(57)【要約】生アースロバクター細胞に基づくワクチンは魚類のピシリケッチア症の予防において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類のピシリケッチア症を治療または予防する薬剤の製造における生アースロバクター細胞の使用。
【請求項２】
魚類がサケ科の魚類である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ピシリケッチア症がサケリケッチア敗血症（ＳＲＳ）である請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
アースロバクター細胞がＡＴＣＣ  ５５９２１の受託番号で寄託されている菌株または均等菌株に由来する請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
魚類がギンザケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ）である請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
薬剤が更にピシリケッチア・サルモニス（Ｐｉｓｃｉｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓａｌｍｏｎｉｓ）抗原を含む請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
生アースロバクター細胞及び免疫賦活剤を医薬的に許容され得る担体と共に含むワクチン組成物。
【請求項８】
免疫賦活剤が死滅細菌細胞材料を含む請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
細胞材料が死滅アースロバクター細胞に由来する請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
死滅アースロバクター細胞材料を含むワクチン組成物。
【請求項１１】
アースロバクター細胞材料が熱死滅されている請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
アースロバクター細胞及び／または死滅アースロバクター細胞材料がＡＴＣＣ  ５５９２１の受託番号で寄託されている菌株に由来する請求項７〜１１のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
凍結乾燥されているかまたは食塩液懸濁液の形態である請求項７〜１２のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
生アースロバクター細胞、更に少なくとも１つの他の免疫原を含むワクチン組成物。
【請求項１５】
免疫原がピシリケッチア・サルモニスから調製した不活化抗原、組換えピシリケッチア・サルモニス抗原及び発現可能なピシリケッチア・サルモニス抗原を有する核酸ベクターからなる群から選択される請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
生アースロバクター細胞及びホルマリンにより不活化したピシリケッチア・サルモニス抗原を含む請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
魚類に別々に、逐次または同時に投与するための生アースロバクター細胞を含む第１ワクチン、及びピシリケッチア・サルモニスから調製した不活化抗原、組換えピシリケッチア・サルモニス抗原及び発現可能なピシリケッチア・サルモニス抗原を有する核酸ベクターからなる群から選択される免疫原を含む第２ワクチンを含むキット。
【請求項１８】
凍結乾燥した生アースロバクター細胞に加えて、不活化ピシリケッチア・サルモニス抗原を含む無菌希釈剤を含む請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
ＳＲＳ及びＢＫＤ感染に対して魚類を防御するための薬剤としての、請求項１６に記載のワクチン組成物または請求項１８に記載のキットの使用。
【請求項２０】
請求項７〜１６のいずれかに記載のワクチン組成物を魚類に投与することを含む、ピシリケッチア症を治療または予防する方法。
【請求項２１】
魚類に対する免疫賦活剤としての死滅アースロバクター細胞材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サケリケッチア敗血症（ＳＲＳ）を治療または予防する薬剤の製造におけるアースロバクターの生菌株の使用、及び前記細菌に基づくワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ピシリケッチア・サルモニス（Ｐｉｓｃｉｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓａｌｍｏｎｉｓ）はサケ科魚類において全身性敗血症（サケリケッチア症候群（ＳＲＳ）またはピシリケッチア症）を引き起こすグラム陰性の真正の細胞内細菌である。現在、ピシリケッチア様細菌は世界中の淡水及び海水産のいろいろな他の魚類でもしばしば認められるようになっている。ピシリケッチア症及びピシリケッチア症様疾患は水産養殖物の生産性、収益性、大量養殖に適合する種及び魚の輸送に悪影響を与える。チリの水産養殖業界だけでも１年でピシリケッチア症のために１５０，０００万ドルの損失を被っている。チリでは、前記症候群のために主たる養殖種が商業的により望ましいギンザケから余り好まれていないがピシリケッチア症に対して耐性のタイセイヨウサケに移行している。
【０００３】
抗菌剤がＳＲＳに対する治療として試験されてきたが、必ずしも成功していない。他の示唆されている方法としては、ストック密度を下げ、死んだ魚を遅れることなく水槽から除去することにより魚のストレスを下げる試みが挙げられる。ＳＲＳ流行に対する最も実際的な解決法は第１にこの病気を予防するための有効なワクチンを見つけることであろう。Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓ由来の不活化バクテリン調製物は若干の防御効果を有することが判明しており、多価オイル調節物として共投与するための唯一の適当な方法であり得るが、商業的規模で製造するにはかなり高価である。Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓ由来の組換え抗原に基づくワクチンはまだ市場に出ていない。
【０００４】
従って、魚類におけるピシリケッチア症に起因する死亡率をかなり低下させることができるワクチンを利用できるようにすることが緊急に要望されている。本発明は、既存の市販されているワクチン製品が上記した病気を予防するのにかなり有効であるという驚くべき知見に基づいている。このワクチンは“Ｒｅｎｏｇｅｎ（商品名）”の名前で市販されており、アースロバクターの非ビルレント生菌株からなる。現在、このワクチンはサケ及び他の養殖魚類を細菌性腎疾患（ＢＫＤ）から防御するために適用されている。この菌株の特徴は、本明細書中に参考として援用されている国際特許出願公開第９８／３３８８４号パンフレットに開示されている。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の第１態様で、魚類におけるピシリケッチア症を治療または予防する薬剤の製造における生アースロバクター細胞の使用が提供される。この薬剤の好ましい標的はＳＲＳ感染の危険に曝されているサケ科魚類である。アースロバクター細胞がＡＴＣＣ  ５９９２１の受託番号で寄託されている菌株、または均等菌株に由来することが好ましい。
【０００６】
本発明の第２態様で、生アースロバクター細胞、死滅細菌性免疫賦活剤、及び医薬的に許容され得る担体を含むワクチン組成物が提供される。本発明の別の態様では、死滅アースロバクター細胞材料を含むワクチン組成物及び免疫賦活剤としての死滅アースロバクター細胞材料の使用が提供される。死滅アースロバクター細胞材料がＡＴＣＣ  ５９９２１の受託番号で寄託されている菌株、または均等菌株に由来することが好ましい。
【０００７】
本発明の更に別の態様で、生アースロバクター細胞及び不活化ピシリケッチア・サルモニス（Ｐｉｓｃｉｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓａｌｍｏｎｉｓ）抗原を含むワクチン組成物が提供され、前記ワクチンは場合により、凍結乾燥したアースロバクター生細胞培養物及び不活化Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓ抗原を含む無菌希釈剤を含むキットの形態で提供される。
【０００８】
本発明の更に別の態様で、治療を要する魚類に生アースロバクター細胞を含むワクチンを投与することを含む魚類におけるピシリケッチア症を治療または予防する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
Ｒｅｎｏｇｅｎ（商品名）はサケ科魚類において細菌性腎疾患（ＢＫＤ）に対処するためにかなりの間使用されてきた。このワクチンは、水産養殖業で使用するために認可された最初の生培養物である点で独自のものであり、１９９６年１２月２０日にバージニア州マナッサスのＢｏｕｌｅｖａｒｄ大学のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ  ５５９２１の受託番号で寄託されているアースロバクターｓｐ．ｎｏｖ．の生培養物を含む。アースロバクターは魚類にとって病原性でない。また、ＢＫＤの病原物質（レニバクテリウム・サルモニアルム（Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ））でもない。
【００１０】
当業界の１現場でＢＫＤに罹患する危険性のあるサケ集団にＲｅｎｏｇｅｎ（商品名）を使用すると非処置魚に比して死亡率が劇的に低下することが観察された。Ｒｅｎｏｇｅｎ処置群の平均体重増加は非処置魚群よりも１８％高かった。ＳＲＳは前記現場で共通して見られ、本発明者らはＲｅｎｏｇｅｎ（商品名）がＢＫＤのみならずＳＲＳにも隠れた防御効果を与え得ると推測した。
【００１１】
この考えを試験するために、実施例２に記載されているように水槽に入れた魚をＲｅｎｏｇｅｎ（商品名）を用いて免疫化した後、Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓで攻撃誘発した。食塩液を注射したネガティブコントロール群では、殆どすべての魚がＳＲＳで死んだ。Ｒｅｎｏｇｅｎ（商品名）ワクチンを投与した試験群は４７１ｄｄ（ｄｅｇｒｅｅ  ｄａｙ（度日））後に非常に低い死亡率を示し、相対生残率（ＲＰＳ）は８８〜１００％になった。（海水中での１年に相当する）１４１１ｄｄ後でも、試験群は６９〜８５％のＲＰＳを有していた。これに対して、不活化Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓ“ゴールド基準”群では４８．６％に過ぎなかった。
【００１２】
Ｒｅｎｏｇｅｎ（商品名）のワクチン接種の可能性は、家兎ポリクローナル抗−アースロバクター抗体を用いてプローブしたときのＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓ抗原の交差反応性により立証されている（実施例１）。
【００１３】
本発明者らは、Ｒｅｎｏｇｅｎ（商品名）がＳＲＳの予防において他の公知のワクチンよりも有効であることを知見した。生アースロバクター細菌は細胞に進入し、限られた時間で複製し得ることが公知である。本発明者らは、このことからＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓのＴ細胞エピトープに十分な相同性を有する炭水化物及びタンパク質の両抗原を抗原プロセッシングすると、ビルレントＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓでの直接的な攻撃誘発に対して高レベルの防御を与えることができると考える。
【００１４】
従って、本発明は、魚類、特にサーモン種及びトラウト種を含めたサケ科魚類、特にギンザケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ）、マスノスケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、サクラマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ ｍａｓｏｕ）、カラフトマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｇｏｒｂｕｓｃｈａ）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）及びタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏｎ ｓａｌａｒ）におけるピシリケッチア症を治療または予防する薬剤の製造におけるアースロバクター細胞の使用を提供する。しかしながら、ピシリケッチア症または他の類似の病気にかかりやすい他の魚種、例えばティラピア（Ｔｉｌａｐｉａ）種、ブラックシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ  ｓｐ．）、ホワイトシーバス（Ａｔｒａｃｔｏｓｃｉｏｎ ｎｏｂｉｌｉｓ）、ハタ、カワスズメ等にも有効であり得る。
【００１５】
Ｒｅｎｏｇｅｎ（商品名）はアースロバクターの特定寄託菌株（ＡＴＣＣ  ５９９２１）に基づくものである。本発明を実施する際、この菌株及び均等のアースロバクター菌株が使用され得る。均等アースロバクター菌株はアースロバクターＡＴＣＣ  ５９９２１の同定特性を有する。これらの均等菌株はＳＲＳに対して同様の防御能を示す。同一の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有するかまたは菌株ＡＴＣＣ  ５９９２１と３％未満しか異ならない１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有するアースロバクター種は均等と見做される。この１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０９９２０２で寄託されている。均等菌株は、Ｓ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，Ｆｉｓｈ  ＆  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８：６０７−６１９（１９９８）に記載されているようなＦ−１２−３７３プライマー（５’−ＡＣＧＧＴＡＣＣＡＧ−３’）を用いるＲＡＰＤアッセイによっても規定される。このアッセイをアースロバクターＡＴＣＣ  ５９２２１及び均等菌株に対して実施すると、約３７３ｂｐの特有の断片が生ずる。プライマーＲｓｘｌｌ−６７ｆ（５’−ＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＣＧＧＧＧＧＡＴＴＡ−３’）及びＲｓｘｌｌ−２８４ｒ（５’−ＧＴＧＧＣＣＧＧＴＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＧ−３’）を用いた同一文献に記載されている別のＲＡＰＤをアースロバクターＡＴＣＣ  ５９２２１または均等菌株に対して実施すると、２６０ｂｐの断片が生ずる。
【００１６】
アースロバクター属の種は多数あり、海洋環境を含めた多種多様の生育地に豊富に存在する。多くのアースロバクター菌株は市販の寄託機関から入手可能である。本明細書で同定した特性及び／またはＳＲＳ免疫原性について公知の菌株または新しく単離した菌株の選択をスクリーニングすることは当業者にとって過度の負担とならない。ＳＲＳ免疫原性は、上記パラグラフに記載したスクリーニングアッセイにより及び／または実施例１及び実施例２に記載の実験方法により同定され得る。
【００１７】
ワクチンの好ましい投与ルートは腹腔への注射であるが、食物に含めて経口で、皮内または筋肉内注射、或いは海水または淡水への浸漬を含めた他の投与方法もある。注射によりワクチンを接種する前に魚は通常麻酔にかけられる。本発明のワクチンを腹腔内注射により投与するためには魚の体重が１０ｇ以上であることが推奨される。浸漬または経口投与の場合には少なくとも２ｇの体重が好ましい。
【００１８】
ワクチンの有効用量は対象の大きさ及び種に応じ、投与モードに従って変更され得る。最適用量は獣医師または水産養殖の専門家により試行錯誤により決定され得る。適当な用量は、１回投与あたり約１０２〜１０９ｃｆｕ、好ましくは約１０４〜１０７ｃｆｕ、より好ましくは約１０５〜１０６ｃｆｕ、最も好ましくは約１０５ｃｆｕであり得る。しかしながら、より高量またはより低量も有効であり得る。処置対象の魚に対して１回投与することが好ましい。小さい魚に対しては約１０４〜１０７ｃｆｕ／ｍｌの用量を、例えば約６０秒間の接触時間でディップ（浸漬）投与され得る。浸漬投与の場合、ワクチンは魚を入れいている水槽またはケージに添加する前に１〜１０倍の水で希釈され得る。
【００１９】
注射のために好ましい投与容量は約０．０５〜０．５ｍｌ、好ましくは０．０７５〜０．２５ｍｌ、より好ましくは０．１〜０．２ｍｌ、最適には０．１ｍｌである。
【００２０】
免疫発生は水温に依存するので、本発明のアースロバクターワクチンを接種してから少なくとも４００ｄｄ（ｄｄ＝日数×平均水温（℃））まで、魚をＳＲＳ感染に曝さないことが好ましい。
【００２１】
本発明の１実施態様では、生アースロバクター細胞は医薬組成物中に医薬的に許容され得る担体またはビヒクルと組み合わされる。好適な担体／ビヒクルには慣用の賦形剤が含まれ、例えば溶媒（例えば、水、油または食塩液）、デキストロース、グリセロール、湿潤または乳化剤、増量剤、コーティング、結合剤、充填剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、ｐＨ緩衝剤、または慣用のアジュバント（例えば、ムラミルジペプチド、アブリジン、水酸化アルミニウム）、油（例えば、鉱油）、サポニン、ブロックコポリマー及び当業界で公知の他の物質であり得る。好ましい医薬組成物は食塩液希釈剤を含む。
【００２２】
典型的には、ワクチンは注射用または水中デリバリー用に液体溶液または懸濁液として調製される。液体ビヒクル中に溶解乃至懸濁させるかまたは投与前に固体食物と混合するのに適した固体（例えば、粉末）形態で調製してもよい。
【００２３】
好ましくは、ワクチンは凍結乾燥培養物である。この形態のワクチンは無菌免疫希釈剤を用いて再構成するのに適している。例えば、凍結乾燥細胞は０．９％  食塩液（場合により包装ワクチン製品の一部として準備されている）中で再構成され得る。本発明の医薬ワクチン組成物は即時放出または遅延放出させる形態で投与され得る。
【００２４】
１態様で、本発明のアースロバクターワクチンは免疫賦活剤を含む。この免疫賦活剤は任意の公知の免疫賦活剤であり得るが、死滅細菌性調製物が好ましい。好ましくは、免疫賦活剤は死滅アースロバクター細胞材料であるが、この材料は場合により熱死滅されていても、または場合によりアースロバクターＡＴＣＣ  ５９９２１の培養物に由来していてもよい。死滅細菌性調製物の好適な例には、“Ｐｅｐｔｉｍｕｎｅ”（熱死滅させたアースロバクターＡＴＣＣ  ５９９２１培養物）及び“Ｕｌｔｒａｃｏｒｎ”（超音波処理したコリネバクテリウム・クティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｕｔｉｓ）溶解物）が含まれる。（ワクチン１回投与あたりの）死滅細菌性免疫賦活剤の最適用量は１〜１００μｇ、好ましくは５〜５０μｇ、より好ましくは１０〜２０μｇ、最適には約１２μｇの細胞材料である。死滅細菌性免疫賦活剤は、場合により凍結乾燥した生アースロバクター細胞と混合するために無菌希釈剤（例えば、食塩液）中に溶解または懸濁される。
【００２５】
本発明は、１態様で生アースロバクター細胞を含み、更に少なくとも１つの他の免疫原（ここで、“免疫原”は魚において特異的免疫応答を生じさせ得る抗原のような分子として定義される）を含むワクチン組成物を提供する。前記免疫原は、任意にピシリケッチア・サルモニス（Ｐｉｓｃｈｉｒｃｋｅｔｔｓｉａ ｓａｌｍｏｎｉｓ、Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓと略す）から作製した不活化抗原、組換えＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓ抗原及び発現可能なＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓ抗原を有する核酸ベクターからなる群から選択される。場合により、ＳＲＳを治療または予防するために、本発明のＲｅｎｏｇｅｎ（商品名）ワクチンを慣用されているＳＲＳワクチン（Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓバクテリン、組換え抗原ワクチンまたは核酸ワクチン）と別々に、逐次または同時に投与するためのキット中で両成分を組み合わせることが望ましいことがある。
【００２６】
好ましい実施態様において、本発明は、生アースロバクター細胞、不活化Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓ抗原及び場合により免疫賦活剤として死滅アースロバクター細胞材料を含むワクチンに関する。Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓ抗原は任意の公知の不活化剤を用いて不活化することにより作製され得るが、ホルマリン不活化により作製することが好ましい。Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓ抗原は任意の細菌の単離物から作製され得る。場合により、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３６１で寄託されている菌株ＬＦ−８９または該菌株に由来する菌株が不活化抗原を作製するために使用される。
【００２７】
Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓ抗原を不活化するための好適方法は、Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓ感染ＣＨＳＥ−１４細胞培養物から上清を収集し、ホルマリン（３７％  ホルムアルデヒド溶液）を０．１２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加することによる。培養液／ホルマリン混合物を均質になるまで撹拌した後、一定撹拌しながら４±２℃で最低７２時間保持する。収集した不活化材料を滅菌限外濾過により濃縮してもよい。抗原のＯＤ４０５／４９０／標準物質のＯＤ４０５／４９０として表される酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）比により規定されるＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓ抗原調製物の適当な最終濃度は１５±０．２単位である。
【００２８】
１つのワクチン中にアースロバクター成分とＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓ成分を組み合わせると、ＳＲＳに対する防御が生アースロバクター細胞ワクチンのみと比較して有意に強化される。実施例２に記載されていると同様のＳＲＳ攻撃誘発トライアルで、長期間にわたる（過去１４００ｄｄ）２価ワクチンは１価生アースロバクターワクチンと比較してＲＰＡ（相対生残％）を２０ポイント高める。
【００２９】
好ましくは、上記ワクチンは、生アースロバクター細胞の凍結乾燥培養物を不活化Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓ抗原（及び場合により死滅細菌性免疫賦活剤）が溶解または懸濁している無菌希釈剤、例えば食塩液と一緒に含むキットの形態で作製され、販売される。例えば、上記したように作製したＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓ抗原は約１０〜約１５０ｍｌ／Ｌ、好ましくは約２０〜約１００ｍｌ／Ｌ、最も好ましくは約７５ｍｌ／Ｌの濃度で希釈剤と混合され得る。
【００３０】
生アースロバクター細胞及びＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓ以外の病原菌由来の抗原を含む多価ワクチンを作製することも本発明の範囲内である。
【００３１】
アースロバクター生細胞を含む本発明のワクチンはいずれもＳＲＳを防御するだけでなく、ＢＫＤ感染から魚類を防御する。
【実施例】
【００３２】
（実施例１）
Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓ抗原と抗−アースロバクターポリクローナル抗体の交差反応性
ＣＨＳＥ−２１４細胞培養物から収集した３回洗浄済みＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓ細菌細胞（約２５μｇ）をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（１００μｌ）と混合し、９５℃で３分間加熱した。サンプル（１０μｌ）を９％アクリルアミドゲルに充填し、１５０ボルトで１時間電気泳動にかけて、タンパク質を分離した。このタンパク質を半乾燥トランスブロッター（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて１００％  ニトロセルロース膜に移した。タンパク質の移動は２０ボルトで５０分間実施した。
【００３３】
ブロットを１％  カゼイントリスボレート食塩液（ｃＴＢＳ）（１５ｍｌ）中で家兎抗−アースロバクターポリクローナル抗体（２０μｌ）と４５分間インキュベートした。次いで、ブロットをヤギ抗−家兎免疫グロブリンアルカリホスファターゼ（ＧＡＲ−ＡＰ）（５μｌ）に更に曝し、展開した。ブロット上で数個のタンパク質が明示された。このことから、抗−アースロバクタータンパク質抗体が特定のＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓタンパク質に対して強い親和性を有していることが分かる。この結果は２Ｄウェスタンブロットでも確認された。
【００３４】
本実験は特定のＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓタンパク質とアースロバクタータンパク質が交差反応することを示している。このことから、アースロバクタータンパク質が免疫系をプライムして、Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓビルレント細菌を認識し、この細菌に対して防御し得る抗体が産生され得ることが分かる。
【００３５】
（実施例２）
アースロバクターワクチンのＳＲＳに対する防御
ギンザケ（治療群あたり１１０匹、平均体重１０ｇ）を１２℃で一般的な操作手順に従って水槽水中に正常な養殖条件下で維持した。１週間の順化後、第１群、第２群及び第３群のそれぞれに対して食塩液希釈剤中で再構成した１０５、１０６及び１０７ｃｆｕ／用量の凍結乾燥アースロバクターｓｐ．ｎｏｖ細胞（Ｒｅｎｏｇｅｎ（商品名））０．１ｍｌを腹腔内にワクチン接種した。第４群及び第５群は、食塩液希釈剤中に１２．２μｇ及び５０μｇ／用量の“Ｐｅｐｔｉｍｕｎｅ”を添加する以外は第１群と同様に処置した。Ｐｅｐｔｉｍｕｎｅは、液体培養物（ＭＴＳＢブロス）中で＞１×Ｅ９の細胞密度まで増殖させた熱死滅アースロバクターの調製物であり、１２及び５０μｇ／投与を投与するようにタンパク質アッセイにより標準化されている。第６群及び第７群は、Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓバクテリンをワクチン接種したポジティブコントロールであった。前記バクテリンはＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓ型菌株ＬＦ−８９を感染させたＣＨＳＥ−１４細胞培養物の上清から４℃において０．１２５％ホルマリンを用いて少なくとも７２時間かけて作製した。Ｕ／Ｆ濃縮を用い、濃縮上清を８μｇ（タンパク質）／０．１ｍｌ用量を取り込むように使用した。バクテリンワクチンは１匹の魚あたり２０μｇ（第６群）及び１００μｇ（第７群）のＵｌｔｒａｃｏｒｎ（フランス国のＶｉｒｂａｃ）を用いてデリバリーした。Ｕｌｔｒａｃｏｒｎは、超音波処理したコリネバクテリウム・クティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｕｔｉｓ）溶解物に基づく免疫賦活剤である。注射前に抗原を等容量の鉱油アジュバントで乳化した。ネガティブコントロール群（第８群）には食塩液を注射した。
【００３６】
処置群［（投与用量（０．１ｍｌ／魚），２０ｍｌ）について表１に要約する。
【００３７】
【表１】
2005536500.tif 000002
【００３８】
攻撃誘発方法：
ワクチン接種から４７１ｄｄ及び１４４１ｄｄに、２重化群の魚類（２５匹／処置）にビルレントＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓを腹腔内注射して攻撃誘発した。ビルレントＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓはＣＨＳＥ−１４細胞上で最低２〜３週間培養した。少なくとも５０％  ＣＰＥに達する培養物の上清を腹腔内注射のために用いた。ビルレントＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓは１０−２以上の希釈度で０．１ｍｌ／魚（ｎ＝２５）の量を注射した。攻撃誘発した魚は１２℃で維持した。
【００３９】
攻撃誘発１の終了前に、第１群、第７群及び第８群（この群では８匹の魚のみが生残した）の生残集団から１０匹の魚を殺し、脾臓及び腎臓組織のサンプル０．５ｇを採取し、ホモジナイズし、組織培地（１０ｍｌ）に希釈した。集密ＣＨＳＥ−２１４細胞を含む９６ウェルプレート上でＴＣＩＤ５０を測定した。
【００４０】
結果及び考察：
【００４１】
【表２】
2005536500.tif 000003
【００４２】
安全性の研究中、第３群の魚が２８日の安全性期間の終わり近くに若干の損失（６．３％）を被ったことが観察された。研究者は、細菌性えら病のために３日間ホルマリン処置した集団のすべての魚を処置した。第５群の死亡率（３．６％）は最初の３日間ｐｖの間に記録された。このことは、希釈剤の４０％としてＰｅｐｔｉｍｕｎｅの配合が多少毒性であったことを示している。安全性期間中のロスから、生ワクチン株または付随的な細菌培養物のいずれに関してもポジティブプレートは培養されなかった。
【００４３】
【表３】
2005536500.tif 000004
【００４４】
ワクチン接種から４７１ｄｄに、第１群の魚は３２日間にわたりＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓの直接感染から高い防御レベルの９７．６％という相対生残率（ＲＰＳ）を有していた。食塩液コントロール群の死亡率は８４％であった。これは、それぞれ５０％及び６９％のＲＰＳ値を示した一般的な不活化ワクチンをワクチン接種した群（第６群及び第７群）で得られた防御よりも優れていた。
【００４５】
第１群、第７群及び第８群における生残魚のＴＣＩＤ５０分析
感染から３２日後４７１ｄｄの攻撃誘発から生残した魚（ｎ＝７〜１０）の組織サンプルにおけるＳＲＳ感染レベル
【００４６】
【表４】
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【００４７】
Ｒｅｎｏｇｅｎ（商品名）群からサンプリングした魚のＴＣＩＤ５０は不活化ワクチン群よりも低く、いずれの群も食塩液コントロールよりも低かった。これは、平均化したとき高力価群の寄与は低感染性用量を無効にするので明白な臨床的関連性はない。しかしながら、Ｒｅｎｏｇｅｎ（商品名）群は、１０１２未満のサンプルはＳＲＳに臨床的に感染されていないと見做されたように最低のポジティブ％（＜２０％）を有していた。これは、魚の５０％がＳＲＳに対してポジティブであった食塩液コントロール群からの同一サンプルに勝り、有利には魚の４４％がＳＲＳに対してポジティブであった不活化ワクチン群にも勝る。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
表注：長期間有効性研究を意図した第６群のバックアップ用魚は、水槽（１７）中の水流の偶発的遮断により失われてしまった。
【００５０】
１１４０ｄｄの経過期間後、最初の試験期間（４７１ｄｄ）に観察された防御の期間応答を評価した。食塩液コントロール群で７２％の死亡率が観察された第２攻撃誘発の結果から、防御レベルはＲｅｎｏｇｅｎ（商品名）処置魚（６９．４％  ＲＰＳ）で依然として高く、より高い用量は長期間防御を改善し得る（１０６及び１０７ｃｆｕ／投与はそれぞれ８５．８及び８１．７のＲＰＳを有していた）。希釈剤に１２及び５０μｇの免疫賦活剤Ｐｅｐｔｉｍｕｎｅを添加すると、各量で産生物の効率が改善された（それぞれ７６．１及び７９．７％）。一般的な基準ワクチン（第６群）の偶発的ロスは第７群のみに匹敵し得、この群は４８．６％のＲＰＳを有していた。
【００５１】
結論：
Ｒｅｎｏｇｅｎは、ワクチン摂取後４７１ｄｄ及び１４４１ｄｄにＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓの直接攻撃誘発に対して十分な防御を与えた。このワクチンは一般的な油ワクチンによる防御よりも優れていた。本発明者らは、Ｒｅｎｏｇｅｎ（商品名）群では、より少ない数の生残魚が臨床的にＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓに感染することを立証できた。この研究から、アースロバクターｓｐ．ｎｏｖ．生ワクチンはＰ．ｓａｌｍｏｎｉｓ感染に対して高度の防御を与えること及び防御効果が長期間であることが立証される。ワクチン中に死滅アースロバクター調製物を配合すると免疫促進効果が生じ、生残率が改善された。
【国際調査報告】
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