(57)【要約】１９Ｆ検出を用いた競合結合実験による、リガンドベースの高処理量ＮＭＲスクリーニング。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子に対するリガンドを同定する方法であって：
前記標的分子と相互作用する１９Ｆ標識された基準化合物を提供することと；
前記標的分子の存在下における、前記１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することと；
少なくとも１つの被検化合物を含む被検試料を準備することと；
前記被検試料および前記標的分子の各々の存在下における、前記１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することと；
前記標的分子の存在下における１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルを、前記被検試料および標的分子の各々の存在下における１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルと比較して、１つまたは複数の前記１９Ｆ標識された基準化合物共鳴における変化を決定することと；
前記標的分子と相互作用する少なくとも１つの前記被検化合物を同定することと；
を含んでなり、
前記被検化合物が、前記１９Ｆ標識された基準化合物を置換する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記被検化合物が、少なくとも前記基準化合物の結合親和性と同程度の緊密な結合親和性を有する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、１つまたは複数の基準化合物共鳴における変化が、少なくとも１つの基準共鳴におけるシグナル強度の増大を含んでなる方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの被検化合物を同定することが、前記被検化合物および前記標的分子の各々の存在下における、１９Ｆ標識された基準化合物の別個の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを記録することを含んでなる方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって：更に、
１９Ｆ標識された基準化合物の異なる濃度において、前記標的分子の存在下における前記基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することと；
前記被検化合物の解離定数を決定することと；
を含んでなる方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって：更に、
前記標的分子の異なる濃度において、前記標的分子の存在下における１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することと；
前記被検化合物の解離定数を決定すること；
を含んでなる方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって：前記比較するステップで用いるために、前記標的分子の存在下において、前記１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集する前に、更に、
前記標的分子の異なる濃度または前記１９Ｆ標識された基準化合物の異なる濃度において、前記標的分子の存在下における前記１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することと；
前記標的分子と相互作用する少なくとも１つの前記被検化合物を同定するための最適実験条件を決定することと；
を含んでなる方法。
【請求項８】
前記標的分子は高分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記高分子はポリペプチドまたはポリヌクレオチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記高分子はタンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記基準化合物はマイクロモル範囲の結合親和性で前記標的分子と結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記基準化合物の結合親和性が等温滴定熱量測定または蛍光分光分析により決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって：更に、前記基準化合物を同定する工程を含んでなり、該工程は、
標的分子の非存在下における、潜在的な基準化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集することと；
標的分子の存在下における、潜在的な基準化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集することと；
前記二つのＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較して、前記潜在的な基準化合物が標的分子と相互作用するか否かを同定することと；
を含んでなる方法。
【請求項１４】
前記被検試料は２つまたはそれ以上の前記被検化合物の混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって：更に、
前記被検化合物および前記標的分子の各々の存在下における、前記１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することと；
前記標的分子の存在下における前記基準化合物のスペクトルを、前記被検化合物および標的分子の各々の存在下おける基準化合物のスペクトルと比較して、選択された１９Ｆ標識された基準化合物共鳴における変化を決定することと；
を含んでなる方法。
【請求項１６】
前記被検化合物は前記基準化合物のものより緊密な結合親和性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって：
前記１９Ｆ標識された基準化合物を準備することは、前記１９Ｆ標識された基準化合物、ならびに定義された線幅、振幅および周波数を有するＥＲＥＴＩＣシグナルを提供することを含み、
前記標的分子の存在下における１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することは、前記標的分子の存在下において、ＥＲＥＴＩＣシグナルを有する１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルを収集することを含み、
前記被検試料および標的分子の各々の存在下における１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することは、前記被検試料および前記標的分子の各々の存在下において、ＥＲＥＴＩＣシグナルを有する１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルを収集することを包含する方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって：
前記１９Ｆ標識された基準化合物を準備することは、前記１９Ｆ標識された基準化合物および１９Ｆ標識された非相互作用化合物を提供することを含み、
前記標的分子の存在下における１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することは、前記標的分子の存在下における１９Ｆ標識された基準化合物および１９Ｆ標識された非相互作用化合物のスペクトルを収集することを含み、
前記被検試料および標的分子の各々の存在下における１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することは、前記被検試料および標的分子の各々の存在下における１９Ｆ標識された基準化合物および１９Ｆ標識された非相互作用化合物のスペクトルを収集することを含む方法。
【請求項１９】
標的分子に対するリガンドを同定するための化合物をスクリーニングする方法であって：
少なくとも１つの被検化合物の一次１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することと；
少なくとも１つの被検化合物を標的分子に曝露することと；
該標的分子に曝露された少なくとも１つの被検化合物の二次１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することと；
前記一次および二次スペクトルを比較して、１つまたは複数の共鳴における変化を決定し、それによって標的分子と相互作用する少なくとも１つの被検化合物を同定することと；
を含んでなる方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法であって、前記被検試料を提供することは複数の被検試料を提供することを含み、各被検試料は少なくとも１つの被検化合物を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、本明細書の一部として援用する米国特許仮出願第６０／４５４，７６６号（２００３年３月１４日出願）の利益を主張する。
【発明の背景】
【０００２】
一般に市販されている多数の薬剤は、高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）から同定された先導分子（leads）から開発された。ＨＴＳで用いられる治療的興味の対象は、しばしば、種々の方法で発現し得るクローニングされた遺伝子から産生される組換えタンパク質である。典型的には、大きな化合物コレクションが、阻害剤の同定のためにこれらのタンパク質に対してスクリーニングされる。
【０００３】
ここ１０年の間に、特許（proprietary）化合物コレクションの規模は、異なる種々のプロジェクトへのコンビナトリアル化学の体系的適用の結果として、幾何級数的に増大した。コンビナトリアル化学は、今日では、伝統的創薬化学および天然供給源から利用可能なその他の化合物ライブラリーを補足する大きな化合物ライブラリーを生じる。ロボット工学およびオートメーションの開発および適用は、短時間に多数の化合物を試験することを実行可能にした。考え得る先導分子の同定のために、幾つかの新しい検出系が用いられる。
【０００４】
近年、核磁気共鳴（ＮＭＲ）が、薬学的興味の対象と相互作用する小分子を検出するための強力な方法として出現した。ＮＭＲは高感度技法ではないが、他の検出系で観察されるアーティファクトにあまり左右されないという利点を有する。極低温ＮＭＲプローブ技術における近年の開発により、スクリーニングのために必要な時間またはタンパク質の量が低減された。
【０００５】
ＮＭＲ法は、同位体元素標識タンパク質について、大きな化合物ライブラリーをスクリーニングするために用いられてきた。標的タンパク質の１５Ｎ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルにおける交差ピークの化学シフト変化が、科学的混合物の存在下でモニタリングされる。次に、混合物の逆重畳により、タンパク質と相互反応する分子（すなわち、化学シフト変化に関与する化合物）が同定される。タンパク質の三次元構造が既知であり、そしてタンパク質主鎖共鳴の配列特異的ＮＭＲ割り当てが得られている場合、当該方法はリガンド結合部位およびリガンド結合方式の重要な構造的情報を提供する。
【０００６】
ＮＭＲスクリーニングを実施するための別の方法は、リガンド共鳴の検出に基づくものである。幾つかのＮＭＲパラメーターが、リガンド同定のためのツールとして文献中に提案されている。これらの方法は、スクリーニングされた混合物の迅速な逆重畳を可能にするので、中〜低親和性リガンドの同定に特に適している。
【０００７】
しかしながら、これらの技法は幾つかの欠点を有している。第一に、結合部位に関して直接利用可能な構造情報がない。第二に、これらの実験で典型的に用いられるタンパク質に比較して被検化合物が大過剰で存在するため、受容体と共有結合する高親和性のリガンドおよび分子が検出されずに逃げてしまう。すなわち、遅い反応動態（kinetics）を有するタンパク質または化合物と緊密に相互作用する化合物は、タンパク質内でのこれらの化合物の滞留時間がＮＭＲ実験に用いられる混合時間ウインドウ（例えば１〜２秒間）よりも長いので、検出されない。第三に、潜在的リガンドである溶解度の低い化合物は、当該方法がリガンドシグナルの観察を要するため、検出するのが困難である。
【０００８】
従って、典型的なリガンド観察スクリーニング実験に付随した欠点を伴わずに、タンパク質のような標的分子に対するリガンドを検出するために用いることができる追加のＮＭＲ法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、合理的なドラッグデザインに関する。具体的には、本発明は、標的分子（例えば典型的にはタンパク質）と相互作用する化合物をスクリーニングするための核磁気共鳴（ＮＭＲ）法を提供する。本方法は、結合相互作用を検出するための１９Ｆ  ＮＭＲの使用、特に１９Ｆ  ＮＭＲ競合結合実験を包含する。
【００１０】
競合結合実験は、競合分子の存在下における基準化合物の置換を包含する。好ましくは、基準化合物は、マイクロモル範囲の結合親和性で標的分子と結合する。好ましくは、被検化合物は１マイクロモルより強い（例えばナノモル範囲の）結合親和性で標的分子と相互作用するが、しかし１マイクロモルより弱い（すなわち１マイクロモルより大きい）結合親和性で結合する化合物も、本発明の方法を用いて評価され得る。
【００１１】
本発明の方法は、特にそれが競合結合実験を包含する場合、典型的リガンド観察スクリーニング実験に付随する欠点を伴わずに、適正に設定された競合結合実験に基づいた効率的高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）を実施するために用いることができる。更に本方法は、単一点測定を用いた、同定されたリガンドのＫＤの概算を提供する。このアプローチを用いて、例えばタンパク質またはＤＮＡおよびＲＮＡ断片に対して、短時間で数千の化合物をスクリーニングすることが可能である。
【００１２】
本発明はまた、植物および真菌抽出物のような化学的混合物（すなわち、２つまたはそれ以上の被検化合物）を、迅速にスクリーニングするための有用な用途を見出すことができるであろう。迅速スクリーニングの技法は典型的には複数の被検試料を提供することを包含し、各々の被検試料は２つまたはそれ以上の被検化合物の混合物を含む。
【００１３】
本発明の方法は、少なくとも以下のステップを使用して、標的分子に対するリガンドを同定することを包含する：標的分子と相互作用する１９Ｆ標識された基準化合物を提供するステップ；標的分子の存在下で１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集するステップ；少なくとも１つの被検化合物を含む被検試料（好ましくは複数の被検試料）を提供するステップ；被検試料および標的分子の各々の存在下で、１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集するステップ；標的分子の存在下での１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルを、被検試料および標的分子の各々の存在下での１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルと比較し、それにより、１つまたは複数の１９Ｆ標識された基準化合物共鳴における変化を決定するステップ；および、標的分子と相互作用する少なくとも１つの被検化合物を同定するステップ（ここで、該被検化合物は１９Ｆ標識された基準化合物に置き換わる）。被検化合物（潜在的リガンド）は、それが基準化合物を標的分子から置き換える場合には、リガンドである。
【００１４】
好ましくは、本発明の方法は、以下を含む基準化合物を同定するステップを包含する：標的分子の非存在下において、潜在的基準化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集すること；標的分子の存在下において、潜在的基準化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集すること；それらのＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較して、潜在的基準化合物が標的分子と相互作用するか否かを同定すること。
【００１５】
本発明の方法のある幾つかの実施形態について、基準化合物は、定義された線幅、振幅および周波数を有するＥＲＥＴＩＣシグナルと組合せて提供される。これらの方法に関して、標的分子の存在下において１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することは、標的分子の存在下でＥＲＥＴＩＣシグナルを有する１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルを収集することを包含し；そして被検試料および標的分子の各々の存在下において１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することは、被検試料および標的分子の各々の存在下でＥＲＥＴＩＣシグナルを有する１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルを収集することを包含する。
【００１６】
本発明の方法のある幾つかの実施形態に関して、１９Ｆ標識された基準化合物は、１９Ｆ標識された非相互作用化合物と組合せて提供される。これらの方法に関しては、標的分子の存在下において１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することは、標的分子の存在下において、１９Ｆ標識された基準化合物および１９Ｆ標識された非相互作用化合物のスペクトルを収集することを包含し；また被検試料および標的分子の各々の存在下において１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することは、被検試料および標的分子の各々の存在下において、１９Ｆ標識された基準化合物および１９Ｆ標識された非相互作用化合物のスペクトルを収集することを包含する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、標的分子に対するリガンドを同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの被検化合物の一次１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集すること；少なくとも１つの被検化合物を標的分子に曝露すること；標的分子に曝露された少なくとも１つの被検化合物の二次１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集すること；および、一次および二次スペクトルを比較して、１つまたは複数の共鳴における変化を確定し、標的分子と相互作用する少なくとも１つの被検化合物を同定することを包含する。
【発明の実施形態の詳細な説明】
【００１８】
本発明は、１９Ｆ  ＮＭＲ、特に１９Ｆ  ＮＭＲ競合結合実験の使用に向けられている。すなわち本発明は、１９Ｆ実験を用いたリガンドベースのスクリーニング（好ましくは競合スクリーニング）に向けられている。フッ素−１９検出は、これらの実験にけるプロトン検出を凌駕する多数の利点を有している。
【００１９】
フッ素は、タンパク質と結合された場合のリガンドシグナルの１９Ｆ横緩和（transverse relaxation）への有意な化学シフト異方性（ＣＳＡ）寄与の故に、これらの実験にとって好ましい核である。すなわち１９Ｆ横緩和へのＣＳＡ寄与は、フッ素シグナルを、標的との複合体形成の作用に対して特に応答性にする。１９Ｆ原子を含有する低〜中親和性リガンドは、新しいリガンドの検出および特徴付けのための基準分子として用いることができる。更にまた、フッ素の検出は、試験される大部分の化合物がフッ素原子を含有しないので、プロトン（１Ｈ）ＮＭＲで生じるスペクトル重複の問題を有意に低減するか、または排除することさえ可能である。プロトンＮＭＲと同様、１９Ｆ−ＮＭＲは高感度であり、そして迅速なデータ収集に応じ易く、大きな化合物ライブラリーの高処理量スクリーニングを可能にする。フッ素は、生物学的活性化合物の薬物動態特性を高めるためのドラッグデザイン作業にしばしば用いられる。利用可能な化学総覧スクリーニング化合物（ＡＣＤ−ＳＣ）からなる分子の約１２％はフッ素原子を含有するので、競合スクリーニングのための基準化合物は、典型的には化学合成に頼らずに得られる。実際、フルオロベンゼンおよびトリフルオロメチルベンゼン部分は、それぞれ約１５０，０００および約４０，０００個の分子に見出される。
【００２０】
競合結合実験は、競合分子の存在下での基準化合物の置換を含んでいる。好ましくは、基準化合物はマイクロモル範囲の結合親和性で標的分子と結合する。好ましくは、被検化合物は１マイクロモルより強い（すなわち１マイクロモル未満の）結合親和性で標的分子と結合するが、１マイクロモルより弱い（すなわち１マイクロモルより大きい）結合親和性で結合する化合物も、本発明の方法を用いて評価することができる。
【００２１】
本明細書中に記載された方法は、標的分子に対して相対的に強力な結合剤であるリガンドを同定するために特に有用であるが、しかしそれらは広範囲の結合親和性のリガンドを同定するためにも用いることができる。相対的に強力な結合剤は、典型的には約１マイクロモル未満、好ましくは約５００ｎＭ未満、更に好ましくは約１００ｎＭ未満の解離結合定数ＫＤを有するものと定義される。
【００２２】
競合結合実験は、水性緩衝液中で高度に可溶性である化合物のライブラリーをスクリーニングすることに限定されない。典型的には、水溶性であることが必要とされるのは基準化合物のみであり、溶解度が限定されている化合物でも、基準化合物のシグナルに及ぼすそれらの間接的作用によって検出することができる。受容体ならびにスクリーニングされる混合物の分子と基準分子との可能な非特異的相互作用からアーティファクトが生じるのを防ぐために、基準分子（その役割のために、スパイ分子と呼ばれる）は一般に水溶性である。基準分子を用いた滴定ＮＭＲ実験は、典型的にはまず、異なるリガンド濃度および固定タンパク質濃度で、あるいは異なるタンパク質濃度および固定リガンド濃度で実施される（C.Dalvit et al., J. Am. Chem. Soc., 124, 7702-7709 (2002)）。これらの実験は、スクリーニング設定条件の最適化のために、ならびに単一点測定から、同定されたＮＭＲヒットの結合定数を得るために用いられる。強力なリガンドは、スパイ分子に及ぼすそれらの大きな作用の故に容易に同定される。しかしながら、現在の１Ｈ  ＮＭＲ競合スクリーニング法の限界の１つは、特に大きな化学的混合物がスクリーニングされる場合に、基準化合物および被検化合物間のスペクトル重複の発生により提示される可能性がある。その他の核（例えば１９Ｆ）のＮＭＲ検出の使用は、これらの問題を有意に低減する。
【００２３】
本発明は、標的分子と相互作用するリガンドを同定する種々の方法を提供する。
【００２４】
ある幾つかの実施形態では、当該方法は、標的分子に対するリガンドを同定するために、化合物をスクリーニングすることを包含する。当該方法は、少なくとも１つの被検化合物の一次１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集すること；少なくとも１つの被検化合物を標的分子に曝露すること；標的分子に曝露された少なくとも１つの被検化合物の二次１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集すること；および、一次および二次スペクトルを比較して、１つまたは複数の共鳴における変化を確定し、それによって標的分子と相互作用する少なくとも１つの被検化合物を同定することを包含する。
【００２５】
ある幾つかの実施形態では、標的分子と相互作用する１９Ｆ標識された基準化合物を提供するステップ；標的分子の存在下で１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集するステップ；それぞれが少なくとも１つの被検化合物を含む少なくとも１つの被検試料（好ましくは複数の被検試料）を提供するステップ；被検試料および標的分子の各々の存在下において、１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集するステップ；標的分子の存在下での１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルを、被検試料および標的分子の各々の存在下での１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルと比較して、１つまたは複数の１９Ｆ標識された基準化合物共鳴における変化を決定するステップ；および、標的分子と相互作用する少なくとも１つの被検化合物を同定するステップが用いられる。この同定ステップにおいて、前記被検化合物は１９Ｆ標識された基準化合物を置換し、この置換は、典型的には被検化合物が基準化合物のものと少なくとも同等の緊密な結合親和性を有するために生じる。
【００２６】
典型的には、１つまたは複数の１９Ｆ標識された基準化合物共鳴における変化は、少なくとも１つの基準共鳴におけるシグナル強度の増大を包含する。好ましくは、１つまたは複数の１９Ｆ標識された基準化合物共鳴における変化は、少なくとも１つの基準共鳴の鋭敏化を包含する。
【００２７】
所望により、実施例の節に記載されているように、１９Ｆスペクトルの取得前に、スピン−エコー型フィルターを適用してもよい。
【００２８】
本明細書中に記載された方法の何れかについての最適実験条件は、実施例の節に記載されているように確定され得る。具体的には、これは、典型的には比較ステップに用いるために、標的分子の存在下において、１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集する前に実行される次のステップ、即ち、標的分子の異なる濃度でまたは１９Ｆ標識された基準化合物の異なる濃度で、標的分子の存在下において、１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集するステップを包含する。この収集された情報を用いて、標的分子と相互作用する少なくとも１つの被検化合物を同定するための最適実験条件を確定する。
【００２９】
被検試料および標的分子の各々の存在下において、１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを収集するときには、広範な種々のパルスシーケンスを用いることができる。スペクトルの有効な比較のためには、同一実験条件を有することが望ましい。しかしながら、滴定実験を用いたグラフがスクリーニング前に作成される限り、標的化合物および１９Ｆ標識された基準分子の濃度は変更することができる。一般に、温度および緩衝液条件は同じであるが、これは、これら実験条件における変化が基準化合物の結合定数に影響を及ぼす可能性があるからである。
【００３０】
２つまたはそれ以上の被検化合物の混合物に関して上記で述べた一般化方法では、少なくとも１つの被検化合物を同定することは、好ましくは被検化合物および標的分子の各々の存在下で別々の１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを記録することを包含する。この後、標的分子の存在下での１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルを、被検化合物および標的分子の各々の存在下での１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルと比較して、選択された１９Ｆ標識基準化合物の共鳴における変化を決定する。これらの実験のパルスシーケンスは、一般的に同一である。このような実験は通常、当業者により逆重畳実験と呼ばれる。
【００３１】
被検化合物および／または基準化合物の解離定数（すなわち結合親和性）は、所望によりＮＭＲ技法を用いてできるが、その他の既知の技法も同様に用いてよい（例えば等温滴定熱量測定）。好ましくは、基準化合物の結合親和性は、等温滴定熱量測定または蛍光分光分析を用いて評価され、その特定の詳細は当業者に既知であり、実施例の節に記載されている。
【００３２】
例えば一つのＮＭＲに基づく方法では、一般化された方法における上記ステップに加えて、１９Ｆ標識された基準化合物とは異なる濃度の標的分子の存在下において、１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することができる。その代わりに、またはそれに加えて、標的分子とは異なる濃度の標的分子の存在下において、１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することができる。この情報を用いて、実施例に記載されるような被検化合物の解離定数を決定することができる。
【００３３】
本発明の任意の一方法の精度を上げるために、種々の技法が用いルことができる。典型的には、非相互作用化合物であり得る内部対照を用いることができる。
【００３４】
非相互作用分子の使用に代わるものは、ＥＲＥＴＩＣ法の使用である（S. Akoka et al., Anal. Chem., 71, 2554-2557 (1999);およびV. Silvestre et al., S. Anal. Chem., 73, 1862-1868 (2001)）。この技法は、定義された周波数、線幅および振幅をもったシグナルの電子的生成に依拠するものである。試料に由来するＦＩＤを用いると、偽ＦＩＤが得られる。この人工シグナルの振幅は、タンパク質の非存在下で記録された基準化合物のシグナルの強度に匹敵するように調整される。次いで、この振幅値を滴定実験およびＮＭＲ−スクリーニング実験に用いて、実際のシグナルおよび人工シグナルのシグナル強度比を測定する。ＥＲＥＴＩＣシグナルを加えることは、シグナルを標準化するための偽造シグナルを加えることと似ている。
【００３５】
本発明の方法のある幾つかの実施形態について、基準化合物は、定義された線幅、振幅および周波数を有するＥＲＥＴＩＣシグナルと組合せて提供される。これらの方法に関しては、標的分子の存在下での１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルの収集は、標的分子の存在下において、ＥＲＥＴＩＣシグナルを用いて１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルを収集することを包含し、そして被検試料および標的分子の各々の存在下での１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルの収集は、被検試料および標的分子の各々の存在下において、ＥＲＥＴＩＣシグナルを用いて１９Ｆ標識された基準化合物のスペクトルを収集することを包含する。
【００３６】
本発明の方法のある幾つかの実施形態に関して、１９Ｆ標識された基準化合物は、１９Ｆ標識された非相互作用化合物と組合せて提供される。これらの方法に関しては、標的分子の存在下で１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することは、標的分子の存在下において、１９Ｆ標識された基準化合物および１９Ｆ標識された非相互作用化合物のスペクトルを収集することを包含し、そして被検試料および標的分子の各々の存在下で１９Ｆ標識された基準化合物の１Ｄ１９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを収集することは、被検試料および標的分子の各々の存在下において、１９Ｆ標識された基準化合物および１９Ｆ標識された非相互作用化合物のスペクトルを収集することを包含する。このような非相互作用化合物は、それらが評価される濃度で標的分子と結合しない対照として作用する。
【００３７】
本発明の競合結合実験と組合せて、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ法、ならびに当業者に既知の他の方法、例えば分光分析または生化学アッセイを用いて基準化合物を同定することができる。好ましくは、基準化合物は、以下のステップによって同定することができる：即ち、標的分子の非存在下において、潜在的基準化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集するステップ；標的分子の存在下において、潜在的基準化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集するステップ；および、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較するステップであって、それにより、潜在的基準化合物が標的分子と相互作用するか否かを同定するステップである。
【００３８】
ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ法（勾配分光分析Ｙにより観察されるウォーター−リガンドとも呼ばれる）は、バルク水のプロトンから、標的分子（例えばタンパク質）と相互作用する化合物のプロトンへの磁化の移動に基づいている。ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ法を用いることにより、結合化合物は、符号が反対であるそれらのウォーター−リガンド核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）により非結合体と区別される。WaterLOGSY法は、国際公開番号ＷＯ０１／２３３３０（２００１年４月５日公開）、C. Dalvit et al., J. Biomol. NMR, 18, 65-68 (2000)、および出願人等の代表的同時係属中の米国特許出願６０／３８６，８９６（２００２年６月５日出願）（代理人整理番号０１１６８．ＰＲＯ１）により詳細に記載されている。
【００３９】
本発明の方法に用いることができる標的分子としては、広範な種々の分子、特に高分子、例えばポリペプチド（好ましくはタンパク質）、ポリヌクレオチド、有機ポリマー等が挙げられる。これらは、生きている細胞内に、または溶解産物中に存在し得る。
【００４０】
「ポリヌクレオチド」とは、本明細書中で用いる場合、任意の長さの高分子形態のヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを意味し、二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む。ポリヌクレオチドは、コード領域および非コード領域の両方を含み、そして天然供給源（例えば微生物）から直接得られるか、或いは、組換え技法、または酵素的もしくは化学的技法を用いて調製され得る。ポリヌクレオチドは、位相幾何学において線状または環状であることができる。ポリヌクレオチドは、例えばベクター、例えば発現またはクローニングベクターの一部、あるいは断片であり得る。
【００４１】
「ポリペプチド」とは、本明細書中で用いる場合、アミノ酸のポリマーを指し、特定長のアミノ酸のポリマーを指さない。従って例えばペプチド、オリゴペプチド、タンパク質および酵素という用語は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等も含む。
【００４２】
基準化合物は、十分に低い結合親和性で選択だれた標的分子と相互作用するものである。相対的に弱く相互作用する基準化合物は、典型的には少なくとも１０マイクロモルの解離結合定数ＫＤを有するものと定義される。
【００４３】
評価することができる被検化合物は、標的に対して広範な種々の結合親和性を潜在的に有する広範な種々の化合物のうちの何れかであることができる。重要なこととして、本発明の方法は、比較的強力な結合剤である化合物を検出する能力を有する。比較的強力な結合剤は、典型的には約１マイクロモル未満の解離結合定数ＫＤを有するものと定義される。本発明の方法を用いてスクリーニングされ得る化合物としては、例えば植物抽出物、真菌抽出物、その他の天然産物、ならびに小有機分子のライブラリーが挙げられる。
【００４４】
本発明は、広範囲の溶解度を有する化合物のライブラリーからのリガンドについて、スクリーニングすることができる（本方法は特に、溶解度の非常に低い化合物に適している）。重要かつ有利なことに、ある幾つかの実施形態について、本発明は、好ましくは相対的に低濃度の標的（すなわち標的分子）で結合アッセイを実行することを包含するの。従って、本発明の好ましい実施形態は、かろうじて可溶性であるに過ぎない化合物の検出を可能にする。典型的にはこれらの化合物は、約１０μＭ以下の水中溶解度を有する。
【００４５】
好ましくは、各試料中の各被検化合物の濃度は約１００μＭ以下であるが、しかし所望に応じてより高い濃度を用いてもよい。しかしながら、本発明の方法の有意な利点は、非常に低いリガンド濃度（例えば約１０μＭ以下）を使用できることである。
【００４６】
使用する標的分子に対する被検化合物の正確な濃度および比率は、標的分子のサイズ、利用可能な標的分子の量、所望の結合親和性検出限界ならびにデータ収集の所望の速度によって変わり得る。好ましくは、標的分子の濃度は約１００ｎＭ〜約１０μＭである。
【００４７】
試験混合物のために用いられる溶媒は、それらが標的を分解（例えば変性）しない限り、広範な種々溶媒の何れであってもよい。典型的には、水およびＤＭＳＯが用いられる。プロトン化溶媒および界面活性剤を用いることができる。
【００４８】
当業者に既知であるように、所望によりその他の構成成分（例えば緩衝剤）を、ある種の利益のために試験混合物に付加することができる。
【００４９】
本発明は、化学的混合物（すなわち２つまたはそれ以上の被検化合物の混合物）の迅速スクリーニングに関しても、有用な用途を見出すことができるであろう。迅速スクリーニング技法は、典型的には複数の被検試料を提供することを包含し、各被検試料は２つまたはそれ以上の被検化合物を含む。
【００５０】
リガンド（好ましくは高親和性リガンド）が同定され且つ確証されたら、その構造を用いて、活性または親和性について検定すべき同様の構造を有する利用可能な化合物を同定し、あるいは活性または親和性について検定すべき構造的に関連する化合物の合成を指令する。次いで、これらの化合物を商品カタログ（inventory）から入手し、または合成する。大抵の場合、それらは、次いで酵素アッセイを用いて活性について検定される。それが酵素ではなく、または利用可能な酵素アッセイがない分子標的の場合には、これらの化合物を、上記と同様のＮＭＲ技法を用いて、あるいはその他の物理的方法、例えば等温変性熱量測定により、親和性について検定することができる。約１．０×１０−６Ｍまたはそれより良好な分子標的に対する親和性を有するこのステップで同定される化合物は、典型的には先導的な化学的テンプレートと考えられる。
【００５１】
幾つかの場合、リガンド結合は、より複雑なＮＭＲ実験またはその他の物理的方法、例えば熱量測定またはＸ線結晶回析を用いて更に研究される。
【００５２】
１Ｈおよび１９Ｆ検出のために最適化される極低温プローブ技法は、このスクリーニング法の処理量を更に増大することができるであろう。この場合の制限因子は、試料を変え、試料温度を平衡させ、そして試料をシミングする（shim）ために必要な時間である。
【実施例】
【００５３】
本発明の目的および利点を以下の実施例により更に説明するが、これらの実施例中に引用された特定の物質およびその量、ならびにその他の条件および詳細は、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００５４】
材料および方法
実施例（Ｉ）における第１組の実験については、セリン／トレオニンｐ２１活性化キナーゼのキナーゼドメイン（分子量約３４０００）を大腸菌中でＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、ＧＳＴタグの除去後に均質になるまで精製した。ＮＭＲ試料をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、コード：Ｐ−３８１３、ロット番号１００Ｋ８２１１（Sigma））、ｐＨ７．４中に入れた。ロックシグナルのために、Ｄ２Ｏをその溶液に添加した（最終濃度８％）。重水素化ＤＭＳＯ中の濃縮ストック溶液に小分子を調製して、２５３Ｋで保存した。
【００５５】
実施例（ＩＩ）における第２組の実験については、脂肪酸フリーのヒト血清アルブミン（Ａ−３７８２）をSigmaから購入し、更に精製せずに用いた。ＮＭＲ試料を、５μＭのＥＤＴＡの存在下でリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、コード：Ｐ−３８１３、ロット番号１００Ｋ８２１１（Sigma））、ｐＨ７．４中に入れた。ロックシグナルのために、Ｄ２Ｏをその溶液に添加した（最終濃度８％）。重水素化ＤＭＳＯまたは水中の濃縮ストック溶液に小分子を調製して、２５３Ｋで保存した。
【００５６】
ＮＭＲ
実施例（Ｉ）における第１組の実験に関しては、試料管理システム（ＳＭＳ）自動試料採取器を装備したバリアン・イノーバ（Varian Inova）６００ＭＨｚ（１９Ｆに関しては５６４ＭＨｚ）ＮＭＲ分光計を用いて、２９３Ｋで全てのＮＭＲスペクトルを記録した。励起スカルプティングシーケンス（sculpting sequence）を用いて、１Ｈ検出実験における水抑制を達成した（T.-L. Hwang, J. Magn. Reson. A, 112, 275-279 (1995)）。このスキームにおける２つの水選択的１８０°方形パルスおよび４つのパルス磁場勾配は、持続時間中がそれぞれ２．６および１ミリ秒（ｍｓ）であった。
【００５７】
実施例（ＩＩ）における第２組の実験に関しては、５６４ＭＨｚの１９Ｆラーモア周波数で動作するブルカー・アバンス（Bruker Avance）６００ＮＭＲ分光計を用いて、２９３Ｋで全てのＮＭＲスペクトルを記録した。１９Ｆ周波数に同調される内部コイルおよび１Ｈ周波数に同調される外部コイルを有する二重コイル｛１９Ｆ｝−｛１Ｈ｝プローブを用いた。これらのプローブのフッ素バックグラウンドは測定を妨げない。これらのシグナルはブロードであり、従ってスピン−エコースキームで記録される基準分子および対照分子のスペクトル中では見えない。スペクトルは全て、取得時間中に適用される弱ワルツ（Waltz）−１６プロトンデカップリングを用いて記録した。典型的には、温度平衡に関して４〜８ダミースキャンを記録した。取得時間前に、異なる長さおよび長い２τ間隔のカー−パーセル−マイボーム−ギル（Carr-Purcell-Meibom-Gill）スキームを用いた。化学シフトは、トリフルオロ酢酸を基準とした。
【００５８】
蛍光
励起光線に対して垂直に配置された補助光電子増倍管を用いたジャスコ（Jasco）Ｊ−７１５偏光分光測光装置で、蛍光測定値を得た。励起波長は３１０ｎｍ（帯域幅５ｎｍ）であり、３８５ｎｍカットオフフィルターを用いた。親和性測定は、ＮＭＲ実験に関して用いたのと同一供給元の脂肪酸フリーのＨＳＡを用いて行なった。５μＭのＥＤＴＡの存在下で、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、コード：Ｐ−３８１３、ロット番号１００Ｋ８２１１（Sigma））、ｐＨ７．４中に検体およびＨＳＡ溶液を調製した。使用前に、緩衝液を０．２μｍフィルターに通して濾過した。路長１．０ｃｍの石英セル中に検体の３μＭ溶液２．０ｍＬをアリコート化し、ＨＳＡ（ストック濃度２５０μＭ）で溶液を滴定することによりアルブミン親和性を決定した。
【００５９】
ＩＴＣ実験
ＯＭＥＧＡ滴定微小熱量計（Microcal, Inc., Northampton, MA）を用いて、等温滴定熱量測定実験を実施した。滴定微小熱量計は、断熱閉鎖容器中に保持された試料および基準セルからなっていた。基準セルにＰＢＳを充填した。ＰＢＳ＋２％ＤＭＳＯ中のＨＳＡの２３μＭ溶液を、１．３７ｍＬ試料セル中に入れた。同一緩衝液中の０．８ｍＭの検体を、２５０μＬ注射器中に保持した。２５℃で保持された試料セル中に、コンピューター制御のステッパモーターにより、検体の３０回注入（各々８μＬ、１２秒／１回注入）を行った。注射器撹拌速度は４００ｒｐｍであった。マイクロカル（Microcal）ナノボルトプリアンプに接続された熱電装置により、各注射器により吸着または放出される熱を測定した。結合相互作用に関する滴定等温線は、各注入に関する示差熱流で構成された。ＰＢＳ中への検体の注入により得られる希釈熱は、無視できる程度であった。計器に含まれた反復非線形最小二乗アルゴリズムを用いて、結合等温線を単一結合部位モデル（T. Wiseman et al., Anal. Biochem., 179, 131-137 (1989)）に適合させた。
【００６０】
[実施例Ｉ］
結果および考察
１９Ｆ緩和理論
１９Ｆの縦緩和は、高分子と相互作用する小分子を同定するために必要とされる直接的なτｃ依存性を欠くため、競合結合実験のための良好なパラメーターではない。しかしながら、以下の方程式により示されるように、横緩和率Ｒ２は、それが異核種１９Ｆ−１Ｈ双極子相互作用に関して、ならびに１９Ｆ化学シフト異方性（ＣＳＡ）相互作用に関して、０周波数で算定されるスペクトル密度を含むため（M. Goldman, Quantum Description of High-Resolution NMR in Liquids, Clarendon Press, Oxford, (1988)）、優れたパラメーターである：
【数１】
2005536763.tif 000002
【００６１】
Ｈｉは、基準化合物の、ならびにフッ素原子と空間的に密接するタンパク質の全プロトンに対応し、Δσは１９Ｆ原子のＣＳＡであり、にＢ０は磁場の強度であり、γＨおよびγＦはそれぞれプロトンおよびフッ素磁気回転比であり、ωＨおよびωＦはそれぞれプロトンおよびフッ素ラーモア周波数であり、τｃは相関時間であり、ｒＦＨｉはプロトンＨｉおよびフッ素原子間の核間距離である。
【００６２】
１９Ｆの大きいＣＳＡ（数百ｐｐｍという大きさ）のために（J.T. Gerig, Methods in Enzymol., 177, 3-23 (1989)；およびJ.T. Gerig, Prog. NMR Spectrosc., 26, 293-370 (1994)）、それは結合したリガンド画分の横緩和に有意に寄与する。緩和に対するＣＳＡの寄与は、磁場の平方に正比例する。従って、その影響はより高い磁場でより顕著である。これは図１のシミュレーションにおいて理解でき、ここでは、小分子が溶液中で遊離の状態のとき、および異なるサイズの大型高分子に結合された状態ときの、ＣＳＡの寄与による１９Ｆ線幅の差がラーモア周波数の関数としてプロットされている。溶液中で遊離の状態にある小分子についての１００ｐｐｍのΔσおよび２００ｐｓのτｃを、シミュレーションのために用いた。図１から分かるように、今日利用可能な最強磁場は、ＣＳＡの強い関与のため、強力なタンパク質結合リガンドおよび１９Ｆで選択的に標識されたタンパク質の１９Ｆ実験には最適ではない。これとは対照的に、強い磁場は、弱親和性基準分子を用いて実施される競合結合ＨＴＳ実験に特に適している。遊離状態と結合状態との間での、基準分子の１９Ｆ共鳴線幅の差は磁場の強度に伴って増大する。更に、遊離状態と結合状態との間での、フッ素リガンド共鳴に関する化学シフト差（δfree−δbound）はより大きくなる。これは、交換項Ｒ２，ｅｘ：
【数２】
2005536763.tif 000003
【００６３】
の基準化合物の１９Ｆ線幅への有意な寄与をもたらす（J.W. Peng,. J. Mang. Reson., 153, 32-47 (2001)）。［ＥＬ］／［Ｌｒｏｒ］は結合リガンドの画分であり、そして１／Ｋ−１はタンパク質に結合されたリガンドの滞留時間である。
【００６４】
基準化合物およびスクリーニングパラメーターの選択
ＮＭＲスクリーニング実験は、典型的にはタンパク質より１０〜１００倍余分量のリガンドを用いて行われる（結合リガンドの小画分のみを生じる）ので、先の節における各項（Δσ、Ｂ０、δfree−δbound、１／Ｋ−１等）は、基準化合物の選択において重要になる。タンパク質に結合された基準化合物の１９Ｆシグナルの化学シフトは、タンパク質に誘導されたシフトの寄与のために、遊離のリガンドの化学シフトと比較して非常に異なり得る（J.T. Gerig, Prog. NMR Spectrosc., 26, 293-370 (1994)；およびJ. Feeney et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 8700-8706 (1996)）。従って、μＭ範囲での中程度の結合親和性を有する分子でさえ、一方は結合形態にそして他方は遊離形態に関する２つの別個の共鳴をもった１９Ｆスペクトルを提示することができるであろう。これは、２つの共鳴の化学シフトの差が、遊離状態の種および結合状態の種の間での交換率と比較して大きいという事実から生じる。ＨＴＳにおいては、結合形態の非常にブロードな共鳴の観察を可能にするためにはタンパク質の濃度は低くなる（low）（数百ｎＭから１〜５μＭ）ので、遊離リガンドの周波数でのシグナルのみがモニタリングされる。
【００６５】
競合スクリーニングのための任意の所定のフッ化リガンドの適合性を評価し、そして最適実験パラメーターを決定するために、１Ｄ１９ＦＲ２フィルター実験または単に１Ｄ１９Ｆ実験を取得することにより、結合リガンドの画分の関数として（C. Dalvit et al., J. Am. Chem. Soc., 124, 7702-7709 (2002)）候補分子に関する滴定実験を実施する。より良好な感度を得るために、取得時間中に１Ｈデカップリングを用いて実験を記録する。候補化合物および実験条件を、それらの感度について、また標的との結合時に有意の摂動を示す単一フッ素共鳴の存在について検査する。
【００６６】
適切なリガンドが同定され、実験条件が確立されたら、次に、図２に示すような基準分子の１９Ｆシグナルの横緩和における変化をモニタリングすることにより（ＣＰＭＧまたはスピン−エコースキームを用いて実施されるＲ２濾過実験により、または単に線幅の分析により）、スクリーニングを実行することができる。
【００６７】
この場合、５０μＭの中等度の親和性リガンド化合物Ａ（ＫＤ＝１０μＭ）を、１．５μＭのＰＡＫ４の存在下で基準化合物として用いた。スピン−エコースキーム後の化合物Ａのシグナルにおける有意の増大を、高親和性リガンドを含有する化合物混合物の存在下で観察した（図２ａを２ｂと比較）。シグナルにおけるこの増大は、混合物中に含められた分子との競合に起因して、基準分子化合物Ａの結合が低減したことを示す。簡単な逆重畳実験（２ｃおよび２ｄ）によって、活性分子としての化合物Ｂの同定が可能になる。
【００６８】
スピン−エコー型のシーケンスを用いる場合、方程式（２）の交換項を利用するために、ハード１８０°パルス間の十分に長い遅延を用いることが推奨される。これが可能なのは、同核種スカラーカップリングが存在せず、そして異核種スカラーカップリング下での進化に再び焦点が合わせられるからである。しかしながら、静磁場の不均等性に由来する緩和を回避するために、遅延は非常に長いものであるべきではない。
【００６９】
フッ化基準化合物以外に、受容体（対照化合物）と相互作用しないフッ素化された小分子を含むことは有益である。図３はこの原理を示すが、この場合、タンパク質の非存在下および存在下で、スパイ分子および非相互作用分子の１９Ｆスペクトルを記録する。スパイ分子のシグナルはスペクトル変化を受けるが、一方、小分子のシグナルは変化しない。これは、図３の差スペクトルにおいて理解することができる。非相互作用分子のシグナルは、単一実験を用いて、スパイ分子のシグナルにおける変化を検量する（calibrating）ために用いルことができる内部参照を表す。小分子が受容体との弱い相互作用（ｍＭ範囲）を有する場合でも、これは測定を妨げないことが指摘されるべきである。小分子の濃度（１０〜３０μＭ）は、弱い結合定数と比較して数量的に小さい水準であり、従って受容体に結合された化合物の画分はごくわずかである。これを立証するために、受容体と相互作用しない小分子として、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を選択した。スクリーニングに際して、幾つかの化合物は微量のＴＦＡを含有し得ることに留意すべきである。従って、代替的対照化合物は、ここに示した概念の立証に有効であるが、より一般的用途のためにも選択されるべきである。ＨＴＳおよび逆重畳による先導物同定のために、スパイ分子および対照化合物の両方を用いることの実用性を図４に示す。６化合物の混合物はスパイ分子共鳴の線幅に影響を及ぼさず（図４ｃ）、そして基準化合物である化合物Ａのシグナルは、ＴＦＡのシグナルと比較して明らかに強度が低い。しかしながら、７化合物混合物中の強い競合分子（化合物Ｂ）の存在は、スパイ分子の共鳴の鋭敏化をもたらし（図４ｄ）、そして２つのシグナルはここで匹敵する強度を有する。
【００７０】
C. Dalvit et al., J. Am. Chem. Soc., 124, 7702-7709 (2002)に記載されているように、結合リガンドの画分の関数として、ならびに競合分子の存在下での基準分子のシグナル強度変化の測定値としてプロットされた、２つの１９Ｆ共鳴のシグナル強度比から同定されたＮＭＲ−ヒットの結合定数を得ることが可能である。この特定の場合、ＮＭＲ−ヒット化合物Ｂに関する結合定数を、２００＋／−１００ｎＭであると決定した。１９Ｆ実験がＨＴＳのために用いられる場合、化学的混合物を含む化合物の濃度を概算し、従ってＮＭＲヒットの結合定数に関する信頼できる値を得るためには、１Ｈスペクトルを記録することも重要である。
【００７１】
１Ｈ−１９Ｆ  ＮＯＥステップもまた、プロトンからフッ素スピンに磁化を移動するために、取得時間前に１９Ｆ実験に適用することができる。このステップは、異なる方法で実施できる。１９Ｆシグナルの増強は、大きな受容体と相互作用しない小分子に関して観察される。非常に弱いシグナル増強またはシグナル低減は、結合リガンドの画分、タンパク質相関時間、そしてＮＯＥステップが実施される方法に応じて、受容体と弱く相互作用する分子に関して観察される。異核種ＮＯＥのこれらの差は、競合結合ＨＴＳ実験において建設的に用いることができる。スパイ分子が競合分子の存在下で受容体から置換される場合、その１９Ｆシグナルは、より小さな線幅および異核種ＮＯＥによるシグナル増強のために更に強くなる。
【００７２】
［実施例ＩＩ］
結果および考察
理論
１９Ｆ  ＮＭＲシグナルの感度は、（γＦ／γＨ）３（式中、γＦおよびγＨはそれぞれフッ素およびプロトンの磁気回転比である）に比例する。１９Ｆは唯一の安定なフッ素同位元素であり、スピン１／２を有するという事実のために感度が高く、プロトンの０．８３倍である。フッ素シグナルは、プロトンデカップリングの存在下で一重項共鳴として出現し、従って強い。
【００７３】
１９Ｆ横緩和は、競合結合実験を用いて実施されるスクリーニングのためにモニタリングされる優れたパラメーターを表す。一定距離で位置するフッ素およびプロトン間の双極子相互作用は、同一距離だけ分離された２つのプロトン間の双極子相互作用に大きさが非常に似ている（０．８８倍）。従って、フッ素またはプロトンシグナルの線幅への双極子の基準分子の与は、類似する。フッ素シグナルの横緩和率Ｒ２は、１９Ｆ原子の大きなＣＳＡ相互作用から生じる付加的寄与を有し、そして以下の方程式により示される（D. Canet, Nuclear Magnetic Resonance Concepts and Methods, John Wiley & Sons, Chichester, (1996)）：
【数３】
2005536763.tif 000004
【００７４】
（式中、Δσは１９Ｆ原子のＣＳＡであり、Δσ＝σｚｚ−（σｘｘ＋σｙｙ）／２により示される）。異なるσは、化学シフトテンソルの構成成分である。非対称パラメーターηＣＳＡ＝（３／２）（σｘｘ−σｙｙ）／Δσ、ならびに軸対称化学シフトテンソルηＣＳＡ＝０である。Ｂ０は磁場の強度であり、γＦはフッ素磁気回転比であり、ωＦはフッ素ラーモア周波数であり、そしてτｃは相関時間である。
【００７５】
実験（Ｉ）の第１組において述べたように、軸対称ＣＳＡテンソルを仮定し、図１に示したように、遊離状態および結合状態のリガンドについて等しいＣＳＡを仮定して実施したシミュレーションは、まさに遊離状態および結合状態の間で、ＣＳＡ寄与単独からの基準分子の１９Ｆシグナルの線幅における差が非常に大きいことを示している（C. Dalvit et al., Comb. Chem. HTS, 5, 605-611 (2002)および上記実施例（Ｉ））。この差は、受容体のサイズに伴って、そして磁場強度の二乗に伴って増大する。高磁場は、高分子（例えば１９Ｆで選択的に標識されたタンパク質）または強くタンパク質結合されたリガンドのフッ素シグナルに関する非常にブロードな線幅（＞２００Ｈｚ）をもたらし得る（W.E. Hull et al., J. Mol. Biol., 98, 121-153 (1975); J.T. Gerig, Methods in Enzymol., 177, 3-23 (1989);J.T. Gerig, Prog. NMR Spectrosc., 26, 293-370 (1994)）。このような線幅は、スクリーニングの目的のための、高分子または高親和性リガンドのフッ素共鳴の直接検出を実行不可能にする。これに比して、強磁場は、弱親和性基準分子を用いて実施される競合結合実験に特に適しており、ここでは遊離状態および結合状態の間で平均化する集団が、操作およびモニタリングされ得る観察線幅を生じる（C. Dalvit et al., Comb. Chem. HTS, 5, 605-611 (2002)および上記実施例（Ｉ））。
【００７６】
典型的に用いられるパルスシーケンスは、取得時間の前に、カー−パーセル−マイボーム−ギル（Carr-Purcell-Meibom-Gill）（ＣＰＭＧ）スピン−エコースキームを用いる（H.Y. Carr et al., Phys. Rev., 94, 630-638 (1954)；およびS. Meiboom et al., Rev. Sci. Instrum., 29, 688 (1958)）。スピン−エコースキームＩ（ｎ２τ）の終了時における基準分子のシグナル強度は、以下の方程式により示される（T.C. Farrar et al., Pulse and Fourier Transform NMR, Introduction to Theory and Methods, Academic Press, New York, 1971）：
【数４】
2005536763.tif 000005
【００７７】
（式中、Ｉ０は初期９０°パルス後のシグナル強度であり、２τは１８０°パルス列の間の間隔であり、Ｇは静磁場の不均質性であり、γＦはフッ素の磁気回転比であり、そしてｎはスピン−エコースキームのサイクル数である）。弱親和性基準分子の観察された並進拡散係数Ｄｏｂｓは、以下の方程式により示される：
【数５】
2005536763.tif 000006
【００７８】
（式中、ＤboundおよびＤfreeは、それぞれ結合状態および遊離状態にある基準分子の拡散係数であり、［ＥＬ］／［ＬＴＯＴ］および（１−［ＥＬ］／［ＬＴＯＴ］）はそれぞれ結合状態および遊離状態のリガンドの画分である）。
【００７９】
弱親和性基準分子に関する横緩和率Ｒ２，ｏｂｓは、以下の方程式により示される：
【数６】
2005536763.tif 000007
【００８０】
（式中、Ｒ２，boundおよびＲ２，freeは、それぞれ結合および遊離状態のリガンドに関する横緩和率定数である）。最後の項は交換項であって、この場合、δboundおよびδfreeがそれぞれ結合および遊離状態にある基準分子のフッ素共鳴の等方性化学シフトであり、そして１／Ｋ−１はタンパク質に結合されたリガンドの滞留時間である。方程式（６）は、実験が、長い２τ時間（ここで、τ＞＞１／Ｋ−１）を用いて実施される場合にのみ有効である。τ＜５／Ｋ−１を用いて記録される実験は、観察される横緩和率に対する交換項の寄与低減を生じる（Z. Luz et al., J. Chem. Phys., 39, 366-370 (1963)；およびA. Allerhand et al., H.S. J. Chem. Phys., 41, 2115-2126 (1964)）。
【００８１】
従って、スクリーニングは、長い２τ時間を用いることにより実施する。これが可能なのは、スキームの終了時に、異核種１Ｈ−１９Ｆスカラーカップリング下での進化に再び焦点を合わせられるからである。しかしながら、基準分子の空間的拡散から生じるシグナル減衰（すなわち方程式（４）の一次指数項）を低減するために、２τ時間は非常に長いものであるべきではない。
【００８２】
スパイ分子および対照分子の選択
表１は、３つの異なる市販化学ライブラリーの中の、フッ素原子を含有する分子の周波数を報告する。この表には、これらの実験にしばしば用いられる２つの基礎構造、モノフルオロベンゼンおよびトリフルオロメチルベンゼンの数も含まれている。フッ素原子を含有する分子が多数存在することにより、化学合成に頼らずにスパイ分子および対照分子を選択することは容易な作業になる。
【表１】
2005536763.tif 000008
【００８３】
表１から浮かび上がる興味深い特徴は、ＭＤＤＲライブラリー中に存在する多数のフッ素含有分子である。図５に示したように、このライブラリー内の年代順調査によって、ここ２０年間で、少なくとも１つのフッ素原子を含有する開発中の化合物のパーセンテージが２倍になっていることが実証される。１９８１〜１９８５年の期間の１０．９％から、１９９６〜２０００年の期間の１９．４％へと着実な増大が見られる。フッ素原子は、効力、物理的−化学的特性、および酵素攻撃に対する代謝安定性を改善するための先導的最適化の工程に益々導入されてきている。
【００８４】
これら２つの分子の選択に際しては、それらの可溶性に特別な注意が払われるべきである。フッ素原子の存在は、化合物の親油性を増大する。水性溶液中であまり可溶性でない分子は、それらが非特異的方法で受容体と結合し得るため、スクリーニング実験には適していない。従って、潜在的なスパイ分子および対照分子についてのプロトンおよびフッ素スペクトル、ならびにプロトンＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルは、スクリーニング工程で用いられる濃度よりも典型的には２〜４倍高い濃度（すなわち１００〜２００μＭ）で、タンパク質の非存在下で記録される。ＮＭＲスペクトルに従って、可溶性で且つこれらの濃度で凝集しない分子のみが、スクリーニングに用いられる基準分子および対照分子のための潜在的候補と考えられる。
【００８５】
ＣＦ３基を有する分子
ＣＦ３基を含有する基準分子は、フッ素シグナルの高感度という利点を有する。図６は、異なる濃度のＨＳＡの存在下において取得時間中にプロトンデカップリングを用いて記録された、基準分子、即ち、５−［１−メチル−３（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］−２−チオフェンカルボン酸（１）および対照分子１−［５−（トリフルオロメチル）１，３，４−チアジアゾール−２−イル］ピペラジン（２）の典型的スピン−エコー１９Ｆスペクトルを示している。（２）を用いて実施されたＩＴＣ測定は、ＮＭＲの結果と一致して、ＨＳＡとの結合の如何なる証拠（３０μＭのＨＳＡ中への８００μＭの（２）の８μＬ注入により、希釈の熱のみを検出した）も見出せなかった。両分子について、２５μＭの濃度のみをＮＭＲ実験に用いた。基準分子の低濃度は、非特異的結合および凝集から生じる問題を回避する。これらの分子に伴う欠点は、結合状態であっても観察された基のＣ３軸の回りでのフッ素原子の高速回転によって提示される。これは、遊離状態および結合状態の間で、基準分子のＣＦ３シグナルに関する線幅の限定された差を生じる。
【００８６】
ＣＦ基を有する分子
ＣＦ基を有する分子は、競合リガンドベースのスクリーニング実験に特に適している。１９Ｆ  ＣＳＡは非常に大きく、従って方程式（３）による基準分子の遊離状態および結合状態間の線幅における差を増大することができる。例えば芳香族ＣＦに関するＣＳＡは、モノフルオロベンゼンに関する７１ｐｐｍから、ヘキサフルオロベンゼンに関する１５８ｐｐｍまでの範囲である（H. Raber et al., Chem. Phys., 26, 123-130 (1977)）。更に、結合状態にある基準分子の１９Ｆ  ＣＳＡは、「オルト効果」により、またはタンパク質との水素結合におけるフッ素原子の直接的関与に起因して増大することができる。これら２つの現象は、遊離状態および結合状態についての等方性化学シフトにける差を大きくするという作用をも有する。弱い親和性基準化合物に関しては、方程式（６）の交換項は、タンパク質の存在下での基準化合物の線幅に有意に寄与し得る。フッ素シグナルは、通常は幾つかのプロトンとスカラー結合し、従って感度改善のためには、取得中のプロトンデカップリングを用いてスペクトルを記録する必要がある。図７は、ＨＳＡ濃度の関数としてプロトンデカップリングを用いて記録された基準分子、即ち２−ヒドロキシ−３−フルオロ安息香酸（３）および対照分子（２）に関する典型的スピン−エコーフッ素スペクトルを示す。これらの分子に伴う欠点は、実験に必要とされるより高い濃度である。図７のスペクトルは、５０μＭの基準分子に関する濃度を用いて記録された。
【００８７】
滴定およびスクリーニング実験
基準分子および対照分子の選択後、タンパク質の関数としての滴定実験を図６および図７に示したように記録する。２つのフッ素シグナルの強度比を、図８の実施例に示したように、タンパク質結合基準分子の画分の関数としてプロットする。（C. Dalvit et al., J. Am. Chem. Soc., 124, 7702-7709 (2002)；およびC. Dalvit et al., Comb. Chem. HTS, 5, 645-650 (2002)）に記載されているように、他の技法（例えばＩＴＣまたは蛍光分光分析）から得られる解離結合定数を用いることにより、結合化合物の画分を算定する。これらの技法は、競合結合実験のための非常に重要なパラメーターである基準分子についての結合部位数（ｎ）も提供する。ＩＴＣ測定は、（１）に関しては４に近い、そして（３）に関しては１に近いｎ値を提供する。従って分子（１）は、実験結果の解釈に幾つかの制限を伴うスクリーニング目的のために依然として用いられ得るが、しかしそれはＮＭＲ−ヒット物の結合定数を得るためには用いられ得ない。分子（３）は、これらの実験に用いられる濃度でＨＳＡ上に唯一の結合部位しか存在しないのため、適切な基準分子である。その化学構造（アスピリン類似体）によれば、その推定結合部位はサドロウ（Sadlow）部位Ｉ（サブドメインＩＩＡに位置する）である（T. Peters, Jr., All about Albumin Biochemistry, Genetics, and Medical Applications Academic Press, San Diego, U.S.A 1996）。タンパク質に結合した基準分子（３）の画分に関する２つの異なる値を、実験誤差により決定されるＫＤの２つの限界値を用いて、図８から抽出する。この特定の場合には、（３）に関するＩＴＣ由来ＫＤは４１±３．３μＭであり、従ってＫＤの２つの限界値はそれぞれ３７．７および４４．３μＭに対応する。
【００８８】
ＮＭＲ実験は、基準分子のみの存在下でも記録され得ることが指摘されるべきである（C. Dalvit et al., Comb. Chem. HTS, 5, 605-611 (2002)および上記実施例（Ｉ））。しかしながら、この場合は２つの実験が記録されねばならない：１つはＣＰＭＧシーケンスを有さないもの（すなわち、２ｎτ＝０）、そしてもう１つは、長い２ｎτを有するＣＰＭＧを有するものである。次に、これら２つのスペクトルから抽出されるシグナル強度比を、結合基準分子の画分の関数としてプロットする。
【００８９】
次いで、スクリーニングに必要な実験条件を設定するために図８のグラフを用いる。図９は、基準分子として（３）を用い、ＨＳＡに対して実施されたスクリーニング工程を示す。スクリーニングのために、合計のスピン−エコー時間（２ｎτ）を選択したが、この間、基準分子のシグナルはゼロに近づいている。非結合剤として既知の５−ＣＨ３Ｄ，Ｌ−Ｔｒｐおよびスクロースが混合物中に存在すること（左から３番目のスペクトル）は、スパイ分子のスペクトルを変えない。これとは対照的に、ワルファリン誘導体である４−ヒドロキシ−３−［１−（ｐ−ヨードフェニル）−３−オキソブチル］クマリン（４）が混合物中に存在（右）は、（３）のシグナルの再出現を生じる。これは、図８のグラフによれば、基準化合物がタンパク質から置換されたことから生じる。次に、その置換の程度を用いて、表２に記載したようなＮＭＲ−ヒット物の結合定数を算定することができる（C. Dalvit et al., J. Am. Chem. Soc., 124, 7702-7709 (2002)；およびC. Dalvit et al., Comb. Chem. HTS, 5, 645-650 (2002)）。
【表２】
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【００９０】
結合定数に関する信頼できる値を得るためには、プロトンスペクトルも記録しなければならない。これは、濃度既知の基準分子シグナルの積分を、ＮＭＲ−ヒット物のシグナルの積分と単に比較することにより、ＮＭＲ−ヒット物の濃度を算定するために必要である。（４）についてのＮＭＲ由来のＫＤは、全滴定蛍光測定由来の値と好都合に匹敵する。その最初の適用以来（C. Dalvit et al., J. Am. Chem. Soc., 124, 7702-7709 (2002)；およびC. Dalvit et al., Comb. Chem. HTS, 5, 645-650 (2002)）、結合定数は、数千の化合物に関してこのアプローチを用いて算定されてきた。純粋な競合結合メカニズムおよび単一結合部位に関しては、単一点ＮＭＲ由来結合定数と全滴定蛍光−およびＩＴＣ−由来結合定数との間で優れた一致が観察された。このＮＭＲアプローチは、他のＮＭＲ法を用いては容易に得られない高親和性結合定数の決定も可能にする。
【００９１】
検出限界
弱い結合親和性基準分子についての大きなＣＳＡおよび大きな交換寄与により、スクリーニングに必要なタンパク質の濃度を有意に低減することが可能である。これは図１０において理解され得るが、この場合、わずか１５０μＭの濃度のＨＳＡの存在下において、（３）を用いてスクリーニングを実施する。大きな比［ＬＴＯＴ］／［ＥＴＯＴ］（＝３３０）および小さな比［ＥＬ］／［ＬＴＯＴ］（＝０．００１６５。４１μＭのＫＤを使用）にもかかわらず、結合リガンドの小画分の作用を観察し、そしてこのような低タンパク質濃度でスクリーニングを実施することが可能である。これはおそらくは幸運な場合を表している。固体状態のＮＭＲ研究によれば、フッ素原子に対してオルト位置にあるＯＨ基の存在が、芳香族環に対して垂直な１９Ｆ化学シフトテンソル構成成分における５０ｐｐｍのシフトの原因であり、大きな１９Ｆ  ＣＳＡを生じる（H. Raber et al., Chem. Phys., 26, 123-130 (1977)）。しかしながら、同様の挙動が、他のタンパク質を用いた場合、ならびにパラ−フルオロベンジル部分を含有する基準分子を用いた場合にも観察された（データは示されていない）。従って、交換項は観察された横緩和にも有意に関与すると考えられる。図１０に報告したスペクトルは、１２８回のスキャンおよび１０分間の全測定時間を用いて記録した。１９Ｆ検出について最適化された極低温プローブ技法を使用することにより、検出限界を更に改善することができるであろう。次に、５０〜１００ｎＭという低いタンパク質濃度を用いた。これは、多量に発現され得ないタンパク質（例えば膜タンパク質）に対する、多数の化学的混合物のスクリーニングを可能にする。フッ素スペクトルは、極低温プローブ技法を用いて非常に迅速に記録できる。極低温プローブ技法を用いた２倍の感度改善を控えめに推定すると、取得時間は４倍減少することになる。従って、図１０のスペクトルはちょうど１５０秒で記録され、従ってこのスクリーニング工程の処理量を増強する。凍結プローブを用いて記録されたプロトン検出実験において遭遇する放射減衰の問題は、フッ素検出実験においては、スパイ分子および基準分子が低濃度であるために存在しないことが指摘されるべきである。
【００９２】
プロトン溶媒および界面活性剤の存在下でのスクリーニング
１９Ｆリガンドベースの競合結合実験の特別な利点は、プロトン化溶媒、緩衝液または界面活性剤の存在下でさえ、スクリーニングを実施できることである。図１１に、１００ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１％グリセロールの存在下でのＨＳＡのプロトンスペクトルを示す。緩衝液およびグリセロールの強度のシグナルは、スクリーニングを実施するために必要な基準分子および対照分子の弱いシグナルの観察を遮る。１９Ｆ検出実験では、これらの問題には遭遇しない。従って、これらの困難な実験条件においても、図１１に示したようなスクリーニングを実施することが可能である。これらの特性のため、フッ素リガンドベースの競合結合スクリーニング実験は、ＳＤＳまたはその他の界面活性剤中に溶解された膜タンパク質に対する分子のスクリーニングに特に有益である。いったん適切な基準分子が同定されれば、１９Ｆリガンドベースの競合結合ＮＭＲスクリーニングが信頼できるヒットを提供する。膜および界面活性剤と簡単に結合する、そして異なるアッセイにおける潜在的リガンドとして現れる分子は、ここに記載した１９Ｆ実験においては検出されない。基準分子と競合する分子のみが同定される。最後に、本実験は、植物および真菌抽出物のスクリーニングのために、ならびに生きている細胞内の分子のスクリーニングのためにも用いることができる。
【００９３】
結論
従って、競合結合実験と組合せた１９Ｆ原子を含有する弱い親和性リガンドの使用は、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片に対する大きな化学的混合物の迅速スクリーニングを可能にする。本方法は更に、同定されたＮＭＲ−ヒット物の結合定数の直接的な決定を提供する。
【００９４】
１９Ｆ競合結合ＨＴＳ実験を用いた場合、重複の問題は見られず、そして１９Ｆ核の高感度（１Ｈ感度の０．８３倍）のため、大きな化学ライブラリーまたは天然産物抽出物を迅速にスクリーニングすることが可能である。本実験は更に、高濃度の非重水素化界面活性剤の存在下においてタンパク質溶液に対して実施でき、従って、膜タンパク質を用いたＨＴＳを可能にする。更に、スクリーニングされる実際の分子からの共鳴が利用されないため、スパイおよび対照分子だけが、フッ素化部分を含有することを必要とされる。従ってフッ素ベースの競合スクリーニングは、製薬産業に多数の用途を見出すに違いないし、更に、薬物発見方法に及ぼすＮＭＲベースのスクリーニングの影響を拡大するはずである。
【００９５】
本方法は迅速であり、そして限定量のタンパク質のみを要し、従って高処理量スクリーニングに用いられるその他の確立された非ＮＭＲ技法に好都合に匹敵する。更に、本方法は、ＮＭＲ−ヒット物の結合定数に関する意味のある値を単一実験内で提供する。重複がないことは、コンビナトリアル化学、創薬化学または天然産物抽出から得られる大きな化学的混合物のスクリーニングを可能にする。異なる界面活性剤中に溶解された膜タンパク質に対するスクリーニングも、このアプローチを用いて可能である。最後に、これらの実験は、生きている細胞内にある受容体に対する分子のスクリーニングに拡大できると想定される。
【００９６】
本明細書中に引用された特許、特許文献および出版物の全開示内容は、その各々が個々に本願明細書に一部をとして組み込まれるように、参照により本明細書に援用される。本発明の範囲および精神を逸脱せずに行われる本発明に対する種々の修正および変更は、当業者に明らかであろう。本発明は、本明細書中に記述された例示的実施形態および実施例によって不当に限定されるものでないことが理解されるべきである。このような実施例および実施形態は例として示されたに過ぎず、本発明の範囲は特許請求の範囲のみに限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】溶液中で遊離状態にあるときと大きな高分子と結合した状態にあるときとの、１９Ｆラーモア周波数の関数としての、小分子の１９ＦシグナルのＣＳＡ相互作用による線幅の差。溶液中で遊離の状態にある場合の小分子について、１００ＰＰｍの１９Ｆ  ＣＳＡおよび２００ｐｓの相関時間τｃを有する軸対称性ＣＳＡテンソルを仮定した方程式１の最終項を用いて、このシミュレーションを実施した。異なるサイズの高分子に対応して、高分子に関する異なる相関時間を考察した（曲線で示された値）。垂直破線は、市販の分光計のうちの幾つかを示す。これらの分光計の１Ｈラーモア周波数に対応する値を、垂直線で示す。
【図２】ｐ２１活性化キナーゼの５０μＭの弱親和性リガンド化合物Ａ（ＫＤ＝１０μＭ）を用いて実施されたＮＭＲスクリーニングおよび逆重畳。基準分子は、６員芳香族環に結合されたＣＦ３基を含有する。化学シフトはＴＦＡを基準にしたものである。τ＝０．１ｓを示すスピン−エコースキームを用いずに（左）および用いて（右）、２つのスペクトルを記録した。単独のスパイ分子について１．５μＭのタンパク質の存在下で（ａ）、分子ＳＰＥＣＳ  ＡＢ−３２３／２５０４８４５６（SPECS, Rijswijk, the Netherlandsにより供給される）、エチル２−キノキサリンカルボキシレート、メチルイソキノリン−３−カルボキシレート、７−フェニル−４−プテリジノール、２−アミノ−６−メチルキナゾリン−４−オール、５−メチルベンズイミダゾールおよび化合物Ｂを含有する２０μＭの７化合物混合物の存在下で（ｂ）、化合物Ｂを伴わない前記化学的混合物の存在下で（ｃ）、化合物Ｂのみの存在下で（ｄ）、スペクトルを取得した。タンパク質の非存在下でのＰＢＳ中の基準化合物のスペクトルを、（ｅ）に示す。各実験について、３．１ｓの反復時間で合計１２８回のスキャンを得た。
【図３】ｐ２１活性化キナーゼの弱い親和性リガンド化合物Ａ、および非相互作用性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）分子の存在下で記録された、一次元１９Ｆスペクトル。化学シフトはＴＦＡを基準にしたものである。各実験について、３．１ｓの反復時間で合計１２８のスキャンを得た。化合物ＡおよびＴＦＡの濃度は、それぞれ５０および１５μＭであった。１．５μＭのタンパク質の非存在下（ａ）および存在下（ｂ）で、スペクトルを記録した。（ｃ）におけるスペクトルは、（ａ）および（ｂ）における２つのスペクトルの差に対応する。差スペクトル中に存在する唯一のシグナルは、スパイ分子に由来する。
【図４】ｐ２１活性化キナーゼの弱い親和性リガンド化合物Ａ、および非相互作用性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）分子の存在下で記録された、一次元１９Ｆスペクトルを用いて実施されたＨＴＳおよび逆重畳。化学シフトはＴＦＡを基準とする。（ａ〜ｄ）５０μＭの化合物Ａおよび１５μＭのＴＦＡを用いて実施されたＮＭＲスクリーニングおよび逆重畳。（ａ）タンパク質の非存在下で記録されたスペクトル。（ｂ〜ｄ）１．５μＭのタンパク質の存在下で記録されたスペクトル。（ｂ）混合物の非存在下で記録されたスペクトル、（ｃ）分子ＳＰＥＣＳ  ＡＢ−３２３／２５０４８４５６、エチル２−キノキサリンカルボキシレート、メチルイソキノリン−３−カルボキシレート、７−フェニル−４−プテリジノール、２−アミノ−６−メチルキナゾリン−４−オール、５−メチルベンズイミダゾールを含有する２０μＭの６化合物混合物の存在下で記録されたスペクトル、（ｄ）２０μＭの化合物Ｂの添加を伴う同一の化学的混合物の存在下で記録されたスペクトル。競合分子化合物Ｂの存在は、タンパク質からの基準化合物のほぼ完全な置換を生じ（ｄ）、そしてスペクトルはＰＢＳ中の２つの分子に関するスペクトルと同様である（ａ）。
【図５】ＭＤＤＲライブラリーにおける、Ｆ原子を含有する分子のパーセンテージ。１９８１年から２０００年まで、５年間隔で調査を実施した。各年度間隔についてのパーセンテージをバーの上に示す。
【図６】ＨＳＡ濃度の関数として記録された１９Ｆスピン−エコースペクトル。対照分子（２）のＣＦ３共鳴は＋１５．４６ｐｐｍにあり、またスパイ分子（１）のＣＦ３共鳴は＋１４．６２ｐｐｍにある。４０ｍｓの１８０°パルス間隔（２τ）および３２０ｍｓの合計スピン−エコー時間でスペクトルを得た。各スペクトルについて、反復時間３．５ｓおよびスペクトル幅２５ｐｐｍで合計９６回のスキャンを得た。フーリエ変換前に、１Ｈｚの指数関数でデータを増倍した。２つの分子の濃度は２５μＭであったが、ＨＳＡの濃度は、上部から底部に、０、３００、５００、７００および９００ｎＭであった。シグナル強度比Ｉ（１）／Ｉ（２）は、上部から底部に、０．８６、０．６６、０．３８、０．２１および０．０７である。
【図７】ＨＳＡ濃度の関数として記録された１９Ｆスピン−エコースペクトル。基準分子（３）のＣＦ共鳴は−６４．０６ｐｐｍであり（下方スペクトル）、そして対照分子（２）のＣＦ３共鳴は＋１５．４６ｐｐｍにある（上方スペクトル）。４０ｍｓの１８０°パルス間隔（２τ）および８０ｍｓの合計スピン−エコー時間でスペクトルを得た。反復時間３．５ｓおよびスペクトル幅２５ｐｐｍで、下方スペクトルに関しては合計９６回のスキャンを、そして上方スペクトルに関しては６４回のスキャンを得た。フーリエ変換前に、１Ｈｚの指数関数でデータを増倍した。（３）および（２）の濃度はそれぞれ５０および２５μＭであったが、一方、ＨＳＡに関する濃度は、左から右に、０、１５０、３００、４５０、６００ｎＭであった。プロットスケール強度でのシグナル強度比Ｉ（３）／Ｉ（２）は、左から右に、０．９４、０．６９、０．５３、０．３６および０．２５である。
【図８】結合基準分子の画分（［ＥＬ］／［ＬＴＯＴ］）（ｙ軸）の関数としての、図７の２つの１９Ｆシグナルのシグナル強度比（ｘ軸）のプロット。右の最終点は、タンパク質の非存在下での値に対応する。２つの比（［ＥＬ］／［ＬＴＯＴ］）は、（３）についての、ＩＴＣ由来のＫＤ値の限界値４１±３．３μＭを用いて、先に述べたようにして算定した。丸で示した値は４４．３μＭのＫＤで算定し、四角で示した値は３７．７μＭのＫＤで算定した。曲線は実験点の最良適合度を表す。
【図９】対照分子（２）（上）およびスパイ分子（３）（下）を用いて実施した、１９Ｆ  ＮＭＲスクリーニング。４０ｍｓの１８０°パルス間隔（２τ）および１６０ｍｓの合計スピン−エコー時間で、スペクトルを記録した。反復時間３．５ｓおよびスペクトル幅２５ｐｐｍで合計９６回のスキャンを記録した。フーリエ変換前に、１Ｈｚの指数関数でデータを増倍した。（３）および（２）の濃度はそれぞれ５０および２５μＭであった。左側のスペクトルはタンパク質の非存在下で記録したが、他のスペクトルは全て、６００ｎＭ  ＨＳＡの存在下で記録した。後者は、化学的混合物の非存在下で（左から２番目）、５０μＭの５−ＣＨ３−Ｄ，Ｌ−Ｔｒｐおよびスクロースの存在下で（左から３番目）、ならびに５０μＭの５−ＣＨ３−Ｄ，Ｌ−Ｔｒｐ、スクロースおよび２５μＭの（４）の存在下で（右）記録した。
【図１０】１９Ｆ  ＮＭＲスクリーニングの検出限界。対照分子（２）（上）およびスパイ分子（３）を用いて実施した実験。４０ｍｓの１８０°パルス間隔（２τ）および３２０ｍｓ（上）および１．２ｓ（下）の合計スピン−エコー時間で、スペクトルを記録した。反復時間３．５ｓおよびスペクトル幅２５ｐｐｍで合計６４回（上）および１２８回（下）のスキャンを記録した。フーリエ変換前に、１Ｈｚの指数関数でデータを増倍した。（３）および（２）の濃度はそれぞれ５０および２５μＭであった。左側のスペクトルはタンパク質の非存在下で記録したが、他のスペクトルは全て、１５０ｎＭ  ＨＳＡのみの存在下で記録した。後者は、化学的混合物の非存在下で（左から２番目）、および２５μＭの（４）を含有する混合物の存在下で（右）記録した。
【図１１】非重水素化緩衝液および界面活性剤の存在下で実施した、１９Ｆ  ＮＭＲスクリーニング。（上）１００ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１％グリセロール中の、ならびに５０μＭのスパイ分子（３）および２５μＭの対照分子（２）の存在下での、ＨＳＡの６００ｎＭ溶液のプロトンスペクトル。水抑制後の可視シグナルは、緩衝液およびグリセロールのものだけである。反復時間２．７ｓで合計１２８回のスキャンを記録した（下）。２５μＭの（４）を含有する混合物の非存在下（左から１番目および３番目のスペクトル）および存在下（左から２番目および４番目のスペクトル）において、同一溶液に関して記録された１９Ｆスペクトル。４０ｍｓの１８０°パルス間の間隔（２τ）および１６０ｍｓの合計スピン−エコー時間で、スペクトルを記録した。反復時間３．５ｓおよびスペクトル幅２５ｐｐｍで合計６４回（左）および１２８回（右）のスキャンを記録した。フーリエ変換前に、１Ｈｚの指数関数でデータを増倍した。
【図１２】化合物１〜４の構造。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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2005536763.tif 000023
2005536763.tif 000024