(57)【要約】  「ＴＡＣＩｓ」及び「ＢＲ３」とここで称する新規レセプターと、そのアゴニスト及びアンタゴニスト、ならびに、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びＴＮＦＲ関連分子、例えばＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡと呼ばれるＴＮＦＲファミリーとＴＮＦファミリーのメンバーの活性を調節するための、ＴＡＣＩｓ及びＢＲ３、ならびにそのアゴニストまたはアンタゴニストの使用法を提供する。さらに、このようなＴＮＦおよびＴＮＦＲ関連分子に関する病理学的症状又は哺乳動物細胞の、インビトロ、インサイツ、及び／又はインビボでの診断及び／又は治療のための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１４のアミノ酸残基１〜２４６の配列を有するＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖を有する単離された核酸。
【請求項２】
前記ＤＮＡが配列番号１３のコーディングヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記ＤＮＡが配列番号１３のコーディングヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
（ａ）配列番号１３のヌクレオチドのコーディング配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、及び（ｂ）ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するＤＮＡを含む単離された核酸。
【請求項５】
ａ）配列番号１４のアミノ酸残基１〜２４６を有するＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ、
ｂ）ストリンジェントな条件下でａ）のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ配列、
ｃ）遺伝子コードの縮重により、ａ）のＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列、及び
ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のＤＮＡに完全に相補的なＤＮＡ
からなる群からのＤＮＡを有する単離された核酸。
【請求項６】
請求項１又は５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７】
ベクターで形質転換される宿主細胞により認識される制御配列に作用可能に結合した請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記細胞が大腸菌である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記細胞が酵母細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
請求項８の宿主細胞を前記ＴＡＣＩｓポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること、及び前記ＴＡＣＩｓポリペプチドを細胞培地から回収することを含む、ＴＡＣＩｓポリペプチド生産方法。
【請求項１３】
図５Ｂ（配列番号１４）のアミノ酸残基１〜２４６を有する単離されたＴＡＣＩｓポリペプチド。
【請求項１４】
図５Ｂ（配列番号１４）の連続するアミノ酸残基１〜２４６の配列を有する単離されたＴＡＣＩｓポリペプチド。
【請求項１５】
図５Ｂ（配列番号１４）のアミノ酸残基１〜１１９を有する単離された可溶性ＴＡＣＩｓポリペプチド。
【請求項１６】
ａ）図５Ｂ（配列番号１４）のアミノ酸残基１〜２４６又は１〜１１９を有するＴＡＣＩｓポリペプチド、及び
ｂ）ａ）の断片であって、生物学的に活性なポリペプチド
からなる群から選択されたポリペプチドを有する単離されたＴＡＣＩｓポリペプチド。
【請求項１７】
異種アミノ酸配列に融合した、請求項１３、１４、又は１５に記載のＴＡＣＩｓポリペプチドを有するキメラ分子。
【請求項１８】
前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である、請求項１７に記載のキメラ分子。
【請求項１９】
前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項１７に記載のキメラ分子。
【請求項２０】
請求項１３、１４、又は１５に記載のＴＡＣＩｓポリペプチドに結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２１】
請求項１３、１４、又は１５に記載のＴＡＣＩｓポリペプチドと担体とを含む組成物。
【請求項２２】
前記担体が製薬的に許容される担体である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
（ａ）配列番号１６のアミノ酸残基１〜１８４の配列を有するＢＲ３ポリペプチドをコード化するＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖を有する、単離された核酸。
【請求項２４】
前記ＤＮＡが配列番号１５のコーディングヌクレオチド配列を有する、請求項２３に記載の核酸。
【請求項２５】
前記ＤＮＡが配列番号１５のコーディングヌクレオチド配列からなる、請求項２４に記載の核酸。
【請求項２６】
（ａ）配列番号１５のヌクレオチドのコーディング配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ（ｂ）ＢＲ３ポリペプチドをコード化するＤＮＡを有する、単離された核酸。
【請求項２７】
ａ）配列番号１６のアミノ酸残基１〜１８４を有するＢＲ３ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ
ｂ）ストリンジェントな条件下でａ）のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ配列
ｃ）遺伝子コードの縮重により、ａ）のＢＲ３ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列、及び
ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のＤＮＡに完全に相補的なＤＮＡ
からなる群からのＤＮＡを有する、単離された核酸。
【請求項２８】
請求項２３、２６、又は２７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２９】
ベクターで形質転換される宿主細胞により認識される制御配列に作用可能に結合した請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
請求項２８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３１】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
前記細胞が大腸菌である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
前記細胞が酵母細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
請求項３０の宿主細胞を前記ＢＲ３ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること、及び前記ＢＲ３ポリペプチドを細胞培地から回収することを含む、ＢＲ３ポリペプチドの生産方法。
【請求項３５】
図６Ｂ（配列番号１６）のアミノ酸残基１〜１８４を有する単離されたＢＲ３ポリペプチド。
【請求項３６】
図６Ｂ（配列番号１６）の連続するアミノ酸残基１〜１８４の配列を有する単離されたＢＲ３ポリペプチド。
【請求項３７】
図６Ｂ（配列番号１６）のアミノ酸残基１〜７７、又は２〜６２を有する単離された可溶性ＢＲ３ポリペプチド。
【請求項３８】
ａ）図６Ｂ（配列番号１６）のアミノ酸残基１〜７７、又は２〜６２を有するＢＲ３ポリペプチド、及び
ｂ）ａ）の断片であって、生物学的に活性なポリペプチド
からなる群から選択されたポリペプチドを有する単離されたＢＲ３ポリペプチド。
【請求項３９】
異種アミノ酸配列に融合した、請求項３５、３７、又は３８に記載のＢＲ３ポリペプチドを有するキメラ分子。
【請求項４０】
前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である、請求項３９に記載のキメラ分子。
【請求項４１】
前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項３９に記載のキメラ分子。
【請求項４２】
請求項３５、３７、又は３８に記載のＢＲ３ポリペプチドに結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項４３】
請求項３５、３７、又は３８に記載のＢＲ３ポリペプチドと担体とを含む組成物。
【請求項４４】
前記担体が製薬的に許容される担体である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
哺乳動物細胞におけるＴＡＬＬ−１ポリペプチドの生物学的活性を阻害又は中和する方法であって、前記哺乳動物細胞にＴＡＬＬ−１ポリペプチドのアンタゴニストの有効量を接触させることを含み、前記ＴＡＬＬ−１ポリペプチドのアンタゴニストが、
ａ）ＴＡＣＩｓレセプターイムノアドヘシン、
ｂ）ＢＲ３レセプターイムノアドヘシン、
ｃ）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群から選択された非タンパク質様ポリマーに結合したＴＡＣＩｓレセプター、
ｄ）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群から選択された非タンパク質様ポリマーに結合したＢＲ３レセプター、
ｅ）ＴＡＣＩｓレセプター抗体、
ｆ）ＢＲ３レセプター抗体
からなる群から選択される方法。
【請求項４６】
前記ＴＡＣＩｓレセプターイムノアドヘシンが、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＴＡＣＩｓ細胞外ドメイン配列を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＢＲ３レセプターイムノアドヘシンが、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＢＲ３細胞外ドメイン配列を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＴＡＬＬ−１ポリペプチドアンタゴニストが、哺乳動物細胞におけるＴＡＬＬ−１ポリペプチドとＡＰＲＩＬポリペプチド両方の生物学的活性を阻害又は中和するアンタゴニスト分子を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記哺乳動物細胞が白血球を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
哺乳動物細胞におけるＡＰＲＩＬポリペプチドの生物学的活性を阻害又は中和する方法であって、前記哺乳動物細胞にＡＰＲＩＬポリペプチドアンタゴニストの有効量を接触させることを含み、前記Ａｐｒｉｌポリペプチドアンタゴニストが、
ａ）ＴＡＣＩｓレセプターイムノアドヘシン、
ｂ）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群から選択された非タンパク質様ポリマーに結合したＴＡＣＩｓレセプター、
ｃ）ＴＡＣＩｓレセプター抗体
からなる群から選択される方法。
【請求項５１】
前記ＴＡＣＩｓレセプターイムノアドヘシンが、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＴＡＣＩｓ細胞外ドメイン配列を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＡＰＲＩＬポリペプチドアンタゴニストが、哺乳動物細胞におけるＴＡＬＬ−１ポリペプチドとＡＰＲＩＬポリペプチド両方の生物学的活性を阻害又は中和するアンタゴニスト分子を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物細胞が白血球を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
哺乳動物細胞におけるＴＡＣＩポリペプチドの活性を増強又は促進する方法であって、前記哺乳動物細胞にＴＡＣＩｓポリペプチドアゴニストの有効量を接触させることを含み、前記ＴＡＣＩｓポリペプチドアゴニストが抗ＴＡＣＩｓアゴニスト抗体を含む方法。
【請求項５５】
哺乳動物細胞におけるＢＲ３ポリペプチドの活性を増強又は促進する方法であって、前記哺乳動物細胞にＢＲ３ポリペプチドアゴニストの有効量を接触させることを含み、前記ＢＲ３ポリペプチドアゴニストが抗ＢＲ３アゴニスト抗体を含む方法。
【請求項５６】
哺乳動物の全身性エリテマトーデスを治療する方法であって、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＢＲ３細胞外ドメイン配列を有するＢＲ３レセプターイムノアドヘシンの有効量を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項５７】
ＴＡＬＬ−１、ＴＡＣＩ、ＴＡＣＩｓ、ＢＣＭＡ又はＢＲ３のアンタゴニスト又はアゴニストとして作用する候補分子を同定するための、スクリーニングアッセイの実施方法であって、請求項５又は１６に記載のＴＡＣＩｓ ＤＮＡ又はポリペプチド、あるいは請求項２７又は３８に記載のＢＲ３ ＤＮＡ又はポリペプチドを使用したアッセイを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、概して、ここで「ＴＡＣＩｓ」及び「ＢＲ３」と称する新規レセプターと、そのアゴニスト及びアンタゴニストに関し、また例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びＴＮＦＲ関連分子、例えば、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡと呼ばれるＴＮＦＲファミリー及びＴＮＦファミリーのメンバーの活性を調節するための、ＴＡＣＩｓ及びＢＲ３、ならびにそのアゴニストまたはアンタゴニストの使用法に関する。本発明はまた、前記ＴＮＦおよびＴＮＦＲ関連分子に関する病理学的症状又は哺乳動物細胞を、インビトロ、インサイツ、及び／又はインビボで診断及び／又は治療する方法に関する。
【０００２】
（発明の分野）
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α（「TNF-α」）、腫瘍壊死因子-β（「TNF-β」又は「リンホトキシン-α」）、リンホトキシン-β（「LT-β」）、CD30リガンド、CD27リガンド、CD40リガンド、OX-40リガンド、4-1BBリガンド、Apo-1リガンド（Fasリガンド又はCD95リガンドとも称される）、Apo-2リガンド（トレイル（TRAIL）とも称される）、Apo-3リガンド（同じくTWEAKと称される）、APRIL、OPGリガンド（RANKリガンド、ODF、又はTRANCEとも称される）、及びTALL-1（BlyS、BAFF又はTHANKとも称されるが、サイトカインの腫瘍壊死因子（「TNF」）ファミリーのメンバーとして同定されてきた［例えば、Grussら, Blood, 85:3378-3404(1995); Schmidら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881(1986);Dealtryら, Eur. J. Immunol., 17:689(1987)；Pittiら,  J. Biol. Chem., 271:12687-12690(1996)；Wileyら, Immunity, 3:673-682(1995)；Browningら，Cell, 72:847-856(1993)；Armitageら,  Nature, 357:80-82(1992)、1997年1月16日に公開された国際公開第97/01633号；1997年7月17日に公開された国際公開第97/25428号；Marstersら、Curr. Biol., 8：525-528(1998)；Chicheporticheら, Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Hahneら, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)；1998年7月2日に公開の国際公開第98/28426号；1998年10月22日に公開の国際公開第98/46751号；1998年5月7日に公開の国際公開第/98/18921号；Mooreら, Science, 285: 260-263(1999)；Shuら, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999)；Schneiderら, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999)；Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)］。これら分子の中で、TNF-α、TNF-β、CD30リガンド、4-1BBリガンド、Apo-1リガンド、Apo-2リガンド（Apo2L/TRAIL）及びApo-3リガンド（TWEAK）がアポトーシス細胞死に関わっていることが報告されてきた。
【０００３】
TNFファミリーの種々の分子も、免疫系の機能又は発生において役割を担うと主張されてきた［Gruss及びDower, Blood, 85:3378(1995)］。Zheng等は、TNF-αがCD8ポジティブＴ細胞のポスト刺激性アポトーシスに関与していることを報告している［Zhengら, Nature, 377：348-351(1995)］。他の研究者は、CD30リガンドが胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠失に関与していることを報告している［Amakawaら, プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第10巻、(1995)］。CD40リガンド活性は、増殖、免疫グロブリン分泌、及び生存を含むB細胞の多くの機能を活性化する［Renshawら, J. Exp. Med., 180: 1889(1994)］。その他の最近に同定されたTNFファミリーサイトカイン、TALL-1（Blys）は、ある条件下でB細胞増殖及び免疫グロブリン分泌を誘導することが報告されている［Mooreら, 上掲；Schneiderら, 上掲；Mackayら, J. Exp. Med., 190: 1697(1999); Shuら, J. Leukocyte Biol., 65:680-683(1999); Grossら, Nature, 404:995-999(2000)］。
【０００４】
マウスFas/Apo-1レセプター又はリガンド遺伝子における変異（それぞれlpr及びgldと呼ばれる）は、幾つかの自己免疫疾患と関連していて、末梢での自己反応性リンパ球のクローン除去の制御を担う可能性があることを示している［Krammerら, Curr. Op. Immunol., 6:279-289(1994)；Nagataら, Science, 267: 1449-1456(1995)］。Apo-1リガンドは、CD4-陽性Tリンパ球及びBリンパ球での刺激後アポトーシスを誘導することも報告されており、もはや必要ないならば、活性リンパ球の除去に関与する可能性がある［Krammerら, 上掲；Nagataら, 上掲］。Apo-1レセプターへ特異的に結合するアゴニストマウスモノクローナル抗体は、TNF-αのものに相当するか又は類似する細胞殺傷活性を示すことが報告されている［Yoneharaら, J. Exp. Med., 169: 1747-1756(1989)］。
【０００５】
OPGリガンド（RANKリガンド、TRANCE、又はODFとも呼ばれる）と呼ばれるTNF関連リガンドは、ある免疫制御活性にある程度関わっていると参考文献で報告されている。１９９８年７月２日に公開の国際公開第98/28426号は、このリガンド（そこでは、RANKリガンドと称されている）を２型膜貫通タンパク質と記載し、可溶型は、樹状突起細胞の成熟を誘導し、MLRでのCD1a＋樹状突起細胞同種抗原提示能、及びTGF-βの存在下におけるインビトロでの生存可能なヒト末梢血T細胞の数を増やすことが見出された［Andersonら, Nature, 390: 175-179(1997)]。国際公開第98/28426号のレファレンスは、１つのマクロファージ腫瘍細胞株（RAW264.7と呼ばれる；ATCCTIB71）によって、リガンドがTNF-αの産生を高めたが、これら腫瘍細胞によって一酸化窒素産生を刺激しなかったことも開示している。
【０００６】
樹状突起細胞活性を調節すること［Wongら, J. Exp. Med., 186: 2075-2080(1997)；Wongら, J. Leukocyte Biol., 65: 715-724(1999)；Josienら, J. Immunol., 162: 2562-2568(1999)；Josienら, J. Exp. Med., 191495-501(2000)を参照のこと］及び免疫応答においてT細胞活性化を刺激すること［Bachmannら, J. Exp. Med., 189: 1025-1031(1999)；Greenら, J. Exp. Med., 189: 1017-1020(1999)を参照のこと]におけるOPGリガンド／TRANCE／ODFの推定上の役割が文献で調べられた。Kongら, Nature, 397: 315-323(1999)は、破壊されたopg1遺伝子を有するマウスがひどい骨粗鬆症を示し、破骨細胞を欠き、そしてT及びBリンパ球の初期分化において欠陥を示したことを報告している。Kongらは、インビボでのT細胞の全身活性化が破骨細胞形成及び骨損失のOPGL-媒介による増加につながったことをさらに報告している［Kongら, Nature, 402: 304-308(1999)］。
【０００７】
そのようなTNFファミリーサイトカインによって媒介される種々の細胞応答の誘導は、特定の細胞レセプターへのそれらの結合によって始まると考えられている。およそ55-kDa（TNFR1）及び75-kDa（TNFR2）の二つの異なるTNFレセプターが同定され［Hohmanら, J. Biol. Chem., 264:14927-14934(1989)；Brockhausら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3127-3131(1990)；1991年3月20日に公開された欧州特許第 417,563号］、［Loesterら, Cell, 61:351(1990)；Schallら, Cell, 61: 361(1990)；Smithら, Science, 248: 1019-1023(1990)；Lewisら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834(1991)；Goodwinら, Mol. Cell. Biol., 11: 3020-3026(1991)］。双方のTNFRは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典形態的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される［Nophar, Yら, EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, Tら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)］。Haleら, ［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］。
【０００８】
１型及び２型のTNFR(TNFR1及びTNFR2)の細胞外部分は、NH2末端から出発して、１〜４とされる４つのシステインリッチドメイン(CRDs)の反復アミノ酸配列パターンを含む［Schallら, 上掲；Loetscherら, 上掲；Smithら, 上掲；Nopharら, 上掲；Kohnoら, 上掲；Bannerら, Cell, 73: 431-435(1993)］。CRDの類似の反復パターンが、p75神経成長因子レセプター（NGFR）［Johnsonら, Cell, 47:545(1986)；Radekeら, Nature, 325: 593(1987)］、B細胞抗原CD40［Stamenkovicら, EMBO J., 8:1403 (1989)］、T細胞抗原OX40［Malletら, EMBO J., 9: 1063(1990)］及びFas抗原［Yoneharaら, 上掲及びItohら, Cell, 66: 233-243(1991)］を含む、幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在する。CRDはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウイルスの可溶形態TNFR(sTNFR)様のT2タンパク質にも見出されている［Uptonら, Virology, 160：20-29(1987)；Smithら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Uptonら, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、TNF/NGFレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。
【０００９】
リンフォトキシン-αを除く、これまでに同定されたTNFファミリーリガンドは、典型的には、そのC末端が細胞外にあるII型膜貫通タンパク質である。対照的に、これまでに同定されたTNFレセプター（TNFR）ファミリーの殆どのレセプターは、典型的にはI型膜貫通タンパク質である。しかしながら、TNFリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主に細胞外ドメイン（「ECD」）で見出されている。TNF-α、Apo-1リガンド及びCD40リガンドを含む幾つかのTNFファミリーサイトカインは、細胞表面でタンパク質分解的に切断されている；それぞれの場合においてその結果として生じたタンパク質は、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。TNFレセプターファミリータンパク質は、また、通常はタンパク質分解的に切断されて、同型のサイトカインの阻害剤として機能することが可能な可溶性レセプターECDsを遊離する。
【００１０】
RANKと呼ばれるTNFRファミリーメンバーは、OPGリガンドのレセプターとして同定されている（１９９８年７月２日に公開の国際公開第98/28426号； Andersonら, Nature, 390: 175-179(1997)；Laceyら, Cell, 93: 165-176(1998)を参照せよ）。OPG（FDCR-1又はOCIF）と呼ばれる他のTNFR-関連分子は、OPGリガンドのレセプターとしても同定されている［Simonetら, Cell, 89:309(1997)；Yasudaら, Endocrinology, 139: 1329(1998)；Yunら, J. Immunol., 161: 6113-6121(1998)］。Yunら, 上掲, がOPG/FDCR-1/OCIFは膜結合型及び分泌型の双方で発現し、樹状突起細胞、EBV-形質転換B細胞株及び扁桃腺B細胞を含む免疫系の細胞で限定された発現パターンを有することを開示した。Yunらは、B細胞及び樹状突起細胞では、OPG/FDCR-1/OCIFの発現はB細胞活性化に関わっている分子であるCD40によってアップレギュレーションされることが可能であることも開示している。しかしながら、Yunらは、免疫応答の制御におけるOPG/FDCR-1/OCIFがどのように機能するのかは知られていないことを認めている。
【００１１】
もっと最近では、TNFRファミリーの他のメンバーが同定されている。von Bulowら, Science, 278: 138-141(1997)では、研究者らは、膜貫通アクチベーター及びCAML-インタラクター又は「TACI」と呼ばれる形質膜レセプターについて記載している。TACIレセプターは、TNFRファミリーの特徴であるシステインリッチモチーフを有することが報告されている。インビトロアッセイでは、TACI-特異的抗体を形質移入したジャーカット細胞の表面へのTACIの架橋は、NF-κBの活性化につながった［１９９８年９月１８日に公開の国際公開第98/39361号も参照せよ］。ＴＡＣＩノックアウトマウスは反応性亢進Ｂ細胞を有することが報告されており、一方ＢＣＭＡヌルマウスは識別可能な表現型を持たない（Yanら, Nature Immunology, 2:638-643(2001); von Bulowら, Immunity, 14:573-582(2001); Xuら, Mol. Cell. Biology, 21: 4067-4074(2001)）。
【００１２】
Laabiら, EMBO J., 11:3897-3904(1992)は、その発現がＢ細胞末端成熟と一致することが見出されている「BCM」と呼ばれる新しい遺伝子の同定を報告した。BCM通常cDNAのオープンリーディングフレームは、単一膜ドメインで１８４アミノ酸長ポリペプチドであると予測された。これらの研究者は後に、この遺伝子を「BCMA」と名付けた[Laabiら, Nucleic Acids Res., 22:1147-1154(1994)]。BCMA mRNA発現は、Bリンパ球段階前を意味するヒト悪性Ｂ細胞株の非存在であり、よってリンパ球の分化の段階に関わっていると考えられることが報告された[Grasら, Int. Immunology, 7:1093-1106(1995)]。Madryら, Int. Immunology, 10:1693-1702(1998)において、マウスBCMA cDNAのクローニングが記載された。マウスBCMA cDNAは、ヒトBCMAポリペプチドに対して６２％同一性を有する１８５アミノ酸長ポリペプチドをコード化することが報告された。マウス及びヒトBCMAタンパク質配列のアラインメントは、N末端領域で６システインの保存されたモチーフ、BCMAタンパク質はTNFRスーパーファミリーに属するという予測を示した[Madryら, 上掲]。
【００１３】
Ｔａｌｌ−１（ＢｌｙＳ）リガンドは、ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡレセプターに結合することが報告されている（Grossら, 上掲, (2000); Thompsonら, J. Exp. Med., 192:129-135 (2000); Yanら, 上掲, (2000); Marstersら, Curr. Biol., 10:785-758 (2000); 2000年7月13日公開のWO00/40716号; 2000年11月9日公開のWO00/67034号）。ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡも同様にＡｐｒｉｌとして知られるリガンドに結合することが報告されている。
【００１４】
Marsters等、Curr. Biol., 6：750(1996)において、研究者は、Apo-3と称される全長天然配列ヒトポリペプチドを開示しており、それは、その細胞外システインリッチ反復についてTNFRファミリーに対して類似性を示し、細胞質死ドメイン配列を含む点でTNFR1及びCD95に似ている［Marstersら,Curr. Biol., 6：1669(1996)もまた参照されたい］。他の研究者によれば、Apo-3はDR3、wsl-1、TRAMP及びLARDとも称されている［Chinnaiyanら, Science, 274：990(1996)；Kitsonら, Nature, 384：372(1996)；Bodmerら, Immunity, 6：79(1997)；Screatonら, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:4615-4619(1997)］。
【００１５】
Pan等は、「DR4」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Panら, Science, 276：111-113(1997)；また、1998年7月30日公開の国際公開第98/32856号参照］。DR4は、細胞自殺機構に関与できる細胞死ドメインを含むことが報告された。Pan等は、DR4がApo-2L/TRAILとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることをさらに開示している。
【００１６】
Sheridanら, Science, 277: 818-821 (1997)及びパンら, Science, 277: 815-818 (1997)においては、Apo-2L/TRAILに対するレセプターと思われる他の分子が記載されている［1998年11月19日発行の国際公開第98/51793号；1998年9月24日発行の国際公開第98/41629号を参照のこと］。この分子は、DR5と称される(あるいは、Apo-2；TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2又はKILLERとも称される［Screaton等，Curr.Biol., 7:693-696(1997)；Walczak等，EMBO J., 16:5386-5387(1997)；Wu等，Nature Genetics, 17:141-143(1997)；1998年8月20日に発行の国際公開第98/35986号；1998年10月14日に発行の欧州特許第870,827号；1998年10月22日に発行の国際公開第98/46643号；1999年1月21日に発行の国際公開第99/02653号；1999年2月25日発行の国際公開第99/09165号；1999年3月11日発行の国際公開第99/11791号］。DR4のように、DR5は細胞死ドメインを含み、アポトーシスのシグナル伝達が可能であると報告されている。Apo-2L/TRAIL及びDR5の間で形成された複合体の結晶構造は、Hymowitzら，Molecular Cell, 4:563-571(1999)に掲載されている。
【００１７】
さらに他の細胞死ドメインを含むレセプターであるDR6が最近同定された［Panら, FEBS Letters, 431:351-356(1998)］。４つの予想される細胞外システインリッチドメイン及び細胞死ドメインの他に、DR6は細胞質領域におけるプロリンリッチモチーフとオーバーラップするような予想されるロイシンジッパー配列を含むと考えられている。プロリンリッチモチーフはsrc相同性-３ドメインと結合する配列に類似しており、それは多くの細胞内シグナル伝達分子に見出されるものである。上述した他の細胞死ドメインを含むレセプターとは対照的に、ＤＲ６はアポトーシスに敏感な指標細胞系であるＭＣＦ−７に細胞死を誘発しない。これはこのレセプターの別の機能を示すものである。この観察結果と一貫して、ＤＲ６は、活性化した細胞死レセプターからの下流へのシグナル伝達を媒介する、ＦＡＤＤ、ＲＡＩＤＤ、およびＲＩＰなどの細胞死ドメインを含むアダプタ分子に関連しないと考えられている（Panら, FEBS Lett., 431:351 (1998)）。
【００１８】
最近同定されたレセプターのさらなるグループは、「デコイレセプター」と称され、シグナル伝達分子というよりはむしろ、阻害剤として機能すると考えられている。このグループには、DCR1（TRID，LIT，又はTRAIL-R3とも称される）［Panら, Science, 276：111-113(1997)；Sheridanら, Science, 277: 818-821 (1997)；McFarlaneら, J. Biol. Chem., 272:25417-25420(1997)；Schneiderら, FEBS Letters, 416:329-334(1997)；Degli-Espostiら, J. Exp. Med., 186:1165-1170(1997)；及びMongkolsapayaら, J. Immunol., 160:3-6(1998)］及びDCR2（TRUNDD，又はTRAIL-R4とも称される）［Marstersら, Curr. Biol., 7：1003-1006(1997)；Panら, FEBS Letters, 424:41-45(1998)；Degli-Espostiら, Immunity, 7:813-820(1997)］が含まれ、両者とも細胞表面分子であり、更にOPG［Simonetら, 上掲；Emeryら, 下記］及びDCR3［Pittiら, Nature, 396:699-703(1998)］も含まれ、これら両者は分泌性の可溶性タンパク質である。
【００１９】
新たに同定されたTNFRファミリーのさらなるメンバーには、CAR1、HVEM、GITR、ZTNFR-5、NTR-1、及びTNFL1が含まれる［Brojatschら, Cell, 87:845-855 (1996); Montgomeryら, Cell, 87:427-436 (1996); Marstersら, J.Biol.Chem., 272:14029-14032 (1997); Nocentiniら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6216-6221(1997); Emeryら, J. Biol. Chem., 273:14363-14367(1998);1999年1月28日公開の国際公開第99/04001号; 1999年2月18日公開の国際公開第99/07738号; 1999年7月8日公開の国際公開第99/33980号]。
【００２０】
Tewari等により最近概説されているように、TNFR1、TNFR2及びCD40は、転写因子、NF-κBの活性化を通して、炎症誘発性及び同時刺激性サイトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調する［Tewariら, Curr. Op. Genet. Develop., 6：39-44(1996)］。NF-κBは、そのサブユニットが保存Rel領域を含有する二量体転写因子のファミリーの原型である［Vermaら, Genes Develop., 9：2723-2735(1996)；Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14：649-681(1996)］。その潜伏形態において、NF-κBはIκB阻害剤ファミリーのメンバーと複合化しており；所定の刺激に反応してIκBの不活性化の際に、放出されたNF-κBが、特異的DNA配列と結合する核に転座して遺伝子転写を活性化する。前記したように、同時に同定されたTNFRメンバーは細胞内死ドメイン領域を含むか、又は欠いている。例えばTNFR2、CD40、HVEM、及びGITRのような、死のドメインを欠くいくつかのTNFR分子は、NF-κB活性の調節の能力がある[例えばLotzら, J. Leukocyte Biol., 60:1-7(1996)参照]。
【００２１】
サイトカインのTNFファミリー及びそれらのレセプター類の概説については、Ashkenazi及びDixit, Science, 281:1305-1308(1998)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753(1997)；上掲のGruss及びDower、及びNagata, Cell, 88:355-365(1997)を参照されたい。
【００２２】
（発明の概要）
本出願人は、「ＴＡＣＩｓ」および「ＢＲ３」と呼ばれる新規分子を同定した。ＴＡＣＩｓポリペプチドは、Bulowら, 上掲に開示された完全長ヒトＴＡＣＩ分子と対照的に、単一のシステインリッチドメインを持つとして特徴付けられている。同様に、ここに開示するＢＲ３ポリペプチドも、単一のシステインリッチドメインを持つとして特徴付けられている。驚くべきことに、本出願人は、ＴＡＬＬ−１およびＡｐｒｉｌと呼ばれるＴＮＦファミリーリガンドがＴＡＣＩｓレセプターに結合することを発見した。本出願人はまた、驚くべきことに、ＴＡＬＬ−１と呼ばれるＴＮＦファミリーリガンドがＢＲ３レセプターに結合することを発見した。ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡレセプターとは対照的に、ＢＲ３は、リガンドであるＡｐｒｉｌに結合せず、ＮＦ−ＫＢ経路を活性化しなかった。したがって、本発明は、これらＴＮＦ関連リガンドおよびレセプターのアンタゴニストまたはアゴニストの新規使用法を提供する。本明細書に開示するアンタゴニストおよびアゴニストには、特に、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ，ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩｓまたはＢＲ３の存在（または不在）に関連する疾患、または哺乳動物細の、インビトロ、インサイツ、またはインビボでの診断または治療に対する効用が見い出されている。
【００２３】
一実施形態では、本発明によりＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するＤＮＡを含む、単離された核酸分子が提供される。特定の態様では、単離された核酸は、図５Ｂのアミノ酸残基１〜２４６または１〜１１９（配列番号１４）を有するＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するＤＮＡを有するか、そのようなコード化核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の、随意で高度のストリンジェンシー条件の下で、結合を安定的に維持する。
【００２４】
別の実施形態においては、本発明によりＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するＤＮＡを有するベクターが提供される。そのようなベクターを有する宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、または酵母である。さらに、ＴＡＣＩｓポリペプチドを生成する方法が提供される。本方法は、ＴＡＣＩｓポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養することと、細胞培地からＴＡＣＩｓポリペプチドを回収することを含む。
【００２５】
別の実施形態では、本発明により単離されたＴＡＣＩｓポリペプチドが提供される。特に、本発明は、図５Ｂの残基１〜２４６（配列番号１４）を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＴＡＣＩｓポリペプチドを提供する。本発明のまた別の実施形態は、図５Ｂに示すアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸位１〜１１９を含む、単離されたＴＡＣＩｓポリペプチドの細胞外ドメイン配列か、その断片、特に生物学的に活性な断片を目的としている。
【００２６】
別の実施形態では、本発明により、ＴＡＣＩｓポリペプチド、あるいは、非相同ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合した、前記ポリペプチドの細胞外ドメイン配列またはその他断片を含むキメラ分子が提供される。そのようなキメラ分子の例は、免疫グロブリンのＦｃ領域、またはエピトープタグ配列に融合されたＢＲ３ポリペプチを含む。
【００２７】
別の実施形態では、本発明により、ＴＡＣＩｓポリペプチドまたはその細胞外ドメインに特異的に結合する抗体が提供される。随意で、抗体はモノクローナル抗体でもよい。
【００２８】
また別の実施形態では、本発明により、ＴＡＣＩｓポリペプチドまたはＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するＤＮＡを使用した診断法および治療法が提供される。
【００２９】
また別の実施形態では、本発明により、ＢＲ３ポリペプチドをコード化するＤＮＡを有する、単離された核酸分子が提供される。特定の態様では、単離された核酸は、図６Ｂのアミノ酸残基１〜１８４、１〜７７または２〜６２（配列番号１６）を持つＢＲ３ポリペプチドをコード化するＤＮＡを有するか、そのようなコード化核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の、随意で高度のストリンジェンシー条件の下で、結合を安定的に維持する。
【００３０】
別の実施形態では、本発明によりＢＲ３ポリペプチドをコード化するＤＮＡを有するベクターが提供される。そのようなベクターを有する宿主細胞も提供される。宿主細胞は、例えば、ＣＨＯ細胞、大腸菌、または酵母でよい。さらに、ＢＲ３ポリペプチドを生成する方法が提供される。本方法は、ＢＲ３ポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養することと、細胞培地からＢＲ３ポリペプチドを回収することを含む。
【００３１】
別の実施形態では、本発明により単離されたＢＲ３ポリペプチドが提供される。特に、本発明は、図６Ｂの残基１〜１８４、１〜７７、または２〜６２（配列番号１６）を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＢＲ３ポリペプチドを提供する。本発明のまた別の実施形態は、図６Ｂに示すアミノ酸配列（配列番号１６）のアミノ酸位１〜７７、または２〜６２を含む、単離されたＢＲ３ポリペプチドの細胞外ドメイン配列か、その断片を目的としている。
【００３２】
別の実施形態では、本発明により、ＢＲ３ポリペプチド、あるいは、非相同ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合した、前記ポリペプチドの細胞外ドメイン配列またはその他断片を含むキメラ分子が提供される。そのようなキメラ分子の例は、免疫グロブリンのＦｃ領域、またはエピトープタグ配列に融合されたＢＲ３ポリペプチを含む。
【００３３】
別の実施形態では、本発明により、ＢＲ３ポリペプチドまたはその細胞外ドメインに特異的に結合する抗体が提供される。随意で、抗体はモノクローナル抗体でもよい。
【００３４】
また別の実施形態では、本発明により、ＢＲ３ポリペプチドまたはＢＲ３をコード化するＤＮＡを使用した診断法および治療法が提供される。
【００３５】
本発明の方法は、ＴＡＬＬ−１またはＡＰＲＩＬの発現の増強または亢進に関連するか、または起因する、哺乳動物の疾患または疾病の治療法も含む。本治療法においては、そのような疾患または疾病に罹患した哺乳動物に対し、ＴＡＬＬ−１アンタゴニストまたはＡＰＲＩＬアンタゴニストを投与する場合がある。本発明への使用を考慮するＴＡＬＬ−１アンタゴニストおよびＡＰＲＩＬアンタゴニストは、ＴＡＣＩｓレセプターイムノアドヘシン、またはＢＲ３レセプターイムノアドヘシン、ならびに、ＴＡＬＬ−１リガンドおよび／またはＡＰＲＩＬリガンドによる、ＴＡＣＩｓレセプター、またはＢＲ３レセプターの結合、または活性をロックするか低減する、それらレセプターに対する抗体を含む。例えば、ＴＡＣＩｓレセプターイムノアドヘシンを使用してリウマチ様関節炎または多発性硬化症を治療することができる。使用が考慮されるＴＡＬＬ−１アンタゴニストおよびＡＰＲＩＬアンタゴニストには、ＴＡＣＩｓレセプターまたはＢＲ３レセプターに対するリガンドの結合をそれぞれブロックするか、または低減する、抗ＴＡＬＬ−１抗体、または抗−ＡＰＲＩＬ抗体が含まれる。さらにアンタゴニスト分子には、共有結合的に修飾された形態、または、ＴＡＣＩｓまたはＢＲ３を含む融合タンパク質が含まれる。そのようなアンタゴニストは、例えば、ＰＥＧ化した(Pegylated)ＴＡＣＩｓまたはＢＲ３、およびエピトープタグやロイシンジッパー等の非相同配列に融合したＴＡＣＩｓまたはＢＲ３を含みうる。随意的に、本方法に使用されるアンタゴニスト分子は、ＴＡＬＬ−１およびＡＰＲＩＬ両方の活性を阻止、または中和でき、例えば、ＴＡＬＬ−１およびＡＰＲＩＬ両方の活性を阻止、または中和する二重アンタゴニストである。随意で、本発明に使用されるアンタゴニスト分子は、ＴＡＬＬ−１の活性をブロックまたは中和できるがＡＰＲＩＬの活性はブロックまたは中和できず、例えばＴＡＬＬ−１の活性を阻止、または中和する（ＢＲ３イムノアドヘシン等の）アンタゴニストである。例えば、ＢＲ３イムノアドヘシンを使用して、ループス等の自己免疫疾患を治療することができる。本発明では、一種類のアンタゴニスト分子の使用、または複数の種類のアンタゴニストを組み合わた使用を考慮する。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、ＴＡＬＬ−１と、ＴＡＣＩｓおよび／またはＢＲ３の相互作用をブロックまたは中和するためのＴＡＬＬ−１アンタゴニストの使用法が提供される。そのようなアンタゴニストは、ＴＡＬＬ−１と、ＴＡＣＩおよび／またはＢＣＭＡの相互作用もブロックまたは中和できる。例えば、本発明は、白血球（好ましくはＢ細胞）等の哺乳動物細胞に対し、ＴＡＬＬ−１リガンドの活性を低減、中和、または阻止するのに有効な量の、１以上のＴＡＬＬ−１アンタゴニストを接触させることを含む方法を提供する。細胞は、細胞培地中のものでも、哺乳動物、例えば免疫関連疾病や癌等に罹患した哺乳動物のものでもよい。このように、本発明は、ここに開示するように、１以上のＴＡＬＬ−１アンタゴニストの有効量を投与することを含む、免疫関連疾病または癌などの疾患を持つ哺乳動物の治療法を含む。特定の実施形態では、免疫関連疾患は、関節炎やループス等の自己免疫疾患である。
【００３７】
また、本発明では、ＡＰＲＩＬとＴＡＣＩｓの相互作用を阻止、または中和するためのＡＰＲＩＬアンタゴニストの使用法が提供される。そのようなアンタゴニストは、ＡＰＲＩＬと、ＴＡＣＩおよび／またはＢＣＭＡの相互作用もブロックまたは中和できる。例えば、本発明は、白血球（好ましくはＢ細胞）等の哺乳動物細胞に対し、ＡＰＲＩＬリガンドの活性を低減、中和、またはブロックするのに有効な量の、１以上のＡＰＲＩＬアンタゴニストを接触させることを含む方法を提供する。細胞は、細胞培地中のものでも、哺乳動物、例えば免疫関連疾病や癌等に罹患した哺乳動物のものでもよい。このように、本発明は、ここに開示するように、１以上のＡＰＲＩＬアンタゴニストの有効量を投与することを含む、免疫関連疾病または癌などの疾患を持つ哺乳動物の治療法を含む。
【００３８】
本発明では、１以上のＴＡＬＬ−１アンタゴニスト、またはＡＰＲＩＬアンタゴニストを含む組成物も提供される。随意的に、本発明の組成物は製薬的に許容される担体または希釈剤を含む。好ましくは、組成物は、疾患または疾病の治療に製薬的に有効な量の、１以上のＴＡＬＬ−１アンタゴニスト、またはＡＰＲＩＬアンタゴニストを含む。
【００３９】
本発明はまた、１以上のＴＡＬＬ−１アンタゴニスト、またはＡＰＲＩＬアンタゴニストを含む製造物およびキットも提供する。
【００４０】
加えて、本発明は、ＴＡＣＩｓアゴニストまたはＢＲ３アゴニストを使用して、例えば、ＴＡＣＩｓレセプターまたはＢＲ３レセプターを、刺激、または活性化する方法も提供する。このような方法は、ＴＡＬＬ−１またはＡＰＲＩＬの発現不測または活性の不足を特徴とするか、またはそれに関する疾患、例えば免疫不全や癌（免疫抗癌反応を高める）の治療に有効である。ＴＡＣＩｓアゴニストまたはＢＲ３アゴニストは、作用的抗ＴＡＣＩｓまたは抗ＢＲ３アゴニスト抗体を含んでよい。そのようなＴＡＣＩｓアゴニストまたはＢＲ３アゴニストの作用的活性には、ＴＡＣＩｓまたはＢＲ３の天然リガンドの活性、あるいは、ＴＡＣＩｓまたはＢＲ３の天然リガンドと同じか、実質的に同じ（つまり類似の）活性を亢進することが含まれる。
【００４１】
したがって、本発明では、１以上のＴＡＣＩｓアゴニストまたはＢＲ３アゴニストを含む組成物も提供する。随意で、本発明の組成物は、製薬的に許容される担体または希釈剤を含んでよい。好ましくは、本組成物は、ＴＡＣＩｓまたはＢＲ３によりシグナル伝達を刺激するのに製薬的に有効な量の、１以上のＴＡＣＩｓアゴニストまたはＢＲ３アゴニストを含む。
【００４２】
さらに、本発明は、１以上のＴＡＣＩｓアゴニストまたはＢＲ３アゴニストを含む製造物およびキットを提供する。
【００４３】
本発明では、また、ＴＡＬＬ−１と、ＴＡＣＩｓまたはＢＲ３の相互作用、あるいはＡＰＲＩＬとＴＡＣＩｓの相互作用に関してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する、小分子化合物、ポリペプチド、または抗体などの候補分子を同定するためにスクリーニングアッセイを実行する方法が提供される。
【００４４】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される場合の用語「ＢＲ３」又は「ＢＲ３ポリペプチド」又は「ＢＲ３レセプター」は、「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」及び「ＢＲ３変異体」（後述）を含む。「ＢＲ３」とは、図６に示されるポリヌクレオチド配列及びその変異体またはその断片を含む核酸分子、図６に示される配列を含む核酸分子、及びその変異体、ならびに前記の断片によってコードされているそれらのポリペプチドに対して与えられた名称である。本発明のＢＲ３ポリペプチドは、ヒト組織型又は別の供給源などの様々な供給源から単離してもよく、または組換えおよび／または合成の方法によって調製してもよい。
【００４５】
「天然配列」のＢＲ３ポリペプチドは、天然に由来し対応するＢＲ３ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＢＲ３ポリペプチドは天然から単離することが可能であるか、又は、組換え及び／又は合成の方法によって作成することが可能である。用語「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」は、特に、ポリペプチドの天然に発生する切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に発生する変異型（例えば、選択的スプライシング形態）及び天然に発生するアレル変異体を含む。本発明のＢＲ３ポリペプチドは、図６Ｂのアミノ酸残基１〜１８４の連続配列を含むか、またはそのような配列からなるＢＲ３ポリペプチドを含む。
【００４６】
ＢＲ３の「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを基本的には有しない、ＢＲ３ポリペプチドの型を指す。通常、ＢＲ３ポリペプチドＥＣＤは、そのような膜貫通及び／又は細胞質ドメインの約１％未満、好ましくはそのようなドメインの０．５％未満を有する。本発明のＢＲ３ポリペプチドについて同定される全ての膜貫通ドメインがその型の疎水性ドメインを同定するのに当該分野で日常的に使用される基準に従って同定されることが、理解されるであろう。正確な膜貫通ドメインの境界は変動しうるが、それは、殆どの場合、最初に同定されたドメインの何れの端においても僅か約５個以内のアミノ酸に限られている。ＢＲ３のＥＣＤ形態は、図６Ｂのアミノ酸１〜７７、または２〜６２を有するものを含む。
【００４７】
「ＢＲ３変異体」とは、天然配列の完全長ＢＲ３、またはＢＲ３のＥＣＤのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＢＲ３ポリペプチドを意味する。随意的に、ＢＲ３変異体は単一のシステインリッチドメインを含む。好ましくは、そのようなＢＲ３変異体は、後述するように、アンタゴニストまたはアゴニストとして作用する。そのようなＢＲ３変異体ポリペプチドは、例えば、完全長アミノ酸配列の、１つ又は複数の内部ドメイン内とともに、N-及び／又はＣ-末端で１つ又は複数のアミノ酸残基が付加又は欠損しているＢＲ３ポリペプチドを含む。ＢＲ３のＥＣＤの断片もまた考慮される。通常は、ＢＲ３変異体ポリペプチドは、図６に示される核酸分子又はその特定の断片によってコード化されるＢＲ３ポリペプチドと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。ＢＲ３変異体ポリペプチドは、天然ＢＲ３ポリペプチド配列を含まない。通常は、ＢＲ３変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、多くは少なくとも約２０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３０アミノ酸長、より多くは少なくとも約４０アミノ酸長、より多くは少なくとも約５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約６０アミノ酸長、より多くは少なくとも約７０アミノ酸長、より多くは少なくとも約８０アミノ酸長、より多くは少なくとも約９０アミノ酸長、より多くは少なくとも約１００アミノ酸長、より多くは少なくとも約１５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２００アミノ酸長、より多くは少なくとも約２５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００４８】
ここで使用する場合の用語「ＴＡＣＩ」又は「ＴＡＣＩポリペプチド」又は「ＴＡＣＩレセプター」は、「天然配列ＴＡＣＩポリペプチド」及び「ＴＡＣＩ変異体」（さらに、ここで定義されている）を含む。「ＴＡＣＩ」とは、図１に示されるポリヌクレオチド配列及びその変異体または断片を含む核酸分子、図１に示される配列及びその変異体、それとともに上記の断片を含む核酸分子によってコードされているこれらポリペプチドに与えられた名称である。本発明のＴＡＣＩポリペプチドは、ヒト組織型又はその他の供給源などの様々な供給源から単離されてもよく、又は組換え及び／又は合成の方法によって調製してもよい。
【００４９】
「天然配列」ＴＡＣＩポリペプチドは、天然に由来し対応するＴＡＣＩポリペプチドと同じ配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＴＡＣＩポリペプチドは天然から単離することが可能であるか、又は、組換え及び／又は合成の方法によって作成することが可能である。用語「天然配列ＴＡＣＩポリペプチド」は、特に、ポリペプチドの天然に発生する切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に発生する変異型（例えば、選択的スプライシング形態）及び天然に発生するアレル変異体を含む。本発明のＴＡＣＩポリペプチドは、それらに限定されるものではないが、von Bulowら, 上掲および1998年9月11日公開のWO98/39361に記載されているポリペプチド、（上述で「ｈＴＡＣＩ（２６５）」と呼ばれ、図８（配列番号１９）に示すスプライシング変異体、および、図１のアミノ酸残基１〜２９３（配列番号３）の連続配列を含むＴＡＣＩポリペプチドを含む。
【００５０】
ＴＡＣＩ「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを基本的には有しないＴＡＣＩポリペプチドの型を指す。通常、ＴＡＣＩポリペプチドＥＣＤは、そのような膜貫通及び／又は細胞質ドメインの約１％未満、好ましくはそのようなドメインの０．５％未満を有する。本発明のＴＡＣＩポリペプチドについて同定される全ての膜貫通ドメインがその型の疎水性ドメインを同定するのに当該分野で日常的に使用される基準に従って同定されることが、理解されるであろう。正確な膜貫通ドメインの境界は変動しうるが、それは、殆どの場合、最初に同定されたドメインの何れの端においても僅か約５個以内のアミノ酸に限られている。ＴＡＣＩのＥＣＤ形態は、von Bulowら, 上掲、およびWO98/39361号に記載のものを含む。
【００５１】
「ＴＡＣＩ変異体」とは、天然配列完全長ＴＡＣＩ又はＴＡＣＩ ＥＣＤと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＴＡＣＩポリペプチドを意味する。好ましくは、このようなＴＡＣＩ変異体は、後述するように、ＴＡＬＬ−１アンタゴニスト、またはＡＰＲＩＬアンタゴニストとして作用する。このようなＴＡＣＩ変異体ポリペプチドには、例えば、全長アミノ酸配列のＮ-及び／又はＣ-末端、並びに一又は複数の内部ドメインにおいて１つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＴＡＣＩポリペプチドが含まれる。ＴＡＣＩのＥＣＤの断片も考慮される。通常、ＴＡＣＩ変異体ポリペプチドは、図１に示される核酸分子又はその特定された断片によってコードされるＴＡＣＩポリペプチドと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＴＡＣＩ変異体ポリペプチドは、天然ＴＡＣＩポリペプチドは含まない。通常、ＴＡＣＩ変異体ポリペプチドは少なくとも約１０アミノ酸長、多くは少なくとも約２０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３０アミノ酸長、より多くは少なくとも約４０アミノ酸長、より多くは少なくとも約５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約６０アミノ酸長、より多くは少なくとも約７０アミノ酸長、より多くは少なくとも約８０アミノ酸長、より多くは少なくとも約９０アミノ酸長、より多くは少なくとも約１００アミノ酸長、より多くは少なくとも約１５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２００アミノ酸長、より多くは少なくとも約２５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００５２】
ここで用いられている場合の「ＴＡＣＩｓ」という語は、図５Ｂの残基１〜２４６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいはその断片または変異体を有し、単一のシステインリッチドメインを含むポリペプチドを指す。場合によっては、そのようなＴＡＣＩｓポリペプチドは図５Ｂの残基１〜２４６の連続配列を有する。場合によっては、そのようなＴＡＣＩｓポリペプチドは、図５Ａに示すコード化ポリヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる。本発明のＴＡＣＩｓポリペプチドは、ヒト組織型又は別の供給源などの様々な供給源から単離されてよく、または組換え法および／または合成の方法によって調製されてもよい。「ＴＡＣＩｓ」という用語は、本明細書で「ＴＡＣＩ」と定義されるポリペプチドを明確に除外する。「天然配列」ＴＡＣＩｓポリペプチドは、天然に由来するポリペプチドを含む。そのような天然配列のＴＡＣＩｓポリペプチドは、天然減から単離してもよく、または組換え法および／または合成の方法によって作成してもよい。ＴＡＣＩｓポリペプチドは、図５Ｂに示すポリペプチドの断片または変異体を含んでよく、図５Ｂに示される配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、図５Ａに示されるコード化核酸分子又はその特定された断片によってコードされるＴＡＣＩｓポリペプチドと、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。好ましくは、そのようなＴＡＣＩｓ変異体は、後述するように、ＴＡＬＬ−１アンタゴニストまたはＡＰＲＩＬアンタゴニストとして作用する。そのような変異体ポリペプチドには、例えば、図５Ｂに示されるアミノ酸配列のＮ-及び／又はＣ-末端、並びに一又は複数の内部ドメインにおいて１つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたポリペプチドが含まれる。
【００５３】
ＴＡＣＩｓ「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを基本的には有しないＴＡＣＩｓポリペプチドの型を指す。通常、ＴＡＣＩｓポリペプチドＥＣＤは、そのような膜貫通及び／又は細胞質ドメインの約１％未満、好ましくはそのようなドメインの０．５％未満を有する。本発明のＴＡＣＩｓポリペプチドについて同定される全ての膜貫通ドメインがその型の疎水性ドメインを同定するのに当該分野で日常的に使用される基準に従って同定されることが、理解されるであろう。正確な膜貫通ドメインの境界は変動しうるが、それは、殆どの場合、最初に同定されたようなドメインの何れの端においても僅か約５個以内のアミノ酸に限られている。ＴＡＣＩｓのＥＣＤドメインには、図５Ｂのアミノ酸残基１〜１１９、および随意で図５Ｂの連続するアミノ酸残基１〜１１９の配列を有するポリペプチドが含まれる。
【００５４】
ここで用いられている場合の「ＢＣＭＡ」又は「ＢＣＭＡポリペプチド」又は「ＢＣＭＡレセプター」は、「天然配列ＢＣＭＡポリペプチド」及び「ＢＣＭＡ変異体」（ここでさらに定義されている）を含む。「ＢＣＭＡ」は、図２に示されるポリヌクレオチド配列及びその変異体を含む核酸分子、上記の断片とともに、図２に示される配列及びその断片を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドへ与えたれた名称である。本発明のＢＣＭＡポリペプチドは、ヒト組織型又はその他の供給源などの様々な供給源から単離されてもよく、又は、組換え及び／又は合成の方法によって調製してもよい。
【００５５】
「天然配列」ＢＣＭＡポリペプチドは、天然に由来し対応するRANKポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＢＣＭＡポリペプチドは、天然から単離することが可能であり、又は、組換え及び／又は合成の方法によって産生させることもできる。用語「天然配列ＢＣＭＡポリペプチド」は、特に、天然に発生する切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に発生する変異型（例えば、選択的スプライシング形態）及びポリペプチドの天然に発生するアレル変異体を含む。本発明のＢＣＭＡポリペプチドには、Laabiら, EMBO J., 11:3897-3904 (1992); Laabiら, Nucleic Acids Res., 22:1147-1154 (1994); Grasら, Int. Immunology, 7:1093-1106 (1995); Madryら, Int. Immunology, 10:1693-1702 (1998)に記載されているポリペプチド、 および図２の連続するアミノ酸残基１〜１８４（配列番号６）の配列を有するＢＣＭＡポリペプチドが含まれる。
【００５６】
ＢＣＭＡ「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを基本的には有しないＢＣＭＡポリペプチドの型を指す。通常、ＢＣＭＡポリペプチドＥＣＤは、そのような膜貫通及び／又は細胞質ドメインの約１％未満、好ましくはそのようなドメインの０．５％未満を有する。本発明のポリペプチドについて同定される全ての膜貫通ドメインがその型の疎水性ドメインを同定するのに当該分野で日常的に使用される基準に従って同定されることが、理解されるであろう。正確な膜貫通ドメインの境界は変動しうるが、それは、殆どの場合、最初に同定されたようなドメインの何れの端においても僅か約５個以内のアミノ酸に限られている。ＢＣＭＡのＥＣＤ型は、Laabiら、EMBO J., 11:3897-3904 (1992); Laabiら, Nucleic Acids Res., 22:1147-1154 (1994); Grasら, Int. Immunology, 7:1093-1106 (1995); Madryら, Int. Immunology,m 10:1693-1702 (1998)に記載されているものを含む。
【００５７】
「ＢＣＭＡ変異体」とは、天然配列ＢＣＭＡ又はＢＣＭＡ ＥＣＤと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＢＣＭＡポリペプチドを意味する。好ましくは、そのようなＢＣＭＡ兵隊は、以下に定義するように、ＴＡＬＬ−１アンタゴニスト又はＡＰＲＩＬアンタゴニストとして作用する。このようなＢＣＭＡ変異体ポリペプチドには、例えば、全長アミノ酸配列のＮ-及び／又はＣ-末端、並びに一又は複数の内部ドメインにおいて１つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＢＣＭＡポリペプチドが含まれる。ＢＣＭＡ ＥＣＤの断片も考慮される。通常、ＢＣＭＡ変異体ポリペプチドは、図２に示される核酸分子又はその特定された断片によってコードされるＢＣＭＡポリペプチドと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＢＣＭＡ変異体ポリペプチドは、天然ＢＣＭＡポリペプチドは含まない。通常、ＢＣＭＡ変異体ポリペプチドは少なくとも約１０アミノ酸長、多くは少なくとも約２０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３０アミノ酸長、より多くは少なくとも約４０アミノ酸長、より多くは少なくとも約５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約６０アミノ酸長、より多くは少なくとも約７０アミノ酸長、より多くは少なくとも約８０アミノ酸長、より多くは少なくとも約９０アミノ酸長、より多くは少なくとも約１００アミノ酸長、より多くは少なくとも約１５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２００アミノ酸長、より多くは少なくとも約２５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００５８】
ここで使用される場合の「ＴＡＬＬ−１」または「ＴＡＬＬ−１ポリペプチド」という用語は、「天然配列ＴＡＬＬ−１ポリペプチド」及び「ＴＡＬＬ−１変異体」を含む。「ＴＡＬＬ−１」とは、図３に示されるポリヌクレオチド配列及びその変異体を含む核酸分子、図３に示される配列及びその変異体、それとともに天然配列のＴＡＬＬ−１の生物学的活性を有する上記の断片を含む核酸分子によってコードされているこれらポリペプチドに与えられた名称である。好ましくは、ＴＡＬＬ−１の変異体は、図３に示される天然配列ＴＡＬＬ−１ポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有している。「天然配列」ＴＡＬＬ−１ポリペプチドは、天然由来の対応するＴＡＬＬ−１ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＴＡＬＬ−１ポリペプチドは、天然源から単離されてもよく、又は組換え及び／又は合成の方法によって調製してもよい。「天然配列ＴＡＬＬ−１ポリペプチド」という用語は、特に、ポリペプチドの天然に発生する切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に発生する変異型（例えば、選択的スプライシング形態）及び天然に発生するアレル変異体を含む。「ＴＡＬＬ−１」という用語は、Shuら, GenBank Accession No. AF136293; 1998年5月7日公開のWO/98/18921号; 1998年10月7日公開のEP869,180号; 1998年6月25日公開のWO98/27114号; 1999年3月18日公開のWO99/12964号; 1999年7月8日公開のWO99/33980号; Mooreら, 上掲; Schneiderら, 上掲; およびMukhopadhyayら, 上掲に開示されているポリペプチドを含む。
【００５９】
ここで使用される場合の「ＡＰＲＩＬ」または「ＡＰＲＩＬポリペプチド」という用語は、「天然配列ＡＰＲＩＬポリペプチド」及び「ＡＰＲＩＬ変異体」を含む。「ＡＰＲＩＬ」とは、図４Ａおよび４Ｂに示されるポリヌクレオチド配列及びその変異体を含む核酸分子、図４Ａおよび４Ｂに示される配列及びその変異体、それとともに天然配列のＡＰＲＩＬの生物学的活性を有する上記の断片を含む核酸分子によってコードされているこれらポリペプチドに与えられた名称である。好ましくは、ＡＰＲＩＬの変異体は、図４Ａおよび４Ｂに示される天然配列ＡＰＲＩＬポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有している。「天然配列」ＡＰＲＩＬポリペプチドは、天然由来の対応するＴＡＬＬ−１ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＡＰＲＩＬポリペプチドは、天然源から単離されてもよく、又は組換え及び／又は合成の方法によって調製してもよい。「天然配列ＡＰＲＩＬポリペプチド」という用語は、特に、ポリペプチドの天然に発生する切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に発生する変異型（例えば、選択的スプライシング形態）及び天然に発生するアレル変異体を含む。「ＡＰＲＩＬ」という用語は、Hahneら, J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); GenBank Accession No. AF0-46888; 1999年1月7日公開のWO99/00518号; 1999年7月15日公開のWO/35170号; 1999年3月18日公開のWO99/12965号; 1999年7月8日公開のWO99/33980号; 1997年9月18日公開のWO97/33902号; 1999年3月11日公開のWO99/11791号; 1999年3月28日公開のEP911,633号; および1999年10月7日公開のWO99/50416号に開示されているポリペプチドを含む。
【００６０】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にすることになり、低い温度は緊縮性を低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明については、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995）を参照のこと。
【００６１】
ここで定義される「ストリンジェントな条件」又は「高度にストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中に変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘSSC（０．７５ＭのNaCl、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子DNA（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％SDS、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘSSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるEDTAを含む０．１ｘSSCからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
【００６２】
「中程度のストリンジェントな条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (ニューヨーク: コールド・スプリング・ハーバー出版, 1989）に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％SDS）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、例えば、２０％ホルムアミド、５ｘSSC（１５０ｍＭのNaCl、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで３７−５０℃の１ｘSSC中におけるフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要性に応じて、温度、イオン強度等を調節する方法を認識する。
【００６３】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されているならば、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響を及ぼすならば、そのコーディング配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コーディング配列に作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【００６４】
「アミノ酸」という用語は、天然に生じるＬ−α−アミノ酸すべてを意味する。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、およびホモシステインを含むことを意図する。アミノ酸はアルファベット１文字または３文字で表す：
Ａｓｐ    Ｄ    アスパラギン酸
Ｔｈｒ    Ｔ    トレオニン
Ｓｅｒ    Ｓ    セリン
Ｇｌｕ    Ｅ    グルタミン酸
Ｐｒｏ    Ｐ    プロリン
Ｇｌｙ    Ｇ    グリシン
Ａｌａ    Ａ    アラニン
Ｃｙｓ    Ｃ    システイン
Ｖａｌ    Ｖ    バリン
Ｍｅｔ    Ｍ    メチオニン
Ｉｌｅ    Ｉ    イソロイシン
Ｌｅｕ    Ｌ    ロイシン
Ｔｙｒ    Ｙ    チロシン
Ｐｈｅ    Ｆ    フェニルアラニン
Ｈｉｓ    Ｈ    ヒスチジン
Ｌｙｓ    Ｋ    リジン
Ａｒｇ    Ｒ    アルギニン
Ｔｒｐ    Ｗ    トリプトファン
Ｇｌｎ    Ｑ    グルタミン
Ａｓｎ    Ｎ    アスパラギン
【００６５】
配列表および図面において使用されている上記以外の1文字または３文字の略表記は、配列中の任意の位置における２つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドを表す。
【００６６】
ここで同定されるリガンド又はアミノ酸配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ここで同定されるそのようなリガンド又はレセプター配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセントとして定義されている。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードを下に提供する。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、ソースコードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087で登録されている。ALIGN-2はジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であるか、下の表に提供されるソースコードから作成できる。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００６７】
（表１−ソースコード）
2005510208.tif 000002
2005510208.tif 000003
2005510208.tif 000004
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【００６８】
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する与えられたアミノ酸配列Ａの％アミノ酸同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸同一性を有する又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍  
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると記録されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％ポジティブとは異なることは理解されるであろう。％アミノ酸配列同一性の計算の例として、図７Ａ及び７Ｂに、「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列の「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の、％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【００６９】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかし、％アミノ酸配列同一性値は、また、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschulら， Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、NCBIインターネットウェブサイトからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００７０】
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する与えられたアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると記録されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００７１】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したポリペプチドを含むキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、抗体を産生することが可能なエピトープを提供するのに十分な長さを有する。また、タグポリペプチドは、好ましくは抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは、約１０〜約２０のアミノ酸残基)を有する。
【００７２】
ここで用いる「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3、又はIgG-4サブタイプ、IgA（IgA-1及びIgA-2を含む）、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００７３】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、ＴＡＬＬ−１ポリペプチド、ＡＰＲＩＬポリペプチド、又はＴＡＬＬ−１およびＡＰＲＩＬ両方の１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。ＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬポリペプチドのこのような生物学的活性の例には、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３へのＴＡＬＬ−１またはＡＰＲＩＬの結合、ＮＦ−ＫＢの活性化、及びリウマチ様関節炎などの免疫関連疾患、Ｂ細胞によるＩｇ分泌と増殖の活性化、並びに文献にさらに報告されているものが含まれる。アンタゴニストは直接的又は間接的な様式で機能する。例えば、アンタゴニストは、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３との直接的結合の結果として、ＴＡＬＬ−１ポリペプチド、ＡＰＲＩＬポリペプチド、又はＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬ両方の、１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和するよう機能することが可能である。また、アンタゴニストは、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、例えば、他のエフェクター分子をブロック又は阻害する結果として、ＴＡＬＬ−１ポリペプチド、ＡＰＲＩＬポリペプチド、又はＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬ両方の、１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和するために間接的にも機能する。アンタゴニスト分子は、分子がＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬ両方の生物学的活性を部分的に、又は完全に阻止、阻害、又は中和できる「二重」アンタゴニスト活性を持ってもよい。
【００７４】
「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、ＴＡＣＩｓポリペプチド、ＢＲ３ポリペプチド、又はＴＡＣＩｓ及びＢＲ３両方の、１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に増強、刺激又は活性化する任意の分子を含む。そのようなＴＡＣＩｓ及びＢＲ３の生物学的活性の例には、ＮＦ−ＫＢの活性化、免疫グロブリン産生及び分泌の誘発、及び細胞増殖が含まれる。アゴニストは直接的又は間接的な様式で機能する。例えば、アゴニストは、レセプター活性化又はシグナル伝達を引き起こす、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３へのその直接的結合の結果として、インビトロ、インサイツ、又はインビボにおいて、ＴＡＣＩｓポリペプチド、ＢＲ３ポリペプチド、又はＴＡＣＩｓ及びＢＲ３両方の、１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に増強、刺激又は活性化するために機能することが可能である。また、アゴニストは、インビトロ、インサイツ、又はインビボにおいて、例えば、その後、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３レセプターの活性化又はシグナル伝達を引き起こす他のエフェクター分子を刺激する結果として、ＴＡＣＩｓポリペプチド、ＢＲ３ポリペプチド、又はＴＡＣＩｓ及びＢＲ３両方の、１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に増強、刺激又は活性化するために間接的にも機能することが可能である。アゴニストは、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３活性又は活動を間接的に増強または増大するために機能するエンハンサー分子として作用することができると考えられている。例えば、アゴニストは、哺乳動物の内因性ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬの活性を増強することが可能である。これは、例えば、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３を事前に複合するか、又は（ＴＡＬＬ−１とＴＡＣＩｓ、又はＡＰＲＩＬとＴＡＣＩｓ間に形成される天然複合体を安定化させるなど、）それぞれのリガンドとＴＡＣＩｓ又はＢＲ３レセプターの複合体を安定化させることにより行うことができる。
【００７５】
「ＴＡＬＬ−１アンタゴニスト」又は「ＡＰＲＩＬアンタゴニスト」なる用語は、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬそれぞれの、又はＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬ両方の、生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和し、限定はされないが、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３の細胞外ドメイン配列等のＴＡＣＩｓレセプター又はＢＲ３レセプターの可溶化型、ＴＡＣＩｓレセプターイムノアドヘシン、ＢＲ３レセプターイムノアドヘシン、ＴＡＣＩｓレセプター融合タンパク質、ＢＲ３レセプター融合タンパク質、ＴＡＣＩｓレセプターの共有修飾型、ＢＲ３レセプターの共有修飾型、ＴＡＣＩｓ変異体、ＢＲ３変異体、ＴＡＣＩｓレセプター抗体、ＢＲ３レセプター抗体、ＴＡＬＬ−１抗体、及びＡＰＲＩＬ抗体を含む任意の分子を指す。ＴＡＬＬ−１アンタゴニスト分子が部分的又は完全にＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬの生物学的活性を阻止、阻害又は中和するかどうかを決定するために、例えば、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３へのＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬの結合、又は、対応するリガンドによるＮＦ−ＫＢの活性化へのアンタゴニスト分子の効果を評価するために、アッセイをおこなうことが可能である。そのようなアッセイは、例えば、ＢＲ３及び／又はＴＡＣＩｓを発現している細胞など、既知のインビトロ又はインビボアッセイ形式により実施してもよい。好ましくは、ここで記述された方法で使用されるＴＡＬＬ−１アンタゴニストは、ここで記載されている（及び実施例）ようなアッセイで場合によっては測定することが可能な、少なくとも１つタイプのＴＡＬＬ−１活性をブロック又は中和することができる。ＡＰＲＩＬアンタゴニスト分子が部分的又は完全にＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬの生物学的活性を阻止、阻害又は中和するかどうかを決定するために、例えば、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３へのＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬの結合、又は、リガンドによるＮＦ−ＫＢの活性化へのアンタゴニスト分子の効果を評価するために、アッセイをおこなうことが可能である。そのようなアッセイは、例えば、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３（又はＴＡＣＩｓ及びＢＲ３両方）を形質移入した細胞を使用する、既知のインビトロ又はインビボアッセイ形式により実施してもよい。好ましくは、ここで記述された方法で使用されるＡＰＲＩＬアンタゴニストは、随意的に結合アッセイ又はＩｇＭ産生アッセイで測定することが可能な、少なくとも１つタイプのＡＰＲＩＬ活性を阻止又は中和することができる。場合によっては、ＴＡＬＬ−１アンタゴニスト又はＡＰＲＩＬアンタゴニストは、結合アッセイにおいて、ネガティブコントロール分子と比較して、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３へのＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬ(又はＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬ両方)の結合を低下させるか、又は阻害することができる。１つの実施態様では、ＴＡｌｌ−１アンタゴニスト又はＡＰＲＩＬアンタゴニストは、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３への別のリガンド又は抗体の結合を競合的に阻害する抗体を含む。競合阻害により抗体の特異性及び親和性を決定するための方法は、当該技術分野において知られている[例えば、Harlowら, Antibodies:A Laboratory Mnual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998)；Colliganら, Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc., NY (1992;1993)；Muller, Meth. Enzym., 92:589-601(1983)を参照せよ]。
【００７６】
「ＴＡＣＩｓアゴニスト」又は「ＢＲ３アゴニスト」なる用語は、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３それぞれの、又はＴＡＣＩｓ及びＢＲ３両方の、生物学的活性を部分的又は完全に増強、刺激、又は活性化し、限定はされないが、抗ＴＡＣＩｓレセプター抗体、及び抗ＢＲ３レセプター抗体を含む任意の分子を指す。ＴＡＣＩｓアゴニスト分子が部分的又は完全にＴＡＣＩｓ又はＢＲ３の生物学的活性を増強、刺激、又は活性化するかどうかを決定するために、例えば、ＰＢＬ又はＴＡＣＩｓ又はＢＲ３を形質移入した細胞に対するアゴニスト分子の効果を評価するためのアッセイを実施することが可能である。そのようなアッセイは、既知のインビトロ又はインビボアッセイ形式により実施してもよい。好ましくは、ここで記述された方法で使用されるＴＡＣＩｓアゴニストは、ここで記載されているようなアッセイで場合によっては測定することが可能な、少なくとも１つタイプのＴＡＣＩｓ活性を増強又は活性化することができる。ＢＲ３アゴニスト分子が部分的又は完全にＴＡＣＩｓ又はＢＲ３の生物学的活性を増強、刺激、又は活性化するかどうかを決定するために、例えば、ＴＡＬＬ−１又はＢＲ３に対するアゴニスト分子の効果を評価するためのアッセイをおこなうことが可能である。そのようなアッセイは、例えば、ＰＢＬｓ又はＢＲ３形質移入細胞を使用する、既知のインビトロ又はインビボアッセイ形式により実施してもよい。好ましくは、ＴＡＣＩｓアゴニスト又はＢＲ３アゴニストは、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３レセプターの天然リガンドにより達成される範囲で、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３それぞれを刺激又は活性化できる。
【００７７】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、ＢＲ３、ＴＡＣＩｓ、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ、又はＢＣＭＡに対する単一のモノクローナル抗体、多エピトープ特異性を持つ抗体組成物、単鎖抗体、及び抗体の断片を特異的を含む。本明細書で使用する「抗体」という表現は、ここに記載される所望の作用的又は拮抗的特性を有していれば、無傷免疫グロブリン又は抗体分子、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（つまり、少なくとも２つの無傷抗体から形成された二重特異性抗体）、及び免疫グロブリン断片（例えばFab、F(ab')2、又はFv）を含む。
【００７８】
典型的に、抗体は、特定の抗原に対する結合特性を示すタンパク質またはポリペプチドである。天然の抗体は、通常、２つの同一の軽(L)鎖および２つの同一の重(H)鎖からなるヘテロ四量体の糖タンパク質である。通常、軽鎖の各々は、共有ジスルフィド結合により１つの重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのイソタイプによって異なる。また、各重鎖および軽鎖は、等間隔に並ぶ鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖の一端には可変ドメイン（ＶＨ）があって、それに複数の定常ドメインが続いている。各軽鎖の一端（ＶＬ）には可変ドメインが、他端には定常ドメインがある；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと整列しており、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖の可変ドメインと重鎖の可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている（Chothia他, J. Mol. Biol., 186:651-663, 1985年; Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596, 1985年）。任意の脊椎動物の種由来の抗体の軽鎖は、その定常ドメインアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる２つの明確に区別される型の一方に割り当てることができる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンを複数のクラスに分けることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG およびIgMがあり、これらのうち複数をさらにサブクラス（イソタイプ）、例えば、IgG-1、IgG-2、IgG-3およびIgG-4、ならびにIgA-1およびIgA-2に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖の定常ドメインを、それぞれ、α、δ、υ、γおよびμと呼ぶ。
【００７９】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、通常は無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片；二重特異性抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００８０】
「可変」という用語は、抗体間で配列が異なる可変ドメインの特定の部分を表すために使用され、特定の抗原に対する特定の抗体の各々の結合および特異性に利用される。しかしながら、抗体の可変ドメインにおいて可変性は通常一様に分布してはいない。典型的には、相補性決定領域（CDR）または軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つの染色体部分に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分をフレームワーク(FR)と呼ぶ。天然の重鎖および軽鎖の各可変ドメインは、大部分がβ−シート構造を取り入れ、３つのCDRにより連結された４つのFR領域を有しており、それらCDRはβ−シート構造を連結するループを形成するか、場合によってはβ−シート構造の一部を形成する。各鎖のCDRはFR領域によって互いに近接して保持されており、別の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat, E.Aら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, メリーランド州、1987年参照）。定常ドメインは抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性への抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。
【００８１】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に指向する。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に指向する。
【００８２】
ここで、モノクローナル抗体は、所望の生物学的活性、または特性を有するものである限りにおいて、起源の種、免疫グロブリンのクラス、またはサブクラスに関係なく、定常ドメイン（例えば「ヒト化」抗体）、または重鎖を有する軽鎖、または別の種由来の鎖を有するある種由来の鎖、または異種タンパク質との融合を有する目的の抗体の（高頻度可変を含む）可変ドメインをスプライシングすることにより生成されるキメラ抗体、ハイブリッド抗体、および組換え抗体、ならびに抗体断片（例えばFab、F(ab')、F(ab')2、およびFv）を含む。例えば米国特許第4,816,567号、およびMageらによるMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications 79-97頁（Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987年）を参照のこと。
【００８３】
「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler及びMilsteinによってNature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第4,816,567号参照)。「モノクローナル抗体」は、また、例えばMcCaffertyらによる Nature, 348:552-554(1990)に記載された技術を用いて生成されたファージライブラリから単離することができる。
【００８４】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいはそれらの断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分において、ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリン共通配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、最適には免疫グロブリン定常領域又はドメイン(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含みうる。
【００８５】
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のものに相当するアミノ酸配列を有するもの、および／または当該分野で既知の、もしくはここで記載されているようなヒト抗体を作成するための技術の何れかを用いて作成されたつくられたものである。ヒト抗体のこのような定義は、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも1つのヒト軽鎖ポリペプチド、例えばマウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。ヒト抗体は、様々な従来技術を使用して生成することができる。一実施態様では、ライブラリがヒト抗体を発現する場合、そのようなファージライブラリからヒト抗体を選択する（Vaughanら,Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996年; Sheets他 PNAS, アメリカ合衆国、95:6157-6162,1998年; HoogenboomおよびWinter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991年; Marksら, J. Mol. Biol., 222:581, 1991年）。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が特異的にまたは完全に非活性化されているマウスに導入することにより生成することができる。実験によりヒト抗体の産生が確認されており、それは遺伝子の再編成、構築、および抗体のレパートリーを含め、すべての面でヒトに見られる抗体産生に非常に類似している。この方法は、例えば、米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、および以下の科学文献に開示されている：Marksら, Bio/Technology, 10: 779-783, 1992年; Lonbergら, Nature, 368: 856-859, 1994年; Morrison, Nature, 368:812-13, 1994年; Fishwildら, Nature Biotechnology, 14: 845-51, 1996年; Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826, 1996年; Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93, 1995年。あるいは、ヒト抗体は、標的となる抗原を志向する抗体を産生するＢリンパ球（このようなＢリンパ球は個体から回収できるか、またはインビボで免疫することができる）の不死化により調製することもできる。 例えば、Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985年; Boerner他, J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991年; および米国特許第5,750,373号を参照のこと。
【００８６】
「Ｆｃ領域」という用語は、無傷の抗体のパパイン消化により生成される免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は天然配列のＦｃ領域または変異体Ｆｃ領域でありうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界はまちまちであるが、ヒトIgG重鎖のFc領域は、通常、約Cys226または約Pro230に位置するアミノ酸残基からFc領域のカルボキシル末端まで延びていると定義される（ここではKabatら, 上掲による番号付けシステムを使用した）。免疫グロブリンのＦｃ領域は、通常、２つの定常ドメイン、１つのＣＨ２ドメインおよび１つのＣＨ３ドメインを含み、随意でＣＨ４ドメインを含む。
【００８７】
ここで使用する「Ｆｃ領域鎖」という表現は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖のうちの１つを意味する。
【００８８】
ヒトIgG Fc領域の「CH2ドメイン」（「Cγ2」ドメインとも呼ばれる）は、通常、約231位のアミノ酸残基から約340位のアミノ酸残基まで延びている。CH2ドメインは、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然IgG分子の２つのCH2ドメインの間に挿入される。炭水化物はドメイン−ドメイン対の代替物を提供し、CH2ドメインの安定化を助けることができると推測される。BurtonによるMolec. Immunol. 22:161-206 (1985年)を参照のこと。ここで、CH2ドメインは天然配列のCH2ドメインまたは変異体CH2ドメインとすることができる。
【００８９】
「CH3ドメイン」は、Fc領域におけるＣ末端からCH2ドメインまでの範囲（つまり、IgGの約341位のアミノ酸残基から約447位のアミノ酸残基）を含む。ここでは、CH3領域は、天然配列のCH3ドメインか、または変異体CH3ドメイン（例えば、その一鎖に「protroberance」が導入され、それに対応して他の鎖に「空洞」が導入されたCH3ドメイン：米国特許第5,821,333号参照）とすることができる。このような変異体CH3ドメインを使用して本明細書に開示する多重特異性（例えば二重特異性）抗体をつくることができる。
【００９０】
「ヒンジ領域」は、通常、ヒトIgG1の約Glu216または約Cys226から約Pro230まで延びていると定義される（Burton, Molec. Immunol.22:161-206, 1985年）。他のIgGイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置に内部重鎖S-S結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによりIgG1配列と整列させることができる。本明細書のヒンジ領域は、天然配列のヒンジ領域か、または変異体ヒンジ領域とすることができる。変異体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、通常、１つのポリペプチド鎖につき少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、よって変異体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本発明の好ましいヒンジ領域は、天然配列のヒトヒンジ領域、例えば天然配列のヒトIgG1ヒンジ領域である。
【００９１】
「機能的Fc領域」は、天然配列Fc領域の少なくとも１つの「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」には、C1q結合、補体依存性細胞障害作用（CDC）、Fcレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用（ADCC）、食作用、細胞表面レセプター（例えばＢ細胞レセプター； BCR）の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、通常、Fc領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わさることを必要とし、そのような抗体のエフェクター機能を評価するための当技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価される。
【００９２】
「天然配列Fc領域」は、天然に由来するFc領域と同じアミノ酸配列を有する。「変異体Fc領域」には、最低１つのアミノ酸修飾だけが天然配列のFc領域と異なるアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、変異体Fc領域は、天然配列のFc領域、または親ポリペプチドのFc領域と比較した場合に、天然配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域において少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば約１から約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。ここに開示する変異体Fc領域は、天然配列のFc領域および／または親ポリペプチドのFc領域に対して、少なくとも約80%の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約90%、さらに好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有する。
【００９３】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用」および「ADCC」は、Fcレセプター（FcR）を発現する非特異性の毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞で結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ADCC、NK細胞を媒介する一次細胞はFcγRIIIのみを発現し、一方単核細胞はFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcR発現は、RavetchおよびKinetによる、Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991年)の、464ページの表３にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するために、インビボADCCアッセイ（例えば米国特許第5,500,362号または同第5,821,337号に記載）を行うことができる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、抹消血単核細胞（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。あるいは、またはそれに加えて、目的とする分子のADCC活性をインビボで、例えばClynesらによる PNAS(アメリカ合衆国)、 95:652-656(1998年)に開示されているような動物モデルにおいて評価することができる。
【００９４】
「ヒトエフェクター細胞」は、１以上のFcRsを発現する白血球であり、エフェクター機能を果たす。好ましくは、細胞は少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を果たす。ADCCを媒介するヒト白血球の例には、抹消血単核細胞（PBMC）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単核細胞、細胞障害性Ｔ細胞および好中球が含まれ、中でもPBMCとNK細胞が好ましい。エフェクター細胞はその天然供給源、例えば血液またはPBMCからここに開示するように単離することができる。
【００９５】
「Fcレセプター」および「FcR」という用語は、抗体のFc領域に結合するレセプターを表すために使用される。好ましいFcRは天然配列ヒトFcRである。さらに、好ましいFcRはIgG抗体に結合するもの（ガンマレセプター）であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラス のレセプターを含み、それには対立変異体およびそれらレセプターの変形スプライス形式が含まれる。FcγRIIレセプターはFcγRIIA（「活性化レセプター」）およびFcγRIIB（「抑制レセプター」）を含み、それらは主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化レセプターであるFcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫レセプターのチロシンベース活性化モチーフ（ITAM）を有する。阻害するレセプターFcγRIIBは、その細胞質ドメインにある免疫レセプター チロシンベース抑制性モチーフ（ITIM）を有する（Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234, 1997年に記載）。FcRはRavetchおよびKinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991年); Capel他, Immunomethods, 4:25-34(1994年); およびde Haas他, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41(1995年)に説明されている。本明細書で使用する「FcR」という語は、将来同定されるものも含め、その他のFcRを包括する。この用語はまた、母性IgGの胎児への移転をつかさどる新生児レセプターであるFcRnを含む（Guyer他, J. Immunol., 117:587, 1976年;およびKim他, J. Immunol., 24:249, 1994年）。
【００９６】
「補体依存性細胞障害作用」および「CDC」は、補体存在下における標的の溶解を指す。補体の活性経路は補体系（C1q）の第一成分の分子の、同族抗原と複合した分子（例えば抗体）への結合により開始される。補体の活性を評価するため、例えばGazzano-SantoroらによるJ. Immunol. Methods, 202:163(1996年)に記載されているようなCDCアッセイを実行することができる。
【００９７】
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、VHドメインとVLドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。CDRおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994年); Schier他、Gene, 169:147-155 (1995年);  Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995年); Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995年); およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992年)に開示されている。
【００９８】
「抗体の免疫特異的結合」に使用される「免疫特異的」という用語は、例えば、抗体の抗原混合部位と抗体により認識される特異的な抗原との間に発生する抗原に特異的な結合の相互作用を意味する。
【００９９】
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用する場合は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の夾雑成分とは、そのタンパク質の診断又は治療への使用を概して妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに十分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下でのSDS-PAGEによって均一になるまで精製される。単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれるが、タンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【０１００】
「治療」又は「治療法」とは、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を意味する。
【０１０１】
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１０２】
「ＴＡＬＬ−１関連疾患」および「ＡＰＲＩＬ関連疾患」とは、正常で健康な哺乳動物における発現又は活性のレベルを上回るか又は下回る、それぞれＴＡＬＬ−１またはＡＰＲＩＬの異常なレベルの発現又は活性に関連する病状および状態を指し、そのような過剰又は不足のレベルは、全身、局所、あるいは身体の特定の組織又は細胞型又は位置に発生する。ＴＡＬＬ−１関連疾患およびＡＰＲＩＬ関連疾患には、急性及び慢性免疫関連病及び癌が含まれる。
【０１０３】
「癌」、「癌性の」および「悪性の」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、膠腫、肉腫、骨髄腫、及び白血病を含む悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、胃腸癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝癌および肝細胞腫などの肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、骨髄腫（多発性骨髄腫等）、唾液腺癌、腎癌およびビルムス腫などの腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、並びに多種多様な頭部及び頸部の癌が含まれる。場合によっては、癌は、癌細胞、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ、ＴＡＣＩｓ、ＢＲ３又はＢＣＭＡを発現するか、又はそれらに関連している。本発明の治療に好ましい癌には、リンパ腫、白血病、骨髄腫、及びそれらのサブタイプ、例えばバーキットのリンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性又はリンパ性白血病、非ホジキン及びホジキンリンパ腫、及び球性骨髄性白血病が含まれる。
【０１０４】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病的状態の原因であるか、媒介又は寄与するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語に含まれるものは、自己免疫疾患、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、炎症疾患、及び免疫欠損症が含まれる。そのうちの免疫又はＴ細胞媒介であり、本発明によって治療することが可能な免疫関連及び炎症性疾患の例には、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、若年型慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症）、自己免疫性血小板減少症（溶血性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（バセドウ病、橋本甲状腺炎、若年型リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫媒介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患例えば多発性硬化症、特発性脱髄多発神経障害又はギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患例えば感染性肝炎（A、B、C、D、E型肝炎、及び他の非肝親和性ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎：クローン病）等の炎症性及び線維性肺疾患、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚病を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、多形滲出性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬 、アレルギー性疾患例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患が含まれる。感染症疾患には、AIDS（HIV感染）、A、B、C、D及びＥ型肝炎、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症及び寄生虫症が含まれる。
【０１０５】
本明細書の「自己免疫疾患」という語は広義で使用され、一般的な意味で、自己の組織成分に対する個体の体液または細胞の免疫反応から正常または健康な組織の破壊が生じる、哺乳動物の障害、または状態を指す。例として、これらに限定するものではないが、エリテマトーデス、甲状腺炎、リウマチ様関節炎、乾癬、多発性硬化症、自己免疫糖尿病、および炎症性腸疾患が挙げられる。
【０１０６】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤(parent drug)に比較して癌細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化されるか又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting, Belfast (1986),及びStella ら, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardtら（編）, pp.247-267, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、これらに限られないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害剤の例には、後述の化学療法剤が含まれる。
【０１０７】
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は抑制し、及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32およびLuの放射性同位体）、化学療法剤、及び小分子毒素または細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素等の毒素、及びそれらの断片および/または変異体を含むことを意図する。
【０１０８】
「化学療法剤」は、癌などの状態の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin）合成類似体を含む）；クリプトフィシン(cryptophycins）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin）；デュオカルマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCBI-TMIを含む）； エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin）；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１I及びカリケアマイシンθＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；エスペラマイシン(esperamicin）； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシン(mitomycins）、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジ���(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)、５−ＦＵのようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(Fareston)；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【０１０９】
ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を指すものである。よって、成長阻害剤とは、S期におけるそのような遺伝子の過剰発現細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行をブロックする薬剤(S期以外の場所において)、例えばG1停止及びM期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なM期ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール（登録商標）、及びトポIIインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。G1を停止させるこれらの薬剤、例えばDNAアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びara-CがS期停止へ波及する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬(Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs)」と題された、癌の分子的基礎(The Molecular Basis of Cancer)、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【０１１０】
「サイトカイン」なる用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
【０１１１】
ＩＩ.  方法と材料
本発明は、本出願でＴＡＣＩｓ及びＢＲ３と呼ばれるポリペプチドをコード化する新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するcＤＮＡおよびＢＲ３ポリペプチドをコード化するcＤＮＡが同定され単離された。
【０１１２】
Ａ．ＴＡＣＩｓおよびＢＲ３ポリペプチドの変異体
ここに記載した完全長天然配列ＴＡＣＩｓポリペプチドおよびＢＲ３ポリペプチドに加えて、それぞれの変異体も調製できると考えられる。ポリペプチド変異体は、ＴＡＣＩｓまたはＢＲ３ポリペプチドコード化ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又は所望のＴＡＣＩｓ又はＢＲ３ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＮＳ４の翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
【０１１３】
天然完全長配列ポリペプチド又はここに記載したポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ポリペプチドと比較してアミノ酸配列が変化するＴＡＣＩｓ又はＢＲ３ポリペプチドをコード化する１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３ポリペプチドの１つ又は複数のドメインにおいて、少なくとも１つのアミノ酸を他の任意のアミノ酸により置換してなる。
【０１１４】
いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ポリペプチドの配列を相同な既知のタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を試験することにより決定される。
【０１１５】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発のようなこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］あるいは他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに対して実施してＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドコード化変異体ＤＮＡを製造することもできる。
【０１１６】
また、連続配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的に好ましい。さらに、それは埋もれた位置と露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、活性中心に作用する(isosteric)アミノ酸を用いることができる。
【０１１７】
Ｂ．ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３ポリペプチドの修飾
ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。本明細書に開示するポリペプチドには、Ｎ末端メチオニン残基が存在していても不在でもよい。共有結合的修飾の一つのタイプには、ＴＡＣＩｓポリペプチドの標的化アミノ酸残基を、ＴＡＣＩｓポリペプチドの選択された側鎖、あるいはＮ又はＣ末端残基と反応する能力のある有機誘導体化試薬と反応させることを含む。同様に、選択された側鎖、あるいはそのＮ又はＣ末端残基を有する標的化アミノ酸残基においてＢＲ３ポリペプチドを修飾できる。
【０１１８】
二官能性試薬での誘導体化は、例えば抗ＴＡＣＩｓポリペプチド抗体の精製方法に使用される水不溶性支持体マトリクス又は表面にＴＡＣＩｓポリペプチドを架橋させるためにあるいはその逆の場合に有用である。そのような二官能性試薬での誘導体化は、例えば抗ＢＲ３ポリペプチド抗体の精製方法に使用される水不溶性支持体マトリクス又は表面にＢＲ３ポリペプチドを架橋させるためにあるいはその逆の場合に有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸とのエステル、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
【０１１９】
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１２０】
本発明の範囲内に含まれるＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプは、いずれかのポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」によりここで意図されるのは、天然配列ＴＡＣＩｓポリペプチドに見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失、天然配列ＢＲ３ポリペプチドに見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失、天然配列ＴＡＣＩｓポリペプチドに存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加、及び／又は天然配列ＢＲ３ポリペプチドに存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加である。
【０１２１】
ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、（Ｏ-結合グリコシル化部位における）１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＴＡＣＩｓポリペプチドへの付加、又は置換か、あるいは１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＢＲ３ポリペプチドへの付加、又は置換によってなされてもよい。ＴＡＣＩｓポリペプチドアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。同様に、ＢＲ３ポリペプチドアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＢＲ３ポリペプチドをコード化するＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【０１２２】
ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に公開された国際公開87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【０１２３】
ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコード化するコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddinら, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdgeら, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
【０１２４】
ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプは、ポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
【０１２５】
Ｃ．ＴＡＣＩｓポリペプチド及びＢＲ３ポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、ＴＡＣＩｓポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＴＡＣＩｓポリペプチドを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＴＡＣＩｓポリペプチドを調製することができると考えられる。例えば、ＴＡＣＩｓポリペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewartら, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サンフランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。マニュアル技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター  シティー, カリフォルニア）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＴＡＣＩｓポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて完全長ＴＡＣＩｓポリペプチドを生産してもよい。
【０１２６】
以下の説明は、主として、ＢＲ３ポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＢＲ３ポリペプチドを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＢＲ３ポリペプチドを調製することができると考えられる。例えば、ＢＲ３ポリペプチド配列、又はその一部は、上述のように、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい。ＢＲ３ポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて完全長ＢＲ３ポリペプチドを生産してもよい。
【０１２７】
１．ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドをコード化するＤＮＡの単離
ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するＤＮＡは、ＴＡＣＩｓポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＴＡＣＩｓポリペプチドコード化ＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＴＡＣＩｓポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
【０１２８】
同様に、ＢＲ３ポリペプチドをコード化するＤＮＡは、ＢＲ３ポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＢＲ３ポリペプチドＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＢＲ３ポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
【０１２９】
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ＴＡＣＩｓポリペプチドに対する抗体、ＢＲ３ポリペプチドに対する抗体、又は少なくとも約２０-８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化する遺伝子、又はＢＲ３ポリペプチドをコード化する遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【０１３０】
ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術では、プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、偽陽性が最小となるように十分な長さがあり、十分にはっきしているものでなければならない。好ましくは、スクリーニングするライブラリにおいてＤＮＡにハイブリダイズした時点で検出できるよう、オリゴヌクレオチドを標識化する。標識化の方法は当技術分野において既知であり、３２ｐ−標識ＡＴＰのような放射標識、ビオチニン化、又は酵素標識を含む。中程度のストリンジェンシー、および高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら, 上掲に提供され、前述のようにに定義されている。場合によっては、ハイブリダイゼーション条件は、22ページ6-20行に定義されているように高度なストリンジェンシーである。
【０１３１】
そのようなライブラリスクリーニング方法において同定された配列を、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的なデータベース、またはその他私的な配列データベースから入手可能な他の既知の配列と比較し、整列させることができる。分子の規定領域内の、又は完全長配列の（アミノ酸又はヌクレオチドレベルでの）配列同一性は、上記に言及されたようなコンピュータソフトウェアプログラム、及び場合によってはここに開示するＡＬＩＧＮ−２プログラムを使用した配列整合により決定できる。
【０１３２】
タンパク質コーディング配列を有する核酸は、まずここに開示する推定アミノ酸配列を用いて、必要であればSambrookら（上掲）に記載の常套的なプライマー伸長法を用いて、選択されたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリをスクリーニングし、ｃＤＮＡに逆転写されていないと思われるｍＲＮＡのプロセシング中間体及び前駆体を検出することにより取得できる。
【０１３３】
２．宿主細胞の選択と形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＴＡＣＩｓポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換する。あるいは、宿主細胞を、ここに記載したＢＲ３ポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換する。宿主細胞を、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコード化する遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば媒質、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrookら, 上掲に見出すことができる。
【０１３４】
多数のトランスフェクションの方法が当業者に知られている。例えば、CaPO4及びエレクトロポレーションである。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらにより記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開の国際公開第89/05859号に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母への形質転換は、典形的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実施する。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０１３５】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公的に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。
【０１３６】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するベクター、又はＢＲ３ポリペプチドをコード化するベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。
【０１３７】
グリコシル化ＴＡＣＩｓポリペプチド、又はグリコシル化ＢＲ３ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamほか, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【０１３８】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
所望のＴＡＣＩｓポリペプチド、又は所望のＢＲ３ポリペプチドをコード化する核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの形成には、当業者に知られた標準的な連結技術を用いる。
【０１３９】
所望のＴＡＣＩｓポリペプチド又は所望のＢＲ３ポリペプチドは、直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＴＡＣＩｓポリペプチドコード化ＤＮＡの一部であるか、又はベクターに挿入されるＢＲ３ポリペプチドコード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む。後者は米国特許第５０１０１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２１７９)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際特許出願第ＷＯ９０／１３６４６号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１４０】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【０１４１】
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコード化する。
【０１４２】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＴＡＣＩｓポリペプチドコード核酸又はＢＲ３ポリペプチドコード核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcombら, Nature, 282：39(1979)；Kingsmanら, Gene, 7：141(1979)；Tschemperら, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する（Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【０１４３】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＴＡＣＩｓポリペプチドコード核酸配列又はＢＲ３ポリペプチドコード核酸配列に作用可能に関連付けられるプロモーターを含む。、プロモーターはｍＲＮＡ合成を制御する。多種の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系（Cahngら, Nature, 275:615 (1978)； Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系（Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776）、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター（deBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)）を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたポリペプチドをコード化するＤＮＡと作用可能に関連付けられたシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【０１４４】
酵母宿主と共に使用するのに好適なプロモーター配列の例には、３-ホスホグリセラートキナーゼ（Hitzemanら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)）又は他の糖分解酵素(Hessら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【０１４５】
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母での発現に適切なベクターとプロモータは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
【０１４６】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０(SV40)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、制御される。
【０１４７】
より高等の真核生物による本発明のＴＡＣＩｓポリペプチドをコードしているＤＮＡ又はＢＲ３ポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＴＡＣＩｓポリペプチドコーディング配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。同様に、エンハンサーは、ＢＲ３ポリペプチドコーディング配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０１４８】
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、ＴＡＣＩｓポリペプチドをコードしているｍＲＮＡ又はＢＲ３ポリペプチドをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【０１４９】
組換え脊椎動物細胞培養でのＴＡＣＩｓポリペプチド及び／又はＢＲ３ポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第117060号; 及び欧州特許第117058号に記載されている。
【０１５０】
４．  遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)）、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。また、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【０１５１】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＴＡＣＩｓポリペプチドに対して、天然配列ＢＲ３ポリペプチドに対して、ここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、ＴＡＣＩｓポリペプチドコード化ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコード化する外因性配列に対して、又はＢＲ３ポリペプチドコード化ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコード化する外因性配列に対して調製され得る。
【０１５２】
５．  ポリペプチドの精製
ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドが膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
【０１５３】
ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。次の手順は適切な精製手順の例である：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された様々なタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産されるＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの性質に依存する。
【０１５４】
６．ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの用途
ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化する核酸配列（又はそれらの補体）、及びＢＲ３ポリペプチドをコード化する核酸配列又はそれらの補体は、染色体及び遺伝子マッピング、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成における、ハイブリッド化プローブとしての使用を含め、分子生物学における種々の用途を有している。また、ＴＡＣＩｓポリペプチドコード化核酸は、ここに記載される組換え技術によるＴＡＣＩｓポリペプチドの調製にも有用であろう。同様に、ＢＲ３ポリペプチドコード化核酸は、ここに記載される組換え技術によるＢＲ３ポリペプチドの調製にも有用であろう。
【０１５５】
また、ＴＡＣＩｓポリペプチド、ＢＲ３ポリペプチド、又はそれらの修飾型をコード化する核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのに使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するｃＤＮＡ又は、確立された技術によりＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。別の実施形態では、ＢＲ３ポリペプチドをコード化するｃＤＮＡ又は、確立された技術によりＢＲ３ポリペプチドをコード化するゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ＢＲ３ポリペプチドをコード化するＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。
【０１５６】
特にマウス又はラット等のトランスジェニック動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＴＡＣＩｓポリペプチド及び／又はＢＲ３ポリペプチド導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化する導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物は、ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。あるいは、胚段階で動物の生殖系列に導入されたＢＲ３ポリペプチドをコード化する導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物は、ＢＲ３ポリペプチドをコード化するＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えば過剰発現を伴う病理的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病状の発病率が低ければ、疾患に対する治療的処置の可能性が示される。
【０１５７】
あるいは、ＴＡＣＩｓポリペプチドの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化する変更ゲノムＤＮＡと、ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化する内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化する欠陥又は変更遺伝子を有するＴＡＣＩｓポリペプチド「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するゲノムＤＮＡの一部を欠失するか、又は組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコード化する遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。
【０１５８】
あるいは、ＢＲ３ポリペプチドの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＢＲ３ポリペプチドをコード化する変更ゲノムＤＮＡと、ＢＲ３ポリペプチドをコード化する内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＢＲ３ポリペプチドをコード化する欠陥又は変更遺伝子を有するＢＲ３ポリペプチド「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＢＲ３ポリペプチドをコード化するｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＢＲ３ポリペプチドをコード化するゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＢＲ３ポリペプチドをコード化するゲノムＤＮＡの一部を欠失するか、又は組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコード化する遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。
【０１５９】
典型的には、「ノックアウト動物」の作成において、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベース含む（例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと）。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーション等によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する（例えば、Liら, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する（例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson編 (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照）。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の発達に対する防御能力によって特徴付けられる。
【０１６０】
ここに開示するＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドは、そのようなポリペプチドのインビボでの発現により、本発明に従って使用することができる。これは多くは遺伝子療法と呼ばれる。
【０１６１】
（場合によってはベクターに含まれた）核酸を患者の細胞に入れるには、インビボおよびインビトロという主要な２つの方法がある。インビボでの導入においては、核酸は、患者の通常ポリペプチドが必要な部位に直接注入される。例えば、ＴＡＣＩｓポリペプチドコード化核酸は、分かっていればＴＡＣＩｓポリペプチドの合成の部位に、又はＴＡＣＩｓポリペプチドの生物学的活性が必要な部位に、注入される。例えば、ＢＲ３ポリペプチドコード化核酸は、分かっていればＴＡＣＩｓポリペプチドの合成の部位に、又はＢＲ３ポリペプチドの生物学的活性が必要な部位に、注入される。エクスビトロ処置については、患者の細胞を切り離してこれら単離された細胞に核酸を導入し、修飾された細胞を、直接患者に投与するか、又は多孔質膜で被覆して患者に埋め込む（例えば、米国特許第4,892,538号及び同5,283,187号）。
【０１６２】
核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸を、インビトロでの培養細胞細胞に移入されるのか、又はインビボで対象とする宿主の細胞に移入されるかによって変わる。哺乳動物にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。形質導入では、複製欠陥の、組換えウイルス（好ましくはレトロウイルス）粒子を細胞レセプターに接触させ、続いて粒子に含まれた核酸を細胞に導入する。
【０１６３】
現在好ましいとされるインビボ遺伝子移入技術は、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））でのトランスフェクション、及び脂質を主とする系でのトランスフェクション（遺伝子の資質媒介移入に有用な資質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌである。例えば、Tonkinsonら、Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996)を参照のこと）を含む。遺伝子療法への使用に最も好ましいベクターはウイルスであり、中でもアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、またはレトロウイルスである。レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー、又は剤決定要素、又は、代替的に、スプライシング、核ＲＮＡエキスポート、又はメッセンジャーの転写後修飾等その他手段により遺伝子発現を制御するその他要素を含む。加えて、レトロウイルスベクターのようなウイルスベクターは、ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化する遺伝子又はＢＲ３ポリペプチドをコード化する遺伝子の存在下で転写されたとき、それに作用可能に結合し、翻訳開始配列として作用する核酸分子を含む。そのようなベクター構築物は、また、パッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）、又はそれらの一部と、（すでにウイルスベクターに存在するのでなければ）使用するウイルスに適した陽性及び陰性鎖プライマー結合部位とを含む。さらに、そのようなベクターは、典型的に、それが配置されている細胞からのＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの分泌のためのシグナル配列を含む。好ましくは、このためのシグナル配列は哺乳動物のシグナル配列であり、もっとも好ましくはTACIｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの陰性シグナル配列である。場合によっては、ベクター構築物は、ポリアデニル化を志向するシグナル、ならびに１つ以上の制限部位及び翻訳末端配列を含んでよい。例えば、そのようなベクターは、典型的に、５'ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の開始点、及び３'ＬＴＲ又はその一部を含む。カチオン性脂質、ポリリシン、及びデンドリマー等、非ウイルス性のその他のベクターを使用することもできる。
【０１６４】
幾つかの状況では、核酸源に、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンド等の標的細胞を標的とする試薬を供給することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、標的化、及び／又は、例として、特定の細胞型指向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルで内在化を受けるタンパク質に対する抗体、細胞間局在化を標的とし、細胞内半減期を向上させるタンパク質の取り込みの促進のために用いることができる。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wuら, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Andersonら, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、WO93/25673及びその引例も参照のこと。適切な遺伝子療法と、レトロ粒子及び構造タンパク質の作成法については、例えば、米国特許第５６８１７４６号を参照できる。
【０１６５】
本発明は、さらに、哺乳動物細胞におけるＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ，ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩｓ、及び／又はＢＲ３活性を調節する方法を提供する。本本法は、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬとＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ，ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３との相互作用に影響するアンタゴニスト又はアゴニストの所望の量に細胞を接触させることを含む。好ましくは、使用するアンタゴニスト又はアゴニストの量は、各リガンド又は各レセプターの結合及び／又は活性に影響することにより治療効果を上げるのに有効な量である。これは、インビボ又はエクスビボで、例えば、後述の方法及び実施例に示す方法に従って達成することができる。このようなＴＡＬＬ−１アンタゴニスト又はＡＰＲＩＬアンタゴニストにより治療すべき例示的症状又は疾患は、臨床的に免疫疾患と呼ばれる哺乳動物の症状を含み、それは、限定はしないが、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、乾癬、及びループス、又は、癌等その他哺乳動物のＢ細胞が異常に上方制御される病的症状を含む。ＴＡＣＩｓアゴニスト又はＢＲ３アゴニストにより治療すべき例示的症状又は疾患は、免疫不全症及び癌を含む。
【０１６６】
本明細書では、治療法も提供する。例えば、アンタゴニスト又はアゴニストを使用して、ＴＡＬＬ−１関連疾患又はＡＰＲＩＬ関連疾患を有していることが判明しているか、又は疑われる哺乳動物において各リガンド（ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬ）又はレセプター（ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３）を検出することができる。アンタゴニスト又はアゴニスト分子を使用して、例えば、イムノアッセイで試料中のＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬを検出又は定量化することができる。哺乳動物から採取した細胞等の試料を標識したアンタゴニスト又はアゴニストの存在下で培養することができ、試料に結合した症式アンタゴニスト又はアゴニストの検出を行うことができる。そのようなアッセイは多様な臨床アッセイ法を含み、例えばVollerらのImmunoassays（University Park, 1981年）に開示されているもの等、当分野で既知である。
【０１６７】
本方法に使用できるアンタゴニスト及びアゴニストは、限定はされないが、ＴＡＣＩｓ及びＢＲ３レセプターの可溶性形態、ＴＡＣＩｓレセプターイムノアドヘシン及びＢＲ３レセプターイムノアドヘシン、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３を含む融合タンパク質、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３の共有結合敵修飾形態、ＴＡＣＩｓレセプター変異体及びＢＲ３レセプター変異体、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３レセプター抗体、及びＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬ抗体を含む。本明細書では、アンタゴニスト及びアゴニストの形成に利用できる様々な技術を開示する。例えば、ＴＡＣＩｓ及びＢＲ３ポリペプチドの調製方法が上述されている。以下に、ポリペプチドの更なる修飾及びＴＡＣＩｓ及びＢＲ３の抗体を開示する。
【０１６８】
ＴＡＣＩｓレセプター又はＢＲ３レセプターの可溶性形態を、本発明の方法におけるアンタゴニストとして使用してもよい。このようなＴＡＣＩｓ又はＢＲ３の可能性形態は、各レセプターの細胞外ドメインを含みうる、あるいはそれからなりうる（及び各レセプターの膜貫通及び細胞内ドメインを欠い）。ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３の細胞外ドメイン配列それ自身をアンタゴニストとして用いるか、又は以下に記述されるように更に修飾することもできる（イムノグロブリン、エピトープタグ又はロイシンジッパーに融合させるなど）。当業者は、過度の実験を行うことなく、アンタゴニストとして使用されるＴＡＣＩｓ又はＢＲ３の所望の細胞外ドメイン配列を選択することができるであろう。
【０１６９】
ここに開示する方法におけるイムノアドヘシン分子の使用についてさらに考慮する。ＴＡＣＩｓレセプターイムノアドヘシンは、種々の型のＴＡＣＩｓレセプター、例えば、細胞外ドメイン（ＥＣＤ)配列又はＥＣＤ配列の断片を含むレセプターの可溶性形態ならびに完全長ポリペプチドを含んでもよい。一実施態様では、この分子は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域を有するＴＡＣＩｓレセプターの融合を含むことができる。イムノアドヘシンの二価の形態については、そのような融合は、IgG分子のFc領域に対して行われてもよい。Ig融合は、好ましくは、Ig分子の少なくとも１の可変領域に代えて、レセプターポリペプチドの可溶性形態（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型）を置換することを含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリンの融合は、IgG1分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。免疫グロブリン融合体の産生については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第5,428,130号、及びChamowら, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
【０１７０】
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、アドヘシンの結合ドメイン(例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ＥＣＤ))を免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域と組み合わせるものである。通常は、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコード化する核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコード化する核酸にＣ末端的に融合させるが、Ｎ末端融合もまた可能である。
【０１７１】
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのＦｃ領域のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域にＮ末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
【０１７２】
好ましい実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンG1 (IgG1)のFc領域のN末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、IgGのFcを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はIgG重鎖の(ａ)ヒンジ領域及びCH2及びCH3又は(ｂ)CH1、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインに融合される。
【０１７３】
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般に、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。ＩｇＧグロブリン、そして時折ＩｇＧグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
【０１７４】
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例を以下に概略的に模式化する： 
(ａ)ＡＣＬ-ＡＣＬ； 
(ｂ)ＡＣＨ-(ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)； 
(ｃ)ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,ＶＬＣＬ-ＡＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)； 
(ｄ)ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ,又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)； 
(ｅ)ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；及び
(ｆ)(Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)２；
ここで、各Ａは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し； 
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
【０１７５】
簡潔にする目的で、上記の構造は単に重要な特徴のみをを示す；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)ドメイン又は他のドメインを示しておらず、ジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子においてそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
【０１７６】
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は、免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の３’末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間で融合される。同様な作成物がHoogenboomら, Mol. Immunol. 28:1027-1037(1991)によって報告されている。
【０１７７】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖は、アドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されて存在してもよい。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコード化するＤＮＡは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコード化するＤＮＡと同時発現される。分泌時に雑種重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
【０１７８】
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンｃＤＮＡ配列にインフレームでアドヘシン部分をコード化するｃＤＮＡ配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffoら,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovicら,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現にＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコード化するｃＤＮＡは、脾臓又は抹消血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーからの刊行された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)法により単離することができる。「アドヘシン」をコード化するｃＤＮＡとイムノアドヘシンの免疫グロブリン部分が、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
【０１７９】
このような可溶性のＥＣＤ配列の例には、図５Ｂに示すＴＡＣＩｓ配列のアミノ酸１〜１１９を有するポリペプチドが含まれる。ＴＡＣＩｓレセプターイムノアドヘシンは従来技術のいずれかの方法に従って作ることができる。
【０１８０】
同様にして、ＢＲ３レセプターイムノアドヘシンを構築することができる。ＢＲ３イムノアドヘシンの構築に使用できる可溶性ＥＣＤ配列の例には、図６Ｂに示すＢＲ３配列のアミノ酸１〜７７、又は２〜６２を有するポリペプチドが含まれうる。
【０１８１】
別の実施形態では、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法で、レセプターポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへ結合させることにより、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３レセプターを共有結合的に修飾できる。このようなpegylated形態のＴＡＣＩｓ又はＢＲ３レセプターは、従来技術を使用して調製できる。
【０１８２】
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手（例えば、ロイシンジッパーが融合するか、連結する配列又は分子）の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こす、ロイシンリッチ配列を意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulzら, Science 240:1759 (1988); 米国特許第5,716,805号；ＷＯ９４／１０３０８；Hoppeら, FEBS Letters 344:1991 (1994); Maniatisら, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパーをＴＡＣＩｓ又はＢＲ３セプター分子の５'又は３'末端に融合しうることを理解するであろう。
【０１８３】
また、本発明のＴＡＣＩｓ又はＢＲ３ポリペプチドは、別の、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列にレセプターポリペプチドを融合することによりキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。好ましくは、そのような異種ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとのＴＡＣＩｓ又はＢＲ３レセプターの融合を含む。エピトープタグは、一般的にレセプターポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。そのようなレセプターのエピトープタグを付された形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出できる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって該レセプターを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチドとその各抗体は従来から良く知られている。例として、ポリ−ヒスチジン（poly-His）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu ＨＡタグポリペプチドとその抗体１２ＣＡ５（Fieldら, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)）；ｃ−ｍｙｃタグとそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体（Evanら, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)）；及び単純ヘルペスウィルス糖タンパクＤ（ｇＤ）タグとその抗体（Paborskyら, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)）が挙げられる。他のタグポリペプチドは、Ｆｌａｇ−ペプチド（Hoppら, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)）；ＫＴ３エピトープペプチド（Martinら, Science, 255:192-194 (1992)）；αチューブリンエピトープペプチド（Skinnerら, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)）；及びＴ７遺伝子１０タンパクペプチドタグ（Lutz-Freyermuthら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)）が含まれる。
【０１８４】
また、抗ＴＡＣＩｓレセプター抗体、又は抗ＢＲ３レセプター抗体が、今回開示される方法において利用できることも考慮される。そのような分子の例には、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬのＴＡＣＩｓ又はＢＲ３レセプターに対する結合を好適に阻害し得る中和又はブロック抗体が含まれる。抗ＴＡＣＩｓ抗体、又は抗ＢＲ３抗体はモノクローナル抗体でもよい。
【０１８５】
モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか、あるいは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【０１８６】
免疫剤は、典型的にはＴＡＣＩｓ又はＢＲ３ポリペプチド（あるいはＴＡＣＩｓ ＥＣＤ又はＢＲ３ ＥＣＤ）、又はそれらの融合タンパク質、例えばＴＡＣＩｓ ＥＣＤ−ＩｇＧ融合タンパク質を含む。免疫剤は、代替的に、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬのＴＡＣＩｓ又はＢＲ３に対する結合に関与する１以上のアミノ酸を有するＴＡＣＩｓ又はＢＲ３の断片又は一部を含んでよい。好適な実施形態では、免疫剤はＩｇＧ配列に融合したＴＡＣＩｓ又はＢＲ３の細胞外ドメイン配列を含む。
【０１８７】
一般に、ヒト由来の細胞が望まれる場合には、末梢血リンパ球(「ＰＢＬｓ」)が使用され、非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化株化細胞は、通常、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いている場合、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１８８】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
【０１８９】
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【０１９０】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる（Goding, 上掲）。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
【０１９１】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０１９２】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコード化するＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコード化する遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えば大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコーディング配列を置換することにより（Morrisonら, Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984)）、又は免疫グロブリンコーディング配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。
【０１９３】
一般に、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインを置換するか、又は本発明の抗体の抗原結合部位の可変ドメインを置換し、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを有するキメラ二価抗体を形成する。
【０１９４】
また、キメラ抗体又はハイブリッド抗体を、架橋剤の使用を含む合成タンパク質化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができる。例えば、ジスルフィド交換反応の使用、又はチオエーテル結合の形成により、免疫毒性を構築できる。このための適切な試薬の例には、イミノチオレート（iminothiolate）及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート（methyl-4-mercaptobutyrimidate）が含まれる。
【０１９５】
また、一本鎖Fv断片は、例えばIliadesら, FEBS Letters, 409:437-441 (1997)に記載されているようにして生成できる。様々なリンカーを使用したこのような一本鎖断片の結合は、Korttら, Protein Engineering, 10:423-433 (1997)に記載されている。組換え生産の及び抗体の取り扱いに関する様々な技術も従来技術に既知である。当業者が一般に利用するそのような技術の例を以下に詳述する。
【０１９６】
(i)ヒト化抗体
一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、基本的に、ウィンター(Winter)及び共同研究者（Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986年)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988年)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988年)）の方法に従って、齧歯類のＣＤＲｓ又はＣＤＲｓ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。
【０１９７】
よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１９８】
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析法によりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の予測される三次元立体配座構造を図示し、ディスプレイするコンピュータプログラムは入手可能である。これらのディスプレイを見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の見込まれる役割の分析、すなわち候補免疫グログリンのその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をコンセンサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、CDR残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１９９】
(ii)ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫の細胞系は、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984年), 及びBrodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987年)に記載されている。
【０２００】
内在性の免疫グロブリン産生がない状態で、免疫化によりヒト抗体のレパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の移入は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551-255 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993)を参照のこと。
【０２０１】
Mendezら(Nature Genetics 15: 146-156 （1997年）)は、この技術をさらに改良し、抗原を投与すると親和性の高い完全ヒト抗体を生成する「ゼノマウスII（Xenomouse II）」と称する系列のトランスジェニックマウスを生成した。これは、上述のように、内因性JHセグメントに欠陥を有するマウスに、メガベースのヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の生殖細胞系を取り込むことにより達成された。ゼノマウスIIは、約66VH遺伝子、完全なDH及びJH領域および３つの異なる定常領域（μ、δおよびχ）を含む1,020kbのヒト重鎖遺伝子座を有し、また32Vκ遺伝子、JκセグメントおよびCκ遺伝子を含む800kbのヒトκ遺伝子座を有する。これらのマウスに生成された抗体は、遺伝子の再編成、構築、およびレパートリーを含め、全ての面でヒトに見られる抗体に非常に類似している。ヒト抗体は、好ましくは、マウス遺伝子座における遺伝子再編成を抑制する内因性JHセグメントの欠損により、内因性抗体全体にわたって発現する。
【０２０２】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348：552-553, 1990年)を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を生産させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子でクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択によっても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコード化する遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991年)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーを構築可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。自然な免疫応答において、抗体遺伝子は高い率で突然変異を蓄積する（体細胞過剰変異）。導入された変化の一部は高い親和性を提供し、親和性の高い表面免疫グロブリンを示すＢ細胞は、その後の抗原曝露の間に優先的に複製され、分化される。このような自然の工程を、「チェーンシャフリング」として知られる技術(Marks他, Bio/Technol. 10, 779-783, 1992年)を使用することにより模倣することができる。この方法では、重鎖Ｖ領域遺伝子と軽鎖Ｖ領域遺伝子を、順に、非免疫化ドナーから取得したＶドメイン遺伝子の自然に生じる変異体（レパートリー）のレパートリーで置換することにより、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を改善することができる。この技術により、nM範囲での親和性を有する抗体および抗体断片の生産が可能である。非常に大きなファージ抗体のレパートリー（「マザーオブオール ライブラリー（the Mother-of-all libraries）」とも呼ばれる）を作る方法が、WaterhouseらによるNucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993年)に開示されている。また、遺伝子シャフリングは、元になっている齧歯類の抗体と類似した親和性および特性をヒト抗体が有している場合、齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」と呼ばれるこの方法により、ファージディスプレイ技術により得られた齧歯類抗体の重鎖Ｖドメイン遺伝子と軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、齧歯類−ヒトキメラを作成する。抗原を選択することにより、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変部が単離される、つまり、エピトープがパートナーの選択をつかさどる（インプリントする）。残りの齧歯類Ｖドメインを置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒ���抗体が得られる（1993年4月1日公開のPCT特許出願WO 93/06213を参照）。伝統的なCDR移植による齧歯類抗体のヒト化と異なり、この技術により、齧歯類起源のフレームワークまたはCDR残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
【０２０３】
下記に詳述するように、本発明の抗体は、随意で、一量体、抗体、二量体抗体、ならびに抗体の多価形態を含んでよい。当業者は、当分野で既知の技術により、そのような二量体または多価形態を構築することができる。一価抗体を調製する方法もまた、当技術分野で周知である。例えば、一方法では、免疫グロブリン軽鎖と修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般にFc領域の任意の点で切断され、重鎖の架橋が形成されることが防止される。あるいは、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか、または削除し、よって架橋結合を防止する。
【０２０４】
(iii)二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＴＡＣＩｓ又はＢＲ３レセプターに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくはレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。例えば、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３レセプターおよび別のアポトーシス／シグナル伝達レセプターに特異的に結合する二重特異性抗体は、本発明に含まれる。
【０２０５】
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の発現に基づく（Millstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983年)）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成されるが、幾分扱いにくく、生産性が低い。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTrauneckerら, EMBO,10:3655-3659 (1991年)に開示されている。
【０２０６】
さらに好ましい別の方法により、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には、軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコード化するＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所最適な収率をもたらす実施態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性がもたらされる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率が発現が高収率をもたらすとき、又はその比率の影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコーディング配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、一方のアームに第一の結合特異性を、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する) を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖からなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、1994年3月3日公開の国際公開第94/04690号に開示されている。
【０２０７】
二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０２０８】
(iv)ヘテロ抱合抗体
ヘテロ抱合抗体も本発明の範囲に含まれる。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)及びＨＩＶ感染の治療のため（WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089)に提案されている。ヘテロ抱合抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して調製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において既知であり、複数の架橋技術と共に、米国特許第4,676,980号に開示されている。
【０２０９】
(v)抗体断片
一部の実施態様においては、抗ＴＡＣＩｓ抗体又は抗ＢＲ３抗体（マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び抗体変異体を含む）は抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されている(例えば、Morimotoら, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985年)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992年))。他の実施態様では、ロイシンジッパーGCN4を使用してF(ab')2を形成し、F(ab') 2分子の構築を促進する。別の方法では、組換え宿主細胞の培地からFv、FabまたはF(ab') 2断片を直接分離することができる。抗体断片を生産するための多くの技術は当業者には明らかである。例えば、パパインを使用して消化を行うことができる。パパイン消化の例は、1994年12月22日公開のWO94/29348および米国特許第4,342,566号に開示されている。抗体のパパイン消化は、通常、Fab断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。各Fab断片は単一の抗原結合部位、および残存性Fc断片を持つ。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を持ち、抗原に架橋結合する能力のあるF(ab')２が生成される。
【０２１０】
抗原消化で生成されるFab断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（CH1）も含む。Fab’断片は、それに加えて、抗体ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含む、重鎖のCH 1ドメインのカルボキシ末端に少数の残基を持つ点においてFab断片と異なる。本発明では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つFab'として、ここではFab'-SHと記載する。F(ab')２抗体断片は、もともと間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生成されたものである。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【０２１１】
抗体をその定常領域の保存位置でグリコシル化する（JefferisおよびLund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997年; WrightおよびMorrison, TibTECH 15:26-32, 1997年）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Boydら, Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996年; WittweおよびHoward, Biochem. 29:4175-4180, 1990年)、および、糖タンパク質の高次構造及び提示される3次元表面に影響しうる糖タンパク質の部分同士の分子内相互作用（HefferisおよびLund, 上掲; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996年）に作用する。オリゴ糖はまた、特異的な認識構造に基づいて任意の糖タンパク質を特定の分子に標的化するのに役立つ。例えば、アガラクトシル化IgGにおいて、オリゴ糖部分はCH2内空間の外に「とび出し(flip)」、末端Ｎ−アセチルグリコサミン残基がマンノース結合タンパク質に結合できるようになることが報告されている（Malhotraら, Nature Med. 1:237-243, 1995年）。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞において、オリゴ糖のグリコペプチダーゼによるCAMPATH-1H（ヒトリンパ球のCDw52抗原を認識する組換えヒト化マウスモノクローナルIgG1抗体）からの除去を実行した結果、補体媒介性溶解（CMCL）が完全に低減したが（Boydら, Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996年)、ノイラミニダーゼを使用してシアル酸残基を選択的に除去した結果、DMCLの低減は見られなかった。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性の細胞の細胞障害性（ADCC）に影響することが報告されている。特に、バイセクティングGlcNAcの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（GnTIII）のテトラサイクリン制御発現を持つCHO細胞で、ADCC活性が向上したことが報告されている（Umanaら, Mature Biotech. 17:176-180, 1999年）。  
【０２１２】
抗体のグリコシル化変異体は、抗体のグリコシル化のパターンが変更された変異体である。変更するとは、抗体に見られる１以上の炭水化物部分を除去すること、抗体に１以上の炭水化物部分を加えること、グリコシル化の組成（グリコシル化パターン）、グリコシル化の範囲、その他を変更すること等を意味する。グリコシル化変異体は、例えば、抗体をコード化する核酸配列について、１以上のグリコシル化部位の、除去、変更、および/または付加を行うことにより調製することができる。
【０２１３】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ−結合かＯ−結合である。Ｎ−結合とは、アウパラギン残基の側鎖への炭水化物成分の付与を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸）は、炭水化物成分のアスパラギン側鎖への酵素的付与の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的グリコシル化部位が創造される。Ｏ−結合のグリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうち１つの付着を指す。５−ヒロドキシプロリン、または５−ヒドロキシリシンを使用してもよい。
【０２１４】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ−結合グリコシル化部位について）上述のトリペプチド配列の１または複数を有するようにアミノ酸配列を変更することにより常套的に達成される。変更は、また、（Ｏ−結合グリコシル化部位について）元の抗体の配列に対して１以上のセリンまたはトレオニン残基を付加または置換することにより行ってもよい。
【０２１５】
抗体のグリコシル化（グリコシル化パターンを含む）は、内在するヌクレオチド配列を変更することなく変更可能である。グリコシル化は抗体を発現するために使用される宿主細胞に大きく依存する。潜在的治療法としての、組換え糖タンパク質の発現に使用される細胞の種類、例えば抗体が、まれに天然細胞であることから、抗体のグリコシル化パターンは大きく変化することが予想される（例えばHseら, J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997年参照）。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え生産の間のグリコシル化に影響を与える因子には、成長形態、媒地、製剤、培養密度、酸素添加、pH、精製スキームなどが含まれる。オリゴ等製造に関わるある種の酵素の導入又は過剰発現を含む、特定の宿主生物においてなされたグリコシル化パターンを変えるための様々な方法が提案されている（米国特許第5,047,335号、米国特許第5,510,261号および米国特許第5,278,299号）。グリコシル化、または特定の種類のグリコシル化は、例えばエンドグリコシダーゼＨ（Endo H）の使用により、糖タンパク質から酵素学的に除去することができる。加えて、組換え宿主細胞を遺伝学的に設計することができ、例えば多糖類の特定種のプロセシングにおいて欠損をつくることができる。これら及び同様の技術は当技術分野において既知である。
【０２１６】
抗体のグリコシル化構造は、レクチンクロマトグラフィ、NMR、質量分析、HPLC、GPC、単糖成分分析、連続酵素消化、および高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィを使用して電荷に基づきオリゴ糖を分離するHPAEC-PADなどの、炭水化物分析を行う従来技術により容易に分析できる。分析的な目的のためにオリゴ糖を遊離させる方法も知られており、それらには、限定はしないが、酵素的処理（通常ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ Ｆ／エンド−β−ガラクトシダーゼを使用して行う）、過酷なアルカリ環境を使用して主にＯ−結合構造を遊離する除去、および水ヒドラジンを使用してＮ−結合とＯ−結合両方のオリゴ糖を遊離させる無化学的方法が含まれる。
【０２１７】
三重特異性抗体も本発明の範囲に含まれる。このような抗体は、例えばIliadesら（上掲）及びKorttら（上掲）により詳述されている。
【０２１８】
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、WO81/01145号を参照)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素又は細胞障害剤（例えば毒素分子）に抗体をコンジュゲートさせることにより、修飾することができる。例えばWO88/07378及び米国特許第4,975,278号を参照されたい。この技術は、「抗体依存酵素媒介プロドラッグ療法」（ＡＤＥＰＴ）とも呼ばれる。
【０２１９】
ADEPTに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；カスパーゼ−３などのカスパーゼ；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としても公知の酵素活性を有する抗体を、本発明のプロドラッグを遊離の活性薬剤に転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【０２２０】
本発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えばヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えDNA技術を使用して作成することができる(Neubergerら, Nature 312:604-608(1984))。
【０２２１】
さらなる抗体の修飾が考察されている。例えば、抗体は種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに結合してもよい。また抗体は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル(例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）にコロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., 編(1980)に開示されている。抗体の血清半減期を増大させるために、米国特許第5,739,277号に記載されているように、抗体(特に抗体断片）へサルベージレセプター結合エピトープを組み込んでもよい。ここで使用される「サルベージレセプター結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボでの血清半減期を増加させる原因となるＩｇＧ分子(例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを称する。
【０２２２】
Ｄ．アッセイ法
リガンド／レセプター結合の研究は任意の周知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイ等で行われうる。診断方法として細胞ベースアッセイ及び動物モデルを用いて、ここに同定するリガンドとレセプターの相互作用、及びここで言及される疾患と疾病の進行と病因をさらに理解することができる。
【０２２３】
一つの方法では、哺乳動物細胞に本発明のリガンド又はレセプターを形質移入し、これらのアゴニスト又はアンタゴニストの、結合又は活性化を刺激又は阻害する能力を分析する。適当な細胞に所望の遺伝子を形質移入し、活性をモニターすることができる。このような形質移入細胞系は、次いで、アンタゴニスト又はアゴニストの、例えばＢ細胞増殖又はＩｇ分泌を阻害又は刺激する能力を試験するために使用できる。ここに同定した遺伝子のコーディング配列を形質移入した細胞は、さらに、免疫関連疾患又は癌の治療用の候補薬の同定に使用できる。
【０２２４】
さらに、トランスジェニック動物から得られた初代培養を細胞ベースのアッセイに使用することができる。トランスジェニック動物から一定の細胞系を誘導するための技術は当該技術においてよく知られている。（例えばSmallら, Mol. Cell. Biol., 5：642-648(1985)を参照されたい。）
【０２２５】
一つの適切な細胞ベースアッセイは、エピトープのタグを付与したリガンド（例えばＡＰ又はＦｌａｇ）を各レセプターを有するか発現する細胞に付与し、（予想アンタゴニストの存在下、又は不在下で）ＦＡＣＳ染色により抗タグ抗体との結合を分析することである。別のアッセイでは、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬにより誘発されたＢ細胞の増殖を阻害するアンタゴニストの能力をアッセイする。予想アンタゴニストの存在下、又は不在下において、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬでＢ細胞又はＢ細胞系を培養し、Ｂ細胞の増殖を３Ｈ−チミジン混和又は細胞番号により測定することができる。
【０２２６】
インビトロでの細胞ベースアッセイの結果は、インビボでの動物モデルを使用してさらに検証することができる。様々な周知の動物モデルを使用して、例えば免疫関連疾患又は癌の病因と進行における、ここに同定されるアゴニスト及びアンタゴニストの役割を理解し、候補治療剤の効果を試験することができる。これらのモデルのインビボ性質により、ヒト患者における反応を特に予測できる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え(トランスジェニック)動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植等により、細胞を同系マウスに導入することにより作成される。
【０２２７】
例えば、移植変対宿主疾患の動物モデルが既知である。移植片対宿主疾患は、免疫適格細胞が免疫抑制され又は耐性のある患者に移植された場合に生じる。ドナー細胞は宿主抗原を認識しそれに反応する。反応は生命に危険性のある重度の炎症から、下痢や体重の減少等の軽度のケースまで多様である。移植片対宿主疾患モデルは、ＭＨＣ抗原及び少量の移植抗原に対するＴ細胞反応性を評価する手段を提供する。適切な手順はCurrent Protocols in Immunology, unit4.3.に詳細に記載されている。
【０２２８】
皮膚同種移植片拒絶のための動物モデルは、Ｔ細胞がインビボで組織の破壊を媒介する能力を試験する手段であり、抗ウイルス及び腫瘍免疫性におけるそれらの役割の指標である。最も一般的で容認されているモデルではマウスの尾の皮膚の移植片が使用される。繰り返し実験により、皮膚同種移植片拒絶がＴ細胞、ヘルパーＴ細胞及びキラー-エフェクターＴ細胞により媒介されるが、抗体では媒介されないことが分かった。（Auchincloss, H. Jr.及びSachs, D.H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W.E.Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992。）適切な手順はCurrent Protocols in Immunology, unit4.4.に詳細に記載されている。本発明の組成物の試験に使用可能な他の移植拒絶モデルは、Tanabe, M.ら, Transplantation(1994)58：23及びTinubu, S.A.ら,  J. Immunol.(1994)4330-4338により記載されている同種心臓移植片モデルである。
【０２２９】
遅発型過敏症の動物モデルは、細胞媒介免疫機能のアッセイをまた提供する。遅発型過敏反応は、抗原投与後一定時間が経過するまでピークに達しない炎症により特徴付けられるＴ細胞媒介インビボ免疫反応である。これらの反応はまた組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症(ＭＳ)及び実験的自己免疫脳脊髄炎(ＥＡＥ、ＭＳ用のモデル)で生じる。適切な手順はCurrent Protocols in Immunology, unit4.5.に詳細に記載されている。
【０２３０】
関節炎の動物モデルは、コラーゲン-誘発関節炎である。このモデルはヒト自己免疫慢性リウマチ様関節炎の臨床的、組織的及び免疫学的特徴を共有し、ヒト自己免疫関節炎の許容可能なモデルである。マウス及びラットモデルは滑膜炎、軟骨の腐食及び軟骨下(subchondral)骨により特徴付けられる。本発明の化合物は、上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit15.5.に記載されているプロトコールを使用し、自己免疫関節炎に対する活性を試験することができる。また、Issekutz, A.C.ら, Immunology(1996)88：569に記載されているＣＤ１８及びＶＬＡ-４インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用するモデルも参照のこと。
【０２３１】
抗原誘発性気道反応亢進、肺好球菌増加症及び炎症が卵白アルブミンで動物を感作させ、ついで、エアゾールにより同じタンパク質を動物を暴露することで誘発される喘息モデルが記載されている。いくつかの動物モデル(モルモット、ラット、非ヒト霊長類)では、エアゾール抗原への暴露時にヒトにアトピー性喘息に類似した徴候が示された。マウスモデルはヒト喘息の多くの特徴を有している。喘息治療における活性と有効性について本発明の組成物を試験するのに適した手順は、Wolyniec, W.W.ら, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.(1998)18：777とそこに引用されている文献に記載されている。
【０２３２】
さらに、本発明の組成物は乾癬様疾患の動物モデルにおいて試験することができる。本発明の化合物は、Schon. M.P.ら, Nat. Med.(1997)3：183に記載されているscid／scidマウスモデルにおいて試験することができ、そのモデルではマウスは乾癬に類似した組織病理学的皮膚病巣を示す。他の適切なモデルはNickoloff, B.J.ら, Am. J. Path.(1995)146：580に記載されているようにして調製されたヒトskin／scidマウスキメラである。
【０２３３】
候補治療用組成物の抗癌活性を試験するために様々な動物モデルが周知である。これらには、胸腺欠損ヌードマウス又はscid/scidマウスにヒト腫瘍を異種移植したもの、又はｐ５３ノックアウトマウス等の遺伝子的マウス腫瘍モデルが含まれる。
【０２３４】
組換え(トランスジェニック)動物モデルは、ここで同定された分子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、関心ある動物のゲノムに導入することにより加工できる。トランスジェニック操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、前核マイクロインジェクション(Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191号)；胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子の転移(例えば、Van der Puttenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985])；胚性肝細胞での遺伝子標的化(Thompsonら, Cell 56, 313-321 [1989])；胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983])；精子媒介遺伝子転移(Lavitranoら, Cell 57, 717-73 [1989])を含む。概説のため、例えば、米国特許第4,736,866号を参照のこと。
【０２３５】
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部にのみ導入遺伝子を有するもの(「モザイク動物」)を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Laskoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。
【０２３６】
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によって監視できる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学等の技術を用いて分析できる。動物は、さらに、特定の組織中への免疫細胞の湿潤を測定するために例えば組織学的検査により、免疫疾患の病原の徴候を検査してもよいし、癌性又は悪性組織の有無について検査してもよい。
【０２３７】
あるいは、動物の胚性細胞に導入された同ポロペプチドをコード化する変更ゲノムＤＮＡと、ポリペプチドをコード化する内在性遺伝子との間の相同的組換えの結果として、ここに同定されるポリペプチドをコード化する欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、特定のポリペプチドをコード化するｃＤＮＡは、確立された技術に従い、該ポリペプチドをコード化するゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特定のポリペプチドをコード化するゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコード化する遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは、数キロベースの無変化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を含む（例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと）。ベクターは胚性幹細胞に(例えば電気穿孔法等によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する（例えば、Liら, Cell, 69:915(1992)参照）。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する（例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照）。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えば、ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【０２３８】
Ｅ．製剤
ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３分子、又は本明細書に記載のアンタゴニスト又はアゴニストは、任意で担体に使用される。適切な担体及びその製剤はRemington’s Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mark Publishing Co., Osol等編に記載されている。典型的には、該製剤に等張性を付与するために、適量の医薬的に許容可能な塩を担体に使用する。担体の例としては、生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液が挙げられる。担体のｐＨは、好ましくは約５ないし８、より好ましくは約７．４ないし７．８である。例えば投与される活性物質の投与経路及び濃度に応じて、特定の担体がより好適であることは、当業者には明らかであろう。担体は凍結乾燥製剤又は水溶液の形態であってよい。
【０２３９】
好ましくは、許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で細胞及び／又は哺乳動物にとって無毒であり、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸塩等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEENTM、PLURONICSTM及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
該製剤はまた、処置される特定の適応に必要な一以上の活性化合物も含んでよく、好適にはこれらの化合物は互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する。
【０２４０】
ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３、又は本明細書に記載のアンタゴニスト又はアゴニストは、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル、及びポリ-（メチルメタシラート）マイクロカプセルに、それぞれコロイド状薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマイクロエマルションで、内包されてもよい。こういった技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌であるべきである。これは、除菌膜でろ過することで容易に達成される。
【０２４１】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、活性物質を含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２-ヒドロキシエチルメタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号））、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUＴＡＣＩＳポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドN DEPOTTM（乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリ-Ｄ-（-）-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。
【０２４２】
Ｆ．治療法
本明細書に記載の分子は、例えば免疫関連の疾患又は癌といった様々な病的状態の処置に有用である。これらの状態は、例えば本明細書に記載のアンタゴニスト又はアゴニストを一又は複数投与して哺乳動物のＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３に関連する選択された活性を刺激又は抑制することによって処置できる。
哺乳動物における本明細書に記載される様々な病的状態の診断は、熟練医師によりなされうる。診断技術は、例えば哺乳動物における癌や免疫関連の疾患の診断又は発見が可能な技術分野のものが利用できる。例えば癌は、限定されないが触診、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲ等を含む技術により確認されうる。免疫関連の疾患もまた容易に確認できる。全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心となるメディエータは、自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産生と、それに続く免疫介在性炎症の発生である。腎臓、肺、骨格筋系、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む多数の器官及び系が臨床的に影響を受ける。
【０２４３】
リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、主に複数の関節の滑膜に関連する慢性全身性自己免疫炎症疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体が産生され、その結果、滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成されることに関連する。関節中のこれらの複合体は、滑膜中へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発し；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば、関節腔／液でもしかりである。冒される組織は主に関節で、多くの場合対称的なパターンをとる。しかしながら、関節外疾患も主に２つの形態で生じる。一形態は進行中の進行性関節疾患を伴う関節外病変の発生であり、典型的には肺線維症、血管炎、及び皮膚潰瘍の病変である。関節外疾患の第二の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、これは、ＲＡ疾患過程の末期、時には関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少症、血小板減少症及び脾腫の存在に関与する。これには、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う複数の器官での血管炎が付随しうる。多くの場合、患者の冒されている関節を覆う皮下組織ではリウマチ様小結節が発生し；その小結節は、末期には混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死中心部（necrotic centers）を有する。ＲＡにおいて生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６歳未満で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子が陽性である患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は３つの主要なカテゴリー：少数関節（pauciarticular）、多関節及び全身性に細分類される。関節炎は重症となりえ、典型的には破壊的であり、関節強直症及び遅延成長の原因となる。他の徴候には慢性前部ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれうる。
【０２４４】
脊椎関節症は、いくつかの共通した臨床的特徴と、ＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子産物の発現と共通の関連性を持つ疾患のグループである。該疾患には：強直性脊椎炎、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。顕著な特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；炎症非対称性関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７（クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ遺伝子座にある血清学的に定義された対立遺伝子）との関連；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導に対する鍵として最も関連があるとされる細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球で、クラスＩ ＭＨＣ分子により提示される抗原を標的とする細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現された外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７に対して反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原性エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋ Ｔ細胞の反応を誘発すると仮定されている。
全身性硬化症（強皮症）の病因はよく知られていない。この疾患の顕著な特徴は皮膚の硬結であり；これは活性な炎症プロセスにより誘発されると思われる。強皮症は局部的又は全身性であり：血管病変が共通しており、微小血管系における内皮細胞傷害が全身性硬化症の発生における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準が、皮膚病変における単核細胞浸潤の存在と、多くの患者における抗細胞核抗体の存在によって導かれる。多くの場合、ＩＣＡＭ-１が皮膚病変の線維芽細胞の細胞表面でアップレギュレーションされ、これらの細胞とのＴ細胞の相互作用が疾患の病因においてある役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：異常なぜん動／運動性を引き起こす平滑筋萎縮症及び線維症；腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖；骨格筋：萎縮、間質性線維症；炎症；肺：間質性肺炎及び間質性線維症；及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
【０２４５】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉傷害／炎症は多くの場合対照的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連する。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分、タンパク質及びＲＮＡに対して産生されその機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫介在性炎症と、それに続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患に関連するか又はそれを伴う場合がある。この疾患は、双方とも小さいＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する自己抗体産生に関連している。病変は乾性角結膜炎、口内乾燥症を引き起こし、胆汁性硬変、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病を含む他の徴候又は関連を伴う。
全身性血管炎は、一次病変が炎症で、続いて血管が損傷を受け、結果として冒された脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、いくつかのケースでは最終的な末端器官機能障害になるといった疾患である。また血管炎症候群（vasculitides）は、他の免疫炎症介在性疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の生成に関連した疾患等の続発症として又は二次病変として生じる場合がある。原発性全身性血管炎症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節（polyarteritis nodosa）、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症、多脈管炎；ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症；及び巨細胞動脈炎が含まれる。その他の血管炎症候群には：粘膜皮膚リンパ節症候群（ＭＬＮＳ又は川崎病）、隔離されたＣＮＳ血管炎、ベヘット（Behet's）病、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）及び皮膚壊死性細静脈炎（venulitis）が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の発病メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性のいずれか又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
サルコイドーシスは、体内のほとんど全ての組織中における類上皮細胞肉芽腫の存在を特徴とする、病因がよく知られていない病状であり；肺の関与が最も一般的である。病因は疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞型より放出される局部的又は全身的活性産物の放出の結果として慢性続発症が生じる。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、及び発作性夜間血色素尿を含む自己免疫溶性血性貧血は、赤血球（場合によっては血小板も含む他の血液細胞）表面で発現した抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体介在性溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-介在性メカニズムを介した、その抗体被覆細胞の除去を反映するものである。
【０２４６】
他の臨床的環境における血小板減少性紫斑病及び免疫介在性血小板減少症を含む自己免疫性血小板減少症では、抗体又は補体が血小板に結合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ-レセプター-介在性メカニズムにより除去される結果として、血小板破壊／除去が生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、及び萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に存在し多くの場合甲状腺に特異的なタンパク質と反応する抗体の産生を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。自然のモデル：ラット（ＢＵＦ及びＢＢラット）及びチキン（肥満チキン種）；誘導性モデル：サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）のいずれかでの動物の免疫化を含む実験用モデルが存在する。
Ｉ型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は膵臓ランゲルハンス島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インスリンレセプター又はインスリンに対する抗体は、インスリン-非反応性の表現型をつくりだすことができる。
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫介在性腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産生される結果として直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応性である、腎臓中の抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果として間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞介在性傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の形成をもたらす他の免疫介在性疾患も、間接的続発症として免疫介在性腎疾患を誘発しうる。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として、器官機能を損ない、場合によっては腎臓機能不全に進行する、病変発生を腎組織に生じさせる／誘発する炎症反応が生じる。体液及び細胞免疫メカニズムの双方が病変の原因に関与しうる。
【０２４７】
多発性硬化症；特発性脱随性多発神経障害又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱随性多発神経障害を含む中枢及び末梢神経系の脱髄疾患は、自己免疫に原因を有し、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に引き起こされる損傷の結果として神経脱髄を生じると考えられている。ＭＳにおいては、疾患の誘発及び進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。病変は優勢なＴ細胞介在性小膠細胞の湿潤と、浸潤しているマクロファージを含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は病変における優勢な細胞型である。オリゴデンドロサイトの細胞死とそれに続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Ｔリンパ球により推進されていると思われる。
好球性肺炎；特発性肺線維症及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連しうる。その反応の阻害は治療的に有益であろう。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫介在性皮膚疾患は自己抗体により媒介され、その発病はＴリンパ球依存性である。
乾癬はＴリンパ球介在性炎症疾患である。病変にはＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴリンパ球依存性である。これらの疾患はTリンパ球誘発性炎症、ＩｇＥ媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
移植片拒絶及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を含む移植関連疾患はＴリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
免疫及び／又は炎症反応による介入が有益である他の疾患は、感染症であり、限定するものではないが、例えばウイルス感染（限定するものではないが、例えばＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎）、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染、（ＭＬＲを刺激する分子（又は誘導体／アゴニスト）を治療に利用して感染要因に対する免疫反応を増強することができる）、免疫欠損疾患（ＭＬＲを刺激する分子／誘導体／アゴニストを治療に利用して遺伝性、後天性、感染誘発性（例えばＨＩＶ感染のような）、又は医原性（即ち、化学療法からのような）免疫欠損の症状に対する免疫反応を増強することができる）、及び異常増殖を含む。
【０２４８】
アンタゴニスト又はアゴニストは、周知の方法に従い、ボーラスとして又は所定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路等により投与することができる。任意で、投与は様々な商業的に入手可能な装置を用いたミニポンプ注入により行うこともできる。当該技術分野で説明される遺伝子治療技術を用いたアンタゴニスト又はアゴニストも利用されうる。
アンタゴニスト又はアゴニストの有効な用量及び投与スケジュールは経験的に決定でき、こういった決定は当該技術分野の範囲内にある。一又は複数の用量が採用されうる。現在、単独で使用されるアンタゴニスト又はアゴニストの有効な用量又は総量は、１日あたりで、体重１kgあたり約１μgないし１００mg以上であると考えられている。用量の種間拡大縮小は、当該技術分野で周知の方法、例えばMordentiら, Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991)に開示の方法で行うことができる。
そのアンタゴニスト又はアゴニストの投与がインビボで行われる場合、通常の用量は１日あたりで、哺乳動物の体重１kgあたり約１０ngから１００mg以上と様々であってよく、好適には約１μg／kg／日ないし１０mg／kg／日であり、投与経路に応じて決まる。特定の用量及び送達方法に関する手引きが、文書で提供される；例えばＵＳ特許番号4,657,760；5,206,344；又は5,225,212参照。異なる処置化合物と異なる疾患には異なる製剤が効果的であり、ある１つの器官又は組織を対象とする投与は例えば、別の器官又は組織に対する場合とは異なる方法で送達する必要がありうる。当業者であれば、投与されなければならないアンタゴニスト又はアゴニストの用量は、例えばアンタゴニスト又はアゴニストを与えられる哺乳動物、投与経路、及びその哺乳動物に投与されている他の薬物又は治療法に応じて異なることを理解するであろう。
細胞の種類及び／又は疾患の重症度に応じて、約１μg／kgないし１５mg／kgのアンタゴニスト抗体又はアゴニスト抗体が、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入による投与のための最初の候補用量である。典型的な１日あたりの用量は、約１μg／kgないし１００mg／kg以上の範囲でありえ、上述した要因に応じて決まる。数日又は長期にわたる繰り返し投与の場合、状態に応じて、疾患症状が所望の鎮静が起こるまで処置を続ける。しかし、他の投与計画も有用である。
随意的に、任意のアンタゴニスト又はアゴニストの投与に先立ち、哺乳動物又は患者を試験してＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩｓ又はＢＲ３のレベル又は活性を決定することができる。このような試験は、血清試料又は末梢血白血球のＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳにより実施できる。
【０２４９】
本発明の方法では、単一タイプのアンタゴニスト又はアゴニストを使用してよい。例えばＴＡＣＩｓレセプターイムノアドヘシン分子等のＴＡＬＬ−１アンタゴニストが投与されうる。あるいは、熟練医師であれば、その方法において、例えば、ＴＡＣＩｓレセプターイムノアドヘシン及び抗ＡＰＲＩＬ抗体の組合せのような、アンタゴニストとアゴニストの組合せを利用することを選択してもよい。さらに、二重のアンタゴニスト、即ちＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬの両方をブロック又は阻害するために作用するアンタゴニストを利用することが望ましい。このようなアンタゴニスト分子は、例えば、ＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬ、又はＴＡＣＩ、ＴＡＣＩｓ、ＢＲ３及びＢＣＭＡ間で保存されたエピトープに結合しうる。
さらなる治療法を本方法において使用することも考えられる。一又は複数の他の治療法には、これらに限定されるものではないが、当該技術分野において既知であり、前述のセクションＩにおいてさらに詳細に定義された、放射線療法、サイトカイン、成長阻害剤、化学治療剤、細胞障害剤、チロシンキナーゼ阻害因子、ラスファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子、血管形成阻害因子、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害因子の投与が含まれる。さらに、RituxanTMはHerceptinTM等の腫瘍抗原を標的とする治療的抗体、並びに抗ＶＥＧＦ等の抗血管形成抗体に基づく治療法も挙げられる。
化学療法剤の調製及び投与スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練医師により経験的に決定されてよい。そのような化学療法剤の調製及び投与スケジュールはまた、Chemotherapy Service, M.C. Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。また、化学療法剤は、例えばアンタゴニストの投与に先行するか後続してよく、又はそれらと同時に与えられてもよい。また、アンタゴニストは、タモキシフェン等の抗エストロゲン化合物、又はオナプリストン（onapristone）（EP616812を参照）等の抗プロゲステロンと、このような分子の場合に既知の用量で組合せてもよい。
また、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、血管内皮因子（ＶＥＧＦ） 又は他のＴＮＦＲファミリーメンバー（例えばＤＲ４、ＤＲ５、ＯＰＧ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２）に結合する抗体等、他の抗原に対する抗体を投与することも好ましい。あるいは、又は付加的に、ここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。時には、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。一実施態様では、ここにおけるアンタゴニストは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明のアンタゴニストを投与することができる。
アンタゴニスト又はアゴニスト（及び一又は複数の他の治療法）が同時的又は経時的に投与されてよい。アンタゴニスト又はアゴニストの投与の後、インビトロで処置された細胞を分析することができる。インビボでの処置の場合、処置を受けた哺乳動物は熟練医師にとって周知の様々な方法によりモニターすることができる。例えば、Ｉｇ生産（非特異的又は抗原特異的）等のＢ細胞活性のマーカーをアッセイすることができる。
【０２５０】
Ｇ．スクリーニング方法
また、本発明は、ＡＰＲＩＬ／ＴＡＣＩｓ相互作用又はＴＡＬＬ−１／ＴＡＣＩｓ／ＢＲ３相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用しうるものを同定するために分子をスクリーニングする方法も含む。そのような分子には、抗体を含む小分子又はポリペプチドが含まれる。小分子の例には、限定するものではないが、小ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチジル有機又は無機化合物が含まれる。薬剤候補についてのスクリーニングアッセイは、ここで同定されるリガンド又はレセプターポリペプチドと結合又は複合体を形成し、又はそうでなければこれらのポリペプチドと他の細胞内タンパク質との結合を妨害する化合物又は分子を同定するように設計される。このようなスクリーニングアッセイは、該化学ライブラリの高処理スクリーニングの影響を受けるアッセイを含み、該アッセイは小分子薬剤候補の同定に特に適したものである。
アッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む、当該技術分野で十分に特徴付けされている種々の形式で実施することができる。
例えばアンタゴニストのアッセイは、薬剤候補とここで同定されるリガンド又はレセプターポリペプチドとを、これら２つの成分を相互作用可能とするのに十分な条件下で及びそれに十分な時間にわたって、接触させることが必要である点で共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用とは結合のことであり、形成される複合体は、反応混合物中で単離され検出することができる。特定の実施態様において、ここで同定されるリガンド又はレセプターポリペプチド、又は薬剤候補は、固体相上、例えばマイクロプレート上に、共有結合又は非共有結合によって固定化される。一般に、非共有結合はリガンド又はレセプターポリペプチド溶液で固体表面をコートし、乾燥させることによって達成される。あるいは、固定化されるべきリガンド又はレセプターポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を使用して、固体表面にそれをアンカーすることもできる。アッセイは検出可能な標識で標識されうる非固定化成分を、固定化成分、例えばアンカー成分を含有する被覆された表面等、に添加することにより行われる。反応が完了した時に、非反応成分を、例えば洗浄により除去し、固体表面にアンカーされた複合体を検出する。元々非固定化されている成分が検出可能な標識を担持している場合、表面に固定された標識の検出は複合化が生じたことを示している。元々非固定化されている成分が標識を担持していない場合、複合体形成は、例えば固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体を使用して検出することができる。
【０２５１】
候補化合物がここで同定される特定のリガンド又はレセプターポリペプチドと相互作用するが結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために周知の方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを解した同時精製等の伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5789-5793 (1991)に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等（Fields及びSong, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chienら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582 (1991)）に記載されている酵母菌ベースの遺伝子系を用いることによりモニターすることができる。酵母菌ＧＡＬ４等の多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッドシステム」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、これらハイブリッドタンパク質の一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下でのＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子の発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する発色基質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特異的なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKERTM）は、Clontechから購入可能である。この系は、特異的なタンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれらの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ここで同定されるリガンド及びレセプターポリペプチドと他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物又は分子は、次のように試験することができる：通常は、遺伝子産物及び細胞内又は細胞外成分を含む反応混合物を、これら２つの産物を相互作用及び結合可能とするのに十分な条件下で及びそれに十分な時間にわたって、調製する。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物あり又はなしで実施される。さらに、第３の反応混合物にプラセボを添加してポジティブ対照としてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のようにモニターする。対照反応では複合体が形成されるが、試験化合物を含む反応混合物では形成されないということは、試験化合物が該試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【０２５２】
アンタゴニストについてアッセイするために、リガンド又はレセプターポリペプチドは、特定の活性に関しスクリーニングされる化合物と共に細胞に添加され、リガンド又はレセプターポリペプチドの存在下において、対象の活性を阻害する化合物の能力は、該化合物がリガンド又はレセプターポリペプチドに対するアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、リガンド又はレセプターポリペプチド及び潜在的アンタゴニストと、膜結合ポリペプチドレセプター又は組換えレセプターとを、競合阻害アッセイにとって適当な条件下で組合せることによって検出されうる。リガンド又はレセプターポリペプチドは、潜在的アンタゴニストの有効性を決定するためにレセプターに結合するポリペプチド分子の数を使用できるように、放射活性等によって標識することが可能である。  レセプターをコード化する遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Coliganら, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがリガンド又はレセプターポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はリガンド又はレセプターポリペプチドに反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を、標識したリガンド又はレセプターポリペプチドに暴露する。リガンド又はレセプターポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位のヨード化又は包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用的なサブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的に推定レセプターをコード化する単一のクローンを生成する。
代替的なアプローチとして、標識されたリガンドポリペプチドを、レセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物にフォトアフィニティー結合させることができる。架橋材料をＰＡＧＥにより溶解し、Ｘ線フィルムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコード化する遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
【０２５３】
Ｈ．製造品
本発明の他の実施態様では、前述した疾患の処置に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器及びラベルを含んでなる。適切な容器としては、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が挙げられる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は病状の処置に有効な組成物を収容し、滅菌した出入口を有する（例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤はアンタゴニスト又はアゴニストである。容器上の又は容器に伴うラベルには、組成物が、選択された病状の処置に使用されることが示されている。製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガル液及びブドウ糖液を収容する第２の容器をさらに具備する。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含むパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料を含んでいてもよい。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、限定するものではない。本明細書で引用した全ての文献を、出典明示によりここに取り込む。
【０２５４】
実施例１：ＴＡＣＩｓ及びＢＲ３の同定及び発現クローニング
図３中に示されるアミノ酸１３６-２８５からなるＴＡＬＬ−１ポリペプチドのＮ末端に融合したヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を用いて、「ＡＰ−ＴＡＬＬ−１」と称されるキメラタンパク質を調製した。ｐＡＰｔａｇ-５（Genehunter Corporation社）を鋳型として用いたＰＣＲ増幅によってＡＰを得て、発現ベクター、ｐＣＭＶ-１Ｆｌａｇ（シグマ社）中へ、ＴＡＬＬ−１のＮ末端において融合させ、クローン化した。ＡＰ−ＴＡＬＬ−１を（リポフェクタミン試薬；Ｇｉｂｃｏ-ＢＲＬを用いて）一過的に形質移入し、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ATCC社）中で発現させた。形質移入された２９３細胞からの条件培地を濾過し（０．４５ミクロン）、２０mM Hepes（ｐＨ７．０）及び１mMアジ化ナトリウムを含むバッファー中、４℃で保存し、その後の細胞染色法に用いた。
ＴＡＬＬ−１に対するレセプターを同定するために、ヒト脾臓及びＩＭ-９細胞由来のポリＡ＋ｍＲＮＡを用いて、ｐＲＫ５ベクター（EP307,247, 1989年3月15日発行）中にｃＤＮＡ発現ライブラリを構築した［Flanaganら, Cell, 63:185 (1990); Tartagliaら, Cell, 83:1263-1271 (1995)］。ライブラリ由来の〜１０００ｃＤＮＡクローン（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ（Qiagen社））のプールを、Ｆｕｇｅｎｅ６（Roche Molecular Biochemicals社）を用いて１２ウェルプレート中のＣＯＳ７細胞（ATCC）へ（リポフェクトアミンを用いて）形質移入し、次いで３６〜４８時間後、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１条件培地と共にインキュベートし、洗浄し、ＡＰ活性についてインサイツで染色した。［Yanら, 上掲 (2000)］。ポジティブプールを、ＴＡＣＩもＢＣＭＡも含まない、連続的により小さなサイズのプールに分類した。複数回のスクリーニングの後、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１結合活性をコード化するｃＤＮＡが同定された。ｃＤＮＡ挿入物の配列決定により、単一の予想される膜貫通領域を有するタンパク質をコード化することが予想される単一のオープンリーディングフレームが明らかになった。このポリペプチド（図６Ｂのアミノ酸残基１-１８４）はＢＲ３と称された。（ＡＰ−ＴＡＬＬ−１及びＡＰ−ＡＰＲＩＬ結合活性をコード化する他のｃＤＮＡもまた同定された。この分子は以下に説明するＴＡＣＩｓとして同定される。）
【０２５５】
配列のアラインメントによって、ＢＲ３分子がＴＮＦ-レセプタースーパーファミリーのメンバーではないようであることが示された。スーパーファミリーは通常、細胞外リガンド結合ドメイン内での特徴的な複数のシステインリッチ反復の存在により定義される。これらアミノ酸擬似反復は通常、高度に保存された６つのシステインによって形成された３つの分子内ジスルフィド架橋により定義される［Locksleyら, Cell, 104:487-501 (2001)］。さらに、ＢＲ３の細胞外ドメインは、ＴＮＦ-レセプターファミリーのメンバーにいかなる相同性も示さなかった。加えて、ＢＲ３は外部ドメインに４つのシステイン残基のみを含んでいた。データベース検索によりマウスＢＲ３の推定オルソログが明らかになった（GenBank受託番号AK008142）。上記で同定されたヒトＢＲ３と同様に、マウスＢＲ３（ｍＢＲ３）は４つのシステイン残基のみを有していた。概して、ｈＢＲ３及びｍＢＲ３は５６％の同一性を示した。ｈＢＲ３及びｍＢＲ３はどちらもＮＨ2-末端シグナルペプチドを欠き、これはそれらがＩＩＩ型膜貫通タンパク質であることを表す［Wilson-Rawlsら, Virology, 201:66-76 (1994)］。ＢＲ３の細胞内ドメインはｈＢＲ３及びｍＢＲ３間に高度に保存されているように見えた。
ノーザンブロッティングを、当業者に周知の一般的な手順に従い行った。手短に言えば、製造業者の指示に従って、ヒト及びマウスポリＡ＋ＲＮＡ正常組織ブロット（Clontech社）をハイブリダイズした。ヒト又はマウスＢＲ３のヌクレオチドコード領域に対応するＤＮＡ断片を用いて、32ｐ-標識されたプローブを生成した。図９Ｂに示したように、比較的高い発現レベルが、ヒト及びマウス脾臓組織とマウス睾丸で検出された。
さらに、ヒトｃＤＮＡパネルのＰＣＲ分析が、ＴＡＬＬ−１又はＢ細胞のレセプターであるＢＲ３に一致する、静止ＣＤ１９＋Ｂ細胞（図９Ｃ）におけるヒトＢＲ３の最も高い発現を示した。ヒトＢＲ３の発現パターンは、よって、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡとは異なる。ＢＣＭＡはＢ細胞に特異性であるように見え、ＴＡＣＩはＢ細胞及び活性Ｔ細胞の双方により発現される［Laabiら, Science, 289:883-884 (2000); Grasら, Int. Immunol., 7:1093-1106 (1995); von Bulowら, Science, 278:138-141 (1997); Khareら, Trends Immunol., 22:61-63 (2001)］一方で、ＢＲ３は静止Ｂ細胞によって高度に発現され、また静止Ｔ細胞で検出可能である。マウスＢＲ３の遺伝子は、Ｂ細胞白血病及びリンパ腫に冒されやすい４つのＡＫＸＤマウス株の１つで転写活性化されることが報告された［Hansenら, Genome Res.. 10:237-243 (2000)］。
【０２５６】
Ｆｌａｇタグ付きリガンドを以下のように調製した。ＡＰＲＩＬのアミノ酸１０５−２５０（図４参照）をｐＣＭＶ-１Ｆｌａｇ（シグマ社）にクローン化し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位でアミノ酸１−２４のＦｌａｇシグナル及びタグ配列に融合させた。ＴＡＬＬ−１のアミノ酸１２４−２８５（図３参照）を、ＮｏｔＩ部位が使用されること以外はＦｌａｇ−ＡＰＲＩＬについて上述したようにして、アミノ酸１−２７のＦｌａｇシグナル及びタグ配列に融合させた。ＡＰＲＩＬコーディング配列がＣ末端でＡＰと融合する一方で、ＡＰがＣ末端でＦｌａｇと融合するように、ＡＰＲＩＬのアミノ酸１０５−２５０（図４参照）をヒト胎盤アルカリホスファターゼをコード化するｐＣＭＶ-１Ｆｌａｇベクターにクローニングすることによって、ＡＰ−ＡＰＲＩＬを調製した。ＡＰ−ＡＰＲＩＬについて上述したように、ＴＡＬＬ−１のアミノ酸１３６−２８５（図３参照）をｐＣＭＶ-１Ｆｌａｇ、ＡＰベクターにクローニングすることによって、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１を調製した。その後、それぞれのタグ付きタンパク質を、２９３細胞又はＣＨＯ細胞中で発現させ、Ｍ２抗Ｆｌａｇレジン（シグマ社）を用いて精製した。
精製したＦｌａｇ-ＡＰＲＩＬ又はＦｌａｇ-ＴＡＬＬ−１の１μgを、ＴＡＣＩ又はＢＲ３のＥＣＤのＩｇＧ１-Ｆｃ融合体を含む精製したヒトイムノアドヘシンの１μgと一晩、４℃でインキュベートした。ＴＡＣＩ-ＥＣＤ．ｈＦｃイムノアドヘシンは、Ashkenaziら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:10535-10539 (1991)中に記載の方法によって調整された。このイムノアドヘシンの構築物は、ヒトＴＡＣＩポリペプチド（図１参照）のアミノ酸２-１６６から構成された。ＴＡＣＩ-ＥＣＤ構築物は、異種結合性シグナル配列（ｐＣＭＶ-１ Ｆｌａｇ（シグマ社）のプレプロトリプシンアミノ酸１-１７）を用い、ＴＡＣＩ配列下流のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードしてＣＨＯ細胞で発現され、次いで、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。ＢＲ３-ＥＣＤイムノアドヘシンは、Ashkenazi等、上掲中に記載の方法によって調製された。イムノアドヘシン構築物は、ヒトＢＲ３ポリペプチドのアミノ酸２-６２から構成された（図６Ｂ参照）。ＢＲ３-ＥＣＤ構築物は、異種結合性シグナル配列（ｐＣＭＶ-１ Ｆｌａｇ（シグマ社）のプレプロトリプシンアミノ酸１-１７）を用い、ＢＣＭＡ配列下流のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードしてＣＨＯ細胞で発現され、次いで、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。
混合物を、プロテインＡ-アガロース（Repligen社）とのレセプター-イムノアドヘシンを介して免疫沈降した。次いで、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ共役抗Ｆｌａｇ Ｍ２ ｍＡｂ（シグマ社）を用いたウェスタンブロットによって、その免疫沈降物を分析し、Ｆｌａｇタグ付きリガンドを検出した。Ｆｌａｇ-ＴＡＬＬ−１はｈＢＲ３-ｈＦｃとの複合体で容易に検出され、Ｆｌａｇ-ＡＰＲＩＬはされなかったが、ＴＡＣＩ-ｈＦｃはＦｌａｇ-ＴＡＬＬ−１とＦｌａｇ-ＡＰＲＩＬの双方に結合した。これらの結果は、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡとは異なり、ＢＲ３はＡＰＲＩＬではなくＴＡＬＬ−１に特異的に結合することを示す。
【０２５７】
インビトロアッセイにおいて、ＣＯＳ７細胞（ATCC）を、形質移入の２４時間前に１２ウェルプレートに播いた。その後、細胞に、１マイクログラムのＴＡＣＩ（後述のようにｐＲＫ５Ｂベクターにクローン化した上述のヒトＴＡＣＩの２６５アミノ酸形態）又はベクタープラスミド（ｐＲＫ５Ｂ）のみを形質移入した。形質移入の１８-２４時間後、細胞を、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬを含む条件培地で１時間室温にてインキュベートし、Tartagliaら, Cell, 83:1263-1271 (1995)中に記載されるようにＡＰ活性についてインサイツで染色した。
ｈＢＲ３又はｍＢＲ３発現構築物のＣＯＳ７細胞への形質移入は、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１に強く結合したが、ＡＰ−ＡＰＲＩＬにはしなかった（図１０、データは示さず）。一方、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１とＡＰ−ＡＰＲＩＬの双方がＴＡＣＩを形質移入された細胞に結合した。ｈＢＲ３の外部ドメインを含むヒトＦｃ融合タンパク質（ｈＢＲ３-ｈＦｃ）は、ＴＡＬＬ−１の全長膜貫通形態をコード化する発現構築物を形質移入されたＣＯＳ７細胞に結合したが、ＡＰＲＩＬ発現細胞にはしなかった。
ヒトＴＮＦ-αを、ｐＲＫ５Ｂベクター（ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmesら, Science, 253:1278-1280 (1991)を参照のこと）にクローン化した。細胞表面上におけるＴＮＦ-α発現の検出のために、Ｆｌａｇタグを、アミノ酸７０とアミノ酸７１の間に挿入した（Pennicaら, 上掲中での配列に従って番号付けを用いる）。ＴＡＬＬ−１（ａａ７５-２８５；図３参照）、４-１ＢＢＬ（ａａ５９-２５４；Goodwinら, Eur. J. Immunol., 23:2631-2641 (1993)）、ＣＤ２７リガンド（ａａ４０-１９３；Goodwinら, Cell, 73:447-456 (1993)）、ＣＤ３０リガンド（ａａ６１-２３４；Smithら, Cell, 73:1349-1360 (1993)、ＲＡＮＫＬ（ａａ７１-３１７；WO98/28426参照）、Ａｐｏ-２リガンド（ａａ４０-２８１；WO97/25428参照）又はＡｐｏ-３Ｌ（ａａ４６-２４９；WO99/19490参照）の細胞外領域は、各々ＢａｍＨＩ部位でクローン化した。この結果、ＴＮＦ-α由来の細胞内及び膜貫通領域と種々のリガンド由来の細胞外領域を有するキメラリガンドが生じた。ＡＰＲＩＬ（図４参照）及びＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２（Srivastavaら, 上掲）に対しては、Ｆｌａｇタグを持たない全長ｃＤＮＡクローンが用いられた。
続いて、形質移入されたＣＯＳ７細胞を、ＴＡＣＩ．ＥＣＤ．ｈＦＣイムノアドヘシン、ｈＢｒ３-ｈＦｃ、又はｍＢＲ３-ｈＦｃ（上述のように調製）と共にインキュベートした。細胞は、ＴＡＣＩ ＥＣＤ-ＩｇＧ（又はAshkenaziら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:10535-10539 (1991)に記載のように調製されたＴＮＦＲ１-ＩｇＧ構築物）と共に１μg／mlで、ＰＢＳ中１時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞染色は、ビオチン化ヤギ抗ヒト抗体（Jackson Labs, １：２００希釈にて）と共にインキュベートした後、Ｃｙ３-ストレプトアビジン（Jackson Labs, １：２００希釈にて）と共にインキュベートして視覚化させた。ｈＢＲ３-ｈＦｃと同様にマウスＢＲ３-Ｆｃもまた、ＴＡＬＬ−１を形質移入されたＣＯＳ７細胞にのみ結合し、ＡＰＲＩＬ-１を形質移入されたＣＯＳ７細胞には結合しなかった（データは示さず）。さらにｈＢＲ３-ｈＦｃは、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＥＤＡ-Ａ１、ＥＤＡ-Ａ２、４-１ＢＢＬ、ＦａｓＬ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、Ａｐｏ３Ｌ／ＴＷＥＡＫ、ＯＸ-４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ、又はＧＩＴＲＬを含む、いくつかの他のＴＮＦファミリーメンバーを発現する細胞には結合できなかった（データは示さず）。一方、ＴＡＣＩ-ｈＦｃ融合タンパク質は、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬのいずれかを形質移入された細胞と結合した（図１０）。
【０２５８】
ＮＦ-ｋＢアッセイにおいて、２９３細胞（ATCC）を形質移入の２４時間前に１×１０5細胞／ウェルで１２ウェルプレート中へ播き、０．２５μgのＥＬＡＭ-ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド、２５ngのｐＲＬ-ＴＫ（Promega社）、及び指示された量の各発現構築物を形質移入した（図１０参照）。形質移入されるＤＮＡの全量は、空のｐＲＫ５Ｂベクターの補充により１mgで一定に保たれた。細胞は形質移入の２０-２４時間後に回収され、レポーター遺伝子活性は、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega社）で決定された。
２９３細胞への形質移入時には、ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡの双方が、レポーター遺伝子アッセイにより決定されたように容量依存的な方法で著しいＮＦ-ｋＢ活性化を誘発した。同様の条件下で、ｈＢＲ３とｍＢＲ３はいずれもＮＦ-ｋＢの検出可能な活性化は誘発しなかった（図１０）。このアッセイでＢＲ３がＮＦ-ｋＢの活性化に失敗したことは、ＢＲ３の発現の乏しさによるものではないようだった。というのは、ＢＲ３を形質移入された細胞はＴＡＣＩ又はＢＤＭＡを形質移入された細胞と同等のレベルでリガンド（ＡＰ−ＴＡＬＬ−１）に結合した（図１０、データは示さず）ためである。
脾臓での、特にＢ細胞によるＢＲ３の顕著な発現は、それがＴＡＬＬ−１の機能的レセプターであることと一致するが、その発現パターンはＴＡＣＩ及びＢＣＭＡのものとは異なる。ＢＣＭＡはＢ細胞特異的であり、ＴＡＣＩはＢ細胞及び活性化Ｔ細胞の双方により発現される［Laabiら, Science, 289:883-884 (2000); Grasら, Int. Immunol., 7:1093-1106 (1995); von Bulowら, Science, 278:138-141 (1997); Khareら, Trends Immunol., 22:61-63 (2001)］。一方、ＢＲ３は静止Ｂ細胞によって高度に発現され、また静止Ｔ細胞で検出可能である。活性化の際、下方制御されるように見えた。興味深いことに、ＢＲ３の遺伝子は、Ｂ細胞白血病及びリンパ腫に侵されやすい４つのＡＫＸＤマウス株の１つで転写活性化されることが報告された［Hansenら, Genome Res.. 10:237-243 (2000)］。ＢＲ３はＢ細胞ホメオスタシスにおいて重要なレセプターとなりえ、その調節障害がＢ細胞新生物の発生の一因となりうると考えられる。
ＡＰＲＩＬ及びＴＡＬＬ−１の双方がＴＡＣＩ及びＢＣＭＡに結合する；しかし、結合にはいくつかの優先傾向が観察され、ＴＡＣＩ-ＴＡＬＬ−１とＢＣＭＡ-ＡＰＲＩＬが好適なパートナーである［Marstersら, 上掲 (2000)］。一方、本実験では、ＢＲ３がＴＡＬＬ−１に結合し、ＡＰＲＩＬにはしなかったことが示された。元々癌細胞成長因子として同定されたＡＰＲＩＬはＴＡＣＩとＢＣＭＡの双方に結合することが示されている［Marstersら, 上掲 (2000); Wuら, J. Biol. Chem., 275 :35478 (2000); Yuら, Nat. Immunol., 1 :252-256 (2000)］が、Ｂ細胞機能におけるその生理的役割は完全には理解されていない。ＢＲ３はＴＡＬＬ−１に特異的であるため、ＢＲ３-Ｆｃの投与（例えばマウスへのイムノアドヘシンの投与）は、ＡＰＲＩＬではなくＴＡＬＬ−１が誘発するＴＡＣＩとＢＣＭＡの活性化をブロックするはずであると考えられる。
【０２５９】
関連するＡ／Ｊ株とは異なり、末梢Ｂ細胞での顕著な欠損の原因である（Ｂ細胞の成熟異常に関する）Ｂｃｍｄと称される単一の常染色体性共優性遺伝子座を持つ、Ｂ細胞欠損Ａ／ＷｙＳｎＪマウスの研究が、Lentzら, J. Immunol. 157:598-606 1996); Lentzら, J. Immunol., 160:3743-3747 (1998); Hoagら, Immunogenetics, 51:924-929 (2000)に記載されている。Ｂｃｍｄ遺伝子座はマウス染色体１５の中間領域にマッピングされ、これはＢＲ３がヒト染色体２２上でマッピングされる領域とシンテニーである。Ａ／ＷｙＳｎＪマウス由来の脾臓Ｂ細胞は、インビトロでもインビボでも組換えＴＡＬＬ−１に対して増殖反応を示さないことが報告されている。こういったＡ／ＷｙＳｎＪマウスの遺伝子欠損は、Ｂｃｍｄ遺伝子座により遺伝子学的に定義されるように、ＢＲ３をコード化する遺伝子にあると現在考えられている。出願人の実験において、ＲＴ-ＰＣＲ分析では、（Dr. Michael Cancro, University of Pennsylvania, Philadelphia, PAから得られた）Ａ／ＷｙＳｎＪマウス由来の脾臓又はＢ細胞ＲＮＡでのＢＲ３転写の存在を明らかにできなかったが、ＴＡＣＩのコントロールの転写は同一試料で容易に検出できた。一方、完全なＢＲ３コード遺伝子がＡ／Ｊマウスで容易に検出された。これらのデータは、Ａ／ＷｙＳｎＪマウスに観察された末梢Ｂ細胞の欠落の原因としての遺伝子欠失によるＢＲ３の不活性化と一致する。ＢＲ３が関与するシグナル経路はＴＡＬＬ−１のＢ細胞増殖作用の原因でありえ、ＢＲ３の非存在下でＢ細胞ホメオスタシスは脅かされうると現在考えられている。
スクリーニングで同定された上記のＴＡＣＩｓ分子は、図５Ｂのアミノ酸１ないし２４６からなるポリペプチドをコード化することが発見された。ＢＲ３と同様に、該ポリペプチドは単一のシステインリッチドメインを含むように見える。推定ＥＣＤは図５Ｂのアミノ酸残基１ないし１１９からなる。インビトロでの結合アッセイ（ＡＰ−ＴＡＬＬ−１染色及びＡＰ−ＡＰＲＩＬ染色を検出するために上述されたように実行された）において、ＴＡＣＩｓがＴＡＬＬ−１とＡＰＲＩＬの双方に結合することが発見された（データは示さず）。
【０２６０】
実施例２：大腸菌におけるＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの発現
この実施例は、大腸菌での組換え発現によるＴＡＣＩｓポリペプチドの形態又はＢＲ３ポリペプチドの形態の調製を例示する。
ＴＡＣＩｓポリペプチドの発現のために、全長ＴＡＣＩｓポリペプチド、又はその断片又は変異体をコード化するＤＮＡ配列を、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。ＢＲ３ポリペプチドの発現のために、全長ＢＲ３ポリペプチド、又はその断片又は変異体をコード化するＤＮＡ配列を、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。
プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含むべきである。様々な発現ベクターが使用できる。適切なベクターは例えば、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Bolivarら, Gene, 2:95 (1977)参照）である。ベクターは制限酵素で消化され、脱リン酸化される。次いでＰＣＲ増幅配列がベクター中に連結される。ベクターは、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＴＡＣＩｓポリペプチドコード領域又はＢＲ３ポリペプチドコード領域、λ転写終結、及びａｒｇＵ遺伝子についてコード化する配列を含むのが好ましい。
次いでこのライゲーション混合物を使用して、Sambrookら, 上掲に記載の方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換させる。形質転換体を、ＬＢプレートでのそれらの成長能力により同定し、その後抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析およびＤＮＡ配列決定により確認することができる。
選択されたクローンを、抗生物質を添加したＬＢ培養液のような液体培地で一晩かけて成長させることができる。この一晩の培養を続いて、より大きなスケールでの培養を接種するために使用してもよい。細胞をその後、所望の光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
さらに数時間細胞を培養した後、細胞は遠心分離により回収できる。遠心分離により得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドを、ポリペプチドの堅固な結合を可能にする条件下で金属キレート化カラムを用いて精製することが可能である。
【０２６１】
実施例３：哺乳動物細胞におけるＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組換え発現によるＴＡＣＩｓポリペプチド及びＢＲ３ポリペプチドの形態の調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（1989年3月15日公開のEP307,247参照）を用いた。任意には、Sambrookら, 上掲に記載されているようなライゲーションの方法を用いて、ＴＡＣＩｓポリペプチドコード化ＤＮＡは選択した制限酵素でｐＲＫ５中に連結させ、ＴＡＣＩｓポリペプチドコード化ＤＮＡの挿入を可能する。得られたベクターは、ｐＲＫ５-ＢＲ３ポリペプチドと呼ばれる。任意には、Sambrookら, 上掲に記載されているようなライゲーションの方法を用いて、ＢＲ３ポリペプチドコード化ＤＮＡは選択した制限酵素でｐＲＫ５中に連結され、ＢＲ３ポリペプチドコード化ＤＮＡの挿入を可能にする。得られたベクターはｐＢＫ５−ＢＲ３ポリペプチドと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び任意で滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化する。約１０μgのｐＲＫ５-ＴＡＣＩｓポリペプチドＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコード化する約１μgのＤＮＡ［Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982)］と混合し、５００μlの１mM トリス-ＨＣｌ、０．１mM ＥＤＴＡ、０．２２７M ＣａＣｌ2に溶解させる。あるいは、約１０μgのｐＲＫ５-ＢＲ３ポリペプチドＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコード化する約１μgのＤＮＡ［Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982)］と混合し、５００μlの１mM トリス-ＨＣｌ、０．１mM ＥＤＴＡ、０．２２７M ＣａＣｌ2に溶解させる。このベクター混合物に、滴状の５００μlの５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０mM ＮａＣｌ、１．５mM ＮａＰＯ4を添加し、２５℃で１０分間沈殿物を形成させる。沈殿物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させる。培地を吸引し、２mlのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加する。次いで２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートする。
形質移入の約２４時間後、培地を除去し、培地（のみ）で、又は２００μＣｉ／mlの35Ｓ-システイン及び２００μＣｉ／mlの35Ｓ-メチオニンを含む培地で置換する。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加する。処理したゲルは乾燥させ、ＴＡＣＩｓポリペプチドの存在又はＢＲ３ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムに曝してよい。形質転換した細胞を含む培地にさらなるインキュベーションを施してよく（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験する。
【０２６２】
代替技術において、ＴＡＣＩｓポリペプチドコード化ＤＮＡ又はＢＲ３ポリペプチドコード化ＤＮＡは、Somparyracら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入されうる。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、続いて７００μgのｐＲＫ５-ＴＡＣＩｓポリペプチドＤＮＡを添加、又は７００μgのＢＲ３ポリペプチドＤＮＡを添加する。細胞を、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ-デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、５μg／ml ウシインシュリン及び０．１μg／ml ウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去する。次いで、発現されたＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の任意の選択した方法によって精製する。
他の実施態様では、ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５-ＴＡＣＩｓポリペプチドベクター又はｐＲＫ５-ＢＲ３ポリペプチドベクターは、ＣａＰＯ4又はＤＥＡＥ-デキストラン等の公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上述したように、細胞培地をインキュベートし、その培地を、培地（のみ）で、又は35Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。所望のポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を回収する。次いで、発現されたＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
また、エピトープタグ付きＴＡＣＩｓポリペプチド又はエピトープタグ付きＢＲ３ポリペプチドは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＴＡＣＩｓポリペプチドコード化ＤＮＡ又はＢＲ３ポリペプチドコード化ＤＮＡはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてよい。このサブクローン挿入物は、ＰＣＲを施してポリ-ｈｉｓタグ等の選択したエピトープタグとフレーム単位でバキュロウイルス発現ベクターへ融合させることができる。ポリ-ｈｉｓタグ付きＴＡＣＩｓポリペプチドコード化ＤＮＡ挿入物又はポリ-ｈｉｓタグ付きＢＲ３ポリペプチド挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最終的に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入できる。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。次いで、発現されたポリ-ｈｉｓタグ付きＴＡＣＩｓポリペプチド又は発現されたポリ-ｈｉｓタグ付きＢＲ３ポリペプチドを含む培地を濃縮して、Ｎｉ2＋キレートアフィニティクロマトグラフィー等の任意の選択した方法によって精製することができる。
【０２６３】
実施例４：酵母菌におけるＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの組換え発現を記載する。
第一に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＴＡＣＩｓポリペプチドの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを構築する。対象のＴＡＣＩｓポリペプチド、選択したシグナルペプチド及びプロモーターをコード化するＤＮＡを、選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＴＡＣＩｓポリペプチドの細胞内発現を導く。分泌のために、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、酵母菌α因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＴＡＣＩｓポリペプチドの発現のためのリンカー配列をコード化するＤＮＡとともに、ＴＡＣＩｓポリペプチドをコード化するＤＮＡを、選択したプラスミドにクローニングすることができる。
あるいは、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＢＲ３ポリペプチドの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを構築する。対象のＢＲ３ポリペプチド、選択したシグナルペプチド及びプロモーターをコード化するＤＮＡを、選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＢＲ３ポリペプチドの細胞内発現を導く。分泌のために、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、酵母菌α因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＢＲ３ポリペプチドの発現のためのリンカー配列をコード化するＤＮＡとともに、ＢＲ３ポリペプチドをコード化するＤＮＡを、選択したプラスミドにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分離と、それに続くクマシーブルー染色でのゲルの染色により分析することができる。
続いて、遠心分離により発酵培地から酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって、組換えＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドを単離及び精製できる。ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０２６４】
実施例５：バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＴＡＣＩｓポリペプチド及びＢＲ３ポリペプチドの組換え発現を記載する。
ＴＡＣＩｓポリペプチドコード化ＤＮＡ又はＢＲ３ポリペプチドコード化ＤＮＡを、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域等）を含む。ｐＶＬ１３９３（Novagen社）等の市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＴＡＣＩｓポリペプチドコード化ＤＮＡ、又はＴＡＣＩｓポリペプチドコード化ＤＮＡの所望の部分（例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコード化する配列）を、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅する。あるいは、ＢＲ３ポリペプチドコード化ＤＮＡ、又はＢＲ３ポリペプチドコード化ＤＮＡの所望部分（例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコード化する配列）を、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅する。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
上記のプラスミド及びBaculoGoldTMウイルスＤＮＡ（Pharmingen社）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより、組換えバキュロウイルスを作成する。２８℃で４ないし５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、さらなる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現を、O'Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford:Oxford University Press (1994)に記載されているように実施する。
次に、発現されたポリ-ｈｉｓタグ付きＴＡＣＩｓポリペプチド又は発現されたポリ-ｈｉｓタグ付きＢＲ３ポリペプチドは、例えばＮｉ2＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製できる。抽出物を、Rupertら, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組換えＳｆ９細胞から調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５mLのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５mMのＭｇＣｌ2；０．１mM ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ-４０；０．４MのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理する。その超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０mMリン酸塩、３００mMのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μmフィルターで濾過する。Ｎｉ2＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagen社から市販）を５mLの総容積で調製し、２５mLの水で洗浄し、２５mLの負荷バッファーで平衡させる。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５mLでカラムに負荷する。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ280のベースラインまで負荷バッファーで洗浄する。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０mMリン酸塩；３００mMのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄する。Ａ280のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００mMイミダゾール勾配で展開する。１mLの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及びアルカリホスファターゼ（Qiagen社）に複合したＮｉ2＋-ＮＴＡでのウェスタンブロット又は銀染色で分析する。溶離したＨｉｓ10-タグ付きＴＡＣＩｓポリペプチド又はＨｉｓ10-タグ付きＢＲ３ポリペプチドを含む分画をプールして負荷バッファーに対して透析する。
あるいは、ＩｇＧタグ付き（又はＦｃタグ付き）ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＩｇＧタグ付き（又はＦｃタグ付き）ＢＲ３ポリペプチドの精製は、例えばプロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０２６５】
実施例６：ＴＡＣＩｓポリペプチド及び／又はＢＲ３ポリペプチドに結合する抗体の調製
この実施例は、ＴＡＣＩｓポリペプチド及び／又はＢＲ３ポリペプチドに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術はこの分野で知られており、例えばGoding, 上掲に記載されている。用いられうる免疫原は、精製ＴＡＣＩｓポリペプチド、精製ＢＲ３ポリペプチド、ＴＡＣＩｓポリペプチド含む融合タンパク質、ＢＲ３ポリペプチドを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＴＡＣＩｓポリペプチドを発現する細胞、及び細胞表面に組換えＢＲ３ポリペプチドを発現する細胞を含む。当業者は過度の実験をすることなく、免疫原の選択をすることができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１ないし１００マイクログラムで注入したＴＡＣＩｓポリペプチド免疫原又はＢＲ３ポリペプチド免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Research, ハミルトン, モンタナ）に乳化し、動物の後足蹠に注入する。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバントに乳化した付加的免疫原で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫してもよい。抗ＴＡＣＩｓポリペプチド抗体又はＢＲ３ポリペプチド抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、球後出血（retro-orbital bleeding）による血清試料をマウスから周期的に採取してよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチド静脈内注射の最後の注入をすることができる。３ないし４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を回収する。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ATCCから番号CRL 1597で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで該ハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
ハイブリドーマ細胞は、ＴＡＣＩｓポリペプチドに対する反応性又はＢＲ３ポリペプチドに対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＴＡＣＩｓポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ＴＡＣＩｓポリペプチドモノクローナル抗体又はＢＲ３ポリペプチドモノクローナル抗体を含む腹水を生成することができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降と、それに続くゲル排除クロマトグラフィーを用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０２６６】
実施例７：インビボ狼瘡モデルにおけるＢＲ３-Ｆｃポリペプチドの影響
ＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンポリペプチドの効果を、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ又は狼瘡）のインビボのマウスモデルで検査した。
マウスＢＲ３-Ｆｃ（実施例１に記載のように調製したイムノアドヘシン）を、生後６月のＮＺＢ×ＮＺＷ（Ｆ１）マウス（１グループあたり１２匹のマウス）に、５週間（１００μgタンパク質の用量で１週間に３回）腹腔内注射した。ＮＺＢ×ＮＺＷ（Ｆ１）マウスは、Jackson Labsから得たもので、従来の初期狼瘡の動物モデルである（Relevance of systemic lupus erythematosus nephritis animal models to human disease, Foster MH, Sem. Nephrol., 19:12-24 (Jan. 1999)参照）。対照動物には同様に生理食塩水を注射した。
生存時間解析；体重；ｄｓＤＮＡ抗体力価；及びタンパク尿測定のために、これらの動物を２週間毎に検査した。タンパク尿レベルは、MultistixTM試薬ストリップ（Bayer社）を用いて処置動物及び対照動物から収集したばかりの尿試料で測定した。ＤｓＤＮＡ抗体レベルは、以下のように処置及び未処置動物で測定した。生後６、８及び９月で血清を収集し、以下のプロトコルに従ってアッセイプレートで試験した。９６ウェルプレート（Nalgene NUNC-ImmunoTM MaxiSorpTM表面プレート）を、１００μlの５０μgポリ-Ｌ-リシン（０．０１％溶液、シグマ社）（０．１Mトリス、ｐＨ７．５で希釈）で、室温で４時間被覆した。１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Gibco社）を添加した２００μlのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、プレートを３回洗浄した。その後、プレートを、１００μlの２０μgポリデオキシアデニル-チミジル酸（シグマ社）（０．１Mトリス、ｐＨ７．５で希釈）で、４℃で一晩被覆した。１０％ウシ胎仔血清（Gibco）を添加した２００μlのＰＢＳで、プレートを３回洗浄した。続いて、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Gibco社）を添加した１００μlのＰＢＳで、室温で１時間、プレートをブロックした。１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Gibco社）を添加した２００μlのＰＢＳで、プレートを３回洗浄した。次いで、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を添加したＰＢＳ中、１：１００に希釈した１００μlの血清試料とともに、室温で２時間、プレートをインキュベートした。１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を添加した２００μlのＰＢＳで、プレートを３回洗浄した。その後、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を添加したＰＢＳ中、１：２０００に希釈した１００μlのＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧｌ（Caltag Labs）とともに、室温で１時間、プレートをインキュベートした。１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を添加した２００μlのＰＢＳで、プレートを５回洗浄した。次いで、１００μlの発色剤（基質試薬Ａ及びＢの１：１の混合、BD Pharmingen社）とともに、室温で１０分間、プレートをインキュベートした。５０μlの４．５Ｎ硫酸を用いて反応を止め、Spectramax 340プレートリーダーを用いて４５０nmで吸収値を測定した。
【０２６７】
図１１Ａないし１１Ｄに結果を示す。図１１Ａ及び１１Ｂは、ＢＲ３-Ｆｃで処置された動物にはタンパク尿がなかったことを示す。ＮＺＢ×ＮＺＷ（Ｆ１）マウスにおいて、生後６月の典型的な（未処置の）動物は約０-３０mg／dlのタンパク尿レベルを有し、生後１２月では動物は典型的には＞３００mg／dlのタンパク尿レベルを示し、約８０％が死に至った。このデータは、ＢＲ３-Ｆｃで処置された動物において、ＢＲ３-Ｆｃは狼瘡の経過中にタンパク尿をブロックする能力があり、腎臓損傷を防御することを意味する。
ＢＲ３-Ｆｃで処置された動物はまた、生存率の向上を示した。図１１Ｃに示したように、ＢＲ３-Ｆｃの投与は動物の生存率を向上した。対照グループでは生後４０週で生存率が７５％まで低下したのに対し、ＢＲ３-Ｆｃで処置されたグループでは１００％の動物が生存していた。生後９月で、対照グループに比べると、ＢＲ３-Ｆｃで処置された動物は抗ｄｓＤＮＡ抗体のレベルも顕著に低かった（図１１Ｄ）。これらのデータは、ＢＲ３-Ｆｃでの処置が、狼瘡のマウスにおけるＢ細胞による自己抗体の生成をブロックし、インビボでＴＡＬＬ−１機能をブロックすることにより生存率を向上したことを意味する。
【図面の簡単な説明】
【０２６８】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、天然配列ヒトＴＡＣＩ（配列番号１）をコード化するポリヌクレオチド配列（逆の相補的配列を配列番号２に提供する）及び推定されるそのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図２】図２は、天然配列ヒトＢＣＭＡをコード化するポリヌクレオチドド配列（配列番号４）（逆の相補的配列を配列番号５に提供する）及び推定されるそのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図３】図３は、天然配列ヒトＴＡＬＬ−１をコード化するポリヌクレオチド配列（配列番号７）（逆の相補的配列を配列番号８に提供する）及び推定されるそのアミノ酸配列（配列番号９）を示す。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、天然配列ヒトＡＰＲＩＬをコード化するポリヌクレオチド配列（配列番号１０）（逆の相補的配列を配列番号１１に提供する）及び推定されるそのアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図５】図５Ａは、天然配列ヒトＴＡＣＩｓをコード化するポリヌクレオチド配列（配列番号１３）（開始及び終結コドンを下線で示す）を示し、図５Ｂは、推定されるそのアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【図６】図６Ａは、天然配列ヒトＢＲ３をコード化するポリヌクレオチド配列（配列番号１５）（開始及び終結コドンを下線で示す）を示し、図６Ｂは、推定されるそのアミノ酸配列（配列番号１６）を示し、図６Ｃは、天然配列マウスＢＲ３をコード化するポリヌクレオチド配列（配列番号１７）（開始及び終結コドンを下線で示す）を示す。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の％アミノ酸配列同一性の計算方法の例を示す。ここでの目的のため、「ＰＲＯ」配列は、本添付図面で言及されるＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ，ＴＡＣＩｓ、又はＢＲ３配列とすることができる。
【図８】図８は、スプライシングされた変異体と考えられる「ｈＴＡＣＩ（２６５）」（配列番号１９）、及び図１Ａと１Ｂにも示す「ｈＴＡＣＩ」というＴＡＣＩレセプターの２つのアミノ酸配列の整列を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ヒト（配列番号：１６）及びマウスＢＲ３（配列番号：１８）の配列を示す。ヒトとマウスＢＲ３で同一であるアミノ酸を太字で示す。保存されたアミノ酸をプラス記号で示す。４つのシステイン残基を含む領域を下線で、予想される膜架橋領域を二重下線で示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＢＲ３のノーザンブロット分析を示す。ヒト（左）及びマウス（右）の複数の組織のノーザンブロット（クローンテック社）を、ヒト又はマウスＢＲ３のコード化領域に対応する３２Ｐで標識したｃＤＮＡ断片で検査した。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ヒトの複数の組織のｃＤＮＡパネル（クローンテック社）のＰＣＲ分析を示す。ｃＤＮＡ断片を、遺伝子特異的プライマーを使用して増幅する。レーン１−９は、１、ＰＢＬ：２、安静ＣＤ４＋細胞；３、活性ＣＤ４＋細胞；４、安静ＣＤ８＋細胞；５、活性ＣＤ８＋細胞；６、安静ＣＤ１９＋細胞；７、活性ＣＤ１９＋細胞；８、リンパ節；９、脾臓である。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、アッセイの実施結果を示す。ＢＲ３は、ＴＡＬＬ−１に特異的なレセプターであるが、ＡＰＲＩＬについてはそうではなく、ＮＦ−ＫＢ経路を活性化しなかったことが示されている。（ａ）ｈＢＲ３（１、２）又はＴＡＣＩ（３、４）を形質移入したＣＯＳ７をＡＰ−ＴＡＬＬ−１（１、３）又はＡＰ−ＡＰＲＩＬ（２、４）を含む条件を整えた培地で培養した。細胞を洗浄し、固定化し、インサイツでＡＰ活性について染色した。（ｂ）ＴＡＬＬ−１（１、２）又はＡＰＲＩＬ（３、４）を形質移入したＣＯＳ７細胞をｈＢＲ３−ｈＦｃ（１、３）又はＴＡＣＩ−ｈＦｃ（２、４）で培養した。細胞を洗浄し、固定化し、ビオチニン化したヤギ抗ヒト抗体、及びその後Ｃｙ３−ストレプトアビシンを使用して結合したレセプター-ｈＦｃタンパク質を検出した。（ｃ）ＢＲ３−ｈＦｃ（１、２）又はＴＡＣＩ−ｈＦｃ（３、４）をＦｌａｇ−ＴＡＬＬ−１（１、３）又はＦｌａｇ−ＡＰＲＩＬ（２、４）で培養した。タンパク質−Ａ−アガロースで沈降させたレセプター-Ｆｃ融合タンパク質に対し、抗Ｆｌａｇ抗体でイムノブロッティングを行った。リガンド（中）又はレセプター-ｈＦｃ（下）に匹敵する量を結合試験に使用した。（ｄ）２９３Ｅ細胞（インビトロゲン社）に０．２５ｕｇのＮＦ−ｋＢルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物、２５ｎｇのｐＲＬ−ＴＫ、及び所定量のｈＢＲ３、ｍＢＲ３、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡをコード化する発現構築物を形質移入した。２０〜２４時間後、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイキット（プロメガ社）を使用してNF-ｋB活性を決定した。
【図１１】図１１A〜１１Dは、ＢＲ３−Ｆｃがループスの治療に有効であったことを示すアッセイの結果を示す。図１１Ａ及び１１Ｂには、ＮＺＢ×ＮＺＷ（Ｆ１）マウスにおいてＢＲ３−Ｆｃによりブロックされるタンパク尿症を、図１１ＣにはＢＲ３−Ｆｃにより治療した動物が生存力の亢進を示したことを、図１１ＤにはＢＲ３−Ｆｃにより治療した動物において抗ｄｓＤＮＡ抗体の存在が低下したことを、それぞれ示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2005510208.tif 000020
【図２】
2005510208.tif 000021
【図３】
2005510208.tif 000022
【図４Ａ】
2005510208.tif 000023
【図４Ｂ】
2005510208.tif 000024
【図５】
2005510208.tif 000025
【図６】
2005510208.tif 000026
【図７】
2005510208.tif 000027
【図８】
2005510208.tif 000028
【図９Ａ】
2005510208.tif 000029
【図９Ｂ】
2005510208.tif 000030
【図９Ｃ】
2005510208.tif 000031
【図１０】
2005510208.tif 000032
【図１１Ａ】
2005510208.tif 000033
【図１１Ｂ】
2005510208.tif 000034
【図１１Ｃ】
2005510208.tif 000035
【図１１Ｄ】
2005510208.tif 000036