(57)【要約】本発明は、生物学的試料中の生体分子を同定かつ特徴付けるための、コンピュータで自動化された方法およびシステムに向けられる。質量分析測定値は、試料中の生体分子について得られる。これらの測定値を解析し、試料中の生体分子の存在量を決定し、かつ、この存在量の測定値は、それらが関連する生体分子の1種または複数の識別特徴と組み合せられ、これにより、複数の生物学的試料からの生体分子の存在量の、コンピュータを媒介した比較を可能とする。
2005536714.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中の生体分子の存在量を決定する方法であって、以下の段階を含む方法：
a)複数の生体分子を含有する生物学的試料を提供する段階；
b)該生体分子の複数のイオンを作成する段階；
c)複数のイオンについて質量分析測定を行い、これにより生体分子に関するイオン数を得る段階；
d)イオンを生体分子に帰属させる段階；および
e)生体分子のイオン数を積算し、これにより生物学的試料中の生体分子の存在量を決定する段階。
【請求項２】
生体分子がタンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
タンパク質が、単離されたオルガネラ由来である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
オルガネラが、ミトコンドリア、葉緑体、ER、ゴルジ、エンドソーム、リソソーム、ファゴソーム、ペルオキシソーム、分泌小胞、輸送小胞、核、および形質膜からなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
タンパク質が、細胞質ゾルタンパク質または細胞骨格タンパク質である、請求項2記載の方法。
【請求項６】
生体分子が標識されない、請求項1記載の方法。
【請求項７】
生体分子が誘導体化されない、請求項1記載の方法。
【請求項８】
生体分子が切断された生体分子である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
切断された生体分子が標識されない、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
切断された生体分子が誘導体化されない、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
生体分子が酵素で切断される、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
酵素がトリプシンである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
段階(b)の前に、複数の生体分子を分離する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
分離が、クロマトグラフィー、電気泳動、免疫分離、または遠心分離により実行される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
生物学的試料が、1種または複数の内部標準を含み、かつイオンの保持時間が、1種または複数の内部標準を用いて補正される、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
第二の生物学的試料をアッセイする段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
生物学的試料が、1種または複数の内部標準を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
段階(c)が、生体分子のイオンの構造情報または配列情報を決定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
構造情報または配列情報が、MS/MSから得られる、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
1種または複数の生体分子のリストが、MS/MS分析のための生体分子のイオンを選択するために提供される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
リストが包含リストである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
リストが除外リストである、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
段階(d)において、コンピュータ手法を用い、データベース由来のイオンの構造または配列を含む生体分子を同定する段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
コンピュータ手法が、Mascot(登録商標)、Protein Lynx Global Server、SEQUEST(登録商標)/TurboSEQUEST、PepSEQ、SpectrumMill、またはSonar MS/MSからなる群より選択される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
データベースが、Genbank(登録商標)、EMBL、NCBI、MSDB、SWISS-PROT(登録商標)、TrEMBL、dbEST、またはヒトゲノム配列データベースである、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
段階(d)が、データベースから同定された生体分子にイオンを帰属させるコンピュータ手法を用いて実行される、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
段階(d)が、そのイオンに関する非荷電質量を計算することによって、生体分子にイオンを帰属させる、コンピュータ手法を用いて実行される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
段階(d)が、ペプチド質量フィンガープリント法を用いて実行される、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
段階(e)が、生体分子に対応する少なくとも2種のイオンのイオン数を積算するコンピュータ手法を用いて実行される、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
積算が、1種または複数の電荷状態、同位体、走査、生体分子の断片、分離の画分、またはそれらの組合せの全体にわたる、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
対照生物学的試料に対する生体分子の存在量を計算する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３２】
対照生物学的試料に対する複数の生体分子の存在量を計算する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３３】
存在量が、疾患または状態の診断に使用される、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
存在量が、薬物の標的とする生体分子の決定に使用される、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
対照生物学的試料に対する、生物学的試料中の生体分子の存在量の増加もしくは減少、または生体分子の有無が、疾患または状態の指標である、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
存在量を使用し、生体分子のアイソフォーム量を決定する、請求項31記載の方法。
【請求項３７】
生物学的試料中の生体分子の存在量を決定するための、コンピュータで実行される方法であって、以下の段階を含む方法：
a)複数の生体分子に関するイオン数を含む質量分析データを、コンピュータへ入力する段階；
b)イオンを生体分子に帰属させる段階；および
c)生体分子のイオン数を積算し、これにより生物学的試料中の生体分子の存在量を決定する段階。
【請求項３８】
生体分子がタンパク質である、請求項26記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項３９】
タンパク質が、単離されたオルガネラ由来である、請求項38記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項４０】
オルガネラが、ミトコンドリア、葉緑体、ER、ゴルジ、エンドソーム、リソソーム、ファゴソーム、ペルオキシソーム、分泌小胞、輸送小胞、核、および形質膜からなる群より選択される、請求項39記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項４１】
タンパク質が、細胞質ゾルタンパク質または細胞骨格タンパク質である、請求項38記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項４２】
生体分子が標識されない、請求項37記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項４３】
生体分子が誘導体化されない、請求項37記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項４４】
生体分子が切断された生体分子である、請求項37記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項４５】
切断された生体分子が標識されない、請求項44記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項４６】
切断された生体分子が誘導体化されない、請求項44記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項４７】
生体分子が酵素で切断される、請求項44記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項４８】
酵素がトリプシンである、請求項47記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項４９】
複数の生体分子が、質量分析データの取得前に分離される、請求項37記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項５０】
分離が、クロマトグラフィー、電気泳動、免疫分離、または遠心分離により実行される、請求項49記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項５１】
生物学的試料が、1種または複数の内部標準を含み、かつイオンの保持時間が、該1種または複数の内部標準を用いて補正される、請求項49記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項５２】
第二の生物学的試料をアッセイする段階をさらに含む、請求項37記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項５３】
生物学的試料が、1種または複数の内部標準を含む、請求項37記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項５４】
質量分析データが、生体分子のイオンの構造情報または配列情報をさらに含む、請求項37記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項５５】
構造情報または配列情報が、MS/MSから得られる、請求項54記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項５６】
1種または複数の生体分子のリストが、MS/MS分析のための生体分子のイオンを選択するために提供される、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
リストが包含リストである、請求項55記載の方法。
【請求項５８】
リストが除外リストである、請求項55記載の方法。
【請求項５９】
データベースから生体分子を同定するために構造情報または配列情報を使用する段階をさらに含む、請求項54記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項６０】
生体分子が、Mascot(登録商標)、Protein Lynx Global Server、SEQUEST(登録商標)/TurboSEQUEST、PepSEQ、SpectrumMill、またはSonar MS/MSからなる群より選択されるコンピュータ手法を用いて同定される、請求項59記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項６１】
データベースが、Genbank(登録商標)、EMBL、NCBI、MSDB、SWISS-PROT(登録商標)、TrEMBL、dbEST、またはヒトゲノム配列データベースである、請求項59記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項６２】
段階(b)において、データベースから同定された生体分子にイオンが帰属される、請求項59記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項６３】
段階(b)において、イオンに関する非荷電質量を計算することにより、イオンが生体分子に帰属される、請求項37記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項６４】
段階(b)において、ペプチド質量フィンガープリント法により、イオンが生体分子に帰属される、請求項37記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項６５】
段階(c)において、積算が、1種または複数の電荷状態、同位体、走査、生体分子の断片、分離の画分、またはそれらの組合せの全体にわたる、請求項37記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項６６】
対照生物学的試料に対する生体分子の存在量を計算する段階をさらに含む、請求項37記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項６７】
対照生物学的試料に対する複数の生体分子の存在量を計算する段階をさらに含む、請求項37記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項６８】
存在量が、疾患または状態の診断に使用される、請求項66記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項６９】
存在量が、薬物の標的とする生体分子の決定に使用される、請求項66記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項７０】
対照生物学的試料に対する生物学的試料中の生体分子の存在量の増加もしくは減少、または生体分子の有無が、疾患または状態の指標である、請求項66記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項７１】
存在量を使用し、生体分子のアイソフォーム量を決定する、請求項66記載のコンピュータで実行される方法。
【請求項７２】
生物学的試料中の生体分子の存在量を決定するためのプログラムが記憶されたコンピュータ読取り可能なメモリーであって：
a)複数の生体分子に関するイオン数を含む、質量分析データを入力として受け取るコンピュータコード；
b)イオンを生体分子へ帰属させるコンピュータコード；および
c)生体分子のイオン数を積算し、これにより生物学的試料中の生体分子の存在量を決定するコンピュータコード
を含むメモリー。
【請求項７３】
生体分子がタンパク質である、請求項72記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項７４】
タンパク質が、単離されたオルガネラ由来である、請求項73記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項７５】
オルガネラが、ミトコンドリア、葉緑体、ER、ゴルジ、エンドソーム、リソソーム、ファゴソーム、ペルオキシソーム、分泌小胞、輸送小胞、核、および形質膜からなる群より選択される、請求項74記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項７６】
タンパク質が、細胞質ゾルタンパク質または細胞骨格タンパク質である、請求項73記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項７７】
生体分子が標識されない、請求項72記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項７８】
生体分子が誘導体化されない、請求項72記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項７９】
生体分子が切断された生体分子である、請求項72記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項８０】
切断された生体分子が標識されない、請求項79記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項８１】
切断された生体分子が誘導体化されない、請求項79記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項８２】
生体分子が酵素で切断される、請求項79記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項８３】
酵素がトリプシンである、請求項82記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項８４】
複数の生体分子が、質量分析データの取得前に分離される、請求項72記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項８５】
分離が、クロマトグラフィー、電気泳動、免疫分離、または遠心分離により実行される、請求項84記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項８６】
生物学的試料が、1種または複数の内部標準を含み、かつイオンの保持時間が、該1種または複数の内部標準を用いて補正される、請求項84記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項８７】
第二の生物学的試料をアッセイする段階をさらに含む、請求項72記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項８８】
生物学的試料が、1種または複数の内部標準を含む、請求項72記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項８９】
質量分析データが、生体分子のイオンの構造情報または配列情報をさらに含む、請求項72記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項９０】
構造情報または配列情報が、MS/MSから得られる、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
1種または複数の生体分子のリストが、MS/MS分析のための生体分子のイオンを選択するために提供される、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
リストが包含リストである、請求項91記載の方法。
【請求項９３】
リストが除外リストである、請求項91記載の方法。
【請求項９４】
段階(b)において、データベースから生体分子を同定するために構造情報または配列情報が使用される、請求項89記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項９５】
生体分子が、Mascot(登録商標)、Protein Lynx Global Server、SEQUEST(登録商標)/TurboSEQUEST、PepSEQ、SpectrumMill、またはSonar MS/MSからなる群より選択されるコンピュータ手法を用いて同定される、請求項94記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項９６】
データベースが、Genbank(登録商標)、EMBL、NCBI、MSDB、SWISS-PROT(登録商標)、TrEMBL、dbEST、またはヒトゲノム配列データベースである、請求項94記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項９７】
段階(b)において、データベースから同定された生体分子にイオンが帰属される、請求項94記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項９８】
段階(b)において、イオンに関する非荷電質量を計算することにより、イオンが生体分子に帰属される、請求項72記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項９９】
段階(b)において、ペプチド質量フィンガープリント法により、イオンが生体分子に帰属される、請求項72記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項１００】
段階(c)において、積算が、1種または複数の電荷状態、同位体、走査、生体分子の断片、分離の画分、またはそれらの組合せの全体にわたる、請求項72記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項１０１】
段階(c)のコンピュータコードが、対照生物学的試料に対する生体分子の存在量をさらに計算する、請求項72記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項１０２】
段階(c)のコンピュータコードが、対照生物学的試料に対する複数の生体分子の存在量をさらに計算する、請求項72記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項１０３】
存在量が疾患または状態の診断に使用される、請求項101記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項１０４】
存在量が薬物の標的とする生体分子の決定に使用される、請求項101記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項１０５】
対照生物学的試料に対する生物学的試料中の、生体分子の存在量の増加もしくは減少、または生体分子の有無が、疾患または状態の指標である、請求項101記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項１０６】
存在量を使用し、生体分子のアイソフォーム量を決定する、請求項101記載のコンピュータ読取り可能なメモリー。
【請求項１０７】
生物学的試料中の生体分子の存在量を決定するシステムであって：
a)複数の生体分子に関するイオン数を含むデータを受け取る、質量分析データ入力モジュール；
b)データ入力モジュールに応答するイオン帰属モジュールであって、イオンを生体分子に帰属させるイオン帰属モジュール；および
c)イオン帰属モジュールに応答するイオン積算モジュールであって、生体分子のイオン数を積算し、これにより生物学的試料中の生体分子の存在量を決定するイオン積算モジュール
を含むシステム。
【請求項１０８】
システムが、プロセッサーおよび該プロセッサーに連結されたメモリーを含み、該メモリーが、データ入力モジュール、イオン帰属モジュール、およびイオン積算モジュールを符号化する、請求項74記載のシステム。
【請求項１０９】
生体分子がタンパク質である、請求項107記載のシステム。
【請求項１１０】
タンパク質が、単離されたオルガネラ由来である、請求項109記載のシステム。
【請求項１１１】
オルガネラが、ミトコンドリア、葉緑体、ER、ゴルジ、エンドソーム、リソソーム、ファゴソーム、ペルオキシソーム、分泌小胞、輸送小胞、核、および形質膜からなる群より選択される、請求項110記載のシステム。
【請求項１１２】
タンパク質が、細胞質ゾルタンパク質または細胞骨格タンパク質である、請求項109記載のシステム。
【請求項１１３】
生体分子が標識されない、請求項107記載のシステム。
【請求項１１４】
生体分子が誘導体化されない、請求項107記載のシステム。
【請求項１１５】
生体分子が切断された生体分子である、請求項107記載のシステム。
【請求項１１６】
切断された生体分子が標識されない、請求項115記載のシステム。
【請求項１１７】
切断された生体分子が誘導体化されない、請求項115記載のシステム。
【請求項１１８】
生体分子が酵素で切断される、請求項115記載のシステム。
【請求項１１９】
酵素がトリプシンである、請求項118記載のシステム。
【請求項１２０】
複数の生体分子が、質量分析データの取得前に分離される、請求項107記載のシステム。
【請求項１２１】
分離が、クロマトグラフィー、電気泳動、免疫分離、または遠心分離により実行される、請求項120記載のシステム。
【請求項１２２】
生物学的試料が、1種または複数の内部標準を含み、かつイオンの保持時間が、該1種または複数の内部標準を用いて補正される、請求項120記載のシステム。
【請求項１２３】
第二の生物学的試料をアッセイする段階をさらに含む、請求項107記載のシステム。
【請求項１２４】
生物学的試料が、1種または複数の内部標準を含む、請求項107記載のシステム。
【請求項１２５】
質量分析データが、生体分子のイオンの構造情報または配列情報を含む、請求項107記載のシステム。
【請求項１２６】
構造情報または配列情報が、MS/MSから得られる、請求項125記載のシステム。
【請求項１２７】
1種または複数の生体分子のリストが、MS/MS分析のための生体分子のイオンを選択するために提供される、請求項126記載のシステム。
【請求項１２８】
リストが、包含リストである、請求項127記載のシステム。
【請求項１２９】
リストが、除外リストである、請求項127記載のシステム。
【請求項１３０】
構造情報または配列情報を使用し、データベースから生体分子を同定する、請求項125記載のシステム。
【請求項１３１】
生体分子が、Mascot(登録商標)、Protein Lynx Global Server、SEQUEST(登録商標)/TurboSEQUEST、PepSEQ、SpectrumMill、またはSonar MS/MSからなる群より選択されるコンピュータ手法を用いて同定される、請求項130記載のシステム。
【請求項１３２】
データベースが、Genbank(登録商標)、EMBL、NCBI、MSDB、SWISS-PROT(登録商標)、TrEMBL、dbEST、またはヒトゲノム配列データベースである、請求項130記載のシステム。
【請求項１３３】
段階(b)において、データベースから同定された生体分子にイオンが帰属される、請求項130記載のシステム。
【請求項１３４】
段階(b)において、イオンに関する非荷電質量を計算することにより、イオンが生体分子に帰属される、請求項107記載のシステム。
【請求項１３５】
段階(b)において、ペプチド質量フィンガープリント法により、イオンが生体分子に帰属される、請求項107記載のシステム。
【請求項１３６】
段階(c)において、積算が、1種または複数の電荷状態、同位体、走査、生体分子の断片、分離の画分、またはそれらの組合せの全体にわたる、請求項107記載のシステム。
【請求項１３７】
方法が、対照生物学的試料に対する生体分子の存在量を計算する段階をさらに含む、請求項107記載のシステム。
【請求項１３８】
方法が、対照生物学的試料に対する複数の生体分子の存在量を計算する段階をさらに含む、請求項107記載のシステム。
【請求項１３９】
存在量が、疾患または状態の診断に使用される、請求項137記載のシステム。
【請求項１４０】
存在量が、薬物の標的とする生体分子の決定に使用される、請求項137記載のシステム。
【請求項１４１】
対照生物学的試料に対する、生物学的試料中の生体分子の存在量の増加もしくは減少、または生体分子の有無が、疾患または状態の指標である、請求項137記載のシステム。
【請求項１４２】
存在量を使用し、生体分子のアイソフォーム量を決定する、請求項137記載のシステム。
【請求項１４３】
使用者に、生物学的試料中の生体分子の存在量に関する情報を表示するための方法であって、以下の段階を含む方法：
a)複数の生体分子に関するイオン数を含む質量分析データを、コンピュータへ入力する段階；
b)イオンを生体分子に帰属させる段階；
c)生体分子のイオン数を積算し、これにより生物学的試料中の生体分子の存在量を決定する段階；および
d)生体分子の存在量を表示する段階。
【請求項１４４】
段階(d)が、メモリー中に生体分子の存在量を記憶する段階をさらに含む、請求項143記載の方法。
【請求項１４５】
生体分子がタンパク質である、請求項143記載の方法。
【請求項１４６】
タンパク質が、単離されたオルガネラ由来である、請求項145記載の方法。
【請求項１４７】
オルガネラが、ミトコンドリア、葉緑体、ER、ゴルジ、エンドソーム、リソソーム、ファゴソーム、ペルオキシソーム、分泌小胞、輸送小胞、核、および形質膜からなる群より選択される、請求項146記載の方法。
【請求項１４８】
タンパク質が、細胞質ゾルタンパク質または細胞骨格タンパク質である、請求項145記載の方法。
【請求項１４９】
生体分子が標識されない、請求項143記載の方法。
【請求項１５０】
生体分子が誘導体化されない、請求項143記載の方法。
【請求項１５１】
生体分子が切断された生体分子である、請求項142記載の方法。
【請求項１５２】
切断された生体分子が標識されない、請求項151記載の方法。
【請求項１５３】
切断された生体分子が誘導体化されない、請求項151記載の方法。
【請求項１５４】
生体分子が酵素で切断される、請求項151記載の方法。
【請求項１５５】
酵素がトリプシンである、請求項154記載の方法。
【請求項１５６】
複数の生体分子が、質量分析データの取得前に分離される、請求項143記載の方法。
【請求項１５７】
分離が、クロマトグラフィー、電気泳動、免疫分離、または遠心分離により実行される、請求項156記載の方法。
【請求項１５８】
生物学的試料が、1種または複数の内部標準を含み、かつイオンの保持時間が、該1種または複数の内部標準を用いて補正される、請求項156記載のシステム。
【請求項１５９】
第二の生物学的試料をアッセイする段階をさらに含む、請求項143記載の方法。
【請求項１６０】
生物学的試料が、1種または複数の内部標準を含む、請求項143記載の方法。
【請求項１６１】
質量分析データが、生体分子のイオンの構造情報または配列情報をさらに含む、請求項143記載の方法。
【請求項１６２】
構造情報または配列情報が、MS/MSから得られる、請求項161記載の方法。
【請求項１６３】
1種または複数の生体分子のリストが、MS/MS分析のための生体分子のイオンを選択するために提供される、請求項162記載の方法。
【請求項１６４】
リストが包含リストである、請求項163記載の方法。
【請求項１６５】
リストが除外リストである、請求項163記載の方法。
【請求項１６６】
構造情報または配列情報を使用し、データベースから生体分子を同定する、請求項161記載の方法。
【請求項１６７】
生体分子が、Mascot(登録商標)、Protein Lynx Global Server、SEQUEST(登録商標)/TurboSEQUEST、PepSEQ、SpectrumMill、またはSonar MS/MSからなる群より選択されるコンピュータ手法を用いて同定される、請求項166記載の方法。
【請求項１６８】
データベースが、Genbank(登録商標)、EMBL、NCBI、MSDB、SWISS-PROT(登録商標)、TrEMBL、dbEST、またはヒトゲノム配列データベースである、請求項166記載の方法。
【請求項１６９】
段階(b)において、データベースから同定された生体分子にイオンが帰属される、請求項166記載の方法。
【請求項１７０】
段階(b)において、イオンに関する非荷電質量を計算することにより、イオンが生体分子に帰属される、請求項143記載の方法。
【請求項１７１】
段階(b)において、ペプチド質量フィンガープリント法により、イオンが生体分子に帰属される、請求項143記載の方法。
【請求項１７２】
段階(c)において、積算が、1種または複数の電荷状態、同位体、走査、生体分子の断片、分離の画分、またはそれらの組合せの全体にわたる、請求項143記載の方法。
【請求項１７３】
対照生物学的試料に対する生体分子の存在量を計算する段階をさらに含む、請求項143記載の方法。
【請求項１７４】
対照生物学的試料に対する複数の生体分子の存在量を計算する段階をさらに含む、請求項143記載の方法。
【請求項１７５】
存在量が疾患または状態の診断に使用される、請求項173記載の方法。
【請求項１７６】
存在量が、薬物の標的とする生体分子の決定に使用される、請求項173記載の方法。
【請求項１７７】
対照生物学的試料に対する、生物学的試料中の生体分子の存在量の増加もしくは減少、または生体分子の有無が、疾患または状態の指標である、請求項173記載の方法。
【請求項１７８】
存在量を使用し、生体分子のアイソフォーム量を決定する、請求項173記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、質量分析、バイオインフォマティクス、およびコンピュータを利用した分子生物学の分野に関する。特に本発明は、生体分子定量の自動化に関する。
【０００２】
発明の背景
近年のゲノムおよびプロテオミクス研究に関する努力は、全体的な細胞および組織スケールでの生命分子を基礎とした分子の理解を非常に高めている。特に、生物の生体分子の時間的および空間的発現は、健常および疾患の両方において生じる生命のプロセスに寄与することが一層明らかになっている。科学は、いかにして遺伝的欠損が遺伝疾患を引き起こすかという理解から、癌のような複雑な医学的障害の病因において、複数の遺伝的欠損が環境因子と相互作用することの重要性の理解へと前進している。癌の場合において、科学的証拠は、いくつかの極めて重要な遺伝子およびそれらのタンパク質産物の発現の変化および複数の欠損が、重要な原因的役割を果たしていることを明らかにする。その他の複雑な疾患は、同様の分子基盤を有している。従って、生物の生体分子の発現と、健康または罹患した状態との間に確立することができる相関関係がより完全でかつ信頼できるようになると、より良く疾患を診断および治療することができる。特定の種類(例えば、タンパク質、脂質、核酸、糖質、代謝産物、およびそれらの組合せ)の1万種もの異なる生体分子を含み得る生物学的試料からの生体分子発現の効率的および迅速な定量を可能にする方法は、このような相関関係を決定する最も可能性のある機会を提供するために必要である。例えばプロテオミクスデータは、遺伝子発現プロファイリングのような、他のデータ型からは正確に予測することができない、機能性分子の真の発現レベルおよびそれらの翻訳後修飾を反映している。
【０００３】
試料中のタンパク質の系統的同定および特徴付けに関連しているプロテオミクスの中心的な目標は、2種またはそれ以上の試料間のタンパク質組成を比較することができるようになることである。この目標を達成するのに重要なことは、唯一の試料または試料型に存在する全てのタンパク質、およびいくつかの試料または試料型に存在するが存在量が異なるタンパク質を同定する能力である。しかし生きている生物のプロテオームの複雑さおよび動的な性質に加え、試料の量的および安定性の限界は、試料中に存在するペプチド材料のアミノ酸配列および供与源タンパク質(複数)を同定すること、試料中に存在する異なるペプチドまたは供与源タンパク質の相対的存在量を定量すること、ならびにプロテオームの正確なスナップショットを作成するための、試料に関する完全で十分なデータを提供することにおいて、非常に大きい障害となっている。プロテオームの複雑性およびこれらの作業の複雑性は、このようなプロテオームの全域にわたる分析および比較を妥当な時間枠内に達成することを困難にしている。
【０００４】
比較可能性それ自体も問題点である。二つの生体分子が同じかまたは同等であると判断される方法は、生体分子のフィールド内の特定の生体分子を同定するために使用される方法、ならびに試料から集められたデータの完全性に依存する。通常、試料中の全てのタンパク質の比較は、複雑なタンパク質混合物を、特定のタンパク質について特徴的移動位置を有する数百または数千のスポットに分ける、二次元(2D)ゲル電気泳動により実現される。ゲルおよび試料が適切に調製されかつ流されている場合には、ゲルパターンは、移動変量の補正により直接比較することができるが、ゲルの再現性は、実験室毎に、更には両性物質(ampholine)の異なるロットによっても、極めて可変性である。理論的には、各スポットは、一種類のタンパク質を表わし、各スポットの強度は、存在するタンパク質量の測定値とみなされる。このスポット中に存在するタンパク質は、次に質量分析または他の方法により、より完全に同定することができる；しかし、そのスポットの全フィールドはいうまでもなく、単独のタンパク質スポットの更なる同定でも、かなりの時間、労力および経費がかかる。2D電気泳動法は、いくつかの他の欠点も有し、その中で最も重要なものは、膜タンパク質同定の困難さである。一般に2-D電気泳動は、高疎水性分子の排除に関する問題点、および高荷電(高酸性または高塩基性)分子に加え、非常に小さい分子もしくは非常に大きい分子の検出における問題点を有する。加えて低存在量または中程度の存在量のタンパク質の検出も困難であり、これは配列解析のための十分な材料を収集するために、数個のゲルを流すことを必要としうる。2Dゲルスポットはまた、極めて大きい場合があり、このことはゲルの大部分にわたってタンパク質を希釈し、タンパク質の検出および正確な定量をより困難にしている。加えて、タンパク質、特に密接に関連したタンパク質または変種タンパク質の同時移動（co-migration）は、特定のタンパク質の適切な同定および定量の両方を妨害し得る。
【０００５】
他方、一次元(1D)ゲル電気泳動は、少なくとも可溶性タンパク質および膜タンパク質の両方の研究を可能にするタンパク質分離に一般に適用可能な道具である。しかし、タンパク質の複雑な混合物が分析される場合、分離の際に50〜100本のタンパク質バンドしか、典型的に検出可能に作成されず、従って1Dゲル中の1本のバンドは、1種よりも多いタンパク質を含むことがある。この理由のために、1本のバンドの強度は、典型的には試料中の単独のタンパク質の存在量を反映せず、同様に同定も問題が多くなる。例えば、単独のバンドの質量分析は、異なる濃度でバンド内に存在する、一種のみではないにしても数種(例えば、10〜20種)のタンパク質の同定につながると考えられる。
【０００６】
質量分析それ自身は、細胞内容物または細胞成分などの、分子の複雑な混合物を分析する別法の選択肢である。質量分析は、生体分子の分離および精製を可能にするクロマトグラフィーの適当な方法と組合せた場合、生体分子の同定および定量のためのデータ、ならびに異なる試料を例えるか、または識別するパターンのためのデータを、作成および分析する出発点を提供する。その最も基本において、質量分析は、生体分子の質量、および特定の走査に関するそれらの強度(イオン数)に関するデータを作成する。特異的分子の断片化パターンも作成することができるが、分子の更なる同定に使用することができるこれらの特徴的スペクトルは、最初の走査において作成された定量的データ(イオン数)には結びつけられない。この基本的データから構造情報を誘導するため、または、DNAもしくはタンパク質のようなポリマーの場合は、断片化パターンから配列情報を得るため、配列情報から供与源タンパク質を決定するため、および配列／同一性情報を定量データに連結するために、補助的努力が必要である。
【０００７】
ある定量的質量分析技術は、異なる同位体タグを各被験試料のペプチドへ結合することに頼っている。この方法論の例は、同位体コード化アフィニティー標識法(ICAT)と称される(Hanら(2001)、Nat. Biotechnol. 19:946-51参照(PMID: 11581660))。この方法は、システイン残基に特異的な反応性基、リンカー鎖およびビオチン化部分を含むアルキル化剤などにより、タンパク質を誘導体化することからなる。このアルキル化剤は、リンカー鎖内の8個の水素原子(軽)または8個の重水素原子(重)に対応する軽型および重型を含む。二つの試料を比較する場合、一方の試料からの全てのペプチドを、軽タグで標識し、および他方の試料からの全てのペプチドを、重タグで標識する。次に両方の試料を混合し、トリプシンで消化し、そして同時に分析する。その結果質量スペクトルにおいて、同じペプチドに対応しているが重タグおよび軽タグの間で正確な質量差(8Da)だけ異なるイオン対が同定される。従ってこれらのイオンは、同じペプチドに対応しているが、二つの異なる試料に由来している。この方法は、二つの試料からの対応するペプチドの存在量の直接的比較を可能にする。試料を直接比較することができるにも関わらず、この技術は一般に、システイン残基を含む全てのペプチドは、分析される前に化学的に修飾されなければならないという制限を有する。このような修飾は、経費および時間の両面でより費用がかかる。これらは更に、反応が完了しない場合に、精度においても経費がかかり、または処理時間に起因した遅延は、タンパク質の分解につながる。更に化学的修飾は、ペプチド中の特異的アミノ酸システインの存在を必要とし、このことはペプチドの大半はこの分析に適していないことを意味する。この要件は、この方法の多種多様なタンパク質への適用可能性を大きく低下している。ICAT法は、MS/MS実験におけるビオチン化された断片イオン由来の干渉強度も生じ、ペプチド配列情報を決定する能力を妨害する。
【０００８】
別の標識法は、水の軽同位体および重同位体を使用する。異なるタンパク質プール由来のトリプシンペプチドは、16Oおよび18O水で、C-末端標識される。この方法は、MS/MS実験におけるb-型およびy-型断片イオンの識別に使用される(Schevshenkoら(1997)、Rapid Commun. Mass Spectrom. 11:1015-1024)。この方法は同じく、アデノウイルスの二つの血清型においてタンパク質の異なる発現をモニタリングするためにも使用される(Yaoら(2001)、Anal. Chem.、73:2836-2842)。前述のように、タンパク質プールは、個別に消化され、標識され、および質量分析による分析のために組み合わされる。次に発現プロファイルが、重イオンの軽イオンに対する比を基に得られる。この方法は同じく、分析前にペプチドまたはタンパク質が標識されることを必要とし、従ってICATのように、不完全な反応、基質の非感受性により苦慮することがあり、余分な経費および余分な調製時間は、制限のある恐らく不安定な試料を害する可能性により、全てをより経費のかかるものにしている。これらの問題点は、生きている生物からこのような試料を調製することのさらなる課題により、一層悪くなる。
【０００９】
従って生体分子の同定または特徴付けの現存する方法は、生物学的試料の成分の定性的、定量的、および特異的な決定に加え、迅速で、正確で、自動化されかつ経済的な決定を実行する能力についてを改善される必要がある。例えば、試料中のペプチドの存在量を決定するために、質量分析を使用する方法であって、ペプチドの化学的修飾を必要としない方法の必要性が存在する。更に、生物学的試料間のタンパク質の相対的存在量を容易に比較することができること、ならびに薬物発見のための標的としてタンパク質を同定および特徴付け可能なことは、引き続き非常に必要とされている。本発明は、これらの必要性を満足し、他の関連した利点をさらに提供する。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、生物学的試料中の生体分子を同定し、かつ特徴付けるための、コンピュータで自動化された方法およびシステムを特徴とする。これらの方法において、質量分析の測定値は、試料中の生体分子について得られる。次にこれらの測定値は、本明細書に説明された方法により分析され、試料中の生体分子の存在量が決定され、および存在量の測定値は、それらが関連した1種または複数の生体分子の際だった特性と組合わされ、これにより複数の生物学的試料由来の生体分子存在量のコンピュータ媒介比較が可能になる。本発明者らは、この技術を「MIPS」または「質量強度プロファイリングシステム（mass intensity profiling system）」と称す。生物学的試料のスクリーニングおよびそれらの質量強度プロファイルの比較に関する、この自動化MIPS技術は、有無または発現の変化が関心対象の疾患または状態に関連する、個々の生体分子の迅速かつ効率的な同定を可能にする。このような生体分子(例えば、タンパク質)は、おそらく治療薬として、治療的介入の標的として、または診断、予後判定および治療反応評価のマーカーとして有用であろう。MIPS技術は、発現パターンが関心対象の疾患または状態に関連する、生体分子セットの迅速な同定も可能にし；このような生体分子のセットは、診断、予後判定および治療反応評価における可能性のある用途のための、生物学的マーカーの収集を提供する。
【００１１】
一つの局面において、本発明は、生物学的試料中の生体分子の存在量を決定する方法を特徴としている。一般にこの方法は、複数の生体分子を含有する生物学的試料を提供する段階；生体分子の複数のイオンを発生する段階；複数のイオンに対し質量分析測定を行い、これにより生体分子に関するイオン数を得る段階；イオンを生体分子へ帰属させる段階；および、生体分子のイオン数を積算し、これにより生物学的試料中の生体分子の存在量を決定する段階を含む。
【００１２】
特に本発明は、試料中のペプチドの存在量を決定する方法およびシステムを特徴としているが、下記の方法は、更に他の生体分子に適用することもできる。本発明は更に、2種またはそれ以上の試料間のペプチドの発現レベルを比較するために使用することができる方法およびシステムに加え、2種類またはそれ以上の試料間のタンパク質の発現レベルを比較する方法も特徴としている。これらの方法は、質量分析のデータの分析を基にしている。
【００１３】
様々な態様において、MIPSを用い、1種または複数のLC/MS走査において存在するペプチド性物質の存在量を決定することができる。MIPSを用い、存在する全ての前駆体、MS/MSにより作成されたスペクトルに合致する全ての前駆体、またはリスト(包含または除外)、照会（query）、もしくは照会セットにより限定された、前駆体の存在量を決定することができる。
【００１４】
一つの態様において、MIPSを使用し、アミノ酸配列の決定または完全長タンパク質同定を伴わずに、1種または複数のペプチドの存在量を計算することができる。あるいはMIPSを用い、アミノ酸配列の決定を行うが、完全長タンパク質同定は行わずに、1種または複数のペプチドの存在量を計算することができる。別の態様において、ペプチド質量フィンガープリント法を含むが、これらに限定されない方法(例えば、Cottrell(1994)、Pept. Res. 7:115-24参照)により、MIPSを使用して1種または複数のペプチドの存在量を計算し、かつ、先にアミノ酸配列決定を行わずに、ペプチドおよび完全長タンパク質の同定を行うことができる。更に別の態様において、MIPSを使用して1種または複数のペプチドの存在量を計算し、アミノ酸配列を決定し、かつペプチドが構成成分である完全長タンパク質を同定することができる。前記方法は、アミノ酸配列を決定することを含むが、完全長タンパク質の同一性の決定においてこの情報に頼らないように改変することができる。そのように同定された完全長タンパク質の存在量は、1種または複数のその構成要素ペプチドの存在量を基に計算することができる。これらの方法を使用し、2種またはそれ以上の試料間で同じペプチドまたはタンパク質の存在量を、または同じかもしくは異なる試料中の異なるペプチドもしくはタンパク質の存在量を、マッチさせるかまたは比較することもできる。試料間の比較は、患者からのデータを、参照試料、操作された試料、代表的試料、組合せ試料、または理論的試料と比較することを含む。
【００１５】
様々な態様において、MIPSを使用して同定された完全長タンパク質の1種または複数の構成要素ペプチドを同定し、かつ1種または複数の同定された構成員ペプチドの存在量を計算することができる。このような存在量のデータを使用し、次に完全長タンパク質の存在量を計算または再計算することができる。
【００１６】
別の態様において、MIPSを用い、その存在量を予め計算してもしなくとも、ならびに1種または複数のペプチドまたはタンパク質を予め同定してもしなくとも、1種または複数の試料中の1種または複数のペプチドまたは完全長タンパク質の存在量を照会することができる。照会は、手作業により入力されるか、またはMS/MSから除外するイオンのリストなどの、自動化処理の一部である。照会は、データ取得の前に行われてよく、そして収集されたデータを全体的もしくは部分的に決定するか、またはこれらはデータ取得後にデータを探査するために行われてもよい。
【００１７】
様々な態様において、完全長タンパク質存在量の計算は、1種または複数の構成要素ペプチドの存在量を基にしてもよい。このようなペプチドは、先に同定されていてもよく、または、これらは(自動または手作業で)探索され、それらの存在量が、特定の完全長タンパク質について推定されたペプチドを基に計算されてもよい。
【００１８】
様々な態様において、ペプチド存在量の計算は、絶対値または相対値であってよい。一般に存在量は、例えば、電荷状態のサブセット、同位体、修飾された状態、またはそれらの組合せのような、試料内の一貫した選択を基にしたイオン数の合計により決定される。
【００１９】
様々な態様において、比較は、同じかまたは異なるペプチドまたはタンパク質に対するものであってよい。比較は、相同体または類似体のペプチドまたはタンパク質、個別のペプチドまたはタンパク質、もしくはファミリーまたはグループを代表するペプチドまたはタンパク質に対するものであってもよい。比較は、無関係のペプチドまたはタンパク質に対するものであってもよい。データは、個別のペプチドおよび／もしくはタンパク質、ならびに／またはそれらの群について、外挿され、かつ統計解析されてもよい。比較に使用されるデータは、試料データの同じセット内、ならびに／または参照試料、操作した試料、代表的試料、組合せ試料、および／もしくは理論的試料を含むが、これらに限定されない、1種または複数の別のデータセット由来であってよい。
【００２０】
様々な態様において、1種のペプチドまたはペプチド類、1種のタンパク質またはタンパク質類のマッチングは、実験的または理論的保持時間を基にすることができる。理論的保持時間は、誤差、電荷状態、理論的および／もしくは調製された電荷状態、または同位体を考慮し計算することができ、これらは、試料に対し外来性であるものを含む1種または複数の内部標準を用いて調整することもできる。他の方法は、同位体パターンモニタリング(ペプチド認識は所定のペプチドの同位体モデルに基づく(ピークの高さ、幅および距離))のような、パターンモニタリングを含むが、これらに限定されない。このようなマッチングは、データの照会、比較、または個別の走査、スペクトル、配列情報、注解、およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない個別のデータ源からのデータの統一を含むが、これらに限定されない目的のためであってよい。
【００２１】
様々な態様において、存在量を計算することができる試料中のペプチドまたはタンパク質を用い、1種または複数のペプチドまたはタンパク質のリストを作成してもよく、これは次に他のリストと組合せるか、または、同じかもしくは別の試料の更なる分析におけるスペクトル決定のための選択のような、照会、マッチング、または管理データ収集のために、直接的もしくは間接的に使用することができる。
【００２２】
本発明は更に、生物学的試料中の生体分子存在量の決定のためにコンピュータで実行される方法を特徴とする。このコンピュータで実行される方法は、一般に複数の生体分子に関するイオン数を含む質量分析データを入力する段階；イオンを生体分子に帰属させる段階；および、生体分子のイオン数を積算し、これにより生物学的試料中の生体分子の存在量を決定する段階を含む。
【００２３】
別の局面において、本発明は、複数の生体分子に関するイオン数を含む質量分析データを入力として受け取るコンピュータコード；生体分子にイオンを帰属させるコンピュータコード；および、生体分子のイオン数を積算し、これにより生物学的試料中の生体分子の存在量を決定するコンピュータコードを含む、生物学的試料中の生体分子の存在量を決定するプログラムを含む、コンピュータ読取り可能なメモリーを特徴とする。
【００２４】
更に別の局面において、本発明は、複数の生体分子に関するイオン数を含むデータを受け取る質量分析データ入力モジュール；データ入力モジュールに応答するイオン帰属モジュール（イオン帰属モジュールは、イオンを生体分子へ帰属する）；および、イオン帰属モジュールに応答するイオン積算モジュール（イオン積算モジュールは、生体分子のイオン数を積算し、これにより生物学的試料中の生体分子の存在量を決定する）を含む生物学的試料中の生体分子の存在量を決定するシステムを特徴としている。一つの態様において、このシステムは、プロセッサーおよびプロセッサーに連結されたメモリーを備え、ここでメモリーは、データ入力モジュール、イオン帰属モジュール、およびイオン積算モジュールを符号化する。
【００２５】
別の局面において、本発明は、複数の生体分子に関するイオン数を含む質量分析データを入力する段階；生体分子にイオンを帰属させる段階；生体分子のイオン数を積算し、これにより生物学的試料中の生体分子の存在量を決定する段階；ならびに、生体分子の存在量を表示する段階を含む、使用者に生物学的試料中の生体分子の存在量に関する情報を表示する方法を特徴とする。一つの態様において、本方法は、更にメモリーに生体分子の存在量を記憶させる段階を含む。
【００２６】
前述の局面のいずれかの様々な態様において、生体分子は、誘導体化されないかまたは標識されない。この生体分子は、切断された生体分子であってもよい。好ましい態様において、生体分子は、酵素で切断される。しかし一般に、これらの方法は、生体分子の同位体標識またはアルキル化のような、切断以外の修飾を必要とせず、すなわち、切断された生体分子は、誘導体化されないかまたは標識されない。更に別の好ましい態様において、本発明は更に、2種またはそれ以上の生物学的試料をアッセイすることを特徴とする。望ましいならば、本発明は、生物学的試料中の1種または複数の内部標準の包含を特徴とする。更に別の態様において、コンピュータ手法は、イオンの非荷電質量を計算することにより、イオンを生体分子に帰属させる。あるいはイオンは、例えば、ペプチド質量フィンガープリント法のような、質量フィンガープリント法により、生体分子に帰属させることができる。更に別の態様において、コンピュータ手法は、生体分子に対応するイオンのイオン数を積算する。この積算は好ましくは、1種または複数の電荷状態、同位体、走査、生体分子の断片、分離の画分、またはそれらの組合せの全体にわたる。別の態様において、本発明は更に、MS分析前の複数の生体分子の分離を特徴としている。典型的には、このような分離は、当技術分野において公知の標準の方法を用い実行される。これらの方法は、クロマトグラフィー、電気泳動、免疫分離(例えば、磁気ビーズの使用)、または遠心分離を含むが、これらに限定されない。イオンの保持時間は、1種または複数の内部標準を用いて補正することができる。
【００２７】
前述の局面のいずれかの様々な他の態様において、生体分子は、典型的にはタンパク質または修飾されたタンパク質である。好ましくは、このタンパク質は、単離されたオルガネラから得られる。単離されたオルガネラの例は、ミトコンドリア、葉緑体、ER、ゴルジ、エンドソーム、リソソーム、ファゴソーム、ペルオキシソーム、分泌小胞、輸送小胞、核、および形質膜を含むが、これらに限定されるものではない。他の細胞成分から得られたタンパク質も、本発明において有用である。これらのタンパク質は、細胞質ゾルタンパク質または細胞骨格タンパク質を含む。
【００２８】
好ましい態様において、質量分析測定値は、例えばMS/MS分析により、生体分子のイオンの構造情報または配列情報を集めることにより得られる。生体分子またはそのイオンは、照会により構造分析または配列分析(例えば、MS/MS分析)について選択されてもよい。一つの態様において、包含または除外リストを用い、どのイオンに構造または配列分析が施されるかが決定される。本発明の方法およびシステムは更に、データベースからイオン配列を含むタンパク質を同定するための、コンピュータ手法の使用を特徴としている。手法の例は、Mascot(登録商標)、Protein Lynx Global Server、SEQUEST(登録商標)/TurboSEQUEST、PEPSEQ、SpectrumMill、またはSonar MS/MSを含む。このような手法を用い検索されるデータベースの例は、Genbank(登録商標)、EMBL、NCBI、MSDB、SWISS-PROT(登録商標)、TrEMBL、dbEST、またはヒトゲノム配列（Human Genome Sequence）データベースである。更に、これらの方法およびシステムは、イオンをデータベースから同定されたタンパク質に帰属させるために、コンピュータ手法を使用する。
【００２９】
前述の局面のいずれかの様々な別の態様において、本発明は、対照生物学的試料に対する生体分子の存在量を計算すること、および対照生物学的試料に対する複数の生体分子の存在量を計算することを特徴としている。典型的には、生体分子セットの存在量測定値は、疾患または状態を診断するために使用される。加えて、存在量は、薬物の標的とする生体分子を決定するために使用される。このような標的は、対照試料と比べ、生物学的試料中の生体分子の存在量の増加もしくは減少、または生体分子の有無を評価することにより同定される。生体分子の存在量を用い、生体分子のアイソフォーム量、または生体分子の天然の修飾量を決定することもできる。
【００３０】
「生体分子」は、生物学的試料中に存在する有機分子を意味し、これはペプチド、ポリペプチド、タンパク質、転写後修飾されたペプチドもしくはタンパク質(例えば、グリコシル化、リン酸化、またはアシル化されたペプチド)、オリゴ糖、多糖、脂質、核酸、および代謝産物を含む。
【００３１】
「生物学的試料」(または「試料」)は、いわゆる単細胞微生物(細菌および酵母など)、ならびに多細胞生物(植物および動物など、例えば脊椎動物または哺乳類、特に健常または見かけ上健常なヒト被験者、または診断もしくは検査されるべき状態または疾患に罹患したヒト患者)を含む、任意の生きている生物から得られるか、排泄されるか、または分泌される、固形または液体の試料を意味する。生物学的試料は、任意の部位(血液、血漿、血清、尿、胆汁、髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の体分泌物など)、排出液(膿瘍または任意の他の感染部位もしくは炎症部位から得られた液体など)、または関節から得られた液体(正常な関節もしくは慢性リウマチのような疾患に罹患した関節など)から得られた生物学的液体であって良い。あるいは、生物学的試料は、臓器または組織(生検もしくは剖検標本を含む)から得ることができ、あるいは細胞(初代細胞もしくは培養細胞のいずれか)、または任意の細胞、組織もしくは臓器により馴化された(conditioned)培地を含むことができる。望ましいならば、生物学的試料には、予備的分離技術を含む、予備処理が施される。例えば細胞または組織は、抽出され、ならびに例えば細胞の異なる部分に認められるタンパク質または薬物のような、個別の細胞下画分中の生体分子の分離分析のために細胞下分画を施すことができる。試料は、例えばゲルのバンドのような、試料のサブセットとして分析することができる。
【００３２】
「イオンを生体分子に帰属させる」とは、質量スペクトルにおいて観察されたイオンを発生した生体分子を特定することを意味する。このイオンは、生体分子またはそれらの断片に帰属させることができる。このような帰属は、例えば、分子量、または他の物理化学的特性を基にすることができる。この帰属はまた、そのイオンの分子量の決定、およびその質量を公知の生体分子とのマッチングを基にするか、または例えば、データベース検索に使用することができるような、イオンに関する構造情報もしくは配列情報を同定するデータ、例えばMS/MSからのデータを基に行うことができる。
【００３３】
「非荷電質量」とは、イオンを発生した生体分子またはその断片の、中性の電荷状態の質量を意味する。
【００３４】
「生体分子のイオン数の積算」とは、m/z値の規定された範囲内のデータに関する、イオン数の合計を意味する。この語句はまた、2種またはそれ以上のイオンの積算されたイオン数の合計も意味する。例えば、異なる電荷状態、同位体、分離の画分、走査、または生体分子の断片で認められたイオンは、積算することができる。
【００３５】
用語「タンパク質」は、1個のアミノ酸(またはアミノ酸残基)のα炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が、隣接アミノ酸のα炭素に結合したアミノ基のアミノ窒素原子と共有結合する場合に形成される、ペプチド結合を介して連結された、2個またはそれ以上の個別のアミノ酸のポリマーを意味する。用語「タンパク質」は、その意味において、「ポリペプチド」および「ペプチド」(これらは、時々、本明細書において互換的に使用することができる)を、更には翻訳後修飾およびそれらの断片を含むと理解される。加えて、複数のポリペプチドサブユニット(例えば、インスリン受容体、シトクロムb/cl複合体、およびリボソーム)または他の成分(例えば、RNA分子)を含むタンパク質も、本明細書において使用されるように「タンパク質」の意味に含まれることは理解されるであろう。同様に、タンパク質およびポリペプチドの断片も、本発明の範囲内であり、かつ本明細書においては「タンパク質」、「ポリペプチド」もしくは「ペプチド」、「トリプシンペプチド」、または「切断断片」と称しても良い。「構成要素ペプチド」は、その配列が、より大きいペプチドまたは完全長タンパク質の配列の直鎖状サブセットであるようなペプチドである。特定のタンパク質の「構成要素ペプチド」は、グループとして、そのタンパク質を形成しているもののセットまたはサブセットである。通常これは、タンパク質を形成するトリプシンペプチドのセットのような、特定の切断断片に限定されたサブセットである。「完全長タンパク質」は、メッセンジャーRNA(mRNA)によりコードされ、かつそれから翻訳されたタンパク質、ならびにその翻訳後修飾物を意味する。完全長タンパク質は、本明細書に説明されたような、コンピュータ手法によるデータベース検索により同定することができる。
【００３６】
「前駆体」は、生体分子、例えば潜在的なペプチドもしくはタンパク質、または未知の配列もしくは未知の同一性の生体分子を意味する。一般にこれは、MS/MSによる配列決定などの二次的同定の努力以前の、質量分析の調査走査データにおける潜在的なペプチドを意味する。「前駆体」は、その質量、またはその保持時間の比較により同定されることが多い。このような保持時間は、実験的または理論的であることができる。理論的保持時間は、1種または複数の内部標準を使用し、試料間で同等の保持時間を生じるように補正されることが多い。推定された保持時間を使用し、走査内の前駆体を求めることができる。「前駆体」は、「ペプチド」と互換的に使用されることが多く、これは完全長タンパク質からの個別の構成ペプチドを識別するために使用されることもある。
【００３７】
「走査」は、単独の試料からの質量スペクトルを意味する。測定される分離画分の各々は走査を生じる。生体分子が複数の分析される画分中にある場合は、その生体分子の質量スペクトルは、複数の走査に存在する。
【００３８】
「画分」は、分離の一部を意味する。画分は、例えばLC(液体クロマトグラフィー)などにおける所定の時間枠内に得られた液体の容量に相当することができる。画分は、ゲル電気泳動により促進された生体分子の分離におけるバンドのように、分離における空間的配置に相当してもよい。
【００３９】
「照会」とは、特定の作用の選択を意味する。照会の一例において、ソフトウェアにより保存されたリストを基に、イオンをMS/MSに供してもよい。あるいは、MS/MSに供されるイオンを手作業により選択することができる。この手作業による選択も、照会である。
【００４０】
「誘導体化されない」生体分子またはその断片とは、その天然の状態から化学的に変更されていない生体分子またはその断片を意味する。誘導体化は、生体分子またはそれらの断片の非-天然の合成の間、またはその後の操作もしくは処理の間に起こり得る。
【００４１】
「標識されない」生体分子またはそれらの断片とは、生体分子またはその断片に天然に合成された生体分子と異なる物理化学特性をもたらす、外来性標識(例えば、同位体標識または放射標識)で誘導体化されない、生体分子またはその断片を意味する。
【００４２】
本発明の方法およびシステムは、多くの著しい利点を提供する。例えば、これらの方法およびシステムは、タンパク質の同定およびその存在量の測定の両方を可能にする方法で、質量分析およびデータ解析を組合わせる。従ってこれらの方法は、生体分子が由来した当初の生体分子の相対的存在量を比較するために、試料セット間で生体分子のイオン強度を相関することが可能である。更にこれらの方法は、異なるデータセットからの限定されない数のタンパク質の包括的比較が可能であるように、完全に自動化される。従ってこの自動化は、比較されるべき2種またはそれ以上の試料中のタンパク質存在量について可能である。全質量スペクトルからの情報は、発現レベルを決定するために使用することもできる。典型的には、質量スペクトルに存在する大量の情報が破棄され、および特異的イオンの強度、または特異的ペプチドの配列、またはペプチド質量のリストのようなサブセットのみが解析される。最後に、自動化の使用は、解析に必要な時間を大きく短縮する。
【００４３】
本発明のその他の特徴および利点は、下記の図面および詳細な説明、ならびに「特許請求の範囲」から明らかであると考えられる。
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明は、生体分子の存在量を、定性的もしくは定量的、または両方で測定するための質量分析を利用する方法およびソフトウェアを特徴としている。一つの適用において、本発明の方法およびシステムを用い、例えば、相対的発現レベルの変動を決定するため、または相対発現の比が予め設定された値を上回るかもしくは下回るようなペプチドを同定するために、2種またはそれ以上の試料中に存在する大量のペプチドを比較する。その後、発現プロファイルの統計解析を使用し、例えば疾患の診断および創薬に関するペプチドマーカーを同定する。
【００４５】
生物学的試料
本発明の方法を用い、生物学的試料中の生体分子の発現プロファイルが、モニタリングされる。本発明の方法において有用な生体分子の例は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、翻訳後修飾されたペプチド(例えば、グリコシル化、リン酸化、またはアシル化されたペプチド)、オリゴ糖および多糖、脂質、核酸、ならびに代謝産物などの、生物学的試料中に存在する有機分子を含む。単細胞の微生物(細菌および酵母など)、ならびに多細胞生物(植物および動物、例えば脊椎動物または哺乳類、ならびに特に健常なもしくは見かけ上健常なヒト被験者、または診断もしくは検査されるべき状態もしくは疾患に罹患したヒト患者)を含む、いずれかの生存している生物から得られるか、排出されるか、または分泌される、固形または液体試料を含むが、これらに限定されない、事実上あらゆる生物学的試料が、本発明の方法において有用である。生物学的試料は、任意の部位(血液、血漿、血清、尿、胆汁、髄液、房水もしくは硝子体液、または体の分泌物など)、排出液(膿瘍または任意の他の感染もしくは炎症部位から得られる液体など)、または関節から得られる液体(正常な関節または慢性リウマチのような疾患に罹患した関節など)から得られる生物学的液体であって良い。あるいは、生物学的試料は、臓器または組織(生検または剖検標本を含む)から得ることができ、あるいは細胞(初代細胞もしくは培養細胞のいずれか)または任意の細胞、組織もしくは臓器により馴化された培地を含むことができる。望ましいならば、生物学的試料には、予備的分離技術を含む、予備処理が施される。例えば、細胞または組織は抽出され、例えば細胞の異なる部分に認められるタンパク質または薬物のような、個別の細胞下画分中の生体分子の分離分析のために、細胞下分画に供してもよい。このような分画法の例は、De Duve((1965) J. Theor. Biol. 6:33-59)に説明されている。
【００４６】
タンパク質を分析する場合、望ましいならば、生物学的試料は、存在する非-ペプチド性物質の量を減少させるために、精製される。更に望ましいならば、タンパク質-含有試料を切断し、分析のためのより小さいペプチドが作成される。このペプチドの切断は、一般に、酵素的に、例えばトリプシン、エステラーゼ、もしくはキモトリプシンでの消化により、または化学的に、例えば臭化シアンにより達成される。タンパク質の特異的位置での切断は、これらのペプチド配列が分かっている場合に、作成されるより小さいペプチドの質量の予測を可能にする。比較されるべき全ての試料は、典型的には同じ方法で処理される。
【００４７】
本明細書において説明された方法で実行される場合に、望ましいならば、参照試料が含まれる。この参照試料は典型的には、既知量の生体分子を含むか、または例えば非疾患組織のような、既知の供与源に由来することができる。参照試料は、公知の生体分子から合成することができる。加えて、未知の試料は、相対存在量を決定するために、参照資料と比較することができる。参照試料は、適当ならば、内部標準として作用するために、他の試料と一緒にしてもよい。
【００４８】
生体分子の分離
前述のいずれかの生体分子を分離する多種多様な技術が、当業者に周知であり(例えば、Laemmli、Nature 1970、227:680-685；Washburnら、Nat. Biotechnol. 2001、19:242-7；Schaggerら、Anal. Biochem. 1991、199:223-31)、かつ本発明に従い使用することができる。
【００４９】
一つの適用において、本発明の方法は、タンパク質の複雑な混合物を研究するために使用される。例証として、タンパク質の混合物を、等電点(例えば、クロマトフォーカシングまたは等電点フォーカシングにより)、電気泳動移動度(例えば、非変性電気泳動、または2-メルカプトエタノールもしくはジチオスレイトールのような還元剤へ予め曝露するか、もしくは曝露しない、尿素もしくはドデシル硫酸ナトリウム(SDS)のような変性剤の存在における電気泳動による)を基に、いずれか適当なマトリックス上でのLC、FPLCおよびHPLCを含むクロマトグラフィーにより(例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィー、例えば固定化抗体または磁気ビーズ上に固定されたレクチンもしくは免疫グロブリンによる)、または遠心分離(例えば、等密度遠心または速度遠心)により、分離することができる。
【００５０】
場合によっては、2種の異なるペプチドは、質量分析計の分解能内で同じ質量を有することがあり、このことはこれらの2種のペプチドの存在量の決定を困難にする。質量分析による分析前のペプチドの分離は、同一質量の2種のペプチドの存在量の分解を可能にする。その後分離画分の多くのスペクトルが得られるが、これらのスペクトルは典型的には、そのペプチドからのイオンピーク数を減らし、このことは所定のスペクトルの分析を単純化する。
【００５１】
一つの態様において、タンパク質の混合物は、当技術分野において公知の方法に従い、1Dゲル電気泳動により分離される。分離されたタンパク質を含むレーンは、ゲルから切出され、画分に分離される。その後これらのタンパク質は、酵素により消化される。その後各画分中に生成されたペプチドは、質量分析により分析される。別の態様において、ペプチドは、当技術分野において公知の方法に従い、2Dゲル電気泳動により分離される。その後これらのタンパク質は、酵素により消化され、ならびに各画分中に生成された消化ペプチドは、次に切出され、質量分析により分析される。更に別の態様において、ペプチドは、当技術分野において公知の方法により、多次元LCを含むが、これに限定されない、液体クロマトグラフィー(LC)により分離される。LC画分は、収集しおよび分析することができ、または溶離液は、実時間分析のために質量分析計に直接連結することができる。LCを使用し、ゲル電気泳動により得られた画分を更に分離することができる。LC中のペプチドの保持時間(RT)の記録は、複数の画分中のそのペプチドの同定を可能にする。この同定は典型的には、正確な存在量を得るために有用である。前記態様のいずれかにおいて、所定のペプチドは、画分がどのようにして得られたかに依存して、複数の画分中に存在しうる。
【００５２】
質量分析
質量分析技術を用い生体分子を分析する例証的方法は、当技術分野において周知である(Godovac-Zimmermannら(2001)、 Mass Spectrom. Rev. 20:1-57(PMID:10344271)；Gygiら(2000)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:9390-9395(PMID:10920198))。
【００５３】
ペプチドに関連する適用において、ペプチドは、質量分析計へ進入する前に、例えば電子スプレーイオン化によりイオン化され、その後望ましいならば異なる種類の質量スペクトルが得られる。質量分析計の正確な種類は、本明細書に開示される方法にとって重要ではない。例えば、サーベイ走査において、試料中の電荷をもつペプチドの質量スペクトルが記録される。更に1種または複数のペプチドのアミノ酸配列が、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化-飛行時間質量分析(MALDI-TOF MS)、電子スプレーイオン化質量分析(ESI MS)、またはタンデム質量分析(MS/MS)のような、適当な質量分析技術により決定される。MS/MS走査において、サーベイ走査において検出された特異的イオンが選択され、衝突チャンバーへ進入する。MS/MSのためにイオンを規定する能力は、特異的前駆体についてのデータの獲得をもたらすが、他の前駆体を排除する可能性がある。これらのイオンは、予め定められたリストまたは照会により規定することができる。リストは、包含リスト(すなわち、リスト上のイオンにMS/MSが施される)または除外リスト(すなわち、リスト上のイオンにMS/MSが施されない)であってよい。その後衝突チャンバー内で発生する一連の断片が、質量分析により再度分析され、こうして得られたスペクトルが記録され、および特定のペプチドのアミノ酸配列を同定するために使用される。次にこの配列は、ペプチド質量のような他の情報と共に、例えばタンパク質を同定するために使用することができる。MS/MSサイクルに供されるイオンは、使用者により定義されるか、または測定器(spectrometer)により自動的に決定されてよい。
【００５４】
質量強度プロファイリングシステム(MIPS)
質量スペクトルを分析するソフトウェアは、典型的には、イオンが由来した生体分子を同定するために使用される。しかし質量スペクトルは、その対応するイオン強度(例えば、イオン数/秒)により反映されるようなイオンの相対強度に関する情報も含む。更に質量スペクトルは、典型的には生体分子のいくつかの電荷状態またはいくつかの同位体からのイオン強度に対応する大量の情報を含む。本明細書に説明されたように、自動化された方法は、その試料中の生体分子の包括的特徴付けを実現するために、1種または複数の試料について記録された質量スペクトルの処理を可能にする。
【００５５】
より詳細に以下に説明されるように、本明細書の方法において使用されるソフトウェアは、スペクトル中のイオンシグナル(例えば、ペプチドイオンシグナル)を自動的に同定する。その後生体分子存在量の測定値は、様々な方法により算出される。例えば、生体分子イオンの特異的サブセット(例えば+2電荷の全てのイオン)の強度、生体分子の一つの同位体由来の全てのイオン(12C、1H、14Nおよび16O-含有生体分子のみ)の強度、生体分子同位体のあるサブセットの強度、全ての同位体の強度、またはそれらの組合せを積算することができる。
【００５６】
本明細書に説明された方法は、事実上任意のコンピュータシステムを用い、かつ下記の例証的プログラムに従い実行される。図1は、例証的コンピュータシステムを示す。コンピュータシステム2は、内部コンポーネントおよび外部コンポーネントを備える。内部コンポーネントは、メモリー6に連結されたプロセッサー4を備える。外部コンポーネントは、例えば、ハードディスクドライブのような大容量記憶装置8、例えば、キーボードおよびマウスのような使用者入力装置10、例えばモニターのようなディスプレイ12、ならびに通常、データおよび処理作業を共有することができるようにコンピュータシステムを他のコンピュータへ接続することが可能な、ネットワークリンク14を備える。プログラムは、操作時に、このシステム2のメモリー6へロードされる。これらのプログラムは、例えば、コンピュータシステムを管理するMicrosoft Windowsのようなオペレーションシステム16、本発明の方法を実行するプログラムを補助する共通言語および関数を符号化するソフトウェア18、ならびに処理言語または記号パッケージ(symbolic package)内に本発明の方法を符号化するソフトウェア20を含んでいる。この方法をプログラムするために使用することができる言語は、Microsoft社のVisual C/C++であるが、これに限定されるものではない。好ましい適用において、本発明の方法は、等式の記号入力および処理の高レベルの特定化を可能にする、数学的ソフトウェアパッケージにおいてプログラムされ、これはこれらのプログラムの実行において使用される手順を含み、これにより使用者は処理用の個別の等式または手順をプログラムする必要性から解放される。この目的に有用な数学的ソフトウェアパッケージの例は、Mathworks社(Natick、MA)によるMatlabである。Matlabソフトウェアを使用し、多重プロセッサーにおける処理を支援する、パラレルバーチャルマシン（Parallel Virtual Machine、PVM)モジュールおよびメッセージパッシングインターフェース（Message Passing Interface、MPI)に適用することもできる。このPVMおよびMPIの本明細書の方法による実行は、当技術分野において公知の方法を用いて達成される。あるいは、このソフトウェアまたはその一部は、当技術分野において公知の方法により専用の回路に符号化される。
【００５７】
図2は、試料中の生体分子の存在量を決定する方法の、コンピュータで実行される流れ図を示している。特に、図2は試料中の一つの生体分子の存在量の決定を説明している。しかしこの方法は、試料中の複数種の生体分子の存在量の決定にも使用することができる。
【００５８】
段階100において、質量分析測定値が、プログラムへ入力される。これらの測定値は、生体分子もしくはその断片の分離からの、MSデータ、MS/MSデータ、複数の走査、および／または例えばデータベースの検索により得られた構造情報もしくは配列情報を含むことができる。段階102において、質量分析計により測定されたイオンが生体分子に帰属される。この生体分子は、比較的大きい生体分子の断片であることができる。この帰属は、本明細書に説明されたような、イオンの質量または電荷状態の決定を基にすることができる。この帰属は、代わりに、例えば、本明細書に記されたようなMS/MSおよびデータベース検索から得られた配列情報または構造情報を基にすることができる。段階104において、イオン強度に相当するイオン数が、積算される。例えば、m/z値または走査範囲の全域に広がる1種のイオンピークに関するイオン数を合計し、各ピークに関する積算された強度を決定する。例えば、電荷状態、同位体、走査、および比較的大きい生体分子の断片、またはそれらのサブセットから、同じ生体分子から生じるいくつかのピークの積算を生じることができる。イオン数は、1種または複数の内部標準により標準化することもできる。試料から積算されたイオン数は、例えば参照試料のような別の試料からのイオン数と比較し、別の試料に対するその試料中の生体分子の存在量を決定することができる。積算されたイオン数は、その生体分子に関する絶対標準によっても標準化することができ、試料中のその生体分子の絶対存在量を決定する。分析の結果は、例えばモニター上で、使用者に対し表示されるか、またはメモリーに記憶することができる。次に、計算された存在量の統計解析のような、このデータの更なる分析を行ってもよい。
【００５９】
本発明は、一つの適用において、タンパク質を研究するためのコンピュータで実行されるモジュールを特徴としている。このようなモジュールは、本発明の方法の例として、本明細書に説明されている。他の生体分子を、同様のモジュールを用いて調べてもよい。以下に説明されているように、「ペプチド存在量モジュール(PAM)」は、既知のペプチド(例えば、MS/MS スペクトルにより配列情報が作成された前駆体、または推定ペプチド、例えば質量および／または保持時間が推定されうる完全長タンパク質もしくは理論的配列の構成ペプチド)の存在量を決定し、ならびに「ペプチドハンターモジュール(PHM)」は、未知のペプチド(例えば、MS/MSスペクトルにマッチしていない前駆体、またはMS/MSスペクトルがまだ決定されていない前駆体)の存在量を同定および決定する。MIPSのPHMおよびPAMモジュールは、望ましいならば、解析に要する時間を短縮するために、マルチプロセッシング環境において同時に実行される。マルチプロセッシング環境は、例えば、システムのクラスター(例えば、Linux-ベースのPC)を含むか、またはマルチプロセッサー(例えば、Sun Microsystems社)を利用し、ならびに本明細書の方法は、そのような分散されたネットワーク上で、当技術分野において公知の方法を用い実行される(Taylorら(1997)、Journal of Parallel and Distributed Computing、45:166-175)。
【００６０】
PAMおよびPHMは、手作業により本明細書の方法を実行することと比べ、著しく加速された解析速度を提供する。例えば5種の試料において5種のトリプシンペプチドを有する一つのタンパク質を見つけるために適用されるPAMは、そのタンパク質の存在量を得るためにおよそ7分間を要する。手作業では、この処理に数日間かかる。別の例において、一つのデータセットに関するPHMは、2000種を超えるタンパク質を見つけるのに15分間要するが、手作業では、この仕事は数百人時を必要とするであろう。
【００６１】
ペプチド存在量モジュール
質量分析は、例えば、MS/MS分析から、試料中の多数のペプチドの同定を可能にする。MS/MSサイクルは、選択されたペプチドに関するペプチド配列情報を作成し、次にこれは包括的にデータベースを検索するために使用することができる。例えば、コンピュータを使用し、発現配列タグ(EST)を含む、マッチングアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に関する利用可能なデータベースを検索する（この推定されたアミノ酸配列は、実験で決定されたアミノ酸配列とマッチする）。この目的のために有用なデータベースの例は、Genbank、EMBL、NCBI、MSDB、SWISS-PROT、TrEMBL、dbEST、ヒトゲノム配列データベース、または使用者の定義したデータベースを含むが、これらに限定されない。その後、選択されたペプチドを含むデータベース中の化合物に関する配列情報を使用し、特定の切断技術を用いその化合物に由来する他のペプチドのリストを作成することができる。次にこの質量スペクトルを、例えば、推定されたペプチドの電荷状態または同位体からのイオンに対応するピークについて自動検索する。これらのイオンの強度プロファイルは、「ペプチド存在量モジュール(PAM)」により作成される。PAMは、切断の方法により推定されるペプチドに加え、データベース検索に用いたものに関する強度プロファイルを作成することができる。MS/MSデータを獲得するペプチドピークは、それらの各保持時間に関してマッチする。
【００６２】
典型的にはペプチドピーク面積の包括的リストが作成され、かつ内部標準化を用いて補正され、これにより試料中のペプチドの強度を、参照ペプチドに対して表現することを可能にする。例えば、バンドまたは画分、電荷状態、断片の全域にわたる特定のペプチドに関するペプチドピーク面積は、比較を円滑にするために組み合わされてよい。化合物の構成成分である多数のペプチドからのペプチドピーク面積は、更に比較を円滑にするために組み合わされてよい。例えば一つのタンパク質由来のペプチド強度の平均を、そのタンパク質存在量に関する測定値として採用することができる。ピーク面積の比較は、実験セット間のタンパク質存在量の差異の同定を可能にする。このプロセスは、全体が自動化され、これによりデータ解析を円滑にしている。
【００６３】
図3は、PAMのコンポーネントを詳述する流れ図を示している。各コンポーネントは、以下に詳細に説明されている。PAMの例に関する流れ図は、図13に示した。この流れ図は、本発明の方法の例証を目的として示されており、本発明の方法を限定するものではない。特定の試料を処理するPAMの推定時間の例は、図14に図示されている。
【００６４】
データフォーマット変換
生の質量分析データファイルは、典型的には、分離の各画分に関する、MS走査または一連のサーベイ走査およびMS/MSサイクルからなる。各質量スペクトルは、例えば、LCに関する溶出時間またはゲル電気泳動に関する画分、またはそれら両方に対応している。各サーベイ走査は、質量分析計により検出された各m/z値のイオンの数を記録する。生の質量分析データファイルは、Micromass社(Beverly、MA)のMassLynxを含むが、これらに限定されない、様々な公に入手できるソフトウェアパッケージにより作成することができる。例えばMassLynxによりMIPSを積算するために、MassLynx内のソフトウェアは、質量分析計からのデータを、例えばASCIIまたはNetCDFフォーマットに変換する。質量分析データを得るための別のソフトウェアパッケージは、同様の変換ソフトウェアを有する。あるいは、データ変換のためのソフトウェアは、当技術分野において公知の方法を用いて書かれており、かつそのモジュール内に含まれる。任意に、データ変換は、複数のファイルの併合(merger)を含んでよい。ファイル併合は、特定の前駆体の存在量のような、ファイル要素の併合を含んでもよい。
【００６５】
タンパク質／遺伝子同定
生の質量分析データは、Matrix Science社(ロンドン、英国)のMascot、Micromass社からのProteinLynx Global Server、Thermo Finnigan社(サンノゼ、CA)からのSEQUEST/TurboSEQUEST、またはProteoMetrics社(ニューヨーク、NY)からのSonar MS/MSなどの道具を用い、化合物、例えばタンパク質の同定について提示される。この分析は、分析下の試料中に存在する可能性が高いタンパク質のリストを作成する。
【００６６】
ペプチドリスト作成
このコンポーネントにおいて、注釈された理論的ペプチド質量のリストは、下記のように同定されたタンパク質、同定された遺伝子、および生の質量分析データのリストから作成される。同定された化合物の切断(例えば、トリプシン処理)ペプチドは、予想することができ、かつこれらのペプチドの理論的質量を作成することができる。次に、ペプチドの質量は、そのアミノ酸配列から推定することができる。この質量は、試料由来のマッチしたペプチドの質量を基にすることもできる。関心対象の他のペプチド質量を、理論的ペプチド質量のリストに加えることができる。例えば翻訳後修飾されたペプチド(例えばリン酸化またはグリコシル化されたペプチド)の質量は、修飾されない質量から推定される。リストにこれらの質量を加えることにより、MIPSが、未修飾のペプチドに対し修飾されたペプチドの相対存在量を追跡することを可能にする。理論的ペプチド質量は、それらの供与源(例えば、タンパク質、遺伝子、生データ、または修飾されたペプチド)により注釈を付けられてもよい。
【００６７】
試料全体の標準化のために、1種または複数の内部ペプチド標準が、任意に各試料へ添加される。その後、任意の内部標準の理論的ペプチド質量は、理論的ペプチド質量リストに加えられる。
【００６８】
観察されたペプチド質量の獲得
測定器により測定されたペプチド質量は、装置のパラメータにより定義される質量測定値の精度に応じて、理論的ペプチド質量とは異なることがある。この不一致は、公知の補正法に従い、理論的ペプチド質量の周辺の予め決められた範囲内の最大イオン数で質量を決定することにより、補正することができる。この範囲は、質量分析装置の精度により、更には使用者の定義した偽陽性および偽陰性の許容範囲により定義される。こうして、観察されたペプチド質量のリストが、理論的ペプチド質量のリストから作成される。
【００６９】
走査、同位体、および電荷状態の全体にわたり観察されたペプチドイオン数の積算
ペプチドの存在量を得るために、そのペプチドに関する全てのイオンまたはそれらのサブセットの強度が、計測される。加えて、望ましいならば、分離のために異なるスペクトルで生じるペプチドのイオンが積算される。
【００７０】
分析される試料中の各ペプチドは、生質量分析データの一連の走査を通して抽出される(elute)(図4参照)。この走査の収集は、ペプチドの「走査ウィンドウ」と称される。このウィンドウ内の各走査は、例えばLCの溶出時間のような、分離に由来する画分に相当している。LCに関して、ペプチドの保持時間は、時間に対応する、走査数の関数としての、そのペプチドに対応するイオンの強度を基に決定される。
【００７１】
ペプチドの走査ウィンドウ内の各走査において、ペプチドは、典型的には+1、+2、+3、または+4の複数の電荷状態を生じる。走査は、質量／電荷(m/z)値を記録する。例えば、二重(doubly)-プロトン化されたペプチド(電荷+2)のピークは、非荷電質量が1974であり(図5参照)、ペプチドが電子スプレーイオン化によりイオン化されている場合は、(1974＋(2×1.0078))／2＝988.0078である。走査におけるペプチドの各電荷状態について、このペプチドのイオンは、複数の同位体を通して分布される。これらのペプチド同位体は、構成原子の同位体の天然の存在量の結果である。一つの電荷状態につき5種またはそれ以上の同位体が存在しうる。これらの同位体のm/zは、ペプチドの質量および電荷から推定される。例えば、質量1974かつ電荷+3のペプチドは、m/z 659を有する(図6参照)。
【００７２】
試験される各同位体について、それを通じてイオン数が合計される積算ウィンドウが定義される。このウィンドウは、典型的に、質量分析計の分解能および質量測定値の精度のために必要である。このウィンドウの幅は、例えば、そのペプチドの同位体ピークに関して予め定義された高さでのピーク幅によって左右される。ガウスピーク（Gaussian peak）に関して、高さが半分のピーク幅(PW50)と5％高さでのピーク幅(PW5)の比は一定であり、かつほぼ2.2に等しくなければならない。PW5をm/z値に結びつける関係は、PW5＝(2.2×m/z)／RESで表わされ、ここでRESはPW50で定義される装置の分解能である。一旦PW5がピークに関して計算されると、例えばそのウィンドウ内に収まるデータ点での測定強度を加えることにより、m/z−PW5/2からm/z＋PW5/2までのイオン数が合計され、そのピークの積算強度が作成される。
【００７３】
観察された質量でペプチドの存在量を決定するための手法は、イオン数の合計が所定のシグナル-ノイズ閾値を上回るような走査における、全ての電荷状態、またはそれらのサブセットの同位体の全体にわたるイオン数を合計することである。
【００７４】
各ペプチドの保持時間は、この手法においても得られる。同じ質量であるが保持時間が著しく異なる2種のペプチドが検出された場合、これらは同じ質量を偶然有する異なるペプチドである可能性があるので、従ってこれらのペプチドについての2種の個別のエントリーが作成される。この二重性(duplicity)は、データに記録されうる。
【００７５】
標準化
観察されたペプチド質量の存在量を、例えばLeu-エンケファリンのような1種または複数の内部標準の存在量を用い、装置のばらつきを補正することができる。標準は、外部供与源(例えば、合成ペプチド標準)から添加するか、もしくはその試料に固有のもの(例えば、比較される条件の全域で一定であり続けると考えられるタンパク質マーカーに由来したペプチド)であってもよい。保持時間の範囲の全域でいくつかのこのような標準が使用されることが、好ましい。ペプチドの絶対存在量は、そのペプチドの精製型（version）または合成型からの強度データを用いて決定することができる。任意に、このモジュールのサブコンポーネントを用い、m/z値、強度、および保持時間を含むが、これらに限定されない、内部標準に関するデータを得ることができる。このようなデータは、他のペプチドおよび前駆体に加え、標準それ自身に関する対応する値を補正および／または予測するために、既知の参照値と組合わせて使用される。例えば、当初のMS-MSペプチドデータからのRTに加え、内部標準由来のデータ(例えば、RTおよびm/z値)を用い、LC-MSサーベイからのMSデータにおけるペプチドの保持時間(RT)を推定することができる。m/z値および補正された保持時間を伴う、内部標準ならびにペプチドに関するデータは、サブセットデータまたはファイル全体に及ぶデータの積算／補正のために作成されうる。
【００７６】
画分またはバンド全体にわたる積算
質量分析により分析される試料が1Dゲルから切出される場合、ペプチドはいくつかのバンドに分れているように見えるので、観察されたペプチドの存在量は通常、隣接バンド全体にわたり積算される。その後隣接バンド内の同一ペプチドが、例えば質量、保持時間、およびMS/MSにより同定される。試料が多次元LC(例えば、2D)により分析される場合は、その存在量は典型的には、塩画分(salt fraction)全体にわたり積算される。
【００７７】
タンパク質／遺伝子存在量の統計解析
タンパク質または遺伝子の存在量は、そのペプチド存在量の存在量に比例する。統計解析は、試料の全域のタンパク質または遺伝子の相対存在量を決定するために行うことができる。例えば、正常な組織中のペプチド存在量の分布は、罹患組織中のペプチド存在量の分布と、有意性の統計検定を用いて比較される。加えて、試料中の翻訳後修飾されたタンパク質および未修飾のタンパク質の相対的存在量は、未修飾のペプチドに対する修飾されたペプチドの相対存在量から決定することができる。タンパク質のアイソフォームの存在量も決定することができる。同様に、遺伝子のスプライシング変種の相対存在量を決定することができる。
【００７８】
個別のペプチド存在量の統計解析
タンパク質同定を通じてタンパク質または遺伝子に帰属されない観察されたペプチドも、試料の全域で比較することができる。試料の全域の存在量の有意差は、更に分析されることが興味深いペプチドを示す。
【００７９】
生の質量分析データには生じるが、同定されたタンパク質または遺伝子のいずれでもないこれらのペプチドは、例えばパターン検出法を用い、例えば生の質量分析データから得ることができる。
【００８０】
ペプチドハンターモジュール
「ペプチドハンターモジュール(PHM)」は、タンパク質tおよびそれらの対応するトリプシンペプチドが「前駆体」である点、ならびにPHM使用前にMS-MSにより配列決定されるなどして同定される必要がない点が、「ペプチド存在量モジュール」とは異なる。従ってPHMは、ペプチドに関する生の質量分析データを探索し、それらの存在量を計算し(例として図16および17)、内部標準の使用を介した、これらの質量、強度、および保持時間の補正により、部分的に試料間でそれらの存在量を比較可能にすることができる。PHMは、完全長タンパク質の同定を可能にし、ペプチドをペプチド質量フィンガープリント法を通じて得ることができる。PHMは、MS/MSのラウンドにより更に同定するための前駆体リストの作成も可能にする。図7は、「ペプチドハンターモジュール(PHM)」のコンポーネントの詳細を示す流れ図である。実線長方形は、MIPSの処理コンポーネントを表わし、点線長方形は、MIPS内にない処理コンポーネントを表わし、および長方形のついていない項目は、データファイルである。例証的なPHMの流れ図は、図15内に示されている。各コンポーネントは、以下に詳細に説明されている。この流れ図は、本発明の方法を例証することを目的として示されており、限定するものではない。
【００８１】
データフォーマット変換
データフォーマット変換は、PAMにおいて先に説明されたように行われる。
【００８２】
閾値の決定
PHMは、ペプチドの証拠に関して生の質量分析データのサーベイ走査を探索するので、イオン強度の閾値は、ペプチドイオンからのシグナルを、ノイズのものから識別するように定義される。この閾値は、「最大エントロピー」法を含むが、これに限定されない方法などの、当技術分野において公知の方法を用い、全ての走査について推定される。
【００８３】
サーベイ走査におけるペプチドの電荷状態の発見
ペプチドの荷電状態の証拠に関して、生の質量分析データのサーベイ走査が検索される。ペプチドの電荷状態のパターンは、図6に示している。各電荷状態は、同位体ピークのパターンからなる。荷電状態の同位体は、スペクトルが1.0034/zにより分離され、ここでzはそのペプチドの電荷である。電荷状態の「第一の同位体」は、スペクトルにおいて((m/z値)＋1.0034/z)に位置した同位体を伴うが、((m/z値)−1.0034/z)に位置した同位体は伴わない、特異的m/z値に位置しうる。第二の同位体は、スペクトルにおいて((m/z値)＋1.0034/z)などに位置することができる。
【００８４】
ペプチドに関する電荷状態の同定のために、m/zに対応するデータ点を、スペクトルのデータから、例えば強度を基に選択することができる。次にデータを、定義された電荷数、例えば+4、+3、+2および+1について、1.0034/zで分離された隣接ピークに関して系統的に検索することができる。このプログラムは、実験データの不確実性を補償するために、1/zの周辺の適当な領域を検索する。これらの電荷は、ピークが認められるまで最高から最低まで順に検索されうる。典型的には、+4電荷ペプチドおよび+1電荷ペプチドは両方とも(第一の同位体のm/z値＋1)に同位体を有するので、+4電荷ペプチドが、+1電荷ペプチドとして誤って理解されることがあるので、この順番は必要である。隣接ピークが認められない場合は、電荷状態をこの方法を用いて帰属させることはできない。隣接ピークが例えばm/z＋0.33に存在する場合は、この電荷状態を、分離により同定することができ、これはこの場合+3状態に相当する(図6)。ある電荷状態における同位体は、一つのピークおよび分離(1.0034/z)を基に同定される。ある電荷状態の同位体を、同じペプチドから生じるピークの積算を促進するために、同じ質量またはm/z、例えば第一の同位体の質量またはm/zに帰属させることができる。この検索は、ピークが第一の同位体であること、および第二の同位体が第一の同位体の少なくとも特定の割合（fraction）(おそらく1より大きい)であることを必要としうる。一旦電荷状態が同定されると、ペプチドの質量は、同じペプチドからの別の電荷状態を検索するために、計算されかつ使用されうる。この手法を用い、一つのピークの最初の同定から、多くのピークを同定することができる。
【００８５】
一つの態様において、最も強いピークから始まり、強度が閾値tを上回る最小のピークへと進む、走査の各ピークmについて、下記の段階が行われる。あるいは、選択された数のみが、下記のように分析される。データ点mの周囲のウィンドウw内のイオン数が積算され、存在量A1が得られる。次にm＋0.25周囲のウィンドウw内のイオン数が積算され、存在量A2が得られる。次にm−0.25周囲のウィンドウw内のイオン数が積算され、存在量A0が得られる。A2がp×A1より大きくかつA1がq×A0よりも大きい場合、mは、ペプチドの+4電荷状態の第一の同位体である。さもなければ、0.25を0.33、0.5、および1に置き換え、前述の段階を繰返し、+3、+2、および+1電荷状態について試験する。パラメータw、t、pおよびqは、使用者が定義したものである。この閾値は、十分な強度のピークのみが試験されることを確実にする。パラメータpおよびqは、第二の同位体が少なくとも第一の同位体の規定された割合（fraction）であること、および別の同位体が((m/z値)−1/z)に存在しないことを必要とすることにより、ピークmが第一の同位体であることを確実にすることができる。複数の同定されたペプチドの形の重複は、除去されうる。
【００８６】
非荷電ペプチド質量の決定
ペプチドは、生の質量分析データの走査において多くの電荷状態で生じることができ、かつこれらの電荷状態の全てまたは一部をこのペプチドについて収集することができる。走査における荷電ペプチドは、式P＝(m/z×z)−(1.0078×z)を用いて、非荷電ペプチド質量に帰属され、ここでPは非荷電質量であり、m/zは測定器により測定され、ならびにzは、電子スプレーイオン化の電荷である。他のイオン化スキームは、当技術分野において公知であり、この式はそれに従い修飾される。PHMにおいて使用されるソフトウェアは、非荷電ペプチド質量に帰属されたペプチドが同様の保持時間を有することを必要としうる。図6の例において、PHMは、非荷電質量P＝(658.96×3)−(1.0078×3)＝1973.86により、+3荷電ペプチドを検出するであろう。
【００８７】
走査、電荷状態、および同位体の全体にわたる存在量の積算
個々のピークについて積算されたイオン数は、前記PAMにおいて説明されるように計算されうる。非荷電ペプチド質量の各々について、非荷電ペプチド質量の存在量の測定値は、例えば、走査、電荷状態、および同位体またはそれらの組合せの全体にわたるイオン数の積算により得ることができる。この存在量は、特定のペプチドに関して各イオン数の存在量を考慮することを必要としないが、例えば単に+2および+3電荷状態のような可能性の一定のサブセットを、試料全体を通して使用しなければならない。各非荷電ペプチドに関して、前の段階は、同じ非荷電質量に相当するそれらの電荷状態および同位体を予め決定する。非荷電ペプチド質量の保持時間は、前述のPAMのように、走査ウィンドウから予想することができる。
【００８８】
1種または複数の内部標準による標準化
観察されたペプチド質量の存在量は、標準の方法に従い1種または複数の内部標準の存在量を用い、装置のばらつきについて任意に補正され、かつこれは前述のPAM同様に行うことができる。PHMがPAM後に実行されるならば、第二の標準化は不要であるが、MS-MSが得られないイオンについては、それが行われることが望ましい。
【００８９】
画分またはバンド全体にわたる積算
質量分析により分析される試料が1Dゲルから切出されるならば、観察されたペプチドは数本のバンドにおいて見えるので、このペプチドの存在量は、典型的には隣接バンド全体にわたり積算される。隣接バンド中の同じペプチドが、例えば質量、保持時間、およびMS/MSにより同定される。試料が多次元LC(例えば、2D)により分析されるならば、その存在量は典型的には塩画分全体にわたり積算される。
【００９０】
個別のペプチド存在量の統計解析
ペプチド質量、それらの存在量、および保持時間のリストが、様々な分析、例えば質量フィンガープリント法によるタンパク質同定；更なるMS/MSラウンドのためのペプチド定義によるタンパク質同定；タンパク質のペプチド対象範囲を増大し、かつファミリー内の類似タンパク質間、またはスプライス変種間および多型間の識別を補助しうる、マッチングMS/MSおよび質量フィンガープリント法を組合せるタンパク質同定；ならびに、分析される試料中の低存在量のタンパク質に対応する、生の質量分析データ中に存在する低存在量のペプチドの決定などに使用される。
【００９１】
発現プロファイリング
本発明の方法を用い、試料中の、例えばタンパク質のような、生体分子またはそれらの断片の相対存在量を決定することができる(図18および19参照)。分析される試料は、参照試料または試料群と比較される。この比較または発現プロファイルは、例えば、タンパク質のような生体分子が、参照と比べ異常に高いまたは低い量で存在するかどうかを決定するために使用される。参照試料に対する試料中の種の発現の差異の決定は、例えば患者における疾患の診断、集団における自然の分散(variance)の決定、または個体における遺伝子型の決定に使用される。個体に関する(図18参照)、または患者の集団の全域の、正常細胞と腫瘍細胞の間のタンパク質存在量の比較が適用例である。
【００９２】
薬物標的
一旦タンパク質が公共のまたは個人のデータベースにおいて同定されたならば、このタンパク質をコードしている遺伝子は、クローニングされ、細菌、酵母または哺乳類宿主細胞へ導入される。このような遺伝子がデータベースにおいて同定されないならば、このタンパク質をコードしている遺伝子は、前述の方法により決定されたそのタンパク質のアミノ酸配列をコードしているプローブの縮重セットを用いて、クローニングされる。データベースが、実験により決定されたタンパク質のアミノ酸配列をコードする1種または複数の部分的ヌクレオチド配列を含む場合は、このような部分的ヌクレオチド配列(またはそれらの相補体)は、遺伝子のクローニングのためのプローブとして利用され、縮重セットの使用の必要性が避けられる。
【００９３】
このような組換えタンパク質を発現するように遺伝的に操作された細胞をスクリーニングプログラムに使用して、例えば治療的投与のために、組換えタンパク質と特異的に相互作用するか、または大量の組換えタンパク質を産生するような、他のタンパク質または薬物を同定することができる。
【００９４】
加えて、当技術分野において公知の標準方法を使用するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の作成のために、本発明に従い同定されたタンパク質を用い、例えばこのタンパク質をマウス、ラット、またはウサギのような動物に投与することにより、抗体を作成することができる。このような抗体は、診断および予後判定試験において、ならびに例えば抗体アフィニティークロマトグラフィーによる大量のタンパク質の精製において有用である。抗体は、癌の治療において使用されるもののような、免疫療法に使用することもできる。
【００９５】
実施例
これらの前述の方法、ならびにこれらの段階を実行するための試薬および技術は、ここで具体的実施例を用い詳細に説明されている。これらの実施例は、本発明を例証するために提供されており、限定するものとして解釈されるべきではない。
【００９６】
実施例1  再現性
U937細胞の総細胞溶解液を調製した。この溶解液50μgを、ウシ血清アルブミン(BSA)30ngと混合した。この混合液の5種の試料を調製し、各試料をSDSゲル電気泳動により分離した。6番目の試料を、BSAを添加せずに調製した。電気泳動後、ゲルを染色し、およびBSAを含むバンドをゲルから切出した。
【００９７】
BSAバンドのトリプシン消化を、標準方法に従い行った。Leu-エンケファリンの350fmolを、各トリプシン消化物に、内部標準として添加した。このペプチド混合物を、Micromass四重極-飛行時間(Q-ToF)型質量分析計を組合わせたWaters CapLC HPLCシステムを用いて分離した。この混合物の分離条件は、以下であった：逆相カラム(1D、10cm×75μm、C18)、流量300nL/分、および10％から80％アセトニトリル／脱イオン水(0.2％ギ酸含有)の25分間かけた直線勾配。質量分析計の設定は以下であった：質量範囲m/z400から1500、溶媒遅延(solvent delay)5分、走査時間19分、走査速度1秒；ならびに、走査間遅延(interscan delay)0.1秒を用いるMS走査。
【００９８】
BSA-由来のペプチドの理論的リストは、BSAの公知のタンパク質配列および公知のトリプシン切断優先性から作成した。質量スペクトルにおいて検出されたこれらのペプチドのサブセットを、選択した。このリストは、質量分析計データファイルと共に、PAMへ入力し、ペプチド存在量のリストを作成した。平均ペプチド存在量を、タンパク質存在量の測定値として計算した。5回の繰返しから平均および標準偏差を計算した。5種の試料全てについて、測定したBSA存在量は、平均に近く、相対的標準偏差はおよそ2〜3％であった。表1は、5種の試料に関するPAMにより決定された、BSA、ヒトジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質2(DHP)、熱ショックタンパク質89(HSP89)、およびイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ(IMP)の相対存在量を示している。DHP、HSP89、およびIMPは、BSAと共に移動した。この実験は、同一試料を数回分析する場合に、この自動化された分析は高い再現性のある結果を生じることを確立した。
【００９９】
【表１】
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【０１００】
実施例2  直線性
標準の培養技術を用い、U937細胞を、25nMホルボールミリステートアセテート(PMA)有りまたは無しで、48時間培養し、マクロファージおよび形質転換されなかった細胞(単球)を作成した。10mM Tris／200mMショ糖(pH7.5)ホモジナイズ緩衝液中に浮遊したおよそ1億個の細胞を、キャビテーションチャンバー内に配置し、N2で1000psiに加圧し、氷上に60分間静置した。各インキュベーション期間後、試料を迅速に大気圧下に置き、900gで15分間4℃で遠心した(低速遠心分離)。上清(後核上清、PNS)を収集し、そのまま保持するかもしくは直ぐに40000rpmで60分間4℃で遠心するかのいずれかにより、後核膜(PNM)試料を作成した。
【０１０１】
単球またはマクロファージタンパク質の5種の50μg試料を調製した。第一の試料は単球タンパク質のみを含み、第二の試料は75％単球および25％マクロファージタンパク質を含み、第三の試料は単球およびマクロファージ両タンパク質を50％づつ含み、第四の試料は25％単球および75％マクロファージタンパク質を含み、かつ第五の試料はマクロファージタンパク質のみを含んだ。各試料に、BSA 50ngを添加した。これらの試料を、電気泳動により分離し、およびゲルを標準方法を用いて染色した。
【０１０２】
各レーンから、10個のバンドを切出した(レーンのほぼ中央に位置したBSAと共に)。各バンドを、前記実施例に説明したように、質量分析により分析した。トリプシンペプチド混合物を、MicromassQ-TOF質量分析計に連結したWaters CapLC HPLCシステムを用い、分離した。この混合物の分離条件は、以下であった：逆相カラム(1D、10cm×75μm、C18)、流量300nL/分、ならびに5％から60％のアセトニトリル／脱イオン水(0.2％ギ酸含有)の15分間かけた直線勾配。質量分析計の設定は以下であった：質量範囲m/z400から1600、走査時間24分間、走査速度1秒；ならびに、走査間遅延0.1秒を用いるMS走査およびMS/MS走査。
【０１０３】
図8は、HSP90タンパク質について得られた質量分析データを示している。3種のペプチドが同定され、かつそれらのLC保持時間、MSサーベイ走査、およびMS/MSにより特徴付けられた。図9は、マクロファージタンパク質および単球タンパク質の濃度の関数としての、各ペプチドの相対存在量の表を示している。HSP90は、マクロファージよりも単球において、より大きな程度に発現された。図12Aは、HSP90発現の直線性を示している。
【０１０４】
図10は、変異体デスミンタンパク質について得られた質量分析データを示している。3種のペプチドが同定され、ならびにそれらのLC保持時間、MSサーベイ走査、およびMS/MSにより特徴付けられた。図11は、マクロファージタンパク質および単球タンパク質の濃度の関数としての、各ペプチドの相対存在量の表を示している。変異体デスミンは、単球よりもマクロファージにおいて、より大きな程度に発現された。図12Bは、変異体デスミン発現の直線性を示している。
【０１０５】
その他の態様
本明細書において参照された全ての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書に参照として組入れられている。
【０１０６】
その他の態様は、特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本発明のコンピュータシステムの態様の例を図示している。
【図２】試料中の生体分子存在量を決定する方法の流れ図を示す。
【図３】「ペプチド存在量モジュール」の流れ図を示している。実線の長方形は、MIPSの処理コンポーネントを表わし、点線の長方形は、MIPS内にない処理コンポーネントを示し、および長方形のついていない項目はデータファイルである。
【図４】図4Aは、走査ウィンドウ内の第一の溶出時間に対応する質量スペクトル走査を示している。図4Bは、走査ウィンドウ内の第二の溶出時間に対応する質量スペクトル走査を示している。図4Cは、走査ウィンドウ内の第三の溶出時間に対応する質量スペクトル走査を示している。図4Dは、走査ウィンドウ内の第四の溶出時間に対応する質量スペクトル走査を示している。
【図５】二つの電荷状態の存在を例示している質量スペクトルを示す。
【図６】+3電荷状態の同位体間の分離を例示している質量スペクトルを示す。
【図７】ペプチドハンターモジュールの流れ図を示す。
【図８】図8A-8Iは、HSP90タンパク質由来の3種の異なるm/z値の結果を示す。図8A-8Cは、m/z924.4のイオンの再構成イオンクロマトグラム、サーベイ走査、およびMS/MSを示している。図8D-8Fは、m/z757.4のイオンの再構成イオンクロマトグラム、サーベイ走査、およびMS/MSを示している。図8G-8Iは、621.8の再構成されたイオンクロマトグラム、サーベイ走査、およびMS/MSを示している。
【図９】5種の試料中のHSP90タンパク質のm/z値の存在量の表を示す。これらの存在量は、数本の1-Dゲルバンドについて合計した。
【図１０】図10A-10Iは、変異体デスミンタンパク質からの3種の異なるm/z値の結果を示している。図10A-10Cは、m/z561.3イオンの再構成イオンクロマトグラム、サーベイ走査、およびMS/MSを示している。図10D-10Fは、m/z558.3のイオンの再構成イオンクロマトグラム、サーベイ走査、およびMS/MSを示している。図10G-10Iは、466.7の再構成イオンクロマトグラム、サーベイ走査、およびMS/MSを示している。
【図１１】5種の試料中の変異体デスミンタンパク質のm/z値の存在量の表を示す。これらの存在量は、数本の1-Dゲルバンドについて合計した。
【図１２】図12Aおよび12Bは、MIPSを使用するU937細胞中のHSP90および変異体デスミンの差次的（differential）発現を示す。
【図１３】マッチした正常および腫瘍組織、または処置／未処置細胞のような、マッチした試料(N/T)を処理するペプチド存在量モジュールの流れ図を示す。Elitoxは、当初のMS-MSからRTを抽出する情報抽出手法である。PAM(IS)は、内部標準情報(m/z値、強度、および保持時間)を獲得するために使用される手法である。PAMラッパー（Wrapper）は、前駆体リスト、ElitoxおよびPAM ISに含まれた情報を積算する手法である。RT補正は、LC-MSサーベイ中のMSデータから保持時間(RT)を推定するために、いずれかの内部標準由来のデータ(PAM IS、RTおよびm/z値)に加えて、当初のMS-MS(Elitox)由来のRTを使用し、かつm/z値および保持時間の補正を提供する。QCチェックは、例えば、予想されたデータ特徴を基に調節または中止が必要であるかどうかなど、プロセスが正確に進行していることを確実にするための、品質チェックである。
【図１４】特定の試料に関する「PAM処理時間」の概算を示す。
【図１５】複数の試料(この実施例における参照試料および処理試料)を処理するペプチドハンターモジュールの流れ図を示し、これはペプチドハンターモジュール、ペプチド併合モジュール(PMM)、バンド併合モジュール(BMM)、および差次的存在量モジュール(DAM)を含む。
【図１６】PHMが実行されるm/z700付近を拡大した、LC-MSサーベイ走査を示す。
【図１７】PHMにより同定されたペプチドに関するm/z値に加え、それらの電荷および計算された存在量を示す。例えば、この図のデータに対する図16の拡大図において、701.3402での+1ペプチドの存在量を、699.9900での+3ペプチドのそれと比較されたい。
【図１８】正常試料由来のタンパク質を、PAMを使用して作成されたマッチした腫瘍試料と比較する、予想される完全長タンパク質(クラスター化ペプチド)の存在量データ(対数スケール)の散乱プロットである。Na/K ATPaseタンパク質は、正常細胞と腫瘍細胞の間で発現を変化させないと予想される、既知の形質膜(PM)マーカーに相当するが、CEA(癌胎児性抗原)は腫瘍において上方制御されることがわかっているタンパク質である。
【図１９】正常試料、およびPAMを用いて作成されたマッチしたものからの、個別のペプチド存在量の散乱プロット(対数スケール)を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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