(57)【要約】  本発明は、動物細胞の培養に適した培地、それを用いた培養方法等を提供する。本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養であって、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法、物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法において、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法、及び１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質を生産する能力を有する動物細胞の培養方法であって、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法。
【請求項２】
１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドがジペプチドまたはジペプチドの二量体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１以上のＬ−システインを有するジペプチドがグリシル−Ｌ−システイン、Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン若しくはγ−グルタミルシステインまたはその塩類である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１以上のＬ−システインを有するジペプチドの二量体がビス−（グリシル−Ｌ−システイン）またはビス−（Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン）である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
さらにＬ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドを培地中に添加して前記動物細胞を培養することを特徴とする、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドがジペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１以上のＬ−チロシンを有するジペプチドがＬ−アラニル−Ｌ−チロシンまたはその塩類である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
培地中に添加される１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
培地中に添加されるＬ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項５〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
動物細胞が哺乳類に属する動物由来の細胞である、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳類に属する動物が霊長類またはげっ歯類である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
動物細胞が骨髄腫細胞若しくは卵巣細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞である、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
物質がペプチドである、請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞である、請求項１０〜請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ペプチドが糖蛋白質である、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
糖蛋白質が抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
オリゴペプチドを添加する培地がフィード培地である、請求項１〜請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
培養方法が培養槽を用いた培養方法である、請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法であって、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法。
【請求項２１】
１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドがジペプチドまたはジペプチドの二量体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
１以上のＬ−システインを有するジペプチドが、グリシル−Ｌ−システイン、Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン若しくはγ−グルタミルシステインまたはその塩類である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１以上のＬ−システインを有するジペプチドの二量体がビス−（グリシル−Ｌ−システイン）またはビス−（Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
さらにＬ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドを培地中に添加して前記動物細胞を培養することを特徴とする、請求項２０〜請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドがジペプチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
１以上のＬ−チロシンを有するジペプチドがＬ−アラニル−Ｌ−チロシンまたはその塩類である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
培地中に添加される１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項２０〜請求項２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
培地中に添加されるＬ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項２４〜請求項２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
動物細胞が哺乳類に属する動物由来の細胞である、請求項２０〜請求項２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳類に属する動物が霊長類またはげっ歯類である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
動物細胞が骨髄腫細胞若しくは卵巣細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞である、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
物質がペプチドである、請求項２０〜請求項３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞である、請求項２９〜請求項３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ペプチドが糖蛋白質である、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
糖蛋白質が抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
オリゴペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、請求項２０〜請求項３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
オリゴペプチドを添加する培地がフィード培地である、請求項２０〜請求項３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
培養方法が培養槽を用いた培養方法である、請求項２０〜請求項３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地。
【請求項４０】
１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドがジペプチドまたはジペプチドの二量体である、請求項３９に記載の培地。
【請求項４１】
１以上のＬ−システインを有するジペプチドが、グリシル−Ｌ−システイン、Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン若しくはγ−グルタミルシステインまたはその塩類である、請求項４０に記載の培地。
【請求項４２】
１以上のＬ−システインを有するジペプチドの二量体がビス−（グリシル−Ｌ−システイン）またはビス−（Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン）である、請求項４１に記載の培地。
【請求項４３】
さらにＬ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドを含有する、請求項３９〜請求項４２のいずれか１項に記載の培地。
【請求項４４】
１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドがジペプチドである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
１以上のＬ−チロシンを有するジペプチドがＬ−アラニル−Ｌ−チロシンまたはその塩類である、請求項４４に記載の培地。
【請求項４６】
１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項３９〜請求項４５のいずれか１項に記載の培地。
【請求項４７】
Ｌ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項３９〜請求項４５のいずれか１項に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養方法であって、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法、物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法であって、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法、及び１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖蛋白質、中でも抗体は、特に近年、種々の医薬品として認可され、更には多くの候補抗体が開発中である（非特許文献１）。今後、動物細胞を用いた抗体等の物質の生産が盛んになることが予測されているが、一方、動物細胞による物質の生産性はまだ充分に高くないことが問題点として挙げられている。【０００３】
抗体をはじめとする糖蛋白質を生産する宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣組織由来細胞（ＣＨＯ細胞）またはハイブリドーマ等の動物細胞が選択される。なぜならば、該細胞から生産された糖蛋白質に結合している糖鎖が相対的にヒトに近いためである（特許文献１、２、非特許文献２）。【０００４】
物質の生産性の向上を目的に、昨今培地の改良が進むが（特許文献５、６）、シスチンの低い溶解性［０．１ｇ／Ｌ（Ｈ２Ｏ、２０℃）］と（非特許文献２）、システイン塩酸塩の水溶液中での低い安定性から（非特許文献３）、システイン、シスチンまたはその塩類は、培地中での沈殿の析出等の課題となり工業的な使用においては制限がある。一方で、ジペプチド等の短鎖ペプチドの細胞培養への利用に関しては、培地の加熱滅菌を目的として、Ｌ−アミノ酸−Ｌ−グルタミンを添加した基礎培地が知られている（特許文献３、４）。【０００５】
また、システイン含有のオリゴペプチド：Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｉｎｅ、Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ−Ｌ−ｇｌｙｃｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｉｎｅ、Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｉｎｅ，Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ  −Ｌ−ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｉｎｅの血中投与例、経口および腸管外投与例（特許文献７、非特許文献３、４）が知られる。システインを含むトリペプチドの一つであるグルタチオンは、グルタミン酸、システインまたはグリシンからなり、培地への添加が知られている（特許文献８）。【０００６】
しかし、Ｌ−システインを有するその他のオリゴペプチドの培地としての応用は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第１９９６／３９４８８号
【特許文献２】米国特許第４７２４２０６号明細書
【特許文献３】日本国特開昭６１−２７１９８５号公報
【特許文献４】欧州特許第０２２０３７９号明細書
【特許文献５】国際公開第２００８／１３６３９８号
【特許文献６】国際公開第２００８／１４１２０７号
【特許文献７】国際公開第１９８８／０３１５０号
【特許文献８】日本国特開２００２−１４２７５９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．，３，３８３（２００４）
【非特許文献２】Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２，１３９３−８（２００４）
【非特許文献３】Ｊ．Ｎｕｔｒｉ．，１３１，２５６２ｓ−２５６８ｓ，（２００１）
【非特許文献４】Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆｕｅｒ  Ｅｒｎａｅｈｒｕｎｇｓｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ，２８，１９１−２００（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
動物細胞を培養し、該細胞から物質を生産させる方法において、生産される物質の生産性を向上するための方法、生産される物質の生産性を向上するため工業利用可能な培地が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
即ち、本発明は、以下の通りである。
１．物質を生産する能力を有する動物細胞の培養方法であって、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法。
２．１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドがジペプチドまたはジペプチドの二量体である、前項１に記載の方法。
３．１以上のＬ−システインを有するジペプチドがグリシル−Ｌ−システイン、Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン若しくはγ−グルタミルシステインまたはその塩類である、前項２に記載の方法。
４．１以上のＬ−システインを有するジペプチドの二量体がビス−（グリシル−Ｌ−システイン）またはビス−（Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン）である、前項２に記載の方法。
５．さらにＬ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドを培地中に添加して前記動物細胞を培養することを特徴とする、前項１〜前項４のいずれか１に記載の方法。
６．１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドがジペプチドである、前項５に記載の方法。
７．１以上のＬ−チロシンを有するジペプチドがＬ−アラニル−Ｌ−チロシンまたはその塩類である、前項６に記載の方法。
８．培地中に添加される１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、前項１〜前項７のいずれか１に記載の方法。
９．培地中に添加されるＬ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、前項５〜前項８のいずれか１に記載の方法。
１０．動物細胞が哺乳類に属する動物由来の細胞である、前項１〜前項９のいずれか１に記載の方法。
１１．哺乳類に属する動物が霊長類またはげっ歯類である前項１０に記載の方法。
１２．動物細胞が骨髄腫細胞若しくは卵巣細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞である、前項１０または前項１１に記載の方法。
１３．物質がペプチドである、前項１〜前項１２のいずれか１に記載の方法。
１４．動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞である、前項１０〜前項１２のいずれか１に記載の方法。
１５．ペプチドが糖蛋白質である、前項１３または前項１４に記載の方法。
１６．糖蛋白質が抗体である、前項１５に記載の方法。
１７．オリゴペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、前項１〜前項１６のいずれか１に記載の方法。
１８．オリゴペプチドを添加する培地がフィード培地である、前項１〜前項１７のいずれか１に記載の方法。
１９．培養方法が培養槽を用いた培養方法である、前項１〜前項１８のいずれか１に記載の方法。
２０．物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法であって、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法。
２１．１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドがジペプチドまたはジペプチドの二量体である、前項２０に記載の方法。
２２．１以上のＬ−システインを有するジペプチドが、グリシル−Ｌ−システイン、Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン若しくはγ−グルタミルシステインまたはその塩類である、前項２１に記載の方法。
２３．１以上のＬ−システインを有するジペプチドの二量体がビス−（グリシル−Ｌ−システイン）またはビス−（Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン）である、前項２１に記載の方法。
２４．さらにＬ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドを培地中に添加して前記動物細胞を培養することを特徴とする、前項２０〜前項２３のいずれか１に記載の方法。
２５．１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドがジペプチドである、前項２４に記載の方法。
２６．１以上のＬ−チロシンを有するジペプチドがＬ−アラニル−Ｌ−チロシンまたはその塩類である、前項２５に記載の方法。
２７．培地中に添加される１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、前項２０〜前項２６のいずれか１に記載の方法。
２８．培地中に添加されるＬ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、前項２４〜前項２７のいずれか１に記載の方法。
２９．動物細胞が哺乳類に属する動物由来の細胞である、前項２０〜前項２８のいずれか１に記載の方法。
３０．哺乳類に属する動物が霊長類またはげっ歯類である前項２９に記載の方法。
３１．動物細胞が骨髄腫細胞若しくは卵巣細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞である、前項２９または前項３０に記載の方法。
３２．物質がペプチドである、前項２０〜前項３１のいずれか１に記載の方法。
３３．動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞である、前項２９〜前項３１のいずれか１に記載の方法。
３４．ペプチドが糖蛋白質である、前項３２または前項３３に記載の方法。
３５．糖蛋白質が抗体である、前項３４に記載の方法。
３６．オリゴペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、前項２０〜前項３５のいずれか１に記載の方法。
３７．オリゴペプチドを添加する培地がフィード培地である、前項２０〜前項３６のいずれか１に記載の方法。
３８．培養方法が培養槽を用いた培養方法である、前項２０〜前項３７のいずれか１に記載の方法。
３９．１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地。
４０．１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドがジペプチドまたはジペプチドの二量体である、前項３９に記載の培地。
４１．１以上のＬ−システインを有するジペプチドが、グリシル−Ｌ−システイン、Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン若しくはγ−グルタミルシステインまたはその塩類である、前項４０に記載の培地。
４２．１以上のＬ−システインを有するジペプチドの二量体がビス−（グリシル−Ｌ−システイン）またはビス−（Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン）である、前項４１に記載の培地。
４３．さらにＬ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドを含有する、前項３９〜前項４２のいずれか１に記載の培地。
４４．１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドがジペプチドである、前項４３に記載の方法。
４５．１以上のＬ−チロシンを有するジペプチドがＬ−アラニル−Ｌ−チロシンまたはその塩類である、前項４４に記載の培地。
４６．１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、前項３９〜前項４５のいずれか１に記載の培地。
４７．Ｌ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、前項３９〜前項４５のいずれか１に記載の培地。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養であって、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法、物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法であって、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法、及び１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養であって、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法に関する。
【００１３】
本発明に用いるオリゴペプチドとしては特に限定されないが、好ましくは２〜２０のアミノ酸からなるペプチド、更に好ましくは２〜１０のアミノ酸からなるペプチド、例えば、ペンタペプチド、テトラペプチド、トリペプチド、ジペプチド、またはこれらのペプチドの二量体が挙げられる。また、本発明に用いるオリゴペプチドは、例えば、塩酸塩、ナトリウム塩等の塩、及び／または、例えば水和物等の溶媒和物を形成していてもよい。
【００１４】
１以上のＬ−システインを有するジペプチドの具体例としては、グリシル−Ｌ−システイン（Ｇｌｙ−Ｃｙｓ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン（Ａｌａ−Ｃｙｓ）、Ｌ−セレニル−Ｌ−システイン（Ｓｅｒ−Ｃｙｓ）、Ｌ−シスチニル−Ｌ−システイン（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）、Ｌ−リジニル−Ｌ−システイン（Ｌｙｓ−Ｃｙｓ）、Ｌ−メチオニル−Ｌ−システイン（Ｍｅｔ−Ｃｙｓ）、Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−システイン（Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）、Ｌ−チロシニル−Ｌ−システイン（Ｔｙｒ−Ｃｙｓ）、Ｌ−トリプトファニル−Ｌ−システイン（Ｔｒｐ−Ｃｙｓ）、Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン（Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）、Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−システイン（Ａｓｐ−Ｃｙｓ）、Ｌ−グルタミニル−Ｌ−システイン（Ｇｌｎ−Ｃｙｓ）、Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−システイン（Ｈｉｓ−Ｃｙｓ）、Ｌ−アルギニル−Ｌ−システイン（Ａｒｇ−Ｃｙｓ）、Ｌ−シスチニル−グリシン（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）、Ｌ−シスチニル−Ｌ−アラニン（Ｃｙｓ−Ａｌａ）、Ｌ−シスチニル−Ｌ−セリン（Ｃｙｓ−Ｓｅｒ）、Ｌ−シスチニル−Ｌ−チロシン（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ）、Ｌ−シスチニル−Ｌ−ロイシン（Ｃｙｓ−Ｌｅｕ）、Ｌ−シスチニル−Ｌ−イソロイシン（Ｃｙｓ−Ｉｌｅ）、Ｌ−シスチニル−Ｌ−メチオニン（Ｃｙｓ−Ｍｅｔ）、Ｌ−シスチニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｃｙｓ−Ｐｈｅ）、Ｌ−シスチニル−Ｌ−トリプトファン（Ｃｙｓ−Ｔｒｐ）、Ｌ−シスチニル−Ｌ−ヒスチジン（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ）、Ｌ−シスチニル−Ｌ−アルギニン（Ｃｙｓ−Ａｒｇ）等が挙げられる（国際公開第２００４／０５８９６０号）。また、１以上のＬ−システインを有するジペプチドの二量体の具体例としては、ビス−（グリシル−Ｌ−システイン）、またはビス−（Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン）等が挙げられる。
【００１５】
本発明は、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地に関する。
【００１６】
さらに、本発明の培地において、さらにＬ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドを添加することが出来る。本発明の培地に添加するＬ−チロシンは、例えば、塩酸塩、ナトリウム塩等の塩、及び／または、例えば、水和物等の溶媒和物を形成していてもよい。
【００１７】
オリゴペプチドを含有する培地に特に制限はないが、拡大培養培地、基本（初発）培地、灌流培地またはフィード（流加）培地から選択される少なくとも１つの培地に添加することが好ましい。
【００１８】
本発明の１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドは公知の合成法、酵素法または発酵法により製造することが出来る。例えば、Ｌ−グリシル−Ｌ−システイン、Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン、ビス−（Ｌ−グリシル−Ｌ−システイン）、またはビス−（Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン）を製造する方法としては、例えば、合成法、または発酵法（国際公開第２００４／０５８９６０号、国際公開第２００６／００１３７９号）等が挙げられる。
【００１９】
また、本発明の動物細胞の培養方法において、さらにＬ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドを添加することが出来る。
【００２０】
１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドのうち、１以上のＬ−チロシンを有するジペプチドの具体例としては、グリシル−Ｌ−チロシン（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン（Ａｌａ−Ｔｙｒ）、Ｌ−セレニル−Ｌ−チロシン（Ｓｅｒ−Ｔｙｒ）、Ｌ−バリニル−Ｌ−チロシン（Ｖａｌ−Ｔｙｒ）、Ｌ−メチオニル−Ｌ−チロシン（Ｍｅｔ−Ｔｙｒ）、Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシン（Ｐｈｅ−Ｔｙｒ）、Ｌ−アルギニル−Ｌ−チロシン（Ａｒｇ−Ｔｙｒ）、Ｌ−チロシニル−グリシン（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ）、Ｌ−チロシニル−Ｌ−アラニン（Ｔｙｒ−Ａｌａ）、Ｌ−チロシニル−Ｌ−セリン（Ｔｙｒ−Ｓｅｒ）、Ｌ−チロシニル−Ｌ−メチオニン（Ｔｙｒ−Ｍｅｔ）またはＬ−チロシニル−Ｌ−アルギニン（Ｔｙｒ−Ａｒｇ）等が挙げられる。
【００２１】
１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドも公知の合成法、酵素法または発酵法により製造することが出来る。例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシンを製造する方法としては、合成法、または発酵法（国際公開第２００４／０５８９６０号、国際公開第２００６／００１３７９号）等が挙げられる。
【００２２】
オリゴペプチドを培地に添加する方法は特に制限はないが、拡大培養培地、基本（初発）培地、灌流培地またはフィード培地から選択される少なくとも１つの培地に添加することが好ましい。
【００２３】
本発明において、フィード培地とは、基本培地とは別に添加する培地を意味する。また、１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドと、Ｌ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドとを、１つの培地に同時に添加をしてもよいし、２つ以上の培地の各々に別に添加をしてもよい。
【００２４】
フィード培地として添加する場合は、オリゴペプチドを単独でフィード培地として培地へ添加してもよいし、またオリゴペプチドと他の培地成分とを予め混合されたフィード培地として培地へ添加してもよい。また、フィード培地を分割して不連続に培地に添加してもよいし、フィード培地を連続して培地に添加してもよい。
【００２５】
フィード培地の保存方法としては、培地が無菌状態を保持する方法であれば特に制限されないが、ステンレスタンクまたはディスポーサブルバッグ等を用いる方法等が挙げられる。
【００２６】
いずれの培地中へ添加される１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドの濃度は、培養に用いる動物細胞の種類、生産する物質の種類、オリゴペプチドの種類、オリゴペプチドの添加時期等により適宜選択すればよいが、好ましくは０．００１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．００５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２７】
また、培地中へ添加されるＬ−チロシンまたは１以上のＬ−チロシンを有するオリゴペプチドの濃度も、培養に用いる動物細胞の種類、生産する物質の種類、オリゴペプチドの種類、オリゴペプチドの添加時期等により適宜選択すればよいが、好ましくは０．００１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．００５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２８】
オリゴペプチドを含有するフィード培地を基礎培地へ添加する時期は、特に制限はなく培養開始前後で添加してよいが、好ましくは対数増殖期に培地へ添加する。対数増殖期は培養する細胞株、培養の制御方法によって異なるが、培養される細胞数が上昇した時点から培養される細胞数が一定になる時点までの期間を指す。
【００２９】
オリゴペプチドを含有するフィード培地を基礎培地へ添加する混合比は任意であるが、工業設備の制約から１０％から５０％であることが好ましく、２０％から３０％前後がより好ましい。
【００３０】
本発明に用いられる培地としては、動物細胞の培養に用いることが出来ればいかなるものでもよく、通常の動物細胞の培養に用いられる培地が用いられる。予めシステインを培地成分として含有していてもよいし、また不含でもよい。
【００３１】
本発明に用いられる培地としては、例えば、基礎培地、血清含有培地、無血清培地、動物由来成分を含まない培地、無蛋白質培地または完全合成培地等が挙げられるが、無血清培地、無蛋白質培地または完全合成培地が好ましい。
【００３２】
基礎培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｆ１２培地（ＬＴＩ社製）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）［Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）］、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）またはこれらの改変培地や混合培地等が挙げられる。
【００３３】
中でも、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ及びＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３２５  ＰＦ培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）またはＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ  ＣＨＯ培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）等が好ましい。
【００３４】
無血清培地としては、例えば、基礎培地に、血清の代替物である生理活性物質、栄養因子、動物細胞が資化しうる炭素源または窒素源等を添加させた培地が挙げられる。これらの添加物は、培養前にあらかじめ培地に含有させることが好ましい。
【００３５】
栄養因子としては、例えば、グルコース、アミノ酸またはビタミン等が挙げられる。
【００３６】
アミノ酸としては、例えば、Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、Ｌ−アルギニン（Ａｒｇ）、Ｌ−アスパラギン（Ａｓｎ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｌ−システイン（Ｃｙｓ）、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｌ−ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｌ−リジン（Ｌｙｓ）、Ｌ−メチオニン（Ｍｅｔ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）、Ｌ−セリン（Ｓｅｒ）、Ｌ−スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｌ−トリプトファン（Ｔｒｐ）またはＬ−バリン（Ｖａｌ）等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。
【００３７】
ビタミンとしては、例えば、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ−α−トコフェロール等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。
【００３８】
生理活性物質としては、例えば、インシュリン、ＩＧＦ−Ｉ、トランスフェリン、血清アルブミンまたは増殖因子を含む血清分画物等が挙げられる。
【００３９】
動物由来成分を含まない培地において、動物由来成分の代わりに添加される物質としては、遺伝子組換え法で製造された生理活性物質や、加水分解物または動物由来原料を含まない脂質等が挙げられる。
【００４０】
加水分解物としては、例えば、大豆、小麦、米、えんどう豆、綿実または酵母抽出物等の加水分解物等が挙げられる。
【００４１】
脂質としては、例えば、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸等が挙げられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。
【００４２】
無蛋白培地としては、例えば、ＡＤＰＦ培地（Ａｎｉｍａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ、ハイクローン社製）またはＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３２５  ＰＦ培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）等が挙げられる。
【００４３】
完全合成培地としては、例えば、ＣＤ  ＣＨＯ  Ｆｕｓｉｏｎ培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）、ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地（インビトロジェン社製）、ＣＤ−ＣＨＯ培地（インビトロジェン社製）、ＩＳ−ＣＤ−ＣＨＯ培地（アーバイン・サイエンティフィック社製）またはＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ  ＣＨＯ培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）等が挙げられる。
【００４４】
長期間または高密度で培養する場合は、アミノ酸及びビタミンを高濃度に含有した培地、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地及びＦ１２培地を１：１：１の比率で混合した培地、ＤＭＥＭ培地及びＦ１２培地を１：１の比率で混合した培地またはハイブリド−マＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）等が用いられる。
【００４５】
本発明に用いられる物質を生産する能力を有する動物細胞としては、例えば、哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類または昆虫類等由来の細胞等が挙げられる。中でも、哺乳類に属する動物細胞が好ましく、ヒトまたはサル等の霊長類に由来する動物細胞またはマウス、ラットまたはハムスター等のげっ歯類に由来する動物細胞がより好ましい。
【００４６】
哺乳類に属する細胞としては、骨髄腫細胞、卵巣細胞、腎臓細胞、血球細胞、子宮細胞結合組織細胞、乳腺細胞、胚性網膜芽細胞またはこれらの細胞に由来する細胞等が好ましく、骨髄腫細胞、骨髄腫細胞に由来する細胞、卵巣細胞、または卵巣細胞に由来する細胞から選ばれる細胞がより好ましい。
【００４７】
哺乳類に属する細胞としては、例えば、ヒト細胞株であるＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２４０）、ＨＴ−１０８０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−１２１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）、２９３（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１２０６０２）、Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４３２）、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）］、ＮＭ−Ｆ９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０５、国際公開第２００５／０１７１３０号）及びＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．９６０２２９４０、米国特許第６８５５５４４号明細書）、サル細胞株であるＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−１６５１）及びＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５１）、マウス細胞株であるＣ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６１６）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８１）、ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）、ＮＳ０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１８２７）、ラット細胞株であるＹ３  Ａｇ１．２．３．（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６３１）、ＹＯ（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０１）及びＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６６２）、ハムスター細胞株であるＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−９０９６）、ＣＨＯ／ＤＧ４４［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］及びＢＨＫ２１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１０）またはイヌ細胞であるＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−３４）等が挙げられる。
【００４８】
鳥類に属する細胞としては、例えば、ニワトリ細胞株ＳＬ−２９（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２９）等が挙げられる。魚類に属する細胞としては、例えば、ゼブラフィッシュ細胞株ＺＦ４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２０５０）等が挙げられる。
【００４９】
昆虫類に属する細胞としては、例えば、蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ９（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１７１１）等が挙げられる。また、ワクチン製造に使用される初代培養細胞としては、例えば、初代サル腎細胞、初代ウサギ腎細胞、初代ニワトリ胎児細胞または初代ウズラ胎児細胞等が挙げられる。
【００５０】
骨髄腫細胞または骨髄腫細胞に由来する細胞としては、例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、ＮＳ０、Ｙ３  Ａｇ１．２．３．、ＹＯまたはＹＢ２／０等が挙げられる。卵巣細胞または卵巣細胞に由来する細胞としては、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−またはＣＨＯ／ＤＧ４４等が挙げられる。
【００５１】
また、腎臓細胞としては、例えば、２９３、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ−７、ＢＨＫ２１またはＭＤＣＫ等が挙げられる。血球細胞としては、例えば、ＨＬ−６０、Ｎａｍａｌｗａ、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１またはＮＭ−Ｆ９等が挙げられる。
【００５２】
子宮細胞としては、例えば、ＨｅＬａ等が挙げられる。結合組織細胞としては、例えば、ＨＴ−１０８０またはＮＩＨ３Ｔ３等が挙げられる。乳腺細胞としては、例えば、Ｃ１２７１Ｉ等が挙げられる。胚性網膜芽細胞としては、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６等が挙げられる。
【００５３】
本発明に用いられる物質を生産する能力を有する動物細胞としては、例えば、物質を産生する動物細胞の他、物質を産生するようになった融合細胞等が挙げられる。例えば、所望の物質が抗体である場合には、Ｂ細胞等の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合細胞であるハイブリドーマ等が挙げられる。
【００５４】
また、変異処理を施して物質を産生するようになった動物細胞、物質の発現量を上昇させるような変異処理を施した動物細胞等も本発明の動物細胞に包含される。
【００５５】
変異処理を施して物質を産生するようになった動物細胞としては、所望の物質を生産出来るようにする為に、蛋白質の修飾酵素等に変異が導入された細胞等が挙げられ、例えば、所望の物質が糖蛋白質である場合には、糖鎖の構造を変化させるために、種々の糖鎖修飾酵素に変異が導入された細胞等が挙げられる。
【００５６】
さらに、本発明の物質を産生する動物細胞としては、例えば、物質の生産に関与する遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換された動物細胞も包含される。該形質転換細胞は、物質の生産に関与するＤＮＡとプロモーターを含む組換え体ベクターを、上記の物質を生産する能力を有する動物細胞に導入することによって得ることが出来る。
【００５７】
物質の生産に関与するＤＮＡとしては、例えば、ペプチド等の物質をコードするＤＮＡ、物質の生合成に関わる酵素または蛋白質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。
【００５８】
本発明の方法により製造される物質としては、動物細胞が生産出来る物質であればいかなるものでもよいが、哺乳類に属する動物細胞が生産できる物質が好ましい。例えば、ペプチド、リボザイム等の生体触媒分子、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン、レシリンまたはフィブロイン等の構造の形成／保持分子、痘瘡ワクチン、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、おたふく風邪ワクチン、狂犬病ワクチン、水痘ワクチン、ウシ流行熱ワクチン、イバラキ病ワクチンまたはウシ伝染性気管炎ワクチン等のワクチン、及びアデノウィルスまたはバキュロウィルス等のウイルス等が挙げられる。
【００５９】
ペプチドとしては、真核細胞由来のペプチドが好ましく、動物細胞由来のペプチドがより好ましく、例えば、哺乳動物細胞由来のペプチドが挙げられる。また、本発明のペプチドは、所望のペプチドが含まれており、活性を有していればいかなる形状でもよく、例えば、他のペプチドと融合させた融合ペプチド等の人工的に改変されたペプチドであってもよいし、部分断片からなるペプチドであってもよい。
【００６０】
ペプチドの具体例としては、糖蛋白質または生理活性を有するペプチド等が挙げられる。
【００６１】
糖蛋白質としては、具体的には、例えば、抗体、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，５５５８（１９７７）］、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）［Ｎａｔｕｒｅ，３６９  ５３３（１９９４）］、組織型プラスミノーゲンアクチベータ、プロウロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩ、血液凝固因子ＸＩＩ、プロトロンビン複合体、フィブリノゲン、アルブミン、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、アクチビン、骨形成因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニ−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，９０１７（１９８３）］マクロファ−ジコロニ−刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，２６９（１９９１）］、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，１９９８（１９７７）］、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９３，１００７（１９７６）］、インターロイキン６、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）［Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．，５５，２８０（１９９４）］、可溶性インターロイキン４受容体、腫瘍壊死因子α、ＤＮａｓｅｌ、ガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘモグロビン若しくはトランスフェリン、これらの誘導体またはこれらの糖蛋白質の部分断片等が挙げられる。
【００６２】
抗体としては、抗原結合性を有する抗体であればいかなるものでもよく、例えば、腫瘍関連抗原を認識する抗体またはその抗体断片、アレルギー若しくは炎症に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、ウイルス若しくは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片等が挙げられる。
【００６３】
腫瘍関連抗原としては、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５８、ＣＤ１６０、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ２００、ＣＤ２２７、ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＡＲＰ４）、ａｕｒｏｒａ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−ＤＣ、ｉｎｔｅｇｌｉｎ、ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２（ＢＳＴ２）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ  ９（ＣＡ９）、ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｃｃ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＣＲ）４、ＣＣＲ７、ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１（ＣＦＲ−１）、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＣＴＡ、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）、ＣＴＬＡ−４、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−１８、ＤＦ３、Ｅ−ｃａｔｈｅｒｉｎ、ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ３）、ＥＧＦＲ４（ＨＥＲ４）、ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＰＣＲ）、ｅｐｈｒｉｎ、ｅｐｈｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｅｐｈ）、ＥｐｈＡ２、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｓｅ−２（ＥＴ２）、ＦＡＭ３Ｄ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＰ）、Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １（ＦｃＲＨ１）、ｆｅｒｒｉｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ８（ＦＧＦ８）、ＦＧＦ８  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  １０（ＦＺＤ１０）、ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４（ＦＺＤ−４）、Ｇ２５０、Ｇ−ＣＳＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２またはＧＭ３等）、ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ｇｐ７５、ｇｐ８８、ＧＰＲ−９−６、ｈｅｐａｒａｎａｓｅ  Ｉ、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＨＬＡ  ａｎｔｉｇｅｎ（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ等）、ＨＭ１．２４、ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ  ｆａｔｇｌｏｂｕｌｅ（ＨＭＦＧ）、ｈＲＳ７、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０（ｈｓｐ９０）、ｉｄｉｏｔｙｐｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ＩＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＧＦＲ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（例えば、ＩＬ−６またはＩＬ−１５等）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＩＬ−６ＲまたはＩＬ−１５Ｒ等）、ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ−４（ＩＲＴＡ−４）、ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  １、ＫＤＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＳ１／４、ｌａｍｐ−１、ｌａｍｐ−２、ｌａｍｉｎｉｎ−５、Ｌｅｗｉｓ  ｙ、ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  ｘ、ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＴＢＲ）、ＬＵＮＸ、ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ（ＭＣＳＰ）、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＩＣＡ、Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＭＩＳＩＩＲ）、ｍｕｃｉｎ、ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＮＣＡＭ）、Ｎｅｃｌ−５、Ｎｏｔｃｈ１、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆａｃｔｏｒ−４（ＰＦ−４）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）、Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＴＨｒＰ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ（ＲＨＡＭＭ）、ＲＯＢＯ１、ＳＡＲＴ３、ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ４Ｂ（ＳＥＭＡ４Ｂ）、ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＬＰＩ）、ＳＭ５−１、ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−７２（ＴＡＧ−７２）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴｆＲ）、ＴＧＦ−ｂｅｔａ、Ｔｈｙ−１、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｍｕｃｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  １（ＴＩＭ−１）、ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ（ｈＴＦ）、Ｔｎ  ａｎｔｉｇｅｎ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＴＦ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＲＡＩＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＤＲ４またはＤＲ５等）、ｓｙｓｔｅｍ  ＡＳＣ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒ��ｅｒ  ２（ＡＳＣＴ２）、ｔｒｋＣ、ＴＲＯＰ−２、ＴＷＥＡＫ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｎ１４、ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３等）、ｖｉｍｅｎｔｉｎまたはＶＬＡ−４等が挙げられる。
【００６４】
抗体としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれでもよく、抗体のクラスとしては、例えば、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）及びイムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）が挙げられる。これらの中でも、ＩｇＧが好ましい。更にＩｇＧのサブクラスとしては、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４が挙げられる。
【００６５】
また、抗体としては、抗体の一部分を含む断片等が包含され、例えば、Ｆａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ、ｓｃＦｖ）及びジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ、ｄｓＦｖ）、または抗体のＦｃ領域を含む融合蛋白質等が挙げられる。
【００６６】
更に、抗体としては、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体の他、遺伝子組換え技術により作製された抗体、即ち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体等が挙げられる。具体的には、例えば、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト型キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体等を挙げることが出来る。
【００６７】
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）及び抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）と、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨとも称す）及びヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスターまたはラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることが出来る。
【００６８】
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマよりＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することが出来る。
【００６９】
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと称す）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましく、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることが出来る。
【００７０】
ヒト化抗体としては、例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト型相同性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下、ＣＤＲと称す）のアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植して作製されたＣＤＲ移植抗体等が挙げられる。
【００７１】
ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することが出来る。
【００７２】
ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましく、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また、ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることが出来る。
【００７３】
ヒト体内に存在するヒト抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、当該培養物より該抗体を精製することが出来る。
【００７４】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。
【００７５】
前記ライブラリーより、固相化した抗原に対する結合活性を指標にして、抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することが出来る。該抗体断片より、２本の完全なＨ鎖及び二本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体へ変換することが出来る。
【００７６】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することが出来る［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，７２２（２０００）］。
【００７７】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物から、ヒト抗体産生ハイブリドーマは、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法により取得出来る。
【００７８】
ヒト抗体産生ハイブリドーマより、ＶＬ及びＶＨをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＬ及びＣＨをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入し、動物細胞へ導入することにより発現させ、ヒト抗体は製造することも出来る。
【００７９】
ヒト抗体に用いるＷＴのＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましく、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また、ヒト抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることが出来る。
【００８０】
本発明の方法により製造される抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられる。
【００８１】
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ＧＤ２抗体［Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３，３３１（１９９３）］、抗ＧＤ３抗体［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０（１９９３）］、抗ＧＭ２抗体［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，１５１１（１９９４）］、抗ＨＥＲ２抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５（１９９２）、ＵＳ５７２５８５６］、抗ＣＤ５２抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５（１９９２）］、抗ＭＡＧＥ抗体［Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３（２０００）］、抗ＨＭ１．２４抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７（１９９９）］、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体［Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９（２０００）］、抗ｂＦＧＦ抗体、抗ＦＧＦ−８抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１（１９８９）］、抗ｂＦＧＦＲ抗体、抗ＦＧＦ−８Ｒ抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５（１９９０）］、抗ＩＧＦ抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗ＰＳＭＡ抗体［Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６（１９９８）］、抗ＶＥＧＦ抗体［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，４５９３（１９９７）］、抗ＶＥＧＦＲ抗体［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８（２０００）、国際公開第９６／３００４６号］、抗ＣＤ２０抗体［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１０，５４８（１９９８）、米国特許第５７３６１３７号明細書］、抗ＣＤ１０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体（国際公開第９６／４０２０１号）、抗Ａｐｏ−２Ｒ抗体（国際公開第９８／５１７９３号）、抗ＡＳＣＴ２抗体（国際公開第２０１０／００８０７５号）、抗ＣＥＡ抗体［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３  ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ−５９４５ｓ，（１９９５）］、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗Ａ３３抗体等が挙げられる。
【００８２】
アレルギーまたは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗インターロイキン１０抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン６受容体抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１（１９９４）］、抗インターロイキン５抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体［Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２（１９９１）］、抗インターロイキン４受容体抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１７，４１（１９９８）］、抗腫瘍壊死因子抗体［Ｌｙｍｐｈ．Ｃｙｔｏ．Ｒｅｓ．，１３，１８３（１９９４）］、抗腫瘍壊死因子受容体抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７（２０００）］、抗ＣＣＲ４抗体［Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６，（１９９９）］、抗ケモカイン抗体［Ｐｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９，（１９９４）］または抗ケモカイン受容体抗体［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３（１９９７）］等が挙げられる。
【００８３】
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８（１９９４）］、抗血小板由来増殖因子抗体［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９（１９９１）］、抗血小板由来増殖因子受容体抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００（１９９７）］、抗血液凝固因子抗体［Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８（２０００）］、抗ＩｇＥ抗体、抗αＶβ３抗体またはα４β７抗体等が挙げられる。
【００８４】
ウイルスまたは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ｇｐ１２０抗体［Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５（２０００）］、抗ＣＤ４抗体［Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５（１９９８）］、抗ＣＣＲ５抗体または抗ベロ毒素抗体［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６（１９９９）］等が挙げられる。
【００８５】
生理活性を有するペプチドとしては、例えば、上記の糖蛋白質の部分断片のうち、該糖蛋白質の活性を維持しているペプチド等が挙げられる。また、糖蛋白質が酵素である場合には、酵素の活性を調節するペプチドまたは酵素の構造を保持するペプチド等も包含される。
【００８６】
酵素の活性を調節するペプチドとしては、具体的には、例えば、糖蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するペプチド等が挙げられる。アゴニストとしては、糖蛋白質の活性を亢進する活性を有するペプチドであればいかなるものでもよい。
【００８７】
アゴニストとしては、具体的には、例えば、ソマトスタチン誘導体、ソマトロビン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、グルカゴン、インスリン、インスリン様成長因子または性腺刺激ホルモン等が挙げられる。アンタゴニストとしては、糖蛋白質の活性を抑制する活性を有するペプチドであればいかなるものでもよく、具体的には、例えば、ペグビソマトン等が挙げられる。
【００８８】
生理活性を有するペプチドを産生する場合に用いられる動物細胞としては、上記のペプチドが産生出来ればいずれの動物細胞を用いてもよいが、好ましくは産生するペプチドをコードする遺伝子を有するベクターが導入された形質転換体が用いられる。
【００８９】
ペプチドをコードする遺伝子を有するベクターが導入された形質転換された細胞は、ペプチドをコードするＤＮＡとプロモーターを含む組換え体ベクターを、宿主細胞に導入することによって取得することが出来る。
【００９０】
宿主細胞としては上記の物質を生産する能力を有する動物細胞が挙げられる。
【００９１】
前記組換え体ベクターを調製するために用いられるベクターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが出来る。例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０６［日本国特開平３−２２９７９号公報］、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］またはｐＡＧＥ２１０等が挙げられる。
【００９２】
プロモーターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが出来、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のイミディエイトアーリー（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターまたはＳＲαプロモーター等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサー等をプロモーターと共に用いてもよい。
【００９３】
宿主細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、当該細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが出来、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等が挙げられる。
【００９４】
本発明の形質転換細胞としては、具体的には、例えば、抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換細胞７−９−５１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６９１）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ２７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０５４）、抗ＣＣＲ４ヒト化抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８７５９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２９）及びＫＭ８７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３０）、７０９  ＬＣＡ−５００Ｄ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３９）、抗ＩＬ−５受容体α鎖キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ７３９９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４９）、抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８３９９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４８）及びＫＭ９３９９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４７）、抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８９６６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１０５）、ＫＭ８９６７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１０６）、ＫＭ８９６９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５２７）、ＫＭ８９７０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５２８）、抗ＣＤ２０抗体を生産する形質転換株Ｍｓ７０４−ＣＤ２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００９２）及びアンチトロンビンＩＩＩを生産する形質転換細胞Ｍｓ７０５−ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４７２）等が挙げられる。
【００９５】
動物細胞を培養する方法としては、例えば、バッチ（回分）培養、リピートバッチ培養、フェドバッチ（セミバッチ、半回分、流加）培養またはパーフュージョン（潅流）培養等、用いる動物細胞に適した方法であればいずれでもよいが、好ましくはフェドバッチ培養が用いられる。
【００９６】
通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃等の条件下で、例えば、フェドバッチ培養では３〜２０日間、パーフュージョン培養では３〜６０日間、培養を行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌等は通常の動物細胞の培養に用いられる方法を用いることが出来る。
【００９７】
本発明において用いられる培養方法の培養量としては、三角フラスコ等を用いた通常１０〜１０００ｍＬの少量の培養量でも、ジャー等の培養槽等を用いた通常１〜２００００Ｌの商用生産に用いることが出来る大量の培養量でも、いかなる培養量でもよい。
【００９８】
また、本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法において、１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法に関する。
【００９９】
１以上のＬ−システインを有するオリゴペプチドを添加する培養は、上述の方法により行うことが出来る。
【０１００】
物質がペプチドである場合、本発明の物質の製造方法としては、例えば、宿主細胞内にペプチドを生産させる直接発現方法または宿主細胞外にペプチドを分泌生産させる方法（モレキュラー・クローニング第２版）等が挙げられる。
【０１０１】
ペプチドは、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または日本国特開平５−３３６９６３号公報、国際公開第９４／２３０２１号等に記載の方法を利用することにより、宿主細胞外へ積極的に分泌させることが出来る。即ち、遺伝子組換えの手法を用いて、所望のペプチドのＮ末端にシグナルペプチドを結合させた形で発現させることにより、所望のペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることが出来る。
【０１０２】
また、日本国特開平２−２２７０７５号公報に記載されている、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用することにより、所望のペプチドの生産量を上昇させることも出来る。
【０１０３】
上述の方法により製造される所望のペプチドは、例えば、通常のペプチドの単離精製法等を用いて単離精製することが出来る。
【０１０４】
所望のペプチドが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のペプチドの単離精製法により、粗精製標品または精製標品を得ることが出来る。
【０１０５】
前記ペプチドの単離精製法としては、例えば、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル−セファロース若しくはＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース若しくはフェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、プロテインＡ若しくはプロテインＧ等を含むレジンを用いたアフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法または等電点電気泳動等の電気泳動法等が挙げられる。これらの方法は、単独または組み合わせて用いてもよい。
【０１０６】
所望のペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ペプチドを回収することができる。即ち、当該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、粗精製標品または精製標品を得ることができる。
【実施例】
【０１０７】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。【０１０８】
［実施例１］
以下の細胞培養用培地を調製し、沈澱形成の相違を比較した。【０１０９】
７００ｍＬの水に、３１．６ｇのＡＧＴ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａ（インビトロジェン社製、カタログ番号：ＡＧ０９０２３１Ｐ７）、０．５０ｍＬのｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社製、カタログ番号：ＡＧ０９０２３２Ｐ８）、２７．２ｇのＡＧＴ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ（インビトロジェン社製、カタログ番号：ＡＧ０９０２３０Ｐ７）、３０．０ｇのＨｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（ＤＭＶ社製、カタログ番号：Ｐ４２４７４）、７０．０ｇのｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬社製、カタログ番号：０４１−００５９５）、及び５．０ｇのＬ−（＋）−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（和光純薬社製、カタログ番号：０７８−００５２５）または７．４ｇのＬ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）を混合した。【０１１０】
約３０分間攪拌後、７．０ｍＬの５ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ水溶液（和光純薬社製、カタログ番号：０８１−０５４３５）を加え、更に約２０分間攪拌してｐＨを６．５にした。その後、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ（純正化学社製、カタログ番号：３９１５５−０３０１）、１００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（シグマ社製、カタログ番号：Ｔ１１４５−１００Ｇ）、および１００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−ｃｙｓｔｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（和光純薬社製、カタログ番号：０３４−０５３２２）を含む５０ｍＬのアルカリ溶液を上記調製したｐＨ６．５の水溶液に加えた。【０１１１】
水溶液の容量を水で１Ｌに合わせた後、約２０分間攪拌し、細胞培養用培地を調製した。また、上記細胞培養用培地のうち、Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔおよびＬ−ｃｙｓｔｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを、等濃度（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）のＬ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）およびｂｉｓ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）に置換した細胞培養用培地をそれぞれ調製した。調製した細胞培養用培地を４℃（冷蔵庫、ホシザキ社製）、２０℃（ｅ−Ｃｏｏｌｉｎｇ  Ｂｕｃｋｅｔ、タイテック社製）、または室温の３条件でそれぞれ保存した。【０１１２】
その結果、Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔおよびＬ−ｃｙｓｔｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを含む細胞培養用培地は、３日後以降全ての条件で沈澱の生成を認めた。中でも保存温度が低い４℃の群で沈澱が多く認められた。【０１１３】
一方で、Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔおよびＬ−ｃｙｓｔｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを、それぞれＬ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）またはｂｉｓ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）に置換した細胞培養用培地は沈澱が生成しなかった。【０１１４】
この結果から、細胞培養用培地に１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加することにより、培地中の沈殿の生成を抑制できることが分かった。【０１１５】
［実施例２］
以下の細胞培養用フィード培地を調製し、ＣＨＯ細胞によるフェドバッチ培養を試み比較した。【０１１６】
フィード培地は、３１．６ｇ／ＬのＡＧＴ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａ（インビトロジェン社製、カタログ番号：ＡＧ０９０２３１Ｐ７）、０．５０ｍｌ／Ｌのｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社製、カタログ番号：ＡＧ０９０２３２Ｐ８）、２７．２ｇ／ＬのＡＧＴ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ（インビトロジェン社製、カタログ番号：ＡＧ０９０２３０Ｐ７）、５．０ｇ／ＬのＬ−（＋）−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（和光純薬社製、カタログ番号：０７８−００５２５）、３０．０ｇ／Ｌのｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（ＤＭＶ社製、カタログ番号：Ｐ４２４７４）、７０．０ｇ／Ｌのｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬社製、カタログ番号：０４１−００５９５）、５．０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）、および５．０ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌまたは１６ｍｍｏｌ／Ｌのｂｉｓ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）からなり、実施例１と同様の方法によりそれぞれ調製した。【０１１７】
抗体Ｘを発現するＣＨＯ細胞を用いた培養において、主培養培地として、４．０ｍｍｏｌ／Ｌのｇｌｕｔａｍｉｎｅ（インビトロジェン社製、カタログ番号：２５０３０）を含むＥＸ−ＣＥＬＬ３２５（ＳＡＦＣ社製、カタログ番号：１４３４０Ｃ−１０００ＭＬ）を用いた。上記フィード培地を加えてフェドバッチ培養を実施した。その結果を表１に示す。【０１１８】
【表１】
2012017925.tif 000002
【０１１９】
表１に示す通り、ｂｉｓ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅの濃度を５．０ｍｍｏｌ／Ｌから１０ｍｍｏｌ／Ｌまたは１６ｍｍｏｌ／Ｌに変更すると培養１３日目において５．０ｍｍｏｌ／Ｌでは生細胞数２８．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率５５．０％、１０ｍｍｏｌ／Ｌでは生細胞数４４．１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率７８．７％、１６ｍｍｏｌ／Ｌでは生細胞数５８．１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率８６．６％となり、ｂｉｓ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅの濃度依存的に生細胞数の増加及び生存率の上昇が認められた。【０１２０】
この結果から、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養において、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することにより、該動物細胞の生細胞数を増加し、生存率を向上できることが分かった。【０１２１】
［実施例３］
抗体生産を確認するため、実施例２の抗体生産能を有するＣＨＯ細胞のフェドバッチ培養における培養１３日目の抗体力価を測定した。フィード培地中のｂｉｓ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅの濃度が５．０ｍｍｏｌ／Ｌでは０．７５ｇ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌでは０．７９ｇ／Ｌ、そして１６ｍｍｏｌ／Ｌでは０．７８ｇ／Ｌであった。【０１２２】
この結果から、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養において、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することにより、動物細胞により該物質を生産できることが分かった。【０１２３】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１０年８月２日付で出願された日本特許出願（特願２０１０−１７３５４６）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明により、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養において、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法、物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法であって、１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法、及び１以上のＬ−システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地を提供することができる。
【国際調査報告】
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