(57)【要約】特定のバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせは、患者における肝細胞癌の状態を評価するのに有用である。これらのバイオマーカー及び組み合わせを用いる診断手法は、例えば肝細胞癌と慢性肝疾患とを区別することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における肝細胞癌の状態を評価する方法であって、該被験者由来の生物学的サンプルを、以下の第１群及び／又は第２群：
以下からなる第１群：
（Ａ）Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ２、Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ４、Ｉ−Ｍ５、Ｉ−Ｍ６、Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ８、Ｉ−Ｍ９、Ｉ−Ｍ１０、Ｉ−Ｍ１１、Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１４、Ｉ−Ｍ１５、Ｉ−Ｍ１６、Ｉ−Ｍ１７、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ２０、Ｉ−Ｍ２１、Ｉ−Ｍ２２、Ｉ−Ｍ２３、Ｉ−Ｍ２４、Ｉ−Ｍ２５、Ｉ−Ｍ２６、Ｉ−Ｍ２７、Ｉ−Ｍ２８、Ｉ−Ｍ２９、Ｉ−Ｍ３０、Ｉ−Ｍ３１、Ｉ−Ｍ３２、Ｉ−Ｍ３３、Ｉ−Ｍ３４、Ｉ−Ｍ３５、Ｉ−Ｍ３６、Ｉ−Ｍ３７、Ｉ−Ｍ３８、Ｉ−Ｍ３９、Ｉ−Ｍ４０、Ｉ−Ｍ４１、Ｉ−Ｍ４２、Ｉ−Ｍ４３、Ｉ−Ｍ４４、Ｉ−Ｍ４５、Ｉ−Ｍ４６、Ｉ−Ｍ４７、Ｉ−Ｍ４８、Ｉ−Ｍ４９、Ｉ−Ｍ５０、Ｉ−Ｍ５１、１−Ｍ５２、Ｉ−Ｍ５３、Ｉ−Ｍ５４、Ｉ−Ｍ５５、Ｉ−Ｍ５６、Ｉ−Ｍ５７、Ｉ−Ｍ５８、Ｉ−Ｍ５９、Ｉ−Ｍ６０、Ｉ−Ｍ６１、Ｉ−Ｍ６１、Ｉ−Ｍ６２、Ｉ−Ｍ６３、Ｉ−Ｍ６４、Ｉ−Ｍ６５、Ｉ−Ｍ６６、Ｉ−Ｍ６７、Ｉ−Ｍ６８、Ｉ−Ｍ６９、Ｉ−Ｍ７０、Ｉ−Ｍ７１、Ｉ−Ｍ７２、Ｉ−Ｍ７３、Ｉ−Ｍ７４、Ｉ−Ｍ７５、Ｉ−Ｍ７６、Ｉ−Ｍ７７、Ｉ−Ｍ７９、Ｉ−Ｍ８０、Ｉ−Ｍ８１、Ｉ−Ｍ８２、Ｉ−Ｍ８３、Ｉ−Ｍ８４、Ｉ−Ｍ８５、Ｉ−Ｍ８６、Ｉ−Ｍ８７、Ｉ−Ｍ８８、Ｉ−Ｍ８９、Ｉ−Ｍ９０、Ｉ−Ｍ９１、Ｉ−Ｍ９２、Ｉ−Ｍ９３、Ｉ−Ｍ９４、Ｉ−Ｍ９５、Ｉ−Ｍ９６、Ｉ−Ｍ９７、Ｉ−Ｍ９８、Ｉ−Ｍ９９、Ｉ−Ｍ１００、
及び／又は
以下からなる第２群：
（Ｂ）Ｗ−Ｍ１、Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ３、Ｗ−Ｍ４、Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ６、Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ８、Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ１０、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１２、Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２、Ｗ−Ｍ２３、Ｗ−Ｍ２４、Ｗ−Ｍ２５、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ２７、Ｗ−Ｍ２８、Ｗ−Ｍ２９、Ｗ−Ｍ３０、Ｗ−Ｍ３１、Ｗ−Ｍ３２、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ３４、Ｗ−Ｍ３５、Ｗ−Ｍ３６、Ｗ−Ｍ３７、Ｗ−Ｍ３８、Ｗ−Ｍ３９、Ｗ−Ｍ４０、Ｗ−Ｍ４１、Ｗ−Ｍ４２、Ｗ−Ｍ４３、Ｗ−Ｍ４４、Ｗ−Ｍ４５、Ｗ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ４７、Ｗ−Ｍ４８、Ｗ−Ｍ４９、Ｗ−Ｍ５０、Ｗ−Ｍ５１、Ｗ−Ｍ５２、Ｗ−Ｍ５３、Ｗ−Ｍ５４、Ｗ−Ｍ５５、Ｗ−Ｍ５６、Ｗ−Ｍ５７、Ｗ−Ｍ５８、Ｗ−Ｍ５９、Ｗ−Ｍ６０、Ｗ−Ｍ６１、Ｗ−Ｍ６１、Ｗ−Ｍ６２、Ｗ−Ｍ６３、Ｗ−Ｍ６４、Ｗ−Ｍ６５、Ｗ−Ｍ６６、Ｗ−Ｍ６７、Ｗ−Ｍ６８、Ｗ−Ｍ６９、Ｗ−Ｍ７０、Ｗ−Ｍ７１、Ｗ−Ｍ７２、Ｗ−Ｍ７３、Ｗ−Ｍ７４、Ｗ−Ｍ７５、Ｗ−Ｍ７６、Ｗ−Ｍ７７、Ｗ−Ｍ７９、Ｗ−Ｍ８０、Ｗ−Ｍ８１、Ｗ−Ｍ８２、Ｗ−Ｍ８３、Ｗ−Ｍ８４、Ｗ−Ｍ８５、Ｗ−Ｍ８６、Ｗ−Ｍ８７、Ｗ−Ｍ８８、Ｗ−Ｍ８９、Ｗ−Ｍ９０、Ｗ−Ｍ９１、Ｗ−Ｍ９２、Ｗ−Ｍ９３、Ｗ−Ｍ９４、Ｗ−Ｍ９５、Ｗ−Ｍ９６、Ｗ−Ｍ９７、Ｗ−Ｍ９８、Ｗ−Ｍ９９、Ｗ−Ｍ１００、
より選択されるタンパク質の診断レベルについて分析するステップを含み、該レベルが正常と比較して上昇しているものである、上記方法。
【請求項２】
タンパク質が、以下からなる群：
（Ａ）Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ４、Ｉ−Ｍ５、Ｉ−Ｍ６、Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ９、Ｉ−Ｍ１１、Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ２０、Ｉ−Ｍ２１、Ｉ−Ｍ２２、Ｉ−Ｍ２３、Ｉ−Ｍ２５、Ｉ−Ｍ２６、Ｉ−Ｍ２８、Ｉ−Ｍ３２、Ｉ−Ｍ３４、Ｉ−Ｍ３６、Ｉ−Ｍ３７、Ｉ−Ｍ４１、Ｉ−Ｍ４４、Ｉ−Ｍ４６、Ｉ−Ｍ４７、Ｉ−Ｍ５２、Ｉ−Ｍ５３、Ｉ−Ｍ６４、Ｉ−Ｍ６８、Ｉ−Ｍ６９、Ｉ−Ｍ７７、Ｉ−Ｍ７９、Ｉ−Ｍ８１、Ｉ−Ｍ８４、Ｉ−Ｍ８７、Ｉ−Ｍ８８、Ｉ−Ｍ８９、及びＩ−Ｍ９２、
並びに／又は
以下からなる第２群：
（Ｂ）Ｗ−Ｍ１、Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ３、Ｗ−Ｍ４、Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ１０、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１２、Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２、Ｗ−Ｍ２３、Ｗ−Ｍ２５、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ２７、Ｗ−Ｍ３０、Ｗ−Ｍ３１、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ３４、Ｗ−Ｍ３５、Ｗ−Ｍ３６、Ｗ−Ｍ３９、Ｗ−Ｍ４０、Ｗ−Ｍ４１、Ｗ−Ｍ４３、Ｗ−Ｍ４４、Ｗ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ４７、Ｗ−Ｍ４８、Ｗ−Ｍ４９、Ｗ−Ｍ５０、Ｗ−Ｍ５２、Ｗ−Ｍ５３、Ｗ−Ｍ５４、Ｗ−Ｍ５５、Ｗ−Ｍ５８、Ｗ−Ｍ６０、Ｗ−Ｍ６２、Ｗ−Ｍ６３、Ｗ−Ｍ７０、Ｗ−Ｍ７１、Ｗ−Ｍ７３、Ｗ−Ｍ７６、Ｗ−Ｍ７８、Ｗ−Ｍ８４、Ｗ−Ｍ８６、Ｗ−Ｍ８８、Ｗ−Ｍ８９、Ｗ−Ｍ９０、Ｗ−Ｍ９３、Ｗ−Ｍ９５、Ｗ−Ｍ９６、Ｗ−Ｍ９８、及びＷ−Ｍ１００、
より選択されるものである、請求項１記載の患者における肝細胞癌の状態を評価する方法。
【請求項３】
タンパク質がＩ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２、又はＷ−Ｍ２３である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
患者における肝細胞癌のリスクを評価する方法であって、
（Ａ）該被験者から採取した生物学的サンプルの質量分光分析により得られるスペクトルを準備するステップ：
（Ｂ）該スペクトルからデータを抽出し、該データを用いて、以下の第１群並びに／又は第２群：
以下からなる第１群：
（ｉ）Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ４、Ｉ−Ｍ５、Ｉ−Ｍ６、Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ９、Ｉ−Ｍ１１、Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ２０、Ｉ−Ｍ２１、Ｉ−Ｍ２２、Ｉ−Ｍ２３、Ｉ−Ｍ２５、Ｉ−Ｍ２６、Ｉ−Ｍ２８、Ｉ−Ｍ３２、Ｉ−Ｍ３４、Ｉ−Ｍ３６、Ｉ−Ｍ３７、Ｉ−Ｍ４１、Ｉ−Ｍ４４、Ｉ−Ｍ４６、Ｉ−Ｍ４７、Ｉ−Ｍ５２、Ｉ−Ｍ５３、Ｉ−Ｍ６４、Ｉ−Ｍ６８、Ｉ−Ｍ６９、Ｉ−Ｍ７７、Ｉ−Ｍ７９、Ｉ−Ｍ８１、Ｉ−Ｍ８４、Ｉ−Ｍ８７、Ｉ−Ｍ８８、Ｉ−Ｍ８９、及びＩ−Ｍ９２、
並びに／又は
以下からなる第２群：
（ｉｉ）Ｗ−Ｍ１、Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ３、Ｗ−Ｍ４、Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ１０、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１２、Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２、Ｗ−Ｍ２３、Ｗ−Ｍ２５、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ２７、Ｗ−Ｍ３０、Ｗ−Ｍ３１、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ３４、Ｗ−Ｍ３５、Ｗ−Ｍ３６、Ｗ−Ｍ３９、Ｗ−Ｍ４０、Ｗ−Ｍ４１、Ｗ−Ｍ４３、Ｗ−Ｍ４４、Ｗ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ４７、Ｗ−Ｍ４８、Ｗ−Ｍ４９、Ｗ−Ｍ５０、Ｗ−Ｍ５２、Ｗ−Ｍ５３、Ｗ−Ｍ５４、Ｗ−Ｍ５５、Ｗ−Ｍ５８、Ｗ−Ｍ６０、Ｗ−Ｍ６２、Ｗ−Ｍ６３、Ｗ−Ｍ７０、Ｗ−Ｍ７１、Ｗ−Ｍ７３、Ｗ−Ｍ７６、Ｗ−Ｍ７８、Ｗ−Ｍ８４、Ｗ−Ｍ８６、Ｗ−Ｍ８８、Ｗ−Ｍ８９、Ｗ−Ｍ９０、Ｗ−Ｍ９３、Ｗ−Ｍ９５、Ｗ−Ｍ９６、Ｗ−Ｍ９８、及びＷ−Ｍ１００、
より選択される少なくとも１つのピークに基づいたパターン認識解析を行うステップ、
を含む、上記方法。
【請求項５】
パターン認識解析が、以下：
（Ａ）Ｉ−Ｍ１３及びＩ−Ｍ２５、Ｉ−Ｍ１３及びＩ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ２５及びＩ−Ｍ４６、Ｉ−Ｍ３７及びＩ−Ｍ７７、Ｉ−Ｍ５及びＩ−Ｍ３６、並びに／又は
（Ｂ）Ｗ−Ｍ１４及びＷ−Ｍ９８、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ１１及びＷ−Ｍ５２、Ｗ−Ｍ１６及びＷ−Ｍ８９、Ｗ−Ｍ１及びＷ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ７６、Ｗ−Ｍ１１及びＷ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ１３及びＷ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ２及びＷ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ３３及びＷ−Ｍ５４、Ｗ−Ｍ２及びＷ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ１６及びＷ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ１１及びＷ−Ｍ５、
より選択されるピークの２つの組み合わせに基づいて行われる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
パターン認識解析が、以下：
（Ａ）Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ４及びＩ−Ｍ３６；Ｉ−Ｍ５、Ｉ−Ｍ７及びＩ−Ｍ１９；Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ１９及びＩ−Ｍ４６；Ｉ−Ｍ９、Ｉ−Ｍ３４及びＩ−Ｍ５２；Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ１８及びＩ−Ｍ４７；Ｉ−Ｍ１１、Ｉ−Ｍ１３及びＩ−Ｍ３６；Ｉ−Ｍ９、Ｉ−Ｍ７７及びＩ−Ｍ８４；Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ２２及びＩ−Ｍ７９、
並びに／又は
（Ｂ）Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２及びＷ−Ｍ３５；Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ４６；Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ１４及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ５４及びＷ−Ｍ７０；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ３３及びＷ−Ｍ４６；Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ３６及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ２２；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ５４；Ｗ−Ｍ５５、Ｗ−Ｍ５８及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１４及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ１、Ｗ−Ｍ３３及びＷ−Ｍ４６；Ｗ−Ｍ４０、Ｗ−Ｍ４６及びＷ−Ｍ４９；Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ２２；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ３６及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１１及びＷ−Ｍ５４；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ２２及びＷ−Ｍ２５；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ５８及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１４及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ７，Ｗ−Ｍ１４及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ５８及びＷ−Ｍ７１；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ２５及びＷ−Ｍ５４；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ６０及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ４６及びＷ−Ｍ１００、
より選択されるピークの３つの組み合わせに基づいて行われる、請求項４記載の方法。
【請求項７】
パターン認識解析が、以下：
（Ａ）Ｉ−Ｍ１１、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１９及びＩ−Ｍ８９；Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ２２及びＩ−Ｍ２６；Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ５、Ｉ−Ｍ３６及びＩ−Ｍ４１；Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ３３、Ｉ−Ｍ４４及びＩ−Ｍ４６；Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ６８及びＩ−Ｍ８１；Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ３４及びＩ−Ｍ８１；Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ３２及びＩ−Ｍ３７；Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ４４、Ｉ−Ｍ４６及びＩ−Ｍ７９；Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ２１及びＩ−Ｍ２３；Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ７７及びＩ−Ｍ９２；Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ７７及びＩ−Ｍ８７；Ｉ−Ｍ６、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ３４及びＩ−Ｍ８１；Ｉ−Ｍ８、Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ５３、Ｉ−Ｍ６４、Ｉ−Ｍ６９；Ｉ−Ｍ４、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ２８、Ｉ−Ｍ４７及びＩ−Ｍ８８；並びに、Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ４、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ３６、Ｉ−Ｍ４１及びＩ−Ｍ４７
並びに／又は
（Ｂ）Ｗ−Ｍ２５、Ｗ−Ｍ５５、Ｗ−Ｍ６２及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１７及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ３１、Ｗ−Ｍ９３及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ４６及びＷ−Ｍ５０；Ｗ−Ｍ４、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ５５及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ３６及びＷ−Ｍ５４；Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ３６、Ｗ−Ｍ４３及びＷ−Ｍ４６；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ４１、Ｗ−Ｍ５４及びＷ−Ｍ７３；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ５２及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ４、Ｗ−Ｍ１４、５８及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ１２、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ２０及びＷ−Ｍ４０；Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ７０及びＷ−Ｍ８８；Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ３４及びＷ−Ｍ４６；Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ４０及びＷ−Ｍ５８；Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ５２及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ３、Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ４６；Ｗ−Ｍ１０、Ｗ−Ｍ２２、Ｗ−Ｍ３０及びＷ−Ｍ９５；Ｗ−Ｍ１、Ｗ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ５４及びＷ−Ｍ７０；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ２５及びＷ−Ｍ５４；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ４６及びＷ−Ｍ９０；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ５４及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ２２；Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ５２及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２２及びＷ−Ｍ５５；Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ４７及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ２７、Ｗ−Ｍ４６及びＷ−Ｍ７８；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ４６及びＷ−Ｍ５３；Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ１９及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ５２、Ｗ−Ｍ８９及びＷ−Ｍ９６；Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ２５、Ｗ−Ｍ４０、Ｗ−Ｍ５２及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ２０及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ２３、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ４０及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ２７、Ｗ−Ｍ３０、Ｗ−Ｍ３５、Ｗ−Ｍ４０及びＷ−Ｍ７０；Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ３９、Ｗ−Ｍ４４、Ｗ−Ｍ６３及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ３５、Ｗ−Ｍ３９、Ｗ−Ｍ８６及びＷ−Ｍ８９；並びに、Ｗ−Ｍ３、Ｗ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２、Ｗ−Ｍ４８及びＷ−Ｍ８４、
より選択されるピークの組み合わせに基づいて行われる、請求項４記載の方法。
【請求項８】
肝細胞癌を検出及び診断するためのキットであって、
（Ａ）以下の第１群又は第２群：
以下からなる第１群：
（ｉ）Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ２、Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ４、Ｉ−Ｍ５、Ｉ−Ｍ６、Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ８、Ｉ−Ｍ９、Ｉ−Ｍ１０、Ｉ−Ｍ１１、Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１４、Ｉ−Ｍ１５、Ｉ−Ｍ１６、Ｉ−Ｍ１７、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ２０、Ｉ−Ｍ２１、Ｉ−Ｍ２２、Ｉ−Ｍ２３、Ｉ−Ｍ２４、Ｉ−Ｍ２５、Ｉ−Ｍ２６、Ｉ−Ｍ２７、Ｉ−Ｍ２８、Ｉ−Ｍ２９、Ｉ−Ｍ３０、Ｉ−Ｍ３１、Ｉ−Ｍ３２、Ｉ−Ｍ３３、Ｉ−Ｍ３４、Ｉ−Ｍ３５、Ｉ−Ｍ３６、Ｉ−Ｍ３７、Ｉ−Ｍ３８、Ｉ−Ｍ３９、Ｉ−Ｍ４０、Ｉ−Ｍ４１、Ｉ−Ｍ４２、Ｉ−Ｍ４３、Ｉ−Ｍ４４、Ｉ−Ｍ４５、Ｉ−Ｍ４６、Ｉ−Ｍ４７、Ｉ−Ｍ４８、Ｉ−Ｍ４９、Ｉ−Ｍ５０、Ｉ−Ｍ５１、Ｉ−Ｍ５２、Ｉ−Ｍ５３、Ｉ−Ｍ５４、Ｉ−Ｍ５５、Ｉ−Ｍ５６、Ｉ−Ｍ５７、Ｉ−Ｍ５８、Ｉ−Ｍ５９、Ｉ−Ｍ６０、Ｉ−Ｍ６１、Ｉ−Ｍ６１、Ｉ−Ｍ６２、Ｉ−Ｍ６３、Ｉ−Ｍ６４、Ｉ−Ｍ６５、Ｉ−Ｍ６６、Ｉ−Ｍ６７、Ｉ−Ｍ６８、Ｉ−Ｍ６９、Ｉ−Ｍ７０、Ｉ−Ｍ７１、Ｉ−Ｍ７２、Ｉ−Ｍ７３、Ｉ−Ｍ７４、Ｉ−Ｍ７５、Ｉ−Ｍ７６、Ｉ−Ｍ７７、Ｉ−Ｍ７９、Ｉ−Ｍ８０、Ｉ−Ｍ８１、Ｉ−Ｍ８２、Ｉ−Ｍ８３、Ｉ−Ｍ８４、Ｉ−Ｍ８５、Ｉ−Ｍ８６、Ｉ−Ｍ８７、Ｉ−Ｍ８８、Ｉ−Ｍ８９、Ｉ−Ｍ９０、Ｉ−Ｍ９１、Ｉ−Ｍ９２、Ｉ−Ｍ９３、Ｉ−Ｍ９４、Ｉ−Ｍ９５、Ｉ−Ｍ９６、Ｉ−Ｍ９７、Ｉ−Ｍ９８、Ｉ−Ｍ９９、Ｉ−Ｍ１００、又は
以下からなる第２群
（ｉｉ）Ｗ−Ｍ１、Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ３、Ｗ−Ｍ４、Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ６、Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ８、Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ１０、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１２、Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２、Ｗ−Ｍ２３、Ｗ−Ｍ２４、Ｗ−Ｍ２５、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ２７、Ｗ−Ｍ２８、Ｗ−Ｍ２９、Ｗ−Ｍ３０、Ｗ−Ｍ３１、Ｗ−Ｍ３２、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ３４、Ｗ−Ｍ３５、Ｗ−Ｍ３６、Ｗ−Ｍ３７、Ｗ−Ｍ３８、Ｗ−Ｍ３９、Ｗ−Ｍ４０、Ｗ−Ｍ４１、Ｗ−Ｍ４２、Ｗ−Ｍ４３、Ｗ−Ｍ４４、Ｗ−Ｍ４５、Ｗ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ４７、Ｗ−Ｍ４８、Ｗ−Ｍ４９、Ｗ−Ｍ５０、Ｗ−Ｍ５１、Ｗ−Ｍ５２、Ｗ−Ｍ５３、Ｗ−Ｍ５４、Ｗ−Ｍ５５、Ｗ−Ｍ５６、Ｗ−Ｍ５７、Ｗ−Ｍ５８、Ｗ−Ｍ５９、Ｗ−Ｍ６０、Ｗ−Ｍ６１、Ｗ−Ｍ６１、Ｗ−Ｍ６２、Ｗ−Ｍ６３、Ｗ−Ｍ６４、Ｗ−Ｍ６５、Ｗ−Ｍ６６、Ｗ−Ｍ６７、Ｗ−Ｍ６８、Ｗ−Ｍ６９、Ｗ−Ｍ７０、Ｗ−Ｍ７１、Ｗ−Ｍ７２、Ｗ−Ｍ７３、Ｗ−Ｍ７４、Ｗ−Ｍ７５、Ｗ−Ｍ７６、Ｗ−Ｍ７７、Ｗ−Ｍ７９、Ｗ−Ｍ８０、Ｗ−Ｍ８１、Ｗ−Ｍ８２、Ｗ−Ｍ８３、Ｗ−Ｍ８４、Ｗ−Ｍ８５、Ｗ−Ｍ８６、Ｗ−Ｍ８７、Ｗ−Ｍ８８、Ｗ−Ｍ８９、Ｗ−Ｍ９０、Ｗ−Ｍ９１、Ｗ−Ｍ９２、Ｗ−Ｍ９３、Ｗ−Ｍ９４、Ｗ−Ｍ９５、Ｗ−Ｍ９６、Ｗ−Ｍ９７、Ｗ−Ｍ９８、Ｗ−Ｍ９９、Ｗ−Ｍ１００、
のいずれかより選択される１以上のバイオマーカーを保持する基板に付着させた吸着剤、
（Ｂ）サンプルと該吸着剤とを接触させて該吸着剤により保持されるバイオマーカーを検出することによってバイオマーカーを検出するための装置、
を含む、上記キット。
【請求項９】
洗浄液又は洗浄液を調製するための説明書をさらに含む、請求項８記載のキット。
【請求項１０】
基板が、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）：
（ｉ）キレート化により遷移金属イオンを吸収する機能体（functionalities）、又は
（ｉｉ）陽イオン交換を行う機能体、
のいずれかを含むＳＥＬＤＩプローブである、請求項８記載のキット。
【請求項１１】
被験者における肝細胞癌の状態を評価するためのソフトウエアであって、該被験者から採取した生物学的サンプルの質量分光分析により得られたスペクトルから抽出したデータを解析するためのアルゴリズムを含み、該データは、以下の第１群又は第２群：
以下からなる第１群：
（ｉ）Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ２、Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ４、Ｉ−Ｍ５、Ｉ−Ｍ６、Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ８、Ｉ−Ｍ９、Ｉ−Ｍ１０、Ｉ−Ｍ１１、Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１４、Ｉ−Ｍ１５、Ｉ−Ｍ１６、Ｉ−Ｍ１７、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ２０、Ｉ−Ｍ２１、Ｉ−Ｍ２２、Ｉ−Ｍ２３、Ｉ−Ｍ２４、Ｉ−Ｍ２５、Ｉ−Ｍ２６、Ｉ−Ｍ２７、Ｉ−Ｍ２８、Ｉ−Ｍ２９、Ｉ−Ｍ３０、Ｉ−Ｍ３１、Ｉ−Ｍ３２、Ｉ−Ｍ３３、Ｉ−Ｍ３４、Ｉ−Ｍ３５、Ｉ−Ｍ３６、Ｉ−Ｍ３７、Ｉ−Ｍ３８、Ｉ−Ｍ３９、Ｉ−Ｍ４０、Ｉ−Ｍ４１、Ｉ−Ｍ４２、Ｉ−Ｍ４３、Ｉ−Ｍ４４、Ｉ−Ｍ４５、Ｉ−Ｍ４６、Ｉ−Ｍ４７、Ｉ−Ｍ４８、Ｉ−Ｍ４９、Ｉ−Ｍ５０、Ｉ−Ｍ５１、Ｉ−Ｍ５２、Ｉ−Ｍ５３、Ｉ−Ｍ５４、Ｉ−Ｍ５５、Ｉ−Ｍ５６、Ｉ−Ｍ５７、Ｉ−Ｍ５８、Ｉ−Ｍ５９、Ｉ−Ｍ６０、Ｉ−Ｍ６１、Ｉ−Ｍ６１、Ｉ−Ｍ６２、Ｉ−Ｍ６３、Ｉ−Ｍ６４、Ｉ−Ｍ６５、Ｉ−Ｍ６６、Ｉ−Ｍ６７、Ｉ−Ｍ６８、Ｉ−Ｍ６９、Ｉ−Ｍ７０、Ｉ−Ｍ７１、Ｉ−Ｍ７２、Ｉ−Ｍ７３、Ｉ−Ｍ７４、Ｉ−Ｍ７５、Ｉ−Ｍ７６、Ｉ−Ｍ７７、Ｉ−Ｍ７９、Ｉ−Ｍ８０、Ｉ−Ｍ８１、Ｉ−Ｍ８２、Ｉ−Ｍ８３、Ｉ−Ｍ８４、Ｉ−Ｍ８５、Ｉ−Ｍ８６、Ｉ−Ｍ８７、Ｉ−Ｍ８８、Ｉ−Ｍ８９、Ｉ−Ｍ９０、Ｉ−Ｍ９１、Ｉ−Ｍ９２、Ｉ−Ｍ９３、Ｉ−Ｍ９４、Ｉ−Ｍ９５、Ｉ−Ｍ９６、Ｉ−Ｍ９７、Ｉ−Ｍ９８、Ｉ−Ｍ９９、Ｉ−Ｍ１００、又は
以下からなる第２群：
（ｉｉ）Ｗ−Ｍ１、Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ３、Ｗ−Ｍ４、Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ６、Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ８、Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ１０、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１２、Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２、Ｗ−Ｍ２３、Ｗ−Ｍ２４、Ｗ−Ｍ２５、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ２７、Ｗ−Ｍ２８、Ｗ−Ｍ２９、Ｗ−Ｍ３０、Ｗ−Ｍ３１、Ｗ−Ｍ３２、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ３４、Ｗ−Ｍ３５、Ｗ−Ｍ３６、Ｗ−Ｍ３７、Ｗ−Ｍ３８、Ｗ−Ｍ３９、Ｗ−Ｍ４０、Ｗ−Ｍ４１、Ｗ−Ｍ４２、Ｗ−Ｍ４３、Ｗ−Ｍ４４、Ｗ−Ｍ４５、Ｗ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ４７、Ｗ−Ｍ４８、Ｗ−Ｍ４９、Ｗ−Ｍ５０、Ｗ−Ｍ５１、Ｗ−Ｍ５２、Ｗ−Ｍ５３、Ｗ−Ｍ５４、Ｗ−Ｍ５５、Ｗ−Ｍ５６、Ｗ−Ｍ５７、Ｗ−Ｍ５８、Ｗ−Ｍ５９、Ｗ−Ｍ６０、Ｗ−Ｍ６１、Ｗ−Ｍ６１、Ｗ−Ｍ６２、Ｗ−Ｍ６３、Ｗ−Ｍ６４、Ｗ−Ｍ６５、Ｗ−Ｍ６６、Ｗ−Ｍ６７、Ｗ−Ｍ６８、Ｗ−Ｍ６９、Ｗ−Ｍ７０、Ｗ−Ｍ７１、Ｗ−Ｍ７２、Ｗ−Ｍ７３、Ｗ−Ｍ７４、Ｗ−Ｍ７５、Ｗ−Ｍ７６、Ｗ−Ｍ７７、Ｗ−Ｍ７９、Ｗ−Ｍ８０、Ｗ−Ｍ８１、Ｗ−Ｍ８２、Ｗ−Ｍ８３、Ｗ−Ｍ８４、Ｗ−Ｍ８５、Ｗ−Ｍ８６、Ｗ−Ｍ８７、Ｗ−Ｍ８８、Ｗ−Ｍ８９、Ｗ−Ｍ９０、Ｗ−Ｍ９１、Ｗ−Ｍ９２、Ｗ−Ｍ９３、Ｗ−Ｍ９４、Ｗ−Ｍ９５、Ｗ−Ｍ９６、Ｗ−Ｍ９７、Ｗ−Ｍ９８、Ｗ−Ｍ９９、Ｗ−Ｍ１００、
のいずれかより選択される１以上のバイオマーカーに関連するものである、上記ソフトウエア。
【請求項１２】
アルゴリズムが、少なくとも１つのバイオマーカーに関連するデータに基づいたパターン認識解析を行うものである、請求項１１記載のソフトウエア。
【請求項１３】
アルゴリズムが、少なくとも１つのバイオマーカーに関連するデータに基づいた分類系統樹解析を含むものである、請求項１２記載のソフトウエア。
【請求項１４】
アルゴリズムが、少なくとも１つのバイオマーカーに関連するデータに基づいた人工ニューラルネットワーク解析を含むものである、請求項１２記載のソフトウエア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的には肝細胞癌（ＨＣＣ）の血清バイオマーカーの分野に関する。より具体的には、本発明は、ＨＣＣと、他の状態（例えば慢性肝臓疾患及び肝硬変）とをそれぞれ区別しうる血清バイオマーカーに関する。
【０００２】
本願は、２００２年４月８日出願の米国特許仮出願第６０／３７０，２３９号に基づくものであり、これは参照により本願明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
全世界において、ＨＣＣは８番目に最も頻度の高い癌であり、また男性において最も頻度の高い悪性腫瘍であり、毎年１００万人が新たに発症している。主に後進国及び発展途上国において毎年約１００万人の死因となっている。合衆国（United States）においては、５年全生存率（１９９２〜１９９６年）は５％である（El-Serag et al., Hepatology 33:62-65 (2001)）。ウイルス感染症（例えばＢ型又はＣ型肝炎）、アルコール性肝臓障害及びアルファトキシンＢ暴露に関連する肝機能障害は、一般的には悪性転換にいたる。実際、全世界のＨＣＣの８０％は病因学的にＨＢＶと関連しており、ＨＢＶは、合衆国における非アジア人においてＨＣＣの４つの症例の１つを占めると推定されている。標準的な治療法はなく、また予後も悪い。
【０００４】
ＨＣＣの従来のバイオマーカーは、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）である。しかしながら、慢性肝臓疾患の患者もまた血清ＡＦＰレベルの上昇を示す。ＨＣＣは典型的に合併慢性肝臓疾患の患者において発症するため、ＡＦＰレベル単独では良好なバイオマーカーとはいえず、癌の予測価値の範囲は４０％にすぎない。ＡＦＰのアイソフォームの定量解析によって、診断価値は７５％に改善されたが、非常に時間がかかり、また過度の労力も必要である。さらに、ＨＣＣ患者の約２０％は、２０ｎｇ／ｍｌ未満の非常に低いＡＦＰレベルを有する。ｐ５３タンパク質及び種々のアルデヒドデヒドロゲナーゼのアイソザイムの両方が可能性のあるマーカーとして試験されているが、これらのうちＡＦＰと同程度にさえ高い予測価値を有するものはない。
【０００５】
ＨＣＣを診断するために生検を利用することもできるが、これは侵襲的な方法であり、そのため望ましいものではない。他のＨＣＣ診断方法には、超音波及びコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンがある。２ｃｍ未満のＨＣＣ小節は、動脈門脈造影法の間に超音波検査及びＣＴスキャンにより２５〜２８％しか検出することはできない。
【０００６】
ＨＣＣを同定するのみならず、ＨＣＣと他の状態のうち慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）とを区別することが可能なバイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせが非常に望まれている。しかしながら、現在までにかかるバイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせを開示するＨＣＣ診断に関する文献はない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明においては、バイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせをＨＣＣの同定に使用する。本方法は、ＨＣＣとＣＬＤとの区別に成功している。一実施形態において、被験者における肝細胞癌の状態を評価する方法は、被験者由来の生物学的サンプルを、以下の第１群及び／又は第２群：
以下からなる第１群：
（Ａ）Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ２、Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ４、Ｉ−Ｍ５、Ｉ−Ｍ６、Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ８、Ｉ−Ｍ９、Ｉ−Ｍ１０、Ｉ−Ｍ１１、Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１４、Ｉ−Ｍ１５、Ｉ−Ｍ１６、Ｉ−Ｍ１７、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ２０、Ｉ−Ｍ２１、Ｉ−Ｍ２２、Ｉ−Ｍ２３、Ｉ−Ｍ２４、Ｉ−Ｍ２５、Ｉ−Ｍ２６、Ｉ−Ｍ２７、Ｉ−Ｍ２８、Ｉ−Ｍ２９、Ｉ−Ｍ３０、Ｉ−Ｍ３１、Ｉ−Ｍ３２、Ｉ−Ｍ３３、Ｉ−Ｍ３４、Ｉ−Ｍ３５、Ｉ−Ｍ３６、Ｉ−Ｍ３７、Ｉ−Ｍ３８、Ｉ−Ｍ３９、Ｉ−Ｍ４０、Ｉ−Ｍ４１、Ｉ−Ｍ４２、Ｉ−Ｍ４３、Ｉ−Ｍ４４、Ｉ−Ｍ４５、Ｉ−Ｍ４６、Ｉ−Ｍ４７、Ｉ−Ｍ４８、Ｉ−Ｍ４９、Ｉ−Ｍ５０、Ｉ−Ｍ５１、１−Ｍ５２、Ｉ−Ｍ５３、Ｉ−Ｍ５４、Ｉ−Ｍ５５、Ｉ−Ｍ５６、Ｉ−Ｍ５７、Ｉ−Ｍ５８、Ｉ−Ｍ５９、Ｉ−Ｍ６０、Ｉ−Ｍ６１、Ｉ−Ｍ６１、Ｉ−Ｍ６２、Ｉ−Ｍ６３、Ｉ−Ｍ６４、Ｉ−Ｍ６５、Ｉ−Ｍ６６、Ｉ−Ｍ６７、Ｉ−Ｍ６８、Ｉ−Ｍ６９、Ｉ−Ｍ７０、Ｉ−Ｍ７１、Ｉ−Ｍ７２、Ｉ−Ｍ７３、Ｉ−Ｍ７４、Ｉ−Ｍ７５、Ｉ−Ｍ７６、Ｉ−Ｍ７７、Ｉ−Ｍ７９、Ｉ−Ｍ８０、Ｉ−Ｍ８１、Ｉ−Ｍ８２、Ｉ−Ｍ８３、Ｉ−Ｍ８４、Ｉ−Ｍ８５、Ｉ−Ｍ８６、Ｉ−Ｍ８７、Ｉ−Ｍ８８、Ｉ−Ｍ８９、Ｉ−Ｍ９０、Ｉ−Ｍ９１、Ｉ−Ｍ９２、Ｉ−Ｍ９３、Ｉ−Ｍ９４、Ｉ−Ｍ９５、Ｉ−Ｍ９６、Ｉ−Ｍ９７、Ｉ−Ｍ９８、Ｉ−Ｍ９９、Ｉ−Ｍ１００、
及び／又は
以下からなる第２群：
（Ｂ）Ｗ−Ｍ１、Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ３、Ｗ−Ｍ４、Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ６、Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ８、Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ１０、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１２、Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２、Ｗ−Ｍ２３、Ｗ−Ｍ２４、Ｗ−Ｍ２５、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ２７、Ｗ−Ｍ２８、Ｗ−Ｍ２９、Ｗ−Ｍ３０、Ｗ−Ｍ３１、Ｗ−Ｍ３２、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ３４、Ｗ−Ｍ３５、Ｗ−Ｍ３６、Ｗ−Ｍ３７、Ｗ−Ｍ３８、Ｗ−Ｍ３９、Ｗ−Ｍ４０、Ｗ−Ｍ４１、Ｗ−Ｍ４２、Ｗ−Ｍ４３、Ｗ−Ｍ４４、Ｗ−Ｍ４５、Ｗ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ４７、Ｗ−Ｍ４８、Ｗ−Ｍ４９、Ｗ−Ｍ５０、Ｗ−Ｍ５１、Ｗ−Ｍ５２、Ｗ−Ｍ５３、Ｗ−Ｍ５４、Ｗ−Ｍ５５、Ｗ−Ｍ５６、Ｗ−Ｍ５７、Ｗ−Ｍ５８、Ｗ−Ｍ５９、Ｗ−Ｍ６０、Ｗ−Ｍ６１、Ｗ−Ｍ６１、Ｗ−Ｍ６２、Ｗ−Ｍ６３、Ｗ−Ｍ６４、Ｗ−Ｍ６５、Ｗ−Ｍ６６、Ｗ−Ｍ６７、Ｗ−Ｍ６８、Ｗ−Ｍ６９、Ｗ−Ｍ７０、Ｗ−Ｍ７１、Ｗ−Ｍ７２、Ｗ−Ｍ７３、Ｗ−Ｍ７４、Ｗ−Ｍ７５、Ｗ−Ｍ７６、Ｗ−Ｍ７７、Ｗ−Ｍ７９、Ｗ−Ｍ８０、Ｗ−Ｍ８１、Ｗ−Ｍ８２、Ｗ−Ｍ８３、Ｗ−Ｍ８４、Ｗ−Ｍ８５、Ｗ−Ｍ８６、Ｗ−Ｍ８７、Ｗ−Ｍ８８、Ｗ−Ｍ８９、Ｗ−Ｍ９０、Ｗ−Ｍ９１、Ｗ−Ｍ９２、Ｗ−Ｍ９３、Ｗ−Ｍ９４、Ｗ−Ｍ９５、Ｗ−Ｍ９６、Ｗ−Ｍ９７、Ｗ−Ｍ９８、Ｗ−Ｍ９９、Ｗ−Ｍ１００、
のいずれかより選択されるタンパク質の診断レベルについて分析するステップを含み、上記バイオマーカーは、ＨＣＣを患う被験者のサンプルとＣＬＤを患う被験者のサンプル中に示差的に存在する。
【０００８】
好ましくは、タンパク質は、以下：
（Ａ）Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ４、Ｉ−Ｍ５、Ｉ−Ｍ６、Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ９、Ｉ−Ｍ１１、Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ２０、Ｉ−Ｍ２１、Ｉ−Ｍ２２、Ｉ−Ｍ２３、Ｉ−Ｍ２５、Ｉ−Ｍ２６、Ｉ−Ｍ２８、Ｉ−Ｍ３２、Ｉ−Ｍ３４、Ｉ−Ｍ３６、Ｉ−Ｍ３７、Ｉ−Ｍ４１、Ｉ−Ｍ４４、Ｉ−Ｍ４６、Ｉ−Ｍ４７、Ｉ−Ｍ５２、Ｉ−Ｍ５３、Ｉ−Ｍ６４、Ｉ−Ｍ６８、Ｉ−Ｍ６９、Ｉ−Ｍ７７、Ｉ−Ｍ７９、Ｉ−Ｍ８１、Ｉ−Ｍ８４、Ｉ−Ｍ８７、Ｉ−Ｍ８８、Ｉ−Ｍ８９、及びＩ−Ｍ９２、
並びに／又は
（Ｂ）Ｗ−Ｍ１、Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ３、Ｗ−Ｍ４、Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ１０、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１２、Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２、Ｗ−Ｍ２３、Ｗ−Ｍ２５、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ２７、Ｗ−Ｍ３０、Ｗ−Ｍ３１、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ３４、Ｗ−Ｍ３５、Ｗ−Ｍ３６、Ｗ−Ｍ３９、Ｗ−Ｍ４０、Ｗ−Ｍ４１、Ｗ−Ｍ４３、Ｗ−Ｍ４４、Ｗ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ４７、Ｗ−Ｍ４８、Ｗ−Ｍ４９、Ｗ−Ｍ５０、Ｗ−Ｍ５２、Ｗ−Ｍ５３、Ｗ−Ｍ５４、Ｗ−Ｍ５５、Ｗ−Ｍ５８、Ｗ−Ｍ６０、Ｗ−Ｍ６２、Ｗ−Ｍ６３、Ｗ−Ｍ７０、Ｗ−Ｍ７１、Ｗ−Ｍ７３、Ｗ−Ｍ７６、Ｗ−Ｍ７８、Ｗ−Ｍ８４、Ｗ−Ｍ８６、Ｗ−Ｍ８８、Ｗ−Ｍ８９、Ｗ−Ｍ９０、Ｗ−Ｍ９３、Ｗ−Ｍ９５、Ｗ−Ｍ９６、Ｗ−Ｍ９８、及びＷ−Ｍ１００、
より選択されるものである。
【０００９】
それ自体がＨＣＣを同定可能なバイオマーカーには、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２、及びＷ−Ｍ２３タンパク質バイオマーカーが含まれる。
【００１０】
本発明はまた、患者における肝細胞癌のリスクを評価する方法であって、（Ａ）該患者から採取した生物学的サンプルを、化学的に誘導体化したアフィニティ表面上でのプロファイリングを含む質量分光分析に供することによって得られるスペクトルを準備するステップ、並びに、（Ｂ）該スペクトルに対し、
以下からなる群：
（ｉ）Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ４、Ｉ−Ｍ５、Ｉ−Ｍ６、Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ９、Ｉ−Ｍ１１、Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ２０、Ｉ−Ｍ２１、Ｉ−Ｍ２２、Ｉ−Ｍ２３、Ｉ−Ｍ２５、Ｉ−Ｍ２６、Ｉ−Ｍ２８、Ｉ−Ｍ３２、Ｉ−Ｍ３４、Ｉ−Ｍ３６、Ｉ−Ｍ３７、Ｉ−Ｍ４１、Ｉ−Ｍ４４、Ｉ−Ｍ４６、Ｉ−Ｍ４７、Ｉ−Ｍ５２、Ｉ−Ｍ５３、Ｉ−Ｍ６４、Ｉ−Ｍ６８、Ｉ−Ｍ６９、Ｉ−Ｍ７７、Ｉ−Ｍ７９、Ｉ−Ｍ８１、Ｉ−Ｍ８４、Ｉ−Ｍ８７、Ｉ−Ｍ８８、Ｉ−Ｍ８９、及びＩ−Ｍ９２、
並びに／又は
以下からなる群：
（ｉｉ）Ｗ−Ｍ１、Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ３、Ｗ−Ｍ４、Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ１０、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１２、Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２、Ｗ−Ｍ２３、Ｗ−Ｍ２５、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ２７、Ｗ−Ｍ３０、Ｗ−Ｍ３１、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ３４、Ｗ−Ｍ３５、Ｗ−Ｍ３６、Ｗ−Ｍ３９、Ｗ−Ｍ４０、Ｗ−Ｍ４１、Ｗ−Ｍ４３、Ｗ−Ｍ４４、Ｗ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ４７、Ｗ−Ｍ４８、Ｗ−Ｍ４９、Ｗ−Ｍ５０、Ｗ−Ｍ５２、Ｗ−Ｍ５３、Ｗ−Ｍ５４、Ｗ−Ｍ５５、Ｗ−Ｍ５８、Ｗ−Ｍ６０、Ｗ−Ｍ６２、Ｗ−Ｍ６３、Ｗ−Ｍ７０、Ｗ−Ｍ７１、Ｗ−Ｍ７３、Ｗ−Ｍ７６、Ｗ−Ｍ７８、Ｗ−Ｍ８４、Ｗ−Ｍ８６、Ｗ−Ｍ８８、Ｗ−Ｍ８９、Ｗ−Ｍ９０、Ｗ−Ｍ９３、Ｗ−Ｍ９５、Ｗ−Ｍ９６、Ｗ−Ｍ９８、及びＷ−Ｍ１００、
より選択される少なくとも１つのピークに基づいたパターン認識解析を行うステップを含む、上記方法を提供する。
【００１１】
パターン認識解析は、例えば、
以下からなる群：
（Ａ）Ｉ−Ｍ１３及びＩ−Ｍ２５、Ｉ−Ｍ１３及びＩ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ２５及びＩ−Ｍ４６、Ｉ−Ｍ３７及びＩ−Ｍ７７、Ｉ−Ｍ５及びＩ−Ｍ３６、並びに／又は
以下からなる群：
（Ｂ）Ｗ−Ｍ１４及びＷ−Ｍ９８、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ１１及びＷ−Ｍ５２、Ｗ−Ｍ１６及びＷ−Ｍ８９、Ｗ−Ｍ１及びＷ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ７６、Ｗ−Ｍ１１及びＷ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ１３及びＷ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ２及びＷ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ３３及びＷ−Ｍ５４、Ｗ−Ｍ２及びＷ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ１６及びＷ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ１１及びＷ−Ｍ５、
より選択されるピークの２つの組み合わせに基づいて行いうる。
【００１２】
あるいは、パターン認識解析は、
以下からなる群：
（Ａ）Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ４及びＩ−Ｍ３６；Ｉ−Ｍ５、Ｉ−Ｍ７及びＩ−Ｍ１９；Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ１９及びＩ−Ｍ４６；Ｉ−Ｍ９、Ｉ−Ｍ３４及びＩ−Ｍ５２；Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ１８及びＩ−Ｍ４７；Ｉ−Ｍ１１、Ｉ−Ｍ１３及びＩ−Ｍ３６；Ｉ−Ｍ９、Ｉ−Ｍ７７及びＩ−Ｍ８４；Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ２２及びＩ−Ｍ７９、
並びに／又は
以下からなる群：
（Ｂ）Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２及びＷ−Ｍ３５；Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ４６；Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ１４及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ５４及びＷ−Ｍ７０；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ３３及びＷ−Ｍ４６；Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ３６及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ２２；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ５４；Ｗ−Ｍ５５、Ｗ−Ｍ５８及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１４及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ１、Ｗ−Ｍ３３及びＷ−Ｍ４６；Ｗ−Ｍ４０、Ｗ−Ｍ４６及びＷ−Ｍ４９；Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ２２；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ３６及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１１及びＷ−Ｍ５４；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ２２及びＷ−Ｍ２５；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ５８及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１４及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ７，Ｗ−Ｍ１４及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ５８及びＷ−Ｍ７１；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ２５及びＷ−Ｍ５４；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ６０及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ４６及びＷ−Ｍ１００、
より選択されるピークの３つの組み合わせに基づいて行いうる。
【００１３】
他の実施形態において、パターン認識解析は、３つ以上のピークの組み合わせ、特に４、５又は６つのピークの組み合わせに基づいて行うことができ、ここでこの組み合わせは、
以下からなる群：
（Ａ）Ｉ−Ｍ１１、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１９及びＩ−Ｍ８９；Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ２２及びＩ−Ｍ２６；Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ５、Ｉ−Ｍ３６及びＩ−Ｍ４１；Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ３３、Ｉ−Ｍ４４及びＩ−Ｍ４６；Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ６８及びＩ−Ｍ８１；Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ３４及びＩ−Ｍ８１；Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ３２及びＩ−Ｍ３７；Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ４４、Ｉ−Ｍ４６及びＩ−Ｍ７９；Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ２１及びＩ−Ｍ２３；Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ７７及びＩ−Ｍ９２；Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ７７及びＩ−Ｍ８７；Ｉ−Ｍ６、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ３４及びＩ−Ｍ８１；Ｉ−Ｍ８、Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ５３、Ｉ−Ｍ６４、Ｉ−Ｍ６９；Ｉ−Ｍ４、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ２８、Ｉ−Ｍ４７及びＩ−Ｍ８８；並びに、Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ４、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ３６、Ｉ−Ｍ４１及びＩ−Ｍ４７
並びに／又は
以下からなる群：
（Ｂ）Ｗ−Ｍ２５、Ｗ−Ｍ５５、Ｗ−Ｍ６２及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１７及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ３１、Ｗ−Ｍ９３及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ４６及びＷ−Ｍ５０；Ｗ−Ｍ４、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ５５及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ３６及びＷ−Ｍ５４；Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ３６、Ｗ−Ｍ４３及びＷ−Ｍ４６；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ４１、Ｗ−Ｍ５４及びＷ−Ｍ７３；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ５２及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ４、Ｗ−Ｍ１４、５８及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ１２、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ２０及びＷ−Ｍ４０；Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ７０及びＷ−Ｍ８８；Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ３４及びＷ−Ｍ４６；Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ４０及びＷ−Ｍ５８；Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ５２及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ３、Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ４６；Ｗ−Ｍ１０、Ｗ−Ｍ２２、Ｗ−Ｍ３０及びＷ−Ｍ９５；Ｗ−Ｍ１、Ｗ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ５４及びＷ−Ｍ７０；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ２５及びＷ−Ｍ５４；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ４６及びＷ−Ｍ９０；Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ５４及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ２１及びＷ−Ｍ２２；Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ５２及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２２及びＷ−Ｍ５５；Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ４７及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ２７、Ｗ−Ｍ４６及びＷ−Ｍ７８；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ４６及びＷ−Ｍ５３；Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ１９及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ５２、Ｗ−Ｍ８９及びＷ−Ｍ９６；Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ２５、Ｗ−Ｍ４０、Ｗ−Ｍ５２及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ２０及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ２３、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ４０及びＷ−Ｍ８９；Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ２７、Ｗ−Ｍ３０、Ｗ−Ｍ３５、Ｗ−Ｍ４０及びＷ−Ｍ７０；Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ３９、Ｗ−Ｍ４４、Ｗ−Ｍ６３及びＷ−Ｍ９８；Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ３５、Ｗ−Ｍ３９、Ｗ−Ｍ８６及びＷ−Ｍ８９；並びに、Ｗ−Ｍ３、Ｗ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２、Ｗ−Ｍ４８及びＷ−Ｍ８４、
より選択される。各場合において、バイオマーカーは、ＨＣＣを患う被験者のサンプルとＣＬＤを患う被験者のサンプル中に示差的に存在する。
【００１４】
本発明はまた、ＨＣＣを検出及び診断するためのキットを包含する。本発明のキットは、例えば、（ｉ）図１又は図２に示される１以上のバイオマーカーを保持する基板に付着させた吸着剤、及び、（ｉｉ）サンプルと該吸着剤とを接触させて該吸着剤により保持されるバイオマーカーを検出することによってバイオマーカーを検出するための装置、を含む。本発明のキットは、さらに洗浄液又は洗浄液を調製するための説明書を含んでもよい。
【００１５】
また本発明は、被験者における肝細胞癌の状態を評価するためのソフトウエアであって、該被験者から採取した生物学的サンプルの質量分光分析により得られたスペクトルから抽出したデータを解析するためのアルゴリズムを含み、該データは、以下の第１群又は第２群：
以下からなる第１群：
（ｉ）Ｉ−Ｍ１、Ｉ−Ｍ２、Ｉ−Ｍ３、Ｉ−Ｍ４、Ｉ−Ｍ５、Ｉ−Ｍ６、Ｉ−Ｍ７、Ｉ−Ｍ８、Ｉ−Ｍ９、Ｉ−Ｍ１０、Ｉ−Ｍ１１、Ｉ−Ｍ１２、Ｉ−Ｍ１３、Ｉ−Ｍ１４、Ｉ−Ｍ１５、Ｉ−Ｍ１６、Ｉ−Ｍ１７、Ｉ−Ｍ１８、Ｉ−Ｍ１９、Ｉ−Ｍ２０、Ｉ−Ｍ２１、Ｉ−Ｍ２２、Ｉ−Ｍ２３、Ｉ−Ｍ２４、Ｉ−Ｍ２５、Ｉ−Ｍ２６、Ｉ−Ｍ２７、Ｉ−Ｍ２８、Ｉ−Ｍ２９、Ｉ−Ｍ３０、Ｉ−Ｍ３１、Ｉ−Ｍ３２、Ｉ−Ｍ３３、Ｉ−Ｍ３４、Ｉ−Ｍ３５、Ｉ−Ｍ３６、Ｉ−Ｍ３７、Ｉ−Ｍ３８、Ｉ−Ｍ３９、Ｉ−Ｍ４０、Ｉ−Ｍ４１、Ｉ−Ｍ４２、Ｉ−Ｍ４３、Ｉ−Ｍ４４、Ｉ−Ｍ４５、Ｉ−Ｍ４６、Ｉ−Ｍ４７、Ｉ−Ｍ４８、Ｉ−Ｍ４９、Ｉ−Ｍ５０、Ｉ−Ｍ５１、Ｉ−Ｍ５２、Ｉ−Ｍ５３、Ｉ−Ｍ５４、Ｉ−Ｍ５５、Ｉ−Ｍ５６、Ｉ−Ｍ５７、Ｉ−Ｍ５８、Ｉ−Ｍ５９、Ｉ−Ｍ６０、Ｉ−Ｍ６１、Ｉ−Ｍ６１、Ｉ−Ｍ６２、Ｉ−Ｍ６３、Ｉ−Ｍ６４、Ｉ−Ｍ６５、Ｉ−Ｍ６６、Ｉ−Ｍ６７、Ｉ−Ｍ６８、Ｉ−Ｍ６９、Ｉ−Ｍ７０、Ｉ−Ｍ７１、Ｉ−Ｍ７２、Ｉ−Ｍ７３、Ｉ−Ｍ７４、Ｉ−Ｍ７５、Ｉ−Ｍ７６、Ｉ−Ｍ７７、Ｉ−Ｍ７９、Ｉ−Ｍ８０、Ｉ−Ｍ８１、Ｉ−Ｍ８２、Ｉ−Ｍ８３、Ｉ−Ｍ８４、Ｉ−Ｍ８５、Ｉ−Ｍ８６、Ｉ−Ｍ８７、Ｉ−Ｍ８８、Ｉ−Ｍ８９、Ｉ−Ｍ９０、Ｉ−Ｍ９１、Ｉ−Ｍ９２、Ｉ−Ｍ９３、Ｉ−Ｍ９４、Ｉ−Ｍ９５、Ｉ−Ｍ９６、Ｉ−Ｍ９７、Ｉ−Ｍ９８、Ｉ−Ｍ９９、Ｉ−Ｍ１００、又は
以下からなる第２群：
（ｉｉ）Ｗ−Ｍ１、Ｗ−Ｍ２、Ｗ−Ｍ３、Ｗ−Ｍ４、Ｗ−Ｍ５、Ｗ−Ｍ６、Ｗ−Ｍ７、Ｗ−Ｍ８、Ｗ−Ｍ９、Ｗ−Ｍ１０、Ｗ−Ｍ１１、Ｗ−Ｍ１２、Ｗ−Ｍ１３、Ｗ−Ｍ１４、Ｗ−Ｍ１５、Ｗ−Ｍ１６、Ｗ−Ｍ１７、Ｗ−Ｍ１８、Ｗ−Ｍ１９、Ｗ−Ｍ２０、Ｗ−Ｍ２１、Ｗ−Ｍ２２、Ｗ−Ｍ２３、Ｗ−Ｍ２４、Ｗ−Ｍ２５、Ｗ−Ｍ２６、Ｗ−Ｍ２７、Ｗ−Ｍ２８、Ｗ−Ｍ２９、Ｗ−Ｍ３０、Ｗ−Ｍ３１、Ｗ−Ｍ３２、Ｗ−Ｍ３３、Ｗ−Ｍ３４、Ｗ−Ｍ３５、Ｗ−Ｍ３６、Ｗ−Ｍ３７、Ｗ−Ｍ３８、Ｗ−Ｍ３９、Ｗ−Ｍ４０、Ｗ−Ｍ４１、Ｗ−Ｍ４２、Ｗ−Ｍ４３、Ｗ−Ｍ４４、Ｗ−Ｍ４５、Ｗ−Ｍ４６、Ｗ−Ｍ４７、Ｗ−Ｍ４８、Ｗ−Ｍ４９、Ｗ−Ｍ５０、Ｗ−Ｍ５１、Ｗ−Ｍ５２、Ｗ−Ｍ５３、Ｗ−Ｍ５４、Ｗ−Ｍ５５、Ｗ−Ｍ５６、Ｗ−Ｍ５７、Ｗ−Ｍ５８、Ｗ−Ｍ５９、Ｗ−Ｍ６０、Ｗ−Ｍ６１、Ｗ−Ｍ６１、Ｗ−Ｍ６２、Ｗ−Ｍ６３、Ｗ−Ｍ６４、Ｗ−Ｍ６５、Ｗ−Ｍ６６、Ｗ−Ｍ６７、Ｗ−Ｍ６８、Ｗ−Ｍ６９、Ｗ−Ｍ７０、Ｗ−Ｍ７１、Ｗ−Ｍ７２、Ｗ−Ｍ７３、Ｗ−Ｍ７４、Ｗ−Ｍ７５、Ｗ−Ｍ７６、Ｗ−Ｍ７７、Ｗ−Ｍ７９、Ｗ−Ｍ８０、Ｗ−Ｍ８１、Ｗ−Ｍ８２、Ｗ−Ｍ８３、Ｗ−Ｍ８４、Ｗ−Ｍ８５、Ｗ−Ｍ８６、Ｗ−Ｍ８７、Ｗ−Ｍ８８、Ｗ−Ｍ８９、Ｗ−Ｍ９０、Ｗ−Ｍ９１、Ｗ−Ｍ９２、Ｗ−Ｍ９３、Ｗ−Ｍ９４、Ｗ−Ｍ９５、Ｗ−Ｍ９６、Ｗ−Ｍ９７、Ｗ−Ｍ９８、Ｗ−Ｍ９９、Ｗ−Ｍ１００、
のいずれかより選択される１以上のバイオマーカーに関連するものである、上記ソフトウエアを提供する。
【００１６】
アルゴリズムは、少なくとも１つのバイオマーカーに関連するデータに基づいたパターン認識解析を行うものとしうる。あるいは、アルゴリズムは、少なくとも１つのバイオマーカーに関連するデータに基づいた分類系統樹解析を含むものとしうる。また別の実施形態においては、アルゴリズムは、少なくとも１つのバイオマーカーに関連するデータに基づいた人工ニューラルネットワーク解析を含むものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明によって、ＨＣＣに関連した一連のバイオマーカーが見いだされた。本明細書において、バイオマーカーとは、ＣＬＤの被験者から採取した対応するサンプルと比較してＨＣＣの被験者から採取したサンプルに示差的に存在する有機生体分子、特にポリペプチド又は蛋白質である。バイオマーカーは、ＨＣＣを示さないＣＬＤ患者のサンプルと比較してＨＣＣ患者のサンプルでレベルが上昇して又は低減して存在する場合には、ＨＣＣ患者及びＣＬＤ患者から採取したサンプルに示差的に存在する。より詳細には、バイオマーカーは、気相イオン分光法によって測定される見かけの分子量を特徴とし、ＣＬＤ被験者と比較してＨＣＣ被験者のサンプルでレベルが上昇又は低減して存在するポリペプチドである。１サンプル中におけるバイオマーカーの量がもう一方のサンプル中におけるバイオマーカーの量と統計学的に有意に異なる場合には、バイオマーカーはこれら２つのサンプル間で示差的に存在する。
【００１８】
本発明のバイオマーカーを使用して、被験者における肝細胞癌の状態を評価することができる。本明細書中、「肝細胞癌の状態」には、特に、疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患のステージ及び疾患治療の効果が含まれる。この状態に基づいて、他の診断試験又は治療方法若しくは治療計画、たとえば、内視鏡検査、生検、手術、化学療法、免疫療法及び放射線療法を含めたさらなる方法の必要性を示すことができる。より詳細には、本発明のバイオマーカーは、ＨＣＣを同定し、ＣＬＤと区別することが可能である。場合によっては、単一のバイオマーカーで少なくとも８５％の予測成功率でＨＣＣを同定することができるが、一方他の場合では、バイオマーカーの組み合わせを使用して少なくとも８５％の予測成功率が得られる。したがって、これらのバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせを使用して、患者におけるＨＣＣリスクを評価することができる。
【００１９】
場合によっては、単一のバイオマーカーで少なくとも８５％の感受性又は特異性で肝細胞癌を同定することができるが、一方他の場合では、複数のバイオマーカーの組み合わせを使用して、少なくとも８５％の感受性又は特異性が達成される。したがって、バイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせを使用して、被験者又は患者における肝細胞癌の状態を評価することができる。
【００２０】
本発明に係るバイオマーカーは、血清中に存在する。しかし、本発明において使用する生物学的サンプルは血清サンプルである必要はない。したがって、肝臓細胞癌の状態を評価するための生物学的サンプルは、血清、血漿又は血液サンプルであってよいが、血清サンプルが好ましい。
【００２１】
バイオマーカーは全て、分子量によって特徴づけられ、本発明のバイオマーカーの２つのリストを図１及び図２に示す。これらの図には、ｐ値によって統計学的に決定された上位１００個のバイオマーカーが挙げられており、それぞれは本明細書で説明したＣｕ（ＩＩ）ＩＭＡＣ３及びＷＣＸ２ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイプロトコールによって同定した。各図において、第１列の数字はバイオマーカー識別名である。したがって、図１の第１行はバイオマーカーＩ−Ｍ１に関し、第２の行はバイオマーカーＩ−Ｍ２に関する、というようになる（「Ｉ−Ｍ」は、ＩＭＡＣチップで同定されたバイオマーカーを意味する）。同様に、図２の第１行は、バイオマーカーＷ−Ｍ１に関し、第２行はバイオマーカーＷ−Ｍ２に関する（「Ｗ−Ｍ」はＷＣＸ２チップで同定したバイオマーカーを意味する）。この図の第２列の数字は、気相イオン分光法によって測定された、バイオマーカーの見かけの分子量（ダルトン）である。この図の最終列の文字は、本明細書で説明したプロトコールでバイオマーカーが溶出する画分を意味しており、すなわち、「Ａ」のバイオマーカーは第１の画分で溶出し、「Ｂ」のバイオマーカーは第２の画分で溶出する、というようになる。バイオマーカーが溶出する画分はそのｐＩと相関しており、高いｐＨで溶出するバイオマーカーはｐＩが高く、低いｐＨで溶出するバイオマーカーはｐＩが低い。
【００２２】
この説明におけるように、本発明の所与のバイオマーカーの質量及びアフィニティ特性を示すことによって、本明細書での教示にしたがってバイオマーカーを得たり、測定したりできることが特徴である。所望するならば、アミノ酸配列を得るために、いずれかのバイオマーカーの配列を決定することができるが、これは本発明を実施するために必要ではない。
【００２３】
たとえば、バイオマーカーはいくつかの酵素、たとえば、トリプシン及びＶ８プロテアーゼでマッピングされたペプチドであることができ、消化断片の分子量を使用して、様々な酵素によって生じた消化断片の分子量に一致する配列をデータベースで検索することができる。あるいは、このバイオマーカーが公知のデータベースに含まれていない蛋白質の場合、このバイオマーカーのＮ末端アミノ酸配列に基づいて縮重プローブを作製することができ、次にこれを使用してバイオマーカーが最初に検出されたサンプルから作製したゲノム又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。陽性クローンを同定し、増幅して、周知の技術を使用してそれらの組換えＤＮＡ配列をサブクローニングすることができる。最後に、蛋白質バイオマーカーは、蛋白質ラダーシーケンス法を使用して配列を決定することができる。蛋白質ラダーは、分子を断片化し、断片に酵素消化又は断片の末端から１個のアミノ酸を連続的に除去する他の方法を行うことによって作製することができる。次にこのラダーを質量分光分析によって分析する。ラダー断片の質量の違いによって、分子末端から除去されたアミノ酸が同定される。
【００２４】
本発明に係る血清バイオマーカーは、新たに診断した２群の被験者、すなわちＨＣＣの被験者及びＣＬＤの被験者から採取された血清に由来するサンプルの質量スペクトルを比較することによって同定した。これらの被験者は、標準的診断基準によって診断した。ＨＣＣ患者は組織学的に確認し、ＣＬＤ患者については、無症候性ＨＣＣの被験者を排除するため、以下の血清採取物をＨＣＣのいずれかの徴候について少なくとも１８ヶ月間モニターした。
【００２５】
各群から被験者の血清を採取し、Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤＦイオン交換樹脂（Biosepra、Cipergen Biosystems, Inc）によって異なるｐＨで溶出する６つの画分に分画した。画分Ａには素通り分及びｐＨ９溶出分が含まれ、画分ＢにはｐＨ７溶出分が含まれ、画分ＣにはｐＨ５溶出分が含まれ、画分ＤにはｐＨ４溶出分が含まれ、画分ＥにはｐＨ３溶出分が含まれ、画分Ｆにはイソプロピルアルコール／アセトニトリルＴＦＡ溶出分が含まれた。
【００２６】
各画分を希釈して、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイのＣｕ（ＩＩ）（ＩＭＡＣ３）アレイ又はＷＣＸ２チップアレイのいずれかに添加した。これらのチップアレイはいずれもCiphergen Biosystems, Inc.（Fremont, CA）によって製造されている。
【００２７】
Ｃｕ（ＩＩ）（ＩＭＡＣ３）は、高い銅結合能及びその後の金属結合残基を有する蛋白質のアフィニティ捕捉のためにニトリロ三酢酸表面を備えた「固定化金属アフィニティ捕捉」チップである。イミダゾールを結合液及び洗浄液に使用して、非特異的蛋白質の結合を含めた蛋白質結合を抑えることができる。洗浄バッファー中のイミダゾールの濃度を増加させると、標的蛋白質の結合が低減する。これは、光重合開始剤として（−）リボフラビン（０．０２ｗｔ％）を使用して５−メチルアシルアミド−２−（Ｎ，Ｎ−ビスカルボキシメチルアミノ）ペンタン酸（７．５ｗｔ％）及びＮ，Ｎ´−メチレンビスアクリルアミド（０．４ｗｔ％）を光重合することによって生成する。モノマー溶液をチップ基板に導入し、照射して光重合させる。次にこのチップをＣｕ（ＩＩ）で活性化する。
【００２８】
ＷＣＸ２は、陽イオン蛋白質と結合するカルボン酸付加表面を備えた弱陽イオン交換アレイである。ＷＣＸ２チップ表面上の負に帯電したカルボン酸基は、標的蛋白質に曝露された正電荷と相互作用する。標的蛋白質の結合は、洗浄バッファーの塩濃度を増大させることによって、又はｐＨを低減させることによって低減する。
【００２９】
溶出画分を添加後、チップをインキュベートして溶出液中のポリペプチドがアフィニティ相互作用によってチップ上の部位に結合するようにした。インキュベーション後、各チップアレイを洗浄して非特異的に結合したポリペプチド及びバッファー混入物を除去した。次に、このチップを乾燥させて、エネルギー吸収分子又はマトリックスをチップに添加して、質量分析計において脱離及びイオン化を促進させた。
【００３０】
質量分析計では、チップアレイ上に捕捉された蛋白質を分析するためにＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェア及びパーソナルコンピュータを組み込んだＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）リーダーでレーザー脱離及びイオン化することによって、保持されたポリペプチドはチップアレイから溶出した。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）リーダーのイオン光学技術及びレーザー光学技術によって、１０００Ｄａ未満の小ペプチドから３００キロダルトン以上の蛋白質までの範囲の蛋白質を検出し、飛行時間に基づいて質量を計算することができる。イオン化したポリペプチドを検出して、その質量をこの飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計によって正確に測定した。
【００３１】
各群から得られた質量スペクトルを用いてスキャタープロット分析を行い、実行毎の変動を排除した。ＨＣＣとＣＬＤの両方で同一のパターンを有する、スキャタープロットの蛋白質クラスタ、すなわち、両条件で上昇するか、両条件で低下する蛋白質クラスタを潜在的バイオマーカーとして排除した。残存するポリペプチドがＨＣＣとＣＬＤとを正確に区別する能力についてさらに解析した。スチューデントｔ検定解析を使用して、スキャタープロットの各蛋白質クラスタについてＨＣＣ群とＣＬＤ群を比較し、２群の間で有意に（ｐ＜０．００１）異なる蛋白質クラスタを選択した。
【００３２】
分子量はスキャタープロット解析から得られ、質量分析計が分子量を分析する能力には限界があるため、図１及び図２に示したバイオマーカーの「絶対」分子量値は、実際にはおよその分子量を表す。したがって、バイオマーカーの所与の分子量は、分子量範囲の中点と解釈すべきである。図に示した「絶対」値の範囲は＋／−０．１５％（Ｉ−Ｍ１については８８４０から８８６７）以下で、一般的に＋／−０．１０％（Ｉ−Ｍ１については８８４４から８８６３）で、＋／−０．０５％（Ｉ−Ｍ１については８８５０から８８５８ダルトン）ほどの小ささであることもある。
【００３３】
他の実施形態では、「マイクロアレイの有意分析」（ＳＡＭ）蛋白質選別と呼ばれる方法を使用して潜在的バイオマーカーを同定した。この蛋白質選別方法は、元々ｃＤＮＡ／オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析用に開発されたＳＡＭアルゴリズムで実施した。Tusher et al.、「Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response」、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 98: 5116-21(2001)。群の同定がなされたら、ＳＡＭを使用して腫瘍群（ＨＣＣ４０例）と対照群（ＡＦＰ５００ｎｇ／ｍＬ未満のＣＬＤ２０例）の正規化したｌｏｇ１０プロテオミクスデータを比較して、中央値偽有意値＜０．０００００５で有意に異なるプロテオミクス特性を同定した。対照群は「１」と明示し、一方腫瘍群は「２」と明示した。「２種類の独立データ」は、データタイプとして選択した。全体で１０００回の並べ替え（permutation）を実施した。
【００３４】
血清サンプルにおいて、ＩＭＡＣ３銅 ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイを使用して１０８７個、ＷＣＸ２ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイを使用して１２９７個の全部で２３８４個のプロテオミクス特性が見いだされた。蛋白質選別用のＳＡＭを使用して、ＨＣＣ症例とＣＬＤ症例とで有意に異なる血清蛋白質／ポリペプチドを検索した。偽有意数の中央値を０．０００００５未満に設定することによって、ＨＣＣ患者血清において７９個のプロテオミクス特性が有意に高いことが同定され、１６０個のプロテオミクス特性が有意に低いことが同定された。したがって、ＨＣＣを同定するために全部で２３９個の潜在的血清マーカーが見いだされた。表１に最も有意な高プロテオミクス特性及び低プロテオミクス特性それぞれ５種類を挙げた。
【表１】
2005522677.tif 000002
【００３５】
２つの手法を使用して、潜在的バイオマーカーがＨＣＣ評価において予測値を示すかどうかを決定した。第１の手法では、Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）（Ciphergen Biosystems、Fremont、CA）を使用して、潜在的バイオマーカーが肝細胞癌の評価で予測値を示すかどうかを決定した。Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）には、隠れ相関及びＳＥＬＤＩ蛋白質プロファイルのパターンを同定する高度多変数解析プログラムが含まれる。
【００３６】
第２の手法には、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）解析が必要である。すなわち、示差的なプロテオミクス特性を含むＡＮＮモデルを開発して、ＣＬＤからＨＣＣを区別するための診断スコアを算出する。ＡＮＮアルゴリズムは、たとえば、Poon et al., Oncology 61:275-83 (2001)及びXu et al.,Cancer Res. 62:3493-7 (2002)に記載されたように、人工知能を分類、パターン認識及び予測に適用する。ＡＮＮモデルは、階層構造をした処理要素（ニューロン）から成る。ＡＮＮモデルは、練習用データセットから入力変数と出力との間の関連パターンを「学習」し、次にこれらのパターンを新たなケースに適用することができる。ＡＮＮモデルは、ＥａｓｙＮＮ（バージョン８．１、Stephen Wolstenholme、Cheshire、UK）で開発した。
【００３７】
開発方法はフィードフォワード型であり、このネットワークは加重逆伝搬法によって訓練させた。学習速度及びモーメンタムの両者はソフトウェアによって自動的に最適化した。ＡＮＮモデルは、３階層、すなわち１つの入力層、１つの隠れ層及び１つの出力層から構成された。中間隠れ層には７個のノードがあった。ＡＮＮモデル開発用の入力変数は、有意なプロテオミクス特性の相対レベルであり、一方、出力変数は各症例の診断スコア（０〜１．００００の範囲）であった。ＡＮＮモデルの訓練中、診断スコアはＣＬＤ症例では０．００００、ＨＣＣ症例では１．００００と定義された。開発されたＡＮＮモデルでは、１０倍クロス確認を実施してＨＣＣ症例及びＣＬＤ症例それぞれについてＡＮＮ診断スコアを算出した。クロス確認解析によって、データによって訓練されたＡＮＮの感受性は９２．５％で、特異性は９０％であることが示された。さらに、ＡＮＮは、ＡＦＰレベルが５００ｎｇ／ｍＬ未満のＡＦＰが認められないＨＣＣ症例全てを正確に分類した。さらに、ＡＦＰレベルが９０３ｎｇ／ｍＬの隠れたＣＬＤ症例、並びにＡＰＦが５００ｎｇ／ｍＬを上回るＨＣＣ症例、ＡＦＰが５００ｎｇ／ｍＬ未満のＨＣＣ症例及びＣＬＤ症例の３種類の隠れたプール血清サンプル全てがＡＮＮによって正確に分類された。同様の結果が、ＷＣＸ２チップで同定されたバイオマーカーで得られた。ＣＬＤ症例からＨＣＣ症例を区別するために、ＡＮＮ診断スコアの異なるカットオフポイントで試験の感受性及び特異性を算出することによって、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作製した。
【００３８】
ＨＣＣ症例の診断スコア（０．８９８５±０．２６８９）は、ＣＬＤ症例（０．１６４７±０．３０９１）よりも有意に高かった（ｐ＜０．０００５、マン−ホイットニー検定）。ＲＯＣ曲線解析によって、ＡＮＮ診断スコアは、血清ＡＦＰレベルに関係なくＨＣＣ症例とＣＬＤ症例との区別に有用であることが示された。ＲＯＣ曲線下の領域はいずれの症例でも０．９３４（９５％ＣＩ：０．８７１〜０．９９６、ｐ＜０．０００５）であり、一方診断できない血清ＡＦＰレベル（５００ｎｇ／ｍＬ未満）の症例の領域は０．９６６（９５％ＣＩ：０．９１７〜１．０１５、ｐ＜０．０００５）であった。ＡＮＮ診断スコアのカットオフ０．５０００では、感受性は９３％（ＨＣＣ４０症例のうち３７症例、ＳＥ４％）で、特異性は９０％（２０対照例のうち１８症例、ＳＥ７％）であった。診断できないＡＦＰレベルのＨＣＣ症例では、ＨＣＣ症例の９５％（２２症例のうち２１症例、ＳＥ５％）が正確に分類された。あるいは、分類系統樹解析を使用して最大の予測値を有するバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせを同定した。この方法では、潜在的バイオマーカーのサンプルデータにＳ−ｐｌｕｓ（バージョン４．５）（MathSoft, Inc.（Cambridge、MA）から販売されている統計ソフトウェアパッケージ）を使用した標準的分類系統樹作成を行った。
【００３９】
プロテオミクス特性の予測値の解析に加えて、ＳＡＭによって同定されたプロテオミクス特性に関係した他の情報が二方向階層クラスタ解析によって得られた。解析の前に、有意なプロテオミクス特性それぞれの強度中央値を１に等しくなるように正規化して、次に正規化した強度データ全てから１を減じた。このようなデータ処理の後、強度データが強度中央値よりも大きければ陽性で、小さければ陰性とした。Eisen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:14863-8 (1998)に記載されたように、有意なプロテオミクス特性及び血清サンプルの処理データについて、クラスタ及びツリー表示を使用して二方向階層クラスタ解析を行った。ピアソン相関（非中心（uncentered））を使用して距離を算出し、完全結合クラスタリングを実施した。
【００４０】
ＡＦＰが５００ｎｇ／ｍＬ未満の一般的なＣＬＤ症例のほとんど（２０症例中１９症例）及び血清ＡＦＰが高い１症例を一緒のクラスタに入れて特有の群を形成した。ＨＣＣ症例は主に一緒のクラスタに入れた。これらは、１７症例を含む優勢な下位群及びいくつかの小さな下位群を形成した。
【００４１】
ＨＣＣ下位群の血清ＡＦＰレベルが高いかどうかを決定するために、マン−ホイットニー検定を実施して、この下位群の症例と残りのＨＣＣ症例との間の血清ＡＦＰレベルを比較した。優勢なＨＣＣ下位群の血清ＡＦＰレベルは有意に高かった（ｐ＝０．０５）。したがって、この結果は、血清ＡＦＰレベルが分からなくても、ＡＦＰの高いＨＣＣ下位タイプは血清プロテオミクス特性に基づいて同定できることを示している。したがって、包括的な血清プロテオミクスプロファイリングによって、ＨＣＣを異なる下位タイプに分類することができる。
【００４２】
ＩＭＡＣチップで同定された１０８７個の蛋白質クラスタのうち、スチューデントｔ検定解析によってこれらのうち１３７個が統計学的に異なる（ｐ＜０．０００１）ことを同定し、一方、ＡＮＮ解析によって１５１個の蛋白質クラスタを潜在的バイオマーカーとして同定し、ｔ検定解析によって同定されなかったバイオマーカーを同定した。これらの他のバイオマーカーのいくつかは、ＨＣＣ検出に有意な価を有することがその後示された。
【００４３】
本発明によって同定されたバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせを使用して、患者のＨＣＣリスクを評価することができる。特に、バイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせを使用して、高い予測成功率で、少なくとも８５％を上回って、好ましくは少なくとも９０％を上回って、より好ましくは９５％を上回って、ＣＬＤ患者からＨＣＣ患者を区別することができる。
【００４４】
本発明によって同定されたバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせを使用して、被験者の肝細胞癌を評価することができる。特に、バイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせを使用して、高い程度の特異性又は感受性で、すなわち、少なくとも８５％を上回って、好ましくは少なくとも９０％を上回って、より好ましくは９５％を上回って、正常な患者から肝細胞癌患者を区別することができる。
【００４５】
したがって、本発明の一態様では、肝細胞癌の状態を診断するためのバイオマーカーの検出には、被験者のサンプルを、基板（たとえば、その上に吸着剤を有するＳＥＬＤＩプローブ）と、バイオマーカーと吸着剤とが結合する条件下で接触させること、次に吸着剤に結合したバイオマーカーを気相イオン分光法、たとえば質量分析法によって検出することを含む。このために使用することができるその他の検出範例には、光学的方法、電気化学的方法（電解電流計及び電流測定技術）、原子力顕微鏡及び高周波方法、たとえば、多極共鳴分光法が含まれる。光学方法の例には、共焦点及び非共焦点両者の顕微鏡に加えて、蛍光、発光、化学発光、吸光、反射、透過及び複屈折率（たとえば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共振鏡法、格子カプラー導波管法（grating coupler waveguide method）又は干渉法）がある。
【００４６】
一態様では、本発明のマーカーは、気相イオンの検出に気相イオン分光器を使用することが含まれる気相イオン分光法によって検出される。気相イオン分光計は、気相イオンを検出する装置である。気相イオン分光計は、気相イオンを供給するイオン源を備える。気相イオン分光法には、たとえば、質量分析計、イオン移動度スペクトル検出器及び総イオン流測定装置が含まれる。
【００４７】
「質量分析計」とは、気相イオンの質量電荷比に翻訳することができるパラメータを測定する気相イオン分光計である。質量分析計は一般的に、イオン源及び質量分析器（mass analyzer）を備える。質量分析計の例には、飛行時間型、磁場型、四重極フィルター型、イオントラップ型、イオンサイクロトロン共鳴型、静電セクター分析型及びこれらの混合型がある。「質量分析」とは、気相イオンを検出するために質量分析計を使用することを意味する。「レーザー脱離質量分析計」とは、分析物を脱離、揮発、及びイオン化する手段としてレーザーを使用する質量分析計のことである。
【００４８】
「質量分析器（mass analyzer）」とは、気相イオンの質量電荷比に翻訳することができるパラメータの測定手段を含む質量分析計のサブアセンブリのことである。飛行時間質量分析計では、質量分析器にはイオン光学アセンブリ、飛行管及びイオン検出器が含まれる。
【００４９】
「イオン源」とは、気相イオンをもたらす気相イオン分光計のサブアセンブリのことである。一実施形態では、イオン源は脱離／イオン化方法によってイオンを提供する。このような実施形態には一般的に、プローブをイオン化エネルギー源に対して呼び出し可能で、大気圧又は大気圧より低い圧力で気相イオン分光計の検出器と同時通信できる位置に配置するプローブインターフェースが含まれる。
【００５０】
固相から分析物を脱離／イオン化するイオン化エネルギーの形態には、たとえば、（１）レーザーエネルギー、（２）（高速原子衝撃を使用した）高速原子、（３）（プラズマ脱離を使用した）放射性核種のベータ崩壊によって生じた高エネルギー粒子、及び（４）（第２イオン質量分析計を使用した）２次イオンを生じる１次イオン、が含まれる。固相分析物のための好ましいイオン化エネルギー形態は、（レーザー脱離／イオン化を使用した）レーザー、特に、窒素レーザー、Ｎｄ−Ｙａｇレーザー及びその他のパルスレーザー源である。「光束量」とは、呼び出しイメージの単位領域当たりに送達されるレーザーエネルギーのことである。一般的に、サンプルをプローブ表面に置くと、プローブはプローブインターフェースと関わって、プローブ表面はイオン化エネルギーの衝撃を受ける。このエネルギーは分析物分子を表面から気相へ脱離して、イオン化させる。
【００５１】
分析物のイオン化エネルギーのその他の形態には、たとえば、（１）中性の気相をイオン化する電子、（２）中性の気相、固相、又は液相からイオン化を誘導する強力な電場、並びに（３）イオン化粒子又は電場と中性化学物質との組み合わせを適用して、中性の固相、気相及び液相の化学イオン化を誘導するイオン源が含まれる。
【００５２】
本発明において使用するために好ましい質量分析技術は、たとえば、いずれもHutchens及びYipによる米国特許第５，７１９，０６０号及び同第６，２２５，０４７号に記載されたような、エネルギー源に分析物（本明細書では、１以上のバイオマーカー）を提示するプローブの表面が分析物分子の脱離／イオン化で積極的な役割を果たす表面活性化レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）である。本明細書においては、「プローブ」とはプローブインターフェースを関与させることに適合し、イオン化し、質量分析計などの気相イオン分光計へ導入するためのイオン化エネルギーに分析物を提示することに適合した装置のことである。プローブには一般的に、分析物をイオン化エネルギー源に提示するサンプル提示表面を有し、弾力性又は剛性の固相基板が含まれる。
【００５３】
「表面活性化アフィニティ捕捉」又は「ＳＥＡＣ」と呼ばれるＳＥＬＤＩの１種には、化学的選択表面から成るプローブ（「ＳＥＬＤＩプローブ」）の使用が必要である。「化学的選択表面」は、吸着剤（「結合部分」又は「捕捉試薬」とも呼ばれる）、あるいは、たとえば、共有結合又は配位共有結合を形成する反応によって捕捉試薬と結合することができる反応部分が結合した表面である。
【００５４】
本明細書では、「反応部分」という用語は、捕捉試薬と結合することができる化学的部分を意味する。エポキシド及びカルボジイミジゾールは、抗体又は細胞受容体などのポリペプチド捕捉試薬と共有結合する有用な反応部分である。ニトリロ酢酸及びイミノ二酢酸は、キレート剤として作用して、ヒスチジン含有ペプチドと非共有結合で相互作用する金属イオンに結合する有用な反応部分である。「反応表面」は、反応部分が結合する表面である。「吸着剤」又は「捕捉試薬」は、本発明のバイオマーカーと結合することができる任意の物質である。本発明に従ってＳＥＬＤＩで使用するために適切な吸着剤は、前記米国特許第６，２２５，０４７号に記載されている。
【００５５】
吸着剤の１種は、一般的にクロマトグラフィで使用される材料である「クロマトグラフィ用吸着剤」である。クロマトグラフィ用吸着剤には、たとえば、イオン交換材料、金属キレート剤、固定金属キレート、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、色素、単純な生体分子（たとえば、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖及び脂肪酸）、混合型吸着剤（たとえば、疎水性引力／静電気反発吸着剤）が含まれる。「生物特異的吸着剤」は、生体分子、たとえば、ヌクレオチド、核酸分子、アミノ酸、ポリペプチド、多糖、脂質、ステロイド又はこれらの複合体（たとえば、糖蛋白質、リポ蛋白質、糖脂質）を含有する吸着剤の他の分類である。特定の場合には、生物特異的吸着剤は、複数の蛋白質の複合体、生体膜又はウイルスなどの巨大分子構造であってもよい。生物特異的吸着剤の例は、抗体、受容体蛋白質及び核酸である。生物特異的吸着剤は一般的に、クロマトグラフィ用吸着剤よりも標的分析物に対する特異性が高い。
【００５６】
他の種類のＳＥＬＤＩは、表面活性化ニート脱離（ＳＥＮＤ）であり、プローブ表面に化学的に結合するエネルギー吸収分子を含むプローブ（「ＳＥＮＤプローブ」）を使用するものである。「エネルギー吸収分子」（ＥＡＭ）という用語は、レーザー脱離イオン化源からエネルギーを吸収し、その後、接触した分析物分子の脱離及びイオン化に関係できる分子のことである。ＥＡＭの分類には、しばしば「マトリックス」と称されるＭＡＬＤＩで使用される分子が含まれ、桂皮酸誘導体、シナピン酸（ＳＰＡ）、シアノ−ヒドロキシ−桂皮酸（ＣＨＣＡ）及びジヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸及びヒドキシアセトフェノン誘導体が挙げられる。この分類にはまた、米国特許第５，７１９，０６０号及び２００２年１月２５に出願された米国特許出願６０／３５１，９７１号（Kitagawa）で挙げられたようなＳＥＬＤＩに使用されるＥＡＭが含まれる。
【００５７】
表面活性化光感受性結合放出（Surface-Enhanced Photolabile Attachment and Release）（ＳＥＰＡＲ）と呼ばれるＳＥＬＤＩの他の種類には、表面に結合した部分を有するプローブであって、分析物と共有結合でき、その後、光、たとえばレーザー光に曝露してこの部分の感光性結合を切断することによって分析物を放出する表面に結合した部分を有するプローブの使用が含まれる。たとえば、米国特許第５，７１９，０６０号参照。ＳＥＰＡＲ及びその他のＳＥＬＤＩ形態は、本発明に従って、バイオマーカー又はバイオマーカープロファイルの検出に容易に適合させることができる。
【００５８】
本発明に係るバイオマーカーの検出は、ある種の選択条件、たとえば、吸着剤又は洗浄液を使用することによって高めることができる。「洗浄液」という用語は、分析物の吸着表面への吸着に影響を与えるか若しくは変更するため、及び／又は表面から未結合物質を除去するために使用する薬剤、一般的には溶液のことである。洗浄液の溶出特性は、たとえば、ｐＨ、イオン強度、疎水性、カオトロープ作用の程度、界面活性剤強度及び温度に応じて異なる。
【００５９】
本発明の一態様に従って、サンプルは一般的に平らな表面を有し、捕捉試薬（吸着剤）が結合した固相基板を意味する用語「バイオチップ」を用いて分析する。バイオチップの表面は、一般に、それぞれ捕捉試薬が結合した複数のアドレス可能位置を含む。バイオチップは、プローブインターフェースと関与し、それにより、気相イオン分光器、好ましくは質量分析計でプローブとして機能するように適合させることができる。あるいは、本発明のバイオチップを他の基板に載せて、分光計に挿入可能なプローブを形成することができる。
【００６０】
本発明によって、Ciphergen Biosystems（Fremont, CA）、Perkin Elmer（Packard BioScience Company（Meriden CT））、Zyomyx（Hayward, CA）、及びPhylos（Lexington, MA）など商業的供給源からの様々なバイオチップをバイオマーカーの捕捉に利用できる。これらのバイオチップの例としては、米国特許第６，２２５，０４７号、及び同第６，３２９，２０９号（Wagner et al.）、及びＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５１７７３号（Kuimelis and Wagner）及びＷＯ００／５６９３４号（Englert et al）に記載されたものがある。
【００６１】
より詳細には、Ciphergen Biosystems製のバイオチップは、アドレス可能位置にクロマトグラフィ吸着剤又は生物特異的吸着剤が結合したストリップ状のアルミニウム基板上に存在する表面を備えている。このストリップの表面は二酸化シリコンでコーティングされている。Ciphergen ProteinChip（登録商標）アレイの例は、バイオチップ表面に物理的に結合するか又はバイオチップ表面にシランによって共有結合させた、ハイドロゲル状の官能性付与した架橋結合ポリマーを含むバイオチップＨ４、ＳＡＸ−２、ＷＣＸ−２及びＩＭＡＣ−３である。Ｈ４バイオチップは、疎水性結合のためにイソプロピル官能基を有する。ＳＡＸ−２バイオチップは、陰イオン交換用の四級アンモニウム官能基を有する。ＷＣＸ−２バイオチップは、陽イオン交換用のカルボン酸官能基を有する。ＩＭＡＣ−３バイオチップは、キレート化によって遷移金属イオン、たとえば、Ｃｕ＋＋及びＮｉ＋＋を吸着するニトリロ酢酸官能基を有する。これらの固定化金属イオンは、次に、配位共有結合によってバイオマーカーの吸着を可能にする。したがって、使用者によって金属溶液が添加されることによって吸着剤になる反応部分を備えたCiphergenのＩＭＡＣ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイが販売されている。
【００６２】
上述した原則を維持して、存在しうるバイオマーカーを吸着剤に結合させるために十分な時間にわたり吸着剤を備えた基板と血清を含むサンプルと接触させる。本発明の一実施形態では、吸着剤を備えた複数種の基板を生物学的サンプルと接触させる。たとえば、サンプルをＷＣＸ及びＩＭＡＣチップの両方に添加することができる。この技術によって、癌の状態をより確実に評価することが可能となる。インキュベーション後、この基板を洗浄して結合しなかった物質を除去する。任意の適切な洗浄液を使用することができるが、好ましくは水溶液を使用する。
【００６３】
次に、結合バイオマーカーを有する基板にエネルギー吸収分子を添加する。注記したように、エネルギー吸収分子は、レーザーなどのエネルギー源からエネルギーを吸収し、それによって基板からバイオマーカーが脱離するのを支援する。前記のように、エネルギー吸収分子の例には、シナミン酸誘導体、シナピン酸及びジヒドロキシ安息香酸が含まれる。好ましくは、シナピン酸を使用する。
【００６４】
基板に結合したバイオマーカーは、気相イオン分光器、たとえば飛行時間型質量分析計で検出する。バイオマーカーをレーザーなどのイオン化源によってイオン化して、発生したイオンをイオン光学アセンブリで収集し、次に質量分析器で分散させ、通過するイオンを分析する。次に、検出器が検出したイオンの情報を質量電荷比に翻訳する。一般的に、バイオマーカーの検出にはシグナル強度の検出が含まれる。したがって、バイオマーカーの量及び質量を決定することができる。
【００６５】
バイオマーカーの脱離及び検出によって得られるデータは、プログラム可能なデジタルコンピュータを使用して解析することができる。このコンピュータプログラムは、データを解析して、検出したマーカーの数、場合によっては、検出したバイオマーカーそれぞれのシグナル強度及び決定した分子量を示す。データ解析には、バイオマーカーのシグナル強度を決定するステップ及び予め決定した統計学的分布から逸脱したデータを除去するステップを含めることができる。たとえば、観察されたピークは、ある基準に対する各ピークの高さを計算することによって正規化することができる。この基準は、装置によって生じるバックグラウンドノイズ及び目盛でゼロに設定されたエネルギー吸収分子などの化学物質であることができる。
【００６６】
このコンピュータは、得られたデータを表示のための様々な形式に変換することができる。標準スペクトルを表示することができるが、有用な一形式では、スペクトル図からピークの高さ及び質量情報のみを保持し、よりきれいな図を作成して、ほぼ同一の分子量を有するバイオマーカーをより見やすくすることができる。他の有用な形式では、２つのスペクトルを比較し、特有のバイオマーカー及びサンプル間でアップレギュレート又はダウンレギュレートされているバイオマーカーを都合よく強調する。これらの形式のいずれかを使用して、特定のバイオマーカーがサンプル中に存在するかどうかを容易に決定することができる。データを解析するために使用するソフトウェアには、本発明に係るバイオマーカーに対応するシグナルにおいて、このシグナルがピークを示すどうかを判定するために、シグナルの解析にアルゴリズムを適用するコードを含めることができる。このソフトウェアはまた、観察されたバイオマーカーピークに関するデータに対して分類系統樹解析又はＡＮＮ解析を行い、肝細胞癌の状態を示すバイオマーカーピーク又はバイオマーカーピークの組み合わせが存在するかどうかを決定することができる。データの解析は、サンプルの質量分光分析から直接的又は間接的に得られた様々なパラメータを「用いる」ことが可能である。これらのパラメータには、１個又は複数のピークの有無、ピーク又はピーク群の形状、１個又は複数のピークの高さ、１個又は複数のピークの高さの対数、及びピークの高さデータのその他の計算処理が含まれるが、それだけには限定されない。
【００６７】
他の態様では、本発明は肝細胞癌の状態の診断において役立ち、本発明に係るバイオマーカーを検出するために使用するキットを提供する。このキットによって、正常な被験者及び肝細胞癌の被験者のサンプルに示差的に存在するバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせの存在がスクリーニングされる。
【００６８】
一実施形態では、このキットには吸着剤を備えた基板及び洗浄液又は洗浄液調製説明書が含まれ、該吸着剤は本発明に係るバイオマーカーとの結合に適しており、該吸着剤及び洗浄液の組み合わせによって、気相イオン分光器、たとえば、質量分析計を使用したバイオマーカーの検出が可能となる。このキットには、複数種の吸着剤を含めることが可能で、それぞれ異なる基板に存在させうる。
【００６９】
他の実施形態では、本発明のキットには、気相イオン分光器、たとえば質量分析計に挿入することができる、吸着剤を含む第一の基板、及びプローブを形成するために該第一の基板を配置した第二の基板を含めることが可能である。他の実施形態では、本発明のキットには、光学計に挿入することができる単一の基板を含めることができる。
【００７０】
他の実施形態では、このようなキットには、標識又は別の挿入物の形態をした、適切な操作上のパラメータの説明書を含めることができる。たとえば、この説明書は使用者にサンプルの採取方法又はプローブの洗浄方法の情報を提供することができる。さらに他の実施形態では、このキットには、較正用標準物として使用するためのバイオマーカーサンプルを含む一以上の容器を含めることができる。
【００７１】
好ましい実施形態では、被験者の肝細胞癌を診断するためのバイオマーカーの検出には、被験者又は患者から採取したサンプル、好ましくは血清サンプルを、吸着剤を備えた基板と、このバイオマーカーと吸着剤との結合が可能な条件下で接触させるステップと、次に気相イオン分光器、好ましくは表面活性化レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析計によって吸着剤に結合したバイオマーカーを検出するステップを含む。このバイオマーカーは、レーザーなどのイオン化源によってイオン化される。生じたイオンはイオン光学アセンブリによって収集され、イオン検出器に加速される。検出器に衝突したイオンは、電位を生じ、これはデジタル的にアナログシグナルを捕捉する高速時間−アレイ記録装置によってデジタル化される。Ciphergen製のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）システムでは、これを実施するためにアナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）を使用する。ＡＤＣには、規則的な時間間隔で時間依存性ビンに出力する検出器が組み入れられている。この時間間隔は一般的に１〜４ナノ秒の長さである。さらに、最後に分析した飛行時間型スペクトルは一般的に、サンプルに対するイオン化エネルギーの単一パルスからのシグナルではなく、多数のパルスのシグナルの和を表す。これによってノイズを減じ、動的範囲を増大させる。次に、この飛行時間データのデータ処理を行う。Ciphergen製のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェアでは、データ処理には一般的に、ＴＯＦ−Ｍ／Ｚ変換、基準線控除、高周波ノイズフィルタリングが含まれる。したがって、バイオマーカーの量及び質量の両方を決定することができる。バイオマーカーの検出は、ある種の選択条件、たとえば吸着剤又は洗浄液を使用することによって高めることができる。一実施形態では、バイオマーカーを発見するために使用したのと同様又は類似の選択条件を、サンプル中のバイオマーカーの検出方法で使用する。たとえば、Ｃｕ（ＩＩ）ＩＭＡＣ３チップなどの固定金属アフィニティ捕捉チップ及びＷＣＸ２チップなどの弱陽イオン交換チップは、バイオマーカー検出用の吸着剤として好ましい。しかし、バイオマーカーの結合に適した結合特性を有するのであれば、その他の吸着剤も使用することができる。
【００７２】
より詳細には、本明細書で同定したバイオマーカーに関する情報が入手できれば、本発明に係るバイオマーカーの２つ、３つ及びより多くの組み合わせのパターンを認識するために様々な方法を使用することができる。これらの方法は、ピークの存在及びその強度に関する生データを収集し、サンプルについて肝細胞癌と正常では異なる診断を与える。
【００７３】
したがって、本発明の方法は、学習相及び分類相に分けることができる。学習相では、分類しようとする異なる種類のメンバーを含む一連のデータ、たとえば、癌と診断された複数のサンプルから得たデータ及び負の診断がなされた複数のサンプルから得たデータに学習アルゴリズムを適用する。データ解析に使用する方法には、人工ニューラルネットワーク、サポートベクターマシーン、遺伝子アルゴリズム及び自己組織化マップ並びに分類及び回帰系統樹解析が含まれるが、それだけには限定されない。これらの方法は、たとえば、ＷＯ０１／３１５７９号、２００１年５月３日（Barnhill et al.）、ＷＯ０２／０６８２９号、２００２年１月２４日（Hitt et al.）及びＷＯ０２／４２７３３号、２００２年５月３０日（Paulse et al.）に記載されている。この学習アルゴリズムは、分類アルゴリズムを生じる。分類子は、データの要素、たとえば、未知のサンプルを２種類のうち１つに分類することができる特定のマーカー及び特定のマーカー強度を、通常組み合わせて用いる。この分類子は最後に診断試験に使用する。
【００７４】
フリーウェア及び所有権があるソフトウェアの両ソフトウェアを、このようなデータのパターンを解析し、任意の予め決定した基準を有する他のパターンをうまく考案するために容易に利用することができる。ＣＬＤに対して肝細胞癌を区別して診断予測するバイオマーカーは、データを解析するためのパターン認識ソフトウェアは必要ではない。
【００７５】
以下の実施例は、例示のために示されており、限定するものではない。
【実施例１】
【００７６】
患者集団
患者の承諾を得て、診察時にＨＨＣ患者４０人及び慢性肝臓疾患患者２１人から凝血サンプルを採取し、アッセイする前に−７０℃で保存した。ＨＣＣの患者は、標準的臨床基準に従って診断した。ＨＣＣ症例については全て組織学的に確認した。ＨＣＣ症例の中で、１８症例のＡＦＰレベルは５００ｎｇ／ｍＬを上回っており、２２症例の血清ＡＦＰレベルは５００ｎｇ／ｍＬ未満であった。ＣＬＤでＡＦＰが５００ｎｇ／ｍＬ未満の患者２０人の血清サンプルを対照群として使用した。ＣＬＤ患者は全て、無症候性ＨＣＣの被験者を排除するために１８ヶ月間ＨＣＣのあらゆる徴候について追跡した。ＡＦＰレベルが５００ｎｇ／ｍＬを上回る（９０５ｎｇ／ｍＬ）ＣＬＤ患者の１血清サンプルもまた、この研究で分析した。血清サンプルそれぞれを分析する他に、ＡＦＰが５００ｎｇ／ｍＬを上回るＨＣＣ患者の血清サンプルを、サンプルＨＣＣＰ１、ＡＦＰが５００ｎｇ／ｍＬ未満のＨＣＣ患者の血清サンプルをサンプルＨＣＣＰ２として採取し、対照群からの血清サンプルはサンプルＣＬＤＰ１としてプールした。血清ＡＦＰレベルは、微粒子ＥＩＡ（MEIA、Abbott Laboratories, Chicago, USA）によって測定した。
【実施例２】
【００７７】
血清の分画
バッファー
１．Ｕ９（９Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９）
２．Ｕ１（１Ｍ尿素、０．２２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９）
３．洗浄バッファー１：０．１％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９
４．洗浄バッファー２：０．１％ＯＧＰを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ７
５．洗浄バッファー３：０．１％ＯＧＰを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム  ｐＨ５
６．洗浄バッファー４：０．１％ＯＧＰを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム  ｐＨ４
７．洗浄バッファー５：０．１％ＯＧＰを含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ３
８．洗浄バッファー６：水に溶かした３３．３％イソプロパノール／１６．７％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸
【００７８】
陰イオン交換分画は、２Ｄ ＰＡＧＥ技術における１次元分離、２次元分離、等電点電気泳動の類似とみなすことができる。いずれの技術も蛋白質をｐＩ値に基づいて分離する。Ｕ９バッファー３０マイクロリットルを試験管内で血清２０μＬに添加し、４℃で２０分間混合した。イオン交換樹脂（Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤＦイオン交換樹脂、Biosepra SA、フランス）を総体積の５倍の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９で３回洗浄して、５０％懸濁液で保存した。Ｂｉｏｍｅｋ ２０００ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Beckman Coulter, Fullerton, CA）上で、９６ウェルフィルタープレート（９６ウェルサイレントスクリーンフィルタープレート、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ膜、孔径０．４５ミクロン、Nalge Nunc International、USA）の各ウェルに、イオン交換樹脂（５０％懸濁液）１２５μＬを添加し、Ｕ１バッファー１５０μＬで３回洗浄して、真空乾燥した。尿素処理した血清をイオン交換樹脂の各ウェルに移した。この血清試験管をＵ１バッファー５０μＬで洗浄して、またフィルタープレートの対応するウェルに移した。フィルタープレートをプラットフォーム振盪機上で４℃で３０分間混合した。素通り画分を真空吸引によって９６ウェルプレートに収集した（画分１）。次に、１００μＬの洗浄バッファー１をフィルタープレートの各ウェルに添加して、室温で１０分間混合した。溶出液を同９６ウェルプレートに収集した（画分１）。その後、フィルタープレートの樹脂を各１００μＬの洗浄バッファー２、３、４、５及び６で２回洗浄した。各溶出液（全量２００μＬ）を９６ウェルプレートに収集した（画分２、３、４、５及び６）。
【実施例３】
【００７９】
分画した血清のＳＥＬＤＩ分析
ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイを９６ウェルバイオプロセッサに設置した。バッファーを入れ、Ｂｉｏｍｅｋ ２０００ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ上でサンプルのインキュベーションを実施した。血清画分それぞれを（銅を添加した）ＩＭＡＣ３及びＷＣＸ２ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイで２連で分析した。異なるＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ表面（２次元）は、非常に存在量の少ない蛋白質の同定に役立った。ＩＭＡＣ３銅及びＷＣＸ２ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ表面は、物理化学的性質によって、異なる群の蛋白質を示差的に保持する。
【００８０】
ＩＭＡＣ３銅及びＷＣＸ２アレイ（Ciphergen Biosystems Inc.、Fremont、CA）は、結合バッファー（ＩＭＡＣ３の場合は１００ｍＭリン酸ナトリウム＋０．５Ｍ ＮａＣｌ  ｐＨ７、ＷＣＸ２の場合は１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４）１５０μＬで２回平衡化した。血清画分をそれぞれ対応する結合バッファー（ＩＭＡＣ３については１／５希釈で、ＷＣＸ２については１／１０希釈）で希釈し、各ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイに１００μＬ添加した。インキュベーションはプラットフォーム振盪機上で室温で３０分間実施した。各アレイを対応する結合バッファー１５０μＬで３回洗浄し、水で２回洗浄した。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイを空気乾燥した。（５０％アセトニトリル、０．５％トリフルオロ酢酸で調製した）シナピン酸マトリックスを各アレイに添加した。
【００８１】
ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイはＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）ＰＢＳＩＩリーダー（Ciphergen Biosystems Inc.）で読み取って、蛋白質ピークの質量及び強度を測定した（Ciphergen）。それぞれのアレイについて、全部で２５３のレーザーショットを平均化した。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ ＰＢＳＩＩリーダーによる質量分光分析（３次元）は、２Ｄ ＰＡＧＥ技術の２次元分離、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに代わる高解像分析と見なすことができる。両技術は、蛋白質を分子量に基づいて分離する。０から２００ｋＤａの範囲の質量を有する各アレイについて２３５のレーザーショットを平均化した。質量スペクトル全てを同じ総イオン電流を有するように正規化した。ピーク強度のＣＶは、１５％未満であった（製造元の情報）。通常の蛋白質ピークは、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐソフトウェア（Ciphergen）のＢｉｏｍａｒｋｅｒ Ｗｉｚａｒｄ（商標）によって選択した。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ＩＭＡＣ３Ｃｕ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ(登録商標)アレイ形式を用いて同定され、スチューデントのｔ検定におけるｐ値に従ってランク付けした上位１００個のバイオマーカーのリストである。
【図２】ＷＣＸ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ(登録商標)アレイ形式を用いて同定され、スチューデントのｔ検定におけるｐ値に従ってランク付けした上位１００個のバイオマーカーのリストである。
【図１】
2005522677.tif 000003
【図２】
2005522677.tif 000004
【国際調査報告】
2005522677.tif 000005