(57)【要約】【課題】本発明は、樹状細胞等の抗原提示細胞の非特異的免疫を効率的に高めることで獲得される抗腫瘍活性により顕著な治療効果を発揮し、さらに安全性、信頼性に優れる医薬組成物を製造することを目的とする。【解決手段】本発明は抗原提示細胞を、バキュロウイルスを含有する活性化液に曝露する曝露工程と、抗原提示細胞と活性化液とを分離する分離工程と、を含む、抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法である。本発明の方法により製造される医薬組成物を投与することで、顕著な治療効果が期待される。【選択図】なし
2011030855.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示細胞を、バキュロウイルスを含有する活性化液に曝露する曝露工程と、
前記抗原提示細胞と前記活性化液とを分離する分離工程と、を含む、
抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法
【請求項２】
前記分離工程の後に、前記抗原提示細胞を培養する培養工程を含む、
請求項１に記載の、抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法
【請求項３】
前記分離工程の後に、前記抗原提示細胞を含む組成物におけるバキュロウイルスの非存在を確認する確認工程を含む、
請求項１又は２に記載の、抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法
【請求項４】
前記活性化液が抗原提示細胞１個当たり約５０ｐｆｕのバキュロウイルスを含有する、
請求項１〜３いずれか一項に記載の、抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法
【請求項５】
前記抗原提示細胞が癌患者から取得された抗原提示細胞である、
請求項１〜４いずれか一項に記載の、抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法
【請求項６】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、
請求項１〜５いずれか一項に記載の、抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法
【請求項７】
前記バキュロウイルスが前記医薬組成物中に存在しない、
請求項１〜６いずれか一項に記載の、抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バキュロウイルスを利用して、抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、未だ有効な治療法が確立されておらず、新しい治療法の開発が盛んに行われている。現在主流となっている抗癌剤を用いた化学療法に替わる新たな癌の治療法として、免疫細胞療法に注目が集まっている。免疫細胞療法のひとつである樹状細胞療法は、癌患者から得た樹状細胞を体外で調整したうえで癌患者に投与する方法である。【０００３】
樹状細胞療法に供するため、樹状細胞を癌抗原ペプチド又は癌抗原をコードする核酸で処理することにより、樹状細胞の特異的免疫を高める方法が開示されている。（特許文献１、２、３参照）。【０００４】
また、樹状細胞の特異的免疫を高めるため、ウイルスを利用する方法も検討されている。樹状細胞に対しin vitroでアデノウイルスを用いて形質導入する方法（特許文献４参照）や、樹状細胞に対しin vitroで弱毒性ヘルペスウイルスを感染させて抗原を導入する方法（特許文献５参照）が開示されている。【０００５】
さらに、樹状細胞の非特異的免疫を高めるため、CpGを用いて樹状細胞を活性化又は成熟化させる方法（特許文献６、７、８、９参照）や、LPSを用いて樹状細胞を活性化又は成熟化させる方法（特許文献６、１０、１１、１２参照）が開示されている。【０００６】
その一方で、バキュロウイルスを利用した癌の治療剤の開発も行われている。近年、バキュロウイルスが免疫応答を誘導することが見出されたことから、バキュロウイルスを含む肝障害の予防・治療剤が開示されている（特許文献１３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１３７８５７号公報
【特許文献２】特開２００８−１１９００４号公報
【特許文献３】特開２００６−２８０３２４号公報
【特許文献４】特表２００５−５２３９４２号公報
【特許文献５】特表２００３−５０２００８号公報
【特許文献６】特表２００９−５１９２３４号公報
【特許文献７】特表２００７−５０１６０７号公報
【特許文献８】特表２００６−５１０６６７号公報
【特許文献９】特表２００５−５２８８９９号公報
【特許文献１０】特開２００７−３１２６８３号公報
【特許文献１１】特開２００４−２９８１８１号公報
【特許文献１２】特表２００４−５３１４９６号公報
【特許文献１３】国際公開０８／０４４６２７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の樹状細胞療法は、癌抗原やウイルス等を利用して特異的免疫を高めても、期待される治療効果が得られないことが多かった。したがって、樹状細胞の特異的免疫を高めるだけでは有効な治療はできないと考えられた。その一方で、非特異的免疫を高めるためにLPSやCpG等を用いて樹状細胞を刺激する方法でも、その方法により得られる樹状細胞の抗腫瘍活性は不十分であった。【０００９】
特許文献１３に開示されているバキュロウイルスを含む治療剤は、患者に直接投与するものである。したがって、多量のバキュロウイルスを必要とするため、抗腫瘍活性を効率的に誘導することができなかった。また、活性のあるウイルスを患者に直接投与することに対し、患者やその家族が抵抗感を抱く可能性もあった。【００１０】
すなわち、本発明は、樹状細胞等の抗原提示細胞の非特異的免疫を効率的に高めることで獲得される抗腫瘍活性により顕著な治療効果を発揮し、さらに安全性、信頼性に優れる医薬組成物を製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、抗原提示細胞を、バキュロウイルスを含有する活性化液に曝露する曝露工程と、前記抗原提示細胞と前記活性化液とを分離する分離工程と、を含む、抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法である。【００１２】
本発明によれば、活性化液に含まれたバキュロウイルスは分離又は分解され、製造される医薬組成物中には存在しない。したがって、バキュロウイルスを含まず、高い抗腫瘍活性を有する医薬組成物を製造することができる。【００１３】
また、分離工程の後に、抗原提示細胞を培養する培養工程を含む製造方法でもよい。培養工程を行うことで、抗原提示細胞の抗腫瘍活性をさらに高めることができる。【００１４】
また、分離工程の後に、前記抗原提示細胞を含む組成物におけるバキュロウイルスの非存在を確認する確認工程を含む製造方法でもよい。確認工程を行うことで、本発明の方法により製造される医薬組成物がバキュロウイルスを含まないことが証明されるため、製造される医薬組成物の安全性及び信頼性をさらに高めることができる。【００１５】
また、曝露工程では、抗原提示細胞１細胞当たり約５０ｐｆｕのバキュロウイルスを含有する活性化液を用いることができる。この活性化液を用いることにより、抗原提示細胞の生存性を高く維持しながら、多量のバキュロウイルスを取り込ませることができる。【００１６】
また、癌患者から取得された抗原提示細胞を用いることができる。製造される医薬組成物を投与しても、癌患者の自己の細胞を用いるため、拒絶反応が起こらない。【００１７】
さらに、抗原提示細胞としては、樹状細胞を用いることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法により、活性化された抗原提示細胞の非特異的免疫により、抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞を含む医薬組成物を製造することができる。本発明の方法で製造される医薬組成物は、従来の抗原提示細胞を含む医薬組成物に比べて抗腫瘍活性が高く、顕著な治療効果が期待される。【００１９】
本発明の方法で製造される医薬組成物はバキュロウイルスを含まないため、安全性、信頼性に優れ、患者やその家族に理解を得られ易い。また、曝露工程において抗原提示細胞にバキュロウイルスを取り込ませるため、バキュロウイルスを患者に直接投与する従来の治療剤に比べて、少ない量のバキュロウイルスで医薬組成物を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】樹状細胞によるバキュロウイルスの取り込みを示す免疫蛍光染色の顕微鏡写真である。
【図２】活性化液に含有するバキュロウイルスの量を変えて樹状細胞に曝露した場合の、バキュロウイルスの取り込み量を示すPCR産物の電気泳動による解析結果の写真である。
【図３】活性化液に含有するバキュロウイルスの量を変えて樹状細胞に曝露した場合の、樹状細胞の生存率を示すグラフである。
【図４】樹状細胞に取り込まれたバキュロウイルスの分解を示すPCR産物の電気泳動による解析結果の写真である。
【図５】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞における表面分子の発現の変化を示すグラフである。「N.C.」は無処理の樹状細胞、「BV」はバキュロウイルスを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「LPS」はLPSを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「CpG」はCpG-ODNを含む活性化液で曝露した樹状細胞を示す。
【図６】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞によるIFN−αの産出を示すグラフである。「N.C.」は無処理の樹状細胞、「BV」はバキュロウイルスを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「LPS」はLPSを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「CpG」はCpG-ODNを含む活性化液で曝露した樹状細胞を示す。
【図７】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞によるIFN−γの産出を示すグラフである。「N.C.」は無処理の樹状細胞、「BV」はバキュロウイルスを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「LPS」はLPSを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「CpG」はCpG-ODNを含む活性化液で曝露した樹状細胞を示す。
【図８】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞によるTNF−αの産出を示すグラフである。「N.C.」は無処理の樹状細胞、「BV」はバキュロウイルスを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「LPS」はLPSを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「CpG」はCpG-ODNを含む活性化液で曝露した樹状細胞を示す。
【図９】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞によるIL−６の産出を示すグラフである。「N.C.」は無処理の樹状細胞、「BV」はバキュロウイルスを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「LPS」はLPSを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「CpG」はCpG-ODNを含む活性化液で曝露した樹状細胞を示す。
【図１０】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞によるIL−10の産出を示すグラフである。「N.C.」は無処理の樹状細胞、「BV」はバキュロウイルスを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「LPS」はLPSを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「CpG」はCpG-ODNを含む活性化液で曝露した樹状細胞を示す。
【図１１】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞によるIL−12p70の産出を示すグラフである。「N.C.」は無処理の樹状細胞、「BV」はバキュロウイルスを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「LPS」はLPSを含む活性化液で曝露した樹状細胞、「CpG」はCpG-ODNを含む活性化液で曝露した樹状細胞を示す。
【図１２】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞とNK細胞との共培養によるCD69の発現を示すグラフである。「N.C.」はNK細胞単独でのCD69の発現、「Control」は無処理の樹状細胞との共培養によるCD69の発現、「BV」は曝露工程を行ってバキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞との共培養によるCD69の発現を示す。
【図１３】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞とCD4＋T細胞との共培養によるCD69の発現を示すグラフである。「N.C.」はCD4＋T細胞単独培養でのCD69の発現、「Control」は無処理の樹状細胞との共培養によるCD69の発現、「BV」は曝露工程を行ってバキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞との共培養によるCD69の発現を表している。
【図１４】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞とCD8＋T細胞との共培養によるCD69の発現を示すグラフである。「N.C.」はCD8＋T細胞胞単独培養でのCD69の発現、「Control」は無処理の樹状細胞との共培養によるCD69の発現、「BV」は曝露工程を行ってバキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞との共培養によるCD69の発現を表している。
【図１５】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞とNK細胞との共培養によるIFN−γ産生を示すグラフである。
【図１６】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞とCD4＋T細胞との共培養によるIFN−γ産生を示すグラフである。
【図１７】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞とCD8＋T細胞との共培養によるIFN−γ産生を示すグラフである。
【図１８】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞と共培養したNK細胞の細胞障害活性を示すグラフである。
【図１９】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞と共培養したCD4＋T細胞の細胞増殖性を示すグラフである。
【図２０】バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞と共培養したCD8＋T細胞の細胞増殖性を示すグラフである。
【図２１】本発明の方法で製造される医薬組成物の投与による脾臓内NK細胞のCD69の発現を示すグラフである。
【図２２】本発明の方法で製造される医薬組成物の投与による脾臓内CD4＋T細胞のCD69の発現を示すグラフである。
【図２３】本発明の方法で製造される医薬組成物の投与による脾臓内CD8＋T細胞のCD69の発現を示すグラフである。
【図２４】本発明の方法で製造される医薬組成物の投与による血清中のIFN−γの産出を示すグラフである。
【図２５】本発明の方法で製造される医薬組成物の投与による脾臓内NK細胞の細胞障害活性を示すグラフである。
【図２６】肺癌細胞株（ＬＬＣ）の投与による肺癌モデルマウスの作製を示す写真である。
【図２７】本発明の方法で製造される医薬組成物の投与による肺結節数を示すグラフである。
【図２８】本発明の方法で製造される医薬組成物の投与による肺の形態を示す写真である。実施例１、比較例１及び比較例３は、それぞれの方法で得られた医薬組成物を１回投与したマウスの肺の形態を示した。
【図２９】本発明の方法で製造される医薬組成物の投与による肺組織のＨＥ染色を示す写真である。実施例１、比較例１及び比較例３は、それぞれの方法で得られた医薬組成物を１回投与したマウスの肺の形態である。アスタリスクは腫瘍内の壊死、矢印は出血、矢頭は腫瘍形成を示す。
【図３０】本発明の方法で製造される医薬組成物の投与によるマウスの生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、抗原提示細胞を、バキュロウイルスを含有する活性化液に曝露する曝露工程と、抗原提示細胞と活性化液とを分離する分離工程と、を含む、抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞を含み、該抗原提示細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法である。
【００２２】
以下、本発明の医薬組成物を製造する方法の好ましい一実施形態として、曝露工程と分離工程とを含む実施形態について説明するが、本発明はこの実施形態のみに限定されるものではない。
【００２３】
（１）曝露工程
本工程では、抗原提示細胞を、バキュロウイルスを含有する活性化液に曝露する。抗原提示細胞が活性化液中のバキュロウイルスを取り込むことで、活性化された抗原提示細胞を得ることができる。
【００２４】
抗原提示細胞とは、体内に侵入した細菌やウイルスなどのタンパク質の断片を抗原として自己の細胞表面に提示し、他の免疫細胞を活性化する細胞である。抗原提示細胞には、樹状細胞、単球、マクロファージ及びB細胞が含まれる。なかでも、樹状細胞はインターフェロン等のサイトカインを産出し、NK細胞、T細胞、NKT細胞、B細胞等を活性化するなど、免疫系で非常に重要な役割を担っている。
【００２５】
抗原提示細胞は、公知の方法を用いて、骨髄液や血液から取得することができる。樹状細胞について具体的に説明すると、樹状細胞を血液から取得する場合は血液中の白血球を、骨髄液から取得する場合は骨髄前駆細胞を、GM-CSF、IL-4等のタンパク質の存在下で培養する。培養して得られた細胞群を樹状細胞の表面に特異的に発現するタンパク質に対する抗体で標識し、磁気分離等の公知の細胞分離手段を行えば、樹状細胞を取得することができる。
【００２６】
本工程では、抗原提示細胞は、活性化液に含まれるバキュロウイルスを取り込むことにより活性化して抗腫瘍活性を獲得する。抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞は、体内で各種サイトカイン等を分泌することでNK細胞やT細胞を活性化し、活性化されたNK細胞やT細胞が腫瘍細胞を攻撃すると考えられる。
【００２７】
本発明において用いられる抗原提示細胞は、本発明により製造した医薬組成物の投与を予定する患者又は動物から取得されたものを用いることが好ましい。自己の細胞を用いることで、医薬組成物を投与しても拒絶反応が起こらないためである。また、第３者から得られた抗原提示細胞を含む医薬組成物であっても、第３者のHLA抗原と投与を予定する患者又は動物のHLA抗原が一致すれば、拒絶反応を生ずることなく投与することができる可能性が高い。
【００２８】
バキュロウイルスとは、環状の二本鎖ＤＮＡ（分子量５９×１０６〜１６４×１０６）を遺伝子としてもつ昆虫の病原ウイルスであり、例えば、核多角体病ウイルス（Nucleopolyhedroviurs；NPV）、ゲアヌロウイルス（geanulovirus；GV）、又は非閉寒性ウイルス（non-occluded virus）等が知られている。核多角体病ウイルスには、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Autographa carifornica nuclear polyhedrosis virus; AcNPV）又はカイコガ核多角体病ウイルス（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus; BmNPV）等が含まれる。
【００２９】
バキュロウイルスは、非常に宿主特異性が高い。バキュロウイルスは哺乳動物の細胞内では複製することができず、バキュロウイルスのＤＮＡは染色体に組み込まれないため、哺乳動物に対する安全性が極めて高い。したがって、抗原提示細胞がバキュロウイルスを取り込んでも、細胞の生存性にはほとんど影響がないと考えられる。
【００３０】
本工程で用いる活性化液は、少なくともバキュロウイルスを含有する液体である。活性化液を抗原提示細胞に曝露することにより、抗原提示細胞がバキュロウイルスを取り込んで活性化する。その結果、抗原提示細胞の非特異免疫が高まり、抗原提示細胞が抗腫瘍活性を獲得する。
【００３１】
活性化液は、バキュロウイルス以外の夾雑物を含有しないことが好ましい。夾雑物を含むと、抗原提示細胞がバキュロウイルスを効率的に取り込むことができないためである。その一方で、活性化液は、抗原提示細胞内の溶液と等張であることが好ましい。活性化液が等張でない場合には、浸透圧により抗原提示細胞が膨張又は収縮して、抗原提示細胞の機能を害する可能性があるためである。したがって、活性化液には、生理食塩水やリン酸緩衝液、無血清培地等にバキュロウイルスを分散させたものを用いることができる。
【００３２】
活性化液に含有されるバキュロウイルスは、活性化液に曝露する抗原提示細胞１細胞当たり約１ｐｆｕから約１００ｐｆｕであることが好ましく、約５０ｐｆｕであることがより好ましい。活性化液に含有されるバキュロウイルスの量が少なければ、抗原提示細胞が獲得する抗腫瘍活性が十分ではなく、一方で、バキュロウイルスの量が多ければ医薬組成物の製造のコストが増大するためである。
【００３３】
上述の抗原提示細胞と上述の活性化液とを混ぜ合わせることで、抗原提示細胞に活性化液を曝露することができる。また、曝露中の活性化液を適時撹拌することで、効率的に曝露することが可能となる。曝露の時間は特に限定されないが、３０分から２時間であることが好ましく、１時間であることがより好ましい。曝露の時間が短過ぎると、抗原提示細胞によるバキュロウイルスの取り込みが不十分であり、一方で、曝露の時間が長過ぎると、抗原提示細胞の生存性が低下する可能性があるためである。
【００３４】
（２）分離工程
本工程では、曝露工程（１）の後で、抗原提示細胞と活性化液とを分離する。本工程により、抗原提示細胞に取り込まれなかったバキュロウイルスが除去される。
【００３５】
本工程は、遠心分離等の方法を用いることができる。抗原提示細胞は沈殿するがバキュロウイルスは沈殿しない条件で遠心分離を行うことで、抗原提示細胞と活性化液とを分離することができる。100Gから300Gで遠心することが好ましく、200Gがより好ましい。
【００３６】
また、遠心分離は1分間から10分間行うことが好ましく、3分間から5分間行うことがより好ましい。遠心分離の時間が短過ぎると、抗原提示細胞と活性化液との分離が不十分であり、一方で、遠心分離の時間が長過ぎると、抗原提示細胞の生存性が低下する可能性があるためである。
【００３７】
また、分離した後の抗原提示細胞を洗浄すると、バキュロウイルスの除去がより確実となるため好ましい。細胞培養用培地や生理食塩水、リン酸緩衝液等、抗原提示細胞の機能を損ねない液体に抗原提示細胞を懸濁し、遠心分離等を用いて抗原提示細胞を沈殿させ、上清を除去することで、洗浄を行うことができる。
【００３８】
以上、曝露工程（１）と分離工程（２）とを含む実施形態について説明したが、本発明は、上述の工程の他に、培養工程や確認工程を含むものであってもよい。以下、培養工程と確認工程とを含む実施形態について説明するが、本発明はこの実施形態のみに限定されるものではない。
【００３９】
（３）培養工程
本工程では、分離工程（２）によって得られる抗原提示細胞を培養する。活性化した抗原提示細胞を培養することで、抗原提示細胞の抗腫瘍活性をより高めることができる。
【００４０】
培養は、公知の細胞培養用培地を用いることができる。培養時間は、１時間から４８時間が好ましい。また、培養の温度は、３０℃から４０℃が好ましく、３７℃がより好ましい。
【００４１】
また、分離工程（２）で分離できなかったバキュロウイルスは本工程中に分解されるため、本発明で製造される医薬組成物中にバキュロウイルスは存在しない。
【００４２】
（４）確認工程
本工程では、分離工程（２）の後に得られる抗原提示細胞を含む組成物におけるバキュロウイルスの非存在を確認する。本発明が培養工程（３）を含む場合においては、分離工程（２）と本工程との間に培養工程（３）を行ってもよいし、分離工程（２）と本工程の後に培養工程（３）を行ってもよい。本工程を行うことで、本発明の方法で製造される医薬組成物中にバキュロウイルスが存在しないことが証明される。
【００４３】
本工程では、バキュロウイルスが特異的に有するタンパク質やＤＮＡを検出する方法や、昆虫細胞と組成物とを混合して培養する方法等を用いることができる。結果が迅速に得られる点から、バキュロウイルスが特異的に有するタンパク質やＤＮＡを検出する方法が好ましい。
【００４４】
バキュロウイルスのタンパク質を検出する方法としては免疫染色法等、ＤＮＡを検出する方法としてはＰＣＲ法等を用いることができる。検出の感度が高い点、操作が簡便である点で、ＰＣＲ法が好ましい。
【００４５】
本工程により、万が一バキュロウイルスの存在が確認された場合には、再度洗浄を行うことで、バキュロウイルスを除去すればよい。その後、バキュロウイルスの非存在が確認されるまで洗浄を行うことにより、安全性、信頼性の高い医薬組成物を製造することができる。
【００４６】
以上、培養工程（３）と確認工程（４）とを含む実施形態について説明した。
【００４７】
本発明により製造された医薬組成物は、抗腫瘍活性を有する抗原提示細胞を含む。また、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる公知の担体や希釈剤を含有することができる。また、本発明により製造された医薬組成物は、ヒト、イヌ、ネコ、サル、マウス、ラット等、抗原提示細胞を有する免疫系を持つ生物に投与することができる。投与経路は特に限定されないが、静脈内投与又は腫瘍内投与が好ましい。
【００４８】
本発明の方法により製造される医薬組成物は、肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、腎臓癌、脳腫瘍、子宮頸癌、乳癌、胆管癌等の、癌や悪性腫瘍の治療に用いることができる。
【実施例】
【００４９】
次に、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、実施例では、モデル動物としてマウスを採用しているが、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ラット等のマウスと同等の免疫系を持つ生物であれば実施可能であることは明らかである。【００５０】
樹状細胞の取得
クロロホルムにて殺処理したマウス（C57BL/6マウス、6〜8週齢、メス）の四肢より骨髄細胞を回収した。RBC lysis solution（1.54mol/L NH4Cl、14mmol/L NaHCO3、0.1mmol/L EDTA2Na、pH 7.3)を用いて溶血を行った。10％FBS（Fetal Bovine Serum）、2mmol/L L-グルタミン、2μmol/L
2-メルカプトエタノール、20ng/mLマウスGM-CSF、20ng/mLマウスIL-4を含むRPMI培地（Sigma-Aldrich社製）を用いて7日間培養した。培養３日目及び５日目に培地を新しく交換した。培養7日目にマウスCD11cマイクロビーズ（Miltenyi
Biotec社製）で染色し、MidiMACSTM セパレータ（Miltenyi Biotec社製）を用いてCD11c＋を発現する樹状細胞を回収した。回収した細胞のうち、樹状細胞が90%以上であることを、FACSを用いて確認した。【００５１】
（１）曝露工程
1.5mLチューブに受容した樹状細胞に、野生型バキュロウイルスを生理食塩水に分散させた活性化液100μLを添加し、37℃・5%CO2の環境に設定したインキュベーター内で１時間曝露した。15分ごとにチューブをタッピングして撹拌した。【００５２】
（２）分離工程
1.5mLチューブに2%FBS入りのRPMI培地（Sigma-Aldrich社製）を添加して1mlにし、200G、4℃、4分間遠心して樹状細胞を沈殿させた。活性化液を含む上清を捨てて、樹状細胞と活性化液とを分離した。さらに樹状細胞を懸濁して、再度RPMI培地（Sigma-Aldrich社製）を1ml添加し、200G、4℃、4分間遠心し上清を捨てて洗浄した。【００５３】
（３）培養工程
樹状細胞を、RPMI培地（Sigma-Aldrich社製）を用いて3〜48時間培養した。200G、4℃、4分間遠心し、RPMI培地（Sigma-Aldrich社製）を捨てた。樹状細胞を懸濁して生理食塩水を添加し、200G、4℃、4分間遠心し上清を捨てて洗浄した。100μLの生理食塩水を添加して樹状細胞を懸濁し、医薬組成物を得た。【００５４】
（４）確認工程
上述のように製造した医薬組成物を一部とって、1500rpm、4℃、4分間遠心し、樹状細胞を沈殿させた。上清についてgp64特異的プライマーを用いてPCRを行った。PCR産物を1.5％アガロースゲル電気泳動により解析したところバンドが検出されなかったことから、製造した医薬組成物にはバキュロウイルスが存在していないことが確認された。【００５５】
以下、上述の工程（１）〜（４）から製造される医薬組成物の性質を検証した。【００５６】
《１．樹状細胞によるバキュロウイルスの取り込みの検証》
培養工程（３）を行った後、医薬組成物に含まれる樹状細胞を遠心分離で回収し、2%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、0.2% Tween20/PBSで透過処理を行った。対照には、曝露工程（１）を行わない樹状細胞を用いた。抗gp64マウスIgG及びヤギ抗マウスIgG-FITCで染色し、蛍光顕微鏡を用いて樹状細胞中のバキュロウイルスのエンベロープタンパク質であるgp64を観察した。図１に示すように、医薬組成物に含まれる樹状細胞にgp64の存在が確認されたことから、in vitroで樹状細胞がバキュロウイルスを取り込むことが明らかとなった。【００５７】
活性化液が含有するバキュロウイルスの量を変えて曝露工程（１）を行った。樹状細胞１細胞当たりそれぞれ0、1、5、10、50、100pfuのバキュロウイルスを含有する活性化液を用いて樹状細胞に曝露した。4時間後に樹状細胞の総DNAを回収してgp64特異的プライマーによるPCRを行い、1.5%アガロースゲル電気泳動によってPCR産物を解析した。図２に示すように、樹状細胞によるバキュロウイルスの取り込み量は、活性化液が含有するバキュロウイルスの量に依存した。1pfuのバキュロウイルスでも樹状細胞への取り込みが確認された。また、樹状細胞１細胞当たり50pfuのバキュロウイルスを含有する活性化液を用いると、取り込みの効率が高いことがわかった。【００５８】
また、曝露工程（１）の24時間後に樹状細胞を回収してトリパンブルー染色を行い、樹状細胞の生存率を算出した。図３に示すように、多量のバキュロウイルスを取り込んでも樹状細胞の生存率は85％以上を示しており、バキュロウイルスの高い安全性が確認された。【００５９】
曝露工程（１）で、樹状細胞１個当たり50pfuのバキュロウイルスを含有する活性化液を樹状細胞に曝露した。培養工程（２）で樹状細胞を6日間培養し、１日おきに樹状細胞の総DNAを回収し、gp64特異的プライマーによるPCRを行い、1.5%アガロースゲル電気泳動によりPCR産物を解析した。図４に示すように、樹状細胞がバキュロウイルスを取り込むと、2日目以降からウイルスの分解が始まり、5日目にはウイルスが完全に分解されていた。バキュロウイルスのＤＮＡは細胞の染色体に組み込まれず分解されることがわかり、バキュロウイルス高い安全性が確認された。【００６０】
《２．バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞の非特異免疫の検証》
樹状細胞は外来から侵入してきた細菌やウイルスを取り込み、MHC分子に抗原断片を結合させてT細胞に提示するが、樹状細胞の表面分子(共刺激分子)であるCD40、CD80、CD86と、T細胞におけるそれぞれのリガンドであるCD40L、CD28との結合が必須である。また、樹状細胞から産出されるサイトカインであるIFN-αやIL-12は、NK細胞やT細胞を強力に活性化させることが知られている。そこで、樹状細胞がバキュロウイルスを取り込んで活性化したことにより高まった非特異免疫を、MHC分子および共刺激分子の発現、及びサイトカインの産生を指標として検証した。【００６１】
曝露工程（１）で、樹状細胞１細胞当たり50pfuのバキュロウイルスを含有した活性化液を用いて曝露した樹状細胞（1.0×106 cells）を用いた。また、対照として、無処理の樹状細胞（N.C）、バキュロウイルスの替わりにLPS（1μg/mL）、又はCpG-ODN（1μg/mL）を含む活性化液で曝露した樹状細胞を用いた。培養工程（３）で48時間培養した後、樹状細胞を回収し、FACSを用いてそれぞれの表面分子の発現を確認した。図５に示すように、バキュロウイルスの取り込みにより、樹状細胞の表面分子の発現量が上昇した。特に、共刺激分子であるCD40、CD80及びCD86の発現量が無処理の樹状細胞と比較して顕著に上昇した。したがって、樹状細胞がバキュロウイルスを取り込むことで活性化し、樹状細胞が未成熟状態から成熟状態へと誘導されたと考えられた。【００６２】
さらに、48時間培養後の培養上清を回収し、IFN-α、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12p70の産生量をELISAで定量した（図６〜図１１）。これらの結果が示すように、樹状細胞がバキュロウイルスを取り込むことにより、IFN-αや炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-6、IL-12p70)が産生されること確認された。一方で、T細胞を抑制するサイトカインであるIL-10の産生は確認されなかった。以上のように、樹状細胞がバキュロウイルスを取り込むことにより免疫応答が促進され、種々のサイトカイン、MHC分子群及び共刺激分子の発現が上昇することが明らかとなった。【００６３】
《３．バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞と他の免疫細胞との相互作用の検証》
バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞を、NK細胞やT細胞と共培養することで、共培養したNK細胞やT細胞が活性化するかどうかを検討した。【００６４】
曝露工程（１）で、樹状細胞１細胞当たり50pfuのバキュロウイルスを含有した活性化液を用いて曝露した樹状細胞（5.0×106 cells）を、マウス脾臓より取得したNK細胞と共に18時間培養した。また、対照として無処理の樹状細胞とNK細胞とを共培養した。樹状細胞とNK細胞との細胞数の比が1:2になるように共培養した。培養後、細胞を回収し、FACSを用いて早期活性化マーカーであるCD69の発現量の測定を（図１２）、ELISAを用いた培養上清中のIFN-γ産生量の定量を（図１５）、NK細胞における細胞傷害性活性の測定を（図１８）、それぞれ行った。【００６５】
図１２に示すように、バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞とNK細胞とを共培養することにより、NK細胞の活性化マーカーであるCD69の発現量が約2.5倍に上昇した。【００６６】
また、図１５に示すように、バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞とNK細胞とを共培養することにより、NK細胞から多量のIFN-γの産生が確認された。バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞が産出したIL-12がNK細胞を活性化し、活性化したNK細胞がIFN-γを産生したと考えられた。【００６７】
また、図１８に示すように、バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞と共培養したNK細胞の細胞傷害性活性を測定したところ、いずれのE/T比（Effecter細胞と腫瘍細胞とを混合培養した際の細胞数の比率）においても高い細胞傷害性が確認された。【００６８】
さらに、曝露工程（１）で、樹状細胞１細胞当たり50pfuのバキュロウイルスを含有した活性化液を用いて曝露した樹状細胞（5.0×106 cells）を、マウス脾臓より取得したCD4＋T細胞及びCD8＋T細胞と共にanti-TCRαβの存在下で24時間培養した。また、対照として無処理の樹状細胞とCD4＋T細胞及びCD8＋T細胞とを共培養した。樹状細胞とCD4＋T細胞及びCD8＋T細胞の細胞数の比が1:10となるように共培養した。培養後に細胞を回収し、FACSを用いて早期活性化マーカーであるCD69の発現量の測定を（図１３、図１４）、ELISAを用いた培養上清中のIFN-γ産生量の定量を（図１６、図１７）、T細胞の細胞増殖性の測定を（図１９、図２０）、それぞれ行った。【００６９】
図１３及び図１４に示すように、バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞と共培養することにより、CD4＋T細胞及びCD8＋T細胞の活性化マーカーであるCD69の発現量が、CD4＋T細胞で約18倍、CD8＋T細胞で約32倍に上昇したことが確認された。【００７０】
また、図１５に示すように、バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞と、CD4＋T細胞又はCD8＋T細胞とを共培養することにより、CD4＋T細胞やCD8＋T細胞から多量のIFN-γの産生が確認された。【００７１】
T細胞の細胞増殖性を調べるため、492nmの吸光度を測定した。図１９及び図２０に示すように、CD4＋T細胞又はCD8＋T細胞と無処理の樹状細胞とを共培養する場合と比較して、バキュロウイルスを取り込んだ樹状細胞と共培養した場合には、CD4＋T細胞又はCD8＋T細胞が活性化し、細胞増殖が盛んになることが確認された。【００７２】
《４．本発明の方法により製造された医薬組成物の抗腫瘍活性の検証》
本発明の方法により製造された医薬組成物（以下、本医薬組成物と称する。）をマウスの尾静脈から投与し、マウス脾臓内のNK細胞、CD4＋T細胞、及びCD8＋T細胞の免疫応答が誘導されるか否かを検証した。また、肺癌モデルマウスに本医薬組成物を投与して、本医薬組成物の抗腫瘍活性を検証した。【００７３】
本医薬組成物の免疫応答の誘導性の検証
曝露工程（１）で、樹状細胞１細胞当たり50pfuのバキュロウイルスを含有した活性化液を用いて樹状細胞(1.0×106 cells)に曝露し、培養工程（３）で、6時間培養し、100 μL のPBSに懸濁して医薬組成物を製造した（実施例１）。また、比較例として、曝露工程（１）を行わずに6時間培養した樹状細胞を含む医薬組成物（比較例１）、1μg/mLのLPSで刺激し6時間培養した樹状細胞を含む医薬組成物（比較例２）、1μg/mLのCpG-ODNで刺激し6時間培養した樹状細胞を含む医薬組成物（比較例３）を用いた。【００７４】
実施例１及び比較例１〜３で得た医薬組成物をマウス（n=3）の尾静脈に投与し、投与6時間後に脾臓を取得した。また、同時に心臓から血液を取得した。脾臓細胞をNK細胞、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞のマーカーであるNK1.1、CD4、CD8に対する抗体および活性化マーカーであるCD69に対する抗体で染色し、FACSを用いて発現を確認した(図２１〜図２３)。また、血液を遠心分離して血清を取得し、血清中のIFN-γをELISAにて定量した(図２４)。また、脾臓細胞における細胞傷害活性を評価した(図２５)。【００７５】
図２１〜図２３に示すように、実施例１で得た医薬組成物を尾静脈投与することにより、脾臓内のNK細胞、CD4＋T細胞及びCD8＋T細胞の活性化マーカーであるCD69の発現が上昇した。NK細胞においては無処置の約8.2倍、CD4＋T細胞においては約6.3倍、CD8＋T細胞においては約11倍の発現量が確認された。また、図２４に示すように、実施例１で得た医薬組成物を尾静脈投与することにより、血中のIFN-γの産生が確認された。さらに、図２５の結果、実施例１で得た医薬組成物によりNK細胞および細胞傷害性T細胞(CD8＋T細胞)が活性化したことにより、細胞傷害性活性が上昇した。【００７６】
さらに、本医薬組成物の抗腫瘍活性について、肺癌モデルマウスを用いた検証を行うため、肺癌モデルマウスの作製を行った。【００７７】
肺癌モデルマウスの作製
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈より１×１０５
ｃｅｌｌｓ、３×１０５ ｃｅｌｌｓ、５×１０５
ｃｅｌｌｓ、１×１０６ ｃｅｌｌｓのＬＬＣを投与し、投与から２８日後にマウスを解剖して肺の状態を観察した。図２６に示すように、１×１０６
ｃｅｌｌｓのＬＬＣを投与したマウスで、他の細胞数で投与したときよりも顕著に腫瘍の形成が確認された。そこで、以下の検証には、１×１０６ ｃｅｌｌｓのＬＬＣを投与して作製した肺癌モデルマウスを用いた。【００７８】
本医薬組成物の有する抗腫瘍作用の検証
肺癌モデルマウスの尾静脈に、実施例１、比較例１及び比較例３で得た医薬組成物を投与した。投与回数は、１回（ＬＬＣ投与後３日目）又は２回（ＬＬＣ投与後３日目及び６日目）とした。ＬＬＣ投与後２８日目にマウスを解剖し、肺結節数のカウント、肺組織の状態の観察、ＨＥ染色による病理解析を行った。また、肺癌モデルマウスに各医薬組成物を１回投与し、生存率の測定を行った。【００７９】
図２７に示すように、無処置のマウス、比較例１を投与したマウスに対して、実施例１を投与したマウスでは優位に腫瘍形成の抑制が認められた。図２８に示した肺組織の写真からも、実施例１を投与したマウスでの腫瘍形成の抑制が明らかとなった。図２９に示した肺のＨＥ染色による病理解析から、無処置のマウス及び比較例を投与したマウスからは、腫瘍形成や、出血、組織の壊死などが観察された。その一方で、実施例１で得た医薬組成物を投与した組織では腫瘍形成の抑制が認められ、正常組織とほぼ同様の形態であった。【００８０】
また、医薬組成物を１回投与した群で肺癌モデルマウスの生存率を測定した。図３０に示すように、比較例１及び比較例３のマウスが６０日目までに全数が死亡した一方で、実施例１で得た医薬組成物を投与したマウスは、他の比較例に比べて優位に高い生存率を示した。【００８１】
以上のように、本医薬組成物を投与した結果、顕著な治療効果を示し、腫瘍形成の抑制がみられた。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の方法により製造される医薬組成物は、癌の治療及び／又は予防に適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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