(57)【要約】選択されたイオン成分をサンプルから分離する方法であって、該サンプルにイオン性吸着剤を接触させる段階を含み、該成分が、前記吸着剤に競合的に結合する付加的イオン成分の非存在下では選択的に結合するような電荷密度を有している、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択されたイオン成分をサンプルから分離する方法であって、該サンプルをイオン性吸着剤に接触させる段階を含み、該成分が、前記吸着剤に競合的に結合する付加的イオン成分の非存在下では選択的に結合するような電荷密度を有していることを特徴とする、方法。
【請求項２】
吸着剤がカチオン性である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
吸着剤がスルホプロピル基を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
吸着剤の電荷密度が１０−１００μｍｏｌ／ｍｌである請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
サンプルが２種類のイオン成分を含み、吸着剤の電荷密度は２種類の成分の１種類だけが結合するように選択されている請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
選択されたイオン成分がタンパク質である請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質が免疫グロブリンである請求項５に記載の方法。
【請求項８】
サンプルがタンパク質に加えてプロテインＡを含む請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
更に、結合した成分を溶出させる段階を含む請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は吸着による分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の条件下では、イオン基を含有する吸着材料はネットでの正反対の電荷をもつ分子に結合できる。このようなプロセス、例えばクロマトグラフィーは、血液または発酵ブロスもしくは細胞培養ブロスのような複合混合物中の生体分子を精製及び分離するために実用化されている。
【０００３】
カラムクロマトグラフィーでは、“固定相”として作用する吸着材料を充填したカラムの頂部に分析すべき混合物を注入する。溶解した混合物を運搬する液体溶媒（“移動相”）は重力または圧力によってカラムを流下する。混合物中の種々の化合物は移動相及び固定相と異なるイオン性相互作用を生じるので、移動相に沿って異なる程度まで運搬され、その結果として分離が生じる。次いで、通常は塩勾配を作用させることによって、結合成分を取り出して分離する。
【０００４】
このようなプロセスでは、正確な分離条件が典型的には試行錯誤によって決定される。吸着剤の処理選択性は、混合物が通過するときに吸着剤に結合する分子の数に関係する。標準条件下では一般に低特異性である。ｐＨまたはイオン強度を変化させると、混合物の個々の成分と吸着剤との間の相互作用に変化が生じる。所望の成分が吸着されるが、吸着剤上の利用可能な結合部位には溶媒分子または付加的成分が競合するようにイオン強度を変化させ、このようにして不要な成分の結合を防止することもできる。選択性はまた、吸着剤の物理的構造、例えば、細孔のサイズ分布または非誘導体化吸着剤の化学的性質次第で変化する。
【０００５】
吸着剤の“処理容量”（動的交換容量）という用語は、吸着剤に結合して保持される特定成分の量を意味する。処理容量は特に、吸着剤の電荷密度、リガンドの種類及び細孔のサイズ分布に左右される。
【０００６】
Ｃｈａｎｇｅら〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，８２７（１９９８），２８１−２９３〕は、吸着剤のタンパク質吸着容量が接近可能な表面積と強い相関関係を有しており、固有の吸着親和性との相関関係はより弱いことを示唆している。この著者は、取り込み動態が平均細孔サイズによって大きく影響されると述べているが、細孔連結性及び吸着親和性のような別の構造的パラメーターが何らかの役割を果たすことも認めている。
【０００７】
ＤｅＰｈｉｌｌｉｐｓら〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，９３３（２００１），５７−７２〕は、閾値量を上回る場合には、電荷密度及びイオン容量の増加が必ずしもタンパク質保持量の増加という結果を生じないと報告している。ＤｅＰｈｉｌｌｉｐｓらは、高い電荷密度が比較的に重要でないと主張しており、より低い電荷密度のリガンドを最適に配向及び配置することによって等価の容量が得られると提唱している。提示されたデータは最適なイオン強度を得るために追加の塩を使用した実験に基づく。
【０００８】
要約すると、この分野の研究は長年にわたって、競合性塩を付加的に使用したときには、吸着剤の電荷密度の増加が容量をある程度まで増加させると示唆してきた。
【０００９】
分析用クロマトグラフィーと生産規模のクロマトグラフィーとの特に顕著な違いは、測定する性能が違うことにある。分析用分離の場合に最も重要な要件は分析が速いことである。この要件はしばしば非多孔性の小さい固定相粒子を使用することによって満たされる。大規模クロマトグラフィー処理の場合、典型的な性能判断要因は容量、回収率及びスループットである。最適性能はスループットと選択性及び回収率とを折り合わせることによって得られる。現状では、高い電荷密度をもつ吸着剤を使用し、追加の塩またはバッファを移動相に組み込むことによって望ましい処理容量が得られている。上述のように、追加の塩（例えば、ＮａＣｌ）の存在は固定相と移動相との間の相互作用の強度を弱めるので、特定成分の特異的結合が可能になる。
【００１０】
現行の方法には多くの制限がある。その一つはコストである。生体分子の製造において重視される要因は原料のコストである。生体分子をｐＨ変化に対して安定させ不溶化（沈降）傾向を抑制するために緩衝溶液が必要である。このような理由から、供給溶液中のバッファ／塩成分の濃度は最低値に維持されており、安定化を要する生体分子次第で通常は１０−１００ｍＭの範囲である。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、吸着剤の結合表面の電荷密度を変更することによって、サンプル中で高い電荷密度の吸着剤及び追加の塩を併用するよりも、望ましい処理容量が得られるという認識に基づく。例えば、ＤｅＰｈｉｌｌｉｐｓらは、電荷密度及びイオン容量の増加が必ずしもタンパク質保持量の増加という結果をもたらさないと報告しているが、該文献では、提示されたデータに基づいて電荷密度を保持変数として系統的に処理していない。
【００１２】
本発明によれば、選択されたイオン成分をサンプルから分離する方法は、該サンプルをイオン性吸着剤に接触させる段階を含み、該成分が、前記吸着剤に競合的に結合する付加的イオン成分の非存在下では選択的に結合するような電荷密度を有している。吸着剤の電荷密度は好ましくは１０−１００μｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは２０−９０μｍｏｌ／ｍｌ、最も好ましくは３０−８０μｍｏｌ／ｍｌである。好ましい実施態様では、吸着材料はカチオン性であり、該材料は好ましくは、適当な基質例えばアガロースまたはセファロースに支持されたスルホプロピル基を含む。
【００１３】
本発明は、別の成分が結合できないほど別の成分との相互作用が弱いならば電荷密度は一種類のイオン成分だけに結合できる低い値で十分であるという知見を利用している。このように大量の追加の塩の使用がもはや不要なので、比較的低いコストで高い選択性及び容量を得ることができる。
【００１４】
吸着剤表面に最適な電荷密度を与えることによって、本発明は高度に選択的な分離方法を提供する。本発明の方法は、吸着剤に結合した競合性分子の量を顕著に減少させ、これによって典型的なｐＨ及びイオン強度の範囲内で処理容量の増加を達成し得る。
【００１５】
本発明は、サンプル中に競合性イオン成分（例えば、塩）を含有させる必要性を排除する。１つのイオン強度範囲で対象イオン成分の選択的結合に適した所定の電荷密度の吸着剤を使用することによって選択性を得ることができる。従って、前処理を全く要せずにサンプルを直接的に吸着剤に接触させ得る。
【００１６】
好ましい実施態様の説明
本発明はイオン性高分子化合物の分離に使用し得る。より特定的には本発明は、血液及び細胞培養ブロスのような複合混合物中に見出される生体分子を分離するために使用され得る。本発明の方法は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生に使用され得る。抗体産生には一般に、プロテインＡ精製のようなタンパク質特異的精製段階が必要なためである。
【００１７】
本発明の方法に使用される吸着剤は、液相とイオン性相互作用することが可能である場合によっては誘導体化された固相または不溶性化合物である。吸着剤は、セラミック、合成または天然の高分子材料またはそれらの混合物を含む。例えば、吸着剤は、固相に化学的または物理的に付着したデキストランまたはその他の天然ポリマーを含み得る。
【００１８】
適当な電荷密度をもつ吸着剤の選択は当業界で公知の適当な方法または技術のいずれかを使用して行うことができる。正確な値は平均的な当業者に公知の要因に左右されるであろう。一つの要因は結合すべき材料及び／または結合してはならない材料の種類である。別の要因は、吸着剤の電荷成分の性質であり、これに関しては多様な性質を使用し得る。
【００１９】
選択性は、対象成分だけが吸着剤に結合するような十分に低いイオン電荷密度を有している吸着剤を使用することによって得られる。この一例は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）とプロテインＡとの混合物の分離である。１４０μｍｏｌ／ｍｌよりも大きいイオン（カチオン）強度を有しているスルホプロピル基はタンパク質及びＩｇＧ−プロテインＡ複合体の両方に結合する。約７５μｍｏｌ／ｍｌというもっと弱い電荷密度を有しているスルホプロピル基はＩｇＧ選択性であり、その結果として、溶出後にプロテインＡは未結合画分中に検出され、ＩｇＧは結合画分中に検出される。
【００２０】
当業界で公知の適当な装置、例えばイオン交換カラムを使用して分離を行うことができる。溶出も公知の手順によって行うことができる。
【００２１】
種々の分離画分を分析するためには、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、特にドデシル硫酸ナトリウムを用いる技術（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用するとよい。
【００２２】
以下の実施例は本発明を添付図面に基づいて説明する。
【実施例１】
【００２３】
免疫グロブリンとプロテインＡの分離
アガロースビーズを製造し、架橋させ、種々の電荷密度のスルホプロピル（ＳＰ）基で化学的に誘導体化した。比較のために、市販のＳＰ吸着剤、ＳＰセファロースも使用した。
【００２４】
免疫グロブリンＧとプロテインＡとを１０：１（ｗ／ｗ）の割合でｐＨ４．０−５．５及び導電率２−６ｍＳｉ／ｃｍの緩衝溶液中で混合した。３種類の異なるＳＰに基づくカチオン交換吸着剤について結合選択性を分析した。これらは、７５μｍｏｌ／ｍｌのＳＰアガロースカチオン基、１４０μｍｏｌ／ｍｌのＳＰアガロースカチオン基及び２００−２５０μｍｏｌ／ｍｌのカチオン基を含有するＳＰセファロースを含有していた。
【００２５】
１カラム量のタンパク質混合物を、バッファで平衡したＳＰ吸着剤充填カラムに１００−３００ｃｍ／時の流速で導入した。次にカラムを緩衝溶液で洗浄して未結合のタンパク質を除去し、漸増する導電率の塩勾配をカラムに加えてイオン結合タンパク質を溶出させた。
【００２６】
オンラインデテクタを使用してカラム溶出液の２２０ｎｍの吸光度を分析した。上記に定義の範囲内の種々のｐＨ及び導電率の値を使用した。毎回のカラム処理で得られた未結合画分と結合して溶出した画分とを保存し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してタンパク質含量を分析した。
【００２７】
結果を図１に示す。１４０μｍｏｌ／ｍｌを上回るカチオン基を有しているＳＰ吸着剤は全部のタンパク質成分、即ち、ＩｇＧ、プロテインＡ及びＩｇＧとプロテインＡとの複合体に結合していた。しかしながら、７５μｍｏｌ／ｍｌの濃度でしかない吸着剤（点線）は、未結合画分中にかなりの量のタンパク質を示す。この未結合タンパク質画分は約９０％のプロテインＡと１０％のＩｇＧから成ることが判明した。溶出するタンパク質画分は９８％のＩｇＧと２％のプロテインＡとを含有することが判明した。低い電荷密度のカチオン性吸着剤がプロテインＡに結合しなかったことが明らかである。
【実施例２】
【００２８】
酸性チーズホエータンパク質の分離
脱脂乳からチーズホエーを採取し、希リン酸でｐＨを４．３に調整した。１カラム量のタンパク質混合物を実施例１に記載の３種類のＳＰカチオン性吸着剤に加えて、種々のタンパク質を分離した。タンパク質をｐＨ４．３のバッファ溶液でカラムから洗浄した。漸増濃度の塩化ナトリウム勾配（０−１Ｍ）を使用してタンパク質を各吸着カラムから溶出させた。塩勾配は各吸着カラムに沿って１２−５０ｍｌの溶出量範囲で使用した。各カラムの溶出液の２８０ｎｍの吸光度をオンラインデテクタで分析した。
【００２９】
図２は、３種類の異なるカチオン性吸着剤を使用し、結合及び溶出勾配の条件を同じにして行った３つの溶出プロフィル（２８０ｎｍの光学密度対溶出量）を示す。３種類のカチオン性吸着剤は異なるイオン電荷密度を有していた。光学密度を追跡すると、酸性のホエータンパク質が各吸着剤にどのように結合しどのように溶出したかが示される。
【００３０】
１００μｍｏｌ／ｍｌを上回るイオン電荷密度を有している吸着剤の吸光度プロフィルは、明らかなピークに分離した２種類のタンパク質を示す。１００μｍｏｌ／ｍｌよりも小さいイオン電荷密度を有している吸着剤はより選択的に１種類のみのタンパク質に結合して溶出させる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＩｇＧとプロテインＡとの分離に使用される種々の電荷密度の３種類の吸着剤の溶出プロフィルを示すグラフである。
【図２】溶出プロフィルが酸性チーズホエータンパク質の分離を表すことを除き、第１図同様のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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