(57)【要約】  本発明は、金属イオン、およびリガンドと特異的に反応しうるアンチリガンドと錯化したキレート剤により機能化された、少なくとも2つのモノマーの電気活性ホモポリマーまたはコポリマーのポリマーからなる電気活性プローブ、ならびに、このようなプローブの調製方法と、それを用いる生物学的試料中のリガンドの検出方法に関する。
2005510606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2つのモノマーのホモポリマーまたはコポリマーであり、金属イオン、アンチリガンド、および前記アンチリガンドと特異的に相互作用したリガンドと錯化したキレート剤により機能化された電気活性ポリマーからなる電気活性錯体。
【請求項２】
前記電気活性ポリマーが、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ(p-フェニレン)、ポリ(p-フェニレンビニレン)、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリエチレンジオキシチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾール、ポリアニリンもしくは2本鎖ポリヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項1に記載の錯体。
【請求項３】
前記キレート剤が、NTA(ニトリロ三酢酸)またはIDA(イミノ二酢酸)から選択されることを特徴とする請求項1および2のいずれかに記載の錯体。
【請求項４】
前記金属イオンが、銅または水銀のカチオンから選択されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の錯体。
【請求項５】
前記リガンドおよび前記アンチリガンドが、特にポリヌクレオチドとポリペプチドから選択される生物学的分子であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の錯体。
【請求項６】
前記アンチリガンドがヒスチジンまたはその高分子誘導体の1つに結合していることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の錯体。
【請求項７】
前記ポリピロールがコポリマーであり、そのピロール環が、-CH2-COOHまたは-CH2-CH2OH基により置換されたモノマーを含むことを特徴とする、請求項2に記載の錯体。
【請求項８】
少なくとも2つのモノマーのホモポリマーまたはコポリマーであり、金属イオン、およびリガンドと特異的に相互作用しうるアンチリガンドと錯化したキレート剤により機能化された電気活性ポリマーからなる電気活性プローブ。
【請求項９】
前記電気活性ポリマーが、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ(p-フェニレン)、ポリ(p-フェニレンビニレン)、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリエチレンジオキシチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾール、ポリアニリンもしくは2本鎖ポリヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項8に記載の電気活性プローブ。
【請求項１０】
前記キレート剤が、NTA(ニトリロ三酢酸)またはIDA(イミノ二酢酸)から選択されることを特徴とする、請求項１から９のいずれかに一項に記載の電気活性プローブ。
【請求項１１】
前記金属イオンが、銅または水銀のカチオンから選択されることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の電気活性プローブ。
【請求項１２】
前記アンチリガンドが、特にポリヌクレオチドとポリペプチドから選択される生物学的分子であることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の電気活性プローブ。
【請求項１３】
前記アンチリガンドがヒスチジンまたはその高分子誘導体の1つに結合していることを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載の電気活性プローブ。
【請求項１４】
前記ポリピロールがコポリマーであり、そのピロール環が-CH2-COOHまたは-CH2-CH2OH基により置換されたモノマーを含むことを特徴とする請求項9に記載の電気活性プローブ。
【請求項１５】
(a) 少なくともその1つが活性化された基により置換されている、少なくとも2つのモノマーからなるホモポリマーまたはコポリマーであるポリマーを準備する、
(b) 水溶液のキレート剤を準備する、また
(c) ホモポリマーまたはコポリマーである前記ポリマーが、加水分解により、前記キレート剤により機能化される、
(d) 前記キレート剤で機能化された前記ポリマーが、金属イオン水溶液との接触により錯化する、
(e) アンチリガンドが、アンチリガンド溶液との接触による、前記キレート剤で機能化され金属イオンと錯体形成した前記の錯化したポリマーの接触によりグラフトされる、
段階を含むことを特徴とする請求項8から14のいずれか一項に記載のプローブを調製する方法。
【請求項１６】
前記ポリマーが、少なくともその1つは活性基により3-位の炭素で置換された、少なくとも2つのピロールモノマーからなるポリピロールであることを特徴とする請求項5に記載の方法。
【請求項１７】
請求項8から14のいずれか一項に記載のプローブを特異的なリガンド/アンチリガンド相互作用にとって適切な反応条件の下で接触させ、また、接触させる前と接触させた後のプローブについて電位差または電流の変化が明らかにされるか、あるいは定量されることを特徴とする生物学的試料中のリガンドの検出方法。
【請求項１８】
前記アンチリガンドがヒスチジンまたはその高分子誘導体の1つに結合していることを特徴とする請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
請求項8から14のいずれか一項に記載のプローブで、その表面の全体または一部分が被覆された電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガントと特異的に相互作用させるためのアンチリガンドが結合する電気活性ポリマーにより調製される有機電極に関する。
【０００２】
先行技術に記載されている電極では、アンチリガンドとリガンドの特異的相互作用により、電気活性ポリマーの電気化学的性質に、前記ポリマーの電気化学活性の低下などの、感知できる選択的な変化が生じる。グラフトされたリガンドの濃度に依存するこの変化は、観察され、場合によっては測定され、グラフトされたリガンドの量に直接関連づけられる。こうして、この技術の1つの重要な応用は、生物学的試料に存在するリガンドの検出、同定、また場合によってはアッセイである。
【０００３】
前記の変化は、相互作用の前後の、電気活性ポリマーの酸化電位の変化などのポテンシオメトリ型のもの、あるいは所定の電位で求められる、ハイブリッド形成前後のポリマーの酸化または還元電流の変化のようなアンペロメトリ型のものである。
【０００４】
WO-A-95/29199は、それぞれ、ピロール環の3-位の炭素で核酸プローブにより置換され、それが共有結合したピロール環からなるモノマーで構成されたポリピロールを開示する。
【０００５】
こうして得られたポリピロールは、in vitroまたはin vivoでのリガンドの検出に、また場合によってはアッセイに応用される。
【０００６】
ポリマーの電気化学的応答を精密に特徴づけるには、そのポリマーの電気化学活性が高くなければならない。
【０００７】
NTA(ニトリロ三酢酸)またはIDA(イミノ二酢酸)などのキレート剤が金属に結合する能力は、すでに2または3価金属で研究されてきた。例えば、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ(IMAC)は、IDAをキレート剤として用いてタンパク質の精製に使用されてきた(Porath et al., Nature, 258, 598-599(1975))。IDAは、Zn2+、Cu2+またはNi2+などの金属イオンを取り込み、タンパク質またはペプチドを精製するために使用されている。
【０００８】
金属は、特徴的で、電気化学によりそれらの検出とそれらのアッセイを可能にする特有の酸化電位をもつ。
【０００９】
しかし、金属イオンを含む媒体の溶液電気化学による従来の分析では、10-5mol/リットルの程度のイオン量で検出することが可能となる。さらに、錯化デバイスの検出限界は、用いられた錯化剤の量に依存する。検出限界を下げる可能な解決策の1つは、キレート剤を電極に結び付けることを媒介として、測定電極上にイオン性の存在(entites)を閉じ込めること(confinement)からなる。
【特許文献１】WO-A-95/29199
【特許文献２】FR-A-2 607 507
【非特許文献１】Porath et al., Nature, 258, 598-599(1975)
【非特許文献２】M.Egholm et al., J.Am.Chem.Soc., 114, 1895-1897(1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、数オングストロームの付着物だけが伝導性であるため、電流の伝導を妨げ、また検出の感度と信頼性を損なうことのないように、EDTAのような通常のキレート剤を単分子層よりも厚い層として電極に付着させることはできないので、電極に多数のキレート剤を結び付けることは容易でなく、従ってそれらが望まれるように閉じ込めることは可能でない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本出願者等は、驚くべきことに、これらのキレート剤の担体として導電性ポリマーを使用すると、約100マイクロメートルの程度の比較的厚い付着物でさえ、導電性の不切断性を保持し、従ってまた10-9から10-10グラム分子/cm2の程度の閾値まで検出限界を下げることが可能となることを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
検出におけるこの不切断性は、キレート剤がそれに結び付けられている導電性ポリマーの3次元構造という利点により得られる。
【００１３】
こうして、キレート剤が結び付いたこれらの導電性ポリマーにより、金属イオンが錯化された時に、容易に特性評価しうる電気化学的応答を得ることが可能となる。
【００１４】
こうして、本発明の第1の主題は、少なくとも2つのモノマーのホモポリマーまたはコポリマーであり、また、金属イオン、アンチリガンド、および前記アンチリガンドと特異的に相互作用するリガンドと錯化したキレート剤により機能化されている電気活性ポリマーからなる電気活性錯体である。
【００１５】
本発明を詳細に説明する前に、明細書と請求の範囲で用いられる特定の用語を以下に定義する。
【００１６】
「アンチリガンド」および「リガンド」という用語は、いずれも、ポリヌクレオチドあるいはペプチドなどの生物学的分子だけではなく、化学的分子についても区別なく表す。
【００１７】
アンチリガンドはリガンドと特異的に相互作用して、リガンド/アンチリガンドのコンジュゲートを形成する。コンジュゲートの例として、すべてのペプチド/抗体、抗体/ハプテン、ホルモン/リセプタ、ポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド、あるいはポリヌクレオチド/核酸可逆対などを挙げることができる。
【００１８】
本発明による、「ポリヌクレオチド」という用語は、適当なハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも部分的に相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な、少なくとも5つの天然または修飾ヌクレオチド(デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド)からなる配列を表す。「修飾されたポリヌクレオチド」という用語は、例えば、修飾塩基を含み、また/あるいはヌクレオチド間の結合のレベルおよび/または骨格のレベルでの修飾を含むヌクレオチドを意味すると理解されている。修飾塩基の例として、イノシン、5-メチルデオキシシチジン、5-(ジメチルアミノ)デオキシウリジン、2,6-ジアミノプリンおよび5-ブロモデオキシウリジンを挙げることができる。修飾されたヌクレオチド間の結合の例として、ホスホロチオエート、Hホスホネートおよびアルキルホスホネート結合を挙げることができる。FR-A-2 607 507に開示されるものなどのα-オリゴヌクレオチド、および論文、M.Egholm et al., J.Am.Chem.Soc., 114, 1895-1897(1992)の主題をなすPNAは、修飾された骨格をもつヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの例である。
【００１９】
「ペプチド」という用語は、化学合成または組換え生物内での発現により得られたペプチドなど、抽出、分離、単離または合成された、タンパク質、タンパク質フラグメントまたはオリゴペプチドなどの、少なくとも2つのアミノ酸からなる配列を特に意味する。次のものも含まれる:配列内の1つまたは複数のL形アミノ酸が、1つまたは複数のD形アミノ酸により置き換えられたすべてのペプチド、およびこの逆のもの;少なくとも1つのCO-NH結合がNH-CO結合に置き換えられたすべてのペプチド;少なくとも1つのCO-NH結合がNH-CO結合に置き換えられたすべてのペプチドであって、各アミノアシル残基のキラリティが、それが前記の1つまたは複数のCO-NH結合に含まれているかどうかに関わらず、参照ペプチド(またはイムノレトロイド(immunoretroids))を構成するアミノアシル残基に対して保持されているか、逆転しているもの;すべてのミモトープ(mimotope)。
【００２０】
関連する様々な種類のペプチドの例として、副腎皮質刺激ホルモンまたはそれらのフラグメント、アンギオテンシン類とそれらの阻害剤、ナトリウム利尿ペプチド、ブラジキニンとそのペプチド誘導体、走化性ペプチド、ダイノルフィンとその誘導体、エンドルフィンとそれらの誘導体、エンケファリンとそれらの誘導体、酵素インヒビター、フィブロネクチンのフラグメントとそれらの誘導体、消化管ペプチド、オピオイドペプチド、オキシトシン、バソプレッシン、バソトシンおよびそれらの誘導体、あるいはプロテインキナーゼを挙げることができる。
【００２１】
「抗体」という用語は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、前記抗体のすべてのフラグメント（Fab、Fab'2またはFcフラグメント、ならびに遺伝子改変または組換えにより得られるすべての抗体など）と定義される。
【００２２】
本明細書では、「グラフトする」、「結合する(to bond)」、「結合する(to bind)」および「取り付ける」という用語は、指摘がなければ区別無く、それらの化学的性質を限定することなく、2つの存在の間の連結を意味する。したがって、それは弱い結合あるいは共有結合でありうる。
【００２３】
本発明による結合基は、少なくともその一方の化学的物質が、活性化されたか、あるいは活性化可能な基により、この相互作用のために、活性化されていたか、あるいは前もって活性化できた、2つの化学的物質の相互作用の後、前記2つの化学的物質を共有結合を介して結合する。このように、結合基は、一方のものの前記活性化された基または活性化可能な基と、他方のものの反応性官能基の反応によるか、またこの逆により、あるいは、一方のものの前記の活性化したか、または活性化可能な基と、他方のものの別の前記の活性化されたか、または活性化可能な基の反応により生成しうる。
【００２４】
「活性化された基」という用語は、その作用により、それが結び付いているものと別のものとの相互作用を可能にする基を意味すると理解されている。例として、-CO-[O-N-フタルイミド]基などは活性化されたエステル基であろう。「活性化可能な基」という用語は、例えば特定の反応条件の下で、あるいはそれと相互作用しうる活性化された基と接触させた時に、活性化された基に変換されうる基を意味すると理解されている。
【００２５】
本発明の電気活性ポリマーは水中で電気活性であるポリマーである。
【００２６】
本発明の錯体に存在する金属イオンは、それらがキレート剤と錯化した後、アンチリガンドと錯化するのに利用しうる数ヶ所の部位をまだ残しておくことができるイオンである。これらの利用しうる部位は、例えば前記アンチリガンドと後で錯化しない場合、水で中性化される。
【００２７】
金属イオンの例として、コバルト、ニッケル、銅および水銀を挙げることができる。
【００２８】
本発明で使用されるキレート剤は、金属イオンと錯化し、その錯化では、今の場合アンチリガンドとの、後の錯化に利用しうるそのイオンの配位サイトが残されるキレート剤である。
【００２９】
それゆえに、NTAは本発明の目的に適する4座配位子のキレート剤である。銅またはニッケルなどの金属イオンとのその錯化により、前記イオンの6つの配位サイトの4つを占め、アンチリガンドとの相互作用に利用しうる2つのサイトが残される。NTAは、キレート形成に利用できる他の樹脂より安定な方法で金属イオンに結合する。
【００３０】
本発明の目的に適するキレート剤の別の例はIDAであり、これはキレート形成に利用しうる3つのサイトをもつ。
【００３１】
金属イオンに結合する以外に、キレート剤は導電性ポリマーにも結合している。この結合は、上で定義された結合基の媒介による結合であり、共有結合の形をとる。
【００３２】
リガンドおよびアンチリガンドは、上で示したように、生体学的または化学的分子である。電気化学的検出を補足する検出が望ましい場合には、当業者に広く知られている方法に従って、直接または間接的に信号を発生しうるトレーサにより、それらに標識することができる。
【００３３】
アンチリガンドの金属イオンへの結合を向上させる性質がある結合媒介体により、アンチリガンドを金属イオンに結合させることができる。このような媒介体の例はヒスチジン、あるいはポリヒスチジンなどのその高分子誘導体の1つである。
【００３４】
上で定義された本発明の錯体は、単独であるいは組合せで考慮される、次の特性に該当すると有利である。
【００３５】
電気活性ポリマーは、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ(p-フェニレン)、ポリ(p-フェニレンビニレン)、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリエチレンジオキシチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾール、ポリアニリンもしくは2本鎖ポリヌクレオチドから選択され、および/または
キレート剤はNTAもしくはIDAから選択され、および/または金属イオンは銅および水銀のカチオンから選択され、および/または
リガンドおよびアンチリガンドは、特にポリヌクレオチドおよびポリペプチドから選択される生物学的分子であり、および/または
アンチリガンドはヒスチジンもしくはその高分子誘導体の1つに結合している。
【００３６】
本発明の好ましい錯体では、電気活性ポリマーは、それぞれがピロール環からなる少なくとも2つのモノマーからなるポリピロールである。
【００３７】
この錯体の好ましい実施形態によれば、ポリピロールはコポリマーであり、そのピロール環が、-CH2-COOHまたは-CH2-CH2OH基により置換されたモノマーを含む。
【００３８】
本発明の別の主題は、少なくとも2つのモノマーのホモポリマーまたはコポリマーであり、金属イオン、およびリガンドと特異的に相互作用しうるアンチリガンドと錯化したキレート剤により機能化された電気活性ポリマーからなる電気活性プローブである。本発明の電気活性プローブは、本発明の錯体について上で示したように、ポリマー、金属イオン、キレート剤およびアンチリガンドの特性をもつ。
【００３９】
電解重合段階は、当業者によく知られた技術を用いて実施される。例えば、一連の酸化と一連の還元により、重合させるのに十分な電位の変化をモノマーに与えることにより、あるいは代わりに、制御された電流(クロノポテンシオメトリ)での、または制御された電位(クロノアンペロメトリ)での重合により、それを実施することができる。
【００４０】
次の段階を含む方法により、本発明のプローブを調製することができる:
(a) 少なくともその1つが活性化された基で置換されている、少なくとも2つのモノマーからなるホモポリマーまたはコポリマーであるポリマーを利用しうる、
(b) 水溶液のキレート剤を利用しうる、また
(c) ホモポリマーまたはコポリマーである前記ポリマーが、加水分解により、前記キレート剤により機能化される、
(d) 前記キレート剤で機能化された前記ポリマーが、金属イオン水溶液との接触により錯化する、
(e) アンチリガンドが、アンチリガンド溶液との接触による、前記キレート剤で機能化され金属イオンと錯体形成した前記の錯化したポリマーの接触によりグラフトされる。
【００４１】
この方法は本発明のさらなる主題を構成する。
【００４２】
好ましい実施形態によれば、ポリマーは、少なくとも1つは活性エステル基により3-位で置換された、少なくとも2つのピロールモノマーからなるポリピロールである。
【００４３】
本発明のプローブには診断上の用途がある。したがって、前記プローブを特異的なリガンド/アンチリガンド相互作用にとって適切な反応条件の下で接触させ、接触させる前と接触させた後のプローブについて電位差または電流の変化が明らかにされるか、あるいは定量されることによれば、本発明は生物学的試料中のリガンドを検出する方法にも関する。
【００４４】
適切な反応条件は関連する反応の種類による。
【００４５】
こうして、標的ポリヌクレオチドの検出をする場合には、特異的なリガンド/アンチリガンド相互作用はハイブリッド形成である。ハイブリッド形成に適する反応条件は当業者に広く知られている。
【００４６】
タンパク質を含むリガンドの検出の場合には、特異的なリガンド/アンチリガンド相互作用は、例えば、抗原/抗体反応のそれである。このような検出に相応しい条件もまた、当業者に広く知られている。
【００４７】
一実施形態によれば、アンチリガンドはヒスチジンまたはその高分子誘導体の1つに結合している。
【００４８】
本発明の別の主題は、その表面の全体または一部分が前記のプローブで被覆されている電極である。当業者によく知られた通常の方法により、このような電極を得ることができる。例として、白金、金、金で被覆されたクロムまたはチタン、ガラス状カーボン、あるいは、酸化スズもしくはスズおよびインジウムの混合酸化物などの導電性酸化物からなる電極表面上に、本発明のポリマーを析出させることにより、この調製を実施することができる。
【００４９】
本発明の様々な主題が以下の実施例に示され、そこで添付図1から8が参照され、それらの好ましい特性とそれらの利点が明らかになるであろう。
【００５０】
（実施例１）
導電性ポリマーに基づくフィルムの調製
N-ヒドロキシフタルイミド(NHP)により3-位で官能化されたピロールモノマーを合成し、次に重合して、活性エステル基をもつポリ(3-(カルボキシメチルピロール)-NHP)ポリマーのフィルムを作製した。
【００５１】
モノマーの合成
室温で、溶剤としてのクロロホルム中で、N-ヒドロキシフタルイミドと、触媒としてのジシクロカルボキシジイミドを用い、3-ピロール酢酸のカルボキシル基をエステル化することにより、3-カルボキシメチルピロール-NHPモノマーを合成した。反応スキームは以下のように表される。
【００５２】
【化１】
2005510606.tif 000003
【００５３】
ポリマーの合成
3-カルボキシメチルピロール-NMPモノマーの0.1M溶液を、新しく蒸留した無水のアセトニトリルで、電解質(LiClO4、0.5M)の存在下で調製する。このモノマーを、0.9Vに電位を制御して、0.7cm2の白金電極、補助白金電極および対照電極としての飽和カロメル電極を用い、4区画セルで重合して、ポリ(3-(カルボキシメチルピロール)-NHP)のフィルムを生成させた。得られたフィルムをアセトンで洗浄し乾燥する。次に、電気活性を、アルゴンでパージして酸素を除去した後、電解質として0.1MのLiClO4を含むアセトニトリル媒体中で測定する。図1に示されるように、サイクロックボルタンメトリを、20mV/sの速度で記録する。酸化ピークEox=317mV/SCEをもつ安定した可逆的な電気化学的信号と、有機媒体中での電気化学活性の確認が得られる。分析後、電極をアセトンで洗浄し乾燥する。
【００５４】
（実施例２）
導電性3-カルボキシメチルピロールポリマーフィルムへのイミノ二酢酸(IDA)またはN-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸(NTA)のグラフト
実施例1に記載されたように、ポリ(3-(カルボキシメチルピロール)-NHP)フィルムを作製し分析した後、電極を、NTAまたはIDAの飽和水溶液に室温で12時間浸漬し、超純水で洗浄し乾燥する。ポリ(3-カルボキシメチルピロール-IDA)またはポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)の合成は以下のように表される：
【００５５】
【化２】
2005510606.tif 000004
【００５６】
得られた電極を超純水で洗浄し乾燥し、電気活性を、0.5MのNaClを含む水性媒体中でモニタする。電気化学的分析を図2に示す。
【００５７】
水性媒体中で、電気化学信号は安定しており可逆的である。
【００５８】
異なる厚さのポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)フィルムを調製し、得られたフィルムにNTAをグラフトした。0.5MのNaClの存在する水性媒体中で記録された電気化学的応答により、水性媒体中で電気化学的に活性なフィルムの存在が確認される。電極に始めに析出したポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)の量と、そのフィルムにグラフトしたNTAの計算量との比較は、フィルムへのNTAまたはIDAのグラフト効率は100%であることを示唆する。別の言い方をすると、ポリ(3-カルボキシ)ピロールフィルムへのNTAまたはIDAのグラフト量は、図3の曲線により示されるように、電極に存在する3-カルボキシメチルピロール-NHP単位の量に依存する。
【００５９】
（実施例３）
電極上でのポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムと銅の錯形成
【００６０】
【化３】
2005510606.tif 000005
【００６１】
ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムを含む電極を、水性媒体中で電気化学的に分析し、脱イオン水で洗浄し乾燥し、次にそれを、0.5MのNaClの存在下にCuCl2の水溶液に室温で3時間浸漬する。
【００６２】
次に、電極を脱イオン水で洗い乾燥し、0.5MのNaClを含む水溶液中で電気化学的に分析する。ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)の電気化学的信号の消失と、水性媒体中で安定しているが可逆的でなく電気活性である、-0.2V〜-0.35VでのCu+からCu2+への酸化に特徴的なピークの出現により、銅とポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)との錯形成が確認される(図4)。
【００６３】
（実施例４）
ポリピロール-NTA/Cu2+フィルムへのポリヒスチジンのグラフト
ポリピロール-NTA/Cu2+フィルムを含む電極を水で洗浄し、次に乾燥して、ポリピロール-NTAフィルムに錯化した銅の量と等モル量の、分子量6300gのポリヒスチジンの、NaClを含むPBS緩衝溶液に、室温で1時間浸漬する。
【００６４】
緩衝溶液で洗浄後、それらを乾燥し、次に、0.5MのNaClを含む水溶液中で電気化学的に分析する。
【００６５】
図5の曲線により示されるボルタモグラムで、銅の信号が依然として存在することが認められる。
【００６６】
次のグラフトの可逆性の実証:
【００６７】
【化４】
2005510606.tif 000006
【００６８】
上で得られた、グラフトされたポリヒスチジンを含む電極を、室温で15分間、EDTA水溶液に浸漬することにより処理し、洗浄し、次に乾燥する。
【００６９】
次に、それらを、0.5MのNaClを含む水溶液中で電気化学的に分析する。
【００７０】
図6の曲線により示されるボルタモグラムで、銅に特徴的なピークが消失したことが認められ、このことは、EDTAがフィルムのNTAとの錯体から銅を外したことを意味する。
【００７１】
ポリピロール-NTAフィルムでの銅の錯化と脱離(decomplexing)は可逆現象であると結論されるであろう。
【００７２】
（実施例５）
Cu2+イオンにより錯化したポリピロール-NTAフィルムへの抗原の固定化
固定化されたタンパク質RH24は、大腸菌(Escherichia coli)により天然に合成された、計算分子量26950gをもつP24タンパク質のN末端位置に、6つのヒスチジンアミノ酸を付加することにより修飾されたタンパク質である。
【００７３】
Cu2+/ポリピロール-NTAフィルムへの、室温で3時間の、5nmolの抗原のインキュベーションにより、グラフトを実施する。次に、それらを、0.5MのNaClを含む水溶液中で電気化学的に分析する。
【００７４】
サイクリックボルタンメトリを20mV/sの速度で記録する。
【００７５】
図7に示されるボルタモグラムにおいて、抗原の錯化に関連する信号の低下が認められる。
【００７６】
（実施例６）
抗原が固定化された、Cu2+イオン錯化ポリピロール-NTAフィルムでの抗体の検出
抗原が固定化された、Cu2+イオン錯化ポリピロール-NTAフィルムを含む電極を、抗原に特異的な抗体の0.6nmol溶液に浸漬することにより、検出を実施する。
【００７７】
次に、それらを、0.5MのNaClを含む水溶液中で電気化学的に分析する。
【００７８】
サイクリックボルタンメトリを20mV/sの速度で記録する。
【００７９】
図8に示されるボルタモグラムにおいて、抗原/抗体のカップリングに関連する信号の変化が認められる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】電気活性を、アルゴンでパージして酸素を除去した後、電解質として0.1MのLiClO4を含むアセトニトリル媒体中で測定し、サイクロックボルタンメトリを、20mV/sの速度で記録した結果を示す図である。
【図２】得られた電極を超純水で洗浄し乾燥し、電気活性を、0.5MのNaClを含む水性媒体中でモニタした、電気化学的分析を示す図である。
【図３】異なる厚さのポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)フィルムを調製し、得られたフィルムにNTAをグラフトし、0.5MのNaClの存在する水性媒体中で記録された電気化学的応答を示す図である。
【図４】ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムを含む電極を、水性媒体中で電気化学的に分析し、脱イオン水で洗浄し乾燥し、次にそれを、0.5MのNaClの存在下にCuCl2の水溶液に室温で3時間浸漬し、次に、電極を脱イオン水で洗い乾燥し、0.5MのNaClを含む水溶液中で電気化学的に分析した結果を示す図である。
【図５】ポリピロール-NTA/Cu2+フィルムを含む電極を水で洗浄し、次に乾燥して、ポリピロール-NTAフィルムに錯化した銅の量と等モル量の、分子量6300gのポリヒスチジンの、NaClを含むPBS緩衝溶液に室温で1時間浸漬し、緩衝溶液で洗浄後それらを乾燥し、次に、0.5MのNaClを含む水溶液中で電気化学的に分析した結果を示す図である。
【図６】グラフトされたポリヒスチジンを含む電極を、室温で15分間、EDTA水溶液に浸漬することにより処理し、洗浄し、乾燥し、次に、それらを、0.5MのNaClを含む水溶液中で電気化学的に分析した結果を示す図である。
【図７】Cu2+/ポリピロール-NTAフィルムへの、室温で3時間の、5nmolの抗原のインキュベーションによりグラフトを実施し、次に、それらを、0.5MのNaClを含む水溶液中で電気化学的に分析し、サイクリックボルタンメトリを20mV/sの速度で記録した結果を示す図である。
【図８】抗原が固定化された、Cu2+イオン錯化ポリピロール-NTAフィルムを備える電極を、抗原に特異的な抗体の0.6nmol溶液に浸漬することにより、検出を実施し、次に、それらを、0.5MのNaClを含む水溶液中で電気化学的に分析し、サイクリックボルタンメトリを20mV/sの速度で記録した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年11月9日(2004.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１６】
前記ポリマーが、少なくともその1つは活性基により3-位の炭素で置換された、少なくとも2つのピロールモノマーからなるポリピロールであることを特徴とする請求項15に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
モノマーの合成
室温で、溶剤としてのクロロホルム中で、N-ヒドロキシフタルイミドと、触媒としてのジシクロヘキシルカルボジイミドを用い、3-ピロール酢酸のカルボキシル基をエステル化することにより、3-カルボキシメチルピロール-NHPモノマーを合成した。反応スキームは以下のように表される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
異なる厚さのポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)フィルムを調製し、得られたフィルムにNTAをグラフトした。0.5MのNaClの存在する水性媒体中で記録された電気化学的応答により、水性媒体中で電気化学的に活性なフィルムの存在が確認される。電極に始めに析出したポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)の量と、そのフィルムにグラフトしたNTAの計算量との比較は、フィルムへのNTAまたはIDAのグラフト効率は100%であることを示唆する。別の言い方をすると、ポリ(3-カルボキシメチル)ピロールフィルムへのNTAまたはIDAのグラフト量は、図3の曲線により示されるように、電極に存在する3-カルボキシメチルピロール-NHP単位の量に依存する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
（実施例４）
ポリ(3-カルボキシメチル)ピロール-NTA/Cu2+フィルムへのポリヒスチジンのグラフト
ポリピロール-NTA/Cu2+フィルムを含む電極を水で洗浄し、次に乾燥して、ポリピロール-NTAフィルムに錯化した銅の量と等モル量の、分子量6300gのポリヒスチジンの、NaClを含むPBS緩衝溶液に、室温で1時間浸漬する。
【国際調査報告】
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