(57)【要約】組換えインフルエンザワクチンとして適切なインフルエンザウイルスを細胞培養生産するためのベクター及び方法を提供する。多重プラスミドインフルエンザウイルス発現システムで使用するための両方向発現ベクターを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）インフルエンザウイルスの複製を許容することが可能な宿主細胞集団にインフルエンザウイルスゲノムを含む複数のベクターを導入する段階と；
ｉｉ）宿主細胞集団を３５℃以下の温度で培養する段階と；
ｉｉｉ）複数のインフルエンザウイルスを回収する段階を含むインフルエンザウイルスの細胞培養生産方法。
【請求項２】
インフルエンザウイルスが弱毒インフルエンザウイルス、低温適応インフルエンザウイルス及び温度感受性インフルエンザウイルスの少なくとも１種を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インフルエンザウイルスが弱毒、温度感受性及び低温適応から構成される群から選択される１種以上の表現型属性をもつ請求項１に記載の方法。。
【請求項４】
インフルエンザウイルスが鼻腔内ワクチン製剤で投与するのに適している請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ａ）インフルエンザＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０ウイルス又はＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０の特徴的生物学的特性を変化させる少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザＡウイルスと、ｂ）インフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６ウイルス又はＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６の特徴的生物学的特性を変化させる少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザＢウイルスの少なくとも１種を含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ａ）インフルエンザＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０のユニークアミノ酸に対応する少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザＡウイルスと、ｂ）インフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６のユニークアミノ酸に対応する少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザＢウイルスの少なくとも１種を含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
インフルエンザウイルスがａ）ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される少なくとも１個の置換アミノ酸を含むインフルエンザＡ株ウイルスと、ｂ）ＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択される少なくとも１個の置換アミノ酸を含むインフルエンザＢ株ウイルスの少なくとも１種を含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
インフルエンザウイルスがａ）ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される少なくとも１個の置換アミノ酸を含むインフルエンザＡ株ウイルスと、ｂ）ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される少なくとも１個の置換アミノ酸を含むインフルエンザＢ株ウイルスの少なくとも１種を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
インフルエンザウイルスが複数の置換アミノ酸を含む請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
複数が２、３、４、５、６、７、８又は９個の置換アミノ酸を含む請求項８に記載の方
法。
【請求項１１】
インフルエンザＢウイルスを含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
インフルエンザＡウイルスを含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）第１のインフルエンザ株の少なくとも６個の内部ゲノムセグメントと、（ｂ）第２のインフルエンザ株の免疫原性インフルエンザ表面抗原をコードする少なくとも１個のゲノムセグメントを含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）弱毒、低温適応、及び／又は温度感受性の第１のインフルエンザ株の少なくとも６個の内部ゲノムセグメントと、（ｂ）第２のインフルエンザ株の免疫原性インフルエンザ表面抗原をコードする少なくとも１個のゲノムセグメントを含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）弱毒、低温適応、及び温度感受性の第１のインフルエンザ株の少なくとも６個の内部ゲノムセグメントと、（ｂ）第２のインフルエンザ株の免疫原性インフルエンザ表面抗原をコードする少なくとも１個のゲノムセグメントを含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）インフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６又はインフルエンザ株Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はインフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６もしくはインフルエンザＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０のユニークアミノ酸に対応する少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザウイルスの少なくとも６個の内部ゲノムセグメントと、（ｂ）別のインフルエンザ株の免疫原性インフルエンザ表面抗原をコードする少なくとも１個のゲノムセグメントを含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）インフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６又はインフルエンザ株Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はインフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６もしくはインフルエンザＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０のユニークアミノ酸に対応する少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザウイルスの６個の内部ゲノムセグメントと、（ｂ）Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６又はＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０以外のインフルエンザ株のＨＡ及びＮＡ抗原をコードする２個のゲノムセグメントを含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）インフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６又はインフルエンザ株Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はインフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６もしくはインフルエンザＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０のユニークアミノ酸に対応する少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザウイルスの７個の内部ゲノムセグメントと、（ｂ）Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６又はＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０以外のインフルエンザ株のＨＡ抗原をコードするゲノムセグメント又はＮＡ抗原をコードするゲノムセグメントのいずれかを含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
複数のプラスミドベクターを導入する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
宿主細胞集団がＶｅｒｏ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３Ｔ細胞、又は
ＣＯＳ細胞の１種以上を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
宿主細胞集団がＭＤＣＫ細胞、２９３Ｔ細胞、及びＣＯＳ細胞の少なくとも２種の混合物を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
宿主細胞集団を約３２℃〜３５℃の温度で培養する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
宿主細胞集団を約３２℃〜約３４℃の温度で培養する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
宿主細胞集団を約３３℃の温度で培養する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
組換えインフルエンザウイルスを回収する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
リアソータントインフルエンザウイルスを回収する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
インフルエンザウイルスを不活化する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の方法により生産されたインフルエンザウイルス。
【請求項２９】
ｉ）インフルエンザウイルスの複製を許容することが可能な宿主細胞集団にインフルエンザＢウイルスゲノムを含む複数のベクターを導入する段階と；
ｉｉ）宿主細胞集団をウイルス複製に許容可能な条件下で培養する段階と；
ｉｉｉ）複数のインフルエンザＢウイルスを回収する段階を含むインフルエンザＢウイルスの細胞培養生産方法。
【請求項３０】
インフルエンザＢウイルスのヘルパーフリー細胞培養生産方法であって、インフルエンザＢウイルスゲノムを含む複数のベクターをヘルパーウイルスの不在下に宿主細胞集団に導入する段階を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
宿主細胞集団を３５℃以下の温度で培養する段階を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞集団を約３２℃〜３５℃の温度で培養する段階を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
宿主細胞集団を約３２℃〜約３４℃の温度で培養する段階を含む請求項２９に記載の方法。
２に記載の方法。
【請求項３４】
宿主細胞集団を約３３℃の温度で培養する段階を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
組換えインフルエンザウイルスを回収する段階を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
リアソータントインフルエンザウイルスを回収する段階を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２９に記載の方法により生産されたインフルエンザウイルス。
【請求項３８】
ｉ）インフルエンザウイルスゲノムを含む複数のベクターをエレクトロポレーションによりＶｅｒｏ細胞集団に導入する段階と；
ｉｉ）Ｖｅｒｏ細胞集団をウイルス複製に許容可能な条件下で培養する段階と；
ｉｉｉ）複数のインフルエンザウイルスを回収する段階を含むインフルエンザウイルスの細胞培養生産方法。
【請求項３９】
インフルエンザウイルスが弱毒、温度感受性及び低温適応から構成される群から選択される１種以上の表現型属性をもつ請求項３８に記載の方法。。
【請求項４０】
インフルエンザウイルスが弱毒、低温適応及び温度感受性インフルエンザウイルスを含む請求項３８に記載の方法。。
【請求項４１】
インフルエンザウイルスが鼻腔内ワクチン製剤で投与するのに適している請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
インフルエンザＢウイルスを含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
インフルエンザＡウイルスを含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
宿主細胞集団を３５℃以下の温度で培養する段階を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
Ｖｅｒｏ細胞を無血清培地で培養する段階を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
ｉ）インフルエンザウイルスの複製を許容することが可能な宿主細胞集団にインフルエンザウイルスゲノムを含む複数のベクターを導入する段階と；
ｉｉ）宿主細胞集団を３５℃以下の温度で培養する段階と；
ｉｉｉ）対象に投与すると免疫応答を誘発することが可能なインフルエンザウイルスを回収する段階を含む組換えインフルエンザウイルスワクチンの生産方法。
【請求項４７】
インフルエンザウイルスが温度感受性、低温適応及び弱毒から構成される群から選択される少なくとも１種の表現型属性をもつ請求項４６に記載の方法。。
【請求項４８】
インフルエンザＢウイルスを含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
インフルエンザＡウイルスを含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
組換えインフルエンザウイルスワクチンがリアソータントインフルエンザウイルスを含む請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
インフルエンザウイルスワクチンが生弱毒インフルエンザウイルスワクチンを含む請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
インフルエンザウイルスを不活化する段階を更に含む請求項４６に記載の方法。
む請求項４１に記載の装置。
【請求項５３】
請求項４６に記載の方法により生産されたインフルエンザウイルスワクチン。
【請求項５４】
第２のプロモーターと両方向ポリアデニル化部位の間に挿入された第１のプロモーター
を含むプラスミドを含む両方向発現ベクター。
【請求項５５】
第１のプロモーターと第２のプロモーターが少なくとも１個のクローニング部位の両側に逆方向に配置されている請求項５４に記載のベクター。
【請求項５６】
両方向ポリアデニル化部位がＳＶ４０ポリアデニル化部位を含む請求項５４に記載のベクター。
【請求項５７】
ｐＡＤ３０００を含む請求項５４に記載のベクター。
【請求項５８】
クローニング部位に挿入されたインフルエンザウイルスゲノムの少なくとも１個のセグメントを含む２本鎖核酸を更に含む請求項５４に記載のベクター。
【請求項５９】
第１のプロモーターと第２のプロモーターがインフルエンザウイルスゲノムのセグメントを含む同一２本鎖ウイルス核酸のどちらかの鎖に機能的に連結されている請求項１に記載のベクター。
【請求項６０】
第２のプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化部位の間に挿入された第１のプロモーターを含むプラスミドを含み、第１のプロモーターと第２のプロモーターがインフルエンザウイルスの少なくとも１個のセグメントの両側に逆方向に配置されている請求項５４に記載のベクター。
【請求項６１】
請求項５４に記載の１種以上の発現ベクターと、細胞、緩衝液、培養培地、説明書、パッケージング材料、及び容器の１種以上を含むキット。
【請求項６２】
インフルエンザウイルスゲノムの少なくとも１個のセグメントを各々含む複数の発現ベクターを含む請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
温度感受性、低温適応及び弱毒から構成される群から選択される少なくとも１種の表現型属性をもつ第１のインフルエンザ株の少なくとも６個の内部ゲノムセグメントを含む複数の発現ベクターを含む請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
複数の発現ベクターが変異体ＨＡ及び／又はＮＡ抗原をコードする核酸ライブラリーを含む請求項６２に記載のキット。
【請求項６５】
インフルエンザウイルスゲノムを含む複数のベクターを含む少なくとも１個の細胞を含む３５℃以下の温度で増殖する細胞培養物を含む組成物。
【請求項６６】
細胞培養培地を更に含む請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
複数のベクターが両方向発現ベクターを含む請求項６５に記載の組成物。
【請求項６８】
両方向発現ベクターが第２のプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化部位の間に挿入された第１のプロモーターを含み、第１のプロモーターと第２のプロモーターがインフルエンザウイルスの少なくとも１個のセグメントの両側に逆方向に配置されている請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
インフルエンザウイルスゲノムを含む複数のベクターを含む少なくとも１個の細胞を含む増殖性細胞培養物と、培養物を３５℃以下の温度に維持するための調節器を含む細胞培養システム。
【請求項７０】
細胞培養培地を更に含む請求項６９に記載の細胞培養システム。
【請求項７１】
複数のベクターが両方向発現ベクターを含む請求項６９に記載の細胞培養システム。
【請求項７２】
両方向発現ベクターが第２のプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化部位の間に挿入された第１のプロモーターを含み、第１のプロモーターと第２のプロモーターがインフルエンザウイルスの少なくとも１個のセグメントの両側に逆方向に配置されている請求項６９に記載の細胞培養システム。
【請求項７３】
ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される位置に１個以上のアミノ酸置換を含むインフルエンザＡウイルス又はＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択される位置に１個以上のアミノ酸置換を含むインフルエンザＢウイルスを含む人工構築組換え又はリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項７４】
インフルエンザウイルスＡがＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含むか又はインフルエンザＢウイルスがＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む請求項７３に記載のインフルエンザウイルス。
【請求項７５】
ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される複数のアミノ酸置換を含む請求項７３に記載のインフルエンザウイルス。
【請求項７６】
ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される複数のアミノ酸置換を含む請求項７３に記載のインフルエンザウイルス。
【請求項７７】
ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される複数のアミノ酸置換を含む請求項７３に記載のインフルエンザウイルス。
【請求項７８】
ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される複数のアミノ酸置換を含む請求項７３に記載のインフルエンザウイルス。
【請求項７９】
ＰＲ８株インフルエンザＡウイルスを含む請求項７３に記載のインフルエンザウイルス。
【請求項８０】
インフルエンザウイルスが温度感受性、低温適応及び弱毒から構成される群から選択される１種以上の表現型属性をもつ請求項７３に記載のインフルエンザウイルス。
【請求項８１】
少なくとも１種の付加的非野生型アミノ酸を更に含む請求項７３に記載のインフルエンザウイルス。
【請求項８２】
インフルエンザウイルスがフェレット弱毒アッセイで少なくとも３．０ｌｏｇ５０の複製低下を示す請求項７３に記載のインフルエンザウイルス。
【請求項８３】
インフルエンザウイルスがフェレット弱毒アッセイで検出不能な複製を示す請求項７３に記載のインフルエンザウイルス。
【請求項８４】
（ａ）ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される位置にアミノ酸置換をもたらす少なくとも１個の突然変異をインフルエンザＡウイルスゲノムに導入するか又はＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択される位置にアミノ酸置換をもたらす少なくとも１個の突然変異をインフルエンザＢウイルスゲノムに導入する段階と；
（ｂ）ウイルスが産生される条件下で突然変異インフルエンザウイルスゲノムを複製する段階を含む温度感受性（ｔｓ）インフルエンザウイルスの生産方法。
【請求項８５】
インフルエンザウイルスＡゲノムがＰＲ８ゲノムを含む請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される置換アミノ酸をコードする少なくとも１個の突然変異をインフルエンザＡウイルスゲノムに導入するか又はＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される置換アミノ酸をコードする少なくとも１個の突然変異をインフルエンザＢウイルスゲノムに導入する段階を含む請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される置換アミノ酸をコードする複数の突然変異をインフルエンザＡウイルスゲノムに導入するか又はＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される置換アミノ酸をコードする複数の突然変異をインフルエンザＢウイルスゲノムに導入する段階を含む請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される複数のアミノ酸置換をもたらす突然変異をインフルエンザＡウイルスゲノムに導入するか又はＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される複数のアミノ酸置換をもたらす突然変異をインフルエンザＢウイルスゲノムに導入する段階を含む請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
突然変異インフルエンザウイルスゲノムを鶏卵で複製する段階を含む請求項８４に記載
の方法。
【請求項９０】
突然変異インフルエンザＡウイルスゲノムを細胞培養で複製する段階を含む請求項８４に記載の方法。
【請求項９１】
ウイルスを鶏卵で増幅する段階を更に含む請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
３５℃以下の温度で細胞を培養する段階を含む請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
細胞培養がＶｅｒｏ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３Ｔ細胞及びＣＯＳ細胞の１種以上を含む請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
（ａ）ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択されるアミノ酸置換をもたらす少なくとも１個の突然変異をインフルエンザＡウイルスゲノムに導入するか又はＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択されるアミノ酸置換をもたらす少なくとも１個の突然変異をインフルエンザＢウイルスゲノムに導入する段階と；
（ｂ）ウイルスが産生される条件下で突然変異インフルエンザウイルスゲノムを複製する段階と；
（ｃ）インフルエンザウイルスを回収する段階を含む生弱毒インフルエンザウイルスワクチンの生産方法。
【請求項９５】
インフルエンザウイルスが少なくとも第２のウイルス株に由来するＨＡ及びＮＡ抗原をコードするゲノムセグメントを含む請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
ＨＡ及びＡ抗原が少なくとも１種のインフルエンザウイルス株に対する防御免疫応答を誘発することが可能である請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される少なくとも１個の導入アミノ酸置換を含む人工構築組換え又はリアソータント温度感受性（ｔｓ）インフルエンザＡウイルス。
【請求項９８】
ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される少なくとも１個の導入アミノ酸置換を含む請求項９７に記載のｔｓインフルエンザＡウイルス。
【請求項９９】
ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される複数の導入アミノ酸置換を含む請求項９７に記載のｔｓインフルエンザＡウイルス。
【請求項１００】
ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される複数の導入アミノ酸置換を含む請求項９７に記載のｔｓインフルエンザＡウイルス。
【請求項１０１】
温度感受性インフルエンザＡウイルスが３９℃で野生型インフルエンザＡウイルスに比較して約２．０〜約５．０ｌｏｇ１０の増殖低下を示す請求項９７に記載のｔｓインフルエンザＡウイルス。
【請求項１０２】
温度感受性インフルエンザＡウイルスが少なくとも約２．０ｌｏｇ１０、少なくとも約３．０ｌｏｇ１０、少なくとも約４．０ｌｏｇ１０、及び少なくとも約４．５ｌｏｇ１０から構成される群から選択される３９℃の増殖低下ｌｏｇ１０値を示す請求項１０１に記載のｔｓインフルエンザＡウイルス。
【請求項１０３】
インフルエンザＡがフェレット弱毒アッセイで野生型インフルエンザＡウイルスに比較して約２．０〜約５．０ｌｏｇ１０の増殖低下を示す請求項９７に記載のｔｓインフルエンザＡウイルス。
【請求項１０４】
フェレット弱毒アッセイにおける増殖低下が少なくとも約２．０ｌｏｇ１０、少なくとも約３．０ｌｏｇ１０、及び少なくとも約４．０ｌｏｇ１０から構成される群から選択される請求項１０３に記載のｔｓインフルエンザＡウイルス。
【請求項１０５】
第２のインフルエンザＡウイルス株に由来するＨＡ又はＮＡ抗原の少なくとも１種をコードする１個以上のゲノムセグメントを含む請求項９７に記載のｔｓインフルエンザＡウイルス。
【請求項１０６】
ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される複数の導入アミノ酸置換を含むインフルエンザＡウイルス又はインフルエンザＡウイルス蛋白質を含む組換え又はリアソータントインフルエンザＡワクチン。
【請求項１０７】
ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される位置に１個以上の導入アミノ酸置換を含むインフルエンザＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え又は単離核酸。
【請求項１０８】
ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される位置に１個以上の導入アミノ酸置換を含む組換え又は単離インフルエンザＡポリペプチド。
【請求項１０９】
ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される少なくとも１個の導入アミノ酸置換を含む人工構築組換え又はリアソータント温度感受性（ｔｓ）インフルエンザＢウイルス。
【請求項１１０】
ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される少なくとも１個の導入アミノ酸置換を含む請求項１０９に記載のｔｓインフルエンザＢウイルス。
【請求項１１１】
ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される複数の導入アミノ酸置換を含む請求項１０９に記載のｔｓインフルエンザＢウイルス。
【請求項１１２】
ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ
５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される複数の導入アミノ酸置換を含む請求項１０９に記載のｔｓインフルエンザＢウイルス。
【請求項１１３】
温度感受性インフルエンザＡウイルスが３９℃で野生型インフルエンザＢウイルスに比較して約２．０〜約５．０ｌｏｇ１０の増殖低下を示す請求項１０９に記載のｔｓインフルエンザＢウイルス。
【請求項１１４】
温度感受性インフルエンザＢウイルスが少なくとも約２．０ｌｏｇ１０、少なくとも約３．０ｌｏｇ１０、少なくとも約４．０ｌｏｇ１０、及び少なくとも約４．５ｌｏｇ１０から構成される群から選択される３９℃の増殖低下ｌｏｇ１０値を示す請求項１１３に記載のｔｓインフルエンザＢウイルス。
【請求項１１５】
インフルエンザＢがフェレット弱毒アッセイで野生型インフルエンザＢウイルスに比較して約２．０〜約５．０ｌｏｇ１０の増殖低下を示す請求項１０９に記載のｔｓインフルエンザＢウイルス。
【請求項１１６】
フェレット弱毒アッセイにおける増殖低下が少なくとも約２．０ｌｏｇ１０、少なくとも約３．０ｌｏｇ１０、及び少なくとも約４．０ｌｏｇ１０から構成される群から選択される請求項１１７に記載のｔｓインフルエンザＢウイルス。
【請求項１１７】
第２のインフルエンザＢウイルス株に由来するＨＡ又はＮＡ抗原の少なくとも１種をコードする１個以上のゲノムセグメントを含む請求項１０９に記載のリアソータントｔｓインフルエンザＢウイルス。
【請求項１１８】
ＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択される複数の導入アミノ酸置換を含むインフルエンザＢウイルス又はインフルエンザＢウイルス蛋白質を含む組換え又はリアソータントインフルエンザＢワクチン。
【請求項１１９】
ＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択される位置に１個以上の導入アミノ酸置換を含むインフルエンザＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え又は単離核酸。
【請求項１２０】
ＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択される１個以上の導入アミノ酸置換を含む組換え又は単離インフルエンザＢポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国仮特許出願第６０／３７５，６７５号(出願日２００２年４月２６日）；第６０／３９４，９８３号(出願日２００２年７月９日）；第６０／４１０，５７６号(出願日２００２年９月１２日）；第６０／４１９，８０２号(出願日２００２年１０月１８日）；第６０／４２０，７０８号(出願日２００２年１０月２３日）；第６０／４５７，６９９号（代理人整理番号２６−０００２５０ＵＳ；出願日２００３年３月２４日）、及び代理人整理番号２６−０００２６０ＵＳ（発明の名称「インフルエンザウイルスの生産用多重プラスミドシステム（Ｍｕｌｔｉ−Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ）」，出願日２００３年４月１０日）の優先権を主張し、前記各出願の開示内容全体を全目的で本明細書に組込む。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスはセグメント化された１本鎖ＲＮＡゲノムを含む内部リボヌクレオプロテインコアとマトリックス蛋白質により裏打ちされた外部リポプロテインエンベロープから構成される。インフルエンザＡ及びＢウイルスは各々負極性をもつ１本鎖ＲＮＡの８個のセグメントを含む。インフルエンザＡゲノムは少なくとも１１種のポリペプチドをコードする。セグメント１−３はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリマーを構成する３種のポリペプチドをコードする。セグメント１はポリメラーゼ複合蛋白質ＰＢ２をコードする。残りのポリメラーゼ蛋白質ＰＢ１及びＰＡは夫々セグメント２及び３によりコードされる。更に、所定のインフルエンザＡ株のセグメント１はＰＢ１コーディング領域内の別の読み枠から産生される小蛋白質ＰＢ１−Ｆ２をコードする。セグメント４は感染中の細胞接着及び侵入に関与するヘマグルチニン（ＨＡ）表面糖蛋白質をコードする。セグメント５はウイルスＲＮＡに関連する主要構造成分であるヌクレオキャプシドヌクレオプロテイン（ＮＰ）ポリペプチドをコードする。セグメント６はノイラミニダーゼ（ＮＡ）エンベロープ糖蛋白質をコードする。セグメント７はディファレンシャルスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳される２種のマトリックス蛋白質Ｍ１及びＭ２をコードする。セグメント８はオルタナティブスプライシングされたｍＲＮＡ変異体から翻訳される２種の非構造蛋白質ＮＳ１及びＮＳ２（ＮＥＰ）をコードする。
【０００３】
インフルエンザＢの８個のゲノムセグメントは１１種の蛋白質をコードする。３個の最大遺伝子はＲＮＡポリメラーゼの成分ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡをコードする。セグメント４はＨＡ蛋白質をコードする。セグメント５はＮＰをコードする。セグメント６はＮＡ蛋白質とＮＢ蛋白質をコードする。蛋白質ＮＢ及びＮＡはいずれも２シストロン性ｍＲＮＡのオーバーラップする読み枠から翻訳される。インフルエンザＢのセグメント７も２種の蛋白質Ｍ１及びＢＭ２をコードする。最小セグメントは２種の産物をコードし、ＮＳ１は全長ＲＮＡから翻訳され、ＮＳ２はスプライスｍＲＮＡ変異体から翻訳される。
【０００４】
インフルエンザウイルスに特異的な防御免疫応答を生じることが可能なワクチンは５０年以上前から生産されている。ワクチンは全ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、表面抗原ワクチン及び生弱毒ウイルスワクチンとして特徴付けることができる。これらのワクチン型のいずれも適切な製剤は全身免疫応答を生じることができるが、生弱毒ウイルスワクチンは気道で局所粘膜免疫を刺激することもできる。
【０００５】
ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）は幼児と成人をインフルエンザ疾患から防御する生弱毒ワクチンである（非特許文献１；非特許文献２）。ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）ワクチン株
は現在流布している野生型株に由来するＨＡ及びＮＡ遺伝子セグメントと一般マスタードナーウイルス（ＭＤＶ）に由来する６個の遺伝子セグメントＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ，ＮＰ，Ｍ及びＮＳを含む。ＦｌｕＭｉｓｔのインフルエンザＡ株（ＭＤＶ−Ａ）のＭＤＶは初代ニワトリ腎組織培養で順次温度を下げてｗｔＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ａ／ＡＡ／６／６０）株を連続継代することにより作製された（非特許文献３）。ＭＤＶ−Ａは２５℃で効率的に複製する（ｃａ，低温適応）が、その増殖は３８℃と３９℃に制限される（ｔｓ，温度感受性）。更に、このウイルスは感染させたフェレットの肺では複製しない（ａｔｔ，弱毒）。ｔｓ表現型は気道の最低温領域以外の全領域にその複製を制限することによりヒトでワクチンを弱毒するのに有用であると考えられる。この特性の安定性は動物モデルと臨床試験で実証されている。化学的突然変異誘発により作製されたインフルエンザ株のｔｓ表現型とは対照的に、ＭＤＶ−Ａのｔｓ特性は感染させたハムスターの継代後又は幼児から脱落した単離体で復帰変異しなかった（最近の報告については、非特許文献４参照）。
【０００６】
１２種の別個の６：２リアソータント株を含む２０，０００人を超える成人と幼児の臨床試験から、これらのワクチンは弱毒され、安全で有効なことが示されている（非特許文献１；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献２）。ＭＤＶ−Ａの６個の内部遺伝子とｗｔウイルスの２個のＨＡ及びＮＡ遺伝子セグメントをもつリアソータント変異体（６：２リアソータント変異体）はｃａ、ｔｓ及びａｔｔ表現型を常に維持する（非特許文献７）。
【０００７】
現在までに米国で市販されている全インフルエンザワクチンは発育鶏卵で増殖されている。インフルエンザウイルスは鶏卵で良好に増殖するが、ワクチン生産が鶏卵の入手可能性に依存する。鶏卵供給を組織化しなければならず、次の流感時期の数カ月前にワクチン生産用株を選択しなければならないため、このアプローチのフレキシビリティは制限され、生産販売の遅れや不足を生じることが多い。
【０００８】
インフルエンザウイルスの細胞培養生産システムも近年開発されている（例えば、非特許文献８；非特許文献９参照）。一般に、これらの方法は適当な不死化宿主細胞に選択ウイルス株を感染させる。鶏卵でのワクチン生産に関連する問題の多くは解消するが、インフルエンザの全病原株が良好に増殖するわけではなく、既存組織培養法に従って生産できるわけでもない。更に、生弱毒ワクチンの生産に適した望ましい特徴（例えば弱毒、温度感受性及び低温適応）をもつ多くの株は既存方法を使用して組織培養で増殖するのに成功していない。
【０００９】
組換えＤＮＡからインフルエンザウイルスを生産するならば、インフルエンザワクチンの組織培養生産法のフレキシビリティと有用性が著しく増すと思われる。最近、ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡを組込んだ組換えプラスミドからインフルエンザＡウイルスを生産するためのシステムが報告されている（例えば、非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；特許文献１参照）。これらのシステムは任意選択株から免疫原性ＨＡ及びＮＡ蛋白質を発現する組換えウイルスとリアソータントウイルスを生産する可能性を提供している。しかし、インフルエンザＡウイルスと異なり、インフルエンザＢウイルスのプラスミドオンリーシステムについて記載した報告はまだ発表されていない。
【００１０】
更に、現在入手可能なプラスミドオンリーシステムのうちで生弱毒ワクチン生産に適した弱毒、温度感受性、低温適応株を作製するのに適切なものは皆無である。本発明は完全にクローン化ｃＤＮＡからインフルエンザＢウイルスを作製するための８プラスミドシステムと、鼻腔内投与に有用な生ウイルスワクチン製剤等のワクチン製剤に適した弱毒生インフルエンザＡ及びＢウイルスの生産方法、更には明細書から自明の多数の他の利点を提供する。
【特許文献１】ＷＯ０１／８３７９４
【非特許文献１】Ｂｅｌｓｈｅら（１９９８）Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ，ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ，ｔｒｉｖａｌｅｎｔ，ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３８：１４０５−１２
【非特許文献２】Ｎｉｃｈｏｌら（１９９９）Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｌｉｖｅ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ，ｗｏｒｋｉｎｇ  ａｄｕｌｔｓ  ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ＪＡＭＡ  ２８２：１３７−４４
【非特許文献３】Ｍａａｓｓａｂ（１９６７）Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ａｔ  ２５  ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｃ  Ｎａｔｕｒｅ  ２１３：６１２−４
【非特許文献４】Ｍｕｒｐｈｙ  ＆  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ（２００２）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：２９５−３２３
【非特許文献５】Ｂｏｙｃｅら（２０００）Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ａｎｄ  ｕｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ  ｔｏ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２１７−２６
【非特許文献６】Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９４）Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｃｏｌｄ  ａｄａｐｔｅｄ  ａｎｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｄｉｓｅａｓｅ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １６９：６８−７６
【非特許文献７】Ｍａａｓｓａｂら（１９８２）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｌｄ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｆｅｒｒｅｔｓ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １４６：７８０−９００
【非特許文献８】Ｆｕｒｍｉｎｇｅｒ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら（ｅｄｓ）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｐｐ．３２４−３３２
【非特許文献９】Ｍｅｒｔｅｎら（１９９６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｃｏｈｅｎ  ＆  Ｓｈａｆｆｅｒｍａｎ（ｅｄｓ）Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｐ．１４１−１５１
【非特許文献１０】Ｎｅｕｍａｎｎら（１９９９）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｉｒｅｌｙ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：９３４５−９３５０
【非特許文献１１】Ｆｏｄｏｒら（１９９９）Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７３：９６７９−９６８２
【非特許文献１２】Ｈｏｆｆｍａｎｎら（２０００）Ａ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｅｉｇｈｔ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：６１０８−６１１３（発明の要約）
【００１１】
本発明はインフルエンザウイルスの細胞培養生産用多重ベクターシステムと、鼻腔内ワクチン製剤で投与するのに適したワクチン等の生弱毒インフルエンザワクチンを含むワクチンとして適切な組換え及びリアソータントインフルエンザウイルス（例えば弱毒（ａｔｔ）、低温適応（ｃａ）及び／又は温度感受性（ｔｓ）インフルエンザウイルス）の生産方法に関する。
【００１２】
第１の側面において、本発明は例えばヘルパーウイルスの不在下に組換えインフルエンザＢウイルスを細胞培養生産するためのベクターと方法を提供する（即ちヘルパーウイルスフリー細胞培養システム）。本発明の方法はインフルエンザウイルスの複製を許容することが可能な宿主細胞集団にインフルエンザＢウイルスの一部を各々組込んだ複数のベクターを導入する段階を含む。宿主細胞をウイルス増殖に許容可能な条件下で培養し、インフルエンザウイルスを回収する。所定態様では、インフルエンザＢウイルスは弱毒ウイルス、低温適応ウイルス及び／又は温度感受性ウイルスである。例えば、１態様では、ベクター由来組換えインフルエンザＢウイルスは例えば鼻腔内ワクチン製剤で生弱毒ワクチンとして投与するのに適したウイルス等の弱毒、低温適応、温度感受性ウイルスである。典型的態様では、ウイルスはインフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６ウイルスゲノム、（例えばｃａ  Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６ウイルスゲノム）の全部又は一部を組込んだ複数のベクターを導入することにより生産される。
【００１３】
例えば、所定態様では、インフルエンザＢウイルスはインフルエンザ株ｃａ  Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６の特徴的生物学的特性を変化させる１個以上のアミノ酸置換を組込んだ人工構築インフルエンザウイルスである。このようなインフルエンザウイルスはＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４位の１個以上にアミノ酸置換をもたらす突然変異、例えばＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）を含む。温度感受性、低温適応又は弱毒を個々に又は組合せて野生型ウイルスよりも増加する（これらの位置の１個以上の）任意突然変異は本発明に関して適切な突然変異である。
【００１４】
所定態様では、１個のインフルエンザＢ株の少なくとも６個の内部ゲノムセグメントと、別のインフルエンザ株の免疫原性インフルエンザ表面抗原をコードする１個以上のゲノムセグメントを宿主細胞集団に導入する。例えば、選択された弱毒、低温適応及び／又は温度感受性インフルエンザＢ株（例えばＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６のｃａ，ａｔｔ，ｔｓ株又は上記位置の１個以上にアミノ酸置換を含む人工構築インフルエンザＢ株）の少なくとも６個の内部ゲノムセグメントと、別のウイルス株に由来する免疫原性抗原をコードする１個以上のセグメントを宿主細胞集団に導入する。一般に、免疫原性表面抗原としてはヘマグルチニン（ＨＡ）及び／又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原の一方又は両方が挙げられる。免疫原性表面抗原をコードする単一セグメントを導入する態様では、選択されたウイルスの７個の相補的セグメントも宿主細胞に導入する。
【００１５】
特定態様では、インフルエンザＢウイルスゲノムセグメントを組込んだ複数のプラスミドベクターを宿主細胞集団に導入する。例えば、各々異なるゲノムセグメントを組込んだ８種のプラスミドを使用して完全インフルエンザＢゲノムを宿主細胞に導入する。あるいは、もっと小さいゲノム配列を組込んだもっと多数のプラスミドを使用することもできる。
【００１６】
一般に、本発明のプラスミドベクターは両方向発現ベクターである。本発明の両方向発現ベクターは一般に第１のプロモーターと第２のプロモーターを含み、第１のプロモーターと第２のプロモーターはインフルエンザウイルスゲノムのセグメントを含むウイルス核酸をコードする同一２本鎖ｃＤＮＡのどちらかの鎖に機能的に連結されている。場合によ
り、両方向発現ベクターはポリアデニル化シグナル及び／又はターミネーター配列を含む。例えば、ポリアデニル化シグナル及び／又はターミネーター配列は２個のプロモーターの内部のインフルエンザウイルスゲノムのセグメントの両側に配置することができる。本発明に関して有利なポリアデニル化シグナルの１例はＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。本発明の典型的プラスミドベクターは図１に示すプラスミドｐＡＤ３０００である。
【００１７】
ベクターはベクタープロモーターからのインフルエンザウイルスの複製を許容することが可能な宿主細胞に導入する。宿主細胞の有利な例としてはＶｅｒｏ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＣＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、２９３細胞（例えば２９３Ｔ細胞）、及びＣＯＳ細胞が挙げられる。本明細書に記載するｐＡＤ３０００プラスミドベクターと併用するには、Ｖｅｒｏ細胞、２９３細胞、及びＣＯＳ細胞が特に適切である。所定態様では、これらの細胞株の少なくとも２種の混合物の共培養物、例えばＣＯＳ細胞とＭＤＣＫ細胞の組合せ又は２９３Ｔ細胞とＭＤＣＫ細胞の組合せが宿主細胞集団を構成する。
【００１８】
インフルエンザＢベクターを導入した宿主細胞を次にウイルスの複製と集合に許容可能な条件下で培養増殖させる。一般に、本発明のインフルエンザＢプラスミドを導入した宿主細胞を３７℃未満の温度、好ましくは３５℃以下の温度で培養する。一般に、細胞を３２℃〜３５℃の温度で培養する。所定態様では、細胞を約３２℃〜３４℃の温度、例えば約３３℃で培養する。ウイルスを高力価まで複製させるのに適した時間にわたって培養後、組換え及び／又はリアソータントウイルスを回収する。場合により、回収したウイルスを不活化してもよい。
【００１９】
本発明はインフルエンザウイルスの複製を許容することが可能な宿主細胞集団にインフルエンザウイルスゲノムを組込んだ複数のベクターを導入し、細胞を３５℃以下の温度で培養し、インフルエンザウイルスを回収することにより組換えインフルエンザウイルスを細胞培養生産する広く適用可能な方法も提供する。
【００２０】
特定態様では、インフルエンザウイルスゲノムセグメントを組込んだ複数のプラスミドベクターを宿主細胞集団に導入する。特定態様では、各々異なるゲノムセグメントを組込んだ８種のプラスミドを使用して完全インフルエンザゲノムを宿主細胞に導入する。一般に、本発明のプラスミドベクター両方向発現ベクターである。本発明の典型的プラスミドベクターは図１に示すプラスミドｐＡＤ３０００である。
【００２１】
所定態様では、インフルエンザウイルスはインフルエンザＢウイルスに対応する。所定態様では、インフルエンザウイルスはインフルエンザＡウイルスに対応する。特定態様では、方法は対象に例えば鼻腔内投与すると免疫応答を誘発することが可能な組換え及び／又はリアソータントインフルエンザウイルスを回収する段階を含む。所定態様では、投与前にウイルスを不活化し、他の態様では、生きた弱毒ウイルスを投与する。本発明の方法により生産された組換え及びリアソータントインフルエンザＡ及びインフルエンザＢウイルスも本発明の特徴である。
【００２２】
特定態様では、ウイルスとしては弱毒インフルエンザウイルス、低温適応インフルエンザウイルス、温度感受性インフルエンザウイルス、又はこれらの望ましい特性の任意組合せをもつウイルスが挙げられる。１態様では、インフルエンザウイルスはインフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６株ウイルス、例えばＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６の低温適応、温度感受性、弱毒株を含む。別の態様では、インフルエンザウイルスはインフルエンザＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０株ウイルス、例えばＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０の低温適応、温度感受性、弱毒株を含む。本発明の別の態様では、ウイル
スは例えばｃａ  Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はｃａ  Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６の特徴的生物学的特性を変化させる１個以上の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザウイルスである。このような置換アミノ酸はｃａ  Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はｃａ  Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６のユニークアミノ酸に対応するものが有利であり、例えばＡ株ウイルスでは、ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）に対応し、Ｂ株ウイルスでは、ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）に対応する。同様に、温度感受性、低温適応及び／又は弱毒をもたらすこれらの位置のいずれかにおける他のアミノ酸置換も本発明のウイルスと方法に含まれる。
【００２３】
場合により、リアソータントウイルスは選択された例えば病原株の表面抗原（ＨＡ及びＮＡ）をコードするゲノムセグメントと共に、ワクチン生産に関するその有利な特性により選択したウイルス株の６個の内部遺伝子を組込んだベクターを導入することにより生産される。例えば、ＨＡセグメントはワクチン生産に日常的に行われているように病原関連Ｈ１、Ｈ３又はＢ株から選択すると有利である。同様に、ＨＡセグメントはＨ２株（例えばＨ２Ｎ２）、Ｈ５株（例えばＨ５Ｎ１）又はＨ７株（例えばＨ７Ｎ７）等の新興病原株から選択することもできる。あるいは、ＨＡ又はＮＡをコードするセグメントと共に第１の株の７個の相補的遺伝子セグメントを導入してもよい。特定態様では、内部遺伝子セグメントはインフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６又はＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０株に由来する。
【００２４】
更に、本発明はワクチン生産に関して望ましい特性をもつ新規インフルエンザウイルス（例えば温度感受性、弱毒、及び／又は低温適応インフルエンザウイルス）の生産方法と、このような新規インフルエンザウイルスを含むインフルエンザワクチンを提供する。特定態様では、温度感受性表現型に重要であることが本発明で実証された１個以上の特定位置（例えばＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４）にアミノ酸置換をもたらす突然変異を導入することにより新規インフルエンザＡ株ウイルスを生産する。例えば、ヌクレオチド位置ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４、又は特定アミノ酸位置にアミノ酸置換をもたらす他のヌクレオチド位置に突然変異を導入する。温度感受性、低温適応又は弱毒を個々に又は組合せて野生型ウイルスよりも増加する（これらの位置の１個以上の）任意突然変異が本発明に関して適切な突然変異である。例えば、ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から選択される突然変異を野生型インフルエンザＡ株（例えばＰＲ８）のゲノムに導入し、生弱毒ワクチンとして投与するのに適した温度感受性変異体を生産すると有利である。所望表現型の安定性を増すためには、一般に複数の突然変異を導入する。選択された突然変異をインフルエンザゲノムに導入後、ウイルスが産生される条件下で突然変異インフルエンザゲノムを複製する。例えば、突然変異インフルエンザウイルスゲノムを鶏卵で複製することができる。あるいは、インフルエンザウイルスゲノムを細胞培養で複製することができる。後者の場合には、場合により力価を増すためにウイルスを鶏卵で更に増幅してもよい。本発明の方法により生産された温度感受性、及び場合により弱毒及び／又は低温適応ウイルスと、このようなウイルスを含むワクチンも本発明の特徴である。同様に、ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４位に１個以上の突然変異、例えばＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から選択される突然変異を組込んだ新規ウイルス核酸と、このようなアミノ酸置換をもつポリペプチドも本発明の特徴である。
【００２５】
同様に、本発明の方法は１個以上の特定突然変異をインフルエンザＢゲノムに導入することにより温度感受性、及び場合により弱毒及び／又は低温適応表現型をもつ新規インフルエンザＢ株を生産するのにも適している。例えば、ＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から選択される位置にアミノ酸置換をもたらす１個以上の突然変異をインフルエンザＢ株ゲノムに導入し、温度感受性インフルエンザＢウイルスを生産する。典型的アミノ酸置換としては、ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）が挙げられる。上述のように、このようなウイルスを組込んだワクチンと、これらの突然変異とアミノ酸置換を組込んだポリペプチドはいずれも本発明の特徴である。
【００２６】
従って、本発明の突然変異を組込んだインフルエンザウイルスは生産方法に関係なく本発明の特徴である。即ち、本発明は本発明の突然変異を含むインフルエンザ株、例えばＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から選択される１個以上の位置に野生型に比較してアミノ酸置換をもつ任意インフルエンザＡウイルス又はＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から選択される１個以上の位置に野生型に比較してアミノ酸置換をもつ任意インフルエンザＢウイルスに関するが、但し、ｃａ  Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０及びＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６株は本発明の特徴とみなさない。特定好適態様では、夫々インフルエンザＡウイルスはＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から選択される複数の突然変異を含み、インフルエンザＢウイルスはＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ））から選択される複数の突然変異を含む。
【００２７】
１態様では、インフルエンザウイルスゲノムを組込んだ複数のプラスミドベクターを宿主細胞に導入する。例えば、インフルエンザウイルスゲノムのセグメントを少なくとも８種のプラスミドベクターに組込むことができる。１好適態様では、インフルエンザウイルスゲノムのセグメントを８種のプラスミドに組込む。例えば、８種のプラスミドの各々にインフルエンザウイルスゲノムの別のセグメントを組込むと有利である。
【００２８】
本発明のベクターは両方向発現ベクターとすることができる。本発明の両方向発現ベクターは一般に第１のプロモーターと第２のプロモーターを含み、第１のプロモーターと第２のプロモーターはインフルエンザウイルスゲノムのセグメントを含む同一２本鎖ウイルス核酸のどちらかの鎖に機能的に連結されている。場合により、両方向発現ベクターはポリアデニル化シグナル及び／又はターミネーター配列を含む。例えば、ポリアデニル化シグナル及び／又はターミネーター配列は２個のプロモーターの内部のインフルエンザウイルスゲノムのセグメントの両側に配置することができる。本発明に関して有利なポリアデニル化シグナルの１例はＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。本発明の典型的プラスミドベクターは図１に示すプラスミドｐＡＤ３０００である。
【００２９】
ベクタープロモーターからのインフルエンザウイルスの複製を許容することが可能な任意宿主細胞が本発明に関して適切である。宿主細胞の有利な例としてはＶｅｒｏ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＣＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、２９３細胞（例えば２９３Ｔ細胞）、及びＣＯＳ細胞が挙げられる。本明細書に記載するｐＡＤ３０００プラスミドベクターと併用するには、Ｖｅｒｏ細胞、２９３細胞、及びＣＯＳ細胞が特
に適切である。所定態様では、これらの細胞株の少なくとも２種の混合物の共培養物、例えばＣＯＳ細胞とＭＤＣＫ細胞の組合せ又は２９３Ｔ細胞とＭＤＣＫ細胞の組合せが宿主細胞集団を構成する。
【００３０】
本発明の１つの特徴は本発明のプラスミドを導入した宿主細胞を３７℃未満の温度、好ましくは３５℃以下の温度で培養することである。一般に、細胞を３２℃〜３５℃の温度で培養する。所定態様では、細胞を約３２℃〜３４℃の温度、例えば約３３℃で培養する。
【００３１】
本発明の別の側面は培養Ｖｅｒｏ細胞から組換え又はリアソータントインフルエンザＡ又はインフルエンザＢウイルス（即ちインフルエンザＡ及び／又はインフルエンザＢウイルスの野生型及び変異体株）をレスキューするための新規方法に関する。インフルエンザウイルスゲノムを組込んだ複数のベクターをＶｅｒｏ細胞集団にエレクトロポレーションする。ウイルス作製に許容可能な条件下で細胞を増殖させ、例えば低温適応、弱毒、温度感受性ウイルス株の場合には、Ｖｅｒｏ細胞を３７℃未満の温度、好ましくは３５℃以下の温度で増殖させる。一般に、細胞を３２℃〜３５℃の温度で培養する。所定態様では、細胞を約３２℃〜３４℃の温度、例えば約３３℃で培養する。場合により（例えばワクチン生産のためには）、動物由来物質を加えずに無血清培地でＶｅｒｏ細胞を増殖させる。
【００３２】
上記本発明の方法では、インフルエンザゲノムプラスミドを導入した宿主細胞の培養後にウイルスを回収する。所定態様では、回収されるウイルスは組換えウイルスである。所定態様では、ウイルスは２種以上の親ウイルス株に由来する遺伝属性をもつリアソータントインフルエンザウイルスである。場合により、回収した組換え又はリアソータントウイルスを培養細胞又は鶏卵で継代することにより更に増幅してもよい。
【００３３】
場合により、回収したウイルスを不活化してもよい。所定態様では、回収したウイルスはインフルエンザワクチンを含む。例えば、回収したインフルエンザワクチンはインフルエンザＡ又はインフルエンザＢの選択株に由来するＨＡ及び／又はＮＡ抗原をもつリアソータントインフルエンザウイルス（例えば６：２又は７：１リアソータントウイルス）とすることができる。特定の有利な態様では、リアソータントインフルエンザウイルスは弱毒表現型をもつ。場合により、リアソータントウイルスは低温適応及び／又は温度感受性であり、例えば表１７の置換から選択される１個以上のアミノ酸置換をもつ弱毒、低温適応又は温度感受性インフルエンザＢウイルスである。このようなインフルエンザウイルスは例えば選択された例えば病原性インフルエンザ株に特異的な免疫応答の予防発生用生弱毒ワクチンとして有用である。本発明の方法により生産されたインフルエンザウイルス（例えば弱毒リアソータントウイルス）も本発明の特徴である。
【００３４】
別の側面では、本発明はインフルエンザウイルスの複製を許容することが可能な宿主細胞集団にインフルエンザウイルスゲノムを組込んだ複数のベクターを導入する段階と、宿主細胞を３５℃以下の温度で培養する段階と、対象に投与すると免疫応答を誘発することが可能なインフルエンザウイルスを回収する段階を含む組換えインフルエンザウイルスワクチンの生産方法に関する。本発明のワクチンはインフルエンザＡ又はインフルエンザＢ株ウイルスとすることができる。所定態様では、インフルエンザワクチンウイルスとしては弱毒インフルエンザウイルス、低温適応インフルエンザウイルス、又は温度感受性インフルエンザウイルスが挙げられる。特定態様では、ウイルスはこれらの望ましい特性の任意組合せをもつ。１態様では、インフルエンザウイルスはインフルエンザＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０株ウイルスを含む。別の態様では、インフルエンザウイルスはインフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６株ウイルスを含む。あるいは、ワクチンはｃａ  Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はｃａ  Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６の特徴的生物学的特性を変化させる少なくとも１個の置換アミノ酸（例えばこれらの株のユ
ニークアミノ酸）を含む人工構築インフルエンザＡ又はインフルエンザＢウイルスを含む。例えば、本発明のワクチンとしては、ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から選択される位置にアミノ酸置換をもたらす少なくとも１個の突然変異を含む人工構築組換え及びリアソータントインフルエンザＡウイルスと、ＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から選択される位置にアミノ酸置換をもたらす少なくとも１個の突然変異を含む人工構築組換え及びリアソータントインフルエンザＢウイルスが挙げられる。
【００３５】
所定態様では、ウイルスは２種以上のインフルエンザウイルス株に由来するウイルスゲノムセグメントをもつリアソータントインフルエンザウイルス（例えば６：２又は７：１リアソータントウイルス）を含む。例えば、リアソータントインフルエンザウイルスワクチンはワクチン生産に関するその望ましい特性により選択したウイルス株の内部ゲノムセグメントと共に、インフルエンザＡ又はＢの選択株に由来するＨＡ及び／又はＮＡ表面抗原を含むと有利である。多くの場合には、ＨＡ及び／又はＮＡをコードするセグメントが由来するインフルエンザ株は（例えば上述のような）病原株の局地的又は世界的流行の予想に基づいて選択することが望ましい。場合により、内部ゲノムセグメントが由来するウイルス株は例えばＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０、Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６の弱毒、低温適応及び／又は温度感受性インフルエンザ株、又は所望表現型をもたらす１個以上のアミノ酸置換をもつ人工構築インフルエンザ株（例えばＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から選択される位置にアミノ酸置換をもたらす少なくとも１個の突然変異を含むインフルエンザＡウイルスと、ＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から選択される位置にアミノ酸置換をもたらす少なくとも１個の突然変異を含むインフルエンザＢウイルス）である。例えば、有利なリアソータントウイルスとしては、ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む人工構築インフルエンザＡウイルスと、ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から選択される１個以上のアミノ酸置換を含むインフルエンザＢウイルスが挙げられる。
【００３６】
所望により、回収後にインフルエンザワクチンウイルスを不活化する。
【００３７】
本発明の方法により生産されたインフルエンザウイルスワクチン（弱毒生ワクチンを含む）も本発明の特徴である。特定の有利な態様では、インフルエンザウイルスワクチンはリアソータントウイルスワクチンである。
【００３８】
本発明の別の側面は両方向発現ベクターであるプラスミドを提供する。本発明の両方向発現ベクターは第２のプロモーターとポリアデニル化部位（例えばＳＶ４０ポリアデニル化部位）の間に挿入された第１のプロモーターを含む。１態様では、第１のプロモーターと第２のプロモーターは少なくとも１個のクローニング部位の両側に逆方向に配置することができる。本発明の典型的ベクターは図１に示すプラスミドｐＡＤ３０００である。
【００３９】
所定態様では、インフルエンザウイルスゲノムの少なくとも１個のセグメントを例えば２本鎖核酸としてクローニング部位に挿入する。例えば、本発明のベクターは第２のプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化部位の間に挿入された第１のプロモーターをもつプラスミドを含み、第１のプロモーターと第２のプロモーターはインフルエンザウイルスの少なくとも１個のセグメントの両側に逆方向に配置されている。
【００４０】
本発明の１個以上の発現ベクターを含むキットも本発明の特徴である。一般に、キットは更にインフルエンザウイルス複製を許容することが可能な細胞株、緩衝液、培養培地、説明書、パッケージング材料、及び容器の１種以上を含む。所定態様では、キットはインフルエンザウイルスゲノムの少なくとも１個のセグメントを各々含む複数の発現ベクターを含む。例えば、ワクチン生産又は投与に関するその望ましい特性により選択されたウイルス株の内部ゲノムセグメントの１個を各々含む複数の発現ベクターを含むキットが本発明の特徴である。例えば、選択ウイルス株は例えばＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６の弱毒、低温適応及び／又は温度感受性株、又は本明細書（例えば表１７）に記載するような１個以上のアミノ酸置換をもつ人工構築株等の所望特性をもつ代替株とすることができる。１態様では、キットは変異体ＨＡ及び／又はＮＡ抗原をコードする核酸ライブラリーのメンバーを組込んだ発現ベクターを含む。
【００４１】
インフルエンザウイルスゲノムを組込んだ複数のベクターを導入した少なくとも１個の細胞を含む３５℃以下の温度で増殖する細胞培養物も本発明の特徴である。組成物は細胞培養培地も含むことができる。所定態様では、複数のベクターは例えば第２のプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化部位の間に挿入された第１のプロモーターを含む両方向発現ベクターを含む。例えば、第１のプロモーターと第２のプロモーターはインフルエンザウイルスの少なくとも１個のセグメントの両側に逆方向に配置することができる。本発明の細胞培養物は３５℃以下の温度、例えば約３２℃〜３５℃、一般には約３２℃〜約３４℃、例えば約３３℃に維持される。
【００４２】
本発明は更に上述のようなインフルエンザウイルスゲノムを組込んだ複数のベクターを導入した少なくとも１個の細胞の増殖性細胞培養物と、培養物を３５℃以下の温度に維持するための調節器を含む細胞培養システムにも関する。例えば、調節器は細胞培養物を約３２℃〜３５℃に維持すると有利であり、一般には約３２℃〜約３４℃、例えば約３３℃に維持する。
【００４３】
本発明の別の特徴は温度感受性、低温適応及び／又は弱毒を変化させる１個以上のアミノ酸置換を含む人工構築組換え又はリアソータントインフルエンザウイルスである。例えば、ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から選択される位置に１個以上のアミノ酸置換をもつ人工構築インフルエンザＡウイルスと、ＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から選択される位置に１個以上のアミノ酸置換をもつ人工構築インフルエンザＢウイルスが本発明の有利な態様である。典型的態様としては、ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）のアミノ酸置換の任意１個以上をもつインフルエンザＡウイルスと、ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）のアミノ酸置換の任意１個以上をもつインフルエンザＢウイルスが挙げられる。特定態様では、ウイルスは上記位置に複数の突然変異（例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９個のアミノ酸置換）を含む。従って、上記全５個の位置にアミノ酸置換（例えばＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ））をもつ人工構築インフルエンザＡウイルスと、上記位置の８個又は全９個にアミノ酸置換（例えばＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ））をもつ人工構築インフルエンザＢウイルスが本発明に含まれる。更に、ウイルスは上記以外の１個
以上の付加的アミノ酸置換を含むことができる。
【００４４】
特定態様では、人工構築インフルエンザウイルスは温度感受性インフルエンザウイルス、低温適応インフルエンザウイルス及び／又は弱毒インフルエンザである。例えば、本発明による温度感受性インフルエンザウイルスは一般に３９℃で野生型インフルエンザウイルスに比較して約２．０〜約５．０ｌｏｇ１０の増殖低下を示す。例えば、温度感受性ウイルスは３９℃で野生型インフルエンザウイルスに比較して少なくとも約２．０ｌｏｇ１０、少なくとも約３．０ｌｏｇ１０、少なくとも約４．０ｌｏｇ１０、又は少なくとも約４．５ｌｏｇ１０の増殖低下を示す。必ずしもそうでない場合もあるが、一般に、温度感受性インフルエンザウイルスは３３℃で強固な増殖特徴を維持する。本発明の弱毒インフルエンザウイルスは一般にフェレット弱毒アッセイで野生型インフルエンザウイルスに比較して約２．０〜約５．０ｌｏｇ１０の増殖低下を示す。例えば、本発明の弱毒インフルエンザウイルスは一般にフェレット弱毒アッセイで野生型インフルエンザウイルスに比較して少なくとも約２．０ｌｏｇ１０、多くの場合には少なくとも約３．０ｌｏｇ１０、有利には少なくとも約４．０ｌｏｇ１０の増殖低下を示す。
【００４５】
図面の簡単な説明
図１はｐＡＤ３０００プラスミドの模式図。
【００４６】
図２は感染細胞の顕微鏡写真。
【００４７】
図３はプラスミドトランスフェクションからのｒＭＤＶ−Ａ及び６：２Ｈ１Ｎ１リアソータントウイルスのゲノタイピング分析を示す。
【００４８】
図４はインフルエンザＢウイルス生産用の８プラスミドシステムの模式図。
【００４９】
図５はＡ及びＢ．ＲＴ−ＰＣＲによる組換えＭＤＶ−Ｂウイルスの特性決定；Ｃ及びＤ．ＲＴ  ＰＣＲによる組換えＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の特性決定。
【００５０】
図６はＧｅｎｅＢａｎｋフォーマットによるｐＡＤ３０００の配列。
【００５１】
図７はＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【００５２】
図８はインフルエンザＢ株のＨＡ及びＮＡセグメントの同時増幅から誘導されたＲＴ−ＰＣＲ産物。
【００５３】
図９は組換え及びリアソータントウイルスの相対力価を示す棒グラフ。
【００５４】
図１０は許容温度と制限温度下のリアソータントウイルスの相対力価（温度感受性）を示す棒グラフ。
【００５５】
図１１は温度感受性と相関する特定突然変異（ノックイン）を組込んだリアソータントウイルスの模式図（左パネル）と、許容温度と制限温度下の相対力価（温度感受性）（右パネル）を示す。
【００５６】
図１２はミニゲノムアッセイにおけるｔｓ突然変異の測定。Ａ．ＨＥｐ−２細胞にＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ，ＮＰ及びｐＦｌｕ−ＣＡＴをトランスフェクトし，３３℃又は３９℃で１８時間インキュベートし、細胞抽出物のＣＡＴレポーター遺伝子発現を分析した。Ｂ．プライマー伸長アッセイによるＣＡＴ  ｍＲＮＡ発現。
【００５７】
図１３はＰＡ，ＮＰ，及びＭ１蛋白質の野生型残基をもつ三重遺伝子組換え体の模式図。
【００５８】
図１４は単一遺伝子及び二重遺伝子組換えウイルスの増殖をまとめた表。
【００５９】
図１５は非ｔｓ表現型に対応するヌクレオプロテインのアミノ酸残基をまとめた表。
【００６０】
図１６は組換えＰＲ８突然変異体の模式図。ＰＢ１及び／又はＰＢ２遺伝子に導入した突然変異を黒丸で示す。
【００６１】
図１７は３３℃と３９℃の相対力価を示す棒グラフ。
【００６２】
図１８は各種温度におけるＰＲ８突然変異体のプラーク形態を示す顕微鏡写真。ＭＤＣＫ細胞に指定ウイルスを感染させ、３３℃、３７℃、及び３９℃で３日間インキュベートした。ウイルスプラークを免疫染色により可視化し、写真撮影した。
【００６３】
図１９は許容温度と非許容温度の蛋白質合成。ＭＤＣＫ細胞に指定ウイルスを感染させ、３３℃又は３９℃で一晩インキュベートした。放射性標識ポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動させ、オートラジオグラフにかけた。ウイルス蛋白質ＨＡ，ＮＰ，Ｍ１及びＮＳを示す。
【００６４】
図２０はＡ．ＭＤＣＫ細胞での複製に比較したＰｅｒ．Ｃ６細胞でのＭＤＶ−Ａ及びＭＤＶ−Ｂの複製を示す折れ線グラフ；Ｂ．Ｐｅｒ．Ｃ６細胞におけるＭＤＶ−Ａ単一遺伝子リアソータントの複製の変動を示す折れ線グラフ。
（詳細な説明）
【００６５】
多くの病原インフルエンザウイルス株は組織培養では不十分にしか増殖せず、生弱毒ウイルスワクチンの生産に適した株（例えば温度感受性、低温適応及び／又は弱毒インフルエンザウイルス）は商業的生産用培養細胞で増殖させるのに成功していない。本発明は標準細胞培養条件下での増殖に適さないインフルエンザウイルス株の増殖と回収を可能にする多重プラスミドトランスフェクションシステムを提供する。
【００６６】
第１の側面では、本発明の方法は完全にクローン化ＤＮＡから組換えインフルエンザＢウイルスを細胞培養生産するためのベクターと方法を提供する。別の側面では、本発明の方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞ワクチン生産に関して望ましい特性（例えば弱毒病原性又は表現型、低温適応、温度感受性等）をもつウイルス株（Ａ株及びＢ株両者のインフルエンザウイルス）の増殖を許容する組織培養条件の開発にも基づく。クローン化ウイルスゲノムセグメントを組込んだ複数のベクターを宿主細胞に導入し、３５℃以下の温度で培養することによりインフルエンザウイルスを生産する。インフルエンザウイルスゲノムを組込んだベクターをトランスフェクトすると、標準精製法によりワクチンとして適切な組換ウイルスを回収することができる。本発明のベクターシステムと方法を使用すると、ワクチン生産に関するその望ましい特性により選択された株の６個の内部遺伝子セグメントと選択された例えば病原株に由来する免疫原性ＨＡ及びＮＡセグメントを組込んだリアソータントウイルスを迅速且つ効率的に組織培養生産することができる。従って、本明細書に記載するシステムと方法は鼻腔内投与に適したワクチン等の生弱毒ワクチンを含むワクチンとして使用するのに適したウイルスを含む組換え及びリアソータントインフルエンザＡ及びＢウイルスの迅速な細胞培養生産に有用である。
【００６７】
一般に、Ａ及びＢサブタイプの各々に単一マスタードナーウイルス（ＭＤＶ）株を選択する。生弱毒ワクチンの場合には、マスタードナーウイルス株は一般にワクチン生産に関
するその有利な特性（例えば温度感受性、低温適応及び／又は弱毒）により選択される。例えば、典型的マスタードナー株としては夫々Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０及びＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６のこのような温度感受性、弱毒及び低温適応株が挙げられる。本発明はこれらのウイルス株のｃａ、ｔｓ及びａｔｔ表現型をもたらす基礎となる突然変異を解明し、組換え及びリアソータントワクチン生産に関してドナー株として使用するのに適した新規インフルエンザ株の生産方法を提供する。
【００６８】
例えば、選択されたマスタードナーＡ型ウイルス（ＭＤＶ−Ａ）、又はマスタードナーＢ型ウイルス（ＭＤＶ−Ｂ）はウイルスゲノムを構成する複数のクローン化ウイルスｃＤＮＡから生産される。１典型的態様では、８種のクローン化ウイルスｃＤＮＡから組換えウイルスを生産する。一方の鎖に由来するＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）プロモーターｐからウイルスゲノムＲＮＡを転写し、他方の鎖に由来するＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーターからウイルスｍＲＮＡを合成できるように、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ及びＮＳの選択されたＭＤＶ−Ａ又はＭＤＶ−Ｂ配列に相当する８種のウイルスｃＤＮＡをプラスミド（例えばｐＡＤ３０００）等の両方向発現ベクターにクローニングする。場合により、（例えば多重塩基切断部位を除去するために）ＨＡセグメントを含む任意遺伝子セグメントを修飾することができる。
【００６９】
次に、８個のウイルスｃＤＮＡをもつプラスミドを適当な宿主細胞（例えばＶｅｒｏ細胞、共培養ＭＤＣＫ／２９３Ｔ又はＭＤＣＫ／ＣＯＳ７細胞）にトランスフェクトした後に感染性組換えＭＤＶ−Ａ又はＭＤＶ−Ｂウイルスを回収する。本明細書に記載するプラスミドと方法を使用すると、本発明は例えば選択されたウイルス（例えばＭＤＶ−Ａ，ＭＤＶ−Ｂ）の６個の内部遺伝子（ＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ，ＮＰ，Ｍ及びＮＳ）と別の対応型（Ａ又はＢ）インフルエンザウイルスに由来するＨＡ及びＮＡをコトランスフェクトすることにより６：２リアソータントインフルエンザワクチンを作製するのに有用である。例えば、ＨＡセグメントはワクチン生産に日常的に行われているように、病原関連Ｈ１，Ｈ３又はＢ株から選択すると有利である。同様に、ＨＡセグメントはＨ２株（例えばＨ２Ｎ２）、Ｈ５株（例えばＨ５Ｎ１）又はＨ７株（例えばＨ７Ｎ７）等の病原株に関連する新興株から選択することができる。ＭＤＶの７個のゲノムセグメントと選択株のＨＡ又はＮＡ遺伝子を組込んだリアソータント（７：１リアソータント）も生産することができる。更に、このシステムはワクチン生産に関連する表現型特徴（例えば弱毒（ａｔｔ）、低温適応（ｃａ）、及び温度感受性（ｔｓ）表現型）の分子基盤を決定するのにも有用である。
定義
【００７０】
特に定義しない限り、全科学技術用語はこれらの用語が属する分野で一般に使用されていると同一の意味をもつものとする。本発明の目的では、以下の用語は以下のように定義される。
【００７１】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」及び「核酸配列」なる用語は１本鎖又は２本鎖デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマー、又はそのキメラもしくは類似体を意味する。本明細書で使用する場合、この用語は場合により天然ヌクレオチドと同様に１本鎖核酸とハイブリダイズするという点で天然ヌクレオチドの本質的特性をもつ天然ヌクレオチドの類似体のポリマー（例えばペプチド核酸）を含む。特に指定しない限り、本発明の特定核酸配列は明示配列に加えて相補配列も含む。
【００７２】
「遺伝子」なる用語は生物学的機能に関連する任意核酸の意味で広義に使用する。従って、遺伝子はコーディング配列及び／又はその発現に必要な調節配列を含む。「遺伝子」なる用語は特定ゲノム配列と、このゲノム配列によりコードされるｃＤＮＡ又はｍＲＮＡに適用される。
【００７３】
遺伝子は更に、例えば他の蛋白質の認識配列を形成する非発現核酸セグメントも含む。非発現調節配列は転写因子等の調節蛋白質が結合して隣接又は近隣配列の転写を誘導する「プロモーター」と「エンハンサー」を含む。「組織特異的」プロモーター又はエンハンサーとは１又は複数の特定組織型又は細胞型で転写を調節するものである。
【００７４】
「ベクター」なる用語は核酸を生物、細胞、又は細胞成分間に伝搬及び／又は輸送することができる手段を意味する。ベクターとしてはプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、及び人工染色体等の自律複製するか又は宿主細胞の染色体に組込むことができるものが挙げられる。ベクターは裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同一鎖内でＤＮＡとＲＮＡの両者により構成されるポリヌクレオチド、ポリリジン共役ＤＮＡ又はＲＮＡ、ペプチド共役ＤＮＡ又はＲＮＡ、リポソーム共役ＤＮＡ等の自律複製しないものでもよい。本発明のベクターはプラスミドが最も一般的である。
【００７５】
「発現ベクター」とはこれに組込んだ核酸の発現と複製を促進することが可能なベクター（例えばプラスミド）である。一般に、発現させようとする核酸はプロモーター及び／又はエンハンサーに「機能的に連結」され、プロモーター及び／又はエンハンサーにより転写調節制御される。
【００７６】
「両方向発現ベクター」は一般に、両方向に発現を開始して例えば正（＋）ないしセンス鎖及び負（−）ないしアンチセンス鎖ＲＮＡを生じるように、２個のプロモーターの間に配置された核酸に関して逆方向に配置された２個の選択的プロモーターにより特徴付けられる。あるいは、両方向発現ベクターはウイルスｍＲＮＡ及び（ｃＲＮＡとしての）ウイルスゲノムＲＮＡが同一鎖から発現されるアンビセンスベクターでもよい。
【００７７】
本発明に関して、「単離」なる用語はその天然環境で通常付随するか又は相互作用する成分を実質的に含まない生物材料（例えば核酸又は蛋白質）を意味する。単離材料は場合によりその天然環境（例えば細胞）ではその材料と併存しない材料を含む。例えば、単離材料がその天然環境（例えば細胞）にある場合には、その環境に存在する材料が本来存在しない細胞内の位置に配置されている（例えばゲノム又は遺伝子エレメント）。例えば、天然核酸（例えばコーディング配列、プロモーター、エンハンサー等）が非天然手段（例えばプラスミドもしくはウイルスベクター等のベクター又はアンプリコン）によりこの核酸の本来のゲノムの遺伝子座以外の遺伝子座に導入されるならばこの核酸は単離されたことになる。このような核酸を「異種」核酸とも言う。
【００７８】
「組換え」なる用語は材料（例えば核酸又は蛋白質）が人的介入により人工的又は合成的（非天然）に改変されていることを意味する。改変はその天然環境又は状態で材料に実施してもよいし、その天然環境又は状態から除去してもよい。具体的にウイルス（例えばインフルエンザウイルス）について言うと、ウイルスは組換え核酸の発現により生産される場合に組換え体である。
【００７９】
ウイルスに関して「リアソータント」なる用語は、ウイルスが２種以上の親ウイルス株又はソースに由来する遺伝子及び／又はポリペプチド成分を含むことを意味する。例えば、７：１リアソータントは第１の親ウイルスに由来する７個のウイルスゲノムセグメント（又は遺伝子セグメント）と、第２の親ウイルスに由来する（例えばヘマグルチニン又はノイラミニダーゼをコードする）単一相補的ウイルスゲノムセグメントを含む。６：２リアソータントは第１の親ウイルスに由来する６個のゲノムセグメント、最も一般的には６個の内部遺伝子と、第２の親ウイルスに由来する２個の相補的セグメント（例えばヘマグルチニンとノイラミニダーゼ）を含む。
【００８０】
異種又は単離核酸に関して「導入」なる用語は真核又は原核細胞に核酸を組込み、核酸を細胞のゲノムに組込む（例えば染色体、プラスミド、プラスチド又はミトコンドリアＤＮＡ）か、自律レプリコンに変換するか、又は一過的に発現させる（例えばトランスフェクトｍＲＮＡ）ことができることを意味する。この用語は「感染」、「トランスフェクション」、「形質転換」及び「形質導入」のような方法を意味する。本発明に関しては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、脂質によるトランスフェクション（リポフェクション）等の種々の方法を使用して核酸を原核細胞に導入することができる。
【００８１】
「宿主細胞」なる用語はベクター等の異種核酸を含み、核酸の複製及び／又は発現、及び場合によりポリペプチド及び／又はウイルスを含む１種以上のコード化産物の生産を補助する細胞を意味する。宿主細胞は大腸菌等の原核細胞でもよいし、酵母、昆虫、両生類、鳥類又はヒト細胞を含む哺乳動物細胞等の真核細胞でもよい。本発明に関して典型的宿主細胞としてはＶｅｒｏ（アフリカミドリザル腎）細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞（ヒト胚性網膜細胞）、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎）細胞、初代ニワトリ腎（ＰＣＫ）細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎（ＭＤＢＫ）細胞、２９３細胞（例えば２９３Ｔ細胞）、及びＣＯＳ細胞（例えばＣＯＳ１，ＣＯＳ７細胞）が挙げられる。宿主細胞なる用語は例えば種々の細胞型又は細胞株の混合培養物等の細胞組み合わせ又は混合物を含む。
【００８２】
「温度感受性」、「低温適応」及び「弱毒」なる用語は当分野で周知である。例えば、「温度感受性」（「ｔｓ」）なる用語はウイルスがインフルエンザＡ株では３３℃に比較して３９℃で１００倍以上の力価低下を示し、ウイルスがインフルエンザＢ株では３３℃に比較して３７℃で１００倍以上の力価低下を示すことを意味する。例えば、「低温適応」（「ｃａ」）なる用語はウイルスが３３℃におけるその増殖の１００倍以内の増殖を２５℃で示すことを意味する。例えば、「弱毒」（「ａｔｔ」）なる用語はウイルスがフェレットの上気道で複製するが、肺組織では検出できず、動物にインフルエンザ様疾患を誘発しないことを意味する。中間表現型をもつウイルス、即ち３９℃（Ａ株ウイルス）又は３７℃（Ｂ株ウイルス）で１００倍未満の力価低下を示し、３３℃におけるその増殖の１００倍を上回る（例えば２００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍以内）増殖を２５℃で示し、及び／又はフェレットの上気道における増殖に比較して肺で増殖低下（即ち部分弱毒）を示すか及び／又は動物でインフルエンザ様疾患の低下を示し、本明細書に記載するアミノ酸置換の１個以上をもつウイルスも本発明の有用なウイルスであることが理解されよう。増殖は力価、プラークサイズもしくは形態、粒子密度又は当業者に公知の他の尺度により表されるウイルス量を示す。
【００８３】
「人工構築」なる用語は本明細書ではウイルス、ウイルス核酸又はウイルスにコードされる産物（例えばポリペプチド、ワクチン）が組換え法（例えば部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発等）により導入された少なくとも１個の突然変異を含むことを表すために使用する。１個以上のヌクレオチド突然変異及び／又はアミノ酸置換を含むウイルス（又はウイルス成分もしくは産物）について「人工構築」と言う場合には、ウイルス（又はウイルス成分もしくは産物）をコードするウイルスゲノム又はゲノムセグメントが天然起源（例えば天然に存在するか又は非組換え法（例えば２５℃での順次継代）により生産された既存実験室ウイルス株（例えば野生型又は低温適応Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はＢ／ＡｎｎＡｒｂｏｒ／１／６６株））に由来しないことを意味する。
インフルエンザウイルス
【００８４】
インフルエンザウイルスのゲノムは免疫原性ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）蛋白質をコードする直鎖（−）リボ核酸（ＲＮＡ）の８個のセグメントと、６個の内部コアポリペプチド、即ちヌクレオキャプシドヌクレオプロテイン（ＮＰ）；マ
トリックス蛋白質（Ｍ）；非構造蛋白質（ＮＳ）；及び３個のＲＮＡポリメラーゼ（ＰＡ，ＰＢ１，ＰＢ２）蛋白質から構成される。複製中に、ゲノムウイルスＲＮＡは宿主細胞の核で（＋）鎖メッセンジャーＲＮＡと（−）鎖ゲノムｃＲＮＡに転写される。８個のゲノムセグメントの各々はＲＮＡ以外にＮＰとポリメラーゼ複合体（ＰＢ１，ＰＢ２，及びＰＡ）を含むリボヌクレオプロテイン複合体にパッケージングされる。
【００８５】
本発明では、インフルエンザウイルスの操作と生産のために８個のセグメントの各々に対応するウイルスゲノムＲＮＡを組換えベクターに挿入する。本発明に関しては、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、ファージ、及び人工染色体等の種々のベクターを使用することができる。一般に、操作し易くするために、ウイルスゲノムセグメントをプラスミドベクターに挿入し、細菌及び真核細胞で機能的な１個以上の複製起点と、場合によりプラスミド配列を導入した細胞をスクリーニング又は選択するのに適したマーカーを加える。典型的ベクターであるプラスミドｐＡＤ３０００を図１に示す。
【００８６】
本発明のプラスミドベクターは挿入したウイルスゲノムセグメントの転写を両方向に開始すること、即ち（＋）鎖及び（−）鎖ウイルスＲＮＡ分子の両者を生じることが可能な両方向発現ベクターが最も一般的である。両方向転写を行うためには、第１鎖に由来する第１のＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＰｏｌ  Ｉ）によりウイルスゲノムＲＮＡのコピーが転写され、第２のＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＰｏｌ  ＩＩ）からウイルスｍＲＮＡが合成されるように、少なくとも２個の独立したプロモーターをもつベクターにウイルスゲノムセグメントの各々を挿入する。従って、２個のプロモーターはウイルスゲノムＲＮＡセグメントの挿入に適した少なくとも１個のクローニング部位（即ち制限酵素認識配列）、好ましくはユニーククローニング部位の両側に逆方向に配置される。あるいは、（＋）鎖ｍＲＮＡと（−）鎖ウイルスＲＮＡ（ｃＲＮＡとして）がベクターの同一鎖から転写される「アンビセンス」ベクターを利用することもできる。
発現ベクター
【００８７】
発現させるインフルエンザウイルスゲノムセグメントはｍＲＮＡ合成を誘導するのに適した転写制御配列（プロモーター）に機能的に連結される。インフルエンザウイルスゲノムセグメントの転写を調節するために発現ベクターで使用するには種々のプロモーターが適している。例えばベクターがプロモーターｐＡＤ３０００である特定態様では、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーターを使用する。所望により、例えば条件付け発現を調節するためには、特定条件下又は特定組織もしくは細胞でＲＮＡ転写を誘導する他のプロモーターに代用することができる。多数のウイルス及び哺乳動物（例えばヒト）プロモーターが入手可能であるか、又は所期特定用途に応じて単離することができる。例えば、動物及びヒトウイルスのゲノムから得られる代替プロモーターとしては、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、パピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルス、及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）等のプロモーターや、種々のレトロウイルスプロモーターが挙げられる。哺乳動物プロモーターとしては特にアクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター等が挙げられる。更に、バクテリオファージプロモーターをコグネイトＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７プロモーター）と併用してもよい。
【００８８】
場合によりエンハンサー配列を加えることにより転写を増加してもよい。エンハンサーは一般に短く、例えばプロモーターと協同作用して転写を増加する１０〜５００ｂｐのシス作用性ＤＮＡエレメントである。多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子（ヘモグロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）、及び真核細胞ウイルスから単離されている。エンハンサーは異種コーディング配列の５´又は３´位でベクターにスプライスすることができるが、一般にはプロモーターの５´部位に挿入される。一般に、プロモーターと所望により他の転写促進配列は異種ＤＮＡを導入する宿
主細胞型における発現を最適化するように選択される（Ｓｃｈａｒｆら（１９９４）Ｈｅａｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２０：１２５−６２；Ｋｒｉｅｇｌｅｒら（１９９０）Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ，ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｇｅｎｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５：５１２−２７）。場合により、アンプリコンは翻訳開始のためのリボソーム結合部位又は内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）も含むことができる。  
【００８９】
本発明のベクターはポリアデニル化部位やターミネーター配列等の転写終結とｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含むと有利である。このような配列は真核又はウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの５´と場合により３´の未翻訳領域から一般に入手可能である。例えばプラスミドｐＡＤ３０００を使用する１態様では、ＳＶ４０ポリアデニル化配列がポリアデニル化シグナルを提供する。
【００９０】
更に、上述のように、発現ベクターは場合により、上記遺伝子に加え、形質転換宿主細胞の選択用表現型形質を提供するための１個以上の選択マーカーを含み、真核細胞培養での選択にはジヒドロ葉酸レダクターゼやネオマイシン耐性等のマーカーが適している。
【００９１】
上記のような適当なＤＮＡ配列と適当なプロモーター又は制御配列を含むベクターを使用して宿主細胞を形質転換し、蛋白質を発現させることができる。本発明のベクターは細菌細胞でも複製できるが、最も多くの場合には発現の目的で哺乳動物細胞（例えばＶｅｒｏ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、ＣＯＳ細胞）に導入することが望ましい。
付加的発現エレメント
【００９２】
最も一般的には、インフルエンザウイルス蛋白質をコードするゲノムセグメントは機能的ウイルス蛋白質への翻訳を含めたその発現に必要な任意付加的配列を含む。他の場合には、ウイルス蛋白質（例えばＨＡ又はＮＡ蛋白質）をコードするミニ遺伝子又は他の人工構築物を利用できる。この場合には、異種コーディング配列の効率的な翻訳を助長する特定開始シグナルを加えることが多くの場合に望ましい。これらのシグナルとしては、例えばＡＴＧ開始コドンと隣接配列が挙げられる。完全インサートの翻訳を確保するためには、ウイルス蛋白質に対して適正な読み枠に開始コドンを挿入する。外来転写エレメント及び開始コドンは天然及び合成の両者の種々の起源とすることができる。発現効率は使用する細胞システムに適したエンハンサーを加えることにより促進することができる。
【００９３】
所望により、例えばポリペプチド発現を所望細胞区画、膜、もしくはオルガネラ、又は細胞培養培地にターゲティングするために、通常は目的ポリヌクレオチド配列とインフレームでベクターにシグナル配列、分泌又は局在配列等の付加的発現エレメントをコードするポリヌクレオチド配列を組込むことができる。このような配列は当業者に公知であり、分泌リーダーペプチド、オルガネラターゲティング配列（例えば核局在配列、ＥＲ保持シグナル、ミトコンドリアトランジット配列）、膜局在／アンカー配列（例えばストップトランスファー配列、ＧＰＩアンカー配列）等が挙げられる。
インフルエンザウイルスワクチン
【００９４】
従来、インフルエンザウイルスワクチンは関連株の経験的予測に基づいて選択されたウイルス株を使用して発育鶏卵で生産されている。より最近では、承認弱毒、温度感受性マスター株に関して選択されたヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ抗原を組込んだリアソータントウイルスが生産されている。鶏卵で複数継代によるウイルスの培養後にインフルエンザウイルスを回収し、場合により、例えばホルムアルデヒド及び／又はβ−プロピオ
ラクトンを使用して不活化する。しかし、このようなインフルエンザワクチンの生産にはいくつかの大きな欠点がある。鶏卵に残留している汚染物質は高度に抗原性、発熱性であり、投与すると有意副作用を生じることが多い。更に重要な点として、インフルエンザワクチンの生産と不活化のための時間を見込んで一般に次の流感時期の数カ月前に生産用株を選択し、販売しなければならない。組換え及びリアソータントワクチンを細胞培養生産する試みはワクチン生産に承認されている株が標準細胞培養条件下で効率的に増殖できないことにより阻まれている。
【００９５】
本発明は１又は多数の選択ウイルス抗原株に対応するワクチンを迅速に生産できるように組換え及びリアソータントウイルスを培養生産するためのベクターシステムと方法を提供する。特に、多重プラスミドシステムから細胞培養でウイルスを効率的に生産する条件と株を提供する。場合により、所望によりウイルスを鶏卵で更に増幅してもよい。
【００９６】
例えば、インフルエンザＢマスター株Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６を標準細胞培養条件下、例えば３７℃で増殖させることはまだ可能ではない。本発明の方法では、インフルエンザウイルスゲノムのセグメントを各々組込んだ多重プラスミドを適切な細胞に導入し、３５℃以下の温度で培養する。一般に、培養物を約３２℃〜３５℃、好ましくは約３２℃〜約３４℃、例えば約３３℃に維持する。
【００９７】
一般に、培養物は温度が３５℃を越えないように確保するためのサーモセット等の温度調節器を使用して一定温度にし、制御下の湿度とＣＯ２条件で細胞培養インキュベーター等のシステムに維持する。
【００９８】
目的株（例えば目的抗原変異体）に由来する相補的セグメントと共にマスターインフルエンザウイルスのゲノムセグメントに対応するベクターのサブセットを導入することによりリアソータントインフルエンザウイルスを容易に得ることができる。一般に、マスター株はワクチン投与に関して望ましい特性により選択される。例えば、ワクチン生産（例えば生弱毒ワクチンの生産）には、弱毒表現型、低温適応及び／又は温度感受性によりマスタードナーウイルス株を選択することができる。この点では、インフルエンザＡ株ｃａ  Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０；インフルエンザＢ株ｃａ  Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６；又はその望ましい表現型特性により選択された別の株（例えば実施例４に記載するような人工構築インフルエンザＡ株又は表１７に記載するアミノ酸置換の１個以上を組込んだ人工構築インフルエンザＢ株等の弱毒，低温適応，及び／又は温度感受性株）；をマスタードナー株として選択すると有利である。
【００９９】
１態様では、インフルエンザマスターウイルス株の６個の内部遺伝子（即ちＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ，ＮＰ，ＮＢ，Ｍ１，ＢＭ２，ＮＳ１及びＮＳ２）を組込んだプラスミドを望ましい抗原株（例えば有意局地的又は世界的インフルエンザ感染を誘発すると予想される株）に由来するヘマグルチニン及びノイラミニダーゼセグメントと共に適切な宿主細胞にトランスフェクトする。効率的回収に適した温度（例えば３５℃以下、例えば約３２℃〜３５℃、例えば約３２℃〜約３４℃、又は約３３℃）でリアソータントウイルスの細胞培養複製後にリアソータントウイルスを回収する。場合により、回収したウイルスをホルムアルデヒド又はβ−プロピオラクトン等の変性剤で不活化してもよい。
弱毒、温度感受性及び低温適応インフルエンザウイルスワクチン
【０１００】
１側面では、本発明は好ましいマスタードナーウイルス株におけるｔｓ表現型の基礎となる突然変異の解明に基づく。ＭＤＶ株ゲノムにおける単一ヌクレオチド変異の機能的重要性を調べるために、Ａ／ＡＡ／６／６０系統内の近縁株に由来するリアソータントウイルスの温度感受性を評価した。２種の親株の同系性によりｔｓ表現型に及ぼす単一ヌクレオチド変異の影響を評価することができる。従って、ＭＤＶ−Ａのｔｓ表現型の遺伝子基
盤はＰＢ１，ＰＢ２，及びＮＰ内の特定アミノ酸残基にヌクレオチドレベルでマッピングされる。
【０１０１】
ｃａＡ／ＡＡ／６／６０のｔｓ表現型の遺伝子基盤をマッピングする従来の試みはＡ／ＡＡ／６／６０と無関係のｗｔ株の間の単一及び多重遺伝子リアソータントを作製するために古典的な共感染／リアソータント技術を使用していた。これらの研究はＰＢ２とＰＢ１の両者がｔｓ表現型に関与していることを示唆している（Ｋｅｎｄａｌら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｔ  ｓｕｂ−ｏｐｔｉｍａｌ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ  ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｔｓ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ａｒｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ＲＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  １  ａｎｄ  ３，ａｎｄ  ｔｈａｔ  ＲＮＡ  １  ｃｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｖｉｒｉｏｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ，ｐ．７３４−７４３．Ｉｎ  Ｂ．Ｗ．Ｊ．Ｍａｈｙ，ａｎｄ  Ｒ．Ｄ．Ｂａｒｒｙ（ｅｄ．）Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ；Ｋｅｎｄａｌら（１９７７）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｃｏｌｄ  ｍｕｔａｎｔ（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ：ｇｅｎｅａｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ（Ｍ）  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ（ＮＳ）ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ  Ｈ３Ｎ２  ｖｉｒｕｓｅｓ  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ３７：１４５−１５９；Ｋｅｎｄａｌら（１９７９）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｃｏｌｄ−ｍｕｔａｎｔ（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ：ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｖｉｒｉｏｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０
ｗｉｔｈ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  Ｈ３Ｎ２  ｓｔｒａｉｎｓ  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ
４４：４４３−４５６０；Ｓｎｙｄｅｒら（１９８８）Ｆｏｕｒ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ  ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６２：４８８−９５）。しかし、これらの研究の解釈は２種の分岐インフルエンザＡ株に由来する遺伝子セグメントを混合することにより生じたコンステレーション効果により混乱している。Ａ／ＡＡ／６／６０とＡ／ＡＡ／６／６０バックグラウンドに由来するｔｓ表現型の発現に特異的に関与しているもの以外のｗｔ遺伝子セグメントの間の変異により相互作用が弱まったと思われる。コンステレーション効果はＭ遺伝子セグメントとａｔｔ表現型の関連の解釈も混乱させることが示されている（Ｓｕｂｂａｒａｏら（１９９２）Ｔｈｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｍ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０  ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（Ｈ２Ｎ２）ｏｎ  ｔｈｅ  Ａ／Ｋｏｒｅａ／８２（Ｈ３Ｎ２）ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ
Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ２５：３７−５０）。
【０１０２】
本発明では、ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４位にアミノ酸置換をもたらす突然変異がＭＤＶ−Ａ株ウイルスに温度感受性表現型を付与するのに機能的に重要であるとみなす。当業者に自明の通り、ＰＢ１１１９５、ＰＢ１１７６６、ＰＢ１２００５、ＰＢ２８２１及びＮＰ１４６位のヌクレオチドの突然変異は夫々ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４位のアミノ酸
置換を意味する。従って、これらの位置にアミノ酸置換をもたらす任意ヌクレオチド置換が本発明の特徴である。典型的突然変異であるＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）は単独、及びより好ましくは組み合わせて温度感受性表現型をもたらす。これらの突然変異が野生型に同時に復帰変異するとｔｓ表現型は失われ、これらの突然変異を野生型バックグラウンドに導入するとｔｓ表現型をもつウイルスが得られる。ウイルスの継代中のこれらの表現型の安定性と一致して、単一変異は得られるウイルスの温度感受性プロフィルを野生型のものに個々に復帰変異させることができない。逆に、これらの変異はｔｓ表現型を完全に発現するように相互に協同作用するように思われる。この発見により、生弱毒インフルエンザワクチンの生産用マスタードナーウイルスに適した付加的温度感受性インフルエンザＡウイルス株を構築することができる。
【０１０３】
同様に、マスタードナーウイルスＢ株における個々のアミノ酸の置換は表１７に示すようにｔｓ表現型と相関する。従って、本明細書に記載する方法は１個以上の特定突然変異をインフルエンザＢゲノムに導入することにより、温度感受性、及び場合により弱毒及び／又は低温適応表現型をもつ新規インフルエンザＢ株を生産するのに適している。例えば、ＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から選択される位置にアミノ酸置換をもたらす１個以上の突然変異をインフルエンザＢ株ゲノムに導入し、温度感受性インフルエンザＢウイルスを生産する。典型的アミノ酸置換としては、ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）が挙げられる。
【０１０４】
本発明の突然変異を組込んだインフルエンザウイルスは生産方法に関係なく本発明の特徴である。即ち、本発明は本発明の突然変異を含むインフルエンザ株、例えばＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から選択される１個以上の位置に野生型に比較してアミノ酸置換をもつ任意インフルエンザＡウイルス又はＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から選択される１個以上の位置に野生型に比較してアミノ酸置換をもつ任意インフルエンザＢウイルスに関するが、但し、ｃａ  Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０及びＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６株は本発明の特徴とみなさない。特定好適態様では、夫々インフルエンザＡウイルスはＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から選択される複数の突然変異（例えば２、又は３、又は４、又は５個以上の突然変異）を含み、インフルエンザＢウイルスはＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ））から選択される複数の突然変異を含む。例えば、ワクチン生産に関して所望表現型をもつウイルスを提供することに加え、ウイルスの表現型における付加的突然変異の関与を解明するには突然変異のサブセット（例えば１、又は２、又は３、又は４、又は５個の選択された突然変異）をもつウイルスが有用である。特定態様では、インフルエンザウイルスは（例えば場合により付加的アミノ酸置換をもたらす）少なくとも１個の付加的な非野生型ヌクレオチドを含み、場合により所望表現型を強化するか又は別の望ましい表現型属性を付与する。
細胞培養
【０１０５】
一般に、ウイルスの増殖は宿主細胞を通常培養する培地組成物中で実施される。インフルエンザウイルスの複製に適した宿主細胞としては例えばＶｅｒｏ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞及びＣＯＳ細胞（２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ７細
胞を含む）が挙げられる。一般に、複製効率を改善するために、上記細胞株の２種（例えばＭＤＣＫ細胞と２９３Ｔ又はＣＯＳ細胞）を含む共培養物を例えば１：１の比で使用する。一般に、細胞は中性緩衝ｐＨ（例えばｐＨ７．０〜７．２）を維持するのに適した湿度とＣＯ２濃度に制御しながら血清（例えば１０％胎仔ウシ血清）を添加したダルベッコ変法イーグル培地等の標準市販培地や無血清培地で培養する。場合により、細菌増殖を防ぐために抗生物質（例えばペニシリン、ストレプトマイシン等）及び／又は付加栄養（例えばＬ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸）、有利な増殖特徴を促進するために付加的添加剤（例えばトリプシン、β−メルカプトエタノール等）を培地に加えてもよい。
【０１０６】
哺乳動物細胞の培養法は広く報告されており、当業者に公知である。一般プロトコールは例えばＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９８３）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｐａｕｌ（１９７５）Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ；Ａｄａｍｓ（１９８０）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｏｎ（ｅｄｓ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍに記載されている。インフルエンザウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産に特に有利な組織培養法に関する他の詳細な文献としては、例えばその開示内容全体を本明細書に組込むＭｅｒｔｅｎら（１９９６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｃｏｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｆｆｅｒｍａｎ（ｅｄｓ）Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓが挙げられる。更に、このような方法の本発明への応用は日常的実験により容易に決定される。
【０１０７】
インフルエンザウイルス生産用細胞は血清添加培地でも無血清培地でも培養することができる。場合により、例えば精製ウイルスを製造するためには、宿主細胞を無血清条件下に増殖させることが望ましい。細胞は例えば２５ｍｌ未満の培地等の小規模の培養管もしくはフラスコで培養してもよいし、撹拌機付き大型フラスコ、ローテーター瓶でもよいし、フラスコ、瓶又は反応器培養液中でマイクロキャリヤービーズ（例えばＤｏｒｍａｃｅｌｌ，Ｐｆｅｉｆｅｒ  ＆  Ｌａｎｇｅｎ；Ｓｕｐｅｒｂｅａｄ，Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ等のＤＥＡＥ−デキストランマイクロキャリヤービーズ；Ｈｉｌｌｅｘ，ＳｏｌｏＨｉｌｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ等のスチレンコポリマー−トリメチレンビーズ）上で培養してもよい。マイクロキャリヤービーズは接着細胞増殖のために大きな細胞培養液容量当たりの表面積を提供する小球（直径１００〜２００ミクロン）である。例えば、培地１リットルに２０，０００，０００万個を越えるマイクロキャリヤービーズを加えると、８０００平方ｃｍを上回る増殖表面積が得られる。例えばワクチン生産用のウイルスの商業的生産には、多くの場合にはバイオリアクター又は発酵器で細胞を培養することが望ましい。バイオリアクターは１リットル未満から１００リットル以上の容量のものが市販されており、例えばＣｙｔｏ３バイオリアクター（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ，Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，ＭＮ）；ＮＢＳバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製品実験室及び商業規模バイオリアクター（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ，ドイツ）が挙げられる。
【０１０８】
培養容量に関係なく、本発明に関しては、本明細書に記載する多重プラスミドシステムを使用して組換え及び／又はリアソータントインフルエンザウイルスの効率的回収を確保するために３５℃以下の温度で培養することが重要である。例えば、細胞を約３２℃〜３
５℃の温度、一般には約３２℃〜約３４℃の温度、通常は約３３℃で培養する。
【０１０９】
一般に、例えばサーモセットや細胞培養システムの温度を感知して維持するための他の装置等の調節器を使用してウイルス複製中に温度が３５℃を越えないように確保する。
宿主細胞へのベクターの導入
【０１１０】
インフルエンザゲノムセグメントを組込んだベクターは異種核酸を真核細胞に導入するための当分野で周知の方法（例えばリン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、及びポリアミントランスフェクション試薬を使用するトランスフェクション）に従って宿主細胞に導入（例えばトランスフェクト）する。例えば、ポリアミントランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ）を製造業者の指示に従って使用してＣＯＳ細胞、２９３Ｔ細胞又はＣＯＳもしくは２９３Ｔ細胞とＭＤＣＫ細胞の組合せ等の宿主細胞にベクター（例えばプラスミド）をトランスフェクトすることができる。宿主細胞集団に導入しようとする各ベクター約１μｇにつきＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１約２μｌを培地、好ましくは無血清培地１６０μｌで希釈し、合計容量２００μｌとする。ＤＮＡ：トランスフェクション試薬混合物を室温で４５分間インキュベートした後に培地８００μｌを加える。トランスフェクション混合物を宿主細胞に加え、細胞を上述のように培養する。従って、組換え又はリアソータントウイルスを細胞培養生産するためには８個のゲノムセグメント（ＰＢ２，ＰＢ１，ＰＡ，ＮＰ，Ｍ，ＮＳ，ＨＡ及びＮＡ）の各々を組込んだベクターをＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１約２０μｌと混合し、宿主細胞にトランスフェクトする。場合により、トランスフェクションの前に血清添加培地を無血清培地（例えばＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ）に交換し、４〜６時間インキュベートする。
【０１１１】
あるいは、インフルエンザゲノムセグメントを組込んだベクターを宿主細胞に導入するためにエレクトロポレーションを使用することもできる。例えば、インフルエンザＡ又はインフルエンザＢウイルスを組込んだプラスミドベクターを以下の手順に従ってエレクトロポレーションによりＶｅｒｏ細胞に導入すると有利である。要約すると、例えば１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を添加した変法イーグル培地（ＭＥＭ）で増殖させたＶｅｒｏ細胞５ｘ１０６個をＯｐｔｉＭＥＭ０．４ｍｌに再懸濁し、エレクトロポレーションキュベットに加える。２５μｌまでの容量中のＤＮＡ２０μｇをキュベット内の細胞に加えた後、タッピングにより温和に混合する。エレクトロポレーションは製造業者の指示に従って（例えばＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩにＣａｐａｃｉｔａｎｃｅ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ  Ｐｌｕｓを接続）３００ボルト，９５０マイクロファラデー及び時定数２８〜３３ｍ秒で実施する。細胞をタッピングにより再混合し、エレクトロポレーションから約１〜２分後に１０％ＦＢＳを添加したＭＥＭ０．７ｍｌをキュベットに直接加える。次にＭＥＭ，１０％ＦＢＳ又は無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ２ｍｌを加えた標準６ウェル組織培養皿のウェル２個に細胞を移す。キュベットを洗浄して残留細胞を回収し、洗浄懸濁液をウェル２個に分配する。最終容量は３．５ｍｌとする。次にウイルス増殖に許容可能な条件下、例えば低温適応細胞には約３３℃で細胞をインキュベートする。
ウイルスの回収
【０１１２】
感染（トランスフェクト）細胞を増殖させた培養培地から一般にウイルスを回収する。一般に、インフルエンザウイルスの濃縮前に粗培地を清澄化する。一般的な方法としては濾過、限外濾過、硫酸バリウム吸着と溶離、及び遠心が挙げられる。例えば、細胞破片や他の大型粒状物を除去するために十分な時間（例えば１０〜３０分間）例えば１０００〜２０００ｘｇで遠心することにより感染培養液からの粗培地をまず清澄化することができる。あるいは、０．８μｍ酢酸セルロースフィルターで培地を濾過し、無傷の細胞と他の大型粒状物を除去してもよい。場合により、清澄化培地上清をその後、例えば１５，０００ｘｇで約３〜５時間遠心してインフルエンザウイルスをペレット化してもよい。ウイル
スペレットをＳＴＥ（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；０．１５ＭＮａＣｌ；０．０００１Ｍ  ＥＤＴＡ）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４等の適当な緩衝液に再懸濁後、ウイルスを蔗糖（６０％−１２％）又は酒石酸カリウム（５０％−１０％）で密度勾配遠心により濃縮する。連続又はステップ勾配（例えば１２％ずつ４ステップで１２％−６０％の蔗糖勾配）が適切である。ウイルスを回収用可視バンドに濃縮するために十分な速度と時間で勾配を遠心する。あるいは、大半の大規模商業用途には、連続モードで運転するゾーナル遠心ローターを使用して密度勾配からウイルスを選別する。組織培養からのインフルエンザウイルスの製造の手引きとして当業者に十分な他の詳細は例えばＦｕｒｍｉｎｇｅｒ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら（ｅｄｓ）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｐｐ．３２４−３３２；Ｍｅｒｔｅｎら（１９９６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｃｏｈｅｎ  ＆  Ｓｈａｆｆｅｒｍａｎ（ｅｄｓ）Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｐ．１４１−１５１、及び米国特許第５，６９０，９３７号に記載されている。所望により、回収したウイルスを安定剤として蔗糖−リン酸塩−グルタミン酸塩（ＳＰＧ）の存在下に−８０℃で保存することができる。
ワクチンの予防投与方法及び組成物
【０１１３】
本発明の組換え及びリアソータントウイルスは１種以上のインフルエンザウイルス株に特異的な免疫応答を刺激するのに適したキャリヤー又は賦形剤に加えて予防投与することができる。一般に、キャリヤー又は賦形剤は医薬的に許容可能なキャリヤー又は賦形剤であり、例えば滅菌水、食塩水溶液、緩衝食塩水溶液、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、無感染鶏卵由来尿膜腔液（即ち正常尿膜腔液「ＮＡＦ」）又はその組合せが挙げられる。無菌性、ｐＨ、等張性、及び安定性を確保するこのような溶液の調製は当分野で確立されているプロトコールに従って実施される。一般に、キャリヤー又は賦形剤はアレルギーや他の望ましくない作用を最小限にすると共に例えば皮下、筋肉内、鼻腔内等の特定投与経路に適合するように選択される。
【０１１４】
一般に、本発明のインフルエンザウイルスは１種以上のインフルエンザウイルス株に特異的な免疫応答を刺激するために十分な量を投与される。インフルエンザウイルスの投与により防御免疫応答を誘発することが好ましい。１種以上のインフルエンザ株に対する防御免疫応答を誘発するための用量と方法は当業者に公知である。例えば、投与用量当たり約１〜１０００ＨＩＤ５０（ヒト感染用量）、即ち約１０５〜１０８ｐｆｕ（プラーク形成単位）の不活化インフルエンザウイルスを投与する。あるいは、アジュバントの不在下に約１０〜５０μｇ、例えば約１５μｇＨＡを投与するが、アジュバントを加える場合にはより低用量を投与する。一般に、用量は例えば年齢、健康状態、体重、性別、食事、投与時間、及び他の臨床因子に基づいてこの範囲内に調節される。予防ワクチン製剤は例えば注射針と注射器又は無針注射装置を使用して皮下又は筋肉内注射により全身投与する。あるいは、ワクチン製剤は滴剤、大粒子エアゾール（＞約１０ミクロン）、又はスプレーにより上気道に鼻腔内投与する。上記送達経路のいずれでも防御全身免疫応答が得られるが、鼻腔内投与はインフルエンザウイルスの進入部位に粘膜免疫を誘発するという付加利点が得られる。鼻腔内投与には、多くの場合には例えば弱毒、低温適応及び／又は温度感受性組換え又はリアソータントインフルエンザウイルス等の弱毒生ウイルスワクチンが好ましい。１回の投与で防御免疫応答を刺激することが好ましいが、所望予防効果を達成するために同一又は別経路で付加用量を投与してもよい。
【０１１５】
あるいは、インフルエンザウイルスを樹状細胞にｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏターゲティングすることにより免疫応答を刺激することもできる。例えば、インフルエンザ抗原を樹状細胞に捕獲させるために十分な量と時間でウイルスに増殖中の樹状細胞を暴露
する。次に、標準静脈内移植法によりワクチン接種すべき対象に細胞を導入する。
【０１１６】
場合により、インフルエンザウイルスの予防投与用製剤又はそのサブセットにインフルエンザ抗原に対する免疫応答を強化するための１種以上のアジュバントを加えてもよい。適切なアジュバントとしてはサポニン、ミネラルゲル（例えば水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油又は炭化水素エマルション）、ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、並びに合成アジュバントＱＳ−２１及びＭＦ５９が挙げられる。
【０１１７】
所望により、インフルエンザウイルスの予防ワクチン投与と１種以上の免疫刺激分子の投与を併用して実施してもよい。免疫刺激分子としては免疫刺激、免疫強化及び炎症予防活性をもつ種々のサイトカイン、リンホカイン及びケモカインが挙げられ、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−１２，ＩＬ−１３）；増殖因子（例えば顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；及び他の免疫刺激分子（例えばマクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２等）が挙げられる。免疫刺激分子はインフルエンザウイルスと同一製剤で投与してもよいし、別に投与してもよい。免疫刺激効果を生じるために、蛋白質又は蛋白質をコードする発現ベクターを投与することができる。
【０１１８】
別の態様では、インフルエンザゲノムセグメントを組込んだ本発明のベクターを使用して上記のような適切な医薬キャリヤー又は賦形剤と共に異種核酸を宿主生物又は宿主細胞（例えば哺乳動物細胞、例えばヒト対象に由来する細胞）に導入することができる。一般に、異種核酸は遺伝子又は遺伝子セグメントの非必須領域（例えばセグメント７のＭ遺伝子）に挿入する。異種ポリヌクレオチド配列はポリペプチドもしくはペプチド、又はアンチセンスＲＮＡもしくはリボザイム等のＲＮＡをコードすることができる。次に、異種核酸を組込んだ組換えウイルスを生産することにより異種核酸を宿主又は宿主細胞に導入し、上述のようにウイルスを投与する。
【０１１９】
あるいは、インフルエンザウイルスに感染させた細胞にベクターをコトランスフェクトすることにより、異種核酸を組込んだ本発明のベクターを宿主細胞に導入して発現させることができる。場合により、次に細胞を対象、一般にはその細胞を取得した部位に返却又は送達する。用途によっては、既存細胞導入又は移植法を使用して細胞を目的組織、臓器、又は（上記のような）身体部位に移植する。例えば、標準送達又は輸液技術を使用して骨髄、臍帯血、又は末梢血由来造血幹細胞等の造血系統の幹細胞を対象に送達することができる。
【０１２０】
あるいは、異種核酸を組込んだウイルスを対象の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏ送達することができる。一般に、このような方法はベクター粒子をターゲット細胞集団（例えば血液細胞、皮膚細胞、肝細胞、（脳を含む）神経細胞、腎細胞、子宮細胞、筋肉細胞、腸細胞、子宮頚管細胞、膣細胞、前立腺細胞等、並びに種々の細胞、組織及び／又は臓器に由来する腫瘍細胞）に投与する。投与は例えばウイルス粒子の静脈内投与により全身に行ってよいし、（例えば注射針と注射器を使用する）注射、無針ワクチン送達、局所投与、又は組織、臓器もしくは皮膚部位への圧入等の種々の方法によりウイルス粒子を１又は複数の目的部位に直接投与してもよい。例えば、ウイルスベクター粒子は吸入、経口、静脈内、皮下、真皮下、真皮内、筋肉内、腹腔内、鞘内、膣もしくは直腸投与、又は例えば手術中にウイルス粒子を体腔もしくは他の部位に配置することにより送達することができる。
【０１２１】
上記方法は治療又は予防薬として有効なポリペプチド（又はペプチド）又はＲＮＡ（例えばアンチセンスＲＮＡ又はリボザイム）をコードする異種ポリヌクレオチドを組込んだ
本発明のベクターをターゲット細胞集団にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ導入することにより疾病又は疾患を治療及び／又は予防処置するために有用である。一般に、目的ポリペプチド（又はペプチド）又はＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは「発現ベクター」及び「付加的発現エレメント」の表題のセクションで上述したように適当な調節配列に機能的に連結される。場合により、２種以上の異種コーディング配列を単一ベクター又はウイルスに組込んでもよい。例えば、治療又は予防活性ポリペプチド又はＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに加え、付加的治療又は予防ポリペプチド（例えば抗原、共刺激分子、サイトカイン、抗体等）及び／又はマーカー等もベクターに加えることができる。
【０１２２】
本発明の方法とベクターは例えばウイルス、細菌等による感染症用ワクチンとして遺伝病や後天性疾患等の多様な疾患を治療又は予防処置するために使用することができる。
キット
【０１２３】
本発明のベクター及びベクターシステムを使用し易くするために、ベクター（例えばコンセンサスインフルエンザウイルスプラスミド、変異体インフルエンザポリペプチドプラスミド、インフルエンザポリペプチドライブラリープラスミド等）のいずれかと実験又は治療目的でインフルエンザウイルスのパッケージングと感染に有用な付加的コンポーネント（例えば緩衝液、細胞、培養培地）をキットとしてパッケージングすることができる。一般に、キットは上記コンポーネントに加え、例えば本発明の方法を実施するための説明書、パッケージング材料、及び容器等の付加的材料を含む。
ウイルス核酸及び蛋白質の操作
【０１２４】
本発明に関して、インフルエンザウイルス核酸及び／又は蛋白質は周知分子生物学技術に従って操作する。増幅、クローニング、突然変異誘発、形質転換等を含む多数のこのような操作の詳細なプロトコールは例えばＡｕｓｕｂｅｌらＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ２０００）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（“Ａｕｓｕｂｅｌ”）；ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”），及び  Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｖ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（“Ｂｅｒｇｅｒ”）に記載されている。
【０１２５】
上記文献に加え、例えば本発明のｃＤＮＡプローブを増幅するために有用なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅、及び他のＲＮＡポリメラーゼ技術（例えばＮＡＳＢＡ）等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅技術のプロトコールはＭｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓらｅｄｓ）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（“Ｉｎｎｉｓ”）；Ａｒｎｈｅｉｍ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０）Ｃ  ＆  ＥＮ  ３６；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１；Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７  ：１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：
２９１；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４：５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７，及びＳｏｏｋｎａｎａｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３  ：５６３に記載されている。本発明に関して核酸のクローニングに有用な他の方法としては、Ｗａｌｌａｃｅら米国特許第５，４２６，０３９号が挙げられる。ＰＣＲによる大型核酸の改善増幅法はＣｈｅｎｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４とその引用文献に要約されている。
【０１２６】
本発明の特定ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）はモノヌクレオチド及び／又はトリヌクレオチドホスホロアミダイトカップリング化学を含む種々の固相ストラテジーを使用して合成することができる。例えば、核酸配列は活性化モノマー及び／又はトリマーを伸長ポリヌクレオチド鎖に順次付加することにより合成することができる。例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら（１９９２）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｖｍｏｌ  ２１１  ：３参照。
【０１２７】
所望配列を合成する代わりに、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｃｒｃ＆ｃｏｍｍａｔ；ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ），Ｔｈｅ
Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ），ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ），Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｏｐｅｒｏｎ．ｃｏｍ），及び他の多数の企業等の種々の商業ソースのに任意のものからほぼ任意の核酸を特注することができる。
【０１２８】
更に、例えば部位特異的突然変異誘発によりウイルスポリペプチドの選択されたアミノ酸残基の置換を行うことができる。例えば、ポリペプチドをコードするウイルス核酸セグメントに特定突然変異を導入することにより、望ましい表現型特徴（例えば弱毒表現型、低温適応、温度感受性）と機能的に相関したアミノ酸置換をもつウイルスポリペプチドを生産することができる。部位特異的突然変異誘発法は当分野で周知であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，前出に記載されている。部位特異的突然変異を実施するためのキットは例えばＣｈａｍｅｌｅｏｎ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａをはじめとする多数のものが市販されており、例えばインフルエンザＡ又はＢポリペプチドを夫々コードするゲノムセグメントに表６又は表１７に記載する１個以上のアミノ酸置換を導入するように製造業者の指示に従って使用することができる。
【実施例１】
【０１２９】
ｐＡＤ３０００の構築
ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルをサルウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するポリアデニル化シグナルで置換するようにプラスミドｐＨＷ２０００（Ｈｏｆｆｍａｎｎら（２０００）Ａ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｅｉｇｈｔ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：６１０８−６１１３）を改変した。
【０１３０】
Ｔａｑ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）と以下のオリゴヌクレオチド（５’→３’方向で示す）：
ｐｏｌｙＡ．１  ：ＡＡＣＡＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＣＡＣＣＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴ（配列番号１）
ｐｏｌｙＡ．２：ＴＡＴＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＧＡＴＡＴＣＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡ（配列番号２）
を使用してＳＶ４０に由来する配列を増幅した。
【０１３１】
プラスミドｐＳＶ２Ｈｉｓを鋳型として使用した。予想１７５ｂｐ産物に一致するフラグメントを取得し、Ｔｏｐｏ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用してｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。得られたプラスミドからＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む所望１３８ｂｐフラグメントをＥｃｏＲＶとＢｓｔＥＩＩで切り出し、アガロースゲルから単離し、慣用技術（例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ参照）を使用してｐＨＷ２０００のユニークＰｖｕＩＩ−ＢｓｔＥＩＩ部位間にライゲーションした。得られたプラスミドｐＡＤ３０００（図１）を配列決定した処、正しい方向にＳＶ４０ポリアデニル化部位を含むことが判明した。ｐＡＤ３０００のヌクレオチド２９５−４２３はＳＶ４０株７７７（ＡＦ３３２５６２）の夫々ヌクレオチド２４６６−２５９４に対応する。
【実施例２】
【０１３２】
ＭＤＶ−Ａ生産用８プラスミドシステム
低温適応Ａ型インフルエンザウイルス株Ａ／ＡＡ／６／６０変異体は鼻腔投与インフルエンザＡワクチンの生産用マスタードナーウイルスとして一般に使用されている。この株は本発明に関して典型的なマスタードナーウイルス（ＭＤＶ）である。簡単にするために、この株Ａ／ＡＡ／６／６０変異体を本明細書ではＭＤＶ−Ａと言う。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＭＤＶ−ＡウイルスＲＮＡを抽出し、表１に示すプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲにより８個の対応するｃＤＮＡフラグメントを増幅した。
【表１】
2005523698.tif 000002
【０１３３】
ＨＡとＰＢ２をコードするインフルエンザゲノムセグメントはＡａｒＩ制限酵素認識部位を含むプライマー使用して増幅したが、それ以外の６個の遺伝子はＢｓｍＢＩ制限酵素認識部位を含むプライマーを使用して増幅した。ＡａｒＩ及びＢｓｍＢＩｃＤＮＡフラグメントのいずれもｐＡＤ３０００ベクターの２個のＢｓｍＢＩ部位の間にクローニングした。
【０１３４】
シーケンシング分析の結果、クローニングした全ｃＤＮＡフラグメントはコンセンサスＭＤＶ−Ａ配列に対してクローニング段階中に導入されたと思われる突然変異を含んでいた。各遺伝子セグメントに検出された突然変異を表２に要約する。
【表２】
2005523698.tif 000003
【０１３５】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と表３に示す合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して全突然変異をコンセンサスＭＤＶ−Ａ配列に補正した。
【表３】
2005523698.tif 000004
【実施例３】
【０１３６】
感染性組換えＭＤＶ−Ａ及びリアソータントインフルエンザウイルスの作製
１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を添加した変法イーグル培地（ＭＥＭ）にＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞とヒトＣＯＳ７細胞を維持した。５％ＦＢＳを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にヒト胚性腎細胞（２９３Ｔ）を維持した。ＭＤＣＫ細胞とＣＯＳ７細胞又は２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートで１：１の比で共培養し、これらの細胞を約８０％のコンフルエンシーでトランスフェクションに使用した。２９３Ｔ細胞とＣＯＳ７細胞はトランスフェクション効率が高いが、インフルエンザウイルス複製には許容されない。ＭＤＣＫ細胞と共培養すると、組換えウイルスの効率的な複製を確保することができる。トランスフェクションに先立ち、血清添加培地を無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ）に交換し、４〜６時間インキュベートした。ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ）を使用し、２０μｌのＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１を１６０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩで希釈して８種のプラスミドＤＮＡ（ＰＢ２，ＰＢ１，ＰＡ，ＮＰ，Ｍ，ＮＳ，ＨＡ及びＮＡ）各１μｇと混合して総容量２００μｌとすることによりプラスミドＤＮＡトランスフェクションを実施した。ＤＮＡ：トランスフェクション試薬混合物を室温で４５分間インキュベートした後に８００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩを加えた。次にトランスフェクション混合物を共培養ＭＤＣＫ／２９３Ｔ又はＭＤＣＫ
／ＣＯＳ７細胞に加えた。トランスフェクト細胞を３５℃又は３３℃で６時間〜２４時間、例えば一晩インキュベートし、トランスフェクション混合物を各ウェルで１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭに交換した。３５℃又は３３℃で２４時間インキュベーション後に１μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ−トリプシンを添加した１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩを各ウェルに加え、更に１２時間インキュベートした。回収したウイルスを次にコンフルエントＭＤＣＫ細胞で増幅するか又は発育鶏卵で直接増幅した。１２ウェルプレート内のＭＤＣＫ細胞にトランスフェクション混合物０．２ｍｌを１時間室温で感染させた後、混合物を除去し、１μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ−トリプシンを添加した２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩに交換した。細胞を３５℃又は３３℃で３〜４日間インキュベートした。増幅したウイルスをＳＰＧ安定剤の存在下に−８０℃で保存するか又はプラーク精製し、ＭＤＣＫ細胞もしくは発育鶏卵で増幅した。
ＭＤＶ−Ａポリメラーゼ蛋白質の機能的発現
【０１３７】
ＥＧＦＰレポーター遺伝子をコードするインフルエンザウイルスミニゲノムを複製する能力により４種のＭＤＶ−Ａポリメラーゼ蛋白質ＰＢ２，ＰＢ１，ＰＡ及びＮＰの機能活性を分析した。Ａ／ＰＲ／８／３４株（Ｈ１Ｎ１）のｃＤＮＡを含む８種１組の発現プラスミド（例えば表４参照）（Ｈｏｆｆｍａｎｎら（２００１）Ｅｉｇｈｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｒｅｓｃｕｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ；Ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｓｅｒｉｅｓ  １２１９：１００７−１０１３）と強化緑色蛍光蛋白質をコードするレポーター遺伝子を含むインフルエンザウイルスミニゲノム（ＥＧＦＰ，ｐＨＷ７２−ＥＧＦＰ）を使用した。
【０１３８】
インフルエンザＡウイルスＥＧＦＰミニゲノムに相当するプラスミド（ｐＨＷ７２−ＥＧＦＰ）と共にＭＤＶ−Ａ  ＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ及びＮＰ又はＰＢ１，ＰＡ，ＮＰ（陰性対照として−ＰＢ２）を共培養ＭＤＣＫ／２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした（Ｈｏｆｆｍａｎｎら（２０００）“Ａｍｂｉｓｅｎｓｅ”ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ：ｖＲＮＡ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｏｎｅ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５：２６７（２）：３１０−７）。トランスフェクト細胞をトランスフェクションから４８時間後に位相コントラスト顕微鏡又は蛍光顕微鏡で観察した。あるいは、フローサイトメトリーを使用してＥＧＦＰ発現を検出した。
【０１３９】
図２に示すように、ＭＤＶ−ＡのＰＢ２，ＰＢ１，ＰＡ及びＮＰをトランスフェクトした細胞にはＥＧＦＰミニゲノムの発現を示す緑色蛍光が観察されたが、ポリメラーゼ蛋白質を３種しかトランスフェクトしなかった細胞には観察されなかった。このことからｐＡＤ３０００におけるＭＤＶ−Ａポリメラーゼ蛋白質は機能的であると思われた。
【０１４０】
他のアッセイでは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含むミノゲノムｐＦｌｕ−ＣＡＴを使用してポリメラーゼ活性を測定する。このようなアッセイでは、ミニゲノム複製の指標として（例えばＥＬＩＳＡにより）蛋白質又はＲＮＡレベルでＣＡＴ発現を測定する。
単一遺伝子リアソータント実験によるＭＤＶ−Ａプラスミドの分析
【０１４１】
ｐＡＤ３０００にクローニングした８種のＭＤＶ−Ａゲノムセグメントの各々はＭＤＡ−Ａに由来する単一遺伝子セグメントを対照Ａ／ＰＲ／８／３４株に由来する相補的な７種のセグメントと共にコトランスフェクトすることによりリアソータント実験で機能的に発現されることが判明した。相補的対照セグメントと併用すると全８種の単一ゲノムセグメントプラスミドから感染性リアソータントウイルスが作製され、感染ＭＤＣＫ細胞に細胞変性効果を生じたので、全８種のプラスミドは機能的ＭＤＶ−Ａ蛋白質をコードすると
思われた。表４。
【表４】
2005523698.tif 000005
【０１４２】
インフルエンザＡウイルスのパッケージング制約を更に調べるために、ＮＳセグメントを２個の別個の遺伝子セグメントに分離し、一方がＮＳ１ゲノムセグメントをコードし、他方がＮＳ２ゲノムセグメントをコードするようにした。インフルエンザＡのゲノムセグメントを含む９種のプラスミドを上述のようにＭＤＣＫ／ＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、回収したウイルスをＭＤＣＫ細胞で力価測定する前に発育鶏卵で増幅した。９プラスミドシステムでは上記８プラスミドシステムに比較してプラークサイズの減少が観察された。ＲＴ−ＰＣＲ分析によると、ビリオンにはＮＳ２セグメントしか存在せず、ＮＳ１遺伝子セグメントはパッケージングされていないことが判明した。
ＭＤＶ−Ａ及び６：２リアソータントウイルスの回収
【０１４３】
上記手順に従い、８種のＭＤＶ−Ａプラスミド（組換え）又は６個のＭＤＶ−Ａ内部遺伝子とＡ／ＰＲ／８／３４に由来するＨＡとＮＡを組込んだプラスミド（６：２リアソータント）のトランスフェクションから３日後に、トランスフェクト培養上清を使用して新鮮なＭＤＣＫ細胞に感染させ、感染細胞を１μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ−トリプシンの存在下に３３℃で３日間インキュベートした。感染ＭＤＣＫ細胞に及ぼす組換えウイルスの細胞変性効果を顕微鏡で観察した。標準血球凝集アッセイ（ＨＡ）を使用してウイルスヘマグルチニンの発現をモニターした。ＨＡアッセイは９６ウェルプレートで系列２倍希釈培養上清５０μｌを１％ヒヨコ赤血球細胞５０μｌと混合することにより実施した。トランスフェクトした８種のＭＤＶ−Ａプラスミドと６：２リアソータントウイルスのどちらに由来する増幅ウイルスにも約１：２５４〜１：１０２４のＨＡ力価が検出された。Ｅ．Ｈｏｆｆｍａｎ博士から入手した８Ａ／ＰＲ／８／３４プラスミドを使用するトランスフェクション反応を陽性対照として使用した。表５に示すようにこれらの３種のトランスフェクション反応から感染性インフルエンザウイルスが生産された。
【表５】
2005523698.tif 000006
【０１４４】
回収したウイルスの遺伝子型をマッピングするためにＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して感染細胞培養上清からウイルスＲＮＡを単離し、各ＭＤＶ−Ａ遺伝子セグメントに特異的なプライマーとＨ１及びＮ１特異的プライマーを使用して８種のインフルエンザウイルスセグメントをＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。図３に示すように、ｒＭＤＶ−ＡはＭＤＶ−Ａに特異的なＰＢ２，ＰＢ１，ＮＰ，ＰＡ，Ｍ及びＮＳとＨ２及びＮ２サブタイプに特異的なＨＡ及びＮＡを含んでいた。６：２リアソータントはＭＤＶ−Ａに由来する６個の内部遺伝子と、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）に由来するＨＡ及びＮＡを含んでいた。このことから、トランスフェクトプラスミドから作製したウイルスは正しい遺伝子型をもつことが確認された。
【０１４５】
レスキューされたウイルスをＭＤＣＫ細胞でプラークアッセイにより力価測定した処、プラークはＭＤＶ−Ａに対するニワトリ血清を使用する免疫染色によりインフルエンザウイルスであることが確認された。１２ウェルプラークで１００％コンフルエントのＭＤＣＫ細胞に１０倍系列希釈ウイルス１００μｌを室温で温和な振盪下に１時間感染させた。接種材料を除去し、０．８％アガロースと１μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ−トリプシンを添加した１ＸＬ１５を細胞に重層した。プレートを３５℃又は３３℃で３日間インキュベートし、１００％メタノールで固定し、ＰＢＳ中５％ミルクによりブロックし、２０００倍希釈ニワトリ抗ＭＤＶ−Ａ抗血清と共に１時間インキュベートした後、ＨＲＰ標識ウサギ抗ニワトリＩｇＧと共に１時間インキュベートした。ＨＲＰ基質溶液（ＤＡＫＯ）を加えることによりプラークを可視化した。回収された全ウイルスは陽性免疫染色を示した。
【実施例４】
【０１４６】
ＭＤＶ−Ａのｃａ、ｔｓ、ａｔｔ表現型の遺伝子基盤のマッピング
ＭＤＶ−Ａインフルエンザウイルスワクチン株は低温適応（ｃａ），温度感受性（ｔｓ）及び弱毒（ａｔｔ）等のワクチン（例えば生弱毒ワクチン）の生産に関連する数種の表現型をもつ。ＭＤＶ−Ａ株と非ｔｓビルレントｗｔＡ／ＡＡ／６／６０株の配列比較の結果、これらの２種の株の間には最低１７ｎｔの差異があることが判明した（表６）。ＭＤＶ−Ａ配列における置換のいくつかはＧｅｎｅＢａｎｋデータベースで入手可能な全Ａ型インフルエンザウイルスに比較してこの株にユニークであり、これらのアミノ酸置換の１個以上がａｔｔ，ｃａ及びｔｓ表現型に機能的に関係することを示唆している。ＰＢ２８２１における単一アミノ酸置換はＭＤＶ−Ａのｔｓ表現型の決定基として従来報告されていた唯一のヌクレオチド位置であった（Ｓｕｂｂａｒａｏら（１９９５）Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｍｉｓｓｅｎｓｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ＰＢ２  Ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  Ｃａｎ  Ｅｆｆｅｃｔ  ａｎ  Ｉｎｃｒｅａ
ｓｅ  ｉｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｍｉｔｓ  ｔｈｅ  Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ
ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｌｉｖｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
Ａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５９６９−５９７７）。
【０１４７】
ＭＤＶ−Ａ表現型に関与する最小置換を特定するために、ｗｔＡ／ＡＡ／６／６０と相異するＭＤＶ−Ａクローンのヌクレオチドを個々にｗｔＡ／ＡＡ／６／６０のヌクレオチドに置換した（即ち「復帰変異させた」）。次に各復帰変異遺伝子セグメントをＭＤＶ−Ａの相補的セグメントと共に宿主細胞に導入し、単一遺伝子リアソータントを回収した。更に、復帰変異遺伝子セグメントと対応するＭＤＶ−Ａセグメントを他の野生型株（例えばＡ／ＰＲ／８／３４株）に由来するセグメントと共にトランスフェクトし、各遺伝子セグメントがウイルス表現型に関与しているか否かを評価することもできる。上記組換えＭＤＶ−Ａプラスミドシステムを使用して部位特異的突然変異誘発を実施し、非ｔｓリアソータントを作製するように６個の内部遺伝子を更に改変した。表６に示すような組換え野生型Ａ／ＡＡ／６／６０ゲノム（ｒＷｔ，Ｆｌｕ０６４）に相当するように合計１５個のヌクレオチド置換突然変異を６種のＭＤＶ−Ａプラスミドに導入した。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞とＣＯＳ−７細胞を上述のように維持及びトランスフェクトした。回収したウイルスを次にＭＤＣＫ細胞で１代継代した後、発育鶏卵の尿膜腔で増幅させた。トランスフェクションとＭＤＣＫ及び鶏卵でのウイルス増殖は温度選択圧を最小限にするためにｃａ及びｗｔウイルスの両者に許容される温度である３３℃で実施した。ウイルスＲＮＡから増幅したｃＤＮＡフラグメントの配列分析によりウイルス遺伝子型を確認した。
【表６】
2005523698.tif 000007
【０１４８】
例えばその開示内容全体を本明細書に組込む米国特許第６，３２２，９６７号（Ｐａｒｋｉｎ，発明の名称「インフルエンザの組換えトリプトファン突然変異体（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）」）に従来記載されているような当分野で公知の方法により表現型特徴を決定した。要約すると、組換えウイルスの温度感受性をＭＤＣＫ細胞でプラークアッセイにより３３、３８及び３９℃で測定した。６ウェルプレート内のＭＤＣＫ細胞に１０倍系列希釈ウイルス４００μｌを感染させ、室温で６０分間吸着させた。接種材料を除去し、１％アガロースと１μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ−トリプシンを添加した１ｘＬ１５／ＭＥＭに交換した。３３℃でＣＯ２インキュベーター又は３８±０．１℃又は３９±０．１℃に維持した循環水浴に沈めた５％ＣＯ２を収容する水密容器で感染細胞をインキュベートした（Ｐａｒｋｉｎら（１９９６）Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｔｏ  ａｌａｎｉｎｅ  ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｖｉｒ．Ｒｅｓ．４６：３１−４４）。３日間インキュベーション後、ニワトリ抗ＭＤＶポリクローナル抗体を使用して単層を免疫染色し、プラークを計数した。各温度で得られたプラークカウントを比較し、各ウイルスのｔｓ表現型を評価し、各アッセイを最低３回ずつ実施した。シャットオフ温度は３３℃に比較して力価低下が１００倍以上となる最低温度として定義した。
【０１４９】
８種のプラスミド（ｐＭＤＶ−ＰＢ２，ｐＭＤＶ−ＰＢ１，ｐＭＤＶ−ＰＡ，ｐＭＤＶ−ＮＰ，ｐＭＤＶ−ＨＡ，ｐＭＤＶ−ＮＡ，ｐＭＤＶ−Ｍ，及びｐＭＤＶ−ＮＳ）をトランスフェクトした共培養ＣＯＳ−７／ＭＤＣＫ細胞から得られた感染性ウイルスを発育鶏卵で増幅させた処、非組換え生物由来ＭＤＶ−Ａの特徴的ｔｓ表現型を示すことが判明した（表７）。ＭＤＶ−ＡとｒＭＤＶ−Ａのどちらも３９℃では明白なプラークを形成しなかったが、どちらも３３℃では容易に目に見えるプラークを形成した。
【表７】
2005523698.tif 000008
【０１５０】
ＭＤＶ−Ａのｔｓ表現型の遺伝子基盤の系統的な詳細分析を実施するために、ｃａ  Ａ／ＡＡ／６／６０に対して７〜４８ｎｔの変異をもつ数種の近縁非ｔｓ、非ａｔｔ  ｗｔＡ／ＡＡ／６／６０株（高度関連単離株ｗｔＡ／ＡＡ／６／６０Ｅ１０ＳＥ２を含む）の配列を比較のために使用した。Ｅ１０ＳＥ２とＭＤＶ−Ａの間には合計１９ｎｔの変異が存在する（表６）。Ｅ１０ＳＥ２はフェレットで非ｔｓ（表７）及び非ａｔｔであることが判明した。組換え非ｔｓウイルスを作製するために、ＭＤＶ−Ａプラスミドを部位特異的突然変異誘発により改変し、１０個のアミノ酸置換に相当する１９個の変異のうちの１５個を組込んだ。ＭＤＶ−ＡとＥ１０ＳＥ２の間で相異するヌクレオチド位置のうちＰＢ２−１１８２，１２１２，ＰＢ１−１２３、及びＮＰ−１５５０の４個はＡ／ＡＡ／６／６０の他の非ｔｓ単離株で観察され、従って、ｔｓ表現型の発現に関与するとは予想されないので、ＭＤＶ−Ａ配列から改変しなかった（Ｈｅｒｌｏｃｈｅｒら（１９９６）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｏｆ  Ａ／ＡＡ／６／６０  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ：ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｈｉｃｈ  ｍａｙ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２：１１−２５）。８種１組のプラスミドｐＷｔ−ＰＢ２，ｐＷｔ−ＰＢ１，ｐＷｔ−ＰＡ，ｐＷｔ−ＮＰ，ｐＷｔ−Ｍ，ｐＷｔ−ＮＳ，ｐＭＤＶ−ＨＡ，及びｐＭＤＶ−ＮＡをトランスフェクトした共培養ＣＯＳ−７／ＭＤＣＫ細胞から１５個のヌクレオチド置換をコードする組換えウイルス（ｒＷｔ，Ｆｌｕ０６４）が得られた。シーケンシング分析の結果、ｒＷｔは指定遺伝子変異を含み、３９℃で非ｔｓであり、生物由来ｗｔＡ／ＡＡ／６／６０に一致することが判明した。これらの知見から、ｔｓ表現型はこれらの１５ｎｔ変異のサブセットにマッピングすることが立証された。
ウイルスｔｓ表現型への６個の内部遺伝子セグメントの関与
【０１５１】
組換え単一遺伝子リアソータント（表７）を作製することにより、ＭＤＶ−Ａ  ｔｓ表現型に及ぼす各ｗｔ遺伝子セグメントの効果を調べた。ｗｔＰＢ２をｒＭＤＶ−Ａに導入すると、３８℃では非ｔｓのウイルスしか得られなかったが、３９℃ではｔｓが維持され
た。ＭＤＣＫ細胞でプラークアッセイにより測定した場合、（３３℃に対して）３８℃と３９℃のウイルス力価の低下は夫々０．６ｌｏｇ１０と２．７ｌｏｇ１０であった。ｗｔＰＢ１遺伝子セグメントを含むリアソータントは３８℃と３９℃の両者でそのプラーク形成能に関して非ｔｓであった。しかし、この組換え体のプラークサイズは温度上昇により変化し、３９℃ではｒＷｔに比較して有意に減少した。ｗｔＮＰ遺伝子セグメントをｒＭＤＶ−Ａに導入すると、同様に３８℃では非ｔｓのウイルスとなったが、ｗｔＰＢ２組換え体と異なり、ｗｔＮＰ遺伝子セグメントを含むウイルスは３９℃でプラークを形成しなかった。ｗｔＰＡ，Ｍ又はＮＳ遺伝子セグメントを個々にｒＭＤＶ−Ａに導入すると、ｔｓ表現型は変化せず、これらの３種の遺伝子セグメントはこの表現型の維持に最小限の役割を果たすと思われた。
【０１５２】
ＭＤＶ−Ａバックグラウンドに個々に発現されたｗｔＰＢ１，ｗｔＰＢ２又はｗｔＮＰはいずれも非ｔｓ  ｒＷＴと同一のプラーク効率とプラークサイズプロフィルを生じることができなかったので、これらの遺伝子セグメントを種々に組合せてＭＤＶ−Ａに導入した。ｗｔＰＢ１とｗｔＰＢ２を組合せると、３８℃と３９℃のどちらでも非ｔｓのウイルスになった（表７）。プラークサイズはどちらの単一遺伝子リアソータントよりも大きかったが、ｒＷｔより有意に小さかった。ｒＭＤＶ−ＡにｗｔＰＢ１／ＰＢ２／ＮＰの三重組合せを導入すると、３９℃でそのプラーク効率とプラークサイズにおいてｒＷｔに類似又は一致するウイルスが得られた。従って、個別に導入した場合にはｗｔＰＢ２，ＰＢ１及びＮＰ遺伝子セグメントはｔｓ表現型を一部だけ復帰変異させたが、全３種のｗｔ遺伝子セグメントを組合せると、ｔｓ表現型をｒＷｔと同一の非ｔｓ表現型に完全に復帰変異させることができた。
【０１５３】
これらの３種の遺伝子セグメントが特徴的ＭＤＶ−Ａ  ｔｓ表現型をｒＷｔに付与することができたか否かを調べるために、ＭＤＶ−Ａに由来する６種の内部遺伝子セグメントを個別又は組合せてｒＷｔに導入した。単一ＰＢ１，ＰＢ２，又はＮＰ遺伝子セグメントをｒＷｔに導入すると、３８℃のウイルス力価は低下し、３９℃では更に低下したが、これらの単一遺伝子リアソータントのうちでｒＭＤＶ−Ａのように高温で制限されるものは皆無であった（図１０）。ｍＭＤＶ−Ａに由来するＰＡ，Ｍ及びＮＳ遺伝子セグメントはｒＷｔの非ｔｓ表現型に影響を与えなかった。上記リアソートメントに一致して、ＭＤＶ−ＡＰＢ１及びＰＢ２遺伝子の両方をｒＷｔバックボーンに導入すると、３８℃でウイルスｔｓ表現型は著しく増加したが、ウイルスｔｓ表現型の完全な復帰変異にはＮＰを加える必要があることが立証された。従って、ＭＤＶ−Ａに由来するＰＢ１，ＰＢ２及びＮＰ遺伝子セグメントは完全なｔｓ表現型の付与に重要であった。
ＭＤＶ−Ａ  ｔｓ表現型を決定した遺伝子座のマッピング
【０１５４】
ｒＷｔ及びｒＭＤＶ−ＡのＰＢ１，ＰＢ２及びＮＰ遺伝子セグメント間の特異的変異を系統的に検討し、ｔｓ表現型に有意な役割を果たした変異を同定した。ｒＭＤＶ−ＡのＮＰ遺伝子はｎｔ１４６のみがｒＷｔＮＰと相異していた（Ｇ３４Ｄ，表６）。ｒＭＤＶ−ＡのＰＢ２遺伝子は３部位がｒＷｔと相異していたが、ｎｔ８２１のみがアミノ酸置換を伴い（Ｎ２６５Ｓ，表６）、ＰＢ２遺伝子セグメントに位置するｔｓ遺伝子座に相当すると予想された。ＭＤＶ−ＡのＰＢ１遺伝子は６ｎｔ位置がｗｔＰＢ１と相異し、そのうち４個はコーディング変異であった（表６）。ｗｔアミノ酸残基置換の各々を個々にｒＭＤＶ−ＡのＰＢ１遺伝子セグメントに置換し、ｔｓ表現型におけるその役割を調べた。１３９５Ｇ（Ｇｌｕ−４５７）と２００５Ｇ（Ａｌａ）はＭＤＶ−Ａ  ｔｓ表現型に影響がなかった。１１９５Ａ（Ｌｙｓ−３９１）と１７６６Ａ（Ｇｌｕ−５８１）は各々３８℃でｔｓ表現型を僅かに低下させたが、３９℃では影響がなかった（表８）。これらのデータから、１１９５Ａと１７６６ＡがＰＢ１遺伝子セグメントにおけるｔｓ遺伝子座ではないかと予想された。しかし、１１９５Ａと１７６６Ａを併用してもｗｔＰＢ１に類似するｔｓ表現型は生じなかった（表６）。１３９５Ａでなく２００５ＧをＰＢ１−１１９５Ａ／
１７６６Ａに加えると、３９℃でウイルスｔｓ表現型は更に低下し、２００５ＡもＭＤＶ−ＡのＰＢ１セグメントにより特定されるｔｓ表現型の発現に役割を果たすことが立証された。
【表８】
2005523698.tif 000009
【０１５５】
次に、ＰＢ１単一部位突然変異をｗｔＰＢ２及びｗｔＮＰと共にｒＭＤＶ−Ａに導入した。ｗｔＰＢ２／ＮＰ及びｒＭＤＶ−Ａリアソータントは３８℃で非ｔｓであり、３９℃で力価低下が１．２５ｌｏｇ１０であったが、そのプラークサイズはｒＷｔに比較して著しく減少した。ＰＢ１−１１９５Ａ又は１７６６Ａを加えてもｗｔＰＢ２／ＮＰリアソータントの表現型は有意に変化しなかった。ＰＢ１−１１９５Ａ及び１７６６ＡをｗｔＰＢ２及びｗｔＮＰと併用した場合のみにｗｔＰＢ１／ＰＢ２／ＮＰ及びｒＭＤＶ−Ａリアソータントと同一の非ｔｓ表現型をもつウイルスが得られた（表８）。ＰＢ１−１３９５Ｇ又は２００５ＧをｗｔＰＢ１−１７６６／ＰＢ２／ＮＰに加えてもウイルスは特徴的ｒＷｔ非ｔｓ表現型に変換しなかった。従って、これらのデータから３種のＰＢ１，ＰＢ２及びＮＰ遺伝子に分配された４種のアミノ酸がＭＤＶ−Ａ  ｔｓ表現型を完全に復帰変異させることができることが立証された。
ＭＤＶ−Ａ及びリアソータントウイルスの宿主細胞制限
【０１５６】
上述のようにＭＤＶ−Ａウイルスと１個以上のＭＤＶ−Ａ由来セグメントをもつリアソータントウイルスは温度感受性及び弱毒表現型を示すが、ＭＤＶ−Ａウイルスは更にＭＤＣＫ細胞に比較してＰｅｒ．Ｃ６細胞における増殖の低下から明らかように宿主細胞制限も示す。図２０Ａ及びＢに示すように、ＭＤＶ−ＡとＭＤＶ−Ａ由来ＰＢ１及びＰＢ２セグメントをもつリアソータントウイルスはＭＤＣＫ細胞に比較してＰｅｒ．Ｃ６細胞で有意増殖低下を示した。
温度感受性、弱毒ウイルス株の構築
【０１５７】
ＭＤＶ−ＡのＰＢ１，ＰＢ２及びＮＰ遺伝子セグメントで同定された５種のアミノ酸がＭＤＶ−Ａのｔｓ及びａｔｔ表現型を再現するか否かを調べるために、ＰＢ１−３９１Ｅ，５８１Ｇ，６６１Ｔ，ＰＢ２−２６５Ｓ，ＮＰ−３４Ｇを分岐野生型ウイルス株（Ａ／ＰＲ／８／３４；“ＰＲ８”）に導入した処、得られたウイルスは３８℃で１．９ｌｏｇ１０のウイルス力価の低下を示し、３９℃では４．６ｌｏｇ１０の低下を示し、ｒＭＤＶ−Ａと非常によく似ていた（図１１）。
【０１５８】
ｃａ  Ａ／ＡＡ／６／６０（ＭＤＶ−Ａ）及びＡ／ＰＲ／８／３４のＰＢ１，ＰＢ２及びＮＰ遺伝子の配列比較の結果、ＭＤＶ−ＡのＰＢ１及びＰＢ２遺伝子で同定された４種の置換アミノ酸はユニークであることが判明した。ＮＰ３４はＭＤＶ−ＡとＰＲ８の間で保存されている。従って、ＭＤＶ−ＡのＰＢ１遺伝子で同定された３個のｔｓ部位ＰＢ１
３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）及びＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）をＡ／ＰＲ／８／３４のＰＢ１に部位特異的突然変異誘発により導入し、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）をＡ／ＰＲ／８／３４のＰＢ２に導入した。ＰＢ１及びＰＢ２遺伝子に導入された突然変異をシーケンシング分析により確認した。突然変異誘発反応に使用したプライマー対を表９に示す。これらのウイルスを図１６に模式的に示す。
【表９】
2005523698.tif 000010
【０１５９】
ＰＲ８のＰＢ１及びＰＢ２遺伝子に導入されたｔｓ突然変異がｔｓ表現型をｉｎ  ｖｉｔｒｏ付与するか否かを調べるために、ミニゲノムアッセイを実施した。インフルエンザミニゲノムレポーターｐＦｌｕ−ＣＡＴはアンチセンスＣＡＴ遺伝子をｐｏｌ  Ｉプロモーターの制御下にクローニングしたものである。ＣＡＴ蛋白質の発現はインフルエンザＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ，及びＮＰ蛋白質に依存した。
【０１６０】
要約すると、ＨＥｐ−２細胞にＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ，ＮＰ及びｐＦｌｕ−ＣＡＴミニゲノム各１μｇをリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりトランスフェクトした。３３℃又は３９℃で一晩（約１８時間）インキュベーション後に、細胞抽出物のＣＡＴ蛋白質発現をＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により分析した。ＣＡＴ  ｍＲＮＡレベルをプライマー伸長アッセイにより測定した。トランスフェクションから４８時間後に全細胞ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出し、水６μｌ中にてその５’末端を［ｒ−３２Ｐ］−ＡＴＰで標識した過剰のＤＮＡプライマー（５’−ＡＴＧＴＴＣＴＴＴＡＣＧＡＴＧＣＧＡＴＴＧＧＧ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとＲＮＡの１／３を混合した。９５℃で３分間変性後、０．５ｍＭｄＮＴＰを添加した反応緩衝液にスーパースクリプト逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０Ｕを添加後に１時間４２℃でプライマー伸長を実施した。ＴＢＥ緩衝液中８Ｍ尿素を加えた６％ポリアクリルアミドゲルで転写産物を分析し、オートラジオグラフにより検出した。
【０１６１】
図１２Ａ及びＢに示すように、３個のアミノ酸置換（ＰＲ８−３ｓ），ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）及びＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）をもつＰＢ１遺伝子はＰＲ８対照に比較して３３℃の活性が低下していた。この突然変異体では３９℃でＣＡＴ蛋白質発現の大幅な低下が観察され（図１２Ａ）、３個のＭＤＶ−Ａ  ｔｓ部位を導入したＰＢ１遺伝子がこのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで温度感受性複製を示すことが示唆された。ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）をＰＲ８に導入しても許容温度（３３℃）と非許容温度（３９℃）のいずれでもその活性に殆ど影響がなかった。ＰＢ１−３ｓとＰＢ２−１ｓを併用すると蛋白質活性は大きく低下し（ＰＲ８−４ｓ）、ＭＤＶ−Ａよりも更にｔｓであると思われた。予想通り、ＭＤＶ−Ａに由来するＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ，ＮＰ遺伝子をトランスフェクトした細胞ではｗｔＡ／ＡＡ／６／６０（ｗｔＡ／ＡＡ）に比較して３９℃で低レベル活性（１５％）が検出された。
【０１６２】
ＰＲ８突然変異体ウイルスを上述のように作製及び回収した。要約すると、ＰＲ８に由
来するＰＲ８  ＨＡ，ＮＡ，ＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ，ＮＰ，Ｍ及びＮＳ遺伝子をコードする８種のプラスミドを共培養ｃｏｓ７及びＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトした。４個のｔｓ遺伝子座（ＰＲ８−４ｓ）をもつウイルスを作製するために、ｎｔ１１９５（Ｋ３９１Ｅ），ｎｔ１７６６（Ｅ５８１Ｇ）及びｎｔ２００５（Ａ６６１Ｔ）位に３個のＰＢ１変異を含むＰＢ１−３ｓと、８２１（Ｎ２６５Ｓ）位に１個のＰＢ２変異を含むＰＢ１−１ｓを使用した。更に、３個のＰＢ１突然変異（ＰＲ８−３ｓ）又は１個のＰＢ２突然変異（ＰＲ８−１ｓ）を含むＰＲ８ウイルスも別に回収した。これらのウイルスを図１６に模式的に示す。全４個の組換え突然変異体ＰＲ８ウイルスは発育鶏卵で非常に高力価まで増殖し、表１０に示すように９．０ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ以上の力価に達した。
【０１６３】
感染細胞におけるウイルス蛋白質合成を試験するために、ＭＤＣＫ細胞にウイルスをｍ．ｏ．ｉ＝５で感染させ、感染から７時間後に細胞を３５Ｓ−Ｔｒａｎｓで１時間標識した。ＳＤＳを添加した１．５％ポリアクリルアミドゲルで標識細胞溶解液を電気泳動し、オートラジオグラフにかけた。蛋白質合成をウェスタンブロッティングでも試験した。感染から８時間後にウイルス感染細胞を回収し、４−１５％勾配ゲルで電気泳動した。ブロットを抗Ｍ１抗体又はニワトリ抗ＭＤＶ−Ａポリクローナル抗体でプローブした後、ＨＲＰ標識二次抗体と共にインキュベートした。抗体と結合した蛋白質バンドをＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により検出した後、Ｘ線フィルムに露光した。
【０１６４】
図１９に示すように、いずれも３３℃で同等の蛋白質合成レベルであったが、３９℃では蛋白質合成レベルはＰＲ８−１ｓがやや低下し、ＰＲ８−３ｓ及びＰＲ８−４ｓ感染細胞では大幅に低下した。ウェスタンブロッティング分析からもＰＲ８−４ｓ＞ＰＲ８−３ｓ＞ＰＲ８−１ｓの順で蛋白質合成が低下することが分かった。従って、ｔｓ突然変異体の複製低下は非許容温度で複製が低下するためであると思われた。
【０１６５】
３３℃，３７℃，３８℃及び３９℃にてＭＤＣＫ細胞でプラークアッセイによりＰＲ８突然変異体ウイルスの温度感受性を測定した。回収したウイルスを上述のように発育鶏卵で増幅させ、細胞に導入した。ウイルス感染細胞を指定温度で３日間インキュベーション後、ニワトリ抗ＭＤＶポリクローナル抗体を使用して細胞単層を免疫染色し、プラークを計数した。各温度で得られたプラークカウントを比較し、各ウイルスのｔｓ表現型を調べた。シャットオフ温度は３３℃に比較して力価低下が１００倍以上となる最低温度として定義した。
【０１６６】
表１０及び図１７に示すように、ウイルス力価の僅かな低下が観察されたが、全突然変異体は３３℃で良好に複製した。３８℃では全突然変異体にウイルス力価の有意低下が観察された。３９℃ではＰＢ１遺伝子に３個のｔｓ遺伝子座をもつウイルス（ＰＲ８−３ｓ及びＰＲ８−４ｓ）で４．０ｌｏｇ１０を上回るウイルス力価の低下が観察された。ＰＲ８−１ｓも３９℃でｔｓであった。ＰＲ８−４ｓのｔｓ表現型は３３℃に比較して３９℃で４．６ｌｏｇ１０低下したＭＤＶ−Ａに非常によく似ていた。全３種のＰＲ８突然変異体は３７℃でウイルス力価の低下が２．０ｌｏｇ１０以下であったが、それらのプラーク形態は３３℃の形態と相違していた。図１８に示すように、各突然変異体のプラークサイズは３３℃ではＰＲ８に比較して僅かしか減少しなかった。ＰＲ８−３ｓでは３７℃でプラークサイズの有意減少が観察され、ＰＲ８−４ｓでは更大幅な減少が観察された。ＰＲ８−１ｓは３７℃でプラークサイズが有意に減少しなかった。３９℃では、ＰＲ８−３ｓとＰＲ８−４ｓのいずれにも非常に小さいサイズのプラークが数個しか観察されなかった。ＰＲ８−１ｓにはｗｔＰＲ８の約３０％のプラークサイズが観察された。
【表１０】
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【０１６７】
突然変異体ＰＲ８ウイルスの弱毒をフェレットで試験した。要約すると、９−１０週齢雄フェレットを使用して動物宿主の気道におけるウイルス複製を評価した。フェレットを１匹ずつ檻に入れ、ウイルス８．５ｌｏｇ１０ｐｆｕを鼻腔内接種した。感染から３日後にフェレットをケタミン−ＨＣＬで麻酔し、肺と鼻甲介（ＮＴ）を摘出した。肺組織ホモジネートを無菌希釈し、１０日齢発育鶏卵で力価測定した。肺におけるウイルス力価（ｌｏｇ１０ＥＩＤ５０／ｍｌ）をＫａｒｂｅｒ法により計算した。ＮＴにおけるウイルス複製をプラークアッセイにより測定し、ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌとして表した。
【０１６８】
肺と鼻甲介におけるウイルス複製レベルをＥＩＤ５０又はプラークアッセイにより測定した（表１１）。感染から３日後に、ＰＲ８は５．９ｌｏｇ１０ＥＩＤ５０／ｇ肺組織のレベルまで複製した。しかし、ＰＲ８−１ｓはフェレット肺の複製の３．０ｌｏｇ１０低下を示し、ＰＲ８−３には殆ど複製が検出されなかった。個々に得られたウイルスを感染させた２群で試験したＰＲ８−４ｓでは全く複製が検出されなかった。ＥＩＤ５０アッセイによるフェレット肺のウイルス検出限界は１．５ｌｏｇ１０であるので、ＰＲ８−４ｓに１．５ｌｏｇ１０ＥＩＤ５０の力価を割当てた。対照として、ＭＤＶ−Ａはフェレット肺で複製せず、ｗｔＡ／ＡＡ／６／６０は力価４．４ｌｏｇ１０まで複製した。鼻甲介（ＮＴ）におけるウイルス複製をＭＤＣＫ細胞でプラークアッセイにより試験した。ＰＲ８は鼻で力価６．６ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｇまで複製した。ＰＲ８−１ｓとＰＲ８−３ｓではウイルス力価の僅かな低下しか観察されなかった。ＰＲ８−４ｓ（Ａ）では２．２ｌｏｇ１０の低下が観察され、ＰＢ１遺伝子に変異（Ｅ３９０Ｇ）をもつＰＲ８−４ｓ（Ｂ）では４．３ｌｏｇ１０の低下が観察された。ＰＲ８−４ｓ（Ｂ）の大幅な複製低下は３７℃でのそのｔｓ表現型と良好に相関した。ここではＭＤＶ−Ａ由来インフルエンザワクチンの弱毒表現型を評価するために通常使用した７．０ｌｏｇ１０ｐｆｕの代わりに８．５ｌｏｇ１０ｐｆｕの感染用量を使用した。この結果、ＭＤＶ−Ａに由来する４個のｔｓ遺伝子座をもつＰＲ８はフェレットの下気道における複製で弱毒されたことが判明した。
【表１１】
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【０１６９】
ｔｓ及びａｔｔアッセイの両者でＰＲ８突然変異体ウイルスはＭＤＶ−Ａと非常によく似たｔｓ及びａｔｔ表現型を示した。これらのデータから、ＭＤＶ−Ａのユニークアミノ酸置換を分岐インフルエンザウイルス株に導入すると、例えば生弱毒ワクチンの生産に望ましい温度感受性及び弱毒表現型を示すウイルスが得られると思われる。更にｔｓ，ａｔ
ｔ，ＰＲ−８ウイルスは生弱毒又は不活化インフルエンザワクチンの生産にマスタードナーウイルスとして使用するのに適した高力価まで増殖した。これらの結果から、５種のＭＤＶ−Ａ突然変異：ＰＢ１−３９１Ｅ，ＰＢ１−５８１Ｇ，ＰＢ１−６６１Ｔ，ＰＢ２−２６５Ｓ，及びＮＰ−３４Ｇは任意インフルエンザＡ株にｔｓ及びａｔｔ表現型を付与できると思われる。同様に、ＭＤＶ−Ｂ株の突然変異をインフルエンザＢ株ウイルスに導入することによりワクチン生産に適した新規ｔｓ，ａｔｔＢ株も生産できる。生弱毒ウイルスワクチンの生産に加え、これらの突然変異をドナー株に導入すると、より安全な不活化ワクチンを生産できると思われる。
【実施例５】
【０１７０】
ＭＤＶ−Ｂの生産用８プラスミドシステム
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して典型的インフルエンザＢマスタードナー株（ＭＤＶ−Ｂ）であるインフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６の低温適応変異体（ｃａ／Ｍａｓｔｅｒ  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６
Ｐ１  Ａｖｉｒｏｎ  １０／２／９７）に由来するウイルスＲＮＡを感染発育鶏卵由来尿膜腔液１００μｌから抽出し、ＲＮＡをＨ２Ｏ  ４０μｌに溶出させた。１ステップＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を添付プロトコールに従って使用し、各反応に抽出ＲＮＡ１μｌを使用してゲノムセグメントのＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＴ反応は５０分間５０℃の後に１５分間９４℃で実施した。ＰＣＲは９４℃１分、５４℃１分、及び７２℃３分を２５サイクル実施した。ＢｓｍＢＩ部位をもつセグメント特異的プライマーを使用してＰ遺伝子を増幅し、２個のフラグメントを作製した（表１２）。
【表１２】
2005523698.tif 000013
【０１７１】
インフルエンザ配列に相補的な配列を太字で示す。５‘末端は制限エンドヌクレアーゼＢｓｍＢＩ（Ｂｍ）又はＢｓａＩ（Ｂａ）の認識配列をもつ。
プラスミドのクローニング
【０１７２】
上述のようにＰＣＲフラグメントを単離し、ＢｓｍＢＩ（又はＮＰはＢｓａＩ）で消化し、ｐＡＤ３０００（アンチセンスｖＲＮＡ及びセンスｍＲＮＡの転写を可能にするｐＨＷ２０００の誘導体）のＢｓｍＢＩ部位に挿入した。得られたプラスミド各２〜４個を配列決定し、ＲＴ−ＰＣＲフラグメントの直接配列決定に基づくＭＤＶ−Ｂのコンセンサス配列と比較した。コンセンサス配列と相異するアミノ酸変異をもたらすヌクレオチド置換をもつプラスミドをプラスミドのクローニング又はＱｕｉｋｃｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の使用により「修復」した。得られたＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６プラスミドをｐＡＢ１２１−ＰＢ１，ｐＡＢ１２２−ＰＢ２，ｐＡＢ１２３−ＰＡ，ｐＡＢ１２４−ＨＡ，ｐＡＢ１２５−ＮＰ，ｐＡＢ１２６−ＮＡ
，ｐＡＢ１２７−Ｍ，及びｐＡＢ１２８−ＮＳと命名した。この両方向転写システムを使用して全ウイルスＲＮＡ及び蛋白質を細胞内で産生させると、感染性インフルエンザＢウイルスが作製される（図４）。
【０１７３】
コンセンサス配列に比較してｐＡＢ１２１−ＰＢ１とｐＡＢ１２４−ＨＡは２個、ｐＡＢ１２８−ＮＳは１個のサイレントヌクレオチド置換をもつことに注目すべきである（表１３）。これらのヌクレオチド置換はアミノ酸変異を生じず、ウイルス増殖とレスキューに影響しないと予想される。これらのサイレント置換は組換えウイルスのゲノタイピングを容易にするために維持されている。
【表１３】
2005523698.tif 000014
【０１７４】
ＰＡ，ＮＰ及びＭ１遺伝子にヌクレオチド置換をもつプラスミドを構築するために、プラスミドｐＡＢ１２３−ＰＡ，ｐＡＢ１２５−ＮＰ，ｐＡＢ１２７−Ｍを鋳型として使用した。ヌクレオチドをＱｕｉｋｃｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）により置換した。あるいは、所望突然変異を含むプライマーを使用して２個のフラグメントをＰＣＲ増幅し、ＢｓｍＢＩで消化し、３フラグメントライゲーション反応でｐＡＤ３０００−ＢｓｍＢＩに挿入した。作製されたプラスミドを配列決定し、ｃＤＮＡが不要な突然変異を含んでいないことを確かめた。
【０１７５】
ローダミン又はジクロロローダミン色素ターミネーターサイクルシーケンシングレディ反応キットとＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して鋳型ＤＮＡの配列を決定した。サンプルを電気泳動により分離し、ＰＥ／ＡＢＩモデル３７３、モデル３７３  Ｓｔｒｅｔｃｈ、又はモデル３７７  ＤＮＡシーケンサーで分析した。
【０１７６】
別実験で、増幅を９４℃３０秒、５４℃３０秒、及び７２℃３分の２５サイクルで実施した以外はＭＤＶ−Ｂ株について上述したようにインフルエンザＢ／Ｙａｍａｎｓｈｉ／１６６／９８に由来するウイルスＲＮＡを増幅し、ｐＡＤ３０００にクローニングした。ＮＰ及びＮＡセグメントの増幅に夫々以下のプライマー：ＭＤＶ−Ｂ５´ＢｓｍＢＩ−ＮＰ：ＴＡＴＴＣＧＴＣＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＧ（配列番号７５）及びＭＤＶ−Ｂ３´ＢｓｍＢＩ−ＮＰ：ＡＴＡＴＣＧＴＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＡＣ（配列番号７６）とＢｍ−ＮＡｂ−１：ＴＡＴＴＣＧＴＣＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡ（配列番号７７）及びＢｍ−ＮＡｂ−１５５７Ｒ：ＡＴＡＴＣＧＴＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＴＴＴＴ（配列番号７８）を使用した以外はＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８株セグメントの増幅にも同一のプライマーを使用した。Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８プラスミドをＡＢ２５１−ＰＢ１，ｐＡＢ２５２−ＰＢ２，ｐＡＢ２５３−ＰＡ，ｐＡＢ２５４−ＨＡ，ｐＡＢ２５５−ＮＰ，ｐＡＢ２５６−ＮＡ，ｐＡＢ２５７−Ｍ，及びｐＡＢ２５８−ＮＳと命名した。組換え及びリアソータントＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８ウイルスのＰＡ助長ゲノタイピングで３個のサイレントヌクレオチド変異が同定された。
【実施例６】
【０１７７】
感染性組換えインフルエンザＢ及びリアソータントインフルエンザウイルスの作製
ヘルパーフリーウイルス細胞培養システムでインフルエンザＢを増殖させようとする際に遭遇する問題を解決するために、本発明は組換え及びリアソータントＢ株インフルエンザウイルスの生産用新規ベクターとプロトコールを提供する。インフルエンザＢウイルスのレスキューに使用されるベクターシステムはインフルエンザＡウイルスの作製に開発されたシステムに基づく（Ｈｏｆｆｍａｎｎら（２０００）Ａ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｅｉｇｈｔ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：６１０８−６１１３；Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ＆  Ｗｅｂｓｔｅｒ（２０００）Ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｅｉｇｈｔ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：２８４３−７）。２９３Ｔ細胞は５％ＦＢＳ細胞を添加したＯｐｔｉＭＥＭＩ−ＡＢ培地に維持し、ＣＯＳ−７細胞は１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭＩ−Ａ培地に維持して２９３Ｔ又はＣＯＳ−７細胞（トランスフェクション効率とｐｏｌＩ活性の高い霊長類細胞）をＭＤＣＫ細胞（インフルエンザウイルスに許容可能）と共培養した。ＭＤＣＫ細胞は抗生物質と抗カビ剤を添加した１×ＭＥＭ，１０％ＦＢＳに維持した。ウイルスゲノムベクターのトランスフェクションに先立ち、細胞をＰＢＳ又はＦＢＳ非添加培地５ｍｌで１回洗浄した。７５ｃｍ２フラスコでコンフルエント細胞にトリプシン−ＥＤＴＡ１０ｍｌを加えた（ＭＤＣＫ細胞は２０〜４５分間インキュベートし、２９３Ｔ細胞は１分間インキュベートした）。細胞を遠心し、ＯｐｔｉＭＥＭＩ−ＡＢ１０ｍｌに再懸濁した。次に各懸濁細胞株１ｍｌをＯｐｔｉＭＥＭＩ−ＡＢ１８ｍｌで希釈し、混合した。次に細胞３ｍｌ／ウェルを６ウェルプレートに分注した。６〜２４時間後に各プラスミド１μｇを１．５ｍｌエッペンドルフチューブでＯｐｔｉＭＥＭＩ−ＡＢと混合した（ｘμｌプラスミド＋ｘμｌ  ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ−ＡＢ＋ｘμｌ  ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１＝２００μｌ；プラスミドＤＮＡμｇ当たり２μｌ  ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１）。混合物を室温で４５分間インキュベートした。次にＯｐｔｉＭＥＭＩ−ＡＢ８００μｌを加えた。培地を細胞から除去し、トランスフェクション混合物を細胞（ｔ＝０）に３３℃で６〜１５時間加えた。トランスフェクション混合物を細胞からゆっくりと除去し、ＯｐｔｉＭＥＭＩ−ＡＢ１ｍｌを加え、細胞を３３℃で２４時間インキュベートした。トランスフェクションから４８時間後に１μｇ／ｍｌＴＰＣＫ−トリプシンを添加したＯｐｔｉＭＥＭＩ−ＡＢ１ｍｌを細胞に加えた。トランスフェクションから９６時間後に１μｇ／ｍｌＴＰＣＫ−トリプシンを添加したＯｐｔｉＭＥＭＩ−ＡＢ１ｍｌを細胞に加えた。
【０１７８】
トランスフェクション後４日〜７日の間に細胞培養上清１ｍｌを回収し、ＨＡ又はプラークアッセイによりモニターした。要約すると、上清１ｍｌをエッペンドルフチューブに分注し、５０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清９００μｌを新しいチューブに移し、（例えば１２ウェルプレートで）ＭＤＣＫ細胞に５００μｌ／ウェルで系列希釈を実施した。上清を細胞と共に１時間インキュベートした後に除去し、１μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ−トリプシンを添加した感染培地（１ｘＭＥＭ）に交換した。次にＨＡアッセイ又はプラークアッセイを実施した。例えば、プラークアッセイでは０．８％アガロースゲルを重層して３日間３３℃でインキュベートしたＭＤＣＫ細胞で上清の力価を測定した。鶏卵に感染させるために、トランスフェクションから６又は７日後にトランスフェクト細胞の上清を回収し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ中ウイルス希釈液１００μｌを１１日齢発育鶏卵に３３℃で注入した。インキュベーションから３日後にＭＤＣＫ細胞でＴＣＩＤ５０アッセイにより力価を測定した。
【０１７９】
ＭＤＶ−Ｂを作製するために、共培養２９３Ｔ−ＭＤＣＫ又はＣＯＳ−７−ＭＤＣＫ細
胞に各プラスミド１μｇをトランスフェクトした。トランスフェクションから５〜７日後に試験した処、共培養ＭＤＣＫ細胞は細胞変性効果（ＣＰＥ）を示し、クローン化ｃＤＮＡから感染性ＭＤＶ−Ｂウイルスが作製されたことが分かった。７種のプラスミドをトランスフェクトした細胞ではＣＰＥは観察されなかった（表１４）。ウイルス作製用ＤＮＡトランスフェクションシステムの効率を測定するために、トランスフェクションから７日後に細胞の上清をＭＤＣＫ細胞で力価測定し、プラークアッセイによりウイルス力価を測定した。共培養２９３Ｔ−ＭＤＣＫの上清のウイルス力価は５．０×１０６ｐｆｕ／ｍｌであり、ＣＯＳ７−ＭＤＣＫ細胞では７．６×１０６ｐｆｕ／ｍｌであった。
【表１４】
2005523698.tif 000015
【０１８０】
一過的共培養２９３Ｔ−ＭＤＣＫ（１，２）又は共培養ＣＯＳ７−ＭＤＣＫ細胞（３，４）に７又は８種のプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから７日後に共培養ＭＤＣＫ細胞で細胞変性効果（ＣＰＥ）をモニターした。トランスフェクションから７日後にトランスフェクト細胞の上清をＭＤＣＫ細胞で力価測定した。ｐｆｕ／ｍｌのデータは複数（例えば３又は４回）のトランスフェクション実験の平均を表す。
【０１８１】
Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８プラスミドベクターを使用したトランスフェクション実験でも同等の結果が得られた。これらの結果は、トランスフェクションシステムが８種のプラスミドからインフルエンザＢウイルスを再現可能にｄｅ  ｎｏｖｏ作製できることを示す。
組換えインフルエンザＢのゲノタイピング
【０１８２】
ＭＤＣＫ細胞で後続継代後に感染細胞の上清のＲＴ−ＰＣＲを使用し、作製されたウイルスの信憑性を確認した。ＲＴ−ＰＣＲは全８種のセグメントにセグメント特異的プラスミドを使用して実施した（表１２）。図５Ａに示すように、全セグメントでＰＣＲ産物が作製された。ＰＢ１，ＨＡ，及びＮＳセグメントのＰＣＲ産物の直接シーケンシングの結果、分析した４種のヌクレオチドはプラスミドｐＡＢ１２１−ＰＢ１，ｐＡＢ１２４−ＨＡ，及びｐＡＢ１２８−ＮＳに存在するものと同一であることが判明した。これらの結果から、作製されたウイルスは所期プラスミドから作製され、（陰性対照に加えて）親ウイルスによる実験室汚染の可能性がないことが確認された（図５Ｂ）。
【０１８３】
同様に、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８プラスミドベクターのトランスフェクション後にウイルスを回収し、ＰＡセグメントのヌクレオチド１２８０−１２９０を含む領域を増幅した。シーケンシングの結果、回収したウイルスはプラスミド由来組換えＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８に対応することが確認された（図５Ｃ及びＤ）。
ｒＭＤＶ−Ｂのフェノタイピング
【０１８４】
ＭＤＶ−Ｂウイルスは温度感受性（ｔｓ）と低温適応（ｃａ）の２つの特徴的表現型を示す。定義によると、ｔｓは３３℃に比較した３７℃のウイルス力価の差が２ｌｏｇ（以上）として定義され、ｃａは３３℃に比較した２５℃のウイルス増殖の差が２ｌｏｇ未満
として定義される。初代ニワトリ腎（ＰＣＫ）細胞に親ウイルスＭＤＶ−Ｂとプラスミド由来トランスフェクトウイルスを感染させ、３種の温度でウイルス増殖を測定した。
【０１８５】
プラークアッセイでは、６ウェルプレートでコンフルエントＭＤＣＫ細胞（ＥＣＡＣＣ）を使用した。ウイルス希釈液を３０〜６０分間３３℃でインキュベートした。細胞に０．８％アガロースを重層した。感染細胞を３３℃又は３７℃でインキュベートした。感染から３日後に細胞を０．１％クリスタルバイオレット溶液で染色し、プラーク数を測定した。
【０１８６】
ｃａ−ｔｓ表現型アッセイは２５、３３、及び３７℃でウイルスサンプルのＴＣＩＤ５０力価測定により実施した。このアッセイフォーマットは９６ウェル細胞培養プレートで各種温度（２５℃，３３℃，３７℃）にて初代ニワトリ腎細胞単層に及ぼすインフルエンザウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）を試験することによりＴＣＩＤ５０力価を測定する。このアッセイは温度及びウイルス株と共に変化するプラーク形態に非依存性であり、インフルエンザウイルスが複製してＣＰＥを誘導する能力のみに依存する。一次組織のトリプシン処理により調製した初代ニワトリ腎（ＰＣＫ）細胞懸濁液を５％ＦＣＳ添加ＭＥＭ（アール）培地に再懸濁した。ＰＣＫ細胞を９６ウェル細胞培養プレートに４８時間播種して＞９０％コンフルエントの単層を作製した。４８時間後に表現型アッセイ培地（ＰＡＭ）と呼ぶ５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、抗生物質、非必須アミノ酸を添加した無血清ＭＥＭ培地でＰＣＫ細胞単層を１時間洗浄した。ＰＡＭを加えた９６ウェルブロックでウイルスサンプルの系列１０倍希釈液を調製した。希釈したウイルスサンプルを次に９６ウェルプレートの洗浄後のＰＣＫ単層にプレーティングした。ウイルスサンプルの各希釈液でウェル６個ずつを使用して希釈ウイルスを感染させた。細胞対照として未希釈細胞も各サンプルにつき６ウェルずつ試験した。各ウイルスサンプルを２〜４回ずつ力価測定した。２５℃、３３℃、及び３７℃で予め測定した力価をもつ表現型対照ウイルスも各アッセイに加える。ウイルスサンプルのｔｓ表現型を測定するために、プレートを３３℃と３７℃にて５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターで６日間インキュベートした。ｃａ表現型特性決定については、プレートを２５℃で１０日間インキュベートした。ウイルス力価をＫａｒｂｅｒ法により計算し、Ｌｏｇ１０平均（ｎ＝４）ＴＣＩＤ５０力価／ｍｌ＋標準偏差として報告した。図１〜３に示すウイルス力価の標準偏差は０．１〜０．３であった。３３℃と３７℃のウイルス力価の差を使用してｔｓ表現型を測定し、ウイルスの２５℃と３３℃の力価の差を使用してｃａ表現型を測定した。
【０１８７】
プラスミド由来組換えＭＤＶ−Ｂ（ｒｅｃＭＤＶ−Ｂ）ウイルスは予想通り、細胞培養でｃａとｔｓの２種類の特徴的表現型を発現した。２５℃の効率的複製に相当するｃａ表現型はＰＣＫ細胞でアッセイした場合に２５℃と３３℃で２ｌｏｇ１０以下の力価の差として機能的に測定される。親ＭＤＶ−Ｂと組換えＭＤＶ−Ｂはいずれもｃａを発現し、２５℃と３３℃の差は夫々０．３及び０．４ｌｏｇ１０であった（表１５）。ｔｓ表現型もＰＣＫ細胞で２種の温度の力価を観察することにより測定されるが、この表現型では、３７℃の力価が３３℃の力価よりも２ｌｏｇ１０以上低くなければならない。親ＭＤＶ−Ｂと組換えＭＤＶ−Ｂの３３℃と３７℃の差は夫々３．４及び３．７ｌｏｇ１０であった（表１５）。従って、組換えプラスミド由来ＭＤＶ−Ｂウイルスはｃａ及びｔｓ表現型の両者を発現した。
【０１８８】
組換えウイルスの力価は３３℃で７．０ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、３７℃で３．３  ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、２５℃で８．８ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった（表１５）。従って、８種のインフルエンザＭＤＶ−Ｂゲノムセグメントプラスミドのトランスフェクションに由来する組換えウイルスはｃａ及びｔｓ表現型の両者をもつ。
【表１５】
2005523698.tif 000016
【実施例７】
【０１８９】
リアソータントＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８ウイルスの生産
インフルエンザＢの主要系統に相当する数種の異なる株のＨＡ及びＮＡセグメントをほぼ上述のように増幅し、ｐＡＤ３０００にクローニングした。プライマーはＨＡ及びＮＡセグメントの同時ＲＴ−ＰＣＲ増幅に最適化させた。セグメント４（ＨＡ）とセグメント６（ＮＢ／ＮＡ）の非コーディング領域に相当するｖＲＮＡの末端領域を比較した結果、５’末端の２０個の末端ヌクレオチドと３’末端の１５ヌクレオチドがインフルエンザＢウイルスのＨＡ及びＮＡ遺伝子間で一致していることが判明した。ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー対（下線配列はインフルエンザＢウイルス特異的である）Ｂｍ−ＮＡｂ−１：ＴＡＴ
ＴＣＧ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＣＡ（配列番号７９）；Ｂｍ−ＮＡｂ−１５５７Ｒ：ＡＴＡ  ＴＣＧ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＡＴＴ  ＡＧＴ
ＡＧＴ  ＡＡＣ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  ＴＴ（配列番号８０）を合成及び使用してＨＡ及びＮＡ遺伝子を種々のインフルエンザＢ株から同時に増幅した（図８）。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／５０４／２０００，Ｂ／Ｈａｗａｉｉ／１０／２００１，及びＢ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／３３０／２００１のＨＡ及びＮＡ  ＰＣＲフラグメントを単離し、ＢｓｍＢＩで消化し、ｐＡＤ３０００に挿入した。これらの結果、これらのプライマーはインフルエンザＢの主要系統に相当する数種の異なる野生型ウイルスに由来するインフルエンザＢ  ＨＡ及びＮＡ遺伝子を含むプラスミドの効率的な作製に適用できることが立証された。ＲＴ−ＰＣＲ産物はシーケンシング及び／又は発現プラスミドへのクローニングに使用することができる。  
【０１９０】
種々のインフルエンザＢ系統から抗原を効率的に発現させるためにＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ウイルス）を利用できることを立証するために、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８に由来するＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ，ＮＰ，Ｍ，ＮＳとＶｉｃｔｏｒｉａ及びＹａｍａｇａｔａ系統の両者に相当する株に由来するＨＡ及びＮＡを含むリアソータント（６＋２リアソータント）を作製した。上記方法に従い、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８に相当する６種のプラスミドと、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７系統に由来する２株（Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／３３０／２００１及びＢ／Ｈａｗａｉｉ／１０／２００１）とＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８系統に由来する１株（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／５０４／２０００）のＨＡ及びＮＡセグメントのｃＤＮＡを含む２種のプラスミドを一過的共培養ＣＯＳ７−ＭＤＣＫ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションから６〜７日後に上清を新鮮なＭＤＣＫ細胞で力価測定した。全３種の６＋２リアソータントウイルスの力価は４〜９×１０６ｐｆｕ／ｍｌであった（表１６）。これらのデータから、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の６個の内部遺伝子は両者インフルエンザＢ系統に由来するＨＡ及びＮＡ遺伝子セグメントと共に感染性ウイルス効率的に形成できることが立証された。
【０１９１】
トランスフェクションから６又は７日後に共培養ＣＯＳ７−ＭＤＣＫ細胞の上清を力価測定し、ＭＤＣＫ細胞でプラークアッセイによりウイルス力価を測定した。
【表１６】
2005523698.tif 000017
【０１９２】
鶏卵で野生型Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の複製により比較的高力価が得られた。この特性がこのウイルスの６個の「内部」遺伝子の固有表現型であるか否かを調べるために実験を行った。この特性を評価するために、鶏卵で中度にしか複製しなかった野生型Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／５０４／２０００の効率と、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／５０４／２０００  ＨＡ及びＮＡを発現する６＋２リアソータントの効率を比較した。これらのウイルスを野生型及び組換えＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８に加えて各々３又は４個の発育鶏卵に１００又は１０００ｐｆｕで接種した。感染から３日後に尿膜腔液を鶏卵から回収し、ＴＣＩＤ５０力価をＭＤＣＫ細胞で測定した。６＋２リアソータントはｗｔ及び組換えＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８株と同等量のウイルスを尿膜腔液に産生した（図９）。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／５０４／２０００と６＋２組換え体の力価の差は約１．６ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０（０．７〜２．５ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ，９５％ＣＩ）であった。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／５０４／２０００と６＋２組換え体の差を３回の別個の実験で確認した（Ｐ＜０．００１）。これらの結果から、鶏卵での複製が不良な株から通常発現されるＨＡ及びＮＡ抗原にＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の鶏卵増殖特性を付与できることが立証された。
【実施例８】
【０１９３】
ｃａ  Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６の弱毒の分子基盤
ＭＤＶ−Ｂウイルス（ｃａ  Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６）はヒトで弱毒されており、フェレットで弱毒表現型を示し、細胞培養で低温適応及び温度感受性表現型を示す。ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用してＭＤＶ−Ｂの内部遺伝子の推定アミノ酸配列をＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓインフルエンザデータベース（ワールドワイドウェブ：ｆｌｕ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）の配列と比較した。他の株には存在しないＭＤＶ−Ｂにユニークな８個のアミノ酸が同定された（表１７）。ＰＢ１，ＢＭ２，ＮＳ１，及びＮＳ２をコードするゲノムセグメントはユニーク置換残基を示さない。ＰＡ及びＭ１蛋白質は各々２個、ＮＰ蛋白質は４個のユニーク置換アミノ酸をもつ（表１７）。ＰＢ２には６３０位に１個の置換アミノ酸が存在する（付加株Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４（ＡＦ１７０５７２）も６３０位にアルギニン残基をもつ）。
【０１９４】
これらの結果は、遺伝子セグメントＰＢ２，ＰＡ，ＮＰ及びＭ１がＭＤＶ−Ｂの弱毒表現型に関与していることを示唆している。ＭＤＶ−Ａについて上述したと同様に、８プラスミドシステムを使用してＭＤＶ−Ａについて上述したようにヘルパーに依存せずに単に該当プラスミドを培養細胞にコトランスフェクトするだけで組換え及びリアソータント（単一及び／又は二重、即ち７：１；６：２リアソータント）を作製することができる。例えば、Ｂ／Ｌｅｅ／４０に由来する６個の内部遺伝子をＭＤＶ−Ｂに由来するＨＡ及びＮＡセグメントと併用して６＋２リアソータントを作製することができる。
【表１７】
2005523698.tif 000018
【０１９５】
８個のユニークアミノ酸変異が特徴的ＭＤＶ−Ｂ表現型に影響を与えるか否かを調べるために、全８個のヌクレオチド位置がｗｔインフルエンザ遺伝子相補体を表すアミノ酸をコードする組換えウイルスを構築した。（表１７に示すように）野生型アミノ酸を表すようにＰＡ，ＮＰ，及びＭ１遺伝子の８個の残基を部位特異的突然変異誘発により変異させた１組のプラスミドを構築した。構築したプラスミドを共培養ＣＯＳ７−ＭＤＣＫ細胞にコトランスフェクトすることにより全８個の変異をもつ組換え体ｒｅｃ５３−ＭＤＶ−Ｂを作製した。ＭＤＣＫ細胞の共培養と３３℃での増殖により、トランスフェクションから６〜７日後に上清が高ウイルス力価を含むように確保した。トランスフェクト細胞の上清を力価測定し、ＭＤＣＫ細胞ではプラークアッセイにより力価を測定し、ＰＣＫ細胞では３３℃と３７℃で力価を測定した。
【０１９６】
図１３に示すように、２回の別個の独立した実験で、ｒｅｃＭＤＶ−ＢはＭＤＣＫ細胞とＰＣＫ細胞の両者でｔｓ表現型を発現した。全８個のアミノ酸変異をもつようにデザインした三重リアソータントウイルスｒｅｃ５３−ＭＤＶ−Ｂは非ｔｓ表現型を発現し、３３℃と３７℃の力価の差はＰＣＫ細胞で０．７ｌｏｇ１０しかなかった。力価はｔｓ定義の特徴である必要な２ｌｏｇ１０差のよりも低く、ｒｅｃＭＤＶ−Ｂで観察される〜３ｌｏｇ１０の差よりも有意に低かった。これらの結果は、ＰＡ，ＮＰ，及びＭ１蛋白質内の８個のアミノ酸の変異が相同及び異種の両者の糖蛋白質を使用して非ｔｓ野生型様ウイルスを作製するのに十分であることを示している。
【０１９７】
次に各遺伝子セグメントのｔｓ表現型への関与を調べた。ＰＡ，ＮＰ，又はＭ遺伝子セグメントと野生型アミノ酸相補体をもつプラスミド由来組換え体をＤＮＡコトランスフェクション法により作製した。全単一遺伝子組換え体はＭＤＣＫ細胞とＰＣＫ細胞で３７℃の増殖制限を示し（図１４）、遺伝子セグメントの変異によりｔｓ表現型を復帰変異させることができないと思われた。更に、ＮＰ及びＭ又はＰＡ及びＭ遺伝子セグメントを併有する組換えウイルスもｔｓ表現型を維持した。他方、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントを併有する組換えウイルスはｒｅｃ５３−ＭＤＶ−Ｂと同様に３７℃と３３℃の力価の差が２．０ｌｏｇ１０以下であった。これらの結果は、ＮＰ及びＰＡ遺伝子が主にｔｓ表現型に関与することを示している。
【０１９８】
ＮＰ蛋白質の４個のアミノ酸とＰＡ蛋白質の２個のアミノ酸の全てが非ｔｓに関与しているか否かを調べるために、ＮＰ遺伝子とＰＡ遺伝子が変異した三重遺伝子及び二重遺伝子組換え体を作製した（図１５）。２個のアミノ酸の置換Ａ１１４→Ｖ１１４及びＨ４１０→Ｐ４１０の結果として非ｔｓ表現型となった。ヌクレオプロテインに単一置換Ｈ４１０→Ｐ４１０をもつウイルスはＭＤＣＫとＰＣＫで非ｔｓ表現型を示した。他方、単一置
換Ａ５５→Ｔ５５はｔｓ表現型を示した。これらの結果から、ＮＰのＰ４１０が３７℃での効率的増殖に関与していると思われる。これらの結果はＰＡ及びＮＰの６個のアミノ酸から４個の残基が非ｔｓ表現型に関与していることを示す。
【０１９９】
従来のデータによると、ｔｓ表現型と弱毒表現型は高度に相関している。ｃａ  Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６ウイルスは感染フェレットの肺組織で検出てきないが、鼻腔内感染後に非弱毒インフルエンザＢウイルスが肺で検出可能であることはよく知られている。ｔｓ及びａｔｔ表現型も同一突然変異に基づくのか否かを調べるために、以下の試験を実施した。
【０２００】
トランスフェクション後に得られた組換えウイルスを発育鶏卵で継代し、ウイルスストックを作製した。９週齢フェレットに各鼻腔０．５ｍｌのウイルスを力価５．５、６．０又は７．０ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌで鼻腔内接種した。感染から３日後にフェレットを屠殺し、その肺と鼻甲介を上述のように試験した。
【０２０１】
フェレット（各群４匹）にｒｅｃＭＤＶ−Ｂ又はｒｅｃ５３−ＭＤＶ−Ｂを鼻腔内感染させた。ウイルス感染から３日後に鼻甲介と肺組織を摘出し、ウイルスの存在を試験した。７．０ｌｏｇ１０ｐｆｕ  ｒｅｃＭＤＶ−Ｂを感染させたフェレットの肺組織にウイルスは検出されなかった。ｒｅｃ５３−ＭＤＶ−Ｂウイルスを力価７．０ｌｏｇ１０ｐｆｕで感染させた４匹のうち３匹から肺組織にウイルスが検出された（この群の１匹の原因は不明）。ｒｅｃ５３−ＭＤＶ−Ｂを低用量（５．５ｌｏｇｐｆｕ／ｍｌ）で感染させた４匹の肺組織のうち２匹で肺組織からウイルスを単離することができた。従って、ＰＡ，ＮＰ，及びＭ１蛋白質の８種のユニークアミノ酸の野性型残基への変異はａｔｔ表現型を非ａｔｔ表現型に変換するために十分であった。
【０２０２】
細胞培養データによるとＰＡとＮＰがｔｓ表現型の要因であることがわかったので、第２の実験では、ｒｅｃ５３−ＭＤＶ−Ｂ（ＰＡ，ＮＰ，Ｍ）、ｒｅｃ６２−ＭＤＶ−Ｂ（ＰＡ）、ＮＰｒｅｃ７１−ＭＤＶ−Ｂ（ＮＰ）を６ｌｏｇｐｆｕでフェレットに感染させた。ｒｅｃ５３−ＭＤＶ−Ｂを感染させた４匹のうちの２匹が肺にウイルスをもっていた。単一及び二重リアソータントウイルスを感染させたフェレットの肺組織のうちでウイルスレベルが検出可能なものは皆無であった。従って、ＰＡ及びＮＰ蛋白質のアミノ酸に加え、Ｍ１蛋白質もａｔｔ表現型に重要である。ｗｔＰＡ及びＮＰをもつウイルスはフェレット肺で複製せず、弱毒に関与する突然変異のサブセットがｔｓ表現型に関与することが示唆された。
【０２０３】
従って、Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６のｔｓ表現型は最大３種の遺伝子により決定される。ＰＡ，ＮＰ，及びＭ１蛋白質の８個のアミノ酸が野性型残基に変換すると、３７℃で効率的に複製する組換えウイルスが得られた。同様に、ＭＤＶ−Ｂの６個の内部遺伝子とＢ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／３３０／０１に由来するＨＡ及びＮＡセグメントに相当する６＋２組換えウイルスはｔｓ表現型を示し、三重組換え体は非ｔｓであった。
【０２０４】
インフルエンザＡ株について上述したように、上記残基の置換、例えばＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）はｔｓ及びａｔｔ表現型を付与する。従って、これらのアミノ酸置換の１個以上をもつインフルエンザＢ株の人工構築変異体はｔｓ及びａｔｔ表現型を示し、弱毒生インフルエンザウイルスワクチンの生産で例えばマスタードナー株ウイルスとして使用するのに適している。
【実施例９】
【０２０５】
Ｖｅｒｏ細胞のエレクトロポレーションによる８種のプラスミドからのインフルエンザのレスキュー
組換えインフルエンザＡをＶｅｒｏ細胞からレスキューできることは従来示唆されている（Ｆｏｄｏｒら（１９９９）Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９６７９−８２；Ｈｏｆｆｍａｎｎら（２００２）Ｅｉｇｈｔ−ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：３１６５−３１７０）。報告されている方法は脂質試薬を使用する必要があり、インフルエンザＡの高度複製コンピテント実験室株の単一株（Ａ／ＷＳＮ／３３及びＡ／ＰＲ／８／３４）についてしか立証しておらず、ワクチン生産に適した生弱毒ウイルスの生産では適用が限られている。本発明はエレクトロポレーションを使用してＶｅｒｏ細胞から組換えインフルエンザウイルスを回収するための新規方法を提供する。これらの方法はインフルエンザＡ及びインフルエンザＢ株両者のウイルスの生産に適しており、例えば鼻腔内ワクチン製剤で投与するのに適した生弱毒ワクチンの製造を容易にする無血清条件下で増殖させたＶｅｒｏ細胞から例えば低温適応、温度感受性、弱毒ウイルスを回収することができる。エレクトロポレーションはウイルス株に広く適用できることに加え、細胞基質用増殖培地以外の付加的試薬を必要としないので望ましくない汚染の危険が少ない。特に、この方法は無血清条件下での増殖に適したＶｅｒｏ細胞（例えば病原体フリーとみなされるワクチン生産に適切なＶｅｒｏ細胞単離体）を使用して組換え及びリアソータントウイルスを作製するのに有効である。この特徴により、ＤＮＡを細胞基質に商業的に導入するのに適した方法としてエレクトロポレーションを選択することができる。
【０２０６】
多数の脂質試薬を使用するトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法及び細胞マイクロインジェクション等のＤＮＡをＶｅｒｏ細胞に導入するための種々の方法にエレクトロポレーションを比較した。インフルエンザＡのレスキューに脂質試薬を使用した場合にはある程度成果が得られたが、インフルエンザＡだけでなくインフルエンザＢもＶｅｒｏ細胞からレスキューすることが実証されたのはエレクトロポレーションのみであった。
【０２０７】
エレクトロポレーションの１日前に９０〜１００％コンフルエントＶｅｒｏ細胞を分割し、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸及び１０％ＦＢＳを添加したＭＥＭ（ＭＥＭ，１０％ＦＢＳ）中にＴ２２５フラスコ当たり細胞９×１０６個の密度で播種した。翌日、細胞をトリプシン処理し、Ｔ２２５フラスコ当たり５０ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。次に細胞をペレット化し、Ｔ２２５フラスコ当たり０．５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉに再懸濁した。場合により、ヒト又は動物由来成分を含まない特注ＯｐｔｉＭＥＭ培地を使用してもよい。例えば血球計で４０倍希釈液をカウントすることにより細胞密度を測定後、細胞５×１０６個を０．４ｃｍエレクトロポレーションキュベットにＯｐｔｉＭＥＭＩ最終容量４００μｌで加えた。次にＭＤＶ−Ａ又はＭＤＶ−Ｂゲノムを組込んだ容量２５μｌ以下の８種のプラスミドの等モル混合物から構成されるＤＮＡ２０μｇをキュベット内の細胞に加えた。細胞をタッピングにより温和に混合し、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩにＣａｐａｃｉｔａｎｃｅ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ  Ｐｌｕｓ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を接続して３００Ｖ、９５０μＦでエレクトロポレーションした。時定数は２８〜３３ｍｓｅｃの範囲にすべきである。
【０２０８】
キュベットの内容物をタッピングにより温和に混合し、エレクトロポレーションから１〜２分後にＭＥＭ，１０％ＦＢＳ０．７ｍｌを１ｍｌピペットで加えた。ピペットを数回上下させることにより細胞を再び温和に混合した後、ＭＥＭ，１０％ＦＢＳ２ｍｌ／ウェルを加えた６ウェル皿の２個のウェルに分割した。次にキュベットをＭＥＭ，１０％ＦＢＳ１ｍｌで洗浄し、２個のウェルに分割し、最収容量約３．５ｍｌ／ウェルとした。
【０２０９】
代替実験では、例えばＯｐｔｉＰｒｏ（ＳＦＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中でＶｅｒｏ細胞を無血清増殖条件に適応させ、ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ中でエレクトロポレーション後に細胞をＯｐｔｉＰｒｏ（ＳＦＭ）で希釈した後、ウイルスレスキューのために培養した以外は上述のようにエレクトロポレーションした。
【０２１０】
エレクトロポレーションした細胞を次に、導入したウイルスの複製と回収に適した条件下（即ち低温適応マスタードナー株には３３℃）で培養した。翌日（例えばエレクトロポレーションから約１９時間後）、培地を除去し、細胞をＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ又はＯｐｔｉＰｒｏ（ＳＦＭ）３ｍｌ／ウェルで洗浄した。ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ又はＯｐｔｉＰｒｏ（ＳＦＭ）１ｍｌ／ウェルを各ウェルに加え、培地を交換することにより上清を毎日採取した。上清を−８０℃でＳＰＧに保存した。ピークウイルス生産は一般にエレクトロポレーションから２〜３日後に観察された。
【表１８】
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【実施例１０】
【０２１１】
遺伝子送達用インフルエンザウイルスベクターシステム
本発明のベクターは遺伝子送達システムとして遺伝子治療用にも使用することができる。このような用途には、組換えインフルエンザウイルス、例えば外来蛋白質を発現する組換えインフルエンザＡ又はＢを作製することが望ましい。例えば、インフルエンザＢウイルスのセグメント７はスプライスされないので、異種核酸配列の挿入に好都合な遺伝子エレメントとなる。ｍＲＮＡはＭ１及びＢＭ２蛋白質をコードする２個のオープンリーディングフレームをもつ２個のシストロンを含む。ＢＭ２又はＭ１のオープンリーディングフレームを目的異種核酸、例えば強化緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子で置換する。本発明のプラスミドベクターシステムを使用して、Ｍ１−ＥＧＦＰのオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡとＢＭ２を２種の異なるプラスミドにクローニングする。オープンリーディングフレームは複製と転写に必要なシグナルを含むセグメント７の非コーディング領域の間に挿入する。あるいは、一方がＭ１  ＯＲＦを含み、他方がＥＧＦＰ−ＢＭ２を含む２種のプラスミドを構築する。得られた９種のプラスミドのコトランスフェクションの結果、異種遺伝子配列を含む組換えインフルエンザＢウイルスが作製される。同様に、インフルエンザＡのＮＳ１セグメントからＥＧＦＰを発現させることができる。
【０２１２】
典型的「緑色」インフルエンザＢウイルスは微量中和アッセイ等のウイルスアッセイで標準化に使用することができる。プラスミド技術と蛋白質発現の単純な検出（図２に示すように、ＥＧＦＰに由来する蛍光をモニターすることができる）を組合せることにより、
蛋白質発現を最適化することができる。
【０２１３】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
【図１】ｐＡＤ３０００プラスミドの模式図。
【図２】感染細胞の顕微鏡写真。
【図３】プラスミドトランスフェクションからのｒＭＤＶ−Ａ及び６：２Ｈ１Ｎ１リアソータントウイルスのゲノタイピング分析を示す。
【図４】インフルエンザＢウイルス生産用の８プラスミドシステムの模式図。
【図５】Ａ及びＢ．ＲＴ−ＰＣＲによる組換えＭＤＶ−Ｂウイルスの特性決定；Ｃ及びＤ．ＲＴ  ＰＣＲによる組換えＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の特性決定。
【図６−１】ＧｅｎｅＢａｎｋフォーマットによるｐＡＤ３０００の配列。
【図６−２】ＧｅｎｅＢａｎｋフォーマットによるｐＡＤ３０００の配列。
【図７−１】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−２】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−３】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−４】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−５】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−６】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−７】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−８】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−９】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−１０】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−１１】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−１２】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−１３】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−１４】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−１５】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−１６】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−１７】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−１８】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−１９】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−２０】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−２１】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−２２】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−２３】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−２４】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−２５】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−２６】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−２７】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−２８】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−２９】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−３０】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図７−３１】ＭＤＶ−Ｂと８種のプラスミドの配列アラインメント。
【図８】インフルエンザＢ株のＨＡ及びＮＡセグメントの同時増幅から誘導されたＲＴ−ＰＣＲ産物。
【図９】組換え及びリアソータントウイルスの相対力価を示す棒グラフ。
【図１０】許容温度と制限温度下のリアソータントウイルスの相対力価（温度感受性）を示す棒グラフ。
【図１１】温度感受性と相関する特定突然変異（ノックイン）を組込んだリアソータントウイルスの模式図（左パネル）と、許容温度と制限温度下の相対力価（温度感受性）（右パネル）を示す。
【図１２】ミニゲノムアッセイにおけるｔｓ突然変異の測定。Ａ．ＨＥｐ−２細胞にＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ，ＮＰ及びｐＦｌｕ−ＣＡＴをトランスフェクトし，３３℃又は３９℃で１８時間インキュベートし、細胞抽出物のＣＡＴレポーター遺伝子発現を分析した。Ｂ．プライマー伸長アッセイによるＣＡＴ  ｍＲＮＡ発現。
【図１３】ＰＡ，ＮＰ，及びＭ１蛋白質の野生型残基をもつ三重遺伝子組換え体の模式図。
【図１４】単一遺伝子及び二重遺伝子組換えウイルスの増殖をまとめた表。
【図１５】非ｔｓ表現型に対応するヌクレオプロテインのアミノ酸残基をまとめた表。
【図１６】組換えＰＲ８突然変異体の模式図。ＰＢ１及び／又はＰＢ２遺伝子に導入した突然変異を黒丸で示す。
【図１７】３３℃と３９℃の相対力価を示す棒グラフ。
【図１８】各種温度におけるＰＲ８突然変異体のプラーク形態を示す顕微鏡写真。ＭＤＣＫ細胞に指定ウイルスを感染させ、３３℃、３７℃、及び３９℃で３日間インキュベートした。ウイルスプラークを免疫染色により可視化し、写真撮影した。
【図１９】許容温度と非許容温度の蛋白質合成。ＭＤＣＫ細胞に指定ウイルスを感染させ、３３℃又は３９℃で一晩インキュベートした。放射性標識ポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動させ、オートラジオグラフにかけた。ウイルス蛋白質ＨＡ，ＮＰ，Ｍ１及びＮＳを示す。
【図２０Ａ】ＭＤＣＫ細胞での複製に比較したＰｅｒ．Ｃ６細胞でのＭＤＶ−Ａ及びＭＤＶ−Ｂの複製を示す折れ線グラフ。
【図２０Ｂ】Ｐｅｒ．Ｃ６細胞におけるＭＤＶ−Ａ単一遺伝子リアソータントの複製の変動を示す折れ線グラフ。
【図１】
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【図３】
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【図１９】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図７−１３】
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【図７−１４】
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【図７−１５】
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【図７−１６】
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【図７−１７】
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【図７−１８】
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【図７−１９】
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【図７−２０】
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【図７−２１】
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【図７−２２】
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【図７−２３】
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【図７−２４】
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【図７−２５】
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【図７−２６】
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【図７−２７】
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【図７−２８】
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【図７−２９】
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【図７−３０】
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【図７−３１】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【国際調査報告】
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2005523698.tif 000073
2005523698.tif 000074