(57)【要約】本発明は、サイトカイン産生に起因する炎症性疾患の治療用候補薬剤を選択するためのアッセイに関する。本発明のアッセイは、ａ）前記候補薬剤を腸細胞に接触させることと、ｂ）ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の核外移行或いは核内移行の変化、ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の転写活性の破壊、ｐ６５（ＲｅｌＡ）の特異的ヒストンアセチル化、腸細胞のサイトゾル内でのＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡ複合体量の変化、及び１以上のサイトカインのレベルの変化から成る群から選択される、前記候補薬剤の作用を解析することとを含む。更に本発明は、炎症性サイトカイン産生に伴う疾患の治療方法と、バクテロイデス・テタイオタオミクロン又はその一構成成分の治療有効量の使用とに関する。
2005510733.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン産生に起因する炎症性疾患の治療用候補薬剤を選択するためのアッセイであって、
ａ）前記候補薬剤を腸細胞に接触させることと、
ｂ）ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の核外移行或いは核内移行の変化、
ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の転写活性の破壊、
ｐ６５（ＲｅｌＡ）の特異的ヒストンアセチル化、
腸細胞のサイトゾル内でのＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡ複合体量の変化、及び
ＰＰＡＲγの核質内破壊から成る群から選択される、前記候補薬剤の作用を解析することを含むアッセイ。
【請求項２】
ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の核外移行の促進或いは核内移行の抑制、
ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の転写活性の破壊、
ｐ６５（ＲｅｌＡ）の特異的ヒストンアセチル化、
腸細胞のサイトゾル内でのＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡ複合体量の増加、及び
ＰＰＡＲγの核質内破壊から成る群から選択される少なくとも１つの作用を示す候補薬剤を選択する工程を更に含む、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
解析される候補薬剤の作用がＮＦ−κＢファミリーの転写因子の核外移行である、請求項１又は２に記載のアッセイ。
【請求項４】
解析される候補薬剤の作用が腸細胞のサイトゾル内でのＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡ複合体量の変化である、請求項１又は２に記載のアッセイ。
【請求項５】
ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＭＩＰ−２α及びＣｏｘ−２から成る群から選択される１以上のサイトカインのレベルに対する候補薬剤の作用を解析する工程を更に含む、請求項１又は２に記載のアッセイ。
【請求項６】
解析される候補薬剤の作用がＩＬ−８及び／又はＭＩＰ−２αのレベルの変化である、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項７】
腸細胞が細胞培養で維持される細胞株から得られるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記細胞株がＣａｃｏ−２細胞株である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項９】
動物に対してインビボで行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記動物が哺乳動物である、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１１】
公知の病原性細菌の存在下で行う、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記公知の病原性細菌がサルモネラ菌である、請求項１１に記載のアッセイ。
【請求項１３】
炎症性サイトカイン産生に伴う疾患の治療方法であって、
ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の核外移行或いは核内移行、
ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の転写活性の破壊、
ｐ６５（ＲｅｌＡ）の特異的ヒストンアセチル化、
腸細胞のサイトゾル内のＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡ複合体量、又は
ＰＰＡＲγの核質内破壊を調節することが可能な化合物の治療有効量を投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
前記化合物がＮＦ−κＢの転写活性を変化させることが可能な化合物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が腸細胞のサイトゾル内でＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡ複合体量を増加させることが可能な化合物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物の免疫系をホメオスタシスへ回復させ且つ維持させる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
炎症性疾患の治療のための請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアッセイによって選択された剤の使用。
【請求項１８】
炎症性疾患が腸細胞の炎症反応によって少なくとも一部引き起こされる疾患である、請求項１７に記載の剤の使用。
【請求項１９】
炎症性疾患が炎症性サイトカインの産生に伴う疾患である、請求項１７又は１８に記載の剤の使用。
【請求項２０】
炎症性疾患が、炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、関節リウマチ、免疫不全症候群、悪液質、多発性硬化症、ケラチノサイトの増殖、皮膚の過剰増殖及び炎症性障害、乾癬及び尋常性ざ瘡から成る群から選択される疾患である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の剤の使用。
【請求項２１】
薬剤としてのバクテロイデス・テタイオタオミクロン又はその一構成成分の使用。
【請求項２２】
炎症性疾患の治療のための請求項２１に記載のバクテロイデス・テタイオタオミクロン又はその一構成成分の使用。
【請求項２３】
腸細胞の炎症反応によって少なくとも一部引き起こされる炎症性疾患の治療のための請求項２１又は２２に記載のバクテロイデス・テタイオタオミクロン又はその一構成成分の使用。
【請求項２４】
炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、関節リウマチ、免疫不全症候群、悪液質、多発性硬化症、ケラチノサイトの増殖、皮膚の過剰増殖及び炎症性障害、乾癬及び尋常性ざ瘡から成る群から選択される炎症性疾患の治療のための請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のバクテロイデス・テタイオタオミクロン又はその一構成成分の使用。
【請求項２５】
バクテロイデス・テタイオタオミクロンを食品や座薬を用いて患者に投与する、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のバクテロイデス・テタイオタオミクロン又はその一構成成分の使用。
【請求項２６】
バクテロイデス・テタイオタオミクロンを経口投与する、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載のバクテロイデス・テタイオタオミクロン又はその一構成成分の使用。
【請求項２７】
バクテロイデス・テタイオタオミクロンを生菌の状態で投与する、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載のバクテロイデス・テタイオタオミクロン又はその一構成成分の使用。
【請求項２８】
炎症性疾患治療用薬剤の製造におけるバクテロイデス・テタイオタオミクロン又はその一構成成分の使用。
【請求項２９】
バクテロイデス・テタイオタオミクロン又はその一構成成分の治療有効量を投与する工程を含む、腸細胞の炎症反応の処置方法。
【請求項３０】
食品や座薬を用いてバクテロイデス・テタイオタオミクロンを生菌の状態で患者に投与する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
炎症性サイトカイン産生に伴う疾患の治療のための請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、関節リウマチ、免疫不全症候群、悪液質、多発性硬化症、ケラチノサイトの増殖、皮膚の過剰増殖及び炎症性障害、乾癬及び尋常性ざ瘡から成る群から選択される疾患の治療のための請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
バクテロイデス・テタイオタオミクロン又はその一構成成分の治療有効量を経口投与する、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染に対する腸の反応の調節、特にバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）を用いた調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の腸においては、数百種類の細菌がコロニーを形成し、この細菌の数は結腸、即ち、感染や炎症性疾患、癌を起こしやすい解剖学的部位において劇的に増加する。しかし、成長した動物においては、消化管内に常在する細菌叢によって感染に対する高い防御作用（コロニー形成耐性）(colonisation resistance)が存在する（ファン・デル・ワーイ（van der Waaij）、１９８４年；サルミネン（Salminen）ら、１９９８年）。その結果、この環境に遭遇する日和見病原菌の多くは足掛かりを築くことができなくなり、急速に排除される（ファン・デル・ワーイ（van der Waaij）、１９８４年；サルミネン（Salminen）ら、１９９８年）。しかし、共生細菌叢が損なわれている場合、日和見病原菌が腸内に存在し続けることがある。例えば、緑膿菌は通常ネズミの腸に存在し続けることはないが、抗生物質によって共生細菌叢が破壊されると、緑膿菌はコロニーを形成し、重篤な感染を引き起こす（ピア（Pier）ら、１９９２年）。また、共生細菌もサルモネラ菌等の悪性病原菌に対してある程度の防御作用をもたらす。しかし、このような悪性病原菌は、その存在する数が非常に多い場合、共生細菌叢の防御作用を克服したりその作用から免れたりして、重篤な感染を引き起こすことがある。
【０００３】
コロニー形成耐性（Colonisation resistance）は有害細菌の競合排除に一部起因するものであるが、この排除は、栄養素や基質を優先的に用いたり、或いは有害細菌が付着する可能性のある腸の部位を共生細菌叢によってブロックすることによって行われる。しかし、共生細菌が宿主の腸細胞及び免疫系を調節することもある（ブライ（Bry）ら、１９９６年；へリアス（Herias）ら、１９９８年、１９９９年；フーパー（Hooper）ら、２０００年、２００１年；セブラ（Cebra）、１９９９年；スネル（Snel）ら、１９９８年；タルハム（Talham）ら、１９９９年；ロペス−ボアド（Lopez-Boado）ら、２０００年；シュー（Shu）ら、２０００年；キャンベル（Campbell）ら、２００１年）。また、共生細菌叢は消化管を変化させ、この細菌叢にはよく適合するが他の細菌には適合しないニッチミクロ環境（niche microenvironments）を形成することがある。或いは、共生細菌叢は有害細菌に対する上皮細胞の反応を変化させ（キャンベル（Campbell）ら、２００１年）、これによってコロニー形成や浸潤を促進する変化を抑制することもある。
【０００４】
健康な腸は様々な細菌の負荷に対して低反応状態（hyporesponsive tone）を維持するが、閾値レベルの病原性細菌が存在すると、腸組織内での炎症誘発性遺伝子の発現を急速にアップレギュレートする転写系が十分に活性化される。こうして得られた転写物によって、一連の反応（例えば、腸の感染部位の粘膜固有層への多形核（ＰＭＮ）細胞の遊走）が引き起こされる。これらのイベントは細菌の排除には必須であるが、病状を悪化させ得る組織異変の原因にもなる。管腔内細菌が最初に接触する場所は、腸免疫系と接続する或いは遮断される上皮細胞の連続層である。腸上皮細胞が病原性細菌と非病原性細菌とを区別する能力は、コロニー形成細菌に対する有害で不適切な反応を防ぎ、腸を健康な状態に維持する上で極めて重要である。この区別機能は細菌認識系及び細胞シグナル伝達系に刷り込まれている。細菌細胞の表面構造の認識は、上皮細胞の先端側表面及び基底外側表面に発現するＴｏｌｌ様受容体の機能の１つであり、この受容体は核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）仲介による免疫活性化を引き起こす（ガーウィルツ（Gerwirtz）ら、２００１年）。従来、免疫抑制剤の活性に関連した受容体系については確認されていない。
【０００５】
ヒト共生細菌Ｂ．テタイオタオミクロンを無菌マウスに投与することによって、腸の成熟やバリア機能の発達に関連する重要な遺伝子の発現が引き起こされた（フーパー（Hooper）ら、２００１年）。この投与によって、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ−グリカンの腸内レベルも上昇し（ブライ（Bry）ら、１９９６年；フーパー（Hooper）ら、２００１年）、また、マトリリシンの腸内レベルも上昇した（ロペス−ボアド（Lopez-Boado）ら、２０００年）。また、Ｂ．テタイオタオミクロンは、サルモネラ菌を用いたインビトロチャレンジに対する上皮細胞の反応を変化させることも見出された（キャンベル（Campbell）ら、２００１年）。特に、炎症誘発経路の一部が抑制された（キャンベル（Campbell）ら、２００１年）。Ｂ．テタイオタオミクロンはこのような潜在的防御特性を有するが、ウェルシュ菌血清型Ａの感染に対する完全無菌マウスの耐性を増加させることはなかった（ユルドゥセフ（Yurdusev）ら、１９８９年）。しかし、このマウスをフソバクテリウム・ネクロジーン（ユルドゥセフ（Yurdusev）ら、１９８９年）及び非病原性クロストリジウム菌株ＣＩ（ユルドゥセフ（Yurdusev）ら、１９８６年）と併用してＢ．テタイオタオミクロンで処理すると、病原菌が腸から排除された。このことから、Ｂ．テタイオタオミクロン単独でも腸内の潜在的防御変化を誘発することが可能であるが、感染に対する全耐性を大幅に高めるためには他の共生菌株と協力して作用させる必要のあることが示唆された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明においては、非病原性細菌並びにＰＰＡＲγの核−細胞質内分布及び（ＮＦ−κＢ）の転写活性の双方による新規なメカニズムを明らかにする。
【０００７】
更に本発明は、炎症反応の調節のための非病原性細菌の使用に関する。更に本発明は、ＩκＢα仲介によるＲｅｌＡの搬出に影響を及ぼすｐ６５（ＲｅｌＡ）の特異的ヒストンアセチル化についての実証データと、ペルオキシソーム増殖因子によって活性化された受容体（ＰＰＡＲγ）の新規な作用モデルについての実証データとを提供する。特に本発明は、非病原性細菌を用いてＰＰＡＲγの核−細胞質内分布とＮＦ−κＢの転写活性とを変化させることによる上皮炎症性遺伝子発現の抑制について記載する。更に本発明は、炎症を軽減して疾患や炎症性障害を治療及び予防する手段を提供する。
【０００８】
本発明に記載の新規な経路を用いて炎症性サイトカインの産生を調節する新規な方法及び新規な製品をスクリーニングすることができる。更に、本発明は、炎症性サイトカインの産生を抑制し、免疫系をホメオスタシスへ回復させることにおける非病原性細菌の使用について記載する。
【０００９】
本明細書に記載の炎症性サイトカイン産生の調節は、公知の刊行物に記載のものとは多くの面で異なる。
【００１０】
米国特許第５，９２５，６５７号は、ＰＰＡＲγのアゴニストについて記載している。このアゴニストはチアゾリジンジオン、即ち、チオゾリジンジオン核に置換アリール部位が結合した化学的化合物である。本発明においては、非病原性細菌を用い、ＰＰＡＲγを直接活性化することにより炎症反応を軽減する。
【００１１】
ネイシュら（２０００年）は、ＩκＢαユビキチン化の阻害による上皮反応の調節について記載している。本発明とネイシュら（２０００年）の記載のものとでは、用いる作用モードが異なる。
【００１２】
ＩκＢα仲介によるＲｅｌＡの搬出に影響を及ぼすｐ６５（ＲｅｌＡ）の特異的ヒストンアセチル化についての実証データと、ペルオキシソーム増殖因子によって活性化された受容体（ＰＰＡＲγ）の新規な作用モデルについての実証データとを提供する。この新規なデータによって、炎症性サイトカインの産生を調節するための新規な手段及び新規な製品を考案する可能性が提供される。また、得られた結果のインビボでの検証についても記載する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、サイトカイン産生に起因する炎症性疾患の治療用候補薬剤を選択するためのアッセイを提供する。本発明のアッセイは、
ａ）候補薬剤を腸細胞に接触させることと、
ｂ）ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の核外移行或いは核内移行の変化、
ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の転写活性の破壊、
ｐ６５（ＲｅｌＡ）の特異的ヒストンアセチル化、
腸細胞のサイトゾル内でのＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡ複合体量の変化、及び
ＰＰＡＲγの核質内破壊から成る群から選択される、前記候補薬剤の作用を解析することを含む。
【００１４】
本発明のアッセイは、
ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の核外移行の促進或いは核内移行の抑制、
ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の転写活性の破壊、
ｐ６５（ＲｅｌＡ）の特異的ヒストンアセチル化、
腸細胞のサイトゾル内でのＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡ複合体量の増加、及び
ＰＰＡＲγの核質内破壊から成る群から選択される少なくとも１つの作用を示す候補薬剤を選択する工程を更に含んでもよい。
【００１５】
好ましい実施形態において、解析される候補薬剤の作用は、ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の核外移行又は腸細胞のサイトゾル内でのＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡ複合体量の変化である。
【００１６】
他の好ましい実施形態において、本発明のアッセイは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＭＩＰ−２α及びＣｏｘ−２から成る群から選択される１以上のサイトカイン（好ましくは、ＩＬ−８及び／又はＭＩＰ−２α）のレベルの変化を解析する工程を更に含む。
【００１７】
好適には、本発明のアッセイに用いる腸細胞は、細胞培養で維持される腸細胞株の形態を有する。適切な細胞株としてはＣａｃｏ−２細胞株が挙げられる。或いは、本発明のアッセイは、哺乳動物（例えば、マウス）等の適切な動物を用いてインビボで行うことができる。
【００１８】
任意的には、本発明のアッセイは、サルモネラ菌等の公知の病原性細菌の存在下で行ってもよい。
【００１９】
更に本発明は、炎症性サイトカイン産生に伴う疾患の治療方法であって、
ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の核外移行或いは核内移行、
ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の転写活性の破壊、
ｐ６５（ＲｅｌＡ）の特異的ヒストンアセチル化、
腸細胞のサイトゾル内のＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡ複合体量、又は
ＰＰＡＲγの核質内破壊を調節することができる剤の治療有効量を投与する工程を含む方法を提供する。
【００２０】
好ましくは、前記剤を炎症性疾患、特に腸細胞の炎症反応によって少なくとも一部引き起こされる疾患の治療に用いる。一般に、このような疾患は炎症性サイトカインの産生を伴う。好適には、前記剤はバクテロイデス・テタイオタオミクロン又はその一構成成分である。本明細書において「その一構成成分」とは、通常Ｂ．テタイオタオミクロンの一部を形成し、免疫反応を軽減させることのできるあらゆる部分（タンパク質やポリペプチド、糖、核酸等）を意味する。
【００２１】
更に本発明は、Ｂ．テタイオタオミクロン又はその一構成成分の薬剤としての使用を提供する。好ましくは、Ｂ．テタイオタオミクロン又はその一構成成分を炎症性疾患、特に腸細胞の炎症反応によって少なくとも一部引き起こされる炎症性疾患の治療に用いる。従って、本発明は、炎症性サイトカイン産生に伴う疾患や病態を軽減、予防又は治療するためのＢ．テタイオタオミクロンの使用を提供する。このような疾患や病態として、炎症性腸疾患（特にクローン病や過敏性腸症候群について言及する場合もある）や、関節リウマチ、免疫不全症候群、悪液質、多発性硬化症、ケラチノサイト増殖阻害、皮膚の過剰増殖及び炎症性障害の阻害（例えば、乾癬や尋常性ざ瘡が挙げられるが、これらに限定されない）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
更に本発明は、炎症性疾患治療用薬剤の製造におけるＢ．テタイオタオミクロンの使用を提供する。
【００２３】
更に本発明は、Ｂ．テタイオタオミクロン又はその一構成成分の治療有効量を投与することを含む、腸細胞の炎症反応の処置方法、或いは該反応を軽減する方法を提供する。
【００２４】
より詳細には、Ｂ．テタイオタオミクロン又はその一構成成分を用いて、ＮＦ−κＢ経路を破壊し、及び／又はｐ６５（ＲｅｌＡ）反応を阻害し、及び／又はＰＰＡＲγの刺激剤或いは阻害剤として作用させることができる。従って、Ｂ．テタイオタオミクロン又はその一構成成分を炎症性サイトカイン産生に伴う疾患の治療に用いることができる。
【００２５】
Ｂ．テタイオタオミクロンは食品や座薬を用いて生菌の状態で患者に投与することができる。
【００２６】
従って、本発明は、Ｂ．テタイオタオミクロン又はその一構成成分の治療有効量を投与する工程を含む、腸細胞の炎症反応を治癒させる方法について記載する。
【００２７】
ここに記載された病態を予防或いは治療するためには、適当な製剤やキャリア、賦形剤、希釈剤、安定剤を用いてＢ．テタイオタオミクロンを経口投与し、消化管の作用部位に優先的に供給する。このような供給手段としては、錠剤やカプセル剤等の固形製剤、ヨーグルトや飲料、懸濁剤等の液状製剤等の製剤が挙げられるが、これらに限定されない。優先的な供給手段の１つとして、Ｂ．テタイオタオミクロンを経口的に、好ましくは不都合なく胃の酸性環境を経由させて腸内の作用部位に供給する手段が挙げられる。Ｂ．テタイオタオミクロンはプレバイオティックと共に投与してもよい。
【００２８】
更に本発明は、本明細書に記載の新規な経路を介して炎症性サイトカイン産生をアゴニスト的或いはアンタゴニスト的に調節する可能性のある特定のリガンドをスクリーニングするための、ＰＰＡＲγの作用とＩκＢα仲介によるＲｅｌＡの搬出に影響を及ぼすｐ６５（ＲｅｌＡ）の特異的ヒストンアセチル化との新規モードを提供する。
【００２９】
更に本発明は、炎症性サイトカイン産生に伴う疾患の治療方法であって、ＮＦ−κＢの転写活性を変化させること或いは腸細胞のサイトゾル内のＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡ複合体量を増加させることが可能な化合物の治療有効量を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３０】
更に本発明は、哺乳動物の免疫系をホメオスタシスに回復させ維持させる方法であって、ＮＦ−κＢの転写活性を変化させること或いは腸細胞のサイトゾル内のＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡ複合体量を増加させることが可能な化合物の治療有効量を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３１】
本発明者らは、Ｂ．テタイオタオミクロンの抗炎症活性が、ＮＦ−κＢの核外移行の促進とサイトゾル内でのＰＰＡＲγ仲介による隔離とによって特徴づけられる全く新規な作用モードを伴うことを見出した。実験的検討（詳細は実施例に記載）は次の３段階で行った。
１）病原性／非病原性細菌への接触後のＣａｃｏ−２細胞内での炎症性サイトカイン遺伝子の発現。データはｃＤＮＡマクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ及びノーザンハイブリダイゼーション解析を用いて得た。
２）Ｂ．テタイオタオミクロンの抗炎症作用の生理学的妥当性のインビトロ（Ｃａｃｏ−２トランスウェル培養）及びインビボ（最少量細菌叢ラット）での検証。
３）ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１シグナル変換経路の解析、並びにサイトゾル内でのＲｅｌＡとＰＰＡＲγとの関係の解析。
【００３２】
実験的検討を行った結果、次の事項が示された。
１）Ｂ．テタイオタオミクロンによる調節の主なターゲットはＮＦ−κＢであり、ＡＰ−１ではない。
２）Ｂ．テタイオタオミクロン及び腸炎菌（S. enteritidis）で処理した細胞内にはｐ６５（ＲｅｌＡ）が蓄積する（最長３０分間検出した）。
３）Ｂ．テタイオタオミクロン存在下でのｐ６５の転写作用の低下は、ｐ６５の核外排除（移行）の促進に起因し、この核外移行はＬＭＢ感受性である（即ち、ｃｒｍ−１仲介による）。
４）データは全て、Ｂ．テタイオタオミクロンに起因する、炎症性サイトカイン／ケモカインの発現の低下、ＩκＢαの発現、ＰＭＮの補充、及びラットにおいてインビボで示された生理的低レベルの炎症に関連付けられる。
５）Ｂ．テタイオタオミクロンの存在下でＰＰＡＲγはサイトゾルに局在する。
６）ＰＰＡＲγとｐ６５がサイトゾル内に共存する場合、両者は物理的に結合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、非限定的な実施例と図面とを参照し本発明について更に説明する。
【００３４】
実施例１：Ｂ．テタイオタオミクロンとＢ．ブルガ−タス（B. vulgatus）の存在下及び非存在下で腸炎菌に接触したＣａｃｏ−２細胞の炎症反応
【００３５】
細菌による宿主炎症反応の調節についての実証データは、バクテロイデス・テタイオタオミクロンの存在下及び非存在下で共培養した腸炎菌にＣａｃｏ−２細胞を短時間接触させた後に炎症性遺伝子の発現を検討した結果から得た。ｃＤＮＡマクロアレイ技法（クロンテック、Ａｔｌａｓヒトサイトカイン／受容体アレイシステム）を用いて、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＭＩＰ−２α及びＣＯＸ−２を含む数種類の遺伝子を同定した。腸炎菌との接触後のこれら遺伝子の誘発はＢ．テタイオタオミクロンの存在により低下した。この結果はノーザンハイブリダイゼーション及びリアルタイムＰＣＲを用いて確認された（図１ａ、ｆ）。また、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＴＮＦ−α、ＰＭＡ、ＬＰＳ及び腸出血性大腸菌０１５７Ｈ７（図１Ｆ）を含む他の炎症性メディエータに対するＢ．テタイオタオミクロンの抗炎症活性についても検討した。Ｃａｃｏ−２細胞内でＩＬ−８発現を誘発したこれらリガンドの内、ＰＭＡ、腸炎菌及び大腸菌０１５７Ｈ７の作用のみがＢ．テタイオタオミクロンによって低下した。
【００３６】
上記検討に用いる実験条件の設定に当り、多くの最適化実験（時間経過、細菌量／増殖相、Ｃａｃｏ−２細胞継代／コンフルエンス検討を含む）を行った。重要な点は、細菌の増殖、付着及び浸潤が培養／共培養条件に影響を受けないことを立証し、これによってデータが特異的付着／浸潤に起因する可能性を排除したことである（図８参照）。
【００３７】
（１）非感染Ｃａｃｏ−２細胞、（２）１０８個の腸炎菌のみと共にインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞、（３）１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共にインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞、及び（４）１０９個のＢ．テタイオタオミクロンのみと共にインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞において炎症性遺伝子の発現を測定した。細菌の添加は２時間行った。細胞を洗浄し回収してｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡ（５μｇ）を、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＭＩＰ−２α、ＴＧＦ−β、ＣＯＸ−２及びＧ３ＰＤＨに特異的な３２Ｐ標識プローブを用いたノーザンハイブリダイゼーションによって解析した。
【００３８】
Ｂ．テタイオタオミクロンの作用を示す結果の一部は、フーパー（Hooper）ら（２００１年）によって報告された最近の分子解析と一致する。本発明者らによる結果は、ノーザンハイブリダイゼーション及びリアルタイムＰＣＲを用いて確認された。ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＭＩＰ−２α及びＣＯＸ−２のレベルは、腸炎菌チャレンジに呼応して有意に上昇した（図１ａ）。しかし、Ｂ．テタイオタオミクロンの存在下では、ＴＦＧ−βの場合を除き、これら遺伝子の全てにおいて発現レベルが低下した。ＴＦＧ−βの発現レベルは腸炎菌によって低下したが、Ｂ．テタイオタオミクロンの存在により対照値に維持された。これら両方の細菌の生残性及び増殖速度、並びに上皮細胞に付着し浸潤した腸炎菌の数については上述の処理の間で差がなく、培養手順による影響を受けなかった。
【００３９】
上記結果を立証する定量的データを図７に示すが、このデータは、ビヒクル（対照）、５×１０８個の腸炎菌（Ｓ．ｅ）、５×１０８個のＳ．ｅ及び１．５×１０９個のＢ．テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔ）、或いはＢ．ｔのみと共に２時間インキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞から精製したｍＲＮＡを用いて得た。ノーザンブロットをデンシトメトリーによって定量化し、Ｇ３ＰＤＨレベルに対して規準化した。また、ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、１８ＳｒＲＮＡレベルに対して規準化した（ｎ＝４  ＋／−標準偏差）。
【００４０】
炎症性サイトカイン発現の低下がＢ．テタイオタオミクロンに特異的なものかどうかを調べるため、関連する耐気性菌株であるＢ．ブルガ−タスについても検討した。
【００４１】
（１）と（２）については上述の様に処理を行い、更に、（３ａ）１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．ブルガ−タスと共にインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞、及び（４ａ）１０９個のＢ．ブルガ−タスのみと共にインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞を用いた。細菌の添加は２時間行った。
【００４２】
Ｂ．ブルガ−タスは抗炎症活性について陰性であった（図１ｂ参照）。
【００４３】
得られた結果において、上記共生菌株の両方によって誘発される炎症性遺伝子の発現が低かったことは、対数期後期の細菌を試験した事実に関連するかもしれないが、注目に値する。細菌細胞片を有しない対数期初期の細菌を用いれば、炎症反応を完全に抑制することができるであろう。従って、Ｃａｃｏ−２細胞を１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共に２時間或いは４時間インキュベートする実験を更に行った。ＩＬ−８発現に対するＢ．テタイオタオミクロンの阻害作用は長時間持続した（図１ｄ）が、ＴＮＦ−αの場合はこれとは対照的であった。この結果から、上記遺伝子の発現を調節するメカニズムはＢ．テタイオタオミクロンによって特異的に影響を受けることが示唆される。
【００４４】
Ｂ．テタイオタオミクロンによる炎症性サイトカインの抑制を示すデータの生理学的妥当性を、ＰＭＮ補充の機能性インビトロモデル及びインビボ腸炎菌ラット感染モデルを用いて確認した。インビトロ及びインビボでのＰＭＮ補充はミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を用いてモニターした。
【００４５】
Ｃａｃｏ−２細胞をインバーテッドトランスウェル（コーニング）に播種し、様々な組合せの細菌を該細胞の先端表面に添加した。新たに単離したヒトＰＭＮを該細胞の側底区画に添加し、該ＰＭＮの経上皮遊走をＭＰＯアッセイ（ネイシュ（Neish）ら、２０００年）で測定した。処理群（１〜４）については上述の通りである。細胞を２時間インキュベートした後、細菌を除去し新しい培地を添加した。細胞を更に２時間インキュベートした後、ＨＢＳＳで洗浄した。細胞と先端区画から得た培地とを１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｃ−１００に可溶化し、ＭＰＯを定量した。
【００４６】
多形核白血球（ＰＭＮ）補充アッセイのインビトロモデルから得た結果から、Ｂ．テタイオタオミクロンの抗炎症活性が確認された（図１ｅ）。
【００４７】
ラットの腸の腸炎菌感染が主に回腸、即ち、Ｂ．テタイオタオミクロンの棲息部位で起こることは注目に値する。
【００４８】
離乳したばかりの（２１日齢）最少量細菌叢ラット（通常の実験飼料で飼育）を２つの群に分け、一方のラット群を更に１０８ｃｆｕのＢ．テタイオタオミクロンを含む嫌気的に調製したゼリー（０．５ｇ／日）で１９日間飼育した。各群のラットの半数に対して１０８個の腸炎菌で経口チャレンジを行った。全てのラットにおける炎症反応の重症度を、腸炎菌感染後６日目に回腸粘膜内のＭＰＯレベルを測定することによって評価した。ラットに対して行った処理は次の通りである。（１）Ｂ．テタイオタオミクロン投与無し、腸炎菌投与無し、（２）Ｂ．テタイオタオミクロン投与無し、１０８個の腸炎菌投与、（３）Ｂ．テタイオタオミクロン投与に次いで１０８個の腸炎菌投与、及び（４）Ｂ．テタイオタオミクロンのみ投与。実験は少なくとも３回行ったが、いずれも同様の結果が得られた。
【００４９】
腸炎菌でチャレンジしたラットの回腸粘膜内のＭＰＯレベルは上昇した（ｐ＜０．００５）が、Ｂ．テタイオタオミクロンの先行経口接種及び細菌叢内での安定化によりＭＰＯレベルは有意に低下した（ｐ＜０．００１）（図１ｆ）。また、ＰＭＮ補充実験から、腸炎菌によって４００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−８タンパク質が培養上清内に４時間に亘り誘導されるが、Ｂ．テタイオタオミクロンの存在下で共培養した場合、ＩＬ−８タンパク質濃度は２３０ｐｇ／ｍｌに有意に低下することを見出した。Ｂ．テタイオタオミクロンによるコロニー形成は、腸組織の特異的プライマー増幅によって確認した。ＩＬ−８およびＭＩＰ−２αはＰＭＮ経上皮遊走に対する必須ケモカインである（マコーミック（McCormick）ら、１９９３年；ハング（Hang）ら、１９９９年）ため、Ｂ．テタイオタオミクロンの作用は、ＩＬ−８及びＭＩＰ−２αの転写の減少に起因し、この転写減少は次いで活性タンパク質の翻訳及び分泌に影響を及ぼす。ネイシュ（Neish）ら（２０００年）の記載と一致するが、本発明者らは、遺伝子発現を調節する宿主系を破壊する（subverting）ことにより非病原性細菌が免疫抑制作用を発揮し得ることを新規なモードシステムを用いて立証した。重要なのは、本発明者らによる知見がインビボでも検証されたことである。
【００５０】
上述したＭＰＯデータに加えて、図１０は、腸炎菌によって誘発される炎症反応時の筋細胞（muscle biology）に対するＢ．テタイオタオミクロンの防御作用の実証データを示す。
【００５１】
実施例２：Ｂ．テタイオタオミクロンは、ＮＦ−κＢ及びＰＰＡＲγタンパク質の細胞内分布と活性化状態を変化させることによって炎症を軽減し、また、ＮＦ−κＢシグナル変換経路を標的破壊する。
【００５２】
転写因子のＮＦ−κＢファミリーは炎症反応の調節において中心的役割を果たす。これらのタンパク質は、Ｒｅｌ相同ドメインと称される高いＮＨ２末端保存配列を共有するが、この配列は、タンパク質のサブユニット二量体化、ＤＮＡ結合、及び阻害性ＩκＢタンパク質との相互作用に必要である。ＮＦ−κＢを誘発するシグナルは阻害性ＩκＢタンパク質（Ｓｅｒ−３２及びＳｅｒ−３６ではＩκＢα）のリン酸化を引き起こし、次いでユビキチン化とプロテオソーム仲介による分解とをターゲットとする。これによって、ＲｅｌＡ（ｐ６５）等のＲｅｌタンパク質は遊離し、核に転位しＤＮＡを結合する。
【００５３】
非感染Ｃａｃｏ−２細胞（１）を１０８個の腸炎菌のみ（２）、１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロン（３）、及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロンのみ（４）と共にそれぞれ２時間インキュベートした。細胞を４％パラホルムアルデヒドに室温で３０分間固定し、０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１０００を用いて４℃で透過処理し、間接免疫蛍光顕微鏡検査法にて試験した。一次抗体（サンタクルズ）：抗ＲｅｌＡ［ＮＦ−κＢ  ｐ６５］（Ａ〜Ｄ）、抗ＰＰＡＲγ（Ｅ〜Ｈ）、抗ＩκＢα（Ｉ〜Ｌ）及び抗ｐκＢα（Ｍ〜Ｐ）。二次抗体：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ種特異的抗ＩｇＧ（モレキュラープローブ）。
【００５４】
Ｃａｃｏ−２細胞を腸炎菌に接触させることによって一連のイベントが引き起こされ、その結果、ＲｅｌＡの核への転位が促進されることが判明した（図２Ｂ）。
【００５５】
特筆べき点として、Ｂ．テタイオタオミクロンによってＲｅｌＡの核への転位が無くなることが見出されたが、Ｂ．テタイオタオミクロンへ２時間接触させた後、ほぼ全てのＲｅｌＡはサイトゾルに局在した（図２Ｃ、Ｄ）。
【００５６】
ＩκＢαのリン酸化と、重要なこととしてのＩκＢαの分解は、Ｂ．テタイオタオミクロンの存在下及び非存在下での腸炎菌への接触後に観察された（図２Ｇ）。２時間の接触後、特に腸炎菌のみに接触させた細胞と腸炎菌及びＢ．テタイオタオミクロンに接触させた細胞において、ＩκＢαのｍＲＮＡ（図３Ｂ）及びＩκＢαタンパク質（図２Ｊ、Ｋ）のレベルが上昇したが、このことは転写活性ＮＦ−κＢの存在を示している（チェン（Cheng）ら、１９９４年；チャオ（Chiao）ら、１９９４年）。
【００５７】
生残Ｂ．テタイオタオミクロンは、ＮＦ−κＢタンパク質の転写活性を選択的に妨害するが、ＡＰ−１タンパク質の合成やリン酸化には影響を及ぼさない。
【００５８】
（１）非感染Ｃａｃｏ−２細胞、（２）１０８個の腸炎菌と共に２時間インキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞、（３）１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共に２時間インキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞、及び（４）１０９個のＢ．テタイオタオミクロンのみと共に２時間インキュベートしたＣａｃｏ−２細胞から得た核抽出物を、ＲｅｌＡ［ＮＦ−κＢ  ｐ６５］特異的抗体（サンタクルズ）と共にインキュベートし、この抽出物に対してスーパーシフトＥＭＳＡを行った。上記Ｂ．テタイオタオミクロンはＣａｃｏ−２細胞へ添加する前に７０℃、１５分で熱失活させた。
【００５９】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって、ＲｅｌＡが腸炎菌により活性化される主要なサブユニットであることが確認された（図３Ａ）が、ｐ５２の活性化レベルが低いことも明らかになった（データは図示せず）。次に、本発明者らは、Ｂ．テタイオタオミクロンがＮＦ−κＢシグナル変換経路を破壊することによって、腸炎菌により引き起こされる免疫反応メディエータの産生を低下させるという仮説を立てた。
【００６０】
同様の実験を行った結果を図９Ａに示すが、Ｃａｃｏ−２細胞内で腸炎菌に接触後２時間でｐ６５の活性化はピークに達することがＥＭＳＡスーパーシフトにより示された。レーン１：タンパク質無し、レーン２、５、８、１１：対照細胞から得た核抽出物、レーン３、６、９、１２：Ｓ．ｅ．を感染させた細胞から得た核抽出物、レーン４、７、１０、１３：Ｓ．ｅ．を感染させｐ６５（ＲｅｌＡ）抗体でスーパーシフトさせた細胞から得た核抽出物。
【００６１】
更に、熱失活していない生残Ｂ．テタイオタオミクロンによってＲｅｌＡ反応が阻害されることが示された（図３Ａ）。また、培養上清及び調製培地（Ｂ．テタイオタオミクロンに接触させたＣａｃｏ−２細胞から得た培地）のいずれも生物活性を有しないことも示された（データは図示せず）。このことから、上皮細胞への接触がＢ．テタイオタオミクロンの抗炎症活性には必須であることが示唆される。腸炎菌に接触させてから２０分以内に、Ｂ．テタイオタオミクロンの存在下及び非存在下でＩκＢαのリン酸化及び分解を観察した（データは図示せず）。また、検討対象細菌株の生残性、増殖、付着及び浸潤は培養処理による影響を受けなかった（データは図示せず）。従って、上記観察された作用は受容体認識及び活性化の差には起因しないと考えられる。
【００６２】
上記と同じ実験群（１〜４）を用いて、細菌の添加を２時間行った後、ｍＲＮＡをノーザンハイブリダイゼーションで解析し、ブロットを特異的３２Ｐ標識ＩκＢα及びＧ３ＰＤＨプローブを用いて試験した。ＩκＢαのｍＲＮＡ（図３Ｂ）及びＩκＢαタンパク質（図２Ｊ、Ｋ）のレベルはいずれも上昇した。このレベルの上昇は、ＩκＢαタンパク質の新生合成を誘発するＲｅｌＡの転写活性に起因するものとされる（チェン（Cheng）ら、１９９４年）。ＩκＢαは次いで核に侵入しＲｅｌＡと結合し、ＲｅｌＡをＤＮＡプロモーター部位から除去する（アレンザナ−セイスデドス（Arenzana- Seisdedos）ら、１９９５年）。興味深いことに、ＰＰＡＲα仲介によるＩκＢα合成の刺激についても報告されている（デレライブ（Delerive）ら、２０００年）。一過性のＲｅｌＡ転位がＢ．テタイオタオミクロンで処理した細胞内で起こるかどうかを更に調べるため、ＣＲＭ−１依存型核外移行の特異的阻害剤であるレプトマイシンＢ（ＬＭＢ）を用いて実験を行った。Ｒｅｌタンパク質（例えば、ｐ６５）の細胞質内での位置はＲｅｌＡ／ＩκＢα複合体のＣＲＭ−１依存型核外移行によって維持される（ファン（Huang）ら、２０００年；タム（Tam）ら、２０００年）というのが理論的根拠である。ＬＭＢによってＲｅｌＡが腸炎菌及びＢ．テタイオタオミクロンの両方と共培養した細胞の核内に蓄積することを見出したが（結果は図示せず）、このことは、Ｂ．テタイオタオミクロンの存在に関係なく、核への一過性ＲｅｌＡ転位が起こることを示している。この結果は、腸細胞を細菌へ初期接触させた後のサイトゾル内のＩκＢα／ＲｅｌＡ複合体のリン酸化及びユビキチン化、並びにＩκＢα遺伝子発現の活性化と一致する。
【００６３】
実施例３：Ｂ．テタイオタオミクロンはＰＰＡＲγの核−細胞質間輸送を誘発させ、ＲｅｌＡを隔離する。
【００６４】
非病原性細菌による免疫抑制についての最近の報告によると、その抑制メカニズムはＩκＢαのユビキチン化及び分解の阻害に起因するものとされている（ネイシュ（Neish）ら、２０００年）が、このことは本発明者らによるモデル系には明らかに適用されない。腸炎菌及びＢ．テタイオタオミクロンの両方と共培養した細胞におけるＮＦ−κＢ複合体のサイトゾル内での主な位置は、ＩκＢα仲介による核外移行が核内局在化よりも効率よく起こることから説明されるであろう。腸炎菌及びＢ．テタイオタオミクロンの両方で処理した細胞の核内でのＩκＢαタンパク質のレベルは、腸炎菌のみで処理した場合に比べて若干高いが、このことはＮＦ−κＢの不活化を促進し、Ｂ．テタイオタオミクロンの全抗炎症特性に寄与する可能性がある。しかし、ＲｅｌＡの特異的脱アセチル化がより適切な説明となる。核内ＲｅｌＡ活性化の継続時間が可逆的アセチル化によって測定されることが最近報告されている（チェン（Chen）ら、２００１年）。アセチル化されたＲｅｌＡはＩκＢαに対する親和性が低いが、ヒストンデアセチラーゼ３（ＨＤＡＣ３）でＲｅｌＡを脱アセチル化することにより、ＩκＢαへの結合が促進され、ＣＲＭ−１仲介によるＲｅｌＡの核外移行が促進される。本発明者らは、Ｂ．テタイオタオミクロンがＨＤＡＣ３のＲｅｌＡとの結合を促進することを示した（図４Ｇ）。ヒストンデアセチラーゼの特異的阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を用いた実験を行った。その結果、ＴＳＡ処理（８００ｎＭ、４時間）に呼応してＨＤＡＣが阻害され、腸炎菌のみで処理した細胞においてｐ６５が部分的に蓄積し、重要なこととしてＰＰＡＲγのサイトゾルへの移行が促進されることが示された。得られたデータから、Ｂ．テタイオタオミクロン処理細胞内でのｐ６５及びＰＰＡＲγの核外移行を促進する上でアセチル化／脱アセチル化が重要な役割を果たしていることが裏付けられた（図１１参照）。
【００６５】
更に、ＲｅｌＡとペルオキシソーム増殖因子によって活性化された受容体γ（ＰＰＡＲγ）タンパク質とが同じ細胞区画に共存することが分かった（図２Ｃ、Ｇ）ため、本発明者らは、Ｂ．テタイオタオミクロン処理細胞内での更なるＲｅｌＡ核内転位を制限する重要なメカニズムはＰＰＡＲγによるＲｅｌＡのサイトゾル内隔離を伴うという仮説を立てた。この仮説を裏付ける実験的証拠を以下に示す。
【００６６】
ＡＰ−１複合体は炎症性遺伝子発現の調節において重要な役割を果たし、増殖因子やサイトカイン、細菌等の様々な細胞外刺激剤によって急速に活性化される（マイヤー−テア−フェーン（Meyer-ter-Vehn）ら、２０００年）。本発明者らは、Ｂ．テタイオタオミクロンの阻害作用がこのシグナル伝達経路まで及ぶかどうかを調べた。ＡＰ−１活性は２つの主要なメカニズム、即ち、プロトオンコジーンファミリーのホモ及びヘテロ二量体から成るＡＰ−１サブユニットの発現の上昇と該サブユニットのリン酸化とによって調節される。プロトオンコジーンファミリーとしては、Ｆｏｓ（ｃ−Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ−１及びＦｒａ−２）、Ｊｕｎ（ＪｕｎＢ、ｃ−Ｊｕｎ及びＪｕｎＤ）及びＡＴＦ（ＡＴＦ２、ＡＴＦ３／ＬＲＦ２及びＢ−ＡＴＦ）が挙げられ、メンバーは全てＤＮＡ結合タンパク質のロイシンジッパーファミリーである。これらのタンパク質は、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼと総称される３種類の関連キナーゼによって主に制御される。ｐ４２及びｐ４４（細胞外シグナル調節キナーゼ；ＥＲＫ）キナーゼ、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）／ストレス活性化プロテイン（ＳＡＰ）キナーゼ及びｐ３８キナーゼのタンパク質リン酸化のレベルが腸炎菌及びＢ．テタイオタオミクロンに呼応して変化するかどうかを調べた。腸炎菌によってｐ３８ＭＡＰキナーゼは活性化されるが（図３Ｃ）ＥＲＫやＪＮＫは試験時に活性化されない（結果は図示せず）ことを見出した。この知見は、ｐ３８が炎症性刺激剤によって急速に活性化され（レインギュード（Raingeaud）ら、１９９６年）、一方、ＪＮＫの活性化はもっと遅い時点で起こる（クジメ（Kujime）ら、２０００年）という事実と一致する。ｐ３８の活性化によってｅｌｋ−１のリン酸化が引き起こされ、ｅｌｋ−１は血清反応因子と共にｃ−ｆｏｓプロモーター内の血清反応成分に結合し、ｃ−ｆｏｓの転写及び翻訳を促進するが、これは遺伝子及びタンパク質レベルの変化によって示される（図３Ｄ、Ｅ）。腸炎菌によって誘発されるｐ３８のリン酸化はＢ．テタイオタオミクロンを用いた共培養によって変化しないことが見出した。メッセージレベル及びタンパク質レベルはいずれも腸炎菌及びＢ．テタイオタオミクロンに呼応して上昇し、ｃ−ｆｏｓ遺伝子発現への作用は相加的なものであることが分かった。デノボｃ−Ｆｏｘ合成によって、１０倍のＤＮＡ結合親和性を有するＪｕｎ−Ｆｏｓへテロ二量体が形成され、ＡＰ−１活性が増加する（ムスティ（Musti）ら、１９９７年；スミール（Smeal）ら、１９９１年）。ＡＴＦ−２もｐ３８ＭＡＰキナーゼ及びＪＮＫシグナル変換経路の標的である。転写因子ＡＴＦ−２はｐ３８ＭＡＰキナーゼによりＴｈｒ−６９及びＴｈｒ−７１上でリン酸化される。一方、ＪＮＫはＡＴＦ−２及びｃ−Ｊｕｎの両方をリン酸化し活性化する。従って、ＡＴＦ−２とｃ−Ｊｕｎは違った形でｐ３８及びＪＮＫシグナル変換経路によって調節される（レインギュード（Raingeaud）ら、１９９６年）。本発明者らの検討においては、ｃ−Ｊｕｎタンパク質レベルの上昇とｃ−Ｊｕｎリン酸化状態は腸炎菌及びＢ．テタイオタオミクロンのいずれにも呼応しなかったが、このことは、腸炎菌に呼応するＡＴＦ−２のリン酸化（図３Ｆ）を誘発しやすいのはｐ３８ＭＡＰキナーゼであってＪＮＫではないことを示している。以上のデータはｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性に対する腸炎菌の直接の作用と一致する。腸炎菌に呼応してｃ−ｊｕｎ遺伝子転写を刺激するｃ−Ｊｕｎ／ＡＴＦ−２ヘテロ二量体の形成はＡＴＦ−２の活性化によって引き起こされやすい（図３Ｄ）。Ｂ．テタイオタオミクロンの抗炎症作用はＮＦ−κＢ経路を選択的にターゲットとすることが分かるが、これにより、ＮＦ−κＢに対して絶対条件を有する遺伝子（例えば、ＩＬ−８）（ムカイダ（Mukaida）ら、１９９４年；エリオット（Elliott）ら、２００１年）がＢ．テタイオタオミクロンによる阻害に対し特に敏感である理由が説明される。
【００６７】
実施例４
非病原性細菌による免疫抑制のメカニズムを更に調べるため、本発明者らは、先ず、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０及びＴＧＦ−βについて検討した。ＩＬ−１０遺伝子発現はＢ．テタイオタオミクロンを用いた処理には影響を受けなかった（データは図示せず）が、このことは構成タンパク質が関与する可能性を排除するわけではない。抗炎症性サイトカインＴＧＦ−βが関与する可能性を示すデータから多少の示唆が得られた。しかし、この短時間の検討の時間経過においてはデノボサイトカイン合成は恐らく十分に行われてないので、ＴＧＦ−βが炎症反応をダウンレギュレートするように作用しているとすれば、ＴＧＦ−βは長期の抗炎症作用に関与している可能性が高い。
【００６８】
ＰＰＡＲが炎症プロセスの重要なモジュレータとして浮上してきた（ナカジマ（Nakajima）ら、２００１年）。ＰＰＡＲはリガンド活性転写因子であり、ヘテロ二量体のパートナーとしてのレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と共に、ＰＰＡＲ反応成分（ＰＰＲＥ）と称される特異的ＤＮＡ配列成分に結合し、遺伝子発現を調節する。しかし、最近の研究から、ＡＰ−１及びＮＦ−κＢ仲介による遺伝子発現を調節する上でＰＰＡＲγのリガンド活性化が重要であることが示唆された（スー（Su）ら、１９９９年）。本発明者らは、Ｂ．テタイオタオミクロンによるＮＦ−κＢの調節におけるＰＰＡＲの役割について調べた。腸炎菌とＢ．テタイオタオミクロンの両方に接触させた細胞内でＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγのｍＲＮＡが減少すること（図４Ａ）、そして、特異的ＰＰＡＲγリガンドである１５−デオキシΔ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）に接触させた細胞内でもｍＲＮＡが減少する一方で、特異的ＰＰＡＲαリガンドであるフェノフィブラートに接触させた細胞内ではｍＲＮＡが減少しないこと（図５Ｂ）を示すことができたが、この知見は受容体活性化と一致する。従来、ＰＰＡＲγの活性化は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＰＰＡＲγのｍＲＮＡ及びタンパク質のダウンレギュレーションを伴うものとされていた（キャンプ（Camp）ら、１９９９年）。本発明者らは更に、１５ｄ−ＰＧＪ２及びシグリタゾンを用いて、生理学的と考えられる濃度範囲に亘って腸炎菌による炎症性サイトカイン発現の活性化が低下することを示した（図４Ｃ、Ｄ）。１５ｄ−ＰＧＪ２がＩκＢキナーゼを直接阻害できる（シュトラウス（Straus）ら、２０００年）ものとして、ＰＰＡＲγの２種類のリガンドについて試験した。１５ｄ−ＰＧＪ２及びシグリタゾンのいずれもヒト腸上皮細胞におけるＡＰ−１及びＣＯＸ−２誘発を阻害することが報告されており（サバラマイア（Subbaramaiah）ら、２００１年）、また、これらは結腸炎の処置においても治療上の利点を有する（スー（Su）ら、１９９９年）。本発明者らは、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲαのリガンドが腸炎菌仲介によるサイトカイン誘発を低下させることができることを見出した（図４Ｃ、Ｄ、Ｅ）。この結果は、最近示されたＰＰＡＲγアゴニストに関する報告、即ち、Ｈ．ピロリ（H. pylori）で処理した胃上皮細胞におけるＮＫ−κＢ及びＩＬ−８の発現がＰＰＡＲγアゴニストによって低下すること（グプタ（Gupta）ら、２００１年）、また、虚血再灌流誘発型腸障害におけるＰＭＮの浸潤がＰＰＡＲγアゴニストによって阻害されること（ナカジマ（Nakajima）ら、２００１年）と一致する。
【００６９】
ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲαアゴニストの作用について述べてきたが、結腸粘膜ではＰＰＡＲγの発現レベルがＰＰＡＲαに比べて遥かに高いことが示されている（マンセン（Mansen）ら、１９９６年；ファジャス（Fajas）ら、１９９７年）ため、下の実験においてはＰＰＡＲγに注目した。
【００７０】
ＰＰＲＥを介して遺伝子転写を調節することに加え、最近では、ＰＰＡＲがＤＮＡ結合とは独立したメカニズムによって他の転写因子経路を妨害することにより遺伝子転写を阻害することが示された（デレライブ（Delerive）ら、１９９９年）。ＰＰＡＲγ２はサイトゾル区画及び核区画で見出される（スイリアー（Thuillier）ら、１９９８年）が、サイトゾルＰＰＡＲγの生理学的妥当性については現在知られていない。本発明者らは、固定したＣａｃｏ−２細胞に対して免疫細胞化学的局在化技法を用い、腸炎菌がＰＰＡＲγの核内蓄積を誘発することを見出した（図２Ｆ）。ＰＰＡＲγのＮＨ２末端ドメイン（Ｓｅｒ−１２２）のＭＡＰキナーゼによるリン酸化によって、リガンド結合親和性が低下し、ＰＰＡＲγの転写及び生物学的機能が負に調節される（シャオ（Shao）ら、１９９８年）ことについて言及することは重要である。これによって、腸炎菌に対する炎症反応の初期段階で、ＰＰＡＲγの核内蓄積が炎症性遺伝子転写の抑制に対し効果的でない理由が説明される。腸炎菌をＢ．テタイオタオミクロンと共培養した後、ＰＰＡＲγはサイトゾルへ再分布された（図２Ｇ、Ｈ）。Ｂ．テタイオタオミクロンの存在下で腸炎菌に接触させたＣａｃｏ−２細胞内のＰＰＡＲγの特異的分布についても、核抽出物及び細胞質抽出物を用いたウェスタンブロッティングによって示された（図４Ｆ）。
【００７１】
ＰＰＡＲγに関して公表されたデータは全て、ＰＰＡＲγの核内作用部位に注目している。本発明者らは、免疫細胞化学的技法を用いて、腸炎菌がＣａｃｏ−２細胞におけるＰＰＡＲγの核内蓄積を誘発することを見出した（図４Ｈ（ｇ））。一方、腸炎菌とＢ．テタイオタオミクロンを用いて共培養した後、ＰＰＡＲγはサイトゾルへ再分布された（図４Ｈ（ｈ、ｉ））。経時的検討によって、この再分布がこれらの細菌への接触後６０分で明らかになり、２時間経過するまでにはほぼ完了することが示された（結果は図示せず）。腸炎菌とＢ．テタイオタオミクロンとに接触させたＣａｃｏ−２細胞内のＰＰＡＲγの特異的分布についても、核抽出物及び細胞質抽出物を用いたウェスタンブロッティングによって示された（図４Ｆ）。
【００７２】
腸炎菌で誘発されたＰＰＡＲγタンパク質はＲＸＲαとヘテロ二量化複合体を形成し（ＩＰで実証済み、結果は図示せず）、洗浄剤不溶性細胞画分へと分配された。一方、Ｂ．テタイオタオミクロンで誘発されたＰＰＡＲγタンパク質は洗浄剤可溶性であった（図４Ｆ）。腸炎菌とＢ．テタイオタオミクロンの共培養によって誘発されたＰＰＡＲγの核−細胞質間輸送は、レプトマイシンＢ（ＬＭＢ）処理ではブロックされず（結果は図示せず）、従って、ＰＰＡＲγの核−細胞質間輸送は、核外移行受容体ｃｒｍ−１（この受容体は他の核内受容体と類似する）によって促進されなかった（ブン（Bunn）ら、２００１年）。しかし、冷却を行うこと及び代謝阻害剤を用いることによって、核外移行は有意に減少した（結果は図示せず）。 ＴＳＡ（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤）（図４Ｈ（ｊ〜ｍ）やＳＢ（ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤）（データは図示せず）等の他の生物学的阻害剤を腸炎菌で処理したＣａｃｏ−２細胞に添加した。これらの阻害剤が点状サイトゾル標識化及びＰＰＡＲγの核外移行を誘発することが示された（図４Ｈ（ｋ））が、この作用はＢ．テタイオタオミクロンの作用と類似する。ｐ３８を含むＡＰ−１シグナル伝達経路はＢ．テタイオタオミクロンによって阻害されなかった（結果は図示せず）が、このことはアセチル化／脱アセチル化反応がＰＰＡＲγ核外移行メカニズムに潜在的に関連していることを示す。
【００７３】
また、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲαリガンドは腸炎菌仲介によるサイトカイン誘発を抑制する（結果は図示せず）が、上記実験で試験したＰＰＡＲリガンドの作用はＢ．テタイオタオミクロンのＰＰＡＲγの細胞内再局在化に対する作用とは異なる。このことは、ＰＰＡＲγを調節する新規な内因性リガンドやメカニズムが存在することを示唆する。
【００７４】
本発明者らは、二重標識免疫細胞化学的技法を用いて、ＰＰＡＲγタンパク質の多くがＲｅｌＡと共存することを見出した（図４Ｈ（ｎ〜ｐ））。ＰＰＡＲγとＲｅｌＡとの物理的結合が、腸炎菌及びＢ．テタイオタオミクロンに接触させた腸細胞における細胞質内局在化を促進する重要な因子であるという仮説を立てた。
【００７５】
核内ＰＰＡＲγとＮＦ−κＢが不活性な複合体を形成し得ることが示唆されている（リコテ（Ricote）ら、１９９９年）。更に、グルタチオンＳトランスフェラーゼプルダウン実験により、ＰＰＡＲαがｃ−Ｊｕｎ及びＲｅｌＡ  ｐ６５と物理的に相互作用することが示されている（デレライブ（Delerive）ら、１９９９年）。本発明者らの検討においては、免疫精製（ＩＰ）プロトコルを用い、Ｂ．テタイオタオミクロン存在下、腸炎菌で処理した細胞からＰＰＡＲγを単離することによってＲｅｌＡが共精製される（図４Ｇ）ことが示されたが、この結果は、ＰＰＡＲγとＲｅｌＡが物理的に結合し、層状多タンパク質複合体を構成している可能性を示唆する。ＰＰＡＲγとＲｅｌＡとの直接相互作用についてはインビトロ翻訳及びＩＰによって確認した（図４ｂ）。
【００７６】
実施例５
ＲｅｌＡの調節におけるＰＰＡＲγの重要性を更に調べるため、ＰＰＡＲγのドミナントネガティブ（ＤＮ）型（英国ケンブリッジ大学チャタージー（Chatterjee）教授の寄贈）（ガーネル（Gurnell）ら、２０００年）を用いた。ＰＰＡＲ受容体内ではロイシンとグルタミン酸の保存性が高い。これらのアミノ酸残基はリガンド結合及び核コアクチベーターの補充において必須である。これらのアミノ酸残基の変異によって上記受容体のＤＮ型が産生し、この受容体が持つコアクチベーターを補充する能力と２種類のコリプレッサー、即ち、レチノイド甲状腺受容体のサイレンシングメディエータ（ＳＭＲＴ）と核コリプレッサー（ＮｃｏＲ）を遊離する能力が低下する（ガーネル（Gurnell）ら、２０００年）。ＤＮ  ＰＰＡＲγを用いた免疫共沈降実験によって、ＳＭＲＴがＰＰＡＲγとインビボで相互作用すること、そして、変異したＰＰＡＲγは強力な転写リプレッサーとなることが示された。ヒトＰＰＡＲγのキメラ蛍光タンパク構造体と、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）をカルボキシ末端ドメインに有するＰＰＡＲγのドミナントネガティブ型とを先に報告されたクローン（ガーネル（Gurnell）ら、２０００年）からＰＣＲ増幅によって調製した。ＹＦＰと結合したキメラＲｅｌＡは、Ｊ  シュミット博士（Dr. J Schmid）から寄贈された（シュミット（Schmid）ら、２０００年）。発現の成功は、抗ヒトＰＰＡＲγ及び抗ヒトＲｅｌＡ抗体を用いた一過性トランスフェクトＨｅｌａ細胞のウェスタンブロット解析によって確認した。
【００７７】
ＰＰＡＲγ  ＤＮ及びＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター（パスツール研究所（フランス、パリ）イスラエル博士（Dr. Israel）の寄贈）を用いた二重トランスフェクションについて検討した。本発明者らは、病原性腸炎菌に長時間接触させた細胞によってルシフェラーゼ活性が失活することを見出したが、この知見は最近の報告（サフコヴィック（Savkovic）ら、２０００年）と一致する。この現象を回避するため、上記細胞を２時間刺激し、洗浄によって腸炎菌を除去し、８時間後にルシフェラーゼタンパク質の産生を測定した。対照細胞及びＰＰＡＲγ  ＤＮをトランスフェクトした細胞において、腸炎菌によりＮＦ−κＢ活性化とルシフェラーゼタンパク質合成が誘発されることを見出した（Ｐ＜０．００１）（図５Ｃ）。ＰＰＡＲγ野生型（ＮＴ）をトランスフェクトした細胞（ルシフェラーゼのみ）においては、上記反応はＢ．テタイオタオミクロンによって低下した（Ｐ＜０．０２８）が、ＰＰＡＲγドミナントネガティブ型（ＤＮ）をトランスフェクトした細胞においてはこのような反応の低下は見られなかった（図５Ｃ）。同様に、ＰＰＡＲγ  ＤＮの存在下及び非存在下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をトランスフェクトした細胞においては、免疫細胞化学的技法及びレーザー走査型共焦点顕微鏡検査法（ＬＳＣＭ）で測定されたように、ＲｅｌＡの細胞内分布が変化した。対照細胞（ＧＦＰのみ）においては、トランスフェクトしていない細胞について上述した様に、ＲｅｌＡは主にサイトゾルに分布していた（図５Ｄ（挿入図Ｂ、Ｃ）)。ＰＰＡＲγ  ＤＮをトランスフェクトした細胞においては、ＲｅｌＡ分布は一定ではなく、ＲｅｌＡはサイトゾル区画及び核区画の両方に局在化していた（図５Ｄ（挿入図Ｄ、Ｅ））。以上のデータから、ＲｅｌＡを隔離し核内転位を防ぐ上でＰＰＡＲγが必須であることが示された。
【００７８】
本発明者らは更に、蛍光顕微鏡検査法を用いて、ＷＴ及びＤＮ  ＰＰＡＲγのキメラ構造体、ＣＦＰ、キメラＹＦＰ、及びＲｅｌＡをトランスフェクトしたＣａｃｏ−２細胞とＨｅｌａ細胞とにおけるＰＰＡＲγ及びＲｅｌＡの細胞内分布について調べた。発現したＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡタンパク質の多くは、既に報告されているように（シュミット（Schmid）ら、２０００年）、トランスフェクトした細胞の核内に局在した。同様に、ＰＰＡＲγ  ＷＴとＲｅｌＡとをトランスフェクトした細胞においても、発現は主に核内で起こったが、Ｂ．テタイオタオミクロンを用いたインキュベーションの後、点状サイトゾル標識化及びＰＰＡＲγとＲｅｌＡとの共存が非常に明確に示された（図５Ｅ（ｆ））。しかし、ＰＰＡＲγ  ＤＮをトランスフェクトした細胞において、ＲｅｌＡはサイトゾル区画には存在しなかった（図５Ｅ（ｉ））。以上の結果から、ＤＮ  ＰＰＡＲγの核外移行（即ちＲｅｌＡとの共存）が阻害されたことが示され、よって、腸細胞内でＢ．テタイオタオミクロンによって誘発されるＲｅｌＡの核外移行及びサイトゾル内分布に対してはＰＰＡＲγが不可欠であることが結論づけられる。Ｃａｃｏ−２細胞トランスフェクション実験及びＨｅｌａ細胞トランスフェクション実験のいずれにおいても、発現したＰＰＡＲγ及びＲｅｌＡタンパク質の核内貯蔵が顕著であった。この場合、ＷＴやＤＮの状態とは関係無く、腸炎菌及びＢ．テタイオタオミクロンの存在下で培養した細胞の核内にＰＰＡＲγとＲｅｌＡとの凝集物がはっきりと見られた（ＩＰによっても確認、結果は図示せず）が、この結果から、ＰＰＡＲγとＲｅｌＡとの相互作用が核区画内で起こることが証明された。本発明者らは、ＰＰＡＲ及びＲｅｌＡの核内での分布が、核斑（nuclear speckles）やスプライセオソーム内で起こるスプライシング因子の分布と類似していることに注目した。共存についての検討において、 本発明者らはＰＰＡＲγタンパク質がＳＣ３５、即ち、特異的プレｍＲＮＡスプライシング因子と共存することを見出した（図５Ｅ（ｋ））が、この知見から、ＰＰＡＲγ／ＲｅｌＡ複合体が細胞のｍＲＮＡ機構と相互作用し得ることが示される。核内受容体とスプライシング区画との相互作用についての実証データが、本明細書作成中に公表された（ゾア（Zhoa）ら、２００２年）。以上から明らかなように、Ｃａｃｏ−２細胞では、Ｂ．テタイオタオミクロンの存在によりＰＰＡＲγの核外移行が促進され、また、これに便乗する形で転写活性ＲｅｌＡの核外移行も促進されることにより、炎症持続中の更なる核内移行及びＲｅｌＡ仲介による転写が防止される。このメカニズムによって、Ｂ．テタイオタオミクロンは強力な抗炎症作用を発揮する。
【００７９】
炎症を抑制する細菌が消化管内に存在することは確実と思われる。炎症を抑制する腸内微生物と炎症反応を持続させる腸内微生物とのバランスが変化すると、それが消化管の炎症性疾患の原因に直接関係する場合がある。従って、炎症性腸疾患が免疫ホメオスタシスに積極的に寄与する細菌株の減少に関係することは妥当と思われ、これによって、プロバイオティック療法に反応する患者もいることの理由が説明される（マッドセン（Madsen）ら、２００１年）。また同様に、受容体タンパク質のレベルが不十分なこと、或いは炎症病態への感受性を高める特定の対立遺伝子変異体の腸内での発現に起因するＰＰＡＲの機能障害が大いに関係する場合もある。この見解は、虚血再灌流誘発型腸炎症及び障害に対するヘテロ接合型ＰＰＡＲγ欠乏性マウスの感受性が有意に高いことを示す最近公表されたデータ（ナカジマ（Nakajima）ら、２００１年）によって更に支持される。
【００８０】
方法
【００８１】
試薬
【００８２】
組織培養試薬はシグマ及びインビトロゲンより入手した。抗体はサンタクルズ、モレキュラープローブ、ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）より入手した。また、分子試薬はプロメガ、インビトロゲン及びアマシャムより入手した。
【００８３】
Ｓ．エンテリティディス／Ｂ．テタイオタオミクロン共培養モデル
【００８４】
Ｃａｃｏ−２細胞及びＨｅｌａ細胞は３５ｍｍ培養皿内で常法によって培養した。通常の実験では、次の４種類の処理でインキュベートした細胞を要した。（１）培地のみでインキュベートした細胞、（２）１０８個の腸炎菌（Ｓ．エンテリティディス）と共にインキュベートした細胞、（３）１０８個の腸炎菌（Ｓ．エンテリティディス）及び１０９個のバクテロイデス・テタイオタオミクロンと共にインキュベートした細胞、及び（４）１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共にインキュベートした細胞。上記細菌は２時間或いは４時間添加した後、十分に洗浄して除去した。試験に用いた他の細菌及びリガンドとしては、大腸菌０１５７Ｈ７、Ｂ．ブルガータス、ＰＭＡ、ＩＬ−１α／β及びＴＮＦαが挙げられる。実験は全て最適化し、プロトコルは詳細な用量反応及び時間経過に基づくものであった。Ｃａｃｏ−２細胞単層を経由するＰＭＮ細胞の経上皮遊走はＭＰＯアッセイ（パーコス（Parkos）ら、１９９１年）によって測定した。Ｃａｃｏ−２細胞を２時間インキュベートした後、上記細菌を除去し新しい培地に取り替えた。その後、細胞を更に２時間インキュベートした。次いで、先端区画から得た培地及び細胞をいずれも１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に可溶化し、ＭＰＯを定量した。
【００８５】
サイトカイン解析
【００８６】
サイトカイン解析はクロンテックマクロアレイ、ノーザンハイブリダイゼーション、及びＣａｃｏ−２細胞から単離したＲＮＡのリアルタイムＰＣＲを用いて行った。全ＲＮＡ及びｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを産生し、ＰＣＲを標準条件下で行った。ＩＬ−８タンパク質濃度はＥＬＩＳＡによって測定した。
【００８７】
ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１のＥＭＳＡ解析
【００８８】
ＮＦ−κＢのコンセンサス結合配列（５’−ＡＧＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  Ｃ−３’）或いはＡＰ−１のコンセンサス結合配列（５’−ＣＧＣ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＡ−３’）を含む一本鎖３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブと共に核抽出物をインキュベートし、電気泳動によって分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。特異的ＮＦ−κＢサブユニット抗体を用いてＥＭＳＡスーパーシフトを行った。ＥＭＳＡ、ウェスタンブロッティング（タンパク質及びリンタンパク質）、プロモーター特異的レポーター解析及び標的遺伝子発現（例えば、ｆｏｓ及びｊｕｎ）によって、ＮＦκＢ及びＡＰ−１のシグナル伝達に対するＢ．テタイオタオミクロンの作用を測定した。
【００８９】
免疫蛍光解析
【００９０】
実験的処理後、３５ｍｍ培養皿で増殖したＣａｃｏ２細胞及びＨｅｌａ細胞を４％パラホルムアルデヒドに固定し、０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＰＢＳで透過処理した。二次抗体を産生させた種由来の血清１％を含むＰＢＳに希釈した一次抗体（１μｇ／ｍｌ）と共に細胞を室温で１時間インキュベートした。二次抗体（１μ／ｍｌ）としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４ロバ抗ヤギＩｇＧ或いはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（モレキュラープローブ）を必要に応じて用いた。標識した細胞をＶｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄ（ベクター）でスライドに載せ（mounted）、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ５０広視野蛍光顕微鏡或いはＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００レーザー走査型顕微鏡にて検査した。代表的デジタル画像をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ６．０に取り込み最終調整を行った。
【００９１】
蛍光標識ＰＰＡＲ・の作成
【００９２】
ＰＰＡＲγのコード配列及びＰＰＡＲγのドミナントネガティブ変異体（ガーネル（Gurnell）ら、２０００年）をＰＣＲ増幅時に修飾し、生成物の５’末端にＸｈｏＩ認識配列とＳａｃＩＩ認識配列を、３’末端にはＳａｃＩＩ配列を付加した。ＰＣＲ増幅はＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。生成物を制限しｐＥＣＦＰ−Ｃ１及びｐＥＹＦＰ−Ｃ１（プロメガ）にクローン化した。クローン化の成功はＤＮＡシークエンシングによって確認した。ｐＥＹＦＰ−Ｃ１へクローン化したヒトｐ６５については既に報告されている（シュミット（Schmid）ら、２０００年）。
【００９３】
Ｃａｃｏ２細胞及びＨｅｌａ細胞を３５ｍｍ培養皿に播種し、９０％コンフルエントまで増殖させ、標準リポフェクタミン仲介法（インビトロゲン）を用いてトランスフェクトした。４８時間後、細菌インキュベーションを上述の様に行い、細胞を室温で３０分間４％パラホルムアルデヒド０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＣＦＰ及びＹＦＰ用カスタムフィルター（オメガオプティカル）を備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ５０広視野蛍光顕微鏡にて検査した。代表的画像をＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍデジタルカメラで記録し、Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ３．０ソフトウェアで処理し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ６．０に取り込み最終調整を行った。一部の実験では、トランスフェクトした細胞を上述の免疫蛍光解析に付した。
【００９４】
実施例６：インビボラット研究
【００９５】
本実施例では、Ｂ．テタイオタオミクロンによって、特定病原不在ラットの腸機能が変化し、該ラットの病原菌チャレンジに対する耐性が増加するどうかを立証した。一般に、バクテロイデスは哺乳期から離乳期への移行時に小腸に現われる（チャン（Chang）ら、１９９４年；フーパー（Hooper）ら、２００１年）。従って、特定病原不在Ｈｏｏｄｅｄ  Ｌｉｓｔｅｒラットに離乳期（１９日齢）から成熟期（３４〜４０日齢）までこの細菌を毎日投与し、腸や免疫の発達に重要なこの時期にこの菌が確実に多数存在するようにした。３４日齢でラットに対し腸炎菌Ｓ１４００の経口チャレンジを行った。
【００９６】
方法
【００９７】
細菌の培養：
【００９８】
ドイチュ・サムルング・フォン・ミクロオーガニズメン・ウント・ＧｍＢＨ（Deutsche Sammlung von Microorganismen und GmBH）（ドイツ、ブラウンシュヴァイク（Braunschweig））から入手したＢ．テタイオタオミクロンをＷｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ嫌気性寒天で凍結保持した。Ｂ．テタイオタオミクロンをＷｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ嫌気性ブロス或いはＭ１０培地［Ｈｕｎｇａｔｅチューブ内１０ｍｌ（ブライアント（Bryant）、１９７２年）］に継代培養し、３７℃で４８時間増殖させた。サンプル（０．５ｍｌ）を新しい培地［Ｈｕｎｇａｔｅチューブ内１０ｍｌ］に移し、３７℃で２４時間増殖させた。得られた培養物には約１０８〜１０９ＣＦＵ／ｍｌのＢ．テタイオタオミクロンが含まれていた。
【００９９】
Ｂ．テタイオタオミクロン培養物（１０ｍｌ）を遠沈し（２０００ｇ、１２分間）、得られたペレットを０．０５Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で洗浄した後、市販のゼリー［１０ｍｌ、３７℃、嫌気条件下で調製済］に再懸濁した。このゼリーをＣＯ２下で滅菌ペトリ皿に注入し４℃で放置した。約１時間後、ゼリーを一定分量（０．５ｇ、Ｂ．テタイオタオミクロン（〜１０８ＣＦＵ））に分割し上記ラットに与えた。Ｂ．テタイオタオミクロンはこの条件下で少なくとも６時間は生存していたが、通常、ゼリーはケージに入れて数分以内には全て食べられた。
【０１００】
腸炎菌Ｓ１４００は当初家禽感染症から単離されたものであり、特徴付けが行われてる（アレン−ヴェルコー（Allen-Vercoe）及びウッドワード（Woodward）、１９９９年）。Ｄｏｒｓｅｔ卵スロープ（Dorset egg slopes）で４℃で保持した菌株をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレートに継代培養し３７℃で一晩増殖させた。該プレートから得た５〜１０個のコロニーをＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（１０ｍｌ）に接種し、３７℃で一晩攪拌しながらインキュベートし、約１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの腸炎菌Ｓ１４００を得た。
【０１０１】
動物実験：ローウェット研究所は英国動物（科学的処置）法１９８６の下で認可を受けている。同研究所の倫理審査委員会及び動物保護部門、更には適切な政府視察団（appropriate governmental inspectorate）によって動物実験は全て視察、監視されている。管理及び実験手続については倫理委員会によって承認され、その手続は実施許可を得た研究所員が上記動物法の厳しい条件に従って行った。
【０１０２】
ローウェット研究所の小動物部門で飼育した、２４匹の特定病原不在Ｈｏｏｄｅｄ  Ｌｉｓｔｅｒ雄性ラット（４０ｇ）を１９日目に離乳させ、すぐにＣｌａｓｓＩＩ施設へ移した。実験継続期間中（２１日間）、ラットを個々にフレキシフィルムアイソレータ（モードゥン、アニマルヘルス、英国、ペニクイク（Penicuik））内の代謝ケージ（テクニプラスト、英国、ケッターリング）に収容した。入れ子状トンネルを各代謝ケージに設け、ラットが互いを視認できても接触できないように該アイソレータ内に代謝ケージを配置した。滅菌蒸留水をいつでも摂取できるようにした。ラットを毎日計量し、糞便を実験期間中採取した。実験は少なくとも３回行ったが、いずれも同様の結果が得られた。データは平均ＩＳＤである（ｎ＝３）。先ず、ラットに良質の半合成（１００ｇタンパク質／ｋｇ）ラクトアルブミンベースの食餌（グラント（Grant）ら、２０００年）を自由に与えた。ラットが約８０ｇに達した時に（約３０日齢）、食餌摂取量を３〜４日間かけて７ｇ／ラット／日（１日２食）まで徐々に減らし、実験の残りの期間中この摂取量を維持した。この摂取量は、腸炎菌を経口感染させた後の同一日齢ラットの１日当りの自由摂取量の平均であり、この量は非感染ラットによる上記食餌の自由摂取量の約７０％であった。ラットを離乳時からこのように収容、管理し、細菌への環境曝露や離乳後の相互汚染を減少させた。（グラント（Grant）、１９９６年）。
【０１０３】
離乳時（１９日目）から実験終了時まで、１２匹のラットにＢ．テタイオタオミクロン（約１０８ＣＦＵ）を１日１回投与した。３４日齢時に、Ｂ．テタイオタオミクロンで前処理した６匹のラットと６匹の対照ラットに、胃管栄養法によって単一用量０．８ｍｌの腸炎菌Ｓ１４００培養物（約１０９ＣＦＵ）を投与した。残りのラットには相当量の培地を投与した。ラットを全て代謝ケージに戻し、ラクトアルブミンベースの食餌（７ｇ／ラット／日）を更に６日間与えた。最終日にラットに２ｇを食餌を与え、その丁度２時間後、ハロタン（ローヌメリュー、英国、エセックス）の過剰摂取及び失血によりラットを殺した。開腹して組織を無菌的に除去した。胃及び小腸をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で流して内容物や非付着細菌を除去した。空腸１０ｃｍ（幽門から５〜１５ｃｍ）と回腸１０ｃｍ（回盲連結部から５〜１５ｃｍ）を除去した。こうして除去した空腸と回腸、胃組織、盲腸及びその内容物、結腸及びその内容物、腸間膜リンパ節、肝臓と脾臓の代表的部分（２００〜４００ｍｇ）及び腎臓１個を処理し生細胞数を測定した。
【０１０４】
更に空腸片（幽門から１５〜２５ｃｍ）及び回腸片（回盲連結部から１５〜２５ｃｍ）を採取し液体窒素で凍結し、生化学的解析を行った。同様の処理を残りの小腸組織（〜４０ｃｍ）、肝臓、脾臓、腎臓、胸腺、肺、心臓及腓腹後肢筋についても行った。これらを計量し、凍結乾燥した後再計量した。
【０１０５】
ラット組織中の生残細菌
【０１０６】
組織サンプルを計量した後、Ｊａｎｋｅ−Ｋｕｎｋｅｌ  Ｕｌｔｒａ−ＴｕｒｒａｘＴ２５組織ホモジナイザー（２０，０００ｒｅｖ／分、３０秒）を用いてＭａｘｉｍｕｍ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＭＲＤ、フィッシャーサイエンティフィック、英国）にホモジナイズした。最大６回の希釈工程を続けて行い、一次ホモジネート（１：１０ｖ／ｖ）をＭＲＤに形成した。各希釈工程におけるサンプルを十分に乾燥したＸＬＤ寒天（フィッシャーサイエンティフィック、英国）及びＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天Ｎｏ．３（フィッシャーサイエンティフィック、英国）プレートの表面に載せ３７℃で一晩インキュベートした。生細胞数をマイルズ（Miles）及びミスラ（Misra）（１９３８年）の方法或いはスプレッドプレート法（コリンズ（Collins）及びライム（Lyme）、１９８９年）によって評価した。
【０１０７】
ＰＣＲ
【０１０８】
ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社、英国、クローリー）を用いてＤＮＡを抽出、精製した。ＰＣＲはテング（Teng）らの方法（２０００年）に基づいた。テング（Teng）ら（２０００年）によって同定されたプライマー対、即ち、５’−ＴＧＧＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＣ−３’（ＢＴＨ−Ｆ）及び５’−ＣＴＧＣＣＣＴＴＴＴＡＣＡＡＴＧＧＧ−３’（ＢＴＨ−Ｒ）はシグマジェノシス社（英国、ケンブリッジ）から購入した。ＴａｑＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（キアゲン社、英国、クローリー）から入手した試薬に基づく反応混合物（５０μｌ）には、上記２種類のプライマー（５０ｐｍｏｌ）、ｄＮＴＰ混合物（１０ｎｍｏｌ）、１０Ｘ  Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲバッファー（５μｌ）、５Ｘ  Ｑ溶液（１０μｌ）、サンプル（１０μｌ）及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１．２５Ｕ）が含まれていた。ホットスタートＰＣＲプログラムを用いた。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含まない反応混合物を９４℃で１５秒間加熱した後、（９４℃×１０秒、５５℃×３０秒、７４℃×１分）のサイクルを３５回行って加熱し、更にその後（７４℃×２分、４５℃×２秒）のサイクルを１回行って加熱した。アンプリコンを臭化エチジウム（１μｇ／ｍｌゲル）を含むアガロースゲル（１０ｇ／ｌ）で分離した。糞便及びＢ．テタイオタオミクロンからＤＮＡと共に単一アンプリコン（７２１ｂｐ）を得た。これらのアンプリコンの配列は互いに一致しており、また公表された配列（テング（Teng）ら、２０００年）とも一致することが分かった。
【０１０９】
ＭＰＯ
【０１１０】
Ｊａｎｋｅ−Ｋｕｎｋｅｌ  Ｕｌｔｒａ−ＴｕｒｒａｘＴ２５組織ホモジナイザー（２０，０００ｒｅｖ／分、３０秒）を用いて、組織サンプルを氷冷５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にホモジナイズし（１：８０ｗ／ｖ）、遠沈した（３０００ｇ×３０分、４℃）。臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＥＴＡＢ、５ｇ／ｌ）及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、３．７２ｇ／ｌ）を含む氷冷０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で、得られたペレット（１：２０ｗ／ｖ）を超音波処理し（３×５秒）、３０分間氷上に放置した後、遠沈した（３０００ｇ×３０分、４℃）［ストゥッキ（Stucchi）ら、２０００年］。得られた上清をアッセイを行うまで凍結した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）での３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、ダイネックステクノロジーズ、英国、アッシュフォード）のＨ２Ｏ２依存型酸化をモニターすることによってミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を測定した（ツィマーマン（Zimmerman）及びグランガー（Granger）、１９９０年）。４５０ｎｍにおける吸光度は０．１８ＭＨ２ＳＯ４との反応終了後に測定した。ヒトミエロペルオキシダーゼ（カルバイオケム、英国）を標準品として用い、数値はＭＰＯ当量として示した。
【０１１１】
腸内容物や糞便内の免疫反応性ＭＰＯを競合ＥＬＩＳＡ法で測定した。１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）［ＰＢＳ］に溶解したヒトミエロペルオキシダーゼでマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ４、ダイネックステクノロジーズ、、アッシュフォード、英国）を４℃で一晩コートした［１０ｎｇ／ウェル］。Ｔｗｅｅｎ−２０（１ｍｌ／ｌ）を含むＰＢＳで洗浄後、プレートをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、１０ｇ／ｌ）含有ＰＢＳで室温下１時間ブロックした。プレートを洗浄し、サンプル及び標準品を添加し［５０μｌ／ウェル］、ＢＳＡ（１ｇ／ｌ）、Ｔｗｅｅｎ−２０（１ｍｌ／ｌ）及びロイペプチン（１ｍｇ／ｌ）を含むＰＢＳで連続的に希釈した。更に、ウサギ抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体［カルバイオケム、英国］（１：４０００希釈品、５０μｌ／ウェル）も添加した。プレートを１時間インキュベートし洗浄した後、ビオチン化抗ウサギＩｇＧと１時間反応させ、次いでＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ／ペルオキシダーゼ（ＥＸＴＲＡ−３キット、シグマアルドリッチ、英国、プール）と反応させた。洗浄後、ＴＭＢ試薬を添加し（７μｌ／ウェル）、暗所で最大２時間インキュベートした。０．１８ＭＨ２ＳＯ４の添加（５０μｌ／ウェル）によって反応を終了させ、吸光度を４５０ｎｍで測定した。数値は免疫反応性ＭＰＯ当量として示した。
【０１１２】
ＩｇＧ
【０１１３】
ＩｇＧは競合ＥＬＩＳＡによって測定した。ＰＢＳに溶解したラットＩｇＧ（シグマアルドリッチ、英国、プール）でマイクロタイタープレートを４℃で一晩コートした［１μｇ／ウェル］。プレートをブロック、洗浄した後、サンプル及びラットＩｇＧ標準品を添加し［５０μｌ／ウェル］、ＢＳＡ（１ｇ／ｌ）及びＴｗｅｅｎ−２０（１ｍｌ／ｌ）を含むＰＢＳで連続的に希釈した。更に、ビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体（シグマアルドリッチ、英国、プール；１：１０００希釈品）も添加し（５０μｌ／ウェル）、プレートを１時間インキュベートした。次いで、ＭＰＯイムノアッセイによりプレートをＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ／ペルオキシダーゼ及びＴＭＢ試薬と反応させた。数値はＩｇＧ当量として示した。
【０１１４】
ＩｇＡ
【０１１５】
ＩｇＡは捕捉ＥＬＩＳＡによって測定した。ヤギ抗ラットＩｇＡ（シグマアルドリッチ、英国、プール；１：１００ＰＢＳ希釈品）でマイクロタイタープレートを４℃で一晩コートした（１００μｌ／ウェル）。プレートをブロック、洗浄した後、サンプル及び標準品を添加し［１００μｌ／ウェル］、ＢＳＡ（１ｇ／ｌ）、Ｔｗｅｅｎ−２０（１ｍｌ／ｌ）及びロイペプチン（１ｍｇ／ｌ）を含むＰＢＳで希釈し、１時間インキュベートした。洗浄後、マウス抗ラットＩｇＡ抗体（シグマアルドリッチ、英国、プール；１：５００希釈品）と共にプレートを１時間インキュベートし、再洗浄後、ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（１：１０００希釈品）と共に更に１時間インキュベートした。次いで、ＭＰＯイムノアッセイによりプレートを処理した。数値はＩｇＡ当量として示した。
ＬＰＳ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ
【０１１６】
腸炎菌（シグマアルドリッチ、ドーセット、プール）由来のリポ多糖類（ＬＰＳ）でマイクロタイタープレートをコートした（１０μｇ／ウェル）。プレートをブロック、洗浄後、サンプル及び標準品を添加した［１００μｌ／ウェル］。１時間後プレートを洗浄し、ビオチン化抗ラットＩｇＧ及び抗ラットＩｇＡを添加した後、プレートを上述の様に処理した。ＥＬＩＳＡにおいて吸光度が少なくとも０．２となる容量（μｌ）に含まれるＬＰＳ特異的抗体の量を該抗体の１ユニットとした。腸炎菌で感染後２２日目のラットから採取した血清（ＬＰＳ−ＩｇＡ：３．２×１０４ユニット／ｍｌ、ＬＰＳ−ＩｇＧ：１．７×１０５ユニット／ｍｌ）を陽性対照とした。
【０１１７】
エラスターゼ
【０１１８】
凍結乾燥した糞便及び腸内容物を、ＨＥＴＡＢ、ＥＤＴＡ及びＮａＮ３（１ｇ／ｌ）を含む氷冷０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に抽出し（１：１０ｗ／ｖ）、氷上で３０分間放置した後、遠沈し（３０００ｇ、３０分、４℃）、得られた上清を凍結した。
【０１１９】
マイクロタイタープレート上で、サンプル及び白血球エラスターゼ（シグマアルドリッチ、英国、プール）を１ＭＮａＣｌ及びロイペプチン（１ｍｇ／ｌ）を含む０．２ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）で連続的に希釈した。基質（Ｎ−スクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリド、０．２ｇ／ｌ、シグマアルドリッチ、英国、プール）を添加し、その直後、４０５ｎｍにおける吸光度をモニターした。更に、３７℃でのインキュベーション時に最大２０時間の間隔で吸光度をモニターした。数値は白血球エラスターゼ当量として示した。
【０１２０】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質
【０１２１】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質は、従来通り、ジフェニルアミン法、オルシノール法及び改良ローリー法によって測定した（グラント（Grant）ら、２０００年）。サケ精巣ＤＮＡ、酵母ＤＮＡ及びウシ血清アルブミンを標準品として用いた。
【０１２２】
統計解析
【０１２３】
Ｉｎｓｔａｔ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｃｋａｇｅ（グラフパッドソフトウェア社、米国、サンディエゴ）を用い、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とチューキーの多重比較検定とを組み合わせてデータを評価した。
【０１２４】
結果
【０１２５】
バクテロイデス・テタイオタオミクロン（ＢＴ）はＢＴ処理ラットから採取した糞便サンプルで検出された。また、ＢＴは対照ラットの糞便でも検出された。しかし、対照ラットの糞便で検出されたＢＴのレベル（約１０４ＣＦＵ／ｇ糞便に相当）は、毎日ＢＴで処理したラットの糞便で検出されたＢＴのレベル（約１０６ＣＦＵ／ｇ糞便に相当）よりも低かった。
【０１２６】
体重増加、主要臓器重量、小腸成分及び肝臓成分については、ＢＴ処理ラットと対照ラットとの間では差が無かった（表１〜４）。ＢＴ処理ラットの場合、乳糖発酵菌及び非乳糖発酵菌の消化管全体への分布は影響を受けなかったと思われ、また、対照ラットの場合と同様に、腸間膜リンパ節、肝臓、脾臓及び腎臓サンプルでは乳糖発酵菌及び非乳糖発酵菌のいずれも検出されなかった。更に、腸内容物や糞便中の非特異的ＩｇＡ、エラスターゼ及び免疫反応性ＭＰＯのレベル、腸組織中のＭＰＯのレベル、及び血清中の非特異的ＩｇＧ及びＩｇＡのレベルについても、対照ラットから採取したサンプルの場合と同程度であった。
【０１２７】
【表１】
2005510733.tif 000003
【０１２８】
腸炎菌［ＳＥ］は経口チャレンジ後６日目に消化管全体で検出された（表１）。更に、腸炎菌は腸間膜リンパ節、肝臓及び脾臓でも検出された。上記ラットにおいて非乳糖発酵菌は全て同様の組織内分布を示した（表１）。腸炎菌感染の腸内乳糖発酵菌数に対する影響については明らかではなかった。しかし、かなりの数の乳糖発酵菌がＳＥ感染ラットの腸間膜リンパ節、肝臓及び脾臓に存在した（表１）。
【０１２９】
腸炎菌チャレンジ後に肝臓及び脾臓で検出された生残腸炎菌の数は、ラットをＢ．テタイオタオミクロンでも処理した場合［ＳＥ＋ＢＴ］には大幅に減少した（表１）。肝臓及び脾臓内では全非乳糖発酵菌の数も減少したが、乳糖発酵菌数は変化しなかった。消化管全体及び腸間膜リンパ節内の腸炎菌、全非乳糖発酵菌及び乳糖発酵菌のレベルは、ＳＥ＋ＢＴとＳＥとの間では差が無かった（表１）。また、６日間の実験中、腸炎菌の糞便への分泌が腸炎菌感染ラットでは同程度で起こった（ＳＥ＋ＢＴ：７．０±０．８Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ／日、ＳＥ：６．２±０．６Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ／日）。
【０１３０】
【表２】
2005510733.tif 000004
【表３】
2005510733.tif 000005
【０１３１】
腸炎菌感染の結果、小腸の重量が増加した（表２、３）。重量の増加は回腸組織で最も顕著であり、これは水分の蓄積と組織内のタンパク質量、ＲＮＡ量及びＤＮＡ量の増加とによるものであると分かる（表３）。ＢＴでの処理により感染に対する反応がわずかに変化した。即ち、ＳＥ＋ＢＴラットから採取した小腸の水分量［７４８±２２ｍｇ／ｇ］はＳＥラットから採取した小腸の水分量［７９９±１７ｍｇ／ｇ］に比べてかなり少ない。実際には、ＳＥ＋ＢＴラットの小腸の水分量は非感染ラットから採取した小腸の水分量［ＢＴ：７４５±２４ｍｇ／ｇ、対照：７６０±１０ｍｇ／ｇ］と同等である。一方、小腸乾燥重量、ＤＮＡ量、ＲＮＡ量及びタンパク質量についてはＳＥラットとＳＥ＋ＢＴラットとの間に有意差は無かった。
【０１３２】
【表４】
2005510733.tif 000006
【０１３３】
ＳＥラットから採取した回腸組織においてミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性は有意に上昇した（表４）。また、腸内容物及び糞便における免疫反応性ＭＰＯ及びエラスターゼの活性も大幅に上昇した（表４）。一方、ＳＥ＋ＢＴラットから採取した腸内容物及び糞便におけるこれらの酵素のレベルは対照ラットの場合と同等か或いはごくわずかに高かった。
【０１３４】
腸炎菌感染の結果、腸内容物、糞便及び血清中の免疫反応性非特異的ＩｇＡは増加した（表４）。しかし、ＩｇＡ反応についてはＳＥ＋ＢＴラットとＳＥラットとの間では差が無かった。血清及び腸内容物では少量のＬＰＳ特異的ＩｇＡも検出された。この場合も、ＳＥ＋ＢＴラットとＳＥラットとの間では有意差が無かったが、ＳＥ＋ＢＴラットの方が腸内でのＬＰＳ特異的ＩｇＡレベルがより高くなる傾向にあった。
【０１３５】
腓腹後肢筋重量については対照ラットよりＳＥラットの方が有意に小さかった（表２）。この傾向はＳＥ＋ＢＴラットでは明らかでなく、よって、この重量減少は筋肉成長の低下によるものと分かった。ＳＥラットの場合、腓腹筋は１日当り湿重量で約６．６±５．７ｍｇ［乾燥重量で１．４±１．２ｍｇ］成長し、一方、ＳＥ＋ＢＴラットの場合、腓腹筋の成長率は１日当り湿重量で１７．１±４．１ｍｇ［乾燥重量で４．２±１．０ｍｇ］であった。また、対照ラットの場合、腓腹筋の成長は１日当り湿重量で１５．５±２．９ｍｇ［乾燥重量で３．８±０．７ｍｇ］であり、ＢＴラットの場合、１日当り湿重量で１７．０±４．２ｍｇ［乾燥重量で４．２±１．０ｍｇ］であった。この結果から、１日当りの全骨格筋の成長については、ＳＥラットの場合、平均０．３ｇ（湿重量）であり、ＳＥ＋ＢＴ、ＢＴ及び対照ラットの場合、約０．７〜０．８ｇであることが示唆される（図６）。
【０１３６】
腸炎菌感染ラットにおいては、肝臓、脾臓及び腸間膜リンパ節の湿重量は有意に増加した（表３）。これは主に、肝臓及び脾臓での水分の蓄積と腸間膜リンパ節での水分及び乾燥物の増加によるものである（表４）。腸炎菌感染ラットの腸間膜リンパ節でのペルオキシダーゼ活性も上昇した［ＳＥ：３１．０±２５．０μｇ、ＳＥ＋ＢＴ：３７．７±２３．８μｇ、ＢＴ：０．９±０．９μｇ、対照：０．４±０．３μｇ］。しかし、腸間膜リンパ節でのペルオキシダーゼ活性については、ＳＥ群とＳＥ＋ＢＴ群との間では有意差が無かった。
【０１３７】
考察
【０１３８】
サルモネラ症：腸炎菌Ｓ１４００（Ｓａｌｍｏｎｅｒａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｖａｒ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ  Ｓ１４００）はラットの消化管全体でコロニーを形成し、腸間膜リンパ節、肝臓及び脾臓に転位した。また、腸炎菌感染により小腸の湿重量及び乾燥重量は大幅に増加した。この重量増加は回腸において最も顕著であり、回腸内での水分の蓄積とタンパク質、ＲＮＡ及びＤＮＡのレベルの上昇とに関連していた。従って、腸炎菌感染の基本的な特徴は、ラットモデルで他のエンテリティディス菌株やネズミチフス菌（Ｓ．ティフィムリウム）株感染において見られる特徴（ノートン（Naughton）ら、１９９６年、２００１年；イーウェン（Ewen）ら、１９９７年；ボヴィー−オーデンホーヴェン（Bovee-Oudenhoven）ら、１９９９年；イスラム（Islam）ら、２０００年；ハヴェラール（Havelaar）ら、２００１年）と類似していた。
【０１３９】
エンテリティディスやティフィムリウムによってラットで自己制限感染が引き起こされ、この細菌は主に消化管に局在し回腸を経由して浸潤するが、全身への伝播は制限されることが分かっている（ノートン（Naughton）ら、１９９６年；ボヴィー−オーデンホーヴェン（Bovee-Oudenhoven）ら、１９９７年、１９９９年；イスラム（Islam）ら、２０００年）。また、ラットの健康状態や腸の完全性が感染以前に他の因子によって損なわれていなければ、重篤な菌血症や死亡が起こることはまれである。これは、エンテリティディスやティフィムリウムによって死亡率の高い重篤な腸チフス様疾患が引き起こされた、マウスモデルの一部におけるサルモネラ症とは全く対照的である（ルー（Lu）ら、１９９９年；キングスレー（Kingsley）及びバウムラー（Baumler）、２０００年；シェヒター（Schechter）及びリー（Lee）、２０００年）。このように、ラットにおけるサルモネラ症は、エンテリティディスやティフィムリウムに感染したヒトや家畜に共通する自己制限胃腸炎型感染症と非常に類似している。
【０１４０】
本発明の検討においては、腸炎菌感染による強い炎症反応が小腸の基部ではなく末端部で引き起こされることを見出した。従って、回腸組織でのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ、好中球マーカー）の活性は有意に上昇した。また、腸内容物や糞便での免疫反応性ＭＰＯ及び白血球エラスターゼの活性レベルも上昇した。この結果は、先にサルモネラ症の動物モデルで観察されたように（ノートン（Naughton）ら、１９９５年、１９９６年；ヴァシロヤナコポウロス（Vassiloyanakopoulos）ら、１９９８年；ダーウィン（Darwin）及びミラー（Miller）、１９９９年；ヘンダーソン（Henderson）ら、１９９９年）、多形核白血球や他の炎症細胞の回腸組織への浸潤及び炎症細胞の腸管内腔への逃避（exvasion）と一致する。また、この結果は、回腸がサルモネラ菌によるコロニー形成及び浸潤の主要部位であるという知見（カーター（Carter）及びコリンズ（Collins）、１９７４；ノートン（Naughton）ら、１９９６年）とも一致する。
【０１４１】
腸炎菌感染によって血清、腸内容物及び糞便中の非特異的ＩｇＡは有意に増加した。また、感染後６日目までにはＬＰＳ特異的ＩｇＡ反応の発生が示された。更に、腸内容物中のタンパク質レベルと同様に、糞便乾燥物、水分及びタンパク質の排出量（outputs）も増加した。腸炎菌感染によって肝臓及び脾臓の重量も増加した。
【０１４２】
サルモネラ症によってラットの骨格筋代謝が損なわれることも見出された。腸炎菌感染ラットと対照ラットは共に同じ乾燥物（７ｇ／ラット／日）及びタンパク質（０．７ｇ／ラット／日）を摂取したが、感染ラットの場合、骨格筋の成長は続いたものの一日当りの成長率は対照ラットの場合の約４０〜５０％であった。これは、感染に対する防御反応を維持するための栄養素の転用や利用（クラシング（Klasing）及びカルバート（Calvert）、１９９９年）及び／又は内毒素や他の細菌性因子の筋肉タンパク質合成への作用（フライマン（Friman）ら、１９８４年；ラング（Lang）ら、２０００年）に起因するものであろう。
【０１４３】
Ｂ．テタイオタオミクロン：本発明の検討においては、腸が急速に成長、成熟し且つ免疫系が発達する時期を通して、ラットを高レベルの外因性Ｂ．テタイオタオミクロンに接触させた。バクテロイデス菌株の一部は日和見病原菌であり、この発達時期に有害な作用を示す可能性がある。しかし、Ｂ．テタイオタオミクロンのみを感染させた成熟完全無菌動物を用いた研究（フーパー（Hooper）ら、１９９９年、２００１年；ノアック（Noack）ら、２０００年）の場合と同様に、Ｂ．テタイオタオミクロンが特定病原不在ラットの腸や全身代謝に悪影響を及ぼさないことが示された。実際、Ｂ．テタイオタオミクロンのみで処理したラットでモニターした全パラメータ（炎症マーカーや免疫グロブリンのレベルを含む）は対照ラットについて得たものと同等であった。
【０１４４】
Ｂ．テタイオタオミクロンとサルモネラ症：Ｂ．テタイオタオミクロンによって、ラットでの腸炎菌Ｓ１４００による感染の特徴が変化し、感染全体の重症度が低下した。特に、小腸での炎症反応が制限され、肝臓及び脾臓で検出された生残腸炎菌の数が大幅に減少し、骨格筋成長率はほぼ対照レベルへ回復した。このように、Ｂ．テタイオタオミクロンは腸内で局所的に作用を示すと同時に、全身組織に対しても遠隔的に作用を示した。
【０１４５】
しかし、サルモネラ症の特徴の一部はＢ．テタイオタオミクロンによっては影響されなかった。消化管及び腸間膜リンパ節内の腸炎菌数は変化せず、また、腸炎菌の糞便排泄についても変化しなかった。また、腸炎菌感染に伴う小腸の拡張（即ち、乾燥重量の増加とＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質量の増加）もＢ．テタイオタオミクロンと腸炎菌を投与したラットにおいて明らかであった。この結果から、Ｂ．テタイオタオミクロンが腸炎菌自身を直接妨害したり、宿主の代謝に対する腸炎菌の一般的な作用をブロックするのではないことが示唆される。むしろ、Ｂ．テタイオタオミクロンは宿主の感染に対する反応を選択的に調節し、腸の完全性を損なう可能性のある反応を標的にするのであろう。
【０１４６】
最近では数多くの細菌株がエンテリティディス感染やティフィムリウム感染を部分的に防御することが示されている。このような細菌株の一部は腸内の付着部位や栄養素における病原菌を打ち負かしたり、殺菌性化合物を産生したりする。その結果、腸内で検出され、腸間膜リンパ節、肝臓及び脾臓に到達するサルモネラ菌の数が減少する（バーネット−カマード（Bernet-Camard）ら、１９９７年；フドールト（Hudault）ら、１９９７年、２００１年；ヘンドリクソン（Hendriksson）及びコンウェイ（Conway）、２００１年）。一方、上記細菌株の多くは腸内のサルモネラ菌の数に対し殆ど或いは全く影響を及ぼさない。しかし、それでもＢ．テタイオタオミクロンの場合と同様に、サルモネラ菌感染を有意に改善する（シルヴァ（Silva）ら、１９９９年；フィルホ−リマ（Filho-Lima）ら、２０００年；シュー（Schu）ら、２０００年；ヘンドリクソン（Hendriksson）及びコンウェイ（Conway）、２００１年；マイア（Maia）ら、２００１年）。従って、後者の細菌株が示す防御作用は競合排除や殺菌性化合物分泌以外のメカニズムによるものである。
【０１４７】
サルモネラ菌は、細胞代謝、細胞間相互作用及び宿主反応メカニズムを妨害することによって腸上皮を突破する（ダーウィン（Darwin）及びミラー（Miller）、１９９９年：ネテア（Netea）ら、２０００年；イーヴス−ピレス（Eaves-Pyles）、２００１年；ゲウィルツ（Gewirtz）ら、２００１年；ルー（Lu）及びウォーカー（Walker）、２００１年；オール（Ohl）及びミラー（Miller）、２００１年）。特に、サルモネラ菌は多形核白血球の腸上皮への急速な浸潤を誘発し、腸の急性炎症や重篤な破壊を引き起こす（マダラ（Madara）、１９９７年；オール（Ohl）及びミラー（Miller）、２００１年）。腸への好中球の浸潤は、サルモネラ菌感染に呼応して上皮細胞により分泌される化学誘引物質ケモカイン（例えばＩＬ−８）によって仲介される（マコーミック（McCormick）ら、１９９５年；マダラ（Madara）、１９９７年；ダーウィン（Darwin）及びミラー（Miller）、１９９９年；フレックスタイン（Fleckstein）及びコペッコ（Kopecko）、２００１年）。上皮細胞をインビトロでサルモネラ菌と共に培養した場合、この化学誘引物質の遊離が促進された（マコーミック（McCormick）ら、１９９５年；キャンベル（Campbell）ら、２００１年）。一方、上皮細胞をサルモネラ菌及びＢ．テタイオタオミクロンと共に培養した場合、この化学誘引物質の産生量は大幅に低下した（キャンベル（Campbell）ら、２００１年）。
【０１４８】
Ｂ．テタイオタオミクロンと腸炎菌とを投与したラットの回腸組織及び腸内容物中のミエロペルオキシダーゼのレベルは、腸炎菌のみを投与したラットから採取した比較サンプルに比べて遥かに低かった。このように、ラットをＢ．テタイオタオミクロンでも処理した場合、腸炎菌により通常腸内で誘発される炎症反応は明らかに抑制された。インビトロで見出されたように（キャンベル（Campbell）ら、２００１年）、Ｂ．テタイオタオミクロンは、サルモネラ菌が関係する腸上皮細胞による化学誘引物質ケモカインの産生をブロックし、腸上皮への好中球の補充を防ぐと思われる。このインビボでの宿主反応をＢ．テタイオタオミクロンが調節することにより、感染の結果起こる腸の炎症や障害の程度を抑制し、腸の完全性を維持するであろう。これによって、炎症の回復に腸が必要とする栄養素の量が減少し（クラシング（Klasing）及びカルバート（Calvert）、１９９９年）、骨格筋等の他の組織へより多くの栄養素を供給することができる。
【０１４９】
サルモネラ菌は一旦腸上皮を通過すると腸間膜リンパ節へ流入する（キングスレー（Kingsley）及びボールマー（Baulmer）、２０００年）。次いで、サルモネラ菌はマクロファージによって腸間膜リンパ節から排除されるか、或いは腸間膜リンパ節から抜け出て血液、肝臓及び脾臓へと伝播し得る（キングスレー（Kingsley）及びボールマー（Baulmer）、２０００年；ルー（Lu）及びウォーカー（Walker）、２００１年）。腸炎菌感染ラットの腸間膜リンパ節、肝臓及び脾臓ではかなりの数の腸炎菌が検出された。Ｂ．テタイオタオミクロンでラットを処理することにより、肝臓及び脾臓で検出される生残腸炎菌のレベルは大幅に減少した。しかし、腸間膜リンパ節での腸炎菌数はこの処理の影響を受けなかった。従って、Ｂ．テタイオタオミクロンは腸代謝に大きく作用するが、腸炎菌の腸間膜リンパ節への浸潤や流入を制限しないことが分かった。腸炎菌のレベルが全身組織で減少したことから、Ｂ．テタイオタオミクロンの主な防御作用は全身代謝の変化によって生じることが示されるであろう。
【０１５０】
共生細菌は強力な免疫調節物質となる（へリアス（Herias）ら、１９９９年；タルハム（Talham）ら、１９９９年；シャレック（Scharek）ら、２０００年；イソラウリ（Isolauri）ら、２００１年；ルー（Lu）及びウォーカー（Walker）、２００１年）。特に、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）でマウスを処理すると、マウスの免疫機能やサルモネラ菌に対する反応性が向上することが分かった（シュー（Schu）ら、２０００年）。血液や腹膜細胞での貪食活性、リンパ球分裂促進反応性及びティフィムリウム特異的抗体の分泌が向上した。Ｂ．テタイオタオミクロンも全身代謝に対して同様の作用を示すと思われる。従って、Ｂ．テタイオタオミクロンで処理したラットの肝臓及び脾臓で腸炎菌数が減少したことは、血液や内臓からの腸炎菌の排除が高まった結果によるものであろう。
【０１５１】
乳糖発酵菌（大腸菌）も、数こそ少ないが、腸炎菌感染ラットの肝臓及び脾臓で検出された。しかし、腸炎菌の場合と異なり、乳糖発酵菌のレベルはＢ．テタイオタオミクロンの影響を受けなかった。このことから、Ｂ．テタイオタオミクロンによって促進される細菌の排除には選択性があると思われる。或いは、大腸菌はラットの常在細菌叢に由来するため、不適切な組織部位に存在している場合でも、潜在的有害物質として容易に認識されないのであろう。
【０１５２】
Ｂ．テタイオタオミクロンは腸に局所的に作用することによって、サルモネラ菌の全身への伝播を抑制すると思われる。サルモネラ菌が腸上皮に付着し、腸上皮内に浸潤し、腸間膜リンパ節へ流入し、肝臓や脾臓へ伝播することは一般に認められている（キングスレー（Kingsley）及びボールマー（Baulmer）、２０００年）。しかし、最近の研究では、サルモネラ菌の全身への伝播が別の経路で起こり得ることが示唆されている。樹状細胞により管腔に摂取されるか、或いはＣＤ１８を発現する貪食細胞により上皮下組織へ摂取されたサルモネラ菌は、リンパ系へ流入することなく、肝臓や脾臓に直接伝播し得る（ヴァルケス−トレス（Varquez-Torres）ら、１９９９年；アイスバーグ（Isberg）及びバーンズ（Barnes）、２０００年；レスチグノ（Rescigno）ら、２００１年）。その結果、肝臓や脾臓で検出されるサルモネラ菌は２種類の摂取経路に由来する可能性がある。上記貪食細胞の補充は、上皮細胞により産生する化学誘引物質ケモカインによって仲介される可能性がある（イザドパナー（Izadpanah）ら、２００１年；ケレンナン（Kellennan）及びマッケヴォイ（McEvoy）、２００１年）。Ｂ．テタイオタオミクロンは腸内での好中球補充や炎症を引き起こすのに必要な化学誘引物質ケモカインの分泌を防ぐことによって、これらの補充や炎症を抑制することが分かっているため（キャンベル（Campbell）ら、２００１年）、樹状細胞やＣＤ１８を発現する貪食細胞の補充に必要とされるケモカインも抑制し、その結果、このような系によるサルモネラ菌の摂取を防止或いは抑制するであろう。
【０１５３】
概要
【０１５４】
経口投与したＢ．テタイオタオミクロンによって、ラットにおける腸炎菌による感染の重症度が低下した。肝臓及び脾臓内の生残腸炎菌数は大幅に減少し、骨格筋成長率は正常値に回復し、また、小腸内の炎症反応は軽減された。これは、免疫反応性が向上したことや遠隔部位（例えば、肝臓や脾臓）で腸炎菌が急速に排除されたことによるものと思われる。しかし、少なくとも一部は、Ｂ．テタイオタオミクロンの腸への局所作用に起因するものでもある。腸内での好中球補充や炎症はＢ．テタイオタオミクロンの作用によって防止或いは遅延された。また、Ｂ．テタイオタオミクロンは、腸炎菌の貪食細胞への直接摂取と肝臓や脾臓への伝播もブロックしたと思われる。
【０１５５】
［参考文献］
1. E. Cario et al. J Immunol. 164, 966 (2000).
2. A. T. Gewirtz, T. A. Navas, S. Lyons, P. J. Godowski, J. L. Madara, J. Immunol. 167, 1882 (2001). 
3. B. A. McCormick, S. P. Colgan, C. Delp-Archer, S. I. Miller, J. L. Madara, J. Cell Biol. 123, 895 (1993). 
4. L. Hang et AL., J. Immunol. 162, 3037 (1999). 
5. S. Ghosh, M. J. May, E. B. Kopp Annu. Rev. Immunol. 16, 225-260 (1998). 
6. M. J. May, S. Ghosh. Immunol. Today (1998). 
7. Q. Cheng et al., J. Biol. Chem. 269, 13551 (1994). 
8. P. J. Chiao, S. Miyamoto, I. M. Verma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 28-32. (1994). 
9. P. Renard et al. J. Biol. Chem. 275, 15193 (2000). 
10. A. S. Neish et al., Science 289, 1560 (2000). 
11. T. Meyer-ter-Vehn, A. Covacci, M. Kist, H. L. Pahl, J. Biol. Chem. 275, 16064 (2000). 
12. J. Raingeaud et al., J. Biol. Chem. 270, 7420 (1995). 
13. Nakajima et al. Gastroenterology 120, 460 2001. 
14. E. D. Rosen, B. M. Spiegelman. J. Biol. Chem. 276, 37731-37734 (2001). 
15. C. G. Su et al., J. Clin. Invest. 104, 383 (1999). 
16. C. F. Bunn et al., Mol. Endocrinol. 15, 512 (2001). 
17. M. Ricote, J. T. Huang, J. S. Welch, C. K. Glass, J. Leukoc. Biol. 66, 733 (1999). 
18. P. Delerive et al., J. Biol. Chem. 274, 32048 (1999). 
19. M. Gurnell et al., J. Biol. Chem.  275, 5754 (2000). 
20. S. D. Savkovic, A. Koutsouris, G. Wu, G. Hecht, Biotechniques 29, 514 (2000). 
21. A. Birbach et al. J. Biol. Chem. 277, 10842 (2002). 
22. J. Schmid et al. J. Biol. Chem. 275, 17035 (2002). 
23. Y. Zhoa et al., J. Biol. Chem. 277, 30031-30039 (2002). 
24. K. Madsen et al., Gastroenterology 121, 580 (2001). 
25. C. A. Parkos et al., J. Clin. Invest. 88, 1605 (1991). 
26. Allen-Vercoe et al., J Med Microbiol 48, 771-780 (1999). 
27. Bardocz, S. et al., Br J Nutr 76, 613-626 (1996). 
28. Bernet-Camard et al., Appl Environ Microbial 63, 2747-2753 (1997). 
29. Bovee-Oudenhoven et al., Gastroenterology 113, 550-557 (1997). 
30. Bovee-Oudenhoven et al., J Nutr 129,607-612 (1999). 
31. Bry, L et al., Science 273, 1380-1383 (1996). 
32. Bryant, M. P. Am J Clin Nutr 25, 1324-1328 (1972). 
33. Carter, J Exp Med 139, 1189-1203 (1974). 
34. Cebra, J. J., Am J CLIN Nutr 69, 1046S-1051S (1999). 
35. Chang, J. et al., J Appl Bacteriol 77, 709-718 (1994). 
36. Collins, C. H. L. P. M. (1989) Microbiological Methods Butterworths, London.
37. Darwin, K. H. et al., Clin Microbiol Rev 12, 405-428 (1999). 
38. Eaves-Pyles, T. et al., J Immunol 166, 1248-1260 (2001). 
39. Ewen, S. W. et al., FEMS Immunol Med Microbiol 18, 185-192 (1997). 
40. Filho-Lima, J. V. et al., J Appl Microbiol 88, 365-370 (2000). 
41. Fleckenstein, J. M. et al., J Clin Invest 107, 27-30 (2001). 
42. Friman, G. et al., Scand J Infect Dis 16, 111-119 (1984). 
43. Gewirtz, A. T. et al., J Immunol 167, 1882-1885 (2001). 
44. Grant, G. (1996) Management of Animal Experiments. COST 98. Effects of antinutrients on the nutritional value of legume diets (Bardocz, S; Pusztai. A., ed) pp. 44-51, European Commision, Brussels.
45. Grant, G. et al., Pancreas 20, 305-312 (2000). 
46. Havelaar, A. H. et al., J Appl Microbiol 91,442-452 (2001). 
47. Henderson, S. C. et al., Infect Immun 67, 3580-3586 (1999). 
48. Henriksson et al., J Appl Microbiol 90, 223-228 (2001). 
49. Herias et al., Scand J Immunol 48, 277-282 (1998). 
50. Herias, M. V. et al., Clin Exp Immunol 116, 283-290 (1999). 
51. Hooper, L. V. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 96, 9833-9838 (1999).52. Hooper, L. V. et al., Curr Opin Microbiol 3, 79-85 (2000). 
53. Hooper, L. V. et al., Glycobiology 11, 1R-10R (2001). 
54. Hooper, L. V. et al., Science 291, 881-884 (2001). 
55. Hudault, S. et al., Appl Environ Microbiol 63, 513-518 (1997). 
56. Hudault, S. et al., Gut 49,47-55 (2001). 
57. Isberg, R. R. et al., Trends Microbiol 8, 291-293 (2000). 
58. Islam, A. F. et al., Infect Immun 68, 1-5 (2000). 
59. Isolauri, E. et al., Am J Clin Nutr 73, 444S-450S (2001). 
60. Izadpanah, A. et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 280, G710-G719 (2001). 
61. Kellermann, S. A. et al., J Immunol 167, 682-690 (2001). 
62. Kingsley, R. A et al., Bacterial Invasion into Eukaryotic Cells (Oelschlaeger, T. A. and Hacker, J., eds) pp. 321-342, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York (2000). 
63. Klasing, K. C. C. C. C. Protein Metabolism and Nutrition (Lobely, G. E; Wnite, . A. and MacRae, J. C., eds) pp. 253-264, Wageningen Pers, Wageningen (1999). 
64. Lang, C. H. et al., Am J Physiol Endocrinol Metab 278, E1133-E1143 (2000).
65. Lopez-Boado, Y. S. et al., J Cell Biol 148, 1305-1315 (2000). 
66. Lu, L. et al., Am J Clin Nutr 73, 1124S-1130S (2001). 
67. Lu, S. et al., Infect Immun 67, 5651-5657 (1999). 
68. Madara, J. L. Aliment Pharmacol Ther 11 Suppl 3, 57-62 (1997). 
69. Maia, O. B. et al., Vet Microbiol 79, 183-189 (2001). 
70. McCormick, B. A. et al., J Cell Biol 131, 1599-1608 (1995). 
71. Miles, A. A. et al., J Hyg 38, 749 (1993). 
72. Naughton, P. J. et al., FEMS Immunol Med Microbiol 12, 251-258 (1995). 
73. Naughton, P. J. et al., J Appl Bacteriol 81, 651-656 (1996). 
74. Naughton, P. J. et al., J Med Microbiol 50, 191-197 (2001). 
75. Netea, M. G. et al., J Immunol 164, 2644-2649 (2000). 
76. Noack, J. et al., J Nutr 130, 1225-1231 (2000).
77. Pier, G. B. et al., Infect Immun 60, 4768-4776 (1992). 
78. Rescigno, M. et al., Nat Immunol 2, 361-367 (2001). 
79. Salminen, S. et al., Br J Nutr 80 Suppl 1, S147-S171 (1998). 
80. Scharek, L. et al., Immunobiology 202, 429-441 (2000). 
81. Schechter, L. M. et al., Bacterial Invasion into Eukaryotic Cells. (Oelschlaeger, T. A. H. J., ed) pp. 289-320, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York (2000). 
82. Shu, Q. et al., Med Microbiol Immunol (BERL) 189, 147-152 (2001). 
83. Silva, A. M. et al., J Appl Microbiol 86, 331-336 (1999). 
84. Snel, J. et al., Can J Microbiol 44, 1177-1182 (1998). 
85. Stucchi, A. F. et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 279, G1298-G1306 (2000). 
86. Talham, G. L. et al., Infect Immun 67, 1992-2000 (1999). 
87. Teng, L. J. et al., J Clin Microbiol 38, 1672-1675 (2000). 
88. Van Der Waaij, D. The Germ-free Animal in Biomedical Research (Coates, M. E. Gustafsson,. B. E., ed) pp. 155-165, Laboratory Animals Ltd, London (1984). 
89. Vassiloyanakopoulos, A. P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 95, 7676-7681 (1998). 
90. Vazquez-Torres, A. et al., Nature 401, 804-808 (1999). 
91. Yurdusev, N. et al., Can J Microbiol 33, 226-231 (1987). 
92. Yurdusev, N. et al., Infect Immun 57, 724-731 (1989). 
93. Zimmerman, B. J. et al., Am J Physiol 259, H390-H394 (1990). 
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】（ａ）１）非感染Ｃａｃｏ−２細胞、２）１０８個の腸炎菌を感染させたＣａｃｏ−２細胞、３）１０８個の腸炎菌と１０９個のＢ．テタイオタオミクロンを感染させたＣａｃｏ−２細胞、及び４）１０９個のＢ．テタイオタオミクロンを感染させたＣａｃｏ−２細胞のＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＭＩＰ−２α、ＴＧＦ−β、ＣＯＸ−２及びＧ３ＰＤＨに特異的な３２Ｐ標識プローブを用いたサイトカインｍＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーション。  （ｂ）ＩＬ８及びＧ３ＰＤＨの半定量的ＰＣＲ。（１）培地のみでインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞；（２）１０８個の腸炎菌、１０８個の大腸菌０１５７Ｈ７、ＰＭＡ（３００ｎｇ／ｍｌ）或いはＩＬ−１α／β（２０ｎｇ／ｍｌ）（図示の通り）と共にインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞；（３）１０９個のＢ．テタイオタオミクロンの存在下で上記（２）のようにインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞；（４）１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共にインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞。  （ｃ）１）非感染Ｃａｃｏ−２細胞、２）１０８個の腸炎菌を感染させたＣａｃｏ−２細胞、３）１０８個の腸炎菌と１０９個のＢ．ブルガータスを感染させたＣａｃｏ−２細胞、及び４）１０９個のＢ．ブルガータスを感染させたＣａｃｏ−２細胞のＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＭＩＰ−２α、ＴＧＦ−β、ＣＯＸ−２及びＧ３ＰＤＨに特異的な３２Ｐ標識プローブを用いたｍＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーション。  （ｄ）１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共にＣａｃｏ−２細胞を２時間或いは４時間（図示の通り）インキュベートした。  （ｅ）上記（ａ）の処理群（１）〜（４）のＭＰＯアッセイにより測定した、Ｃａｃｏ−２細胞単層を経由するＰＭＮ細胞の経上皮遊走。  （ｆ）（１）対照、（２）１０８個の腸炎菌、（３）Ｂ．テタイオタオミクロンに次いで１０８個の腸炎菌、及び（４）Ｂ．テタイオタオミクロンのみでチャレンジしたラットの処理後６日目の回腸粘膜のＭＰＯアッセイ。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）。
【図２】１）非感染Ｃａｃｏ−２細胞、２）１０８個の腸炎菌と共にインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞、３）１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共にインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞、及び４）１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共にインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞。次の一次抗体を用いて試験した。抗ＲｅｌＡ（Ａ〜Ｄ）、抗ＰＰＡＲγ（Ｅ〜Ｈ）、抗ＩκＢα（Ｉ〜Ｌ）及び抗ｐＩκβα（Ｍ〜Ｐ）。スケールバーは全て２５μｍ。Ｏ及びＰ中の挿入図は点状核標識の詳細を示す。
【図３】（Ａ）図１Ａで上述した群（１）〜（４）に関して、コンセンサス３２Ｐ標識ＮＦ−κＢ結合配列オリゴヌクレオチドを用い、抗ＲｅｌＡ抗体と共にインキュベートしたＣａｃｏ−２核抽出物について行ったスーパーシフトＥＭＳＡ。ここで、上記Ｂ．テタイオタオミクロンは７０℃、１５分で熱失活させた。  （Ｂ）上記実験処理群（１）〜（４）のｍＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション。ブロットは特異的３２Ｐ標識ＩκＢα及びＧ３ＰＤＨプローブを用いて試験した。  （Ｃ）Ｃａｃｏ−２細胞由来の核抽出物のウェスタンブロット。処理群は上述の通りである（１〜４）。免疫ブロットは、抗ｐ３８及び抗ｐｐ３８（ニューイングリッシュバイオラボ）（New English Biolabs）に特異的な抗体を用いて試験した。  （Ｄ）ｃ−Ｆｏｓ及びｃ−Ｊｕｎの超誘発は、Ｃａｃｏ−２細胞から得た全ＲＮＡについてのノーザンハイブリダイゼーションによって測定した。Ｃａｃｏ−２細胞の処理はシクロヘキサミドの非存在下（−Ｃ）或いはシクロヘキサミド（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で上述のように（１〜４）行った。ブロットは、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ及びＧ３ＰＤＨに特異的な３２Ｐ標識プローブでハイブリダイズした。  （Ｅ、Ｆ）Ｃａｃｏ−２細胞由来の核抽出物のウェスタンブロット。処理群は上述の通りである（１〜４）。ｃ−Ｆｏｓ（サンタクルズ）、ＡＴＦ−２及びｐＡＴＦ−２（ニューイングランドバイオラボ）（New England Biolabs）に特異的な抗体を用いた。  （Ｇ）ＩκＢα及びｐＩκＢαを用いた免疫沈降（ＩＰ）。Ｃａｃｏ−２細胞は標準培養プロトコルに従い調製した。処理群（１〜４）。ＩＰはウェスタンブロッティングで解析した。ＮＳは非特異的であることを示し、Ｂｌは細胞抽出物を含まない対照である。
【図４】（Ａ）特異的３２Ｐ標識ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲαプローブで解析した、（１）非感染Ｃａｃｏ−２細胞、（２）１０８個の腸炎菌と共にインキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞、（３）１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共にインキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞、及び（４）１０９個のＢ．テタイオタオミクロンのみと共にインキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞から得たｍＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション。細菌の添加は２時間行った。  （Ｂ）処理（１）及び（２）は上述の通りであり、更に（３ａ）３０μＭの１５ＰＧ−Ｊ２の存在下で１０８個の腸炎菌と共にインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞、及び（３ｂ）３０μＭのフェノフィブラートの存在下で１０８個の腸炎菌と共にインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞を用いた（図示の通り）。細菌及びこれら薬剤の添加は２時間行った。３２Ｐ標識ＰＰＡＲγ特異的プローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡを解析した。  （Ｃ）（１）非感染Ｃａｃｏ−２細胞、（２）１０８個の腸炎菌と共にインキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞、（３）（４）（５）１０、２０或いは３０μＭの１５ＰＧ−Ｊ２の存在下で１０８個の腸炎菌と共にインキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞、及び（６）３０μＭの１５ＰＧ−Ｊ２のみと共にインキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞から得たｍＲＮＡを、３２Ｐ標識ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＣＯＸ−２及びＧ３ＰＤＨを用いたノーザンハイブリダイゼーションで解析した。細菌及び薬剤の添加は２時間行った。  （Ｄ）（１）非感染Ｃａｃｏ−２細胞、（２）１０８個の腸炎菌と共にインキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞、及び（３）（４）１０或いは３０μＭのシグリタゾンの存在下で１０８個の腸炎菌と共にインキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞から得たｍＲＮＡを、３２Ｐ標識ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＣＯＸ−２及びＧ３ＰＤＨを用いたノーザンハイブリダイゼーションで解析した。細菌及び薬剤の添加は２時間行った。  （Ｅ）（１）非感染Ｃａｃｏ−２細胞、（２）１０８個の腸炎菌と共にインキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞、及び（３）１０８個の腸炎菌及び３０μＭのフェノフィブラートと共にインキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞から得たｍＲＮＡを、３２Ｐ標識ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＣＯＸ−２及びＧ３ＰＤＨを用いたノーザンハイブリダイゼーションで解析した。細菌及び薬剤の添加は２時間行った。  （Ｆ）（１）非感染Ｃａｃｏ−２細胞、（２）１０８個の腸炎菌と共にインキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞、（３）１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共にインキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞、及び（４）１０９個のＢ．テタイオタオミクロンのみと共にインキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞から得た核抽出物及び細胞質抽出物を抗ＰＰＡＲγ（サンタクルズ）を用いたウェスタンブロッティングで解析した。細菌は２時間適用した。Ｃａｃｏ−２細胞は核画分、細胞質画分、洗浄剤可溶画分（Ｄ．可溶）或いは洗浄剤不溶画分（Ｄ．不溶）として調製した。  （Ｇ）１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共に２時間共培養したＣａｃｏ−２細胞を���％ノニデットＰ４０溶液含有ＰＢＳに溶解し、ポリクローナル抗ＲｅｌＡセファロース（サンタクルズ）と共に一晩インキュベートした。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した。モノクローナル抗ＲｅｌＡ［ＮＦ−κＢ  ｐ６５］、抗ＰＰＡＲγ抗体及び抗ＨＤＡＣ３（サンタクルズ）を用いてウェスタンブロットを展開した。  （Ｈ）ＰＰＡＲγ（ｆ〜ｍ、ｏ）及びＲｅｌＡ（ｎ）の免疫蛍光顕微鏡検査。プレートｎ及びｏ（ｐ）からＰＰＡＲγとＲｅｌＡとの共存を確認。培地のみで（ｔ、ｊ）、１０８個の腸炎菌と共に（ｇ、ｋ）、１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共に（ｈ、ｌ、ｎ〜ｐ）、或いは１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共に（ｉ、ｍ）Ｃａｃｏ−２細胞を増殖させた。４μＭのＴＳＡの非存在下（ｔ〜ｉ、ｎ〜ｐ）及び存在下（ｊ〜ｍ）で処理を行った。スケールバーは全て２５μｍ。
【図５】ＰＰＡＲγの変異はＢ．テタイオタオミクロン仲介によるＮＦ−κＢの抑制及びＲｅｌＡのサイトゾル内隔離を妨害する。  （Ａ）ＲｅｌＡの免疫検出。Ｃａｃｏ−２細胞は標準培養プロトコルに従い調製した。処理群（１〜４）。免疫沈降物は抗ＰＰＡＲγセファロース複合体を用いて調製した。  （Ｂ）ＲｅｌＡ／ＰＰＡＲγ結合を示すインビトロ翻訳  （Ｃ）ＰＰＡＲγＤＮとＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター構造体をトランスフェクトしたＣａｃｏ−２細胞（ＤＮ）と、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターのみをトランスフェクトした対照細胞（ＭＯＣＫ）とを比較した。（１）非感染Ｃａｃｏ−２細胞、（２）１０８個の腸炎菌と共に更に６時間インキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞、及び（３）１０９個のＢ．テタイオタオミクロンの存在下で１０８個の腸炎菌と共に更に６時間インキュベートした後のＣａｃｏ−２細胞において、ルシフェラーゼ活性（％刺激で示す）を測定した。  （Ｄ）構成的に発現する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）構造体をトランスフェクトしたＣａｃｏ−２細胞（Ｂ、Ｃ）及びＰＰＡＲγＤＮとＧＦＰをトランスフェクトしたＣａｃｏ−２細胞（Ｄ、Ｅ）。細胞は全て１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共にインキュベートした。次いで、細胞を抗ＲｅｌＡ（ｐ６５）特異的抗体（サンタクルズ）で免疫染色し、ＬＳＣＭで試験した。（Ｂ）及び（Ｄ）はＧＦＰ（緑）とＲｅｌＡ（赤）の複合画像を示す２チャンネルキャプチャである。（Ｂ）及び（Ｄ）はそれぞれ（Ｂ）及び（Ｄ）と面積が同じであり、ＲｅｌＡのみを示す１チャンネルキャプチャである。スケールバー＝２５μＭ。  （Ｅ）カルボキシ末端に黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を有するＲｅｌＡキメラ構造体とＰＰＡＲγ（ｄ〜ｆ）或いはＰＰＡＲγＤＮ（ｇ〜ｉ）とをＣａｃｏ−２細胞にトランスフェクトした。ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲγＤＮはいずれもカルボキシ末端にシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を有するキメラ構造体である。トランスフェクション後２日目に、細胞を１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共にインキュベートした。ＣＦＰ蛍光（ｄ、ｇ）及びＹＦＰ蛍光（ｅ、ｈ）。ＣＦＰ−ＰＰＡＲγとＹＦＰ−ＲｅｌＡとの共存をプレートｄ及びｅ（ｆ）から確認し、ＣＦＰ−ＰＰＡＲγ（ＤＮ）とＹＦＰ−ＲｅｌＡとの共存をプレートｇ及びｈ（ｉ）から確認した。スケールバーは全て２５μｍ。（ｊ、ｋ）ＣＦＰ−ＰＰＡＲγをＨｅｌａ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション後２日目に、細胞を１０８個の腸炎菌及び１０９個のＢ．テタイオタオミクロンと共にインキュベートした。Ｈｅｌａ細胞を固定し、透過処理し、免疫染色してＳＣ３５を確認した（immuno-stained for SC35）。ＣＦＰ−ＰＰＡＲγ（ｊ）及びＳＣ３５の間接免疫蛍光（ｋ）。スケールバー＝１０μｍ。
【図６】図６は、対照ラット、バクテロイデス・テタイオタオミクロンを経口投与したラット（ＢＴ）、腸炎菌を経口投与したラット（ＳＥ）、及び腸炎菌とＢ．テタイオタオミクロンとを経口投与したラット（ＳＥ＋ＢＴ）での骨格筋（□：湿重量、■：乾燥重量）の成長（ｍｇ／ラット／日）を示す。＊は、乾燥重量及び湿重量それぞれについて対照、ＢＴ及びＳＥ＋ＢＴと有意差があることを示す（ｐ≦０．０５）。骨格筋を腓腹筋で代表させたが、若いＨｏｏｄｅｄ−Ｌｉｓｔｅｒラットの全骨格筋重量は腓腹筋重量の約４７倍である（バルドクス（Bardocz）ら、１９９６年）。腓腹筋の初期重量は、初期新鮮体重１００ｇ当り湿重量で８０４±１０ｍｇ［乾燥重量で１９４±７ｍｇ］。
【図７】図７は、ケモカイン／サイトカインｍＲＮＡ発現への作用を示す定量的データ（ノーザンブロット及びリアルタイムＰＣＲ）を示す。Ｓ．ｅ．＝腸炎菌。Ｂ．ｔ．＝Ｂ．テタイオタオミクロン。
【図８】図８は、Ｃａｃｏ−２細胞単層と共に２時間インキュベートした後の細菌の数を示す。  ａ）Ｂ．ｔの存在下及び非存在下でＣａｃｏ−２細胞に付随するＢ．ｔ（細胞単層洗浄後に残ったＢ．ｔ）。  ｂ）Ｂ．ｔの存在下及び非存在下でＣａｃｏ−２細胞に付随するＳ．ｅ。  ｃ）Ｂ．ｔの存在下及び非存在下でＣａｃｏ−２細胞に浸潤した腸炎菌（細胞洗浄及びゲンタマイシン処理（１００μｇ／ｍｌ、４時間）後に残った腸炎菌）。ｎ＝６、＋／−標準偏差。
【図９】図９Ａ：ＥＭＳＡを用いて測定した、Ｃａｃｏ−２細胞における腸炎菌に呼応するＮＦ−κＢ活性化を示す。  図９Ｂ：ノーザンハイブリダイゼーションによるサイトカイン反応の解析  ａ）１０８及び１０１０ｃｆｕのＳ．ｅに２時間接触させた後のＣａｃｏ−２細胞から得たｍＲＮＡを解析して炎症誘発性サイトカインの誘発を確認し、Ｇ３ＰＤＨに対して規準化した。  ｂ）１０９個のＳ．ｅに各時間接触させた後のＣａｃｏ−２細胞から得たｍＲＮＡを解析して炎症誘発性サイトカインの誘発を確認し、Ｇ３ＰＤＨに対して規準化した。２時間或いは４時間まで接触させた際のデータも示す（図９Ｄ）。  ｃ）１０７〜１０１０個のＢ．ｔ．に２時間接触させた後のＣａｃｏ−２細胞から得たｍＲＮＡを解析して炎症誘発性サイトカインの誘発を確認し、Ｇ３ＰＤＨに対して規準化した。  ｄ）Ｃａｃｏ−２細胞から得たｍＲＮＡを解析して炎症性サイトカインの発現（ＣＯＸ−２及びＩＬ−８）を確認した。２時間及び４時間でのＢ．ｔ．の抑制作用を示す。  図９Ｃ：免疫細胞化学的検出法を用いて得た、腸炎菌及びＢ．テタイオタオミクロンにＣａｃｏ−２細胞を接触させた後のＲｅｌ（ｐ６５）活性化の経時データ。Ｓ．ｅ．＋／−Ｂ．ｔ．に２時間接触させたＣａｃｏ−２細胞を４％パラホルムアルデヒドに固定し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、抗ｐ６５（ＲｅｌＡ）（サンタクルズ）で免疫標識した。二次検出はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗ウサギＩｇＧ（モレキュラープローブ）を用いて行った。Ａｘｉｏｖｅｒｔ２０００顕微鏡に搭載したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｃａｍを用いて画像をデジタル記録した。  図９Ｄ：免疫細胞化学的検出法を用いて得た、腸炎菌とＢ．テタイオタオミクロンにＣａｃｏ−２細胞を接触させた後のＰＰＡＲγ作用の経時データ。  Ｓ．ｅ．＋／−Ｂ．ｔ．に２時間接触させたＣａｃｏ−２細胞を４％パラホルムアルデヒドに固定し、のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、抗ＰＰＡＲγ（サンタクルズ）で免疫標識した。二次検出はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８抗ヤギＩｇＧ（モレキュラープローブ）を用いて行った。Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００顕微鏡に搭載したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｃａｍを用いて画像をデジタル記録した。  図９Ｅ  Ｂ．テタイオタオミクロンと腸炎菌に２時間接触させた後のＣａｃｏ−２細胞におけるＮＦ−κＢ  ｐ６５とＰＰＡＲγとの共標識化（co-labelling）を示す。
【図１０】対照ラット、Ｂ．テタイオタオミクロンを経口投与したラット［Ｂ．ｔ］、腸炎菌を経口投与したラット［Ｓ．ｅ］、及び腸炎菌とＢ．テタイオタオミクロンとを経口投与したラット［Ｓ．ｅ＋Ｂ．ｔ］での骨格筋（腓腹筋）（□：湿重量、■：乾燥重量）の増量（ｍｇ／ラット／日）。ｎ＝６、＋／−標準誤差。
【図１１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、エレクトロブロットし、アセチル化リジンモノクローナル抗体で免疫染色したｐ６５免疫沈降物を示す。
【図２】
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【図６】
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【図８】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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