(57)【要約】  ラベル化抗体が不要の抗原の検出方法を提供する。抗原を含む第１の緩衝液に、抗体及びマルチ銅酸化酵素ＣｕｅＯが固定化された担体を接触させ、前記担体及び第２の緩衝液を用いるポテンシオスタット法により電流を測定し、測定された電流が１．５×（ブランク値）以上であるとき、前記抗原が存在することが決定される。前記第２の緩衝液は、前期ＣｕｅＯの基質を含有し、０．３ｍＭ以上１．０ｍＭ以下の範囲に収まるイオン強度を有する。
2011151964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を具備する、抗原を検出する方法：
前記抗原を含有すると予想される第１の緩衝液に担体を接触させる工程（Ａ）、
ここで、前記担体には抗体およびマルチ銅酸化酵素CueOが固定されており、
当該担体は導電性であり、
前記抗体は前記抗原に特異的に反応し、
前記担体および第２の緩衝液を用いるポテンシオスタット法により電流を測定する工程（Ｂ）、
ここで、前記第２の緩衝液は、前記マルチ銅酸化酵素CueOの基質を含有し、
前記第２の緩衝液は、０．３ｍＭ以上１．０ｍＭ以下の範囲に収まるイオン強度を有し、および
以下の不等式が充足されれば前記第１の緩衝液において前記抗原が存在することが決定される工程（Ｃ）
工程（Ｂ）において測定された電流  ＞＝  １．５×（ブランク値）
ここで、前記ブランク値は、前記抗原は用いられないが、前記第２の緩衝液は用いられるポテンシオスタット法により測定された電流である。
【請求項２】
前記担体はカーボンから構成される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記第２の緩衝液は、５．０以上６．０以下のｐＨを有する、請求項１の方法。
【請求項４】
前記第２の緩衝液は酸素およびプロトンを含有する、請求項１の方法。
【請求項５】
前記第１の緩衝液は、トリス−塩酸緩衝液、トリス緩衝生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水である、請求項１の方法。
【請求項６】
前記第２の緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、または２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液である、請求項１の方法。
【請求項７】
前記第２の緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、または２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液である、請求項5の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体および酵素を利用して抗原を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、酵素免疫測定法を開示している。図２は当該酵素免疫測定法に含まれるサンドイッチ法を示す。【０００３】
図２に示されるように、担体１０７は、抗体１０８を表面に有する。抗原１０９を含有する試料が担体１０７の表面に供給され、抗原１０９が抗体１０８に特異的に結合することがもたらされる。その後、未反応の抗原１０９を含有する試料が洗浄により除去される。【０００４】
次に、抗原１０９を検出する酵素１１０を具備しているラベル化抗体１１１が、担体１０７の表面に供給され、抗体１０８、抗原１０９、およびラベル化抗体１１１から構成される複合体を形成する。その後、未反応のラベル化抗体が洗浄により除去される。【０００５】
最後に、酵素１１０の基質１１２が担体１０７の表面に供給される。酵素１１０は基質１１２と代謝的に反応して、生成物１１３を形成する。生成物１１３の発光または吸光度が測定され、抗原１０９を間接的に検出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４２７１０８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、サンドイッチ法は、抗体１０８だけでなく、酵素１１０を具備しているラベル化抗体１１１をも必要とする。ラベル化抗体１１１は、抗体１０８と抗原１０９との間の特異的反応の後に供給されることを必要とする。さらに、未反応のラベル化抗体１１１は除去されることを必要とする。【０００８】
本発明の目的は、ラベル化抗体を用いずに抗原を検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（１）以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を具備する、抗原を検出する方法：
前記抗原を含有すると予想される第１の緩衝液に担体を接触させる工程（Ａ）、
ここで、前記担体には抗体およびマルチ銅酸化酵素CueOが固定されており、
当該担体は導電性であり、
前記抗体は前記抗原に特異的に反応し、
前記担体および第２の緩衝液を用いるポテンシオスタット法により電流を測定する工程（Ｂ）、
ここで、前記第２の緩衝液は、前記マルチ銅酸化酵素CueOの基質を含有し、
前記第２の緩衝液は、０．３ｍＭ以上１．０ｍＭ以下の範囲に収まるイオン強度を有し、および
以下の不等式が充足されれば前記第１の緩衝液において前記抗原が存在することが決定される工程（Ｃ）
工程（Ｂ）において測定された電流  ＞＝  １．５×（ブランク値）
ここで、前記ブランク値は、前記抗原は用いられないが、前記第２の緩衝液は用いられるポテンシオスタット法により測定された電流である。
（２）前記担体はカーボンから構成される、（１）の方法。
（３）前記第２の緩衝液は、５．０以上６．０以下のｐＨを有する、（１）の方法。
（４）前記第２の緩衝液は酸素およびプロトンを含有する、（１）の方法。
（５）前記第１の緩衝液は、トリス−塩酸緩衝液、トリス緩衝生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水である、（１）の方法。
（６）前記第２の緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、または２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液である、（１）の方法。
（７）前記第２の緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、または２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液である、（５）の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、ラベル化抗体を用いずに抗原を検出する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明による抗原検出方法の反応フローを示す図である。
【図２】図２は、従来の酵素免疫測定法（サンドイッチ法）の反応フローを示す図である。
【図３】図３は、本発明による抗原検出方法において用いられる電気化学測定装置の基本構成を示す図である。
【図４】図４は、本発明による抗原検出方法において用いられる作用電極の基本構成を示す図である。
【図５】図５は、実施例１における電気化学測定の例を示す図である。
【図６】図６は、実施例１における電気化学測定の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施の形態が説明される。
【００１３】
図１は、本発明による抗原検出方法の反応フローを示す。
【００１４】
（工程Ａ）
工程（Ａ）では、抗原１０４を含有すると予想される第１の緩衝液に担体１０１が接触される。
【００１５】
本発明により検出される抗原１０４の例は、ウイルス、細菌、真菌、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドである。ウイルス、細菌、または真菌が好ましい。
【００１６】
第１の緩衝液の例は、トリス−塩酸緩衝液、トリス緩衝生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水である。好ましくは、当該第１の緩衝液は、中性付近のｐＨを有する。
【００１７】
担体１０１は、マルチ銅酸化酵素１０２および抗体１０３を表面に具備する。
【００１８】
担体１０１は、工程（Ｂ）において作用電極の一部を構成するため、電気的に導電性であることが必要とされる。担体１０１の材料の好適な例は、カーボンである。当該カーボンとして、カーボンナノチューブ、カーボンブラック、ケッチェンブラック、グラッシーカーボン、および高配向性結晶黒鉛（ＨＯＰＧ、高配向熱分解黒鉛）が好ましく用いられる。カーボンナノチューブがより好ましい。
【００１９】
図１に示されるように、抗体１０３およびマルチ銅酸化酵素１０２が、担体１０１の表面に固定されている。抗体１０３は、抗原１０４と特異的に結合する。
【００２０】
抗体１０３は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。Ｆｃ領域が人為的に除去されたＦａｂフラグメント抗体およびＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体も用いられ得る。
【００２１】
マルチ銅酸化酵素１０２は、酸化還元反応を触媒する酵素の一種である。本明細書においては、マルチ銅酸化酵素１０２は、「ＣｕｅＯ」と表記され得る。マルチ銅酸化酵素１０２は、分子状酸素からなる基質１０５を４電子還元し、生成物１０６として水が生成される反応を触媒する。マルチ銅酸化酵素１０２の活性中心は、タイプ１、タイプ２、タイプ３ａ、およびタイプ３ｂと呼ばれる性質の異なる４個の銅イオンから構成される。
【００２２】
好ましいマルチ銅酸化酵素１０２は、ラッカーゼである。大腸菌由来のＣｕｅＯが用いられることがより好ましい。
【００２３】
抗体１０３及びマルチ銅酸化酵素１０２を担体１０１に固定する方法としては、以下の方法（ａ）および方法（ｂ）が挙げられる。
方法（ａ）：担体１０１と、抗体１０３またはマルチ銅酸化酵素１０２との間の疎水性相互作用による非特異的吸着を利用する方法。
方法（ｂ）：担体１０１を、抗体１０３またはマルチ銅酸化酵素１０２に化学的に結合させる方法。
【００２４】
具体的な（ｂ）の方法は、以下の通りである。
担体１０１にカルボキシル基が導入される。そのカルボキシル基が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて処理される。その後、抗体１０３及びマルチ銅酸化酵素１０２が添加される。抗体１０３の表面が有するリジン残基のアミノ基が、カルボキシル基と反応し、アミド結合を形成する。同様に、マルチ銅酸化酵素１０２の表面が有するリジン残基のアミノ基も、カルボキシル基と反応し、アミド結合を形成する。
【００２５】
第１の緩衝液に担体１０１を接触させる方法としては、以下の２つの方法が挙げられる：
第１の緩衝液で、担体１０１の表面を被覆する方法、および
第１の緩衝液に、担体１０１を浸漬する方法。
【００２６】
当該接触は、抗体１０３と抗原１０４との間の特異的結合をもたらす。その後、洗浄により、未反応の抗原１０４を含有する第１の緩衝液は、担体１０１の表面から除去される。
【００２７】
本発明では、抗原１０４と抗体１０３との特異的結合が、マルチ銅酸化酵素１０２の酵素活性の上昇をもたらす。
【００２８】
（工程（Ｂ））
工程（Ｂ）では、担体１０１および第２の緩衝液を用いるポテンシオスタット法により電流が測定される。
【００２９】
第２の緩衝液は、前記マルチ銅酸化酵素ＣｕｅＯの基質１０５を含有する。基質１０５の例は、酸素およびプロトンである。これらは、市販されている一般的な緩衝液に含まれている。
【００３０】
第２の緩衝液は、５．０以上６．０以下のｐＨを有することが好ましい。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、およびトリメチルアンモニウムが用いられて、ｐＨを調整する。第２の緩衝液の例は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、およびＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液である。酢酸緩衝液が好ましい。
【００３１】
前記第２の緩衝液は、０．３ｍＭ以上１．０ｍＭ以下の範囲に収まるイオン強度を有することを必要とされる。０．３ｍＭ未満では、ｐＨの安定性を確保することが困難である。１．０ｍＭを超えると、後述する実施例からも明らかなように、第１の緩衝液に含有される抗体を検出することが困難となる。
【００３２】
図３は、ポテンシオスタット法のために用いられる電気化学測定装置を示す。当該電気化学測定装置は、ポテンシオスタットから構成される測定器１１４、作用電極１１５、参照電極１１６、およびカウンター電極１１７を具備する。
【００３３】
参照電極１１６の例は、飽和ＫＣｌ銀／塩化銀電極である。カウンター電極１１７の例は、Ｐｔ電極である。作用電極１１５は、担体１０１を具備する。
【００３４】
図５は、作用電極１１５の一例を示す。作用電極１１５は、グラッシーカーボン電極１２１の先端に取り付けられた担体１０１を具備する。グラッシーカーボン電極１２１の先端は、ネット１２２およびリング１２３をさらに具備する。ネット１２２およびリング１２３によって、担体１０１がグラッシーカーボン電極１２１の先端に固定される。好ましくは、ネット１２２の材料はナイロンである。
【００３５】
図３に示されるように、測定器１１４に接続されたこれら３つの電極１１５〜１１７は、反応槽１１８の内部に貯められた第２の緩衝液１１９に浸漬される。その後、ポテンシオスタット法により電流が測定される。ポテンシオスタット法では、開始電位０．６Ｖおよび終了電位０Ｖの間で掃引が行われ得る。マルチ銅酸化酵素１０２の酵素活性により生じる還元電流は、電位が０Ｖに近づくに従い増大する。後述する実施例１から明らかなように、開始電位０．６Ｖから電位０．４５Ｖまでの期間では、電流はほとんど変化しない。これは、当該期間においては、マルチ銅酸化酵素１０２の反応がほとんど進行しないためである。
【００３６】
３つの電極１１５〜１１７が第２の緩衝液１１９に浸漬されることに代えて、図４に示されるように、第２の緩衝液１１９が、作用電極１１５、参照電極１１６、およびカウンター電極１１７を被覆し得る。図４に示される３つの電極１１５〜１１７は、基板１２０の表面に配置されている。
【００３７】
（工程（Ｃ））
工程（Ｃ）では、以下の不等式が充足されれば第１の緩衝液が抗原を含有することが決定される。
工程（Ｂ）において測定された電流≧１．５×（ブランク値）
ここで、ブランク値は、抗原は用いられないが、第２の緩衝液は用いられるポテンシオスタット法により測定された電流である。当該決定により、抗原が検出される。
【００３８】
ブランク値は、工程（Ｃ）と平行して算出され得る。または、ブランク値は、予め算出され得る。
【００３９】
以下の実施例１を用いて、本発明はより詳細に説明される。
【００４０】
（実施例１）
（抗体の調製）
抗Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ抗体（抗ＢＳＡ抗体：ＩｇＧ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−Ａｌｂｕｍｉｎ  （Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）  ［Ｒａｂｂｉｔ］  ；Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を含有する溶液が用いられた。当該抗体の溶媒が、限外ろ過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４、ＭＷＣＯ：  ３０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて１０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（トリス−塩酸緩衝液）（ｐＨ７．５）に置換された。
【００４１】
溶媒を置換した後、抗体の濃度は、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）をスタンダードとして用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（プロテインアッセイキットＩＩ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に基づいて測定された。抗体は２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有した。得られた抗ＢＳＡ抗体は４℃で保管された。
【００４２】
（ＣｕｅＯ溶液の調製）
大腸菌由来（Ｋ−１２株）のＣｕｅＯは、以下に記述されるように、組換体ＣｕｅＯとして大腸菌内で生産され、精製された。
【００４３】
ＣｕｅＯの遺伝子は、大腸菌ゲノムＤＮＡ（ＬＡ  ＰＣＲ用ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｔ；  タカラバイオ社製）を用いるＰＣＲ法により増幅された。
【００４４】
当該ＰＣＲにおいては、ヒスチジンタグをコードする塩基配列がオリゴＤＮＡプライマーに付加され、ＣｕｅＯのアミノ酸配列のカルボキシル末端側にヒスチジンタグを付加した。
【００４５】
増幅されたＤＮＡ断片は、発現ベクター（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１  Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングされた（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔｓ；クロンテック社製）。当該発現ベクターを用いて大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）；ストラタジーン社製）が形質転換された。形質転換された大腸菌は、１ｍＭの硫酸銅を含有するＬＢ培地上で３０℃、１６時間培養された。
【００４６】
回収した菌体よりペリプラズム画分が抽出され、ヒスチジンタグ精製カラム（ＴＡＬＯＮ  ＣｅｌｌＴｈｒｕ  Ｒｅｓｉｎ；  クロンテック社製）および陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  ５ｍＬ；  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、抽出液からＣｕｅＯが精製された。
【００４７】
脱塩カラム（ＨｉＴｒａｐ  ｄｅｓａｌｔｉｎｇ；  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、精製されたＣｕｅＯを含有する溶液の溶媒が１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に置換された。その後、限外ろ過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４、ＭＷＣＯ：３０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてＣｕｅＯ溶液は濃縮された。濃縮後のＣｕｅＯ溶液は、４  ｍｇ／ｍＬの濃度を有していた。ＣｕｅＯの濃度は、ＢＳＡをスタンダードとして用いたＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定された。得られたＣｕｅＯ溶液は４℃で保管された。
【００４８】
（担体の調製）
５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が５ｍｇのカーボンナノチューブ（ＳＷＣＮＴ；Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に添加された。その後、当該ＤＭＳＯ溶液を超音波ホモジナイザー（ｓｏｎｉｆｉｅｒ  １５０；Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて、出力１０  Ｗａｔｔｓ  （ＲＭＳ）で３分間かけて均質化し、ＳＷＣＮＴ懸濁液を得た。
【００４９】
２ｍｍの厚みを有するカーボンフェルト（日本カーボン社製）から、６ｍｍの直径を有するカーボンフェルトが切り抜かれた。当該カーボンフェルトは、プラスチック製カラム（バイオスピンエンプティーカラム；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にセットされた。
【００５０】
５００μＬのＳＷＣＮＴ懸濁液がカーボンフェルト上に滴下され、当該カーボンフェルトにカーボンナノチューブを吸着した。０．３ｍＬのＤＭＳＯおよび３ｍＬの超純水が当該カラムにこの順に流された。次に、当該カラムに１ｍＬのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）が流され、当該カラムを洗浄した。当該カラム内で得られたカーボンフェルトが担体として用いられた。
【００５１】
（ＣｕｅＯ溶液及び抗体の担体への固定）
上記の担体がセットされたカラムに、２ｍｇ／ｍＬのＣｕｅＯ溶液、６ｍｇ／ｍＬの抗ＢＳＡ抗体を含有する０．１ｍＬのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）が滴下された。２５℃で１０分間のインキュベートにより、ＣｕｅＯおよび抗ＢＳＡ抗体がカーボンフェルトから構成される担体に結合した。このようにして、ＣｕｅＯおよび抗ＢＳＡ抗体が固定化された。
【００５２】
当該カラムに、２ｍＬの氷冷したトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）が流された。得られた担体は４℃で保管された。
【００５３】
（酢酸緩衝液の調製）
ｐＨメータを用いてｐＨを測定しながら、酢酸に水酸化ナトリウムが加えられて、３のｐＨを有する１Ｍ酢酸緩衝液を調製した。当該酢酸緩衝液は０．１％に希釈され、１．０ｍＭの濃度を有する酢酸緩衝液（ｐＨ：３）を調製した。同様に、６のｐＨを有する１Ｍ酢酸緩衝液を調製した。さらに、１．０ｍＭの濃度を有する酢酸緩衝液（ｐＨ：６）を調製した。
【００５４】
ｐＨメータを用いてｐＨを測定しながら、１．０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ：６）に１．０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ：３）が添加され、１．０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ：５．５）を調製した。ｐＨ調整時の温度は２５℃であった。
【００５５】
同様に、０．５ｍＭ、５ｍＭ、及び１０ｍＭの濃度を有する酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）がそれぞれ調製された。
【００５６】
（ポテンシオスタット法による電気化学測定）
（測定装置）
ＣｕｅＯの酵素活性は、ポテンシオスタット法による電気化学測定により測定された。図３に示される電気化学測定装置が用いられた。測定器１１４は、ポテンシオスタット（ＡＬＳ７６０Ｃ（ＢＡＳ社製））であった。参照電極１１６は飽和ＫＣｌ銀／塩化銀電極（ＲＥ−１Ｃ；ＢＡＳ社製）であった。カウンター電極１１７はＰｔ電極（長さ２３ｃｍ、ＢＡＳ社製）であった。
【００５７】
図１及び図５に示されるように、抗体１０３及びマルチ銅酸化酵素１０２を具備する担体１０１が、ナイロンネット１２２およびリング１２３によってグラッシーカーボン電極１２１（電極サイズ（ＩＤ）：３ｍｍ、ＢＡＳ社製）に固定され、作用電極１１５を得た。
【００５８】
（ブランク値の算出）
当該作用電極１１５を用いて測定が行なわれた。支持電解質として１０ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５、１ｍＭ）をセルに供給した。当該セルに、作用電極１１５、参照電極１１６、及びカウンター電極１１７が浸漬された。当該浸漬は、担体１０１に含有される１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）が１ｍＭ酢酸緩衝液に置換されることをもたらした。
【００５９】
２５℃においてポテンシオスタット法により、２０ｍＶ／ｓｅｃの掃引速度で、開始電位０．６Ｖから終了電位０Ｖまで掃引がなされ、電流値を測定した。図６の（２）は、測定結果を示す。
【００６０】
ＣｕｅＯの酵素活性により生じる還元電流は電位が０．６Ｖから０Ｖに近づくに従い増大した。開始電位０．６Ｖから０．４５Ｖまでの期間では、酵素反応がほとんど進行しなかったため、０．４５Ｖの電位における電流値が基準値（図６における符号「１」）として定義された。以下の等式によってブランク値が定義された。
（ブランク値）＝（測定された電流値（２））−（当該基準値（１））
【００６１】
（抗原の検出）
ＣｕｅＯおよび抗体が固定された担体がプラスチック製カラムの一端にセットされた。カラムに１ｍＬのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）が流された。
【００６２】
次に、被覆されたシリカビーズ（３００ｎｍ、ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）を含有する１ｍＬのトリス−塩酸緩衝液（２５  ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ））が当該カラムに流された。各シリカビーズは、抗原であるＢＳＡによって被覆されていた。
【００６３】
当該カラムの末端より流れ出てきた溶液が回収され、再度、当該カラムに流された。これが１０回、繰り返された。最後に、２ｍＬのトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）がカラムに流された。
【００６４】
カラムから担体が取り出された。図５に示されるように、グラッシーカーボン電極１２１の先端に、ナイロンネット１２２およびリング１２３を用いて担体１０１が取付けられ、作用電極１１５を得た。
【００６５】
ブランク値の測定と同様に、１０ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５、１．０ｍＭ）を含有するセルに作用電極１１５が浸漬された。２５℃においてポテンシオスタット法により、２０ｍＶ／ｓｅｃの掃引速度で、開始電位０．６Ｖから終了電位０Ｖまで掃引がなされ、電流値を測定した。図６の（３）は、測定結果を示す。
【００６６】
測定値は以下の等式により定義された。
（測定値）＝（測定された電流値（３））−（基準値（１））
【００６７】
増幅率が以下の等式のように定義された：
（増幅率）＝（測定値）／（ブランク値）。
【００６８】
０．５ｍＭ、５ｍＭ、および１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ：５．５）を用いて、上記の場合と同様に増幅率が求められた。
【００６９】
表１は、掃引電位が０．０Ｖ、０．１Ｖ、０．２Ｖ、および０．３Ｖである場合におけるブランク値、測定値、および増幅率を示す。
【００７０】
【表１】
2011151964.tif 000003
【００７１】
表１から理解されるように、酢酸緩衝液の濃度が０．５ｍＭまたは１．０ｍＭである場合には、１．５以上の増幅率が得られた。一方、酢酸緩衝液の濃度が５ｍＭ以上である場合には、増幅率が小さかった。
【００７２】
従って、１．０ｍＭ以下の濃度を有する第２の緩衝液を用いるポテンシオスタット法によって測定された増幅率が１．５以上であれば、第１の緩衝液が抗原を含有することを当業者は表１に基づいて理解するであろう。このようにして、本発明では抗原が検出される。さらに、当業者は、本発明においてラベル化抗体１１１が用いられていないことを容易に理解し得るであろう。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、バイオセンサに用いられ得る。本発明は、マルチプレックスアッセイによる迅速な免疫診断に特に有用である。
【符号の説明】
【００７４】
１０１、１０７  担体
１０２  マルチ銅酸化酵素
１０３、１０８  抗体
１０４、１０９  抗原
１０５、１１２  基質
１０６、１１３  生成物
１１０  酵素
１１１  ラベル化抗体
１１４  測定器
１１５  作用電極
１１６  参照電極
１１７  カウンター電極
１１８  反応槽
１１９  低イオン強度の緩衝液
１２１  グラッシーカーボン電極
１２２  ナイロンネット
１２３  リング
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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