(57)【要約】本発明は、患者におけるアルツハイマー病の状態を判定する方法を開示する。さらに、患者におけるアルツハイマー病の進行を監視する方法を開示する。本発明は、質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）を用いて、体液（例えばＣＳＦ）中の特定のマーカーの検出に提供される。具体的なマーカーは、ヒトシスタチンＣ、ヒトβ−２−ミクログロブリン、ヒトミオグロビン神経分泌タンパク質ＶＧＦまたはそれらタンパク質のフラグメントである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量が各々４８２４±２０Ｄａ、７６９１±２０Ｄａ、１１７８７±２０Ｄａ、１１９８８±２０Ｄａ、１３４１６±２０Ｄａ、４７６９±２０Ｄａ、６９５８±２０Ｄａ、６９９１±２０Ｄａ、１３４１２±２０Ｄａ、１３７８７±２０Ｄａ、１７２７６±２０Ｄａ、４０４３７±２０Ｄａ、６８９５±２０Ｄａ、６９２８±２０Ｄａ、７６９１±２０Ｄａ、７７６９±２０Ｄａ、７９３４±２０Ｄａ、５０８２±２０Ｄａ、６２６７±２０Ｄａ、６５１８±２０Ｄａ、７２７４±２０Ｄａおよび８２０９±２０Ｄａであるポリペプチドの群に含まれる少なくとも１つのポリペプチドの検出を含む、被験者におけるアルツハイマー病の状態を判定する方法。
【請求項２】
前記ペプチドの群のうち、少なくとも２、３、４、５、１０またはすべてのポリペプチドが検出される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および／または配列番号１７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドの検出を含む、被験者におけるアルツハイマー病の状態を判定する方法。
【請求項４】
以下からなる群に含まれる少なくとも１つのポリペプチドの検出を含む、被験者におけるアルツハイマー病の状態を判定する方法：
ｉ）ヒトシスタチンC；
ｉｉ）ヒトβ−２−ミクログロブリン、
ｉｉｉ）ヒトミオグロビン（新規変異体）
ｉｖ）神経分泌タンパク質ＶＧＦ
ｖ）少なくとも５アミノ酸のヒトシスタチンCフラグメント
ｖｉ）少なくとも５アミノ酸のヒトβ−２−ミクログロブリンフラグメント
ｖｉｉ）少なくとも５アミノ酸のヒトミオグロビンフラグメント（新規変異体）
ｖｉｉｉ）少なくとも５アミノ酸の神経分泌タンパク質ＶＧＦフラグメント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法を、同一の被験者から採取した少なくとも２つの別個の試料について行うことを特徴とする、アルツハイマー病の進行を調べる方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドの検出がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによるものである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
特定の抗体または前記ポリペプチドを認識する抗体を該ポリペプチドの検出に用いる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記検出が、前記被験者の、ＣＳＦ、血液、血清、血漿、尿、精漿、乳頭液および／または細胞抽出液を含む試料におけるものである、請求項１〜７記載の方法。
【請求項９】
分子量が各々４８２４±２０Ｄａ、７６９１±２０Ｄａ、１１７８７±２０Ｄａ、１１９８８±２０Ｄａ、１３４１６±２０Ｄａ、４７６９±２０Ｄａ、６９５８±２０Ｄａ、６９９１±２０Ｄａ、１３４１２±２０Ｄａ、１３７８７±２０Ｄａ、１７２７６±２０Ｄａ、４０４３７±２０Ｄａ、６８９５±２０Ｄａ、６９２８±２０Ｄａ、７６９１±２０Ｄａ、７７６９±２０Ｄａ、７９３４±２０Ｄａ、５０８２±２０Ｄａ、６２６７±２０Ｄａ、６５１８±２０Ｄａ、７２７４±２０Ｄａおよび／または８２０９±２０Ｄａであるポリペプチドを含むキット。
【請求項１０】
少なくとも５アミノ酸のヒトシスタチンCフラグメント、少なくとも５アミノ酸のヒトβ−２−ミクログロブリンフラグメント、少なくとも５アミノ酸のヒトミオグロビン（新規変異体）フラグメント、および少なくとも５アミノ酸の神経分泌タンパク質ＶＧＦフラグメントを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は診断の分野に属する。より具体的には、本発明は、アルツハイマー病に特異的なマーカーポリペプチドの検出による、被験者におけるアルツハイマー病の状態の判定の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病
アルツハイマー病は、６５歳以上の人の痴呆全体の５０〜６０％を占める増加傾向にある神経変性の形態である。病態としては、アルツハイマー病の神経変性は、神経死とニューロンのシナプスの損失による皮質辺縁（corticolimbic）構造の顕著な萎縮と、神経原線維変化（ＮＦＴ）の形成、および脳内のアミロイドβ１−４２（Ａβ４２）凝集体の堆積物を含む老人斑の形成によって特徴付けられる［Francis PT 1999］。認識低下の進行が最初の兆候から死に至るまで約７年間継続する。発症期の前に、継続的なアミロイド班の堆積および神経原繊維変化の前発症期が１５〜３０年間あるとされている。疾患が発症し進行する年齢は、原因となる遺伝子の突然変異および遺伝的な罹患因子により大きく左右される。個人的な遺伝的危険因子に加え、いくつかの環境危険因子もあり得る。早期に発症する家族性アルツハイマー病に関係することが知られている遺伝因子は、プレセニリン１（ＰＳ１）、プレセニリン２（ＰＳ２）およびアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の突然変異、およびアポリポタンパク質Ｅ４対立遺伝子の存在である。但し、大部分（９５％）のアルツハイマー病は、弧発性であり、異質性である。
【０００３】
現在、アルツハイマー病の臨床診断は、疾患の後期、即ち脳の構造的変化と並行して認識力が有意に低下したときでのみ確定することができる。臨床診断には、入念な、病歴；生理学的および神経学的検査；アルツハイマー病に見せかけ得る医学的な疾患状態を排除するための血液、尿および脳脊髄液（ＣＳＦ）検査、精神状態と認知力を判定するための詳細な精神鑑定、および脳のコンピューター断層撮影スキャンまたは磁気共鳴画像診断が必要である。専門施設での診断の精度は約８０〜８５％である。これらの検査は、費用がかかる上、時間を要し、特に患者には不自由を強いるということから、ＣＳＦ、血液または尿等の体液中で測定することができ、アルツハイマー病の診断に関して高い陽性適中率を有する、あるいはアルツハイマー病と他の形態の痴呆とを区別するのを助ける、容易に利用できる特異的な診断用生物分子マーカーの必要性が高まっている。さらに、疾患の進行に感受性のある信頼性のあるマーカーは、アルツハイマー病における新しい原因指向型且つ疾患修飾型の治療方法の評価と開発に必要な条件である代替のパラメーターとなり得る。
【０００４】
ＣＳＦは脳のすぐ周囲に存在するので、そのタンパク質組成における変化は、タンパク質発現パターンの具体的な変化に関連する病理学的状態に最も正確に反映し得る。最近の１０年間で、アルツハイマー病患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）における数多くの生物学的異常、特にアミロイド前駆体タンパク質のＡβ−４２フラグメントのレベルの変化、および高リン酸化ｔａｕタンパク質のレベルの変化、が報告されている。しかし、これらマーカーの感受性および特異性は、低いかまたは中程度でしかない［The Ronald and Nancy Reagan Research Institue of the Alzheimer's Association and the National Institute on Aging Working Group, 1998, Robles A 1998, Teunissen CE et al., 2002］。
【０００５】
従って、（ｉ）アルツハイマー病をできるだけ早期に検出し；（ｉｉ）疾患を他のタイプの痴呆または神経変性疾患と区別することが可能で；（ｉｉｉ）例えば臨床薬の開発において、代替のパラメーターとして、治療効果を監視し、薬物治療をできるだけ早期に開始して記憶の喪失と疾患の進行を遅らせるための、十分な感受性と特異性を有する新規のバイオマーカーが必要とされる。
【０００６】
プロテインチップ法
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（Surface Enhanced LaserDesorption/Ionisation time of flight mass spectrometry）と称するプロテインチップ法が近年開発され、複合的生物学的混合物のタンパク質のプロフィリングが容易になった［Davies HA 2000, Fung ET 2001, Merchant M 2000］。
【０００７】
プロテインチップ質量分析は、血清、精漿、乳頭液、尿または細胞抽出液中の、前立腺および膀胱の［Adam BL 2001］あるいは乳癌の［Wulfkuhle JD 2001］可能性のある新規のバイオマーカーを検出するために既にいくつかのグループによって用いられている。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いるバイオマーカー検索についての概説は［Issaq HJ 2002］を参照のこと。
【０００８】
シスタチンＣ
脳脊髄液（ＣＳＦ）において１９６１年に最初に記載された。シスタチンＣ（γ−trace またはポスト−γグロブリン、Acc. No. P01034）は全てのヒトの体液中に生理学的に関係する濃度で存在する小さなシステインプロテアーゼ阻害物質である。シスタチンＣの生理学的役割は、微生物の侵入あるいは死滅した細胞または病的な細胞からのリソソームプロテイナーゼの放出から生じる細胞外システインプロテアーゼ活性の調節のようである。シスタチンＣは、アルツハイマー病の脳および大脳のアミロイド 血管障害において細動脈壁内でβ−アミロイド（AB）と共存する［Levy E2001］。これらは、３つの部位（２つはプロモーターにおける塩基対の変化であり、１つは単一のペプチドドメインにおいてアミノ酸置換を引き起こす（アラニンからトレオニンへ））で互いに相違する、シスタチンＣのCST3遺伝コードの２つの共通のハプロタイプ（A and B）である。最近、症例対照研究により、晩年発症型アルツハイマー病の危険性の増大がCST3と関連していることが認められた［Crawford FC 2000, Finckh U 2000, Beyer K 2001］。
【０００９】
遺伝性シスタチンＣアミロイド血管障害（HCCAA）とも称される、hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis, Icelandic type（HCHWA-I）は、常染色体優性型の脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）である。脳の血管壁に蓄積したアミロイドは主にLeu68-Gln置換の存在によって特徴付けられるシスタチンＣ変異体から構成される［Cohen 1983, Ghiso1986］。この病態は、脳脊髄液中のこの主要なプロテイナーゼ阻害物質の濃度の減少と結びついており、脳におけるアミロイド蓄積につながる［Grubb AO 1984］。
【００１０】
Leung-Tack らはまた、腎臓移植を受けた１人の患者から得た尿中のシスタチンＣの２つのＮ末端欠失型異性体を精製した。それらのデータによれば、（desl-4）シスタチンＣは、ヒト末梢単核球（ＰＭＮ）細胞；Ｎ末端配列「ＫＰＰＲ」に起因し得る２つの機能、Ｏ2放出および食作用、に対して阻害効果を有する。それらのデータは、炎症における可能性のある免疫調節物質としてのシスタチンＣに関する潜在的に重要な役割を支持している。これまでの証拠は、細胞の機能に対するフリーラジカル介在の損傷の増大が、加齢プロセスと、年齢に関係する神経変性障害とに寄与することを示している。酸化ストレスは、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）において役割を担っている。ニューロンに対するフリーラジカルによる損傷は、これら疾患を発症する一義的な事象ではないかもしれないが、フリーラジカルによる損傷は、これら疾患の病理学的カスケードに関与するものとみられる。
【００１１】
ベータ−2-ミクログロブリン
ベータ−２−ミクログロブリン（Acc. No. P01884）は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＣＭＨ）の小さい定常領域を構成するものであり、体液中のその存在は、膜タンパク質回転率と排出との間のバランスを示す。このペプチドは、免疫応答の上昇によって特徴付けられる疾患において増加するとみられるので、体液中のその定量は、in vivoでの免疫学的状態の有用な指標である［Hoekman et al 1985］。このタンパク質の機能は不明であるが、グリア細胞の破壊を伴う疾患に関わっているようである［Ernerudh et al 1987］。
【００１２】
本発明によって解決される技術的課題は、アルツハイマー病を診断するためのおよび／または被験者におけるアルツハイマー病の進行を監視するための方法を提供することである。 
【００１３】
神経分泌タンパク質（ＶＧＦ）
ＶＧＦ（ヒトVGF,Acc.-No. : 015240）は、神経細胞によって発現しプロセシングされる分泌性ペプチド前駆体である［Canu et al. 1997］。成体ラット大脳中枢神経系におけるin situハイブリダイゼーション試験により、VGFmRNAが脳全体に広く分布し、海馬、内膜皮質、および新皮質において顕著に発現することが明らかになった。さらに、VGF転写および分泌は、ニューロトロフィン様ＮＧＦおよびＢＤＮＦによって、およびin vivoの脱分極によって選択的にアップレギュレートされる。ＢＤＮＦ発現の増大は、アルツハイマー病が原因で早期に死滅すると見られる組織である海馬の歯状回とＣＡ３領域において観察することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
発明の記載
本発明は、健康な対照群と比較した場合、アルツハイマー病を有する被験者では特定のポリペプチドの発現量が異なるという意外な知見に基づくものである。これらの発現量の異なるポリペプチドは、例えばアルツハイマー病であると診断された被験者の脳脊髄液の試料中で検出することができる。本発明の個々のポリペプチドは、単独でまたは本発明の他のポリペプチドと組み合わせて検出および／または定量することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明のポリペプチドマーカーは、その各々の分子量によって定義される。実施例に記載のSAX2法によって同定される５つのマーカーは以下の分子量を示す：
マーカー１（Ｍ１）：  ４８２４±２０Ｄａ；
マーカー２（Ｍ２）：  ７６９１±２０Ｄａ；
マーカー３（Ｍ３）：１１７８７±２０Ｄａ；
マーカー４（Ｍ４）：１１９８８±２０Ｄａ；
マーカー５（Ｍ５）：１３４１６±２０Ｄａ。
【００１６】
表１は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって測定された、ポリペプチド マーカーＭＩ〜Ｍ５の観察された分子量、ポリペプチド マーカーＭ１〜Ｍ５の観察されたフラグメントのアミノ酸配列、およびポリペプチド マーカーＭ１〜Ｍ５が由来するタンパク質を示す。
【表１】
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【００１７】
本発明の発現量の異なるポリペプチドは、例えば、アルツハイマー病であると診断された被験者の脳脊髄液の試料中で検出することができる。さらに、具体的な態様に依存して、本発明のポリペプチドマーカーの量を測定するための試料元は血液、精子または尿であってよいが、これらの身体の画分に限定はされない。
【００１８】
図１に示されるように、陰性の診断結果（健常対照）と比較して、ＭＩの発現量はアルツハイマー病患者のＣＳＦにおいて低く（ｐ＜0.05）、マーカーＭ２〜Ｍ５の発現量はアルツハイマー病患者のＣＳＦにおいて高い（ｐ＜0.05）。
【００１９】
健常対照の被験者の本発明のポリペプチドのレベルとの比較における本発明の１またはいくつかのポリペプチドのレベルの変化によって、被験者におけるアルツハイマー病の状態を判定するおよび／またはその進行を監視することができ、アルツハイマー病処置の有効性を監視することができ、そして医薬品開発のための有用な情報となる。さらに、これらの生物分子マーカーは、アルツハイマー病を、他の形態の痴呆や神経変性疾患と区別するのに有用である。
【００２０】
アルツハイマー病であると診断され監視される好ましい被験者はヒトである。但し、本発明のアルツハイマー病の診断は、他の哺乳類においても可能である。必要ならば、本発明のペプチドマーカーのオルソログを用いることができる。
【００２１】
本発明はさらに、被験者の体液から採取した試料中の特定のポリペプチドの量を検出および／または定量することによる、ヒトの被験者におけるアルツハイマー病を検出するための、およびヒトの被験者におけるアルツハイマー病の進行を判定するための質量分析法（ＭＳ）の使用に関する。本発明の好ましい態様では、試料は被験者の脳脊髄液（ＣＳＦ）から採取する。
【００２２】
本発明のポリペプチドの検出および／または定量は、好ましくは、本発明のポリペプチドのＭ／ｚ比に対応する特定の質量電荷数比（Ｍ／ｚ）にてＭＳにより検出されるシグナルを数値化することによって達成する。好ましくは、本発明のポリペプチドに近いＭ／ｚ比もまた測定する。
【００２３】
本発明のポリペプチドの検出および／または定量はまた、特定のマーカーまたはそのポリペプチドフラグメントに対して惹起した特異的な抗体を用いるイムノアッセイを用いることにより行うことができる。精製されたマーカーまたはそのフラグメントを用いるか、または合成あるいは当分野で周知の任意の適当な方法［Coligan 1991］を用いて組換えにより発現させたマーカーの特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることにより製造することができる。そのような技術には、ファージまたは適当なベクター中の組換え抗体のライブラリーから抗体を選択することによる抗体調製、並びにウサギまたはマウスを免疫することによるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製［Huse 1989, Ward 1989］が含まれるがこれに限定されない。抗体を用意したら、任意の数多くの標準的な免疫学的結合分析を用いてマーカーを検出および／または定量することができる［米国特許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；および同第４，８３７，１６８号］。有用な分析法としては、例えば、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ(RIA）、ウェスタンブロット分析またはスロットもしくはドットブロット分析等が挙げられる。一般的なイムノアッセイの概説としては、Coligan 1991を参照のこと。一般に、被験者から得た試料をマーカーに特異的に結合する抗体と接触させることができる。体液混合物試料から特定のマーカーを捕捉するための有力な技術は、ガラスまたはプラスチック、例えばマイクロタイタープレート、スティック、ビーズ、またはマイクロビーズのような固体の支持体に固定化された抗体を使用するものである。あるいは、マーカーを、ＳＥＬＤＩ−ベースのイムノアッセイについて記載されているように、プローブ基質またはプロテインチップアレイに固定化した特異的抗体によって体液試料から捕捉することもできる ［Xiao2001］。試料を抗体とインキュベーションした後、結合しなかった物質を特定の条件下で洗浄し、形成した抗体−マーカー複合体を適当な検出試薬を用いて検出することができる。ＳＥＬＤＩプロテインチップアレイ法を用いる態様では、固定化抗体によって選択的に豊富化されたマーカーを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法によって検出し定量することができる。
【００２４】
１．
本発明は、具体的には、
ｉ）分子量４８２４±２０Ｄａのポリペプチド、
ｉｉ）分子量７６９１±２０Ｄａのポリペプチド、
ｉｉｉ）分子量１１７８７±２０Ｄａのポリペプチド、
ｉｖ）分子量１１９８８±２０Ｄａのポリペプチド、および
ｖ）分子量１３４１６±２０Ｄａのポリペプチド
からなるポリペプチドの群に含まれる少なくとも１つのポリペプチドの検出を含んでなる、被験者におけるアルツハイマー病の状態を判定する方法に関する。
【００２５】
本発明はさらに、分子量が各々４８２４±２０Ｄａ、７６９１±２０Ｄａ、１１７８７±２０Ｄａ、１１９８８±２０Ｄａ、１３４１６±２０Ｄａ、４７６９±２０Ｄａ、６９５８±２０Ｄａ、６９９１±２０Ｄａ、１３４１２±２０Ｄａ、１３７８７±２０Ｄａ、１７２７６±２０Ｄａ、４０４３７±２０Ｄａ、６８９５±２０Ｄａ、６９２８±２０Ｄａ、７６９１±２０Ｄａ、７７６９±２０Ｄａ、７９３４±２０Ｄａ、５０８２±２０Ｄａ、６２６７±２０Ｄａ、６５１８±２０Ｄａ、７２７４±２０Ｄａおよび８２０９±２０Ｄａであるポリペプチドの群に含まれる少なくとも１つのポリペプチドの検出を含む、被験者におけるアルツハイマー病の状態を判定する方法に関する。
【００２６】
１つのそのようなポリペプチドの検出は、ほとんどの場合、アルツハイマー病を信頼性を持って診断するのに十分であるが、本発明の２またはそれ以上のポリペプチドの検出は本方法の感受性と信頼性を高めることができる。好ましくは、前記ポリペプチドの１、２、３、４、５、１０、最も好ましくは前記ポリペプチドの全部を同じ試料から検出する。この検出はまた、好ましくは健康な被験者と比較してアルツハイマー病を有する被験者において発現量が異なる他のポリペプチドの検出と同時に行うことができる。「アルツハイマー病の状態を判定すること」とは、被験者または患者におけるアルツハイマー病の存在を診断すること、被験者または患者におけるその疾患の進行を判定すること、および／またはアルツハイマー病が進行する患者の傾向を調べることと理解される。
【００２７】
２．
本発明はさらに、前記ペプチドの群のうち、２、または３、または４、または５のポリペプチドが検出される、上記１の方法に関する。本発明はさらに、前記ペプチドの群のうち、２、または３、または４、または５、または１０またはすべてのポリペプチドが検出される、上記１の方法に関する。
【００２８】
３．
本発明はさらに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および／または配列番号１６の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドの検出を含む、被験者におけるアルツハイマー病の状態を判定する方法に関する。本発明はさらに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および／または配列番号１７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドの検出を含む、被験者におけるアルツハイマー病の状態を判定する方法に関する。１つのそのようなポリペプチドの検出は、ほとんどの場合、アルツハイマー病を信頼性を持って診断するのに十分であるが、本発明の２またはそれ以上のポリペプチドの検出は本方法の感受性と信頼性を高め得る。好ましくは、前記ポリペプチドの１、２、３、４、５、１０または全部を同じ試料から検出する。この検出はまた、好ましくは健康な被験者と比較してアルツハイマー病を有する被験者において発現量が異なる他のポリペプチドの検出と同時に行うことができる。
【００２９】
４．
本発明はさらに、以下からなる群に含まれる少なくとも１つのポリペプチドの検出を含む、被験者におけるアルツハイマー病の状態を判定する方法に関する：
ｉ）ヒトシスタチンC；
ｉｉ）ヒトβ−２−ミクログロブリン、
ｉｉｉ）ヒトミオグロビン（新規変異体）
ｉｖ）少なくとも５、８，１０または２０アミノ酸の、ヒトシスタチンCフラグメント
ｖ）少なくとも５、８，１０または２０アミノ酸の、ヒトβ−２−ミクログロブリンフラグメント
ｖｉ）少なくとも５、８，１０または２０アミノ酸の、ヒトミオグロビン（新規変異体）フラグメント。
【００３０】
本発明はさらに、以下からなる群に含まれる少なくとも１つのポリペプチドの検出を含む、被験者におけるアルツハイマー病の状態を判定する方法に関する：
ｉ）ヒトシスタチンC、
ｉｉ）ヒトβ−２−ミクログロブリン、
ｉｉｉ）ヒトミオグロビン（新規変異体）
ｉｖ）神経分泌タンパク質ＶＧＦ
ｖ）少なくとも５、８，１０または２０アミノ酸の、ヒトシスタチンCフラグメント
ｖｉ）少なくとも５、８，１０または２０アミノ酸の、ヒトβ−２−ミクログロブリンフラグメント
ｖｉｉ）少なくとも５、８，１０または２０アミノ酸の、ヒトミオグロビン（新規変異体）フラグメントおよび
ｖｉｉｉ）少なくとも５、８，１０または２０アミノ酸の、神経分泌タンパク質ＶＧＦフラグメント。
【００３１】
１つのそのようなポリペプチドの検出は、ほとんどの場合、アルツハイマー病を信頼性を持って診断するのに十分であるが、本発明の２またはそれ以上のポリペプチドの検出は本方法の感受性と信頼性を高め得る。好ましくは、前記ポリペプチドの１、２、３、４、５または６を同じ試料から検出する。より好ましくは、好ましくは、前記ポリペプチドの１、２、３、４、５、６または全部を同じ試料から検出する。この検出はまた、好ましくは健康な被験者と比較してアルツハイマー病を有する被験者において発現量が異なる他のポリペプチドの検出と同時に行うことができる。
【００３２】
５．
本発明はさらに、同一の被験者から得られた２つの別個の試料をについて上記１〜４のいずれかの方法を行うことを特徴とする、アルツハイマー病の進行を調べる方法に関する。この目的のために、種々の時点で被験者から採取した試料を分析する。各々のポリペプチドの量の変化によってその被験者におけるアルツハイマー病の進行についての結論付けが可能になる。
【００３３】
６．
本発明はさらに、前記ポリペプチドの検出がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによるものである、上記１〜５のいずれかの方法に関する。他の、適当な質量分析法および代わりの他の検出方法を用いることができる。より具体的には、本発明は、該ポリペプチドの検出がハイドロホビックＨ５０、ＷＣＸ２，またはＩＭＡＣ表面をイオン化の後に支持体として用いる、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによるものである。イオン化のための支持体の違いにより、目的の特定のタンパク質に対して異なる感受性が得られる。
【００３４】
７．
本発明はさらに、特異的な抗体または前記ポリペプチドを認識する抗体を該ポリペプチドの検出に用いる、上記１〜５のいずれかの方法に関する。
【００３５】
８．
本発明はさらに、前記被験者のＣＳＦを含む試料における検出である上記１〜７の方法に関する。被験者から採取する試料は、採取後に即処理するか、まず凍結し、後で分析することができる。試料はまた、血液、血清、血漿、尿、精漿、乳頭液または細胞抽出液等のその他の体液から構成されていてもよいし、これを含有していてもよい。
【００３６】
９．
本発明はさらに、分子量４８２４±２０Ｄａのポリペプチド、分子量７６９１±２０Ｄａのポリペプチド、分子量１１７８７±２０Ｄａのポリペプチド、分子量１１９８８±２０Ｄａのポリペプチド、分子量１３４１６±２０Ｄａのポリペプチドを含むキットに関する。本発明はさらに、分子量４８２４±２０Ｄａのポリペプチド、分子量７６９１±２０Ｄａのポリペプチド、分子量１１７８７±２０Ｄａのポリペプチド、分子量１１９８８±２０Ｄａのポリペプチド、分子量１３４１６±２０Ｄａのポリペプチドを含むキットに関する。本発明はさらに、分子量４８２４±２０Ｄａのポリペプチド、分子量７６９１±２０Ｄａのポリペプチド、分子量１１７８７±２０Ｄａのポリペプチド、分子量１１９８８±２０Ｄａのポリペプチド、分子量１３４１６±２０Ｄａのポリペプチド、分子量４７６９±２０Ｄａのポリペプチド、分子量６９５８±２０Ｄａのポリペプチド、分子量６９９１±２０Ｄａのポリペプチド、分子量１３４１２±２０Ｄａのポリペプチド、分子量１３７８７±２０Ｄａのポリペプチド、分子量１７２７６±２０Ｄａのポリペプチド、分子量４０４３７±２０Ｄａのポリペプチド、分子量６８９５±２０Ｄａのポリペプチド、分子量６９２８±２０Ｄａのポリペプチド、分子量７６９１±２０Ｄａのポリペプチド、
分子量７７６９±２０Ｄａのポリペプチド、分子量７９３４±２０Ｄａのポリペプチド、
分子量５０８２±２０Ｄａのポリペプチド、分子量６２６７±２０Ｄａのポリペプチド、
分子量６５１８±２０Ｄａのポリペプチド、分子量７２７４±２０Ｄａのポリペプチド、
分子量８２０９±２０Ｄａのポリペプチドを含むキットに関する。このようなキットは、種々の目的に、例えば、上記方法のいずれかにおいて標準として使用するために、適用することができる。このキットは、前記ポリペプチドの２、５、１０または全部を含むことができる。
【００３７】
１０．
本発明はさらに、少なくとも５アミノ酸のヒトシスタチンCフラグメント、少なくとも５アミノ酸のヒトβ−２−ミクログロブリンフラグメント、少なくとも５アミノ酸のヒトミオグロビンフラグメントを含むキットに関する。このキットは、種々の目的に、例えば、上記方法のいずれかにおいて標準として使用するために、適用することができる。本発明はさらに、少なくとも５、１０または２０アミノ酸のヒトシスタチンCフラグメント、少なくとも５、１０または２０アミノ酸のヒトβ−２−ミクログロブリンフラグメント、少なくとも５、１０または２０アミノ酸のヒトミオグロビンフラグメントおよび少なくとも５、１０または２０アミノ酸の神経分泌タンパク質ＶＧＦのフラグメントを含むキットに関する。これらのキットは、種々の目的に、例えば、上記方法のいずれかにおいて標準として使用するために、適用することができる。
【実施例】
【００３８】
以下の１またはいくつかの実施例によって本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を実施例の範囲に限定するものと決して理解してはならない。
【００３９】
実施例１：患者の評価およびＣＳＦ採取
ヒトの被験者におけるアルツハイマー病の診断は、National Institute of Neurologic and Communicative Disorders and Stroke Alzheimer's Disease and Related Disorders Association（NTNCDS-ADRDA）の診断基準に従った。アルツハイマー病群は９人の患者からなる（７５±７歳、男性６人、女性３人）。健常者の対照群は１０人で構成される（７８±１４歳、男性２人、女性８人、病歴なし、精神病あるいは神経系疾患の症状・兆候なし）。
【００４０】
試験の前に、各患者とその介護人に対しインフォームド・コンセントを行った。実験は現地の倫理委員会により承認された。腰椎穿刺の後、ＣＳＦ試料を採取後ベッドの横ですぐに０．５ｍＬずつドライアイス上で凍結し、分析まで−８０℃で保存した。
【００４１】
実施例２：ＣＳＦのＳＡＸ２チップ上でのプロテインチップＳＥＬＤＩ解析
ＳＡＸ２プロテインチップアレイ（Ciphergen Biosystems, Fremont, CA, USA）を５μLの結合緩衝液(１００ｍＭ 酢酸ナトリウムpH＝４．０）で５分間平衡化した。緩衝液をハンカチーフで注意深く除き、２．５μLの結合緩衝液をウェルに加えた。粗製のCSF 試料（２．５μL）をウェルに加え、ロッキングプラットフォーム上、調湿チャンバー内で室温にて２０分間インキュベーションした。ＣＳＦを取り出し、ウェルを１０μＬの結合緩衝液で５分間洗浄した。次いで、アレイを１５ｍＬ容の円錐エッペンドルフに入れ、結合緩衝液で５分間２回洗浄した。最後に、チップを蒸留水で２回リンスした。過剰の水を除去し、表面が湿っている間、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のアセトニトリルおよび０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）トリフルオロ酢酸中のシナピン酸（ＳＰＡ）（２ｍg／ｍL）０．５μLを各ウェルに２回加え、乾燥した。次いで、アレイをプロテインチップリーダーシステム、ＰＢＳＩＩシリーズ（Ciphergen Biosystems）で読み取った。レーザービームを真空中試料に照射した。これによりタンパク質がマトリックスに吸収されイオン化されると同時にプロテインチップアレイ表面から脱離する。イオン化されたタンパク質を検出し、それらの分子量を飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析法により測定した。正イオンモードで収集したＴＯＦマススペクトルは、レザー出力を閾値よりも若干（閾値より１０〜１５％高い）高くセットし、取得する高質量を４０ｋＤaにセットし、１〜１５ｋDaに最適化して、スポット中平均６５のレーザー照射を用いて作成した。スペクトルを収集し、Ciphergen Proteinchip（バージョン３．０）ソフトウェアを用いて解析した。ＳＰＡマトリックス（１：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）に希釈した「all-in-１」ペプチド分子量標準（Ciphergen biosystems, Inc.）を用いてレーザーの外部校正を行い、ウェルに直接適用した。タンパク質プロファイルの比較を、同じ実験に含まれる全てのスペクトルの全イオン電流に対する標準化の後に行った。並行処理した、同じプロテインチップアレイの（アッセイ内チップ内再現性）の、２つの異なるチップの（アッセイ内チップ間再現性）、４つの異なるウェル上で同じＣＳＦ試料の別のアリコートを分析することにより、そしてさらに実験を再現する（アッセイ間再現性）ことにより、再現性を試験した。
【００４２】
１０人の対照と比較した９人の患者から得られたＣＳＦ試料の分析結果は、２つの群の間で５つのピークの発現量が有意（ｐ＜０．０５）に異なっていることが明らかになった。発現量の異なる５つのタンパク質に関するおおよその平均のSELDI質量は、４．８２ｋＤａ、７．７ｋＤａ、１１．８ｋＤａ、１２．０ｋＤａ、１３．４ｋＤａ（ｐ＜０．０５）であった（表１、図１参照）。
【００４３】
実施例３：強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）精製
これらのピークに対応するタンパク質を同定するために、粗製のＣＳＦの分画をＳＡＸスピンカラムにより行った。溶出画分をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより解析した。
【００４４】
ＳＡＸスピンカラム（ロット番号： SAX2-001116-01, Ciphergen Biosystems, Fremont, CA, USA）を、平衡緩衝液（２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．０）中、４℃にて一晩再水和した。カラムを室温に温め、気泡を除いた。重力にしたがってカラムマトリックスに平衡緩衝液を流した。平衡緩衝液（０．５ｍＬ）をカラムに加え、樹脂に２回通した。２ｍＬのＣＳＦを平衡緩衝液で希釈した（１：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）。タンパク質試料の画分０．８ｍＬをカラムに加え、カラムから１滴も出なくなるまで重力にしたがって通した。次いで、カラムを１５０×ｇで１分間遠心した。次いで、樹脂を同体積の平衡緩衝液で洗浄した。全試料を樹脂に充填するために、この工程を数回繰り返した。結合したタンパク質の溶出は、ｐＨを下げることによって行った。溶出緩衝液Ａは、２０ｍＭ トリス−ＨＣＩ、５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）からなり；溶出緩衝液Ｂ＝２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）；溶出緩衝液Ｃ＝２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）；溶出緩衝液Ｄ＝２０ｍＭ リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）；溶出緩衝液Ｅ＝２０ｍＭ リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．０）；溶出緩衝液Ｆ＝２０ｍＭ リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．４）；溶出緩衝液Ｇ＝３０％アセトニトリル（溶出緩衝液Ｆ中）である。溶出緩衝液２×７５μＬを加え、１５０×ｇで１分間遠心することにより溶出を行った。回収した各画分（１５０μＬ）をspeed-vacにて１０μＬまで濃縮した。タンパク質のプロファイルを、ＳＡＸ２プロテインチップアレイを用いるＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより解析した。チップを２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ＝９．０）からなる結合緩衝液で平衡化した。各濃縮画分の０．５μＬのアリコートをスポット毎に２．５μＬの結合緩衝液に直接加え、前に記載したとおりに処理した。画分の残りを以下に記載するようにトリストリシンゲル上に加えた。
【００４５】
発現量が異なる１３．４ｋＤａのピークを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、５ｍＭ ＮａＣＩ  ｐＨ８．０）および緩衝液Ｂ（２０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７．０）で溶出した。１１．８ｋＤａおよび１２．０ｋＤａの発現量が異なるピークは、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．０）および緩衝液Ｄ（２０ｍＭ リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムｐＨ５．０）で溶出した画分中に認められた。７．７ｋＤａの集団は、緩衝液Ｄ  （２０ｍＭ リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムｐＨ５．０）および緩衝液Ｅ（２０ｍＭ リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムｐＨ４．０）で溶出された。
【００４６】
溶出した各画分を１６．５％のトリストリシンドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルに加え、電気泳動した（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）。クーマシーブルーで着色した後、ゲル上に認められたバンドをもってＳＥＬＤＩ解析によって得られた結果とした。７．７ｋＤａ、１１．８ｋＤａおよび１２．０ｋＤａの集団に対応するバンドを切り出した。タンパク質を実施例６に記載のとおりに抽出し、ＱＴＯＦによって同定した。７．７ｋＤａのピークのＭＳ解析は、既知のいずれのタンパク質とも一致しなかったが、ミオグロビンの新規の変異体あるいはホモローグを示し得る。
ペプチド配列は、以下の通りである
ＸＸＡＤ（Ｌ／Ｉ）ＡＧＨＧ（Ｑ／Ｋ）ＥＶ（Ｌ／Ｉ）（Ｌ／Ｉ）Ｒおよび
ＨＧＴＷ（Ｌ／Ｉ）ＴＡ（Ｌ／Ｉ）ＧＧ（Ｌ／Ｉ）（Ｌ／Ｉ）Ｋ
【００４７】
１１．８ｋＤａおよび１２．０ｋＤａのピークのＭＳ解析によってそれら両方についてベータ−2-ミクログロブリンと同定された。
【００４８】
１３．４ｋＤａの集団はトリストリシンゲル上で認められなかったので、粗製のＣＳＦ試料を用いてトリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。ベータ−２−ミクログロブリンに対応するバンドがこの染色ゲル上で容易に認められた。ベータ−２−ミクログロブリンのすぐ上で凝集しているこのタンパク質は、ＳＥＬＤＩプロファイルで認められるすぐ隣の豊富なタンパク質、即ち１３．４ｋＤａのピークに対応すると結論付けた。このバンドをゲルから切り出し、ＭＡＬＤＩ解析の前にトリプシンにより消化した。ペプチド質量フィンガープリント解析により、シスタチンＣの同定が可能になった。この解析によって得られるシーケンスカバー率は６０％であった。
【００４９】
実施例４：一次元電気泳動／トリスグリシンゲル
２０μＬのＣＳＦを１０μＬ変性Laemmli緩衝液と混合した ［Laemmli 1970］。試料を９５℃に５分間加熱し、Laemmliの方法にしたがって１５％Ｔ（Ｔ＝全アクリルアミド濃度）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに加えた。ゲルを、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０（０．１％ｗ／ｖ）とメタノール（５０％ｖ／ｖ）を含有する溶液中で３０分間染色した。メタノール（４０％ｖ／ｖ）と酢酸（１０％ｖ／ｖ）を含有する溶液中で脱色を行った。
【００５０】
実施例５：一次元電気泳動：トリストリシンゲル
トリストリシンゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を、Schaggerおよびvon Jagow ［1987］にしたがって１６．５％Ｔゲル(Biorad, Hercules, CA）を用いて行った。陽極緩衝液を、０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．９で構成し、陰極緩衝液を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍトリシン、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．２５で構成した。試料を、１０μＬの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１２％（ｗ／ｖ）スクロース、５％（ｖ／ｖ）β−メルカプトメタノールおよび微量のブロモフェノールブルー（ｐＨ６．８）中に希釈した。９５℃で５分間変性した後、試料をゲルに加えた。ゲルを８０Ｖで３時間泳動した。電気泳動の後、ゲルを４０％メタノール、１０％酢酸で３０分間固定した。次いで、ゲルをコロイダルブルークーマシーＧ２５０で一晩染色し、３０％メタノール中で脱色した。同定するバンドを迅速にカットし、エッペンドルフ中に移し、さらに解析するまで４℃に維持した。ポリペプチド分子量（ＭＷ）標準：トリオースリン酸イソメラーゼＭＷ２６，６２５；ミオグロビンＭＷ１６，９５０；α−ラクトアルブミンＭＷ１４，４３７；アプロチニンＭＷ６，５１２；インスリンｂ鎖酸化型ＭＷ３，４９６およびバシトラシンＭＷ１，４２３（Biorad）を泳動することにより、明白な分子量の測定を行った。 
【００５１】
実施例６：タンパク質消化およびペプチド抽出［Bienvenu1999］
目的のタンパク質を含有するゲルのフラグメントを、以前に公開された手順［Shevchenko 1996, Hellman 1994, Rosenfeld 1992］を用いてそのタンパク質をトリプシン消化するため切り出し、以下のように修飾した。まず、ゲルの切片を、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル１００μＬで１５分間、室温で脱色した。変性溶液を除去し、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中の２５μＬの１０ｎＭＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）に置き換え、５６℃にて３５分間インキュベーションした。次いでＤＴＴ溶液を５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中の５５ｍＭヨードアセトアミド２５μＬに置き換え、暗所にて室温で４５分間インキュベーションした。ゲル切片を、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム１００μＬで１０分間洗浄し、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムおよび３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル１００μＬで１０分間洗浄した。
【００５２】
次いで、ゲル切片をHetovac真空遠心(HETO, Allerod, Denmark）にて３０分間乾燥した。乾燥したゲル切片を、トリプシンを６．２５ｎｇ／μＬ含有する５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム５〜２０μＬ中で、４℃にて４５分間再水和した。３７℃で一晩インキュベーションした後、ゲル切片を高真空遠心下で乾燥した後、蒸留水を２０μＬ添加することにより再水和し、最後に再びspeed-vacにて３０分間乾燥した。ペプチドの抽出は、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）２０μＬで時々振りながら室温にて２０分間行った。ペプチドを含有するＴＦＡ溶液をポリプロピレンチューブに移した。２回目の溶出を、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ２０μＬを用い、時々振りながら、室温にて２０分間行った。２回目のＴＦＡ溶液を１回目のものと一緒にプールした。減圧下の蒸発により、プールした抽出液の体積を１〜２μＬまで減少させた。対照の抽出（ブランク）は、タンパク質を含まないゲル数片を用いて行った。
【００５３】
実施例７：ペプチド質量フィンガープリンティング解析によるタンパク質の同定
試料１．５μＬをＭＡＬＤＩ１００ウェルターゲットプレートに加えた。同体積のマトリックス（５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中、１０ｍｇ／ｍＬのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）を、先に加えた消化物に加えた。試料を、真空容器を用いてできるだけ素早く乾燥した。液体の溶液からの質量測定は、３３７ｎｍ窒素レーザーを備えたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器VoyagerTM Elite and Super STR（PerSeptive Biosystems, Framingham MA, USA）を用いて行った。分析器を、加速電圧２０ｋＶ、１００〜１４０ｎｓの遅延抽出パラメーターおよび８５０Ｄａの低質量ゲートにて反射モードで用いた。分子イオン発生のためにレーザー出力を閾値よりも若干高く（閾値よりも１０〜１５％高い）セットした。スペクトルを１０〜２５６の継続的レーザー照射の加算によって得た。最も高い６０個のピークの質量をスペクトルから抽出し、SmartIdentペプチド質量フィンガープリントツール［Gras1999］を用いるタンパク質同定に用いた。リサーチはＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴおよびＴｒＥＭＢＬデータベースに対して行った。ヒトに対してクエリを行い、質量の一致の最小数を４とし、トリプシンの自己消化産物を用いた内部校正後の質量の最大許容度を５０ｐｐｍとし、最大で１つのトリプシンペプチドの間違った開裂を許容し、許容できる改変はシステインのヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化とメチオニンの人工的酸化であった。
【００５４】
実施例８：ペプチド断片解析によるタンパク質同定
ナノＬＣ（ＬＣ＝液体クロマトグラフィー）分離の前に、ペプチド含有溶液の体積を０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸溶液を添加して７μＬに調整した。試料をTriathlon オートサンプラー（Spack, Emmen, Holland）にセットした。各実験につき、ペプチド含有溶液５μＬを内径７５μｍのＣ１８逆相カラム（YMS-ODS-AQ200, Michrom Bioresource, Auburn, CA）に注入した。ペプチドを、SunFlowポンプ（SunChrom, Friderichsdorf, Germany）を用いて０．１％ギ酸の存在下アセトニトリル（ＡＣＮ）グラジェントで溶出した。ポンプの下流の流速を２００ｐｌ／分から０．４ｐｌ／分に減少させるために流路スプリッターを用いた。四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析計（Micromass,Wythenshawe, England）を用いてペプチドを解析した。２７００Ｖの電圧をナノエレクトロスプレーキャピラリー（New Objective,Woburn, MA, USA）にかけた。アルゴンを衝突ガスとして用いた。衝突エネルギーを前駆体イオン質量の関数として固定した。ＭＳ／ＭＳスペクトルをＭＳとＭＳ／ＭＳモード間の自動切り替えにより得た。得られたＭＳ／ＭＳデータを、ProteinLynx ソフトウェア（Micromass,Wythenshawe, England）により、互換性のあるフォーマット（ＤＴＡファイル）に変換し、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＴｒＥＭＢＬ、ＮＣＢＩｎｒおよびＥＳＴデータベースに対し慣用の検索エンジンを用いて解析した。ＭＳ／ＭＳデータをマニュアルで解釈する場合は、配列のみの検索により同定を行った。
【００５５】
マーカーＭ５はシスタチンＣのフラグメントであり、マーカーＭ３およびＭ４はベータ−２−ミクログロブリンの異性体であり、Ｍ２はミオグロビンの新規の変異体またはホモローグであることが分かった。マーカーＭ１は神経分泌タンパク質ＶＧＦのフラグメントであることが分かった。
【００５６】
実施例９：統計的解析
当業者に周知の標準的な統計的手法を用いてＰ値を算出した。０．０５未満のＰ値を統計的有意とした。
【００５７】
実施例１０：４．８ｋＤａフラグメントの単離（マーカーＭ１）
対照の患者から得られたＣＳＦ試料は、３０ｋＤａを超える分子量のタンパク質を除去するためにCentricon 30 濾過装置（Millipore Corp. , Bedford, MA）を用いて分画した。塩および３ｋＤａ未満の分子量のポリペプチドをCentricon 3（Millipore Corp. , Bedford,MA）を用いて除去した。次いで、Centricon 3 を超高純度蒸留水で洗浄した。その洗浄画分に、４．８２ｋＤａの主要な成分が認められた。まず、この液体の画分を１０ｍＭ溶液で洗浄し、１，４−ジチオエリトリトールで５６℃にて１時間還元した後、５４ｍＭヨードアセトアミドで室温にて４５分間アルキル化した。最後に、ポリペプチドを６ｍｇ／Ｌトリプシンで３７℃にて一晩消化した。この液体画分を、以前に記載したようにナノＬＣおよびＱ−ＴＯＦで解析した。
【００５８】
実施例１１：ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ解析のための異なる表面材料
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦを用いて、ＡＤ患者から得た１０のＣＳＦ試料と１０人の対照の解析を３種類の異なる表面（ハイドロホビックＨ５０、ＷＣＸ２、およびＩＭＡＣ表面（Ciphergen Biosystems, Fremont, California, USA, resp.）で行った。Ｈ５０上で発現量の異なる７つのピークが認められ、ＷＣＸ２上で５つマーカーが、ＩＭＡＣ表面上で５つのマーカーが認められた。マーカーをＨ５０チップ上で用いる診断テストにより、特異性と感受性は、それぞれ１００％、７０％であることが判明した。Ｈ５０およびＷＣＸ２上で認められたマーカーの組み合わせにより、１００％の特性性と８０％の感受性が得られた。最後に、Ｈ５０、ＷＣＸ２およびＩＭＡＣ上で認められたマーカーの組み合わせは、１００％の特異性と９０％の感受性が得られた。
【００５９】
異なる表面材料を用いるＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによって測定した、発現量の異なるポリペプチドの平均質量は、以下の通りであった。
表面ハイドロホビックH50：７ピーク
マーカー１：  ４７６９±s.d.Ｄａ
マーカー２：  ６９５８±s.d.Ｄａ
マーカー３：  ６９９１±s.d.Ｄａ
マーカー４：１３４１２±s.d.Ｄａ
マーカー５：１３７８７±s.d.Ｄａ
マーカー６：１７２７６±s.d.Ｄａ
マーカー７：４０４３７±s.d.Ｄａ
表面ＩＭＡＣＣｕ：５ピーク
マーカー１：６８９５ ± s.d. Ｄａ
マーカー２：６９２８ ± s.d. Ｄａ
マーカー３：７６９１ ± s.d. Ｄａ
マーカー４：７７６９ ± s.d. Ｄａ
マーカー５：７９３４ ± s.d. Ｄａ
表面ＷＣＸ２：５ピーク
マーカー１：５０８２ ± s.d. Ｄａ
マーカー２：６２６７ ± s.d. Ｄａ
マーカー３：６５１８ ± s.d. Ｄａ
マーカー４：７２７４ ± s.d. Ｄａ
マーカー５：８２０９ ± s.d. Ｄａ
【００６０】
上記の各マーカーについての標準偏差（s. d.）は２０Ｄａであった。但し、上記の各マーカーについての標準偏差が４０Ｄａ、または１０Ｄａ、または５Ｄａとなることもある。
【００６１】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】対照群と比較して疾患群において発現量が異なる、表１の５つのマーカーペプチドの平均強度。
【配列表】
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【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月25日(2005.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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