(57)【要約】本発明は、ヒト又は動物組織を様々な試験にかける前に、又はそれらをレシピエント患者に移植する前に、それら組織を物理的又は生化学的に処理することによって、該組織の機能性を改善する２つの新たな方法に関する。このように処理された組織は機械的応力に対して優れた抵抗性を有するようになり、より高い収縮性を示すようになる【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト若しくは動物組織又は該組織の成分に含まれる細胞及び細胞外マトリックス成分の組織化（オーガナイゼーション）を引き起こすに十分な期間、該組織又は該組織の成分に少なくとも一つの機械的緊張を少なくとも一つの配向で適用することにより、ヒト又は動物組織の機能性を増大する方法。
【請求項２】
生体組織シートを形成するために、組織が少なくとも一つの生体組織のシートを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
生体組織シートが組織構築物に会合している、請求項２記載の方法。
【請求項４】
細胞増殖阻害剤又は細胞周期阻害剤を含む培地中で、組織内に含まれる細胞の分化を誘起する十分な期間、該組織を培養することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
細胞が分化したときに、該細胞が組織構築物に会合するのに十分な期間、該細胞を培養する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
機能性が少なくとも以下の一つ：生物学的活性化合物に対する細胞の機械的耐性、収縮性、透過性、又は、応答性である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
機能性が周期的牽引、拍動圧、又はそれらの組み合わせによって改善される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
組織が生検（バイオプシー）である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
組織が自己生産マトリックスで会合している細胞のインビトロ培養から得られた組織構築物である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
組織がスカフォールド上に蒔かれた細胞のインビトロ培養から得られた組織構築物である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
組織が管状又は平面状である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
組織が血管組織、皮膚組織、角膜組織、弁組織、結合組織、又は、間葉組織である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
組織化が細胞の平行、横断、若しくは直線状の配置、又はそれらの組み合わせである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
細胞が間葉細胞又は中胚葉細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
細胞が、平滑筋、繊維芽細胞、骨格筋細胞、内皮細胞、神経細胞、外胚葉細胞、成人又は胎児性幹細胞、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
細胞が遺伝的に変更された細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
細胞が変異、欠失、又は挿入により遺伝的に変更された、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
細胞増殖阻害剤又は細胞周期阻害剤がヘパリンまたはオロモウシンである、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、組織工学（tissue engineering）分野におけるものである。本出願は様々な培養組織構築物（engineered
tissue constructs）の機能性（functionality）を改善する方法に関する。本発明によれば、組織構築物の機能性の改善は、細胞及び細胞外マトリックス要素を配置（alignment）させることによって達成することが出来る。特に配置によって応答する細胞としては、平滑筋細胞及び繊維芽細胞（又は、間葉細胞）がある。本発明による機能性の改善は、細胞培養培地組成を調整することによって、組織構築物中に存在する細胞をより高い分化レベルに到達させることによっても達成することが出来る。
【背景技術】
【０００２】
組織工学の主な目的の一つは、ヒトに移植することができる「交換パーツ」を提供するために、機能的な組織又は器官を再生することである。組織培養は、器官再構成（organ reconstruction）のために、増殖中の組織、人工又は生分解性スカフォールド（scaffold）及びコラーゲンゲルへの細胞を蒔くこと（seedling）等の広範な方法を提供する。それらの中でも、細胞をそれら自身の細胞外マトリックスの分泌内にうまくおさめる（coaxing）ことによって生体シート（living
sheet）を形成する方法を使用する新たな組織工学的手法が現れてきた。この方法は、「自己アセンブリアプローチ」と呼ばれ、外来性スカフォールドを全く必要としない高品質の生体組織シートを生産するものである。
【０００３】
自己アセンブリ（自己会合）又はその他の方法で生産された生体細胞シートは複雑な三次元培養組織構築物の基材として使用することができる。この物質の生体特性（living nature）によって、細胞が細胞外マトリックス蛋白質を定常的に分解しかつ合成する動的環境を可能とする。その結果、特定の形態にプレスされた生体シートを適当な機械的支持体と融合することが可能となり、一定時間の後に完全な組織を生み出す。例えば、生体シートを互いに積み重ねて厚い多層組織構築物を生み出すか、又は、それらをシリンダー上に巻いて管状構造を作りあげることができる。これらの方法はヒト血管、皮膚及び角膜のような組織の再構成において大きな成功を収めてきた。
【０００４】
天然又は培養で得られた生体組織の強度及び機械的特性は、該組織内の細胞によって合成される細胞外マトリックスの繊維に依る。しかしながら、これらの繊維は単に合成される必要があるだけではなくて、それらの三次元環境に中で適当に配向され、その他の繊維ネットワークに固定される必要がある。再構成組織を生産するこれまでの組織工学的方法の開発においては、組織の組織学的特性の最適化に焦点が絞られてきた。しかしながら、例えば、機械的強度又は収縮応答のような、全体的な繊維及び細胞の配置に関連する再構成組織の機能的面も、天然の組織の機能性に出来るだけ近づけるべきである。近年、このアプローチは機能的組織工学と称されるようになった。例えば、自己会合（アセンブリ）アプローチは、薬理学的研究のために、培養ヒト血管平滑筋細胞から再構築ヒト血管媒体（reconstruted human vascular media:ＲＨＶＭ）を生産するのに使用することが出来る。この構築物はインビトロのヒト収縮性ＲＨＶＭのパイオニアとされ、細胞が元々それから単離された正常ヒト血管の多くの機能特性を示す。しかしながら、その応答の収縮／緩和レベルはそれが由来する臍静脈で観察されるものより小さいものであった。
【０００５】
細胞及び細胞外マトリックス繊維の配向（orientation）を調節することは器官の機能に関連するものと思われる。例えば、細胞、特に間葉器官の細胞は配向していることが多くの組織で知られている。天然の組織、細胞及び細胞外マトリックス繊維はしばしば特徴的な配向を呈する。これは、気管支、血管、胃腸管及び泌尿生殖管等の管状組織、並びに、筋肉及び靱帯等のその他の組織で広範囲にわたり見られるものである。
【０００６】
生体シートからのアセンブリ組織はこのような器官の組織工学構築物 （tissue-engineered
constructs）を生産する効率的な方法である。しかしながら、これら構築物の機能性を高める技術が必要とされている。これは、細胞及びそれを取り巻くマトリックス繊維の適切な配向を誘起することによって達成される。これによって、交換又はインビトロ試験のための、より天然に近い特性を有する組織工学生産物が提供される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一つの目的は、細胞及び細胞外マトリックス繊維の所望の配置パターンを誘起することにより、シートに基づく組織工学構築物の機能性を増大させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これは、細胞及び細胞外マトリックス繊維の配置を誘起するために生体組織シートに適当な機械的サポートを与えることによってなされる。配置された生体シートは、機能性が改善された三次元組織構築物を生産する目的で使用される。例えば、再構築ヒト血管媒体（ＲＨＶＭ）のような管状構築物は、自己アセンブリアプローチを用いて本発明方法に従って調製することが出来る。配置された生体シートからなるＲＨＶＭは、細胞が配置されていないシートから成るＲＨＶＭと比較して収縮応答性が大きい。例えば、真皮及び表皮を含む再構成ヒト皮膚（ＲＨＳ）のような平面状構築物は、配置された皮膚繊維芽細胞及び配置された細胞外マトリックス繊維を含む生体シートを用いて生産することができる。これら平面状構築物の機械的強度及び耐性は、皮膚繊維芽細胞及び細胞外マトリックス繊維がランダムに分布している皮膚繊維芽細胞生体シートから成るＲＨＳと比較して改善されている。このことは、皮膚繊維芽細胞及び細胞外マトリックス繊維の配置によってＲＨＳのような平面状構築物の機械的強度が著しく改善されることを示している。
【０００９】
本発明の別の目的は、細胞増殖阻害剤を使用することによって、組織構築物中に存在している細胞の分化レベルを増大させる方法を提供することである。このような細胞増殖阻害剤と共に培養したＲＨＶＭのような管状構築物は、それら阻害剤なしで培養したＲＨＶＭと比較して、収縮応答が増大している。
【００１０】
本発明の別の目的は、ヒト又は動物の組織に含まれている細胞及び細胞外マトリックス成分の組織化を引き起こすに十分な期間だけ該組織を付着させることを含む、該組織の機能性を増大させる方法を提供することである。
【００１１】
ヒト又は動物の組織の機能性を増大することは、細胞増殖阻害剤又は細胞周期阻害剤を含む培地中で、該組織内に含まれる細胞の分化を誘起する十分な期間、該組織を培養することを含むものであり得る。
【００１２】
機能性は、生物学的活性剤（biologically active agent）から成る群から選択される生物学的活性化合物に対する細胞の機械的耐性、収縮性、透過性、又は、応答性の少なくとも一つであり得る。
【００１３】
本発明方法を実施する組織は、生検（バイオプシー）、又は、自己生産マトリックスで会合している細胞のインビトロ培養から得られた組織構築物であり得る。組織は又、管状又は平面状構築物、血管組織、皮膚組織、角膜組織、弁組織、結合組織、又は、間葉組織であり得る。
【００１４】
組織化が細胞の平行、横断、若しくは直線状の配置、又はそれらの組み合わせであり得る。
【００１５】
本発明の別の目的は、一般的に間葉細胞又は中胚葉細胞である細胞を使用することである。
【００１６】
本発明の別の目的によれば、細胞型は、平滑筋、繊維芽細胞、骨格筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞、外胚葉細胞、成人又は胎児性幹細胞、及びそれらの組み合わせから成る群から選択され得る。
【００１７】
更に、細胞が遺伝的に変更された細胞であるか、又は、変異、欠失、又は挿入により遺伝的に変更されたゲノムを含むものであっても良い。
【００１８】
細胞増殖阻害剤又は細胞周期阻害剤がヘパリンまたはオロモウシン（olomoucine）であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
間葉性起源の細胞（例えば、平滑筋細胞及び繊維芽細胞）は、該細胞自身で合成した複雑で生理学的な細胞外マトリックス内で絡み合って増殖する。これらの細胞がコンフルエンスになった後の数日の培養で維持されると、細胞及びマトリックス全体が培養基体から剥離するか、又は剥離できる状態になり、内因性起源の複雑で生理学的な繊維マトリックス内の細胞から成る生体シートが生成される。このような生体シートは、そのシート長を一定に保ちながら、その後培養することが出来る。本発明によれば、生体シートを更に、プラスチックフレームの両端に取り付けて付着させることが出来る。時間と共に張力が発生し、組織の圧密の間に細胞はコラーゲン繊維を引っ張るために、緩く付着していた生体シートが張ってくる。その結果、細胞及び細胞外マトリックスが張力の軸に沿って配置する。生体シートが細胞及び細胞外マトリックス配置を示す場合、それは機能性が改善された三次元組織構築物を再構成するのに使用することが出来る。
【００２０】
培地条件も生産される組織の機能性に影響を与える。本発明によれば、細胞増殖阻害剤を培養培地に添加することによって該組織構築物に存在する細胞の分化レベルを増大させることにより、組織構築物の機能性を改善させることが出来る。処理後に、細胞は細胞増殖阻害剤なしで培養した組織構築物中に存在する細胞と比較してより高い分化レベルに達する。
【００２１】
本発明の別の具体例では、生理学的、生化学的又は代謝的機能を改善する為に、細胞が機械的拘束（mechnical strain）によって横断（横）方向又は縦方向に配置された生体シートから組織を構築することが出来る。
【００２２】
本発明の別の具体例では、生存細胞及びその中に該細胞が蒔かれたスカフォールドから組織を構築することが出来る。
【００２３】
以下の実施例は培養組織構築物の機能性を改善する方法を記述するものである。二種類の組織構築物、収縮性管状構築物（ＲＨＶＭ）及び平面状組織構築物（ＲＨＳ）を用いて、以上の方法がこれら組織の機能性に与える影響を示す。これらの実施例は本発明を説明するために提供されるものであって、その範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００２４】
配置された平滑筋細胞及び細胞外マトリックス繊維を含有する生体シートによる再構築ヒト血管媒体（ＲＨＶＭ）の機能性の改善
継代培養（３−７代）した生存ヒト平滑筋細胞を標準７５cm2培養フラスコ内に10,000細胞個／cm2の密度で蒔いた。細胞に、ダルベッコ変性イーグル培地(Dulbecco
‘s
Modifiction of Eagle’s Medium)（商標）及びハムＦ１２（Ham’s F12）変性培地（商標）（３：１混合）、１０％胎児性クローンII (HycloneTM)、100
U/ml のペニシリンＧ及び25 μｇ/ml のゲンタマイシンを含む培養培地１５ｍｌを充填した。培養培地を１週間に３回交換した。培地交換の度に、新たに調製したアスコリビン酸溶液を最終濃度５０μｇ/mlとなるように添加した。細胞は加湿雰囲気下（９２％空気及び８％ＣＯ２）で維持した。
【００２５】
上記の培養条件下で、細胞はプラスチック培養フラスコに付着し、全培養表面が細胞で覆われてしまう（コンフルエンス）まで増殖した。培養条件が維持されると、細胞は繊維性物質を合成する。培養が更に数日延びると、この繊維性組織は培養基体から剥離する徴候を示し、自発的に且つ完全にそれ自身が全体として剥がれる。例えば、成熟時間を調節するために、形成されるシートの剥離を誘発させることも可能である。一つの可能性は、剥離の徴候が明らかになったときに、フラスコを開け（図１Ｂ，パートＩ）、ラバーポリースマン又は小さなピンセットを用いて培養表面から該シートを注意深く剥離させることである（図１Ｂ，パートＩＩ）。
【００２６】
管状構築物を作成する為に、平滑筋細胞の生体シートを配置するのに使用される方法を図１に示す。生体シートを培養表面から剥がしたら、剥離させた生体シートの先端を、リガクリップ（Ligaclip：商標）を用いて優しくクリップすることにより、迅速に且つ注意深くプラスチックフレームの一端に付着させた（図１Ｃ，パートＩ）。シートのもう一方の先端をプラスチックフレームの反対側にクリップした（図１Ｃ，パートＩＩ）。次いで、シートがクリップされたプラスチックフレームを、アスコリビン酸含有培養培地を含む微生物ペトリ皿に沈めた（図１Ｄ，パートＩ）。この時点では、付着した生体シートは緩く、生体シート中に存在する細胞はランダムに配向していた（図１Ｄ，パートＩＩ,図２）。培養７日後には、生体シートはより緊張し、コラーゲン繊維を引っ張る細胞によって生み出される張力の軸に沿って配向された（図２）。
【００２７】
図３は成熟時間の関数としての、生体シートの顕微鏡像示す。培養表面に付着した細胞はランダムに配向していた（図３Ａ）．一度培養表面から剥離すると（０時間、図３Ｂ）、細胞構造は自発的に収縮し、細胞クラスターから構成されるダークゾーンのように観察された。４８時間後に、細胞が単一軸方向に収縮するにつれて、このゾーンは分離する傾向を示した（図３Ｃ）。最後に、平滑筋αアクチン及びコラーゲンＩの配置により示されるように、細胞は時間経過と伴に張力に沿って（図３Ｄ）、７日後に細胞及び細胞外マトリックス繊維の平行な配向が観察されるようになるまで再組織化し続けた（図３Ｅ及び図４）。これら二種類の蛋白質は、夫々、細胞の細胞骨格及び細胞外マトリックスに関連する。
【００２８】
配置された生体シートに円筒上の形態を与えるために、該シートを管状支持体の周りに巻いた。配置された生体シートの一端（取り付けられた二つの端のうちの一つ）を管状支持体とスレッドとの間に置いた。次にスレッドをアローに沿って引っ張り、シートの一端をスレッドと管状支持体の外表面の間に圧搾した。この時点で、全ての端が確保されていることが重要であるが、シートの最小量がスレッドを超えるようにすべきである。生体シートを巻く間、生体シートが退縮しないように、常に張力をかけなければならない。シートが完全に巻き上がったときに、スレッドを滑らせてはずした。スレッドは１〜２日後に除去しても良い。管状生体シート組織はアスコルビン酸添加によって、数週間培養し、更に組織の成熟を可能にすることが出来る。予め配置された又はそうしない細胞及び細胞外マトリックスを含む生体シートを用いて、三次元血管構築物を作成した。
【００２９】
管状組織構築物の機能性を評価するために、再構築ヒト血管媒体（ＲＨＶＭ）を管状支持体から滑らせてはずし、２〜５ｍｍの環状部分に切断した。これらの環状部分を用いてＲＨＶＭのインビトロにおける収縮を試験した。本発明に従って調製した環状部分は、生理学的血管作用物質であるヒスタミンで試験した。ＲＨＶＭ収縮により引き起こされる等尺性張力は力変換器 (Kilster-Morse, DSG BE4) を介して直接記録した。図５はヒスタミンの累積的投与（10-8−10-4 mol/L）により刺激されたときの、管状構築物の環状部分の収縮応答を示したものである。得られた結果は、ＲＨＶＭの構築前の生体シートの配置によって、収縮応答の増大がもたらされることを示している。実際に、ヒスタミンに誘起されるこれら管状構築物の収縮応答は、巻かれる前に配置されなかった生体シートから得られたＲＨＶＭに関して得られた収縮よりも大きかった。これは、一部には、ＲＨＶＭにおいて観察された細胞及び細胞外マトリックス繊維の最終配向が原因であり得る（図６）。
【００３０】
構築物の作成に使用する菅状支持体は、いろいろなルーメン口径を生み出すために、様々な物質及び直径から成るものであり得る。多方向の層を有する組織を得るために、一つ以上の配置シートを様々な配向に巻くことも可能である。本発明の範囲が、一つの特定の形態又は細胞起源に限定されることは意図しない。当該技術分野において通常の知識を有する者であれば、本発明の範囲及び思想から離脱することなく本発明方法に様々な修飾・変形を行うことが出来ることは、容易に理解されるであろう。
【００３１】
こうして、平滑筋細胞又は血管周囲繊維芽細胞からなる配置された生体シートの収縮応答を得ることが出来た。
【実施例２】
【００３２】
配置された繊維芽細胞及び細胞外マトリックス繊維を含む生体シートからの再構築ヒト皮膚（ＲＨＳ）の調製
再構築ヒト皮膚（ＲＨＳ）のような平面状構築物の作成の為に繊維芽細胞から成る生体シートを配置させる為に使用する方法を図７で説明した。真皮繊維芽細胞を標準７５cm2培養フラスコ内に8,000細胞個／cm2の密度で蒔き、ダルベッコ−フォクト変性イーグル培地（ＤＭＥ：商標）、１０％牛胎児性血清
(HycloneTM)、100 UI/ml のペニシリンＧ（シグマ）及び25 μｇ/ml のゲンタマイシン（シグマ）を含み、新たに調製したアスコリビン酸溶液（５０μｇ/ml）を添加した培養培地で操作可能な生体シートが形成されるまで３５日間培養した。培地は一週間に３度交換した。
【００３３】
ＲＨＳの真皮部分を製造するために、プラスチックフレームを成熟シート上に置き、生体シートの先端の一方を剥がし、フレームに巻きつけた（図７Ｂ）。リガクリップ（Ligaclip：商標）を用いて生体シートの両先端をフレームに固定した（図７Ｃ）。生体シートをフラスコの底から剥がした後に、夫々のプラスチックフレーム上に載せられた２つの繊維芽細胞シートを重ね合わせ（図７Ｄ）、スポンジを構築物の表面に１日加えて両シートが接着するようにした。培地は一週間に３度交換した。
【００３４】
７日後に、ＲＨＳの表皮部分を製造するために、2x105 個／cm2のヒトケラチノサイトを再構築された真皮上に蒔いた。次いで、ＲＨＳをＤＭＥ及びハムＦ１２（３：１）、１０％牛胎児性血清
(HycloneTM)、10 ng/ml の上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ：Austral Biologicals）、24.3 μｇ/ml のアデニン（シグマ）、5
μｇ/ml のインシュリン（シグマ）、2x10-９Ｍの3,3’,5’トリイオド−Ｌ−チロシン（シグマ）、5 μｇ/ml のヒトトランスフェリン（ロッシュ）、0.4
μｇ/ml のハイドロコルチゾン（カルビオケム）、10-10Ｍのコレラトキシン（ＩＣＮバイオケミカル）、100 Ul/ml のペニシリンＧ（シグマ）、及び25
μｇ/ml のゲンタマイシン（シグマ）含むケラチノサイト培地で培養した。培養培地には、アスコリビン酸（５０μｇ/ml）を補充した。培地中での培養８日後にケラチノサイトはコンフルエンス状態に達した。表皮の分化を促進させるために、プラスチックフレームにクリップされたＲＨＳを気−液境界面まで上げ、気−液培地、即ち、上記のケラチノサイト培地においてＥＧＦを含まず、アスコリビン酸（５０μｇ/ml）は補充された培地で培養した。培地は一週間に３度交換した。培養２１日後に、ＲＨＳを機械的試験にかけた。
【００３５】
新たに剥がしたＬＴＳ（ｎ＝４）、並びに非配置（ｎ＝４）及び配置（ｎ＝４）成分含むＬＴＳの破裂点（rupturing point）を、半自動化機械的引っ張り装置を用いて直接測定した。ＬＴＳの両先端をアンカージャーに固定し、一方は移動させ、もう一方は細胞力変換器に繋いだ。配置ＬＴＳはその成分（細胞及びＥＣＭ）の配向と平行の方向に伸長した。
【００３６】
新たに剥がした生体シート（ｎ＝４）、並びに非配置（ｎ＝４）及び配置（ｎ＝４）成分を含む生体シートで調製したＲＨＳの終局強さ（破裂点）を半自動化機械的引っ張り装置を用いて直接測定した。ＲＨＳ矩形断片の両先端をアンカージャーに固定し、一方は移動させ、もう一方は細胞力変換器に繋いだ。配置ＲＨＳはその生体シート、即ち、細胞及び細胞外マトリックスの配向と平行の方向に伸長した。成分が配置されていないＬＴＳに関しては、それらの反対側にランダムに付着させた。アンカーに固定させた後、移動ジャーを引っ張ることによって装置が伸長をはじめ、その距離に対する制約（constraint）又は抵抗（resistance）から得られるデータを、収集ソフトウェアで記録し処理する。力をＲＨＳの開始断面積で割ることにより、力（Ｎ）及び引張応力を計算した。この制約−変形グラフから、ＲＨＳの弾性又は剛性（カーブの直線部分の傾斜）及び終局引張強さ（最大荷重における応力）を求めた。
【００３７】
図８は、非配置又は配置生体シートを用いたＲＨＳの伸長距離に対する抵抗を示す。配置生体シートを用いたＲＨＳの破裂点（図８における矢印で示す）は非配置生体シートを用いたＲＨＳの破裂点の２倍の抵抗であった。これは、配置生体シートを使用することによって、その抵抗によって測定されたＲＨＳの機能性が増大したことを示している。
【実施例３】
【００３８】
細胞増殖阻害剤を用いた再構築ヒト血管媒体（ＲＨＶＭ）の機能性の改善
実施例１に従い、再構築ヒト血管媒体（ＲＨＶＭ）をコントロール組織構築物（非配置）の代わりに調製した。この実施例で使用したＲＨＶＭは以下のように処理した。上記の培地で培養したＲＨＶＭはコントロール条件（非処理ＲＨＶＭ）とし、細胞増殖阻害剤であるヘパリン又はオロモウシン（olomoucine）添加の培地によるものは処理ＲＨＶＭとした。
【００３９】
処置又非処理（コントロール条件）のＲＨＶＭの収縮機能を評価するために、成熟２１日後に、５−７ｍｍの長さのＲＨＶＭリングを培養に使用した管状支持体から取った。リングをミオグラフ（筋運動記録器）に載せ、血管活性化剤であるヒスタミンの累積的投与の存在下で調べた。ＲＨＶＭ収縮によって生じる等尺性張力（isometric tension）を力変換器（Kilster-Morse, DSG BE4）により直接記録した。
【００４０】
図９に示されるように、低濃度のヒスタミン（10-6Ｍ）の存在下では、処理及び非処理ＲＨＶＭの間に収縮に有意な差は認められなかった。より高い濃度のヒスタミン、即ち、10-5Ｍ及び10-4Ｍでは、ヘパリン又はオロモウシンと共に培養したＲＨＶＭの収縮は、コントロールＲＨＶＭと比較して顕著に増大した。これらの結果は、ヘパリン又はオロモウシンの存在下で培養した細胞では、細胞増殖阻害剤と共に培養しなかった細胞と比較して分化マーカーの発現が増大する結果を示す図１０と一致する。
【００４１】
組織工学で製造された生物組織の機械的安定性は困難なものである。例えば、体の内部構造を保護する皮膚は重大な機械的応力を支えなければならない。更に、移植目的で再構築された皮膚は、抵抗性、安定性があり、良好な美的品質を有していなければならない。同様に、気管支、血管、胃腸管及び泌尿生殖器官のような管状器官の機能は、細胞の分化レベル及び細胞及び細胞外マトリックスの配向に依存していることが示されている。
【００４２】
本発明において、再構築組織の機能性を増大させる２つの戦略が提案された。一つの戦略では、配置された生体シートを組織構築に使用することに焦点が当てられ、もう一つの戦略では、組織構築物に存在する細胞の分化レベルを増大させるために細胞増殖阻害剤を使用することに焦点が当てられた。
【００４３】
再構築ヒト血管媒体の製造のための生体シートにおいて細胞及び細胞外マトリックス繊維を配置することによって、組織工学による等価物の収縮機能が改善された。このような改善は、培地に細胞増殖阻害剤を添加することによっても獲得された。同様に、真皮が配置された繊維芽細胞を含む再構築ヒト皮膚は優れた機械的強度を示した。
【００４４】
これらの再構築組織は、特に、物理的応力が高い解剖学的部位（例えば、関節における再構築皮膚の移植）において、特異的な利点を示すことが出来る。更に、再構築ヒト皮膚真皮内の再組織化された細胞外マトリックスにより、移植後の美的（美容上の）結果が非常に改善される。実際に、繊維芽細胞は細胞外マトリックスのコラーゲン繊維とそれらの配向で接触するために、皮膚再構築物中で配置された皮膚繊維芽細胞により収縮が調節され、その結果、治癒の質が改善される。再構築ヒト血管媒体の収縮性特性は特に冠状動脈の交換に使用することが出来る。しかしながら、この再構築ヒト血管媒体は、薬理学的研究のための興味あるモデル、及び、血管構造の血管生理学及び生理病理学的機能の解明に関する基礎研究のためのインビトロでのモデルでもあり得る。
【００４５】
本発明はその具体的な実施例に関連して説明されたが、本発明は、一般的に、本発明の原理に従うところの、本発明が関連する技術分野において公知又は慣用の方法内で得られ、及び、これまでに記載され特許請求の範囲にある本発明の重要な特徴に適用されるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、又は適用も含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、再構築ヒト血管媒体である管状構築物の作成の為に、生体シート内の平滑筋細胞及び細胞外マトリックス繊維を配置させる方法を示す。
【図２】図２は、プラスチックフレームの反対端に付着した平滑筋細胞を含む生体シートの、０日目及び７日目における顕微鏡面を示す。
【図３】図３Ａから図３Ｅは、０日目から７日目までの成熟期間に対する、配置された生体シートの顕微鏡面を示す。
【図４】図４は、本発明方法に従い、０日目から７日目までの生体シートにおける、夫々、細胞骨格蛋白質及び細胞外マトリックスである、平滑筋αアクチン及びコラーゲンＩの免疫標識された共焦点像を示す。
【図５】図５は、ヒスタミンの累積的投与に応答する、配置された又は配置されていない生体シートからなる再構築ヒト血管媒体（ＲＨＶＭ）である管状構築物の収縮を示す投与−応答曲線である。
【図６】図６は、配置された又は配置されていない平滑筋細胞及びその細胞外マトリックスを含む生体シートで調製され、マッソントリクロム（Masson’s trichrome）で染色された再構築ヒト血管媒体（ＲＨＶＭ）の顕微鏡面を示す。
【図７】図７Ａから図７Ｆは、再構築ヒト皮膚（ＲＨＳ）である平面構造の調製に必要な生体シートを配置するために用いられる方法を示す。
【図８】図８は、平面状構築物の抵抗性を示す。グラフは配置された又は配置されていない繊維芽細胞及びその細胞外マトリックスを含む生体シートから調製された再構築ヒト皮膚（ＲＨＳ）の伸長距離に対する終局引張強さの代表的な曲線である。
【図９】図９は、細胞増殖阻害剤の存在下又は非存在下で培養された再構築ヒト血管媒体（ＲＨＶＭ）である管状構築物のヒスタミン累積投与に対する収縮を示す投与応答曲線である。
【図１０】図１０は、細胞増殖阻害剤の存在下又は非存在下で培養された再構築ヒト血管媒体中に存在する平滑筋細胞の免疫標識された分化マーカーの顕微鏡像を示す。
【図１】
2005510300.tif 000002
【図２】
2005510300.tif 000003
【図３】
2005510300.tif 000004
【図４】
2005510300.tif 000005
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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