(57)【要約】本発明はイソフラボン類を多量に生成する大豆細胞培養物及び大豆細胞株に関し、そして高い収量でイソフラボン化合物を調製し、単離するための方法に関する。本発明はまた、そのような細胞株から再生された大豆植物に関し、そしてイソフラボン化合物を得るためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２５ｍｇ／ｇ乾燥物質を超える含有量のイソフラボン類を発現する、大豆植物細胞培養物又は細胞株。
【請求項２】
イソフラボン類の含有量が３５ｍｇ／ｇ乾燥物質を超える、請求項１に記載の大豆植物細胞培養物又は細胞株。
【請求項３】
細胞がグルコシド−マロニル化複合体として７０％より多いイソフラボン類を含有する、請求項１又は２に記載の大豆植物細胞培養物又は細胞株。
【請求項４】
マロニルダイジン含有量が総イソフラボン類の６０〜８０％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の大豆植物細胞培養物又は細胞株。
【請求項５】
マロニルゲニスチン含有量が総イソフラボン類の５〜３０％である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の大豆植物細胞培養物又は細胞株。
【請求項６】
ＤＳＭ１４８８３である、大豆植物細胞株。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の大豆植物細胞又は細胞株から再生された大豆植物。
【請求項８】
イソフラボン類に富む食品及び食物サプリメントのいずれかの製造のための原料材料として請求項１〜７のいずれか１項に記載の大豆植物細胞又は再生された植物の使用。
【請求項９】
マロニルダイゼインに富む食品及び食物サプリメントのいずれかの製造のための原料材料として請求項１〜７のいずれか１項に記載の大豆植物細胞又は再生された植物の使用。
【請求項１０】
マロニルゲニステインに富む食品及び食物サプリメントのいずれかの製造のための原料材料として請求項１〜７のいずれか１項に記載の大豆植物細胞又は再生された植物の使用。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の植物細胞培養物又は細胞株又は植物を原料材料として使用する、イソフラボン類の製造方法。
【請求項１２】
植物細胞培養物又は細胞株を、バイオリアクター中で培養する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抽出溶媒がＥｔＯＨ／水又はＭｅＯＨ／水の混合物である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
イソフラボン類を製造するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の大豆植物細胞培養物又は植物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高水準でイソフラボン類を生成する大豆（グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ））細胞及び大豆細胞株、及び高収量でイソフラボン化合物を製造し且つ単離するための方法に関する。本発明はまた、そのような細胞株から再生された大豆植物及びイソフラボン化合物を得るためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソフラボン類は、植物界において限られた分布を有し、無色の結晶質ケトン類として化学的に特徴づけられるユニークな植物フラボノイド類である。自然におけるこの種類の化合物のための最も普通の源は大豆であって、本質的に１２種のイソフラボン異性体、即ちゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ゲニスチン、６”−０−マロニルゲニスチン、６”−０−アセチルゲニスチン、ダイジン（ｄａｉｄｚｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、６”−０−マロニルダイゼイン、６”−０−アセチルゲニステイン；グリシテイン（ｇｌｙｃｉｔｅｉｎ）、グリシチン（ｇｌｙｃｉｔｉｎ）、６”−０−マロニルグリシチン（６”−０−ｍａｌｏｎｙｌｇｌｙｃｉｔｉｎ）、６”−０−アセチルグリシチン（６”−０−ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｉｔｉｎ）を含有する。大豆に見いだされる主要なタイプのイソフラボン類は、（糖を有する）グリコン類及び（糖を有しない）アグリコン類である。グリコン類は、結合したグルコース分子を有し、ゲニスチン、ダイジン及びグリシチン（ｇｌｙｃｉｔｉｎ）を含み、その一方でアグリコン類は、グルコース分子なしのイソフラボン類であり、そしてゲニステイン、ダイゼイン及びグリシテイン（ｇｌｙｃｉｔｅｉｎ）を含む。
【０００３】
近時、イソフラボン類を摂取すると、生物に多くの有益な効果を発揮することが分かった。それらの効果は、哺乳類においてコレステロール水準を減少させる大豆の一般的に認められている特性に、少なくとも部分的によるものと考えられている（ＭｃＬａｃｈｌａｎ  ＪＡ監修のＥｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ＩＩ（１９８５）第６９頁〜第８５頁におけるＳｅｔｃｈｅｌｌの記事）。霊長類に関する研究は、大豆イソフラボン類が、前記低コレステロールの原因の約６０〜７０％までの割合を占めることさえ示唆している（Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｎ  ９１（１９９５）第９２５頁のＡｎｔｈｏｎｙ、等の記事）。冠状動脈性心臓疾患（ＣＨＤ）は、特に工業化した国において死の主要な原因である。上昇した総コレステロール及び低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）水準はＣＨＤについての重大な危険因子である。ヒトにおいて、大豆たんぱく質製品を、大豆たんぱく質が４７ｇ／日の平均摂取水準となるように消費した場合、血清総コレステロール水準及び低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）コレステロールを平均約１０％低下させると思われる。
【０００４】
イソフラボン類が、或るタイプの癌の防止に関与することがまた示唆されている。食品摂取に起因して、殆ど毎日、大豆たんぱく質を消費する日本女性が、欧米の人々に比較して、乳ガンの発生が全く低いことが統計的に認められている（Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２５（１９９５）第７５７Ｓ頁〜第７７０Ｓ頁の、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ、等）。科学的確認として、動物モデルにおいて、ラットに大豆たんぱく質を与えると乳房の腫瘍形成の減少又は乳房腫瘍の進行の阻止が示された（Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３４７（１９９１）第２３９頁〜第２５３頁のＢａｒｎｅｓ、等）。
【０００５】
特にゲニステインはたんぱく質チロシンキナーゼを阻害すること（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１９８７）第５５９２頁〜第５５９５頁のＡｋｉｙａｍａ、等）、新脈管形成を阻害すること（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１９９３）第２６９０頁〜第２６９４頁のＦｏｔｓｉｓ、等）、そして数種の悪性細胞株における分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を誘導すること（Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２５（１９９５）第７８４Ｓ頁〜第７８９Ｓ頁のＰｅｔｅｒｓｏｎ）が判明した。これらは全て癌発生における重大な危険因子であると考えられてる。ゲニステイン及びビオカニンＡ（ｂｉｏｃｈａｎｉｎ  Ａ）は、男性ホルモン−依存性及び非依存性の前立腺癌細胞の増殖をまた阻止すること（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２２（１９９３）第３３５頁〜第３４５頁のＰｅｔｅｒｓｏｎ及びＢａｒｎｅｓ）及び酸化防止剤として働くこと（Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０（１９９３）第１頁〜第１２頁のＷｅｉ、等）が推定されている。
【０００６】
癌の他に、少なくとも幾種かの大豆イソフラボン画分は、それらが植物エストロゲンの源であるので、一般に女性のために特に有益であるとまた考えられる。植物エストロゲンは多くの利点を提供し、動物エストロゲンの或る種の主張されている欠点を避けると信じられ、その結果イソフラボン類は更年期障害の治療のために用いられるべきであると提案されている。
【０００７】
今までのところ研究はイソフラボン化合物の薬理学的効果は、ダイゼイン又はゲニステインのようなそれらのアグリコン類に主として起因していることを明らかにしてきた。特に、大豆イソフラボンアグリコン類の中で、ゲニステインは骨粗鬆症防止活性、動脈硬化防止活性、そして乳房、胃及び前立腺における抗癌活性を包含する生理学的活性において特に優れていることが最近示された（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９（１９９７）第６６１頁のＳ．Ｂｒａｎｅｓの記事）。
【０００８】
したがって、このような既知の有益な効果から考えて、高い量でイソフラボン類を提供することが、常にかつますます切望されている。
当業界において、イソフラボン類を単離するための幾つかの方法が提案されてきており、最初の成功は１９３１年にさかのぼる（Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．４８９（１９３１）第１１８頁）。
【０００９】
米国特許第５，７０２，７５２号は、大豆糖蜜（ｍｏｌａｓｓｅｓ）供給物流からイソフラボン有用物（ｖａｌｕｅｓ）を回収するための方法を開示している。その方法は、水性大豆抽出液を限外濾過に付して透過物としてイソフラボン類を回収し、そして慣用の手段によりイソフラボン類をさらに精製することからなる。
【００１０】
さらに、米国特許第５，８２１，３６１号は、大豆糖蜜（ｍｏｌａｓｓｅｓ）からイソフラボン類を回収するための別の方法を開示している。イソフラボン複合体をイソフラボングルコシド類に変換させるｐＨ及び温度で水中の大豆糖蜜の溶液を処理し、イソフラボングルコシド類を沈殿させ、そして濾過及び遠心分離によりその溶液からイソフラボングルコシド類を分離する。
また、特開平５−１７０７５６号は、８０％メタノールで大豆をベースとする材料を抽出することによる大豆をベースとする材料からのイソフラボン誘導体の回収を開示している。
【００１１】
しかしながら、すべての先行技術の方法の実質的な欠点は、出発物質である大豆の使用材料単位当たり、約０．１〜０．５％の乾燥重量の限られた量のイソフラボン類しか提供しないことであり、これは結局、利用できる量を制限し且つ抽出費用を増大させることになる。また、大豆中のイソフラボン類のレベルが年毎に３〜８倍変動し、この事実は、品種間でのレベルがまた約２〜３倍変動する可能性がある点で深刻である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
それ故に、本発明の課題は先行技術の欠点を克服し、多量のイソフラボン化合物を一定して得るための改良した方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
多量のイソフラボン類を固有（ｉｎｈｅｒｅｎｔｌｙ）に生成する、大豆細胞培養物又は細胞株を提供することにより、上記課題を解決した。
本発明に関して、“多量”と言う用語は、少なくとも約２５ｍｇ／ｇ細胞乾燥物質（ｄｒｙ  ｍａｔｔｅｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ）、好ましくは少なくとも３５ｍｇ／ｇ細胞乾燥物質、さらに好ましくは少なくとも４５ｍｇ／ｇ細胞乾燥物質の量を意味する。
【００１４】
認識されるように、本発明は、大豆に見い出す量をはるかに超える量でイソフラボン類を合成する大豆細胞株が存在し、その結果、その細胞株をイソフラボン類の生産道具として使用することができるとの驚くべき発見に基づいている。この出願に関して、細胞及び細胞株と言うそれらの用語は相互互換的に用いる。これらの細胞株は、ほんの少量の出発物質を用いて高い収量を得ることを可能にするイソフラボンの単離のための出発物質を確実に提供する。また同時に、植物におけるそれらの合成の年毎の変動に影響を受けることなく一定の量の前記物質を確実に提供する。
【００１５】
好ましくは、本発明の細胞株は、９０％より多くのイソフラボンをグルコシド−マロニル化複合体として含有する。別の好ましい態様に従えば、マロニルダイジンが総イソフラボン類の約６０〜８０％の量で合成され、マロニルゲニスチンが総イソフラボンの約５〜３０％の量で合成される。
【００１６】
最も好ましい態様に従えば、本発明は、ブダペスト条約ＤＳＭＺ（（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）に従って、２００２年２月２７日に寄託し、寄託番号ＤＳＭ  １４８８３を受け取った、細胞株に関する。
【００１７】
本発明の細胞株は、既知の大豆植物に比較して、より多いイソフラボンを合成する大豆植物を再生するために用いることができる。単一の植物細胞から植物を造る方法は当業界において周知であり、この方法はインビトロで苗条を再生させ、次に根づけさせるか、又は細胞体の胚を形成し、次に適当な培地を用いて発芽させ、そして温室で環境順化させる工程を包含する。
【００１８】
本発明はまた、出発物質として、本発明に従う細胞株又はそれから誘導した植物を用いることを含む、大豆からイソフラボン類を調製又は単離する方法を提供する。
【００１９】
細胞株採取物を、固体培地上でカルス培養物として保存する。それでもやはり、好ましくは、細胞の増殖及び所望の化合物の合成のために適当な条件下、バイオリアクター中で、（カルス培養のために用いる培地と同じであるが、しかし寒天のようなゲル化剤の存在なしの）液体培地で本発明の細胞株を培養する。適当な条件は、例えば、植物ホルモン類、例えばオーキシン類（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、又はナフタレン酢酸（ＮＡＡ）又はインドール酢酸（ＩＡＡ））、シトキニン類（ベンジルアデニン又はベンジルアミノプリン）及び糖類（例えば２０〜６０ｇ／リットルで、スクロース、グルコース）を加えての、例えば基本的なガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）、等の培地（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．５０第１５１頁〜第１５８頁（１９６８）のＮｕｔｒｉｅｎｔ
ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ
ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｒｏｏｔ  ｃｅｌｌｓのＧａｍｂｏｌｇ  Ｏ．Ｌ．、Ｍｉｌｌｅｒ  Ｒ．Ａ．及びＯｊｉｍａ  Ｋ．）又はムラシゲ及びスクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ）の培地（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５第４７３頁〜第４９７頁（１９６２）のＡ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓのＭｕｒａｓｈｉｇｅ  Ｒ．及びＳｋｏｏｇ  Ｆ．）を使用する。ｐＨは５〜６単位であり、そして温度は２０℃〜３０℃である。
【００２０】
細胞は固体培地（寒天又はゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ）を加えた培地）上でペトリ皿中で“カルス培養”として培養し、月毎に継代培養することができる。これらのカルスはかき混ぜられた液体培地（三角フラスコ）に容易に移して細胞懸濁培養物を得ることが出来、これを１５〜２１日毎に継代培養することができる。これらの細胞懸濁液を、バイオリアクター中での集団細胞培養のために用いる。
【００２１】
本発明の細胞又は細胞株の安定性に起因して、先行技術のシステムに比較して、単位材料当たり高い量でイソフラボンを高い品質で連続して且つ均一に生産できる。イソフラボン類の単離のために通常使用する大豆植物において、イソフラボン類のレベルは通常、年ごとに３〜８倍変動し、そして品種間で２〜３倍変動する。それ故、本発明がなされるまで、イソフラボン類の再現性よく一定の量で大豆からのイソフラボン抽出物を得ることは困難であった。
【００２２】
さらに、大豆植物から単離した抽出物はまた、比較的に高いレベルの苦み成分のサポニン類を含有し、典型的にはこれらのイソフラボン化合物は固有の苦いフレーバーを伴っていた。しかし、本発明の細胞中ではイソフラボン類は固有の高い濃度を有するので、そのような苦み成分に関連する不純物は最小に減少している。また、（同じ量のイソフラボン類を生成するために）より少ない出発物質を単離処理に付せばすむので、通常非常に高いレベルに達する純粋なイソフラボン化合物の費用を減少させることができる。出発物質中のイソフラボン類−不純物の割合がすでに所望化合物側にシフトしてしまっているので、（特に苦みを取り除くための）多くの精製工程を減少させることができる。例として、化学的に合成したゲニステイン、たんぱく質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）阻害剤、あるいは現在において大豆から抽出したゲニステインは＄５．０００，００／ｇまで費用がかかる可能性がある。本発明に従えば、先行技術のこれらの欠点は、当該の化合物の発現のレベル及び安定性に起因して、すべて克服することができる。
【００２３】
いったん細胞／カルスを所望の濃度に培養したら、それらを採取し、そしてイソフラボン類を抽出し且つ精製するための処理に付し、その処理は抽出溶媒としてＥｔＯＨと水との混合物又はメタノールを使用し、次ぎに合成吸着剤（例えば分析カートリッジＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐｐａｃｋ  Ｃ１８、又はＸＡＤ２、ポリアミンＭＮ  ＳＣ６のような重合体樹脂）上で精製し、そしてＥｔＯＨ又はＭｅＯＨのような選択溶媒による溶離することを含むことができる。
【００２４】
したがって、細胞又は細胞株、及びそれらから誘導された植物からの大豆でさえ、イソフラボン類を単離するために用いることができ、出発物質の最小量を用いたときでさえ、結局、高い収量が得られ、同時に費用を節約する。
いったん得られたならば、それ自体既知の方法でイソフラボン化合物を栄養製品又は医薬品のような所望の製品に導入することができる。
【実施例】
【００２５】
以下の例は、本発明を説明するものであって、これらの例に限定するものではない。
組織培養：
組織培養物と対照として異なる園芸品種の種子とを平行して分析した。グリシンマックス（Ｌ）メル（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ）Ｍｅｒｒ）の組織培養株は、２０ｇ／リットルのスクロース、７ｇ／リットルの寒天（ｂａｃｔｏ−寒天Ｄｉｆｃｏ）及び１ｍｇ／リットルの２，４−Ｄを補充したガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）らの培地上で異なる園芸品種の子葉から２５年前にイニシエート（ｉｎｉｔｉａｔｅ）したものである。ｐＨを５．８に調節した後に、オートクレーブに入れた（１１５℃で２０分）。４０株を毎月、ペトリ皿（１０ｃｍ直径）中の同じ培地上で継代培養し、そして光（１６時間の明期、３６μモル／ｍ２秒、（ドイツのＳｙｌｖａｎｉａ  Ｇｒｏｓｌｕｘ社の）冷白色蛍光ランプ）の下に２６℃で置いた。ｃｖ．Ａｍｓｏｙの２１株Ａｌｔｏｎａの１１株、Ｍａｐｌｅ  ａｒｒｏｗの７株ｍａｎｄａｒｉｎからの１株をイニシエートした。
【００２６】
１株（１３４０６、ｃｖ．Ｍａｐｌｅ  ａｒｒｏｗ）を液体培地（組織培養のための培地と同じ、但し寒天なしで３０ｇ／リットルのスクロースを有する）に移し、そして組織培養物のコレクションと同じ条件下で２週間毎に２５０ミリリットルの三角フラスコ（１００ミリリットルの培地中に５ｇの新鮮重量）中で継代培養した。その三角フラスコを１００ｒｐｍのオービタルシェーカー（米国エジソンのＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）上に置いた（２０分直径方向に振り混ぜる）。
【００２７】
バイオリアクターとして、２つの６枚刃のかき混ぜタービンを有する１０リットルのかき混ぜバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を、上記と同じ条件の培地、温度及びｐＨ下に用いた。５０ｍｇ／リットルの発泡防止剤（フランスのＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｃｈｉｍｉｅ製のＳｉｌｂｉｏｎｅ  ７０４１４）を加えた後、滅菌した。新しい培地の９．６リットルを含有するバイオリアクターを１１５℃で４０分間オートクレーブに入れた。７日齢の細胞を２つの１リットル三角フラスコ（４００ミリリットル培地）から濾過した。
【００２８】
バイオリアクターに接続される特定のアウトプットを有する１リットルの三角フラスコ（４００ミリリットルの新しい培地）中に３００ｇの新しい物質を入れた。かき混ぜ速度は１００ｒｐｍであった。滅菌可能な酸素プローブ（Ｉｎｇｏｌｄ製）及び質量流量計（フランスのＳＧＩカンパニー製）を備えたバイオコントローラー（ＳＧＩカンパニー製）を用いて溶解酸素を３０％に維持した。ぜん動性ポンプ（ＳＧＩカンパニー製）を用いて、必要に応じて新しい培地を連続的に供給した。この場合において、培地水準プローブにより制御され、空気のあふれ及び採取を可能にする電磁バルブを介して流出液を自動的に除去した。培地の水準がプローブ水準により固定した限界より高くなった場合、タイマーによって３０分間バルブが開かれる。次ぎに採取が起こなわれ、そしてプローブと培地との接触が断たれると、すぐに採取が停止される。この方法により半連続又は連続培養を行うことができた。
【００２９】
サンプル採取、抽出及び分析
増殖測定：
新しい重量の測定のためにサンプルを採取した分別量（アリコート）のバイオマスの凍結乾燥後に乾燥重量を得た。米国のＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからのアッセイ試薬キット（ｎ°７１６２６０）を用いて、糖類（スクロース、グルコース、フルクトース）を酵素的に測定した。
【００３０】
抽出及び分析：
凍結乾燥した細胞培養物の１ｇを、乳鉢で粉砕し、シーライト（ｃｅｌｉｔｅ）の１ｇと混合し、２つのフリット間の２５ミリリットルのプラスチックカラム中にパックした。ＭｅＯＨ−水（８０／２０の体積／体積）の５０ミリリットルを該カラム中のサンプルを通して吸引し、そして得た抽出物を０．４５μｍの精密濾過膜中に通して濾過し、その後にＨＰＬＣシステム中に注入した。カルス培養のために、継代培養のとき（１ヵ月）にイソフラボン含有量の第１評価を行った。実験は３回行った。培養時間全体を通じての評価のために、実験点毎に３つのペトリ皿に採取し、そして別々に分析した。細胞懸濁培養物についても実験点毎に、３ｘ２５０ミリリットル三角フラスコを用いて同じ方法に従った。
【００３１】
イソフラボン類の分析：
ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）１００−Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ  ｘ４．３ｍｍ、Ｎａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ７２００１４）を用いて、イソフラボン類のＨＰＬＣ分離を行った。（Ａ）純粋なアセトリトリル及び（Ｂ）水中の０．０５％燐酸から構成される線状勾配の溶離液を用いて室温で１．０ミリリットル／分の流速で溶離を行った。２０μリットルのサンプルの注入後、４０分間、溶媒（Ａ）を１０％から５０％に線状に増大させ、次ぎに３分間５０％から１００％に増大させ、そして５分間１００％に維持した。次の注入に進行する前に、カラムを再平衡化し、初期の条件で１０分間、作動させた。２５８ｎｍで光ダイオードアレイデテクターを用いて分析を監視し、ピーク確認のために２２０ｎｍ〜４００ｎｍで走査した。対照はフランスのＥｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅからのダイジン、ゲニスチン、ダイゼイン及びゲニステインであり、そしてマロニルダイジン及びマロニルゲニスチンは大豆抽出物から精製したものである。保持時間は、ダイジンについて１２分、ゲニスチンについて１５．７分、マロニルダイジンについて１６．３分、マロニルゲニスチンについて１９．７分、ダイゼインについて２１．４分、そしてゲニステインについて２６．８分であった。
【００３２】
カルス培養
図１は、継代培養時の４０の異なる株のコレクションにおいて観察されたイソフラボン含有量を起源である園芸品種ごとに示したものである。これらの株内で、０．１０ｍｇ／ｇ  ＤＷ（ｎ°１２８０７）から４６ｍｇ／ｇ（ｎ°１３４０６）まで、イソフラボン含有量の大きな変動性が観察される。各々の園芸品種について極、少数の株数しか使用していないので起源である品種の効果について結論づけることは不可能である。同じ品種からの種子のイソフラボン含有量は２．５ｍｇ／ｇより決して高くない。細胞培養物及び種子において、グルコシド−マロニル化複合体は常に主要な化合物であった。
【００３３】
懸濁培養
メープルアロー（Ｍａｐｌｅ  ａｒｒｏｗ）株１３４０６において観察されたイソフラボン含有量が驚くべきほど高いので、三角フラスコ及び１０リットルのバイオリアクター中の液体培地におけるイソフラボン類の蓄積をキャラクタライズする実験のためにこの株を選択した。カルスを液体培地に移し、それらをかき混ぜた以外は固体培地上での培養条件と同じ培養条件下に培養した。
【００３４】
細胞懸濁液は、μｍａｘ＝０．１５８／日で５００ｇ／リットル（新鮮重量）及び１４．５ｇ／リットル（乾燥重量）まで増殖した（図２）。低い接種密度（２５ｇ／リットル）の故に、誘導期は比較的に長く（３〜４日）、もし接種密度が５０ｇ／リットルなら、１〜２日に減少する。反応速度はＦＷ及びＤＷで類似している。しかしながら、乾燥物質含有量は規則的に減少し、培養時間につれて細胞がいっそう膨らむことを示している。このことは、イソフラボン類を蓄積するキャパシティに効果を有するかもしれない。初期のスクロースは、グルコースとフルクトースに規則的に加水分解され、グルコースは優先的に消費される。糖類が存在しなくなるときは、１５日目での増殖の定常状態の始まりに十分に対応しており、糖類が増殖に対する第１の限界因子の少なくとも１つであることを意味している。
【００３５】
イソフラボン類の分布（図３）：
誘導期に相当する培養の初期の日々及び増殖期の始まりの間に僅かな差を有する以外は、７０％のマロニル−ダイジン、２０％のマロニル−ゲニスチン、及び１０％の他の形態（主としてダイジン及びゲニスチン、そして極微量のダイゼイン及びゲニステイン）との比で安定している。これらの結果は、１３４０６株のカルス培養で得られた結果に非常に類似している（表１）。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
イソフラボン濃度（図４）：
カルス培養より高い７２ｍｇ／ｇまでのＤＷを得た。ＦＷに関連するイソフラボン類における濃度は、培養の４日後の増殖中にほんの２倍だけ増加した（０．８から１．６ｍｇ／ｇＦＷに）、それに対してＤＷに関連してイソフラボン類における濃度は６．５倍増加した（１１から７２ｍｇ／ｇＤＷに）。この最後の曲線はＦＷ曲線に平行である。蓄積速度は、１０日目から２５日目まで一定の５．３ｍｇ／ｇＤＷ／日である。イソフラボン類は増殖期の全体にわたって蓄積され細胞の体積によってそれらの最終濃度は調節される。
【００３８】
これらの含有量は、驚くべきことに、先行技術において発表された含有量より１０００倍まで高かった（例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  １３，３（１９９７）第３３６頁〜第３３９頁のＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄａｉｚｅｉｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｉｎ  ａ  ｍａｇｎｅｔｏｆｌｕｉｄｉｚｅｄ  ｂｅｄ  ｒｅａｃｔｏｒにおいてのＡｍｅｓ、等、（彼らは１０〜２００μｇ／ｇＤＷを得た））。
【００３９】
イソフラボン生成（図５）：
バイオマス単位当たりのイソフラボン含有量の増加は、総バイオマスの増加と組み合わさって、総イソフラボン類の８８０ｍｇ／リットルまで到達した。この蓄積は増殖期にわたって規則正しく、そして定常期中に明らかな分解は存在しない。
【００４０】
液体媒体中で高い生産性株（１３４０６）を今まで２年間研究したが、イソフラボン類を、蓄積するその能力に何ら減少はなかった。
したがって、グルコース−マロニル化複合体における特定のバランスを得ることができる。大豆の植物細胞培養によるイソフラボン類の特定の生産の目的において、本件の研究は、三角フラスコ（エルレンマイヤーフラスコ）及びバイオリアクターにおいて、高い含有量（７％ＤＷ）、高い濃度（８８０ｍｇ／リットル）及び生産力（６００ｍｇ／リットル・日）に到達することができることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】異なる大豆細胞株中のイソフラボンの総含有量を調べる実験の結果を示す。
【図２】本発明の細胞株の増殖の速度性を示す。
【図３】本発明に従う細胞株中のイソフラボン類の分布を示す。
【図４】本発明に従う細胞株中のイソフラボン類の生成を調べる実験の結果を示す。
【図５】本発明に従う細胞株中のイソフラボン類の生成を調べる実験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年5月14日(2004.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＳＭ１４８８３である、大豆植物細胞株。
【請求項２】
イソフラボン類に富む食品又は食物サプリメントの何れかを生産するための原料材料として請求項１に記載の大豆植物細胞株の使用。
【請求項３】
マロニルダイゼインに富む食品又は食物サプリメントの何れかを製造するための原料材料として請求項１に記載の大豆植物細胞株の使用。
【請求項４】
マロニルゲニステインに富む食品又は食物サプリメントのいずれかを製造するための原料材料として請求項１に記載の大豆植物細胞株の使用。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の大豆植物細胞株を原料材料として使用する、イソフラボン類の製造方法。
【請求項６】
細胞株をバイオリアクター中で培養する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抽出溶媒がＥｔＯＨ／水又はＭｅＯＨ／水の混合物である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
イソフラボン類を製造するための、請求項１に記載の大豆植物細胞株の使用。
【国際調査報告】
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