(57)【要約】本発明は、腫瘍細胞等を含む各種細胞に対して簡便にアポトーシスを誘導することができるアポトーシス誘導剤等を提供する。本発明のアポトーシス誘導剤は、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする。（ａ）式：Ｃ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｃ  （Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アポトーシス誘導活性を有するペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
（ａ）下記式（Ｉ）：
2011025050.tif 000066
（Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Ｃはシステインを表し、Ｄはアスパラギン酸を表し、Ｆはフェニルアラニンを表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アポトーシス誘導活性を有するペプチド。
【請求項２】
前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列が、配列番号２又は配列番号３に示されるアミノ酸配列である、請求項１記載の誘導剤。
【請求項３】
前記（ａ）のペプチドが、配列番号５又は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１又は２記載の誘導剤。
【請求項４】
目的の細胞又は細胞集団に対して請求項１〜３のいずれか１項に記載の誘導剤を作用させる工程を含む、アポトーシス誘導方法。
【請求項５】
前記工程が、目的の細胞又は細胞集団に前記誘導剤を接触させる工程である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の誘導剤を含む、癌の治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス誘導剤等に関する。詳しくは、腫瘍細胞等を含む各種細胞に対してアポトーシスを誘導するアポトーシス誘導剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、細胞死の形態の一つであり、特に細胞内の核の破壊を伴う細胞死のことを言う。これまで、癌細胞におけるアポトーシスの死分子機構としては、カルシウム経路、死のシグナル経路、セラミド経路、ミトコンドリア経路、及びｐ５３アポトーシス経路の５つの経路を介して誘導される分子機構が知られている（例えば、「橋本嘉幸、新アポトーシスの分子医学、羊土社、２００１年４月、１０−５８頁」参照）。
アポトーシスを誘導する物質は数多く知られており、臨床医学ではマイトマイシンやタキソールなどの抗がん剤が使用されている。これらの人工物以外に、生体にはＦａｓＬ（Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ）やＴＮＦαのようなアポトーシスを誘導するタンパクが存在している。これら人工、自然のアポトーシス誘導物質を用いて、がん細胞のように人体に有害な細胞を死に至らしめることが可能である。上述したように、化学療法に使用される抗がん剤も、遺伝子療法についての研究が進みつつあるＦａｓＬも、この原理を適用している。化学療法では、健常組織への副作用が治療の障害となるため、病巣にのみ効果を及ぼすことを期待して、病巣への遺伝子導入による遺伝子治療が検討されている。しかしながら、実際に遺伝子が導入される細胞は、通常、病巣にある細胞のうちの一部分であり、また遺伝子を導入された病的細胞はその後死滅し、治療効果のあるタンパク質等は当該細胞からそれ以上産生されないため、結果的に、遺伝子治療の効果は部分的なものになる場合が多い。そのため、残存する病的細胞には、繰り返し遺伝子導入を行う必要が出てくる。また、最初の遺伝子導入により遺伝子が導入されなかった細胞は、導入を受けにくい特性を有している可能性があり、治療の妨げとなる。
【発明の概要】
【０００３】
このような状況下において、腫瘍細胞等を含む各種細胞に対して簡便にアポトーシスを誘導することができるアポトーシス誘導剤の開発が望まれていた。
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、アポトーシス誘導剤、癌の治療用医薬組成物等を提供するものである。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
（ａ）下記式（Ｉ）：
2011025050.tif 000002
（Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Ｃはシステインを表し、Ｄはアスパラギン酸を表し、Ｆはフェニルアラニンを表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アポトーシス誘導活性を有するペプチド。
上記（１）の誘導剤において、式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列は、例えば、配列番号２又は配列番号３に示されるアミノ酸配列が挙げられる。また、前記（ａ）のペプチドは、例えば、配列番号５又は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。
（２）目的の細胞又は細胞集団に対して上記（１）の誘導剤を作用させる工程を含む、アポトーシス誘導方法。
当該誘導方法において、前記工程は、例えば、目的の細胞又は細胞集団に前記誘導剤を接触させる工程が挙げられる。
（３）上記（１）の誘導剤を含む、癌の治療用医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、実施例１における、位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡による観察結果を示す図である。
図２は、実施例２における、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果（左）と、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性測定の結果（右）を示す図である。
図３は、実施例３における、蛍光顕微鏡による観察結果を示す図である。
図４は、実施例４における、蛍光顕微鏡による観察結果を示す図である。
図５は、実施例５における、蛍光顕微鏡による観察結果を示す図である。
図６は、実施例６における、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色の結果を示す図である。
図７は、実施例７における、ＬＤＨ活性測定の結果を示す図である。である。
図８は、実施例８における、位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡による観察結果を示す図である。
図９は、実施例９における、ＬＤＨ活性測定の結果を示す図である。
図１０は、実施例１０における、ＬＤＨ活性測定の結果を示す図である。
図１１は、実施例１１における、ＬＤＨ活性測定の結果を示す図である。
図１２は、実施例１２における、各遺伝子導入後の腫瘍サイズの経時的測定（７日間：Ｄａｙ０〜Ｄａｙ７）の結果を示す図である。腫瘍サイズの測定は、定規で腫瘍の長径と短径を計測して積算した。図中、腫瘍サイズ（縦軸）は、遺伝子導入時の値を１として相対値で表した（平均値±ＳＤ）。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００９−１９４７４７号明細書（２００９年８月２５日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．アポトーシス誘導剤
本発明のアポトーシス誘導剤（以下、本発明の誘導剤という。）は、先に述べた通り、下記（ａ）のペプチドを含むものである。
（ａ）下記式（Ｉ）：
2011025050.tif 000003
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
上記（ａ）のペプチド中、式（Ｉ）のアミノ酸配列は、アミノ酸の１文字表記を用いて示したものであり、例えば、Ｃはシステイン（Ｃｙｓ）、Ｄはアスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｙはチロシン（Ｔｙｒ）を意味する。また、Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、任意のアミノ酸残基は、通常、２０種類のアミノ酸残基、すなわちＡ（アラニン；Ａｌａ）、Ｒ（アルギニン；Ａｒｇ）、Ｄ（アスパラギン酸；Ａｓｐ）、Ｎ（アスパラギン；Ａｓｎ）、Ｃ（システイン；Ｃｙｓ）、Ｑ（グルタミン；Ｇｌｎ）、Ｅ（グルタミン酸；Ｇｌｕ）、Ｇ（グリシン；Ｇｌｙ）、Ｈ（ヒスチジン；Ｈｉｓ）、Ｉ（イソロイシン；Ｉｌｅ）、Ｌ（ロイシン；Ｌｅｕ）、Ｋ（リジン；Ｌｙｓ）、Ｍ（メチオニン；Ｍｅｔ）、Ｆ（フェニルアラニン；Ｐｈｅ）、Ｐ（プロリン；Ｐｒｏ）、Ｓ（セリン；Ｓｅｒ）、Ｔ（スレオニン；Ｔｈｒ）、Ｗ（トリプトファン；Ｔｒｐ）、Ｙ（チロシン；Ｔｙｒ）、Ｖ（バリン；Ｖａｌ）から選択することができる。本明細書では、他のアミノ酸配列を示す場合も、式（Ｉ）と同様に１文字表記で表すことがある。
前記式（Ｉ）のアミノ酸配列としては、例えば、以下の配列番号２及び配列番号３に示されるアミノ酸配列が好ましく挙げられ、なかでも配列番号２に示されるアミノ酸配列がより好ましい。
2011025050.tif 000004
本発明において、「ペプチド」とは、少なくとも２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合して構成されたものを意味し、オリゴペプチド、ポリペプチドなどが含まれる。さらに、ポリペプチドが一定の立体構造を形成したものはタンパク質と呼ばれるが、本発明においては、このようなタンパク質も上記「ペプチド」に含まれるものとする。従って、本発明の誘導剤に含まれるペプチドは、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質のいずれをも意味し得るものである。
また本発明の誘導剤は、先に述べた通り、下記（ｂ）のペプチドを含むものであってもよい。
（ｂ）前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アポトーシス誘導活性を有するペプチド。
ここで、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、１個〜５個程度、好ましくは１個〜２個程度のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が挙げられ、限定はされない。ただし本発明においては、前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列における第１番目、第３番目、第８番目、第１０番目、第１２番目のアミノ酸残基（それぞれ順に、Ｃ、Ｄ、Ｙ、Ｃ、Ｃ）が欠失、置換又は付加されていないもの、及び／又は、前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列における第２番目、第４〜７番目、第９番目、第１１番目のアミノ酸残基（いずれもＸ）が欠失又は付加されていないものが好ましい。上記欠失、置換、付加等の変異の導入は、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えば、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、及びＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、上記欠失、置換又は付加の変異が導入されたペプチドであるかどうかは、各種アミノ酸配列決定法、並びにＸ線及びＮＭＲ等による構造解析法などを用いて確認することができる。
本発明において、アポトーシス誘導活性とは、細胞内の核の破壊を伴う細胞死をもたらす活性を意味し、当該活性は、例えば、ＤＮＡラダーの検出、クロマチン染色、アネキシンＶ染色等により測定することができる。
本発明の誘導剤に含まれる前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドは、前記式（Ｉ）のアミノ酸配列を含むペプチド、又は前記欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドである限り、その構成アミノ酸の残基数は限定されず、好ましくは１２残基以上であり、例えば１２〜１００残基であってもよいし、１２〜５０残基であってもよいし、１２〜３０残基であってもよい。
前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドは、天然物由来のペプチドであってもよいし、人工的に化学合成して得られたものであってもよく、限定はされないが、天然物由来のペプチドである場合は、アポトーシス誘導の目的とする細胞以外の細胞に対する細胞毒性等の悪影響がない場合が多いため好ましい。
天然物由来のペプチドとしては、天然に存在するオリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質、又はこれらを断片化した状態のもの等が挙げられる。天然物由来のペプチドは、天然物から公知の回収法及び精製法により直接得てもよいし、又は、公知の遺伝子組換え技術により、当該ペプチドをコードする遺伝子を各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し、発現させた後、公知の回収法及び精製法により得てもよい。あるいは、市販のキット、例えば、試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）及びＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）等を用いた無細胞タンパク質合成系により当該ペプチドを産生し、公知の回収法及び精製法により得てもよく、限定はされない。
また、化学合成ペプチドは、公知のペプチド合成方法を用いて得ることができる。合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法及び酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置を使用してもよい。合成反応後は、クロマトグラフィー等の公知の精製法を組み合わせてペプチドを精製することができる。
ここで、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドであって天然物由来のペプチドに該当するものとして、（ｉ）内皮細胞遺伝子座−１（Ｄｅｌ−１；ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｌｏｃｕｓ−１）タンパク質及びその部分断片、並びに（ｉｉ）血液凝固因子  第ＩＸ因子を、以下に例示説明する。
Ｄｅｌ−１タンパク質は、上皮増殖因子（ＥＧＦ；ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）類似ドメイン及びジスコイジンＩ類似ドメインを有する細胞外基質沈着タンパク質であり、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。このＤｅｌ−１タンパク質のＥＧＦ類似ドメインとしてはＥＧＦ１、ＥＧＦ２及びＥＧＦ３があり、ジスコイジンＩ類似ドメインとしてはＤｉｓｃｏｉｄｉｎ１及びＤｉｓｃｏｉｄｉｎ２があることが知られている。本発明者は、上記各種ドメインのうちＥＧＦ３に着目し、さらにＥＧＦ３を構成するアミノ酸配列（配列番号７）中の特定の１２アミノ酸残基からなる領域：Ｃ−Ｔ−Ｄ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｎ−Ｙ−Ｓ−Ｃ−Ｅ−Ｃ（配列番号２）に着目した。そして、この特定領域からなる又はこの特定領域を含むペプチドが、高いアポトーシス誘導活性を有することを見出した。すなわち、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドであって天然物由来のペプチドに該当するものとしては、例えば、Ｄｅｌ−１タンパク質全長（配列番号５）、並びにＥＧＦ３からなる部分断片（配列番号７）、及びＥＧＦ３を一部に含む各種部分断片（配列番号９、１１、１３、１５、１７及び１９（下記表１参照）、並びに配列番号４２）を挙げることができる。特に、前記（ａ）のペプチドとしてＤｅｌ−１タンパク質全長（配列番号５）、ＥＧＦ３からなる部分断片（ＥＧＦ３を構成するペプチド；配列番号７）、及びＥＧＦ３とＤｉｓｃｏｉｄｉｎ１との融合ペプチド（配列番号４２）が好ましい。なお、Ｄｅｌ−１タンパク質及びその部分断片に関する詳細については、ＷＯ  ２００５／０００１０９３に記載の内容を全て参酌することができ、下記表１に示したアミノ酸配列を有する部分断片以外の部分断片についても本発明の例示として含むことができる。例えば、下記表１中の「Ｄｅｌ−１全長」のうちシグナルペプチド部分を除いたアミノ酸配列を有する部分断片も、本発明の例示として含まれる。
【表１】
2011025050.tif 000005
また、血液凝固因子  第ＩＸ因子は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、Ｎ末端から順に、Ｇｌａドメイン、ＥＧＦドメイン及びプロテアーゼドメインを有する一本鎖糖タンパク質である。ここで、第ＩＸ因子のＥＧＦドメインは、配列番号２３に示されるアミノ酸配列のうちの第９０番目〜第１２３番目のアミノ酸からなる配列（配列番号２５）で構成される。本発明者は、第ＩＸ因子のＥＧＦドメインを構成するアミノ酸配列中には、前述したＤｅｌ−１タンパク質のＥＧＦ３（ＥＧＦ類似ドメイン）と同様に、特定の１２アミノ酸残基からなる領域：Ｃ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｉ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｅ−Ｃ−Ｗ−Ｃ（配列番号３）が含まれていることに着目し、この領域を含むペプチドが、遺伝子導入効率を高めることができることを見出した。すなわち、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドであって天然物由来のペプチドに該当するものとしては、例えば、第ＩＸ因子全長のほか、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片又は当該断片を一部に含む各種部分断片、及びＥＧＦドメインからなる部分断片又は当該ＥＧＦドメインを一部に含む各種部分断片を挙げることができる。なお、第ＩＸ因子全長をコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号２２に示されるものであり、第ＩＸ因子のＥＧＦドメインをコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号２４に示されるものである。
本発明の誘導剤は、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドとともに又はそれに代えて、当該ペプチドの誘導体を含むことができる。当該誘導体とは、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドに由来して調製され得るものをすべて含む意味であり、例えば、構成アミノ酸の一部が非天然のアミノ酸に置換されたものや、構成アミノ酸（主にその側鎖）の一部に化学修飾が施されたもの等が挙げられる。
本発明の誘導剤は、前記（ａ）或いは（ｂ）のペプチド、及び／又は当該ペプチドの誘導体とともに又はそれに代えて、当該ペプチド及び／又は当該誘導体の塩を含むことができる。当該塩としては、生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
塩は、塩酸などの適切な酸、又は水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコルを用いて処理することにより調製することができる。
本発明の誘導剤は、上述した（ａ）若しくは（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩からなるものであってもよいし、当該ペプチド、その誘導体又はこれらの塩と他の成分とを含むものであってもよく、限定はされない。他の成分としては、例えば、ＰＢＳ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、並びにアジ化ナトリウム及びグリセロール等の添加剤などが挙げられる。他の成分を含む場合、その含有割合は、上記ペプチド、その誘導体又はこれらの塩によるアポトーシス誘導効率の上昇活性が著しく妨げられない範囲で、適宜設定することができる。具体的には、上記ペプチドの溶液で用いる場合、ペプチド濃度は、限定はされないが、０．３ｎｇ／ｍｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．３〜５ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．３〜２ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは０．４〜１．５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは０．６〜１ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．８〜１ｎｇ／ｍｌである。
本発明の誘導剤によるアポトーシス誘導の対象となる細胞としては、限定はされず、腫瘍細胞等を含む各種細胞が挙げられるが、特に接着細胞が好ましい。例えば、Ｃｏｓ細胞、ＣＲＬ細胞（ヒトメラーノマ細胞株）、Ｐ５細胞（血管内皮細胞株）、ＫＮ細胞（ヒト扁平上皮がん細胞株）等が挙げられる。本発明においては、腫瘍細胞をアポトーシス誘導の目的の細胞とすることが好ましく、腫瘍細胞としては、具体的には、上記ＣＲＬの他、Ｃｏｓ細胞、Ｐ５細胞、ＫＮ細胞（ヒト扁平上皮がん細胞株）等が好ましく挙げられる。
本発明の誘導剤は、目的の細胞にアポトーシスを誘導させるために当該細胞内に導入する必要は必ずしもなく、当該細胞外から添加することでその細胞のアポトーシスを誘導することができる。そのため、各種腫瘍細胞等のアポトーシス誘導を、従来にない簡便さで、且つより広い範囲の細胞腫（癌種）に対して行うことができ、例えば、癌の治療やその研究等において極めて有用なものである。
また、本発明の誘導剤は、上述した（ａ）又は（ｂ）のペプチド等が、アポトーシスを起こさせる目的細胞の周辺（癌の病巣等）に残存し得るという特徴を有するものである。また、上述した（ａ）又は（ｂ）のペプチド等は、細胞への遺伝子導入効率を向上させ得るという特徴を有するものでもある。従って、例えば、癌の治療において、本発明の誘導剤の使用と遺伝子治療とを併用すれば、残存する病的細胞に繰り返し遺伝子導入を行う必要が生じた場合などに、病巣に残存している本発明の誘導剤（上述した（ａ）又は（ｂ）のペプチド等）が、病的細胞への遺伝子導入効率を向上させるという効果をもたらす。その結果、治療効果の高い遺伝子治療を行うことができる。
本発明においては、本発明の誘導剤を用いるアポトーシス誘導方法も提供することができる。当該誘導方法は、目的の細胞又は細胞集団（組織、臓器）に対して本発明の誘導剤を作用させる工程を含む方法であり、それ以外にどのような工程を含むものであってもよく、限定はされない。本発明の誘導剤を作用させるとは、目的の細胞又は細胞集団に対して本発明の誘導剤を接触させる（すなわち当該細胞等に添加してその外部に接触させる）ことや、目的の細胞内に本発明の誘導剤を導入することを意味し、中でも前者の添加の態様が好ましい。なお、目的の細胞内に本発明の誘導剤を導入する場合は、本発明の誘導剤の有効成分である前述の（ａ）又は（ｂ）のペプチドを、当該細胞内に直接導入してもよいし、あるいは当該ペプチドをコードするＤＮＡの状態で導入（遺伝子導入）してもよく、限定はされない。ＤＮＡの導入は、リポソーム法（リポプレックス法）、ポリプレックス法、ペプチド法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、及びウイルスベクター法などの公知の各種遺伝子導入方法を用いて行うことができる。
２．ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体
（１）ＤＮＡ
本発明においては、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡも包含される。当該ＤＮＡは、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡであってもよいし、あるいは、当該塩基配列を一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、ＳＤ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター等）を含んでなるＤＮＡであってもよく、限定はされない。なお、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする塩基配列では、コドンの種類は限定されず、例えば、転写後、ヒト等の哺乳類において一般的に使用されているコドンを用いたものであってもよいし、大腸菌や酵母等の微生物や、植物等において一般的に使用されているコドンを用いたものであってもよく、適宜選択又は設計することができる。
また本発明においては、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであってアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも包含される。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、塩（ナトリウム）濃度が１５０〜９００ｍＭであり、温度が５５〜７５℃、好ましくは塩（ナトリウム）濃度が１５０〜２００ｍＭであり、温度が６０〜７０℃での条件をいう。
（２）ＤＮＡを含む組換えベクター
本発明においては、適当なベクターに上記本発明のＤＮＡを連結（挿入）することにより得られる組換えベクターも包含される。本発明のＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルス等が挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。またウイルスとしてはアデノウイルスやレトロウイルスなどが挙げられる。
本発明の組換えベクターには、プロモーター、本発明のＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子などを連結することができる。なお、選択マーカー遺伝子としては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。レポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体（ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ等の蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ＬａｃＺ等の遺伝子が挙げられる。
（３）形質転換体
本発明においては、上記本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入して得ることができる形質転換体も包含される。宿主としては、本発明のＤＮＡを発現し得るものであれば限定されず、例えば、当該分野において周知の細菌、酵母等を用いることができる。
細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列を含めることができる。細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などが挙げられる。プロモーターとしては、例えばｌａｃプロモーターなどが用いられる。細菌へのベクター導入法としては、公知の各種導入方法、例えばカルシウムイオン法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター等が挙げられる。酵母へのベクター導入法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
３．医薬組成物
本発明の誘導剤（前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチドと言うこともできる。）は、医薬組成物に含まれる有効成分として有用である。
当該医薬組成物は、癌（腫瘍）の治療用の医薬組成物として有用である。特に、本発明の誘導剤は、腫瘍細胞等に対してアポトーシス誘導活性を有するものであるため、腫瘍の治療用に使用されることが好ましい。すなわち、本発明の誘導剤は、腫瘍治療剤に含まれる有効成分として有用なものである。
また、本発明の誘導剤は、既存の抗腫瘍剤（腫瘍治療剤）と併用し、癌治療用医薬組成物の有効成分として用いることもできる。この場合、本発明の誘導剤のアポトーシス誘導活性により、結果として、既存の抗腫瘍剤の抗腫瘍効果（抗腫瘍活性）を増強することができる。よって、本発明は、本発明の誘導剤を含む、抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤、及び、本発明の誘導剤を用いる、抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強方法等を提供することができる。抗腫瘍剤としては、公知のものが全て含まれ、特に限定はされないが、例えばＦａｓＬ（Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ）、ＴＮＦα、マイトマイシン及びタキソール等が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、本発明の誘導剤を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
本発明の医薬組成物の適用の対象となる癌（腫瘍）としては、具体的には、肺癌（小細胞肺癌等）、大腸癌、乳癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、神経内分泌腫瘍、神経芽細胞腫、神経膠腫、１型神経線維腫症、胃癌、大腸癌、すい臓癌、膀胱癌、皮膚癌等が挙げられ、好ましくは、これらのヒト癌（腫瘍）である。
「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、１つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。また、本発明の誘導剤（前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチド）を生体内に投与する場合は、コロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、上記ペプチドの生体内の安定性を高めたり、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであればよく限定はされないが、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げることができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞である。
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される本発明の誘導剤（前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチド）の種類などにより異なっていてもよい。通常、成人一人あたり、一回につき１００μｇ〜５０００ｍｇの範囲で投与することができるが、限定はされない。
例えば注射剤により投与する場合は、ヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１００μｇ〜１００ｍｇの量を、１日平均あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
なお、本発明は、癌（腫瘍）を治療する医薬（薬剤）を製造するための、前記本発明の誘導剤（あるいは前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチド）の使用を提供するものでもある。また、本発明は、癌（腫瘍）の治療用の前記本発明の誘導剤（あるいは前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチド）を提供するものでもある。
さらに、本発明は、前記本発明の誘導剤（あるいは前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチド）を用いること（すなわち患者に投与すること）を特徴とする癌（腫瘍）の治療方法を提供するものであり、また、癌（腫瘍）を治療するための、前記本発明の誘導剤（あるいは前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチド）の使用を提供するものでもある。
４．アポトーシス誘導用キット
本発明においては、構成成分として本発明の誘導剤を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導用キットも提供される。本発明のキットは、腫瘍細胞等を含む各種細胞に対して、簡便に且つ効果的にアポトーシス誘導を行う場合に用いることができるため、前述した癌の治療の分野に限らず、各種実験・研究等の分野においても極めて有用性が高いものである。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
Ｄｅｌ−１のアポトーシス誘導（１）
発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＤｅｌ−１全長のｃＤＮＡ（配列番号４）を組み込んで、培養Ｃｏｓ細胞に導入した。コントロールには、Ｄｅｌ−１全長のｃＤＮＡを含まないｐｃＤＮＡ３を使用した。導入から２４時間後に、細胞核染色用のＨ３３３４２（ヘキスト社）で染色し、位相差顕微鏡（透過像）及び蛍光顕微鏡（Ｈ３３３４２）を用いて観察した。その結果を図１に示した。
図中の矢印で示したように、上記導入後の培養Ｃｏｓ細胞では、位相差顕微鏡の透過像により培養容器底面から剥がれかけている細胞の核が、Ｈ３３３４２で強く染まり、染色体が凝集していることが認められた。
【実施例２】
【０００７】
Ｄｅｌ−１のアポトーシス誘導（２）
発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＤｅｌ−１全長のｃＤＮＡ（配列番号４）を組み込んで、培養Ｃｏｓ細胞に導入した。コントロールには、Ｄｅｌ−１全長のｃＤＮＡを含まないｐｃＤＮＡ３を使用した。導入率の標準化のため、ＬａｃＺ遺伝子を組み込んだＤＮＡを同時に導入し。その結果を図２（左図及び右図）に示した。
左図：細胞から染色体ＤＮＡを採取し、ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動にかけ、銀染色を施した。Ｄｅｌ−１を強制発現させた細胞のサンプルでは、アポトーシスを示すラダーが観察された。
右図：培養上清中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定した。ＬＤＨは、通常、細胞質中に含まれている酵素であり、細胞死により、培養上清中に漏出されたことが確認された。
【実施例３】
【０００８】
Ｄｅｌ−１のアポトーシス誘導（３）
発現ベクターにＤｅｌ−１全長のｃＤＮＡ（配列番号４）を組み込んで、培養Ｃｏｓ細胞に導入した。導入から２４時間後に、Ｈ３３３４２及びＣ３−ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（蛍光色素Ｃ３と結合したａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ）で細胞を染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。その結果を図３に示した。
Ｈ３３３４２染色により凝集した染色体が観察される細胞の細胞膜は、Ｃ３−ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖで染色され、アポトーシスを起こしていることが認められた。なお、ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖは細胞膜の構成成分であるホスファチジルセリンと結合し得るものであり、ホスファチジルセリンは細胞がアポトーシスを起こした場合に細胞膜の外側に出てくる（局在してくる）ことが知られている。
【実施例４】
【０００９】
Ｄｅｌ−１のアポトーシス誘導（４）
ｅＧＦＰ−Ｄｅｌ−１（ｅＧＦＰとＤｅｌ−１全長との融合タンパク質）をコードするｃＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを、培養Ｃｏｓ細胞に導入した。導入から２４時間後に細胞を固定し、Ｈ３３３４２で染色した。その結果を図４に示した。
Ｄｅｌ−１が遺伝子導入された細胞（すなわち上記融合タンパク質を発現する細胞）は、ｅＧＦＰ由来の緑色に観察された。これらの細胞では染色体の凝集が認められ、アポトーシスを起こしていることが確認された。図中の矢印で示された３つの細胞は、緑色蛍光が観察されずＤｅｌ−１を発現していない（すなわちＤｅｌ−１が遺伝子導入されていない）にも関わらず、染色体の凝集が認められた。これは、Ｄｅｌ−１が遺伝子導入された細胞から分泌されたＤｅｌ−１が、近接した細胞にも機能しアポトーシスを誘導することを意味すると考えられた。
【実施例５】
【００１０】
Ｄｅｌ−１のアポトーシス誘導（５）
アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）発現ベクター（ＡＰｔａｇ４）に、Ｄｅｌ−１全長のｃＤＮＡ（配列番号４）を組み込んで、培養Ｃｏｓ細胞に導入した。コントロールにはＤｅｌ−１全長のｃＤＮＡを含まないＡＰ発現ベクターを使用した。得られた培養上清のＡＰ活性を測定して、ＡＰ融合タンパク濃度を標準化し、ＣＲＬ細胞（ヒトメラーノマ細胞）とＰ５細胞（血管内皮細胞株）の培養液に添加した（ＣＲＬとＰ５は遺伝子導入率が低いので、直接遺伝子を導入する方法をとらず、Ｃｏｓ細胞に組み換えタンパク質を生産させ、そのｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍを使用した。）。添加から２４時間後に、Ｈ３３３４２及びＣ３−ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖで細胞を染色して、観察した。その結果を図５に示した。
Ｈ３３３４２染色により凝集した染色体が観察される細胞の細胞膜は、Ｃ３−ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖで染色され、アポトーシスを起こしていることが認められた。
【実施例６】
【００１１】
Ｄｅｌ−１のアポトーシス誘導（６）
ＡＰ発現ベクター（ＡＰｔａｇ４）に、Ｄｅｌ−１全長のｃＤＮＡ（配列番号４）を組み込んで、培養Ｃｏｓ細胞に導入した。コントロールにはＤｅｌ−１全長のｃＤＮＡを含まないＡＰ発現ベクターを使用した。得られた培養上清のＡＰ活性を測定して、ＡＰ融合タンパク濃度を標準化し、ＣＲＬ細胞（ヒトメラーノマ細胞）とＰ５細胞（血管内皮細胞株）の培養液に添加した（ＣＲＬとＰ５は遺伝子導入率が低いので、直接遺伝子を導入する方法をとらず、Ｃｏｓ細胞に組み換えタンパク質を生産させ、そのｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍを使用した。）。添加から２４時間後に細胞から染色体ＤＮＡを採取し、ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動にかけ、銀染色を施した。その結果を図６に示した。
Ｄｅｌ−１を強制発現させた細胞のサンプルでは、アポトーシスを示すラダーが観察された。
【実施例７】
【００１２】
アポトーシス誘導の活性中心（１）
ＡＰ発現ベクター（ＡＰｔａｇ４）に、Ｄｅｌ−１全長のｃＤＮＡ（配列番号４）を組み込んで、培養Ｃｏｓ細胞に導入した。同様に、ＡＰｔａｇ４にＤｅｌ−１の一部分のｃＤＮＡを組み込んで、培養Ｃｏｓ細胞に導入した。コントロールには上記Ｄｅｌ−１全長等のｃＤＮＡを含まないＡＰ発現ベクターを使用した。なお、上記Ｄｅｌ−１の一部分としては、Ｄｅｌ−１全長タンパク質のＥＧＦ類似ドメインであるＥＧＦ１（Ｅ１；ｃＤＮＡ：配列番号２６、アミノ酸配列：配列番号２７）、ＥＧＦ２（Ｅ２；ｃＤＮＡ：配列番号２８、アミノ酸配列：配列番号２９）及びＥＧＦ３（Ｅ３；ｃＤＮＡ：配列番号６、アミノ酸配列：配列番号７）、ジスコイジンＩ類似ドメインであるＤｉｓｃｏｉｄｉｎ１とＤｉｓｃｏｉｄｉｎ２との融合タンパク質（Ｃ１Ｃ２；ｃＤＮＡ：配列番号３０、アミノ酸配列：配列番号３１）、上記Ｄｅｌ−１全長のアミノ酸置換（Ｄ１３６Ｅ）変異体（Ｄｅｌ１ｍ；ｃＤＮＡ：配列番号３２、アミノ酸配列：配列番号３３）、並びに上記Ｅ３のアミノ酸置換（Ｄ１３６Ｅ）変異体であるＥ３  Ｄ１３６Ｅ（Ｅ３ｍ；ｃＤＮＡ：配列番号３４、アミノ酸配列：配列番号３５）をそれぞれ用いた。ここで、Ｅ３ｍのアミノ酸置換態様を示す「Ｄ１３６Ｅ」中の「１３６」の表記は、Ｄｅｌ−１全長のアミノ酸配列（配列番号５）中の第１３６番目のアミノ酸残基の位置を示しており、Ｅ３のアミノ酸配列（配列番号７）においては第１４番目のアミノ酸残基の位置に対応するものである。導入率の標準化のため、ＬａｃＺ遺伝子を組み込んだＤＮＡを同時に導入した。導入から２４時間後に新鮮な培養液と交換し、さらに１時間後に上清のＬＤＨ活性を測定した。細胞融解液を調製し、ＬａｃＺ活性を測定した。Ｄｅｌ−１全長のｃＤＮＡを導入した細胞のＬａｃＺ活性を１として、ＬＤＨ活性の上昇を標準化した。その結果を図７に示した。
Ｅ３のｃＤＮＡを導入した細胞上清には、Ｄｅｌ−１全長のｃＤＮＡを導入した場合に近いＬＤＨ活性の上昇が認められた。その効果は、Ｅ３ｍのｃＤＮＡを導入した場合の結果から、Ｄ１３６Ｅの変異により失われたことが確認された。
【実施例８】
【００１３】
アポトーシス誘導の活性中心（２）
培養Ｃｏｓ細胞に、形質転換大腸菌で産生した組換えＥ３タンパク質を添加した。添加から２４時間後にＨ３３３４２で染色し、位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡とを用いて検鏡した。その結果を図８に示した。
図中の矢印で示したように、上記添加後の培養Ｃｏｓ細胞では、位相差顕微鏡の透過像により培養容器底面から剥がれかけていると観察される細胞の核が、Ｈ３３３４２で強く染まり、染色体が凝集していることが認められた。
【実施例９】
【００１４】
Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＡＰ発現ベクター（ＡＰｔａｇ４）に、Ｄｅｌ−１の一部分であるＥ３及びそのアミノ酸置換変異体のｃＤＮＡを組み込んで、それぞれ培養Ｃｏｓ細胞に導入した。同様に、ＡＰｔａｇ４に血液凝固因子第ＩＸ因子のＥＧＦドメイン（Ｆ  ＩＸ；ｃＤＮＡ：配列番号２４、アミノ酸配列：配列番号２５）のｃＤＮＡを組み込んで、培養Ｃｏｓ細胞に導入した。コントロールには上記Ｅ３等のｃＤＮＡを含まないＡＰ発現ベクターを使用した。なお、上記Ｅ３のアミノ酸置換変異体としては、Ｅ３  Ｄ１３６Ｅ（ｃＤＮＡ：配列番号３４、アミノ酸配列：配列番号３５）、Ｅ３  Ｄ１３６Ｎ（ｃＤＮＡ：配列番号３６、アミノ酸配列：配列番号３７）及びＥ３  Ｙ１４１Ｆ（ｃＤＮＡ：配列番号３８、アミノ酸配列：配列番号３９）をそれぞれ用いた。ここで、Ｅ３変異体のアミノ酸置換態様を示す「Ｄ１３６Ｅ」、「Ｄ１３６Ｎ」及び「Ｙ１４１Ｆ」中の「１３６」及び「１４１」の表記は、Ｄｅｌ−１全長のアミノ酸配列（配列番号５）中の第１３６番目及び第１４１番目のアミノ酸残基の位置を示しており、Ｅ３のアミノ酸配列（配列番号７）においては第１４番目及び第１９番目のアミノ酸残基の位置に対応するものである。導入率の標準化のため、ＬａｃＺ遺伝子を組み込んだＤＮＡを同時に導入した。導入から４時間後に新鮮な培養液と交換し、さらに２４時間後に上清のＬＤＨ活性を測定した。細胞融解液を調製し、ＬａｃＺ活性を測定した。Ｅ３（野生型）を導入した細胞のＬａｃＺ活性を１として、ＬＤＨ活性の上昇を標準化した。その結果を図９に示した。
Ｅ３変異体を導入した場合のＬＤＨ活性はすべて低下した。このことから、アスパラギン残基の水酸化配列（ＡＳＮ−ＨＹＤＲＯＸＹＬ）を構成するアミノ酸配列（Ｃ−Ｘ−［Ｄ／Ｎ］−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−［Ｙ／Ｆ］−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｃ（配列番号４０））中の特定のアミノ酸残基（Ｃ，Ｄ，Ｙ，Ｃ，Ｃ（配列番号４０中の第１、３、８、１０及び１２番目のアミノ酸残基））に対応するアミノ酸残基（本実施例ではＤやＹ）が変異することで、ＬＤＨ活性が低下することが分かった。一方、上記特定のアミノ酸残基の他にはＥ３と共通するアミノ酸残基のないＦ  ＩＸを導入した場合は、Ｅ３を導入した場合と同様に、高いＬＤＨ活性を有することが認められた。
【実施例１０】
【００１５】
濃度依存性
形質転換大腸菌で産生した組換えＥ３タンパク質を、種々の濃度（０〜２．０ｎｇ／ｍｌ）で培養Ｃｏｓ細胞に添加した。添加から２４時間後に、培養上清中のＬＤＨ活性を測定した。その結果を図１０に示した。
Ｅ３タンパク質濃度が０．４ｎｇ／ｍｌ以上の場合にアポトーシス誘導の有効性が現れた。なお、Ｅ３タンパク質濃度が１ｎｇ／ｍｌ以上の場合は、アポトーシス誘導の効果は変わらなかった。
【実施例１１】
【００１６】
種々の細胞におけるＥ３の有効性
形質転換大腸菌で産生した組換えＥ３タンパク質を、１ｎｇ／ｍｌ又は５ｎｇ／ｍｌの濃度で培養Ｃｏｓ細胞に添加した。添加から２４時間後に、培養上清中のＬＤＨ活性を測定した。その結果を図１１に示した。
Ｅ３タンパク質は、接着細胞であるＣＲＬ細胞（ヒトメラーノマ細胞）及びＰ５細胞（血管内皮細胞株）に対しては細胞障害活性（アポトーシス誘導）を示したが、浮遊細胞であるＭＥＬ細胞（マウス白血病細胞）に対しては同活性を示さなかった。
【実施例１２】
【００１７】
ＥＧＦ３ドメインを含むペプチドの腫瘍治療効果
移植腫瘍モデルマウスを用い、Ｄｅｌ−１の一部分であるＥＧＦ３ドメインを含むペプチドによる腫瘍治療効果を検討した。詳しくは、当該ペプチドと、既に抗腫瘍効果が確立しているＦａｓＬ（Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ）タンパク質とを併用した場合に、ＦａｓＬのみの場合と比較して、抗腫瘍効果の増強（亢進）がみられるかどうか確認した。
まず、下記（Ａ）及び（Ｂ）のｃＤＮＡを、それぞれ、発現ベクターとしてのｐｃＤＮＡ３Ｄベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込んでクローニングし、２種の組換えＤＮＡを作製した。
（Ａ）全長マウスＦａｓＬ（ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１０１７７）：配列番号４３、アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０３４３０７）：配列番号４４）のｃＤＮＡ
（Ｂ）上記（Ａ）のｃＤＮＡ、及び、ＥＧＦ３ドメインとＤｉｓｃｏｉｄｉｎ１との融合ペプチド（Ｅ３Ｃ１；ｃＤＮＡ：配列番号４１、アミノ酸配列：配列番号４２）のｃＤＮＡ（計２種のｃＤＮＡ）
なお、Ｅ３Ｃ１は、マウス全長Ｄｅｌ−１のアミノ酸配列（配列番号５）の第１２３番目〜第３１９番目のアミノ酸からなるペプチド（マウス全長Ｄｅｌ−１の塩基配列（配列番号４）の第９８５番目〜第１５７５番目の塩基配列によりコードされるペプチド）である。
次いで、５週齢のヌードマウス背部皮下に、５×１０６個のＳＣＣＫＮ（ヒト口腔扁平上皮癌由来の細胞株）を注射した。その後、経時的に腫瘍サイズを測定し、１０×１０ｍｍ大を超えた時点で、予め作製した２種の組換えＤＮＡをそれぞれ腫瘍内に注射（遺伝子導入）して、各ｃＤＮＡを腫瘍細胞内で発現させた。当該遺伝子導入の際、遺伝子導入試薬としてはｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔ−ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｓｆｅｃｔｉｏｎ社）を用い、導入ＤＮＡ量は１０μｇとした。前記（Ａ）のｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの導入は、マウス４匹に対して行い、前記（Ｂ）のｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの導入は、マウス５匹に対して行った。
遺伝子導入後の腫瘍サイズを経時的に測定し（７日間：Ｄａｙ０〜Ｄａｙ７）、その結果を図１２に示した。Ｅ３Ｃ１のｃＤＮＡを併せて導入した方が、優れた抗腫瘍効果を示し、Ｅ３Ｃ１によるＦａｓＬの抗腫瘍効果の増強効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明によれば、腫瘍細胞等を含む各種細胞に対してアポトーシスを誘導するアポトーシス誘導剤等を提供することができる。
本発明のアポトーシス誘導剤は、幅広い細胞種に対して簡便にアポトーシスを誘導することができ、腫瘍細胞に対しても有効にアポトーシス誘導ができる。よって、癌の治療用医薬組成物や癌の治療方法等に有効に用い得る点で極めて有用なものである。
また、本発明のアポトーシス誘導剤は、病巣等の目的細胞の周辺に残存し、その後の遺伝子治療等における遺伝子導入効率を向上させ得るという効果も有する。よって、本発明のアポトーシス誘導剤は、遺伝子治療剤との併用により、治療効果の高い癌の治療用医薬組成物や癌の治療方法等を提供することができる点で、極めて有用なものである。
【配列表フリーテキスト】
【００１９】
配列番号１：ペプチド
配列番号１：存在位置：２，４，５，６，７，９，１１のＸａａは任意のアミノ酸残基を表す。
配列番号４０：ペプチド
配列番号４０：存在位置：２，４，５，６，７，９，１１のＸａａは任意のアミノ酸残基を表す。
配列番号４０：存在位置：３のＸａａはアスパラギン酸又はアスパラギンを表す。
配列番号４０：存在位置：８のＸａａはチロシン又はフェニルアラニンを表す。
［配列表］
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年6月23日(2011.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
（ａ）下記式（Ｉ）：
2011025050.tif 000079
（Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Ｃはシステインを表し、Ｄはアスパラギン酸を表し、Ｆはフェニルアラニンを表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アポトーシス誘導活性を有するペプチド。
【請求項２】
前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列が、配列番号２又は配列番号３に示されるアミノ酸配列である、請求項１記載の誘導剤。
【請求項３】
前記（ａ）のペプチドが、配列番号５又は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１又は２記載の誘導剤。
【請求項４】
目的の細胞又は細胞集団に対して請求項１〜３のいずれか１項に記載の誘導剤を作用させる工程を含む、アポトーシス誘導方法。
【請求項５】
前記工程が、目的の細胞又は細胞集団に前記誘導剤を接触させる工程である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の誘導剤を含む、癌の治療用医薬組成物。
【請求項７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む１２〜１００残基のアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
【請求項８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
【請求項９】
配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
【請求項１０】
配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
【請求項１１】
配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
【請求項１２】
配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
【請求項１３】
配列番号４２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれか１項に記載の誘導剤を含む、癌の治療用医薬組成物。
【請求項１５】
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
【請求項１６】
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
【請求項１７】
配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
【請求項１８】
配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の誘導剤を含む、癌の治療用医薬組成物。
【国際調査報告】
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