(57)【要約】  本発明は、流加培養法を使用してＥ．ｃｏｌｉから炭疽防御抗原タンパク質を調製するためのプロセスに関する。このプロセスは、Ｅ．ｃｏｌｉから炭疽ＰＡを迅速に、効率的に、高い費用対効果で、高レベルで生成するための構成的発現系を生成する。このプロセスの工程は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を、ＰＡ遺伝子を含む組換え構成的発現プラスミドを用いて形質転換して、組換えＤＨ５α細胞を得る工程、ならびにその細胞を溶解した後、変性ゲル電気泳動およびＰＡ抗体を使用するウェスタンブロッティング技術によってＰＡ発現を試験する工程を包含する。この後に、発酵および高細胞密度細胞の収集が行われる。この細胞は、６モル濃度〜８モル濃度の尿素を使用して可溶化され、そして遠心分離によって分離される。この尿素変性されたＰＡが、上清から単離され、そして精製され、その後溶出される。
2005510215.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流加培養法を使用してＥ．ｃｏｌｉから炭疽防御抗原タンパク質を調製するためのプロセスであって、
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を、防御抗原遺伝子を含む組換え構成的発現プラスミドを用いて形質転換して、防御抗原タンパク質を発現する組換えＤＨ５α細胞を生成する工程、
該組換えＤＨ５α細胞を増殖させ、そして該細胞を溶解した後、変性ゲル電気泳動および防御抗原抗体を使用するウェスタンブロッティング技術によって該防御抗原の発現を試験する工程、
該細胞を、
ポリオール、糖質または有機酸を、３２℃〜４２℃のＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地における主要補充物として使用し、
流加培養法技術を使用し、かつ
栄養素欠乏を検知するｐＨ・ＤＯスタット法を使用して、
バイオリアクター中で発酵させて、防御抗原タンパク質を発現する高細胞密度培養物を生成して、高収量を生じる工程、
該高細胞密度培養物を５０００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍにて１０分間〜３０分間遠心分離することによって、該細胞を収集する工程、
６モル濃度〜８モル濃度の尿素溶液を使用し周囲温度にて１時間〜２時間攪拌することによって、該高細胞密度培養物の細胞を可溶化する工程、
３２℃〜４２℃にて１０，０００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍで３０分間〜６０分間遠心分離することによって該高細胞密度培養物の残骸を分離し、尿素変性した防御抗原を含む上清を収集する工程、
該尿素変性した防御抗原を該上清から単離し、そしてＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって、該防御抗原が該アフィニティカラムに結合している状態で尿素を次第に除去することによって、該尿素変性した防御抗原を精製する工程、ならびに
該精製した変性防御抗原を溶出し、そして即時使用かまたは長期使用かに依存して−２０℃〜−７０℃にて凍結アリコートとして防御抗原（ＰＡ）タンパク質を保存する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスであって、使用される前記組換え構成的発現プラスミドが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞株において前記防御抗原タンパク質を不溶性封入体として発現する、プロセス。
【請求項３】
請求項１に記載のプロセスであって、前記高細胞密度培養物の遠心分離によって前記細胞を収集する工程が、５０００ｒｐｍにて１０分間実行される、プロセス。
【請求項４】
請求項１に記載のプロセスであって、前記高細胞密度培養物の残骸の遠心分離が、前記細胞の収集を最大にするために、１０，０００ｒｐｍにて３０分間実行される、プロセス。
【請求項５】
請求項１に記載のプロセスであって、３７℃のＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地における主要補充物として前記発酵の間に使用されるポリオールが、グリセロールである、プロセス。
【請求項６】
請求項１に記載のプロセスであって、３７℃のＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地における主要補充物としての前記糖質が、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース、およびラクトースである、プロセス。
【請求項７】
請求項１に記載のプロセスであって、３７℃のＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地における主要補充物としての前記有機酸が、リンゴ酸である、プロセス。
【請求項８】
請求項１に記載のプロセスであって、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地における主要補充物として、ポリオール、糖質、または有機酸を使用することによって、前記最大細胞密度が、振盪フラスコ培養物中で１０光学密度単位〜１３光学密度単位の間の範囲に及ぶ、プロセス。
【請求項９】
請求項１に記載のプロセスであって、前記組換え細胞の最大細胞密度が、ＭｇＳＯ４を含む流加培養法によって達成される、プロセス。
【請求項１０】
請求項１に記載のプロセスであって、前記供給物において使用されるＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地の濃度が、５倍〜２５倍である、プロセス。
【請求項１１】
請求項１に記載のプロセスであって、前記供給物において使用されるＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地の濃度が、発酵の間に添加される供給物の容積を最小にするために、２５倍である、プロセス。
【請求項１２】
請求項１に記載のプロセスであって、前記プラスミドが、Ｅ．ｃｏｌｉが認識可能なファージプロモーターを含む、ｐＱＥシリーズのベクターである、プロセス。
【請求項１３】
請求項１〜１２のうちのいずれか１項に記載のプロセスによって調製された時にはいつでも安全な宿主Ｅ．ｃｏｌｉ中において発現される、純粋な炭疽防御抗原タンパク質。
【請求項１４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞において６×ヒスチジン融合タンパク質として発現されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの構造的、生物学的、および機能的に活性である精製された組換え防御抗原（ＰＡ）タンパク質を含む炭疽抗原であって、多糖類、死滅細菌、培養培地、水溶性副産物および水不溶性副産物、および懸濁不純物を含まない、炭疽抗原。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）  
本発明は、流加培養法によってＥ．ｃｏｌｉにおいて炭疽防御抗原を高レベルで構成的に生成することに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）  
炭疽は、グラム陽性の芽胞形成細菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓにより引き起こされる、人畜共通の伝染疾患である、防御抗原（ＰＡ）は、炭疽に対するワクチンすべての主要な構成成分である。今日まで、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの培養物上清が、ＰＡを精製するための主要な供給源であった。しかし、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ培養物を用いる作業は、コストがかかるＰ３施設を必要とする。これとは別に、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓからのＰＡ調製物は、しばしば、他の炭疽毒素タンパク質で汚染される。研究者は、他の微生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、バキュロウイルス、およびＥ．ｃｏｌｉ）においてＰＡを発現および精製することを試みてきた。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓからのＰＡの精製は、収量が乏しく、リッチな培地における増殖を必要とし、多量のＰＡが、この生物により分泌されるプロテアーゼに起因して分解された（Ｌ．Ｗ．Ｊ．Ｂａｉｌｌｉｅら、Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ（１９９４）１９，２２５〜２２７）。バキュロウイルスベクターは、昆虫細胞中でＰＡを発現した。しかし、低収量に起因して、精製は可能ではなかった。ＰＡはＥ．ｃｏｌｉにおいて発現されたが、このタンパク質を過剰生成する試みは、成功しなかった（Ｍ．Ｈ．Ｖｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ（１９８３）３４，６９３〜６９７）。研究者らはまた、このタンパク質をペリプラズム空間に導くことによってＰＡを精製した。しかし、精製されたＰＡの収量は、非常に低かった。Ｅ．ｃｏｌｉを使用する防御抗原発現のための公知の発現系はすべて、高価な化学物質であるＩＰＴＧの使用を必要とする誘導系である。
【０００３】
米国特許第２，０１７，６０６号は、適切な培養培地にてＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを増殖させ、その培養培地からそのＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌を分離することによる、炭疽抗原の調製を記載する。
【０００４】
米国特許第２，１５１，３６４号は、炭疽ワクチンを製造する方法を記載し、この方法は、炭疽芽胞の懸濁物を調製する工程、およびその懸濁物に、ミョウバンを含む滅菌溶液を添加する工程を包含する。
【０００５】
上記の米国特許における欠点は、両方とも、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ培養物または胞子を使用することである。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓは、感染性生物であり、汚染封じ込め設備なしでは取り扱うことができない。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓにおいて発現される防御抗原のレベルは、非常に低い。この種類のワクチン調製物はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の他の毒性タンパク質および非毒性タンパク質で汚染され、多数の副作用および反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を生じる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、流加培養法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉから炭疽ＰＡを迅速に、効率的に、高い費用対効果で、そして高レベルで生成するための構成的発現系を作製することである。
【０００７】
この目的を達成するために、本発明は、流加培養法を使用してＥ．ｃｏｌｉから炭疽防御抗原タンパク質を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を、ＰＡ遺伝子を含む組換え構成的発現プラスミドを用いて形質転換して、ＰＡタンパク質を発現する組換えＤＨ５α細胞を生成する工程、
この組換えＤＨ５α細胞を増殖させ、そしてこの細胞を溶解した後、変性ゲル電気泳動およびＰＡ抗体を使用するウェスタンブロッティング技術によってこのＰＡの発現を試験する工程、
この細胞を、
ポリオール、糖質または有機酸を、３２℃〜４２℃のＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地における主要補充物として使用し、
流加培養法技術を使用し、かつ
栄養素欠乏を検知するｐＨ・ＤＯスタット（ｓｔａｔ）法を使用して、
バイオリアクター中で発酵させて、ＰＡタンパク質を発現する高細胞密度培養物を生成する工程、
この高細胞密度培養物を５０００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍにて１０分間〜３０分間遠心分離することによって、この細胞を収集する工程、
６モル濃度〜８モル濃度の尿素溶液を使用し周囲温度にて１時間〜２時間攪拌することによって、この高細胞密度培養物の細胞を可溶化する工程、
３２℃〜４２℃にて１０，０００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍで３０分間〜６０分間遠心分離することによってこの高細胞密度培養物の残骸を分離し、尿素変性したＰＡを含む上清を収集する工程、
この尿素変性したＰＡをこの上清から単離し、そしてＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって、このＰＡがこのアフィニティカラムに結合している状態で尿素を次第に除去することによって、この尿素変性したＰＡを精製する工程、ならびに
この精製した変性ＰＡを溶出し、そして即時使用かまたは長期使用かに依存して−２０℃〜−７０℃にて凍結アリコートとして防御抗原（ＰＡ）タンパク質を保存する工程、
を包含する。
【０００８】
使用される上記組換え構成的発現プラスミドは、上記Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞株において上記ＰＡタンパク質を不溶性封入体として発現する。
【０００９】
上記高細胞密度培養物の遠心分離によって上記細胞を収集する工程は、５０００ｒｐｍにて１０分間実行される。
【００１０】
上記高細胞密度培養物の残骸の遠心分離は、上記細胞の収集を最大にするために、１０，０００ｒｐｍにて３０分間実行される。
【００１１】
発酵の間に上記Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地における主要補充物として使用されるポリオールは、グリセロールである。
【００１２】
上記Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地における主要補充物として使用される糖質は、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース、およびラクトースである。
【００１３】
上記Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地における主要補充物として使用される有機酸は、リンゴ酸である。
【００１４】
Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地における主要補充物として、ポリオール、糖質、または有機酸を使用することによって、上記最大細胞密度は、振盪フラスコ培養物中で１０光学密度単位〜１４光学密度単位の間の範囲に及ぶ。
【００１５】
上記組換え細胞の最大細胞密度は、ＭｇＳＯ４を含む流加培養法によって達成される。
【００１６】
上記供給物において使用されるＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地の濃度は、５倍〜２５倍である。
【００１７】
上記供給物において使用されるＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地の濃度は、発酵の間に添加される供給物の容積を最小にするために、２５倍である。
【００１８】
上記プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉが認識可能なファージプロモーターを含む、ｐＱＥシリーズのベクターである。
【００１９】
炭疽抗原は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞において６×ヒスチジン融合タンパク質として発現されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの構造的、生物学的、および機能的に活性である精製された組換え防御抗原（ＰＡ）タンパク質を含み、多糖類、死滅細菌、培養培地、水溶性副産物および水不溶性副産物、ならびに懸濁不純物を含まない。
【００２０】
（詳細な説明）
ｐＱＥシリーズベクター中にクローン化されたＰＡ遺伝子を含む組換え構成的発現プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株コンピテント細胞を形質転換するために使用した。この組換えプラスミドを含む細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬｕｒｉａブロス中で、３７℃および２５０ｒｐｍにて一晩増殖させた。細胞を５，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離することによって収集した。ＰＡの発現および局在化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。この組換えタンパク質のうちの９０％より多くが、封入体中に存在することが見出された。発現されたタンパク質の量は、増殖培地の細胞密度の増加と正比例して増加することが見出された。
【００２１】
各々５倍濃度の１００ｍｌの改変ＬＢの複合培地を、振盪フラスコ中で、異なる７つの炭素源としてのグルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、リンゴ酸、およびグリセロールを用いて調製した。さらなる炭素源を何ら含まないＬＢのみを、コントロールとして使用した。等モル量の炭素源子を、炭素源として使用した。その濃度を、０．５％グルコースと等価に維持した。１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１００ｍＭリン酸カリウム、および微量元素もまた、添加した。すべてのフラスコに、上記組換えプラスミドを含むＤＨ５α細胞の一晩増殖接種物を、同時に接種した。サンプルを１時間ごとに無菌的に収集し、ＯＤ６００を測定した。培養アリコートを収集し、その組換えタンパク質含量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。最高のＯＤ６００（６００ナノメートルでの光学密度）は、グルコースを主要炭素源として使用した場合に達成され得た。最低のＯＤ６００が、ＬＢおよびマルトースの場合に観察された（図１）。最大タンパク質濃度が、リンゴ酸、マルトース、およびグリセロールを主要炭素源として使用することによって得られた。最低のタンパク質濃度が、ＬＢおよびラクトースの場合に観察された。
【００２２】
ｐＨプローブ、温度プローブ、溶存酸素プローブおよび消泡プローブを備えた、５Ｌ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂ（Ｂ  Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）発酵装置を、発酵実施のために使用した。この発酵装置を、パーソナルコンピューターとインターフェースをとった。ＭＦＣＳ／ｗｉｎ  ２．０ソフトウェアを、バッチおよび流加培養モードの両方においてデータを獲得し、この発酵装置を作動するために、使用した。
【００２３】
発酵のために使用した培地は、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１０ｍＭ）、リン酸カリウム（５ｇ／ｌ）およびグリセロール（１％）を含むＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ｐＨ７．４）からなる、複合培地であった。流加培養のために、ＭｇＳＯ４を、オートクレーブする前にこの培地に添加した。グリセロールもまた、オートクレーブする前にこの培地に添加した。２５倍の供給物を、２５％グリセロール（ｗ／ｖ）および２５×ＬＢを用いて調製し、別個にオートクレーブした。リン酸カリウム溶液もまた、別個にオートクレーブし、室温にさせ、発酵実施を開始する直前に無菌的に添加した。ｐＨプローブを、オートクレーブする前にｐＨ７．０およびｐＨ９．２の標準的緩衝液を用いて較正した。発酵装置をオートクレーブした後で、１Ｎ  ＮａＯＨ／１Ｍ  ＨＣｌを添加することによって培地をｐＨ７．４に自動調整し、そして温度を３７℃に設定した。ＤＯ（溶存酸素）プローブを、０〜＋１５ナノアンペア（ｎＡｍｐ）の範囲おいて溶存酸素の電子的ゼロ値を設定することによって較正し、１００％  ＤＯ値を、攪拌速度２５０ｒｐｍにて、２ｖｖｍの注入空気の酸素圧に対して得た。この発酵装置を、作業容積２Ｌのバッチフェーズにて開始した。組換えプラスミドを含む細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンの選択圧下で、３７℃、２５０ｒｐｍにてＬＢ上で一晩増殖させた。この一晩増殖培養物のうちの１％を使用して、この発酵装置に接種した。そのＤＯ値を４０％に設定し、攪拌器をカスケードモードにシフトさせた。このモードにおいて、接種後に、このＤＯが４０％を下回り始めたときに、攪拌器の速度を自動的に増加させて、この値を４０％に維持した。サンプルを１時間間隔で収集した。培養物アリコートを、ほぼ０．５単位を下回る光学密度（ＯＤ６００）へと希釈した。増殖中の培養物が対数期中期に達した時に、ペリスタポンプ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、２５×供給物からの給餌を開始した。この供給速度をモニターし、ｐＨ値を７．２と７．４との間に維持するように手動制御した。酸素補充が、ＯＤ７０に到達した後に必要になった。酸素を、この発酵装置のＧａｓｍｉｘ機能を使用して培養物に供給した。この培養物をＯＤ６００  １２０単位まで増殖させ、その後、この細胞を収集した。この培地にまず消泡剤を添加し、その後、オートクレーブし、その後、必要な場合に必要なように、消泡剤を添加した。
【００２４】
連続発酵の実施のために培地組成および他の条件を最適にするために、一連のバッチの実施を、増殖培地においてグリセロールを含みかつＭｇＳＯ４を組込んでいるかまたは組込んでいない、改変ＬＢにて実行した。改変ＬＢ中にＭｇＳＯ４を含まない（炭素源としてグリセロールを含む）バッチの実行により、最大ＯＤ約１４を達成し得た一方で、改変ＬＢ中にＭｇＳＯ４を含むバッチの実行によって、１８より大きなＯＤ６００値を達成し得た。ＭｇＳＯ４が、より高密度の細胞増殖のために必要であることが、推察された。増殖培地中にＭｇＳＯ４を組込むことは、発酵の間により高いバイオマス収量を達成するために必須である（図２）。
【００２５】
この高細胞密度培養物のうちの５ｍｌを、予め秤量したチューブにおいて、１０，０００ｇにて３０分間遠心分離した。上清を排出した後、遠心分離した細胞を含むチューブを天秤にて秤量して、湿細胞重量を測定した。乾燥細胞重量を決定するために、同じチューブを７０℃のインキュベーター中に一晩放置し、翌日秤量した。
【００２６】
この発酵装置におけるプラスミドｐＭＷ１の安定性を調査するために、培養サンプルを、発酵実行の間に１時間毎に無菌的に収集した。それらのサンプルを、各サンプルのＯＤ６００が約５．０となるように希釈し、１０，０００ｇにて１分間遠心分離した。その上清を完全に排出し、そのペレットを、１００μｌ溶解緩衝液（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を８Ｍ尿素とともに含む）中に懸濁した。これらのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、この組換えプラスミドからのタンパク質発現について調査した。コロニー調製物およびプラスミドＤＮＡのミニ調製物もまた作製して、発現細胞内部の組換えプラスミドの存在を直接調査した。プラスミドを含まない細胞が顕著に生成されることは、観察されなかった。
【００２７】
このタンパク質を、変性条件下で金属キレートアフィニティクロマトグラフィを使用して、精製した。簡単に述べると、１００ｍｌ培養物からのペレットを、１００ｍｌの変性緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、３００ｍＭ塩化ナトリウムおよび８Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を含む）中に再懸濁した。再懸濁したペレットを、回転振盪器において、３７℃にて２時間インキュベートした。溶解物を、２回、各々室温で６０分間遠心分離し、その上清を、５０％  Ｎｉ−ＮＴＡスラリーと混合した。そのスラリーをカラムに充填し、落ち着かせた。そのフロースルーを、このカラムに再ローディングした。Ｎｉ−ＮＴＡマトリックスを、５００ｍｌ変性緩衝液（８Ｍ尿素を含む）を用いて洗浄し、その後、８Ｍ〜０Ｍ尿素勾配を使用して、このタンパク質のカラム上再生を行った。このタンパク質を、溶出緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭ  イミダゾールおよび３００ｍＭ塩化ナトリウム）中の２５０ｍＭイミダゾールクロリドを用いて溶出した。１０μｌの各画分を、１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。このタンパク質を含む画分を収集し、プールし、そして１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）に対して透析し、そしてアリコート状態で−７０℃にて凍結保存した。
【００２８】
この特定のタンパク質を、多数の方法によって評価した。濃度測定を、ＢｉｏＲａｄゲルドキュメンテーションシステムとＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアとを使用して行った。ＰＡの精製倍数を、Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ様細胞のうちの５０％をＬＦ（１μｇ／ｍｌ）と組み合わせて３７℃で３時間の間に死滅させるために必要なタンパク質量（ＥＣ５０）を計算することによって、種々の段階で測定した。この精製タンパク質を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。この精製タンパク質を、２８０ｎｍでの調製物のＯＤを測定することによっても測定した。ＰＡは、全細胞タンパク質のうちの３０％より多くを占めた。このＰＡは、封入体の形態で細胞中に存在した。５〜８ｇ／ＬのＰＡが、この細胞の内部で生成された。
【００２９】
ｒＰＡ（組換えＰＡ）の生物学的活性もまた、Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ様細胞株に対する細胞傷害性アッセイによって測定した。すべての実験を三連で行った。簡単に述べると、種々の濃度のｒＰＡタンパク質を、ＬＦ（１μｇ／ｍｌ）とともに細胞に添加した。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来のネイティブＰＡをＬＦとともに、ポジティブコントロールとして維持した。３時間後、細胞生存度を、ＭＴＴ色素を使用して決定し、生じた沈殿を、０．５％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、２５ｍＭ  ＨＣｌを９０％イソプロピルアルコール中に含む、緩衝液中に溶解した。５４０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して読取り、生存度％を決定した。ｒＰＡおよびＬＦは、マクロファージ細胞を十分に溶解可能であり、その生物学的活性は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓから調製したＰＡと同様であることが、見出された。ｒＰＡおよびｎＰＡのＥＣ５０は、各々約５０ｎｇ／ｍｌであることが見出された（図３）。このタンパク質の精製倍数を、上記の細胞傷害性アッセイによって各精製段階にて決定した（表１）
【００３０】
【表１】
2005510215.tif 000003
ａ  ＥＣ５０は、Ｊ７７４Ａ．１細胞のうちの５０％を死滅させるために必要とされるＰＡ（μｇ／ｍｌ）およびＬＦ（１μｇ／ｍｌ）の濃度として規定される。３時間のインキュベーション後、ＭＴＴ色素によって生存度を決定した。結果は、３回の実験の平均を示す。
【００３１】
ｂ  精製倍数を、細胞溶解物についてのＥＣ５０を、別個のカラムから得られた画分についてのＥＣ５０で除算することによって決定した。
【００３２】
（考察）
任意の組換えタンパク質の過剰発現は、発現系の種々の要素の最適な構成に依存する。いくつかの要因（プロモーターの強度、プラスミドの安定性、プラスミドのコピー数、転写ターミネーター、最終的にｍＲＮＡ安定性を増加させる転写および翻訳の効率、翻訳ターミネーター、遺伝子転写の緊密な調節、リボソームの利用性、翻訳後修飾、組換えタンパク質自体の安定性および可溶性、ならびに宿主細胞および培養の条件など）に劇的に影響を与える。高レベルの異種タンパク質発現を目的とするプロセスは、強力なプロモーター（Ｔ５、Ｔ７、ＰＬ、ＰＲ、Ｐｔｒｃ、Ｐｔａｃなど）を使用して、有効な発現系を作製する。このような系のほとんどは、誘導性プロモーターを保有し、誘導前には、低量の生成物形成段階しかないか、または全く生成物形成しない。誘導の際、特定の生成速度が、短時間のうちに最大にまで増加し、そのタンパク質が、４〜５時間連続生成される。誘導後、多数の変化（酢酸塩蓄積を生じる炭素代謝の変化、呼吸活性の増加、ハウスキーピングタンパク質の合成の減少、および熱ショック様応答およびＳＯＳ応答の発生など）が、報告されている。これらの応答すべては、組換え生成物の分解に寄与する。封入体の形成は、この組換えタンパク質を細胞プロテアーゼの攻撃から防ぐ。この細胞プロテアーゼの攻撃は、防がれなければ、このタンパク質の広範な分解を生じ得、これは低い生成物回収をもたらす。種々の時点でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウェスタンブロット分析により、組換えプラスミドｐＭＷ１からのＰＡ発現が漏出性ではなく、そしてその培養物のＯＤに比例するという事実が実証される。有意な分解が全くなく、このタンパク質のほとんどは、封入体の形態で、この細胞内部に存在した。
【００３３】
一旦強力な発現系が作製されると、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこの組換えタンパク質の生成は、種々の技術を使用する高細胞密度培養を使用することによって、有意に増加され得る。５０ｇ／ｌを超える乾燥重量が、対費用効果が高い組換えタンパク質の生成を提供するために、慣用的に達成され得る。しかし、高細胞密度培養物は、いくつかの欠点（例えば、基質阻害、限定的酸素運搬能力、増殖阻害副産物の形成、および発酵装置の混合効率の低下をもたらす限定的熱散逸）を有する。高細胞密度培養（ＨＣＤＣ）で組換えタンパク質を生成することにおける主要な挑戦事項は、細胞増殖に対して有害である親油性因子である酢酸塩の蓄積である。増殖培地における酢酸塩の蓄積は、組換えタンパク質の生成を減少させることが、報告されている。流加培養における酢酸塩形成を減少するために、多数のストラテジー（培地の必須栄養分（例えば、炭素源または窒素源）を制限することによる特定の増殖速度の制御、増殖条件およびＥ．ｃｏｌｉ株の変化など）が開発されている。発酵研究の主要な目標は、費用対効果の高い組換えタンパク質生成であるので、望ましい生成物の収量を最大にすることを可能にする培養方法を開発することが、重要である。増殖培地の組成は、生成物の形成を増加することおよび酢酸塩の減少のために、重要である。酢酸塩は、酸素制限条件下で、または嫌気性条件下の過剰グルコース存在下で、炭素中心的代謝経路における炭素流動がその生合成需要および細胞内でのエネルギー生成能力を超えた場合に、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成される。
【００３４】
増殖速度論および組換えタンパク質収量に基づいて、グリセロールが、ＨＣＤＣのための主要な炭素源として、他の７つの炭素源（すなわち、グルコース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、マルトース、リンゴ酸およびグリセロール）のうちから選択された。グリセロールが炭素源として使用される場合には、酢酸塩は生成されず、高細胞密度が、グリセロールを使用して比較的容易に達成され得る。グルコースの輸送速度と比較して低い細胞中へのグリセロール輸送速度により、明らかに、解糖を通る炭素流動の減少がもたらされ、これにより、酢酸塩形成を大いに減少させる。この細胞は、グリセロールにてよりゆっくり増殖する。グリセロールはまた、消泡効果を有し、発酵実行過程の間により少ない泡立ちをもたらす。
【００３５】
栄養分供給のために利用される方法もまた、ＨＣＤＣの成功のために重要である。なぜなら、その方法は、細胞密度および細胞の生産性の両方に影響を及ぼすからである。一定供給または断続的供給が、栄養制限条件下で実行される。他の供給ストラテジーが、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＣＤＣのために首尾良く使用されているが、フィードバック制御スキームを備えたより洗練された供給ストラテジーが、後に開発された。その供給速度は、他の物理的パラメータ（例えば、ＤＯ（溶存酸素）、ｐＨ、微生物熱およびＣＯ２放出速度（ＣＥＲ））と関連されている。ＤＯスタット（ｓｔａｔ）供給法は、培養物中のＤＯは、その基質が欠乏した時に急激に増加するという事実に基づいている。その細胞は、栄養分レベルが低下してより少量の酸素しかその細胞により利用されない場合には、迅速に増殖することが可能ではない。従って、このＤＯスタット（ｓｔａｔ）法において、基質濃度は、ＤＯが予め設定された値を超えて増加した時に栄養分を自動的に添加することによって、望ましい範囲内に維持される。別の選択肢であるｐＨスタット（ｓｔａｔ）法は、主要炭素源が限定的になった時に培地のｐＨが変化するという事実に基づく。その炭素源が消耗された場合、主にその細胞により排出／分泌されるアンモニウムイオンの濃度増加の結果として、そのｐＨが上昇し始める。
【００３６】
この供給システムの分析は、プロービングおよび検出方法の特徴付けから始まる。その概念は、供給速度における振動に対するＤＯの応答およびｐＨの応答を調査することによって、呼吸の飽和を検出することである。一旦供給が開始されそしてＥ．ｃｏｌｉが対数期に入ると、供給物は、指数関数様式で多少消費される。しかし、供給速度は、栄養分需要も供給物消費速度も上回らないように、制御されなければならない。このｐＨおよびＤＯをその設定値付近に維持することによって、これは行われる。ｐＨおよびＤＯの低下は、基質過剰投与の指標である。ｐＨ値およびＤＯ値の上昇は、炭素源または基質のうちの１種が、限定的であり、従って、供給が必要であることを示す。供給の振動／速度の増加がいかなる有意な応答（すなわち、ＤＯの低下または攪拌器速度の増加）を生じることもできない場合、ＭｇＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４または微量元素などの他のいくつかの因子が限定的になり、そのような場合に断続的に添加されなければならないことが、完全な指標である。この添加の後に、上記の変数の迅速な変化が続く。Ｅ．ｃｏｌｉは、グルコースまたは他の任意の主要炭素源が存在しない場合に、炭素源として酢酸塩を利用することが可能である。酢酸塩の消費は、予め設定された値からのｐＨ値を低下させるような偏向によって特徴付けられ、酸素の消費において現れる周期的パターンが始まり、予め設定したｐＨ値が次第にその培養物により回復されるまで続く。この時点で、供給は再開される。
【００３７】
このＤＯスタット（ｓｔａｔ）法は、ｐＨスタット（ｓｔａｔ）法よりも迅速に栄養分欠乏に対して応答する。複合基質が糖質基質とともに使用される場合、ＤＯの変化は、細胞がその複合基質を使用し続ける場合程度には明らかではない。本実験において使用される供給ストラテジーは、ｐＨスタット（ｓｔａｔ）法およびＤＯスタット（ｓｔａｔ）法の両方の組み合わせであった。上記パラメータを両方とも同時にモニタリングすると、増殖中の培養物の増殖条件に対して良好な制御が与えられる。この基質供給ストラテジーを使用して、本発明者らは、ＯＤ  １２０を達成し得た。この値は、バッチ実施において達成されたＯＤよりも６倍を超えて増加しており、振盪フラスコ培養物において達成されたＯＤよりも２３倍を超えて増加している。
【００３８】
これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける高いＰＡ収量を達成するための流化培養ＨＣＤＣ条件の最適化に関する、最初の報告である。この研究は、防御ワクチン候補として役立ち得る大量の非反応性ＰＡを得るための試みである。本明細書中に報告されたＰＡ生成方法は、新規かつ有利な基質と、単純かつ容易な供給制御ストラテジーを利用する。これらはまた、高い生成物収量を達成するための他の組換えタンパク質発現系にも首尾良く適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本発明は、上記プロトコルおよび添付の図面を参照してここに記載される。
【図１】図１は、振盪フラスコ培養物中の最大光学密度が、グルコースをさらなる炭素源として使用することによって得られ、最小光学密度が、マルトースを使用することによって得られることを、示す。
【図２】図２は、ＭｇＳＯ４を含むバッチおよび流加培養およびＭｇＳＯ４を含まないバッチおよび流加培養において得られた光学密度を示す。
【図３】図３は、生成された組換えＰＡが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来のネイティブＰＡと同程度に生物学的および機能的に活性であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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