(57)【要約】本発明は、哺乳類から得られたサンプル中のＢＮＰ前駆体またはその断片の濃度を測定することによるサンプル中のＢＮＰ前駆体またはその断片のレベルを測定する改良されたより正確なアッセイを提供し、該方法はＢＮＰ前駆体を切断する薬剤でサンプルを処理する工程および切断された産物に特異的に結合する抗体にサンプルを曝す工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＮＰ前駆体を切断する薬剤でサンプルを処理する工程、および、
切断された産物に特異的に結合する抗体にサンプルを曝す工程、
を含む哺乳類から得たサンプルにおけるＢＮＰ前駆体またはその断片の濃度の測定方法。
【請求項２】
切断された産物が抗体に結合しうるいずれのプロＢＮＰ断片であってもよい、請求項１の方法。
【請求項３】
断片が少なくとも６アミノ酸長である、請求項１または２の方法。
【請求項４】
抗体が切断された産物のN-末端またはC-末端に結合する請求項１から３のいずれかの方法。
【請求項５】
抗体がプロＢＮＰ1-21のN-末端に結合する、請求項４の方法。
【請求項６】
サンプルが、血液、血清、血漿、尿および心臓またはその他の臓器の組織診からなる群から選択される、請求項１から５のいずれかの方法。
【請求項７】
薬剤がＢＮＰ前駆体を切断して抗体に結合しうる断片を生じさせるいずれの分子であってもよい請求項１から６のいずれかの方法。
【請求項８】
薬剤が酵素である、請求項７の方法。
【請求項９】
酵素がトリプシン、フリン、コリン、酵母Kex2、ホルモン前駆体転換酵素-1およびホルモン前駆体転換酵素-2からなる群から選択されるセリンプロテアーゼである、請求項８の方法。
【請求項１０】
塩基性アミノ酸においてタンパク質を切断する薬剤でサンプルを処理する工程、および、サンプルをプロＢＮＰ1-21のN-末端に特異的に結合する抗体に曝す工程を含む、請求項１から９のいずれかの、哺乳類から得たサンプルにおけるＢＮＰ前駆体またはC-末端が切断されたその断片の濃度を測定する方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかの方法を行うことを含み、抗体結合レベルの上昇が心臓機能障害を示す、心臓疾患を予測または診断する方法。
【請求項１２】
心臓機能障害が、うっ血性心不全、左心室機能障害、心筋梗塞後心不全、催不整脈性右心室異形成、結核による慢性呼吸器疾患、先天性心疾患、閉塞性肥大性心筋症、老人の予測性死亡および心臓関連急性呼吸困難からなる群から選択される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
抗体結合レベルの上昇が拒絶エピソードを示す、請求項１から１０のいずれかの方法を行うことを含む心臓移植拒絶エピソードを予測または診断する方法。
【請求項１４】
抗体結合レベルの上昇が呼吸困難の原因が心血管であることを示す、請求項１から１０のいずれかの方法を行うことを含む呼吸困難の原因が肺であるか心血管であるかを識別する方法。
【請求項１５】
抗体結合レベルの上昇が虚血性心疾患を示す、請求項１から１０のいずれかの方法を行うことを含む虚血性心疾患を予測または診断する方法。
【請求項１６】
抗体結合レベルの上昇が15 pmol/Lを超えるレベルである請求項１１から１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
(血液)サンプリングの時間が浸潤性評価と相関している、請求項１から１０のいずれかの方法を行うことを含む冠動脈血管造影法の効果の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のヒトＢ型ナトリウム排泄増加ペプチド前駆体またはその断片のレベルの測定方法に関する。特に本発明は、ヒトＢ型ナトリウム排泄増加ペプチド前駆体またはその断片のレベルの上昇に関係する様々な症状、例えば心臓機能障害などの患者のリスクを判定するためのかかる方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓ナトリウム排泄増加ペプチドファミリーのメンバーであるヒトＢ型ナトリウム排泄増加ペプチド(ＢＮＰ)は、強力なナトリウム排泄増加、利尿および血管拡張の内分泌機能を有する32アミノ酸のペプチドである。ＢＮＰ遺伝子は心不全の筋細胞において優勢に発現しており、ＢＮＰはうっ血性心不全患者において循環中に多く分泌される。したがって、血漿ＢＮＰ測定の診断用途が研究されている(Mair et al.、2001)。ＢＮＰの血漿濃度の上昇はその原因と関係なく左心室の機能障害と関連しており、それゆえ心不全の一次診断において有用である。
【０００３】
ＢＮＰ遺伝子は、134アミノ酸残基の前駆体であるプレプロＢＮＰをコードし、プレプロＢＮＰ内のプロＢＮＰは108アミノ酸残基を含み、生理活性なＢＮＰ-32配列がC-末端を構成する(図1)。1995年に、Huntらは活性ペプチドのN-末端断片も血漿中を循環し、心不全患者においてはその濃度が上昇していることを示した。クロマトグラフィー研究により、少なくとも高分子量プロＢＮＰペプチド(当該技術分野においてプロＢＮＰまたはＢＮＰ1-108として知られる)およびより短いおそらく1-76断片のN-末端断片(当該技術分野においてプロＢＮＰ1-76として知られる)の、うっ血性心不全患者の血漿における存在が示唆されたが、血漿におけるプロＢＮＰ-由来ペプチドの分子的不均一性の完全な解明はなされていない(Hunt et al.、1995および1997a; Schultz et al.、2001)。
【０００４】
プロＢＮＰのN-末端部分および生理活性ＢＮＰ-32の両方に対するいくつかのアッセイが開発されており(Hunt et al.、1995および1997a、b; Schultz et al.、2001; Karl et al.、1999; Hughes et al.、1999; Campbell et al.、2000;米国特許第6124430号; 米国特許第5786163号)、一般に、生理活性ＢＮＰ-32などのこれらの部分の血漿濃度は、心不全患者において上昇していることが報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、異なるイムノアッセイを用いた場合、健康な対象および心不全患者における様々なプロＢＮＰ断片の報告された濃度の間にやっかいなことに矛盾が残っている。これによって心臓疾患状態の信頼できる指標として現在用いられているＢＮＰ-関連アッセイの能力がある程度妨げられてしまっている。したがって、本発明は生物サンプルにおけるＢＮＰ前駆体またはその断片のレベルの正確な定量のための改良されたアッセイを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概略）
本発明者らはサンプルにおけるＢＮＰ前駆体またはその断片のレベルを測定するための既存のものに代わるアッセイを開発した。
【０００７】
１つの態様において、本発明は哺乳類から得たサンプル中のＢＮＰ前駆体またはその断片の濃度の測定方法を提供し、該方法は、サンプルをＢＮＰ前駆体を切断する薬剤で処理する工程、および切断された産物に特異的に結合する抗体にサンプルを曝す工程を含む。
【０００８】
本発明者らは、塩基性アミノ酸残基においてタンパク質を切断する薬剤によるＢＮＰ前駆体またはその断片の切断が、N-末端、例えば、プロＢＮＰ1-21およびプロＢＮＰ1-76に結合する抗体の非特異的免疫反応性を低下させることを見いだした。
【０００９】
したがって、第２の態様において本発明は、哺乳類から得たサンプル中のＢＮＰ前駆体またはC-末端が切断されたその断片の濃度の測定方法を提供し、該方法は塩基性アミノ酸においてタンパク質を切断する薬剤でサンプルを処理する工程およびプロＢＮＰ1-21のN-末端に特異的に結合する抗体にサンプルを曝す工程を含む。
【００１０】
本発明の方法は患者における心臓疾患のリスクまたは存在を判定するのにも用いられる。したがって、第３の態様において本発明は心臓疾患を予測または診断する方法を提供し、該方法は第１の態様による方法を行うことを含み、ここで、抗体結合レベルの上昇が心臓機能障害を示す。
【００１１】
本発明の第４の態様は、患者における心臓移植拒絶エピソードの予測または診断方法を提供し、該方法は第１の態様による方法を行うことを含み、ここで抗体結合の上昇が拒絶エピソードを示す。
【００１２】
本発明の第５の態様は、呼吸困難の原因が肺性であるか心血管性であるかを区別する方法を提供し、該方法は第１の態様による方法を行うことを含み、ここで抗体結合レベルの上昇が呼吸困難の原因が心血管性であることを示す。
【００１３】
本発明の第６の態様は、虚血性心疾患の予測または診断方法を提供し、該方法は第１の態様による方法を行うことを含み、ここで抗体結合レベルの上昇が虚血性心疾患を示す。  
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明者らはサンプルにおけるＢＮＰ前駆体またはその断片のレベルの測定のための既存のものに代わるアッセイを開発した。
【００１５】
第１の態様において本発明は、哺乳類から得たサンプルにおけるＢＮＰ前駆体またはその断片の濃度を測定する方法を提供し、該方法はＢＮＰ前駆体を切断する薬剤でサンプルを処理する工程および切断された産物に特異的に結合する抗体にサンプルを曝す工程を含む。
【００１６】
当業者に理解されるように、インビボ切断事象により、薬剤の作用による結果得られるものと同一のＢＮＰ前駆体の少なくともいくらかの断片が既に生じている。しかし、本発明はインビボで起こったホルモン前駆体プロセシングの程度にかかわらずＢＮＰ前駆体またはその断片のレベルの分析を可能にするものである。
【００１７】
特に、薬剤による切断によって、より均質でより小さいプロＢＮＰ断片の集団が得られる。これによって異なる断片における同一のエピトープが同一の抗体が結合した場合に同じく有効に認識されないという問題が回避される。例えば、好適な態様によると、プロＢＮＰ1-21が生じるトリプシンでの切断により、配列がプロＢＮＰ1-76またはプロＢＮＰ1-108の一部を形成する場合、この配列に対する抗体の異なる結合が回避される。さらに切断された産物が、可能性のあるキャリアタンパク質に結合しない、および／または、ホモオリゴマーを形成しないという利点があり得る。
【００１８】
正確な結果を得るためには、薬剤はサンプルにおけるすべての可能性のあるＢＮＰ前駆体またはその断片を切断するのが好ましい。
【００１９】
プレプロＢＮＰおよびその断片
図1は、ヒト(配列番号1)、ブタ(配列番号2)およびマウス(配列番号3)におけるプレプロＢＮＰアミノ酸配列を提供する。しかし、少なくとも天然の変異体／突然変異体は本発明の方法の枠内に含まれる。
【００２０】
「プレ」領域には分子を分泌経路に向けるN-末端シグナル配列が含まれる。この配列は典型的には細胞内で一般に「シグナラーゼ」と称される酵素の作用により除去される。ヒトプレプロＢＮＰについて考える場合、シグナラーゼ活性によりN-末端26アミノ酸が除かれた後、ポリペプチドが顆粒にパッケージされ細胞により分泌されるということが一般に当該技術分野で受け入れられている。
【００２１】
「プロＢＮＰ」および「ＢＮＰ前駆体」および「プロＢＮＰ1-108」の語は本明細書において一般に完全なＢＮＰホルモン前駆体配列(ヒトについては配列番号5を参照)のことをいうのに互換的に用いられる。ヒト以外の種に関しては、「プロＢＮＰ1-108」の番号付けは一般に異なるものとなる。上述のように、ヒトプレプロＢＮＰの最初の26アミノ酸はシグナラーゼ活性により除かれると一般に考えられている。しかし、「プロＢＮＰ1-108」を超えてN-末端が伸長した分泌プロＢＮＰ分子の可能性は本発明から除外されるものではない。
【００２２】
多くのプレプロＢＮＰの循環する断片が記載されている。これらには活性ＢＮＰ(配列番号4)、プロＢＮＰ1-108(配列番号5)、およびプロＢＮＰ1-108の切断によって活性ペプチド(配列番号4)が放出されて生じるプロＢＮＰ1-76(配列番号6)と当該技術分野で称されるN-末端産物が含まれる。本明細書において用いる場合、「ＢＮＰの領域」とはプロＢＮＰ1-76のことをいう。
【００２３】
好ましくは、ＢＮＰ前駆体の断片は、成熟ＢＮＰまたはその断片、およびＢＮＰの領域またはその断片からなる群から選択される。より好ましくはプロＢＮＰの領域の断片はプロＢＮＰ1-21である。
【００２４】
切断産物は抗体に結合することが出来るいずれのプロＢＮＰの断片であってもよい。１つの態様において、断片は、少なくとも6アミノ酸長、例えば、7アミノ酸長、8アミノ酸長または9アミノ酸長である。別の態様において断片は少なくとも10アミノ酸長、例えば、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、15アミノ酸長、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長または19アミノ酸長である。さらなる態様において断片は少なくとも20アミノ酸長、例えば、21アミノ酸長、22アミノ酸長、23アミノ酸長、24アミノ酸長、少なくとも25アミノ酸長、少なくとも30アミノ酸長、少なくとも35アミノ酸長、少なくとも40アミノ酸長、少なくとも45アミノ酸長、少なくとも50アミノ酸長、少なくとも55アミノ酸長または少なくとも60アミノ酸長である。さらに、76アミノ酸長未満、例えば、75アミノ酸長、74アミノ酸長、73アミノ酸長、72アミノ酸長、71アミノ酸長、70アミノ酸長、65アミノ酸長未満または62アミノ酸長未満の断片を提供することが好適な態様の目的である。
【００２５】
好ましくは、抗体は切断された産物のN-末端またはC-末端に結合する。
【００２６】
好ましくは、抗体はプロＢＮＰ1-21のN-末端に結合する。
【００２７】
サンプルはＢＮＰ前駆体またはその断片を含む哺乳類からのいずれの生物材料であってもよい。好ましくは、サンプルは、全血、血清、血漿、尿および心臓その他の臓器の組織抽出物からなる群から選択される。もっとも好ましくは、サンプルは哺乳類の血液から抽出された血漿である。
【００２８】
薬剤は、抗体に結合することが出来る断片が生じるようにＢＮＰ前駆体を切断するいずれの分子であってもよい。好ましくは、薬剤は酵素である。より好ましくは、酵素は塩基性アミノ酸において切断するエンドプロテアーゼである。より好ましくは、塩基性アミノ酸において切断するエンドプロテアーゼは、セリンプロテアーゼである。より好ましくは、セリンエンドプロテアーゼは、トリプシン、フリン（furin）、コリン（Corin）、酵母Kex2、ホルモン前駆体転換酵素-1およびホルモン前駆体転換酵素-2からなる群から選択される。さらにより好ましくは、セリンエンドプロテアーゼはトリプシンである。
【００２９】
当業者であれば理解するように、サンプルをさらに精製して、例えば、ＢＮＰ前駆体より大きい脂質および／または核酸および／またはタンパク質を除いてもよい。かかるサンプル画分も本発明の方法に有用である。しかし、本方法は非分画サンプルに対して行うのが一般にもっとも便利である。
【００３０】
さらなる態様において、哺乳類は、ヒト、ウマ、類人猿、ブタ、ラット、ウシ、イヌおよびマウスからなる群から選択される。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００３１】
抗体
本発明の方法に有用な抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、ならびにFab断片、即ちFab発現ライブラリーの産物のいずれであってもよい。当該技術分野において知られている様々な手法をかかる抗体および断片の産生に用いることが出来る。抗体は好適な実験動物においてインビボで作ってもよいし、組換えDNA技術を用いてインビトロで作ってもよい。
【００３２】
本明細書において用いる場合、「切断された産物に特異的に結合する」という語は、切断されたプロＢＮＰ断片を認識するが、サンプル中のプロＢＮＰまたはその断片のレベルの上昇についての診断アッセイとして用いられる本発明の方法の性能を阻害する程度にはサンプルにおけるその他のポリペプチドには結合しない抗体の能力を指す。抗体は切断された断片(例えばプロＢＮＰ)のより大きい前駆体に結合してもしなくてもよい。
【００３３】
抗体の調製および特徴付け手段は当該技術分野において周知である(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1988を参照されたい)。ポリクローナル抗体の作成方法も当該技術分野において周知である。簡単に説明すると、ポリクローナル抗血清は、所望の抗原によって動物を免疫し、免疫された動物から抗血清を回収することによって調製される。広範な動物種を抗血清の産生に用いることが出来る。典型的には抗-抗血清の産生に用いられる動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ヒツジまたはニワトリである。ウサギは血液量が比較的多く、高アフィニティーの抗体を産生することが出来るため、ポリクローナル抗体の産生にはウサギが好適に選択される。
【００３４】
ポリクローナル抗体の産生に用いられる抗原組成物の量は、抗原の性質、および免疫に用いられる動物によって異なる。様々な経路を用いて抗原を投与することが出来る(皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹腔内)。ポリクローナル抗体の産生は免疫した動物の血液を免疫後の様々な時点でサンプリングすることによってモニターすることが出来る。第２の追加免疫注入を行ってもよい。追加免疫プロセスを好適な力価が達成されるまで繰り返す。所望のレベルの免疫原性が得られると、免疫した動物から血液を採取し、血清を単離および保存する、および／または、動物を用いてMAbを作成してもよい(後述)。
【００３５】
本発明によるポリクローナル抗血清は、全体のインタクトなエピトープを含むと予測されるペプチドに対して産生する。かかるエピトープはそれゆえ、免疫学的により好適であって、したがって免疫系に対してより一貫性のある免疫学的標的を発現すると考えられている。このモデルの下では、このペプチドに応答する可能性のあるＢ細胞クローン数はかなり少なく、したがって、その結果得られる血清の均一性はより高くなる。様々な態様において、本発明は、クローン性、即ち、実際のRIA設定において用いられる抗体の産生に寄与する、抗体産生クローンの数が１つに限られている(モノクローナル性)または数クローンである(オリゴクローン性)、ポリクローナル抗血清を提供する。したがって、機能的観点から、競合的RIAに用いる抗体は好ましくは、単一クローン由来のものである(機能的MAb)。
【００３６】
MAbは周知技術、例えば米国特許第4196265号に例示されている技術を用いることによって容易に調製することが出来る。典型的には、この技術は、好適な動物を選択された抗原組成物、例えば、精製または部分的に精製されたタンパク質、合成タンパク質またはその断片で免疫することを含む。免疫組成物を抗体産生細胞を刺激するのに有効な方法で投与する。げっ歯類、例えばマウスおよびラットが好ましい動物であるが、その他の動物、例えば、ウサギ、ヒツジまたはカエル細胞の使用も可能である。ラットの使用により、一定の利点が提供されるが、マウスが好適であり、BALB/cマウスは通常使用される動物としてもっとも好適であり、一般に安定な融合物が高いパーセンテージで得られる。
【００３７】
免疫化の後、抗体産生能力を有する体細胞、特にＢリンパ球(Ｂ細胞)を、MAb作成プロトコールに用いるために選択する。これら細胞は生検を行った（biopsied）脾臓、扁桃腺またはリンパ節から、あるいは末梢血サンプルから得られる。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましい。というのは、前者は分裂する形質芽球段階の抗体産生細胞の豊富なソースであり、後者は末梢血の入手が容易であるからである。しばしば、一連の動物が免疫され、もっとも抗体力価が高い動物の脾臓が取り出される。脾臓リンパ球はシリンジで脾臓をホモジナイズすることにより得られる。
【００３８】
免疫された動物からの抗体-産生Ｂリンパ球は不死ミエローマ細胞と融合され、かかる細胞は一般に免疫された動物と同一の種のものである。ハイブリドーマ-産生融合手順における使用に好適なミエローマ細胞株は好ましくは非-抗体-産生性であり、融合効率が高く、特定の選抜培地での増殖を不可能とする酵素の欠失を有するものである。かかる酵素の欠失により「ハイブリドーマ」と称される所望の融合細胞のみの増殖が支持される。
【００３９】
選抜されたハイブリドーマは段階希釈され、クローンニングされて個々の抗体産生細胞株となり、かかるクローンは無制限に増殖してMAbを提供する。該細胞株は２つの基本的な様式でMAb産生に利用される。ハイブリドーマのサンプルを組織適合性動物の通常腹腔に注入する。かかる組織適合性動物は元々融合のための体細胞およびミエローマ細胞を得るために用いられたものである。注入された動物には融合細胞ハイブリッドから産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍が起こる。動物の体液、例えば、血清または腹水から高濃度のMAbが得られる。個々の細胞株はインビトロで培養してもよく、ここでMAbは自然に培地に分泌され、この培地から高濃度のMAbが容易に得られる。いずれの手段で産生されたMAbも所望により、ろ過、遠心分離および様々なクロマトグラフィー方法、例えば、HPLCまたはアフィニティークロマトグラフィーを用いてさらに精製することができる。
【００４０】
別の態様において、本発明によるモノクローナル抗体は当該技術分野において周知の技術によって産生される「ヒト化」モノクローナル抗体である。即ち、マウス相補性決定領域(「CDR」)がマウスIgの重鎖および軽鎖V-鎖からヒトV-ドメインに移され、その後、そのマウス対応物のフレームワーク領域においていくつかのヒト残基と置換される。
【００４１】
上述のように、本発明の方法に有用なモノクローナル抗体およびその断片は当該技術分野において周知のインビトロおよびインビボ方法によって増殖させることが出来る。インビトロ増殖は、好適な培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地またはRPMI 1640培地であって、所望により哺乳類血清、例えば、胎児ウシ血清または微量元素および培養支持補充物、例えば、フィーダー細胞、例えば正常マウス腹膜滲出液細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージなどを補充した培地において行われる。インビトロ産生により比較的純粋な抗体調製物が得られ、スケールアップすることにより大量の所望の抗体が得られる。組織培養条件下でのラージスケールハイブリドーマ培養技術は当該技術分野において知られており、例えば、エアリフトリアクターまたは連続撹拌リアクターで均質懸濁培養してもよく、固定化または捕捉細胞培養としてもよい。
【００４２】
モノクローナル抗体の断片は上記のように産生されたモノクローナル抗体から得られる。かかる方法には酵素、例えばペプシンまたはパパリンによる消化および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断が含まれる。あるいは、本発明に含まれるモノクローナル抗体断片は自動ペプチド合成機を用いて合成することによっても得られ、あるいは当該技術分野において周知の技術によって手作業で作ることも出来る。
【００４３】
切断されたＢＮＰ前駆体に対する抗体結合は当該技術分野において知られているあらゆる方法によって検出することが出来る。好ましくは、抗体結合は以下からなる群から選択されるアッセイによって検出する：ラジオイムノアッセイ (RIA)、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、蛍光免疫アッセイ、免疫蛍光定量アッセイ、免疫放射線測定法および質量分析、例えば、MALDI-TOFスペクトロメトリ。もっとも好ましくは、切断産物に対する抗体結合はRIAまたはELISAによって検出する。
【００４４】
イムノアッセイ
イムノアッセイとはもっとも簡単かつ直接的にいうと、結合アッセイである。切断産物に対する抗体結合は当該技術分野において知られているあらゆるイムノアッセイ法によって検出できる。好ましくは、抗体結合は以下からなる群から選択されるアッセイによって検出する。タンパク質マイクロアレイアッセイ、ラジオイムノアッセイ (RIA)、酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA)、蛍光免疫アッセイ、免疫蛍光定量アッセイおよび免疫放射線測定法。
【００４５】
免疫放射線測定法は、プロＢＮＰに対する抗体に適用可能であり、一般的にKono et al. (1993) および Clerico et al. (1998)に記載されている。かかるアッセイを本発明の方法に利用することが出来る。
【００４６】
もっとも好ましくは、抗体結合はRIAまたはELISAによって検出する。
【００４７】
ラジオイムノアッセイ(RIA)
RIAは0.001μg/ml未満の濃度の抗原または抗体を検出することが出来る感度の高い技術である。
【００４８】
RIAの原理には高アフィニティーの抗体に対する放射標識された抗原と非標識抗原との競合的結合が関与する。抗原は一般にガンマ放射同位体、例えば125Iによって標識する。標識した抗原を抗体分子の抗原-結合部位をちょうど飽和する濃度にて抗体と混合し、濃度未知の非標識抗原の量が徐々に増加するよう添加する。抗体は非標識抗原と標識抗原とを区別せず、そのため２種の抗原が抗体上の結合部位について競合する。非標識抗原の濃度を増加させるにつれて、より多くの標識抗原が結合部位から解離する。溶液中の遊離の標識抗原の量を測定することによって、非標識抗原の濃度を得ることが出来る。
【００４９】
RIAにおいて結合型の抗原と遊離の抗原を分離するいくつかの方法が開発されている。１つの方法では、Ag-Ab複合体を、二次抗-アイソタイプ抗血清によって沈降させる。例えば、Ag-Ab複合体がウサギ IgG 抗体を含んでいる場合、ヤギ抗-ウサギIgGが複合体を沈降させうる。黄色ブドウ球菌のタンパク質AがIgGに対して高アフィニティーを有するという事実を利用する方法もある。複合体がIgG 抗体を含んでいると、ホルマリンで殺した黄色ブドウ球菌と混合することによって複合体を沈降させうる。これらいずれかの方法によって複合体を取り出した後、上清に残っている遊離の標識抗原量をガンマカウンターによって定量することが出来る。標準曲線を非標識抗原の既知の濃度に対する結合型標識抗原のパーセンテージをプロットして得る。標準曲線をプロットすると、濃度未知の非標識抗原の濃度を標準曲線から得ることが出来る。
【００５０】
Ag-Ab複合体と非結合型抗原との分離を容易にする様々な固相RIAが開発されている。ある場合では抗体はセファロース（登録商標）ビーズに共有結合により架橋される。ビーズに結合した放射標識された抗原の量が、ビーズを遠心分離して洗浄した後に定量することが出来る。あるいは、抗体をポリスチレンまたはポリ塩化ビニルに固定化し、上清中の遊離の標識抗原の量をガンマカウンターで測定してもよい。別のアプローチでは、抗体をマイクロタイターウェルの壁に固定化する。この手法は多数のサンプルにおける特定の抗原の濃度の測定に非常に適している。
【００５１】
酵素結合免疫測定法 (ELISA)
ELISAはRIAと類似の原理に基づくが、放射性標識ではなく酵素を用いる。より具体的には、抗体に結合した酵素が好適な基質の存在下で検出可能なシグナルを生成する。
【００５２】
１つの例示的なELISAにおいて、本発明の方法に有用な抗体が、タンパク質にアフィニティーを示す選択された表面、例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレートにおけるウェルに固定化される。次いで、臨床サンプルなどの抗原を含むと考えられる被験組成物をウェルに添加する。結合、そして非特異的に結合した免疫複合体を除くための洗浄後、結合した抗原を検出する。検出は一般に、検出可能な標識に結合した抗原に結合する別の抗体の添加によって達成される。このタイプのELISAは簡便な「サンドイッチ ELISA」である。検出は抗原に結合する二次抗体の添加、次いで二次抗体に対する結合アフィニティーを有する、検出可能な標識に結合している三次抗体の添加によって達成してもよい。
【００５３】
別の例示的なELISAにおいて、抗原を含むと考えられるサンプルをウェル表面に固定化し、抗体と接触させる。結合および適当な洗浄の後、結合した免疫複合体を検出する。最初の抗体が検出可能な標識に結合している場合、免疫複合体は直接検出することが出来る。また、免疫複合体は一次抗体に対して結合アフィニティーを有し、検出可能な標識に結合している二次抗体によって検出することも出来る。
【００５４】
被験サンプルが既知量の標識された抗原または抗体と結合について競合する場合、競合ELISAも可能である。未知サンプルにおける反応種の量は、コーティングされたウェルとのインキュベーションの前またはその間にサンプルを既知の標識された種と混合することによって測定される。サンプル中の反応種の存在は、ウェルに結合できる標識された種の量を減らすように作用し、したがって最終的なシグナルを減少させる。
【００５５】
用いる形式にかかわらず、ELISAはコーティング、インキュベーションまたは結合、非特異的結合種を除くための洗浄および結合した免疫複合体の検出などの共通の特徴を有する。これらを以下に記載する。
【００５６】
抗原または抗体のいずれかでプレートをコーティングするには、一般にプレートのウェルを抗原または抗体の溶液とともに、一晩または特定の時間インキュベートする。プレートのウェルを洗浄して不完全に吸着した物質を除く。残った使用されうるウェルの表面を被験抗血清に関して抗原的に中立の非特異的タンパク質で「コーティング」する。かかるタンパク質には、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼインおよび粉乳溶液が含まれる。コーティングにより、固定化用表面の非特異的吸着部位のブロッキングが可能となり、したがって抗血清の表面への非特異的結合によるバックグラウンドが減少する。
【００５７】
ELISAにおいては、直接的方法よりも二次的または三次的検出手段の方がおそらくより慣用されている。したがって、ウェルに抗原または抗体が結合した後、非反応性物質によるコーティングによってバックグラウンドを低下させ、洗浄して非結合物質を除き、固定化用表面に免疫複合体(抗原/抗体)形成を可能にするのに有効な条件下で試験すべき臨床または生物サンプルを接触させる。免疫複合体の検出には標識された二次結合リガンドまたは抗体、または二次結合リガンドまたは抗体と結合した標識された三次抗体または三次リガンドが必要である。
【００５８】
「免疫複合体(抗原/抗体)形成を可能にするのに有効な条件下」とは、好ましくは溶液、例えば、BSA、ウシガンマグロブリン(BGG)およびリン酸緩衝食塩水(PBS)/Tweenでの抗原および抗体の希釈を含む条件を意味する。これらの添加薬剤はまた、非特異的バックグラウンドの低下も助ける傾向にある。
【００５９】
好適な条件はまた、インキュベーションが効果的な結合を可能にするのに十分な温度と時間であることを意味する。インキュベーション工程は典型的には約1〜2 〜4時間、好ましくは25〜27℃程度の温度、あるいは一晩約4℃などでもよい。
【００６０】
ELISAにおけるすべてのインキュベーション工程の後、接触させた表面を洗浄して非複合体形成物質を除去する。洗浄にはしばしばPBS/Tween溶液、またはホウ酸緩衝液での洗浄が含まれる。被験サンプルともとから結合している物質との間の特異的免疫複合体の形成、そして洗浄の後、例え僅かな量であっても免疫複合体の発生を検出することが出来る。
【００６１】
検出手段を提供するために、二次または三次抗体は検出を可能にするための結合した標識を有する。好ましくは、これは適当な色素産生性基質とのインキュベーションによって発色を起こす酵素である。したがって、例えば、一次または二次免疫複合体とウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは水素ペルオキシダーゼ結合抗体とを接触させ、さらなる免疫複合体の形成に好ましい条件下で一定時間インキュベートする。例えば、2時間、室温でPBS-含有溶液、例えば、PBS-Tween中でインキュベーションする。
【００６２】
標識された抗体とのインキュベーション、次いで非結合物質の除去のための洗浄の後、色素産生性基質、例えば、尿素およびブロモクレゾールパープル（bromocresol purple）または2,2'-アジノ-ジ-(3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸[ABTS]、およびペルオキシダーゼが酵素標識の場合はH2O2などとのインキュベーションにより標識の量を定量する。定量は、例えば、可視スペクトル分光光度計を用いて色素生成の程度を測定することにより達成される。
【００６３】
あるいは、標識は化学発光のものであってもよい。かかる標識の使用は、米国特許第5310687号、第5238808号および第5221605号に記載されている。
【００６４】
タンパク質マイクロアレイアッセイ
本発明の別の態様はタンパク質マイクロアレイアッセイを用いて特異的に検出される、サンプル中に存在する少なくとも一形態のプロＢＮＰの量を検出することに関する。これは、少なくとも一形態のプロＢＮＰの捕捉を抗体またはその断片を用いて行うことを意味し、ここで検出は質量分析計、例えば、MALDI-TOF分析計を用いて行う。さらに、少なくとも一形態のプロＢＮＰの表面への結合は捕捉機構として利用でき、検出は質量分析計、例えばSELDI-TOF分析計を用いて行うことが出来る。
【００６５】
本発明者らは、塩基性アミノ酸残基においてタンパク質を切断する薬剤によるＢＮＰ前駆体またはその断片の切断により、例えば、プロＢＮＰ1-21、プロＢＮＰ1-46、プロＢＮＰ1-54、プロＢＮＰ1-62、プロＢＮＰ1-65、プロＢＮＰ1-73およびプロＢＮＰ1-76のN-末端に結合する抗体の非特異的免疫反応性が減少することを見いだした。
【００６６】
したがって第二の態様において、本発明は哺乳類から得たサンプルにおけるＢＮＰ前駆体またはC-末端が切断されたその断片の濃度の測定方法を提供し、該方法は塩基性アミノ酸においてタンパク質を切断する薬剤でサンプルを処理する工程、およびＢＮＰ前駆体、例えばプロＢＮＰ1-21のN-末端に特異的に結合する抗体にサンプルを曝す工程を含む。
【００６７】
第二の態様に関して、薬剤は塩基性アミノ酸においてタンパク質を切断するいずれの分子であってもよい。好ましくは薬剤は酵素である。より好ましくは、酵素はセリンプロテアーゼである。さらにより好ましくは、セリンプロテアーゼはトリプシンである。
【００６８】
心臓機能障害
ＢＮＰ前駆体および様々なその断片の濃度は心臓機能障害に関連していることが示された。したがって本発明の方法を用いて患者における心臓関連疾患のリスクまたは存在を判定することが出来る。
【００６９】
したがって第三の態様において本発明は、心臓疾患を予測または診断する方法を提供し、該方法は第一の態様による方法を行うことを含み、ここで抗体結合レベルの上昇が心臓機能障害を示す。
【００７０】
当業者に理解されるように、予後および／または診断マーカー、例えばサンプル中のＢＮＰ前駆体濃度に基づくあらゆる医学評価は、基準値に対する相関を必要とする。疾患の中には、その固有の好ましい基準値を有するものもあり、通常は複数の疾患を示すものである共有値を有するものもある。
【００７１】
基準値は疾患を有する個体からのサンプルのプールから、健康な個体からのサンプルのプールとの比較によって計算でき、陽性および陰性細胞の範囲が得られる。疾患の進行または段階を判定するために様々な段階の疾患からのサンプルのプールに基づく基準値を設定する可能性もある。疾患の予後のための基準値を設定するのが望ましい。基準値はそれぞれの得られた濃度の平均または中央値として計算するとよい。
【００７２】
以下の実施例に示すようにプロＢＮＰの抗体結合レベルの15 pmol/Lを超える上昇したレベルは通常心臓疾患の強い指標である。ほとんどの個体において0-15 pmol/LのプロＢＮＰのレベルは正常であると考えられる。これはしかし例えば14 pmol/L、13 pmol/L、12 pmol/L、11 pmol/Lなど、15 pmol/L未満のレベルに変動することがあり、pmol/Lが疾患状態を示す場合もある。特に老人においては、プロＢＮＰの個々のレベルは変動し、好ましくは基準値と相関するべきである。しかし、本発明の好適な態様の目的は15 pmol/Lを超える抗体結合の上昇したレベルに基づいて心臓疾患を診断することである。15 pmol/Lを超えるレベルが得られた場合、さらに心臓検査を行うべきである。たとえばこれに限定されないが冠動脈造影法を用いる。15 pmol/Lを下回るレベルが観察される場合、その個体はさらに観察するかより特異的な基準値と相関させればよい。
【００７３】
第三の態様の好適な態様において、心臓機能障害は以下からなる群から選択される:うっ血性心不全、左心室の機能障害、心筋梗塞後の心不全、催不整脈性右(right)異形成、先天性心疾患、閉塞性肥大性心筋症、および心臓関連急性呼吸困難。
【００７４】
心臓同種移植片拒絶
ＢＮＰ前駆体およびその様々な断片の濃度が、同種移植を受けた患者における心臓同種移植片拒絶の予測および診断の指標となりうることが以前に確かめられている(米国特許第6117644号)。本発明の方法はこの目的にも利用できる。
【００７５】
したがって本発明の第四の態様は、患者における心臓移植拒絶エピソードの予測または診断方法を提供し、該方法は第一の態様による方法を行うことを含み、ここで抗体結合の上昇が拒絶エピソードの指標となる。
【００７６】
呼吸困難の原因が肺であるか心血管であるかの識別 
本発明者らは本発明の方法が呼吸困難の原因が肺であるか心血管であるかを区別する簡便な診断試験に用いることが出来ることを示した。
【００７７】
本発明の使用により、本発明者らは右心カテーテル検査を経た肺移植についての評価について参考とされた、左心室機能が正常な末期柔組織肺疾患患者(n = 50)におけるプロＢＮＰ血漿濃度を測定したところ、その結果はカテーテル検査から得た血行動態変数と関連していた。
【００７８】
末期柔組織肺疾患を患っているが左心室機能は正常な患者において血漿プロＢＮＰ濃度は変化していなかった(中央値2.5 pmol/l、範囲0.0-22.0、基準上限(upper reference limit): 15.0 pmol/l)。一方原発性肺高血圧患者は血漿プロＢＮＰ濃度の40倍以上の上昇を示した(中央値107 pmol/l 対 中央値2.5 pmol/l、P < 0.0001)。局所血管プロＢＮＰ濃度により心臓が分泌部位（secretory site）であることが明らかになった。
【００７９】
これらの知見は、ナトリウム排泄増加ペプチド測定が呼吸困難の原因が心血管であることの有効なマーカーであるという主張を強く支持する。さらにこれらの結果はナトリウム排泄増加ペプチドが末期柔組織肺疾患患者における中程度の肺高血圧のマーカーであることを排除する。
【００８０】
したがって、第五の態様において、本発明は呼吸困難の原因が肺であるか心血管であるかを識別する方法を提供し、該方法は第一の態様による方法を行うことを含み、ここで抗体結合レベルの上昇は呼吸困難の原因が心血管であることを示す。
【００８１】
心臓ＢＮＰ発現の心筋虚血における上昇
本発明の第六の態様は、虚血性心疾患の予測または診断方法を提供し、該方法は第一の態様による方法を行うことを含み、ここで抗体結合レベルの上昇が虚血性心疾患を示す。
【００８２】
うっ血性心不全には心臓ＢＮＰ遺伝子発現の上昇およびＢＮＰおよびその前駆体であるプロＢＮＰの血漿濃度の上昇が伴う。最近の研究によると、ＢＮＰおよびプロＢＮＰの血漿濃度は、不安定冠不全症候群または心筋梗塞の患者においても上昇していることが示された。本発明者らは明白な心不全を伴わない心筋虚血が、心臓 ＢＮＰ遺伝子 発現の上昇および血漿ＢＮＰおよびプロＢＮＰ濃度の上昇の別の機構であるかを調べ、そのデータを実施例3に示す。
【００８３】
心臓でのＢＮＰ遺伝子発現が心不全において上昇しており、ＢＮＰおよびプロＢＮＰの血漿測定値が左心室機能障害のマーカーであることが知られている。最近、血漿ＢＮＰおよびプロＢＮＰ濃度が、急性心筋梗塞の際の心不全の後期進行の予後情報を提供し、さらに急性冠不全症候群患者における罹患率および死亡の予後マーカーであることが示された。今までどのようにしてＢＮＰまたはプロＢＮＰの血漿濃度上昇が、明らかな心不全のマーカーとなるか正確には説明されておらず、別の研究が進行しており、結果的な心臓機能障害を予測している。本発明を用いることにより、本発明者らは心筋虚血自体が血漿ＢＮＰおよびプロＢＮＰ濃度の上昇を引き起こすことを示した。この機構はおそらく虚血性左心室における心臓ＢＮＰ遺伝子発現の上昇を反映している。というのは、血漿ＢＮＰおよびプロＢＮＰ濃度は、心室のＢＮＰ ｍＲＮＡ発現に密接に関連していたからである。一方、本発明者らは、心房組織診の方が心室組織診と比べて顕著にＢＮＰ ｍＲＮＡ含量が高いにもかかわらず、血漿ＢＮＰおよびプロＢＮＰ濃度と心房のＢＮＰ ｍＲＮＡ発現には関係がないことを見いだした。これはおそらく心房と心室の筋細胞におけるプロＢＮＰペプチドのプロセシングと貯蔵が異なること、そして、大きい心室の心筋と比較して心房が小さいことを反映している。結論として、本発明者らは、心筋虚血において心室のＢＮＰ遺伝子発現が上昇しており、その結果、ＢＮＰおよびプロＢＮＰの血漿濃度が上昇するということを示した。したがって、ＢＮＰおよびプロＢＮＰ濃度の上昇は心不全のマーカーであるだけでなく、心臓虚血のマーカーでもある。
【００８４】
当業者であれば様々な変更および／または改変を広く記載された本発明の精神または枠から逸脱することなく特定の態様に示された本発明に対して行うことが出来ることを理解するであろう。本発明の態様はそれゆえ、例示的であって限定するものではないと理解されたい。
【００８５】
上記のすべての刊行物はその全内容を本明細書に含める。
【００８６】
本明細書に含まれる文献、作用、物質、装置、物品などについての議論はすべて本発明を単に説明するためのものである。これらのいずれも、本出願の各請求項の優先日より前に存在していた従来技術または本発明の関連分野の技術常識であると認めるわけではない。
【００８７】
本明細書全体を通じて、「含む」なる語または例えば「含有する」などの同様の語は、言及する要素、数または工程あるいは要素のグループ、工程数を含めるという意味に理解されるべきであり、その他の要素、工程数または要素のグループ、数または工程を除外する訳ではないと理解されたい。
【００８８】
本発明を以下の非限定的な図および実施例によってさらに説明する。
【００８９】
配列表について
配列番号1 - ヒトプレプロＢＮＰ
配列番号2 - ブタプレプロＢＮＰ
配列番号3 - マウスプレプロＢＮＰ
配列番号4 - ヒトＢＮＰ(活性ペプチド)
配列番号5 - ヒトプロＢＮＰ1-108
配列番号6 - ヒトプロＢＮＰ1-76
配列番号7 - ヒトプロＢＮＰ1-21
【実施例１】
【００９０】
ヒト血漿におけるプロＢＮＰのアッセイの開発及び特徴付け 
材料&方法
ペプチド
トレーサー調製のためにC-末端がチロシル残基によって伸長されたN-末端1-10配列に対応するヒトプロＢＮＰ1-21、および方向性キャリアカップリングのためにC-末端がシステインによって伸長された同ペプチドは注文合成した(Cambridge Biochemical Research Ltd、Cheshire、UK)。プロＢＮＰ1-21のN-末端切断（切型）断片は自動タンパク質シーケンサー(Johnsen and Kastrup、1994)における制御された切断によって得た。ペプチドの純度と含量は、逆相HPLC、アミノ酸分析および質量分析によって確認した。
【００９１】
抗血清
ヒトプロＢＮＰの配列1-10に対する抗体は、10 mgのC-末端がシステインによって伸長された1-10 断片を用いて作り、20 mgのウシ血清アルブミンに、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル結合方法を用いてカップリングさせた。カップリング産物を20 mlの蒸留水に溶解した(コンジュゲート溶液)。抗原溶液(2 ml)を3 mlの等張食塩水と混合し、等量の完全フロイントアジュバント (The State Serum Institute、Copenhagen、Denmark)で乳化し、第一回目の免疫化に用いた。追加免疫注入用に、1 mlの抗原溶液を4 mlの食塩水、および等量の不完全フロイントアジュバントと混合した。８匹のランダムに飼育した白色デンマークウサギの下背皮下に8週間隔で免疫した。20 mlの血液を耳静脈から各免疫化の14日後に回収し、血清を-20℃で保存した。
【００９２】
トレーサーの調製
チロシン-伸長1-10断片(4.5 nmol)を以前に記載された穏やかなクロラミン-T法(Stadil et al.、1972)を用いてヨウ素化し、逆相 HPLC (Pierce C8 カラム、RP-300、4.6x220 mm)で精製し、1% トリフルオロ酢酸中の直線エタノールグラジエント(5-30%)にて溶出した。グラジエントは、非標識ペプチドのヨウ素化トレーサーからの分離を確実にするよう選択した。画分(1 mL)を流速1.0 mL/分にて回収した。標識ペプチドと非標識ペプチドのクロマトグラフィー分離を評価するために、1 mLのモノヨウ素化ピーク画分を10pmolの非標識プロＢＮＰ1-10Tyrと混合し、再びHPLC-カラムにかけた。放射能と免疫反応性をその後に測定した。トレーサー比放射能を自己置換(Morris et al.、1976)によって測定した。ペプチド標準を0.2% ヒト血清アルブミンを含有するTris緩衝液(pH 8.5)中の合成プロＢＮＰ1-10Tyrから作った。
【００９３】
血漿の酵素処理
測定用の血漿は最初にトリプシンTPCK (Worthington Biochemical Cooperation、Lakewood、N,1、USA)で処理した。簡単に説明すると、血漿サンプルおよび標準(200μL)を、インキュベーション混合物中のトリプシンの終濃度が2g/Lとなるように、トリプシンを含有する0.1 mol/L リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.5)と混合した。混合物を室温で30分間インキュベートし、その後すぐに10分間煮沸して酵素反応を終了させた。トリプシン-処理サンプルと標準を- 80℃で保存した。サンプルを10分間3000gで遠心分離した後、アッセイを設定し、その後のRIAでは上清のみを用いた。
【００９４】
血漿サンプル
基準範囲を確立するために、全身または心臓疾患の病歴または症状の無い、90名の健康なボランティアを登録し、２群に分けた：23-50歳(65名の対象、年齢中央値33歳、28名の女性、37名の男性)および51-65歳(25名の対象、年齢中央値 53、14名の女性、11名の男性)。血液サンプルを絶食対象から20分座った状態で安静にした後に採取した。心臓疾患または症状の病歴のない18名の老人対象(年齢中央値72(66-88)、10名の女性、8名の男性)からなる群を地方のダンスクラブから募った。さらに心臓疾患の病歴も症状や徴候もない18名の老人の群(年齢中央値68歳(60-79)、9名の女性、9名の男性)に対して心エコー図法、血圧測定、運動試験(運動力測定)、肺機能試験および血液スクリーニングを用いて評価した。心肺疾患の知見は全くなかった。最後に、腎疾患の生化学的徴候のない16名の安定心不全患者を心臓移植に関する評価について調べた(年齢中央値55歳(30-68)、6名の女性、10名の男性)。心不全患者はNYHA群II-lVに分類され、すべて左心室拍出率が低下していた(中央値30%、範囲15-40)。血液サンプルを前腕静脈から採取し、血漿を- 80℃で分析を行うまで保存した。地方医療倫理委員会がヒト血漿の使用について許可し、すべての対象および患者からインフォームドコンセントを得た(KF01-231/99)。
【００９５】
ラジオイムノアッセイ(RIA)手順
RIAのために、150μLのトリプシン-処理標準および血漿サンプルを0.2% ヒト血清アルブミン、トレーサーペプチド (1000 カウント/分)および抗血清(最終希釈度1:150000)を含有するTris 緩衝液(100μL)と混合した。合成プロＢＮＰ 1-10Tyrを標準として用いた。4℃で5日間のインキュベーションの後、抗体-結合トレーサーおよび遊離トレーサーを2 mLの血漿-炭末（plasma coated charcoal）(10% 血漿 Tris 緩衝液中、15 g木炭/L)を添加することにより分離し、10分室温で放置して遠心分離した。対照、緩衝液ブランクおよびサンプルブランク(抗血清不添加)をアッセイに含め、サンプルは常に二連でアッセイした。アッセイの信頼性は感受性(検出限界)、特異性、精度(アッセイ内およびアッセイ間再現性)および正確さについて評価した。
【００９６】
クロマトグラフィー
血漿を2000x10 mm セファデックス（Sephadex）G-50 スーパーファイン（Superfine）カラム(Pharmacia、Uppsala、Sweden)にかけ、4℃で0.2% ヒト血清アルブミンを含有するTris 緩衝液pH 8.5にて溶出した(流速 4 ml/時間)。カラムを合成プロＢＮＰ1-21で較正し、ボイドおよびトータル容量を125I-アルブミンおよび22NaCLでそれぞれ溶出することによって測定した。
【００９７】
統計分析
結果は中央値および範囲として表す。基準範囲の計算はReed et al (Reed et al.、1971)にしたがって非パラメトリック方法により行った。統計学的比較はMann-Whitney非パラメトリック検定によって行い、両側P 値0.05未満を有意とみなした。
【００９８】
結果
放射ヨウ素標識
チロシン-伸長プロＢＮＰ1-10における125lの取り込みは80〜95%の範囲であった。標識化および非標識化ペプチドを完全に分離し、標識化および非標識化抗原の希釈曲線は平行であった。トレーサーの放射活性を自己置換によって評価したところ3.90 Ci/μmolであった。
【００９９】
抗血清評価
免疫化に応答したすべてのウサギおよび抗血清98192を、タイター (1:150000)および結合活性が高いためにさらなる特徴付けのために選んだ。したがって、この抗血清の結合アフィニティーは、有効平衡定数(Koaff)として表すと、0.45 x 1012 L/molであり、検出限界0.07 pmol/Lに対応する。検出限界は、10連の0-標準の平均-3SDとして計算したところ0.20 pmol/Lであった。不均一性の指標はSips (1948)により計算したところ1.10であり、リガンドは非常に均質であり、抗血清はモノクローナル抗体溶液として作用することが示される(Rehfeld、1988)。
【０１００】
抗血清の特異性を、トレーサー置換における切型N-末端プロＢＮＰペプチドについての抑制量中央値(ID50)の比として表した。N-末端ヒスチジンの除去により結合が大幅に減少し(0.001)、2つのN-末端アミノ酸である、ヒスチジンおよびプロリンの除去により、結合はさらに減少した(0.0006)。したがって、この2つのN-末端アミノ酸は抗血清 98192についてのエピトープの必須部分を構成する。マウスおよびブタからの心臓抽出物におけるN-末端プロＢＮＰ濃度を測定することにより特異性をさらに評価した(図1)。いずれの種においても免疫反応性は検出されず、ヒト配列における位置5-6のアミノ酸である、セリンおよびプロリンが抗体結合に必要であるということが示された。コンピュータプログラム FASTAを用いてSwissProtデータベースをヒトN-末端プロＢＮＰに類似するアミノ酸配列について検索した。その他の哺乳類の対応するN-末端プロＢＮＰ配列以外の関連配列はみられなかった。
【０１０１】
アッセイ信頼性
トリプシン-処理血漿サンプルについての希釈曲線は較正曲線と平行であり(データ示さず)、ネイティブなペプチド抗原に対する抗血清アフィニティーは合成ペプチドのものと同じであることが示された。重複するサンプルのアッセイ間変異係数は16 pmol/L において20%、70 pmol/Lにおいて8%そして145 pmol/Lにおいて10%であった(n =10)。アッセイ間変位は13 pmol/Lにおいて12%、75 pmol/Lにおいて7%そして130 pmol/L において5%であった(n = 10)。高濃度の内因性N-末端プロＢＮＰによる血漿サンプルの希釈ならびに血漿サンプルと高濃度および低濃度のN-末端プロＢＮＰとの混合(本アッセイにおいて測定したところ)は、計算濃度からの偏差<15%であって高度の相関を示した。アッセイの測定範囲は0-250 pmol/Lであった。
【０１０２】
血漿のクロマトグラフィーによって評価される抗血清特異性
正常血漿のゲルクロマトグラフィーにより、ボイド容量位置において溶出される明らかな免疫反応性が確認された。同じ画分はトリプシン処理後には免疫反応性を失うことが明らかになった(図2)。心不全患者からの血漿のクロマトグラフィーは２つの免疫反応性ピークを示したが、画分のトリプシンによる切断後は、１つのピークのみが残った(KD= 0.10、図3A)。心不全患者からの血漿をゲルクロマトグラフィーの前にSep-pak C18 カートリッジ (Millipore Waters、Milford、MA、USA)を用いて抽出したところ、免疫反応性は画分のトリプシン処理後のピークと同じ位置において単一のピークとして溶出したが(図3B)、トリプシン処理後のピークにおける総免疫反応性は減少した。最後に、クロマトグラフィーにかけたトリプシン処理心不全血漿の免疫反応性は、合成プロＢＮＰ1-21較正ペプチドの位置に対応する単一のピークとして溶出した(KD = 0.59、図4)。
【０１０３】
血漿におけるN-末端プロＢＮＰ安定性
室温で24時間放置し、トリプシンで処理した心不全血漿は、内因性N-末端プロＢＮＰ濃度の有意な減少を示さなかった(127から105 pmol/L、n = 5)。同様に、最初の血漿のトリプシン処理、次いで24時間室温でのインキュベーションによっては内因性ペプチドの分解は起こらなかった(128から125 pmol/L、n =5)。
【０１０４】
健康な対象におけるN-末端プロＢＮＰ
トリプシン処理後の血漿中N-末端プロＢＮＰ濃度を図5に示す。中央値は23-50歳群と51-65歳群の間に有意差があり(1.0 pmol/L (0-16、n = 65)対 2.0 pmol/L (0-15、n = 25)、p < 0.01)、51-65歳群と66-88歳群の中央値の間にも有意差があった(22 pmol/L (3-40、n = 18)、p < 0.0001)。客観的な心肺疾患の徴候を示さない選択された60-79歳の老人群における血漿濃度は症状について質問されただけの年齢をマッチングした健康老人群と比較して低かった(8 pmol/L (4-28、n =18) 対 22 pmol/L (3-40、n = 18)、P< 0.0005)。年齢にかかわらず男女間で有意な濃度差はなかった。得られた濃度のヒストグラムにより、N-末端プロＢＮＰの測定は単一の分布からではないことが明らかになった。それゆえ、基準範囲を分布が均質な23-65歳の対象から決定した。ガウス分布ではなく、データをガウス分布に合致するよう変換できないため、基準範囲をランク数25を用いた非パラメトリック方法により決定し、基準上限(97.5 パーセンタイル)を23-65歳の対象について計算して15 pmol/Lとした(信頼区間9-16 pmol/L、n = 90)。
【０１０５】
心不全血漿におけるN-末端プロＢＮＰ 
心不全患者における血漿濃度を図6に示す。N-末端プロＢＮＰ濃度は年齢をマッチングした健康な対象群と比較して有意に上昇しており(89 pmol/L (29-659、n = 16) 対 1.0 pmol/L (0-16、n = 90)、p < 0.0001)。常に基準上限より高かった(図6)。
【０１０６】
考察
本研究はヒト血漿におけるプロＢＮＰについてのアッセイの開発および特徴付けを記載する。産生される抗血清は結合活性および均一性が高かった;そしてモノヨウ素化されたトレーサーと組み合わせて用いた場合、感度が高く特異的なアッセイが達成された。さらに本発明者らはプロＢＮＰの切断を行い、それによって血漿中の内因性プロＢＮＰとそのN-末端断片を切断して小さい1-21断片とした。この工程により正確なプロＢＮＰおよびその産物の定量がホルモン前駆体プロセシングの程度に関わりなく可能となる。RIAに先立つ血漿サンプルのトリプシン処理もまた、ラジオイムノアッセイにおける血漿タンパク質からの非特異的妨害を避けることにより抽出の有効な代替手段として役立つ。
【０１０７】
ヒトプロＢＮＰ配列は、アミノ酸誘導体化およびエンドタンパク分解性切断のための可能性のあるいくつかの部位を含む(図1)。さらに、プロ配列は、血漿中のプロＢＮＰのN-末端断片およびプロＢＮＰのオリゴマー化を誘導することが報告されているロイシンジッパー-様配列モチーフを含む(Seidler et al.、1999)。この知見は、オリゴマー化したN-末端プロＢＮＰ断片はいくらかの領域を曝す一方、抗体結合に利用できないものもあるという可能性を投げかける。これは少なくとも部分的に、今日まで報告されていた健康および心不全患者におけるN-末端プロＢＮＰ断片の血漿濃度がなぜかなりの変動を示すのかを説明する(Hunt et al.、1995 and 1997a,b; Schultz et al.、2001; Karl et al.、1999; Hughes et al.、1999; Campbell et al.、2000)。ほとんどの方法はプロＢＮＰのN-末端に対する抗血清を用いるイムノアッセイに基づくが、エピトープの正確な定義は今まで常に報告されていたわけではない。本発明者らは、N-末端切型形態のヒトプロＢＮＰおよび異常な（deviant）N-末端配列を有するその他の哺乳類からのプロＢＮＰに対する結合に付き本発明者らの抗血清を試験することにより、ヒトプロＢＮＰの遊離N-末端を結合部位であるとして確立した。さらに、本発明の好ましい態様において、本発明者らは血漿のトリプシン処理によって位置21のアルギニル残基の後で内因性N-末端プロＢＮＰ形態が有効に切断されることを見いだした(図4)。本発明者らはしたがって、本発明の好適な態様において、等モルの有効性を有するN-末端プロＢＮＰのすべての形態からのプロＢＮＰのN-末端1-21断片を測定するアッセイを開発した。このアッセイは、健康な対象におけるN-末端プロＢＮＰ断片が低ピコモル濃度範囲にて循環することを確認し、これは以前の報告と一致する(Hunt et al. 1995; Campbell et al.、2000)。
【０１０８】
血漿中のN-末端プロＢＮＰ濃度を様々な年齢および異なる性の群において測定した。本発明者らは年齢群間で血漿濃度の有意な上昇を見いだした。70歳未満の対象については、基準上限の計算に臨床的重要性は無かった。本発明者らは男女間での差を見いだすことは出来なかった。しかし、以前に心臓疾患または症状が無かった70歳を超える対象は、血漿中のN -末端プロＢＮＰ濃度において有意な上昇を示し(図5)、これは未同定の心臓機能障害またはその他の病状を彼らが実際は有していたことを示唆する。心臓機能障害の客観的徴候がない70歳を超える第二の老人群を調査した場合、N-末端プロＢＮＰ濃度は第一の老人群と比較した場合に低いことが見いだされたが、70歳未満の対象群と同等ではなかった。心不全患者におけるN-末端プロＢＮＰ濃度は、年齢をマッチングした参照限界（reference limit)より常に高かった。それゆえ、本発明のアッセイの多くの有用な診断用途の１つは、心臓機能障害の診断を除外する。
【実施例２】
【０１０９】
末期柔組織肺疾患患者におけるプロＢＮＰの測定
材料&方法
患者 
末期柔組織肺疾患であると診断された続発患者を2000年2月から2001年4月までの肺移植評価で調査した。患者は以下の基準を満たす必要があった:1)二次元心エコー図法によって評価した結果、正常な左心室機能; 2) 血管造影法によって評価した結果、有意な冠動脈疾患無し; 3)腎機能障害無し(血清クレアチニンα130 gmol/L);および4) 持続性不整脈、例えば、心房細動無し。44名の患者を含めた：慢性閉塞性肺疾患を有する末期柔組織肺疾患(COPD、n=19)、α-1抗-トリプシン欠乏があってもなくてもよい肺気腫(n =17)または肺線維症(n = 8)。さらに6名の原発性肺高血圧(PPH)患者も評価した。研究は地方倫理委員会により許可され(KF 01-307/99)、研究への参加についての書面によるインフォームドコンセントをすべての患者から得た。
【０１１０】
血行動態および心臓機能 
右心および左心カテーテル検査を大腿アプローチによって一晩の絶食後に行った。右心房(RAP平均)、右心室(RVP 収縮期および弛緩期)、肺動脈(PAP 収縮期、弛緩期および平均)および肺動脈閉塞位置(PCWP平均)からの圧力を記録した。心拍出量(CO)は、DeltatracTMを用いる酸素取り込み測定についてのFick's 酸素法またはVigilanceTMコンピュータモニターを用いる連続熱法のいずれかによって測定した。肺高血圧とは、安静時のmPAPが20 mmHgを超えるもの定義した(Rich et al.、1987)。心係数(CI)はCO/体表面積として算出し、肺血管抵抗(PVR)はPAP平均 - PCWP平均/COとして算出した。左心室圧力測定および心室造影を含む左心カテーテル検査および冠動脈造影を右心カテーテル検査の後に行った。右心室拍出率は放射性核種造影技術によって評価し、左心室拍出率は胸骨傍および頂端の4-室における二次元測定を用いて評価した。左心室壁における分節運動も中隔の奇異な運動を含めて記載した。
【０１１１】
血漿中N-末端プロＡＮＰおよびプロＢＮＰ濃度
カテーテル検査中に、20 mlの血液サンプルを大腿静脈および肺動脈の躯幹からカテーテルを介して注意深く採取した。血液をすぐにEDTAカリウム (1 mg/ml)を含有する10 ml チューブおよびEDTAカリウムおよびアプロチニン(500 U/ml)を含有する10 ml チューブに移した。また、20 mlの血液サンプルを大腿動脈から得た。サンプルをすぐに遠心分離し、血漿を分析まで-80℃で保存した。N-末端プロＡＮＰの測定のために、本発明者らは市販のキット(Biotop OY、Oulu、Finland)を用いた。このラジオイムノアッセイ(RIA)は報告されている感度が30 pmoVLであり、健康な対象に予測される濃度は110-600 pmol/Lである(Kettunen et al.、1994)。プロＢＮＰの血漿濃度は実施例１に記載のように測定した。
【０１１２】
統計分析
すべてのデータは中央値および範囲として表した。異なる患者群からのデータの比較は非パラメトリック検定(Krustal-Wallis)を用い、その後Dunn's 多重比較検定を行った。Log 変換を用いてペプチド濃度分布を標準化した後、相関(ピアソン(Pearson))または直線回帰分析を行った。異なる血管床における血漿濃度の比較のため、一元配置分散分析の繰り返し測定を行い、その後、Newman-Keulis 多重比較検定を行った。P値0.05未満を有意とした。
【０１１３】
結果
末期柔組織肺疾患の44名の患者をその特徴により亜群に分け、PPHの6名の患者を表１に挙げる。
【０１１４】
【表１】
2005522697.tif 000002
【０１１５】
50名の対象における左心室拍出率(LVEF)、努力肺活量(FVC)、1秒間の強制呼気量(FEV1)および拡散能 (DLCO)についての値(中央値および範囲)
【０１１６】
血行動態変数および心臓機能 
平均肺圧力、右心室拍出率、肺血管抵抗および心係数は柔組織肺疾患の3亜群間で相違はなかった(図7)。しかし、これら患者の平均肺圧力は44名のうち27名(67%)で上昇しており、mPAP中央値は20.5 (11-40) mmHgであった。右心室拍出率を評価したところ48 (30-60)%であり、総肺抵抗は2.1 (0.7-5.0)であった。Wood単位および心係数を計算したところ2.7 (1.5-4.6) L/分 x m2であった。一方、原発性肺高血圧であると診断されたすべての患者は平均肺圧力(63、57-99) mmHgが非常に上昇しており、右心室拍出率(32、27-37%)が低かった。肺血管抵抗は上昇しており(15.5、9.8-33.0 Wood 単位)、心係数は低下していた(1.9、1.3-2.1 L/分 x m2) (図7)。心エコー図法において、心室間中隔の逆説（paradox）運動がすべてのPPH患者において記録されたが、末期柔組織肺疾患患者においては記録されなかった(データ示さず)。
【０１１７】
血漿N-末端プロＡＮＰ
肺動脈からのN-末端プロＡＮＰ血漿濃度は、柔組織肺疾患患者における基準上限よりも有意に高く(664 (365-1620)対600 pmol/L、P < 0.05)、3つの亜群の間での有意差はなかった(データ示さず)。44名の患者のうち14名(32%)では平均肺圧力が正常であるにかかわらずN-末端プロＡＮＰ濃度が上昇しており、44名のうち11名(25%)ではN-末端プロＡＮＰ血漿濃度は正常である一方、mPAPは上昇していた。いずれの亜群においても平均肺圧力と血漿中のN-末端プロＡＮＰ濃度には統計学的関係は示されなかった。PPH 患者群においては、N-末端プロＡＮＰ濃度は末期柔組織肺疾患患者よりも２倍高かった(1186 (1008-1803) 対664 (365-1620) pmol/L、P < 0.001)。
【０１１８】
血漿プロＢＮＰ
肺動脈からの血漿の測定結果を図8に示す。末期柔組織肺疾患であってmPAPが正常の患者においては、血漿プロＢＮＰ濃度は常に基準上限より低く、27名のうち4名のmPAPが上昇した患者のみ(15%)においてプロＢＮＰ濃度が中程度に上昇していた。末期柔組織肺疾患患者における血漿プロＢＮＰ濃度中央値は2.5 (0.0-22.0) pmol/Lであり、亜群の間で有意差はなかった。一方、PPH 患者における血漿プロＢＮＰは40-倍以上上昇し、106.5 (22-140) pmol/Lであった。mPAPとプロＢＮＰ血漿濃度との間の有意な関連性は柔組織肺疾患亜群においては無かった。にもかかわらず、直線回帰分析では、すべての柔組織肺疾患患者およびPPH群を含めた場合、血漿プロＢＮＰ濃度のmRAPおよびmPAPの両方に対する有意な関係が示された(図9)。すべての患者においてN-末端プロＡＮＰおよびプロＢＮＰ濃度は有意であるとみなされるほど相関していた(r- 0.47、P< 0,0001)。患者をmPAPに基づいて3群に分けた場合、N-末端プロＡＮＰまたはプロＢＮＰ濃度において差は認められず、mPAP < 60 mmHgであった(図10)。mPAP > 60 mmHgの患者群(6名のPPH患者および1名の末期柔組織肺疾患患者からなる)においてのみ血漿プロペプチド濃度が上昇していた。
【０１１９】
カテーテル検査において肺動脈中の酸素飽和が測定された50名の患者のうち19名において、血漿プロＢＮＰ濃度は、患者における肺動脈酸素飽和および心係数に依存することが判明した(図11)。最後に3種類の血管におけるプロＢＮＰ濃度を比較した。プロＢＮＰ濃度が上昇した患者において(末期柔組織肺疾患の4名の患者および6名のPPH患者、n = 10)、大腿静脈および大腿動脈での濃度と比較して有意に高いプロＢＮＰ濃度が肺動脈においてみられた(図12、P < 0.05)。
【０１２０】
考察
末期柔組織肺疾患であって正常な左心室機能を有する患者は血漿プロＢＮＰが上昇しておらず、これらの患者においては平均肺動脈圧と血漿ペプチド濃度の間に関係はなかった。一方、PPH患者群では、N-末端プロＢＮＰ血漿濃度が上昇しており(2-倍)、血漿プロＢＮＰは40-倍以上上昇していた(図12)。平均肺動脈圧とプロＢＮＰ濃度の関係は、この群の患者も含めた場合にのみ示された。
【０１２１】
肺動脈からサンプリングした血漿における方がプロＢＮＰ濃度が高いことは、ペプチド測定が心臓分泌を表すことを確認する(図12)。しかし、結果は心臓内の合成および分泌の確かな起源を示すものではない。プロＢＮＰの濃度上昇はほぼもっぱらPPH患者群において検出されるため、これらの患者が心室間中隔の逆説運動も示すことは驚くべきことである。中心肺動脈圧が2-倍上昇した急性右心室過負荷実験モデルにおいて、心室間中隔からの組織サンプルは末端肺動脈バンド形成の後にＡＮＰおよびＢＮＰ ｍＲＮＡが上昇制御されないことを示した(Adachi et al.、1995)。本研究において原発性肺高血圧のすべての患者は慢性的に肺動脈圧が3-倍以上上昇した。それゆえ厳しい右心室過負荷における心室間中隔の関与がナトリウム排泄増加ペプチドの血漿濃度の上昇に寄与していると考えられる。肺動脈と大腿動脈との間の有意な濃度勾配はさらにプロＢＮＰが肺で代謝されている可能性を示唆する。代謝酵素中性エンドペプチダーゼの発現の研究によって(Li et al.、1995)、肺はC-末端、生理活性ＢＮＰペプチドの主要なクリアランス器官であると示唆されている。
【０１２２】
末期柔組織末端肺疾患の主な症状は低酸素症を伴う重篤な呼吸困難である。かかる慢性呼吸症状の臨床的な悪化により、しばしば救急治療部への入院が必要となり、ここで主に存在する症状は呼吸困難であり、これはまたうっ血性心不全の主症状でもある。ナトリウム排泄増加ペプチド測定が呼吸困難の原因が心血管であるか肺であるかの判別生化学的マーカーであるとの研究が現在蓄積しており、知見が多く得られつつある(Morrison et al.、2002; Harrison et al.、2002)。本発明者らのデータは、肺移植に適する摘出柔組織疾患の末期患者においてさえ、プロＢＮＰ血漿濃度は、中程度の肺高血圧の存在下でも正常であることを示す。
【０１２３】
本研究は、肺移植が奨められる末期柔組織肺疾患患者におけるプロＢＮＰ血漿濃度が肺高血圧の存在下においてさえ上昇しないことを明らかにした。次ぎに、プロＢＮＰは、血管性肺疾患患者において主に心臓から分泌されるようである。この知見はしたがってナトリウム排泄増加ペプチドが柔組織肺疾患患者における肺高血圧のマーカーであることを否定し、ナトリウム排泄増加ペプチドが、呼吸困難の原因が肺であるか心血管であるかの判別マーカーとして利用できるとの考えを確認する。したがって、本発明の方法は呼吸困難の原因が肺であるか心血管であるかを識別するための簡便な診断試験として利用できる。
【実施例３】
【０１２４】
心筋虚血における心臓のプロＢＮＰ発現の上昇
心臓ＢＮＰ分泌を、冠動脈バイパス移植術または経皮経管的インターベンション治療を受ける冠動脈疾患患者からの血漿において調べた。心室機能は心室造影によって評価したところ、正常個体群と比較して虚血性患者において有意に減少していなかった(図13A)。しかし、冠動脈バイパス移植術患者における血漿ＢＮＰおよびプロＢＮＰ濃度は冠動脈疾患でない対照群と比較した場合、顕著に上昇していた(ＢＮＰ 5-倍、P < 0.01、プロＢＮＰ 8-倍、P < 0.01)(図13B)。冠動脈バイパス移植術患者と同様に経皮インターベンション治療を受けた別の患者群も左心室拍出率は正常であり(図13A)、血漿ＢＮＰおよびプロＢＮＰ濃度は対照群と比較して顕著に上昇していた(ＢＮＰ 5-倍、P < 0.01、プロＢＮＰ 10-倍、P < 0.01)(図13B)。注目すべきことに冠動脈疾患患者における血漿ＢＮＰおよびプロＢＮＰ濃度は、左心室拍出率が非常に低下しているうっ血性心不全患者群においてみられるものと有意な差はなかった(図13B)。
【０１２５】
冠動脈バイパス移植術を受けた冠動脈疾患患者からの心房および心室の組織診における心臓ＢＮＰ ｍＲＮＡの定量分析により、心室ＢＮＰ ｍＲＮＡ発現と血漿ＢＮＰ濃度(r = 0.83、P <0.001、図14A)および血漿プロＢＮＰ濃度 (r = 0.78、P < 0.001)との間の正の関係が明らかとなった。一方、心室組織診よりも心房組織診における方が心房 ＢＮＰ ｍＲＮＡ発現がほぼ6-倍高かったにもかかわらず、血漿ＢＮＰおよびプロＢＮＰ濃度と心房ＢＮＰ ｍＲＮＡ発現との関連はなかった(図14B)。
【０１２６】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図1は、マウス(配列番号3)、ブタ(配列番号2)およびヒト(配列番号3)におけるプレプロＢＮＰ前駆体のアミノ酸配列である(パネルA)。太字のアミノ酸はヒト配列との相同性を示す。N-末端プロ配列1-10および公知のヒト生理活性ペプチド(残基103-134)を下線で示す。パネルBは塩基性アルギニル残基を表す黒丸で示したプロＢＮＰおよびペプチド断片を示す。断片1-76および断片1-21および生理活性ＢＮＰ-32を図示する。
【図２】図2は、健康な対象からの血漿のクロマトグラフィープロフィールである。パネルAは溶出した非処理血漿の免疫反応性を示し、パネルBはトリプシン処理後に回収した画分における免疫反応性を示す。
【図３】図3は、心不全血漿のクロマトグラフィープロフィールである。パネルAはカラムに直接かけられた血漿を示し、パネルBは最初にSep-pak C1 Sカートリッジを用いて抽出した場合の血漿プロフィールを示す。白丸は未処理画分を示し、黒丸はトリプシン-処理画分を示す。
【図４】図4は、トリプシン処理され、G-50 Superfineゲルろ過クロマトグラフィーにかけた心不全血漿である(黒丸)。合成プロＢＮＰ1-21の溶出プロフィールも示す(白丸)。
【図５】図5は、健康な対象におけるN-末端プロＢＮＰである。対象を以下の群に分けた:I:23-50歳(n = 65)、II: 51-65歳(n = 25)、III:心肺疾患症状のない老人、66-88歳(n = 18)、IV:心肺疾患の客観的所見のない老人、60-79歳(n =18)。
【図６】図6は、心不全患者(黒丸、n = 16)および年齢をマッチングした対照群(白丸、n = 90)のN-末端プロＢＮＰである。１名の心不全患者の血漿プロＢＮＰ濃度は659 pmol/Lであり、この図にプロットしていない。破線は基準上限計算値(15 pmol/L)を示す。
【図７】図7は、末期柔組織肺疾患(n = 44)および原発性肺高血圧(n = 6)の患者の血行動態特性である。パネルAは平均肺動脈圧(mPAP);パネルBは心係数;パネルCは右心室拍出率(RVEF);パネルDは肺血管抵抗(PVR)である。
【図８】図8は、末期柔組織肺疾患患者(n = 44)および原発性肺高血圧患者(n = 6)の亜群におけるプロＢＮＰの血漿濃度である。破線は血漿濃度の基準上限(水平線)および平均肺動脈圧(垂直線)である。
【図９】図9は、平均右心房圧(mRAP、r2 = 0.21、P < 0.005) （パネルA）または平均肺動脈圧 (mPAP)（パネル）B (r2 = 0.50、P < 0.0001)に対するプロＢＮＰ血漿濃度(Log)の直線回帰を示す。破線は血漿濃度の基準上限(水平線) および平均右心房または肺動脈圧(垂直線)である。
【図１０】図10では、患者(n = 50)を平均肺動脈圧(0-20、21-60、< 61 mmHg)に応じて3群に分けた。データを中央値(線)として示し、破線は血漿におけるプロペプチドの基準上限を示す。** は P < 0.01、*** はP < 0.001を表す。
【図１１】図11は、14名の末期柔組織疾患患者および5名のPPH患者における血漿プロＢＮＰと肺動脈酸素飽和 (SVO2、r2 = 0.45、P < 0.005)および心係数(r2 = 0.47、P < 0.005)との直線回帰である。
【図１２】図12は、血漿プロＢＮＰ濃度が上昇した患者における大腿静脈、肺および大腿動脈の血漿プロＢＮＰである(n = 10)。 *はP 値 < 0.05を示す。n.s. = 有意差なし。
【図１３】図13は、左心室拍出率および血漿ＢＮＰおよびプロＢＮＰ濃度である。パネルA:経皮インターベンション(PCI)、冠動脈バイパス移植術(CABG)を受けた冠動脈疾患患者、冠動脈疾患でない心不全患者(CHF)および冠動脈疾患でも左心室機能障害でもない正常個体(対照)において心室造影によって測定した左心室拍出率。パネルB: 4群における血漿ＢＮＰ(黒丸)およびプロＢＮＰ(白丸)濃度。水平線は中央値を示し、各点は個々の患者の値を示す。
【図１４】図14は、冠動脈疾患の患者の心臓における心室ＢＮＰ ｍＲＮＡ含量および心房 ｍＲＮＡ含量である。パネルA: CABG 患者における血漿ＢＮＰ濃度と左心室ＢＮＰ ｍＲＮＡ含量との関係。パネルB:血漿ＢＮＰ濃度と右心房ＢＮＰ ｍＲＮＡ含量との関係の欠失。各点は個々の患者の値を示す。r-値は対数的に変換したデータの直線回帰分析より得た。
【図１５】図15は、心室ＢＮＰ遺伝子発現の調節およびＢＮＰとプロＢＮＰの血漿濃度の上昇に関する提案される機構の模式図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月10日(2004.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005522697000001.app
【国際調査報告】
2005522697.tif 000021
2005522697.tif 000022
2005522697.tif 000023