(57)【要約】【課題】  本発明は、重篤な副作用を伴わない新規な作用機序による遅延型過敏症治療剤、及びそのスクリーニング方法を提供するものである。また、本発明は、ＰＡＲ−２阻害剤・発現抑制剤の新規なアッセイ方法を提供するものである。【解決手段】  本発明は、ＰＡＲ−２阻害剤及びＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤からなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分、並びに製薬上許容される担体を含有してなる遅延型過敏症の予防・治療用の医薬組成物、および、ＰＡＲ−２を発現する細胞に被検物質を接触させて、ＰＡＲ−２の発現又は活性を判定することにより、遅延型過敏症の予防・治療用の有効成分をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、イノシトールを含有する培地中でＰＡＲ−２発現細胞を用いて、被検物質のＰＡＲ−２に対する作用を検出又は定量方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＡＲ−２阻害剤及びＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤からなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分、並びに製薬上許容される担体を含有してなる遅延型過敏症の予防・治療用の医薬組成物。
【請求項２】
遅延型過敏症の予防・治療用の医薬組成物が、接触性皮膚過敏反応及び／又は、同種移植拒絶反応抑制剤である請求項１に記載の遅延型過敏症の予防・治療用の医薬組成物。
【請求項３】
遅延型過敏症の予防・治療用の医薬組成物が、接触性皮膚炎、移植片拒絶反応、移植片対宿主反応、ツベルクリン反応、肉芽腫形成、結核、ハンセン病、サルコイドーシス、クローン病、潰瘍性大腸炎、住血吸虫症、自己免疫疾患（関節リウマチ、亜慢性関節リウマチ、若年性亜慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、インスリン依存性糖尿病、橋本甲状腺炎、強皮症、悪性貧血等）、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性呼吸器疾患、鼻炎、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー、腎炎、好中球・マクロファージ・リンパ球・好酸球のうち１種以上の炎症性細胞の浸潤を伴なう疾患の予防・治療剤である請求項１又は２に記載の遅延型過敏症の予防・治療用の医薬組成物。
【請求項４】
ＰＡＲ−２阻害剤及びＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤からなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分の、遅延型過敏症の予防又は治療における使用。
【請求項５】
ＰＡＲ−２阻害剤及びＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤からなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分の、遅延型過敏症の予防又は治療用製剤の製造のための使用。
【請求項６】
ＰＡＲ−２阻害剤及びＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤からなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分の、接触性皮膚過敏反応及び／又は、同種移植拒絶反応抑制剤の製造のための使用。
【請求項７】
ＰＡＲ−２阻害剤及びＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤からなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分の、請求項３に記載の疾患を予防又は治療する製剤の製造のための使用。
【請求項８】
ＰＡＲ−２阻害剤及びＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤からなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分の無毒性で有効な量を、必要な患者に投与することを特徴とする遅延型過敏症の予防又は治療方法。
【請求項９】
ＰＡＲ−２阻害剤及びＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤からなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分の無毒性で有効な量を、必要な患者に投与することを特徴とする請求項２又は３に記載の疾患の予防又は治療方法。
【請求項１０】
ＰＡＲ−２を発現する細胞に被検物質を接触させて、ＰＡＲ−２の発現又は活性を判定することにより、被検物質のＰＡＲ−２に対する阻害作用又はＰＡＲ−２遺伝子の発現の抑制作用をスクリーニングすることからなる、遅延型過敏症の予防・治療用の有効成分をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
ＰＡＲ−２を発現する細胞が、ＮＣＴＣ２５４４細胞である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＡＲ−２に対する阻害作用又はＰＡＲ−２遺伝子の発現の抑制作用をスクリーニングする方法が、イノシトールリン酸の産生を指標にしたＰＡＲ−２アッセイによるものである請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
イノシトールを含有する培地中でＰＡＲ−２発現細胞を培養し、培養中に被検物質を添加してＰＡＲ−２発現細胞によりリン酸化されたイノシトールの量を検出又は定量することによるＰＡＲ−２の作用を検出又は定量する方法。
【請求項１４】
ＰＡＲ−２発現細胞が、ＮＣＴＣ２５４４細胞である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１０乃至１２のいずれかに記載の方法により得られるＰＡＲ−２阻害作用又はＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制作用を持つ物質。
【請求項１６】
請求項１０乃至１２のいずれかに記載の方法により得られるＰＡＲ−２阻害作用又はＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制作用を持つ物質を、請求項１乃至３のいずれかに記載の疾患を予防又は治療する薬剤として用いる方法。
【請求項１７】
請求項１０乃至１２のいずれかに記載の方法により得られるＰＡＲ−２阻害作用又はＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制作用を持つ物質の、請求項１乃至３のいずれかに記載の疾患を予防又は治療する薬剤を製造するための使用。
【請求項１８】
請求項１０乃至１２のいずれかに記載の方法により得られるＰＡＲ−２阻害作用又はＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制作用を持つ物質の無毒性で有効な量を、請求項１乃至３のいずれかに記載の疾患を予防又は治療することが必要な患者に投与する方法。
【請求項１９】
請求項１乃至３のいずれかに記載の疾患を予防又は治療するための物質をスクリーニングするための、ＰＡＲ−２発現細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＡＲ（Protease-activated receptor）−２阻害剤及び／又はＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤を有効成分とする遅延型過敏症予防・治療用医薬組成物に関するものである。また、本発明は、被検物質のＰＡＲ−２に対する阻害作用又はＰＡＲ−２遺伝子の発現の抑制作用をスクリーニングすることからなる、遅延型過敏症の予防・治療用の有効成分をスクリーニングする方法に関する。さらに、本発明は、イノシトールリン酸の産生を指標にしたＰＡＲ−２の活性のアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー（過敏症）とは、生体の免疫反応が過度に、あるいは不適当な形で起こる状態のことであり、時に組織障害を引き起こす場合がある。
アレルギー反応（過敏症）は、同一の抗原との２度目の接触により引き起こされ、体液性免疫が関与する即時型過敏症と細胞性免疫が関与する遅延型過敏症の２種類に大別され、さらにクームズとゲルによりその発現機序、症状の違い等によってＩ〜ＩＶ型に分別されている。Ｉ型過敏症は、組織の肥満細胞および血中の好塩基球と結合した免疫グロブリンＥ抗体が特異抗原と反応し、それらの細胞で脱顆粒が起こり、ヒスタミン等の化学伝達物質が遊離される。この遊離した化学伝達物質が種々の臓器に作用して急性炎症を生じるものである。ＩＩ型過敏症は、抗体が自己細胞表面の抗原または外来細胞表面の抗原に結合し、その細胞が貪食されたり、キラー細胞を活性化したり、補体の関与した細胞溶解を生じるものである。ＩＩＩ型過敏症は、抗原導入によって生体内で形成された抗原抗体結合物に補体が結合した免疫複合体が組織に沈着し、補体が活性化され、多形核白血球がその沈着部位に集まり、局所の障害が生じるものである。ＩＶ型過敏症、つまり遅延型過敏症は、抗原と特異的に反応しうる能力を備えたＴ細胞が直接抗原と反応することで、サイトカイン等の生物学的活性を有するケミカル・メディエイターズが遊離・放出され、局所の組織に細胞が集合して炎症が生じるものである。
【０００３】
遅延型過敏症反応には、ツベルクリン型反応、同種移植拒絶反応、細胞依存型感染防御反応、接触性皮膚過敏症反応などがあり、これらの反応はステロイド剤によって最も強く抑制されることが知られている。従って遅延型過敏症反応を介して引き起こされる疾患に対しては、ステロイド剤が有効であるが、ステロイド剤は、長期連用すると重篤な副作用、いわゆるステロイド依存性を発現するため、投薬の中止時期や投薬方法が難しいという問題がある。また接触性皮膚過敏症反応である接触性皮膚炎のステロイド剤による治療においては、皮膚の萎縮、にきび及び多毛などの皮膚状態の変化による多様な副作用が起こり、逆に皮膚状態が悪化する症例もある。
遅延型過敏症反応による慢性疾患は極めて多種類あり、非感染性物質によるサルコロイドーシスやクローン病や、細菌、原虫、真菌などによる感染性微生物によるものもある。これらの感染性微生物が慢性的な抗原刺激を与えることによると考えられている。マクロファージの活性化などにより感染は局所に限定されることが多いが、持続的な刺激により組織障害が生じるものと考えられる。これらの感染性の疾患としては、結核、ハンセン病、住血吸虫症などがある。
【０００４】
一方、ＰＡＲ(Protease-activated receptor)−２は、７回膜貫通型のＧ蛋白共役受容体ファミリーの１種であるプロテアーゼ受容体（ＰＡＲ）の一種である。
ＰＡＲは現在までに、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３及びＰＡＲ−４の４種類がクローニングされており、トロンビン、トリプシンなどのセリンプロテアーゼの各種細胞に対する作用を媒介する受容体ファミリーである。ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３、及びＰＡＲ−４は、いずれもトロンビンによる血小板凝集を媒介する受容体として機能が明らかにされているが、ＰＡＲ−２は構造的あるいは活性メカニズム的には他のＰＡＲと多くの共通点があるものの、トロンビンでは活性化されずトリプシンやトリプターゼで活性化されることなど、機能的には他のＰＡＲと異なる。
これらのＰＡＲは、レセプターのＮ末端側のアミノ酸配列の特定部位がトロンビンや他のプロテアーゼの作用により切断され、露出された切断末端が受容体自体の結合部位に結合して受容体の活性化が起こる。切断部位の受容体を活性化させるアミノ酸配列の概要をアミノ酸の１文字表記で示す。
【０００５】
ＰＡＲ−１    ＳＦＬＬＲＮ−ＮＨ２  （ヒト）
ＰＡＲ−２    ＳＬＩＧＫＶ−ＮＨ２  （ヒト）
ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２  （マウス）
ＰＡＲ−３    なし
ＰＡＲ−４    ＧＹＰＧＱＶ          （ヒト）
ＧＹＰＧＫＦ          （マウス）
【０００６】
ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、及びＰＡＲ−４は、切断部位のアミノ酸配列を有する外来性のペプチドによっても非酵素的に活性化することができるが、ＰＡＲ−３はこのような外来性のペプチドでは活性化することはできない。最近の研究では、マウスＰＡＲ−３はそれ自体では活性化されず、ＰＡＲ−４との共存下においてのみ機能する、ＰＡＲ−４のコファクターであることが証明された（Nature, 404, 609-613 (2000)）。
ＰＡＲ−２は、ティッシュファクター／ＶＩＩａ因子、Ｘａ因子、精子プロテアーゼの一種アクロシン、ラットの脳より同定されたトリプシン様セリンプロテアーゼ、トリプシン、トリプターゼ及びＰＡＲ−２のリガンドと同様の配列を持つ合成ペプチドにより活性化されることが知られている。
【０００７】
ＰＡＲ−２の炎症及び過敏症に関する生理学的・病理学的役割については、トリプシン、トリプターゼ、ＰＡＲ−２活性化ペプチド及びＰＡＲ−２欠損マウスなどを利用した報告が存在する（Br J Pharmacol 125,419-422(1998); Br J Pharmacol 127,1083-1090(1999);Eur J Pharmacol 328,89-97(1997); J Pharmacol Exp Ther 288,671-678(1999) ; J Immunol 165,6504-6510(1999))。
ＰＡＲ−２のアゴニスト（ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２）により一過性の炎症反応が誘発されることが報告されたが（Br J Pharmacol 125,419-422(1998)）、腹腔肥満細胞においてＰＡＲ−２のｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ法により検出することはできず、またＰＡＲ−２アゴニストによる肥満細胞の脱顆粒も観察できなかったことから（Jpn. J. Pharmacol., 82, 74-77 (2000)）、ＰＡＲ−２のアゴニスト（ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２）による一過性の炎症反応は、肥満細胞以外の細胞・組織に対する作用を介する二次的なものである可能性が高いと考えられている。また、高濃度のＰＡＲ−２のアゴニスト（ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２）を用いた実験では、肥満細胞非依存的に神経性炎症が生起することが報告されている（Br J Pharmacol 127,1083-1090(1999)：Nat Med, 6, 151-158 (2000)）。
しかしながら、これらはＰＡＲ−２の即時型過敏症や神経性炎症に関する間接的な証明または、循環器に関する報告であり、遅延型過敏症における役割については、全く示唆されていない。
【０００８】
また、トリプターゼ阻害剤が遅延型過敏症マウスモデルの皮膚炎の治療に有効であるとの報告があるが（J Med Chem 41,4854-4860(1998)）、その中でＰＡＲ−２の関与については全く示唆されていない。またトリプターゼはＰＡＲ−２以外にＶＩＰ(vasoactive intestinal peptide：血管作用性小腸ペプチド)、ＰＨＭ(peptide histidine methionine：ペプチド性ヒスチジン−メチオニン)、ＣＧＲＰ(calcitonin gene related peptide：カルシトニン遺伝子関連ペプチド)、fibrinogen：フィブリノーゲン、gelatinase：ゼラチナーゼ、fibronectinフィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、ＭＭＰ(matrix metalloprotease：マトリックスメタロプロテアーゼ)、uPA(urinary type plasminogen activator：尿排泄型プラスミノーゲン活性化因子)及びkininogenase：キニノゲナーゼ (Pharmacol Rev 53, 245-282 (2001))など数多くのリガンドを分解、活性化することが知られており、どのようなメカニズムにより遅延型過敏症マウスモデルの皮膚炎の治療に有効であったかということは記載されていない。また、本発明者らは、ＰＡＲ−２欠損マウスを用いた実験において、受身皮膚アナフィラキシー反応と呼ばれる、肥満細胞からトリプターゼが放出される皮膚炎モデルにはＰＡＲ−２がほとんど関与しないことを示しており、この文献にはＰＡＲ−２活性化抑制と遅延型過敏症の関係については開示されていない（J. Med. Chem., 41:4854-4860, 1998）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、重篤な副作用を伴わない新規な作用機序による遅延型過敏症治療用医薬組成物、及びそのスクリーング方法を提供するものである。また、本発明は、ＰＡＲ−２阻害剤及び／又はＰＡＲ−２発現抑制剤の新規なアッセイ方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意研究の結果、ＰＡＲ−２が遅延型過敏症反応に関与していることを見出し、ＰＡＲ−２阻害剤及び／又はＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤が副作用の発現の少ない遅延型過敏症治療薬であることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、ＰＡＲ−２阻害剤及びＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤からなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分、並びに製薬上許容される担体を含有してなる遅延型過敏症の予防・治療用の医薬組成物に関する。
また、本発明は、ＰＡＲ−２を発現する細胞に被検物質を接触させて、ＰＡＲ−２の発現又は活性を判定することにより、被検物質のＰＡＲ−２に対する阻害作用又はＰＡＲ−２遺伝子の発現の抑制作用をスクリーニングすることからなる、遅延型過敏症の予防・治療用の有効成分をスクリーニングする方法に関する。
さらに、本発明は、イノシトールを含有する培地中でＰＡＲ−２発現細胞を培養し、培養中に被検物質を添加してＰＡＲ−２発現細胞によりリン酸化されたイノシトールの量を検出又は定量することによるＰＡＲ−２の作用を検出又は定量する方法に関する。
【００１１】
ＰＡＲ−２はニステッド（Nystedt）らにより１９９４年にクローニングされたものである（Proc Natl Acad Sci USA , 91, 9208-9212 (1994)）。ＰＡＲ−２の塩基配列とコーディング領域におけるアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
また、ＰＡＲ−２遺伝子欠損マウス（ＰＡＲ−２−／−マウス）の作製についても１９９９年にダミアノ（Damiano）らによって報告されている（J Pharmacol Exp Ther, 288, 671-678 (1999)）。
【００１２】
本発明者らは、ＰＡＲ−２−／−マウスを用いてＰＡＲ−２の機能を解析している中で、ＰＡＲ−２が遅延型過敏症反応に関与していることを見出した。
まず、野生型マウスとＰＡＲ−２−／−マウスとの耳介厚を測定して、ＰＡＲ−２遺伝子欠損により皮膚萎縮が生起しているかどうかを検討した。
感作を行なっていない野生型のマウスおよびＰＡＲ−２−／−マウスの各々の１０例の耳介厚の平均値は、野生型のマウスで２２．７±０．４（×１０−２ｍｍ：平均値±標準誤差）であり、ＰＡＲ−２−／−マウスでは２２．０±０．４（×１０−２ｍｍ：平均値±標準誤差）であり、両者に統計学的な差が認められなかった。また、肉眼的観察によっても、両者に差が認められなかった事から、ＰＡＲ−２を阻害しても、皮膚萎縮を生じさせない事が示された。
【００１３】
次に、ＰＡＲ−２−／−マウスを用いてピクリルクロライド（ＰＣ）誘発接触性皮膚炎モデル及びオキサゾロン（Ｏｘ）誘発接触性皮膚炎モデルについての試験を行ったところ、野生型マウスとＰＡＲ−２−／−マウスとの間に有意な差があることを見出した。
図１Ａ（図１の上段）は、ピクリルクロライド（ＰＣ）誘発接触性皮膚炎モデルにおける耳介浮腫の結果を示したものであり、図１Ｂ（図１の下段）はオキサゾロン（Ｏｘ）誘発接触性皮膚炎モデルにおける耳介浮腫の結果を示したものである。図１Ａ及びＢの縦軸は、耳介両面に１％ＰＣ−オリーブオイル溶液（図１Ａ）または０．５％Ｏｘ−アセトン溶液（図１Ｂ）を塗布して感作を行ったマウスで浮腫の誘発を行ない、２４時間後の耳介厚を測定したときの誘発前後の耳介厚の差を示している。図１Ａ及びＢの左側は野生型マウスのものであり、右側はＰＡＲ−２−／−マウスのものである。
これらの試験において、溶媒（オリーブオイル又はアセトン）の塗布による影響は認められなかった。
野生型マウスにおいて、ＰＣ又はＯｘのチャレンジにより、２４時間後をピークとする浮腫が認められ、肉眼的にも耳介の浮腫及び発赤が観察された。これに対しＰＡＲ−２−／−マウスにおいて、ＰＣのチャレンジにより誘発された浮腫は明らかに抑制され（図１Ａ）、またＯｘにより誘発された浮腫にいたっては、野生型マウスの耳介浮腫がピークを示す２４時間後の時点で完全に抑制されることが分かった。
【００１４】
次にこれらの浮腫の組織学的検討を行った。
ＰＣおよびＯｘ誘発接触性皮膚炎モデルの試験に用いたマウスの両耳介の薄切標本にヘマトキシリンーエオジン染色を行ない、ＰＣまたはＯｘ誘発接触性皮膚炎に対するＰＡＲ−２欠損の影響を組織学的に観察した。
図２は、野生型マウス（図２の左側、Ａ、Ｃ及びＥ）およびＰＡＲ−２−／−マウス（図２の右側、Ｂ、Ｄ及びＦ）におけるＰＣまたはＯｘの塗布の２４時間後の組織病理像を示す図面に代わるカラー写真である。図２の上段（図２Ａ及びＢ）は溶媒（オリーブオイル）処置後の耳介であり、それぞれ左側（図２Ａ）は野生型マウス、右側（図２Ｂ）はＰＡＲ−２−／−マウスのものである。図２の中段（図２Ｃ及びＤ）はＰＣ処置後の耳介であり、それぞれ左側（図２Ｃ）は野生型マウス、右側（図２Ｄ）はＰＡＲ−２−／−マウスのものである。図２の下段（図２Ｅ及びＦ）はＯｘ処置後の耳介であり、それぞれ左側（図２Ｅ）は野生型マウス、右側（図２Ｆ）はＰＡＲ−２−／−マウスのものである。
野生型マウスの耳介にＰＣまたはＯｘを塗布することにより、浮腫および好中球・マクロファージ・リンパ球・好酸球などの炎症性細胞の浸潤が認められた（図２Ｃ及びＥ）。ＰＡＲ−２−／−マウスにおいては、これらの浮腫および好中球・マクロファージ・リンパ球・好酸球などの炎症性細胞の浸潤が著しく抑制された（図２Ｄ及びＦ）。組織学的観察においても、ＰＡＲ−２−／−マウスにおいてはこれらの試験において炎症の発生が明らかに抑制された。
【００１５】
さらに、受身皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）反応モデルにおける試験を行った。マウスの両耳介に抗ＯＡ抗血清を皮内投与した。４８時間後にエバンスブルー溶液とＯＡ溶液を等量混和したものを静脈内投与し、３０分後に耳介を切り、色素を抽出して、分光度計で吸光度（λ＝６２０ｎｍ）を測定して色素漏出量を定量した。
結果を図３に示す。図３の縦軸は色素の漏出量（μｇ）であり、左側は野生型マウスであり右側はＰＡＲ−２−／−マウスである。図３に示されるように、野生型のマウスおよびＰＡＲ−２−／−マウスともに、ＰＣＡ反応が生じており明らかなＰＡＲ−２の欠損による影響は認められなかった。
【００１６】
遅延型過敏症反応による接触性皮膚炎はＰＣ（２，４，６−トリニトロ−クロロベンゼン）やＯｘ（４−エトキシメチレン−２−フェニル−２−オキサゾリン−５−オン）等のハプテン抗原により惹起され、その反応には、好中球を初めとした炎症性細胞及び各種サイトカインやメディエーター等が関与していることが知られている。その中で、ＰＡＲ−２を活性化するトリプターゼは、多様な生理活性を有するセリンプロテアーゼの１種であり、血管内皮細胞上に発現しているＰＡＲ−２を介して、間接的に好中球や好酸球の湿潤を活性化させることが報告されている。同様なことは、選択的ＰＡＲ−２活性化ペプチドがケラチノサイトからのＩＬ−８の遊離やＮＦκＢとＤＮＡの結合を促進し、さらに、好中球に対し、血管内皮細胞上のローリングや接着を引き起こすことからも裏付けられている。しかし、遅延型過敏症反応におけるＰＡＲ−２の役割は明らかではない。
今回のＰＡＲ−２−／−マウスにおける接触性皮膚炎の著しい抑制は、ＰＡＲ−２を介した炎症性反応の欠如によるものであると考えられる。
また、トリプターゼがアナフィラキシー反応において肥満細胞から遊離され、様々な炎症反応を促進していることは広く知られているが、ＰＡＲ−２のアナフィラキシー反応における役割は明らかではない。今回典型的な皮膚アナフィラキシー反応モデルであるＰＣＡ反応を用いて、ＰＡＲ−２の役割を検討したが、ＰＣＡ反応に対して野生型のマウスとＰＡＲ−２−／−マウスとの間に有意な差が認められなかったことから、ＰＡＲ−２は皮膚アナフィラキシー反応における関与は少ないことがわかった。
【００１７】
これらのことから、ＰＡＲ−２−／−マウスは受身皮膚アナフィラキシー反応においては野生型マウスと殆ど同様な反応を示し、肥満細胞からトリプターゼが放出される皮膚炎モデルにはＰＡＲ−２がほとんど関与しないことがわかる。しかし、遅延型過敏症反応に対しては有意に野生型マウスとは異なる反応を示し、ＰＡＲ−２の欠損により明らかな抑制作用を示すことがわかった。即ち、本発明は、ＰＡＲ−２の活性を阻害、又はＰＡＲ−２遺伝子の発現を抑制することにより遅延型過敏症反応を抑制することができ、これは肥満細胞からのトリプターゼの放出を抑制するものではなく、これとは異なる機構による新規な遅延型過敏症反応を抑制する手段を提供するものである。
したがって、本発明により、ＰＡＲ−２を阻害する物質（アンタゴニスト）や、ＰＡＲ−２遺伝子の発現を抑制することができる物質により、遅延型過敏症反応を抑制することができることが初めて明らかにされたことになる。
【００１８】
また、本発明はＰＡＲ−２の活性を測定する新規な方法を提供するものでもある。ＰＡＲ−２はＧ蛋白質結合型受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーに属し、受容体の活性化にともないセカンドメッセンジャーとしてリン酸化イノシトールを産生する。このメカニズムに基づき、ＰＡＲ−２発現細胞において産出したリン酸化イノシトールをイオンクロマトグラフなどにより定量することにより、ＰＡＲ−２の活性化における被検物質の効果を定量的に測定することができる。
この方法によりトリプシンあるいはＰＡＲ−２活性化ペプチドＳＬＩＧＫＶによるＰＡＲ−２の活性化を測定することができた。トリプシンによるＰＡＲ−２の活性化は大豆由来のトリプシン阻害剤により阻害されたが、ＳＬＩＧＫＶ刺激による活性化は阻害されなかった。このことは、トリプシンやトリプターゼなどの酵素の阻害と、レセプターの直接的阻害が基本的に相違するものであることを明らかにしている。
本発明のこのＰＡＲ−２の活性を測定する方法は、ＰＡＲ−２の活性化剤あるいは阻害剤のスクリーニングなどに広く応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、ＰＡＲ−２阻害剤及びＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤からなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分、並びに製薬上許容される担体を含有してなる遅延型過敏症の予防・治療用の医薬組成物を提供するものである。また、本発明は、遅延型過敏症を患っている患者に有効量のＰＡＲ−２阻害剤及びＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤からなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分を含有する医薬を投与することからなる、遅延型過敏症を予防・治療する方法を提供する。さらに、本発明は、ＰＡＲ−２阻害剤及びＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤からなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分の、遅延型過敏症の予防・治療用の医薬組成物を製造するための使用（USE）を提供するものである。
本発明のＰＡＲ−２阻害剤又はＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤は、ＰＡＲ−２発現細胞を用いたスクリーニング方法により、ＰＡＲ−２の活性を阻害又はＰＡＲ−２遺伝子の発現を抑制することができるものである。
【００２０】
本発明のＰＡＲ−２阻害剤又はＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤は、遅延型過敏症反応に対する抑制作用を有し、接触性皮膚炎、移植片拒絶反応、移植片対宿主反応、ツベルクリン反応、肉芽腫形成、結核、ハンセン病、サルコイドーシス、クローン病、潰瘍性大腸炎、住血吸虫症、自己免疫疾患（関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、インスリン依存性糖尿病、橋本甲状腺炎、強皮症、悪性貧血等）、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性呼吸器疾患、鼻炎、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー、腎炎、および、好中球・マクロファージ・リンパ球・好酸球のうち１種類以上の炎症性細胞浸潤を伴なう疾患の予防・治療用医薬組成物として有用である。
本発明のＰＡＲ−２阻害剤は単独又は他の薬学的に許容される溶解剤、賦形剤、結合剤、希釈剤等の担体を用いて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、ローション剤、軟膏剤、注射剤、坐剤等の剤型とすることができる。これらの製剤は、公知の方法で製造することができる。例えば、経口投与用製剤とする場合には、トラガントガム、アラビアガム、ショ糖エステル、レシチン、オリーブ油、大豆油、ＰＥＧ４００等の溶解剤、澱粉、マンニトール、乳糖等の賦形剤：カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤：結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤：タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、軽質無水ケイ酸等の流動性向上剤等を適宜組み合わせて処方することにより製造することができる。
本発明のＰＡＲ−２阻害剤は、経口投与又は非経口投与により投与される。
本発明のＰＡＲ−２阻害剤の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状等によって異なるが、通常成人の場合、一日０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇを１〜３回に分けて投与するのが好ましい。
【００２１】
また、本発明は、ＰＡＲ−２を発現する細胞に被検物質を接触させて、ＰＡＲ−２の発現又は活性を判定することにより、被検物質のＰＡＲ−２に対する阻害作用又はＰＡＲ−２遺伝子の発現の抑制作用をスクリーニングすることからなる、遅延型過敏症の予防・治療用の有効成分をスクリーニングする方法を提供するものである。
本発明のスクリーニング方法で使用されるＰＡＲ−２発現細胞としては、例えばＮＣＴＣ２５４４細胞やＨＥＫ２９３細胞が挙げられるが、これに限定されるものではなく、マウス、ラット、ヒトなどの動物のＰＡＲ−２を発現している細胞を使用することができる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、これらのＰＡＲ−２発現細胞を当該細胞を培養できる培地中で候補化合物などの被検物質と接触させて、ＰＡＲ−２の活性を測定することにより行うことができる。ＰＡＲ−２の活性の測定方法としては特に制限はないが、次に述べるイノシトールのリン酸化による測定方法が好ましい。
【００２２】
本発明は、イノシトールを含有する培地中でＰＡＲ−２発現細胞を培養をし、培養中に被検物質を添加してＰＡＲ−２刺激によりリン酸化されたイノシトールの量を検出又は定量することによるＰＡＲ−２の活性化に対する作用を検出又は定量する方法を提供するものである。
本発明の方法で使用するイノシトールとしては、ＰＡＲ−２の活性化によりリン酸化されるものであればよいが、通常はミオイノシトール（myo-inositol）が好ましい。イノシトールのリン酸化の測定方法も特に制限はないが、簡便で感度がよいと報告されているオルドハムらの方法（Oldham, K. G.(1990). Polyphosphoinositide turnover. In Receptor-effector coupling - A practical approach. ed. Hulme, E.C. pp.99-116: Oxford University Press)が好ましい。この方法はイノシトールモノホスファターゼの阻害剤であるリチウム塩の存在下に３Ｈ−ミオイノシトールを用いて行うものである。産生されたリン酸化イノシトールは有機溶媒あるいはＴＣＡ溶液で抽出して、イオン交換クロマトグラフィーを用いて遊離のイノシトールと分離される。
このように、放射性元素で標識化されたイノシトールを用いる方法が比較的簡便で好ましい。放射性元素としては、イノシトールの水素や酸素や炭素のいずれでもよく、例えば水素原子を放射性の３Ｈで標識化することもできる。このような標識化されたイノシトールを用いて、リン酸化されたイノシトールを検出又は定量することにより、ＰＡＲ−２の活性を測定することができる。本発明のこの方法により被検物質がＰＡＲ−２に対する阻害作用又はＰＡＲ−２遺伝子の発現の抑制作用を有しているか否かをスクリーニングすることができる。
【００２３】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下の実験に使用したマウスは、自家繁殖したＣ５７ＢＬ／６と１２９／Ｏｌａの交雑系の雄性ＰＡＲ−２−／−マウス及びその野生型マウスであり、週齢は６〜９週齢であり、飼育は２３±３℃、飼料及び水は自由摂取とした。
【実施例１】
【００２４】
（皮膚萎縮に関する検討）
感作を行なっていない野生型マウスおよびＰＡＲ−２−／−マウスの耳介厚を測定した。各々の１０例の平均値は、
野生型のマウス：２２．７±０．４（×１０−２ｍｍ；平均値±標準誤差）
ＰＡＲ−２−／−マウス：２２．０±０．４（×１０−２ｍｍ；平均値±標準誤差）
であり、両者に統計学的な差が認められなかった。また、肉眼的観察によっても、両者に差が認められなかった事から、ＰＡＲ−２を阻害しても、皮膚萎縮を生じさせない事が示された。
【実施例２】
【００２５】
（ピクリルクロライド（ＰＣ）（２，４，６−トリニトロ−クロロベンゼン）誘発接触性皮膚炎モデル）
ＰＡＲ−２−／−マウスおよびその野生型のマウスの各々１０例の腹部を毛刈りし、７％ＰＣ−エタノール溶液を１００μＬ塗布して感作した。６日後に誘発前の両耳介厚をダイヤルシックネスゲージ（Peacock G-1A、OZAKI MFG. Co. Ltd.）で測定した後、耳介両面に１％ＰＣ−オリーブオイル溶液または溶媒のみを２０μＬ塗布して誘発を行ない、６、２４、４８時間後の耳介厚を測定した。誘発前後の耳介厚の差を算出し、浮腫の指標とした。結果を後記の表１に示す。
この２４時間後の結果を図１Ａにグラフにして示す。ＰＣを野生型マウスの耳介に塗布することにより、２４時間後をピークとする浮腫が認められた。肉眼的にも、耳介の浮腫および発赤が観察された。この浮腫は、ＰＡＲ−２−／−マウスにおいて明らかに抑制された（図１Ａ）。なお、溶媒（オリーブオイル）の塗布による影響は認められなかった。
【実施例３】
【００２６】
（オキサゾロン（Ｏｘ）（４−エトキシメチレン−２−フェニル−２−オキサゾリン−５−オン）誘発接触性皮膚炎モデル）
マウス腹部を毛刈りし、０．５％Ｏｘ−エタノール溶液を１００μＬ塗布して感作した。５日後に誘発前の両耳介厚をダイヤルシックネスゲージで測定した後、耳介に０．５％Ｏｘ−アセトン溶液または溶媒のみを２０μＬ塗布して誘発を行ない、６、２４、４８時間後の耳介厚を測定した。誘発前後の耳介厚の差を算出し、浮腫の指標とした。結果を前記の結果と併せて次の表１に示す。
【００２７】
【表１】
2005523883.tif 000002
【００２８】
表１の各数値は、耳介浮腫の平均値±標準偏差を示す。表中の＊（Ｐ＜０．０５）及び＊＊（Ｐ＜０．０１）は統計学的有意差があることを示す。
また、２４時間後の結果を図１Ｂにグラフにして示す。図１Ｂに示すようにＰＣと同様に、Ｏｘを野生型マウスの耳介に塗布することにより、浮腫が認められた。ＰＡＲ−２−／−マウスにおいて浮腫反応は完全に抑制されていた。なお、溶媒（アセトン）の塗布による影響は認められなかった。
【実施例４】
【００２９】
（組織学的検討）
ＰＣおよびＯｘ誘発接触性皮膚炎モデルに関する検討で用いたマウスの両耳介を麻酔致死後に切り取り、中性緩衝ホルマリンにて固定後、パラフィン包埋、薄切を経て、ヘマトキシリン−エオジン染色を行なった。ＰＣまたはＯｘ誘発接触性皮膚炎に対するＰＡＲ−２遺伝子の欠損の影響を組織学的に観察した。
図２に、野生型マウスおよびＰＡＲ−２−／−マウスにおけるＰＣまたはＯｘチャレンジ２４時間後の組織病理像を、図面に代わるカラー写真で示す。野生型マウスの耳介にＰＣまたはＯｘを塗布することにより、浮腫および好中球・マクロファージ・リンパ球・好酸球などの炎症性細胞の浸潤が認められた（図２ＣおよびＥ）。ＰＡＲ−２−／−マウスにおいては、これら、浮腫および好中球・マクロファージ・リンパ球・好酸球などの炎症性細胞の浸潤が著しく抑制されていた（図２．ＤおよびＦ）。
【実施例５】
【００３０】
（受身皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）反応モデル）
マウスをエーテル麻酔後、生理食塩水で希釈した抗ＯＡ抗血清（ＢＡＬＢ／ｃマウス由来，ＰＣＡ  Ｔｉｔｅｒ  １６倍）を両耳介にマイクロシリンジを用いて５μＬ／ｓｉｔｅの容量で皮内投与した。４８時間後に１％エバンスブルー溶液と０．２％ＯＡ溶液を等量混和したものを、１０ｍＬ／ｋｇの容量で静脈内投与し、３０分後に耳介を切り取った。これに１Ｎ−ＫＯＨを０．２５ｍＬ添加し、３７℃で一晩インキュベートした後、０．６Ｎ−リン酸を０．３７５ｍＬとアセトンを１．１２５ｍＬ加えて混和し、遠心（３，０００ｒｐｍ，１０分）して色素を抽出した。分光度計（ＵＶ−２２００，島津製作所）で吸光度（λ＝６２０ｎｍ）を測定することにより、色素漏出量を定量した。
結果を図３にグラフにして示す。野生型のマウスおよびＰＡＲ−２−／−マウスにＰＣＡ反応を惹起させ、両者の反応性を比較した。図３に示すように、野生型マウスおよびＰＡＲ−２−／−マウスともに、ＰＣＡ反応が生じており、明らかなＰＡＲ−２遺伝子の欠損の影響は認められなかった。
【実施例６】
【００３１】
（イノシトールリン酸の産生を指標にしたＰＡＲ−２アッセイ法）
ＰＡＲ−２を安定的に高発現させたＮＣＴＣ２５４４細胞を２ｍＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−ミオイノシトール（myoinositol）を含有する無血清培地にて１８時間培養した。刺激の３０分前に５ｍＭの塩化リチウムを添加し、引き続きトリプシン（１−３０ｎＭ）あるいはＰＡＲ−２アゴニストペプチドＳＬＩＧＫＶ（１０−３００μＭ）により刺激し、４５分後に脂質成分をメタノールで抽出し、アニオン交換樹脂（ＡＧ１−Ｘ、ホーメート型）で分離してリン酸化イノシトール産生量をシンチレーションカウンターで測定した。被試験薬は刺激の１５分前に添加した。
【実施例７】
【００３２】
（ＰＡＲ−２欠損マウスにおける慢性関節炎の減弱）
野生型マウスに対し完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）を関節内及び関節周囲へ投与すると、膝関節の直径は４週間以上に渡り増加するが、ＰＡＲ−２−／−マウスでは明らかに、そして有意に（p<0.001;2-way ANOVA）抑制された（図４）。全ての動物において、ＦＣＡ投与後２４時間で炎症の初期反応が見られるが、野生型マウスで見られた慢性期の炎症がＰＡＲ−２−／−マウスでは明らかに消失した。
【００３３】
上記の試験の結果から、ＰＡＲ−２阻害剤及びＰＡＲ−２遺伝子発現の抑制剤は副作用の伴わない遅延型過敏症抑制剤として有用であることがわかる。本発明は、遅延型過敏症反応の原因を解明することにより、この原因となる作用を抑制することによる新規な副作用の発現の少ない遅延型過敏症の予防・治療用医薬組成物を提供するものである。本発明の遅延型過敏症の予防・治療用医薬組成物は、特に遅延型過敏症反応によって生じる接触性皮膚炎、移植片拒絶反応、移植片対宿主反応、ツベルクリン反応、肉芽腫形成、結核、ハンセン病、サルコイドーシス、クローン病、潰瘍性大腸炎、住血吸虫症、自己免疫疾患（関節リウマチ、亜慢性関節リウマチ、若年性亜慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、インスリン依存性糖尿病、橋本甲状腺炎、強皮症、悪性貧血等）、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性呼吸器疾患、鼻炎、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー、腎炎、好中球・マクロファージ・リンパ球・好酸球のうち１種類以上の炎症性細胞浸潤を伴なう疾患の予防・治療用医薬組成物としても有用である。更に、現在臨床で多く用いられているステロイド外用剤の副作用の一つである皮膚萎縮が生じないことから、より副作用発現の可能性が低くなる。
また、本発明は、ＰＡＲ−２が遅延型過敏症反応に関与していることを明らかにすることにより、ＰＡＲ−２の発現細胞を用いる遅延型過敏症の予防・治療用医薬組成物のスクリーニング方法を提供するものである。本発明のスクリーニング方法により、副作用の少ない新規な遅延型過敏症の予防・治療用医薬組成物を簡便に見出すことが可能となる。さらに、本発明は、ＰＡＲ−２の活性の測定方法を提供するものであり、本発明の測定方法は簡便にかつ正確にＰＡＲ−２の活性を測定することができ、被検物質のＰＡＲ−２に対する作用を検出又は定量することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、野生型マウスおよびＰＡＲ−２−／−マウスにおけるピクリルクロライド（ＰＣ）またはオキサゾロン（Ｏｘ）誘発遅延型アレルギー反応試験の結果を示すものである。図１ＡはＰＣ誘発接触性皮膚炎モデルの結果を示し、図１ＢはＯｘ誘発接触性皮膚炎モデルの結果を示す。各々左側は野生型マウスを示し、右側はＰＡＲ−２−／−マウスの場合を示す。図１Ａ及びＢの縦軸は、誘発前後の耳介厚の差（×１０−２ｍｍ）を示す。各数値は、平均値および標準誤差を表わす。＊＊印は統計学的有意差（Ｐ＜０．０１）があることを示す。
【図２】図２は、野生型マウスおよびＰＡＲ−２−／−マウスにおけるＰＣまたはＯｘ誘発遅延型アレルギー反応のヘマトキシリン・エオジン染色標本の組織病理像を示す図面に代わるカラー写真である。野生型マウス（図２Ａ，Ｃ，Ｅ）およびＰＡＲ−２−／−マウス（図２Ｂ，Ｄ，Ｆ）をそれぞれ、溶媒（オリーブオイル；図２Ａ，Ｂ）、ＰＣ（図２Ｃ，Ｄ）またはＯｘ（図２Ｅ，Ｆ）で処置したものである。バーの長さは、１００μｍを表わす。
【図３】図３は、野生型マウスおよびＰＡＲ−２−／−マウスにおける受身皮膚アナフィラキシー反応試験の結果を示すものである。図３の縦軸は色素の漏出量（μｇ）であり、左側は野生型マウスであり右側はＰＡＲ−２−／−マウスである。図３のカラムとバーは各群における平均値と標準誤差を表わす。
【図４】図４は、野生型マウスおよびＰＡＲ−２−／−マウスにおける完全フロイントアジュバント誘発間接炎に対するＰＡＲ−２欠損の影響を検討した結果を示すものである。図４の縦軸は膝関節直径の変化率（％）であり、■は野生型マウスを、○はＰＡＲ−２−／−マウスをそれぞれ示す。図４の各ポイントとバーは各測定点における平均値±標準誤差を表わす。
【図１】
2005523883.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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