(57)【要約】本発明は、生物活性画分の分離方法に従って、植物源Barleria prionitis linnから単離されたイリドイド配糖体、アセチルバーレリン（acetyl barlerin）およびシャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methyl ester）を本質的に含む生物活性画分の共力組成物を提供し、本発明は、前記共力生物活性組成物の、哺乳類の肝臓毒素、ストレスおよび免疫不全の治療への使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物Barleria prionitis linnから得られるイリドイド配糖体の生物活性画分を含み、前記生物活性画分が以下に示す成分を含み、患者に対する肝保護、抗ストレスならびに免疫促進特性を有する、新規共力剤組成物。
（ａ）バーレリン（barlerin）1.6-6.2％
（ｂ）アセチルバーレリン（acetyl barlerin）0.015-0.38％
（ｃ）シャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methyl esters）4.4-8.0％
（ｄ）薬学上許容できる添加物
【請求項２】
前記組成物が、四塩化炭素、アセトアミノフェンおよびガラクトサミンにより生じる肝損傷の治療に使用される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
CCl4で誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する好ましい投薬量が、20-200mg/kg（体重）である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
CCl4で誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、88％までである、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
アセトアミノフェンで誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する投薬量が、50-100mg/kg（体重）である、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
アセトアミノフェンで誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、86％までである、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
ガラクトサミンで誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する投薬量が、50-100mg/kg（体重）である、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
ガラクトサミンで誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、86％までである、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
哺乳類の抗疲労活性のための投薬量が、25-100mg/kg（体重）である、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳類の抗疲労活性のための好ましい投薬量が、50-100mg/kg（体重）である、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
哺乳類における前記抗疲労効果が80％以上である請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
免疫促進活性のための投与量が、50-100mg/kg（体重）である、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
免疫促進活性が70％までである請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、血清グルタミン酸-ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）の上昇レベルを約92％まで減少する、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、血清グルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）の上昇レベルを約74％まで減少する、請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、血清アルカリホスファターゼ（ALP）の上昇レベルを約88％まで減少する、請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、血清トリグリセリドの上昇レベルを約88％まで減少する、請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
ビリルビンの上昇レベルに対する前記組成物の肝保護活性が、約85.96％である、請求項１記載の組成物。
【請求項１９】
患者が哺乳類から選択される請求項１記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、単独または薬学上許容できるキャリアーと組合わせて使用される、請求項１記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、薬学上許容できる添加物、キャリアー、希釈剤、溶剤、フィルタ、潤滑剤、賦形剤、バインダーまたは安定化剤と組合わせて、患者に投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項２２】
所望の投与量が、予防および治療特性の両方のために投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物が、全身、経口、または、臨床／医療上許容できる方法によって投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項２４】
患者が、動物および哺乳類から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項２５】
以下の工程を含む、イリドイド配糖体（ａ）アセチルバーレリン（acetyl barlerin）（ｂ）バーレリン（barlerin）（ｃ）シャンシザイド  メチルエステル（shanzhiside methyl ester）を含む共力生物活性成分の調製方法。
（ａ）水性アルコールにより粉末状の植物材料を抽出する工程、
（ｂ）45℃までの温度で、減圧下、前記抽出物を濃縮する工程、
（ｃ）水と中程度の極性有機溶媒との間で、前記濃縮物を分配する工程、
（ｄ）生物活性成分を得るために、完全な乾燥度まで、45℃までの温度で水成分をエバポレートする工程。
【請求項２７】
前記水性アルコールが、エタノール、メタノールおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記水性エタノールおよび水性メタノールが、3：7〜1：9の範囲である、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記分配に使用する前記有機溶媒が、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、塩化メチレンおよび／または酢酸エチルからなる群から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
前記植物材料が、葉、枝および樹皮からなる気生部位（aerial parts）、またはそれらの混合物から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
前記生物活性成分を含む抽出物が、凍結乾燥機または薄膜エバポレーターを用いてエバポレートされる、請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
肝臓毒素、免疫不全およびストレスを持つ患者の治療への使用であり、前記使用が、選択された患者に、Barleria prionitis linnから抽出された植物源由来のイリドイド配糖体を含む生物活性画分の共力組成物を薬学的に効果的な投与量で投与する工程を含み、前記組成が、（ａ）バーレリン（barlerin）1.6-6.2％、（ｂ）アセチルバーレリン（acetyl barlerin）0.015-0.38％、および、（ｃ）シャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methyl esters）4.4-8.0％を含む、使用。
【請求項３３】
前記組成物が、四塩化炭素、アセトアミノフェンおよびガラクトサミンにより生じる肝損傷の治療に使用される、請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
CCl4で誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する投薬量が、20-200mg/kg（体重）である、請求項３２記載の使用。
【請求項３５】
CCl4で誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、88％までである、請求項３２記載の使用。
【請求項３６】
アセトアミノフェンで誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する投薬量が、50-100mg/kg（体重）である、請求項３２記載の使用。
【請求項３７】
アセトアミノフェンで誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、86％までである、請求項３２記載の使用。
【請求項３８】
ガラクトサミンで誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する投薬量が、50-100mg/kg（体重）である、請求項３２記載の使用。
【請求項３９】
ガラクトサミンで誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、86％までである、請求項３２記載の使用。
【請求項４０】
哺乳類の抗疲労活性のための投薬量が、50-100mg/kg（体重）である、請求項３２記載の使用。
【請求項４１】
哺乳類における前記抗疲労効果が80％以上である、請求項３２記載の使用。
【請求項４２】
免疫促進活性のための投与量が、50-100mg/kg（体重）である、請求項３２記載の使用。
【請求項４３】
免疫促進活性が70％までである、請求項３２記載の使用。
【請求項４４】
前記組成物が、血清グルタミン酸-ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）の上昇レベルを約92％まで減少する、請求項３２記載の使用。
【請求項４５】
前記組成物が、血清グルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）の上昇レベルを約74％まで減少する、請求項３２記載の使用。
【請求項４６】
前記組成物が、血清アルカリホスファターゼ（ALP）の上昇レベルを約88％まで減少する、請求項３２記載の使用。
【請求項４７】
前記組成物が、血清トリグリセリドの上昇レベルを約88％まで減少する、請求項３２記載の使用。
【請求項４８】
ビリルビンの上昇レベルに対する前記組成物の肝保護活性が、約85.96％である、請求項３２記載の使用。
【請求項４９】
病気の状態が、胃疾患または肝臓疾患から選択される、請求項３２記載の使用。
【請求項５０】
患者が哺乳類から選択される、請求項３２記載の使用。
【請求項５１】
前記組成物が、単独で、または、薬学上許容できるキャリアーと組合わせて使用される、請求項３２記載の使用。
【請求項５２】
前記組成物が、薬学上許容できる添加物、キャリアー、希釈剤、溶剤、フィルタ、潤滑剤、賦形剤、バインダーまたは安定化剤と組合わせて、患者に投与される、請求項３２記載の使用。
【請求項５３】
所望の投与量が、予防および治療特性の両方のために投与される、請求項３２記載の使用。
【請求項５４】
前記組成物が、全身、経口、または、臨床／医療上許容できる方法によって投与される、請求項３２記載の使用。
【請求項５５】
患者が、動物および哺乳類から選択される、請求項３２記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物活性画分の単離方法に沿って植物源Barleria prionitis linnから単離された、イリドイド配糖体：アセチルバーレリン（acetyl barlerin）およびシャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methyl ester）を必須成分とする生物活性成分の共力組成物に関する。本発明は、また、肝臓毒素、ストレスおよび免疫不全の哺乳類の治療のための、前記共力生物活性組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Barleria prionitis linn（キツネノマゴ科（Acanthaceae））は、インドの医薬の固有システムにおいて使用されている公知の植物である。そのほぼ全ての部分が、医薬として使用されている。葉は、利尿薬であり、尿感染や、麻痺発作、リュウマチ痛および胃の不調の治療に使用される。その苗は、防腐特性を有し、煎じ汁は、水腫の洗浄液として使用される。根は、歯痛や炎症性疾患に使用される。その樹皮は、百日咳に去痰剤として使用される（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００３】
この植物に関する化学的研究の初めての報告は、1970年、モリタらの、β-シトステロールの存在の報告である（非特許文献３）。ハルボーンら（Harborne et al. ）は、新鮮な花からのスクテラレイン-7-ラムノシルグルコシド（scutellarein -7-rhamnosyl glucoside）の単離を報告した（非特許文献４）。この化合物の構造は、後に、5,6,4'-トリヒドロキシ -7-0-ネオヘスペリドシルフラボン（neohesperidosylflavone）として修正された（非特許文献５）。葉や枝には、５つのイリドイド配糖体が存在する。これらのうち４つ、アセチルバーレリン（acetylbarlerin；6,8-ジ-O-アセチル シャンシザイド  メチルエステル（shanzhiside methyl ester））、バーレリン（barlerin；8-O-アセチル  シャンシザイド  メチルエステル（shanzhiside methyl ester））、シャンシザイド  メチルエステル（shanzhiside methyl ester）および6-O-アセチル  シャンシザイド  メチルエステル（shanzhiside methyl ester）が特定されている（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。
【０００４】
強い肝保護活性および免疫促進活性が、Picrorhiza kurroa viz. kutkinの根のイリドイド配糖体：picrosideおよびkutkoside（非特許文献９、非特許文献１０）、ならびにVitex negundo viz. のイリドイド配糖体：agnusideやnegundosides （特許文献１、特許文献２）により示されている。
【０００５】
Barleria prionitis（気生部位）についての詳細な化学的、薬理学的研究は、肝保護、免疫促進および抗ストレス活性を示す収率14％の生物活性画分の単離を導いた。
【非特許文献１】アソルカーら（L.V. Asolkar et al）、インド医薬植物用語辞典（Glossary of Indian Medicinal Plants）第２版 (second supplement)、カウンシル  フォー  サイエンティフィック  アンド  インダストリアル  リサーチ（Council for Scientific and Industrial Research (CSIR)）、ニューデリー、1992年、115頁。
【非特許文献２】ウェルス  オブ  インディア（Wealth of India）、ロウ  マテリアル、CSIR、ニューデリー、1988年、Vol. II B、47頁。
【非特許文献３】モリタら（Moitra, S.K. et al.）、Bull. Calcutta Sch. Trop. Med、1970年, 18,7。
【非特許文献４】ハルボーンら（Harborne, J.B. et al;）、phytochemistry、1971年, 10, 2822。
【非特許文献５】ネアーら（Nair, A.G. Ramchandran  et al.）、Ind. J.Chem.、1982年、21 B、1135。
【非特許文献６】タネジャ（Taneja, S.C.）、ティワリ（Tiwari, H.P.）、Tetrahedron Lett、1975年、1995年。
【非特許文献７】ダントフら（Damtoft , S. et al.）、ibid, 1982年、23,4155
【非特許文献８】エマリーら（Emary, N.A. et al.）、Bull Pharm. Sci. Assuit Univ. 1990年、13 (1)、65-72。
【非特許文献８】アンサリら（Ansari, R.A. et al.）、Indian J.  Med.  Research、1988年、87,401。
【非特許文献９】シャーマ（Sharma, M.L., Ph.D）、哺乳類における医薬植物の免疫促進活性の向上（Evaluation of immunomodulatory activity of some medicinal plants in mammals）、1991年、University of Jammu。
【特許文献１】インド特許178389/1997号（Suri , J.L.et al）
【特許文献２】インド特許明細書116/DEL/98（Banerjee, S.K. et al.）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（本発明の目的）
本発明の主目的は、植物源Barleria prionitis linnから単離された、イリドイド配糖体：アセチルバーレリン（acetyl barlerin）およびシャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methyl ester）を必須成分とする生物活性画分の共力組成物の提供である。本発明の他の目的は、前記生物活性画分の単離方法の提供である。さらに、本発明の他の目的は、肝臓毒素、ストレスおよび免疫不全の哺乳類の治療のための、前記共力生物活性組成物の使用の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、植物源Barleria prionitis linnから単離された、イリドイド配糖体：アセチルバーレリン（acetyl barlerin）およびシャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methyl ester）を必須成分とする生物活性生物の共力組成物に関する。本発明は、また、前記生物活性画分の単離方法を提供する。さらに、本発明は、肝臓毒素、ストレスおよび免疫不全の哺乳類の治療のための、前記共力生物活性組成物の使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、植物Barleria prionitis linnから得られるイリドイド配糖体の生物活性画分を含み、前記生物活性画分が以下に示す成分を含み、患者に対する肝保護、抗ストレスならびに免疫促進特性を有する、新規共力剤組成物を提供する。
（ａ）バーレリン（barlerin）1.6-6.2％
（ｂ）アセチルバーレリン（acetyl barlerin）0.015-0.38％
（ｃ）シャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methylesters）4.4-8.0％
（ｄ）薬学上許容できる添加物
【０００９】
本発明の一実施形態において、前記組成物は、四塩化炭素、アセトアミノフェンおよびガラクトサミンにより生じる肝損傷の治療に使用される。
【００１０】
本発明の他の実施形態において、CCl4で誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する好ましい投薬量が、20-200mg/kg（体重）である。また、本発明の他の実施形態において、CCl4で誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、88％までである。
【００１１】
本発明の他の実施形態において、アセトアミノフェンで誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する投薬量が、50-100mg/kg（体重）である。本発明の他の実施形態において、アセトアミノフェンで誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、86％までである。
【００１２】
本発明の他の実施形態において、ガラクトサミンで誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する投薬量が、50-100mg/kg（体重）である。本発明の他の実施形態において、ガラクトサミンで誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、86％までである。
【００１３】
本発明の他の実施形態において、哺乳類の抗疲労活性のための投薬量が、25-100mg/kg（体重）である。本発明の他の実施形態において、哺乳類の抗疲労活性のための好ましい投薬量が、50-100mg/kg（体重）である。本発明の他の実施形態において、哺乳類における前記抗疲労効果が80％以上である。
【００１４】
本発明の他の実施形態において、免疫促進活性のための投与量が、50-100mg/kg（体重）である。
【００１５】
本発明の他の実施形態において、免疫促進活性が70％までである。
【００１６】
本発明の他の実施形態において、前記組成物が、血清グルタミン酸-ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）の上昇レベルを約92％まで減少する。本発明の他の実施形態において、前記組成物が、血清グルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）の上昇レベルを約74％まで減少する。本発明の他の実施形態において、前記組成物が、血清アルカリホスファターゼ（ALP）の上昇レベルを約88％まで減少する。本発明の他の実施形態において、前記組成物が、血清トリグリセリドの上昇レベルを約88％まで減少する。本発明の他の実施形態において、ビリルビンの上昇レベルに対する前記組成物の肝保護活性が、約85.96％である。
【００１７】
本発明の他の実施形態において、患者が哺乳類から選択される。
【００１８】
本発明の他の実施形態において、単独または薬学上許容できるキャリアーと組合わせて使用される。本発明の他の実施形態において、前記組成物が、薬学上許容できる添加物、キャリアー、希釈剤、溶剤、フィルタ、潤滑剤、賦形剤、バインダーまたは安定化剤と組合わせて、患者に投与される。
【００１９】
本発明の他の実施形態において、所望の投与量が、予防および治療特性の両方のために投与される。本発明の他の実施形態において、前記組成物が、全身、経口、または、臨床／医療上許容できる方法によって投与される。本発明の他の実施形態において、患者が、動物および哺乳類から選択される。
【００２０】
本発明は、さらに、以下の工程を含む、イリドイド配糖体：（ａ）アセチルバーレリン（acetyl barlerin）（ｂ）バーレリン（barlerin）（ｃ）シャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methyl ester）を含む共力生物活性成分の調製方法を提供する。
（ａ）水性アルコールにより粉末状の植物材料を抽出する工程、
（ｂ）45℃までの温度で、減圧下、前記抽出物を濃縮する工程、
（ｃ）水と中程度の極性有機溶媒との間で、前記濃縮物を分配する工程、
（ｄ）生物活性生物を得るために、完全な乾燥度まで、45℃までの温度で水成分をエバポレートする工程。
【００２１】
本発明の一実施形態において、前記水性アルコールが、エタノール、メタノールおよびそれらの混合物からなる群から選択される。本発明の他の実施形態において、前記水性エタノールおよび水性メタノールが、3：7〜1：9の範囲である。
【００２２】
本発明の他の実施形態において、前記分配に使用する前記有機溶媒が、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、塩化メチレンおよび／または酢酸エチルからなる群から選択される。
【００２３】
本発明の他の実施形態において、前記植物材料が、葉、枝および樹皮からなる気生部位（aerial parts）、またはそれらの混合物から選択される。
【００２４】
本発明の他の実施形態において、前記生物活性成分を含む抽出物が、凍結乾燥機または薄膜エバポレーターを用いてエバポレートされる。
【００２５】
本発明は、さらに、肝臓毒素、免疫不全およびストレスを持つ患者の治療への使用であり、前記使用が、選択された患者に、Barleria prionitis linnから抽出された植物源由来のイリドイド配糖体を含む生物活性画分の共力組成物を薬学的に効果的な投与量で投与する工程を含み、前記組成が、（ａ）バーレリン（barlerin）1.6-6.2％、（ｂ）アセチルバーレリン（acetyl barlerin）0.015-0.38％、および、（ｃ）シャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methyl ester）4.4-8.0％を含む、使用を提供する。
【００２６】
本発明の他の実施形態において、前記組成物が、四塩化炭素、アセトアミノフェンおよびガラクトサミンにより生じる肝損傷の治療に使用される。本発明の他の実施形態において、CCl4で誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する投薬量が、20-200mg/kg（体重）である。本発明の他の実施形態において、CCl4で誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、88％までである。
【００２７】
本発明の他の実施形態において、アセトアミノフェンで誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する投薬量が、50-100mg/kg（体重）である。本発明の他の実施形態において、アセトアミノフェンで誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、86％までである。
【００２８】
本発明の他の実施形態において、ガラクトサミンで誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する投薬量が、50-100mg/kg（体重）である。本発明の他の実施形態において、ガラクトサミンで誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、86％までである。
【００２９】
本発明の他の実施形態において、哺乳類の抗疲労活性のための投薬量が、50-100mg/kg（体重）である。本発明の他の実施形態において、哺乳類における前記抗疲労効果が80％以上である。
【００３０】
本発明の他の実施形態において、免疫促進活性のための投与量が、50-100mg/kg（体重）である。本発明の他の実施形態において、免疫促進活性が70％までである。
【００３１】
本発明の他の実施形態において、前記組成物が、血清グルタミン酸-ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）の上昇レベルを約92％まで減少する。本発明の他の実施形態において、前記組成物が、血清グルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）の上昇レベルを約74％まで減少する。本発明の他の実施形態において、前記組成物が、血清アルカリホスファターゼ（ALP）の上昇レベルを約88％まで減少する。本発明の他の実施形態において、前記組成物が、血清トリグリセリドの上昇レベルを約88％まで減少する。本発明の他の実施形態において、ビリルビンの上昇レベルに対する前記組成物の肝保護活性が、約85.96％である。
【００３２】
本発明の他の実施形態において、病気の状態が、胃疾患または肝臓疾患から選択される。本発明の他の実施形態において、患者が哺乳類から選択される。
【００３３】
本発明の他の実施形態において、前記組成物が、単独で、または、薬学上許容できるキャリアーと組合わせて使用される。本発明の他の実施形態において、前記組成物が、薬学上許容できる添加物、キャリアー、希釈剤、溶剤、フィルタ、潤滑剤、賦形剤、バインダーまたは安定化剤と組合わせて、患者に投与される。
【００３４】
本発明の他の実施形態において、所望の投与量が、予防および治療特性の両方のために投与される。本発明の他の実施形態において、前記組成物が、全身、経口、または、臨床／医療上許容できる方法によって投与される。本発明の他の実施形態において、患者が、動物および哺乳類から選択される。
【００３５】
本発明は、さらに、以下に示す好ましい実施形態および実施例により説明される。
【００３６】
生物活性分画は、肝保護、免疫促進および抗ストレス活性を示す。多服用治療（経口）における公知の肝保護剤シリマリン（silymarin）と比較すると、パラセタモールにより誘導される、血清グルタミン酸-ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）、グルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）、血清アルカリホスファターゼ（ALP）の上昇レベルをシリマリンと同じ効果で減少することが明らかとなった。
【００３７】
類似する効果は、CCl4およびガラクトサミンの肝損傷の誘導についても観察される。加えて、生物活性画分の肝保護活性は、投与量100mg/kg/day(経口)の２週間の治療により、低酸素下での生存時間とスイミング生存時間（swimming survival time）を、それぞれ47.72％および82％まで増加する、注目すべき抗ストレス活性を示した。
【００３８】
また、細胞媒介の遅延型アレルギー（DTH）および体液応答（抗体力）の両方を、それぞれ69.5％、56.87％まで、ならびに公知の免疫抑制化学療法剤であるシクロホスファミドで処理した動物の免疫促進活性を33.3％まで刺激する、注目すべき免疫競争活性を示した。
【００３９】
本発明の方法は、以下の実施例により例示されるが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４０】
Barleria prionitis（1kg）の粉末状気生部位（葉および枝）を、抽出器に入れ、80％水性エタノール（４リットル）で処理し、室温で一晩放置した。その抽出液を排出し、残渣を、３回、それぞれ３Ｌの溶剤で、室温で一晩維持した状態で抽出処理を行った。合わせた抽出液を、45℃以下の浴温度に維持した薄膜エバポレーターを用いて、減圧下で濃縮する。水性濃縮物（500ｍｌ）を酢酸エチル（4×250ｍｌ）で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を100ｍｌの水で洗浄し、洗浄液を、水性濃縮物に混合した。そして、45℃以下、減圧条件下で、薄膜エバポレーターにより、完全に乾燥するまでエバポレートした（収率148ｇ）。この産物のＨＰＬＣ分析により、アセチルバーレリン（acetyl barlerin）0.37％、バーレリン（barlerin）6.12％およびシャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methyl ester）7.9％含むことがわかった。
【実施例２】
【００４１】
Barleria prionitis（気生部位、1kg）を粉末化し、その材料を抽出器に入れた。これに、80％水性エタノール（４リットル）を添加して、この混合液を、室温で一晩放置した。その抽出液を排出し、残渣を、３回、それぞれ３Ｌの溶剤で、室温で一晩維持した状態で抽出処理を行った。合わせた抽出液を、45℃以下、減圧下で500ｍｌに濃縮した。水性濃縮物（500ｍｌ）をクロロホルム（4×250ｍｌ）で抽出した。合わせたクロロホルム抽出物を100ｍｌの水で洗浄し、洗浄液を、水性濃縮物に混合し、45℃以下、薄膜エバポレーターにより、完全に乾燥するまでエバポレートした（収率150ｇ）。この産物のＨＰＬＣ分析により、アセチルバーレリン（acetyl barlerin）0.3％、バーレリン（barlerin）5.8％およびシャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methyl ester）7.5％含むことがわかった。
【実施例３】
【００４２】
Barleria prionitis（1kg）の細かい気生部位（葉および枝）を抽出器に入れ、一晩室温に維持して、80％水性エタノール（5リットル）で抽出を行った。この工程は、水性メタノール3リットルを用いて、３回繰り返し行った。合わせた抽出液を、45℃以下、減圧下（薄膜エバポレーター）、500ｍｌに濃縮した。水性濃縮物を酢酸エチル（4×250ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物を100ｍｌの水で洗浄し、洗浄液を、水性濃縮物に混合し、凍結乾燥機で、完全に乾燥するまでエバポレートした（収率169ｇ）。この産物のＨＰＬＣ分析により、アセチルバーレリン（acetyl barlerin）0.015％、バーレリン（barlerin）3.04％およびシャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methyl ester）6.22％含むことがわかった。
【００４３】
肝保護活性（H）は、下記式により算出される。ここで、ＴＣ、ＴＶおよびＶは、それぞれ、薬剤＋毒素、賦形剤＋毒素、および、賦形剤で処理した動物群である。
【００４４】
Ｈ＝［1−（ＴＣ−Ｖ/ＶＣ-Ｖ）］×100
【実施例４】
【００４５】
薬理研究は、Institute's animal houseにおける、両性、colony - bredである、Wisterシロネズミ（Wistar albino rats）(150-180g)とスイスシロマウス（Swiss albino mice）(25-30g)を用いた。入手した後、これらの動物は全て、それぞれのグループに分け、実験室に順応させるため一週間放置し、標準状態（23±2℃、相対湿度60-70％、光照射時間12時間）に維持した。これらの動物は、標準のげっ歯類用ペレット状の餌と水が自由に与えられた。一般的行動と急性毒性の研究に、各グループ１０匹の動物を使用する以外は、各グループ、６匹の動物を使用した。
【実施例５】
【００４６】
肝臓毒素
急性肝炎の原因となる肝臓毒素は、臨床的、生化学的および組織学的に、ウイルス性肝炎と極めて類似している。薬剤もまた、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬変および肝臓の様々な血管損傷のような慢性肝臓疾患の原因となる。多くの例において、薬剤が誘導する肝炎が、ウイルス肝炎と区別ができないことが判明している。実験研究のために化学的に誘導された肝損傷は、細胞死を引き起こし、または肝機能を変更するには十分である。急性肝損傷のメカニズムは、化学化合物や、使用する動物種に依存する。多くの化学物質が、実質的なダメージを与え、胆汁の流れを阻止、黄疸（cholretic injury）の原因となる。出願人は、CCl4、パラセタモールおよびD-ガラクトサミンで誘導される肝臓毒素に対する、肝保護活性について研究した。
【００４７】
四塩化炭素（CCl4）
最も強力な肝臓毒素（損傷の酷さという意味）の一つである。これは、急性ウイルス性肝炎と同様の臨床的特徴を有する生化学的変化を導く毒性壊死の原因となる（Vogel, 1977, Bramanti et. al., 1978, Agarwal 1983, Kumar et. al., 1992）。肝損傷は、液体パラフィンと混合したCCl4の投与によって起こる。動物には、急性の一回の治療についてはCCl4 の単一投与量(50 μl.kg-1, 経口)、多数回の治療にはCCl4 投与量(0.5 ml.kg-1, 経口)が投与された。胃への挿管法によって、経口投与された。コントロール動物は、当量の液体パラフィンが投与された。そのデータを表３および表４に示す。
【００４８】
パラセタモール(APAP；アセトアミノフェン)
これは、鎮痛剤／解熱剤として広く使用される治療剤である。大量に投与した場合、急性ウイルス性肝炎と同様の臨床的特徴を示す生化学的変化を導く肝壊死の原因となる(Proudfoot and Wright, 1970)。類似する効果は、動物において観察された(Potter et. al., 1973)。麻酔用エーテル吸入の後、数時間おくと、毒性効果は強化される(Wells et. al., 1985)。
【００４９】
密閉室における麻酔用エーテル吸入(4ml/4min/6animals)の後６時間で、標準食塩水（pH9.4）で腹腔内にパラセタモール(200mg.kg-1)を注入することにより、肝損傷を誘導させた。コントロール動物には、当量の賦形剤を注入した（表２）。
【００５０】
D-ガラクトサミン
これは、ラット肝臓において、臨床的にウイルス肝炎に類似する肝炎状態を誘導する毒素の一つである。GalNで肝損傷が誘導されるメカニズムは、広く研究されており、このモデルは、真のシステムの一つとして今日受入られている(Bauer et. al., 1974, Al-Tuwaijiri et. al., 1981; Zimmerman, H. J. 1978)(表１)。肝損傷は、GalN(300 mg.kg-1)を標準食塩水で皮下に注入することによって得られた。コントロール動物には、当量の賦形剤を注入した。
【実施例６】
【００５１】
生物活性化合物とシリマリン（silymarin）での治療
0.2％アラビアゴム添加標準食塩水に懸濁した新鮮な調製懸濁物（1〜5 %（w/v））を、毒性試験を除く全ての試験に使用した。前記毒性試験には、10 %（w/v）の懸濁液を使用した。シリマリン（ポジティブコントロールおよび他の関連する薬剤懸濁物（1〜5%,w/v））の0.2％アラビアゴム懸濁物を使用した。
【００５２】
以下のパラメーターについて研究した。
GPTおよびGOT：アミノ基転移反応により形成されたピルビン酸を、2,4-ジニトロフェニルヒドラジンとの反応後に測定した(Reitman and Frankel, 1957)。
ALP：アルカリ溶媒において形成されたｐ-ニトロフェノールを、基質としてｐ-ニトロフェニルリン酸を用いて、光学的に測定した(Walter and Schutt, 1974)。
ビリルビン：全ビリルビンを、NaNO2とのジアゾ化反応により測定した(Malloy and Evelyn, 1937)。
トリグリセリド：血清由来のトリグリセリドは、イソプロパノールで抽出し、KOHでケン化した。遊離グリセロールは、過ヨウ素酸塩によってホルムアルデヒドに変換され、アセチルアセトンと反応させた後に測定した。トレオレインは、標準として使用した(Neri and Firings, 1973)。
【実施例７】
【００５３】
一般的行動と急性毒性
異なる投与量(10, 30, 100, 1200, 1400, 1600, 1800 および 2000 mg.kg-1)の抽出物とTAFを、各グループの１０匹のマウスに経口投与した。同じ数のマウスである一つのグループをコントロールとした。動物について、１時間連続的に、それから３０分ごとに４時間、おおまかな行動変化および一般的な運動活性、よじり、痙攣、尾を挟むことに対する反応、かじり、起毛、瞳孔のサイズ、糞の排泄量、摂食行動等を観察した。そして、さらに72時間まで、死亡率を観察した。マウスの急性LD50値は、MillerとTainterの方法によって算出される(1944)。治療期間において肝保護活性を決定するために使用された全グループの動物の死亡率は、亜急性毒性のラフな指標としても記録された。
【００５４】
統計分析
得られたデータは、異なるグループと比較するためのANOVA(Armitage, 1987)およびコントロールと試験グループのDunnett's t テスト(Dunnett, 1964)を用いた統計分析を行った。処理前と処理後を比較するためのtwo tailed paired student t testと、コントロールと薬剤処理グループを比較するためのone tailed unpaired student t testが使用された(Ghosh, 1984)。ｐ値＜0.05は、重要な判定基準となる。
【実施例８】
【００５５】
免疫促進活性
アダプトゲン（強壮剤：adaptogen）は、健常者に強い免疫調節の影響を及ぼし、非特異的な免疫促進と考えられる。ストレスは、免疫機能を大きく低下させる原因である (Solomon et al, 1985; Harman, D., 1993)。我々の研究は、ストレスを受けている間、TAFは、免疫システムを生体サポートすることを示した（表１４）。これは、さらに、ラットにおける外傷を誘導するカラゲナンへの影響によりサポートされる(Swingle, 1974; Bowen and fauci, 1984,  Sternberg and Licinio, 1995.; Otterness and Bliven, 1985;)。カラゲナンで誘導される外傷の阻害は、化学メディエーターを中和する血管透過性を安定化させて血管膜を安定化することにより(Kumar et al, 1992)、また、応答に介在する免疫(体液と細胞とを介在する免疫)を刺激することにより (Arrigoni-Martelli and Bramm .1975 Arrigoni-Martelli et al 1976;)達成できる。免疫刺激活性は、抗原としてSRBCを使用するDTHモデルにおける効果によってサポートされ、第１および第２抗体合成の増強に関連する(Arrigoni-Martelli et al, 1976)（表、図１４）。
【００５６】
標準マウスにおける免疫刺激活性
８つのグループのマウスを使用した（表１４）。マウスは、０日目、薬剤処理した後１時間に、新しいヒツジ赤血球（SRBC；発熱因子が無い滅菌された大量の標準食塩水で洗浄）0.2ｍｌ（5×109 SRBC/ml）を腹腔内に注射することにより免疫された(Sharma et al, 1996)。そして、７日後、全ての動物の眼窩洞から少量の血液を採取し、一次抗体滴定のために血清を分離してから、同じ量のSRBC（腹腔内投与）を注射した。そして、１４日目、V型96ウェルミクロ滴定プレートにおけるserial two fold dilutionを用いた血球凝集方法(Nelson and Mildenhall, 1967)による２次抗体滴定のため、最後の投与がされた１時間後、再び全ての動物から血液を回収した。認識できる凝集を示す高い希釈が、抗体滴定として行われた。
【００５７】
免疫抑制されたマウスにおける免疫刺激活性
８つのグループのマウスを使用した。グループ１および３を除き、24時間ごとに２日間、シクロホスファミド（CY）250 mg kg-1（経口）を与えた。３日目、全ての動物を、薬剤処理した後1時間に、SRBC(0.2 mlの5×109 SRBC ml-1、腹腔内投与)で免疫させた(Sharma et al, 1996)。異なる投与量のテスト薬剤を標準食塩水に溶解し、賦形剤（標準食塩水）を３日目から７日目まで、２４時間ごとに１日一回経口投与した。７日目に、血球凝集方法(Nelson and Mildenhall, 1967)による抗体滴定(Sharma et al,1992)のため、最後の投与後１時間で、全ての動物から血液を回収した。凝集が認識できる高い希釈が、抗体滴定として行われた。
【００５８】
マウスにおける過敏症（DTH）反応の抑制
マウスは、0日目、20μｌの5×109 SRBC/mlを、右後足（foot pad）に皮下(s.c.)注射することにより感作され、７日目に、左後足（foot pad）に、同量のSRBC(i.d.)を注射した(Doherry, 1981)。各マウスの左後足（foot pad）の厚みは、注射後２４時間、スフェロミクロメーター（spheromicrometer：0.1ｍｍまで表示）を用いて測定し、それぞれのグループについて、「the mean ± S.E」として表した（表14）。
【００５９】
抗低酸素症効果
抗低酸素効果は、低酸素に対する大脳の抵抗力を向上または上昇させることや、急性低酸素における大脳の酸素消費を減少させることに関連する(Qu et al., 1988)。マウスが特定の期間、低酸素環境に曝された場合、マウスの心臓や脳細胞のミトコンドリアは、ひどくダメージを受け、ノルエピネフリン（NE）、ドーパミン（DA）、セロトニン（５-HT）およびアセチルコリン（Ach）のような脳神経伝達物質が、減少する。我々の結果は、TAF投与量が12.5-100mg.kg-1であれば（経口）、投与量に関連する方法において、低酸素時間が延長されることがわかった（表２）。その効果は、おそらく、低酸素に対する大脳の抵抗力を増加させ、急性低酸素での大脳の酸素消費を減少させることに関連している。急性低酸素におけるBFの保護作用は、脳下垂体-副腎下垂腺軸（pituitary-adrenal gland axis）におけるBFの作用による(Lu et al., 1988)。
【００６０】
様々な理由のストレス発現は、有害な変化の原因となり、体の標準機能を変化させ、労働効率を低下、疲労の増加、運動活性の低下および精神の抑うつを誘導する。真のアダプトゲンは、このような効果を戻すと解される(Brekhman, 1965, Brekhman, 1969)。行動の抑圧は、通常ストレスの結果であり(Solomon  et  al., 1985)、抗疲労活性は、セントラルNEおよび5-HT等の神経化学物質に大きく依存しているため、ストレスは、中枢ニュートロンの損傷を導く(Anisman et al., 1985)。我々の結果は、BFでのプレトリートメントが、労働効果を増加し、疲労を減少することを示している（表１）。
【００６１】
（実験モデル）
低酸素時間
マウスの６つのグループを使用した。15日目、処理後15時間で、低酸素時間を全ての動物についてそれぞれ測定した(Caillard et al, 1975)。動物は、電子時計を備える300ml容量の空のガラスジャーに入れた。前記ジャーは、グリースを塗ったガラスストッパーで気密状態にし、痙攣開始までの時間を記録した（表１３）。
【００６２】
スイミング行動時間
マウス７グループを使用した。15日目、処理後１時間、全ての動物のスイミング時間を、それぞれ測定した(Porsolt et al., 1977)。動物は、26±1℃に維持し、底から連続的に空気を流したperpexガラスビーカー（高さ30cm、直径20cm、高さ25cmまで水が入っている）内で泳がせた。マウスが10秒以上底にいる時を、水泳の持続時間の終了点をとした（表１）。
【００６３】
ストレスは、通常の身体機能を変化させる（Brekhman, 1965）。特別な装置において、動物を泳がせた場合、強壮活性の初期段階の後、精神抑うつ状態と似て、動かなくなり(Porsolt et al., 1977; Anisman et al., 1985)、ひどい疲労の原因となる。我々の結果は、おそらく神経筋の調整が維持されることによるスイミング行動と抗疲労活性の増加によって記録されたように、TAFでのプレトリートメントは、労働能率を増加し、疲労を低減することを示している(Anisman et al., 1985)（表１３）。
【００６４】
抗疲労効果
マウスは、回転棒に置き、トレーニングさせた。20r.p.m.の前記回転棒に、５日連日、3回連続のトライアルにおいて5分以上置いたマウスを用いて研究した。15日目、処理後１時間でストレスなしのコントロールを除き、全てのグループのマウスを、２時間連続でスイミングさせた。ティッシュペーパーで乾かした後、回転棒におかれたマウスについて、すぐに抗疲労および運動神経効果をモニターした(Dua et al., 1989)。180秒以上回転棒においたマウスの数は、完全な運動神経で疲れていないと考察される。各グループの効果％は、１グループにおける全反応又は無反応のような悉無性（quantal）反応により、180秒を超えて回転棒に置かれたマウスの数を基準として算出された。同じ動物を、再度抗疲労効果をモニターするために、スイミングバスから出し、30分間後、回転棒に再び置いた。スイミングさせていない２グループの動物が、同様に、抗疲労効果をモニターするために回転棒に置かれた（表１３）。抗ストレス活性が下記式より算出された。
【００６５】
A=[1-［（TS-V）/(VS-V)］]×100
【００６６】
Vは、賦形剤、TSおよびVSは、薬剤および賦形剤で処理した動物のグループをそれぞれ示す。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
（利点）
１．本発明は、肝保護、免疫強壮および抗ストレス特性を有する。生物活性組成物を提供する。
２．本発明は、マーカーとして使用される３つの化合物からなる共力組成物の調整方法が開示されている。
３．３つのマーカー化合物は、イリドイド化合物（すなわちアセチルバーレリン（acetyl barlerin）およびシャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methylesters））に属する。
４．本発明の方法により得られる共力生物活性組成物は、毒性を含まない。
５．本発明の方法は、植物の共力画分の最適収率を提供する。
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月24日(2004.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物Barleria prionitis linnから得られるイリドイド配糖体の生物活性画分を含み、前記生物活性画分が以下に示す成分を含み、患者に対する肝保護、抗ストレスならびに免疫促進特性を有する、新規共力剤組成物。
（ａ）バーレリン（barlerin）1.6-6.2％
（ｂ）アセチルバーレリン（acetyl barlerin）0.015-0.38％
（ｃ）シャンシザイド  メチルエステル（shanshizide methyl esters）4.4-8.0％
（ｄ）薬学上許容できる添加物
【請求項２】
前記組成物が、四塩化炭素、アセトアミノフェンおよびガラクトサミンにより生じる肝損傷の治療に使用される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
CCl4で誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する好ましい投薬量が、20-200mg/kg（体重）である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
CCl4で誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、88％までである、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
アセトアミノフェンで誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する投薬量が、50-100mg/kg（体重）である、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
アセトアミノフェンで誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、86％までである、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
ガラクトサミンで誘導される哺乳類の肝臓毒素に対する投薬量が、50-100mg/kg（体重）である、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
ガラクトサミンで誘導される哺乳類の肝臓毒素における肝保護活性が、86％までである、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
哺乳類の抗疲労活性のための投薬量が、25-100mg/kg（体重）である、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳類の抗疲労活性のための好ましい投薬量が、50-100mg/kg（体重）である、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
哺乳類における前記抗疲労効果が80％以上である請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
免疫促進活性のための投与量が、50-100mg/kg（体重）である、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
免疫促進活性が70％までである請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、血清グルタミン酸-ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）の上昇レベルを約92％まで減少する、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、血清グルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）の上昇レベルを約74％まで減少する、請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、血清アルカリホスファターゼ（ALP）の上昇レベルを約88％まで減少する、請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、血清トリグリセリドの上昇レベルを約88％まで減少する、請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
ビリルビンの上昇レベルに対する前記組成物の肝保護活性が、約85.96％である、請求項１記載の組成物。
【請求項１９】
患者が哺乳類から選択される請求項１記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、単独または薬学上許容できるキャリアーと組合わせて使用される、請求項１記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、薬学上許容できる添加物、キャリアー、希釈剤、溶剤、フィルタ、潤滑剤、賦形剤、バインダーまたは安定化剤と組合わせて、患者に投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項２２】
所望の投与量が、予防および治療特性の両方のために投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物が、全身、経口、または、臨床／医療上許容できる方法によって投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項２４】
患者が、動物および哺乳類から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項２５】
以下の工程を含む、イリドイド配糖体（ａ）アセチルバーレリン（acetyl barlerin）（ｂ）バーレリン（barlerin）（ｃ）シャンシザイド  メチルエステル（shanzhiside methyl ester）を含む共力生物活性成分の製造方法。
（ａ）水性アルコールにより粉末状の植物材料を抽出する工程、
（ｂ）45℃までの温度で、減圧下、前記抽出物を濃縮する工程、
（ｃ）水と中程度の極性有機溶媒との間で、前記濃縮物を分配する工程、
（ｄ）生物活性成分を得るために、完全な乾燥度まで、45℃までの温度で水成分をエバポレートする工程。
【請求項２６】
前記水性アルコールが、エタノール、メタノールおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２５記載の製造方法。
【請求項２７】
前記水性エタノールおよび水性メタノールが、3：7〜1：9の範囲である、請求項２５記載の製造方法。
【請求項２８】
前記分配に使用する前記有機溶媒が、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、塩化メチレンおよび／または酢酸エチルからなる群から選択される、請求項２５記載の製造方法。
【請求項２９】
前記植物材料が、葉、枝および樹皮からなる気生部位（aerial parts）、またはそれらの混合物から選択される、請求項２５記載の製造方法。
【請求項３０】
前記生物活性成分を含む抽出物が、凍結乾燥機または薄膜エバポレーターを用いてエバポレートされる、請求項２５記載の製造方法。
【請求項３１】
請求項１記載の組成物を含む肝損傷治療剤。
【請求項３２】
請求項１記載の組成物を含む肝保護剤。
【請求項３３】
請求項１記載の組成物を含む抗疲労剤。
【請求項３４】
請求項１記載の組成物を含む免疫促進剤。
【国際調査報告】
2005523301.tif 000002
2005523301.tif 000003
2005523301.tif 000004
2005523301.tif 000005
2005523301.tif 000006