(57)【要約】本発明は、核移植により、体細胞由来の胚幹細胞（体細胞核によりエンコードされている）、ES細胞様細胞、その他の種類の胚由来幹細胞を得るプロセス、並びに前記幹細胞を様々な種類の分化細胞に誘導するプロセスを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞の核移植により、胚幹細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞を調製する方法であって、
I.     哺乳類の細胞又は細胞核を除核卵母細胞に移植してnt株を得るステップ、
II.    得られた前記nt株を活性化するステップ、
III.   前記活性化されたnt株を培養し、様々な着床前段階のnt株を得るステップ、
IV.   ２細胞期よりも成長した発育段階のnt株から、胚幹細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞を単離するステップ、
を包含する方法。
【請求項２】
前記ドナー細胞が、ヒトの体細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記卵母細胞が、哺乳類又は両生類由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記卵母細胞が、分裂期の中期、望ましくは第２分裂中期にある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記卵母細胞が、ヒト絨毛性ゴナドトロピンの注射後２４時間以内に除核される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記得られたnt株が、室温培養によって又は活性化剤の使用によって活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記活性化剤が、マンニトール電気融合溶液、スクロース電気融合溶液、ソルビトール電気融合溶液、リン酸緩衝液からなる群から選択され、より好ましくはスクロース電気融合溶液である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記活性化された核移植株が、RD培地、M199培地、DMEM培地からなる群から選択される培地、より望ましくはRD培地内で培養され、例えば２〜４細胞期、８細胞期、桑実胚期、胚盤胞期、孵化胚盤胞期をはじめとする様々な着床前段階のnt株が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記活性化された核移植株が、RD培地、M199培地、DMEM培地からなる群から選択される培地で培養され、多数の種類の細胞、例えば顆粒細胞、卵管細胞、子宮細胞及びSTO（ネズミ線維芽細胞）細胞と共培養系を形成し、例えば２〜４細胞期、８細胞期、桑実胚期、胚盤胞期、孵化胚盤胞期をはじめとする様々な着床前段階のnt株が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
２細胞成長期よりも成長したnt株を培養し、適切な条件下でntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞を単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ntES細胞、前記胚幹様細胞、又は前記その他の種類の胚由来幹細胞を培養するために使用される培地が、限定はしないが、DMEM培地あるいはノックアウト培地、好ましくはDMEM培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が、１つ又は複数の他の要素を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記他の要素が、白血病阻害因子（LIF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、及びForskolinから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法による、体細胞の核移植によって得られた核移植胚幹細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞。
【請求項１５】
核移植胚幹細胞、又は胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞由来の分化細胞を生産する方法であって、
I. 体細胞核移植により胚幹細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞を得るステップ、
II. ステップIで得られた細胞を適切な条件下で特定の種類の細胞に分化するよう誘導するステップ、
を包含する方法。
【請求項１６】
前記ntES細胞、前記胚幹様細胞、又は前記その他の種類の胚由来幹細胞が、RA、DMSO、H2O2、β−メルカプトエタノールからなる群から選択される試薬を含有する培地内で誘導することができる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記胚幹細胞、又は前記胚幹様細胞、又は前記その他の種類の胚由来幹細胞（誘導していない前記細胞、又は自然誘導もしくは生化学的誘導後の前記細胞を含む）が、種々の特定の細胞に応じて様々な培地にて培養される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
個々に様々な成長因子を含有する又はこれらの組み合わせを含有する全ての培地が、胚幹細胞又は胚幹様細胞又はその他の種類の胚由来幹細胞を誘導する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ntES細胞、前記胚幹様細胞、又は前記その他の種類の幹細胞が、動物又はヒトの特定部分に移植され、体環境において種々の種類の細胞に分化するよう誘導される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法により得られた核移植胚幹細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞。
【請求項２１】
ヒトの分化細胞であり、且つ核DNAが移植されたヒトの体細胞によりエンコードされている、請求項２０の分化細胞。
【請求項２２】
２細胞期以上のnt株、及びその核移植胚幹細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞から誘導を介して得られる、請求項２１に記載の分化細胞。
【請求項２３】
任意の部分、例えば核DNA、ミトコンドリア、RNA、細胞器官、細胞膜などを、人工的に変性又は変化させることができる、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の分化細胞。
【請求項２４】
人工的に付加された分子を体内へ運ぶ担体として使用される、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２５】
薬物の検定及び評価に使用される、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２６】
請求項２０に従って調製されたヒトの分化細胞を患者に投与することからなる治療法。
【請求項２７】
前記細胞移植療法が、限定はしないが、例えばパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄異常又は損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、肝臓疾患、糖尿病、心臓疾患、軟骨異常又は損傷、火傷、足の壊疽、血管疾患、尿路疾患、AIDS、癌をはじめとする病気からなる群から選択される疾病又は症状を治療するのに効果がある、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ヒトの体細胞又はその核を、除核した動物の卵母細胞、好適な実施例においてはウサギの除核卵母細胞、に移植することによる、種々の着床段階の核移植(nt)株（nt株）からの、体細胞由来の胚幹細胞（S-ES細胞、核移植胚幹細胞、ntES細胞とも呼ばれる）、又は胚幹様細胞もしくはその他の種類の胚由来幹細胞の調製に関する。本発明は、より詳細には、ヒトの細胞又は細胞核を、除核した動物の卵母細胞、より好適にはウサギ科の卵母細胞、最適には除核したニュージーランドウサギの卵母細胞、に移植することによる、ヒトのntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞の調製に関する。
【０００２】
本発明はさらに、分化細胞の誘導における、ntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞の使用に関する。分化の有無にかかわらず、ntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の胚由来幹細胞は変性することができ、DNA、RNA、タンパク質をはじめとする様々な種類の生理活性分子をヒトの体内へ導入する細胞キャリアとして使用し得る。ntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞は、変性の有無にかかわらず、疾病の治療及び診断のために、任意の種類の分化細胞、組織、器官の生産に使用することができる。また、その遺伝子の変化の有無にかかわらず、当該細胞はそれ自体で核移植における核ドナーとして使用することもできる。
【背景技術】
【０００３】
核移植には、除核卵母細胞へのドナー細胞又は細胞核の移植が包含される。得られたnt株は、種々の着床前段階、あるいはさらに生命を有する動物へ成長し得る。この方法は、１９５０年代終わりに、両生類に適用した場合に成功することが見出された。BriggsとKingは、卵母細胞にトノサマガエルの腸上皮の核を移植することによって核移植したカエルを得た。核移植は、１９８０年代終わりまで哺乳類に適用されることはなかった。核移植では、胚割球、内細胞塊、末端胚細胞（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃｅｌｌｓ）をはじめとする多くの種類の体細胞が、核ドナー細胞として核移植実験に使用された（Collasらによる、"Mol. Reprod. Dev.," 第３８号、p. ２６４−２６７、１９９４年；Keeferらによる、"Biology of Reproduction," 第５０号、p. ９３５−９３９、１９９４年；Simsらによる、"PNAS," 第９０号、p. ６１５５−６１５９、１９９３年）。
【０００４】
成体のヒツジの乳腺をドナー細胞として用いて、イギリスのWilmutら（"Nature,"  １９９７年、第３８５号、p. ８１０−８１３）は、体細胞核移植によって初の生きた子ヒツジを作り出した。１９９８年には、アメリカで連続的なネズミ体細胞核移植が成功裏に行われた（Wakayamaらによる、"Nature,"  第３９４号、p. ３６９−３７４、１９９８年）。１９９９年には、ネズミの胚幹細胞（ES）の核移植が行われた（Teruhikoらによる、"PNAS," 第９６号、p. １４９８４−１４９８９、１９９９年）。成体の体細胞を用いた核移植の成功は、技術の進歩だけでなく、概念における進歩でもあり、発育を再開するように再プログラムされれば、高度に分化した成体の体細胞核は新しい個体を形成し得る可能性が示された。
【０００５】
１９９９年に、Dominkoらは、様々な動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、サル、及びウサギ）から得た体細胞核を、ウシ科の卵母細胞に注射し、nt株を発育させたが、その各々がある程度まで成長した（"Biology of Reproduction," 第６０（６）号、p. １４９６−１５０２、１９９９年）。これらの実験によって、哺乳類の体細胞核は、核ドナーとは異なる種の卵母細胞により活性化され、nt株を形成し得ることが示された。そのようなnt株はあらゆる着床前段階へ成長し得る。ある種の卵母細胞が異なる種の体細胞核を再プログラムすることができるという発見によって、種々の哺乳類種において再プログラムを制御する機構が非常にしっかりと保存されていることが示唆される。
【０００６】
核移植技術の開発が広く行われている一方で、ES細胞育成の進歩もまた近年世界中で目立ってきている。ES細胞の育成に関わる基本的操作及び基本的特徴及びその用途が、１９８１年のネズミES細胞株の確立（Evansらによる、"Nature," 第２９号、p. １５４−１５６、１９８１年；Martinらによる、"PNAS," 第７８号、p. ７６３４−７６３８、１９８１年を参照）以来、当分野において周知である。ES細胞は、それらの培養を線維芽細胞の栄養支持細胞層において行えば（Evans他著）、又はそれらの培養を分化阻害状態で行えば（Smithらによる、"Development Biology," 第１２１号、p. １−９、１９８７年）、未分化の、無限に増殖する状態に保つことができる。
【０００７】
ES細胞は、胚細胞をはじめとする体のあらゆる種類の細胞に成長する可能性を有する。ES細胞は、適切な誘導条件下で、様々な特定の種類の細胞に分化し得る。胚幹細胞に関しては、体外で、例えば造血幹細胞（Ronaldらによる、"PNAS," 第９２号、p. ７５３０−７５３４、１９９５年）、神経細胞（Dinsmoreらによる、"Theriogenology," 第４９号、p. １４５−１５１、１９９８年）、筋肉細胞（Reubinoffらによる、"Nature Biotechnology," 第１５（４）号、p. ３９９−４０４、２０００年）、含脂肪細胞（Dani C Smithらによる、"J Cell Sci,"  第１１０号、p. １２７９−１２８５、１９９７年）、内皮細胞（Vittetらによる、"Blood," 第８８（９）号、p. ３４２４−３２３１、１９９６年）など、様々な種類の細胞へ分化するよう導くことに成功している。ES細胞から分化した筋様細胞などの特定の種類の細胞は、その自然な同等の種類の細胞、即ち筋肉細胞に似た性質を示し、したがってES細胞から分化した細胞は、疾患の治療（細胞、組織、又は臓器移植）に使用することができる。
【０００８】
ネズミES細胞の可能性を考慮して、大型哺乳類のES細胞を培養しようという試みがなされてきた。何故なら当該細胞の育成は、科学的研究において意義があるだけでなく、医療にも適用できるからである。例えば、ヒトのES細胞は、疾患の治療のために、あらゆる特殊化した細胞に導くことができる。その増殖と分化の可能性により、ES細胞は、遺伝子組み換えの基盤をもたらした。大型動物のES細胞は、様々な生物学的製品を生産するために遺伝子を組み替えることができる。
【０００９】
大型哺乳類からの、ES細胞又は胚幹様細胞の単離に関しては既に報告がある。例えばNotarianniら（"J. Reprod. Fert., Suppl.," 第４３号、p. ２５５−２６０、１９９１年）は、豚とヒツジの胚盤胞から得た内細胞塊の初代培養における細胞が、ES細胞に似たある形態的及び成長的特徴を示すと報告している。Chen RLら（"Biology of Reproduction," 第５７（４）号、p. ７５６−７６４、１９９７年）及びWiannyら（"Theriogenology," 第５２（２）号、p. １９５−２１２、１９９９年）は、それぞれ豚の胚盤胞からの豚のES細胞の単離に関して報告している。
【００１０】
Stekelenburg-Hamersらは、ウシ胚盤胞の内細胞塊からの胚幹様細胞の単離に関して報告している（"Mol. Reprod.," 第４０号、p. ４４４−４５４、１９９５年）。
【００１１】
Thomsonらは、霊長類のサルからES細胞を単離することに成功したと報告している（"PNAS," 第９２（１７）号、p. ７８４４−８、１９９５年）。
【００１２】
Thomsonらは、ヒトのES細胞株を確立することに成功しており（"Science," 第２８２（６）号、p. １１４５−１１４７、１９９８年）、これは幹細胞研究において重要な進歩である。これらの細胞株は、ヒトの発育に関する研究において重要なツールとして使えるだけでなく、医療分野においても広範な用途の可能性がある。例えば、（１）ヒトのES細胞株を特定の種類の細胞に育成、分化して、患者のニーズに合わせることができる。これらは細胞又は臓器移植治療のための細胞源となる。細胞移植によって、多くのヒトの疾患を治療できる可能性がある。医療用途のほかに、（２）ヒトのES細胞株は新薬の検定と薬の安全性検査を円滑にする可能性も有している。
【００１３】
しかし、ヒトのES細胞から分化した細胞は、異なるMHC型を持つ個人間の移植に使用する際、免疫拒否反応を引き起こす可能性があり、したがって患者は毒性のある免疫抑制剤を摂取しなければならない。現在、患者の体細胞を用いて当該患者の免疫システムと適合するES細胞を得る方法はない。
【００１４】
Munsieらは、体細胞核移植により取り出した胚盤胞から得たネズミのES細胞を単離したことを報告している（"Current Biology," 第10号、 p. 989-992、2000年）。Wakayamaらは、体外で様々な種類の特定の細胞に誘導し得るネズミのES細胞を、体細胞核移植により取り出した胚盤胞を培養したものから得たことを報告している（"Science," 第２９２（５５１７）号、p. 740-743、2001年）。Wakayamaらが行った研究の結果は、ES細胞が、体細胞核移植により核移植胚から単離できることを示唆している。体細胞由来のntES細胞は、多能性で、正常な接合体から取り出したES細胞として、あらゆる特定の種類の細胞へ分化することができる。
【００１５】
前述のこれら全ての科学者が収めた成功により、疾患の治療、即ち治療クローニング、への新たな方法が確立した。これは、患者の体細胞が核移植により再プログラムすることができ、ntES細胞を生産することができることを示唆するものである。得られたntES細胞はさらに、当該患者が必要とする特定の種類の細胞に分化する。ntES細胞とその分化した後代は、当該患者と同じ遺伝子タイプを有しており、したがって当該患者に移植される際に当該患者の免疫システムは拒否反応を起こさないのである。治療クローニングは、移植医療で一般に見られる免疫拒否反応の問題を解決する方法をもたらす。
【００１６】
WO 98/07841（米国マサチューセッツ州のRobeらにより1998年出願）は、ヒトのリンパ球及び口の上皮からウシの卵母細胞への、異質遺伝子の核移植から、３０個の２細胞期胚と、６個の４細胞期から１６細胞期の胚と、１個の１６細胞期から４００細胞期の胚の単離に関して開示している。しかしながら、この研究は、胚と当該胚から取り出した細胞コロニーが、ウシのゲノムDNAでなく、ヒトのゲノムDNAでエンコードされていることを実証するいかなる証拠も提示できていない。胚盤胞は、ウシの卵母細胞の単為生殖により容易に作り出すことができる。さらに、当該特許出願は、該コロニーが、ヒトのゲノムDNAでエンコードされ、ヒト又は霊長類の幹細胞の特徴をわずかでも示したということを実証するいかなる証拠も提示していない。
【００１７】
本願の提出以前は、ntES細胞がヒトの体細胞核移植により得られるという報告も、ヒトの特定の種類の細胞がそこから分化できるという報告もなされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明者は、成体の体細胞又は細胞核を、除核した哺乳類（ヒトを含む）の卵母細胞へ移植することにより、核移植(nt)株（nt株）が得られることを見出した。さまざまな着床前段階のnt株から、核移植胚幹細胞（ntES細胞）を得ることができる。当該ntES細胞は、受精した接合体から得たヒトのES細胞に似た特徴及び分化の可能性を有している。この結果は、ヒトの体細胞核が、除核卵母細胞への移植後、再プログラムでき得るという初の証拠であった。同結果はまた、ヒトの胚幹細胞が、胚盤胞期のnt株からも得られることを証明した。
【００１９】
同結果はさらに、異種間の核移植、例えばヒトの細胞又は細胞核を、ウサギ科動物、例えばウサギの除核卵母細胞へ移植することによって、nt株を生産し、それを適切な条件下で培養し、ドナー核がエンコードされた様々な発育段階のnt株を生み出すことの実現可能性も証明した。
【００２０】
したがって、本発明の目的は、ntES細胞、胚幹様細胞又はその他の種類の胚由来幹細胞を得る方法を提供することである。当該方法は、核移植によってnt株を得るためにヒトの体細胞核を再プログラムすること、種々の着床前段階のnt株からntES細胞、胚幹様細胞又はその他の種類の胚由来幹細胞を単離すること、からなる。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、異種間における体細胞核移植の改良された方法を提供することである。
【００２２】
本発明の詳細な目的は、哺乳類種（ヒトを含む）の細胞又は細胞核の核ドナーとは異なる種の除核卵母細胞への移植を包含する、ntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞を生産する新たな方法を提供することである。
【００２３】
本発明のもう一つの目的は、細胞、例えばヒト成体の体細胞又は細胞核の、同種の除核卵母細胞、例えばヒトの卵母細胞への移植を包含する、ヒトのntES細胞、胚幹様細胞又はその他の種類の胚由来幹細胞を生産する新たな方法を提供することである。
【００２４】
本発明のもう一つの目的は、ヒトの細胞又は細胞核を、除核卵母細胞、例えばウサギ科動物の除核卵母細胞へ移植することによって、ヒトのntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞を生産する新たな方法を提供することである。
【００２５】
本発明のもう一つの目的は、ヒトの細胞又は細胞核の、除核卵母細胞、例えばウサギの除核卵母細胞への移植を包含する、ntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞を生産する新たな方法を提供することである。
【００２６】
本発明のより詳細な目的は、受精胚から得た胚幹細胞と同様の方法に制限されることなく、無限に増殖する可能性を有するntES細胞株を得ることであり、それは、霊長類のES細胞の全ての特異マーカとなり、且つ外胚葉、中胚葉、内胚葉のあらゆる種類の細胞へ分化する可能性を有するであろう。
【００２７】
本発明の詳細な目的は、ドナーの免疫システムに適合するntES細胞株を得ることである。ntES細胞、及び当該ntES細胞から取り出した細胞、組織、臓器は、当核ドナーのゲノムによりエンコードされ、したがってntES細胞、及び当該ntES細胞から取り出した細胞、組織、臓器を、当核ドナー、例えば患者、に再移植しても、免疫拒否反応は起こらない。
【００２８】
本発明のより詳細な目的は、ヒトのntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｏｒｏの誘導システムをはじめとする特定の誘導環境において、筋肉細胞、神経細胞、線維芽細胞、含脂肪細胞をはじめとする特定の種類の細胞へ誘導することである。
【００２９】
本発明のもう一つの詳細な目的は、ヒトのntES細胞又は胚幹様細胞又はその他の種類の胚由来幹細胞及びそれらが分化した後代を、疾患の治療及び診断に用いることである。
【００３０】
本発明のもう一つの詳細な目的は、ヒトのntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞及びそれらが分化した後代を、分化したヒトの組織又は臓器の構築のために用いることである。
【００３１】
本発明のもう一つの目的は、体細胞核移植により得たntES細胞、又は胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞、又は分化した細胞、組織もしくは臓器を、移植医療のために提供することである。かかる治療には、例えば、限定はしないが、パーキンソン症候群、ハンチントン症候群、アルツハイマー症候群、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝臓疾患、心臓疾患、軟骨置換（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、火傷、血管疾患、尿路疾患をはじめとする疾患及び負傷の治療や、免疫不全症、骨髄移植、癌などの治療が含まれる。
【００３２】
本発明のもう一つの詳細な目的は、あらゆる種類の生理活性分子、変性DNA、RNA又はタンパク質などをヒトの体に輸送するために、ヒトのntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞及びそれらが分化した後代を、細胞キャリアとして用いることである。当該細胞は、変性の有無にかかわらず、疾患の治療及び診断をはじめとする医学的療法に使用するあらゆる種類の分化細胞、組織、臓器の作製に使用することができる。
【００３３】
本発明のもう一つの目的は、様々な疾患の治療、特に、先に指定した疾患及び傷害の治療及び／又は予防のために、ヒトのntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞及びそれらが分化した後代を用いることである。
【００３４】
本発明のもう一つの目的は、変性されたヒトntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞及びそれらが分化した後代を、核移植における核ドナーとして用いることである。
【００３５】
本発明のもう一つの詳細な目的は、細胞分化の研究、並びに薬物検査及び毒性評価において、ヒトntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞及びそれらが分化した後代を用いることである。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
本発明は、ntES細胞、胚由来幹細胞、その他の種類の胚由来幹細胞を調製する方法を提供し、それは、
(i) 核ドナーである細胞又は細胞核を除核卵母細胞に移植してnt株を形成するステップ、
(ii)  得られた核移植株を活性化するステップ、
(iii)  前記核移植株を様々な着床前段階にまで培養するステップ、
(iv)  2細胞期よりも成長した発育段階にあるnt株からのドナー核によってエンコードされている核移植胚幹細胞、肺幹様細胞、その他の種類の胚由来幹細胞を得るステップ、
を包含する。
【００３７】
本発明は、ntES細胞を、多くの種類の特定の細胞へ誘導するためのさらなる方法を提供し、それには、
(i)  核移植によって、再プログラムされた体細胞から、胚幹細胞、胚幹様細胞、その他の種類の胚由来幹細胞を作製するステップ、
(ii)  適切な条件下で、分化細胞へと分化するよう上記細胞を誘導するステップ、
が包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明の上述の及びその他の目的、利点及び特徴に関しては、以下の本発明の好適な実施例に関する詳細な説明、及び添付の特許請求の範囲を参照することでより明確に理解されるであろう。
【００３９】
本発明では、核移植（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（nt）と核移植（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）という用語を互いに交換して用いる。
【００４０】
本発明では、体細胞胚とnt株という用語を互いに交換して用いる。
【００４１】
本発明では、核移植胚幹細胞（ntES細胞）と体細胞分化胚幹細胞（S-ES）という用語を互いに交換して用いる。
【００４２】
本明細書の「核移植」という用語は、ドナー細胞又は細胞核を、除核卵母細胞へ移植することを意味する。得られるnt株は、様々な着床前段階（例えば胚盤胞）へと培養されるか、又はヒト以外の生産動物（ｌｉｖｅ−ｂｏｒｎｅ  ａｎｉｍａｌｓ）へのさらなる成長を許される。核移植では、ヒト又は動物、例えば霊長類、有蹄動物、両生類、齧歯類などの動物、の細胞もしくは細胞核を全て核ドナーとして使用できる。霊長類、両生類、齧歯類などをはじめとする他種からの卵母細胞と同様に、ヒト卵母細胞も、核移植に使用することができる。
【００４３】
本明細書の「同種核移植」という用語は、ドナー細胞又は細胞核を、同じ種の除核卵母細胞へ移植することを意味する。得られるnt株は、様々な着床前段階へと培養されるか、又は生産動物へのさらなる成長を許される。
【００４４】
本明細書の「異種間の核移植」という用語は、ドナー細胞又は細胞核を、当核ドナーとは異なる種の除核卵母細胞へ移植することを意味する。得られるnt株は、様々な着床前段階へと培養されるか、又は生産動物へのさらなる成長を許される。
【００４５】
本明細書の「核移植（nt）株（nt株）」という用語は、核ドナーと除核卵母細胞との組み合わせから得られる株を意味する。核ドナーと除核卵母細胞とは、同じ種から、又は異なる種から得ることができる。
【００４６】
本明細書の「体細胞胚」という用語は、２細胞期、４細胞期、８細胞期、桑実胚期、胚盤胞期、孵化胚盤胞期をはじめとする様々な着床前段階のnt株を意味する。
【００４７】
本明細書の「体細胞」という用語は、胚細胞を除く、成人の体内にある全ての種類の細胞を意味する。
【００４８】
哺乳類に関しては、接合体は、２細胞期、４細胞期、８細胞期、桑実胚期、胚盤胞期、孵化胚盤胞期と順に成長する。胚盤胞内にある内細胞塊が胚本体であり、それは、胚の全細胞を生み出す。ES細胞は、内細胞塊の細胞に相当し、したがって多能性で、生殖細胞系列をはじめとする成長する胎児のあらゆる細胞へと成長することができる。
【００４９】
前記内細胞塊から得たヒトES細胞は、一種の多能性幹細胞であり、それは、生殖細胞系列の細胞をはじめとする、あらゆる種類の細胞へと分化するよう誘導することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて耐久性に優れる。長期培養において、これらの細胞は、正常な核型を維持する。当該細胞は、SSEA-1には陰性、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81には陽性といった、特異マーカとなる。これらは、アルカリホスファターゼに対しては陽性である。
【００５０】
ヒトの細胞核をヒト以外の哺乳類の卵母細胞に移植して得られたヒトの核移植胚幹細胞は、受精した接合体から単離したES細胞と類似の特性を有する。ヒトntES細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無限に繁殖し、且つ正常な核型を維持することができる。これらの細胞は、三胚葉全ての細胞への分化を誘導することができる。未分化のヒトntES細胞は、霊長類ES細胞に特徴的なマーカとなり、それは、SSEA-1には陰性で、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81には陽性であり、アルカリホスタファーゼに対しても陽性である。
【００５１】
本明細書の「胚幹様細胞」という用語は、上記のようなヒト胚幹細胞の特徴の一部を有する、2細胞期よりも成長したnt株から得た細胞塊を意味する。
【００５２】
本明細書の「他の種類の胚由来幹細胞」という用語は、胚幹細胞と胚幹様細胞を除く、様々な着床前段階のnt株から得た全ての細胞を意味する。本明細書の「分化細胞」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工的に分化するよう誘導され得るntES細胞、胚幹様細胞、その他の種類の胚由来幹細胞から分化した細胞を意味する。
【００５３】
好ましい実施形態では、ウサギなどの適切な小動物を、核移植の卵母細胞ドナーとして使用する。これらの動物を適切な動物小屋で飼育することにより、これらの動物は、標準的な食事を与えられ、より容易に管理され、それによって低コストとなる。さらに、これらのウサギを、病気にかからずSPF（特定病原体を持たない）状態に管理することもより容易であろう。人工ホルモンをウサギに注射してから４日後に、核移植実験用の約30個の卵母細胞が得られる。ウサギの自然発情期間は、７〜９日である。
【００５４】
本発明の発明者は、ヒト細胞の核移植によって核移植株が得られること、詳細には、ヒトの線維芽細胞をウサギの除核卵母細胞に移植することによって様々な発育段階のnt株が得られること、を発見した。
【００５５】
ヒトの細胞核がウサギの卵母細胞により効果的に再プログラムされるという事実から見て、ヒトの体細胞をウサギ以外の他の動物種（例えば有蹄動物）の卵母細胞へ移植することでもnu株を得ることが可能と予想することは理にかなっている。他の動物源からの卵母細胞も適しているはずである。例えば、ヒト以外の霊長類、両生類、齧歯類などから得た卵母細胞である。さらに、同様の方法を用いて、ヒトの細胞又は核を、ヒトの卵母細胞に移植し、得られた胚盤胞を用いてntES細胞を作り出すことが可能であろう。
【００５６】
したがって、広い意味で、本発明は、ヒトあるいは動物の細胞又は細胞核を核ドナーとは異なる種の除核卵母細胞に移植することによって、胚幹細胞又は胚幹様細胞又は胚由来幹細胞を単離するのに用いるnt株を得ることに関する。例えば、本発明は、ヒトの細胞又は細胞核を他の種（例えば齧歯類）の除核卵母細胞に移植してnt株を生産することを包含しており、当該nt株は、桑実胚期、胚盤胞期、孵化胚盤胞期をはじめとする様々な着床前段階のnt株へと成長することができる。様々な着床前段階のnt株は、治療クローニング用の胚幹細胞、胚幹様細胞、その他の種類の胚由来幹細胞の単離に有用である。
【００５７】
本発明の発明者は、胚盤胞段階のnt株を生産するためにヒトの体細胞核を動物の除核卵母細胞に移植することで核移植株が得られることを発見した。その後、ntES細胞は、胚盤胞期のnt株から単離することができる。これらの結果により、異種間の核移植から得られる胚盤胞は、受精した接合体と同様の胚幹細胞株を発生させる機能を有することが実証された。
【００５８】
異種間の核移植で得られたntES細胞株は、長時間、栄養支持細胞層上で培養することができ、３０継代以上、継代することができる。得られた細胞は、外胚葉、中胚葉、内胚葉を含む、３つ全ての胚葉に分化する機能を有するだけでなく、筋細胞、含脂肪細胞、神経細胞、線維芽細胞などをはじめとする多くの種類の分化細胞に分化する機能も有している。
【００５９】
これらの発見は、移植医療における免疫システムの拒絶反応問題の解決において、極めて重要である。当技術分野で周知のように、元の臓器、細胞もしくは組織が適切に機能しない場合、それらの機能に取って代わる又は同機能を改善するために、新しい臓器、細胞もしくは組織を使用することができる。例えば、腎臓が正常に機能しない場合は腎臓移植を行うことができ、また、腫瘍の治療においは、消耗した造血幹細胞を取り替えるために他の人間の造血幹細胞を用いることができる。臓器提供者と受容者との間のMHC遺伝子の不一致により、患者に移植された臓器、細胞もしくは組織に対して、受容者の免疫システムが拒否反応を起こすことが、移植医療において数十年もの間深刻な問題であった。近年、科学者たちは、免疫システムの拒否反応の解決を目的とした治療クローニング構想を提示した。体細胞を核移植により再プログラムすることで、ntES細胞を単離するのに必要なnt株を得ることができる。その後、ntES細胞は、患者が必要としている臓器、組織もしくは細胞に分化するよう誘導され、再度患者に移植することができる。得られる細胞、組織もしくは臓器は、患者自身のゲノムによりエンコードされており、「自己」として認識される可能性が高いので、治療クローニングから得られる細胞、組織もしくは臓器の移植は、免疫システムの拒否反応を起こさないはずである。本発明の発明者は、本発明において以下を見出した。
(i)  ntES細胞株は、体細胞の核移植によって、ヒトの体細胞核から得ることができる。
(ii)  ntES細胞株は、受精した接合体から得た従来のヒトES細胞と同様、ｉｎ  ｖｉｖｏで長時間増殖することができる。
(iii)  nt細胞は、外胚葉、中胚葉、内胚葉を含む、３種全ての胚葉細胞に分化する可能性を有する。これらの発見により、治療クローニングが、事実上実現可能だということが実証された。本発明の発明者はさらに、ヒトの体細胞は、ヒト以外の哺乳類の卵母細胞、望ましくはウサギの卵母細胞により、効果的に再プログラムされることを見出した。
【００６０】
従って、広い意味で、本発明は、ヒトあるいは動物の細胞又は細胞核を、核ドナーとは異なる種の除核卵母細胞へ移植することによって、ntES細胞を単離するための様々な着床前段階のnt株を得ることを包含している。
【００６１】
ヒト細胞核移植技術
核移植（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）法又は核移植（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）法は、発明の背景技術にて引用した文献（特に、Wilmutらによる、"Nature,"  第３８５号、p. ８１０−８１３、1997年；Campbellらによる、"Biology of Reproduction," 第４９（５）号、p. ９３３−９４２、1993年；Collasらによる、"Mol. Reprod. Dev.," 第３８号、p. ２６４−２６７、1994年；Kefferらによる、"Biology of Reproduction," 第５０号、p. ９３５−９３９、1994年；Simsらによる、"PNAS," 第９０号、p. ６１５５−６１５９、1993年；国際公開第９４／２６８８４号、国際公開第９４／２４２７４号、国際公開９０／０３４３２号を参照。参照することで、本明細書にこれらの全てを取り入れることとする。）などの多くの文献において説明されている。
【００６２】
核ドナー
本発明では、核移植のドナーとして用いる細胞は、ヒトの細胞、望ましくはヒトの線維芽細胞から得られる。
【００６３】
ヒトあるいは動物の細胞、好ましくは体細胞は、当技術分野で周知の方法にしたがって得ることができ、培養することができる。本発明に有用であるヒトや動物の細胞として、例えば、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、表皮ケラチン細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（B及びTリンパ球）、有核赤血球、マクロファージ、単核細胞、線維芽細胞、心筋細胞、及びその他の筋細胞が挙げられる。さらに、核移植に使用し得るヒト細胞は、他の臓器、例えば皮膚、肺、すい臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道、及びその他の泌尿器から得ることができる。適切なドナー細胞（即ち本件発明において有用な細胞）は、全ての体細胞を含む体内のあらゆる細胞又は臓器から得ることができる。
【００６４】
卵母細胞
核移植に使用される卵母細胞は、哺乳類や両生類をはじめとする様々な動物から得ることができる。適切な哺乳類の卵母細胞源として、ヒツジ、牛、豚、馬、ウサギ、モルモット、ハツカネズミ、ハムスター、ネズミ、霊長類などが挙げられる。好ましい実施形態では、卵母細胞は、ウサギ科源から、最適にはウサギから得られる。
【００６５】
成熟した第2分裂中期（ｍａｔｕｒｅ  ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ＩＩ）の卵母細胞は、発情期の始期後、又はヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）もしくは同様のホルモンを注射した後、14〜24時間後、最適時間は15〜18時間、過排卵していないウサギ又は過排卵しているウサギの生殖器官から外科的に集めることができる。
【００６６】
卵母細胞の単離方法は、当分野で周知である。基本的に、当該方法は、哺乳類や両生類、例えばウサギの卵巣又は生殖器官から、卵母細胞を単離すること、を包含する。
【００６７】
核移植における卵母細胞の成長度は、核移植法の成功の主要要因だと伝えられてきた（Prather他著、"Differentiation," 第４８号、p. １−８、1991年を参照）。一般に、以前成功した哺乳類動物クローニングの実践では、第2減数分裂段階の卵母細胞を受容体の卵母細胞として使用する。なぜなら、卵母細胞はこの段階において導入された核を効果的に「活性化」し、動物の胚を創始し発育すると考えられているからである。
【００６８】
除核
本発明では、ニュージーランドウサギから得た成熟した卵母細胞は、hCG注射後15〜23時間の間に除核すべきことを見出した。除核前に、卵母細胞を、ヒアルロニダーゼを含有するM２培地（シグマ社）に配置する。極小内径のピペットによる繰り返し吸入により、又はしばらくの間渦動させることにより、卵丘細胞を除去する。次いで、裸にされた卵母細胞を、極体を含むものに選別し、極体の存在が確認された、選ばれた第2分裂中期の卵母細胞を、核移植と除核に使用する。
【００６９】
一般に、動物の卵巣から集めた未熟な卵母細胞は、第2分裂中期に入るまでは、適切にｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させるべきである。
【００７０】
ニュージーランドウサギに関しては、除核は、hCG注射後20時間以上経過してから行うべきではなく、16〜18時間が好適である。
【００７１】
除核は、マイクロピペットを用いて、極体と隣接する細胞質を除去することで超微細手術にて実施される。除核の有効性は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染料により、除去後の極体とクロマチンを染色し、すぐに紫外線照射下でDNAを観察することにより、調べることができる。
【００７２】
nt株調製
nt株は、当分野で本質的に周知の方法、例えば透明帯への注射や細胞質への注射などによって、調製することができる。
【００７３】
透明帯への注射
典型的に除核卵母細胞のものとは異なる種のものである、動物あるいはヒトの、単一の細胞又は細胞核を、除核卵母細胞の囲卵腔内へ移入させる。好適には、ヒトあるいは動物の細胞とウサギの卵母細胞とからなるnt株は、hCG注射後約16〜20時間の間に、電気融合培地（マンニトール、スクロース、又はソルビトール融合培地）内で毎回６０マイクロ秒又はより頻繁に９０〜１２０Vの電気パルスを１〜２度適用することによって、０．５ｍｍの容器内で電気融合される。融合後、融合したnt株の各々を、孵卵まで適切な組織培地、例えばRD｛DEME（ギブコ社）、RPMI-1640（ギブコ社）｝、M199（ギブコ社）、DMEM（ギブコ社）に配置する。
【００７４】
電気融合は、原形質膜に一時的な破壊を起こすのに十分な電気パルスを与えることによって達成される。基本的に、２つの隣接する膜が破壊されるよう誘導される場合、それらの脂質二重層は混ざり合い、膜の再形成後には、２つの細胞間に小さいチャネルが開いている。そのような小さい開口部の熱力学的不安定性に起因して、２つの細胞は、１つに融合するまで該開口部が拡大する。Pratherらによる米国特許第４９９７３８４号を参照すると（参照することでその内容の全てを本明細書に取り入れることとする）、この過程のさらなる検討がなされている。例えばスクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸緩衝液などの種々の電気融合培地を使用することができる。融合はまた、センダイウイルスを融合誘導因子に用いて実施することもできる。
【００７５】
本発明によると、nt株は、当該nt株を準生理学的な(sub-physiological)温度で培養することをはじめとする既知の方法、基本的にnt株に冷温衝撃を適用すること、によって、活性化することができる。これは、胚が通常さらされる生理学的温度条件に比べて低い室温下で、nt株を培養することによって、最も簡単に実施することができる。
【００７６】
適切な卵母細胞活性化法は、Susko-Parrishらによる米国特許第５４９６７２０号の主部であり、参照することでその内容を本明細書に取り入れることとする。
【００７７】
卵母細胞の活性化は、順次的に起こる。
(i)  卵母細胞内の二価カチオン濃度の上昇、
(ii)  卵母細胞内における細胞タンパク質のリン酸化反応の減少。
【００７８】
二価カチオン濃度を上昇させる方法として、例えば、セリン−トリオニンキナーゼ阻害剤、６‐ジメチル−アミノ−プリン、スタウロスポリン、２−アミノプリン、スフィンゴシンなどのキナーゼ阻害剤の添加、が挙げられる。
【００７９】
あるいはまた、卵母細胞にホスファターゼを導入することによって細胞タンパク質のリン酸化反応を阻害することができる（例えばホスファターゼ２A、又はホスファターゼ２B）。
【００８０】
細胞質への注射
核移植には、エレクトロポレーション法を用いるのではなく、卵母細胞の細胞質に直に細胞核を注射することをはじめとする、他の方法を用いることができる。これらの手法は、ドナーの体細胞が卵母細胞によって再プログラムされることが可能な場合にのみ適用することができ、即ち、ウサギの卵母細胞細胞質内でヒト体細胞が再プログラムされるよう誘導され得なければならない（CollasとBarnesによる、"Lol. Reprod. Dev," 第３８号、p. ２６４−２６７、１９９４年）。
【００８１】
nt株の培養
活性化したnt株は、さらなる発育のために適切な培地内で培養することができる。例えば、活性化したnt株は、培地RD、M199、DMEM50、パラフィン層で被覆されている５０マイクロリットルの培地、に移し、例えば３８℃、５％CO2にて、培養することができる。好適な一例においては、培地RD内で培養した場合に最高の割合で胚盤胞が得られた。
【００８２】
本発明者の経験によると、ヒトの細胞とウサギの除核卵母細胞とから得られたnt株に関しては、胚盤胞は、卵母細胞活性化開始後約６〜７日で得られる。nt株は、通常、卵母細胞ドナー種ではなく、核ドナー種の胚に似た外観と細胞的特徴を示す。例えば、ウサギの除核卵母細胞に、ヒトの核ドナー細胞を移植して得られたnt株の場合には、nt株の発育は、ウサギの胚よりもヒトによくみられる日程に従う。通常約３〜４日で胚盤胞を形成するウサギとは異なり、胚盤胞の形成には約６〜７日かかる。
【００８３】
組織培養及びウサギ胚の維持に用いる培地として、DMEM＋１５％FBS、M199＋１５％FBS、RD＋１５％FBSが挙げられる。さらに、これらは、顆粒細胞、卵管細胞、子宮細胞、STO細胞をはじめとする、様々な種類の細胞との共培養にも使用できる。
【００８４】
ntES細胞株の育成
培養システムは、ntES細胞株の形成において最も重要な因子である。当該システムには、培地と栄養支持細胞層が含まれる。培地とは、DMEM（ギブコ社）、FBS（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）社）、非必須アミノ酸ストック（ギブコ社）、β−メルカプトエタノール、ノックアウト培地（ギブコ社）、SR（ギブコ社）、その他様々な要素を含有物質として含む、ntES細胞の培養に適する液体、を意味する。
【００８５】
前記要素の第１の種類は、例えばLIF（R&D社）などのグルコースタンパク質１３０のリガンドであり、それは、グルコースタンパク質１３０と共に、情報（ｓｉｇｎａｌ）伝達経路を開くものである。
【００８６】
前記要素の第２の種類は、例えば、好適には１０μMのForskoline（シグマ社）といった、内因性cAMPアゴニストである。
【００８７】
前記要素の第３の種類は、ES細胞のアポトーシスを阻害し得る内因性cAMPアゴニスト、例えばbFGF（R&D社）、である。
【００８８】
栄養支持細胞層とは、１３．５日のマウス胚から得られた線維芽細胞を意味する。これらは、マイトマイシンC（シグマ社）による不活性化後に、ntES細胞の成長を持続させることができる。好ましい一実施形態では、栄養支持細胞は、マウス胚線維芽細胞からなっている。適切な線維芽細胞の栄養支持細胞層の調製に関しては、後述の実施例にて説明する。
【００８９】
ヒトntES細胞株は、上記培養システムを用いて、nt株からうまく得ることができた。ヒトntES細胞コロニーは、マウスES細胞よりも倍加時間が長く、当該コロニーは、マウスES細胞ではなくヒトES細胞に近い外観と成長特性を示した。
【００９０】
本発明によって得られたヒトntES細胞は、３０継代を超える長期間の培養後、アルカリホスファターゼ（Sigma）に対する高い陽性を維持している。これらはまた、霊長類のES細胞と同様に表面マーカとなる。例えば、SSEA-1（−）、SSEA-3（＋）、SSEA-4（＋）、TRA-1-10（＋）、TRA-1-81（＋）。これは、前記ES細胞が、未分化の状態で成長を維持することを示している。
【００９１】
本発明によってコロニーとして得られたヒトntES細胞は、集中密集しており、比較的大きい核と比較的少ない細胞質を有する細胞が近接して配列している。これらは、以下のように、霊長類のES細胞と同じ成長特性を有している。
(i)  ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて未分化状態での成長を維持する、
(ii)  長期培養の間、正常な核型を維持する、
(iii)  外胚葉、中胚葉、内胚葉を含む、３つの胚葉のうちの特定の種類の細胞に発達し得る。
【００９２】
誘導及び分化
Thomsonら（"Science," 第２８２（６）号、１１月号、p. １１４５−１１４７、１９９８年）は、体外受精（ＩＶＦ）後残った胚盤胞を用いて、ヒトES細胞株をうまく形成することができたと報告した。彼らはまた、ヒトES細胞とそこから取出した細胞が、胚様体（EB）、並びに外胚葉、中胚葉、内胚葉を含む３つ全ての胚葉の誘導体を形成する能力を有することも実証した。
【００９３】
Wakayamaら（"Science," 第２９２（５５１７）号、p. ７４０−７４３、２００１年）は、体細胞核移植により、胚盤胞からマウスES細胞を単離することに成功したと報告した。この体細胞から得られたES細胞は、あらゆる種類の特定の細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導することができる。彼の実験により、核移植から得られる胚盤胞は、通常の胚盤胞と同様に、ES細胞を抽出するという用途があることが証明された。体細胞から得られたこのntES細胞は、完全な多能性を有し、完全な成体及びそこに含まれる全ての種類の細胞へと成長することができる。
【００９４】
本発明は、核移植によりntES細胞を生産する方法を提供する。本発明者が実施した研究によって、ヒトntES細胞は、取出された通常のES細胞と同様の能力、即ち胚様体を形成して３つ全ての胚葉（例えば、外胚葉‐神経フィラメント、NSE；中胚葉‐MyoD、ミオグロビン、デスミン、vWF；内胚葉‐α抗トリプシン、αフェトプロテイン分子マーカ陽性）へと分化する能力を有することが実証された。
【００９５】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方における誘導をはじめとする、ヒトntES細胞の分化を誘導する様々な条件を提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘導は、（A）自己誘導、特定の培養条件下でのntES細胞又はntES様細胞の自動的誘導等、及び（B）生化学的誘導、第１段階で、レチノイン酸又はベータメルカプトエタノール（シグマ社）又はDMSO又はH2O2からなる培地に、ntES細胞又はntES様細胞を配置し、次いでその培地を細胞の分化を促す他の特別な培地と取り替えること等、に分類することができる。
【００９６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの誘導には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導した後に、ヒトntES細胞を直に又は間接的に動物あるいはヒトの特別な部位に配置し分化を促すこと、含まれる。
【００９７】
ntES細胞の可能性
本発明においてnt株から得られたヒトntES細胞、胚幹様細胞又はその他の胚由来幹細胞は、多くの病気治療／多くの治療用途に使用できる。
【００９８】
原則として、ntES細胞は、希望するあらゆる種類の分化細胞を得るために使用することができる。このような分化したヒト細胞を治療において使用することは、他に例を見ないものである。例えば、ヒト造血幹細胞は、骨髄移植を必要とする治療に用いることができ、ヒト神経幹細胞は、脊髄損傷やパーキンソン病の再生医療に用いることができる。
【００９９】
同質遺伝子型細胞療法において治療可能な疾病や状態として、例えば、多発性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝疾患、心疾患、軟骨置換、火傷、足の糖尿病性壊疽、胃腸疾患、血管疾患、腎臓病、尿路疾患、老化に伴う病気や状態などが挙げられる。
【０１００】
本発明によって生産されたヒトntES細胞又はそれから取出された細胞は、あらゆる種類の外来性の生理機能物質をヒトの体内へ運搬する細胞キャリアとして使用することができる。DNA、RNA、タンパク質又は他の生理機能物質を、ntES細胞又はそれから取出された細胞に、トランス遺伝子、相同遺伝子組換え、トランスポゾンプラスミドトランスフェクション、ウイルストランスフェクションなどの方法で移入し、次いで該ntES細胞又はそれから取出された細胞をヒトの体内へ移植することで、移植された該DNA、RNAやタンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏで機能を果たすことができる。
【０１０１】
前述の方法を用いて、欠陥遺伝子、例えば免疫システム欠陥遺伝子、嚢胞性線維症遺伝子は、交換することができるか、又は成長因子、リンフォカイン、サイトカイン、酵素などの治療上有益なタンパク質を発現する遺伝子を取り入れることができる。例えば、脳の成長因子をエンコードした遺伝子をヒトの胚幹細胞又は取り出した他の種類の細胞に取り入れ、その後遺伝子操作された分化細胞又は未分化細胞をパーキンソン病患者に移植し、病気を治療することができる。
【０１０２】
当該方法を用いて、希望する遺伝子を、対象とするntES細胞に取り入れ、その細胞を必要な種類の細胞、例えば造血細胞、神経細胞、すい臓細胞、軟骨細胞などに分化させ、次いで得られた細胞又はそれから取出した細胞を治療に使用することができる。
【０１０３】
対象とするntES細胞に取り入れられる遺伝子として、例えば、上皮成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、神経膠由来の神経栄養成長因子、インスリン様増殖因子（I及びII）、ニューロトロフィン‐３、ニューロトロフィン‐４／５、毛様体神経栄養因子、AFT-1、サイトカイン遺伝子（インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子（アルファ及びベータ）など）、酵素をエンコードした遺伝子などが挙げられる。
【０１０４】
対象ntES細胞はまた、制御遺伝子として使用することができ、また、細胞分化の過程において重要な因子を見つけるために、初期発達の調節に関与する遺伝子の研究に使用することができる。細胞の異常分化及び分裂は、多くの重病や先天性奇形を引き起こす。したがって、正常な細胞の分化、分裂及び誘導プロセスに関して徹底的に研究することによって、それらの病気における細胞の病理学的変化についての明確な理解がもたらされるであろう。
【０１０５】
また、対象のntES細胞から分化した細胞、組織、臓器は、薬の開発に使用することができる。胚幹細胞に関する研究により、薬の生産方法や安全性検査の方法が大きく変わるであろう。胚幹細胞は、薬の研究、検査、識別に使用し得る種々の細胞へと分化することができる。今後の薬物研究においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるES細胞実験に合格した試験薬剤のみが、実験用動物に又はヒトの臨床実験に使用され得るであろう。
【０１０６】
さらに、核の異種移植技術を用いて、ジャイアントパンダのような絶滅の近い種を救うこともできる。これらの種においては、メスの数が少ないため、多くのメスの卵母細胞を採取するのは困難である。したがって、当該種の体細胞を異なる種の除核卵母細胞に移植することができる。その結果得られた核移植株は、次いで胚盤胞を得るためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、その胚盤胞は、正常な個体を成長させるために、妊娠中の母親に移植することができる。
【０１０７】
本発明をより明確に説明するため、以下の実施例を挙げる。
【実施例１】
【０１０８】
核移植用核ドナー細胞の調製
インフォームド・コンセントの上で、手術により得た包皮の組織を細分化し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、毎分１０００回転で５分間遠心分離機にかけ、０．０５％トリプシンと０．０２％EDTA（Gibco）からなる溶液を用いて、３７℃にて３０分間消化させた。チューブから過剰溶液を除去し、該チューブを毎分１０００回転で５分間遠心分離した。上清を捨て、細胞の沈殿物を、９０％DMEM（ギブコ社）＋１０％FBS（ハイクローン社）＋５０IU/ｍｌペニシリン‐ストレプトマイシン（ギブコ社）内で培養した。再度プレート内に懸濁させ、そして３７℃、５％CO2にて培養し、３日ごとに培地を変えた。細胞が密集成長した後に継代させ、第７〜第２０継代の細胞を核ドナー細胞（図１）として使用した。
【０１０９】
卵母細胞の調製
成熟した２．５〜３ｋｇほどのメスのニュージーランドウサギを、１００IUの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）（筋肉注射）（第一生物医薬品社、上海）を１回注射して過剰排卵させ、７２時間後に100IUのhCG（HuaFu High バイオテクノロジー社、天津）（静脈注射）を１回注射した。成熟した卵母細胞は、予熱したM2溶液（シグマ社）を用いて、hCG注射から１４〜１６時間後に卵管から洗い流した。当該卵母細胞を、３００IU/ｍｌのヒアルロニダーゼを含む溶液に入れ、卵丘細胞を取り除いた。該卵母細胞（図２）を、その後、M２溶液を用いて３度洗浄した。
【０１１０】
核移植法
透明帯への注射
卵母細胞を、７．５μg/mlのサイトカラシンB（シグマ社）を含むM2培地内で処理し、培養し、室温で１０分間保持した後、斜端針で除核した。その後、単一のドナー線維芽細胞を、除核したウサギの卵母細胞の囲卵腔に移植し、nt株を形成した。当該nt株を、０．３Mグルコース（シグマ社）、０．１ｍM塩化マグネシウム（シグマ社）、０．０５ｍM塩化カルシウム（シグマ社）を含有する融合緩衝液内で平衡状態におき、HV１２０Vの直流パルスで１回、６０μ秒間刺激した。刺激後、nt株を、４２．５％DMEM（ギブコ社）、４２．５％RPMI-1640（ギブコ社）、１５％FBS（ハイクローン社）からなるRD培地内で培養し、胚盤胞を得た（図３〜６、１１）。
【０１１１】
細胞質への注射
卵母細胞を、７．５μg/mlのサイトカラシンB（Sigma）入りのM2溶液内で培養し、室温で１０分間保持した後、斜端針で除核した。次いで、単一のドナー線維芽細胞を、除核したウサギの卵母細胞の細胞質へ移入し、nt株を形成した。多くのnt株を、４２．５％DMEM（ギブコ社）、４２．５％RPMI‐１６４０（ギブコ社）、１５％FBS（ハイクローン社）からなるRD培地内で培養した。６〜７日後、胚盤胞が得られた（図７〜１０）。
【実施例２】
【０１１２】
ヒトの核移植胚幹細胞株の育成
上述のようにして胚盤胞期のnt株を得、そして、透明帯を剥ぎ取るために胚盤胞より直径の小さいガラス針（直径３ｍｍのガラス管から伸びている）を用いて優しくピペットで上下させた。それから胚盤胞の内細胞塊を単離し、栄養支持細胞層上にのばし、７９％DMEM（ギブコ社）、２０％FBS（ハイクローン社）、１％非必須アミノ酸ストック（ギブコ社）、０．１ｍMベータ‐メルカプトエタノール（ギブコ社）、１０ng/ml のLIF（R&D社）、１０ng/ml のbHGH（R&D社）、１０μM Forskolin（シグマ社）内で、５％CO2、37℃にて培養し、２日毎に培地を半分変えた。
【０１１３】
２〜４日間培養した後、細胞塊が栄養支持細胞上で成長するのを観察した。７〜２０日後、コロニーが見られた（図１２）。該コロニーを酵素又は機械によって分散させ、未使用の栄養支持細胞層を含むプレートに移した。２０継代後、該ntES細胞を、低温保存した。
【０１１４】
線維芽細胞栄養支持細胞層
栄養支持細胞は、１４〜１６日のハツカネズミの胎児から得た。胎児の頭、肝臓、心臓、食道を無菌状態で除去した後、胎児の残留物を細分化し、０．０５％トリプシンと０．０２％EDTA（ギブコ社）を含む予熱した溶液内で消化させ、３７℃にて３０分間培養し、毎分１０００回転で５分間遠心分離を行った。細胞の沈殿物を、９０％DMEM（ギブコ社）、１０％FBS（ハイクローン社）、５０IUペニシリン‐ストレプトマイシン（ギブコ社）からなる溶液内に再度懸濁させ、培地にのばして、５％CO2、３７℃にて培養した。３継代後に栄養支持細胞層を１０ｍMマイトマイシンC（Sigma）により３〜４時間処理し、４ウェル又は９６ウェルプレートに移した。栄養支持細胞層は、５％のCO2を含む加湿器付き培養器内で、３７℃にて成長した。均質の栄養支持細胞層を有するプレートを用いて、S-ES株（Culture）を調製した。
【０１１５】
ntES細胞のキャラクタリゼーション
霊長類のES細胞は、アルカリホスファターゼ活性を発現し、一連の特徴的な表面抗原を発現することができ、それ故、これらは、アルカリホスファターゼ活性と、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-10、TRA-1-81抗体の免疫組織化学特性を検知することにより同定することができる。
【０１１６】
アルカリホスファターゼ活性の検知方法：４ウェルプレート上で培養したES細胞を、４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて５分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水で3度洗浄した。次いで、アルカリホスファターゼ（シグマ社）基質を前記ウェルに加え、１５分間暗闇中に放置した。ntES細胞は、高レベルのアルカリホスファターゼ活性を発現したが、ハツカネズミの栄養支持細胞は陰性であった（図１３）。
【０１１７】
免疫組織化学法：ES細胞を、プラスチック製スライドガラス上にのばし、４％パラホルムアルデヒドにより５分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水で３度洗浄した。１：５〜１：２５のSSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-10、TRA-1-81（アイオワ州アイオワシティーのバイオ産業研究細胞バンク（Developmental Hybridoma Bank）で入手可能）の抗体希釈物を、それぞれのウェルに添加し、室温で１時間放置し、リン酸緩衝生理食塩水で２度洗浄した。第２の抗体FITCを添加し、室温で３０分間放置し、リン酸緩衝生理食塩水で２度洗浄した。FITCと表示されている第２の抗体を添加し、３０分間培養し、レーザー共焦点顕微鏡により試験した。
【０１１８】
５つの異なる抗体を検出した結果、うち４つが陽性であった（図１３）。
【０１１９】
【表１】
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【０１２０】
染色体分析：
１０μg/mlのコルヒチンを、細胞培養液に添加した。３７℃にて４時間放置した後、該細胞をプレートから除去し、毎分１０００回転で８分間遠心分離した。上清を捨て、細胞残留物を、予熱した０．０５M塩化カリウムを用いて再度懸濁させ、３７℃にて３０分間培養した。毎分１０００回転で８分間遠心分離し、上清を捨て、細胞固定液（メタノール：氷酢酸＝３：１）に細胞残留物を再度懸濁させ、室温にて１５分間放置した。毎分１０００回転で８分間遠心分離し、上清を捨て、細胞残留物を室温下の細胞固定液内で１５分間再度懸濁させた。毎分１０００回転で８分間遠心分離した後、細胞残留物をガラスプレートに入れ、ＧＩＭＥＭＳＡ染色液を用いて染色し、核型を調べた。結果の一例を図２０に示す。
【実施例３】
【０１２１】
筋肉細胞の初期分化の誘導：
DMEM（ギブコ社）、０．５μmのレチノイン酸（シグマ社）、１０％FBS（ハイクローン社）を含有するRA培地内で、EB細胞塊又はEB様細胞塊を５日間培養した。前記培地を、７９％DMEM（ギブコ社）、１０％FBS（ハイクローン社）、ウマ血清（シグマ社）、鶏胚抽出物（ギブコ社）を含有する筋肉細胞培養培地と取り替えた後、さらに７〜１０日間培養すると、筋肉様細胞とすることができた。当該細胞は、平行に配列しており、そのうちのいくつかは数個の核を有していた（図１５）。
【実施例４】
【０１２２】
ニューロン分化の誘導：
DMEM（ギブコ社）、０．５μmのレチノイン酸（シグマ社）、１０％FBS（ハイクローン社）を含有するRA培地内で、EB細胞塊又はEB様細胞塊を５日間培養した。前記培地を、DMEM-F12（ギブコ社）、１％ITS（ギブコ社）を含有するニューロン培養培地と取り替えた後、さらに７〜１０日間培養すると、前記EB細胞塊又はEB様細胞は、細胞体から伸びるいくつかの繊維状突起を有するニューロン細胞となることができた（図１６）。
【実施例５】
【０１２３】
線維芽細胞様分化の誘導：
９０％DMEM（ギブコ社）、０．５μmのレチノイン酸（シグマ社）、１０％FBS（ハイクローン社）を含有するRA培地、又はDMEM-F12（ギブコ社）、１％ITS（ギブコ社）を含有するニューロン培養培地、又は７９％DMEM（ギブコ社）、１０％FBS（ハイクローン社）、１０％ウマ血清（シグマ社）、１％鶏胚抽出物（ギブコ社）を含有する筋肉細胞培養培地内で、EB細胞塊又はEB様細胞塊を培養すると、該EB細胞又はEB様細胞は、線維芽細胞様細胞となることができた。当該細胞は、平坦で多形性で、大きい核とはっきりとした核小体、豊富な細胞質を備えている（図１７）。
【実施例６】
【０１２４】
含脂肪細胞分化の誘導：
９０％DMEM（ギブコ社）、０．５μmのレチノイン酸（シグマ社）、１０％FBS（ハイクローン社）を含有するRA培地内で、EB細胞塊又はEB様細胞塊を数日間培養すると、該EB細胞又はEB様細胞は、含脂肪細胞（図１８）となることができた。Oil Red Oという含脂肪細胞特異性染料により染色された前記細胞は、細胞質内に脂肪滴を含有する含脂肪細胞であることが確認された。
【実施例７】
【０１２５】
EBの調製：
ntES細胞を、７９％DMEM（ギブコ社）、２０％FBS（ハイクローン社）、１％非必須アミノ酸ストック（ギブコ社）、０．１ｍMベータ‐メルカプトエタノール、１０ng/ml のLIF（R&D社）、１０ng/mlのｂFGF（R&D社）、１０μMのForskolin（シグマ社）を含有する培地内で、３７℃、５％CO2にて、７〜１４日以上培養したところ、ntES細胞の一部が自然分化し、EBを形成した（図１４）。
【実施例８】
【０１２６】
３つの胚葉の同定：
EB細胞塊又はEB様細胞塊は、免疫組織化学法により同定した。
外胚葉マーカ抗体：ネスチン（ケミコン（Chemicon）社）に対し陽性。
中胚葉マーカ：ミオグロビン（ダコ（Dako）社）及びKDR（シグマ社）に対し陽性。
内胚葉マーカ：α−フェトプロテイン（バイオジェネックス（BioGenex）社）、α−抗トリプシン（ダコ社）に対し陽性。
【０１２７】
結果によると、EB細胞塊又はEB様細胞塊から分化した細胞塊は、３胚葉全ての細胞に由来する細胞を含んでいることが示唆された（図１９）。
【０１２８】
特定の実施形態を参照して本発明を説明してきたが、当業者は、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更や修正をすることが可能であると理解されよう。それら全ての修正は、詳細な説明及び本明細書に添付の特許請求の範囲内にあると意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】４２歳男性の包皮から得た線維芽細胞の写真
【図２】ウサギの卵母細胞の写真
【図３】４細胞期のnt株（透明帯へ体細胞を注射して得られたもの）の写真
【図４】桑実胚期のnt株（透明帯へ体細胞を注射して得られたもの）の写真
【図５】胚盤胞期のnt株（透明帯へ体細胞を注射して得られたもの）の写真
【図６】孵化胚盤胞期のnt株（透明帯へ体細胞を注射して得られたもの）の写真
【図７】４細胞期のnt株（卵母細胞の細胞質へ体細胞を注射して得られたもの）の写真
【図８】桑実胚期のnt株（卵母細胞の細胞質へ体細胞を注射して得られたもの）の写真
【図９】胚盤胞期のnt株（卵母細胞の細胞質へ体細胞を注射して得られたもの）の写真
【図１０】孵化胚盤胞期のnt株（卵母細胞の細胞質へ体細胞を注射して得られたもの）の写真
【図１１】異なる年齢のドナーから得られた体細胞が、類似する効率で胚盤胞を形成することを示す表
【図１２】ウサギの卵母細胞により再プログラムされたヒトの体細胞から取り出したntES細胞コロニーの写真
【図１３】ヒトの体細胞核移植により得られたntES細胞コロニー、霊長類のES細胞に典型的に表れるマーカ、高アルカリホスファターゼ活性の写真
【図１４】ntES細胞が、体細胞核移植により胚様体を形成し得ることを示す図
【図１５】体細胞核移植によりヒトのntES細胞から分化した筋肉細胞の写真
【図１６】体細胞核移植によりヒトのntES細胞から分化した神経細胞の写真
【図１７】体細胞核移植によりヒトのntES細胞から分化した線維芽細胞の写真
【図１８】体細胞核移植によりヒトのntES細胞から分化した含脂肪細胞の写真
【図１９】ntES細胞が、３つ全ての胚葉のマーカとなる細胞へ分化し得ることを示す図
【図２０】第２６継代のntES細胞の核型の写真
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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