(57)【要約】特定の濃度で高分子量ヒアルロン酸塩（ＨＡ）を含有した、無菌の直ちに使用可能な水性薬用処方物の製造方法は、特定の最終濃度以下の濃度で高分子量ＨＡを含有した水性処方物を用意し、０．４５μｍ以下の孔径を有するフィルターへ該水性処方物を通過させ、上記特定の最終濃度に達するまで真空を適用して水を蒸発させることにより、該水性処方物を濃縮する、ステップを含んでなる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の濃度で高分子量ヒアルロン酸塩（ＨＡ）を含んでなる、無菌の直ちに使用可能な水性薬用処方物を製造するための方法であって、
特定濃度以下の濃度で高分子量ＨＡを含有した水性処方物を用意し、
０．４５μｍ以下の孔径を有するフィルターへ該水性処方物を通過させ、
上記特定の濃度に達するまで真空を適用して水を蒸発させることにより、該水性処方物を濃縮する
ステップを含んでなる、方法。
【請求項２】
濃縮ステップ後、薬用処方物が直ちに使用可能な無菌容器へ充填されるか、あるいは無菌タンク中へ移された後、直ちに使用可能な無菌容器へ充填される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
濃縮ステップで適用される真空が、２００ミリバール以下の絶対圧力である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
真空が３０〜６０ミリバール範囲の圧力である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＨＡの平均分子量が８００，０００〜５，０００，０００ドルトンの範囲である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
フィルターが０．２２μｍ以下の孔径を有している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
濃縮ステップに際して、ＨＡの濃度がリアルタイムで測定され、特定濃度が測定されたとき真空沸騰プロセスが自動的に停止される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＨＡ濃度が、処方物中における分光光度計検出波光吸収で測定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
賦形剤が濾過ステップ後に処方物へ加えられ、賦形剤の量が所要値に達するまでＨＡ処方物の導電率がリアルタイムで測定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬用向け最終処方物として無菌高分子量ヒアルロン酸塩を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸には、その塩形として、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸カルシウムなどがある。
【０００３】
ヒアルロン酸は生物源のムコ多糖であり、性質上広く分布している。例えば、ヒアルロン酸は、臍帯、滑液、硝子体液、鶏冠のような様々な動物組織、および皮膚および軟骨のような様々な結合組織に存在することが知られている。
【０００４】
化学的に、ヒアルロン酸はグリコサミノグリカンの１種であり、それはＤ‐グルクロン酸およびＮ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミンの交互繰返し単位により構成され、１３×１０６ドルトン以内の分子量を有する直鎖を形成している。
【０００５】
本発明の趣旨から、高分子量ヒアルロン酸とは、０．５×１０６ドルトン以上の平均分子量を有するヒアルロン酸である。
【０００６】
ヒアルロン酸またはその塩の薬用は、文献で広く記載されている。
【０００７】
ヒアルロン酸は非免疫原性物質であり、粘弾性および親水性を有するため、例えばBalazsのＵＳ‐Ａ‐４，１４１，９７３で開示されているように、それは数年前から、目硝子体もしくは関節液代用品としてまたは眼手術で支持媒体として用いられている。
【０００８】
関節液において、粘稠なヒアルロン酸溶液は細胞へ防護環境をもたらす潤滑液として働き、この理由から、それは炎症膝関節の治療で用いられている。
【０００９】
ＥＰ‐Ａ‐０７８１５４７は、目手術用のヒアルロン酸ナトリウムベース眼用処方物を開示している。
【００１０】
ＥＰ‐Ａ‐０７１９５５９は、エキシマレーザーによる治療光学的角膜切除術でマスキング液用として、ヒアルロン酸ナトリウム粘稠溶液について開示している。
【００１１】
ＥＰ‐Ａ‐０８７５２４８は、関節内洗浄液として有用な水溶液の調製用として、ヒアルロン酸またはその薬学上許容される塩の１種の使用について開示している。
【００１２】
Chemedica S.A.のＥＰ‐Ａ‐０６９８３８８は、増粘剤としてヒアルロン酸を含有した人工涙用の眼用製剤を開示している。
【００１３】
ヒアルロン酸またはその塩の薬用には、高純度で無菌の製品を要する。
【００１４】
ヒアルロン酸は、臍帯、鶏冠、または例えばBalazsのＵＳ‐Ａ‐４，１４１，９７３、RomeoらのＵＳ‐Ａ‐５，５５９，１０４およびＷＯ００／４９２５で開示されているようなＡおよびＣ群連鎖球菌のような、動物または微生物源から抽出および精製しうる。
【００１５】
ヒアルロン酸の工業的抽出および精製プロセスでは、典型的には、ヒアルロン酸ナトリウムのようなヒアルロン酸塩を乾燥粉末の形で生産する。精製された薬用乾燥粉末は、例えば関節間注射液、点眼液または硝子体液代用品のような、様々な薬用向けの水性薬用処方物を製造するために用いられる。
【００１６】
直ちに使用可能な薬用処方物を製造するための一般的工業プロセスでは、規定重量のヒアルロン酸ナトリウムと、正確な容量の水、場合により塩化ナトリウムのような塩、リン酸塩のような緩衝剤およびその他の賦形剤とを混合する。薬用処方物の濃度および組成は狭い規定範囲内に留めるべきであるため、処方物の様々な成分が慎重に計測される。次いで、処方物は直ちに使用可能な規定用量分のシリンジおよびバイアルのような容器中へ充填される。容器充填後、処方物は典型的には約１２１℃で１５分間以上かけてオートクレーブで滅菌される。
【００１７】
ヒアルロン酸を滅菌する上で熱の使用に伴う問題の１つは、ＨＡを形成する分子鎖を壊して、ＨＡの平均分子量を減少させてしまう、という公知の作用である。
【００１８】
ヒアルロン酸の高い分子量は重要な薬理特性である。
【００１９】
多くの薬学的用途において、例えば、ＵＳ４，１４１，９７３で報告されているような低分子量ＨＡの炎症作用、および高分子量ＨＡの有益レオロジー性の喪失からみると、処方物中に低分子量ヒアルロン酸を有することは望ましくない。前記滅菌法において所定濃度の処方物でＨＡの分解を補うために、処方物を製造する上で最初に用いられるヒアルロン酸またはその塩は、最終処方物で望まれる最小平均分子量よりも高い平均分子量を有している。しかしながら、必要な平均分子量が増すにつれて出発物質からのヒアルロン酸の歩留まりは減少するため、これは非経済的である。
【００２０】
ヒアルロン酸を滅菌するもう１つの公知方法は、濾過によるものである。この技術は、通常乾燥粉末の形で、精製ヒアルロン酸塩を濃縮形で製造するための慣用的工業プロセスで用いられており、低濃度水溶液がフィルターに通されてから、乾燥されている。
【００２１】
このような滅菌ステップは、例えば、欧州特許出願ＥＰ８６７４５３およびＰＣＴ出願ＷＯ００／４４９２５で記載されている。これらの出願において、０．２２μｍと孔径の小さなフィルターも滅菌用に開示されている。０．２２μｍの孔径を有するフィルターは、最小であることが知られた細菌Pseudomonas diminutaに基づくと１０７細菌当たりで１個の細菌侵入であり、０．４５μｍの孔径を有するフィルターでは（常にPseudomonas diminutaに基づくと）１０４細菌当たりで１個の細菌侵入である。こうした理由から、０．４５μｍ以下の孔径を有するフィルターであれば、滅菌されると考えられる。
【００２２】
慣用的工業プロセスにおいて、高粘度薬用水性処方物でＨＡの所要濃度、典型的には１〜２％ｗｔ／ｖの範囲のとき、すべてのヒアルロン酸が０．２２μｍのフィルターを通過しうるわけではないことから、濾過による滅菌の方法は、直ちに使用可能な高粘度薬用処方物の製造に使用されるものとは知られていない。ヒアルロン酸の濃度変化および／または喪失に関するこの結果から、直ちに使用可能な高粘度薬用処方物を製造するための濾過滅菌には問題が残されている。
【００２３】
ＵＳ５，０９３，４８７では、直ちに使用可能な、高分子量ヒアルロン酸ナトリウムを含有して、０．２２μｍのフィルターで滅菌された水性薬用処方物の製造が記載されている。しかしながら、この特許で記載された滅菌方法は、ヒアルロン酸の粘度を不可逆的に減少させる上で、０．２２μｍフィルターへのヒアルロン酸水性処方物の通過回数に依存している。１％以上の濃度でＨＡを含有した水性薬用処方物の滅菌は、この開示に従うと、複数回のフィルター通過で生じるヒアルロン酸の粘度低下からみて可能である。ＨＡの分子量の低下なしに粘度が減少することも、この出願で更に論じられている。前記文献で報告された発見の有効性を認める立場はとりたくないが、関節内適用のような多くの薬学的用途にとって、ＨＡの粘度の低下は望ましくない。
【発明の概要】
【００２４】
本発明の目的は、特に工業的条件下で、無菌で経済的に製造しうる、ヒアルロン酸塩を含有した無菌の直ちに使用可能な薬用水性処方物を得ることである。処方物の諸成分について濃度の許容性が狭い、このような処方物を提供することは有利である。
【００２５】
本発明の目的は、請求項１による薬用向けの無菌高分子量ヒアルロン酸処方物の製造方法により達成される。
【００２６】
特定の最終濃度で高分子量ヒアルロン酸塩（ＨＡ）を含有した無菌の直ちに使用可能な水性薬用処方物の製造方法であって、
特定の最終濃度以下の濃度で高分子量ＨＡを含有した水性処方物を用意し、
０．４５μｍ以下の孔径を有するフィルターへ該水性処方物を通過させ、
上記特定の最終濃度に達するまで真空を適用して水を蒸発させることにより、該水性処方物を濃縮する
ステップを含んでなる方法が、ここでは開示されている。
【００２７】
好都合なことに、濾過前における水性処方物の低濃度は、分子量の関数として、粘度を減少させ、ＨＡ全体をフィルター通過および滅菌させることができ、次いで真空下での沸騰により、本質的に熱依存性のＨＡ分解が生じないよう保証している。そのプロセスは工業環境とよく適合して、特に経済的であるため、ＨＡを含有した薬用処方物の直ちに使用可能な用量分を更に滅菌することなく無菌容器へ充填しうる。
【００２８】
別な利点は、処方物が微生物学的に安定であり、薬用製剤として用いられる前に数週間保存可能なことである。
【発明の具体的説明】
【００２９】
水溶液中ＨＡの粘度は、分子量、濃度、温度、塩の濃度および品質、溶液へ適用されるｐＨおよび剪断速度のようないくつかのパラメーターに依存する特性である。高い分子量および濃度ほど粘度を増し、一方高い剪断速度および塩ほど粘度を減少させる。温度に関しては、M.Cardones et al.”hysteresis Behavior of Sodium Hyaluronate Solutions during Heating and Cooling”,Clear Solutions Biotech,Inc.,Technical Rep 01で報告されているように、ＨＡはヒステリシス挙動を有する。温度を上昇または低下させることにより、粘度は不規則に増加および減少する。６０〜７０℃のとき、溶液の最小粘度を得られる。したがって、このヒステリシス特性は溶液の粘度を減少または増加させるために用いられるが、ＨＡ鎖の分解は温度とこの温度が保たれる時間に比例すると考えねばならない。
【００３０】
濾過後の濃縮ステップに際して、直ちに使用可能な薬用処方物の特定濃度に達したとき、真空沸騰を止めるために、ＨＡの濃度がリアルタイムでモニターしてもよい。モニターまたは測定プロセスは有利には処方物中に置かれた検出ビームにより分光光度計で行われ、紫外範囲（ＵＶ）の光吸収はＨＡ濃度に比例する。本発明で特に有利な特徴は、正確な量の水およびヒアルロン酸を混合して特定濃度を得る必要性を解消し、このような濃度がプロセス全体を通して確実に維持しうることである。代わりに、初期のＨＡおよび水混合液は最終処方物よりも低い大体の濃度を有しており、こうしてプロセスを簡素化している。
【００３１】
濃縮プロセスに際して適用される真空は、好ましくは２００ミリバール絶対圧力以下、特に３０〜６０ミリバールの範囲、例えば４０ミリバールであり、その場合の沸騰温度は約２６〜２８℃である。工業装置はこのような圧力のとき信頼しながら作業する上で経済的であり、低温のおかげでヒアルロン酸分子量の有意または相当な減少を避けられる。
【００３２】
フィルター孔径は有利には約０．２２μｍ以下であり、そのため高度無菌処方物の製造を保証している。１〜３％範囲のＨＡ濃度を有する、フィルター滅菌された直ちに使用可能な高粘度薬用処方物は、このようにして本発明に従い、好結果に無菌で経済的に製造することができる。
【００３３】
図１によると、特定の薬用濃度で高分子量ヒアルロン酸塩を含有する、直ちに使用可能な水性薬用処方物を製造するための方法が示されている。処方物を製造する前に、プロセスプラント装置が精製水で清浄され（ステップ１）、クリーンなストリームで滅菌され（ステップ２）、注射用無菌蒸留水（ＷＦＩ）で洗浄される（ステップ３）。
【００３４】
水性ＨＡ処方物の調製液、例えば最終薬用処方物用に特定された濃度以下の濃度における希釈ヒアルロン酸ナトリウム溶液が、濾過前処方物を調製するために混合反応器中へ導入される（ステップ４）。
【００３５】
水性ＨＡ溶液は、乾燥プロセス前に、乾燥ＨＡ塩またはＰＣＴ出願ＷＯ００／４４９２５に従い調製された溶液から調製される。
【００３６】
蠕動ポンプにより加えられる濃縮塩溶液（２５×）の添加が、ＨＡの添加量に応じて正確な量の塩を加えるために行われる（ステップ５）。塩溶液は最終薬用処方物用に特定されるＮａＣｌ、緩衝剤および他の賦形剤を通常含有しており、それらはｐＨを７．４のような生理的ｐＨにし、最終処方物を３００ｍＯｓｍ／ｌｔのような生理的オスモル濃度にするために加えられる。
【００３７】
塩溶液、緩衝剤および他の賦形剤は、濾過ステップ７後に直接反応室中へ無菌的に加えてもよい。これは、塩がＨＡの濾過性を減らすために、濾過前溶液でより大きな希釈を要するという事実からみて、非常に高い分子量のＨＡの場合で特に有利である。加えられる賦形剤の量は、反応室で導電率センサー（プローブ）によりリアルタイムでモニターしうる。ＨＡ処方物の導電率は処方物中における賦形剤の量と関連しており、実験で調べられる。そのため、所要濃度に達するまで賦形剤が反応室へ加えられる際に、ＨＡ処方物の導電率を測定することにより、処方物中における賦形剤の所要量が簡単で信頼しうる正確な手法で加えられる。上記のことから、予め用量を計算および測定しておく必要性を特に解消し、たとえ少量でも、濾過ステップ７に際してフィルターに留まるある量のＨＡを考慮して補わねばならない問題を特に解消できる。
【００３８】
例として、処方物は、１５リットルのＷＦＩと混合された、平均分子量２２０万ドルトンの乾燥ヒアルロン酸ナトリウム４５グラムから調製される。この場合には、ＨＡの高分子量を考慮して、上記のように、必要以上に大きな濾過前溶液の希釈を避けるために、塩および緩衝剤溶液が濾過後に加えられる。
【００３９】
反応器の攪拌機は、濾過前溶液が均質になるまで、例えば約１２０分間にわたり、それを混合する（ステップ６）。この具体例では、濾過前溶液は０．３％ｗｔ／ｖのＨＡ濃度を有している。この濃度のとき、分子量２２０万ドルトンのヒアルロン酸は、室温および生理的ｐＨで、孔径０．２２μｍのフィルターを全体で通過しうるほどの低粘度を有している。ＨＡ処方物の全部が孔径０．２２μｍのフィルターを通過しうる最大粘度は、２０℃のとき０．１ｓ−１剪断速度で測定すると、約５Ｐａ・ｓであることがわかった。しかしながら、この最大粘度はフィルター孔径に依存する：０．１μｍのようにより小さな孔径であれば、すべてのＨＡがフィルターを通過しうるこの最大粘度を低下させることになる。
【００４０】
上記のように、実質的にすべてのＨＡが滅菌フィルター、例えば０．２２μｍのフィルターを通過しうる水溶液中ＨＡの最大濃度は、ヒアルロン酸の分子量に依存する。これは図２および３で示されたグラフにより示されており、図２では、濃度の関数（デシリットルの水当たりヒアルロン酸ナトリウムのグラム数）として、実質的環境温度（約２０℃）および実質的中性ｐＨ（約７）で０．２２μｍ孔径のフィルターを通過する、平均分子量約１１０万ドルトンのヒアルロン酸ナトリウムの割合を示している。
【００４１】
図３は、ヒアルロン酸ナトリウムが約２２０万ドルトンの平均分子量を有すること以外は、同条件下で類似したグラフを示している。すべてのヒアルロン酸ナトリウムは、１１０万ドルトンの分子量のとき、約０．９２ｗｔ／ｖ（またはｇ／ｄｌ）の濃度までフィルターを通過し、一方２２０万ドルトンの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムの場合、最大濃度は約０．３２ｗｔ／ｖであることが、図２のグラフでみられる。このように、ヒアルロン酸塩の分子量が１１０万から２２０万ドルトンへ増すと、０．２２μｍフィルターを１００％通過しうる水溶液中ＨＡの最大濃度は、約０．９２ｗｔ／ｖから約０．３２ｗｔ／ｖへと減少する。
【００４２】
工業プロセスにおいて、濾過後に溶液が濃縮されることを考慮すると、ヒアルロン酸ナトリウムの分子量、温度および混合濃度に関してバッチ毎の誤差または変動のある許容範囲内で、濾過プロセスが完了および信頼しうることを保証するために、上限よりやや低い濃度を有することが好ましい。
【００４３】
溶液は、混合反応器中において窒素のようなガスを圧力下、例えば約３バール圧で導入することにより、またはポンプにより、滅菌フィルターに通される（ステップ７）。滅菌フィルターは好ましくは０．２２μｍの孔径を有するが、０．４５μｍ以下で約０．１μｍ以上の他の孔径を有するフィルターも、このようなフィルターが市販されている、またはされるようになる程度まで、用いてよい。
【００４４】
すべての溶液がフィルターから蒸留器へと通過したとき、蒸留器はフィルターおよび混合反応器からバルブで遮蔽され、真空ポンプが作動されて、調節バルブにより蒸留器の圧力を調節する（ステップ８、９、１０）。圧力は沸騰温度を６０℃以下にする上で２００ミリバール以下であるが、好ましくは圧力は３０〜６０ミリバールの範囲、例えば４０ミリバールであり、その場合における水の沸騰温度は環境温度に近い２６〜２８℃の範囲である。
【００４５】
蒸留器の代わりに、薄膜蒸発器またはいずれか他の真空下濃縮器も、ＨＡ処方物のバッチ、フィードバッチまたは連続濃縮に用いうる。
【００４６】
蒸留器周辺の加熱ジャケットは、沸騰プロセスに際して熱エネルギーを供給する。有利には、３０℃以下の沸騰温度であれば、ヒアルロン酸の分子量が減少しないように、ヒアルロン酸の分解が本質的に生じないことを保証する。
【００４７】
ＨＡ濃度センサーは、好都合には光ファイバーを処方物中へ浸した分光光度計の形で、ヒアルロン酸の濃度をリアルタイムで測定するために用意され（ステップ１１）、特定濃度に達したとき沸騰プロセスを自動的に停止する。分光光度計は、例えば、蒸留器で溶液内に置かれた紫外線のビーム（例えば、波長２３０ｎｍ）の吸収に基づいている。図４は、全濃縮プロセス（例えば２％ｗ／ｖ以下）で経時的に測定された、２３０ｎｍにおける光学濃度を示している。リアルタイムＨＡ濃度測定は希釈濾過前溶液の調製に際して非常に正確な量を混合する必要性を解消し、こうしてプロセスを簡素化している。
【００４８】
真空沸騰は、混合プロセスと濾過プロセスに際する高圧での窒素適用からみて、最終薬用処方物で許容されないバブル、マイクロバブルおよび溶解ガスを含んだ処方物を脱気しうる、という重要な利点も有している。
【００４９】
蒸留器中のＨＡ濃度センサーが特定濃度に達したことを知らせたとき、蒸留器の圧力がガス、例えば窒素を導入することによりそこで急速に増加され（ステップ１３）、蒸留器周辺を加熱するジャケットが環境温度以下に冷却され、こうして処方物の濃縮プロセスを直ちに停止させる（ステップ１２）。
【００５０】
本発明によるプロセスによると、処方物中におけるヒアルロン酸の濃度は、特定の薬用に応じて、３％以下の範囲内であることに注目される。
【００５１】
次いで、処方物は、他の箇所で充填するために無菌タンク（ステップ２８、３０）中へ加圧下でガス（例えば窒素）により、および／または後の段階で、直ちに使用可能なシリンジ（ステップ１６）のような無菌容器中へ直接送入または導入される。薬用処方物は、無菌タンクで中間貯蔵せずに、薬用の無菌容器中へ直接充填してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
本発明の別の有利な面は、各請求項と、プロセスの例および添付図面の下記の詳細な説明から明らかになるであろう：
【図１】本発明によるプロセスの態様におけるフローチャート図ステップを表わしている。
【図２】２０℃および中性ｐＨにおいて、水溶液中％ｗｔ／ｖ濃度の関数として、０．２２μｍのフィルターを通過する、各々分子量１１０万ドルトンのＨＡの割合を表わしている。
【図３】２０℃および中性ｐＨにおいて、水溶液中％ｗｔ／ｖ濃度の関数として、０．２２μｍのフィルターを通過する、各々分子量２２０万ドルトンのＨＡの割合を表わしている。
【図４】分光光度計により測定された、濃度プロセスに際して、時間の関数として２３０ｎｍにおける処方物の光学濃度（ＯＤ）を表わしたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2005536530.tif 000009