(57)【要約】Ｐ−カドヘリン発現に関与する癌を処置または診断する方法が、Ｐ−カドヘリンを標的化するリガンド、詳細には、ヒト抗Ｐ−カドヘリン抗体を用いて提供される。また、治療的活性を有する抗Ｐ−カドヘリン抗体を同定するためのスクリーニングも提供される。Ｐ−カドヘリンは、細胞質ゾルタンパク質（カテニン）との完全な膜貫通タンパク質の結合による複合体の形成を通して細胞の細胞骨格に連結するタンパク質のクラスの一部である膜貫通タンパク質である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションにより特徴付けられる癌を処置する方法であって、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された、有効量の少なくとも１つのＰ−カドヘリンアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
Ｐ−カドヘリンを発現する癌の移動、接着および／または増殖を阻害する方法であって、そのような処置を必要とする被検体に、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された、有効量の少なくとも１つのＰ−カドヘリンアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３】
Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションにより特徴付けられる消化器の癌を処置または予防する方法であって、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された、有効量の少なくとも１つのＰ−カドヘリンアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項４】
Ｐ−カドヘリンを発現する消化器の癌の移動、接着および／または増殖を阻害する方法であって、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された、有効量の少なくとも１つのＰ−カドヘリンアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項５】
Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションにより特徴付けられる結腸または結腸直腸の癌を処置する方法であって、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された、有効量の少なくとも１つのＰ−カドヘリンアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項６】
結腸癌細胞の移動、接着および／または増殖を阻害する方法であって、そのような処置を必要とする被検体に、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された、有効量の少なくとも１つのＰ−カドヘリンアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項７】
Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションにより特徴付けられる癌を処置または予防する方法であって、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された有効量の少なくとも１つのＰ−カドヘリンアンタゴニストまたはＰ−カドヘリン結合抗体フラグメントを投与する工程を包含する、方法。
【請求項８】
Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションにより特徴付けられる癌を処置または予防する方法であって、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された、Ｐ−カドヘリン発現を調節するリボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項９】
Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションにより特徴付けられる消化器の癌を処置または予防する方法であって、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された有効量の少なくとも１つの抗Ｐ−カドヘリン抗体またはＰ−カドヘリン結合抗体フラグメントを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションにより特徴付けられる消化器の癌を処置または予防する方法であって、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された、Ｐ−カドヘリン発現を調節するリボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションにより特徴付けられる結腸または結腸直腸の癌を処置または予防する方法であって、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された有効量の少なくとも１つの抗Ｐ−カドヘリン抗体またはＰ−カドヘリン結合抗体フラグメントを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
前記Ｐ−カドヘリンアンタゴニストがモノクローナル抗体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体がヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、またはヒトＩｇＧ４定常ドメインを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を保有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が、アポトーシスを誘導する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
必要に応じて治療的薬剤に結合体化された、Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションにより特徴付けられる癌の処置に適するヒト抗Ｐ−カドヘリン抗体、キメラ抗Ｐ−カドヘリン抗体またはヒト化抗Ｐ−カドヘリン抗体。
【請求項２１】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項２０の組成物。
【請求項２２】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項２０の組成物。
【請求項２３】
前記抗体がヒト抗体である、請求項２０の組成物。
【請求項２４】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項２０の組成物。
【請求項２５】
前記抗体がヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、またはヒトＩｇＧ４定常ドメインを含む、請求項２０の組成物。
【請求項２６】
前記抗体が、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を保有する、請求項２０の組成物。
【請求項２７】
前記抗体が、アポトーシスを誘導する、請求項２０の組成物。    
【請求項２８】
Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する組み換え抗体を発現する、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２９】
Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する組み換えヒト抗体を発現する、トランスジェニック動物。
【請求項３０】
前記抗体がＩｇＧ１である、請求項２８に記載の動物またはトランスジェニック動物。
【請求項３１】
Ｐ−カドヘリンを発現する細胞におけるＰ−カドヘリン発現を調節するリボザイム。
【請求項３２】
Ｐ−カドヘリンを発現する細胞におけるＰ−カドヘリン発現を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項２８の動物。
【請求項３４】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項２８の動物。
【請求項３５】
前記抗体がヒト抗体である、請求項２８の動物。
【請求項３６】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項２８の動物。
【請求項３７】
前記抗体がヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、またはヒトＩｇＧ４定常ドメインを含む、請求項２８の動物。
【請求項３８】
前記抗体が、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を保有する、請求項２８の動物。
【請求項３９】
前記抗体が、アポトーシスを誘導する、請求項２８の動物。
【請求項４０】
Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションにより特徴付けられる癌の処置のために適合された薬学的組成物であって、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する、ヒト抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体またはヒト抗体フラグメント、キメラ抗体フラグメントもしくはヒト化抗体フラグメントのうちの少なくとも１つの治療有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項４１】
Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションにより特徴付けられる癌の処置のために適合された薬学的組成物であって、Ｐ−カドヘリン発現を調節するリボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つの治療有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項４２】
Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する、ヒト抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体またはヒト抗体フラグメント、キメラ抗体フラグメントもしくはヒト化抗体フラグメントを発現する、組み換え宿主細胞。
【請求項４３】
昆虫細胞、哺乳動物細胞または酵母細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションに関与する癌の存在を決定する方法であって、以下：
（ｉ）Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションに関与する癌の存在または非存在について診断される患者由来の細胞サンプルを得る工程；
（ｉｉ）該細胞サンプルにおけるＰ−カドヘリンの発現レベルを決定する工程；
（ｉｉｉ）正常な細胞のサンプルに対する、該Ｐ−カドヘリンの発現のレベルを比較する工程；
（ｉｖ）該正常な細胞のサンプルに対する該患者の細胞サンプルにおける該Ｐ−カドヘリンの発現のレベルを、Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションに関与する癌の陽性の診断または陰性の診断に関連させる工程、
を包含する方法。
【請求項４５】
Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する、Ｐ−カドヘリンに対する抗体またはそのフラグメントの有効量を投与する工程を包含する、そのような処置を必要とする被検体における結腸癌の増殖を阻害する方法。
【請求項４６】
Ｐ−カドヘリンのアップレギュレーションに関連する癌細胞の接着、増殖および／または移動のうちの少なくとも１つを阻害する方法であって、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された、阻害有効量の少なくとも１つのＰ−カドヘリンアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
Ｐ−カドヘリンのアップレギュレーションに関連する結腸癌細胞の接着、移動および／または増殖のうちの少なくとも１つを阻害する方法であって、そのような処置を必要とする被検体に、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された、阻害有効量の少なくとも１つのＰ−カドヘリン抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項４８】
Ｐ−カドヘリンのアップレギュレーションに関連する癌細胞の接着、移動および／または増殖のうちの少なくとも１つを阻害する方法であって、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された、阻害有効量の少なくとも１つのＰ−カドヘリン抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項４９】
Ｐ−カドヘリンのアップレギュレーションにより特徴付けられる結腸癌細胞の接着、移動および／または増殖のうちの少なくとも１つを阻害する方法であって、そのような処置を必要とする被検体に、必要に応じて治療的薬剤に結合体化された、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する阻害有効量の少なくとも１つの抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項５０】
Ｐ−カドヘリン結合抗体またはＰ−カドヘリン結合抗体フラグメントを投与することにより、Ｐ−カドヘリンを過剰発現する腫瘍組織を優先的に標的化する工程を包含する、治療の方法。
【請求項５１】
前記抗体がヒト抗体である、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体が化学療法剤に付着されている、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体が放射線ヌクレオチドに付着されている、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体が毒素に付着されている、請求項４４〜４９のいずれか１項の方法。
【請求項５７】
潜在的な治療活性を有する抗Ｐ−カドヘリン抗体をスクリーニングするための方法であって、抗Ｐ−カドヘリン抗体の集団を、腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体についてスクリーニングする工程を包含する、方法。
【請求項５８】
潜在的な治療活性を有する抗Ｐ−カドヘリン抗体をスクリーニングするための方法であって、抗Ｐ−カドヘリン抗体の集団を、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する抗体についてスクリーニングする工程を包含する、方法。
【請求項５９】
潜在的な治療活性を有する抗Ｐ−カドヘリン抗体をスクリーニングするための方法であって、抗Ｐ−カドヘリン抗体の集団を、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を保有する抗体についてスクリーニングする工程を包含する、方法。
【請求項６０】
潜在的な治療活性を有する抗Ｐ−カドヘリン抗体をスクリーニングするための方法であって、抗Ｐ−カドヘリン抗体の集団を、腫瘍細胞の移動を阻害する抗体についてスクリーニングする工程を包含する、方法。
【請求項６１】
潜在的な治療活性を有する抗Ｐ−カドヘリン抗体をスクリーニングするための方法であって、抗Ｐ−カドヘリン抗体の集団を、転移を阻害する抗体についてスクリーニングする工程を包含する、方法。
【請求項６２】
ＥＣ１ドメインに結合する抗Ｐ−カドヘリン抗体をスクリーニングするための方法であって、抗Ｐ−カドヘリン抗体の集団を、ＥＣ１ドメインを結合する抗体についてスクリーニングする工程を包含する、方法。
【請求項６３】
抗Ｐ−カドヘリン抗体の集団を、以下の特性：
（ｉ）Ｐ−カドヘリン鎖形成を妨害する特性；
（ｉｉ）Ｐ−カドヘリンタンパク質のｃｉｓ二量体形成を妨害する特性；
（ｉｉｉ）Ｐ−カドヘリンによるカルシウム結合をブロックまたは阻害する特性；および
（ｉｖ）Ｐ−カドヘリンドメインの整列を妨害する特性、
のうち少なくとも１つを有する抗体についてスクリーニングすることによって、該特性のうち１つを有する抗Ｐ−カドヘリン抗体をスクリーニングする方法。
【請求項６４】
請求項５８〜６３のいずれか１項に記載の方法により産生された、抗Ｐ−カドヘリンモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０００年６月２日に出願された米国仮特許出願番号６０／２０８，８７１号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に関連する。本願は、２００１年５月３１に出願された米国仮特許出願番号６０／２９４，２２５号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本願は、Ｐ−カドヘリン過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）またはアップレギュレーションにより特徴付けられる癌の処理、予防、および／または件出のためのＰ−カドヘリンの使用に関する。
【技術分野】
【０００３】
（関連技術の説明）
膜貫通糖タンパク質のカドヘリンファミリーは、細胞分化、細胞移動、および細胞内接着において重要な役割を果たす。ファミリーのメンバーとしては、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンが挙げられ、これらの全ては、βカテニンおよびγカテニンと相互作用し得る細胞質ドメインを有する。次いで、βカテニンおよびγカテニンは、αカテニンを結合し、カテニン−カテニン構造が細胞骨格アクチンと複合体化することを可能にする。
【０００４】
カドヘリンは、種々の型の新生物形成の条件に関連付けられてきた。例えば、Ｐ−カドヘリン（カルシウム依存性細胞接着タンパク質）は、乏しく分化し、そして侵襲性膀胱癌細胞において報告されてきた。そのような膀胱癌細胞は、減少したＥ−カドヘリン発現を示す（Ｍｉａｌｈｅ，Ａら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６４：８２６（２０００））。Ｅ−カドヘリンおよびＰ−カドヘリンのダウンレギュレーションは、培養された新生物前立腺細胞と関連付けられてきた（Ｗａｎｇ，Ｊ．ら、Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．５：３０８（２０００））。ヒト直腸結腸癌が、Ｅ−カドヘリン／カテニン複合体の細胞レベルの減少に、少なくとも一部、寄与していた（Ｄｅｂｒｕｙｎｅ，Ｐ．ら、Ａｃｔａ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｂｅｌｇ．６２（４）：３９３（１９９９））。Ｐ−カドヘリンの異常なアップレギュレーションが、胃腸管の組織の新生物変換に関連し得る増殖細胞表現型と関連することが、最近報告された（Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｄ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９０（５）：５２６（２０００））。しかし、Ｐ−カドヘリンが種々の結腸癌において過剰発現されることの直接的相関は、以前には知られていなかった。
【０００５】
Ｊａｎｋｏｗｓｋｉのグループからの１つの報告は、Ｐ−カドヘリンが、Ｅ−カドヘリン、カテニン、およびＡＰＣの発現／変異における変化の前に、結腸細胞変換の形態学的に識別可能な最も早い段階から異常に発現していたことを観察した。しかし、単独のＰ−カテニン発現は、組織形態学を予測せず、そしてそのような発現は、関連するカドヘリンおよびカテニンの発現に依存しなかった（Ｈａｒｄｙら、Ｇｕｔ（４）：５１３−５１９（２００２））。Ｈａｒｄｉｓｓｏｎのグループからの別の報告は、Ｅ−カドヘリン発現が、陽性のエストロゲンレセプターおよびプロゲステリンレセプターと結合するが、Ｐ−カテニン陽性腫瘍が、エストロゲンレセプターおよびプロゲステロンレセプターに対して陰性である観察し、このことがＰ−カドヘリン抗体が、ＥＲ陰性癌集団の処置のために用いられ得ることを示した（Ｇａｍｍａｌｌｏら、Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  １４（７）：６５０−６５４（２００１））。  
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、癌の診断、予防または処置のための標的としてのＰ−カドヘリンの使用に関する。Ｐ−カドヘリンは、細胞質ゾルタンパク質（カテニン）との完全な膜貫通タンパク質の結合による複合体の形成を通して細胞の細胞骨格に連結するタンパク質のクラスの一部である膜貫通タンパク質である。カドヘリンは、上皮細胞−細胞接着において主要な役割を果たすものであると考えられる。他の主要な役割としては、細胞表現型の決定および腫瘍細胞の移動および散布を含む細胞動態における関連が挙げられる。Ｐ−カドヘリン（胎盤カドヘリン）は、上皮組織において一般的に発現されることが知られている。Ｐ−カドヘリンの関連する役割および異なる作用は、以前には、記載されていなかった。
【０００７】
これらに関連して、本発明は、特定の癌の型（特にいくつかの消化系の癌の型（例えば、結腸癌））が正常な細胞と比較したＰ−カドヘリンのアップレギュレーションおよび過剰発現により特徴付けられ、そしてＰ−カドヘリンの発現および／または活性を結合および／または阻害する部分が、Ｐ−カドヘリン過剰発現により特徴付けられる癌（例えば、結腸癌を含む消化器系癌）を処置または予防するために使用され得るという発見による。
【０００８】
詳細には、複数の結腸癌サンプルからのマイクロチップアレイのデータは、これらのサンプルにおけるＰ−カドヘリン転写のアップレギュレーションを示す。これらの組織からのインサイチュハイブリダイゼーションデータは、結腸癌細胞における転写を局在化させた。Ｐ−カドヘリンは、マイクロチップアレイを介して分析された、３３人の結腸癌患者から得られた腫瘍サンプルの５０％において、５倍より高くアップレギュレートされた。従って、この細胞接着タンパク質は、検査された有意な数の結腸癌の腫瘍において異常に発現されたようである。
【０００９】
Ｐ−カドヘリン特異的モノクローナル抗体を用いるヒト結腸癌サンプルの免疫組織化学分析は、結腸の癌組織において、正常なヒト結腸組織サンプルより多いＰ−カドヘリン遺伝子産物が存在することを示す。Ｐ−カドヘリンに対して誘導された市販のマウスモノクローナル抗体を用いて、細胞接着および細胞増殖が、Ｐ−カドヘリンを発現する細胞株を含む培養物においてブロックされた。正常な組織および癌組織におけるＰ−カドヘリンの組織分布もまた、市販の抗Ｐ−カドヘリンモノクローナル抗体を用いて評価された。結腸癌細胞におけるＰ−カドヘリンの発現が、免疫組織化学を介してさらに確認された。免疫化学はまた、いくつかの正常な上皮層（例えば、口腔上皮および膣上皮）がＰ−カドヘリンを発現することを示す。Ｐ−カドヘリンの発現はまた、正常な膵臓および下垂体のサンプルにおいても観察された。ヌードマウス中で増殖したヒト結腸癌細胞の体外移植組織（ＫＭ１２細胞）が、Ｐ−カドヘリンを発現することが示された。Ｐ−カドヘリン発現は、他の癌（特に肺癌、胃癌、および乳癌）において免疫組織化学的に検出されている。
【００１０】
アンチセンス技術を用いる、ノックアウト研究は、Ｐ−カドヘリンが癌細胞増殖の調節において重要であることを示した。特に、Ｐ−カドヘリンを中程度のレベルで発現した細胞株を用いて得られたアンチセンスデータは、発現の阻害が、細胞増殖にネガティブに影響することを示す。
【００１１】
これらの観察（すなわち、Ｐ−カドヘリンがいくつかのヒト癌の型（例えば、ヒト結腸癌）において過剰発現され、そしてＰ−カドヘリンの発現または機能を阻害および／またはブロックすることは、癌細胞の増殖、移動および／または増殖を蓄積し得ること）に基づき、本発明は、Ｐ−カドヘリンを標的化または検出することによって、Ｐ−カドヘリンの過剰発現および／またはアップレギュレーションにより特徴付けられる癌を診断、予防または処置する方法に関する。
【００１２】
Ｐ−カドヘリンの過剰発現またはアップレギュレーションが関与する癌の予防または処置の場合、本発明は、一般に、少なくとも１つの「Ｐ−カドヘリンアンタゴニスト」の投与を含む。対照的に、Ｐ−カドヘリンの過剰発現により特徴付けられる癌の診断の場合、本発明、コントロールの（正常な）組織または細胞サンプルに対する組織または細胞サンプルにおけるＰ−カドヘリンの発現のレベルを決定する工程、およびＰ−カドヘリンのアップレギュレーションにより特徴付けられる癌の陽性または陰性の診断に対する発現のレベルを関連付ける工程を包含する。
【００１３】
本発明はまた、特定の「Ｐ−カドヘリンアンタゴニスト」（上記により規定）、詳細には、Ｐ−カドヘリンを結合する抗体もしくは抗体フラグメント、または低分子、ならびにＰ−カドヘリン発現を調節するリボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【００１４】
さらに、本発明、そのようなアンタゴニストを含む新規の薬学的組成物に関する。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
関連出願である米国仮出願第６０／２０８，８７１号（２０００年６月２日出願；本明細書中に参考として援用される）では、本譲受人は、結腸癌細胞において示差的に発現される多数のポリヌクレオチド配列を開示した。これらのポリヌクレオチド配列は、Ｐ−カドヘリンを含んでいた。本発明は、その表面にＰ−カドヘリンを（好ましくは、正常組織よりも高いレベルで）発現する腫瘍組織によって特徴付けられる（結腸癌のような）癌の処置および／または予防における治療介入のための標的としてのＰ−カドヘリンの使用に関する。また、本発明は、診断標的としてのＰ−カドヘリンの使用に関する。
【００１６】
種々のデータおよび観察によって、Ｐ−カドヘリンが癌治療に適切な標的であることが示唆される。例えば、チップマイクロアレイデータは、Ｐ−カドヘリンが、分析した結腸癌患者の約５０％において５倍よりも高くアップレギュレートされることを示す。３３人の患者に関するこのマイクロアレイデータを表１（以下）にまとめ、そしてこのデータによって、Ｐ−カドヘリンの過剰発現がいくつかの癌の存在に相関することが示唆される。さらに、Ｐ−カドヘリンは、細胞間接着において助けになると考えられる、カドヘリンおよびカドヘリン様タンパク質を含む大きなタンパク質ファミリーのメンバーであるので、このタンパク質が、おそらく転移を容易にすることによって、Ｐ−カドヘリン関連癌において原因の役割を果たし得るという理論が立てられた。
【００１７】
第２に、中程度のレベルのＰ−カドヘリンを発現する癌細胞にトランスフェクトされた場合に、Ｐ−カドヘリン転写産物に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、その増殖を抑制することが示されている。Ｐ−カドヘリン発現が癌細胞の増殖に影響を与え得る（促進し得る）ことが示されたので、このデータによって、適切な治療標的としてのＰ−カドヘリンの効力がさらに示唆される（これらのアンチセンス実験の結果を、実験実施例の節でさらに詳細に考察する）。
【００１８】
第３に、Ｐ−カドヘリンに特異的なモノクローナル抗体が、組織培養中のＰ−カドヘリン発現細胞の接着をブロックすることが示されている。実施例においてさらに詳細に考察するように、ヒトＰ−カドヘリンを結合するＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９（Ｚｙｍｅｄから入手されたマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体）が、Ａ−４３１（中程度のレベルのＰ−カドヘリンを発現する上皮腫瘍細胞株）の接着をブロックすることがことが示されている。対照的に、試験した別のマウスＩｇＧ１抗ヒトＰ−カドヘリンモノクローナル抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（ＲＤＩ）から入手可能なＲＤＩ−ＰＣＡＤＨＥＲ  ａｂｍ、および無関係のマウスＩｇＧ１抗体）は、Ａ−４３１細胞の接着に影響を与えなかった。これらの結果は、図２に含まれる。（細胞接着をブロックしなかった抗Ｐ−カドヘリン抗体に関しては、この抗体は、細胞接着に関与しない別個のエピトープに結合し得るか、またはこれらの２つの抗体の異なる活性もしくは親和性に寄与し得ることが理論立てられた）。組み合わされたこれらの結果は、Ｐ−カドヘリンを特異的に結合するリガンド（例えば、抗体もしくは抗体フラグメント）またはＰ−カドヘリン発現を阻害するリガンド（例えば、アンチセンスオリゴもしくはリボザイム）が、Ｐ−カドヘリン関連癌の処置に有用であり得ることを実証する。特に、これらの結果は、抗Ｐ−カドヘリンリガンドが、Ｐ−カドヘリン発現癌細胞が異なる部位で移動、接着および腫瘍産生するのを妨害または阻害することによって、転移を阻害し得ることを示唆する。
【００１９】
第４に、Ｐカドヘリンに特異的なモノクローナル抗体が、組織培養においてＰ−カドヘリン発現細胞株の増殖を阻害することが示されている。実施例においてさらに詳細に考察されるように、市販のモノクローナル抗体ＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９（Ｚｙｍｅｄから入手される）が組織培養においてＡ−４３１細胞の増殖を阻害したことが示されている（図３における結果）。対照的に、無関係のマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体は、細胞増殖を阻害しなかった。試験した他の抗Ｐ−カドヘリンモノクローナル抗体（ＲＤＩから入手されるＲＤＩ−ＰＣＡＤＨＥＲ  ａｂｍも細胞増殖を阻害しなかった（試験した２つの抗Ｐ−カドヘリンモノクローナル抗体の機能的挙動における相違は、これらの２つの抗体の間のエピトープの相違、アビディティの相違および／または親和性の相違に潜在的に寄与し得ると再度理論立てられる）。
【００２０】
これらの結果は、癌細胞におけるＰ−カドヘリンをＰ−カドヘリンアンタゴニストの投与によって破壊またはブロックすることが、Ｐ−カドヘリンを過剰発現する癌細胞の増殖を阻害するか、またはＰ−カドヘリン関連癌の始まりを阻害するという証拠を提供する。
【００２１】
第５に、Ｐ−カドヘリンの組織分布を免疫組織化学的（ＩＨＣ）に評価するためにＰ−カドヘリンを特異的に結合する市販の抗体を用いることによって、Ｐ−カドヘリンがいくつかの癌（特に、いくつかの消化器癌）において、より高いレベルで発現されることが示されている。同様の染色結果が、２つの異なる抗Ｐ−カドヘリンモノクローナル抗体を用いて得られた。ＩＨＣの結果のいくつかは、図４〜図１０に含まれる。図４および図５は、異なる種類の上皮組織（すなわち、皮膚、胸部、食道、膀胱、膣、舌、扁桃および肛門）におけるＰ−カドヘリン発現を評価するＩＨＣの結果を含む。図６は、Ｐ−カドヘリンがいくつかの正常組織（特に、副腎、胸腺、膵臓、気管支および下垂体）で発現され得ることを示唆するＩＨＣのデータを含む。図７は、Ｐ−カドヘリンが正常組織で発現され、そして癌性胸部組織でより高いレベルで発現されることを示唆するＩＨＣデータを含む。図８は、これらの異なる組織においてＩＨＣ  Ｐ−カドヘリン発現によって決定された、３つの組織のアレイ（正常結腸、結腸腫瘍、および結腸転移物）の結果を含む。この結果は、Ｐ−カドヘリンが、癌性組織において、正常結腸組織よりも高いレベルで発現されることを示す。図９は、ヒト結腸癌モデル（ヌードマウスにおけるＫＭ１２ヒト癌）におけるＰカドヘリン発現を示す。これらのＩＨＣの結果は、このヒト結腸癌モデルまたは他のヒト結腸癌モデルが潜在的Ｐ−カドヘリンアンタゴニスト（例えば、抗Ｐ−カドヘリンモノクローナル抗体）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボでの効力を確認するために有用であることを示唆する。
【００２２】
最後に、Ｐ−カドヘリンを用いて、ヒトｓｃＦＶ抗体ライブラリーがパンニングされている。これらの結果は、本明細書中に報告されていないが、多数の可能なＰカドヘリン結合ｓｃＦｖ配列が、公知の方法を用いて同定されている。
【００２３】
これらの結果は、Ｐ−カドヘリンアンタゴニストの投与が、Ｐ−カドヘリン過剰発現によって特徴付けられる癌を処置するに有効な（ｅｆｆｉｃｉｏｕｓ）手段を提供するはずであるという、人を動かさずにはおかない証拠を累積的に提供する。なぜなら、これらのアンタゴニストが、Ｐカドヘリン発現癌細胞の増殖、移動および／または接着を阻害し得るからである。このことは、低減した腫瘍成長をもたらすはずであり、そして腫瘍転移を潜在的に阻害するはずである。
【００２４】
また、Ｐ−カドヘリン発現は特定の癌において上昇しており、そして癌細胞の増殖に明らかに相関しているので、これらの結果は、細胞におけるＰ−カドヘリン発現のレベルを測定するアッセイを用いて、このような細胞の増殖能力を決定し得ることを示唆する。
【００２５】
従って、上記に基づいて、本発明は、Ｐ−カドヘリンの検出、または治療介入もしくは予防的介入のための標的としてのＰ−カドヘリンの使用に基づく、Ｐ−カドヘリン過剰発現によって特徴付けられる癌を診断、処置および／または予防する新規方法を提供する。
【００２６】
しかし、本発明は、もちろん変動し得るので、記載される特定の実施形態に限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語が、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、そして限定されることは意図されないこともまた理解されるべきである。
【００２７】
他に定義しない限り、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において用いられ得るが、好ましい方法および材料はここで記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物および特許出願が、刊行物が引用される方法および／または材料に関連した方法および／または材料を開示および記載するために、参考として援用される。
【００２８】
本明細書中では、そうでないことを文脈が明らかに示さない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」が、複数形への言及を含むこともまた留意される。従って、例えば、「抗Ｐ−カドヘリンアンタゴニスト」への言及は、複数のこのようなアンタゴニストを含み、そして「Ｐ−カドヘリン発現癌細胞」への言及は、１以上のこのような細胞および当業者に公知のその等価物への言及を含む。
【００２９】
本明細書中で考察される刊行物および出願は、本発明の出願日前のそれらの開示のために単に提供される。本明細書中のものはいずれも、本発明が先の発明によってこのような刊行物に先立つ権利がないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される発行日は、実際の発行日と異なり得、これらは個々に確認される必要があり得る。
【００３０】
本発明をさらに記載するために、以下の特定の用語およびより一般的な用語を以下の通りに定義する。
【００３１】
（定義）
「Ｐ−カドヘリンアンタゴニスト」は、Ｐカドヘリンタンパク質（好ましくは、ヒトＰ−カドヘリン）に特異的に結合するか、またはＰ−カドヘリンポリヌクレオチドもしくはそのフラグメントに結合する化合物、および／あるいはＰ−カドヘリンタンパク質またはＰ−カドヘリンポリヌクレオチドの活性および／または発現を阻害する化合物である。これらの例としては、Ｐ−カドヘリンを結合するリガンド（例えば、抗体および抗体フラグメント）（組換え体またはネイティブ）、他の結合パートナー（例えば、レセプター、合成ペプチド（例えば、ペプチドライブラリーによって発現される）および非タンパク質性結合パートナー（例えば、低分子）が挙げられる。他のアンタゴニストとしては、Ｐ−カドヘリン発現を阻害するための、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはＰ−カドヘリン遺伝子の構造を改変する化合物が挙げられる。
【００３２】
好ましくは、Ｐ−カドヘリンアンタゴニスト（例えば、抗Ｐ−カドヘリン抗体）は、他のカドヘリン（例えば、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンおよびＨ−カドヘリン）よりも高い親和性でＰ−カドヘリンを結合する。より好ましくは、Ｐ−カドヘリンの、Ｅ−カドヘリンまたは別の非Ｐ−カドヘリンに対する相対結合親和性は、少なくとも５／１、より好ましくは少なくとも１０／１、２０／１、５０／１、１００／１もしくは１０００／１であるか、または抗体は、Ｐ−カドヘリン以外のカドヘリンに検出可能に結合しない。また、好ましくは、このタンパク質の重要な領域（例えば、ＥＣ１結合領域）に結合するＰ−カドヘリン抗体が選択される。
【００３３】
Ｐ−カドヘリンアンタゴニストとしては具体的に、以下で非常に詳細に記載するような、Ｐ−カドヘリンタンパク質の特定の部分に結合する分子（例えば、ＥＣ１ドメインを結合する分子、鎖二量体式（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍｕｌａ）を阻害する分子、シス二量体式（ｃｉｓ  ｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍｕｌａ）を阻害する分子、カルシウム結合を妨害する分子、およびタンパク質コンホメーションを妨害する分子（例えば、特定のドメインの整列を可能にする分子））が挙げられる。これは、このタンパク質のＰ−カドヘリンの特定の部分のこのタンパク質の構造および機能を詳細に記載する刊行物を参照して、以下に非常に詳細に開示される。
【００３４】
「Ｐ−カドヘリンポリペプチド」は、胎盤カドヘリンをいい、これは、タンパク質のカドヘリンファミリーに属するポリペプチドである。このファミリーは、細胞−細胞接着に関与するタンパク質メンバーを包含する。Ｐ−カドヘリンポリペプチドは、異なる種のＰ−カドヘリン（例えば、ヒト、マウス、またはこのポリペプチドを天然に発現する別の種）、ならびにそれらのフラグメントの部分を包含することが意図されている。このようなポリペプチドは、Ｐ−カドヘリンの対立遺伝子改変体をさらに包含し、このような改変体は、同じまたは異なる種の起源であり得る。一般に、改変体ポリペプチドは、上記パラメーターを用いてＢＬＡＳＴ  ２．０により測定されるように、本明細書に開示されたＰ−カドヘリンポリペプチドと少なくとも８０％、通常、少なくとも９０％、そしてより通常には、少なくとも約９８％の配列同一性である配列を有する。
【００３５】
好ましくは、Ｐ−カドヘリンは、ヒトＰ−カドヘリンをいい、これは、推定シグナルペプチド、推定前駆領域、細胞外ドメイン含有内部反復、および高度に疎水性の膜貫通領域を有する８８２アミノ酸のタンパク質である。好ましくは、Ｐ−カドヘリンは、ヒトカドヘリン、それらのホモログまたはフラグメントである。ヒトＰ−カドヘリンのアミノ酸配列を以下に記載する（配列番号１）：
【００３６】
【化１】
2005522982.tif 000002
【００３７】
［この配列は、Ｓｈｉｍｏｙｏｍａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０９．１７８７−１７９４（１９８９）（その全体が本明細書によって参考として援用される）に報告された］。
【００３８】
「Ｐ−カドヘリンポリヌクレオチド」、「Ｐ−カドヘリン核酸」および「Ｐ−カドヘリンＤＮＡ」は、本明細書中で交換可能に使用され、そしてＰ−カドヘリンポリペプチドまたはそれらの改変体もしくはフラグメントをコードするポリヌクレオチドをいう。特に、このような改変体は、天然に存在するＰ−カドヘリンまたはそれらのフラグメントに対して少なくとも９５％配列同一性を有する配列を包含する。好ましくは、Ｐ−カドヘリンポリヌクレオチドは、ヒトＰ−カドヘリンまたはそれらのフラグメントもしくは改変体をコードする。ヒトＰ−カドヘリンについての核酸配列もまた、Ｓｈｉｍｏｙｏｍａら、（同書）によって報告され、そしてこれを以下に記載する（配列番号２）：
【００３９】
【化２−１】
2005522982.tif 000003
【００４０】
【化２−２】
2005522982.tif 000004
【００４１】
【化２−３】
2005522982.tif 000005
【００４２】
「Ｐ−カドヘリンを発現する細胞」は、検出可能なレベルのＰ−カドヘリンを発現する任意の細胞をいう。検出は、周知のタンパク質検出方法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、または免疫蛍光）、またはＰ−カドヘリンをコードする転写物の検出（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応による、またはインサイチュハイブリダイゼーション）によって決定され得る。特異的なポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出するための他の方法は、下方に確認され、そして当業者に周知である。
【００４３】
「Ｐ−カドヘリンを過剰発現またはアップレギュレートする細胞」は、Ｐ−カドヘリンタンパク質または転写物が、対応する正常細胞におけるよりも高いレベルで発現される細胞をいう。例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質が、対応する正常細胞よりも少なくとも２５％高い、少なくとも約５０％〜約７５％高い、少なくとも約９０％高い、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、または少なくとも約５倍のレベルで生成される。大腸癌の場合、試験された大腸癌の約５０％において、（マイクロアレイチップデータに基づいて）正常大腸細胞の５倍より多いＰ−カドヘリン転写物を発現することが観察されている。比較は、異なる組織間、または異なる細胞間でなされ得る。
【００４４】
本明細書中で交換可能に使用される用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか）の重合形態をいう。従って、これらの用語は、一重鎖、二重鎖、または多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン塩基およびピリミジン塩基または他の天然のヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に改変されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含するが、これらに限定されない。これらの用語は、イントロン配列を含むｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを包含するが、これらに限定されない（例えば、Ｎｉｗａら、（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９（７）：６９１−７０２を参照のこと）。ポリヌクレオチドの骨格は、糖基およびリン酸基（ＲＮＡまたはＤＮＡにおいて典型的に見出され得るような）、または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミダイトのような合成サブユニットのポリマーを含み得、従って、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデートまたは混合ホスホルアミデート−ホスホジエステルオリゴマーであり得る。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら、（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：１８４１−１８４８；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４．２３１８−２３２３。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ）、ウラシル、他の糖、および連結基（例えば、フルオロリボースおよびチオエート）、およびヌクレオチド分枝を含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後にさらに改変され得る（例えば、標識化成分との結合体化による）。この定義に含まれる改変の他のタイプは、キャップ、アナログによる１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、およびタンパク質、金属イオン、標識化成分、他のポリヌクレオチドまたは固体支持体へのポリヌクレオチドの付着のための手段の導入である。
【００４５】
本明細書中で交換可能に使用される用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の重合形態をいう。これは、コードされたアミノ酸およびコードされていないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に改変されたまたは誘導体化されたアミノ酸、および改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを包含し得る。この用語は、融合タンパク質を包含し、これらとしては、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、異種リーダー配列および相同リーダー配列（Ｎ末端メチオニン残基を有するもしくは有さない）との融合物；免疫学的にタグ化されたタンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書中で使用されるように、用語「癌細胞で差次的に発現される遺伝子」および「癌細胞で差次的に発現されるポリヌクレオチド」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして一般に、癌細胞においてより高いレベルで発現されるポリヌクレオチドをいい、例えば、ｍＲＮＡは、癌でない同じ細胞型の細胞と比較した場合、癌細胞において、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％から約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約９５％、または少なくとも約５０倍以上異なる（例えば、高いまたは低い）レベルで見出される。比較は、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、または組織中の細胞型間でのある程度の識別を可能にする別のアッセイを使用する場合に、２つの組織間でなされ得る。この比較はまた、それらの組織供給源から取り出された細胞間でなされ得る。「Ｐ−カドヘリン」は、これまで試験された約５０％の大腸癌において差次的に発現される遺伝子である。
【００４７】
本明細書中で使用される「差次的に発現されるポリヌクレオチド」は、差次的に発現される遺伝子を表す配列を含む核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）をいい、例えば、差次的に発現されるポリヌクレオチドは、サンプル中の差次的に発現されるポリヌクレオチドの検出が、サンプル中の差次的に発現される遺伝子の存在と相関するように、差次的に発現される遺伝子を独自に同定する配列（例えば、遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレーム；非コード配列）を含む。「差次的に発現されるポリヌクレオチド」はまた、開示されたポリヌクレオチドのフラグメント（例えば、生物学的活性を保持するフラグメント）、ならびに、開示されたポリヌクレオチドに対して相同な、実質的に類似する、または実質的に同一の（例えば、約９０％配列同一性を有する）核酸を包含することを意味する。
【００４８】
本明細書中で使用される「診断」は、一般に、疾患または障害に対する被験体の感受性の決定、被験体が疾患または障害に現在罹患しているかに関する決定、疾患または障害に罹患した被験体の予後（例えば、転移前もしくは転移の癌状態、癌の段階、または治療に対する癌の感応度の同定）、ならびに治療（例えば、治療の効果または効力に関する情報を提供するための被験体の状態のモニタリング）を包含する。
【００４９】
本明細書中に使用される場合、用語「癌と関連したポリペプチド」は、癌細胞（例えば、大腸癌）において差次的に発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドをいう。
【００５０】
用語「生物学的サンプル」は、生物から得られる種々のサンプルタイプを包含し、そして診断またはモニタリングアッセイにおいて使用され得る。この用語は、血液および他の生物学的起源の液体サンプル、固体組織サンプル（例えば、生検標本もしくは組織培養物またはそれらに由来する細胞およびそれらの子孫）を包含する。この用語は、それらの獲得後にいかなるようにも操作された（例えば、試薬での処理、可溶化、または特定の成分についての富化）サンプルを包含する。この用語は、臨床サンプルを包含し、そして細胞培養物、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的流体、および組織サンプル中の細胞もまた包含する。
【００５１】
用語「処置」「処置すること」、「処置する」などは、本明細書中において、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを一般的に指すために使用される。その効果は、疾患もしくはその症状を完全にかまたは部分的に予防することに関して予防的であり得、そして／あるいは疾患および／もしくはその疾患に帰因し得る有害な効果の部分的安定化もしくは完全な安定化または部分的治癒もしくは完全な治癒に関して、治療的であり得る。「処置」とは、本明細書中で使用される場合、哺乳動物（特にヒト）における疾患のすべての処置を包含し、「処置」としては、（ａ）その疾患または症状になる傾向があり得るがその疾患または症状を有するとはまだ診断されていない被験体において、その疾患または症状が生じるのを防ぐこと；（ｂ）その疾患または症状を阻害すること（すなわち、その発症を阻止すること）；またはその疾患または症状を軽減すること（すなわち、その疾患または症状（例えば、結腸癌または別の消化器癌（例えば、胃癌もしくは肝臓癌）または乳癌）の後退を引き起こすこと）が挙げられる。
【００５２】
用語「個体」、「被験体」、「宿主」および「患者」とは、本明細書中で互換可能に使用される場合、診断、処置、または治療が望まれる任意の哺乳動物対象物（特にヒト）を指す。他の対象物としては、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどが挙げられ得る。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」とは、天然に存在する環境とは異なる環境にある、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞を指す。単離されているポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞は、一般的には実質的に精製されている。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に精製された」とは、天然の環境から取り出されておりかつ天然で結合している他の成分を少なくとも６０％（好ましくは７５％、最も好ましくは９０％）含まない、化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは抗体のいずれか）を指す。従って、例えば、Ａを含む組成物は、その組成物中の全Ａ＋Ｂの少なくとも８５重量％がＡである場合、Ｂを「実質的に含まない」。好ましくは、Ａは、その組成物中の全Ａ＋Ｂの少なくとも約９０重量％、より好ましくは少なくとも約９５重量％または９９重量％さえも含む。
【００５５】
「宿主細胞」とは、本明細書中で使用される場合、組換えベクターまたは他の移入ポリヌクレオチドのレシピエントとして使用され得るかもしくは使用されている、単細胞実態として培養される微生物または真核細胞もしくは細胞株を指し、トランスフェクトされたもとの細胞の子孫を包含する。単一細胞の子孫は、天然の変異、突然変異または意図的変異に起因して、もとの親と形態もゲノムＤＮＡ相補体も全ＤＮＡ相補体も、必ずしも完全に同一である必要はないかもしれないことが理解される。
【００５６】
用語「癌」、「新生物」、「腫瘍」および「癌腫」とは、比較的自律的な増殖を示し、その結果細胞増殖の制御の有意な喪失により特徴付けられる異常な増殖表現型を示す、細胞を指すために、本明細書中で互換可能に使用される。一般に、本願における検出または処置のため目的の細胞としては、前癌（例えば、良性）細胞、悪性細胞、転移細胞、および非転移細胞が挙げられる。癌性細胞の検出が、特に興味深い。
【００５７】
（Ｐ−カドヘリンポリヌクレオチド）
１つの局面において、本発明は、いくつかの癌（特に、消化器癌（例えば、結腸癌））において差次的に発現されるＰ−カドヘリンをコードするポリヌクレオチドの阻害または検出に関する。そのポリヌクレオチドならびにそれによりコードされるポリペプチドは、種々の治療法および診断法において用途を見出す。
【００５８】
本明細書中に記載される方法において有用なポリヌクレオチド組成物に関する本発明の範囲は、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つに示される配列を有するポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件（特に高ストリンジェンシー条件）下でのハイブリダイゼーションによって、本明細書中に記載される生物学的材料または他の生物学的供給源（特にヒト供給源）から得られるポリヌクレオチド；提供されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子；提供されるポリヌクレオチドの改変体およびそれらの対応する遺伝子（特に、コードする遺伝子産物の生物学的活性（例えば、タンパク質ファミリーにその遺伝子産物が割り当てられる結果および／またはその遺伝子産物中に存在する機能性ドメインの同定の結果として、提供されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子産物に帰せられる生物学的活性を保持する改変体；を包含するが、必ずしもこれらに限定されない。本発明により企図されそして本発明の範囲内にある他の核酸組成物は、本明細書中の開示を提供される場合に、当業者に容易に明らかである。その組成物の核酸に関して本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、特に示されない限り、その核酸の長さに関しても構造に関しても限定することにはなっていない。
【００５９】
本発明は、ヒト癌組織（特に、ヒト結腸組織）において発現されるＰ−カドヘリンポリヌクレオチドを特徴とする。特に目的とされる本明細書中に記載される核酸組成物は、本明細書中に提供さえるポリヌクレオチド配列またはその同定する配列のいずれか１つに示される配列を含む。「同定する配列」とは、ポリヌクレオチド配列を独特に同定する（例えば、約２０ヌクレオチドを超える任意の連続ヌクレオチド配列に対して、９０％未満、通常は約８０％〜８５未満の配列同一性を示す）、少なくとも１０ヌクレオチド長〜約２０ヌクレオチド長、通常は少なくとも約５０ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長の残基の連続配列である。従って、本核酸組成物は、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つ由来の連続ヌクレオチドの同定する配列を包含する、全長ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを包含する。
【００６０】
本明細書中に記載される方法において有用なポリヌクレオチドはまた、ネイティブＰ−カドヘリンＤＮＡと配列類似性または配列同一性を有するポリヌクレオチドを包含する。これは、付随している、５’非翻訳配列および３’非翻訳配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列、ならびにセンス方向の配列およびアンチセンス方向の配列を包含する。配列類似性を有する核酸は、低ストリンジェンシー条件（例えば、５０℃および１０×ＳＳＣ（０．９Ｍ生理食塩水／０．０９Ｍクエン酸ナトリウム）下でのハイブリダイゼーションにより検出され、そして１×ＳＳＣ中で５５℃での洗浄に供された場合に結合したままである。配列同一性は、ストリンジェントな条件下（例えば、５０℃以上および０．１×ＳＳＣ（９ｍＭ生理食塩水／０．９ｍＭクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションによって、決定され得る。ハイブリダイゼーションの方法および条件は、当該分野で周知であり、例えば、米国特許第５，７０７，８２９号を参照のこと。提供されるポリヌクレオチド配列と実質的に同一な核酸（例えば、対立遺伝子改変体、その遺伝子の遺伝子改変形など）は、提供されるポリヌクレオチド配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合する。プローブ（特に、ＤＮＡ配列の標識プローブ）を使用することによって、相同性遺伝子または関連遺伝子を単離し得る。相同性遺伝子の供給源は、任意の種（例えば、霊長類種（特にヒト）；齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）；イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、酵母、線虫などであり得る。
【００６１】
１つの実施形態において、ハイブリダイゼーションは、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つの少なくとも１５個連続するヌクレオチドを使用して、実施される。すなわち、開示されるポリヌクレオチド配列のうちの１つの少なくとも１５個連続するヌクレオチドが、プローブとして使用される場合、そのプローブは、相補的配列を含む核酸と優先的にハイブリダイズし、選択されたプローブに独特にハイブリダイズする核酸の同定および回収を可能にする。本明細書中に提供される１つより多くのポリヌクレオチド配列由来のプローブは、由来するｃＤＮＡが１つのｍＲＮＡに対応する場合に、同じ核酸とハイブリダイズし得る。１５ヌクレオチドより長いプローブ（例えば、約１８ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、７５ヌクレオチドまたは１００ヌクレオチドの範囲内にあるサイズのプローブ）が、使用され得るが、一般には、約１５ヌクレオチドが、独特の同定に十分な配列を示す。
【００６２】
本発明により企図されるポリヌクレオチドはまた、そのヌクレオチド配列の天然に存在する改変体（例えば、縮重改変体、対立遺伝子改変体など）を包含する。本発明により企図されるポリヌクレオチドの改変体は、推定改変体と本明細書中に開示されるヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション（好ましくは、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション）によって同定される。例えば、適切な洗浄条件を使用することによって、対立遺伝子改変体が、選択されたポリヌクレオチドプローブに対して最大約２５〜３０％の塩基対（ｂｐ）ミスマッチを示す、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの改変体が、同定される。一般に、対立遺伝子改変体は、１５〜２５％のｂｐミスマッチを含み、そして５〜１５％、または２〜５％、または１〜２％程度のｂｐミスマッチ、ならびに一ｂｐミスマッチを含み得る。
【００６３】
本発明はまた、本明細書中に提供されるＰ−カドヘリンポリヌクレオチド配列に対応するホモログを包含し、その相同性遺伝子の供給源は、任意の哺乳動物種（例えば、霊長類種（特にヒト）；齧歯類（例えば、ラット）；イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、酵母、線虫など）であり得る。哺乳動物種間（例えば、ヒトとマウスとの間）で、ホモログは、一般的には、Ｐ−カドヘリン遺伝子またはその一部（好ましくは、その遺伝子の細胞外領域部分）と実質的な配列類似性（例えば、ヌクレオチド配列間で少なくとも７５％配列同一性、通常は少なくとも９０％、より通常は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）を有する。配列類似性は、参照配列（より大きな配列のサブセット、好ましくは細胞外コード配列（例えば、保存モチーフ、コード領域の一部、隣接領域など）であり得る）に基づいて計算され得る。参照配列は、通常は、少なくとも約１８個連続するヌクレオチド長であり、より通常は、少なくとも約３０ヌクレオチド長であり、そして比較される完全配列まで広がり得る。配列分析のためのアルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９７）２５：３３８９〜３４０２に記載される、ギャップ付きＢＬＡＳＴ）は、当該分野で公知である。
【００６４】
一般に、本明細書中に記載されるＰ−カドヘリンポリヌクレオチドの改変体は、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）にて実施されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される場合に、少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８５％を超える配列同一性を有し、そして少なくとも約９０％、９５％、９６％、９８％、９９％以上を超え得る。本発明の目的のために、同一性パーセントを計算する好ましい方法は、以下を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムである。全体ＤＮＡ配列同一性は、以下の検索パラメータを用いるアフィンギャップ検索を使用するＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実施されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される場合、６５％を超えなければならない：ギャップオープンペナルティ１２：およびギャップエクステンションペナルティ１。
【００６５】
本核酸は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡならびにそれらのフラグメント（特に、生物学的に活性な遺伝子産物をコードするフラグメント、および／または本明細書中に開示される方法（例えば、診断において、目的の差次的に発現される遺伝子の独特の識別子として）において有用であるフラグメント）であり得る。用語「ｃＤＮＡ」は、本明細書中で使用される場合、ネイティブの成熟ｍＲＮＡ種において見出される配列エレメントの配置を共有するすべての核酸（配列エレメントは、エキソンならびに３’非コード領域および５’非コード領域である）を包含することになっている。通常は、ｍＲＮＡ種は、連続するエキソンを有し、介在するイントロンが存在する場合は、そのイントロンは、ポリペプチドをコードする連続的オープンリーティングフレームを生成するように核ＲＮＡスプライシングにより取り除かれている。ｍＲＮＡ種はまた、イントロンが選択的スプライシングにより取り除かれ得る場合、エキソンおよびイントロンの両方とともに存在し得る。さらに、同じゲノム配列によりコードされる異なる種のｍＲＮＡは、細胞中で種々のレベルで存在し得ること、そしてこれらの種々のｍＲＮＡ種のレベルの検出は、その細胞におけるコードされる遺伝子産物の差次的発現を示し得ることが、留意されるべきである。
【００６６】
目的のゲノム配列は、列挙された配列中に規定される、開始コドンと終止コドンとの間に存在する核酸（ネイティブ染色体中に通常存在するイントロンすべてを含む）を含む。そのゲノム配列は、成熟ｍＲＮＡ中に見出される３’非翻訳領域および５’非翻訳領域をさらに含み得る。そのゲノム配列は、特定の転写調節配列および翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）（転写領域の５’末端および３’末端のいずれかに約１ｋｂ（しかし、それより大きい可能性がある）隣接ゲノムＤＮＡをさらに含み得る。そのゲノムＤＮＡは、１００ｋｂ以下のフラグメントとして単離され得、そして隣接する染色体配列を実質的に含まない。そのコード領域に３’および５’のいずれかで隣接するゲノムＤＮＡまたはイントロン中で時々見出される内部調節配列は、適切な組織特異的発現、段階特異的発現、または疾患状態特異的発現に必要とされる配列を含む。
【００６７】
本発明の核酸組成物は、本Ｐ−カドヘリンポリペプチドの全てもしくは一部をコードし得るか、または（例えば、その遺伝子の５’非コード領域もしくは３’非コード領域由来の）非コード配列を含み得る。注意される場合、これらのＤＮＡまたはＲＮＡは、センス方向またはアンチセンス方向であり得る。二重鎖フラグメントまたは一本鎖フラグメントは、従来の方法に従って（制限酵素消化、ＰＣＲ増幅などによって）オリゴヌクレオチドを化学合成することによって、ＤＮＡ配列から得られ得る。本発明により企図される単離されたポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドフラグメントは、本明細書中に提供されるポリヌクレオチドから選択される少なくとも約１０連続ヌクレオチド、約１５連続ヌクレオチド、約２０連続ヌクレオチド、約３５連続ヌクレオチド、約５０連続ヌクレオチド、約１００連続ヌクレオチド、約１５０連続ヌクレオチド〜約２００連続ヌクレオチド、約２５０連続ヌクレオチド〜約３００連続ヌクレオチドまたは約３５０連続ヌクレオチドを含む。大体は、フラグメントは、少なくとも１５ヌクレオチド、通常は少なくとも１８ヌクレオチド〜２５ヌクレオチド、そして少なくとも約５０連続ヌクレオチド長以上までである。好ましい実施形態において、そのポリヌクレオチド分子は、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つから選択さえる少なくとも１２ヌクレオチドの連続配列を含む。
【００６８】
Ｐ−カドヘリンポリヌクレオチドに特異的なプローブは、本明細書中に開示されるＰ−カドヘリンポリヌクレオチド配列を使用して生成され得る。そのプローブは、好ましくは、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つに対応する連続配列の少なくとも約１２ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２４ヌクレオチドまたは２５ヌクレオチドのフラグメントであり、そして２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満、０．１ｋｂ未満または０．０５ｋｂ未満の長さであり得る。このプローブは、化学合成され得るか、または制限酵素を使用してより長いポリヌクレオチドから生成され得る。そのプローブは、例えば、放射性タグ、ビオチン化タグ、または蛍光タグで標識され得る。好ましくは、プローブは、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つの同定する配列に基づいて、設計される。より好ましくは、プローブは、その配列への低複雑性をマスクするためのマスクプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ）の適用後にマスクされていないままである、本ポリヌクレオチドの１つの連続配列に基づいて設計される（すなわち、このマスクプログラムにより生成されるマスク配列のポリｎストレッチの外側にあるポリヌクレオチドにより示される、非マスク領域を選択する）。
【００６９】
本発明のＰ−カドヘリンポリヌクレオチドは、実質的に純粋な状態で、一般的にはインタクトな染色体以外として、単離されそして得られる。通常は、このポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとして、他の天然に存在する核酸配列を実質的に含まずに得られ、一般的には、少なくとも約５０％、通常は少なくとも約９０％純粋であり、そして代表的には、「組換え」である（例えば、天然に存在する染色体上で通常は結合していない１つ以上のヌクレオチドが隣接している）。
【００７０】
本明細書中に記載されるＰ−カドヘリンポリヌクレオチドは、線状分子としてかまたは環状分子内に提供され得、そして自律複製する分子（ベクター）内または複製配列を含まない分子内に提供され得る。そのポリヌクレオチドの発現は、それ自体によってか、または当該分野で公知の他の調節配列によって、調節され得る。そのポリヌクレオチドは、当該分野で利用可能な種々の技術（例えば、トランスフェリンポリカチオン媒介ＤＮＡ移入、裸核酸またはカプセル化核酸によるトランスフェクション、リポソーム媒介ＤＮＡ移入、ＤＮＡコートラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションなど）を使用して、適切な宿主細胞中に導入され得る。
【００７１】
本明細書中に記載される核酸組成物は、例えば、生物学的サンプル（例えば、ヒト細胞抽出物）中でｍＲＮＡを検出するためのプローブとしてのポリペプチド（抗Ｐ−カドヘリン抗体を得るために使用され得る）を生成して、そのポリヌクレオチドのさらなるコピーを生成するため、リボザイムもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するため、そして一本鎖ＤＮＡプローブとして、または三本鎖形成オリゴヌクレオチドとして、使用され得る。本明細書中に記載されるプローブは、例えば、サンプル中で本明細書中に提供されるポリヌクレオチドまたはその改変体のいずれか１つの存在または非存在を決定するために使用され得る。これらの使用および他の使用が、以下により詳細に記載される。
【００７２】
（Ｐ−カドヘリンポリペプチドおよびその改変体）
本発明により企図されるポリペプチドは、開示されるＰ−カドヘリンポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに遺伝コードの縮重によって開示されるＰ−カドヘリンポリヌクレオチドとは配列が同一ではない核酸によってコードされるポリペプチドが挙げられる。従って、本発明は、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つの配列またはその改変体を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを、その範囲内に包含する。
【００７３】
一般に、用語「ポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、言及されるポリヌクレオチドによりコードされる全長ポリペプチド、言及されたポリヌクレオチドにより示される遺伝子によりコードされるポリペプチド、ならびにその一部もしくはフラグメントの両方を指す。「ポリペプチド」はまた、天然に存在するタンパク質の改変体を包含し、そのような改変体は、その天然に存在するタンパク質と相同であるかまたは実質的に類似し、そしてその天然に存在するタンパク質と同じ種または異なる種（例えば、ヒト、マウス、または言及されたポリペプチドを天然で発現する他の種、通常は哺乳動物種）起源であり得る。一般的に、改変体Ｐ−カドヘリンポリペプチドは、本明細書中に記載される差次的に発現されるポリペプチドと、上記のパラメーターを使用するＢＬＡＳＴ２．０により測定した場合に、少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％、より通常は少なくとも約９５％以上の配列同一性（すなわち、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性）を有する配列を有する。その改変体ポリペプチドは、天然でグリコシル化していても天然ではグリコシル化していなくてもよい（すなわち、そのポリペプチドは、対応する天然に存在するタンパク質中に見出されるグリコシル化パターンと異なるグリコシル化パターンを有する）。
【００７４】
本発明はまた、Ｐ−カドヘリンポリペプチドのホモログ（またはそのフラグメント）を包含し、そのホモログは、他の種から単離され、異なるグリコシル化パターンを示し得る天然に存在するグリコシル化Ｐ−カドヘリン（正常細胞および新生物細胞により生成されるＰ−カドヘリンを含む）を包含し、すなわち、他の動物種または植物種とは、通常は哺乳動物種（例えば、齧歯類（例えば、マウス、ラット）；家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ）；およびヒトである。「ホモログ」によって、上記で同定される特定の差次的に発現される（配列同一性が、上記のパラメーターを用いてＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムを使用して決定される場合）タンパク質と少なくとも約３５％、通常は少なくとも約４０％、より通常は少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有する、ポリペプチドが意味される。
【００７５】
一般に、本発明のＰ−カドヘリンポリペプチドは、天然に存在しない環境にて提供される（例えば、その天然に存在する環境から分離されている）。特定の実施形態において、本タンパク質は、コントロールと比較してそのタンパク質が濃縮されている組成物中に存在する。このように、精製ポリペプチドが提供され、精製される、によって、そのタンパク質が、差次的には発現されないポリペプチドを実質的には含まない組成物中に存在することが意味され、実質的に含まない、によって、その組成物の９０％未満、通常は６０％未満、より通常は５０％未満が、差次的に発現されないポリペプチドから構成されることが意味される。
【００７６】
また、本発明の範囲内には、改変体が存在する；ポリペプチドの改変体は、変異体、フラグメント、および融合物を包含する。変異体は、アミノ酸の置換、付加、または欠失を包含し得る。アミノ酸置換は、グリコシル化部位、リン酸化部位、もしくはアセチル化部位を変更するため、または機能に必要ではない１つ以上のシステイン残基の置換もしくは欠失によるミスフォールディングを最小にするための、保存的アミノ酸置換または必須でないアミノ酸を除去する置換であり得る。保存的アミノ酸置換は、置換されるアミノ酸の全体的電荷、疎水性／親水性、および／または立体的かさを保存するアミノ酸置換である。改変体は、そのタンパク質の特定の領域（例えば、機能性ドメインおよび／またはそのポリペプチドがタンパク質ファミリーのメンバ−である場合は、コンセンサス配列と関係する領域）の生物学的活性を保持するように、または増強されたその生物学的活性を有するように、設計され得る。改変体の生成のためのアミノ酸変化の選択は、アミノ酸の接近可能性（内部対外部）（例えば、Ｇｏら、Ｉｎｔ．Ｊ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．（１９８０）１５：２１１を参照のこと）、改変体ポリペプチドの熱安定性（例えば、Ｑｕｅｒｏｌら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．（１９９６）９：２６５を参照のこと）、所望のグリコシル化部位（例えば、ＯｌｓｅｎおよびＴｈｏｍｓｅｎ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１３７：５７９を参照のこと）、所望のジスルフィド架橋（例えば、Ｃｌａｒｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９３）３２：４３２２；およびＷａｋａｒｃｈｕｋら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（１９９４）７：１３７９を参照のこと）、所望の金属結合部位（例えば、Ｔｏｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）３０：９７およびＨａｅｒｚｅｒｂｒｏｕｃｋら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（１９９３）６：６４３を参照のこと）、ならびにプロリンループにおける所望される置換（例えば、Ｍａｓｕｌら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９４）６０：３５７９）に基づき得る。システイン欠失ムテインは、米国特許第４，９５９，３１４号に開示されるように生成され得る。
【００７７】
改変体はまた、本明細書中に開示されるポリペプチドのフラグメント、特に、生物学的に活性なフラグメント、および／または機能性ドメインに対応するフラグメントを包含する。目的のフラグメントは、代表的には、少なくとも約１０アミノ酸長〜少なくとも約１５アミノ酸長、通常は少なくとも約５０アミノ酸長であり、そして３００アミノ酸長以上の長さであり得るが、通常は、約１０００アミノ酸長を超えず、そのフラグメントは、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列のいずれかの配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドまたはそのホモログと同一の、アミノ酸ストレッチを有する。本明細書中に記載されるタンパク質改変体は、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドによりコードされる。その遺伝コードは、対応する改変体を構築するために適切なコドンを選択するために使用され得る。特に、フラグメントは、Ｐ−カドヘリンタンパク質の特定のドメインまたはエピトープを含むフラグメントを包含する。
【００７８】
本明細書中の用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そしてこの用語は、所望の生物学的活性を示す限り、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）、ならびに抗体フラグメントを特に包含する。好ましくは、本抗体は、少なくとも１つのヒト定常ドメイン、またはヒトエフェクター機能を保持し、ヒト定常ドメインと少なくとも約９０〜９５％配列同一性を示す定常ドメインを含む。
【００７９】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部を含み、好ましくは、その抗原結合部位または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）分子；直鎖抗体分子；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多特異的抗体が挙げられる。
【００８０】
「ネイティブの抗体」は、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる。各々の鎖は、１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に結合されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖の間で異なる。各々の重鎖および軽鎖はまた、規則正しく間隔の空いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各々の重鎖は、１末端に可変ドメイン（ＶＨ）、それに続けて多くの定常ドメインを有する。各々の軽鎖は、１末端に可変ドメイン（ＶＬ）および他末端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列され、そして軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間のインターフェースを形成すると考えられている。
【００８１】
用語「可変な（ｖａｒｉａｂｌｅ）」とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列が著しく異なっており、そして特定の抗原に対する各々特定の抗体の結合および特異性において使用される事実をいう。しかし、この多様性は抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分散されない。これは、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方中の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集約される。可変ドメインのより高度に保存される部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲを含み、Ｐ−シート構成に大部分は適合し、３つの超可変領域により連結され、これらＦＲはβ（（３）シート構造に繋がるループを形成し、そしていくつかの場合において部分的βシート構造を形成する。各々の鎖の超過変領域は、ＦＲによって一緒に近い位置、かつ他の鎖由来の超過変領域と一緒になって配置されて、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合において直接的には関連しないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与）を示す。
【００８２】
抗体のパパイン消化は、単一の抗原結合部位を各々有する、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、および残りのＦｃフラグメント（この名前は、容易に結晶化する能力を反映する）を生じる。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、そして依然として抗原と架橋する能力を有し得る、Ｆ（ａｂ’２フラグメントを生じる。
【００８３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む、最小の抗体フラグメントである。この領域は、強固な非共有結合した、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この領域は、各々の可変ドメインの３つの超可変領域が、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用する構成である。要約すると、これら６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（またはある抗原に特異的な３つの超過変領域のみを含む、半分のＦｖ）でさえ、全体の結合部位よりも低い親和性であるが、抗原を認識および結合する能力を有する。
【００８４】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨＩ）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体のヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨＩドメインのカルボキシ末端の２、３残基の付加だけ、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆａｂ’についての本明細書中における命名であり、この定常ドメインのシステイン残基は少なくとも１つの遊離のチオール基を有する。Ｆ（ａｂ’）Ｚ抗体フラグメントは、元々、Ｆａｂ’フラグメント対の間にヒンジのシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として作製された。抗体フラグメントの他の化学的結合もまた公知である。
【００８５】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）鎖およびラムダ（λ）鎖と呼ばれる、２つの明確に異なる型の１つに割り当てられ得る。
【００８６】
抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、抗体は異なるクラスに割当てられ得る。インタクトな抗体の５つの主要なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、そしてこれらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２）に分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元構造は、周知である。本発明は、異なるアイソタイプの抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２）の使用を含む。いくつかの例において、異なる抗体アイソタイプの使用が好ましくあり得る。例えば、細胞の消耗（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）が好ましい場合、ＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ３アイソタイプの抗体の使用が好ましくあり得る。対照的に、Ｐ−カドヘリンが正常細胞により有意に発現される場合、細胞増殖を阻害するが細胞を直接には殺さない抗体（例えば、ＩｇＧ２アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプの抗体）を投与することが好ましくあり得る。
【００８７】
「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓｃＦＶ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは単一のポリペプチ鎖中に存在する。好ましくは、このＦｖポリペプチドはさらに、ｓｃＦｖが抗原の結合に望ましい構造を形成し得るような、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ共編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４）を参照のこと。
【００８８】
用語「ディアボディー」とは、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントをいい、これらフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間を対合させるには短過ぎるリンカーを使用することによって、これらドメインは、別の鎖の相補的ドメインと共に対合し、そして２つの抗原結合部位を形成するようにされる。ディアボディーは、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４４８（１９９３）により詳細に記載される。
【００８９】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から獲得された抗体、すなわち、ごく少量で存在し得る可能性ある自然発生の変異を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一であること、をいう。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に指向される。さらに、異なる決定基（エピトープ）に指向される異なる抗体を典型的に含む、従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に指向される。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによる異物混入のされない、ハイブリドーマ培養によって合成されることにおいて有利である。修飾語「モノクローナル（な）」とは、抗体の実質的に均一な集団から獲得されるような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするようには解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を使用する、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。用語モノクローナル抗体は、また具体的には、組換え方法、ファージディスプレイ、単鎖抗体、などによって作製された抗体を含む。
【００９０】
モノクローナル抗体は、本明細書中において具体的には、これらが所望の生物学的活性を提示する限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるかまたはそれに相同であるが、その鎖の残りの部分は、別種に由来する抗体、または別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるかまたはそれに相同である場合の、「キメラ」抗体または「ヒト化」抗体、ならびにそのような抗体のフラグメントを含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書中で目的のキメラ抗体は、非ヒトの霊長類由来の可変ドメイン抗原結合配列（例えば、Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  Ｍｏｎｋｅｙ（例えば、ヒヒ、アカゲザルおよびカニクイザル））およびヒト定常領域の配列を含む、「霊長類化された（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体を含む（米国特許第５，６９３，７８０号）。
【００９１】
非ヒト（例えば、マウス）の抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラ抗体である。大部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基を、非ヒトの種（ドナー抗体）（例えば、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギおよび非ヒト霊長類）の超可変領域由来の残基によって置換した、ヒト免疫グロブリン（レシピエントの抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基を、対応する非ヒトの残基によって置換する。さらに、ヒト化抗体は、レシピエントの抗体にもドナーの抗体にも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するために作製され得る。一般的に、ヒト化抗体は、実質的に全てまたは少なくとも１つ（代表的に２つ）の可変ドメインを含み、ここで、全てまたは実質的に全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものに対応する。ヒト化抗体は、必要に応じてまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。ヒト化抗体の好ましい作製手段は、ＡＭＥによってＷＯ  ０１／２７１６０に開示されており、この出願は本明細書においてその全体が参考として援用される。好ましくは、ヒト化抗体は、アクセプター（非ヒト）ＦＲ（例えば、マウスＦＲ）と少なくとも６５％同一な配列を提示する、ヒト化ＦＲを含む。
【００９２】
用語「超可変領域」とは、本明細書中で使用される場合、抗原結合を担う、抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、残基５０〜５６（Ｌ２）および残基８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５（Ｈ１）、残基５０〜６５（Ｈ２）および残基９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、（１９９１））由来のアミノ酸残基、および／または「超可変ループ」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、残基５０〜５２（Ｌ２）および残基９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｈ１）、残基５３〜５５（Ｈ２）および残基９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））由来の残基を含む。「フレームワーク」残基または「ＦＲ」残基は、本明細書中に規定されるような超可変領域の残基以外の、可変領域の残基である。目的の抗原（例えば、Ｂ細胞表面マーカー）「を結合する」アンタゴニストは、このアンタゴニストが抗原を発現する細胞を標的化するための治療剤として有用であるような、十分な親和性および／または親和力でその抗原を結合し得るアンタゴニストである。
【００９３】
「抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性」および「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識して、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性の反応をいう。ＡＤＣＣを媒介するための開始細胞（ＮＫ細胞）は、ＦｃｙＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩおよびＦｃｙＲＩＩＩを発現する。要約した血球系細胞上のＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３である。目的分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ（例えば、米国特許第５，５００，３６２号、または同第５，８２１，３３７号に記載のアッセイ）を実施し得る。このようなアッセイについて有用なエフェクター細胞としては、末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて、インビボで評価され得る。
【００９４】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、そしてエフェクター機能を実施する白血球である。好ましくは、これら細胞は、少なくともＦｃＲＩＩＩを発現し、そしてＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。
【００９５】
用語「Ｆｃレセプター」または「ＦＣＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するために使用される。
【００９６】
好ましいＦｃＲは、天然の配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体を結合するＦｃＲ（γレセプター）であり、そしてＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩおよびＦｃｙＲＩＩＩのサブクラスのレセプターを含み、対立遺伝子改変体、およびこれらレセプターの選択的スプライシング形態を含む。ＦｃｙＲＩＩレセプターとしては、ＦｃｙＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃｙＲＩＩＢ（「阻害化レセプター」）が挙げられ、これらは、その細胞質ドメインにおいて主に異なる、類似したアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃｙＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫レセプターのチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害化レセプターＦｃｙＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫レセプターのチロシンベースの阻害化モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。（Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照のこと）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説される。他のＦｃＲは、将来的に同定されるものを含めて、本明細書中で、用語「ＦＣＲ」により包含される。この用語はまた、新生児のレセプターＦｃＲｎを含み、これは、胎児への母体ＩｇＧの移送を担う（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
【００９７】
「補体依存的細胞傷害性」または「ＣＤＣ」とは、補体存在下で標的を溶解する分子の能力をいう。補体活性化経路は、同種抗原と複合体化した分子（例えば、抗体））への、補体系の第１成分（Ｃｌｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されるようなアッセイ）を実施し得る。
【００９８】
「単離された」アンタゴニストとは、同定されており、そしてその天然の環境の成分から分離および／または回収されているアンタゴニストである。その天然の環境の異物混入成分とは、アンタゴニストのための診断的使用または治療的使用を妨害する物質であり、そしてこれら成分としては、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態において、このアンタゴニストは、（１）ローリー法によって決定される場合、アンタゴニストのうち９５重量％超まで、そして好ましくは９９重量％超までか、（２）スピニングカップシーケネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によってＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度までか、または（３）クマシーブルー染色または好ましくは銀染色を使用する、還元条件下もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる単一性を示すように、精製される。アンタゴニストの天然の環境の少なくとも１つの成分が存在することはないので、単離されたアンタゴニストは、組換え細胞内でインサイチュでのアンタゴニストを含む。しかし通常は、単離されたアンタゴニストは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００９９】
処置目的の「哺乳動物」とは、哺乳動物として分類される任意の動物をいい、ヒト、家畜および農業用動物、ならびに動物園の動物、競技用動物または愛玩動物（例えば、犬、馬、猫、牛など）が挙げられる。好ましくは哺乳動物はヒトである。
【０１００】
「処置」とは、治療処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）および予後または予防処置（ｍｅａｓｕｒｅ）の両方をいう。処置の必要な哺乳動物は、病気または障害をすでに有する哺乳動物、ならびにその病気または障害が予防されるべき哺乳動物を含む。従って、哺乳動物は、その病気もしくは障害を有すると診断され得たか、またはその病気に対して予め処置されるかもしくは感受性であり得る。
【０１０１】
表現「治療有効量」とは、特定の癌を予防、回復または処置するのに有効なアンタゴニストの量をいう。
【０１０２】
用語「細胞傷害性薬剤」とは、本明細書中で使用される場合、細胞機能を阻害もしくは妨害し、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｙ９０、Ａｒ２１１、Ｐ３２、Ｒｅ１８８、Ｒｅ１８６、Ｓｍ１５３、Ｂ２１２など）、化学療法剤、および毒物（例えば、細菌起源、真菌起源、植物起源もしくは動物起源の低分子毒物もしくは酵素的に活性な毒物、またはそれらのフラグメント）を含むことが意図される。
【０１０３】
「化学療法剤」とは、癌の処置に有用な化合物である。化学療法剤の例としては、以下が挙げられる：アルキル化剤（例えば、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）およびシクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ））；アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｎｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む）；窒素マスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、ミクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩化物、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｅｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）；抗生物質（例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシ（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルチノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｉｎｙｃｉｎ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オクソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エソルビシン、イダンビシン（ｉｄａｍｂｉｃｉｎ）、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン）；抗代謝物（例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート、テロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ）、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストロラクトン）；抗副腎剤（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）；葉酸補充剤（例えば、フロリン酸）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキセート；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｒｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬＯ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＷ、Ｒｈ６ｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ））；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカブトプリン；メトトレキセート；白金アナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン（ｎａｂｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；セローダ（ｘｅｒｏｄａ）；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ；インヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；ならびに上記の任意の薬学的に受容可能な塩、酸または誘導体。また、この定義においては、以下のような、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する、抗ホルモン剤も含まれる：例えば、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、４（５）−イミダゾールを阻害するアロマターゼ、４ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、オナプリストンおよびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）；ならびに抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）およびゴセレリン）；ならびに上記の任意の薬学的に受容可能な塩、酸または誘導体。
【０１０４】
用語「サイトカイン」とは、ある細胞集団によって放出され、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用するタンパク質についての一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカインおよび慣習的なポリペプチドホルモンである。このサイトカインの中には、以下も含まれる：成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニン化ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン）；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン（例えば、葉酸刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；ミュラー阻害物質；マウスゴナドトロピン結合ペプチド；インヒビン、アクチビン；血管内皮細胞増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経増殖因子（例えば、ＮＧＦ−β）；血小板増殖因子；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＦＧ−αおよびＴＧＦ−β）；インスリン様増殖因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球−ＣＳＦ（ＧＣＳＦ））；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５）；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β）；ならびにＬＩＦおよびキットリガンド（ｋｉｔ  ｌｉｇａｎｄ）（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子。本明細書中で使用される場合、用語サイトカインとは、天然供給源由来または組換え細胞培養物由来のタンパク質、および天然の配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【０１０５】
用語「プロドラッグ」とは、本出願中で使用される場合、その親薬物と比較して、腫瘍細胞に対してより細胞傷害性の少なく、そして酵素的に活性化されるか転換されてより活性な親形態になり得る、薬学的に活性な物質の前駆形態または誘導形態をいう。例えば、Ｗｉｈｎａｎ「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  １４、３７５−３８２頁、第６１５回  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）およびＳｔｅｌｌａら、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら編、２４７−２６７頁、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと。本発明のプロドラッグとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、（３−ラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、または必要に応じて置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ）、５フルオロシトシン、およびより活性な細胞傷害性のない薬物に転換され得る５−フルオロウリジンプロドラッグ。本発明の使用のためのプロドラッグ形態に誘導化され得る細胞傷害性プロドラッグの例としては、上記の化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。  
【０１０６】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質、および／または界面活性剤から構成される小胞である。これは、薬物（例えば、本明細書中に開示されるアンタゴニスト、および、必要に応じて、化学療法剤）の哺乳動物への送達に有用である。リポソームの成分は、生物学的な膜の脂質の配置と同様に、二重層の形成において普通に配置される。用語「パッケージ挿入物」は、治療生成物の市販パッケージに慣用的に包含される指示書をいうために使用され、このような指示書は、この治療生成物の使用に関する指示、用法、用量、投与方法、禁忌および／または警告についての情報を包含する。
【０１０７】
（アンタゴニストの産生）
本発明の製品の方法および物品は、Ｐ−カドヘリンアンタゴニストを使用するかまたは組込む。従って、このようなアンタゴニストを生成する方法は、本明細書中に記載される。アンタゴニストの生成またはアンタゴニストのスクリーニングのために使用されるＰ−カドヘリンは、例えば、所望のエピトープを含む抗原またはその一部の可溶性形態であり得る。あるいは、または、さらに、細胞表面上にＰ−カドヘリンを発現する細胞は、アンタゴニストを生成またはアンタゴニストをスクリーニングするために使用され得る。
【０１０８】
好ましいアンタゴニストが抗体である一方で、抗体以外のアンタゴニストが、本明細書中で企図される。例えば、アンタゴニストは、細胞傷害性剤（例えば、本明細書中に記載される細胞傷害性剤）と必要に応じて融合されるかまたは結合体化される低分子アンタゴニストを含み得る。低分子のライブラリーは、その抗原に結合する低分子を同定するために、Ｐ−カドヘリンまたはＰ−カドヘリン発現細胞に対してスクリーニングされる。低分子は、さらにアンタゴニスト特性についてスクリーニングされ得、そして／または細胞傷害性剤と結合体化され得る。
【０１０９】
特に、本発明は、Ｐ−カドヘリンタンパク質の特定の領域に結合する抗体を企図し、この抗体は、結合するタンパク質の部分に基づき、所望の特徴を保有する。この点について、ｐＣＤＨは、「古典的な」カドヘリンまたはＩ型カドヘリン（ＣＤＨ）であり、その接着特性にカルシウムを必要とする膜タンパク質である。カルシウムに加えて、カドヘリンは、隣接する細胞上の分子間で、トランスダイマーを形成する前に、同じ細胞上の分子間で、シスダイマーを形成する必要がある。
【０１１０】
代表的なＩ型カドヘリン細胞外ドメインの構造は、最近、Ｘ線結晶構造解析によって決定された。このＣ−ＣＤＨの新たな構造は、注目すべきである。なぜなら、これは、全ての機能性細胞外（ＥＣ）ドメインを含むからである。細胞外ドメインは、５個の反復ドメインから構成され、これらのドメインは、「ドメイン間」領域において結合される１２個のカルシウムイオンによって堅くされる。各ドメインは、以前のカドヘリンＥＣドメインフラグメントの構造において見られるような「ギリシャ鍵」構造を有する。ＥＣドメイン全体は、長く、湾曲した構造またはアーチ状（ａｒｃｅｄ）の構造であり、膜から遠位の第１のＥＣドメイン（ＥＣ１）を有する。（Ｇｕｍｂｉｎｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４８：３９９−４０３（２０００）；Ｂｏｇｇｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１３０８−１３１３（２００２）；およびＣｈａｐｐｕｉｓ−Ｆｌａｍｅｎｔら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１５４：２３１−２４３（２００１）（これらの全ては、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０１１１】
推定のトランスダイマー界面は、以前のＥＣドメインフラグメントの構造においてもまた見られる「鎖ダイマー」界面のように、ＥＣ１サブユニットのＴｒｐ２面の間で観察される。この「鎖ダイマー」は、対向する分子上の疎水性ポケットにＴｒｐ２が対称的に結合することによって特徴付けられる。
【０１１２】
推定のシスダイマー界面は、Ｔｒｐ２に対向するＥＣ１の面とＥＣ２の底またはＥＣ２のＣ末端側との間に観察される。このような相互作用は、分子から分子へと伸長し、平行なＥＣドメインのアレイを形成する。このアレイは、トランスダイマー結合に対して親和性効果を引き起こすことが期待される。
【０１１３】
Ｐ−カドヘリンは、Ｃ−カドヘリンと同じファミリーに存在するので、類似するドメイン構造を保有することが予想される。従って、本発明は、以下の結合特性の少なくとも１つを保有するＰ−カドヘリンに対する抗体を産生することを企図する。
【０１１４】
具体的には、ｐＣＤＨ接着活性を破壊または阻害する、抗体または他のアンタゴニスト分子は、以下を含むいくつかの方法において達成され得るがこれらに限定されない：
１．鎖ダイマー形成を干渉する抗体の産生。例えば、Ｐ−カドヘリンタンパク質におけるＴｒｐ２またはその近くの残基を含むエピトープに対して指向される抗体である、抗Ｐ−カドヘリン抗体が、産生され得る。
２．シスダイマー形成を干渉する抗体もまた、生成され得る。例は、Ｐ−カドヘリンタンパク質におけるＥＣ２のＣ末端表面およびＥＣ１のＴｒｐ２遠位表面に対して指向される抗体である。
３．カルシウム結合を干渉する抗体もまた、生成され得る。ドメイン間領域に対する抗体は、潜在的にこの活性を保有する。
４．全体構造を干渉する抗体が、なおさらに生成され得、その結果、関連するドメインは、適切に配列され得ない。このために、抗体は、ＥＣドメイン中の種々の領域のいずれに対しても潜在的に指向され得る。
【０１１５】
１つ以上の前述の特徴を有する抗体は、これらの部分の少なくとも一部を保有するＰ−カドヘリンに対する、抗Ｐ−カドヘリンモノクローナル抗体の集団をスクリーニングすることによって同定され得る。
【０１１６】
アンタゴニストはまた、合理的な設計によってかまたはファージディスプレイによって、生成されるペプチドであり得る（例えば、１９９８年８月１３日に公開されたＷＯ９８／３５０３６号を参照のこと）。１つの実施形態において、分子の選択は、抗体のＣＤＲに基づいて設計された「ＣＤＲ模倣物」または抗体アナログであり得る。このようなペプチドがそれ自体でアンタゴニスト性であり得る一方で、ペプチドは、このペプチドのアンダゴニスト特性を追加するかまたは増強するように、必要に応じて、細胞傷害性剤に融合され得る。さらに、アンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムであり得る。
【０１１７】
本明細書は、本発明に従って使用される抗体アンタゴニストの産生のための例示的な技術に関して、後に続く。
【０１１８】
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）注射、腹腔内（ｉｐ）注射または筋内（ｉｍ）注射により、動物で惹起される。関連する抗原を、二官能性薬剤または誘導体化剤（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合される）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣ１２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここで、ＲおよびＲＩは、異なるアルキル基である））を使用して、免疫される種において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシンインヒビター）に結合することは有用であり得る。例えば、１００ｐｇまたは５ｗｇのタンパク質または結合体（それぞれ、ウサギまたはマウスに対して）を３倍体積のフロイント完全アジュバントと合わせること、および複数の部位でこの溶液を経皮注射することにより、動物を、抗原、免疫原性結合体または誘導体に対して免疫する。１ヵ月後、動物は、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたは結合体の最初の量の５分の１から１０分の１で、複数の部位での皮下注射によって、ブーストされる。７〜１４日後、動物は採血され、血清が抗体力価についてアッセイされる。動物は、力価がプラトーに達するまでブーストされた。好ましくは、動物は、同じ抗原であるが異なるタンパク質に結合体化され、そして／または異なる架橋試薬で結合体された、結合体でブーストされる。結合体はまた、タンパク質融合体のように、組換え細胞の培養物中で、作製され得る。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を強化するために、適切に使用される。
【０１１９】
（モノクローナル抗体）
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る、天然に存在し得る変異を除いて同一である）から得られる。従って、修飾語「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではないという、抗体の特徴を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。
【０１２０】
ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、ウサギまたはハムスター）が、本明細書中上記に記載されるように免疫され、免疫に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。次いで、リンパ球は、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５９頁〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）］。
【０１２１】
次いで、調製されたハイブリドーマ細胞は、適切な培養培地中で播種され、増殖させられる。この培養培地は、好ましくは、融合されない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損する場合、ハイブリドーマについての培養培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻害する。
【０１２２】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を維持する細胞であり、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性である。これらのうち、好ましいミエローマ細胞株は、マウスミエローマ株（例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１マウス腫瘍およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来のマウスミエローマ株ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞）である。ヒトミエローマ細胞株およびマウスヒトへテロミエローマ細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている［Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１頁〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）］
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、必須の特異性を有するモノクローナル抗体の産生について、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）のようなインビトロ結合アッセイによって、アッセイされる。抗体を発現する細胞の位置は、ＦＡＣＳによって検出され得る。その後、ハイブリドーマクローンは、限界希釈手順によってサブクローニングされ得、そして標準の方法によって増殖され得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）５９頁〜１０３頁）。この目的のための適切な培養培地としては、例えば、ＤＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍として、インビボで増殖され得る。
【０１２３】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロースクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィー）によって培養培地、腹水流体、または血清から適切に分離される。
【０１２４】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。一旦、単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いで、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を他に産生しないミエローマ細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡの、細菌における組換え発現についての総説としては、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）およびＰｈｉｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１−１８８（１９９２）が挙げられる。
【０１２５】
さらなる実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）は、ファージライブラリーを使用して、それぞれマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載する。その後の刊行物は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））ならびに巨大なファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））を記載する。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実現可能な代替である。
【０１２６】
ＤＮＡはまた、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインに対するコード配列を使用すること（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））によって、または非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全部もしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって、改変され得る。代表的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換されるか、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換され、１つの抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を包含する、キメラの二価抗体を生成する。
【０１２７】
さらに、Ｐ−カドヘリンに対する組換え抗体は、トランスジェニック動物（例えば、種々の特許に記載され、それらの多くが、ＡｂｇｅｎｉｘおよびＭｅｄａｒｅｘと指定された動物）において産生され得る。例えば、組換え抗体は、トランスジェニック動物（例えば、米国特許第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、同第５，８１４，３１８号、同第５，７８９，６５０号、同第５，７７０，４２９号、同第５，６６１，０１６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５４５，８０６号、同第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１３０，３６４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０９１，００１号、同第５，９３９，５９８号のいずれかに開示される齧歯類）において発現され得る。あるいは、組換え抗体は、米国特許第５，８４９，９９２号または同第５，８２７，６９０号（参考として本明細書中に援用される）に考察されるような、Ｐｆａｒｍｉｎと指定されるトランスジェニック動物の乳汁中に発現され得る。
【０１２８】
（ヒト化抗体）
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来の抗体に導入された１種以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」残基と呼ばれ、これは、代表的に、「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよびその協同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈａｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、超可変領域の配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって実施され得る。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、ここで、実質的により少ないインタクトなヒト可変ドメインは、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は、代表的に、ヒト抗体であり、ここで、いくつかの超可変領域の残基および潜在的にいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体におけるアナログ部位由来の残基によって置換される。
【０１２９】
ヒト化抗体を作製するために使用される、ヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を減少するために非常に重要である。いわゆる「最適」方法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。従って、齧歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、全てのヒト抗体における特定のサブグループの軽鎖または重鎖のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同一のフレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体について使用され得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１３０】
抗体が、抗原に対する高親和性の遅延時間および他の有利な生物学的特徴でヒト化されていることは、さらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用して、親配列および種々の概念的なヒト化生成物の分析プロセスによって、調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な３次元コンフォメーション構造を図示および表示するコンピュータープログラムが、入手可能である。これらの表示を検査することによって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析（すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に影響する残基の分析）を可能にする。この方法によって、ＦＲ残基は、レシピエント配列および移入配列から選択され得、そして組み合わされ得、その結果、所望の抗体特性（例えば、標的抗原に対する増加した親和性）が達成される。一般的に、超可変領域残基は、抗原結合の作用に直接的かつほとんど実質的に関係する。
【０１３１】
（ヒト抗体）
ヒト化の代わりとして、ヒト抗体が、産生され得る。上に記載されるように、抗体（特に、トランスジェニック動物におけるヒト抗体）の産生は、公知である。例えば、免疫の際に、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の全レパートリーを産生することが可能であるトランスジェニック動物（例えば、マウス）が、産生され得る。例えば、キメラマウスおよび生殖細胞系列変異型マウスにおいて、抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子の同型接合欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されている。このような生殖細胞系列変異型マウスへのヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動は、抗原チャレンジの際に、ヒト抗体の産生を生じる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｍａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号および同第５，５４５，８０７号を参照のこと。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）は、非免疫ドナーに由来する免疫グロブリン可変領域（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからのヒト抗体およびヒト抗体フラグメントを、インビトロで産生するために使用され得る。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３またはｆｄ）の主要なコートタンパク質遺伝子または少数のコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上の機能的抗体フラグメントとして提示される。繊維状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能特性に基づいた選択はまた、これらの特徴を示す抗体をコードする遺伝子の選択を生じる。次いで、このファージは、Ｂ細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式において実施され得る；これらの概説としては、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源は、フェージディスプレイに使用される。Ｃｌａｃｋｓｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫されたマウスの脾臓由来のＶ遺伝子の小ランダムコンビナトリアルライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の種々のアレイを単離した。非免疫ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーが構築され、種々のアレイ抗原に対する抗体（自己抗原を含む）は、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載される技術に本質的に従って、単離され得る。米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号もまた参照のこと。ヒト抗体はまた、インビトロで活性化されたＢ細胞によって産生され得る（米国特��第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照のこと）。
【０１３２】
（抗体フラグメント）
種々の技術は、抗体フラグメントの産生のために開発されてきた。伝統的に、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解によって誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントは、現在、組換え宿主細胞によって直接産生され得る。例えば、抗体フラグメントは、上記に考察される抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成するために化学的に結合され得る［Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）］。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体フラグメント生成のための他の技術は、当業者に明らかである。他の実施形態において、抗体の選択は、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；および同第５，５８７，４５８号を参照のこと。抗体フラグメントはまた、「直鎖抗体」（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような）であり得る。このような直鎖抗体フラグメントは、一重特異的（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）であっても二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）であってもよい。
【０１３３】
（二重特異的抗体）
二重特異的抗体を作製するための方法は、当該分野で公知である。全長二重特異的抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、ここでこれらの２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖のランダムな分類に起因して、これらのハイブリドーマ（クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ））は、１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、これらのうちの１つのみが、正しい二重特異性構造を有する。通常アフィニティクロマトグラフィー工程によって実施される正しい分子の精製は、厄介であり、生成物の収率は低い。類似する手順は、ＷＯ９３／０８８２９号およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示される。
【０１３４】
異なるアプローチに従って、所望の結合特性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体の可変ドメインは、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合される。ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖の定常ドメインとの融合が、好ましい。少なくとも１つの融合物中に存在する軽鎖の結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨＩ）を有することが好ましい。免疫グロブリンの重鎖融合物および所望である場合、免疫グロブリンの軽鎖をコードするＤＮＡは、別の発現ベクターへと挿入され、そして適切な宿主生物体へと共トランスフェクトされる。これは、構成に使用される３つのポリペプチド鎖の不等な割合が、最適な収率を提供する実施形態において、３つのポリペプチドのフラグメントの相互の比率の修正において多大な可動性を提供する。しかし、等しい割合で少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が、高い収率を生じる場合、または割合が特に重要でない場合、１つの発現ベクター中に２つまたは全３つのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【０１３５】
このアプローチの好ましい実施形態において、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、１つのアームに第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖および他のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）で構成される。二重特異性分子の２分の１のみでの免疫グロブリン軽鎖の存在が、分離の容易な方法を提供するので、この非対称な構造が、所望されない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を促進することが見出された。このアプローチは、ＷＯ  ９４／０４６９０に開示される。二重特異性抗体を産生するさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１３６】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載される別のアプローチに従って、抗体分子対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大にするために操作され得る。好ましい界面は、抗体の定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面由来の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、大きな側鎖（たとえば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖に対する同一または類似の大きさの代償性の「腔」は、より小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で大きなアミノ酸側鎖を置換することによって第２の抗体分子の界面上に作製される。これは、ホモダイマーのような他の所望でない最終生成物を超えて上でのヘテロダイマーの収率を増加するための機構を提供する。
【０１３７】
二重特異性抗体は、架橋抗体または「ヘテロ結合体」抗体を含む。例えば、ヘテロ結合体における１つの抗体は、アビジンに結合し得、他方はビオチンに結合し得る。このような抗体は、例えば、所望でない細胞に免疫系細胞を標的化するため（米国特許第４，６７６，９８０号）およびＨＩＶ感染の処置のため（ＷＯ  ９１／００３６０、ＷＯ  ９２／２００３７３およびＥＰ  ０３０８９）に提案される。ヘテロ結合体抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋薬剤は、当該分野で周知であり、そして多数の架橋技術と共に、米国特許第４，６７６，９８０号に開示される。
【０１３８】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を産生する技術はまた、文献に記載される。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がＦ（ａｂ’）２フラグメントを産生するためにタンパク分解性に切断される手順を記載する。これらのフラグメントは、ビシナルジチオールを安定化しそして分子間ジスルフィド形態を防止するためにジチオール錯化剤（亜ヒ酸ナトリウム）の存在下で、還元される。産生されたＦａｂ’フラグメントは、次いで、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、次いでメルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そして当量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合され、二重特異性抗体を形成する。産生されたこの二重特異性抗体は、酵素の選択的な固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１３９】
最近の進歩は、Ｅ．ｃｏｌｉからのＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接的な回収を容易にし、このＦａｂ’−ＳＨフラグメントは、化学的に結合し得、二重特異性抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載する。各々のＦａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別個に分泌され、そして直接的にインビトロでの化学的カップリングに供され、二重特異性抗体を形成する。このように、形成されたこの二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒトの胸部腫瘍の標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発し得る。
【０１４０】
組換え細胞培養物から直接的に二重特異性抗体フラグメントを作製し、そして単離するための種々の技術はまた、記載される。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して生成される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３  （１９９２）。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。この抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されモノマーを形成し、次いで再酸化され、抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた、抗体ホモダイマーを生成するために利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載された「ディアボディー」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替の機構を提供する。フラグメントは、同じ鎖で２つのドメインの間で対形成を可能にするには短いリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【０１４１】
従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対形成するように強いられ、それによって、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製する別のストラテジーはまた、報告される。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。２より大きい結合価を有する抗体が、意図される。例えば、三重特異性（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、調製され得る。Ｔｕｔｔら  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１４２】
（アンタゴニストの結合体化および他の改変）
本明細書中の方法に使用されるアンタゴニストまたは本明細書中の製品に含まれるアンタゴニストは、細胞傷害性薬剤または治療剤に必要に応じて結合体化される。例としては、上記の化学療法剤が挙げられる。好ましい、このような化学治療剤は、特定の癌の処置において確立された効力を有する。
【０１４３】
アンタゴニストおよび１つ以上の低分子毒素（例えば、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、マイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）およびＣＣ１０６５）の結合体はまた、本明細書中で考えられる。本発明の１つの実施形態において、アンタゴニストは、１つ以上のマイタンシン分子に結合体化される（例えば、約１〜約１０のマイタンシン分子／アンタゴニスト分子）。マイタンシンは、例えば、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換され得、これは、Ｍａｙ−ＳＨ３に還元され得、そして改変された、アンタゴニストと反応され得（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２））、マイタンノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）−アンタゴニスト結合体を生産する。
【０１４４】
あるいは、アンタゴニストは、１つ以上のカリケアマイシン分子に結合体化される。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ｐＭ以下の濃度で二本鎖ＤＮＡの崩壊を生産し得る。カリケアマイシンの構造アナログはまた、公知である（Ｈｉｎｍａｎら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）およびＬｏｄｅら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８））。
【０１４５】
使用され得る酵素活性毒素およびそのフラグメントは、以下が挙げられる：酵素学的に活性なトキシンおよびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカカランチアインヒビター、カルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリスインヒビター、ゲロニン、ミトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが挙げられ得る。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ  ９３／２１２３２を参照のこと。
【０１４６】
本発明は、核溶解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を有する化合物と結合体化されるアンタゴニストをさらに意図する（例えば、リボヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）のようなＤＮＡエンドヌクレアーゼ）。種々の放射活性の同位体は、放射結合体化（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）アンタゴニストの生産のために使用可能である。例としては、Ｙ９０、Ａｔ２１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射活性同位体が挙げられる。アンタゴニストおよび細胞傷害性薬剤の結合体は、種々の二機能性タンパク質カップリング試薬（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−Ｉ−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（ａｉｄｅｈｙｄｅ）（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリレン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製され得る。炭素−１４で標識された１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種をアンタゴニストに結合体化するための例示的なキレート剤である。ＷＯ  ９４／１１０２６を参照のこと。リンカーは、細胞中の細胞傷害生薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２））が使用され得る。あるいは、アンタゴニストおよび細胞傷害性薬剤を含む融合タンパク質は、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作製され得る。
【０１４７】
なお別の実施形態において、アンタゴニストは、腫瘍を予め標的化するのに利用するための（ストレプトアビジンのような）「レセプター」に結合体化され得、ここで、アンタゴニストレセプター結合体は、患者に投与され、除去試薬を使用して、未結合の結合体を循環から除去し、次いで、細胞傷害剤（例えば、放射性核種）に結合体化される「リガンド」（例えば、アビジン）の投与が続く。本発明のアンタゴニストはまた、活性抗癌薬物にプロドラッグを変換するプロドラッグ活性化酵素と結合体化され得る（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ  ８１／０１１４５を参照のこと）。例えば、ＷＯ  ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。
【０１４８】
このような結合体の酵素成分は、そのより活性な細胞傷害性形態へとプロドラッグを変換するような方法でプロドラッグに作用し得る任意の酵素を含む。本発明の方法において有用であるとして酵素は、限定されないが、フリー薬物へとリン酸塩含有プロドラッグを変換するために有用なアルカリホスホターゼ；フリー薬物へと硫酸塩含有プロドラッグを変換するために有用なアリールスルファターゼ；抗癌薬物である５−フルオロウラシルへと非毒性５−フルオロシトシンを変換するために有用なシトシンデアミナーゼ、；プロテアーゼ（例えば、セラチアプロテアーゼ、セルモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカセプシン（例えば、カセプシンＢおよびカセプシンＬ））（これはフリー薬物へとペプチド含有プロドラッグを変換するのに有用である）；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；フリー薬物へとグリコシル化プロドラッグを変換するのに有用な炭水化物切断酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼおよびノイラミンダーゼ）；フリーな薬物へと（３−ラクタムで誘導体化された薬物を変換するのに有用な（３−ラクタマーゼ；およびフリーな薬物へと、それぞれ、フェノキシアセチルまたはフェニルシアセチル基でそれらのアミン窒素で誘導体化された薬物を変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ（例えば、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼ）が挙げられる。あるいは、当該分野で「アブザイム」としてもまた公知である酵素活性を有する抗体は、フリーな活性薬物へと本発明のプロドラッグを変換するために使用され得る（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照のこと）。アンタゴニスト−アブザイム結合体は、腫瘍細胞集団へのアブザイムの送達について本明細書中に記載されるように調製され得る。
【０１４９】
酵素は、上記で議論されるヘテロ二機能性架橋試薬の使用のような当該分野で周知の技術によって、Ｐ−カドヘリンアンタゴニストに共有結合され得る。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能活性の部分に結合された、本発明のアンタゴニストの少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る［例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照のこと］。
【０１５０】
アンタゴニストの他の改変は、本明細書中で意図される。例えば、アンタゴニストは、種々の非タンパク質の（ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ）ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレンまたはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー）の１つに結合され得る。本明細書中で開示されるアンタゴニストはまた、リポソームとして処方され得る。アンタゴニストを含むリポソームは、当該分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｍａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびに１９７７年１０月２３日に公開されたＷＯ  ９７／３８７３１に記載されるような方法）によって調製される。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６に開示される。
【０１５１】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる、逆相エバポレーション方法によって産生され得る。リポソームは、規定された細孔サイズのフィルターを介して押し出され、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合体化され得る。化学療法剤は、必要に応じて、リポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと。本明細書中に記載されるタンパク質アンタゴニストまたはペプチドアンタゴニストのアミノ酸配列の改変は、意図される。例えば、アンタゴニストの結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが所望され得る。
【０１５２】
アンタゴニストのアミノ酸配列改変体は、アンタゴニストの核酸への適切なヌクレオチド変化を導入することによってか、またはペプチド合成によって調製される。このような改変は、例えば、アンタゴニストのアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または残基への挿入ならびに／または残基の置換を含む。欠失、挿入および置換の任意の組み合わせによって、公式の構築物に達成される。ただし、最終的な構築物は、所望される特性を有する。アミノ酸の変化はまた、アンタゴニストの翻訳後プロセスを変更し得る（例えば、グリコシル化部位の数または部分の変化）。
【０１５３】
変異の好ましい位置であるアンタゴニストの特定の残基または領域を同定する有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）に記載されるように「アラニンスキャンニング（ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基または基は、同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕのような荷電した残基）、そして中性のアミノ酸または負に荷電されたアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置き換えられ、抗原とのアミノ酸の相互作用に影響する。次いで、置換に機能的な感受性を示すアミノ酸の位置は、さらなる改変体または他の改変体の置換の部位でのまたは置換の部位に対しての導入によって精製される。従って、アミノ酸配列の変化を導入する部位は、予め決定されるが、変異の性質自体は、予め決定される必要はない。例えば、所定の部位での変異の実行を分析するために、アラニンスキャンニング（ａｌａ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）またはランダム変異は、標的コドンまたは領域で実施され、そして発現されたアンタゴニスト改変体は、所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１５４】
アミノ酸配列の挿入は、１つの残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さにおよぶアミノ末端融合および／またはカルボキシ末端融合、および単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有するアンタゴニストまたは細胞傷害性ポリペプチドに融合されたアンタゴニストが挙げられる。アンタゴニスト分子の他の挿入性の改変体は、酵素のアンタゴニストのＮ末端またはＣ末端、またはアンタゴニストの血清半減期を増加するポリペプチドへの融合を含む。
【０１５５】
改変体の別の型は、アミノ酸置換改変体である。これらの改変体は、アンタゴニスト分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる残基によって置き換えられている。抗体アンタゴニストの置換的変異のための最も目的となる部位は、超可変領域を含むが、ＦＲの変化はまた、意図される。
【０１５６】
アンタゴニストの生物学的特性における実質的な改変は、（ｉ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたはヘリックスコンフォメーション、（ｉｉ）標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは（ｉｉｉ）側鎖の大きさ、を維持することにおける、置換の効果において有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいて群に分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１５７】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを意味する。保存的置換は、同じクラス内のアミノ酸の交換に関する。
【０１５８】
アンタゴニストの適切なコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基はまた、分子の酸化的な安定性を改善し、そして異常な架橋を防止するために、一般的にセリンで置換され得る。逆に、システイン結合は、その安定性を改善するために、（特に、アンタゴニストが、Ｆｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）アンタゴニストに付加され得る。
【０１５９】
置換の改変の特に好ましい型は、親抗体の１つ以上の超可変領域の残基を置換する工程を包含する。一般的に、さらに開発されるために選択される、得られた改変体は、改変体が生産される親抗体に対して改善された生物学的特性を有する。このような置換改変体を生産するための簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性の変異である。手短に言えば、様々な超可変領域部位（例えば、６〜７の部位）は、各々の部位で全ての可能なアミノ置換を生産するために変異される。このように、生産された抗体の改変体は、各々の粒子内でパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合として、糸上のファージ粒子から一価の様式で表示される。ファージディスプレイ改変体は、次いで、本明細書中に開示されるようにそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング変異誘発は、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定するために行なわれ得る。あるいは、またはさらに、抗体と抗原との間の結合点を同定するための、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することは有益であり得る。このような結合残基および隣接する残基は、本明細書中に述べられた技術に従う置換の候補である。一旦このような改変体が生産されると、改変体のパネルは、本明細書中に記載されるようなスクリーニングに供され、そして１つ以上の関連アッセイにおける優れた特性を有する抗体は、さらに開発されるために選択され得る。
【０１６０】
アンタゴニストのアミノ酸改変体の別の型は、アンタゴニストの元のグリコシル化パターンを変更する。変更は、アンタゴニスト中で見出された１つ以上の炭水化物部分を除去すること、および／またはアンタゴニスト中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０１６１】
ポリペプチドのグリコシル化は、代表的に、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合をいう。トリペプチド配列（アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン、ここでＸは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的な結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作製する。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸（５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンはまた、使用され得るが、最も一般的にセリンまたはスレオニン）への糖のＮ−アセチルガラクトサミン（ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトースまたはキシロースの１つの結合をいう。アンタゴニストへのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合グリコシル化部位に対して）１つ以上の上記のトリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に達成される。改変はまた、（Ｏ結合グリコシル化部位に対して）元のアンタゴニストの配列への１つ以上のセリン残基またはスレオニン残基の付加または置換によってなされ得る。
【０１６２】
アンタゴニストのアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、限定されないが、以下が挙げられる：天然供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列改変体の場合）または初期に調製されたアンタゴニストの改変体バージョンまたは非改変バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、およびカセット式変異誘発による調節。
【０１６３】
（例えば、アンタゴニストの抗原依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強するように）エフェクター機能について本発明のアンタゴニストを改変することが所望され得る。これは、抗体アンタゴニストのＦｃ領域中に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成され得る。あるいは、またはさらに、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、これにより、この領域における鎖間のジスルフィド結合の形成を可能にする。このように、産生されるホモダイマー抗体は、改善された内部移行能力ならびに／あるいは増加された相補体媒介細胞殺傷および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体がまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるようなヘテロ二機能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｅｔｉｏｎａｌ）架橋を用いて調製され得る。あるいは、抗体は、二重Ｆｃ領域を有し、これにより、増強された相補的溶解性およびＡＤＣＣ能力を有し得るように操作され得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１６４】
アンタゴニストの血清中半減期を増強するために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載のように、サルベージレセプター結合エピトープがアンタゴニスト（特に、抗体フラグメント）に組み込まれ得る。本明細書に使用される場合、用語「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清中半減期を増強する役目を果すＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープをいう。
【０１６５】
本発明はまた、所望の治療特性または診断特性を有する抗Ｐ−カドヘリン抗体を同定するスクリーニングを含む。特に、本発明は、他のカドヘリン（例えば、Ｅ−カドヘリン、Ｃ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、またはＨ−カドヘリン）より大きな相対的親和性（例えば、Ｅ−カドヘリンまたはＰ−カドヘリン以外の別のカドヘリンに比べ、５／１、１０／１、１５／１、２０／１、５０／１、１００／１またはそれよりも大きな親和性）でＰ−カドヘリンと結合する抗体を同定するスクリーニングを含む。他のスクリーニングとして、トランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウスおよび他のげっ歯動物）における、腫瘍細胞の増殖および／または接着、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性に影響を及ぼす、抗Ｐ−カドヘリン抗体を同定するアッセイ、抗アポトーシスアッセイ、細胞周期チェックポイントアッセイ、およびインビボアッセイが挙げられる。また、本発明によって、前出のタンパク質の所望な部分と結合し、所望の特性（例えば、カルシウム結合をブロックする、ダイマー形成をブロックする、鎖形成をブロックする、および／またはＰ−カドヘリンドメインアラインメントを妨害する）を保持する抗体を同定するスクリーニングが検討される。Ｐ−カドヘリンタンパク質またはフラグメントに対し提供された抗体の集団において、このような抗体が同定され得る。
【０１６６】
（ポリヌクレオチド構築物）
Ｐ−カドヘリンまたはフラグメントあるいは抗体のようなＰ−カドヘリンアンタゴニストをコードする、ポリヌクレオチド分子が、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物のようなポリヌクレオチド構築物に挿入され得る。本発明のポリヌクレオチド分子は、例えば、宿主細胞での、全てまたは一部のタンパク質、改変体、融合タンパク質、または単鎖抗体を発現するための発現構築物において使用され得る。発現構築物は、選択された宿主細胞において機能的であるプロモーターを含む。当業者は、当該分野で公知であり使用されている細胞型特異性である多数のプロモーターから適切なプロモーターを容易に選択し得る。発現構築物はまた、宿主細胞において機能的である転写ターミネーターを含み得る。発現構築物は、所望なタンパク質を全部または一部コードするポリヌクレオチドセグメントを含む。ポリヌクレオチドセグメントは、プロモーターの下流に位置する。ポリヌクレオチドセグメントの転写はプロモータで開始する。発現構築物は、直線状または環状であり得、所望される場合、自律複製についての配列を含み得る。
【０１６７】
（宿主細胞）
Ｐ−カドヘリンまたはＰ−カドヘリンアンタゴニストをコードする発現構築物は、宿主細胞に導入され得る。発現構築物を含む宿主細胞は、任意の適切な原核細胞または真核細胞でもあり得る。細菌中の発現系として、以下に記載される発現システムが挙げられる；Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４（１９７９）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）；ＥＰ  ３６，７７６；米国特許第４，５５１，４３３号；ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５（１９８３）；およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ  ２０：２６９（１９８０）。
【０１６８】
酵母中の発現系として、以下に記載される発現システムが挙げられる；Ｈｉｎｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９（１９７８）；Ｉｔｏら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １５３：１６３（１９８３）；Ｋｕｒｔｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２（１９８６）；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１（１９８５）；Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９（１９８６）、Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２（１９８６）；Ｄａｓら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５（１９８４）；Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７（１９８３）、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５（１９９０）；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１（１９８５）；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６（１９８５）；米国特許第４，８３７，１４８号；米国特許第４，９２９，５５５号；ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７０６（１９８１）；Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０（１９８５）；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９（１９８５）；Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２：２８４−２８９（１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ  ２６：２０５−２２（１９８３）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４（１９８４）；ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：４７５４７９（１９８５）；ＥＰ  ２４４，２３４；およびＷＯ  ９１／００３５７。
【０１６９】
昆虫における異種遺伝子の発現は、以下に記載されるように達成され得る；米国特許第４，７４５，０５１号；Ｆｒｉｅｓｅｎら（１９８６）ＴＨＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＳ（Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ（編））の「Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」；ＥＰ  １２７，８３９；ＥＰ  １５５，４７６；Ｖｌａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５−７７６（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７（１９８８）；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｇｅｎｅ  ７３：４０９（１９８８）；Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２−５９４（１９８５）；Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９（１９８８）；Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８４０４（１９８５）；Ｍｉｙａｊｉｍａら、Ｇｅｎｅ  ５８：２７３（１９８７）；およびＭａｒｉｎら、ＤＮＡ  ７：９９（１９８８）。宿主由来の多数のバキュロウイルス株ならびに改変体および対応する許容範囲の昆虫宿主細胞が以下に記載される；Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：４７−５５、Ｍｉｌｌｅｒら、ＧＥＮＥＴＩＣ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ら（編））、第８版、ｐｐ．２７７−２７９（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８６）；およびＭａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３１５：５９２−５９４（１９８５）。
【０１７０】
哺乳動物中の発現が、以下に記載されるように達成され得る；Ｄｉｊｉｋｅｍａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１（１９８５）；Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７（１９８２ｂ）；Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ  ４１：５２１（１９８５）；および米国特許第４，３９９，２１６号。哺乳動物の発現の他の特性が、以下に記載されるように容易にされ得る；ＨａｍおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）；ＢａｒｎｅｒｓおよびＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）；米国特許第４，７６７，７０４号；米国特許第４，６５７，８６６号；米国特許第４，９２７，７６２号；米国特許第４，５６０，６５５号；ＷＯ  ９０／１０３４３０、ＷＯ  ８７／００１９５およびＵ．Ｓ．ＲＥ３０，９８５。
【０１７１】
発現構築物が、当該分野にて公知の任意の技術を使用して宿主細胞に導入され得る。これらの技術として、トランスフェリン−ポリカチオン媒介ＤＮＡ転移、裸の核酸および被包性核酸でのトランスフェクト、リポソーム媒介細胞融合、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、原形質融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」、およびリン酸カルシウム媒介トランスフェクトが挙げられる。
【０１７２】
（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
特定の状況において、発現されるＰ−カドヘリンの量を調節または低減することが所望され得る。従って、本発明の別の局面において、Ｐ−カドヘリン抗アンチセンスオリゴヌクレオチド、および１つ以上のＰ−カドヘリンアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、細胞よるＰ−カドヘリンの発現レベルを低減するために使用される方法が完成され得る。Ｐ−カドヘリンアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｐ−カドヘリンの発現が低減されるように、Ｐ−カドヘリンの発現に関与する特定の相補的な核酸配列での塩基対形成を介して、相互作用するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをいう。好ましくは、Ｐ−カドヘリンの発現に関与する特定の核酸配列は、Ｐ−カドヘリンをコードするゲノムＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子である。このゲノムＤＮＡ分子は、Ｐ−カドヘリン遺伝子の調節領域または、成熟Ｐ−カドヘリンタンパク質のコード配列を含み得る。
【０１７３】
Ｐ−カドヘリンアンチセンスヌクレオチドおよびそれについての方法について、用語「ヌクレオチド配列に相補的な」は、細胞中で（すなわち、生理的条件下で）ヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションを可能にするように、十分相補的であることを意味する。Ｐ−カドヘリンアンチセンスヌクレオチドは、好ましくは、約８〜約１００個のヌクレオチドを含み、より好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１５〜約３０個のヌクレオチドを含む。Ｐ−カドヘリンアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、核酸分解に対する耐性を与える様々な改変を含み得る。その改変の例として、改変ヌクレオシド間結合（ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３−５４８（１９９０）；ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＢａｎｎｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１：３３５（１９９０）（これらは、参考として援用される））、改変核酸塩基（５，９５８，７７３および本明細書中で開示される特許で開示される）、および／または糖などが挙げられる。
【０１７４】
当該分野で公知のアンチセンス分子のいかなる改変または変異も、本発明の範囲内に含まれる。このような改変として、米国特許第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号、同第５，６２５，０５０号および同第５，９５８，７７３号に開示される、リン含有結合の調製が挙げられる。
【０１７５】
本発明のアンチセンス化合物として、改変塩基が挙げられ得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分散、または細胞取り込みを高めるため、オリゴヌクレオチドと１つ以上の部分または結合体を化学的に結合させることによって改変され得る。このような部分または結合体として、コレステロールのような脂質、コール酸、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチル部分、および例えば、米国特許第５，５１４，７５８号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９７，６９６号、および同第５，９５８，７７３号に開示される他のものが挙げられる。
【０１７６】
キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、本発明の範囲内であり、例えば米国特許第５，０１３，８３０号、同第５，１４９，７９７号、同第５，４０３，７１１号、同第５，４９１，１３３号、同第５，５６５，３５０号、同第５，６５２，３５５号、同第５，７００，９２２号、および同第５，９５８，７７３号に記載の方法を用いて、本発明のオリゴヌクレオチドから調製され得る。
【０１７７】
アンチセンスの分野において、特定の標的に対する最適のアンチセンス分子を選択するために、ある程度の慣習的な実験が必要とされる。好ましくは、標的ＲＮＡ分子のアクセス可能で露出した部分に対し、アンチセンス分子が標的化される。いくつかの事例において、標的ｍＲＮＡ分子の構造についての情報が入手可能であるが、アンチセンスを用いての阻害する現在のアプローチは、実験を介するものである。細胞中のｍＲＮＡレベルは、処理された細胞およびコントロール細胞で、ｍＲＮＡの逆転写によってｃＤＮＡレベルをアッセイして、慣用的に測定され得る。当該分野で周知のように、細胞増殖または生存度を測定することによって、生物学的作用が慣用的に決定され得る。
【０１７８】
ｃＤＮＡレベルをアッセイおよび分析することによって、アンチセンス活性の特異性を測定することは、アンチセンスの結果を確証する、当該分野で認知された方法である。処置された細胞およびコントロール細胞由来のＲＮＡが逆転写されるべきで、得られるｃＤＮＡ集団が分析されることが提案されてきた。（Ｂｒａｎｃｈ、Ａ．Ｄ．、Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．２３：４５−５０（１９９８））。
【０１７９】
（リボザイム）
本発明はさらに、Ｐ−カドヘリン発現を阻害するリボザイムの合成を含む。リボザイムは、相補的な領域を有する一本鎖核酸をクリアし得るリボ核酸の活性を有する触媒ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイム）は、触媒的にＰ−カドヘリン転写をクリアし、それによってＰ−カドヘリンｍＲＮＡの転写を阻害するために使用され得る。Ｐ−カドヘリン対し特異的であるリボザイムは、Ｐ−カドヘリンのヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に与えられたヒトＰ−カドヘリンＤＮＡ配列）に基づいて設計され得る。リボザイムを合成する技術は、参考として援用されるＣｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号および同第５，１１６，７４２号に記載される。あるいは、Ｐ−カドヘリンｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプール由来の特定のリボ核酸の活性を有する触媒ＲＮＡを選択するために使用され得る。（ＢａｒｔｅｌおよびＳｔｏｓｔａｋ、Ｊ．Ｗ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１２６１：１４１１−１４１８（１９９３）を参照のこと）。
【０１８０】
あるいは、Ｐ−カドヘリンの調節領域（プロモーター、エンハンサー）に相補的であるヌクレオチド配列を標的化することによって、標的細胞中の転写を阻止する三重らせん状構造を形成し、Ｐ−カドヘリンの発現が阻害され得る。（Ｈｅｌｅｎｅら、Ａｎｎａｌ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６（１９９２））。
【０１８１】
（薬学的処方物）
所望の純度を有するアンタゴニストと任意の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）（１９８０））とを混合することよって、本発明に従うＰ−カドヘリンアンタゴニストの治療的処方物が、凍結乾燥された処方物または水溶液の形態で、貯蔵用に調製される。受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、使用される投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そしてこれらとしては、以下が挙げられる：緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸）、抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸およびメチオニン）；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）：低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはロイシン）；単糖類、二糖類および他の炭化水素（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、亜鉛−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。
【０１８２】
本明細書中の処方物はまた、１つ以上の活性化合物を含有する。好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物である。例えば、細胞毒性物質、化学療法物質、サイトカインをさらに提供することが所望され得る。このような他の薬剤の有効な量は、処方物中に存在するアンタゴニストの量、癌処置のタイプ、および上で考察された他の要因に依存する。これらは一般的に、以前ここで使用されたのと同じ用量および投与経路で、または以前使用された用量の約１〜９９％で使用される。
【０１８３】
この活性成分はまた、例えば、コアセルベーションの技術、または界面重合によって調製されるマイクロカプセル中（例えば、ヒドロキシメチルセルロース−マイクロカプセルまたはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系中（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、もしくはナノカプセル）、またはマクロエマルジョン中に包理され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）（１９８０）に開示されている。
【０１８４】
徐放調製物が、調製され得る。徐放放出調製物の適切な例としては、アンタゴニストを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、ここで、このマトリクスは、成形品の形態（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）である。徐放マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性酢酸エチレン−酢酸ビニルコポリマー、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グルコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される、注射可能なミクロスフェア））、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１８５】
インビボ投与のために使用される処方物は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を介する濾過によって容易に達成される。
【０１８６】
（アンタゴニストでの処置）
Ｐ−カドヘリンアンタゴニスト（例えば、抗体または低分子）を含む組成物が優良医療模範（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）に一致する様式で処方、投薬（ｄｏｓｅ）、および投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）される。好ましくは、Ｐ−カドヘリンアンタゴニストは、ヒト抗Ｐ−カドヘリン抗体ｓｃＦｖ、キメラ抗Ｐ−カドヘリン抗体ｓｃＦｖ、またはヒト化抗Ｐ−カドヘリン抗体ｓｃＦｖ、もしくは抗体フラグメント、あるいはＰ−カドヘリン発現を阻害する抗体フラグメント又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本文中で考慮される要因として、処置される特定の癌、処置される特定の哺乳動物、それぞれの患者の病態、疾患または障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与の日程計画、開業医に公知の他の要因が挙げられる。投与されるべきアンタゴニストの治療的に有効な量が、このような考慮によって決定される。
【０１８７】
一般的な提案として、投薬量あたりの非経口投与されるアンタゴニストの治療的に有効な量は、１日当たり患者の体重の約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり、使用されるアンタゴニストの代表的な初期の範囲は、約２〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１８８】
しかし、上記のように、これらの提案されたアンタゴニストの量は、多数の治療の裁量に左右される。上記のように得られた結果が、適切な量および日程計画を決定する際の重要な要因である。
【０１８９】
例えば、進行中の疾患および急性疾患を処置するために、比較的多い用量が初めに必要とされる。最も有効な結果を得るために、疾患または障害に依存し、疾患または障害の第一の徴候、診断、出現または発症にできるだけ近く、または疾患または障害の回復する間、アンタゴニストが投与される。
【０１９０】
アンタゴニストが、任意の適切な方法によって投与され、この適切な方法として、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、および鼻腔内投与、および局所的免疫抑制処置が所望される場合、病巣内投与が挙げられる。非経口注入として、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が挙げられる。
【０１９１】
さらに、アンタゴニストは、パルス注入によって、例えば、アンタゴニストの用量を少なくしながら適切に投与され得る。投与が短期であるか長期であるかに一部依存し、好ましくは、注射によって投薬され、最も好ましくは、動脈内注射または皮下注射によって投薬される。
【０１９２】
細胞毒性物質、化学療法的物質、免疫抑制物質および／またはサイトカインのような他の化合物が、本明細書中のアンタゴニストと共に投与され得る。組み合わせの投与として、別々の処方物または単一の薬学的処方物を用いた同時投与、およびいずれかの順序での連続投与が挙げられ、ここで、両方の（または全ての）活性物質が同時に生物活性を示す期間が存在するのが好ましい。
【０１９３】
タンパク質アンタゴニストの患者への投与を除き、本発明は遺伝子治療によるアンタゴニストの投与を検討する。アンタゴニストをコードする核酸のこのような投与は、「治療的に有効な量のアンタゴニストを投与する」という表現によって包含される。細胞内抗体を作成するための遺伝子治療の使用に関して、例えば、１９９６年３月１４日に公開されたＷＯ  ９６／０７３２１を参照のこと。
【０１９４】
患者の細胞に核酸（必要に応じてベクター内に含まれる）を挿入する２つの主要なアプローチ（インビボおよびエキソビボ）がある。インビボ送達として、一般的にアンタゴニストが必要とされる部位に、患者へ核酸が直接注射される。エキソビボ処置として、患者の細胞が取り出され、核酸がこれらの隔離された細胞に導入され、そして、改変された細胞が、直接か、あるいは例えば患者に移植される多孔質膜内でカプセル化されて（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および同第５，２８３，１８７号）患者へ投与される。生存可能な細胞中に核酸を導入するために利用可能な種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が、意図される宿主の細胞のインビトロで培養された細胞中に、またはインビボで移入されるか否かに依存して、変化する。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の移入に適切な技術としては、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法などが挙げられる。遺伝子のエキソビボ送達のためにの一般的に使用されるベクターは、レトロウイルスである。
【０１９５】
現在好ましいインビボ核酸移入技術として、ウイルス性ベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、またはアデノ随伴ウイルス）でのトランスフェクトおよび脂質ベースシステム（遺伝子の脂質媒介転移に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである）が挙げられる。いくつかの状況においては、核酸の供給源に標的細胞を標的化する薬剤（例えば、細胞表面の膜タンパク質または標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドなど）を提供することが所望される。リポソームが使用される場合は、エンドサイトーシスに関連する細胞表面の膜タンパク質に結合するタンパク質が、例えば、特定の細胞型について向性である、キャプシドタンパク質またはそのフラグメント、循環している際にインターナライズを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的化しそして細胞内半減期を増大するタンパク質中の取りこみを標的化および／または促進するために、使用され得る。レセプターによって媒介されるエンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４（１９９０）によって記載されている。現在知られている遺伝子作製および遺伝子治療プロトコルの概要については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）を参照のこと。ＷＯ  ９３／２５６７３および本明細書中に引用された参考文献もまた参照のこと。
【０１９６】
（診断、予後診断、治療（療法）の評価、および癌の管理）
本明細書中に記載されるＰ−カドヘリンポリヌクレオチドおよびそれらの遺伝子産物は、発癌経路に沿って初期の変化を検出し、および／または様々な治療および予防処置の効力を観察する、遺伝マーカーまたは生化学マーカー（例えば、血液中または組織中）としてのさらなる目的物である。例えば、Ｐ−カドヘリンの発現レベルは、より乏しい予後を示唆し、従って、患者のためのより強力な化学療法または放射療法を保証し得るか、またはその逆である。患者の処置および結果と新規の代理の腫瘍特異的特性との相関関係は、腫瘍の分子プロフィールに基づいて要求に応じた療法の設計を可能にする予後指標を規定し得る。これらの療法として、抗体ターゲティング、アンタゴニスト（例えば、低分子）、および遺伝子治療が挙げられる。Ｐ−カドヘリンの発現の測定および、正常組織中および疾患の変異組織中の既知の発現と患者のプロフィールとの比較は、処置の特異性および患者の快適度の両方の点から、患者のための最良の処置を決定し得る。代理の腫瘍マーカー（例えば、ポリヌクレオチド発現）はまた、癌の異なる形態および疾患の状態をより良く分類する（従って、診断し、処置する）ために使用され得る。本明細書中に記載のポリヌクレオチドに応答する遺伝子の発現レベルの同定から恩恵を受け得る腫瘍学において広く使用されている２つの分類は、癌障害の病期分類および癌細胞の性質の類別である。
【０１９７】
分子レベルで潜在的な悪性事象を、これらが、巨視的な形態学的レベルで検出可能になる前に検出するために、Ｐ−カドヘリン発現を測定することは、癌を有するかまたは癌に感受性の患者をモニターするために有用であり得る。さらに、Ｐ−カドヘリンポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドに対応する遺伝子は、例えば、ポリヌクレオチドまたはそれらにコードされる遺伝子産物を使用することによる治療の有効性を評価するために、例えば、治療前、治療中、および治療後における患者中の腫瘍荷重を評価するための治療測定基準（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）として有用であり得る。
【０１９８】
さらに、１つのタイプの癌において差示的に発現される遺伝子に対応するとして同定され、従って１つのタイプの癌について重要であるポリヌクレオチドはまた、他のタイプの癌（例えば、ポリヌクレオチドが、種々の癌のタイプを越えて差示的に発現される遺伝子を示す場合）の発生または発生の危険性について関連を有し得る。従って、例えば、転移性結腸癌について臨床的関連を有する遺伝子に対応するポリヌクレオチドの発現はまた、胃癌または子宮内膜癌について臨床的関連を有し得る。
【０１９９】
（病期分類）  病期分類は、癌性状態が、患者においてどのように進行したかを表すために医師によって使用されるプロセスである。病期分類は、予後の決定、処置の計画、およびこのような処置の結果の評価において医師を支援する。病期分類システムは、癌のタイプで変動するが、一般的には、以下の「ＴＮＭ」システムに関する：腫瘍のタイプ（Ｔによって示される）；癌がリンパ節の近くに転移したか否か（Ｎによって示される）；および癌が身体のより遠い部分に転移したか否か（Ｍによって示される）。一般的には、癌が任意のリンパ節への広がらずに原発性病変の領域においてのみ検出可能である場合、これをステージＩという。癌が最近接のリンパ節にのみ広がった場合、これをステージＩＩという。ステージＩＩＩでは、癌は、一般的に、原発性病変の部位に対して近くに近接するリンパ節にリンパ節に広がっている。身体の離れた部分（例えば、肝臓、骨、脳または他の部位）に広がった癌は、ステージＩＶであり、最も進行したステージである。
【０２００】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドは、癌の攻撃性（例えば、転移可能性）ならびに身体の異なる領域における存在についてのマーカーを同定することによって、病期分類のプロセスの微調整を容易にし得る。従って、高い転移可能性の癌を示すポリヌクレオチドを有するステージＩＩの癌は、ステージＩＩの腫瘍からステージＩＩＩの腫瘍へと境界を変更して、より積極的な治療を正当化するために使用され得る。逆に、より低い転移可能性を示すポリヌクレオチドの存在は、より控えめな腫瘍の病期分類を可能にする。
【０２０１】
（癌の悪性度分類）  悪性度分類（ｇｒａｄｅ）は、腫瘍が、その同じ型の正常組織にどの程度近い共通点があるかを説明するために使用される用語である。腫瘍の顕微鏡的な外見は、細胞形態学、細胞性組織化、および他の分化のマーカーのようなパラメーターに基づく腫瘍の悪性度分類を同定するために使用される。一般的な規則として、腫瘍の悪性度分類は、一般的に十分に分化した腫瘍または低い悪性度分類の腫瘍よりもより攻撃的である未分化腫瘍または高い悪性度分類の腫瘍を伴う、その増殖速度または攻撃性に対応する。以下の指針が、一般的に、腫瘍の悪性度分類のために使用される：１）ＧＸ（悪性度分類が評価され得ない）；２）Ｇ１（十分に分化した）；Ｇ２（中程度に十分に分化した）；３）Ｇ３（不十分に分化した）；４）Ｇ４（未分化）。本発明によって企図されるポリヌクレオチドは、それらが、腫瘍細胞の分化状態の決定に役立ち得るだけでなく、それらがまた、腫瘍の攻撃性（例えば、転移可能性）の決定に価値のある分化以外の因子を同定し得るので、腫瘍の悪性度分類の決定において特に有用であり得る。
【０２０２】
（癌の検出）  Ｐ−カドヘリンの発現パターンは、被験体における癌（特に、結腸癌）を検出するために使用され得る。結腸直腸癌は、ヒトにおいて最も一般的な新生物の１つであり、そしておそらく遺伝性新生物の最も頻繁な形態である。予防および早期検出は、結腸直腸癌の制御および治療における重要な因子である。結腸直腸癌は、ポリープとして始まり、このポリープは、小さく、結腸の内層上に形成する細胞の良性の増殖である。数年の期間にわたって、これらのポリープのいくつかは、さらなる変異を蓄積して、そして癌性になる。複数の家族性の結腸直腸癌障害が同定され、これらは、以下のようにまとめられる：１）家族性腺腫様ポリープ（ＦＡＰ）；２）ガードナー症候群；３）遺伝性非ポリープ性結腸癌（ＨＮＰＣＣ）；および４）Ａｓｈｋｅｎａｚｉユダヤ人（Ｊｅｗ）における家族性結腸直腸癌。適切なポリヌクレオチドの発現は、癌の診断、予後および管理において使用され得る。癌の検出は、単独または他の遺伝子と組合わせてのＰ−カドヘリン配列発現レベルを用いて決定され得る。結腸癌の攻撃的な性質および／または転移可能性の決定は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の１つ以上の遺伝子産物のレベルの比較、および癌性組織において変化することが知られる別の配列（例えば、ｐ５３、ＤＣＣ、ｒａｓ、ＦＡＰの発現）の全体レベルの比較によって決定され得る（例えば、Ｆｅａｒｏｎ  ＥＲら、Ｃｅｌｌ（１９９０）６１（５）：７５９；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＳＲら、Ｃａｎｃｅｒ（１９９３）７２：９５７；Ｂｏｄｍｅｒ  Ｗら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）４（３）：２１７；Ｆｅａｒｏｎ  ＥＲ、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．（１９９５）７６８：１０１を参照のこと）。例えば、癌の発生は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドに対応するＰ−カドヘリンの発現レベルを、癌遺伝子（例えば、ｒａｓ）または腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＦＡＰまたはｐ５３）のレベルに対して試験することによって検出され得る。従って、特定のマーカーポリヌクレオチドの発現は、正常結腸組織と癌性結腸組織との間を区別するため、起源の細胞が異なる癌の間の区別のため、異なる潜在的転移速度を有する癌の間を区別するためなどに使用され得る。癌のマーカーの総説については、例えば、Ｈａｎａｈａｎら（２０００）Ｃｅｌｌ  １００：５７〜７０を参照のこと。
【０２０３】
（癌の処置）  本発明は、Ｐ−カドヘリンの発現によって特徴付けられる、癌細胞の増殖の阻害ならびに／または癌の接着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）、移動および／もしくは転移の調節のための方法を提供する。これらの例としては、消化管の癌（例えば、結腸癌、胃癌および肝臓癌）および他の癌（例えば、肺癌および乳癌であるかもしれない）が挙げられる。本発明は、任意の癌（Ｐ−カドヘリンアンタゴニストの投与が癌細胞増殖、癌細胞移動、癌細胞接着および転移の少なくとも１つを調節（阻害）する）の処置を含む。実施例に示されるように、Ｐ−カドヘリンアンタゴニストは、癌細胞接着を阻害することおよび癌細胞増殖を阻害することが示されている。接着の阻害は、最初の腫瘍とは異なる部位に接着し、そしてそこで腫瘍を発生させる癌細胞の能力を阻害することによって、転移に対して調節効果を有し得る。一般的には、この方法は、癌細胞を、（１）Ｐ−カドヘリンに相当するポリヌクレオチドの発現を調節するか；または（２）Ｐ−カドヘリンポリペプチドのレベルおよび／もしくは活性を調節する物質と接触させる工程を包含する。この方法は、癌細胞におけるＰ−カドヘリンの発現を減少させることか、またはＰ−カドヘリンのレベルを減少させることか、および／もしくはＰ−カドヘリンの活性を減少させることを提供する。この阻害は、減少した癌細胞の増殖、移動および／または接着をもたらす。
【０２０４】
「癌細胞の増殖が減少する」とは、限定することなく、癌細胞の増殖を減少させること、および癌性細胞になる非癌性細胞の発生数を減少させることを含む。癌細胞増殖における減少が達成されたか否かは、任意の公知のアッセイを用いて容易に決定され得、これらのアッセイとしては、限定することなく、以下が挙げられる：「３Ｈ」−チミジンの取り込み；一定期間にわたった細胞数の計数；結腸癌に関連したマーカー（例えば、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、およびＬＡＳＡ）の検出および／または測定。
【０２０５】
本発明は、特に、Ｐ−カドヘリンに関連した癌、好ましくは、結腸癌を処置するための方法を提供し、この方法は、癌細胞増殖を減少させる物質を、癌細胞増殖を減少させ、そして癌を治療するのに十分な量で、これを必要とする個体に投与する工程を包含する。物質、または特定の量の物質が、患者における癌の処置に有効であるか否かは、任意の種々の公知の癌についての診断アッセイを用いて評価され得、このアッセイとしては、限定することなく、以下が挙げられる：Ｓ状結腸鏡検査法、直腸鏡検査法、直腸試験、生検を用いた結腸鏡検査、コントラストＸ線撮影研究、ＣＡＴスキャン、血管造影法、および個体の血液中の結腸癌に関連した腫瘍マーカーの検出。物質は、全身的または局所的に投与され得る。従って、いくつかの実施形態において、この物質は、局所的に投与され、そして結腸癌増殖が、投与の部位で減少される。局所投与は、例えば、固形腫瘍の処置において有用であり得る。
【０２０６】
（Ｐ−カドヘリンの検出に関する診断方法および他の方法）
本発明は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドを使用する方法を提供する。特定の非限定的な実施形態において、この方法は、Ｐ−カドヘリンに関連した癌細胞、特に結腸癌細胞を検出するため、被験体における癌および癌の重篤度（例えば、腫瘍悪性度分類、腫瘍荷重（ｂｕｒｄｅｎ）など）の診断を容易にするため、被験体の予後の決定を容易にするため、ならびに治療に対する被験体の応答性を（例えば、化学療法レジメンの間またはこのレジメンの後に腫瘍荷重を評価することを通じて治療効果の測定を提供することによって）評価するために有用である。検出は、細胞（例えば、結腸癌細胞）中のＰ−カドヘリンのレベルの検出および／または癌細胞中のＰ−カドヘリンポリペプチドの検出に基づき得る。本発明の検出方法は、単離された細胞に対してか、または組織全体もしくは体液（例えば、血液、血漿、血清、尿など）において、インビボまたはインビトロで実施され得る。
【０２０７】
検出方法は、キットの一部として提供され得る。従って、本発明は、さらに、癌細胞中に発現したＰ−カドヘリンの存在および／もしくはレベルを検出するため（例えば、差示的に発現した目的の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの検出によって）検出するため、ならびに／または生物学的サンプル中の、それによってコードされるポリペプチドを検出するためのキットを提供する。これらのキットを使用する手順は、臨床検査室、実験室、医師、または一個人によって実施され得る。結腸癌細胞において差示的に発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを検出するための本発明のキットは、このポリペプチドに特異的に結合する部分を含み、この部分は、特異的抗体であり得る。結腸癌細胞において差示的に発現されるポリヌクレオチドを検出するための本発明のキットは、このようなポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする部分を含む。このキットは、必要に応じて、この手順において有用なさらなる成分を提供し得、この成分としては、緩衝液、発色（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ）試薬、標識、反応表面、検出手段、コントロールサンプル、標準物質、指示書、および説明情報が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０８】
（結腸癌細胞におけるＰ−カドヘリンポリペプチドの検出）
いくつかの実施形態において、Ｐ−カドヘリン過剰発現細胞を検出することによって、Ｐ−カドヘリンに関連した癌を検出するための方法が提供される。任意の種々の公知の方法が、検出のために使用され得、これらの方法としては、コードされたポリペプチドに対して特異的な抗体を用いる免疫アッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）などによる）；およびコードされたポリペプチドについての機能性アッセイ（例えば、結合活性または酵素活性）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０９】
例えば、免疫蛍光アッセイは、最初にコードされたポリペプチドを単離することなく、細胞に対して容易に実施され得る。細胞は、最初に、固体支持体（例えば、顕微鏡用スライドまたはマイクロタイターウェル）上に固定化される。この固定化工程は、細胞膜を透過化し得る。細胞膜の透過化処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）は、ポリペプチド特異的抗体が結合することを可能にする。次に、固定化された細胞は、コードされたポリペプチドに対して特異的な抗体に曝される。このアッセイの感度を増加させるために、固定化細胞は、二次抗体（これは、標識され、そしてコードされたポリペプチドに特異的である第１の抗体に結合する）にさらに曝され得る。代表的には、この二次抗体は、例えば、蛍光マーカーを用いて検出可能に標識される。コードされたポリペプチドを発現する細胞は、蛍光標識され、そして顕微鏡下で容易に可視化される。例えば、Ｈａｓｈｉｄｏら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８７：１２４１〜１２４８を参照のこと。
【０２１０】
本明細書を読む際に当業者に容易に明らかであるように、本明細書中に記載される検出方法および他の方法は、容易に変更され得る。このような変更は、本発明の意図される範囲内である。例えば、上記検出スキームにおいて、検出における使用のためのプローブは、固体支持体上に固定化され得、そして試験サンプルは、固定化プローブと接触され得る。次いで、このプローブに対する試験サンプルの結合は、種々の方法（例えば、試験サンプルに結合した検出可能標識を検出することによる）で検出されて、試験サンプル−固定化プローブ複合体の検出を容易にし得る。
【０２１１】
本発明は、さらに、Ｐ−カドヘリンに特異的な抗体を使用して、生物学的サンプル中のＰ−カドヘリンポリペプチドの存在を検出するため、および／またはＰ−カドヘリンポリペプチドのレベルを測定するための方法を提供する。この方法は、一般的には、以下の工程：ａ）サンプルを、Ｐ−カドヘリンに対して特異的な抗体と接触させる工程；およびｂ）抗体とサンプルの分子との間の結合を検出する工程、を包含する。
【０２１２】
Ｐ−カドヘリンに対して特異的な抗体の特異的結合の検出は、適切なコントロールと比較される場合、Ｐ−カドヘリンがサンプル中に存在するという指標である。適切なコントロールは、Ｐ−カドヘリンを含まないことが知られているサンプル；およびコードされたポリペプチドに対して特異的でない抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）と接触されたサンプルを含む。特異的抗体−抗原相互作用を検出するための種々の方法が、当該分野において公知であり、そしてこの方法において使用され得、標準的な免疫組織学的方法、免疫沈降法、酵素免疫アッセイ、および放射免疫アッセイが挙げられるがこれらに限定されない。一般的には、特異的抗体は、直接的または間接的のいずれかで検出可能に標識される。直接的な標識としては、以下が挙げられる：放射性同位体；生成物が検出可能な酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなど）；蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンなど）；蛍光発光金属（例えば、金属キレート基（例えば、ＥＤＴＡ）を介して抗体に付着した１５２Ｅｕまたは他のランタニド系列）；化学発光化合物（例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩など）；生物発光化合物（例えば、ルシフェリン、エクオリン（緑色蛍光タンパク質）など）。抗体は、不溶性支持体（例えば、ポリスチレンプレートまたはビーズ）に付着（結合）され得る。間接的な標識としては、コードされたポリペプチドに特異的な抗体（「第１の特異的抗体」）に対して特異的な第２の抗体（この第２の抗体は、上記のように標識されている）；および特異的結合対（例えば、ビオチン−アビジン）のメンバーなどが挙げられる。生物学的サンプルは、細胞、細胞粒子、または可溶性タンパク質を固定化し得る、固体支持体またはキャリア（例えば、ニトロセルロース）と接触され得、そしてこれらの上に固定化され得る。次いで、この支持体は、適切な緩衝液で洗浄され、続いて検出可能に標識した第１の特異的抗体と接触され得る。検出方法は、当該分野において公知であり、そして検出可能な標識によって放出されるシグナルに対して適切であるように選択される。検出は、一般的には、適切なコントロールに対する比較、および適切な標準物質に対する比較で達成される。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、この方法は、インビボでの使用（例えば、Ｐ−カドヘリンに関連した癌細胞が存在する部位を位置決めまたは同定する）ために適応される。これらの実施形態において、検出可能に標識した部分（例えば、抗体）（これは、（例えば、注射によって）個体に投与されたＰ−カドヘリンに対して特異的である）、および標識した細胞は、標準的な画像化技術を使用して位置決めされ、これらの技術としては、磁気共鳴画像法、コンピュータ連動断層撮影スキャンなどが挙げられるが、これらに限定されない。このようにして、Ｐ−カドヘリンを発現する細胞は、差示的に標識される。
【０２１４】
（癌細胞におけるＰ−カドヘリンポリヌクレオチドの検出）
癌細胞中のＰ−カドヘリン転写物の細胞における発現を検出することによって、Ｐ−カドヘリン癌細胞を検出するための方法が提供される。任意の種々の公知の方法が、検出のために使用され得、この検出としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｐ−カドヘリンポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションによる転写物の検出；特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応による転写物の検出；結腸癌細胞において差示的に発現される遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとして用いる細胞のインサイチュハイブリダイゼーション。方法は、癌細胞において発現されたＰ−カドヘリン遺伝子のｍＲＮＡレベルの検出および／または測定のために使用され得る。いくつかの実施形態において、この方法は、以下の工程：ａ）ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、サンプルをＰ−カドヘリンポリヌクレオチドと接触させる工程；およびｂ）存在する場合、ハイブリダイゼーションを検出する工程、を包含する。
【０２１５】
差示的ハイブリダイゼーションの検出は、適切なコントロールに対して比較される場合、癌細胞において差示的に発現されるポリヌクレオチドのサンプルにおける存在の指標である。適切なコントロールとしては、例えば、Ｐ−カドヘリンポリヌクレオチドを含まないことが知られているサンプルが挙げられる。ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、当該分野で公知である。検出はまた、任意の公知の方法によって達成され得、この方法には、適切に標識したポリヌクレオチドを使用する、インサイチュハイブリダイゼーション、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）、および「ノザン」ブロッティングすなわちＲＮＡブロッティング、またはこのような技術の組合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドのための種々の標識および標識方法は、当該分野で公知であり、本発明のアッセイ方法において使用され得る。特異的ハイブリダイゼーションは、適切なコントロールに対する比較によって決定され得る。
【０２１６】
配列表に示されるような、本明細書中に提供されるＰ−カドヘリンポリヌクレオチドの少なくとも１２個連続するヌクレオチド（ｎｔ）を一般的に含むポリヌクレオチドは、種々の目的（例えば、結腸癌細胞において差示的に発現されるポリヌクレオチドの転写レベルの検出および／または測定のためのプローブ）のために使用される。本明細書中に開示されるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブは、他の無関係な配列を用いて提供されるバックグラウンドのハイブリダイゼーションよりも、少なくとも５倍、１０倍、または２０倍高い検出シグナルを提供するべきである。本明細書中に使用される場合、「プローブ」とは、試験サンプル中のＰ−カドヘリン遺伝子産物を検出するために使用されるポリヌクレオチド配列について言及することを意味することは注意すべきである。当業者によって容易に理解されるように、プローブは、検出可能に標識され得、そして例えば、試験サンプル（例えば、ｍＲＮＡ）から得られた固定化ポリヌクレオチドを含むアレイと接触され得る。あるいは、プローブは、アレイ上に固定化され得、そして試験サンプルが、検出可能に標識され得る。本発明の方法のこれらの変更および他の変更は、十分に当業者の範囲内であり、かつ本発明の範囲内である。
【０２１７】
ヌクレオチドプローブは、提供されたポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を検出するために使用される。ノザンブロットにおいて、ｍＲＮＡは、電気泳動によって分離され、そしてプローブと接触させられる。プローブは、特定のサイズのｍＲＮＡ種にハイブリダイズする場合に検出される。ハイブリダイゼーションの量は、例えば、特定の条件下で、発現の相対量を決定するために定量化され得る。プローブは、発現を検出するために細胞へのインサイチュハイブリダイゼーションのために使用される。プローブはまた、ハイブリダイズする配列の診断的検出のためにインビボで使用され得る。プローブは、代表的には、放射性同位体で標識される。他の型の検出可能標識（例えば、発色団、蛍光団、および酵素）が、使用され得る。ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイの他の例は、ＷＯ９２／０２５２６およびＵＳＰＮ５，１２４，２４６において記載される。
【０２１８】
ＰＣＲは、少量の標的核酸を検出するための別の手段である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：３３５；ＵＳＰＮ４，６８３，１９５；およびＵＳＰＮ４，６８３，２０２を参照のこと）。標的核酸とハイブリダイズする２つのプライマーポリヌクレオチドヌクレオチドは、反応を開始するために使用される。プライマーは、配列表のポリヌクレオチド内の配列またはこれらに対して３’側の配列および５’側の配列から構成され得る。あるいは、プライマーが、これらのポリヌクレオチドに対して３’側および５’側である場合、これらのプライマーは、これらまたは相補体に対してハイブリダイズする必要がない。熱安定性ポリメラーゼを用いる標的の増幅後、増幅された標的核酸は、当該分野に公知の方法（例えば、サザンブロット）によって検出され得る。ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に記載される従来のブロッティング技術（例えば、サザンブロット、ノザンブロットなど）によって、（例えば、ＰＣＲ増幅なしに）検出され得る。一般的には、ｍＲＮＡまたはポリメラーゼ酵素を用いてｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を使用して精製および分離され得、そして固体支持体（例えば、ニトロセルロース）に移され得る。固体支持体は、標識プローブに曝され、任意のハイブリダイズしなかったプローブを除去するために洗浄し、そして標識プローブを含む二重鎖が検出される。
【０２１９】
ＰＣＲ増幅を使用する方法は、単一の細胞由来のＤＮＡに対して実施され得るが、少なくとも約１０５細胞を使用することが好都合である。ポリメラーゼ連鎖反応の使用は、Ｓａｉｋｉら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７に記載され、そして現在の技術の総説は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，ｐｐ．１４．２〜１４．３３に見出され得る。検出可能標識は、増幅反応中に含まれ得る。適切な検出可能標識としては、以下が挙げられる：蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ））、放射活性標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈなど）など。標識は、２段階システムであり得、ここで、ポリヌクレオチドは、高い親和性の結合パートナー（例えば、アビジン、特異的抗体など）を有するビオチン、ハプテンなどに結合体化され、ここで、この結合パートナーは、検出可能標識に結合体化されている。この標識は、プライマーの一方または両方に結合体化され得る。あるいは、増幅において使用されるヌクレオチドのプールは、増幅産物中に標識を組込むように標識される。
【０２２０】
（アレイ）
ポリヌクレオチドアレイは、サンプル中の多数のポリヌクレオチドまたはポリペプチドをアッセイし得るハイスル−プット技術を提供する。この技術は、差次的発現について試験するツールとして使用され得る。アレイを生産する種々の方法、ならびにこれらの方法のバリエーションは当該分野で公知であり、本発明での使用について企図される。例えば、アレイは、結合されたプローブを有する２次元マトリックスまたはアレイでポリヌクレオチドプローブを基材（例えば、ガラス、ニトロセルロースなど）上にスポットすることにより作製され得る。プローブは、共有結合または疎水性相互作用のような非特異的相互作用のいずれかによって、基材に結合され得る。ポリヌクレオチドのサンプルは、（例えば、放射性標識または蛍光標識を使用して）検出可能に標識され得、次いでプローブにハイブリダイズされる。一旦、サンプルの非結合部分が洗い出されると、プローブポリヌクレオチドに結合された、標識されたヌクレオチドを含む２本鎖ポリヌクレオチドは、検出され得る。あるいは、試験サンプルのポリヌクレオチドは、アレイ上に固定化され得、そしてプローブが検出可能に標識される。アレイを構築する技術およびこれらのアレイを使用する方法は、例えば、Ｓｃｈｅｎａら、（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９３（２０）：１０６１４〜９；Ｓｃｈｅｎａら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０（５２３５）：４６７〜７０；Ｓｈａｌｏｎら、（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６（７）：６３９〜４５，ＵＳＰＮ  ５，８０７，５２２，ＥＰ  ７９９  ８９７；ＷＯ  ９７／２９２１２；ＷＯ９７／２７３１７；ＥＰ  ７８５  ２８０；ＷＯ  ９７／０２３５７；ＵＳＰＮ  ５，５９３，８３９；ＵＳＰＮ  ５，５７８，８３２；ＥＰ  ７２８  ５２０；ＵＳＰＮ  ５，５９９，６９５；ＥＰ  ７２１  ０１６；ＵＳＰＮ５，５５６，７５２；ＷＯ  ９５／２２０５８；およびＵＳＰＮ５，６３１，７３４に記載される。
【０２２１】
アレイは、例えば、遺伝子の差次的発現を試験するために使用され得るし、遺伝子の機能を決定するために使用され得る。例えば、アレイは、Ｐ−カドヘリン遺伝子の差次的発現を検出するために使用され得、ここで発現は、試験細胞とコントロール細胞（例えば、癌細胞と正常細胞）との間で比較される。例えば、癌細胞における、対応する正常細胞で観察されない特定のメッセージの高発現は、癌特異的遺伝子産物を示し得る。アレイの例示的用途は、例えば、Ｐａｐｐａｌａｒａｄｏら、Ｓｅｍ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌ．（１９９８）８：２１７；およびＲａｍｓａｙ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）１６：４０にさらに記載される。さらに、アレイを使用する検出方法の多くのバリエーションは、十分に当業者の能力内であり、本発明の範囲内である。例えば、固体支持体にプローブを固定することよりむしろ、試験サンプルが個体支持体上に固定され得、次いで、試験サンプルは、プローブと接触される。
【０２２２】
Ｐ−カドヘリンアレイを選択する際の使用のための好ましいヌクレオチドは、以下の配列を有する。このヌクレオチドは、Ｉｎｃｙｔｅから入手した（配列番号３）。
【０２２３】
【化３】
2005522982.tif 000006
【０２２４】
（製品）
本発明の別の実施形態において、上に記載された疾患または障害の処置に有用である、Ｐ−カドヘリンを含む製品が提供される。この製品は、容器および容器上にあるラベルもしくは添付文書または容器に結び付けられたラベルもしくは添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。この容器は、ガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成され得る。この容器は、選ばれた疾患もしくは障害の処置に有効な組成物を保存するか、または含み、滅菌したアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈注射用の溶液袋または皮下注射針により刺し通し可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、Ｐ−カドヘリンアンタゴニスト（拮抗薬）、好ましくは抗体である。ラベルまたは添付文書は、この組成物が、癌（例えば、結腸癌）を有する、または素因がある患者の処置に使用されることを示す。この製品は、さらに注射用静菌水（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ  ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液のような薬学的に受容可能な希釈緩衝液を含有する第２の容器を含み得る。この容器は、さらに、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料（他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、およびシリンジを含む）を含有し得る。
【０２２５】
本発明のさらなる詳細は、以下の限定しない実施例により例示される。本明細書の全ての参考文献の開示は、参考として明白に援用される。
【実施例】
【０２２６】
（実施例１：生物学的物質の供給源）
本発明に導かれる実験で使用される生物学的材料を、以下に記載する。
【０２２７】
（患者組織サンプルの供給源）
正常組織および癌性組織を、当該分野で周知のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）技術を使用して、患者から収集した（例えば、Ｏｈｙａｍａら、（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：５３０〜６；Ｃｕｒｒａｎら、（２０００）Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．５３：６４〜８；Ｓｕａｒｅｚ−Ｑｕｉａｎら、（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６：３２８〜３５；Ｓｉｍｏｎｅら、（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １４：２７２〜６；Ｃｏｎｉａら、（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１１：２８〜３８；Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９９８〜１００１を参照のこと）。表１（前出）は、サンプルが単離された各患者についての情報を提供し、以下を含む：患者ＩＤおよび病理報告ＩＤ、識別目的のための患者および病理報告に割り当てられた番号；腫瘍の解剖学的部位（解剖学的部位）；原発腫瘍のサイズ；原発腫瘍のグレード；組織病理学的グレード；腫瘍が浸潤した局所的位置の詳細（局所浸潤）；リンパ節転移の存在（リンパ節転移）；リンパ節転移の発生率（試験したリンパ節の数に対する、転移について陽性のリンパ節の数として提供される）（リンパ節転移の発生率）；領域性のリンパ節グレード；腫瘍と離れた位置への転移の同定または検出およびそれらの部位（遠隔転移および部位）；遠隔転移の記載（遠隔転移の記載）、遠隔転移のグレード（遠隔転移のグレード）；および患者または腫瘍についての一般的な所見（コメント）。腺腫は、いずれの患者にも記載されなかった。腺腫異型性（病理学者により過形成として記載される）は、患者ＩＤ番号６９５で記載があった。結節外への拡大は、二人の患者、患者ＩＤ番号７８４および７９１で記載があった。リンパ脈管（ｌｙｍｐｈｏｖａｓｃｕｌａｒ）浸潤は、七人の患者、患者ＩＤ番号１２８、２７８、５１７、５３４、７８４、７８６、および７９１で記載があった。クローン病様浸潤（Ｃｒｏｈｎ’ｓ−ｌｉｋｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ）は、七人の患者、患者ＩＤ番号５２、２６４、２６８、３９２、３９３、７８４、および７９１で記載があった。
【０２２８】
【表１−１】
2005522982.tif 000007
【０２２９】
【表１−２】
2005522982.tif 000008
【０２３０】
【表１−３】
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【０２３１】
【表１−４】
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【０２３２】
【表１−５】
2005522982.tif 000011
【０２３３】
【表１−６】
2005522982.tif 000012
【０２３４】
【表１−７】
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【０２３５】
【表１−８】
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【０２３６】
【表１−９】
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【０２３７】
【表１−１０】
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【０２３８】
【表１−１１】
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【０２３９】
【表１−１２】
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【０２４０】
【表１−１３】
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【０２４１】
【表１−１４】
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【０２４２】
【表１−１５】
2005522982.tif 000021
【０２４３】
（実施例２：Ｐ−カドヘリンマイクロアレイの設計）
Ｐ−カドヘリンマイクロアレイを、以前に規定されたオリゴヌクレオチド（配列番号３）を使用して、同一の空間レイアウトおよびコントロールスポットセットを有するプローブとして、（各アレイは、２区域に分割され、各区域は、３２×１２スポットの１２グループ、１アレイあたり総数約９，２１６スポットを有する）構築した。この２区域を、同一にスポットして、１アレイに各クローンの少なくとも２つの複製を提供した。０．５ｋｂ〜２．０ｋｂのＰＣＲ増幅産物を使用して、スポットする工程を達成し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｇｅｎ  ＩＩＩ  ｓｐｏｔｔｅｒを製造者の推奨に従って使用してスポットした。アレイ上の２４グループそれぞれの第１の列は、約３２（４つのネガティブコントロールスポットおよび８つの試験ポリヌクレオチドを含む）のコントロールスポットを有した。
【０２４４】
試験ポリヌクレオチドを、標識反応の前に、２〜６００ｐｇ／スライドの濃度範囲および１：１の比率で各サンプルに加えた（ｓｐｉｋｅ）。各アレイの設計について、２枚のスライドを、標識反応で逆標識した（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｌａｂｅｌｅｄ）試験サンプルでハイブリダイズした。これは、各サンプルにつき、各クローンの約４つの複製（１色につき２つおよび他の色につき２つ）の測定のために提供した。
【０２４５】
（実施例３：差次的発現遺伝子の同定）
実施例１に記載の患者細胞から単離した全ＲＮＡから、ｃＤＮＡプローブを調製した。ＬＣＭは、実質的に同質な細胞サンプルを提供する特定の細胞型の単離のために提供されるので、これは、同様に純粋なＲＮＡサンプルのために提供される。
【０２４６】
全ＲＮＡを、最初にＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むオリゴｄＴプライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写し、続いて第２鎖ＤＮＡ合成をした。次いで、Ｔ７プロモーター−エレメントを使用する増幅工程（Ｌｕｏら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ５：１１７〜１２２）で、ｃＤＮＡをインビトロ転写し、アンチセンスＲＮＡを産生した。次いで、このアンチセンスＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。第２セットのｃＤＮＡを、Ｔ７プロモーターを使用して再度インビトロ転写し、さらにアンチセンスＲＮＡを増幅した。必要に応じて、さらなるアンチセンスＲＮＡを産生するために、ＲＮＡを再度ｃＤＮＡに変換し、第３ラウンドまでのＴ７媒介増幅を許容した。従って、この手順は、２回目または３回目のインビトロ転写のために提供され、蛍光標識に使用される最終ＲＮＡを生成する。蛍光プローブを、コントロールＲＮＡを最終回のアンチセンスＲＮＡ混合物に加え、ＲＮＡ開始材料から蛍光標識したｃＤＮＡを合成することによって作成した。腫瘍ＲＮＡサンプルから調整された蛍光標識化ｃＤＮＡを、正常細胞ＲＮＡサンプルから調整された蛍光標識化ｃＤＮＡと比較した。例えば、正常細胞由来のｃＤＮＡプローブを、Ｃｙ３蛍光色素（緑）で標識し、腫瘍細胞から調製したｃＤＮＡプローブを、Ｃｙ５蛍光色素（赤）で標識した。
【０２４７】
差次的発現アッセイを、同じ患者の腫瘍細胞および正常細胞由来の等量のプローブを混合することにより、実施した。アレイを、５×ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、６０℃で約２時間のインキュベーションにより、プレハイブリダイゼーションし、次いで、水中で３回、イソプロパノール中で２回洗浄した。アレイのプレハイブリダイゼーションの後、次いで、プローブ混合物を、高ストリンジェンシー条件下で、アレイにハイブリダイゼーションした。（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび０．２％  ＳＤＳ中で４２℃一晩。ハイブリダイゼーション後、アレイを以下のように５５℃で３回洗浄した：１）１×ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳ中で第１洗浄；２）０．１×ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳ中で第２洗浄；そして３）０．１×ＳＳＣ中で第３洗浄。
【０２４８】
次いで、アレイを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩ  デュアルカラーレーザースキャナー／ディテクターを使用して、緑色蛍光および赤色蛍光をスキャンした。画像を、ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｕｔｏｇｅｎｅソフトウェアを使用して、処理し、そして各スキャンからのデータを、標準化し、正常と比較した発現の比率について提供した。マイクロアレイ実験からのデータを、Ｅ．Ｊ．Ｍｏｌｅｒ，Ｍ．Ａ．ＢｏｙｌｅおよびＦ．Ｍ．Ｒａｎｄａｚｚｏにより、２０００年１１月２０日に出願され、「Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｉｎ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ」と題された米国特許第６０／２５２，３５８に記載のアルゴリズムに従って解析した。この出願は、本明細書中に参考として具体的に援用される。
【０２４９】
この実験を、今度は両方の「色の方向（ｃｏｌｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ）」においてアッセイを実施するために、逆の色で２つのプローブを標識して、繰り返した。各実験を、時々２枚のさらなるスライドを用いて繰り返した（各色の方向につき１枚）。アレイ上の各配列の蛍光のレベルを、４つのアレイからの、１遺伝子あたり８複製スポットまたは２つのアレイもしくはいくつかの他の順列からの、１遺伝子あたり４複製スポットの相乗平均の比率として表した。データを、各複製区域に存在する、加えられたポジティブコントロールを使用して標準化し、この標準化の精度は、各差次の有意性の最終決定に含まれる。どのスポットが、各サンプル中で有意な発現レベルを検出したのか決定するために、各スポットの蛍光強度をまた、各複製区域においてネガティブコントロールと比較した。
【０２５０】
蛍光強度の統計学的解析を、複製スポットの各セットに供し、各差次測定の精度および有意性を評価し、各患者の腫瘍サンプルと正常サンプルとの間の発現レベルに差次がないとする帰無仮説を検定するｐ値を得た。マイクロアレイの最初の解析の中で、この仮説は、ｐ＞１０−３の場合、受容され、そして差次比率を、それらのスポットについて１．０００に設定した。全ての他のスポットは、腫瘍サンプルと正常サンプルとの間の発現において有意な差を有する。腫瘍サンプルが検出可能な発現を有し、正常サンプルが有しない場合、正常サンプルでの発現に対する値は０であり、この比率は数学的に有用な値でないので（例えば、無限大）、この比率を１０００で切り捨てた。正常サンプルが検出可能な発現を有し、腫瘍が検出可能な発現を有しない場合、腫瘍サンプルにおける発現の値は０であり、この比率は数学的に有用な値でないので、比率を０．００１にした。これらの後者２つの状況を、本明細書中で「オン／オフ」という。データベースの表は、９５％信頼水準（ｐ＞０．０５）で、占められている。
【０２５１】
表１は、３３人の結腸癌患者から得た組織でのＰ−カドヘリン差次的発現解析の結果を要約する。表１はまた、これらの同じ患者に関する病理学的評価の要約を含む。少なくとも１サンプルにおいて検出可能な発現のレベルがあり、比率値が、少なくとも約１．２倍、好ましくは少なくとも約１．５倍、より好ましくは少なくとも約２．０倍である場合（ここで、比率値を、上記に記載の方法を使用して計算する）、ポリヌクレオチドを、２つのサンプル間で有意に、差次的に発現された遺伝子を表すと言う。
【０２５２】
差次的発現比率１は、その遺伝子の発現レベルが同じ患者の正常結腸細胞におけるその遺伝子の発現と統計学的に異ならなかったことを示す。正常結腸細胞に対する癌性結腸細胞の１より有意に大きい差次的発現比率は、その遺伝子が正常細胞と比較して癌性細胞中での発現において増加されたことを示し、このことは、その遺伝子が癌性表現型の発生において特定の役割を果たし、その細胞の転移の促進に関与し得ることを示す。このような遺伝子由来の遺伝子産物の検出は、細胞が癌性であることの指標であり、治療の標的および／または診断の標的を提供し得る。それは、Ｐ−カドヘリンが、試験された結腸癌患者の多くの結腸癌組織中で、有意に、差次的に曝露された遺伝子であるという結果から明らかに理解され得る。
【０２５３】
（実施例４：Ｐ−カドヘリンの差次的発現）
結腸直腸癌細胞株、ＳＷ６２０の定量的ＰＣＲを、Ｐ−カドヘリンの発現を解析するために使用した。製造者の指示書に従ってＲｏｃｈｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキットを使用し、細胞からまずＲＮＡを単離することにより、定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。１μｇのＲＮＡを使用して、製造者の緩衝液、推奨濃度のオリゴｄＴ、ヌクレオチド、およびＲｎａｓｉｎ中で、ＭＭＬＶ  逆転写酵素（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて第一鎖ｃＤＮＡを合成した。第一鎖ｃＤＮＡは、機械のマニュアルで推奨されるようにＲｏｃｈｅ  ｌｉｇｈｔ−ｃｙｃｌｅｒを使用する定量的リアルタイムＰＣＲのテンプレートとして働く。順方向プライマー  ＡＣＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＧＡＣＣＡ（ＣＡＤＰ１９００）（配列番号４）および逆方向プライマー  ＡＡＡＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡ（ＣＡＤＰ２０７７）（配列番号５）で、Ｐ−カドヘリンを増幅した。ＰＣＲ産物を、増幅が増幅の直線性段階に入ったサイクルに基づいて、内部標準と比較して、そして製造者に供給されたソフトウェアを使用して定量した。第一鎖ｃＤＮＡ反応における全テンプレート量の小さい差を、順方向プライマー  ５’−ＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧ−３’（配列番号６）および逆方向プライマー  ５’−ＴＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣＧＧ−３’（配列番号７）を使用して、別個の定量的ＰＣＲ反応中で増幅されたアクチンの量に対し標準化することにより、排除した。
【０２５４】
（実施例５：Ｐ−カドヘリン発現のアンチセンス制御）
アンチセンスノックアウト技術を使用して、Ｐ−カドヘリンにおけるさらなる機能的な情報を、作成した。癌性細胞中のＰ−カドヘリン発現を、さらに解析し、腫瘍形成における、この遺伝子産物の（例えば、転移表現型の促進のような）役割（ｒｏｌｅ）および機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を確認した。
【０２５５】
Ｐ−カドヘリンｍＲＮＡに相補的な多くの異なるオリゴヌクレオチドを、潜在的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとして設計し、Ｐ−カドヘリンの発現を抑制するそれらの能力について試験した。設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドそれぞれの遺伝子発現を阻害する能力を、ＳＷ６２０結腸結腸直腸癌細胞へのトランスフェクションを介して、試験した。（この細胞株は、増殖実験での使用に十分に適切であるが、Ｐ−カドヘリンｍＲＮＡを高レベルには発現しないことが言及されるべきである）。
【０２５６】
各々のトランスフェクション混合物として、キャリア分子、好ましくはリピトイド（ｌｉｐｉｔｏｉｄ）またはコレステロイド（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｉｄ）を、０．５ｍＭの使用濃度（水中）に調製し、均一な溶液を得るために超音波処理し、０．４５μｍＰＶＤＦ膜を通して濾過した。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドは、次いで、１００μＭの使用濃度（滅菌ミリポア水中）に調製した。オリゴヌクレオチドを、さらに微量遠沈管中で、ＯｐｔｉＭＥＭＴＭにおいて、２μＭまたはおおよそ２０μｇオリゴ／ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭＴＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）に希釈した。別の微量遠心チューブ中で、リピトイドまたはコレステロイド（代表的には約１．５〜２ｎｍｏｌリピトイド／１μｇアンチセンスオリゴヌクレオチドの量）を、同じ量の、オリゴヌクレオチドを希釈するために使用したＯｐｔｉＭＥＭＴＭに希釈した。希釈されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、すぐに希釈されたリピトイドに加え、ピペットでの吸い上げおよび吐き出しにより混合した。オリゴヌクレオチドを、最終濃度３０ｎＭになるように細胞に加えた。
【０２５７】
トランスフェクトされた細胞における標的ｍＲＮＡ（Ｐ−カドヘリン）のレベルを、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭリアルタイムＲＣＰマシンを使用して、癌細胞株で定量した。標的ｍＲＮＡに対する値を、内部コントロール（例えば、β−アクチン）に対して標準化した。各２０μｌの反応物について、抽出されたＲＮＡ（一般に０．２〜１μｇ総量）を、滅菌０．５または１．５ｍｌ微量遠心チューブに置き、総容量１２．５μｌになるように水を加えた。各チューブに、２．５μｌ  Ｈ２Ｏ、２．０μｌ  １０×反応緩衝液、１０μｌ  オリゴｄＴ（２０ｐｍｏｌ）、１．０μｌ  ｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、０．５μｌ  ＲＮＡｓｉｎ（登録商標）（２０ｕ）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）、および０．５μｌ  ＭＭＬＶ逆転写酵素（５０ｕ）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を（記載した順に）混合することにより調製した、７．５μｌの緩衝液／酵素混合物を加えた。内容物を、ピペットでの吸い上げおよび吐き出しにより混合し、そして反応混合物を４２℃で１時間インキュベートした。各チューブの内容物を、増幅の前に遠心分離した。
【０２５８】
増幅混合物は、以下の順に混合することにより調製した：１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各１４０μＭ  ｄＮＴＰ、各０．１７５ｐｍｏｌ  オリゴ、１：５０，０００希釈のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１単位  Ｔａｑポリメラーゼ、および２０μｌまでのＨ２Ｏ。（ＰＣＲ緩衝液ＩＩは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴより１０倍濃度で入手可能である）。１倍濃度中に、それは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）および５０ｍＭ  ＫＣｌを含有する。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）は、２本鎖ＤＮＡに結合された場合、蛍光を発する色素である。２本鎖ＰＣＲ産物は、増幅中に産生されるので、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ由来の蛍光は、増加する。増幅混合物の各２０μｌアリコートに、２μｌのテンプレートＲＴを加え、そして標準的なプロトコルに従い、増幅を実施した。
【０２５９】
次のアンチセンスのオリゴヌクレオチド、およびこれらの逆コントロールが、トランスフェクションアッセイで、使用された：
【０２６０】
【化４】
2005522982.tif 000022
【０２６１】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＷ６２０大腸癌細胞中に導入された。さらに、コントロールが実施され、ここで同量の逆コントロールオリゴヌクレオチドが、ＳＷ６２０細胞中へ導入された。
【０２６２】
これらの実験結果（示されない）は、決定的ではなかった。このことは、ＳＷ６２０細胞株によって発現される比較的低レベルのＰカドヘリンｍＲＮＡに基づいて、説明可能であろう。
【０２６３】
特に、ＳＷ６２０細胞中のＰカドヘリンｍＲＮＡのレベルが比較的低いので、メッセージ定量実験が行われた場合、アンチセンス対コントロールのノックアウトのパーセンテージは測定され得なかった。なぜならば、そのレベルが、低すぎて（ほぼ０）、比率の計算が可能でなかったからである。
【０２６４】
対照的に（表２に要約されたデータ）、異なる大腸癌の細胞株を用いた結果は、Ｐカドヘリン発現のノックアウトが達成されたということを（同一のＰカドヘリンアンチセンスおよび逆オリゴヌクレオチドが、ＫＭ１２Ｃ細胞を含む他の細胞で試験された場合）示した。（不幸なことに、ＫＭ１２Ｃ細胞株は、増殖研究には適切ではないことを注意すべきである）。
【０２６５】
【表２】
2005522982.tif 000023
【０２６６】
Ｐカドヘリンアンチセンスオリゴ（ｏｌｉｇｏ）および逆コントロールで、トランスフェクトされたＡ４３１細胞を用いたさらなる増殖データは、表４および表５に含まれる。増殖は、アンチセンス処理によって阻害されたことが、この結果から、理解され得る。
【０２６７】
【表３】
2005522982.tif 000024
【０２６８】
【表４】
2005522982.tif 000025
【０２６９】
（実施例６：増殖に対するＰカドヘリン発現の影響）
細胞増殖に対するＰカドヘリンの影響がＳＷ６２０大腸結腸直腸癌細胞で評価された。前述したように、この細胞株は、低レベルのＰカドヘリンを発現する。トランスフェクションは、実施例５において上記されたように行われた。
【０２７０】
細胞は、９６のウェルのシャーレで約６０〜８０％コンフルエンシーまでプレートされた。アンチセンスまたは逆コントロールのオリゴヌクレオチドは、ＯｐｔｉＭＥＭＴＭ中で２μＭまで希釈され、そしてＳＷ６２０細胞の場合、送達ビヒクル、リピトイド（ｌｉｐｉｔｏｉｄ）１１６−６を、希釈されたＯｐｔｉＭＥＭＴＭの中に添加された。次いで、このオリゴ／送達ビヒクル混合物は、細胞上において血清を有する培地中でさらに希釈された。全ての実験についてのオリゴヌクレオチドの最終濃度は、３００ｎＭであり、そして全ての実験についての送達ビヒクルに対するオリゴの最終比率は、１．５ｎｍｏｌリピトイド／μｇオリゴヌクレオチドであった。細胞は、終夜３７℃でトランスフェクトされ、そしてトランスフェクション混合物は、次の朝、新しい培地と取り替えられた。
【０２７１】
両方のアンチセンスオリゴヌクレオチドのＳＷ６２０結腸直腸癌細胞中へのトランスフェクションは、一致した逆コントロール（ＲＣ）オリゴヌクレオチドに比較して増殖率の低下を生じた。
【０２７２】
（実施例７：細胞−細胞接触を分裂させるための、抗Ｐカドヘリン抗体を使用したインビトロでのアッセイ）
インビトロでの実験は、抗Ｐカドヘリン抗体の癌免疫療法に対する可能性を試験するために行われた。特に、適量のＰカドヘリンを発現する上皮腫瘍の細胞株Ａ−４３１は、２種類の抗Ｐカドヘリン抗体（ＲＤＩから得られたカタログ番号ＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９，Ｚｙｍｅｄおよびクローン番号ＲＤＩ−ＰＣＡＤＨＥＲ  ａｂｍ）の治療可能性を評価するためのモデルシステムとして、使用された。コントロールマウスのＩｇＧ１もまた、この実験で使用された（図１を参照のこと）。この抗体は、培養物をプレートする時に、９６の細胞培養プレートに含まれた細胞にそれぞれ添加され、この培養物は、次いで４日間インキュベートされた。細胞増殖パターンは、光学顕微鏡によって観察され、そして増殖は、ＤＮＡの蛍光染色（Ｑｕａｎｔｏｓ  Ｋｉｔ）によって測定された。
【０２７３】
この実験は、抗Ｐカドヘリン抗体、ＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９がＡ−４３１細胞における細胞−細胞接触を分裂させることを示す。対照的に、抗体が添加されずか、または関連性がないコントロール抗体の存在下で、Ｐカドヘリン発現Ａ−４３１細胞は、密接結合したクラスターで増殖した。抗Ｐカドヘリン抗体（ＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９）の存在下の細胞は、散乱したパターンで増殖した。これらの結果は、図２に示される。２種類の抗体で観察される異なる結果は、２種類の抗体間の差異に帰すると仮定される。
【０２７４】
（実施例８：細胞増殖に対する抗Ｐカドヘリン抗体の影響）
実験はまた、細胞増殖に対する同一の抗Ｐカドヘリン抗体ＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９、および（ＲＤＩから得られる）抗Ｐカドヘリン抗体ＲＤＩ−ＰＣＡＤＨＥＲ  ａｂｍの影響を評価するために行われた。Ａ−４３１細胞は、抗Ｐカドヘリンと共に９６の細胞板にプレートされ、そして細胞増殖は、４日目に測定された。コントロール培養物の細胞増殖は、関連性がないアイソタイプの一致した同量のＩｇＧ１抗体の存在下でまた評価された。
【０２７５】
得られた結果（図１２）は、Ａ−４３１増殖がＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９抗体の存在下で阻害されたが、ＩｇＧ１アイソタイプのコントロール抗体の存在下、またはＲＤＩから得られた他の抗Ｐカドヘリン抗体の存在下では、阻害されないことを示す。この阻害は、ポジティブコントロールの抗体２２５（抗ＥＧＦＲ抗体）で見られる阻害に匹敵した。これらの結果は、図１２に含まれる。
【０２７６】
これらの結果は、Ｐカドヘリンが接着分子として公知であり、そして他の研究者が、Ｐカドヘリンの発現が低い生存率に相関することを観察したのに対して、Ｐカドヘリンが細胞−細胞接触および細胞増殖の調節において２つの役割を果たし得ることを示唆する。結果的に、Ｐカドヘリンを破壊すること、またはブロックすることは、腫瘍増殖および／または腫瘍移行を阻害する。このことはまた、腫瘍細胞の他の部位への移動および／または接着を阻害し得る抗体として、転移における阻害的な役割を有し得る。
【０２７７】
（実施例９：免疫およびスクリーニングのためのカドヘリンの発現および精製）
全てのカドヘリンタンパク質についての発現構築物は、ＧａｔｅｗａｙＴＭシステム（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲによって得られた。ＰカドヘリンについてのＫＭ１２−Ｌ４細胞に由来する全てのＲＮＡ、Ｅカドヘリンについての大腸に由来する全てのヒトＲＮＡ、Ｈカドヘリンについての心臓に由来する全てのヒトＲＮＡ、およびＮカドヘリン構築物について全てのヒト脳ＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成用の鋳型として使用された。ＰＣＲ反応生成物は、Ｇａｔｅｗａｙの手順に従って、ベクターｐＤＯＮＲ２０１中に組換えられた。正確なクローンは、配列の検証後に選択された。
【０２７８】
ヒトＰカドヘリンの異なる形態に対応するｃＤＮＡ配列は消化され、そして必要条件に依存してバキュロウイルスベクターのｐＭｅｌＢａｃまたはｐＢｌｕｅＢａｃ中に挿入された。このプラスミドは、野生型のウイルスＤＮＡと共に、昆虫細胞（Ｋｉｔｔｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５６６７−５６７２（１９９０））の中で同時にトランスフェクトされた。この組換えバキュロウイルスは、プラーク（ｐｌａｑｕｅ）精製によって単離された。抗Ｈｉｓ抗体および抗Ｐカドヘリン抗体を用いたウエスタンブロット分析がタンパク質の発現を確認するために行われた。カドヘリン生成に関して、ＴＮ５細胞は、タンパク質のない培地中で、感染の多重度（ｍｏｉ）が２〜１０で適切なバキュロウイルスを用いて感染された。ＢＶ７１６で感染されたＴＮ５細胞は、感染４８時間後に収集され、細胞結合Ｐカドヘリン（図１０Ａ）を分析した。それぞれの可溶性カドヘリンは、培養培地から別個に収集され、そして精製が行われた。この可溶性カドヘリンの精製は、ＱセファロースＦＦカラムで行われた。このカドヘリンの生成は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析（図１０Ｂ）によって測定された。タンパク質のＮ末端の配列は、エドマンズ（Ｅｄｍｕｎｄｓ）分解によって確認されている。最終産物中のエンドトキシンレベルは、全てのカドヘリンについて検出未満である。カドヘリンベクターおよび組換えバキュロウイルスは、表３に要約される。
【０２７９】
ＰカドヘリンのＥＣ１ドメインを得るために、ＰＣＡＤ−ＥＣ１／Ｓａｇ融合体が哺乳動物の発現ベクターＨＢＳａｇ−ＥＣ１（Ｓ．Ｓｃｈｌｅｙｅｒ）をＤＮＡ鋳型として使用して、ＰＣＲによって生成された。このプロモーター／融合遺伝子フラグメントは、酵母発現ベクターｐＢＳ２４．１中でクローン化された。得られたプラスミドは、ＰＣＡＤ−ＥＣ１／Ｓａｇと名付けられた。このＰＣＡＤ−ＥＣ１／Ｓａｇプラスミドは、酵母ＡＤ３中に形質転換され、そして選択的培地上でプレートされた。単一のコロニー（ｃｏｌｏｎ）は選択され、そしてＰカドヘリンＥＣ１タンパク質の生成のために培養された。溶解された酵母細胞に由来するタンパク質は、ウエスタンブロットによって組織内（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）のＰカドヘリン抗体の結合部位を決定するために使用された。
【０２８０】
（実施例１０：免疫化および細胞融合）
治療的なＰカドヘリン抗体を開発するために、６〜１０週齢のトランスジェニックマウスを得る。この免疫化は、腹腔内（ＩＰ）、足蹠（ＦＰ）、または尾の付け根（ＢＯＴ）およびＩＰを介して、Ｐカドヘリンを発現する昆虫細胞ＢＶ７１６および／または可溶性タンパク質ＢＶ７０３を用いて行われた。ＩＰ免疫化およびＢＯＴ免疫化において、抗原は、初回刺激免疫のために、完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）（ＣＦＡ）を用いて、そして追加免疫のために不完全フロイントアジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）（ＩＦＡ）を用いて乳化された。全ての免疫化は、２週間間隔で５回行われる。ＦＰを介して免疫されたマウスにおいて、可溶性Ｐカドヘリンは、初回刺激免疫のために、ＴｉｔｅｒＭａｘアジュバントを用いて、そして追加免疫のためにＡｌｕｍアジュバントを用いて乳化され、２日間隔で８回行われた。
【０２８１】
動物を採血し、そしてＰカドヘリン抗血清がＥＬＩＳＡによって試験された。免疫化マウスの力価が測定され、そして比較された。その後、融合は、ＩＰを介して免疫されたマウスに関しては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）か、またはＦＰおよびＢＯＴおよびＩＰを介して免疫化されたマウスに関しては、エレクトロポレーションのいずれかによって行われる。
【０２８２】
（実施例１１：抗体の特徴付け）
融合された細胞は、ＥＬＩＳＡによって可溶性ＰカドヘリンＢＶ７０３でスクリーニングされ，そしてＦＡＣＳによって、Ｐカドヘリン発現腫瘍細胞（Ａ４３１）上でさらにスクリーニングされた。細胞表面結合ハイブリドーマは、限定希釈によって、クローン化される。他のＰカドヘリンファミリーメンバーに対する交差反応はまた、可溶性Ｅカドヘリン（ＢＶ７４４）、Ｎカドヘリン（ＢＶ７５１）、およびＨカドヘリン（ＢＶ７６７）に対するＥＬＩＳＡ、ならびにＥカドヘリン発現細胞（ＭＣＦ−７）およびＨカドヘリン発現細胞（Ｈ４６０）に対するＦＡＣＳによって試験される。
【０２８３】
これらの方法を使用して、Ｐカドヘリン細胞表面のドメイン結合を実証するクローンが得られる。３種の抗体は、細胞−細胞接触を阻害する抗体の能力を評価するためにスクリーニングされる。ＥＣ１ドメインを結合する抗体の生物学的機能が評価される。
【０２８４】
（実施例１２：遊走アッセイ）
腫瘍細胞（ＨＣＴ１１６、大腸癌細胞株）の接着および浸潤に対するＰカドヘリン特異的抗体の影響は、遊走アッセイによって試験される。Ｂｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎからのＦＡＬＣＯＮ  ＨＴＳ  ＬｕｏｒｏＢｌｏｋ  Ｉｎｓｅｒｔｓは、このアッセイで使用される。ＨＣＴ  １１６細胞は、抗Ｐカドヘリン抗体、またはコントロール抗体と共に、３０分間インキュベートされ、そして２００μｌの培地中８×１０ｅ４細胞が８μｍ孔径の挿入部分の中に詰められる。６００の培地は、底のチャンバーに添加され、ネガティブコントロールとして１％ＢＳＡ、またはポジティブコントロールとして適切な化学誘引物質（ＥＧＦまたはフィブロネクチン）が補充される。この細胞は、２２時間、３７℃、５％ＣＯ２で遊走するのを可能にする。この遊走細胞は、蛍光色素で染色され、そして蛍光リーダーによって測定される。
【０２８５】
（実施例１３：細胞内の接着アッセイ）
Ｐカドヘリン抗体はまた、細胞内接着アッセイにおける適用を有する。例えば、皮膚の線維芽細胞またはＨＵＶＥＣ細胞は、単層を形成するために培養される。Ｐカドヘリンを発現する腫瘍細胞は、赤色蛍光色素で２時間、あらかじめ標識され、ＨＢＳＳを用いて洗浄され、そして、３０分間、３７℃で、２ｍＭカルシウムを含むＨＢＳＳ中の０．２％トリプシンを用いる処理によって回収される。これらの細胞は、４℃で、３０分間、抗ＰカドヘリンｍＡｂ（４０μｇ／ｍｌ），またはコントロール抗体と共にインキュベートされ、次いでＨＢＳＳを用いて洗浄される。約５０００個の細胞が、ゼラチンコートされた、８ウェルのチャンバースライド中の皮膚線維芽細胞、またはＨＵＶＥＣ単層に添加され、そして３０分間、接着させる。非接着細胞の除去後、スライドが固定される。３つ組ウェル中の強力な視野あたりの接着細胞の数が、蛍光顕微鏡下で計数される（Ｖｏｌｂｅｒｇ  Ｔ．，Ｇｅｉｇｅｒ  Ｂ．，Ｋａｒｔｅｎｂｅｃｋ  Ｊ．，Ｆｒａｎｋｅ  Ｗ．Ｗ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１０２：１８３２−１８４２（１９８６））。
【０２８６】
（実施例１４：増殖アッセイ）
Ｐカドヘリン抗体はまた、増殖アッセイにおける適用を有する。例えば、Ａｂを用いたＰカドヘリンを発現する細胞の直接的阻害が、増殖アッセイによって、チェックされる。２００μｌの培地中の１５００〜２０００のＡ４３１細胞、またはＨＣＴ１１６細胞は、９６ウェルプレート中にプレートされ、そしてＰカドヘリン特異的抗体を伴ってかまたは伴わずに、４日間、インキュベートされる。４日目に、上清は、排除することによって除去され、そして細胞は、−８０度（Ｃ）の中に少なくとも２時間入れられる。これらの細胞は次いで、解凍され、そして細胞増殖シカントキット（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｃｙｑｕａｎｔ  ｋｉｔ）が製造者の指示書に従って、増殖速度を測定するために使用される。
【０２８７】
（実施例１５：ＡＤＣＣ／ＣＤＣ特性試験）
エフェクター機能を有する抗体は、治療的な使用に関して優れ得る。例えば、ヒトＩｇＧ１抗体は、そのＦｃレセプターに結合することによる、抗体依存的な細胞媒介による細胞毒性（ＡＤＣＣ）、および補体を固定することによる、補体依存的な細胞毒性（ＣＤＣ）を介して、癌を処置するために適用され得る。ＬＤＨ細胞毒性検出キット（ＬＤＨ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）が両方のアッセイで使用される。ＡＤＣＣ試験において、Ｐカドヘリンを発現する細胞株Ａ４３１およびＨＣＴ１１６は標的細胞として、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）はエフェクターとして、使用される。ウェル１個あたり５０００個の標的細胞は、ＰＭＢＣに関して、エフェクター対標的の比率が１００：１、５０：１および２５：１、ならびにＮＫに関して、１０：１、５：１および２．５：１でのＵ字型底部プレート中にプレートされる。これらの細胞は、４時間、同時にインキュベートされ、そして上清は収集され、ＬＤＨアッセイキットを用いて、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を測定する。ＣＤＣの特性が、ヒトＰＢＭＣ、またはヒトＮＫの代わりに、ヒトの補体を添加することを除けば、ＡＤＣＣと同一の方法で試験される。
【０２８８】
（実施例１６：足場非依存的な細胞生存度アッセイ）
Ｐカドヘリン抗体はまた、足場依存的な細胞アッセイに適用を有する。例えば、このようなアッセイにおいて、細胞は、抗体処理を伴ってかまたは伴わずに、１％アガロースでコーティングされたシャーレ中で培養される。生存度がトリパンブルー排除アッセイ（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）によって、３つ組のサンプル中で測定され、そして生存指数が以下のように算定された：生存指数＝生存細胞数／全ての細胞数。
【０２８９】
（実施例１７：ＡＫＴ／ＰＫＢシグナル伝達チェック）
Ｐカドヘリンは、抗アポトーシスタンパク質を活性化することによって、腫瘍細胞の生存を促進することに潜在的に関連し、そして引き続いてＢカドヘリンを安定化させそしてアポトーシス前のＢａｄ因子を不活化する。抗Ｐカドヘリン抗体がＡｋｔ／ＰＫＢ活性化に影響するか否かを測定するために、コンフルエントな細胞は、終夜血清飢餓させ、ＥＧＴＡ（最終濃度、４ｍＭ）で３０分間、処理され、そしてＣａ２＋依存的なＰカドヘリンで媒介された接着を分裂される。この培地は次いで、２ｍＭカルシウムを含む無血清培地と置換され、そしてカルシウム回復の前に１０分間、４０μｇ／ｍｌで、Ｐカドヘリン特異的なブロック抗体、またはコントロール抗体と共にインキュベートされる。カルシウム回復の３０分後、細胞が溶解され、そしてＡｋｔ／ＰＫＢおよびホスホ−Ａｋｔ／ＰＫＢ（Ｓｅｒ−４７３）に対する抗体を用いて、免疫ブロットされる（Ｇａｎｇ  Ｌｉ，Ｋａｐａｅｔｔｕ  ＳａｔｙａｍｏｏｒｔｈｙおよびＭｅｅｎｈａｒｄ  Ｈｅｒｙｌｎ，Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｃｅｕｌｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：３８１９−３８２５（２００１））。
【０２９０】
（実施例１８：細胞周期チェックポイントアッセイ）
Ｐカドヘリンを発現する腫瘍細胞は、６ウェルプレートの中でプレートされ、そして抗Ｐカドヘリン抗体と共に、２４時間、インキュベートされる。この細胞は次いで、回収され、そしてアジ化ナトリウムを含むＰＢＳを用いて、洗浄される。細胞周期分布、および細胞のアポトーシスＤＮＡの特徴は、ＲｎａｓｅＡの存在下で、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって測定され、そしてフローサイトメトリーによって分析される。
【０２９１】
（実施例１９：インビボでの評価）
上記されるように、Ｐカドヘリン抗体の効果は、インビボでのアッセイに限局され得る。このＰカドヘリン特異的抗体は、Ｐカドヘリンを発現する腫瘍を阻害するためにインビボで試験される。大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、および類表皮細胞株ＫＭ１２は、ヌードマウスにおける異種移植片の腫瘍に使用される。腫瘍を有するマウスは、ｉｐ注射を介して投与されるＰカドヘリン特異的抗体を用いて、処理される。従って、腫瘍体積および動物の生存が、モニターされる。
【０２９２】
【表５】
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【０２９３】
本発明は、以下の図面において例示される。
【図面の簡単な説明】
【０２９４】
【図１】図１は、２つの抗Ｐ−カドヘリン抗体（Ｚｙｍｅｄより得られたＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９、抗Ｐ−カドヘリン抗体およびＲＤＩより得られたＲＤＩ−ＰＣＡＤＨＥＲ  ａｂｍ、抗Ｐ−カドヘリン抗体）およびＩｇＧ１抗体に適合する無関係の（コントロールの）アイソタイプを用いて測定されたＡ−４３１細胞およびＳＷ６２０細胞の表面上でのＰ−カドヘリンの発現を示す。
【図２】図２は、Ａ−４３１細胞培養物中の細胞−細胞接着に対する、２つの抗Ｐ−カドヘリン抗体（Ｚｙｍｅｄより得られたＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９、抗Ｐ−カドヘリン抗体およびＲＤＩより得られたＲＤＩ−ＣＡＤＨＥＲ  ａｂｍ、抗Ｐ−カドヘリン抗体）およびＩｇＧ１抗体に適合する無関係の（コントロールの）アイソタイプの効果を示す。
【図３】図３は、Ａ−４３１細胞培養物およびＳＷ６２０細胞培養物の増殖に対する２つの抗Ｐ−カドヘリン抗体（Ｚｙｍｅｄより得られたＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９、抗Ｐ−カドヘリン抗体およびＲＤＩより得られたＥＤＩ−ＰＣＡＤＨＥＲ  ａｂｍ、抗Ｐ−カドヘリン抗体）およびＩｇＧ１抗体に適合する無関係の（コントロールの）アイソタイプの効果を示す。
【図４】図４および図５は、異なる上皮上のＰ−カドヘリンおよびＥ−カドヘリンの発現に関するＩＨＣ分析の結果を含む。
【図５】図４および図５は、異なる上皮上のＰ−カドヘリンおよびＥ−カドヘリンの発現に関するＩＨＣ分析の結果を含む。
【図６】図６は、種々の正常な組織上のＰ−カドヘリンの発現に関するＩＨＣ分析の結果を含む。
【図７】図７は、いくつかの正常な胸部および癌性の乳癌上のＰ−カドヘリンの発現に関するＩＨＣ分析の結果を含む。
【図８】図８は、正常な結腸、腫瘍結腸、および転移結腸上のＰ−カドヘリンの発現に関するＩＨＣ分析の結果を含む。
【図９】図９は、ヒト結腸癌モデルにおいてＰ−カドヘリンを検出したＩＨＣ分析の結果を含む。
【図１０】図１０は、バキュロウイルス系におけるＰ−カドヘリンの発現を示す。
【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月18日(2005.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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