(57)【要約】本発明は、種々の形態のコラーゲンまたはアルギン酸塩ビーズまたは糸のような支持材料であって、それへの軟骨細胞の付着および増殖を助けることができる支持材料を含んで成る流動性インプラント可能組成物、ならびに支持材料およびそれに保持された軟骨細胞を含んで成る流動性インプラント可能組成物の製造法に関する。さらに、本発明は、支持材料およびそれに保持された軟骨細胞を含有する流動性組成物の移植による、連結関節面軟骨の有効な治療法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持材料に近接に保持された軟骨細胞を含んで成る流動性のインプラント可能組成物。
【請求項２】
接着剤をさらに含んで成る請求項１に記載のインプラント可能組成物。
【請求項３】
該支持材料が微粒固体または半固体材料である請求項１に記載のインプラント可能組成物。
【請求項４】
該支持材料が生分解性である請求項１に記載のインプラント可能組成物。
【請求項５】
該生分解性材料がコラーゲンである請求項４に記載のインプラント可能組成物。
【請求項６】
該生分解性材料が架橋コラーゲンである請求項５に記載のインプラント可能組成物。
【請求項７】
該軟骨細胞が該支持材料上に保持されている請求項１に記載のインプラント可能組成物。
【請求項８】
該軟骨細胞が該支持材料中に保持されている請求項１に記載のインプラント可能組成物。
【請求項９】
インプラント可能組成物の製造法であって、
それに付着した軟骨細胞を保持するように構成された支持材料に、軟骨細胞を添加し、
該軟骨細胞および該支持材料の流動性混合物を形成する、
ことを含んで成る方法。
【請求項１０】
該形成工程が、接着剤を、該軟骨細胞および該支持材料と混合することを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該軟骨細胞および該支持材料を、該支持材料への該細胞の付着を促進する環境条件に暴露することをさらに含んで成る請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該支持材料が微粒固体または半固体材料である請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
該支持材料が生分解性である請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
該生分解性材料がコラーゲンである請求項１３に記載のインプラント可能組成物。
【請求項１５】
該軟骨細胞が該支持材料上に保持されている請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
該軟骨細胞が該支持材料中に保持されている請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のインプラント可能組成物を治療すべき面に注入することによる、連結関節面軟骨の有効な治療法であって、
（ａ）該インプラント可能組成物を、治療すべき面に配置する工程、および
（ｂ）該軟骨細胞を、該面において増殖させ、軟骨を形成させる工程、
を含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）  
本発明は、軟骨細胞のインプランテーション（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、軟骨の移植、治療、関節修復、および関節炎性病状の予防の分野に関する。本発明は、特に、新規形態のインプラント（ｉｍｐｌａｎｔ）、ならびに軟骨細胞のインプランテーションおよび軟骨再生の新規方法に関する。
（発明の背景）
米国において毎年５００，０００以上の関節形成術および全関節置換術が実施されている。ほぼ同数の同処置がヨーロッパでもなされている。これらの数値には、毎年約９０，０００の全膝置換術および約５０，０００の膝欠陥修復術が含まれる（Ｐｒａｅｍｅｒ  Ａ．，  Ｆｕｒｎｅｒ  Ｓ．，  Ｒｉｃｅ，  Ｄ．Ｐ．，  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，  Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，  Ｉ１１．、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ，  １９９２，  １２５）。軟骨の再生治療法が最も有効であり、関節損傷の初期段階で実施することができ、それによって、人工関節置換手術を必要とする患者数を減らすことができる。そのような予防的治療法によって、変形性関節症を発症する患者数も減少しうる。
【０００２】
損傷した関節の軟骨構造を再平滑化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）するのに使用されている方法は、主に、軟骨下の穴開け、研磨およびその他の方法を使用して軟骨の修復を誘導しようとするものであり、それによって、疾患のある軟骨および軟骨下の骨が切除され、血管化海綿質が露出される（Ｉｎｓａｌｌ，  Ｊ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｏｒｔｈｏｐ．  １９７４，  １０１，  ６１、Ｆｉｃａｔ  Ｒ．Ｐ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ．  １９７９，  １４４，  ７４、Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｌ．Ｌ．（ＭｃＧｉｎｔｙ  Ｊ，Ｂ．，編）Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９１，  ３４１）。
【０００３】
ＣｏｏｎおよびＣａｈｎ（１９６６，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５３、１１１６）は、ニワトリ胚原節から軟骨合成細胞を培養する方法を記載している。後に、ＣａｈｎおよびＬａｓｈｅｒ（１９６７，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ５８、１１３１）は、軟骨分化の必要条件としてのＤＮＡ合成の関与を分析するシステムを使用した。軟骨細胞は、増殖によりＥＧＦおよびＦＧＦの両方に反応する（ＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚおよびＭｅｓｃｈｅｒ，  １９７７，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ９３、１１７）が、最終的にそれらの分化した機能を失う（Ｂｅｎｙａら、１９７８，  Ｃｅｌｌ  １５、１３１３）。軟骨細胞を増殖させる方法は記載されており、（Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ  Ｍら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９９４，  ３３１，  ８８９）による記載のように少し調整して主に使用されている。これらの方法を使用して増殖させた細胞は、患者の膝関節に自己移植片（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）として使用された。
【０００４】
Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭａｒｙｌａｎｄのＣｈｏｎｄｒｏｓ，  Ｉｎｃ．に譲渡された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／０６５４１号は、マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）上で増殖させた細胞を開示している。次に、酵素的消化によって、細胞をマイクロキャリアから分離させている。この文献は、インプランテーションに使用される細胞の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）として機能しうる種々のポリマーも開示している。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／０６５４１号の全ての内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００５】
さらに、Ｋｏｌｅｔｔａｓらは、長期細胞培養下の、コラーゲンおよびプロテオグリカンのような軟骨特異性分子の発現を調査した。彼らは、単層培養での培養中の形態的な変化（Ａｕｌｔｈｏｕｓｅ，  Ａら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  １９８９，  ２５，  ６５９、Ａｒｃｈｅｒ，  Ｃ．ら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １９９０，  ｍ９７，  ３６１、Ｈａａｎｓｅｌｍａｎｎ，  Ｈ．ら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １９９４，  １０７，  １７、Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒｅ，  Ｊ．ら、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １９９４，  ２１２，  ９７）にもかかわらず、アガロースゲル、アルギン酸塩ビーズ上での懸濁培養、または攪拌培養（丸い細胞形態を維持）と比較した場合、ＩＩおよびＩＸ型コラーゲンおよび大きい凝集プロテオグリカン、アグレカン、バーシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）およびリンクタンパク質のような発現マーカーは変化しないことを見出した（Ｋｏｌｅｔｔａｓ，  Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，  １０８，  １９９１）。
【０００６】
関節軟骨細胞は、軟骨にもっぱら見られる特殊間葉誘導細胞である。軟骨は、無血管組織であり、その物理的特性は、軟骨細胞によって産生される細胞外マトリックスに依存する。軟骨内骨形成の間に、軟骨細胞は、Ｘ型コラーゲンの発現の開始を特徴とする、細胞肥大に導く成熟を受ける（Ｕｐｈｏｌｔ，  Ｗ．Ｂ．およびＯｌｓｅｎ，  Ｒ．Ｒ．，  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｐｅｃｔｓ（Ｈａｌｌ，  Ｂ．  ＆  Ｎｅｗｍａｎ，  Ｓ．編）ＣＲＣ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  １９９１，  ４３、Ｒｅｉｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｅ．ら、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  １９９１，  １４８，  ５６２、Ｋｉｒｓｃｈ，  Ｔ．ら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，  １９９２，  ５２，  ８９、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，  Ｍら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １９９３，  １０３，  １１１１）。
（発明の概要）
本発明は、支持材料、好ましくは、微粒ビーズ、糸、ウェファー、糸玉、またはビーズ、糸、ウェファーおよび／または糸玉の組み合わせを含有する固体または半固体材料（以下「微粒支持材料（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」）を含んで成るインプラント可能組成物を提供する。１つの態様において、微粒支持材料は、種々の大きさおよび形である。１つの態様において、微粒支持材料は、軟骨細胞または他の種類の細胞のそれへの付着および増殖を助け、いくつかの態様においては、微粒支持材料の表面に保持された軟骨細胞と共に、インプランテーション部位への注入の前および／または後において流動性を有する。
【０００７】
本発明の１つの態様において、微粒支持材料がその表面に１個またはそれ以上の多孔性開口部を有する故に、軟骨細胞は微粒支持材料の表面ならびにその中において増殖または付着する（今後ひとまとめにして「付着（ａｄｈｅｒｅ）」と称す）。使用において、本発明のインプラント可能組成物は、さらに１つまたはそれ以上の接着剤および／または賦形剤、例えば、ゲル、コラーゲン、フィブリングルー、自己、半自己および非自己グルーならびにコラーゲン、皮膚グルー、外科用グルー、およびアルギン酸塩を任意に含有する。
【０００８】
次に、本発明のインプラント可能組成物を、下記の１つまたはそれ以上として、患者に（一般に注入により）投与することができる、１）接着剤および／または賦形剤およびインプラント可能組成物の混合物、２）接着剤または賦形剤を任意に含有するインプラント可能組成物の層、次に、１つまたはそれ以上の接着剤の層、３）１つまたはそれ以上の接着剤の層、次に、接着剤または賦形剤を任意に含有するインプラント可能組成物の層、または４）接着剤または賦形剤を含有しないインプラント可能組成物の層。
【０００９】
本発明は、微粒支持材料、およびそれに保持された軟骨細胞または軟骨を形成しうるかまたは軟骨を形成しうる細胞に分化しうる他の細胞を含んで成るインプラント可能組成物の製造方法も含む。間葉細胞、血液細胞および脂肪細胞のような他の細胞を本発明に使用できる。他の態様において、本発明は、接着剤または賦形剤と組み合せた前記のインプラント可能組成物の製造法を含む。さらに、本発明は、微粒支持材料およびそれに保持された軟骨細胞を含有し、そして／または接着剤または賦形剤と任意に組み合せた組成物のインプランテーション（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）による、連結関節面軟骨の有効な治療法（例えば、損傷関節面の患者使用の向上）を提供する。
【００１０】
本明細書において使用される「約」という語は、表示値の±約１０％を意味し、例えば「約２０ミクロン」は近似的に１８〜２２ミクロンを指す。粒子の大きさは、当業者に既知の通常法によって測定できる。
（発明の詳細な説明）
本発明は、微粒支持材料表面上またはその中における軟骨細胞の付着および／または増殖を助けることができる微粒支持材料を含んで成るインプラント可能組成物を含む。本発明はさらに、軟骨細胞がその上またはその中に付着および／または増殖している微粒支持材料を含んで成るインプラント可能組成物の製造法も含む。さらに、本発明は、微粒支持材料ならびにその中および／またはその上に付着および／または増殖している軟骨細胞を含有する組成物の移植またはインプランテーションによる、損傷した連結関節面軟骨の有効な治療法も含む。組成物のインプランティングまたは移植による連結関節面軟骨の有効な治療法は、任意に注入、特に関節鏡注入、または他の最小限に侵襲性の配置によって、治療すべき面上または領域内に組成物を配置し、そして、該面上および領域内に軟骨細胞を増殖させ、それによって軟骨組織を保持することを含む。１つの態様において、該治療法は、最小の骨表面スペースを有する関節、例えば、肩および股関節部の球関節、ならびに手および足の指節間関節のような他の関節および顎のような顔関節（それらに限定されない）における、関節面軟骨の治療に特に使用しうる。
【００１１】
さらに、本発明の組成物および方法のいくつかの態様において、本発明は、１つまたはそれ以上の生物適合性接着剤ならびに１つまたはそれ以上の賦形剤の使用を任意に含む。本明細書において使用され、下記に詳しく記載されるように、賦形剤は、インプラント可能組成物の流動性に影響を与えうる生物適合性物質である。接着剤は、処置される所望表面上または所望領域中に本発明の組成物を保持するのに使用される。１つの態様において、接着剤は、止血バリアとして機能し、インプランテーションの前および後に賦形剤と同様にインプラント可能組成物の流動性に任意に影響を与えるように選択される。
【００１２】
本発明の各成分について、下記に詳しく説明する。説明目的にすぎないが、糸、ビーズ、糸玉および／またはウェファーとして使用される例示的生分解性材料として、コラーゲンを記載するが、本発明に使用するのに好適な他の生分解性材料も使用しうる。
【００１３】
インプラント可能組成物
本発明のインプラント可能組成物は、微粒支持材料（「支持材料」または「多孔性コラーゲン生体材料」とも称される）および、該支持材料に付着した細胞、または支持材料表面が多孔性である場合は該支持材料中に付着した細胞を含有する。
【００１４】
微粒支持材料は、コラーゲンの酸化溶液を架橋浴に注入することによって製造できる（図１０〜１８に関して下記に記載）。そのような１つの態様において、ペプシン抽出法を使用して酸化コラーゲンを製造して、コラーゲン繊維を形成し、それを−２０℃に維持する。定期的に、繊維を酸酸化に付して炭水化物およびヒドロキシリシン官能基を酸化し、これらはアルデヒド基を形成する。次に、コラーゲンをＮａＣｌの溶液に沈殿させることができ、次に、追加ＮａＣｌで洗浄する。沈殿および洗浄後に、沈殿物をアセトンで再び洗浄して、酸化コラーゲン粉末を形成し、次に、該粉末を酸に溶解して、架橋浴への注入に好適な酸化コラーゲン溶液を得、該浴において、１）アミン基と、２）酸化炭水化物およびヒドロキシリシン基との反応が生じ、それによってポリイミン架橋網状構造が形成される。１つの態様において、図１０〜１２に関して下記に詳しく記載するように、９０°末端（９０  ｄｅｇｒｅｅ  ｅｎｄ）および０．５ｍｍ直径を有する針１６を使用して、０．５〜１．５％コラーゲン溶液を架橋浴に注入することができる。
【００１５】
多孔性コラーゲン生体材料を形成するために、一般に、コラーゲンα鎖を架橋法によって原線維に共有結合させる。初めに、コラーゲンを過ヨウ素酸によって酸化して、ヒドロキシリシンおよび糖残基の酸化によってα鎖内にアルデヒド基を生成する。１つの態様において、Ｔａｒｄｙらの米国特許第４９３１５４６号（その全ての内容は参照として本明細書に組み入れられる）に開示されている方法によって、コラーゲンを架橋させることができる。下記のように、次に、毛管によってコラーゲンゲルを注入することによって、ビーズ、糸、糸玉およびウェファーを形成することができる。米国特許第４９３１５４６号に開示のように、架橋は、中性ｐＨにおいて、アルデヒド基（Ｒ−ＣＨＯ）とアミノ基（Ｒ’−ＮＨ２）との反応によって起こり、次に、ポリイミンＲ−ＣＨ＝Ｎ−Ｒ’架橋を生じる。そのような態様において、糸を、グルタルアルデヒドで架橋してもよくしなくてもよい。さらに他の態様において、コラーゲン構造物の一部を追加量のコラーゲンで被覆して、構造物表面の一部にフィルムを形成する。フィルムは、細胞移動を防止するバリアとして機能する。
【００１６】
コラーゲンビーズ２２、糸１２、糸玉１２およびウェファー３７の形成は、架橋浴へのコラーゲンの種々の注入法を含み、各方法を図１０〜１８に関して下記に詳しく説明する。１つの態様において、該浴への注入後に、コラーゲン支持材料の酸性度を中和し、グリセロール培養に付す。１つの態様において、次に、支持材料を空気流下で乾燥し、ガンマ滅菌のように放射線によって滅菌して、細胞培養に好適な支持材料を得る。
【００１７】
本発明において使用される支持材料は、糸１２、糸玉１２、ビーズ２２またはウェファー３７、および／またはそれらの混合物の形態である。
【００１８】
Ａ．糸
１つの態様において、微粒支持材料は、１つまたはそれ以上の糸から成る。糸の一部分を図１に示す。図１に示す態様において、糸１２は、糸１２の表面に付着した細胞１１を有する。他の態様において、糸１２を、あらゆる生分解性材料、例えばコラーゲン、特にＩ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンまたはそれらの組み合わせ、または下記の微粒支持材料の１つまたはそれ以上から製造することができる。支持材料を互いに架橋させることもできる。一般に、糸１２の寸法は、その上またはその中への（糸１２の多孔度および細胞１１の大きさに依存）、哺乳動物細胞の付着および／または増殖に適している。糸１２は一般に直径約２０〜４００ミクロンである。糸１２のいくつかの態様において、孔は、軟骨細胞のような細胞の糸１２の内部への移動を可能にするのに充分な孔を有する。次に、糸１２を使用して、図６および７に示し下記に詳しく記載するスポンジ状材料を形成することができ、または糸１２を、糸玉１２（図１２に糸玉１２Ａとして参照符を付す）に形成するかプレスするかまたは巻くことができ、いくつかの態様において、糸１２は総表面積約３０ｃｍ２を有しうる。図１９に示し、下記に詳しく記載するように、糸１２をウェファーに形成することもできる。
【００１９】
１つの態様において、コラーゲンゲルのような生分解性材料を毛管によって、凝結浴に注入することによって、糸１２を製造することができる。糸は、架橋の発生後に不溶性になる。図１０、１１および１２に示すように、酸化コラーゲン１３の溶液（好ましくは１％酸化コラーゲン）を、一般に、９０°末端および０．５ｍｍ直径を有する針１６によって、架橋緩衝剤浴１４に注入することができる。１つの態様において、コラーゲンを、連続または半連続流または糸１２において注入する。コラーゲンが架橋緩衝剤と接触すると共に、コラーゲンが凝固し始める。糸玉１２（図１２において１２Ａとして示す）を、単一のコラーゲン糸から形成することができ、その糸は、それ自体に架橋するか、または別に架橋したコラーゲン糸または糸断片（それら自体互いに架橋できる）に架橋する。
【００２０】
架橋コラーゲン糸の形態の糸玉１２の例を、図１９の顕微鏡図に示す。
【００２１】
または、糸を支持材料として使用する１つの態様において、糸１２を、他の玉状形態に成形するか巻くかまたはプレスすることができ、または下記のようにスポンジ状材料に形成することができる。
【００２２】
Ｂ．ビーズ
他の態様において、微粒支持材料は、図２に示す１つまたはそれ以上のビーズ２２を含有する。図２に示す態様において、ビーズ２２は、ビーズ２２の表面に付着および／または増殖した（ビーズ２２の多孔度および細胞１１の大きさに依存）細胞１１を有する。ビーズ２２は、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンまたはそれらの組み合わせを包含する任意の生分解性材料、または下記の微粒支持材料の１つまたはそれ以上から製造できる。一般に、ビーズ２２の直径は、それへの哺乳動物細胞の付着および／または増殖に適した大きさであり、通常、直径２０〜４００ミクロンである。架橋コラーゲンから製造したビーズ２２の例を、図２０の顕微鏡図に示す。他の態様において、ビーズ２２が充分な多孔度を有する場合、細胞１１はビーズ２２の中に付着および／または増殖しうる。ビーズ２２の多孔性態様において、孔は、ビーズ２２の内部への軟骨細胞のような細胞の移動を可能にするのに充分な直径を有する。
【００２３】
１つの態様において、ＩＭＥＤＥＸのＥＰ特許出願公開第３５１２９６Ａ１号（その全ての内容は参照として本明細書に組み入れられる）に開示されている方法によって、ビーズ２２を製造することができる。ＩＭＥＤＥＸのＥＰ特許出願公開によれば、ブタまたはウシ由来の真皮からのＩ型コラーゲン小滴を形成し、コラーゲン溶液から回収する。図１３、１４および１５に示すように、酸化コラーゲン溶液２５（一般に約０．８％コラーゲン）を、針１６によって架橋緩衝剤溶液１４に注入して、ビーズ２２を形成する。１つの態様において、圧縮空気３１を使用して、コラーゲン溶液を針１６に入れる。コラーゲンを架橋緩衝剤に注入すると共に、バイブレーター２９が注入装置を静かに振動させて、針から滴下したコラーゲンを１滴ずつの形態にし、ビーズ小滴２２を形成する。図１４および１５に示すように、ビーズ小滴２２が別々に架橋緩衝剤と接触すると共に、ビーズ小滴２２の表面が架橋し、凝固し、架橋緩衝剤中に固体ビーズ２２として集まる。ビーズの分離は、攪拌によって維持することができ、１つの態様においては電磁攪拌バー２７によって維持される。次に、コラーゲン小滴を、凝固コラーゲンビーズ２２として溶液から分離する。この態様において、ビーズの大きさは、直径約２０μｍ〜約２ｍｍである。本発明のコラーゲンビーズの例示的顕微鏡図を図２０に示す。
【００２４】
Ｃ．ウェファー
図１６、１７および１８にさらに示すように、多量の酸化コラーゲン溶液１３を、架橋緩衝剤１４（コラーゲン糸１２をそこに架橋させ沈降させるポリマーメッシュ３５を任意に含有）に、針１６で注入することによって、ウェファー３７を形成することもできる。この方法の１つの態様において、糸１２の連続または半連続モノフィラメントを手動的に調製し、脱水前に適切な大きさの立体容器に充填し、それによってウェファー３７の選択的態様を形成することができる。架橋コラーゲン糸から形成したウェファー３７の例を、図１９の顕微鏡図に示す。
【００２５】
ウェファー３７（または本明細書に記載した他の微粒支持材料）が一旦形成されれば、付加的コラーゲンのフィルム（架橋または非架橋コラーゲンフィルム）に結合させることができる。１つの態様において、ペトリ皿のような固体支持体に含有されているコラーゲンフィルム上に、ウェファー３７を置くことによって、ウェファー３７をコラーゲンフィルムに結合させることができる。図９に示すように、１つの態様において、糸１２を（図７に示すように、糸１２を乾燥し、容器にランダムに充填した後）、細胞の移動を防止する細胞バリアを形成するフィルム９５に結合させる。
【００２６】
いくつかの態様において、ウェファー３７は、約５０ｃｍ２までの細胞培養に使用できる表面積を有する。
【００２７】
Ｄ．微粒支持材料の他の形態
１つの態様において、図８に記載されている方法によって、即ち、所望支持材料（例えばコラーゲン）の溶液８３を、図示されている容器８６のような容器中でインキュベーションすることによって、均質コラーゲンゲル８５を製造することができる。しかし、他の態様においては、スポンジ状ゲル構造物を、ビーズ２２または糸１２から製造することができる。特に、ビーズ２２および／または糸１２を一緒に充填して、図５、６、７および８に示すようなビーズ２２および／または糸１２およびゲル５４を含有するゲル構造物を形成することができる。ゲル構造物の多孔度は、粒子間の間隙量によって限定され、一般に、充填されたビーズ２２および／または糸１２の総容量の３０％〜５０％である。１つの態様において、ゲル５４はコラーゲンである。
【００２８】
図５において、微粒支持材料は、容器５２に充填された本発明のビーズ２２を含有する（しかし、微粒支持材料は、糸１２および／またはウェファー３７も含有しうる）。１つの態様において、次に、ビーズ２２をコラーゲンゲル５４に分散させる。
【００２９】
図６に示す態様において、微粒支持体は、糸１２を架橋する前または後に容器６２に充填した糸１２のモノフィラメントを含有し、乾燥後に、乾燥不溶性モノフィラメントを形成する。１つの態様において、本発明の糸１２を架橋の前または架橋の間に容器に充填し、それによって、図７に示すように、糸１２が容器７２においてランダムに充填され、相互連結される。
【００３０】
選択的態様において、微粒支持材料（糸１２またはビーズ２２）を、１つまたはそれ以上の他の再吸収性材料から製造することができる。そのような微粒支持材料は、適切な寸法基準が満たされれば、アルギン酸塩、デンプン、ヒアルロナン、デキストラン（Ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ，  Ａ．Ｌ．  １９６７，  Ｎａｔｕｒｅ  ２１６、６４、６５参照）、セルロース（Ｒｅｕｖｅｎｙ，  Ｓ．ら、１９８２，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｔａｎｄ．  ５０、１１５−１２３参照）、コラーゲン（Ｒ．  Ｃ．  Ｄｅａｎら、１９８５，  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｅｄ，  Ｂ．  Ｋ．  Ｌｙｄｅｒｓｅｎ，  Ｈａｎｓｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｐ．１４５−１６７参照）、またはゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅ，  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，  Ｐｅｒｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ  ＡＢ参照）から製造することができる。他の関連基準は、支持材料の多孔度、支持材料の分解時間、および支持材料が架橋されるかどうかを包含する。１つの態様において、本発明の微粒支持材料は、１つまたはそれ以上の他の再吸収性材料と組み合わせたコラーゲンを含んで成る。さらに、本発明によれば、微粒支持材料は、非架橋でもあってよく、または当業者に明らかな１つまたはそれ以上の架橋剤を使用して架橋してもよい。適切な架橋剤は、グルタルアルデヒドおよび同様の化合物を包含する。好ましくは、微粒支持材料は、微粒支持材料上またはその中への軟骨細胞の付着および／または増殖を助け、インプラントを受けている患者の体内で徐々に吸収される生分解性材料を包含する。
【００３１】
さらに、本発明は、前記のような微粒支持材料に軟骨細胞を添加することを含むインプラント可能な組成物の製造法も含む。そのような態様において、ビーズ、糸、またはビーズと糸の混合物を、本発明によって製造する。付着性細胞は、微粒支持材料の表面に付着する本来の性質を有する。しかし、他の態様において、該方法は、接着剤、例えば１つまたはそれ以上の下記接着剤を、軟骨細胞および微粒支持材料と混合することをさらに含んでなる。接着剤を使用する態様において、（１）細胞より先に支持材料に適合した接着剤層を使用して、細胞を支持材料に付着させるか、（２）接着剤を使用せずに支持材料に付着させた細胞上に、１つまたはそれ以上の接着剤層を適用するか、または（３）接着剤と細胞の混合物を支持材料に付着させる。本発明は、自系および／または同種異系軟骨細胞および／または異種軟骨細胞も使用しうる。
【００３２】
１つの態様において、当業者に明らかな方法によって、一般に、β線またはγ線照射ならびにエチレンオキシド拡散によって、微粒支持材料を滅菌することができる。
【００３３】
本発明において使用されるように、本発明のインプラント可能組成物は、それに付着した細胞を有する微粒支持材料を含有する。インプラント可能組成物は、本明細書に記載のような適切な賦形剤および接着剤も任意に含有する。
【００３４】
賦形剤
いくつかの態様において、それに付着した細胞を有する微粒支持材料の個々の粒子が、引力およびファン・デル・ワールス力のような力によって会合し、それによって、微粒支持材料および細胞を含有する容器（即ち、インプラント可能組成物）の底部に沈殿物を形成することがわかった。この沈殿物はある範囲の粘度を有し、多くの要因に依存して流動性であるか分からない場合、または流動性でない場合もある。本明細書において使用されるように、流動性とは、流体に特徴的な仕方で、間断ない連続性で滑らかに移動または流動することを意味する。しかし、いくつかの態様において、例えば下記のように粘性ゲルを賦形剤として使用した場合、本発明物質はゆっくり流れることができ、従って、易流動性から硬化にまで及ぶことができる。本発明物質の流動性に影響を与える要因は、１）微粒支持材料および細胞が収納容器に留まる時間、２）微粒支持材料の個々の粒子の寸法および形、および３）微粒支持材料およびあらゆる周辺材料における細胞増殖の量、を包含する。
【００３５】
従って、例えば注入による、本発明物質の患者への投与を容易にするために、前記組成物の流動性を調節することが望ましい場合が多い。組成物の流動性を調節するために、賦形剤をインプラント可能組成物に直接組み合わすことができる。賦形剤の流動性、およびそれに伴ってインプラント可能組成物の流動性に影響を与える要因は、当業者によって認識されるものであり、密度および粘度を包含するがそれらに限定されない。流動性に影響を与える他の要因は、使用される接着剤ならびに本発明に使用される賦形剤または添加剤の化学的および物理的特性を包含する。いくつかの態様において、微粒支持材料は、接着剤によって欠損部に固定されるので、粘度はまた測定時期にも依存し、従って流動性から固定にまで及ぶ。
【００３６】
好適な賦形剤は、あらゆる生物適合性（例えば、軟骨細胞およびインプラントしうるあらゆる組織との適合性）の液体、縣濁液、ゲルまたはゲル状物質、または微粒固体または半固体物質を包含し、それらは下記の能力を特徴とする、処置すべき面へのインプランテーション前およびインプランテーション後の両方において、その中またはその上における軟骨細胞の付着および／または成長および／または増殖を可能にする時間にわたって表面上または内部に軟骨細胞を保持する能力、および、細胞増殖および細胞分化（適用可能であれば、使用される特定の種類の細胞への分化）を最適化する軟骨細胞の自然環境に類似した系を与える能力。好ましくは、微粒支持材料は、軟骨細胞の付着および増殖を助け、インプラントを受けている患者の体内に徐々に吸収される生分解性材料を含有する。
【００３７】
接着剤
１つの態様において、インプラント可能組成物はさらに、何らかの生物適合性接着剤も含有する。そのような接着剤は、コラーゲンまたはフィブリングルー、生理的グルー、自己グルー、半自己および非自己グルーまたはゲルを包含する。本発明のインプラント可能組成物は、１つまたはそれ以上の接着剤および／または賦形剤、例えば、ゲル、皮膚グルー、外科用グルーおよびアルギン酸塩も任意に含有する。適用可能な接着剤の特定の例は、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  １６２７  Ｌａｋｅ  Ｃｏｏｋ  Ｒｏａｄ，  ＬＣ−ＩＶ  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，  ＩＬ  ６００１５，  ＵＳＡから入手可能なＴｉｓｓｅｅｌ  ＶＨＴＭフィブリンシーラントである。好適な有機グルー物質が市販されており、その例は、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）またはＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（フィブリンに基づく接着剤、Ｉｍｍｕｎｏ  ＡＧ，  Ａｕｓｔｒｉａ）、Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（カタログＮｏ．Ａ−２７０７、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  ＵＳＡ）、およびＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｂ（カタログＮｏ．８９５−３、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ＵＳＡ）である。
【００３８】
前記のように、それに付着した細胞を有する微粒支持材料に、生物適合性接着剤を直接組み合わすことができ、それによって、下記に詳しく記載するように、本発明物質の流動性に影響を与えることができる。または、処置すべき面に接着剤を層として適用し、次に、付着した細胞を有する微粒支持材料の層を適用することができる。または、付着した細胞を有する微粒支持材料の層を処置すべき面に適用した後に、接着剤を層として適用することもできる。他の態様においては、生物適合性接着剤、細胞および微粒支持材料を、別々に、または混合によって組み合わせて、処置すべき面に適用する。
【００３９】
接着剤を本発明のインプラント可能組成物に直接組み合わす態様において、接着剤はまた、軟骨受容者の特定の要求に適合するように、本発明物質の流動性を調節しうるという利益も与える。接着剤は、粘度および密度のような接着剤の特性に依存して、前記の賦形剤と同様に本発明物質の流動性に影響を与える。
【００４０】
治療法
本発明は、治療すべき面への組成物のインプラントによる、連結関節面軟骨の有効な治療法を提供し、該治療法は、治療すべき面にインプラント可能組成物を先ず配置し、軟骨細胞がその面に付着し増殖するのを可能にすることによって行われる。次に、細胞が軟骨基質を産生し、増殖し、軟骨基質を生息させる。他の態様において、本発明の方法は、米国特許第５８５７２６９号（その全ての内容は参照として本明細書に組み入れられる）に開示のように、治療すべき面を被覆パッチで覆う付加的段階を含んで成る。
【００４１】
被覆パッチは、インプラント可能組成物を処置すべき面に配置する前に、処置すべき面に部分的に付着させてもよく、またはインプラント可能組成物をその面に配置した後に、その面に配置してもよい。移植した軟骨細胞が適切な位置に保持され、しかも栄養分が得られるように、被覆パッチを修復部位にかぶせる。１つの態様において、被覆パッチは、少なくとも１つの有孔面を有する半透過性コラーゲンマトリックスである。被覆バッチを使用する場合、それは好ましくは、細胞不含、生理的被吸収性、非抗原性の膜状物質である。本発明の１つの態様において、被覆パッチの有孔面を処置すべき面に向ける。さらに、１つの態様において、被覆パッチは、１つの比較的平滑な面、および１つの比較的粗い有孔面を有するシート状の形態である。この態様において、粗い有孔面は一般に、軟骨欠損部に向いて軟骨細胞の内方増殖を促進し、平滑面は一般に、軟骨欠損部に向かず、組織の内方増殖を妨げる。他の態様において、被覆パッチは同じ多孔度の２つの平滑面を有する。
【００４２】
被覆パッチとして使用するのに好適な２つの物質は、商業的に入手可能なＩ型／ＩＩ型コラーゲン膜、Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）またはＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）（Ｅｄ．  Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｓｏｈｎｅ，  Ｗｏｌｈｕｓｅｎ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）である。本発明に使用できる付加的物質は、商業的に入手可能なＩＩ型コラーゲンマトリックス膜、Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｃｅｌｌ（登録商標）（Ｅｄ．  Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｓｏｈｎｅ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）である。
【００４３】
止血態様
１つの態様において、本発明の方法はまた、インプラント可能組成物の移植および任意に被覆パッチと連結して、止血製品を使用することも含む。止血製品は、軟骨の欠損部への軟骨細胞の自己移植の過程において、定着しつつある軟骨の中に突き出ている毛細血管ワナのような血管組織の形成を阻止する。そのような製品は、軟骨下の層の中または下に欠損が広がっている骨の軟骨損傷（全厚損傷と称される場合もある）を修復するのに有効な場合がある。下にある骨からの血管組織の形成は、形成すべき新しい軟骨の中に突き出す傾向があり、これは、所望される間葉特殊軟骨細胞以外の細胞を発生させる。血管新生によって導入される夾雑細胞は、インプラントした軟骨細胞によって形成される軟骨への侵入および異常増殖を生じる。
【００４４】
本発明は止血製品またはバリアと共に使用できるが、前記のような、接着剤または賦形剤を本発明のインプラント可能組成物と共に使用する態様においては、接着剤または賦形剤が有効な止血バリアとして機能しうることが見出された。しかし、他の態様においては、前記のような任意の膜を使用して、血液がインプラント可能組成物に接触するのを防止することができる。
【００４５】
本発明に使用できる市販膜製品の種類の１つは、７〜１４日後に被吸収性のＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｌｔｄ．，  ＵＫ）である。これは、この特定止血器具、例えばＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）の、Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｌｔｄ．による製品差込に記載されている通常使用とは異なる。他の膜製品は、前記のＣｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）およびＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）を包含する。
【００４６】
軟骨への再血管新生を阻止するために、止血材料を使用することができ、それはゲル状人工凝固剤として作用する。そのような止血バリアによって被覆されている関節軟骨の全厚欠損部内に赤血球が存在する場合、これらの血球はヘマチンに化学的に変化し、それによって血管増殖を誘発できない。このように、フィブリン接着剤の使用または不使用において、再血管新生抑制バリアとして使用される止血製品、例えばＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）は、本発明によって開示される方法の１つの態様に有効である。
【００４７】
本発明のインプランテーション法は、関節鏡法、関節小切開（ｍｉｎｉａｒｔｈｒｏｔｏｍｉｃ）法または切開手術（ｏｐｅｎ  ｓｕｒｇｉｃａｌ）法によって行うことができる。
【００４８】
欠損または損傷は、直接的に治療しうるか、または、米国特許出願第０９／３２０２４６号（その全ての内容は参照として本明細書に組み入れられる）に開示のように、インプラント可能組成物を収容するために、インプラント前に外科的方法によって少し広げるかまたは削ることができるものと理解される。
【００４９】
培養手順
付着性細胞１１および２１が、付着し増殖するのに最適な表面積を有することは注目すべきことである。ビーズ２２、ウェファー３７または糸１２の表面積が、細胞（例えば、細胞２１または１１）に対して広すぎるかまたは狭すぎる場合、細胞は増殖しない。従って、ビーズ２２または糸１２への細胞２１および１１の付着および増殖のために、細胞２１および１１に対する微粒支持材料ビーズ２２または糸１２の最適表面積が必要とされる。一般的な最適表面積は、直径２０ミクロン〜４００ミクロンのビーズ２２または糸１２を使用することによって得られる。
【００５０】
例として、軟骨細胞の培養手順、付着および／または増殖、ならびに軟骨細胞の培養手順および／または付着および／または増殖に使用される移植培地を、それぞれ下記に詳しく記載し、始めに記載するのは、採取した軟骨生検試料を処理し、本発明によって軟骨細胞を培養するのに使用される実験手順である。
（実施例１軟骨細胞の採取および増殖）
培養工程の間に軟骨生検試料を輸送および／または処理し、軟骨細胞を増殖させるのに使用される増殖培地（以下に、「培養基」と称す）は、下記のものを混合して約４００ｍＬの培養基を形成することによって製造される、２．５ｍＬ  硫酸ゲントマイシン（濃度７０μｍｏｌ／Ｌ）、４．０ｍＬ  アンホテリシン（濃度２．２μｍｏｌ／Ｌ、商品名Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）、Ｓｑｕｉｂｂから入手可能な抗真菌薬）、１５ｍＬ  １−アスコルビン酸（３００μｍｏｌ／Ｌ）、１００ｍＬ  ウシ胎児血清（最終濃度２０％）および残りのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地。（同じ培養基が、軟骨生検試料を病院から実験室に移すのにも使用され、該実験室で軟骨細胞を抽出し、増殖させる）
自己インプラントについては、例えば患者の関節の非体重支持領域から、軟骨生検試料を関節鏡法によって先ず採取し、２０％ウシ胎児血清を含有する培養基に入れて実験室に輸送する。次に、軟骨生検試料を、トリプシンエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような酵素、タンパク質分解酵素および結合剤で処理して、軟骨から軟骨細胞を分離し、抽出する。次に、抽出した軟骨細胞を、培養基において、初期細胞数約５万から最終軟骨細胞数約２千万またはそれ以上に培養する。
【００５１】
患者から得た血液を、約３，０００ｒｐｍで遠心分離して、血清を他の血液構成物から分離する。分離した血清を保存し、後の培養工程段階および移植工程において使用する。
【００５２】
自己移植のために患者から前もって採取した軟骨生検試料を、前記の培養基に入れて実験室に輸送し、そこで培養する。実験室に到着した際に、軟骨生検試料を分離するために、培養基をデカンテーションし、捨てる。次に、軟骨生検試料を単純（ｐｌａｉｎ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２において少なくとも３回洗浄して、軟骨生検試料上のウシ胎児血清の薄膜を除去する。
【００５３】
次に、２８ｍＬのトリプシンＥＤＴＡ（濃度０．０５５）を添加した前記の培養基を含有する組成物中で、軟骨生検試料を洗浄する。この組成物中で、３７℃、５％ＣＯ２において、軟骨生検試料を５〜１０分間培養する。培養後、軟骨生検試料を培養基中で２〜３回洗浄して、生検試料から任意のトリプシン酵素を除去する。次に、軟骨の重さをはかる。一般に、軟骨細胞の増殖に必要とされる軟骨の最小量は、約８０〜１００ｍｇである。それより幾分多い量、例えば２００〜３００ｍｇが好ましい。計量後、軟骨を、単純ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地約５０ｍＬ中のコラゲナーゼ（濃度５０００酵素単位、消化酵素）２ｍＬの混合物に入れ、細かく刻んで、酵素が軟骨を部分的に消化しうるようにする。細かく刻んだ後、刻んだ軟骨を漏斗でビンに移し、コラゲナーゼと単純ＤＭＥＭ／Ｆ１２の混合物約５０ｍＬをビンに添加する。次に、細かく刻んだ軟骨を、３７℃、５％ＣＯ２で１７〜２１時間培養する。
【００５４】
１つの態様において、培養した細かく刻んだ軟骨を４０μｍメッシュで漉し、１０分間遠心分離し（１０５４ｒｐｍ、または２００倍の重力にて）、培養基で２回洗浄する。次に、軟骨細胞を数えて、それらの生存率を測定し、次に、軟骨細胞を培養基において３７℃、５％ＣＯ２で少なくとも２週間培養し、その間に培養基を３〜４回交換した。
【００５５】
次に、軟骨細胞をトリプシン処理（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）および遠心分離によって培養基から取り出し、移植培地に移した（該移植培地は、１．２５ｍＬ  硫酸ゲントマイシン（濃度７０μｍｏｌ／Ｌ）、２．０ｍＬ  アンホテリシン（濃度２．２μｍｏｌ／Ｌ、商品名Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）、Ｓｑｕｉｂｂから入手可能な抗真菌薬）、７．５ｍＬ  １−アスコルビン酸（３００μｍｏｌ／Ｌ）、２５ｍＬ  自己血清（最終濃度１０％）および残りのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含有して約３００ｍＬの移植培地を形成する）。
（実施例２インプラント可能組成物）
最適な支持材料、例えば、生物適合性、再吸収性ビーズ、メッシュまたは糸を、滅菌ペトリ皿中の移植培地に混合して、支持材料を移植培地で「湿潤」させ、１つの態様においては、支持材料を移植培地に１〜１０時間またはそれ以上接触させることができる。次に、軟骨細胞を、支持材料と移植培地との混合物に添加する。移植培地は、ＨＡＭ  Ｆ１２および１５ｍＭ  ヘペス緩衝液および１０〜２０％自己血清（これらを全てＣＯ２インキュベーターに３７℃で入れる）を含有する最少必須培地であってよい。
【００５６】
次に、軟骨細胞を、１時間〜１週間のある期間にわたって、支持材料上または支持材料中に付着および増殖させ、１つの態様においては、軟骨細胞を約３７℃の温度に維持する。好ましくは、軟骨細胞を支持材料と共に一晩培養する。１つの態様において、軟骨細胞および培地をゆっくり攪拌して、軟骨細胞が支持材料の全面に付着し増殖しうるようにする。
【００５７】
１つの選択的態様において、攪拌中に、付加的支持材料を軟骨細胞および支持材料の培養細胞に添加して、新しく添加した支持材料への軟骨細胞の付加的付着および増殖を可能にする。いくつかの態様において、１０〜４０ｍｇの支持材料を培養細胞に添加しうる。他の態様においては、支持材料の添加を１〜２０回繰り返すことができる。約１日〜約６週間の培養期間が終了したら、支持材料上またはその中に付着した軟骨細胞を含有する培地は、欠損部位への配置（例えば注入による）の準備ができている。
【００５８】
他の態様において、培養期間中に、支持材料を酵素的に分解し（例えばコラゲナーゼを使用）、それによって細胞を遊離させることができる。次に、酵素を細胞培養から除去し、付加的支持材料を細胞培養に添加することができる。
【００５９】
後の段階で添加される支持材料は、同種の支持材料であってもよく、または異種の支持材料であってもよい。１つの態様において、細胞を、小さい（２０μｍ）支持材料から大きい（４００μｍ）支持材料に移すことができる。他の態様において、細胞を、大きい支持材料から小さい支持材料に移すこともできる。さらに他の態様においては、細胞を、ビーズから、細胞増殖を促進するのに適した大きさおよび表面積を有する糸、ウェファーまたはそれらの任意の組み合わせに移すこともできる。移す段階は１〜２０回繰り返すことができる。
（実施例３インプラント可能組成物）
他の態様において、支持材料を「予備湿潤」せずに、培地に懸濁させた軟骨細胞を支持材料に直接添加しうる。この場合、次に、軟骨細胞を、約１時間〜約６週間のある期間にわたって、支持材料上またはその中に付着および増殖させる。好ましくは、軟骨細胞を支持材料と共に一晩培養する。１つの態様において、軟骨細胞および培地をゆっくり攪拌して、軟骨細胞が支持材料の全面に付着し増殖しうるようにする。
【００６０】
選択的態様において、付加的支持材料（最初の支持材料と同じかまたは異なる支持材料）を、培養期間にわたって添加して細胞培養を拡大した。他の態様においては、トリプシンのような酵素を使用して、支持材料を先ず分解した。次に、分解された最初の支持材料より大きい表面積を有する付加的支持材料を、細胞培養に添加する。培養期間にわたって、支持材料を分解する工程を２回またはそれ以上繰り返すことができる。
【００６１】
培養期間が終了したら、支持材料上またはその中に付着し増殖した軟骨細胞を含有する培地は、欠損部位に配置する準備ができている。
（実施例４選択的支持材料の試験）
種々の支持材料を、細胞の付着および増殖を補助するそれらの能力、ならびに細胞生存率について試験した。下記の支持材料を試験した、グルタルアルデヒドで架橋したＩＭＥＤＥＸからのコラーゲン糸（まだ市販されていない）（図３および４に「糸＋」として示す）、前記のＩＭＥＤＥＸの特許出願公開第３５１２９６Ａ１号に開示されているグルタルアルデヒドを使用せずに架橋したコラーゲン糸（図３および４に「糸−」として示す）、およびグルタルアルデヒドを使用せずに架橋したコラーゲンビーズ（図３および４に「ビーズ」として示す）。Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）膜（正の対照）、ＣＲ−１、ＩＭＥＤＥＸ（登録商標）膜、および膜なし（負の対照）も、比較支持材料として試験した。
【００６２】
コラーゲン糸をプレスして、約０．５ｃｍの直径をおおよそ有する丸い不規則形（例えば、球形の糸玉）を形成した。糸をプレスして球形を形成した場合でも、それらは本明細書において「糸」と称される。ビーズおよび両方の糸型の試料の重さを滅菌条件下にはかり、１２穴の皿に入れた。これらの試料の重さを、各試験番号と共に表１に示す。
【００６３】
【表１】
2005523770.tif 000002
次に、支持材料を燐酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、洗浄液のｐＨを検査して、支持材料がｐＨ値を変化させるかを調べた。支持材料を含有する各穴および空の穴（図３および４に示す）に、培地（ＤＭＥＭ＋２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ））を添加した。軟骨細胞懸濁液を一般的な細胞培養法によって調製し、対照穴および支持材料含有穴に添加した。軟骨細胞を支持材料と共に、ＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃で３日間培養した。３日後、培地を穴から除去し、支持材料をＰＢＳで洗浄した。
【００６４】
次に、酵素溶液（０．２５％トリプシン、５，０００Ｕ／ｍＬコラゲナーゼ）を各穴に添加し、３７℃で培養して、支持材料を溶解させた。各試料の溶解を顕微鏡的に確認し、溶解と同時に、穴の中の懸濁液を遠心管に移した。次に、穴をＤＭＥＭで濯ぎ、その遠心管に移した。懸濁液を２００ｘｇで１０分間遠心分離し、次に、上澄みを捨てた。残留する小球をＤＭＥＭ０．５０ｍＬに再懸濁し、細胞数を数えた。
【００６５】
表１に示すように、ビーズについては合計１２回の試験を行い、グルタルアルデヒドを使用していない糸については１１回の試験、グルタルアルデヒドを使用した糸については９回の試験を行った。細胞の数および生存率についての試験結果を平均し、図３および４に示す。
【００６６】
図３に示すように、結果は、グルタルアルデヒドを使用せずに架橋した糸（「糸−」）から、最も多量の細胞が採取されたことを示した。ビーズにおける細胞量は、負の対照および正の対照（Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）膜）と同等であり、グルタルアルデヒドで架橋した糸（「糸＋」）およびＣＲ−１膜における細胞量はかなり少なかった。さらに、図４に示すように、結果は、ビーズ、グルタルアルデヒドを使用しない架橋糸、およびＣｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）膜において増殖させた軟骨細胞の生存率が、負の対照の軟骨細胞と同等であることも示した。グルタルアルデヒドを使用して架橋した糸、および膜において増殖させた軟骨細胞の生存率も、他の支持材料において増殖させた軟骨細胞よりやはり少なかったが、全ての場合において、いくらかの軟骨細胞の保持および増殖が観察された。
【００６７】
図３に示すように、特に、種々の担体材料から採取した細胞量の違いが明らかであった。最も多い細胞量は、グルタルアルデヒドを使用せずに架橋した糸（「糸−」）から得られた。ほぼ同じ細胞量は、ビーズならびに正および負の対照試験において得られた。より少ない数の細胞は、糸をグルタルアルデヒドで架橋した穴（「糸＋」）、またはＣＲ−１膜を担体とする穴から採取された。
【００６８】
図４は、採取した細胞の生存率を示す。グルタルアルデヒドを使用せずに架橋した糸（糸−）は、平均９４％の最大生存率を有する細胞を生じた。正および負の対照試験ならびにビーズは、それぞれ、同様の結果、９２％、８９％および９２％の細胞生存率を示した。グルタルアルデヒドで架橋した糸（「糸＋」）またはＣＲ−１膜から採取した細胞の生存率は、両方の場合において約７０％であった。
【００６９】
さらに、細胞生存率における、糸の大きさの機械的減少の作用を調べるために、グルタルアルデヒドで架橋した糸の大きさを機械的に小さくした。この試験において、機械的に減少させていない糸から採取した細胞の平均生存率は６５％であり、機械的に減少した糸からの細胞の平均生存率は７８％であった。
【００７０】
この比較試験は、一般にコラーゲンビーズおよび糸ならびに特にグルタルアルデヒドを使用せずに架橋したそのようなビーズおよび糸の形態の微粒支持材料の、軟骨細胞の付着および増殖を助ける能力を立証するものである。コラーゲンビーズ／軟骨細胞組成物、ならびにコラーゲン糸／軟骨細胞組成物は、各場合において、軟骨インプランテーションに好適な流動性組成物であった。
（実施例５支持材料の添加）
コラーゲンミクロビーズを使用した他の例において、ビーズあたり約０．３ｍｍ２の表面積を有するミクロビーズ４０ｍｇの３つの試料を、前記の方法で調製した。十万個の軟骨細胞を、各試料に添加した。試料を、前記の方法で培養基において３日間培養した。第一試料に、さらに１０ｍｇのミクロビーズを添加した。第二試料には、２０ｍｇのミクロビーズを添加した。第三試料には、４０ｍｇのミクロビーズを添加した。試料を３７℃でさらに４日間培養した。４日後、第一試料に、さらに１０ｍｇのミクロビーズを添加した。第二試料には、２０ｍｇのミクロビーズを添加した。第三試料には、４０ｍｇのミクロビーズを添加した。次に、試料を１日間培養した。
【００７１】
次に、細胞を数えたところ、第一試料においては、細胞数１５７，５００個、生存率９５％（図２１）、第二試料においては、細胞数３４７，５００個、生存率９８％（図２２）、第三試料においては、細胞数３２５，０００個、生存率９８％（図２３）であった。この実施例は、付加的支持材料を添加した後の、支持材料において培養した細胞の生存率、および細胞増殖を示すものである。
【００７２】
特定の態様に関して本発明を開示したが、本発明の他の態様および変異形も、本発明の真意および範囲を逸脱せずに当業者によって考案しうることは明らかである。請求の範囲は、そのような全ての態様および同等の変異形も含むものと理解される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】表面に付着し増殖している細胞を有する本発明の糸の一部分の側面図である。
【図２】表面に付着し増殖している細胞を有する本発明のビーズ、微小球またはミクロビーズの側面図である。
【図３】被験支持材料から採取した細胞の平均数を示すグラフである。
【図４】被験支持材料から採取した細胞の平均生存率を示すグラフである。
【図５】本発明の充填微粒ビーズから形成した不均質コラーゲンゲルを示す図である。
【図６】本発明の糸から形成したスポンジ状材料の図である。
【図７】立体容器（ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）に充填した乾燥不溶性繊維のコラーゲンスポンジ状材料を示す図である。
【図８】均質コラーゲンゲルおよびコラーゲンゲル形成法を示す図である。
【図９】コラーゲンフィルムで被覆したコラーゲンスポンジ状材料を示す図である。
【図１０】本発明の糸玉の製造に使用される装置を示す図である。
【図１１】本発明の糸玉の製造法を示す図である。
【図１２】本発明の糸玉の製造法ならびに本発明の糸玉を示す図である。
【図１３】本発明のビーズの製造に使用される装置を示す図である。
【図１４】本発明のビーズの製造法を示す図である。
【図１５】本発明のビーズの製造法を示す図である。
【図１６】本発明のウェファーの製造に使用される装置を示す図である。
【図１７】本発明のウェファーの製造法を示す図である。
【図１８】本発明のウェファーの製造法を示す図である。
【図１９】本発明のコラーゲン糸からそれぞれ製造した糸玉およびウェファーの顕微鏡図である。
【図２０】本発明のコラーゲンビーズの顕微鏡図である。
【図２１】軟骨細胞の顕微鏡図である。
【図２２】軟骨細胞の顕微鏡図である。
【図２３】軟骨細胞の顕微鏡図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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