(57)【要約】サンプル中の細胞内分析物（例えば、ｃＡＭＰ）の存在および濃度を決定するための競合アッセイが、提供される。このアッセイの工程すべては、同じアッセイプレート上で実施され得、それによって、細胞を、その細胞が増殖し、誘導され、そして溶解した組織培養プレートから、別個のアッセイプレートへと移動させる必要が除かれる。このアッセイ手順は、捕捉抗体が提供された反応チャンバ中で、その分析物に対する抗体、アッセイされるサンプル、およびその分析物と酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）との結合体を、合わせる工程を包含する。その混合物は、インキュベートされ、そして洗浄され、そして酵素不安定性基質（例えば、化学発光性基質、蛍光性基質、または色素原性基質）が添加される。このアッセイはまた、酵素結合体の代わりに、タグ化分析物（例えば、放射性タグまたは蛍光タグを有する、分析物）を用いて実施され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含むサンプル中の分析物の量を検出するための競合イムノアッセイであって、該イムノアッセイは、
１つ以上のウェルを備えるアッセイプレートを提供する工程であって、該ウェルは、捕捉抗体でコーティングされている、工程；
該１つ以上のウェルに該サンプルを添加する工程；
該１つ以上のウェルにおいて、該サンプルの細胞を増殖させる工程；
該１つ以上のウェルにおいて、該細胞を溶解する工程；
該１つ以上のウェル中の該細胞溶解物またはサンプルを、（１）該分析物と酵素との結合体、および（２）該捕捉抗体により結合されておりかつそのように結合した場合に該分析物と結合して反応混合物を形成する一次抗体と、合わせる工程；
該反応混合物を、該一次抗体と該結合体との結合を許容するようにインキュベートする工程；
未結合結合体も未結合抗体も除去するために該反応混合物を洗浄する工程；
該１つ以上のウェル中の該反応混合物に、酵素不安定性基を含む基質を添加する工程であって、該結合体の酵素は、該基質の酵素不安定性基を切断可能である、工程；ならびに
該酵素不安定性基の切断から生じるシグナルを測定する工程；
を包含し、該測定されたシグナルは、該サンプル中の該分析物の存在および／または濃度を決定するために使用され得る、アッセイ。
【請求項２】
請求項１に記載の競合アッセイであって、前記分析物は、サイクリックヌクレオチドリン酸である、アッセイ。
【請求項３】
請求項２に記載の競合アッセイであって、前記分析物は、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、サイクリックウリジン一リン酸（ｃＵＭＰ）、およびサイクリックシチジン一リン酸（ｃＣＭＰ）からなる群より選択される、アッセイ。
【請求項４】
請求項３に記載のアッセイであって、前記サイクリックヌクレオチドリン酸は、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）である、アッセイ。
【請求項５】
請求項４に記載のアッセイであって、前記サイクリックアデノシン一リン酸は、アセチル化されているか、またはアセチル化されていない、アッセイ。
【請求項６】
請求項５に記載のアッセイであって、前記サイクリックアデノシン一リン酸は、アセチル化されておらず、そして該アッセイの感度は、約０．００５ｐｍｏｌ／ウェル以下である、アッセイ。
【請求項７】
請求項５に記載のアッセイであって、前記サイクリックアデノシン一リン酸は、アセチル化されておらず、そして該アッセイは、約５ｌｏｇ以上のダイナミックレンジを有する、アッセイ。
【請求項８】
請求項１に記載のアッセイであって、前記酵素は、アルカリホスファターゼである、アッセイ。
【請求項９】
請求項１に記載のアッセイであって、前記基質は、化学発光性基質、蛍光性基質、または色素原性基質である、アッセイ。
【請求項１０】
請求項１に記載のアッセイであって、前記基質は、１，２−ジオキセタンである、アッセイ。
【請求項１１】
請求項１に記載のアッセイであって、前記捕捉抗体は、前記１つ以上のウェルの表面に提供される、アッセイ。
【請求項１２】
請求項１０に記載のアッセイであって、
前記１つ以上のウェル中の前記反応混合物に、ポリマー性オニウム塩を添加する工程であって、該ポリマー性オニウム塩は、誘発された場合に前記ジオキセタンによって発光される光の量を、該増強因子の非存在下で発光される光の量と比較して増強する、工程；
をさらに包含する、アッセイ。
【請求項１３】
請求項１に記載のアッセイであって、前記化学発光性シグナルが、ルミノメーターまたは電荷結合素子（ＣＣＤ）によって検出される、アッセイ。
【請求項１４】
請求項１に記載のアッセイであって、前記反応混合物は、前記インキュベートする工程の間に少なくとも１回振盪される、アッセイ。
【請求項１５】
請求項１に記載のアッセイであって、前記分析物に結合する抗体は、モノクローナル抗体である、アッセイ。
【請求項１６】
請求項１に記載のアッセイであって、前記洗浄する工程は、ｐＨ８．０〜１１．０を有する緩衝液を用いて洗浄する工程を包含する、アッセイ。
【請求項１７】
請求項１６に記載のアッセイであって、前記緩衝液は、炭酸塩、重炭酸塩、および界面活性剤を含む、アッセイ。
【請求項１８】
細胞を含むサンプル中のサイクリックヌクレオチドリン酸の量を検出するための競合イムノアッセイであって、該イムノアッセイは、
１つ以上のウェルを備えるアッセイプレートを提供する工程であって、該ウェルは、捕捉抗体でコーティングされている、工程；
該１つ以上のウェルに該サンプルを添加する工程；
該１つ以上のウェルにおいて、該サンプルの細胞を増殖させる工程；
該１つ以上のウェルにおいて、該サンプルを溶解する工程；
該１つ以上のウェル中の該細胞を、（１）該サイクリックヌクレオチドリン酸とアルカリホスファターゼとの結合体、および（２）該捕捉抗体により結合されておりかつそのように結合した場合に該サイクリックヌクレオチドリン酸と結合して反応混合物を形成する一次抗体と、合わせる工程；
該反応混合物を、該一次抗体と該結合体との結合を許容するようにインキュベートする工程；
未結合結合体も未結合抗体も除去するために該反応混合物を洗浄する工程；
該反応混合物に、アルカリホスファターゼ誘発性１，２−ジオキセタンを添加する工程であって、該アルカリホスファターゼ誘発性１，２−ジオキセタンは、該結合体のアルカリホスファターゼと接触した場合に、分解して光を放出する、工程；ならびに
該反応混合物によって発光される光を検出する工程；
を包含し、該検出された光は、該サンプル中の該分析物の存在および／または濃度を決定するために使用され得る、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載のアッセイであって、
前記１つ以上のウェル中の前記反応混合物に、ポリマー性オニウム塩を添加する工程であって、該ポリマー性オニウム塩は、誘発された場合に前記ジオキセタンによって発光される光の量を、該増強因子の非存在下で発光される光の量と比較して増強する、工程；
をさらに包含する、アッセイ。
【請求項２０】
細胞を含むサンプル中の分析物の量を検出するための競合イムノアッセイであって、該イムノアッセイは、
１つ以上のウェルを備えるアッセイプレートを提供する工程であって、該ウェルは、捕捉抗体でコーティングされている、工程；
該１つ以上のウェルに該サンプルを添加する工程；
該１つ以上のウェルにおいて、該サンプルの細胞を増殖させる工程；
該１つ以上のウェルにおいて、該細胞を溶解する工程；
該１つ以上のウェル中の該細胞を、（１）タグ化分析物、および（２）該捕捉抗体により結合されておりかつそのように結合した場合に該分析物と結合して反応混合物を形成する一次抗体と、合わせる工程；
該反応混合物を、該一次抗体と該タグ化分析物との結合を許容するようにインキュベートする工程；
未結合タグ化分析物も未結合抗体も除去するために該反応混合物を洗浄する工程；ならびに
該１つ以上のウェル中の残っている該タグ化分析物からのシグナルを検出する工程；
を包含し、該シグナルは、該サンプル中の該分析物の存在および／または濃度を決定するために使用され得る、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載のイムノアッセイであって、前記分析物は、蛍光タグまたは放射性タグでタグ化されている、アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、１９９９年５月１０日に出願された、米国仮特許出願番号０９／３０７，７９７の一部継続である。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般には、サンプル中の分析物の存在を検出するための競合化学発光アッセイに関する。より具体的には、本発明は、細胞を含むサンプル中の分析物（例えば、サイクリックヌクレオチド一リン酸（例えば、ｃＡＭＰ））の濃度を決定するための競合アッセイに関し、その細胞は、抗体でコーティングされたプレート上で増殖される。
【背景技術】
【０００３】
（背景の考察）
広範な種類の代謝応答が、細胞内サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の放出に対して調節される。多くの場合、これらの応答は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによって媒介される。このキナーゼは、増加したｃＡＭＰレベルの存在下で、広範な種類の活性化反応を誘発する。ｃＡＭＰに対して調節される最も知られている代謝応答の中には、肝臓におけるグリコーゲンからグルコースへの転換、ならびにグリコーゲン／グルコースエネルギーサイクルに対して調節された種々の活性がある。ｃＡＭＰの増加を誘導するこのサイクル中の主要モルホンは、エピネフリンである。しかし、ｃＡＭＰ放出もまた誘発する広範な種類の他のホルモンが存在し、それらは、その後、このキナーゼにより媒介される代謝応答を調節する。これらとしては、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副甲状腺ホルモン、バソプレシン、およびプロスタグランジンＩが、挙げられる。従って、哺乳動物（ヒトを含む）の特定の組織におけるｃＡＭＰレベルは、種々のホルモンの機能および相互作用の重要な指標であり得ることは、明らかである。
【０００４】
ｃＡＭＰは、サイクリックヌクレオチドのうちで唯一最も知られている。一般に、サイクリックヌクレオチドは、一リン酸として存在する。グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、ウリジン一リン酸（ｃＵＭＰ）およびシチジン一リン酸（ｃＣＭＰ）はすべて重要なことに、望ましくは測定され得る広範な種類のホルモンの機能および細胞内相互作用に対して、影響を与え得る。ｃＡＭＰは、これらの「メッセンジャー」サイクリックヌクレオチドのうちで最も研究されている。
【０００５】
ｃＡＭＰについてのアッセイ（競合ＥＬＩＳＡアッセイを含む）は、公知である。広く報告されたアッセイは、Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎから入手可能であり、そしてそのアッセイは、比色アッセイである。他のイムノアッセイ生成物が、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（シンチレーション近接アッセイ）、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（ＦＬＡＳＨＰＬＡＴＥ（登録商標）、ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎＴＭ、蛍光偏光）ならびにＩＧＥＮ（電子蛍光発光）から入手可能である。このＡｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎの実施形態は、競合ＥＬＩＳＡアッセイの古典的例においてアッセイキット（商標ＢＩＯＭＯＬ（登録商標）の下でも入手可能）を使用し、そのアッセイにおいて、そのシグナルの強度は、存在するサイクリックヌクレオチドの濃度と反比例する。Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎからのこのキットは、光吸収の測定用である。蛍光アッセイキットが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓから入手可能である。
【０００６】
種々の組織サンプルにおいて検出される必要があり得る非常に低いサイクリックヌクレオチド値が原因で、高い感度がしばしば要求される。ｃＡＭＰ自体についての市販のアッセイの多くは、この感度を提供せず、従って、より高感度のためには、ｃＡＭＰのアセチル化がより良好な抗体結合を促進することを必要とする。従って、ｃＡＭＰアッセイの感度を改善することが望ましい。そのような強化した感度は、ｃＡＭＰレベルに対するＧタンパク質（例えば、Ｇｉタンパク質およびＧｓタンパク質）の効果を決定するためのアッセイにおいて、特に有用である。そのようなアッセイは、シグナル伝達機構を解明するのを補助するために、有用であり得る。
【０００７】
さらに、従来のアッセイは、アッセイを完了するために必要な多数の工程に部分的には起因して、非常に高価である。従って、より少ない工程しか必要とせず、従って、自動化し易く、かつ実行するのにより高価ではない、アッセイについての需要もまた存在する。
【０００８】
従って、より少ない工程しか必要とせず、かつ非常に高感度であり、広いダイナミックレンジを提供し、そして簡略化された手順を介して得られ得る試薬を使用する、競合イムノアッセイを見出すことが、当業者の目標のままである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明の第１局面に従って、細胞を含むサンプル中の分析物の量を検出するための競合イムノアッセイが提供される。このイムノアッセイは、
１つ以上のウェルを備えるアッセイプレートを提供する工程であって、そのウェルは、捕捉抗体でコーティングされている、工程；
その１つ以上のウェルに上記サンプルを添加する工程；
上記１つ以上のウェルにおいて、上記サンプルの細胞を増殖させる工程；
上記１つ以上のウェルにおいて、上記細胞を溶解する工程；
上記１つ以上のウェル中の上記細胞溶解物を、（１）上記分析物と酵素との結合体、および（２）上記捕捉抗体により結合されておりかつそのように結合した場合に上記分析物と結合して反応混合物を形成する一次抗体と、合わせる工程；
上記反応混合物を、上記一次抗体と上記結合体との結合を許容するようにインキュベートする工程；
未結合結合体も未結合抗体も除去するために上記反応混合物を洗浄する工程；
上記１つ以上のウェル中の上記反応混合物に、酵素不安定性基を含む基質を添加する工程であって、その結合体の酵素は、その基質の酵素不安定性基を切断可能である、工程；ならびに
上記酵素不安定性基の切断から生じるシグナルを測定する工程；
を包含する。このシグナルは、上記サンプル中の上記分析物の存在および／または濃度を決定するために使用され得る。上記分析物は、サイクリックヌクレオチドリン酸（例えば、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、サイクリックウリジン一リン酸（ｃＵＭＰ）、およびサイクリックシチジン一リン酸（ｃＣＭＰ））であり得る。上記酵素は、アルカリホスファターゼであり得る。上記基質は、化学発光性基質、蛍光性基質、または色素原性基質であり得る。好ましくは、上記基質は、化学発光性１，２−ジオキセタン基質である。
【００１０】
本発明の第２局面に従って、細胞を含むサンプル中の分析物の量を検出するための競合イムノアッセイが提供される。このイムノアッセイは、
１つ以上のウェルを備えるアッセイプレートを提供する工程であって、このウェルは、捕捉抗体でコーティングされている、工程；
上記１つ以上のウェルに上記サンプルを添加する工程；
上記１つ以上のウェルにおいて、上記サンプルの細胞を増殖させる工程；
上記１つ以上のウェルにおいて、上記サンプルを溶解する工程；
上記１つ以上のウェル中の上記細胞溶解物を、（１）タグ化分析物、および（２）上記捕捉抗体により結合されておりかつそのように結合した場合に上記分析物と結合して反応混合物を形成する一次抗体と、合わせる工程；
上記反応混合物を、上記一次抗体と上記タグ化分析物との結合を許容するようにインキュベートする工程；
未結合タグ化分析物も未結合抗体も除去するために上記反応混合物を洗浄する工程；ならびに
上記１つ以上のウェル中の残っている上記タグ化分析物からのシグナルを検出する工程；
を包含する。このシグナルは、上記サンプル中の上記分析物の存在および／または濃度を決定するために使用され得る。上記分析物は、酵素を用いて改変され得るか、または蛍光タグもしくは放射性タグを用いてタグ化され得る。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
上記の目的および以下により詳細に考察される他の目的は、１，２−ジオキセタンの高い化学発光感度に依存する化学発光性競合ＥＬＩＳＡアッセイによって満たされる。これらのジオキセタンは、多数の米国特許の主題である。本願発明において有用な１，２−ジオキセタンは、代表的には、式Ｉの一般構造
【００１２】
【化１】
2005523439.tif 000002
【００１３】
を有する。式Ｉにおいて、Ｙ１、Ｙ２およびＸは、電子供与性または電子吸引性のいずれかであるという点で、種々に電子活性である部分である。例示的基としては、ハロゲン（特に、塩素）；アルコキシ基（特に、メトキシ）；アミン；アルキルなどが、挙げられる。代替形において、これらの基は、水素である。Ｙ１、Ｙ２またはＸのうちのいずれか１つ以上が水素以外であり得るか、またはこれらは、すべて水素であり得る。置換基Ｒは、Ｏ部分、Ｎ部分、Ｐ部分、またはＳ部分を含む、一般に２０個未満の炭素原子のアルキル、アラルキル、環状アルキルまたはヘテロアルキルである。望ましくは、Ｒは、アルキルである。Ｒは、可溶性および反応性を増強することを意図される基で置換され得、その基としては、ハロゲン置換基（例えば、１つ以上のフッ素原子、カルボキシ（ＣＯＯ）置換基、スルホキシ置換基などが挙げられ得る。可溶性を増強するために使用される同じ置換基はまた、Ｙ１、Ｙ２またはＸ上に存在し得る。Ａｒは、アリール部分（代表的には、フェニルまたはナフチル、最も好ましくはフェニル）である。Ｚは、酵素により切断される結合を含む部分であり、これは、切断された場合に、上記アリール部分に結合されたＯまたは上記アリール部分に結合されたＮのいずれかを残す。このアニオンは、上記ジオキセタンを不安定化し、その分解をもたらす。分解の際に、ジオキセタンは、光を放出する。本発明の目的のために、Ｚは、リン酸部分（好ましくは、リン酸二ナトリウム）である。
【００１４】
この型のジオキセタンは、米国特許第４，９６２，１９２号；同第４，９３１，５６９号；同第５，１１２，９６０号；同第５，１４５，７７２号および同第５，６５４，１５４号に開示される。上記特許のいずれも、その全体が本明細書中に参考として援用される。例えば米国特許第５，１１２，９６０号において開示されるように、酵素により誘発される（ｅｎｚｙｍｅ−ｔｒｉｇｇｅｒａｂｌｅ）ジオキセタン（例えば、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４イル）−フェニルホスフェート）およびその塩は、この型の非常に有効なレポーター分子である。このジオキセタンは、「ＡＭＰＰＤ」として市販されており、「ＡＭＰＰＤ」は、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎまたはその関連子会社の登録商標である。アダマンチル環上の置換基（例えば、塩素原子）によるこの「非置換」１，２−ジオキセタンの誘導体化は、性能を劇的に改善する。塩素置換ジオキセタンは、「ＣＳＰＤ」として市販されており、「ＣＳＰＤ」は、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎまたはその関連子会社の登録商標である。同様に、上記の酵素により切断可能な置換基付近（特に、３位またはメタ位）にあるフェニル環上の置換基は、さらなる改善された収量をもたらす。これらのレポーター分子（これは、本質的に化学発光性である）は、酵素により誘発される（ｅｎｚｙｍｅ−ｔｒｉｇｇｅｒａｂｌｅ）ジオキセタンと呼ばれる。好ましくは本願発明において作用する特定の酵素は、Ｚをリン酸部分として選択するアルカリホスファターゼである。
【００１５】
米国特許第５，１４５，７７２号および同第５，３３６，５９５号（これらの両方もまた、本明細書中で参考として援用される）において示されるように、増強因子分子としてポリマー性オニウム塩（ｐｏｒｉｍｅｒｉｃ  ｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ）（例えば、アンモニウム、ホスホニウム、およびスルホニウム）を使用すると、分解時に上記ジオキセタンからの高められた程度の光放射をもたらす。これは、これらの高分子ポリマーがジオキセタンアニオンを封鎖する傾向が原因である。このジオキセタンアニオン（これは、非水性「微小環境」中で非常に疎水性である）は、化学発光放射を最大にし得る。この１，２−ジオキセタンはまた、米国特許第５，５４７，８３６号（これもまた、その全体が参考として援用される）に教示されるような二次増強因子を用いて使用され得る。
【００１６】
米国特許第５，１４５，７７２号にさらに開示されるように、これらのジオキセタンは、エネルギー受容蛍光分子（例えば、フルオレセイン）と組み合わせて、分解時にそのジオキセタンにより放射されるエネルギーが蛍光受容体へと移り、その蛍光が検出されるようにされ得る。本発明のアッセイは、化学発光放射のために特に適切である。
【００１７】
本発明のアッセイにおいて、アッセイプレートまたは同様な反応チャンバーのウェル（例えば、マイクロウェル）が、捕捉抗体でコートされる。本発明に従って、細胞増殖、細胞誘導、および細胞溶解はすべて、上記アッセイプレートの抗体でコートされたウェル中で生じ得る。その後、分析物（例えば、環状ヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）と酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）との結合体が、その分析物に対する抗体とともにウェルに添加されて、反応混合物を形成し得る。その後、この反応混合物は、インキュベートされ得そして洗浄され得る。その後、その結合体の酵素によって誘発される基質（例えば、１，２−ジオキセタン基質）が、添加され得る。その基質が１，２−ジオキセタンである場合、化学発光増強因子（例えば、ポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド））もまた、好ましくはこのウェルに添加される。その後、その基質はインキュベートされ、反応チャンバーが、好ましくは、ルミノメーターまたは他の何らかの型の光感受性デバイス（例えば、ＣＣＤ）を用いて、シグナルについて検査される。そのシグナルの強度は、そのサンプル中の分析物濃度の指標である。例えば、そのシグナルが強いほど、サンプル中の分析物濃度は低い。
【００１８】
本発明者らは、驚くべきことに、アッセイプレート上の抗体（すなわち、捕捉抗体）は、同じプレート上で細胞が増殖した後に一次抗体に結合する能力を保持することを、見出した。従って、本発明に従って、細胞は、同じプレート上で増殖され得、誘導され得、溶解され得、そしてアッセイされ得る。この様式で、細胞が増殖され、誘導され、溶解される組織培養プレート由来のサンプルをスクリーニング用の第２のアッセイプレートに移動させるという従来の工程が、排除され得る。結果として、本発明に従うアッセイは、より少ない工程しか必要とせず、従って、より自動化し易く、そして実行するためにより高価ではない。
【００１９】
本発明のアッセイプロトコルは、細胞内分析物と結合体とが、サンプルプレート上の結合部位について競合する、競合アッセイである。従って、検出されるシグナルの強度とサンプル中の分析物の濃度との間の逆の関係である。
【００２０】
本発明のアッセイは、すべてのイムノアッセイに一般に適用可能であるが、特に、サイクリックヌクレオチド（ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ｃＣＭＰ、ｃＵＭＰ、ｃＩＭＰおよびｃＴＭＰを含む）についてのアッセイに適用可能である。サイクリックヌクレオシドの中でも、ｃＡＭＰは、おそらく広範に公知であり、種々の細胞経路、細胞内経路および細胞外経路における一次メッセンジャーまたは二次メッセンジャーとして関係付けられている。頻繁に、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、広範な種類の生理学的経路において、直列した逆向きの関係で存在する。従って、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、最も関心を集めている。しかし、ｃＡＭＰは、サイクリックヌクレオチドのうちで明らかに最も十分研究されそして特徴付けられている。従って、本発明の以下の説明は、ｃＡＭＰおよびｃＡＭＰ検出試薬を使用して例証される。他のサイクリックヌクレオチド用の試薬（特に、一次抗体、好ましくはモノクローナル抗体）の置換は、本明細書中の開示を考慮すると、当業者にとって簡単であり、容易に想到される。
【００２１】
サイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ）が上記に例証されるが、細胞ベースの任意の分析物が、本発明に従ってアッセイされ得る。例えば、サイトカインおよびケモカインもまた、本発明に従ってアッセイされ得る。
【００２２】
本発明はまた、基質として、塩素置換ジオキセタンを使用して例証され、この塩素置換ジオキセタンにおいて、上記に示された一般式Ｉにおいて、アダマンチル基は、１つの塩素原子で置換され、Ｘは水素であり、Ｒはメチルであり、Ｚはリン酸である。しかし、酵素によって誘発された場合にシグナルを放つ任意の基質が、本発明に従って使用され得る。適切な基質としては、化学発光基質、蛍光基質および比色基質が挙げられる。例えば、その基質が１，２−ジオキセタンである場合、酵素によって誘発される一般式Ｉに対応する１，２−ジオキセタン複合体が、本発明に従って使用され得る。その結合体の酵素は、使用される基質を誘発する任意の酵素（アルカリホスファターゼが挙げられるが、これに限定されない）であり得る。従って、上記分析物と任意の内因性基質との結合体が、本発明において使用され得る。
【００２３】
本発明に従って、化学発光放射を増強するための増強因子が、使用され得る。そのような物質は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。例示的な増強因子として、ポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド）が使用され得る。増強因子は、本発明の実施のために好ましいが必要というわけではない。他の四級オニウムポリマーならびに疎水性高分子（例えば、大きなタンパク質（ウシ血清アルブミンまたはその混合物を包含する））が、同様に使用され得る。
【００２４】
酵素結合体が上記で考察されているが、任意のタグ化分析物が、本発明に従って使用され得る。例えば、放射性タグまたは蛍光タグを有する分析物が、アッセイプレート上の結合部位について細胞内分析物と競合するために使用され得る。その後、洗浄の後、プレート上の蛍光タグ化物質または放射性タグ化物質の量が、従来のアッセイ技術を使用して決定され得る。
【００２５】
現行の従来のアッセイプロトコルにおいて、細胞は、組織培養プレート中で増殖され誘導され、そして細胞溶解物が、ｃＡＭＰレベルまたは他の細胞内分析物レベルの決定のために別のアッセイプレートに移動される。本発明に従って、細胞増殖、細胞誘導、細胞溶解、および細胞ベースの不均質アッセイにおける細胞内分析物レベルの決定が、すべて、抗体でコートされた同じアッセイプレートのウェル中で実施され得る。本明細書中で使用される場合、用語「細胞ベース（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ）」とは、刺激に対する細胞の応答（より具体的には、サイクリックヌクレオチドリン酸（例えば、ｃＡＭＰ）の生成に関する刺激に対する細胞の応答）を測定する、本発明と同様のアッセイを指す。
【００２６】
本発明の実施において、従来のマイクロプレートまたは同様の反応チャンバーのウェルが、まず、捕捉抗体でコートされる。そのプレートは、好ましくは、光学的に透明なウェルの底を有して細胞増殖および細胞溶解が可視化され得るようになっている、マイクロプレートである。本発明の例証において、その捕捉抗体は、ヤギ抗ウサギ抗体（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘから入手可能である）である。そのプレートのウェルは、その捕捉抗体の調製物を用いてコートされ、一晩インキュベートされ、その後、洗浄される。非特異的結合を回避するために、そのプレートの残りは、その残り部分とのいかなる相互作用も抑制するように処理され得る。洗浄の後、各プレートは、ＳＵＰＥＲＬＯＣＫ（登録商標）ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅから入手可能である）または同様の薬剤で処理される。その後、そのプレートは、乾燥される。このプロセスは、図１に例証される。
【００２７】
調製されたプレートは、今や、反応チャンバーまたはウェルとして、競合アッセイのために使用される準備ができている。ｃＡＭＰの供給源は、基準化された値を確立するために特定の希釈物へと調製される標準物、または検査用のサンプル物質を提供するためにいくつかの型の刺激に供した後で溶解された細胞のいずれかであり得る。細胞が、ウェルに添加される。そのウェルにおいて、細胞増殖が生じ、細胞誘導が生じ、その後、細胞溶解が生じる。このアッセイを実施するために、本明細書中以下に記載されるｃＡＭＰとアルカリホスファターゼとの結合体が、このウェルに添加されて、ウェル中の溶解細胞との反応混合物が形成する。その反応混合物への最終添加は、一次抗体（例えば、ｃＡＭＰに対する抗体）である。ｃＡＭＰに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が、利用可能である。いずれもが、有効に使用され得る。ウサギ抗ｃＡＭＰ抗体が、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から、およびＩｍｍｕｎｏｇｅｎから、入手可能である。他の抗体が、同様に入手可能である。その反応物が、コートされたウェル中に混合され、その後、好ましくは一晩インキュベートされて、十分な抗体結合が確実にされる。その後、インキュベートされた反応混合物が、洗浄緩衝液で反復洗浄される。この洗浄緩衝液は、例えば、０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウムおよび０．０５％界面活性剤（好ましくは、ポリソルベート２０（ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓから商標Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）の下で入手可能である））、ｐＨ約８．０〜１１．０（例示的値は約９．６である）であり得る。この理論によって拘束されることは望まないが、洗浄緩衝液のアルカリ特徴は、アルカリホスファターゼの性能を改善し得るようである。このアッセイ緩衝液自体は、このアッセイのために簡便な約５．５と６．０との間（好ましくは約５．８）のｐＨで、ＢＳＡ（０．０２％）を酢酸ナトリウム（０．０５モル濃度（ｍｏｌａｒ））とともに含む。ブロッキング緩衝液、洗浄緩衝液、およびアッセイ緩衝液、ならびにマイクロウェルをコートするために使用される緩衝液の正体は、それ自体が本発明の厳格な特徴ではなく、むしろ、当業者によって変更され得、そしてなお本願発明を使用し得ることを、当業者は認識する。
【００２８】
洗浄の後に、ジオキセタンが、増強因子（もしあれば）とともに添加される。化学発光ジオキセタンからのグロー放電が一定レベルに達するのを可能にするための室温で約３０分間のさらなるインキュベーションが続き、その後、化学発光シグナルが、検出デバイスにおいて読み取られる。適切な検出デバイスとしては、ＴＲ７１７ＴＭマイクロプレートルミノメーターまたはＮｏｒｔｈＳｔａｒＴＭ  ＨＴＳ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎが挙げられる。ＴＲ７１７ＴＭおよびＮｏｒｔｈＳｔａｒＴＭは、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびその関連子会社の商標である。
【００２９】
このアッセイは、自動化ロボットアッセイシステムのために最適化されて、ハイスループットの機会を提供することが、明らかである。感度およびダイナミックレンジに関する結果は、マイクロプレートまたは他の反応チャンバーがインキュベーション期間中に振盪される場合に、有意に改善され得る。振盪アッセイおよび非振盪アッセイの相対的成績が、図２Ａおよび図２Ｂにおいて反映される。
【００３０】
図２Ａにおいて、光強度が、振盪（白丸）アッセイおよび非振盪（黒丸）アッセイの両方について、ｃＡＭＰ濃度（ｐｍｏｌ／ウェル）の関数としてプロットされる。図２Ａにおけるデータは、１時間のインキュベーション時間の間に取られた。この実験のデータは、評価した各濃度におけるシグナル対ノイズ比の計算値とともに、図２Ｂにおいて表にされている。図２Ａおよび図２Ｂから観察され得るように、振盪アッセイは、特に低いｃＡＭＰ濃度において、有意に高い分解能を提供する。
【００３１】
このアッセイは、広範な種々の条件における使用のために適切である。増強された感度ならびに広範になったダイナミックレンジによって、広範な種類の変数と一致する適用が生じる。標準物が確立された場合、本発明に従ってアッセイされるサンプルは、哺乳動物接着細胞株および哺乳動物非接着細胞株を溶解することによって得られ得る。最適性能は、９６ウェルプレート中の細胞型に依存して、広範囲の細胞密度（１ウェル当たり１，０００細胞〜１００，０００細胞の範囲）にわたって達成され得る。より多数のウェルを備える他のプレートが、使用され得る。ルミノメーターが、本発明に従って化学発光シグナル（すなわち、光放射）を検出するために使用され得る。ルミノメーターが使用される場合、適切な尺度は、１ウェル当たり約１秒である。代替的に、シンチレーションカウンター（例えば、ＴＯＰ  ＣＯＵＮＴ（登録商標）の下で入手可能なシンチレーションカウンター）が、ルミノメーターの代用品として使用され得る。感度は、減少され得、そして化学発光を直接測定するために一致回路（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔ  ｃｉｒｃｕｉｔ）をオフにする必要があり得る。
【００３２】
このアッセイの「競合的」基礎は、分析物（例えば、ｃＡＭＰ）と酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）との結合体（例えば、ｃＡＭＰ−ＡＰ結合体）を、抗体に対してサンプル中の分析物と競合するために使用することである。上記の酵素によって切断されるジオキセタンを切断してシグナルを生成するのは、その分析物に特異的な抗体によって捕捉される分析物−酵素結合体の酵素である。従って、溶解したサンプルにおける分析物濃度が低いほど、分析物−酵素結合体が多く一次抗体により捕捉され、生じるシグナルがより大きい。
【００３３】
本発明に従う分析物−酵素結合体の合成が、図３に示される。図３に示されるように、ｃＡＭＰ−ＡＰ結合体は、ＮＨＳ活性化ｃＡＭＰを、アルカリホスファターゼと、４モルの活性化ｃＡＭＰ  対  １モルのＡＰの比で合わせることによって、調製され得る。他の分析物−酵素結合体はまた、当該分野で公知の合成化学技術を使用して調製され得る。
【００３４】
上記のように、標準物を確立して、溶解したサンプル中の実際の濃度をその確立した濃度を基にして決定し得るようにすることが、望ましくあり得る。代表的な標準曲線の集合が、図４に示される。図４は、種々のｃＡＭＰ濃度についての時間（分）の関数として発光（ＲＬＵ）を示すグラフである。
【００３５】
種々のｃＡＭＰ検出アッセイについての感度およびダイナミックレンジが、公開されている。種々の検出系（本発明に従う化学発光ＥＬＩＳＡ系を含む）についての感度およびダイナミックレンジが、図５に示される。ジオキセタン化学発光技術をｃＡＭＰ特異的イムノアッセイ技術と合わせることによる感度およびダイナミックレンジの改善が、アセチル化の非存在下でさえ、予期せぬほどに優れた性能をもたらしていることが、図５のデータから明らかである。
【００３６】
上記のように、本発明に従う光放射は、好ましくは、ルミノメーターまたは電荷結合素子（ＣＣＤ）を使用して検出される。２つの例示的検出デバイス（ＴＲ７１７ＴＭマイクロプレートルミノメーターおよびＮｏｒｔｈＳｔａｒＴＭ  ＨＴＳ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）が、図６において比較される。図６Ａにおいて、発光が、１秒／ウェル読取りにおけるＴＲ７１７ＴＭマイクロプレートルミノメーターについてのｃＡＭＰ濃度（ｐｍｏｌ／ウェル）の関数（黒丸）として、および１分／プレート読取りにおけるＮｏｒｔｈＳｔａｒＴＭ  ＨＴＳ  ＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎについてのｃＡＭＰ濃度（ｐｍｏｌ／ウェル）の関数（白丸）として、プロットされる。図６Ｂにおいて、実験データが、表にされ、そしてシグナル対ノイズ比が、測定された各ｃＡＭＰ濃度について計算されている。図６Ａおよび図６Ｂにおけるデータから観察され得るように、両方のデバイスは、本発明によって有利に提供される改善された性能を与える。
【００３７】
抗体でコートされたマイクロプレートにおける細胞ベースの不均質アッセイのすべての工程を実施する能力は、いくつかの利点を有する。第１に、このアッセイからある工程（例えば、移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ）工程を除くと、このアッセイの自動化が実施しやすくなり、変動係数を改善する。次に、上記移動工程のための空隙容量としてより濃縮された細胞溶解物を有する能力は、もはや問題ではない。このことは、少量のサンプルが測定される状況において、特に有利である。また、第２のプレート（例えば、組織培養プレート）の必要を除去すると、このアッセイを実施するコストが低減する。
【００３８】
本発明は、ここで、以下の詳細な実施例を参照して記載される。これらの実施例は、例示のために示されるのであり、範囲を限定することは意図されない。
【実施例】
【００３９】
（本発明）
本発明に従って、接着ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を、Ｔ−２２５フラスコにおいて増殖させ、Ｓｉｇｍａから入手可能な酵素を含まない溶液（Ｃ−１５４４）を使用して、解離させた。細胞を、９０，０００／ｍｌにて計数し、９６ウェルの透明な底の抗体でコートしたプレート（９０μｌ／ウェル、または８，１００細胞／ウェル）および３８４ウェルの透明な底の抗体でコートしたプレート（５０μｌ／ウェル、または４，５００細胞／ウェル）の両方において播種する。細胞を、プレート洗浄機を使用して培地を除去する前に、約９０時間接着させる。０．５％  ＦＢＳおよび１ｍＭ  ＩＢＭＸ（５００ｍＭストック。最終ＤＭＳＯパーセントは０．２０％である）を含む新鮮な培地を、９６ウェルプレートについては８０μｌ／ウェルにて、そして３８４ウェルプレートについて４０μｌ／ウェルにて、添加する。細胞は、約８０％コンフルエントである。細胞を、培地吸引の際に除去しない。プレートを、アゴニスト添加の前に、５％ＣＯ２中で約３７℃で約３０分間平衡にさせる。
【００４０】
添加物番号１（Ｇｉ−アゴニスト）：ＨＥＰＥＳ中に希釈したヒトニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）を、最終濃度０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭにて、プレート（９６ウェルプレートについては１０μｌ／ウェル、３８４ウェルプレートについては５μｌ／ウェル）に添加する。このＮＰＹを、２回目の添加の前に、５％ＣＯ２中で約３７℃で約３０分間インキュベートする。
【００４１】
添加物番号２（Ｇｓ−アゴニスト／フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ））：ＨＥＰＥＳ中に希釈したイソプロテレノールおよびフォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）を、最終濃度０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭにて、プレート（９６ウェルプレートについては１０μｌ／ウェル、３８４ウェルプレートについては５μｌ／ウェル）に添加する。このイソプロテレノールおよびフォルスコリンを、細胞溶解の前に、５％ＣＯ２中で約３７℃で約３０分間インキュベートする。
【００４２】
細胞溶解：培地およびアゴニストを、プレート洗浄機を使用して除去する。アッセイ／溶解緩衝液を、プレート（９６ウェルプレートについては６０μｌ／ウェル、３８４ウェルプレートについては２０μｌ／ウェル）に添加し、約３７℃にて約３０分間溶解させる。細胞溶解を、顕微鏡を使用して確認する。
【００４３】
ｃＡＭＰアッセイ：ｃＡＭＰ−ＡＰ結合体を、プレート（９６ウェルプレートについては３０μｌ／ウェル、３８４ウェルプレートについては１０μｌ／ウェル）に添加し、その後、ｃＡＭＰ抗体を、プレート（９６ウェルプレートについては６０μｌ／ウェル、３８４ウェルプレートについては２０μｌ／ウェル）に添加する。それらのプレートをシールし、一晩インキュベートする。インキュベーションの後、それらのプレートを、プレート洗浄機を使用してｃＡＭＰ洗浄緩衝液で洗浄する。その後、Ｓａｐｐｈｉｔｅ−ＩＩＴＭ増強因子を含むＣＳＰＤ（登録商標）基質を、それらのプレートに（９６ウェルプレートについては１００μｌ／ウェル、３８４ウェルプレートについては３０μｌ／ウェル）添加し、室温で約３０分間インキュベートさせ、その後、ＴＲ７１７ＴＭマイクロプレートルミノメーターおよびＮｏｒｔｈＳｔａｒＴＭ  ＨＴＳ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにて読み取る。そのデータが、図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃに提示される。
【００４４】
３８４ウェルプレートについての標準曲線データが、下記の表Ｉに示される。
【００４５】
【表１】
2005523439.tif 000003
【００４６】
（比較例）
現行の従来のｃＡＭＰアッセイプロトコルに従って、接着ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を、Ｔ−２２５フラスコにおいて増殖させ、Ｓｉｇｍａから入手可能な酵素を含まない溶液（Ｃ−１５４４）を使用して、解離させた。細胞を、９０，０００／ｍｌにて計数し、９６ウェルの透明な底の抗体でコートしたプレート（９０μｌ／ウェル、または８，１００細胞／ウェル）および３８４ウェルの透明な底の抗体でコートしたプレート（５０μｌ／ウェル、または４，５００細胞／ウェル）の両方において播種する。細胞を、プレート洗浄機を使用して培地を除去する前に、約９０時間接着させる。０．５％  ＦＢＳおよび１ｍＭ  ＩＢＭＸ（５００ｍＭストック。最終ＤＭＳＯパーセントは０．２０％である）を含む新鮮な培地を、９６ウェルプレートについては８０μｌ／ウェルにて、そして３８４ウェルプレートについて４０μｌ／ウェルにて、添加する。細胞は、約９５％コンフルエントである。細胞を、培地吸引の際に除去しない。プレートを、アゴニスト添加の前に、５％ＣＯ２中で約３７℃で約３０分間平衡にさせる。
【００４７】
添加物番号１（Ｇｉ−アゴニスト）：ＨＥＰＥＳ中に希釈したヒトニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）を、最終濃度０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭにて、プレート（９６ウェルプレートについては１０μｌ／ウェル、３８４ウェルプレートについては５μｌ／ウェル）に添加する。このＮＰＹを、２回目の添加の前に、５％ＣＯ２中で約３７℃で約３０分間インキュベートする。
【００４８】
添加物番号２（Ｇｓ−アゴニスト／フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ））：ＨＥＰＥＳ中に希釈したイソプロテレノールおよびフォルスコリンを、最終濃度０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭにて、プレート（９６ウェルプレートについては１０μｌ／ウェル、３８４ウェルプレートについては５μｌ／ウェル）に添加する。このイソプロテレノールおよびフォルスコリンを、細胞溶解の前に、５％ＣＯ２中で約３７℃で約３０分間インキュベートする。
【００４９】
細胞溶解：培地およびアゴニストを、プレート洗浄機を使用して除去する。アッセイ／溶解緩衝液を、プレート（９６ウェルプレートについては１００μｌ／ウェル、３８４ウェルプレートについては４０μｌ／ウェル）に添加し、約３７℃にて約３０分間溶解させる。細胞溶解を、顕微鏡を使用して確認する。
【００５０】
ｃＡＭＰアッセイ：細胞溶解物を、アッセイ捕捉プレート（９６ウェルプレートについては６０μｌ／ウェル、３８４ウェルプレートについては２０μｌ／ウェル）に移動させ、その後、ｃＡＭＰ−ＡＰ結合体（９６ウェルプレートについては３０μｌ／ウェル、３８４ウェルプレートについては１０μｌ／ウェル）を添加する。その後、ｃＡＭＰ抗体を、プレートに（９６ウェルプレートについては６０μｌ／ウェル、３８４ウェルプレートについては２０μｌ／ウェル）添加する。それらのプレートをシールし、一晩インキュベートする。インキュベーションの後、それらのプレートを、プレート洗浄機を使用してｃＡＭＰ洗浄緩衝液で洗浄する。その後、Ｓａｐｐｈｉｔｅ−ＩＩＴＭ増強因子を含むＣＳＰＤ（登録商標）基質を、それらのプレートに（９６ウェルプレートについては１００μｌ／ウェル、３８４ウェルプレートについては３０μｌ／ウェル）添加し、室温で約３０分間インキュベートさせ、その後、ＴＲ７１７ＴＭマイクロプレートルミノメーターおよびＮｏｒｔｈＳｔａｒＴＭ  ＨＴＳ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにて読み取る。そのデータが、図８に提示される。
【００５１】
本実施例の３８４ウェルプレートについての標準曲線データが、下記の表ＩＩに示される。
【００５２】
【表２】
2005523439.tif 000004
【００５３】
このデータは、本発明が、細胞ベースのＥＬＩＳＡ型アッセイの性能特徴を改善することを示す。本発明のアッセイのアッセイを用いて達成される変動係数（％ＣＶ）が、改善される。観察される改善は、移動工程を排除することから生じたものであり得る。この工程の排除はまた、関係するあらゆるピペット操作の誤差を排除し得る。さらに、基礎細胞と刺激された細胞との間のシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が、増加され得た。なぜなら、移動工程の除去によって、細胞溶解物全体をこのアッセイにおいて使用することが可能になり、従って、より高いｃＡＭＰレベルが測定され得るからである。
【００５４】
上記のデータは、抗体がこのアッセイを実施する能力に関連して、その抗体でコートされたマイクロプレート表面上部で細胞を増殖することにおいて何ら有害な効果は存在しないことを、示唆する。むしろ、上記の知見によって示されるように、抗体でコートされたマイクロプレート上で増殖した細胞は、ｃＡＭＰ生成を刺激または阻害するように誘導される能力を維持する。
【００５５】
図９Ａおよび図９Ｂは、本発明に従うアッセイおよび従来のアッセイにおける、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞におけるｃＡＭＰ生成の刺激／阻害を比較する棒グラフである。図９Ａは、４つの異なるヒトニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）濃度（０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ）および種々のイソプロテレノール濃度（０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ）についての、３８４ウェルｃＡＭＰ−ＳｃｒｅｅｎＴＭアッセイプロトコルについてのデータを示す。図９Ｂは、４つの異なるヒトニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）濃度（０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ）および種々のフォルスコリン（ｆｏｅｓｋｏｌｉｎ）濃度（０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ）についての、３８４ウェルｃＡＭＰ−ＳｃｒｅｅｎＴＭアッセイプロトコルについてのデータを示す。
【００５６】
図９Ａおよび図９Ｂにおいて、「新（ｎｅｗ）」とは、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞が４日間増殖され、アゴニストで処理され、溶解され、３８４ウェル透明底アッセイ捕捉プレートのウェルにおいてすべてアッセイされる、プロトコルを指す。「旧（ｏｌｄ）」とは、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞が４日間増殖され、アゴニストで処理され、溶解され、標準的３８４ウェル組織培養プレートのウェルにおいてすべてアッセイされる、従来のプロトコルを指す。その後、細胞溶解物は、ｃＡＭＰアッセイについて３８４ウェル中実の底アッセイ捕捉プレートに移動させる。
【００５７】
本発明はまた、細胞を含むサンプル中で分析物の量を決定するために化学発光アッセイを実行するためのキットに関する。本発明に従って、このキットは、１つ以上のウェルを含むアッセイプレート（このウェルは、捕捉抗体でコートされている）；分析物と酵素との結合体；その捕捉抗体によって結合され、そのように結合した場合に上記分析物に結合する一次抗体；その結合体中の酵素と接触した場合に分解して光を放出する基質；を含み得る。その基質は、蛍光基質、化学発光基質、または比色基質であり得る。本発明の好ましい実施形態に従って、この基質は、１，２−ジオキセタン基質である。本発明に従う酵素は、好ましくは、アルカリホスファターゼである。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態に従うと、その分析物は、サイクリックヌクレオチドリン酸（例えば、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、サイクリックウリジン一リン酸（ｃＵＭＰ）、およびサイクリックシチジン一リン酸（ｃＣＭＰ））であり得る。本発明の好ましい実施形態に従って、その分析物は、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）である。
【００５９】
その基質が１，２−ジオキセタンである場合、そのキットは、化学発光増強因子をさらに含み得、この化学発光増強因子は、誘発された場合にそのジオキセタンによって放出される光の量を、その増強因子の非存在下と比較して増強する。本発明の好ましい実施形態に従って、この化学発光増強因子は、ポリマー性オニウム塩である。
【００６０】
本発明は、一般的に開示されており、そして特定の実施例に関して、開示されている。その特定の実施例は、そのように示されない限り、限定するものとして意図されず、そう解釈されるべきでもない。特に、本ジオキセタンの正体、緩衝液組成物、シグナル検出装置、プロトコル時間、温度、および条件などの変化形は、発明能力の実行を伴わずに、当業者が想到する。示される特許請求の範囲の記載によって排除されない限り、これらの変化形は、本発明の範囲内に残る。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、本発明のコーティングされたプレート（「反応チャンバ」）を製造する方法を示すフローチャートである。
【図２Ａ】図２Ａは、インキュベーション期間の間に反応混合物を振盪することによって得たシグナルと、反応混合物を振盪せずに得たシグナルとを比較する、グラフ表示を提供する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、インキュベーション期間の間に反応混合物を振盪することによって得たシグナルと、反応混合物を振盪せずに得たシグナルとを比較する、表データを提供する。
【図３】本発明のアルカリホスファターゼ／サイクリックヌクレオチド結合体の形成の模式図である。
【図４】種々の濃度のｃＡＭＰに関する、標準化したシグナル  対  時間のグラフ表示である。
【図５】本願発明の感度およびダイナミックレンジを、ｃＡＭＰについての他の市販のアッセイとを比較する、表である。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明に従って２つの異なるルミノメーターから得られた発光データを比較する、グラフ表示を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明に従って２つの異なるルミノメーターから得られた発光データを比較する、表データを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明に従うアッセイから得られるデータを提示する表であり、このアッセイにおいて、細胞が増殖され、アゴニストで処理され、溶解され、そして透明な底のアッセイ捕捉プレートのウェル中ですべてがアッセイされる。
【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明に従うアッセイから得られるデータを提示する表であり、このアッセイにおいて、細胞が増殖され、アゴニストで処理され、溶解され、そして透明な底のアッセイ捕捉プレートのウェル中ですべてがアッセイされる。
【図７Ｃ】図７Ｃは、本発明に従うアッセイから得られるデータを提示する表であり、このアッセイにおいて、細胞が増殖され、アゴニストで処理され、溶解され、そして透明な底のアッセイ捕捉プレートのウェル中ですべてがアッセイされる。
【図８Ａ】図８Ａは、従来のアッセイから得られるデータを提示する表であり、このアッセイにおいて、細胞が増殖され、アゴニストで処理され、標準的組織培養プレート中で溶解され、その後、その細胞用溶解物が、そのアッセイのための中実の底のアッセイ捕捉プレートに移される。
【図８Ｂ】図８Ｂは、従来のアッセイから得られるデータを提示する表であり、このアッセイにおいて、細胞が増殖され、アゴニストで処理され、標準的組織培養プレート中で溶解され、その後、その細胞用溶解物が、そのアッセイのための中実の底のアッセイ捕捉プレートに移される。
【図８Ｃ】図８Ｃは、従来のアッセイから得られるデータを提示する表であり、このアッセイにおいて、細胞が増殖され、アゴニストで処理され、標準的組織培養プレート中で溶解され、その後、その細胞用溶解物が、そのアッセイのための中実の底のアッセイ捕捉プレートに移される。
【図９Ａ】図９Ａは、本発明に従うアッセイと従来のアッセイとの両方において、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞におけるｃＡＭＰ生成の刺激／阻害を比較するグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、本発明に従うアッセイと従来のアッセイとの両方において、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞におけるｃＡＭＰ生成の刺激／阻害を比較するグラフである。
【図１】
2005523439.tif 000005
【図２Ａ】
2005523439.tif 000006
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【国際調査報告】
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