(57)【要約】  本発明は幹細胞に由来するヒト病態、例えば慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞系急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞系急性リンパ母細胞性白血病に関連する染色体異常や、造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関連する染色体異常などを再現する遺伝子導入哺乳動物に関する。本発明は、Ｓｃａ−１＋細胞において導入遺伝子の発現を導くプロモータを使用して前記ヒト病態に関与する遺伝子の発現の一使用方法に関するものである。前記遺伝子導入動物は前記疾病を研究するためかつ前記疾病を治療および／または予防するための化合物を評価するために使用するモデルを形成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常によって形成および／または活性化される遺伝子からなり、該遺伝子がＳｃａ−１＋ 細胞中において前記遺伝子の発現を導くプロモータにより制御されるＤＮＡ構造体。
【請求項２】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常が慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連するか、造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関連する染色体異常の中から選択されることを特徴とする請求項１に記載の構造体。
【請求項３】
幹細胞由来のヒト病態に関連した染色体異常によって形成および／または活性化される遺伝子がＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ 、ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ 、Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２およびＴＡＬ１として確認されている遺伝子の中から選択されることを特徴とする請求項1または２に記載の構造体。
【請求項４】
幹細胞由来のヒト病態に関連した染色体異常によって形成および／または活性化される遺伝子が、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ 、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ 、マウスＳｌｕｇ、マウスＳｎａｉｌ、ヒトＨＯＸ１１、ヒトＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２およびヒトＴＡＬ１細胞の中から選択されることを特徴とする請求項３に記載の構造体。
【請求項５】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常によって形成および／または活性化される遺伝子のＳｃａ−１＋ 細胞に発現を導くプロモータがマウスプロモータｐＬｙ６Ｅ．１またはその機能的な断片であることを特徴とする請求項1乃至４のいずれか１項に記載の構造体。
【請求項６】
そのゲノムに請求項1乃至５のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体を含む遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
前記哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項６に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
前記遺伝子導入マウスがＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ 、Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ｌ ９ ０ 、Ｓｃａ−１＋ Ｓｌｕｇ、Ｓｃａ−１＋ Ｓｎａｉｌ、Ｓｃａ−１＋ ＨＯＸ１１、Ｓｃａ−１＋ ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２およびＳｃａ−１＋ ＴＡＬ１として確認されているマウスの中から選択されることを特徴とする請求項７に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
請求項６乃至８のいずれか１項記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物の子孫。
【請求項１０】
ゲノムに請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体を含む遺伝子導入非ヒト哺乳動物の細胞系。
【請求項１１】
前記細胞系がマウスの細胞系であることを特徴とする請求項１０記載の細胞系。
【請求項１２】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常を有する遺伝子導入非ヒト哺乳動物を調製する方法であって、該方法を、
（ｉ）請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体を遺伝子導入非ヒト哺乳動物の受精卵母細胞に導入すること、
（ｉｉ）前記受精卵母細胞を子孫を生成するために偽妊娠の乳母に移植すること、
（ｉｉｉ）幹細胞由来のヒト病態に関与する染色体異常によって形成および／または活性化された遺伝子の存在を評価するために前記子孫を分析すること、
からなる遺伝子導入非ヒト哺乳動物を調整する方法。
【請求項１３】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常が慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連するか、造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関連する染色体異常の中から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常を示す非ヒト動物モデルを発生させるために、Ｓｃａ−１＋ 細胞に遺伝子の発現を導くプロモータを使用するプロモータの使用方法。
【請求項１６】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常が慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連するか、造血幹細胞または胚性幹細胞の移動に関連する染色体異常の中から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の使用方法。
【請求項１７】
Ｓｃａ−１＋ 細胞に遺伝子の発現を導くプロモータがマウスのｐＬｙ−６Ｅ．１プロモータであることを特徴とする請求項１５乃至１６のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項１８】
造血幹細胞または非造血幹細胞のいずれかに由来する腫瘍性または非腫瘍性のヒト病態と関連する染色体異常を治療および/または予防するための潜在的に有効な化合物を評価するために請求項６乃至９のいずれか１項に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物またはその子孫、または請求項１０乃至１１のいずれか１項に記載の細胞系の使用方法。
【請求項１９】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常が慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連するか、造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関連する染色体異常の中から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の使用方法。
【請求項２０】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常の治療および／または予防のための治療手段において媒体としてＳｃａ−１＋ 細胞に遺伝子の発現を導くプロモータを使用する方法。
【請求項２１】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常が慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連するか、造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関連する染色体異常の中から選択されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常の治療および／または予防に対する前記治療手段が遺伝子または悪性の遺伝子融合の非活性化、欠損している機能遺伝子の含有、または機能遺伝子による欠陥遺伝子の置換からなる請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常の治療および／または予防に適切な治療遺伝子から成るＤＮＡ構造体と、およびＳｃａ−１＋ 細胞に遺伝子の発現を導くプロモータとから構成し、前記治療遺伝子をＳｃａ−１＋ 細胞に発現を導く前記プロモータによって制御し、任意に１つまたは複数の薬学的に容認できる賦形剤を有する医薬組成物。
【請求項２４】
前記治療遺伝子が幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常の治療および／または予防に有効な遺伝子または遺伝子構造体であることを特徴とする請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記治療遺伝子がリボザイム遺伝子、融合またはアンチセンス遺伝子構造体、および幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常によって活性化および／または形成される遺伝子に対して有効な遺伝子、遺伝子融合、または遺伝子構造体の中から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常が慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連するか、造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関連する染色体異常であることを特徴とする請求項２３乃至２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記治療遺伝子がウィルス性ベクターまたは非ウィルス性ベクターに基づいていることを特徴とする請求項２３乃至２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体の変化の治療および／または予防のための医薬組成物の合成にＳｃａ−１＋ 細胞に遺伝子の発現を導くプロモータを使用するプロモータの使用方法。
【請求項２９】
幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常が慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する染色体異常か、造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関連する染色体異常の中から選択されることを特徴とする請求項２８に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＳｃａ−１細胞において導入遺伝子の発現を導くプロモータの手段によってヒト病態に伴う遺伝子の発現を使用する幹細胞由来のヒト病態を再現する遺伝子導入非ヒト哺乳動物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子導入動物はそのゲノムに外因性遺伝子（導入遺伝子）を支持する動物であり、該遺伝子は発生の初期段階でその動物の生殖細胞またはその前身に導入される。動物に対する導入遺伝子の導入は導入される遺伝子の行動、発現または機能を研究する目的を有している。また、治療上の目的のために病気におかされている人間を遺伝的によくしたり、動物を改良したりすることを目的とすることもある。
【０００３】
遺伝子導入哺乳動物の産出は十分に確立された技術であり（例えば、ホーガン，コンスタンチニ  および  ラシー（１９８６年）著、マウス胎生触診、研究所手引、コールド  スプリング  ハーバー  所在、コールド  スプリング  バーバ研究所発行（１９８６年）を参照「Ｈｏｇａｎ，Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｙ（１９８６），Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８６）」）、遺伝子導入哺乳動物について記述した多くの論文および特許文献があることによってもこのことがわかる。実例としては、米国特許第４，７３６，８６６号、同第４，８７３，１９１号、同第５，１７５，３８３号および同第５，１７５，３８４号明細書などを挙げることができる。
【０００４】
導入遺伝子の発現は哺乳動物に新しい表現型を与えることができる。挿入される導入遺伝子および哺乳動物におけるその発現レベルに依存して、動物は特定の疾病に関して感受性が強くなったり弱くなったりする。このような遺伝子導入哺乳動物は疾病の診断に対する有益な方法の開発および／または疾病の予防及び治療において潜在的に有効となる化合物の生体内研究における貴重なモデルである。
【０００５】
ヒト疾病のグループ「幹細胞由来のヒト病態」という部類において、造血幹細胞および非造血幹細胞に由来の腫瘍性のものおよび非腫瘍性のもの、例えば、骨髄性白血病、Ｂ細胞リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、リンパ腫、肉腫および幹細胞発生の病態、例えば、先天性免疫不全症およびファンコーニ貧血等を挙げることができる。ヒトの悪性腫瘍病態（ほとんど全てが幹細胞由来である）は現在のところ化学療法、照射療法および／または外科手術を組み合わせて治療されているが、これらの方法では、正常な細胞と腫瘍細胞を区別することができない。非腫瘍性病態の治療では、これらに代わって、免疫グロブリン、ワクチン、輸血などの治療が行われている。
【０００６】
近年、造血性腫瘍および固体腫瘍の両方に関連する染色体異常によって発生する遺伝子および／または活性化遺伝子が確認された（遺伝学評論年鑑（１９９７年）第３１巻、第４２９頁乃至第４５３頁「Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）３１：４２９−４５３」）。しかし、生体内で前記遺伝子が腫瘍形成することは証明されてはいるが（現代遺伝学（２０００年）第１巻、第７１頁乃至第８０頁「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２０００），１：７１−８０」）、これらの確認にもかかわらず、前記病態を再現するための動物モデルは今のところ存在しない（ガン遺伝子（１９９９年）第１８巻、第５２４８頁及びガン遺伝子（１９９９年）第１８巻、第５２４９頁乃至第５２５２頁「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９９）１８：５２４８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９９）１８：５２４９−５２５２」）。同様に、近年、ガンが始まるターゲットは幹細胞であることが示されている（血液（２０００年）第９５巻、第１００７頁乃至第１１１３頁、ガン遺伝子（２０００年）第１９（２０）巻、第２１４３頁乃至第２４２２頁およびネイチャー（２００１年）第４１４巻、第１０５頁乃至第１１１頁「Ｂｌｏｏｄ（２０００）９５：１００７−１１１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０００）１９（２０）：２４１３−２４２２，Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１４：１０５−１１１」）。
【０００７】
現代遺伝子（２０００年）第１巻、第７１頁乃至第８０頁（Ｃｕｒｓｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２０００）１：７１−８０）には、例えば慢性骨髄性白血病（ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ ）、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病（ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ ）、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病（ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２およびＴＡＬ１）等の異なる病態に関連する染色体異常によって活性化される遺伝子融合または遺伝子を発現する周知のマウスモデルが示されている。しかし、該モデルは前記遺伝子または遺伝子融合によって発現されたタンパク質が腫瘍形成することのみが示され、前記モデルと関連するヒト病態が特別に再現されるものではない。
【０００８】
幹細胞由来のヒト病態の破滅的な作用の観点から、該病態の治療および／または予防の潜在的に有効な化合物を研究することはもちろん、前記ヒト病態を研究するために生体内モデルを備える適切な動物を生成する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は幹細胞由来のヒト病態を再現する動物モデルを生成する問題に取り組んでいる。
【００１０】
本発明による幹細胞由来のヒト病態を再現する動物モデルは  ａ）このような病態がどのようにして発現され、維持されるのかを研究するための特別な工具を用いること、  ｂ）ヒトに対して潜在的に有効な治療の有効性を予想すること、  ｃ）新しい治療方法の発見、  ｄ）各病態の経過を抑制または増加させる対立遺伝子のゲノム識別が可能になる。
【００１１】
従って、本発明の目的は幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常によって形成および／または活性化される遺伝子から成るＤＮＡ構造体を構成し、前記遺伝子はＳｃａ−１＋ 細胞において前記遺伝子の発現を導くプロモータによって制御される。
【００１２】
本発明の他の目的は非遺伝子導入哺乳動物と比較した場合に、幹細胞由来のヒト病態を発生させるために非常に強い性向を与える遺伝子型を持つ遺伝子導入非ヒト哺乳動物を生成することにある。前記遺伝子導入非ヒト哺乳動物はとりわけ前記病態の研究にとってそして前記病態に対して潜在的に有効な治療および／または予防のための化合物の評価にとって有効である。従って、本発明の目的は導入遺伝子を含有する遺伝子導入非ヒト哺乳動物およびその子孫を生成することにある。
【００１３】
本発明のその他の目的は導入遺伝子を含有する遺伝子導入マウスおよびその子孫を生成することにある。特別な実施例において、前記遺伝子導入マウスはＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ 、Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ｌ ９ ０ 、Ｓｃａ−１＋ Ｓｌｕｇ、Ｓｃａ−１＋ Ｓｎａｉｌ、Ｓｃａ−１＋ ＨＯＸ１１、Ｓｃａ−１＋ ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２、Ｓｃａ−１＋ ＴＡＬ１によって構成されるグループから選択される。
【００１４】
本発明のその他の別の目的は幹細胞由来のヒト病態を生体内で研究するための動物モデルとして有効な遺伝子導入非ヒト哺乳動物を生成する方法からなっている。
【００１５】
本発明のその他の別の目的はそのゲノムに前記ＤＮＡ構造体を含む有する遺伝子導入非ヒト哺乳動物の細胞系を構成することにある。
【００１６】
本発明のその他の別の目的はその幹細胞由来のヒト病態を再現する動物モデルの発生のためＳｃａ−１＋ 細胞における遺伝子の発現を導くプロモータを使用することからなっている。
【００１７】
本発明のその他の別の目的は幹細胞由来のヒト病態を治療および／または予防するために潜在的に有効な化合物の評価を行うための遺伝子導入非ヒト哺乳動物を使用することからなっている。
【００１８】
本発明のその他の別の目的は治療方法の媒体としてＳｃａ−１＋ 細胞における遺伝子の発現を導くプロモータを使用することからなっている。また、Ｓｃａ−１＋ 細胞における遺伝子の発現を導く前記プロモータの使用はもちろん、前記プロモータと治療遺伝子とから成るＤＮＡ構造体を含む医薬組成物も本発明の目的を構成する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明により提供する解決策は各種の白血病と関係する染色体異常または造血幹細胞または胚幹細胞の移動によって形成および／または活性化される遺伝子からなるＤＮＡ構造体を含有する遺伝子導入マウスが造血幹細胞または非造血幹細胞由来の腫瘍性および非腫瘍性のヒト病態を種々のレベルで発生させるという発見に基づいており、前記遺伝子は幹細胞のようなＳｃａ−１＋ 細胞において前記遺伝子の発現を導くプロモータによって制御される。Ｓｃａ−１＋ 細胞においてこのような遺伝子の発現を導くプロモータの使用によって幹細胞の行動に対して各種の遺伝子の発現を導くことにより、ヒト病態を再現する動物モデルを発生させることが可能となった。この事実は、非遺伝子導入マウスと比較した際に幹細胞由来のヒト病態を発生させるために非常に強い性向を与える遺伝子型を有する一連の遺伝子導入マウスの発生によって証明されている。従って、本発明によって提供される遺伝子導入哺乳動物は前記疾病についての研究および前記疾病の治療および／または予防に有効な化合物の評価に関して新規で有用なモデルである。
【００２０】
本発明のその他の目的は以下の説明および特許請求の範囲を参照することによって当業者にとっては明白である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
図１は慢性骨髄性白血病を有するＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスの表現型および組織学的実施を構成する小区画写真図である。図１Ａは、ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスの骨髄（ＢＭ）および末梢血管（ＰＢ）に存在する細胞組織の代表的な分析結果を示している。Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスから分離された細胞は指定された単クローン抗体を用いて染色され（顆粒球系列はＧｒ−１、骨髄単球系列はＭａｃ１、幹系列はＳｃａ１である）、流動血球計算（フローサイトメトリー）によって分析された。陽性細胞の割合が示されている。Ｇｒ１＋Ｍａｃ１およびＧｒ−１＋Ｓｃａ１の陽性細胞の分布は寸法（サイズ、ＳＳＣ）と粒度（ｆｏｗａｒｄ、ＦＳＣ）によって示されている。図１Ｂは慢性骨髄性白血病を有するＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスの脾臓、肝臓およびリンパ節の部分の代表的な組織学的検査の結果を示す。全ての部分は、ヘマトキシリンおよびエオシンによって染色された。矢印は慢性骨髄性白血病のプロセスの一般的な線維症および巨核球の存在を示している。図１Ｃは、Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスの末梢血管に対するギムザ染色の代表的な事例を示している。
【００２２】
図２はＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスにおける骨髄性およびリンパ性未分化危機の表現型および組織学的実例を構成する小区画写真図である。図２Ａは未分化危機に於けるＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスの骨髄（ＢＭ）、脾臓および末梢血管（ＰＢ）に存在する細胞組織の代表的な分析結果を示している。未分化危機のＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスから分離された細胞は指定されたモノクローナル抗体で染色され（顆粒球系列の場合はＧｒ−１、骨髄性単球系列の場合はＭａｃ１、Ｂリンパ系列の場合はＢ２２０、幹系列の場合はＳｃａ１である）、そしてフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により分析された。Ｂリンパ性未分化危機の例（ＰＢ＃１）と骨髄性未分化危機の例（ＰＢ＃２）が示されている。Ｇｒ−１＋Ｍａｃ１についての陽性細胞の分布がサイズ（サイズ、ＳＳＣ）に従って示されている。図２Ｂは未分化危機を有するＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスの肝臓の部分の代表的な組織学的検査の結果を示す。全ての部分はヘマトキシリンおよびエオシンで染色された。白血病細胞による肝臓浸潤が観察された。図２Ｃはギムザで染色された未分化危機のＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスの末梢血管のギムザ染色の代表的な事例を示し、未分化細胞が観察することができる。
【００２３】
図３は、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病を有するＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ マウスの骨髄系およびリンパ系未分化危機の表現型および組織学的実例を構成する小区画写真図である。図３Ａは、ＡＢＬ特別プローブによるハイブリッド  コントロールおよびＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ マウスに対するサザン  ブロット法を用いたＤＮＡ分析を示している。Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ マウスには、導入遺伝子（ｐｌ９０）の存在が観察される。図３Ｂは、Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ マウスおよびコントロール  マウスの脾臓、肝臓、肺に対する代表的な組織学的検査の結果と末梢血管の染色結果を示している。全ての組織学的な部位に対してヘマトキシリンおよびエオシンで染色を行い、末梢血管に対してはギムザ染色を行った。Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ マウスにおいて白血病細胞の存在が観察された。図３Ｃは、コントロール  マウスとＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ マウスの骨髄（ＢＭ）および末梢血管（ＰＢ）に存在する細胞組織の代表的な分析を示している。コントロール  マウスおよびＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ マウスから分離された細胞は指定されたモノクローナル抗体を用いて染色し（骨髄単球系列の場合はＭａｃ１、リンパ系列の場合はＢ２２０、ＣＤ１９およびＣＤ４３、幹系列の場合はＳｃａ１である）、そしてフローサイトメトリーを用いて分析を行った。Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ マウスの腫瘍性細胞の割合を示す。Ｂ２２０／ＣＤ１９に対する腫瘍性細胞の分布がサイズ（サイズ、ＳＳＣ）と粒度（ｆｏｗａｒｄ／ＦＳＣ）に従って示されている。
【００２４】
本発明は、幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常によって形成および／または活性化される遺伝子から成るＤＮＡ構造体（以下において本発明のＤＮＡと記載する）を提供するものであり、前記遺伝子はＳｃａ−１＋ 細胞における前記遺伝子の発現を導くプロモータによって制御される。特別な実施例において、幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常は慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する染色体異常か、造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関連する染色体異常の中から選択される。ｃ−ｋｉｔレセプタまたはそのリガンドの変化（幹細胞因子（ＳＣＦ））は造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関連したヒト病態の一例である。
【００２５】
本明細書中、「幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常によって形成および／または活性化される遺伝子」という表現（以下において活性化可能な遺伝子と記載する）は遺伝子および遺伝子融合を意味し、該遺伝子及び遺伝子融合は哺乳動物のゲノムに組み込まれた場合に、該哺乳動物が前記遺伝子または遺伝子融合に関連する病態を発生させる可能性を増大させる。特別な実施例において、活性化可能な遺伝子は慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する染色体異常か、造血幹細胞または胚幹細胞に関連する染色体異常から選択された幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常によって形成および／または活性化される遺伝子である。実際には、該活性化可能な遺伝子は、ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ 、ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ 、Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２およびＴＡＬＩとして確認された遺伝子の中から選択されている。特に詳述すると、前記活性化可能な遺伝子は以下の遺伝子の中から選択されている。
【００２６】
ヒト遺伝子融合ＢＣＲ−  ＡＢＬＰ ２ １ ０ − ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）の結果として生成され、慢性骨髄性白血病に関連する。この染色体異常を示す患者は時間の経過において前記疾病の進化現象特色を有する未分化危機を発生する。
【００２７】
ヒトＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ −  ｔ（９：２２）染色体転座によって発生するガン遺伝子で、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する。
【００２８】
マウスＳｌｕｇ−  造血幹細胞の動態に関与する遺伝子。
【００２９】
マウスＳｎａｉｌ−  胚幹細胞の移動に関与するＳｌｕｇファミリーの遺伝子。
【００３０】
ヒトＨＯＸ１１−  Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する染色体異常によって活性化される遺伝子。
【００３１】
ヒトＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２−  Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する染色体異常によって活性化される遺伝子。
【００３２】
マウスＴＡＬ１−  Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する染色体異常によって活性化される遺伝子。
【００３３】
ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ 、ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ｌ ９ ０ 、ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２およびＴＡＬ１として確認された活性化可能な遺伝子は、遺伝学評論年鑑（１９９７年）第３１巻、第４２９頁乃至第４５３頁（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ（１９９７）３１：４２９−４５３）に記載されている。Ｓｌｕｇ遺伝子は  ニエト  エム  エー，サーゲント  エム  ジェー，ウィルキンソン  デー  ジェーおよびコーク  ジェイ著（１９９４年）、「Ｓｌｕｇ．ジンク−フィンガー遺伝子による脊椎発育中の細胞行動の制御」、サイエンス、第２６４巻、第８３５頁乃至第８４９頁（Ｎｉｅｔｏ  ＭＡ，Ｓａｒｇｅｎｔ  ＭＧ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ＤＧ  ａｎｄ  Ｃｏｏｋｅ  Ｊ（１９９４），「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ−ｂｙ  Ｓｌｕｇ，  Ａ  Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｇｅｎｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：８３５−８４９）に記載され、Ｓｎａｉｌ遺伝子は  ジアング  アール，ラン  ワイ，ノートン  シー  アール，サンドバーグ  アイ  ピーおよびクライドレイ  テー著（１９９８年）、「Ｓｌｕｇ遺伝子はマウスにおける中胚葉または神経冠発育のために不可欠ではない」発育生物学、第１９８巻、第２７７頁乃至第２８５頁（Ｊｉａｎｇ  Ｒ，Ｌａｎ  Ｙ，Ｎｏｒｔｏｎ  ＣＲ，Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  ＩＰ  ａｎｄ  Ｇｒｉｄｌｅｙ  Ｔ（１９９８），「Ｔｈｅ  Ｓｌｕｇ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ  ｏｒ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９８：２７７−２８５）に、セフトン  エム，サンチス  エス，およびニエト  エム  エー著（１９９８年）、「ヒヨコおよびマウス胎児における転写因子のＳｎａｉｌファミリーの構成員についての保存および分岐役割」、発育、第１２５巻、第３１１１頁乃至第３１２１頁（Ｓｅｆｔｏｎ  Ｍ，Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｓ  ａｎｄ  Ｎｉｅｔｏ  ＭＡ（１９９８））「Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｓｎａｉｌ  ＦＡＭＩＬＹ  ｏｆ  ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ」Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５−３１１１−３１２１）に、およびヘマベス  ケ，アスザラフ  エス  アイおよびルプ  ワイ  ティー著（２０００年）、「発育およびガンの速いレーンにゆっくり移行する抑制体の  Ｓｎａｉｌ／Ｓｌｕｇ  ファミリー」遺伝子、第２５７巻、第１頁乃至第１２頁（Ｈｅｍａｖａｔｈｙ  ｋ，Ａｓｔｈｒａｆ  ＳＩ  ａｎｄ  Ｌｐ  ＹＴ（２０００）、「Ｓｎａｉｌ／Ｓｌｕｇ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ：ｓｌｏｗｌｙ  ｇｏｉｎｇ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｆａｓｔ  ｌａｎｅ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ」（Ｇｅｎｅ  ２５７：１−１２）に記載されている。これらの活性可能な遺伝子は前述の刊行物により提供された情報から得られる。これらの遺伝子はいくつかの実施例に対して特殊化されているが、本発明の教示はガンに存在する染色体異常によって形成および／または活性化されるどのよ���な遺伝子または遺伝子融合に対しても適用することができる。このような遺伝子または遺伝子融合についての情報は例えば遺伝子学評論年鑑（１９９７年）第３１巻、第４２９頁乃至第４５３頁（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９７）３１；４２９−４５３）に見出すことができる。
【００３４】
Ｓｃａ−１＋ 細胞において活性化可能な遺伝子の発現を導くプロモータは、Ｓｃａ−１＋ 細胞において活性化可能な遺伝子の発現を導く転写の開始に関連しかつ必要な核酸の配列であり、そしてＲＮＡポリメラーゼの結合サイトを含んでいる。本明細書においては、「プロモータ」という用語は転写調整タンパク質が結合できる他のサイトを含む。特別な実施例において、Ｓｃａ−１＋ 細胞の活性化可能な遺伝子の発現を導くプロモータは、マウスのｐＬｙ−６Ｅ１プロモータまたはその機能的断片であり、換言すれば、マウスにおける各種の導入遺伝子の組織の特別な発現を導くことが可能である。ｐＬｙ−６Ｅ１プロモータは良好に特徴付けられており、Ｓｃａ−１＋ 細胞における選択的な発現に必要な全ての要素を含んでいる（ミレス  シー，サチス  エム  ジェイ，シンクライヤ  エーおよびドジエルザク  イー著（１９９７年）、「成人造血幹細胞及び発育マウス退治におけるＬｙ−６Ｅ１（Ｓｃａｌ−１）導入遺伝子の発現」、発育、第１２４巻、第５３７頁乃至第５４７頁（Ｍｉｌｅｓ  ｃ．，Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｍ−Ｊ，Ｓｉｎｃｌａｉｒ  Ａ，ａｎｄ  Ｄｚｉｅｒｚａｋ，Ｅ．（１９９７）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｙ−６Ｅ１（Ｓｃａ−１）ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ」Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：５３７，５４７））。
【００３５】
「作用的に結合する」という表現は、活性化可能な遺伝子の配列に関するプロモータの配置に関するものである。プロモータは、活性化可能な遺伝子の発現を制御または調製することができるように配置されている。
【００３６】
本発明のＤＮＡ構造体は、サムブロック，フィッチおよびマニアチス著（１９８９年）、ニューヨーク州，コールド  スプリング  ハーバー研究所新聞社発行、「分子クローン化、研究所手引き」（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ）に示されるように、制限および結合酵素、および同様の酵素を用いる従来の分解法によって容易に得ることができる。
【００３７】
本発明のＤＮＡ構造体は、必要に応じて、上記に引用したサムブロック等著による刊行物に記載の従来の方法を使用して哺乳動物胚を形質転換するためおよび遺伝子導入動物を発生させるために有用なベクターの生成に使用することができる。
【００３８】
変形例において、本発明のＤＮＡ構造体は遺伝子導入動物を発生させるため、ＤＮＡを受精卵母細胞に微量注入するために有益であるＤＮＡの線状断片を得るために使用できる。微量注入に有用なＤＮＡの線状断片は活性化可能な遺伝子からなる線状ＤＮＡ断片を得るために制限酵素で切断することによって得ることができる。
【００３９】
その他の態様において、本発明はそのゲノムに本発明のＤＮＡ構造体換言すれば、幹細胞由来のヒト病態に関与する異常な染色体例えば慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病、または、造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関連する染色体異常により形成および／または活性化される遺伝子から成る構造体を含む遺伝子導入非ヒト哺乳動物を提供するものであり、該遺伝子はＳｃａ−１＋ 細胞における該遺伝子の発現を導くプロモータによって制御される。本発明が提供する遺伝子導入非ヒト哺乳動物は、結果として、非遺伝子導入哺乳動物と比較した場合に、幹細胞由来のヒト病態を発生する強い傾向を与える遺伝子型を所有する。前記非ヒト哺乳動物は、中でも、前記病態を研究するためおよび前記病態を治療および／または予防するための潜在的に有効な化合物を評価するために有効である。
【００４０】
本明細書中で使用される「非ヒト哺乳動物」という表現は例えばマウスなど哺乳動物の種に属するヒト以外のすべての動物が含まれる。
【００４１】
特別な実施例において、本発明により提供される遺伝子導入非ヒト動物は以下のように確認された遺伝子導入マウスである。
【００４２】
Ｓｃａ−１＋   ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ ：これらのマウスは慢性骨髄性白血病を発生する。
【００４３】
Ｓｃａ−１＋   ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ ：これらのマウスはＢ細胞急性リンパ母細胞性白血病を発生する。
【００４４】
Ｓｃａ−１＋   Ｓｌｕｇ：これらのマウスは造血幹細胞を動態化する。
【００４５】
Ｓｃａ−１＋   Ｓｎａｉｌ：これらのマウスは胚幹細胞を動態化する。
【００４６】
Ｓｃａ−１＋   ＨＯＸ１１：これらのマウスはＴ細胞急性リンパ母細胞性白血病を発生する。
【００４７】
Ｓｃａ−１＋   ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２：これらのマウスはＴ細胞急性リンパ母細胞性白血病を発生する。
【００４８】
Ｓｃａ−１＋   ＴＡＬ１：これらのマウスはＢ細胞急性リンパ母細胞性白血病を発生する。
【００４９】
本発明が提供する遺伝子導入非ヒト哺乳動物の発生のために、本発明のＤＮＡ構造体は胚芽状態において、例えば一細胞の状態、または受精卵母細胞の状態で、そして一般的にはｇ細胞の段階よりは前に、前記哺乳動物またはその先祖に導入される。
【００５０】
従って、本発明は以下のことから成る幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常を有する遺伝子導入非ヒト哺乳動物を調製する方法を提供する。
（ｉ）本発明のＤＮＡ構造体を遺伝子導入非ヒト哺乳動物の受精卵母細胞に導入すること。
（ｉｉ）子孫を生成するため前記受精卵母細胞を偽妊娠の乳母に移植すること。
（ｉｉｉ）幹細胞由来のヒト病態に関与する染色体異常によって形成された遺伝子および／または活性化遺伝子の存在を評価するために前記子孫を分析すること。
【００５１】
特別な実施例において、幹細胞由来のヒト病体に関与する染色体異常は慢性骨髄性白血病、急性Ｂ細胞リンパ性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する染色体異常、または造血幹細胞または胚幹細胞の移動（例えば、レセプターｃ−ｋｉｔまたはそのリガンドの変化（ＳＦＣ））に関連する染色体異常から選択されるヒト病態であり、その場合に、幹細胞由来のヒト病態に関与する染色体異常によって形成される遺伝子および／または活性化遺伝子の存在を検査するために子孫の分析が行われる。
【００５２】
活性化状態で染色体に組み入れられるように、核酸の配列が動物の胚に導入され得る技術的な各種の方法が考えらており、これらは全て本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物の発生に適用することができる。１つの方法は核酸の配列を胚に自然に発生するように取り込ませて増殖させ、結果として配列の活性化を与える座に配列が染色体上に組み込まれている遺伝子導入動物を選択することから成っている。他の方法は胚に核酸の配列を導入する前に、核酸の配列またはその制御配列を変更する方法がある。別の方法としては、導入する核酸の配列を含むベクターを使用して胚に取り込ませて増殖させる手段がある。
【００５３】
特別な実施例において、本発明のＤＮＡ構造体を非ヒト哺乳動物の発芽系列に導入することは非ヒト哺乳動物の受精卵母細胞にＳｃａ−１＋ 細胞の発現を導くプロモータに作用的に結合する活性化可能な遺伝子を含む線状ＤＮＡ断片の微量注入によって行われる。
【００５４】
受精卵母細胞は、従来の方法、例えば、メスの排卵を誘発する方法、オスとの交尾に応じて、または黄体ホルモンを処理するこによって分離することができる。一般的には、ホルモンの作用およびオスとの交尾によって、メスに過剰排卵が生じる。適切な時間の経過後、メスを屠殺し、受精卵母細胞を卵管から取り出し、これを適切な培養媒体中に保管する。受精卵母細胞は顕微鏡下で前核の存在によって確認することができる。線状ＤＮＡ断片の微量注入はオスの前核に対して行なわれる。
【００５５】
本発明のＤＮＡ構造体を含む線状ＤＮＡ断片を受精卵母細胞に導入した後、これらは適切な期間中生体内において培養されるか、偽妊娠の乳母（生殖不能なオスとメスを交尾させることよって得る）に再移植される。移植は従来の方法、例えば、メスに麻酔を施して、十分な数の胚、例えば、１０〜２０の胚を偽妊娠の乳母の卵管に外科手術で挿入することによって行う。妊娠期間が終了したとき、いくつかの胚は妊娠が終了し、遺伝子導入非ヒト哺乳動物が生み出される。これらの遺伝子導入非ヒト哺乳動物は理論的にそのゲノムに組み込まれた本発明のＤＮＡ構造体を支持しており、生物の全ての細胞に存在している。この子孫はＧ０世代であり、その各々は「遺伝子導入始祖」である。各々が注入された核酸を組み込んでおり、そして遺伝子導入されていることの確認は子孫の各々を分析することによって行われる。このためには、それぞれの動物の構成体のサンプル、例えば、動物の尾から採取した小さなサンプル（マウスの場合など）または血液サンプルなどからＤＮＡを抽出し、従来の方法、例えば、特定のイニシエーター（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）を使用するポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）や、少なくとも導入遺伝子の一部分に対して補足するプローブなどを用いるサザンブロット分析法またはノーザンブロット分析法や、導入遺伝子によってコード化されたタンパク質に対して抗体を使用するウェスタンブロット分析法よって分析を行う。導入遺伝子の存在を確認するためのこれ以外の方法には、酵素および／または免疫学的な検査、特定マーカーの組織学的な染色、酵素作用など、数多くの適切な生化学検査がある。
【００５６】
一般的には、遺伝子導入動物においては、挿入された導入遺伝子はメンデルの遺伝法則の特性として伝達されるので、個々の安定可能な系列を設立することは困難ではない。Ｇ０世代の各々が親の子孫群と交配すると（レトロクロス）され、そして導入遺伝子がメンデルの特性に従って行動を行う場合に、子孫の５０％が挿入された導入遺伝子に対してヘテロ接合体（へミ接合体）である。これらの各々は、Ｇ１世代の子孫を構成すると共に不確定に維持され得る遺伝子導入系列を構成し、正常な各々とＧ１世代のヘミ接合体を交配させる。変形例において、導入遺伝子は子孫の生存度に影響しないと仮定した場合に、Ｇ１世代の個人が同世代の個人と交配すると、挿入された導入遺伝子に対して２５％のホモ接合体、５０％のへミ接合体、および２５％の導入遺伝子なしを備える。
【００５７】
本発明によって提供される遺伝子導入非ヒト哺乳動物の子孫、例えば本発明により提供される遺伝子導入マウスの子孫などは、遺伝子導入動物を適切な個人と交尾させることにより、または生体内で遺伝子導入動物の卵子および／または精子を受精させることによって得ることができる。
【００５８】
本明細書中で使用される「子孫」または「遺伝子導入非ヒト動物の子孫」という表現は最初に形質転換を受けた遺伝子導入非ヒト哺乳動物の前の世代の全ての祖先に関係する。子孫は、前記方法のいずれかを用いて導入遺伝子の存在を確認するために分析され得る。
【００５９】
本発明は、本発明によるＤＮＡ構造体、つまり、慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する染色体異常、もしくは造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関連する染色体異常によって形成および／または活性化される遺伝子からなる構造体をゲノムに含む遺伝子導入非ヒト哺乳動物の細胞系にも関するものであり、前記遺伝子は、Ｓｃａ−１＋ 細胞において前記遺伝子の発現を導くプロモータによって制御される。特別な実施例において、前記細胞系はマウス細胞系である。
【００６０】
他の実施態様において、本発明は、幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常、例えば、慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病、または造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関連する染色体異常造血幹細胞または非造血幹細胞に由来するヒトの腫瘍または非腫瘍性の病態を再現する非ヒト動物モデルの発生のために、Ｓｃａ−１＋ 細胞に遺伝子の発現を導くプロモータの使用に関するものである。特別な実施例において、前記プロモータは、Ｓｃａ−１＋ 細胞において遺伝子の発現を導くマウスのｐＬｙ−６Ｅ．１プロモータである。
【００６１】
本発明によって提供される遺伝子導入非ヒト哺乳動物、その子孫または本発明による細胞系は、例えば、慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する染色体異常や、造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関連する染色体異常などの造血幹細胞または非造血幹細胞由来のいずれの腫瘍性または非腫瘍性のヒト病態に関連する染色体異常を治療および／または予防するための潜在的に有効な化合物を評価するために有用なものである。従って、本発明は幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常の治療および／または予防のための潜在的に有効な化合物の評価において本発明によって提供される遺伝子導入非ヒト哺乳動物、その子孫または細胞系の使用にも関するものである。実施例において、前記染色体異常は、慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病、もしくは造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関与する染色体異常から選択されるものである。
【００６２】
遺伝子導入動物の場合において、幹細胞由来のヒト病態に対する治療および／または予防に関して潜在的に有効な化合物を評価することは、遺伝子導入動物に対して検査する化合物を種々の投与量で投与しそしてその動物の生理学的反応を時間の経過について評価することによって行われる。検査する化合物の投与は評価する化合物の化学的性質に依存して経口または非経口で投与することが可能である。場合によっては、その化合物を、化合物の効果を向上させる共同因子と共に投与することもできる。
【００６３】
本発明における細胞系の場合において、幹細胞由来のヒト病態治療および／または予防のための潜在的に有効な化合物の評価は検査する化合物を適切な時間に異なる濃度で細胞培養媒体に加えそして適切な生化学検査および／または組織学的検査を用いて時間経過におけるその化合物に対する細胞の反応を評価することによって行うことができる。同時に、化合物の効果を増長させる共同因子と共に、その化合物を細胞培養媒体に加えることが必要である。
【００６４】
他の実施態様において、本発明は幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常、例えば、慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病、もしくは造血幹細胞または胚幹細胞の移動に関する染色体異常から選択される幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常の治療および／または予防のための治療手段の媒体として、Ｓｃａ−１＋ 細胞に遺伝子の発現を導くプロモータの使用方法に関するものである。プロモータが、幹細胞などのＳｃａ−１＋ 細胞に導入遺伝子の発現を導くという事実は、幹細胞に種々の治療手段の特別で独占的な発現が可能である。特別な具体例において、前記プロモータは、Ｓｃａ−１＋ 細胞に遺伝子の発現を導くマウスのｐＬｙ−６Ｅ．１プロモータである。
【００６５】
治療手段用の媒体としてＳｃａ−１＋ 細胞に遺伝子の発現を導くプロモータの使用によって発生する幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常の治療および／または予防のための治療手段には、腫瘍形成における悪性遺伝子または融合遺伝子の非活性化、もしくは免疫不全症における機能遺伝子による欠陥遺伝子の置換または欠陥遺伝子を欠損させた機能遺伝子の導入がある。これらの治療手段は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の方法によって具現化できる。
（ｉ）Ｓｃａ−１＋ 細胞に遺伝子の発現を導くプロモータと治療および／または予防を行う幹細胞由来のヒト病体に関連する染色体異常の治療および／または予防のための適切な治療遺伝子とから成るＤＮＡ構造体を調製すること（この場合に、前記治療遺伝子はＳｃａ−１＋ 細胞に発現を導く遺伝子の制御下にある）、および（ｉｉ）細胞に外因性遺伝子を導入するプロセスにおいて遺伝子が正常に機能するように細胞内の伝達およびのその生物学的利用能を促進するベクターまたはシステムにＤＮＡ構造体を組み入れること。実例として、前記ベクターまたはシステムは、例えば、アデノウィルス、レンチウィルスなどのウィルス性ベクターや、ＤＮＡ−リポソーム、ＤＮＡ−ポリマー、ＤＮＡ−ポリマーリポソーム複合体などの非ウィル性のものが挙げられる（ファング，ハングおよびワグナー編集、アカデミック  プレス（１９９９年）発行の「遺伝子治療用の非ウイルス性ベクター」「Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｕａｎｇ，Ｈｕｎｇ，Ｗａｇｎｅｒ，「Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）」を参照のこと）。
【００６６】
本明細書中に使用される用語「遺伝子治療」は幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常の治療および／または予防のために有効な遺伝子または遺伝子構造体を意味し、リボソーム、遺伝子、融合体またはアンチセンス遺伝子構造体、および一般的には、慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病、ｃ−ｋｉｔレセプターまたはそのリガンド（ＳＣＦ）における変質などの染色体異常によって形成および／または活性化される遺伝子に対して有効な全ての遺伝子、遺伝子融合または遺伝子構造体を含むものである。
【００６７】
さらに、本発明は治療および／または予防させる幹細胞由来のヒト病態に関連する染色体異常の治療および／または予防のために適切な治療遺伝子と、Ｓｃａ−１＋ 細胞に遺伝子の発現を導くプロモータとから成るＤＮＡ構造体から成る医薬品組成物に関連するものであり、前記遺伝子は任意に１つまたはそれ以上の医薬的に容認できる賦形剤と共に用いて、Ｓｃａ−１＋ 細胞に発現を導く前記プロモータを制御するものである。治療遺伝子とプロモータとから成るＤＮＡ構造体は遺伝子工学における従来の技術によって得ることができる。本発明の医薬組成物に存在することが可能な賦形剤は、特に、医薬組成物の投与経路に依存する。使用する賦形剤の活性物質の異なる投与経路およびこれらの製造方法の概説については、シー  ファウリ  イ  トリロ著、ルザン５  ソシエダット  アノニマ編集（１９９３年）、「医薬学学説の解説」（Ｔｒａｄａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ  ｃ．Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ，Ｌｕｚａｎ  ５，Ｓ．Ａ．  ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ，（１９９３））を参照されたい。
【００６８】
特別な実施例において、本発明の医薬組成物の活性成分（ＤＮＡ構造体）の遺伝子の性質のため、これは内部にＤＮＡ構造体を含む細胞に外因性遺伝子の導入プロセスに役立つためのベクターまたはシステムから成るものであり、（それは例えば、アデノウィルス、レンチウィルス、レトロウィルスなどに基づくウイルス性のものや、ＤＮＡ−リポソーム、ＤＮＡ−ポリマー、ＤＮＡ−ポリマーリポソーム複合体などの非ウイルス性のものがある。（ファング，ハングおよびワグナー著、アカデミックプレス（１９９９年）編集、遺伝子治療用の非ウイルス性ベクター「Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｕａｎｇ，Ｈｕｎｇ，Ｗａｇｎｅｒ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）」を参照）。
【００６９】
また、本発明は例えば慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病、Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病、もしくは造血幹細胞または胚幹細胞の移動（例えば、ｃ−ｋｉｔレセプターまたはそのリガンドの変化）などの幹細胞由来のヒト病態に関連する異常染色体の治療および／または予防のための医薬組成物の合成においてＳｃａ−１＋ 細胞に遺伝子の発現を導くプロモータの使用方法に関するものである。
【００７０】
以下の例は本発明について説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。例１は遺伝子導入マウスの発生について説明し、例２は幹細胞由来のヒト病態の生体内の研究モデルとして、前記遺伝子導入マウスの使用を示すものである。このためには、ヒトの白血病に関連するキメラタンパク質をコード化する遺伝子融合に導く特徴的な染色体の転座が選択されている（例２参照）。前記遺伝子融合の変化する発現はヒトの白血病特有のサブグループに関係している。導入遺伝子は、Ｓｃａ−１＋ 細胞において、マウスのプロモータｐＬｙ−６Ｅ．１によって、前記導入遺伝子の発現が十分に導かれるマウスのゲノムに遺伝子融合が含まれるように導入される。前記遺伝子生成物が引き起こす過剰発現は各々の場合に研究されているヒトの白血病のほとんどの症状が現れ、分化プログラムにおいて、芽細胞（適切な場合）の存在および調和性のブロックが含まれる。遺伝子導入マウスには他の組織からの腫瘍は見つかっていない。これによって、前記導入遺伝子の過剰発現は研究されるヒトの白血病において主要な因子であること、また、研究対象である関連する遺伝子融合と関連しているヒト病態を生体内で模倣するマウスモデルを最初に提供したことの結論を導く。これらの結果は本発明が提供する遺伝子導入マウスが生体内で、研究される導入遺伝子の生態を研究するための新しいモデルを構成し、かつ腫瘍の発育において特定の染色体異常の役割を研究するための手段の有用有効性を表わすことを示している。
［実施例］
【００７１】
本実施例で使用される材料および方法は以下の通りである。
【００７２】
〔材料〕
プロモータ：Ｃ５７ＢＬ７６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において異なる導入遺伝子（ｃＤＮＡ）の組織特有の発現を導くためにプロモータｐＬｙ−６Ｅ．１が使用された。このプロモータは優れた特徴があり、使用された１６キロベース（ＫＢ）の断片には、Ｓｃａ−１＋ 細胞における選択的な発現に必要な全ての要素が含まれている（マイルス  シ，サンチス  エム  ジェイ，シンクレアー  エイおよびジェルサック著、（１９９７年）、成人造血幹細胞におけるＬｙ−６Ｅ１（Ｓｃａ−１）導入遺伝子の発現およびマウス胎芽の発育、発育、第１２４巻、第５３７頁乃至第５４７頁「Ｍｉｌｅｓ  Ｃ，Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｍ−Ｊ，Ｓｉｎｃｌａｉｒ  Ａ，ａｎｄ  Ｄｚｉｅｒｚａｋ，Ｅ  （１９９７）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｙ−６Ｅ１（Ｓｃａ−１）ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ」Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４，５３７，５４７」）。
遺伝子：使用された遺伝子は以下の通り。
【００７３】
ヒトＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ −ｔ（９：２２）（ｑ３４：ｑ１１）の結果として生成される遺伝子融合で、慢性骨髄性白血病に関連する。この染色体異常を示す患者は時間が経過すると、前記疾病の過程の特徴的な症状である胚盤胞を発生する。
【００７４】
ヒトＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ −ｔ（９；２２）染色体の転座によって発生するガン遺伝子で、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する。
【００７５】
マウスＳｌｕｇ−造血幹細胞の動態に関与する遺伝子。
【００７６】
マウスＳｎａｉｌ−胚幹細胞の移動に関与するSlugファミリーの遺伝子。
ヒトＨＯＸ１１−Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する異常染色体によって活性化される遺伝子。
【００７７】
ヒトＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２−Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する染色体異常によって活性化される遺伝子。
【００７８】
マウスＴＡＬ１−Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病に関連する異常染色体によって活性化される遺伝子。
【００７９】
ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ 、ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ｌ ９ ０ 、ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２およびＴＡＬ１として確認された活性化可能な遺伝子は遺伝学評論年鑑（１９９７年）第３１巻、第４２９頁乃至第４５３頁（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９７）３１：４２９−４５３に、Ｓｌｕｇ遺伝子はサイエンス（１９９４年）、第２６４巻、第８３５頁乃至第８４９頁（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６４：８３５−８４９）に、Ｓｎａｉｌ遺伝子は発育生化学（１９９８年）、第１９８巻、第２７７頁乃至第２８５頁、発育（１９９８年）第１２５巻、第３１１１頁乃至第３１２１頁および遺伝子（２０００年）第２５７巻、第１頁乃至第１２頁（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８）１９８：２７７−２８５，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９８）１２５：３１１１−３１２１，ａｎｄ  Ｇｅｎｅ（２０００）２５７：１−１２）に記載されている。
【００８０】
マウス：使用されたマウスはＧ５７ＢＬ／６  ｘ  ＣＢＡであり、乳母はＣＤ１である。
これらの動物は市販されており、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（米国）から入手できる。
【００８１】
〔方法〕
遺伝子導入マウスの発生および選択（スクリーニング）
各種のｃＤＮＡ（ヒトＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ 、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ 、マウスＳｌｕｇ、マウスＳｎａｉｌ、ＨＯＸ１１、ヒトＬＭＯ２／ＲＨＯＭ２およびマウスＴＡＬ１）を、ｐＬｙ−６Ｅ．１プロモータのＣｌａＩサイトにおいてクローン化した。適切な制限エンドヌクレアーゼでの消化により異なるｃＤＮＡが得られた。各ｃＤＮＡは、従来技術によりＣｌａＩで消化されたｐＬｙ−６Ｅ．１プロモータを含むベクターにおいてクローン化された（分子クローン化、第３版、サムブロークおよびルーセル著、シーエスエッチエルプレス（２００１年）発行「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１年）」）。
【００８２】
遺伝子導入マウスＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ 、Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ 、Ｓｃａ−１＋ Ｓｌｕｇ、Ｓｃａ−１＋ ＳｎａｉｌおよびＳｃａ−１＋ ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２の発生のために、ＮｏｔＩでの消化により微量注入用の線状ＤＮＡ断片が取得された。また、遺伝子導入マウスＳｃａ−１＋ ＨＯＸ１１およびＳｃａ−１＋ ＴＡＬ１の発生のために、微量注入用の線状ＤＮＡの断片をＢａｍＨ１による消化によって取得した。各種の線状ＤＮＡ断片がＣ５７ＢＬ／６Ｊ  ｘ  ＣＢＡマウスの受精卵母細胞に微量注入された。基礎となる遺伝子導入マウスはマウスの尾から抽出されたＤＮＡサンプルにおいて前記ｃＤＮＡを認識する特別なプローブを用いるサザン  ブロット分析法を使用して識別された。
【００８３】
受精卵母細胞の準備、プロモータと作用的に結合させた活性化可能な遺伝子とを含むＤＮＡ構造体の微量注入、および前記ＤＮＡ構造体が注入された受精卵母細胞の偽妊娠乳母への再移植、および妊娠期間中乳母を維持することは、従来の技術を用いて行った（ホガン，コンスタンチニ  および  ラシー（１９８６年）著、マウス胎芽の処理、研究所手引き、コールド  スプリング  ハーバー研究所発行、コールド  スプリング  ハーバー（１９８６）「Ｈｏｇａｎ，Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ＆Ｌａｃｙ（１９８６）「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８６））。  （ｉ）正しく形質転換した受精卵母細胞と  （ｉｉ）終結まで発達しそして遺伝子導入マウスを生み出した胚との割合は前記ホガン，コンスタンチニ  および  ラシー（１９８６）の結果と同様であった。
【００８４】
遺伝子導入マウスの子／子孫は基礎となるＣ５７ＢＬ／６  ｘ  ＣＢＡを有するマウスを交配させ、ｃＤＮＡを認識する特別なプローブを用いてサザン  ブロット分析法によって陽性マウスを識別することによって得られる。
【００８５】
〔胎児分析〕
血球計算（サイトメトリー）のための染色には、モノクローナル抗マウス抗体（ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０，Ｔｈｙ−１．１およびＴｈｙ−１．２、骨髄性マーカ（Ｍａｃ  １／ＣＤ１１ｂおよびＧｒ−１）およびＳｉｇ）をフィコエリトリン（ＰＥ）と結合させる（すべてＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ製）。ルーチン技術によって得られた全血液サンプルからの細胞の懸濁液はＦｃによるレセプターとの結合をブロックするために精製されたＣＤ３２／ＣＤ１６抗マウス（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、それぞれ室温において４℃に適切に希釈された各種の抗体で培養された。赤血球は溶解液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて溶解した。サンプルはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄し、そしてＰＢＳ中に再懸濁させた。サンプル中の死細胞はプロピジウムヨウ化物（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）を用いた染色によって排除した。サンプルおよびデータはＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてＦＡＣＳｃａｎで分析した。
【００８６】
〔ＰＣＲ分析〕
ｍＲＮＡはキメラマウスの異なる組織から得た。ｃＤＮＡは、ＲＮａｓｅのＤＮＡｓｅ  Ｉ（ＨＴ）で処理したＲＮＡの各標本の逆転写によって得た。ｃＤＮＡは各場合に特別な表示器を用いてＰＣＲにかけた（ダイレクトイニシエーター（５' ）は、ｃＤＮＡの最初の２０ベースに対応し、インバースイニシエーター（３' ）は、ｃＤＮＡの最後の２０ベースに対して補足的であった）。反応は、Ｔａｑポリメラーゼのサプライヤー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）の指示に従って、９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分のサイクルを２５サイクル行い、そして最後に７２℃で１０分延長した。
【００８７】
〔組織学的分析〕
組織サンプルは、ＰＢＳにおいて４％のホルムアルデヒドで固定し、そしてパラフィンに浸した。処理した薄膜を切り出し、ルーチン技術によってヘマトキシリン−エオシンを用いて染色した。薄膜を試験しかつ写真撮影した。
【００８８】
〔ウェスタンブロット分析〕
脾臓から採取した細胞の懸濁液を従来の方法を使用する免疫ブロット法で分析した（抗体、研究所手引き、ハーロウおよびレーン著、ＣＳＨ、１９８８年発行「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ＣＳＨ，１９８８」）。
【００８９】
〔免疫グロブリン再編成／ＴＣＲ遺伝子〕
ＤＮＡは異なる細胞から従来の技術を用いて調製した。ＤＮＡはＢａｍＨＩで分解し、特定の免疫グロブリンのプローブでサザンブロット法によって分析した（血液（迅速出版）第９０巻、第２１６８頁乃至第２１７４頁、１９９７年「Ｂｌｏｏｄ（ｒａｐｉｄ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）９０：２１６８−２１７４（１９９７）」）。
【００９０】
〔細胞導入〕
ドナーマウスの器官から得た細胞は懸濁され、洗浄され、４〜６か月のレセプターマウスの尾に静脈注射された（ＮＯＤ／ＳＣＤＩ）（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。マウスの観察は１週間に１度行われ、死にかけた状態の時に、ＤＮＡ分析用の組織病理研究および組織収集のために犠牲にされた。
【実施例１】
【００９１】
遺伝子導入マウスの発生
１．１  Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ 遺伝子導入マウスの発生
遺伝子生成物、ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ （ｔ（９：２２）（ｑ３４；ｑ１１）の結果として生じかつ慢性骨髄性白血病に関連する遺伝子融合）の発現の直接的な結果を生体内で確認するため、キメラヒトタンパク質ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ のｃＤＮＡをマウスのプロモータｐＬｙ−６Ｅ．１のコントロール下でクローン化し、受精卵母細胞を前記「方法」の項で述べた方法に従ってＣ５７ＢＬ／６Ｊ  ｘ  ＣＢＡマウスに注入した。２匹の遺伝子導入始祖マウス（Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ ）が、導入遺伝子を生殖細胞系に伝達する能力を示した。導入遺伝子の発現が両方の系で観察され、Ｆ７レベル（第７世代）まで子孫が繁殖された。導入遺伝子の発現は、ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロット分析法によって証明された。両方の細胞系はＳｃａ−１＋ 細胞に優先的な発現が認められた。導入遺伝子の発現はオスとメスの両方のマウスにおいて観察され、Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ 遺伝子導入マウスの両方の系で結果は同様であった。
【００９２】
１．２  その他の遺伝子導入マウスの発生
生体内で遺伝子生成物、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ 、マウスＳｌｕｇ、マウスＳｎａｉｌ、ヒトＨＯＸ１１、ヒトＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２およびマウスＴＡＬ１の発現の直接的な結果を調べるために、対応するｃＤＮＡをマウスのプロモータｐＬｙ−６ｂ．１のコントロール下でクローン化し、生じた構造体を前もって直線化しそしてＣ５７ＢＬ／６Ｊ  ｘ  ＣＢＡマウスの受精卵母細胞に前記「方法」の項で示される方法に従って注入した。各構造体に対して、導入遺伝子を生殖細胞系に伝達する能力を有する２匹の遺伝子導入始祖マウスが得られた。このようにして実験を行い、以下のように認識された遺伝子導入マウスを得た。
Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ｌ ９ ０ （Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病を生じる）（図３参照）：
Ｓｃａ−１＋ Ｓｌｕｇ（造血幹細胞の移動を生じるが、白血病を有しない）；
Ｓｃａ−１＋ Ｓｎａｉｌ（造血幹細胞の移動を生じるが、白血病を有しない）；
Ｓｃａ−１＋ ＨＯＸ１１（Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病を生じる）；
Ｓｃａ−１＋ ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２（Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病を生じる）；
Ｓｃａ−１＋ ＴＡＬ１（Ｔ細胞急性リンパ母細胞性白血病を生じる）；
全ての場合に、両方の系において導入遺伝子の発現が観察され、Ｆ７レベル（第７世代）まで子孫が繁殖された。導入遺伝子の発現はＰＣＲおよび／またはウェスタンブロット分析法によって確認された。両方の細胞系はＳｃａ−１＋ 細胞に優先的な発現が認められた。導入遺伝子の発現はオスとメスの両方のマウスにおいて観察され、両方の系で結果は同様であった。
【実施例２】
【００９３】
遺伝子導入マウスにおける白血病の発現
ヒト病態では、遺伝子のキメラ生成物Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ 、Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ 、Ｓｃａ−１＋ Ｓｌｕｇ、Ｓｃａ−１＋ Ｓｎａｉｌ、Ｓｃａ−１＋ ＨＯＸ１１、Ｓｃａ−１＋ ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２およびＳｃａ−１＋ ＴＡＬ１は各種の白血病に、特に、慢性骨髄性白血病（ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ ）、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病（ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ 、）およびＴ細胞急性リンパ母細胞性白血病（ＨＯＸ１１、ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２およびＴＡＬ１）に関与しているが、適切な細胞タイプの発現を行うためのプロモータの選択が難しいことから、前記白血病のための現在のマウスモデルは、前記病態を一貫して再現することに失敗している（遺伝子学評論年鑑、（１９９７年）、第３１巻、第４２９頁乃至第４５３頁および現代遺伝子学（２０００年）、第１頁、第７０頁乃至第８０頁「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）３１：４２９−４５３；Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２０００）、１：７１−８０」）。
【００９４】
対応する白血病の診断を確立させることができるように、各種の遺伝子導入マウスの白血病細胞の詳細な分析が行われた（Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ （図１及び２）、Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ 、（図３）、Ｓｃａ−１＋ ＨＯＸ１１、Ｓｃａ−１＋ ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２およびＳｃａ−１＋ ＴＡＬ１）。ヘマトキシリン／エオシンによる染色は白血病細胞がリンパ系／骨髄系の形態を有していることを示した。末梢血管の単核細胞のほとんどは対応する白血病に適合する表現型を有している。
【００９５】
分析する遺伝子導入マウスの細胞の腫瘍形成能をテストするために、１×１０６ 個の細胞を静脈注射で正常な非照射のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注入した。全てのマウスは移植後６〜１１週間の間に漸次発生した白血病を示した。反対に、１０匹のコントロールマウスから得た細胞を注入した２０匹のマウスはドナーに起因する可能性のある白血病を示さなかった。移植された細胞は同じクラスの白血病を発生させた。また、ドナーマウスの白血病クローンの起源はＰＣＲ分析法を用いて確認し、対応する導入遺伝子の存在が明らかになった。
【００９６】
詳述すると、各場合において、遺伝子導入マウスのオスとメスは一様に（対応する病態の）同じ症状を示しており、８週間後に臨床的な兆候を示し始め、時間の経過と共にそれが増加し、１２〜１６か月に１００％のマウスが死亡する。基礎となるマウスはオスとメスで、その他の遺伝子導入マウスのものと同じように、対応する疾病に関連する臨床病状を生じた。全ての遺伝子導入マウスは腫瘍のため１４〜１８カ月で死亡した。２匹の基礎となるマウスの系で生き残ったものの割合は各場合において同様であった。各非遺伝子導入同腹の子において同数のマウスからなるコントロールグループには腫瘍は観察されなかった。しばしばその動物が頻呼吸に陥ったため屠殺した。病理解剖を行うと、その動物には触診でわかる造血性組織と関連する塊（各病態に特有）が発育しており、解剖後に、正常な器官の５〜１００倍大きいことがわかった。非造血組織における腫瘍の湿潤が観察されたため、顕微鏡を用いて確認した。この検査は造血組織の疾病と一致している。しかし、これらの遺伝子導入マウスでは、他の組織からの腫瘍は見られなかった。これらの動物の組織学的分析は造血組織(脾臓および骨髄)および非造血組織(肝臓、肺、精巣など)からの白血病細胞の顕著な湿潤を示した。
【００９７】
従って、研究されたマウスモデルは対象となるヒトの白血病（慢性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ母細胞性白血病およびＴ細胞急性リンパ母細胞性白血病）で起こる再編成に似ているだけではなく、その含有する遺伝子融合がヒト病態に関連しているものと同じ表現型をも再現する。これらの結果はこれらのマウスモデルが検査する導入遺伝子（ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ 、ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ 、Ｓｃａ−１＋ ＨＯＸ１１、Ｓｃａ−１＋ ＲＨＯＭ２／ＬＭＯ−２およびＳｃａ−１＋ ＴＡＬ１）の生態の生体内研究のための理想的なモデルであることを示している。
【００９８】
全体として、得られた結果はマウスプロモータｐＬｙ−６Ｅ．１の発現のコントロール要素を制限することおよび染色体異常の結果を反復することによって、対応するガン遺伝子の発現が導かれる新しいマウスモデルの発生を証明している。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１Ａ】ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスの骨髄（ＢＭ）および末梢血管（ＰＢ）に存在する細胞組織の代表的な分析結果の小区画写真図である。
【図１Ｂ】慢性骨髄性白血病を有するＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスの脾臓、肝臓およびリンパ節の部分の代表的な組織学的検査の結果の小区画写真図である。
【図１Ｃ】Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスの末梢血管に対するギムザ染色の代表的な例の写真図である。
【図２Ａ】Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスの骨髄（ＢＭ）、脾臓および末梢血管（ＰＢ）に存在する細胞組織の代表的な分析結果の小区画写真図である。
【図２Ｂ】Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスの肝臓の部分の代表的な組織学検査の結果を示す写真図である。
【図２Ｃ】Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスの末梢血管のギムザ染色の代表的な例を示す写真図である。
【図３Ａ】コントロールマウスおよびＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスに対するサザンブロット分析法によるＤＮＡ分析を示す写真図である。
【図３Ｂ】Ｓｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ ２ １ ０ マウスおよびコントロールマウスの脾臓、肝臓、肺に対する代表的な組織学検査の結果と末梢血管の染色結果を示す写真図である。
【図３Ｃ】コントロールマウスとＳｃａ−１＋ ＢＣＲ−ＡＢＬＰ １ ９ ０ マウスの骨髄および末梢血管（ＰＢ）に存在する細胞組織の代表的な分析を示す小区画写真図である。
【図１Ａ】
2005510241.tif 000002
【図１Ｂ】
2005510241.tif 000003
【図１Ｃ】
2005510241.tif 000004
【図２Ａ】
2005510241.tif 000005
【図２Ｂ】
2005510241.tif 000006
【図２Ｃ】
2005510241.tif 000007
【図３Ａ】
2005510241.tif 000008
【図３Ｂ】
2005510241.tif 000009
【図３Ｃ】
2005510241.tif 000010
【国際調査報告】
2005510241.tif 000011
2005510241.tif 000012
2005510241.tif 000013
2005510241.tif 000014
2005510241.tif 000015
2005510241.tif 000016
2005510241.tif 000017
2005510241.tif 000018