(57)【要約】  本発明は、選択したポリペプチドから遊離した切断産物の量を、該切断産物に対応する外因性ポリペプチドを基準として用いて測定することにより、サンプル中の選択したポリペプチドの実際量を測定するために有用な方法及び材料に関する。本方法及び材料は、例えば、混合サンプル中の選択した１以上のポリペプチドの実際量を定量するために用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の１以上の選択したポリペプチドの実際量を測定するための方法であって、
１以上の選択したポリペプチドの各々から、少なくとも１つの切断剤を用いて少なくとも１つの特定の切断産物を遊離させること、及び
前記少なくとも１つの特定の切断産物の各々の実際量を、対応する外因性ポリペプチドの規定量と比較して測定すること、
を含み、前記少なくとも１つの特定の切断産物の各々の実際量は、該切断産物が遊離した前記選択したポリペプチドの実際量に直接関係する、上記方法。
【請求項２】
サンプルが１つの選択したポリペプチドを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
選択したポリペプチドから１つの特定の切断産物が遊離する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
特定の切断産物と選択したポリペプチドとの直接の関係が１：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
特定の切断産物と選択したポリペプチドとの直接の関係が１：１である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
遊離ステップの前に対応する外因性ポリペプチドの規定量をサンプルに添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
選択したポリペプチドから２〜５の特定の切断産物が遊離する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
サンプルが２〜５の選択したポリペプチドを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
選択したポリペプチドの各々から１つの特定の切断産物が遊離する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
選択したポリペプチドの各々から２〜５の特定の切断産物が遊離する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
サンプルが６〜１０の選択したポリペプチドを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
選択したポリペプチドの各々から１つの特定の切断産物が遊離する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
選択したポリペプチドの各々から２〜５の特定の切断産物が遊離する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
切断剤の少なくとも１つが酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
酵素がトリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
切断剤の少なくとも１つが化学物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
化学物質が臭化シアンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
選択したポリペプチドの少なくとも１つが膜ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
選択したポリペプチドの少なくとも１つが神経受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
測定ステップが、切断産物の少なくとも１つの実際量を測定するための抗体の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
測定ステップが、切断産物の少なくとも１つの実際量を測定するためのタンデム質量分光測定法又は高次質量分光測定法の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
遊離ステップの前にリカバリーポリペプチドの規定量をサンプルに添加すること、及び
遊離ステップの後にリカバリーポリペプチドの実際量を測定すること、
をさらに含み、上記測定ステップが、上記添加ステップの後に生じたリカバリーポリペプチドの損失を反映させるために、該リカバリーポリペプチドと対応する特定の切断産物の１つの量を調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
遊離ステップの前に切断可能な合成ポリペプチドの規定量をサンプルに添加すること、
切断可能な合成ポリペプチドから切断剤を用いて少なくとも２つの示差的に標識したポリペプチドを遊離させること、及び
上記示差的に標識したポリペプチドの各々の実際量を測定すること、
をさらに含み、上記測定ステップが、上記切断剤による切断の不完全性を反映させるために、特定の切断産物の各々の量を調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
示差的に標識したポリペプチドの１つが特定の切断産物の少なくとも１つに対応し、測定ステップが、添加ステップの後に生じた、対応する示差的に標識したポリペプチドの損失を反映させるために、特定の切断産物の少なくとも１つの量を調節することを含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドの定量分析に関する。特に、本発明は、サンプル中の選択したポリペプチドの実際量を測定するために有用な方法及び材料に関する。本方法は、選択したポリペプチドから遊離した特定の切断産物の量を、該特定の切断産物と対応する外因性ポリペプチドを基準として測定することを含む。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドは、生物系において重要な役割を有する。例えば、ポリペプチドは、生物学的反応を触媒する酵素として、種々の分子の輸送体又はキャリアーとして、細胞内及び細胞外のシグナル伝達のための受容体として、ホルモンとして、並びに細胞、組織及び器官の構造要素として機能することができる。
【０００３】
特定のポリペプチドの量の測定は、研究の設定（例えば、薬物の発見及び開発）において、及び臨床の設定（例えば、医学診断及び治療効果のモニターのため）において重要なことが多い。個々のポリペプチドは、例えば、イムノアッセイ、質量分光測定法及び高速液体クロマトグラフィーなどのアフィニティー方法によって一般に定量される。放射性同位元素、安定な同位元素、蛍光及び化学発光を、これらの方法と一緒に、ポリペプチドを定量するために用いることができる。酵素は、それらの触媒活性を生化学的にアッセイすることによって定量されている。
【０００４】
伝統的方法は、サンプル中の特定のポリペプチドの実際量（相対量に対するものとして）を測定する能力に制限されることがある。この欠点の存在により、例えば、疾患又は治療的処置のような作用のため、タンパク質レベルの変化を評価することが困難となっている。複雑な混合物又は水不溶性環境（例えば、細胞膜）中の特定のポリペプチドの実際量の定量は、特に問題のあることが判明している。それ故に、本発明の方法は、無傷のタンパク質を定量的に表す可溶性タンパク質分解性断片を選択しうるため、不溶性タンパク質に関連する多くの問題を回避するものである。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、サンプル中の選択したポリペプチドの実際量を測定するための方法及び材料を特徴とする。本方法は、選択したポリペプチドから遊離した特定の切断産物の量を、その特定の切断産物に対応する外因性ポリペプチドを基準として測定することを含む。開示する方法及び材料は、伝統的なポリペプチド定量方法と比較して多くの利点を提供する。選択したポリペプチドの実際量（相対量に対するもの）は、容易に作製される参照ポリペプチドを基準として決定することができる。参照ポリペプチドは、測定する特定の切断産物に対応し、それ故に、参照切断産物及び測定する切断産物の示差的な挙動に関する誤差が排除される。膜関連タンパク質の測定は、特定の切断産物を溶液中に遊離させることにより（例えば、選択したポリペプチドにおける溶液接触可能部位を標的として切断することにより）、行うことができる。本発明の方法及び材料は、複雑なサンプル及び水不溶性環境中であっても、１以上の選択したポリペプチドの量を定量するために用いることができる。
【０００６】
本発明は、サンプル中の１以上の選択したポリペプチドの実際量を測定する方法を特徴とする。これら特徴ある方法は、１）選択したポリペプチドの各々から、少なくとも１つの切断剤を用いて少なくとも１つの特定の切断産物を遊離させること、及び、２）特定の切断産物の各々の実際量を、対応する外因性ポリペプチドの規定量と比較することにより測定すること、を含む。特定の切断産物の各々の実際量は、該切断産物が遊離した選択したペプチドの実際量に直接関係する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、サンプルは１つの選択したポリペプチドを含有する。他の実施形態において、サンプルは２〜５の選択したポリペプチドを含有する。他の実施形態において、サンプルは６〜１０の選択したポリペプチドを含有する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、１つの特定の切断産物は、その選択したポリペプチドから遊離しうる。他の実施形態において、２〜５の特定の切断産物が、該選択したポリペプチドから遊離しうる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、特定の切断産物と選択したポリペプチドの量には、１：１の直接の関係がある。
【００１０】
いくつかの実施形態において、選択したポリペプチドは膜ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、選択したポリペプチドは神経受容体である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、対応する外因性ポリペプチドの規定量が、遊離ステップの前にサンプルに添加される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、切断剤は、酵素（例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ及びエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）である。他の実施形態において、切断剤は、化学物質（例えば、臭化シアン）である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、切断産物の量を測定するために、抗体が用いられる。他の実施形態において、切断産物の量を測定するために、タンデム又は高次質量分光測定法が用いられる。
【００１４】
また、いくつかの実施形態において、これら特徴ある方法は、１）選択したポリペプチドから切断産物を遊離させる前に、リカバリーポリペプチドの規定量をサンプルに添加すること、及び、２）該選択したポリペプチドから切断産物を遊離させた後に、該リカバリーポリペプチドの実際量を測定すること、を含む。これらの実施形態において、リカバリーポリペプチドと対応する特定の切断産物の実際量は、該リカバリーポリペプチドをサンプルに添加した後に生じた該リカバリーポリペプチドの損失を反映させるために調節される。
【００１５】
また、いくつかの実施形態において、これら特徴ある方法は、１）選択したポリペプチドから切断産物を遊離させるステップの前に、切断可能な合成ポリペプチドの規定量をサンプルに添加すること、２）少なくとも２つの示差的に標識したポリペプチドを、切断剤を用いて切断可能な合成ポリペプチドから遊離させること、及び、３）示差的に標識した切断産物の各々の実際量を測定すること、を含む。これらの実施形態において、特定の切断産物の実際量は、切断の不完全性を反映させるために調節される。これらのいくつかの実施形態において、一方の示差的に標識したポリペプチドは特定の切断産物に対応し、そして特定の切断産物の実際量は、切断可能なポリペプチドをサンプルに添加した後に生じた、対応する示差的に標識したポリペプチドの損失を反映させるために調節される。
【００１６】
本発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかにされるであろう。
【００１７】
別に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって普通に理解される意味を有する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が参照されるであろう。開示する材料、方法、及び例は、例示にすぎず、かつ限定を意図するものではない。当業者であれば、本明細書に記載するものと類似するか又は同等の方法及び材料を、本発明を実施するために使用できることを理解するであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、少なくとも一部は、サンプル中の選択したポリペプチドの実際量を測定するための方法及び材料を提供する。本発明は、選択したポリペプチドから特定の切断産物を遊離させ、次いで、その特定の切断産物の実際量を、該特定の切断産物に対応する外因性ポリペプチドを基準として測定することにより、サンプル中の選択したポリペプチドの実際量を測定することができるという発見に基づいている。理論に拘束されるものではないが、この測定は、選択したポリペプチドと測定する遊離したポリペプチドに１：１モルの相関関係が存在するために可能となっていると考えられる。加えて、特定の切断産物及び対応する外因性ポリペプチドは、測定中に同様に挙動し、それ故に、測定する種及び参照物の種の示差的挙動に起因する潜在的誤差が排除される。
【００１９】
提供する方法及び材料は、サンプル中の単一の選択したポリペプチドの実際量を測定するために用いることができ、また、サンプル中の複数の選択したポリペプチドの実際量を測定するために用いることができる。感度を上昇させ、そして／又は精度を確証するために、１より多い特定の切断産物を測定することができる。
【００２０】
本明細書に開示する方法は、細胞生物学、タンパク質化学及び臨床化学における現在の多くの研究ニーズに直接に応用することができる。本明細書に開示する方法は、多数の異なるポリペプチドの絶対的定量を、現在の方法により達成されるものよりも優れた感度、動的範囲、精度及び速度で提供することができる。本発明の方法に要求される分析サイクル時間が比較的短いので、特定のタンパク質セットのレベルを、例えば、ストレス又は急性薬物投与が始まった後の多くの時点で動力学的に測定して、調節経路をより明確に解明することができる。加えて、本方法によって、現在利用しうる方法よりも遙かに短い分析サイクル時間になるとすれば、本発明の方法は高処理量実験のためによく適している。
【００２１】
選択したポリペプチド及びサンプル
選択したポリペプチドは、任意のポリペプチド（すなわち、ペプチド結合により結合した２以上のアミノ酸）であってよく、そしてサンプルは、任意のポリペプチド含有サンプルであってよい。好適なサンプルは、細胞サンプル、組織サンプル、体液、及び環境サンプルを包含する。サンプルは、動物（例えば、ヒト）に由来するものであってよく、そして動物の細胞、組織又は器官でありうる。サンプルは、植物に由来するものであってよく、そして植物の細胞、組織又は器官であってもよい。サンプルはまた、真菌、細菌及びウイルスに由来するものであってもよい。サンプルは、環境サンプル（例えば、土壌、水、及び空気サンプル）であってもよい。ポリペプチドは、動物、植物、真菌、細菌及びウイルスに由来するものであってよい、ポリペプチドは、膜関連ポリペプチド（例えば、脂質二重層に存在するもの又は脂質二重層の表面に吸着したもの）であってよい。膜関連ポリペプチドは、例えば、形質膜、細胞壁、細胞内小器官膜、ウイルスキャプシドに関連したものであってよい。ポリペプチドは、細胞質又は細胞内小器官のものであってよい。ポリペプチドは、間質又は体液（例えば、血漿及び髄液）に存在する細胞外のものであってもよい。ポリペプチドは、生物学的触媒、種々の分子の輸送体又はキャリアー、細胞間及び細胞内シグナル伝達のための受容体、ホルモン、並びに細胞、組織及び器官の構造要素であってよい。いくつかのポリペプチドには腫瘍マーカーも含まれる。
【００２２】
サンプル調製物は、選択したポリペプチドの位置及び生物物理的特性、並びに測定しようとする特定の切断産物によって測定される。サンプルは、特定の切断産物を遊離させる前に、選択したポリペプチドを富化（濃縮）させることができる。組織又は細胞サンプルは、選択したポリペプチドの細胞内位置及び測定しようとする切断産物に応じて、切断剤で処理する前に均質化するか又は未処理のままにしておくことができる。受容体のような膜関連ポリペプチドは、一般的に、細胞質タンパク質とは別様に処理される。細胞膜は、例えば、切断剤で処理する前に膜関連ポリペプチドを富化させるために、遠心により単離することができる。細胞質は、切断剤で処理する前に細胞質タンパク質を富化させるために、サンプルの調製中に単離することができる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、サンプルは、切断剤で処理する前に可溶化される。サンプルポリペプチドは、サンプルの性質に応じて、種々の媒質中に可溶化することができる。例えば、粗製膜抽出物を、６Ｍ尿素、還元剤、及びアルキル化剤を含む緩衝した界面活性剤中で可溶化することができる。サンプルは、切断剤で処理する前に脱脂することができる（例えば、９５％アルコール及びヘキサン又はアセトン中）。サンプルは、切断剤で処理する前に可溶化及び脱脂することができる（例えば、９５％アルコール及びヘキサン又はアセトン中）。場合によっては、特に、特定の切断産物を溶液中のものとして入手しうる場合には、サンプルは、可溶化又は脱脂することなく消化することができる。溶液として入手しうる特定の切断産物としては、例えば、細胞質、細胞外、間質、体液、及び特定の環境ポリペプチドから遊離した切断産物、並びに膜関連ポリペプチドから溶液中に遊離した切断産物が挙げられる。
【００２４】
特定の切断産物及び切断反応
特定の切断産物は、１以上の切断剤で処理することにより選択したポリペプチドから遊離させることができる。この処理は、１以上の切断剤をポリペプチド含有サンプルに添加する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｓｉｔｕ切断反応により行うことができる。切断剤は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸間のペプチド結合を切断し、それにより特定の切断ポリペプチドを遊離させる。切断剤は、選択したポリペプチドから特定の切断産物を遊離させるために、単独で又は組み合わせて用いることができる。いくつかの切断剤は、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びトリプシンのような酵素である。これら特定のエンドプロテイナーゼは、商業販売業者から入手可能であり、そして狭い特異性を有し、そのためタンパク質定量に用いるための理想的な切断ツールとなっている。他の有用な切断剤は、臭化シアンのような化学物質である。
【００２５】
切断剤により既知のアミノ酸配列を有する選択したポリペプチドから遊離する特定の切断産物の正体を予測することは可能である。このような予測は、しばしば「バーチャル消化物」と呼ばれる。容易に入手可能なコンピュータプログラムは、選択したポリペプチドのバーチャル消化物の調製に利用できる。ラットプリン作動性受容体Ｐ２Ｘ３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＡＡ６２５９４）のバーチャル消化物を、表１に示す。天然タンパク質中のアミノ酸の位置に対応して特定の切断産物の終点が、「開始」及び「終止」の欄に示されている。
【表１】
2005510234.tif 000002
【００２６】
2005510234.tif 000003
【００２７】
典型的には、５〜１００（例えば、５〜１０、１０〜２０、２０〜４０、６０〜８０及び８０〜１００）アミノ酸の特定の切断産物を、測定のために選択する。
【００２８】
典型的には、遊離しそうで、かつ溶液と接触可能な特定の切断産物を、測定のために選択する。切断及び測定の実施容易性は、例えば、選択したポリペプチドの既知の又は予測した三次元構造に基づいて評価することができる。加えて、比較的親水性のアミノ酸配列を有する特定の切断産物は、測定のために特に適している。特定の切断産物の疎水性／親水性は、コンピュータソフトウェアを用いるか、又は周知のアミノ酸疎水性インデックスに基づいて手動で、評価することができる。
【００２９】
典型的には、翻訳後修飾に対して低い可能性を有する特定の切断産物を、測定のために選択する。翻訳後修飾のためのアミノ酸配列決定因子は周知であり（例えば、Ｈａｎ及びＭａｒｔｉｎａｇｅ，１９９２，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４：１９−２８参照）、そして、このような配列決定因子を欠いた特定の切断産物は、手動検査によって容易に確認される。
【００３０】
切断反応の条件は、使用する切断剤に応じて異なる。サンプルポリペプチドは、切断剤が特定の切断産物（例えば、ＡＴＰ、又はＭｇ２＋）を遊離させるのに必要な任意の分子を含有する緩衝液で希釈することができる。タンパク質分解酵素を用いる処理は、典型的には、高温（例えば、３７℃）で数時間又はそれ以上かけて行われる。
【００３１】
特定の切断産物は、例えば、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー（例えば、高性能液体クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー）、固相抽出、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及びイムノアフィニティー分離、並びにこれらの技術の種々の組み合わせによって、切断反応物から得ることができる。イムノアフィニティー分離のために有用な抗体は、特定の切断産物に対応する外因性ペプチドを用いて作製することができる。
【００３２】
ポリペプチドの測定及び定量
特定の切断産物の実際量は、当技術分野で公知の任意の方法により測定することができる。いくつかの実施形態において、特定の切断産物の量は、質量分光測定法（例えば、タンデム質量分光測定法又は高次質量分光測定法（例えば、ＭＳＮ））を用いて測定される。他の実施形態において、特定の切断産物の量は、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、又はＲＩＡ）のようなアフィニティーアッセイにより測定される。イムノアッセイは競合的であってよく、又は競合的でなくてもよい。ＲＩＡを用いて測定するために、外因性ポリペプチドは、典型的にトレーサーとして用いられ、そして典型的に３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉのような放射性同位元素で標識される。他の実施形態において、特定の切断産物の量は、高速液体クロマトグラフィーにより測定される。いくつかの実施形態において、特定の切断産物の実際量の測定は、切断産物を検出可能に標識すること（例えば、蛍光、化学発光又は放射性分子の結合による）を含む。例えば、特定の切断産物は、質量分光測定法を用いて測定するために、２Ｈ、１５Ｎ、１３Ｃ又は１８Ｏのような安定な同位元素で標識することができる。
【００３３】
特定の切断産物の実際量は、対応する外因性ポリペプチドを基準として測定される。対応する外因性ポリペプチドの規定量を測定し、そしてポリペプチド量に対する、得られたシグナルに関する標準曲線を作成する。実験サンプルを同じ手段で測定し、そして測定したシグナルを実際のポリペプチド量に変換するために、標準曲線を用いる。部分的には、対応する外因性ポリペプチドは測定中に特定の切断産物と同様に挙動し、これにより特定の切断産物及び外因性ポリペプチドの示差的挙動に関する潜在的誤差が排除されるので、選択したポリペプチドの実際量を測定することができる。
【００３４】
本明細書で用いる、化合物（例えば、特定の切断産物又は選択したポリペプチド）の「実際」量は、サンプル中の該化合物の絶対量を指す。化合物の「実際」量は、例えば、質量分光測定法を用いる直接測定により得ることができるか、又は対応する化合物の規定量を用いて作成した標準曲線との比較により得ることができる。このような対応する化合物は、サンプルに対して一般的に外因性である（すなわち、細胞、組織、又は器官の外部に由来するか又は外部で産生される）。化合物の「実際」又は「絶対」量は、化合物の「相対」量と対比することができ、ここで、測定しようとする化合物の量は、測定する化合物に対応しない化合物（「非対応」化合物）の量に基づくか又は依存する（すなわち、相対的である）。当業者であれば、好適な非対応化合物は、測定する化合物と同種の化合物である必要がある（例えば、ポリペプチドを測定する場合には、非対応化合物もポリペプチドである必要がある）ことが明らかであろう。
【００３５】
本発明の方法は、ポリペプチドとそれから生成される特有の切断産物とにはモル比１：１の関係があるので、選択したポリペプチドの実際量の測定が可能となる。この１：１比が有効であるためには、切断剤による完全な切断が必要である。本発明はさらに、切断が不完全である場合に（以下で論じる）、選択したポリペプチドの実際量を測定する方法を提供する。本発明の方法は、例えば、容易に又は効率的に精製されないポリペプチドの実際量を得るために、特に有用である。このようなポリペプチドは、膜ポリペプチド（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体又は神経受容体のような受容体）を包含するが、これらに限定されるものではない。本発明の方法は、特定の切断産物の実際量、及び、その結果として、選択したポリペプチドの実際量（通常の実験誤差範囲内にある）の測定に使用しうると考えられる。
【００３６】
選択したポリペプチドを定量するために質量分光測定法を用いる方法において、対応する外因性ポリペプチドは、典型的には、特定の切断産物と組成が一致するものである。本明細書で用いる場合、組成が一致するポリペプチドは、同じアミノ酸を含有するが、異なる一次配列を有していてもよい。選択したポリペプチドを定量するために抗体を用いる方法において、対応する外因性ポリペプチドは、選択したポリペプチドの切断に起因する特定の切断産物と結合する抗体に対して特異的に免疫反応性を有するものである。特異的免疫反応性ポリペプチドは、抗体調製物が結合するポリペプチドであって、かつ希釈線形性（すなわち、抗原の連続希釈に対して比例反応性）を示すものである。抗体調製物は、選択したポリペプチド以外のポリペプチド又はその断片と交差反応性を示してはならない。抗体調製物の特異的免疫反応性は、ポリペプチド内のアミノ酸の任意の群（例えば、エピトープ）に対するものとすることができる。ある１つの生物のポリペプチドに対して特異的反応性である抗体調製物は、別の生物の構造類似ポリペプチドに対して特異的免疫反応性である。例えば、ラットポリペプチドに対して特異的反応性の抗体調製物は、ヒトポリペプチドに対して特異的免疫反応性でありうる。免疫反応性の対応する外因性ポリペプチドは、特定の切断産物と一致する必要がある。当業者であれば、選択したポリペプチドを定量するイムノアッセイに用いる抗体調製物は、特定の切断産物の１００％を検出するために、過剰量が必要であることが明らかであろう。
【００３７】
リカバリーポリペプチド及び切断対照物
リカバリーポリペプチドは、サンプルを調製、切断、及び／又は定量分析する間に生じる可能性のある、特定の切断産物の何らかの損失を補正するために用いることができる。リカバリーポリペプチドは、特定の切断産物に対応する標識した外因性ポリペプチドである。使用する場合には、リカバリーポリペプチドは、規定量が内部対照物としてサンプルに直接添加される。リカバリーポリペプチドの添加は、それをサンプルに添加する時点以後、及び該リカバリーポリペプチドを測定する時点までに生じる可能性のある損失の補正を可能にする。従って、サンプルを調製、切断、及び／又は定量分析する間に生じる全ての損失を補正するために、リカバリーポリペプチドの規定量をサンプル調製を始める前にサンプルに添加することができ、次いで、対応する特定の切断産物の量を測定するときに、リカバリーポリペプチドの量を測定する。リカバリーポリペプチド（及び、従って、対応する特定の切断産物）の損失を、サンプル調製の後に存在するリカバリーポリペプチドの量とサンプルに添加した規定量との比較によって測定することができる。次いで、特定の切断産物の測定量を、リカバリーポリペプチドの損失を反映させるために調節することができる。
【００３８】
リカバリーポリペプチドは、測定する特定の切断産物と同一であってよい。選択したポリペプチドを定量するために質量分光測定法を用いる方法において、リカバリーポリペプチドは、典型的には、測定する特定の切断産物と同一のものである。選択したポリペプチドを定量するために抗体を用いる方法において、リカバリーポリペプチドは、典型的には、測定する特定の切断産物を結合する抗体に対して特異的免疫反応性のものである。
【００３９】
リカバリーポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の手段を用いて標識することができる。例えば、質量分光測定法を用いて測定するために、リカバリーポリペプチドを２Ｈ、１５Ｎ、１３Ｃ及び１８Ｏのような安定な放射性同位元素で標識することができる。イムノアッセイを用いて測定するために、リカバリーポリペプチドを３Ｈ、１４Ｃ又は１２５Ｉのような放射性同位元素で標識することができる。リカバリーポリペプチドは、蛍光又は化学発光分子で標識することもできる。標識した特定の切断産物を含有するサンプルにリカバリーポリペプチドを添加する場合には、該標識した特定の切断産物及び対応するリカバリーポリペプチドは、典型的には、示差的に標識される。特定の切断産物を測定するためにラジオイムノアッセイを用いる場合には、リカバリーポリペプチドの放射能の量は、該特定の切断産物の測定を妨害しないように、十分に少ない。
【００４０】
特定の切断産物と、選択した出発ポリペプチドとの１：１モル相関関係を検証するために、切断反応の完全性が検証される必要がある。切断反応の完了を確認するために、種々の手法を行うことができる。例えば、特定の切断剤が、選択したポリペプチドを切断産物に完全に変換するのに要する時間を推定するために、既知のポリペプチド（例えば、選択したポリペプチド）が切断産物に変換するのをモニターする動力学的実験を用いることができる。
【００４１】
選択したポリペプチドの完全な切断を検証する別の方法は、切断可能部位（例えば、切断剤がトリプシンであるならば、リジン）を有する示差的に標識した切断可能な合成ペプチドの設計及び調製を含む。切断可能部位のＮ末端側における１以上のアミノ酸、及び切断可能部位のＣ末端側における１以上のアミノ酸は、異なる放射性同位元素で標識される。例えば、Ｎ末端側におけるアミノ酸は１４Ｃで標識することができ、そしてＣ末端側におけるアミノ酸は３Ｈで標識することができる。示差的に標識した切断可能なポリペプチドは、切断反応の前のサンプルに添加され、選択したポリペプチドを含有するサンプルに直接添加するか、又は並行サンプルに添加するかの何れかによる。放射性同位元素の量は、２チャンネル型液体シンチレーションカウンターを用いて定量することができ、そして一方の放射性同位元素と他方との比は、切断反応の完全性の尺度である。
【００４２】
示唆的に標識した切断可能な合成ポリペプチドを、選択したポリペプチドを含有するサンプルに直接添加する場合には、それは、特定の切断産物の測定を妨害しない量で添加される。切断可能なペプチドを、選択したポリペプチドを含有するサンプルに直接添加する場合には、それは、標識した特定の切断産物（例えば、ＭＳ／ＭＳにより測定しようとする切断産物）の何れとも異なるように標識される。
【００４３】
切断可能な合成ポリペプチドにおける切断部位の片側又は両側上のアミノ酸は、特定の切断産物に対応するものとしうる。切断部位の両側のアミノ酸が測定しようとする特定の切断産物に対応する場合には、これらのアミノ酸は、特定の切断産物の損失の原因を説明するためのリカバリーポリペプチドとして機能しうる。
【００４４】
複数の切断産物の測定
任意の個々のサンプルについて、種々の異なる特定の切断産物を測定することができる。ある特定の選択したポリペプチドから遊離した複数の特定の切断産物を測定することにより、その特定の選択したポリペプチドの定量分析の感度を上昇させ、そして／又は精度を確証することができる。異なる選択したポリペプチドから遊離した特定の切断産物を測定することにより、ある特定のサンプルについて複数の選択したポリペプチドを定量することができる。特定の切断産物の各々は、対応する外因性ポリペプチドを基準として測定することができ、そしてリカバリーポリペプチドは、測定した特定の切断産物の何れか又は全ての損失の原因を説明するために用いることができる。
【００４５】
本発明を下記の実施例によってさらに説明するが、これら実施例は特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１：ヒトＰ２Ｘ３のＥＬＩＳＡ定量
本実施例は、膜関連プリン受容体であるヒトＰ２Ｘ３の定量を実証する。ヒトＰ２Ｘ３カルボキシ末端から遊離した切断産物を、対応する合成ポリペプチドを基準として測定した。切断産物は、アミノ酸配列：ＱＳＴＤＳＧＡＦＳＩＧＨ（配列番号２）を有する。対応する合成ポリペプチドは、ラットＰ２Ｘ３アミノ酸配列：ＶＥＫＱＳＴＤＳＧＡＹＳＩＧＨ（配列番号３）を有する。合成ポリペプチドを、該合成ポリペプチド及び切断産物に対して特異的な免疫反応性を有する抗体を生じさせるために用いた。抗体もまた、選択したポリペプチドに対する特異的反応性を実証するために、免疫細胞化学及びウェスタンブロッティングにより検証した。
【００４７】
サンプル及び切断反応：Ｐ２Ｘ３含有調製物を、ヒトＰ２Ｘ３を発現するＨｅｘ細胞トランスフェクタントから調製した。簡単に説明すると、Ｐ２Ｘ３含有Ｈｅｘ細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させ、音波処理し、−７０℃で凍結した。凍結細胞懸濁液を氷浴中で解凍し、音波処理し、１００，０００×ｇで、４℃で１時間遠心した。ペレットをＰＢＳに再懸濁した。細胞懸濁液を音波処理し、１００，０００×ｇで、４℃で１時間遠心した。ペレットを膜可溶化緩衝液（６Ｍ尿素、２ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１％Ｃｈａｐｓ、０．０５Ｍトリス（ｐＨ８．０））に再懸濁し、膜調製物中のタンパク質濃度を１００μｌ当たり約１．０〜１．５ｍｇにした。Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ法によるタンパク質測定は、約８ｍｇの全膜タンパク質がサンプル中に存在したことを示した。ウェスタンブロッティングにより、膜調製物中にＰ２Ｘ３の存在を確認した。膜調製物を−７０℃で凍結した。
【００４８】
切断試薬トリプシンで処理する前に、細胞懸濁液を解凍し、音波処理し、室温で１５分間インキュベートし、５ｍｌのＷｈｅａｔｏｎバイアル中で、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）及び１ｍＭ  ＭｇＣｌ２で７倍希釈した。１ｍｇのタンパク質当たり１０μｇのトリプシン（配列決定グレード；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を添加することにより、切断反応を開始した。切断反応物を振盪しながら３７℃で２４時間インキュベートした。完全な消化を確認するために、シトクロムＣを並行してトリプシンで消化し、消化の経過をＨＰＬＣでモニターした。切断反応物を１００％ＴＦＡでｐＨ約１〜２に酸性化し、生成した沈殿を高速遠心機で１０，０００ｒｐｍで遠心することにより除去した。
【００４９】
１０ｍｌのメタノール、次いで１０ｍｌの０．１％ＴＦＡで洗浄したＣ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）に、切断反応物を２回アプライした。Ｃ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）を１ｍｌの０．１％ＴＦＡ及び８％アセトニトリルで洗浄した。切断産物を、予め秤量した１２×７５ｍｍ試験管中に、１ｍｌの０．１％ＴＦＡ及び４８％アセトニトリルで溶出させた。溶出物を窒素雰囲気下で約２００μｌとなるまで乾燥した。試験管をその乾燥重量を基準として秤量することにより、サンプル量を水で３００μｌにし、２００μｌアリコートを１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５倍希釈し、ＥＬＩＳＡのためにｐＨ７．２〜７．４に調節した。ＨＰＬＣは、切断産物を含めて、ポリペプチドのほとんど完全なリカバリーを確認した。
【００５０】
ＥＬＩＳＡ測定及び定量：標準曲線を下記のように作製した。ブロッキングし、洗浄し、かつブロットした９６ウェルＮｕｎｃ−Ｐｏｌｙｓｏｒｂプレートの二重ウェル（ウェル当たり合成ポリペプチド０．２５μｇを予め塗布した）中に、ＢＳＡ−ＰＢＳ中に０．０７８〜２．５μｇ／ｍｌの合成ポリペプチドを含有するサンプル５０μｌをピペットで加えた。トリプシン阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を添加した抗体（２０，０００倍希釈）５０μｌを、各ウェルに加えた。ウシチログロブリンに結合した合成ラットＰ２Ｘ３ポリペプチドＶＥＫＱＳＴＤＳＧＡＹＳＩＧＨ（配列番号３）を注射したウサギから抗体を取得し、免疫細胞化学及びウェスタンブロッティングにより、ヒトＰ２Ｘ３切断産物ＱＳＴＤＳＧＡＦＳＩＧＨ（配列番号２）及び合成ポリペプチドＶＥＫＱＳＴＤＳＧＡＹＳＩＧＨ（配列番号３）の両者に対して特異的反応性であることを確認した。４℃で２４〜４８時間インキュベートしたのち、プレートを４回洗浄し、ブロッティング紙上に裏返した。セイヨウワサビペルオキシダーゼと複合体化したロバ抗ウサギ抗体（５０，０００倍希釈）１００μｌを各ウェルに加え、室温で４５分間インキュベートしたのち、プレートを４回洗浄し、ブロッティング紙上に裏返した。１００μｌのＨＲＰ基質呈色試薬（５００μｌの０．４８％ＴＭＢ溶液＋０．００２４Ｍ  Ｈ２Ｏ２を含有する１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２５））を各ウェルに加え、青色が十分に発色するまでインキュベートした。１００μｌの２．０Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに加え、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＶＥＫＱＳＴＤＳＧＡＹＳＩＧＨ（配列番号３）の量の関数としてＡ４５０をプロットした標準曲線は、約１ｐｍｏｌの最低検出用量を示した。実験サンプルの分析は、ＱＳＴＤＳＧＡＦＳＩＧＨ（配列番号２）切断産物に当てはめたところ、アッセイの線形性を示した。
【００５１】
実験トリプシン消化サンプル中に存在する切断産物の量を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。実験ＥＬＩＳＡ測定値を、トリプシン消化サンプル中に存在するＱＳＴＤＳＧＡＦＳＩＧＨ（配列番号２）の量を測定するために標準曲線と比較した。表２を参照されたい。
【表２】
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【００５２】
Ｐ２Ｘ３の定量的量を得るために、切断産物の測定量を、サンプルの調製、消化、及び処理の間に生じた損失を補正するために調節した。損失を管理するために、合成ポリペプチドＶＥＫＱＳＴＤＳＧＡＹＳＩＧＨ（配列番号３）を、並行サンプルの調製、消化、及び処理のステップを通じて使用した。この合成ポリペプチドのリカバリーは６７％であると測定された。表３は、上記の実験、及び反復実験で測定した、Ｐ２Ｘ３含有Ｈｅｘ細胞中に存在するＰ２Ｘ３の量を示す。
【表３】
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【００５３】
実施例２：ロドプシンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ定量
本実施例は、受容体に結合した膜貫通Ｇタンパク質であるロドプシンの定量を実証する。ロドプシンのカルボキシ末端から遊離した切断産物を、同一の合成ポリペプチドを基準として測定した。切断産物及び対応する外因性ポリペプチドは、次のアミノ酸配列：ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１）を有した。
【００５４】
サンプル及び切断反応：ロドプシン含有調製物は、ウシ桿体外節（ＲＯＳ）から、Ｎｅｍｉｓ及びＤｒａｔｚの方法（１９８２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８１：１１６−２３，Ｐａｃｋｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）により調製した。１３μｇ／μｌ又は３１５ｐｍｏｌ／μｌのロドプシンを含有するＲＯＳ調製物を１３倍希釈し、２０μｌのサンプルを微小遠心管中に分注した。定量しようとする各サンプルは、４８５ｐｍｏｌのロドプシンを含有した。いくつかのサンプルに、４８０ｐｍｏｌ量の合成ポリペプチド（すなわち、１２μｌの４０ｐｍｏｌ／μｌストック）を添加した。対照サンプルは、緩衝液及び４８０ｐｍｏｌの合成ポリペプチドを含有した。
【００５５】
切断剤トリプシンで処理する前に、サンプルを５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２で２００μｌの体積にした。サンプルに対して５μｌの１μｇ／μｌストックのトリプシンを含有する切断反応物を、３７℃で一夜インキュベートした。ニートＴＦＡ（neat TFA）を濃度１％まで加えることにより、切断反応物を酸性化し、２０，０００×ｇで３０分間遠心して、残留ＲＯＳをペレットにした。切断反応物を、ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて真空遠心することにより約４０μｌの容量に濃縮した。１０μｌのサンプルをＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に用いた。
【００５６】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定及び定量：線形フィットの１×加重標準曲線を、ある範囲の濃度（すなわち、０．５００ｐｍｏｌ／μｌ、１ｐｍｏｌ／μｌ、及び４０ｐｍｏｌ／μｌ）にわたる合成ポリペプチドＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定値から作成した。標準曲線を、複数反応モニタリングを用いて作成した（すなわち、単一及び二重荷電合成ポリペプチドイオンに由来する複数の娘イオンに対応するピーク面積を測定した）。図１は、合成ポリペプチドＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１）のＭＳスペクトル及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。上のパネルはＭＳスペクトルを示し、矢印は、ｍ／ｚ９０３Ｄａで示されるポリペプチドの単一荷電［Ｍ＋Ｈ］＋１イオンに関連する質量を表すピークを示す。下のパネルは、ポリペプチドの［Ｍ＋Ｈ］＋１イオンの衝突誘導解離に由来するＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ定量のために用いた娘イオンは、ｍ／ｚ７１７、６４６、及び１８７のものであった。標準曲線は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法が大体０．５ｐｍｏｌの検出限界、及び約１〜２０００ｐｍｏｌの線形動的範囲を有したことを示した。
【００５７】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法を、ＲＯＳ、ＲＯＳ＋合成ポリペプチド、及び緩衝液＋合成ポリペプチドを含有する実験トリプシン消化サンプル中のＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１）ポリペプチドを測定するために用いた。図２は、実験及び標準サンプルに関するＬＣ／ＭＳ／ＭＳイオンクロマトグラムを示す。ピークの面積は、ＨＰＬＣカラムから溶出するポリペプチドイオンの数を示す。ピークからの面積カウントを、線形検量線及び未知濃度測定のための計算に用いた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ実験測定値を、ＲＯＳ、ＲＯＳ＋合成ポリペプチド、及び緩衝液＋合成ポリペプチドを含有するトリプシン消化サンプル中に存在するＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１）の量を測定するために、標準曲線と比較した。表４を参照されたい。
【表４】
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【００５８】
ＲＯＳサンプル中で測定したＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１）ポリペプチドの量を、添加した合成ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１）ポリペプチドの存在を説明するために調節し、かつリカバリーについて調節する。緩衝液及び合成ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１）ポリペプチドを含有するサンプルは、切断及び測定後に、ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１）を添加したＲＯＳサンプル中に存在する合成ポリペプチドの量の指標を与え、そしてＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１）ポリペプチドのリカバリーの指標を与える。
【００５９】
合成ポリペプチドを添加したＲＯＳサンプルについて、４２１．６ｐｍｏｌ−２３４．９ｐｍｏｌ＝１８６．７ｐｍｏｌ、及び１８６．７ｐｍｏｌ×（１／０．４９）＝３８１ｐｍｏｌ。ロドプシンの測定は、サンプル中に存在するロドプシンの既知量と一致する（すなわち、３８１ｐｍｏｌは４８５ｐｍｏｌの７８．６％である）。切断産物の測定は、添加しなかったＲＯＳサンプル中で測定したＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１）切断産物の量と一致する（すなわち、１８６．７ｐｍｏｌ対１６１．７ｐｍｏｌ）。従って、緩衝液サンプル及びＲＯＳサンプルに由来する合成ポリペプチドのリカバリーが同様であると仮定することは、最も有効であると思われる。
【００６０】
他の実施形態
本発明を詳細な説明において説明してきたが、上記の記載は、例示を意図するものであって、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって特定されるものである。他の態様、利点及び変更は、請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】合成ポリペプチドＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１）のＭＳスペクトル及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図２】実験及び標準サンプルに関するＬＣ／ＭＳ／ＭＳイオンクロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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