(57)【要約】  組換えタンパク質を変性型から活性型へ再構成する方法において、該組換えタンパク質を変性型及び/又は生物学的に不活性な中間型で含有する供給溶液がクロマトグラフィー分離工程に供され、ここで、該タンパク質は該タンパク質のリフォールディングを促進させる条件下で再構成され、該中間型がリフォールディングした該タンパク質から分離される。該タンパク質の該変性型及び/又は該不活性な中間型がリフォールディングした該タンパク質から連続又は準連続方法で分離され、場合によっては該供給溶液に再利用される。
2005510481.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性な組換えタンパク質をその変性型および／または生物学的に不活性な中間体型として含む供給溶液をクロマトグラフィー分離工程にかけ、前記タンパク質を前記タンパク質のリフォールディングを促進する条件下で再構成し、前記中間体型を前記リフォールディングしたタンパク質から分離することによって前記生物学的に活性な組換えタンパク質を得る方法であって、前記タンパク質の前記変性型および／または不活性中間体型を前記リフォールディングしたタンパク質から連続的または準連続的クロマトグラフィー法によって分離することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
リフォールディングしたタンパク質から分離された中間体型が供給溶液中へ再導入され、それによって少なくとも1回の再構成過程を受ける、請求項１記載の方法。
【請求項３】
分離工程が、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コバレントクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび吸着クロマトグラフィーから選ばれる、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
分離工程が環状クロマトグラフィーの形態で準連続的に操作される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
分離工程が擬似移動層クロマトグラフィーの形態で準連続的に操作される、請求項３記載の方法。
【請求項６】
分離工程がカルーセルクロマトグラフィーの形態で準連続的に操作される、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質生産の分野に関する。
工業的用途、例えば、生物薬剤又はファインケミカルとして用いられるタンパク質は、植物又は動物の組織又は微生物のような天然の供給源から抽出や精製によって得られるか又は組換えDNA技術によって得られる。
組換えタンパク質を生産するために、対象のタンパク質をコードしているcDNAを発現ベクターへ挿入し、その組換えベクターをホスト細胞へ形質転換し、それらを生育させてタンパク質を過剰発現させる。ホスト細胞は、細菌、酵母又は真菌のような微生物、又は動物細胞又は植物細胞より選ぶことができる。
タンパク質の過剰発現は、複雑な現象である。正しいコンホメーションを得るために、既に天然型状態にあるタンパク質はいわゆる“折りたたみヘルパータンパク質”や酵素と会合している。“シャペロン”又は“ミニシャペロン”とも呼ばれる折りたたみヘルパータンパク質は、タンパク質がいろいろな中間体状態を通過した後に未変性コンホメーションを回復するように複雑な方法で相互作用する。中間体状態の一部は、きわめて安定ななことがある。タンパク質の成熟に関係する酵素は、ジスルフィド架橋の迅速な形成(1; 2)、プロリル-ぺプチド結合の異性化(3-6)又はより複雑な修飾、例えば、タンパク質の切断、側鎖修飾又はN末端やC末端の修飾を触媒する。タンパク質が効率良く過剰発現している場合、タンパク質の折りたたみよりも速く新生ぺプチド鎖の生産が起こる。あるタンパク質については、中間状態は凝集体を形成することがある(以後“中間体”型という用語は凝集体形態を包含する)。
概して、凝集体形成は、タンパク質の完全な折りたたみよりずっと速く起こる(7; 8)。
そのような条件が存在する発現系においては、タンパク質はいわゆる“封入体”、“屈折体”とも呼ばれる準結晶形態で細胞内に沈着する。
タンパク質が不溶性封入体の形で存在する場合には、タンパク質分解のような酵素の攻撃から保護され、細胞の生理学を妨害することがない。組換えDNA技術は、例えば、細胞に毒性であるタンパク質の生産については、この異常な方法のタンパク質分泌を利用してきた。
【０００２】
変性型、即ち、生物学的活性のないコンフォメーション状態で蓄積される場合にタンパク質をホスト細胞から得るためには、そのタンパク質を正しく折りたたまれた形で得るために種々の工程を用いなければならない。例えば、封入体を保持する細菌細胞を崩壊させ、封入体を遠心分離により回収し、その後、カオトロピック剤を含有する緩衝液に溶解する。その後、変性タンパク質は未変性コンホメーションの回収を容易にする環境へ移される。タンパク質は未変性状態をとる前に、種々の半安定な中間体を通って遷移する。中間体は会合しやすい露出された疎水性ドメインを有するので、中間体は凝集体を形成する傾向がある。原理的には、通常、リフォールディングは凝集体形成に対する競争と考えることができるが、凝集体形成は二次反応速度論に従うのに対し、一方、タンパク質のリフォールディングは一次反応速度論に従う(8)。
現在用いうる方法においては、タンパク質のリフォールディングはタンパク質をリフォーリディング緩衝液中でバッチ方式又は連続方式で希釈することにより達成される(9-13)。これらの方法では、バッチ方式の希釈により高度に希釈されたタンパク質溶液が生じ、従って大体積処理になり、しばしば工業的方法のネックになっている。
他の方法では、折りたたみ経路はシャペロン及び/又はミニシャペロン、及び/又は折りたたみ経路におけるあるステップを触媒する酵素を添加することによってin vivoでシミュレートされる(2; 14-18)。リフォールディング反応を改善するために、一連のタンクを含む複雑なリフォールディングリアクタ系が設計されている(19)。
他の方法では、ヘルパータンパク質と酵素が固相に固定化される。その後、タンパク質溶液を固定化ヘルパータンパク質及び/又はヘルパー酵素を含むいわゆる充填床上に通過させる、これにより未変性コンホメーションへ折りたたまれる(20-23)。折りたたみヘルパータンパク質と酵素は化学量論比で存在しなければならないので、このプロセスにはほとんど同量のヘルパータンパク質が最後に得られる産物として必要であり、このヘルパータンパク質も組換えDNA技術によって生産されなければならない。更に、折りたたみを改善するために、ヘルパータンパク質は、通常、注目するタンパク質に融合され、融合タンパク質の処理が更に必要である。これらの理由から、このストラテジーは非常にコストがかかる。
【０００３】
ある種のタンパク質画分は凝集体の形で失われるので、タンパク質の遊離溶液又はマトリクッス支援処理におけるタンパク質のリフォールディングは変性タンパク質を折りたたまれた形へ定量的方法で移行させるのにほとんど有効でない。
タンパク質は、未変性コンホメーションへの変化を助ける環境へ移すことにより変性コンホメーションから正しく折りたたまれたコンホメーションへリフォールディングし得る。この再配置中、タンパク質はいくつかの中間コンフォメーション状態を通過し、凝集体を形成しやすい。個々のタンパク質や環境条件によっては、凝集体は沈殿することがある。凝集体が可溶性であるか沈殿するかに関係なく、この過程によって正しく折りたたまれたタンパク質の収量が劇的に減少する。一般に、タンパク質の未変性コンホメーションへの折りたたみは一次反応速度論に従い、中間体からの凝集体形成は二次又は高次反応速度論に従う。
本発明の目的は、現在用いられている方法の欠点を克服するとともにヘルパータンパク質を用いずに操作し得る、変性状態からタンパク質をリフォールディングする効率の良い方法を提供することであった。
本発明の背景にある課題の解決法は、クロマトグラフィー分離工程を、これを連続的に行うことにより改善することができるという考えに基づくものである。更に、タンパク質の中間体型の再利用は、組換えタンパク質の収量を改善すること、および高タンパク質濃度で処理することにより工程体積を著しく減少させることの双方を可能することができるという仮説を立てた。
本発明は、タンパク質を変性状態から活性形態へ再構成することにより生物学的に活性な組換えタンパク質を得る方法であって、注目する該組換えタンパク質を変性型及び/又は生物学的に不活性な中間体型として含有する供給溶液がクロマトグラフィー分離工程に供され、ここで、該タンパク質が該タンパク質のリフォールディングを促進させる条件下で再構成され、該中間体型がリフォールディングした該タンパク質から分離される前記方法であって、該変性型及び/又は該不活性な中間体型がリフォールディングした最終該タンパク質から連続型又は準連続型クロマトグラフィー法で分離されることを特徴とする、前記方法に関する。
【０００４】
本発明の意味において“変性型”という用語は、組換え生産工程の産物として得られるような、通常は封入体を溶解した後に得られるような、発現された注目するタンパク質の生物学的に不活性な形態を表すものである。
本発明の意味において“中間体型”又は“中間体”という用語は、タンパク質がその変性型と再構成(リフォールディング)した未変性かつ生物学的に活性な状態との間で通過する形態を表すものである。生物学的に不活性であるか又は未変性タンパク質より生物学的活性が低い中間体は、凝集体形態のこともある。(中間体型との関連において“不活性”という用語は、タンパク質の生物学的に完全に活性な形態と比べて活性が低いタンパク質形態を包含している。)
好適実施態様においては、リフォールディングタンパク質から分離した中間体型を供給溶液へ再導入(再利用)するので、更に少なくとも1回再構成工程が行われる。本発明の方法によって分離した場合、中間体は変性タンパク質の一部をなお含むことがある。
クロマトグラフィー媒体、通常はゲルが、適切に機能するように保つためには、再生されなければならない。このことは、充填床に加えられる再生溶液によって達成される。クロマトグラフィー媒体の化学的性質によっては、この溶液は強アルカリ溶液又は強酸性溶液、又はカオトロピック緩衝液、又は有機溶媒、例えば、エタノール、又は有機溶媒を添加した水性緩衝液、又はイオン性又は非イオン性界面活性剤を含む水性緩衝液であってもよい。再生溶液(再生液)は、不可逆的に結合したタンパク質画分をクロマトグラフィー媒体から除去することができなければならない。再生液は供給溶液自体であってもよく、供給溶液と異なっていて供給溶液と別個にクロマトグラフィー媒体に加えてもよい。
クロマトグラフィー工程を出る再生液が有意量(≧10%)の中間体を含む場合には、好適実施態様においては、この再生液は単独で又は中間体を含む溶出液と合わせることによりこの工程に再利用される。
【０００５】
特に好ましい実施態様においては、中間体型を含む溶出液及び/又は再生液は出発供給溶液へ再導入される前に濃縮及び/又はダイアフィルトレーションされ得る。それによって、リフォールディング工程の収量と生産性が更に改善される。濃縮は、慣用的手段、例えば、限外ろ過(可溶性中間体の場合)又はミクロフィルトレーション (不溶性中間体/凝集体の場合)によって達成させることができる。
タンパク質に言及している下記においては、“リフォールディング”という用語は“変性型から活性型へ再構成すること”に用いられる。
(出発)供給溶液は、注目する異種タンパク質をコードしている発現ベクターをもつ細菌、酵母、真菌、植物又は動物の細胞の発酵から得られた溶液である。
本発明においては、供給溶液は慣用の微生物学的発酵から通常得られるものである。供給溶液は、封入体から得られるように組換えタンパク質を可溶化形態で含んでいる。
供給溶液は、緩衝物質のほかに、再利用凝集体の解離を促進させる成分、例えば、尿素、塩化グアニジニウム(GuHCl)、ナトリウム及び/又はカリウムチオイソシアネートのようなカオトロピック剤、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、モノチオグリセロールのような還元剤を含んでいる。典型的な組成物や条件は当該技術において既知であり、文献において詳しく記載されている(11; 12; 58)。サイズ排除クロマトグラフィーの場合、変性剤及び/又は還元剤を含む供給溶液は、同時に再生溶液として働く。
一定の供給溶液から開始するならば、当業者は本発明のクロマトグラフィー工程中にリフォールディング、即ち、適切なリフォールディング環境を促進させる条件を与えるように用いるべき規準に明るい。まず、タンパク質のリフォールディングを促進させる条件を得るために、供給溶液に含まれる封入体の可溶化やタンパク質の変性に必要とされるカオトロピック剤及び/又は還元剤は、完全に又はタンパク質によって許容される程度まで除去されなければならない。本発明においては、このことは、pH、導電性、温度の点で最適リフォールディング環境が得られるように、クロマトグラフィー工程中に上記薬剤を適切なリフォールディング緩衝液、例えば、トリス又はリン酸緩衝液で洗い流すことにより達成される(11, 12, 58)。
【０００６】
供給溶液は、クロマトグラフィーリフォールディング工程を行なう前にタンパク質の部分的リフォールディングを達成するために希釈されてもよい。
リフォールディングに最適な条件を確実にするために、リフォールディング緩衝液に、最適酸化還元電位を与え、それによりジスルフィド架橋の正しい形成を促進させる物質、例えば、酸化および還元型グルタチオン又はシスチン/システイン、及び/又は凝集を防止する物質、例えば、L-アルギニン、尿素を添加してもよい(11, 12, 58)。
正しく折りたたまれたタンパク質からの中間体の分離は、タンパク質の分離に有効とわかっているどのような連続型又は準連続型クロマトグラフィー法でも達成することができる。
タンパク質分離に通常用いられる多くの標準クロマトグラフィー法は文献から既知であり、ほとんどが市販の装置、例えば、クロマトグラフィーカラムに適用できる。分離の原理に依存して、それらの方法はイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コバレントクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又は吸着クロマトグラフィーに区分される。
原則として、これらのクロマトグラフィー法は、バッチ方式、準連続又は連続方式の操作で行なわれ得る。バッチ方式の操作では、供給溶液をクロマトグラフィー支持体、例えば、充填床又は拡張床に充填し、固定相に対する親和性によって、タンパク質が強く保持されるか又はカラムを通過する。タンパク質が強く保持される場合には、非結合物質が洗い流された後に実験条件を変えることにより脱着し得る。
バッチ工程は、いくつかのカラムを連続方法で使用するか又は“カルーセルクロマトグラフィー”と呼ばれる連続操作を可能にするバルブのマニホールドにカラムを設置することにより準連続方式に移すことができる。
準連続方式又は連続方式で行なうことができるならばいずれのクロマトグラフィータンパク質分離法も本発明に使用し得る。当業者は、これらの方法に明るく、ある分離が要求されるものに最も適切なものを選択し得る。
【０００７】
環状クロマトグラフィー(AC)、カルーセルクロマトグラフィー、疑似移動床(SMB)クロマトグラフィー、真移動床(TMB)クロマトグラフィーは、連続又は準連続方法で操作される最も広く用いられるクロマトグラフィー分離システムである。ACがSMBやTMBより有利な点は、勾配溶離の適用や多成分混合物の分離にある(24)。
好適実施態様においては、本発明の方法は環状クロマトグラフィーである。この方法は、小分子から生体ポリマーの分離種々の問題に対して示唆されている(25-51)。Martin (59)によって提唱され、Fox et al.(52-54)によって提唱された環状クロマトグラフの最初の概念は、ある圧力下でシステムを操作するようにOak Ridge National Laboratoryで更に発展された(25; 38; 49)。加圧連続型環状クロマトグラフ(P-CAC)は、閉鎖系として設計された。2つの同心円柱が環を形成し、それにクロマトグラフィー媒体が充填される。供給原料と溶離液(本発明の方法ではリフォールディング緩衝液である)を床の上方に連続様式で導入する。床全体がゆっくりと回転するが、供給溶液は静止した入口から導入され、溶離液は環の周りのいたる所に存在する。供給溶液の単一成分への分離は、吸着剤の回転によって起こる。分離した成分は、らせん状バンドとして現れ、それぞれが特徴的な静止した出口点を有する。3つの要素：(a)溶離液速度、(b)環の回転速度、(c)分配係数が出口点に影響する。
どのような環状クロマトグラフィー法および装置も本発明に使用し得る。本発明に用いるのに適した環状クロマトグラフの例は、文献(前項を参照のこと)および次の特許出願: WO 98/45699号、同第99/28740号、同第01/388866号、EP 1 134 581号に記載されている。装置は、市販で、例えば、Prior、Goetzis、オーストリアから入手し得る。
本発明の方法において環状クロマトグラフィーを用いる場合、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コバレントクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又は吸着クロマトグラフィーに従って分離を可能にする特別なクロマトグラフィー媒体を環に充填する。クロマトグラフィー原理の選択は、タンパク質の構造、タンパク質の濃度、不純物の量と種類、全体のプロセスフロースキーム、具体的なタンパク質リガンドの利用可能性に左右される(最後の場合、通常の選択法はアフィニティクロマトグラフィーである)。
【０００８】
変性タンパク質(及び場合によっては自然に形成された中間体と凝集体)を含む供給溶液をクロマトグラフィー媒体が充填されている回転中の環に連続して供給する。媒体、通常ゲルは、タンパク質のリフォールディングを促進させる緩衝液(上記リフォールディング緩衝液)で潅流させる。タンパク質がカラムを通過するとともに、リフォールディング工程が行なわれる。中間体の物理化学的性質(例えば、分子サイズ、疎水性、接近可能な荷電した疎水性基、溶解度等)に基づき、未変性リフォールディングタンパク質および中間体は別個に保持される。異なる保持特性によれば、タンパク質の種々の状態、即ち、中間体と生物学的に活性なタンパク質はそれぞれ環の異なる出口点で溶離する。好適実施態様においては、中間体を含む出口流は、おそらく可溶性又は懸濁凝集体の形で集められ、供給溶液に再循環される。中間体/凝集体の量を増加させるために、適切な濃縮装置、例えば、接線流限外ろ過ユニットによって濃縮し得る。場合によって濃縮した再循環中間体/凝集体は、その後、供給溶液の成分になり、更に少なくとも1回リフォールディング工程を受ける。
環状クロマトグラフィーを用いる代替的実施態様においては、変性タンパク質を吸着し、リフォールディング緩衝液の存在下に起こる吸着工程中で完全に又は部分的にリフォールディングする。続いての脱着の条件は、リフォールディングに好都合なものでなければならない。即ち、この条件は、一方では、吸着中に既にリフォールディングしたタンパク質が未変性コンホメーションを維持し、もう一方では、残存するタンパク質のリフォールディングが促進されることを確実にしなければならない。リフォールディングされなかったタンパク質画分は、吸着及び/又は脱着工程中にリフォールディングタンパク質から分離することができ、好適実施態様においては、供給溶液に添加することにより再利用される。
【０００９】
環状クロマトグラフィー法によって、変性タンパク質が正しく折りたたまれた変性状態に化学量論変換される。他の利点は、プロセス体積の縮小と連続工程を維持する可能性である。クロマトグラフィーゲルが適切に機能し続けるように、ゲルを再生しなければならない。再生溶液と供給溶液との混合を避けるために、再生溶液は供給入口位置から十分に離れた位置の充填床に加えられる。再生溶液の組成は、上述したクロマトグラフィーゲルの化学的性質に左右される。再生溶液は、中間体および未変性リフォールディングタンパク質を含む溶出液と異なる位置で溶出する。有意濃度のタンパク質を含む場合には、再生液を再利用することができる。このことは、再生液を出発供給溶液自体へ再導入することにより又は中間体を含む溶出液と合わせることにより行なうことができる。
他の好適実施態様においては、本発明の方法に用いられるクロマトグラフィー法は疑似移動床(SMB)法であり、SMB法は60年代初めにUniversal Oil Product社によって最初に開発された(55; 56)。この方法は主に工業的規模の分離、例えば、キシレンの分離又はフルクトースやグルコースの分離に適用された。適切な吸着剤と溶出液の系を用いることにより、供給流は二成分混合物又は擬二成分混合物(異なる物理化学的性質に基づき2つの画分に分けることができる2種以上の化合物の混合物)を含む2つの回収流(withdrawal stream)へ分離される。SMB工程は、大きなカラムを“ゾーン”とも呼ばれる一定数の小部分に分け、その間に回収管が位置している。これらの管は、特別に設計された回転バルブを介して循環様式で入口と出口で接続されている。決められた時点で回転バルブのスイッチを切り換えることにより固相と流体相の向流がシミュレートされる。SMBはTMBに等価であることがHidajat et al. 1986 (57)によって示されている。SMB適用については、1つの大きなカラムを用いることができ、その大きなカラムは多くの小さなカラムで置き換えることができる。ノードと呼ばれる供給溶液、溶離緩衝液、抽出液、ラフィネートの入口又は出口があり、これらによりカラムの配置は4つのゾーンに分けられる。特殊バルブは、一方向にのみ液体を流すことができる。入口と出口は予め決められた方法で配置される。これらのノードは液体が流れるのと同じ向きにスイッチが切り換えられ、又は、カラムは決められた時間間隔でこの向きと逆にスイッチが切り換えられる。結果として、固相と流体相の向流が生じる。
【００１０】
SMB態様においては、本発明の方法は準連続方式で操作され、好ましくは次のように行なわれる。
時間t0で変性タンパク質(及び場合によっては中間体)を含む供給溶液をゾーンIIとIIIの間に連続して注入する。ゾーンは真移動床と同じように規定される。ゾーンIに液体が導入され、ゾーンIとIIの間に抽出液が集められ、ゾーンIIとIIIの間に供給溶液が導入され、ゾーンIIIとIVの間にラフィネートが集められる。これにより、成分A (凝集体)は最少吸着性画分として定義され、成分B (中間体および混入している追加タンパク質を含むリフォールディングタンパク質)は強く保持された成分として定義される。供給溶液は溶出液(リフォールディング緩衝液)によってゾーンIIIへ押し入れられる。成分A (最少吸着性)は、成分B (強い吸着又は保持)より速く移動する。成分AがゾーンIVに達する前に、タンパク質溶液の一部がラフィネート出口によって回収される。残りの部分はゾーンIVへ運搬される。成分Bの先端がファフィネート出口に達する直前に、ラフィネートの混入を避けるために入口と出口のスイッチを次の位置に切り換えなければならない。スイッチの切り換えは液体フローと同じ向きでなければならず、カラムは静止したままである。ゾーンIIの飽和カラムは新しい溶離剤によって洗浄される。ゾーンIIから流れ出る混合液は、供給溶液と混合され、ゾーンIIIへ運搬される。この部分で、成分Aが成分Bで置き換えられる。速く移動する成分Aは、再びラフィネート出口に達する。成分Bがラフィネート出口点で出てくる前に、第3状態へスイッチが切り換えられる。SMB又はTMBの最も簡単な構成と仮定すると、第4スイッチの切り換え後に全サイクルが完了する。
カラムが360°回転することは明らかである。数回の全サイクル後にシステムの循環的定常状態が達成される。抽出液およびラフィネート出口で、成分AとBの脱着先端と流出先端を集めることができる。中間体(成分B)は供給溶液に連続して再循環される。
連続操作方式においては、溶出液流のタンパク質濃度は、例えば、ある出口での環状クロマトグラフィーでは経時一定である。対照的に、準連続方式においては、例えば、個別的ゾーンにのためにSMBでは経時循環的に変化する。
【００１１】
その極端な形においては、連続分離工程が無制限の分離部分に分けられる。
クロマトグラフィー工程中のリフォールディング環境に関して、多くの工業的に有用なタンパク質の場合、リフォールディングを促進させるパラメータを定義する指標は文献的に入手できる(11; 12; 58)。注目する新規なタンパク質の場合、特定のタンパク質によっては発酵工程から供給溶液を与え、小規模バッチ方式で希釈実験を行なうことにより一連の実験においてリフォールディングパラメータを求めることができ、最適化することができる。これらの実験は、上記要素、例えば、pH、酸化還元電位等に関してリフォールディング緩衝液を変えることにより行なうことができる。得られた条件はクロマトグラフィーカラムに移される。種々のタンパク質形態、即ち、リフォールディングした中間体と凝集体の形態に対する溶離位置が求められる。その後、これらの値に基づいて適切なクロマトグラフィー工程が設計される。
リフォールディング緩衝液の組成と同様に、その他のクロマトグラフィー工程パラメータ、例えば、供給流量、溶出液流量、供給濃度、カラム長とカラム径、温度等を求めることができ、個々のタンパク質に依存して最適化することができる。分離の必要条件は、凝集体、中間体、タンパク質のリフォールディング型に対する選択性が異なることである。凝集体と中間体は、少なくともサイズ、疎水性、電荷において未変性分子と異なる。
中間体を含む溶出液が再利用される本発明の好適実施態様については、再循環（再利用）割合はクロマトグラフィー分離の態様によって調整される。イオン交換クロマトグラフィーや吸着クロマトグラフィーのような吸着分離法については、再利用凝集体を含む溶液でいかなる程度までも供給溶液を希釈し得る。再循環（再利用）割合は中間体/凝集体を含む溶出液流に依存する。サイズ排除法においては、再循環供給体積は重要ではない。これらの方法において、分離は溶出液の供給容量と流量によって強く影響されるからである。これらの方法においては、供給溶液の量が決して全カラム体積の1/3を超えてはならないことを注意する必要がある。重要な分離課題の場合、この量は非常に少量である。従って、溶離した中間体/凝集体を集めた後に濃縮工程を挿入しなければならない。このことは、慣用の限外ろ過システムによって達成し得る。
【００１２】
他の好適実施態様においては、本発明の方法はカルーセルクロマトグラフィーである。適切な装置は、例えば、SepTor Technologies BV、ユトレヒトから市販されている。Septorは、カルーセル型準連続システムである。プロセスサイクルのすべての工程を通ってクロマトグラフィーカラムを運搬するために、ゆっくりと回転するカルーセルに取り付けられる。カルーセルは、典型的には時計回りで回転し、慣用のクロマトグラフィー工程に適用されるすべての工程段階(平衡、供給溶液の装填、洗浄、溶離、リフォールディング)を含んでいる。カラムがプロセスサイクルのすべての異なる部分に沿って移動するように、カラムをマルチポートインデックスバルブに接続する。中間体/凝集体を含む溶出液流は、供給流に再利用されることが好ましい。再利用する前に、溶出液は濃縮されることが好ましい。
図10はカルーセルクロマトグラフィーの典型的なスキームを示す図である。
まとめると、本発明の方法は次の利点を有する:供給溶液中の高タンパク質濃度を可能にし、リフォールディング収量の点で非常に効率が良く、リフォールディングタンパク質の中間体からの分離が可能であり、シャペロンを用いずに操作し得る。(しかしながら、本発明の方法はシャペロンの使用を除外するものではない。シャペンロンはクロマトグラフィーカラムに固定化されてもよく、従って触媒リフォールディングリアクタとして作動させてもよく、リフォールディング緩衝液の成分として加えてもよい。) 
本発明の方法は、実験的規模から工業的規模まで作動させることができる。本発明の方法に用いられるクロマトグラフィー装置は、市販され、サイズと性能の点で、ユーザーニーズに従って製造業者から供給され得る。組換えタンパク質の場合、必要とされる容量は通常は数mgからkg量までの範囲にある。
【００１３】
実施例 1  ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによるマトリックス支援リフォールディングによるα-ラクトアルブミンの連続リフォールディング
a) 工程を連続方式に移す前に、AP biotech製(ウプサラ、スウェーデン)Superdex 75 PrepGradeカラムを用いて慣用の充填床によりリフォールディングを試験した。α-ラクトアルブミンを6 M GuHClと20mMジチオトレイトールを添加した50mMトリス緩衝液, pH 8.5に溶解した。これらの条件はタンパク質の完全な変性とジスルフィド架橋の遊離スルフヒドリル基への分解を誘導する。タンパク質濃度は3.7 mg/mlであった。内径1.6 cm×高さ37 cmのSuperdex 75 PrepGradeカラムを充填し、カラムを50mM トリス緩衝液2mMシステイン、2mMシステイン、10mM CaCl2で流量30 cm/hにて平衡にした後に1mlの供給原料(還元α-ラクトアルブミン)を注入した。カラムを通過させつつ、リフォールディングタンパク質を凝集体から分離した(図1)。カラム流出液は280 nmにおいて連続してモニタした。未変性タンパク質と凝集体を分析用サイズ排除クロマトグラフィーとRP-HPLCで分析した。リフォールディング収率は約26％であった。0.25M L-アルギニンをリフォールディング緩衝液に添加すると収率が40%に上がった。
【００１４】
b) 連続リフォールディング実験について、同じタンパク質溶液と緩衝液を用いた。Superdex 75 PrepGradeクロマトグラフィー媒体を環状クロマトグラフィーシステム、Prior Separation Technology製(Goetzis、オーストリア)PCACに充填した。PCACは、固定相が充填される環を形成する2つの同心円柱からなる。円柱の外径は15 cmで内径が14 cmであり、環の幅は0.5 cmになる。円柱外側の上の部分はガラス製であり、下の部分はポリプロピレン製である。円柱内側はポリプロピレンでできており、外側より短く、上にヘッドスペースが残る。円柱は共にPEEK (ポリエーテルエーテルケトン)のヘッドで閉鎖され、それを通して溶出液と供給流が挿入される。先端がガラスビーズ層の中にある固定した供給ノズルを通してゲル床の上に供給流をポンプで送った。ユニットの底で、2つの円柱がナイロンフィルタ(孔サイズ11μm)で被覆された90個の出口穴を含むステンレス鋼プレートに結合している。回転カラムの底は、Tygonチュービング(Norton Performance Plastic Corporation、アクロン、オハイオ州、米国)の短い部分に接続された90個の出口ポートを含む固定したテフロンスリップリングに接続されている。出口ポートは環に沿って4°間隔で一様に分布している。カラムを41cmの高さまでSuperdex 75 PrepGradeで充填した。ガラスビーズ床は2.6 cmの高さであった。
【００１５】
凝集体を供給溶液に再循環するためのポンプを更に系に取り付けた。バッチ方式分離の連続方式分離への移行は、溶離時間(t)と角速度(ω)の角変位(θ)への変換によって行なわれる。
θ = ω*t
この計算から、種々の分離成分の出口点を求めることができる。
次に、リフォールディング工程を連続して行なった。250°/hの回転速度を加え、溶出液流量は30 cm/hとした。0.31 ml/minの供給流量を加えた。サイズ排除クロマトグラフィーによるラクトアルブミンの連続リフォールディング後に得られたクロマトグラムを図2に示す。
分離が定常状態に達した後、凝集体を含む画分の収集を開始した。50 mlが集まったときに連続濃縮を始めた。試料を抜き取り、凝集タンパク質と未変性タンパク質の量を求めた。
凝集体が溶離するポートの溶出液を連続して集め、Biomax 5K膜を含むMillipore接線流ろ過システムを用いた接線流ろ過によって濃縮した。濃縮は約1 mg/mlに調整した。環状クロマトグラフィーによる連続リフォールディングの実験構成と凝集体再循環の概略図を図3に示す。
1は還元ラクトアルブミンを分配する供給ポンプであり、2は接線流ろ過によって濃縮した後に新しい供給原料と再循環供給原料とをブレンドするミキサである。3は再循環凝集体の還元を完了させる反応ループであり、4は環状クロマトグラフィーシステムの溶出液ポンプであり、5は環状クロマトグラフィーシステムであり、6は簡単なガラスびんからなる捕集装置であり、7は接線流ろ過装置であり、8は濃縮凝集体の捕集用容器であり、9は再循環ポンプであり、10はリフォールディングタンパク質の捕集用容器である。
系が平衡に達した後、3.7 mg/mlのタンパク質濃度のリフォールディング効率は再循環しない場合の26%から再循環した場合の> 80%に上がった。
【００１６】
実施例 ２  環状クロマトグラフィーシステムPCACとエストラジオールセファロースによるヒトαフェトプロテイン(rHuAFP)の連続リフォールディング
ヒトα-フェトプロテインをBoismenu et al.(60)に記載されているように大腸菌で発現させた。細胞を10×5リットルの振盪フラスコで増殖させ、バケット遠心分離機で収集した。浮遊細胞を高圧ホモジナイザーにより500バールで崩壊させた。ホモジネートを10.000gで遠心分離により清澄化し、封入体を含む沈降物を過度に撹拌することにより6M尿素に溶解した。この溶液を希釈により部分的にリフォールディングした。この部分的にリフォールディングした溶液をエストラジオールセファロースによる連続吸着/脱着で更に処理した。エストラジオールセファロースをFeng et al.(61)に記載されるように調製し、環状クロマトグラフへ充填した。実施例1と同じ環状クロマトグラフを用いた。リフォールディングrHuAFPはエストラジオールセファロースに結合し、濃縮形態で溶離することができたが、非リフォールディング部分はフロースルーに見られ、供給溶液に再利用した。供給原料の過度の希釈を避けるために、再利用溶液を接線流ろ過によって濃縮し、供給溶液におけるカオトロピック活性を補足するために尿素を添加した。
【００１７】
実施例 ３  疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)吸着剤によるα-ラクトアルブミンの連続リフォールディング
ウシα-ラクトアルブミンを50 mMトリス/HCl、10 mM CaCl2、pH 7.0に溶解し、6M GuHClと250mMβ-メルカプトエタノールで変性した。これは、5 mg/mlの濃度で室温において行なった。リフォールディングはHIC吸着剤で行なった。一例としてBioRad製(Hercules、カリフォルニア州、米国)のMacroprep Methylを選定した。変性ラクトアルブミンを装荷する前に、カラムを1.5 M硫酸アンモニウムで平衡にした。硫酸アンモニウムを50mMトリス/HCl、10mM CaCl2、2mMシステイン/シスチン緩衝液pH 7.0に溶解した。変性タンパク質溶液に固体の硫酸アンモニウムを添加して最終濃度1.5 Mにした。次に硫酸アンモニウムを添加した2.5 mlの変性タンパク質溶液を14cm×内径1.0 cmのメチルセファロースカラムに100 cm/hの直線速度でローディングした。カラム流出液を280 nmでモニタした。タンパク質の25分間の滞留時間はリフォールディングタンパク質を50 mMトリス/HCl、10mM CaCl2、2mMシステイン/シスチン緩衝液pH 7.0で溶離するのに十分であった。カラムを水に溶解した20%エタノールで再生した。このピークは、残存している折りたたまれていない状態のα-ラクトアルブミンを含有していた。
逆相HPLC (Vydac C4, 214TP54)でリフォールディングを調べた。十分に変性したα-LAを酸化的折りたたみ中間体と未変性タンパク質から0.1% TFAを含む37%〜45%のアセトニトリル/水の直線勾配溶離で15分間、1 ml/min、30℃で分離した。
すべての実験をAgilent LC 1100システムで行なった。HICによるマトリックス支援リフォールディング後のリフォールディングタンパク質を含む画分の逆相HPLCクロマトグラムを図4Aに示す。未変性α-ラクトアルブミンと変性/還元α-ラクトアルブミンのRP-HPLCクロマトグラムをそれぞれ図4Bと図4Cに示す。
これらのリフォールディング条件を連続型環状クロマトグラフィーに移した。Macroprep Methyl媒体を Prior Separations Technologies製(Goetzis、オーストリア)の環状クロマトグラフへ充填した。システムは実施例1に記載されている。カラムの高さ14 cmを選定し、環の幅は0.5 cmであった。0-12°の位置で、変性α-ラクトアルブミンを導入した。200°の位置で、ラクトアルブミンを50 mMトリス/HCl、10mM CaCl2、2mMシステイン/シスチン緩衝液pH 7.0で溶離し、300°の位置でカラムをH2Oに溶解した20 %エタノールで再生した。再生液をBiomax 5フィルタを用いてMilliporeシステムにより連続して限外-ダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション緩衝液として50 mMトリス/HCl、10mM CaCl2、pH 7.0/6 M GuHCl、250 mMβ-メルカプトエタノール、1.5 M硫酸アンモニウムを用いた。限外-ダイアフィルトレーションした溶液を供給原料に再循環し、定常状態条件が達成されるまで連続リフォールディングを行なった。
【００１８】
実施例 ４  未変性組換えヒトα-フェトプロテイン(rHuAFP)、折りたたみ中間体、凝集体の連続リフォールディングと分離
rHuAFPは、16個のジスルフィド架橋を有する複雑なタンパク質である。これは封入体としてE.coli中で生産される。
a) 工程を組合せ連続方式に移す前に、rHuAFPのリフォールディングおよび捕捉工程をAP biotech製(ウプサラ、スウェーデン)のSephacryl 200HRとQ-Sepharose XLで充填した慣用のクロマトグラフィーカラムにより試験した。
rHuAFPを含む封入体を実施例1に記載されるように分離し、50mMトリス-HCl、pH 8.5、6M GuHCl、100mM DTTに溶解した。rHuAFPの最終濃度は約0.5 mg/mlであり、ホスト細胞からのタンパク質不純物を含む全タンパク質濃度は約5mg/mlであった。
タンパク質のリフォールディングは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いたマトリックス支援リフォールディングにより行なった。カラムをPBS (pH 7.4)で11 cm/hの直線速度において平衡化した。1 mlの供給溶液をSephacryl 200HRで充填した内径2.6 cm×長さ26 cmのカラムに装荷した。カラムを通過するときに、カオトロピック成分と還元成分がrHuAFPから分離され、タンパク質がリフォールディングし始めた(Sephacryl 200HRによるrHuAFPのマトリックス支援リフォールディングを示す図5を参照のこと)。
リフォールディング後、タンパク質のわずか20%が未変性コンホメーションであり、残りのタンパク質は非天然ジスルフィド架橋と不可逆凝集体から得られる安定な折りたたみ中間体からなる。画分を集め、SDS-PAGEとウェスタン-ブロットで分析した。
次のステップでは、イオン交換クロマトグラフィー(Q-Sepharose XL)でタンパク質を捕捉した。
集めたタンパク質画分を、PBSで平衡化したQ-Sepharose XLカラム(内径10mm、高さ50mm)に装荷した。折りたたみ中間体はマトリックスと相互作用せず、フロースルー中に溶離し、未変性rHuAFPは樹脂に結合し、PBS+0.2M NaClによる段階勾配で溶離され、凝集体はPBS+0.5M NaClによる第二の段階勾配で溶離された。捕捉工程のクロマトグラムを図6に示す。集めた未変性ピーク画分(溶出液1)を銀染色SDS-PAGE (図7)とSuperdex 200HRカラム(AP biotech、ウプサラ、スウェーデン)を用いた分析用サイズ排除クロマトグラフィー (図8)で分析した。
【００１９】
b) 連続リフォールディング実験については、a)と同じタンパク質溶液、ゲル、緩衝液を用いた。
2種のクロマトグラフィー媒体を環状クロマトグラフィーシステム、Prior Separation Technology製 Goetzis、オーストリアのPCACへ充填した。下層は5cmのQ-Sepharose XLからなり、上相は35cmのSephacryl 200HRからなる。
システムをPBSで20 cm/hの直線速度において平衡化した。円柱の回転速度は250°/hとした。
供給流を、先端がガラスビーズの層の中に位置している固定した供給ノズルを通してゲル床の上にポンプで送った。PBS+0.2M NaClを、ゲル床の上に供給ノズルから‐60度ずらして別のノズルによってポンプで送った。
第一ゲル層(Sephacryl 200HR)において、変性還元タンパク質がリフォールディングし始めた。高分子量凝集体を、リフォールディングしたモノマー未変性rHuAFPとモノマー折りたたみ中間体から分離した。第一ゲル層を離れた後、タンパク質は第二の下層ゲル(Q-Sepharose XL)に捕捉された。未変性モノマーrHuAFPをPBS+0.2M NaClで連続して溶離し、凝集体を6M GuHClと0.1M DTTを含む塩画分に溶離した。
試料を抜き取り、凝集タンパク質と未変性タンパク質の量をSDS-PAGEで求めた。
【００２０】
実施例 ５  イオン交換クロマトグラフィーによるα-ラクトアルブミンの連続リフォールディング
a) イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質モデルのα-ラクトアルブミンのリフォールディング用条件をバッチ方式で最適化した。カラム(0.5cm i.d.)をDEAE Sepharose 4FF (AP biotech、ウプサラ、スウェーデン)で充填した。得られた床の高さは8 cmであり、連続方式とほぼ同じ範囲であった。平衡緩衝液は、pH 8に調整した20mMトリス/HCl、2mM CaCl2、2M尿素とした。溶離緩衝液は、0.5M NaClを添加した平衡緩衝液と同じものとした。再生緩衝液として、100mMモノチオグリセロール含む6M GuHClか0.5M NaOHを用いた。
全量3mgの変性および還元α-ラクトアルブミンをDEAE Sepharose 4FFに装荷した。変性剤と還元剤を洗い流した後、タンパク質を溶離した。集めた還元α-ラクトアルブミンを含むプールにシステインとシスチンをそれぞれ最終濃度2mMに添加した。リフォールディング緩衝液中で6〜7時間インキュベートした後、最初に装荷したタンパク質の約80%が未変性コンホメーションである。これらの条件下、全タンパク質回収率は90〜100%であった。
また、2mMシスチンと2mMシステインを平衡化緩衝液と溶離緩衝液に添加した。この場合、タンパク質は未変性コンホメーションとして溶離された。未変性タンパク質の収率は約10%であり、回収率は80%であった。連続工程に必要とされる条件をシミュレートするために、流量と試料装荷量に関する制限を行なった。
【００２１】
b) 凝集体を再利用しない連続リフォールディング
連続方式のパラメータをバッチ実験に用いたように維持した。種々の緩衝液の流速と緩衝液の適用角度を計算した。0.1mg/mlおよび1mg/mlの変性および還元α-ラクトアルブミンの溶液をDEAE Sepharose 4FFで充填した加圧連続型環状クロマトグラフ(PCAC)に加えた。平衡化緩衝液(20mMトリス/HCl、2mM CaCl2、2M尿素)をP-6000 (AP biotech、ウプサラ、スウェーデン)により22 ml/minの流量で主注入口を通ってポンプで送った。装荷は、P-500ポンプ(AP biotech、ウプサラ、スウェーデン)により4.2 ml/minの流量で0°において行った。溶離は、P-500ポンプ(AP biotech、ウプサラ、スウェーデン)により2.1ml/minの流量で溶離緩衝液(20mMトリス/HCl、2mM CaCl2、2M尿素、0.5M NaCl)で135°において行なった。再生溶液(6M GuHCl、100mMモノチオグリセロール)をペリスタ実験ポンプにより環状クロマトグラフへ1.5ml/minの流量で222°において送った。定常平衡状態に達した後、20分間、90画分すべてを2回集めた。電導率を測定し、外部光度計(日立)でUV吸収を測定した。代表的なクロマトグラフを図9に示す。タンパク質が溶離した画分を求め、試料を採取した。200mMシステインおよび200mMシスチンの原液のアリコートを各画分に最終濃度2mMまで加えた。7時間インキュベートした後、タンパク質含量および折りたたみコンホメーションを逆相HPLCで決定した。未変性タンパク質の収率と回収率は、それぞれ80%および95%であった。
【００２２】
c) 凝集体を再利用した連続リフォールディング
モデルタンパク質のリフォールディングは、2mMシステインおよび2mMシスチンを平衡緩衝液と溶離緩衝液に添加することにより促進させ得る。タンパク質は、クロマトグラフィー中に未変性構造を回復する。リフォールディング速度が速いために、いずれもカラム上で大いに凝集が行なわれる。これらの条件下、タンパク質は未変性状態でカラムから溶離する。しかしながら、ほとんどのタンパク質はクロマトグラフィー中に凝集する。凝集体は、還元剤として100mMモノチオグリセロールを含む6M GuHClでカラムから定量的に取り出すことができる。溶解した凝集体をイオン交換樹脂に再循環させるために、電導率は1 mS/cmより小さくなければならない。従って、溶解した凝集体は8M尿素に対してダイアフィルトレーションされなければならない。
変性および還元α-ラクトアルブミンの0.1mg/mlおよび0.5mg/mlの溶液を装荷した。再生は、還元剤として100mMモノチオグリセロールを含む6M GuHClにより行なった。90画分すべてを集めて溶出液と再生液を含む画分を決定した。再生液を含む画分をプールし、電導率が供給溶液と同じになるまで8M尿素に対してダイアフィルトレーションした。限外ダイアフィルトレーションを接線流実験用限外ろ過ユニット(Labscale TFFシステム、Millipore)により行なった。逆相HPLCで最終タンパク質含量を測定した。最後に、ダイアフィルトレートを供給溶液へポンプで送った。未変性タンパク質の収率は再利用しない場合の14%から凝集タンパク質画分を再利用した場合の78%に上がった。
【００２３】
参考文献
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【００２４】
2005510481.tif 000004
【００２５】
2005510481.tif 000005
【００２６】
2005510481.tif 000006
【００２７】
2005510481.tif 000007
【００２８】
2005510481.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】直線速度30cm/hにおけるSuperdex 75 PrepGradeカラム上のサイズ排除クロマトグラフィーによる変性還元α-ラクトアルブミンのリフォールディング。
【図２】250°/hおよび30cm/hにおけるSuperdex 75 PrepGradeカラム上の環状サイズ排除クロマトグラフィーによる変性α-ラクトアルブミンの連続リフォールディング。
【図３】環状クロマトグラフィーによる連続リフォールディングと凝集体の再利用のための実験構成の概略図。
【図４Ａ】HICによるマトリックス支援リフォールディングからの画分の逆相HPLCクロマトグラム。
【図４Ｂ】未変性α-ラクトアルブミンの逆相HPLCクロマトグラム。
【図４Ｃ】変性還元α-ラクトアルブミンの逆相HPLCクロマトグラム。
【図５】Sephacryl 200HRによるrHuAFPのマトリックス支援リフォールディング。
【図６】Q-Sepharose XLによるリフォールディングrHuAFPの捕捉ステップ。
【図７】Q-Sepharose XLから溶離した未変性タンパク質画分のSDS-PAGE (銀染色)。
【図８】Q-Sepharose XLから溶離した未変性タンパク質画分の分析用サイズ排除クロマトグラフィー。
【図９】環状イオン交換クロマトグラフィーによる変性還元α-ラクトアルブミンの連続リフォールディング。
【図１０】カルーセルクロマトグラフィーの概略図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005510481.tif 000017
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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