(57)【要約】  下記一般式で示される多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体を有効成分とするウィルス阻害剤（上記式（Ｉ）中、Ｗ１及びＷ２はそれぞれ水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基を表し、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基を表し、Ｙは、一般式（Ｙ−１）又は（Ｙ−２）で表される２価の連結基を表し、ｍは０又は１の整数を表し、ｎは２〜４の整数を表し、Ｚは単結合又は二価〜四価の連結基を表す。ただし、Ｗ１とＷ２が共にＮ−アセチルノイラミン酸残基になることはない。式（Ｙ−１）及び（Ｙ−２）中、Ｌ１は炭化水素基、アミド結合を含む炭化水素基及びエーテル基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表し、Ｌ２はオキシアルキレン基、アミド基及びアルキレン基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表す。2011108471.tif 000024
2011108471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示される多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体を有効成分とするウィルス阻害剤。
【化１】
2011108471.tif 000021
（式（Ｉ）中、Ｗ１及びＷ２はそれぞれ水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基を表し、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基を表し、Ｙは、下記一般式（Ｙ−１）又は（Ｙ−２）で表される２価の連結基を表し、ｍは０又は１を表し、ｎは２〜４の整数を表し、Ｚは単結合又は四価〜二価の連結基を表す。ただし、Ｗ１及びＷ２が共にＮ−アセチルノイラミン酸残基になることはない。）
【化２】
2011108471.tif 000022
（式（Ｙ−１）及び（Ｙ−２）中、Ｌ１は、炭化水素基、アミド結合を含む炭化水素基及びエーテル基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表し、Ｌ２はオキシアルキレン基、アミド基及びアルキレン基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表す。）
【請求項２】
前記Ｌ１中の炭化水素基が炭素数１〜３０の炭化水素基である請求項１記載のウィルス阻害剤。
【請求項３】
前記Ｌ１が、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基又はこれらを２つ以上アミド結合で連結させたものである請求項１又は請求項２記載のウィルス阻害剤。
【請求項４】
前記Ｚは、下記（Ｚ−１）〜（Ｚ−３）のいずれか１つである請求項１〜請求項３のいずれか１項記載のウィルス阻害剤。
【化３】
2011108471.tif 000023
（式（Ｚ−３）中、ｐは１〜２０の整数を表す。）
【請求項５】
前記Ｗ１及びＷ２がいずれも水酸基を表すアシアロ糖鎖配糖体である請求項１〜請求項４のいずれか１項記載のウィルス阻害剤。
【請求項６】
前記ウィルス阻害剤がインフルエンザウィルス阻害剤である請求項１〜請求項５のいずれか１項記載のウィルス阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか１項記載のウィルス阻害剤を担体上に固定化させたウィルス吸着担体。
【請求項８】
請求項１〜請求項５のいずれか１項記載のウィルス阻害剤を患者へ投与することを含むウィルス疾患の治療又は予防方法。
【請求項９】
前記ウィルス疾患がインフルエンザウィルス疾患である請求項８記載のウィルス疾患の治療又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィルス阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、有効な治療法や感染防御方が見出されていない病原体のひとつであり、極めて感染力が強く、抗原変異を繰り返し、それまでの抗原性とは異なる新種が出現するため、ワクチンなどによる効果的な防御対策が立てにくいことで知られている。最近では、トリインフルエンザウィルスを起源とした新たなヒトインフルエンザウィルスの発生が危惧されており、インフルエンザ予防・治療薬の開発が期待されている。【０００３】
インフルエンザウィルスの宿主への感染は、ウィルス表面タンパク質であるヘマグルチニン（血赤球凝集素：ＨＡ）が細胞表面のシアル酸含有複合糖鎖を受容体として認識して結合することによって起こると考えられている。例えば、トリ類から単離したインフルエンザウィルスＡ型は、末端にＮ−アセチルノイラミン酸α２，３ガラクトース（ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ）を有する糖鎖に優先的に結合し、このウィルスと非常に類似したヒトインフルエンザウィルスは、末端のＮｅｕＡｃ（α２，６）Ｇａｌ構造に高い結合親和性を示すことが報告されている。【０００４】
特に、シアル酸含有糖鎖（シアロ糖鎖）化合物が、ウィルス受容体への結合を阻害する感染阻害剤として期待されている。例えば、特開平１０−３１０６１０号公報には、ポリスチレン誘導体にシアリルラクトースを結合させた高分子体が、インフルエンザウィルスと強い結合を有することが記載されている。また、特開２００３−７３３９７号公報には、広範囲なインフルエンザウィルス分離株に対して感染阻害活性を有する化合物として、α−ポリグルタミン酸を骨格とし、その側鎖に、ｐ−アミノフェニル基をリンカーとしてＮ−アセチルラクトサミンを導入し、さらにオリゴ糖酸の非還元末端にシアル酸を付与した分子量２０００〜１００万のシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドを開示している。【０００５】
また、特開２００８−３１１５６号公報には、高い吸着阻害活性及び感染阻害活性を有し、かつ安価に製造されるウィルス吸着剤として、シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドのシアル糖鎖部を改変したシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工ポリペプチドや、γポリグルタミン酸を骨格とし、リンカーを変更したシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドを開示している。これらのＮ−アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドは分子量２００〜５００万と記載されている。【０００６】
国際公開第２００９／００１８０５号パンフレットには、γ−ポリグルタミン酸に、末端にアミノ基とカルボキシル基を有する化合物をリンカーとしてシアロ糖鎖を結合させたＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーが開示されている。このＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーは、合成収率も高く実用的な方法で合成でき、インフルエンザウィルスの感染阻害活性も向上されたものと記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これらの文献に開示されているいずれの化合物も、ウィルス吸着結合能としては充分でなく、また合成が容易であるとする特開２００８−３１１５６号公報及び国際公開第２００９／００１８０５号パンフレットにそれぞれ開示された人工糖鎖ポリペプチドは、いずれもポリマー型であり、分子量が大きいため取扱いが困難な場合がある。【０００８】
従って、本発明の目的は、高いウィルス阻害能を有する低分子量のウィルス阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の各態様によれば、以下のウィルス阻害剤、ウィルス吸着担体及びインフルエンザの治療又は予防方法が提供される。
［１］  下記一般式（Ｉ）で示される多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体を有効成分とするウィルス阻害剤。【００１０】
【化１】
2011108471.tif 000003
【００１１】
上記式（Ｉ）中、Ｗ１及びＷ２はそれぞれ水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基を表し、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基を表し、Ｙは、下記一般式（Ｙ−１）又は（Ｙ−２）で表される二価の連結基を表し、ｍは０又は１の整数を表し、ｎは２〜４の整数を表し、Ｚは単結合又は四価〜二価の連結基を表す。ただし、Ｗ１及びＷ２が共にＮ−アセチルノイラミン酸残基になることはない。式（Ｙ−１）及び（Ｙ−２）中、Ｌ１は炭化水素基、アミド結合を含む炭化水素基及びエーテル基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表し、Ｌ２はオキシアルキレン基、アミド基及びアルキレン基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表す。【００１２】
［２］  前記Ｌ１中の炭化水素基が炭素数１〜３０の炭化水素基である［１］記載のウィルス阻害剤。
［３］  前記Ｌ１が、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基又はこれらを２つ以上アミド結合で連結させたものである［１］又は［２］に記載のウィルス阻害剤。
［４］  前記Ｚは、下記（Ｚ−１）〜（Ｚ−３）のいずれか１つである［１］〜［３］のいずれかに記載のウィルス阻害剤。下記式（Ｚ−３）中、ｐは１〜２０の整数を表す。【００１３】
【化２】
2011108471.tif 000004
【００１４】
［５］  前記Ｗ１及びＷ２がいずれも水酸基を表すアシアロ糖鎖配糖体である［１］〜［４］のいずれかに記載のウィルス阻害剤。
［６］    前記ウィルス阻害剤がインフルエンザウィルス阻害剤である［１］〜［５］のいずれかに記載のウィルス阻害剤。
［７］  ［１］〜［６］のいずれかに記載のウィルス阻害剤を担体上に固定化させたウィルス吸着担体。
［８］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のウィルス阻害剤を患者へ投与することを含むウィルス疾患の治療又は予防方法。
［９］  前記ウィルス疾患がインフルエンザウィルス疾患である［８］に記載のウィルス疾患の治療又は予防方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例にかかるＯ結合型多価配糖体化合物のウィルス感染阻害評価の結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例にかかるＮ結合型多価配糖体化合物のウィルス感染阻害評価の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のウィルス阻害剤は、下記一般式（Ｉ）で示される多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体を有効成分とするウィルス阻害剤である。
【００１７】
【化３】
2011108471.tif 000005
【００１８】
上記式（Ｉ）中、Ｗ１及びＷ２はそれぞれ水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基を表し、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基を表し、Ｙは、下記一般式（Ｙ−１）又は（Ｙ−２）で表される二価の連結基を表し、ｍは０又は１を表し、ｎは２〜４の整数を表し、Ｚは単結合又は四価〜二価の連結基を表す。ただし、Ｗ１及びＷ２が共にＮ−アセチルノイラミン酸残基になることはない。式（Ｙ−１）又は（Ｙ−２）中、Ｌ１は、炭化水素基、アミド結合を含む炭化水素基及びエーテル基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表し、Ｌ２はオキシアルキレン基、アミド基及びアルキレン基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表す。
【００１９】
本発明のウィルス阻害剤にかかる上記一般式（Ｉ）で表される多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体は、糖単位を有する複数の糖鎖部が非糖鎖部で連結された低分子且つ多価の配糖体であり、高いウィルス吸着能を有することができる。特に、本発明にかかる多価配糖体は、シアロ糖鎖配糖体だけでなく、アシアロ配糖体であっても、高いウィルス吸着能を備えている。
従って本発明によれば、高いウィルス吸着能を有する低分子量のウィルス阻害剤を提供することができる。
以下、本発明について説明する。
なお、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
【００２０】
式（Ｉ）中、Ｗ１及びＷ２は、本発明にかかる配糖体の末端の糖鎖部に位置しており、水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基を表すが、共にＮ−アセチルノイラミン酸残基となることはない。ここで、Ｗ１又はＷ２としてＮ−アセチルノイラミン酸残基を有する場合、シアロ糖鎖部となって、式（Ｉ）の化合物はシアロ糖鎖配糖体を構成する。具体的に、Ｗ１がＮ−アセチルノイラミン酸残基でＷ２が水酸基であるα２，６型とすれば、ヒト感染型のインフルエンザウィルスに対する感染阻害のためのウィルス阻害剤となり、Ｗ１が水酸基でＷ２がＮ−アセチルノイラミン酸残基であるα２，３型とすれば、トリ感染型のインフルエンザウィルスに対する感染阻害のためのウィルス阻害剤とすることができる。なお、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基は、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基、アシル基等で化学的に修飾されていてもかまわない。
一方、Ｗ１及びＷ２が共に水酸基の場合、アシアロ糖鎖部となって、式（Ｉ）の化合物はアシアロ糖鎖配糖体を構成する。
糖鎖部としては、合成し易さの点で一工程少ないアシアロ糖鎖であることが有利である。
【００２１】
前記化合物が、式（Ｉ）におけるＹで示される二価の連結基のうち、上記式（Ｙ−１）を連結基として有する場合は、所謂、Ｎ結合型多価配糖体を示す。連結基としてのＮ型は、合成し易さ及び収率の点で有利である。式（Ｙ−１）中、Ｌ１は、炭化水素基、アミド結合を含む炭化水素基及びエーテル基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表す。Ｌ１の連結基における炭化水素基としては、炭素数１〜３０のものが合成上の溶解度およびウィルス捕捉の観点から好ましく、飽和炭化水素基及び不飽和炭化水素基のいずれであってもよい。具体的にはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基が挙げられる。アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基としては、好ましくは、炭素数１〜２０の直鎖又は分岐鎖のものが挙げられる。
【００２２】
アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基等の直鎖アルキル基；イソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、２−エチルヘキシル基等の分岐鎖アルキル基が挙げられる。アミド結合を有する炭化水素基としては、これらの炭化水素基が２つ以上をアミド結合で連結したものを挙げることができる。
【００２３】
アルケニル基の具体例としてはビニル基、プロペニル基、アリル基等が挙げられる。アルキニル基の具体例としては、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基などが挙げられる。シクロアルキル基としては、炭素数３〜１０のものが挙げられ、特に炭素数３〜８のもの、例えばシクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が好ましい。
【００２４】
アリール基としては炭素数６〜１４のもの、例えばフェニル基、トリル基、ナフチル基等が挙げられる。アラルキル基としては、炭素数７〜１４のアラルキル基、具体的にはベンジル基、フェネチル基などが挙げられる。シクロアルキル置換アルキル基としてはＣ３−Ｃ８シクロアルキル置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、例えばシクロプロピルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロプロピルエチル基、シクロペンチルエチル基、シクロヘキシルエチル基、シクロプロピルプロピル基、シクロペンチルプロピル基、シクロヘキシルプロピル基等が挙げられる。
【００２５】
また、当該炭化水素は置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、ヒドロキシル基、アジド基、シアノ基、アルコキシ基、シクロアルキルオキシ基、アリールオキシ基、エステル化されていてもよいカルボキシル基等が挙げられる。
【００２６】
前記化合物が、式（Ｉ）におけるＹで示される二価の連結基のうち、上記式（Ｙ−２）を連結基として有する場合は、所謂、Ｏ結合型多価配糖体を示す。式（Ｙ−２）中、Ｌ２は、オキシアルキレン基、アミド基及びアルキレン基からなる群より選択された少なくとも１つを表す。
オキシアルキレン基としては、炭素数２又は３のオキシアルキレン基を挙げることができる。アルキレン基としては、炭素数１〜６のアルキレン基を挙げることができ、溶解度の観点から炭素数３〜６程度のアルキレン基であることが好ましい。
【００２７】
式（Ｉ）中、ｍは、合成上の観点から０又は１を表すものである。
また、ｎは、ウィルス捕捉の観点から２〜４の整数を表すものである。
【００２８】
式（Ｉ）中、Ｚは、単結合又は４価〜２価の連結基を表し、上記ｎの数に応じて選択される。即ち、Ｚが単結合を表す場合、ｎは２となって、当該シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体は二価の配糖体となる。一方、Ｚが３価以上の連結基を表す場合、ｎは３以上となって、当該シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体は分岐して、分岐型多価配糖体となる。
Ｚとしては、多価配糖体の価数に相当する単結合又は分岐型配糖体を生成する多価の連結基であれば特に制限はなく、Ｙで示される二価の連結基の末端との反応性に応じて、当業者であれば適宜選択可能である。
Ｚとして表される連結基の具体例としては、以下の連結基（Ｚ−１）〜（Ｚ−３）を挙げることができ、溶解度の観点から連結基（Ｚ−１）であることが好ましい。なお、連結基（Ｚ−３）におけるｐは、１〜２０の整数を表し、合成上の観点から４、１０又は１６であることが好ましい。
【００２９】
【化４】
2011108471.tif 000006
【００３０】
このような多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体としては、例えば、以下のものをあげることができる。なかでも、多価アシアロ糖鎖配糖体であることがウィルス捕捉の観点から好ましい。
【００３１】
【化５】
2011108471.tif 000007
【００３２】
【化６】
2011108471.tif 000008
【００３３】
【化７】
2011108471.tif 000009
【００３４】
【化８】
2011108471.tif 000010
【００３５】
【化９】
2011108471.tif 000011
【００３６】
【化１０】
2011108471.tif 000012
【００３７】
【化１１】
2011108471.tif 000013
【００３８】
【化１２】
2011108471.tif 000014
【化１３】
2011108471.tif 000015
【００３９】
【化１４】
2011108471.tif 000016
【００４０】
【化１５】
2011108471.tif 000017
【００４１】
本発明にかかる多価シアル糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体は、公知の方法を適用して製造することができる。製造方法については特に制限はなく、アシアロ糖鎖の合成工程及びアシアロ糖鎖と多価リンカー化合物との縮合工程により、多価アシアロ糖鎖配糖体を得ることができ、多価糖鎖配糖体のシアル化工程を更に加えることにより、多価シアロ糖鎖配糖体を得ることができる。
また、例えば、糖供与体を合成する工程及び、糖転移酵素を用いて糖供与体を糖受容体へ転移させる工程を含むＯ結合型配糖体の合成方法；縮合剤を用いて、多価カルボキシル基を有する有機酸にアミノ糖を結合させる工程を含むＮ結合型配糖体の合成方法なども利用することができる。これらの方法については、J. Biochem., 2008, Vol.143, 22、Carbohydr. Res., 2008, Vol.343, p434、特開２００８−３１１５６号公報、ＷＯ２００７／０２６６６９号、ＷＯ２００９／００１８０５号などに記載されている。
【００４２】
対象となるウィルスとしては、インフルエンザウィルスが好適なウィルスであり、具体的には、高病原性Ａ型トリインフルエンザウィルス、ヒトＡ型インフルエンザウィルスおよびヒトＢ型インフルエンザウィルス等が挙げられる。従って、前記シアロ糖又はアシアロ糖鎖配糖体を含むウィルス阻害剤は、インフルエンザ治療剤として好適に用いられる。
【００４３】
また、有効成分として用いるシアロ糖又はアシアロ糖鎖配糖体のキレート機能により阻害又は吸着され得るウィルスは、インフルエンザウィルスに限らず、インフルエンザウィルス以外の様々なウィルスにも適用可能である。そのようなウィルスとしては、例えば、パラミクソウィルス群、パラインフルエンザウィルス群、ロタウィルス、アデノウィルス、コロナウィルス、ポリオーマウィルス等が例示される。
【００４４】
本発明のウィルス阻害剤を医薬製剤として利用する場合、特にその剤型に制限されるものではないが、点鼻用の液剤及びゲル剤、口腔スプレーなどのエアロゾルなどの鼻腔や咽頭に直接適用する点鼻適用製剤、あるいは軟膏剤、乳剤及びクリーム剤などの経皮吸収用製剤が好ましい剤型として例示され、それらは常法により調製することができる。また、医薬製剤とする場合には、前記ウィルス阻害剤と、基剤成分として医薬として許容可能な担体とを含むものとすることができる。
【００４５】
たとえば、点鼻適用製剤としては、液剤、ゲル剤、懸濁剤、エアゾール剤等の剤形として用いることが好ましい。上記剤形を製造するための基剤成分について説明すると、液剤、ゲル剤、懸濁剤及びエアゾール剤を製造する場合の基剤成分としては、オクチルドデカノール等の高級アルコール；ミリスチン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル及びパルミチン酸イソプロピル等の脂肪酸エステル；ポリソルベート８０及びポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の懸濁化剤；カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びヒアルロン酸ナトリウム等の高分子化合物；グリセリン、プロピレングリコール及び１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール；ジイソプロパノールアミン、水酸化ナトリウム、リン酸二水素カリウム及びリン酸水素ナトリウム等のｐＨ調節剤；リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム及びエデト酸ナトリウム等の安定化剤；メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウム等の防腐剤等が挙げられる。
【００４６】
液剤、ゲル剤、懸濁剤及びエアゾール剤などの医薬製剤を製造する場合、本発明の有効成分である多価アシアロ糖鎖又はシアロ糖鎖配糖体及び水等の媒体を混合して製造することができる。前記医薬製剤における各成分の配合割合に特に制限はなく、たとえば、水（媒体）５０〜９９質量％、高級アルコール０〜２５質量％、脂肪酸エステル０〜２０質量％、懸濁化剤０〜５質量％、高分子化合物０〜１０質量％、多価アルコール０〜３０質量％、ｐＨ調節剤０〜１０質量％、安定化剤０〜１０質量％及び防腐剤０〜５質量％とすることができる。
【００４７】
軟膏剤、乳剤及びクリーム剤を製造する場合の基剤成分の例としては、白色ワセリン、流動パラフィン、パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、スクワラン及びプラスチベース等の炭化水素；セタノール、ステアリルアルコール及びベヘニルアルコール等の高級アルコール；イソステアリン酸及びオレイン酸等の高級脂肪酸；中鎖脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル及びパルミチン酸イソプロピル等の脂肪酸エステル；ポリソルベート８０及びポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤；カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びヒアルロン酸ナトリウム等の高分子化合物；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール；ジイソプロパノールアミン、水酸化ナトリウム、リン酸二水素カリウム及びリン酸水素ナトリウム等のｐＨ調節剤；リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム及びエデト酸ナトリウム等の安定化剤；メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウム等の防腐剤等が挙げられる。
【００４８】
軟膏剤、乳剤及びクリーム剤を製造する場合、本発明の有効成分である多価配糖体及び水等の媒体を混合して製造することができる。前記医薬製剤における各成分の配合割合に特に制限はなく、たとえば水（媒体）０〜８０質量％、炭化水素０〜９０質量％、高級アルコール０〜２５質量％、高級脂肪酸０〜２５質量％、脂肪酸エステル０〜２０質量％、界面活性剤０．０１〜１０質量％、高分子化合物０〜１０質量％、多価アルコール０〜３０重量％、ｐＨ調節剤０〜１０質量％、安定化剤０〜１０質量％及び防腐剤０〜５質量％である。
【００４９】
また、本発明のウィルス阻害剤をウィルスの拡散防止や感染予防のために、適当な担体に固定化することもでき、得られたウィルス吸着担体も本発明に包含される。本ウィルス阻害剤をフィルターやマスクへ充填して利用する場合、たとえば、本発明のウィルス阻害剤をシートに担持させることにより実施することができる。
【００５０】
用いられるシートの例としては、合成繊維または天然繊維からなる不織布または織布を挙げることができ、材質としては、例えば、ポリエステル、ポリアミド、ポリアクリル、ポリプロピレン、レーヨン、木綿、木材パルプ等が挙げられる。特にメルトブローン不織布は、繊維径を細くでき、ポアサイズを小さくできることから、マスクや空気清浄機用並びにエアコン用フィルターとして好ましい。また、シートに有効成分である多価配糖体を担持させる方法は任意であるが、たとえば接着剤を用いて担持させる方法を採用することができる。
【００５１】
本発明は、前記ウィルス阻害剤を患者へ投与することを含むウィルス疾患の治療又は予防方法も包含する。
前記ウィルス阻害剤は、高いウィルス吸着能を有しているので、ウィルスと接触してウィルスを捕捉し、生体に対してウィルスが作用することによって生じる症状の発生を阻害することができる。
【００５２】
前記ウィルス疾患としては、前述と同様であり、高病原性Ａ型トリインフルエンザウィルス、ヒトＡ型インフルエンザウィルス及びヒトＢ型インフルエンザウィルス等のインフルエンザウィルスによるインフルエンザ；パラミクソウィルス群、パラインフルエンザウィルス群、ロタウィルス、アデノウィルス、コロナウィルス、ポリオーマウィルス等のウィルスによるウィルス疾患等を挙げることができる。特に、インフルエンザウィルス疾患の治療又は予防方法であることが好ましい。
【００５３】
本発明において「治療」とは、本発明にかかる組成物の投与前後においてウィルス疾患に特有の症状が軽減又は、重篤化が抑制されることを意味し、また、本発明において「予防」とは、本発明にかかる組成物の投与後においてウィルス疾患に特有の症状の顕著な発生が抑制されることを意味する。ただし、本発明においては、用語「治療」と「予防」とを明確に区別することなく使用してもよい。
【００５４】
ウィルス阻害剤の投与量は、症状、年令、剤型等によって適宜選択できるが、例えば注射剤として、例えば有効成分として１回０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜８０ｍｇの量で１日１回又は数回投与してもよい。なお、必要により当該範囲外の量を用いてもよい。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」は質量基準である。【００５６】
なお、使用材料の略語は以下のとおりである。
A.orientalis：Amycolatopsis orientalis
APase：Alkaline phosphatase
BSA：Bovine serum albumin
Bt：Butane-1,4-diyl
CMP：Cytidine monophosphate
DEG：Diethylene glycol
DIEA：N-Ethyldiisopripylamine
DMSO：Dimethyl sulfoxide
EDC：1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimide HCl
EGTA：Ethylene glycol tetraacetic acid
ESI-MS：Electrospray ionization mass spectrometry
EtOH：Ethanol
FAB-mass：Fast atom bombardment mass spectrometry【００５７】
Gal：D-Galactose
GalT：Galactosyltransferase
Glc：D-Glucose
GlcNAc：N-Acetylglucosamine
(GlcNAc)2：N, N’-diacetylchitobiose (GlcNAcβ1-4GlcNAc)
(GlcNAc)3：N, N',N''-triacetylchitotriose (GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc)
(GlcNAc)4：N,N',N'',N'''-tetraacetylchitotetraose
(GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc)
GlcNAcβ-pNP：p-Nitrophenyl β-N-acetylglucosaminide
GlcNAc-Pr-GlcNAc：Propan1,3-diyl-β-N-acetylglucosaminide
GlcNAc-Bt-GlcNAc：Butan1,4-diyl-β-N-acetylglucosaminide
GlcNAc-Pt-GlcNAc：Pentan-1,5-diyl-β-N-acetylglucosaminide
GlcNAcβ-Hx：6-Hydroxyhexyl β-N-acetylglucosaminide
GlcNAc-Hx-GlcNAc：Hexan-1,6-diyl-β-N-acetylglucosaminide
GlcNAc-Hp-GlcNAc：Heptan-1,7-diyl-β-N-acetylglucosaminide【００５８】
GnT：N-Acetylglucosaminyltransferase
HBTU：O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N',-tetramethyluronium hexafluorophosphate
HEPES：2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic Acid
Hp：Heptane-1,7-diyl
HPLC：High performance liquid chromatography
Hx：Hexane-1,6-diyl
IC50：Half maximal (50%) inhibitory concentration
ITC：Isothermal titration calorimeter【００５９】
Lac：Lactose (Galβ1,4Glc)
LacNAc：N-Acetyllactosamine (Galbeβ1,4GlcNAc)
LacNAc-Bt-LacNAc：Butan1,4-diyl-β-N-acetyllactosaminide
LacNAc-Hx-LacNAc：Hexan-1,6-diyl-β-N-acetyllactosaminide
MeOH：Methanol
MOPS：3-Morpholinopropanesulfonic acid【００６０】
Na-Ac buffer：Sodium acetate buffer
NAHase：β-N-Acetyl-D-hexosaminnidase
Na-Pi buffer：Sodium phosphate buffer
Neu5Ac：N-Acetylneuraminic acid
Neu5Acα2,6LacNAc-Bt-LacNAcα2,6Neu5Ac：
1,4-dioxybutyl-bis-β-(Neu5Acα2,6-N-acetyllactosaminide)
Neu5Acα2,6LacNAc-Hx-LacNAcα2,6Neu5Ac：
1,6-dioxyhexyl-bis-β-(Neu5Acα2,6-N-acetyllactosaminide)【００６１】
NMR：Nuclear magnetic resonance
PBS：Phosphate-buffered saline, 10 mM, pH 7.4
pNP：p-Nitrophenyl
Pr：Propane-1,3-diyl
Pt：Pentane-1,5-diyl
PTC：Aminopentanecarboxyamido
RU：Resonance unit
SiaT：Sialyltransferase
SNA：Sambusus nigra agglutinin (elderberry)
SPR：Surface plasmon resonance
SSA：Sambucus sieboldiana agglutinin (Japanese elderberry)
TFA：Trifluoroacetic acid
TLC：Thin layer chromatography
T. reesei：Trichoderma reesei
Tris-HCl：Bis(2-hydroxylethy)iminotris-(hydroxymethyl)methane-hydrochloric acid
UDP：Uridine 5’-diphosphate
WGA：Wheat germ agglutinin (Tritium vulgare)【００６２】
また、各種測定には、以下の機器又は条件をそれぞれ適用した。
・HPLC
送液装置          ：JASCO PU-2080 Plus Intelligent HPLC Pump
オートサンプラー  ：JASCO AS-2055 Plus Intelligent Sampler 
検出器            ：JASCO MD-2010 Plus Multiwavelength Detector
データ処理        ：JASCO-BORWIN/HSS-2000
分析条件
カラム            ：Asahipak NH2P-50 4-E (φ4.6 × 250 mm)
溶媒              ：80% CH3CN
カラム温度   ：40 ℃
検出              ：UV 210 nm
流速              ：1.0 ml/min
又は、
カラム            ：Imtakt Unison UK-Amino (φ4.6 × 250 mm)
溶媒              ：75% CH3CN
カラム温度   ：40 ℃
検出              ：UV 210 nm
流速              ：0.8 ml/min
又は、
カラム            ：Imtakt Unison US-C18 (φ4.6 × 250 mm)
溶媒              ：15% MeOH containing 0.05% TFA
カラム温度   ：40℃
検出              ：UV 210 nm 260 nm
流速              ：1.0 mL/min【００６３】
・NMR
1H-NMR
分析機器   ：JEOL JNM-LA 500FT NMR spectrometer
外部標準   ：sodium 3-(trimethylsilyl)-propionate (TPS)
温度   ： 25℃
溶媒        ： D2O
サンプル管  ： φ3 mm
又は、
１H-NMR、13C-NMR
分析機器   ：  JEOL EX-270 NMR
外部標準   ：  sodium 3-(trimethylsilyl)-propionate (TPS)
温度   ： 25℃
溶媒        ： D2O
サンプル管  ： φ5 mm【００６４】
・ESI-MS
サンプル溶液 (0.1 mg/ml) を調整し、以下の機器を用いて測定した。
分析機器            ： JEOL JMS-T100LC Accu TOF mass spectrometer
オリフィス電圧掃引  ： 80 V
計算機              ： レセルピン
イオン化モード     ： ESIζ
溶媒               ： D.W.
温度                ： RT【００６５】
・MALDI-TOF-MS
分析機器            ： Autoflex (BRUKER DALTONICS)
測定モード          ： positive reflection mode
マトリックス        ： 2,5-dihydroxybenzoic acid 10 mg/ml (H2O/EtOH=70/30)
ターゲット         ： MTP 384 target ground steel T F
スタンダード        ： peptide calibration standard【００６６】
［多価配糖体の合成］
本発明にかかる二価配糖体は、簡単に言えば、A. orientalis由来粗酵素標品中のキチン分解酵素の糖転移反応を用いて、(GlcNAc)4を供与体とし、アルカンジオールを受容体として、J. Biochem., 2008, Vol.143, pp.21-30に記載された方法に従い、GlcNAc二価配糖体を合成し、次いで、得られたGlcNAc二価配糖体にウシミルク由来のβ1,4-galactosyltransferaseを用いて、ＷＯ２００７／０２６６６９及び特開２００８−３１１５６号に記載された方法に従って、両末端GlcNAc残基にガラクトースを導入することによって合成した。シアロ糖鎖二価配糖体は、得られたアシアロ糖鎖二価配糖体に、WO２００７／０２６６６９号に記載された方法に従って、α２，６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ等を用いてシアリル基を導入することによって合成した。【００６７】
また本発明にかかる四価配糖体は、簡単に言えば、A. orientalis由来粗酵素標品中のキチン分解酵素の糖転移反応を用いて、(GlcNAc)4を供与体とし、トリフルオロアセタミド末端アルコールリンカーを受容体として、これらを連結してGlucNAc片末端配糖体を得て、次いで、得られたGlcNAc片末端配糖体のアグリコンアミノ基と、多価カルボキシル基を有する多価キレート分子のカルボキシル基とを、ＨＢＴＵのようなペプチド合成用縮合剤により縮合させて合成した。シアロ糖鎖四価配糖体は、得られたアシアロ糖鎖四価配糖体に、ＷＯ２００７／０２６６６９号に記載された方法に従って、α２，６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ等を用いてシアリル基を導入することによって合成した。【００６８】
【化１６】
2011108471.tif 000018
【００６９】
【化１７】
2011108471.tif 000019
【００７０】
【化１８】
2011108471.tif 000020
【００７１】
なお、以下の合成において使用された材料は、以下のとおりである。
A. orientalis由来粗酵素標品：放線菌Amycolatopsis orientalis (IFO 12806)培養液上清の80％硫安沈殿の画分の乾燥粉末。
ウシミルク由来β1,4-galactosyltransferase；シグマアルドリッチジャパン（株）社製。
ウシ小腸由来alkaline phosphatase,gradeＩ：ROCHE社製
Trichoderma reesei由来cellulase (XL-522) ：ナガセケムテック社製
ヒト由来組換え体昆虫細胞発現β1,3-(N)-Acethylglucosaminyltransferaseは本学農学部応用生物化学科生物工学研究室より供与。α2,6-sialyltransferase (Photobacterium damsela) はヤマサ醤油（株）より供与。α2,6-sialyltransferase (Rat, Recombinant, Bombyx mori) は本学農学部応用生物化学科生物工学研究室より供与して頂いたカイコの体液をそのまま粗酵素標品として用いた。BMC. Biotechnol., 2009, Vol.9, pp.1-13
α2,3-sialyltransferase (Rat, Recombinant, Spodoptera fungiperda)：CALBIOCHEM社製
(GlcNAc)4：焼津水産化学工業（株）製キトオリゴ糖から精製。
LacNAc：焼津水産化学工業（株）製ラクトサミン溶液を活性炭−セライトカラムクロマトグラム処理により精製。
UDP-Gal、UDP-GlcNAc、CMP-Neu5Ac：ヤマサ醤油（株）製
なお、各種酵素は、ＷＯ２００７／０２６６６９、ＷＯ２００９／００１８０５に記載の方法に従って、精製し、活性を測定したものを使用した。
各化合物の合成は、以下のとおりである。【００７２】
＜化合物６の合成＞
(GlcNAc)4 (830 mg、1.0 mmol) 及び 1,4-butanediol (45 μｌ、0.5 mmol) を50 mM Na-Pi buf. (pH 6.7) 8.96 mlに溶解後、A. orientalis由来粗酵素標品（0.5 U/mlを1.0 ml添加し、40℃で振とう反応を行い、常法に従って、GlcNAc-Bt-GlcNAc（化合物２）を得た。GlcNAc-Bt-GlcNAcは収量40.9 mg (0.0823 mmol) で供与体当たりの収率は8.24 %であった。
得られたGlcNAc-Bt-GlcNAc (29.8 mg、0.060 mmol) 及びUDP-Gal (109.8 mg、0.18 mmol)を、50 mM Tris-HCl buf. (pH 8.0) 12.0 ml、200 mM MnCl2・H2O 1.0 ml、10 mg/ml BSA 1.0 mlに溶解後、182 U/μｌ APase を2.2μｌ及びβ1,4-GalT 500 mUを 添加し、37℃で静置反応を行った。反応液10μｌを経時的に採取し、190μｌのD.W.に加え、100℃で10分間煮沸し、反応の経時変化をHPLCにより分析した。Galが両末端に転移された目的生成物のピークが定常に達した40時間後に100℃で10分間煮沸して反応を停止した。この反応液をD.W.で平衡化したODSクロマトグラフィー (φ 20×300 mm) に供した。流速2.7 ml/min、D.W. (250 ml) で洗浄後、D.W. (500 ml) - 25% MeOH (500 ml) のメタノール直線濃度勾配法で溶出し、各試験管に15 mlずつ分取した。各フラクションにつき、GlcNAcのN-アセチル基に由来する210 nm及び、ウリジンに由来する260 nmの吸光度測定及びTLC Silica gel 60（展開溶媒：CHCl3/CH3OH/H2O =5/5/1, 呈色試薬：オルシノール硫酸）による分析を行なった。210 nmでのみ吸収のあったピークを回収・濃縮しF-1 (Fr.No.16〜22) を得た。F-1を凍結乾燥し、1H-NMR、13C-NMR及び ESI-MSにより構造解析を行なった。その結果、F-1がLacNAc-Bt-LacNAc（化合物６）であることを確認した。LacNAc-Bt-LacNAcの収量は42.1 mg (0.051 mmol)、受容体当たりの収率は85.5%であった。【００７３】
LacNAc-Bt-LacNAc；HRESIMS：m/z 843.32240 [M＋Na]＋(calcd for C32H56N2Na1O22, 843.32224)；1H-NMR(D2O, 500 MHz)：δ 4.54 (d, 2H, J1,28.0 Hz, H-1), 4.49 (d, 2H, J1’2’ 8.0 Hz, H-1'), 4.00 (dd, 2H, J5,6a2.5 Hz, J6a,6b 12.5 Hz, H-6b), 3.94 (2H, H-4’), 3.91 (m, 2H, H-αb), 3.84 (dd, 2H, J5,6a 5.0 Hz, J6a6b 12.5Hz, H-6a), 3.80-3.73 (8H, H-5’, H-6’, H-4), 3.72 (t, 2H, J1,2 6.0 Hz, J2,3 6.0 Hz, H-2), 3.70 (t, 2H, H-3), 3.66 (dd, 2H, J2’,3’ 10 Hz, J3’,4’3.5 Hz, H-3’), 3.61-3.59 (4H, H-5, H-αa), 3.55 (dd, 2H, J1’,2’ 10 Hz, J2’,3’ 8.0 Hz, H-2’), 2.04 (s, 6H, CH3CONH-), 1.59 (q, 4H, H-β)；13C-NMR(D2O, 500 MHz)：δ177.2 (CH3CONH-), 105.7 (C-1’), 103.8 (C-1), 81.4 (C-4), 78.2 (C-5’), 77.6 (C-5), 75.4 (C-3’), 75.3 (C-3), 73.8 (C-2’), 72.7 (C-α), 71.4 (C-4’), 63.8 (C-6’), 63.0 (C-6), 57.9 (C-2), 27.9 (C-β), 25.0 (CH3CONH-) 【００７４】
＜化合物７の合成＞
供与体を(GlcNAc)4(830 mg、1.0 mmol) とし、受容体を1,6-hexanediol (59 mg、0.5 mmol) とし、A. orientalis由来粗酵素標品 0.5 U/mlを用いた以外は、上記化合物２の合成と同様にして合成反応を行い、GlcNAc-Hx-GlcNAcを得た。GlcNAc-Hx-GlcNAc（化合物４）の収量は44.3 mg (0.0844 mmol)、供与体当たりの収率は8.44%であった。
得られたGlcNAc-Hx-GlcNAc (62.9 mg、0.120 mmol) 及びUDP-Gal (219.6 mg、0.36 mmol)を50 mM Tris-HCl buf. (pH 8.0) 34.0 ml、200 mM MnCl2・H2O 2.0 ml、10 mg/ml BSA 2.0 mlに溶解後、182 U/μｌ APase を4.4μｌ及びβ1,4-GalT 1000 mUを 添加し、37℃で静置反応を行った。反応液10μｌを経時的に採取し、190μｌのD.W.に加え、100℃で10分間煮沸し、反応の経時変化をHPLCにより分析した。Galが両末端に転移された目的生成物のピークが定常に達した28時間後に100℃で10分間煮沸して反応を停止した。この反応液を、D.W及び100％メタノールで洗浄したSep-Pak C18カラムクロマトグラフィー (35 cc) に供した。D.W、5％メタノール、10％メタノール、15％メタノール、20％メタノールそれぞれ175 mlにより溶出させた。それぞれの画分をTLC Silica gel 60 (展開溶媒：CHCl3/CH3OH/H2O =5/5/1、呈色試薬：オルシノール硫酸)による分析を行った。TLCにより目的物があると確認された10％メタノール、15％メタノールの画分を濃縮し、さらにCHCl3/CH3OH/H2O (5/5/1) で平衡化したシリカゲルカラムクロマトグラフィー (φ20×300 mm) に供し、同溶媒にて流速10 ml/minで溶出した。各試験管に15 mlずつ分取してTLC Silica gel 60（同条件）で分析した。F-1(Fr.No.16〜40)、F-2(Fr.No.41〜98)を回収・濃縮・凍結乾燥し、1H-NMRにより構造解析を行った。その結果、F-2として、LacNAc-Hx-LacNAc（化合物７）を得た。LacNAc-Hx-LacNAcの収量は76.3 mg (0.090 mmol)、受容体当たりの収率は74.9%であった。【００７５】
LacNAc-Bt-LacNAc； FAB-mass：m/z 850 [M＋Na]+ ； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)： δ 4.53 (d, 2H, J1,2 8.0 Hz, H-1), 4.47 (d, 2H, J1’2’7.7 Hz, H-1’), 4.00-3.52 (28H, H-6b, H-6a, H-5, H-4, H-3, H-2, H-6’b, H-6’a, H-5’, H-4’, H-3’, H-2’, H-αb, H-αa), 2.03 (s, 6H, CH3CONH-)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ177.1 (CH3CONH-), 105.7(C-1’), 103.8 (C-1), 81.3 (C-4), 78.2 (C-5’), 77.6 (C-5), 75.3 (C-3’), 75.3(C-3), 73.8 (C-2’), 73.3 (C-α), 71.4 (C-4’), 63.8 (C-6’), 62.9 (C-6), 57.9 (C-2), 31.4 (C-β), 27.5 (C-γ), 25.0 (CH3CONH-) 【００７６】
＜化合物８の合成＞
上記化合物８は以下のようにして合成した。
CMP-Neu5Ac・2Na (26.3 mg, 40 μmol) 及びLacNAc-Bt-LacNAc；化合物６ (13.1 mg、16 μmol) を100 mM MOPS buf. (pH 7.4) 1000 μl、D.W. 731 μlに溶解し、250 mM MnCl2 20 μl及び10 mg/ml BSA 20 μlを加えた。7500 U/410 μl APase 3.65 μl及び22.5 U/ml α2,6-SiaT 45 μl (25 mU) を添加し、37℃で静置反応を行った。反応液10 μlを経時的に採取し、190 μlのD.W.に加え、100℃で10分間煮沸し、反応の経時変化をHPLCにより分析した。Neu5Acが両末端に転移された目的生成物のピークが定常に達した73時間後に100℃で10分間煮沸して反応を停止した。この反応液をD.W.で平衡化したODSクロマトグラフィー (φ20×300 mm) に供した。流速2.7 ml/min、D.W.で溶出し、各試験管に15 mlずつ分取した。各フラクションにつき、GlcNAcのN-アセチル基に由来する210 nm及び、シチジンに由来する260 nmの吸光度測定、及びTLC Silica gel 60（展開溶媒：CHCl3/CH3OH/H2O =5/5/1, 呈色試薬：オルシノール硫酸）による分析を行なった。210 nmでのみ吸収のあったピークを回収・濃縮しF-1 (Fr.No.7〜9)、D.W.で平衡化したSephadex G-25 column chromatography (φ25×550 mm)に供した。約0.35 ml/min、D.W.で溶出し、各試験管に約3.5 mlずつ分取後、各フラックションにつき210、260 nmの吸光度測定 (Fig. 14B)、及びTLC Silica gel 60（同条件）による分析を行なった。210 nmでのみ吸収のあったピークを回収・濃縮しF-2 (Fr.No.31〜50) を凍結乾燥し、1H-NMR、13C-NMR及び ESI-MSにより構造解析を行なった。その結果、F-2として、Neu5Acα2,6LacNAc-Bt-LacNAcα2,6Neu5Acを得た。Neu5Acα2,6LacNAc-Bt-LacNAcα2,6Neu5Acの収量は14.3 mg (10 μmol)、受容体当たりの収率は62.7%であった。【００７７】
Neu5Acα2,6LacNAc-Bt-LacNAcα2,6Neu5Ac；ESI-MS：m/z 1423.19105 [M＋Na]+ ；1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 4.57 (d, 2H, J1,2 8.0 Hz, H-1), 4.46 (d, 2H, J1’2’7.5 Hz, H-1’), 4.01 (dd, 2H, J5,6a 4.5 Hz, J6a,6b 5.5 Hz, H-6b), 3.99 (dd, 2H, H-6’b) 3.95 (t, 2H, J3’,4’ 3.0 Hz, J4’,5’3.0 Hz, H-4’), 3.92-3.88 (6H, H-8”, H-9”b, H-αb), 3.86-3.81 (8H, H-6a, H-5’, H-5”, H-6”), 3.79-3.73 (4H, H-2, H-3), 3.71-3.67 (4H, H-3’, H-4”), 3.66-3.61 (8H, H-4, H-5, H-9”a, H-αa), 3.56-3.54 (6H, H-2’, H-6’a, H-7”), 2.69 (2H, J3”ax,3”eq12.5 Hz, J3”eq,4”4.5 Hz, H-3”eq), 2.06 (s, 6H, CH3CONH”-), 2.05 (s, 6H, CH3CONH-), 1.73 (t, 2H, J3”ax,3”eq12.0 Hz, J3”ax,4” 12.5 Hz, H-3”ax), 1.61 (m, 4H, H-β)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)： δ177.8 (CH3CONH”-), 177.2 (CH3CONH-), 176.3 (C-1”), 106.3 (C-1’), 103.7 (C-1), 103.0 (C-2”), 83.6 (C-4), 77.3 (C-5’), 76.5 (C-5), 75.4 (C-6”), 75.3 (C-3’), 75.3(C-3), 74.5 (C-8”), 73.6 (C-2’), 72.6 (C-α), 71.3 (C-4’), 71.3 (C-4”), 71.0 (C-7”), 66.2 (C-6’), 65.5 (C-9”), 63.2 (C-6), 57.8 (C-2), 54.8 (C-5”), 42.9 (C-3”), 27.9 (C-β), 25.1 (CH3CONH-), 24.9 (CH3CONH”-)【００７８】
＜化合物９の合成＞
CMP-Neu5Ac・2Na (48.4 mg、73.6 μmol) 及びLacNAc-Hx-LacNAc；化合物７ (25 mg、29.5 μmol) を100 mM MOPS buf. (pH 7.4) 1840 μl、D.W. 1340 μlに溶解し、250 mM MnCl236.8 μl及び10 mg/ml BSA 36.8 μlを加えた。7500 U/410 μl APase 6.71 μl及び22.5 U/ml α2,6-SiaT 89 μl (50 mU) を添加し、37℃で静置反応を行い、上記化合物８と同様にして、Neu5Acα2,6LacNAc-Hx-LacNAcα2,6Neu5Acを得た。Neu5Acα2,6LacNAc-Hx-LacNAcα2,6Neu5Acの収量は24.2 mg (16.9 μmol)、受容体当たりの収率は57.5%であった。【００７９】
Neu5Acα2,6LacNAc-Hx-LacNAcα2,6Neu5Ac；FAB-mass： m/z 1432 [M+H]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)： δ 4.55 (d, 2H, J1,2 8.0 Hz, H-1), 4.45 (d, 2H, J1’2’ 8.0 Hz, H-1’), 3.892-3.366 (40H, H-6b, H-6’b, H-4’, H-8”, H-9”b, H-αb, H-6a, H-5’, H-5”, H-6”, H-2, H-3, H-3’, H-4”, H-4, H-5, H-9”a, H-αa, H-6’a, H-7”), 2.68 (dd, 2H, J3”ax,3”eq 12.2 Hz, J3”ax,4”4.6 Hz, H-3”eq), 2.05 (s, 6H, CH3CONH”-), 2.03 (s, 6H, CH3CONH-), 1.71(t, 2H, J3”ax,3”eq 12.5 Hz, J3”ax,4” 12.5 Hz, H-3”ax), 1.56 (m, 4H, H-β), 1.30 (m, 4H, H-γ)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)： δ177.8 (CH3CONH”-), 177.2 (CH3CONH-), 176.3 (C-1”), 106.3 (C-1’), 103.7 (C-1), 103.0 (C-2”), 83.5 (C-4), 77.3(C-5’), 76.5 (C-5), 75.4 (C-3), 75.3 (C-3’), 75.2 (C-6”), 74.5 (C-8”), 73.6 (C-2’), 73.4 (C-α), 71.2 (C-4’), 71.2 (C-4”), 71.0 (C-7”), 66.1 (C-6’), 65.5 (C-9”), 63.2 (C-6), 57.7 (C-2), 54.7 (C-5”), 42.9 (C-3”), 31.4 (C-β), 27.5 (C-γ), 25.2 (CH3CONH”-), 25.1 (CH3CONH-)【００８０】
＜化合物１１の合成＞
上記化合物１１は以下のようにして合成した。
2-(2-Aminoethoxy)ethanol 50 mlにピリジン 100 mlを氷冷、攪拌しながら加え、無水TFA 100 mlを添加して、常法により、リンカー化合物である2-(2-trifluoroacetamidoethoxy)ethanolを合成した。
LacNAc (25.0 mg、65 mmol) 及び2-(2-Trifluoroasetamidoethoxy)ethanol (16.41 ml、82 mmol) を100 mM Na-Ac buf. (pH 4.0) 48.6 mlに溶解後、T. ressei生産部分精製cellulase2100 Uを1.0 mg添加し、37℃で振とう反応を行い、常法によって、2-(2-Trifluoroacetamidoethoxy)ethyl β-LacNAcを得た。次いで、2-(2-Trifluoroacetamidoethoxy)ethylβ-LacNAcに0.1 M NaOHを加えて溶解し、Sephadex G-25 column chromatographyを用いて常法により、脱アシル化し、アミノ基に変換して、2-(2-Aminoethoxy)ethylβ-LacNAcを得た。収量85.4 mg (0.182 mmol) で受容体当たりの収率は98.7%であった。【００８１】
次いで、EGTA (33.8 mg、0.08 mmol) をDMSO 240 μl及びトリエチルアミン 180 μlに溶解し、DIEA (154.5 μl、0.88 mmol) と、縮合剤としてHBTU (269.5 mg、0.71 mmol) を添加し、10分間撹拌した。2-(2-Aminoethoxy)ethylβ-LacNAc(188 mg、0.4 mmol)をDMSO (1000 μl) に溶解して先ほどの反応液に加え、室温で攪拌しながら反応した。TLC Silica gel 60（展開溶媒：CHCl3/CH3OH/H2O =6/4/1, 呈色試薬：オルシノール硫酸）により反応の進行を追跡し、目的生成物のスポット濃度が変化しない72時間後に反応を終了した。反応液をD.W.で平衡化したBiogel P-2 Extra fineカラムクロマトグラフィー (φ35×600 mm) に供した。1.5 ml/min、D.W.で溶出し、各試験管に15 mlずつ分取後、各フラックションにつき210 nmの吸光度測定及びTLC Silica gel 60（同条件）による分析を行い、F-1 (Fr.No.45〜63) を回収・濃縮した。次に、F-1画分を15% MeOHで平衡化したODSカラムクロマトグラフィー (φ20×500 mm) に供した。流速2.0 ml/min、同溶媒により溶出し、各試験管26 mlずつ分取した。各フラクションにつき210 nmの吸光度測定及びTLC Silica gel 60（同条件）、RP-18F（展開溶媒：15% MeOH, 呈色試薬：オルシノール硫酸）により分析し、F-2 (Fr.No.33〜37) を回収・濃縮した。F-2の画分を濃縮・凍結乾燥し、1H-NMR、13C-NMR及びMALDI-TOF-MSにより構造解析を行なった。その結果、F-2としてLacNAc四価配糖体（化合物１１）を得た。LacNAc四価配糖体は収量143.1 mg (0.0654 mmol) で受容体当たりの収率は81.7%であった。【００８２】
LacNAc四価配糖体； MALDI-TOF-MS：m/z 2211.800 [M＋Na]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 4.58 (d, 4H, J1,2 8.0 Hz, H-1), 4.48 (d, 4H, J1’,2’8.0 Hz, H-1’), 4.00 (4H, H-6b), 3.98 (4H, H-αb), 3.98 (4H, H-4’), 3.84 (4H, H-6a), 3.81-3.71 (20H, H-6’, H-2, H-5’, H-4, H-3), 3.69-3.60 (40H, H-d, H-3’, H-β, H-αa, H-γ, H-c, H-5), 3.55 (dd, 4H, J1’,2’ 7.5 Hz, J2,310.0 Hz, H-2’), 3.44 (m, 8H, H-δ), 3.36 (s, 8H, H-a), 2.85 (t, 4H, H-b), 2.05 (s, 12H, CH3CONH-)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ177.2 (CH3CONH-), 176.5 (-NHCO-), 105.7 (C-1’), 103.8 (C-1), 81.4 (C-4), 78.2 (C-5’), 77.6 (C-5), 75.4 (C-3), 75.3 (C-3’), 73.8 (C-2’), 72.4 (C-d), 72.3 (C-β), 71.8 (C-α), 71.7 (C-γ), 71.5 (C-c), 71.4 (C-4’), 63.8 (C-6’), 63.0 (C-6), 61.3 (C-a), 57.9 (C-2), 57.1 (C-b), 41.5 (C-δ), 25.1 (CH3CONH-)【００８３】
＜化合物１２の合成＞
上記化合物１２は、以下のようにして合成した。
受容体基質LacNAc四価配糖体 (65.7 mg、0.03 mmol)、供与体基質UDP-GlcNAc・2Na (117.2 mg、0.18 mmol)、補因子MnCl2・4H2O (19.0 mg、0.96 mmol) を50 mM Tris-HCl buf. (pH 6.8) 10.29 mlに溶解し、防腐剤として1% (w/v) NaN3 (0.12 ml) を加え、部分精製酵素β3GnTII (221.4 mU、1.59 ml) を添加し、37℃で静置反応を行い、上記と同様にして、原料及び中間生成物のピークがなくなり、GlcNAcが4箇所に転移された目的生成物のピークが定常に達した220時間後に100℃で10分間煮沸して反応を停止した。この反応液にUDP-Gal・２Na (128.1 mg、0.21 mmol) を加え、β4GalTＩ (1000 mU、1 ml) を添加し、37℃で静置反応を行った。GlcNAc転移反応と同様に反応液を経時的に採取して、HPLCにより分析し、ガラクトースが4箇所に転移された目的生成物のピークが定常に達した48時間後に100℃で10分間煮沸して反応を停止した。この反応液を濃縮し、D.Wで平衡化したODSカラムクロマトグラフィー (φ20×500 mm) に供した。流速2.7 ml/min、同溶媒により1100 ml溶出した後、20% MeOHに溶媒を切り替え溶出させた。各試験管27 mlずつ分取し、210 nm、260 nmの吸光度測定及びTLC Silica gel 60（展開溶媒：CHCl3/CH3OH/H2O =6/4/1, 呈色試薬：オルシノール硫酸）、RP-18F（展開溶媒：15% MeOH, 呈色試薬：オルシノール硫酸）により分析し、210 nmでのみ吸収のあったピークを回収・濃縮しF-1 (Fr.No.52〜58) を得た。F-1を凍結乾燥し、1H-NMR、13C-NMR及び MALDI-TOF-MSにより構造解析を行なった。その結果、F-1として、糖鎖延長型LacNAc四価配糖体（化合物１２）を得た。糖鎖延長型LacNAc四価配糖体の収量は90.5 mg (0.025 mmol)、受容体あたりの収率は82.6%であった。【００８４】
糖鎖延長型LacNAc四価配糖体； MALDI-TOF-MS：m/z 3675.252 [M＋Na]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ4.73 (d, 4H, H-1”), 4.58 (d, 4H, J1,28.0 Hz, H-1), 4.50-4.45 (8H, H-1''', H-1’), 4.17 (4H, H-4’), 4.01-3.94 (16H, H-6'''b, H-4''', H-6b, H-αb), 3.89-3.54 (108H, H-6'''b, H-5''', H-3''', H-2''', H-6”, H-5”, H-4”, H-3”, H-2”, H-6’, H-5’, H-3’, H-2’, H-6a, H-5, H-4, H-3, H-2, H-αa, H-β, H-γ, H-c, H-d), 3.44 (m, 8H, H-δ), 3.36 (s, 8H, H-a), 2.83 (t, 4H, H-b), 2.05 (s, 24H, CH3CONH”-, CH3CONH-)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ177.7 (CH3CONH”-), 177.2 (CH3CONH-), 176.5 (-NHCO-), 105.75 (C-1’), 105.71 (C-1'''), 105.5 (C-1”), 103.8 (C-1), 84.9 (C-3’), 81.4 (C-4), 81.1 (C-4”), 78.2 (C-5'''), 77.7 (C-5’), 77.6 (C-5), 77.4 (C-5”), 75.4 (C-3), 75.3 (C-3'''), 75.0 (C-3”), 73.8 (C-2'''), 72.8 (C-2’), 72.4 (C-d), 72.3 (C-β), 71.8 (C-α), 71.7 (C-γ), 71.5 (C-c), 71.4 (C-4'''), 71.1 (C-4’), 63.84 (C-6'''), 63.77 (C-6’), 62.9 (C-6), 62.7 (C-6”), 61.3 (C-a), 58.0 (C-2”), 57.8 (C-2), 57.1 (C-b), 41.3 (C-δ), 25.1 (CH3CONH”-), 25.0 (CH3CONH-)【００８５】
＜化合物１３の合成＞
6-Trifluoroacetamidohexanoic acid (238.4 mg、0.105 mmol) をDMSO 1000 μlに溶解させ、DIEA (608.5 μl、3.50 mmol) とHBTU (265.3 mg、0.70 mmol) を添加し、15分間撹拌した。2-(2-Aminoethoxy)ethylβ-LacNAc (329 mg、0.7 mmol) を溶解したDMSO (2750 μl) 溶液を、先ほどの反応液に加え、室温で攪拌しながら反応を行い、上記と同様にして、2-[2-(5-Trifluoroacetamidopentanecarboxyamidoethoxy)]ethylβ-LacNAcを得た。
次いで、2-[2-(5-Trifluoroacetamidopentanecarboxyamidoethoxy)]ethylβ-LacNAc (122.8 mg、0.181 mmol) に0.1 M NaOH (1.5 ml) を加えて溶解し、室温で反応を行って、常法により、脱アシル化し、アミノ基に変換して、2-[2-(5-Aminopentanecarboxyamidoethoxy)]ethylβ-LacNAcを得た。【００８６】
EGTA (25.3 mg、0.067 mmol) をDMSO 210 μl及びトリエチルアミン 140 μlに溶解し、DIEA (115.9 μl、0.67 mmol) と、縮合剤としてHBTU (252.7 mg、0.53 mmol) を添加し、15分間撹拌した。2-[2-(5-Aminopentanecarboxyamidoethoxy)]ethylβ-LacNAc (175.2 mg、0.30 mmol) をDMSO (16000 μl) に溶解して、先ほどの反応液に加え、室温で攪拌しながら反応を行い、前記と同様にして、スペーサー延長型LacNAc四価配糖体（化合物１３）を得た。スペーサー延長型LacNAc四価配糖体は収量144.1 mg (0.0546 mmol) で受容体当たりの収率は81.5%であった。【００８７】
スペーサー延長型LacNAc四価配糖体；MALDI-TOF-MS：m/z 2666.006 [M + Na]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 4.59 (d, 4H, J1, 28.0 Hz, H-1), 4.49 (d, 4H, J1', 2' 8.0 Hz, H-1'), 4.02 (4H, H-6b), 3.99 (m, 4H, H-ab), 3.95 (4H, H-4'), 3.85 (dd, 4H, J5, 6a 5.5 Hz, J6a, 6b12.5 Hz, H-6a), 3.80-3.68 (52H, H-6', H-2, H-5', H-4, H-3, H-d, H-b, H-aa, H-g, H-c, H-5), 3.56 (dd, 4H, J1’, 2’ 8.0 Hz, J2’, 3’ 10.0 Hz, H-2’), 3.38 (m, 8H, H-δ), 3.31 (s, 8H, H-a), 3.24 (t, 2H, H-ι), 2.82 (t, 4H, H-b), 2.27 (t, 8H, H-ε), 2.05 (s, 12H, CH3CONH-), 1.62 (8H, H-ζ) 1.55 (8H, H-θ), 1.33 (8H, H-η)；13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 179.6 (-NHCO- of spacer), 177.2 (CH3CONH-), 176.0 (-NHCO- of EGTA), 105.7 (C-1'), 103.8 (C-1), 81.4 (C-4), 78.2 (C-5'), 77.6 (C-5), 75.4 (C-3) 75.3 (C-3’), 73.8 (C-2'), 72.5 (C-d), 72.3 (C-b), 71.8 (C-a), 71.8 (C-g, C-c), 71.4 (C-4'), 63.8 (C-6'), 62.9 (C-6), 61.5 (C-a), 57.9 (C-2), 57.5 (C-b), 41.8 (C-ι), 41.7 (C-δ), 38.4 (C-ε), 31.1 (C-θ), 28.5 (C-η), 27.8 (C-ζ), 25.1 (CH3CONH-)【００８８】
＜化合物１４の合成＞
上記化合物１４は以下のようにして合成した。
CMP-Neu5Ac・2Na (32.9 mg、50 μmol) 及びLacNAc四価配糖体；化合物１１ (21.9 mg、10 μmol) を100 mM MOPS buf. (pH 7.4) 625 μl、D.W. 73 μlに溶解し、200 mM MnCl2・4H2O 12.5 μl及び100 mg/ml BSA 12.5 μlを加えた。7500 U/410 μl APase 2 μl及び595.4 mU/ml α2,6-SiaT含有カイコ体液 525 μl (313 mU) を添加し、37℃で静置反応を行って、前記と同様にして、Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体を得た。Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体の収量は22.7 mg (6.78 μmol)、受容体当たりの収率は67.7%であった。【００８９】
Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体；MALDI-TOF-MS：m/z 3355.584 [M + H]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 4.61 (4H, H-1), 4.46 (d, 4H, J1', 2' 8.0 Hz, H-1'), 4.01-3.40 (124H, H-9”, H-8”, H-7”, H-6”, H-5”, H-4”, H-6', H-5’, H-4’, H-3’, H-2’, H-6, H-5, H-4, H-3, H-2, H-a, H-b, H-g, H-δ, H-a, H-c, H-d), 2.85 (4H, H-b), 2.69 (dd, 4H, H-3”eq), 2.08 (s, 12H, CH3CONH”-), 2.05 (s, 12H, CH3CONH-), 1.73 (t, 4H, H-3”ax)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 177.8 (CH3CONH-), 177.2 (CH3CONH”-), 176.5 (C-1”), 176.3 (-NHCO-), 106.3 (C-1'), 103.7 (C-1), 103.0 (C-2”), 83.6 (C-4), 77.3 (C-5'), 76.5 (C-5), 75.40 (C-6”), 75.37 (C-3), 75.3 (C-3’), 74.5 (C-8”), 73.6 (C-2’), 72.3 (C-b, C-d), 71.8 (C-a), 71.7 (C-g), 71.3 (C-4”, C-4), 71.0 (C-7”, C-c), 66.2 (C-6’), 65.5 (C-9”), 63.2 (C-6), 61.4 (C-a), 57.6 (C-2, C-b), 54.8 (C-5”), 42.9 (C-3”), 41.6 (C-δ), 25.2 (CH3CONH-), 24.9 (CH3CONH”-) 【００９０】
＜化合物１５の合成＞
上記化合物１５は以下のようにして合成した。
CMP-Neu5Ac・2Na (32.9 mg、50 μmol) 及びLacNAc四価配糖体；化合物１１ (21.9 mg、10 μmol) を100 mM MOPS buf. (pH 7.4) 625 μl、D.W. 509 μlに溶解し、200 mM MnCl2・4H2O 12.5 μl及び100 mg/ml BSA 12.5 μlを加えた。7500 U/410 μl APase 2 μl及び100 mU/178 μl α2,3-SiaT 89 μl (50 mU) を添加し、37℃で静置反応を行って、前記と同様にして、Neu5Acα2,3LacNAc四価配糖体（化合物１５）を得た。Neu5Acα2,3LacNAc四価配糖体の収量は13.5 mg (4.03 μmol)、受容体当たりの収率は38.0%であった。【００９１】
Neu5Acα2,3LacNAc四価配糖体；MALDI-TOF-MS：m/z 3356.970 [M + 4H]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 4.59-4.56 (8H, H-1, H-1'), 4.13 (4H, H-5’), 4.02-3.98 (12H, H-6b, H-ab, H-4'), 3.92-3.85 (16H, H-9”, H-8”, H-6’b), 3.77-3.57 (76H, H-7”, H-6”, H-5”, H-4”, H-6'a, H-3’, H-2’, H-6a, H-5, H-4, H-3, H-2, H-aa, H-b, H-g, H-c, H-d), 3.45 (m, 8H, H-δ), 3.58 (s, 8H, H-a), 2.84 (t, 4H, H-b), 2.78 (dd, 4H, H-3”eq), 2.05 (s, 24H, CH3CONH”-, CH3CONH-), 1.82 (t, 4H, H-3”ax)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 177.8 (CH3CONH”-), 177.2 (CH3CONH-), 176.7 (C-1”), 176.5 (-NHCO-), 105.4 (C-1'), 103.9 (C-1), 102.7 (C-2”), 81.2 (C-4), 78.3 (C-5'), 78.0 (C-3’), 77.6 (C-5), 75.7 (C-6”), 75.3 (C-3), 74.6 (C-8”), 72.4 (C-d), 72.3 (C-b), 72.2 (C-2'), 71.8 (C-a), 71.7 (C-g), 71.5 (C-c), 71.5 (C-4”), 70.9 (C-7”), 70.3 (C-4’), 65.4 (C-9”), 63.8 (C-6’), 62.9 (C-6), 61.3 (C-a), 57.9 (C-2, C-b), 54.5 (C-5”), 42.5 (C-3”), 41.6 (C-δ), 25.1 (CH3CONH-), 24.9 (CH3CONH”-)【００９２】
＜化合物１６の合成＞
上記化合物１６は以下のようにして合成した。
CMP-Neu5Ac・2Na (29.6 mg、45 μmol) 及び糖鎖延長型LacNAc四価配糖体；化合物１２ (36.5 mg、10 μol) を100 mM MOPS buf. (pH 7.4) 625 μl、D.W. 73 μlに溶解し、200 mM MnCl2・4H2O 12.5 μl及び100 mg/ml BSA 12.5 μlを加えた。7500 U/410 μl APase 2 μl及び595.4 mU/ml α2,6-SiaT含有カイコ体液 525 μl (313 mU) を添加し、37℃で静置反応を行って、前記と同様にして、糖鎖延長型Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体（化合物１６）を得た。糖鎖延長型Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体の収量は10.7 mg (2.22 μmol)、受容体当たりの収率は22.2%であった。【００９３】
糖鎖延長型Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体；MALDI-TOF-MS：m/z 4819.738 [M + 4H]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 4.57 (d, 4H, J1, 2 8.0 Hz, H-1), 4.48 (8H, H-1''', H-1’), 4.17 (4H, H-4’), 4.03-3.54 (152H, H-9"", H-8"", H-7"", H-6"", H-5"", H-4"", H-6''', H-5''', H-4''', H-3''', H-2''', H-6”, H-5”, H-4”, H-3”, H-2”, H-6’, H-5’, H-3’, H-2’, H-6, H-5, H-4, H-3, H-2, H-α, H-β, H-γ, H-c, H-d), 3.46 (16H, H-δ, H-a), 2.89 (t, 4H, H-b), 2.69 (t, 4H, H-3""eq), 2.07 (s, 12H, CH3CONH""-), 2.05 (s, 24H, CH3CONH”-, CH3CONH-) 1.73 (4H, H-3""ax)；13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ177.8 (CH3CONH""-), 177.7 (CH3CONH”-), 177.2 (CH3CONH-), 176.7 (C-1""), 176.3 (-NHCO-), 106.3 (C-1'''), 105.7 (C-1'), 105.4 (C-1”), 103.9 (C-1), 103.0 (C-2""), 84.8 (C-3’), 83.3 (C-4”), 81.4 (C-4), 77.7 (C-5'), 77.6 (C-5), 77.1 (C-5”), 76.5 (C-5'''), 75.4 (C-6""), 75.31 (C-3) 75.28 (C-3'''), 75.1 (C-3”), 74.5 (C-8""), 73.6 (C-2'''), 72.8 (C-2'), 72.3 (C-b, C-d), 71.9 (C-a), 71.6 (C-g), 71.3 (C-4"", C-4''') 71.2 (C-4’), 71.1 (C-c), 71.0 (C-7""), 66.2 (C-6'''), 65.5 (C-9""), 63.8 (C-6'), 63.0 (C-6), 62.9 (C-6”), 61.7 (C-a), 57.8 (C-2”, C-2, C-b), 54.7 (C-5""), 42.9 (C-3""), 41.8 (C-δ), 25.14 (CH3CONH”-), 25.09 (CH3CONH-), 24.9 (CH3CONH""-) 【００９４】
＜化合物１７の合成＞
上記化合物１７は以下のようにして合成した。
CMP-Neu5Ac・2Na (32.9 mg、50 μmol) 及びスペーサー延長LacNAc四価配糖体；化合物１３ (26.4 mg、10 μmol) を100 mM MOPS buf. (pH 7.4) 625 μl、D.W. 73 μlに溶解し、200 mM MnCl2・4H2O 12.5 μl及び100 mg/ml BSA 12.5 μlを加えた。7500 U/410 μl APase 2 μl及び595.4 mU/ml α2,6-SiaT含有カイコ体液 525 μl (313 mU) を添加し、37℃で静置反応を行って、上記と同様にして、スペーサー延長Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体（化合物１７）を得た。スペーサー延長Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体の収量は23.6 mg (6.31 μmol)、受容体当たりの収率は63.1%であった。【００９５】
スペーサー延長Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体；MALDI-TOF-MS：m/z 3809.790 [M + 4H]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ4.61 (d, 4H, J1, 2 8.0 Hz, H-1), 4.46 (d, 4H, J1', 2'8.0 Hz, H-1'), 4.03-3.99 (12H, H-6b, H-6’b, H-ab), 3.94 (4H, H-4'), 3.90-3.53 (92H, H-9”, H-8”, H-7”, H-6”, H-5”, H-4”, H-6'a, H-5', H-3’, H-2’, H-6a, H-5, H-4, H-3, H-2, H-aa, H-b, H-g, H-c, H-d), 3.50 (s, 8H, H-a), 3.39 (m, 8H, H-δ), 3.26 (t, 2H, H-ι), 2.93 (4H, H-b), 2.68 (dd, 4H, H-3”eq), 2.27 (t, 8H, H-ε), 2.07 (s, 12H, CH3CONH”-), 2.04 (s, 12H, CH3CONH-), 1.73 (t, 4H, H-3”ax), 1.61 (8H, H-ζ), 1.54 (8H, H-θ), 1.33 (8H, H-η)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ179.6 (-NHCO- of spacer), 177.7 (CH3CONH-), 177.3 (CH3CONH”-), 176.4 (C-1”), 176.2 (-NHCO- of EGTA), 106.3 (C-1'), 103.7 (C-1), 103.0 (C-2”), 83.6 (C-4), 77.3 (C-5'), 76.5 (C-5), 75.4 (C-6”), 75.4 (C-3) 75.3 (C-3’), 74.5 (C-8”), 73.6 (C-2'), 72.3 (C-b), 72.2 (C-d), 71.9 (C-a), 71.8 (C-g), 71.2 (C-4”, C-4'), 71.1 (C-7”), 71.0 (C-c), 66.2 (C-6’), 65.5 (C-9”), 63.2 (C-6), 62.0 (C-a), 59.4 (C-b), 57.6 (C-2), 54.8 (C-5”), 42.9 (C-3”), 42.2 (C-ι), 41.8 (C-δ), 38.4 (C-ε), 30.8 (C-θ), 28.4 (C-η), 27.8 (C-ζ), 25.2 (CH3CONH-), 24.9 (CH3CONH”-)【００９６】
［実施例１］
＜多価配糖体のインフルエンザウィルス感染阻害評価＞
（１）  Ｏ結合型多価配糖体
上記のＯ結合型多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体である化合物７、化合物９、化合物１１、化合物１４、化合物１２及び化合物１６のインフルエンザウィルスに対する吸着評価として、コンフルエント状態となったＭＤＣＫ細胞を用いてヒトインフルエンザウィルス［Ａ／Ｋａｄｏｍａ／２／２００６（Ｈ３Ｎ２）］（１００ＰＦＵ／ウェル）に対するプラークアッセイを常法により行った。吸着は１時間行い、余剰のウィルス液を除去した後、１％寒天培地を重層化して３５℃４８時間の培養によりプラークを発生させた。プラークの数をカウントし、コントロール（インフルエンザウィルスのみをインキュベートしたもの）と比較し、各ペプチドに対するインフルエンザウィルス感染阻害率を計算した。ポジティブコントロールとして、タミフルを用いた。
結果を図１に示す。なお図１において、Ａ〜Ｇはそれぞれ以下のとおりである。
Ａ：化合物７、Ｂ：化合物９、Ｃ：化合物１１、Ｄ：化合物１４、Ｅ：化合物１２、Ｆ：化合物１６、Ｇ：タミフル。【００９７】
図１に示されるように、評価を行ったいずれの化合物、即ちＯ結合型多価配糖体も、糖シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖の糖鎖部の種類に拘わらず、インフルエンザウィルスの感染を阻害できることがわかる。
特に、四量体のアシアロ糖鎖配糖体の化合物１１と、シアロ糖鎖配糖体の化合物１４は、いずれの濃度でもタミフルよりも強い阻害率を示した。【００９８】
（２）  Ｎ結合型多価配糖体
上記のＮ結合型多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体である化合物Ｎ−１及び化合物Ｎ−２について、インフルエンザウィルスに対する吸着評価を行った。評価は、化合物種を変更した以外は上記（１）と同様にして、ヒトインフルエンザウィルス［Ａ／Ｋａｄｏｍａ／２／２００６（Ｈ３Ｎ２）］（１００ＰＦＵ／ウェル）に対するプラークアッセイにより行った。ポジティブコントロールとして、タミフルを用いた。
結果を図２に示す。なお図２において、Ｈ、Ｉ及びＧはそれぞれ以下のとおりである。
Ｈ：化合物Ｎ−１、Ｉ：化合物Ｎ−２、Ｇ：タミフル。【００９９】
図２に示されるように、評価を行ったいずれの化合物、即ちＮ結合型多価配糖体も、Ｏ結合型の化合物と同様に、インフルエンザウィルスの感染を阻害できることがわかる。【０１００】
また、Ｏ型配糖体及びＮ型配糖体について、上記評価に用いたインフルエンザウィルス［Ａ／Ｋａｄｏｍａ／２／２００６（Ｈ３Ｎ２）］とは別の株であるインフルエンザウィルス［Ａ／Ｎａｒｉｔａ／１／２００９（Ｈ１Ｎ１）］に対する阻害評価を行ったところ、Ｏ結合型アシアロ糖鎖配糖体である化合物１１、Ｏ結合型シアロ糖鎖配糖体である化合物１７、Ｎ結合型アシアロ糖鎖配糖体である化合物Ｎ−１及びＮ結合型シアロ糖鎖配糖体である化合物Ｎ−２で、５０％以上の感染阻害率を示すことがわかった。特に、化合物１１、化合物Ｎ−１及び化合物Ｎ−２の３種は、１００μｇ／ｍｌの化合物濃度で８０％以上の感染阻害率を示し、中でも化合物Ｎ−１及び化合物Ｎ−２は、１０μｇ／ｍｌの化合物濃度でも７０％以上の感染阻害率を示すことがわかった。【０１０１】
２０１０年３月４日に出願された日本国特許出願第２０１０−０４８４６３号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図１】
2011108471.tif 000025
【図２】
2011108471.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月6日(2012.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示されるシアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体を有効成分とするウィルス阻害剤。
【化１】
2011108471.tif 000027
（式（Ｉ）中、Ｗ１及びＷ２はそれぞれ水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基を表し、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基を表し、Ｙは、下記一般式（Ｙ−１）又は（Ｙ−２）で表される２価の連結基を表し、ｍは０又は１を表し、ｎは４の整数を表し、Ｚは下記（Ｚ−１）〜（Ｚ−３）のいずれか１つを表す。ただし、Ｗ１及びＷ２が共にＮ−アセチルノイラミン酸残基になることはない。）
【化２】
2011108471.tif 000028
（式（Ｙ−１）及び（Ｙ−２）中、Ｌ１は、炭化水素基、アミド結合を含む炭化水素基及びエーテル基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表し、Ｌ２はオキシアルキレン基、アミド基及びアルキレン基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表す。）
【化３】
2011108471.tif 000029
（式（Ｚ−３）中、ｐは１〜２０の整数を表す。）
【請求項２】
前記Ｌ１中の炭化水素基が炭素数１〜３０の炭化水素基である請求項１記載のウィルス阻害剤。
【請求項３】
前記Ｌ１が、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基又はこれらを２つ以上アミド結合で連結させたものである請求項１又は請求項２記載のウィルス阻害剤。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記Ｗ１及びＷ２がいずれも水酸基を表すアシアロ糖鎖配糖体である請求項１〜請求項３のいずれか１項記載のウィルス阻害剤。
【請求項６】
前記ウィルス阻害剤がインフルエンザウィルス阻害剤である請求項１〜請求項３及び請求項５のいずれか１項記載のウィルス阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜請求項３及び請求項５〜請求項６のいずれか１項記載のウィルス阻害剤を担体上に固定化させたウィルス吸着担体。
【請求項８】
請求項１〜請求項３及び請求項５のいずれか１項記載のウィルス阻害剤を患者へ投与することを含むウィルス疾患の治療又は予防方法。
【請求項９】
前記ウィルス疾患がインフルエンザウィルス疾患である請求項８記載のウィルス疾患の治療又は予防方法。
【請求項１０】
前記Ｙが、（Ｙ−１）である請求項１〜請求項３のいずれか１項記載のウィルス阻害剤。
【請求項１１】
前記Ｙが、（Ｙ−２）である請求項１〜請求項３のいずれか１項記載のウィルス阻害剤。
【請求項１２】
前記Ｗ１及びＷ２がそれぞれ水酸基である請求項１０項記載のウィルス阻害剤。
【請求項１３】
前記Ｗ１及びＷ２がそれぞれ水酸基である請求項１１項記載のウィルス阻害剤。
【国際調査報告】
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