(57)【要約】  本発明は、二本鎖核酸であって、少なくとも一方の核酸が、自己相補的な塩基対を形成する人工塩基、またはいずれの天然型塩基とも同程度の熱安定性で塩基対を形成する人工塩基、を有する、前記二本鎖核酸を提供する。本発明はまた、自己相補的な塩基対を形成する人工塩基、またはいずれの天然型塩基とも同程度の熱安定性で塩基対を形成する人工塩基を有する第一の核酸を第二の核酸とハイブリダイズさせる方法、および、該核酸をＳＮＰ検出、ＤＮＡチップ、ＤＮＡ／ＲＮＡコンピューティング、インビトロ翻訳系への適用、に利用する方法を提供する。本発明はまた、人工塩基を核酸に導入することにより、当該核酸のハイブリダイゼーションについての熱力学的安定性を操作する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸であって、第一の核酸と第二の核酸を含み、
ここで該第一の核酸は式Ｉ：
【化１】
2011043385.tif 000040
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチド（単数または複数）を含み、そして該第二の核酸は式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチド（単数または複数）を含んでいても含んでいなくてもよく、
ここで、第一の核酸中の式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、第二の核酸中のいずれかの天然塩基または式Ｉの人工塩基もしくはその誘導体と塩基対を形成している、
前記二本鎖核酸。
【請求項２】
式Ｉで表される人工塩基において、
Ａ１がＮであり；
Ａ２がＣＨであり；
Ｒ１が水素であり；そして、
Ｒ２が２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される；
請求項１に記載の二本鎖核酸。
【請求項３】
式Ｉで表される人工塩基又はその誘導体が、
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）；もしくは
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）；
またはそれらの誘導体である、請求項１に記載の二本鎖核酸。
【請求項４】
式Ｉで表される人工塩基の誘導体が、式Ｉ中のＲ２で示される置換基がさらなる置換基の付加により修飾された誘導体である、請求項１に記載の二本鎖核酸。
【請求項５】
第一の核酸が、式Ｉで表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを複数含む、但し該人工塩基又はその誘導体を塩基として有する複数のヌクレオチドは第一の核酸のヌクレオチド鎖中で互いに隣接していない、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の二本鎖核酸。
【請求項６】
第一の核酸において、式Ｉで表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドの５’側に隣接するヌクレオチドがシトシン（Ｃ）もしくはチミン（Ｔ）であり、及び／又は該ヌクレオチドの３’に隣接するヌクレオチドがグアニン（Ｇ）である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の二本鎖核酸。
【請求項７】
人工塩基を含む核酸をハイブリダイズさせる方法であって、
式Ｉ：
【化２】
2011043385.tif 000041
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む第一の核酸を、式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含むまたは含まない第二の核酸とハイブリダイズさせることを含む、
ここで、第一の核酸中の式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、第二の核酸中のいずれかの天然塩基または式Ｉの人工塩基もしくはその誘導体と塩基対を形成する、前記方法。
【請求項８】
第一の核酸が、ハイブリダイゼーション用プローブ、タグ又はプライマーである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第一の核酸および第二の核酸が、ＤＮＡコンピュータ用計算素子である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
第一の核酸および第二の核酸が、ＤＮＡ或いはＲＮＡ折り紙用集積素子である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ハイブリダイズがマルチプレックスで行われる、請求項７ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
一塩基変異を同定する方法であって、以下の工程
（ａ）ターゲット核酸中の同定したい一塩基変異部位を含む配列に相補的なプローブを調製する、ここで該プローブは、式Ｉ：
【化３】
2011043385.tif 000042
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを、該同定したい一塩基変異部位に相補的なヌクレオチドに隣接して有する；
（ｂ）ターゲット核酸と、（ａ）のプローブをハイブリダイズさせる；および、
（ｃ）プローブとのハイブリダイズが確認されたターゲット核酸は、同定したい一塩基変異部位においてプローブと相補的な塩基を有することを同定する；
を含む、前記方法。
【請求項１３】
一塩基変異を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）ターゲット核酸中の同定したい一塩基変異部位を含む配列に相補的なプライマーを調製する、ここで該プライマーは、式Ｉ：
【化４】
2011043385.tif 000043
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを、該同定したい一塩基変異部位に相補的なヌクレオチドに隣接して有する；
（ｂ）ターゲット核酸をテンプレートとし、（ａ）のプライマー、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチド基質および天然型ヌクレオチド基質、ならびにＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを行う；および、
（ｃ）ＰＣＲ反応による増幅が確認されたターゲット核酸は、同定したい一塩基変異部位においてプライマーと相補的な塩基を有することを同定する；
を含む、前記方法。
【請求項１４】
人工塩基を含むプローブを用いて核酸を捕捉する方法であって、以下の工程：
（ａ）式Ｉ：
【化５】
2011043385.tif 000044
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含むプローブを調製し、固相に固定する；
（ｂ）（ａ）のプローブに相補的な配列で構成されるタグを捕捉する核酸に付加する、ここで該タグは、プローブ中の式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドに相補的な部位に、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを有する；および、
（ｃ）固相に固定された（ａ）のプローブと、（ｂ）のタグを付加した核酸をハイブリダイズさせることにより、核酸を捕捉する；
を含む、前記方法。
【請求項１５】
固相が、ＤＮＡチップ基板、またはビーズである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡまたはＲＮＡコンピューティングを行う方法であって、以下の工程：
（ａ）式Ｉ：
【化６】
2011043385.tif 000045
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む複数の核酸を計算素子として調製し、ここで一の計算素子の一部は、別の計算素子の一部と相補的であり、そして当該式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドは、計算素子の相補的な部分の間で互いに塩基対を形成するように配置される；および、
（ｂ）一の計算素子の一部と、別の計算素子の一部をハイブリダイズさせる；
を含む、前記方法。
【請求項１７】
一態様において、本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡ折り紙を形成する方法であって、以下の工程：
（ａ）式Ｉ：
【化７】
2011043385.tif 000046
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む複数の核酸を集積素子として調製し、ここで一の集積素子の一部は、別の集積素子の一部と相補的であり、そして当該式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドは、集積素子の相補的な部分の間で互いに塩基対を形成するように配置される；および、
（ｂ）一の集積素子の一部と、別の集積素子の一部をハイブリダイズさせる；
を含む、前記方法
【請求項１８】
インビトロ翻訳系によりペプチドを合成する方法であって、以下の工程：
（ａ）式Ｉ：
【化８】
2011043385.tif 000047
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドをアンチコドン部位に含むトランスファーＲＮＡを調製する；
（ｂ）式Ｉで表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドをコーディング配列に含むメッセンジャーＲＮＡを調製する、ここで該メッセンジャーＲＮＡにおける式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドは、該人工塩基を含むトランスファーＲＮＡのアンチコドン部位に対応するコドンとして、コドン及びアンチコドンのハイブリダイゼーションにおいて式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドが互いに塩基対を形成するように配置される；
（ｃ）（ａ）のトランスファーＲＮＡ、（ｂ）のメッセンジャーＲＮＡ、およびリボソームを用いて、試験管内翻訳によりペプチドを合成する；
を含む、前記方法。
【請求項１９】
核酸のハイブリダイゼーションについての熱力学的安定性を操作する方法であって、核酸中のヌクレオチドを、式Ｉ：
【化９】
2011043385.tif 000048
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドに置換することを含む、前記方法。
【請求項２０】
核酸が、プローブ、プライマー、または分子内ハイブリダイゼーションする一本鎖核酸である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖核酸であって、少なくとも一方の核酸が自己相補的な塩基対を形成する人工塩基、またはいずれの天然型塩基とも同程度の熱安定性で塩基対を形成する人工塩基を有する、前記二本鎖核酸に関する。本発明はまた、自己相補的な塩基対を形成する人工塩基、またはいずれの天然型塩基とも同程度の熱安定性で塩基対を形成する人工塩基を有する第一の核酸を第二の核酸とハイブリダイズさせる方法に関する。本発明はさらに、自己相補的な塩基対を形成する人工塩基、またはいずれの天然型塩基とも同程度の熱安定性で塩基対を形成する人工塩基を有する核酸をＳＮＰ検出、ＤＮＡチップ、ＤＮＡ／ＲＮＡコンピューティング、インビトロ翻訳系への適用、に利用する方法に関する。本発明はまた、自己相補的な塩基対を形成する人工塩基、またはいずれの天然型塩基とも同程度の熱安定性で塩基対を形成する人工塩基を核酸に導入することにより、当該核酸のハイブリダイゼーションについての熱力学的安定性を操作する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡはＡ−ＴとＧ−Ｃの塩基対を介して二本鎖構造を形成する。この塩基対の相補性によるＤＮＡのハイブリダイゼーションによる二本鎖形成は、ＤＮＡの検出を目的としたＤＮＡタグ、サザンハイブリダイゼーションなどのＤＮＡプローブ、ＤＮＡアレイ、ＤＮＡのｚｉｐコード、ＴａｑＭａｎなどのリアルタイムＰＣＲ技術、モレキュラービーコン、あるいは、特定の配列のＤＮＡの単離のためのＤＮＡアフィニティーカラム、さらにはＤＮＡコンピュータなどの広範な分野に応用されている。Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔの４種類の塩基からなる配列の組み合わせは、１０塩基の鎖長のＤＮＡでもおよそ１０６種類（＝４１０）の膨大な数になる。しかし、１０塩基のＤＮＡ中の一箇所にＡ−ＴやＧ−Ｃ以外の間違った塩基対（Ｇ−Ｔなど、ミスマッチ塩基対）が入っていても、条件によっては二本鎖を形成してしまう（ミスハイブリダイゼーション）ことがあり、正確なＤＮＡの検出が行えない場合がある。特にＧ−Ｃ塩基対はＡ−Ｔ塩基対よりも熱的に安定であるため、同じ長さのＤＮＡでもＧ−Ｃ塩基対の含量の違いによりそれらの二本鎖ＤＮＡの安定性が異なる。Ｇ−Ｃ含量が高い二本鎖ＤＮＡでは、そのうちの一箇所にミスマッチ塩基対が入っていても、Ｇ−Ｃ含量の低い二本鎖ＤＮＡよりも安定になってしまうことも多々ある。ハイブリダイゼーションを利用した応用技術は全て同一温度の同一条件で行うため、複数のＤＮＡタグやプローブを用いるには、それぞれの二本鎖ＤＮＡの熱安定性が等しいことが重要である。したがって、Ａ−ＴとＧ−Ｃの塩基対にさらに人工的に作り出した新たな塩基対を加えて塩基配列のバリエーションを増やすと共に、新たな塩基対を加えることで同じ長さの異なる二本鎖ＤＮＡのそれぞれがＧ−Ｃ含量に依存せずに同じ熱安定性を示すようになれば、複数のＤＮＡのタグやプローブを用いる手法でミスハイブリダイゼーションを減らすことができ、それぞれの応用技術の精度を高めることができる。さらに標的ＤＮＡとの１塩基変異レベルでのマッチ・ミスマッチを選択的に識別できるプローブが作成できれば、ＳＮＰ解析などの手法の精度を上げることができる。【０００３】
人工的に新たな塩基対を作り出しＤＮＡの遺伝情報を拡張する技術は、汎用性の高い２つの応用が考えられ、人工塩基対の開発研究が盛んに行われている。応用の１つは、複製・転写・翻訳で機能する人工塩基対を作り出し、新たな構成成分を組み込んだＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質を作り出すことである。もう１つの応用は、人工塩基対をＤＮＡやＲＮＡに組み込んだ二本鎖核酸を形成させることで、核酸断片のプローブの配列種を増やすことによりリアルタイムＰＣＲによるマルチプレックスやＤＮＡコンピュータへの応用、さらに翻訳でタンパク質中に人工のアミノ酸を導入する際の新たなコドンとアンチコドンに用いることができる。【０００４】
Ｓ．Ａ．Ｂｅｎｎｅｒらは、天然型塩基対の水素結合様式の組み合わせを変えることによりｉｓｏＧ−ｉｓｏＣ塩基対などを作り出し、これらの人工塩基対が二本鎖ＤＮＡ中で選択的に塩基対を形成することを見出している（特許文献１−３、非特許文献１および２）。そして、Ｊ．Ｒ．Ｐｒｕｄｅｎｔらは、ｉｓｏＧ−ｉｓｏＣ塩基対を用いて、新たなＤＮＡプローブを作成しマルチプレックスＰＣＲ法を考案している（特許文献４、非特許文献３−６）。しかし、これらの塩基対は水素結合性の置換基を有するため、ＤＮＡ合成の際にはそれらの塩基の置換基に保護基を導入したＤＮＡ合成用のアミダイト試薬を調製する必要がある。本発明者らは、ＤＮＡの遺伝情報を拡張するために第三の塩基対（人工塩基対）の開発を進めてきた。そしてこれまでにｓ−ｙ塩基対（ｓ：２−アミノ−６−チエニルプリン、ｙ：ピリジン−２−オン）、ｖ−ｙ塩基対（ｖ：２−アミノ−６−チエニルプリン）、ｓ−Ｐａ塩基対（Ｐａ：ピロロ−２−カルバルデヒド）、Ｄｓ−Ｐａ塩基対（Ｄｓ：７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン）、Ｄｓ−Ｐｎ塩基対（Ｐｎ：２−ニトロピロール）など複製や転写で機能する数種類の人工塩基対の開発に成功している（特許文献５、非特許文献９および１０）。しかしながら、これらの人工塩基は、塩基対として利用するために２種類の塩基のアミダイト試薬を準備しなければならない。【０００５】
これらの問題点を克服するためには、水素結合性の置換基を持たない塩基が自己相補的に塩基対を形成すれば、１種類のアミダイト試薬を調製するだけで良いので、その利用が著しく容易になる。このような自己相補的な塩基対は、Ｆ．Ｅ．Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇらによって作り出されている（非特許文献７−８）。彼らの自己相補的な塩基対（７‐プロピニルイソカルボスチリル）はＧ−Ｃ塩基対よりも安定であり、天然型塩基との塩基対は７−１１℃不安定になる。しかし、この人工塩基は自己相補的に複製でＤＮＡ中に取り込ませられるが、自己相補塩基対を形成したところで複製が止まってしまう。【０００６】
また、今までに開発された人工塩基対では、二本鎖ＤＮＡ中での人工塩基対と隣接する天然型塩基対の組み合わせによるＤＮＡの熱安定性を網羅的に調べた報告例は無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，４３２，２７２号
【特許文献２】米国特許第６，１４０，４９６号
【特許文献３】米国特許第６，６１７，１０６号
【特許文献４】米国特許第６，９７７，１６１号
【特許文献５】国際公開第ＷＯ０７／６６７３７号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】S. A. Benner, Acc. Chem. Res., 37, 784-797 (2004).
【非特許文献２】P. Sheng, et al., Chem. Commun, 5128-5130 (2008).
【非特許文献３】F. S. Nolte, et al., J. Clin. Microbiol., 45, 2779-2786 (2007).
【非特許文献４】E. S. Svarovskaia, et al., J. Clin. Microbiol. 44, 4237-4241 (2006).
【非特許文献５】J. R. Prudent, Expert. Rev. Mol. Diagn., 6, 245-252 (2006).
【非特許文献６】S. C. Johnson, et al., Clin. Chem., 50, 2019-2027 (2004).
【非特許文献７】M. Berger, et al., Nucleic Acids Res., 28, 2911-2914 (2000).
【非特許文献８】D. L. McMinn, et al., J. Am. Chem. Soc., 121, 11585-11586 (1999).
【非特許文献９】M. Kimoto, et al, Nucleic Acids Res., 37, e14 (2009).
【非特許文献１０】I. Hirao, et al., Nature Methods, 3, 729-735 (2006).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、二本鎖核酸であって、少なくとも一方の核酸が自己相補的な塩基対を形成する人工塩基、またはいずれの天然型塩基とも同程度の熱安定性で塩基対を形成する人工塩基を有する、前記二本鎖核酸を提供することを目的とする。本発明はまた、自己相補的な塩基対を形成する人工塩基、またはいずれの天然型塩基とも同程度の熱安定性で塩基対を形成する人工塩基を有する第一の核酸を第二の核酸とハイブリダイズさせる方法；自己相補的な塩基対を形成する人工塩基、またはいずれの天然型塩基とも同程度の熱安定性で塩基対を形成する人工塩基を有する核酸をＳＮＰ検出、ＤＮＡチップ、ＤＮＡ／ＲＮＡコンピューティング、インビトロ翻訳系への適用、に利用する方法；そして、自己相補的な塩基対を形成する人工塩基、またはいずれの天然型塩基とも同程度の熱安定性で塩基対を形成する人工塩基を核酸に導入することにより、当該核酸のハイブリダイゼーションについての熱力学的安定性を操作する方法；を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記問題解決のために鋭意研究に努めた結果、人工塩基Ｄｓ（７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン）が自己相補的に二本鎖ＤＮＡ中で安定な塩基対（Ｄｓ−Ｄｓ）を形成することを見出した（図１）。そして二本鎖ＤＮＡ中でのＤｓ−Ｄｓ塩基対の安定性は、その両側の天然型の塩基対の種類に依存することがわかった。その隣接塩基対の依存性には規則性があり、さらに、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対を含む二本鎖ＤＮＡの安定性は、Ｇ−Ｃ塩基対を多く含む二本鎖ＤＮＡの安定性が高いという既成概念とは異なることを見出した。またＤｓが天然型塩基と塩基対を形成する場合には、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対よりも安定性は低下するが、どの天然型塩基とも同程度の安定性で塩基対を形成するユニバーサル塩基としての性質を有することもわかった。また、Ｄｓのチオフェン部分にさらにチオフェンを結合した人工塩基Ｄｓｓ（７−（２，２’−ビチオフェン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン）も同様の性質を示すことがわかった。このＤｓと天然型塩基との塩基対は、二本鎖ＤＮＡ中においてそれと隣接する部位に天然型塩基同士のミスマッチ塩基対が存在すると、その二本鎖ＤＮＡの熱安定性を極端に低下させられることがわかった。【００１１】
この自己相補的なＤｓ−Ｄｓ塩基対は、第三の塩基対としてハイブリダイゼーション用の新たなＤＮＡタグの作成、モレキュラービーコンなどのイメージング技術への利用、Ｄｓ−ＰａやＤｓ−Ｐｎ塩基対と組み合わせた複製・転写での利用、ＤＮＡやＲＮＡコンピュータへの利用、非天然型アミノ酸をタンパク質に取り込ませるための新たなコドンとアンチコドンとしての利用など多方面への利用が可能である。さらに、Ｄｓと天然型塩基との塩基対は、ターゲット遺伝子の一塩基変異を選択的に識別できるＤＮＡプローブに利用することができることを見出した。【００１２】
また、簡易の最近接塩基法（Nearest neighbor法）により、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対を含む二本鎖ＤＮＡの熱安定性の指標となるＴｍ値（Melting temperature）を予測する方法も考案した。これにより、ミスハイブリダイゼーションを減らしたＤＮＡタグやプローブの作成が可能になった。さらに、二本鎖ＤＮＡ中のＤｓと天然型塩基による塩基対（例えばＤｓ−Ｇ塩基対）が、隣接するミスマッチ塩基対の安定性を低下させることも見出した。【００１３】
以上、本発明の理解のために本発明を想到するに至る経緯を説明したが、本発明の範囲は上記説明に限定されず、請求の範囲の記載によって定められる。【００１４】
一例として、本発明は以下の態様１−２０を提供する。【００１５】
態様１：  二本鎖核酸であって、第一の核酸と第二の核酸を含み、
ここで該第一の核酸は式Ｉ：【００１６】
【化１】
2011043385.tif 000002
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチド（単数または複数）を含み、そして該第二の核酸は式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチド（単数または複数）を含んでいても含んでいなくてもよく、
ここで、第一の核酸中の式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、第二の核酸中のいずれかの天然塩基または式Ｉの人工塩基もしくはその誘導体と塩基対を形成している、
前記二本鎖核酸。【００１７】
態様２：  式Ｉで表される人工塩基において、
Ａ１がＮであり；
Ａ２がＣＨであり；
Ｒ１が水素であり；そして、
Ｒ２が２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される；
態様１に記載の二本鎖核酸。【００１８】
態様３：  式Ｉで表される人工塩基又はその誘導体が、
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）；もしくは
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）；
またはそれらの誘導体である、態様１に記載の二本鎖核酸。【００１９】
態様４：  式Ｉで表される人工塩基の誘導体が、式Ｉ中のＲ２で示される置換基がさらなる置換基の付加により修飾された誘導体である、態様１に記載の二本鎖核酸。【００２０】
態様５：  第一の核酸が、式Ｉで表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを複数含む、但し該人工塩基又はその誘導体を塩基として有する複数のヌクレオチドは第一の核酸のヌクレオチド鎖中で互いに隣接していない、態様１ないし４のいずれか１項に記載の二本鎖核酸。【００２１】
態様６：  第一の核酸において、式Ｉで表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドの５’側に隣接するヌクレオチドがシトシン（Ｃ）もしくはチミン（Ｔ）であり、及び／又は該ヌクレオチドの３’に隣接するヌクレオチドがグアニン（Ｇ）である、態様１ないし５のいずれか１項に記載の二本鎖核酸。【００２２】
態様７：  人工塩基を含む核酸をハイブリダイズさせる方法であって、
式Ｉ：【００２３】
【化２】
2011043385.tif 000003
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む第一の核酸を、式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含むまたは含まない第二の核酸とハイブリダイズさせることを含む、
ここで、第一の核酸中の式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、第二の核酸中のいずれかの天然塩基または式Ｉの人工塩基もしくはその誘導体と塩基対を形成する、前記方法。【００２４】
態様８：  第一の核酸が、ハイブリダイゼーション用プローブ、タグ又はプライマーである、態様７に記載の方法。【００２５】
態様９：  第一の核酸および第二の核酸が、ＤＮＡコンピュータ用計算素子である、態様７に記載の方法。【００２６】
態様１０：  第一の核酸および第二の核酸が、ＤＮＡ或いはＲＮＡ折り紙用集積素子である、態様７に記載の方法。【００２７】
態様１１：  ハイブリダイズがマルチプレックスで行われる、態様７ないし１０のいずれか１項に記載の方法。【００２８】
態様１２：  一塩基変異を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）ターゲット核酸中の同定したい一塩基変異部位を含む配列に相補的なプローブを調製する、ここで該プローブは、式Ｉ：【００２９】
【化３】
2011043385.tif 000004
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを、該同定したい一塩基変異部位に相補的なヌクレオチドに隣接して有する；
（ｂ）ターゲット核酸と、（ａ）のプローブをハイブリダイズさせる；および、
（ｃ）プローブとのハイブリダイズが確認されたターゲット核酸は、同定したい一塩基変異部位においてプローブと相補的な塩基を有することを同定する；
を含む、前記方法。【００３０】
態様１３：  一塩基変異を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）ターゲット核酸中の同定したい一塩基変異部位を含む配列に相補的なプライマーを調製する、ここで該プライマーは、式Ｉ：【００３１】
【化４】
2011043385.tif 000005
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを、該同定したい一塩基変異部位に相補的なヌクレオチドに隣接して有する；
（ｂ）ターゲット核酸をテンプレートとし、（ａ）のプライマー、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチド基質および天然型ヌクレオチド基質、ならびにＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを行う；および、
（ｃ）ＰＣＲ反応による増幅が確認されたターゲット核酸は、同定したい一塩基変異部位においてプライマーと相補的な塩基を有することを同定する；
を含む、前記方法。【００３２】
態様１４：  人工塩基を含むプローブを用いて核酸を捕捉する方法であって、以下の工程：
（ａ）式Ｉ：【００３３】
【化５】
2011043385.tif 000006
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含むプローブを調製し、固相に固定する；
（ｂ）（ａ）のプローブに相補的な配列で構成されるタグを捕捉する核酸に付加する、ここで該タグは、プローブ中の式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドに相補的な部位に、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを有する；および、
（ｃ）固相に固定された（ａ）のプローブと、（ｂ）のタグを付加した核酸をハイブリダイズさせることにより、核酸を捕捉する；
を含む、前記方法。【００３４】
態様１５：  固相が、ＤＮＡチップ基板、またはビーズである、態様１４に記載の方法。【００３５】
態様１６：  ＤＮＡまたはＲＮＡコンピューティングを行う方法であって、以下の工程：
（ａ）式Ｉ：【００３６】
【化６】
2011043385.tif 000007
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む複数の核酸を計算素子として調製し、ここで一の計算素子の一部は、別の計算素子の一部と相補的であり、そして当該式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドは、計算素子の相補的な部分の間で互いに塩基対を形成するように配置される；および、
（ｂ）一の計算素子の一部と、別の計算素子の一部をハイブリダイズさせる；
を含む、前記方法。【００３７】
態様１７：  一態様において、本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡ折り紙を形成する方法であって、以下の工程：
（ａ）式Ｉ：【００３８】
【化７】
2011043385.tif 000008
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む複数の核酸を集積素子として調製し、ここで一の集積素子の一部は、別の集積素子の一部と相補的であり、そして当該式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドは、集積素子の相補的な部分の間で互いに塩基対を形成するように配置される；および、
（ｂ）一の集積素子の一部と、別の集積素子の一部をハイブリダイズさせる；
を含む、前記方法【００３９】
態様１８：  インビトロ翻訳系によりペプチドを合成する方法であって、以下の工程：
（ａ）式Ｉ：【００４０】
【化８】
2011043385.tif 000009
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドをアンチコドン部位に含むトランスファーＲＮＡを調製する；
（ｂ）式Ｉで表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドをコーディング配列に含むメッセンジャーＲＮＡを調製する、ここで該メッセンジャーＲＮＡにおける式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドは、該人工塩基を含むトランスファーＲＮＡのアンチコドン部位に対応するコドンとして、コドン及びアンチコドンのハイブリダイゼーションにおいて式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドが互いに塩基対を形成するように配置される；
（ｃ）（ａ）のトランスファーＲＮＡ、（ｂ）のメッセンジャーＲＮＡ、およびリボソームを用いて、試験管内翻訳によりペプチドを合成する；
を含む、前記方法。【００４１】
態様１９：  核酸のハイブリダイゼーションについての熱力学的安定性を操作する方法であって、核酸中のヌクレオチドを、式Ｉ：【００４２】
【化９】
2011043385.tif 000010
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドに置換することを含む、前記方法。【００４３】
態様２０：  核酸が、プローブ、プライマー、または分子内ハイブリダイゼーションする一本鎖核酸である、態様１９に記載の方法。
【発明の効果】
【００４４】
従来の人工塩基よりもその合成（ＤＮＡ合成用のアミダイト試薬など）が容易であり、Ｇ−Ｃ塩基対と同程度の安定性を示す自己相補的な人工塩基対Ｄｓ−Ｄｓをはじめとする人工塩基対を見出した。また、Ｄｓをはじめとする人工塩基（式Ｉの人工塩基またはその誘導体）はいずれの天然型塩基とも同程度の安定性を示す塩基対を形成し、ユニバーサル塩基として特異な性質を示すことを見出した。このＤｓ塩基等を第５の塩基として、ハイブリダイゼーション用のＤＮＡタグに用いることができる。Ｄｓ塩基等は複製や転写でＰａやＰｎなどの人工塩基に相補してＤＮＡやＲＮＡ中にポリメラーゼを用いて組み込むことができる。よって、例えば、複製と転写で機能するＤｓ−ＰａあるいはＤｓ−Ｐｎ塩基対を用いてＤｓをＤＮＡやＲＮＡ中の特定部位に導入することが可能である。また、熱安定性の高いＤｓ−Ｄｓ塩基対や特異な性質を示すＤｓと天然型塩基との塩基対を用いたハイブリダイゼーションにより、標的とするＤＮＡやＲＮＡを選択的に検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、二本鎖ＤＮＡ中で安定な塩基対を形成する自己相補的なＤｓ−ＤｓならびにＤｓｓ−Ｄｓｓ塩基対と複製で機能するＤｓ−ＰａとＤｓ−Ｐｎ塩基対を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の人工塩基を有する核酸の応用の一例を示した模式図である。（ａ）複製・転写で機能するＤｓ−ＰａあるいはＤｓ−Ｐｎ塩基対と自己相補のＤｓ−Ｄｓ塩基対を組み合わせたＤＮＡチップの例（マルチプレックスも可能）。（ｂ）Ｄｓを含むＤＮＡプローブを用いたターゲット遺伝子のＳＮＰ解析。プローブにＤｓを組み込むことにより、プローブとターゲット遺伝子の１塩基変異体との二本鎖形成の安定性を著しく下げ、選択的にターゲット遺伝子を識別させることができる。
【図３】図３は、人工塩基を組み込んだ二本鎖ＤＮＡ断片の熱安定性を検討した結果を示す表である。
【図４】図４は、相補人工塩基対Ｄｓ−Ｄｓ、ならびにＤｓと天然型塩基（Ｇ）との塩基対、のそれぞれに隣接する天然型塩基対の種類に依存した二本鎖ＤＮＡの熱安定性検討した結果を示す表である。
【図５】図５は、二本鎖ＤＮＡ中のＤｓ−Ｄｓ塩基対の両側に位置する天然型塩基対の種類により変化するそれぞれの二本鎖ＤＮＡの熱安定性を示す表である。図５の表は、図４上段の表に記載の結果をまとめたものである。
【図６】図６は、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対による二本鎖ＤＮＡのＧＣ含量に依存する熱安定性の中和を示す図である（カッコ内はＧ−Ｃ塩基対の数を示す）。
【図７】図７は、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対を含む４種類の配列の二本鎖ＤＮＡタグとそれぞれのミスハイブリダイゼーションによるＤＮＡの熱安定性を示す図である。
【図８】図８は、Ｄｓを含む二本鎖ＤＮＡの配列からのＴｍ値の予測法を示す模式図および、Nearest-neighbor配列ごとの自由エネルギーΔＧを示す表である。（既知のNearest-neighbor法にＤｓ−Ｄｓ塩基対を組み込む）
【図９】図９は、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対を含む二本鎖ＤＮＡの熱安定性の実測値と本発明による予測値との比較を示すグラフである。
【図１０】図１０は、複数のＤｓ−Ｄｓ塩基対を含む二本鎖ＤＮＡの熱安定性を示す図である。
【図１１】図１１は、Ｇ−Ｄｓ塩基対による天然型塩基のミスマッチペアの認識能を示す図である。
【図１２】図１２は、Ｇ−Ｄｓ塩基対による二本鎖ＤＮＡのＧＣ含量に依存する熱安定性の中和を示す図である（カッコ内はＧ−Ｃ塩基対の数を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００４７】
定義
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。
【００４８】
本明細書において、「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。ここで、核酸塩基は、天然型塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル、天然型塩基の修飾体及び塩基類似体、並びに人工塩基も含む概念である。人工塩基は、該塩基が組み込まれた核酸において、天然型塩基または他の人工塩基と塩基対を形成可能な、天然型塩基ではない官能基を意味する。人工塩基の種類は特に限定されないが、例えば、置換された又は置換されていない２−アミノプリン、置換された又は置換されていないイミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン、置換された又は置換されていないピロロ［２，３−ｂ］ピリジン、置換された又は置換されていないピリジン−２−オン、置換された又は置換されていないピロロ−２−カルバルデヒド、置換された又は置換されていない２−ニトロピロールに相当する塩基、イソグアニン、イソシトシン、キサントシン、５−（２，４−ジアミノピリミジン）、４−メチルベンズイミダゾール、ジフルオロトルエン、プロピニルイソカルボスチリル、７−アザインドールなどが挙げられる。人工塩基はまた、天然型塩基の誘導体であってもよい。
【００４９】
本明細書において、「ヌクレオチド」とは、前記ヌクレオシドの糖部分がリン酸とエステルを作っている化合物をいう。より好ましくは、一、二、又は三リン酸エステルである。
【００５０】
ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分は、リボフラノシル、２’−デオキシリボフラノシル、あるいはハロゲンなどの置換基を２’位に有する２’−置換リボフラノシルであってよい。限定されるわけではないが、リン酸部分はアミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基、およびフルオロ基、からなる群より選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されていることが望ましい。ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分、およびヌクレオチドのリン酸部分は、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド、あるいはこれらの誘導体にみられる構成をとっていればよい。糖部分がリボフラノシルであるリボヌクレオチドはリボ核酸（ＲＮＡ）の構成成分となり、２’−デオキシリボフラノシルであるデオキシリボヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の構成成分となる。
【００５１】
本明細書において、ヌクレオシド又はヌクレオチドの誘導体には、例えば、ホスホロアミダイト誘導体、Ｈ−ホスホネート誘導体が含まれる。
【００５２】
ホスホロアミダイト誘導体は、核酸の化学合成に使用するためにヌクレオシド中の１またはそれより多くの箇所において置換基が保護基で修飾されている態様である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版, Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（２００１），１０．４２−１０．４６）。具体的には、（デオキシ）リボースの５’−水酸基は、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル基、レブリニル基などの核酸合成に用いられる５’位保護基で保護されうる。これは、５’−水酸基が核酸の化学合成の際に投入されるヌクレオシドホスホロアミダイトと反応するのを防止するためである。また、投入されるヌクレオシドホスホロアミダイト上の（デオキシ）リボース残基に結合した三価のリン酸基は、ジイソプロピルアミノ基等で保護されうる。これは、結合の際に、テトラゾール等によって活性化されるためである。この三価のリン酸基はまた、シアノエチル、メトキシ等も結合する。これは、側鎖の反応を抑制するためである。さらに、塩基のプリン環のアミノ基は、フェノキシアセチル基、イソブチリル基等で保護されうる。これは、環外アミノ基の求核機能を保護するためである。本発明のホスホロアミダイト誘導体は、これらの保護基が１またはそれより多くの箇所において導入されている。好ましくは、上述したすべての箇所において保護基が導入されている。
【００５３】
本明細書において、「核酸」とは、１より多くのヌクレオチドが５’→３’の方向に結合した核酸鎖の分子を意味する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡを含む。二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡであってもよい。また、ＤＮＡには、ＲＮＡを鋳型として逆転写してなるｃＤＮＡも含まれる。あるいは、核酸は三本鎖、四本鎖等も形成しうる。
【００５４】
本明細書において、「ユニバーサル塩基」とは、どの天然型塩基とも同程度の安定性で塩基対を形成する塩基類似体を意味する。
【００５５】
人工塩基を含む二本鎖核酸
一態様において本発明は、二本鎖核酸であって、第一の核酸と第二の核酸を含み、
ここで該第一の核酸は式Ｉ：
【００５６】
【化１０】
2011043385.tif 000011
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチド（単数または複数）を含み、そして該第二の核酸は式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチド（単数または複数）を含んでいても含んでいなくてもよく、
ここで、第一の核酸中の式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、第二の核酸中のいずれかの天然塩基または式Ｉの人工塩基もしくはその誘導体と塩基対を形成している、前記二本鎖核酸、を提供する。
【００５７】
式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、式Ｉの人工塩基またはその誘導体と自己相補的な塩基対を形成することが可能である。また、式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンのどの天然型塩基とも同程度の安定性で塩基対を形成することが可能であり、ユニバーサル塩基としての性質を有する。
【００５８】
したがって、第二の核酸が式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む場合は、第一の核酸中の式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドの位置と相補的な位置に組み込まれる。それにより、第一の核酸中の複数の式Ｉの人工塩基またはその誘導体はそれぞれ、第二の核酸中の天然塩基または式Ｉの人工塩基もしくはその誘導体と塩基対を形成する。
【００５９】
第一の核酸と第二の核酸は、互いに完全に相補的であってもよい。あるいは、第一の核酸と第二の核酸により形成される二本鎖核酸は、１またはそれより多くのミスマッチ塩基対を含んでいてもよい。
【００６０】
好ましくは、本発明の式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、
【００６１】
【化１１】
2011043385.tif 000012
［ここにおいて、
Ａ１がＮであり；Ａ２がＣＨであり；
Ｒ１が水素であり；そして、
Ｒ２が２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される、
で表される人工塩基またはその誘導体である。
【００６２】
さらに好ましくは、式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）；
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）；
７−（２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓｓ）；
２−アミノ−６−（２-チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）；
２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓ）；
２−アミノ−６−（２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓｓ）；
４−（２−チエニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（ｄＤｓａ）；
４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｓ）；
４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｖ）； 
４−（２−チアゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（ｄＤｖａ）；
４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｖａｓ）；及び
４−（２−イミダゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（ｄＤｉａ）、
からなる群から選択される人工塩基またはその誘導体であってもよい。
【００６３】
さらに好ましくは、式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）、またはそれらの誘導体であってもよい。
【００６４】
本明細書において、式Ｉの人工塩基の誘導体は、式Ｉで表される骨格構造を有する人工塩基であれば特に限定されない。例えば、式Ｉ中のＲ２で示される置換基がさらなる置換基、例えば、Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルケニル基、Ｃ１−Ｃ３アルキニル基等の付加により修飾されている人工塩基誘導体であってもよい。あるいは、本発明の人工塩基の官能基が保護基で修飾された誘導体もまた、式Ｉの人工塩基の誘導体に含まれる。具体的には、本発明の人工塩基のアミノ基を保護するのに適切な保護基には、フェノキシアセチル基、イソブチリル基、ジメチルホルムアミジル基などが挙げられる。
【００６５】
別の態様において、本発明の二本鎖核酸における第一の核酸は、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを複数含んでいてもよい。その場合、式Ｉの人工塩基又はその誘導体が、第一の核酸ヌクレオチド鎖中で隣接していると、二本鎖核酸の熱安定性を低下させる。第一の核酸中の複数のヌクレオチドは、ヌクレオチド鎖中で互いに隣接していないことが好ましい。
【００６６】
第一の核酸が式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを複数含む場合、第二の核酸は当該人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを複数含んでいても含んでいなくてもよい。第二の核酸が式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む場合、その人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドは、第一の核酸中の式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドの位置と相補的な位置に組み込まれる。それにより、第一の核酸中の複数の式Ｉの人工塩基またはその誘導体はそれぞれ、第二の核酸中の天然塩基または式Ｉの人工塩基もしくはその誘導体と塩基対を形成する。
【００６７】
また、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む第一の核酸が、第二の核酸とハイブリダイズして二本鎖核酸を形成する場合、第一の核酸中の式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの種類に依存して熱安定性が変化する。すなわち、安定性の高い順から５’−ＣＤｓＧ−３’  ＞  ５’−ＣＤｓＡ−３’  ＞  ５’−ＴＤｓＧ−３’  ＞  ５’−ＧＤｓＧ−３’  ＞５’−ＴＤｓＡ−３’  ＞  ５’−ＡＤｓＧ−３’  ＞  ５’−ＧＤｓＡ−３’  ＞  ５’−ＧＤｓＣ−３’  ＞  ５’−ＡＤｓＡ−３’  ＞  ５’−ＡＤｓＣ−３’  ＞  ５’−ＡＤｓＴ−３’となる。したがって、好ましい態様において、本発明の二本鎖核酸における第一の核酸は、式Ｉで表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドの５’側にシトシン（Ｃ）もしくはチミン（Ｔ）ヌクレオチドを隣接し、及び／又は３’側にグアニン（Ｇ）ヌクレオチドを隣接する。
【００６８】
式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、疎水性相互作用により、式Ｉの人工塩基またはその誘導体と自己相補的な塩基対を形成する。また、水素結合性の塩基対形成ではないために、式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンのどの天然型塩基とも同程度の安定性で塩基対を形成することが可能であり、ユニバーサル塩基としての性質を有することが考えられる。したがって、嵩高い疎水性の人工塩基、例えば、９員以上のアリール基またはヘテロアリール基を含む官能基で構成される人工塩基もまた、自己相補的な塩基対を形成する性質や、ユニバーサル塩基としての性質など、式Ｉの人工塩基またはその誘導体が有する特徴を有するものと考えられる。
【００６９】
したがって、本発明は、二本鎖核酸であって、第一の核酸と第二の核酸を含み、該第一の核酸は、９員以上のアリール基またはヘテロアリール基を含む官能基を人工塩基として有するヌクレオチドを少なくとも１つ含み、そして該第二の核酸は式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチド（単数または複数）を含んでいても含んでいなくてもよく、ここで、第一の核酸中の人工塩基は、第二の核酸中のいずれかの天然塩基または人工塩基と塩基対を形成している、前記二本鎖核酸をも提供する。
【００７０】
９員以上のアリール基またはヘテロアリール基を含む官能基は特に限定されないが、例えば、以下グループ１〜グループ７の官能基が挙げられる。
【００７１】
・グループ１
式：
【００７２】
【化１２】
2011043385.tif 000013
［式中、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立してＣＨ、ＣＦおよびＮからなる群より選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して水素、Ｃｌ、Ｆ、ＣＨ３、フェニル、ＮＯ２からなる群より選択される］
で表される官能基またはその誘導体、である人工塩基。
【００７３】
グループ１に属する人工塩基としては、例えば、
−Guckianら（J. Am. Chem. Soc., 118: 8182-8183 (1996)）に記載の４−メチルインドール（上記式中、Ｘ１＝Ｘ２＝ＣＨ，Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈ，Ｒ２＝ＣＨ３）；
−Schweitzerら（J. Org. Chem., 59: 7238-7242 (1994)）に記載のＤ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｘ２＝ＣＨ，Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ，Ｒ２＝Ｒ４＝ＣＨ３）；
−Moralesら（J. Am. Chem. Soc., 121: 2323-2324 (1999)）に記載のＱ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｘ２＝Ｎ，Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈ，Ｒ２＝ＣＨ３）；
−Guckianら（J. Org. Chem., 63: 9652-9656 (1998)）に記載のＺ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｎ，Ｘ２＝ＣＨ，Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈ，Ｒ２＝ＣＨ３）；
−Taniguchiら（J. Am. Chem. Soc., 129: 8836-8844 (2007)）に記載の塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｘ２＝ＣＨ，Ｒ１＝Ｃｌ，Ｒ２＝Ｆ，Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈ）及び塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｎ，Ｘ２＝ＣＨ，Ｒ１＝Ｃｌ，Ｒ２＝ＣＨ３，Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈ）；
−Laiら（J. Am. Chem. Soc., 126: 3040-3041 (2004)）に記載のＦＩ塩基（上記式中、Ｘ１＝ＣＨ，Ｘ２＝ＣＦ，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｆ）；
−Girgisら（J. Heterocycl. Chem., 25: 361-366 (1988)）に記載のインドール塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｘ２＝ＣＨ，Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈ）；
−Loakesら（Nucleic Acids Res., 22: 4039-4043 (1994)）に記載の５−ニトロインドール塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｘ２＝ＣＨ，Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ４＝Ｈ，Ｒ３＝ＮＯ２）；
−Kruegerら（Curr. Opin. Chem. Biol., 11: 588-594 (2007)）に記載の５−ＰｈＩ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｘ２＝ＣＨ，Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ４＝Ｈ，Ｒ３＝フェニル）；
−Kruegerら（Chem. Biol., 16: 242-248 (2009)）に記載のＤＮＢ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｎ，Ｘ２＝ＣＨ，Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝Ｒ４＝ＮＯ２）；
などが挙げられる。
【００７４】
・グループ２
式：
【００７５】
【化１３】
2011043385.tif 000014
［式中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、それぞれ独立してＣＨまたはＮである］
で表される官能基またはその誘導体、である人工塩基。
【００７６】
グループ２に属する人工塩基としては、例えば、
−Wuら（J. Am. Chem. Soc., 122: 7621-7632 (2000)）に記載のＰＰ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｘ３＝ＣＨ，Ｘ２＝Ｎ）及びＩｍＰｙ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｎ，Ｘ２＝Ｘ３＝ＣＨ）；
−Leconteら（J. Am. Chem. Soc., 130: 2336-2343 (2008)）に記載のＮｅｂ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｘ３＝Ｎ，Ｘ２＝ＣＨ）；
−Ogawaら（J. Am. Chem. Soc., 122: 3274-3287 (2000)）に記載の７ＡＩ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｘ２＝Ｘ３＝ＣＨ）；
などが挙げられる。
【００７７】
・グループ３
式：
【００７８】
【化１４】
2011043385.tif 000015
［式中、Ｘは、ＮＨ、ＯまたはＳから選択される］
で表される官能基またはその誘導体、である人工塩基。または、式：
【００７９】
【化１５】
2011043385.tif 000016
で表される官能基（ＢＴｚ塩基）またはその誘導体、である人工塩基。
【００８０】
グループ３に属する人工塩基としては、例えば、Matsudaら（J. Am. Chem. Soc., 125: 6134-6139 (2003))に記載される、ＢＴｐ塩基（上記式中、Ｘ＝Ｓ）、ＢＦｒ塩基（上記式中、Ｘ＝Ｏ）、ＩＮ塩基（上記式中、Ｘ＝ＮＨ）およびＢＴｚ塩基などが挙げられる。
【００８１】
・グループ４
式：
【００８２】
【化１６】
2011043385.tif 000017
［式中，Ｘ１は、ＯまたはＳであり、
Ｘ２およびＸ３は、ＣＨ、ＯまたはＳから選択される］
で表される官能基またはその誘導体、である人工塩基。
【００８３】
上記の式で表される人工塩基としては、例えば、
−Henryら（J. Am. Chem. Soc., 125: 9638-9646 (2003)）に記載の７ＯＦＰ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｘ２＝Ｏ，Ｘ３＝ＣＨ）、４ＴＦＰ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｓ，Ｘ２＝ＣＨ，Ｘ３＝Ｏ）、４ＯＦＰ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｏ，Ｘ２＝ＣＨ，Ｘ３＝Ｏ）、７ＯＴＰ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｏ，Ｘ２＝Ｓ，Ｘ３＝ＣＨ）、４ＯＴＰ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｏ，Ｘ２＝ＣＨ，Ｘ３＝Ｓ）、および７ＴＦＰ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｓ，Ｘ２＝Ｏ，Ｘ３＝ＣＨ）；などが挙げられる。
【００８４】
あるいは、グループ４に含まれる人工塩基は以下の式：
【００８５】
【化１７】
2011043385.tif 000018
［式中，Ｘ１は、ＯまたはＳであり、
Ｘ４およびＸ５は、ＣＨまたはＮである］
で表される人工塩基またはその誘導体であってもよい。
【００８６】
上記の式で表される人工塩基としては、例えば、
−Yuら（Angew. Chem. Int. Ed., 41: 3841-3844 (2002)に記載のＮＩＣＳ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｏ，Ｘ４＝ＣＨ，Ｘ５＝Ｎ）、ＳＮＩＣＳ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｓ，Ｘ４＝ＣＨ，Ｘ５＝Ｎ）、およびＳＩＣＳ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｓ，Ｘ４＝Ｘ５＝ＣＨ）；
−Ogawaら（J. Am. Chem. Soc., 122: 324-3287 (2000)）に記載のＩＣＳ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｏ，Ｘ４＝Ｘ５＝ＣＨ）；
−Leconteら（J. Am. Chem. Soc., 130: 2336-2343 (2008)）に記載のｏＮＩＣＳ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｏ，Ｘ４＝Ｎ，Ｘ５＝ＣＨ）、およびＳｏＮＩＣＳ塩基（上記式中、Ｘ１＝Ｓ，Ｘ４＝Ｎ，Ｘ５＝ＣＨ）；などが挙げられる。
【００８７】
・グループ５
式：
【００８８】
【化１８】
2011043385.tif 000019
［式中、Ｘは、ＯまたはＳであり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、それぞれ独立してＨ、ＣＨ３、または−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３である］
で表される官能基またはその誘導体、である人工塩基。
【００８９】
グループ５に属する人工塩基としては、例えば、
−McMinnら（J. Am. Chem. Soc., 121: 11585-11586 (1999)）に記載のＰＩＣＳ塩基（上記式中、Ｘ＝Ｏ，Ｒ１＝  −Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３，Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ）；
−Leconteら（J. Am. Chem. Soc., 130: 2336-2343 (2008)）に記載の５ＳＩＣＳ塩基（上記式中、Ｘ＝Ｓ，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝ＣＨ３，Ｒ３＝Ｈ）、及び４ＳＩＣＳ塩基（上記式中、Ｘ＝Ｓ，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）；
などが挙げられる。
【００９０】
・グループ６
式：
【００９１】
【化１９】
2011043385.tif 000020
［式中、Ｘは、ＣＨ、Ｃ−ＣＨ３、またはＮであり、
Ｒ１またはＲ２は、それぞれ独立してＨ、ＣＨ３、または−ＯＣＨ３である］
で表される官能基またはその誘導体、である人工塩基。
【００９２】
グループ６に属する人工塩基としては、例えば、
−Renら（J. Am. Chem. Soc., 118, 7671-7678 (1996)）に記載の２Ｎｐ塩基（上記式中、Ｘ＝ＣＨ，Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ）；
−Ogawaら（J. Am. Chem. Soc., 122: 3274-3287 (2000)）に記載の２ＭＮ塩基（上記式中、Ｘ＝ＣＨ，Ｒ１＝ＣＨ３，Ｒ２＝Ｈ）、及びＤＭＮ塩基（上記式中、Ｘ＝  Ｃ−ＣＨ３，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝ＣＨ３）；
−Ogawaら（J. Am. Chem. Soc., 122: 8803-8804 (2000)）に記載の３ＭＮ塩基（上記式中、Ｘ＝ＣＨ，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝ＣＨ３）；
−Seoら（J. Am. Chem. Soc., 131: 3246-3252 (2009)）に記載のＮａＭ塩基（上記式中、Ｘ＝ＣＨ，Ｒ１＝ＯＣＨ３，Ｒ２＝Ｈ）;
−Hariら（ChemBioChem, 9: 2769-2799 (2008)）に記載のＱＬ塩基（上記式中、Ｘ＝Ｎ，Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ）；
などが挙げられる。
【００９３】
・その他
Renら（J. Am. Chem. Soc., 118: 7671-7678 (1996))、Gaoら（J. Am. Chem. Soc., 126: 12748-12749 (2004)）、及びGaoら（J. Am. Chem. Soc., 124: 11590-11591 (2002)）に記載のナフタレン塩基、フェナントレン塩基、ピレン塩基、ベゾピレン塩基、ペリレン塩基、及びオキシペリレン塩基などの官能基、またはその誘導体、である人工塩基もまた、嵩高い疎水性の人工塩基、に含まれる。
【００９４】
【化２０】
2011043385.tif 000021
Colemanら（J. Org. Chem., 63: 5700-5703 (1998)）に記載のクマリン塩基：
【００９５】
【化２１】
2011043385.tif 000022
【００９６】
またはその誘導体である人工塩基もまた、嵩高い疎水性の人工塩基、に含まれる。
【００９７】
本発明の核酸の製造
本発明の二本鎖核酸における第一の核酸または第二の核酸に、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを導入するためには、複製・転写・逆転写により、あるいは、化学合成により、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを導入する方法を利用することが可能である。
【００９８】
（Ａ）複製・転写・逆転写による方法
複製・転写・逆転写により、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを第一または第二の核酸に導入するためには、式ＩＩ：
【００９９】
【化２２】
2011043385.tif 000023
［ここにおいて、Ｒは水素、ならびに、置換されたまたは置換されていないアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基からなる群より選択され、
ここにおいて置換されたアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基は、機能性官能基または蛍光性官能基で置換されている］
で表される塩基（以下、Ｐａ誘導体と記載する）を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型鎖として用い；
複製基質として式Ｉの人工塩基を有するデオキシリボヌクレオチド５’−三リン酸又はリボヌクレオチド５’−三リン酸を用いて、核酸の複製反応、転写反応、または逆転写反応を行い；
それにより塩基Ｐａ誘導体と式Ｉの人工塩基との塩基対を含む核酸が生成することにより、式Ｉの人工塩基を含むヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡ中に導入される；
ことを含む方法、を利用することができる。
【０１００】
本発明の人工塩基は、別の人工塩基であるＰａ誘導体と塩基対を形成することが可能である。本発明の人工塩基の相補塩基であるＰａ誘導体を鋳型鎖ＤＮＡに組み込み、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素を用いた核酸複製反応により、本発明の人工塩基が鋳型ＤＮＡ中のＰａ誘導体に相補してＤＮＡ又はＲＮＡ中に取り込まれる。すなわち、本発明の人工塩基は鋳型ＤＮＡ中のＰａに相補することにより、特定の位置に選択的にＤＮＡ又はＲＮＡ中に導入することができる。
【０１０１】
上記の方法における核酸の複製・転写・逆転写反応は公知の方法に従って行うことができる。酵素の選択、基質濃度の選択、またはアニーリング条件の選択などの反応条件は、当業者が適宜設定することができ、そのような検討は当業者が日常的に行う事項の範囲内である。しかしながら、核酸の複製・転写・逆転写反応を行う際の人工塩基のヌクレオチド基質の濃度の割合は、それぞれの天然型塩基のヌクレオチド基質濃度に対して少ない濃度とすることが、効率のよい核酸の複製・転写・逆転写のために好ましい。例えば、人工塩基のヌクレオチド基質の濃度の割合は、それぞれの天然型塩基のヌクレオチド基質濃度に対して１／２以下、１／５以下、１／１０以下、１／２０以下、１／１００以下である。
【０１０２】
上記の方法により式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを第一または第二の核酸中に導入する場合に使用可能なＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌のクレノウ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、並びに、Ｐｆｕ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ、Ｖｅｎｔ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ、及びＫｌｅｎＴａｑなどの耐熱性ポリメラーゼ、などが挙げられる。また、その際に基質として利用可能な本発明の人工塩基を有するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド−５’−三リン酸である。
【０１０３】
上記の方法により式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを第一または第二の核酸中に導入する場合に使用可能なＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなどのファージ由来ＲＮＡポリメラーゼ、並びに、Ｑβ  レプリカーゼなどのＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、などが挙げられる。また、その際に基質として利用可能な本発明の人工塩基を有するヌクレオチドは、リボヌクレオチド５’−三リン酸である。
【０１０４】
上記の方法により式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを第一または第二の核酸中に導入する場合に使用可能な逆転写酵素は、ＨＩＶ、ＡＭＶ、及びＭＭＬＶ由来の逆転写酵素、などが挙げられる。また、その際に基質として利用可能な本発明の人工塩基を有するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド−５’−三リン酸である。
【０１０５】
（Ｂ）化学合成による方法
化学合成により、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを第一または第二の核酸に導入するためには、式Ｉで表される人工塩基または誘導体を有するヌクレオシドのホスホロアミダイト誘導体、Ｈ−ホスホネート誘導体、またはトリホスフェート誘導体を用いたＤＮＡ又はＲＮＡの合成を利用することができる。
【０１０６】
ヌクレオシドのホスホロアミダイト誘導体、Ｈ−ホスホネート誘導体、またはトリホスフェート誘導体を用いてＤＮＡ又はＲＮＡを合成する方法は、当業者に知られている。本願発明の人工塩基またはその誘導体に関して、当業者は適宜反応条件等を設定することが可能である。
【０１０７】
人工塩基を含む核酸をハイブリダイズさせる方法
本発明の式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、式Ｉの人工塩基またはその誘導体と自己相補的な塩基対を形成することが可能である。また、式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンのどの天然型塩基とも同程度の安定性で塩基対を形成することが可能である。
【０１０８】
本発明は、上記の式Ｉの人工塩基またはその誘導体の性質を利用して、人工塩基を含む核酸をハイブリダイズさせる方法を提供する。すなわち、人工塩基を含む核酸をハイブリダイズさせる方法であって、
式Ｉ：
【０１０９】
【化２３】
2011043385.tif 000024
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む第一の核酸を、式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含むまたは含まない第二の核酸とハイブリダイズさせることを含む、
ここで、第一の核酸中の式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、第二の核酸中のいずれかの天然塩基または式Ｉの人工塩基もしくはその誘導体と塩基対を形成する、前記方法、を提供する。
【０１１０】
天然塩基で構成される核酸のハイブリダイゼーションの場合、同じ長さの二本鎖ＤＮＡであってもそれぞれの配列中のＧＣ含量が異なると、それらの二本鎖ＤＮＡの熱安定性は異なる。すなわち、ＧＣ含量が高くなると二本鎖ＤＮＡの熱安定性も高くなる。このことにより、ＧＣ含量が異なる複数の断片を用いた一定温度下でのマルチプレックス検出を行う場合には、ＧＣ含量が高いプローブがミスハイブリダイゼーションしやすくなる。一方、本発明の式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドは、当該ヌクレオチドを核酸に導入することにより、第一の核酸と第二の核酸のハイブリダイゼーションにおける熱力学的安定性を操作することが可能である。よって、ＧＣ含量が異なる、複数種類の第一の核酸と第二の核酸の対が存在する場合であっても、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドの導入により、各核酸の対のハイブリダイゼーションにおける熱力学的安定性が一定になるように設計することができる。したがって、本発明の方法において、ハイブリダイゼーションはマルチプレックスで行うことが可能である。
【０１１１】
好ましい態様において、本発明の方法における第一の核酸は、ハイブリダイゼーション用プローブ、タグ、又はプライマーであることができる。
【０１１２】
別の好ましい態様において、本発明の方法における第一および第二の核酸は、ＤＮＡコンピュータ用計算素子であることができる。
【０１１３】
本発明の方法は、ＳＮＰ検出、ＤＮＡチップのプローブ、ＤＮＡタグ、モレキュラービーコンなどのイメージング技術への利用、ＤＮＡ／ＲＮＡコンピューティング、コドン／アンチコドンなど翻訳系への導入、など、核酸のハイブリダイゼーションを活用する多方面の技術において利用することができる。
【０１１４】
一塩基多型検出への応用
本発明者らは、式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、天然型塩基ともある程度の安定性で塩基対を形成することを見出した。そして、式Ｉの人工塩基またはその誘導体と天然型塩基との塩基対に隣接する塩基対がミスマッチペア（Ａ−ＴまたはＧ−Ｃペア以外の組み合わせ）の場合に、その二本鎖ＤＮＡの安定性が著しく低下することを見出した。具体的には、天然型塩基のみの核酸の対において、完全に相補的な対とミスマッチペアを含む対のＴｍ値の差よりも、式Ｉの人工塩基またはその誘導体と天然型塩基との塩基対に隣接する塩基対がミスマッチペアを含まない場合と含む場合のＴｍ値の差が大きくなることを見出した。このことから、本発明者らは、本発明のハイブリダイゼーション方法における第一の核酸をハイブリダイゼーション用のプローブやＰＣＲ用のプライマーに応用することにより、一塩基多型（ＳＮＰ）検出が可能であることを見出した。
【０１１５】
（Ａ）ハイブリダイゼーションによるＳＮＰ検出
一態様において、本発明は、一塩基変異を同定する方法であって、以下の工程
（ａ）ターゲット核酸中の同定したい一塩基変異部位を含む配列に相補的なプローブを調製する、ここで該プローブは、式Ｉ：
【０１１６】
【化２４】
2011043385.tif 000025
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを、該同定したい一塩基変異部位に相補的なヌクレオチドに隣接して有する；
（ｂ）ターゲット核酸と、（ａ）のプローブをハイブリダイズさせる；および、
（ｃ）プローブとのハイブリダイズが確認されたターゲット核酸は、同定したい一塩基変異部位においてプローブと相補的な塩基を有することを同定する；
を含む、前記方法、を提供する。
【０１１７】
上記の方法において、ハイブリダイゼーションの温度設定は、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を含むプローブとターゲット核酸が、プローブ上の式Ｉの人工塩基またはその誘導体を含むヌクレオチドに隣接する塩基においてミスマッチペアを含まない場合のＴｍよりも低く、かつ、該プローブとターゲット核酸がプローブ上の式Ｉの人工塩基またはその誘導体を含むヌクレオチドに隣接する塩基においてミスマッチペアを含む場合のＴｍよりも高い温度を設定する。そうすることで、ミスマッチペアを含まない対を検出することにより、ＳＮＰの同定が可能である。
【０１１８】
式Ｉの人工塩基又はその誘導体を含むプローブとターゲット核酸がハイブリダイズした場合のＴｍ値は、後述する指標に基づいて決定することができる。また、ハイブリダイゼーション実験により、確認することも可能である。
【０１１９】
この態様の模式図は、図２（ｂ）に示される。
【０１２０】
（Ｂ）ＰＣＲによるＳＮＰ検出
別の態様において、本発明は、一塩基変異を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）ターゲット核酸中の同定したい一塩基変異部位を含む配列に相補的なプライマーを調製する、ここで該プライマーは、式Ｉ：
【０１２１】
【化２５】
2011043385.tif 000026
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを、該同定したい一塩基変異部位に相補的なヌクレオチドに隣接して有する；
（ｂ）ターゲット核酸をテンプレートとし、（ａ）のプライマー、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチド基質および天然型ヌクレオチド基質、ならびにＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを行う；および、
（ｃ）ＰＣＲ反応による増幅が確認されたターゲット核酸は、同定したい一塩基変異部位においてプライマーと相補的な塩基を有することを同定する；
を含む、前記方法。
【０１２２】
ＰＣＲは、当業者に公知の手法で行うことができる。ヌクレオチド基質は、ヌクレオチド５’−三リン酸であってもよい。式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型鎖とした場合、式Ｉの人工塩基またはその誘導体に対しては、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチド基質が導入される。
【０１２３】
ＤＮＡチップへの応用
一態様において、本発明は、人工塩基を含むプローブを用いて核酸を捕捉する方法であって、以下の工程：
（ａ）式Ｉ：
【０１２４】
【化２６】
2011043385.tif 000027
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含むプローブを調製し、固相に固定する；
（ｂ）（ａ）のプローブに相補的な配列で構成されるタグを捕捉する核酸に付加する、ここで該タグは、プローブ中の式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドに相補的な部位に、式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを有する；および、
（ｃ）固相に固定された（ａ）のプローブと、（ｂ）のタグを付加した核酸をハイブリダイズさせることにより、核酸を捕捉する；
を含む、前記方法を提供する。
【０１２５】
好ましい態様において、固相は、ＤＮＡチップ基板、またはビーズである。
【０１２６】
本発明の式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドをプローブおよびタグに導入することにより、プローブとタグで構成される二本鎖核酸の熱安定性をコントロールすることが可能である。よって、当該プローブとタグのハイブリダイゼーションでは、ミスハイブリダイゼーションが少ないため、マルチプレックス解析に適している。
【０１２７】
プローブの固相への固定は、当業者に公知の手法を利用して行うことができる。
【０１２８】
タグを捕捉する核酸に付加するためには、例えば、式Ｉの人工塩基またはその誘導体とＰａ塩基（Ｐａ：ピロロ−２−カルバルデヒド）またはＰｎ塩基（Ｐｎ：２−ニトロピロール）との塩基対形成を利用したＰＣＲ反応を利用することができる。具体的には、捕捉する核酸の相補鎖を鋳型として、Ｐａ塩基またはＰｎ塩基を有するプライマー、天然型ヌクレオチド基質および式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として含むヌクレオチド基質、ならびにＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応を行う。Ｐａ塩基またはＰｎ塩基に相補的な部分には、式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として含むヌクレオチド基質が導入されるため、捕捉する核酸に式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として含むタグを導入することが可能である（図２（ａ）の模式図）。
【０１２９】
プローブとタグをハイブリダイズさせる温度については、当業者が適宜設定することが可能である。好ましくは、式Ｉの人工塩基またはその誘導体を含むプローブとタグで構成される二本鎖核酸のＴｍ程度である。式Ｉの人工塩基又はその誘導体を含むプローブとタグがハイブリダイズした場合のＴｍ値は、後述する指標に基づいて決定することができる。また、ハイブリダイゼーション実験により、確認することも可能である。
【０１３０】
ＤＮＡまたはＲＮＡコンピューティングへの応用
一態様において、本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡコンピューティングを行う方法であって、以下の工程：
（ａ）式Ｉ：
【０１３１】
【化２７】
2011043385.tif 000028
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む複数の核酸を計算素子として調製し、ここで一の計算素子の一部は、別の計算素子の一部と相補的であり、そして当該式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドは、計算素子の相補的な部分の間で互いに塩基対を形成するように配置される；および、
（ｂ）一の計算素子の一部と、別の計算素子の一部をハイブリダイズさせる；
を含む前記方法、を提供する。
【０１３２】
ＤＮＡコンピューティングとは、１９９４年にＡｄｌｅｍａｎが提案したＤＮＡを計算素子として利用する計算手法である。その一例としては、組み合わせ問題の各選択肢をＤＮＡの塩基配列として表現し、それらのＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた後に、ＰＣＲ増幅等で増幅させ、得られた増幅産物の中から、最適な長さ、有するべき特定の配列、等の指標に基づいて増幅産物を選別し、選別した増幅産物の配列解析により、最適な組み合わせ問題の解を得る手法である。
【０１３３】
本発明の式Ｉの人工塩基またはその誘導体は、天然塩基とは異なる新たな塩基対を提供するものであり、ＤＮＡコンピューティングにおける計算素子のバリエーションを増やすことが可能である。
【０１３４】
ＤＮＡコンピューティングの計算素子としては、ＤＮＡのみならず、ＲＮＡも利用可能である。ＲＮＡを計算素子として用いる場合は、ＲＮＡコンピューティングと称する。
【０１３５】
ＤＮＡまたはＲＮＡ折り紙への応用
一態様において、本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡ折り紙を形成する方法であって、以下の工程：
（ａ）式Ｉ：
【０１３６】
【化２８】
2011043385.tif 000029
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む複数の核酸を集積素子として調製し、ここで一の集積素子の一部は、別の集積素子の一部と相補的であり、そして当該式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドは、集積素子の相補的な部分の間で互いに塩基対を形成するように配置される；および、
（ｂ）一の集積素子の一部と、別の集積素子の一部をハイブリダイズさせる；
を含む前記方法、を提供する。
【０１３７】
ＤＮＡ折り紙とは、ＤＮＡを集積素子として用いたナノスケールの任意の二次元或いは三次元構造を創造するためのナノスケール折りたたみ構造の総称であり、相補的な塩基配列間相互作用を介することにより、有用なナノスケール構造物を提供する。ＲＮＡを集積素子として用いた場合には、ＲＮＡ折り紙と称する。
【０１３８】
翻訳系への応用
一態様において、本発明は、インビトロ翻訳系によりペプチドを合成する方法であって、以下の工程：
（ａ）式Ｉ：
【０１３９】
【化２９】
2011043385.tif 000030
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドをアンチコドン部位に含むトランスファーＲＮＡを調製する；
（ｂ）式Ｉで表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドをコーディング配列に含むメッセンジャーＲＮＡを調製する、ここで該メッセンジャーＲＮＡにおける式Ｉの人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドは、該人工塩基を含むトランスファーＲＮＡのアンチコドン部位に対応するコドンとして、コドン及びアンチコドンのハイブリダイゼーションにおいて式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドが互いに塩基対を形成するように配置される；
（ｃ）（ａ）のトランスファーＲＮＡ、（ｂ）のメッセンジャーＲＮＡ、およびリボソームを用いて、試験管内翻訳によりペプチドを合成する；
を含む前記方法、を提供する。
【０１４０】
式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドをアンチコドン部位に含むトランスファーＲＮＡ、および／またはメッセンジャーＲＮＡの調製は、化学合成法により行ってもよく、あるいは、転写反応により行ってもよい。
【０１４１】
試験管内翻訳に用いるリボソームの調製方法は、当業者に公知の手法が利用できる。
【０１４２】
核酸のハイブリダイゼーションにおける熱力学的安定性の操作
一態様において、本発明は、核酸のハイブリダイゼーションについての熱力学的安定性を操作する方法であって、核酸中のヌクレオチドを、式Ｉ：
【０１４３】
【化３０】
2011043385.tif 000031
［ここにおいて、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立してＮ又はＣＨであり；
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり；そして、
Ｒ２は、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される置換基である］
で表される人工塩基又はその誘導体を塩基として有するヌクレオチドに置換することを含む前記方法、を提供する。
【０１４４】
核酸のハイブリダイゼーションについての熱力学的安定性を操作する核酸は、プローブ、プライマー、または分子内ハイブリダイゼーションする一本鎖核酸であってもよい。
【０１４５】
本発明者らは、核酸において、本発明の人工塩基対に隣接する天然型塩基対の種類に依存して、二本鎖核酸の熱安定性が変化することを見出した。このことから、二本鎖核酸において、式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドを導入することにより、当該二本鎖核酸の熱安定性がＧＣ含量に依存しないように変化させることができることを本発明者らは見出した。
【０１４６】
具体的には、核酸における式Ｉの人工塩基またはその誘導体を塩基として有するヌクレオチドの５’側の天然型塩基がＣ＞Ｔ＞Ｇ＞Ａの順で、該核酸を含む二本鎖核酸の熱安定性が低下していく。よって、例えば、天然型塩基で構成される二本鎖核酸の熱安定性を大きく変化させたい場合は、ＧまたはＡ塩基の３’側の塩基を式Ｉの人工塩基またはその誘導体と置換する。天然型塩基で構成される二本鎖核酸の熱安定性を小さく変化させたい場合は、ＣまたはＴ塩基の３’側の塩基を式Ｉの人工塩基またはその誘導体と置換する。
【０１４７】
上記の指標に基づいて、複数の二本鎖核酸において、二本鎖核酸の熱安定性をＧＣ含量に依存せず、一定となるようコントロールすることも可能である。このように、二本鎖核酸の熱安定性、すなわち、Ｔｍ値をコントロールできるので、複数の核酸の対を同時にハイブリダイズさせるマルチプレックス解析用のプローブの作成において、有用である。
【０１４８】
Ｔｍ値の測定は、当業者に公知の手法、例えば二本鎖核酸の吸光度変化から算出することが可能である。
【０１４９】
また、Ｄｓ（７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基）に関しては、図８に示すように、本発明者らは、Ｄｓを含む二本鎖ＤＮＡの配列からのＴｍ値の予測（Nearest-neighbor法による予測）に必要な自由エネルギーΔＧの値を算出した。また、算出したΔＧ値に基づいて予測したＤｓを含む二本鎖ＤＮＡのＴｍ値は、実験値とよい相関を示した（図９）。よって、上記のΔＧ値に基づいてＤｓを含む二本鎖ＤＮＡのＴｍ値を予測することが可能となったので、当業者は、所望のＴｍ値を有する核酸を得るために、核酸中のどの部分にＤｓを導入すればよいのかを決定することが可能である。
【実施例】
【０１５０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【０１５１】
試薬・溶媒など
試薬及び溶媒は、標準的な供給業者から購入し、さらに精製することなく使用した。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、２７０ＭＨｚ）および３１Ｐ−ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ）スペクトルは、ＢＲＵＫＥＲ  ＡＶ３００もしくはＪＥＯＬ核磁気共鳴スペクトロメーター上に記録した。合成したヌクレオシド誘導体は、分取用カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｂｏｎｄ  Ｓｐｈｅｒｅ，Ｃ１８，１９ｍｍ  ｘ  １５０ｍｍ、流速１０ｍｌ／分）、ヌクレオシド５’−三リン酸は、分取用カラム（ＰＥＧＡＳＩＬ  Ｃ８，センシュウ科学，１０ｍｍ  ｘ  １５０ｍｍ、流速６ｍｌ／分）を用いてＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステムで精製を行った。エレクトロスプレイ−イオン化マススペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）は、Ｗａｔｅｒｓ２６９０  ＬＣシステムを伴ったＷａｔｅｒｓ  ＺＭＤ  ４０００マスシステム上に記録した。蛍光スペクトルは、ＪＡＳＣＯ  ＦＰ６５００蛍光分光計により測定し、蛍光量子収率は、硫酸キニーネを標準にして決定した。【０１５２】
実施例１：７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）を塩基として有するヌクレオシド及びヌクレオチドの合成
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）を塩基として有するヌクレオシド及びヌクレオチド、例えば：
７−（２−チエニル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ｄＤｓ）；
７−（２−チエニル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ｒＤｓ）；
７−（２−チエニル）−３−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン  ２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイト（Ｄｓを塩基として有するデオキシリボヌクレオシドのホスホロアミダイト誘導体）；
７−（２−チエニル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン  ５’−三リン酸（ｄＤｓＴＰ）；及び
７−（２−チエニル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン  ５’−三リン酸（ｒＤｓＴＰ）；
等は、公知の手法、例えばＷＯ０７／０６６７３７に記載の方法に従って合成した。【０１５３】
実施例２：ヌクレオシドの合成；７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ｄＤｓｓ）および７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ｄＤｓｓｓ）の合成【０１５４】
【化３１】
2011043385.tif 000032
条件：
（ａ）５−トリブチルスタンニル−２，２’−ビチオフェン又は５−トリブチルスタンニル−２，２’、５’、２”−ターチオフェン、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２、ＤＭＦ；
（ｂ）Ｐｄ／Ｃ、ＮａＢＨ４、ピリジン、Ｈ２Ｏ；
（ｃ）ＨＣＯＯＨ；
（ｄ）ＮａＨ、２−デオキシ３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド、ＣＨ３ＣＮ、そしてＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２。
Ｒは２，２’−ビチエン−５−イル基又は２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル基である。【０１５５】
（２−１）４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミンおよび４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミンの合成
２，２’−ビチオフェン（８３０ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍｌ）溶液にｎ−ブチルリチウム（１．５７Ｍのヘキサン溶液３．２ｍｌ、５．０ｍｍｏｌ）を−７８℃で加えた。この溶液を−７８℃で３０分撹拌した後、トリブチルスタンニルクロリド（１．５ｍｌ）を加えた。反応溶液を室温で３０分間撹拌した後、水と酢酸エチルを用いて分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を濃縮したのち、２−アミノ−３−ニトロ−４−クロロピリジン（５１９ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１０５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１８ｍｌ）溶液に加えた。この溶液を１００℃で５時間撹拌したのち、酢酸エチルと水で分液した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち、減圧下で濃縮した。４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミン（８０９ｍｇ、８９％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％酢酸エチルの塩化メチレン溶液で溶出）で精製して得た。【０１５６】
４−（２，２’，５’，２”−ターチオフェン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミンの合成は、２，２’，５’，２”−ターチオフェン（１．２４  ｇ、  ５．０  ｍｍｏｌ）を用いて同じ反応により、２５０ｍｇ、２２％の収率で得た。【０１５７】
４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミン：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ8.19 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 7.60 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.41 (dd, 1H, J = 1.2, 3.6 Hz), 7.35 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.20 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.14 (dd, 1H, J = 3.6, 5.1 Hz), 6.97 (bs, 1H), 6.80 (d, 1H, J = 5.1 Hz)．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）  Ｃ１３Ｈ１０Ｎ３Ｏ２Ｓ２について（Ｍ＋Ｈ）＋  計算値：３０４．０２１４、実測値：３０４．０１７２．
４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミン：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ8.19 (d,1H,J=5.0 Hz), 7.57 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.40 (m, 3H), 7.32 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.22 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.13 (dd, 1H, J = 3.7, 5.1 Hz), 6.99 (bs, 2H), 6.80 (d, 1H, J = 5.0 Hz)．【０１５８】
（２−２）４−（２，２’−ビチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミンおよび４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミンの合成
４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミン（７６０  ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）とパラジウム（１０％カーボン）のピリジン（２５ｍｌ）溶液に、１Ｍ  ＮａＢＨ４（７．５ｍｌ）を０℃で加えた。０℃で３０分間撹拌したのち、５％アンモニウムクロリド水溶液を加えた。５分間撹拌したのち、溶液をろ過した。ろ液を塩化メチレンと水で分液した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮した。４−（２，２’−ビチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミン（４４８ｍｇ、６５％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製して得た。【０１５９】
４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミンの合成は、４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミン（２５０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を用いて同じ反応により、１０３ｍｇ、４５％の収率で得た。【０１６０】
４−（２，２’−ビチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミン：１Ｈ  ＮＭＲ  （３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ7.54 (dd, 1H, J = 7.54 Hz), 7.36-7.32 (m, 4H), 7.12 (dd, 1H, J = 3.6, 5.1 Hz), 6.51 (d, 1H, J = 5.3 Hz), 5.70 (bs, 2H), 4.77 (bs, 2H)．  ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ１３Ｈ１２Ｎ３Ｓ２について（Ｍ＋Ｈ）＋  計算値：２７４．０４７３、実測値：２７４．０４７０．
４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミン：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ7.55 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.39-7.29 (m, 6H), 7.12 (dd, 1H, J = 3.6, 5.1 Hz), 6.52 (d, 1H, J = 5.3 Hz), 5.71 (bs, 2H), 4.79 (bs, 2H)．【０１６１】
（２−３）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンおよび７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
４−（２，２’−ビチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミン（２７３ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）のギ酸（３．０ｍｌ）溶液を１４０℃で１２時間還流した。反応溶液を０℃に冷却して、２８％アンモニア水（５．０ｍｌ）を加えた。この溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧下で濃縮して７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（２７２ｍｇ、９６％）を得た。【０１６２】
７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンは、４−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）ピリジン−２，３−ジアミン（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を用いて同じ反応により、１０６ｍｇ、９９％の収率で得た。【０１６３】
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ13.25 (bs, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.32 (s, 1H, J = 5.2 Hz), 8.22 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.61 (d, 1H, J = 5.0 H), 7.59 (dd, 1H, J = 5.0, 6.2 Hz), 7.47 (dd, 1H, J = 1.1, 3.6 Hz), 7.45 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 7.15 (dd, 1H, J = 3.6, 5.1 Hz)．  ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ１４Ｈ１０Ｎ３Ｓ２について（Ｍ＋Ｈ）＋  計算値：２８４．０３１６、実測値：２８４．０３６５．
７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ13.25 (bs, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.33 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.23 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.62 (d, 1H, J = 5.3 H), 7.57 (dd, 1H, J = 1.2, 5.1 Hz), 7.50 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.44 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.40 (dd, 1H, J = 1.2, 3.6 Hz), 7.34 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.13 (dd, 1H, J = 3.6, 5.1)．【０１６４】
（２−４）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ｄＤｓｓ）および７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ｄＤｓｓｓ）の合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１４２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（１０ｍｌ）溶液に、ＮａＨ（２４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、鉱物油中６０％分散液）を加えた。反応溶液を室温で３０分、４０℃で３０分撹拌したのち、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド（２３３ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を室温で加えた。この反応溶液を室温で１２時間撹拌した後、酢酸エチルと水で分液し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下で濃縮した。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（２２７ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％  メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製して得た。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（２２７ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（３．５ｍｌ）とメタノール（３．５ｍｌ）溶液に、２８％  ＮａＯＣＨ３のメタノール溶液（２０８ｍｇ）を加えて、室温で３０分間撹拌した。反応溶液を、酢酸エチルと飽和塩化アンモニウム水溶液で分液し、有機層を水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（９０ｍｇ、４５％、２段階収率）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製後、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製により得た。【０１６５】
７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成は、７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を用いて（ＮａＨを加えて１２時間リフラックスすること以外）同じ反応により２２ｍｇ、１７％、２段階収率で得た。【０１６６】
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ8.77 (s, 1H), 8.35 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.23 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.68 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.60 (dd, 1H, J = 1.0, 5.1 Hz), 7.48-7.45 (m, 2H), 7.15 (dd, 1H, J = 3.7, 5.1 Hz), 6.54 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 5.34 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 5.11 (t, 1H, J = 5.8 Hz), 4.47 (m, 1H), 3.92 (m, 1H), 3.69-3.52 (m, 2H), 2.81 (m, 1H), 2.36 (ddd, 1H, J = 3.3, 6.2, 13.2 Hz)．１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） a147.06, 144.01, 143.65, 140.02, 136.11, 135.50, 131.45, 130.82, 129.95, 128.56, 126.24, 124.74, 124.55, 113.51, 87.89, 83.77, 70.78, 61.71, 39.39．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ１９Ｈ１８Ｎ３Ｏ３Ｓ２について（Ｍ＋Ｈ）＋  計算値：４００．０７９０、実測値：４００．０８１５．
７−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ8.77 (s, 1H), 8.36 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.24 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.70 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.57 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.51 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.45 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.40 (dd, 1H, J = 1.1, 3.6 Hz), 7.34 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.13 (dd, 1H, J = 3.6, 5.1 Hz), 6.54 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 5.34 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 5.11 (t, 1H, J = 5.3 Hz), 4.46 (m, 1H), 3.92 (m, 1H), 3.60 (m, 2H), 2.81 (m, 1H), 2.36 (ddd, 1H, J = 3.3, 6.2, 13.2 Hz)．【０１６７】
実施例３：ヌクレオシドの合成；２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｄｓｓ）および２−アミノ−６−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｄｓｓｓ）の合成【０１６８】
【化３２】
2011043385.tif 000033
条件：（ａ）５−トリブチルスタンニル−２，２’−ビチオフェン又は５−トリブチルスタンニル−２，２’，５’，２”−ターチオフェン、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＬｉＣｌ、ジオキサン；次いでＴＢＡＦ、ＴＨＦ。Ｒは２，２’−ビチエン−５−イル基又は２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル基である。【０１６９】
６−Ｏ−トシル−３’，５’−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−デオキシグアノシン（６５０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（５８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、リチウムクロリド（８４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）、および５−トリブチルスタニル−２，２’−ビチオフェン（５．０ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液を１２０℃で４．５時間還流した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧下で濃縮した。２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（５５０ｍｇ、８６％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製した。２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（５５０ｍｇ）のＴＨＦ（８．６ｍｌ）溶液に、１Ｍ  テトラブチルアンモニウムフルオリドのＴＨＦ溶液（２．６ｍｌ）を加えて、室温で１時間撹拌した。反応溶液を濃縮後、２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２６４ｍｇ、６４％、２段階収率）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーおよびＲＰ−ＨＰＬＣ精製により得た。【０１７０】
２−アミノ−６−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｄｓｓｓ）（４０５ｍｇ、８１％、２段階収率）は、５−トリブチルスタニル−２，２’，５’，２”−ターチオフェン（５．０ｍｍｏｌ）を用いて同じ反応により得た。【０１７１】
２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｄｓｓ）：  １Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ8.45 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 8.38 (s, 1H), 7.61 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.48-7.46 (m, 2H), 7.16 (dd, 1H, J = 3.7, 5.1 Hz), 6.57 (bs, 2H), 6.29 (t, 1H, J = 7.4 Hz), 5.30 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 4.98 (t, 1H, J = 5.5 Hz), 4.40 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.58 (m, 2H), 2.66 (m, 1H), 2.28 (m, 1H)．
２−アミノ−６−（２，２’，５’，２”−ターチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｄｓｓｓ）：  １Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ8.44 (d, 1H, J = 4 Hz), 8.37 (s, 1H), 7.56 (dd, 1H, J = 1.1, 4.9 Hz), 7.49 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.43 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.39 (dd, 1H, J = 1.0, 3.6 Hz), 7.32 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.12 (dd, 1H, J = 3.6, 4.9 Hz), 6.56 (bs, 2H), 6.28 (t, 1H, J = 6.9 Hz), 5.29 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.96 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 4.38 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.55 (m, 2H), 2.65 (m, 1H), 2.28 (m, 1H)．【０１７２】
実施例４：ヌクレオシドの合成；１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２−チエニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａ）、１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２−チアゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｖａ）、１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２−イミダゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｉａ）、１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａｓ）、１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａｖ）および１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｖａｓ）の合成【０１７３】
【化３３】
2011043385.tif 000034
【０１７４】
Ｒは、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、又は５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基。【０１７５】
試薬および略号：
（ａ）ｍＣＰＢＡ、ＥｔＯＡｃ、次いでメタンスルホニルクロリド、ＤＭＦ；
（ｂ）ＮａＩ、ＣＨ３ＣＯＣｌ、ＣＨ３ＣＮ；
（ｃ）ＮａＨ、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロリド、ＣＨ３ＣＮ；
（ｄ）ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、トリブチルスタンニル誘導体、ＤＭＦ；
（ｅ）ＮＨ３、メタノール又はＮａＯＭｅ、メタノール【０１７６】
（４−１）４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの合成
１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（５．３ｇ，４５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（４５ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（３０ｍｌ）に溶解したメタ−クロロ化安息香酸（１４ｇ，５４ｍｍｏｌ）溶液を０℃で撹拌しながら１時間かけて滴下して加えた。滴下後室温で３時間撹拌した後、０℃で静置した。結晶をろ過し、酢酸エチルで洗浄後、減圧下で乾燥した。これを水（３０ｍｌ）に溶解後、３０％Ｋ２ＣＯ３をｐＨ１０になるまで加え、室温で１時間、０℃で１時間静置した後、沈殿をろ過、エーテルで洗浄してＮ−オキシドを３．５ｇ（５８％）得た。Ｎ−オキシド（３．０ｇ、２２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１６ｍｌ）に溶解し５０℃で加熱した。メタンスルホニルクロリド（４．７ｍｌ，６０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６．４ｍｌ）溶液を７０℃で滴下し、この反応溶液を７５℃で２時間撹拌した。反応溶液を氷に加えた後、０℃で１０ＮのＮａＯＨを用いて中和した。室温で１時間撹拌し生成した沈殿をろ過して水で洗浄した後、６０℃で減圧乾燥して目的とする４−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを２．７ｇ（８０％）得た。４−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２．７ｇ、１８ｍｍｏｌ）、ＮａＩ（１３ｇ、８８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２８ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌しながらＣＨ３ＣＯＣｌ（３．５ｍｌ、５０ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を８５℃で１２時間加熱した。反応溶液を室温に戻した後、１０％Ｎａ２ＣＯ３（２８ｍｌ）、１０％ＮａＨＳＯ３（２８ｍｌ）を加えて室温で１５分撹拌した。酢酸エチルを加えて分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムで精製して４−ヨード−１−Ｎ−アセチル−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２．０ｇ）ならびに４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２．３ｇ）を得た。４−ヨード−１−Ｎ−アセチル−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２．０ｇ、７．０ｍｍｏｌ）は、エタノール（７０ｍｌ）に溶解し、メタノール中２８％ナトリウムメトキシド（１．４ｍｌ、７．０ｍｍｏｌ）を加えて１時間還流した。反応溶液を濃縮後、酢酸エチルと飽和アンモニウムクロリド水溶液で分液し、有機層を飽和アンモニウムクロリド水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮後、先に得られた４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２．３ｇ）とあわせてエタノールで再結晶して４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（４．０ｇ，９２％）を得た。【０１７７】
４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ12.01 (s, 1H), 7.89 (d, 1H, J = 5.0 Hz), 7.59 (t, 1H, J = 3.1 Hz), 7.51 (d, 1H, J = 5.0 Hz), 6.27 (d, 1H, J = 3.4 Hz)．【０１７８】
（４−２）１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−ヨード−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの合成
４−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（９５０  ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３９ｍｌ）溶液に、ＮａＨ（１５６ｍｇ、６０％油中分散液、３．９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−エリスロペントフラノシルクロリド（１．８ｇ、１．２当量）を加えて室温で１．５時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと飽和アンモニウムクロリド水溶液で分液し、有機層を飽和アンモニウムクロリド水溶液と飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製して１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−ヨード−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを１．８ｇ（７７％）得た。【０１７９】
（４−３）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−チエニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａ）および１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−チアゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｖａ）の合成
１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−ヨード−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７１５ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）とジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（４２ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１２ｍｌ）溶液に２−（トリブチルスタンニル）チオフェン（６０１μｌ，１．８ｍｍｏｌ）を加えて１００℃で１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムで精製してトルイル体を５８６ｍｇ（８８％）得た。１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−チエニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（５８０ｍｇ）にメタノリックアンモニア（５０ｍｌ）を加えてトルオイル基の脱保護を室温１２時間で行い、シリカゲルカラムで精製後、最終精製をＨＰＬＣで行い１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−チエニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを３０４  ｍｇ（９１％）得た。ｄＤｖａの合成は、２−（トリブチルスタンニル）チアゾールを用いた以外は同様に行い、１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−チアゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（４４９ｍｇ，８１％）、並びに１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−チアゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２４５  ｍｇ，９７％）をそれぞれ得た。【０１８０】
ｄＤｓａ：  １Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 8.27 (d, 1H, J=5.1 Hz), 7.87 (d, 1H, J=3.8 Hz), 7.83 (d, 1H, J=3.6 Hz), 7.79 (d, 1H, J=5.1 Hz), 7.41 (d, 1H, J=5.0 Hz), 7.28 (dd, 1H, J=3.7 and 5.0 Hz), 6.93 (d, 1H, J=3.8 Hz), 6.76 (dd, 1H, J=6.0 and 8.2 Hz), 5.28 (d, 1H, J=4.1 Hz), 5.02 (t, 1H, J=5.6 Hz), 4.39 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.56 (m, 2H), 2.57 (m, 1H), 2.26 (m,1H).
ｄＤｖａ：  １Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ 8.38 (d, 1H, J=5.1 Hz), 8.13 (d, 1H, J=3.2 Hz), 8.01 (d, 1H, J=3.2 Hz), 7.96 (d, 1H, J=3.7 Hz), 7.72 (d, 1H, J=5.1 Hz), 7.15 (d, 1H, J=3.7 Hz), 6.79 (dd, 1H, J=6.1 and 8.0 Hz), 5.29 (d, 1H, J=4.0 Hz), 4.50 (t, 1H, J=5.5 Hz), 4.40 (m, 1H), 3.86 (m, 1H), 3.57 (m, 2H), 2.58 (m, 1H), 2.26 (m, 1H).【０１８１】
（４−４）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−イミダゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｉａ）の合成
１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−ヨード−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（５９６ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）とリチウムクロリド（４２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（５８ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）のジオキサン（１０ｍｌ）溶液に、Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２−（トリブチルスタニル）イミダゾール（９３０ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）を加えて１２０℃で４時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、シリカゲルカラムで精製したのち、メタノリックアンモニア（３０ｍｌ）を加えて、室温で２４時間撹拌した。反応溶液を濃縮後、シリカゲルカラムで精製後、ＨＰＬＣで精製を行い１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２−イミダゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを２１８ｍｇ（５４％、２段階収率）得た。１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２−イミダゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２００ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）を８０％酢酸に溶解し、６０℃で３時間撹拌した。反応溶液を濃縮後、アンモニア水を加えてさらに濃縮した後、ＨＰＬＣで精製して１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−イミダゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｉａ：１０９ｍｇ，  ７４％）を得た。【０１８２】
ｄＤｉａ：  １Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ 12.81 (s, 1H), 8.30 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 7.79 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 7.60 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 7.39 (s, 1H), 7.30 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 7.22 (s, 1H), 7.74 (dd, 1H, J = 5.9 Hz), 5.27 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 5.03 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 4.38 (m, 1H), 3.84 (m, 1H), 3.57 (m, 2H), 2.55 (m, 1H), 2.22 (m, 1H).【０１８３】
（４−５）１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａｓ）の合成
２−トリブチルスタニル−５，２−ビチオフェン（０．３ｍｍｏｌ）、１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−ヨード−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（１２０ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）、ジクロロビストリフェニルフォスフィンパラジウム（７ｍｇ）のＤＭＦ（２ｍｌ）の溶液を１００℃で１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮してシリカゲルカラムにより精製して、１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを得た。これを、塩化メチレン（１０ｍｌ）とメタノール（２ｍｌ）に溶解し、２８％ナトリウムメチラート（０．１２ｍｌ）を加えて室温で３０分撹拌した。シリカゲルカラムならびにＨＰＬＣにより精製して１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａｓ、５４ｍｇ、６８％）を得た。【０１８４】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ8.26 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 7.88 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.80 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.58 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.44 (m, 3H), 7.14 (dd, 1H, J = 3.7, 5.1 Hz), 6.96 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 6.75 (dd, 1H, J = 6.1, 8.1 Hz), 5.26 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 5.00 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 4.39 (m, 1H), 3.84 (m, 1H), 3.56 (m, 2H), 2.59 (m, 1H), 2.23 (m, 1H)．【０１８５】
（４−６）１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａｖ）の合成
２−ブロモチアゾール（０．９ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）、ジクロロビストリフェニルフォスフィンパラジウム（３５０ｍｇ）のＤＭＦ（５０ｍｌ）の溶液に２−トリブチルスタンニルチオフェン（３．５ｍｌ、１１ｍｍｏｌ）を加え、９０℃で３時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、酢酸エチルと水で分液後、飽和食塩水で有機層を洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を濃縮後シリカゲルカラムで精製して２，２’−チエニルチアゾール（１．４ｇ，８７％）で得た。２，２’−チエニルチアゾール（２５１ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５ｍｌ）の溶液を−７８℃に冷却し、ｎ−ブチルリチウム（０．９６ｍｌ，１．５ｍｍｏｌ，１．５７Ｍヘキサン溶液）を加え、−７８℃で３０分間撹拌した。これにトリメチルシリルクロリド（１．５ｍｍｏｌ、０．１９ｍｌ）を加えて−７８℃で３０分間撹拌した。さらにｎ−ブチルリチウム（０．９６ｍｌ、１．５ｍｍｏｌ、１．５７Ｍヘキサン溶液）を加え、−７８℃で３０分間撹拌した後、トリブチルスタンニルクロリド（０．４５ｍｌ、１．６ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮してシリカゲルカラムにより精製して、２−トリブチルスタンニル−５−（５’−トリメチルシリル−２−チエニル）チオフェン（７３５ｍｇ）を得た。１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−ヨード−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２９８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、ジクロロビストリフェニルフォスフィンパラジウム（１８ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍｌ）の溶液に、２−トリブチルスタンニル−５−（５’−トリメチルシリル−２−チエニル）チオフェン（３９７ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮してシリカゲルカラムにより精製して、１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−（２−（５−（５’−トリメチルシリル−２−チエニル）チオフェン）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（３３５ｍｇ）を得た。これを、塩化メチレン（５ｍｌ）とメタノール（５ｍｌ）に溶解し、２８％ナトリウムメチラート（２９０ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分撹拌した。反応溶液にアンモニウムクロリド（８０ｍｇ）を加えて濃縮した後、シリカゲルカラムならびにＨＰＬＣにより精製して１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｓａｖ，１１２ｍｇ）ならびに、１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−［２−（２−チエニル）チアゾール−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｖ’ａｓ、２６ｍｇ）を得た。【０１８６】
ｄＤｓａｖ：  １Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  8.30 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 7.91 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.87 (m, 2H), 7.79 (m, 2H), 7.48 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 6.96 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 6.76 (dd, 1H, 6.1, 8.0 Hz), 5.27 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 4.99 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 4.38 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.56 (m, 2H), 2.56 (m, 1H), 2.24 (m, 1H)．
ｄＤｖ’ａｓ：  １Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  8.51 (s, 1H), 8.30 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 7.93 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.79 (m, 2H), 7.47 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 7.22 (dd, 1H, J = 4.0, 4.9 Hz), 7.94 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 6.75 (dd, 1H, J = 6.2, 7.9 Hz), 5.27 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 4.99 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 3.38 (m, 1H), 3.59 (m, 2H), 2.57 (m, 1H), 2.24 (m, 1H).【０１８７】
（４−７）１−［２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（ｄＤｖａｓ）の合成
５−（２−チエニル）チアゾール（０．４ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル溶液を−７８℃に冷却し、ｎ−ブチルリチウム（０．４ｍｍｏｌ、１．５７Ｍ  ヘキサン溶液）を加えて−７８℃で３０分間撹拌した。トリブチルスタニルクロリドを加えた後、室温で３０分間撹拌し、反応溶液を酢酸エチルと水で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄濃縮後、１−［２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（トルオイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−４−ヨード−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（１２０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、クロロビストリフェニルフォスフィンパラジウム（５％  ｍｏｌ）、ＤＭＦ（２ｍｌ）を加えて１００℃で１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、飽和食塩水と水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。シリカゲルカラムで精製後、ナトリウムメトキシド（１．６ｍｌ）を加えて室温で３０分間撹拌し、シリカゲルカラムで精製後、ＨＰＬＣで精製してｄＤｖａｓヌクレオシド（３４ｍｇ）を得た。【０１８８】
ｄＤｖａｓ  ：  １Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  8.37 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 8.31 (s, 1H), 7.96 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.68 (m, 2H), 7.54 (dd, 1H, J = 1.1, 3.6 Hz), 7.19 (dd, 1H, 3,7, 5,1 Hz), 7.15 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 6.77 (dd, 1H, J = 6.1, 8.0 Hz), 5.28 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 4.98 (t, 1H, J = 5.5 Hz), 4.38 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.56 (m, 2H), 2.57 (m, 1H), 2.49 (m, 1H)．【０１８９】
実施例５：アミダイト合成（ｄＤｓｓ及びｄｓｓ）【０１９０】
【化３４】
2011043385.tif 000035
条件：
（ａ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ｄＤｓｓについてピリジン、トリメチルシリルクロリド、フェノキシアセチルクロリド、ヒドロキシベンゾトアゾール、ピリジン、ＣＨ３ＣＮ、次いでＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン
（ｂ）２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイト、ジイソプロピルアミン、ＴＨＦ。【０１９１】
（５−１）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成。
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ｄＤｓｓ）（２６２ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸乾燥した後、ピリジン（７．０ｍｌ）に溶解させ４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（３６７ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ  ［４，５−ｂ］ピリジン（４０８ｍｇ、８９％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製して得た。【０１９２】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  8.66 (s, 1H), 8.30 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.22 (d, 1H, J = 3.9 hz), 7.67 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.60 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.48-7.46 (m, 2H), 7.34-7.31 (m, 2H), 7.24-7.14 (m, 8H), 6.80 8d, 2H, J = 9.0 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 6.55 (t, 1H, J = 6.3 Hz), 5.39 (d, 1H, J = 4.6 Hz), 4.51 (m, 1H), 3.70 および 3.67 (s, s, 6H), 3.19 (m, 2H), 2.96 (m, 1H), 2.41 (m, 1H)．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ４０Ｈ３５Ｎ３Ｏ５Ｓ２Ｎａについて  （Ｍ＋Ｎａ）＋  計算値：７２４．１９１６、実測値：７２４．１９７８【０１９３】
（５−２）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン  ２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイトの合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（２０３ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）は、ピリジンで３回、ＴＨＦで３回共沸乾燥した。これにジイソプロピルエチルアミン（７６μｌ、０．４３  ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（１．５ｍｌ）を加えて、最後に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイト（７８μｌ、０．３５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液にメタノール（５０μｌ）を加え、ＥｔＯＡｃ：ＴＥＡ（２０：１、ｖ／ｖ、２０ｍｌ）で希釈した。５％炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、有機層を減圧下で濃縮した。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン  ２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイト（２６０ｍｇ、９９％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％トリエチルアミンを含む塩化メチレンとヘキサン２：３の溶液で溶出）で精製して得た。【０１９４】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  8.33-8.30 (m, 2H), 8.11 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.47-7.41 (m, 3H), 7.35-7.17 (m, 10H), 7.07 (dd, 1H, J = 3.6, 5.1 Hz), 6.82-6.76 (m, 4H), 6.62 (m, 1H), 4.80 (m, 1H), 4.34 (m, 1H), 3.91-3.78 (m, 10H), 3.49-3.32 (m, 2H), 2.94 (m, 1H), 2.73 (m, 1H), 2.64 (t, 1H, J = 6.5 Hz), 2.48 (t, 1H, J = 6.4 Hz), 1.23-1.12 (m, 12H)．
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  １４９．４７および１４９．２９  （ジアステレオ異性体）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ４９Ｈ５２Ｎ５Ｏ６Ｓ２ＰＮａについて（Ｍ＋Ｎａ）＋  計算値：９２４．２９９４、実測値：９２４．３３２８．【０１９５】
（５−３）２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリンの合成
２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｓｓ）（２０８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸した後、ピリジン（２．５ｍｌ）に溶解し、トリメチルシリルクロリド（４７６μｌ、  ３．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分撹拌した（溶液Ａ）。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１２２ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸した後、ピリジン（０．２５ｍｌ）とアセトニトリル（０．２５ｍｌ）に溶解し、この溶液を０℃に冷却して、フェノキシアセチルクロリド（１０４μｌ，  ０．７５ｍｍｏｌ）を加えて５分間撹拌した（溶液Ｂ）。溶液Ｂに溶液Ａを０℃で加え、室温で１２時間撹拌した。反応溶液を０℃に冷却し、１４％アンモニア水溶液（０．５ｍｌ）を加えて１０分撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮した。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２４６ｍｇ、８９％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％メタノールの塩化メチレンで溶出）で精製して得た。【０１９６】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ  10.77 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 8.55 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.65 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.54 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.51 (dd, 1H, J = 1.1, 3.6 Hz), 7.34-7.29 (m, 2H), 7.17 (dd, 1H, J = 5.7, 5.1 Hz), 7.01-6.94 (m, 3H), 6.41 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 5.35 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 5.10 (s, 2H), 4.93 (t, 1H, J = 5.5 Hz), 4.46 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.59 (m, 2H), 2.79 (m, 1H), 2.35 (m, 1H)．【０１９７】
（５−４）２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリンの合成
２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２４０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸乾燥した後、ピリジン（４．４ｍｌ）に溶解させ４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１６３ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（３１４ｍｇ、８４％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製して得た。【０１９８】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ  10.72 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 8.56 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.65 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.55 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.52 (dd, 1H, J = 1.1, 3.6 Hz), 7.34-7.27 (m, 4H), 7.19-7.12 (m, 8H), 7.00-6.95 (m, 3H), 6.75 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 6.69 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 6.45 (t, 1H, J = 5.8 Hz), 5.33 (d, 1H, J = 4.7 Hz), 5.05 (m, 2H), 4.55 (m, 1H), 4.01 (m, 1H), 3.67, 3.64 (s, s, 6H), 3.30 (m, 1H, H2O シグナルピークと重なる), 3.12 (m, 1H), 2.95 (m, 1H), 2.40 (m, 1H)．【０１９９】
（５−５）２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン  ２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイトの合成
２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（３１０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）は、ピリジンで３回、ＴＨＦで３回共沸乾燥した。これにジイソプロピルエチルアミン（９５μｌ、０．５５ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（１．８ｍｌ）を加えて、最後に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイト（９８μｌ、０．４４ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液にメタノール（５０μｌ）を加え、ＥｔＯＡｃ：ＴＥＡ（２０：１、ｖ／ｖ、２０ｍｌ）で希釈した。５％炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、有機層を減圧下で濃縮した。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン  ２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイト（３７０ｍｇ、９７％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％トリエチルアミンを含む塩化メチレンとヘキサン２：３の溶液で溶出）で精製して得た。【０２００】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  8.59, 8.58 (s, s, 1H), 8.22 (d, 1H, J = 4.4 Hz), 7.39-7.17 (m, 14H), 7.13-7.05 (m, 4H), 6.82-6.75 (m, 4H), 6.50 (t, 1H, J = 6.6 Hz), 4.94 (bs, 2H), 4.80 (m, 1H), 4.34 (m, 1H), 3.94-3.55 (m, 4H), 3.77 (s, 6H), 3.45-3.40 (m, 2H), 2.93 (m, 1H), 2.80-2.66 (m, 1H), 2.65 (t, 1H, J = 6.4 Hz), 2.48 (t, 1H, J = 6.4 Hz), 1.22-1.11 (m, 12H)．
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  １４９．５７．【０２０１】
実施例６：アザインドール系ヌクレオシド（ｄＤｓａ、ｄＤｖａ、ｄＤｉａ）のアミダイト合成【０２０２】
【化３５】
2011043385.tif 000036
ｄＤｓａアミダイト：Ｘ＝ＣＨ、Ｙ＝Ｓ
ｄＤｖａアミダイト：Ｘ＝Ｎ、Ｙ＝Ｓ
ｄＤｉａアミダイト：Ｘ＝Ｎ、Ｙ＝ＮＨ【０２０３】
ｄＤｓａ（３００ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸乾燥した後、ピリジン（９．０ｍｌ）に溶解させ４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（３８６ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。ｄＤｓａのジメトキシトリチル体（５７０ｍｇ，９７％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０％酢酸エチルの塩化メチレン溶液で溶出）で精製して得た。ｄＤｖａのジメトキシトリチル体（４２４ｍｇ，９９％），ｄＤｉａのジメトキシトリチル体（２００ｍｇ，９５％）をそれぞれ同じ方法により得た。【０２０４】
ｄＤｓａのジメトキシトリチル体（２９０ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）は、ピリジンで３回、ＴＨＦで３回共沸乾燥した。これにジイソプロピルエチルアミン（１２３μｌ，０．７ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（２．４ｍｌ）を加えて、最後に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイト（１１５μｌ，０．５２ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液にメタノール（５０μｌ）を加え、ＥｔＯＡｃ：ＴＥＡ（２０：１，ｖ／ｖ，２０ｍｌ）で希釈した。５％炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、有機層を減圧下で濃縮した。ｄＤｓａのホスホロアミダイト体（ｄＤｓａアミダイト：３４５ｍｇ、９０％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％トリエチルアミンを含む塩化メチレンとヘキサン２：３の溶液で溶出）で精製して得た。ｄＤｖａアミダイトならびにｄＤｉａアミダイトはそれぞれ、同じ方法により合成し、２２７ｍｇ（ｄＤｖａアミダイト，８６％）、１２５ｍｇ（ｄＤｉａアミダイト，９３％）得た。【０２０５】
ｄＤｓａアミダイト：  １Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  8.26 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 7.83 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 7.79 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 7.72 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.43 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 7.37 (m, 2H), 7.29-7.18 (m, 8H), 6.93 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 6.85-6.79 (m, 4H), 7.75 (t, 1H, J = 7.0 Hz), 4.69 (m, 1H), 4.13-4.06 (m, 1H), 3.82-3.59 (m, 10H), 3.31-3.16 (m, 2H), 2.83 (m, 1H), 2.78 (t, 1H, J = 5.9 Hz), 2.68 (t, 1H, J = 5.9 Hz), 1.17-1.04 (m, 12H).  ３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  148.82, 148.21.
ｄＤｖａアミダイト：  １Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  8.36 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 8.13 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 8.01 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 7.81 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 7.73 (d, 1H, J = 5.0 Hz), 7.37 (m, 1H), 7.29-7.19 (m, 7H), 7.14 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 6.85-6.75 (m, 5H), 4.70 (m, 1H), 4.13-4.07 (m, 1H), 3.82-3.52 (m, 10H), 3.31-3.15 (m, 2H), 2.85 (m, 1H), 2.78 (t, 1H, J = 5.9 Hz), 2.69 (t, 1H, J = 5.9 Hz), 2.49 (m, 1H), 1.17-1.06 (m, 12H).  ３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  148.85, 148.22.
ｄＤｉａアミダイト：  １Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  9.79 (bs, 1H), 8.34 (m, 1H), 7.56-7.20 (m, 12H), 6.98 (m, 1H), 6.87 (m, 1H), 6.76 (m, 4H), 4.75 (m, 1H), 4.24 (m, 1H), 3.84-3.40 (m, 13H), 2.71 (m, 1H), 2.60 (t, 1H, J = 6.6 Hz), 2.44 (t, 1H, J = 6.6 Hz) 1.19-1.07 (m, 12H).  ３１Ｐ  ＮＭＲ（１０９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  149.22, 149.05.【０２０６】
実施例７：デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（ｄＤｓｓＴＰ）の合成【０２０７】
【化３６】
2011043385.tif 000037
条件：
（ａ）無水酢酸、ピリジン、次いでジクロロ酢酸、ＣＨ２Ｃｌ２
（ｂ）クロロ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン、ジオキサン、ピリジン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリブチルアンモニウム）ピロホスフェート、Ｉ２、Ｈ２Ｏ、２８％ＮＨ４ＯＨ【０２０８】
（７−１）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−３−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１９５ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸乾燥したのち、ピリジン（２．８ｍｌ）に溶解し、無水酢酸（１０５μｌ、１．１ｍｍｏｌ）を加えて室温で１２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。残渣をトルエンで共沸乾燥した後、塩化メチレン（２８ｍｌ）に溶解させ、ジクロロ酢酸（２８０μｌ）を０℃で加えて１５分撹拌した。反応溶液に５％炭酸水素ナトリウムを加えて分液した後、有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液ならびに飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−３−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１１５ｍｇ、９３％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％メタノールの塩化メチレンで溶出）で精製して得た。【０２０９】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  8.79 (s, 1H), 8.37 (d, 1H, J = 4.7 Hz), 8.24 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.71 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.60 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.48 (m, 2H), 7.16 (dd, 1H, J = 3.7, 5.1 Hz), 6.55 (dd, 1H, J = 5.9, 8.7 Hz), 5.41 (d, 1H, J = 5.8 Hz), 5.31 (t, 1H, J = 5.2 Hz), 4.13 (m, 1H), 3.71-3.63 (m, 10H), 3.71-3.63 (m, 2H), 3.06 (m 1H), 2.53 (m, 1H), 2.11 (s, 3H)．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ２１Ｈ２０Ｎ３Ｏ４Ｓ２について（Ｍ＋Ｈ）＋  計算値：４４２．０８９５、実測値：４４２．０８６９．【０２１０】
（７−２）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン  ５’−三リン酸の合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−３−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（４４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を、ピリジンで共沸乾燥した後、ピリジン（１００μｌ）とジオキサン（１００μｌ）に溶解させ、２−クロロ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンの１Ｍジオキサン溶液（１１０μｌ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えて１０分撹拌した。この溶液にトリブチルアミン（１００μｌ）とビス（トリブチルアンモニウム）ピロフォスフェートの０．５Ｍ  ＤＭＦ溶液（３００μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１０分撹拌した。１％  ヨウ素のピリジン／水（９８：２、ｖ／ｖ、２．０ｍｌ）を加えて１５分撹拌した後、亜硫酸水素ナトリウムの５％水溶液（１５０μｌ）を加えた。水（５．０ｍｌ）を加えて、３０分撹拌した後、２８％アンモニア水（２０ｍｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮した後、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン  ５’−三リン酸（３３μｍｏｌ、３３％）は、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ａ−２５）カラムクロマトグラフィー（５０ｍＭから１．０Ｍ  ＴＥＡＢ溶液で溶出）ならびにＣ１８−ＨＰＬＣ  （０％から５０％  アセトニトリルの１００ｍＭ  ＴＥＡＡにより溶出）により精製して得た。【０２１１】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ  8.49 (s, 1H), 8.08 (d, 1H, J = 5.4 Hz), 7.58 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.33-7.30 (m, 2H), 7.06 (dd, 1H, J = 1.1, 4.7 Hz), 6.99 (dd, 1H, J = 3.7, 5.1 Hz), 6.91 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 6.29 (t, 1H, J = 6.9 Hz), 4.68 (m, 1H, D2Oと重なる), 4.18 (m, 1H), 4.10-4.02 (m, 2H), 3.05 (q, 22H, J = 7.3 Hz), 2.68 (m, 1H), 2.41 (m, 1H), 1.14 (t, 34H, J = 7.3 Hz)．
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ  -9.71 (d, 1P, J = 19.8 Hz), -10.72 (d, 1P, J = 19.8 Hz), -22.54 (t, 1P, J = 20.0 Hz)．
１０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ７．０）中のＵＶ−ｖｉｓスペクトルデータ、λｍａｘ＝２６４ｎｍ（ε９９００）、３６８ｎｍ（ε３１４００）．
ＥＳＩ−ＭＳ（Ｃ１９Ｈ２０Ｎ３Ｏ１２Ｓ２Ｐ３）；計算値：６３７．９６（Ｍ−Ｈ）−、実測値：６３７．８７（Ｍ−Ｈ）−．【０２１２】
実施例８：リボヌクレオシド５’−三リン酸（ＤｓｓＴＰ）の合成【０２１３】
【化３７】
2011043385.tif 000038
条件：
（ａ）テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノース、クロロ酢酸
（ｂ）（ｉ）ＤＭＴｒＣｌ、ピリジン；（ｉｉ）無水酢酸、ピリジン、次いでジクロロ酢酸、ＣＨ２Ｃｌ２；
（ｃ）２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン、ジオキサン、ピリジン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェート、ＤＭＦ、次いでＩ２／ピリジン／Ｈ２Ｏ【０２１４】
（８−１）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン  （５６６ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とテトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノース（７００ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）およびクロロ酢酸（１２ｍｇ）を２００℃で１０分間溶融させた。冷却した後、塩化メチレンとメタノール（１：１、ｖ／ｖ、１６ｍｌ）に溶解させ、２８％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（２．０ｍｌ）を加えて室温で３０分撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮した後、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１９０ｍｇ、２３％）を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）ならびにＣ１８−ＨＰＬＣで精製して得た。【０２１５】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  8.80 (s, 1H), 8.36 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.24 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.70 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 6.60 (dd, 1H, J = 1.0, 5.1 Hz), 7.49-7.46 (m, 2H), 7.16 (dd, 1H, J = 3.7, 5.1 Hz), 6.09 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 5.51 (d, 1H, J = 6.0 Hz), 5.26 (dd, 1H, J = 5.0, 6.4 Hz), 5.21 (d, 1H, J = 4.9 Hz), 4.68 (m, 1H), 4.20 (m, 1H), 3.75-3.55 (m, 2H)．
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ 147.25, 144.04, 143.94, 140.10, 136.09, 135.43, 131.58, 130.89, 130.03, 128.57, 126.27, 124.78, 124.57, 113.60, 87.83, 85.57, 73.49, 79.41, 61.41．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ１９Ｈ１８Ｎ３Ｏ４Ｓ２について（Ｍ＋Ｈ）＋  計算値：４１６．０７３９、実測値：４１６．０７５５．  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｃ１９Ｈ１７Ｎ３Ｏ４Ｓ２）；  計算値：４１６．０７（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値：４１５．８６（Ｍ＋Ｈ）＋．【０２１６】
（８−２）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１６６ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸乾燥した後、ピリジン（４．０ｍｌ）に溶解させ、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１６２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウムで分液し、有機層を水ならびに飽和食塩水で洗浄し、減圧下で濃縮した。ジメトキシトリチル体は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製した後、ピリジンで３回共沸乾燥した。これに、ピリジン（４ｍｌ）を加え、無水酢酸（１５１μｌ、１．６ｍｍｏｌ）を加えて室温で１２時間撹拌した。反応溶液は、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウムで分液し、有機層を水ならびに飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。トルエンで共沸乾燥した後、塩化メチレン（４０ｍｌ）に溶解させ、ジクロロ酢酸（４００μｌ）を０℃で加えて１５分撹拌した。反応溶液に５％炭酸水素ナトリウムを加えて分液した後、有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液ならびに飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１７８ｍｇ、８９％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．５％メタノールの塩化メチレンで溶出）で精製して得た。【０２１７】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  8.83 (s, 1H), 8.38 (d, 1H, J = 5.3 Hz), 8.25 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.73 (d, 1H, J = 5.3 Hz), 7.61 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.50-7.47 (m, 2H), 7.16 (dd, 1H, J = 3.7, 5.1 Hz), 6.39 (d, 1H, J = 6.7 Hz), 6.04 (dd, 1H, J = 5.7, 6.6 Hz), 5.58-5.53 (m, 2H), 4.28 (m, 1H), 3.81-3.63 (m, 2H)2.15 (s, 3H), 2.00 (s, 3H)．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ、３−ＮＢＡマトリクス）Ｃ２３Ｈ２２Ｎ３Ｏ６Ｓ２について（Ｍ＋Ｈ）＋  計算値：５００．０９５０、実測値：５００．０９２９．【０２１８】
（８−３）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン  ５’−三リン酸の合成
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（３−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（５０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を、ピリジンで共沸乾燥した後、ピリジン（１００μｌ）とジオキサン（１００μｌ）に溶解させ、２−クロロ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンの１Ｍジオキサン溶液（１１０μｌ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えて１０分撹拌した。この溶液にトリブチルアミン（１００μｌ）とビス（トリブチルアンモニウム）ピロフォスフェートの０．５Ｍ  ＤＭＦ溶液（３００μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１０分撹拌した。１％ヨウ素のピリジン／水（９８：２、ｖ／ｖ、２．０ｍｌ）を加えて１５分撹拌した後、亜硫酸水素ナトリウムの５％水溶液（１５０μｌ）を加えた。水（５．０ｍｌ）を加えて、３０分撹拌した後、２８％アンモニア水（２０ｍｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮した後、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン  ５’−三リン酸（２６μｍｏｌ、２６％）は、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ａ−２５）カラムクロマトグラフィー（５０ｍＭから１．０Ｍ  ＴＥＡＢ溶液ならびに１０％アセトニトリルの１Ｍ  ＴＥＡＢ溶液で溶出）ならびにＣ１８−ＨＰＬＣ（０％から５０％アセトニトリルの１００ｍＭ  ＴＥＡＡにより溶出）により精製して得た。【０２１９】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ  8.64 (s, 1H), 8.14 (d, 1H, J = 5.4 Hz), 7.75 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.44 (d, 1H, J = 5.4 Hz), 7.30 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.15 (dd, 1H, J = 1.1, 3.6 Hz), 7.10 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 6.97 (dd, 1H, J = 3.7, 5.1 Hz), 6.12 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.74 (m, 1H, Ｄ２Ｏと重なる), 4.53 (m, 1H), 4.33 (m, 1H), 4.26-4.12 (m, 2H), 3.08 (q, 26H, J = 7.4 Hz), 1.16 (t, 38H, J = 7.3 Hz)．
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ  -9.56 (d, 1P, J = 19.7 Hz), -10.69 (d, 1P, J = 20.0 Hz), -22.44 (t, 1P, J = 20.0 Hz)．
１０  ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中でのＵＶ−ｖｉｓスペクトルデータ、λｍａｘ＝２６４ｎｍ（ε１０１００）、３６８ｎｍ（ε３１８００）．
ＥＳＩ−ＭＳ（Ｃ１９Ｈ２０Ｎ３Ｏ１３Ｓ２Ｐ３）；計算値：６５３．９６（Ｍ−Ｈ）−、実測値：６５３．９９（Ｍ−Ｈ）−【０２２０】
実施例９：リボヌクレオシド５’−三リン酸（ｒｓｓＴＰ）の合成【０２２１】
【化３８】
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条件：
（ａ）５−トリブチルスタンニル−２，２’−ビチオフェン、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＬｉＣｌ、ジオキサン、次いでＴＢＡＦ、ＴＨＦ
（ｂ）トリメチルシリルクロリド、フェノキシアセチルクロリド、ヒドロキシベンゾトリアゾール、ピリジン、ＣＨ３ＣＮ、次いでＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン
（ｃ）無水酢酸、ピリジン
（ｄ）ジクロロ酢酸、ＣＨ２Ｃｌ２
（ｅ）クロロ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン、ジオキサン、ピリジン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリブチルアンモニウム）ピロホスフェート、Ｉ２、Ｈ２Ｏ、２８％ＮＨ４ＯＨ【０２２２】
（９−１）２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｒｓｓ）の合成
６−Ｏ−トシル−２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ｔｅｒ−ブチルジメチルシリル−グアノシン（７８０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（５８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、リチウムクロリド（８４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）、および５−トリブチルスタンニル−２，２’−ビチオフェン（５．０ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液を１２０℃で５時間還流した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧下で濃縮した。２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ｔｅｒ−ブチルジメチルシリル−２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリンは、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（塩化メチレンで溶出）で精製した。２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ｔｅｒ−ブチルジメチルシリル−２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリンのＴＨＦ（５．５ｍｌ）溶液に、１ＭテトラブチルアンモニウムフルオリドのＴＨＦ溶液（４．５ｍｌ）を加えて、室温で３０分撹拌した。反応溶液を濃縮後、２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（３９１ｍｇ、９０％、２段階収率）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーおよびＲＰ−ＨＰＬＣ精製により得た。【０２２３】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  8.46 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 8.41 (s, 1H), 7.61 (dd, 1H, J = 1.1, 5.1 Hz), 7.49-7.46 (m, 2H), 7.16 (dd, 1H, J = 3.7, 5.1 Hz), 6.58 (bs, 2H), 5.87 (d, 1H, J = 5.9 Hz), 5.47 (d, 1H, J = 5.9 Hz), 5.47 (d, 1H, J = 6.0 Hz), 5.17 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 5.08 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 4.53 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.93 (m, 1H), 3.70-3.53 (m, 2H)．【０２２４】
（９−２）２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２’，３’−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリンの合成
２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２１６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸した後、ピリジン（２．５ｍｌ）に溶解し、トリメチルシリルクロリド（６３５μｌ、５．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分撹拌した（溶液Ａ）。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１２２ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸した後、ピリジン（０．２５ｍｌ）とアセトニトリル（０．２５ｍｌ）に溶解し、この溶液を０℃に冷却して、フェノキシアセチルクロリド（１０４μｌ、０．７５ｍｍｏｌ）を加えて５分間撹拌した（溶液Ｂ）。溶液Ｂに溶液Ａを０℃で加え、室温で１２時間撹拌した。反応溶液を０℃に冷却し、１４％アンモニア水溶液（０．５ｍｌ）を加えて１０分撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮した。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２３０ｍｇ、８１％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％メタノールの塩化メチレンで溶出）で精製して得た。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２３０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸乾燥した後、ピリジン（４．０ｍｌ）に溶解させ４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１５２ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２２８ｍｇ、６５％）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）で精製して得た。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２２８ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸乾燥した後、ピリジン（２．６ｍｌ）に溶解させ、無水酢酸（９９μｌ、１．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１２時間撹拌した。反応溶液は、酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウムで分液し、有機層を水ならびに飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。トルエンで共沸乾燥した後、塩化メチレン（２６ｍｌ）に溶解させ、ジクロロ酢酸（２６０μｌ）を０℃で加えて１５分撹拌した。反応溶液に５％炭酸水素ナトリウムを加えて分液した後、有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液ならびに飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（２’，３’−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（１３４ｍｇ、７９％、２段階収率）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．５％メタノールの塩化メチレンで溶出）で精製して得た。【０２２５】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  10.83 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.55 (d, 1H, J = 1H), 7.66 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 7.56 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.52 (d, 1H, J = 3.5 Hz), 7.32 (m, 2H), 7.18 (m, 1H), 7.02-6.95 (m, 3H), 6.27 (d, 1H, J = 6.5 Hz), 5.92 (t, 1H, J = 6.2 Hz), 5.57 (dd, 1H, J = 2.9, 5.6 Hz), 5.33 (t, 1H, J = 5.4 Hz), 5.10 (s, 2H), 4.26 (m, 1H), 3.73 (m, 2H), 2.14 (s, 3H), 1.99 (s, 3H)．【０２２６】
（９−３）２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン  ５’−三リン酸の合成。
２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−１−（２’，３’−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（６５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）  を、ピリジンで共沸乾燥した後、ピリジン（１００μｌ）とジオキサン（３００μｌ）に溶解させ、２−クロロ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンの１Ｍジオキサン溶液（１１０μｌ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えて１０分撹拌した。この溶液にトリブチルアミン（１００μｌ）とビス（トリブチルアンモニウム）ピロフォスフェートの０．５Ｍ  ＤＭＦ溶液（３００μｌ，０．１５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１０分撹拌した。１％  ヨウ素のピリジン／水（９８：２、ｖ／ｖ、２．０ｍｌ）を加えて１５分撹拌した後、  亜硫酸水素ナトリウムの５％水溶液（１５０μｌ）を加えた。水（５．０ｍｌ）を加えて、３０分撹拌した後、２８％アンモニア水（２０ｍｌ）を加えて５５℃で３時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮した後、２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン  ５’−三リン酸（２７．６μｍｏｌ、２７％）は、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ａ−２５）カラムクロマトグラフィー（５０ｍＭから１．０Ｍ  ＴＥＡＢ溶液ならびに１０％アセトニトリルの１Ｍ  ＴＥＡＢ溶液で溶出）ならびにＣ１８−ＨＰＬＣにより精製して得た。【０２２７】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ  8.42 (s, 1H), 8.10 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.36 (d, 1H, J = 5.0 Hz), 7.24 (d, 2H, J = 3.9 Hz), 7.01 (dd, 1H, J = 3.8, 5.0 Hz), 6.00 (d, 1H, J = 5.9 Hz), 4.86 (m, 1H), 4.64 (m, 1H), 4.41 (m, 1H), 4.29 (m, 2H), 3.19 (q, 25H, J = 7.4 Hz), 1.28 (t, 37H, J = 7.3 Hz)．
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ  -9.28 (d, 1P, J = 19.4 Hz), -10.70 (d, 1P, J = 19.7 Hz), -22.41 (t, 1P, J = 20.0 Hz)．
１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ７．０）中のＵＶ−ｖｉｓスペクトルデータ、λｍａｘ＝３８８ｎｍ（ε３２５００）．
ＥＳＩ−ＭＳ（Ｃ１８Ｈ２０Ｎ５Ｏ１３Ｓ２Ｐ３）；計算値：６６９．９７（Ｍ−Ｈ）−、実測値：６６９．３９（Ｍ−Ｈ）−．【０２２８】
実施例１０：自己相補的なＤｓ−Ｄｓ塩基対、及びＤｓｓ−Ｄｓｓ塩基対
Ｄｓ−Ｄｓ塩基対、及びＤｓｓ−Ｄｓｓ塩基対が自己相補的な塩基対を形成することを、人工塩基を組み込んだ、又は組み込んでいない１２−ｍｅｒの二本鎖ＤＮＡの熱安定性を、Ｔｍ値の測定により検討した。【０２２９】
図３に示す配列（配列番号１及び配列番号２）を有する１２−ｍｅｒのＤＮＡを、ホスホロアミダイト法による化学合成により作成した。ここで、Ｄｓ塩基は７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基、Ｄｓｓ塩基は７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基である。【０２３０】
二本鎖ＤＮＡの吸光度変化を、紫外可視分光光度計  ＵＶ−２４５０（島津）により測定し、その一次微分から融解温度であるＴｍ値を算出した。その結果を図３に示す。【０２３１】
Ｄｓ−Ｄｓ塩基対を含む二本鎖ＤＮＡ（Ｔｍ＝５２．０℃）は、Ｃ−Ｇ塩基対（Ｔｍ＝５３．１℃）と比べて１℃程度しか安定性は低下せず、Ｔ−Ａ塩基対（Ｔｍ＝４８．６℃）よりも高い安定性を示した。【０２３２】
また、Ｄｓと天然型塩基との塩基対と比較しても、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対は８〜１２℃安定であり、高い特異性を示した。そして、Ｄｓと天然型塩基との塩基対を含む二本鎖は、いずれの天然塩基と塩基対を形成した場合でも、それぞれ同程度の安定性を示し、Ｄｓがユニバーサル塩基としても利用可能であることを示している。【０２３３】
また、複製や転写で機能するＤｓ−Ｐａ（Ｐａ：ピロロ−２−カルバルデヒド）やＤｓ−Ｐｎ（Ｐｎ：２−ニトロピロール）塩基対の二本鎖中での安定性は、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対よりも低いことが分かった。この結果から、複製や転写で鋳型ＤＮＡ中のＰａやＰｎに相補してＤＮＡやＲＮＡ中の特定位置にＤｓを導入でき、生じた配列に相補したＤｓを含むＤＮＡプローブを用いることにより、たとえば複製で精製した二本鎖ＤＮＡ中のＤｓ−Ｐｎ塩基対を解離させてＤｓを含むプローブをハイブリダイズさせることができる。【０２３４】
同様に、Ｄｓｓ−Ｄｓｓ塩基対も高い熱安定性を示し、Ｄｓの修飾体も同じように効果があることがわかった。【０２３５】
実施例１１：相補人工塩基対Ｄｓ−Ｄｓに隣接する天然型塩基対の種類に依存した二本鎖ＤＮＡの熱安定性
Ｄｓ−Ｄｓ塩基対を組み込んだ二本鎖ＤＮＡの安定性をさらに詳しく調べるため、二本鎖ＤＮＡ中のＤｓ−Ｄｓ塩基対の両側の天然型塩基対を変え、それらのＤＮＡ断片の熱安定性を調べた。図４に示す配列（配列番号３ないし５）を有する１２−ｍｅｒのＤＮＡを、ホスホロアミダイト法による化学合成により作成した。二本鎖ＤＮＡのＴｍ値の算出は、実施例１０と同様に行った。その結果を図４に示す（別途、ΔＧなどのデータも算出した）。その結果、安定性の高い順から５’−ＣＤｓＧ−３’  ＞  ５’−ＣＤｓＡ−３’  ＞  ５’−ＴＤｓＧ−３’  ＞  ５’−ＧＤｓＧ−３’  ＞  ５’−ＴＤｓＡ−３’  ＞  ５’−ＡＤｓＧ−３’  ＞  ５’−ＧＤｓＡ−３’  ＞  ５’−ＧＤｓＣ−３’  ＞  ５’−ＡＤｓＡ−３’  ＞  ５’−ＡＤｓＣ−３’  ＞  ５’−ＡＤｓＴ−３’となることがわかった。【０２３６】
このように、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対を含むと必ずしも水素結合が３つあるＧ−Ｃ塩基対を両側に持つ配列が安定ではなく、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対をＤＮＡ中に組み込むことにより、従来概念とは異なる配列特異性のＤＮＡプローブが作成できることがわかった（図５）。この結果から、Ｄｓ塩基の５’側の塩基がＣ＞Ｔ＞Ｇ＞Ａの順と二本鎖ＤＮＡの熱安定性が相関することもわかった。【０２３７】
またＤｓと天然型塩基との塩基対（Ｄｓ−Ｇ塩基対）の場合は、その両側の天然型塩基対の配列を変えると、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対と比べて一様に７〜８℃安定性が低下することがわかった。したがってＤｓ−Ｄｓ塩基対の両側の天然型塩基対の配列により二本鎖ＤＮＡの安定性は異なるが、Ｄｓが天然型塩基と塩基対を形成した場合は、常に二本鎖ＤＮＡの安定性が低下する。これは二本鎖ＤＮＡ中でＤｓ−Ｄｓ塩基対が選択的に塩基対を形成することを示している。また、Ｄｓと天然型塩基との塩基対の場合も、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対と同様の隣接塩基対の規則性があることも示唆する。【０２３８】
実施例１２：Ｄｓ−Ｄｓ塩基対によるＧＣ含量に依存しない二本鎖ＤＮＡの熱安定性のコントロール
天然型塩基のみで構成される二本鎖ＤＮＡにおいては、同じ長さの二本鎖ＤＮＡであってもそれぞれの配列中のＧＣ含量が異なると、それらの二本鎖ＤＮＡの熱安定性は異なる。すなわち、ＧＣ含量が高くなると二本鎖ＤＮＡの熱安定性も高くなる。例えば図６（左側の断片）に示すように、１２−ｍｅｒのＤＮＡでは、９個のＧ−Ｃ塩基対を含むとそのＴｍは６１．５℃であるが、６個のＧ−Ｃ塩基対を含む断片ではＴｍは４５〜４７℃まで低下する。また８個のＧ−Ｃ塩基対を含む断片では、１塩基のミスマッチ（図中ではＴ−Ｇ塩基対）が入っても、Ｔｍ値は６０．０℃から５３．９℃にしか低下しない。したがって、Ｇ−Ｃ塩基対の数が異なる複数の断片を用いた一定温度下でのマルチプレックス検出を行う場合には、Ｇ−Ｃ塩基対の多いプローブがミスハイブリダイゼーションしやすくなる、という問題点が存在した。【０２３９】
そこで、これらの１２−ｍｅｒの天然型ＤＮＡ断片の一箇所をＤｓ−Ｄｓ塩基対に置き換えた二本鎖ＤＮＡを作成し、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対の導入による二本鎖ＤＮＡの熱安定性のコントロールについて検討した。【０２４０】
図６及び図７に示す配列（配列番号６ないし２７）を有するＤＮＡを、ホスホロアミダイト法による化学合成により作成した。二本鎖ＤＮＡの熱安定性は、SHIMADZU UV-2450 UV-VISIBLE SPECTROMETERで測定し、IgorProソフトウエア（WaveMetrics）を用いて一次微分法でＴｍ値を算出した。５μＭの二本鎖ＤＮＡ（鎖長１２塩基対）を、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、２６０ｎｍの吸光度の温度変化を測定した。【０２４１】
その結果、図６（右側の断片）に示すように、Ｇ−Ｃ塩基対の数が８〜６個の断片でそれぞれのＴｍ値をほぼ同程度の値（５０．７℃〜５３．４℃）にすることができた。また、これらの二本鎖ＤＮＡのそれぞれの一本鎖断片を他の配列とミスハイブリダイゼーションさせても、Ｔｍ値は３０℃以下に低下するので、それぞれの断片を同時にマルチプレックス解析用のプローブに用いることができる（図７）。【０２４２】
実施例１３：Ｄｓ−Ｄｓ塩基対を含む二本鎖ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）の予測
Ｄｓ−Ｄｓ塩基対を含む二本鎖ＤＮＡ断片の安定性は、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対に隣接する天然型塩基対の種類に依存し、その天然型塩基対の種類には法則性があることから、従来の最近接塩基対法をさらに簡便にした方法でＤｓ−Ｄｓ塩基対を含む二本鎖ＤＮＡ断片のＴｍ値の予測が可能になった。【０２４３】
二本鎖ＤＮＡの融解温度は、Wallace法やＧＣ％法、そして最近接塩基対法（Nearest Neighbor method）によって予測されることが一般的である。とくに、最近接塩基対法では、最近接エントロピー変化ΔＳの合計、および最近接エンタルピー変化ΔＨの合計、ＤＮＡ断片のモル濃度、Ｎａ塩濃度がわかれば計算することができ、最近接塩基対の熱力学的パラメータは公知である。本実験でのＴｍ測定から算出した自由エネルギーΔＧとＴｍ値に強い一次の正の相関が認められた。そこでこれを利用して、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対を含む最近塩基対のパラメータを求め（図８、右表の下４列）、塩基配列から計算した理論値ΔＧを利用してＴｍ値の予測を行った。そして、予測されたＴｍ値を、ＵＶ吸収変化の温度依存性から実験的に求めたＴｍ値と比較することで評価を行った（図９）。【０２４４】
具体的にはＤｓ−Ｄｓ塩基対を含む１０種類の二本鎖ＤＮＡと、天然型塩基対だけからなる１種類の二本鎖ＤＮＡのＵＶ吸収変化による融解曲線を測定し、バリアン社の解析ソフトウエアCary WinUV Themal applicationのHyperChromicity法を用いて、３７℃における自由エネルギーΔＧをそれぞれ算出した。次に、Santa Luccia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95, pp. 1460-1465, 1998に報告された計算式とパラメータを用いて、Ｄｓ−Ｄｓ塩基対を含む最近塩基対のパラメータを算出した。求めたパラメータから算出したΔＧをもとにして予測したＴｍ値（予測値）と測定した融解曲線から一次微分法により求めたＴｍ値（実験値）をプロットしたのが図９である。一部外れる断片もあるがほとんどのものが計算結果と実測値が良い相関を示した。【０２４５】
実施例１４：複数のＤｓ−Ｄｓ塩基対を含む二本鎖ＤＮＡの熱安定性
２つのＤｓ−Ｄｓ塩基対が二本鎖ＤＮＡ中に存在する場合の安定性も調べた。図１０に示す配列（配列番号２０、２１、２８〜３７）を有するＤＮＡを、ホスホロアミダイト法による化学合成により作成した。二本鎖ＤＮＡのＴｍ値の算出は、実施例１２と同様に行った。その結果を図１０に示す。【０２４６】
隣接してＤｓ−Ｄｓ塩基対を２つ組み込んだ５’−ＴＤｓＤｓＧ−３’配列を含む二本鎖ＤＮＡ（配列番号２８および２９）の安定性は、１つの場合（配列番号２０および２１）と比較して１０℃以上不安定化した。しかし、２つの天然型塩基対を挟んでＤｓ−Ｄｓ塩基対を２つ組み込んだ場合（５’−ＣＤｓＧＣＤｓＡ−３’：配列番号３２および３３）には、１つの場合と比べて１０℃ほどさらに安定化することがわかった。これはＤｓ−Ｄｓ塩基対をＧ−Ｃ塩基対で置き換えた５’−ＣＧＧＣＧＡ−３’配列を含む天然型塩基対からなる二本鎖ＤＮＡ（配列番号３４および３５）の熱安定性と同程度であった。このようにＤＮＡプローブを作成する際に、複数のＤｓ−Ｄｓ塩基対を二本鎖ＤＮＡ中に導入することも可能である。【０２４７】
実施例１５：人工塩基と天然型塩基からなる塩基対（Ｄｓ−Ｇなど）による、１塩基ミスマッチの認識
二本鎖ＤＮＡにおいて、Ｄｓと天然型塩基との塩基対に隣接する塩基対のミスマッチの認識について検討するために、図１１に示す配列（配列番号２１、３８〜４５）を有するＤＮＡを、ホスホロアミダイト法による化学合成により作成した。二本鎖ＤＮＡのＴｍ値の算出は、実施例１２と同様に行った。その結果を図１１に示す。【０２４８】
人工塩基Ｄｓは、天然型塩基ともある程度の安定性で塩基対を形成する。そして、本発明者は、Ｄｓと天然型塩基との塩基対に隣接する塩基対がミスマッチペア（Ａ−ＴとＧ−Ｃ以外の組み合わせ）の場合に、その二本鎖ＤＮＡの安定性が著しく低下することを見出した。例えば、Ｇ−Ｄｓ塩基対を二本鎖ＤＮＡに導入した場合（図１１）、Ｇ−Ｄｓ塩基対を含む１２−ｍｅｒＤＮＡ（Ｔｍ＝４５．５℃）は、Ｇ−Ｃ塩基対の場合（Ｔｍ＝５２．３℃）と比べて、そのＴｍは７℃程度低下するが、隣接するＴ−Ａ塩基対（図１１中下線で示した塩基対）がミスマッチペアになると、それらの二本鎖ＤＮＡの熱安定性はさらに低下する。【０２４９】
具体的には、Ｇ−Ｃ塩基対に隣接するＴ−Ａ塩基対が、Ａ−Ａ、Ｇ−Ａ、Ｃ−Ａになると、Ｔ−Ａ塩基対と比較してそれぞれのＴｍ値は、順に１５．０℃、９．６℃、１２．６℃低下した。これに対して、Ｇ−Ｄｓ塩基対の場合は、隣接するＴ−Ａ塩基対が、Ａ−Ａ、Ｇ−Ａ、Ｃ−Ａになると、Ｔ−Ａ塩基対と比較してそれぞれのＴｍ値は、１８．７℃、１６．２℃、１３．９℃低下した。【０２５０】
この結果から、Ｇ−Ｄｓ塩基対をミスマッチペアに隣接して導入することにより、天然型塩基対がミスマッチペアに隣接して存在する場合と比較して、それらのＤＮＡの安定性を著しく低下させることができることが明らかとなった。ターゲット遺伝子の１塩基変異を認識する方法において、Ｄｓを有するＤＮＡをハイブリダイゼーション用のプローブやＰＣＲ用のプライマーに利用することにより、ＳＮＰ検出が可能である。【０２５１】
実施例１６：人工塩基と天然塩基からなる塩基対（Ｄｓ−Ｇ）を含む二本鎖ＤＮＡの熱安定性
Ｄｓ−Ｇ塩基対が二本鎖ＤＮＡ中に存在する場合の安定性を調べた。図１２に示す配列（配列番号１０、１１、１４−１７、２０、２１、２６、２７、３８、４２−５０）を有するＤＮＡを、ホスホロアミダイト法による化学合成により作製した。二本鎖ＤＮＡのＴｍ値の算出は、実施例１２と同様に行った。その結果を図１２に示す。【０２５２】
天然型の塩基対では、Ｇ−Ｃ塩基対がＡ−Ｔ塩基対よりも熱的に安定であることから、同じ長さの二本鎖ＤＮＡであっても、その配列中のＧ−Ｃ塩基対の数に依存して、二本鎖ＤＮＡの熱安定性が異なる。図１２の左列のように、Ｇ−Ｃ塩基対を８つあるいは９つ含む１２塩基対のＤＮＡは、そのＴｍ値が６０℃以上であるのに対して、Ｇ−Ｃ塩基対が７つになると５０℃まで熱安定性が低下する。このＧ−Ｃ塩基対の含有量に依存した二本鎖ＤＮＡの安定性の違いが、ＳＮＰ検出やＤＮＡ診断などに用いられるプライマーやプローブの設計を困難にしている。本発明では、二本鎖ＤＮＡ中の一箇所のＧ−Ｃ塩基対をＤｓ−Ｄｓ塩基対に変えることにより、このＧ−Ｃ含量の依存性を緩和させることが出来る（図１２、中央の列、及び図６）。【０２５３】
一方、Ｇ−Ｃ塩基対をＧ−Ｄｓ塩基対に置き換えても同様の効果が得られることが明らかとなった（図１２、右列）。Ｇ−Ｄｓ塩基対の置き換えにより、二本鎖ＤＮＡの熱安定性は低下するが、Ｇ−Ｃ含量の依存性は緩和できる。この結果は、天然型の塩基からなるターゲットＤＮＡ用のプライマーやプローブの設計にＤｓ塩基が有効であることを示す。従って、Ｇ−Ｄｓ塩基対の導入により、人工塩基を含むＤＮＡのみならず、天然型のＲＮＡをターゲットとした幅広い応用が可能になった。【０２５４】
なお、Ｄｓの相補塩基としては、Ｇが最も安定であるが（図１２参照）、その他の天然型塩基とＤｓの間で塩基対を作らせてもよい。すなわち、Ｇ以外の天然型塩基とＤｓとの塩基対の利用もまた、Ｇ−Ｄｓ塩基対の利用と同様に二本鎖ＤＮＡの熱安定性に関するＧ−Ｃ含量の依存性を緩和するのに有用である。
【産業上の利用可能性】
【０２５５】
本発明の人工塩基による自己相補的な塩基対は、第三の塩基対としてハイブリダイゼーション用の新たなＤＮＡタグの作成、モレキュラービーコンなどのイメージング技術への利用、Ｄｓ−ＰａやＤｓ−Ｐｎ塩基対と組み合わせた複製・転写での利用、ＤＮＡやＲＮＡコンピュータへの利用、非天然型アミノ酸をタンパク質に取り込ませるための新たなコドンとアンチコドンとしての利用など多方面への利用が可能である。さらに、本発明の人工塩基は、いずれの天然型塩基とも同程度の熱安定性で塩基対を形成することができるので、当該人工塩基と天然型塩基との塩基対は、ターゲット遺伝子の一塩基変異を選択的に識別できるＤＮＡプローブに利用することができる。【０２５６】
本発明の人工塩基を含む塩基対は、Ａ−ＴとＧ−Ｃの塩基対に新たな塩基対を加えることとなり、塩基配列のバリエーションを増やすことが可能である。また、新たな塩基対を加えることで同じ長さの異なる二本鎖ＤＮＡのそれぞれがＧ−Ｃ含量に依存せずに同じ熱安定性を示すように操作できるので、複数のＤＮＡのタグやプローブを用いる手法でミスハイブリダイゼーションを減らすことができる。すなわち、生物工学分野の応用技術の精度を高めることができる。さらに標的ＤＮＡとの１塩基変異レベルでのマッチ・ミスマッチを選択的に識別できるプローブが作成でるので、ＳＮＰ解析などの手法の精度を上げることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０２５７】
配列番号１：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号２：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号３：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号４：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号５：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号６：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号７：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号８：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号９：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号１０：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号１１：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号１２：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号１３：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号１４：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号１５：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号１６：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号１７：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号１８：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号１９：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号２０：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号２１：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号２２：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号２３：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号２４：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号２５：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号２６：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号２７：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号２８：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号２９：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号３０：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号３１：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号３２：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号３３：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号３４：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号３５：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号３６：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号３７：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号３８：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号３９：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号４０：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号４１：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号４２：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号４３：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号４４：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号４５：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号４６：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号４７：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号４８：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号４９：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
配列番号５０：熱安定性を試験するためのＤＮＡ断片
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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