(57)【要約】本発明は、人工プロモーターのライブラリー及び／又は修飾リボソーム結合部位のライブラリーを含むＤＮＡライブラリーを構築し、及び、当該ライブラリーを細菌宿主細胞に形質転換して、対象染色体遺伝子に対する一連の発現レベルを有する細菌クローンの集団を得る方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工プロモーターのライブラリーを構築する方法であって、
ａ）第１リコンビナーゼ部位、第２リコンビナーゼ部位、及び当該第１と第２リコンビナーゼ部位の間に位置する選択マーカー遺伝子を含む挿入ＤＮＡカセットを得る工程；
ｂ）i）対象染色体遺伝子の上流領域に相同な第１核酸断片、及び、ii）前記挿入ＤＮＡカセットの５’末端に相同な第２核酸断片、を含む第１オリゴヌクレオチドを得る工程；
ｃ）i）前記挿入ＤＮＡカセットの３’末端に相同な第３核酸断片、ii）−３５コンセンサス領域（−３５乃至−３０）、リンカー配列、及び−１０コンセンサス領域（−１２乃至−７）を含むプロモーター前駆体であって、ここで、当該リンカー配列は、１４乃至２０ヌクレオチドを含み及び前記−３５領域と前記−１０領域に隣接し、前記プロモーター前駆体は、修飾されて当該プロモーター前駆体の少なくとも１の修飾ヌクレオチド配列部分を含み、さらに、前記−３５領域及び前記−１０領域は、それぞれ前記プロモーターの４乃至６の保存ヌクレオチドを含む、当該プロモーター前駆体、及びiii）前記プロモーターの転写開始部位の下流領域に相同な第４核酸断片、を含む第２オリゴヌクレオチドを得る工程；及び、
ｄ）増幅反応において、前記第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドを挿入ＤＮＡカセットと混合し、人工プロモーターを含む２本鎖の増幅生成物のライブラリーを得る工程、
を含む当該方法。
【請求項２】
前記増幅生成物を精製する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プロモーター前駆体の−３５領域が、ＴＴＧＡＣＡ、ＴＴＧＣＴＡ、ＴＴＧＣＴＴ、ＴＴＧＡＴＡ、ＴＴＧＡＣＴ、ＴＴＴＡＣＡ、及びＴＴＣＡＡＡよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プロモーター前駆体の−３５領域が、当該プロモーター前駆体の−３０における残基の修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プロモーター前駆体の−１０領域が、ＴＡＡＧＡＴ、ＴＡＴＡＡＴ、ＡＡＴＡＡＴ、ＴＡＴＡＣＴ、ＧＡＴＡＣＴ、ＴＡＣＧＡＴ、ＴＡＴＧＴＴ、及びＧＡＣＡＡＴよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プロモーター前駆体の−３５領域がＴＴＧＡＣＡであり、前記プロモーター前駆体の−１０領域がＴＡＴＡＡＴである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記プロモーター前駆体の−３５領域がＴＴＧＡＣＡであり、前記プロモーター前駆体の−１０領域がＡＡＴＡＡＴである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記リンカー配列が１６乃至１８ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロモーター前駆体が、Ｐｔｒｃ（配列番号２）、ＰＤ／Ｅ２０（配列番号４）、ＰＨ２０７（配列番号２）、ＰＮ２５（配列番号５）、ＰＧ２５（配列番号６）、ＰＪ５（配列番号７）、ＰＡ１（配列番号８）、ＰＡ２（配列番号９）、ＰＡ３（配列番号１０）、Ｐｌａｃ（配列番号１）、ＰＧＩ（配列番号１５）、ＰｌａｃＵＶ５（配列番号１２）、ＰＣＯＮ（配列番号４）、及びＰｂｌｓ（配列番号１４）よりなる群から選択されるプロモーターから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記人工プロモーターのライブラリーが、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロモーター前駆体と前記対象染色体遺伝子が非相同である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロモーター前駆体と前記対象染色体遺伝子が相同である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
リボソーム結合部位を修飾する工程であって、
ｄ）i）前記対象染色体遺伝子の５’末端に相同な第５核酸断片、
ii）少なくとも１の修飾ヌクレオチドを含む、対象遺伝子の修飾リボソーム結合部位、及び
iii）前記第２オリゴヌクレオチドの−１０領域の下流領域と相同な第６核酸断片、
を含む第３オリゴヌクレオチドを得る工程；及び、
ｅ）ＰＣＲ反応において、請求項１に記載のＰＣＲ生成物を、前記第３オリゴヌクレオチド及び請求項１に記載の第１オリゴヌクレオチドと混合し、修飾リボソーム結合部位を有する人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物を得る工程、
を含む当該工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーター前駆体からのリボソーム結合部位が、ＡＧＧＡＡＡ（配列番号３０）、ＡＧＡＡＡＡ（配列番号３１）、ＡＧＡＡＧＡ（配列番号３２）、ＡＧＧＡＧＡ（配列番号３３）、ＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡ（配列番号３４）、ＡＡＧＧＡＡＡＡ（配列番号３５）、ＡＡＧＧＡＡＡＧ（配列番号３６）、ＡＡＧＧＡＡＡＵ（配列番号３７）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡ（配列番号３８）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＧ（配列番号３９）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＵ（配列番号４０）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ（配列番号４１）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧ（配列番号４２）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＵ（配列番号４３）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号４４）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号４５）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号４６）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号４７）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号４８）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号４９）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号５０）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号５１）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号５２）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号５３）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号５４）、ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡ（配列番号５５）、及び、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号５６）よりなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾リボソーム結合部位と前記第３オリゴヌクレオチドの転写開始部位との間にｍＲＮＡ安定化配列を挿入する工程を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第３オリゴヌクレオチドにおける対象遺伝子の開始コドンを改変する工程を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ｄ）i）前記対象染色体遺伝子の５’末端に相同な第５核酸断片、
ii）縮重しており及び少なくとも１の修飾オリゴヌクレオチドを含む、対象遺伝子の開始コドン、及び
iii）前記第２オリゴヌクレオチドの−１０領域の下流領域と相同な第６核酸断片、
を含む第３オリゴヌクレオチドを得る工程；及び、
ｅ）ＰＣＲ反応において、請求項１に記載のＰＣＲ生成物を、前記第３オリゴヌクレオチド及び前記第１オリゴヌクレオチドと混合し、修飾開始コドンを有する人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物を得る工程、
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記人工レセプターの−１０ボックスと前記第３オリゴヌクレオチドの転写開始部位との間にｍＲＮＡ安定化配列を挿入する工程を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法により生産された人工プロモーターのライブラリー。
【請求項２１】
請求項２に記載の方法により生産された人工プロモーターのライブラリー。
【請求項２２】
ａ）対象染色体遺伝子の上流領域に相同な核酸断片、
ｂ）第１リコンビナーゼ部位、
ｃ）抗菌薬耐性遺伝子をコード化する核酸配列、
ｄ）第２リコンビナーゼ部位、
ｅ）プロモーター及びリンカー配列の２つのコンセンサス領域であって、ここで、第１コンセンサス領域が−３５領域を含み、第２コンセンサス領域が−１０領域を含み、及び前記リンカー配列が少なくとも１４乃至２０ヌクレオチドを含み及び前記第１コンセンサス領域とに隣接し、さらに、前記−３５領域及び前記−１０領域はそれぞれ前記プロモーターの対応コンセンサス領域の４乃至６の保存ヌクレオチドを含む、当該コンセンサス領域、及び、
ｆ）前記プロモーターの＋１転写開始部位の下流領域に相同な核酸断片、
をこの順番で含む２本鎖ポリヌクレオチド混合物を含む人工プロモーターのライブラリー。
【請求項２３】
前記２本鎖ポリヌクレオチドが、前記プロモーターの修飾リボソーム結合部位を更に含み、ここで、当該結合部位が、前記−１０領域と前記＋１転写開始部位の下流領域に相同な核酸配列との間に位置する、請求項２２に記載の人工プロモーターのライブラリー。
【請求項２４】
前記２本鎖ポリヌクレオチドが、修飾開始コドンを更に含み、ここで、当該修飾開始コドンが、前記−１０領域と前記＋１転写開始部位の下流領域に相同な核酸配列との間に位置する、請求項２２に記載の人工プロモーターのライブラリー。
【請求項２５】
前記２本鎖ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡ安定化核酸配列を更に含み、ここで、当該ｍＲＮＡ安定化配列が、前記−１０領域と前記＋１転写開始部位の下流領域に相同な核酸配列との間に位置する、請求項２２に記載の人工プロモーターのライブラリー。
【請求項２６】
前記−３５領域が、残りのヌクレオチド位置を保存しつつ、１のヌクレオチド位置における置換を含む、請求項２２に記載の人工プロモーターのライブラリー。
【請求項２７】
残りのヌクレオチド位置を保存しつつ、前記−１０領域の１のヌクレオチド位置における置換を更に含む、請求項２６に記載の人工プロモーターのライブラリー。
【請求項２８】
選択宿主細胞においてプロモーターを修飾する方法であって、
ａ）請求項１に記載の人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物のライブラリーを得る工程；
ｂ）細菌宿主細胞を前記ＰＣＲ生成物で形質転換する工程であって、前記人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物が相同組換えによって当該細菌宿主細胞中に組込まれる、当該工程；
ｃ）前記形質転換細菌細胞を成長させる工程；
ｄ）前記人工プロモーターを含む前記形質転換細菌細胞を選択する工程、
を含む当該方法。
【請求項２９】
選択宿主細胞においてプロモーターを修飾する方法であって、
ａ）請求項１４に記載の人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物のライブラリーを得る工程；
ｂ）細菌宿主細胞を前記ＰＣＲ生成物で形質転換する工程であって、前記人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物が相同組換えによって当該細菌宿主細胞中に組込まれて、形質転換細菌細胞が産出される、当該工程；
ｃ）前記形質転換細菌細胞を成長させる工程；
ｄ）少なくとも１の人工プロモーターを含む前記形質転換細菌細胞を選択する工程、
を含む当該方法。
【請求項３０】
選択宿主細胞においてプロモーターを修飾する方法であって、
ａ）請求項１８に記載の人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物のライブラリーを得る工程；
ｂ）細菌宿主細胞を前記ＰＣＲ生成物で形質転換する工程であって、前記人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物が相同組換えによって当該細菌宿主細胞中に組込まれて、形質転換細菌細胞が産出される、当該工程；
ｃ）前記形質転換細菌細胞を成長させる工程；
ｄ）少なくとも１の人工プロモーターを含む前記形質転換細菌細胞を選択する工程、
を含む当該方法。
【請求項３１】
前記細菌宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｐ．、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．よりなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記細菌宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｐ．、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．よりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記細菌宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｐ．、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．よりなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
対象染色体遺伝子の一連の発現レベルを有する細菌細胞のライブラリーを構築する方法であって、
ａ）請求項１に記載の人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物のライブラリーを得る工程；
ｂ）細菌宿主細胞を前記ＰＣＲ生成物で形質転換する工程であって、前記人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物が、相同組換えによって前記細菌宿主細胞中に組込まれて、形質転換細菌細胞が産出される、当該工程；
ｃ）前記形質転換細菌細胞を成長させる工程；及び、
ｄ）対象染色体遺伝子の一連の発現レベル示す形質転換細菌細胞のライブラリーを得る工程、
を含む当該方法
【請求項３５】
前記ライブラリーから形質転換細菌細胞を選択する工程を更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記選択された形質転換細胞が、対象遺伝子の低い発現レベルを有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記選択された形質転換細胞が、対象遺伝子の高い発現レベルを有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記形質転換細菌細胞から選択マーカーを切除する工程を更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３５に記載の方法によって選択される形質転換細菌細胞。
【請求項４０】
前記細菌宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｐ．、又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．である、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌細胞の遺伝子修飾に関するものである。詳細には、人工プロモーターのライブラリー及び／又は修飾調節領域のライブラリーを含むＤＮＡライブラリーを構築する方法、及び、細菌宿主細胞におけるプロモーター前駆体及び調節領域を置換して、対象遺伝子の一連の発現レベルを有する細菌クローンのライブラリーをもたらすライブラリーの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
長年にわたって、有用な製品（例えば、工業用の酵素、ホルモン、及び抗体）の生産のための産業的応用において微生物が活用されてきた。これらの微生物の生産性を増大させるために組換えＤＮＡ技術が用いられてきたが、（特に、工業的発酵において）菌株の性能を向上するための代謝系遺伝子組換え技術の使用は満足のいくものではなかった。
【０００３】
微生物菌株の性能を向上させるために用いられる一般的な戦略は、遺伝子発現を改変することであり、この目的を達成するために多くの手法が用いられてきた。１つのアプローチとして、選択した宿主菌株の多コピープラスミドにおいて非相同又は相同遺伝子をクローニングすることが挙げられる。別のアプローチは、染色体遺伝子の発現を改変させることに関する。これは種々の方法によって達成されており、例えば、（１）染色体の所定の領域における部位特異的変異、欠失、又は挿入、（２）トランスポゾンによってＤＮＡを染色体へランダムに挿入すること、及び（３）遺伝子の天然調節領域を染色体の位置で改変することが含まれる。調節領域の改変は、例えば、プロモーターの長さを変更することにより、又は、誘発物質により影響を受ける制御可能プロモーターを用いることにより行うことができる。Ｊｅｎｓｅｎ及びＨａｍｍｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、５８巻、１９３−１９５頁（１９９８年）；Ｊｅｎｓｅｎ及びＨａｍｍｅｒ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．、６４巻、８２−８５頁（１９９８年）；及び、Ｋｈｌｅｂｎｉｋｏｖら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１４７巻、３２４１頁（２００１年）を参照されたい。染色体遺伝子の調節領域を置換するために用いるその他の技術は、Ａｂｄｅｌ−Ｈａｍｉｄら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１４７巻、１４８３−１４９８頁（２００１年）、及びＲｅｐｏｉｌａ及びＧｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８３巻、４０１２−４０２３頁（２００１年）において開示されている。
【０００４】
選択宿主における代謝経路設計の最適化に関して、上記のアプローチはある程度成功しているが、いくつか不利益も存在する。研究によると、プラスミドにおける遺伝子組換えされた遺伝子の発現レベルは、染色体に位置する同じ組換え遺伝子の発現レベルと必ずしも関連しない（Ｋｈｌｅｂｎｉｋｏｖら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１４７巻、３２４１頁、２００１年、及び、ＭｃＣｒａｋｅｎ及びＴｉｍｍｓ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８巻、６５６９頁、１９９９年を参照されたい）。
【０００５】
さらに、代謝経路における１の遺伝子の発現を向上させることの効果は、当該代謝経路の流量における最低限の（ｍａｒｇｉｎａｌ）効果しか有しない。たとえ前記遺伝子が律速段階における酵素に対する操作コードである場合であっても、代謝経路の制御は多数の酵素に依存し得るので、上記の見解は正しいであろう。それゆえ、遺伝子を操作して高レベルの発現（例えば、発現における１０乃至１００倍の増大）を達成しても、バイオリアクターにおける組換え微生物の全体の性能は減少するであろう。当該減少は、代謝経路に関与するその他の因子のバランス、又は最適な細胞増殖に必須であるその他の物質の欠乏に起因するものと考えられる。
【０００６】
上記の問題点は、Ｊｅｎｓｅｎ及びＨａｍｍｅｒ（ＷＯ９８／０７８４６）においても部分的に検討されている。ＷＯ９８／０７８４６には、種々のレベルの遺伝子発現を提供する一連の構成プロモーターの構築が記載されている。詳細には、−３５コンセンサスボックス、−１０コンセンサスボックス、及びこれらのコンセンサスボックスの間に位置するスペーサー（リンカー）領域を有する調節領域の変異体を含む人工プロモーターライブラリーが構築されている。しかしながら、ＷＯ９８／０７８４６に記載された方法の欠点の１つは、種々のレベルの遺伝子発現を有するクローンのライブラリーを構築するため（時間及び工程数の点で）大規模なスクリーニングを要することである。また、当該文献には、コンセンサス配列におけるわずかな塩基対の変更による、又はリンカー領域における変更によるプロモーター強度の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）が、プロモーター強度に大きな影響をもたらし、それゆえ、少ない工程のプロモーター強度調節を行うことができないことが開示されている。
【０００７】
それゆえ、代謝経路における対象遺伝子の最適な発現を評価する方法であって、それにより所望の生産物に対する菌株性能の最適化がもたらされる、迅速で効率的な方法の開発に対する要求が、代謝経路設計の分野において存在する。本発明の方法は、遺伝子発現レベルにおけるわずかな変化を明らかにし、それにより最適な発現レベルを提供する細胞の選択を可能にする方法を提供することによって、当該要求に応えるものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１の側面において、本発明は、人工プロモーターのライブラリーを構築する方法であって、ａ）第１リコンビナーゼ部位、第２リコンビナーゼ部位、及び第１と第２リコンビナーゼ部位の間に位置する選択マーカー遺伝子を含む挿入ＤＮＡカセットを得る工程；ｂ）i）対象染色体遺伝子の上流領域に相同な第１核酸断片及びii）前記挿入ＤＮＡカセットの５’末端に相同な第２核酸断片、を含む第１オリゴヌクレオチドを得る工程；ｃ）i）前記挿入ＤＮＡカセットの３’末端に相同な第３核酸断片、ii）−３５コンセンサス領域（−３５乃至−３０）、リンカー配列、及び−１０コンセンサス領域（−１２乃至−７）を含むプロモーター前駆体であって、ここで、当該リンカー配列は、１４乃至２０ヌクレオチドを含み及び前記−３５領域と前記−１０領域に隣接し、前記プロモーター前駆体は、修飾されて当該プロモーター前駆体の少なくとも１の修飾ヌクレオチド配列部分を含み、さらに、前記−３５領域及び前記−１０領域は、それぞれ前記プロモーターの４乃至６の保存ヌクレオチドを含む、当該プロモーター前駆体、及びiii）前記プロモーターの転写開始部位の下流領域に相同な第４核酸断片、を含む第２オリゴヌクレオチドを得る工程；及び、ｄ）増幅反応において、前記第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドを挿入ＤＮＡカセットと混合し、人工プロモーターを含む２本鎖の増幅生成物のライブラリーを得る工程、を含む当該方法に関する。１の実施態様では、当該方法は、増幅生成物を精製する工程をさらに含む。別の実施態様では、増幅工程はＰＣＲによるものである。別の実施態様では、プロモーター前駆体は、Ｐｔｒｃ（配列番号２）、ＰＤ／Ｅ２０（配列番号４）、ＰＨ２０７（配列番号２）、ＰＮ２５（配列番号５）、ＰＧ２５（配列番号６）、ＰＪ５（配列番号７）、ＰＡ１（配列番号８）、ＰＡ２（配列番号９）、ＰＡ３（配列番号１０）、Ｐｌａｃ（配列番号１）、ＰｌａｃＵＶ５（配列番号１２）、ＰＣＯＮ（配列番号４）、ＰＧＩ（配列番号１５）、及びＰｂｌｓ（配列番号１４）よりなる群から選択される。更なる実施態様では、人工プロモーターライブラリーは、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７で表されるプロモーターを含む。更なる実施態様では、本発明は、上記の方法によって生産された人工プロモーターライブラリーを含む。
【０００９】
第２の側面では、本発明は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）のライブラリーを構築する方法であって、ａ）第１リコンビナーゼ部位、第２リコンビナーゼ部位、及び第１と第２リコンビナーゼ部位の間に位置する選択マーカー遺伝子を含む挿入ＤＮＡカセットを得る工程；ｂ）i）対象染色体遺伝子の上流領域に相同な第１核酸断片及びii）前記挿入ＤＮＡカセットの５’末端に相同な第２核酸断片、を含む第１オリゴヌクレオチドを得る工程；ｃ）i）前記挿入ＤＮＡカセットの３’末端に相同な第３核酸断片、ii）−３５コンセンサス領域（−３５乃至−３０）、リンカー配列、及び−１０コンセンサス領域（−１２乃至−７）を含むプロモーター前駆体であって、ここで、当該リンカー配列は、１４乃至２０ヌクレオチドを含み及び前記−３５領域と前記−１０領域に隣接し、前記プロモーター前駆体は、修飾されて当該プロモーター前駆体の少なくとも１の修飾ヌクレオチド配列部分を含み、さらに、前記−３５領域及び前記−１０領域は、それぞれ前記プロモーターの４乃至６の保存ヌクレオチドを含む、当該プロモーター前駆体、及びiii）前記プロモーターの転写開始部位の下流領域に相同な第４核酸断片、を含む第２オリゴヌクレオチドを得る工程；及び、ｄ）増幅反応において、前記第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドを挿入ＤＮＡカセットと混合し、人工プロモーターを含む２本鎖の増幅生成物のライブラリーを得る工程；ｅ）i）前記対象染色体遺伝子の５’末端に相同な第５核酸断片、ii）少なくとも１の修飾ヌクレオチドを含む、対象遺伝子の修飾リボソーム結合部位、及びiii）前記第２オリゴヌクレオチドの−１０領域の下流領域と相同な第６核酸断片、を含む第３オリゴヌクレオチドを得る工程；及び、ｅ）ＰＣＲ反応において、工程ｄ）のＰＣＲ生成物を工程ｅ）の第３オリゴヌクレオチド及び工程ｂ）の第１オリゴヌクレオチドと混合し、修飾リボソーム結合部位を有する人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物を得る工程、を含む当該方法に関する。１の実施態様では、リボソーム結合部位は、ＡＧＧＡＡＡ（配列番号３０）、ＡＧＡＡＡＡ（配列番号３１）、ＡＧＡＡＧＡ（配列番号３２）、ＡＧＧＡＧＡ（配列番号３３）、ＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡ（配列番号３４）、ＡＡＧＧＡＡＡＡ（配列番号３５）、ＡＡＧＧＡＡＡＧ（配列番号３６）、ＡＡＧＧＡＡＡＵ（配列番号３７）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡ（配列番号３８）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＧ（配列番号３９）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＵ（配列番号４０）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ（配列番号４１）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧ（配列番号４２）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＵ（配列番号４３）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号４４）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号４５）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号４６）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号４７）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号４８）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号４９）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号５０）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号５１）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号５２）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号５３）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号５４）、ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡ（配列番号５５）、及び、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号５６）よりなる群から選択される。更なる実施態様では、本発明は、上記の方法によって生産された人工プロモーターライブラリーを含む。
【００１０】
第３の側面では、本発明は、ａ）対象染色体遺伝子の上流領域に相同な核酸断片、ｂ）第１リコンビナーゼ部位、ｃ）抗菌薬耐性遺伝子をコード化する核酸配列、ｄ）第２リコンビナーゼ部位、ｅ）プロモーター及びリンカー配列の２つのコンセンサス領域であって、ここで、第１コンセンサス領域が−３５領域を含み、第２コンセンサス領域が−１０領域を含み、及び前記リンカー配列が少なくとも１４乃至２０ヌクレオチドを含み及び前記第１コンセンサス領域と前記第２コンセンサス領域に隣接し、さらに、前記−３５領域及び前記−１０領域はそれぞれ前記プロモーターの対応コンセンサス領域の４乃至６の保存ヌクレオチドを含む、当該コンセンサス領域、及び、ｆ）前記プロモーターの＋１転写開始部位の下流領域に相同な核酸断片、をこの順番で含む２本鎖ポリヌクレオチド混合物を含む人工プロモーターライブラリーに関する。１の実施態様では、２本鎖ポリヌクレオチド混合物を含む人工プロモーターライブラリーは修飾された開始コドンをも含み、ここで、当該修飾された開始コドン配列は、−１０領域と＋１転写開始部位の下流領域に相同な核酸配列との間に位置する。別の実施態様では、２本鎖ポリヌクレオチド混合物を含む人工プロモーターライブラリーはｍＲＮＡ安定化核酸配列をさらに含み、ここで、当該ｍＲＮＡ安定化配列は、−１０領域と＋１転写開始部位の下流領域に相同な核酸配列との間に位置する。
【００１１】
第４の側面では、本発明は、選択宿主細胞においてプロモーターを修飾する方法であって、ａ）本発明の人工プロモーター、ＲＢＳ、開始コドン、又はｍＲＮＡ安定化配列、又はそれらの混合物を含むＰＣＲ生成物のライブラリーを得る工程；ｂ）細菌宿主細胞を前記ＰＣＲ生成物で形質転換する工程であって、前記人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物が相同組換えによって前記細菌宿主細胞中に組込まれる、当該工程；ｃ）前記形質転換細菌細胞を成長させる工程；ｄ）前記人工プロモーターを含む前記形質転換細菌細胞を選択する工程、を含む当該方法に関する。特定の実施態様では、細菌宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｐ．、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．よりなる群から選択される。
【００１２】
第５の側面では、本発明は、対象染色体遺伝子の一連の発現レベルを有する細菌細胞のライブラリーを構築する方法であって、ａ）本発明の人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物のライブラリーを得る工程；ｂ）細菌宿主細胞を前記ＰＣＲ生成物で形質転換する工程であって、前記人工プロモーターを含むＰＣＲ生成物が、相同組換えによって前記細菌宿主細胞中に組込まれて、形質転換細菌細胞が産出される、当該工程；ｃ）前記形質転換細菌細胞を成長させる工程；及び、ｄ）対象染色体遺伝子の一連の発現レベル示す形質転換細菌細胞のライブラリーを得る工程、を含む当該方法に関する。１の実施態様において、当該方法は、前記ライブラリーから形質転換細菌細胞を選択する工程をさらに含む。第２の実施態様において、前記選択された形質転換細胞は対象遺伝子の低い発現レベルを有し、及び、別の実施態様では、前記選択された形質転換細胞は対象遺伝子の高い発現レベルを有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、増幅ＤＮＡライブラリー（特に、ＰＣＲによって得たＤＮＡライブラリー）から細菌クローンのライブラリーを構築する方法であって、当該細菌クローンが対象染色体遺伝子の種々の発現レベルを示す、当該方法に関する。当該生成ＤＮＡライブラリーは、人工プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、開始コドン、及びｍＲＮＡ安定化配列いずれか１のライブラリーを含む。本明細書に開示する方法の利点は、細菌クローンのライブラリーを構築するために、インビボにおいてたった１つの工程しか要しないことである。
【００１４】
本発明の１の側面は、−３５コンセンサス領域（−３５ボックス）、−１０コンセンサス領域（−１０ボックス）、リンカー領域、ＲＢＳ、及び／又は開始コドンにおける１又は２のヌクレオチドを改変することによって遺伝子発現レベルが変化するという発見、さらには、当該改変によって、表現型を大きく変える一連の遺伝子発現の迅速な同定が可能になるという発見に関するものである。第２の側面では、本発明は、ＤＮＡライブラリーを１又は２の増幅工程によって生じさせるための、１又は２の変性オリゴヌクレオチド内に含まれるプロモーター前駆体、ＲＢＳ、開始コドン、及び／又はｍＲＮＡ安定化配列の使用方法に関する。
【００１５】
定義
特に別記しない限り、本明細書において用いられる技術の説明は、複数の周知の文献においてなされている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）；Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編集、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（１９９１年）；Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ編集、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（１９８９年）；及び、Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（１９９０年）である。別途定義しない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。  Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９９４年）、及びＨａｌｅ及びＭａｒｔｉｎ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ニューヨーク（１９９１年）は、当業者にとって、本発明において用いられている多くの用語を収録する一般的な辞書である。
【００１６】
本明細書に記載されるものと類似又は等価である任意の方法及び物質を、本発明の実施又は試験において用いることができるのではあるが、ここでは、好ましい方法及び物質について説明する。数値範囲には、当該範囲を規定する数字が含まれる。
【００１７】
特に示さない限り、核酸は左から右に５’から３’の方向へ記載し、アミノ酸配列は、左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向へ記載する。本明細書における見出しは、明細書全体にわたる本発明の種々の側面及び実施態様を制限するものではない。従って、以下に定義する用語は、本明細書全体を参照することによってさらに明確に定義される。本明細書において引用される文献、特許、及び特許出願は、引用により本願に援用される。
【００１８】
本発明の目的において、“ＤＮＡライブラリー”には、人工プロモーターライブラリー、修飾リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ライブラリー、修飾開始コドンライブラリー、及びｍＲＮＡ安定化ライブラリーのうちのいずれか１又は組合せが含まれる。ライブラリーには１０３以上のメンバーが含まれ得るが、好ましい実施態様では、ライブラリーは、少なくとも２、３、４、６、８、１６、又は６４のメンバーが含まれる。また、ＤＮＡライブラリーは、２本鎖ＤＮＡ分子に関しても用いられる。
【００１９】
本発明の目的において、“プロモーター”又は“プロモーター領域”という語は、転写開始の際にＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼによって認識及び結合される核酸配列を意味する。所定の遺伝子又は遺伝子群（オペロン）を発現するためには、その他の転写及び翻訳調節核酸配列（“調節配列”ともいう）と共に当該プロモーターが必要である。一般に、転写及び翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、及びエンハンサーまたは活性化配列が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。“転写開始部位”は、転写される最初のヌクレオチドを意味し、＋１で表される。当該開始部位の下流のヌクレオチドは、＋２、＋３、＋４等の番号が付され、逆に、反対側（上流側）のヌクレオチドは、−１、−２、−３等の番号が付される。プロモーターは、ＩＰＴＧ又は構成プロモーターによって誘発される調節可能プロモーター（例えば、Ｐｔｒｃ）である。
【００２０】
本発明において、プロモーターは、２つのコンセンサス領域を含む。コンセンサス領域は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される、異なる群の短い保存配列であり、これらはシグマ係数が相違する。１のコンセンサス領域は、転写開始部位から約１０塩基対（ｂｐ）上流に中心があり、これを−１０コンセンサス領域（−１０ボックス又はプリブナウボックス）と呼ぶ。他方のコンセンサス領域は、転写開始部位から約３５ｂｐ上流に中心があり、これを−３５コンセンサス領域（−３５ボックス）と呼ぶ。リンカー配列は、各コンセンサス領域の間に位置し、約１４乃至２０ｂｐからなる。
【００２１】
本発明のプロモーター前駆体は、天然（内因性）プロモーター又は外因性プロモーターであることができる。さらに、プロモーター前駆体は、対象遺伝子と相同又は非相同のいずれかである遺伝子組換えプロモーターであることができる。一般に、プロモーター前駆体は、転写開始部位（＋１）から、２５０乃至２５塩基対（ｂｐ）、１５０乃至２５ｂｐ、１００乃至２５ｂｐ、７５乃至２５ｂｐ、及び、好ましくは５０乃至３０ｂｐの範囲である。
【００２２】
本発明における“人工プロモーター”は、−３５ボックス、−１０ボックス、及び／又はリンカー配列における位置に対応する少なくとも１の位置においてヌクレオチドを改変することによって修飾されたプロモーター前駆体である。好ましい実施態様では、人工プロモーターは、転写開始部位（＋１）の上流の３０乃至５０ｂｐを含み、５０乃至３０ｂｐを有するプロモーター前駆体に由来するものである。
【００２３】
“プロモーターのライブラリー”という語は、少なくとも２のメンバーを有する、人工プロモーターを含むプロモーターの集団について用いられる。１の実施態様では、ライブラリーは、同一のプロモーター前駆体に由来する。
【００２４】
“リボソーム結合部位”（ＲＢＳ）は、通常は約４−１６塩基対を含む短いヌクレオチド配列であって、コード化タンパク質の翻訳のためのｍＲＮＡ分子に位置することで機能する。“修飾リボソーム結合”部位は、１以上の塩基対が改変されたリボソーム結合部位である。プロモーター前駆体とＲＢＳいずれもが修飾されて、同一のライブラリーで用いられる場合、好ましい修飾ＲＢＳは、プロモーター前駆体と同一の調節領域に由来するものである。修飾リボソーム結合部位のライブラリーは、同一の前駆体に由来する少なくとも２の修飾リボソーム結合部位を含む。
【００２５】
“ｍＲＮＡ安定化”は、遺伝子発現に影響を与える核酸配列挿入断片である。当該挿入断片は、一般に、遺伝子又は核酸配列の転写開始部位と翻訳開始部位との間に位置する。
【００２６】
“細菌クローンのライブラリー”は、ほぼ同一の成長条件で成長させた細菌細胞の集団であって、そのゲノムの大部分は同一であるが、（例えば、人工プロモーターのライブラリーを含み得る）本明細書に記載のＤＮＡライブラリーを含む。細菌クローンのライブラリーは、同一の対象遺伝子に対して種々の発現レベルを有する。
【００２７】
本明細書において、“核酸”という語には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びｃＤＮＡ分子が含まれる。遺伝子コードの縮重によって、所望のタンパク質をコード化する多数のヌクレオチド配列が産出され得ることが理解できるであろう。核酸という語は、“ポリヌクレオチド”という語と同義語的に用いられる。“オリゴヌクレオチド”は、短鎖の核酸分子である。精製制限消化などによって自然発生したものか又は合成によって産出されたものかどうかにかかわらず、プライマーはオリゴヌクレオチドである。これは、核酸ストランドの相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘発される条件下（すなわち、ヌクレオチド及び誘発剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下で、及び適切な温度及びｐＨ）に置かれた場合に、合成の開始点として機能することができる。増幅における最大の効率を得るためには１本鎖のプライマーが好ましいが、２本鎖も用いることができる。２本鎖の場合には、当該プライマーは、伸長生成物の生産に用いる前に、まず２本鎖を分離するために処理される。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。当該プライマーは、誘発剤の存在下における伸長生成物の合成を開始するために十分な長さでなければならない。当該プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、及び用いる方法などの多数の因子に依存する。
【００２８】
本明細書において、“遺伝子”という語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡ断片を意味し、そのコード領域の前及び後の領域（例えば、５’非翻訳配列（５’ＵＴＲ）又は
“リーダー”配列、及び３’ＵＴＲ又は“トレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ）”配列）、及び個々のコード部分（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【００２９】
本明細書において、“ポリペプチド”という語は、ペプチド結合で結合したアミノ酸残基により構成される化合物について用いられる。本明細書において、タンパク質、ペプチド、及びポリペプチドという語は、同義的に用いられる。
【００３０】
“修飾”という語には、配列における少なくとも１のヌクレオチド又はアミノ酸の欠失、挿入、置換、又は切断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ）が含まれる。
【００３１】
本明細書において、“欠失”という語は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列のいずれかにおいて、それぞれ１以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基がなくなるような変化を意味する。
【００３２】
本明細書において、“挿入”又は“付加”という語は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列において、それぞれ１以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基を追加することによってもたらされる、親配列に対する配列の変化である。
【００３３】
本明細書において、“置換”は、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸をそれぞれ別のヌクレオチド又はアミノ酸によって置き換えることである。
【００３４】
１の実施態様では、改変ＤＮＡ配列は、少なくとも１のヌクレオチドにおける部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により産出される。別の実施態様では、部位特異的変異誘発は、２以上のヌクレオチドについて実施される。更なる実施態様では、改変又は変異体ＤＮＡ配列は、改変前の野生型配列に対して、４０％より高い、４５％より高い、５０％より高い、５５％より高い、６０％より高い、６５％より高い、７０％より高い、７５％より高い、８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、９６％より高い、９７％より高い、又は９８％より高い相同性を有する。別の実施態様では、変異体ＤＮＡは、任意の公知の変異誘発工程（例えば、放射線、ニトロソグアニジン等）を用いて生体内で産出される。
【００３５】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係で位置する場合に“作動可能に連結する”という。例えば、プロモータは、配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に連結し；或いは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進する位置に存在する場合に、コード配列に作動可能に連結するという。核酸配列の連結は、適宜の制限部位における連結反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ）により達成される。そのような部位が存在しない場合には、従来法にしたがって合成オリゴヌクレオチド・アダプター、又はリンカーを用いることができる。
【００３６】
本明細書において、“ＤＮＡ構築物”という語は、宿主細胞又は有機体中に配列を導入するために使用されるＤＮＡについて用いられる。当該ＤＮＡは、ＰＣＲ又は任意のその他の適切な技術によって生体外で産出することができる。特定の実施態様では、本発明のＤＮＡ構築物は、プロモーター前駆体、対象遺伝子、又は別のＤＮＡセグメントに対して相同な上流（５’）配列及び／又は相同な下流（３’）配列を含む。更なる別の実施態様では、ＤＮＡ構築物は、ベクターに挿入することができる。当該ＤＮＡ構築物は、宿主細胞遺伝子と相同又は非相同の配列を含むことができ、さらに、相同配列と非相同配列の組合せを含むこともできる。特定の実施態様では、ＤＮＡ構築物は、選択マーカー遺伝子を含む。別の実施態様では、ＤＮＡ構築物は、人工プロモーターを含み、別の実施態様では、ＤＮＡ構築物は、修飾されたＲＢＳ配列、修飾された転写開始コドン、及びｍＲＮＡ安定化配列を含む。本明細書において、これらのＤＮＡ構築物は、まとめて又は個々に“調節ＤＮＡ構築物”と記載される場合がある。
【００３７】
本明細書において、“ベクター”という語は、異なる宿主間を移動するために設計された核酸構築物について用いられる。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、クローニングベクター、シャトルベクター、又は発現ベクターであることができる。“発現ベクター”という語は、異種ＤＮＡ断片を外来細胞中に組み込み、発現させることができるベクターについて用いられる。多くの原核及び真核生物の発現ベクターが市販されている。適当な発現ベクターを選択することは当業者の知識の範囲内である。本発明の方法において用いられるベクターは、プロモーターの単離及びキャラクタリゼーションに適切な任意のベクターであることができる。
【００３８】
本明細書において、“フランキング配列”という語は、議論の対象となっている配列の上流又は下流のいずれかに存在する任意の配列について用いられる（例えば、遺伝子ＡＢＣにおいて、遺伝子Ｂは、Ａ及びＣの遺伝子配列に隣接している）。特定の実施態様では、隣接配列は片側（３’又は５’）にのみ存在するが、好ましい実施態様では、隣接される配列の両側に存在する。
【００３９】
本明細書において、“異種核酸構築物”及び“異種核酸配列”という語は、発現する細胞に天然ではない遺伝子配列の一部について用いられる。調節配列に関して、“異種”という語は、ここで制御されるのと同一の遺伝子の発現を制御する機能を天然には有していない調節配列（すなわち、プロモーター）について用いられる。一般に、異種核酸配列は、それらが存在する細胞又はゲノム部分にとって内因性のものではなく、感染、形質移入、マイクロインジェクション、又はエレクトロポレーション等によって細胞に付加されたものである。特定の実施態様では、“異種核酸構築物”は、天然の細胞において得られる調節配列／ＤＮＡコード配列の組合せと同一又は異なる調節配列／ＤＮＡコード配列の組合せを含有する。
【００４０】
本明細書において、“相同性”という語は、配列の類似性又は同一性について用いられる（同一性が好ましい）。当該相同性は、当該技術分野において公知の標準的な技術を用いて評価することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２巻、４８２頁、１９８１年；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３頁、１９７０年；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、２４４４頁、１９８８年；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、マディソン、ウイスコンシン州）；及び、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１２巻、３８７−３９５頁、１９８４年、を参照されたい）。
【００４１】
“標的部位”という語は、ＤＮＡ構築物又はＤＮＡライブラリーの組込みが起こる細菌染色体内の特定の遺伝子位置を意味する。
【００４２】
本明細書において、“染色体組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）”という語は、外因性核酸配列が宿主細胞（例えば、バチルス）の染色体に導入される工程について用いられる。当該外因性核酸配列の非相同配列は、染色体の相同領域と合致する。その後、当該染色体配列の相同領域の間にある配列は、二重交差（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）（すなわち、相同組換え）において入力外因性配列と置換される。
【００４３】
本明細書において、核酸配列を細胞に挿入することに関して用いられる“導入”という語は、“形質移入”、“形質転換”、又は“形質導入”を意味し、及び、核酸配列を真核または原核細胞に組み込むことを含み、ここで、当該核酸配列は、当該細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、又はミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自律レプリコン（ａｕｔｏｍｏｕｓ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ）に変換され、又は一時的に発現される（例えば、トランスフェクトｍＲＮＡ）。
【００４４】
本明細書において、細胞に関する“形質転換”、“安定な形質転換”、又は“トランスジェニック”という語は、ゲノムに組み込まれた、又は複数世代を通して保存されるエピソームプラスミドとして非天然（異種）核酸配列を有する細胞を意味する。
【００４５】
本明細書において、“挿入ＤＮＡ構築物”又は“挿入ＤＮＡカセット”は、両側がリコンビナーゼ認識部位に隣接する選択マーカーを含むＤＮＡ構築物である。“リコンビナーゼ認識部位”は、ＤＮＡ断片の組込みが起こる細菌染色体内の所定の遺伝子位置（標的部位）における、対応組換え部位へのヌクレオチド配列の指向性挿入を促進する新規な組込み部位である。
【００４６】
本明細書において、“選択マーカー”という語は、宿主細胞において発現することができ、導入核酸又はベクターを含む宿主細胞の選択を容易にし得る遺伝子について用いられる。そのような選択マーカーの例には、抗菌薬（例えば、カナマイシン、エリスロマイシン、アクチノマイシン、クロラムフェニコール、及びテトラサイクリン）が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。従って、“選択マーカー”という語は、宿主細胞が外因性ポリヌクレオチド配列を受け入れたこと又はその他の反応が生じたことを示す指標を提供する遺伝子について用いられる。典型的には、選択マーカーは、宿主細胞に抗菌薬耐性又は代謝における利益を提供し、それにより、外因性ＤＮＡを含む細胞と、形質転換の間に外因性配列を全く摂り込まなかった細胞とを区別することを可能にする遺伝子である。
【００４７】
本明細書において、“増幅”及び“遺伝子増幅”という語は、増幅された遺伝子が、当初にゲノム中に存在するよりも多いコピー数で存在することとなるように、特定のＤＮＡ配列を不均衡に複製する工程について用いられる。この語は、また、増幅マーカーと共にその他の遺伝子配列（すなわち、発現ベクターの含まれるような非選択遺伝子の１以上を含むもの）を単一の細胞に導入し、適切な選択圧を用いて、当該細胞が増幅マーカー及びその他の非選択的遺伝子配列を両方とも増幅させることについて用いられる。
【００４８】
当該増幅マーカーはその他の遺伝子配列と物理的に連結することができ、或いは、２つの別個のＤＮＡ（一方は増幅マーカーを含有し、他方は非選択的マーカーを含有する）が同一の細胞に導入されることもできる。
【００４９】
本明細書において、“ポリメラーゼ連鎖反応”（“ＰＣＲ”）という語は、米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号、及び４，９６５，１８８号における方法について用いられる（これらは引用により本明細書中に取り込まれる）。これには、クローニングや精製を行うことなしに、ゲノムＤＮＡ混合物における標的配列のセグメントの濃度を増大させる方法が含まれる。標的配列を増幅する当該方法は、所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物に大過剰の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを導入する工程、その後、ＤＮＡポリメラーゼの存在下において正確な順序で熱サイクルを行う工程よりなる。当該２種のプライマーは、２本鎖標的配列のそれぞれのストランドと相補的である。効果的な増幅のために、混合物を変性させた後、標的分子内の相補的配列にプライマーをアニールする。アニーリングの後、新しい相補的ストランドのペアを産出するために、プライマーはポリメラーゼによって伸長される。当該変性、プライマーのアニーリング、及びポリメラーゼ伸長は、何回も繰り返される（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長は、１つの“サイクル”を構成し、多数の“サイクル”が存在し得る）。これにより、所望の標的配列のセグメントが高濃度で増幅される。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、それぞれのプライマーの相対的な位置によって決定されるので、その長さは調節可能なパラメータである。標的配列の所望の増幅セグメントは、混合物中における（濃度の点で）主要な配列になるので、それを“ＰＣＲ増幅”と呼ばれる。
【００５０】
本明細書において、“ＰＣＲ生成物”という語は、変性、アニーリング、及び伸長からなるＰＣＲ工程の２以上のサイクルが完了した後に得られる化合物の混合物について用いられる。これらの用語は、当該増幅が１以上の標的配列の１以上のセグメントについて行われた場合も包含する。２本鎖増幅生成物という語には、ＰＣＲ生成物が含まれる。
【００５１】
本明細書において、制限酵素”という語は、特定のヌクレオチド配列において又はその近くで２本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素について用いられる。
【００５２】
ＰＣＲを用いることにより、ゲノムＤＮＡにおける特定の標的配列の単一コピー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｐｙ）を、複数の異なる方法論で検出可能なレベルに増幅することが可能となる。当該方法論は、例えば、標識化プローブとのハイブリッド形成；ビオチン化プライマーを取り込んだ後のアビジン−酵素接合体の検出；増幅セグメントへの３２Ｐ−標識化デオキシリボヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＣＴＰ又はｄＡＴＰ）の取り込みである。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列を適切なプライマー分子を用いることにより増幅させることができる。特に、ＰＣＲ工程により産出された増幅セグメントは、それ自身が、その後のＰＣＲ増幅における効果的な鋳型となる。
【００５３】
本明細書において、“宿主細胞”という語は、本発明の導入ＤＮＡ（外因性）配列に対する宿主及び発現手段として機能し得る細胞について用いられる。
【００５４】
本明細書において、“発現”という語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成される工程をいう。当該工程には、転写及び翻訳の両方が含まれる。
【００５５】
“一連の発現レベル”という語は、ＰＣＲにより生産されたＤＮＡライブラリーを用いて形質転換された細菌クローンのライブラリーから得られた対象遺伝子の発現を意味する。１の実施態様では、クローンライブラリーにおける発現レベルは、プロモーター前駆体又は天然プロモーター及び調節領域を含む対象をほぼ同じ条件下で成長させた場合と比較して、１乃至５００％の範囲である。
【００５６】
“最適の発現”という語は、特定のコード領域に対する最適の遺伝子発現レベルを提供する累積（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ）条件について用いられる。特定の実験室条件では、最適の発現は、低いレベルの遺伝子発現を意味する。他の条件では、最適の発現は、発現遺伝子又はそれから生産された生成物が、特定の条件下で細胞の生存能力に有害であり又は当該細胞に悪影響を有するような状況において細胞内で共存し得る高いレベルの遺伝子発現を意味する。
【００５７】
本明細書において、“単離された”という語は、天然に由来する少なくとも１の成分から除去された核酸又はアミノ酸について用いられる。
【００５８】
本明細書において、“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”及びその同族語は、包括的な意味で用いられ、すなわち、“含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”という語及びその同族語と等価である。
【００５９】
冠詞である“Ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”には、特に明確に指示しない限り、複数形への言及が含まれる。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様
本発明の人工プロモーターを構築するために適切なプロモーター配列には、以下の表１に示すプロモーター前駆体が含まれる。図４は、−３５ボックス、−１０ボックス、及びリンカー領域を含む当該プロモーター前駆体のいくつかにおける配列を示すものである。表におけるプロモーターは全てベータ−ラクタマーゼプロモーターＰｂｌａによって特徴付けられ、プロモーター強度は“Ｐｂｌａ−単位”で示される（Ｄｅｕｓｃｈｌｅら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、５巻（１１）、２９８７−２９９４頁、１９８６年）。
【００６１】
一般に、本発明において用いられるプロモーターは、転写開始部位（＋１）から、２００乃至２０塩基対（ｂｐ）、好ましくは１５０乃至２５ｂｐ、より好ましくは１００乃至３０ｂｐ、及び、最も好ましくは５０乃至３０ｂｐ上流の間のプロモーター配列を含む。ＤＮＡライブラリーは、短い配列を有する一重縮重オリゴヌクレオチドにおいてより容易に構築することができるので、短い配列（５０乃至３０ｂｐの間）が最も好ましい。それゆえ、好ましい実施態様では、図４に開示されているようなプロモーターの短い配列を用いて、本発明の人工プロモーターが得られる。これらの好ましい配列は、おおよそ前記プロモーターの転写開始部位（＋１）から始まる約５０乃至３０ｂｐを含む。
【表１】
2005523015.tif 000002
【００６２】
本発明において有用な更なるプロモーターは、Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．、１４６巻、２６４３−２６５３頁（２０００年）に開示されており、１又は２の塩基対変化を含むＰｔａｃ及び変異体の配列が記載されている。１の実施態様では、好ましいプロモーター前駆体は、ｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）である。その−３５ボックス（ＴＴＧＡＣＡ）及び−１０ボックス（ＴＡＴＡＡＴ）は、Ｐｔａｃと同じである。しかしながら、Ｐｔｒｃのリンカー領域は１７ｂｐを含む（一方、Ｐｔａｃでは１６ｂｐ）。Ｐｔａｃの−１８及び−１０におけるヌクレオチドの間に“Ｃ”が付加されている（Ｒｕｓｓｅｌｌ及びＢｅｎｎｅｔｔ、Ｇｅｎｅ、２０巻、２３１頁、１９８２年、及び、Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ、２５巻、１６７−１７８頁、１９８３年）。
【００６３】
更なる有用なプロモーターは、グルコースイソメラーゼプロモーターＰＧＩである。当該プロモーターは、文字どおりにキシロースソメラーゼプロモーターとしても知られており、Ａｍｏｎｅら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３０巻、３５１−３５７頁に記載されている。当該ＰＧＩプロモーターは、ＧＣＣＣＴＴＧＡＣＡＡＴＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＴＡＡＴＴＣＡＡＣＣＡＣＴＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡ（配列番号１５）を含み、ここで、−３５ボックスはＴＴＧＡＣＡで表され、−１０ボックスはＡＡＴＡＡＴで表され、＋１転写開始部位はＡである。
【００６４】
上記のプロモーターに加えて、種々のプロモーター前駆体を本発明の実施において用いることができる。時として、強いプロモーターは、過剰発現して宿主細胞の生存能力に損失を及ぼす。細胞は、限られた組合せのシグナルを用いて、転写機構に関与し及び遺伝子を転写する。大腸菌等の細菌は、コアＲＮＡポリメラーゼ及び複数のシグマサブユニットを用いて、異なるタイプのプロモーターを認識する（ｄｅＨａｓｅｔｈら、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１８０巻、３０１９−３０２５頁、１９９８年）。急な成長に要する大腸菌遺伝子は、主として、ｒｐｏＤ遺伝子にコード化されたシグマ因子の制御下にある。ＲｐｏＤ依存性プロモーターの最も明白な構成要素は、コンセンサス配列ＴＴＧＡＣＡ及びＴＡＴＡＡＴのそれぞれに変異を有する−３５及び−１０領域である。当該プロモーター領域は、プロモーター強度に微妙な影響を与える２つのその他の構成要素、すなわち、上流領域（Ｇｏｕｒｓｅら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３７巻、６８７−６９５頁、２０００年）及びスペーサー領域（Ｂｕｒｒら、ＮＡＲ、２８巻、１８６４−１８７０頁、２０００年）を有する。これら２成分のそれぞれの寄与度は、−３５及び−１０領域がどの程度コンセンサスと類似しているかに依存して変化する。
【００６５】
本明細書に記載の人工プロモーターのライブラリーを得るために用いられるプロモーター前駆体は、種々の典型的な方法によって決定することができる。限定されることを望まないが、１の実施態様では、特定の宿主ゲノムの配列決定を行うことができ、コンピューター化検索アルゴリズムによって推定プロモーター配列を同定できる。例えば、ゲノム領域を配列決定し、プロモーター予測神経回路網ソフトウェア（ＮＮＰＰ）を用いて、推定プロモーターの存在を分析することができる。ＮＮＰＰは、ほとんどが２つの特徴的層よりなる時間遅延神経回路網である。２つの層の１つは、ＴＡＴＡボックスを認識するためのものであり、他方は、転写開始部位に及ぶ領域であるいわゆる“イニシエーター”を認識するためのものである。当該特徴的層は、いずれも出力装置に連結している。プロモーター前駆体の配列の更なる同定は、相同性分析を用いて（例えば、ＢＬＡＳＴを用いて）宿主細胞のゲノムにおいて同定された推定プロモーター配列を検証することによって、同定することができる。その後、これらの推定配列は、大腸菌における予備的キャラクタリゼーション及び／又は直接キャラクタリゼーションに適切なカセット中にクローン化することができる。
【００６６】
別の実施態様では、コンセンサスプロモーター配列の同定は、相同性分析を用いて所定のゲノムにおいて同定された推定プロモーター配列及びゲノム群を検証することによって、同定することができる。例えば、ゲノム群の相同性実験は、ＢＬＡＳＴを用いて実行し、推定コンセンサスプロモーターの存在について分析することができる。その後、これらの推定配列は、大腸菌における予備的キャラクタリゼーションに適切なカセット中にクローン化することができる。
【００６７】
本発明の人工プロモーターは、プロモーター前駆体におけるヌクレオチドに対する少なくとも１の修飾を含む。１の実施態様では、当該修飾は、−３５コンセンサス領域に位置するヌクレオチドに対するものである。当該修飾には、プロモーター前駆体の−３０、−３１、−３３、−３４、−３５、及び／又は−３６位置のヌクレオチドに対応する位置における１以上のヌクレオチドに対する修飾が含まれ得る。好ましくは、修飾は１又は２のヌクレオチドのものであり、好ましくは、当該修飾は、１又は２のヌクレオチドの置換である。２つの位置が修飾される場合には４つの位置が保存され、１つの位置が修飾される場合には５つの位置が保存される。別の実施態様では、当該修飾には、位置−３０で表されるヌクレオチドの修飾、及び／又は−３５に対応する位置の変更が含まれる。
【００６８】
好ましい実施態様では、人工プロモーターは、以下の配列；ＴＴＧＡＣＡ、ＴＴＧＣＴＡ、ＴＴＧＣＴＴ、ＴＴＧＡＴＡ、ＴＴＧＡＣＴ、ＴＴＴＡＣＡ、及びＴＴＣＡＡＡによって表される−３５ボックスを有するプロモーター前駆体から得られる。前駆体プロモーターからの特に好ましい−３５コンセンサス領域は、ＴＴＴＡＣＡ及びＴＴＧＡＣＡである。プロモーター前駆体の−３５ボックスがＴＴＧＡＣＡである場合の非限定的な例では、位置−３０におけるヌクレオチドはＡであり、Ｔ、Ｇ、又はＣヌクレオチドで置換することができる。また、位置−３１におけるヌクレオチドはＣであり、Ａ、Ｔ、又はＧヌクレオチドで置換することができる。位置−３２におけるヌクレオチドはＡであり、Ｔ、Ｇ、又はＣヌクレオチドで置換することができる。位置−３３におけるヌクレオチドはＧであり、Ａ、Ｔ、又はＣヌクレオチドで置換することができる。位置−３４におけるヌクレオチドはＴであり、Ａ、Ｇ、又はＣヌクレオチドで置換することができる。位置−３５におけるヌクレオチドはＴであり、Ａ、Ｇ、又はＣヌクレオチドで置換することができる。
【００６９】
別の実施態様では、修飾は−１０コンセンサス領域におけるものである。当該修飾には、プロモーター前駆体の−７、−８、−９、−１０、−１１、及び／又は−１２の位置に対応する位置おける１以上のヌクレオチドに対する修飾が含まれる。好ましくは、当該修飾は、１又は２のヌクレオチド位置におけるものである。特に好ましい実施態様では、前駆体プロモーターは、−１０ボックスの以下の配列；ＴＡＡＧＡＴ、ＴＡＴＡＡＴ、ＴＡＴＡＣＴ、ＧＡＴＡＣＴ、ＴＡＣＧＡＴ、ＡＡＴＡＡＴ、ＴＡＴＧＴＴ、及びＧＡＣＡＡＴを含む。特に好ましいのは、ＴＡＴＡＡＴ、ＴＡＴＧＴＴ、ＡＡＴＡＡＴ、及びＴＡＡＧＡＴであり、最も好ましいのは、ＴＡＴＡＡＴ及びＡＡＴＡＡＴである。１の特定の実施態様では、プロモーター前駆体は、ｔｒｃプロモーター、特に、＋１転写開始部位の５０乃至３０ｂｐ上流である。人工プロモーターは、ＴＡＡＧＡＴで表される−１０ボックスにおけるヌクレオチドに対して少なくとも１の修飾を含む。例えば、位置−７におけるヌクレオチドはＴであるから、Ｃ、Ｇ、又はＡヌクレオチドで置換することができる。また、位置−８におけるヌクレオチドはＡであるから、Ｃ、Ｇ、又はＴヌクレオチドで置換することができる。位置−９におけるヌクレオチドはＧであるから、Ｃ、Ｔ、又はＡヌクレオチドで置換することができる。位置−１０におけるヌクレオチドはＡであるから、Ｔ、Ｃ、又はＧヌクレオチドで置換することができる。位置−１１におけるヌクレオチドはＡであるから、Ｔ、Ｃ、又はＧヌクレオチドで置換することができる。及び、位置−１２におけるヌクレオチドはＴであるから、Ｃ、Ｇ、又はＡヌクレオチドで置換することができる。
【００７０】
本発明における特定の実施態様では、プロモーター前駆体の−３５ボックス及び−１０ボックスの両方を修飾される。１の実施態様では、当該修飾は各コンセンサス領域における１のヌクレオチドを含み、更なる実施態様では、当該修飾は各コンセンサス領域における２のヌクレオチドを含む。別の実施態様では、修飾は、ＴＴＧＡＣＡで表される−３５ボックスに対する修飾、及びＡＡＴＡＡＴで表される−１０ボックスに対する修飾を含む。別の実施態様では、修飾は、ＴＴＧＡＣＡで表される−３５ボックスに対する修飾、及びＴＡＴＡＡＴで表される−１０ボックスに対する修飾を含む。
【００７１】
また、プロモーター前駆体のリンカー配列を修飾して、本発明の人工プロモーターを得ることもできる。当該前駆体リンカー配列は、欠失、置換、又は挿入を含むことができる。好ましくは、リンカー配列は、１４乃至２０塩基対の長さである。欠失分析を行うことによって（例えば、前駆体プロモーターにおいて連続的欠失をもたらす部位特異的変異誘発によって）、リンカー配列の長さを変更して、発現を最適化することができる。当該リンカー配列又はプロモーター前駆体が、１６塩基対、１７塩基対、１８塩基対、１９塩基対、又は２０塩基対を含むようにその長さを変更することができる。
【００７２】
１の実施態様では、プロモーター前駆体における修飾ＤＮＡ配列は、周知の技術に従って縮重オリゴヌクレオチドを用いることにより生産される。好ましい実施態様では、人工プロモーターは、転写部位（＋１）の上流の３０乃至５０ｂｐを含み、それにより、当該プロモーターは、オリゴヌクレオチドの縮重によって構築されたプロモーターライブラリーの中及びオリゴヌクレオチドの中に含まれることができる。
【００７３】
特定のＤＮＡ片に対するＲＮＡポリメラーゼの結合速度論を測定し、さらには転写の開始を観測することができるインビトロの方法（Ｄ．Ｋ．Ｈａｗｌｅｙら、ＰＲＯＭＯＴＥＲＳ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３章、Ｒ．Ｌ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＭ．Ｊ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ編集、Ｐｒａｅｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．、ニューヨーク）を用いて、プロモーター強度を定量することができる。また、インビボの方法を用いてプロモーター強度を定量することもできる。この場合、当該アプローチは、プロモーターをリポーター遺伝子に融合することであり、ＲＮＡ合成の効率が測定される。
【００７４】
人工プロモーターのライブラリーを含むＤＮＡライブラリーを構築するために、挿入ＤＮＡ構築物の第１末端（好ましくは、３’末端）と相同な核酸配列、上述のプロモーター、及びプロモーター前駆体又は天然プロモーターにおける転写開始部位の下流領域と相同な核酸配列を含む第１縮重オリゴヌクレオチドは、i）対象染色体遺伝子のプロモーター前駆体又は天然プロモーターにおける上流領域と相同な核酸配列、及び挿入ＤＮＡ構築物の第２末端（好ましくは、５’末端）と相同な核酸配列を含む第２オリゴヌクレオチド、及び、ii）増幅反応（好ましくは、人工プロモーターを含む２本鎖増幅生成物を得るためのＰＣＲ反応）における挿入ＤＮＡ構築物の両方と混合される。
【００７５】
好ましい実施態様では、挿入ＤＮＡ構築物は、プラスミド（好ましくは、Ｒ６Ｋプラスミド）上にあり、リコンビナーゼ認識部位の両側に隣接する抗生物質耐性遺伝子を含む（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｒｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．、９７巻、６６４０−６６４５頁、２０００年）。任意の所望の選択マーカーを用いることができるが、抗生物質耐性マーカー（ＡｎｂＲ）が最も有用である。これらには、ＣｍＲ、ＫｍＲ、及びＧｍＲが含まれる（ただし、これらに限定されない）。好ましくは、リコンビナーゼ認識部位は同一である。リコンビナーゼ部位は、当該技術分野において周知であり、一般に、その触媒機構に基づいて２つの族に分類される（Ｈｕａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９巻、４４３頁、１９９１年；及び、Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２６巻、３９１−４０６頁、１９９８年を参照）。
【００７６】
好ましい組換えシステムは、Ｆｌｐ酵素、及び２つの非対称３４ｂｐＦＲＴ最小組換え部位を含む、サッカロミセスＦｌｐ／ＦＲＴ組換えシステムである（Ｚｈｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０巻、１１６４６−１１６５３頁、１９９５年）。ＦＲＴ部位は、反転し、不完全に反復した２つの１３ｂｐ配列を含み、これらは、交差（ｃｒｏｓｓｉｎｇ−ｏｖｅｒ）が起こる８ｂｐのコア非対称配列を取り囲む。２つの平行なＦＲＴ部位の間におけるＦＬＰ−依存性分子内組換えにより、それぞれが１のＦＲＴ部位を含有する２つの組換え生成物を生産する環状分子として任意の介在性ＤＮＡ配列が切除される（Ｈｕｆｆｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８６巻、１−１３頁）。
【００７７】
一般に、下流領域又は上流領域に相同な核酸配列は、２−１５０ｂｐ、好ましくは５−１００ｂｐ、より好ましくは５−５０ｂｐ、及び１０−４０ｂｐを含み得る。特定の実施態様では、プロモーター前駆体又は天然プロモーターの転写開始部位の下流に相同な核酸、又は対象染色体遺伝子のプロモーター前駆体の上流領域に相同な核酸配列は、約５乃至１０塩基対、及び５乃至５０塩基対を含み得る。挿入ＤＮＡ構築物に５’末端又は３’末端に相同な核酸は、約１０乃至４０塩基対、好ましくは約２乃至２５塩基対を含み得る。プロモーター前駆体の上流領域とは、−３５コンセンサス配列の上流（５’）の断片を意味する。
【００７８】
本発明の更なる実施態様では、プロモーター前駆体領域の下流であるＲＢＳは、修飾されることができる。修飾され得る好ましいＲＢＳは、以下の配列から選択される配列を含む：ＡＧＧＡＡＡ（配列番号３０）、ＡＧＡＡＡＡ（配列番号３１）、ＡＧＡＡＧＡ（配列番号３２）、ＡＧＧＡＧＡ（配列番号３３）、ＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡ（配列番号３４）、ＡＡＧＧＡＡＡＡ（配列番号３５）、ＡＡＧＧＡＡＡＧ（配列番号３６）、ＡＡＧＧＡＡＡＵ（配列番号３７）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡ（配列番号３８）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＧ（配列番号３９）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＵ（配列番号４０）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ（配列番号４１）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧ（配列番号４２）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＵ（配列番号４３）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号４４）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号４５）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号４６）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号４７）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号４８）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号４９）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号５０）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号５１）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号５２）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号５３）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号５４）、ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡ（配列番号５５）、及びＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号５６）。最も好ましいＲＢＳには、ＡＧＧＡＡＡ（配列番号３０）、ＡＧＡＡＧＡ（配列番号３２）、ＡＧＧＡＧＡ（配列番号３３）、及びＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡ（配列番号５５）が含まれる。当該修飾ＲＢＳには、ＲＢＳに含まれる任意の１の塩基対における置換、欠失、又は挿入が含まれ得る。
【００７９】
修飾ＲＢＳライブラリーを含むＤＮＡライブラリーを得るために、プロモーター又は人工プロモーターにおける−１０ボックスの下流領域と相同な核酸断片、修飾ＲＢＳ、及び開始コドンを含む対象染色体遺伝子の５’末端と相同な核酸断片を含むオリゴヌクレオチドは、同様のＰＣＲ条件下において、上述の人工プロモーターを含む２本鎖増幅生成物と混合される。当該相同な核酸断片は、２乃至１００塩基対、好ましくは２乃至５０塩基対を含むことができる。１の実施態様では、対象遺伝子の（ＸＴＧ）開始コドンが修飾され得る。これらの変異には、対象遺伝子における天然開始コドンに応じて、Ｘ＝Ａ、Ｔ、Ｇとすることが含まれ得る。
【００８０】
本明細書に記載の方法における別の実施態様では、ｍＲＮＡ安定化配列を、オリゴヌクレオチド中に取り込むことができる。当該オリゴヌクレオチドは、人工プロモーター又は修飾リボソーム結合部位、或いはその両方を含むことができる。好ましくは、当該安定化配列は、ＲＢＳと転写開始部位の間に挿入される。
【００８１】
ｍＲＮＡ安定化配列は、当該技術分野において周知である（Ｃａｒｒｉｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、１５巻、５８−６４頁、１９９９年を参照されたい）。好ましいｍＲＮＡ安定化配列には、以下の配列
ＧＧＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＡＣＧ（配列番号６３）；
ＧＧＴＧＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＡＣＧ（配列番号６４）；
ＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＡＣＧ（配列番号６５）；
ＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＡＣＧ（配列番号６６）；
ＣＧＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＡＣＧ（配列番号６７）；
ＧＧＴＧＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＡＣＧ（配列番号６８）；及び、
ＧＣＴＧＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＡＣＧ（配列番号６９）；
が含まれる。好ましい実施態様では、当該安定化配列は、配列番号６７である。また、２本鎖増幅生成物は、対象遺伝子の修飾開始コドンを含むこともできる。
【００８２】
本発明の人工プロモーター、修飾リボソーム結合部位、修飾開始コドン、ｍＲＮＡ安定化配列、及びそれらの組合せを含む２本鎖増幅生成物は、それぞれ独立に用いて、宿主細胞中に導入することができる。さらに、２本鎖増幅生成物は、ＤＮＡライブラリー中に用いることができ、ここで、当該ライブラリーは、人工プロモーターのライブラリー、修飾リボソーム結合部位のライブラリー、修飾開始コドンのライブラリーのうちの１以上を含むが、ｍＲＮＡ安定化配列は含んでも含まなくてもよい。当該ＤＮＡライブラリーは、細菌宿主細胞中に導入され、対象遺伝子の染色体調節領域を置換する。好ましくは、当該２本鎖増幅生成物は、宿主細胞染色体中に組込まれる。当該２本鎖増幅生成物のフランキング相同領域は、宿主染色体の対象遺伝子配列の認識部位における相同領域を置換する。好ましい実施態様では、ＰＣＲ生成物の組込みは、安定な不可逆（ｎｏｎ−ｒｅｖｅｒｔｉｎｇ）組込みである。好ましくは、置換は、二重交差（すなわち、相同組換え）によるものである。導入されたＰＣＲ生成物は、対象遺伝子における一連の発現レベルを有する細菌細胞のライブラリーを構築することができる。
【００８３】
本明細書に記載の方法は、任意の特定の遺伝子又は遺伝子群（オペロン）の発現に限定されるものではなく、多くのその他の遺伝子又はオペロンもついても広く適用可能なものである。１の好ましい実施態様では、本発明の人工プロモーター又はその他の調節ＤＮＡ構築物は、プロモーター前駆体と非相同なコード配列へ作動可能に連結し、別の実施態様では、当該人工プロモーター又はその他の調節ＤＮＡ構築物は、プロモーター前駆体と相同なコード配列へ作動可能に連結することができる。さらに、当該コード配列は、本発明によって形質転換された宿主細胞に対して異種であっても又は内因性であってもよい。
【００８４】
特定の実施態様では、当該遺伝子は、治療的に重要なタンパク質又はペプチド、例えば、成長因子、ホルモン、サイトカイン、リガンド、レセプター、及び阻害剤、さらには、ワクチン及び抗体をコード化する。また、当該遺伝子は、商業的に重要な工業用タンパク質又はペプチド、例えば、酵素（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、デヒドロゲナーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ガラクトシダーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、キナーゼ、キシラナーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、キチナーゼ、グルコオキシダーゼ、カタラーゼ、フィターゼ、イソメラーゼ、ホスファターゼ、及びリパーゼ）をコード化することもできる。更なる実施態様では、対象遺伝子は、広範囲の制御因子をコード化し、例えば、輸送タンパク質（例えば、グルコース及び／又はＤＫＧパーミアーゼ）、及び、一次及び二次代謝から得られる酵素（例えば、それぞれトリオースリン酸イソメラーゼ及びＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするｔｐｉ及びｎｕｏ）をコード化する。
【００８５】
１の実施態様では、宿主細胞は、グラム陽性細菌などの細菌細胞である。別の実施態様では、当該宿主細胞は、グラム陰性細菌である。特定の好ましい実施態様では、当該用語は、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、バチルス属、及び大腸菌細胞のおける細胞について用いられる。
【００８６】
本明細書において、“バチルス属”には、当該技術分野における当業者に公知の全ての種類が含まれ、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リシェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィラス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケフェシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウジ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、及びＢ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。バチルス属は、分類学的に再編成され続けている。従って、当該属には再分類された種も含まれ、例えば、現在は“ジェオバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）”と命名されているＢ．ステアロサーモフィラス等の微生物が含まれる（ただし、これに限定されるものではない）。酸素存在下における耐性内生胞子（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｅｎｄｏｓｐｏｒｅ）の生産は、バチルス属の特性を定義する際に考慮されるが、当該特性は、また、近年命名された、アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アニュリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びビルジバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）についても適用される。
【００８７】
本明細書において、本明細書において、“パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属”には、当該技術分野における当業者に公知の全ての種類が含まれ、例えば、Ｐ．アグロメランス（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、Ｐ．ジスペルサ（Ｐ．ｄｉｓｐｅｒｓａ）、Ｐ．プンクタータ（Ｐ．ｐｕｎｃｔａｔａ）、Ｐ．シトエア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）、Ｐ．テレア（Ｐ．ｔｅｒｒｅａ）、Ｐ．アナナス（Ｐ．ａｎａｎａｓ）、及びＰ．ステラルチ（Ｐ．ｓｔｅｒａｒｔｉｉ）が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。パントエア属は、分類学的に再編成され続けている。従って、当該属には再分類された種も含まれ、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）等の微生物が含まれる（ただし、これに限定されるものではない）。
【００８８】
当該技術分野における当業者は、宿主細胞（特に、大腸菌、バチルス、及びパントエア宿主細胞）中にポリヌクレオチドを導入する方法について十分な知識を有している。一般的な形質転換の手法は、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１巻、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、第７章、１９８７年）、及び、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）に開示されている。また、Ｈａｒｄｗｏｏｄら編集、Ｂａｃｉｌｌｕｓにおける、Ｆｅｒｒａｒｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５７−７２頁、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、１９８９年；Ｃｈａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１６８巻、１１−１５頁、１９７９年；Ｓｍｉｔｈら、Ａｐｐｌ．ａｎｄ  Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５１巻、６３４頁、１９８６年；及びＨ．Ｐｏｔｔｅｒ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７４巻、３６１−３７３頁、１９８８年、を参照されたい。これらには、形質転換の方法、例えば、電気せん孔法、プロトプラスト形質転換法及びコングレッション（ｃｏｎｇｒｅｓｓｉｏｎ）、形質導入及びプロトプラスト融合が開示されている。形質転換法が特に好ましい。
【００８９】
細菌細胞を維持し成長させる適切な方法は周知である。Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔら編集、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９８１年）、及び、Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ  ＭＡ（１９８９年）を参照されたい。
【００９０】
形質転換宿主細胞は、挿入ＤＮＡ構築物で提供された選択マーカーに応答する表現型に基づいて選択される。特定の実施態様では、当該選択マーカーは、宿主細胞外で切除することができる（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖら、Ｇｅｎｅ、１５８巻、９−１４頁、１９９５年）。
【００９１】
さらに、種々の技術を用いて、形質転換体を分析し、調節ＤＮＡ構築物（例えば、人工プロモーター）の組込みを確認することができる。人工プロモーターを含む調節ＤＮＡ構築物は、リコンビナーゼ領域の外部のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによって評価することができる。１の例では、人工プロモーターから得られたＰＣＲ生成物の大きさは、アガロースゲルにおいて参照プロモーターから得られたＰＣＲ生成物の大きさと比較される。当該調節ＤＮＡ構築物は、人工プロモーターを消化できないが参照プロモーターを消化することができる制限酵素を用いて、人工プロモーターから得られたＰＣＲ生成物を消化することによって確認することができる。また、調節ＤＮＡ構築物は、遺伝子の発現及び生産を評価することによっても確認することができる。酵素活性を測定するための多くのアッセイが公知である。例えば、ベータ−ガラクトシダーゼはｌａｃＺ遺伝子によって生産される酵素であるが、当該酵素の活性は、Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ  ＳＨＯＲＴ  ＣＯＵＲＳＥ  ＩＮ  ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２年、に開示されているアッセイによって評価することができる。
【００９２】
さらに、宿主細胞における人工プロモーター領域及びその他の調節領域は、当該技術分野において周知の方法によって配列決定することができる（Ｍａｘａｍら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、７４巻、５６０−５６４頁、１９７７年）。
【００９３】
本発明によって形質転換された宿主細胞は、対照の親細胞における遺伝子のコード領域の発現レベルよりも高い又は低い、対象遺伝子の発現レベルを有することができる。１の実施態様では、形質転換宿主における遺伝子発現レベルは、対応する親細胞における同一遺伝子の発現レベルの約１乃至５００％、約１乃至２５０％、約５乃至２００％、約１０乃至１５０％、及び約１０乃至１００％である。また、対応する親細胞の発現レベルの約５％、１５％、２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、及び２００％である。
【００９４】
人工プロモーターのライブラリー、修飾ＲＢＳのライブラリー、ｍＲＮＡ安定化配列のライブラリー、又は開始コドンのライブラリー、又はそれらの組合せを含む、本発明のＤＮＡライブラリーを用いて、対象遺伝子の種々の発現レベルを有する細菌細胞集団を構築することは、代謝工学の経路構造において特に有用である。代謝経路は、大きな分子をより小さな分子に分解する化学反応（異化代謝）、又は小さな分子からより複雑な分子を合成する化学反応（同化代謝）を含む一連の化学反応である。これらの化学反応のほとんどは、多数の酵素によって触媒される。多くの代謝経路には、当該経路を制御する役割を果たす律速酵素工程が存在する。例えば、グルコースがピルビン酸化合物とＡＴＰに転化される解糖経路では、ホスフォフルクトキナーゼが、制御における鍵酵素であると考えられている。ＮＡＤＰＨとリボース−５−リン酸が生産されるペントースリン酸経路では、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びフルクトース−１，６−ジホスファターゼが鍵酵素であると考えられている。
【００９５】
商業的な実現可能性のためには、化学物質又はタンパク質は、微生物中において低い培養コストで大量に生産され回収できなければならない。多くの工業的バイオプロセスでは、全細胞（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ）培養技術が利用されている。多くの場合、単離された酵素系を用いることは、あまりにも高価であり、非実用的である。多くの酵素（例えば、薬剤の中間体のキラル合成を行うために利用されるデヒドロゲナーゼ等）は、その反応のために補因子（例えば、ＮＡＤ（Ｐ））を必要とする。補因子は、反応において化学量論的に用いられ、反応混合物に繰り返し添加しなければならず、若しくは、当該反応において補因子を再生しなければならない。全細胞系は、これらの多くの酵素に対する代替物を提供する。その他の酵素は、膜に結合したものであることができ、或いは、複合サブユニット又は多酵素複合体（例えば、シトクロム  Ｐ−４５０ｓ）を必要とし、これによって、全細胞系を用いてより簡易に実施することができる。さらに、複雑な分子（例えば、ステロイド、抗生物質、及びその他の薬剤）の合成には、複雑な多重触媒経路が必要となる場合がある。
【００９６】
孤立系では、特定の代謝経路における各工程は、人工的に操作される必要がある。一方、全細胞系において用いられる微生物は、所望の各工程を提供する。しかしながら、特定のプロモーター（例えば、あまりにも強すぎるもの）を用いることによって問題が生じる場合もある。その結果、特定の遺伝子の過剰発現が生じ、細胞にとって悪影響となることがある。それにより、細胞の生存能力が減少し、生産時間が限られる場合がある。
【００９７】
本明細書に記載の方法を用いて、細菌宿主細胞に導入されて一連の遺伝子発現を有する形質転換細胞の集団をもたらす、調節ＤＮＡ構築物のライブラリー（例えば、修飾プロモーターのライブラリー、修飾ＲＢＳのライブラリー、及び修飾開始コドンのライブラリーなどであって、これらは、ｍＲＮＡ安定化配列を含むことができる）を得ることができる。最適の発現レベルを有しかつ細胞生存性も維持する特定の細菌クローンの選択（例えば、所望の生産レベルを維持する宿主細胞の生存能力に関する所望の最終生成物の連続的生産）を可能にするので、遺伝子発現の幅は有用である。特定の実施態様では、最適な遺伝子発現レベルは、高いものであり、別の実施態様では、最適な遺伝子発現レベルは低いものである。１の実施態様では、クローンライブラリーにおける対象遺伝子の発現レベルは、−１００乃至＋５００％、−５０乃至＋１５０％、及び−８０乃至１００％であることができる。例えば、特定のクローンのライブラリーにおける対象遺伝子の発現レベルは、対応する親細胞における遺伝子発現よりも１００％低いものであることができる。また、特定のクローンにおける対象遺伝子の発現レベルは、対応する親細胞における同じ遺伝子の発現よりも５００％高いものであることもできる。
【００９８】
当該方法の直接的な利点は、細菌クローンを、ＤＮＡライブラリーから得られる発現レベルに基づいて選択することができ、その後、対象遺伝子の発現によって細胞生存性が悪影響を受けないように発酵工程においてすぐに使用する状態にできることである。
【００９９】
以下の実施例は、本発明を例証するためのものであり、本発明を限定するものと捉えられるべきものではない。当該技術分野における当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく変更及び修正が可能であることは明らかであろう。
【０１００】
実施例について
ＡＴＣＣ番号４７０７６を有する大腸菌株ＭＧ１６６５を用いて、人工プロモーターのライブラリー、ｍＲＮＡ安定化配列のライブラリー、及び修飾ＲＢＳのライブラリーを含む細菌クローンのライブラリーを構築した。
【実施例１】
【０１０１】
ＰＣＲにより得た種々の強度の人工プロモーターによって天然プロモーターを置換し、制御因子を欠失することによる、染色体遺伝子の種々の発現レベルを有する大腸菌クローンライブラリーの構築
本実施例では、ＰＣＲにより産出した種々の強度を有する人工プロモーターによる（ベータ−ガラクトシダーゼをコード化する）天然ｌａｃＺプロモーターの大腸菌ゲノムの置換、及び抑制因子をコード化するｌａｃｌの欠失について記載する。
【０１０２】
ａ）ｌａｃＺプロモーターを置換するためのオリゴヌクレオチドの設計
ｌａｃｌ遺伝子の５’に相同な７９ｂｐ配列、パン酵母のＦＲＴ部位に隣接するクロラムフェニコールコード化遺伝子（ｃａｔ）、３つの人工ＧＩプロモーター配列のライブラリー（図６）、及び、天然ｌａｃＺプロモーターの＋１転写開始部位の下流領域に相同な４０ｂｐ配列を含むカセットをＰＣＲによって増幅するために、オリゴヌクレオチド（ｌａｃＺＦ及び縮重したｌａｃＺＲ）を設計した。
【０１０３】
縮重ｌａｃＺＲプライマーは、１００ヌクレオチドの長さであり、転写開始部位の＋１からｌａｃＺのＡＴＧまで（３６５５２９乃至３６５５６７）の全体配列を含む。ｌａｃＺＲオリゴヌクレオチドは、
ＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＡＡＣＡＡＴＴＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＨＧＴＣＡＡＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ
であり、ここで、Ｈは、Ａ、Ｃ、又はＴである（配列番号５７）。
【０１０４】
−３５の４ｂｐ上流から−１０の８ｂｐ下流のＧＩプロモーターを、−３５の最後の塩基で縮重させ（ＴＴＧＡＣＡ、ＴＴＧＡＣＴ、及びＴＴＧＡＣＧ）、相違点を作った。ｐＫＤ３におけるプライミング部位（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ、ＰＮＡＳ、９７巻、６６４０−６６４５頁、２０００年）、Ｒ６Ｋプラスミドは、２つのＦＲＴ部位に隣接するｃａｔ遺伝子を含む。
【０１０５】
ｌａｃＺＦプライマーは、１００ヌクレオチドの長さであり（配列番号５８）、ｌａｃｌ遺伝子の５’末端における７９ｂｐの配列（３６６７３４乃至３６６６７５）及びｐＫＤ３におけるプライミング部位を有する。
【０１０６】
ｌａｃＺＦオリゴヌクレオチドは、
ＧＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡＴＡＣＧＡＴＧＴＣＧＣＡＧＡＧＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＣＧＴＴＴＣＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ
である（配列番号５８）。
【０１０７】
ｂ）ＧＩプロモーター置換カセットの増幅及び精製
プライマーｌａｃＺＦ及びｌａｃＺＲを用い、鋳型としてプラスミドｐＫＤ３を用いて、プロモーター置換カセットのライブラリーを増幅した。当該増幅では、製造者（ＢｉｏＬａｂｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ）の指示どおりＴａｑポリメラーゼを用いて、９４℃で２分間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間の３０サイクルを行った。１．１５ｋｂのＰＣＲ生成物の混合物を、Ｑｕｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．）を用いてゲル精製した。
【０１０８】
ｃ）ｌａｃＺ遺伝子の前の種々の人工プロモーターを有するクローンライブラリーの構築
Ｒｅｄ  Ｈｅｌｐｅｒプラスミド（ｐＫＤ４６）（上述のＤａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）を有する形質転換体を、カルベニシリン（１００ｍｇ／ｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）を含むＳＯＢ培養液２０ｍｌ中で３０℃においてＯＤ５５０ｎｍが０．６まで培養し、その後、１００濃度でエレクトロコンピーテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）を行い、氷冷水で１回洗浄し、氷冷１０％グリセロールで２回洗浄した。５０μｌの細胞及び０．１乃至１．０μｇの精製ＰＣＲ生成物の混合物（上述）において、電圧ブースターと０．２ｃｍのチャンバーを有するＧｅｎｅパルス（ＢｉｏＲａｄ−モデルII装置１６５−２１０６）を使用説明書に基づいて用い、電子せん孔法を行った。刺激を受けた細胞を３０℃で２時間培養した１ｍｌのＳｏｃ培養液に添加し、その後、細胞の半数を寒天に塗布し、ＣｍＲ形質転換体を選択した。４０ｍｇ／ｌのＸｇａｌを寒天プレートに添加し、βガラクトシダーゼの発現を評価した。２４時間以内に細胞が増殖しなかった場合には、残りを３０℃で一晩維持した後に塗布した。
【０１０９】
ｄ）形質転換体のＰＣＲ確認
３０ｍｇ／ｌのＣｍを含むＬＢ培地において、変異体を一晩成長させた。１ｍｌの培養液を氷冷水で洗浄し、当該洗浄した細胞を熱処理（９４℃で５分間）した後、染色体ＤＮＡを上澄みから回収した。当該染色体ＤＮＡ及び２つのオリゴヌクレオチド（ＬａｃｓｅｑＦ及びＬａｃｓｅｑＲ）の組を用いて、ＰＣＲを行った。上述のように増幅を行った。１．６ＰＣＲ生成物を得た。
【０１１０】
ＬａｃｓｅｑＦ  オリゴヌクレオチド
ＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡ      （配列番号５９）
ＬａｃｓｅｑＲ  オリゴヌクレオチド
ＣＡＴＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＡＡＧ  （配列番号６０）
【０１１１】
ＰＣＲ生成物をＥＣＯＲＶで消化した（１Ｕ／μｇのＥＣＯＲＶ、３７℃で２時間）。変異体（修飾前駆体）の消化プロファイルを野生型菌株と比較することにより、プロモーターが置換された場合はＥＣＯＲＶが存在しないことが分かった。
【０１１２】
ｌａｃｓｅｑＦプライマーで種々の１．２ｋｂのＰＣＲ生成物を配列決定することによって、種々のクローンにおけるＰＧＩの配列を評価した。変異体の染色体ＤＮＡから得られたカラム精製ＰＣＲ生成物（Ｑｕｉａｑｕｉｃｋ、Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）の５０μｌを用い、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｍｅｙｌａｎ、フランス）によって配列決定した。
【０１１３】
得られた３種類の組換えクローンにおけるＧＩ  ｌａｃＺプロモーター領域の構成を図６に示す。予想どおり、それらは、−３５領域における１の塩基対のみが相違し、ＴＴＧＡＣＡを１．６ＧＩ  ｌａｃＺ、ＴＴＧＡＣＴを１．５ＧＩ  ｌａｃＺ、ＴＴＧＡＣＧを１．２０ＧＩ  ｌａｃＺと名付けた。
【０１１４】
ｅ）β−ガラクトシダーゼ活性
Ｃｍ（３０ｍｇ／ｌ）を含む変異体のＬＢ培地２５ｍｌを３７℃で５時間維持した。細胞を４０００ｇで１０分間遠心分離し、３００μｌのＢ−ＰＥＲ細菌タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）中に再懸濁させた。氷上で１０分間培養した後、当該溶液を１２０００ｇ、４℃において２分間遠心分離し、細胞片から可溶性タンパク質を分離した。上澄みを用いてβ−ガラクトシダーゼ活性を評価した。当該β−ガラクトシダーゼ活性は、Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ  ＳＨＯＲＴ  ＣＯＵＲＳＥ  ＩＮ  ＢＡＣＴＥＲＩＡ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２年）の手順に従い、合成基質ＯＮＰＧ（オルト−ニトロフェニルβ−ガラクトピラノシド）を用いて測定した。反応条件は、３７℃、ｐＨ７．３、λ４１０ｎｍ、光路長１ｃｍである（図７）。
【０１１５】
ｆ）抗生物質耐性遺伝子の脱離
ｐＣＰ２０（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖら、Ｇｅｎｅ、１５８巻、９−１４頁、１９９５年）は、アンピシリン耐性マーカー含むプラスミドであり、ＦＬＰ合成の熱誘発および複製の温度感受性起点を有する。ＣｍＲ変異体を形質転換し（ｐＣＰ２０）、アンピシリン耐性形質転換体を３０℃で選択した。いくつかのコロニーを４３℃で選択的に精製し、その後、全ての抗生物質耐性の喪失について試験した。大部分は、ＦＲＴ隣接耐性遺伝子及びＦＬＰヘルパープラスミドを同時に喪失した。
【実施例２】
【０１１６】
１．６ＧＩによって天然プロモーターを置換し、及びＰＣＲにより得た直鎖状ＤＮＡ断片を有するＲＢＳライブラリーを構築することによる、染色体遺伝子の種々の発現レベルを有する大腸菌クローンライブラリーの構築
本実施例では、ＰＣＲにより産出した人工プロモーター及び種々の結合能を有するＲＢＳによる（ベータ−ガラクトシダーゼをコード化する）天然ｌａｃＺプロモーター及びＲＢＳの大腸菌ゲノムの置換及びｌａｃｌの欠失について記載する。
【０１１７】
ａ）置換カセットライブラリーを構築して、天然プロモーターを置換し、ＲＢＳ及び開始コドンを修飾するためのオリゴヌクレオチドの設計
ｌａｃｌ遺伝子の５’に相同な７９ｂｐ配列、パン酵母のＦＲＴ部位に隣接するクロラムフェニコールコード化遺伝子（ｃａｔ）、１．６ＧＩプロモーター配列（配列番号１９）、及び、天然ｌａｃＺプロモーターの＋１転写開始部位の下流領域に相同な４０ｂｐ配列を含むカセットを、ｌａｃＺＦを用いるＰＣＲによって増幅するために、オリゴヌクレオチドｌａｃＺＲＴを設計した。
【０１１８】
ＬａｃＺＲＴ  オリゴヌクレオチド  （配列番号７０）
ＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＡＡＣＡＡＴＴＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ
【０１１９】
縮重オリゴヌクレオチドｌａｃＺＲＢＳＲは、開始コドンの後のｌａｃＺに相同な６０塩基領域、及びｌａｃＺＲＴオリゴヌクレオチドに相同な４０塩基領域を用いて設計した。
【０１２０】
ＬａｃＺＲＢＳ  Ｒ  オリゴヌクレオチド  （配列番号６１）
ＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＹＴＹＣＴＢＹＫＷＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＡ（ここで、Ｂは、Ｔ、Ｃ、又はＧ；Ｋは、Ｔ又はＧ；Ｙは、Ｃ又はＴ；及び、Ｗは、Ａ又はＴである）
【０１２１】
当該オリゴヌクレオチド（配列番号６１）は、ＲＢＳ配列（ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡ）において縮重しており、第１塩基（Ａ）はＴと、第２塩基（Ａ）はＣと、第３塩基（Ｇ）はＡと、第４塩基（Ｇ）はＡ又はＣと、第７塩基（Ｇ）はＡと、及び第９塩基（Ａ）はＧと縮重している。
【０１２２】
ｂ）置換カセットの増幅及び精製
プライマーｌａｃＺＦ及びｌａｃＺＲＴを用い、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＫＤ３を用いて、１．６ＧＩプロモーター置換カセットをＰＣＲで増幅した。当該増幅では、製造者（ＢｉｏＬａｂｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ）の指示どおりＴａｑポリメラーゼを用いて、９４℃で２分間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間の３０サイクルを行った。
【０１２３】
プライマーｌａｃＺＦ及びｌａｃＺＲＢＳＲを用い、上記で構築した１．６ＧＩプロモーター置換カセットを鋳型として用いて、置換構築物のライブラリーを増幅した。当該増幅では、製造者（ＢｉｏＬａｂｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ）の指示どおりＴａｑポリメラーゼを用いて、９４℃で２分間、６０℃で３秒間、７２℃で２分間の３０サイクルを行った。１．１５ｋｂのＰＣＲ生成物の混合物を、Ｑｕｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．）を用いてゲル精製した。
【０１２４】
ｃ）直鎖状ＤＮＡの置換カセットを用いる染色体における相同組換えによる、ｌａｃＺ発現レベルを有する大腸菌ライブラリーの構築
Ｒｅｄ  Ｈｅｌｐｅｒプラスミド（ｐＫＤ４６）（上述のＤａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）を有する形質転換体を、カルベニシリン（１００ｍｇ／ｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）を含むＳＯＢ培養液２０ｍｌ中で３０℃においてＯＤ５５０ｎｍが０．６まで培養し、その後、１００濃度でエレクトロコンピーテントを行い、氷冷水で１回洗浄し、氷冷１０％グリセロールで２回洗浄した。５０μｌの細胞及び０．１乃至１．０μｇの精製ＰＣＲ生成物の混合物（上述）において、Ｇｅｎｅパルス（ＢｉｏＲａｄ−モデルII装置１６５−２１０６）を使用説明書に基づいて用い、電子せん孔法を行った。刺激を受けた細胞を３０℃で２時間培養した１ｍｌのＳｏｃ培養液に添加して、その後、細胞の半数を寒天に塗布し、ＣｍＲ形質転換体を選択した。４０ｍｇ／ｌのＸｇａｌを寒天プレートに添加し、βガラクトシダーゼの発現を評価した。２４時間以内に細胞が増殖しなかった場合には、残りを３０℃で一晩維持した後に塗布した。
【０１２５】
ｄ）形質転換体のＰＣＲ確認
３０ｍｇ／ｌのＣｍを含むＬＢ培地において、変異体を一晩成長させた。１．０ｍｌの培養液を氷冷水で洗浄し、当該洗浄した細胞を熱処理（９４℃で５分間）した後、染色体ＤＮＡを上澄みから回収した。当該染色体ＤＮＡ、及び上記実施例１で述べた２つのオリゴヌクレオチド（ＬａｃｓｅｑＦ及びＬａｃｓｅｑＲ）を用いて、ＰＣＲを行った。実施例１に従って増幅を行った。１．６ｋｂのＰＣＲ生成物を得た。当該ＰＣＲ生成物をＥＣＯＲＶで消化した（１Ｕ／μｇのＥＣＯＲＶ、３７℃で２時間）。変異体の消化プロファイルを野生型菌株と比較することにより、プロモーターが置換された場合はＥＣＯＲＶ部位が存在しないことが分かった。
【０１２６】
ｌａｃＦプライマーで種々の１．６ｋｂのＰＣＲ生成物を配列決定することによって、種々のクローンにおける置換カセットの配列を評価した。変異体の染色体ＤＮＡから得られたカラム精製ＰＣＲ生成物（Ｑｕｉａｑｕｉｃｋ、Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）の５０μｌを用い、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｍｅｙｌａｎ、フランス）によって配列決定した。
【０１２７】
以下に示すように、８つの組換えクローンを消化した。各組換えクローンにおけるｌａｃＺの上流領域の構成は、Ａ＝ＣＡＡＧＧＡＧＧＡＡ  ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２２）、Ｂ＝ＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡ  ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２３）、Ｃ＝ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ  ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２４）、Ｄ＝ＣＴＣＡＣＡＧＧＡＧ  ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２５）、Ｅ＝ＣＴＣＡＣＡＧＧＡＡ  ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２６）、Ｆ＝ＣＡＣＡＣＡＧＡＡＡ  ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２７）、Ｇ＝ＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡ  ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２８）、及び、Ｈ＝ＣＴＣＡＣＡＧＡＡＡ  ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２９）である。
【０１２８】
予想どおり、形質転換体はＲＢＳのみにおいて相違し、ライブラリーの種々のクローンにおける発現の範囲は、タンパク質１ｍｇ当り５．７乃至０．０２Ｕであった（図８）。
【０１２９】
抗生物質耐性遺伝子の脱離は、実施例１に従って行った。
【実施例３】
【０１３０】
１．６ＧＩプロモーターによって天然プロモーターを置換し、及びＰＣＲにより得た直鎖状ＤＮＡ断片のライブラリーを用いてｍＲＮＡ安定化構造体を導入することによって、染色体遺伝子の種々の発現レベルを有する大腸菌クローンライブラリーの構築
本実施例では、ＰＣＲにより産出した種々の強度を有する人工プロモーター及び種々の効率を有する人工ｍＲＮＡ安定化構造体による、（ベータ−ガラクトシダーゼをコード化する）天然ｌａｃＺプロモーター及びｌａｃオペレーターの大腸菌ゲノムの置換及びｌａｃｌの欠失について記載する。
【０１３１】
ａ）置換カセットライブラリーを構築して、人工プロモーター及びｍＲＮＡ安定化構造体により天然プロモーター及びｌａｃオペレーターを置換するためのオリゴヌクレオチドの設計
広いｌａｃＺの発現レベルを得るために、組換えカセットのライブラリーを設計して、ｌａｃｌ、天然ｌａｃＺプロモーター、及びｌａｃオペレーターを除去し、それらを１．６ＧＩプロモーター及びｍＲＮＡ安定化構造体ライブラリーで置換した。この目的のために、縮重オリゴヌクレオチドｌａｃＺＭＲＮＡは、ＲＢＳ部位の下流のｌａｃＺに相同な４３塩基領域、ｍＲＮＡ安定化構造体の３４塩基、及びｌａｃＺＲＴオリゴヌクレオチドの＋１転写開始部位の上流領域に相同な２３ｂｐ配列を用いて設計した。当該オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ安定化配列において縮重している。
【０１３２】
ＬａｃＺｍＲＮＡ  Ｒ  オリゴヌクレオチド  （配列番号６２）
ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＴＣＡＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＳＴＣＧＡＳＳＴＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧ（ここで、Ｓは、Ｃ又はＧである）
【０１３３】
鋳型ＤＮＡとしてプロモーター置換カセット（プライマーｌａｃＺＦ及びｌａｃＺＲＴ（配列番号７０）を用いるＰＣＲによって得られたもの）を用いるＰＣＲ反応においてプライマーｌａｃＦ及びｌａｃＭＲＮＡを用いる場合、ｌａｃｌが欠失し、プロモーターが置換され、及びｍＲＮＡ構造が導入された新規なライブラリーが得られる。
【０１３４】
ｂ）置換カセットの増幅及び精製
プライマーｌａｃＦ及びｌａｃＺＭＲＮＡを用い、上記実施例２で構築した１．６ＧＩプロモーター置換カセットを鋳型ＤＮＡとして用いて、置換カセットのライブラリーを増幅した。実施例１に従って増幅を行った。１．１５ｋｂのＰＣＲ生成物の混合物を、アガロースゲル電気泳動、その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【０１３５】
ｃ）直鎖状ＤＮＡの置換カセットを用いる染色体における相同組換えによる、ｌａｃＺ発現レベルを有する大腸菌ライブラリーの構築
Ｒｅｄ  Ｈｅｌｐｅｒプラスミド（ｐＫＤ４６）（上述のＤａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）を有する形質転換体を、カルベニシリン（１００ｍｇ／ｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）を含むＳＯＢ培養液２０ｍｌ中で３０℃においてＯＤ５５０ｎｍが０．６まで培養し、その後、１００濃度でエレクトロコンピーテントを行い、氷冷水で１回洗浄し、氷冷１０％グリセロールで２回洗浄した。５０μｌの細胞及び０．１乃至１．０μｇの精製ＰＣＲ生成物の混合物（上記ｂ）の記載）において、電圧ブースターと０．２ｃｍのチャンバーを有するＧｅｎｅパルス（ＢｉｏＲａｄ−モデルII装置１６５−２１０６）を使用説明書に基づいて用い、電子せん孔法を行った。刺激を受けた細胞を３０℃で２時間培養した１ｍｌのＳｏｃ培養液に添加して、その後、細胞の半数を寒天に塗布し、ＣｍＲ形質転換体を選択した。４０ｍｇ／ｌのＸｇａｌを寒天プレートに添加し、βガラクトシダーゼの発現を評価した。２４時間以内に細胞が増殖しなかった場合には、残りを３０℃で一晩維持した後に塗布した。
【０１３６】
ｄ）形質転換体のＰＣＲ確認
３０ｍｇ／ｌのＣｍを含むＬＢ培地において、変異体を一晩成長させた。１．０ｍｌの培養液を氷冷水で洗浄し、当該洗浄した細胞を熱処理（９４℃で５分間）した後、染色体ＤＮＡを上澄みから回収した。
【０１３７】
当該染色体ＤＮＡ、及び上記実施例１で述べた２つのオリゴヌクレオチド（ＬａｃｓｅｑＦ及びＬａｃｓｅｑＲ）の組を用いて、ＰＣＲを行った。実施例１に従って増幅を行った。１．６ｋｂのＰＣＲ生成物を得た。当該ＰＣＲ生成物をＥＣＯＲＶで消化した（１Ｕ／μｇのＥＣＯＲＶ、３７℃で２時間）。変異体の消化プロファイルを野生型菌株と比較することにより、プロモーターが置換された場合はＥＣＯＲＶ部位が存在しないことが分かった。
【０１３８】
ｌａｃＦプライマーで種々の１．６ｋｂのＰＣＲ生成物を配列決定することによって、種々のクローンにおける置換カセットの配列を評価した。変異体の染色体ＤＮＡから得られたカラム精製ＰＣＲ生成物（Ｑｕｉａｑｕｉｃｋ、Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）の５０μｌを用い、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｍｅｙｌａｎ、フランス）によって配列決定した。
【０１３９】
組換えクローンにおけるｌａｃＺの上流領域の構成を図９に示す。予想どおり、ライブラリーの種々のクローンにおける発現の範囲は、タンパク質１ｍｇ当り４．１乃至１８．４Ｕであった。
【実施例４】
【０１４０】
ＰＣＲにより得た直鎖状ＤＮＡ断片のライブラリーによる、種々の人工プロモーター、修飾開始コドン、及び修飾ＲＢＳを有する大腸菌クローンライブラリーの構築
本実施例では、ＰＣＲにより産出した種々の強度の人工プロモーター、種々の結合能を有するＲＢＳ、及び種々の効率の開始コドンによる（ベータ−ガラクトシダーゼをコード化する）天然ｌａｃＺプロモーター、ＲＢＳ、及び開始コドンの大腸菌ゲノムの置換及びｌａｃｌの欠失について記載する。
【０１４１】
ａ）ｌａｃＺプロモーターを置換するためのオリゴヌクレオチドの設計
広いｌａｃＺの発現レベルを得るために、組換えカセットのライブラリーを設計して、ｌａｃｌを除去し、プロモーターを置換し、及びＲＢＳを修飾した。ＲＢＳ及び開始コドンにおける縮重オリゴヌクレオチドｌａｃＺＲＢＳＲ２は、開始コドンの後のｌａｃＺに相同な６０塩基領域、及びｌａｃＲオリゴヌクレオチドに相同な４０塩基領域を用いて設計した。
【０１４２】
ＬａｃＺＲＢＳ  Ｒ２  オリゴヌクレオチド  （配列番号７１）
ＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＨＡＧＣＴＧＴＹＴＹＣＴＢＹＫＷＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＡ（ここで、Ｂは、Ｔ、Ｃ、又はＧ；Ｈは、Ａ、Ｔ、又はＧ；Ｋは、Ｔ又はＧ；Ｙは、Ｃ又はＴ；及び、Ｗは、Ａ又はＴである）
【０１４３】
ｂ）ＰＧＩ置換カセットの増幅及び精製
プライマーｌａｃＺＦ及びｌａｃＺＲを用い、実施例１に従って鋳型としてプラスミドｐＫＤ３を用いて、プロモーター置換カセットのライブラリーを増幅した。プライマーｌａｃＺＦ及びｌａｃＺＲＳＢ２Ｒを用い、上記で得たＰＣＲ生成物の混合物を鋳型として用いて、修飾開始コドン及び修飾ＲＢＳを有するプロモーター置換カセットのライブラリーを増幅した。実施例１に従って増幅を行った。１．１５ｋｂのＰＣＲ生成物の混合物を、アガロースゲル電気泳動、その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【０１４４】
ｃ）ｌａｃＺ遺伝子の前の、修飾開始コドン及び修飾ＲＢＳを有する種々の人工プロモーターを含むクローンライブラリーの構築
Ｒｅｄ  Ｈｅｌｐｅｒプラスミド（ｐＫＤ４６）（上述のＤａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）を有する形質転換体を、カルベニシリン（１００ｍｇ／ｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）を含むＳＯＢ培養液２０ｍｌ中で３０℃においてＯＤ５５０ｎｍが０．６まで培養し、その後、１００濃度でエレクトロコンピーテントを行い、氷冷水で１回洗浄し、氷冷１０％グリセロールで２回洗浄した。５０μｌの細胞及び０．１乃至１．０μｇの精製ＰＣＲ生成物の混合物（上述）において、電圧ブースターと０．２ｃｍのチャンバーを有するＧｅｎｅパルス（ＢｉｏＲａｄ−モデルII装置１６５−２１０６）を使用説明書に基づいて用い、電子せん孔法を行った。刺激を受けた細胞を３０℃で２時間培養した１ｍｌのＳｏｃ培養液に添加し、その後、細胞の半数を寒天に塗布し、ＣｍＲ形質転換体を選択した。４０ｍｇ／ｌのＸｇａｌを寒天プレートに添加し、βガラクトシダーゼの発現を評価した。２４時間以内に細胞が増殖しなかった場合には、残りを３０℃で一晩維持した後に塗布した。
【０１４５】
ｄ）形質転換体のＰＣＲ確認
３０ｍｇ／ｌのＣｍを含むＬＢ培地において、変異体を一晩成長させた。１．０ｍｌの培養液を氷冷水で洗浄し、当該洗浄した細胞を熱処理（９４℃で５分間）した後、染色体ＤＮＡを上澄みから回収した。
【０１４６】
当該染色体ＤＮＡ、及び上記実施例１で述べた２つのオリゴヌクレオチド（ＬａｃｓｅｑＦ及びＬａｃｓｅｑＲ）の組を用いて、ＰＣＲを行った。実施例１に従って増幅を行った。１．６ｋｂのＰＣＲ生成物を得た。当該ＰＣＲ生成物をＥＣＯＲＶで消化した（１Ｕ／μｇのＥＣＯＲＶ、３７℃で２時間）。変異体の消化プロファイルを野生型菌株と比較することにより、プロモーターの置換によってＥＣＯＲＶ部位が消失することが分かった。
【０１４７】
ｌａｃｓｅｑＦプライマーで種々のＰＣＲ生成物を配列決定することによって、種々のクローンにおけるＧＩプロモーターの配列を評価した。変異体の染色体ＤＮＡから得られたカラム精製ＰＣＲ生成物（Ｑｕｉａｑｕｉｃｋ、Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）の５０μｌを用い、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｍｅｙｌａｎ、フランス）によって配列決定した。得られた４つの組換えクローンにおけるｌａｃＺの上流領域の構成は、予想どおりであった。
【０１４８】
１．６ＧＩ−クローン１：開始コドン−ＴＴＧ；ＲＢＳ−ＴＣＡＣＡＧＧＡＧＡ；β−ガラクトシダーゼ活性、０．２８Ｕ／ｍｇ；
１．６ＧＩ−クローン２：開始コドン−ＡＴＧ；ＲＢＳ−ＡＡＧＧＡＧＧＡＡ；β−ガラクトシダーゼ活性、５．７Ｕ／ｍｇ；
１．２ＧＩ−クローン３：開始コドン−ＡＴＧ；ＲＢＳ−ＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡ；β−ガラクトシダーゼ活性、０．６８Ｕ／ｍｇ；及び、
１．６ＧＩ−クローン４：開始コドン−ＴＴＧ；ＲＢＳ−ＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡ；β−ガラクトシダーゼ活性、０．０３２Ｕ／ｍｇ
【０１４９】
当該技術分野における当業者であれば、通常の実験を行うこと無しに、本明細書で説明した本発明の特定の実施態様に対する多くの均等物を認識し又は確認することができるであろう。そのような均等物は、本願の特許請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は、人工プロモーターライブラリーを構築する方法、及び本発明の方法によって得られる２本鎖ＰＣＲ生成物の略図を示すものである。番号（１）及び（２）によって表される２つのオリゴヌクレオチド及びプラスミドにおける挿入ＤＮＡカセット（３）をＰＣＲ反応において混合し、２本鎖ＰＣＲ生成物の混合物が得られる。オリゴヌクレオチド（１）は、対象染色体遺伝子の上流領域に相同な核酸配列（Ｈ１）及びプライマー部位（ＰＳ１）を含む。当該ＰＳ１は、挿入ＤＮＡカセット（３）の第１末端（５’）に相同である。オリゴヌクレオチド（２）は、変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ）しており、プライマー部位（ＰＳ２）及び人工プロモーター配列（Ｈ２）を含む。当該ＰＳ２は、挿入ＤＮＡカセット（３）の第２末端（３’）に相同である。人工プロモーター配列（Ｈ２）は、種々の修飾−３５コンセンサス領域、種々の修飾リンカー領域、及び種々の修飾−１０コンセンサス領域又はそれらの組合せを含む。挿入ＤＮＡ構築物（３）は、（好ましくは抗生物質耐性遺伝子であり）２つのリコンビナーゼ部位（ＦＲＦ）に隣接する選択マーカーを含む。
【図２】図２は、本発明の人工プロモーター、修飾リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、及び／又は修飾開始コドンを含むＤＮＡライブラリーを構築する方法を示す略図である。当該図では、更なるＰＣＲ反応において、図１の２本鎖ＰＣＲ生成物混合物が、オリゴヌクレオチド（１）、及び、対象遺伝子（図１の対象遺伝子と同じ）の５’末端に相同な核酸断片、修飾開始コドンであることができる開始コドン、プロモーター前駆体の修飾リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化セグメント、及び対象遺伝子の開始コドンの下流領域に相同な核酸断片を含む第３オリゴヌクレオチドと混合され、２本鎖ＰＣＲ生成物の新たな混合物が得られる。Ｘが、開始コドンが修飾され得ることを示している。
【図３】図３は、本発明のＰＣＲ生成物による染色体調節配列の置換の略図である。
【図４】図４は、−３５コンセンサスボックス、リンカー配列、及び−１０コンセンサスボックスを含む、転写開始部位（＋１）の上流の約５０塩基対（ｂｐ）を含む種々の特徴的プロモーターの配列を示すものである。これらのプロモーターは、−３５コンセンサスボックスの最初のＴ及び−１０コンセンサスボックスの最後のＴについて整列している。保存領域を太字で示す。ＰＤ／Ｅ２０を配列番号３、ＰＨ２０７を配列番号４、ＰＮ２５を配列番号５、ＰＧ２５を配列番号６、ＰＪ５を配列番号７、ＰＡ１を配列番号８、ＰＡ２を配列番号９、ＰＡ３を配列番号１０、ＰＬを配列番号１１、Ｐｌａｃを配列番号１、ＰｌａｃＵＶ５を配列番号１２、Ｐｔａｃｌを配列番号２、ＰＣＯＮを配列番号１３、及びＰｂｌａを配列番号１４で表す。
【図５】図５は、野生型菌株のラクトースオペロンの染色体組織（Ａ）と本発明のプロモーターで形質転換した宿主菌株の染色体組織（Ｂ）を比較するものである。
【図６】図６は、ラクトースオペロンプロモーターＰｌａｃ（配列番号１８）及びｌａｃｌ制御因子を置換するために用いる３つの人工プロモーターを含むプロモーターライブラリーを示すものである。当該プロモーターライブラリーは、１．６ＧＩプロモーター（配列番号１５）を含む１．６ＧＩ  ｌａｃＺ（配列番号１９）；１．５ＧＩプロモーター（配列番号１６）を含む１．５ＧＩ  ｌａｃＺ（配列番号２０）；及び、１．２ＧＩプロモーター（配列番号１７）を含む１．２ＧＩ  ｌａｃＺ（配列番号２１）の３つの人工グルコースイソメラーゼプロモーターを含む。
【図７】図７は、１．６ＧＩ  ｌａｃＺ（配列番号１９）、１．５ＧＩ  ｌａｃＺ（配列番号２０）、及び１．２ＧＩ  ｌａｃＺ（配列番号２１）を含むライブラリーで形質転換した大腸菌細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの特異的活性として測定したｌａｃＺ遺伝子の発現を示すものである。
【図８】図８は、リボソーム結合部位が改変された１．６ＧＩプロモーター（配列番号１９）を有するｌａｃＺ遺伝子の発現を示すものである。用いた形質転換体は、Ａ  ＝  ＣＡＡＧＧＡＧＧＡＡ ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２２）、Ｂ  ＝  ＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡ ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２３）、Ｃ  ＝  ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２４）、Ｄ  ＝  ＣＴＣＡＣＡＧＧＡＧ ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２５）、Ｅ  ＝  ＣＴＣＡＣＡＧＧＡＡ ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２６）、Ｆ  ＝  ＣＡＣＡＣＡＧＡＡＡ ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２７）、Ｇ  ＝  ＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡ ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２８）、及びＨ  ＝  ＣＴＣＡＣＡＧＡＡＡ ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号２９）、である。
【図９】図９は、リボソーム結合部位（ＡＧＧＡＡＡ）が改変され、かつｍＲＮＡ安定化配列が挿入された、１．６ＧＩプロモーター（配列番号１９）を有するｌａｃＺ遺伝子の発現を示すものである。
【図１】
2005523015.tif 000003
【図２】
2005523015.tif 000004
【図３】
2005523015.tif 000005
【図４】
2005523015.tif 000006
【図５】
2005523015.tif 000007
【図６】
2005523015.tif 000008
【図７】
2005523015.tif 000009
【図８】
2005523015.tif 000010
【図９】
2005523015.tif 000011
【国際調査報告】
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2005523015.tif 000013
2005523015.tif 000014