(57)【要約】血清中で、ＰＳＰ９４は、遊離型として存在する、または、担体タンパク質と会合している。結合型のＰＳＰ９４は、前立腺癌患者の血中で定量化され、これらの測定値は、予後の評価時に有用性を示す。本発明は、ＰＳＰ９４が結合する担体タンパク質（ＰＳＰ９４結合タンパク質と称される）、その精製方法、その核酸およびアミノ酸配列を同定し、ＰＳＰ９４関連疾患の診断および予後におけるこれらの配列の使用に関する。より特には、本発明は、前立腺癌および良性の前立腺肥大など、異常もしくは上昇したＰＳＰ９４レベルに関連した状態の評価に有用な試薬だけでなく、改善された診断および予後分析を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１に記載のポリヌクレオチド、
ｂ）配列番号６に記載のポリヌクレオチド、
ｃ）配列番号６の配列１から１３９２を有するポリヌクレオチド、
ｄ）配列番号６の配列１から１６５３を有するポリヌクレオチド、
ｅ）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１０塩基の連続部分に順に一致する１０から２００５塩基長の間のサイズのポリヌクレオチド、および、
ｆ）配列番号６に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１０塩基の連続部分に順に一致する１０から１８７６塩基長の間のサイズのポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるメンバーを含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１に記載のものである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが配列番号６に記載のものである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが配列番号６の配列１から１３９２を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが配列番号６の配列１から１６５３を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、ポリリボヌクレオチド、ポリデオキシリボヌクレオチド、修飾ポリリボヌクレオチド、修飾ポリデオキシリボヌクレオチド、および相補的ポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
ａ）配列番号２に記載のポリペプチド、
ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド、
ｃ）配列番号７に記載のポリペプチド、
ｄ）配列番号８に記載のポリペプチド、
ｅ）配列番号９に記載のポリペプチド、
ｆ）配列番号２の同じサイズの連続部分に一致する１０から５０５のサイズのアミノ酸長のポリペプチド、
ｇ）配列番号３の同じサイズの連続部分に一致する１０から５９２のサイズのアミノ酸長のポリペプチド、
ｈ）配列番号７の同じサイズの連続部分に一致する１０から６２４のサイズのアミノ酸長のポリペプチド、
ｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、または、配列番号９に記載のアミノ酸配列に一致する少なくとも９０％のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体、
ｊ）配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、または、配列番号９に記載のアミノ酸配列に一致する少なくとも７０％のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体、
ｋ）配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、または、配列番号９に記載のアミノ酸配列に一致する少なくとも５０％のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体、
ｌ）−配列番号２の、１０から５０５の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、
−配列番号３の、１０から５９２の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、または、
−配列番号７の、１０から６２４の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、
のアミノ酸配列に一致する少なくとも９０％のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体、
ｍ）−配列番号２の、１０から５０５の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、
−配列番号３の１０から５９２の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、または、
−配列番号７の、１０から６２４の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、
のアミノ酸配列に一致する少なくとも７０％のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体、
ｎ）−配列番号２の、１０から５０５の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、
−配列番号３の、１０から５９２の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、または、
−配列番号７の、１０から６２４の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、
のアミノ酸配列に一致する少なくとも５０％のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体、
からなる群から選択される単離ポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号２に記載のものである請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号３に記載のものである請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、配列番号７に記載のものである請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、配列番号８に記載のものである請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、配列番号９に記載のものである請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、および、
ｂ）希釈剤または緩衝剤、
を含む免疫化組成物。
【請求項１４】
更にアジュバントを含む、請求項１３に記載の免疫化組成物。
【請求項１５】
更に、ＰＳＰ９４、ＰＳＰ９４変異体、ＰＳＰ９４断片、ＰＳＰ９４をコードするポリヌクレオチド、ＰＳＰ９４変異体をコードするポリヌクレオチド、ＰＳＰ９４断片をコードするポリヌクレオチド、およびその組み合わせを含む、請求項１４に記載の免疫化組成物。
【請求項１６】
ａ）請求項７に記載のポリペプチド、および、
ｂ）希釈剤または緩衝剤、
を含む免疫化組成物。
【請求項１７】
更にアジュバントを含む、請求項１６に記載の免疫化組成物。
【請求項１８】
更に、ＰＳＰ９４、ＰＳＰ９４変異体、ＰＳＰ９４断片、ＰＳＰ９４をコードするポリヌクレオチド、ＰＳＰ９４変異体をコードするポリヌクレオチド、ＰＳＰ９４断片をコードするポリヌクレオチド、およびその組み合わせを含む、請求項１６に記載の免疫化組成物。
【請求項１９】
哺乳動物に、請求項１５に記載の免疫化組成物を投与することを含む、ポリペプチドに対する抗体を生産する方法。
【請求項２０】
哺乳動物に、請求項１８に記載の免疫化組成物を投与することを含む、ポリペプチドに対する抗体を生産する方法。
【請求項２１】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一つを組み込んでいる細胞。
【請求項２２】
請求項７に記載のポリペプチドの少なくとも一つを組み込んでいる細胞。
【請求項２３】
請求項７に記載のポリペプチドの少なくとも一つを発現している細胞。
【請求項２４】
ＰＳＰ９４またはＰＳＰ９４結合タンパク質の増大したレベルと関連した状態の診断または予後における、請求項１に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１に記載のものである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号６に記載のものである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号６の配列１から１３９２を有する、請求項２４に記載の使用。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号６の配列１から１６５３を有する、請求項２４に記載の使用。
【請求項２９】
ＰＳＰ９４またはＰＳＰ９４結合タンパク質の増大したレベルに関連した状態の診断または予後における、請求項７に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択される、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
ＡＴＣＣに特許寄託番号：ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、およびその抗原結合断片。
【請求項３２】
ＡＴＣＣに特許寄託番号：ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、およびその抗原結合断片。
【請求項３３】
ＡＴＣＣに特許寄託番号：ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系。
【請求項３４】
ＡＴＣＣに特許寄託番号：ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系。
【請求項３５】
試料中における、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および、配列番号９からなる群から選択されるポリペプチド、またはその組み合わせの量を測定するための方法であって、前記試料を、前記ポリペプチドを認識することができる分子と接触させることを含む方法。
【請求項３６】
前記分子が、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択される抗体である、請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記分子が、ＰＳＰ９４およびその類似体である、請求項３５の方法。
【請求項３８】
さらに、前記分子によって、または、標識を担持する第二の分子によって、提供される、標識からのシグナルを検出することを含む、請求項３５の方法。
【請求項３９】
試料に関して得られたシグナルを、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択される少なくとも一つのポリペプチド、または、その組み合わせの既知量を含む対照試料に関して得られたシグナルと比較する、請求項３８の方法。
【請求項４０】
試料中における、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９、またはその組み合わせからなる群から選択される、ＰＳＰ９４に結合していないポリペプチドの量を測定するための方法であって、
ａ）ＰＳＰ９４と、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択されるいずれか一つのポリペプチドとによって形成される複合体を前記試料から除去すること、複合体不含試料を生成すること、および、
ｂ）配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択されるいずれか一つのポリペプチドを認識することができる抗体と、前記複合体不含試料を接触させること、
を含む方法。
【請求項４１】
前記抗体が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項４０の方法。
【請求項４２】
さらに、前記抗体によって、または、標識を担持する第二の分子によって提供される、標識からのシグナルを検出することを含む、請求項４０の方法。
【請求項４３】
試料に関して得られるシグナルを、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および、配列番号９からなる群から選択されるポリペプチドの既知量を含む対照試料に関して得られるシグナルと比較する、請求項４２の方法。
【請求項４４】
ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択される抗体の、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９、またはその組み合わせの量を評価するための使用。
【請求項４５】
配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９に記載のポリペプチド、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択される分子の、ＰＳＰ９４の量を評価するため、または、異常もしくは増大したＰＳＰ９４レベルに関連した状態の診断のための使用。
【請求項４６】
前記状態が、前立腺癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、他の上皮分泌部の癌、および良性の前立腺肥大からなる群から選択される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
第一部分と第二部分を含む抗体接合物であって、前記第一部分は、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択され、前記第二部分は、薬剤、固形支持体、レポーター分子、レポーター分子を担持する基、キレート剤、アシル化剤、架橋剤、および標的基からなる群から選択される、抗体接合物。
【請求項４８】
前記固形支持体が、炭水化物、リポソーム、脂質、コロイド状金、微粒子、マイクロカプセル、ミクロエマルジョン、およびアフィニティーカラムのマトリックスからなる群から選択される、請求項４７の接合物。
【請求項４９】
前記レポーター分子が、フルオロホア、クロモホア、染料、酵素、放射性分子、および結合／リガンド複合体分子からなる群から選択される、請求項４７の接合物。
【請求項５０】
前記薬剤が、毒素、薬、およびプロドラッグの群から選択される、請求項４７の接合物。
【請求項５１】
ＰＳＰ９４を認識することができる分子を有する容器を含む、ＰＳＰ９４の量を評価する際に用いるための、または、ＰＳＰ９４の異常もしくは増大したレベルに関連した状態の診断のための、キット。
【請求項５２】
前記分子が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、請求項４７の抗体接合物からなる群から選択される、請求項５１のキット。
【請求項５３】
前記分子が、配列番号２に記載のポリペプチド、配列番号３に記載のポリペプチド、配列番号７に記載のポリペプチド、配列番号８に記載のポリペプチド、および配列番号９に記載のポリペプチドからなる群から選択される、請求項５１のキット。
【請求項５４】
配列番号２に記載のポリペプチド、配列番号３に記載のポリペプチド、配列番号７に記載のポリペプチド、配列番号８に記載のポリペプチド、および配列番号９に記載のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを認識することができる抗体を有する容器を更に含む、請求項５３のキット。
【請求項５５】
前記抗体が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項５４のキット。
【請求項５６】
配列番号２に記載のポリペプチド、配列番号３に記載のポリペプチド、配列番号７に記載のポリペプチド、配列番号８に記載のポリペプチド、および配列番号９に記載のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを調製するための方法であって、
ａ）細胞による前記ポリペプチドの発現をもたらす条件下において、宿主細胞を、培養すること、および、
ｂ）一つ以上の精製工程により、ポリペプチドを回収すること、
を含む方法。
【請求項５７】
前記精製工程が、単独もしくは組み合わせて、硫酸アンモニウム沈降、サイズ除外クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項５６の方法。
【請求項５８】
配列番号２に記載のポリペプチド、配列番号３に記載のポリペプチド、配列番号７に記載のポリペプチド、配列番号８に記載のポリペプチド、配列番号９に記載のポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを調製するための方法であって、
ａ）前記ポリペプチドを含む一つ以上の生物試料を採取すること、および、
ｂ）一つ以上の精製工程により、ポリペプチドを回収すること、
を含む方法。
【請求項５９】
前記精製工程が、単独もしくは組み合わせて、硫酸アンモニウム沈降、サイズ除外クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記精製工程が、
ａ）硫酸アンモニウムを前記生物試料に加える工程、
ｂ）イオン交換クロマトグラフィーを行なう工程、
ｃ）ＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックスを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行なう工程、
ｄ）サイズ除外クロマトグラフィーを行なう工程、および
ｅ）実質的に純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質を含む画分を回収する工程、
を含む、請求項５８の方法。
【請求項６１】
前記生物試料が、血清試料、血漿試料、血液試料、および細胞溶解試料である、請求項５８の方法。
【請求項６２】
ａ）硫酸アンモニウムを前記試料に、ＰＳＰ９４結合タンパク質の沈降が生じるように加える工程、
ｂ）工程ａ）の混合物を遠心分離して、沈降タンパク質を回収する工程、
ｃ）前記沈降タンパク質を再度懸濁する工程、
ｄ）イオン交換クロマトグラフィーを行って、ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質の画分を回収する工程
ｅ）ＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックスを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行って、ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質の画分を回収する工程、
ｆ）サイズ除外クロマトグラフィーを行って、ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質の画分を回収する工程、および
ｇ）実質的に純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質を含む画分を回収する工程、
を含む、試料からＰＳＰ９４結合タンパク質を精製する方法。
【請求項６３】
前記試料が、ヒト男性血清である、請求項６２の方法。
【請求項６４】
ＰＳＰ９４結合タンパク質の沈降が、硫酸アンモニウムを４７％以下の最終濃度まで加えることによってもたらされる、請求項６２の方法。
【請求項６５】
前記イオン交換クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスを用いることによって行なわれる、請求項６２の方法。
【請求項６６】
前記ＰＳＰ９４結合タンパク質が、配列番号２に記載のポリペプチド、配列番号３に記載のポリペプチド、配列番号７に記載のポリペプチド、配列番号８に記載のポリペプチド、および、配列番号９に記載のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドである、請求項６２の方法。
【請求項６７】
請求項６２の方法から得られる生成物。
【請求項６８】
ＰＳＰ９４が他のポリペプチドに結合している時でさえ利用できるＰＳＰ９４エピトープを、認識することができる抗体。
【請求項６９】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および、配列番号９からなる群から選択される、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７０】
前記抗体が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体である、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７１】
請求項６８に記載の抗体を生産するハイブリドーマ細胞系。
【請求項７２】
ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、およびその抗原結合断片。
【請求項７３】
ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、およびその抗原結合断片。
【請求項７４】
ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系。
【請求項７５】
ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系。
【請求項７６】
ａ）前記試料を、ＰＳＰ９４に結合することができる分子と接触させること、および、
ｂ）ＰＳＰ９４を含まない試料を回収すること、
を含む、試料からＰＳＰ９４を除去するための方法。
【請求項７７】
前記分子が、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記試料が、血液、血漿、血清、尿、精液、細胞培養培地、および細胞溶解物からなる群から選択される、請求項７６の方法。
【請求項７９】
ＰＳＰ９４と、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、または、配列番号９に記載されたポリペプチドおよびその組み合わせのいずれか一つとによって形成される複合体を、試料から除去するための方法であって、
ａ）前記試料を、前記複合体の露出したエピトープを認識することができる抗体と接触させること、および、
ｂ）前記複合体を含まない試料を回収すること、
を含む方法。
【請求項８０】
前記抗体が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項７９の方法。
【請求項８１】
前記抗体が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体である、請求項７９の方法。
【請求項８２】
試料中のＰＳＰ９４の総量を測定するための方法であって、ＰＳＰ９４が他のポリペプチドに結合している時でさえ、ＰＳＰ９４を認識することができる抗体と、前記試料を接触させることを含む方法。
【請求項８３】
前記抗体が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体である、請求項８２の方法。
【請求項８４】
前記抗体によって、または、標識を担持する第二の分子によって、提供される、標識からのシグナルを検出することをさらに含む、請求項８２の方法。
【請求項８５】
試料に関して得られるシグナルを、ＰＳＰ９４、ＰＳＰ９４断片、その変異体もしくは類似体の既知量を含む対照試料に関して得られるシグナルと比較する、請求項８４の方法。
【請求項８６】
ａ）ＰＳＰ９４と、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９、およびその組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドのいずれか一つとによって形成される複合体を除去すること、複合体不含試料を生成すること、
ｂ）前記複合体不含試料を、ＰＳＰ９４を認識することができる抗体と接触させること、
を含む、試料中の遊離ＰＳＰ９４の量を測定するための改善された方法。
【請求項８７】
前記抗体が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項８６の方法。
【請求項８８】
前記抗体によって、または、標識を担持する第二の分子によって、提供される、標識からのシグナルを検出することをさらに含む、請求項８６の方法。
【請求項８９】
試料に関して得られるシグナルを、ＰＳＰ９４の既知量を含む対照試料に関して得られるシグナルと比較する、請求項８８の方法。
【請求項９０】
試料中の遊離ＰＳＰ９４の量を測定するための改善された方法であって、前記試料を、ＰＳＰ９４を認識することができる抗体と、接触させることを含む方法。
【請求項９１】
前記抗体が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項９０の方法。
【請求項９２】
前記抗体によって、または、標識を担持する第二の分子によって、提供される、標識からのシグナルを検出することをさらに含む、請求項９０の方法。
【請求項９３】
試料に関して得られるシグナルを、ＰＳＰ９４の既知量を含む対照試料に関して得られるシグナルと比較する、請求項９２の方法。
【請求項９４】
ＰＳＰ９４がポリペプチドに結合している時でさえ、ＰＳＰ９４に結合することができる第一および第二の抗体を用いることを含み、前記第一および第二の抗体が異なるＰＳＰ９４エピトープに結合する、試料中の全てのＰＳＰ９４のレベルを測定するための方法。
【請求項９５】
試料中のＰＳＰ９４のレベルを測定するための方法であって、前記試料を、遊離および結合形態でＰＳＰ９４を認識することができる抗体と接触させることを含む方法。
【請求項９６】
前記抗体が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体である、請求項９５の方法。
【請求項９７】
第一および第二の抗体を用いることを含み、前記第一の抗体は、ＰＳＰ９４が他のポリペプチドに結合している時でさえ、ＰＳＰ９４に結合することができ、前記第二の抗体は、ＰＳＰ９４に結合することができ、かつ、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択されるポリペプチドのいずれか一つを、ＰＳＰ９４と前記ポリペプチドとによって形成される複合体から外すことができる、試料中の全ＰＳＰ９４を測定するための方法。
【請求項９８】
前記第一の抗体が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体である、請求項９７の方法。
【請求項９９】
前記第二の抗体が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体である、請求項９７の方法。
【請求項１００】
配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、または配列番号９に記載のポリペプチド、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択される分子の、試料中のＰＳＰ９４、ＰＳＰ９４変異体およびその類似体の量を評価するための使用。
【請求項１０１】
ＰＳＰ９４の増大したレベルを伴う状態の処置のためのＰＳＰ９４抗体の使用。
【請求項１０２】
前記抗体が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１０１に記載の使用。
【請求項１０３】
ＰＳＰ９４の増大したレベルを伴なう状態の処置のための薬剤の製造におけるＰＳＰ９４抗体の使用。
【請求項１０４】
前記抗体が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１０３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＳＰ９４を結合することができる新しいポリペプチド（ＰＳＰ９４結合タンパク質）、および核酸およびアミノ酸配列、および疾病の診断および予後におけるこれらの配列の使用に関する。
【０００２】
また、本発明は、改善された診断分析、キット、および、ＰＳＰ９４もしくはＰＳＰ９４結合タンパク質を認識することができる抗体などの試薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
雄の哺乳動物においてのみ見出される前立腺は、精液、および、血液のいくつかの成分、および、いくつかの調節ペプチドを生産する。前立腺は、間質および上皮細胞を含み、後者の群は、円柱分泌性細胞および基底非分泌性細胞からなる。間質細胞同様に、これらの基底細胞の増殖も、一般的な一前立腺疾患である良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）を引き起こす。他の一般的な前立腺疾患は、前立腺腺癌（ＣａＰ）であり、これは、最も一般的な致命的病態生理学的前立腺癌であり、前立腺の周辺領域における上皮細胞の悪性転換を伴う。前立腺腺癌および良性前立腺肥大は、二つの一般的な前立腺疾患であり、老人男性において高い発生率を有する。
【０００４】
５５歳を超えた男性のおよそ各４人に１人が、ある型、もしくは別の前立腺疾患を患う。前立腺癌は、診断されたおよそ１８５，０００症例および米国において毎年報告される約３９，０００の死亡に関して、高齢男性における癌に関連した死因の二番目に一般的な原因である。
【０００５】
様々な前立腺疾患の病因の理解を得るために行なわれた、正常、良性、および癌性の前立腺によって合成および分泌される様々な物質の研究により、これらの物質の幾つかが、前立腺疾患の診断における免疫組織化学の腫瘍マーカーとして用いられることができることが明らかとなる。正常な前立腺によって分泌される３つの主なタンパク質もしくはポリペプチドは、（１）前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）；（２）前立腺特異抗原（ＰＳＡ）；および、（３）前立腺インヒビンペプチド（ＰＩＰ）、ヒト精漿インヒビン（ＨＳＰＩ）、またはβ−マイクロセミノプロテイン（β−ＭＳＰ）としても知られ、以後、ＰＳＰ９４として称する、９４アミノ酸の前立腺分泌タンパク質（ＰＳＰ９４）である。
【０００６】
ＰＳＰ９４は、単一の糖化されていないシステインに富んだタンパク質であり、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）および前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＳＡ）と共に、ヒトの精液において見出された３つの主なタンパク質の１つである。ＰＳＰ９４は、１０．７ｋＤａの分子量を有し、このタンパク質の完全なアミノ酸配列が、既に確定されている。ＰＳＰ９４のｃＤＮＡおよび遺伝子は、クローン化され、特徴づけられている（Ｕｌｖｓｂａｃｋ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．，１６４：１３１０、１９８９；Ｇｒｅｅｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．，１６７：１１８４、１９９０）。免疫組織化学およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術により、ＰＳＰ９４が、主に、前立腺上皮細胞に位置することが示されている。しかしながら、それは、様々な他の分泌性上皮細胞にも存在する（Ｗｅｉｂｅｒ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１３７：５９３、１９９０）。ＰＳＰ９４は、前立腺腺癌細胞系、ＬＮＣａｐにおいて発現されることが示されている（Ｙａｎｇ等、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１６０：２２４０、１９９８）。さらに、腫瘍細胞の増殖における外因性ＰＳＰ９４の阻害効果が、in vivoおよびin vitroの両方において観察されており（Ｇａｒｄｅ等、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、２２：２２５、１９９３；Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３：４８５５、１９９３）、これは、ＰＳＰ９４が、腫瘍細胞において、同種の受容体との相互作用を介し、前立腺癌の成長に対して負の調節因子であり得たことを示している。
【０００７】
天然のＰＳＰ９４は、ホルモン難治性前立腺癌（および潜在的に他の前立腺の兆候）の処置時に治療効果を有することが示されている。例えば、前立腺癌内でのＰＳＰ９４の発現は、腫瘍の進行度および攻撃力が増えるにつれて、減ることが知られている。腫瘍のＰＳＰ９４の発現は、抗アンドロゲン処置時に、特に高い進行度の腫瘍において、刺激される。ここに参照によって組み込まれる米国特許第５，４２８，０１１号（Ｓｈｅｔｈ  Ａ．Ｒ．等、１９９５年６月２７日発行）は、前立腺、胃腸および胸の腫瘍成長のin vitroおよびin vivoの阻害に用いられる天然のＰＳＰ９４を含む製剤を記載している。これらの製剤は、天然のＰＳＰ９４単独、または、天然ＰＳＰ９４と、例えば、マイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシンおよびダウノマイシンなどの抗癌剤との混合物を含む。更に、組換えヒトＰＳＰ９４（ｒｈｕｓＰＳＰ９４）、および、ＰＣＫ３１４５などのポリペプチド類似体の治療効果は、カナダ特許出願第２，３５９，６５０号（参照によってここに組み込まれる）において記載されている。
【０００８】
ｍＲＮＡレベルでの免疫組織化学的研究および調査により、前立腺がＰＳＰ９４の主要源であることが示されている。ＰＳＰ９４は、成体雄ラットのin vitroおよびin vivoの両方において、循環卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の、フィードバック制御に関与し、分泌抑制に作用する。前立腺部位ならびに下垂体の両方で、両方にＰＳＰ９４に対する受容体部位が存在するため、ＰＳＰ９４は作用する。ＰＳＰ９４は、前立腺によるＦＳＨ様ペプチドの合成／分泌に影響を及ぼし得るだけでなく、ラット下垂体からのＦＳＨの生合成および分泌を抑制することも示されている。これらの発見は、in vivoの腫瘍成長におけるＰＳＰ９４の作用が、血清ＦＳＨレベルの低減の結果であり得ることを示唆する。
【０００９】
最近、ＢＰＨまたはＣａｐ患者の血清中のＰＳＰ９４濃度が、正常者よりも有意に高いことが示されている。正常男性において観察されたＰＳＰ９４の最高血清濃度が、およそ４０ｎｇ／ｍｌであるのに対し、ＢＰＨまたはＣａＰを伴う男性におけるＰＳＰ９４の血清濃度は、４００ｎｇ／ｍｌまで観察されている。
【００１０】
血清において、ＰＳＰ９４は、遊離（非結合）形、または未知の正体の担体タンパク質と会合した結合形として存在する。結合形（状態）のＰＳＰ９４は、前立腺癌患者の血中において定量化され、これらの測定値は、予後の評価時のそれらの有用性について分析されている（Ｂａｕｍａｎ，Ｇ．Ｓ．，等、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｊ．２：９４−１０１、２０００；Ｘｕａｎ，Ｊ．Ｗ．、米国特許第６，１０７，１０３号；Ｗｕ．Ｄ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６：７１−８３、１９９９）。遊離形および結合形のＰＳＰ９４の測定値が、遊離形単独の測定値よりも、前立腺癌のいくつかの領域において、より大きな臨床的関連性を有するであろうことが示唆された。更に、ＰＳＰ９４の両方の形態の測定値は、放射線治療後の前立腺癌における再発しない間隔の正確な予測を可能とすることが示された。しかしながら、Ｘｕａｎ，Ｊ．Ｗ．米国特許第６，１０７，１０３号に記載されたものなど、今日のＰＳＰ９４測定分析は、タンパク質の結合および遊離形態を分離するための精製工程に依存しており、それゆえ、有用かつ能率的な工業用分析のために必要である簡易性に欠いている。
【特許文献１】米国特許第５，４２８，０１１号（Ｓｈｅｔｈ  Ａ．Ｒ．等、１９９５年６月２７日発行）
【特許文献２】カナダ特許出願第２，３５９，６５０号
【特許文献３】Ｘｕａｎ，Ｊ．Ｗ．米国特許第６，１０７，１０３号
【特許文献４】カナダ特許出願第２，３５９，６５０号
【特許文献５】国際特許出願第０２／３３０９０号
【特許文献６】米国特許第６，１５６，５１５号
【特許文献７】米国特許第４，１９６，２６５号
【特許文献８】米国特許第３，８１７，８３７号
【特許文献９】米国特許第３，８５０，７５２号
【特許文献１０】米国特許第３，９３９，３５０号
【特許文献１１】米国特許第３，９９６，３４５号
【特許文献１２】米国特許第４，２７７，４３７号
【特許文献１３】米国特許第４，２７５，１４９号
【特許文献１４】米国特許第４，３６６，２４１号
【非特許文献１】Ｕｌｖｓｂａｃｋ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．，１６４：１３１０、１９８９
【非特許文献２】Ｇｒｅｅｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．，１６７：１１８４、１９９０
【非特許文献３】Ｗｅｉｂｅｒ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１３７：５９３、１９９０
【非特許文献４】Ｙａｎｇ等、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１６０：２２４０、１９９８
【非特許文献５】Ｇａｒｄｅ等、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、２２：２２５、１９９３
【非特許文献６】Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３：４８５５、１９９３
【非特許文献７】Ｂａｕｍａｎ，Ｇ．Ｓ．，等、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｊ．２：９４−１０１、２０００
【非特許文献８】Ｗｕ．Ｄ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６：７１−８３、１９９９
【非特許文献９】Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９８４）
【非特許文献１０】Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版社（１９８９）、
【非特許文献１１】Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１および２巻、ＩＲＬ出版社（１９９１）
【非特許文献１２】Ｄ．Ｍ．ＧｌｏｖｅｒおよびＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集者）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１〜４巻、ＩＲＬ出版社（１９９５および１９９６）
【非特許文献１３】Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（編集者）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ出版協会およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての改訂版を含む）
【非特許文献１４】Ｔｏｄａｒｏ  ＧＪおよびＧｒｅｅｎ  Ｈ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７：２９９−３１３、１９６３）
【非特許文献１５】Ｐｕｃｋ  ＴＴ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１０８：９４５−９５６、１９５８）
【非特許文献１６】Ｂｕｃｋｈｏｌｚ，Ｒ．Ｇ．およびＧｌｅｅｓｏｎ，Ｍ．Ａ．Ｇ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：１０６７−１０７２、１９９１
【非特許文献１７】Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：９０５−９１０、１９９３
【非特許文献１８】Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ等、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２８：２６５−２７８、１９８８
【非特許文献１９】Ｗｅｇｎｅｒ，Ｇ．Ｈ．、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、８７：２７９−２８４、１９９０
【非特許文献２０】Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第二版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３
【非特許文献２１】Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．およびＷａｔｅｒｍａｎ  Ｍ．Ｓ．（１９８１）Ａｄ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２−４８９
【非特許文献２２】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３
【非特許文献２３】Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８
【非特許文献２４】Ｇｏｄｉｎｇ，第６５−６６ページ、１９８６
【非特許文献２５】Ｃａｍｐｂｅｌｌ、第７５−８３ページ、１９８４
【非特許文献２６】Ｂａｉｊａｌ  Ｇｕｐｔａ等、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ８：４８３−４８８、１９９６）
【非特許文献２７】Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ８：４８３−４８８、１９９６
【非特許文献２８】Ｇａｌｆｒｅ  Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６、１９８１
【非特許文献２９】Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｅｄｓ  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ＰＳＰ９４（全ＰＳＰ９４だけでなく、遊離または結合形のＰＳＰ９４）のレベルを評価（定量化）する方法が、ここに記載されている。本発明は、ＰＳＰ９４またはＰＳＰ９４結合タンパク質に対する特異性を有する抗体、および改善された診断および予後分析、ハイブリドーマ、そのキットおよび抗体に関する。
【００１２】
さらに、ＰＳＰ９４が結合する担体タンパク質が、本出願において、記載され、同定され、そして、特徴付けられている。
【００１３】
ＰＳＰ９４との会合能により、ＰＳＰ９４結合タンパク質および関連抗体は、ＰＳＰ９４の生物活性における影響力を有することができ、それゆえ、ここに、（ＰＳＰ９４関連）疾患の診断および予後マーカーとして用いることができる。
【００１４】
それゆえ、本発明は、ここに、ＰＳＰ９４結合タンパク質として同定されたポリペプチド（配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９）、精製方法、核酸およびアミノ酸配列、および、疾患（例えば、前立腺癌、または、ＰＳＰ９４および／または卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の異常もしくは増大したレベル、および／または、ＰＳＰ９４結合タンパク質の異常もしくは増大したレベルによって特徴付けられる疾患）の診断および予後におけるこれらの配列の使用に関する。
【００１５】
第一の局面において、本発明は、
ａ）配列番号１に記載のポリヌクレオチド、
ｂ）配列番号６に記載のポリヌクレオチド、
ｃ）配列番号６の配列１から１３９２を有するポリヌクレオチド、
ｄ）配列番号６の配列１から１６５３を有するポリヌクレオチド、
ｅ）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１０塩基の連続部分に順に一致する１０から２００５（又は２００４）塩基長の間のサイズのポリヌクレオチド、および、
ｆ）配列番号６に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１０塩基の連続部分に順に一致する１０から１８７６（又は１８７５）塩基長の間のサイズのポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるメンバーを含むことができる（例えば単離される）ポリヌクレオチド（例えば、ＰＳＰ９４結合タンパク質をコードしている）を提供する。
【００１６】
ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１に記載のポリヌクレオチド、または、配列番号６に記載のポリヌクレオチド、または、配列番号６の配列１から１３９２を有するポリヌクレオチド、または、配列番号６の配列１から１６５３を有するポリヌクレオチドであることができる。本発明のポリヌクレオチドは、特に、コードされたタンパク質のＰＳＰ９４結合能に基づいて、選択することができる。ここでは、配列番号１は、配列番号６の類似体とみなされてよいと理解されるべきである。
【００１７】
第二の局面において、本発明は、例えば、
配列番号２に記載のポリペプチド、
配列番号３に記載のポリペプチド、
配列番号７に記載のポリペプチド、
配列番号８に記載のポリペプチド、
配列番号９に記載のポリペプチド、
配列番号２の同じサイズの連続部分に一致する１０から５０５のサイズのアミノ酸長のポリペプチド、
配列番号３の同じサイズの連続部分に一致する１０から５９２のサイズのアミノ酸長のポリペプチド、
配列番号７の同じサイズの連続部分に一致する１０から６２４のサイズのアミノ酸長のポリペプチド、
配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、または、配列番号９に記載のアミノ酸配列に一致する少なくとも９０％のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体、
配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、または、配列番号９に記載のアミノ酸配列に一致する少なくとも７０％のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体、
配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、または、配列番号９に記載のアミノ酸配列に一致する少なくとも５０％のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体、
−配列番号２の、１０から５０５の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、
−配列番号３の、１０から５９２の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、または、
−配列番号７の、１０から６２４の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、
のアミノ酸配列に一致する少なくとも９０％のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体、
−配列番号２の、１０から５０５の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、
−配列番号３の、１０から５９２の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、または、
−配列番号７の、１０から６２４の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、
のアミノ酸配列に一致する少なくとも７０％のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体、
−配列番号２の、１０から５０５の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、
−配列番号３の、１０から５９２の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、または、
−配列番号７の、１０から６２４の長さの連続アミノ酸のポリペプチド、
のアミノ酸配列に一致する少なくとも５０％のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体、
などのポリペプチドおよびポリペプチド類似体を提供する。
【００１８】
本発明によると、ポリペプチドは、好ましくは、配列番号２に記載のポリペプチド、配列番号３に記載のポリペプチド、配列番号７に記載のポリペプチド、配列番号８に記載のポリペプチド、または、配列番号９に記載ポリペプチドであることができる。本発明のポリペプチドは、特に、ＰＳＰ９４の結合能に基づいて選択されることができる。ここでは、配列番号２および配列番号３は、配列番号７の類似体とみなして良いと理解されるべきである。配列番号８および配列番号９も、配列番号７の類似体とみなして良い。
【００１９】
更なる局面において、本発明は、例えば、ここに記載されたポリヌクレオチドを含むベクターを含む免疫化組成物を提供する。（２１塩基対ポリヌクレオチド配列によってコードされた）７アミノ酸のポリペプチドが、抗原呈示時に、しばしば、大きな組織適合複合体（ＭＨＣ）と会合するため、時に、所望する配列の少なくとも２１塩基長のポリヌクレオチドを有することが好ましい。ベクターは、例えば、配列番号１に記載のポリヌクレオチド、配列番号６に記載のポリヌクレオチド、配列番号６の配列１から１３９２を有するポリヌクレオチド、配列番号６の配列１から１６５３を有するポリヌクレオチド、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの同じサイズの連続部分に順に一致する２１から２００５塩基長の間のサイズのポリヌクレオチド、または、配列番号６に記載のポリヌクレオチドの同じサイズの連続部分に順に一致する２１から１８７６塩基長の間のサイズのポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド、および、希釈剤または緩衝剤を含むことができる。ここで、ベクターは、前記ポリヌクレオチドからコードされたポリペプチドの発現を可能にすることができると理解されるべきである。ベクターは、直鎖状または環状であることができ、ポリヌクレオチド自身に加えて最小限の配列を含むことができる（例えば、ゲノムに組み込むための配列、プロモーター、ＣｐＧ配列）。本発明のポリヌクレオチドの投与（いかなる付加的な配列も用いない、すなわち、ベクターを用いない）は、時に所望する免疫反応を始めるのに十分であることがある。
【００２０】
更なる局面において、本発明は、ここに明記したポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９）、ポリペプチド類似体、変異体、断片、またはその組み合わせ、および希釈剤または緩衝剤を含む免疫化組成物に関する。ここに記載された免疫化組成物の任意の組み合わせを用いた免疫化も本発明に含まれる。
【００２１】
免疫化組成物は、更にアジュバントを含むことができる。更なる実施態様において、免疫化組成物は、ＰＳＰ９４（天然体、および／または、組換え体）、ＰＳＰ９４変異体、ＰＳＰ９４断片、ＰＳＰ９４をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ＰＳＰ９４変異体をコードするポリヌクレオチド、ＰＳＰ９４断片をコードするポリヌクレオチド、およびその組み合わせも含むことができる。さらに、ベクターは、前記ポリヌクレオチドからコードされるポリペプチドの発現を可能にすることができる。天然ＰＳＰ９４、組換えＰＳＰ９４（例えば、ｒＨｕＰＳＰ９４）、ＰＳＰ９４変異体、類似体、および断片における参考のために、カナダ特許出願第２，３５９，６５０号または国際特許出願第０２／３３０９０号を参照してください。
【００２２】
更なる局面において、本発明は、ポリペプチド（例えば、ＰＳＰ９４、ＰＳＰ９４結合タンパク質、および／または、ＰＳＰ９４／ＰＳＰ９４結合タンパク質複合体）に対する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を生産する方法であって、哺乳動物に、ここに記載された免疫化組成物（ポリペプチド、ポリペプチド類似体、ポリヌクレオチド、およびその組み合わせなどを含む）を投与することを含む方法に関する。
【００２３】
本発明によると、本方法を用いて免疫化される哺乳動物は、例えば、ヒト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ラット、ブタ、および機能的な免疫システムを有する他の哺乳動物を含む。ここで、「機能的な免疫システムを有する哺乳動物」は、抗原により免疫化した時に、抗体（免疫グロブリン）を生産することができる（すなわち、抗原に対する体液性免疫反応および／または細胞免疫反応を有する）哺乳動物として理解されるべきである。
【００２４】
本発明の更なる局面は、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体およびその抗原結合断片、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体およびその抗原結合断片、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系に関する。
【００２５】
更なる局面において、本発明は、本発明の任意のポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、配列番号６、アンチセンス、断片、変異体、ｍＲＮＡなど、を、組み込んだ（形質転換した、形質導入した、トランスフェクトした、など）細胞に関する。
【００２６】
更に、付加的な局面において、本発明は、本発明のポリペプチド、例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、変異体、断片、類似体、もしくはその組み合わせ、の少なくとも一つを、組み込み、および／または、発現している（単離される）細胞に関する。
【００２７】
別の局面において、本発明は、ＰＳＰ９４の異常な（例えば、高い、増大した）レベル、またはＰＳＰ９４結合タンパク質の異常な（例えば、高い、増大した）レベルと関連した状態の診断または予後（もしくは処置）における、ここに明記したポリヌクレオチド（配列番号１、配列番号６、断片、アンチセンス、類似体、ｍＲＮＡ）の使用を含む。
【００２８】
更に、別の局面において、本発明は、ＰＳＰ９４の異常な（例えば、高い、増大した）レベルまたはＰＳＰ９４結合タンパク質の異常な（例えば、高い、増大した）レベルと関連した状態の診断または予後（もしくは処置）における、ここに明記したポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、類似体、変異体、断片）の使用を提供する。
【００２９】
本発明によると、ここに明記したポリヌクレオチドまたはここに明記したポリペプチドは、例えば、前立腺癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、他の上皮分泌部の癌、良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）またはＦＳＨの増大したレベルに特徴付けられる疾患などの状態の診断または予後において用いることができる。
【００３０】
更なる局面において、本発明は、ここに明記したポリペプチド、例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９（ならびにその変異体、類似体、および断片）からなる群から選択されるポリペプチド、またはその組み合わせの試料中における量を測定するための方法に関する。本発明によると、方法は、前記試料を、前記ポリペプチドを認識することができる分子（抗体またはポリペプチド）と接触させることを含むことができる。ここで意図された方法は、ブロット膜、プレート、マトリックスに固定化された、または、固定化されていない（溶液状態）ポリペプチドに適用することができる。
【００３１】
ここで、ポリペプチドのレベルを評価するための定量分析を発展させるために、好ましい分子は、所望されるポリペプチドに対する十分な親和性と特異性を有するであろうと理解されるべきである。親和性と特異性は、例えば、関連性のないポリペプチドに対する分子の結合を比較する、関心のあるポリペプチドに対する競合分析などによって決定することができる。
【００３２】
本発明の一実施態様において、前記方法に用いられる分子は、例えば、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体を含むことができる。本発明の別の実施態様において、分子は、例えば、ＰＳＰ９４およびその類似体であることができる。
【００３３】
ここで意図された配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択されるポリペプチドの量を測定するための方法は、さらに、例えば、以下の工程：
ａ）本発明のポリペプチドの少なくとも一つを含む試料を、適切な基材（例えば、ＥＬＩＳＡプレート、マトリックス、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット膜）に固定した抗体と接触させること、
ｂ）工程ａ）に、標識またはマーカーを含む検出試薬を加えること、および、
ｃ）標識またはマーカーから得られるシグナルを検出すること、
を含むことができる。
【００３４】
適切な検出試薬は、例えば、抗体、または本発明のポリペプチドに対する親和性を有するポリペプチドを含むことができ、検出試薬は、好ましくは、抗体とは異なる結合部位を有することができる。ここに記載されたように、検出試薬は、直接、標識（もしくはマーカー）に結合させる（接合させる）ことができ、あるいは、前記標識もしくはマーカーを担持する（と接合させた）第二の分子によって認識させることができる。
【００３５】
工程ａ）において用いられることができる抗体の例は、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（１７Ｇ９）である。その場合、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（３Ｆ４）を、工程ｃ）における検出試薬として用いることができる。
【００３６】
表１０に列挙される抗体（クローンとして識別されている）など、ＰＳＰ９４−結合タンパク質（配列番号２、配列番号３など）に結合することができるいかなる抗体も、ここに記載された方法に用いることができる（例えば、（クローン）２Ｂ１０、１Ｂ１１、９Ｂ６、Ｐ８Ｃ２、Ｂ３Ｄ１、２６Ｂ１０）。この方法を行なうために、二つの抗体を必要とする場合、異なるエピトープに結合する抗体を選択することが好ましいであろう。
【００３７】
工程ａ）において用いることができる抗体の別の例は、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（３Ｆ４）である。その場合、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（１７Ｇ９）を、工程ｃ）における検出試薬として用いることができる。
【００３８】
更なる局面において、本発明は、ＰＳＰ９４に結合していない（すなわち、遊離している（未結合の））、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９（変異体、類似体、断片）からなる群から選択されるポリペプチドまたはその組み合わせの試料中における量を測定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）前記試料から、ＰＳＰ９４と、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９（変異体、類似体、断片）からなる群から選択されるポリペプチドのいずれか一つとによって形成される複合体を除去し、複合体不含試料を生成すること、および、
ｂ）前記複合体不含試料を、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９（変異体、類似体、断片）およびその組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドのいずれか一つを認識することができる抗体と接触させること、
を含む。
【００３９】
本発明の一実施態様において、工程ｂ）で用いられる抗体は、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択されることができる。
【００４０】
前記で意図されたＰＳＰ９４に結合していない本発明のポリペプチドの量を測定するための方法は、例えば、以下の工程；
ａ）前記試料から、ＰＳＰ９４と、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択されるポリペプチドのいずれか一つとによって形成される複合体を除去し、複合体不含試料を生成すること、
ｂ）抗体を、適切な基材（ＥＬＩＳＡプレート、マトリックス、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット膜）に、固定する（被覆する、吸着させる）こと、
ｃ）前記複合体不含試料を加えること、
ｄ）標識またはマーカーを含む検出試薬を加えること、および、
ｅ）標識またはマーカーから得られるシグナルを検出すること、
を含むことができる。
【００４１】
複合体の除去は、例えば、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体を用いることによって、行なうことができる。
【００４２】
工程ｂ）において用いることができる適切な抗体は、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（３Ｆ４）、および、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（１７Ｇ９）からなる群から選択される抗体である。
【００４３】
更なる局面において、本発明は、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（２Ｄ３）、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（Ｐ１Ｅ８）、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（３Ｆ４）、および、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（１７Ｇ９）からなる群から選択される（モノクローナル）抗体の、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、変異体、断片、類似体、および／または、その組み合わせの（試料中における）量（分量、濃度）（遊離型、結合型、および／または、全ての量）を評価するための使用を含む。
【００４４】
別の局面において、本発明は、配列番号２に記載のポリペプチド、配列番号３に記載のポリペプチド、配列番号７に記載のポリペプチド、配列番号８に記載のポリペプチド、配列番号９に記載のポリペプチド、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（２Ｄ３）、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（Ｐ１Ｅ８）、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（３Ｆ４）、および、特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（１７Ｇ９）からなる群から選択される分子の、ＰＳＰ９４の（試料中における）量を評価するため、または、ＰＳＰ９４もしくはＰＳＰ９４結合タンパク質の異常または増大したレベルに関連した状態の診断のための使用を含む。
【００４５】
別の局面において、本発明は、第一部分と第二部分を含み、前記第一部分が、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（２Ｄ３）、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（Ｐ１Ｅ８）、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（３Ｆ４）、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（１７Ｇ９）からなる群から選択され、かつ、前記第二部分が、薬剤、固形支持体、レポーター分子、レポーター分子を担持する基、キレート剤、アシル化剤、架橋剤、および標的基からなる群から選択される、抗体接合物であって、前記第二部分もしくは前記第二部分の接合が、第一部分の生物活性（例えば、親和性、安定性）を妨げない抗体接合物に関する。
【００４６】
本発明の一実施態様において、固形支持体の例は、炭水化物、リポソーム、脂質、コロイド状金、微粒子、マイクロカプセル、ミクロエマルジョン、およびアフィニティーカラムのマトリックスであることができる。
【００４７】
更なる実施態様において、レポーター分子は、フルオロホア（例えば、ローダミン、フルオロセイン、および緑色蛍光タンパク質）、クロモホア、染料、酵素（例えば、アルカリ・ホスファターゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ）、放射性分子、および結合／リガンド（例えば、ビオチン／アビジン（ストレプトアビジン））複合体の分子からなる群から選択されることができる。
【００４８】
更に、付加的な実施態様において、薬剤は、毒素（例えば、細菌毒素）、（例えば、抗癌）薬、およびプロドラッグの群から選択されることができる。
【００４９】
更なる局面において、本発明は、（結合）ＰＳＰ９４を認識することができる分子を有する容器を含む、（試料中の）ＰＳＰ９４の量を評価する際に用いるための、または、ＰＳＰ９４（またはＰＳＰ９４結合タンパク質）の異常な（高い、もしくは増大した）レベルに関連した状態の診断のための、キットを含む。ここで、キットは、分離した構成要素で提供される（売られる）ことができると理解されるべきである。
【００５０】
本発明の一実施態様において、キットに含まれることができるＰＳＰ９４を認識できる分子は、（以下の一つ以上）ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（２Ｄ３）、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（Ｐ１Ｅ８）、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（３Ｆ４）、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（１７Ｇ９）、本発明の抗体接合物、および、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択されるポリペプチドからなる群から選択される分子である（例えば、含む）ことができる。
【００５１】
本発明の別の実施態様において、キットは、配列番号２に記載のポリペプチド、配列番号３に記載のポリペプチド、および配列番号７に記載のポリペプチド、配列番号８に記載のポリペプチド、配列番号８に記載のポリペプチド、変異体、断片、類似体およびその組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを認識（結合）することができる抗体を有する容器を更に含むことができる。ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（１７Ｇ９）、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（３Ｆ４）が、本発明によって考慮されている。
【００５２】
ここで、キットは、個別の構成要素で提供されてよいと理解されるべきである。キットで提供された抗体は、プレートもしくは膜、もしくは別の型の固形マトリックスに結合させるなど、種々の形態で、または、濃縮形態または適切な抗体の作用希釈物を含むガラス瓶中にあることができる。
【００５３】
別の局面において、本発明は、ここに明記したポリペプチド（ＰＳＰ９４結合タンパク質、例えば、配列番号２に記載のポリペプチド、配列番号３に記載のポリペプチド、配列番号７に記載のポリペプチド、配列番号８に記載のポリペプチド、および配列番号９に記載のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド）を調製するための方法であって、
ａ）細胞による前記ポリペプチドの発現をもたらす条件下において、宿主細胞を、培養すること、および、
ｂ）一つ以上の精製工程により、ポリペプチドを回収すること、
を含む方法を提供する。
【００５４】
更に別の局面において、本発明は、ここに明記したポリペプチド（ＰＳＰ９４結合タンパク質、例えば、配列番号２に記載のポリペプチド、配列番号３に記載のポリペプチド、配列番号７に記載のポリペプチド、配列番号８に記載のポリペプチド、配列番号９に記載のポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択されるポリペプチド）を調製するための方法であって、
ａ）前記ポリペプチドを含む一つ以上の生物試料を採取すること、および、
ｂ）一つ以上の精製工程により、ポリペプチドを回収すること、
を含む方法を提供する。
【００５５】
ここにおいて、単独もしくは組み合わせた精製工程が、硫酸アンモニウム沈降、サイズ除外クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーなどからなる群から選択されることができる。
【００５６】
本発明の別の実施態様において、精製工程は、
ａ）硫酸アンモニウムを前記生物試料に加える工程、
ｂ）イオン交換クロマトグラフィーを行なう工程、
ｃ）ＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィーを行なう工程、
ｄ）サイズ除外クロマトグラフィーを行なう工程、および
ｅ）実質的に純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質を含む画分を回収する工程、
を含むことができる。
【００５７】
更なる局面において、本発明は、試料からのＰＳＰ９４結合タンパク質の精製方法であって、
ａ）硫酸アンモニウムを前記試料（例えば、ヒト男性血清）に、ＰＳＰ９４結合タンパク質の沈降が生じるように加える工程、
ｂ）工程ａ）の混合物を遠心分離して、沈降タンパク質を回収する工程、
ｃ）前記沈降タンパク質を再度懸濁する工程、
ｄ）イオン交換クロマトグラフィーを行って、ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質の画分を回収する工程、
ｅ）ＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックスを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行って、ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質の画分を回収する工程、
ｆ）サイズ除外クロマトグラフィーを行って、ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質の画分を回収する工程、および
ｇ）実質的に純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質（例えば、配列番号２に記載のポリペプチド、配列番号３に記載のポリペプチド、配列番号７に記載のポリペプチド、配列番号８に記載のポリペプチド、配列番号９に記載のポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択されるポリペプチド）を含む画分を回収する工程、
を含む方法も含む。
【００５８】
本発明の一実施態様において、工程ａ）におけるＰＳＰ９４結合タンパク質の沈降は、硫酸アンモニウムを、４７％以下の最終濃度まで加えることによって、もたらされることができる。
【００５９】
本発明の第二の実施態様において、工程ｄ）のイオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスを用いることによって行なわれることができる。
【００６０】
その更なる局面において本発明は、ＰＳＰ９４結合タンパク質（例えば、配列番号２に記載のポリペプチド、配列番号３に記載のポリペプチド、配列番号７に記載のポリペプチド、配列番号８に記載のポリペプチド、配列番号９に記載のポリペプチド、およびその組み合わせからなる群から選択されるポリペプチド）のための精製方法を含む（図８に要約されている）。血清からのＰＳＰ９４結合タンパク質の精製は、例えば、以下の工程：
ａ）硫酸アンモニウム最終濃度が３２％の溶液を供するように、硫酸アンモニウムを、ヒト（男性）血清試料に、加えること、
ｂ）非特異的ヒト血清タンパク質を含むペレット画分およびＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質の上清画分を回収するために前記工程の溶液を遠心分離すること、
ｃ）ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質の上清画分を回収し、ＰＳＰ９４結合タンパク質を含む沈降タンパク質溶液を供するように、硫酸アンモニウム濃度を、最終濃度４７％に調節すること、
ｄ）ＰＳＰ９４結合タンパク質を含む沈降タンパク質を回収するため、混合物を遠心分離すること、
ｅ）水性溶剤（例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水、１０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＭＯＰＳ、１０ｍＭのＢｉｃｉｎｅ：これらの溶液（適切な場合）は、例えば、４．７から９．０の間、好ましくは５．７から８．０の間、より好ましくは５．７から６．７の間に含まれるｐＨであることができる）中に、ＰＳＰ９４結合タンパク質を含む、前記沈降タンパク質を再度懸濁すること、しかしながら、好ましい水性溶剤は、ｐＨ６．５の１０ｍＭＭＥＳ緩衝液である
ｆ）ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質の前記水溶液を、イオン交換（陰イオン交換）クロマトグラフィーマトリックス（樹脂、ゲル）を含むイオン交換（陰イオン交換）クロマトグラフィーカラムに充填すること、
ｇ）前記イオン交換クロマトグラフィーから、ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質を回収する（溶出する、分離する）ために、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウムからなる群から選択される塩溶液、好ましくは、例えば、１００ｍＭから１０００ｍＭまで変動するモル濃度の塩化ナトリウム、を、加えること、
ｈ）ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質の画分（ピーク）を回収すること、
ｉ）ＰＳＰ９４結合タンパク質と結合したＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックスを作るために、ＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックスを、回収された画分と、接触させる（充填する、通す）こと、
ｊ）ＰＳＰ９４結合タンパク質を回収する（溶出する、分離する）ために、ＰＳＰ９４結合タンパク質と結合した前記ＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックスに、溶出剤（遊離ＰＳＰ９４、尿素、酢酸ナトリウムまたはＣＡＰＳ；好ましくは、遊離ＰＳＰ９４）を加えること、
ｋ）ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質の画分を回収すること、
ｌ）ＰＳＰ９４結合タンパク質を不純物から分離するために、サイズ除外クロマトグラフィーマトリックスを含むサイズ除外クロマトグラフィーカラムに、前記ＰＳＰ９４結合タンパク質を充填すること、および
ｍ）（実質的に）純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質を含む画分を回収すること、
を含むことができる。
【００６１】
ここに記載された精製工程の幾つかが、必要とされる精製レベル、または、一つ以上の残りの工程の最適化に応じて、不要になるかもしれないことを理解されるべきである。
【００６２】
更なる局面において、本発明は、前記精製方法から得られる生成物に関する。
【００６３】
本発明によると、ここで称される試料（例えば、生物試料）は、例えば、血液、血漿、血清、尿、精液、細胞培養培地、細胞溶解物などを  含むことができる。試料は、好ましくは、ヒト（例えば、男性）の試料である。
【００６４】
別の局面において、本発明は、ＰＳＰ９４が他のポリペプチド（他の分子）に結合している時でさえ利用できる、ＰＳＰ９４エピトープ（すなわち、露呈されたエピトープ）を認識することができる抗体、および、その抗原結合断片に関する。そのようなポリペプチドは、例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、変異体、断片、類似体、および、その組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドであることができる。そのような抗体を生成するハイブリドーマ細胞系も、本発明によって意図されている。そのような抗体の例は、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１（Ｐ１Ｅ８）として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、または、ＰＳＰ９４の遊離および結合型を認識することができるポリクローナル抗体である。
【００６５】
露呈されたエピトープの同定は、ＰＳＰ９４の遊離および結合型に対する特異性について、抗体のパネルを試験することによって、行なうことができる。両方の型と反応する（認識する）抗体は、候補抗体を表すことができる。同時に、部分的トリプシン消化を、ＰＳＰ９４／ＰＳＰ９４結合タンパク質複合体に行なうことができる。複合型で利用できるＰＳＰ９４エピトープ（例えば、直鎖状エピトープ）を、次いで、アミノ酸配列分析によって同定することができる。この、もしくは、これらの（利用できる）エピトープに結合することができる抗体を、生産することができる。ここで、露呈されたエピトープは、好ましくは、分子または複合体が天然（自然）の状態（例えば、変性されていない、天然の、または、３Ｄ型）である時に、抗体に近づける分子（例えば、ＰＳＰ９４、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、およびそれらの複合体）のエピトープとして理解されることができる。
【００６６】
更なる局面において、本発明は、試料からＰＳＰ９４を除去するための方法であって、
ａ）前記試料を、ＰＳＰ９４に結合することができる分子と、接触させること（分子は、直接的または間接的に、マトリックスまたは固形支持体に結合させることができる）、および、
ｂ）ＰＳＰ９４を含まない試料を回収すること、
を含む方法を提供する。
【００６７】
例えば、試料（生物試料）からＰＳＰ９４を除去すること、増大したＰＳＰ９４レベルを有する個体の血清から過剰のＰＳＰ９４を除去すること（すなわち、ＰＳＰ９４の血清の涸渇）、および、涸渇した血清を個体（例えば、必要とする患者）に再度注入することが有用であることが判明するかもしれない。他の場合において、他の血清構成要素の測定を最適化するために、ＰＳＰ９４を試料から除去することが有用であるかもしれない。ＰＳＰ９４の除去は、ＰＳＰ９４と、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９に記載された配列、ＰＳＰ９４抗体、およびその組み合わせのいずれか一つとの間の親和性に基づいている。
【００６８】
前記分子は、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体からなる群から選択されることができる分子であることができる。
【００６９】
また、更なる局面において、本発明は、ＰＳＰ９４と、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９に記載されたポリペプチドおよびその組み合わせのいずれか一つによって形成される複合体（例えば、ＰＳＰ９４／配列番号２、および／または、ＰＳＰ９４／配列番号３、および／または、ＰＳＰ９４／配列番号７など）を試料から除去するための方法であって、
ａ）前記試料を、前記複合体の利用できる（露出した）エピトープを認識することができる抗体と、接触させること（例えば、抗体は、直接的または間接的に、マトリックスもしくは固形支持体に結合させることができる）、および、
ｂ）前記複合体を含まない試料を回収すること、
を含む方法を提供する。
【００７０】
本発明の一実施態様において、工程ｂ）に用いられる抗体は、例えば、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体を含むことができる。ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体が、好ましくは用いられる。
【００７１】
本発明の別の局面は、ＡＴＣＣに特許寄託（例えば、受入）番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、ならびに、ＡＴＣＣに特許寄託（例えば、受入）番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、およびその抗原結合断片を包含する。
【００７２】
ここに記載された抗体を生産するハイブリドーマ細胞系も、本発明によって網羅されている。これらは、ＡＴＣＣに特許寄託（例えば、受入）番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系、および、ＡＴＣＣに特許寄託（例えば、受入）番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系を含む。
【００７３】
別の局面において、本発明は、試料中のＰＳＰ９４の総量を測定するための方法を提供し、前記方法は、ＰＳＰ９４が、他のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９、変異体、断片、および類似体）に、結合している時でさえ、ＰＳＰ９４を認識することができる抗体と、前記試料を接触させることを含むことができる。発明のこの局面は、一以上の工程を行なわなければいけない、もしくは行なわない、という事に関係無く、この工程を含む、任意の方法を包含する。
【００７４】
一実施態様において、試料中のＰＳＰ９４の総量を測定する際に用いられることができる抗体は、例えば、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体であることができ、または、ＰＳＰ９４の遊離および結合型を認識することができるポリクローナル抗体であることができる。
【００７５】
前記で意図された試料中のＰＳＰ９４の全体（遊離（未結合）および結合）の量を測定するための方法は、以下の工程を含むことができる；
ａ）ＰＳＰ９４−抗体を、適切な基材（ＥＬＩＳＡプレート、マトリックス、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット膜）に固定化する（被覆する、吸着させる）こと。抗体は、ＰＳＰ９４を、ＰＳＰ９４結合タンパク質（配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９など）に結合している時でさえ、認識することができる；
ｂ）ＰＳＰ９４を含む試料を加えること、および、
ｃ）標識またはマーカーを含むＰＳＰ９４検出試薬を加えること、および；
ｄ）標識またはマーカーから得られるシグナルを検出すること。
【００７６】
この方法の工程ｃ）において用いられることができる適切な検出試薬の例は、ＰＳＰ９４に対する親和性を有する抗体およびポリペプチドを含む。しかしながら、検出試薬は、好ましくは、ＰＳＰ９４抗体およびＰＳＰ９４結合タンパク質とは異なる結合部位を有するであろう。検出試薬は、標識（またはマーカー）に直接的に結合させる（例えば、本発明の抗体接合物）、または、前記標識またはマーカーを担持する（接合させた）第二の分子によって認識させることができる。
【００７７】
工程ａ）において用いられることができるＰＳＰ９４抗体の例は、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産される抗体（Ｐ１Ｅ８）である。その場合、検出試薬は、例えば、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産される抗体（２Ｄ３）（例えば、抗体接合物）、または、任意の他の適切なＰＳＰ９４抗体であることができる。
【００７８】
ここで、ＰＳＰ９４の遊離および結合型を認識することができるポリクローナル抗体（一つ以上のポリクローナル抗体）が、ここに記載された任意のモノクローナル抗体と組み合わせて、工程ａ）またはｃ）のいずれにも適しているであろうことが理解されるべきである。例えば、全てのＰＳＰ９４は、ポリクローナル抗体（ＰＳＰ９４の遊離および結合型を認識することができる抗体）で捕らえることができ、そして、検出を、Ｐ１Ｅ８などの他の抗体で、（直接的または間接的に）行なうことができる（逆の場合も同様である）。
【００７９】
さらに、全てのＰＳＰ９４は、例えば、ポリクローナル抗体、または、（ハイブリドーマ細胞系ＰＴＡ−４２４１によって生産される）Ｐ１Ｅ８抗体など、遊離および結合（例えば、ここに記載されたように、ＰＳＰ９４結合タンパク質に結合した）型のＰＳＰ９４を認識することができる抗体で、捕捉されることができ、そして、捕捉されたタンパク質（複合体）の検出は、二つ以上の抗体の組み合わせ、すなわち、一つは、遊離ＰＳＰ９４を検出することができ（例えば、ハイブリドーマ細胞系ＰＴＡ−４２４０によって生産される２Ｄ３）、かつ、一つ以上の抗体が、ＰＳＰ９４結合タンパク質を検出することができる（例えば、ハイブリドーマ細胞系ＰＴＡ−４２４３によって生産される１７Ｇ９；および／または、ハイブリドーマ細胞系ＰＴＡ−４２４２によって生産される３Ｆ４）で行なうことができる。
【００８０】
更に別の局面において、本発明は、試料中の遊離ＰＳＰ９４の量を測定するための改善された方法であって、（例えば、遊離型の）ＰＳＰ９４を認識することができる抗体と、前記試料を、接触させることを含む方法を提供する。
【００８１】
本発明の一実施態様において、適切な抗体は、例えば、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体を含むことができる。しかしながら、１２Ｃ３抗体（表１０）など、別の適した抗体が、本発明によって、包含される。
【００８２】
更なる局面において、本発明は、試料中の遊離（未結合ＰＳＰ９４）ＰＳＰ９４（および／または、ＰＳＰ９４断片およびその類似体）の量を測定するための改善された方法であって、ＰＳＰ９４／ＰＳＰ９４結合タンパク質複合体不含試料を、ＰＳＰ９４、ＰＳＰ９４断片およびその類似体を認識することができる抗体と接触させることを含む方法を提供する。例えば、試料中の遊離ＰＳＰ９４の量を測定するための改善された方法は、
ａ）ＰＳＰ９４と、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、およびその組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドのいずれか一つとによって形成される複合体を、除去すること、複合体不含試料を生成すること、および；
ｂ）前記複合体不含試料を、ＰＳＰ９４を認識することができる抗体と接触させること、
を含むことができる。
【００８３】
ここで意図される試料中の遊離（未結合ＰＳＰ９４）ＰＳＰ９４の量を測定するための改善された方法は、例えば、以下の工程；
ａ）ＰＳＰ９４と、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、変異体、断片類似体、およびその組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドのいずれか一つとによって形成される複合体を、除去すること、（例えば、ここに記載された方法を用いて）複合体不含試料を生成すること、
ｂ）ＰＳＰ９４抗体を、適切な基材（ＥＬＩＳＡプレート、マトリックス、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット膜）に、固定化する（被覆する、吸着させる）こと、
ｃ）遊離（未結合）ＰＳＰ９４を含む前記複合体不含試料を加えること、
ｄ）標識またはマーカーを含む（ＰＳＰ９４）検出試薬を加えること、および、
ｅ）標識またはマーカーに由来するシグナルを検出すること、
も含むことができる。
【００８４】
本発明において用いられることができる適した検出試薬の例は、抗体およびＰＳＰ９４に対する親和性を有するポリペプチドからなる群から選択される試薬である。検出試薬は、ＰＳＰ９４抗体とは異なる結合部位を有することができ、そして、検出試薬は、直接的に標識（またはマーカー）に結合させる、または、前記標識もしくはマーカーを担持する（接合させた）第二の分子によって認識させることができる。
【００８５】
工程ｂ）で用いられるＰＳＰ９４抗体の例は、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（２Ｄ３）である。その場合、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（Ｐ１Ｅ８）（例えば、接合させた）を、（ここに記載されたように、直接的または間接的に）検出試薬として用いることができる。
【００８６】
工程ｂ）において用いられることができるＰＳＰ９４抗体の別の例は、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（Ｐ１Ｅ８）である。その場合、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（２Ｄ３）（例えば、接合させた）を、（ここに記載されたように、直接的または間接的に）検出試薬として用いることができる。
【００８７】
更なる局面において、本発明は、試料中の全ＰＳＰ９４（結合および未結合（遊離））の量を測定するための方法に関し、方法は、ＰＳＰ９４が、別のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９）に、結合している時でさえ、ＰＳＰ９４に結合することができる第一および第二の抗体を用いることを含むことができる。第一および第二の抗体が、異なるＰＳＰ９４エピトープに結合することが好ましいであろう。
【００８８】
また、更なる局面において、本発明は、試料中の全ＰＳＰ９４を測定するための方法であって、第一および第二の抗体を用いることを含み、前記第一の抗体は、ＰＳＰ９４がポリペプチドに結合している時でさえ、ＰＳＰ９４に結合することができ、そして、前記第二の抗体は、ＰＳＰ９４に結合することができ、かつ、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９からなる群から選択されるポリペプチドのいずれか一つを、ＰＳＰ９４と前記ポリペプチドとによって形成される複合体から、外すことができる方法にも関する。
【００８９】
本発明の一実施態様において、第一の抗体は、例えば、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、または、任意のほかの適した抗体であることができる。第二の抗体は、例えば、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体であることができる。
【００９０】
更なる局面において、本発明は、試料中のＰＳＰ９４のレベル（量、濃度）を測定するための方法であって、遊離および結合型の（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９などに結合した）ＰＳＰ９４を認識することができる抗体と、前記試料を接触させることを含む方法を提供する。
【００９１】
本発明の一実施態様において、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体を用いることができる。
【００９２】
ここに記載された（例えば、全てのＰＳＰ９４、遊離ＰＳＰ９４、遊離もしくは全てのＰＳＰ９４結合タンパク質を測定し、そして、割合を算出する）方法は、臨床試料（血清、血液、血漿など）に適用され、ＰＳＰ９４の異常な、または、増大したレベルに関連した状態（例えば、前立腺癌（例えば、放射線治療後の前立腺癌において、再発しない期間の予測））について被験体をスクリーニングするために、および、例えば、前立腺癌であると診断された被験体における予後を評価するために、有用であるであろう。例えば、前立腺癌を有する個体における全ＰＳＰ９４のレベル（または、遊離ＰＳＰ９４／全ＰＳＰ９４、または、全ＰＳＰ９４結合タンパク質の割合）が、対照の被験体と比べて、高ければ高いほど、予後が悪くなる、または、（進展した再発の）前立腺癌を有する可能性が高くなることが、見出されるであろう。さらに、増大したレベルの全ＰＳＰ９４（または、ここに記載した他のパラメーター）が、被験体において観察される場合、それが、被験体における前立腺癌の前兆（または暗示）であることがある。このように、前立腺癌（または、ＰＳＰ９４もしくはＰＳＰ９４結合タンパク質の異常な、もしくは増大したレベルに関連した他の任意の状態）について、被験体をスクリーニングするための診断および予後方法も、本発明によって、包含される。
【００９３】
所望もしくは必要ならば、本発明の方法は、試料；例えば、ＰＳＰ９４の増大したレベルに関連した状態、もしくは、他の状態を有する、個体由来の血液試料を、回収して、前記方法および分析を行なう工程も含むことができる。
【００９４】
本発明の方法は、さらに、前記分子（抗体、ポリペプチド）によって供与された（担持された）標識（例えば、分子に結合させる標識）から、もしくは、前記標識を担持する第二の分子（抗体または結合／リガンドシステム）によって供与される（担持された）標識から、シグナルを検出することを含むことができる。
【００９５】
本発明の方法は、試料に関して得られるシグナル（結果）を、興味のあるポリペプチドの既知量を含む対照試料に関して得られるシグナル（結果）と、比較（検出）することを含むこともできる。
【００９６】
更なる局面において、本発明は、ＰＳＰ９４の増大したレベルを伴う状態の処置のためのＰＳＰ９４抗体の使用に関する。ＰＳＰ９４抗体を投与することを含む、そのような状態の患者を処置する方法も、ここに包含されると理解されるべきである。
【００９７】
また、さらなる局面において、本発明は、ＰＳＰ９４の増大したレベルを伴う状態の処置のための薬剤の製造におけるＰＳＰ９４抗体の使用に関する。
【００９８】
ＰＳＰ９４抗体は、例えば、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体、または、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体であることができる。
【００９９】
試料は、ここでは、血液、血清、血漿、生物学的液体のアリコートとして理解されるべきであり、あるいは、例えば、ＥＬＩＳＡプレートのウェル、膜、ゲル、マトリックスなどに結合した（他の成分を含む、または、含まない）タンパク質であることができる。
【０１００】
また、更なる局面において、本発明は、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９に記載のポリペプチド、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４０として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（２Ｄ３）、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４１として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（Ｐ１Ｅ８）、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（３Ｆ４）、および、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（１７Ｇ９）からなる群から選択される分子の、試料中における、（遊離、および／または、結合、および／または、全ての）ＰＳＰ９４、ＰＳＰ９４変異体、および、その類似体の量を評価するための使用に関する。
【０１０１】
本発明によると、ここに記載された方法および使用に意図される状態は、例えば、前立腺癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、上皮分泌細胞の他の癌、および良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）を含むことができる。
【０１０２】
ここでは、他の抗体が、ここで記載された方法に、用いられることができる（適している）と、理解されるべきである。例えば、表１０に列挙されたＰＳＰ９４結合タンパク質特異抗体は、交換可能であり、（それらのハイブリドーマ細胞系を含む）本発明によって包含される。例えば、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４２として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（３Ｆ４）は、モノクローナル抗体２Ｂ１０、９Ｂ６、１Ｂ１１などと交換可能であることができ、そして、ＡＴＣＣに特許寄託番号ＰＴＡ−４２４３として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体（１７Ｇ９）は、モノクローナル抗体ｐ８Ｃ２、１Ｂ１１、２６Ｂ１０、９Ｂ６などと交換可能であることができる。様々な他の状態が可能である。しかしながら、この方法を行なうために二つの抗体が必要とされる場合、異なるエピトープに結合する抗体を選択することが好ましい。
【０１０３】
また、ここで開示された任意の（モノクローナル）抗体の抗原結合断片（例えば、抗原結合部位）など、抗体断片が、本発明によって包含されることも、ここで理解されるべきである。
【０１０４】
一般的な分子生物学および定義
他に示さなければ、本発明において使用された組換えＤＮＡ技術は、当業者に知られた標準的な方法である。そのような技術の例は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９８４）；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版社（１９８９）；Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１および２巻、ＩＲＬ出版社（１９９１）
；Ｄ．Ｍ．ＧｌｏｖｅｒおよびＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集者）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１〜４巻、ＩＲＬ出版社（１９９５および１９９６）；および、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（編集者）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ出版協会およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての改訂版を含む）
などの出典文献において説明され、そして、参照によってここに組み込まれる。
【０１０５】
「ポリヌクレオチド」は、一般的に、修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであることができる、任意のポリヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」は、限定されずに、一本および二本鎖ＤＮＡ、一本および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本および二本鎖ＲＮＡ、および一本および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、もしくは、より典型的には、二本鎖もしくは一本および二本鎖領域の混合物であることができるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ、または、ＤＮＡ、または、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域を指す。用語ポリヌクレオチドは、一つ以上の修飾された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、および、安定性または他の理由のために修飾されたバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの普通でない塩基を含む。様々な修飾が、ＤＮＡおよびＲＮＡになされ；このように、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然で見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的、または代謝的に修飾された型、ならびに、ウィルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特性の化学的型を包含する。「ポリヌクレオチド」は、限定されないが、直鎖状および末端が閉じた分子を含む。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドとして称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【０１０６】
それゆえ、本発明によると、ポリヌクレオチドは、例えば、ポリリボヌクレオチド、ポリデオキシリボヌクレオチド、修飾されたポリリボヌクレオチド、修飾されたポリデオキシリボヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス）またはその組み合わせであることができる。
【０１０７】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチド等量線）によって、互いに接合された二つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」は、一般的には、ペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーと称される短鎖、および、通常、タンパク質と称される長鎖の両方を指す。上記のように、ポリペプチドは、遺伝子コードされた２０アミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。
【０１０８】
ここで用いられる用語「変異体」は、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは、各々、異なるが、本質的な特性は保持する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。典型的なポリヌクレオチド変異体は、ヌクレオチド配列が、他のもの、基準ポリヌクレオチドと異なる。変異体のヌクレオチド配列における変化により、基準ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を、変える、または、変えないことができる。ヌクレオチドの変化により、ここで論じられたように、基準配列によってコードされたポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合およびトランケーション（切断）を生じることがある。典型的なポリペプチド変異体は、アミノ酸配列が、他のもの、基準ポリペプチドと異なる。一般的に、違いは、基準ポリペプチドと変異体の配列が、全般的に酷似し、かつ、多くの領域で同一であるように、限定される。変異体および基準ポリペプチドは、アミノ酸配列において、一以上の置換、付加、欠失、またはその任意の組み合わせによって、異なることができる。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされたものであること、または、コードされたものではないことができる。変異ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、対立遺伝子変異体など、自然に生じたものであることができ、あるいは、天然に生じることが知られていない変異体であることができる。非自然的に生じるポリヌクレオチドおよびポリペプチド変異体は、突然変異生成技術または直接合成によって、作ることができる。ここで用いられる「変異体」は、（活性）突然変異体、類似体、相同体、キメラ、断片およびその一部を包含する。しかしながら、ここで用いられる「変異体」は、もともとのポリペプチドの生物活性の一部を保持することができる。
【０１０９】
ここで用いられるように、「薬学的組成物」は、適切な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／または、担体と共に、治療的に有効な量の薬品を、を意味する。ここで用いられる「治療的に有効な量」は、所定の状態および投与計画に対して治療効果をもたらす量を指す。そのような組成物は、液体、または、凍結乾燥させた、または他の乾燥させた製剤であり、かつ、様々な緩衝成分（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ、および、イオン強度の希釈剤、表面への吸着を防ぐためのアルブミンまたはゼラチンなどの添加剤、界面活性剤（例えば、ツイーン２０、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタバイスルファイトナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、充填物質、または張性調節剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、タンパク質へのポリエチレングリコールなどのポリマーの共有結合、金属イオンとの錯化、または、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどの重合化合物の粒状製剤中もしくは上への、もしくは、リポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層または複層のベシクル、赤血球影、もしくは、スフェロプラスト上への、物質の取り込み、を含む。そのような組成物は、物理状態、可溶性、安定性、in vivo遊離速度、および、in vivoクリアランスに影響を及ぼすであろう。制御された、もしくは、持続性の遊離組成物は、親油蓄積物（例えば、脂肪酸、ワックス、油）中の製剤を含む。ポリマー（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）によって被覆された特定の組成物も、発明に包含される。発明の組成物の他の実施態様は、腸管外、肺、鼻および口経路を含む、様々な投与経路のための、特定の型の保護被覆剤、プロテアーゼ阻害剤、または、浸透増強剤を組み込む。一実施態様において、薬学的組成物は、腸管外的、傍癌的、経粘膜的、経皮的、粘膜内的、静脈内的、皮内的、皮下的、腹腔内的、脳室内的、頭蓋内的、および腫瘍内的に投与される。
【０１１０】
ここで用いられる「免疫化組成物」または「免疫原性組成物」は、そのような組成物を受け入れる宿主における免疫反応を促進することができる組成物を指す。「免疫化組成物」は、例えば、抗体を探索するポリペプチド（または、ポリペプチドをコードすることができるＤＮＡまたはＲＮＡ）などの化合物を含む。ポリペプチドは、通常、緩衝剤、希釈剤、または薬学的に許容可能な担体中に、希釈される。「免疫化組成物」は、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、および水酸化アルミニウムなどのアジュバントを含むことができる。
【０１１１】
さらに、ここに用いられる「薬学的に許容可能な担体」または「薬学的担体」は、当該分野において公知であり、限定されないが、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液、または０．８％生理食塩水を含む。さらに、そのような薬学的許容可能な担体は、水性もしくは非水性溶剤、懸濁液、および乳濁液であることができる。非水性溶剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、生理食塩水および緩衝媒体を含む、乳濁液または懸濁液を含む。腸管外ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルオルフィックス（ｏｒｆｉｘｅｄ）油を含む。静脈内ビヒクルは、体液および栄養補充剤、リンゲルデキストロースなどに基づいた電解質補充剤などの電解質補充剤を含む。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、照合剤、不活性ガスなど、防腐剤および他の添加剤も、存在することができる。
【０１１２】
ここで用いられるように、「ＰＳＰ９４結合タンパク質」は、通常、可逆的様式で、ＰＳＰ９４に、結合（すなわち、会合）することができるタンパク質（配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、など）に関する。
【０１１３】
ここで用いられるように、用語「遊離ＰＳＰ９４」は、他のポリペプチドと会合していないＰＳＰ９４タンパク質に関する。用語「遊離ＰＳＰ９４」は、ＰＳＰ９４が未結合型（状態）であることを意味する。
【０１１４】
ここで用いられるように、用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ）２’、およびＦａｂなどを含む抗体断片のいずれかを指す。
【０１１５】
ここで用いられるように、用語「抗原結合断片」は、興味のある抗原を認識（結合）することができる抗体断片（抗原結合領域）を指す。「抗原結合断片」は、分子生物学的方法を用いて、抗体をコードする遺伝子（例えば、可変領域をコードする遺伝子）から単離されることができる。単離された遺伝子は、例えば、一本鎖抗体を作るように設計されていることができる。
【０１１６】
ここで用いられるように、「ＰＳＰ９４」は、天然および組換えＰＳＰ９４に関する。
【０１１７】
遺伝子（ｃＤＮＡ）クローニングおよびタンパク質発現
同定および単離された遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド）は、適切なクローニングもしくは発現ベクター（すなわち、発現システム）に挿入することができる。当該分野において公知の多数のベクター宿主システムを用いることができる。可能なベクターは、限定されないが、プラスミドまたは修飾されたウィルス（例えば、バクテリオファージ、アデノウィルス、アデノ関連随伴ウィルス、レトロフィルス）を含むが、ベクターシステムは、用いられる宿主細胞と適合できなければならない。クローニングベクターの例は、限定されないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラムダ派生体などのバクテリオファージ、または、ｐＢＲ３２２派生体またはｐＵＣプラスミド派生体（例えば、ｐＧＥＸベクター、ｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧなど）などのプラスミドを含む。発現ベクターの例は、以下に論じられている。クローニングもしくは発現ベクターへの挿入は、例えば、相補的な付着末端を有するクローニングベクターにＤＮＡ断片を結紮することによって、成し遂げることができる。しかしながら、ＤＮＡ断片に用いられた相補的な制限酵素認識部位がクローニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を、酵素的に改変することができる。あるいは、所望された任意の部位を、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）を結紮することによって、作り出すことができ；これらの結紮されたリンカーは、制限酵素認識配列をコードする、特定の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。組換え分子は、宿主細胞に、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、感染、エレクトロポレーションなどによって、挿入することができる。クローン化された遺伝子は、クローニング細胞、例えば大腸菌、における増殖をもたらし、適切な発現細胞系への次の挿入のために、精製を、そのようなことが所望されれば、容易にする、シャトルベクタープラスミドに含ませることができる。例えば、一種類を超える生物体で、複製することができるベクターである、シャトルベクターは、大腸菌およびサッカロマイセス・セレヴィシエの両方における複製のために、大腸菌プラスミド由来の配列を、酵母２．ｍｕ．プラスミド由来の配列と連結することによって、調製することができる。
【０１１８】
ここで、本発明のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）は、適切なベクター中に挿入されると、例えば、単離のために、外来宿主細胞（細菌、酵母、昆虫、動物または植物細胞など）に、または、遺伝子治療処置もしくは（例えば、樹状細胞を用いた）細胞介在予防接種を目的として、個体由来の（単離された）細胞に、タンパク質を発現する手段として、用いられることができると理解されるべきである。例えば、細胞は、哺乳動物から単離することができ、そして、同じ個体または適合できる個体に再度注入する前に、本発明のポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ、遺伝子、ＲＮＡ、アンチセンス）を用いて、ex-vivoで処置する（例えば、さらす、トランスフェクションする、リポフェクションする、感染させる（高速マイクロプロジェクタイルを用いて）衝撃を与える）ことができる。in vivoのポリヌクレオチドの送達は、前記した以外の方法によって行なうことができる。例えば、注入時のリポソームの形成も、ポリヌクレオチドのin vivo送達を媒介するのに適しているであろう。
【０１１９】
任意の広範囲の発現システムを、組換えポリペプチド（タンパク質）を提供するために用いることができる。用いられる明確な宿主細胞は、発明にとって重要でない。本発明のポリペプチドは、原核生物宿主（例えば、大腸菌、バシラス・サチリス（Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または真核生物宿主（酵母、例えば、サッカロマイセスまたはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ）；哺乳動物細胞、例えば、サルＣＯＳ細胞、マウス３Ｔ３細胞（Ｔｏｄａｒｏ  ＧＪおよびＧｒｅｅｎ  Ｈ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７：２９９−３１３、１９６３））、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（例えば、Ｐｕｃｋ  ＴＴ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１０８：９４５−９５６、１９５８））、ＢＨＫ、ヒト腎臓２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、またはヒトＨｅＬａ細胞（例えば、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）、または昆虫細胞）で発現させることができる。
【０１２０】
ピキア・パストリス（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母細胞発現システムでは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ｐＰＩＣ９ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの適切な発現ベクター中にクローニングすることができる。本発明のポリペプチドの全て、もしくは、一部をコードするＤＮＡ配列を含むベクターの、Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞への導入時に、例えば、ＡＯＸ１座に組換え事象が起こることがある。そのような組換え事象により、本発明のポリペプチドのＤＮＡ配列が、ＡＯＸ１遺伝子プロモーターの依存下に置かれることがある。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子（すなわち、ＤＮＡ配列）の成功した挿入によって、宿主細胞の成長培地に加えられたメタノールにより、制御および／または誘導される、前記ポリペプチドの発現がもたらされるであろう（Ｂｕｃｋｈｏｌｚ，Ｒ．Ｇ．およびＧｌｅｅｓｏｎ，Ｍ．Ａ．Ｇ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：１０６７−１０７２、１９９１；Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：９０５−９１０、１９９３；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ等、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２８：２６５−２７８、１９８８；Ｗｅｇｎｅｒ，Ｇ．Ｈ．、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、８７：２７９−２８４、１９９０を参照）。
【０１２１】
哺乳動物宿主細胞において、多くのウィルスに基づいた発現システムが利用できる。例えば、本発明のポリペプチドの発現ベクターとしてアデノウィルスを用いる場合、核酸配列を、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列）に結紮することができる。このキメラ遺伝子を、アデノウィルスゲノムに、例えば、in vitro、もしくは、in vivoでの組換えによって、挿入することができる。ウィルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１もしくはＥ３）への挿入により、感染させた宿主において、生存でき、かつ、本発明のポリペプチドを発現することができる組換えウィルスを得ることができる。
【０１２２】
本発明のタンパク質およびポリペプチドは、植物細胞によって、生成させることもできる。カリフラワーモザイクウィルスおよびタバコモザイクウィルスなどの発現ベクター、および、プラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を、植物細胞におけるポリペプチドの発現のために用いることができる。そのような細胞は、広範囲の供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍｄ．）から入手できる。形質転換もしくはトランスフェクションの方法、および発現ビヒクルの選択は、もちろん、選択される宿主細胞に応じて、選択されるべきである。
【０１２３】
スポドプテラ・フルギペルダ細胞で増殖する、オートグラファ・カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）などの昆虫細胞発現システムにおいて、ＡｃＮＰＶは、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ウィルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子（すなわち、ＤＮＡ配列）の成功した挿入により、ポリヘドリン遺伝子の不活性化と、非閉塞組換えウィルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされたタンパク質の被覆を欠くウィルス）の生成をもたらすであろう。これらの組換えウィルスは、挿入された遺伝子を発現するスポドプテラ・フルギペルダ細胞を感染させるために、用いることができる。
【０１２４】
さらに、宿主細胞は、挿入された配列の発現を調節する、または、特定の所望された様式に、遺伝子産物を修飾する、もしくはプロセシングするための性能によって、選択されることができる。そのようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、開裂）は、タンパク質の機能に重要であることがある。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセシング、および、タンパク質および遺伝子産物の修飾に関して、特性および特異的なメカニズムを有する。もちろん、細胞系または宿主システムは、発現された外来タンパク質の所望された修飾とプロセシングを確実にするために、選択されることができる。このために、一次転写産物の適切なプロセシング、グリコシル化、および、遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳動物の宿主細胞は、例えば、限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、および３Ｔ３を含む。
【０１２５】
あるいは、本発明のポリペプチドは、安定的にトランスフェクトした哺乳動物細胞系によって生産させることができる。哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションに適した多くのベクターは、一般に入手することができ；そのような細胞系を構築するための方法も、公に入手することができる。一例において、ｒＨｕＰＳＰ９４タンパク質をコードするｃＤＮＡを、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む発現ベクターにクローニングすることができる。宿主細胞染色体への、プラスミドの組み込み、および、それゆえ、本発明のポリペプチドのＤＮＡ配列の組み込みは、細胞培養培地中にメトトレキサートを含ませることによって、選択することができる。この選択は、殆どの細胞型で行なうことができる。
【０１２６】
また、特定の開始シグナルが、前記適切な発現ビヒクルに挿入されたＤＮＡ配列の有効な翻訳のために必要とされることがある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含むことがある。例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはｃＤＮＡが、それら自身の開始コドンおよび隣接配列を有さない場合、更なる翻訳制御シグナルが必要とされるであろう。例えば、おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが、必要とされるであろう。当該分野において、開始コドンは、所望のポリペプチドの適切な翻訳を確実にするために、ポリペプチド配列のリーディングフレームと一致していなければならないことが知られている。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方を含む、様々な由来のものであることができる。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターを含めることによって、高めることができる。転写、翻訳シグナルは、所望された発現形態とレベルを供するように、特に設計されることができる（例えば、特定の誘導因子を必要とするであろうシグナル、所定の細胞種もしくは特定の時間枠内で、発現を許容するであろうシグナル）。しかしながら、これらのシグナルは、しばしば、所望された宿主細胞でのポリペプチドの発現を可能にするプロモーターを含む、発現ベクターによって提供されることができる。
【０１２７】
ポリペプチドの修飾（突然変異体、変異体、類似体、相同体、キメラおよび部分／断片）
認識されるように、本発明のポリペプチドおよび断片に、ポリペプチドもしくは断片の生物活性に有害な影響を及ぼすことなく、多くの修飾をなすことができる。本発明のポリペプチドは、例えば、翻訳後プロセシングなどの自然の過程、または、当該分野において知られている化学的修飾技術のいずれかによって、修飾されたアミノ酸配列を含むものなどを含む。修飾は、ポリペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、および、アミノもしくはカルボキシ末端を含む、ポリペプチドの任意の場所に生じることがある。同じ種類の修飾が、所定のポリペプチドの幾つかの部位で、同じもしくは異なる程度で存在することがあることが認識されるであろう。また、所定のポリペプチドが、多くの種類の修飾を含むことがある。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として、分岐されることがあり、そして、分岐を有する、もしくは有さない環状であることがある。環状、分枝状、および分枝環状ポリペプチドが、翻訳後の自然の過程の結果得られることがあり、または、合成方法によって、作られることがある。修飾は、例えば、限定なしに、アセチル化、アシル化、アセトミドメチル（Ａｃｍ）基の付加、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンへの共有結合、ヘム部分への共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、二硫化結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタマートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化およびユビキチン化などのタンパク質への転移ＲＮＡ介在アミノ酸付加を含む（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第二版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３を参照）。
【０１２８】
他の種類のポリペプチド修飾は、例えば、そのような変化が、ポリペプチドの全生物活性を実質的には変えないポリペプチド配列において、保存的または非保存的（例えば、Ｄ−アミノ酸、脱アミノ酸）のいずれかである、アミノ酸挿入（すなわち、付加）、欠失、および、置換（すなわち、置き換え）、を含むことができる。本発明のポリペプチドは、例えば、生物学的に活性な当然変異体、変異体、断片、キメラ、および類似体を含み；断片は、一つ以上のアミノ酸のトランケーションを有するアミノ酸配列であって、該トランケーションが、アミノ末端（Ｎ−末端）、カルボキシ末端（Ｃ−末端）から、または、タンパク質の内部から、生じるであろう、アミノ酸配列を包含する。発明のポリペプチド類似体は、一つ以上のアミノ酸の挿入もしくは置換を含む。変異体、突然変異体、断片、キメラ、および、類似体は、本発明のポリペプチドの生物学的特性を有するであろう。
【０１２９】
さらに、ポリペプチドが、合成的に作られる場合、ＤＮＡによって自然にはコードされないアミノ酸による置換もなされることがあることに、留意されるべきである。例えば、代替残基は、式、ＮＨ２（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ、式中、ｎは２〜６である、のオメガアミノ酸を含む。これらは、サルコシン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、および、ノルロイシンのように、中性の無極性アミノ酸である。フェニルグリシンは、トリプトファン、チロシン、またはフェニルアラニンと置換することができ；シトルリンおよびメチオニンスルホキシドは、中性の無極性であり、システイン酸は酸性であり、オルニチンは塩基性である。プロリンは、ヒドロキシプロリンで置換することができ、特性を与える構造を保持することができる。
【０１３０】
当該分野において、突然変異体または変異体は、置換突然変異生成によって、生成することができ、本発明のポリペプチドの生物活性を保持することが、知られている。これらの変異体は、タンパク質分子における少なくとも一つのアミノ酸残基が除去され、その箇所に異なる残基が挿入されている。例えば、置換突然変異生成のための興味ある一部位は、限定されないが、活性部位または免疫部位として同定された部位を含むであろう。興味ある他の部位は、例えば、様々な種から得られる特定の残基が一致する部位であろう。これらの位置は、生物活性に重要であろう。「保存的置換」として同定された置換の例は、表１に示す。そのような置換により、望ましくない変化が生じた場合、次に、表１で「典型的な置換」と称された、あるいは、ここに、アミノ酸の種類として更に記載された、別の種類の置換を、挿入し、生成物をスクリーニングする。
【０１３１】
置換の例は、保存的である（すなわち、残基が、同じ一般型の別のものによって置換されている）ものであることができる。理解されるように、天然に生じるアミノ酸は、酸性、塩基性、中性かつ極性、または、中性かつ無極性として、下位区分されることができる。さらに、コードされたアミノ酸の三つは、芳香族である。本発明の決定されたポリペプチドと異なる、コードされたポリペプチドが、置換されたアミノ酸と同じ群に由来するアミノ酸に対応する置換されたコドンを含むことが有用であろう。このように、いくつかの場合において、塩基性アミノ酸のリジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ）が、交換可能であることがあり；酸性アミノ酸のアスパラギン酸（Ａｓｐ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ）が交換可能であることがあり；中性極性アミノ酸のセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびアスパラギン（Ａｓｎ）が交換可能であることがあり；無極性脂肪族アミノ酸のグリシン（Ｇｌｎ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、およびロイシン（Ｌｅｕ）が交換可能であるが、大きさのため、ＧｌｙとＡｌａが、最も密接に関係し、そして、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、およびＬｅｕが、互いにより密接に関係し、そして、芳香族アミノ酸のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、およびチロシン（Ｔｙｒ）が交換可能であることがある。
【０１３２】
【表１】
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【０１３３】
いくつかの場合において、アミノ酸置換、挿入、または欠失により、ポリペプチドの生物活性を修飾することが、興味深いかもしれない。例えば、ポリペプチドの修飾は、ポリペプチドの生物活性を増加する、その毒性を調節する、生物学的利用能もしくは安定性における変化をもたらす、または、免疫活性もしくは免疫学的同一性を調節する、ことがある。機能もしくは免疫学的同一性における実質的な修飾は、（ａ）例えば、シート状もしくは螺旋状構造のように、置換領域におけるポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、または、（ｃ）側鎖の容積、を、保持する効果が有意に異なる置換を、選択することによって、行なわれる。天然に生じる残基は、一般的な側鎖の特性に基づいた群に分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン（Ｍｅｔ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）
（２）中性親水性：システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）
（３）酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）
（４）塩基性：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）
（５）鎖の配向に影響する残基：グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）；および
（６）芳香族：トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）。
【０１３４】
非保存的な置換は、これらの分類の一つのメンバーを、別のものと取り替えることを必要とするであろう。
【０１３５】
突然変異ポリペプチドは、アミノ酸残基の欠失（例えば、トランケーション）、挿入（例えば、付加）、または置換である、一つ以上の突然変異を有するであろう。突然変異は、天然に生じる（すなわち、天然源から精製もしくは単離される）、または、合成（例えば、コードしているＤＮＡにおける特定部位突然変異誘発を行なうことによる、または、化学合成などの他の合成方法によってなされた）のいずれかのものであることができる。このように、発明のポリペプチドが、天然に生じる、または、組換え体（すなわち、組換えＤＮＡ技術から調製される）のいずれかのものであり得ることは明らかである。
【０１３６】
当業者に公知の方法（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．およびＷａｔｅｒｍａｎ  Ｍ．Ｓ．（１９８１）Ａｄ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２−４８９またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３によって記載された方法）によって測定される場合、本発明のポリペプチドと少なくとも５０％一致するタンパク質が、本発明のタンパク質と、少なくとも７０％または８０％、より好ましくは少なくとも９０％一致するタンパク質と同様に、発明に含まれる。これは、一般的には、少なくとも５、好ましくは、少なくとも２０連続アミノ酸領域にわたるであろう。
【０１３７】
アミノ酸配列変異体は、ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入する、または、所望するポリペプチドのin vitro合成によって調製することができる。そのような変異体は、例えば、アミノ酸配列内残基の欠失、挿入、または置換を含む。最終タンパク質産物が、所望された特性を有するならば、最終構築物に達するように、欠失、挿入、および置換の組み合わせをなすことができる。また、アミノ酸変化により、グリコシル化部位の数または位置を変える、膜アンカー特性を変える、挿入、欠失、もしくは、天然タンパク質の膜貫通配列に影響を及ぼすことにより、細胞内局在を変える、または、タンパク質分解開裂に対する感受性を変更するなど、翻訳後のプロセスを変えることもできる。
【０１３８】
タンパク質精製
本発明の幾つかの局面は、ポリペプチドの、精製、および、特定の実施態様において、実質的な精製に関係する。ここで用いられる用語「精製されたポリペプチド」は、他の成分から単離可能な組成物であって、ポリペプチドが、天然で得られる状態に対して（すなわち、この場合、前立腺細胞抽出物中の純度に対して）、任意の程度まで精製されている組成物を指すと意図される。それゆえ、精製されたポリペプチドは、それが天然に生じるかもしれない環境にないポリペプチドも指す。
【０１３９】
一般的に、「精製された」は、様々な他の成分を除去するために分別され、かつ、組成物が実質的にその発現された生物活性を保持する、ポリペプチド組成物を指すであろう。用語「実質的に精製された」が用いられる場合、これは、組成物中、約５０％以上のポリペプチドを構成するなど、組成物の主な成分を、ポリペプチドが、形成している組成物を指すであろう。
【０１４０】
ポリペプチドの精製における使用に適した様々な技術が、当業者によく知られているであろう。これらは、例えば、遠心分離を次いで行なう、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いた沈降、または、熱変性；イオン交換、ゲル濾過（すなわち、サイズ除外クロマトグラフィー）、逆相、ヒドロキシアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動法；ゲル電気泳動法；および、そのような、および、他の技術の組み合わせを、含む。これらの技術は、単独、または、組み合わせて用いることができる。当該分野において一般的に知られているように、様々な精製工程を行なう順序は、変更することができ、または、幾つかの工程は、省略することができ、そしてさらに、実質的に精製されたポリペプチドの調整に適している方法になると考えられる。
【０１４１】
硫酸アンモニウム沈降によりタンパク質を精製する性能は、タンパク質の溶解性が、高い塩濃度で低下するという事実に基づく。しかしながら、タンパク質の溶解性は、それらの特性に応じて、異なった様式で、影響を受ける。
【０１４２】
サイズ除外クロマトグラフィーまたはゲル濾過は、分子をそれらのサイズに基づいて分ける。ゲル（すなわち、マトリックス、樹脂）媒体は、特定の分布の孔を含むビーズからなることができる。異なるサイズの分子が、マトリックス中の孔に含まれる、または、孔から排出される時に、分離を生じるであろう。小さな分子は、孔中に拡散し、カラムからのそれらの流出が妨げられ、一方、大きな分子は、孔に入らず、カラムの空隙容積に溶出される。従って、分子は、カラムを通る時にそれらのサイズに基づいて分離し、分子量が減少していく順に溶出される。
【０１４３】
タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーにより、それらの実効電荷に基づいて分離することができる。例えば、タンパク質が、ｐＨ７で、実効陽電荷を有する場合、それは、通常、陰性に荷電されている基を含むビーズ（例えば、マトリックス）に結合（吸着）するであろう。例えば、陽性に荷電されているタンパク質を、陰性に荷電されているカルボキシメチルセルロース、もしくは、カルボキシメチルアガロースマトリックス上で分離させることができる。溶出後、低密度の実効陽電荷を有するタンパク質が、最初に、カラムから出てきて、より高い電荷密度を有するものがそれに続く傾向にあるであろう。陰性に荷電されたタンパク質は、陽性に荷電されたジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ−セルロース）またはＤＥＡＥ−アガロースマトリックス上のクロマトグラフィーにより分離させることができる。イオン交換マトリックスに結合した荷電タンパク質は、塩化ナトリウムまたは溶出緩衝剤としての他の塩溶液の濃度を増やすことによって、溶出（放出、分離）させることができる。イオンは、マトリックスに結合するために、タンパク質上の荷電された基と競合するであろう。
【０１４４】
塩溶液は、マトリックスに、連続的に（すなわち、特定のモル濃度の溶液（例えば、１００ｍＭの塩化ナトリウム）を加え、次いで、異なるモル濃度の一つ以上の溶液（例えば、２００ｍＭ、次いで３００ｍＭの溶液、次いで４００ｍＭの溶液、次いで５００ｍＭの溶液、次いで１０００ｍＭの溶液）を、発明の特定のポリペプチド（すなわち、ＰＳＰ９４結合タンパク質（配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９）が溶出されるまで、加えることによって）加えることができる。更に、塩溶液は、連続的に勾配するように加えることができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィーカラムに入れる前に、高いモル濃度（例えば、１０００ｍＭ）の塩溶液を、より低いモル濃度（例えば、１００ｍＭ）の第二溶液に、徐々に加えることができる。カラムに入る溶液は、１００ｍＭから１０００ｍＭまで、緩やかに増加するモル濃度を有するであろう。
【０１４５】
アフィニティークロマトグラフィーは、化合物に対するポリペプチドの特異性（親和性）が知られている、もしくは、推測される時に用いることができる。例えば、第一段階として、そのような化合物（例えば、ＰＳＰ９４）を、カラム（例えば、臭化シアン活性化セファロースマトリックス）に共有的に結合させ、所望するポリペプチド（例えば、ＰＳＰ９４結合タンパク質）を含む混合物（溶液）を、マトリックスに加えることができる。未結合タンパク質を除去するために、マトリックスを洗浄した後、所望するポリペプチドは、高濃度の可溶型の化合物（例えば、ＰＳＰ９４）を加えることによって、マトリックスから溶出させることができる。抗体が、化合物の一例であり、それが結合するタンパク質を精製するために、しばしば用いられる。
【０１４６】
当該分野において、不要な（すなわち、非特異的な）タンパク質の結合（非特異結合）を最小限度にするために、クロマトグラフィーマトリックス（すなわち、樹脂）（例えば、イオン交換マトリックス、サイズ除外マトリックス、アフィニティーマトリックス）の平衡化および十分な洗浄が好まれることが知られている。
【０１４７】
抗体およびハイブリドーマ
本発明の別の局面は、抗体およびハイブリドーマ細胞系に関する。抗体の調製および特徴付けは、当該分野において、よく知られており（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照；ここに参照によって組み込まれる）、米国特許第６，１５６，５１５号で論じられており、その全ての内容が参照によってここに組み込まれる。
【０１４８】
例えば、ポリクローナル抗体の調製品は、免疫原（免疫性を与える）組成物を用いて、動物に免疫性を与え、そして、免疫性を与えた動物から抗血清を回収することによって、得ることが出来る。抗血清を生成するために、広範囲の動物種を用いることができる。典型的には、抗血清の生成のために用いられる動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ギニーピッグ、またはヤギである。
【０１４９】
例えば、免疫原を、担体（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））に結合させる、または、アジュバントを、ここに記載されたように、免疫化組成物にアジュバントを組み込ませることによって、宿主の免疫システムを高めることが、しばしば必要である。
【０１５０】
抗体の生成は、免疫性を与えた後、様々な時点で、免疫性を与えた動物の血液をサンプリングすることによって、観測することができる。時々、抗体の十分な力価を得るために、追加抗原投与（ブースト）が必要とされることがある。
【０１５１】
所望された抗体は、例えば、他の抗体または固形マトリックスに結合させたペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーなど公知の方法によって、精製することができる。
【０１５２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、全内容が参照によって組み込まれる米国特許第４，１９６，２６５号に例示された技術など、公知の技術の使用により、容易に調製することができる。マウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）およびラットが、免疫化に通常用いられる動物である。免疫化後、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）が、ｍＡｂ生成プロトコルにおける使用のために、選択される。しばしば、動物のパネルが、免疫性を与えられていなければならず、最も高い抗体力価を有する動物が選択されるであろう。免疫化動物由来の抗体生成Ｂリンパ球を、次いで、不死化骨髄腫細胞の細胞と、（例えば、ポリエチレングリコールを用いて）融合させる。当業者に公知のように、多くの骨髄腫細胞のうちのいずれか一つを、用いることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，第６５−６６ページ、１９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、第７５−８３ページ、１９８４）。例えば、免疫化動物がマウスの場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／ＪＵ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７、および、Ｓ１９４／５ＸＸＯ  Ｂｌｕを用いることができ；ラットの場合、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、および、４Ｂ２１０を用いることができ；および、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、および、ＵＣ７２９−６は、全て、ヒト細胞融合に関して有用である。
【０１５３】
融合されたハイブリッドは、融合細胞と親細胞（すなわち、骨髄腫細胞およびＢ細胞）の間の区別化を可能にする選択培地中で培養される。選択培地は、通常、ヌクレオチドのデノボ合成を阻害する薬品（例えば、アミノプテリン、メトトレキサート、アザセリン）を含む。アミノプテリンまたはメトトレキサートが用いられる場合、培地は、ヌクレオチド源として、ヒポキサンチンとチミジンで補充されている（ＨＡＴ培地）。アザセリンが用いられる場合、培地は、ヒポキサンチンで補充されている。ヌクレオチドサルベージ経路を使うことができる細胞のみが、ＨＡＴ培地中で生き抜くことができる。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の主要な酵素、例えば、ヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）が欠けており、それらは生き抜くことができない。Ｂ細胞は、この経路を使うことができるが、培養時の寿命が限られており、通常約二週間以内に死ぬ。それゆえ、選択培地で生き抜くことができる唯一の細胞は、骨髄腫とＢ細胞から形成されるそれらのハイブリッドである。
【０１５４】
ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートで、単一クローン希釈によって細胞を培養し、次いで、所望する反応性に関して各クローンの上清を試験することによって、行なわれる。選択されるハイブリドーマは、次いで、順次に希釈し、各抗体生成細胞系にクローン化し、次いで、ｍＡｂを供するために、クローンを、無期限に増殖させる。
【０１５５】
モノクローナル抗体の断片が、本発明によって包含される。これらは、ペプシンまたはパパインなどの酵素による消化、および／または、化学的還元による二硫化結合の開裂を含む方法によって得ることができる。あるいは、本発明によって含まれるモノクローナル抗体断片は、自動ペプチド合成装置を用いて合成する、または、適切な細胞（細胞系）において、そのような断片（例えば、単一鎖抗体）を生成するように設計されたクローン化遺伝子セグメントから生産させることができる。
【０１５６】
抗体接合物も、本発明によって包含される。これらは、抗体を、フルオロホア、クロモホア、もしくは染料（例えば、ローダミン、フルオロセイン、および緑色蛍光タンパク質）、または、単一で作用することにより、もしくは、生物反応に続いて、検出可能なシグナルを生じる任意の他の薬品もしく標識（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、および、β−ガラクトシダーゼなどの酵素）と結合させることにより生成させることができる。ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）などの分子も、抗体に連結させることができる。ＤＴＰＡは、放射性同位元素（例えば、インジウムの同位元素１１１（１１１Ｉｎ））を含む重金属イオンと結合することができるキレート剤として、作用させることができる。これらの接合物は、免疫学的分析または画像化における検出手段として用いることができる。あるいは、毒素などの治療剤を有する接合物を、本発明のモノクローナル抗体から生成することができ、これらは、癌細胞を標的にし、それらの破壊を促進するために用いることができる。
【０１５７】
当業者によって、前立腺癌に関連しているタンパク質に特異的なモノクローナル、または、ポリクローナル抗体が、いくつかの種類の適用に有用性を有するであろうことが、認識されているであろう。これらは、前立腺癌を有する個体の予後を検出し、診断し、または、評価する際に、用いられるための診断キットの生成を含むであろう。
【０１５８】
抗原検出
抗原検出の用語において、分析される生物試料は、興味のある抗原を含むと推測される任意の試料、組織、細胞溶解物、尿、血液、血清、血漿などであることができる。
【０１５９】
生物試料を、抗原検出試薬（タンパク質、ペプチド、または抗体）と接触させることは、通常、単に、組成物を試料に加え、そして、抗体が、抗原と、免疫複合体を形成するために十分な長さの時間、混合物を、インキュベーションする事である。試料（すなわち、組織断片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロット、またはウエスタンブロット）の洗浄は、通常、あらゆる非特異的結合抗体種を除去するために、必要とされる。抗原−抗体複合体（免疫複合体）は、次いで、特定の試薬を用いて検出される。
【０１６０】
例えば、抗原検出試薬が抗体（特異抗体）の場合、抗体は、複合体の検出を可能にするためのマーカー（フルオロホア、クロモホア、染料、酵素、放射性同位元素など）で、（直接的に）標識することができる。他の例において、第二抗体などの第二の結合リガンド、または、当該分野に公知のように、ビオチン／アビジン（ストレプトアビジン）（結合／リガンド複合体）の配合を用いることが有益であるかもしれない。また、第二抗体は、前記マーカー、もしくは、ビオチン／アビジン（すなわち、アビジンペルオキシダーゼ）の配合で標識することができ、これにより、免疫複合体を検出することができる。そのような標識の使用に関する米国特許は、各自参照によってここに組み込まれる、米国特許第３，８１７，８３７号、米国特許第３，８５０，７５２号、米国特許第３，９３９，３５０号、米国特許第３，９９６，３４５号、米国特許第４，２７７，４３７号、米国特許第４，２７５，１４９号、および、米国特許第４，３６６，２４１号を含む。通常、第二抗体は、例えば、抗マウスＩｇＧなど、所定のアイソタイプおよび種の特異抗体（一次抗体）に導かれる抗体であるであろう。
【０１６１】
他方、抗原検出試薬は、複合体（すなわち、ポリペプチド−ポリペプチド複合体、または、抗体−ポリペプチド複合体）を形成する、抗体または他のポリペプチドに対する親和性を有するポリペプチドであることもできる。その場合、ポリペプチド自体を、直接的な検出を可能にする、前記マーカーを用いて、標識することができる。また、複合体は、第二の（標識化）抗体またはポリペプチドを加えることによって、間接的に検出することができる。
【０１６２】
酵素免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロットなどの免疫検出法は、前立腺癌などの状態の診断において有用性を有する。しかしながら、これらの方法は、抗原または抗体試料の力価の測定、ハイブリドーマの選択においてなど、非臨床試料への適応性も有する。
【０１６３】
ＥＬＩＳＡ
前記のように、本発明のコードされたポリペプチド（配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９）は、免疫組織化学およびＥＬＩＳＡ分析において有用性を見出すであろうが、ワクチン開発に関連した免疫原（すなわち、抗原）としても有用性を見出すであろう。コードされたポリペプチドおよび対応する抗体の一つの明白な有用性は、前立腺癌の診断／予後のための免疫分析にある。
【０１６４】
本発明の試薬（配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、または、配列番号９に規定されるポリペプチド、および抗体）を用いて行なうことが出来る免疫分析は、例えば、当該分野に知られている、酵素免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫分析（ＲＩＡ）を含む。組織断片を用いた免疫組織化学的検出も、特に有用である。しかしながら、検出が、そのような技術に限定されず、ウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、ＦＡＣＳ分析なども用いてよいことが、容易に認識されるであろう。
【０１６５】
ＥＬＩＳＡ分析の例は、以下を含む：ポリペプチドに結合する抗体（例えば、ＰＳＰ９４に対する抗体、または、ＰＳＰ９４結合タンパク質（配列番号２、配列番号３など）に対する抗体）を、ポリスチレンマイクロタイタープレート（ＥＬＩＳＡプレート）におけるウェルなど、タンパク質親和性を示す選択される表面（すなわち、適切な物質）上に固定させる。次いで、ポリペプチドを含むと推測される試料を、プレートのウェルに加える。結合、および、非特異結合免疫複合体を除去するための洗浄後、結合した抗原を検出することができる。検出は、検出可能な標識に結合させた、標的ポリペプチドに対して特異的な第二の抗体を、加えることにより、行なうことができる。この種のＥＬＩＳＡは、単に、「サンドウィッチＥＬＩＳＡ」である。検出は、第二の抗体を加えた後、第二の抗体に対する結合親和性を有し、検出可能な標識（マーカー）と結合させた、第三の抗体を、加えることによっても行なうことができる。
【０１６６】
ＥＬＩＳＡ分析の別の例は、以下のとおりである：興味のあるポリペプチドを含むと推測される試料を、適切な物質の表面上に固定させ、次いで、発明の抗体と接触させる。結合、および、非特異結合免疫複合体を除去するための洗浄後、結合した抗原を検出する。免疫複合体は、ここに記載されたように、直接的または間接的に、検出することができる。
【０１６７】
ＥＬＩＳＡ分析の更なる例は、以下である：再び、ポリペプチドを、物質に固定させるが、その場合、分析は、競合工程を含む。このＥＬＩＳＡでは、興味のあるポリペプチドの既知量を、プレートに吸着させる。次いで、固定化ポリペプチドを含むウェルとのインキュベーション前、もしくはインキュベーション時に、試料を、特異抗体と混合することにより、未知試料中のポリペプチドの量を、測定する。固定化ポリペプチドと結合することができる抗体を定量するために、検出試薬を加える（例えば、抗体）。試料中におけるポリペプチドの存在は、ウェルに含まれるポリペプチドに結合するために用いられることができる抗体の量を減らし、それに伴って、シグナルを減らす。
【０１６８】
シグナルと、未知試料中のポリペプチドの量（濃度）との間の相関関係を得るために、対照試料を、分析時に含ませることができる。例えば、ポリペプチド（通常、実質的に純粋な型）の既知量を、未知試料と同時に、測定（検出）することができる。次いで、未知試料に関して得られたシグナルを、対照に関して得られたシグナルと比較する。シグナルの強度（レベル）は、通常、試料中のポリペプチド（ポリペプチドに結合した抗体）の量に比例する。しかしながら、定量分析を行なうために必要とされる対照ポリペプチドおよび抗体の量は、最初に評価する必要がある。
【０１６９】
抗原（ポリペプチド）または抗体のいずれかでプレートを被覆する時、通常、プレートのウェルを、抗原または抗体の溶液と共に、一晩、または、特定の時間、インキュベーションするであろう。次いで、プレートのウェルを、不完全に吸着された物質を除去するために、洗浄するであろう。次いで、ウェルのあらゆる残存している利用可能な表面を、試験抗血清に関して抗原的に中性である非特異的タンパク質で「被覆」する。これらは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、および、粉ミルク溶液を含む。被覆は、固定表面上の非特異吸着部位のブロックキングを許容し、それに従って、表面上への抗血清の非特異的結合によって生じるバックグラウンドを減らす。
【０１７０】
免疫複合体（抗原／抗体）形成を許容することができる状態は、抗原および抗体を、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）、および、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）などの溶液で、希釈することを含む。これらの加えられた物質も、非特異的バックグラウンドの低減を助ける傾向にある。
【０１７１】
適切な状態は、インキュベーションが、有効な結合を許容するのに十分な温度と時間であることを含む。インキュベーション工程は、典型的には、約１から２から４時間まで、好ましくは、およそ２０℃から２７℃の温度であり、あるいは、一晩、約４℃くらいであることができる。
【０１７２】
しばしば、免疫複合体の検出は、酵素に連結させた試薬を用いて行なわれる。次いで、検出は、酵素基質の添加を必要とする。例えば、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼなどの酵素は、適切な基質が与えられた場合、生じた色の強度（程度）を測定することによって、定量することができる反応を生じるであろう。反応は、通常、広範囲の濃度にわたって、直線状であり、可視スペクトル分光光度計を用いて、定量することができる。
【０１７３】
キット
本発明は、前記免疫検出方法で用いるための免疫検出キットおよび試薬にも関する。本発明のポリペプチドは、抗体を検出するために用いられることができ、そして、対応する抗体が、ポリペプチドを検出するために用いられることができるので、そのような成分の一方、もしくは両方を、キット中で提供することができる。このように、免疫検出キットは、適切な容器手段中、ポリペプチド（ＰＳＰ９４、または、ＰＳＰ９４結合タンパク質）、または、ポリペプチドに結合する第一の抗体、および／または、免疫検出試薬を含むことができる。キットは、選択される抗体またはポリペプチドが既に結合していることができる適切なマトリックスも含むことができる。適切なマトリックスは、ＥＬＩＳＡプレートを含む。キットで提供されるプレートは、既に、選択された抗体またはポリペプチドで被覆されていることができる。被覆されたＥＬＩＳＡプレートは、非特異結合を防ぐために、ここで記載された試薬を用いて、ブロッキングされていることもできる。検出試薬も、提供されることができ、そして、例えば、標識またはマーカー、および／または、酵素基質を担持することができる、二次抗体もしくはリガンドを、含むことができる。キットは、さらに、対照として用いられることができる（通常、既知の力価または濃度の）抗体またはポリペプチドを含むことができる。例えば、試薬は、（明確な濃度の）凍結乾燥させた形態、または、液体の形態で提供されることができ、かつ、（試薬の安定性、安全性などを保証する）適切な容器中で提供されることができる。
【０１７４】
ここで、「範囲」、「物質の群」、または特定の特性（例えば、温度、濃度、時間など）が述べられる場合、本発明は、何であれ、そこの、各々の、および、全ての、特定メンバー、および、部分的な範囲または部分的な群の組み合わせに関し、ここに明白に組み込むと、理解されるべきである。このように、任意の明記された範囲もしくは群は、各々、範囲もしくは群の各および全メンバー、ならびに、ここに包含される、各々の、および、全ての可能な部分的な範囲もしくは部分的な群を指す略記様式として；そして、同様に、そこの任意の部分的な範囲もしくは部分的な群に関すると理解されるべきである。このように、例えば、
−反応時間に関し、1分以上の時間は、各および全単一時間、ならびに、例えば、１分、３から１５分、１分から２０時間、１から３時間、１６時間、３から２０時間など、１分を超える部分的な範囲を、ここに、特に組み込んでいるとして、理解されるべきであり；
−そして、同様に、濃度、温度などの他のパラメーターに関して、・・。
【０１７５】
また、ここで、非ＰＳＰ９４結合タンパク質（または、ポリペプチドなどをコードするＤＮＡ）は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを除くと理解されるべきである。
【０１７６】
【表２】
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【０１７７】
本出願において記載された各出版物、特許、および特許出願の内容は、参照によって、ここに組み込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１７８】
ＰＳＰ９４は、ＰＳＰ９４結合タンパク質の単離および同定時のおとりとして用いた。その目的のため、標識したＰＳＰ９４を、様々な精製工程を施す血清画分におけるＰＳＰ９４結合タンパク質の存在を検出するために、用いた。さらに、ＰＳＰ９４は、ＰＳＰ９４結合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製のために用いた。以下に記載した例は、ＰＳＰ９４結合タンパク質の精製、同定および有用性を示す。
【実施例】
【０１７９】
（実施例１）
ＰＳＰ９４の放射性標識およびＰＳＰ９４結合タンパク質反応速度分析
１２５Ｉ−ＰＳＰ９４標識を最適化するための実験、ヒト男性血清タンパク質に対する１２５Ｉ−ＰＳＰ９４結合分析、および遊離（すなわち、未結合の）および複合化（すなわち、結合、会合した）１２５Ｉ−ＰＳＰ９４を分離するための手段の開発を行なった。ＰＳＰ９４（この場合は、１２５Ｉ−ＰＳＰ９４）に結合するであろうヒト男性血清タンパク質は、遊離ＰＳＰ９４（または、遊離１２５Ｉ−ＰＳＰ９４）よりも高い分子量の複合体の形成を生じるであろう。
【０１８０】
ＰＳＰ９４のヨウ素化は、以下のように行なった。１５マイクロリットルの１００ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中、前記（Ｂａｉｊａｌ  Ｇｕｐｔａ等、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ８：４８３−４８８、１９９６））のように調製した２０マイクログラムの天然ヒトＰＳＰ９４を、１ミリキュリーのモノヨウ素化ボルトン−ハンター（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ）試薬を、製品の使用説明書（ＮＥＮ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に従って、０℃で用いて、標識した。２時間後に、１００マイクロリットルの１００ｍＭグリシンを加えることによって、反応を終結させた。遊離ヨウ素を、ＰＤ１０使い捨てゲル濾過カラムにより、製品の使用説明書（ＢＩＯＲＡＤ）に従って、ＰＳＰ９４に組み込まれたヨウ素から分離した。典型的には、ＰＳＰ９４タンパク質に組み込まれるようになったヨウ素の割合は、約６０％であり、１マイクログラムのＰＳＰ９４につき、約３０マイクロキュリーの特異活性を生じた。
【０１８１】
ヒト男性血清タンパク質の１２５Ｉ−ＰＳＰ９４に対する結合分析の最適化を、最適なインキュベーション時間、温度、および分離条件を明らかにするために、行なった。３７℃でのかなりのインキュベーション時間後に、平衡（例えば、インキュベーション時間を延ばしても、結合が更に有意に増加しない）に近づいたため、１６時間のインキュベーション時間を選択した。より高い分子量を有する複合型（すなわち、結合型）ＰＳＰ９４（または、複合化１２５Ｉ−ＰＳＰ９４）と低分子量を有する遊離ＰＳＰ９４（または、遊離１２５Ｉ−ＰＳＰ９４）の分離は、１ｘ２０ｃｍカラムに詰められたセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ１００樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによって行なった。分子ふるいクロマトグラフィーは、より高い温度では、処置時の複合体の解離が著しいことが示されたため、４℃で行なった。
【０１８２】
前記最適化の結果に基づいて、ＰＳＰ９４結合血清成分（すなわち、ＰＳＰ９４結合タンパク質）の放射性リガンド結合分析を行なった。この分析は、総量５００マイクロリットルで行なった。試験試料は、ＰＳＰ９４結合タンパク質（ウシ血清、または、精製試験からの画分）５０ｎｇの放射性標識したＰＳＰ９４を、リン酸緩衝生理食塩水−ゼラチン（ＰＢＳ−ゼラチン：１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のゼラチン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ型）、ｐＨ７．５、抗菌剤として８ｍＭのアジ化ナトリウムを含む）中、過剰の遊離競合体（１０マイクログラムの遊離ＰＳＰ９４（未標識））と共に、または、伴わずに、含んだ。それらを、３７℃で１６時間インキュベーションした。この時、平衡化した混合物を、氷上に置き、ＰＢＳ−ゼラチンで平衡化した１ｘ２０ｃｍのセファデックスＧ１００カラムを用いた、４℃での分子ふるいクロマトグラフィーにより、成分を、それらの分子量に従って、分離した。試料をカラム中に流した後、３ｍｌを捨て、０．５ｍｌの２０画分を、回収した。３０ｍｌの単一画分も流動の終わりに回収した。
【０１８３】
回収した画分における放射能（一分当たりのカウント（ｃｐｍ）で表した）を、ＬＫＢラックガンマカウンターを用いて測定し、高分子量のピーク（一般的には、画分４〜１４に含まれる）および低分子量のピーク（０．５ｍｌの画分の残りおよび単一の３０ｍｌの画分）における全放射能を算出した。典型的な溶出の概要を図１に示す。
【０１８４】
図１は、ヨウ素の同位元素１２５（１２５Ｉ）で放射性標識したＰＳＰ９４（すなわち、１２５Ｉ−ＰＳＰ９４）に結合（特異結合）したヒト男性血清由来のタンパク質のサイズ除外クロマトグラフィーの結果を示す。１２５Ｉ−ＰＳＰ９４のヒト男性血清タンパク質への結合は、各画分における放射能により測定され、一分当たりのカウント（ｃｐｍ）で表される。非特異結合は、インキュベーション混合物中に、１０μｇの遊離ＰＳＰ９４を、２５０μｌのヒト男性結血清および５０ｎｇの１２５Ｉ−ＰＳＰ９４と共に含ませることにより測定した。遊離（すなわち、未結合）および複合（すなわち、結合）−ＰＳＰ９４を含む画分の位置を、グラフに示す。遊離ＰＳＰ９４（１２５Ｉ−ＰＳＰ９４）のほとんどが、画分２０より遅くに溶出した。典型的には、２５０マイクロリットルのヒト血清に加えられた全放射性ＰＳＰ９４の約３３％が、ＰＳＰ９４結合タンパク質複合体の一部として、より早い画分に溶出し、そして、放射性ＰＳＰ９４の約６７％が、未結合のまま、より遅い画分中に溶出した。インキュベーション混合物中に、１０マイクログラムの未標識ＰＳＰ９４を含有させた競合対照において、約３％の放射性ＰＳＰ９４だけが、高分子量複合体の一部として、より速い画分に溶出し、ＰＳＰ９４結合タンパク質に対するＰＳＰ９４の特異性を確認した。
【０１８５】
この方法を用い、そして、放射性標識した競合ＰＳＰ９４の濃度を変え、かつ、ヒト男性血清の量を一定（２５０μｌ）に維持することにより、平衡結合データの反応速度分析を行なうことができた。ＰＳＰ９４が、ＰＳＰ９４結合タンパク質の分子量の約５分の１であると推定すると、これは、血清１ミリリットルが、約１マイクログラムのＰＳＰ９４結合タンパク質を有することを示唆する。血清の全タンパク質含有量は、１ミリリットル当たり８０ミリグラムであり、ＰＳＰ９４結合タンパク質：血清中の全タンパク質の割合は、およそ、１：８０，０００である。
【０１８６】
放射性リガンド結合分析からの更なる情報により、ＰＳＰ９４結合タンパク質が、ヒト女性血清、未婚女性のヒト血清、ウシ胎仔血清、および貯留させたマウス血清中に存在することが示された。
【０１８７】
（実施例２）
硫酸アンモニウム沈降
実施例１で得られた反応速度の結果から、ＰＳＰ９４結合タンパク質は、ヒト血清中に不十分であることが示された。
【０１８８】
更なる特徴づけと同定のためにＰＳＰ９４結合タンパク質を単離するために、第一の精製工程を硫酸アンモニウム沈降により行なった。ＰＳＰ９４結合タンパク質を沈降させるために必要である硫酸アンモニウムの適切な濃度を確立するために、小規模の硫酸アンモニウム沈降試験を行なった。沈降物中のＰＳＰ９４結合タンパク質の存在は、溶解および透析後、実施例１で記載したように放射性リガンド結合分析によって、ＰＳＰ９４に対して測定した。これらの試験により、３２〜４７％の硫酸アンモニウム画分が、図２に示されたように、ＰＳＰ９４結合物質の大部分を含むことが確認された。
【０１８９】
硫酸アンモニウム沈降は、より大規模に、慣例的に行なった。簡単には、１リットルの男性凍結血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を、解凍させ、１０ｍＭの冷リン酸ナトリウム、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５（リン酸緩衝生理食塩水；ＰＢＳ）１リットルに加え、これに、３７０ｇの硫酸アンモニウム（ＢＤＨ  ＡＣＳ試薬グレード）を、持続的に攪拌しながら、硫酸アンモニウム濃度が３２％に至るまで、ゆっくりと加えた。塩の溶解後、５，０００ｘｇで１５分間の遠心分離前に、混合物（すなわち、硫酸アンモニウムを含む男性血清）を、２０分間攪拌した。ペレットを捨て、ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質の上清画分を回収した。さらに、硫酸アンモニウム（１８８ｇ）を、持続的に攪拌しながら、上清画分にゆっくりと加え、全硫酸アンモニウム濃度を４７％にした。２０分後、この混合物も、５，０００ｘｇで回転させ、上清を捨て、そして、ペレットを、１０ｍＭのＭＥＳ（（２−[Ｎ−モルホリノ]エタンスルホン酸）水和物）、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５の全５００ｍｌ中に溶解した。このペレットは、６−８，０００分子量でカットオフ（分離）する透析管（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｎａｄａ）を用い、１０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５、１６リットルで、１６時間、４℃にて透析後、さらに１６リットルの同一緩衝液をさらに７時間用いた別の透析工程を行なった。生成物中のタンパク質濃度は、２８０ｎｍの紫外線（ＵＶ）吸光度を用いて測定し、調製品を、−２０℃にて、４ｇのタンパク質アリコート（通常、約１５０ｍｌ）で保存した。典型的な硫酸アンモニウム沈降分析は、図２に示す。
【０１９０】
（実施例３）
イオン交換クロマトグラフィー分析
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）は、分子を、それらの実効電荷に基づいて、分離する。陰性または陽性に荷電した官能基は、陽イオンまたは陰イオン交換体を生じる固形支持マトリックスに共有結合する。荷電分子を、逆に荷電された交換体に接触させると、それが、吸着され、一方で、中性イオンまたは同一電荷のイオンが、カラムの空隙容量に溶出される。荷電分子の結合は、可逆的であり、吸着された分子は、一般に、塩またはｐＨ勾配で溶出される。
【０１９１】
ＰＳＰ９４結合タンパク質の特徴について何も事前に知らずに、様々なｐＨ値でのＰＳＰ９４結合タンパク質を吸着する陰イオンおよび陽イオン交換マトリックスの性能を、一連のイオン交換分析で測定した。硫酸アンモニウムで沈降させた血清のアリコートは、製品の使用説明書に従って、適切な緩衝液で平衡化したバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）ＤＧ  １０カラムを用いて、表３に示した緩衝液中で交換した。７００マイクロリットルのアリコートを、５００マイクロリットルのイオン交換マトリックス（製造元の勧めに従って調製された）と共に、インキュベーションした。ゆるやかに振とうしながら、室温で９０分間インキュベーションした後、混合物を、１０００ｘｇで５分間、回転させ、マトリックスを上清から分離した。ＰＳＰ９４結合タンパク質が、マトリックスに結合（吸着）している場合、遠心分離後もそれに結合したままであり、上清には存在しないであろう。上清は、０．３容量の２５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、で、すぐに中和し、この溶液２５０マイクロリットルを、ここ（実施例１）に記載した１２５Ｉ−ＰＳＰ９４結合分析で評価した。試験した条件およびこれらの分析結果は、表３に示されている。
【０１９２】
【表３】
2005523724.tif 000004
【０１９３】
これらのイオン交換クロマトグラフィー分析の主な結果は、極端なｐＨ（８以上、および６以下）にＰＳＰ９４結合タンパク質を一時的にさらすことにより、ＰＳＰ９４結合タンパク質のＰＳＰ９４への結合能が低減する結果となり、ＰＳＰ９４結合タンパク質がｐＨ感受性であることを示唆することを示す。陽イオンマトリックスへのＰＳＰ９４結合たんぱく質の吸着が、ｐＨ４．７では見られなかった。陽イオンマトリックスへの多少の吸着が、ｐＨ５．７で見られ、最大の吸着がｐＨ６．７で見られた。これらの結果は、約ｐＨ５の等電点を示唆しているのであろう。
【０１９４】
陰イオン交換クロマトグラフィー分析は、等電点５に一致した、ｐＨ５．７と９．０の間で、マトリックスへのＰＳＰ９４結合タンパク質の良好な吸着を示した。中性（非変性）ｐＨ値で、良好な吸着が達成され得たため、好ましい精製方法が、陰イオンマトリックスを用いなければならないであろうことが明らかであった。それゆえ、陰イオン交換マトリックス、および、ｐＨ６．５の１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液が、ｐＨ溶出ではなく、塩濃縮溶出を用いた更なる作業のために選択された。
【０１９５】
陰イオン交換マトリックスからのＰＳＰ９４結合タンパク質溶出条件の最適化を、様々な塩化ナトリウム濃度を用いて行なった。
【０１９６】
マクロ・プレップ・ハイ（Ｍａｃｒｏ  Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ）Ｑを含むカラム（１ｘ１５ｃｍ）を、１０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５を含む緩衝液で平衡化し、１分当たり０．５ｍｌで流した。同一緩衝液で平衡化した７ミリリットルの３２〜４７％の硫酸アンモニウムカット（すなわち、表４の出発物質）を、カラムに投入し、様々な緩衝液を、ＰＳＰ９４結合タンパク質を溶出するために投入した。溶出物は、ＵＶ記録装置で観測した。画分を回収し、分子量のカットオフが１０ｋＤａであるセントリプレップ（ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ）濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、緩衝液を、ＰＢＳに交換した。これらの試料は、実施例１に記載した１２５Ｉ−ＰＳＰ９４結合分析で試験した。表４は、この実験で、用いられた異なる条件と、得られた結果を、要約する。星印（＊）は、緩衝液交換時に多少の損失が生じたことを示す。タンパク質の濃縮は、１ｍｇのタンパク質に相当する１ＯＤ単位で、２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）から評価した。
【０１９７】
【表４】
2005523724.tif 000005
【０１９８】
これらのデータから、３００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液が効果的であり、陰イオン交換マトリックスからのＰＳＰ９４結合タンパク質の溶出に好ましく用いられるであろうことが、明らかである。これらの結果を用いて、以下に記載する５ｃｍｘ１２ｃｍの陰イオン交換マトリックスへの、４ｇの硫酸アンモニウム沈降血清抽出物の適用を許容する、拡大したイオン交換プロトコルを開発した。
【０１９９】
（実施例４）
ＰＳＰ９４結合タンパク質の大規模陰イオン交換クロマトグラフィー精製
陰イオン交換カラム（直径５ｃｍｘ長さ１２ｃｍ、マクロ−プレップ・ハイＱ、Ｂｉｏｒａｄ）を、製品の指針に従って、１０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５中で、調製および平衡化し、一分当たり約３ｍｌの流速で、室温にて流した。硫酸アンモニウム沈降した血清のアリコート（実施例２から：約１５０ｍｌの溶液中、全タンパク質４ｇ）をカラムに投入し、次いで、それを、１０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５、約２５０ｍｌで洗浄した（図３）。溶出は、約４００ｍｌの１０ｍＭのＭＥＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５緩衝液で、行なった後、１０ｍＭのＭＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。３００ｍＭの溶出画分を回収した（図３）。溶出タンパク質の概要を、チャート式記録計上で、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって、観測した。典型的な概要を図３に示す。図３は、マクロプレップ・ハイ・Ｑ陰イオンカラムを用い、硫酸アンモニウム（約４グラム）により精製したタンパク質を負荷した、陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。タンパク質は、塩化ナトリウム濃度を段階的に増やして、溶出させる。点ＡとＢの間に位置するピークは、ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質画分を表す。タンパク質は、２８０ｎｍで測定された吸光度によって検出される。
【０２００】
カラムは、１０ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５（３００ｍｌ）で再生させた後、１０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５、５００ｍｌで平衡化させることができた。２４時間以上カラムを保存するために、アジ化ナトリウムを、この緩衝液に、０．０５％（ｗ／ｖ）で、加えた。
【０２０１】
３００ｍＭの画分（約９０ｍｌ）を、回収し（マーカーＡとＢの間、図３）、これが、ＰＳＰ９４結合活性の大部分を含むことが、予め示された。「部分的に純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質」（ＰＰＢＰ）として同定されたこの調製物を、製品の使用説明書に従って、遠心分離濃縮器（セントリプレップ１０、Ａｍｉｃｏｎ）で、２０ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳで６０ｍｌに希釈し、２０ｍｌまで濃縮し、さらにＰＢＳで６０ｍｌに希釈し、２０ｍｌまで濃縮し、そして最後に、ＰＢＳで、Ａ２８０が２．０の溶液（通常、最終容量が約１５０ｍｌ）となるように希釈した。この溶液を−２０℃で保存した。２０ｇのタンパク質の全適用（５サイクル）後、カラムを、１ＭのＮａＯＨを用いて消毒し、ＢＩＯＲＡＤにより記載されたプロトコルを用い、１０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５で再度平衡化した。
【０２０２】
硫酸アンモニウム分別（すなわち、沈降）および陰イオン交換クロマトグラフィーは、各々、ＰＳＰ９４結合タンパク質のおよそ４倍、および１０倍の精製の結果となる。ウシ血清において、評価は、ＰＳＰ９４結合タンパク質：全タンパク質の割合が１：８０，０００であることを示した。実施例２および実施例４に記載した２つのタンパク質の精製工程の効率は、実施例１に記載したＰＳＰ９４放射性リガンド結合分析を用いて観測した。両工程において、ＰＳＰ９４結合物質の大部分は、単一画分内にとどまっていた。この情報から、これらの２つの工程は、組み合わせると、ＰＳＰ９４結合物質の損失が（質的に）ほとんどない、能率的な精製方法になると思われる。しかしながら、損失が小さいとすれば、実施例２および４に記載された２つのタンパク質生成工程の組み合わせにより生じた部分的に精製された結合タンパク質（ＰＰＢＰ）は、約１質量部の結合タンパク質：２０００質量部の他のタンパク質を含むべきである。
【０２０３】
（実施例５）
アフィニティークロマトグラフィー分析
ＰＳＰ９４結合タンパク質精製のためのアフィニティーマトリックスの調製を、以下のように行なった。およそ０．５ｇの臭化シアン活性化セファロースＣＬ  ４Ｂ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を、１ｍＭのＨＣｌで膨潤させ、製造元の勧めに従って調製した。この混合物１ｍｌに、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．０中、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ８：４８３−４８８、１９９６に記載されたように精製された５ｍｇのＰＳＰ９４を含む溶液５ｍｌを加え、反応物を、断続的に振とうしながら、４℃でインキュベーションした。マトリックスへのＰＳＰ９４の結合の割合を測定するために、時間間隔で、反応物を、２００ｘｇで２分間回転させ、上清のアリコートの、光学密度（ＯＤ）単位で表した２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）を測定した。ＰＳＰ９４の活性化セファロース（すなわち、マトリックス）への接合（すなわち、結合）の時間経過を示す結果を、表５に要約する。
【０２０４】
【表５】
2005523724.tif 000006
【０２０５】
接合反応は、７０〜８０％のＰＳＰ９４が、マトリックスに結合するまで（表５に示す調製では約６０分後）、続けた。この時、あらゆる更なる反応基をふさぐために、１ｍｌの２００ｍＭグリシンを、加え、スラリーを、一晩、ゆるやかに振とうしながら、４℃でインキュベーションした。製造元の勧めに従って、マトリックスを洗浄し、ＰＳＰ９４に関して、１マイクロリットル当たり１マイクログラムの濃度のスラリーとなるようにＰＢＳで希釈した。アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）を、抗菌剤として、０．０５％まで加えた。
【０２０６】
前記最適化分析の結果に基づいて、ＰＳＰ９４を、臭化シアン活性化セファロースに接合させることにより、ＰＳＰ９４アフィニティーマトリックスを調製した。典型的には、マトリックスは、充填されたマトリックス１マイクロリットル当たり４マイクログラムのＰＳＰ９４を有し、１マイクロリットル当たり１マイクログラムのＰＳＰ９４を含む作用スラリーを、０．０５％のＮａＮ３を含むＰＢＳで希釈することにより、調製した。ＰＳＰ９４アフィニティーマトリックス（ＰＳＰ９４に関して、１ミリリットル当たり５マイクログラムの濃度で）を、部分的に純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質に加えた。０．１％（ｖ／ｖ）濃度のツイーン２０および０．０５％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３も、混合物に含ませ、次いで、それを、３４℃で１８時間、揺り机でインキュベーションした。平行する対照実験において、遊離ＰＳＰ９４も、１ミリリットル当たり５０マイクログラムの濃度で加えた。この対照実験における遊離ＰＳＰ９４の添加は、ＰＳＰ９４結合タンパク質の結合のためにマトリックスに接合させたＰＳＰ９４と競合するであろう。これは、アフィニティーカラムへのＰＳＰ９４結合タンパク質の結合を逆転させ、それにより、ＰＳＰ９４に特異的に結合しているタンパク質の同定を可能にするであろう。アフィニティーマトリックスは、急速濾過により、上清から分離し、マトリックスを、４℃にて、ＰＢＳで十分に洗浄した。マトリックスを回収し、結合タンパク質を解離させるために、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）還元試料緩衝液（試料中の最終濃度：５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ６．８、２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、１０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、８ｍＭのジチオスレイトール、０．００１％のブロモフェノール・ブルー）中で煮沸し、これらを、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。この実験の結果を、図４に示す。
【０２０７】
図４は、以下のＰＳＰ９４アフィニティークロマトグラフィー後に得られた試料を負荷したドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す。ゲルは、電界中で流し、クマシー・ブリリアント・ブルーで染色した。レーン１は、分子量マーカー（カレイドスコープ・プレステインド・スタンダード（Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ  ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を表す。レーン２は、ＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックスに結合させたタンパク質を表す。レーン３は、ＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックスに結合させ、過剰のＰＳＰ９４とインキュベーションしたタンパク質を表す。少なくとも２つのタンパク質、ＡおよびＣが、２つのレーン（レーン２および３）に存在したままであることに留意すべきである。２つのバンド、ＢおよびＤは、レーン３に存在するが、対照実験（レーン２）には存在しない。これらのバンド（ＢおよびＤ）は、特異的ＰＳＰ結合タンパク質であると思われる。
【０２０８】
（実施例６）
ＰＳＰ９４アフィニティーマトリックスからのＰＳＰ９４結合タンパク質の溶出の最適化
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（非還元条件である、または非還元条件でない）中での煮沸よりも変性しない条件を用いて、アフィニティーマトリックスからＰＳＰ９４結合タンパク質を解離するために、条件の範囲を評価した。試験した条件を表６に要約する。非変性活性ＰＳＰ９４結合タンパク質は、抗体生成、および、さらなる実験と開発に必要とされる。部分的に純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質と共に、予めインキュベーションし、洗浄したＰＳＰ９４アフィニティーマトリックス（すなわち、結合タンパク質が付着している）のアリコートを、表６に列挙した溶出（解離）条件で、1時間、インキュベーションした。インキュベーション後、アフィニティーマトリックスを、遠心分離により、溶出緩衝液から除去した。マトリックスは、ＰＢＳ中で洗浄し、非還元ＳＤＳ試料緩衝液（試料中の最終濃度：５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ６．８、２％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ、１０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、０．００１％のブロモフェノール・ブルー）中で煮沸し、タンパク質を、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質が、溶出後に、マトリックスと付着したままである場合、条件は、適切な解離に適していない。このように、ＰＳＰ９４結合タンパク質が、図５に示されたＳＤＳ−ＰＡＧＥに存在しな場合、溶出（解離）条件は、適している。大部分の汚染バンドが、２つのＰＳＰ９４結合タンパク質のバンドの間ではなく、ゲルの上端に残っていたため、非還元条件が、優れた分離条件を提供することが見出された。試験された条件およびこの実験の結果は、図５に示され、表６に要約される。
【０２０９】
【表６】
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【０２１０】
図５は、異なる溶出（解離）条件を用いた、ＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックスからのＰＳＰ９４結合タンパク質の溶出に続いて、得られた試料を負荷したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。異なる溶出緩衝液中でのインキュベーション後、アフィニティーマトリックスを、遠心分離により溶出緩衝液から除去した。マトリックスをＰＢＳ中で洗浄し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で煮沸した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは電界中で流し、ゲルコード（Ｇｅｌｃｏｄｅ）（登録商標）ブルー・コード試薬（Ｂｌｕｅ  Ｃｏｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｉｅｒｃｅ）で染色した。矢印は、高分子量結合タンパク質（ＨＭＷ）および低分子量結合タンパク質（ＬＭＷ）の位置を表す。レーンＡは、分子量マーカー（カレイドスコープ・プレステインド・スタンダート、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を表す。レーンＢは、未処置試料を表す。レーンＣは、ＰＢＳ中、３４℃で１時間インキュベーションした試料を表す。レーンＤは、水中、３４℃で１時間インキュベーションした試料を表す。レーンＥは、３４℃にて、１ｍｌのＰＢＳ中、３００μｇのＰＳＰ９４と共にインキュベーションした試料を表す。レーンＦは、レーンＢの試料と同様に、マトリックスをＰＰＢＰと共にインキュベーションしたが、このインキュベーション中に、飽和状態の過剰の遊離ＰＳＰ９４が含まれていた、競合対照を表す。レーンＧは、２Ｍの尿素中でインキュベーションした試料を表す。レーンＨは、８Ｍの尿素中でインキュベーションした試料を表す。レーンＩは、１００ｍＭの酢酸ナトリウム中、ｐＨ２．７で、インキュベーションした試料を表す。レーンＪは、１００ｍＭの３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）中、ｐＨ１１．０で、インキュベーションした試料を表す。
【０２１１】
前記実験から、ＰＳＰ９４結合タンパク質およびＰＳＰ９４アフィニティーマトリックスの相互作用が、様々な条件下で、とても安定していたことが、明らかである。多少の解離が、８Ｍの尿素および極端なｐＨで見られたが、これらの変性条件は、過剰の遊離リガンド（すなわち、ＰＳＰ９４）を用いた非変性の競合的な解離よりも、好ましくない。それゆえ、このアプローチは、活性ＰＳＰ９４結合タンパク質を精製するために選択された。
【０２１２】
データは、図５のＨＭＷおよびＬＭＷのバンドが、図４のバンドＢおよびＤと、各々、同じであることを示す。
【０２１３】
（実施例７）
ＰＳＰ９４アフィニティークロマトグラフィーによるＰＳＰ９４結合タンパク質の精製
０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０および０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３を含む、部分的に純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質（実施例４に記載したように生成した調製品）１００ミリリットルを、（ＰＳＰ９４に関して）２５０マイクログラムのアフィニティーマトリックスと共に、１６時間、３４℃でインキュベーションした。マトリックスを、使い捨てのポリプレップ（Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ）カラム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いた急速濾過により、可溶性画分から分離した。カラムのエンドキャップに取り付けられた１０ｍｌの注射器から空気圧を加えることにより、液体を、カラムに押し込んだ。マトリックスを１０ｍｌの氷冷ＰＢＳで、同様に、３回洗浄し、マトリックスを、マイクロピペットでカラムのポリマー基盤支持体から回収した。２ｍｇの遊離ＰＳＰ９４を含む、１ミリリットルの１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５、中に、マトリックスを再度懸濁し、ゆるやかに振とうしながら、３４℃で５時間、インキュベーションした。次いで、マトリックスを、遠心分離（１０００ｘｇ、３０秒間）により、溶液から分離し、（溶出されたＰＳＰ９４結合タンパク質および遊離ＰＳＰ９４を含む）上清を、室温で、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した１ｘ２０ｃｍセファデックス（ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ１００カラムを用い、一分当たりおよそ０．７ｍｌの流速で流した、分子ふるいクロマトグラフィーにより、分離した。溶出液の２８０ｎｍでの吸光度は、チャート式記録形上で記録した（図６）。ＰＳＰ９４結合タンパク質の捕捉、溶出、および精製産物の定性的な評価を、非還元７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、行なった（図７）。
【０２１４】
図６は、硫酸アンモニウム沈降および陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した試料の（ＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックス（セファデックスＧ１００）を用いた）アフィニティークロマトグラフィーの結果を示す。
【０２１５】
ＰＳＰ９４結合タンパク質は、過剰のＰＳＰ９４（遊離ＰＳＰ９４）を加えることによって、カラムから溶出させた。高分子量タンパク質は、総量４ｍｌ（点ＡとＢの間）で回収した。この溶液は、遠心分離濃縮器（Ａｍｉｃｏｎからのセントリコン１０）を用いて、ＰＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）に交換され、１マイクロリットル当たりおよそ１００ｎｇに濃縮された緩衝液であった。典型的には、１００ｍｌのＰＰＢＰ出発物質から４０マイクログラムを生産する。点ＡとＢの間に位置するピークは、ＰＳＰ９４結合タンパク質画分を表す。タンパク質は、２８０ｎｍで測定した吸光度によって、検出し、定量化する。得られた結果は、遊離ＰＳＰ９４およびＰＳＰ９４結合タンパク質の間で適切な分離を示す。
【０２１６】
図７は、非還元条件で行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％）の写真である。レーンＡは、分子量マーカー（カレイドスコウプ・プレステインド・スタンダード、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）である。レーンＢは、硫酸アンモニウム沈降および陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製したＰＳＰ９４結合タンパク質とのインキュベーション後、かつ、競合（すなわち、過剰の）ＰＳＰ９４（すなわち、遊離ＰＳＰ９４）での溶出前のＰＳＰ９４アフィニティーマトリックスを表す。レーンＣは、競合対照を表す。レーンＤは、過剰のＰＳＰ９４での溶出後のアフィニティーマトリックスを表す。レーンＥは、最終的に溶出され、かつ、濃縮された、（実質的に）純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質を表す。得られた結果は、アフィニティークロマトグラフィーにより、有意に、ＰＳＰ９４結合タンパク質の純度が増すことを示す。
【０２１７】
ＰＳＰ９４結合タンパク質の精製方法を、図８に要約している。
【０２１８】
（実施例８）
ＰＳＰ９４結合タンパク質アミノ末端アミノ酸配列決定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、実施例５に記載されたように調製した。しかしながら、タンパク質は、配列決定の準備のために、ミニ・トランス−ブロット・トランスファー・セル（Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、製造元の勧めに従って用い、配列決定等級ＰＶＤＦ膜（プロブロット（ＰｒｏＢｌｏｔｔ）膜、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）に転写した。この膜は、クマシー・ブリリアント・ブルーで染色し、アミノ末端（すなわち、Ｎ−末端）アミノ酸配列決定により分析した。アミノ末端アミノ酸配列決定は、図４に示されたバンドＢ、Ｃ、およびＤに関して行なった。
【０２１９】
【表７】
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【０２２０】
表７に見られるように、バンドＢおよびＤは、同じＮ末端アミノ酸配列を有し、そのため、これらは、Ｂがおそらくある型の集合体（多重結合体）を表し、あるいは、ＢおよびＤが代替的にスプライシングまたはプロセシングされた、同じタンパク質の異なる型であると思われる。
【０２２１】
（実施例９）
ＰＳＰ９４結合タンパク質遺伝子配列のクローニング
全ＲＮＡを、Ｔｒｉ−試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を用い、２ｘ１０６ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）クローンＥ６−１細胞（ＴＩＢ  １５２、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｒｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から、または、健康な献血者の末梢血単核細胞から単離した。ＲＮＡは、エタノール沈降し、水中に懸濁した。ＲＮＡは、サーモスクリプトＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用い、ｃＤＮＡに逆転写させた。ｃＤＮＡは、プラチナ・Ｔａｑ・ＤＮＡポリメラーゼ・ハイ・フィデリティ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、５’−プライマー（５’−ＡＴＧＣＡＣＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴＴ−３’）および３’−プライマー（５’−ＧＣＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ（Ｔ）１７−３’）（ライフ・テクノロジーズ・３’レース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３’Ｒａｃｅ）アダプタープライマー、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、実質的に増幅させた。５’プライマーＤＮＡ配列は、ＰＳＰ９４結合タンパク質アミノ酸配列、および、遺伝子銀行データベース（国立衛生研究所、米国）Ｇ．Ｂ．受入番号ＡＡ３１１６５４（ＥＳＴ１８２５１４  Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞ＶＩホモ・サピエンスｃＤＮＡ５’ｍＲＮＡ配列）に公表された、部分ｃＤＮＡ配列に基づいた。増幅させたＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動により分離し、ゲルから切り出し、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＩＩ  ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を用いて濃縮した。精製したＤＮＡは、ｐＣＲ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に結紮し、大腸菌株ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換するために用いた。アンピシリン耐性コロニーを、制限酵素分析およびＤＮＡ配列分析により、ｃＤＮＡ陽性挿入物を選別した。
【０２２２】
遺伝子銀行に、ＰＳＰ９４結合タンパク質のＤＮＡ配列をブラスト検索することにより、例えば、遺伝子銀行受入番号ＸＭ０９４９３３（ＰＲＩ、２００２年２月６日）、ＢＣ０２２３９９（ＰＲＩ、２００２年２月４日）、ＮＭ１５３３７０（ＰＲＩ、２００３年４月７日）、ＢＣ０３５６３４（ＰＲＩ、２００２年９月２３日）など、有用性が未知の幾つかのＤＮＡ配列が同定された。
【０２２３】
（実施例１０）
ＰＳＰ９４結合タンパク質メッセンジャーＲＮＡの組織発現
ＰＳＰ９４結合タンパク質メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、単離し、サイズとヒト組織における相対的な発現レベルを、ノーザンブロットにより測定した。１レーンにつき１または２マイクログラムのヒト組織ポリＡ  ＲＮＡを含む市販のノーザンブロット（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  （ＭＴＮＴＭ）  Ｂｌｏｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、製造元の勧めにしたがって、ＰＳＰ９４結合タンパク質ｃＤＮＡ配列３４６から７４５に及ぶ[３２Ｐ]標識化ＰＳＰ９４結合タンパク質ｃＤＮＡプローブと、ハイブリダイズさせた。バンドの強度を、アルファ・イメージャー（ａｌｐｈａ  ｉｍａｇｅｒ）２０００、２２５９５型を用いて、定量化した。バンドの相対的な強度を測定し、＋から＋＋＋まで変動する任意のスコアを与えた。このスコア付けは、見られる最低の検出可能な２．０ｋｂのシグナルバンドに基づいた。
【０２２４】
図９ａおよび９ｂに示された結果の定量化は、各々、表８と９に要約する。簡単には、脳、心臓、骨格筋、結腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、前立腺、精巣、卵巣、および、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）からのＲＮＡを、ＰＳＰ９４結合タンパク質ＲＮＡ発現について分析した。
【０２２５】
【表８】
2005523724.tif 000009
【０２２６】
【表９】
2005523724.tif 000010
【０２２７】
（実施例１１）
遊離ＰＳＰ９４、結合ＰＳＰ９４、およびＰＳＰ９４結合タンパク質に対するモノクローナル抗体の生成
抗体生成
ここに記載した免疫化の概要は、ＰＳＰ９４結合タンパク質に結合した時に、露呈されるＰＳＰ９４のエピトープに対する抗体の生成を促進するために開発された。
【０２２８】
（ａ、ｂ、ｃおよびｄとして識別された）４匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、ＴｉｔｅｒＭａＸＴＭアジュバント中の（実質的に）純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質（すなわち、この調製物はＰＳＰ９４も含む）調製物、各１５マイクログラムで、皮下的に免疫性を与えた。２１日後、全てのマウスに二回目の追加免疫（ブースト）を行い、さらに８日後、マウス血清を、前記ＥＬＩＳＡスクリーニング分析でＰＳＰ９４とＰＳＰ９４結合タンパク質の両方に対する反応について試験した。ＰＳＰ９４結合タンパク質の精製は、全ての結合部位をＰＳＰ９４で飽和させることを含むので、実質的に純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質の調製物で免疫化した動物の血清を、両方の抗原対する陽性を試験した。
【０２２９】
マウスａおよびｂは、更にアジュバントを含まないＰＳＰ９４結合タンパク質１５μｇを腹膜内に追加投与した。残りの２匹のマウス（ｃおよびｄ）は、ＰＳＰ９４の露呈されたエピトープに対する抗体を得る可能性を増やすために、Ｔｉｔｅｒ  ＭａＸＴＭアジュバント中、１５μｇの天然ＰＳＰ９４と共に、更に１５μｇのＰＳＰ９４結合タンパク質を皮下に追加投与した。
【０２３０】
さらに４日後、マウスＡおよびＢの脾臓を採取し、Ｂリンパ球を回収し、ハイブリドーマを生成するために、ＮＳＯ骨髄腫細胞と融合させた（Ｇａｌｆｒｅ  Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６、１９８１）。Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ＭＤＭ選択培地（２０％ＦＢＳ、ＨＡＴ、１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン６、および抗生物質で補充した）中の１０万脾臓細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。抗体は、細胞から分泌されるので、細胞培養培地（すなわち、上清）を、生成された抗体の特徴付けのために採取することができる。３７℃でのインキュベーション１０日後、クローンを含むウェルの上清を、ＥＬＩＳＡスクリーニング分析（以下を参照）により、評価した。ＰＳＰ９４またはＰＳＰ９４結合タンパク質プレートに陽性の認識（結合）を示し、ＰＢＳ被覆プレートに対する非特異的結合を示さない抗体を生成するクローンを、更なる調査と特徴付けのために選択した。
【０２３１】
所望する（陽性）クローンを、６ウェルプレートに播種した。上清を、特異抗体の存在について再度試験し、陽性のままであるクローンの上清を、限界希釈法により、クローニングの連続サイクルに通した。そのような方法のクローニングは、生成されたハイブリドーマ細胞系が安定し、純粋であることを、保証する。典型的には、この目的を達成するために、２サイクルのクローニングが必要であった。凍結保存の複数のガラス瓶を調製し、各群から、１つのガラス瓶を、生存可能性と抗原生成について試験した。クローンの特徴付けの結果を、表１０に示す。
【０２３２】
（実施例１２）
抗体の特徴づけ
ＥＬＩＳＡに基づいたハイブリドーマスクリーニング分析
マウス、または、マウスＢ細胞から生成されたハイブリドーマから生産される抗体の力価および特異性を評価するために、ＥＬＩＳＡスクリーニング分析を開発した。
【０２３３】
簡単には、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐ）を、天然ＰＳＰ９４（ヒト精漿から単離；０．１Ｍ炭酸ナトリウムｐＨ９．６中、５μｇ／ｍｌ）、または、ＰＳＰ９４結合タンパク質（０．１Ｍ、ＮａＨＣＯ３中、０．１μｇ／ｍｌ）、または、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１４０ｍＭ、ＮａＣｌ、１０ｍＭ、リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）のいずれかのアリコート１００μｌで、一晩、４℃で被覆した。プレートを、リン酸緩衝生理食塩水中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液で、１時間、３４℃にて、ブロッキングした（ＢＳＡは、結合部位を飽和させ、プレートへの非特異結合を制限する）。次いで、マウス血清試料もしくは０．５％ＢＳＡで希釈したハイブリドーマ上清を加える前に、プレート（ウェル）を、０．１％ポリオキシエチレン−ソルビタンモノラウラートを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄した。ＰＢＳ−０．５％ＢＳＡ中、マウス免疫グロブリンを認識するペルオキシダーゼ接合ポリクローナルウサギ免疫グルブリン（ウサギ抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ）の１：１０００希釈液を加える前に、プレートを、１時間、３４℃でインキュベーションした。３４℃での更なる１時間のインキュベーション後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）中でのペルオキシダーゼシグナルの顕色前に、プレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した。３０分後、６３０ｎｍでの光学密度を、マイクロプレートリーダーで読んだ。
【０２３４】
抗体精製
マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体を、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｅｄｓ  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
で詳述された高塩タンパク質Ａ方法を用いて精製した（前記を参照）。
【０２３５】
抗体アイソタイピング
アイソタイピングを、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＵＳＡ）を用いて行なった。このキットは、種類（ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ）、軽鎖の型（κまたはλ）、およびＩｇＧサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２a、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＧ３）に関する情報を提供する。試験した抗体は、主にＩｇＧ１κサブタイプのものであった。しかしながら、一つの抗体については、ＩｇＭκサブタイプのものであることが示された（Ｂ２６Ｂ１０）。
【０２３６】
相対エピトープ分析
ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＳＰ９４結合タンパク質、または、ＰＳＰ９４のどちらかで被覆し、前記したように、ブロッキングした。前記したように調製した、適切な濃度のビオチン化抗体を、５０倍過剰量の未標識抗体のパネルの存在もしくは不在下で、被覆されたプレートと共にインキュベーションした。未標識抗体との競合は、２つの抗体間で共有されるエピトープを示す。競合の欠如は、独立したエピトープを示す。エピトープの結果は、表１０に示す。
【０２３７】
【表１０】
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【０２３８】
抗体ビオチン化
精製した抗体の希釈剤（緩衝液）を、０．１ＭのＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ８．０に変え、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌに調節した。２ｍｇ／ｍｌのビオチンアミドカプロアートＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル溶液を、ＤＭＳＯ中で調製し、この溶液の適切な容量を、抗体に、５、１０、または２０倍過剰のビオチン化剤を生じるように加えた。これを、０．１Ｍ、ＮａＨＣＯ３中の０．２Ｍグリシン等容積を、最終濃度が０．１Ｍグリシンになるように加える前に、氷上で、時折振とうしながら、２時間インキュベーションした。
【０２３９】
氷上でさらに一時間インキュベーション後、抗体を、ＰＤ１０ゲル濾過カラム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いたゲル濾過により、遊離ビオチン化剤から分離した。ビオチン化抗体は、防腐剤として加えられた０．０５％アジ化ナトリウムと共に４℃で保存した。ビオチン化の最適範囲およびビオチン化抗体の最適使用濃度を、抗原被覆プレート上で測定した。
【０２４０】
ウエスタンブロット
抗体は、ウエスタンブロットで評価した。簡単には、０．２マイクログラムの（実質的に）精製したＰＳＰ９４結合タンパク質、または、２５マイクロリットルの部分的に純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質を、非還元条件下で、７．５％ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で流した。タンパク質を、ＰＶＤＦ膜に写し、膜を、１％ＢＳＡでブロッキングし、１：５の希釈（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中）でハイブリドーマの上清を用いて調べ、そして、結合した抗体を、ウサギで高めた抗マウス免疫グロブリンペルオキシダーゼ接合物で検出した。シグナルは、０．０５％ジアミノベンジジン、０．０１％過酸化水素で顕色させた。
【０２４１】
遊離または全ＰＳＰ９４に対するＰＳＰ９４抗体の特異性
ここで生成された抗体の特異性を更に特徴付けるために、モノクローナル抗体が、遊離型の、および／または、ＰＳＰ９４結合タンパク質に結合している時の、ＰＳＰ９４を、識別するかどうかを測定するために、分析を開発した。
【０２４２】
ＰＳＰ９４／ＰＳＰ９４結合タンパク質複合体の形成を促進するために、２つの（実質的に、または、部分的に）精製されたタンパク質を、共に、予めインキュベーションした。簡単には、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌの濃度（全タンパク質濃度）の、部分的に純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質調製物（実施例４参照）を、３４℃で1時間、５μｇ／ｍｌの天然のＰＳＰ９４と共に、または、５μｇ／ｍｌの天然のＰＳＰ９４を伴わずに、予めインキュベーションした。
【０２４３】
ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェルプレート）は、２μｇ／ｍｌ（０．１ＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．０、中）の濃度で、１７Ｇ９モノクローナル抗体を用い、一晩、４℃でのインキュベーションにより被覆した。ここに記載するように、この抗体は、ＰＳＰ９４結合タンパク質を認識する。プレートのウェルを、続けて、１％ＢＳＡで、１時間、３４℃にてブロッキングした。前記で生成したＰＳＰ９４／ＰＳＰ９４結合タンパク質複合体は、あらゆる未結合物質を洗浄除去する前に、１７Ｇ９被覆プレートで、１時間、３４℃にてインキュベーションした。次いで、プレートを、ビオチン化ＰＳＰ９４特異抗体（ＰＢＳ−０．５％ＢＳＡ中、２μｇ／ｍｌ）と共にインキュベーションした。これらの抗体のどの陽性結合も、認識されたＰＳＰ９４エピトープが、ＰＳＰ９４結合タンパク質に結合している時でさえ、露呈されている（利用できる）ことを示すであろう。これらの結果を、表１０に示す。結合ＰＳＰ９４へのビオチン化ＰＳＰ９４特異抗体の結合は、ストレプトアビジンペルオキシダーゼシステムにより視覚化され、青色を生じるＴＭＢで顕色された。
【０２４４】
図１１に示す結果は、試験した抗体のいずれもが、捕捉されたＰＳＰ９４結合タンパク質と、結合部位がＰＳＰ９４で飽和されていない場合、反応しないことを示す。結合部位が、ＰＳＰ９４で飽和されている場合、Ｐ１Ｅ８は、複合体に対して、強い反応性を示す。しかしながら、２Ｄ３と１２Ｃ３は、示さない。このように、Ｐ１Ｅ８は、結合および遊離ＰＳＰ９４を認識し、他の２つの抗体（２Ｄ３および１２Ｃ３）は、タンパク質の遊離型だけを認識する。抗体２Ｄ３と１２Ｃ３は、おそらく、ＰＳＰ９４結合タンパク質と結合する際に、マスクされるＰＳＰ９４エピトープを認識するのであろう。これらの各抗体は、ＥＬＩＳＡプレートに被覆されると、天然および組換えＰＳＰ９４を検出する。全ての３つの抗体が、ＰＳＰ９４の濃度の有用な範囲にわたって、直線状の標準曲線を生じるための、サンドウィッチＥＬＩＳＡ形式における、捕捉または検出抗体として機能する。しかしながら、１２Ｃ３は、２Ｄ３またはＰ１Ｅ８よりも、ＰＳＰ９４に対して、親和性が低いようである。
【０２４５】
ＰＳＰ９４を検出するためのこれらの抗体の有用性は、以下の分析で示された：ＥＬＩＳＡプレートを、ｐＨ９．６の炭酸緩衝液中、５μｇ／ｍｌのＰＳＰ９４で被覆し、４℃で一晩インキュベーションした。プレートを、１％ＢＳＡで、一晩、３４℃にて、ブロッキングした。試料を、次いで、プレート中で、一晩、４℃にて、インキュベーションした。ビオチン化Ｐ１Ｅ８を、１マイクログラム／ｍｌで、２時間、３４℃にて加え、ペルオキシダーゼストレプトアビジンを、３４℃で１時間、加え、ＴＭＢで顕色した。定量化の下限値（ＬＬＱ）は、１ｎｇ／ｍｌの範囲であることが示された。分析（例えば、標準曲線）が、天然ＰＳＰ９４（すなわち、ヒト血清から単離されたＰＳＰ９４）または組換えＰＳＰ９４で行なえることが、特に注目される。
【０２４６】
（実施例１３）
遊離ＰＳＰ９４免疫検出分析
前記３つのＰＳＰ９４モノクローナル抗体（２Ｄ３（ＰＴＡ−４２４０）、Ｐ１Ｅ８（ＰＴＡ−４２４１）、１２Ｃ３）は、競合ＥＬＩＳＡ分析（すなわち、プレートをＰＳＰ９４（または、試料）で被覆し、ＰＳＰ９４被覆プレートへのモノクローナル抗体の結合を阻害するために、試料中にＰＳＰ９４を用いること）に用いられる。２Ｄ３の競合ＥＬＩＳＡ形式における使用を調べた。
【０２４７】
遊離ＰＳＰ９４を測定するためのＥＬＩＳＡ分析の例は、ＥＬＩＳＡプレートを２Ｄ３抗体で被覆することを含む。被覆したプレートを、次いで、試料と共にインキュベーションし、そして、２Ｄ３とＰ１Ｅ８は異なるＰＳＰ９４エピトープを認識するため、ＰＳＰ９４を、ビオチン化Ｐ１Ｅ８により検出させることができる。図１２ｂは、図１２ａに示す方法を用いたＥＬＩＳＡ分析の結果を表す。
【０２４８】
ＥＬＩＳＡ分析時に起こり得るＰＳＰ９４／ＰＳＰ９４結合タンパク質複合体の解離（例えば、２Ｄ３によって促進される）を抑えるために、改良点を導入した。簡単には、改良した分析は、分析を行なう前に、ＰＳＰ９４結合タンパク質抗体を用い、ＰＳＰ９４／ＰＳＰ９４結合タンパク質複合体を予め吸着すること（除去すること）を含む。ＰＳＰ９４結合タンパク質抗体は、選択的に、ＰＳＰ９４−結合タンパク質およびＰＳＰ９４／ＰＳＰ９４結合タンパク質複合体（すなわち、結合ＰＳＰ９４）を除去する。これは、ＰＳＰ９４結合タンパク質とＰＳＰ９４との間の平衡反応の反応速度を乱すことなく、行なうことができる。例えば、セファロースマトリックスに結合させた１７Ｇ９を用いて予め吸着させることができ、その結果、複合体を含まない（未結合ＰＳＰ９４は残存している）試料を生じる。次いで、試料を前記のように処理する（すなわち、複合体不含試料を、２Ｄ３で被覆したプレートとインキュベーションし、ビオチン化Ｐ１Ｅ８で検出する）。
【０２４９】
（実施例１４）
全ＰＳＰ９４免疫検出分析
Ｐ１Ｅ８抗体は、遊離および結合型の両方のＰＳＰ９４を認識することができるので、全ＰＳＰ９４を測定するための分析が開発された。例えば、Ｐ１Ｅ８を、プレートに固定化し、そして、遊離ＰＳＰ９４およびＰＳＰ９４結合タンパク質と複合化したＰＳＰ９４を含む試料を加えた。ＰＳＰ９４および複合体は、抗体に結合したままであり、Ｐ１Ｅ８とは異なる親和性（ＰＳＰ９４における異なる結合部位）を有する抗体を加えることができる。そのような抗体の例は、２Ｄ３、または、任意の他の適切なＰＳＰ９４抗体である。検出は、２Ｄ３に接合させることができる標識を用いることによって、または、直接的もしくは間接的（例えば、ビオチン／アビジン、もしくは、ストレプトアビジンシステム）に、２Ｄ３抗体を認識する第二の分子（抗体もしくはタンパク質）によって、行なうことができる。
【０２５０】
しかしながら、２Ｄ３が、ＰＳＰ９４とＰＳＰ９４結合タンパク質との間の結合平衡を乱すかもしれないという観察に基づいて、全ＰＳＰ９４（結合および未結合）を測定するための分析を改良した。
【０２５１】
特に、分析を、図１３に示すように、行なった。図１３において、全ＰＳＰ９４を、Ｐ１Ｅ８抗体で捕らえ、高濃度（過剰）のビオチン化２Ｄ３を、ＰＳＰ９４結合タンパク質の解離（置換）を促進するために用いる。前記した分析において、プラスチックが５０ｎｇ以下の受容力を有するため、プレートを被覆するための２Ｄ３の実際の濃度は低い。
【０２５２】
複合体（ＰＳＰ９４／ＰＳＰ９４結合タンパク質）を、測定前に、血清から吸着除去する場合、この分析は、遊離（未結合）ＰＳＰ９４を測定することもできることに留意すべきである。
【０２５３】
（実施例１５）
ＰＳＰ９４結合タンパク質免疫検出分析
全てのＰＳＰ９４結合タンパク質抗体についての特異性を、前記ＥＬＩＳＡ分析およびウェスタンブロットにより確認した。それらの各々は、ウエスタンブロットにより、結合タンパク質の高および低分子量型の両方を認識する。
【０２５４】
表１０に示すように、抗体１７Ｇ９は、３Ｆ４とは異なるエピトープを認識する。このように、図１４ａに示すように、サンドウィッチＥＬＩＳＡ分析は、これらの２つの抗体を用いて顕色させる。図１４ｂは、血清試料中のＰＳＰ９４結合タンパク質を測定するために用いられた分析の標準曲線を示す。これら２つの抗体は、交換できることに留意すべきである。例えば、捕獲抗体は、検出試薬（標識された場合）として用いられるように変更されることができる。
【０２５５】
男性ドナー由来の４０血清試料を、前記（図１４ａに示した）ＰＳＰ９４結合タンパク質ＥＬＩＳＡ分析で評価した。ＰＳＰ９４結合タンパク質血清濃度を、連続的に測定した。これらの男性ドナーにおけるＰＳＰ９４結合タンパク質値は、約１μｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌまで変動し、２例で２０μｇ／ｍｌを超えた。女性ドナー由来の２例を評価した；一つは約３μｇ／ｍｌであり、他方は、約７．８μｇ／ｍｌである。
【０２５６】
（実施例１６）
免疫検出分析の適用
既知の全ＰＳＡ値のヒト男性血清の試料を、参照標準実験から得た。４０例は、低い全ＰＳＡ血清レベル（＜４ｎｇ／ｍｌ）を有し、および、６９例は、高い全ＰＳＡ血清レベル（＞４ｎｇ／ｍｌ）を有した。分析は、これらの低および高カテゴリーで行なった。これらの患者までさかのぼることができる関連がなく、従って、全ＰＳＡ値以外、標本と結びついた臨床的な情報がない。この分析の目的は、ＰＳＰ９４測定の臨床的な関連性を決定するのではなく、傾向とパターンを探すことである。全ＰＳＰ９４、ＰＳＰ９４結合タンパク質、遊離ＰＳＰ９４、および補正遊離ＰＳＰ９４の血清濃度の分布を、ここに記載する更なる図に示す。
【０２５７】
更なる図について；
図１５Ａは、ＰＳＡ値が、カットオフ値４ｎｇ／ｍｌよりも低い、もしくは、高いことが知られている、個体の血清中の全ＰＳＰ９４の測定に次いで、そして、図１３に示され、かつ、実施例１４に記載された分析を用いて、得られた結果を示すグラフである。結果は、各個体について測定された全ＰＳＰ９４濃度（ｎｇ／ｍｌ）の対数として表す。各点は、特定の個体について得られた結果を表す。この図に関して、１から２２５０ｎｇ／ｍｌの全ＰＳＰ９４濃度は、個体の血清中で測定した。
【０２５８】
図１５Ｂに関し、この図は、ＰＳＡ値が、カットオフ値４ｎｇ／ｍｌよりも低い、もしくは、高いことが知られている、個体の血清中の遊離ＰＳＰ９４の測定後に得られた結果を示すグラフである。結果は、サンドウィッチＥＬＩＳＡ分析における２Ｄ３とＰ１Ｅ８モノクローナル抗体を用いた遊離ＰＳＰ９４の測定の前の、ここに記載した抗ＰＳＰ９４結合タンパク質抗体を用いた、ＰＳＰ９４結合タンパク質およびＰＳＰ９４／ＰＳＰ９４結合タンパク質複合体の血清からの除去（枯渇）に基づいた分析を用いて得られた。結果は、各個体について測定した遊離ＰＳＰ９４濃度（ｎｇ／ｍｌ）の対数として表す。各点は、特定の個体について得られた結果を表す。
【０２５９】
図１５Ｃに関し、この図は、ＰＳＡ値が、カットオフ値４ｎｇ／ｍｌよりも低い、もしくは、高いことが知られている、個体の血清中の全ＰＳＰ９４結合タンパク質の測定後に得られた結果を示すグラフである。結果は、図１４ａに示され、実施例１５に記載された分析を用いて得られた。結果は、各個体について測定した全ＰＳＰ９４結合タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）の対数として表す。各点は、特定の個体について得られた結果を表す。この図に関し、０．７から１２５マイクログラム／ｍｌまで変動するＰＳＰ９４結合タンパク質濃度を、個体の血清中で測定した。
【０２６０】
図１５Ｄに関し、この図は、ＰＳＡ値が、カットオフ値４ｎｇ／ｍｌよりも低い、もしくは、高いことが知られている、個体の血清中で得られた遊離ＰＳＰ９４濃度の補正後に得られた結果を示すグラフである。結果の取得に影響を及ぼすであろう枯渇後でも、１から５％の残存ＰＳＰ９４／ＰＳＰ９４結合タンパク質複合体が、血清中に残っていること、すなわち、２Ｄ３抗体が加えられた後、複合体からＰＳＰ９４が解離し、疑似的に「遊離ＰＳＰ９４」値が増加することがあることを考慮して、結果を補正した。結果は、再度、各個体について測定した補正遊離ＰＳＰ９４濃度（ｎｇ／ｍｌ）の対数として表す。各点は、特定の個体について得られた結果を表す。この図に関し、補正された遊離ＰＳＰ９４レベルは、高ＰＳＡカテゴリー（＞４ｎｇ／ｍｌ）で、有意に上昇した。
【０２６１】
図１６は、個体の血清中で測定した、全ＰＳＰ９４結合タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）対全ＰＳＰ９４濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示すグラフであり、各点は、特定の個体について得られた結果を表す。この図に関し、これら２つのパラメーター間に、有意な正の関係が観察されるであろう。
【０２６２】
この明細書中に引用された全ての文献および特許出願は、各個々の文献および特許出願が、明確かつ個別的に、参照によって組み込まれるように示されたかのように、ここに参照によって組み込まれる。任意の文献の引用は、出願日前の開示のためであり、本発明が、先行発明によるそのような文献に先行する権利がないことを認めることとして解釈されるべきではない。
【０２６３】
前述の発明は、理解を明確にするための図面および実施例として、多少詳細に記載しているが、当業者にとって、本発明の教示に鑑みて、添付のクレームの精神または範囲から逸脱することなく、それに、特定の変更と改変をなすことができることは非常に明確である。
【図面の簡単な説明】
【０２６４】
【図１】図１は、ヨウ素の同位元素１２５（１２５Ｉ）で放射標識されたＰＳＰ９４に結合した（特異的に結合している）ヒト男性血清由来のタンパク質のサイズ除外クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。ヒト男性血清タンパク質への１２５Ｉ−ＰＳＰ９４の結合は、各画分における、一分当りのカウント（ｃｐｍ）で表わされる放射能により測定する。非特異結合は、インキュベーション混合物中に、ヒト男性血清および１２５Ｉ−ＰＳＰ９４と共に、遊離ＰＳＰ９４を含ませることによって、測定した。遊離−および複合−ＰＳＰ９４（担体と会合したＰＳＰ９４）を含む画分の位置をグラフに示す。
【図２】図２は、硫酸アンモニウム沈降により部分的に精製された、ヒト男性血清由来のタンパク質の画分中の１２５Ｉ−ＰＳＰ９４結合の結果を表すグラフである。全ヒト男性血清を、様々な濃度の硫酸アンモニウム（０から３２％、３２から４７％、４７から６２％、および、６２から７７％の硫酸アンモニウム（％は、Ｗ／Ｖで計算した））で沈降し、画分内のＰＳＰ９４結合活性の存在を、放射性標識したＰＳＰ９４の、各血清画分（高分子量成分）中に含まれるタンパク質との会合能を測定することによって、評価した。結果は、結合分析に用いられた放射能の総量に対する、各画分中のヒト男性血清タンパク質に結合した放射能の量として（百分率で）表す。
【図３】図３は、硫酸アンモニウムにより精製したタンパク質で充填した、マクロプレップ・ハイ・キュー（ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ）陰イオン交換カラムを用いた、陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。タンパク質は、塩化ナトリウムで溶出する。点ＡとＢの間に位置するピークは、ＰＳＰ９４結合タンパク質を含むタンパク質画分を表す。タンパク質は、２８０ｎｍで測定した吸光度によって検出し、定量した。
【図４】図４は、ＰＳＰ９４−アフィニティークロマトグラフィー後、得られた試料を充填した還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルの写真である。ゲルは、電界中で泳動し、ゲルコード（Ｇｅｌｃｏｄｅ）（登録商標）ブルーコード（Ｂｌｕｅ  Ｃｏｄｅ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で染色した。レーン１は、分子量マーカーを表す。レーン２は、ＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックスに結合したタンパク質を表す。レーン３は、インキュベーション混合物中に過剰の遊離ＰＳＰ９４を含ませた時のＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックスに結合したタンパク質を表す。
【図５】図５は、異なる溶出（解離）条件を用いたＰＳＰ９４接合アフィニティーマトリックスからのＰＳＰ９４結合タンパク質の溶出後に得られた試料で充填した非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。インキュベーション後、異なる溶出緩衝剤中、アフィニティーマトリックスを、遠心分離により溶出緩衝剤から除去した。マトリックスを、ＰＢＳで洗浄し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝剤中で煮沸させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、電界中で泳動し、ゲルコード（登録商標）ブルーコード試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で染色した。矢印は、高分子量結合タンパク質（ＨＭＷ）および低分子量結合タンパク質（ＬＭＷ）の位置を表す。レーンＡは、分子量マーカーを表す。レーンＢは、未処置試料を表す。レーンＣは、ＰＢＳ中、３４℃で１時間インキュベーションした試料を表す。レーンＤは、水中、３４℃で１時間、インキュベーションした試料を表す。レーンＥは、３４℃で、１ｍｌのＰＢＳ中、３００μｇのＰＳＰ９４と共にインキュベーションした試料を表す。レーンＦは、競合対照を表す。レーンＧは、２Ｍの尿素中でインキュベーションした試料を表す。レーンＨは、８Ｍ尿素中で、インキュベーションした試料を表す。レーンＩは、１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ２．７で、インキュベーションした試料を表す。レーンＪは、１００ｍＭの３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、ｐＨ１１．０でインキュベーションした試料を表す。
【図６】図６は、硫酸アンモニウム沈降後、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した試料の（ＰＳＰ９４−接合アフィニティーマトリックスを用いた）アフィニティークロマトグラフィーの結果を示すグラフである。点ＡとＢの間に位置するピークは、ＰＳＰ９４結合タンパク質画分を表す。タンパク質は、２８０ｎｍでの吸光度によって、検出され、定量される。
【図７】図７は、非還元条件で行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。レーンＡは、分子量マーカーである。レーンＢは、硫酸アンモニウム沈降および陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製されたＰＳＰ９４結合タンパク質とのインキュベーション後、かつ、競合するＰＳＰ９４での溶出前のＰＳＰ９４アフィニティーマトリックスを表す。レーンＣは、競合対照を表す。レーンＤは、過剰のＰＳＰ９４での溶出後のアフィニティーマトリックスを表す。レーンＥは、最終的に溶出および濃縮された、(実質的に)純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質を表す。
【図８】ＰＳＰ９４結合タンパク質のために提案される精製方法の概略図である。
【図９Ａ】図９Ａは、ヒト組織ポリＡのＲＮＡ試料で行なったノーザンブロットの写真である。レーン１は、脳のＲＮＡを表し、レーン２は、心臓のＲＮＡを表し、レーン３は、骨格筋のＲＮＡを表し、レーン４は、結腸のＲＮＡを表し、レーン５は、胸腺のＲＮＡを表し、レーン６は、脾臓のＲＮＡを表し、レーン７は、腎臓のＲＮＡを表し、レーン８は、肝臓のＲＮＡを表し、レーン９は、小腸のＲＮＡを表し、レーン１０は、胎盤のＲＮＡを表し、レーン１１は、肺のＲＮＡを表し、そして、レーン１２は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のＲＮＡを表す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ヒト組織ポリＡのＲＮＡ試料で行なったノーザンブロットの写真である。レーン１は、脾臓のＲＮＡを表し、レーン２は、胸腺のＲＮＡを表し、レーン３は、前立腺のＲＮＡを表し、レーン４は、精巣のＲＮＡを表し、レーン５は、卵巣のＲＮＡを表し、レーン６は、小腸のＲＮＡを表し、レーン７は、結腸のＲＮＡを表し、そして、レーン８は、抹消血リンパ球（ＰＢＬ）のＲＮＡを表す。
【図１０】図１０は、特異的モノクローナル抗体（１Ｂ１１）を用いたＰＳＰ９４結合タンパク質の認識（結合）を示すウエスタンブロットの写真である。レーン１は、分子量マーカー（上から下まで、２１２、１３２、８６、４４ｋＤａ）である。レーン２は、０．２μｇの（実質的に）精製されたＰＳＰ９４結合タンパク質であり、レーン３は、２５μｇの部分的に純粋なＰＳＰ９４結合タンパク質である。
【図１１】図１１は、結合および遊離型のＰＳＰ９４に対するモノクローナル抗体の特異性が評価されるＥＬＩＳＡプレートの写真である。着色したウェルは、陽性の結果を表す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、遊離ＰＳＰ９４の量を測定するために用いられる方法の概略図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、図１２Ａに示された方法を用いたＥＬＩＳＡ分析の結果である。
【図１３】図１３は、試料中の全ＰＳＰ９４の量を測定するために用いられる提案された方法（ＰＳＰ９４サンドウィッチＥＬＩＳＡ）の概略図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、試料中の全ＰＳＰ９４結合タンパク質の量を測定するために用いられる（ＰＳＰ９４結合タンパク質サンドウィッチＥＬＩＳＡを用いた）方法の概略図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、図１４Ａに示された方法を用いて、試料中のＰＳＰ９４結合タンパク質を測定するために用いられたＥＬＩＳＡ分析の結果である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、低（＜４ｎｇ／ｍｌ）および高（＞４ｎｇ／ｍｌ）ＰＳＡカテゴリーにおける個体の血清からの全ＰＳＰ９４レベルの濃度を表す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、低（＜４ｎｇ／ｍｌ）および高（＞４ｎｇ／ｍｌ）ＰＳＡカテゴリーにおける個体の血清からの遊離ＰＳＰ９４レベルの濃度を表す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、低（＜４ｎｇ／ｍｌ）および高（＞４ｎｇ／ｍｌ）ＰＳＡカテゴリーにおける個体の血清からの全ＰＳＰ９４結合タンパク質レベルの濃度を表す。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、低（＜４ｎｇ／ｍｌ）および高（＞４ｎｇ／ｍｌ）ＰＳＡカテゴリーにおける個体の血清からの補正された遊離ＰＳＰ９４レベルの濃度を表す。吸着プロトコル後に、１〜５％のＰＳＰ９４結合タンパク質（および複合化ＰＳＰ９４）が残存していたので、遊離ＰＳＰ９４値を、補正した。補正により、結合ＰＳＰ９４ｘ吸着されていないＰＳＰ９４結合タンパク質の割合を、未補正の遊離ＰＳＰ９４値から差し引く。
【図１６】図１６は、全ＰＳＰ９４と比較した全ＰＳＰ９４結合タンパク質濃度を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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