(57)【要約】遺伝子の組換え方法が開示される。この方法は、１つの鋳型の５’末端およびもう１つの鋳型の３’末端への相同性を有する不対フォワードおよびリバースプライマーの設計を包含する。短いプライマー伸長期間の結果として、ついで増幅されうる、対になった５’末端および３’末端を有する組換え鋳型を生じる。増幅されたサンプルは、親鋳型を含んでいない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１つの二本鎖第一核酸鋳型および少なくとも１つの第二二本鎖核酸鋳型（ここで前記第一核酸鋳型のセンス鎖の５’領域は、前記第二核酸鋳型のセンス鎖の５’領域と異なる配列を有し、前記第一核酸鋳型のセンス鎖の３’領域は、前記第二核酸鋳型のセンス鎖の３’領域と異なる配列を有する）を準備し、
ｂ）前記第一核酸鋳型のアンチセンス鎖の３’領域にのみアニールする、少なくとも１つのフォワードプライマーを準備し、
ｃ）前記第二核酸鋳型のセンス鎖の３’領域にのみアニールする、少なくとも１つのリバースプライマーを準備し、
ｄ）（ａ）の前記第一および第二核酸鋳型と複製組成物中の（ｂ）および（ｃ）の前記プライマーとを接触させ、これによって前記プライマーのプライマー誘導性伸長が生じ、
ｅ）約１，０００以下のヌクレオチドの付加後、（ｄ）のプライマーの伸長を終結させ、
ｆ）前記伸長されたフォワードおよびリバースプライマーを、前記第一および第二鋳型から分離し、
ｇ）前記伸長されたフォワードおよびリバースプライマーを、前記第一および第二鋳型と再アニールさせ、これによって、前記伸長されたプライマーが、前記第一鋳型または第二鋳型のどちらかにアニールし、そして
ｈ）前記第一および第二二本鎖鋳型の組換えを含んでなる少なくとも１つの全長伸長産物が生成されるまで、工程（ｄ）〜（ｇ）を繰返すこと
を含んでなる目的とする核酸鋳型の組換え方法。
【請求項２】
ａ）少なくとも１つの第一アンチセンス一本鎖核酸鋳型および少なくとも１つの第二センス一本鎖核酸鋳型を準備し、
ｂ）前記第一核酸鋳型の３’領域にのみアニールする、少なくとも１つのフォワードプライマーを準備し、
ｃ）前記第二核酸鋳型の３’領域にのみアニールする、少なくとも１つのリバースプライマーを準備し、
ｄ）（ａ）の前記第一および第二核酸鋳型と複製組成物中の（ｂ）および（ｃ）の前記プライマーとを接触させ、これによって前記プライマーのプライマー誘導性伸長が生じ、
ｅ）約１，０００以下のヌクレオチドの付加後、（ｄ）の前記プライマーの伸長を終結させ、
ｆ）前記伸長されたフォワードおよびリバースプライマーを、前記第一および第二鋳型から分離し、
ｇ）前記伸長されたフォワードおよびリバースプライマーを、前記第一および第二鋳型と再アニールさせ、これによって、前記伸長されたプライマーが、前記第一鋳型または第二鋳型のどちらかにアニールし、そして
ｈ）前記第一および第二鋳型の組換えを含んでなる少なくとも１つの全長伸長産物が生成されるまで工程（ｄ）〜（ｇ）を繰返すこと
を含んでなる目的とする核酸鋳型の組換え方法。
【請求項３】
該第一および第二鋳型が、互いに対して少なくとも５０％の同一性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第一および第二鋳型が、互いに対して少なくとも７０％の同一性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第一および第二鋳型が、互いに対して少なくとも９０％の同一性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型の長さが約０．０３ｋＢ〜約２０ｋＢである請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記プライマー伸長が、約５００以下のヌクレオチドの付加後に終結される請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記プライマー伸長が、約３００以下のヌクレオチドの付加後に終結される請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記プライマー伸長が、約２０〜５０以下のヌクレオチドの付加後に終結される請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記プライマー伸長が、アニール温度の変更、ｐＨの変更、およびポリメラーゼ阻害剤の添加よりなる群から選択されるプロセス工程によって終結される請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記第一鋳型または第二鋳型のどちらかの３’領域が、長さ約６〜約２００塩基である請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記第一鋳型が、アンチセンス一本鎖鋳型であり、そして前記フォワードプライマーが、前記第一鋳型の３’領域にのみアニールする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第二鋳型が、センス一本鎖鋳型であり、そして前記リバースプライマーが、前記第二鋳型の３’領域にのみアニールする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンチセンス鎖の３’領域が、改変されたフランキング領域である請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記センス鎖の３’領域が、改変されたフランキング領域である請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記全長伸長産物が、場合によっては前記第一および第二鋳型から精製される請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記全長伸長産物が、場合によっては増幅される請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記フォワードおよびリバースプライマーが、至適条件下でアニールする請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記フォワードおよびリバースプライマーが、長さ約６〜約２００ヌクレオチドである請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記プライマー誘導性伸長が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、および鎖置換増幅よりなる群から選択される技術を用いて実施される請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記第一および第二核酸鋳型が、未知の配列を有する請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記第一および第二核酸鋳型を、前記鋳型がニックされる条件下に酵素と接触させる請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸鋳型がＲＮＡであり、そして前記酵素がリボヌクレアーゼである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸鋳型がＤＮＡであり、そして前記酵素がデオキシリボヌクレアーゼ、ＤＮＡジャイレース、およびｒｅｃＡよりなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記第一および第二核酸鋳型が線状である請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記第一および第二核酸鋳型の１つもしくは両方が、プラスミド上に含まれている請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記第一および第二核酸鋳型の１つもしくは両方が、対立遺伝子バリアントである請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記組換え第一および第二鋳型を含んでなる（ｈ）の全長伸長産物がさらに、工程（ｃ）〜（ｇ）を受ける請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記フォワードおよびリバースプライマーが、異なる配列を有する請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記フォワードおよびリバースプライマーが、同じ配列を有する請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ａ）前記第一鋳型のアンチセンス鎖の該３’領域が、第一ユニーク制限部位を含んでなり、そして前記第二鋳型のセンス鎖の該３’領域が、第二ユニーク制限部位を含んでなり、ここで該第一ユニーク制限部位は前記第二鋳型に存在せず、そして前記第二ユニーク制限部位は該第一鋳型に存在せず、かつ
ｂ）前記全長伸長産物が、前記第一および第二ユニーク制限部位を含んでなる
請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
ａ）該第一ユニーク制限部位を切断する第一制限酵素、および該第二ユニーク制限部位を切断する第二制限酵素のどちらか１つもしくは両方で前記全長伸長産物を制限切断して、制限切断された全長伸長産物を生成させ、そして
ｂ）該制限切断された全長伸長産物をベクター中に連結させること
をさらに含んでなる請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ａ）少なくとも１つの二本鎖第一核酸鋳型および少なくとも１つの第二二本鎖核酸鋳型（ここで前記第一核酸鋳型のセンス鎖の５’領域は、前記第二核酸鋳型のセンス鎖の５’領域と異なる配列を有し、そして前記第一核酸鋳型のセンス鎖の３’領域は、前記第二核酸鋳型のセンス鎖の３’領域と異なる配列を有する）を準備し、
ｂ）前記第一核酸鋳型のアンチセンス鎖の３’領域にのみアニールする、少なくとも１つのフォワードプライマーを準備し、
ｃ）前記第二核酸鋳型のセンス鎖の３’領域にのみアニールする、少なくとも１つのリバースプライマーを準備し、
ｄ）（ａ）の前記第一および第二核酸鋳型と複製組成物中の（ｂ）および（ｃ）の前記プライマーとを接触させ、これによって前記プライマーのプライマー誘導性伸長が生じ、
ｅ）約１，０００以下のヌクレオチドの付加後、（ｄ）の前記プライマーの伸長を終結させ、
ｆ）前記伸長されたフォワードおよびリバースプライマーを、前記第一および第二鋳型から分離し、
ｇ）前記伸長されたフォワードおよびリバースプライマーを、前記第一および第二鋳型と再アニールさせ、これによって、前記伸長されたプライマーが、前記第一鋳型または第二鋳型のどちらかにアニールし、 
ｈ）前記第一および第二鋳型の組換えを含んでなる少なくとも１つの全長伸長産物が生成されるまで、工程（ｄ）〜（ｇ）を繰返し、
ｉ）（ｈ）の前記全長伸長産物を発現させて、組換えられたポリペプチドを生成させ、そして
ｊ）前記第一または第二二本鎖核酸鋳型のどちらかから発現された前記ポリペプチドと比較して改変された特性について、（ｉ）の前記組換えられたポリペプチドをスクリーニングすること
を含んでなる改変された特性を有する組換えられたポリペプチドの生成方法。
【請求項３４】
ａ）少なくとも１つの第一アンチセンス一本鎖核酸鋳型および少なくとも１つの第二センス一本鎖核酸鋳型を準備し、
ｂ）前記第一核酸鋳型の３’領域にのみアニールする、少なくとも１つのフォワードプライマーを準備し、
ｃ）前記第二核酸鋳型の３’領域にのみアニールする、少なくとも１つのリバースプライマーを準備し、
ｄ）（ａ）の前記第一および第二核酸鋳型と複製組成物中の（ｂ）および（ｃ）の前記プライマーとを接触させ、これによって前記プライマーのプライマー誘導性伸長が生じ、
ｅ）約１，０００以下のヌクレオチドの付加後、（ｄ）の前記プライマーの伸長を終結させ、
ｆ）前記伸長されたフォワードおよびリバースプライマーを、前記第一および第二鋳型から分離し、
ｇ）前記伸長されたフォワードおよびリバースプライマーを、前記第一および第二鋳型と再アニールさせ、これによって、前記伸長されたプライマーが、前記第一鋳型または第二鋳型のどちらかにアニールし、
ｈ）前記第一および第二鋳型の組換えを含んでなる少なくとも１つの全長伸長産物が生成されるまで、工程（ｄ）〜（ｇ）を繰返し、
ｉ）（ｈ）の前記全長伸長産物を発現させて、組換えられたポリペプチドを生成させ、そして
ｊ）前記第一または第二二本鎖核酸鋳型のどちらかから発現された前記ポリペプチドと比較して改変された特性について、（ｉ）の前記組換えられたポリペプチドをスクリーニングすること
を含んでなる改変された特性を有する組換えられたポリペプチドの生成方法。
【請求項３５】
該第一および第二鋳型が、互いに対して少なくとも５０％の同一性を有する請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記第一および第二鋳型が、互いに対して少なくとも７０％の同一性を有する請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記第一および第二鋳型が、互いに対して少なくとも９０％の同一性を有する請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記プライマー伸長が、約５００以下のヌクレオチドの付加後に終結される請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記プライマー伸長が、約３００以下のヌクレオチドの付加後に終結される請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記プライマー伸長が、約２０〜５０以下のヌクレオチドの付加後に終結される請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記プライマー伸長が、アニール温度の変更、ｐＨの変更、およびポリメラーゼ阻害剤の添加よりなる群から選択されるプロセス工程によって終結される請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記第一鋳型または第二鋳型のどちらかの３’領域が、長さ約６〜約２００塩基である請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記アンチセンス鎖の３’領域が、改変されたフランキング領域である請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記センス鎖の３’領域が、改変されたフランキング領域である請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記フォワードおよびリバースプライマーが、ストリンジェントな条件下でアニールする請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記フォワードおよびリバースプライマーが、長さ約６〜２００ヌクレオチドである請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記プライマー誘導性伸長が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、および鎖置換増幅よりなる群から選択される技術を用いて実施される請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記組換えられたポリペプチドが酵素である請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記酵素が、プロテアーゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、レバナーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、ヌクレオチダーゼ、トランスフルクトシラーゼ、ラクターゼ、デサチュラーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、デヒドラターゼ、デスルフラーゼ、ヒドラターゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼホスファターゼ、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ、ｏ−メチルトランスフェラーゼ、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ、シンナモイルＣｏＡレダクターゼ、およびアセトラクテートシンターゼよりなる群から選択される請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記酵素がグリセロールデヒドラターゼである請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記酵素の特性が、酵素活性、基質特異性、阻害剤に対する安定性、熱安定性、プロテアーゼ安定性、溶媒安定性、洗剤安定性、および折たたみ特性よりなる群から選択される特性に関して改変される請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記組換えられたポリペプチドが酵素でない請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記組換えられたポリペプチドが、サイトカイン、糖タンパク質、成長因子、ビオチン結合タンパク質、免疫グロブリン結合タンパク質、構造タンパク質、ウイルスタンパク質、エンベロープタンパク質、および微生物抗原よりなる群から選択される請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ポリペプチドの特性が、熱安定性、プロテアーゼ安定性、溶媒安定性、洗剤安定性、折たたみ特性、構造特性よりなる群から選択される特性に関して改変される請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
請求項３３または３４のいずれかに記載の方法によって製造された、改変された特性を有するポリペプチド。
【請求項５６】
配列番号：１６、１８、２０、２２、および２４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
配列番号：１２および１４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００２年２月２６日に出願された米国仮出願第６０／３６０，２７９号の特典を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は分子生物学の分野に関する。より具体的には本発明は、改変された特性を有する新しいポリヌクレオチドおよび／または新しいポリペプチドの生成のための遺伝要素の組換え方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
組換え遺伝学の出現は、改変された、または増強された生物特性を有するタンパク質の開発へのニーズをもたらした。タンパク質を改変させる（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）方法は多数あり、生物内および試験管内技術の両方を使用し、翻訳ならびに転写事象に焦点を当てている。これらの技術は自然の進化によって着想が与えられ、機能性において特異的な所望の改変を有するタンパク質を同定するための変異分子プールの生成および選択、またはスクリーニングを一般に包含する。このプロセスは一般的に、変異遺伝子ライブラリーの作製から始まる。所望の特性または特性セットに関して改良を示す遺伝子産物は、選択またはスクリーニングによって同定される。これらの産物をコードする遺伝子は、有利な突然変異を累積するために、このプロセスのそのほかのサイクルを受けることもある。この進化は、所望の結果、および各世代において典型的に見られる突然変異の効果に応じて、世代をほとんど包含しないこともあり、または多くの世代を包含することもある。このような方法は、新規の機能的核酸、ペプチド、およびその他の小さい分子、抗体、酵素、およびその他のタンパク質を作製するために用いられてきた。これらの型の「定向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）進化」技術の利点は、産物それ自体についての特別な知識がほとんど必要とされないということである。その代わり、最適化される機能を評価するための方法論を開発することが重要なだけである。
【０００４】
タンパク質工学の最も広く実施されている方法の１つは、「遺伝子シャフリング」として知られている方法を包含する。遺伝子シャフリングは、ＤＮＡ鋳型の短いランダムセグメントへの（通常はデオキシリボヌクレアーゼＩを用いる）フラグメント化から始まり；これらのフラグメントを溶融して、一本鎖を生成し；ついでこれらの鎖を再アニールさせる。これらの鎖はランダムに再アニールするので、ダイマーは多くの場合、異なる長さの鎖を有し、オーバーハングが発生する。これらはポリメラーゼおよび遊離ヌクレオチドを用いて埋め戻され（ｂａｃｋ−ｆｉｌｌ）、このプロセスは、たとえシャッフルされたセグメントを有するものであっても完全な鋳型が発生するまで繰返される。これらの方法およびそれらの変形例は、次の特許に記載されている：特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、および特許文献９。
【０００５】
改変されたタンパク質を生産するための遺伝子／ＤＮＡフラグメントをシャッフルまたは組換えるためのこれに代わる方法では、鋳型を最初にフラグメント化するために中断されたポリメラーゼ伸長プロセスを利用する。１つの方法において、突然変異または付加物が、ＵＶ光、化学薬品、またはその他の突然変異原を用いて鋳型に導入される。これらの突然変異は、ポリメラーゼのための破壊点としての機能を果たす。突然変異生成後、これらの鎖は変性され、短いランダムプライマーでプライミングされ、伸長される。しかしながら伸長は、突然変異または付加物点までしか発生せず、ついで停止される。上記の「遺伝子シャフリング」技術と同様な方法で、短いフラグメントはついで精製され、ランダムに再アニールさせられ、これによって、多くの場合異なる長さの鎖を含んでなるダイマーを発生する。このようにして生じたオーバーハングは、ポリメラーゼおよび遊離ヌクレオチドを用いて埋め戻され、このプロセスは、（シャッフルされたセグメントを含んでいる）完全な鋳型が発生するまで繰返される。この方法は一般に、特許文献１０に教示されている。
【０００６】
上に教示されている方法の変形例が、非特許文献１によって提供されている。このランダムプライミング組換え（ＲＰＲ）方法は、鋳型配列の様々なセクションに相補的な多数の短いＤＮＡフラグメントを発生させるためにランダム配列を利用する。その場合、短いＤＮＡフラグメントは、相同性に基づいて互いにプライミングすることができ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下に反復熱循環によって組換えられ、全長遺伝子に再結合または再組立てされうる。
【０００７】
これらのプロセスのもう１つの変形例は、直列の鋳型分子の様々な部分にアニールして短い二本鎖ＤＮＡフラグメントプールを生成する、一組の規定されたプライマーの設計が必要である。このことは、１ＰＣＲ反応あたり２つの対になったプライマーを用いて、または１反応あたり多数のプライマーの使用によって別々に実施することができる。最終結果は、さらなる循環においてほかの鋳型または同じ鋳型上の異なる位置にランダムにアニールする短い二本鎖ＤＮＡフラグメントを生じ、これによってシャフリングを発生させうる。この方法は一般に、特許文献１１に記載されている。
【０００８】
遺伝子を組換えるためのこれに代わる方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の固有の特性を利用し、これは一般に組換え促進性ＰＣＲとして知られている。ＰＣＲによって生成されたこの固有の「シャフリング」は、非特許文献２によって最初に観察された。その時、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて実施されたＰＣＲの結果、異なる対立遺伝子のキメラが増幅されることが注目された。シャッフルされたクローンは、伸長の「１サイクルの間のアニールされたプライマーの不完全な伸長」から生じ、したがって「後のサイクルにおいてこれらの不完全な産物がほかの対立遺伝子の鋳型［あるいはまた、非同一鋳型］とハイブリダイズし、伸長され、したがってモザイクを生成することがある」という仮説が立てられた。この現象は、伸長しつつあるポリメラーゼが休止するか、または伸長が完了する前に鋳型から離れる時に発生すると考えられた。
【０００９】
非特許文献２（上記）の研究の後に、非特許文献３が続いた。この特別な研究は、２つの異なるＨＩＶ１ｔａｔ遺伝子配列のＰＣＲ共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって、組換えＤＮＡ分子の形成を調べた。このような組換え体の頻度は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ延長時間における６倍増加によって２．７倍減少しうるであろうと決定された。非特許文献４は、ＰＣＲ媒介組換えまたはキメラ形成の刺激および抑制を調べた。不完全伸長／延長、および鋳型鎖交換を介してこれらの不完全に伸長された産物のその後のプライミングを特異的に促進するように設計されたＰＣＲ循環プログラムは、組換え＞２０％を刺激しうると決定された。不完全延長の程度は、酵素の合成能力（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）および延長に与えられる時間の長さによって影響されると考えられた。さらには、変性工程とアニーリング工程との間の遅い冷却は、より豊富なプライマー上への不完全な産物のアニーリングを促進すると示唆された。不完全に延長された産物が、非伸長プライマーよりもはるかに高い鋳型へのアニール温度を有するので、変性工程とアニーリング工程との間の遅い冷却によって、不完全に延長された産物を鋳型と結合させ、プライマーのアニール温度に到達する前に、さらなる延長を開始させた。
【００１０】
非特許文献５、特許文献１２によって１９９８年に開発されたスタッガー伸長プロセス（ＳｔＥＰ）は、組換え促進性ＰＣＲに関するこれらの初期の発見の産物であった。このＳｔＥＰプロセスは、鋳型配列のプライミング、ついで変性、および極端に短縮されたアニーリング／ポリメラーゼ−触媒伸長の反復サイクルからなる。各サイクルにおいて、成長しつつあるフラグメントのいくつかは、配列相補性に基づいて異なる鋳型にアニールし、さらに伸長しうるであろう。これは、全長配列が形成するまで繰返される。鋳型スイッチングによって、これらのシャッフルされたポリヌクレオチドは、異なる親配列からの配列情報を含んでいる。この方法は、試験管内突然変異生成およびポリヌクレオチド配列の組換えの両方に対して効率的であることが証明された。ＳｔＥＰについての対になったプライマー配列は、これらの鋳型の５’および３’フランキング配列にアニールするように優先的に（ランダムに対して）設計されている。ただしこのプロセスはまた、普遍的なフランキングプライマーを用いても実施することもできるであろうことは知られている。
【００１１】
最後に、非特許文献６の研究は、組換えポリヌクレオチドの生成方法への１つの追加の洞察を提供した。具体的にはこれらの著者は、ＤＮＡニッキングがＰＣＲ組換えを促進すると報告した。その理由は、デオキシリボヌクレアーゼによってニックされた鋳型の使用が、ＰＣＲ反応の間、２つの鋳型間の試験管内組換えを増加したからである。
【００１２】
上記の方法はすべて、新しいポリペプチドの開発のための組換え遺伝子の生成にとって有用である。しかしながらこれらの方法によってこのように作製されたライブラリーは、シャッフルされていない親遺伝子によるコンタミネーションの問題がある。その理由は、これらの方法のすべてが、親鋳型分子のプライマー増幅を可能にする対になったプライマーを用いるからである。親遺伝子が、低い相同性（ＤＮＡレベルで＜８０％）を有する場合、シャッフルされていない親遺伝子のコンタミネーションは、非効率的で時間がかかるスクリーニングを行なう結果になり、さらにその結果として、多くの有用な新しい組換え体を見逃すことがある。さらには親遺伝子の組換え（例えばシャフリング効率、交差数等）は、大部分熱循環条件による。親遺伝子が低い相同性を有する時、上記の方法では組換えのための熱循環条件を迅速に最適化するのは難しい。増幅された産物が親遺伝子またはシャッフルされた遺伝子であるかどうかを決定することができないので、このような結果が生じる。この問題の唯一の解決法は、各ライブラリーを配列決定し、ついで熱循環条件を調節することであるが、これはひどく時間がかかり、費用がかかる。
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５，６０５，７９３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８１１，２３８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８３０，７２１号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８３７，４５８号明細書
【特許文献５】米国特許第６，１３２，９７０号明細書
【特許文献６】米国特許第６，２９１，２４２号明細書
【特許文献７】米国特許第６，２９７，０５３号明細書
【特許文献８】米国特許第６，２８７，８６１号明細書
【特許文献９】米国特許第６，１１７，６７９号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，９６５，４０８号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，１５３，４１０号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，１７７，２６３号明細書
【非特許文献１】シャオ（Ｓｈａｏ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６（２）：６１８〜６８３ページ（１９９８年）
【非特許文献２】サイキ（Ｓａｉｋｉ），Ｒ．Ｋ．ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３９（４８３９）：４８７〜９１ページ（１９８８年）。
【非特許文献３】メイヤーハンス（Ｍｅｙｅｒｈａｎｓ），Ａ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８（７）：１６８７〜９１ページ（１９９０年）
【非特許文献４】ジュドー（Ｊｕｄｏ），Ｍ．Ｓ．Ｂ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２６（７）：１８１９〜１８２５ページ（１９９８年）
【非特許文献５】ザオ（Ｚｈａｏ），Ｈら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６（３）：２５８〜６１（１９９８年）
【非特許文献６】マートン（Ｍａｒｔｏｎ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９（９）：２４２３〜２４２６ページ（１９９１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって解決すべき問題は、スクリーニングされるライブラリーにおける親鋳型の存在を排除し、さらには新しい突然変異（すなわち欠失、置換、挿入）の導入を可能にする遺伝子組換え方法を提供することである。このような方法はさらに、組換え条件の容易な最適化を可能にするものである方がよい。
【００１５】
出願人らは、新しい組換え促進性産物のみが生産されるように、遺伝子の組換え方法を提供することによって、提示された問題を解決した。この方法は、１つの鋳型の５’末端および異なる鋳型の３’末端との相同性を有する不対フォワードおよびリバースプライマーの設計を包含する。短いプライマー伸長期間は結果として、さらに増幅させることができる対になった５’および３’末端を有する全長組換え促進性伸長産物プールを生じる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
ａ）少なくとも１つの二本鎖第一核酸鋳型および少なくとも１つの第二二本鎖核酸鋳型（ここで第一核酸鋳型のセンス鎖の５’領域は、第二核酸鋳型のセンス鎖の５’領域と異なる配列を有し、第一核酸鋳型のセンス鎖の３’領域は、第二核酸鋳型のセンス鎖の３’領域と異なる配列を有する）を準備し、ｂ）第一核酸鋳型のアンチセンス鎖の３’領域にのみアニールする、少なくとも１つのフォワードプライマーを準備し、ｃ）第二核酸鋳型のセンス鎖の３’領域にのみアニールする、少なくとも１つのリバースプライマーを準備し、ｄ）（ａ）の第一および第二核酸鋳型と複製組成物中の（ｂ）および（ｃ）のプライマーとを接触させ、これによってこれらのプライマーのプライマー誘導性伸長が生じ、ｅ）約１，０００以下のヌクレオチドの付加後、（ｄ）のプライマーの伸長を終結させ、ｆ）前記伸長されたフォワードおよびリバースプライマーを、第一および第二鋳型から分離し、ｇ）前記伸長されたフォワードおよびリバースプライマーを、第一および第二鋳型と再アニールさせ、これによって、前記伸長されたプライマーが、第一鋳型または第二鋳型のどちらかにアニールし、そしてｈ）第一および第二二本鎖鋳型の組換えを含んでなる少なくとも１つの全長伸長産物が生成されるまで、工程（ｄ）〜（ｇ）を繰返すことを含んでなる目的とする核酸鋳型の組換え方法を提供することが、本発明の一態様である。
【００１７】
これに代わる実施態様において、本発明の方法は、第一鋳型が二本鎖分子のアンチセンス鎖であり、第二鎖が二本鎖分子のセンス鎖である、一本鎖鋳型を用いることによって実施されてもよい。
【００１８】
もう１つの実施態様において、本発明の方法は、第一アンチセンス一本鎖鋳型、および第一鋳型の３’領域にのみアニールするフォワードプライマーを用いることによって実施されてもよい。あるいはまた本発明は、リバースプライマーが第二鋳型の３’領域にのみアニールする第二センス一本鎖鋳型を用いる方法を包含する。
【００１９】
場合により、本発明の方法によって生産された全長伸長産物は、当業界においてよく知られた手段によって精製されてもよい。
【００２０】
好ましい実施態様において、本発明は、ａ）少なくとも１つの二本鎖第一核酸鋳型および少なくとも１つの第二二本鎖核酸鋳型（ここで第一核酸鋳型のセンス鎖の５’領域は、第二核酸鋳型のセンス鎖の５’領域と異なる配列を有し、そして第一核酸鋳型のセンス鎖の３’領域は、第二核酸鋳型のセンス鎖の３’領域と異なる配列を有する）を準備し、ｂ）第一核酸鋳型のアンチセンス鎖の３’領域にのみアニールする、少なくとも１つのフォワードプライマーを準備し、ｃ）第二核酸鋳型のセンス鎖の３’領域にのみアニールする、少なくとも１つのリバースプライマーを準備し、ｄ）（ａ）の第一および第二核酸鋳型と複製組成物中の（ｂ）および（ｃ）のプライマーとを接触させ、これによってこれらのプライマーのプライマー誘導性伸長が生じ、ｅ）約１，０００以下のヌクレオチドの付加後、（ｄ）のプライマーの伸長を終結させ、ｆ）前記伸長されたフォワードおよびリバースプライマーを、第一および第二鋳型から分離し、ｇ）前記伸長されたフォワードおよびリバースプライマーを、第一および第二鋳型と再アニールさせ、これによって、前記伸長されたプライマーが、第一鋳型または第二鋳型のどちらかにアニールし、ｈ）第一および第二鋳型の組換えを含んでなる少なくとも１つの全長伸長産物が生成されるまで工程（ｄ）〜（ｇ）を繰返し、ｉ）（ｈ）の全長伸長産物を発現させて、組換えられたポリペプチドを生成させ、そしてｊ）第一または第二二本鎖核酸鋳型のどちらかから発現されたポリペプチドと比較して改変された特性について、（ｉ）の組換えられたポリペプチドをスクリーニングすることを含んでなる改変された特性を有する組換えられたポリペプチドの生成方法を提供する。
【００２１】
あるいはまた、組換えられたポリペプチドの生成方法は、一本鎖鋳型であって、第一鋳型が二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり、第二鋳型が二本鎖分子のセンス鎖である鋳型を用いることがある。
【００２２】
本発明はさらに、配列番号：１２、１４、１６、１８、２０、２２、および２４において示されている新しいポリペプチドも提供する。
【００２３】
本発明は、次の詳細な説明、および本出願の一部をなす添付配列の説明からさらに十分に理解することができる。
【００２４】
次の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の開示を含んでいる特許出願の必要条件−配列ルール（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に合致し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列リスト要件（ルール５．２および４９．５（ａ−ビス）、および実施細則のセクション２０８および補遺Ｃ）と整合性がある。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに用いられる記号およびフォーマットは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示されているルールに従う。
【００２５】
ロドスポリジウム・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）に由来するＰＡＬおよびＴＡＬ酵素には、それぞれの核酸配列およびアミノ酸配列にしたがって次の配列番号が割当てられている（表１）。
【００２６】
【表１】
2005523690.tif 000002
【００２７】
配列番号：２５〜２８は、それぞれ２０００ＹＦ１、１８−３’、１８−５’、および２０００ＹＲ１９Ｔ７として知られているプライマー配列である。
【００２８】
配列番号：２９および３０は、組換えＤＮＡ産物の生成のために用いられるプライマーＰＡＤＨ３１６Ｆ１およびＴ７Ｔである。
【００２９】
配列番号：３１は、１８−３’ＡＣとして知られているプライマー配列である。
【００３０】
配列番号：３２は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ２５９５５から単離された野生型ＧＤＨを含んでいる１２．１ｋＢ  ＥｃｏＲＩ−ＳａＩＩフラグメントである（エンプタージ（Ｅｍｐｔａｇｅ）ら、国際公開第０１／０１２８３３Ａ２）。野生型ＧＤＨは、ａ−サブユニット（ｂｐ７０４４−８７１１）、β−サブユニット（ｂｐ８７２４−９３０８）、およびγ−サブユニット（ｂｐ９３１１−９７３６）によってコードされる。ＧＤＨのα、β、およびγ−サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３３、配列番号：３４、および配列番号：３５として供給される。
【００３１】
配列番号：３６および３７は、プラスミドｐＧＨ２０からＧＤＨをクローンするために用いられる、それぞれＤＨＡ−Ｆ１およびＤＨＡ−Ｒ１をコードする。
【００３２】
配列番号：３８は、ＧＤＨのα−サブユニット全体およびβ−サブユニットの一部分をクローンするために用いられる、リバースプライマーＤＨＡ−Ｒ２をコードする。
【００３３】
配列番号：３９〜４４は、ＧＤＨのα−サブユニットの領域的（ｒｅｇｉｏｎａｌ）ランダム突然変異生成に用いられる、それぞれプライマーｐＧＤ２０ＲＭ−Ｆ１、ｐＧＤ２０ＲＭ−Ｒ１、ＴＢ４ＢＦ、ＴＢ４ＢＲ、ｐＧＤ２０ＲＭ−Ｆ２、およびｐＧＤ２０ＲＭ−Ｒ２をコードする。
【００３４】
配列番号：４５〜４７は、領域的ランダム突然変異体ライブラリーの調製に用いられる、それぞれ縮重プライマーｐＧＤ２０ＲＭ−Ｆ３、ＴＢ４Ｂ−Ｒ１、およびｐＧＤ２０ＲＭ−Ｒ４をコードする。
【００３５】
配列番号：４８は、融合タンパク質Ｓｍａ３００２のα−およびβ−サブユニット間のリンカーをコードする。配列番号：４９は、融合タンパク質Ｘｂａ３００９のα−およびβ−サブユニット間のリンカーをコードする。
【００３６】
配列番号：５０〜５３は、純粋融合突然変異体１−Ｅ１および２２−Ｇ７を作製するために用いられる、それぞれプライマー１−Ｅ１−Ｆ１、１−Ｅ１−Ｒ１、２２−Ｇ７−Ｆ１、および２２−Ｇ７−Ｒ１をコードする。
【００３７】
配列番号：５４〜５９は、Ｓｍａ３００２由来突然変異体の合成に用いられる、それぞれプライマー８−Ｃ９−Ｆ１、８−Ｃ９−Ｒ１、９−Ｄ７−Ｆ１、９−Ｄ７−Ｒ１、１０−Ｇ６−Ｆ１、および１０−Ｇ６−Ｒ１をコードする。
【００３８】
配列番号：６０〜６２は、飽和突然変異生成ライブラリーを作製するために用いられる、それぞれＴ５３−ＳＭ−ｆｏｒ、Ｌ５０９−ＳＭ−ｆｏｒ、およびＶ２２４−ＳＭ−ｆｏｒとして知られているプライマー配列である。
【００３９】
配列番号：６３〜６６は、組換え促進性伸長方法に用いるための親ＧＤＨ酵素を増幅するために用いられる、それぞれＧＤＨＭ−Ｆ１、ＧＤＨＭ−Ｒ１、ＧＤＨＭ−Ｆ２、およびＧＤＨＭ−Ｒ２として知られている５’および３’フランキングセグメントである。
【００４０】
配列番号：６７は、ＧＤＨのα、β、およびγ−サブユニットおよび１つのサイレント突然変異（ＴＣＡ（ａ−Ｓｅｒ４）〜ＴＣＴ（Ｓｅｒ））を含んでいる、配列番号：３２に由来する２６９３ｂｐフラグメントである。このＧＤＨのα、β、およびγ−サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：６８、配列番号：６９、および配列番号：７０として供給される。
【００４１】
配列番号：６７によってコードされる野生型ＧＤＨに由来する突然変異体酵素には、これらのそれぞれの核酸配列およびアミノ酸配列にしたがって、次の配列番号が割当てられている（表２）。
【００４２】
【表２】
2005523690.tif 000003
【００４３】
【表３】
2005523690.tif 000004
【００４４】
配列番号：１９９は、４ＢＲ−１ライブラリーを作製するために用いられるプライマーＧＤ−Ｃである。
【００４５】
配列番号：２００は、図３に示されているように、突然変異体ＴＡＬ酵素、ＲＭ１２０−１の５’領域である。
【００４６】
配列番号：２０１は、図３に示されているように、突然変異体ＴＡＬ酵素、ＲＭ１２０−１の３’領域である。
【００４７】
配列番号：２０２は、図３に示されているように、突然変異体ＴＡＬ酵素、ＲＭ４９２−１の５’領域である。
【００４８】
配列番号：２０３は、図３に示されているように、突然変異体ＴＡＬ酵素、ＲＭ４９２−１の３’領域である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
本発明は、ポリヌクレオチドの組換え方法について記載する。この方法は、不対フォワードおよびリバースプライマーを利用し、このフォワードプライマーは１つの鋳型の５’末端にアニーリングし、このリバースプライマーは異なる鋳型の３’末端にアニールする。先端部が切取られたプライマー伸長を用いた鋳型のプライマー誘導性増幅の結果、対になった５’および３’末端を有する組換え産物の生成を生じる、これらの全長組換え伸長産物の増幅の結果、親鋳型を欠いているライブラリーを生じる。場合によりこれらの全長組換え伸長産物は、さらに組換えられてもよい。本発明の方法は、組換え分子の広大なプールを作製するために、互いに５０％超の相同性を共有する分子の遺伝子組換えに有用である。ついでこれらの組換え分子は、改変された特性、例えば酵素の場合、安定性（すなわち、プロテアーゼ、溶媒、洗剤、温度、阻害剤に対して）、折畳みまたは構造特性、または活性または特異性の同定のために、選択されるか、またはスクリーニングされてもよい。
【００５０】
省略形および定義
この明細書において、いくつかの用語および省略形が用いられている。次の定義が与えられる。
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと省略される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと省略される。
「フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ」は、ＰＡＬと省略される。
「４−ヒドロキシ桂皮酸」は、ＰＨＣＡと省略される。
「チロシンアンモニア−リアーゼ」は、ＴＡＬと省略される。
「３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド」は、３−ＨＰと省略される。
【００５１】
「ＰＡＬ活性」という用語は、フェニルアラニンの桂皮酸への変換を触媒するタンパク質の能力のことを言う。
【００５２】
「ＴＡＬ活性」という用語は、チロシンのＰＨＣＡへの直接変換を触媒するタンパク質の能力のことを言う。
【００５３】
「ＰＡＬ／ＴＡＬ活性」または「ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素」という用語は、ＰＡＬおよびＴＡＬ活性の両方を含んでいるタンパク質のことを言う。このようなタンパク質は、酵素基質としてチロシンおよびフェニルアラニンの両方に対して少なくともなんらかの特異性を有する。
【００５４】
「突然変異体ＰＡＬ／ＴＡＬ」という用語は、野生型ＰＡＬ酵素に由来したタンパク質のことを言う。突然変異体ＰＡＬ／ＴＡＬは、野生型酵素と比較して改変されたＴＡＬ／ＰＡＬ酵素を有する。「ＴＡＬ／ＰＡＬ比」という用語は、ＴＡＬおよびＰＡＬ活性の迅速な比較を可能にし、かつ酵素の基質特異性を示す計算のことを言う。この比は、全細胞中のＴＡＬおよびＰＡＬ活性の別々の測定にしたがって決定される。この比は、改変されたＰＡＬまたはＴＡＬ活性（野生型活性に対して）を有する遺伝子の迅速な評価を容易にし、基質特異性における変化を監視することを可能にする。
【００５５】
「ＧＤＨ」という用語は特定的に、肺炎桿菌ＡＴＣＣ２５９５５から単離され、かつ配列番号：３２のｂｐ７０４４−８７１１、ｂｐ８７２４−９３０８、およびｂｐ９３１１−９７３６によってコードされたＢ１２−依存性グリセロールデヒドラターゼ、または配列番号：６７によってコードされたこれの誘導体のことを言う。「ＧＤＨ」という用語は、α、β、およびγ−サブユニットの集合錯体のことを言うために用いられ、アポ酵素またはホロ酵素のことを言うこともある。ＧＤＨの個々のサブユニットへの言及は、このサブユニット、例えば「ＧＤＨのα−サブユニット」または「ＧＤＨ  α−サブユニット」を特定する。同様にＧＤＨのアミノ酸配列にも言及されることがあり、集合的にα−、およびβ−、およびγ−サブユニットのことを言うか、またはＧＤＨの個々のサブユニットのことを言う。ＧＤＨのα、β、およびγ−サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３３、配列番号：３４、および配列番号：３５、および配列番号：６８、配列番号：６９、および配列番号：７０として提供される。この発明の開示のためには、野生型ＧＤＨ（配列番号：６７によってコードされる）は、改変された（突然変異体）誘導体と比較した、ＤＮＡおよびアミノ酸配列についての対照として用いられる。ＧＤＨはまた、野生型反応速度についての対照としても用いられ、この速度に対して、本発明の使用によって作製された、改変された誘導体の反応速度が測定される。
【００５６】
「突然変異体ＧＤＨ」という用語は、突然変異プロセスによって発生させられたＧＤＨ酵素またはＧＤＨ配列を含んでいる細菌クローン、プラスミド、ライブラリー、またはベクターのことを言う。あるいはまた、突然変異体という用語は直接、突然変異プロセスによって発生させられたＧＤＨ酵素、ＧＤＨアミノ酸配列、またはＧＤＨ  ＤＮＡ配列のことを言う。したがって突然変異体ＧＤＨは、（野生型）ＧＤＨとは異なる。
【００５７】
「改良された反応速度」という用語は、野生型酵素に対して、グリセロールおよび／または１，３−プロパンジオールの存在下におけるデヒドラターゼの不活性化の低下した速度のことを言う。したがって改良反応速度とは、グリセロールおよび／または１，３−プロパンジオールの存在下における増加した総酵素代謝回転数に関する。これは、ｋｃａｔの増加、および／または酵素不活性化率の低下のどちらかによって達成することができる。
【００５８】
「触媒効率」という用語は、酵素のｋｃａｔ／ＫＭとして規定される。「触媒効率」は、基質に対する酵素の特異性を定量化するために用いられる。
【００５９】
「ｋｃａｔ」および「ＫＭ」は当業者に知られており、「酵素の構造およびメカニズム（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）」、第二版、（ファースト（Ｆｅｒｓｔ）；Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）、ニューヨーク、１９８５年、９８〜１２０ページ）に記載されている。「ｋｃａｔ」という用語は、「代謝回転数」と呼ばれることが多く、１単位時間につき１活性部位あたり産物に変換される基質分子の最大数、または酵素が１単位時間あたり代謝回転する回数として規定される。ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［Ｅ］（式中、［Ｅ］は酵素濃度である）（ファースト、上記）。「総代謝回転」および「総代謝回転数」という用語は、本明細書において、反応開始（Ｔ０）とホロ酵素の完全な不活性化が発生した時間との間の時間に、Ｂ１２−依存性デヒドラターゼホロ酵素とグリセロール（および場合により１，３−プロパンジオールの存在下）との反応によって形成された産物の量のことを言うために用いられる。
【００６０】
「Ｔ１」という用語は、１０ｍＭグリセロールおよび５０ｍＭ１，３−プロパンジオールの存在下における反応開始の３０秒後にＧＤＨ酵素反応によって生産された産物の量のことを言う。Ｔ１はｋｃａｔに比例する。
【００６１】
「Ｔ２」という用語は、１０ｍＭグリセロールおよび５０ｍＭ１，３−プロパンジオールの存在下における反応開始の４０分後に測定されたＧＤＨ酵素反応によって生産された産物の量のことを言う。Ｔ２はｋｃａｔ／Ｋｉｎａｃｔ  ｏｂｓｄに比例し、これは酵素の総代謝回転数を反映する。
【００６２】
「Ｔ２／Ｔ１比」という用語は、Ｔ２対Ｔ１比のことを言う。Ｔ２／Ｔ１比は、１／ｋｉｎａｃｔ  ｏｂｓｄに比例する。
【００６３】
「Ｔ（６００）」という用語は、１０ｍＭグリセロールおよび６００ｍＭ１，３−プロパンジオールの存在下における反応開始の７０分後に測定されたＧＤＨ酵素反応によって生産された産物の量のことを言う。Ｔ（６００）はｋｃａｔ／ｋｉｎａｃｔ  ｏｂｓｄに比例する。
【００６４】
「宿主細胞」および「宿主生物」という用語は、外来遺伝子または異種遺伝子を受入れ、これらの遺伝子を発現して、活性遺伝子産物を生産しうる微生物のことを言う。
【００６５】
本明細書において用いられている「単離された核酸フラグメント」は、場合により合成、非天然、または改変ヌクレオチド塩基を含んでいる、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントから構成されていてもよい。
【００６６】
「タンパク質」または「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、互換的に用いられ、規定された機能を有する隣接アミノ酸の配列のことを言う。「野生型タンパク質」とは、非改変形態で自然界から単離されたタンパク質のことを言う。「突然変異体タンパク質」とは、アミノ酸配列において改変を有する野生型タンパク質のことを言う。
【００６７】
「組換え」という用語は、交差または独立組合わせのプロセスによって、親鋳型分子中に存在しなかった遺伝的組合わせが形成されるプロセスのことを言う。したがって組換えは、親鋳型分子から得ることができる（これによって、新たに発生した「組換え促進性産物」が、その特定のヌクレオチド位置において親鋳型のどれに由来してもよい）遺伝子配列のすべての組合わせを包含する。さらには組換えは、新しい突然変異の導入（すなわち、欠失、置換、挿入）を包含する。
【００６８】
「組換えられたポリペプチド」という用語は、本発明の組換え遺伝子、ＤＮＡ、またはＲＮＡによってコードされたポリペプチドを意味する。組換えられたポリペプチドは、改変または増強した特性を有することが多い。
【００６９】
ポリペプチドまたはタンパク質に適用される場合の「改変された特性」という用語は、アッセイ方法によって測定することができる、ヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質と関連する特徴のことを言う。この場合、この特徴は、自然の配列と関連した特徴と比較して増強されているか、または減少しているかのどちらかである。改変することができる酵素の好ましい特性の例には、酵素活性、基質特異性、阻害剤に対する安定性、熱安定性、プロテアーゼ安定性、溶媒安定性、洗剤安定性、および折たたみ特性が含まれる。「増強された生物特性」とは、自然の配列と関連したものよりも大きい、改変された特性のことを言う。「減少した生物特性」とは、自然の配列と関連したものよりも小さい改変された特性である。
【００７０】
「分子マーカー」という用語は、核酸分子の組換えに迅速にアクセスするために用いることができる核酸分子における特異的突然変異のことを言う。この決定は、核酸分子の配列決定によって、および周りのヌクレオチド配列に関する「分子マーカー」の存在または不存在を評価することによって実施される。
【００７１】
「鋳型」または「親鋳型」という用語は、ワトソン・クリック塩基対合ルールにしたがい、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによってコピーされて、ＤＮＡまたはＲＮＡの新しい鎖を生成する核酸モデルのことを言う。この鋳型（または「モデル」）における配列情報は保持されるが、その理由は、この鋳型分子から生成された第一コピーが、相補配列を有するからである。鋳型分子は、一本鎖または二本鎖であってもよく、どんな源に由来してもよい。二本鎖鋳型は一般的にポリペプチドをコードし、センス鎖およびアンチセンス鎖から構成される。一本鎖鋳型は一般的に二本鎖分子から発生させられ、この場合、１つの鋳型は１つの分子のセンス鎖であり、他方の鋳型は、別の分子のアンチセンス鎖である。
【００７２】
「対立遺伝子バリアント」は、本明細書において、これらの鋳型が一対の相同遺伝子のメンバーである鋳型の１つの型として規定される。
【００７３】
「複製」は、「鋳型」核酸の核酸鎖の相補コピーが、ポリメラーゼ酵素によって合成されるプロセスである。「プライマー誘導性」複製において、このプロセスは、複製開始のために「二重らせん」「オリゴヌクレオチド」の末端ヌクレオチドの（デオキシ）リボーゼ部分の３’位におけるヒドロキシル基（ＯＨ）を必要とする。
【００７４】
核酸の「３’領域」とは、末端ヌクレオシドが、リボーゼまたはデオキシリボーゼのその５’炭素によって、先行ヌクレオチドのリン基に接着されている末端である。核酸の「５’領域」とは、末端ヌクレオシドが、リボーゼまたはデオキシリボーゼのその３’炭素によって、先行ヌクレオチドのリン基に接着されている末端である。これらの領域はともに、組換えが発生するのが望ましいヌクレオチドの領域をフランキングし、これらの領域は、鋳型分子の中にあってもよく、または鋳型分子に接着しているフランキングＤＮＡ配列の中にあってもよい。不対プライマーは、これらの５’および３’領域の一部分にアニールする。
【００７５】
「フランキング配列」または「フランキングＤＮＡフラグメント」とは、不対プライマーがアニールすることができるユニークなヌクレオチド配列（鋳型分子に対して）を供給するために鋳型分子の５’または３’領域のどちらかに接着しているＤＮＡの短いセグメントのことを言う。このＤＮＡフランキング配列は場合により、ユニーク制限酵素部位を含んでいてもよい。
【００７６】
「全長伸長産物」とは、親鋳型の５’領域と３’領域間に含まれているものと非常に類似した長さ（約１００塩基内）を有するプライマー誘導性複製によって生成されたヌクレオチド配列である。
【００７７】
「増幅」とは、複製が循環的に反復され、したがって「鋳型」核酸のコピー数が、直線的または対数的に増加するプロセスである。
【００７８】
「プライマー」という用語は、相補鎖の合成がポリメラーゼによって触媒される条件下に置かれた時に、鋳型分子の相補鎖に沿った核酸合成または複製の開始点として作用しうるオリゴヌクレオチド（合成または自然発生）のことを言う。このプライマーは、プライマーそれ自体と、核酸の相補鎖との間の配列相補性に基づいて、相補鎖にアニールする能力を有していなければならない。しかしながら塩基におけるいくつかのミスマッチは許容される。プライマーサイズ、塩基配列、相補性、および標的相互作用の必要条件は、以下でより詳細に考察される。「プライマー」という用語はそれ自体では一般に、本明細書において出願人によって、核酸複製プロセスを開始させる機能を果たす（すなわち、プライミング合成によって）あらゆる配列結合オリゴヌクレオチドを包含するために用いられている。
【００７９】
「フォワードプライマー」という用語は、鋳型分子のセンス鎖上の５’領域と同一の配列を有し、その同じ鋳型分子のアンチセンス鎖上の３’領域にアニールするプライマーのことを言う。この鋳型分子は、二本鎖または一本鎖分子であってもよい。この鋳型が一本鎖である場合、３’末端におけるプライミングを可能にするのは、アンチセンス配向においてである。さらにはフォワードプライマーは、プライマー誘導性伸長の開始に適していなければならない。
【００８０】
「リバースプライマー」という用語は、鋳型分子のアンチセンス鎖上の５’領域と同一の配列を有し、同じ鋳型分子のセンス鎖上の３’領域にアニールするプライマーのことを言う。この鋳型分子は、二本鎖または一本鎖分子であってもよい。この鋳型が一本鎖である場合、３’末端におけるプライミングを可能にするのはセンス配向においてである。さらにはリバースプライマーは、プライマー誘導性伸長の開始に適していなければならない。
【００８１】
「対になったプライマー」という用語は、フォワードおよびリバースプライマーからなる一対のプライマーのことを言う。これらは、単一鋳型分子にアニールするように設計され、プライマー誘導性核酸増幅プロセスによってその鋳型の正確なコピーの合成を可能にする。二本鎖鋳型分子の場合、フォワードおよびリバースプライマーは、二本鎖鋳型の正確なコピーの合成を可能にするが、その理由は、フォワードプライマーが、アンチセンス鎖の正確なコピー（すなわち、これが鋳型として利用しているセンス鎖の相補コピー）を生成し、リバースプライマーが、センス鎖の正確なコピー（すなわち、これが鋳型として利用しているアンチセンス鎖の相補コピー）を生成するからである。これに対して、鋳型分子が一本鎖である時、この鋳型の正確なコピーは、プライマー誘導性核酸増幅プロセスを用いて生成される。
【００８２】
「不対プライマー」という用語は、フォワードおよびリバースプライマーからなる一対のプライマーのことを言う。これらは、単一鋳型分子にアニールするように設計されておらず、プライマー誘導性核酸増幅プロセスによってこの鋳型の正確なコピーの合成を可能にする。その代わりフォワードプライマーは、第一鋳型分子にアニールするが、第二鋳型分子にアニールすることはできない。リバースプライマーは、第一鋳型分子とは配列が異なる第二鋳型分子にアニールするが、第一鋳型分子にアニールすることはできない。不対プライマーのこのユニークな設計によって、組換えが鋳型スイッチングを介した複製中に発生するのでなければ、確実に一本鎖または二本鎖鋳型分子がプライマー誘導性核酸増幅プロセスによって増幅されえないようにする。
【００８３】
「不対プライマーを用いた組換え促進性伸長方法」および「不対プライマー方法」という用語は、組換え促進性産物が、不対プライマーに基づく方法を用いて鋳型分子から生産される、本発明に開示された方法のことを言うために互換的に用いられる。
【００８４】
「プライマー誘導性伸長」という用語は、プライマーが、核酸分子の直線的または対数的増幅における核酸配列の複製を支援するために用いられている、当業界において知られているあらゆる方法のことを言う。出願人は、プライマー誘導性伸長が、当業界において知られているいくつかの図式のどれによって達成されてもよいと考える。この図式には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００８５】
「複製組成物」という用語は、核酸複製を実施するのに必要な成分を含んでなる組成物のことを言い、これには、ヌクレオチドトリホスフェート、二価イオン、反応緩衝液、およびプライマー誘導性複製の場合、適切な配列を有する少なくとも１つのプライマー、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、およびその他の必要なタンパク質が含まれる。
【００８６】
「ニッキング」という用語は、二本鎖分子の鎖「Ａ」のバックボーンにおけるホスホ−ジエステル結合が破壊され、一方、鎖「Ｂ」のバックボーンにおける対応ホスホ−ジエステル結合が無傷のままであるプロセスのことを言う。したがってこの分子は、２つの別個のフラグメント分子に分裂（ｃｌｅａｖｅ）されない。ＤＮＡ分子をニッキングするのに適した典型的な酵素の例は、デオキシリボヌクレアーゼＩである。
【００８７】
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下に、他方の核酸分子にアニールすることができる時、別の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡへ「ハイブリダイズ可能である」。ハイブリダイゼーションはよく知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９年）（本明細書に完全に援用される）に例示されている。
【００８８】
「アニール」という用語は、水素結合を介して二本鎖ポリヌクレオチドを形成するための相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の対合のことを言う。本明細書の目的のためには、「アニール」とは、プライマーが鋳型分子に結合するプロセスのことを言う。しかしながらこの用語法は、プライマーと鋳型との間の１００％相補性を必要としない。その理由は、いくつかのミスマッチが許容されるからである。
【００８９】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズしうるヌクレオチド塩基間の関係を記載するために用いられる。例えばＤＮＡに関して、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。したがって本発明は、添付配列リストに報告されている完全配列と相補的である、単離された核酸フラグメント、ならびに実質的に類似の核酸配列を包含する。
【００９０】
当業界において知られている「パーセント同一性」という用語は、２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列または２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の、これらの配列を比較することによって決定された関係である。当業界において「同一性」とはまた、場合に応じて、このような配列のストリング間のマッチによって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、既知の方法によって容易に計算することができる。これらの方法には、次のものに記載されている方法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、１）「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、（レスク（Ｌｅｓｋ），Ａ．Ｍ．編）、オックスフォード大学（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）：ニューヨーク（１９８８年）；２）「生物計算：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、（スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｄ．Ｗ．編）、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）：ニューヨーク（１９９３年）；３）「配列データのコンピュータ分析、パート１（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １）」、（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ａ．Ｍ．およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ｈ．Ｇ．編）、ヒューマナ（Ｈｕｍａｎａ）：ニュージャージー（１９９４年）；４）「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、（フォン・ハインジェ（Ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ），Ｇ．編）、アカデミック（１９８７年）；および５）「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」、（グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ），Ｍ．およびドブルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ），Ｊ．編）、ストックトン（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ）；ニューヨーク（１９９１年）である。同一性を決定するのに好ましい方法は、テストされた配列間の最長のマッチを与えるように設計されている。同一性および類似性を決定するための方法は、一般に入手しうるコンピュータプログラムにおいて体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するのに好ましいコンピュータプログラム方法には、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、本発明に用いられているＧＣＧプログラムパッケージに見られるＧＣＧパイルアッププログラムであって、ギャップ作製ペナルティー＝１２およびギャップ伸長ペナルティー＝４の標準的なデフォルト値でのニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズムを用いるプログラム（ドブルーら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１２：３８７〜３９５ページ（１９８４年））；およびブラスト（ＢＬＡＳＴ）Ｐ、ブラストＮ、およびファスト（ＦＡＳＴ）Ａ（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：２４４４〜２４４８（１９９８年）である。ブラストＸプログラムは、ＮＣＢＩおよびその他の供給源から一般的に入手し��る（「ブラストマニュアル（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ）」、アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎａｔｌ．Ｃｅｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｉｎｆ．、Ｎａｔｌ．Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｍｅｄ．（ＮＣＢＩ  ＮＬＭ）ＮＩＨ、メリーランド州ベセズダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）；アルトシュールら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０ページ（１９９０年））。パーセント同一性を決定するためのもう１つの好ましい方法は、ジョタン−ヘイン（Ｊｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎ）アルゴリズムを用いるＤＮＡスター（ＤＮＡＳＴＡＲ）タンパク質アラインメントプロトコルの方法による（ヘイン（Ｈｅｉｎ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３：６２６〜６４５ページ（１９９０年））。アラインメントのジョタン−ヘイン方法のためのデフォルトパラメーターは、１）多重アラインメントの場合、ギャップペナルティー＝１１、ギャップ長さペナルティー＝３；および２）ペア毎のアラインメントの場合、ｋｔｕｐｌｅ＝６である。
【００９１】
例えば対照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、対照配列におけるヌクレオチドの５％までが欠失されるか、または別のヌクレオチドで置換されてもよく、または対照配列中の総ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド数が、対照配列中に挿入されてもよい。対照配列のこれらの突然変異は、対照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置に、または対照配列中のヌクレオチドの中に個別に、または対照配列内の１つもしくはそれ以上の隣接基中に散在するこれらの末端位置間のどこで発生してもよい。
【００９２】
「コドン縮重」とは、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列をもたらさずにヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする遺伝子コードにおける性質のことを言う。当業者は、ある一定のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用における特異的宿主細胞によって示された「コドン−バイアス」をよく知っている。したがって宿主細胞中の改良された発現のための遺伝子を合成する時、コドン使用のその頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように遺伝子を設計することが望ましい。
【００９３】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的化学構造単位のことを言う。次の省略形が、特定のアミノ酸を識別するために本明細書において用いられる。
【００９４】
【表４】
2005523690.tif 000005
【００９５】
多くのアミノ酸が、ある一定のタンパク質においてそのタンパク質の化学的または機能的性質を改変せずに別のアミノ酸の代わりになりうることはよく知られている。例えば、ある一定の部位において化学的に同等のアミノ酸の生産を結果として生じるが、このコードされたタンパク質の機能的性質に影響を与えない遺伝子の改変が普通であることは、当業界においてよく知られている。本発明の目的のために、置換は、次の５つの群のうちの１つの中での交換として規定される：
１．小さい脂肪族、非極性、またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．極性負荷電残基およびこれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性正荷電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．大きい脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；および
５．大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００９６】
したがってアラニン、すなわち疎水性アミノ酸は、これよりも疎水性でない別の残基（例えばグリシン）、またはより疎水性の残基（例えばバリン、ロイシン、またはイソロイシン）によって置換されてもよい。同様に、１つの負荷電残基の別のものとの置換（例えばグルタミン酸の代わりのアスパラギン酸）、または１つの正荷電残基の別のものとの置換（例えばアルギニンの代わりのリシン）を結果として生じる変化も、機能的に同等の産物を生産すると予想することができる。さらには多くの場合、タンパク質分子のＮ−末端およびＣ−末端部分の改変は、同様にタンパク質の活性を改変するとは予想されないであろう。
【００９７】
「遺伝子」とは、コーディング配列に先立つ（５’非コーディング配列）およびこれの後に続く（３’非コーディング配列）調節配列を含んでいる特異的タンパク質を発現する核酸フラグメントのことを言う。「天然の遺伝子」または「野生型遺伝子」とは、それ自身の調節配列を有する、自然に見出されるままの遺伝子のことを言う。「キメラ遺伝子」とは、天然の遺伝子ではないあらゆる遺伝子のことを言う。これは、自然に一緒には発見されない調節配列およびコーディング配列を含んでなるか、または２つもしくはそれ以上の関連遺伝子の組換えによって作製された「非天然の」遺伝子を含んでなる。したがってキメラ遺伝子は、異なる源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ源に由来するが、自然に見出されるものとは異なる方法で配置されている調節配列およびコーディング配列を含んでなることがある。「内生遺伝子」とは、生物のゲノムのその天然の位置にある天然の遺伝子のことを言う。「外来性」遺伝子とは、宿主生物には通常発見されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子のことを言う。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることがある。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。
【００９８】
「合成遺伝子」は、当業者に知られている手順を用いて化学的に合成されたオリゴヌクレオチドビルディングブロックから組み立てることができる。これらのビルディングブロックは、連結反応させられ、アニールされ、遺伝子セグメントを形成し、これらはついで酵素的に組み立てられて、遺伝子全体を構成する。ＤＮＡ配列に関連した「化学的に合成された」とは、構成成分ヌクレオチドが、試験管内で組み立てられたことを意味する。ＤＮＡの手動的化学合成は、十分に確立された手順を用いて実施されてもよく、または自動化学合成は、いくつかの商品として入手しうる機械の１つを用いて実施することができる。したがってこれらの遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映させるためのヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のためにテーラーメードすることができる。当業者は、コドン使用が宿主によって好まれた（ｆａｖｏｒｅｄ）これらのコドンの方にバイアスされているならば、遺伝子発現の成功の可能性を認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手しうる場合、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づいて行なうことができる。
【００９９】
「コーディング配列」とは、特異的アミノ酸配列についてコーディングするＤＮＡ配列のことを言う。「適切な調節配列」とは、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、その中、または下流（３’非コーディング配列）に位置し、かつ転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コーディング配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列のことを言う。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでいてもよい。
【０１００】
「プロモーター」とは、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御しうるＤＮＡ配列のことを言う。一般にコーディング配列は、プロモーター配列に対して３’位に位置する。プロモーターは、全体が天然の遺伝子に由来してもよく、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されていてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなることさえある。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、または発達の様々な段階において、または異なる環境または生理条件に応じて、遺伝子の発現を指図しうることは当業者によって理解されている。大部分の時に大部分の細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは通常、「構成的プロモーター」と呼ばれる。さらには、大部分の場合、調節配列の正確な境界は完全に画定されているわけではないので、異なる長さのＤＮＡフラグメントは、同一のプロモーター活性を有しうると認められる。
【０１０１】
「３’非コーディング配列」とは、コーディング配列の下流に位置するＤＮＡ配列のことを言い、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えうる調節シグナルをコードするほかの配列を包含する。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ先駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクト（ｔｒａｃｔ）の付加に影響を与えることを特徴とする。
【０１０２】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ−触媒転写の結果生じる産物のことを言う。ＲＮＡ転写物が、ＤＮＡ配列の完全な相補コピーである時、これは第一転写物と呼ばれ、またはこれは第一転写物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを伴なわず、細胞によってタンパク質に翻訳されうるＲＮＡのことを言う。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補的であり、かつこれに由来する二本鎖ＤＮＡのことを言う。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、したがって細胞によってタンパク質に翻訳されうるＲＮＡ転写物のことを言う。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的第一転写物またはｍＲＮＡのすべてまたは一部と相補的であり、かつ標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写物のことを言う（米国特許第５，１０７，０６５号；国際公開第９９２８５０８）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特異的遺伝子転写物のあらゆる部分との相補性であってもよい。すなわち、５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、またはそのコーディング配列においてである。「機能的ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されないが、細胞プロセスに対して効果を有するほかのＲＮＡのことを言う。
【０１０３】
「操作可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一核酸フラグメント上の核酸配列の組合わせを言う。例えばプロモーターは、そのコーディング配列の発現に影響を与えうる時に、コーディング配列と操作可能に連結されている（すなわち、このコーディング配列は、プロモーターの転写制御下にある）。コーディング配列は、センスまたはアンチセンス配向において調節配列に操作可能に連結されうる。
【０１０４】
本発明において用いられている「発現」という用語は、本発明の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な累積のことを言う。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳のことを言うこともある。
【０１０５】
「形質転換」とは、核酸フラグメントの宿主生物のゲノム中への移動であって、結果として遺伝子的に安定な遺伝を生じるものを言う。形質転換された核酸フラグメントを含んでいる宿主生物は、「形質転換」生物または「組換え」生物または「形質転換された」生物と呼ばれる。
【０１０６】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある、遺伝子を運ぶことが多い染色体外要素のことを言う。このような要素は、あらゆる源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、線状または環状の自己複製配列、ゲノム組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよい。この場合、いくつかのヌクレオチド配列が接合または組換えられてユニークな構成になり、この構成は、適切な３’非翻訳配列とともに選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を細胞中に導入しうる。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、かつ外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特異的ベクターのことを言う。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、かつ外来遺伝子に加えて、外来宿主におけるその遺伝子の増強した発現を許容する要素を有する特異的ベクターのことを言う。
【０１０７】
「配列分析ソフトウエア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウエアのことを言う。「配列分析ソフトウエア」は、商品として入手することができ、または独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウエアには、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない：１）ＧＣＧプログラム一式（ウイスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）・パッケージバージョン９．０、ウイスコンシン州マジソンのジェネティックス・コンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ）（ＧＣＧ））；２）ブラストＰ、ブラストＮ，ブラストＸ（アルトシュールら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０ページ（１９９０年））；および３）ＤＮＡスター（ウイスコンシン州マジソンのＤＮＡスター（ＤＮＡＳＴＡＲ）社）。この出願の文脈内で、配列分析ソフトウエアが分析のために用いられ、この分析の結果は、ほかに特定されていなければ、参照されたプログラムの「デフォルト値」に基づいていると理解される。本明細書において用いられている「デフォルト値」は、最初に初期化された時にそのソフトウエアとともに最初から搭載されているあらゆるセットの値またはパラメーターを意味する。
【０１０８】
本発明に用いられている標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当業界においてよく知られており、次の文献に記載されている。すなわち、サムブルック，Ｊ、フリッチュ，Ｅ．Ｆ．およびマニアティス，Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル」、第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー：ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８９年）（以下「マニアティス」）；シルヘイビー（Ｓｉｌｈａｖｙ），Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ），Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ），Ｌ．Ｗ．、「遺伝子融合を用いた実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー：ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８４年）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、「分子生物学における現行のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．）、およびワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８７年）出版である。
【０１０９】
不対プライマーを用いた組換え促進性伸長方法の原理
図１は、２つの遺伝子の組換えに基づいた不対プライマーを用いる組換え促進性伸長方法の原理を例証している。この方法では、親遺伝子が、これらの５’および３’末端に異なるＤＮＡ配列を有する必要がある。親遺伝子が同じ５’および３’配列を有する場合は、短いフランキングＤＮＡフラグメントが、標準ＰＣＲによってこれらの遺伝子の５’または３’末端に付着されなければならない（図１の工程Ａに示されているように）。
【０１１０】
ついでこれらのＰＣＲ産物は、熱循環のための２つの不対プライマーの設計の後に、組換え促進性伸長方法の鋳型として用いることができる。プライマー−１は、鋳型−１の５’末端（アンチセンス鎖の３’領域）とアニールするが、鋳型−２の５’末端とは結合しない。プライマー−２は、鋳型−２の３’末端（センス鎖の３’領域）とアニールするが、鋳型−１の３’末端とは結合しない（工程Ｂ）。このことによって確実に、親鋳型のどちらも、熱循環反応によって増幅することはできなくなる。
【０１１１】
短いアニーリングおよび合成サイクルが実施され、これによって一連の短いＤＮＡフラグメントが作製される（工程Ｃ）。十分な相同性をもって、これらのＤＮＡフラグメントのいくつかは、その後のアニーリングサイクル（工程Ｄ）において異なる鋳型にアニールする（すなわち「鋳型スイッチング」）。その後、組換えＤＮＡフラグメントは、図１に示されているように作製される。場合によっては鋳型−１の５’末端、および鋳型−２の３’末端を有する組換えＤＮＡ遺伝子が作製される（工程Ｅ）。
【０１１２】
この時点で、以前は不対のプライマー−１およびプライマー−２は、新たに作製された組換え遺伝子のための、対になったプライマーになる。さらにアニーリングおよび合成サイクルは、鋳型−１の５’末端、および鋳型−２の３’末端を有する組換えＤＮＡ遺伝子のプールを増幅する（図１の工程Ｆ）。増幅工程の間、組換えＤＮＡ遺伝子はさらに組換えられてもよく、このことは、組換えＤＮＡ遺伝子の交差数を増加させる。理論的には、増幅産物のすべてが組換えＤＮＡ産物であるべきである。これらの組換え産物は、親鋳型分子から直接由来してもよく、または追加の突然変異（例えば挿入、欠失、置換）が、最終組換え促進性産物中に組込まれてもよい。最終反応混合物における親鋳型のコンタミネーションは、無視しうる。
【０１１３】
遺伝子アセンブリー（および必要であれば二本鎖形態への変換）に続いて、組換えられた遺伝子は、発現遺伝子産物のスクリーニングに適用されるあらゆる方法に先立って、場合により増幅されてもよいであろうことは、当業者によって理解されるであろう。さらには、第二反応における鋳型分子として第一反応の組換え促進性産物を用いて（以下同様）、本発明の不対プライマー方法が反復されうるであろうことは、当業者には明らかであろう。このようにして、このプロセスによってこのように生じた「分子進化」が、組換え促進性産物の大きいプールを生じ、これから所望の機能性を有する新規酵素が単離されうると予想されるであろう。
【０１１４】
本発明のそのほかの実施態様において：１）プライマー−１およびプライマー−２は同一配列を有していてもよい；２）ユニーク制限酵素部位は、フランキングＤＮＡ配列中に組込むことができ、このことによって確実に、最終組換え促進性突然変異体ライブラリーは、すべての親鋳型がなくなることになる；３）組換え促進性伸長の前に鋳型分子の酵素的ニッキングを、組換え促進性効率を増すために用いることができる。
【０１１５】
ＤＮＡ鋳型
本発明は、組換えのために少なくとも２つの核酸鋳型を必要とする。ただし、多くの核酸鋳型のプールが好ましい。これらの鋳型分子源は決定的なものではなく、したがって微生物源（例えば細菌、酵母、菌類、または藻類）を包含するあらゆる源に由来する、ならびに植物、動物、または人的源に由来する核酸を含んでいてもよく、医学的、獣医学的、環境的、栄養学的、または工業的有意性を有しうる。さらにはこれらの鋳型分子は、合成的に生成することもできる。これらの核酸は、一本鎖、または二本鎖であってもよく、したがってｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡを含んでなる。いくつかの以前のＤＮＡシャフリング方法は、鋳型として二本鎖分子のみを用いることによって制限されている。鋳型が一本鎖である場合、これは一般に、二本鎖分子から得られ、この鎖は、センスまたはアンチセンス配向のどちらかであろう。
【０１１６】
本発明の好ましい実施態様によって、点突然変異または対立遺伝子バリアントを含んでいる遺伝子間の組換えが可能になる。しかしながら鋳型分子間のパーセント同一性は、少なくとも５０％の少なさであってもよく、この場合、少なくとも７０％のパーセント同一性が好ましく、少なくとも９０％のパーセント同一性が最も好ましい。鋳型分子が、これらの５’または３’末端のどちらかに相同性を含むという必要条件はない。その理由は、本発明の方法では、不対プライマーを用いるからである。この方法は、配列情報が入手できない遺伝子を組換えるために特に有用である。その理由は、適切である機能性５’および３’増幅プライマーを改変することができるからである。
【０１１７】
不対プライマー反応は、鋳型分子の長さとは無関係である。したがって鋳型分子は、核酸伸長のためのポリメラーゼに固有の制限以上に、長さが制限されていると予想されない。これに対して鋳型分子は、約３０ヌクレオチドよりも短くない方がよい。この小さいサイズによって、この方法のペプチドエンジニアリングへの適用が可能になる。したがって本発明は、約０．０３〜２０ｋＢ；より好ましくは約０．１〜１０ｋＢ；最も好ましくは約０．２〜５ｋＢのサイズ範囲の鋳型分子の組換えに適切であると考えられる。
【０１１８】
本発明の鋳型分子は、線状または環状、またはこれらの組み合わせであってもよく、特異的核酸フラグメントは、ＤＮＡのフランキング領域から単離されてもよく（例えば単離された遺伝子配列）、または特異的核酸フラグメントは、ほかのヌクレオチド配列によってフランキングされてもよい（例えばベクター中にクローンされた遺伝子またはオペロン）。
【０１１９】
本発明のもう１つの実施態様において、鋳型分子は酵素でニックされてもよい。二本鎖鋳型のニッキングの結果、分子の１つの鎖の破断を生じ、この場合、相補鎖は無傷のままである。この分子がＲＮＡである場合、リボヌクレアーゼ酵素がニッキングに適している。この分子がＤＮＡである場合、デオキシリボヌクレアーゼ、ＤＮＡジャイレースおよびｒｅｃＡが、ニッキングに適した酵素である。鋳型ニッキングは、十分なニッキング部位を鋳型分子中に導入し（鋳型フラグメンテーションを生じることなく）、これによって不対プライマー方法によって生成された突然変異体に観察される組換え効率を増加させる（未処理鋳型を用いて作製された突然変異体に対して）。
【０１２０】
鋳型へのフランキングＤＮＡ配列の付着
５’末端または３’末端において有意な相同性を有する鋳型分子の場合、鋳型分子は、短いＤＮＡフラグメントの形態にある短い特異的非天然５’または３’配列を含むように改変することができ、したがって第一核酸鋳型の５’領域は、第二鋳型の５’領域とは異なる配列を有し、第一核酸鋳型の３’領域は、第二鋳型の３’領域とは異なる配列を有する（図１に示されているように）。このフランキングＤＮＡ配列は、鋳型分子中に配列ベースを有していないことが好ましい。換言すれば、フランキングＤＮＡ配列は、熱循環反応の間、鋳型分子にアニールすることができない。フランキングＤＮＡ配列は、標準的ＰＣＲを用いて発生させることができる。当業界においてよく知られているように、標的中に補体を有していない５’末端に配列を含んでいる、対になったプライマーを合成することができる（５’オーバーハングまたは５’ミスマッチ）。この５’オーバーハングまたは５’ミスマッチは、エキストラ配列、例えばフランキングＤＮＡ配列を加えることによって、複製された核酸産物の長さを延長するために用いることができる。
【０１２１】
５’領域をベースとした１つの鋳型分子と、３’領域をベースとした第二鋳型分子とを区別することが可能になったら、その場合には、フォワードおよびリバース不対プライマーセット（下記の要件に合致するもの）が、これらのフランキング配列に特異的にアニーリングするように設計することができる。
【０１２２】
これらの５’または３’フランキング領域の特別な長さまたは配列のどちらも本発明には決定的ではないことに注目することが重要である。しかしながらこれらのフランキング領域の設計は、このフラグメントが十分な長さを有していなければならず、鋳型の単一領域にアニールするユニークプライマーの設計のために（鋳型分子に対して）十分なヌクレオチド配列のユニークさを有する必要がある。これらの要件によって、いくらかの可変性が可能になる。一般的には、短い５’または３’フランキングＤＮＡ領域は、長さが約６〜２００塩基であり、約１０〜１００塩基が好ましい。より長い非天然配列は、ほとんど利点を提供せず、合成されなければならない組換え促進性分子の最終サイズを増加させる。
【０１２３】
これらのフランキングＤＮＡ領域の特異的配列に関して、２つの同様なフランキングＤＮＡフラグメント（これらの内部「中間」配列によってのみ識別される）を２つの鋳型の５’末端に付着させることが可能である。フォワードプライマー（プライマー−１）は、鋳型−１に付着されているフランキングＤＮＡ配列の内部「中間」配列にアニールするように設計されうるであろう。鋳型−２に付着されるフランキングＤＮＡ配列の中間配列が異なるので、プライマー−１は、鋳型−２にアニールすることはできない。同様な状況を、鋳型−１および鋳型−２の３’末端に対して発生させることができるであろう。したがってこの例において、フランキングＤＮＡフラグメントにおける配列類似性にもかかわらず、不対プライマーを作製することは依然として可能である。上記の考察の後で、２つの鋳型分子の５’および３’末端は、同一または異なっていてもよいことは、当業者に明らかであろう。内部領域がプライマーアニーリングに利用されるならば、どちらの実施態様も可能である。
【０１２４】
これに代わる実施態様において、これらのＤＮＡフランキング配列を、フォワードプライマーおよびリバースプライマーが同一な配列を有するように設計することも可能である。このことは、鋳型−１に付着されたフランキング配列の一部分が、鋳型−２に付着されたフランキング配列の一部分と相補的であることを必要とするであろう。当然ながら各鋳型は、この分子の５’または３’領域においてのみ合成のためにプライミングされる（このようにして、不対プライマーのその後の作製を確実にする）。
【０１２５】
好ましい実施態様において、組換え促進性産物の最終プールにおける親鋳型ＤＮＡの存在をさらに最小限にするために、各々がユニーク制限部位を含むように鋳型分子に付着された５’および３’フランキングＤＮＡ配列を設計することが可能である。換言すれば、５’フランキング領域は、第一ユニーク制限部位（例えばＲＥ部位１）を含んでなるヌクレオチド配列を有するであろう。同様に、３’フランキング領域は、第一制限部位とは異なる第二ユニーク制限部位（例えばＲＥ部位２）を含むであろう。不対プライマー反応の後で、このように生産された全長伸長産物は、ＲＥ部位１およびＲＥ部位２（すなわちＲＥ−１およびＲＥ−２）に対応する特別な制限酵素で消化されうるであろう。もとの不対プライマーからの組換えおよび伸長によって生産されたこれらの産物のみが、これらの制限酵素（すなわちＲＥ−１およびＲＥ−２）によって分裂され、発現ベクター中への連結反応に適しているであろう。これは、ＲＥ部位１およびＲＥ部位２に対応するＲＥ−１およびＲＥ−２で分裂される（またはＲＥ−１およびＲＥ−２と適合性のある制限酵素で分裂される）。親鋳型分子は、このプロセスにおいてクローンされないであろうし、したがってその後のスクリーニングプロセスから排除されるであろう。これによって時間とお金が節約される。したがってこの戦略はさらに、親のコンタミネーションをゼロに減少させるであろう。
【０１２６】
プライマー
本発明の顕著な要素は、プライマーの不対性である。組換え促進性反応における２つの親鋳型分子の場合、フォワードプライマーは、第一鋳型分子の５’領域（アンチセンス鎖の３’領域）にアニールするが、第二鋳型分子の５’領域にアニールしてはならない。同様にリバースプライマーは、第二鋳型分子の３’領域（センス鎖の３’領域）とアニールしなければならないが、第一鋳型分子の３’領域にアニールしてはならない。別な言い方をすれば、不対プライマー方法では、反応中に存在する各鋳型分子が、単一プライマーを、その特定の鋳型（すなわち前進またはリバースプライマー）へアニールさせることができるだけである。どの場合も、フォワードおよびリバースプライマーの両方が、単一鋳型分子にアニールすることはできない。その理由は、これが、一組の対になったプライマーになるからである。
【０１２７】
当然ながら、２つ以上のユニーク鋳型分子が当初反応混合物中に存在する時、目標は、鋳型分子の５〜９５％に結合するフォワードプライマー、および残りの鋳型分子にアニールするリバースプライマーを有することである。「不対」プライマーのこの独特な設計は、最終組換え促進性反応混合物中の親鋳型のコンタミネーションの最小化にとって不可欠である。
【０１２８】
これらのプライマーの特異的配列は、第一鋳型分子の５’領域または第二鋳型分子の３’領域と１００％相補的であってもよく、またはこの配列はわずかにミスマッチされていてもよい。ミスマッチの程度は、プライマー配列の全体の長さによる。好ましいプライマーは、長さが約６〜２００ヌクレオチドである。しかしながらプライマー配列におけるあらゆるミスマッチは、プライマー誘導性伸長に参加するプライマーの能力を妨げるほど大きいものであってはならない。不対プライマーが鋳型分子内のあらゆる内部ヌクレオチド配列への有意な相同性を有していないならば、これはさらに好ましい。
【０１２９】
これに代わる実施態様において、フォワードおよびリバースプライマーは、同一配列を有していてもよい（例えばフォワードおよびリバースプライマーの両方の役割を果たす単一プライマーが用いられる）。例えば鋳型遺伝子がフォワードおよびリバース配向の両方においてベクター中にクローニングされるならば、このことは可能であろう。したがってベクターフォワードプライマーは、これが１つの配向にクローンされる時に遺伝子のセンス鎖を増幅するであろうが、一方で、同じベクタープライマーはまた、遺伝子が反対の配向にクローンされる時、遺伝子のアンチセンス鎖を同様に増幅するであろう。
【０１３０】
あらゆる場合に、プライマーは、熱循環反応のアニーリング工程の間、特異的鋳型分子上のその標的領域に特異的にアニールすることができなければならない。プライマーアニーリングに影響を与える変数は当業界においてよく知られており、リクリック（Ｒｙｃｈｌｉｋ），Ｗ．、（「ＰＣＲプロトコル：現行方法および用途（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」に議論されている。「分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第１５巻、３１〜４０ページ；ホワイト（Ｗｈｉｔｅ），Ｂ．Ａ．編：ニュージャージー州ヒューマナ（１９９３年））に開示。アニール温度は、まずプライマーの融解温度（Ｔｍ）を決定して評価することができる。Ｔｍを計算するための多様な方法が当業界において知られている。例えば次のものである：
１．Ｔｍの推定値（長さが２５ヌクレオチド未満のプライマーについて）は、セイン（Ｔｈｅｉｎ）およびウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）、（「遺伝性障害の診断における特異的ハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」、「ヒトの遺伝性疾患：実際的アプローチ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｋ．Ｅ．デイビス（Ｄａｖｉｓ）編、（１９８６年）３３〜５０ページ、ＩＲＬ：バージニア州ハーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ））に記載されているように、プライマーの塩基組成に基づいて決定することができる（４×（＃Ｃ＋＃Ｇ）＋２×（＃Ａ＋＃Ｔ）℃）。この式は、例えばホルムアミドなどの変性剤の不存在下において非常に概略的なＴｍを与える。
２．アニール温度のより洗練された計算方法は、Ｔｍについての次の式に基づいている。この場合、Ｔｍ＝８１．５＋［１６．６×（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）］＋０．４１×（％Ｇ＋Ｃ）−６７５／ｎである。註：［Ｎａ＋］は、モル塩濃度であり；［Ｋ＋］＝［Ｎａ＋］であり、ｎ＝オリゴヌクレオチド中の塩基数である。
【０１３１】
当然ながら、最適アニール温度は、あるプライマー／鋳型の組合わせの場合、実験によってのみ決定することができる。不対プライマー方法による組換えを可能にするために、最適アニール温度が正確に同定されることが重要である。
【０１３２】
プライマーの選択および設計において、いくつかの単純な規則が有用である。一般的に好ましい反応において、プライマーは、長さが約１０〜３５塩基対であり、５０〜６０％Ｇ＋Ｃ組成を有するであろう。選択された条件に応じて、５０℃〜８０℃のＴｍが適切である。Ｔｍに加えて、プライマーの３’末端における相補性は、重要な考察事項である。一般的に、プライマー対の相補性は、特に３’末端において避けるべきである。同様にパリンドローム配列とともにプライマーの３’末端におけるＣおよびＧ（３もしくはそれ以上）の連続実施は避けるべきである。複製環境中のプライマー分子の濃度に対しても考慮すべきである。０．０１〜１．０μＭのプライマー濃度が一般に適切であり、約０．０５〜１．０μＭの濃度が最適である。
【０１３３】
本発明の方法は、ランダムまたはバイアス的に核酸分子を組換えることについて考察している。この分化は、プライマー設計および鋳型濃度に基づいている。具体的には、ランダム組換えがすべての鋳型分子の長さ全体に望まれるならば、その場合には２つの別々の不対組換え促進性反応が準備されるべきである。第一反応は、フォワードプライマーのプライマー−１（これは第一鋳型分子の５’領域とアニールするが、第二鋳型分子の５’領域にアニールしないであろう）、およびリバースプライマーのプライマー−２（これは第二鋳型分子の３’領域とアニールするが、第一鋳型分子の３’領域にアニールしないであろう）を含むであろう。逆に、第二不対組換え促進性反応は、フォワードプライマーのプライマー−３（これは第二鋳型分子の５’領域とアニールするが、第一鋳型分子の５’領域にアニールしないであろう）およびリバースプライマーのプライマー−４（これは第一鋳型分子の３’領域にアニールするが、第二鋳型分子の３’領域にアニールしないであろう）を含むであろう。各反応（および場合により増幅）からの組換え促進性分子の作製後に、これら２つの反応が互いに混合され、不対プライマーがアニーリングのために設計されている特定の鋳型に依存しないランダム的方法で組換えが確実に発生するようにすることができるであろう。
【０１３４】
特異的領域の中にまたはそこから離れたところに組換えを集中しうるバイアス組換えは、プライマーの選択によって促進することができる。具体的には、第一鋳型分子の５’領域において組換えを最小限にし、第一鋳型分子の３’領域において組換えを最大限にしたいと望むならば、１）第一鋳型分子の３’領域にアニールする単一リバースプライマーを設計することができ；２）残りの鋳型分子（第一鋳型分子を除外する鋳型プール）にアニールする１つもしくはそれ以上のフォワードプライマーを設計することができる。その結果、次のようなバイアス突然変異体ライブラリーが得られるであろう。すなわち、組換え突然変異体が、第一鋳型分子の５’領域配列を含まないが、第一鋳型分子の３’領域配列を含んでいるライブラリーである。
【０１３５】
ランダムまたはバイアス組換えはまた、鋳型濃度を調節することによって得ることもできる。例えば鋳型の等モル比を、ランダム組換えに用いることができる。バイアス組換えのために、鋳型のバイアスモル比を用いることができるであろう。この状況において、より低い濃度を有する鋳型は、この組換えライブラリーにおいて最小限にされ、高い方の濃度を有する鋳型が、このライブラリーにおいて最大限にされるであろう。
【０１３６】
不対プライマーを用いた全長伸長産物の作製のためのプライマー伸長方法
ポリメラーゼ酵素は、あらゆるプライマー誘導性伸長方法において必要な成分であり、複製によって作製される核酸鎖へヌクレオチドを連続的に付加するために用いられる。多様なＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼは、当業界において通常のものであり、よく知られている。これらの各々は、ヌクレアーゼ活性、熱安定性、合成能力、鎖置換活性、およびフィデリティーに基づいて評価することができる。ＤＮＡポリメラーゼの有用な評論は、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ），Ｓ．Ｃ．ら（「バイオ技術（Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、３１（２）：３７０〜３８３ページ（２００１年））に見ることができる。本発明のポリメラーゼには、多様なプライマー誘導性複製方法において機能するものが含まれる。これらの方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれる、これらのすべては、下記においてより詳細に考察される。
【０１３７】
本発明において有用なポリメラーゼには、複製のハイフィデリティーを与えるもの、ならびに複製された鋳型中にエラーを導入するものの両方が含まれる。このようなエラープローンポリメラーゼの使用は、本発明の組換え促進性方法の有効性を増強するために役立つ。
【０１３８】
突然変異および／または交差が、異なるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いることによってＤＮＡレベルで、または異なるＲＮＡ依存性ポリメラーゼを用いることによってｍＲＮＡから直接にでも導入されうることはよく知られている。多くの研究（エコールズ（Ｅｃｈｏｌｓ），Ｈ．およびＭ．Ｒ．グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６０：４７７〜５１１ページ（１９９１年）；ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ），Ｊ．Ｄ．およびＴ．Ａ．クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、「真核細胞におけるＤＮＡ複製：概念、酵素、およびシステム（ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｅｎｚｙｍｅｓ  ＆  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、（デ・パンフィリス（Ｄｅ  Ｐａｍｐｈｉｌｉｓ），Ｍ．編）、２１７〜２４７ページ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ：ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９９６年）；およびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ），Ｋ．Ａ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２：６８５〜７１３ページ（１９９３年）において評論されている）は、２つの事象が大部分の重合エラーを開始させることを証明している。その１つは、不正確なヌクレオチドの誤挿入である。これは通常、塩基置換突然変異を生じるが、同様に、誤挿入されたヌクレオチドが、隣接鋳型塩基と相補的であり、プライマーが再配置されて誤アラインメント鎖を生成するときにフレームシフトも生じることがある。反応サイクルにおけるいくつかの工程が、誤挿入によって創始されたエラー率に影響を与えることがある。例えば、ｄＮＴＰ結合、化学反応に先立つその後の構造変化、ホスホジエステル結合形成率、および誤挿入された塩基の伸長と、そのエキソヌクレオチド分解性除去または転位とのバランスである。第二のエラー創始事象は、鋳型−プライマーのずれ（上記ロバーツおよびクンケルにおいて評論されている）であり、通常、結果として１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失または付加、特に反復配列を生じる。
【０１３９】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエラー率は、次のものについて評価されている：
・タック（Ｔａｑ）（テルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ））：２．４×１０−５フレームシフト突然変異／ｂｐ（ティンダル（Ｔｉｎｄａｌｌ），Ｋ．Ｒ．およびＴ．Ａ．クンケル、「生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２７：６００８〜６０１３ページ（１９８８年））〜２．１×１０−４エラー／ｂｐ（ケオハヴァング（Ｋｅｏｈａｖａｎｇ），Ｐ．およびＷ．Ｇ．ティリー（Ｔｈｉｌｌｙ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６（２３）：９２５３〜９２５７ページ（１９８９年））；
・クレン（Ｋｌｅｎ）タック（テルムス・アクアティクス、Ｎ−末端欠失突然変異体）：５．１×１０−５エラー／ｂｐ（バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ），Ｗ．Ｍ．、「遺伝子（Ｇｅｎｅ）」、１１２（１）：２９〜３５ページ（１９９２年））；
・ベント（Ｖｅｎｔ）（テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ））：２．４×１０−５エラー／ｂｐ（カリエロ（Ｃａｒｉｅｌｌｏ），Ｎ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９（１５）：４１９３〜４１９８ページ（１９９１年））〜５．７×１０−５エラー／ｂｐ（マティラ（Ｍａｔｉｌｌａ），Ｐ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９（１８）：４９６７〜４９７３ページ（１９９１年））；
・ベント（エクソ（ｅｘｏ）−）（テルモコッカス・リトラリス）：１．９×１０−４エラー／ｂｐ（上記マティラら）；
・ディープ（Ｄｅｅｐ）ベント（ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種ＧＢ−Ｄ）：出版されている文献はない；ニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ））は、フィデリティーがベントのものと同じであるか、もしくはそれ以上であると主張している；
・ディープベント（エクソ−）（ピロコッカス種）：出版されている文献はない；
・Ｐｆｕ（ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ））：１．６×１０−６エラー／ｂｐ（ランドバーグ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ）ら、「遺伝子（Ｇｅｎｅ）」、１０８（１）：１〜６ページ（１９９１年））；および
・レプリナーゼ（テルムス・フラビス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｉｓ））：１．０３×１０−４エラー／ｂｐ（上記マティラら）。
【０１４０】
さらには、野生型ポリメラーゼに対して、実質的に誤挿入率を増加させうるポリメラーゼの突然変異体誘導体も知られている（例えばクレノウフラグメントＤＮＡポリメラーゼの突然変異体誘導体であり、カロール（Ｃａｒｒｏｌｌ），Ｓ．Ｓ．ら、「生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、３０：８０４〜８１３ページ（１９９１年）に記載されている）。
【０１４１】
熱循環条件
本発明の１つの重要な要素は、低いアニール温度（好ましくは短時間）および短い合成サイクル（好ましくは低温での）の使用である。三工程または二工程のどちらかの熱循環を用いることができる。二工程サイクルの場合、この熱循環反応のアニーリングおよびポリメラーゼ触媒伸長要素は、単一の短縮工程として圧縮される。プライマー伸長の間、プライマーが、なんらかの非特異的プライミングを許容することができ、したがって組換え効率を増加しうることは非常に重要である。低いアニール温度の使用が、この目的を達成するであろう。この方法のもう１つの重要な側面は、短い短縮アニーリング／伸長工程の使用である。これもまた、組換えを容易にするであろう。この現象は、ジュドー（Ｊｕｄｏ），Ｍ．Ｓ．Ｂ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２６（７）：１８１９〜１８２５ページ（１９９８年）によって、ＰＣＲ−仲介組換えの刺激および抑制、またはキメラ形成の調査において最初に文献化された。ジュドーらは、不完全伸長／延長および鋳型鎖交換を介して不完全に伸長されたこれらの産物のその後のプライミングを特異的に促進するように設計されたＰＣＲ循環プログラムは、高いレベルの遺伝子組換えを刺激しうると決定した。したがってこの工程は、プライマー誘導性伸長が、約１，０００以下のヌクレオチド、またはより好ましくは約１００〜３００ヌクレオチド、最も好ましくは約２０〜５０ヌクレオチドの付加後のプライマー伸長の終結とともに、非常に短い時間確実に発生させるために重要である。プライマー伸長の終結は、多様な方法によって実施することができる。これらの方法には、温度の上昇または低下、反応混合物のｐＨの変更、またはポリメラーゼを阻害するために役立つ様々な試薬の添加による方法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１４２】
次の変性サイクルは、プライマー伸長の終結の直後に行なわれ、鋳型および一部伸長されたプライマー産物を変性する機能を果たす。次のアニーリング／伸長サイクルにおいて、一部伸長されたプライマー産物は、異なる鋳型分子にアニールすることができ、プライマー誘導性伸長のもう１つの短いサイクルを完了することができる。
【０１４３】
対になったプライマーを用いた全長伸長産物のプライマー誘導性増幅
本発明は場合により、組換え促進性核酸分子の増幅を提供する。多様な核酸増幅方法が当業界において知られており、これには、熱循環方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ならびに恒温方法、および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれる。ＲＮＡ複製のそのほかの方法、例えば複製ＲＮＡ系（例えばＱβ−レプリカーゼ）およびＤＮＡ依存性ＲＮＡ−ポリメラーゼプロモーター系（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）は、本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１４４】
本発明の目的のためには、全長組換え促進性伸長産物のプライマー誘導性増幅のためのこれらの方法は場合により、親鋳型にアニールするように特異的に設計された独創的な「不対」プライマーを利用することができる。しかしながら組換え後、これらのプライマーは事実上、組換え促進性産物のための「対になった」プライマーになった。あるいはまた新しいプライマーは、全長組換え促進性伸長産物の効率的かつ忠実な複製のために設計することができる。
【０１４５】
ポリメラーゼ連鎖反応
一般的に、ＰＣＲ型増幅技術において、対になったプライマーは異なる配列を有し、互いに対して相補的でない。ＰＣＲプライマー設計の方法は、当業界において通常であり、よく知られている（セインおよびウォリス、「遺伝性障害の診断における特異的ハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」であって、「ヒトの遺伝性疾患：実際的アプローチ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｋ．Ｅ．デイビス編、（１９８６年）３３〜５０ページ、バージニア州ヘムドンのＩＲＬ）；およびリクリック，Ｗ．（「分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」中の「ＰＣＲプロトコル：現行方法および用途」、ホワイト，Ｂ．Ａ．編（１９９３年）、第１５巻、３１〜３９ページ、ニュージャージー州トトワのヒューマニア（Ｈｕｍａｎｉａ，Ｔｏｔｏｗａ）参照）。
【０１４６】
リガーゼ連鎖反応
二本鎖組換え促進性核酸プールの複製のためにリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が用いられる時には、二組の標的特異性プライマーが必要とされる。一組のプライマーのメンバーが、この標的のある一定の鎖上に見られる隣接配列と相補的であり、一方、第二組のメンバーは、反対側鎖上の隣接配列に対して相補的である。このようにして、一組の隣接プライマーが、各標的鎖に対して特異的である。複製プロセスの間、標的核酸が加熱され、これら２つの標的鎖を変性する。これら２つのプライマーの組を含んでなる４つの相補的オリゴヌクレオチドプライマーはついで、これらの融解温度の近くで、分離された標的鎖にハイブリダイゼーションされる。熱安定性リガーゼは、各標的鎖上の隣接プライマーに共有結合的に付着する。この標的と完全に相補的な隣接プライマーのみが互いに連結反応される。このようにして、連結反応の第一段階からの産物は、次の連結反応ラウンドの標的になる。したがってこれらの産物は、標的縮重、プライマーハイブリダイゼーション、および連結反応工程の連続サイクルとともに幾何学級数的に増加する。
【０１４７】
プライマー、サイズ、塩基組成、およびプライマーの融解温度間の非相補性の必要条件は、ＰＣＲ複製について上記されたものと同様なものになる傾向がある。一般に、ＬＣＲ複製のためのプライマーは、各々が標的核酸上のその特異的結合部位に優先的に結合するように、十分に長いものであるべきである。連結反応の特異性を確保するために、反応は、オリゴヌクレオチドプライマーの融解温度（Ｔｍ）近くで実施することができる。より高い温度では、隣接プライマー間の接合部における末端塩基の不安定化が形成されることがある。この結果として、不完全な二重らせんを生じるのみならず、より低い連結反応速度も生じる。
【０１４８】
鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、組換え促進性核酸の増幅のためのＰＣＲの恒温代替方法を提供し、一本鎖または二本鎖標的のどちらかを増幅するために用いることができる。ＳＤＡ増幅に必要な材料には、非対称制限酵素部位を含んでいる１つもしくは２つの短いプライマーが含まれる。例えばＨｉｎｃＩＩ、エキソヌクレアーゼ−欠失ＤＮＡポリメラーゼ、ＨｉｎｃＩＩ制限酵素、および塩基ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびデオキシアデノシン５’［α−チオ］トリホスフェート（ｄＡＴＰ［αＳ］）である。
【０１４９】
増幅される標的が一本鎖であるならば、単一プライマーが用いられ、これはその相補的３’末端において標的と結合し、各々の末端で５’オーバーハングと二重らせんを形成する。このプライマーの５’オーバーハング鎖は、制限酵素ＨｉｎｃＩＩに対する認識配列を含んでいる。エキソヌクレアーゼ−欠失ＤＮＡポリメラーゼＩは、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ、およびｄＡＴＰ［αＳ］を用いてこの二重らせんの末端を伸長し、これは、ヘミホスホロチオエート認識部位を生成する。ＨｉｎｃＩＩは、ヘミホスホロチオエート部位の非保護プライマー鎖をニックし、修飾された相補鎖を無傷なままに残す。エキソ−ポリメラーゼは、このニックのところで３’末端を伸長し、標的鎖の下流相補体を置換する。重合／置換工程は、ニック可能なＨｉｎｃＩＩ認識部位を再生する。ニッキングおよび重合／置換工程は連続的に循環し、標的鎖の直線増幅された一本鎖産物を生産する。
【０１５０】
核酸標的が、幾何学級数的に増幅されることになれば、その場合には各々が標的中のこれらの鎖の１つのみと相補的な領域を有する２つのプライマーが用いられる。熱変性後、一本鎖標的フラグメントは、過剰に存在するそれぞれのプライマーに結合する。両方のプライマーは、標的結合配列の５’位に位置する非対称制限酵素認識配列を含んでいる。各々のプライマー−標的複合体は、制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、および上記の３つのｄＮＴＰおよび１つのｄＮＴＰ［αＳ］の存在下に、ニッキングおよび重合／置換工程を通して循環する。ＳＤＡ方法の徹底的な考察は、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）らによって示されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：３９２ページ（１９９２年））。
【０１５１】
タンパク質の発現および改変された特性についてのスクリーニング
組換え遺伝子または核酸配列が組換えられた後で、発現ベクター中にこれを挿入することが、次のことのために有用であろう：
１）組換えられたポリペプチドの適切な宿主細胞における発現；および
２）改変された特性についてのポリペプチドのスクリーニング。典型的な宿主細胞は、微生物（細菌、酵母、または菌類）、および植物細胞系（全植物および植物組織培養系を包含する）であろう。
【０１５２】
微生物および植物スクリーンの開発
組換え促進性分子のスクリーニングに用いられるアッセイは、確固として、感受性が高く、特異的で、かついくつかの源からの潜在的緩衝のバックグラウンド上で操作しうるものでなければならない。アッセイ技術は一般的に、高処理能力スクリーニング環境を特に参照して審査される。その理由は、高処理能力（ＨＴＰ）スクリーニングは多くの場合、スクリーニングプロセスを促進するために、ＤＮＡチップまたはマイクロアレー、および大規模スクリーニングのための自動データプロセシングを用いるからである。
【０１５３】
宿主系中に発現された組換え促進性分子のスクリーニング活性のために用いられる通常の技術には、マススペクトロメトリー、バイオアッセイ、免疫化学アッセイ、化学アッセイ、および生化学アッセイが含まれる。結果の迅速な分析を可能にするスクリーンを開発することが望ましい。特に望ましい微生物スクリーニング系は、好ましい特性を示すこれらの組換え生物を選択するための方法（例えば抵抗性、基質利用、または温度安定性に基づく方法）として、組換え微生物が特定の培地上で、または特定条件下に成長する能力に基づいている。
【０１５４】
微生物発現系
外来タンパク質の発現を指図する調節配列を含んでいる微生物発現系および発現ベクターは、当業者によく知られている。本明細書に記載されている不対プライマー方法によって生成された組換え促進性分子をテストするために、これらのどれでも用いることができるであろう。その場合これらのキメラ遺伝子は、形質転換を介して適切な微生物中に導入され、酵素の発現を可能にしうるであろう。
【０１５５】
適切な微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当業者によく知られている。一般的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指図する配列、選択可能なマーカー、および自律的複製または染色体組込みを可能にする配列を含んでいる。適切なベクターは、転写開始制御因子を含んでいる遺伝子の５’領域（すなわち全長組換え促進性伸長産物）、および転写終結を制御する組換え促進性産物の３’領域を含んでなる。これは、両方の制御領域が、形質転換された宿主細胞と相同な遺伝子に由来する時に最も好ましい。ただし、このような制御領域は、生産宿主として選択された特異種本来の遺伝子に由来する必要はないと理解すべきである。
【０１５６】
所望の宿主細胞における組換え促進性産物の発現を推進するのに有用な開始制御領域（またはプロモーター）は多数あり、当業者によく知られている。事実上、これらの遺伝子を推進しうるあらゆるプロモーターが、本発明に適している。これには次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）；ＡＯＸ１（ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）；およびｌａｃ、ｔｒｐ、ＩＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現にとって有用）である。
【０１５７】
終結制御領域はまた、好ましい宿主本来の様々な遺伝子に由来してもよい。場合により、終結部位は不要であることもある。しかしながらこれが含まれる場合が最も好ましい。
【０１５８】
植物発現系
本発明によって合成される全長組換え促進性産物の過剰発現は、植物宿主においても実施することができる。これは、まず組換え促進性遺伝子をベクターにクローンすることによって実施される。したがって、これらのコーディング領域は、発達の所望の段階で所望の組織における遺伝子の発現を指図しうるプロモーターに操作可能に連結される。転写終結シグナルをコードする３’非コーディング配列も備えられなければならない。
【０１５９】
プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するために用いられる方法に応じる。当業者は、組換え促進性遺伝子を含んでいる宿主細胞を首尾よく形質転換し、選択し、増殖させるためにプラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝子要素についてよく知っている。当業者はまた、様々な独立した形質転換事象が、結果として様々なレベルおよびパターンの発現を生じるであろうということ（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１〜２４１８ページ（１９８５）；デアルメイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１８：７８〜８６ページ（１９８９年））、およびしたがって多数の事象が、所望の発現レベルおよびパターンを示す系統を得るためにスクリーニングされなければならないということも認識するであろう。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３ページ（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロチェック（Ｋｒｏｃｚｅｋ），Ｊ．、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８：１３３〜１４５ページ（１９９３年））、タンパク質発現のウエスタン分析、発現遺伝子産物の酵素活性分析、および／または表現型分析によって実施されてもよい。
【０１６０】
コーディング領域の発現を誘発しうるあらゆるプロモーターとあらゆるターミネーターとのあらゆる組合わせを、組換え促進性遺伝子配列とともに用いることができる。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの適切な例には、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）、およびカリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子からのものが含まれる。用いることができる効率的な植物プロモーターの１つの型は、高レベル植物プロモーターである。このようなプロモーターは、本発明の遺伝子配列と操作可能な連結にあり、本発明の遺伝子産物の発現を促進しうるものであるべきである。この発明において用いることができる高レベル植物プロモーターには、例えば大豆からのリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小さいサブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー−ロウ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐ．Ｇｅｎ．、１：４８３〜４９８ページ（１９８２年））、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが含まれる。これら２つのプロモーターは、植物細胞において光誘発されることが知られている（例えば、キャッシュモア（Ｃａｓｈｍｏｒｅ），Ａ、「植物の遺伝子工学、農業的観点（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）」、ニューヨーク州プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、１９８３年、２９〜３８ページ；コラッジ（Ｃｏｒｕｚｚｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８：１３９９ページ（１９８３年）；およびダンスミュイア（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：２８５ページ（１９８３年）参照）。
【０１６１】
いくつかの用途の場合、組換え促進性遺伝子の遺伝子産物を、異なる細胞区画に導くことは有用であろう。したがって、上記のキメラ遺伝子を含んでいるベクター構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）はさらに、適切な細胞内標的配列、例えばトランジット配列（キーグストラ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ）、Ｋ．、「細胞（Ｃｅｌｌ）」、５６：２４７〜２５３ページ（１９８９年））、シグナル配列、または小胞体位置決定をコードする配列（クリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ），Ｊ．Ｊ．、Ａｎｎ.Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２：２１〜５３ページ（１９９１年））、または付加された、および／または既に存在する標的配列が除去されている核局在化シグナル（ライクヘル（Ｒａｉｋｈｅｌ）,Ｎ.、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．、１００：１６２７〜１６３２ページ（１９９２年）の付加によってさらに補足されてもよいと考えられる。引例は、これらの各々の例を示しているが、このリストは網羅的なものではなく、本発明において有用になりうるようなさらに多くの有用な標的シグナルが、将来発見されるかもしれない。
【０１６２】
組換えられたポリペプチド
本発明の遺伝子鋳型は、あらゆる源から得ることができ、医学、獣医学、環境、栄養学、または農学分野を包含する研究および工業の広い分野に用途を有する。これらの鋳型によってコードされた本発明のポリペプチドは、酵素、毒素、サイトカイン、糖タンパク質、および治療的有意性を有する成長因子であってもよい。農学および栄養学分野において、本発明によって組換えおよび改変することができるであろう有用なポリペプチドの特定例には、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、１）植物における第一または第二代謝のための酵素（例えばフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ、ｏ−メチルトランスフェラーゼ、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ、およびシンナモイルＣｏＡレダクターゼ遺伝子であり、これらのすべては、リグニン生合成において機能する［Ａ．Ｍ．ボウデット（Ｂｏｕｄｅｔ）ら、Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．、１２９：２０３ページ（１９９５年）］）；２）耐病性（例えばバシルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の内毒素についての遺伝子、国際公開第９２／２０８０２）、または耐除草剤性（例えば突然変異体アセトラクテートシンターゼ、国際公開第９２／０８７９４）を付与するタンパク質；および３）種子貯蔵タンパク質（例えば高硫黄１０ｋＤコーン種子タンパク質、または高硫黄ゼインタンパク質、およびグルテリンポリペプチド、国際公開第９３／１８６４３）を包含する動物用の餌またはヒトの食品において有用な所望の特性を有するタンパク質である。さらには工業的有意性を有するポリペプチドも本発明によって組換えられ、かつ増強されうると認められる。これには例えば次のものが含まれる。すなわち、１）好熱性生物および中温生物からの工業用酵素（例えばプロテアーゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、レバナーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、ヌクレオチダーゼ、トランスフルクトシラーゼ、ラクターゼ、デサチュラーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、デヒドラターゼ、デスルフラーゼ、ヒドラターゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、およびグルコースイソメラーゼホスファターゼ）；２）ビオチン結合タンパク質（例えばアビジンおよびストレプトアビジン）；３）免疫グロブリン結合タンパク質（例えばタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、およびタンパク質Ｌ）；４）免疫グロビン、受容体タンパク質、および構造タンパク質（例えばアクチン、フィブリン、コラーゲン、シルクタンパク質、およびエラスチン）；５）ウイルスタンパク質（例えばプロテアーゼ逆トランスクリプターゼ、およびエンベロープタンパク質）；および６）微生物および原生動物からの抗原（例えばスタフィロコッカスタンパク質Ａ、レヴァンスクラーゼ、およびバルナ−ゼ）である。多くのこのようなタンパク質は当業者によく知られている。アミノ酸、およびこのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、多くのコンピュータデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔを通して容易に入手しうる��あるいはまた、標的タンパク質のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、当業界の通常の手順を用いて決定することができる。
【０１６３】
好ましい実施態様の説明
不対プライマー方法の組換え促進性の可能性を開発および研究するために、２つの異なる生物系が用いられた。第一系は、より大きいチロシンアンモニア−リアーゼ（ＴＡＬ）活性を導入するために、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子の最適化を包含していた。したがって突然変異体は、シンナメートの仲介をともなわず、基質チロシンから直接、４−ヒドロキシ桂皮酸（ＰＨＣＡ）を合成することができた。
【０１６４】
第二系は、工業用途における使用、特に３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドおよび１，３−プロパンジオールの生成のために、改良された反応速度を有する（すなわち、グリセロールおよび１，３−プロパンジオールの存在下に増加した総代謝回転数を有する）補酵素Ｂ１２−依存性デヒドラターゼの開発を包含していた。これらの突然変異体デヒドラターゼは、野生型酵素（これからこれらが作製された）に対して増加したｋｃａｔおよび／または減少した酵素不活性化率を有することを特徴とする。
【０１６５】
両方の生物系において、不対プライマーを用いる組換え促進性伸長方法は、改変された特性（例えば酵素活性および基質特異性）を有する、全長組換え促進性伸長産物の発生を首尾よく可能にすることが発見された。
【０１６６】
不対プライマー方法の開発のためのモデル系：ＰＡＬ／ＴＡＬ生物系
本発明の開発は、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）（ＥＣ４．３．１．５）およびチロシンアンモニア−リアーゼに関連する遺伝子および酵素を用いて実施された。
【０１６７】
ＰＡＬ酵素は、Ｌ−フェニルアラニンからの（プロ−３Ｓ）−水素および−ＮＨ３＋の除去によって、フェニルアラニンをトランス−桂皮酸へ変換する。トランス−桂皮酸はその後、シンナメート−４−ヒドロキシラーゼによってパラ位でヒドロキシル化され、ＰＨＣＡを生成することができる（ピエレル（Ｐｉｅｒｒｅｌ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２４：８３５ページ（１９９４年）；アーバン（Ｕｒｂａｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２２：８４３ページ（１９９４年）；カベロ−フルタード（Ｃａｂｅｌｌｏ−Ｈｕｒｔａｄｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３：７２６０ページ（１９９８年）；およびトーチュ（Ｔｅｕｔｓｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ.Ｕ．Ｓ．Ａ、９０：４１０２ページ（１９９３年））か、またはＰ４５０酵素系の存在下にヒドロキシル化されうる。ＰＡＬをコードする遺伝子は当業界で知られており、いくつかは、植物および微生物源の両方から配列決定されている（例えばＥＰ３２１４８８［ロードスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ］；国際公開第９８１１２０５［ユーカリプタス・グランディス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）およびピヌス・ラディアタ（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ）］；国際公開第９７３２０２３［ペチュニア］；ＪＰ０５１５３９７８［ピスム・サティヴァム（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）］；国際公開第９３０７２７９［ジャガイモ、米］；および例えばＧｅｎＢａｎｋ  ＡＪ０１０１４３およびＸ７５９６７参照）。様々な源からのＰＡＬ遺伝子が、酵母、大腸菌、および昆虫細胞培養物中に活性ＰＡＬ酵素として過剰発現されている（フォークナー（Ｆａｕｌｋｎｅｒ）ら、「遺伝子（Ｇｅｎｅ）」、１４３：１３〜２０ページ（１９９４年）；ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）ら、「生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ）」、３６：１０８６７〜１０８７１ページ（１９９７年）；マッケグニー（ＭｃＫｅｇｎｅｙ）ら、「植物化学（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、４１：１２５９〜１２６３ページ（１９９６年））。
【０１６８】
いくつかのＰＡＬ遺伝子は、フェニルアラニンをシンナメートに変換する能力に加えて、基質としてチロシンを受入れることができる。このような反応において、酵素活性は、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）と呼ばれている。ＴＡＬによるチロシンの変換の結果、シンナメートの仲介をともなわずにチロシンからＰＨＣＡの直接形成を生じる。しかしながらすべての天然ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素は、これらの基質としてチロシンよりむしろフェニルアラニンを利用することを優先する。酵母ロードスポリジウムからの野生型ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素は、チロシンと比較した場合フェニルアラニンへの優先傾向が減少しており、ＴＡＬ触媒活性対ＰＡＬ触媒活性比がわずか０．５８である（ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）およびハビア（Ｈａｖｉｒ）の「植物の生化学（Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ）」；ニューヨーク、アカデミック、１９８１年；第７巻、５７７〜６２５ページに報告されている）。比較のために、ほかの生物において調査されたＰＡＬ／ＴＡＬ酵素は一般的に、１５もしくはそれ以上のＰＡＬ／ＴＡＬ比を有する。
【０１６９】
米国特許第６，５２１，７４８号（本明細書に援用される）は、野生型ロードスポリジウム・トルロイデスＰＡＬの突然変異生成によって、増強されたチロシンアンモニア−リアーゼ（ＴＡＬ）活性を有するいくつかの突然変異体ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子を開発した。これらの遺伝子は、これらの特異的突然変異およびＰＡＬ／ＴＡＬ比に応じて、下記の表３に要約される。
【０１７０】
【表５】
2005523690.tif 000006
【０１７１】
これらの突然変異体遺伝子は、「分子マーカー」として用いることができるこれらの既知の突然変異によって、本発明における鋳型分子として用いられる。したがって、組換え促進性分子の配列決定によって、不対プライマー方法から結果として生じる遺伝子組換えの容易な評価が可能になる。さらには全体の酵素機能は、酵素活性および基質特異性を改変する不対プライマー方法の能力を研究するために、ＴＡＬ／ＰＡＬ比に応じて容易に評価することができる。
【０１７２】
不対プライマーを用いた組換え促進性伸長方法
特異的ヌクレオチド塩基の３つの置換を表わす、全部で３つの分子マーカーを有する２つの突然変異体ＴＡＬ／ＰＡＬ遺伝子が、不対プライマーでの組換え促進性伸長方法を用いる最初の実験のための鋳型分子として選択された。短いフランキングＤＮＡフラグメントが、標準的ＰＣＲを用いて各親遺伝子の５’または３’末端に付着され、フォワードプライマーが、第一鋳型分子の５’領域（第二鋳型分子の５’領域にではなく）にアニールし、一方で、リバースプライマーが、第二鋳型分子の３’領域（第一鋳型分子の３’領域にではなく）にアニールするように、確実にその後のプライマーが設計されうるようにした。ついでプライマー誘導性伸長は、変性を促進し、かつアニーリング／ポリメラーゼ触媒伸長を極端に短縮した熱循環条件を用いて、複製組成物（鋳型、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ緩衝物、不対プライマー、ポリメラーゼ、および水から構成されている）において実施された。アニーリング／ポリメラーゼ−触媒伸長に最適な温度をみつけるために、温度勾配が用いられた。
【０１７３】
親鋳型と同様なサイズを有する全長伸長産物の合成を可能にする効果的なプライマー伸長の証拠は、アガロースゲル電気泳動法によって様々な勾配温度で実施された不対プライマー反応の産物を分離することによって評価された（図２）。アニーリング／ポリメラーゼ触媒伸長の温度が徐々に増加するにつれて、効果的なプライマー伸長の証拠が、アニーリング／ポリメラーゼ触媒伸長に最適な温度において、適切な分子量（親鋳型に対して）の分離したバンドの突然の出現によって見られた。
【０１７４】
ゲル電気泳動法による全長伸長産物の最初の確認の後、ついで組換え促進性産物がｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミドベクターにクローンされ、大腸菌細胞に形質転換された。これらの組換え促進性挿入物の配列決定によって、この不対プライマー方法が、非常に高い効率（７つのクローンのうちの７つが組換え促進性であった）で、組換えＤＮＡ産物を生産することができると決定された。
【０１７５】
その後の実験で、不対プライマーを用いたこの組換え促進性伸長はまた、２つの鋳型遺伝子を用い、同様に鋳型遺伝子プール（３）も用いる親鋳型に対して、改良された酵素活性および改変された基質特異性を有する突然変異体酵素を作製するのに適していると決定された。親鋳型の分子マーカーを組換えることに加えて、追加の突然変異が、新しい突然変異および置換の形態で組換え促進性分子中に導入された。ハイスループットスクリーニングによって、発現された遺伝子産物のスクリーニングが可能になり、配列決定は、分析された突然変異体のすべてが、組換え突然変異体遺伝子であることを証明した。
【０１７６】
不対プライマー方法の工業的用途：１，３−プロパンジオールの合成のためのグリセロールデヒドラターゼ
ポリエステル、ポリエーテル、およびポリウレタンの生産のための出発原料である１，３−プロパンジオールの生物学的生産方法は、二工程連続反応用の基質としてグリセロールを必要とする。まず、デヒドラターゼ（一般的に補酵素Ｂ１２−依存性デヒドラターゼ）は、グリセロールを中間体３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰ）へ変換する。ついで３−ＨＰが、ＮＡＤＨ−（またはＮＡＤＰＨ）依存性オキシドレダクターゼによって１，３−プロパンジオールに還元される。１，３−プロパンジオールは、それ以上代謝されず、その結果、培地中に高濃度で蓄積される。例えばゼング（Ｚｅｎｇ）ら、（Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４：２３９〜２５９ページ（２００２年））；米国特許第５，６８６，２７６号；国際公開第０１／０１２８３３；米国特許第６０／３７４９３号；米国特許第６０／４１６１９２号；および米国特許第６０／４３３７０８号参照。各々の特許出願は、その全体が本明細書に示されているかのように、本明細書に援用される。
【０１７７】
グリセロールの３−ＨＰへの変換を担う酵素は、大部分補酵素Ｂ１２−依存性グリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）および補酵素Ｂ１２−依存性ジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）である。これらの酵素をコードする遺伝子は、次のものにおいて同定されている。すなわち、肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）、シトロバクター・フルウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・パスツリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびラクトバシルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）である（トラヤ（Ｔｏｒａｙａ），Ｔ．、「アミノ酸−残基および関連基を含む金属酵素（Ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ−Ｒｅｓｉｄｕｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒａｄｉｃａｌｓ）」；シーゲル（Ｓｉｇｅｌ），Ｈ、およびシーゲル，Ａ．編；「生物系における金属イオン（Ｍｅｔａｌ  Ｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」；マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）；ニューヨーク、１９９４年；第３０巻、２１７〜２５４ページ；ダニエル（Ｄａｎｉｅｌ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、２２：５５３〜５６６ページ（１９９９年）；およびソーバジョット（Ｓａｕｖａｇｅｏｔ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２０９：６９〜７４ページ（２００２年））。
【０１７８】
構造的には、補酵素Ｂ１２−依存性デヒドラターゼは、３つのサブユニットから構成されている。すなわち、大きいまたは「α」サブユニット、中位または「β」サブユニット、および小さいまたは「γ」サブユニットである。これらのサブユニットは、α２β２γ２構造に組み立てられ、アポ酵素を形成する。補酵素Ｂ１２（活性補因子種）は、アポ酵素に結合して、触媒的に活性なホロ酵素を形成する。補酵素Ｂ１２は、触媒作用が発生する根本的なメカニズムに含まれるので、触媒活性に必要とされる。
【０１７９】
生化学的に、補酵素Ｂ１２−依存性デヒドラターゼは、グリセロールおよびその他の基質によるメカニズムに基づいた自己不活性化を受けることが知られている（上記ダニエルら；セイファート（Ｓｅｉｆｅｒｔ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：２３６９〜２３７８ページ（２００１年））。さらには不活性化は、ホロ酵素と高濃度の１，３−プロパンジオールとの相互作用を介して発生する。不活性化は、補酵素Ｂ１２補因子のコバルト−炭素（Ｃｏ−Ｃ）結合の分裂に関わり、これは５’−デオキシアデノシンおよび不活性コバラミン種の形成を生じる。この不活性化は、３−ＨＰ形成と関連する反応速度を有意に減少させることがあり、したがって間接的に１，３−プロパンジオール生産を減少させる。
【０１８０】
補酵素Ｂ１２−依存性デヒドラターゼ不活性化の効果は、多様な方法で一部克服することができるが、好ましい方法は、減少した不活性化速度を有する補酵素Ｂ１２−依存性デヒドラターゼの同定であろう。これは、微生物宿主における補酵素Ｂ１２−依存性デヒドラターゼの代謝回転比（モル産物／モルホロ酵素）を増加させ、これによってデヒドラターゼおよび補酵素Ｂ１２−需要を減少させるであろう。
【０１８１】
ＧＤＨを遺伝子的に改変するための標準的な方法
次のものを用いて、低下した不活性化速度を有するいくつかの突然変異体ＧＤＨ遺伝子が開発された（米国仮出願第６０／４３３７０８号およびその中の開示物）。すなわち、：１）ＧＤＨのα−、β−、およびγ−サブユニット、またはＧＤＨのα−サブユニットおよびβ−サブユニットの一部分のいずれかを標的とする突然変異体ライブラリーを発生させるためのエラープローンＰＣＲ；および２）ＧＤＨのα−サブユニットのアミノ酸Ｎｏ．１４１−１５２、Ｎｏ．２１９−２２６、およびＮｏ．３３０−３４２を標的とする、オリゴ誘導性突然変異生成を用いた。
【０１８２】
５つの総突然変異（これらのうちの１つは、α−サブユニットとβ−サブユニットとの融合であった）を含んでいるこれらの突然変異体の１つは、次のことによってさらに詳細に調査された。すなわち、１）野生型ＧＤＨに対して、融合突然変異のみを含んでいる２つの突然変異体を構成すること；２）および１つのコドンをその野生型配列に戻すために、点突然変異を作製し、４つの突然変異を残すことによってである。これらの遺伝子の各々は、特異的突然変異、Ｔ２／Ｔ１比（５０ｍＭの１，３−プロパンジオールおよび１２ｍＭグリセロールの存在下に行なわれる４０分反応の間、酵素安定性の指標を与える）、およびＴ２値に応じて、下記の表４に要約される。Ｔ２は、酵素の総代謝回転数の評価（すなわちｋｃａｔ／ｋｉｎａｃｔ  ｏｂｓｄ）であり、一方、Ｔ１はｋｃａｔに正比例する。
【０１８３】
【表６】
2005523690.tif 000007
【０１８４】
【表７】
2005523690.tif 000008
【０１８５】
上記の表４に示されている突然変異体に加えて、部位飽和突然変異生成が、酵素機能性において重要な役割を果たすように見える、ＧＤＨ中の３つのコドンに対して実施された。６００ｍＭの１，３−プロパンジオール（Ｔ（６００））の存在下における総酵素代謝回転数を測定するために設計されたアッセイに基づくスクリーニングによって、表５に示されている野生型ＧＤＨに対して減少した不活性化速度を有する４つの追加突然変異体の同定が可能になった。
【０１８６】
【表８】
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【０１８７】
野生型酵素に対する突然変異体ＧＤＨの不活性化速度（表４および表５）の全体的な減少に向かう有意な改良にもかかわらず、これらの突然変異体遺伝子は、３−ＨＰおよび１，３−プロパンジオールの工業的生産方法における使用のための酵素の不活性化速度をさらに改良するために、本発明における鋳型分子として用いられる。ＰＡＬ／ＴＡＬ研究の場合のように、これらの親鋳型の既知の突然変異は、組換え促進性産物を発生させるための不対プライマーを用いた、組換え促進性伸長方法の能力をさらに詳しく評価するための「分子マーカー」として用いられる。さらにはこれらの鋳型は、当業者によく知られている「標準的」突然変異生成方法を介して得られたものに対して、不対プライマー方法を用いて発生された組換え促進性産物の品質の評価を可能にする。
【０１８８】
不対プライマーを用いた組換え促進性伸長方法
全部で４２の分子マーカーを有する２４の突然変異体ＧＤＨ遺伝子が、不対プライマーでの組換え促進性伸長方法の鋳型分子として用いられた。短いフランキングＤＮＡフラグメントは、次のことを確実に行なうように、標準ＰＣＲを用いて各々の親遺伝子の５’または３’末端に付着された。すなわち、その後のプライマーは、フォワードプライマーが第一１１鋳型分子の５’領域にアニールし（しかしながら第二１３鋳型分子の５’領域にアニールしない）、一方、リバースプライマーは、第二１３鋳型分子の３’領域にアニールする（しかしながら第一１１鋳型分子の３’領域にアニールしない）ように設計されうるようにした。これらの短いフランキングＤＮＡフラグメントは各々、組換え促進性プロセス後にあらゆる痕跡量の親鋳型コンタミネーションの完全な除去を可能にするユニーク制限酵素部位を含んでいた。ついでプライマー誘導性伸長は、変性を促進し、かつアニーリング／ポリメラーゼ触媒伸長を極端に短縮する熱循環条件を用いて複製組成物中で実施された。
【０１８９】
組換え促進性伸長方法の産物上の制限酵素消化後、組換え促進性産物のみが確実にクローンされるように、突然変異体ＧＤＨを含んでいる約７，０００コロニーをスクリーニングして、高濃度の１，３−プロパンジオールの高濃度の存在下に減少した不活性速度を有するものを同定した（総酵素代謝回転数の尺度としてＴ（６００）をアッセイすることによって）。９つの正の突然変異体が特性づけされた。これらの各々は、エラープローンＰＣＲによって得られた最良の突然変異体に対して少なくとも１３９％改良されたＴ（６００）値を有する。最良の突然変異体は、そのＴ（６００）値によって測定された時、野生型ＧＤＨよりも６６０％改良されていた。これらの突然変異体の配列決定は、本発明の組換え促進性伸長方法が、４つの異なる親鋳型分子からの４つまでの異なる突然変異を、単一２．７ｋＢ組換え促進性産物中へ組込んだことを明らかにした。さらには新しい突然変異もまた、親鋳型に見られなかった組換え促進性産物中に導入された。
【実施例】
【０１９０】
本発明は、次の実施例においてさらに規定される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しているが、例証のためにのみ示されていると理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特徴を確認することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、これを様々な使用および条件に合わせるために、本発明の様々な変更および修正を行なうことができる。
【０１９１】
一般的な方法
ＰＣＲ増幅、エンドヌクレアーゼ、およびエキソヌクレアーゼ（ＤＮＡのクローニングおよび連結反応のために所望の末端を発生させるためのもの）、および細菌形質転換に必要とされる手順は、当業界においてよく知られている。標準的分子クローニング技術が本発明に用いられ、これについては次のものに記載されている。すなわち、サムブルック，Ｊ．、フリッチュ，Ｅ．Ｆ．およびマニアティス，Ｔによる「分子クローニング：実験室マニュアル」、第二版、（ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８９年；以下「マニアティス」）において；シルヘイビー，Ｔ．Ｊ．、ベンナン，Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト，Ｌ．Ｗ．による「遺伝子融合を用いた実験」（ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８４年）；およびオースベルらによる、「分子生物学における現在のプロトコル」、（グリーン・パブリッシング、およびワイリー−インターサイエンス；１９８７年）である。
【０１９２】
細菌培養物の維持および成長に適した材料および方法は、当業界においてよく知られている。次の実施例への使用に適した技術は、次のものに示されているように見出すことができる：１）「一般的細菌学の方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」（フィリップ・ゲルハート（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マリー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロー（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウイリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、アメリカ微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）：ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．）、１９９４年）；または２）ブロック（Ｂｒｏｃｋ），Ｔ．Ｄ．「生物技術：工業微生物学のテキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、第二版、（メリーランド州サンダーランドのシナウア・アソシエイツ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）、１９８９年）。細菌細胞の成長および維持のために用いられるすべての試薬、制限酵素、および材料は、ほかに特定されていなければ、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウイスコンシン州ミルウオーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ））、ディフコ（ＤＩＦＣＯ）ラボラトリーズ（ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ））、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／ＢＲＬ（メリーランド州ゲイターズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））、シグマ（Ｓｉｇｍａ）・ケミカル・カンパニー（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））、またはプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ウイスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））から入手された。
【０１９３】
ＰＣＲ反応は、ほかに特定されていなければ、ＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジン（マサチューセッツ州ウォルサムのＭＪリサーチ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ））でエクスパンドハイフィデリティー（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＰＣＲシステム（インディアナ州インディアナポリスのロッシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ））を用いて、またはＧｅｎｅＡＭＰ  ＰＣＲシステム９７００でアンプリタック（Ａｍｐｌｉｔａｑ）またはアンプリタックゴールド酵素（カリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ））を用いて実施された。循環条件および反応は、ほかの記載がなければ、製造業者の指示にしたがって標準化された。
【０１９４】
ＤＮＡ配列決定反応は、ほかに特定されていなければ、ＡＢＩ３７７自動シークエンサー（ＰＥアプライド・バイオシステムズ）で実施された。同様に、データは、ベクターＮＴＩプログラム（メリーランド州ベセスダのインフォーマックス社（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ））またはＤＮＡスタープログラム（ウイスコンシン州マジソンのＤＮＡスター社）を用いて管理された。
【０１９５】
省略形の意味は、次のとおりである。「ｓｅｃ」は秒、「ｍｉｎ」は分、「ｈｒ」は時間、「ｄ」は日数、「μＬ」はマイクロリットル、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットル、「ｍｍ」はミリメートル、「μｍ」はマイクロメートル、「ｎｍ」はナノメートル、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）、「μＭ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）、「ｎＭ」はナノモル、「Ｍ」はモル、「ｍｍｏｌ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）、「μｍｏｌ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）、「ｎｇ」はナノグラム、「ｍｇ」はミリグラム、「ｇ」はグラム、「ｋＢ」はキロベース、「ｍＵ」はミリ単位、および「Ｕ」は単位を意味する。
【０１９６】
菌株、ベクター、および培養条件
大腸菌ＸＬ１−ブルーＭＲＦエレクトロポレーションコンピテントセルが、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフォルニア州ラジョラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ））から購入された。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞が、酵素過剰発現のために用いられた（シュスター（Ｓｈｕｓｔｅｒ），Ｂ．およびレテイ（Ｒｅｔｅｙ），Ｊ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４９：２５２〜２５４ページ（１９９４年））。野生型大腸菌５Ｋは、当初はコリ・ジェネティック・ストック・センター（Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＣＧＳＣ＃４５１０；コネチカット州ニューヘイブンのエール大学（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｈｅａｖｅｎ））から入手され、ラムダＤＥ３（５Ｋ（ＤＥ３））で溶原化された。
【０１９７】
不対プライマー組換え促進性産物が、ｐＣＲ４ＴＯＰＯ（カリフォルニア州カールズバッドのインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ））中にクローンされた。ｐＥＴ１７ｂは、ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）（ウイスコンシン州マジソン）から購入された。ベクターｐブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＩＩＳＫ＋は、ストラタジーンから購入された。
【０１９８】
ベクターＰＣＡ１２Ｋｍおよび構築物ＥＰ１８Ｋｍ−６の構成は、米国特許第６，５２１，７４８号に記載されている。エンプタージ（Ｅｍｐｔａｇｅ）ら（国際公開第０１／１２８３３）は、プラスミドｐＤＴ２の構成について記載している。これは、肺炎桿菌ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３遺伝子を含んでなる。プラスミドｐＧＤ２０は、ｐＤＴ２のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩフラグメント（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３をを含んでいる）をｐブルースクリプトＩＩＳＫ＋中に挿入することによって構成され、これによって、ＧＤＨ遺伝子の発現をＴ７プロモーターの制御下に置いた。
【０１９９】
ほかに特定されていなければ、分子生物学的用途のためのすべてのキットは、製造業者の指示にしたがって用いられた。
【０２００】
全細胞ＴＡＬ／ＰＡＬ活性アッセイ
大腸菌細胞を、ルリア−ベルトニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉ）（ＬＢ）培地中で一晩成長させた。細胞濃度は、ＯＤ６００ｎｍを測定して評価され、ついで１のＯＤ６００ｎｍに調節された。調節された細胞培養物１ｍＬをペレット化し、０．５ｍＭチロシン（ＴＡＬ活性測定のため）または０．５ｍＭフェニルアラニン（ＰＡＬ活性測定のため）を含んでいる５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液１ｍＬ（ｐＨ８．５）中に再懸濁した。反応混合物をシェーカーで、３７℃で１時間インキュベートした。ＴＡＬまたはＰＡＬ活性は、結果として生じるＰＨＣＡまたはシンナメートの濃度を測定することによって決定した。これは、０．２μｍ細孔サイズフィルター（メリーランド州ベッドフォードのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ））を用いて、反応混合物を濾過し、この濾過物をヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）１１００ＨＰＬＣシステム（カリフォルニア州パロアルトのヒューレット・パッカード社（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ））中に注入し、ＰＨＣＡまたはシンナメートの濃度を決定して実施した。
【０２０１】
ＰＨＣＡ  ＨＰＬＣ分析
オートサンプラーおよびダイオードアレーＵＶ／ビス検出器を備えたヒューレット・パッカード１１００ＨＰＬＣシステム（カリフォルニア州パロアルト）を、ヒューレット・パッカード社によって供給されている逆相ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）ＳＢ−Ｃ８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍ）とともに用いた。ＨＰＬＣ条件は次のとおりであった：流量：１．０ｍＬ／分；カラム温度：４０℃；溶媒計画：表６に示されている。ＵＶ検出器は、２５０、２３０、２７０、２９０、および３１０ｎｍ波長で溶離液を監視するよう設定された。
【０２０２】
【表９】
2005523690.tif 000010
【０２０３】
上に記載されているＨＰＬＣシステムを用いた関連代謝物の保持時間（ＲＴ）は、下記の表７に要約される。
【０２０４】
【表１０】
2005523690.tif 000011
【０２０５】
ハイスループットＰＡＬ／ＴＡＬスクリーニングアッセイ
ハイスループット様式の全細胞を用いたＴＡＬ／ＰＡＬ比の直接測定によって、改良されたＴＡＬまたはＰＡＬ活性を有する突然変異体のスクリーニングが可能になった（米国特許第６，５２１，７４８号に詳細に記載されている）。コロニーが手で採取される時、１日あたり数千クローンをスクリーニングすることができる。
【０２０６】
大腸菌コロニーをアガロースプレートから採取し、０．３ｍＬの成長培養物を含んでいる９６−ディープウエルプレート（カリフォルニア州フラートンのベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ））で成長させた。各プレートを覆い、シエーカーで、３００ｒｐｍ、３６℃で５〜１６時間成長させた。成長後、２５μＬの細胞培養物をミリポア・マルチスクリーン９６ウエルプレート（マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア）に移し替えた。このプレートの底部は、大腸菌細胞の通過を防ぐが、真空による成長培地の除去を可能にする０．２２μｍ細孔サイズのデュラポア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）膜を有する。ついでこれらの細胞を、バイオメック（Ｂｉｏｍｅｋ）２０００ラボラトリー・オートメーション・ワークステーション（ベックマン・コールター社）を用いて５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で洗浄した。
【０２０７】
ＴＡＬ活性を測定するために、０．５ｍＭチロシン１００μＬを各ウエルに添加し、シーカーで、室温で５〜１２時間インキュベートした。ついで反応溶液をこれらの細胞から分離し、バイオメック２０００を用い、真空を加えて、コスター（Ｃｏｓｔｅｒ）９６−ウエルＵＶプレート（ニューヨーク州コーニングのコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ））に移し替えた。ＰＡＬ活性を測定するために同様な手順を用いた。ただし、この反応には０．５ｍＭのフェニルアラニンを用いた。検出のために、吸収は、スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）１９０  ９６−ウエルプレートリーダー（カリフォルニア州サニーベイルのモレキュラー・デバイシーズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ））を用いて、２９０または２７０ｎｍで測定し、ＰＨＣＡまたはシンナメートの形成を調べた。
【０２０８】
細胞成長率および酵素発現レベルの差による変動性を排除するために、ＴＡＬ／ＰＡＬ比は、ＴＡＬおよびＰＡＬデータをマイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）（登録商標）（ワシントン州レッドモンド（Ｒｅｄｍｏｎｄ））エクセルにエクスポートした後で計算した。
【０２０９】
ＧＤＨハイスループットスクリーニングアッセイ
野生型Ｂ１２−依存性デヒドラターゼまたは突然変異体Ｂ１２−依存性デヒドラターゼライブラリーを発現する培養物は、これらが酵素の補因子源、補酵素Ｂ１２を有していないならば、アポ−Ｂ１２−依存性デヒドラターゼを生産する。これに対して、ホロ酵素は、補酵素がトルエン−および洗剤−浸透化全細胞に添加されるならば、自然に形成される。したがって補酵素プラス基質をこのような細胞に添加することによって、Ｂ１２−依存性デヒドラターゼ反応を「開始させる」ことが可能である。この反応生成物３−ＨＰは、試薬３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン（ＭＢＴＨ）および酸化剤の塩化第二鉄を用いて、比色アルデヒドアッセイ（ズレック（Ｚｕｒｅｋ），Ｇ．、カースト（Ｋａｒｓｔ），Ｕ、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、３５１：２４７〜２５７ページ（１９９７年）によって検出することができる。ハイスループットＧＤＨアッセイは、本明細書に援用される米国仮出願第６０／４３３７０８号において考察されている。
【０２１０】
２点高処理能力ＧＤＨスクリーニングアッセイ
培養基で培養されたライブラリーからのコロニーを、０．１５ｍＬ／ウエルの１５％レノックス（Ｌｅｎｎｏｘ）ブロス（１５容積のレノックスブロス（メリーランド州ロックビルのギブコ−ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））を８５容積の０．５％ＮａＣｌで希釈し、ついで滅菌して作られたもの）が入っている標準的９６ウエルミクロ滴定プレートの９４ウエルに採取した。残りの２つのウエルに、野生型ＧＤＨを生産する細胞を接種し、これらの細胞を、４〜６時間、静的インキュベーターにおいて３７℃で成長させておいた。あるいはまた、スクリーニングの前に−８０℃での採取細胞の保存が望まれるならば、この培地はまた、グリセロール（１０％ｖ／ｖ）を含んでおり、採取された細胞を、保存の前に一晩成長させておいた。スクリーニングの前、予め凍結されている細胞を、９６ピン接種器（カリフォルニア州サンディエゴのＶ＆Ｐサイエンティフィック（Ｖ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ））で、グリセロールを伴なわない１５％レノックスブロスの入っている新たな９６ウエルプレートに移し替え、振とうせずに３７℃で６〜１６時間成長させておいた。
【０２１１】
細胞成長プロトコルは次のとおりであった：１５％レノックスブロス培地を、ポリプロピレンディープウエル９６−ウエルプレート（カリフォルニア州フラートンのベックマン−コールター）に分配した（０．３ｍＬ／ウエル）。細胞を、浅い９６ウエルプレートから、９６ピン長さのピン接種器（Ｖ＆Ｐサイエンティフィック）を用いてディープウエル中に接種し、このプレートを、３インチ幅マイクロポア外科手術用テープ（ミネソタ州セントポールの３Ｍヘルスケア（３Ｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ））で覆った。浅い９６ウエルプレートを、アッセイが完了するまで４℃で保存した。この時、これらは、潜在的に改良されたものとして同定された系統のさらなる検査のために、生存能力のある細胞源として用いられた。ディープウエルプレートの細胞を、３７℃で一晩振とうしつつ（２５０ｒｐｍ）成長させておいた。インキュベーター（イノバ（Ｉｎｎｏｖａ）４３００、ニュージャージー州ニュー・ブランズウイックのニュー・ブランズウイック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ））中の空気を、プラスチックトレー中の濡れたスポンジで湿らせた。
【０２１２】
２．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００洗剤を含むトルエン１０μＬを各々のウエルに添加して、細胞を９６ウエルプレートにおいて浸透化させた。ついでプレートを、ＩＫＡ  ＭＴＳ４シェーカー（ドイツ国スタウフェン（Ｓｔａｕｆｅｎ）のイカ・ヴェルケ社（ＩＫＡ−Ｗｅｒｋｅ  Ｇｍｂｈ））で、最高速度で１０分間振とうした。浸透化された細胞のアリコート（８μＬ）を、バイオメック（Ｂｉｏｍｅｋ）２０００ロボット（ベックマン−コールター）を用いて、９６ウエル反応プレートに移し替えた。これは、基質混合物を白色室内灯から保護するために、赤いプラスチックフィルムで覆われたプレキシガラス（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ）（登録商標）（ペンシルバニア州フィラデルフィアのローム・アンド・ハース（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ））封入物の中に配置されている。室温での反応は、２４μＭ補酵素Ｂ１２、１２ｍＭグリセロール、および０．１Ｍカリウム−ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８中の５０ｍＭ１，３−プロパンジオールを含んでいる基質混合物（赤色灯下に調製され、必要になるまでホイルラップされた容器中に−２０℃で保存されたもの）４０μＬの細胞へのロボットによる添加によって開始された。基質添加の３０秒後、反応物の１２．５μＬアリコート（Ｔ１サンプル）を、第二プレート中に移し替えた。このウエルには、０．４Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７中の３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン（ＭＢＴＨ）１２．５μＬが入っていた。基質添加の約４０分後、この反応物の同様なアリコート（Ｔ２サンプル）を、ＭＢＴＨの入っている第三プレートに移し替えた。この移し替えの少なくとも２０分後、１０ｍＭ  ＨＣｌ中５．５ｍＭ  ＦｅＣｌ３の溶液１２５μＬを、第二および第三（ＭＢＴＨが入っている）プレートの各ウエルに添加した。さらに２０〜６０分後、ＧＤＨ活性と関連する青色を、６７０ｎｍでの吸光度として定量化した（スペクトラマックス（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）１６０プレートリーダー、カリフォルニア州サニーベイルのモレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＳＵｎｎｙｖａｌｅ））。
【０２１３】
プレートリーダーからのデータを、修正マイクロソフト（登録商標）（ワシントン州レッドモンド）エクセルコンピュータプログラムに送った。このプログラムを各反応プレートからの第一（Ｔ１）および第二（Ｔ２）サンプルに合うように、かつプレート、プレート内の位置、および各反応についてのＴ１、Ｔ２、およびＴ２／Ｔ１比を示す結果の表として出力を作成するようにフォーマットした。Ｔ１、Ｔ２、またはＴ２／Ｔ１比について例外的に高い値を示すこれらのサンプルには、さらなる検査のために保持された浅い９６ウエルプレートから出して画線培養した。
【０２１４】
一点ハイスループット力ＧＤＨスクリーニングアッセイ
１，３−プロパンジオールの濃度が約３００ｍＭよりも高い時、ＧＤＨの不活性化は、反応が開始されたほぼ直後に発生する。したがってこれらの条件下、突然変異体をスクリーニングするために、上記の二点高処理能力スクリーニングアッセイを用いることはできない。その理由は、Ｔ１を正確に測定できないからである。高濃度の１，３−プロパンジオールの存在下に改良された総酵素代謝回転数を有する突然変異体についてスクリーニングするために、下記の修正された高処理能力スクリーニングアッセイが開発された。１，３−プロパンジオールバイオ生産のための発酵の後期段階において、１，３−プロパンジオール濃度は、１Ｍにまで達することがある。
【０２１５】
要するに、突然変異体細胞を成長させ、上記のように９６ウエルプレートにおいて浸透化させた。浸透化された細胞のアリコート（８μＬ）を、バイオメック２０００ロボットを用いて、９６ウエル反応プレートに移し替えた。室温での反応は、Ｑｆｉｌｌ２（英国ハンプシャー、ニューミルトンのジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｎｅｗ  Ｍｉｌｔｏｊｎ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ））を用いて、２４μＭ補酵素Ｂ１２、１２ｍＭグリセロール、および０．１Ｍカリウム−ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８中の７２０ｍＭ１，３−プロパンジオールを含んでいる基質４０μＬの細胞への添加によって開始された［このアッセイにおけるグリセロールの最終濃度は１０ｍＭである；このアッセイにおける１，３−プロパンジオールの最終濃度は６００ｍＭである］。室温で約７０分間プレートをインキュベートした後、反応の１２．５μＬアリコートを、バイオメック２０００ロボットを用いて、０．４Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７中のＭＢＴＨ１２．５μＬが入っているウエルを有する第二プレートに移し替えた。産物３−ＨＰの濃度は、二点アッセイについて上記されているように決定した。総酵素代謝回転数（Ｔ（６００））は、スペクトラマックス１６０プレートリーダーを用いて、６７０ｎｍでの吸光度として測定して評価した。
【０２１６】
野生型ＧＤＨおよび異なる酵素速度論的パラメーターを有するいくつかの突然変異体について、二点および一点アッセイを用いて実施されたアッセイの比較結果を、下記の表８に示す。
【０２１７】
【表１１】
2005523690.tif 000012
【０２１８】
各エッセイは、異なる速度パラメーターについてスクリーニングする。しかしながら、一点スクリーニングアッセイを用いて同定されたこれらの突然変異体は、１，３−プロパンジオールのより高い濃度に対してさらに抵抗性があり、一般に改良された安定性およびｋｃａｔの妥当な値を有する。
【０２１９】
実施例１
不対プライマーでの組換え促進性伸長方法を用いた、組換えＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子の発生
２つのＰＡＬ突然変異体遺伝子であるＲＭ１２０−１（配列番号：５）およびＲＭ４９２−１（配列番号：９）を用い、不対プライマーに基づいた本発明の組換え促進性伸長方法を利用して、組換えＤＮＡライブラリーを作製した。これらの遺伝子のどちらも、もとの野生型酵母Ｒ．グルティニス（ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＰＡＬ遺伝子（配列番号：１）から生産された点突然変異体である。
【０２２０】
ＲＭ１２０−１およびＲＭ４９２−１遺伝子は、野生型酵母ＰＡＬに由来する点突然変異体であるので、両方の遺伝子は、同一な５’および３’末端を有する。したがって不対プライマー反応は、各遺伝子の５’または３’への短いＤＮＡフラグメントの付着を必要とする。その場合これら２つのＰＣＲ産物は、不対プライマーを用いる組換え促進性伸長方法のための鋳型として用いられ、この反応の産物がクローニングされ、分析のために配列決定された。
【０２２１】
親遺伝子の５’または３’末端への短いフランキングＤＮＡフラグメントの付着
短いフランキングＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって親遺伝子の５’または３’末端へ付着させた。次のフォワードおよびリバースプライマーを、これらのＰＣＲ反応に用いた。すなわち、２０００ＹＦ１（配列番号：２５）、１８−３’（配列番号：２６）、１８−５’（配列番号：２７）、および２０００ＹＲ１９Ｔ７（配列番号：２８）である。２つのエクスパンドハイフィデリティーＰＣＲ反応は、一般的な方法に記載されている、エクスパンドハイフィデリティーＰＣＲシステム（インディアナ州インディアナポリスのロッシュ・アプライド・サイエンス）を用いて実施された。フォワードプライマー２０００ＹＦ１およびリバースプライマー１８−３’を用いて、ＲＭ１２０−１遺伝子を増幅し、フランキング領域をその５’末端において付着させた。フォワードプライマー１８−５’およびリバースプライマー２０００ＹＲ１９Ｔ７Ｔを用いて、ＲＭ４９２−１を増幅し、フランキング領域をその３’末端において付着させた。ついでこれらのＰＣＲ反応混合物を、１％アガロースゲル上に負荷し、ＰＣＲ産物（約２．２ｋＢ）を、ＱＩＡＥＸＩＩ  ＤＮＡ抽出キット（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ））を用いて、ゲルから精製した。
【０２２２】
不対プライマー方法を用いた組換え促進性突然変異体産物の生産
これら２つの増幅ＰＣＲ産物を、組換えＤＮＡ産物の発生のための鋳型として用いた。さらには次の２つの不対プライマーを用いた。すなわちＰＡＤＨ３１６Ｆ１（配列番号：２９）、およびＴ７Ｔ（配列番号：３０）である。プライマーＰＡＤＨ３１６Ｆ１は、プライマー２０００ＹＦ１（上記のようなもの）によって生産された短いＤＮＡフラグメントの付加によって、ＲＭ１２０−１鋳型の５’末端とアニールする。しかしながらプライマーＰＡＤＨ３１６Ｆ１は、ＲＭ４９２−１鋳型の５’末端に結合しない。同様にプライマーＴ７Ｔは、ＲＭ４９２−１鋳型の３’末端にアニールするが、ＲＭ１２０−１鋳型の３’末端に結合しない。
【０２２３】
次の反応混合物を、反応のために集めた。すなわち、１０ｎｇＲＭ１２０−１鋳型、１０ｎｇＲＭ４９２−１鋳型、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（最終濃度として、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を有する）、３００ｎＭｐＡＤＨ３１６Ｆ１、３００ｎＭＴ７Ｔ、０．９ＵエクスパンドハイフィデリティーＰＣＲシステム（インディアナ州インディアナポリスのロッシュ・アプライド・サイエンス）、および２５μｌまでのｄＨ２Ｏである。熱循環条件は、１０分間９４℃変性；ついで９４℃で３０秒、５０℃で５秒、５５〜７０℃の熱勾配での１サイクルあたり５秒＋１秒の９９サイクル；７分間の７２℃最終伸長；および４℃での保持である。
【０２２４】
この反応に用いられた２つのプライマーは、どちらかの鋳型の５’および３’末端に同時に適合せず、親鋳型のどちらも、この反応の間増幅することはできない。しかしながら５’および３’末端の両方を有するあらゆる組換えＤＮＡ産物は、その後の熱サイクルの間増幅されるであろう。不対プライマー反応後に、これらの反応混合物を、１％アガロースゲル上に負荷した。図２は、不対プライマー反応の結果を示している。左から右へ、合成温度は５０℃〜７０℃であった［ＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジン（マサチューセッツ州ウオルサムのＭＪリサーチ）は、加熱ブロックにおいて直線温度勾配を設定することを可能にする特別な部材（ｆｅａｔｕｒｅ）を提供する］。約６６℃で、多量の２．２ｋＢ  ＰＣＲ産物が、不対プライマー反応から得られた。このサイズの産物が予想されたが、その理由は、鋳型として用いられたもとの親分子それ自体が約２．２ｋＢであったからである。
【０２２５】
組換え促進性突然変異体ライブラリーの作製およびスクリーニング
組換え促進性ＤＮＡ産物を、ＤＮＡ抽出キット（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン）を用いてゲルから精製し、ついでｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミドベクター（カリフォルニア州カールズバッドのインビトロゲン）中に連結反応させた。ついでこの連結反応混合物を、エレクトロポレーションによってＸＬ１−ブルー大腸菌細胞（カリフォルニア州ラジョラのストラタジーン）中に形質変換させた。
【０２２６】
７つのクローンを、分析のためにランダムに選択し、各々からのプラスミドＤＮＡを、プラスミドミニプレップ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット（キアゲン）を用いて精製した。クローンされた挿入物の５’および３’末端を、ＡＢＩ３７７自動シークエンサー（カリフォルニア州フォスターシティーのアプライドバイオシステムズ）で配列決定し、データをベクターＮＴＩプログラム（メリーランド州ベセスタのインフォーマックス社）を用いて管理した。図３は、配列結果を示している。これによって、７つのクローンすべてが、組換え促進性ＤＮＡ産物であると決定された。太字で示されている配列は、親鋳型ＲＭ１２０−１の５’末端への同一性を有する。下線が引かれた配列は、親鋳型ＲＭ４９２−１の３’末端と同一性を有する。この結果は、不対プライマーを用いたこの新規技術が、組換え促進性ＤＮＡ産物を作成するのに効率的な方法であることを証明した。この方法によって作製されたライブラリーにおける親鋳型のコンタミネーションは、検出できなかった。
【０２２７】
実施例２
エラープローンＰＣＲを用いた、遺伝子組換えを追跡するための「分子マーカー」ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子の合成
不対プライマーを用いて組換え促進性伸長方法をさらに調査するために、遺伝子組換えを追跡するための「分子マーカー」として用いることができるいくつかの追加遺伝子を発生させることが必要であった。ＷＭ−６およびＷＭ−７として知られている２つの突然変異体ＰＡＬ遺伝子が、エラープローンＰＣＲ方法を用いてこの実施例において作製される。これらは、酵素活性および基質特異性を改変した。
【０２２８】
エラープローンＰＣＲ
有意に改変された活性および／または基質特異性を有する突然変異体を発生させるために、突然変異体ＰＡＬ遺伝子ＥＰ１８Ｋｍ−６（配列番号：３）を、さらなる突然変異生成のための出発遺伝子として用いた。プライマー１８−５’（配列番号：２７）および１８−３’（配列番号：２６）を用いて、エラープローンＰＣＲによって、ＥＰ１８Ｋｍ−６構築物（米国特許第６，５２１，７４８号）から突然変異体ＰＡＬ遺伝子全体を増幅した。フォワードプライマーの１８−５’プライマーは、ＡＴＧコドンの直前にＸｂａＩ制限酵素部位を含んでいたが、一方で、プライマー１８−３’は、停止コドンの直後にＰｓｔＩ部位を有していた。
【０２２９】
次の３つの戦略を用いて、ＰＣＲエラー率を増加させた。すなわち１）標準的Ｔａｑポリメラーゼを用いた；２）追加反応サイクル（すなわち３５サイクル）を用いた；３）ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰの比を変えた。４つの異なる反応を実施した。したがってｄＮＴＰの１つの濃度は０．１ｍＭであるが、一方、その他の３つのｄＮＴＰの濃度は０．４ｍＭに調節された。
【０２３０】
突然変異体ライブラリーの作製
４つのエラープローン反応の各々からのＰＣＲ産物を、反応の完了後に互いに混合した。ＸｂａＩおよびＰｓｔＩでのエラープローンＰＣＲ産物の消化後、フラグメントを、ＸｂａＩ−ＰｓｔＩ−消化されたＰＣＡ１２Ｋｍに連結反応させた。突然変異体ライブラリーが、大腸菌株ＸＬ１−ブルーへの連結反応混合物の形質変換によって得られた。
【０２３１】
突然変異体ライブラリーのスクリーニングおよびこれらの突然変異体の特性づけ
一般的な方法に記載されているように、５，０００突然変異体コロニーをアガロースプレートから採取し、高処理能力ＰＡＬ／ＴＡＬスクリーニングアッセイを用いてスクリーニングした。スクリーニング結果を確認するために、当初ヒットを、追跡アッセイによってさらに調査した。ＴＡＬおよびＰＡＬ活性は、全細胞アッセイを用いて測定した（一般な方法参照）。次の表（表９）は、エラープローンＰＣＲ反応を開始させるために用いられたＥＰ１８Ｋｍ−６遺伝子と比較した、該２つの突然変異体についての追跡アッセイの結果を要約している。
【０２３２】
【表１２】
2005523690.tif 000013
【０２３３】
両方の突然変異体が、有意に改変された酵素活性を示した。突然変異体ＷＭ−７は、ＴＡＬ／ＰＡＬ比における大きい変化を示したが、これは、この突然変異体における基質特異性の有意な変化を示している。
【０２３４】
突然変異体の配列分析
プラスミドＤＮＡを、プラスミドミニプレップキット（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン）を用いて、これらの突然変異体から精製した。これらの突然変異体遺伝子を、ＡＢＩ３７７自動シークエンサー（アプライド・バイオシステムズ）で配列決定し、データは、ベクターＮＴＩプログラム（インフォーマックス社）を用いて管理した。突然変異体の分析、ついでもとの野生型酵母Ｒ．グルティニスＰＡＬ遺伝子との比較は、これらの突然変異体遺伝子が、次の単一塩基置換突然変異（点突然変異）を含んでいることを示した。
【０２３５】
【表１３】
2005523690.tif 000014
【０２３６】
これらの点突然変異は、実施例４および５に記載されている不対プライマー反応のための分子マーカーとして用いられた。
【０２３７】
実施例３
ＲＭ１２０−７突然変異体ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子のベクターＰＣＡ１２Ｋｍへのクローニング
突然変異体ＲＭ１２０−７を、その既知の分子マーカーに基づいて適切な鋳型遺伝子として同定した。しかしながらこの遺伝子は、ベクターｐＥＴ１７ｂ（米国特許第６，５２１，７４８号）中に作製され、一方、親鋳型分子ＷＭ−６およびＷＭ−７（実施例２からのもの）は、ＰＣＡ１２Ｋｍベクター中に作製された。不対プライマー方法によって生産された組換え体の組換えまたはスクリーニングおよび分析におけるあらゆるバイアスを排除するために、ＲＭ１２０−７遺伝子を、ＰＣＡ１２Ｋｍベクター中にサブクローンした。これによって、全細胞アッセイを用いた各々の遺伝子活性の直接比較が可能になった。
【０２３８】
プライマー１８−５’（配列番号：２７）および１８−３’（配列番号：２６）を用い、一般的な方法に記載されているエクスパンドハイフィデリティーＰＣＲシステム（インディアナ州インディアナポリスのロッシュ）を利用したエクスパンドハイフィデリティーＰＣＲによって、ＲＭ１２０−７突然変異体ＰＡＬ遺伝子（配列番号：７）全体を増幅した。１８−５’プライマーは、ＡＴＧコドンの直前にＸｂａＩ制限酵素部位を含んでおり、プライマーの１８−３’プライマーは、停止コドンの直後にＰｓｔＩ部位を有していた。このＰＣＲ産物は、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩで消化され、ついでＸｂａＩ−ＰｓｔＩ−消化されたＰＣＡ１２Ｋｍへ連結反応させられた。この連結反応混合物は、エレクトロポレーションによって、大腸菌株ＸＬ−１ブルーに形質転換された。いくつかのコロニーをプラスミド調製のために採取した。挿入物全体を、ＡＢＩ３７７自動シークエンサー（アプライド・バイオシステムズ）で配列決定し、データは、ベクターＮＴＩプログラム（インフォーマックス社）を用いて管理した。配列決定の結果は、サブクローニングの間突然変異が導入されないことを示した。
【０２３９】
実施例４
２つの親遺伝子の組換えのための不対プライマー方法を用いた、酵素活性およびＰＡＬ突然変異体のＴＡＬ／ＰＡＬ比の改良
実施例１に示されているように、不対プライマー方法によって作製されたライブラリーに対する組換え効率は、調べられた７クローンのうちの７つにおいて１００％であった。この効率は、以前に公開された方法よりも有意に大きい。したがって突然変異体ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素の酵素活性および基質特異性を改良するためにこの方法を用いることが望ましかった。２つの突然変異体ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子、ＷＭ−６（配列番号：１１）およびＲＭ−１２０−７（配列番号：１３）を、鋳型分子として用いた。
【０２４０】
親遺伝子の５’または３’末端への短いフランキングＤＮＡフラグメントの付着
まず、エクスパンドハイフィデリティーＰＣＲを用いて各親遺伝子を増幅して、これらの鋳型を作製した。次の２対のプライマーを用いた。すなわち、ＷＭ−６の増幅のために１８−５’（配列番号：２７）および２０００ＹＲ１９Ｔ７Ｔ（配列番号：２８）；およびＲＭ１２０−７の増幅のために１８−３’（配列番号：２６）および２０００ＹＦ１（配列番号：２５）である。その結果生じたＰＣＲ産物は各々、もとの遺伝子の５’または３’末端に付加された短いＤＮＡフラグメントを含んでいた。付着されたＤＮＡフラグメントは、不対プライマーを用いた組換え促進性伸長方法のための結合部位として用いられた。増幅された産物は、アガロースゲルから精製され（実施例１に記載されているように）、ついで不対プライマー反応のための親鋳型として用いられた。
【０２４１】
不対プライマー方法を用いた組換え促進性突然変異体産物の生産
実施例１に記載されているように、２つの不対プライマーＰＡＤＨ３１６Ｆ１（配列番号：２９）およびＴ７Ｔ（配列番号：３０）を用いて、２つの親鋳型から、組換え促進性産物（すなわち突然変異体遺伝子）が生産された。ＰＡＤＨ３１６Ｆ１は、プライマー２０００ＹＲ１９Ｔ７Ｔ（上記のようなもの）によって生産された短いＤＮＡフラグメントの付加によって、ＷＭ−６鋳型の５’末端とアニールする。しかしながらプライマーＰＡＤＨ３１６Ｆ１は、ＲＭ１２０−７鋳型の５’末端に結合しない。同様にプライマーＴ７Ｔは、ＲＭ１２０−７鋳型の３’末端にアニールするが、ＷＭ−６鋳型の３’末端に結合しない。
【０２４２】
次の反応混合物を、反応のために集めた。すなわち、１０ｎｇＷＭ−６鋳型、１０ｎｇＲＭ１２０−７鋳型、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（最終濃度として、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を有する）、３００ｎＭｐＡＤＨ３１６Ｆ１、３００ｎＭＴ７Ｔ、０．９Ｕ膨張酵素混合物（ロッシュ）、および２５μｌまでのｄＨ２Ｏである。次の二工程勾配熱循環プロフィールを用いて、最適伸長温度のテストを行なった。すなわち、２分間の９４℃変性；ついで９４℃で３０秒、５０〜７０℃の熱勾配での１サイクルあたり５秒＋１秒の１００サイクル；７分間の７２℃最終伸長；および４℃での保持である。これらの結果から、６６℃の温度が、最も豊富な増幅を生成したと決定された。ついで下に示されているように、二工程熱循環プロフィールにおいてこの温度を用いた：２分間の９４℃変性；ついで９４℃で３０秒、６６℃の１サイクルあたり５秒＋１秒の１００サイクル；７分間の７２℃最終伸長；および４℃での保持である。
【０２４３】
図４は、不対プライマー反応の結果を示している。列Ａは、標準分子量マーカーであり、列Ｂは、２つの親遺伝子の組換えを示し（この実施例）、列Ｃは、３つの親遺伝子の組換えを示している（実施例５で考察される）。予想されているように、サイズが約２．２ｋＢの組換え促進性ＤＮＡフラグメントが得られた。ついでこれらの組換え促進性産物は、キアゲンＤＮＡ抽出キット（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン）を用いて、ゲルから精製された。
【０２４４】
組換え促進性突然変異体ライブラリーの作製およびスクリーニング
組換えＤＮＡフラグメントが、ＳｐｅＩおよびＰｓｔＩで消化され、ついでＸｂａＩ−ＰｓｔＩ−消化されたＰＣＡ１２Ｋｍ中に連結反応させられた。突然変異体ライブラリーが、エレクトロポレーションによるこの連結反応混合物のＸＬ１−ブルー大腸菌細胞への形質転換によって得られた。このライブラリーサイズは、１連結反応あたり百万コロニー超であった。
【０２４５】
４，８００突然変異体コロニーを、アガロースプレートから採取し、一般的な方法に記載されているように、ＰＡＬ／ＴＡＬ高処理能力スクリーニングアッセイによってスクリーニングした。スクリーニング結果を確認するために、当初ヒットを、追跡アッセイによってさらに調査した。ＴＡＬおよびＰＡＬ活性は、全細胞アッセイを用いて測定した（一般的な方法参照）。次の表は、鋳型として用いられた２つの親分子（ＷＭ−６およびＲＭ１２０−７）および３つの興味深い突然変異体（１Ａ−１、１Ａ−２、および１Ａ−３）についての追跡アッセイの結果を要約している。
【０２４６】
【表１４】
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【０２４７】
これらの結果は、出発親遺伝子の酵素活性が、不対プライマーでの組換え促進性伸長方法を用いてこれらの２つの親遺伝子を組換えることによって、実質的に改良されていることを明らかに証明した。親酵素と比較して、突然変異体１Ａ−１のＴＡＬ活性は、約１８倍改良され、そのＰＡＬ活性は、７倍〜１５倍改良された。突然変異体１Ａ−２および１Ａ−３も、酵素活性の改良を示した。
【０２４８】
酵素活性の改良に加えて、突然変異体酵素のＴＡＬ／ＰＡＬ比もまた、親酵素と比較して改良された。ＴＡＬ／ＰＡＬ比は、酵素基質特異性を示している。例えば突然変異体１Ａ−１のＴＡＬ／ＰＡＬ比は、親酵素ＲＭ１２０−７と比較した場合２．６倍改良され、親ＷＭ−６への２０％改良を示した。突然変異体１Ａ−２および１Ａ−３も、ＲＭ１２０−７と比較して改良されたＴＡＬ／ＰＡＬ比を証明した。これらの結果は、親酵素の基質特異性は、不対プライマーでの組換え促進性伸長方法を用いて変更されうるであろうことを証明した。
【０２４９】
突然変異体遺伝子の配列分析
突然変異体１Ａ−１、１Ａ−２、および１Ａ−３からのプラスミドＤＮＡが精製され、これらの突然変異体の各々の遺伝子配列全体が、ＡＢＩ３７７自動シークエンサー（アプライド・バイオシステムズ）で配列決定された。データ管理は、ベクターＮＴＩプログラム（インフォーマックス社）を用いて行なわれた。突然変異体の分析、ついでもとの野生型酵母Ｒ．グルティニスＰＡＬ遺伝子との比較は、突然変異体遺伝子が、次の単一塩基置換突然変異（点突然変異）を含んでいることを示した。
【０２５０】
【表１５】
2005523690.tif 000016
【０２５１】
図５は、これら２つの親遺伝子および３つの組換え促進性突然変異体遺伝子の比較を示している。突然変異は、野生型ヌクレオチド、位置、および突然変異体ヌクレオチドを示すことによって例証されている（すなわち、Ｔ４４５Ｃは、遺伝子中の４４５位の野生型ヌクレオチド「Ｔ」が、「Ｃ」に突然変異されたことを意味する）。アミノ酸置換はカッコに入れて示されている（すなわち、Ｓ１４７Ｐは、セリンからプロリンへのアミノ酸位置１４７における変化を示している）。両方の親遺伝子が、ＥＰ１８Ｋｍ−６からの４つの点突然変異を含んでいるので（表１２において太字で標識されている）、これらの突然変異は、図５には示されなかった。図５に示されているその他の突然変異は、組換え促進性反応のための分子マーカーとしての役割を果たした（斜線によって識別されている突然変異部位は、親ＲＭ１２０−７本来のものであり、一方、黒い突然変異体部位は親ＷＭ−６本来のものであった）。
【０２５２】
これらの結果は、親鋳型の組換えを明らかに証明した。例えば１Ａ−２および１Ａ−３突然変異体は各々、ＲＭ１２０−７からの１つの突然変異（Ｔ４４５Ｃ）およびＷＭ−６からの２つの突然変異（Ｔ９５３ＣおよびＧ１８７０Ａ）を含んでいた。親分子中に存在するその他の３つの突然変異（ＲＭ１２０−７からのＡ６０４；およびＷＭ−６からのＴ７９ＣおよびＡ３７７Ｔ）は、これらの２つの突然変異体において組換えによって除去された。突然変異体１Ａ−１は、ＲＭ１２０−７からのＴ４４５Ｃを例外として、組換えによって親遺伝子中のすべての突然変異を失った。組換え反応はまた、新しい突然変異を突然変異体遺伝子中に導入した。これらの突然変異は、サイレントである（すなわち突然変異体１Ａ−１中のＣ１９８３Ｔおよび突然変異体１Ａ−３中のＧ１６２９Ａ）か、または同類アミノ酸置換を導入した（１Ａ−３中のＡ２１１９Ｇ）。さらには突然変異体１Ａ−３は、７０７位に新しいアミノ酸置換を含んでいた。この場合、イソロイシンがバリンと交換された。
【０２５３】
実施例５
３つの親遺伝子の組換えのための不対プライマー方法を用いた、酵素活性およびＰＡＬ突然変異体のＴＡＬ／ＰＡＬ比の改良
実施例４は、酵素活性および基質特異性が、２つの遺伝子を鋳型として用いた時、不対プライマーでの組換え促進性伸長方法を用いて改良することができることを示した。この実施例の目的は、不対プライマー反応が、酵素活性および基質特異性を改良するために、鋳型分子のプールとともに用いることができることを証明することであった。したがって、ＷＭ−６（配列番号：１１）、ＷＭ−７（配列番号：１３）、およびＲＭ１２０−７（配列番号：７）を親遺伝子として用いて、３つの遺伝子組換えをテストした。
【０２５４】
親遺伝子の５’または３’末端への短いフランキングＤＮＡフラグメントの付着
実施例４に示されているように、エクスパンドハイフィデリティーＰＣＲを用いて、各親遺伝子を増幅し、鋳型を作製した。２対のプライマー（実施例１に記載されているようなもの）を用いた。すなわち、ＷＭ−６およびＷＭ−７の増幅のための１８−５’（配列番号：２７）および２０００ＹＲ１９Ｔ７Ｔ（配列番号：２８）；およびＲＭ１２０−１の増幅のための１８−３’（配列番号：２６）および２０００ＹＦ１（配列番号：２５）である。結果として生じたＰＣＲ産物は各々、もとの遺伝子の５’または３’末端に付加された短いＤＮＡフラグメントを含んでいた。付着されたＤＮＡフラグメントは、不対プライマー反応のための結合部位として用いられた。増幅産物は、実施例１に記載されているようにアガロースゲルから精製され、ついで不対プライマーでの組換え促進性伸長方法用の親鋳型として用いられた。
【０２５５】
不対プライマー方法を用いた組換え促進性突然変異体産物の生産
組換え促進性産物（すなわち突然変異体遺伝子）が、実施例１に記載されているように、２つのプライマーＰＡＤＨ３１６Ｆ１（配列番号：２９）およびＴ７Ｔ（配列番号：３０）を用いて３つの親鋳型から生産された。ＰＡＤＨ３１６Ｆ１は、プライマー２０００ＹＲ１９Ｔ７Ｔ（上記のようなもの）によって生産された短いＤＮＡフラグメントの付加によって、ＷＭ−６およびＷＭ−７鋳型の５’末端とアニールする。しかしながら、プライマーＰＡＤＨ３１６Ｆ１は、ＲＭ１２０−７鋳型の５’末端に結合しない。同様にプライマーＴ７Ｔは、ＲＭ１２０−７鋳型の３’末端にアニールするが、ＷＭ−６またはＷＭ−７鋳型の３’末端に結合しない。次の反応混合物を、この反応のために集めた。すなわち、５ｎｇＷＭ−６鋳型、５ｎｇＷＭ−７鋳型、１０ｎｇＲＭ１２０−７鋳型、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（最終濃度として１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を有する）、３００ｎＭ  ｐＡＤＨ３１６Ｆ１、３００ｎＭＴ７Ｔ、０．９Ｕ膨張酵素混合物（ロッシュ）、および２５μｌまでのｄＨ２Ｏである。
【０２５６】
不対プライマー反応を、実施例４に記載されているように実施した。図４、列Ｃは、不対プライマー反応の結果を示している。ついで組換えＤＮＡ産物（約２．２ｋＢ）が、キアゲンＤＮＡ抽出キットを用いてゲルから精製された。
【０２５７】
組換え促進性突然変異体ライブラリーの作製およびスクリーニング
ＳＰｅＩ−ＰｓｔＩ−消化された組換えＤＮＡフラグメントを、実施例４に記載されているように、ＸｂａＩ−ＰｓｔＩ−消化されたＰＣＡ１２Ｋｍ中に連結反応させた。突然変異体ライブラリーは、ＸＬ１−ブルー大腸菌細胞中への連結反応混合物のエレクトロポレーションによって得られた。４，８００突然変異体コロニーを、実施例４に記載されているようにスクリーニングした。当初ヒットを、スクリーニング結果を確認するために、追跡アッセイによってさらに調査した。ＴＡＬおよびＰＡＬ活性は、全細胞アッセイを用いて測定した。表１３は、２つの興味深い突然変異体についての追跡アッセイの結果を要約している。
【０２５８】
【表１６】
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【０２５９】
実施例４に記載された２遺伝子組換え実験の結果と同様に、上記の結果は、不対プライマーでの組換え促進性伸長方法を用いた３親遺伝子の組換えによって、親酵素と比較して改良された酵素活性および基質特異性を示した。突然変異体３Ａ−１は、３つの親酵素すべてと比較した時、増加した酵素活性を示した。突然変異体３Ａ−２は、親酵素のどれよりも高いＴＡＬ／ＰＡＬ比を有しており、これは基質特異性の変化を示している。
【０２６０】
突然変異体遺伝子の配列分析
プラスミドＤＮＡを、突然変異体３Ａ−１および３Ａ−２から精製し、各組換え促進性遺伝子を配列決定した。これらの突然変異体の分析、ついでもとの野生型酵母Ｒ．グルティニスＰＡＬ遺伝子との比較は、これらの突然変異体遺伝子が、次の単一塩基置換突然変異（点突然変異）を含んでいることを示した。
【０２６１】
【表１７】
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【０２６２】
図６は、３つの親遺伝子および２つの組換え突然変異体遺伝子の比較を示している。ここでもまた、突然変異は、野生型ヌクレオチド、位置、および突然変異体ヌクレオチドを示すことによって例証されている。アミノ酸置換はカッコに入れて示されている。３つの親遺伝子のすべて、および両方の突然変異遺伝子が、ＥＰ１８Ｋｍ−６（表１４では太字で標識されている）からの４つの点突然変異を含んでいるので、これらの突然変異は、この図には示されなかった。
【０２６３】
二遺伝子組換え実験において得られた結果と同様に、図６は、３つの親鋳型の組換えの成功を証明している。突然変異体３Ａ−１は、ＷＭ−６からのＧ１８７０Ａ突然変異を保持したが、親遺伝子中のその他のすべての突然変異は、組換えによって除去された。これらの組換え反応はまた、新しいサイレント突然変異を３Ａ−１（Ｃ６９０Ｔ）中に導入した。興味深いことに、親遺伝子中の突然変異のすべては、突然変異体３Ａ−２において除去された。しかしながらこの突然変異体は、新しい突然変異Ａ１０５５Ｇが、組換え促進性伸長反応によって導入されていた。この単一塩基置換は、アミノ酸位置３５２においてロイシンをアルギニンに変えた。
【０２６４】
実施例６
異なるユニーク制限部位を含んでいるフランキングＤＮＡフラグメントを有する不対プライマーを用いた、組換え促進性伸長方法
不対プライマー反応は、組換え促進性産物（親鋳型ではなく）のみを増幅する。しかしながら、親鋳型が組換え突然変異体遺伝子としてクローニングのために用いられた同じ制限部位を含んでいるならば、突然変異体ライブラリーは、痕跡量の親鋳型でコンタミネーションされることがあるであろう。例えば実施例５において、ＳｐｅＩおよびＰｓｔＩが、組換え突然変異体遺伝子を消化するために用いられた。ＷＭ−６鋳型は、そのフランキング領域にＸｂａＩおよびＰｓｔＩ部位を含んでおり、ＲＭ１２０−７鋳型は、ＳｐｅＩおよびＰｓｔＩ部位を含んでいる。これらの制限部位は、鋳型を発生させるために用いられたプライマーからのものであった。明らかにＷＭ−６鋳型は、コンタミネーション問題を引起こすはずがない。その理由は、これがＳｐｅＩ部位を含んでいないからである。しかしながらＲＭ１２０−７鋳型は、突然変異体ライブラリーにおけるコンタミネーション体（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ）として存在しうるであろう。親鋳型のコンタミネーションを完全にゼロまで減少させるために、次の実験は、様々なプライマーを改変して、ＲＭ１２０−７鋳型を発生させる。その結果として、新しいＲＭ１２０−７鋳型は、そのフランキング領域にＰｓｔＩ部位を含んでいない。
【０２６５】
親遺伝子の５’または３’末端への短いフランキングＤＮＡフラグメントの付着
実施例４に記載されているように、エクスパンドハイフィデリティーＰＣＲを用いて、ＷＭ−６およびＲＭ１２０−７遺伝子を増幅し、鋳型を作製した。しかしながら、ＲＭ１２０−７鋳型を発生させるために、次の新しいプライマーセットを用いた。すなわち、２０００ＹＦ１（配列番号：２５）および１８−３’ＡＣ（配列番号：３１）である。当初、１８−３’プライマー（配列番号：２６）は、ＰｓｔＩ部位（ＣＴＧＣＡＧ）を含んでいた。１８−３’ＡＣ（配列番号：３１）において、ＰｓｔＩ部位は、ＣＴＧＣＡＧをＣＴＧＣＣＧに変えることによって除去されている。
【０２６６】
これらの鋳型は、実施例１に記載されているようにアガロースゲルから精製され、ついで、不対プライマー反応のための親鋳型として用いられた。
【０２６７】
不対プライマー方法を用いた組換え促進性突然変異体産物の作製
実施例４に記載されているように、不対プライマーを用いた組換え促進性伸長方法によって、組換え突然変異体遺伝子が作製された。次の二工程勾配熱循環プロフィールを用いた。すなわち、２分間９４℃変性；ついで９４℃で３０秒、６３〜７０℃の勾配での１サイクルあたり５秒＋１秒の１００サイクル；７分間の７２℃最終伸長；および４℃での保持である。
【０２６８】
組換え促進性産物のゲル分析は、異なる制限部位を有する新しい鋳型を用いた不対プライマー反応が、実施例４において用いられたもとの鋳型と同様に良好に機能したことを示した。
【０２６９】
組換え突然変異体遺伝子は、実施例４に記載されているように、ゲルから精製され、ＳｐｅＩおよびＰｓｔＩで消化され、ついでＸｂａＩ−ＰｓｔＩ−消化されたベクター中にクローンされうる。新しいＲＭ１２０−７鋳型は、もはやＰｓｔＩ部位を含んでいないので、突然変異体ライブラリーにおける親鋳型のコンタミネーションは、実際的にゼロであろう。
【０２７０】
実施例７
ＧＤＨのランダム突然変異生成
エラープローンＰＣＲ増幅を用いて、２つのランダム突然変異体ライブラリーを作製した。第一のものは、肺炎桿菌ＧＤＨのｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３遺伝子を標的とし、第二のものは、主として肺炎桿菌ｄｈａＢ１遺伝子を標的とした。これらのライブラリーの代表的配列分析は、それぞれ１ｋＢあたり約４．２および４．５点突然変異があることを証明した。酵素活性測定は、各ライブラリーにおける突然変異体の約１５〜２５％が活性であると決定した。
【０２７１】
「Ｘｂａ−ライブラリー」の構成：ＧＤＨのα−、β−、およびγ−サブユニットを標的とするランダム突然変異生成
ＧＤＨの３つすべての遺伝子を標的とするランダム発生された突然変異体ライブラリーを作製した。まず、ｄｈａＢ１（１６６８ｂｐ）、ｄｈａＢ２（５８５ｂｐ）、およびｄｈａＢ３（４２６ｂｐ）を含んでなる配列を、次のプライマーを用いたエラープローンＰＣＲによってｐＧＤ２０から増幅した。すなわち、ＤＨＡ−Ｆ１（配列番号：３６）およびＤＨＡ−Ｒ１（配列番号：３７）である。エラープローンＰＣＲを実施するために、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）突然変異生成キット（カリフォルニア州パロアルトのクロンテック・ラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ））を用いた。この反応混合物は、次のものから構成されていた。すなわち、３８μｌＰＣＲグレード水、５μｌ  １０×アドバン・タック・プラス（ＡｄｖａｎＴａｑ  Ｐｌｕｓ）緩衝液、２μｌ  ＭｎＳＯ４（８ｍＭ）、１μｌ  ｄＧＴＰ（２ｍＭ）、１μｌ  ５０×ダイバーシファイ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ）ｄＮＴＰミックス、１μｌプライマーミックス、１μｌ鋳型ＤＮＡ、および１μｌアドバン・タック・プラス・ポリメラーゼである。熱循環反応は、製造業者の指示にしたがって実施した。２．７ｋＢ  ＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化され、連結反応のために調製された。
【０２７２】
ＧＤＨの３つの遺伝子すべてを含んでいる挿入物全体を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ消化を用いて、ｐＧＤ２０構築物から除去することができるが、この挿入物サイズは約２．７ｋＢであり、一方、ベクターサイズは、約２．９ｋＢである。アガロースゲル上でのこれらの２つのフラグメントの分離を容易にするため、ｐＧＤ２０は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、およびＰｓｔＩを用いて消化された。ＰｓｔＩは、ベクターを切断せず、その代わり、挿入物を３つの位置で切断しただけで、この挿入物から４つの小さいフラグメントを生じた。したがって消化されたベクターは、ほかのＤＮＡフラグメントからのコンタミネーションをともなわずにアガロースゲル上で約２．９ｋＢ泳動した。ついでＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ／ＰｓｔＩ消化されたベクターを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ消化されたエラープローンＰＣＲ産物と連結反応させた。エタノール沈殿後、この連結反応混合物は、形質転換の準備ができていた。
【０２７３】
「Ｓｍａ−ライブラリー」の構成：α−サブユニットおよびＧＤＨのβ−サブユニットの一部分を標的とするランダム突然変異生成
次のプライマーを用いて、鋳型としてｐＧＤ２０を用いたエラープローンＰＣＲによって、ｄｈａＢ１遺伝子全体およびｄｈａＢ２遺伝子の約２００ｂｐ部分を増幅した。すなわち、ＤＨＡ−Ｆ１（配列番号：３６）およびＤＨＡ−Ｒ２（配列番号：３８）である。エラープローンＰＣＲ反応を、上記のように、クロンテック突然変異生成を用いて実施した。ついで１．９ｋＢ  ＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで消化された。
【０２７４】
ベクターを調製するために、ｐＧＤ２０プラスミドが、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで消化され（野生型ｄｈａＢ１遺伝子およびｄｈａＢ２遺伝子の一部分を除去し）、ついでアガロースゲルから精製された。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ−消化されたエラープローンＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ−消化されたｐＧＤ２０ベクターと連結反応させた。
【０２７５】
連結反応混合物の形質転換
Ｔ７プロモーターがこの突然変異体ライブラリーに用いられたので、ラムダＤＥ３で溶原化された大腸菌細胞を、突然変異体酵素発現用の宿主細胞として用いた。具体的には、突然変異体ライブラリー構成のために、５Ｋ（ＤＥ３）大腸菌株を用いた。まず、エレクトロポレーション−コンピテント５Ｋ（ＤＥ３）セルを、次のように作製した。２．５ｍＬの一晩細胞培養物を、２Ｌ滅菌フラスコにおいて５００ｍＬのＬＢブロスに添加した。この培養物を、ＯＤ６００が０．５〜０．８に達するまで、シェーカーで３７℃でインキュベートした。ついでこれらの細胞を、１０分間氷上でインキュベートし、ついで４℃で１０分間遠心分離した。これらの細胞を５００ｍＬの氷冷水で一回洗浄した後、これらの細胞を、１０％氷冷グリセロール１〜２ｍＬ中に再懸濁した。アリコート（５０μＬ）を、滅菌エッペンドルフ管で作り、すぐにドライアイスで凍結した。コンピテントセルを、−８０℃で保存した。
【０２７６】
形質転換のために、１μＬの連結反応混合物を、４０μＬのコンピテントセルに添加し、サンプルを、０．１ｃｍギャップを有するエレクトロポレーションキュベット中に移し替えた。エレクトロポレーションのために、１．７ｋｖ／ｃｍの電圧を用いた。これらの細胞を、アンピシリンの存在下にＬＢプレート上で培養し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２７７】
「Ｘｂａ」および「Ｓｍａ」突然変異体ライブラリーのＤＮＡ配列分析
９または１０突然変異体コロニーを、ＤＮＡ配列決定分析のためにランダム採取し、各ライブラリーの完全さ（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を調べた。各突然変異体について、生成された突然変異の数、突然変異の位置、および観察された突然変異の特定の型を決定した。この分析は、塩基置換のすべての型が、これらの突然変異体中に存在することを明らかにした。このことは、特定の突然変異型に対するバイアスの欠如を示している。さらには、分析された１９の突然変異体クローンにおいて１つの欠失突然変異のみが観察された。塩基挿入突然変異は同定されなかった。このことは、突然変異体ライブラリーにおける欠失および挿入の頻度が非常に低いことを示した。平均突然変異率は、Ｘｂａ−ライブラリーにおいて１ｋＢあたり４．２点突然変異、Ｓｍａ−ライブラリーにおいて１ｋＢあたり４．５点突然変異であった。酵素活性測定は、両方のライブラリーにおける突然変異体の約１５〜２５％が活性であることを明らかにした。
【０２７８】
実施例８
ＧＤＨのα−サブユニットの領域的ランダム突然変異生成
ＧＤＨの結晶構造に基づいて（リアオ（Ｌｉａｏ）ら、Ｊ．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９３（１〜２）：８４〜９１ページ（２００３年）；ヤマニシら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６９：４４８４〜４４９４ページ（２００２年））、ＧＤＨのα−サブユニットの次の領域を、領域的ランダム突然変異生成のための標的とした：１）アミノ酸Ｎｏ．１４１〜１５２；２）アミノ酸Ｎｏ．２１９〜２２６；および３）アミノ酸Ｎｏ．３３０〜３４２。これらの領域の各々は、長さがかなり短いので、これら３つの突然変異体ライブラリーを作製するために、オリゴ誘導性突然変異生成方法が用いられた。これは次のような多工程プロセスを含んでいた。すなわち、突然変異されることになる各領域の上流または下流のユニーク制限部位に対応するサイレント突然変異が、まず、クローニングを容易にするために作製された。ついで縮重オリゴヌクレオチドプライマーが調製され、α−サブユニットの標的領域を突然変異するためにＰＣＲ反応において用いられた。これらの突然変異されたＰＣＲフラグメントは、ついで大腸菌中にクローンされ、「ＰｐｕＭＩ−ライブラリー」、「４ＢＲ１−ライブラリー」、および「ＲｓｒＩＩ−ライブラリー」が作製された。
【０２７９】
ｐＧＤ２０へのサイレント突然変異の導入
プラスミドｐＧＤ２０におけるユニーク制限部位の作製のために、各標的領域の上流または下流に１つのサイレント突然変異が生成された。各領域のために点突然変異を作るために、次のプライマーペアが用いられた。各プライマーにおいて大文字の太字体で示されているヌクレオチドは、導入されることになる特異的突然変異の位置を示している。
【０２８０】
【表１８】
2005523690.tif 000019
【０２８１】
突然変異生成実験は、ストラタジーンのクイックチェインジ部位特異的突然変異生成キット（カリフォルニア州ラジョラ）を用いて、製造業者の指示にしたがって実施された。突然変異生成後に、プラスミドを各突然変異体クローンから精製した。点突然変異は、制限酵素消化、ついで直接ＤＮＡ配列分析によって確認された。
【０２８２】
オリゴ誘導性突然変異生成
領域的ランダム突然変異体ライブラリーを作製するため、３つの縮重オリゴヌクレオチドを合成した（下に示されているように、ｐＧＤ２０ＲＭ−Ｆ３、ＴＢ４Ｂ−Ｒ１、およびｐＧＤ２０ＲＭ−Ｒ４）。大文字で示されているヌクレオチドについてのオリゴヌクレオチド合成のために、標準状態を用いた。これに対して、小文字の太字体で示されているヌクレオチドには、合成の間、各プライマーの下に示されている縮重ヌクレオチド混合物を用いた。したがって１〜２点突然変異は、結果としてプライマーの各「縮重領域」を生じると予測された。
【０２８３】
ｐＧＤ２０ＲＭ−Ｆ３（ａ．ａ．１４１−ａ．ａ．１５２領域の場合−「ＰｐｕＭＩライブラリー」）：
５’−  ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ａａｃ  ｃａｇ  ｔｇｃ  ｃａｃ  ｇｔｃ  ａｃｃ  ａａｔ  ｃｔｃ  ａａａ  ｇａｔ  ａａｔ  ｃｃｇ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＴ−３’          （配列番号：４５）
ａ＝  ２％Ｇ、２％Ｃ、および２％Ｔと混合された９４％Ａ；
ｇ＝  ２％Ａ、２％Ｃ、および２％Ｔと混合された９４％Ｇ；
ｃ＝  ２％Ｇ、２％Ａ、および２％Ｔと混合された９４％Ｃ；
ｔ＝  ２％Ｇ、２％Ｃ、および２％Ａと混合された９４％Ｔ。
ＴＢ４Ｂ（ａ．ａ．２．１９−ａ．ａ．２２６領域の場合−「４ＢＲ１ライブラリー」）：
５’−ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ｃａｇ  ｃｔａ  ｃｇｃ  ｃｇａ  ｇａｃ  ｇｇｔ  ｇｔｃ  ｇｇｔ  ｃｔａ  ｃＧＧ  ＣＡＣ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  Ｃ−３’          （配列番号：４６）
ａ＝  ２％Ｇ、２％Ｃ、および２％Ｔと混合された９４％Ａ；
ｇ＝  ２％Ａ、２％Ｃ、および２％Ｔと混合された９４％Ｇ；
ｃ＝  ２％Ａ、２％Ｔ、および２％Ｇと混合された９４％Ｃ；
ｔ＝  ２％Ａ、２％Ｇ、および２％Ｃと混合された９４％Ｔ。
ｐＧＤ２０ＲＭ−Ｒ４（ａ．ａ．３３０−ａ．ａ．３４２領域の場合−「ＲｓｒＩＩライブラリー」）：
５’−ＧＧＴ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＧＧＴ  ＧＣＧ  ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＡＴＣ  ｃｇａ  ｇｔｇ  ｇｇａ  ｇａａ  ａｇｔ  ｃｔｇ  ｇｔｃ  ｇｔｔ  ｇｇｃ  ｇｇａ  ｃｇｃ  ｃａｃ  ｔｔｃ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＧ−３’          （配列番号：４７）
ａ＝  １．６６％Ｇ、１．６６％Ｃ、および１．６６％Ｔと混合された９５％Ａ；
ｇ＝  １．６６％Ａ、１．６６％Ｃ、および１．６６％Ｔと混合された９５％Ｇ；
ｃ＝  １．６６％Ｇ、１．６６％Ａ、および１．６６％Ｔと混合された９５％Ｃ；
ｔ＝  １．６６％Ｇ、１．６６％Ｃ、および１．６６％Ａと混合された９５％Ｔ。
【０２８４】
ついで次のプライマーペアを用いて突然変異生成ＰＣＲフラグメントを生成するために、ハイフィデリティーＰＣＲ反応が実施された：
・ＰｐｕＭＩ−ライブラリー：ｐＧＤ２０ＲＭ−Ｆ３およびＤＨＡ−Ｒ２（配列番号：４５および３８）；
・４ＢＲ１−ライブラリー：ＴＢ４Ｂ−Ｒ１およびＧＤ−Ｃ（配列番号：４６および１９９）；
・ＲｓｒＩＩライブラリー：ＤＨＡ−Ｆ１およびｐＧＤ２０ＲＭ−Ｒ４（配列番号：３６および４７）。
【０２８５】
ＰＣＲフラグメントが、アガロースゲルから精製され、ついで各々ＰｐｕＭＩ／ＸｂａＩ（ＰｐｕＭＩ−ライブラリーの場合）、Ｈｐａｌ／ＸｂａＩ（４ＢＲ−１ライブラリーの場合）、およびＨｉｎｄＩＩＩ／ＲｓｒＩＩ（ＲｓｒＩＩ−ライブラリーの場合）で消化された。
【０２８６】
突然変異体ライブラリーの構成
突然変異されたｐＧＤ２０構築物（ＰｐｕＭＩ、ＨｐａＩ、またはＲｓｒＩＩユニーク制限酵素消化部位が、部位誘導性突然変異生成によって導入されたもの）を、それぞれＰｐｕＭＩ／ＸｂａＩ、Ｈｐａｌ／ＸｂａＩ、またはＨｉｎｄＩＩＩ／ＲｓｒＩＩで消化した。線状化されたベクターを、アガロースゲルから精製し、ついで制限酵素−消化されたＰＣＲ産物と連結反応させた。実施例７に記載されているように、突然変異体ライブラリーは、連結反応混合物を大腸菌株５Ｋ（ＤＥ３）中にエレクトロポレーションすることによって調製した。
【０２８７】
領域的ライブラリーについての配列決定分析
９〜１０突然変異体コロニーを、各領域的ライブラリーからのＤＮＡ配列決定分析のためにランダムに採取した。ＰｐｕＭＩ−ライブラリーの場合、１突然変異体あたりの平均突然変異率は、２．８突然変異（ｎ＝９）であった。４ＢＲ１−ライブラリーにおいて、１突然変異体あたりの平均突然変異率は、２．０突然変異であった（ｎ＝８）。最後に、ＲｓｒＩＩライブラリーからの配列決定データは、１突然変異体あたり２．２突然変異の平均突然変異率を明らかにした（ｎ＝１０）。挿入も欠失も、これら３つのライブラリーのどれにおいても観察されなかった。しかしながら、塩基置換のすべての型が検出されたが、あらゆる特異的突然変異型に対するバイアスがないことを示した。
【０２８８】
実施例９
ランダム突然変異生成によって作製されたＧＤＨ突然変異体ライブラリーのスクリーニングおよび減少した不活性化速度を有するこれらの突然変異体の同定
一般的な方法に記載されている自動二点高処理能力ＧＤＨスクリーニングアッセイを用いて、ＸｂａおよびＳｍａライブラリー（実施例７）およびＰｐｕＭＩ、４ＢＲ１、およびＲｓｒＩＩライブラリー（実施例８）からの約１００，０００突然変異体コロニーをスクリーニングした。第一スクリーンからのすべての推定上の「ヒット」が、追跡アッセイにおいて確認された。突然変異体遺伝子の配列分析、ついで野生型遺伝子との比較によって、各突然変異体遺伝子中に存在する特異的点突然変異の同定が可能になった。
【０２８９】
突然変異体ライブラリーのスクリーニングおよびヒットの確認
約１００，０００突然変異体の第一スクリーニング後、推定上のヒットは、追跡確認アッセイによって確認された。要するに、各推定ヒットを、８ウエルにおいて再アッセイした。各々の個々のクローンからの結果を統計的に分析して、Ｔ１（３０秒の時点で測定されたアルデヒドの量）およびＴ２（４０分の時点で測定されたアルデヒドの量）についての平均および標準偏差を得た。これらの結果を、野生型酵素と比較した。
【０２９０】
図７は、典型的な追跡アッセイ結果を示しており、これは、ｘ軸上のアッセイ数対ｙ軸上のＯＤ６７０ｎｍをプロットしている。クローンＸｂａ３０１０および野生型についてのＴ１およびＴ２における各個別アッセイ（ｎ＝８）からの結果が示されている。平均値は図表的には水平線として示され、カッコ内±標準偏差において数字的に示されている。一般に標準偏差は約１０〜１５％であった。
【０２９１】
スクリーニング結果
表１６は、野生型のものよりも大きいＴ２／Ｔ１比、または野生型のものよりも大きいＴ２のどちらか、またはその両方を有するいくつかのヒットについての追跡アッセイ結果を要約している。Ｔ２／Ｔ１比は、４０分の反応の間、酵素安定性の指標を与える。これは、１，３−プロパンジオールおよびグリセロールの存在下に発生する。Ｔ２は、これが完全に不活性化される前の酵素の総代謝回転数を示す。Ｔ２／Ｔ１比が高くなればなるほど、酵素安定性は良好になる。したがって改良された安定性を有する突然変異体酵素は、野生型酵素と比較した場合、グリセロールおよび１，３−プロパンジオールの存在下の減少した不活性化率を有するであろう。この表において、野生型結果への規準化後、追跡アッセイからのＴ１およびＴ２の平均値が報告されている。表１６はまた、各突然変異体において同定された特異的点突然変異も要約している。
【０２９２】
【表１９】
2005523690.tif 000020
【０２９３】
【表２０】
2005523690.tif 000021
【０２９４】
配列結果から分かるように、大部分の突然変異は、アミノ酸置換と同定された（ただしサイレント突然変異を除く）。しかしながらこれらの突然変異体の２つ（Ｓｍａ３００２およびＸｂａ３００９）は、融合タンパク質であった。具体的には、α−サブユニット（ｄｈａＢ１）をコードする遺伝子の停止コドン（ＴＡＡ）は、それぞれＳｍａ３００２およびＸｂａ３００９において、ＣＡＡ（Ｇｌｎ）またはＧＡＡ（Ｇｌｕ）に変えられた。この停止コドンと、β−サブユニット（ｄｈａＢ２）をコードする遺伝子の最初のコドンとの間に１５ｂｐがあるので、これらの融合タンパク質のどれも、β−サブユニットにおいてフレームシフトを発生させなかった。これによって、両方の突然変異体酵素が活性を保持することができた。β−サブユニットの最初のコドン（ＧＴＧ）は通常、ｆＭｅｔ−ｔＲＮＡによって認識される。しかしながら融合突然変異体において、このコドンは、Ｖａｌ−ｔＲＮＡによって認識されるべきである。Ｓｍａ３００２融合タンパク質は、次の６つのアミノ酸残基からなるリンカーを含んでいた。すなわち、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列番号：４８）である。Ｘｂａ３００９融合タンパク質の場合、このリンカーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列番号：４９）であった。
【０２９５】
実施例１０
純粋融合第一世代ＧＤＨ突然変異体の合理的な突然変異生成
２つの融合突然変異体、Ｘｂａ３００９（配列番号：１０７）およびＳｍａ３００２（配列番号：１１０）が実施例９において記載された。どちらも融合それ自体に加えて、ほかの突然変異を含んでいた。α−およびβ−融合の効果を調査するために（できればランダム突然変異生成の第一ラウンドから得られた突然変異体をさらに改良するために）、２つの純粋な融合突然変異体（１Ｅ１および２２Ｇ７）が構成された。
【０２９６】
野生型α−サブユニット（ＴＡＡ）の停止コドンは、ＣＡＡ（１Ｅ１）またはＧＡＡ（２２−Ｇ７）に変えられた。この修飾は、単一点突然変異を野生型ＧＤＨプラスミド中に導入することによって達成された。次の２対のプライマーが、点突然変異の作製に用いられた。
【０２９７】
１−Ｅ１突然変異体の場合：
１−Ｅ１−Ｆ１：  ５’−ｇａｃ  ａｃｃ  ａｔｔ  ｇａａ  Ｃａａ  ｇｇｃ  ｇｇｔ  ａｔｔ  ｃｃｔ−３’    （配列番号：５０）
１−Ｅ１−Ｒ１：  ５’−ａｇｇ  ａａｔ  ａｃｃ  ｇｃｃ  ｔｔＧ  ｔｔｃ  ａａｔ  ｇｇｔ  ｇｔｃ−３’    （配列番号：５１）
２２−Ｇ７突然変異体の場合：
２２−Ｇ７−Ｆ１：
５’−ｃｃｃ  ｇａｃ  ａｃｃ  ａｔｔ  ｇａａ  Ｇａａ  ｇｇｃ  ｇｇｔ  ａｔｔ  ｃｃｔ  ｇｔｇ−３’    （配列番号：５２）
２２−Ｇ７−Ｒ１：
５’−ｃａｃ  ａｇｇ  ａａｔ  ａｃｃ  ｇｃｃ  ｔｔＣ  ｔｔｃ  ａａｔ  ｇｇｔ  ｇｔｃ  ｇｇｇ−３’    （配列番号：５３）
【０２９８】
各プライマーにおける大文字の太字体で示されているヌクレオチドは、導入されることになる特異的突然変異の位置を示している。
【０２９９】
突然変異生成実験は、実施例８に記載されているようにストラタジーン・クイックチェインジ部位誘導性突然変異生成キット（カリフォルニア州ラジョラのストラタジーン）を用いて実施された。これら２つの突然変異体のＴ２／Ｔ１比およびＴ２値は、一般的な方法に記載されているように測定された。これらの結果は、表１７に示されている。
【０３００】
【表２１】
2005523690.tif 000022
【０３０１】
Ｓｍａ３００２（配列番号：１１０）における３つの非融合突然変異のどれかが、１，３−プロパンジオールおよびグリセロールの存在下に酵素の安定性を増すために協調して作用したかどうかを決定するために、３つの追加突然変異体が作製された。これらの突然変異体の各々において、Ｓｍａ３００２（α−Ｙ２７１Ｃ、α−Ｙ５０２Ｈ、またはβ−Ｑ２Ｒ）の３つの非融合突然変異のうちの１つが、単一点突然変異として野生型ＤＮＡ配列を導入して除去された。この結果として、３つのＳｍａ３００２−由来突然変異体が生じた。これらの各々は、Ｓｍａ３００２中に存在するもとの非融合突然変異のうちの２つを含んでいた。単一点突然変異が、ストラタジーン・クイックチェインジ部位誘導性突然変異生成キット（実施例８）および下記の表１８に示されているプライマーを用いて、Ｓｍａ３００２プラスミド中に導入された。
【０３０２】
【表２２】
2005523690.tif 000023
【０３０３】
これらの突然変異体のＴ２／Ｔ１比およびＴ２値は、実施例５に記載されているように測定された。表１９はこの分析の結果を示している。
【０３０４】
【表２３】
2005523690.tif 000024
【０３０５】
実施例１１
ＧＤＨ突然変異体の部位飽和突然変異生成
実施例９において特性づけされた突然変異体中に存在する３つの突然変異部位が、部位飽和突然変異生成を受けた。具体的にはこれらの部位は、γ−Ｔｈｒ５３（突然変異体Ｘｂａ３００９に見られる）、α−Ｌｅｕ５０９（突然変異体Ｘｂａ３０２９に見られる）、およびα−Ｖａｌ２２４（突然変異体４ＢＲ１００１に見られる）であった。飽和突然変異生成ライブラリーを調製するために、１−Ｅ１および８−Ｃ９突然変異体（実施例１０）が、これらの宿主細胞から精製され、下記の表２０に示されている縮重プライマーとともに鋳型として用いられた。
【０３０６】
【表２４】
2005523690.tif 000025
【０３０７】
突然変異生成実験は、ストラタジーン・クイックチェインジ多部位誘導性突然変異生成キット（カリフォルニア州ラジョラのストラタジーン）を用いて、製造業者の指示にしたがって実施され、ＧＤＨ−ＳＭ１、ＧＤＨ−ＳＭ２、ＧＤＨ−ＳＭ３、およびＧＤＨ−ＳＭ４ライブラリーが調製された。プラスミドの大腸菌株５Ｋ（ＤＥ３）中へのエレクトロポレーション後（実施例７に記載されているように）、各ライブラリーからの８８突然変異体コロニーが、一点ＧＤＨアッセイを用いてスクリーニングされた（一般的な方法参照）。具体的にはこのアッセイは、高濃度の１，３−プロパンジオール（６００ｍＭ）の存在下にＴ（６００）（総酵素代謝回転数）を測定する。ついで各スクリーンからのベストヒットが、ＤＮＡ配列分析を受けた。次の表がこれらの結果を示している。
【０３０８】
【表２５】
2005523690.tif 000026
【０３０９】
４つの飽和突然変異体すべて（ＧＤＨ−ＳＭ１−Ｇ１１、ＧＳＨ−ＳＭ２−Ｂ１１、ＧＤＨ−ＳＭ３−Ｄ２、およびＧＤＨ−ＳＭ４−Ｈ２、各々上に太字で示されている）は、これらが由来する親突然変異体遺伝子と比較して、Ｔ（６００）においてさらなる改良を示した。
【０３１０】
実施例１２
２４親遺伝子の組換えのための不対プライマー方法を用いた、ＧＤＨ突然変異体の酵素安定性および不活性化速度の改良
ランダム突然変異生成、合理的設計突然変異生成、および飽和突然変異生成を用いた、グリセロールおよび１，３−プロパンジオールの存在下における不活性化ＧＤＨ率の有意な改良にもかかわらず（実施例７〜１１）、工業的用途のためにはさらなる改良が望ましかった。したがって、実施例９〜１１からの２４グリセロールデヒドラターゼ突然変異体が、本明細書に開示されている不対プライマー方法を用いた、単一組換え促進性伸長反応において親鋳型として用いられた。
【０３１１】
親遺伝子の５’または３’末端への短いフランキングＤＮＡフラグメントの付着
短いフランキングＤＮＡフラグメントが、ＰＣＲによって親遺伝子の５’または３’末端へ付着された。これはその後、不対プライマーを用いて、組換え促進性伸長方法のための結合部位として用いられた。これらの短いフランキングＤＮＡフラグメントはさらに、その結果として生じる突然変異体ライブラリーが確実に痕跡量の親鋳型でコンタミネーションされないようにするためにも有用であった。具体的にはこれは、ユニークＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含んでいる親鋳型の５’領域への付着のための短いフランキングフラグメントの設計によって達成された。これに対して、親鋳型の３’領域に付着されたこれらの短いフランキングＤＮＡフラグメントは、ユニークＸｂａＩ制限酵素部位を有していた。５’領域に付着された短いフランキングＤＮＡフラグメントを有するこれらの鋳型分子は、ＸｂａＩ部位を含んでおらず、３’領域に付着された短いフランキングＤＮＡフラグメントを有する鋳型が、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有していなかったので、このことによって、親鋳型（これのどれも、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩの両方で分裂されなかった）と、組換え産物（これらのすべてが、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位の両方を含んでおり、これによってＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩの両方で分裂された発現ベクター中への迅速クローニングを可能にした）との間の区別が可能になった。したがってその結果として生じた突然変異体ライブラリーは、痕跡量の親鋳型コンタミネーションを含んでいなかった。ＧＤＨを含んでいるプラスミドは、宿主細胞から精製され、実施例１に記載された方法を用いて、エクスパンドハイフィデリティーＰＣＲ反応における鋳型として用いられた。
【０３１２】
具体的には、フォワードプライマーＧＤＨＭ−Ｆ１（配列番号：６３）およびリバースプライマーＧＤＨＭ−Ｒ１（配列番号：６４）が、次の１１鋳型遺伝子を増幅するために用いられた。すなわち、１−Ｅ１（配列番号：１４５）、野生型ＧＤＨ（配列番号：６７）、Ｘｂａ３０２３（配列番号：１０３）、Ｘｂａ３０１０（配列番号：９９）、８−Ｃ９（配列番号：１５１）、４ＢＲ１００１（配列番号：１３７）、Ｘｂａ３０１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）、Ｘｂａ３００８（配列番号：８７）、Ｓｍａ３００３（配列番号：１１３）、Ｘｂａ３０１６（配列番号：９１）、およびＸｂａ３０２０（配列番号：９５）である。ついで、その結果生じたＰＣＲ産物は、等モル比において互いに混合され、「混合物−１」と名付けられた。
【０３１３】
フォワードプライマーＧＤＨＭ−Ｆ２（配列番号：６５）およびリバースプライマーＧＤＨＭ−Ｒ２（配列番号：６６）が、次の１３鋳型遺伝子を増幅するために用いられた。すなわち、Ｘｂａ３００７（配列番号：７１）、Ｘｂａ３０２９（配列番号：７５）、Ｘｂａ３０２５（配列番号：７９）、Ｓｍａ３００９（配列番号：１１７）、Ｓｍａ３０１０（配列番号：１２１）、Ｓｍａ３００８（配列番号：１２５）、ＲｓｒＩＩ００１（配列番号：１３３）、ＰｐｕＭＩ００２（配列番号：１２９）、ＫＧ００５（配列番号：１４１）、ＧＤＨ−ＳＭ１−Ｇ１１（配列番号：１６０）、ＧＤＨ−ＳＭ２−Ｂ１１（配列番号：１６３）、ＧＤＨ−ＳＭ３−Ｄ２（配列番号：１６６）、およびＧＤＨ−ＳＭ４−Ｈ２（配列番号：１６９）である。ついで、その結果生じたＰＣＲ産物は、等モル比において互いに混合され、「混合物−２」と名付けられた。
【０３１４】
これらの増幅された産物が、アガロースゲルから精製され（実施例１に記載されているように）、ついで不対プライマーでの組換え促進性伸長方法のための親鋳型として用いられた。
【０３１５】
不対プライマー方法を用いた、組換え促進性突然変異体産物の生産
組換え促進性産物（すなわち、ＧＤＨ突然変異体遺伝子）が、実施例１に記載されているように、２つのプライマーＰＡＤＨ３１６Ｆ１（配列番号：２９）およびＴ７Ｔ（配列番号：３０）を用いて、上記の２４親鋳型から生産された。ＰＡＤＨ３１６Ｆ１は、配列番号：６３によって生成された短い５’ＤＮＡフラグメントの付加によって、「混合物−１」（すなわち、１−Ｅ１、野生型ＧＤＨ、Ｘｂａ３０２３、Ｘｂａ３０１０、８−Ｃ９、４ＢＲ１００１、Ｘｂａ３０１５、Ｘｂａ３００８、Ｓｍａ３００３、Ｓｍａ３０１６、およびＸｂａ３０２０）におけるこれらの鋳型の５’末端とアニールする。しかしながらプライマーＰＡＤＨ３１６Ｆ１は、「混合物−２」鋳型の５’末端に結合しない。同様にプライマーＴ７Ｔは、「混合物−２」鋳型（すなわち、Ｘｂａ２００７、Ｘｂａ３０２９、Ｘｂａ３０２５、Ｓｍａ３００９、Ｓｍａ３０１０、Ｓｍａ３００８、ＲｓｒＩＩ００１、ＰｐｕＭＩ００２、ＫＧ００５、ＧＤＨ−ＳＭ１−Ｇ１１、ＧＤＨ−ＳＭ２−Ｂ１１、ＧＤＨ−ＳＭ３−Ｄ２、およびＧＤＨ−ＳＭ４−Ｈ２）の３’末端にアニールするが、「混合物−１」鋳型の３’末端に結合しない。
【０３１６】
次の反応混合物が、反応のために集められた。すなわち、１０ｎｇ「混合物−１」、１０ｎｇ「混合物−２」、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（最終濃度として、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を有する）、２８６ｎＭ  ｐＡＤＨ３１６Ｆ１、２８６ｎＭ  Ｔ７Ｔ、０．６２５Ｕ  ホットスタータック（ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ）（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン）、および２５μｌまでのｄＨ２Ｏである。熱循環条件は、２分間９５℃変性；ついで９５℃で３０秒、６３〜６９℃の勾配での１サイクルあたり１秒＋１秒の６０サイクル；７分間の７２℃最終伸長；および４℃での保持である。エッペンドルフマスターサイクル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）勾配５３３１（ニューヨーク州ウエストベリーのエッペンドルフ・サイエンティフィック社（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ））が、熱循環反応に用いられた。組換えＧＤＨ突然変異体遺伝子産物は、約６６〜６７℃で得られた。
【０３１７】
組換え促進性突然変異体ライブラリーの作製およびスクリーニング
組換えＧＤＨ  ＤＮＡ産物（約２．７ｋＢ）が、キアゲンＤＮＡ抽出キットを用いてゲルから精製され、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ついでこのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたｐＧＤ２０ベクターに連結反応された（実施例７）。突然変異体ライブラリーは、実施例７に記載されているように、エレクトロポレーションによる連結反応混合物の大腸菌株５Ｋ（ＤＥ３）への形質転換によって得られた。このライブラリーサイズは、１連結反応あたり３０万コロニー超であった。
【０３１８】
６，０００〜７，０００突然変異体コロニーが、アガロースプレートから採取され、一般的な方法に記載されているように、一点高処理能力ＧＤＨスクリーニングアッセイを用いてスクリーニングされた。一次スクリーニング後、推定ヒットが、追跡確認アッセイによって確認された。要するに、各推定ヒットは、８ウエルにおいて再アッセイされた。各個別クローンからの結果が統計的に分析され、Ｔ（６００）（高濃度の１，３−プロパンジオールの存在下における総酵素代謝回転数）についての平均および標準偏差が得られた。
【０３１９】
さらにはいくつかのヒットが、これらのヒットについての当初反応速度および不活性化を大雑把に評価するために、二点ＧＤＨアッセイ（一般的な方法）を用いてさらに調査された。既に記載されているように、Ｔ１値は酵素のｋｃａｔを大雑把に反映し、Ｔ２値は総酵素代謝回転数を示し、Ｔ２／Ｔ１比は酵素の安定性を示している（例えば酵素不活性化の減少は、結果としてＴ２／Ｔ１比の増加を生じるであろう）。
【０３２０】
表２２は、いくつかの組換え促進性ＧＤＨ突然変異体についてのこれらの様々なアッセイの結果を要約している。
【０３２１】
【表２６】
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【０３２２】
異なる組換えＧＤＨ突然変異体は、異なる酵素反応速度を示した（同様なＴ（６００）値を有するにもかかわらず）が、これは単に、各アッセイが測定するパラメーターの差を反映しているだけである。例えば突然変異体ＳＨＧＤＨ２４およびＳＨＧＤＨ４３は、同一のＴ（６００）値を有していたが、ＳＨＧＤＨ２４は野生型と比較してわずかに改良されたＴ１値を有するだけであったが、一方、ＳＨＧＤＨ４３は大幅に減少したＴ１を有していた。ＳＨＧＤＨ２４の場合、この酵素のｋｃａｔは減少しなかった。これに対して、ＳＨＧＤＨ４３は、大幅に減少したｋｃａｔを有していた。どちらの場合も、ＳＨＧＤＨ２４およびＳＨＧＤＨ４３の両方のＧＤＨ酵素安定性が増加し。したがって総酵素代謝回転数の改良を可能にした。
【０３２３】
これらの結果は、不対プライマー方法を用いた新しい突然変異体の作製によって、ＧＤＨ安定性の実質的な改良を明らかに証明した。具体的には、ランダム突然変異生成を介して得られた最良の突然変異体（実施例９）は、３．３のＴ（６００）を有した（すなわち突然変異体Ｓｍａ３００２）；ランダム突然変異生成およびスクリーニングを通して同定された突然変異体の合理的組合わせ、または部位飽和突然変異生成を用いたこれらの突然変異の半ランダムな組合わせ（実施例１０および１１）は、４．３の最大Ｔ（６００）を有する突然変異体（すなわち突然変異体ＧＤＨ−ＳＭ１−Ｇ１１）を生じた。これに対して、最良のＴ（６００）値は、不対プライマー方法によって作製された突然変異体の場合６．６であった。したがって、本発明の不対プライマーを用いた組換え促進性伸長方法を用いたランダム組換え方法は、以前の合理的および半ランダム方法よりもさらに強力な技術であると結論される。
【０３２４】
突然変異体遺伝子の配列分析
プラスミドＤＮＡが、表２２に記載されている組換えＧＤＨ突然変異体から精製され、各々におけるＧＤＨ遺伝子全体が配列決定された。これらの突然変異体の分析、ついでもとの野生型ＧＤＨ遺伝子配列との比較は、これらの組換え突然変異体遺伝子が、次の単一塩基置換突然変異（点突然変異）を含んでいることを示した。
【０３２５】
【表２７】
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【０３２６】
【表２８】
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【０３２７】
【表２９】
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【０３２８】
興味深いことに、すべての突然変異体（配列番号：１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、および１９６）は、α−β融合突然変異を含んでいた（Ｓｍａ３００２およびＸｂａ３００９突然変異体に当初発見されたように［実施例９］）。このことは、この突然変異が、Ｔ（６００）値の改良にとって非常に重要であることを示している。ＳＨＧＤＨ４３は、４つの新たに作製された突然変異に加えて、４つの異なる親遺伝子（すなわち、４ＢＲ１００１、１−Ｅ１、Ｘｂａ３００８、およびＧＤＨ−ＳＭ１−Ｇ１１）からの突然変異を含んでいた。このことは、少なくとも４つの交差が、組換え促進性ＰＣＲの間に４つの異なる親遺伝子の中に発生したことを示した。ＳＨＧＤＨ２５およびＳＨＧＤＨ５１は、いくつかの新たに作製された突然変異に加えて、３つの親遺伝子（すなわち、ＳＨＧＤＨ２５の場合Ｓｍａ３００３、４ＢＲ１００１、および１−Ｅ１、ＳＨＧＤＨ５１の場合ＲｓｒＩＩ００１、１−Ｅ１、およびＸｂａ３００７）からの突然変異を含んでいた。
【０３２９】
これらの結果は、不対プライマー方法が、良好な組換え効率を有することを確認した。さらには、表２３の９ＧＤＨ突然変異体の各々が、親鋳型のどれにも見られない「新しい」突然変異を有しているので、このことは、不対プライマー方法が、新しい突然変異を組換え促進性産物へ容易に導入しうるという以前の結論を確認した。最後に、単一伸長反応における２４親遺伝子の組換えの技術的成功に基づいて、本明細書に開示されている不対プライマーを用いた組換え促進性伸長方法の信頼性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）が確認される。
【０３３０】
実施例１３
不対プライマー方法への鋳型ニッキング方法の組込み
マートン（Ｍａｒｔｏｎ）ら、（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９（９）：２４２３〜２４２６ページ（１９９１年））は、ＤＮＡニッキングがＰＣＲ組換えを促進すると報告している。具体的にはモートンらは、デオキシリボヌクレアーゼによってニックされた鋳型の使用が、ＰＣＲ反応の間に２つの鋳型間の試験管内組換えを増加させることを発見した。したがってこの鋳型ニッキング方法は、不対プライマーを用いた組換え促進性伸長のために本発明において用いられた技術に容易に組み込むことができた。
【０３３１】
短いＤＮＡフラグメントが、（実施例１に記載されているように）エクスパンドハイフィデリティーＰＣＲ反応を用いて、鋳型Ａの５’末端、または鋳型Ｂの３’末端に付着され、このようにして、不対プライマーを用いた組換え促進性伸長のための２つのＤＮＡ鋳型の使用が可能になる。しかしながら組換え促進性伸長に先立って、鋳型ＡおよびＢは、当業者によく知られた方法を用いて、デオキシリボヌクレアーゼで処理される。この処理は、鋳型がフラグメント化される直前に停止され、したがってＤＮＡ鋳型は、フラグメント化の問題を伴なわずに十分なニッキングサイトを含む。デオキシリボヌクレアーゼ処理されたＤＮＡ鋳型は、ついでゲル精製される。不対プライマーを用いた組換え伸長反応は、これらのデオキシリボヌクレアーゼ処理されたＤＮＡ鋳型を用いて、実施例１に記載されているように実施される。ニックされた鋳型を用いた不対プライマー方法によって作製された突然変異体において得られた組換え効率は、未処理ＤＮＡ鋳型を用いて得られたものよりも高いであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３３２】
【図１】不対プライマーを用いた組換え促進性伸長方法の原理を示している。
【図２】鋳型としてＲＭ１２０−１およびＲＭ４９２−１を用い、不対プライマーを利用した組換え促進性伸長方法のアガロースゲルである。このゲルの一番右よりの列は、標準分子量マーカーである。
【図３】不対プライマーを用いた組換え促進性伸長方法を利用して、ＲＭ１２０−１およびＲＭ４９２−１から生産された７つの組換えＤＮＡ産物の５’および３’末端のＤＮＡ配列分析を示している。
【図４】２つの不対プライマー反応の結果を示すアガロースゲルである。列Ａは、標準分子量マーカーであり、列Ｂは２つの親遺伝子の組換えを示し（実施例４）；列Ｃは３つの親遺伝子の組換えを示している（実施例５）。
【図５】２つの親遺伝子と、二遺伝子組換え実験からの組換え突然変異体遺伝子との間の配列の比較を示している。
【図６】３つの親遺伝子と、三遺伝子組換え実験からの組換え突然変異体遺伝子との間の配列の比較を示している。
【図７】実施例９に記載されているような、典型的なＧＤＨ追跡アッセイの結果を例証している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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