(57)【要約】栄養補助食品組成物が、体重１kg当たり０．０１〜約３mgの１日投薬量を対象に投与するのに十分な量のビオチンと、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される少なくとも一つの付加的な成分とを含む。本組成物は、１型及び２型の糖尿病の処置、並びに前糖尿病又は耐糖能異常（ＩＧＴ）もしくは肥満を有する個体における２型糖尿病の予防に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体重１kg当たり０．０１〜約３mgの１日投薬量を対象に投与するのに十分な量のビオチンと、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される少なくとも一つの付加的な成分とを含む組成物。
【請求項２】
ビオチンと、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸及びリポ酸より選択される少なくとも一つの付加的な成分とが存在する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
パンテチンが存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
体重１kg当たり１〜約５０mgの１日投薬量を対象に投与するのに十分な量のパンテチンを含有している、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
ＥＧＣＧが存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
体重１kg当たり０．３〜約３０mgの１日投薬量を対象に投与するのに十分な量のＥＧＣＧを含有している、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
フィタン酸が存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
体重１kg当たり１〜約１００mgの１日投薬量を対象に投与するのに十分な量のフィタン酸を含有している、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
リポ酸が存在する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
体重１kg当たり０．３mg〜約３０mgの１日投薬量を対象に投与するのに十分な量のリポ酸が存在する、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
ポリコサノールが存在する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
体重１kg当たり０．００２mg〜約１．５mgの１日投薬量を対象に投与するのに十分な量のポリコサノールが存在する、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
投薬単位剤形で存在する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
投薬単位剤形が固形投薬単位剤形である、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
投薬単位剤形が約０．３５〜約２００mgのビオチンを含有している、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
投薬単位剤形が液状投薬単位剤形である、請求項１３記載の組成物。
【請求項１７】
投薬単位剤形が１ml当たり約０．３５〜約２００mgのビオチンを含有している、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
食品もしくは飲料、又は食品もしくは飲料用の補助組成物である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
一食分当たり約０．０３〜５０mgのビオチンと、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される少なくとも一つの付加的な成分とを含む食品又は飲料。
【請求項２０】
一食分当たり約０．０３〜５０mgのビオチンと、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸及びリポ酸より選択される少なくとも一つの付加的な成分とを含む食品又は飲料。
【請求項２１】
栄養補助食品組成物の製造における、ビオチンと、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される少なくとも一つの付加的な成分との使用であって、体重１kg当たり０．０１〜約３mgの１日投薬量を提供するのに十分な量のビオチンが使用される、使用。
【請求項２２】
栄養補助食品組成物の製造における、ビオチンと、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸及びリポ酸より選択される少なくとも一つの付加的な成分との使用であって、体重１kg当たり０．０１〜約３mgの１日投薬量を提供するのに十分な量のビオチンが使用される、使用。
【請求項２３】
栄養補助食品組成物が、食品もしくは飲料、又は食品もしくは飲料用の補助組成物である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
栄養補助食品組成物が、１型及び２型の糖尿病の処置、並びに前糖尿病又は耐糖能異常（ＩＧＴ）もしくは肥満を有する個体における２型糖尿病の予防のためのものである、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
栄養補助食品組成物が、１型及び２型の糖尿病の処置、並びに前糖尿病又は耐糖能異常（ＩＧＴ）もしくは肥満を有する個体における２型糖尿病の予防のための医薬組成物である、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
１型及び２型の糖尿病の処置、並びに前糖尿病又は耐糖能異常（ＩＧＴ）もしくは肥満を有する個体における２型糖尿病の予防のための方法であって、体重１kg当たり０．０１〜約３mgの１日投薬量のビオチンを、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される少なくとも一つの付加的な成分と共に、そのような処置を必要とする対象へ投与することを含む方法。
【請求項２７】
１型及び２型の糖尿病の処置、並びに前糖尿病又は耐糖能異常（ＩＧＴ）もしくは肥満を有する個体における２型糖尿病の予防のための方法であって、体重１kg当たり０．０１〜約３mgの１日投薬量のビオチンを、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸及びリポ酸より選択される少なくとも一つの付加的な成分と共に、そのような処置を必要とする対象へ投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真性糖尿病又は症候群Ｘ及び肥満のような耐糖能異常に関連したその他の状態の処置又は予防のための活性成分としてのビオチンと、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される少なくとも一つの付加的な成分とを含む新規栄養補助食品組成物に関する。一つの面において、本発明は、体重１kg当たり０．０１〜約３mgの１日投薬量を対象に投与するのに十分な量のビオチンと、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される少なくとも一つの付加的な成分とを含む組成物に関し、そして、該処置又は予防のための栄養補助食品としての、例えば、正常な代謝機能の維持にとって不可欠であるが体内では合成されないビタミン及びミネラルを含むマルチビタミン製剤への添加剤としての、そのような組成物の使用に関する。さらなる面において、本発明は、付加的な成分が、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸及びリポ酸より選択される、そのようなビオチン組成物、及びそれらの使用に関する。
【０００２】
本発明の組成物は、特に、１型及び２型の糖尿病の処置、並びに前糖尿病又は耐糖能異常（ＩＧＴ）もしくは肥満を有する個体における２型糖尿病の予防のためのものである。
【０００３】
活性成分、即ちビオチンと、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される少なくとも一つの付加的な成分との組み合わせを含む組成物は、ブドウ糖代謝及びインスリン感受性に対する異なる作用機序を有し、従って、糖尿病の処置において付加的及び／又は共同的な効果を提供する。
【０００４】
栄養補助食品（neutraceutical）という用語は、ここで使用されるように、栄養的及び医薬的な適用領域の両方における有用性を意味する。従って、新規栄養補助食品組成物は、食品及び飲料への補助剤として、そして、カプセル剤もしくは錠剤のような固形製剤又は液剤もしくは懸濁剤のような液状製剤であり得る経口又は非経口の適用のための医薬製剤として、有益であり得る。上記から明白であろうように、栄養補助食品組成物という用語は、ビオチンと、パンテチン又はその代謝産物、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される少なくとも一つの付加的な成分とを含有している食品及び飲料、並びに前記活性成分を含有している補助組成物も含む。
【０００５】
糖尿病は、現在のところ治療法を有していない、広く蔓延した慢性疾患である。糖尿病の罹患率及び有病率は指数関数的に増加しており、それは、先進国及び発展途上国における最も一般的な代謝障害のうちの一つである。真性糖尿病は、複数の原因に由来し、インスリン分泌の欠損及び又はインスリン抵抗性に関連した炭水化物、タンパク質及び脂肪の代謝異常を特徴とする、複雑な疾患である。これは、未処置のまま放置されれば合併症へと至る、絶食時及び食後の血清ブドウ糖の上昇をもたらす。この疾患には、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、１型）及びインスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、２型）という２つの主要なカテゴリが存在する。
【０００６】
１型及び２型の糖尿病は、高血糖、高コレステロール血症及び高脂血症に関連している。１型及び２型の糖尿病におけるインスリンに対する非感受性及び絶対的なインスリン欠損は、肝臓、筋肉及び脂肪組織によるブドウ糖利用の減少、並びに血糖値の増加へと至る。コントロールされない高血糖は、腎症、神経障害、網膜症、高血圧、脳卒中及び心疾患を含む微小血管性及び大血管性疾患のリスクの増加による、増加した早発性の死亡率に関連している。最近の証拠は、厳密な血糖コントロールが、１型及び２型両方の真性糖尿病におけるこれらの合併症の予防の主要な要因であることを示した。従って、薬物又は治療計画による最適な血糖コントロールは、糖尿病の処置のための重要なアプローチである。
【０００７】
２型糖尿病の治療は、まず、食事及び生活様式の変化を含み、これらの措置が適切な血糖コントロールを維持できない場合、患者は、経口血糖降下剤及び／又は外因性インスリンにより処置される。現在の２型糖尿病の処置のための経口薬理学的薬剤は、インスリン分泌を強化するもの（スルホニル尿素剤）、肝臓におけるインスリンの作用を改善するもの（ビグアナイド剤）、インスリン感作剤（チアゾリジンジオン類）及びブドウ糖の取り込みを阻害するよう作用する薬剤（α−グルコシダーゼ阻害薬）を含む。しかしながら、現在入手可能な薬剤は、一般に、膵細胞機能の進行性の損失に起因する高血糖の進行性の悪化のため、長期にわたり適切な血糖コントロールを維持することができない。目標血糖値を維持することができる患者の割合は、時間と共に著しく減少し、付加的／代替的な薬理学的薬剤の投与が必要となる。さらに、薬物は、不要な副作用を有している場合があり、高い一次性及び二次性の失敗率に関連している。最後に、血糖降下薬の使用は、血糖値のコントロールにおいて有効であるかもしれないが、糖尿病の全ての合併症を予防することはできない。従って、全ての型の真性糖尿病のための現在の処置の方法は、正常血糖の理想及び糖尿病合併症の予防を達成することができていない。
【０００８】
従って、１型及び２型の糖尿病の処置において選択される治療法は、本質的にはインスリン及び経口血糖降下薬の投与に基づくが、糖尿病の処置及び予防のための最小の副作用を有する安全かつ有効な栄養補助剤の必要が存在している。多くの患者が、高用量の薬物に関連した副作用を最小限に抑えることができ、付加的な臨床的利点を与えることができる代替的な療法に関心を抱いている。糖尿病を有する患者は、補佐的な処置として使用され得る、穏やかな抗糖尿病効果を有し、主要な副作用のない、「天然」と見なされる処置に、特別な関心を抱いている。２型糖尿病は、インスリン産生を担う膵細胞に重大な傷害が起こるまで通常は認識されない、進行性かつ慢性の疾患である。従って、糖尿病発症のリスクを有する人々、特にその高いリスクを有する高齢者において糖尿病の発症を予防するために使用され得る栄養補助食品の開発への関心も増してきている。さらに、２型は、複数の器官部位に共存する欠陥：筋肉及び脂肪組織におけるインスリン作用に対する抵抗性、膵臓インスリン分泌の欠損、脂質異常に関連した無制限の肝ブドウ糖産生並びに内皮機能障害に起因する複雑な疾患である。従って、２型糖尿病における複数の病態生理学的病変のため、組み合わせ療法は、その管理のための魅力的なアプローチである。
【０００９】
特に、異なる作用機序を個々に発揮するパンテチンもしくはその代謝産物、ＥＧＣＧ及び／又はフィタン酸と特別に組み合わせられた、体重１kg当たり約０．０１〜３mgの１日投薬量のビオチンの使用は、糖尿病患者における目標血糖値の達成及び維持において有効である。
【００１０】
上記において同定された活性成分の組み合わせは、異なる作用のため、付加的／共同的な効果及び多器官効果を活用するために好ましい。個々の活性成分の別個の作用機序のため、その組み合わせは、血糖コントロールを改善するのみならず、いくつかの情況においては薬物の投薬量を減少させ、副作用を最小限に抑える。別個の作用の機序及び部位のため、前述の栄養補助食品の特別の組み合わせは、単一薬剤が達成し得るより大きな程度のブドウ糖降下を達成するために、付加的／共同的な効果を活用する。従って、１型及び２型の糖尿病の治療的処置において選択される療法は、本質的にはインスリン及び経口血糖降下薬の投与に基づくが、適当な栄養学的療法も、糖尿病の処置の成功にとって大いに重要である。
【００１１】
本発明の栄養補助食品組成物の各活性成分の機能を、以下に記載する。
【００１２】
ビオチン：ビオチンの補給は、肝ブドウ糖クリアランスを増強するため、循環血中ブドウ糖濃度を低下させ、肝ＰＥＰＣＫ活性の減少を誘導する。ＰＥＰＣＫは、肝糖新生の最初のコミットされた（committed）工程を触媒する律速サイトゾル酵素である。肝ＰＥＰＣＫ活性の減少は、肝ブドウ糖出力の減少をもたらす。本発明により、経口的（２〜１６mg／日）又は非経口的（０．１mg／日）に与えられたビオチンが、糖尿病ＫＫマウス（ＮＩＤＤＭモデル）、ストレプトゾトシン糖尿病ラット（ＩＤＤＭ）及び前糖尿病オオツカロングエバンストクシマファッティ（Otsuka Long-Evans Tokushima fatty）（ＯＬＥＴＦ）ラット（ＮＩＤＤＭ）において、経口耐糖能を改善することが見出された。予備的なヒト研究は、１型及び２型の糖尿病患者において、ビオチン補給の後、絶食時血糖値が低下することを示した。
【００１３】
従って、高用量のビオチンは、１型及び２型の糖尿病患者における高血糖を改善し得る。ビオチンは、肝ブドウ糖出力を減少させ、ブドウ糖により刺激されるインスリン分泌に利益を与える。従って、ビオチンと、末梢インスリン感受性を改善する生成物との組み合わせは、糖尿病管理において有用である。そのような生成物は、特に、フィタン酸及びリポ酸である。
【００１４】
ＥＧＣＧ：没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）は、緑茶中に見出される主要なカテキンである。ラットにおいて、緑茶カテキンは、デンプン又はショ糖の豊富な食事の後の血漿中のブドウ糖及びインスリンの濃度の上昇を用量依存的に抑制した。本発明によるビオチンとＥＧＣＧとの組み合わせは、耐糖能異常を有している患者、老化により食後ブドウ糖の上昇を発症する高齢患者及び未診断の糖尿病を有する患者にとって特に有用である。
【００１５】
パンテチン：ヒト研究において、パンテチンの経口投与は、総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールの進行性の減少及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールの増加をもたらし、従って、心血管リスクを低下させる、より望ましいＣｈｏｌ／ＨＤＬ比率をもたらした。真性糖尿病は、冠動脈疾患のリスクの３〜４倍の増大に関連している。２型真性糖尿病は、血漿脂質プロファイルに悪影響を与え、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）及び超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）のようなアテローム生成脂質のレベルを上昇させ、抗アテローム生成脂質である高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のレベルを低下させる。アテローム性動脈硬化の出現は、糖尿病を有する個体において一般的であるのみならず、重大な長期的合併症をもたらす。従って、パンテチンの経口補給は、糖尿病患者が脂質値を正常化し、冠動脈心疾患及び血栓イベントのリスクを低下させるのを助ける。パンテチンの代わりに、又はパンテチンに加え、システアミンのようなパンテチンの代謝産物も、本発明において有益であり得る。
【００１６】
リポ酸：リポ酸（１，２−ジチオラン−３−ペンタエン酸）は、ブドウ糖からエネルギーを発生させるミトコンドリア特異的経路において不可欠の役割を果たしており、ブドウ糖酸化の速度に潜在的に影響する。リポ酸は、培養中の筋肉細胞及び脂肪細胞の両方においてブドウ糖輸送を刺激する。さらに、リポ酸の投与は、ブドウ糖不耐性で、非インスリン依存性糖尿病の動物の骨格筋による基底のブドウ糖取り込み及びインスリンにより刺激されるブドウ糖取り込みも上昇させた。さらに、リポ酸は、２型を有する患者におけるブドウ糖処分を改善し、糖尿病関連合併症を予防かつ／又は処置するため、そしてインスリン感作活性を有する薬剤として、本発明の栄養補助食品組成物に配合し得る。
【００１７】
フィタン酸：約１０〜ｌ００μMの範囲の濃度のフィタン酸（３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデカン酸）は、ラット初代肝細胞におけるブドウ糖取り込みを増強する。シグリタゾンのような特異的ＰＰＡＲ−γアゴニストと比較して、フィタン酸は、前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化に対して軽微な効果のみを発揮する。従って、フィタン酸の摂取は、ＰＰＡＲ及びＲＸＲの活性化を通して、インスリン感受性の改善を助け、２型糖尿病及び症候群Ｘに対する予防措置として作用し得る。
【００１８】
ポリコサノール：ポリコサノールは、植物ロウ、主としてサトウキビから単離され精製された第一級脂肪族アルコールの混合物である。この混合物の脂肪族アルコールは、炭素原子１８〜４０個の範囲の鎖長を有するＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２ＯＨアルコールである。この混合物の典型的な脂肪族アルコールは、オクタコサノール、ヘキサコサノール、ヘプタコサノール、トリアコンタノール及びドトリアコンタノール（dotriacontanol）である。ポリコサノールは、動物モデル、健康有志者及びＩＩ型高コレステロール血症を有する患者においてコレステロールを低下させることが示されている。従って、それは、２型真性糖尿病に関連した異脂肪血症において有用である。
【００１９】
マルチビタミン及びミネラルの補助剤も、食事に欠けている必須栄養素を適切な量得るため、本発明の栄養補助食品組成物に添加され得る。マルチビタミン及びミネラルの補助剤は、疾患予防、並びに生活様式パターン及び糖尿病において観察されることのある一般的な不適切な食事パターンによる栄養の損失及び不足からの防御のためにも有用であり得る。さらに、酸化体ストレスが、インスリン抵抗性の発症と関連づけられている。活性酸素種は、インスリン受容体シグナル伝達カスケードを妨害することにより、インスリンにより刺激されるブドウ糖取り込みを障害し得る。α−トコフェロール（ビタミンＥ）アスコルビン酸（ビタミンＣ）のような抗酸化剤による酸化体ストレスのコントロールは、糖尿病の処置において有用であるかもしれない。従って、マルチビタミン補助剤の摂取は、良好なバランスのとれた栄養を維持するため、前記の活性物質に添加され得る。
【００２０】
本発明の栄養補助食品組成物は、１日当たり体重１kg当たり約０．０１〜３mg、好ましくは１日当たり体重１kg当たり約０．１〜０．５mgの投薬量を対象に投与するのに十分な量のビオチンを含有している。従って、栄養補助食品組成物が、食品又は飲料である場合、それらに含有されるビオチンの量は、好適には、一食分当たり約０．０３〜５０mgの範囲にある。栄養補助食品組成物が医薬製剤である場合、そのような製剤は、固形投薬単位、例えば、カプセル剤もしくは錠剤１個当たり約０．３５〜２００mg、又は液状製剤中の対応する投薬量、もしくは１日用量当たり約０．３５〜２００mgを含有し得る。
【００２１】
本発明の好ましい面において、本発明の栄養補助食品組成物は、さらにパンテチンを含有する。組成物中のパンテチンの量は、それが投与される対象の体重１kg当たり約１〜５０mgの１日投薬量を提供するようなものであり得る。食品又は飲料は、好適には、一食分当たり約２０〜８００mgのパンテチンを含有する。栄養補助食品組成物が医薬製剤である場合、そのような製剤は、投薬量単位当たり、例えば、カプセル剤もしくは錠剤１個当たり約２０〜１０００mg、又は液状製剤の１日用量当たり約７０〜３５００mgの量のパンテチンを含有し得る。
【００２２】
ＥＧＣＧが本発明に係る組成物の中に存在する場合、その量は、それが投与される対象の体重１kg当たり約０．３〜３０mgの１日投薬量を提供するようなものであり得る。食品又は飲料は、好適には、一食分当たり約５〜５００mgのＥＧＣＧを含有する。栄養補助食品組成物が医薬製剤である場合、そのような製剤は、投薬量単位当たり、例えば、カプセル剤もしくは錠剤１個当たり約１０〜５００mg、又は液状製剤の１日用量当たり約２０〜２０００mgの量のＥＧＣＧを含有し得る。
【００２３】
フィタン酸が本発明に係る栄養補助食品組成物の中に存在する場合、その量は、それが投与される対象の体重１kg当たり約１〜１００mgの１日投薬量を提供するようなものであり得る。食品又は飲料は、好適には、一食分当たり約２０〜２０００mgのフィタン酸を含有する。栄養補助食品組成物が医薬製剤である場合、そのような製剤は、投薬量単位当たり、例えば、カプセル剤もしくは錠剤１個当たり約３０〜５００mg、又は液状製剤の１日用量当たり約７０〜７０００mgの量のフィタン酸を含有し得る。フィタン酸は、エステル、例えば、メチルエステル又はエチルエステルのような生物学的に等価な誘導体の形態で使用されてもよい。
【００２４】
リポ酸が本発明に係る栄養補助食品組成物の中に存在する場合、その量は、それが投与される対象の体重１kg当たり約０．３〜３０mgの１日投薬量を提供するようなものであり得る。食品又は飲料は、好適には、一食分当たり約５〜５００mgのリポ酸を含有する。栄養補助食品組成物が医薬製剤である場合、そのような製剤は、投薬量単位当たり、例えば、カプセル剤もしくは錠剤１個当たり約５〜８００mg、又は液状製剤の１日用量当たり約５〜２０００mgの量のリポ酸を含有し得る。
【００２５】
ポリコサノールが本発明に係る栄養補助食品組成物の中に存在する場合、その量は、それが投与される対象の体重１kg当たり約０．００２〜１．５mgの１日投薬量を提供するようなものであり得る。食品又は飲料は、好適には、一食分当たり約０．１〜２０mgのポリコサノールを含有する。栄養補助食品組成物が医薬製剤である場合、そのような製剤は、投薬量単位当たり、例えば、カプセル剤もしくは錠剤１個当たり約０．１〜３０mg、又は液状製剤の１日用量当たり約０．１〜１００mgの量のポリコサノールを含有し得る。
【００２６】
本発明の栄養補助食品組成物は、好ましくは、ビオチンとパンテチンとの組み合わせを含む。以下を含む組成物も好ましい。
ビオチン及びフィタン酸； 
ビオチン及びＥＧＣＧ；
ビオチン及びリポ酸；
ビオチン、フィタン酸及びＥＧＣＧ；
ビオチン、フィタン酸及びパンテチン；
ビオチン、パンテチン及びＥＧＣＧ；並びに
ビオチン、フィタン酸、パンテチン及びＥＧＣＧ。
【００２７】
投薬量範囲（７０kgのヒトの場合）
ビオチン：０．７〜２１０mg／日
ＥＧＣＧ：２０〜２１００mg／日
パンテチン：７０〜３５００mg／日
フィタン酸：７０〜７０００mg／日
リポ酸：２０〜２１００mg／日
ポリコサノール：０．１５〜１００mg／日
【００２８】
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。
【００２９】
Ａ．医薬組成物は、下記の成分を使用して、従来の製剤化手順により調製した。
【００３０】
実施例１：軟ゼラチンカプセル剤
軟ゼラチンカプセル剤は、下記の成分を使用して、従来の手順により調製した。
活性成分：ビオチン３０mg  パンテチン１００mg
その他の成分：グリセロール、水、ゼラチン、植物油
【００３１】
実施例２：硬ゼラチンカプセル剤
硬ゼラチンカプセル剤は、下記の成分を使用して、従来の手順により調製した。
活性成分：ビオチン３０mg  パンテチン１００mg
その他の成分：
増量剤：乳糖又はセルロースもしくはセルロース誘導体  十分量
滑沢剤：必要であれば、ステアリン酸マグネシウム（０．５％）
【００３２】
実施例３：錠剤
錠剤は、下記の成分を使用して、従来の手順により調製した。
活性成分：ビオチン２０mg、パンテチン５０mg
その他の成分：微晶質セルロース、二酸化シリコン（ＳｉＯ2）、ステアリン酸マグネシウム、クロスカルメロースナトリウム
【００３３】
Ｂ．食品アイテムは、下記の成分を使用して、従来の手順により調製した。
【００３４】
実施例４：３０％ジュースを含むソフトドリンク
活性成分：
ビオチン、並びに場合により、パンテチン、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される一つ以上の付加的な成分を、この食品アイテムに配合した。
ビオチン：一食分当たり０．０３〜５０mg
パンテチン：一食分当たり２０〜８００mg
ＥＧＣＧ：一食分当たり５〜５００mg
フィタン酸：一食分当たり２０〜２０００mg
リポ酸：一食分当たり５〜５００mg
ポリコサノール：一食分当たり０．１〜２０mg
典型的な一食分：２４０ml
【００３５】
Ｉ．ソフトドリンク化合物は以下の成分から調製した。
ジュース濃縮物及び水溶性香料
［g］
オレンジ濃縮物  ６０．３°Ｂｒｉｘ、５．１５％酸性度  ６５７．９９
レモン濃縮物  ４３．５°Ｂｒｉｘ、３２．７％酸性度    ９５．９６
オレンジ香料、水溶性                                  １３．４３
アンズ香料、水溶性                                    ６．７１
水                                                    ２６．４６
【００３６】
１．２  着色料
β−カロテン１０％ＣＷＳ                              ０．８９
水                                                    ６７．６５
【００３７】
１．３  酸及び抗酸化剤
アスコルビン酸                                        ４．１１
無水クエン酸                                          ０．６９
水                                                    ４３．１８
【００３８】
１．４  安定剤
ペクチン                                              ０．２０
安息香酸ナトリウム                                    ２．７４
水                                                    ６５．６０
【００３９】
１．５  油溶性香料
オレンジ香料、油溶性                                  ０．３４
オレンジ油  蒸留物                                    ０．３４
【００４０】
１．６  活性成分
前記の濃度の活性成分（これは、前記の活性成分：ビオチン、並びにＥＧＣＧ、パンテチン、リポ酸及び／又はフィタン酸のうちの一つ以上を意味する）。
【００４１】
果汁濃縮物及び水溶性香料を、空気の取り込みなしに混合した。着色料を脱イオン水に溶解させた。アスコルビン酸及びクエン酸を水に溶解させた。安息香酸ナトリウムを水に溶解させた。撹拌しながらペクチンを添加し、煮沸して溶解させた。その溶液を冷却する。オレンジ油及び油溶性香料を、予備混合した。１．６で言及されたような活性成分を、乾燥混合し、次いで好ましくは果汁濃縮物混合物（１．１）へと撹拌した。
【００４２】
ソフトドリンク化合物を調製するため、全パート３．１．１〜３．１．６を共に混合した後、ツラックス（Turrax）、次いで高圧均質化装置（ｐ１＝２００バール、ｐ２＝５０バール）を使用して均質化した。
【００４３】
ＩＩ．ボトリングシロップ（Bottling syrup）は、以下の成分から調製した：
［g］
ソフトドリンク化合物        ７４．５０
水                          ５０．００
糖シロップ  ６０°Ｂｒｉｘ  １５０．００
【００４４】
ボトリングシロップの成分を、共に混合した。ボトリングシロップを、水で、１ｌのストレート（ready to drink）飲料へと希釈した。
【００４５】
変法：
安息香酸ナトリウムを使用する代わりに、飲料を低温殺菌してもよい。飲料は、炭化されてもよい。
【００４６】
実施例５：五穀パン
活性成分：
ビオチン、並びにパンテチン、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される一つ以上の付加的な成分を、この食品アイテムに配合した。
ビオチン：一食分当たり０．０３〜５０mg
パンテチン：一食分当たり２０〜８００mg
ＥＧＣＧ：一食分当たり５〜５００mg
フィタン酸：一食分当たり２０〜２０００mg
リポ酸：一食分当たり５〜５００mg
ポリコサノール：一食分当たり０．１〜２０mg
典型的な一食分：５０g
［％］
五穀粉    ５６．８
水        ３９．８
イースト  ２．３
塩        １．１
【００４７】
イーストを水の一部に溶解させた。生地を形成するため、全ての成分を共に混合した。塩は混捏時間の終わりに添加した。発酵後、生地を再加工（reworked）し分割した後、ローフ（loaf）を形成した。焼成の前に、ローフの表面にはけで水を塗り、小麦粉を振りかけた。
【００４８】
手順パラメータ：
混捏：
螺旋型混捏システム  ４分  第１ギア；５分  第２ギア
生地膨化（proofing）：６０分
生地温度：２２〜２４℃
膨化時間：３０分
焼成：
オーブン：ダッチタイプオーブン
焼成温度：２５０／２２０℃
焼成時間：５０〜６０分
【００４９】
実施例６：ミラノタイプクッキー
活性成分：
ビオチン、並びにパンテチン、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される一つ以上の付加的な成分を、この食品アイテムに配合した。
ビオチン：一食分当たり０．０３〜５０mg
パンテチン：一食分当たり２０〜８００mg
ＥＧＣＧ：一食分当たり５〜５００mg
フィタン酸：一食分当たり２０〜２０００mg
リポ酸：一食分当たり５〜５００mg
ポリコサノール：一食分当たり０．１〜２０mg
典型的な一食分：３０g
［g］
小麦粉、タイプ５５０  ４１．０
砂糖                  ２０．５
脂肪／バター          ２０．５
全卵（液状）          １８．０
レモン香料            十分量
ベーキング剤          十分量
【００５０】
スイートショートペストリーを形成するため、全成分を混合下で徐々に添加した。その後、ペストリーを少なくとも２時間低温（４℃）で維持した後、ペストリーをおよそ５mmの厚さに平らにした。小片に切り分け、表面にはけで卵黄を塗った後、焼成した。
【００５１】
焼成：
オーブン：ファンオーブン
焼成温度：１８０℃
焼成時間：１５分
【００５２】
実施例７：トースト
活性成分：
ビオチン、並びにパンテチン、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される一つ以上の付加的な成分を、この食品アイテムに配合した。
ビオチン：一食分当たり０．０３〜５０mg
パンテチン：一食分当たり２０〜８００mg
ＥＧＣＧ：一食分当たり５〜５００mg
フィタン酸：一食分当たり２０〜２０００mg
リポ酸：一食分当たり５〜５００mg
ポリコサノール：一食分当たり０．１〜２０mg
典型的な一食分：１００g
［％］
小麦粉  タイプ５５０  ５５．４
水                    ３３．２
イースト              ２．８
塩                    １．１
脂肪／バター          ５．５
麦芽                  ０．６
乳化ベーキング剤      １．４
【００５３】
イーストを水の一部に溶解させた。生地を形成するため、全成分を共に混合した。塩は混捏時間の終わりに添加した。その後、生地を再加工し分割し、発酵のためベーキングティン（baking tin）内に置いた。焼成後、ローフを直接取り出した。
【００５４】
プロセスパラメータ：
混捏：
螺旋型混捏システム  ５〜６分  第１ギア；３〜４分  第２ギア
生地膨化：なし
生地温度：２２〜２４℃
膨化時間：４０分
焼成：
オーブン：ダッチタイプオーブン
焼成温度：２２０℃
焼成時間：３５〜４０分
【００５５】
実施例８：ヨーグルト−静置型、脂肪分３．５％
活性成分：
ビオチン、並びにパンテチン、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される一つ以上の付加的な成分を、この食品アイテムに配合した。
ビオチン：一食分当たり０．０３〜５０mg
パンテチン：一食分当たり２０〜８００mg
ＥＧＣＧ：一食分当たり５〜５００mg
フィタン酸：一食分当たり２０〜２０００mg
リポ酸：一食分当たり５〜５００mg
ポリコサノール：一食分当たり０．１〜２０mg
典型的な一食分：２２５g
［％］
全脂肪乳（脂肪分３．８％）  ９０．５
脱脂粉乳                    ２．０
砂糖                        ５．０
培養物                      ２．５
【００５６】
牛乳を３５℃に加熱した後、粉乳、安定剤、砂糖及び活性成分を添加した。この混合物を６５℃に加熱し、全成分を溶解させた。次いで、その混合物を、６５℃の高圧均質化装置（ｐ１＝１５０バール、ｐ２＝５０バール）で均質化した。次いで、このエマルジョンを、８０℃で２０分間低温殺菌した。４５℃に冷却した後、天然ヨーグルト／培養物を添加し混合した。次いで、この混合物をカップに充填し、４．３のｐＨに達するまで４５℃で３〜４時間発酵させ、次いで４℃で保管した。
【００５７】
実施例９：ヨーグルト−撹拌型、脂肪分３．５％
ビオチン、並びに場合によりパンテチン、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される一つ以上の付加的な成分を、この食品アイテムに配合した。
ビオチン：一食分当たり０．０３〜５０mg
パンテチン：一食分当たり２０〜８００mg
ＥＧＣＧ：一食分当たり５〜５００mg
フィタン酸：一食分当たり２０〜２０００mg
リポ酸：一食分当たり５〜５００mg
ポリコサノール：一食分当たり０．１〜２０mg
典型的な一食分：２２５g
［％］
全脂肪乳（脂肪分３．８％）  ９０．２
脱脂粉乳                    ２．０
安定剤                      ０．３
砂糖                        ５．０
培養物                      ２．５
【００５８】
牛乳を３５℃に加熱した後、粉乳、安定剤、砂糖及び活性成分を添加した。この混合物を６５℃に加熱し、全成分を溶解させた後、６５℃の高圧均質化装置（ｐ１＝１５０バール、ｐ２＝５０バール）で均質化した。次いで、このエマルジョンを、８０℃で２０分間低温殺菌した。４５℃に冷却した後、天然ヨーグルト／培養物を添加し混合し、続いて、４．３のｐＨに達するまで４５℃で３〜４時間発酵させた。冷却し激しく撹拌した後、ヨーグルトをカップに充填し、４℃で保管した。
【００５９】
実施例１０：アイスクリーム、脂肪分８％
活性成分：
ビオチン、並びにパンテチン、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される一つ以上の付加的な成分を、この食品アイテムに配合した。
ビオチン：一食分当たり０．０３〜５０mg
パンテチン：一食分当たり２０〜８００mg
ＥＧＣＧ：一食分当たり５〜５００mg
フィタン酸：一食分当たり２０〜２０００mg
リポ酸：一食分当たり５〜５００mg
ポリコサノール：一食分当たり０．１〜２０mg
典型的な一食分：８５g
［％］
牛乳（脂肪分３．７％）  ６００．００
乳脂（脂肪分３５％）    １６６．００
脱脂粉乳                ４９．１０
砂糖                    １０９．００
ブドウ糖シロップ８０％  ７０．００
アイスクリーム安定剤    ５．００
香料  十分量
着色料  十分量
【００６０】
砂糖、脱脂分乳及び安定剤を牛乳及び乳脂に添加し、混合し、４５℃に加熱した。次いで、ストック溶液としての着色料及びブドウ糖シロップを添加し、活性成分も添加した。その混合物を加熱し低温殺菌した（８０℃、２０分）。次いで、均質化工程を行った。その後、混合物を絶えず撹拌しながら冷却し、香料を５℃で添加した。混合物を、５℃で少なくとも４時間熟成させ、次いで、アイスクリームマシンに通した（オーバーラン  およそ１００％）。アイスクリームをカップに充填し、−２０〜−３０℃で保管した。
【００６１】
実施例１１：ワインガム
活性成分：
ビオチン、並びにパンテチン、ＥＧＣＧ、フィタン酸、リポ酸及びポリコサノールより選択される一つ以上の付加的な成分を、この食品アイテムに配合した。
ビオチン：一食分当たり０．０３〜５０mg
パンテチン：一食分当たり２０〜８００mg
ＥＧＣＧ：一食分当たり５〜５００mg
フィタン酸：一食分当たり２０〜２０００mg
リポ酸：一食分当たり５〜５００mg
ポリコサノール：一食分当たり０．１〜２０mg
典型的な一食分：３０g
［g］
ゼラチン２００ブルーム    ８０．０
水Ｉ                      １２５．０
砂糖結晶                  ２９０．０
水ＩＩ                    １２０．０
ブドウ糖シロップＤＥ３８  ３９０．０
クエン酸                  １０．０
香料                      ２．０
着色料                    十分量
全量                      およそ１０００．０
【００６２】
ゼラチンを水Ｉに分散させ、撹拌し、蒸気浴上で加熱するか又はマイクロ波を使用することにより溶解させた。砂糖を水ＩＩと混合し、透明な溶液が得られるまで煮沸した。熱源から除去した。溶解した砂糖溶液がまだ熱い間に、ブドウ糖シロップと混合した。徐々にゼラチン溶液を添加した。表面の泡が除去され得、６０〜６５℃に達するまで、休ませた。撹拌しながら、香料、クエン酸及び着色料溶液、並びに活性成分を添加した。スターチトレー（starch tray）へと印刷された型へ投入し、室温で少なくとも４８時間放置した。デンプン粉末を除去し、油又はロウで仕上げを施した。室温で乾燥させ、気密小袋に包装した。
【００６３】
実施例１２
ビオチン及びフィタン酸の組み合わせ、並びに単独の両化合物のブドウ糖除去に対する効力を、Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ  ｄｂ／ｄｂマウスにおける５週間の研究において試験した（ｎ＝７〜８／群）。この重度の高血糖症を有する末期（late）２型糖尿病のモデルは、抗糖尿病化合物の効力を決定するために広範に使用されている。
【００６４】
雄ｄｂ／ｄｂマウスを、ジャクソン研究所（Jackson Laboratory)(Bar Harbor, ME, USA）より入手した。８週齢の成体マウスを実験に使用した。マウスは、敷きわらを備えたプラスチックケージに個々に収容し、標準的なげっ歯動物用飼料及び水道水を自由に摂取させた。動物飼育室は、温度（２４℃）、湿度（５５％）及び光（１２ｈ明暗周期）についてコントロールされていた。動物を、無作為に４群に分割した。ビオチン及びフィタン酸は、飼料添加剤（feed-ad-mix）として投与された。コーン油（食事の１％）を、ビオチン及びフィタン酸のための担体物質として用い、単独で使用してプラセボとしても用いた。群１にはプラセボを与え、群２には８mg／kg体重（ＢＷ）／日の用量のビオチンを与え、群３には３００mg／kg  ＢＷ／日の用量のフィタン酸を与え、群４には、それぞれ８及び３００mg／kg  ＢＷ／日の用量のビオチン及びフィタン酸の組み合わせを与えた。４週間の処置の後、経口ブドウ糖負荷（１g／kg体重）の９０分後、１２０分後、１５０分後及び１８０分後にブドウ糖除去を査定した。血糖値の測定のため、９０分後、１２０分後、１５０分後、１８０分後に尾静脈から血液試料を採取した。血糖は、ブドウ糖分析装置（Glucotrend Premium, Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland）により測定した。全てのデータが、各食事群の動物についての平均値として表される。食事群間の平均値の差の統計的有意性は、一元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）により試験した。有意差が見出された場合には、ダネットの多重比較検定を使用して、各群をコントロール群と比較した。０．０５未満のＰ値を有意と見なした。全ての分析をスタティスティカ（Statistica）（バージョン5.5A, StatSoft, Inc）により実施した。
【００６５】
ブドウ糖負荷（１gブドウ糖／kg体重）中、ビオチン及びフィタン酸の組み合わせにより処置された動物の血糖値は、全ての時点で、コントロール群と比較して、より低かった。単治療法として使用された場合には、ビオチンもフィタン酸も、ブドウ糖レベルの有意な減少を引き起こさなかった。
【００６６】
ビオチン及びフィタン酸による組み合わせ治療は、ブドウ糖除去速度（ＧＲＲ）に対して予想外の相乗効果を及ぼした。ＧＲＲとは、ブドウ糖が血中から除去され、末梢組織へと差し向けられる速度と定義される。ブドウ糖負荷の適用の９０分後、１２０分後、１５０分後及び１８０分後、ビオチン及びフィタン酸の組み合わせにより処置された動物における血糖値は、ビオチン又はフィタン酸による単独療法による減少から予想されるよりも大きな程度に低下した。これらの事実は、ビオチン及びフィタン酸の組み合わせにより処置された動物において、ＧＲＲが相乗的に増強されることを示している。ＧＲＲを評価するため、ブドウ糖レベルを、コントロール群と比較した各群のブドウ糖レベルの変化率として表した。ＧＲＲの値は表１に示した。予想ＧＲＲとは、単独療法として使用された場合のビオチン及びフィタン酸により発揮されるＧＲＲの合計と定義される。
【００６７】
表１
ビオチン、フィタン酸及び両化合物の組み合わせにより処置されたｄｂ／ｄｂマウスにおけるＯＧＴＴの９０分目、１２０分目、１５０分目及び１８０分目におけるブドウ糖除去速度（コントロールに対する％ブドウ糖減少）
【表１】
2005536543.tif 000002
【００６８】
表１は、ビオチン及びフィタン酸の組み合わせを補給された群における効果が、ビオチン及びフィタン酸を単独で与えられた群の効果の合計より大きいことを示している。従って、ビオチン及びフィタン酸の組み合わせは、ブドウ糖代謝に対して相乗効果を有する。
【００６９】
実施例１３
肝ブドウ糖代謝に関与している遺伝子の相乗的な制御に対する、化合物ＥＧＣＧ及びシステアミンと組み合わせられたビオチンの効果を調査した。アフィメトリックスジーンチップ（Affymetrix GeneChip）（登録商標）高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイアプローチを、Ｈ−４−ＩＩ−Ｅラット肝細胞における包括的な遺伝子発現を決定するために選んだ。組み合わせ処置条件のうちの一つにおいて制御様式における相乗的な挙動を示した遺伝子をろ過し、ブドウ糖ホメオスタシスマーカー遺伝子をさらなる分析のために選択した。肝炭水化物代謝は、厳密に制御されている。二つの特異的酵素グルコキナーゼ（ＧＫ）及びグルコース−６ホスファターゼ（Ｇｌｃ６Ｐａｓｅ）は、肝臓がブドウ糖ホメオスタシスにおいて決定的な役割を果たすことを可能にする。ブドウ糖の過剰産生が、ヒトにおける絶食時高血糖及び真性糖尿病の主因であるため、Ｇｌｃ−６−Ｐａｓｅによるグルコース−６−リン酸の加水分解の調整は、循環系へとブドウ糖を放出する過程における遠位の速度決定酵素工程である。肝Ｇｌｃ−６−Ｐａｓｅ  ｍＲＮＡレベルの著しい上昇が、糖尿病動物モデルにおいて報告されている。従って、Ｇｌｃ−６−Ｐａｓｅの触媒サブユニットの発現を低下させ得る化合物又は化合物の組み合わせは、高血糖を正常化し、糖尿病状態を予防すると考えられる。ＥＧＣＧは、以前に、Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ細胞におけるＧｌｃ−６−Ｐａｓｅ  ｍＲＮａレベルを低下させることが示されている。ビオチンがラット肝細胞におけるＧＫの発現を誘導し得ることも既知である。
【００７０】
細胞培養
Ｈ−４−ＩＩ−Ｅラット肝細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）から入手し、３７℃で、湿潤５％Ｃ０２雰囲気において１０％ウシ胎仔血清が補給されたメディウム（Medium）１９９（Invitrogen, Basel, Switzerland）において培養した。細胞をサブコンフルエンスで定期的に継代し、低い継代数で使用した。最終アッセイのため、細胞をトリプシン処理し、６穴細胞培養プレートに１×１０６細胞／ウェルの密度で播種し、さらに６時間、メディウム１９９＆０．１％ＢＳＡ（Invitrogen）で維持した後、化合物を適用した。ＥＧＣＧはＤＭＳＯに入れて適用し；システアミンは、まず１M  ＨＣｌに溶解させ、次いで、刺激培地に適用し、ビオチンは培地に直接溶解させた。２４時間の処理の後、全ＲＮＡを採集した。
【００７１】
高密度オリゴヌクレオチドアレイハイブリダイゼーション
２４個の試料全てを、アフィメトリックスジーンチップ（登録商標）アレイプロトコル（Affymetrix, Santa Clara, Ca, USA）に従って調製した。簡単に説明すると、全細胞ＲＮＡを、オンカラムＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩダイジェスト（on-column RNase-free DNase I digest)(Qiagen, Basel, Switzerland）を含むキアゲン（Qiagen）ＲＮｅａｓｙミニキット（Mini Kit）を使用することにより抽出した。Ｔ７−（Ｔ）２４プライマー（５’−ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧ（ｄＴ）２４−３’）を全ＲＮＡ  １０μgにアニーリングさせ、スーパースクリプト（Superscript）ＩＩ逆転写酵素（４００U）を利用して、ＤＴＴ、ｄＮＴＰ及びｌ×反応緩衝液の存在下で、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。第二鎖合成は、ｄＮＴＰの存在下でｌ×第二鎖緩衝液を含有している最終反応物にＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（４０U）、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ（１０U）及びＲＮａｓｅＨ（２U）を添加することにより実施した。最後に、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（１０U）（スーパースクリプト（Superscript）（登録商標）マイクロアレイカスタマイズドキット（Microarray Customized Kit), Invitrogen, Basel, CH）を使用して鎖を平滑末端化した。ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出により精製し、続いて、ｂｉｏ−１６−ＵＴＰ及びｂｉｏ−１１−ＣＴＰ（Roche Molecular Biochemicals, Penzberg, Germany）を組み込むインビトロ転写を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｔ７キット（Kit), Ambion, Texas, USA）を使用して３時間実施した。ＲＮｅａｓｙ精製の後、得られたｃＲＮＡ  １０μgを、９５℃で３５分間、４０mMトリス酢酸（ｐＨ８．１）、１００mM酢酸カリウム及び３０mM酢酸マグネシウムを使用して断片化した。アフィメトリックスジーンチップ（登録商標）発現分析技術マニュアル（Expression Analysis Technical Manual）に記載されたようにして、１００mM  ＭＥＳ緩衝液、１M  ＮａＣｌ、２０mM  ＥＤＴＡ、０．０１％トゥイーン２０、試料ｃＲＮＡ、断片化された細菌コントロールスパイク、ビオチン化されたオリゴ（oligo）９８４、ニシン精子ＤＮＡ（０．５μg/μl;Invitrogen）及びアセチル化されたＢＳＡ（０．２５μg/μl;Promega, Madison, WI, USA）を含有しているハイブリダイゼーションカクテルを調製した。次いで、試料を、４５℃で１６時間、アフィメトリックスジーンチップ（登録商標）ラット（Ｒａｔ）２３０（ＳｕｂＡ）へとハイブリダイズさせた。最後に、アレイを、ＥｕｋＧＥ−ＷＳ２ｖ３プログラムを有するジーンチップ（登録商標）フルイディクス（Fluidics）４００ステーション（Affymetrix）で洗浄し、抗体増幅プロトコルを使用して、ストレプトアビジンＲ−フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）による染色を２回実施した。
【００７２】
データ分析
生蛍光データを共焦点レーザー走査（Hewlett Packard, Palo Alto, Ca, USA）により収集し、アフィメトリックスマイクロアレイスイート（Affymetrix Microarray Suite）（ＭＡＳ４．０）により分析した。データ処理はＲＡＣＥ−Ａ分析ツール（Roche, Basel, Switzerland）を使用して実施した。全てのアレイを、全ての使用されたアレイ間の平均差（Average Difference)(AvgDiff）値の合計の平均値に対して規準化した。４未満の規準化ＡｖｇＤｉｆｆ値には、４という値を自動的に割り当てた。平均平均差値（Mean average difference values)(MeanAvgDiff）及び標準偏差（ＳＤ）をレプリケート試料から計算した。処置群は、媒体（Ｖ；０．１％ＤＭＳＯ）；単一化合物として適用された５０μM  ＥＧＣＧ（Ａ）、１μMビオチン（Ｂ）、５０μMシステアミン（Ｃ）、並びにＥＧＣＧ／ビオチン（Ｄ）及びシステアミン／ビオチン（Ｅ）の組み合わせであり；各実験をトリプリケートで実施した。包括的分析のため、ｐ＜０．０５の独立ｔ検定における有意水準と組み合わせられた最大相乗係数（synergistic factor）（ＳＦ）＞＋／−１を有する遺伝子をろ過した。処置群内の相対遺伝子発現は、平均平均差（MeanAvgDiff）と等しい。実験はレプリケートで行われたため、対応する平均値は、
【表２】
2005536543.tif 000003
である（ここで、媒体処置条件がＶであり、単一化合物がＸ又はＹであり、かつ多重組み合わせがＭである）。相乗係数（ＳＦ）は、媒体差し引き多重遺伝子発現と、媒体差し引き相加的遺伝子発現との比率と見なされ、従って、
【数１】
2005536543.tif 000004
である。
【００７３】
結果
Ｈ−４−ＩＩ−Ｅラット肝細胞を、媒体（０．１％ＤＭＳＯ）、単一化合物として適用された５０μM  ＥＧＣＧ、１μMビオチン、５０μMシステアミン、並びにＥＧＣＧ／ビオチン及びシステアミン／ビオチンの組み合わせのいずれかにより２４時間刺激した。全ＲＮＡ試料をｃＲＮＡプローブへと加工し、アフィメトリックスラット２３０（ＳｕｂＡ）アレイにハイブリダイズさせた。生蛍光データの計算を、アフィメトリックスＭＡＳ４．０プログラムで実施した。グルコース−６−ホスファターゼ遺伝子発現に関するMeanAvgDiff発現レベル、標準偏差（ＳＤ）及びＳＦの値を、ＲＡＣＥ−Ａプログラムで作製されたろ過された遺伝子のリストから取り出した。
【００７４】
【表３】
2005536543.tif 000005
【００７５】
グルコース−６−ホスファターゼ（アフィメトリックスＩｄ：１３７０７２５−ａ−ａｔ）の触媒サブユニットの遺伝子発現レベルは、アフィメトリックスジーンチップ法を使用して測定した。平均平均差（MeanAvgDiff）は、レプリケート試料の対比較により計算された。
【００７６】
肝臓がブドウ糖を産生することを可能にするＧｌｃ６Ｐａｓｅの活性は、肝糖新生の増強と一致して、短期絶食中に増加した。他方、肝臓がブドウ糖を利用することを可能にするＧＫ活性は絶食中に減少した。摂食状態においては、両酵素の活性の短期制御のメカニズムが、食後の期間に起きた。肝臓によるブドウ糖の過剰産生は、インスリン依存性真性糖尿病及びインスリン非依存性真性糖尿病の両方における絶食時高血糖の主因である。ブドウ糖出力の過程の遠位酵素工程は、グルコース−６−ホスファターゼ複合体により触媒された。表２から分かるように、ＥＧＣＧ／ビオチン又はシステアミン／ビオチンのいずれかで処理されたＨ−４−ＩＩ−Ｅ細胞は、グルコース−６−ホスファターゼの触媒サブユニットのメッセンジャーＲＮＡの予想外の相乗的な減少を示した。従って、表２のデータは、驚くべきことに、ラット肝細胞における主要なブドウ糖代謝律速酵素のうちの一つの発現のダウンレギュレーションにおいて、ビオチンが、ＥＧＣＧ又はパンテチン代謝産物システアミンと共に相乗的に作用することを示している。従って、そのような組み合わせ処置は、ブドウ糖出力を低下させ、従って、高血糖を低下させ、糖尿病を予防するであろう。
【国際調査報告】
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