(57)【要約】目的とする形質を発現するトランスジェニック多細胞植物又はその一部を生成し、前記形質は子孫への前記形質の分配が制御されている方法であって、その際前記方法は（ｉ）核染色体の第１座位中に前記目的とする形質をコードするヌクレオチド配列の第１断片を含む第１異種ヌクレオチド配列を有する第１植物又はその細胞を生成するステップ、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核染色体に相同する核染色体の第２座位中に前記目的とする形質をコードするヌクレオチド配列の第２断片を含む第２異種ヌクレオチド配列を有する第２植物又はその細胞を生成するステップ、及び（ｉｉｉ）前記第１植物及び前記第２植物或いはその細胞をハイブリッド形成して、前記第１異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドと、前記第２異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドとを結合することにより前記当該機能形質を示す子孫を発生させるステップを含む。さらに、本発明は、農業用ハイブリッド種子の生成方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とする形質を発現し、前記形質は子孫への前記形質の分配が制御されている、トランスジェニック多細胞植物又はその部分の生成方法であって、前記方法は、
（ｉ）核染色体の第１座位中に前記目的とする形質をコードするヌクレオチド配列の第１断片を含む第１異種ヌクレオチド配列を有する第１植物又はその細胞を生成するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核染色体に相同する核染色体の第２座位中に前記目的とする形質をコードするヌクレオチド配列の第２断片を含む第２異種ヌクレオチド配列を有する第２植物又はその細胞を生成するステップ、及び
（ｉｉｉ）前記第１植物及び前記第２植物或いはその細胞をハイブリッド形成して、前記第１異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドと、前記第２異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドとを結合することにより前記当該機能形質を示す子孫を発生させるステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
前記多細胞植物体又は前記部分が、２つの目的とする形質、形質（１）及び形質（２）を発現し、両形質は子孫への分配が制御されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ｉ’）ステップ（ｉ）の前記第１異種ヌクレオチド配列は、
形質（１）をコードするヌクレオチド配列の第１断片、及び
形質（２）をコードするヌクレオチド配列の第１断片を含み、且つ
（ｉｉ’）ステップ（ｉｉ）の前記第２異種ヌクレオチド配列は、
形質（１）をコードするヌクレオチド配列の第２断片、及び
形質（２）をコードするヌクレオチド配列の第２断片を含み、且つ
（ｉｉｉ’）ステップ（ｉｉｉ）は、前記第１植物及び前記第２植物或いはその細胞をハイブリッド形成して、形質（１）及び形質（２）を示す子孫を発生させるステップを含み、前記第１異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドと、前記第２異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドとを結合させることによって形質（１）が示される、
請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第１異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドと、前記第２異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドとを結合させることによって、ステップ（ｉｉｉ’）で発生する子孫が形質（２）を示す、請求項３記載の方法。
【請求項５】
インテイン媒介トランススプライシングによって前記子孫が、形質（１）及び／又は形質（２）を示す、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１異種ヌクレオチド配列によってコードされているＲＮＡ発現産物と、前記第２異種ヌクレオチド配列によってコードされているＲＮＡ発現産物とのＲＮＡトランススプライシングによって形質（１）及び／又は形質（２）が示される、請求項２記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｉｉｉ）が、前記形質（１）及び前記形質（２）を示す子孫を選択することを伴う、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
形質（１）が、除草剤耐性である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｉｉｉ）が、前記子孫に除草剤を適用することによって前記形質（２）を示す子孫を選択することを伴い、前記形質（１）が前記除草剤に対する耐性を付与する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
形質（２）が、雄性又は雌性不稔である、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉｉｉ）が、前記子孫に除草剤を適用することによって、前記形質（２）として雄性不稔を示す子孫を選択することを伴い、前記形質（１）が前記除草剤に対する耐性を付与する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
トランススプライシングによってステップ（ｉｉｉ）で２つ以上の形質が組入れられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉ）が、予め設計した組込み部位中への部位標的組込み又は相同組換えによって、植物又は植物細胞の核染色体の前記第１座位中に前記第１異種ヌクレオチド配列を導入するステップを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｉｉ）が、予め設計した組込み部位中への部位標的組込み又は相同組換えによって、植物又は植物細胞の核染色体の前記第２座位中に前記第２異種ヌクレオチド配列を導入するステップを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）が、
（ａ）前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列を含む親異種ヌクレオチド配列を、親生物又はその細胞の核染色体中に導入するステップ、
（ｂ）場合によっては、前記親異種ヌクレオチド配列を所望する染色体又は染色体座位中に組込ませた生物又はその細胞を選択するステップ、
（ｃ）続いて、前記親異種ヌクレオチド配列を分割し、その結果前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列は異なる植物体又は細胞中の相同染色体上に位置するステップ、
によって実施される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）が、前記親異種ヌクレオチド配列を核染色体の所定の座位中へ相同組換え又は部位標的組込みすることによって実施される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）又は（ｂ）の後に、前記親ヌクレオチド配列に関してホモ接合である生物又はその細胞を生成するステップが続く、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）又はステップ（ｂ）で得られた前記生物体が、前記親ヌクレオチド配列に関してヘテロ接合である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）が、前記親異種ヌクレオチド配列から前記第２異種ヌクレオチド配列を切取るステップを含み、場合によっては、その後前記親異種ヌクレオチド配列の染色体に対して相同である染色体の座位中へ前記切取った第２異種ヌクレオチド配列を再組込みするステップが続く、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｃ）が、前記親異種ヌクレオチド配列から前記第１異種ヌクレオチド配列を切取るステップを含み、場合によっては、その後前記親異種ヌクレオチド配列の染色体に対して相同である染色体座位中へ前記切取った第１異種ヌクレオチド配列を再組込みするステップが続く、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１９又は２０において得られた植物又はその細胞或いはその子孫を、前記切取った異種ヌクレオチド配列の再組込みについて分析し、且つ前記切取った異種ヌクレオチド配列を含まない植物又はその細胞、或いは切取られていない異種ヌクレオチド配列を収容する染色体に相同な染色体の所望の座位に前記異種ヌクレオチド配列を含む植物又はその細胞を選択する、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記親異種ヌクレオチド配列中の前記第１及び／又は前記第２異種ヌクレオチド配列が、非自律的トランスポゾン中に含まれ、且つ前記切取りが前記トランスポゾン用のトランスポザーゼを提供することを含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
（Ａ）前記親異種ヌクレオチド配列中の前記第１異種ヌクレオチド配列が、第１非自律的トランスポゾン中に含まれ、且つ前記第２異種ヌクレオチド配列が、第２非自律的トランスポゾン中に含まれ、且つ
（Ｂ）前記第１非自律的トランスポゾンの許で機能する第１トランスポザーゼを得ることによって前記第１異種ヌクレオチド配列を切取り、且つ前記第２非自律的トランスポゾンの許で機能する第２トランポザーゼを得ることによって前記第２異種ヌクレオチド配列を切取る、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記第１又は前記第２異種ヌクレオチド配列の切取りによって、それぞれ前記第２又は前記第１非自律的トランスポゾンの撹乱がもたらされる結果となるように、前記親異種ヌクレオチド配列中の前記第１及び前記第２トランスポゾンが重複する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記親異種ヌクレオチド配列中の前記第１異種ヌクレオチド配列が両側に第１部位特異的リコンビナーゼの組換え部位を置き、且つ前記親異種ヌクレオチド配列中の前記第２異種ヌクレオチド配列が両側に第２部位特異的リコンビナーゼの組換え部位を置く、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１部位特異的リコンビナーゼが、前記第２部位特異的リコンビナーゼと異なる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記親異種ヌクレオチド配列のセグメント１及びセグメント２が重複し、それによってセグメント１は、前記第１部位特異的リコンビナーゼで機能する組換え部位を両側に置く前記第１異種ヌクレオチド配列を含み、且つセグメント２は、前記第２部位特異的リコンビナーゼで機能する組換え部位を両側に置く前記第２異種ヌクレオチド配列を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記親異種ヌクレオチド配列中の前記第１異種ヌクレオチド配列が両側に部位特異的インテグラーゼの異なる組換え部位を置き、前記親異種ヌクレオチド配列中の前記第２異種ヌクレオチド配列が両側に同じ部位特異的インテグラーゼの異なる組換え部位を置き、且つステップ（ｃ）が、
前記親生物又はその細胞に前記部位特異的インテグラーゼを提供するステップ、
前記第１異種ヌクレオチド配列を含むが前記第２異種ヌクレオチド配列を含まない前記親生物又はその細胞の子孫を選択するステップ、及び
前記第２異種ヌクレオチド配列を含むが前記第１異種ヌクレオチド配列を含まない前記親生物又はその細胞の子孫を選択するステップ、
によって実施される、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記トランスポザーゼ、前記部位特異的リコンビナーゼ、及び前記部位特異的インテグラーゼが、前記トランスポザーゼ又は前記リコンビナーゼをコードする遺伝子を含む植物又は植物細胞とハイブリッド形成又は交配することによって、或いは前記トランスポザーゼ又は前記リコンビナーゼをコードする遺伝子を用いるアグロバクテリウム媒介形質転換、ウイルス形質移入、パーティクルボンバードメント、電気穿孔法又はＰＥＧ媒介形質転換によって提供される、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
それによって交差乗り換えが行われる確率を減少させるために前記第１及び前記第２座位を選択する請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１及び前記第２座位が、前記相同染色体上で相応する座位である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記第１植物及び前記第２植物或いはその細胞が、前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列に関してホモ接合になされている、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記蛋白質又はポリペプチドの前記結合後に前記蛋白質又はポリペプチド間でペプチド結合の形成が続く請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記結合及び前記ペプチド結合の形成が、インテイン媒介トランススプライシングである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記トランスジェニック多細胞植物体と前記第１及び前記第２異種配列を欠く生物体との交配によって、子孫生物での前記形質の出現頻度が１％未満であり、０．１％未満が好ましく、０．０１％未満がより好ましく、０．００１未満％が最も好ましいことを前記制御された分配が意味する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記トランスジェニック多細胞植物体が、前記第１又は前記第２異種ヌクレオチド配列の不在下では前記目的とする形質を発現できない、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記結合及び／又は前記ペプチド結合の形成に必要な機能を提供するために、さらに前記多細胞植物を遺伝的に又は一過的に改変した、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１及び／又は前記第２異種ヌクレオチド配列が、前記第１又は前記第２異種ヌクレオチド配列転写産生物のＲＮＡシススプライシング用イントロンを含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記目的とする形質が、雄性又は雌性不稔に関与する、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記形質が、除草剤耐性、殺虫剤耐性、選択マーカー、逆選択マーカー、転写因子、ＤＮＡ又はＲＮＡ改変酵素、当該蛋白質の産生の群から選択される、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記多細胞植物体が、子孫を産生することができる、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記結合及び／又は前記ペプチド結合の形成が、それに結合するポリペプチドを有する蛋白質を生成させ、前記ポリペプチドが、シグナルポリペプチド、標的ポリペプチド、膜形質導入ポリペプチド、結合領域、認識又は可視化タグ、精製タグ、蛋白質切断配列の群から選択される、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記目的とする形質をコードする前記遺伝子の前記第２及び／又は前記第１断片が、調節したプロモーターに動作可能に結合されている、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記目的とする形質をコードする前記遺伝子の前記第１又は前記第２断片が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードし、前記第１又は第２断片転写物の翻訳を可能にする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１〜４４のいずれか一項にしたがって得られた、又は得ることができる目的とする形質を発現する植物、種子、又は植物細胞、及びそれに由来する産生物。
【請求項４６】
請求項２〜４４のいずれか一項にしたがってトランスジェニック多細胞植物を生成するステップを含む、ハイブリッド種子の生成方法。
【請求項４７】
さらに、前記トランスジェニック多細胞植物体を雄性稔性である別の植物と交配するステップを含む、請求項４６記載のハイブリッド種子の生成方法。
【請求項４８】
形質（１）が除草剤耐性であり、且つ形質（２）が雄性不稔である、請求項４６又は４７に記載のハイブリッド種子の生成方法。
【請求項４９】
前記ハイブリッド種子から生育した植物の子孫種子が子葉期に到達しない、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ハイブリッド種子から生育した植物の子孫種子が発芽しない、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
それによって、前記トランスジェニック多細胞植物体及び／又は前記他の植物が、前記ハイブリッド種子から生長した植物中で発現できるようになった発現不能種子発芽制御遺伝子を含む、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の方法にしたがって得られた、又は得ることができるハイブリッド種子、及びその種子から生長した植物。
【請求項５３】
前記植物の子孫が、生存不能である請求項５２記載のハイブリッド種子から生長した植物。
【請求項５４】
前記植物の子孫種子が発芽しない、請求項５３記載の植物。
【請求項５５】
活性化蛋白質の発現によって活性化し得る不活性種子の発芽制御遺伝子を含む、請求項５３又は５４に記載の植物。
【請求項５６】
当該蛋白質、特に薬剤蛋白質を発現させるための、請求項５２〜５５のいずれか一項によるハイブリッド種子又は植物の使用。
【請求項５７】
請求項１〜４４のいずれか一項のステップ（ｉ）又はステップ（ｉｉ）にしたがって得られた、又は得ることができる植物又は種子又はその細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリッド種子の生成方法に関する。さらに、本発明は、目的とする形質を発現し、子孫又は他の生物への前記形質の分配が制御されている、トランスジェニック多細胞植物体の生成方法に関する。さらに、本発明は、２つの目的とする形質を発現するトランスジェニック多細胞植物体を生成し、前記形質は子孫への分配が制御されている方法に関する。前記形質の１つは、雄性不稔であることが好ましい。さらに、本発明は、ハイブリッド種子、特に農業用種子の生成方法に関する。さらに、本発明は、形質を発現し、前記形質の子孫への分配が制御されている、すなわち、特に他家受粉によって、前記形質が不当な子孫に伝達される確率が非常に低い植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子操作作物種の商業用途は、導入遺伝子及び導入遺伝子によってコードされている形質を遺伝子改変植物（ＧＭ植物）から在来種、野生近縁種、又は他の非ＧＭ植物品種、或いは関連作物種へ伝達させる恐れがあるという懸念をもたらしてきた（Ｅｌｌｓｔｒａｎｄ、Ｎ．Ｃ．、２００１年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２５号、１５４３〜１５４５頁、Ｑｕｉｓｔ及びＣｈａｐｅｌａ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、４１４号、５４１〜５４３頁）。それは、影響を受けた生態系の生態的調和を変化させ、又は他の、何よりも社会経済問題を招く恐れがある。加えて、導入遺伝子、特に形質転換マーカーとして使用される抗生物質耐性遺伝子が周囲の微生物中に逸出、いわゆる水平伝達し（Ｃｈｉｔｅｒら、２０００年ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４８１号、１６４〜１６８頁）、それによって望ましくない方式で微小植物相を変化させ得るというある種の不安が存在する。
【０００３】
こうした懸念の多くは、科学的には十分に納得のいく説明がなされていないが（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ、Ｐ．、２００２年、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．、１１号、ｉｉｉ−ｖ）、安全で制御された導入遺伝子管理系の作出は非常に望ましい。それは将来的な禍根を未然に防ぐであろうし、最も効率的な方式で現存植物種の生殖質の保護に役立つからである。さらに、トランスジェニック栽培品種による有機栽培作物又は非ＧＭ作物の汚染によって生じる問題もある。これは、トランスジェニック作物及び非トランスジェニック作物の売買における深刻な衝撃であり、生産者が無視できない問題である。
【０００４】
ヒトによって生産された他の産物とは異なり、生物工学によって作出された生成物は潜在的に自己複製機である。したがって、現在の技術によって作出され環境へ放出されたどんなトランスジェニック材料も非常に長い時間そこに存続する可能性がある。植物遺伝子工学の慣行は、当該遺伝子の連続的コード配列を含む、発現カセット及びベクターの使用に基づく。このような発現カセットを宿主染色体中に組込み、ＧＭ植物と別の生物体の間でハイブリッド形成又は別の遺伝情報交換を行うと、正当又は不当に関わらず、発現カセットは機能性転写単位として子孫又は別の受容体に伝達される確率が高い。
【０００５】
ＷＯ００／５２１４６号は、１個又は複数の遺伝子を２個以上の断片に分割し、親生物の交配後にトランススプライシングによって断片を再結合することによって、目的とする形質をコード化する概念について述べており、ここで親生物は前記断片を提供する。ＷＯ００／５２１４６号は概念を超えていない。それは、こうした着想をいかにして実行に移すことができるかについての実用的開示を含んでいない。特に、それは実施例を含んでいない。ＷＯ００／７１７０１号は、前記蛋白質をコードする導入遺伝子の封じ込めを改善するためのインテイン媒介蛋白質トランススプライシング／相互作用による機能性蛋白質の組入れついて述べている。ＷＯ００／７１７０１号は、親生物の交配による蛋白質断片の接合について述べていない。さらに、ＷＯ００／７１７０１号による導入遺伝子伝達の頻度は、特に導入遺伝子が選択的利点を提供するときは農業のような大規模適用に十分なほど低くない。
【０００６】
ＷＯ０１１６２８７号は、導入遺伝子が別個の配偶子に分離することを目的に、その発現が表現型を決定する導入遺伝子用の対立形質の位置の作出に関する。この特許出願は、導入遺伝子の動きの制御問題については対処せずに、少なくとも２個の導入遺伝子によってコードされる形質の発生、具体的には雄性不稔について対処する。さらに、これはインテイン媒介トランススプライシングについて述べていない。さらに、この出願は、２個以上の断片での形質コード遺伝子の分割による形質の動きの制御については述べていない。
【０００７】
前記形質の望ましくない伝達を最も厳重に制御するために、実際上最も実施可能な方式でのコード断片の最適な位置を実現する方法を知らなくては、形質をコードする部分からの形質の組入れには余り有用性がない。農業目的のような大規模適用には、生物学的安全は導入遺伝子の望ましくない伝達を事実上頻度ゼロにまで減少させることを求める。
【０００８】
ハイブリッド種子の生成には目的とする形質として雄性又は雌性不稔を発現する作物植物が広く使用されている。ハイブリッド作物は、近交系品種よりも平均２０％収量が多くハイブリッド種子の生成は大産業である。ハイブリッド種子を生成するために多くの異なる技術が使用されている（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｒａｔ  Ｅ．及びｖａｎ  Ｌｏｏｋｅｒｅｎ  Ｃａｍｐａｇｎｅ、ＭＭ、２００２年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、７号、１９９〜２０２頁を参照のこと）。こうした技術は、条件付きで受粉制御機構（機械的、化学的、遺伝子的、及びトランスジェニック的）により少なくとも４群に分けることができる。しかしながら、これらの技術全てにおいて１つの重要な要件が共通している。理想的には、ハイブリッド形成法には１００％雄性不稔系統を使用すべきであり、Ｆ１子孫では１００％の雄性稔性の回復が実現されなければならない。自家受粉種子での汚染が皆無なハイブリッド種子の生成にはこのような厳格な要件が無条件に必要とされる。
【０００９】
現在のハイブリッド種子の生成方法は上記の点で満足のいくものではない。これらの方法は、トウモロコシの雄花の穂の機械的な摘花（除雄）の場合と同様に高価であり、又は遺伝子的手法の場合と同様に「漏出しやすく」、或いは化学的処理に基づく方法の場合と同様に高価で漏出しやすい（たとえば米国特許第４５６９６８８号）。
【００１０】
遺伝子的手法は、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）突然変異体及び稔性回復体を有する系統の使用（たとえばＷＯ０２０９８２０９号）を含むことが好ましい。トランスジェニック手法は、遺伝子操作した核雄性不稔（ＮＭＳ）又はＣＭＳである植物を主に使用しＦ１子孫では稔性回復される（ＷＯ８９１０３９６号、米国特許第５５３０１９１号、同第６２５５５６４号、ＷＯ９８３２３２５号、ＷＯ９２０１７９９号、米国特許第６３９２１１９号、ＷＯ０１１６２８７号）。これらの手法は、雄性不稔系統の伝播及び維持のためにいわゆる維持系統の使用も必要とする。
【００１１】
雄性不稔を提供する１個の導入遺伝子、及び雄性稔性を回復する機能を所持する別の導入遺伝子をもとに築かれたトランスジェニック系（たとえば米国特許第６２５５５６４０）は、ハイブリッド子孫での雄性稔性の完全な回復を保証しないばかりか、前記子孫の全健康状態に及ぼす雄性不稔を準備する導入遺伝子の潜在的な悪影響の完全な除去も保証していない。すなわち、これらの系は漏出しやすい。さらに、上記した系のどれも雄性不稔系統を生成し維持することに好都合な方式を提供しない。これは、ハイブリッド種子生成用のどんな遺伝子操作系にも重要な要素であり、大規模生産用にそのような系を首尾よく適用することは、雄性不稔雌親系統を経済的及び効率的な方式で繁殖させることができるかどうかに左右される。すなわち、現在、原系統の維持、ハイブリッド形成法、ハイブリッド子孫での雄性稔性の回復に必要な要件全てを組込み、同時に高い生物学的安全パラメータを有する広く普及し確実で経済的なハイブリッド種子生成用の系、たとえば、導入遺伝子分離に対して厳重な制御を準備する系は存在しない。現存の遺伝子的手法／トランスジェニック手法を使用するハイブリッド種子生成の一般的スキームを図１２に示す。
【００１２】
本発明で本発明者らは、理想的なハイブリッド形成系の要件に適合するために必要な特徴全てを備える新規なハイブリッド種子生成法（図１３）を説明する。本発明のハイブリッド種子生成系と従来技術の方法との比較を表１に示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、目的とする形質、特に雄性不稔を発現し、前記形質の子孫への分配が厳重に制御され、生じる確率が低い、トランスジェニック植物の生成方法を提供することが本発明の目的である。
【００１４】
さらに、目的とする形質を発現する生物学的に安全なトランスジェニック植物、特に雄性不稔植物であって、低い確率で前記形質の望ましくない伝達が生じる結果となるように前記形質をコードする遺伝子断片を位置させた植物の生成方法を提供することが本発明の目的である。
【００１５】
さらに、相同染色体上に、特に多細胞生物体の相同染色体の同じ座位にトランスジェニックＤＮＡ配列を位置させる方法を提供することが本発明の目的である。
【００１６】
さらに、雄性不稔植物系統の生成方法を提供することが本発明の目的である。
【００１７】
不稔植物系統を使用してハイブリッド種子を生成し、前記ハイブリッド種子で稔性の完全な回復がもたらされる普遍的で環境上安全な方法を提供することが本発明の別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、目的とする形質を発現し、子孫への前記形質の分配が制御されているトランスジェニック多細胞植物体又はその一部の生成方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）核染色体の第１座位中に前記目的とする形質をコードするヌクレオチド配列の第１断片を含む第１異種ヌクレオチド配列を有する第１植物又はその細胞を生成するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核染色体に相同する核染色体の第２座位中に前記目的とする形質をコードするヌクレオチド配列の第２断片を含む第２異種ヌクレオチド配列を有する第２植物又はその細胞を生成するステップ、及び
（ｉｉｉ）前記第１植物及び前記第２植物或いはその細胞をハイブリッド形成して、前記第１異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドと、前記第２異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドとを結合することにより前記当該機能形質を示す子孫を発生させるステップを含む。前記結合は、蛋白質トランススプライシングを伴うことが好ましい。
上記方法によって生成される前記多細胞植物体又は前記部分は、２つの目的とする形質、形質（１）及び形質（２）を発現することができ、両形質は子孫への分配が制御されている。
【００１９】
本発明の発明者らは、導入遺伝子、又は前記植物によって発現された目的とする形質は、前記植物の子孫への分配が制御されているという点でトランスジェニック植物を環境上安全にする方法を初めて開発した。今回、ＧＭ植物から他の生物への導入遺伝子の伝達を効果的に制御し制限することができるので、本発明は、生物工学の、特に植物バイオテクノロジーの主要な問題を解決する。他の生物への導入遺伝子の伝達は、他家受粉による生殖子孫への伝達及び水平遺伝子転移を含む。上記方法によって入手可能な遺伝子改変多細胞植物で目的とする形質の封じ込めの制御がなされる。
【００２０】
重要な実施形態では、前記目的とする形質は雄性又は雌性不稔であり雄性不稔が好ましい。この場合は、本発明のトランスジェニック多細胞植物体をそれぞれ雄性稔性又は雌性稔性である別の植物との交配によってハイブリッド種子生成用に使用することができる。本発明のトランスジェニック多細胞植物を使用し生成したハイブリッド種子は、子孫への不稔性形質の分配が制御されるために１００％稔性であり得る。特に好ましい実施形態では、本発明の前記トランスジェニック多細胞植物は、２つの目的とする形質、雄性不稔形質及び除草剤耐性形質を発現することができ、それはいくつかの点で従来技術の方法に勝る、ハイブリッド種子の新規な生成方法を容易にするものである（以下を参照のこと）。
【００２１】
本発明の方法では、前記形質をコードする（又は関与する）ヌクレオチド配列を２個以上の断片に分割する。前記ヌクレオチド配列を前記ヌクレオチド配列の２個の断片に分割し、それによってヌクレオチド配列の５’部分及び３’部分を得ることが好ましい。前記５’部分は、本質的に前記第１断片に相当する。前記３’部分は、本質的に前記第２断片に相当する。通常、前記ヌクレオチド配列は、前記形質に関与する蛋白質コード配列（又は読み枠）である。しかしながら、前記ヌクレオチド配列は、１つ又は複数のイントロンを含んでもよい。前記断片を得るためには、発現と同時に得られた各断片が他方の断片の不在下では前記形質を生ずることができないように前記ヌクレオチド配列を分割することが好ましい。各断片は、前記形質に関与する蛋白質の機能に必要な配列部分を含む。たとえば、前記形質に関与する前記蛋白質が酵素である場合、各断片は酵素の触媒作用又は基質結合に必要なアミノ酸を含むことが好ましい。関与する蛋白質又は形質をコードする蛋白質は、多くの異なる方式で前記断片に分割することができるが、前記形質の発現には前記断片全て及びその互いの結合を必要とする。前記形質に関与する蛋白質について知られている構造及び機能情報は、前記ヌクレオチド配列の適当な分割部位を見つけるために役立てることができる。どんな場合でも、ヌクレオチド配列の分割によって無作為に選択した部位で生じた断片が、前記ヌクレオチド配列によってコードされている形質を発現できるどうかは容易に実験的に試験することができる。以下の説明は、好ましい実施形態に焦点を当てており、その際前記形質をコードする前記ヌクレオチド配列は２個の断片に分割される。
【００２２】
前記形質の発現には同じ植物中の前記両断片が存在しなければならず同じ細胞が好ましい。さらに、前記形質の発現には、前記第１及び前記第２断片の転写及び翻訳、並びにペプチド結合の形成の有無に関わらず前記断片翻訳産生物の相互結合が必要とされる。前記結合は、前記断片間でのペプチド結合の形成を伴うことが好ましい。
【００２３】
第１断片を第１異種ヌクレオチド配列中に組込み、第２断片を第２異種ヌクレオチド配列中に組込む。前記異種ヌクレオチド配列はＤＮＡ配列であることが好ましい。
【００２４】
前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列は、それぞれ、さらに第１及び第２結合ポリペプチドをコードすることが好ましく、それにより前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列によってコードされている前記ポリペプチドが前記結合をできるようにする。各結合ポリペプチドは、前記第１又は前記第２断片によってコードされているポリペプチドとの蛋白質融合体として発現されることが好ましい。
【００２５】
前記第１異種ヌクレオチド配列によってコードされている前記ポリペプチド又は蛋白質は、第１結合ポリペプチド、及び前記第１断片によってコードされているポリペプチドを含み、好ましくはそれらからなる。前記第２異種ヌクレオチド配列によってコードされている前記ポリペプチド又は蛋白質は、第２結合ポリペプチド、及び前記第２断片によってコードされているポリペプチドを含み、好ましくはそれらからなる。
【００２６】
転写及び翻訳後、前記ポリペプチド又は蛋白質のそれぞれは、少なくとも以下の２つの機能を有する。
（ｉ）前記形質に関与する蛋白質の一部を提供すること、
（ｉｉ）他方の断片によってコードされているポリペプチド又は蛋白質への結合を可能にすること。前記機能（ｉ）及び（ｉｉ）を担うアミノ酸配列部分は重複していてもよいし、していなくてもよい。
【００２７】
前記結合は、前記第１及び第２異種ヌクレオチド配列によってコードされている前記蛋白質間又はポリペプチド間でのペプチド結合の形成に関与していてもよいし、していなくてもよい。ペプチド結合の形成が無くても、前記結合ポリペプチドは親和性によって互いに結合することができる。この場合は、前記結合ポリペプチドは、互いに結合することが知られているポリペプチド、たとえば、蛋白質複合体の自然に存在する結合領域に由来するポリペプチドでよい。前記結合親和性に関与している前記結合ポリペプチド類、又は少なくともそれらの１個を人工的に設計できることが好ましい。前記結合ポリペプチドは、たとえば、抗原−抗体対の構成要素であってよい。さらに、前記結合ポリペプチドを、たとえば、無作為ペプチドファージディスプレイライブラリを使用して（以下を参照のこと：Ｂａｒｂａｓ  ＣＦ．、１９９３年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４号、５２６〜５３０頁、Ｉｒｖｉｎｇら、２００１年、Ｃｕｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、５号、３１４〜３２４頁、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ＨＲ、１９９７年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５号、６２〜７０頁）又は酵母２ハイブリッド系を使用して（以下を参照のこと：Ｆｉｅｌｄｓ及びＳｔｅｒｎｇｌａｎｃ、１９９４年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、１０号、２８６〜２９２頁、Ｂａｒｔｅｌ及びＦｉｅｌｄｓ．、１９９５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２５４号、２４１〜２６３頁）人工的に選択することができる。さらに、前記結合ポリペプチドは、インテインスプライシングには機能しないようにすることもできたであろうインテイン断片でもよい。
【００２８】
重要な実施形態では、前記結合は、前記第１及び第２異種ヌクレオチド配列によってコードされている前記蛋白質間又はポリペプチド間のペプチド結合の形成を含む。前記断片によってコードされているポリペプチド間のペプチド結合の形成が好ましい。前記結合は、優先的にインテイン媒介トランススプライシングである、又はこれを含む。この目的のために、前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列は、さらに、蛋白質トランススプライシングが可能な蛋白質又はポリペプチドをコードする。前記トランススプライシングによって、前記第１及び前記第２断片によりコードされている蛋白質及びポリペプチドは、ペプチド結合の形成によって結合することができる。この実施形態では、前記結合ポリペプチドは、トランススプライシングが可能なインテインに由来することが好ましい。トランススプライシングインテインは、真核生物、古細菌、真正細菌を含む異種生物の核小体ゲノム及び細胞小器官ゲノムから選択することができる。本発明を実施するために使用することができるインテインは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂ／ｉｎｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌ．に収載されている。さらに、ここに引用した参照に記載されているインテインも使用することができる。インテインの選択は、コンセンサス配列、及び効率的なトランススプライシングに必要な条件に左右されるであろう。
【００２９】
前記異種ヌクレオチド配列を設計するためには、インテインをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ（本明細書で示す）５’インテイン及び３’インテインをコードする５’部分及び３’部分に分割することができる。インテインスプライシングに必要とされない配列部分（たとえばホーミングエンドヌクレアーゼ領域）は欠失していてよい。インテインコード配列は、５’インテイン及び３’インテインがトランススプライシングできるような具合に分割される。インテインコード配列の適当な分割部位に関しては、Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈらにより公にされた考察（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９８年）、１７号、９１８〜９２６頁）に従うことができる。もちろん、トランススプライシングのための５’インテイン及び３’インテインの能力は、たとえば、Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈらによるに記載（前記文献）のように実験的に試験することができる。実験的試験は、トランススプライシングによって行うことができる。トランススプライシングの機能を損なうことなく欠失している可能性があるインテイン部分の実験的試験は、トランススプライシング又はシススプライシングによって行うことができる。
【００３０】
５’インテインは、本質的に第１結合ポリペプチドに相当する。３’インテインは、本質的に第２結合ポリペプチドに相当する。前記異種ヌクレオチド配列を設計するためには、５’インテインコード配列を前記第１断片の３’末端と結合させる。３’インテインコード配列を前記第２断片の５’末端と結合させる。所望のトランススプライシング機能を実現するために、特に結合部位付近でヌクレオチド及び／又はコドン（アミノ酸）を変化させることができる。
【００３１】
したがって、前記第１異種ヌクレオチド配列は以下を含むことができる。前記第１断片、前記第１結合ポリペプチド、転写調節配列（たとえばプロモーター、３’転写停止配列）、及び翻訳調節配列。前記第２異種ヌクレオチド配列には以下を含めてよい：前記第２断片、前記第２結合ポリペプチド、転写調節配列（たとえばプロモーター、３’転写停止配列）及び翻訳調節配列。さらに、これには、前記第１及び／又は前記第２植物の生成、並びに部位特異的リコンビナーゼ配列又はトランスポゾン配列によって認識される配列に必要とされる選択マーカー及び／又は逆選択マーカーを含めてよい（以下を参照のこと）。
【００３２】
さらに、２つ以上の形質を、特にトランススプライシングによって組入れるために本発明の方法を使用することもできる。しかしながら、トランススプライシング用であった付属蛋白質断片に非依存的なインテイン部分間の相互作用の普遍的な性格に帰因する形質ミススプライシングを回避するために各形質の組入れに異なるインテイン系を使用しなくてはならない。
【００３３】
本発明の方法では、前記第１異種ヌクレオチド配列を前駆体植物又はその細胞に導入することによって前記第１植物又はその細胞を生成することができる。前記第２異種ヌクレオチド配列を前駆体植物又はその細胞へ導入することによって前記第２植物又はその細胞を生成することができる。前記導入は、当技術分野で公知の方法にしたがって行うことができる。両異種ヌクレオチド配列は、第１及び第２植物の核ゲノム染色体中に安定して組込むことが好ましい。それによって得られた前記第１植物及び前記第２植物は、それぞれの異種ヌクレオチド配列に関して当技術分野で既知の手順にしたがって、特に自家受粉によってホモ接合になされていることが好ましい。前記第１植物及び前記第２植物は、同じ科に属することが好ましく、より好ましくは同じ属、最も好ましくは同じ生物種に属する。
【００３４】
本発明は、目的とする形質を発現し子孫への前記形質の分配が制御され、それによって前記異種配列によってコードされているポリペプチドを特にトランススプライシングにより結合することによって前記形質に関与する蛋白質を産生する多細胞植物（及び、種子のようにその一部）を提供する。前記ポリペプチドは、前記生物体の相同染色体上、第１及び第２異種ヌクレオチド配列にコードされる。
【００３５】
原則として、本発明のトランスジェニック植物中には前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列のいくつかの相対的位置、及びそのそれぞれの断片が存在する。前記本発明のトランスジェニック植物の前記第１及び前記第２異種配列は、非連続座位として分離するように位置していなければならない。減数分裂期組換え又は交差乗り換え、並びに前記座位間結合の作出を最小限に抑えるために、前記座位を非連続的に位置させることが好ましい。
【００３６】
前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列の可能な相対的位置及びその中に含まれる前記断片を一例として２倍体生物を使用し概括的に図２Ｂに示す。
【００３７】
図２Ｂの事例Ｉでは、前記第１及び前記第２断片は同じ染色体上に位置し、すなわちこれらは物理的に同じＤＮＡ分子上で結合するが、生物体固有の染色体配列によって互いに分離している。断片は、異なる転写単位に属することになる。減数分裂期の交差乗り換えは、断片の分離を招く恐れがあるので（すなわち異種配列が断片を含む）、両断片によってコードされている形質が子孫に伝達される確率は、形質が連続コード配列によってコードされている従来の場合に比べて減少する。
【００３８】
事例ＩＩでは（図２Ｂ参照）、前記第１及び前記第２断片は別個の異種染色体上に位置する。自家交配により異なる染色体上の２個の断片によってコードされている前記形質を受継ぐ頻度は約５０％であり、生物体との交配によってこれらの断片のいずれも持たない頻度は２５％である。従来技術の事例Ｉ及びＩＩでは、特に前記断片中でコードされている形質が生存又は伝播に利益をもたらしている場合、子孫又は他の生物へ両断片が伝達される確率は実用化目的には余りにも高過ぎる。これらの事例では、トランスジェニック植物の生物学的に安全な事例が示されていない。
【００３９】
図２Ｂ事例ＩＩＩ及びＩＶに概略的に示すように、前記断片が相同染色体上に位置する場合、子孫（前記形質を有しない植物との交配による）及び他の生物への前記形質の伝達の頻度をけた外れに減少させることができるということを本発明の発明者らは見出している。
【００４０】
事例ＩＩＩ（図２Ｂ）では、２個の断片は相同染色体上の異なる座位に存在し、すなわち相反に結合されている。断片の位置が近いほど前記座位間での組換えの頻度は低く、したがって交差ハイブリッド形成の結果子孫へ形質が伝達される。最も好ましい事例（図２Ｂ事例ＩＶ）では、断片は、相同染色体上の同じ座位に位置する。したがって、本発明の多細胞植物の交差子孫（ハイブリッド子孫）で形質は確実に分離される。
【００４１】
本発明の植物の相同染色体上の前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列のそのような相対的位置は、前記第１植物及び前記第２植物或いはその細胞をハイブリッド形成し、特に交配することによって実現する。前記第１植物及び前記第２植物は、当技術分野で既知の方法によってを得ることができる。より詳しい可能性を以下に開示する。
【００４２】
一実施形態では、前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列を用いて多くの形質転換体を産生する。次いで、染色体中に前記異種配列を組込み、且つ形質転換配列位置を含む染色体を遺伝子生物学的又は分子生物学的方法によって決定することができる。次に、適当な位置に前記第１異種ヌクレオチド配列を有する形質転換植物又はその細胞クローンを選択することができる。次いで、前記第１配列と関連して適当な位置に前記第２異種ヌクレオチド配列を有する形質転換植物又はその細胞クローンを選択することができる。それによって、第１及び第２植物の適当な対を選択することができる。
【００４３】
第２の実施形態では、所望する染色体の所望の座位を標的とした組込みは相同組換えを使用して利用する。部位特異的組換えと組合せて、予め染色体中に組込まれた標的部位を有する多細胞植物を使用して標的組込みを行うことが好ましい。後者の手法は、前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列の同じ染色体の同じ座位中への導入に特に有用である。前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列を形質転換するために予め組込まれた標的部位を有する同じ出発生物体系統を使用することができるからである。標的組込みは、たとえば、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０２／０３２６６号（ＷＯ０２／０７７２４６号）に記載されている。異なる発現プロフィールを有する植物中に標的組込み用部位を作出する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ０２／１１９２４号に記載されている。部位標的組込みの効率を改善する方法は、たとえば、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０２／０３２６６号に記載されている。
【００４４】
或いは、前記第１異種ヌクレオチド配列を第１生物体核ゲノム染色体中に組込むことができ、前記第２異種ヌクレオチド配列を、同じ又は別の生物体の色素体ゲノム又はミトコンドリアゲノム中に組込むことができる。しかしながら、両異種ヌクレオチド配列を核染色体へ組込むことが好ましい。
【００４５】
前記第１植物及び前記第２植物の好ましい生成方法を図２Ｅの右手側（「切取り」）及び図５から８に概略的に図示する。これらの好ましい方法では、
（ａ）前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列を含む親異種ヌクレオチド配列を、親生物又はその細胞の核染色体中に導入するステップ、
（ｂ）場合によっては、前記親異種ヌクレオチド配列を所望する染色体又は染色体座位中に組込ませた生物又はその細胞を選択するステップ、
（ｃ）続いて、前記親異種ヌクレオチド配列を分割し、その結果前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列は異なる植物体又は細胞中の相同染色体上に位置するステップによって請求項１のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を実施する。
前記親異種ヌクレオチド配列は、前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列を含む。前記親異種ヌクレオチド配列は、さらに前記第１及び／又は前記第２異種配列を切取るための配列を含むことが好ましい（詳細は以下を参照のこと）。前記導入（ａ）は、どんな既知の形質転換法によっても行うことができる（以下を参照のこと）。アグロバクテリウム媒介形質転換が好ましい。前記親異種ヌクレオチド配列を持つ植物又は細胞をその配列に含ませた選択マーカーを使用して選択することができる。完全な植物を形質転換した細胞又は組織から再発生させることができる。前記親配列に関してホモ接合である植物を作出することが好ましい。
【００４６】
次いで、前記親配列より前記第１異種ヌクレオチド配列を切取るために前記親配列を持つ植物（又は一群の植物）を使用することができる。それによって、前記第２植物を得ることができる。前記第１植物を得る目的で別の植物（又は一群の植物）を前記第２異種ヌクレオチド配列を切取るために使用することができる。異種配列は、前記第１植物及び前記第２植物の相同染色体中に、特に前記相同染色体の同じ座位に、すなわちイソ座位に位置する。
【００４７】
切取った異種ヌクレオチド配列のゲノム中へのどんな再組込みのためにも、このようにして得られた第１及び第２植物或いはその細胞（又はその子孫）を、たとえば、遺伝子生物学又は分子生物学的技術（たとえばＰＣＲやサザンハイブリダイゼーション用ヌクレオチドプローブの使用）によって有利に分析する。次いで、切取られていない異種ヌクレオチド配列を収容する染色体に相同な染色体の所望の座位に再組込みした前記異種ヌクレオチド配列を含む植物又はその細胞を選択することができる。それによって、本発明のトランスジェニック植物を直接に得ることができる。切取った異種ヌクレオチド配列が含まれていない植物又はその細胞を選択することが好ましい。前記選択には、遺伝子生物学又は分子生物学的技術による分析を含めてもよい。切取るべき異種配列中の逆選択マーカーによって前記選択を裏付けることが好ましい。前記第１植物及び前記第２植物は、切取られていない前記異種配列に関してホモ接合になされていることが好ましい。
【００４８】
前記切取りは、たとえば、部位特異的リコンビナーゼを使用して行うことができる（図２Ｅ参照）。トランスポゾン、特に非自律的トランスポゾン（すなわち、それぞれのトランスポザーゼをコードしないトランスポゾン）を使用し前記切取りを行うことが非常に好都合である。後者の実施形態のために前記親異種ヌクレオチド配列中の前記第１及び／又は前記第２異種ヌクレオチド配列は、そのようなトランスポゾン中に包埋される。前記切取りは、前記トランスポゾン用のトランスポザーゼを提供することを含む。特に、
（ａ）前記親異種ヌクレオチド配列中の前記第１異種ヌクレオチド配列が第１トランスポゾン中に含まれ、前記第２異種ヌクレオチド配列が第２トランスポゾン中に含まれ、及び
（ｂ）前記第１トランスポゾンの許で機能する第１トランスポザーゼを得ることによって前記第１異種ヌクレオチド配列を切取り、前記第２トランスポゾンの許で機能する第２トランポザーゼ（ｔｒａｎｐｏｓａｓｅ）を得ることによって前記第２異種ヌクレオチド配列を切取る。
前記第１又は前記第２異種ヌクレオチド配列の切取りによって、それぞれ前記第２又は前記第１非自律的トランスポゾンの撹乱がもたらされる結果となるように、前記親異種ヌクレオチド配列中の前記第１及び前記第２トランスポゾンが重複することが好ましい。図７及び８に示すように重複領域中の選択マーカー及び逆選択マーカーを用いて重複するトランスポゾンを好都合に使用することができる。
【００４９】
さらに、前記ステップ（ｃ）の分割は前記第１又は前記第２異種ヌクレオチド配列の前記切取りのために、必ずしも異なるリコンビナーゼを必要としない。非常に好都合な実施形態では、前記親異種ヌクレオチド配列中の前記第１異種ヌクレオチド配列が両側に部位特異的インテグラーゼの異なる組換え部位を置き、前記親異種ヌクレオチド配列中の前記第２異種ヌクレオチド配列が両側に同じ部位特異的インテグラーゼの異なる組換え部位を置き（図２１及び２２参照）、且つステップ（ｃ）が、
前記親生物又はその細胞に前記部位特異的インテグラーゼを提供するステップ、
前記第１異種ヌクレオチド配列を含むが前記第２異種ヌクレオチド配列を含まない前記親生物又はその細胞の子孫を選択するステップ、及び
前記第２異種ヌクレオチド配列を含むが前記第１異種ヌクレオチド配列を含まない前記親生物又はその細胞の子孫を選択するステップによって実施される。
【００５０】
次いで、本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）では、本発明のトランスジェニック多細胞植物を得るために前記第１植物及び前記第２植物或いはその細胞をハイブリッド形成する。ハイブリッド形成は、生殖交配又は前記植物の細胞融合でよい。細胞融合は、生殖細胞又は体細胞の融合でよい。ハイブリッド形成は、植物の受粉又はプロトプラストの体細胞融合を伴うことが好ましい。植物の生殖交配が最も好ましい。蛋白質トランススプライシングによって前記植物が前記目的とする形質を示すような具合に、前記ハイブリッド形成は前記形質をコードする、又は前記形質に関与する前記断片を１つの植物又はその細胞中で接合する。蛋白質結合又は蛋白質トランススプライシングに帰因する前記形質の提示は、結合又はトランススプライシングが前記目的とする形質の発現に必要な条件であることを意味する。本発明のトランスジェニック生物の生成には、前記ハイブリッド形成の他に追加のステップを含めてよい。植物の場合には、そのような追加ステップの例に以下が含まれる。種子の育成及び採取、播種、及び本発明の植物の栽培。プロトプラスト融合の場合には、このような追加ステップに以下が含まれる。コロニーを得るための融合プロトプラストの増殖、植物の再生。
【００５１】
子孫への前記形質の分配の制御とは、染色体の１個の座位中にコードされている前記目的とする形質に関与する導入遺伝子を特に単一転写単位として、又は異種染色体上に有する従来のトランスジェニック生物に比べて、子孫への前記形質の伝達の確率が著しく減少していることを意味する。本発明の前記トランスジェニック多細胞植物と、前記第１及び前記第２異種配列を欠く植物との交配による子孫での前記形質の出現頻度は、１０％未満であり、１％未満が好ましく、０．１％未満がより好ましく、０．０１％未満がさらに好ましく、０．００１未満％が最も好ましい。比較用に、単一転写単位中に前記導入遺伝子を有し、導入遺伝子に関してヘテロ接合である従来のトランスジェニック（２倍体）生物体と、前記導入遺伝子を有しない別の同種生物体との交配による子孫での導入遺伝子の出現頻度は約５０％である。目的とする形質を発現するトランスジェニック植物が、前記頻度に関する本発明の判定基準を満たすかどうかは、容易に実験的に確かめることができる。
【００５２】
本明細書では、ペプチド結合は、あるポリペプチドのカルボキシル基と別のポリペプチドのアミノ基の間のアミド結合を意味する。この結合は、自由回転を許さずシス位又はトランス位で生じることができ、常にシスであるプロリンのアミノ基への結合を除き天然ペプチドでは後者のトランス位が最も一般的である。（出所：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｌａｂ．ｇｌａ．ａｃ．ｕｋ／ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ／）。インテイン媒介トランススプライシングによってペプチド結合を形成することができる。
【００５３】
本発明の方法では、トランスジェニック多細胞植物体を生成する。植物のうちでは、オオムギ、オートムギ、ライムギ、コムギ、トウモロコシ、コメ、アワ、ジャガイモ、採油用ナタネ、キャノーラ、トマト、ワタ、モロコシ、タバコを含む作物植物が好ましい。本発明の方法は、２倍体及び倍数体植物に適用することができる。
【００５４】
本発明によって、特に植物で発現可能な形質の例は、雄性不稔、除草剤耐性、殺虫剤耐性、選択マーカー、逆選択マーカー、生物的形態、種子内容、種子安定性、気候適応、ビタミン含有量、炭水化物含有量及び組成、脂肪含有量及び組成などである。さらに、前記形質は、当該蛋白質、特に薬剤蛋白質の発現であってよい。そのような蛋白質の例を以下に示す。一事例では（実施例１参照）、本発明の植物ではレポーター遺伝子が発現される。本発明の別の例では（実施例２）、除草剤耐性を付与するＥＰＳＰＳ（５−エノルピルビルシキマート−３−リン酸シンターゼ）遺伝子、たとえば、グリホサート耐性が発現される。本発明の前記多細胞植物及び前記トランスジェニック多細胞植物は、さらに遺伝的に又は一過的に、たとえば、前記トランススプライシング及び／又は前記目的とする形質の発現に必要な機能を得るために改変することができる。さらに、前記目的とする形質又は異なる形質の発現に関与する第２導入遺伝子を発現させることができる。
【００５５】
本発明の方法を広範な適用に使用することができる。たとえば、前記トランスジェニック生物中で目的とする形質を発現させるために使用することができる。前記形質は、前記生物体のどんな特性でもよく、単一遺伝子又はいくつかの遺伝子によってコードされていてもよい。前記形質は、少なくとも１個の蛋白質の発現によって引き起こすことができる。前記形質には２個以上の蛋白質が必要であってもよい。この場合は、本明細書に記載した通り１個の蛋白質しか発現の制御を十分に行うことができない。しかしながら、本発明の方法によって形質を生ずる蛋白質全てを制御することが環境上より安全である。
【００５６】
前記方法の非常に重要な適用は、農業目的用植物を生成するための、又は前記植物での蛋白質産生のためのハイブリッド種子の生成であり、それによって前記植物は子孫への形質分配が制御される。前記ハイブリッド種子によって、親系統で発現されないばかりか子孫において迅速に分離される目的とする形質を発現する植物の生成が可能になる。
【００５７】
子孫への形質の分配が制御されている２つの目的とする形質を発現する植物又はその細胞の生成
本発明によって生成したトランスジェニック多細胞植物又はその一部は、２つ（以上）の目的とする形質を発現させることができ、それによって先に定義した通り両形質の子孫への分配を制御することができる。そのような２つの目的とする形質の好ましい事例では、これらは以下で形質（１）及び形質（２）と呼ばれる。前記目的とする形質に関する上記説明を前記形質（１）又は前記形質（２）に当てはめることができる。その説明が前記形質（１）及び前記形質（２）に当てはまることが好ましい。しかしながら、形質（１）又は形質（２）の発現は、前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列のｍＲＮＡ発現産物のＲＮＡトランススプライシングに左右され得る。この場合、トランススプライスされたＲＮＡの翻訳が、前記形質（１）又は（２）の１つを発生させることができる。ＲＮＡトランススプライシングは、ＷＯ０２／９６１９２号及びその中で引用されている参照文献に詳述されている。ＲＮＡトランススプライシングによって２つ以上の形質を発現させることも可能である。
【００５８】
本発明の方法ステップ（ｉｉｉ）で生じた子孫（すなわち、本発明によるトランスジェニック多細胞植物又はその一部）は、前記第１異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドと、前記第２異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドとを結合させることによって形質（１）及び形質（２）を示すことが好ましい。さらに、前記子孫は、インテイン媒介トランススプライシングによって形質（１）又は形質（２）を示し得る。さらに、前記子孫は、インテイン媒介トランススプライシングによって形質（１）及び形質（２）を示し得る。
【００５９】
２つの目的とする形質を発現する多細胞植物又はその一部の生成方法では、１つの形質についての先の詳述と同様にステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を実施することができる。ステップ（ｉ）で生成した植物（図１３植物Ａ１）は、形質（１）をコードするヌクレオチド配列（第１）断片、及び形質（２）をコードするヌクレオチド配列（第１）断片を含むことができる。ステップ（ｉｉ）で生成した植物（図１３植物Ａ２）は、形質（１）をコードするヌクレオチド配列の別の（第２）断片、及び形質（２）をコードするヌクレオチド配列の別の（第２）断片を含むことができる。ステップ（ｉ）で生成した植物中の前記（形質（１）の、及び形質（２）の）第１断片は同じ又は異なる染色体上にあってよい。同様に、ステップ（ｉｉ）で生成した植物中の前記（形質（１）の、及び形質（２）の）第２断片は同じ又は異なる染色体上にあってよい。前記第１断片が同じ染色体上にあり、前記第２断片が同じ染色体上にあることが好ましい。前記第１断片が染色体の同じ座位中にあり、前記第２断片が染色体の同じ座位中にあることがより好ましい。前記第１植物の前記第１断片を有する座位、及び前記第２植物の前記第２断片を有する前記座位が相同染色体上の同じ座位、すなわちイソ座位であることが最も好ましい。
【００６０】
好ましい実施形態では、形質（１）をコードする前記ヌクレオチド配列の第１断片、及び形質（２）をコードする前記ヌクレオチド配列の第１断片は、本発明の前記第１異種ヌクレオチド配列に含まれる。同様に、形質（１）をコードする前記ヌクレオチド配列の第２断片、及び形質（２）をコードする前記ヌクレオチド配列の第２断片は、本発明の前記第２異種ヌクレオチド配列に含まれる。次いで、ステップ（ｉｉｉ）には、前記第１植物及び前記第２植物或いはその細胞をハイブリッド形成して、形質（１）及び形質（２）を示す子孫を生成することを含めることができ、それによって前記第１異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドと、前記第２異種ヌクレオチド配列によってコードされている蛋白質又はポリペプチドとを結合することにより形質（１）が示される。
【００６１】
前記の好ましい実施形態では、本発明の方法によって生成した植物中の形質（１）及び形質（２）の分配の厳重な制御は、前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列が、前記第１植物及び前記第２植物中でイソ座位で位置する場合に好都合に実現することができる。したがって、前記２つの目的とする形質を発現する本発明の前記トランスジェニック多細胞植物と、前記断片を含まない別の植物の交配によって得られた子孫は、形質（１）だけでなく形質（２）も発現しない。
【００６２】
ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は、
（ａ）前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列を含む親異種ヌクレオチド配列を、親生物又はその細胞の核染色体中に導入するステップ、
（ｂ）場合によっては、前記親異種ヌクレオチド配列を所望する染色体又は染色体座位中に組み込ませた生物又はその細胞を選択するステップ、
（ｃ）続いて、前記親異種ヌクレオチド配列を分割し、その結果前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列は異なる植物体又は細胞中の相同染色体上に位置するステップによって実施することが好ましく、それによって前記親ヌクレオチド配列の前記第１異種ヌクレオチド配列は形質（１）の第１断片及び形質（２）の第１断片を含み、前記親ヌクレオチド配列の前記第２異種ヌクレオチド配列は形質（１）の第２断片及び形質（２）の第２断片を含む。ステップ（ｃ）の前記分割は、上記の通り実施することができ、それによって植物Ａ１及び植物Ａ２を得ることができる。前記第１及び／又は前記第２異種ヌクレオチド配列に関してホモ接合にするために、ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）で生成した前記植物を自家受粉することが好ましい。
【００６３】
形質（１）及び形質（２）の例は上記したものでよい。
【００６４】
ハイブリッド種子の生成方法
最も重要な実施形態では、形質（１）は除草剤耐性であり、形質（２）は雄性又は雌性不稔であり、よって雄性不稔が好ましい。この実施形態では、本発明の方法を農業目的でハイブリッド種子生成用に使用することができる。したがって、本発明は、本発明によるトランスジェニック多細胞植物（本明細書では図１３植物Ａ１／Ａ２をさす）の生成を含むハイブリッド種子の生成方法を提供する。形質（１）が除草剤耐性であり、形質（２）が雄性不稔であることが好ましい。通常、前記ハイブリッド種子の生成方法は、さらに、前記トランスジェニック多細胞植物体と、雄性稔性である別の植物（本明細書では図１３植物Ｂをさす）の交配を含む。植物Ｂは、前記除草剤耐性又は前記雄性不稔をコードするヌクレオチド配列断片を含んではならない。次いで、雄性不稔除草剤耐性植物Ａ１／Ａ２で栽培したハイブリッド種子を収穫することができる。本発明は、それによって得られたハイブリッド種子も提供する。
【００６５】
前記除草剤耐性形質の使用によって前記ハイブリッド種子の生成方法は以下の利点を有する（図１３参照）：前記親異種ヌクレオチド配列を含む植物の選択に前記耐性を使用することができる（図１３系統Ａ）。さらに、前記除草剤耐性を本発明のステップ（ｉｉｉ）で雄性不稔交差子孫の選択に使用することができる（図１３の系統Ａ１及び系統Ａ２の交差子孫）。系統Ａ１の非不稔性自家受粉子孫、及び系統Ａ２の非不稔性自家受粉子孫は除草剤耐性ではないからである。結果として、純粋に雄性不稔植物を得ることができ、系統Ｂとの交配によって雄性不稔系統Ａ１／Ａ２で生長する子孫種子は１００％ハイブリッドとなる。系統Ｂ植物で生長する自家受粉子孫種子は、系統Ｂで生長した種子から別々に系統Ａ１／Ａ２の種子を収穫することによって分離することができる。雄性不稔植物系統を使用する従来技術のハイブリッド種子の生成方法とは対照的に、本明細書で開示したハイブリッド植物の生成方法は、植物系統Ａ１及びＡ２が自家受粉によって容易に維持することができるので実施がより優れて効率的であり手間もかからない。
【００６６】
プロ座位配列を含む系統Ａ（図１３）は雄性不稔でよい。これは、所望の表現型（たとえば、雄性不稔、除草剤耐性など）を備えた系統Ａの一次形質転換体の生成に有利であるが、系統Ａの維持は困難なものになりかねない。したがって、系統Ａを稔性となるように設計することもできるが、依然として系統Ａ１及びＡ２は雄性不稔植物Ａ１／Ａ２を交配によって提供することができる。これは、系統Ａの前記親異種ヌクレオチド配列（プロ座位）中の雄性不稔形質をコードするヌクレオチド配列断片の１個をそのプロモーターから分離することによって実現することができる。その後、雄性不稔をコードする断片の１個は発現されないので、前記プロ座位が雄性不稔を準備するはずがない。イソ座位の作出（系統Ａ１及びＡ２）によって前記断片が発現できるようにプロモーター及び断片を接合することができ、それによって雄性不稔Ａ１／Ａ２植物を得ることが可能になる。一例として、前記第１異種ヌクレオチド配列は、プロ座位中の前記第２異種ヌクレオチド配列を撹乱することができる。系統Ａ１及びＡ２の作出と同時に、前記第１異種ヌクレオチド配列を切取ることによって前記第２異種ヌクレオチド配列の機能性を回復することができる。
【００６７】
子孫への両形質の分配を制御することによって、交差子孫（図１３のＦ１子孫）は、雑種強勢を示すようになり、稔性が回復し植物Ａ１／Ａ２が耐性であった除草剤に対する感受性が回復される。不稔性及び除草剤感受性は、少なくとも９６％の子孫で回復することが好ましく、より好ましくは少なくとも９９％の子孫で回復する。結果として、異系交配又は機能性除草剤耐性遺伝子を環境へ伝達させるどんな危険も冒さずに農場での大規模栽培に前記Ｆ１子孫を使用することができる。
【００６８】
本発明の実施例４では、分割ＡＨＡＳ遺伝子を設計してイミダゾリン除草剤及びスルホニルウレア除草剤に対する耐性を準備することを記載している。ＡＨＡＳ遺伝子を一過性検定でその機能を試験するためにシロイヌナズナゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、変異させ、ベクター（図１６）でクローン化した。実施例５では、分割バルナーゼを設計して細胞障害性ＲＮａｓｅを準備することを記載する。両実施例では、本発明者らは、インテイン系を使用して分割遺伝子断片によってコードされている蛋白質のトランススプライシングを準備する。トランススプライシングは、互いに交差反応しない異なる２個のインテイン系によって媒介される。この系は、シアノバクテリア（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３のＡＨＡＳに関するＤｎａＥインテイン及びバルナーゼに関するＤｎａＢインテインに基づく。分割ＡＨＡＳ−インテイン融合体及び分割バルナーゼ−インテイン融合体との中間構築体をそれぞれ図１７及び１８に示す。
【００６９】
一過性試験では、遺伝子断片によってコードされている機能性蛋白質のインテインが媒介する組入れを示した。本発明は、除草剤耐性を準備するＡＨＡＳ遺伝子の使用だけには限らない。インテイン媒介トランススプライシングによる分割及び再構築を修正するために他の多くの除草剤耐性を付与する遺伝子を使用することができる。そのような遺伝子の例には、とりわけ、５−エノルピルビルシキマート−３−リン酸シンターゼ、フォスフィノスリシンアセチル転移酵素（ＢＡＲ）、ベタインアルデヒド脱水素酵素（ＢＡＤＨ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＦＲ１）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）、グリホサート酸化還元酵素が含まれる。
【００７０】
さらに、バルナーゼは、雄性不稔を準備することができるいくつかの適切な遺伝子の１つである。葯細胞中で又は花粉形成の所望の時期で、発現したときに花粉の発生に作用する他の多くの遺伝子を使用することもできる。実際にどんな遺伝子でも、花粉の機能及び発生を阻害することができる遺伝子の遺伝子産物を本発明で使用することができる。そのような遺伝子の例には、とりわけ、リボソーム阻害蛋白質（Ｃｈｏら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ、１１号、３２６〜３３３頁）、スクロース異性化酵素（ＷＯ１５９１３５号）、タンパク質分解酵素、グルカナーゼ（Ｔｓｕｃｈｉａら、１９９５年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３６号、４８７〜４９４頁）などがある。或いは、自家受粉不適合（前記遺伝子を含む植物の自家受粉を防止）を担う遺伝子を使用して、特に上述した雄性不稔形質の代わりにハイブリッド種子生成を準備することができる（Ｅｎｔａｎｉ、Ｔ．ら、２００３年、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ、８号、２０３〜２１３頁、Ｕｓｈｉｊｉｍａ、Ｋ．ら、２００３年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１５号、７７１〜７８１頁）。
【００７１】
雄性不稔の発生に様々な花粉又はタペータム特異的プロモーターを使用して遺伝子／遺伝子断片の発現を駆動することができる。タペータム特異的プロモーターの例は、Ａ３及びＡ９遺伝子プロモーター（ＵＳ５７２３７５４号、Ｈｏｄｇｅら、１９９１年、Ｊ  Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ、４２号、２３８頁補遺、４６頁）、イネＯｓｇ６Ｂ遺伝子由来タペータム特異的プロモーター（Ｔｓｕｃｈｉａら、１９９４年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６号、１７３７〜１７４６頁）、タバコ遺伝子ＴＡ２９プロモーター（Ｋｒｉｅｔｅら、１９９６年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、９：８０９〜８１８頁）などである。雄性不稔を準備する遺伝子の組織特異的発現は、ＷＯ９８／３２３２５号に詳述されている。
【００７２】
次ステップのクローニングでは、前記遺伝子断片をペアにして実施例６の説明にしたがって最終プロ座位ベクター設計（図２１）のために設計した中間構築体（図１９）に組み立てた。前記プロ座位ベクターを実施例８に記載した通り親系統Ａの生成のために設計する。雄性不稔となる前記親系統を分割ＡＨＡＳ遺伝子によって得られた除草剤耐性の使用によって選択することができる。親植物から系統Ａ１及びＡ２を生成するために、部位特異的組換えを使用することができる。リコンビナーゼ活性用に提供したベクターの説明を実施例７に示す。リコンビナーゼ遺伝子を持つトランスジェニック植物を、プロ座位を持つ親植物と同様の方法で生成することができる。形質転換の方法を実施例８に例示する。
【００７３】
イソ座位を持つ系統Ａ１及びＡ２を生成するために、親系統に相当する一次形質転換体をリコンビナーゼ活性用に提供された植物由来の花粉と他家受粉した（実施例８）。そのような交配由来の子孫を１つのイソ座位に相当する異種ＤＮＡの存在、及び別のイソ座位に相当する異種ＤＮＡの不在についてＰＣＲによって試験し、逆も同様に行った。イソ座位の生成及び構造を図２２に示す。生成した異なるイソ座位を持つ系統Ａ１及びＡ２を他家受粉によるその機能について試験した。ホモ接合系統を使用した場合は、そのような系統由来の子孫は全て、除草剤耐性であり雄性不稔であった。図２２では、本発明者らは、１つの部位特異的リコンビナーゼを用いてプロ座位からイソ座位を発生させる可能性を実証する。リコンビナーゼＰｈｉＣ３１に関して、組換え（切取り又は組込み）には異なる２個の組換え部位、ＡｔｔＰ及びＡｔｔＢが必要である。このインテグラーゼにより触媒された組換えは、リコンビナーゼＰｈｉＣ３１によって認識されないＡｔｔＬ部位又はＡｔｔＲ部位の形成をもたらすので不可逆プロセスである。図２２に示すプロ座位は、３個のそのような部位を含み、そのうちの２個間の（インテグラーゼにより触媒された）無作為相互作用は、２つの起り得る結果、イソ座位を有する系統Ａ１又は系統Ａ２の生成を伴う切取り事象をもたらすはずである。それに反して、ベクターｐＩＣＨ１２９７０で形質転換した親系統を用いる同様の手法（図２１）は、追加のＡｔｔＢ部位の存在によってＨＰＴ選択マーカーの有無により異なる４個のイソ座位変異体を生成する。
【００７４】
親系統Ａ中の前記プロ座位を用いる手法は、既知のハイブリッド種子生成系に勝る重要な利点がある：それは必要な雄性不稔表現型を示す一次形質転換体を直接選択できるようにする親系統由来イソ座位で系統Ａ１及びＡ２を生成中に稔性回復を試験することができる。これにより本発明のハイブリッド種子生成系の開発に必要な時間が短縮され、その維持は好都合且つ容易になる。
【００７５】
さらに、本発明の手法は、他の方法、たとえば、種子の発芽を制御する方法に容易に適合する。種子の発芽を制御することによってハイブリッド植物における特定の生物学的安全問題に、特に産業的酵素、ヒト及び動物健康に関する蛋白質などを生成する場合に対処することができる。種子の発芽を制御することによって、しばしば以下の収穫に混入する深刻な生物学的安全問題、特に「薬剤（ｐｈａｒｍａ）」蛋白質の場合には問題を惹起する恐れがある植物「自生植物」が原因の問題を取り除くことができる。種子の発芽の制御問題に取り組むいくつかの報告（ＵＳ５７２３７６５号、ＷＯ９７４４４６５号、ＵＳ５１２９１８０号、ＵＳ５９７７４４１号）があるが、こうした方法はハイブリッド種子の生成方法に組み込まれていない。ハイブリッド植物から収穫した種子の発芽を制御することは、本発明の概括的な教示にしたがって行うことができる。ハイブリッド（Ｆ１）植物は、活性化された後、種子の発芽を制御できる不活性座位Ａ３（図１４Ｄを参照）に関してホモ接合であることが好ましい（図１４Ｄでは活性化した座位Ａ３をＡ３＊とする）。これは、Ｆ１植物の子孫全てに座位Ａ３を提供するはずである。前記Ｆ１におけるホモ接合性は、種子の発芽を制御する異種配列を、系統Ａ１／Ａ２の核染色体（又は系統Ａ１、Ａ２のｉｓｔ前駆体、或いは系統Ａ）及び系統Ｂの所定の位置に導入することによって、たとえば、相同組換え又は部位特異的組込みによって実現することができる。或いは、標準の育種方法による所望の座位の遺伝子移入も可能である。さらに、ハイブリッド植物（Ｆ１）には前記不活性座位（Ａ３）用アクチベータ（Ａ４＋Ｂ４）を含める必要があり、前記アクチベータは、２個の異種ヌクレオチド配列、Ａ４及びＢ４によってコードされていてよい（図１４Ｄ）。系統Ａ１／Ａ２及び系統Ｂ間での交配の結果として配列Ａ３、Ａ４、及びＢ４を接合してＦ１植物を生成することができる。Ｆ１植物では、それぞれ、Ａ４配列及びＢ４配列から発現される蛋白質又はＲＮＡ配列の、インテイン媒介又はリボザイム媒介トランススプライシングによってアクチベータに機能性を持たせることができる。前記アクチベータは、一時的の活性プロモーターの制御下、リコンビナーゼ又はトランスポザーゼであることが好ましく（ＵＳ５９７７４１号）、それによって前記プロモーターは胚特異的、種子特異的、又は種子の発芽特異的でないことが好ましく、すなわち前記プロモーターは、種子の発芽を制御するＡ３座位遺伝子の発現を駆動するプロモーターの発現パターンに重複又は先行しない。Ａ３を制御するプロモーター及び種子の発芽の制御する前記遺伝子（Ａ３）は、前記アクチベータとして使用される、前記リコンビナーゼ／トランスポザーゼによって除去され得る遮断配列によって分離することができる。或いは、部位特異的組換えによってＡ３を制御する前記プロモーター、又は種子の発芽を制御する前記遺伝子を互いに関連して再方向付けしＡ３の活性化及び発現を得ることができる。活性化Ａ３（Ａ３＊）は、Ｆ１植物子孫へ受け継がれることになる。自家受粉Ｆ１植物子孫はＡ３＊に関してホモ接合となり、Ｆ１植物交配子孫はＡ３＊に関してヘテロ接合になる。結果として、Ｆ１植物の子孫種子は生存できなくなり、すなわち発生の初期に生長停止する。
【００７６】
発芽に続いて植物の成長を２つの主要な段階グループ：植物生長期（Ｖ）及び生殖期（Ｒ）に分けることができる。植物生長期は、発生期（ＶＥ）に始まり、続いて子葉期（ＶＣ）、生殖期の開始（開花の始まり）まで連続的な成長発達期が続く。したがって、本発明は、本発明のハイブリッド種子から生長した植物も提供し、前記（ハイブリッド）植物の子孫種子は子葉期には至らず、ＶＣ期に達しないことが好ましく、ＶＥ期に達しないことが好ましく、発芽しないことが最も好ましい。本実施形態を使用し、潜在的に問題の多い遺伝子内容を有するハイブリッド植物を、たとえば、これらの植物由来の種子が翌生長シーズンに不要な植物を発生する危険を冒さずに当該蛋白質の発現に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
本発明では、本発明者らは、目的とする形質に関与する導入遺伝子のコード配列を蛋白質レベルで、特にトランススプライシングによって互いに結合できる２個以上の断片に分割することを提案する。これらの断片を含む異種ヌクレオチド配列を、親植物をハイブリッド形成することによって宿主植物のゲノムに、好ましくは相同染色体に、或いはトランスジェニック多細胞植物ゲノム及びプラストームに導入する。一度転写され翻訳されると、蛋白質トランススプライシングによって蛋白質断片を組入れることができ、それによって、機能性蛋白質、特に目的とする形質を準備することができる蛋白質を形成する。植物育種法は、通常非常に特異的な親交配を必要とするので、本発明の前記方法を操作することが深刻な追加の問題をもたらすことはない。本発明のトランスジェニック植物と望まれていない生物の間のどんな望ましくない自然発生的交配も効果的に前記形質を分解し、それによって発現を無効にし機能性遺伝子の不当子孫への伝達の機会を大幅に減少させる。
【００７８】
本発明の方法によってどんな不当交配の子孫も生存不能にされるので、導入遺伝子それ自体の発現が制御され、又はトランスジェニック品種の制御に使用することができるという機構の構築が可能になる。これらの可能性のどちらも、とりわけ本発明で企図されている。
【００７９】
本発明は、当業者が選択マーカーに基づいて一次形質転換体を選択するためのスキームを設計することも可能にし、この選択マーカーはＴ０子孫中で有効且つ実施可能であるが、断片又はその対立遺伝子は、その後の交配によって異なるトランスジェニック子孫に分離し、それによって機能性選択マーカー遺伝子としては消失する。
【００８０】
さらに、異なる当該転写単位断片を含む親を交配することによって、異なる遺伝子の迅速なｉｎ  ｖｉｖｏ組入れが本発明によって可能になり、それによって翻訳エンハンサ、トランジットペプチド、シグナルペプチド、標的ペプチド、精製タグ、蛋白質の異なる機能性領域など、異なる機能性領域の交換を、そのような機能性遺伝子の所望の断片を持つ植物を単に交配することによって可能にする。
【００８１】
バルナーゼ遺伝子断片に基づくハイブリッド種子生成系を説明する。前記断片が同じ細胞（葯細胞）中に発現する場合、蛋白質断片は結合して生成され、それによってバルナーゼ活性は回復して雄性不稔が発生する（ＵＳ６３９２１１９号、Ｂｕｒｇｅｓｓら、２００２年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、３１号、１１３〜１２５頁）。前記手法を用いて生成したハイブリッド種子は、異なる配偶子に対するバルナーゼ遺伝子断片の分離、それによって雄性不稔を担う細胞障害性遺伝子の不活性化を引き起こすことによって稔性を回復する。しかしながら、前記系には深刻な限界がある。それが蛋白質断片間の相互作用上に築かれ、トランススプライシングではないからである。その結果、前記系は感温性であり、１８℃を超える温度でバルナーゼ蛋白質断片を解離することによって雄性不稔系統の稔性を回復することができる。
【００８２】
本発明において、蛋白質の結合及び／又はトランススプライシングは、設計したインテインを使用することによって実現することができる。まず、インテインを、蛋白質前駆体内にインフレームで包埋されている蛋白質配列として確認し蛋白質の成熟過程中に切取った（Ｐｅｒｌｅｒら、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２号、１１２５〜１１２７頁、Ｐｅｒｌｅｒ、Ｆ．Ｂ．、１９９８年、Ｃｅｌｌ、９２号、１〜４頁）。自己スプライシング反応を実施するために必要な情報の全て及び触媒基は、インテイン及び２個の隣接アミノ酸中に存在する。蛋白質スプライシングの化学的機構は、Ｐｅｒｌｅｒ及び同僚（１９９７年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１号、２９２〜２９９頁）並びにＳｈａｏ及びＫｅｎｔ（１９９７年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、４号、１８７〜１９４頁）によって詳細に説明されている。通常、インテインはＮ末端及びＣ末端スプライシング領域、並びに中央ホーミングエンドヌクレアーゼ領域又は小型のリンカー領域からなる。現在までに１００を超えるインテインが知られており、これらは真核生物、古細菌、真正細菌を含む、異なる生物の核及び細胞小器官のゲノムのうちに分布する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂ／ｉｎｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌ）。インテイン分子はトランススプライシングできることが示されている。中央ホーミングエンドヌクレアーゼ領域を除去してもインテインの自己スプライシングにはなんの影響も及ぼさない。これはトランススプライシング系の設計をも可能にし、その場合インテインのＮ末端及びＣ末端断片は分離断片として同時発現され、エクステインに融合した場合（蛋白質断片、インテインを用いて一緒に連結されている）、ｉｎ  ｖｉｖｏでトランススプライシングを実施することができる（Ｓｈｉｎｇｌｅｄｅｃｋｅｒら、１９９８年、Ｇｅｎｅ、２０７号、１８７〜１９５頁）。ヒト型結核菌ＲｅｃＡインテインＮ末端及びＣ末端セグメントで蛋白質トランススプライシングがｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じ得ることも実証された（Ｍｉｌｌｓら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５号、３５４３〜３５４８頁）。この現象は、シアノバクテリア（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）株ＰＣＣ６８０３のＤｎａＥ蛋白質でも確認された（Ｗｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５号、９２２６〜９２３１頁）。異なる２個の遺伝子は、この蛋白質をコードし対向するＤＮＡ鎖上に７００Ｋｂ．ｐ．を超えて分離位置する。これらの遺伝子によってコードされる２個のインテイン配列は、分割ミニインテインを再構築し、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞で試験した場合、蛋白質トランススプライシング活性を媒介できることも示された。同起源のインテイン分子［シアノバクテリア（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）株ＰＣＣ６８０３由来ＤｎａＥインテイン］を使用して機能性除草剤耐性アセト乳酸合成酵素ＩＩを、２個の非連続断片（Ｓｕｎら、２００１年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．ＭｉｃｒｏＢｉｏｌ．、６７号、１０２５〜２９頁）及び大腸菌中の５−エノルピルビルシキマート−３−リン酸シンタ���ゼ（ＥＰＳＰＳ）から産生した（Ｃｈｅｎら、２００１年、Ｇｅｎｅ、２６３号、３９〜４８頁）。インテイン媒介トランススプライシングの一般原理を図１に示す。
【００８３】
さらに別の首尾よく確立されたインテインの適用は、インテインに基づく蛋白質精製系へのその使用である（概説はＡｍｉｔａｉ及びＰｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ（１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７号、８５４〜８５５頁を参照のこと）。エクステインからのインテインの自己切断によってｐＨ（Ｗｏｏｄら、１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１７号、８８９〜８９２頁）又は温度（Ｓｏｕｒｔｈｗｏｒｔｈら、１９９９年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２７号、１１０〜１１４頁）変化に曝露後、遊離蛋白質分子としてエクステインが放出される。或いは、求核性薬剤（たとえばＤＴＴ）も切断を惹起するが、そのような薬剤は放出された蛋白質に共有結合し続ける（Ｋｌａｂｕｎｄｅら、１９９８年、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、５号、３１〜３７頁）。我々の知る限りでは、生物学的に安全且つ制御可能な方式で植物細胞中へ有用な形質を組入れるための、インテイン媒介蛋白質トランススプライシングの使用を記載した従来技術はない。トランススプライシングを媒介としたＦ１子孫中への形質の組入れの概括的スキームを図２Ａに示す。２個の親系統（Ｐ１及びＰ２）のどちらも前記形質のコードに十分機能的な線状遺伝子を含まない。それに反して、それぞれは、好ましくは相同染色体上に位置する前記遺伝子断片（Ａ又はＢ）を含む。Ｐ１とＰ２間でのハイブリッド形成の結果として、断片Ａ及びＢによってコードされている蛋白質のトランススプライシング媒介組入れによって機能性形質を準備する子孫が生成する。一次ハイブリッドの自家受粉由来子孫Ｓ１の４分の１しか目的とする形質を保持しないが、他方で他の半数は前記形質を提供するために必要な２個の断片のうちの１個しか受け継がず、４分の１はＡ又はＢのどちらをも持たないことは前記の図から明白である。断片Ａ及びＢのどちらも有しない他の植物（不当な交配）との他家受粉によっては、機能性遺伝子に必要な２個の断片の１個しか各子孫植物に伝達されないので形質の伝達はもたらされないことも明白である。
【００８４】
本発明を実施するために使用することができるいくつかの手法が開発され、インテインが設計されている（上記に引用した参照文献）。それらは、事実上、真核細胞でのトランススプライシング事象を設計するための既知のインテイン型全ての使用を包含する。実施例３では、本発明者らは、ＥＰＳＰ合成酵素の２個の領域を接合して除草剤耐性を準備するインテイン媒介相互作用を説明する。実際、蛋白質トランススプライシングの発生なしに、機能に必要な領域を接合することによって、機能性蛋白質２量体の組入れの可能性を実証する。そのようなインテイン媒介蛋白質−蛋白質間の相互作用は、幾つかの特定の事例で蛋白質トランススプライシングなしに形質を準備するための代替案も提供する。
【００８５】
本発明の方法は、モジュール、又は構成単位が異なるトランスジェニック植物として使用し、所望の配列及び／又は途上にある異なる部分に由来する発現単位を組入れる好都合な方式として使用することができる。そのハイブリッド子孫は、設計したインテイン媒介トランススプライシングによって異なる親から受け継いだモジュールを組み立てるはずである。必要なモジュールを含む適当なトランスジェニック親ペアを選択することによって目的とする形質を形成することが可能であり、これは従来の育種における高価値ハイブリッド種子を生成するために適当な親植物ペアを選択することに非常によく似ている。そのようなモジュールの例には、異なるシグナルペプチド、結合領域（たとえばセルロース、ペクチン、澱粉結合領域など）、保持シグナル、区分化シグナル、活性化領域、酵素活性を有する領域、親和性タグ、調節配列、異なる当該遺伝子、及びその一部が含まれる。この点で、目的とする形質は広く理解され、特異的能力を有する機能性蛋白質だけでなく、特に特異的区画又は高分子マトリックスを標的とする蛋白質、又はその後の単離／精製用に設計した蛋白質を含む。
【００８６】
加えて、蛋白質レベルでのトランススプライシングは、ＲＮＡトランススプライシングによって得ることができない多くの重要な利点をもたらす。前記利点は以下の特徴の結果である：
ａ）インテイン媒介トランススプライシングは直接に蛋白質分子をもたらすが、リボザイム媒介トランススプライシングはＲＮＡ分子を形成し、ほとんどの場合、このＲＮＡ分子は蛋白質に翻訳され、それによって前記トランススプライシングのための細胞／細胞間区画の選択を制限し、
ｂ）本発明者らは蛋白質分子を扱っているのでインテイン媒介トランススプライシング成分を標的にすることによって高い柔軟性を準備するが、ＲＮＡ分子の標的化はサイトゾルに制限することが好ましく、
ｃ）上記の他に、ｐＨ、温度、又は求核性薬剤を変えることによって、設計したインテインはトランススプライシングの調節が可能になる。
ｄ）トランススプライシング用に設計したインテインは高効率で相互作用し、たとえ共有結合（トランススプライシング）が生じなくても、そのような相互作用に続いて酵素活性を準備する蛋白質領域を接合することができる。
【００８７】
インテイン媒介トランススプライシング又は相互作用の調節用パラメータのこのように多様な選択性（区分化選択と無生物パラメータの調節の組合せ）は、ＲＮＡトランススプライシング手法に比較して柔軟であり非常に広範な選択をもたらす。
【００８８】
しかしながら、好ましくは核染色体上で互いに関連する前記異種断片の最も好ましい位置を実現する方法を知らなくては、これらの潜在的適用例は全て、価値が制限される。
【００８９】
本発明によって前記断片は異なる相同染色体上にある（図２Ｂ、事例ＩＩＩ及びＩＶ）。事例ＩＩＩでは、自家受粉子孫は、形質を受け継ぐことができるが、減数分裂交差乗り換えが無視され又は無い場合、どちらの前記断片も保持しない植物との交配の結果として生じた子孫によって前記形質が受け継がれることはない。しかしながら、２個の相同染色体間の減数分裂期組換えは、物理的に前記断片Ａ及びＢを結合する可能性がある。そのような組換え事象の頻度は、２個の相同染色体上の前記断片間の相対的距離に直接依存する。
【００９０】
減数分裂期組換えによる前記断片の物理的結合を抑制するために、前記断片を相同染色体上の相対的に近い距離に置くのが好ましく、最も好ましくは相同染色体上の同じ座位に置き（図２Ｂ、事例ＩＶ）、それによって、そのような断片間の減数分裂期組換えの頻度を最小限度に抑えて事実上ゼロにする。前記断片のこの最も好ましい対立形質の位置を実現するために異なる技術的解決策がある。前記断片を部位特異的組換えによって予め設計した組込み部位の同じ座位に組み込むことができる（図２Ｃ）。そのような系の例には、以下が含まれる：バクテリオファージＰ１由来Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系（Ａｕｓｔｉｎら、１９８１年、Ｃｅｌｌ、２５号、７２９〜７３６頁）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来Ｆｌｐ−Ｆｒｔ系（Ｂｒｏａｃｈら、１９８２年、Ｃｅｌｌ、２９号、２２７〜２３４頁）、チゴサッカロミセスルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）由来Ｒ−ＲＳ系（Ａｒａｋｉら、１９８５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８２号、１９１〜２０３頁）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージＰｈｉＣ３１（Ｔｈｏｒｐｅ及びＳｍｉｔｈ、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９５号、５５０５〜５５１０頁、Ｇｒｏｔｈら、２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９７号、５９９５〜６０００頁）由来インテグラーゼ。
【００９１】
前記断片Ａ及びＢを１個の構築体ＡＢとして染色体ＤＮＡの中に組み込むことができる（図２Ｄ）。構築体の設計は、ＤＮＡ制御可能再配列（切取り又は遺伝子転移）の機構を使用し、ＤＮＡ断片（Ａ又はＢ）の１個の選択的除去を可能にするものでなければならず、それによって、同じ座位に断片Ａ又は断片Ｂを含む子孫を生成し、前記断片の１個のみ又は両断片を持つ植物の交配よって、両断片又はその転写物を接合するが、必要な転写物の１個しか目的とする形質の発現をもたらさない。
【００９２】
前記ＤＮＡ再配列の制御の一例は、断片Ａ及びＢの両側に異なる部位特異的リコンビナーゼによって認識される配列を置き、それぞれのリコンビナーゼの提供と同時に、断片Ａ又は断片Ｂを選択的に除去することである。或いは、転写開始部位（プロモーター）の配置の両側に、まさに前記断片間に逆組換え部位を置くことによって、前記転写開始部位の向きに応じて断片Ａ又はＢの選択的転写を導くことができる。前記領域の向きの反転（切取りではない）は、リコンビナーゼ供給源への曝露によって誘発することができる。その結果、断片Ａ又は断片Ｂの選択的転写の実現がそれらを（物理的に）除去せずに可能であるが、ただし逆位ＤＮＡをスイッチとして使用する。しかしながら、同じ位置にある両異種ＤＮＡ配列の存在下での１個の異種ＤＮＡ断片の選択的発現の事例は、本発明の好ましい実施形態の中にはない。これは、要求されるレベルの制御を形質の発現及び移動に対して提供することができないからである。
【００９３】
前記ＤＮＡ再配列制御の重要な実施形態は遺伝子転移の使用を含み、その場合断片の１個、たとえば、断片Ｂは非自律的転移因子内に位置し転写され、構築体からそれを切取りとることは断片Ａの転写を誘発する。トランスポゾンの切取りに続いて他の場所へのその再挿入が続くことも続かないこともあり、断片Ａ又はＢしか含まない子孫を選択することができる。ほとんどのトランスポゾンの再挿入が提供部位に近接に関連した位置で生じることを考慮して（Ｊｏｎｅｓら、１９９０年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２号、７０１〜７０７頁、Ｃａｒｒｏｌｌら、１９９５年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１３９号、４０７〜４２０頁）、（染色体対の異なる染色体上で）相反に結合する断片Ａ及びＢを含む子孫を選択する可能性が非常に高い。図２Ｅでは、部位標的組込み及び前記断片の切取りを含む、第１及び第２異種ヌクレオチド配列の対立形質の位置を達成するための様々な手法を要約する。トランスポザーゼ媒介又はリコンビナーゼ媒介前記断片の切取りは、１個（図２Ｅ、ａ／、ａ’／、ｄ／及びｄ’／）又は異なる２個のトランスポゾン系又はリコンビナーゼ系（図２Ｅ、ｂ／、ｂ’／、ｃ／、ｃ’／、ｅ／、ｅ’／、ｆ／及びｆ’／）を用いて実現することができる。異なる２系の使用が好ましい。異なる２個のトランスポゾン系の使用がより好ましい。重複するトランスポゾン末端を有する、異なる２個のトランスポゾン系の使用が最も好ましい（ｃ／及びｃ’／）実施形態である。
【００９４】
インテイン媒介蛋白質トランススプライシング（図３、４）又はインテイン媒介蛋白質断片相互作用（図５）による形質組入れ用構築体の設計の説明をそれぞれ実施例１、２及び３に記載する。部位特異的組換え又は遺伝子転移の使用によって構築体由来の第１及び第２異種ヌクレオチド配列の相同染色体上の同じ座位での位置付けが可能となり、これは交差子孫への目的とする形質の分配の制御に関して最も適している。（アグロバクテリウム媒介形質転換用ベクターのＴ−ＤＮＡでの）そのような構築体の概略図、及び異なる２個の植物トランスポゾン系（Ｓｐｍ／ｄＳｐｍ及びＡｃ／Ｄｓ）を使用する、１方の又は他方の前記異種ヌクレオチド配列の切取りを図６に示す。図６では、インテイントランススプライシング系の２つの成分（異種ヌクレオチド配列）は、同じＴ−ＤＮＡ上に位置（図６Ａ）するが、それぞれ異なるトランスポザーゼ、Ａｃ又はＳｐｍ、によって認識される異なるトランスポゾン末端（Ｄｓ又はｄＳｐｍ）を両側に置く。手短に言えば、Ｔ−ＤＮＡ中の構築体は、一端が重複する２個の非自律的転移因子を有する。そのような構築体を持つ植物又は植物細胞のＳｐｍ又は、Ａｃトランスポザーゼ源への曝露によって、Ｄｓ配列を両側に置く断片の切取り（Ａｃトランスポザーゼへ曝露）、又はｄＳｐｍ配列を両側に置く断片の切取り（Ｓｐｍトランスポザーゼへ曝露）をもたらす。得られたＴ−ＤＮＡ構造をそれぞれ図６Ｂ及びＣに示す。これらの得られた構築体は、（Ｂの場合には）Ｓｐｍ又は（Ｃの場合には）Ａｃトランスポザーゼの存在下でさえも安定している。遺伝子転移に必要な２個の非自律的トランスポゾン末端の１個が、他の非自律的転移因子と共に切取られるからである。残余の転移因子のそのような安定化は非常に有用であり、特に内在性トランスポザーゼ源を持つ植物の場合には有用であり、たとえば、Ａｃ又はＳｐｍトランスポザーゼの場合にはトウモロコシである。不要なＤＮＡ断片のトランスポゾンに基づく選択的除去のスキームを図７に示す。図７には、遺伝子転移は、他の不要な配列、たとえば、選択マーカー（ＳＭ）及び逆選択マーカー（ＣＳＭ）遺伝子の除去をももたらし、それによって必要な異種ヌクレオチド配列（ｈＤＮＡ１又は２）だけを持つ植物／植物細胞のスクリーニングを容易にする。対立形質の関係で異なる異種ヌクレオチド配列を有する植物の生成が可能なスキームの１つを図８に示す。選択マーカー遺伝子を有するこれらの例は、抗生物質耐性又は除草剤耐性を付与する遺伝子だけには限らない。そのような遺伝子の広範な一覧を以下に示す。植物系、細菌性ｃｏｄＡ、及びシトクロムＰ−４５０に適用可能な幾つかの逆選択マーカー遺伝子の例（Ｋｏｐｒｅｃｋら、１９９９年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１９号、７１９〜７２６頁、Ｇａｌｌｅｇｏら、１９９９年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３９号、８３〜９３頁）は、トランスポゾン系と組合せたその適用例を含めいくつかの論文に記載されている（Ｔｉｓｓｉｅｒら、１９９９年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１１号、１８４１〜１８５２頁）。
【００９５】
詳しく研究されている植物用トランスポゾン系があり、それらは文献に豊富に記載されている（概説は以下を参照：Ｄｅａｎら、１９９１年、Ｓｙｍｐ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ．、４５号、６３〜７５頁、Ｗａｌｂｏｔ、Ｖ．、２０００年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、４１号、７３３〜７４２頁、Ｆｅｄｏｒｏｆｆ、Ｎ．、２０００年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ、９７号、７００２〜７００７頁）。Ａｃ／Ｄｓ系（Ｂｒｉｚａら、１９９５年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４１号、３８３〜３９０頁、Ｒｏｍｍｅｎｓら、１９９２年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２０号、６１〜７０頁、Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎら、１９９５年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、９号、１７９７〜８１０頁、Ｔａｋｕｍｉ、Ｓ．、１９９６年、Ｇｅｎｏｍｅ、３９号、１１６９〜１１７５頁、Ｎａｋａｇａｖａら、２０００年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、４１号、７３３〜７４２頁）及びＳｐｍ／ｄＳｐｍ系（Ｃａｒｄｏｎら、１９９３年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、３号、７７３〜７８４頁、Ａａｒｔｓら、１９９５年、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．、２４７号、５５５５〜６４頁、Ｔｉｓｓｉｅｒら、１９９９年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１１号、１８４１〜１８５２頁）は、多くの作物植物を含む多くの植物種でのトランスポゾンタギングに関してよく確立されており、本発明を実施するためのその採用は当業者には常法である。本発明は、Ａｃ／Ｄｓ系及びＳｐｍ／ｄＳｐｍ系だけには限らない。実際に、その遺伝子転移に「カットアンドペースト」（切取り及び再挿入）機構を使用し、植物中で活性などんなトランスポゾン系も本発明に使用することができる。
【００９６】
実施例では、本発明者らは、植物細胞中でアグロバクテリウムが媒介したＴ−ＤＮＡ送達を使用し、それによって前記Ｔ−ＤＮＡは、ベクターとして前記第１及び／又は前記第２異種ヌクレオチド配列を含む。微粒子銃、電気穿孔法、又はプロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換による細胞中への前記ベクターの直接導入など、異なる方法を植物細胞中へのベクターの送達に使用することができる。アグロバクテリウム媒介植物形質転換が好ましい。それによって、アグロバクテリウムにより運搬されるＴｉプラスミドベクター（ＵＳ５，５９１，６１６号、ＵＳ４，９４０，８３８号、ＵＳ５，４６４，７６３号）、粒子銃、又は微粒子銃（ＵＳ０５１００７９２号、ＥＰ００４４４８８２Ｂ１号、ＥＰ００４３４６１６Ｂ１号）など、様々な適当な技術によってＤＮＡを植物細胞中へ形質転換することができる。原則として、たとえば、微量注入（ＷＯ０９２０９６９６号、ＷＯ０９４００５８３Ａ１号、ＥＰ１７５９６６Ｂ１号）、電気穿孔法（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１号、ＥＰ００２９０３９５Ｂ１号、ＷＯ０８７０６６１４Ａ１号）など、他の植物形質転換方法も使用することができる。形質転換法の選択は、形質転換すべき植物種に応ずる。たとえば、微粒子銃は、単子葉植物の形質転換に好ましく、他方双子葉植物には、アグロバクテリウム媒介形質転換が一般に良い結果をもたらす。
【００９７】
トランススプライシング系は２個の断片を含み、これら断片は途上で提供され相同染色体上の対立形質の位置に置かれている。これは、本系がよく制御され安全であることを意味し、たとえば、本系は未誘発状態では形質発現レベルはゼロであり、他の植物との他家受粉中では形質転移はゼロであり得る。
【００９８】
本発明を使用してセンス又はアンチセンス方向で発現可能な当該遺伝子又はその断片には以下が含まれる：澱粉修飾酵素（澱粉合成酵素、澱粉リン酸化酵素、脱分枝酵素、澱粉分枝酵素、澱粉分枝酵素ＩＩ、澱粉粒結合型澱粉合成酵素）、ショ糖リン酸合成酵素、ショ糖ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ（ｐｏｌｙｆｒｕｃｔａｎ  ｓｕｃｒａｓｅ）、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、シクロデキストリン糖転移酵素、フルクトシル（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）転移酵素、グリコーゲン合成酵素、ペクチンエステル分解酵素、アプロチニン、アビジン、細菌性納豆菌、大腸菌ｇｉｇＡ蛋白質、ＭＡＰＫ４及び直系（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅｓ）、窒素同化／代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼｐｈｉＣ３１、又は活性断片又はその変異体）、イソペンテニル転移酵素、ＳｃａＭ５（大豆カルモジュリン）、鞘翅目型毒素又はａｎ殺虫剤的活性断片、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合蛋白質類；脂質、アミノ酸、糖類、核酸、及び多糖類を代謝させる酵素類；スーパーオキシドジスムターゼ、タンパク質分解酵素不活性酵素前駆体、植物蛋白質毒素類、繊維生成植物中の形質改変繊維、バチルスチューリンゲンシス（Ｂｔ２毒素、殺虫性結晶蛋白質（ＩＣＰ）、ＣｒｙｌＣ毒素、δエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロトキシンなど）由来鞘翅目活性毒素、昆虫特異的トキシンＡａｌＴ、セルロース分解酵素類、アシドテルムスセルロチクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓ）由来Ｅ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素類、シンナモイルアルコール脱水素酵素、トレハロース−６−リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路酵素類、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵蛋白質、エルウィニアヘルビコラリコペン（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ  ｌｙｃｏｐｅｎ）合成酵素、ＡＣＣ  酸化酵素、ｐＴＯＭ３６コード蛋白質、フィチン酸分解酵素、ケト加水分解酵素、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタン酸）合成酵素、アシルキャリア蛋白質、ナピン、ＥＡ９、非高等植物フィトエン合成酵素、ｐＴＯＭ５コード蛋白質、ＥＴＲ（エチレン受容体）、色素体ピルビン酸リン酸ジキナーゼ、線虫誘導性膜貫通型細孔蛋白質、植物細胞形質強化光合成機能又は色素体機能、スチルベン合成酵素、フェノール類水酸化能酵素、カテコールジオキシゲナーゼ、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ、クロロムコン酸シクロイソメラーゼ、アントラニル酸合成酵素、アブラナ科アブラナ属ＡＧＬ１５蛋白質、フルクトース１，６−ビホスファターゼ（ＦＢＰａｓｅ）、ＡＭＶＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポティウイルスコート蛋白質、ＣＭＶコート蛋白質、ＴＭＶコート蛋白質、ルテオウイルスレプリカーゼ、ＭＤＭＶメッセンジャーＲＮＡ、突然変異体ジェミニウイルスレプリカーゼ、ミルトル（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）Ｃ１２：０選択性（ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ）アシル−���ＣＰチオエステラーゼ、植物Ｃ１０又はＣ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物合成酵素因子Ａ、植物合成酵素因子Ｂ、６−不飽和化酵素、植物細胞中の脂肪酸ペルオキシソーム酸化酵素活性を有する蛋白質、アシル−ＣｏＡ酸化酵素，３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシアセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ、５−エノルピルビルシキマート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）、フォスフィノスリシンアセチル転移酵素（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４蛋白質、ＡＣＣ  脱アミノ酵素、リボザイム、翻訳後切断部位を有する蛋白質、Ｇａｌ４転写アクチベータＤＮＡ結合領域及び転写活性化領域からなる蛋白質の融合体、オレオシン蛋白質と、融合蛋白質に脂質相を標的とさせることができる当該蛋白質との翻訳融合体、スルホンアミド耐性を付与するＤＨＰＳ遺伝子、細菌性ニトリラーゼ、２，４−Ｄモノオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、細菌性ニトリラーゼ、色素体内側エンベロープ膜内に存在する成熟リン酸輸送体蛋白質のアミノ末端疎水性領域と前記膜中を標的とした当該蛋白質との融合体など。
【００９９】
どんなヒト蛋白質又は動物蛋白質も、特にハイブリッド種子及びそれから生長した植物中で本発明のトランススプライシング系を使用し発現させることができる。そのような当該蛋白質の例には、とりわけ以下の蛋白質（薬剤蛋白質）が含まれる：免疫反応蛋白質（モノクローナル抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体など）、抗原、コロニー刺激因子、リラキシン、ポリペプチドホルモン、サイトカイン及びその受容体、インターフェロン、増殖因子及び凝固因子、酵素活性リソソーム酵素、線維素溶解ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシノーゲン、１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、及び融合体様機能保存蛋白質、上記蛋白質の突然変異体及び合成誘導体。
【０１００】
さらに、本発明の方法は、前記トランスジェニックコード配列のＰＴＧＳを抑制するために、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）サプレッサ蛋白質又は機能保存変異体、或いはその断片をコードする遺伝子を植物中で発現させることを含むことができる。前記ＰＴＧＳサプレッサ蛋白質遺伝子又は機能保存変異体、或いはその断片を前記トランスジェニックコード配列を持つ同じベクター又は追加のベクターで植物に提供することができる。前記ＰＴＧＳサプレッサ蛋白質は、ウイルス起源又は植物起源のものが好ましい。ＰＴＧＳサプレッサ蛋白質の例は、ジャガイモウイルスＸｐ２５蛋白質、アフリカ産キャッサバモザイクウイルスＡＣ２蛋白質、イネ黄班（ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｔｔｌｅ）ウイルスＰ１蛋白質、トマト矮化（ｂｕｓｈｙ  ｓｔｕｎｔ）ウイルス１９Ｋ蛋白質、ｒｇｓＣＡＭ又は機能保存変異体、或いはこれらの蛋白質の１つの断片である。前記機能保存変異体又は断片は、上記蛋白質の１つに対して配列同一性７５％が好ましく、少なくとも７５％が好ましい。ＰＴＧＳサプレッサ蛋白質についての詳細及びその用途はＷＯ０１３８５１２号に見出すことができる。
【０１０１】
さらに、本発明は、目的とする形質を発現するトランスジェニック多細胞植物体を提供し、前記植物体は子孫への前記形質の分配が制御されており、その場合前記形質の発現はポリペプチド断片のトランススプライシングによる蛋白質分子の産生を伴い、それによって前記ポリペプチド断片は異なる異種ヌクレオチド配列上にコードされる。前記異なる異種ヌクレオチド分子をこの植物の相同染色体上に組み込む。トランススプライシング又は他の特異的ポリペプチド相互作用後、前記ポリペプチドが異種蛋白質を形成することが好ましい。
【０１０２】
さらに、本発明は、本発明のトランスジェニック植物体部分又は生成物、或いは前記ハイブリッド形成により得られた植物種子を含む。さらに、請求項１ステップ（ｉ）又はステップ（ｉｉ）によって得られた、又は得ることができる植物又は植物材料（特に種子又はその細胞）。さらに、本発明の方法を実施するためのベクターを提供し、それによって前記ベクターは本明細書で定義した親異種ヌクレオチド配列を含む。さらに、本発明の方法を実施するためのベクター、特に図に示したもの、及び本発明の実施例で使用したものを提供する。
【０１０３】
要するに、本発明者らは、機能性蛋白質への非機能性蛋白質断片又は下位単位の組入れによる、形質を準備するモジュール原理に基づく形質／遺伝子固定系を提案する。そのような系は、交配中、特に不当な生殖交配中又は仮説の水平伝達の過程中に独立に分離する少なくとも２個の座位による目的とする形質の遺伝子制御に応じる。本発明に基づいて、必要な座位が存在し同じ細胞中で又は同じ生物体中で発現する場合そのような固定は、機能性蛋白質の組入れに左右される。本発明に基づいて、そのような機能の獲得は、蛋白質トランススプライシングによって実現することが好ましい。インテイン媒介トランススプライシングによって非機能性蛋白質断片から機能性蛋白質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組入れ（Ｍｉｌｌｓら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５号、３５４３〜３５４８頁）、及び異なる微生物中への組入れ（Ｓｈｉｎｇｌｅｄｅｃｋｅｒら、１９９８年、Ｇｅｎｅ、２０７号、１８７〜１９５；Ｗｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５号、９２２６〜９２３１頁、Ｓｕｎら、２００１年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．ＭｉｃｒｏＢｉｏｌ．、６７号、１０２５〜２９頁、Ｃｈｅｎら、２００１年、Ｇｅｎｅ、２６３号、３９〜４８頁）が可能となることを先に示した。しかしながら、本発明は、機能性蛋白質組入れ機構として蛋白質トランススプライシングだけには限らない。目的とする形質をもたらすそのような機能性を異数の蛋白質の異なるサブ単位を提供することによっても実現することができるが、ただし（ａ）当該蛋白質の機能性が当該サブ単位の存在に応じ、且つ（ｂ）形質成分の遺伝子が、不当交配の防止を可能にするようにコードされている場合に限る。
【０１０４】
本発明によって、たとえば、シグナルペプチド、結合領域、保持シグナル、膜貫通シグナル、活性化領域、酵素活性を有する領域、親和性タグ、調節配列のモジュールに由来する蛋白質をコードする配列の組入れも可能になる。そのようなモジュール的な手法は、特定の目的のための最適発現カセットを発見すること、或いは細胞又はその特定の区画中で過剰に発現、蓄積する特異的遺伝子の最適分泌又はトランジットペプチドを発見することを容易にする。この手法は、機能ゲノム科学及びプロテオミクス研究の貴重なツールで有り得る。たとえば、植物ライブラリを作出することができ、それによってライブラリの各構成要素は、上記モジュールクラスの１つの特定のモジュール（たとえば特異的シグナルペプチド）、たとえば、前記第１断片を含む。次いで、第２断片は当該蛋白質をコードすることになる。前記ハイブリッド形成に続き、前記蛋白質配列をトランススプライシングによって前記モジュールに結合させる。
【０１０５】
蛋白質スプライシングは、少なくとも２個の遺伝子設計した座位間でしか生じ得ず、この蛋白質スプライシングはｉｎ  ｖｉｔｒｏでは非常に効率的に生じており、それによって親ポリペプチドの定量的スプライシングを可能とし、翻訳されたポリペプチドが同じオルガネラを標的にしている限り、この蛋白質スプライシングは核ゲノム、色素体又はミトコンドリアゲノム、染色体外エピゾームなど、異なる細胞小器官ゲノム中でコードされているポリペプチド間で生じ得る。
【０１０６】
本明細書に記載の技術は、多細胞性動物にも同様に適用できることを述べなければならない。ヒトを除外する。
【実施例１】
【０１０７】
ＧＦＰのインテイン媒介トランススプライシング
ＧＦＰ遺伝子５’末端を、プラスミドｐＩＣＨ５２９０（３５Ｓ−オメガリーダｇｆｐコード配列−ｏｃｓターミネーター、Ｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製ＢＡＲ含有植物選択用バイナリーベクターｐＩＣＢＶ１、図９）由来のプライマー３５ｓｐｒ３（ｃｇｃ  ａｃａ  ａｔｃ  ｃｃａ  ｃｔａ  ｔｃｃ  ｔｔｃ  ｇ）及びｇｆｐｐｒ８（ｃｔｇ  ｃｔｔ  ｇｔｃ  ｇｇｃ  ｃａｔ  ｇａｔ  ａｔａ  ｇ）を使用しＰＣＲによって増幅した。シアノバクテリア（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）由来ＤＮＡＥインテインのＣ末端を含むＤＮＡ断片を、ゲノムＤＮＡ（米国基準菌株保存機構のＰＣＣ６８０３株）からプライマーｇｆｐｉｎｔｅ１（ｃｔａ  ｔａｔ  ｃａｔ  ｇｇｃｃ  ｇａｃ  ａａｇ  ｃａｇ  ａａｇ  ｔｔｔ  ｇｃｇｇ  ａａｔａｔ  ｔｇｃｃ  ｔｃａｇｔ）及びｉｎｔｅｐｒ２（ｔｔｔ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｔｔａ  ｔｔｔ  ａａｔ  ｔｇｔ  ｃｃｃ  ａｇｃ  ｇｔｃ  ａａｇ）を使用しＰＣＲによって増幅した。ＧＦＰ断片及びインテイン断片の融合体を予め増幅したＤＮＡ断片並びに第２増幅用プライマー３５Ｓｐｒ３及びｉｎｔｅｐｒ２を使用しＰＣＲによって製造した。ＰＣＲ生成物をｐＩＣＢＶ１６（Ｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製ＮｐｔＩＩを備える植物選択用バイナリーベクター、図１１；他のバイナリ−ベクターもまた使用することもできる）でＮｃｏ１−ＢａｍＨＩ断片としてクローン化した。得られたプラスミドｐＩＣ５’ｇｆｐｉｎｔ（図３）を配列決定により確認した。
【０１０８】
ＧＦＰ遺伝子３’末端をプラスミドｐＩＣＨ５２９０由来プライマーｇｆｐｐｒ９（ａａｇ  ａａｃ  ｇｇｃ  ａｔｃ  ａａｇ  ｇｔｇ  ａａｃ）及びｎｏｓｔｅｒｒｅｖ（ｔｃａ  ｔｃｇ  ｃａａ  ｇａｃ  ｃｇｇ  ｃａａ  ｃａｇ  ｇ）を使用しＰＣＲによって増幅した。シアノバクテリア由来ＤＮＡＥインテインのＮ末端を含むＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡからプライマーｉｎｔｅｐｒ３（ｔｔｔ  ｃｃａ  ｔｇｇ  ｔｔａ  ａａｇ  ｔｔａ  ｔｃｇ  ｇｔｃ  ｇｔｃ）及びｉｎｔｅｇｆｐ２（ｇｔｔ  ｃａｃ  ｃｔｔ  ｇａｔ  ｇｃｃ  ｇｔｔ  ｃｔｔ  ａｃａ  ａｔｔ  ｇｇｃ  ｇｇｃ  ｇａｔ  ｃｇｃ  ｃｃｃ  ａｔｔ）を使用しＰＣＲによって増幅した。インテイン断片及びＧＦＰ断片の融合体を予め増幅したＤＮＡ断片並びにプライマーｉｎｔｅｐｒ３及びｎｏｓｔｅｒｒｅｖ第２増幅用を使用しＰＣＲによって製造した。ＰＣＲ生成物をＮｃｏ１−ＢａｍＨＩ断片としてｐＩＣＢＶ１６でクローン化した。得られたプラスミドｐＩＣｉｎｔｇｆｐ３’（図３）を配列決定により確認した。
【０１０９】
インテイン媒介トランススプライシングで得られたＧＦＰ遺伝子産物は、アミノ酸１５６（Ｋ）と１５７（Ｑ）の間に追加の６個のアミノ酸（ＫＦＡＥＹＣ）を含む。この挿入はＧＦＰ蛍光に余り影響を与えなかった（Ｏｚａｗａら、２００１年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７３号、５８６６〜５８７４頁）。アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１中にｐＩＣ５’ｇｆｐｉｎｔ及びｐＩＣｉｎｔｇｆｐ３’を電気穿孔法によって形質転換した。両構築体をニコチアナベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉中でアグロバクテリウムが媒介する一時的発現を利用し、一時的に同時発現させた（Ｖａｑｕｅｒｏら、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６号、１１１２８〜１１１３３頁）。ＧＦＰ蛍光は、両構築体を同時発現させたときは検出され、構築体を別個に発現させたときは検出されなかった。
【０１１０】
両構築体もＢｅｎｔらによって記載された通りシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｃｏｌ−０）植物中に形質転換した（１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５号、１８５６〜１８６０頁）。種子を減圧浸潤後３週間目に採取し、発芽させ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含むプレート上で形質転換体に関してスクリーニングした。形質転換体の選択に同構築体を、さらに、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを使用しアグロバクテリウム媒介のタバコタバカム植物葉ディスク形質転換に使用した（Ｈｏｒｓｈら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７号、１２２９〜１２３１頁）。タバコ及びシロイヌナズナでは、ＧＦＰ蛍光は、いずれかの構築体だけの形質転換体では検出されない恐れがあるが、両導入遺伝子を含むＦ１植物では検出された。
【実施例２】
【０１１１】
ＥＰＳＰのインテイン媒介トランススプライシング
酵素５−エノルピルビルシキマート３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ合成酵素）は、ホスホエノルピルビン酸及びシキマート３−リン酸から５−エノルピルビルシキマート３−リン酸の形成を触媒する。ＥＰＳＰ合成酵素は、除草剤グリホサート（Ｎ−ホスホノメチルグリシン）の細胞標的である。サルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ａｒｏＡ遺伝子のＰ１０１Ｓ突然変異での突然変異対立遺伝子は、ＥＰＳＰ合成酵素をコードし、グリホサートに対する活性は低減している。植物中でこの遺伝子が発現するとグリホサートに対する耐性が付与される（Ｃｏｍａｉら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、３１７号、７４１〜７４４頁）。突然変異体ＥＰＳＰ遺伝子５’末端をサルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ゲノムＤＮＡ（米国基準菌株保存機構のＡＴＣＣ３９２５６株から調製）からプライマーｅｐｓｐ１（ｔｃｔｃｃ  ａｔｇ  ｇａａ  ｔｃｃ  ｃｔｇ  ａｃｇ  ｔｔａ  ｃａａ  ｃ）及びｅｐｓｐｐｒ２（ａｃｃ  ｔｇｇ  ａｇａ  ｇｔｇ  ａｔａ  ｃｔｇ  ｔｔｇ）を使用しＰＣＲによって増幅した。シアノバクテリア由来ＤＮＡＥインテインのＣ末端を含むＤＮＡ断片をｐＩＣ５’ｇｆｐｉｎｔからプライマーｉｎｔｅｐｒ５（ｃａａ  ｃａｇ  ｔａｔ  ｃａｃ  ｔｃｔ  ｃｃａ  ｇｇｔ  ａａｇ  ｔｔｔ  ｇｃｇ  ｇａａ  ｔａｔ  ｔｇｃ  ｃｔｃ  ａｇｔ）及びｉｎｔｅｐｒ２を使用しＰＣＲによって増幅した。ＥＰＳＰ断片及びインテイン断片の融合体を予め増幅したＤＮＡ断片並びにプライマーｅｐｓｐ１及びｉｎｔｅｐｒ２を使用しＰＣＲによって製造した。ＰＣＲ生成物をＮｃｏ１−ＢａｍＨＩ断片としてｐＩＣＨ５３００（Ｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製ＢＡＲ遺伝子含有植物選択用バイナリーベクター、図１０）でクローン化した。得られたプラスミドｐＩＣ５’ｅｐｓｐ−ｉｎｔ（図４）は、ＥＰＳＰ−Ｎ−インテイン融合体を含み、３５Ｓプロモーターの制御下、人工葉緑体トランジットペプチド（ｍａｓｓｍ  ｌｓｓａａｖ  ｖａｔｒａ  ｓａａｑａ  ｓｍｖａｐ  ｆｔｇｌｋ  ｓａａｓｆ  ｐｖｔｒｋ  ｑｎｎｌｄ  ｉｔｓｉａ  ｓｎｇｇｒ  ｖｑｃａ）に翻訳されて融合する。ｐＩＣ５’ｅｐｓｐ−ｉｎｔを配列決定により確認した。
【０１１２】
ＥＰＳＰ遺伝子３’末端をサルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ゲノムＤＮＡからプライマーｅｐｓｐ３（ｃｇｃ  ｔａｔ  ｃｔｇ  ｇｔｃ  ｇａｇ  ｇｇｃ  ｇａｔ）及びｅｐｓｐ４（ｃｇｇ  ｇｇａｔｃｃ  ｔｔａ  ｇｇｃ  ａｇｇ  ｃｇｔ  ａｃｔ  ｃａｔ  ｔｃ）を使用しＰＣＲによって増幅した。シアノバクテリア由来ＤＮＡＥインテインのＮ末端を含むＤＮＡ断片をｐＩＣｉｎｔｇｆｐ３’ＤＮＡからプライマーｉｎｔｅｐｒ３及びｉｎｔｅｐｒ６（ａｔｃ  ｇｃｃ  ｃｔｃ  ｇａｃ  ｃａｇ  ａｔａ  ｇｃｇ  ｇｇａ  ｔｔｔ  ｇｔｔ  ａａａ  ａｃａ  ａｔｔ  ｇｇｃ  ｇｇｃ  ｇａｔ）を使用しＰＣＲによって増幅した。インテイン断片及びＥＰＳＰ断片の融合体を予め増幅したＤＮＡ断片並びにプライマーｉｎｔｅｐｒ３及びｅｐｓｐ４を使用しＰＣＲによって製造した。ＰＣＲ生成物をＮｃｏ１−ＢａｍＨＩ断片としてｐＩＣＨ５３００でクローン化した。得られたプラスミドｐＩＣｉｎｔ−ｅｐｓｐ３’（図４）は、Ｃ−インテイン−ＥＰＳＰ融合体を含み、３５Ｓプロモーターの制御下、人工葉緑体トランジットペプチドに翻訳されて融合する。ｐＩＣｉｎｔ−ｅｐｓｐ３’を配列決定により確認した。
【０１１３】
インテイン媒介トランススプライシングから得られたＥＰＳＰ遺伝子産物は、アミノ酸２３５（Ｇ）と２３６（Ｒ）の間に追加の１０個のアミノ酸（ＫＦＡＥＹＣＦＮＫＳ）を含む。ＥＰＳＰ遺伝子中のこの位置は、遺伝子機能を損なうことなしに少なくとも５から１２個のアミノ酸挿入物を収容することができることが既に示されている（Ｃｈｅｎら、２００１年、Ｇｅｎｅ、２６３号、３９〜４８頁）。アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１中にｐＩＣ５’ｅｐｓｐ−ｉｎｔ及びｐＩＣｉｎｔ−ｅｐｓｐ３’を電気穿孔法によって形質転換した。Ｂｅｎｔらによって記載された通り、両構築体をシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｃｏｌ−０）植物中に形質転換した（１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５号、１８５６〜１８６０頁）。種子を減圧浸潤後３週間目に採取し、土壌に発芽させ、フォスフィノスリシン５０ｍｇ／Ｌを含む溶液（ＰＰＴ）を数回噴霧することによって形質転換体に関してスクリーニングした。
【０１１４】
形質転換体の選択に同構築体を、さらに、ＰＰＴ１０ｍｇ／Ｌを使用してアグロバクテリウム媒介のタバコタバカム植物葉ディスク形質転換に利用した（Ｈｏｒｓｈら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７号、１２２９〜１２３１頁）。植物に市販製剤のグリホサート（Ｎ−ホスホノメチルグリシン）を噴霧することにより形質転換体をＥＰＳＰ遺伝子活性に関して確認した。シロイヌナズナ及びタバコでは、いずれかの構築体だけを含む形質転換体は、グリホサート耐性を示さなかった。両構築体を含むＦ１植物はグリホサート耐性であった。
【実施例３】
【０１１５】
トランススプライシングせずにインテイン媒介機能性ＥＰＳＰの組入れ
ｐＩＣ５’ｅｐｓｐ−ｉｎｔＭは、構築体ｐＩＣ５’ｅｐｓｐ−ｉｎｔに類似するが、５個に代えて４個の天然Ｎエクステインアミノ酸を加えることにより、且つＣｙｓからＡｌａに変化させた第１のＮインテインアミノ酸により連結部ＥＰＳＰ−Ｎインテインが異なる。プライマーｉｎｔｅｐｒ５に代えてプライマーｉｎｔｅｐｒ７（ｃａａ  ｃａｇ  ｔａｔ  ｃａｃ  ｔｃｔ  ｃｃａ  ｇｇｔ  ｔｔｔ  ｇｃｇ  ｇａａ  ｔａｔ  ｇｃｃ  ｃｔｃ  ａｇｔ  ｔｔｔ  ｇｇｃ  ａｃ）を使用した点以外はＰＩＣ５’ｅｐｓｐ−ｉｎｔの戦略と同じ戦略にしたがってＰＩＣ５ｅｐｓｐ−ｉｎｔＭを製造した。
【０１１６】
ＰＩＣｉｎｔ−ｅｐｓｐ３’Ｍは、構築体ＰＩＣｉｎｔ−ｅｐｓｐ３’に類似するが、５個に代えて３個のＣエクステインアミノ酸を加えることにより、且つＣｙｓからＡｌａに変化させた第１のアミノ酸及び他の２個の天然アミノ酸、及びＡｓｎからＡｌａに変異させた最後のＣインテインアミノ酸により連結部Ｃインテイン−ＥＰＳＰで異なる。プライマーｉｎｔｅｐｒ６に代えてプライマーｉｎｔｅｐｒ８（ａｔｃ  ｇｃｃ  ｃｔｃ  ｇａｃ  ｃａｇ  ａｔａ  ｇｃｇ  ｇｔｔ  ａａａ  ａｇｃ  ａｇｃ  ｇｇｃ  ｇｇｃ  ｇａｔ  ｃｇｃ  ｃｃｃ  ａｔｔ  ｇ）を使用した点以外はＰＩＣｉｎｔ−ｅｐｓｐ３’の戦略と同じ戦略にしたがってＰＩＣｉｎｔ−ｅｐｓｐ３’Ｍを製造した。
【０１１７】
３個を変異させたアミノ酸は、インテイン媒介トランススプライシングを完全に防止するが、Ｎインテイン断片及びＣインテイン断片の連結は防止しない（Ｃｈｅｎら、２００１年、Ｇｅｎｅ、２６３号、３９〜４８頁）。アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１中にｐＩＣ５’ｅｐｓｐ−ｉｎｔＭ及びｐＩＣｉｎｔ−ｅｐｓｐ３’Ｍを電気穿孔法によって形質転換した。両構築体をシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｃｏｌ−０）及びタバコ中に上記の通り形質転換した。一次形質転換体は全てグリホサート感受性であったが、タバコ又はシロイヌナズナ中で両構築体を含むハイブリッドＦ１植物はグリホサート耐性を示した。
【実施例４】
【０１１８】
シロイヌナズナＡＨＡＳ遺伝子の分割
シロイヌナズナ（Ｇｅｎｂａｎｋ  受託番号  ＡＹ０４２８１９）由来アセト乳酸合成酵素（ＡＨＡＳ）遺伝子をシロイヌナズナゲノムＤＮＡからプライマーＡｌｓ１（５’ｔａａａｃｃａｔｇｇ  ｃｇｇｃｇｇｃａａｃ  ａａｃａａｃ３’）及びＡｌｓ２（５’ｇａｃｔｃｔａｇａｃ  ｃｇｇｔｔｔｃａｔｃ  ｔｃｔｃａｇｔａｔｔ  ｔａａｔｃ  ｃｇｇｃｃ  ａｔｃｔｃｃ３’）を使用し増幅し、Ｎｃｏ１−Ｘｂａ１断片としてＩｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製バイナリーベクターｐＩＣＢＶ２４（ＫａｎＲ、大腸菌及びアグロバクテリウム中で選択）でクローン化した。プライマーＡｌｓｍ５（５’ｃａｇｇａｃａａｇｔ  ｃｔｃｔｃｇｔｃｇｔ  ａｔｇ３’）、Ａｌｓ４（５’ｇａａａｇｔｇｃｃａ  ｃｃａｔｔｃｇｇｇａ  ｔｃａｔｃｇ３’）、Ａｌｓ３（５’ｃｇａｔｇａｔｃｃｃ  ｇａａｔｇｇｔｇｇｃ  ａｃ３’）、及びＡｌｓ２を使用しＰＣＲによってＳｅｒ６５３をＡｓｎへ変異させた。増幅、変異させた断片をＮｈｅ１−Ａｇｅ１断片としてクローン化した。プライマーＡｌｓ１、Ａｌｓｍ５、Ａｌｓｍ６（５’ａｃｇａｃｇａｇａｇ  ａｃｔｔｇｔｃｃｔｇ  ｔｇ３’）、及びＡｌｓｐｒ１を使用しＰＣＲによって第２アミノ酸Ｐｒｏ１９７をＳｅｒへ変異させた。増幅、変異させた断片をＳａｐｌ−Ｍｌｕｌ断片としてサブクローン化した。
【０１１９】
イネａｃｔｉｎ１プロモーターをイネゲノムＤＮＡからプライマーＡｃｔｐｒ１（５’ａｔｇｇｇｃｇｃｇｃ  ｃａｇａｔｃｔｇｃａ  ｔｇｃｃｇｇｔｃｇａ  ｇｇｔｃａｔｔｃａｔ  ａｔｇｃｔｔｇａｇ３’）及びＡｃｔｐｒ２（５’ｃｇｃｃａｔｇｇｔｔ  ｔａｔｃｇａｔａｇｃ  ｔｔａｔｃｇｔｃｔａ  ｃｃｔａｃａａａａａ  ａｇｃｔｃｃｇｃａｃ  ｇ３’）を使用しＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物をＡＨＡＳ遺伝子上流にＡｓｃｌ−Ｎｃｏｌ断片としてクローン化した。得られたプラスミドｐＩＣＨ１２５９０（図１６）は、イネａｃｔｉｎ１プロモーターとそれに続く２個の変異アミノ酸を有するシロイヌナズナＡＨＡＳコード配列、及びＮｏｓターミネーターを有する。
【０１２０】
変異Ａｈａｓ遺伝子をシアノバクテリア（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３ＤｎａＥインテインを使用し２個の部分に分割する。分割ＡＨＡＳの位置を試験するために、アミノ酸ＲＡＥＥＬＬＫ（アミノ酸４２８から４３４）をプライマーＡｌｓｍ５、Ａｌｓｍ４（５’ｇｇｃｃａｔｇｇｔｔ  ａａａａｃａａｔａｔ  ｔｃｃｇｃａａａｃｔ  ｔｇａｃｇｔｃｇｔｔ  ｃｔｃａａｇａａｃｃ  ｔｔａｔｔｃａｔｃｃ３’）、Ａｌｓｍ３（５’ｇｃｇｇａａｔａｔｔ  ｇｔｔｔｔａａｃｃａ  ｔｇｇｃｃｔｔｇａｔ  ｔｔｔｇｇａｇｔｔｔ  ｇｇａｇｇ３’）及びＮｏｓｔｅｒｒｅｖ（５’ｔｃａｔｃｇｃａａｇ  ａｃｃｇｇｃａａｃａ  ｇｇ３’）を用いてＰＣＲを利用してアミノ酸ＤＶＫＡＹＣＦＮＫＫＧで置換した。この置換によって、以下（図１７のｐＩＣＨ１２６１０及びｐＩＣＨ１２６５０を参照）に説明した構築体のインテイン媒介トランススプライシングによって生成されるはずの蛋白質に類似する蛋白質がもたらされる。変異断片をＢｓｐＥｌ−Ｓｃａｌ断片としてサブクローン化した。得られたプラスミドｐＩＣＨ１２６００（図１６）をＡＨＡＳ活性に関してヒトツブコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）細胞懸濁液培養物への砲撃、及びスルホメツロンメチル（Ｓｉｇｍａ）を０．５から３マイクロモルを含むプレート上での選択によって試験した。
【０１２１】
ＤｎａＥインテインのインテイン−Ｎ部分をシアノバクテリアゲノムＤＮＡからプライマーＩｎｔＮ１（５’ｇｃａａｇｃｔｔｇａ  ｃｇｔｃａａｇｔｔｔ  ｇｃｇｇａａｔａｔｔ  ｇｃｃｔｃａｇｔ３’）及びＩｎｔＮ３（５’ｃｇｔｃｔａｇａｇｔ  ｃｇａｃｃｔｇｃａｇ  ｔｔａｔｔｔａａｔｔ  ｇｔｃｃｃａｇｃｇｔ  ｃａａｇ３’）を用いてＰＣＲによって増幅し、Ａａｔ２−Ｘｂａ１断片としてｐＩＣＨ１２６００（図１６）中にサブクローン化した。得られたプラスミドｐＩＣＨ１２６１０（図１７）は、インテイン−Ｎ断片に融合しているＡＨＡＳ遺伝子のＮ部分を含む。
【０１２２】
ＤｎａＥインテインのインテイン−Ｃ部分を含むＰＣＲ断片をシアノバクテリアゲノムＤＮＡからプライマーＣｔｉｎｔｅ１（５’ｇｇｔｃｔａｇａａｔｃｇａｔｇｇｔｔａａａｇｔｔａｔｃｇｇｔｃｇｔｃｇ３’）及びＩｎｔＣ２（５’ｃｇｃｃａｔｇｇｔｔ  ａａａａｃａａｔｔｇ  ｇｃｇｇｃｇａｔｃｇ  ｃ３’）を用いて増幅した。人工葉緑体標的シグナル（配列：ｍａｓｓｍｌｓｓａａ  ｖｖａｔｒａｓａａｑ  ａｓｍｖａｐｆｔｇｌ  ｋｓａａｓｆｐｖｔｒ  ｋｑｎｎｌｄｉｔｓｉ  ａｓｎｇｇｒｖｑｃａ）を含むＰＣＲ断片をｐＩＣＨ５３００からプライマーＳｐｒ３（５’ｃｇｃａｃａａｔｃｃ  ｃａｃｔａｔｃｃｔｔ  ｃｇ３’）及びＣｔｉｎｔｅ２（５’ｃｔｔｔａａｃｃａｔ  ａｇｃｇｃａｔｔｇａ  ａｃｔｃｔｔｃｃｔｃ  ｃ３’）を用いて増幅した。融合葉緑体標的シグナル−インテイン−Ｃ断片を含む断片を両断片からプライマーＳｐｒ３及びＩｎｔＣ２を用いて増幅によって得た。この断片をＣｌａＩ及びＮｃｏｌを使用しｐＩＣＨ１２６００中にクローン化した（図１６）。得られたプラスミドｐＩＣＨ１２６５０は、イネａｃｔｉｎ１プロモーターの制御下でバイナリーベクター中に融合人工葉緑体標的シグナルＤｎａＥインテインＣ−ＡＨＡＳＣ断片を含む。分割ＡＨＡＳ遺伝子の機能を試験するためにｐＩＣＨ１２６１０及びｐＩＣＨ１２６５０（図１７）をヒトツブコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）細胞懸濁液培養物中に同時砲撃し、スルホメツロンメチル０．５から３マイクロモルを含む培地で細胞を選択した。
【実施例５】
【０１２３】
バルナーゼ遺伝子の分割
バルナーゼ遺伝子をシアノバクテリア（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３ＤｎａＢインテインを使用し分割した。適当な制限部位を両側に置くバルナーゼのＮ及びＣ末端部分用のＤＮＡ断片を市販のＤＮＡ合成会社のもの（ｃｏｍｐａｎｙ）によって化学合成した。
【０１２４】
Ｎ末端の配列は、
５’  ｇｃａａｔｃｇａｔｇ  ｇｃａｃａｇｇｔｔａ  ｔｃａａｃａｃｇｔｔ  ｔｇａｃｇｇｇｇｔｔ  ｇｃｇｇａｔｔａｔｃ  ｔｔｃａｇａｃａｔａ  ｔｃａｔａａｇｃｔａ  ｃｃｔｇａｔａａｔｔ  ａｃａｔｔａｃａａａ  ａｔｃａｇａａｇｃａ  ｃａａｇｃｃｃｔｃｇ  ｇｃｔｇｇｇａｃｇｔ  ｃｃｇｃ  ３’
である。
【０１２５】
Ｃ末端の配列は、
５’  ｃｇｃｃａｔｇｇｇｇ  ｔｇｇｃａｔｃａａａ  ａｇｇｇａａｃｃｔｔ  ｇｃａｇａｃｇｔｃｇ  ｃｔｃｃｇｇｇｇａａ  ａａｇｃａｔｃｇｇｃ  ｇｇａｇａｃａｔｃｔ  ｔｃｔｃａａａｃａｇ  ｇｇａａｇｇｃａａａ  ｃｔｃｃｃｇｇｇｃａ  ａａａｇｃｇｇａｃｇ  ａａｃａｔｇｇｃｇｔ  ｇａａｇｃｇｇａｔａ  ｔｔａａｃｔａｔａｃ  ａｔｃａｇｇｃｔｔｃ  ａｇａａａｔｔｃａｇ  ａｃｃｇｇａｔｔｃｔ  ｔｔａｃｔｃａａｇｃ  ｇａｃｔｇｇｃｔｇａ  ｔｔｔａｃａａａａｃ  ａａｃｇｇａｃｃａｔ  ｔａｔｃａｇａｃｃｔ  ｔｔａｃａａａａａｔ  ｃａｇａｔａａｇｇａ  ｔｃｃｇｃ  ３’．
である。
【０１２６】
バルナーゼＮ末端をＤｎａＢインテインのＮ部分に融合した。ＤｎａＢインテイン−Ｎ断片をシアノバクテリアＤＮＡからプライマーＤｎａＢｉｎｔＮｐｒ１（５’ｇｔＡＡＧＣＴＴＧＡ  ＣＧＴｃａｇａｇａｇ  ａｇｔｇｇａｔｇｃａ  ｔｃａｇｔｇｇａｇａ  ｔａｇ  ３’）及びＤｎａＢｉｎｔＮｐｒ２（５’ｃａＣＴＧＣＡＧｃｔ  ａｔａａｔｔｇｔａａ  ａｇａｇｇａｇｃｔｔ  ｔｃｔａｇ３’）を使用し増幅した。バルナーゼ断片（オートムギＡａｔｌｌ断片）及びインテイン断片（Ａａｔｌｌ  Ｐｓｔｌ断片）をＩｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製バイナリーベクター中にクローン化するとクローンｐＩＣＨ１２７９０がもたらされた。
【０１２７】
バルナーゼＣ末端をＤｎａＢインテインのＣ部分に融合した。ＤｎａＢインテイン−Ｃ断片をシアノバクテリアＤＮＡからプライマーｄｎａＢｉｎｔＣｐｒ１（ｇｔ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ｇｃｃ  ｃａｇ  ａａａ  ｔａｇ  ａａａ  ａｇｔ  ｔｇｔ  ｃｔｃ）及びｄｎａＢｉｎｔＣｐｒ２（ｔｃ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ｔｃｔ  ｔｇｃ  ｔｃｔ  ｔｃａ  ｃｔｇ  ｔｔａ  ｔｇｇ  ａｃａ  ａｔｇ  ａｔｇ  ｔｃａ  ｔ）を使用し増幅した。インテイン断片（ａＳａｃ１  Ｎｃｏｌ断片）及びバルナーゼ断片（Ｎｃｏ１  ＢａｍＨＩ断片）をＩｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製バイナリーベクター中にクローン化するとクローンｐＩＣＨ１２８２０がもたらされた。
【０１２８】
Ｎ及びＣ末端バルナーゼ−インテイン融合クローンの機能をニコチアナベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉のアグロ浸潤法（ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって試験した。予想通り、浸潤した区域は壊死した。
【０１２９】
バルナーゼ活性を低化させるために、フレームシフトをバルナーゼ遺伝子のＮ部分に導入した。ｐＩＣＨ１２７９０のＰＣＲをそのフレームシフトを含むプライマーＢａｒｎｐｒ４（５’ｇｃａａｔｃｇａｔｇ  ｇｃａｃａｇｇｔｔａ  ｔｔｃａａｃａｃｇｔ  ｔｔｇａｃ３’）、及びＢａｒｎｐｒ５（５’ｇｃｇｇａｃｇｔｃｃ  ｃａｇｃｃｇａｇｇｇ  ｃｔｔｇｔｇｃ３’）を用いて実施し、ｐＩＣＨ１２７９０中にサブクローン化するとプラスミドｐＩＣＨ１２８００がもたらされた。タペータム特異的プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｄ２１１６０、Ｔｓｕｃｈｉａら、１９９４年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２６号、１７３７〜１７４６頁）をイネゲノムＤＮＡからプライマーＴａｐｐｒ１（５’ｃｇｇａａｔｔｃｇｇ  ｃｇｃｃｔｔｔｔｔｔ  ｔｔａｃａｃａｇｔｔ  ｃａａａｇｔｇａａｔ  ｔｔｔｇｇ３’）及びＴａｐｐｒ２（５’ｃｇｃａｔｃｇａｔｇ  ｃｔｔａａｔｔａｇｃ  ｔｔｔｇｇｔｔａａｔ  ｔｇｇａｇ３’）を使用し増幅し、ｐＩＣＨ１２８００中にＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片としてサブクローン化するとプラスミドｐＩＣＨ１２８３０がもたらされた（図１８）。イネタペータム特異的プロモーターをｐＩＣＨ１２８３０（図１８）からｐＩＣＨ１２８２０中にＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片としてサブクローン化した。得られた構築体ｐＩＣＨ１２８４０（図１８）は、イネタペータム特異的プロモーターの制御下でインテイン−Ｃバルナーゼ−Ｃ融合体を含む。
【実施例６】
【０１３０】
プロ座位構築体の生成
最終構築体に必要な成分全ての組入れを段階的に行った。第１には、適当な制限部位を両側に置く、ＡｔｔＰ部位及びＡｔｔＢ部位を含む配列を重複オリゴヌクレオチドから製造し、Ｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製バイナリーベクターｐＩＣＢＶ２６中でクローン化した（Ｔ−ＤＮＡ境界間にＸｈｏＩ−ＣｌａＩ−ＸｂａＩ部位のみを含む、大腸菌及びアグロバクテリウム中でＫａｎＲ選択）。得られた配列（ａｇａｔｃｔｇｔｇｃ  ｃｃｃａａｃｔｇｇｇ  ｇｔａａｃｃｔｔｔｇ  ａｇｔｔｃｔｃｔｃ  ａｇｔｔｇｇｇｇｇｃ  ｇｔａｇｇｇａａｔｔ  ｃｔｇｔｃｔｇｃａｇ  ｔｃｔａｇａｔｔｔａ  ｔｇｃａｔｇｇｃｇｃ  ｇｃｃｔａｔｃｔｃｇ  ａｇｃｔｃｇａａｇｃ  ｃｇｃｇｇｔｇｃｇｇ  ｇｔｇｃｃａｇｇｇｃ  ｇｔｇｃｃｃｔｔｇｇ  ｇｃｔｃｃｃｃｇｇｇ  ｃｇｃｇｔａｃｔｃｃ  ａｃｃｔｃａｃｃｃａ  ｔｃａｃｔａｇｔｔｇ  ｔｇｇｔａｃｃａｔｃ  ｇｃａｇｇｇｃｃｃ）は構築体ｐＩＣＨ１２９２０中に存在する。Ｎ末端バルナーゼ−インテイン断片（ｐＩＣＨ１２８３０由来ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ１断片、図１８）、Ａｈａｓ−インテイン断片（ｐＩＣＨ１２６１０由来Ａｓｃｌ  ＸｈｏＩ断片、図１７）、及びＯｃｓターミネーター（ｐＩＣＨ１２９００由来ＸｂａＩ  Ｐｓｔ１断片）をｐＩＣＨ１２９２０中にサブクローン化した。得られたクローンｐＩＣＨ１２９５０（図１９）は、バイナリーベクター中に両Ｎ末端バルナーゼ並びにＡｔｔＰ及びＡｔｔＢ部位を両側に置くＡｈａｓ断片を含む。
【０１３１】
次に、適当な制限部位を両側に置くＡｔｔＰ部位を含む配列を重複オリゴヌクレオチドから製造し、ｐＩＣＢＶ２６中でクローン化した。得られた構築体ｐＩＣＢＶ１２８５０は、Ｔ−ＤＮＡ上に配列（ｇｇｔａｃｃｔｇｃａ  ｇｔａｔｔｃｔａｇａ  ｔｔｃｇａａｔｔｃｔ  ｃｇａｇｔｇｔｇｇｃ  ｇｃｇｃｃｇｔｇｃｃ  ｃｃａａｃｔｇｇｇｇ  ｔａａｃｃｔｔｔｇａ  ｇｔｔｃｔｃｔｃａｇ  ｔｔｇｇｇｇｇｃｇｔ  ａｇｇｇｃｃｃｔ）を含む。Ｃ末端インテイン−バルナーゼ断片（ｐＩＣＨ１２８４０由来ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片、図１８）、Ｏｃｓターミネーター（ｐＩＣＨ１２９００由来ＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ１断片）、及びＣ末端インテイン−Ａｈａｓ断片（ｐＩＣＨ１２６５０由来Ａｓｃｌ  ＸｈｏＩ断片）をｐＩＣＨ１２８５０中でサブクローン化した。得られたクローンｐＩＣＨ１２９１０（図１９）は、バイナリーベクター中に両Ｃ末端バルナーゼ及びＡｈａｓ断片、及びＡｔｔＰ部位を含む。
【０１３２】
Ｃ末端断片及びＮ末端断片をｐＩＣＨ１２９１０由来Ｋｐｎｌ  Ａｐａｌ断片をｐＩＣＨ１２９５０中にサブクローニングすることによって１個のバイナリーベクター中で組み合わせる（図１９）と、ｐＩＣＨ１２９６０がもたらされた（図２１）。
【０１３３】
形質転換用選択マーカー：
トウモロコシユビキチンプロモーターの制御下でＨＰＴ遺伝子を植物の形質転換に使用した。選択を容易にするために、イントロンをＨＰＴコード配列に挿入した。まず、クローニング用標的部位をｐＩＣ０５２（ｐＵＣ１９中にＨＰＴコード配列−Ｎｏｓターミネーター）から重複プライマーＢａｍｈｐｔ（５’ｃｇｇｇａｔｃｃａａ  ｔｃａｇａｔａｔｇａ  ａａａａｇｃｃｔｇａ  ａｃ３’）、Ｈｐｔｉｎｔ１（５’ｃｃａｃａａｃｔｇｔ  ｇｇｔｃｔｃａａｇｇ  ｔｇｃｔｔｇａｃａｔ  ｔｇｇｇｇａｇｔｔｃ  ａｇ３’）、Ｈｐｔｉｎｔ２（５’ｇｇａｔａｔｃｇｇｔ  ｃｔｃｇｔａｃｃｔｃ  ｃｇｇａａｔｃｇｇｇ  ａｇｃｇｃｇｇ３’）、Ｓｇｆｈｐｔ（５’ｃｇｃａｇｃｇａｔｃ  ｇｃａｔｃｃａｔｔｇ  ｃｃｔｃｃｇｃｇａｃ  ｃｇｇｃｔｇｇａｇａ  ａｃａｇｃｇ３’）、及びＩｎｔｔａｒｇ（５’ａｇｇｔａｃｇａｇａ  ｃｃｇａｔａｔｃｃａ  ｃａａｃｔｇｔｇｇｔ  ｃｔｃａａｇｇｔ３’）を用いてＰＣＲ断片を増幅することによってＨＰＴコード配列に挿入し、増幅した断片をＢａｍＨＩ  Ｓｇｆｌ断片としてｐＩＣ０５２中にサブクローニングした。イントロンをペチュニアゲノムＤＮＡからプライマーＩｎｔｐｅｔ３（５’ｇｔｃｔｇｇｔｃｔｃ  ａｇｇｔａａｇｔｔｃ  ｔｇｃａｔｔｔｇｇｔ  ｔａｔｇｃｔｃｃｔｔ  ｇｃａｔｔｔ３’）及びＩｎｔｐｅｔ４（５’ｇｔｃｔｇｇｔｃｔｃ  ｔａｃｃｔｇｔａｇｃ  ａａｔａａｔｔａａａ  ａｃａａａａａｔａ３’）を用いて増幅し、Ｂｓａ１断片として上記プラスミド中にクローン化するとプラスミドｐＩＣＨ１２７１０がもたらされた。トウモロコシユビキチンプロモーターをゲノムＤＮＡからプライマーＵｂｉ１（５’ｔｔｇｃａｔｇｃｃｔ  ｇｃａｇｔ  ｇｃａｇｃ  ｇｔｇａｃｃｃｇｇｔ  ｃ３’）及びＵｂｉ２（５’ｇｇｇａｔｃｃｔｃｔ  ａｇａｇｔｃｇａｃｃ  ｔｇｃａｇａａｇｔａ  ａｃａｃｃａａａｃａ  ａｃａｇｇｇｔｇ３’）を使用しＰＣＲによって増幅し、Ｓｐｈｌ−ＢａｍＨＩ断片としてＨＰＴ（ｐＩＣＨ１２７１０由来ＢａｍＨＩ  ＸｂａＩ断片）と共にｐＩＣＨ１２７２０（制限部位及びＡｔｔＢ部位を含む中間構築体：配列５’ｔｃｔａａｇｃｔａｃ  ｔｃｇａｇａｃｔａｇ  ｔｇｃａｔｇｃｔｇｔ  ｔｃｔａｇａｃｔｃｇ  ａａｇｃｃｇｃｇｇｔ  ｇｃｇｇｇｔｇｃｃａ  ｇｇｇｃｇｔｇｃｃｃ  ｔｔｇｇｇｃｔｃｃｃ  ｃｇｇｇｃｇｃｇｔａ  ｃｔｃｃａｃｃｔｃａ  ｃｃｃａｔｃｇｇｔａ  ｃｃｇ３’）中にクローン化した。得られた構築体ｐＩＣＨ１２８７０（図２０）は、ハイグロマイシン遺伝子、トウモロコシユビキチンプロモーターに融合させたイントロンとそれに続くＡｔｔＢ部位を含む。
【０１３４】
最後に、ＨＰＴ遺伝子をＫｐｎ１−Ｓｐｅ１断片としてｐＩＣＨ１２９６０（図２１）中にサブクローン化した。得られた構築体ｐＩＣＨ１２９７０（図２１）は、ＡｈａｓのＮ及びＣ末端、インテイン断片に融合させたバルナーゼ、ＨＰＴ選択マーカー、２個のＡｔｔＰ部位、及び２個のＡｔｔＢ部位を含む。
【実施例７】
【０１３５】
インテグラーゼクローンの構築
ｐＩＣＨ１３１６０（図２０）は、ストレプトマイセスファージＣ３１インテグラーゼ（Ｄａｖｉｄ  Ｏｗより入手、米国農務省農業研究部植物遺伝子発現センター、米国カリフォルニア州９４７１０、Ａｌｂａｎｙ）、並びにｐＩＣ０２８からプライマーＳｐｍｐｒｆｗｄ（５’ｃｇｔｃｔａｇａｇｔ  ｃａａａｇｇａｇｔｇ  ｔｃａｇｔｔａａｔｔ  ａ３’）及びＳｐｍｐｒｒｅｖ（５’ｃｇｃｔｇｃａｇｔｇ  ｃｔｔｇｇｃｇａｇｇ  ｃｃｇｃｃｃ３’）を用いてＰＣＲによって増幅したＳｐｍプロモーターをＩｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製バイナリーベクター（アグロバクテリウム及び大腸菌中で選択：ＫａｎＲ）中でクローニングすることによって製造した。
【０１３６】
トウモロコシユビキチンプロモーターをｐＩＣＨ１２７２０からＢｓｐＤ１−平滑Ｐｓｔ１断片として、Ａｓｃ１−平滑及びＰｓｔ１で消化したｐＩＣＨ１３１６０（図２０）中にサブクローン化した。得られたプラスミドｐＩＣＨ１３１３０（図９）は、トウモロコシユビキチンプロモーターの制御下でインテグラーゼを含む。
【実施例８】
【０１３７】
プロ座位を有するトランスジェニック植物の生成
ｐＩＣＨ１２９７０（図２１）、ｐＩＣＨ１３１３０（図２０）、及びｐＩＣＨ１３１６０（図２０）構築体は、ハイグロマイシン選択を利用しトウモロコシ、イネ、及びタバコに形質転換した。
【０１３８】
突然変異分割ＡＨＡＳ遺伝子を発現する植物を選択するために、ｐＩＣＨ１２９７０形質転換体にクロルスルホン（Ｇｌｅａｎ、デュポン社）を除草剤耐性に十分な濃度で噴霧した（或いは、構築体ｐＩＣＨ１２９６０（図２１）をクロロスルフロン又はスルホメツロンメチルでの選択を利用し植物に形質転換させることができ、ＡＨＡＳを十分な濃度で発現する形質転換体の直接選択という利点が備わる）。分割バルナーゼ遺伝子が存在するにも関わらず健康に見えたが雄性不稔であった植物をサザンブロットによって分析して単一導入遺伝子を含む個体を同定した。そのような形質転換体をｐＩＣＨ１３１３０形質転換体（図２０）又はｐＩＣＨ１３１６０（図２０）形質転換体によって受粉させた。同じ形質転換体を野生型植物とも受粉させ未変性の非再組込み導入遺伝子座を有する植物を救済した。Ｆ１植物（ｐＩＣＨ１２９７０×インテグラーゼ形質転換体）は、両導入遺伝子（ｐＩＣＨ１２９７０導入遺伝子、図２１参照、インテグラーゼ、図２０参照）の存在に関してＰＣＲによって確認し種子を採取した。実生Ｆ２を生長させ、ＰＣＲによってスクリーニングして分割バルナーゼ遺伝子及びＡｈａｓ遺伝子のＮ末端部分又はＣ末端部分を欠く組換え体を検出した。そのような植物は、完全に稔性であった。（インテグラーゼ媒介組換えの結果として）構築体の相補的部分を含む植物対を交配した。これらの交配から入手した実生にクロルスルフロンを噴霧して、構築体の両方の部分を含んでいない植物を除去した。クロルスルフロンに耐性だった植物も全て雄性不稔であった。
【０１３９】
トランスジェニック植物の生成に以下の方法を使用した。
【０１４０】
タバコ形質転換
ハイグロマイシン（２５〜１００ｍｇ／Ｌ）、又はスルホメツロンメチル（０．５〜３．０マイクロモル）、又はクロルスルフロン（０．２〜５．０マイクロモル）での選択を使用し、構築体をアグロバクテリウム媒介のタバコタバカム植物葉ディスク形質転換に使用した（Ｈｏｒｓｈら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７号、１２２９〜１２３１頁）。
【０１４１】
イネ形質転換
イネｃｖｓ．プサバスマチ（Ｐｕｓａ  Ｂａｓｍａｔｉ）１、コシヒカリ（Ｋｏｓｈｈｉｋａｒｉ）などの成熟胚及び未成熟胚からカルス培養を誘導した。
培地は、Ｃｈｕ（Ｎ６）塩及びビタミン（Ｃｈｕら、Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ｓｉｎｉｃａ、１８（５）：６５９〜６８頁、１９７５年）に基づいた。
カルス誘導及び増殖培地にショ糖３０ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン６００ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ  ２．０ｍｇ／Ｌ、及び０．３％ｇｅｌｒｉｔｅを補充した。
再生前培地には、ショ糖３０ｇ／Ｌ、ＮＡＡ  １ｍｇ／Ｌ、ＢＡ  ２ｍｇ／Ｌ、ＡＢＡ  ２ｍｇ／Ｌ、及び０．６％ｇｅｌｒｉｔｅと共にＮ６塩及びビタミンを含めた。
再生培地には、ショ糖３０ｇ／Ｌ、ＮＡＡ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ＢＡ  ２ｍｇ／Ｌ、及び０．６％ｇｅｌｒｉｔｅと共にＮ６塩及びビタミンを含めた。
【０１４２】
感染培地（ＩＭ）には、２，４−Ｄ  ２ｍｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、マルトース６０ｇ／Ｌ、アスコルビン酸５０ｍｇ／Ｌ、ＭＥＳ（２−Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）１ｇ／Ｌ、及びアセトシリンゴン（ＡＳ）４０ｍｇ／Ｌと共にＮ６塩及びビタミンを含めた。培地のｐＨを１ＮのＫＯＨで５．２に調整した。
【０１４３】
共培養培地（ＣＭ）は、ＩＭ（アスコルビン酸を除く）と同じであり、０．６％ｇｅｌｒｉｔｅを加えることによって固化させた。
【０１４４】
感染培地をろ過滅菌したが、他の培地は全て、オートクレーブにかけた。滅菌後ＤＭＳＯ（４００ｍｇ／ｍｌ）に溶解したＡＳを加えた。
【０１４５】
適当なバイナリプラスミドを含むアグロバクテリウム培養物（株ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＬＢＡ４４０４など）を適当な抗生物質を補充したＬＢ２Ｎ（ＮａＣｌ  ２ｇ／Ｌ及び１．５％寒天を含むＬＢ培地）プレート上、室温で３日間増殖させた。細菌をプレートから掻き取り、５０−ｍＬのファルコンチューブに入れたＩＭ（１０〜２０ｍｌ）中に再懸濁した。チューブをシェーカープラットフォームに水平に固定し、室温で４から５時間低速で振盪した。細菌懸濁液の光学濃度を測定しＯＤ６００を１．０〜２．０に調整した。
【０１４６】
カルス片をアグロバクテリウム懸濁液中室温で２０〜１８０分間培養し、ろ紙ディスク上にブロットし、マルトース６０ｇ／Ｌを含むｇｅｌｒｉｔｅ固化ＣＭに移した。ＣＭ上で培養３日から６日後にカルスを滅菌水で５度洗浄し、ショ糖６０ｇ／Ｌ、適当な選択剤、及び適宜Ｔｉｍｅｎｔｉｎ  １５０ｍｇ／Ｌを含むｇｅｌｒｉｔｅ固化ＣＭに移した。
【０１４７】
選択下で発生させた耐性カルスを適当な選択剤を含む再生前培地にプレートした。２週間後、培養物を適当な選択剤を含む再生培地に移した。再生した苗を土壌へ移植する前に半強度のホルモン不含Ｎ６培地で１ヶ月間生長させた。
【０１４８】
ｈｐｔ（ハイグロマイシン  ホスホ転移酵素）遺伝子に基づく選択のために、ハイグロマイシンＢを濃度２５〜１００ｍｇ／Ｌで使用した。ＡＨＡＳ（アセトヒドロキシ酸合成酵素）遺伝子の除草剤耐性形に基づく選択をスルホメツロンメチル（０．５〜３．０マイクロモル）又はクロルスルフロン（０．２〜５．０マイクロモル）について実施した。
【０１４９】
トウモロコシの形質転換
トウモロコシの未成熟胚及び系統Ａ１８８、Ｈｉｌｌなどから入手したカルス培地を本質的にイネの培養物と同様の方法で形質転換した。ほとんどの培地及び形質転換ステップは同じであった。再生前培地は使用しなかった。再生培地には、Ｎ６塩及びビタミン、ショ糖３０ｇ／Ｌ、Ｚｅａｔｉｎ２ｍｇ／Ｌ、及び２，４−Ｄ  ０．０５ｍｇ／Ｌを含めた。チオ硫酸銀を再生培地に濃度０．０１〜０．０６ｍＭで加えた。
【０１５０】
【表１】
2005536990.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】機能性蛋白質の形成をもたらすインテイン媒介トランススプライシングの一般的スキームを示す図である。
【図２Ａ】本発明の一般原理を示す図であり、そこではトランススプライシングが媒介する機能性蛋白質の形成が、ハイブリッド子孫細胞中で行われる。
【図２Ｂ】生物体の宿主染色体上での第１及び第２異種ヌクレオチド配列の可能な４つの相対的位置を示す図である。事例ＩＩＩ及びＩＶは、本発明のトランスジェニック多細胞植物中での前記異種配列の相対的位置を示す。２つの染色体、並びに２個の断片（Ａ及びＢ）によってコードされている目的とする形質を有する２倍体生物を一例として使用する。
【図２Ｃ】前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列の対立形質の位置を達成し、部位標的組込みによるトランススプライシングを提供する基本原理を示す図である。
【図２Ｄ】前記第１及び前記第２異種ＤＮＡ配列の対立形質の位置を達成し、遺伝子転移によるトランススプライシングを提供する基本原理を示す図である。
【図２Ｅ】相同染色体上での異なる異種ＤＮＡ配列の対立形質の位置を達成する方法の一般的スキームを示す図である。
【図３】プラスミドｐＩＣ５’ｇｆｐｉｎｔ及びｐＩＣｉｎｔｇｆｐ３’のＴ−ＤＮＡ領域を示す概略図である。
【図４】プラスミドｐＩＣ５’ｅｐｓｐ−ｉｎｔ及びｐＩＣｉｎｔ−ｅｐｓｐ３’のＴ−ＤＮＡ領域を示す概略図である。
【図５】プラスミドｐＩＣ５’ｅｐｓｐ−ｉｎｔＭ及びｐＩＣｉｎｔ−ｅｐｓｐ３’ＭのＴ−ＤＮＡ領域を示す概略図である。
【図６】ＥＰＳＰコード配列の５’又は３’部分の対立形質の位置を達成するために設計した構築体（Ａ）、並びにトランスポザーゼ源への曝露と同時の非自律的転移因子（それぞれＤｓ又はｄＳｐｍ）の切取りの結果として生じるその誘導体（Ｂ及びＣ）を示す概略図である。
【図７】トランスポザーゼ源への曝露直後の遺伝子転移が媒介する不要な断片の除去を経て、異なる異種ＤＮＡ断片（ｈＤＮＡ１及びｈＤＮＡ２）の対立形質の位置を達成するために設計した構築体（中央）の一般的スキームを示す図である。ＳＭ：選択形質転換マーカー、ＣＳＭ：逆選択マーカー。上段には、それぞれのトランスポザーゼの作用によって切取られる不要な断片を示す。下段には、遺伝子転移によって後に残された所望の断片を示す。
【図８】異なる異種ＤＮＡ断片（ｈＤＮＡ１及びｈＤＮＡ２）を対立形質の位置で有する植物の、遺伝子転移を使用する生成方法を示す概略図である。植物１を植物２と交配することによりトランスポザーゼを植物１の子孫に提供する。ＳＭ：選択マーカー遺伝子、ＣＳＭ：逆選択マーカー遺伝子、ＴＰａｓｅ：トランスポザーゼ。
【図９】図３及び４に示す構築体を作製するために使用する中間構築体及びバイナリーベクターを示す図である。
【図１０】プラスミドｐＩＣＨ５３００のマップを示す図である。
【図１１】Ｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製バイナリーベクターｐＩＣＢＶ１６のマップを示す図である。
【図１２】現存の遺伝子／トランスジェニックハイブリッド形成系用の一般的スキームを示す図である。現在の系は３つの植物系統：雄性不稔系統、維持系統、及び稔性回復系統の設計を必要とする。
【図１３】本発明によるハイブリッド種子の生成方法の原理を示す概略図である。本系は、本発明の親異種ヌクレオチド配列を含むプロ座位を有する、１つの原親系統Ａを設計するだけでよい。系統Ａは、除草剤耐性（ＨＲ）及び雄性不稔（ｍｓ）でよく、利用した耐性形質に適した除草剤を使用し選択できるようにする。前記親異種ヌクレオチド配列の分割によって、それぞれ、前記第１及び前記第２異種ヌクレオチド配列を含む系統Ａ１及び系統Ａ２がもたらされる。したがって、系統Ａ１及びＡ２は、雄性稔性及び除草剤感受性（ＨＳ）である。系統Ａ１及びＡ２は、自家受粉によって維持することができる。系統Ａ１及び系統Ａ２の交配によって、本発明の雄性不稔及び除草剤耐性系統Ａ１／Ａ２がもたらされ、それによって前記除草剤耐性を使用し系統Ａ１の自家受粉子孫及び系統Ａ２の自家受粉子孫を除去することができる。系統Ａ１／Ａ２と野生型（ＷＴ）系統でよい系統Ｂの交配によって、Ａ１／Ａ２植物上で生長する種子（Ｆ１子孫）がもたらされる。前記Ｆ１子孫種子を播種すると、それから生長するＦ１植物は雑種強勢を示す。
【図１４Ａ】本発明によるハイブリッド種子の生成方法のステップを示す。上段に示した親異種ヌクレオチド配列を含むプロ座位を有する親系統Ａからイソ座位を持つ系統Ａ１及びＡ２を作出するスキームを示す図である。系統ＡをリコンビナーゼＡ１で処理すると、断片ＨＲ５’及びＭＳ５’を含む親異種ヌクレオチド配列の一部が除去され、よって系統Ａ１が形成される。系統ＡをリコンビナーゼＡ２で処理すると、断片ＨＲ３’及びＭＳ３’を含む親異種ヌクレオチド配列の一部が除去され、よって系統Ａ２が形成される。  遺伝子断片は全て、トランススプライシングが可能なインテイン断片との翻訳性融合体として設計することができる。黒塗り三角及び点描三角は、異なる部位特異的リコンビナーゼによって認識される組換え部位を示す。  ＳＭ：選択マーカー、ＨＲ３’：除草剤耐性を付与する遺伝子の３’断片、ＨＲ５’：除草剤耐性を付与する遺伝子の５’断片、ＭＳ３’：雄性不稔をもたらす遺伝子の３’断片、ＭＳ５’：雄性不稔をもたらす遺伝子の５’断片。
【図１４Ｂ】本発明によるハイブリッド種子の生成方法のステップを示す。系統Ａ１と系統Ａ２の交配による雄性不稔系統の作出（中下段）を示す図である。系統Ａ１の自家受粉子孫（下段左図）及び系統Ａ２の自家受粉子孫（下段右図）を除草剤感受性によって除去することができ、雄性不稔除草剤耐性系統Ａ１／Ａ２純粋作物が得られるようにする（下段中央）。
【図１４Ｃ】本発明によるハイブリッド種子の生成方法のステップを示す。系統Ａ１／Ａ２の交配（系統Ａ１×Ａ２）によるハイブリッド種子生成を示す図である。子孫は全て、除草剤感受性且つ雄性不稔である。交配子孫は、雑種強勢を示すが、系統Ｂの自家受粉子孫は雑種強勢を示さない。系統Ｂ植物上で生長する自家受粉子孫種子は、系統Ａ１／Ａ２上で生長する交配子孫種子から、それらを別々に収穫することによって分離することができる。
【図１４Ｄ】本発明によるハイブリッド種子の生成方法のステップを示す。種子発芽が制御されているＦ２子孫を得るためのハイブリッド種子生成を示す図である。Ａ３座位は、Ａ４座位及びＢ４座位によって提供されたアクチベータによって一度活性化された（Ａ３＊）種子発芽の制御を準備する。
【図１５】イソ座位を生成するために可能な手法を示す図である。ＳＭ：選択マーカー。黒塗り三角及び点描三角は、異なる部位特異的リコンビナーゼによって認識される組換え部位を示す。
【図１６】プラスミドｐＩＣＨ１２５９０及びｐＩＣＨ１２６００のＴ−ＤＮＡ領域を示す概略図である。
【図１７】プラスミドｐＩＣＨ１２６１０及びｐＩＣＨ１２６５０のＴ−ＤＮＡ領域を示す概略図である。
【図１８】プラスミドｐＩＣＨ１２８３０及びｐＩＣＨ１２８４０のＴ−ＤＮＡ領域を示す概略図である。
【図１９】構築体ｐＩＣＨ１２９１０及びｐＩＣＨ１２９５０のＴ−ＤＮＡ領域を示す概略図である。
【図２０】プラスミドｐＩＣＨ１２８７０、ｐＩＣＨ１３１３０、及びｐＩＣＨ１３１６０のＴ−ＤＮＡ領域を示す概略図である。
【図２１】プラスミドｐＩＣＨ１２９６０及びｐＩＣＨ１２９７０のＴ−ＤＮＡ領域を示す概略図である。
【図２２】系統ＡのｐＩＣＨ１２９６０由来のプロ座位（上段）、及びｐＩＣＨ１２９６０のＴ−ＤＮＡ領域のプロ座位からイソ座位を生成するための親異種ヌクレオチド配列の分割を示す図である。プロ座位は、インテグラーゼのＡｔｔＰ及びＡｔｔＢ組換え部位を含む。インテグラーゼの適用によって、プロ座位の一部又は他の部分の統計学的除去がもたらされ、よって系統Ａ１及び系統Ａ２を生じさせる。通常、組換え結果を分析するために、たとえば、ＰＣＲによる分子分析を実施する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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