(57)【要約】  本発明によって、ナチュラルキラー細胞及び／又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団を、生物応答修飾剤及び増殖能を奪う処理が施された細胞の存在下で拡大培養する工程を包含することを特徴とする、ナチュラルキラー細胞を含有する細胞集団の製造方法などが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラー細胞及び／又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団を、生物応答修飾剤及び増殖能を奪う処理が施された細胞の存在下で拡大培養する工程を包含することを特徴とする、ナチュラルキラー細胞を含有する細胞集団の製造方法。
【請求項２】
生物応答修飾剤が細菌由来製剤である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
生物応答修飾剤が、ＯＫ−４３２、ＢＣＧ、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ及びこれらの細胞壁骨格からなる群より選択される細菌由来製剤である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
増殖能を奪う処理が施された細胞が、末梢血単核球細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット及びＢ細胞からなる群より選択される細胞に増殖能を奪う処理を施したものである、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
増殖能を奪う処理が施された細胞が、人為的に拡大培養されたＴ細胞に増殖能を奪う処理を施したものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
増殖能を奪う処理が施された細胞が、ナチュラルキラー細胞又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞と同一の個体に由来する細胞である、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
増殖能を奪う処理が施された細胞の存在下で拡大培養する工程において、当該細胞を添加することを複数回実施することを特徴とする、請求項１〜６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ナチュラルキラー細胞及び／又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞として末梢血単核球細胞が使用される、請求項１〜６いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか１項に記載の方法により得られる細胞集団。
【請求項１０】
請求項９記載の細胞集団を含有する医薬。
【請求項１１】
疾患の治療に用いるための請求項９記載の細胞集団。
【請求項１２】
有効量の請求項９記載の細胞集団を対象に投与する工程を含む、疾患の治療方法又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において有用な高純度ナチュラルキラー細胞集団を取得する方法に関する。
なお、本願は、２００９年９月１１日出願の日本国特許出願第２００９−２１０１７８号に対して優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２００９−２１０１７８号の全内容を本願に組み込むものである。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、免疫反応の一翼を担うリンパ球系の細胞である。この細胞には様々な機能があるが、特に腫瘍細胞を殺す強い活性があることから、体内では腫瘍化した、あるいは腫瘍化しつつある異常な細胞を取り除く免疫監視機構の重要メンバーであると考えられている。したがって、この細胞を腫瘍治療に有効利用しようという研究は古くから行われていた。【０００３】
例えば、リンホカインの一種であるインターロイキン（ＩＬ）−２を大量に培養液に添加し、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を培養すると、ヒトの場合には１週間前後でいわゆるリンホカイン活性化キラーリンパ球（ＬＡＫ細胞）が増殖してくるが、この中にはＮＫ細胞が多く含まれていることはよく知られている。ＬＡＫ細胞は腫瘍の養子免疫療法に広く使用されている。また、ＬＡＫ細胞は感染症にも有効であることが知られており、抗生物質では治しにくい感染症対策として注目されている。【０００４】
これまで、生体外でのＮＫ細胞の培養方法が数多く報告されていて（例えば非特許文献１）、補助細胞（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｃｅｌｌ）を使用する方法と使用しない方法に分けられる。補助細胞を使用しない方法は、例えばＰＢＭＣをＩＬ−２又はＩＬ−１５などにより刺激する方法である。しかし、この方法は多くの場合拡大培養率及び培養後のＮＫ細胞含有率が低く、ＰＢＭＣのドナーにより治療に必要なＮＫ細胞を得られないことがある。さらに、大量のＮＫ細胞を得るために培養期間を延長すると、細胞傷害活性が低下することが報告されている。【０００５】
一方、補助細胞を使用する方法は、例えばＢリンパ腫細胞株であるＫ５６２細胞、悪性リンパ腫細胞株であるＤａｕｄｉ細胞、Ｗｉｌｍｓ腫瘍細胞株であるＨＦＷＴ細胞などに放射性線照射を施したものを使用する方法である。さらにこれらの腫瘍細胞にサイトカイン発現遺伝子を導入した補助細胞を使用する方法も報告されている。しかし、これらの補助細胞は腫瘍細胞であること、非自己の細胞であること、及び遺伝子導入細胞であることから、補助細胞と混合培養したＮＫ細胞を生体に注入することを考えると、安全性の確保に多くの注意を必要とする。また、放射線照射したＰＢＭＣを補助細胞として使用する方法も報告されている（特許文献１）。しかし、この方法はＮＫ細胞を含有する細胞集団としてＣＤ３陽性細胞を除去する工程を必要とし、さらにドナーから大量のＰＢＭＣを調製する必要がある。この方法の拡大培養率は、培養開始後２２日で最大約１４０倍である。【０００６】
また、がんの免疫療法において、生体の免疫機構を調節し、種々の疾患に対する治療効果が期待される物質である生物応答修飾剤が用いられている。しかし、これら薬剤は期待されたほどリンパ球機能を活性化しないことが知られている。このためリンパ球機能の活性化を必要としている患者にそれらを直接投与して同機能を活性化させるような治療は一般的には行われておらず、限られた症例に対してのみ使用されているのが現状である。その作用機序は、腫瘍細胞に対して直接的な作用を行うのではなく、生物応答修飾剤を投与する生体固有の免疫細胞を活性化し、免疫細胞の作用を介して抗腫瘍効果を発揮すると考えられている。したがって、生物応答修飾剤の投与による効果は、その投与を受けた生体の本来有する免疫状態に大きく左右され、生体の背景因子の影響を受け、抗腫瘍効果の個体差、及び患者の臨床状態による作用の強度に差が認められやすいと言われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００７／１０３９０１号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈｏ  Ｄ及びＣａｍｐａｎａ  Ｄ、Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ、２００９年、第２９巻、第８９−９６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
高い治療効果が期待されるＮＫ細胞について、高純度のＮＫ細胞を効率よく取得する方法は確立されていないのが現状である。したがって、ＮＫ細胞の製造のために、更なる細胞増殖方法の開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、リンパ球の培養、特に拡大培養の諸条件について鋭意検討を重ねた結果、ＮＫ細胞の効率のよい拡大培養方法を見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明は、
［１］ナチュラルキラー細胞及び／又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団を、生物応答修飾剤及び増殖能を奪う処理が施された細胞の存在下で拡大培養する工程を包含することを特徴とする、ナチュラルキラー細胞を含有する細胞集団の製造方法、
［２］生物応答修飾剤が細菌由来製剤である、［１］記載の方法、
［３］生物応答修飾剤が、ＯＫ−４３２、ＢＣＧ、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ及びこれらの細胞壁骨格からなる群より選択される細菌由来製剤である、［２］記載の方法、
［４］増殖能を奪う処理が施された細胞が、末梢血単核球細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット及びＢ細胞からなる群より選択される細胞に増殖能を奪う処理を施したものである、［１］〜［３］いずれか記載の方法、
［５］増殖能を奪う処理が施された細胞が、人為的に拡大培養されたＴ細胞に増殖能を奪う処理を施したものである、［４］記載の方法、
［６］増殖能を奪う処理が施された細胞が、ナチュラルキラー細胞又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞と同一の個体に由来する細胞である、［１］〜［５］いずれか記載の方法、
［７］増殖能を奪う処理が施された細胞の存在下で拡大培養する工程において、当該細胞を添加することを複数回実施することを特徴とする、［１］〜［６］いずれか記載の方法、
［８］ナチュラルキラー細胞及び／又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞として末梢血単核球細胞が使用される、請求項［１］〜［６］いずれか記載の方法、
［９］［１］〜［８］いずれか記載の方法により得られる細胞集団、
［１０］［９］記載の細胞集団より分離されるＮＫ細胞を含有する細胞亜集団、
［１１］［９］記載の細胞集団及び／又は［１０］記載の細胞亜集団を含有する医薬、
［１２］医薬の製造のための、［９］記載の細胞集団及び/又は［１０］記載の細胞亜集団の使用、
［１３］有効量の［９］記載の細胞集団及び/又は［１０］記載の細胞亜集団を対象に投与する工程を含む、疾患の治療方法又は予防方法、
［１４］［９］記載の細胞集団及び／又は［１０］記載の細胞亜集団を凍結し、凍結した細胞集団及び／又は細胞亜集団を解凍後、サイトカイン存在下で培養する工程を包含するナチュラルキラー細胞を含有する細胞集団及び／又は細胞亜集団の製造方法、ならびに
［１５］ナチュラルキラー細胞及び／又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞を含有する単離及び／又は純化した細胞集団を、生物応答修飾剤の存在下で拡大培養する工程を包含することを特徴とする、ナチュラルキラー細胞を含有する細胞集団の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、新規なＮＫ細胞の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高く、強い細胞傷害活性を示す細胞を得られることから、本発明により得られるＮＫ細胞は、例えば、養子免疫療法に好適に使用することが可能である。したがって、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において「ＮＫ細胞」とは、抗原感作なしにＭＨＣ非拘束性に腫瘍細胞、ウイルス感染細胞などを傷害し、生体の恒常性維持のために働く大型顆粒リンパ球を含む細胞集団を意味する。代表的な表面マーカーとして、ＣＤ５６、ＣＤ９４及びＣＤ１６が知られている。また、ＣＤ３に関して陰性である。
【００１４】
本明細書において「末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）」とは、末梢血由来のリンパ球及び単球を含む細胞集団を意味し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などを含む。
【００１５】
本明細書において「フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、分子内にフィブロネクチン由来のアミノ酸配列、もしくはその一部を含有するポリペプチドを意味し、フィブロネクチン又はフィブロネクチンのフラグメントが例示される。フィブロネクチン又はフィブロネクチンのフラグメントは、天然由来の単離されたポリペプチド、人為的に合成されたポリペプチド、又は遺伝子工学的に調製された組換えポリペプチドのいずれでもよい。フィブロネクチンは、例えば、ルオスラーティ  Ｅ．ら〔Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２５６巻、第１４号、第７２７７〜７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。ここで、本発明に使用されるフィブロネクチン、又はフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を実質的に含有していない。上記のポリペプチドは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して本発明に使用することができる。
【００１６】
なお、フィブロネクチンには多くのスプライシングバリアントの存在が知られているが、本発明に使用されるポリペプチドは、本発明の所望の効果を発現するものであれば、いずれのバリアント由来のアミノ酸配列を有するものであってもよい。例えば、血漿由来のフィブロネクチンの場合、細胞結合ドメインの上流に存在するＥＤ−Ｂと呼ばれる領域、及び細胞結合ドメインとヘパリン結合ドメインとの間に存在するＥＤ−Ａと呼ばれる領域が欠失していることが知られているが、このような血漿由来のフィブロネクチンのアミノ酸配列を有するものも本発明に使用することができる。
【００１７】
本発明に使用できるフィブロネクチン  フラグメント、ならびに該フラグメントの調製に関する有用な情報は、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、第２８４〜２９１頁（１９９１）、ＥＭＢＯ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第４巻、第７号、第１７５５〜１７５９頁（１９８５）、及びバイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、第４９３６〜４９４１頁（１９８６）、国際公開第２００７／１４２３００号パンフレット等より得ることができる。また、フィブロネクチンをコードする核酸配列及びフィブロネクチンのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７にて開示されている。
【００１８】
フィブロネクチンのドメイン構造は７つに分けられており、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれている。これらの各配列の繰り返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列は、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型とそれぞれ呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型は７１〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７〜４０％である。フィブロネクチン中には１４個のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目及び１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９及びＩＩＩ−１０と称する）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目及び１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３及びＩＩＩ−１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側に、ＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには、２５アミノ酸からなるＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する。本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメントは、ＩＩＩ−７、８、９、１１、１２、１３又はＣＳ−１のいずれかのドメインを含むフラグメントであればよく、さらに複数のドメインが繰り返し連結されたフラグメントであってもよい。例えば、ＶＬＡ−５へのリガンドを含む細胞接着ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、ＶＬＡ−４へのリガンドであるＣＳ−１ドメイン等を含有するフラグメントが本発明に使用される。前記フラグメントとしては、例えば、前記のＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１１０巻、２８４〜２９１頁（１９９１）に記載されたＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、ならびにこれらの誘導体や改変物が例示される。前記のＣＨ−２９６はレトロネクチン（登録商標）の名称で市販されている。
【００１９】
本明細書において「生物応答修飾剤」とは、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ（ＢＲＭ）とも呼ばれる、生体において非特異的な免疫応答能を向上される一群の物質を意味する。生物応答修飾剤には細菌由来製剤［ＯＫ−４３２、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ及びこれらの細胞壁骨格］や担子菌由来多糖（レンチナン、シゾフィラン、ＰＳＫ等）、合成物質（ピランコポリマー、レバミゾール等）、サイトカイン類が知られている。「ＯＫ−４３２」とは、Ａ群３型溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の弱毒性自然変異株（Ｓｕ株）をペニシリンで処理した細菌由来製剤の一般名を意味する。本製剤はピシバニール（登録商標）の商品名で市販されている。
以下、本発明を具体的に説明する。
【００２０】
本明細書において「増殖能を奪う処理」とは、細胞の増殖能を喪失させるか、もしくは低下させる処理であれば特に限定はなく、例えば、化学的処理及び／又は物理的処理により実施することができる。前記の化学的処理としては、例えば化学薬剤（ホルマリン等）又は抗癌剤（有糸分裂インヒビター、例えばマイトマイシンＣ等）による処理が例示される。また、前記の物理的処理として、放射線、温熱（加熱・加温）、凍結・解凍又は超音波による処理が例示される。例えば、放射線の照射により前記の処理を実施する場合、例えば、γ線やＸ線が使用され得る。
増殖能を奪う処理が施された細胞は、細胞分裂、ＤＮＡ合成といった増殖に関わる能力を失ったか、あるいは当該能力が低下した細胞であるため、処理しない細胞と比較して増殖能が低下している。例えば、放射線処理を行った細胞は、増殖能が低下しているが、処理直後は生細胞と同様の形態及び形質を示し、サイトカイン等のタンパク質を分泌する代謝能を維持している。
【００２１】
１．ＮＫ細胞の製造方法
本発明のＮＫ細胞の製造方法は、ＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団を、生物応答修飾剤及び増殖能を奪う処理が施された細胞の存在下で拡大培養する工程を包含することを特徴とする方法である。本発明のＮＫ細胞の製造方法によれば、従来の方法に比べて、拡大培養率、ＮＫ細胞の含有率、及びＮＫ細胞が有する細胞傷害活性が極めて高い細胞集団を安定して調製することが可能である。ここで拡大培養率とは、培養開始時と比較しての増殖倍率を意味し、培養開始時の細胞数で培養終了時の細胞数を除し、さらに継代時に継代に使用した細胞数の割合で除して算出した倍率である。
【００２２】
本発明の方法の特徴の一つとして、増殖能を奪う処理が施された細胞の使用が挙げられる。増殖能を奪う処理を施す細胞に特に限定はない。本発明の好適な態様においては、ＰＢＭＣ、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット（例えばＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞等）、Ｂ細胞又はこれらの細胞を培養して調製される細胞集団が使用される。
【００２３】
ＰＢＭＣの製造方法に特に限定はない。血液もしくは血液から血漿を分離して得られる血球成分から公知の方法、例えば、密度勾配遠心分離法により製造することができる。Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＴ細胞サブセットは、ＰＢＭＣ又はその他の生体試料（末梢血、骨髄液、臍帯血等）から公知の方法で分離することができる。さらに、前記の細胞を培養して細胞数を増やすことにより得られる細胞集団も、本発明に使用することができる。例えば、Ｔ細胞もしくはＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を拡大培養操作に供して得られるＴ細胞集団が例示される。前記のＴ細胞集団の調製の際に、前出のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドをさらに共存させておくことにより、Ｔ細胞の増殖効率が向上する。すなわち、少量の材料（血液又はＰＢＭＣ）から大量のＴ細胞を取得することができる。
【００２４】
前記の、フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド共存下でのＴ細胞の拡大培養は、下記のように実施される。
フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下で培養する細胞集団は、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団であればよく、末梢血、骨髄液、臍帯血、リンパ液などの体液を使用することができる。またこれらの体液、各臓器又は器官から分離した細胞集団、例えば、ＰＢＭＣ、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット又はこれらの混合物が使用できる。なお、治療を目的として生体に移植されるＮＫ細胞を調製する際には、これらの細胞又は細胞集団は、後述の「ＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化し得る細胞」と同一の個体、すなわち同一のドナー由来のものとすることができる。特に好適には、「ＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化し得る細胞」と「増殖能を奪う処理が施された細胞」はともに患者自身に由来するものであることが望ましい。
【００２５】
フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下での細胞集団の培養は、国際公開第０３／０８０８１７号パンフレットに詳細に記載されており、これを参照して実施することができる。フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下での細胞集団の培養は、極めて拡大培養率が高く、大量の細胞を容易に調製することができる。
【００２６】
前記のＴ細胞拡大培養における培養開始時の細胞濃度としては、特に限定はないが、例えば、１〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１０〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１×１０２〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
【００２７】
前記のＴ細胞拡大培養に使用される培地としては、細胞培養に使用される公知の培地を使用すればよく、各種サイトカイン類、適当なタンパク質又はその他の成分をさらに含んでいてもよい。サイトカイン類としては、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ等が例示される。好適には、ＩＬ−２を含有する培地が使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度に特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ、より好適には１〜１×１０４Ｕ／ｍＬであってもよい。また、適当なタンパク質としては、例えば、抗ＣＤ３抗体又は抗ＩＬ−４抗体が例示される。本発明に使用される抗ＣＤ３抗体としては、特に本発明を限定するものではないが、好適には抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体、より好適にはＯＫＴ３［Ｓｃｉｅｎｃｅ（サイエンス）、１９７９年、第２０６巻、第３４７〜３４９頁］が例示される。また、レクチン等のリンパ球刺激因子を添加することもできる。さらに、パミドロネート、ゾレドロネートなどのビスホスフォン酸系の化合物、イソペンテニルピロリン酸、２−メチル−３−ブテニル−１−ピロリン酸などのピロリン酸モノエステル系化合物、ホスホハロヒドリン類、ホスホエポキシド類等を含む培地を使用してもよい。当該成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば、特に限定されるものではない。
【００２８】
さらに、培地中に血清又は血漿を添加することもできる。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０超〜２０容量％、好ましくは０超〜１０容量％である。例えば、自己由来の血清又は血漿を使用することができる。
【００２９】
培養に使用される細胞培養器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、例えば、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量のリンパ球を製造する場合には、バイオリアクターの使用が有利である。また、培養は開放系又は閉鎖系のいずれでも実施することができるが、得られるリンパ球の安全性の観点から、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
【００３０】
培養は、公知の培養条件で行ってもよく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈したり、培地を新鮮なものに交換したり、又は細胞培養器材を交換することができる。使用される培地、同時に使用されるその他の成分等は、後述のとおり、製造するリンパ球の種類に応じて適宜設定することができる。培養期間は、例えば１〜４０日、好適には２〜３５日、より好適には３〜３０日であることが好ましく、より高い拡大培養率を実現する観点から、３〜２５日の培養期間が好ましい。
【００３１】
前記の培養において使用されるフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドをはじめとする成分は、培地中に溶解して共存してもよく、適切な固相、例えば、細胞培養器材、ビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化してもよい。例えば、抗ＣＤ３抗体の固定化は国際公開第９７／１８３１８号パンフレットに記載の方法に従って、フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの固定化は国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載の方法に従って実施することができる。
【００３２】
増殖能を奪う処理には、抗がん剤、例えば、マイトマイシンＣを使用することができる。抗がん剤処理の条件は、処理された細胞の増殖能が失われるか、もしくは低下する処理条件であれば特に限定はない。マイトマイシンＣの濃度は、例えば、１〜１００μｇ／ｍＬ、好ましくは２〜５０μｇ／ｍＬ、好適には５〜３０μｇ／ｍＬである。処理温度は、例えば、３０〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃である。処理時間は、例えば、０．１〜２時間、好ましくは０．５〜１時間である。
【００３３】
また、γ線又はＸ線といった放射線の照射により増殖能を奪う処理を実施する場合、放射線の照射量は照射された細胞の増殖能が失われる量であれば特に限定はないが、例えば、１００〜２００００Ｒ（０．８８〜１７６Ｇｙ）、好ましくは１０００〜８０００Ｒ（８．８〜７０Ｇｙ）である。
また、温熱処理により増殖能を奪う処理を実施する場合、処理温度及び処理時間は細胞の増殖能が失われる量であれば特に限定はないが、例えば、４０〜５５℃、好ましくは４２〜５０℃で、例えば、０．１〜８時間、好ましくは０．２〜４時間である。
【００３４】
ＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団の培養において、増殖能を奪う処理が施された細胞の細胞濃度としては、特に限定はないが、例えば、１〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１×１０１〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１×１０２〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
【００３５】
本発明の方法は、ＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団を、生物応答修飾剤及び増殖能を奪う処理が施された細胞の存在下で拡大培養することを特徴とする。
【００３６】
本発明には、ＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団が使用される。ここで、ＮＫ細胞に分化し得る細胞とは、当該細胞に分化する能力を有している細胞であればよく、特に限定はない。当該細胞集団として、末梢血、骨髄液、臍帯血、リンパ液などの体液、あるいはこれらの体液、各臓器又は器官から分離した細胞集団（例えばＰＢＭＣ、臍帯血単核球、骨髄細胞、造血幹細胞等）を本発明に使用することができる。前記細胞又は細胞集団として、生体から採取されたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。さらに、前記の細胞集団から種々の誘導操作又は分離操作を経て得られた細胞集団、例えば、ＰＢＭＣ等から特定の細胞表面マーカーに基づいて分離された細胞のサブセット、例えば、単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）ＮＫ細胞集団又はＣＤ３陽性細胞を除去した細胞集団を本発明に使用することもできる。また、純化した（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）ＮＫ細胞集団又はＮＫ細胞株を本発明に使用することができる。本発明の方法は、例えば、ＮＫ細胞の含有率が低いＰＢＭＣから直接培養を始めても、ＮＫ細胞含有率が高く、かつ細胞傷害活性が強い細胞集団を効率よく得ることができることに特徴がある。
【００３７】
本発明の方法におけるＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団の培養期間は、例えば、３〜４０日、好適には５〜３５日、より好適には１０〜３０日が好ましく、より高い拡大培養率を実現する観点から、１４〜２５日の培養期間が好ましい。
また、ＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団の培養において、ＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化し得る細胞濃度に特に限定はないが、例えば、１〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１×１０１〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１×１０２〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。当該細胞集団と増殖能を奪う処理が施された細胞集団の細胞数の比は、特に限定はないが、例えば、１：０．１〜２０、好適には１：１〜１０である。
【００３８】
増殖能を奪う処理が施された細胞集団は、ＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団の培養開始時に培地に添加される。さらに、培養開始時以外に、培養の途中で、例えば、１回、２回又は３回添加し、培養開始時に加えて複数回添加することにより、ＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団を刺激し、拡大培養率をさらに向上させることができる。特に限定はされないが、例えば、ＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団の培養開始後、５〜９日目の間の好適な時期及び／又は１１〜１５日目の間の好適な時期に増殖能を奪う処理が施された細胞を再添加してもよい。また、増殖能を奪う処理が施された細胞集団は、使用するまで適当な方法により凍結保管してもよい。
【００３９】
本発明の方法のもう一つの特徴である生物応答修飾剤は、所望のＮＫ細胞増殖誘導活性を有するものであれば特に限定はない。好適な態様において、本発明には微生物由来製剤である生物応答修飾剤が使用され、特に好適にはＯＫ−４３２、ＢＣＧ、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ又はこれらの細胞壁骨格が使用される。
【００４０】
培地への生物応答修飾剤の添加量に特に限定はなく、拡大培養に供される細胞及び併用される増殖能を奪う処理が施された細胞集団の使用量に応じて、適切な量を選択すればよい。特に本発明を限定するものではないが、ＯＫ−４３２を使用する場合、０．００１〜１ＫＥ／ｍＬ、好ましくは０．００５〜０．５ＫＥ／ｍＬ、さらに好ましくは０．０１〜０．２ＫＥ／ｍＬの終濃度でＯＫ−４３２が培地に添加される。通常、生物応答修飾剤は、培養開始時に培地に添加され得る。
【００４１】
本発明の製造方法に使用される培地について、生物応答修飾剤及び増殖能を奪う処理が施された細胞の使用を除いて特に限定はなく、リンパ球の培養に適した公知の培地を使用することができる。例えば、ＮＫ細胞培養用として市販されている培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社のＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ、タカラバイオ社のＧＴ−Ｔ５０２等）を使用してもよい。また、本発明の有効成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類又はその他の成分を含んでいてもよい。好適には、ＩＬ−２を含有する培地が本発明に使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度は、特に限定はないが、例えば、０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ、好適には０．１〜１×１０４Ｕ／ｍＬである。
【００４２】
培地中に血清又は血漿を添加してもよい。これらの培地中への添加量は、特に限定はないが、０超〜２０容量％、好ましくは０超〜５容量％である。製造されたＮＫ細胞を含有する細胞集団又は当該細胞集団から分離された細胞亜集団が生体に移入される場合、ＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化し得る細胞と由来を同じとする（すなわち、同一個体由来の）血清又は血漿を使用することが好ましい。また、血液由来タンパク質、例えば、血清アルブミンを培地に添加してもよい。この場合、単離された血液由来タンパク質、すなわち血液由来の他の成分を実質的に含有しない血液由来タンパク質が好適に使用される。また、入手可能な組換え血液由来タンパク質を使用してもよい。
【００４３】
本発明の製造方法における培養の過程で、適当な時間間隔もしくは細胞数の増加に応じて、細胞培養液の希釈、培地の交換もしくは細胞培養器材の交換を行っても良い。
【００４４】
この他、本発明の製造方法は、ＮＫ細胞又はＬＡＫ細胞を培養するための一般的な条件等に準じて実施することもできる。例えば、Ｋｌｉｎ  Ｐａｄｉａｔｒ、２００５年、第２１７巻、第３４５〜３５０頁；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９８２年、第１５５巻、第１８２３〜１８４１頁；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、補遺１７、ＵＮＩＴ７．７に従えばよい。
【００４５】
本発明は、ナチュラルキラー細胞及び／又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞を含有する単離及び／又は純化した細胞集団を、生物応答修飾剤の存在下で拡大培養する工程を包含することを特徴とする、ナチュラルキラー細胞を含有する細胞集団の製造方法をさらに提供する。例えば、純化されたＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞をＯＫ−４３２の存在下で培養するナチュラルキラー細胞を含有する細胞集団の製造方法が提供される。この製造方法において、増殖能を奪う処理が施された細胞の存在下で培養することにより、ナチュラルキラー細胞を含有する細胞集団の拡大培養率が向上する。
【００４６】
２．本発明の製造方法により得られるＮＫ細胞を含有する細胞集団、当該細胞集団を含有する医薬、当該細胞集団の使用、ならびに当該細胞集団を用いた治療方法又は予防方法
さらに、本発明は、上記本発明のＮＫ細胞の製造方法で得られたＮＫ細胞を含有する細胞集団及び前記細胞集団から分離された細胞亜集団を提供する。また、本発明は、当該細胞集団及び／又は細胞亜集団を有効成分として含有する医薬（治療剤）、当該細胞集団及び／又は細胞亜集団の医薬の製造のための使用、ならびに有効量の当該細胞集団及び／又は細胞亜集団を対象に投与する工程を含む疾患の治療方法又は予防方法を提供する。
【００４７】
本発明の製造方法により得られるＮＫ細胞を含有する細胞集団及び／又は細胞亜集団（以下、単に本発明の細胞集団と記載する）は、従来の方法により得られる細胞集団と比べて、ＮＫ細胞の含有率、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を含む細胞傷害活性、及びマルチファンクション能が極めて高い細胞集団である。特に、本発明の細胞集団では、ＮＫ細胞の表面マーカーであるＣＤ３陰性かつＣＤ５６陽性の細胞が少なくとも５０％以上を占める。また、本発明の細胞集団は、細胞傷害活性の高いＣＤ１６及びＣＤ５６が陽性である細胞を多く含み、細胞集団の少なくとも５０％、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上がＣＤ１６陽性かつＣＤ５６陽性の細胞である。さらに、本発明の細胞集団は、成熟したＮＫ細胞であるＣＤ９４及びＣＤ５６が陽性である細胞を多く含み、細胞集団の少なくとも５０％、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上がＣＤ９４陽性かつＣＤ５６陽性の細胞である。また、本発明の細胞集団は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性に関与していると言われるＮＫｐ４４及びＮＫＧ２Ｄ、ＮＫ細胞共通の表面抗原マーカーであるＮＫｐ４６、活性化ＮＫ細胞で発現するＣＤ２５、リンパ球のホーミングに関与するＣＤ６２Ｌ、ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＡＩＭ）としても知られ、白血球の活性化初期に表出され、ＮＫ細胞では標的細胞融解作用に関与するＣＤ６９、あるいはケモカインであるＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０のリガンドであり、これらのケモカイン発現がん細胞への高い遊走能や集積能を示すと考えられるＣＸＣＲ３を発現する細胞を多く含む、高機能性ＮＫ細胞集団である。
ＮＫ細胞のマルチファンクション能は、一般に、インターフェロン（ＩＦＮ）−γもしくは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αなどのサイトカインの産生、又はＣＤ１０７ａなどの細胞表面抗原により細胞集団の免疫応答を評価することが可能である。本発明で製造されるＮＫ細胞を含有する細胞集団は、複数のサイトカイン産生又は細胞表面抗原を示す細胞を高含有し、マルチファンクション能を有するマルチファンクション性細胞集団として細胞免疫療法において極めて有用である。
また本発明の細胞集団を適当なサイトカイン、例えばインターフェロンα（ＩＦＮ−α）と共存させることにより、その細胞傷害性を増強させることができ、当該処理された細胞集団は、さまざまながん細胞に対して細胞傷害性を発揮することが可能になる。
本発明の細胞集団に遺伝子を導入してもよい。例えば、標的物質に対する親和性タンパク質［例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体、レセプターなど］、細胞表面抗原、酵素、シグナル伝達分子（例えば、サイトカイン）、これらの機能的ドメイン（例えば、抗体又はＴＣＲの可変領域、一本鎖抗体、レセプターのシグナル伝達ドメイン）、又はこれらの機能的ドメインを有するキメラタンパク質をコードする遺伝子を導入してもよい。なお、遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、又は該ベクターを使用しない方法のいずれも本発明に使用できる。それらの方法の詳細については、既に多くの文献が公表されている。
【００４８】
本発明の細胞集団は、凍結保存してもよい。本発明の細胞集団の凍結・解凍を行う場合、解凍後の細胞集団を再培養することにより、凍結する前の細胞傷害活性を保持した細胞に復帰させることができる。当該細胞集団の培養は、例えば、１日（一晩）行えばよい。再培養時に適当なサイトカイン、例えば、ＩＬ−２を共存させることによりその細胞傷害能を更に増強することができる。
【００４９】
本発明のＮＫ細胞を含有する細胞集団から分離される細胞亜集団としては、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＸＣＲ３及びＣＤ９４からなる群より選択される少なくとも１つのＮＫ細胞の表面マーカーを指標としてＮＫ細胞から分離した細胞亜集団が挙げられる。
【００５０】
本発明の細胞集団を含有する医薬（治療剤）は、養子免疫療法への使用に適している。養子免疫療法において、患者の治療に適した本発明の細胞集団は、例えば、経静脈的に患者に投与される。当該医薬は、後述の疾患及びドナーリンパ球輸注での使用において非常に有用である。当該医薬は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の細胞集団を有効成分として、公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより調製できる。なお、医薬における本発明の細胞集団の含有量、医薬の投与量及び当該医薬に関する諸条件は、公知の養子免疫療法に従って適宜決定でき、特に限定はないが、例えば、本発明の細胞集団を成人一日あたり、好適には１×１０５〜１×１０１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは５×１０５〜５×１０１１ｃｅｌｌｓ／日、さらに好ましくは１×１０６〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／日投与することが例示される。通常、ＮＫ細胞を含む細胞集団は、注射、点滴などにより静脈、動脈、皮下、腹腔、腫瘍内等へ投与される。
【００５１】
本発明の医薬の投与において、特に限定はないが、例えば、治療しようとする疾病に対してワクチンとして機能しうる成分と一緒に投与することもできる。例えば、がんの治療に際して、腫瘍抗原、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、人為的操作により増殖能を失った腫瘍組織由来の細胞、腫瘍組織からの抽出物などを投与することもできる。また、当該医薬の投与において、リンパ球刺激因子、例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β等）、ケモカイン等を適宜投与することもできる。本発明の医薬は、これらのリンパ球刺激因子によって処理した本発明の細胞集団を有効成分として含有するものであってもよい。なお、本願明細書において、リンパ球刺激因子はリンパ球増殖因子を包含する。
【００５２】
本発明の細胞集団が投与される疾患として、特に限定はないが、例えば、癌、白血病等の悪性腫瘍疾患、肝炎、インフルエンザ、ＨＩＶ等のウイルス、細菌又は真菌が原因となる感染性疾患（例えば、結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ又は深在性真菌症）が例示される。また、本発明の方法により製造されるＮＫ細胞を含有する細胞集団は、骨髄移植又は放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注、抗がん剤治療、放射線治療、抗体療法、温熱療法、他の免疫療法等といった従来の治療法と組み合わせて利用できる。
【００５３】
本発明の細胞集団の医薬の製造における使用、例えばがん性疾患や感染性疾患治療用の医薬の製造における使用も本発明に包含される。
また、疾患の治療に用いるための本発明の細胞集団も本発明に包含される。
【００５４】
また、本発明の別の態様として、前記医薬を用いた疾患の治療方法が提供される。当該疾患の治療方法は、本発明の細胞集団を用いることを特徴とし、当該医薬の投与の諸条件については、公知の養子免疫療法又は前述の医薬の投与の開示に従って実施できる。
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例】
【００５５】
実施例１  ＯＫ−４３２及びＡｕｔｏｌｏｇｏｕｓ−Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ（ＡＩＣ）を用いたＮＫ細胞培養
（１）ＰＢＭＣの分離及び保存
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーにおいて、成分採血を実施した（ここでいう成分採血とは、単核球採取を目的とした採血である）。得られた成分採血液をダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製又は日水製薬社製；以下、ＤＰＢＳと記載する）又は１％ヒト血清アルブミン（製剤名  ブミネート：バクスター社製、以下、ＨＳＡと記載する）を含む生理食塩水（以下、１％ＨＳＡ／生理食塩水と記載する）で約２倍希釈した後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ又はＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（いずれもＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）１５ｍＬの上に希釈した成分採血液を３０ｍＬずつそれぞれ重層して、７００×ｇ、室温で２０分間遠心した。遠心後、分離した層のうち、ＰＢＭＣ層をピペットで回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地又は１％ＨＳＡ／生理食塩水を用いて４５ｍＬにフィルアップした後、６５０×ｇ、４℃にて１０分間遠心し、上清を除去した。同様に、６００×ｇ、５００×ｇと段階的に遠心Ｇを落としながら順次遠心操作を行い、計３回洗浄を繰り返し、ＰＢＭＣを採取した。【００５６】
採取したＰＢＭＣは８％ＨＳＡを含むＣＰ−１（極東製薬社製）とＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製、シグマ社製又は和光純薬社製）との等量混合液からなる保存液（以下、ＣＰ１／ＨＳＡと記載する）に懸濁し、液体窒素中にて保存した。ＮＫ細胞拡大培養時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速解凍し、１０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ（カルビオケム社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地又は０．５％ヒトＡＢ型血清（Ｌｏｎｚａ社製）を含むＧＴ−Ｔ５５１（タカラバイオ社製；以下、０．５ＨＧＴ−Ｔ５５１と記載する）で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。【００５７】
（２）ＰＢＭＣ  ＡＩＣの調製
実施例１−（１）で調製した必要量のＰＢＭＣを５％ヒトＡＢ型血清、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ  ｍｉｘｔｕｒｅ、１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＬｏｎｚａ社製）、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコＢＲＬ社製）又は１００μｇ／ｍＬ  硫酸ストレプトマイシン（明治製菓社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下、５ＨＲＰＭＩと記載する）に懸濁後、Ｘ線照射装置を使用し３４００Ｒ（２９．８Ｇｙ）のＸ線を照射した（このＸ線照射後の細胞を以下、ＰＢＭＣ  ＡＩＣと記載する）。調製したＰＢＭＣ  ＡＩＣを２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩに懸濁した。【００５８】
（３）ＮＫ細胞の拡大培養
５ＨＲＰＭＩに２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ  ＡＩＣと同一ドナー由来）を懸濁後、Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞とした。２４穴細胞培養プレート（ベクトン  ディッキンソン社製又はコーニング社製）に、上記Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞及びＰＢＭＣ  ＡＩＣを０．５ｍＬ／ウェルずつ添加し、計１ｍＬ／ウェルとした（ＡＩＣ刺激群）。この際、ＰＢＭＣ  ＡＩＣを添加しない群（ＡＩＣ非刺激群）を作製した。
各ウェルにＯＫ−４３２（製剤名  ピシバニール：中外製薬社製）を終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬとなるように添加した。全てのウェルに終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２（製剤名  プロロイキン：カイロン社製又はノバルティス社製）を添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養を開始した（培養０日目）。２日目には、各ウェルに５ＨＲＰＭＩを１ｍＬずつ添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。【００５９】
４日目には、各ウェルに終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。７日目、９日目には各ウェルの細胞液を、５ＨＲＰＭＩを用いてそれぞれ３倍希釈し、各ウェルに終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した後、新しい２４穴細胞培養プレートに希釈した細胞液２ｍＬを移した。培養開始１１日目には４倍希釈し、新しい１２穴細胞培養プレート（ベクトン  ディッキンソン社製又はコーニング社製）に希釈した細胞液４ｍＬを移した後、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始１４日目まで培養を継続し、培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表１に示す。なお、以下の表中、−は無添加、＋は添加をそれぞれ意味する。また、実施例において、ＡＩＣ添加はＡＩＣ刺激と同義であり、ＡＩＣ非添加はＡＩＣ非刺激と同義である。【００６０】
【表１】
2011030851.tif 000002
【００６１】
表１に示されるように、ＯＫ−４３２及びＡＩＣを組み合わせることによって、ＰＢＭＣ  ＡＩＣ添加群（ＡＩＣ刺激群）は、ＰＢＭＣ  ＡＩＣ無添加群（ＡＩＣ非刺激群）と比較して高い拡大培養率を示した。
すなわち、拡大培養時にＯＫ−４３２及びＡＩＣを組み合わせることにより、高い拡大培養率でＮＫ細胞が得られることが明らかとなった。【００６２】
（４）ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）含有比率の解析
実施例１−（３）で調製した培養開始後１４日目の細胞についてＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞含有比率（以下、ＮＫ細胞含有比率と記載する）をフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００：ベックマンコールター社製）で解析した。すなわち、培養開始後１４日目の細胞をＤＰＢＳで洗浄した後、細胞を１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製、以下、ＢＳＡと記載）を含むＤＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ／ＤＰＢＳと記載）中に懸濁し、ＦＩＴＣ標識又はＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体及びＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ５６抗体（全てベックマンコールター社製）を添加した。同様に、各細胞集団の一部に、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１（ベックマンコールター社製）を添加した。各々の抗体を添加後、４℃で３０分インキュベートした。インキュベート後、細胞を０．１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ（以下、０．１％ＢＳＡ／ＤＰＢＳと記載する）で洗浄し、再度ＤＰＢＳに懸濁した。これらの細胞をフローサイトメトリーに供し、ＣＤ３陰性かつＣＤ５６陽性細胞群をＮＫ細胞として、ＮＫ細胞含有比率を算出した。結果を表２に示す。【００６３】
【表２】
2011030851.tif 000003
【００６４】
表２に示されるように、ＯＫ−４３２及びＡＩＣを組み合わせた培養によって、ＰＢＭＣ  ＡＩＣ無添加群と比較して高いＮＫ細胞含有比率の細胞集団が得られた。【００６５】
（５）細胞傷害活性の測定
実施例１−（３）で調製した培養開始後１４日目の細胞について、細胞傷害活性を測定した。細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ  Ｒ．ら（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ.  Ｉｍｍｕｎｏｌ.  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７２巻、第２号、第２２７〜２３９頁（１９９４）〕にて評価した。すなわち慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク  ＪＣＲＢ００１９）、バーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク  ＪＣＲＢ９０７１）、バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ（ヒューマンサイエンス研究資源バンク  ＩＦＯ５００４６）をそれぞれ１〜２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学研究所社製）を添加し、３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。【００６６】
実施例１−（３）で調製した培養開始後１４日目の細胞をエフェクター細胞として１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ又は１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう５ＨＲＰＭＩで希釈後、９６穴細胞培養プレート（コーニング社製）の各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注しておき、これらに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を１００μＬ／ウェルずつ添加した。この際、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の比、すなわちＥ／Ｔ比は１０、３、１の３通りとした。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００×ｇで１分間遠心後、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間インキュベートした。その後、各ウェルから培養上清１００μＬを採取し、蛍光プレートリーダー（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ  ９４０：ベルトールド社製）（励起４８５ｎｍ／測定５３５ｎｍ）によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「細胞傷害活性（％）」は以下の式（１）に従って算出した。【００６７】
【数１】
2011030851.tif 000004
【００６８】
上式において、最小放出量は、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞のみ含有するウェルのＣａｌｃｅｉｎ放出量であり、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量は、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に０．１％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のＣａｌｃｅｉｎ放出量を示している。細胞傷害活性測定の結果を表３に示す。【００６９】
【表３】
2011030851.tif 000005
【００７０】
表３に示されるように、ＯＫ−４３２及びＡＩＣを組み合わせた培養で得られた細胞集団は、ＡＩＣを組み合わせずに得られた細胞集団と同等の細胞傷害活性を発揮した。
すなわち、培養時にＯＫ−４３２及びＡＩＣを組み合わせることにより、高い細胞傷害活性を発揮するＮＫ細胞を含む細胞集団が効率よく拡大され、大量に得られることが明らかとなった。【００７１】
実施例２  ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養（ＡＩＣに対するＸ線照射量の比較）
（１）ＰＢＭＣ  ＡＩＣの調製
実施例１−（２）と同様の方法でＰＢＭＣ  ＡＩＣを調製した。ただし、Ｘ線照射量を３４００Ｒ（２９．８Ｇｙ）及び８０００Ｒ（７０．２Ｇｙ）として、２種のＰＢＭＣ  ＡＩＣをそれぞれ調製した。【００７２】
（２）ＮＫ細胞の拡大培養
実施例１−（３）と同様の方法で、ＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、ＯＫ−４３２を添加しない群、ＰＢＭＣ  ＡＩＣを添加しない群及びＰＢＭＣ  ＡＩＣの代わりに、等量のＰＢＭＣ（Ｘ線未照射）を添加する群を作製した。培養開始７日目には各ウェルの細胞液を５ＨＲＰＭＩを用いて２倍希釈し、各ウェルに終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した後、新しい２４穴細胞培養プレートに細胞液２ｍＬを移した。９日目及び１３日目に同様の継代操作を行った。なお、９日目及び１１日目の細胞液の希釈倍率は、それぞれ４倍及び２倍とした。各継代日に、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。１４日目まで培養を継続し、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例１−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞含有比率を解析した。結果を表４に示す。【００７３】
【表４】
2011030851.tif 000006
【００７４】
表４に示されるように、ＯＫ−４３２及びＰＢＭＣ  ＡＩＣを組み合わせた場合の拡大培養率は、ＯＫ−４３２無添加群、ＰＢＭＣ  ＡＩＣ無添加群及びＰＢＭＣ（Ｘ線照射なし）添加群と比較して高く、また、得られた細胞集団におけるＮＫ細胞含有比率も高いものであった。さらに、ＰＢＭＣ  ＡＩＣ調製時に照射するＸ線照射量にかかわらず、その効果が発揮された。すなわち、培養時にＯＫ−４３２及びＡＩＣを組み合わせることにより、高率でＮＫ細胞を含む細胞集団を高い拡大培養率で得られることが明らかとなった。【００７５】
実施例３  ＯＫ−４３２及び各種ＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養（ＰＢＭＣ  ＡＩＣとＲＮ−Ｔ  ＡＩＣの比較）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
１２穴細胞培養プレートに終濃度５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（製剤名：オルソクローンＯＫＴ３注、ヤンセンファーマ社製）及び終濃度２５μｇ／ｍＬのレトロネクチン（登録商標名、タカラバイオ社製）を含むＡＣＤ−Ａ液（テルモ社製）を０．４５ｍＬ／ウェルずつ添加して必要ウェル数作製し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で５時間インキュベートした。なお、抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン固定化プレートは使用直前にＤＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した。【００７６】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
１％ヒトＡＢ型血清（Ｌｏｎｚａ社製）を含むＧＴ−Ｔ５５１（タカラバイオ社製；以下、１ＨＧＴ−Ｔ５５１と記載する）に、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁した。実施例３−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体／レトロネクチン固定化プレートに１ＨＧＴ−Ｔ５５１を４．７７ｍＬ／ウェル添加しておき、前記の細胞懸濁液を０．５３ｍＬ／ウェルずつ添加して必要ウェル数作製した。続いて終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるように各ウェルにＩＬ−２を添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養を開始した（培養０日目）。培養開始４日目に、培養液を１ＨＧＴ−Ｔ５５１を用いて適宜希釈後、Ｔ７５細胞培養フラスコ（コーニング社製）に移した。このフラスコに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、７日目まで培養を継続した（以下、抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激により拡大培養して得られたＴ細胞をＲＮ−Ｔと記載する）。【００７７】
（３）ＰＢＭＣ及びＲＮ−Ｔを用いたＡＩＣの調製
実施例１−（２）と同様の方法でＡＩＣを調製した。ただし、ＡＩＣとして実施例１−（１）と同様の方法で調製したＰＢＭＣ及び実施例３−（２）で調製した培養開始７日目のＲＮ−Ｔのそれぞれに、３４００Ｒ（２９．８Ｇｙ）のＸ線を照射した（以下、このＸ線照射後のＲＮ−ＴをＲＮ−Ｔ  ＡＩＣと記載する）。調製したＰＢＭＣ  ＡＩＣ及びＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ヒトＡＢ型血清を含むＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社製；以下、１ＨＣｅｌｌＧｒｏと記載する）又は５％ヒトＡＢ型血清を含むＣｅｌｌＧｒｏ（以下、５ＨＣｅｌｌＧｒｏと記載する）に懸濁して、以下の実験で使用した。【００７８】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１−（３）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として１ＨＣｅｌｌＧｒｏ又は５ＨＣｅｌｌＧｒｏを使用し、ＡＩＣとして実施例３−（３）で調製したＰＢＭＣ  ＡＩＣ及びＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを使用した。
培養開始２日目に、各ウェルに１ＨＣｅｌｌＧｒｏ又は５ＨＣｅｌｌＧｒｏを１ｍＬずつ添加し、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。５日目に、各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。７日目に、各ウェルの細胞液を１ＨＣｅｌｌＧｒｏ又は５ＨＣｅｌｌＧｒｏを用いて３倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに希釈した細胞液２ｍＬを移した。９日目及び１３日目に同様の継代操作を行った。なお、９日目及び１３日目目の細胞液の希釈倍率はそれぞれ５倍及び４倍とした。こうして、培養開始１６日目まで培養を継続した。各継代日にはそれぞれ各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１６日目にトリパンブルー染色法によって生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例１−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞含有比率を解析した。結果を表５に示す。【００７９】
【表５】
2011030851.tif 000007
【００８０】
表５に示されるように、ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣの使用によって、ＰＢＭＣ  ＡＩＣ添加群と比較して同等の拡大培養率が得られた。得られた細胞集団におけるＮＫ細胞含有比率にも違いは見られなかった。すなわち、ＮＫ細胞培養時にＯＫ−４３２とＰＢＭＣ  ＡＩＣ又はＲＮ−Ｔ  ＡＩＣとを組み合わせることにより、培養用培地中の血清濃度にかかわらず、高率でＮＫ細胞を含む細胞集団が効率よく得られることが明らかとなり、低血清濃度での拡大培養法が確立された。【００８１】
実施例４  ＯＫ−４３２及び各種ＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養（ＡＩＣによる再刺激−１）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例３−（１）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【００８２】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例３−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。ただし、培養期間は１９日間とし、培養開始４日目以降、１ＨＧＴ−Ｔ５５１を用いて適宜希釈し、各継代日ごとに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加して培養を継続した。【００８３】
（３）ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣの調製
実施例３−（３）と同様の方法でＡＩＣを調製した。実施例４−（２）において培養されたＲＮ−Ｔについて、培養開始６、１３及び１９日目に回収した細胞にＸ線照射装置を使用して３４００Ｒ（２９．８Ｇｙ）のＸ線を照射して１ＨＣｅｌｌＧｒｏに懸濁して以下の実験に使用した。【００８４】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１−（３）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として１ＨＣｅｌｌＧｒｏを使用し、ＡＩＣとして実施例４−（３）で調製した各ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを使用した。
培養開始２日目に、各ウェルに１ＨＣｅｌｌＧｒｏを１ｍＬずつ添加し、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。
５日目に、各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。７日目に、各ウェルの細胞液を１ＨＣｅｌｌＧｒｏを用いて３倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに希釈した細胞液２ｍＬを移した。９、１３、１６及び２０日目に同様の継代操作を行った。なお、９、１３、１６及び２０日目の細胞液の希釈倍率は、それぞれ５倍、３倍、５倍及び２倍とした。各継代日に、各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始７日目及び１３日目に、それぞれ実施例４−（３）で調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ添加した。培養開始後１６日目、２０日目及び２２日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表６に示す。【００８５】
【表６】
2011030851.tif 000008
【００８６】
表６に示されるように、ＮＫ細胞拡大培養期間にてＲＮ−Ｔ  ＡＩＣによる刺激を組み合わせることによって、培養開始１６日目、２０日目及び２２日目において高いＮＫ細胞拡大培養率が得られた。
また、ＮＫ細胞の培養期間中におけるＲＮ−Ｔ  ＡＩＣでの刺激回数が多くなるに従って、高いＮＫ細胞拡大培養率が得られた。
すなわち、ＡＩＣによる刺激によりＮＫ細胞の増殖性が高くなることが明らかとなり、ゆえにＮＫ細胞培養時にＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを組み合わせることにより、高い拡大培養率でＮＫ細胞が得られることが明らかとなった。【００８７】
実施例５  ＯＫ−４３２及び各種ＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養（ＡＩＣによる再刺激−２）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例３−（１）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【００８８】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例４−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。【００８９】
（３）ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣの調製
実施例３−（３）と同様の方法でＡＩＣを調製した。実施例５−（２）において培養開始７及び１４日目にそれぞれ回収したＲＮ−Ｔに、Ｘ線照射装置を使用して３４００Ｒ（２９．８Ｇｙ）のＸ線を照射し、５ＨＣｅｌｌＧｒｏに懸濁して、以下の実験に使用した。【００９０】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１−（３）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として５ＨＣｅｌｌＧｒｏを使用し、ＡＩＣとして実施例５−（３）で調製した各ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを使用した。
培養開始２日目に、各ウェルに５ＨＣｅｌｌＧｒｏを１ｍＬずつ添加し、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。
５日目に、各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。７日目に、各ウェルの細胞液を５ＨＣｅｌｌＧｒｏを用いて３倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに希釈した細胞液２ｍＬを移した。同様の継代操作を９日目、１３日目、１６日目及び２０日目に行い、２２日目まで培養を継続した。なお、９、１３、１６及び２０日目の細胞液の希釈倍率は、それぞれ３倍、２．５倍、４倍及び２倍とした。各継代日に各ウェルに５ＨＣｅｌｌＧｒｏを１ｍＬずつ添加し、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。７日目に実施例５−（４）で調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ添加した。培養開始後２０日目及び２２日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表７に示す。【００９１】
【表７】
2011030851.tif 000009
【００９２】
表７に示されるように、ＮＫ細胞拡大培養途中にＲＮ−Ｔ  ＡＩＣによる刺激を再度行うことによって、当該操作を行っていない群と比較して高い拡大培養率が得られた。
すなわち、ＮＫ細胞培養時にＯＫ−４３２とＲＮ−Ｔ  ＡＩＣによる複数回刺激を組み合わせることにより、高い拡大培養率でＮＫ細胞が得られることが明らかとなった。【００９３】
（５）ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）含有比率の解析
実施例１−（４）と同様の方法で、実施例５−（４）で調製した培養開始後２２日目の細胞について、ＮＫ細胞含有比率を測定した。結果を表８に示す。【００９４】
【表８】
2011030851.tif 000010
【００９５】
表８に示されるように、ＮＫ細胞拡大培養途中にＲＮ−Ｔ  ＡＩＣによる刺激を再度与えることによって、このような刺激を行っていない群と同等の高いＮＫ細胞含有比率が得られた。すなわち、ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣによる複数回の刺激を行っても、ＮＫ細胞含有比率は低下しなかった。【００９６】
（６）細胞傷害活性の測定
実施例１−（５）と同様の方法で、実施例５−（４）で調製した培養開始後２２日目の細胞について、その細胞傷害活性を測定した。ただし、標的細胞としてＫ５６２及びＤａｕｄｉを使用した。細胞傷害活性測定の結果を表９に示す。【００９７】
【表９】
2011030851.tif 000011
【００９８】
表９に示されるように、ＮＫ細胞拡大培養途中にＲＮ−Ｔ  ＡＩＣによる刺激を再度行った細胞群には、培養開始０日目のみにＲＮ−Ｔ  ＡＩＣによる刺激行った群よりも高い細胞傷害活性が付与されることが明らかとなった。
すなわち、ＮＫ細胞培養時にてＯＫ−４３２と複数回のＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ刺激とを組み合わせることにより、より高い細胞傷害活性を発揮するＮＫ細胞を含む細胞集団が効率よく得られることが明らかとなった。【００９９】
実施例６  ＯＫ−４３２及び各種ＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養（Ｘ線照射量の比較）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例３−（１）と同様の方法に従って、抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【０１００】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例４−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。ただし、培養期間は１４日間とした。【０１０１】
（３）ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣの調製
実施例３−（３）と同様の方法でＡＩＣを調製した。実施例６−（２）において培養開始７及び１４日目にそれぞれ回収したＲＮ−ＴにＸ線照射装置を使用して１０００Ｒ（８．８Ｇｙ）、２０００Ｒ（１７．６Ｇｙ）、３４００Ｒ（２９．８Ｇｙ）又は５５００Ｒ（４８．２Ｇｙ）のＸ線を照射し、５ＨＣｅｌｌＧｒｏに懸濁して、以下の実験に使用した。【０１０２】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１−（３）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として５ＨＣｅｌｌＧｒｏを使用し、ＡＩＣとして実施例６−（３）で調製した各ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを使用した。
培養開始１日目又は３日目に、各ウェルに５ＨＣｅｌｌＧｒｏを１ｍＬずつ添加し、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。
４日目又は５日目に、各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。７日目に、各ウェルの細胞液を５ＨＣｅｌｌＧｒｏを用いて９倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに希釈した細胞液２ｍＬを移し、それぞれ実施例６−（３）で調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ添加した。前記の、細胞液を希釈して、希釈した細胞液２ｍＬを新たなプレートに移す継代操作を、１１日目、１４日目、１５日目、１７日目又は１８日目に行い、培養開始２１日目まで培養を継続した。なお、１１、１４、１５、１７及び１８日目の細胞液の希釈倍率は、それぞれ５倍、３倍、４倍、４倍及び２倍とした。各継代日に各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。７日目にはそれぞれ実施例６−（３）で調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ添加した。培養開始後２１日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表１０に示す。【０１０３】
【表１０】
2011030851.tif 000012
【０１０４】
表１０に示されるように、ＮＫ細胞拡大培養途中にＲＮ−Ｔ  ＡＩＣによる刺激を再度与えることによって、このような刺激を行っていない群と比較して、高いＮＫ細胞拡大培養率が得られた。ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ調製時のＸ線照射量を１０００、２０００、３４００又は５５００Ｒに変えてもその効果は発揮された。
すなわち、ＮＫ細胞培養時にＸ線照射量の異なるＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを組み合わせても、高い拡大培養率でＮＫ細胞が得られることが明らかとなった。【０１０５】
（５）ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）含有比率の解析
実施例１−（４）と同様の方法で、実施例６−（４）で調製した培養開始後２１日目の細胞について、ＮＫ細胞含有比率を測定した。結果を表１１に示す。【０１０６】
【表１１】
2011030851.tif 000013
【０１０７】
表１１に示されるように、ＮＫ細胞拡大培養途中にＲＮ−Ｔ  ＡＩＣによる刺激を再度与えた群では、何も刺激しない群と同等の高いＮＫ細胞含有比率が得られた。また、ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ調製時のＸ線照射量を１０００、２０００、３４００又は５５００Ｒに変えてもその効果は発揮された。
すなわち、ＮＫ細胞培養時にＯＫ−４３２とＡＩＣを組み合わせることにより、高含有比率でＮＫ細胞を含む細胞集団が得られることが明らかとなった。【０１０８】
実施例７  ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養（培養用基本培地の比較−１）
（１）ＰＢＭＣを用いたＡＩＣの調製
実施例１−（２）と同様の方法でＰＢＭＣ  ＡＩＣを調製した。【０１０９】
（２）ＮＫ細胞の拡大培養
実施例１−（３）と同様の方法で、ＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用基本培地として、５ＨＲＰＭＩ、５％ヒトＡＢ型血清及び０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３（タカラバイオ社製；以下、５Ｈ０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３と記載する）又は５ＨＣｅｌｌＧｒｏを使用した。
培養開始７日目に各ウェルの細胞液をそれぞれの培養用基本培地を用いて３倍希釈し、各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した後、新しい２４穴細胞培養プレートに希釈した細胞液２ｍＬを移した。９日目に、同様に３倍希釈した細胞液２ｍＬを新しい２４細胞培養プレートに移し、さらに１１日目に５倍希釈した細胞液４ｍＬを新しい１２穴細胞培養プレートに移した。各継代日に各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２をそれぞれ添加した。培養開始１５日目まで培養を継続し、培養開始後１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を１２に示す。【０１１０】
【表１２】
2011030851.tif 000014
【０１１１】
表１２に示されるように、ＯＫ−４３２、ＰＢＭＣ  ＡＩＣ及びＣｅｌｌＧｒｏを組み合わせた場合、他の培地と比較して高い拡大培養率が得られた。【０１１２】
（３）ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）含有比率の解析
実施例７−（２）で調製した培養開始後１５日目の細胞について、実施例１−（４）と同様の方法でＮＫ細胞含有比率を解析した。結果を表１３に示す。【０１１３】
【表１３】
2011030851.tif 000015
【０１１４】
表１３に示されるように、どの培地でも７０％以上の比率でＮＫ細胞を含む細胞集団が得られたが、使用した中ではＣｅｌｌＧｒｏ使用群のＮＫ細胞含有比率が最も高かった。【０１１５】
実施例８  ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養（培養用基本培地の比較−２）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例３−（１）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【０１１６】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例６−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。【０１１７】
（３）ＲＮ−Ｔを用いたＡＩＣの調製
実施例８−（２）で調製したＲＮ−Ｔを用いて、実施例５−（３）と同様の方法でＡＩＣを調製した。ただし、Ｘ線照射後のＲＮ−Ｔ  ＡＩＣは、１ＨＣｅｌｌＧｒｏ、１％ヒトＡＢ型血清を含むＧＴ−Ｔ５０２（タカラバイオ社製；以下、１ＨＧＴ−Ｔ５０２と記載する）、１％ヒトＡＢ型血清及び０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３（タカラバイオ社製；以下、１Ｈ０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３と記載する）にそれぞれに懸濁して、以下の実験に使用した。【０１１８】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１−（３）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用基本培地として、培養開始時には１ＨＣｅｌｌＧｒｏを使用し、培養開始７日目又は９日目以降の培地を１ＨＧＴ−Ｔ５０２又は１Ｈ０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３に変更する群も設定した。また培養開始１４日目に培地を１ＨＧＴ−Ｔ５０２に変更するする群、さらに培養開始時から終了時まで１ＨＣｅｌｌＧｒｏと１ＨＧＴ−Ｔ５０２を比率１：１で混合した基本培地（以下、１ＨＣｅｌｌＧｒｏ／ＧＴ−Ｔ５０２と記載する）を使用する群も設定した。
培養開始４日目に、各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。７日目に、各ウェルの細胞液を各培養用培地を用いて３倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに細胞液２ｍＬを移した。同様の継代を９日目、１４日目及び１８日目に実施し、２２日目まで培養を継続した。なお、９、１４及び１８日目の細胞液の希釈倍率は、それぞれ５倍、３倍及び２倍とした。各継代日に各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始７日目にそれぞれ実施例８−（３）で調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ添加した。
培養開始後１４日目、１８日目及び２１日目にトリパンブルー染色法によって生細胞数をそれぞれ計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表１４に示す。【０１１９】
【表１４】
2011030851.tif 000016
【０１２０】
表１４に示されるように、ＮＫ細胞拡大培養初期にてＯＫ−４３２、ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ及びＣｅｌｌＧｒｏを組み合わせることによって、培養期間途中に基本培地を変更しても培養開始１４、１８及び２１日目において高い拡大培養率がそれぞれ得られた。また、１ＨＣｅｌｌＧｒｏ／ＧＴ−Ｔ５０２のような基本培地２種からなる混合培地（希釈したＣｅｌｌＧｒｏ）を使用しても、同様に高い拡大培養率が得られた。【０１２１】
（５）ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）含有比率の解析
実施例８−（４）で調製した培養開始後２１日目の細胞について、実施例１−（４）と同様の方法でＮＫ細胞含有比率を解析した。結果を表１５に示す。【０１２２】
【表１５】
2011030851.tif 000017
【０１２３】
表１５に示されるように、ＮＫ細胞拡大培養初期にＯＫ−４３２、ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ及びＣｅｌｌＧｒｏを組み合わせることによって、培養期間途中に基本培地を変更しても培養開始１４、１８、２１日目において高いＮＫ細胞含有比率が得られた。また、１ＨＣｅｌｌＧｒｏ／ＧＴ−Ｔ５０２のような基本培地２種からなる混合培地（希釈したＣｅｌｌＧｒｏ）を使用しても同様に、高いＮＫ細胞含有比率が得られた。
以上のとおり、培養途中で培地を変更した場合であっても、本発明によれば、高い比率でＮＫ細胞を含む細胞集団を効率よく取得できることが明らかになった。【０１２４】
実施例９  ガス透過性培養バッグを用いたＮＫ細胞培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標）  ２１５の作製
培養面積を８６ｃｍ２になるようにシールしたガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５（タカラバイオ社製）に終濃度５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンを含むＡＣＤ−Ａ液を１０．４ｍＬ添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で５時間インキュベートした。抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン固定化ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５を、使用直前に１％ＨＳＡ／生理食塩水で３回洗浄した。【０１２５】
（２）新鮮血液からのＰＢＭＣ分離
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーにて、３０ｍＬ分のへパリン加採血を実施した。得られた血液を７００×ｇ、室温で２０分間遠心し、遠心後の上清である血漿画分とＰＢＭＣを含む細胞画分とに分離した。血漿画分は、５６℃にて３０分間非働化処理を行い、９００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、その上清を非働化済み自己血漿（以下、血漿と記載する）として、以後の工程で使用した。【０１２６】
ＰＢＭＣを含む細胞画分を、１％ＨＳＡ／生理食塩水を用いて、それぞれ２０ｍＬにフィルアップし、希釈した。得られた希釈細胞液を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ２０ｍＬの上にそれぞれ重層して、７００×ｇ、室温で２０分間遠心した。遠心後、分離した層のうちＰＢＭＣ層をピペットで回収し、１％ＨＳＡ／生理食塩水を用いて２０ｍＬにフィルアップし、６５０×ｇ、４℃にて１０分間遠心して上清を除去した。同様に、６００×ｇ及び５００×ｇと段階的に遠心Ｇを落としながら順次遠心操作を行い、計３回洗浄を繰り返し、得られたＰＢＭＣを１ＨＧＴ−Ｔ５５１に懸濁後、生細胞数及び生存率をトリパンブルー染色法にて算出して、各実験に供した。【０１２７】
（３）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例９−（２）で分離したＰＢＭＣ  １．２×１０７ｃｅｌｌｓを１ＨＧＴ−Ｔ５５１  １２０ｍＬに懸濁し、実施例９−（１）で作製した抗ＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５に添加した。終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養を開始した（培養０日目）。培養開始４日目に、各ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５内の細胞液を懸濁し、４０ｍＬを培養面積を４３０ｃｍ２となるようにシールした何も固定化していないガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標）  Ｅｖａ（タカラバイオ社製）に移した。この際、１ＨＧＴ−Ｔ５５１を２９２．６ｍＬ添加し、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａ内の総液量を３３６ｍＬとし、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した後、５％ＣＯ２中３７℃で培養した。培養を７日目まで継続し、７日目に必要量の培養ＲＮ−Ｔを分取（ＡＩＣ材料として、以後の工程で使用する）後、バッグ内に残った細胞液と等量の無血漿ＧＴ−Ｔ５５１及び終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。１１日目にＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａ内の細胞液を無血漿ＧＴ−Ｔ５５１を用いて２倍希釈した後、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。１４日目に必要量のＲＮ−Ｔを分取し、ＡＩＣ材料として以後の工程で使用した。【０１２８】
（４）ＲＮ−Ｔを用いたＡＩＣの調製
実施例９−（３）で調製したＲＮ−Ｔを用いて、実施例５−（３）と同様の方法でＡＩＣを調製した。培養開始７日目のＲＮ−Ｔを用いて調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．８％血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ（以下、０．８％血漿／ＣｅｌｌＧｒｏと記載する）に懸濁し、また、培養開始１４日目のＲＮ−Ｔを用いて調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．８％血漿／ＣｅｌｌＧｒｏに懸濁した。【０１２９】
（５）ＮＫ細胞集団の拡大培養
ガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標）  Ｓｐｉｎ（タカラバイオ社製）に、実施例９−（２）で調製したＰＢＭＣ及び実施例９−（４）で調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ（培養開始７日目のＲＮ−Ｔを用いて調製したもの）をそれぞれ３×１０７ｃｅｌｌｓずつ添加し、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を、終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬとなるようにＯＫ−４３２をそれぞれ添加し、０．８％血漿／ＣｅｌｌＧｒｏを用いて最終的に総液量を３０ｍＬとした。細胞液を添加した培養バッグを５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養を開始した（培養０日目）。培養開始２日目に、培養バッグに０．８％血漿／ＣｅｌｌＧｒｏを３０ｍＬ添加し、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。４日目に、培養バッグに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。７日目に、培養バッグ内の総細胞数をトリパンブルー染色法により算出後、細胞液３０ｍＬをＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５に移し、実施例９−（４）で調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ（培養開始１４日目のＲＮ−Ｔを使用したもの）を細胞数比が１：１になるように添加した。この培養バッグに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した後、０．８％血漿／ＣｅｌｌＧｒｏを用いて総液量が１８０ｍＬとなるようにした。１１日目に、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５内の細胞液９０ｍＬをＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａに移し替え０．８％血漿及び０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３（以下、０．８％血漿／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３と記載する）を用いて５倍希釈し総液量を４５０ｍＬとした後、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。１３日目には、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａ内の細胞液２２５ｍＬを０．２６％血漿及び０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３（以下、０．２６％血漿／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３と記載する）を用いて３倍希釈し総液量を６７５ｍＬとした後、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した後、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａに移し替えた。培養は１６日目まで継続した。培養開始後１３及び１６日目にそれぞれサンプリングした細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表１６に示す。【０１３０】
【表１６】
2011030851.tif 000018
【０１３１】
表１６に示されるように、ガス透過性培養バッグを用いて培養を実施しても、高い拡大培養率が得られることが明らかとなった。【０１３２】
（６）ＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性細胞（Ｔ細胞）、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）及びＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率の解析
実施例９−（５）で調製した培養開始後１６日目の細胞について、実施例１−（４）と同様の方法でＮＫ細胞含有比率を解析した。ただし、ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ１６抗体（ベックマンコールター社製）を組み合わせて、ＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性細胞（Ｔ細胞）及びＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率についても併せて解析した。結果を表１７に示す。【０１３３】
【表１７】
2011030851.tif 000019
【０１３４】
表１７に示されるように、ガス透過性培養バッグを用いてＯＫ−４３２及びＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを用いる培養を実施しても、高いＮＫ細胞含有比率が得られた。また、培養後に得られるＮＫ細胞では高い比率でＣＤ１６が発現しており、抗体依存性細胞傷害活性の発揮に重要な役割を果たすＣＤ１６分子を発現する高機能性ＮＫ細胞を高含有することが確認された。また、得られた細胞集団中ではわずかなＴ細胞しか認められなかった。【０１３５】
（７）細胞傷害活性の測定
実施例９−（５）で調製した培養開始後１６日目の細胞について、実施例１−（５）と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。ただし、標的細胞として、下表のＫ５６２、Ｄａｕｄｉ、食道扁平上皮癌細胞株Ｔ．Ｔｎ、乳腺癌由来細胞株ＭＣＦ７、肺がん細胞株Ａ５４９、メラノーマ細胞株Ａ３７５、胃癌細胞株ＭＫＮ４５及び大腸癌細胞株ＨＴ２９を使用し、Ｅ／Ｔ比３０、１０、３、１について測定を行った。細胞傷害活性測定の結果を表１８に示す。【０１３６】
【表１８】
2011030851.tif 000020
【０１３７】
表１８に示されるように、ＯＫ−４３２、ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ及びガス透過性培養バッグを用いて実施した培養により得られた細胞集団は、各種の標的細胞に高い細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。また、その活性は、ＮＫ細胞感受性細胞株として知られるＫ５６２、及びＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ非発現細胞株として知られるＤａｕｄｉのみならず、様々なＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ発現細胞株に対しても確認され、これらの細胞集団が様々な癌細胞株に対して細胞傷害活性を発揮する高機能性ＮＫ細胞であることが確認された。
すなわち本発明によりＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性の表現型を示し、高い細胞傷害性を有する細胞集団を高い純度で得ることが可能になった。【０１３８】
実施例１０  ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養（Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ−Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌとの比較）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例３−（１）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【０１３９】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例６−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。ただし、ＮＫ細胞培養を行う際に材料となるＰＢＭＣを提供するドナーと同一ドナー由来ＰＢＭＣからＲＮ−Ｔを培養するもの（以下自己ＲＮ−Ｔと記載）、及び異なるドナー由来ＰＢＭＣからＲＮ−Ｔを培養するもの（以下非自己ＲＮ−Ｔと記載）をそれぞれ培養した。【０１４０】
（３）ＲＮ−Ｔを用いたＸ線照射細胞の調製
実施例１０−（２）で調製した自己ＲＮ−Ｔ及び非自己ＲＮ−Ｔそれぞれを用いて、実施例５−（３）と同様の方法でＸ線照射細胞を調製した。【０１４１】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１−（３）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として５ＨＣｅｌｌＧｒｏを使用し、ＡＩＣとして実施例１０−（３）で調製した自己ＲＮ−ＴＸ線照射細胞（ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣと同義）及び非自己ＲＮ−ＴＸ線照射細胞を使用した。
培養開始２日目に、各ウェルに５ＨＣｅｌｌＧｒｏを１ｍＬずつ添加し、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。４日目に、各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。７日目に、各ウェルの細胞液を５ＨＣｅｌｌＧｒｏを用いて３倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに細胞液２ｍＬを移した。９日目に、各ウェルの細胞液を同様に３倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに希釈した細胞液２ｍＬを移した。さらに、１１日目に、各ウェルの細胞液を同様に２．５倍希釈し、新しい１２穴細胞培養プレートに希釈した細胞液４ｍＬを移した。各継代日に各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらの細胞の培養は１５日目まで継続した。培養開始後１１及び１５日目にそれぞれサンプリングした細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表１９に示す。【０１４２】
【表１９】
2011030851.tif 000021
【０１４３】
表１９に示されるように、使用するＲＮ−Ｔが自己又は非自己であるに関わらず、同等の拡大培養率が得られた。
異なるドナーの２種のリンパ球細胞を混合すると、自己細胞を混合した際には起こらない非自己混合リンパ球反応（Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；以下、Ａｌｌｏ−ＭＬＲと記載する）により、非自己抗原を認識してリンパ球が増殖することが一般的に知られ、Ｘ線照射非自己細胞はフィーダー細胞として汎用されている。しかし、Ｘ線照射非自己細胞の代わりに、Ｘ線照射自己細胞であるＲＮ−Ｔ  ＡＩＣをＮＫ細胞培養時に用いた場合にも同様のＮＫ細胞拡大培養効果が得られたことは、驚くべきことである。さらには、培養後のＮＫ細胞を当該ドナーに投与する医療の安全性の点からも、自己由来のＲＮ−Ｔ  ＡＩＣをＮＫ培養時に用いることは、その安全性を著しく向上させることになる。【０１４４】
（５）ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）及びＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率の解析
実施例１０−（４）で調製した培養開始後１５日目の細胞について、実施例９−（６）と同様の方法でＮＫ細胞含有比率及びＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞比率を解析した。結果を表２０に示す。【０１４５】
【表２０】
2011030851.tif 000022
【０１４６】
表２０に示されるように、自己ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを使用した場合、非自己ＲＮ−ＴＸ線照射細胞添加群と比較して高いＮＫ細胞含有比率及びＣＤ１６陽性ＮＫ細胞含有比率が得られた。
すなわち、ＯＫ−４３２及び自己ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを組み合わせたＮＫ細胞培養方法は、高いＮＫ細胞含有比率及びＣＤ１６陽性ＮＫ細胞比率を有し、かつ安全性の高いＮＫ細胞が得られる方法であることが明らかとなった。【０１４７】
実施例１１  ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養（培養ＮＫ細胞の分化ステージ）
（１）ＰＢＭＣを用いたＸ線照射細胞の調製
実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを用いて、実施例３−（３）と同様の方法でＰＢＭＣ  ＡＩＣを調製した。調製したＰＢＭＣ  ＡＩＣを５ＨＣｅｌｌＧｒｏに懸濁し、以下の実験で使用した。【０１４８】
（２）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１−（３）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として５ＨＣｅｌｌＧｒｏを使用し、ＡＩＣとして実施例１１−（１）で調製したＰＢＭＣ  ＡＩＣを使用した。
培養開始７日目に、各ウェルの細胞液を５ＨＣｅｌｌＧｒｏを用いて８倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに細胞液２ｍＬを移した。この際、各ウェルに実施例１１−（１）で調製したＰＢＭＣ  ＡＩＣ  １×１０６ｃｅｌｌｓを添加し、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。同様の継代操作を１０日目及び１５日目に実施した。なお、１０日目及び１５日目の細胞液の希釈率は、それぞれ６倍及び３倍とした。さらに、１８日目に、各ウェルの細胞液を同様に４倍希釈し、新しい１２穴細胞培養プレートに希釈した細胞液を４ｍＬ移した。各継代日に終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらの細胞を培養開始２２日目まで培養を継続し、その一部についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果（拡大培養率）を表２１に示す。【０１４９】
【表２１】
2011030851.tif 000023
【０１５０】
（３）ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）、ＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ３４陰性ＣＤ１1７陰性細胞、及びＣＤ９４陽性ＣＤ５６陽性含有比率の解析
実施例１１−（２）で調製した培養開始後２２日目の細胞について、実施例９−（６）と同様の方法でＮＫ細胞含有比率及びＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞比率を解析した。ただし、この際、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３４抗体（ベクトン  ディッキンソン社製）、ＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ１１７抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ９４抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、ＣＤ３４陽性ＣＤ１１７陽性細胞及びＣＤ９４陽性ＣＤ５６陽性含有比率についても同様に解析した。結果を表２２に示す。【０１５１】
【表２２】
2011030851.tif 000024
【０１５２】
表２２に示されるように、ＯＫ−４３２及びＰＢＭＣ  ＡＩＣを組み合わせた方法で得られる細胞集団中において、ＣＤ５６陽性、ＣＤ１６陽性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性かつＣＤ９４陽性細胞が大部分を占めていた。
ＮＫ細胞はその表面抗原の発現により４つの分化段階に分けられることが知られているが、その中でも特にＣＤ５６陽性、ＣＤ１６陽性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１1７陰性かつＣＤ９４陽性細胞は最終分化段階の細胞にみられる表現型であり、高い細胞傷害活性を発揮する成熟化ＮＫ細胞であることが知られている。
すなわち、本発明の方法により、成熟化したＮＫ細胞が効率的に得られることが明らかとなり、本発明により成熟ＮＫ細胞の効率良い製造方法が提供された。【０１５３】
実施例１２  ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養（ＯＫ−４３２、ＡＩＣ有効性の比較）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例３−（１）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【０１５４】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例６−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。ただし、培養開始７日目以降は無血漿ＧＴ−Ｔ５５１を使用した。【０１５５】
（３）ＲＮ−Ｔを用いたＡＩＣの調製
実施例１２−（２）で調製したＲＮ−Ｔを用いて、実施例５−（３）と同様の方法でＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを調製した。ただし、培養開始７日目のＲＮ−Ｔは、０．８％ヒトＡＢ型血清を含むＣｅｌｌＧｒｏ（以下、０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏと記載）に懸濁し、１４日目のＲＮ−Ｔは０．８％ヒトＡＢ型血清を含むＧＴ−Ｔ５０２（以下、０．８ＨＧＴ−Ｔ５０２と記載）に懸濁した後、以下の実験に使用した。【０１５６】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１−（３）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、ＯＫ−４３２又はＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを添加しない群も設定した。また培養用基本培地として、培養開始時から４日目までは０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏを使用し、７日目には０．８ＨＧＴ−Ｔ５０２を、１３日目には０．２９％ヒトＡＢ型血清を含むＧＴ−Ｔ５０２（以下、０．２９ＨＧＴ−Ｔ５０２と記載）を使用した。培養開始１日目には、各ウェルに０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏ１ｍＬ及び終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。４日目には、各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。７日目には、各ウェルの細胞液を０．８ＨＧＴ−Ｔ５０２を用いて６倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに細胞液２ｍＬを移した。同様の継代操作を１１日目及び１３日目にそれぞれ実施し、１７日目まで培養を継続した。なお、１０日目及び１５日目の細胞液の希釈は、それぞれ０．８ＨＧＴ−Ｔ５０２による５倍希釈、０．２９ＨＧＴ−Ｔ５０２による３倍希釈とした。培養開始７日目には一部条件については、実施例１２−（３）で調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ添加した。
培養開始後１１日目、１３日目及び１７日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数をそれぞれ計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表２３に示す。【０１５７】
【表２３】
2011030851.tif 000025
【０１５８】
表２３に示されるように、ＯＫ−４３２及びＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを組み合わせることによって、ＯＫ−４３２無添加群、ＡＩＣ無添加群、ＯＫ−４３２及びＡＩＣ無添加群と比較して、１１、１３及び１７日目において高い拡大培養率が得られた。【０１５９】
（５）ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）含有比率、ＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性細胞（Ｔ細胞）含有比率、及びＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）含有比率の解析
実施例１２−（４）で調製した培養開始後１７日目の細胞について実施例９−（６）と同様の方法で、ＮＫ細胞含有比率、ＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性細胞比率、及びＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞を解析した。結果を表２４に示す。【０１６０】
【表２４】
2011030851.tif 000026
【０１６１】
表２４に示されるように、ＯＫ−４３２及びＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを組み合わせることによって、ＯＫ−４３２無添加群、ＡＩＣ無添加群、ＯＫ−４３２及びＡＩＣ無添加群と比較して、高いＮＫ細胞含有比率が得られた。またＯＫ−４３２無添加群、ＡＩＣ無添加群、ＯＫ−４３２及びＡＩＣ無添加群においてはＮＫ細胞の比率が低く、特にＡＩＣ無添加群、ＯＫ−４３２及びＡＩＣ無添加群ではＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性すなわちＴ細胞が優位に増殖していた。これらの群に対し、ＯＫ−４３２及びＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを組み合わせた群では、ＮＫ細胞が極めて高い比率で増殖しており、また、得られたＮＫ細胞は抗体依存性細胞傷害活性を発揮するために重要な分子であるＣＤ１６を高発現していた。すなわち、ＯＫ−４３２及びＡＩＣを組み合わせることにより、高いＮＫ含有率及びＣＤ１６陽性比率を有するＮＫ細胞が得られることが明らかとなった。【０１６２】
（６）ＮＫ細胞拡大培養率の解析
培養開始前のＰＢＭＣ及び実施例１２−（４）で調製した培養開始後１７日目の細胞について、それぞれ実施例９−（６）と同様の方法でＮＫ細胞含有比率を解析した。また、実施例１２−（４）で得られた拡大培養率（総細胞換算）を用いて、培養開始時のＮＫ細胞数と比較して、培養１７日目におけるＮＫ細胞拡大培養率を算出した（以下の式（２）を参照のこと）。結果を表２５に示す。【０１６３】
【数２】
2011030851.tif 000027
【０１６４】
【表２５】
2011030851.tif 000028
【０１６５】
表２５に示されるように、ＯＫ−４３２及びＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを組み合わせることによって、ＯＫ−４３２無添加群、ＡＩＣ無添加群、ＯＫ−４３２及びＡＩＣ無添加群と比較して、高いＮＫ細胞拡大培養率が得られることが明らかとなった。【０１６６】
実施例１３  拡大培養後のＮＫ細胞集団の表面抗原の解析
（１）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例９−（５）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養１３日目には、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａ内の細胞液２２５ｍＬを０．２９％血漿及び０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３（以下、０．２９％血漿／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３と記載する）を用いて３倍希釈し総液量を６７５ｍＬとした後、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａに移し替えた。培養１５日目に、培養バッグに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養１８日目に、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａ内の細胞液３３８ｍＬを０．２９％血漿／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を用いて総液量を６７５ｍＬとした後、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａに移し替えた。培養は２０日目まで継続した。培養開始後１８及び２０日目にそれぞれサンプリングした細胞について、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表２６に示す。【０１６７】
【表２６】
2011030851.tif 000029
【０１６８】
（２）培養後のＮＫ細胞の表面抗原の解析
実施例１３−（１）で調製した培養開始後２０日目の細胞について、実施例９−（６）と同様の方法で、Ｔ細胞含有比率、ＮＫ細胞含有比率及びＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率を解析した。ただし、この際、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＮＫｐ４４抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社製)、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＮＫｐ４６抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製)、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ２５抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）、及びＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（ベックマンコールター社製）を用いて、ＮＫｐ４４陽性ＣＤ５６陽性細胞、ＮＫｐ４６陽性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ２５陽性ＣＤ５６陽性細胞及びＣＤ６２Ｌ陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率についても解析した。結果を表２７に示す。【０１６９】
【表２７】
2011030851.tif 000030
【０１７０】
表２７に示されるように、ＯＫ−４３２及びＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを組み合わせた方法で得られる細胞集団中は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌを発現していた。
ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６は、ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＣＲ）ファミリーに属し、ＮＫ細胞による細胞傷害活性にそれぞれ関与していると言われる。ＮＫｐ４４は静止期ＮＫ細胞には発現せず活性化ＮＫ細胞だけに発現し、ＮＫｐ４６はＮＫ細胞にのみ発現するＮＫ細胞共通の表面抗原であり、ＣＤ２５はＩＬ−２で刺激され、活性化したＮＫ細胞に発現する。ＣＤ６２Ｌはリンパ球のホーミングの際に重要な役割を果たし、血流から炎症部位への集積にも関与することが知られている。
すなわち、本発明の方法により、成熟化かつ活性化したＮＫ細胞が効率的に得られることが明らかとなり、本発明により成熟ＮＫ細胞の効率よい製造方法が提供された。【０１７１】
実施例１４  ガス透過性培養バッグを用いたＮＫ細胞培養
（１）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例９−（２）と同様の方法で分離したＰＢＭＣ１．２×１０７ｃｅｌｌｓを１ＨＧＴ−Ｔ５５１  １２０ｍＬに懸濁し、実施例９−（１）と同様の方法で作製した抗ＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５に添加し、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養を開始した（培養０日目）。培養開始４日目に、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５内の細胞液を懸濁し、３０ｍＬを培養面積が３２０ｃｍ２となるようにシールした何も固定化していないガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａに移した。この際、１ＨＧＴ−Ｔ５５１を２２０ｍＬ添加し、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａ内の総液量を２５０ｍＬとし、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した後、５％ＣＯ２中３７℃で培養した。培養を７日目まで継続し、７日目に必要量の培養ＲＮ−Ｔを分取（ＡＩＣ材料として、以後の工程で使用する）後、バッグ内に残った細胞液と等量の無血漿ＧＴ−Ｔ５５１及び終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。１１日目にＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａ内の細胞液を無血漿ＧＴ−Ｔ５５１を用いて２倍希釈した後、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。１４日目に、必要量のＲＮ−Ｔを分取し、ＡＩＣ材料として以後の工程で使用した。【０１７２】
（２）ＲＮ−Ｔを用いたＡＩＣの調製
実施例１４−（１）で調製したＲＮ−Ｔを用いて、実施例５−（３）と同様の方法でＡＩＣを調製した。培養開始７日目のＲＮ−Ｔを用いて調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、培養開始１４日目のＲＮ−Ｔを用いて調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、それぞれ０．８％血漿／ＣｅｌｌＧｒｏに懸濁した。【０１７３】
（３）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例９−（５）と同様の方法でＮＫ細胞集団の拡大培養を行った。ただし、培養開始時にはＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５を使用し、１３日目の希釈操作を１４日目に実施した。培養は１８日目まで継続した。培養開始後１８日目にサンプリングした細胞について、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表２８に示す。【０１７４】
【表２８】
2011030851.tif 000031
【０１７５】
表２８に示されるように、ガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５を培養開始時に使用しても、高い拡大培養率が得られることが明らかとなった。すなわち、培養開始時のガス透過性培養バッグの種類によらず、所望の効果が発揮されることが明らかとなった。【０１７６】
（４）ＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性細胞（Ｔ細胞）、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）及びＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率の解析
実施例１４−（３）で調製した培養開始後１８日目の細胞について、実施例９−（６）と同様の方法で、Ｔ細胞含有比率、ＮＫ細胞含有比率及びＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率を解析した。ただし、ＰＥ標識マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体（ベックマンコールター社製）を組み合わせて、ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率についても併せて解析した。結果を表２９に示す。【０１７７】
【表２９】
2011030851.tif 000032
【０１７８】
表２９に示されるように、ガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５を培養開始時に使用してＯＫ−４３２及びＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを用いる培養を実施しても、高いＮＫ細胞含有比率が得られた。また、培養後に得られたＮＫ細胞では高い比率でＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄが発現しており、抗体依存性細胞傷害活性の発揮に重要な役割を果たすＣＤ１６分子を発現する高機能性ＮＫ細胞及びＮＫＧ２Ｄを介した高い細胞傷害活性を示す高機能性ＮＫ細胞を高含有することが確認された。【０１７９】
（５）細胞傷害活性の測定
実施例１４−（３）で調製した培養開始後１８日目の細胞について、実施例１−（５）と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。ただし、標的細胞としてＫ５６２及びＡ５４９をそれぞれ使用し、Ｅ／Ｔ比１０、３、１及び０．３について測定を行った。細胞傷害活性測定の結果を表３０に示す。【０１８０】
【表３０】
2011030851.tif 000033
【０１８１】
表３０に示されるように、ＯＫ−４３２、ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ及びガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５を培養開始時に用いて実施した培養により得られた細胞集団は、各種の標的細胞に高い細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。また、その活性は、ＮＫ細胞感受性細胞株として知られるＫ５６２のみならず、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ発現細胞株Ａ５４９に対しても確認され、これらの細胞集団が様々な癌細胞株に対して細胞傷害活性を発揮する高機能性ＮＫ細胞であることが確認された。
すなわち、本発明により、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性の表現型を示し、高い細胞傷害性を有する細胞集団を高い純度で得ることが可能になった。【０１８２】
実施例１５  ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養（細胞傷害活性の比較）
（１）ＰＢＭＣを用いたＡＩＣの調製
実施例１−（２）と同様の方法でＰＢＭＣ  ＡＩＣを調製した。ただし、調製したＰＢＭＣ  ＡＩＣを２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏに懸濁して、以下の実験に使用した。【０１８３】
（２）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１−（３）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏを使用し、ＡＩＣとして実施例１５−（１）で調製したＰＢＭＣ  ＡＩＣを使用した。
培養開始１日目に、各ウェルに０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏを１ｍＬずつ添加し、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。３日目に、各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。７日目に、各ウェルの細胞液を０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏを用いて６倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに希釈した細胞液１．６７４ｍＬを移した。１０日目に、各ウェルの細胞液を０．８ＨＧＴ−Ｔ５０２を用いて５倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに希釈した細胞液２ｍＬを移した。各継代日に各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始１４日目の細胞を５ＨＲＰＭＩを用いて１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう調製し、インターフェロン（ＩＦＮ）アルファ（製剤名  スミフェロン：大日本住友製薬；以下、ＩＦＮ−αと記載する）を終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１時間静置した。この細胞液を洗浄した後、５ＨＲＰＭＩで懸濁した（ＩＦＮα処理）。この際、ＩＦＮ−αを添加しない群（ＩＦＮα未処理）も作製した。【０１８４】
（３）細胞傷害活性の測定
実施例１５−（２）で調製した培養開始後１４日目の細胞について、実施例１−（５）と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。ただし、標的細胞としてＫ５６２、Ａ５４９及びＨＴ２９を使用し、Ｅ／Ｔ比１０、３、１及び０．３について測定を行った。細胞傷害活性測定の結果を表３１に示す。【０１８５】
【表３１】
2011030851.tif 000034
【０１８６】
表３１に示されるように、ＯＫ−４３２及びＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを用いた培養により得られた細胞集団をＩＦＮ−αで処理することによって、各種の標的細胞に対しての細胞傷害活性が増強されることが明らかとなった。また、この細胞集団は、その活性がＮＫ細胞感受性細胞株として知られるＫ５６２のみならず、様々な癌細胞株に対して細胞傷害活性を発揮する高機能性ＮＫ細胞であることが確認された。【０１８７】
実施例１６  ＯＫ−４３２及び温熱処理細胞を用いたＮＫ細胞培養（温熱処理細胞数の比較)
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例３−（１）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。  【０１８８】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例３−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。【０１８９】
（３）ＲＮ−Ｔを用いた温熱処理細胞の調製
実施例１６−（２）で培養したＲＮ−Ｔを５ＨＲＰＭＩで５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製し、１．５ｍＬチューブ（ワトソン社製又はトレフ社製）に０．６ｍＬずつ移し、４５℃で１時間ウォーターバスを用いて温熱処理を行った。処理した細胞液を回収、遠心した後、上清を除去し、０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏで２、４及び１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにそれぞれ調整した（以下、この温熱処理後のＲＮ−Ｔ細胞を温熱処理ＲＮ−Ｔと記載する）。【０１９０】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１２−（４）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養開始時には１２穴細胞培養プレートに、Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞及び実施例１６−（３）で各細胞濃度に調整した温熱処理ＲＮ−Ｔを０．９５ｍＬ／ウェルずつ添加し、計１．９ｍＬ／ウェルとした。この際、温熱処理ＲＮ−Ｔ条件及びＯＫ−４３２のみを添加する群（以下、対照群と記載）を設定した。実施例１２−（４）における１３日目の操作を当該実施例においては１４日目に行い、１８日目まで培養を継続した。培養用基本培地として、培養開始時７日目までは０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏを使用し、１１日目には０．８ＨＧＴ−Ｔ５０２を、１４日目には０．３ＨＧＴ−Ｔ５０２を使用した。培養開始後１８日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例１−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞含有比率を解析した。結果を表３２に示す。【０１９１】
【表３２】
2011030851.tif 000035
【０１９２】
表３２に示されるように、ＯＫ−４３２及び温熱処理ＲＮ−Ｔを使用することで、温熱処理ＲＮ−Ｔ添加群は、対照群と比較して高い拡大培養率及びＮＫ細胞含有比率が得られた。また、これらの効果は培養開始時のＲｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞に対する温熱処理ＲＮ−Ｔとの比に限定されるものではなく、広範囲の条件で効果が確認された。
すなわち、ＮＫ細胞培養時にＯＫ−４３２及び温熱処理ＲＮ−Ｔを組み合わせることで高い拡大培養率で高純度のＮＫ細胞が得られることが明らかとなった。【０１９３】
実施例１７  ＮＫ細胞の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）測定
（１）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１６−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養開始時にはＲｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞及び実施例５−（３）と同様の方法で調製したＡＩＣを０．９５ｍＬ／ウェルずつ添加し、計１．９ｍＬ／ウェルとした。２０日目まで培養を継続し、１８日目には血清を含まないＧＴ−Ｔ５０２を用いて２倍希釈した後、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。【０１９４】
（２）ＮＫ細胞の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）測定
実施例１−（５）と同様の方法で実施例１７−（１）で調製した培養開始２０日目の細胞について、細胞傷害活性を測定した。ただし、乳癌細胞株であるＢＴ−４７４、ＳＫＢＲ３、及び胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７を使用し、１％ＢＳＡ／ＤＰＢＳを用いて１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう調製した各細胞株にトラスツズマブ製剤（製剤名  ハーセプチン注射用：中外製薬社製）を終濃度１０μＬ／ｍＬとなるよう添加し、４℃で３０分間インキュベートした。これを遠心、洗浄した後、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で調製した細胞液を標的細胞とした。この際、Ｅ／Ｔ比は１０、３及び１とし、トラスツズマブ製剤を添加しない群も作製した。細胞傷害活性測定の結果を表３３に示す。【０１９５】
【表３３】
2011030851.tif 000036
【０１９６】
トラスツズマブ製剤は、がん遺伝子として働くＨｅｒ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ２）結合抗体であり、ＮＫ細胞のＦｃ受容体（ＣＤ１６分子等）を介した抗体依存性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）を惹起する。表３３に示されるように、ＯＫ−４３２及びＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを用いた培養により得られた細胞集団は、トラスツズマブ製剤で処理した各種標的細胞に対して、さらに高い細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。また当該実施例で使用した細胞株はＨｅｒ２高発現株であり、これらの細胞集団が様々なＨｅｒ２発現癌細胞株に対し高い抗体依存性細胞傷害活性を発揮する高機能性ＮＫ細胞であることが確認された。【０１９７】
実施例１８  ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養（添加ＡＩＣ量の比較）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例３−（１）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。ただし、抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン固定化プレートは、使用直前にＤＰＢＳで２回、ＧＴ−Ｔ５５１で１回洗浄した。【０１９８】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例３−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。【０１９９】
（３）ＲＮ−Ｔを用いたＡＩＣの調製
実施例１８−（２）で調製したＲＮ−Ｔを用いて、実施例３−（３）と同様の方法でＡＩＣを調製した。ただし、培養開始７日目に回収したＲＮ−Ｔは、Ｘ線照射後０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏに懸濁して、以下の実験に使用した。【０２００】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１２−（４）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、添加するＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ細胞数をＲｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞に対して１倍、５倍及び１０倍にそれぞれ設定し、全ての群にＯＫ−４３２を添加した。また、培養用基本培地として、培養開始時から１１日目までは０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏを使用し、実施例１２−（４）における４、７及び１３日目の操作を当該実施例では５、８及び１５日目にそれぞれ行った。培養開始後１８日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例１−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞含有比率を解析した。結果を表３４に示す。【０２０１】
【表３４】
2011030851.tif 000037
【０２０２】
表３４に示されるように、添加するＲＮ−Ｔ  ＡＩＣの比率を５倍又は１０倍と増やすことによって、高い拡大培養率及びＮＫ細胞含有比率(％)が得られた。
すなわち、ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ量依存的にＮＫ細胞の増殖性が高くなることが明らかとなり、ＮＫ細胞培養時においてＲＮ−Ｔ  ＡＩＣが好適に使用されることが明らかとなった。【０２０３】
実施例１９  ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いて培養したＮＫ細胞の凍結・解凍後の細胞傷害活性測定
（１）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例１４−（１）と同様の方法で、抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養を行った。【０２０４】
（２）ＲＮ−Ｔを用いたＡＩＣの調製
実施例１９−（１）で調製したＲＮ−Ｔを用いて、実施例１４−（２）と同様の方法でＡＩＣを調製した。【０２０５】
（３）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１４−（３）と同様の方法でＮＫ細胞集団の拡大培養を行った。【０２０６】
（４）ＮＫ細胞の保存
実施例１９−（３）で調製した１６日目の細胞を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｖｉａｌとなるように実施例１−（１）と同様にＣＰ−１／ＨＳＡを用いて液体窒素中にて保存した。【０２０７】
（５）ＮＫ細胞の解凍
実施例１９−（４）で凍結保存した細胞を３７℃のウォーターバスで急速解凍後ＧＴ−Ｔ５０２を用いて洗浄した。これらの細胞を約２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．２Ｈ  ＧＴ−Ｔ５０３を用いて調整し、１２穴細胞培養プレートに４ｍＬずつ添加した。また、これらのプレートにＩＬ−２を０（非添加群）、２００又は１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で一晩インキュベーションした。【０２０８】
（６）ＮＫ細胞の細胞傷害活性の測定
実施例１９−（３）及び（５）で調製した細胞を用いて、実施例１−（５）と同様の方法により標的細胞Ａ５４９及びＡ３７５に対して凍結保存前後の細胞傷害活性を測定した。ただし、Ｅ／Ｔ比は１０とした。結果を表３５に示す。【０２０９】
【表３５】
2011030851.tif 000038
【０２１０】
表３５に示されるように、ＮＫ細胞は凍結・解凍直後に一旦細胞傷害活性が低下するものの、一晩培養することによって凍結・解凍直後と比較して同等の細胞傷害活性が得られた。また、その活性は、ＩＬ−２を添加して培養することによってさらに増強され、凍結前の活性を上回る高い細胞傷害活性を示した。
すなわち、凍結解凍後のＮＫ細胞を一晩培養することにより活性が回復し、更にＩＬ−２を添加することによって細胞傷害活性が高くなることが明らかとなった。【０２１１】
実施例２０  ＯＫ−４３２及び温熱処理細胞を用いたＮＫ細胞培養（温熱処理条件の比較−１）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例１８−（１）と同様の方法で、抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【０２１２】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例３−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。【０２１３】
（３）ＲＮ−Ｔを用いた温熱処理細胞の調製
実施例２０−（２）で調製したＲＮ−Ｔを、実施例１６−（３）と同様の方法で温熱処理ＲＮ−Ｔを調製した。ただし、温熱処理時の温度は４５及び４８℃とし、処理時間は０．５、１、２又は４時間を設定し、処理時の細胞濃度は０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏで２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整した。【０２１４】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１２−（４）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、ＡＩＣの代わりに温熱処理ＲＮ−Ｔを用いＯＫ−４３２添加を組み合わせた群、及びＯＫ−４３２のみを添加する群（以下、対照群と記載する）を設定した。実施例１２−（４）での１及び１３日目の操作を当該実施例においては２及び１４日目にそれぞれ行い、培養開始後１６日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例１−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞含有比率を解析した。結果を表３６に示す。【０２１５】
【表３６】
2011030851.tif 000039
【０２１６】
表３６に示されるように、ＯＫ−４３２及び温熱処理したＲＮ−Ｔを使用することで、温熱処理細胞無添加群（対照群）と比較して、高い拡大培養率及びＮＫ細胞含有比率（％）が得られた。また、温熱処理時の温度及び時間は特に限定されるものではなく、広範囲の処理条件で所望の効果が確認された。
すなわち、ＮＫ細胞培養時にＯＫ−４３２及びＲＮ−Ｔ温熱処理細胞を組み合わせることで、高い拡大培養率で高純度のＮＫ細胞が得られることが明らかとなった。【０２１７】
実施例２１  ＯＫ−４３２及び温熱処理細胞を用いたＮＫ細胞培養（温熱処理条件の比較−２）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例１８−（１）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【０２１８】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例３−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。【０２１９】
（３）ＲＮ−Ｔを用いた温熱処理細胞の調製
実施例２１−（２）で調製したＲＮ−Ｔを、１又は２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＧＴ−Ｔ５５１を用いて懸濁した。２００ｍＬ分離バッグ（テルモ社製）に調製した細胞液５０ｍＬを移し、４５℃で０．２５又は０．５時間ウォーターバスを用いて温熱処理を行った。ただし、細胞濃度２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの条件では、４５℃で０．５時間の温熱処理のみ行った。温熱処理後の細胞液を５０ｍＬコニカルチューブ（コーニング社製）に回収し、４４０×ｇ、室温で５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏに２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞を懸濁した。【０２２０】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１２−（４）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養開始時には１２穴細胞培養プレートに、Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞及び実施例２１−（３）で調製した温熱処理ＲＮ−Ｔを０．９５ｍＬ／ウェルずつ添加し、計１．９ｍＬ／ウェルとした。３日目に、各ウェルに０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏ１．９ｍＬを添加した。７日目に、各ウェルの細胞液を０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏを用いて６倍希釈し、新しいＴ２５細胞培養フラスコ（ファルコン社製またはコーニング社製）に細胞液１．４ｍＬを移し、立てて培養した。同様の継代操作を１１日目及び１４日目に実施し、１７日目まで培養を継続した。なお、１１日目び１４日目の細胞液の希釈は、それぞれ０．８ＨＧＴ−Ｔ５０２による５倍希釈、０．２９ＨＧＴ−Ｔ５０２による３倍希釈とした。培養開始後１７日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例１−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞含有比率を解析した。結果を表３７に示す。【０２２１】
【表３７】
2011030851.tif 000040
【０２２２】
表３７に示されるように、ＯＫ−４３２のみを添加し、温熱処理細胞を添加しなかった対照群と比較して、ＯＫ−４３２及び温熱処理したＲＮ−Ｔを添加した群では、温熱処理時の時間及び細胞濃度が特に限定されることなく、広範囲の処理条件で所望の効果が確認された。
すなわち、ＮＫ細胞培養時にＯＫ−４３２及びＲＮ−Ｔ温熱処理細胞を組み合わせることによって、高い拡大培養率と高純度のＮＫ細胞が得られることが明らかとなった。【０２２３】
実施例２２  ＮＫ細胞を用いたマルチファンクション能の測定
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例１８−（１）と同様の方法で、抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【０２２４】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例３−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。【０２２５】
（３）ＲＮ−Ｔを用いたＡＩＣの調製
実施例１８−（３）と同様の方法で、ＡＩＣの調製を行った。【０２２６】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例２１−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、温熱処理細胞の代わりに実施例２２−（３）で調製したＡＩＣを使用し、実施例２１−（４）における３日目の操作を当該実施例では２日目に行い、培養を２２日目まで継続した。【０２２７】
（５）ＮＫ細胞のマルチファンクション能の測定
実施例２２−（４）で調製した培養開始後２２日目の細胞を、エフェクター細胞として３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩで希釈後、９６穴細胞培養プレートの各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注しておき、これらに１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した標的細胞（Ｋ５６２）を１００μＬ／ウェルずつ添加した。この際、標的細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の比、すなわちＥ／Ｔ比は、３とした。ＰＥ／Ｃｙ５標識マウスＣＤ１０７ａ抗体（ａｂｃａｍ社製）を１μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃１時間インキュベーションした。さらに、ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（シグマ社製）を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加後、３７℃３時間インキュベーションした。インキュベーション後のプレートを２５０×ｇ、５分遠心し、上清を除去後、１％ＢＳＡ／ＤＰＢＳ中に懸濁し、ＥＣＤ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体及びＰＣ７標識マウス抗ヒトＣＤ５６抗体（全てベックマンコールター社製）を添加した。同様に、各細胞集団の一部には、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１（ベックマンコールター社製）を添加した。各々の抗体を添加した後で、４℃で３０分インキュベートし、その後、細胞を０．１％ＢＳＡ／ＤＰＢＳで洗浄した。細胞内サイトカイン測定のために、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ（ベックマンコールター社製）を使用した。細胞の固定化及び膜透過処理を目的としてＩｎｔｒａＰｒｅｐＲｅａｇｅｎｔを使用した後、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＴＮＦ−α抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）及びＰＥ標識マウス抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（ベックマンコールター社製）を添加した。各々の抗体を添加した後で、室温で１５分インキュベートした。インキュベーション後のプレートを２５０×ｇ、５分遠心し、上清を除去後、０．１％ＢＳＡ／ＤＰＢＳで懸濁した。これらの細胞をフローサイトメトリーに供し、ＣＤ３陰性及びＣＤ５６陽性細胞群をＮＫ細胞として、ＮＫ細胞中のＣＤ１０７ａ、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ陽性率を算出して、マルチファンクション能の解析を行った。ＣＤ１０７ａ、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γのうち３つを同時に発現する細胞を＋＋＋、うち２つを発現する細胞を＋＋、うち１つを発現する細胞を＋、いずれも発現しない細胞を−として、マルチファンクション性を解析した。結果を表３８に示す。【０２２８】
【表３８】
2011030851.tif 000041
【０２２９】
表３８に示されるように、ＮＫ細胞を標的細胞と混合することで、マルチファンクション能が上がることが確認された。
すなわち、当該培養法で培養したＮＫ細胞は高い多機能性を有し、その機能は腫瘍細胞と混合した際さらに高くなることが明らかとなり、機能性の高いＮＫ細胞であることが示された。【０２３０】
実施例２３  ＯＫ−４３２及びマイトマイシン処理細胞を用いたＮＫ細胞培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例１８−（１）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【０２３１】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例３−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。【０２３２】
（３）ＲＮ−Ｔを用いたマイトマイシンＣ処理細胞の調製
実施例２３−（２）で調製したＲＮ−Ｔを、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩを用いて懸濁した。１５ｍＬコニカルチューブ（コーニング社製）に調製した細胞液５ｍＬを移し、マイトマイシンＣ（製剤名：マイトマイシン協和Ｓ、協和発酵キリン社製）を終濃度１０又は２０μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で０．５又は１．０時間インキュベーションした。反応後、４４０×ｇ、室温で５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、５ＨＲＰＭＩを用いて同様に２回洗浄を行った後、０．８％ＨＣｅｌｌＧｒｏを用いて２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整した。【０２３３】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例２１−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、温熱処理細胞の代わりにマイトマイシンＣ処理細胞条件群を設定した。また、対照群はＯＫ−４３２のみ添加した。実施例２１−（４）における３日目の操作を当該実施例では１日目に行い、培養を１８日目まで継続した。培養開始後１８日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例１−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞含有比率を解析した。結果を表３９に示す。【０２３４】
【表３９】
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【０２３５】
表３９に示されるように、ＯＫ−４３２のみを添加し、マイトマイシンＣ処理細胞を添加しなかった対照群と比較して、ＯＫ−４３２及びマイトマイシンＣ処理したＲＮ−Ｔを添加した群ではマイトマイシンＣ処理時の濃度及び時間は特に限定されることなく、広範囲の処理条件で所望の効果が確認された。
すなわち、ＮＫ細胞培養時にＯＫ−４３２及びマイトマイシンＣ処理ＲＮ−Ｔ細胞を組み合わせることで、高い拡大培養率で高純度のＮＫ細胞が得られることが明らかとなった。【０２３６】
実施例２４  ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養（ＡＩＣ処理細胞の比較）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例１８−（１）と同様の方法で、抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。また、抗ヒトＣＤ３抗体のみを固定化するプレートも作製した。【０２３７】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞及び抗ＣＤ３抗体刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例３−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。また、同様に、実施例２４−（１）で作製した抗ヒトＣＤ３抗体のみを固定化したプレートを用いて、抗ＣＤ３抗体刺激により拡大培養したＴ細胞（以下ＯＫＴ３−Ｔと記載）も調製した。【０２３８】
（３）ＲＮ−Ｔ及びＯＫＴ３−Ｔを用いたＡＩＣの調製
実施例１８−（３）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣの調製を行った。この際、実施例２４−（２）で調製したＯＫＴ３−Ｔを用いて、ＡＩＣを同様に調製した（以下、ＯＫＴ３−Ｔ  ＡＩＣと記載する）。【０２３９】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例２３−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、実施例２４−（３）で調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ、ＯＫＴ３−Ｔ  ＡＩＣ、又は実施例１−（２）と同様の方法で調製したＰＢＭＣ  ＡＩＣを初日に添加する群も設定した。また、培養７日目にもＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ、ＯＫＴ３−Ｔ  ＡＩＣ又はＰＢＭＣ  ＡＩＣを１×１０６ｃｅｌｌｓ／フラスコずつ添加した。また、ＯＫ−４３２のみを添加したものを対照群とした。培養開始後１８日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例１−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞含有比率を解析した。結果を表４０に示す。【０２４０】
【表４０】
2011030851.tif 000043
【０２４１】
表４０に示されるように、ＰＢＭＣ  ＡＩＣを用いた場合と比較して、ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣ又はＯＫＴ３−Ｔ  ＡＩＣを用いた群では、高い拡大培養率とＮＫ細胞含有比率が得られた。
すなわち、ＮＫ細胞培養時に用いるＡＩＣをＯＫＴ３−Ｔ又はＲＮ−Ｔにすることによって、高い拡大培養率で高純度のＮＫ細胞が得られることが明らかとなった。
また、ＡＩＣを調製するためにＰＢＭＣを使用することはその分血液を多量に必要とするが、少量の血液から拡大培養したＯＫＴ３−Ｔ又はＲＮ−Ｔを使用することで、患者本人への肉体的負担を低減しながら、より純度の高い高機能ＮＫ細胞を大量に得ることができる。よって、当該発明により、より肉体的負担の少ないＮＫ拡大培養技術が利用可能となる。【０２４２】
実施例２５  ＯＫ−４３２及び温熱処理細胞を用いたＮＫ細胞培養（温熱処理細胞の比較）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例２４−（１）と同様の方法で、抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレート、ならびに抗ヒトＣＤ３抗体のみを固定化するプレートを作製した。【０２４３】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞及び抗ＣＤ３抗体刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例２４−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔ及びＯＫＴ３−Ｔの拡大培養を行った。【０２４４】
（３）ＲＮ−Ｔ及びＯＫＴ３−Ｔを用いた温熱処理細胞の調製
実施例１６−（３）と同様の方法で、温熱処理細胞の調製を行った。この際、実施例２５−（２）で調製したＯＫＴ３−Ｔを用いて同様に温熱処理細胞を調製した（以下、温熱処理ＯＫＴ３−Ｔ細胞と記載する）。【０２４５】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例２４−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、実施例２５−（３）で調製した温熱処理ＲＮ−Ｔ細胞及び温熱処理ＯＫＴ３−Ｔ細胞を使用するか、または対照群としてＯＫ４３２のみ添加する群も設定した。培養開始後１８日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例９−（６）と同様の方法で、ＮＫ細胞含有比率及びＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率を解析した。結果を表４１に示す。【０２４６】
【表４１】
2011030851.tif 000044
【０２４７】
表４１に示されるように、温熱処理ＯＫＴ３−Ｔ細胞を用いた場合と比較して、温熱処理ＲＮ−Ｔ細胞を用いた群では、高い拡大培養率及びＮＫ細胞含有比率、ならびに１６陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率が得られた。
すなわち、ＮＫ細胞培養時に用いる温熱細胞をＲＮ−Ｔにすることによって、より高い拡大培養率で高純度、高機能のＮＫ細胞が得られることが明らかとなった。【０２４８】
実施例２６  免疫不全マウス異種腫瘍モデルを用いたヒトＮＫ細胞の抗腫瘍活性の評価
（１）マウスと群構成
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス（日本クレア社製）７週齢、雌１６匹を、以下の表４２に示す群構成とした。ヒトＮＫ細胞投与群はＢ−Ｄ群である。なお、各群はＮ＝４とした。【０２４９】
【表４２】
2011030851.tif 000045
【０２５０】
（２）抗アシアロＧＭ１抗体の投与
抗アシアロＧＭ１抗体処理は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおいてマウスＮＫ細胞を除去し、ヒト細胞の生着を高めることが知られている。Ａ５４９の接種前日及びヒトＮＫ細胞１回目投与前日に、抗アシアロＧＭ１抗体溶液（和光純薬社製）２０μＬを０．４％ＨＳＡ含有生理食塩水（大塚製薬社製）０．３８ｍＬで希釈し、全量をマウスの腹腔内に投与した。【０２５１】
（３）ＮＯＤ／ｓｃｉｄ−Ａ５４９の異種腫瘍モデル
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの全群にＸ線照射（３Ｇｙ）し、麻酔下で右鼠蹊部を９平方センチメントール程剃毛し、ＲＰＭＩ１６４０培地に５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製したＡ５４９を０．１ｍＬ皮下接種した。【０２５２】
（４）投与ヒトＮＫ細胞の培養・調製
実施例１４−（３）と同様の方法で、ヒトＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養１６日目に、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、１８日目に、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａ内の細胞液３３８ｍＬを０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を用いて総液量を６７５ｍＬとした後、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａに移し替えた。培養は、２１日目まで継続した。【０２５３】
（５）ヒトＮＫ細胞の投与
腫瘍接種７日後、９日後及び１２日後の計３回、以下の処置を行った。
Ａ群には、４％ＨＳＡ含有生理食塩水を０．３ｍＬ尾静脈投与した。Ｂ群には、４％ＨＳＡ含有生理食塩水にて３．３３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したヒトＮＫ細胞を０．３ｍＬ尾静脈投与した。Ｃ群には、実施例（１５）−２と同様の方法でＩＦＮα処理を行ったヒトＮＫ細胞を４％ＨＳＡ含有生理食塩水にて３．３３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、０．３ｍＬ尾静脈投与した。Ｄ群には、４％ＨＳＡ含有生理食塩水にて１．００×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したヒトＮＫ細胞を０．１ｍＬ腫瘍内投与した。【０２５４】
（６）ＮＯＤ／ｓｃｉｄ−Ａ５４９の異種腫瘍モデルにおけるヒトＮＫ細胞投与後の抗腫瘍活性の評価
各個体における腫瘍体積を腫瘍接種後４２日目に、電子ノギスを用いて測定した。その結果を表４３に示す。
腫瘍体積を、以下の式（３）：【０２５５】
【数３】
2011030851.tif 000046
［式中、Ｒ１は短直径、Ｒ２は長直径を表す］
を用いて算出した。【０２５６】
【表４３】
2011030851.tif 000047
【０２５７】
また、各個体における腫瘍接種後４２日目の腫瘍重量を測定した。結果を表４４に示す。【０２５８】
【表４４】
2011030851.tif 000048
【０２５９】
表４３及び４４に示されるように、当該培養法で拡大培養したヒトＮＫ細胞を投与した群は、コントロール群（Ａ群）と比較して腫瘍体積及び重量ともに小さく、高い抗腫瘍活性を有することが明らかとなった。この効果は、ヒトＮＫ細胞をＩＦＮαで処理して投与することにより増強された。また、腫瘍内投与を行った場合、より顕著な抗腫瘍活性が示され、当該培養法で拡大培養したヒトＮＫ細胞の高い有効性が認められた。
以上の結果により、当該培養法で培養したヒトＮＫ細胞投与による治療が極めて有効であることが確認された。【０２６０】
実施例２７  免疫不全マウス異種腫瘍転移モデルを用いたヒトＮＫ細胞の転移抑制活性の評価
（１）マウスと群構成
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス７週齢、雌２０匹を、以下の表４５に示す群構成とした。ヒトＮＫ細胞投与群はＢ−Ｅ群である。なお、各群はＮ＝４とした。【０２６１】
【表４５】
2011030851.tif 000049
【０２６２】
（２）抗アシアロＧＭ１抗体の投与
Ａ５４９接種前日に、抗アシアロＧＭ１抗体溶液２０μＬを０．４％ＨＳＡ含有生理食塩水０．３８ｍＬで希釈し、全量をマウスの腹腔内に投与した。【０２６３】
（３）ＮＯＤ／ｓｃｉｄ−Ａ５４９の異種腫瘍転移モデル
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの全群にＸ線照射（３Ｇｙ）し、ＲＰＭＩ１６４０培地に６．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製したＡ５４９を０．３ｍＬ尾静脈投与した。【０２６４】
（４）ヒトＮＫ細胞の培養
実施例２６−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養２１日目に、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｅｖａ内の細胞液３３８ｍＬを０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を用いて総液量を６７５ｍＬとした後、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養は２３日目まで継続した。【０２６５】
（５）投与用細胞の調製
培養開始１８日目、２１日目及び２３日目の細胞を、実施例１５−（２）と同様の方法でＩＦＮαで処理した群を作製した（ＩＦＮ−α処理ＮＫ細胞）。ただし、ＧＴ−Ｔ５０３で５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう調製した細胞液を用いてＩＦＮα処理をした。同様に、ＩＬ−２を終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加するか（ＩＬ−２処理ＮＫ細胞）又はＩＦＮ−αとＩＬ−２をそれぞれ終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加（ＩＦＮα＋ＩＬ−２処理ＮＫ細胞）する条件を設定し、それぞれ３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１時間静置した。その他に、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１時間静置のみの条件を設定した。
ヒトＮＫ細胞及び各処理ヒトＮＫ細胞を、４％ＨＳＡ含有生理食塩水を用いて３．３３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。【０２６６】
（６）ヒトＮＫ細胞の投与
腫瘍投与したのち、３日後、６日後及び８日後の計３回、以下の処置を行った。
Ａ群には、４％ＨＳＡ含有生理食塩水を０．３ｍＬ尾静脈投与した。Ｂ群にはヒトＮＫ細胞を、Ｃ群にはＩＦＮα処理ヒトＮＫ細胞を、Ｄ群にはＩＬ−２処理ヒトＮＫ細胞を、Ｅ群にはＩＦＮα＋ＩＬ−２処理ヒトＮＫ細胞を、それぞれ０．３ｍＬ尾静脈投与した。【０２６７】
（７）ＮＯＤ／ｓｃｉｄ−Ａ５４９の異種腫瘍転移モデルにおけるヒトＮＫ細胞投与後の抗腫瘍活性の評価
各個体における腫瘍投与後３１日目の肝重量を測定した。その結果を表４６に示す。【０２６８】
【表４６】
2011030851.tif 000050
【０２６９】
表４６に示されるように、当該培養法で拡大培養したヒトＮＫ細胞を投与した群は、コントロール群と比較して肝重量が低く、高い転移抑制活性を有することが明らかとなった。以上の結果により、当該培養法で培養したヒトＮＫ細胞投与による治療が極めて有効であることが確認された。【０２７０】
実施例２８  ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞拡大培養法とＯＫＴ−３を用いたＮＫ細胞拡大培養法との比較
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートの作製
実施例１８−（１）と同様の方法で、抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【０２７１】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例３−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。【０２７２】
（３）ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣの調製
実施例１８−（３）と同様の方法でＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを調製した。【０２７３】
（４）ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１−（１）と同様の方法でＰＢＭＣの分離を行い、凍結保存を実施せずにＮＫ細胞拡大培養に使用した。分離したＰＢＭＣを０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏで２×１０６ｃｅｌｌｓとなるように調製し、０．２５ｍＬずつ４８穴細胞培養プレート（コーニング社製）に添加した。実施例２８−（３）で調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを０．２５ｍＬずつ添加し、ＯＫ−４３２を終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬ、ＩＬ−２を終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、培養を開始した。
培養開始２日目に、プレートの各ウェルに０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏを０．５ｍＬずつ添加し、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。４日目に、各ウェルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。７日目には、各ウェルの細胞液を０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏを用いて６倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに希釈した細胞液１．５９６ｍＬを移した。１１日目に、各ウェルの細胞液を０．８ＨＧＴ−Ｔ５０２を用いて５倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに希釈した細胞液１．３３０ｍＬを移した。１４日目には、０．３ＨＧＴ−Ｔ５０２を用いて３倍希釈し、新しい２４穴細胞培養プレートに希釈した細胞液２．０ｍＬを移し、１８日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をＡ法と記載する。【０２７４】
（５）ＯＫＴ−３を用いたＮＫ細胞集団の拡大培養
（参考文献  Ａｌｉｃｉら、ＢＬＯＯＤ、２００８年、第１１１巻、第３１５５−３１６２頁、及び米国公開第２００３/００６８３０６号公報）
実施例１−（１）と同様の方法でＰＢＭＣの分離を行い、凍結保存を実施せずにＮＫ細胞拡大培養に使用した。分離したＰＢＭＣを、５ＨＣｅｌｌＧｒｏで０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整し、１ｍＬずつ４８穴細胞培養プレートに添加した。ＯＫＴ−３を終濃度１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２を終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、培養を開始した。
培養５日目に細胞を５００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を捨て、２ｍＬの５ＨＣｅｌｌＧｒｏで懸濁した。全量を新しい２４穴細胞培養プレートに添加後、ＩＬ−２を終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。培養７日目、９日目、１１日目、１３日目及び１５日目に細胞液１ｍＬを新しい２４穴細胞培養プレートに移し、１ｍＬの５ＨＣｅｌｌＧｒｏを添加した後、ＩＬ−２を終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。１８日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をＢ法と記載する。【０２７５】
（６）表面抗原の解析
実施例２８−（４）及び実施例２８−（５）のＮＫ細胞集団の拡大培養において、実施例１４−（４）と同様の方法で、Ｔ細胞含有比率、ＮＫ細胞含有比率、ＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率及びＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率を解析した。結果を表４７に示す。【０２７６】
【表４７】
2011030851.tif 000051
【０２７７】
表４７に示されるように、培養後のＮＫ細胞の比率はＡ法の方が顕著に高く、さらに高い比率でＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄが発現しており、抗体依存性細胞傷害活性の発揮に重要な役割を果たすＣＤ１６分子を発現する高機能性ＮＫ細胞及びＮＫＧ２Ｄを介した高い細胞傷害活性を示す高機能性ＮＫ細胞を高含有することが確認された。【０２７８】
（７）細胞傷害活性の測定
実施例２８−（４）及び実施例２８−（５）で調製した培養開始後１８日目の細胞について、実施例１４−（５）と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。結果を表４８に示す。【０２７９】
【表４８】
2011030851.tif 000052
【０２８０】
表４８に示すように、Ａ法で得られた細胞集団は、各種の標的細胞に対して、Ｂ法で得られた細胞集団よりも高い細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。またその活性の差は、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ発現細胞株Ａ５４９に対して顕著に確認され、様々な癌細胞株に対して細胞傷害活性を発揮する高機能性ＮＫ細胞であることが確認された。
すなわち本発明の方法により拡大培養されたＮＫ細胞集団は、他の培養法と比較して、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞の純度が高く、高い比率でＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄを発現しており、高い細胞傷害性を有する高機能性ＮＫ細胞集団であることが明らかとなった。【０２８１】
実施例２９  純化したＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートの作製
実施例１８−（１）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【０２８２】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例３−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。【０２８３】
（３）ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣの調製
実施例１８−（３）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを調製した。【０２８４】
（４）ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞の純化
実施例１−（１）と同様の方法でＰＢＭＣの分離を行い、凍結保存を実施せずにＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞の純化に使用した。５×１０７個の細胞を０．４ｍＬの０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、ナカライテスク社製）を添加したＤＰＢＳ（以下セレクションバッファーと記載）に懸濁し、０．１ｍＬのＣＤ３マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を添加し、４℃で１５分間インキュベートした。セレクションバッファーを５ｍＬ添加し、３００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清を除き、０．５ｍＬのセレクションバッファーに懸濁した。あらかじめ磁場に固定し、３ｍＬのセレクションバッファーを通したＬＳカラム（ミルテニーバイオテク社製）に細胞懸濁液を通し、３ｍＬのセレクションバッファーでカラムを３回洗浄することで、カラムへの非結合画分を回収し、３．５×１０７個のＣＤ３陰性細胞を得た。【０２８５】
得られたＣＤ３陰性細胞を０．２８ｍＬのセレクションバッファーに懸濁し、７０μＬのＣＤ５６マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を添加し、４℃で１５分間インキュベートした。セレクションバッファーを５ｍＬ添加し、３００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清を除き、０．５ｍＬのセレクションバッファーに懸濁した。あらかじめ磁場に固定し、０．５ｍＬのセレクションバッファーを通したMＳカラム（ミルテニーバイオテク社製）に細胞懸濁液を通し、０．５ｍＬのセレクションバッファーでカラムを３回洗浄した。カラムを磁場からはずし、１ｍＬのセレクションバッファーをカラムに通すことで、７．２×１０６個のＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞を得た。【０２８６】
（５）ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例２９−（４）で純化したＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞を０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏで２×１０６ｃｅｌｌｓとなるように調製し、０．２５ｍＬずつ４８穴細胞培養プレートに添加した。ＡＩＣは添加又は非添加条件で実施し、添加条件では実施例２９−（３）で調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを０．２５ｍＬずつ添加し、非添加条件では０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏを０．２５ｍＬずつ添加した。ＯＫ−４３２を終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬ、ＩＬ−２を終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、培養を開始した。
培養開始２日目以降、培養を実施例２８−（４）と同様に実施した。当該実施例において、以下、本法をＡ’法と記載する。【０２８７】
（６）Ｘ−ＶＩＶＯ  １０培地（Ｌｏｎｚａ社製）を用いたＮＫ細胞集団の拡大培養
（参考文献Ｋｏｅｈｌら、ＢＬＯＯＤ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００４年、第３３巻、第２６１−２６６頁）
実施例２９−（４）で純化したＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞を、１０％ヒトＡＢ型血清を含むＸ−ＶＩＶＯ  １０培地（以下１０ＨＸ−ＶＩＶＯと記載）で１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製し、０．５ｍＬずつ４８穴細胞培養プレートに添加した。ＩＬ−２を終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、培養を開始した。
培養３日目に０．５ｍＬの１０ＨＸ−ＶＩＶＯを添加し、ＩＬ−２を終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。培養６日目に細胞液全量を新しい２４穴細胞培養プレートに移した後、１ｍＬの１０ＨＸ−ＶＩＶＯを添加し、ＩＬ−２を終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。９日目、１２日目及び１５日目に培養上清１ｍＬを除去し、１ｍＬの１０ＨＸ−ＶＩＶＯを添加した後、ＩＬ−２を終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。１８日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をＣ法と記載する。【０２８８】
（７）細胞数測定及び表面抗原の解析
実施例２９−（５）及び実施例２９−（６）のＮＫ細胞集団の拡大培養において、培養開始後１８日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。また、実施例１４−（４）と同様の方法で、Ｔ細胞含有比率、ＮＫ細胞含有比率、ＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率及びＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率を解析した。結果を表４９に示す。【０２８９】
【表４９】
2011030851.tif 000053
【０２９０】
表４９に示されるように、純化した末梢血ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞を用いた培養における拡大培養率は、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０培地を用いた拡大培養法（Ｃ法）に比べてＯＫ−４３２を用いた拡大培養法（Ａ’法）の方が顕著に高かった。Ａ’法においてＡＩＣを用いた条件でより高い拡大培養率となった。また、培養後のＮＫ細胞の比率及びＮＫＧ２Ｄ発現率はＡ’法とＣ法で同等であったが、抗体依存性細胞傷害活性の発揮に重要な役割を果たすＣＤ１６分子の発現はＡＩＣの有無に関わらずＡ’法の方が高く、高い細胞傷害活性を示す高機能性ＮＫ細胞を高含有することが確認された。【０２９１】
（８）細胞傷害活性の測定
実施例２９−（５）及び実施例２９−（６）で調製した培養開始後１８日目の細胞について、実施例１−（５）と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。ただし、標的細胞としてＡ５４９を使用し、Ｅ／Ｔ比１０、３、１及び０．３について測定を行った。細胞傷害活性測定の結果を表５０に示す。【０２９２】
【表５０】
2011030851.tif 000054
【０２９３】
表５０に示すように、Ａ’法で得られた細胞集団は、ＡＩＣの使用の有無に関わらず、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ発現細胞株Ａ５４９に対してＣ法よりも高い細胞障害活性を示すことが明らかとなった。
すなわち、本発明によるＮＫ細胞拡大培養では、培養開始細胞として純化した末梢血ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞を用いた場合においても、他の培養法と比較して顕著に高い拡大培養率を示し、高い細胞傷害性を有するＮＫ細胞を高純度で培養できることが明らかとなった。【０２９４】
実施例３０  拡大培養後のＮＫ細胞と末梢血由来ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞との活性比較
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例１８−（１）と同様の方法で、抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【０２９５】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例３−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。【０２９６】
（３）ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣの調製
実施例１８−（３）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを調製した。【０２９７】
（４）末梢血ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞の純化
実施例２９−（４）と同様の方法で、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞を純化した。【０２９８】
（５）ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞集団の拡大培養
ＮＫ細胞集団の拡大培養を、ＰＢＭＣ又は純化したＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞を用いて実施した。ＰＢＭＣを用いた拡大培養は、実施例２８−（４）と同様の方法によって実施した。また、純化したＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞を用いた拡大培養は、実施例２９−（５）と同様に実施した。ただし、ＡＩＣ添加条件のみ実施した。【０２９９】
（６）拡大培養後の細胞数測定
実施例３０−（５）のＮＫ細胞集団の拡大培養において、培養開始後１８日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表５１に示す。【０３００】
【表５１】
2011030851.tif 000055
【０３０１】
表５１に示すように、ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞集団の拡大培養では、培養開始細胞がＰＢＭＣあるいは純化したＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞のいずれであっても、同等の拡大培養率が得られることが明らかとなった。【０３０２】
（７）表面抗原の解析
実施例１４−（４）と同様の方法で、実施例３０−（４）の純化した末梢血ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞及び実施例３０−（５）の培養後の細胞にて、Ｔ細胞含有比率、ＮＫ細胞含有比率及びＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率を解析した。結果を表５２に示す。【０３０３】
【表５２】
2011030851.tif 000056
【０３０４】
表５２に示すように、ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞集団の拡大培養では、培養開始細胞としてＰＢＭＣあるいは純化したＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞のいずれを用いた場合においても、同等に高純度および高ＣＤ１６陽性率を示す高機能ＮＫ細胞が得られることが明らかとなった。また、培養１８日目の細胞は、培養前のＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞と比較してＣＤ１６発現率が高く、本発明により拡大培養された細胞集団は、機能的に優れた細胞集団であることが示された。【０３０５】
（８）細胞傷害活性の測定
実施例３０−（４）の純化した末梢血ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞及び実施例３０−（５）の培養後細胞にて、実施例１４−（５）と同様の方法で細胞傷害活性を測定した。結果を表５３に示す。【０３０６】
【表５３】
2011030851.tif 000057
【０３０７】
表５３に示すように、ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞集団の拡大培養で得られた細胞集団は、培養開始細胞としてＰＢＭＣあるいは純化したＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞のいずれを用いた場合においても、各種の標的細胞に対して、純化末梢血ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞よりも高い細胞障害活性を示すことが明らかとなった。また、その活性の差は、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ発現細胞株Ａ５４９に対して顕著に確認され、これらの細胞集団が様々な癌細胞株に対して細胞傷害活性を発揮する高機能性ＮＫ細胞であることが確認された。さらに、培養開始細胞に純化したＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞を用いることで、さらに高い細胞障害活性を示すＮＫ細胞集団が得られることが明らかとなった。
すなわち本発明は、末梢血ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞の機能性を高める効果のある培養法であることが明らかとなった。【０３０８】
実施例３１  ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養と各種ＮＫ細胞培養方法との比較
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートの作製
実施例１８−（１）と同様の方法で、抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【０３０９】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例１２−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。ただし、培養期間は１５日間とした。【０３１０】
（３）ＲＮ−Ｔを用いたＡＩＣの調製
実施例３１−（２）で調製したＲＮ−Ｔを用いて、実施例５−（３）と同様の方法でＡＩＣを調製した。ただし、培養開始８日目のＲＮ−Ｔを用いて調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣを２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、培養開始１５日目のＲＮ−Ｔを用いて調製したＲＮ−Ｔ  ＡＩＣは１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、それぞれ０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏに懸濁した。【０３１１】
（４）ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞集団の拡大培養
実施例１７−（１）と同様の方法でＮＫ細胞の拡大培養を行った。ただし、培養７日目には、各ウェルの細胞液１．４ｍＬを新しいＴ２５細胞培養フラスコに移し、０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏを用いて６倍希釈した。同様の継代操作を１１日目及び１４日目に実施し、１６日目まで培養を継続した。培養１１日目及び１４日目の細胞液の希釈は、それぞれ０．８ＨＧＴ−Ｔ５０２による５倍希釈、０．３ＨＧＴ−Ｔ５０２による３倍希釈とした。培養開始７日目に実施例３１−（３）で調製した２種のＲＮ−Ｔ  ＡＩＣをそれぞれ２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／フラスコずつ添加した。培養開始後１６日目まで培養を継続した。当該実施例及び実施例３２において、以下、本法をＡ’’法と記載する。【０３１２】
（５）抗ヒトＣＤ１６抗体固定化フラスコの作製
Ｔ２５細胞培養フラスコに終濃度１μｇ／ｍＬのＬＥＡＦ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ１６（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製；以下、抗ヒトＣＤ１６抗体と記載する）を含むＤＰＢＳを０．５７ｍＬ／フラスコずつ添加して、必要本数のフラスコを作製し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で一晩インキュベートした。なお、抗ヒトＣＤ１６抗体固定化フラスコは、使用直前にＤＰＢＳで２回洗浄した。【０３１３】
（６）ＯＫ−４３２及び抗ヒトＣＤ１６抗体を用いたＮＫ細胞集団の拡大培養
（参考文献  特許公開第２００７−２９７２９１号公報、特許第４２７５６８０号公報）
実施例１−（１）と同様の方法で調製したＰＢＭＣを、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％ヒトＡＢ型血清を含むＡＩＭ  Ｖ  Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社製、以下５ＨＡＩＭ  Ｖと記載）で懸濁後、実施例３１−（５）で作製した抗ヒトＣＤ１６抗体固定化フラスコに１．７ｍＬ／フラスコずつ添加した。各フラスコにＯＫ−４３２を終濃度０．０１ＫＥ／ｍＬ、ＩＬ−２を終濃度７００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、これらのフラスコを５％ＣＯ２存在下、３９℃で培養を開始した（培養０日目）。ただし、１日目以降、これらのフラスコを５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。４日目に、各フラスコの細胞液を全量回収し、３２０×ｇ、室温で遠心した後、上清を除去した。各フラスコより回収した細胞をそれぞれ１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＡＩＭ  Ｖで懸濁後、新しいＴ２５細胞培養フラスコに全量添加した。６日目に、各フラスコの細胞液を０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、計１．３ｍＬ／フラスコとなるように５ＨＡＩＭ  Ｖを用いて希釈し、新しいＴ２５細胞培養フラスコに添加した。１１日目に、各フラスコへ５ＨＡＩＭ  Ｖを２．６ｍＬ添加し、計３．９ｍＬ／フラスコとした。上記培養４日目、６日目及び１１日目に加え、１４日目には各フラスコヘＩＬ−２を終濃度７００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、１６日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をＤ法と記載する。【０３１４】
（７）抗ヒトＣＤ５２抗体及び抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレートの作製
２４穴細胞培養プレートに終濃度０．１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体及び終濃度２０μｇ／ｍＬのＲＡＴ  ＡＮＴＩ  ＨＵＭＡＮ  ＣＤ５２（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社製；以下、抗ヒトＣＤ５２抗体と記載する）を含むＤＰＢＳを０．５ｍＬ／ウェルずつ添加して必要ウェル数を作製し、４℃で一晩静置した。なお、抗ヒトＣＤ５２抗体／抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレートは、使用直前にＤＰＢＳで２回洗浄した。【０３１５】
（８）抗ヒトＣＤ３抗体及び抗ヒトＣＤ５２抗体を用いたＮＫ細胞集団の拡大培養
（参考文献  特許公開第２００６−３４０６９８号公報）
実施例１−（１）と同様の方法で調製したＰＢＭＣを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＫＢＭ５４０（コージンバイオ社製）で懸濁後、実施例３１−（７）で作製した抗ヒトＣＤ５２抗体／抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレートに、１ｍＬ／ウェルずつ添加した。３日目に、各フラスコへＫＢＭ５４０を１ｍＬずつ添加し、計２ｍＬ／フラスコとした。５日目に、各フラスコの細胞液１ｍＬを新しい６穴細胞培養プレート（ベクトン  ディッキンソン社製又はコーニング社製）に移し、ＫＢＭ５４０を用いて１１倍希釈した。同様の継代操作を９日目及び１４日目に実施し、それぞれの細胞液の希釈はＫＢＭ５４０による２倍希釈とした。上記培養３日目、５日目、９日目及び１４日目に加え、７日目及び１１日目には各ウェルヘＩＬ−２を終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、１６日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をＥ法と記載する。【０３１６】
（９）細胞数測定
実施例３１−（４）、実施例３１−（６）及び実施例３１−（８）のＮＫ細胞集団の拡大培養において、培養開始後１６日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表５４に示す。【０３１７】
【表５４】
2011030851.tif 000058
【０３１８】
（１０）培養後細胞集団の表面抗原の解析
実施例３１−（４）、実施例３１−（６）及び実施例３１−（８）で調製した培養開始後１６日目の細胞について、実施例１４−（４）と同様の方法で、ＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性細胞（Ｔ細胞）、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）、ＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率及びＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率を解析した。ただし、この際、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ６９抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製)、及びＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＸＣＲ３抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製)を用いて、ＣＤ６９陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率及びＣＸＣＲ３陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率を解析した。結果を表５５に示す。【０３１９】
【表５５】
2011030851.tif 000059
【０３２０】
表５４に示されるように、拡大培養率は、ＯＫ４３２及びＡＩＣを用いた拡大培養法（Ａ’’法）では、抗ヒトＣＤ３抗体及び抗ヒトＣＤ５２抗体を用いた拡大培養法（Ｅ法）と同等であり、ＯＫ４３２及び抗ヒトＣＤ１６抗体を用いた拡大培養法（Ｄ法）に比べて高かった。表５５に示されるように、培養後のＮＫ細胞の比率はＡ’’法にて顕著に高く、さらに高い比率でＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ６９及びＣＸＣＲ３を発現していた。ＣＤ６９は、ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＡＩＭ）としても知られており、白血球の活性化初期に表出され、ＮＫ細胞では標的細胞融解作用に関与する。ＣＸＣＲ３はケモカインであるＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０のリガンドであり、これらのケモカイン発現がん細胞への高い遊走能及び集積能を示すと考えられる。したがって、Ａ’’法で得られたＮＫ細胞には、高い比率でＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ６９及びＣＸＣＲ３を発現する高機能性ＮＫ細胞を高含有し、また同時に、生体内での癌細胞への遊走能及び局所への集積能の高いと考えられるＮＫ細胞が高含有されていることが確認され、極めて優れた抗腫瘍活性を発揮することが期待されるＮＫ細胞集団であることが明らかとなった。【０３２１】
（１１）細胞傷害活性の測定
実施例３１−（４）、実施例３１−（６）及び実施例３１−（８）で調製した培養開始後１６日目の細胞について、実施例１４−（５）と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。細胞傷害活性測定の結果を表５６に示す。
【表５６】
2011030851.tif 000060
【０３２２】
表５６に示されるように、Ａ’’法で得られた細胞集団は、各種の標的細胞に高い細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。また、その活性は、ＮＫ細胞感受性細胞株として知られるＫ５６２のみならず、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ発現細胞株Ａ５４９に対しても確認され、この細胞集団が、様々ながん細胞株に対して細胞傷害活性を発揮する高機能性ＮＫ細胞であることが確認された。
すなわち、本発明Ａ’’法は、既知のＮＫ細胞培養方法であるＤ法及びＥ法と比較して、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性の表現型を示し、より高い細胞傷害性を有する細胞集団を純度良く得ることが可能な培養方法であることが明らかとなった。【０３２３】
実施例３２  ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養と各種ＮＫ細胞培養方法との比較（同じ培養用基本培地条件下での初期刺激の比較）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートの作製
実施例１８−（１）と同様の方法で、抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。【０３２４】
（２）抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン刺激Ｔ細胞の拡大培養
実施例３１−（２）と同様の方法で、ＲＮ−Ｔの拡大培養を行った。【０３２５】
（３）ＲＮ−Ｔを用いたＡＩＣの調製
実施例３１−（３）同様の方法で、ＡＩＣを調製した。【０３２６】
（４）ＮＫ細胞集団の拡大培養（ＯＫ−４３２及びＡＩＣを用いたＮＫ細胞培養）
実施例３１−（４）と同様の方法で、ＮＫ細胞の拡大培養を行った（Ａ’’法）。【０３２７】
（５）抗ヒトＣＤ１６抗体の固定化プレートの作製
１２穴細胞培養プレートに終濃度１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ１６抗体を含むＤＰＢＳを０．２１７ｍＬ／ウェルずつ添加して、必要ウェル数を作製し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で一晩インキュベートした。なお、抗ヒトＣＤ１６抗体固定化プレートは、使用直前にＤＰＢＳで２回洗浄した。【０３２８】
（６）ＯＫ−４３２及び抗ヒトＣＤ１６抗体を用いたＮＫ細胞集団の拡大培養
（参考文献  特許公開第２００７−２９７２９１号公報、特許第４２７５６８０号公報）
実施例１−（１）と同様の方法で調製したＰＢＭＣを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏで懸濁後、実施例３２−（５）で作製した抗ヒトＣＤ１６抗体固定化プレートに、１．９ｍＬ／ウェルずつ添加した。各ウェルにＯＫ−４３２を終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬ、ＩＬ−２を終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、５％ＣＯ２存在下、３９℃で培養を開始した（培養０日目）。ただし、１日目以降、５％ＣＯ２存在下３７℃で培養した。２日目に、各ウェルへ０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏを１．９ｍＬずつ添加し、計３．８ｍＬ／ウェルとした。４日目に、各ウェルの細胞液を全量回収し、３２０×ｇ、室温で遠心した後、上清を除去した。各ウェルより回収した細胞を３．８ｍＬの０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏで懸濁後、新しい１２穴細胞培養プレートに全量添加した。７日目に、各フラスコの細胞液１．４ｍＬを０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏで６倍希釈し、新しいＴ２５細胞培養フラスコに添加した。上記培養２日目、４日目及び７日目に加え、１１日目及び１４日目に各フラスコヘＩＬ−２を終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、１６日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をＤ’法と記載する。【０３２９】
（７）抗ヒトＣＤ５２抗体及び抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレートの作製
２４穴細胞培養プレートに、終濃度０．１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体及び終濃度２０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ５２抗体を含むＤＰＢＳを０．９５ｍＬ／ウェルずつ添加して必要ウェル数を作製し、４℃で一晩静置した。なお、抗ヒトＣＤ５２抗体／抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレートは、使用直前にＤＰＢＳで２回洗浄した。【０３３０】
（８）抗ヒトＣＤ３抗体及び抗ヒトＣＤ５２抗体を用いたＮＫ細胞集団の拡大培養
（参考文献  特許公開第２００６−３４０６９８号公報）
実施例１−（１）と同様の方法で調製したＰＢＭＣを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏで懸濁後、実施例３２−（７）で作製した抗ヒトＣＤ５２抗体／抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレートに、１．９ｍＬ／ウェルずつ添加した。３日目に、各ウェルへ０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏを１．９ｍＬずつ添加し、計３．８ｍＬ／ウェルとした。５日目に、各フラスコの細胞液１．４ｍＬを０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏで６倍希釈し、新しいＴ２５細胞培養フラスコに添加した。同様の継代操作を９日目、１１日目及び１４日目に実施し、１６日目まで培養を継続した。培養９日目、１１日目及び１４日目の細胞液の希釈は、それぞれ０．８ＨＣｅｌｌＧｒｏによる２倍希釈、０．８ＨＧＴ−Ｔ５０２による５倍希釈、及び０．３ＨＧＴ−Ｔ５０２による３倍希釈とした。上記培養３日目、５日目、９日目、１１日目及び１４日目に加え、７日目に各フラスコヘＩＬ−２を終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、１６日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をＥ’法と記載する。【０３３１】
（９）培養後の細胞集団の表面抗原の解析
実施例３２−（４）、実施例３２−（６）及び実施例３２−（８）で調製した培養開始後１６日目の細胞について、実施例３１−（１０）と同様の方法で、ＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性細胞（Ｔ細胞）、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）、ＣＤ１６陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率、ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率、ＣＤ６９陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率及びＣＸＣＲ３陽性ＣＤ５６陽性細胞含有比率を解析した。結果を表５７に示す。【０３３２】
【表５７】
2011030851.tif 000061
【０３３３】
表５７に示されるように、培養後のＮＫ細胞の比率はＡ’’法が顕著に高く、さらに高い比率でＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ６９及びＣＸＣＲ３を発現していた。Ａ’’法で得られたＮＫ細胞は、高い比率でＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ６９及びＣＸＣＲ３を発現する高機能性ＮＫ細胞を高含有し、また同時に、生体内での癌細胞への遊走能、及び局所への集積能が高いと考えられるＮＫ細胞を高含有することが確認され、極めて優れた抗腫瘍活性を発揮することが期待されるＮＫ細胞集団であることが明らかとなった。【０３３４】
（１０）細胞傷害活性の測定
実施例３２−（４）、実施例３２−（６）及び実施例３２−（８）で調製した培養開始後１６日目の細胞について、実施例１４−（５）と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。ただし、Ｅ／Ｔ比３、１及び０．３について測定を行った。細胞傷害活性測定の結果を表５８に示す。【０３３５】
【表５８】
2011030851.tif 000062
【０３３６】
表５８に示されるように、Ａ’’法で得られた細胞集団は、各種の標的細胞に高い細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。また、その活性は、ＮＫ細胞感受性細胞株として知られるＫ５６２のみならず、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ発現細胞株Ａ５４９に対しても確認され、この細胞腫団が、様々な癌細胞株に対して細胞傷害活性を発揮する高機能性ＮＫ細胞であることが確認された。
すなわち、本発明であるＡ’’法は、既知のＮＫ細胞培養方法であるＤ’法及びＥ’法と比較して、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性の表現型を示し、より高い細胞傷害性を有する細胞集団を純度良く得ることが可能な培養方法であることが明らかとなった。よって、本発明の培養方法（ＮＫ細胞刺激方法）は、同じ培養用培地条件下においても、既知のＮＫ細胞培養方法（ＮＫ細胞刺激方法）よりも極めて優れた発明であり、高い治療効果が期待できる免疫療法を提供することができることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０３３７】
本発明により、ＮＫ細胞の拡大培養方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られるＮＫ細胞を含有する細胞集団は、細胞傷害活性において優れており、養子免疫療法をはじめとする医療分野において極めて有用である。
【国際調査報告】
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