(57)【要約】  本発明は、被験者から採取された血液試料に含まれる細胞を、蛍光タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスで処理し、細胞の蛍光情報及び細胞の大きさ情報を取得し、取得された蛍光情報及び細胞の大きさ情報に基づいて、細胞が癌細胞か否かを判定する血液中癌細胞の検出方法及びそれに用いるプログラムを提供する。
2011099565.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された血液試料に含まれる細胞を、蛍光タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスで処理することにより、測定用試料を調製する工程と、
前記測定用試料に含まれる細胞の蛍光情報及び細胞の大きさ情報を取得する工程と、
取得工程で取得された蛍光情報及び細胞の大きさ情報に基づいて、細胞が癌細胞か否かを判定する工程と、
を含む、血液中癌細胞の検出方法。
【請求項２】
蛍光情報が、蛍光強度のピーク値及び積分値の少なくとも一つである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞の大きさ情報が、細胞の直径、細胞の面積、細胞の体積、及び細胞の周円長の少なくとも一つである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
調製工程が、前記腫瘍溶解性ウイルスで処理した血液試料を、非イオン性界面活性剤及び固定化剤と混合することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
固定化剤が、タンパク質を架橋させる物質であり、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドから選択される請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
血液試料が、末梢血から血清を除去したものである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、テロメアーゼプロモーターが組み込まれた腫瘍溶解性ウイルスである請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、ヒトアデノウイルス由来である請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
コンピュータを、
血液試料中の腫瘍溶解性ウイルスが感染し増殖した細胞の蛍光情報及び細胞の大きさ情報を取得する取得手段、
前記取得手段で取得された情報に基づいて、細胞が癌細胞か否かを判定する判定手段、
前記判定手段の判定結果を表示する表示手段、
として機能させるための血液中癌細胞の検出プログラム。
【請求項１２】
前記取得手段が、血液試料中の腫瘍溶解性ウイルスが感染し増殖した細胞を撮像することにより得られた細胞画像から、蛍光タンパク質由来の蛍光情報及び細胞の大きさ情報を取得する、請求項１１に記載のプログラム。
【請求項１３】
前記取得手段で取得される蛍光情報が、蛍光強度のピーク値及び積分値の少なくとも一つである請求項１１又は１２に記載のプログラム。
【請求項１４】
前記取得手段で取得される細胞の大きさ情報が、細胞の直径、細胞の面積、細胞の体積、及び細胞の周円長の少なくとも一つである請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者から採取された血液試料から癌細胞を検出するための方法及びそれに用いるプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の転移は、原発巣の癌細胞が血管やリンパ管を通って全身に広がり、その一部が他部位の臓器などに生着して増殖することにより起こると考えられている。血液中を循環する癌細胞は、CTC(Circulating Tumor Cell)と呼ばれている。血液中のCTC数と癌の転移や予後とが相関することが報告されている。そのため、CTC数の測定が、転移性癌、例えば転移性乳癌の予後や治療効果を予測する方法として有用であると考えられている。【０００３】
癌細胞では、正常な細胞の大部分ではほとんど検出されないテロメラーゼの活性が亢進していることが知られている。そこで、テロメラーゼプロモーターを含む複製カセットと、標識タンパク質(例えば緑色蛍光タンパク質(GFP))の遺伝子を含む標識カセットとを保持するウイルス（腫瘍溶解性ウイルス(Oncolytic Virus)）を、癌細胞で増殖させて、癌細胞を特異的に標識する技術が知られている(特許文献１)。GFP遺伝子を有する腫瘍溶解性ウイルスは、テロメスキャン(登録商標)(OBP-401)として市販されている。テロメスキャン(登録商標)は、癌細胞で特異的に増殖し、GFPを産生することにより、癌細胞を特異的に蛍光発光させることができる。【０００４】
このテロメスキャン(登録商標)(OBP-401)を利用したCTC検出方法として、テロメスキャン(登録商標)(OBP-401)を血液中の癌細胞に感染させ増殖させて、GFPの蛍光発光を利用することにより血液中の癌細胞を検出する方法が知られている(非特許文献１)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開公報２００６／３６００４号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Toru K., et al. A simple biological imaging system for detecting viable human circulating tumor cells. J. Clin. Invest. 119:3172-3181(2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１における、テロメスキャン(登録商標)(OBP-401)のような蛍光タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスを利用したCTC検出方法を用いれば、血液中の癌細胞、すなわちCTCを特異的に検出できると考えられる。【０００８】
しかしながら、発明者らが検討したところ、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞だけではなく一部の正常細胞、例えば白血球(一部の単球及びリンパ球)にも感染し、増殖することがわかった。そのため、蛍光タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスを用いてCTCの検出を行うと、癌細胞以外の正常細胞においても蛍光強度が検出されることがある。結果として、正確に癌細胞を検出できない場合がある。【０００９】
したがって、本発明は、蛍光タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスを用いて、被験者から採取された血液試料に含まれる細胞が癌細胞か否かを正確に判定することのできる血液中癌細胞の検出方法及びそれに用いるプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、蛍光タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスを用い、細胞の蛍光情報と細胞の大きさ情報を利用することにより、細胞が癌細胞か否かを正確に判定できることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、被験者から採取された血液試料に含まれる細胞を、蛍光タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスで処理することにより、測定用試料を調製する工程と、前記測定用試料に含まれる細胞の蛍光情報及び細胞の大きさ情報を取得する工程と、取得工程で取得された蛍光情報及び細胞の大きさ情報に基づいて、細胞が癌細胞か否かを判定する工程とを含む、血液中癌細胞の検出方法を提供する。
また、本発明は、コンピュータを、血液試料中の腫瘍溶解性ウイルスが感染し増殖した細胞の蛍光情報及び細胞の大きさ情報を取得する取得手段、前記取得手段で取得された情報に基づいて、細胞が癌細胞か否かを判定する判定手段、前記判定手段の判定結果を表示する表示手段、として機能させるための血液中癌細胞の検出プログラムを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、蛍光タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスを用いて、被験者から採取された血液試料に含まれる細胞が癌細胞か否かを正確に判定することができ、これによって癌細胞を精度良く検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】経時的な蛍光強度の波形の分析結果の一例を示す模式図である。
【図２】経時的な電気抵抗の波形の分析結果の一例を示す模式図である。
【図３】経時的な散乱光強度の波形の分析結果の一例を示す模式図である。
【図４】判定工程におけるスキャッタグラムの一例を示す模式図である。
【図５】取得工程及び判定工程を実施するコンピュータの一例を示す模式図である。
【図６】コンピュータによって実行される癌細胞か否かを判定する処理を示すフローチャートの一例である。
【図７】実施例１における、Ｘ軸に積分値、Ｙ軸に体積を取ったスキャッタグラムである。
【図８】実施例１における、Ｘ軸にピーク値、Ｙ軸に体積を取ったスキャッタグラムである。
【図９】実施例１における、Ｘ軸に積分値、Ｙ軸に面積を取ったスキャッタグラムである。
【図１０】実施例１における、Ｘ軸に積分値、Ｙ軸に直径を取ったスキャッタグラムである。
【図１１】実施例１における、Ｘ軸に積分値、Ｙ軸に周囲長を取ったスキャッタグラムである。
【図１２】実施例１における、Ｘ軸に面積、Ｙ軸にピーク値、Ｚ軸に積分値を取った三次元頻度分布図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本実施形態の血液中癌細胞の検出方法は、
（１）被験者から採取された血液試料に含まれる細胞を、蛍光タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスで処理することにより、測定用試料を調製する工程（調製工程）；
（２）前記測定用試料に含まれる細胞の蛍光情報及び細胞の大きさ情報を取得する工程（取得工程）；
（３）取得工程で取得された蛍光情報及び細胞の大きさ情報に基づいて、細胞が癌細胞か否かを判定する工程（判定工程）
を含む。
【００１５】
本実施形態において、「血液試料」は、被験者から採取された血液、及び血液を処理して得られた処理血液のいずれかであってもよい。判定効率がより向上される点で、血液試料は、全血、特に末梢血から血清を除去したものが好ましい。被験者は、通常、癌に羅患したことが疑われる患者、癌に羅患している患者などの癌細胞を有するか否かを判定しようとする患者が挙げられる。
【００１６】
全血から血清を除去する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、抗凝固剤（例えばエチレンジアミン四酢酸、クエン酸ナトリウム、へパリンなど）を加えた全血を、遠心分離する方法が挙げられる。遠心分離は、５００ｒｐｍ〜３５００ｒｐｍで、３〜３０分間行うことが好ましい。
【００１７】
本実施形態において、蛍光タンパク質としては、生化学分野で通常用いられる公知のタンパク質を用いることができる。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びその変異体（例えばＥｎｈａｎｃｅｄ−ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔＧＦＰ（ｒｓＧＦＰ））、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）などの蛍光タンパク質などを用いることができる。本実施形態では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質が好ましい。
【００１８】
本実施形態において、「腫瘍溶解性ウイルス」とは、正常細胞内では増殖できず、癌細胞内で特異的に増殖可能な制限増殖型ウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスとしては、特に限定されないが、癌細胞において特異的にプロモーター活性を示すプロモーターが組み込まれたウイルスが挙げられる。癌細胞において特異的にプロモーター活性を示すプロモーター（以下、「癌細胞特異的プロモーター」ともいう）としては、ヒトテロメラーゼプロモーター、ヒト前立腺癌特異抗原(ＰＳＡ)プロモーター、ヒトアルファプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）プロモーターなどが挙げられる。多種類の癌細胞でプロモーター活性を示すことができる点で、ヒトテロメラーゼプロモーターが好ましい。なかでも、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素をコードする遺伝子であるｈＴＥＲＴのプロモーターがより好ましい。
【００１９】
配列番号１は、ｈＴＥＲＴプロモーターの核酸配列である。ｈＴＥＲＴプロモーターとしては、配列番号１に示す４５５ｂｐの核酸配列の全体を用いてもよいが、配列番号１の５’上流の１８１ｂｐの領域が、下流の遺伝子発現に重要なコア領域であると考えられているので、このコア領域を少なくとも含む核酸配列を用いればよい。
【００２０】
上記の腫瘍溶解性ウイルスは、蛍光タンパク質を発現する。すなわち、上記の腫瘍溶解性ウイルスは、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する。
【００２１】
上記の蛍光タンパク質の遺伝子は、上記の癌細胞特異的プロモーターの制御下に置くことができる。
また、上記の蛍光タンパク質の遺伝子は、腫瘍溶解性ウイルス内でプロモーター活性を示し得るプロモーターの制御下におくこともできる。蛍光タンパク質遺伝子の発現を制御し得るプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＭＭＴＶ  ＬＴＲプロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが挙げられる。
本実施例では、蛍光タンパク質の遺伝子は、ＣＭＶプロモーター又はｈＴＥＲＴプロモーターの制御下におくことが好ましい。
これらのプロモーターの核酸配列は、公知である。
【００２２】
上記の蛍光タンパク質をコードする遺伝子と、それを発現するためのプロモーター（癌細胞特異的プロモーター又は腫瘍溶解性ウイルス内でプロモーター活性を示し得るプロモーター）とを少なくとも含む発現カセットは、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、及びプロモーターを、公知の配列に基づいて、ＰＣＲなどにより増幅させ、得られた各遺伝子を、適切なプラスミドに連結し、必要な部分を切り出すことにより、発現カセットを得ることができる。例えば、国際公開２００６／３６００４号を参照されたい。
【００２３】
上記の腫瘍溶解性ウイルスは、上記の癌細胞特異的プロモーターの下流に、ウイルスの増殖に必要な遺伝子を連結した複製カセットを有するものであってもよい。ウイルスの増殖に必要な遺伝子としては、初期遺伝子（ＥＩＡ、ＥＩＢなど）、ピコルナウイルス科に特異的なタンパク質合成開始シグナルであるＩＲＥＳなどが挙げられる。これらの遺伝子の核酸配列は公知である。
【００２４】
上記の複製カセットは、通常の遺伝子工学的手法により作製できる。例えば、上記の癌細胞特異的プロモーター、及び所望によりウイルスの増殖に必要な遺伝子を、公知の配列に基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などにより増幅させ、得られた各遺伝子を、適切なプラスミドに連結し、必要な部分を切り出すことにより、複製カセットを得ることができる。例えば、国際公開２００６／３６００４号を参照されたい。
【００２５】
上記のウイルスとしては、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、センダイウイルス、レオウイルスに由来するものが挙げられる。本実施形態では、ヒトアデノウイルスが好ましい。
【００２６】
上記の腫瘍溶解性ウイルスは、市販のものを用いることもできる。本明細書における腫瘍溶解性ウイルスとしては、ｈＴＥＲＴプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ遺伝子及びＥ１Ｂ遺伝子を含む複製カセットと、ＣＭＶプロモーター及びＧＦＰ遺伝子を含む発現カセットとを有するアデノウイルスであるテロメスキャン（登録商標）（ＯＢＰ−４０１）（オンコリスバイオフォーマ社製）が好ましい。
【００２７】
（１）調製工程
本実施形態は、血液試料に含まれる細胞を、蛍光タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスで処理することにより、測定用試料を調製する工程（以下、「調製工程」ということがある）を含む。血液試料に含まれる細胞を、腫瘍溶解性ウイルスで処理することで、蛍光タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスを、血液試料中の癌細胞に感染させる。これにより、蛍光タンパク質を癌細胞内で発現させることができる。腫瘍溶解性ウイルスによる、血液試料に含まれる細胞の処理は、公知の手法により行ってよく、特に制限されない。例えば、動物細胞培養に通常使用される培地の存在下で、血液試料と腫瘍溶解性ウイルスとをインキュベートすることにより、腫瘍溶解性ウイルスを、血液試料中の癌細胞に感染させることができる。血液試料と腫瘍溶解性ウイルスのインキュベートに用いる培地としては、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最少必須培地（ＭＥＭ）などが挙げられる。
【００２８】
血液試料と腫瘍溶解性ウイルスとをインキュベートする場合、腫瘍溶解性ウイルスを、血液試料１ｍｌあたり６×１０4〜６×１０8ＰＦＵ（Ｐｌａｑｕｅ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）の量で、血液試料とインキュベートすることが好ましい。上記の血液試料を、腫瘍溶解性ウイルスとインキュベーションする時間及び温度は、腫瘍溶解性ウイルスが血液試料中の癌細胞で増殖できる条件であればよく、腫瘍溶解性ウイルスの種類により適宜調節できる。本実施形態において、インキュベーションは、２５〜４０℃の温度で、１〜３６時間、より好ましくは３０〜３７℃にて１２〜２４時間行うことができる。
【００２９】
本実施形態の調製工程は、腫瘍溶解性ウイルスで処理した血液試料を、非イオン性界面活性剤及び固定化剤と混合することをさらに含み得る。血液試料中に存在する白血球（単球、リンパ球など）は、テロメラーゼのような癌細胞で特異的に発現する酵素を稀に発現する。そのため、血液試料に含まれる細胞を、蛍光タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスで処理すると、正常な白血球で腫瘍溶解性ウイルスが増殖する場合がある。結果として、正常な白血球から、蛍光タンパク質由来の蛍光が生じることがある。従って、後述する取得工程において、ノイズとなる蛍光情報が増えてしまう。ここで、腫瘍溶解性ウイルスで処理した血液試料を、非イオン性界面活性剤及び固定化剤と混合すると、正常な白血球などに損傷を与え、かつ、赤血球を溶血することができる。これにより、取得工程におけるノイズを減らすことができる。結果として、後述する判定工程において、細胞が癌細胞か否かをより正確に判定することが可能となる。
【００３０】
ここで、腫瘍溶解性ウイルスで処理した血液試料と、非イオン性界面活性剤及び固定化剤との混合の順序は、特に制限されない。例えば、非イオン性界面活性剤と腫瘍溶解性ウイルスで処理した血液試料とを混合した後に、固定化剤を混合してもよい。また、固定化剤と腫瘍溶解性ウイルスで処理した血液試料とを混合した後に、非イオン性界面活性剤を混合してもよい。さらに、非イオン性界面活性剤、固定化剤及び腫瘍溶解性ウイルスで処理した血液試料を同時に混合してもよい。本実施形態において、固定化剤と腫瘍溶解性ウイルスで処理した血液試料とを混合した後に、非イオン性界面活性剤を混合する順序がより好ましい。
【００３１】
上記の非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン系界面活性剤、及びポリオキシ化合物の脂肪酸エステル系界面活性剤のいずれであってもよいが、ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤がより好ましい。ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤としては、高級アルコール・エチレンオキシド付加物、アルキルフェノール・エチレンオキシド付加物、高級脂肪酸・エチレンオキシド付加物、高級脂肪族アミン・エチレンオキシド付加物、高級脂肪酸アミド・エチレンオキシド付加物などが挙げられる。本実施形態における非イオン性界面活性剤としては、高級アルコール・エチレンオキシド付加物が好ましい。
【００３２】
高級アルコール・エチレンオキシド付加物の高級アルコールのアルキル基は、直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよく、炭素数が１２〜２０が好ましく、より好ましくは１５〜２０である。高級アルコール・エチレンオキシド付加物は、エチレンオキシドの重合数が１５〜４０のものが好ましく、より好ましくは２０〜３０である。本実施形態における非イオン性界面活性剤としては、高級アルコールのアルキル基が分岐鎖であり、炭素数が１８であり、エチレンオキシドの重合数が２５であるポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテルがより好ましい。
【００３３】
血液試料及び固定化剤と混合したときの非イオン性界面活性剤の濃度は、非イオン性界面活性剤の種類により適宜選択できるが、０．００５〜０．５重量％が好ましく、より好ましくは０．０４５〜０．０５５重量％である。
【００３４】
上記の固定化剤としては、組織の固定のために通常用いられるタンパク質を架橋させる物質を用いることができ、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドなどのアルデヒド化合物が好ましい。なかでも、パラホルムアルデヒドがより好ましい。
【００３５】
血液試料及び非イオン性界面活性剤と混合したときの固定化剤の濃度は、固定化剤の種類により適宜選択できるが、０．００５〜０．５重量％が好ましく、０．０４５〜０．０５５重量％がより好ましい。
【００３６】
また、上記の混合は、ｐＨ６〜９、浸透圧２００〜４００m0smで行うことが好ましい。
【００３７】
（２）取得工程
本実施形態は、調製工程で得られた測定用試料に含まれる細胞の蛍光情報及び細胞の大きさ情報を取得する工程（以下、「取得工程」ともいう）を含む。
【００３８】
本実施形態における「蛍光情報」とは、蛍光タンパク質の発する蛍光から得られる情報である。例えば、蛍光タンパク質が発する蛍光から検出した蛍光強度、蛍光強度のピーク値、蛍光強度の最小値、蛍光強度の平均値、蛍光強度の積分値などの蛍光強度から導かれる算出された数値などが挙げられる。本実施形態における蛍光情報としては、蛍光強度のピーク値、蛍光強度の積分値が好ましい。
【００３９】
細胞の蛍光情報は、公知の手法で取得できる。より具体的には、蛍光顕微鏡、フローサイトメータなどを用いて、細胞の蛍光情報を取得することができる。
【００４０】
例えば、蛍光顕微鏡を用いて、細胞の蛍光情報を取得する場合、まず上述の調製工程で得られた測定用試料をスライドグラスに塗抹して、塗抹標本を作製する。この際、細胞が重層しないようスライドを作成することが好ましい。
【００４１】
次に、上述で作製した塗抹標本に存在する、細胞における蛍光を、ＣＣＤカメラを備えた蛍光顕微鏡で観察する。ここで、蛍光顕微鏡が照射する励起光は、用いる蛍光タンパク質の種類により適宜選択することができる。例えば、蛍光タンパク質として、ＧＦＰを用いる場合、緑色光（Ｇ励起・５４６ｎｍ）を励起光として用いることができる。
【００４２】
次に、蛍光顕微鏡のＣＣＤカメラを用いて、上述の細胞における蛍光を撮像する。
【００４３】
次に、撮像により得られた画像を画像処理することで、上述の細胞の蛍光情報を取得する。ここで、蛍光情報を取得するための画像処理は、蛍光情報の種類に応じ、適宜行うことができる。より具体的には、蛍光情報は、撮像により得られた画像を、画像処理用のコンピュータプログラムがインストールされたコンピュータを用いて処理することにより取得できる。画像処理用のコンピュータプログラムは公知であり、このようなコンピュータプログラムが記憶された記憶媒体（画像処理ソフト）も一般に市販されている。画像処理ソフトとしては、例えば、ＩｍａｇｅＰｒｏ（登録商標）（ローパーインダストリーズ社製）、ＷｉｎＲＯＯＦ（登録商標）（三谷商事）、及びＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｃｉｃｅｓ）などが挙げられる。
【００４４】
例えば、ＩｍａｇｅＰｒｏを用いて、蛍光強度のピーク値を取得する場合、上述の画像において選択された範囲内の輝度値を持つピクセルのうち、最も大きい輝度を有するピクセルの輝度（最大輝度）を蛍光強度のピーク値として取得する。また、蛍光強度の積分値を取得する場合、上述の画像において選択された範囲内の輝度値を持つ各ピクセルの輝度を積算した値を蛍光強度の積分値として取得する。
【００４５】
また、細胞の蛍光情報をフローサイトメータで取得する場合、用い得るフローサイトメータは、蛍光の検出が可能なフローサイトメータである。
例えば、フローセル、光源、蛍光を検出する検出部（蛍光検出部）、蛍光検出部から出力されるデータを分析する分析部などを備える従来公知のフローサイトメータを用いることができる。
【００４６】
上記のフローサイトメータのフローセルを通過する測定用試料に、光源からの光を照射する。ここで、フローサイトメータの光源は、用いる蛍光タンパク質の励起に好適な波長を有するものであればよい。例えば、蛍光タンパク質としてGFPを用いる場合、２９５〜４９５ｎｍの光を励起光として用いることができる。具体的な光源としては、例えば、半導体レーザ、アルゴンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザなどが挙げられる。
【００４７】
上記の光源からの光を照射された測定用試料からの蛍光は、蛍光検出部によって検出される。蛍光検出部は、フローサイトメータにおいて一般的に用いられる、蛍光の検出が可能な受光素子を有し得る。蛍光検出部の具体例としては、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードなどが挙げられる。蛍光検出部によって検出する蛍光の波長は、用いる蛍光タンパク質の種類により適宜選択することができる。例えば、蛍光タンパク質として、GFPを用いる場合、４８０〜５８０ｎｍの蛍光を、蛍光検出部で検出すればよい。
【００４８】
蛍光検出部により検出された蛍光は、電気信号として分析部に出力される。分析部は、蛍光検出部から出力された電気信号を用いて分析を行い、蛍光情報を取得する。例えば、分析部は、蛍光検出部から電気信号が出力されたときの蛍光強度を求めることで、経時的な蛍光強度の波形の分析ができる。この分析部による、経時的な蛍光強度の波形の分析結果の一例を、図１に示す。図１において、縦軸は蛍光強度を示し、横軸は検出時間を示す。この場合、例えば蛍光強度の波形の最大の高さを、蛍光強度のピーク値として取得することができる。また、蛍光強度の波形の面積値を、蛍光強度の積分値として取得することもできる。
【００４９】
本実施形態における「細胞の大きさ情報」とは、細胞の大きさを反映する情報であれば、特に制限されない。細胞の大きさ情報は、例えば、細胞の直径、細胞の面積、細胞の体積、細胞の周囲長、真円度などが挙げられる。本実施形態おける細胞の大きさ情報としては、細胞の直径、細胞の面積、細胞の体積、細胞の周囲長が好ましい。
【００５０】
細胞の大きさ情報は、公知の手法で取得できる。より具体的には、蛍光顕微鏡、フローサイトメータなどを用いて、細胞の大きさ情報を取得することができる。
【００５１】
例えば、蛍光顕微鏡を用いて、細胞の大きさ情報を取得する場合、上述した蛍光情報を取得する場合と同様に、撮像により得られた画像を市販の画像処理ソフトで画像処理することにより、細胞の大きさ情報を取得することができる。
【００５２】
例えば、ＩｍａｇｅＰｒｏを用いて、細胞の直径を取得する場合、上述の画像において細胞の占める面積を測定して平均値を算出し、細胞が球状と仮定したときの直径に換算する。また、細胞の面積を取得する場合は、上述の画像において選択された範囲内の輝度値を持つピクセルからなる面積を測定する。また、細胞の体積を取得する場合は、上述の画像において細胞の3次元画像を構築し、体積を測定する。また、細胞の周囲長を取得する場合は、細胞の外周（アウトライン）の長さを測定する。
【００５３】
また、細胞の大きさ情報をフローサイトメータで取得する場合、用い得るフローサイトメータとしては、例えば、電気的又は光学的測定により細胞の大きさ情報を取得できる従来公知のフローサイトメータが挙げられる。より具体的には、電気抵抗により細胞の大きさ情報が取得できる電気抵抗式フローサイトメータ、又は散乱光により細胞の大きさ情報が取得できる光学式フローサイトメータなどが挙げられる。また、電気的及び光学的測定の両方を行うことができるフローサイトメータを用いることもできる。
【００５４】
細胞の大きさ情報を取得するための電気抵抗式フローサイトメータは、上記の測定用試料を導入するオリフィスと、オリフィスを介して電解液によって電気的に接続された一対の電極を備えた測定部と、分析部を備える。上記のフローサイトメータのオリフィスに測定用試料が通過する際に生じる電極間電気抵抗は、フローサイトメータの測定部により測定される。
【００５５】
測定部により測定された電極間電気抵抗は、電気信号としてフローサイトメータの分析部に出力される。分析部は、測定部から出力された電気信号に基づいて分析を行い、細胞の大きさ情報を取得する。例えば、分析部は、測定部から電気信号が出力されたときの電気抵抗を求めることで、経時的な電気抵抗の波形の分析ができる。この分析部による、経時的な電気抵抗の波形の分析結果の一例を、図２に示す。図２において、縦軸は電気抵抗を示し、横軸は検出時間を示す。一般に、電気抵抗の大きさは細胞の体積に強く相関することが知られている。この場合、例えば電気抵抗の波形の最大の高さを、細胞の体積として取得することができる。また、得られた細胞の体積から、細胞の直径、細胞の面積及び細胞の周囲長を取得することもできる。
【００５６】
また、細胞の大きさ情報を取得するための光学式フローサイトメータは、上述の蛍光検出に用いたフローサイトメータの蛍光検出部の代わり又は蛍光検出部に加えて、散乱光を検出する検出部（散乱光検出部）を備える。散乱光検出部は、フローサイトメータにおいて一般的に用いられる、散乱光の検出が可能な受光素子を有し得る。散乱光検出部の具体例としては、例えば、フォトダイオードやアバランシェフフォトダイオードなどが挙げられる。フローサイトメータのフローセルに測定用試料が通過する際に生じる散乱光は、この散乱光検出部により測定される。ここで、散乱光としては、前方散乱光が好ましい。
【００５７】
散乱光検出部により測定された散乱光は、電気信号としてフローサイトメータの分析部に出力される。分析部は、散乱光検出部から出力された電気信号に基づいて分析を行い、細胞の大きさ情報を取得する。例えば、分析部は、散乱光検出部から電気信号が出力されたときの前方散乱光の強度を求めることで、経時的な前方散乱光強度の波形の分析ができる。この分析部による、経時的な前方散乱光強度の波形の分析結果の一例を、図３に示す。図３において、縦軸は前方散乱光強度を示し、横軸は検出時間を示す。一般に、前方散乱光強度は細胞の表面積に強く相関し、前方散乱光強度の波形の幅は細胞の長さに強く相関することが知られている。この場合、例えば、前方散乱光強度の波形の最大の高さを細胞の表面積として取得することができる。また、前方散乱光強度の波形の最大の幅を細胞の直径として取得することができる。また、取得された細胞の表面積や細胞の直径から、細胞の体積、細胞の面積及び細胞の周囲長を取得することもできる。
【００５８】
（３）判定工程
本実施形態は、取得工程で取得された蛍光情報及び細胞の大きさ情報に基づいて、細胞が癌細胞か否かを判定する工程（以下、「判定工程」ともいう）を含む。
【００５９】
判定工程では、取得工程で得られた蛍光情報及び細胞の大きさ情報を用い、測定用試料中の癌細胞を、測定用試料中の他の細胞及びデブリス等から分別する。より具体的には、所定の蛍光情報及び所定の細胞の大きさ情報を有する測定用試料中の細胞を癌細胞と判定する。
【００６０】
例えば、細胞の蛍光情報に関する値が、所定の閾値より大きく、かつ細胞の大きさ情報に関する値が、所定の閾値より大きい場合、この細胞を癌細胞と判定することができる。ここで、閾値は、血液中の癌細胞の蛍光情報及び細胞の大きさ情報に関するデータや、血液中に含まれる癌細胞以外の細胞の蛍光情報と細胞の大きさ情報に関するデータの蓄積から、経験的に導き出すことができる。例えば、癌細胞のみを含む複数の測定試料から、上述の取得工程の手順に基づいて、蛍光情報に関する値及び細胞の大きさ情報に関する値を含む、複数のデータを取得する。さらに、癌細胞を含まない血液試料から調製された測定用試料から、同様に蛍光情報に関する値及び細胞の大きさ情報に関する値を含む、複数のデータを取得する。これら取得されたデータに基づき、血液試料から調製された測定用試料に含まれる細胞及びデブリス等から、癌細胞か否かを判定できる、蛍光情報に関する値及び細胞の大きさ情報に関する値それぞれの閾値を設定することができる。
【００６１】
また、例えば、蛍光情報及び細胞の大きさ情報に基づくスキャッタグラムにおいて、所定の領域に出現する細胞を癌細胞と判定することもできる。図４に、取得工程で得られる、蛍光情報及び細胞の大きさ情報に基づく、スキャッタグラムの模式図を示す。図４のスキャッタグラムは、Ｘ軸が蛍光情報、Ｙ軸が細胞情報である。上述のように、調製工程において、癌細胞で腫瘍溶解性ウイルスが増殖する。そのため、腫瘍溶解性ウイルスの増殖に伴い、腫瘍溶解性ウイルスにコードされた蛍光タンパク質が、癌細胞内に多く蓄積する。結果として、癌細胞からの蛍光情報に関する値は、大きい。また、癌細胞は、血液試料に含まれる細胞において、細胞の大きさが大きい。そのため、癌細胞からの細胞の大きさに関する値は、大きい。よって、癌細胞は図４のＡの領域に主に出現する。また、上述のように、白血球で腫瘍溶解性ウイルスが増殖する場合がある。そのため、白血球は、癌細胞と同様の蛍光情報に関する値を示す場合がある。しかし、発明者らの検討により、腫瘍溶解性ウイルスが増殖するような白血球からの細胞の大きさ情報に関する値は、癌細胞よりも小さいことがわかった。よって、白血球は図４のＢの領域に主に出現する。また、癌細胞及び白血球以外の細胞及びデブリス等では、腫瘍溶解性ウイルスが増殖しない。従って、癌細胞及び白血球以外の細胞及びデブリス等の蛍光情報に関する値は、極めて小さい。よって、癌細胞及び白血球以外の細胞及びデブリス等は、図４のＣの領域に主に出現する。すなわち、上述した取得工程で得られた蛍光情報及び細胞の大きさ情報が、図４のＡの領域に出現する細胞を癌細胞と判定ができる。
【００６２】
なお、上記の取得工程及び判定工程は、例えば、コンピュータにおいて実施することができ、その具体的なコンピュータの一例を、図５に示す。
コンピュータ１００は、本体１１０と表示部１２０と、入力部１３０とから主として構成されている。本体１１０は、ＣＰＵ１１０ａと、ＲＯＭ１１０ｂと、ＲＡＭ１１０ｃと、ハードディスク１１０ｄと、読出装置１１０ｅと、入出力インターフェイス１１０ｆ、及び画像出力インターフェイス１１０ｈは、お互いにバス１１０ｉによってデータ通信可能に接続されている。
【００６３】
ＣＰＵ１１０ａは、ＲＯＭ１１０ｂに記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ１１０ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。
ＲＯＭ１１０ｂは、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ等によって構成されており、ＣＰＵ１１０ａに実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。
ＲＡＭ１１０ｃは、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭ等によって構成されている。ＲＡＭ１１０ｃは、ＲＯＭ１１０Ｂ及びハードディスク１１０ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ１１０ａの作業領域として利用される。
【００６４】
ハードディスク１１０ｄは、オペレーティングシステム及びアプリケーションシステムプログラム等、ＣＰＵ１１０ａに実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。後述するアプリケーションプログラム１４０ａも、このハードディスク１１０ｄにインストールされている。
【００６５】
読出装置１１０ｅは、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によって構成されており、可搬型記憶媒体１４０に記録されたコンピュータプログラム又はデータを読み出すことができる。また、可搬型記憶媒体１４０には、コンピュータに取得工程及び判定工程に係るアプリケーションプログラム１４０ａが格納されており、ＣＰＵ１１０ａが可搬型記憶媒体１４０から当該アプリケーションプログラム１４０ａを読み出し、アプリケーションプログラム１４０ａをハードディスク１１０ｄにインストールすることも可能である。
【００６６】
また、ハードディスク１１０ｄには、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインターフェイス環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。以下の説明においては、上述した取得工程及び判定工程に係るアプリケーションプログラム１４０ａは、当該オペレーティングシステム上で動作するものとしている。
【００６７】
入出力インターフェイス１１０ｆは、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃ等のシリアルインターフェイス、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４等のパラレルインターフェイス、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器等からなるアナログインターフェイス等から構成されている。入出力インターフェイス１１０ｆには、キーボード及びマウスからなる入力デバイス１３０が接続されており、ユーザが当該入力デバイス１３０を使用することにより、コンピュータ本体１１０にデータを入力することが可能である。
【００６８】
また、入出力インターフェイス１１０ｆには、ＣＣＤカメラを搭載した蛍光顕微鏡２００が接続されている。これにより、コンピュータ本体１１０は、蛍光顕微鏡２００から、撮像された画像データを取得することが可能である。
【００６９】
画像出力インターフェイス１１０ｈは、ＬＣＤ又はＣＲＴ等で構成された表示部１２０に接続されており、ＣＰＵ１１０ａから与えられた画像データに応じた映像信号を表示部１２０に出力するようになっている。表示部１２０は、入力された映像信号にしたがって、画像データを出力する。また、表示部１２０は、後述するＣＰＵ１１０ａから与えられた判定結果を出力する。
【００７０】
図６は、ＣＰＵ１１０ａによって実行される癌細胞か否かを判定する処理を示すフローチャートの一例である。
まず、蛍光顕微鏡２００から測定用試料に含まれる細胞を撮像した画像データを、ＣＰＵ１１０ａが入出力インターフェイス１１０ｆを介して取得し、ハードディスク１１０ｄに記憶させる（ステップＳ１１）。
【００７１】
ＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄに格納された上記プリケーションプログラム１４０ａを読み出して、画像データに対して画像処理を行い、パラメータとして蛍光強度の積分値及び細胞の体積を算出する処理を実行する（ステップＳ１２）。
【００７２】
次に、ＣＰＵ１１０ａは、算出されたパラメータである蛍光強度の積分値及び細胞の体積に基づいて、細胞が癌細胞か否かを判定する（ステップＳ１３）。
ハードディスク１１０ｄには、蛍光強度の積分値及び細胞の体積について、図７の領域Ａに示される癌細胞が出現するパラメータ領域の座標が記憶されている。
【００７３】
ＣＰＵ１１０ａは、算出されたパラメータである蛍光強度の積分値及び細胞の体積と当該パラメータ領域から、細胞が癌細胞か否かを判定する。具体的には、細胞に関してそれぞれのパラメータが当該パラメータ領域に入る場合は、該細胞が癌細胞であると判定する。また外れる場合は、該細胞が癌細胞でないと判定する。
そして、ＣＰＵ１１０ａは、判定結果として図７に示されるスキャッタグラムを、ＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに画像出力インターフェイス１１０ｆを介して表示部１２０に出力する（ステップＳ１４）。
【００７４】
なお、本実施形態においては、上述した判定結果として、スキャッタグラムを用いる例を示したが、判定結果はこれに限定されるものではない。判定結果としては、例えば、癌細胞と判定された細胞のカウント数、癌細胞と判定された細胞の画像データ、測定用試料中の癌細胞の有無を示す値（陽性又は陰性）などが挙げられる。また、表示部に出力される判定結果は一つに限定されるものではない。上記の判定結果より選択される少なくとも一つを表示部に出力することができる。
【００７５】
なお、本実施形態においては、コンピュータにより実施する取得工程において、蛍光強度の積分値及び細胞の体積を算出する例を示したが、蛍光情報及び細胞の大きさ情報のパラメータとしては、これに限定されるものではない。例えば、蛍光情報のパラメータとしては、蛍光強度のピーク値、蛍光強度の最小値及び蛍光強度の平均値が挙げられる。また、細胞の大きさ情報のパラメータとしては細胞の面積、細胞の周囲長、細胞の直径及び細胞の真円度が挙げられる。
【００７６】
また、本実施形態においては、コンピュータにより実施する判定工程において、癌細胞が出現するパラメータ領域として、蛍光強度の積分値と細胞の面積とのパラメータ領域を用いる例を示したが、パラメータ領域はこれに限定されるものではない。パラメータ領域としては、例えば、図８の領域Ａに示される蛍光強度のピーク値及び細胞の体積に対するパラメータ領域、図９の領域Ａに示される蛍光強度の積分値及び細胞の面積に対するパラメータ領域、図１０の領域Ａに示される蛍光強度の積分値及び細胞の直径に対するパラメータ領域、又は図１１の領域Ａに示される蛍光強度の積分値及び細胞の周囲長に対するパラメータ領域などが挙げられる。また、パラメータ領域に用いるパラメータの数は二つに限定されるものではない。上記の蛍光情報のパラメータより選択される少なくとも一つと、上記の細胞の大きさ情報のパラメータより選択される少なくとも一つを、パラメータとして用いることができる。例えば、パラメータ領域に用いるパラメータとして、蛍光強度のピーク値、蛍光強度の積分値及び細胞の面積からなる３つのパラメータを用いることもできる。
【００７７】
また、本実施形態においては、コンピュータ１００と蛍光顕微鏡２００が別体に備えられる例を示したが、これらの態様はこれに限定されるものではなく、例えば一体型でもよい。
【００７８】
また、本実施形態においては、入出力インターフェイス１１０ｆを介して、ＣＣＤカメラを搭載した蛍光顕微鏡２００が、コンピュータ１００に接続される例を示したが、これらの態様はこれに限定されるものではない。例えば、蛍光顕微鏡２００の代わりに、フローサイトメータ３００が接続されていてもよい。この場合、コンピュータ本体１１０は、フローサイトメータ３００から、蛍光に関するデータと、電気抵抗及び／又は散乱光に関するデータとを取得する。ＣＰＵ１１０ａは、取得された蛍光に関するデータから、蛍光情報のパラメータを算出する。また、電気抵抗及び／又は散乱光に関するデータから、細胞の大きさ情報のパラメータを算出する。
【００７９】
また、コンピュータ１００とフローサイトメータ３００は別体型でも、一体型でもよい。
【実施例１】
【００８０】
＜蛍光情報と細胞の体積による癌細胞か否かの判定＞
細胞画像から得られた蛍光情報と細胞の大きさ情報により、細胞が癌細胞か否かを判定できることを調べるため、Ｙ軸は細胞の大きさ情報として体積を共通のパラメータとしてプロットし、Ｘ軸は蛍光情報としてピーク値又は積分値をプロットした二次元スキャッタグラムを作製した。【００８１】
本実施例で使用する測定用試料は、以下の通りに調製した。
＜単核球試料の調製＞
白血球（WBC）の一つである単核球を以下の通り調製した。
１．12〜15mLの遠心チューブに、単核球を分離するための試薬であるPolymorphprep(商標)(第一化学薬品)5.0mLを入れ、真空採血管(ベノジェクトII真空採血管、3.8％クエン酸ナトリウム 4.5ML含有、テルモ社製)を用いて４人の健常人から採取された、採取後２時間以内の血液5.0ｍLを重層した。
２．スウィングローターを用いて、室温で500×g、30分間遠心分離した。
３．パスツールピペットを用いて単核球浮遊液を採取した。
４．単核球浮遊液に同量のリン酸緩衝液(PBS)(-)を加え、混和した。
５．室温で400×g、10分間遠心分離した。
６．上清を除去し、単核球をPBS(-)に懸濁し、５．と同様に遠心分離して上清を除去し、単核球試料を調製した。【００８２】
＜癌細胞試料の調製＞
乳癌細胞の一つであるMB468を、１２５cm2のフラスコにおいて９０%コンフルエントとなるように、培養液(１０％FBS(Hyclone社製)を含むDMEM-F12(Sigma社製))中で培養した。得られた培養細胞を、DMEM-F12 1000μl中に約3×105個となるように懸濁して、MB468細胞試料を調製した。【００８３】
次に、上記の単核球試料及び癌細胞試料について、それぞれ以下に示す工程を行った。【００８４】
＜ウイルス増殖＞
得られた試料に、RPMI-1640を加え、10mlにメスアップした。腫瘍溶解性ウイルス(テロメスキャン(商標登録)(OBP-401))を、最終濃度6×106PFU/mlとなるように加え、37℃にてローテーションしながら24時間培養した。培養液を、1500rpmで5分間、弱ブレーキで遠心分離し、上清を除去して、腫瘍溶解性ウイルスを増殖させた細胞を得た。【００８５】
＜固定化剤及び非イオン性界面活性剤での処理＞
得られたウイルスが増殖した沈殿細胞に、該細胞と同体積の４％パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、室温にて20分間静置した。
次いで、沈殿細胞及びPFAの合計体積の２倍の体積の非イオン性界面活性剤(エマルゲン2025G、花王社製)のPBS(-)溶液(0.05重量％)を加えて懸濁し、攪拌しながら40℃にて5分間インキュベートした。
エマルゲン2025Gは、以下の構造式を有する。【００８６】
【化１】
2011099565.tif 000003
（式中、ｎは２５である。）【００８７】
＜スライド作製及び顕微鏡観察＞
1500rpmで５分間、弱ブレーキで遠心分離し、上清を除去し、沈殿物を1ml  PBSに懸濁した。1500rpmで５分間、上清を除去し、サイトスピンを用いて(1000rpm、４分)、スライドを作製した。マウンティングメディウム(Fluorescent Mounting Medium, Dako, S3032)を載せ、カバーガラスを載せて、倒立型リサーチ顕微鏡(Power IX71、オリンパス社製)を用いて、露光時間20ms、50ms、100ms、200ms及び400msの条件下で、蛍光強度を測定した。
なお、上記と同様の条件下で、蛍光強度が既知の異なる蛍光強度を有する7種のビーズ(7 Peaks Beads (Cyto-Cal Multifluor Fluorescence Intensity Calibrator, Thermo Scientific, FC3M))を撮像して、それぞれの露光時間における検量線を作成した。得られた検量線に基づいて、上記の処理試料からの蛍光強度を数値化した。【００８８】
＜蛍光情報及び細胞の大きさ情報の取得＞
露光時間20ms、50ms、100ms、200ms及び400msの条件下で蛍光強度が既知の異なる蛍光強度を有する7種のビーズ(7 Peaks Beads (Cyto-Cal Multifluor Fluorescence Intensity Calibrator, Thermo Scientific, FC3M))を撮像して、それぞれの露光時間における検量線を作成した。次にImage-Pro Plus Ver6.1（Media Cybernetics, Inc.）を用いて、得られた検量線に基づいて、処理試料からの最大蛍光強度（細胞のピーク値(MEFL)）、蛍光強度の積分値(MEFL)、蛍光分布面積（細胞の面積(pixel2)）、蛍光分布周囲長(細胞の周囲長(pixel))を数値化した。細胞の体積(pixel3)は細胞が真球であると仮定し、蛍光分布面積を用いて算出した。細胞の直径(pixel)も同様に蛍光分布面積を用いて算出した。【００８９】
＜スキャッタグラム、及び三次元頻度分布図の作成＞
次に、Image-Pro Plus Ver6.1（Media Cybernetics, Inc.）を用いて算出したパラメータである蛍光強度のピーク値、蛍光強度の積分値、細胞の面積、細胞の周囲長、細胞の体積、細胞の直径をプロットした二次元スキャッタグラムを作成した。本実施例では、蛍光強度の積分値−細胞の体積、蛍光強度のピーク値−細胞の体積、蛍光強度の積分値−細胞の面積、蛍光強度の積分値−細胞の直径、及び蛍光強度の積分値−細胞の周囲長をプロットしたスキャッタグラムを作成した。また、グラフ作成フリーソフト（GNUPLOT）を用いて、上述したパラメータをプロットした三次元頻度分布図を作成した。本実施例では、細胞の面積−蛍光強度のピーク値−蛍光強度の積分値をプロットした三次元頻度分布図を作成した。【００９０】
上記の工程により得られた結果を、スキャッタグラムを図７〜図１２に示す。【００９１】
図７及び８の結果から、蛍光情報のパラメータの一つ(積分値及びピーク値)と細胞の大きさ情報の一つとしての体積を用いることにより、白血球と癌細胞を分別し、細胞が癌細胞か否かを判定できることがわかる。さらに図９〜１１の結果から、蛍光情報と細胞の大きさ情報のパラメータの一つ（直径、面積及び周囲長）を用いることにより、白血球と癌細胞を分別し、細胞が癌細胞か否かを判定できることがわかる。この結果から、蛍光情報及び細胞の大きさ情報により、細胞が癌細胞か否かを判定できることが示された。また、図１２の結果から、蛍光情報及び細胞の大きさ情報から複数のパラメータを選択しても、白血球と癌細胞を分別し、細胞が癌細胞か否かを判定できることがわかる。【００９２】
本出願は、２０１０年２月１０日に出願された日本国特許出願  特願２０１０−２７９２８号に関し、この特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【図１】
2011099565.tif 000004
【図２】
2011099565.tif 000005
【図３】
2011099565.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
2011099565.tif 000009
【図７】
2011099565.tif 000010
【図８】
2011099565.tif 000011
【図９】
2011099565.tif 000012
【図１０】
2011099565.tif 000013
【図１１】
2011099565.tif 000014
【図１２】
2011099565.tif 000015
【配列表】
2011099565000001.app
【国際調査報告】
2011099565.tif 000016
2011099565.tif 000017
2011099565.tif 000018
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