【手続補正書】
【提出日】令和2年5月15日(2020.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親野生型志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドに由来する毒素エフェクターポリペプチドを含むタンパク質であって、
前記親野生型志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドが、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸１〜２５１からなり、
前記毒素エフェクターポリペプチドが、配列番号１６と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を有し、
前記毒素エフェクターポリペプチドが、細胞内在化、細胞内の経路指定、触媒活性、及び細胞毒性から選択される、１又は２以上の志賀毒素Ａサブユニットエフェクター機能を示すことができ、
前記毒素エフェクターポリペプチドが、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含まない前記親野生型志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと同じ総数のアミノ酸を有するように、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが組み込まれており、
前記組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、前記タンパク質。
【請求項２】
組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、少なくとも１つの内因性Ｂ細胞エピトープ領域及び／又は少なくとも１つの内因性ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域を破壊することにより、毒素エフェクターポリペプチドを脱免疫化し、その結果、組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチドにおけるＢ細胞抗原性若しくは免疫原性及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞抗原性若しくは免疫原性が、組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含まない親野生型志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと比べ、低減しており、
前記組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの少なくとも１つのアミノ酸残基により、前記Ｂ細胞エピトープ領域及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域の少なくとも１つのアミノ酸残基が置換され、その結果、前記Ｂ細胞エピトープ領域及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域が破壊される、
請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
少なくとも１つの内因性Ｂ細胞エピトープ領域が、配列番号１又は配列番号２の天然位置のアミノ酸領域５３〜６６にあり；及び／又は
少なくとも１つの内因性ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域が、配列番号１又は配列番号２の天然位置のアミノ酸領域３４〜７８にある、
請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号１６と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を有する志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを含むタンパク質であって、
前記ポリペプチドのアミノ酸残基５３〜６１が、配列番号６に示される異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープからなり、
前記ポリペプチドが、細胞内在化、細胞内の経路指定、触媒活性、及び細胞毒性から選択される、１又は２以上の志賀毒素Ａサブユニットエフェクター機能を示すことができる、
前記タンパク質。
【請求項５】
毒素エフェクターポリペプチドが、前記毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の初期エンドソーム区画からＭＨＣクラスＩ分子に、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを細胞内送達することができる、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
毒素エフェクターポリペプチドが、前記毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の初期エンドソーム区画からＭＨＣクラスＩ分子に、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを細胞内送達することに加えて、１又は２以上の志賀毒素Ａサブユニットエフェクター機能を示すことができる、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
志賀毒素Ａサブユニットエフェクター機能が、細胞毒性、酵素活性、及び／又はポリペプチドが存在する細胞のサイトゾル区画に経路指定する能力である、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
配列番号１６と少なくとも９８％同一であるポリペプチド配列を含む、又はそれからなる、請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号１６に示されるポリペプチドを含む、又はそれからなる、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質と、細胞標的化部分又は細胞標的化剤とを含む、細胞標的化分子。
【請求項１１】
細胞標的化部分が、少なくとも１つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域を含む、請求項１０に記載の細胞標的化分子。
【請求項１２】
結合領域が、シングルドメイン抗体断片、一本鎖可変断片、抗体可変断片、抗原結合断片、Ｆｄ断片、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ断片）、軟骨魚類に由来する重鎖抗体ドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、ＶＮＡＲ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ等の多量体化ｓｃＦｖ断片、二重特異性タンデムｓｃＦｖ断片、ジスルフィド安定化抗体可変（Ｆｖ）断片、及び二重特異性ミニボディからなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１１に記載の細胞標的化分子。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の細胞標的化分子であって、前記細胞標的化分子を結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合されている細胞に投与すると、前記細胞の死を導く、前記細胞標的化分子。
【請求項１４】
メンバーが結合領域によって結合される細胞外標的生体分子と物理的に結合されている第１の細胞集団において、メンバーが前記結合領域によって結合されるいかなる細胞外標的生体分子とも物理的に結合されていない第２の細胞集団と比較して、少なくとも３倍大きい細胞毒性を示す、請求項１３に記載の細胞標的化分子。
【請求項１５】
細胞又は第１の細胞集団が、細胞外標的生体分子、又はその一部分を細胞の外部と結合させる、共有結合性及び／又は非共有結合性の分子間相互作用によって、前記細胞外標的生体分子と物理的に結合されているか、或いは
前記細胞外標的生体分子が、前記細胞若しくは第１の細胞集団によって発現される不可欠膜タンパク質若しくは表在性膜タンパク質である、請求項１３又は１４に記載の細胞標的化分子。
【請求項１６】
結合領域が、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原、Ｃｒｉｐｔｏ、エンドグリン／ＣＤ１０５、線維芽細胞活性化タンパク質、ＬＥＷＩＳ−Ｙ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素ＩＸ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドＬＥＷＩＳ−Ｙ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、テネイシン、ＣＤ６４、メソセリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、チロシナーゼ関連抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン・バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトプロテイン抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１／ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５、Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ｍｒｐ−１４、Ｓｉｇｌｅｃ−８、Ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ＴＬＲ４、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ−ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ２８４／ＴＬＲ４、ＣＤ１０７／Ｍａｃ３、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２／ＴＬＲ２、ＣＤ１１ｃ、及び前述のもののいずれかの任意の免疫原性断片
からなる群から選択される、請求項１１〜１５のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項１７】
毒素エフェクターポリペプチドが、前記毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性を変化させる、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットに対する変異を含む、請求項１０〜１６のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項１８】
変異が、ポリペプチドの細胞毒性を低減させる又は除去する、請求項１７に記載の細胞標的化分子。
【請求項１９】
ホモ多量体又はヘテロ多量体の形態の、請求項１０〜１８のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項２０】
ペプチド、タンパク質、細胞毒性剤、検出促進剤、小分子の化学療法剤、及びポリヌクレオチドのいずれかから選択される追加の外因性物質に連結される、請求項１０〜１９のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項２１】
追加の外因性物質が、ペプチド又は抗原を含むタンパク質である、請求項２０に記載の細胞標的化分子。
【請求項２２】
薬学的に許容される塩又は溶媒和物の形態の、請求項１０〜２１のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項２３】
請求項１０〜２２のいずれかに記載の細胞標的化分子と、
少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体と
を含む医薬組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容される担体が、生理学的に許容される溶媒又は分散媒を含み；及び／又は
薬学的に許容される担体が、水、アルコール、ポリオール、及びそれらの好適な混合物、植物油、又は注入可能な有機エステルを含む、
請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
アジュバント、コーティング、抗微生物剤、抗菌剤又は抗真菌剤；等張剤；ポリアルコール；吸収遅延剤；安定化剤；緩衝剤；界面活性剤；及び／又は薬学的に許容される抗酸化剤をさらに含む、請求項２３又は２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
アジュバントが、保存剤、湿潤剤、乳化剤、又は分散剤であり；
コーティングが、レシチンであり；
抗菌剤又は抗真菌剤が、パラベン、クロロブタノール、フェノール、又はソルビン酸であり；
等張剤が、糖又は塩化ナトリウムであり；
ポリアルコールが、マンニトール又はソルビトールであり；及び／又は
薬学的に許容される抗酸化剤が、水溶性抗酸化剤、油溶性抗酸化剤、又は金属キレート剤である、
請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
水溶性抗酸化剤が、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、又は亜硫酸ナトリウムであり；
油溶性抗酸化剤が、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、レシチン、没食子酸プロピル、又はアルファ−トコフェロールであり；及び／又は
金属キレート剤が、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、ソルビトール、酒石酸又はリン酸である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１０〜２２のいずれかに記載の細胞標的化分子と、
検出促進剤と
を含む診断用組成物。
【請求項２９】
請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質、若しくは請求項１０〜２１のいずれかに記載の細胞標的化分子をコードするポリヌクレオチド;又はその補体。
【請求項３０】
請求項２９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３１】
請求項２９に記載のポリヌクレオチド又は請求項３０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３２】
細胞を、請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質、請求項１０〜２２のいずれかに記載の細胞標的化分子、又は請求項２３〜２７のいずれかに記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、前記細胞を殺滅するインビトロにおける方法。
【請求項３３】
請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質、請求項１０〜２２のいずれかに記載の細胞標的化分子、又は請求項２３〜２７のいずれかに記載の医薬組成物を含む、患者における疾患、障害又は状態の治療剤であって、
前記疾患、障害又は状態が、前記細胞標的化部分又は細胞標的化剤によって標的化される細胞によって特徴づけられる、前記治療剤。
【請求項３４】
疾患、障害又は状態が、がん、腫瘍、免疫障害及び微生物感染からなる群から選択される、請求項３３に記載の治療剤。
【請求項３５】
がんが、骨がん、乳がん、中枢／末梢神経系がん、胃腸がん、胚細胞がん、腺がん、頭頸部がん、血液がん、腎・尿路癌、肝がん、肺／胸膜がん、前立腺がん、肉腫、皮膚がん、及び子宮がんからなる群から選択されるか、又は
免疫障害が、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶、移植片対宿主病、橋本甲状腺炎、溶血性尿毒症症候群、ＨＩＶ関連疾患、エリテマトーデス、多発性硬化症、多発動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び血管炎からなる群から選択される疾患に関連するものである、
請求項３４に記載の治療剤。
【請求項３６】
細胞標的化分子又は医薬組成物が、脊索動物内の組織部位への「接種」により投与するためのものであり、前記組織部位が、前記細胞標的化分子により標的化される細胞を含む、請求項３３〜３５のいずれかに記載の治療剤。
【請求項３７】
組織部位が、悪性組織、罹病組織、炎症組織、腫瘍塊、がん性腫瘍、腫瘍、感染組織、又は異常細胞塊を含む、請求項３６に記載の治療剤。
【請求項３８】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、ＭＨＣクラスＩ複合体中の細胞標的化分子の標的細胞によって天然に提示されないペプチド、前記標的細胞によって発現されるいずれのタンパク質中にも自然に存在しないペプチド配列、前記標的細胞のプロテオーム中に自然に存在しないペプチド配列、接種される部位の細胞外微小環境に天然に存在しないペプチド、及び標的にされる腫瘍塊又は感染組織部位に天然に存在しないペプチドからなる群から選択される、請求項３６又は３７に記載の治療剤。
【請求項３９】
がん、腫瘍、免疫障害、又は微生物感染の治療又は予防における使用のための、請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１０〜２２のいずれかに記載の細胞標的化分子を含む組成物。
【請求項４０】
がん、腫瘍、免疫障害、若しくは微生物感染の治療又は予防のための医薬品の製造における、請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質、請求項１０〜２２のいずれかに記載の細胞標的化分子、請求項２３〜２７のいずれかに記載の医薬組成物、又は請求項２８に記載の診断用組成物の使用。
【請求項４１】
細胞標的化分子、医薬組成物又は診断用組成物が、脊索動物内の組織部位への「接種」により投与するためのものであり、前記組織部位が、細胞標的化分子により標的化される細胞を含む、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
組織部位が、悪性組織、罹病組織、炎症組織、腫瘍塊、がん性腫瘍、腫瘍、感染組織、又は異常細胞塊を含み、細胞標的化分子により標的化される細胞を含む、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、ＭＨＣクラスＩ複合体中の細胞標的化分子の標的細胞によって自然に提示されないペプチド、前記標的細胞によって発現されるいずれのタンパク質中に自然に存在しないペプチド配列、前記標的細胞のプロテオーム中に自然に存在しないペプチド配列、接種される部位の細胞外微小環境に自然に存在しないペプチド、及び標的にされる腫瘍塊又は感染組織に自然に存在しないペプチドからなる群から選択される、
請求項４１又は４２に記載の使用。
【請求項４４】
疾患、障害又は状態の診断、予後予測又は特性評価における、請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１０〜２２のいずれかに記載の細胞標的化分子の使用。
【請求項４５】
外因性物質を細胞の内部に送達するインビトロの方法であって、前記細胞を請求項１０〜２２のいずれかに記載の細胞標的化分子、請求項２３〜２７のいずれかに記載の医薬組成物、又は請求項２８に記載の診断用組成物と接触させるステップを含み、前記外因性物質が、組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである、前記方法。
【請求項４６】
外因性物質を細胞の内部に送達するインビトロの方法であって、前記細胞を請求項２０又は２１に記載の細胞標的化分子と接触させるステップを含み、前記外因性物質が、追加の外因性物質である、前記方法。
【請求項４７】
請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質、請求項１０〜２２のいずれかに記載の細胞標的化分子、請求項２３〜２７のいずかに記載の医薬組成物、請求項２８に記載の診断用組成物、請求項２９に記載のポリヌクレオチド、請求項３０に記載の発現ベクター、又は請求項３１に記載の宿主細胞、並びに追加の試薬及び／又は医薬送達デバイスを備えるキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５６】
ジフテリア毒素由来エフェクターポリペプチド
ジフテリア毒素は、抗毒素及びリガンド毒素融合分子を設計するために用いられており、ジフテリア由来成分は細胞内在化及び細胞質ゾルルーティングエフェクター機能を提供することができる。計算法を利用して、哺乳類の免疫システムによる応答を誘発する可能性があるジフテリア毒素Ａサブユニット中の抗原性及び／又は免疫原性Ｂ細胞エピトープを予測した。BcePredウェブサーバー（Saha S, Raghava G, Lecture Notes in Comput Sci 3239: 197-204 (2004)）を使って、ジフテリア毒素のＡサブユニット（配列番号４４）中のＢ細胞エピトープ領域を予測した。この計算法で、典型的なジフテリア毒素Ａサブユニット中に７つの推定されるＢ細胞エピトープ領域があることが明らかになった（表５）。さらに、米国立アレルギー感染病調査所（ＮＩＡＩＤ、National Institutes of Allergy and Infectious Diseases of the U.S.）が管理する免疫エピトープデーターベース（ＩＥＤＢ）は、全ての実験で特徴づけられたジフテリア毒素のＢ細胞及びＴ細胞エピトープを提供すると言われている。現在、ＩＥＤＢは、本実施例で使用されるジフテリア毒素Ａサブユニット及びジフテリア毒素エフェクターポリペプチド配列番号４５に関連するペプチドエピトープに関する少なくとも１つの陽性測定を有する７つのエピトープを提供する（表５、並びに配列番号４５の領域１８２〜２０１及び２２５〜２３８を参照されたい）。