(57)【要約】本発明は、標的化された免疫応答を誘発するための製造物および方法に関する。詳細には、本発明は、抗原提示細胞標的化機構を含むエピトープ構築物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのエピトープ配列と、抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化機構を含有する、免疫応答を刺激することができるペプチド構築物。
【請求項２】
前記免疫応答が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答、ヘルパーＴ細胞応答およびＢ細胞応答からなる群から選択される、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記エピトープが、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の構築物。
【請求項４】
前記エピトープが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原および真菌抗原からなる群から選択される抗原に由来する、請求項１に記載の構築物。
【請求項５】
前記エピトープが腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する、請求項１に記載の構築物。
【請求項６】
前記腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）がガン胎児性抗原（ＣＥＡ）である、請求項５に記載の構築物。
【請求項７】
前記エピトープが、ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ（配列番号２）、ＨＬＦＧＹＳＷＹＫ（配列番号３）およびＩＰＱＱＨＴＱＶＬ（配列番号４）からなる群から選択される、請求項６に記載の構築物。
【請求項８】
前記エピトープが非天然エピトープであり、この非天然エピトープは、少なくとも１つの変化がそのアミノ酸配列に含有されるという点で、この非天然エピトープが由来する天然エピトープとは異なる、請求項１に記載の構築物。
【請求項９】
前記非天然エピトープは、ＭＨＣ分子またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または両方に対してより大きい親和性で結合するという点で、この非天然エピトープが由来する天然エピトープとは異なる、請求項８に記載の構築物。
【請求項１０】
２つ以上のエピトープを含み、前記エピトープが１つ以上の異なる抗原に由来する、請求項１に記載の構築物。
【請求項１１】
前記エピトープが連続して配置される、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
少なくとも１つのエピトープが細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープである、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１３】
前記エピトープが、内部プロセシング配列を含むスペーサー（隣接）配列によって少なくとも一方の側面に配置される、請求項１に記載の構築物。
【請求項１４】
前記エピトープが、スペーサー（隣接）配列によって両側に配置される、請求項１３に記載の構築物。
【請求項１５】
前記内部プロセシング配列がエンドソームまたはリソソームでの構築物のプロセシングのためのシグナルを含有する、請求項１３に記載の構築物。
【請求項１６】
前記内部プロセシング配列が、下記の式：
［Ｌｅｕおよび／またはＡｓｐおよび／またはＰｒｏ］−［Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−ＹT/C］
（式中、各Ｘａａは任意のアミノ酸から独立して選択され、ＹT/Cは、トリプシンまたはキモトリプシンによる切断を受けやすいアミノ酸である）
によって表される、請求項１３に記載の構築物。
【請求項１７】
前記内部プロセシング配列は、下記の式：
［Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｒｏ］−［Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ］
（式中、各Ｘａａは任意のアミノ酸から独立して選択される）
によって表される、請求項１３に記載の構築物。
【請求項１８】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化機構は、構築物を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に導くＡＰＣ標的化配列を含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項１９】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化配列はエピトープ含有配列に共有結合により結合される、請求項１８に記載の構築物。
【請求項２０】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化配列は、ＣＤ９１、マンノース受容体（ＭＲ）、ＤＥＣ−２０５、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＦｃγＲＩからなる群から選択される細胞表面タンパク質との相互作用を媒介することができる配列に由来する、請求項１８に記載の構築物。
【請求項２１】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化機構は、下記の機能：
（ｉ）ＡＰＣ標的化を媒介すること；
（ｉｉ）その意図されたＡＰＣに到達するまで構築物の存続性を保つこと；
（ｉｉｉ）構築物の制御された放出を媒介すること
の少なくとも１つを行うべヒクルをさらに含む、請求項１８に記載の構築物。
【請求項２２】
前記べヒクルはミクロスフェアまたはリポソームである、請求項２１に記載の構築物。
【請求項２３】
請求項１に記載される構築物をコードする単離された核酸。
【請求項２４】
請求項２３に記載される核酸を含む発現ベクター。
【請求項２５】
ＡＰＣ標的化機構をさらに含む、請求項２４に記載される発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２３に記載される核酸を含む宿主細胞。
【請求項２７】
ＡＰＣである、請求項２６に記載される宿主細胞。
【請求項２８】
免疫原として有効量の請求項１に記載される構築物を含む医薬組成物。
【請求項２９】
医薬的に許容されるアジュバントまたは賦形剤をさらに含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
免疫原として有効量の請求項１に記載される構築物を含むワクチン組成物。
【請求項３１】
医薬的に許容されるアジュバントまたは賦形剤をさらに含む、請求項３０に記載のワクチン組成物。
【請求項３２】
哺乳動物において抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、請求項２８に記載される医薬組成物の少なくとも１回の服薬を哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３３】
前記抗原が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、請求項３２に記載される方法。
【請求項３４】
請求項２８に記載される医薬組成物を投与することにより、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）免疫応答が誘導される、請求項３３に記載される方法。
【請求項３５】
哺乳動物において抗原により誘導される免疫性を増強するための方法であって、請求項２８に記載される医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３６】
哺乳動物において疾患を処置するための方法であって、請求項２８に記載される医薬組成物の少なくとも１回の服薬を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３７】
前記疾患が、新生物性疾患、感染および自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項３６に記載される方法。
【請求項３８】
前記疾患がガンである、請求項３６に記載される方法。
【請求項３９】
哺乳動物において腫瘍を処置するための方法であって、抗腫瘍免疫応答を刺激することができる構築物の免疫原としての有効量を含む医薬組成物の少なくとも１回の服薬を前記哺乳動物に投与することを含み、前記構築物が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する少なくとも１つのエピトープ配列と、抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化機構を含む、方法。
【請求項４０】
前記構築物中のエピトープが、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）がガン胎児性抗原（ＣＥＡ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記構築物中のエピトープが、ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ（配列番号２）、ＨＬＦＧＹＳＷＹＫ（配列番号３）およびＩＰＱＱＨＴＱＶＬ（配列番号４）からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記構築物中のエピトープが非天然エピトープであり、この非天然エピトープは、（ｉ）変化がそのアミノ酸配列に含有されるという点で、また、（ｉｉ）ＭＨＣ分子またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対してより大きい親和性で結合するという点で、この非天然エピトープが由来する天然エピトープとは異なり、かつ、この非天然エピトープが由来する天然エピトープに対する免疫応答を調節するために有用である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記構築物は２つ以上のエピトープを含み、前記エピトープが１つ以上の異なる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記構築物中のエピトープが連続して配置される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記構築物中の少なくとも１つのエピトープが細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記構築物中のエピトープが、内部プロセシング配列を含むスペーサー（隣接）配列により少なくとも一方の側面に配置される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記エピトープが、スペーサー（隣接）配列の両側に配置される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記内部プロセシング配列がエンドソームまたはリソソームでの構築物のプロセシングのためのシグナルを含有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化機構が、構築物を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に導くＡＰＣ標的化配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化配列がエピトープ含有配列に共有結合により結合している、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化配列は、ＣＤ９１、マンノース受容体（ＭＲ）、ＤＥＣ−２０５、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＦｃγＲＩからなる群から選択される細胞表面タンパク質との相互作用を媒介することができる配列に由来する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化機構が、下記の機能：
（ｉ）ＡＰＣ標的化を媒介すること；
（ｉｉ）その意図されたＡＰＣに到達するまで構築物の存続性を保つこと；
（ｉｉｉ）構築物の制御された放出を媒介すること
の少なくとも１つを行うべヒクルをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記べヒクルはミクロスフェアまたはリポソームである、請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的化された免疫応答を誘発するための製造物および方法に関する。詳細には、本発明は、抗原提示細胞に標的化されたエピトープ配列を有する構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンは依然として米国における２番目に多い死因である。現在、乳ガン、肺ガンおよび結腸ガンならびに多くの他の固形腫瘍に対する非外科的治療は良好でない。
【０００３】
腫瘍関連抗原
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は腫瘍細胞の重要な生化学的マーカーであり、これには、変異した細胞タンパク質、例えば、変異した腫瘍抑制因子遺伝子産物、発ガン遺伝子産物（融合タンパク質を含む）、および異物タンパク質（例えば、ウイルス遺伝子産物など）などが挙げられる。変異していない細胞タンパク質もまた、それらが（例えば、不適切な細胞レベル下区画において）異常に発現しているか、または正常値を超える量で発現している場合、ＴＡＡになり得る。ガン細胞で観測される細胞の悪性変換の数多くの段階、および場合により、奇異な遺伝子型を考えた場合、腫瘍細胞は、免疫系によって潜在的に認識され得る多くの新しい抗原を含有する可能性があると議論され得る。関連した組織または細胞起源の異なる腫瘍が同じＴＡＡをともに有し得ることもまた報告されている（Sahasrabudhe他、1993、J.Immunol.、151:6302〜6310;Shamamian他、1994、Cancer Immunol.Immunother.、39:73〜83;Cox他、1994、Science、264:716;Peoples他、1993、J.Immunol.、151:5481〜5491;Jerome他、1991、Cancer Res.、51:2908〜2916;Morioke他、1994、J.Immunol.、153:5650〜5658)。これらのデータは、ＴＡＡを標的化する特異的な抗腫瘍免疫療法（例えば、ワクチンなど）がガンの２つ以上の形態に対して有効であり得るという可能性を裏付けている。
【０００４】
ガンの免疫療法
ガンにおいて、対応する腫瘍関連エピトープまたは腫瘍関連抗原をその細胞表面に呈示している腫瘍細胞に結合し、このような腫瘍細胞を溶解することができる腫瘍特異的なＴ細胞を患者から得ることができる。腫瘍特異的なＴ細胞は、血液（この場合、腫瘍特異的なＴ細胞が末梢画分および単核細胞画分に見出され得る）、一次および二次のリンパ系組織（すなわち、脾臓）、卵巣ガン患者における腹水（腫瘍関連リンパ球または「ＴＡＬＳ」）、または腫瘍そのものの内部（腫瘍浸潤リンパ球または「ＴＩＬＳ」）における場合を含めて、ガン患者体内のいくつかの部位に局在化している。これらのＴ細胞集団の中で、ＴＩＬが、腫瘍抗原およびそのエピトープを同定することにおいて最も有用である。
【０００５】
腫瘍特異的なＴ細胞の特異性は、ＭＨＣクラスＩ分子および一部の細胞タイプではＭＨＣクラスＩＩ分子よって腫瘍細胞の表面に提示される短いアミノ酸配列を認識し、これに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の能力に基づいている。簡単に記載すると、これらのアミノ酸結合配列（これはまた「ＴＡＡリガンド」または「ＴＡＡエピトープ」とも呼ばれる）は、腫瘍細胞において独自にまたは異常でのいずれかで発現する遺伝子によってコードされる細胞内タンパク質のタンパク質分解に由来する。
【０００６】
腫瘍細胞自身の表面または抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面のいずれかに主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラスＩ複合体に関連して提示されるＴＡＡは腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導することができる。ＡＰＣ表面における共刺激分子（例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２）の存在、およびＩＬ−２の分泌は、呼び寄せられたＣＤ８＋リンパ球のＣＴＬへの分化を促進させる。
【０００７】
実際、免疫系がガンの予防および腫瘍成長の制御において極めて重要な役割を果たしていることを示す実質的な証拠が存在する。これには、腫瘍の自然退行が不定期で観測されること、自然退行と腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在との相関、および、ＴＡＡに対して特異的であるＴＩＬの同定が挙げられる。しかしながら、ガン発生率によって明らかに示されるように、免疫応答は、多くの場合、腫瘍と戦って成功するためには十分ではない。
【０００８】
腫瘍の成長および転移拡大は、大方の場合、宿主の免疫監視を逃れ、かつ宿主の防御に打ち勝つその能力による。すべての腫瘍が、免疫系によって様々な程度に認識される抗原を発現しているが、多くの場合、部分的な抗原遮蔽またはエフェクター細胞の効果的でない活性化のために、十分な免疫応答が誘発されていない。免疫エフェクターからの腫瘍の回避が、ほとんどの場合、ＴＡＡの弱い免疫原性、抗原遮蔽、または全体的な免疫抑制（進行したガンの特徴）によって引き起こされる。抗原プロセシングまたはＭＨＣ分子への結合ができないこと、Ｔ細胞受容体に対するＭＨＣ複合体の不十分な親和性または低い親和性での結合、抗原提示ＭＨＣ複合体に関連する共刺激接着分子の不十分な発現はすべてが、ＴＡＡの不良な免疫原性および損なわれた抗腫瘍応答をもたらし得る。
【０００９】
近年、ガンワクチンの開発が新たに注目されている。これは、部分的には、新しいＴＡＡが同定されたこと、抗原提示およびリンパ球活性化の重要性への理解が増大したことによってもたらされている。免疫療法による方法は、多くの付随する副作用を伴ってより全身的かつ浸襲的である現行の化学療法または放射線療法とは対照的に、腫瘍細胞のみを標的化する際に示す特異性に関して優れているとして今や受け入れられている。
【００１０】
免疫療法による様々な方法が開発されており、それらにより、ガンに関連する免疫応答の様々な態様を「調節」することが試みられている。免疫原性ペプチドを用いたワクチン接種、試験管内で拡大培養および活性化された免疫エフェクター細胞の投与、サイトカイン治療による生体内でのエフェクター細胞の拡大培養、または、サイトカイン遺伝子もしくは共刺激分子をコードする遺伝子による免疫エフェクターもしくは腫瘍細胞のいずれかの遺伝子改変により、抗腫瘍免疫応答が活性化されることが示された。
【００１１】
文献では、腫瘍特異的ＣＴＬの養子移植、または腫瘍細胞全体もしくは細胞由来調製物による特異的な能動的免疫療法はいずれも、少数以上の患者において、腫瘍の撲滅または長期間の生存をもたらさないことが明らかにされている。対照的に、様々なペプチドが、細胞由来調製物が失敗したＴ細胞に抗原刺激することに成功していることが試験管内で明らかにされている。従って、多数のＣＴＬ系統によって認識されるエピトープは、ペプチドに基づく抗腫瘍ワクチンにおいて使用される有望な候補物であることがこれまでに示唆されている。
【００１２】
しかしながら、重要なことに、ＴＡＡに由来する合成ペプチドの投与は腫瘍特異的な免疫応答を試験管内で誘発した一方で、ＴＡＡタンパク質フラグメントまたはペプチドフラグメントを用いたワクチン接種によって生体内で抗腫瘍応答を惹起させる試みは、これらのタンパク質フラグメントまたはペプチドフラグメントが細胞の細胞質ゾルに接近することができず、従って、正しくプロセシングされず、エフェクター細胞に提示されなかったと考えられるために、不成功であることが多かった。
【００１３】
ＴＡＡペプチドは、一般には、ＭＨＣ分子に弱く結合するという事実と考え合わせると、上述のデータは、ＴＡＡペプチド免疫原のＭＨＣ結合親和性および細胞内標的化を改善することにより、その免疫原性が改善されるはずであることを示唆している。
【００１４】
Ｔ細胞ワクチンを調製するためのいくつかの新しい可能性が、ＭＨＣ関連ペプチドの同定および特徴づけに基づいて示唆されている。これらのＴ細胞エピトープに対応する合成ペプチドは、安全なワクチンのための理想的なサブユニットを表し得る。しかしながら、合成ペプチドは、その分子サイズが小さく、かつ血清半減期が非常に短いので、良好な免疫原ではない。これらの欠点を克服するために、短い免疫原性エピトープを有する様々な組換えタンパク質が記載されている（Leclerc他、Int.Rev.Immunol.、11:123〜132(1994);FreimuthおよびSteinman、Res.Microbial.、141:995〜1001(1990);Evans他、Nature、339:385〜388(1989);Bona他、Chem.Immunol.、65:179〜206(1997);Baier他、J.Virol.、69:2357〜2365(1995)）。例えば、遺伝子操作された抗体分子は、Ｔ細胞ペプチドに対するこのような送達システムとして機能することができ、微生物ワクチンにはときおり付随する副作用を有しない自己タンパク質であるという利点を有しており、またその上、合成ペプチドと比較して、長い半減期を有している（Billetta他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:4713〜4717(1991);Zaghouani他、Science、259:224〜227(1993);Rasmussen他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、2001、98:10296〜301)。
【００１５】
ＴＡＡの同定および改変
ペプチドに基づく抗腫瘍免疫療法の開発はさらに、ＴＡＡを同定するための信頼できる反復可能な方法がないことによって妨げられている。現在のプロトコルには、極めて純粋なＭＨＣ分子を抗原提示細胞（ＡＰＣ）から単離し、それらをアッセイすること（ChiczおよびUrban、1004、Immunol.Today、15:155〜160）、または、Ｘ線結晶学を使用してＭＨＣ／ペプチド複合体の構造的特徴を決定すること（MengおよびButterfield、Pharm Res、19:926〜32(2002)）が伴う。腫瘍特異的なＴ細胞を培養し、サブクローン化するための従来の様々な方法が当該技術分野で既知である。強力な抗腫瘍Ｔ細胞集団が回収されると、このような抗腫瘍Ｔ細胞集団は、従来の、しかし単調であることが多い発現クローニング方法論（Kawakami他(1994)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:3515〜3519）、または、ファージライブラリーで産生されるエピトープをアッセイすること（ScottおよびSmith、1990、Science、249:386〜390;Cwirla他、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.、87:6378〜6382;Devlin他、1990、Science、249:404〜406）によって腫瘍抗原を同定するために使用することができる。
【００１６】
異なる方法では、病原体または腫瘍に関連した既知の抗原が要求されるが、天然エピトープを同定することを試みる様々な方法が開発されている。例えば、推定されるエピトープを、特定のＭＨＣ（ＨＬＡ）対立遺伝子に関連するアミノ酸残基の「モチーフ」または規定されたパターンを含有するアミノ酸配列に対する遺伝子（抗原）の配列をスキャンするためにコンピューターを使用して予測することができる。例えば、Englehard(1994)、Annu.Rev.Immunol.、12:181;Rammenesee他(1993)、Annu.Rev.Immunol.、11:213を参照のこと。「予測」されたエピトープ配列は、その後合成され、試験される。多くのエピトープ配列が、「モチーフ」によって全長のタンパク質配列をスキャンすることから「予測」されているが、標準的な機能的アッセイで試験したとき、大多数のこれらの「予測」されたエピトープは免疫原性ではなかった。他の技術には、例えば、ペプチド溶出後のデータベース検索（Hunt他(1992)、Science、255:1261;Udaka他(1992)、Cell、69:989)；複合抗原混合物からの抗原の単離および同定（Van de Wal他(1998)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95:10050;Lamb他(1987)、Immunology、60:1）；発現ライブラリーのスクリーニングおよびその後のデータベース検索（Boon他(1994)、Annu.Rev.Immunol.、12:337;Neophytou他(1996)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93:2014;Gavin他(1994)、Eur.J.Immunol.、24:2124）；コンビナトリアルライブラリーのペプチドポジショナルスキャニング（Gundlach他(1996)、J.Immunol.Meth.、192:149;Blake他(1996)、J.Exp.Med.、184:121;Hiemstra他(1997)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、94:10313;Hemmer他(1997)、J.Exp.Med.、185:1651）などが挙げられる。
【００１７】
より近年には、病原体および腫瘍に関連したある種のタンパク質が、病原体またはＴＡＡの抗原決定基ドメインのアミノ酸配列にそのアミノ酸配列が対応する合成ペプチドによって免疫学的に模倣されている。これらの進歩にもかかわらず、天然の配列に基づくペプチド免疫原は、一般に、成績が、免疫応答を誘導することに関して最適でない。従って、増強された免疫調節特性を有する改変された合成抗原性ペプチドエピトープが求められている。
【００１８】
コンビナトリアルペプチド方法論およびコンビナトリアル非ペプチド化学方法論により、Ｔ細胞エピトープを決定するためのさらなるツールが提供される。そのようにして決定されたエピトープは、典型的には、その天然エピトープに類似する限定され得る配列（例えば、保存的置換ならびに同一アミノ酸）を有するが、しかし、天然エピトープとの絶対的な同一性を必ずしも有しないという点で、天然エピトープを「模倣」している。エピトープ模倣体は、既知エピトープの配列を直接改変することによって設計することができ、または、天然の抗原を同定するためのデータベース検索を伴ってランダム化分子ライブラリーを用いて新たに定義することができる。（Gavin他(1994)、Eur.J.Immunol.、24:2124;Blake他(1996)、J.Exp.Med.、184:121;Chen他(1996)、J.Immunol.、157:3783;Strausbauch他(1998)、Intl.Immunol.、10:421;Valmori他(2000)、J.Immunol.、164(2):1125〜1131;Needels他、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:10700〜4;Ohlmeyer他、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:10922〜10926;Van der Zee、1989、J.Immunol.、19:43〜47；国際特許出願公開ＷＯ９２／００２５２）。
【００１９】
従って、効果的な抗腫瘍免疫応答を生じさせることによる免疫クリアランスのために腫瘍細胞を標的化するための効果的な方法を同定することが当該技術分野では求められている。特に、強い標的化された抗腫瘍免疫応答を誘導する新しいペプチド型免疫原を開発することが当該技術分野では求められている。上記に概略されるように、新しい改善されたペプチド型免疫原に対する必要性ととともに、天然の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するペプチドを上回る増強された免疫調節特性および標的化特性を有する新しい改変された合成型抗原性ペプチドを開発することもまた求められている。
【００２０】
本発明は、ガン抗原に由来する非天然エピトープの同定、および、エピトープ列構築物へのそれらの組み立てに基づく効果的な治療を、これらのエピトープ列構築物の適切な抗原提示細胞（ＡＰＣ）への標的化された送達、ならびに、取り込まれたエピトープのＡＰＣ内における適切なプロセシングおよび提示を行わせるために構築物に配列を含めることとの連携で発見することにより、当該技術分野におけるこれらの要求および他の要求に対処している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（発明の要約）
本発明は、少なくとも１つのエピトープ配列を含むペプチド構築物を提供する。この場合、構築物はまた、抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化機構を含むか、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化機構と関連しており、免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはヘルパーＴ細胞および／またはＢ細胞の応答を刺激することができる。
【００２２】
本発明のペプチド構築物に含有されるエピトープは、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、またはそれらの任意の組合せであり得る。本明細書中に開示されるように、エピトープは任意の抗原に由来し得る。例えば、エピトープは、ガン抗原（これは腫瘍関連抗原またはＴＡＡとも呼ばれる）、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原または真菌抗原に由来し得る。好ましくは、エピトープはＴＡＡに由来する。実施態様の１つにおいて、ＴＡＡはガン胎児性抗原（ＣＥＡ）である。
【００２３】
好ましくは、エピトープは非天然エピトープであり、この場合、非天然エピトープは、ＭＨＣ分子に対して大きい親和性で結合し、かつ、この非天然エピトープが由来する対応する天然エピトープに対する免疫応答を調節するために有用である。本発明の非天然エピトープ配列は、好ましくは、ＭＨＣ結合ドメインにおいてその天然配列に対してアミノ酸配列における変化を含有し、それにより、ＭＨＣ分子に対してより強固な結合をもたらすという点で、その天然の対応体とは異なる。あるいは、またはさらに、本発明の非天然エピトープ配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に対する増大した親和性をもたらす変異を推定されるＴ細胞受容体結合ドメインに含有することができる。天然配列からのこれらの相違は、本発明の非天然エピトープが増強された免疫調節特性を有するという点で、天然配列の使用を上回る、本発明の方法における様々な利点をもたらす。
【００２４】
同様に好ましくは、本発明のペプチド構築物は、２つ以上のエピトープを含むポリエピトープ構築物であり、この場合、前記エピトープは１つ以上の異なる抗原に由来する。本発明のポリエピトープ構築物において、少なくとも１つのエピトープは好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープである。特定の実施態様において、構築物は、エピトープが連続して配置されるエピトープ列を表す。
【００２５】
同様に好ましくは、本発明のペプチド構築物におけるエピトープのそれぞれは、内部プロセシング配列を含むスペーサー（隣接）配列が、少なくとも一方の側面に、好ましくは両側に配置される。内部プロセシング配列は、構築物が抗原提示細胞（ＡＰＣ）に到達すると、エンドソームおよび／またはリソソームでの構築物のプロセシングを容易にするために設計される。
【００２６】
ＡＰＣ標的化機構は、（ｉ）ＡＰＣ標的化配列（これは対象の体内において構築物を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に向かわせる）、および場合により、（ｉｉ）べヒクル（例えば、マイクロスフェアまたはリポソームなど、これはまた、標的化機構として作用し、および／またはおよび／または、構築物がその意図されたＡＰＣに到達するまで構築物の存続性を保ち、および／または構築物の制御された放出を媒介する）から構成される。ＡＰＣ標的化配列はエピトープに共有結合または非共有結合により結合させることができる。好ましくは、ＡＰＣ標的化配列は、エピトープ列における最初のエピトープまたは最後のエピトープがそれぞれ配置される配列のＮ末端またはＣ末端に共有結合により結合する。特定の実施態様において、ＡＰＣ標的化配列は、例えば、熱ショックタンパク質受容体（ＨＳＲ）（ＣＤ９１など）、Ｃタイプレクチン受容体（マンノース受容体（ＭＲ）、ＤＥＣ−２０５およびＤＣ−ＳＩＧＮなど）、およびＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃＲ）（ＦｃγＲＩなど）のような細胞表面タンパク質との相互作用を媒介することができる配列に由来する。
【００２７】
特定の実施態様において、本発明のペプチド構築物は下記の一般式によって表すことができる：
Ｎ−［ＡＰＣ標的化配列］−［内部プロセシング配列を有する隣接配列］−［エピトープ１］−［内部プロセシング配列を有する隣接配列］−［エピトープ２］．．．［エピトープｎ］−Ｃ
または
Ｎ−［エピトープ１］−［内部プロセシング配列を有する隣接配列］−［エピトープ２］．．．［エピトープｎ］−［内部プロセシング配列を有する隣接配列］−［ＡＰＣ標的化配列］−Ｃ、
式中、ｎは構築物におけるエピトープの数であり、内部プロセシング配列は下記の一般式によって表すことができる：
［Ｌｅｕおよび／またはＡｓｐおよび／またはＰｒｏ］−［Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−ＹT/C］
式中、各Ｘａａは任意のアミノ酸から独立して選択され、ＹT/Cは、トリプシンまたはキモトリプシンによる切断を受けやすいアミノ酸である。
【００２８】
本発明はまた、上述のペプチド構築物を調製するための方法を提供する。特定の実施態様において、構築物は合成により製造される。別の実施態様では、構築物は組換え技術により製造される。
【００２９】
さらなる実施態様において、本発明は、上述のペプチド構築物をコードする単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、このような核酸を含む発現ベクター、ならびに、このような核酸を含む宿主細胞（例えば、ＡＰＣ）および／または組換え非ヒト宿主を提供する。特定の実施態様によれば、本発明のエピトープ構築物をコードする核酸を含む発現ベクターは、ＡＰＣ標的化機構をさらに含むことができ、またはＡＰＣ標的化機構と組み合わせることができ、従って、宿主のＡＰＣにおいて発現させるために直接的に標的化され得る。
【００３０】
さらに、本発明のペプチド構築物の免疫原有効量、またはこのようなペプチド構築物をコードする核酸分子を含み、場合により、医薬的に許容されるアジュバントまたは賦形剤をさらに含む医薬組成物およびワクチン組成物が提供される。
【００３１】
本発明では、本発明の医薬組成物またはワクチン組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において抗原により誘導される免疫性（好ましくは、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）免疫応答）を誘導または増強するための方法もまた提供される。
【００３２】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明の医薬組成物またはワクチン組成物の少なくとも１回の服薬を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において疾患を処置するための予防方法および／または治療方法を提供する。本明細書中に示されるように、この方法は、様々な新生物性疾患、感染症、自己免疫疾患などを予防および／または処置するために有用であり得る。特定の実施態様において、本発明の方法は、ガンを処置するために用いられる。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、エピトープ配列が、（ｉ）エピトープ（１つまたは複数）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達し、かつ、（ｉｉ）ＡＰＣに送達されると、エピトープの適切なプロセシングを容易にする構築物に組み込まれ得るという発見に基づいている。
【００３４】
具体的には、本発明は、少なくとも１つのエピトープ配列を含むペプチド構築物を提供する。この場合、構築物はまた、抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化機構を含むか、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化機構と結合しており、免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはヘルパーＴ細胞および／またはＢ細胞の応答を刺激することができる。
【００３５】
本発明のペプチド構築物に含有されるエピトープは、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、またはそれらの任意の組合せであり得る。本明細書中に開示されるように、エピトープは任意の抗原に由来し得る。例えば、エピトープは、ガン抗原（これは腫瘍関連抗原またはＴＡＡとも呼ばれる）、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原または真菌抗原に由来し得る。好ましくは、エピトープはＴＡＡに由来する。実施態様の１つにおいて、ＴＡＡはガン胎児性抗原（ＣＥＡ）である。
【００３６】
本発明はまた、ＭＨＣ分子に対する増強された結合のために設計された新規な非天然エピトープで、非天然エピトープが由来する対応する天然ペプチドに対する免疫応答を調節するために有用である新規な非天然エピトープを提供する。好ましくは、本発明の合成された抗原性ペプチドエピトープ配列は、ＭＨＣクラスＩ結合ドメインにおいて、その天然配列に対してアミノ酸配列における変化を含有し、それにより、ＭＨＣに対してより強固な結合をもたらすという点で、その天然の対応体とは異なる。あるいは、またはさらに、本発明の合成された抗原性ペプチドエピトープ配列は、ＴＣＲに対する増大した親和性をもたらす変異を推定されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインに含有する。天然配列からのこれらの相違は、本発明の合成された抗原性ペプチドエピトープが増強された免疫調節特性を有するという点で、天然配列を上回る、本発明の方法における様々な利点をもたらす。
【００３７】
本発明の構築物は少なくとも１つのエピトープ配列またはエピトープ配列の組合せを含み、この場合、エピトープ配列は同じまたは異なり得る。好ましくは、本発明のペプチド構築物は、２つ以上のエピトープを含むポリエピトープ構築物であり、この場合、前記エピトープは１つ以上の異なる抗原に由来する。本発明のポリエピトープ構築物において、少なくとも１つのエピトープは、好ましくは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープである。特定の実施態様において、構築物は、エピトープが連続して配置されるエピトープ列を表す。
【００３８】
同様に好ましくは、本発明のペプチド構築物におけるエピトープのそれぞれは、内部プロセシング配列を含むスペーサー（隣接）配列が、少なくとも一方の側面に、好ましくは両側に配置される。内部プロセシング配列は、構築物が抗原提示細胞（ＡＰＣ）に到達すると、エンドソームおよび／またはリソソームでの構築物のプロセシングを容易にするために設計される。
【００３９】
内部プロセシング配列に含まれ得る具体的な残基には、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）またはプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、内部プロセシング配列は１つ以上のＡｒｇ残基、Ａｓｐ残基およびＰｒｏ残基を含む。エンドソームおよびリソソームは、基質特異性がトリプシンおよびキモトリプシンに類似するタンパク質分解活性を有する（Ｈｅｒｓｈｋｏ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７：４２５〜７９（１９９８）を参照のこと）ので、本発明の構築物に含まれるエピトープ配列は、好ましくは、このような酵素に対する基質として作用するアミノ酸残基によって、例えば、トリプシンについてはリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）またはアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）によって、、キモトリプシンについてはフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）またはチロシン（Ｔｙｒ、Ｔ）によって結合される。
【００４０】
特定の実施態様において、内部プロセシング配列はさらに、ユビキチン化のシグナルとなる配列、および／または、ＥＲ、エンドソームもしくはリソソームへの輸送のためのさらなる標的化シグナルを含むことができる。特定の実施態様によれば、このようなさらなる標的化シグナルは、内部プロセシング配列について上記で特定された残基の１つ以上を含有することができ、その後には「内部配列」が続き、これには、少なくとも１つのリシン残基が含有され、好ましくは２つのリシン残基が内部配列の３位および１７位に含有される。内部配列の直後または内部配列に隣接して、エピトープの配列が存在する。１つ以上のこのようなさらなる標的化配列およびユビキチン化配列を本発明の構築物に取り込むことができ、この場合、１つ以上の標的化配列が各エピトープ配列の間に配置される。上記で記載されたさらなる標的化配列に関しては、Bachmair他、Science、1986、234:179〜186;Dantuma他、Nature Biotech.、2000、18:538〜43;Velders他、J.Immunol.、2001、166:5366〜5373;Toes他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1997、94:14660〜14665;Thomson他、J.Virol.、1998、72:2246〜2252;Ishioka他、J.Immunol.、1999、162:3915〜3925;Thomson他、J.Immunol.、1998、160:1717〜1723；ならびに、国際特許出願公開ＷＯ０１／１９４０８、同ＷＯ０１／４７５４１および同ＷＯ９７／３５０２１が参照される。
【００４１】
本発明によれば、「標的化機構」は、本発明の構築物をＡＰＣに向かわせることができ、かつ、ＡＰＣの内部に入ると、構築物の適正な内部プロセシングを容易にすることができるシステムである。具体的には、ＡＰＣ標的化機構は、（ｉ）ＡＰＣ標的化配列（これは対象の体内においてＡＰＣに向かわせる）、および場合により、（ｉｉ）べヒクル（例えば、マイクロスフェアまたはリポソームなど、これはまた、標的化機構として作用し、および／または、構築物がその意図されたＡＰＣに到達するまで構築物の存続性を保ち、および／または構築物の制御された放出を媒介する）から構成される。
【００４２】
ＡＰＣ標的化配列はエピトープに共有結合または非共有結合により結合させることができる。好ましくは、ＡＰＣ標的化配列は、エピトープ列における最初のエピトープまたは最後のエピトープがそれぞれ配置される配列のＮ末端またはＣ末端に共有結合により結合される。特定の実施態様において、ＡＰＣ標的化配列は、例えば、熱ショックタンパク質受容体（ＨＳＲ）（ＣＤ９１など）、Ｃタイプレクチン受容体（マンノース受容体（ＭＲ）、ＤＥＣ−２０５およびＤＣ−ＳＩＧＮなど）、およびＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃＲ）（ＦｃγＲＩなど）のような細胞表面タンパク質との相互作用を媒介することができる配列に由来する。下記に提供される実施例１では、ＡＰＣ標的化配列は、Ｃ末端において構築物に取り込まれ、熱ショックタンパク質に対する受容体（Binder他、Nature Immunol.、1:151〜55(2000)を参照のこと）であるＣＤ９１のαサブユニットのＮ末端のｐ８０フラグメントと相互作用するｇｐ９６配列を含む。
【００４３】
従って、本明細書中で使用される用語「構築物」は、少なくとも１つのエピトープ配列と、少なくとも１つのＡＰＣ標的化配列とからなる分子を示し、この場合、ＡＰＣ標的化配列はエピトープ配列と共有結合または非共有結合のいずれかにより結合し得る。
【００４４】
特定の実施態様において、本発明のペプチド構築物は下記の一般式によって表すことができる：
Ｎ−［ＡＰＣ標的化配列］−［内部プロセシング配列を有する隣接配列］−［エピトープ１］−［内部プロセシング配列を有する隣接配列］−［エピトープ２］．．．［エピトープｎ］−Ｃ
または
Ｎ−［エピトープ１］−［内部プロセシング配列を有する隣接配列］−［エピトープ２］．．．［エピトープｎ］−［内部プロセシング配列を有する隣接配列］−［ＡＰＣ標的化配列］−Ｃ、
式中、ｎは構築物におけるエピトープの数であり、内部プロセシング配列は下記の一般式によって表すことができる：
［Ｌｅｕおよび／またはＡｓｐおよび／またはＰｒｏ］−［Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−ＹT/C］
式中、各Ｘａａは任意のアミノ酸から独立して選択され、ＹT/Cは、トリプシンまたはキモトリプシンによる切断を受けやすいアミノ酸である。
【００４５】
上記のように、ＡＰＣ標的化配列に加えて、本発明の標的化機構は、ＡＰＣによる内在化、例えば、ＡＰＣによるエンドサイトーシス、食作用または飲作用を受け、その後、細胞内のエンドソームおよび／またはリソソームによってさらにプロセシングされるべヒクル（マイクロスフェアまたはリポソームなど）に本発明の構築物を取り込むことを含むことができる。これに関して、米国特許第６，３１２，７３１号が参照され、これは、免疫応答を誘導または強化するための組成物であって、構造的一体性を組成物に提供するために十分な量で存在するポリマーと、迅速に生分解し得る成分、迅速に溶解する成分、迅速に膨潤する成分、またはカプセル化されたポリマー組成物の浸透圧破裂を引き起こす成分とからなるポリマー組成物にカプセル化された抗原および／または生物活性剤を含む組成物に関連している。
【００４６】
本発明のペプチド構築物の作製方法
本発明はまた、上述のペプチド構築物を調製するための方法を提供する。このような方法では、従来の様々な技術が用いられる。本発明のエピトープ含有ペプチド構築物は、一般には短い配列であるので、標準的な技術を使用する化学合成によって日常的に調製することができる。固相ペプチド合成技術が特に好都合である（例えば、ＳｔｅｗａｒｄおよびＹｏｕｎｇ編（１９６８）、「Solid Phase Peptide Synthesis」(Freemantle、San Francisco、Calif.)を参照のこと）。自動化されたペプチドシンセサイザーが、それらの使用のために必要な試薬同様に市販されている（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．米国）により製造されるシンセサイザー（モデル４３０Ａまたは４３１Ａ）など）。ペプチドはまた、下記の宿主細胞および核酸ベクターのシステムを使用して当業者に既知の組換え技術を使用して調製することができる。
【００４７】
本発明の単離されたペプチドが得られると、ペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の差による分離を含む標準的な方法によって、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって精製することができる。免疫アフィニティークロマトグラフィーの場合、エピトープを、そのペプチドまたは本発明の関連ペプチドに対して惹起され、固定支持体に結合させられた抗体を含むアフィニティーカラムにエピトープを結合させることによって単離することができる。あるいは、アフィニティータグ、例えば、ヘキサ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、マルトース結合ドメイン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、インフルエンザコート配列（Kolodziej他(1991)、Methods Enzymol.、194:508〜509）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどを、適切なアフィニティーカラムに通すことよる精製を容易にするために本発明のペプチドに結合させることができる。単離されたペプチドは、タンパク質分解、核磁気共鳴およびＸ線結晶学のような技術を使用して物理的に特性を調べることができる。
【００４８】
さらに、免疫原として有効な量の本発明のペプチド構築物、またはこのようなペプチド構築物をコードする核酸分子を含み、場合により、医薬的に許容されるアジュバントまたは賦形剤をさらに含む医薬組成物およびワクチン組成物が提供される。
【００４９】
本発明では、哺乳動物において抗原により誘導される免疫性（好ましくは、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）免疫応答）を誘導または増強するための方法で、本発明の医薬組成物またはワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法もまた提供される。
【００５０】
さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物において疾患を処置するための予防方法および／または治療方法で、本発明の医薬組成物またはワクチン組成物の少なくとも１回の服薬を前記哺乳動物に投与することを含むこのような方法を提供する。本明細書中に示されるように、この方法は、様々な新生物性疾患、感染症、自己免疫疾患などを予防および／または処置するために有用である。特定の実施態様において、本発明の方法は、ガンを処置するために用いられる。本発明の構築物は、好ましくは、腫瘍の成長速度を低下させ、腫瘍の退行を生じさせ、再発までの時間を増大させ、死亡を低下させることを目指して抗腫瘍免疫応答を誘発するために設計される。
【００５１】
一般的定義
本明細書中で使用されている用語は、一般には、本発明に関連して、また、各用語が使用されている特定の状況で、当該技術分野でのその通常的な意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびに、それらをいかにして作製および使用するかを記載することにおいて実施者に対するさらなる指針を提供するために、いくつかの用語が下記または本明細書の他で議論される。
【００５２】
用語「ガン」、用語「新生物」および用語「腫瘍」は互換的に使用され、細胞を宿主生物に対して病的にする悪性の形質転換を受けている細胞を示す。原発性ガン細胞（すなわち、悪性形質転換の部位の近くから得られる細胞）は、十分に確立された技術によって、具体的には組織学的検査によって非ガン性細胞から容易に識別することができる。本明細書中で使用される「ガン細胞」の定義には、原発性ガン細胞だけでなく、ガン細胞の祖先に由来する任意の細胞もまた含まれる。これには、転移したガン細胞、ならびに、ガン細胞に由来する試験管内培養物および細胞株が挙げられる。固形腫瘍として通常的に現れるタイプのガンを示すとき、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、腫瘍塊に基づいて、例えば、ＣＡＴスキャン、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波または触診のような手法によって検出可能な腫瘍である。生化学的所見または免疫学的所見は単独で、この定義を満たすためには不十分である場合も、不十分でない場合もある。
【００５３】
用語「ワクチン」は、保護免疫性を受容者において誘発させるために使用することができる組成物（例えば、本発明のペプチド構築物またはこのような構築物をコードする核酸を含む組成物）を示す。効果的であるためには、本発明のワクチンは、集団の一部において免疫性を誘発させることができることに留意しなければならない。これは、一部の個体では、強固または保護的な免疫応答、あるいは場合により、何らかの免疫応答を生じさせることができない場合があるからである。免疫応答を生じさせることができないことは、個体の遺伝的背景から生じることがあり、あるいは、免疫不全状態（後天的または先天的のいずれか）または免疫抑制（例えば、臓器の拒絶を予防するか、または自己免疫状態を抑制するための免疫抑制薬物による処置）のために生じることがある。効力を動物モデルにおいて明らかにすることができる。
【００５４】
用語「ＤＮＡワクチン」は、正式な専門用語ではなく、本明細書中では、組換えベクターによって送達されるワクチンを示すために使用される。本明細書中で使用される、代わりの、より記述的な用語は、「ベクターワクチン」である（一部の潜在的なベクター、例えば、レトロウイルスおよびレンチウイルスなどはＲＮＡウイルスであり、場合により、ＤＮＡの代わりに、非ウイルスＲＮＡが、ベクターにより細胞に送達されるので）。一般には、ベクターが生体内で投与され、しかし、形質導入された細胞の生体内での投与を用いた適切な抗原提示細胞（樹状細胞（ＤＣ）など）の生体外形質導入もまた考えられる。
【００５５】
用語「免疫療法」は、抗原特異的な免疫応答の活性化に基づく処置法を示す。ワクチン投与は免疫療法の１つの形態であり得る。
【００５６】
「免疫応答」は、広義には、リンパ球の抗原特異的な応答を示す。免疫応答を誘発することができる物質はどれも、「免疫原性」であると言われ、「免疫原」として示される。本発明の免疫応答は、体液性（抗体活性による）または細胞媒介（Ｔ細胞の活性化による）またはそれらの両方であり得る。
【００５７】
本明細書中で使用される用語「免疫原性」は、因子（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖、糖タンパク質、糖脂質、核酸、またはそれらの組合せ）が、免疫系を有する動物に投与されたとき、体液性免疫応答または細胞媒介免疫応答、好ましくはそれらの両方を誘発することができることを意味する。免疫原性ペプチドはまた抗原性である。分子は、免疫系の抗原認識分子、例えば、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などと特異的に反応することができるとき、「抗原性」である。抗体と特異的に相互作用する抗原性リガンド配列、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子が本明細書中に記載される。ペプチドの抗原性部分（これはまた本明細書中ではエピトープとも呼ばれる）は、抗体またはＴ細胞受容体が認識するために免疫優性であるこのような部分であるか、あるいは、抗原性部分を免疫化のためにキャリアポリペプチドにコンジュゲート化することによって分子に対する抗体を生じさせるために使用される部分である。抗原性である分子は、それ自体が免疫原性である必要はなく、すなわち、キャリア、アジュバントまたは賦形剤を用いることなく免疫応答を誘発することができる。
【００５８】
本発明の抗原およびエピトープ
用語「抗原」は、免疫系を有する宿主に（直接的に、または、例えば、ＤＮＡワクチンの場合のように発現したときに）導入されたとき、宿主の免疫系によって認識され、特異低な免疫応答を誘発することができる任意の抗原（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖、糖タンパク質、糖脂質、核酸、またはそれらの組合せ）を示す。
【００５９】
用語「腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）」および用語「腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）」は互換的に使用され、腫瘍に関連する抗原性ペプチドを示す。背景の節で記載したように、ＴＡＡには、例えば、変異した細胞タンパク質、例えば、変異した腫瘍抑制因子遺伝子産物、発ガン遺伝子産物（融合タンパク質を含む）、および外来タンパク質（ウイルス遺伝子産物など）などが挙げられる。変異していない細胞タンパク質もまた、それらが（例えば、不適切な細胞以下の区分において）異常に発現しているか、または正常値を超える量で発現している場合、ＴＡＡになり得る。
【００６０】
用語「エピトープ」または用語「抗原決定基」は、Ｂ細胞もしくはＴ細胞のいずれか、または両者によって認識される抗原の任意の部分を示す。好ましくは、エピトープと免疫グロブリンまたはＴＣＲの抗原認識部位との相互作用は抗原特異的な免疫認識を伴う。
【００６１】
ＣＴＬエピトープ配列、Ｔヘルパー細胞の配列およびＢ細胞エピトープ配列を本発明の構築物に含むことができる。本発明の免疫原性組成物（例えば、ワクチン）において使用されるエピトープは、真核生物細胞（例えば、腫瘍、寄生虫、真菌）に存在する任意の抗原、細菌細胞に存在する任意の抗原、ウイルス粒子に存在する任意の抗原、またはそれらの任意の部分に由来する。
【００６２】
本発明の好ましい抗原の例には、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、ＥｒｂＢ受容体、ＭｅｌａｎＡ［ＭＡＲＴ１］、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５およびＴＲＰ−２（メラノーマにおいて；さらなる例については、StorkusおよびZarour、Forum(Genova)、2000、Jul-Sep、10(3):256〜270に提供される抗原のリストもまた参照のこと）；ＭＡＧＥ−１およびＭＡＧＥ−３（膀胱ガン、頭部および頸部のガン、ならびに非小細胞ガンにおいて）；ＨＰＶのＥＧタンパク質およびＥ７タンパク質（子宮頸部ガンにおいて）；ムチン［ＭＵＣ−１］（乳ガン、膵臓ガン、結腸ガンおよび前立腺ガンにおいて）；前立腺特異的抗原［ＰＳＡ］（前立腺ガンにおいて）；ガン胎児性抗原［ＣＥＡ］（結腸ガン、乳ガン、肺ガン、甲状腺ガンおよび胃腸ガンにおいて）、Ｐ１Ａ腫瘍抗原（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９８／５６９１９に開示されるような腫瘍抗原）、ならびに、共通部を有する腫瘍特異的抗原、例えば、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＧＥ−１０、ＭＡＧＥ−１２、ＢＡＧＥ−１、ＣＡＧＥ−１、２、８、ＣＡＧＥ−３〜７、ＬＡＧＥ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＮＡ−８８およびＧｎＴＶのような腫瘍特異的抗原（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９８／５６９１９を参照のこと）が挙げられる。
【００６３】
特定の実施態様において、本発明の構築物は、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）に由来する少なくとも１つのエピトープを含む。ＣＥＡは、胃腸管、乳房、肺および甲状腺のガン腫を含む上皮起源の新生物に関連しており、従って、ＣＥＡエピトープを含む本発明の構築物は、上皮起源の新生物を処置するために使用することができる。
【００６４】
本発明の他の抗原には、下記の抗原が含まれるが、これらに限定されない：（ｉ）原生動物抗原、例えば、プラスモジウム・エスピー（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐ．）、トキソプラスマ・エスピー（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、リーシュマニア・エスピー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）およびトリパノソーマ・エスピー（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐ．）に由来する抗原；（ｉｉ）下記のウイルスに由来するウイルスタンパク質抗原またはウイルスペプチド抗原、例えば、インフルエンザウイルス（例えば、表面糖タンパク質のヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）または核タンパク質（ＮＰ）（これらは、Ｂｏｄｍｅｒ他、Cell、52:253、1988；Ｔｓｕｊｉ他、J.Virol.、72:6907〜6910、1998に記載される）、あるいはＮＰのＣＴＬエピトープ（これは、Ｇｏｕｌｄ他、J.Virol.、65:5401、1991；Ｍｕｒａｔａ他、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７３：９６〜１０７、１９９６、およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９８／５６９１９に記載される））；免疫不全症ウイルス（例えば、サル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）抗原［例えば、ＳＩＶ−ｅｎｖのＣＴＬエピトープ（これはＰＣＴ出願公開ＷＯ９８／５６９１９に開示される）］、またはヒト免疫不全症ウイルス抗原（ＨＩＶ−１）、例えば、ｇｐ１２０のＣＴＬエピトープ（これは、例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９８／５６９１９に開示される）、ｇｐ１６０、ｐ１８抗原［例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープおよびｇｐ４１のＣＴＬエピトープ（これらは、例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９８／５６９１９に開示される）］、Ｇａｇ  ｐ２４  ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、Ｇａｇ  ｐ１７  ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、Ｔａｔ、Ｐｏｌ、ＮｅｆのＣＴＬエピトープ［これらは、例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９８／５６９１９に開示される］、およびＥｎｖのＣＴＬエピトープ［これは、例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９８／５６９１９に開示される］；ヘルペスウイルス（例えば、下記のウイルスに由来する糖タンパク質：例えば、ネコヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、偽狂犬病ウイルス、イヌヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ、例えば、ＨＳＶのｔｋ、ｂＢ、ｇＤ）、帯状疱疹ウイルス、マレック病ウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはエプスタイン・バールウイルス）；Ｃ型肝炎ウイルス；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）；ウシ白血病ウイルス（例えば、ｇｐ５１、３０エンベロープ抗原）；ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）（例えば、ＦｅＬＶエンベロープタンパク質、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）抗原、例えば、ＨＮまたはＦ）；ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ−１ｅｎｖなど）；感染性気管支炎ウイルス（マトリックスおよび／またはプレプロマー）；フラビウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）抗原、黄熱病ウイルス抗原またはデング熱ウイルス抗原）；麻疹ウイルス（例えば、イヌジステンバーウイルス抗原、麻疹抗原、または牛疫抗原（ＨＡまたはＦなど））；狂犬病（例えば、狂犬病糖タンパク質Ｇ��；パルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス抗原）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ポックスウイルス（例えば、エクトロメリア抗原、カナリアポックスウイルス抗原、または家禽ポックスウイルス抗原（水痘帯状疱疹ウイルス抗原）；伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（例えば、ＶＰ２、ＶＰ３またはＶＰ４）；ハンターンウイルス；ムンプスウイルスおよび麻疹ウイルス；（ｉｉｉ）細菌抗原、例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｃｕｌｏｓｉｓ）特異的抗原（例えば、カルメット・ゲラン菌［ＢＣＧ］−３８ｋＤタンパク質；抗原８５複合体［これは、Klein他、J.Infect.Dis.、183:928〜34、2001に記載される］、KleinおよびMcAdam、Arch.Immunol.Ther.Exp.(Warsz.)、47:313〜320、1990における抗原リストもまた参照のこと）；リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）特異的抗原（これは、例えば、Finelli他、Immunol.Res.、19:211〜223、1999にも開示される）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｉ）特異的抗原、フレキシネリ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｉｎｅｒｉ）特異的抗原、ブドウ球菌特異的抗原、連鎖球菌特異的抗原、肺炎双球菌特異的抗原（例えば、ＰｓｐＡ［ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１４４８８を参照のこと］、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）特異的抗原、ボレリア特異的抗原（例えば、ライム病に関連するボレリア属（ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｆｚｅｌｌｉ）およびボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）など）のＯｓｐＡ抗原、ＯｓｐＢ抗原、ＯｓｐＣ抗原［例えば、米国特許第５，５２３，０８９号；ＰＣＴ出願公開ＷＯ９０／０４４１２１、同ＷＯ９１／０９８７０、同ＷＯ９３／０４１７５、同ＷＯ９６／０６１６５、同ＷＯ９３／０８３０６；ＰＣＴ／ＵＳ９２／０８６９７；Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３、４７９〜４８６、１９８９；Ｊｏｈｎｓｏｎ他、Infect.and Immun.、60:1845〜1853、1992；Johnson他、Vaccine、13:1086〜1094、1995；ライムボレリア症に関する第６回国際会議：ライム病ワクチンの開発に関する進歩、Vaccine、13:133〜135、1995を参照のこと］）、Ａ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ特異的抗原、Ｓ．ｐａｒａｔｈｙｐｈｏｉｄ  Ａおよび同Ｂに特異的な抗原、ジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）特異的抗原、破傷風（Ｃ．ｔｅｔａｎｕｓ）特異的抗原、ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）特異的抗原、Ｃ．ｐｅｒｉｆｒｉｎｇｅｎｓ特異的抗原、Ａ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ特異的抗原、Ａ．ｐｅｓｔｉｓ特異的抗原、コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ）特異的抗原、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）特異的抗原、Ｔ．ｐａｌｌａｄｉｕｍ特異的抗原、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）特異的抗原（これは、例えば、Kim他、J.Immunol.、162:6855〜6866、1999に開示される）、シュードモナス特異的なタンパク質またはペプチド；ならびに（ｉｖ）下記から単離された真菌抗原、例えば、カンジダ属（例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）に由来する６５ｋＤａマンノプロテイン［ＭＰ６５］）、白癬菌属��菌、またはプチロスポルム（ｐｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ）。
【００６５】
目的とする抗原は任意の動物またはヒトの病原体または腫瘍に由来するので、抗原の前記列挙は例示として意図される。目的とする病原体由来抗原をコードするＤＮＡに関しては、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号、同第５，１７４，９９３号、同第５，３３８，６８３号、同第５，４９４，８０７号、同第５，５０３，８３４号、同第５，５０５，９４１号、同第５，５１４，３７５号、同第５，５２９，７８０号；英国特許ＧＢ２２６９８２０Ｂ；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２６４１、同ＷＯ９３／０３１４５、同ＷＯ９４／１６７１６、同ＷＯ９６／３９４１；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０６６５２が注目される。腫瘍ウイルス由来の抗原に関しては、Molecular Biology of Tumor Viruses,RNA Tumor Viruses（第２版、Ｗｅｉｓｓ他編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1982）もまた参照される。本発明の組成物において有用であるさらなる抗原の列挙については、Stedman’s Medical Dictionary（第２４版、１９８２）もまた参照のこと。
【００６６】
本発明の構築物において使用されるさらなる抗原由来のＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープを提供するために、これらのエピトープは、当該技術分野で広く既知のいくつかの方法の１つまたは組合せによって、例えば、（ｉ）目的とする抗原を、タンパク質分解酵素を使用して重複するペプチドにフラグメント化し、その後、全長の抗原により誘発された抗体に結合するか、または、Ｔ細胞もしくはＢ細胞の活性化を誘導する個々のペプチドの能力を調べること（例えば、Janis Kuby、Immunology、７９頁〜８０頁、W.H.Freeman、1992を参照のこと）によって、（ｉｉ）配列が所与抗原のセグメントまたはアナログである合成ペプチド（例えば、Alexander他、Immunity、1:751〜61、1994；Hammer他、J.Exp.Med.、180:2353〜8、1994を参照のこと）を調製するか、または、このようなセグメントに基づく構築物、またはキャリアもしくは異種抗原に連結もしくは融合されたアナログを調製して、このような合成ペプチドの抗原特異的な抗体またはＴ細胞活性化を誘発する能力を調べること（例えば、試験管内および生体内の両方でＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用するその能力を調べること［例えば、O’Sullivan他、J.Immunol.、147:2663〜9、1991;Hill他、J.Immunol.、147、189〜197、1991を参照のこと］）によって、ただし、Ｔ細胞エピトープを決定する場合、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子の溝を占有するために少なくとも８個〜１０個のアミノ酸の長さでなければならず、また、ＭＨＣクラスＩＩ分子の溝を占有するために少なくとも１３個〜２５個のアミノ酸の長さでなければならず、好ましくは、ペプチドはより長くなければならない；これらのペプチドはまた、免疫応答を生じさせるために大きい十分な親和性および特異性で様々なＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子にペプチドが結合することを可能にする適切なアンカーモチーフを含有しなければならない（Ｂｏｃｃｈｉａ他、Blood、85:2680〜2684、1995;Englehard、Ann.Rev.Immunol.、12:181、1994を参照のこと）、（ｉｉｉ）精製されたＭＨＣ分子と会合するペプチドを配列決定すること（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、94:628〜33、1997を参照のこと）によって、（ｉｖ）ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＴＣＲ、全長の抗原に対して惹起された抗体などに大きい親和性で結合することについてペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングすること（例えば、Ｈａｍｍｅｒ他、J.Exp.Med.、176:1007〜13、1992）によって、（ｖ）種々のタンパク質配列をコンピューター分析して、例えば、親水性領域（親水性アミノ酸残基はタンパク質の表面に位置することが多く、従って、抗体に近づくことができる）および／または高親和性のＴＣＲ対立遺伝子またはＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に特異的なモチーフを、例えば、目的とするタンパク質の配列を、ＭＨＣ分子と会合するペプチドの発表された構造と比較することにより同定すること（Ｍａｌｌｉｏｓ、Bioinformatics、15:432〜439、1999；Ｍｉｌｉｋ他、Nat.Biotechnol.、16:753〜756、1998；Ｂｒｕｓｉｃ他、Nuc.Acids Res.、26:368〜371、1998；Ｆｅｌｌｅｒおよびｄｅ  ｌａ  Ｃｒｕｚ、Nature、349:720〜721、1991を参照のこと）によって、（ｖｉ）天然の抗原−抗体複合体のＸ線結晶学的解析を行うこと（Janis Kuby、Immunology、８０頁、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、１９９２）によ���て、および（ｖｉｉ）目的とする抗原の様々な部分に対するモノクローナル抗体を作製し、その後、それらの抗体が、その抗原が得られた病原体または腫瘍の試験管内または生体内での成長を弱めるかどうかを確認すること（米国特許第５，０１９，３８４号およびそれにおける引用参考分を参照のこと）によって同定することができる。
【００６７】
非天然エピトープおよびその作製方法
「天然」または「野生型」または「自然」または「自己」のエピトープは、天然の生物学的供給源から単離されたエピトープで、免疫系によって認識され得るエピトープである。
【００６８】
「変化した」または「非自然」または「非天然」または「改変された」または「合成（された）」エピトープは、対応する天然エピトープの一次配列とは異なる一次配列を有するエピトープである。非天然ペプチド配列を有するエピトープを使用することにより、意図された標的に対して特異的でない免疫応答を本発明に従って誘導することができるが、本発明によれば、非天然エピトープの使用は下記の理由のために好ましい。第１に、抗原（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、または自己免疫疾患における自己抗原）に由来する天然ペプチド配列は免疫系によって自己として認識されることがあり、患者はこれらのペプチド配列に対して寛容化されることがあると考えられる。第２に、多くの天然ペプチド配列はＭＨＣ分子に対して大きい親和性で結合しない。特定のエピトープに対する免疫応答の強さがＭＨＣクラスＩ複合体に対するエピトープの結合親和性に関係づけられる（すなわち、より強い免疫応答が、ＭＨＣ分子に対してより大きい親和性で結合するペプチドによって誘導され得る）ことが示されているので、天然エピトープに対する免疫応答は、ＭＨＣ分子に対してより大きい親和性で結合する非天然エピトープに対する免疫応答よりも低いと考えられる。
【００６９】
非天然ペプチドエピトープは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して作製することができる。下記には、このような方法の非限定的な例が示される。さらに、下記の方法のいずれかの改変または組合せを使用することができる。
【００７０】
非天然エピトープは、免疫応答を生じさせるその能力が完全に妨げられない限り、当該技術分野で既知の任意の方法で天然エピトープを改変することによって、（例えば、部位特異的変異誘発を使用して）天然エピトープから得ることができる。特に、本発明の構築物は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有することができる。例えば、このようなアミノ酸置換は、機能的に等価なアミノ酸残基の置換を含むことができる。１つ以上のアミノ酸残基を、サイレントな変化を生じさせる機能的等価体として作用する、極性が類似する別のアミノ酸によって置換することができる。アミノ酸に対する置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００７１】
さらに、１つ以上のアミノ酸残基を非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログによって置換することができる。非古典的アミノ酸には、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸、例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、Ｎ−α−メチルアミノ酸、および一般的にはアミノ酸アナログが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のペプチドはまた、特別な性質をペプチドに伝えるために、様々な「デザイナー」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、Ｎ−α−メチルアミノ酸など）を含むことができる。さらに、特定のアミノ酸を特定のカップリング工程において指定することによって、α−らせん、β−ターン、β−シート、γ−ターンを有するペプチド、および環状ペプチドを生じさせることができる。一般には、α−らせんの二次構造またはランダムな二次構造が好ましいと考えられている。
【００７２】
下記の非古典的アミノ酸を、特定の立体配座モチーフを導入するために本発明のペプチドに取り込むことができる：１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシラート（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ他（１９９１）、J.Am.Chem.Soc.、113:227S〜2283)；（２Ｓ，３Ｓ）−メチルフェニルアラニン、（２Ｓ，３Ｒ）−メチルフェニルアラニン、（２Ｒ，３Ｓ）−メチルフェニルアラニンおよび（２Ｒ，３Ｒ）−メチルフェニルアラニン；２−アミノテトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（Ｌａｎｄｉｓ（１９８９）、博士論文、アリゾナ大学）；ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシラート（Ｍｉｙａｋｅ他（１９８９）、J.Takeda Res.Labs.、43:53〜76）、ヒスチジンイソキノリンカルボン酸（Ｚｅｃｈｅｌ他（１９９１）、Int.J.Pep.Protein Res.、43）およびＨＩＣ（ヒスチジン環状ウレア）（Ｄｈａｒａｎｉｐｒａｇａｄａ）。
【００７３】
下記のアミノ酸アナログおよびペプチドミメティクスを、特定の二次構造を誘導するために、または特定の二次構造を有利にするために、ペプチド内に取り込むことができる：ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン−６−カルボン酸）、β−ターン誘導ジペプチドアナログ（Ｋｅｍｐ他（１９８５）、J.Org.Chem.、50:5834〜5838）；β−シート誘導アナログ（Ｋｅｍｐ他（１９８８）、Tetrahedron Lett.、29:5081〜5082）；β−ターン誘導アナログ（Ｋｅｍｐ他（１９８８）、Tetrahedron Lett.、29:5057〜5060）；α−らせん誘導アナログ（Ｋｅｍｐ他（１９８８）、Tetrahedron Lett.、29:4935〜4938）；γ−ターン誘導アナログ（Ｋｅｍｐ他（１９８９）、J.Org.Chem.、54:109〜115）；および下記の参考文献によって提供されるアナログ：ＮａｇａｉおよびＳａｔｏ（１９８５）、Tetrahedron Lett.、26:647〜650；ＤｉＭａｉｏ他（１９８９）、J.Chem.Soc.Perkin Trans．、１６８７頁；同様にＧｌｙ−Ａｌａターンアナログ（Ｋａｈｎ他（１９８９）、Tetrahedron Lett.、30:2317）；アミド結合の等量式体（ｃｌｏｎｅｓ他（１９８８）、Tetrahedron Lett.、29:38S3〜38S6）；テトラゾール（Ｚａｂｒｏｃｋｉ他（１９８８）、J.Am.Chem.Soc.、110:587S〜5880）；ＤＴＣ（Samanen他(1990)、Int.J.Protein Pep.Res.、35:501〜509）；、Olson他(1990)、J.Am.Chem.Sci.、112:323〜333、およびGarvey他(1990)、J.Org.Chem.、56:436に教示されるアナログ。β−ターンおよびβ−バルジの立体配座的に制限された模倣体、ならびにそれらを含有するペプチドが、米国特許第５，４４０，０１３号に記載されている。
【００７４】
さらに、本発明では、より十分に明らかにされた構造的性質を有するペプチドを調製すること、ならびに、新規な性質を有するペプチドを調製するための、ペプチドミメティクスおよびペプチドミメティクス結合（例えば、エステル結合など）の使用が考えられる。別の実施態様では、還元されたペプチド結合、すなわち、Ｒ１−−ＣＨ２ＮＨ−−Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２はアミノ酸残基またはアミノ酸配列である）を含むペプチドを作製することができる。還元されたペプチド結合はジペプチドサブユニットとして導入することができる。このような分子は、ペプチド結合の加水分解に対して、例えば、プロテアーゼ活性に対して抵抗性である。このような分子は、他にない機能および活性（例えば、代謝的分解またはプロテアーゼ活性に対する抵抗性による生体内での長くなった半減期など）を有するリガンドを提供する。
【００７５】
特定の実施態様において、非天然エピトープは、翻訳後修飾を導入することによって、例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解による切断、抗体分子または膜分子または他のエピトープへの結合によって、組換えにより天然エピトープから得られる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ他、Ann.Rev.Biochem.、1988、57:285〜320）。
【００７６】
非常に多数の新しい非天然エピトープ配列を生じさせるために、バクテリオファージの「ファージディスプレイ」ライブラリー（１０6〜１０8の化学的実体）を構築することができる（ScottおよびSmith(1990)、Science、249:386〜390；Cwirla他(1990)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87:6378〜6382；Devlin他(1990)、Science、249:404〜406）。他の方法は主に化学合成法であり、Geysen法(Geysen他(1986)、Molecular Immunology、23:709〜715;Geysen他(1987)、J.Immunologic Method、102:259〜274)およびFodor他の方法（（１９９１）、Science、251:767〜773）がその例である。また、Furka他(1988)、14th International Congress of Biochemistry、第５巻、アブストラクトＦＲ：０１３；Furka(1991)、Int.J.Peptide Protein Res.、37:487〜493も参照のこと。また、米国特許第４，６３１，２１１および同第５，１０１，１７５号も参照のこと（これらは、ペプチドの混合物を製造するための方法を記載している）。用いられ得る他の方法は、合成ライブラリーの使用（Needels他(1993)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:10700〜4;Ohlmeyer他(1993)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:10922〜10926；国際特許出願公開ＷＯ９２／００２５２）、および、ｃＤＮＡサブトラクションまたはディファレンシャルディスプレイに基づく技術（Ｈｅｄｒｉｃｋ他（１９８４）、Nature、308:149；ＬｉａｎおよびＰａｒｄｅｅ（１９９２）、Science、257:967）を伴う。使用され得る別の技術は「ペプスキャン（ｐｅｐｓｃａｎ）」技術（Van der Zee(1989)、Eur.J.Immunol.、19:43〜47）であり、この技術では、数十個のペプチドが、各ピンの位置がそれに対する合成履歴を規定するという点でインデックス化されたライブラリーに類似する９６ウエルマイクロタイタープレートパターンで配列されたポリエチレンロッド上で同時に合成される。ペプチドは、その後、固体担体から化学的に切断され、放射線照射された同系の胸腺細胞に抗原提示のために与えられる。クローン化されたＣＴＬ系統を、その後、3Ｈ−チミジンの取り込みによってモニターされる増殖アッセイにおいて反応性について調べることができる。
【００７７】
特定の実施態様において、本発明の非自然エピトープは、ＳＰＨＥＲＥTM技術（これは、国際特許出願公開ＷＯ９７／３５０３５、米国特許第６，５２８，０６０号および同第６，３３８，９４５号、ならびに米国特許出願公開第２００２／０１６４３４６号に記載される）を使用して固相担体に結合されたオリゴペプチドのコンビナトリアルライブラリーから得られる。この方法では、別個のアリコートにおけるビーズから化学的に遊離させることができる単一のペプチドの純粋な集団を各ビーズが含有するポリスチレンビーズ上で合成されたコンビナトリアルペプチドライブラリーが利用される。１つのビーズに結合しているペプチドは、本質的に同じアミノ酸配列を有する。各ペプチドの合成履歴は、目的のビーズが迅速かつ効率的にデコードされ得るように、不活性な分子タグのコードで各固体担体に記録され得る。光切断される架橋剤により、ＵＶ光にさらすことによってオリゴペプチドの一部を遊離させることが可能になる。分子タグは、存在する場合には、アッセイ後の分析のためにビーズに共有結合的に結合したままである。プールされたビーズアレイから遊離されたペプチドは、目的とするＴ細胞を活性化することができるペプチドプールを同定するために、Ｔ細胞の活性化を検出するための方法を使用して、例えば、3Ｈ−チミジンの取り込み（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のＴ細胞について）、51Ｃｒ放出アッセイ（ＣＴＬについて）、またはＩＬ−２産生（ＣＤ４＋Ｔ細胞について）を含む方法を使用してスクリーニングされる。ペプチドプール／遊離の反復可能な方法を用いることによって、１０7個以上のペプチドをほんの数日でスクリーニングすることが可能である。対応する陽性ビーズ上の残留ペプチド（＞１００ｐｍｏｌ）の分析により、エピトープ配列の迅速かつ曖昧でない同定が可能になる。
【００７８】
上記で示されたように、本発明の非天然エピトープは、対応する天然エピトープよりも大きい親和性でＭＨＣ分子に結合することができる。ＭＨＣ分子に対する本発明のエピトープの結合性を、当該技術分野で既知の様々な方法によって測定することができ、このような方法には、あるアルゴリズムに基づいて親和性を計算すること（例えば、Parker他(1992)、J.Immunol.、149:3580〜3587を参照のこと）；結合親和性を実験的に決定すること（例えば、Ｔａｎ他（１９９７）、J.Immunol.Meth.、209:25〜36を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＭＨＣ分子に対するペプチドの相対的結合性を、（例えば、１００ｍＭ〜１ｎＭに及ぶ）試験ペプチドの様々な濃度を使用して、界面活性剤で可溶化されたＭＨＣ分子に対する放射能標識された標準ペプチドの結合性に基づいて測定することができる。例えば、ＭＨＣクラスＩ重鎖およびβ２−ミクロブロブリンを、プロテアーゼ阻害剤の混合物の存在下、室温で好適な時間（例えば、２時間〜７２時間）にわたって、一定の濃度（例えば、５ｎＭ）の放射能標識された天然（コントロール）ペプチドおよび様々な濃度の対応する非天然ペプチドと同時にインキュベーションすることができる。ＭＨＣに結合した放射能の割合がゲルろ過によって決定される。ＩＣ50（コントロールペプチドの結合の５０％阻害を生じさせる試験ペプチドの濃度）が各ペプチドについて計算される。
【００７９】
上記で示されたように、本発明の非天然エピトープはまた、対応する天然エピトープよりも高い親和性でＴＣＲに結合することができる。ＴＣＲに対する結合親和性を決定するための様々な方法が当該技術分野では知られており、このような方法には、al-Ramadi他(1992)、J.Immunol.、155(2):662〜673;Zuegel他(1998)、J.Immunol.、161(4):1705〜1709に記載される方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
免疫エフェクター細胞
用語「免疫エフェクター細胞」は、抗原に結合することができる細胞で、それにより免疫応答を媒介する細胞を示す。このような細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＴ細胞の活性化は、その増殖、および、抗原をその表面に呈示する任意の標的細胞に対して作用し得る武装化されたエフェクターＴ細胞へのその子孫の分化をもたらす。エフェクターＴ細胞は様々な機能を媒介することができる。１組の重要な機能は、ＣＤ８＋ＣＴＬによって細胞（例えば、ガン細胞、またはウイルスもしくは細菌が感染した細胞）を殺すこと、および、細胞媒介型免疫性を一緒になって構成するＴH１細胞によるマクロファージの活性化である。さらに、Ｂ細胞が、異なるタイプの抗体を産生させ、従って体液性免疫応答を駆動させるためにＴH２細胞によって活性化される。
【００８１】
用語「抗原提示細胞」または用語「ＡＰＣ」は、免疫系の特異的なエフェクター細胞によって認識可能な、従って、提示されている抗原（１つまたは複数）に対する効果的な細胞免疫応答を誘導する抗原−ＭＨＣ複合体の形態で１つ以上の抗原を提示することができる種類の細胞を示す。多くのタイプの細胞がＴ細胞認識のために抗原をその細胞表面に提示することができると考えられるが、専門的なＡＰＣのみが、抗原を効率的な量で提示し、さらに、Ｔ細胞をＣＴＬ応答のために活性化する能力を有している。ＡＰＣには、例えば、マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）が挙げられる。
【００８２】
用語「樹状細胞」または用語「ＤＣ」は、様々なリンパ系組織および非リンパ系組織において見出される形態学的に類似する細胞タイプの多様な集団を示す（Steinman(1991)、Ann.Rev.Immunol.、9:271〜296）。ＤＣは、生物において最も強力かつ好ましいＡＰＣを構成する。ＤＣの全部ではないが、その一部は骨髄の前駆体細胞に由来し、少数が末梢血に循環し、未成熟なランゲルハンス細胞または最終分化した成熟細胞のいずれかとして現れる。ＤＣは、末梢組織において抗原を効率的に捕捉し、これらの抗原をプロセシングして、ＭＨＣ−ペプチド複合体を形成させるする専門的ＡＰＣである。抗原を取り込んだ後、これらの未成熟なＤＣは、末梢から二次リンパ器官のＴ細胞領域に遊走することができる特有の能力を獲得する。細胞が移動するに従い、未成熟なＤＣは成熟し、細胞表面分子のそのプロフィルを変化させて、休止Ｔ細胞を引き寄せ、その抗原性負荷物を提示する（Shaw他(1986)、Nature、323、262〜264;Adema他(1997)、Nature、387、713〜717;BanchereauおよびSteinman(1998)、Nature、392、245〜252）。ＤＣは、単球から分化することができる一方で、異なる表現型を有する。例えば、特定の分化マーカー（ＣＤ１４抗原）が、ＤＣでは見出されず、しかし、単球によってプロセシングされる。また、成熟ＤＣは食作用性でなく、これに対して、単球は強力な食作用細胞である。ＤＣは、Ｔ細胞の活性化および増殖のために必要なシグナルのすべてを提供することが示されている。
【００８３】
Ｔ細胞は、タンパク質がより小さいペプチドに切断され、別の細胞の表面に存在する「主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）」と呼ばれる複合体で提示されたときにだけ、タンパク質を認識する。用語「主要組織適合性複合体」または用語「ＭＨＣ」は、Ｔ細胞に対する抗原提示および迅速な移植片拒絶のために要求される細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を示す。ヒトでは、ＭＨＣはまた、「ヒト白血球抗原」複合体または「ＨＬＡ」複合体として知られている。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、「ＭＨＣ分子」として知られており、クラスＩ  ＭＨＣ分子およびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に分類される。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、β２−ミクログロブリンと非共有結合的に連結される、ＭＨＣ内にコードされるα鎖から構成されるヘテロ二量体膜タンパク質を含む。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、ほぼすべての有核細胞によって発現され、、ＣＤ８＋Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ８タンパク質をその表面に有するＴ細胞）に対する抗原提示において機能することが示されている。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体に特異的に結合する。これにより、細胞溶解性エフェクター活性がもたらされる。Ｉ型分子には、ヒトでは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃが含まれる。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子もまた、非共有結合的に会合したα鎖およびβ鎖からなるヘテロ二量体膜タンパク質を含む。クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体は、ＡＰＣ表面にだけ見出されるだけであり、ＡＰＣによるエンドサイトーシスを受けた抗原に由来するペプチドを提示するために使用される。ＣＤ４タンパク質をその表面に有するＴ細胞、すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＴＣＲを介してＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体に結合する。これにより、免疫応答を刺激する特異的なサイトカインの合成がもたらされる。ヒトにおけるクラスＩＩ  ＭＨＣには、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲが挙げられる。当業者はＨＬＡの血清型および遺伝子型を熟知している（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．Ｇ．、Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｊ．およびＳｔｅｖａｎｏｖｉｃ、Ｓ．、MHC Ligands and Peptid Motifs(1977)、Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ他、ＨＬＡ辞書、Tissue Antigens、1999、54:409〜437）。ＭＨＣクラスＩ提示を介して免疫系によって効果的に認識されるためには、抗原性ポリペプチドは少なくとも約８個〜１０個のアミノ酸のエピトープを含有しなければならず、一方、ＭＨＣクラスＩＩ提示を介して免疫系によって効果的に認識されるためには、抗原性ポリペプチドは少なくとも約１３個〜２５個のアミノ酸のエピトープを含有しなければならない。例えば、Fundamental Immunology（第３版、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、１９９９年、Lippincott-Raven Publ.）を参照のこと。
【００８４】
用語「天然抗体」または用語「免疫グロブリン」は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンの通常的にはヘテロ四量体の糖タンパク質を示す。免疫グロブリン分子のほとんどのクラスにおいて、各軽鎖は１つの共有結合ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、その一方で、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンイソ型の重鎖の間では異なる。重鎖および軽鎖はそれぞれがまた、一定の間隔で鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の端部に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後には多数の定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端部に可変ドメイン（ＶＬ）を、その反対側の端部に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと連携し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと連携している。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の境界を形成していると考えられている（Clothia他、J.Mol.Biol.、186:651〜663、1985;NovotnyおよびHaber、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82:4592〜4596、1985）。
【００８５】
用語「抗体」または用語「Ａｂ」は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望する生物学的活性を示す限り、天然の抗体だけでなく、単一モノクローナル抗体（アゴニスト抗体およびアンタゴニスト抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、ならびに、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖおよびＦｖ）をも包含する。
【００８６】
用語「交差反応性の」は、機能的に重複している本発明の化合物を記載するために使用される。より詳細には、天然エピトープおよび／またはそれにより活性化された免疫エフェクター細胞の免疫原性特性は、それに由来する非天然エピトープによって、ある程度、共有され、その結果、非天然エピトープは、天然エピトープおよび／またはそれにより活性化された免疫エフェクター細胞との「交差反応性」を有するようになる。本発明の目的のために、交差反応性は多種多様のレベルで現れることがある：（ｉ）エピトープのレベルで、例えば、非天然エピトープは天然エピトープ特異的ＣＴＬのＴＣＲと結合し、天然エピトープ特異的ＣＴＬを活性化することができる；（ｉｉ）Ｔ細胞のレベルで、すなわち、本発明の非天然エピトープはＴＣＲと結合し、天然エピトープを呈示している細胞を効果的に標的化および溶解することができるＴ細胞の集団（これは、天然エピトープ特異的ＣＴＬの集団とは異なる）を活性化する；（ｉｉｉ）抗体のレベルで、例えば、「抗」非天然エピトープ抗体は、天然エピトープを検出し、また、天然エピトープを認識し、また、天然エピトープと結合して、免疫応答におけるエフェクター機構を開始することができる。
【００８７】
治療的定義
本明細書中で使用される用語「対象において免疫応答を誘導する」は、当該技術分野で広く理解されている用語であり、抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答の増大が、本発明の構築物を対象に導入した後、本発明の構築物を対象に導入する前の免疫応答（存在する場合）に対して、検出または測定され得ることを意味する。所与の抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答が誘導されているかどうかを明らかにする様々な方法が当該技術分野では広く既知である。例えば、抗原特異的な抗体を、当該技術分野で既知の様々な免疫アッセイのいずれかを使用して検出することができ、このような免疫アッセイには、ＥＬＩＳＡ（この場合、例えば、固定化された抗原（またはエピトープ）に対するサンプル中の抗体の結合が、検出可能に標識された二次抗体（例えば、酵素標識されたマウス抗ヒトＩｇ抗体）を用いて検出される）が含まれるが、これに限定されない。
【００８８】
用語「処置する」は、対象における疾患または状態の少なくとも１つの症状を緩和または軽減することを意味するために本明細書中では使用される。本発明の目的の範囲内において、用語「処置する」は、プレパテンシー（ｐｒｅｐａｔｅｎｃｙ）、すなわち、感染または新生物形質転換と疾患の臨床的発現との間の期間を長くすることを意味する場合がある。用語「保護する」は、対象における疾患の発症または継続を必要に応じて予防または処置するか、あるいは両方であることを意味するために本明細書中では使用される。本発明の目的の範囲内において、疾患は、悪性腫瘍（例えば、肉腫、ガン腫、神経膠腫、芽細胞腫、膵臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、リンパ腫、白血病、メラノーマなどのような固形腫瘍または血液腫瘍）、感染（例えば、ウイルス性、細菌性、寄生虫性または真菌性）、および自己免疫疾患（例えば、関節炎、潰瘍性大腸炎、喘息または多発性硬化症のほとんどの形態）からなる群から選択される。例えば、本発明の構築物に取り込まれているエピトープ（１つまたは複数）が、胃腸管、乳房、肺および甲状腺のガン腫を含む上皮起源の新生物に関連するＣＥＡ（ガン胎児性抗原）に由来する場合、本発明の構築物は、このような処置を必要としている対象において上皮起源の新生物を予防または処置するために投与することができる。従って、本発明の構築物の意図された使用は、主に、エピトープの起源に依存する。ワクチンの予防的投与により、例えば、家族歴から明らかにされるようなガンを発症させる危険性のある受容者対象を保護することができる。
【００８９】
本発明の組成物に関連して使用される表現「医薬的に許容される」は、ヒトに投与されたとき、生理学的に許容可能であり、かつ、不都合な反応を典型的には生じさせない、このような組成物の分子的実体および他の成分を示す。好ましくは、本明細書中で使用される用語「医薬的に許容される」は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されているか、または、哺乳動物（より好ましくはヒト）における使用について米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に記載されていることを意味する。
【００９０】
用語「アジュバント」および用語「免疫アジュバント」は、本発明では互換的に使用され、宿主に単独で投与されたときに非免疫原性であり得るが、別の抗原に対する宿主の免疫応答を、このような抗原との共同で投与されたときに増強する化合物または混合物を示す。
【００９１】
本発明のアジュバントは、抗原を含む医薬組成物またはワクチン組成物の一部として、あるいは別個の配合物として投与することができる。本発明のアジュバントには、オイルエマルションおよび乳化剤型アジュバント、例えば、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ＭＦ５９またはＳＡＦなど；無機ゲル、例えば、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、リン酸アルミニウムまたはリン酸カルシウムなど；微生物由来アジュバント、例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素、大腸菌の熱感受性毒素（ＬＴ）、変異型毒素（例えば、ＬＴＫ６３またはＬＴＲ７２）、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）、コリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、ＤＮＡ  ＣｐＧモチーフ、ムラミルジペプチドまたはモノホスホリル脂質Ａなど；粒子状アジュバント、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、リポソーム、生分解性マイクロスフェアまたはサポニン類（例えば、ＱＳ−２１）など；サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２またはＧＭ−ＣＳＦなど；合成アジュバント、例えば、非イオン性ブロック共重合体、ムラミルペプチドアナログ（例えば、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン［ｔｈｒ−ＭＤＰ］、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−［１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ］エチルアミン）、ポリホスファゼン類、または合成ポリヌクレオチド、および界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニクポリオール、ポリアニオン、ペプチド、炭化水素エマルション、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、これらのアジュバントは、ヒトでの使用について医薬的に受容可能である。
【００９２】
本発明の目的の範囲内において、用語「共同投与」は、免疫アジュバントおよび抗原を１つの組成物において同時に、または異なる組成物において同時に、または連続して投与することを示すために使用される。
【００９３】
本発明の医薬組成物またはワクチン組成物に適用される用語「賦形剤」は、抗原含有化合物および／またはアジュバントが一緒に投与される希釈剤またはべヒクルを示す。このような医薬的賦形剤は、無菌の液体、例えば、水およびオイルなどであり、オイルには、石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のオイルが含まれ、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる。水または水溶液、生理的食塩水溶液、ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液が、特に注射用溶液のための賦形剤として好ましく用いられる。様々な好適な医薬的賦形剤がE.W.Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」（第１８版）に記載されている。
【００９４】
用語「保護免疫性」は、抗原の不活性化および／または抗原量の減少を生じさせ、また、（例えば、抗体の産生により獲得される）免疫性の生成をもたらす免疫応答で、同じ抗原または関連した抗原に繰り返しさらされたときに疾患の発症を予防または遅延させる宿主動物における免疫応答（能動的／後天的または受動的／生来的のいずれか、あるいは両方）を示す。「保護免疫応答」は、例えば、免疫化（ワクチン接種）された対象における腫瘍負担を軽減するために、あるいは、病原体または感染細胞の量の排除もしくは減少させるか、または病原体または感染細胞の量の増大を遅らせるために（あるいは、感染の何らかの他の測定可能な軽減を生じさせるために）効果的な体液性（抗体）免疫性または細胞免疫性あるいは両者を伴う。本発明の目的の範囲内において、保護免疫性は部分的であり得る。本発明の特定の実施態様において、保護免疫性は、疾患の進行を遅らせること、再発までの長さを増大させること、腫瘍成長の低下した速度、腫瘍退行、低下した死亡率などのいずれか１つを含む、処置されている何らかの状態または症状における何らかの改善によって反映される。
【００９５】
本明細書中で使用される用語「免疫応答を増強する」は、免疫応答を高めること、または免疫応答の持続期間を延ばすこと、またはそれらの両方を意味する。
【００９６】
本発明の目的に含まれる表現「免疫応答を高める」は、所与の抗原に対する免疫反応性の規模および／または効率を増大させる性質またはプロセスを示し、この場合、前記免疫反応性は液性免疫性または細胞免疫性のいずれか、あるいは両者である。免疫応答は、抗原特異的な免疫反応性の任意の測定可能なパラメーター（例えば、抗体力価、Ｔ細胞産生）が、少なくとも２倍、好ましくは１０倍、最も好ましくは３０倍増大する場合、高められたと考えられる。
【００９７】
用語「免疫応答を調節する」には、免疫応答を誘導（増大または誘発）すること、および、免疫応答を低下させる（抑制する）ことが含まれる。免疫調節方法（またはプロトコル）は、対象における免疫応答を調節する方法である。
【００９８】
用量または量に適用される用語「治療的に有効な」は、それを必要としている哺乳動物に投与されたときに所望する活性を生じさせるために十分である、化合物または医薬組成物またはワクチンのこのような量を示す。医薬組成物またはワクチンに関して本明細書中で使用される用語「治療的に有効な量／用量」は、用語「免疫原として有効な量／用量」と互換的に使用され、哺乳動物に投与されたときに効果的な免疫応答を生じさせるために十分である、化合物（例えば、本発明の構築物の一部として提供されるエピトープ）または医薬組成物またはワクチンの量／用量を示す。
【００９９】
本明細書中で使用される用語「サイトカイン」は、例えば、成長または増殖を誘導する様々な作用を細胞に対して発揮する数多くの因子のいずれか１つを示す。本発明の実施において単独または組合せで使用され得るサイトカインの非限定的な例には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１Ｉ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１１、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびｆｌｔ３リガンドが含まれる。本発明はまた、１つ以上のサイトカインが培地から特に除かれている培養条件を包含する。サイトカインは、いくつかのベンダーから、例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびＩｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）などから市販されている。必ずしも常に明示的に述べられていないが、野生型サイトカインまたは精製されたサイトカインと類似する生物学的活性を有する分子（例えば、組換え産生体またはそのムテイン）は、本発明の精神および範囲において使用されることが意図される。
【０１００】
本明細書中で使用される用語「対象」は、免疫系を有する動物、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどの齧歯類）を示す。実際には、この用語はヒトを示す。
【０１０１】
用語「約」または用語「おおよそ」は、通常、所与の値または範囲の２０％以内であり、より好ましくは１０％以内であり、最も好ましくはさらには５％以内であることを意味する。あるいは、生物学的システム（例えば、免疫応答を測定しているとき）では特に、用語「約」は、所与の値の、対数で約１（すなわち、１桁）の範囲内を意味し、好ましくは、２倍以内を意味する。
【０１０２】
分子生物学に関連した定義
用語「単離された」は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはそれらのフラグメントが自然界では通常的に会合している構成成分（細胞性および他のもの）から分離されていることを意味する。例えば、核酸分子に関しては、単離された核酸は、その核酸分子が染色体において通常の場合には結合している５’配列および３’配列から分離されている核酸である。当業者には明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはそれらのフラグメントは、それらをその天然に存在する対応体から区別するために「単離」を必要としない。さらに、「濃縮された」、「分離された」、または「希釈された」核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはそれらのフラグメントは、体積あたりの分子の濃度および数が、その天然に存在する対応体の濃度または数がより大きく「濃縮されている」か、または、より少なく「分離されている」という点で、その天然に存在する対応体から区別することができる。核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはそれらのフラグメントは、天然に存在する対応体からその一次配列が異なるか、または、例えば、そのグリコシル化パターンによって異なる場合、その単離された形態で存在する必要はない。これは、このような核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはそれらのフラグメントは、その一次配列によって、あるいは、別の特徴（例えば、グリコシル化パターンなど）によって、その天然に存在する対応体から区別することができるからである。本明細書中に開示された発明のそれぞれについて明示的に言及されていないが、下記および適切な条件のもとで開示される組成物のそれぞれに対する上記の実施態様のすべてが本発明によって提供されることを理解しなければならない。従って、天然に存在しない核酸が、単離された天然に存在する核酸に由来する別個の実施態様として提供される。細菌細胞において産生されるタンパク質が、そのタンパク質が天然において産生される真核生物細胞から単離された天然に存在するタンパク質に由来する別個の実施態様として提供される。
【０１０３】
「コード配列」、すなわち、発現産物（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素）を「コードする」配列は、発現したとき、このようなＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列である。すなわち、ヌクレオチド配列は、このようなポリペプチド、タンパク質または酵素に対するアミノ酸配列をコードする。タンパク質に対するコード配列は、開始コドン（通常、ＡＴＧ）および停止コドンを含んでもよい。
【０１０４】
用語「遺伝子」は、「構造的遺伝子」とも呼ばれるが、１つ以上のタンパク質のすべてまたは一部を含む特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、またはこのような配列に対応するＤＮＡ配列であって、例えば、遺伝子が発現する条件を決定する調節ＤＮＡ配列（例えば、プロモーター配列、など）を含んでもよいＤＮＡ配列、またはこのような調節ＤＮＡ配列を含まなくてもよいＤＮＡ配列を意味する。遺伝子の転写された領域は、翻訳された領域（コード領域）に加えて、５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）ならびにイントロンを含むことができる。
【０１０５】
「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を明確にする目的のために、プロモーター配列には、その３’末端において転写開始部位が結合し、上流（５’方向）に広がって、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な最低限の数の塩基またはエレメントが含まれる。プロモーター配列の内部には、転写開始部位（これは、好都合には、例えば、ヌクレアーゼＳ１によるマッピングによって明らかにされる）、ならびに、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関わるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
【０１０６】
コード配列は、細胞内では、転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下」にあるか、または転写制御配列および翻訳制御配列と「作動的（機能的）に結合している」。ＲＮＡポリメラーゼはコード配列をｍＲＮＡに転写し、ｍＲＮＡは、その後、（イントロンを含有する場合）トランスＲＮＡスプライシングされ、コード配列によりコードされるタンパク質に翻訳される。「機能的に結合している」は、エレメントが協調して機能することを可能にする配置にある並置状態を示す。
【０１０７】
用語「発現する」および用語「発現」は、遺伝子またはＤＮＡ配列における情報が現れることを可能にするか、またはこのような情報を現れさせることを意味し、例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生させることを意味する。ＤＮＡ配列は、「発現産物」（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質など）を形成させるために、細胞において、または細胞によって発現させられる。発現産物そのもの、例えば、生じたｍＲＮＡまたはタンパク質は、細胞によって「発現」させられたとも言うことができる。発現産物は、細胞内、細胞外または分泌型として特徴づけることができる。用語「細胞内」は、細胞の内部に存在するものである。用語「細胞外」は、細胞の外部に存在するものである。物質は、その物質が細胞の外部で有意な量で存在する場合、細胞表面のどこかまたは細胞の内部から、細胞によって「分泌」される。試験管内で「発現を可能にする条件」は、温度（一般には約３７℃）、湿度（湿っている空気）、ｐＨを維持するための二酸化炭素濃度（一般には約５％ＣＯ2〜約１５％ＣＯ2）、ｐＨ（一般には約７．０〜８．０、好ましくは７．５）、および宿主細胞タイプに依存する培養液組成の培養条件である。生体内では、発現を可能にする条件は、主に、十分な栄養、水、住居および環境条件（明暗サイクル、温度、湿度、ノイズレベル）に依存する非ヒトトランスジェニック動物の健康状態である。いずれの系でも、発現は、当該技術分野で広く知られているように、リプレッサーまたは誘導因子の制御システムに存在し得る。
【０１０８】
用語「異種の」は、特定の遺伝子座において天然に存在しないエレメントの組合せを示す。例えば、異種ＤＮＡは、細胞または細胞の特定の染色体部位に天然には存在しないＤＮＡを示す。異種の発現調節エレメントは、自然界で機能的に結合している遺伝子とは異なる遺伝子と機能的に結合しているこのようなエレメントである。本発明に関連して、構築物のコード配列は、その配列がクローニングまたは発現のために挿入されているベクターＤＮＡに対して異種であり、また、その配列が発現する、このようなベクターを含有する宿主生物（例えば、ＣＨＯ細胞）に対して異種である。
【０１０９】
本明細書中で使用される用語「遺伝子送達」、用語「遺伝子移入」、用語「トランスフェクション」などは、「外来」遺伝子（すなわち、外因性遺伝子または細胞外遺伝子）、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を宿主細胞に導入し、その結果、宿主細胞が、導入された遺伝子または配列を発現して、所望する物質（典型的には、導入された遺伝子または配列によりコードされるタンパク質または酵素）を産生することを意味する。導入された遺伝子または配列は、「クローン化された」または「外部」の遺伝子または配列とも呼ばれることがあり、調節配列または制御配列、例えば、開始配列、停止配列、プロモーター配列、シグナル配列、分泌配列、または細胞の遺伝子装置によって使用される他の配列を含むことができる。遺伝子または配列は、非機能的な配列、または機能が全く知られていない配列を含むことができる。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け取り、このようなＤＮＡまたはＲＮＡを発現する宿主細胞は「トランスフェクション」されており、「トランスフェクタント」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同じ属もしくは種の細胞、または異なる属もしくは種の細胞を含む任意の供給源に由来し得る。
【０１１０】
「遺伝子送達べヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞に運ぶことができる任意の分子として定義される。遺伝子送達べヒクルの例には、リポソーム、生物適合性ポリマー（これには、天然ポリマーおよび合成ポリマーが含まれる）；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖；リポ多糖；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；、細菌、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ関連ウイルスなど）、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、ならびに、当該技術分野で典型的に使用されている他の組換えべヒクルがある（これらは、様々な真核生物宿主および原核生物宿主における発現のために記載されており、単純なタンパク質発現のためだけでなく、遺伝子治療のために使用され得る）。
【０１１１】
用語「ベクター」、用語「クローニングベクター」および用語「発現ベクター」は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）が宿主細胞に導入され、その結果、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するようにし得る遺伝子送達べヒクルを意味する。
【０１１２】
ベクターは典型的には、外来ＤＮＡが挿入される伝達可能な媒介因子のＤＮＡを含む。１つのＤＮＡセグメントを別のＤＮＡセグメントに挿入するための一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特定の部位（特定のヌクレオチド群）でＤＮＡを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の使用を伴う。「カセット」は、規定された制限部位においてベクターまたは別のＤＮＡ片に挿入され得るＤＮＡセグメントを示す。好ましくは、カセットは「発現カセット」であり、この場合、ＤＮＡは、規定された制限部位においてベクター内に挿入され得る、発現産物をコードするコード配列またはＤＮＡセグメントである。カセットの制限部位は、一般には、適正な読み枠でのカセットの挿入を確実にするために設計される。一般には、外来ＤＮＡがベクターＤＮＡの１つ以上の制限部位において挿入され、その後、伝達可能なベクターＤＮＡと一緒にベクターによって宿主細胞内に運ばれる。挿入または付加されたＤＮＡを有するＤＮＡセグメントまたはＤＮＡ配列（例えば、発現ベクターなど）はまた、「ＤＮＡ構築物」と呼ばれる。一般的なタイプのベクターは、さらなる（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、かつ好適な宿主細胞に容易に導入することができる、二本鎖ＤＮＡの一般には自己完結型の分子である「プラスミド」（これは通常的には細菌起源である）である。プラスミドベクターは、多くの場合、コードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含有しており、外来ＤＮＡを挿入するために好適な１つ以上の制限部位を有する。非常に多数のベクター（これには、プラスミドベクターおよび真菌ベクターが含まれる）が、様々な真核生物宿主および原核生物宿主における複製および／または発現のために記載されている。非限定的な例には、ｐＫＫプラスミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＲＥＳＴプラスミドもしくはｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、またはｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、および多くの適切な宿主細胞が含まれ、これらは、本明細書に開示もしくは引用されている方法、または、そうでない場合には、関連技術分野の当業者に既知の方法を使用している。組換えクローニングベクターは、多くの場合、クローニングまたは発現のための１つ以上の複製システム、宿主での選択のための１つ以上のマーカー（例えば、抗生物質耐性）、および１つ以上の発現カセットを含む。
【０１１３】
用語「宿主細胞」または用語「レシピエント細胞」は、細胞によって物質を産生させるために、例えば、遺伝子（ＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列）またはタンパク質、すなわち、バリアント構築物を細胞によって発現させるために、バリアント構築物をコードする核酸またはベクターを導入することによって任意の方法で選択、改変、形質転換、生育、または使用もしくは操作される任意の生物の任意の細胞を意味する。宿主細胞は、試験管内で、すなわち、組織培養で、または、生体内で、すなわち、微生物、植物もしくは動物において見出され得る。これらの用語は、単一細胞の子孫を含むことが意図され、子孫は、自然的、偶発的もしくは意図的な変異のために、またはさらなる変化の導入のために、元の親細胞と、（形態学的に、またはゲノムＤＮＡ相補体もしくは全体的なＤＮＡ相補体において）必ずしも完全に同一でなくてもよい。細胞は原核生物性または真核生物性であってもよく、細胞には、細菌細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞（例えば、ハツカネズミ、ラット、ハムスター、サルまたはヒトの細胞）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１４】
用語「発現システム」は、例えば、ベクターにより運ばれ、宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現させるための好適な条件のもとでの宿主細胞および適合し得るベクターを意味する。好ましくは、導入された核酸は宿主細胞において安定的または一過性に維持される。安定な維持には、典型的には、導入された核酸が、宿主細胞と適合し得る複製起点を含有するか、または宿主細胞のレプリコン（例えば、染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）、または核もしくはミトコンドリアの染色体など）に組み込まれるかのいずれかが要求される。一般的な発現システムには、大腸菌宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが含まれる。特定の実施態様において、構築物はＣＯＳ−１細胞またはＣＨＯ細胞において発現する。他の好適な細胞には、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３ｅ（ヒト腎臓細胞）、マウス一次筋芽細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が含まれる。
【０１１５】
用語「培養（する）」は、様々な種類の培地の表面上および様々な種類の培地における宿主細胞または生物の試験管内での増殖を示す。好ましくは、培養は、様々な構築物の発現を可能にする条件のもとで行われる。「拡大培養された」によって、細胞の任意の増殖または分裂が意味される。
【０１１６】
用語「ミュータント」および用語「変異」は、遺伝物質（例えば、ＤＮＡ）における任意の検出可能な変化、または、このような変化の任意のプロセス、機構もしくは結果を意味する。これには、遺伝子の構造（例えば、ＤＮＡ配列）が変化する遺伝子変異、何らかの変異プロセスから生じる任意の遺伝子またはＤＮＡ、および、改変された遺伝子またはＤＮＡ配列によって発現した任意の発現産物（例えば、タンパク質または酵素）が含まれる。用語「バリアント」もまた、改変された、または変化した遺伝子、ＤＮＡ配列、酵素、細胞など、すなわち、任意の種類のミュータントを示すために使用されることがある。
【０１１７】
本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、目的とする配列を有するゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子に対してハイブリダイゼーション可能な一般には少なくとも１０ヌクレオチドの核酸、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの核酸、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの核酸で、好ましくは多くても約１００ヌクレオチドの核酸を示す。オリゴヌクレオチドは、例えば、標識（例えば、ビオチンなど）が共有結合によりコンジュゲート化されている32Ｐ−ヌクレオチド（１つまたは複数）で標識することができる。１つの実施態様において、標識されたオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用することができる。別の実施態様において、オリゴヌクレオチド（その一方または両方が標識され得る）を、エピトープ列の全長もしくはフラグメントをクローン化するために、または、エピトープ列をコードする核酸の存在を検出するために、それらのいずれかでＰＣＲプライマーとして使用することができる。さらなる実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、精製目的のために、エピトープ列をコードするＤＮＡ分子との三重らせんを形成することができる。一般に、オリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸シンセサイザーで合成的に調製される。従って、オリゴヌクレオチドは、天然に存在しないホスホエステルアナログ結合（例えば、チオエステル結合など）を伴って調製することができる。
【０１１８】
免疫応答を対象において誘導するために、本発明のペプチド構築物は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして投与することができる。ポリヌクレオチドは遺伝子送達べヒクルで投与することができ、または、コードされたポリペプチドを組換え的に転写、翻訳およびプロセシングする宿主細胞に挿入することによって投与することができる。従って、医薬的に許容されるキャリアに本発明のポリヌクレオチドを含有する単離された宿主細胞を、効果的なワクチン療法のために、適切かつ効果的な量のアジュバント、サイトカインまたは共刺激分子と組み合わせることができる。１つの実施態様において、宿主細胞は、必要なＭＨＣ／共刺激分子を発現するＡＰＣ（例えば、樹状細胞（ＤＣ）、単球／マクロファージ、Ｂリンパ球または他の細胞タイプ）である。宿主細胞は、サイトカインおよび共刺激分子のいずれかまたは両方の有効量をコードするポリヌクレオチドを挿入することによってさらに改変することができる。
【０１１９】
ＡＰＣは、本発明のペプチド構築物をコードするウイルスベクターを用いて試験管内で形質導入することができる。最も一般的なウイルスベクターには、組換えポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルスおよび鶏痘ウイルス（Bronte他(1997)、PNAS、94:3183〜3188;Kim他(1997)、J.Immunother.、20:276〜286)、および、優先的にはアテ゛ノウイルス(Arthur他(1997)、J.Immunol.、159:1393〜1403;Wan他(1997)、Human Gene Therapy、8:1355〜1363;Huang他(1995)、J.Virol.、69:2257〜2263）などが含まれる。レトロウイルスもまた、形質導入のために使用することができる（Marian他(1996)、J.Virol.、70:2957〜2962）。形質導入されたＡＰＣは、続いて、静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内または腹腔内の送達経路によって宿主に投与することができる。さらなる実施態様において、ＡＰＣまたは免疫エフェクター細胞は、有効量の刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２など）または共刺激分子と一緒に投与される。
【０１２０】
あるいは、ＤＣまたは他のＡＰＣの生体内形質導入を、静脈内送達、筋肉内送達、鼻腔内送達、腹腔内送達または皮膚送達を含む種々の経路によってウイルスベクターを投与することによって達成することができる。好ましい方法は、およそ１ｘ１０10ｉ．ｕ．〜１ｘ１０12ｉ．ｕ．の総用量を使用する多部位でのＡｄベクターの皮膚送達である。
【０１２１】
ウイルス遺伝子送達はより効率的であるが、ＤＣはまた、非ウイルス遺伝子送達法によって、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、またはカチオン性脂質／プラスミドＤＮＡ複合体などによって試験管内／生体外で形質導入するすることができる（Arthur他(1997)、Cancer Gene Therapy、4:17〜25）。そのままのプラスミドＤＮＡの皮膚内への遺伝子銃による送達または注入もまた、ＤＣの形質導入をもたらす（Condon他(1996)、Nature Med.、2:1122〜1128;Raz他(1994)、PNAS、91:9512〜9523）。プラスミドＤＮＡの筋肉内送達もまた、免疫化のために使用することができる（Rosato他(1997)、Human Gene Therapy、8:1451〜1458）。
【０１２２】
本発明の構築物により標的化される有用なＡＰＣ受容体の例
上記で示されたように、本発明のペプチド構築物はＡＰＣ標的化配列を含む。
【０１２３】
典型的には、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は外因性抗原を主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ）分子の表面に提示し、内因的に合成された抗原をＭＨＣＩ分子の表面に提示する。例外的な環境では、外因性抗原がＭＨＣＩ分子の表面に提示され得る。この現象は、抗原の間接的な提示にとって非常に重要である。特に、これは、腫瘍および他の非感染性因子に対して特異的なナイーブなＣＤ８＋Ｔリンパ球の抗原刺激に関係づけられるからである（Bevan、J.Exp.Med.、182、639〜641(1995)）。
【０１２４】
腫瘍細胞を排除する能力とともに、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する一次ＣＴＬ応答を生じさせるために、ＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩに対して複合体化されたペプチドを提示しなければならない。今や、専門的なＡＰＣ、ＤＣ、単球およびマクロファージが、プロセシングおよびＭＨＣクラスＩ分子表面での提示のために外因性抗原を内在化できることが明らかになりつつある。ＡＰＣがペプチドを取り込み、ＭＨＣクラスＩに関連してペプチドを提示するいくつかの機構が報告されている。最初に、分解されたタンパク質に由来するペプチドが、外部において高い濃度で産生され、その後、表面のＭＨＣクラスＩ分子上のペプチドと交換され得る（CarboneおよびBevan(1990)、J.Exp.Med.、171:377〜387;Pfeifer他(1993)、Nature、361:359〜362）。あるいは、ＡＰＣは、エンドサイトーシスまたは食作用によって抗原を取り込み、抗原がＭＨＣクラスＩと会合するエンドソーム小胞におけるタンパク質分解によって抗原をプロセシングすることがあり、その後、抗原が、細胞質ゾルに一度も進入することなく表面に輸送される（Bachmann他(1995)、Eur.J.Immunol.、25:1739〜1743;Liu他(1997)、Scand.J.Immunol.、45:527〜533）。近年には、外因性抗原がＡＰＣによって内在化され、細胞質ゾルに輸送され、プロセシングされて、古典的な内因性ＭＨＣクラスＩ経路によって提示される第３の機構が、マクロファージ（Kovacsovics-BankowskiおよびRock(1995)、Science、267:243〜246)およびDC(Rodriguez他(1999)、Nature Cell Biol.、1:362〜368）の両方について明らかにされた。
【０１２５】
以前には、ｇｐ９６などの熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）によってシャペロン化された外因性抗原がＡＰＣによって取り込まれ、そのＭＨＣＩ分子を介して提示され、これにより、抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激を生じさせ得ることが示されている（SutoおよびSrivastava、Science、269、1585〜1588(1995)）。広範囲の様々なペプチドが、それらが単離される供給源に依存してｇｐ９６によってシャペロン化される（Srivastava他、Immunity、8、657〜665(1998)）。腫瘍由来のｇｐ９６は腫瘍抗原ペプチドを有し（Ishii他、J.Immunol.、162、1303〜1309(1990)）、ウイルス感染細胞からのｇｐ９６調製物はウイルスエピトープを有し（SutoおよびSrivastava、Science、269、1585〜1588(1995);Nieland他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95、1800〜1805(1985)）、また、モデル抗原（例えば、オバルブミンまたはガラクトシダーゼなど）でトランスフェクションされた細胞からのｇｐ９６調製物は、対応するエピトープと会合する（Arnold他、J.Exp.Med.、182、885〜889(1995);Breloer他、Eur.J.Immunol.、28、1016〜1021(1998)）。ｇｐ９６とペプチドとの会合が生体内で生じる（MenoretおよびSrivastava、Biochem.Biophys.Res.Commun.、262、813〜818(1999)）。ｇｐ９６とペプチドとの複合体は、細胞からの単離（Tamura他、Science、278、117〜120(1997))または試験管内での再構成（Blachere他、J.Exp.Med.、186、1183〜1406(1997)）のいずれかであっても、優れた免疫原であり、ｇｐ９６によってシャペロン化された抗原性ペプチドに対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を幅広く誘発させるために使用されている。
【０１２６】
Binder他(Nature Immunol.(2001)、1:151〜155)は、ＡＰＣが、熱ショックタンパク質ｇｐ９６によってシャペロン化された外因性の抗原性ペプチドを取り込み、それらを内因性経路によってそのＭＨＣクラスＩ分子表面に提示できることを示している。このプロセスの効率が大きいことは、以前にはＡＰＣ上のｇｐ９６に対する受容体に起因すると考えられた。ＣＤ９１分子（これはまた２−マクログロブリン受容体または低密度リポタンパク質関連タンパク質と呼ばれている）が熱ショックタンパク質ｇｐ９６に対する細胞表面受容体であると、Ｂｉｎｄｅｒ他によって提案されていた。ＣＤ９１は、肝細胞、繊維芽細胞および角化細胞だけでなく、単球系譜の細胞の表面に存在する。Ｂｉｎｄｅｒ他は、ＨＳＰのｇｐ９６がＣＤ９１に対するリガンドであることを示している。ｇｐ９６に直接結合することが示されたＣＤ９１のｐ８０フラグメントは、ＣＤ９１のαサブユニットのＮ末端の分解産物である。ＡＰＣ−ｇｐ９６の相互作用はｇｐ９６とＣＤ９１との相互作用をもたらし、その結果、ＡＰＣのＭＨＣＩ分子によるｇｐ９６シャペロン化ペプチドの再提示をもたらし、その後、抗原特異的なＴ細胞の刺激（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ、Science、269、1585〜1588(1995)）および前炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン１２など）の分泌（Basu他、Int.Immunol.(2000)、12:1539〜1546）をもたらしている。
【０１２７】
同様に、Suzie他(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、94:13146〜13151(1997)）は、ニワトリオバルブミンの大きいフラグメントを融合パートナーとして有する可溶性のｈｓｐ７０融合タンパク質が、アジュバントの非存在化で、Ｈ−２bマウスを刺激して、オバルブミンに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬを生じさせ得ることを示している。マウス腫瘍細胞（ドナー細胞）から単離された熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）で免疫化されたマウスは、応答しているマウスの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質と連携してドナー細胞ペプチドを認識するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をもたらしている。
【０１２８】
結果として、ｈｓｐ分子は、非共有結合的に会合したペプチドを他の（レシピエント）細胞（ＡＰＣを含む）のＭＨＣクラスＩタンパク質に送達することができることになる。従って、本発明の実施態様の１つにおいて、ＡＰＣ標的化配列は、ＡＰＣの表面に存在するｈｓｐ受容体（ＨＳＲ）（例えば、ＣＤ９１受容体）との相互作用を媒介するｈｓｐ配列に由来する。
【０１２９】
ＤＣは、液相での飲作用によって、または受容体媒介によるエンドサイトーシスによって外因性抗原を内在化する。ＤＣは、抗原の内在化および提示を容易にするいくつかの受容体を発現しており、このような受容体には、Ｃタイプレクチン受容体、例えば、マンノース受容体（Sallusto他(1995)、J.Exp.Med.、182:389)、DEC205(Jiang他(1995)、Nature、375:151)およびDC-SIGN(Engering他、J.Immunol.(2002)、168:2118〜2126)など、ならびに、様々なＩｇのＦｃドメインに対する受容体（SallustoおよびLanzavecchia(1994)、J.Exp.Med.、179:1109）が含まれる。
【０１３０】
様々なＦｃＲが、ＤＣを含む造血系譜のほとんどの細胞で発現しており、免疫応答の体液性部門および細胞性部門を結びつけることにおいて重要な役割を果たしている。抗原−ＩｇＧ複合体（免疫複合体（ＩＣ））は、様々なＦｃＲに結合し、架橋する一方で、食作用から、抗体媒介による細胞の細胞傷害性にまで及ぶ試験管内での様々な応答を媒介している。ＤＣによるＩＣのＦｃＲ媒介内在化は、ＩＣに存在する抗原に由来するＭＨＣクラスＩ結合ペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの両方の高まった提示に関連しており、ＤＣの活性化をもたらし、ＤＣがペプチド特異的なＣＤ８＋ＣＴＬを生体内で抗原刺激することを可能にする（AmigorenaおよびBonnerot(1999)、Semin.Immunol.、11:385;AmigorenaおよびBonnerot(1999)、Immunol.Rev.、172:279;Regnault他(1999)、J.Exp.Med.、189:371）。
【０１３１】
Schuurhuis他(J.Immunol.(2002)、168:2240〜2246）は、ＯＶＡ／抗ＯＶＡのＩＣで処理されたＤＣが、ＩＣに存在するＯＶＡ  Ａｇに由来する優性ＣＴＬエピトープに対するＣＴＬを抗原刺激したことを示している。
【０１３２】
ＩｇＧのＦｃ受容体ファミリーの８個を超えるメンバーのなかで、１つの受容体、すなわち、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）が、単球、マクロファージおよびＤＣでのみ構成的に発現している（Pan他(1990)、J.Immunol.、145:267〜275;Fanger他(1997)、J.Immunol.、158:3090〜3098）。ＩＣの形態での、ＤＣ表面上のＦｃγＲＩに対する抗原の標的化は、プロテオソームによる分解を要求する効率的なクラスＩ限定の提示をもたらし、かつ機能的ＴＡＰ（抗原プロセシングに関連する輸送体）に依存することが示された（Regnault他(1999)、J.Exp.Med.、189:371〜380)。Kaufman他((1996）、Tumor Target.、2:17〜28）は、ＦｃγＲＩに対して特異的な二重特異性抗体が単球を効率的に標的化し、宿主の抗腫瘍応答を一部の患者で誘導することをヒト臨床試験で示している。さらに、Wallace他((2001)、J.Immunol.Methods、248:183〜194）は、ＦｃγＲＩを標的化するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に基づく融合タンパク質（この場合、重鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインが除かれ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）で置き換えられた）が、ヒト骨髄性ＴＨＰ−１細胞株によって内在化およびプロセシングされ、その結果、ＭＨＣクラスＩと会合したＰＳＡペプチドの提示およびＰＳＡ特異的ヒトＣＴＬによるＴＨＰ−１の溶解をもたらしたことを最近報告している。
【０１３３】
結果として、ＩｇＧに基づく複合体（例えば、免疫複合体（ＩＣ）またはキメラなＩｇＧ融合ポリペプチド）は、ＦｃＲに結合する一方で、非共有結合的に会合したペプチドを他の（レシピエント）細胞（ＡＰＣを含む）のＭＨＣクラスＩタンパク質に送達することができることになる。従って、本発明の実施態様の１つにおいて、ＡＰＣ標的化配列は、ＡＰＣの表面のＦｃＲ（例えば、ＦｃγＲＩ）との相互作用を媒介するＩｇＧ配列に由来する。
【０１３４】
未成熟なＤＣによって発現されるいくつかの受容体はＣ型レクチンスーパーファミリーに属し、これには、ランゲリン（ＣＤ２０７）、マンノース受容体（ＭＲ；ＣＤ２０６）およびＤＥＣ−２０５が含まれる（Mason編、Leucocyte Typing、第VII巻:2000、Oxford University Press、Oxford）。
【０１３５】
ムチン（ＭＵＣ１）が腺ガンでは非常に発現している。マウスにおいて、ＭＵＣ１に連結された酸化型マンナン（Ｍ−ＦＰ）は、生体内で与えられた場合、強力なＭＨＣ限定ＣＴＬおよび腫瘍保護を誘導する。Apostolopoulos他(Vaccine(2000)、18:3174〜84）は、腹膜滲出細胞（ＰＥＣ）から得られ、Ｍ−ＦＰとともに生体外で培養された、ハツカネズミのマンノース受容体（ＭＲ）を有するマクロファージが、養子移植の後、ＭＵＣ１をＴ細胞に効率的に提示し、それにより、非常に高頻度のＣＴＬ、および腫瘍攻撃からの保護をもたらし得ることを示している。Ｍ−ＦＰはＭＲを標的化し、ＭＨＣクラスＩ分子へのペプチドの迅速な移動を確実にしており、また、マクロファージによる試験管内でのＩＬ−１２産生を直接的に刺激することができる。さらに、他の研究でのＭＲの標的化は、ＭＲに結合した後、リソソームおよびファゴソームへの移動を伴う内在化が存在するので、効率的なクラスＩＩ提示をもたらすことが示されていた（Tan他(1997)、Eur.J.Immunol.、27:2426〜2432;Engering他(1997)、Eur.J.Immunol.、27:2417〜2425;Wileman(1985)、J.Biochem.、260:7387〜7393;Prigozy(1977)、Immunity、6:187〜193)。
【０１３６】
Mahnke他(J.Cell Biol.(2000)、151:673〜84)は、ＤＥＣ−２０５マルチレクチン受容体が、ＭＨＣクラスＩＩ産物が多い後期のエンドソームまたはリソソームを標的化し、これに対して、相同的なマクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）がより末梢のエンドソームに見出されることをＤＣにおいて明らかにしている。ＤＥＣ−２０５の細胞質ゾルドメインは、後期エンドソームを介する効率的な再循環と、ＣＤ４+Ｔ細胞に対する非常に高まった効率の抗原提示とを伴う受容体媒介によるエンドサイトーシスの新しい経路を媒介すると結論された。
【０１３７】
Geijtenbeek他((2000)、Cell、100:575）は最近、他の細胞タイプでもまた発現しているＭＲおよびＤＥＣ−２０５とは対照的に、ＤＣ表面でもっぱら発現する新規なＣタイプレクチン、すなわち、ＤＣ特異的なＩＣＡＭ捕捉の非インテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ；ＣＤ２０９）を同定している。ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣ遊走およびＴ細胞活性化の両方を媒介する細胞接着受容体として機能している。ＤＣ−ＳＩＧＮはまた、ＨＩＶｇｐ１２０を捕捉し、Ｔ細胞のＤＣ誘導によるＨＩＶ伝播を容易にするＨＩＶ−１Ｒとして機能している。ＤＣ−ＳＩＧＮの細胞質テールにおける内在化モチーフは、エンドサイトーシス受容体としてのＤＣ−ＳＩＧＮの機能に対するヒントを与えている。Engering他(J.Immunol.(2002)、168:2118〜2126）は、ＤＣ表面で、ＤＣ−ＳＩＧＮが、可溶性リガンドと結合したときに迅速に内在化され、後期エンドソーム／リソソームに標的化されることを明らかにしている。そのうえ、ＤＣ−ＳＩＧＮによって内在化されたリガンドは効率的にプロセシングされ、ＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される。
【０１３８】
結果として、ＡＰＣの表面に存在するＣ型レクチン受容体の少なくとも一部（例えば、マンノース受容体（ＭＲ；ＣＤ２０６）、ＤＥＣ−２０５（ＣＤ２０５）およびＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）など）は、抗原（例えば、ＴＡＡ）を特異的にＡＰＣ（例えば、ＤＣ）に標的化して、抗原特異的な免疫性を誘導するために使用される能力を有することになる。従って、特定の実施態様において、本発明のＡＰＣ標的化配列は、Ｃ型レクチン受容体を標的化する配列を含む。
【０１３９】
核酸および遺伝子ワクチン
組換え核酸（特に、ＤＮＡ分子）により、本発明のペプチド構築物の効率的な発現が提供される。１つの実施態様において、本発明は、上述の、ＡＰＣに対して標的化されるペプチド構築物をコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、発現制御配列（１つまたは複数）と機能的に結合しているこのような核酸を含む発現ベクター、および宿主細胞（例えば、発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換されたＡＰＣ）、およびこのような核酸を含む非ヒト宿主を提供する。特定の実施態様によれば、本発明のエピトープ構築物をコードする核酸を含む発現ベクターは、ＡＰＣ標的化機構をさらに含むことができ、またはＡＰＣ標的化機構と組み合わせることができ、従って、宿主のＡＰＣにおいて発現させるために直接標的化することができる。本発明のペプチド構築物は、ペプチド構築物をコードする核酸の発現を可能にする条件のもとで生育させた宿主細胞から単離することによって組換え的に製造することができる。
【０１４０】
本発明に従って、当業者の範囲内にある、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡの従来の様々な技術を用いることができる。このような技術は文献において詳しく説明されている。例えば、Sambrook、Fritsch&Maniatis、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(本明細書中では「Sambrook他、1989」);DNA Cloning:A Practical Approarch、第I巻および第II巻(Glover編、1985);Oligonucleotide Synthesis(Gait編、1984);Nucleic Acid Hybridization、Hames&Higgins編(1985);Transcription And Translation、Hames&Higgins編(1984);Animal Cell Culture、Freshney編(1986);Immobilized Cells And Enzymes、IRL Press(1986);Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);Ausubel他(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley&Sons,Inc.(1994);Goeddel他、Gene Expression Technology、Academic Press(1991);GacesaおよびRamji、Vectors:Essential Data Series、John Wiley&Sons,Inc.(1994)を参照のこと。
【０１４１】
特定の実施態様において、本発明のペプチド構築物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターは、本発明の構築物が特異的な免疫応答を誘発する分子の発現または機能に関連する疾患または障害を処置または予防するために投与される。
【０１４２】
当該技術分野で利用可能な遺伝子治療のための方法はどれも、本発明に従って使用することができる。例示的な方法が下記に記載される。
【０１４３】
遺伝子治療方法の一般的な総説については、米国特許第６，２２８，８４４号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８９，４６６号、同第５，５８０，８５９号、同第６，２１４，８０４号および同第５，７０３，０５５号、国際特許出願公開ＷＯ９０／１１０９２、同ＷＯ８９／１２４５８、同ＷＯ９４／２９４６９、欧州特許１０２６２５３；Goldspiel他、Clinical Pharmacy、1993、12:488〜505;WuおよびWu、Biotherapy、1991、3:87〜95;Tolstoshev、Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.、1993、32:573〜596;Mulligan、Science、1993、260:926〜932;MorganおよびAnderson、Ann.Rev.Biochem.、1993、62:191〜217;May、TIBTECH、1993、11:155〜215を参照のこと。使用され得る組換えＤＮＡ技術の、当該技術分野で一般に知られている様々な方法が、Ausubel他(編)、1993、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley&Sons、NY;Kriegler、1990、Gene Transfer and Expression、A Laboratory Manuak、Stockton Press、NY;第12章および第13章において、Dracopoli他(編)、1994、Current Protocols in Human Genetics、John Wiley&Sonsに記載されている。遺伝子治療のための好適な様々なベクターが上記に記載されている。
【０１４４】
本発明はまた、（生体内または生体外または試験管内のどれかで）本発明の核酸分子を細胞内に送達するために好適な送達べヒクルを提供する。本発明の核酸分子はクローニングベクターまたは発現ベクターに含有され得る。これらのベクター（特に発現ベクター）は、次に、例えば、細胞への送達および／または細胞内への進入を容易にし得る多数の形態のいずれかを取るために操作することができる。
【０１４５】
ベクターが生体内または生体外で遺伝子治療のために使用されるとき、医薬的に許容されるベクターが好ましく、例えば、複製が不完全なレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターなどが好ましい。本発明の核酸を含有する医薬的に許容されるベクターは、挿入されたポリヌクレオチドの一過性の発現または安定な発現のためにさらに改変することができる。
【０１４６】
本発明の核酸を含有する宿主細胞は、ポリヌクレオチドの組換え複製およびペプチドの組換え産生のために有用である。あるいは、このような細胞は、本明細書中に記載される方法で対象における免疫応答を誘導するために使用することができる。宿主細胞がＡＰＣであるとき、細胞は、養子免疫療法において有用である免疫エフェクター細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）など）の集団を拡大培養するために使用することができる。
【０１４７】
１つの態様において、治療用ベクターは、好適な宿主において構築物を発現させる核酸分子を含む。特に、このようなベクターは、ペプチドエピトープ構築物に対するコード配列に機能的に連結されたプロモーターを有する。プロモーターは、誘導型または構成的であり、場合により組織特異的である。別の実施態様において、抗体コード配列および任意の他の所望する配列が、ゲノム内の所望する部位での相同的組換えを促進する領域によってはさまれている核酸分子が使用され、従って、これにより、ゲノム内に組み込まれた核酸分子からの構築物の発現が規定される（KollerおよびSmithier、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1989、86:8932〜8935;Zijlstra他、Nature、1989、342:435〜438）。
【０１４８】
患者体内へのベクターの送達は、直接的（このような場合、患者はベクターまたは送達複合体に直接さらされる）または間接的（このような場合、細胞が最初にベクターにより試験管内で形質転換され、その後、患者に移植される）のいずれかである。これらの２つの方法は、それぞれ、生体内遺伝子治療および生体外遺伝子治療として知られている。
【０１４９】
特定の実施態様において、ベクターは生体内で直接投与され、この場合、ベクターは生物の細胞に進入し、構築物の発現を媒介する。これは、当該技術分野で既知の多数の方法のいずれかによって達成することができ、例えば、適切な発現ベクターの一部として構築物を構築し、発現ベクターを投与し、その結果、例えば、欠陥型または弱毒化されたレトロウイルスベクターもしくはウイルスベクターを使用して感染させることにより、構築物を細胞内に至らせること（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）によって、またはそのままのＤＮＡの直接的な注入によって、または微小粒子衝撃の使用（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって；脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤による被覆、バイオポリマーでのカプセル化（例えば、ポリβ１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン多糖；例えば、米国特許第５，６３５，４９３号を参照のこと）、リポソームでのカプセル化、微小粒子、またははマイクロカプセル；核に進入することが知られているペプチドまたは他のリガンドに連結して構築物を投与することによって；あるいは、受容体媒介によるエンドサイトーシスを受けるリガンドに連結して構築物を投与すること（例えば、WuおよびWu、J.Biol.Chem.、1987、62:4429〜4432を参照のこと）などによって達成することができる。別の実施態様では、リガンドが、エンドソームを破壊するために融合誘導性のウイルスペプチドを含む核酸／リガンドの複合体を形成させることができ、これにより、核酸がリソソームでの分解を回避することが可能になる。さらに別の実施態様では、核酸は、特異的な受容体を標的化することによって、細胞特異的な取り込みおよび発現のために生体内で標的化することができる（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１８０、同ＷＯ９２／２２６３５、同ＷＯ９２／２０３１６および同ＷＯ９３／１４１８８を参照のこと）。これらの方法は、「ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター」に関連して上記で議論された方法に加えてのものである。
【０１５０】
使用のために考えられる治療用核酸の形態および量は、疾患のタイプ、および所望する効果の度合い、患者状態などに依存しており、当業者によって決定され得る。
【０１５１】
本発明の構築物の治療的使用
本発明はまた、本発明の治療剤を投与することによって疾患を処置するための方法を提供する。このような治療剤には、本発明のペプチド構築物、および本発明の構築物をコードする核酸が含まれる。
【０１５２】
開示された組成物において、本発明のペプチド構築物、または本発明の構築物をコードする核酸は、免疫原有効量で存在する。それぞれの特異的な抗原について、免疫原有効量は、広く知られている様々な方法を使用して、（所与の患者および／または処置のタイプの具体的な特徴を考慮に入れて）実験により容易に決定される。一般には、この量は体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇの抗原の範囲である。
【０１５３】
本発明が適用可能である対象は任意の哺乳動物または脊椎動物である。このような動物種には、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えば、ニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、ラット、サル、ウサギ、チンパンジーおよびヒトが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、対象はヒトである。
【０１５４】
本発明の免疫原性強化方法は、様々なガンに対抗するために使用することができ、このようなガンには、限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸ガン、膵臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、リンパ腫、白血病、扁平上皮ガン、基底細胞ガン、腺ガン、肝細胞ガン、汗腺ガン、皮脂腺ガン、乳頭ガン、乳頭腺ガン、嚢腺ガン、髄様ガン、気管支原性ガン、腎細胞ガン、肝ガン、胆管ガン、絨毛ガン、精上皮腫、胎児性ガン、ウィルムス腫瘍、子宮頸ガン、精巣ガン、肺ガン、小細胞肺ガン、膀胱ガン、上皮ガン、神経膠腫、星状膠細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫が特に含まれる。
【０１５５】
本発明の方法はまた、感染症の処置において有用であり、このような感染症には、寄生虫感染症（例えば、マラリア原虫種などによって引き起こされる感染症）、ウイルス感染症（例えば、インフルエンザウイルス、白血病ウイルス、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶなど）、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、ポックスウイルス、ムンプスウイルス、サイトメガロウイルス［ＣＭＶ］、エプスタイン・バールウイルスなどによって引き起こされる感染症）、ＭＨＣクラスＩを伴う細菌感染症（例えば、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎双球菌、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、ボレリア属、シュードモナス属細菌、ミコバクテリウム属細菌、サルモネラ属などによって引き起こされる感染症）、および真菌感染症（例えば、カンジダ属、トリコフィトン属、プチロスポルム属などによって引き起こされる感染症）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５６】
本発明の方法はまた、自己免疫疾患の処置において有用であり、このような自己免疫疾患には、関節炎、潰瘍性大腸炎、喘息、多発硬化症、狼瘡および重症筋無力症のほとんどの形態が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
ガンの処置および予防
好ましい実施態様において、本発明は、ガンを処置または予防する方法を提供する。本発明の方法は、このような処置または予防を必要としている対象に、本発明のペプチド構築物、または本発明のペプチド構築物をコードする核酸を投与することを含む。
【０１５８】
ガンには、制御されない細胞成長によって特徴づけられる任意の疾患または障害が含まれ、この場合、腫瘍細胞は、ヒトガンに関連した免疫原性特性を有する本明細書中に記載されるような腫瘍関連抗原を発現しているが、このようなガンを、本発明の構築物を投与することによって処置または予防することができる。特定の治療剤が、特定のタイプのガンを処置または予防するために効果的であるかどうかは、当該技術分野で既知の任意の方法によって決定することができる。
【０１５９】
本発明の他の実施態様において、本発明の構築物で処置されている対象は、場合により他のガン処置で処置することができ、例えば、手術、放射線治療または化学療法などで処置することができる。特に、ガンを処置または予防するために使用される本発明の治療剤は、化学療法剤の１つまたは組合せと一緒に投与することができ、このような化学療法剤には、メトトレキサート、タキソール、タキソテレ、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシウレア、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア類、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン、エトポシド、カンパテシンス（ｃａｍｐａｔｈｅｃｉｎｓ）、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６０】
ワクチン配合物および投与
本発明はまた、本発明のペプチド構築物、または本発明のペプチド構築物をコードする核酸を含有するワクチン配合物を提供し、この場合、このようなワクチン配合物は、例えば、疾患の処置および予防のために、本明細書中に記載されるようなリガンドを有するガン細胞に対する保護免疫（体液性および／または細胞媒介型）応答を誘発させるための投与に好適である。
【０１６１】
本発明のペプチド構築物、または本発明のペプチド構築物をコードする核酸は、意図された使用に依存して変化し得る様々な配合物において使用することができる。
【０１６２】
本発明のペプチド構築物、または本発明のペプチド構築物をコードする核酸は、特定の目的に依存してその性質が変化し得る様々な他の分子に共有結合または非共有結合により連結（複合体化）することができる。例えば、本発明のペプチドは、高分子キャリアに共有結合または非共有結合により複合体化することができ、このような高分子キャリアには、天然ポリマーおよび合成ポリマー、タンパク質、多糖、ポリ（アミノ酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンならびに脂質が含まれるが、これらに限定されない。ペプチドは、リポソーム内への導入のために、脂肪酸にコンジュゲート化することができる（米国特許第５，８３７，２４９号）。本発明の合成されたペプチドは固体担体と共有結合または非共有結合により複合体化することができ、様々な固体担体が当該技術分野では既知である。本発明の合成された抗原性ペプチドエピトープは、より詳細には下記に記載されるように、共刺激分子を伴って、または共刺激分子を伴うことなく、抗原提示マトリックスと結合させることができる。
【０１６３】
タンパク質キャリアの例には、スーパー抗原、血清アルブミン、破傷風毒素、オバルブミン、チログロブリン、ミオグロブリンおよび免疫グロブリンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６４】
ペプチド−タンパク質キャリアのポリマーを、カルボジイミドなどの従来の架橋剤を使用して形成させることができる。カルボジイミドの例には、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、および１−エチル−３−（４−アゾニア−４４−ジメチルペンチル）カルボジイミドがある。
【０１６５】
他の好適な架橋剤の例には、臭化シアン、グルタルアルデヒドおよび無水コハク酸がある。一般には、多数のホモ二官能基剤はどれも、ホモ二官能基アルデヒド、ホモ二官能基エポキシド、ホモ二官能基イミドエステル、ホモ二官能基Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能基基マレイミド、ホモ二官能基アルキルハリド、ホモ二官能基ピリジルジスルフィド、ホモ二官能基アリールハリド、ホモ二官能基ヒドラジド、ホモ二官能基ジアゾニウム誘導体およびホモ二官能基光反応性化合物を含めて、使用することができる。ヘテロ二官能基化合物もまた含まれ、例えば、アミン反応基およびスルフヒドリル反応基を有する化合物、アミン反応基および光反応基を有する化合物、ならびに、カルボニル反応基およびスルフヒドリル反応基を有する化合物が含まれる。
【０１６６】
このようなホモ二官能基架橋剤の具体的な例には、下記の化合物が含まれる：二官能基Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、すなわち、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）、ジスクシンイミジルスベラートおよびジスクシンイミジルタルタラート；二官能基イミドエステル、すなわち、ジメチルアジピミダート、ジメチルピメリミダートおよびジメチルスベリミダート；二官能基スルフヒドリル反応性架橋剤、すなわち、１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン、ビスマレイイミドヘキサンおよびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン；二官能基アリールハリド、すなわち、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンおよび４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホン；二官能基光反応性剤、例えば、ビス［ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィドなど；二官能基アルデヒド、すなわち、ホルムアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびアジパルデヒド；二官能基エポキシド、例えば、１，４−ブタンオジオールジグリシジルエーテルなど；二官能基ヒドラジド、すなわち、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジドおよびコハク酸ジヒドラジド；二官能基ジアゾニウム、すなわち、ｏ−トリジン、ジアゾチゼドおよびビス−ジアゾチゼドベンジジン；二官能基アルキルハリド、すなわち、Ｎ１Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ１Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ１Ｎ’−ウンデカメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、ならびに、ベンジルハリド類およびハロマスタード、例えば、それぞれ、ａｌａ’−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸およびトリ（２−クロロエチル）アミン。
【０１６７】
ペプチドへのタンパク質のコンジュゲート化を行うために使用され得る他の一般的なヘテロ二官能基架橋剤の例には、限定されないが、下記の化合物が含まれる：ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート）、ＧＭＢＳ（Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＭＰＢＨ（４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）、Ｍ２Ｃ２Ｈ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド）、ＳＭＰＴ（スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルチオ）トルエン）、およびＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート）。
【０１６８】
架橋は、カルボニル基を還元的アミン化によりアミン基またはヒドラジド基にカップリングすることによって達成することができる。
【０１６９】
本発明のペプチド構築物はまた、イオン相互作用、吸着相互作用または生物特異的相互作用によるモノマーの非共有結合的結合として作製することができる。高度な正荷電または負荷電の分子とのペプチドの複合体を、低イオン強度の環境での塩架橋形成によって、例えば、脱イオン水における塩架橋形成によって作製することができる。大きな複合体を、荷電ポリマー、例えば、数多くの負荷電および正荷電をそれぞれ含有するポリ（Ｌ−グルタミン酸）またはポリ（Ｌ−リシン）を使用して作製することができる。ペプチドの吸着は、微小粒子ラテックスビーズなどの表面に対して、または、架橋タンパク質もしくは化学的に多量体化させたタンパク質を効果的に模倣する非共有結合的に会合したペプチド−スーパー抗原複合体を形成する他の疎水性ポリマーに対して行われ得る。最後に、ペプチドは、他の分子との間での生物特異的な相互作用の使用によって非共有結合的に連結することができる。例えば、アビジンまたはストレプトアビジンまたはそれらの誘導体などのタンパク質に対するビオチンの強い親和性の利用を、ペプチド複合体を形成させるために使用することができる。これらのビオチン結合タンパク質は、ビオチンと溶液中で相互作用することができるか、または別の分子に共有結合的に結合することができる結合部位を４つ含有する（Wilchek(1988)、Anal Biochem.、171:1〜32）。ペプチドは、タンパク質表面の利用可能なアミン基と反応する一般的なビオチン化試薬、例えば、Ｄ−ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ−ビオチン）などを使用してビオチン基を有するように改変することができる。ビオチン化されたペプチドは、その後、大きい複合体を作製するためにアビジンまたはストレプトアビジンとインキュベーションすることができる。このようなポリマーの分子量は、ビオチン化ペプチド対アビジンまたはストレプトアビジンのモル比を注意深く制御することによって調節することができる。
【０１７０】
本発明のペプチド構築物はまた、様々な液相キャリア、例えば、無菌溶液または水溶液、医薬的に許容されるキャリア、懸濁物およびエマルションなどと組み合わせることができる。非水性溶媒の例には、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコールおよび植物油が含まれる。抗体を調製するために使用されるとき、キャリアはまた、特異的な免疫応答を非特異的に増強するために有用であるアジュバントを含むことができる。当業者は、アジュバントが要求されるかどうかを容易に決定することができ、また、アジュバントを選択することができる。しかしながら、例示目的のためだけに、好適なアジュバントには、フロイントの完全アジュバントおよび不完全アジュバント、無機塩、ならびにポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７１】
このようなワクチンおよび治療剤の好適な調製物には、液体溶液もしくは液体懸濁物のいずれかとして注射可能な薬物が含まれる。注射前に液体に溶解または懸濁するために好適な固体形態もまた調製することができる。調製物はまた乳化することができ、または抗体の構築物をリポソームにカプセル化することができる。活性な免疫原性成分は、医薬的に受容可能であり、かつ有効成分と適合し得る賦形剤と混合されることが多い。好適な賦形剤は、例えば、水、生理的食塩水、緩衝化生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、無菌の等張性水性緩衝液またはその他、およびそれらの組合せである。さらに、所望する場合、ワクチン調製物はまた、少量の補助物質、例えば、湿潤化剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／または、ワクチンの有効性を高めるアジュバントを含むことができる。構築物は、ワクチンとして調製されたとき、例えば、ＰＧＬＡから調製されたマイクロスフェアまたはマイクロカプセルで導入することができる（米国特許第５，８１４，３４４号、同第５，１００，６６９号および同第４，８４９，２２２号；ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１１０１０および同ＷＯ９３／０７８６１を参照のこと）。
【０１７２】
アジュバントの有効性は、標的化された抗原に対する免疫応答の誘導を測定することによって決定することができる。
【０１７３】
組成物、ワクチンおよび治療剤は、液体溶液、懸濁物、エマルション、錠剤、ピル、カプセル、持続放出配合物または粉末剤にすることができる。経口投与の場合、治療剤は、例えば、医薬的に許容される賦形剤（例えば、結合剤（例えば、事前にゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはナトリウムデンプングリコラート）；または湿潤化剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）など）を用いて従来の手段によって調製される錠剤またはカプセルの形態を取ることができる。錠剤は、当該技術分野で広く知られている方法によってコーティングすることができる。経口投与される液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、エマルションまたは懸濁物の形態を取ることができ、あるいは、使用前に水または他の好適なべヒクルを用いて再構成される乾燥製造物として提供され得る。このような液体調製物は、医薬的に許容される添加物（例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性べヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画化された植物油）；および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸）など）を用いて従来の手段によって調製することができる。調製物はまた、緩衝剤塩類、矯味矯臭剤、着色剤および甘味剤を適するように含有することができる。
【０１７４】
一般に、各成分は別々に供給されるか、または、例えば、活性な薬剤の量を示す封じられた容器（例えば、バイアルまたは薬袋など）における乾燥凍結粉末または無水濃縮物として単位投薬形態で混合される。組成物が注射によって投与される場合、無菌希釈剤のアンプルを、成分が投与前に混合され得るように提供することができる。
【０１７５】
特定の実施態様において、本発明の凍結乾燥された構築物が第１の容器で提供され、第２の容器には、５０％グリセリン、０．２５％フェノールおよび防腐剤（例えば、０．００５％ブリリアントグリーン）の水溶液からなる希釈剤が含まれる。
【０１７６】
本発明はまた、本発明のワクチン配合物の成分の１つまたは複数で満たされた１つ以上の容器を含む医薬用のパックまたはキットを提供する。このような容器には、医薬品または生物学的製造物の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式での通知を伴わせることができ、この場合、このような通知は、ヒトへの投与に関する製造、使用または販売の当局による承認を反映している。
【０１７７】
多くの方法を、本発明のワクチン配合物を導入するために使用することができ、これらには、経口経路、脳内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、および乱切法（例えば、二叉ニードルを使用する、皮膚の上部層を貫通するスクラッチング）による経路、または免疫化の任意の他の標準的な経路が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
効果的な用量および安全性評価
本発明の方法によれば、本明細書中に記載された医薬組成物およびワクチン組成物は、好ましくは最小限の毒性を伴うが、免疫原有効用量で患者に投与される。「定義」と題された節で示されたように、開示された配合物の「免疫原有効用量」または「治療有効用量」は、処置されている対象において効果的な免疫応答を生じさせるために十分であり、従って、前記対象に対する健康上の利益をもたらすために十分である抗原含有組成物のこのような量を示す。
【０１７９】
当該技術分野で十分に確立されている方法論（例えば、生物学的評価センター、食品医薬品局およびアレルギー・感染性疾患研究所の間での共同作業でのいくつかのワクチン配合物の評価に関する報告書を参照のこと［Goldenthal他、全米共同ワクチン開発作業グループ、AIDS Res.Hum.Retroviruses、1993、9:545〜549］）に従って、本発明の化合物および組成物の有効用量および毒性が、これらの化合物および組成物が免疫原性であることが見出されている小動物モデル（例えば、マウス）であって、ヒトでの臨床試験のために提案された同じ経路によって再現可能に免疫化され得るこのような小動物モデルを使用して前臨床研究で最初に明らかにされる。
【０１８０】
特定の実施態様において、本発明の医薬組成物およびワクチン組成物に対するエピトープ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答の効率が酵素結合免疫スポット技術（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって決定される。ＥＬＩＳＰＯＴは、本発明者らおよび共同研究者によって最初に開発された当該技術分野での標準的な方法であり（Miyahira他、J.Immunol.Meth.、181:45〜54、1995)、他の研究者によって広く使用されている(例えば、Guelly他、Eur.J.Immunol.、32:182〜192、2002;NikitinaおよびGabrilovich、Int.J.Cancer、94:825〜833、2001;Field他、Immunol.Rev.、182:99〜112、2001;Altfeld他、J.Immunol.、167:2743〜2752、2001;Skoberne他、J.Immunol.、167:2209〜2218、2001を参照のこと）。この方法では、あるサイトカインの異なるエピトープに対する複数対の抗体が用いられ、抗原による試験管内刺激の後での個々のＴ細胞によるサイトカイン分泌の可視化が可能になる。ＥＬＩＳＰＯＴは、活性化／メモリーＴ細胞のみを検出するという利点を有しており、サイトカイン放出を１個の細胞レベルで検出することができ、これによりＴ細胞頻度の直接的な測定を可能にする（Czerkinsky他、J.Immunol.Methods、25:29、1988;Taguchi他、J.Immunol.Methods、128:65、1990）。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける固定化抗体によって捕捉されたサイトカインが、不溶性のペルオキシダーゼ基質を使用してその位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で検出される。従って、個々の細胞によるサイトカイン分泌が明瞭に可視化される。高感度および容易な実行は、事前の試験管内での拡大培養を用いることなくペプチド反応性Ｔ細胞の直接的な計数を可能にする一方で、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、Ｔ細胞応答、特に、頻度が非常に低いＣＤ８＋Ｔ細胞応答をモニターおよび測定するために著しく十分に適するようにする。代わりの実施態様によれば、本発明の医薬組成物およびワクチン組成物に対するエピトープ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答の効率は、当該技術分野で認められている他の免疫検出方法を使用して、例えば、ＥＬＩＳＡ（TanguayおよびKillion、Lymphokine Cytokine Res.、13:259、1994）および細胞内染色（CarterおよびSwain、Curr.Opin.Immunol.、9:1977、1997）などを使用して明らかにすることができる。
【０１８１】
本明細書中に開示されているように、本発明の方法において使用される任意の医薬組成物またはワクチン組成物について、治療有効用量は、ＩＣ50（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルから最初に見積もることができる。動物システムから得られた用量応答曲線が、その後、ヒトにおける最初の臨床研究に対する試験用量を決定するために使用される。各組成物について安全性を明らかにする場合、免疫化の用量および頻度は、臨床試験での使用のために予想される用量および頻度を満たすか、または上回らなければならない。
【０１８２】
本発明のペプチド構築物、本発明のペプチド構築物をコードする核酸、および本発明の組成物における他の構成成分の用量は、連続的または間断的に投与される用量が、試験動物における結果および患者の個々の状態を考慮してある量を超えないことを確保するために決定される。具体的な用量は、当然のことではあるが、投薬手法、患者または対象動物の状態（例えば、年齢、体重、性別、感受性、飼料、投薬期間、組合せで使用される薬物、疾患の重症度など）に依存して変化する。特定の条件のもとでの適切な用量および投薬回数は、上述の指針に基づく試験によって決定することができ、標準的な臨床技術に従う医師の判断および各患者の状況に従って決定されなければならない。これに関連して、抗原の用量は、一般には、体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲である。
【０１８３】
本発明の免疫原性組成物の毒性および治療効力は、実験動物における標準的な薬学的手法によって、例えば、ＬＤ50（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ50（集団の５０％において治療効果的な量）を決定することによって明らかにすることができる。毒性作用と治療作用との間の用量比は治療指数であり、これはＬＤ50／ＥＤ50の比として表すことができる。大きい治療指数を示す組成物が好ましい。毒性副作用を示す治療剤を、（例えば、ガンまたは命を脅かす感染症の重篤な形態を処置するときには）使用することができるが、このような免疫原性組成物を特定の部位（例えば、腫瘍、または感染性媒介因子の複製を助ける器官）に標的化する送達システムを、他の組織および器官に対する潜在的な損傷を最小限に抑え、それにより、副作用を減少させるために設計するように注意しなければならない。本明細書中に開示されているように、本発明の構築物は、比較的低い用量（例えば、体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００μｇ）で大きい免疫刺激を有するだけでなく、低い毒性をも有し、また、著しい副作用を生じさせない。
【０１８４】
上記で示されたように、動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用される投薬量の範囲を定める際に使用することができる。本発明の組成物の治療効果的な投薬量は、好ましくは、毒性をほとんど伴うことなくＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられた投薬形態および使用された投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。理想的には、単回服薬を使用することが望ましい。
【実施例】
【０１８５】
下記の実施例により、本発明が、その範囲を限定することなく例示される。
【０１８６】
実施例１：ＣＥＡ由来のアミノ酸配列を含有するエピトープ列の構築
ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）は、多くのタイプの腫瘍細胞により発現される腫瘍関連抗原である（Thomas他、Biochem.Biophys.Acta、1032:177〜79(1990)）。ＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＡ６２８３５）を下記に示す：
MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVIIRSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLLIAKIQPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATAGIMIGVLVGVALI
【０１８７】
ヒトＣＥＡのＣＴＬエピトープを含有するエピトープ列が、標準的なクローニング工程およびクローニング条件を用いて構築される。
【０１８８】
下記のＣＥＡエピトープがエピトープ列構築物に取り込まれる：
【表１】
2005536987.tif 000002
【０１８９】
これらのＣＥＡエピトープ配列は、その後、適切な隣接配列に連結され、得られたエピトープ列構築物が、熱ショックタンパク質に対する受容体（Ｂｉｎｄｅｒ他、Nature Immunol.、1:151〜55(2000)を参照のこと）であるＣＤ９１のαサブユニットのＮ末端のｐ８０フラグメントと相互作用するｇｐ９６配列を含む、ＣＤ９１のＡＰＣ標的化配列にＣ末端で連結される。
【０１９０】
最終的なエピトープ列構築物は下記の一般式によって表すことができる：
Ｎ−［Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｒｏ］［Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ］−［ＣＥＡエピトープ１］−［Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｒｏ］［Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ］−［ＣＥＡエピトープ２］−・・・−［ＣＥＡエピトープｎ］−［Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｒｏ］［Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ］−［ｇｐ９６由来のＣＤ９１標的化配列］−Ｃ
（式中、ｎはエピトープの数を表し、Ｘａａは任意のアミノ酸を表す）。
【０１９１】
本発明は、本明細書中に記載された特定の実施態様によって範囲が限定されることはない。実際には、本明細書中に記載された改変に加えて、本発明の様々な改変が、前記の説明および添付された図面から当業者には明らかになる。このような改変は、添付された請求項の範囲に含まれることが意図される。
【０１９２】
本明細書中に引用された特許、出願明細書、公開公報、試験方法、文献およびその他はすべて、参考のために本明細書により組み込まれる。