(57)【要約】  精製ヒアルロン酸類の製造方法は、平均分子量が４００〜１０万であるヒアルロン酸類を含むｐＨ３以下の溶液に水溶性有機溶媒を添加して、懸濁液を得る工程と、前記懸濁液をｐＨ３．５〜８に調整して、精製ヒアルロン酸類を沈殿させる工程と、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均分子量が４００〜１０万であるヒアルロン酸類を含むｐＨ３以下の溶液に水溶性有機溶媒を添加して、懸濁液を得る工程と、
前記懸濁液をｐＨ３．５〜８に調整して、精製ヒアルロン酸類を沈殿させる工程と、
を含む、精製ヒアルロン酸類の製造方法。
【請求項２】
前記水溶性有機溶媒を添加する前の前記溶液がｐＨ２以下である、請求項１記載の精製ヒアルロン酸類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製ヒアルロン酸類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、鶏冠、さい帯、皮膚、軟骨、硝子体、関節液などの生体組織中に広く分布しており、例えば、化粧品、医薬品、食品の成分として広く利用されている。また、近年、化学修飾されたヒアルロン酸や低分子化されたヒアルロン酸を、化粧品、医薬品、食品の成分として利用する試みがなされている。例えば、国際公開第ＷＯ／２００８／１３３２６７号公報には、カチオン化ヒアルロン酸およびその製造方法が記載されている。また、特公平５−７７６８１号公報には、ヒアルロン酸を低分子化する方法が記載されている。【０００３】
国際公開第ＷＯ／２００８／１３３２６７号公報には、ヒアルロン酸（平均分子量２００万）を塩基性含水媒体中でカチオン化剤と反応させ、デカンテーションにより液を除去して得られた固形物を食塩水に溶解させた後、アルコールを添加して沈殿物を得、次いでろ別した沈殿物をエタノールで洗浄して精製し、乾燥させるカチオン化ヒアルロン酸の製造方法が記載されている。このように、処理液からヒアルロン酸や化学修飾されたヒアルロン酸を回収する際には、処理液にエタノールを添加してヒアルロン酸を沈殿させる方法が通常用いられている。しかしながら、低分子化されたヒアルロン酸（例えば平均分子量が１０万以下）の場合、処理液にエタノールを添加するだけでは沈殿しにくく、回収率が低いという問題があった。【０００４】
また、特公平５−７７６８１号公報には、ヒアルロン酸を酸性水溶液中で分解した後にエタノールを加えてヒアルロン酸を沈殿させ、次いで濾過した各沈殿物をエタノールで洗浄して精製する方法が記載されている。しかしながら、この方法では、ヒアルロン酸の回収率が低いため、低分子のヒアルロン酸に関して、より効率の良い製造方法が求められている。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、低分子の精製ヒアルロン酸類を得ることができ、かつ、回収率が高い精製ヒアルロン酸類の製造方法を提供する。
【０００６】
本発明の一態様に係る精製ヒアルロン酸類の製造方法は、
平均分子量が４００〜１０万であるヒアルロン酸類を含むｐＨ３以下の溶液に水溶性有機溶媒を添加して、懸濁液を得る工程と、
前記懸濁液をｐＨ３．５〜８に調整して、精製ヒアルロン酸類を沈殿させる工程と、
を含む。
【０００７】
上記精製ヒアルロン酸類の製造方法において、前記水溶性有機溶媒を添加する前の前記溶液がｐＨ２以下であることができる。
【０００８】
上記精製ヒアルロン酸類の製造方法によれば、平均分子量が４００〜１０万であるヒアルロン酸類を含むｐＨ３以下の溶液に水溶性有機溶媒を添加して、懸濁液を得る工程と、前記懸濁液をｐＨ３．５〜８に調整して、精製ヒアルロン酸類を沈殿させる工程と、を含むことにより、低分子の精製ヒアルロン酸類を高い回収率にて得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の一実施形態に係る精製ヒアルロン酸類の製造方法について詳細に説明する。なお、本発明において「％」は「質量％」、「部」は「質量部」を意味する。
【００１０】
１．精製ヒアルロン酸類の製造方法
本実施形態に係る精製ヒアルロン酸類の製造方法は、平均分子量が４００〜１０万であるヒアルロン酸類を含むｐＨ３以下の溶液に水溶性有機溶媒を添加して、懸濁液を得る工程と、懸濁液をｐＨ３．５〜８に調整して、精製ヒアルロン酸類を沈殿させる工程と、を含む。
【００１１】
本実施形態に係る精製ヒアルロン酸類の製造方法は、ヒアルロン酸溶液を処理する工程の後に行うことができる。これにより、精製ヒアルロン酸類を沈殿によって、処理液中の他の成分と分離することができる。
【００１２】
ヒアルロン酸溶液を処理する工程としては、例えば、ヒアルロン酸および／またはその塩の抽出工程（例えば天然物からの抽出）、ヒアルロン酸および／またはその塩の生産工程（例えば、培養、化学合成、酵素合成）、ヒアルロン酸および／またはその塩の低分子化工程（例えば、酸性処理、塩基性処理、酵素（例えばヒアルロニダーゼ）処理、高圧処理、高温処理、機械的剪断処理、電子線照射処理）、ヒアルロン酸および／またはその塩の化学修飾工程（例えばヒアルロン酸および／またはその塩に含まれる官能基の化学修飾）が挙げられる。このうち、低分子化工程としては、本発明の懸濁液を得る工程における、ヒアルロン酸類を含む溶液のｐＨが３以下であることから、作業性を考慮して、ヒアルロン酸を酸性処理する工程であるのが好ましい。
【００１３】
あるいは、本実施形態に係る精製ヒアルロン酸類の製造方法は、ヒアルロン酸および／またはその塩に混在する不純物を低減することを目的として行ってもよい。
【００１４】
本発明において「精製ヒアルロン酸類」は、ヒアルロン酸類の含有量が９０％以上（好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上）であるものをいう。なお、本発明において「ヒアルロン酸類の含有量」は、後述のカルバゾール硫酸法によって測定されたグルクロン酸定量値から算出された値である。
【００１５】
精製ヒアルロン酸類の平均分子量は４００〜１０万であることが好ましく、４００〜５万であることがより好ましく、４００〜１万であることがさらに好ましい。
【００１６】
本実施形態に係る精製ヒアルロン酸類の製造方法によれば、精製ヒアルロン酸類の回収率が高く、かつ、精製ヒアルロン酸類の純度を簡便な方法にて高めることができる。
【００１７】
１．１．原料
本実施形態に係る精製ヒアルロン酸類の製造方法における原料は、平均分子量が好ましくは４００〜１０万（より好ましくは４００〜５万、さらに好ましくは４００〜１万）であるヒアルロン酸類である。ここで、「原料」とは、本実施形態に係る精製ヒアルロン酸類の製造方法の対象となるヒアルロン酸類を意味する。したがって、ヒアルロン酸溶液を処理する工程を行った後に、本実施形態に係る精製ヒアルロン酸類の製造方法を実施する場合、原料の平均分子量は、例えば、ヒアルロン酸溶液を処理する工程を行った後のヒアルロン酸類の平均分子量を意味する。よって、例えば、ヒアルロン酸溶液を処理する工程が低分子化である場合、低分子化する前のヒアルロン酸類の平均分子量は１０万より大きくてもよい（例えば４００〜３００万）。
【００１８】
原料であるヒアルロン酸類の平均分子量が１０万を超える場合、ｐＨ３以下に調整された溶液に水溶性有機溶媒を添加した際にゲル化し、懸濁相と上澄み相に分離しない場合がある。
【００１９】
本発明において、「ヒアルロン酸」とは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの二糖からなる繰り返し構成単位を１以上有する多糖類をいう。また、「ヒアルロン酸類」は、ヒアルロン酸およびヒアルロン酸誘導体ならびにそれらの塩を含む概念である。本発明において、「ヒアルロン酸誘導体」とは、ヒアルロン酸に含まれる官能基（例えば、水酸基、カルボキシル基、アミド基）が修飾された化合物であり、例えば、カチオン化ヒアルロン酸、アシル化ヒアルロン酸、アセチル化ヒアルロン酸などが挙げられる。また、「ヒアルロン酸の塩またはヒアルロン酸誘導体の塩」としては、特に限定されないが、食品または薬学上許容しうる塩であることが好ましく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００２０】
ヒアルロン酸は、基本的にはβ−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものでかつβ−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンとから基本的に構成され、２糖単位が複数個結合したものである。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４，５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。
【００２１】
原料であるヒアルロン酸および／またはその塩は、動物等の天然物（例えば鶏冠、さい帯、皮膚、関節液などの生体組織など）から抽出されたものでもよく、または、微生物もしくは動物細胞を培養して得られたもの（例えばストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法）、化学的または酵素的に合成されたものなどを使用することができる。
【００２２】
１．１．１．平均分子量
本発明において、（精製）ヒアルロン酸類の平均分子量は、以下の方法にて測定された値である。
【００２３】
即ち、約０．０５ｇの（精製）ヒアルロン酸類（本品）を精密に量り、０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液に溶かし、正確に１００ｍＬとした溶液及びこの溶液８ｍＬ、１２ｍＬ並びに１６ｍＬを正確に量り、それぞれに０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液を加えて正確に２０ｍＬとした溶液を試料溶液とする。この試料溶液および０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液につき、日本薬局方（第十四改正）一般試験法の粘度測定法（第１法毛細管粘度測定法）により３０．０±０．１℃で比粘度を測定し（式（１））、各濃度における還元粘度を算出する（式（２））。還元粘度を縦軸に、本品の換算した乾燥物に対する濃度（ｇ／１００ｍＬ）を横軸にとってグラフを描き、各点を結ぶ直線と縦軸との交点から極限粘度を求める。ここで求められた極限粘度をＬａｕｒｅｎｔの式（式（３））に代入し、平均分子量を算出する（Torvard C Laurent,Marion Ryan,and Adolph Pietruszkiewicz,”Fractionation of hyaluronic Acid”, Biochemina et Biophysica Acta.,42,476-485(1960)、四方田千佳子、「ヒアルロン酸ナトリウム製剤のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量評価」、国立衛研報、第121号，030-033(2003) ）。
（式１）
比粘度 ＝ {試料溶液の所要流下秒数)/(０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液の所要流下秒数)}−１
（式２）
還元粘度（ｄＬ／ｇ）＝ 比粘度/(本品の換算した乾燥物に対する濃度ｇ／１００ｍＬ))
（式３）
極限粘度（ｄＬ／ｇ）＝３．６×１０−４Ｍ０．７８
Ｍ：平均分子量
【００２４】
１．１．２．ヒアルロン酸類の含有量
（精製）ヒアルロン酸類において、ヒアルロン酸類の含有量は、（精製）ヒアルロン酸類の純度の指標であり、ヒアルロン酸類の含有量が多いほど、（精製）ヒアルロン酸類の純度が高いといえる。
【００２５】
本発明において、（精製）ヒアルロン酸類におけるヒアルロン酸類の含有量は、カルバゾール硫酸法（例えば日本薬局方）にて測定されたグルクロン酸定量値から算出された値である。
【００２６】
カルバゾール硫酸法は、ホウ酸ナトリウム・硫酸溶液中にヒアルロン酸水溶液を加えて混和し、ヒアルロン酸を加熱分解した後冷却し、カルバゾール・エタノール溶液を加えて混和し、加熱後放冷した試料液の吸光度（５３０ｎｍ）を測定する方法である。同様に処理したＤ−グルクロノラクトンを用いて検量線を作成し、Ｄ−グルクロノラクトン換算値を算出した後、１．１０２を乗じてグルクロン酸定量値を求める。得られたグルクロン酸定量値に（ヒアルロン酸類の分子量／グルクロン酸の分子量）を乗じてヒアルロン酸類の含有量を算出する。
【００２７】
１．２．懸濁液を得る工程
本実施形態に係る精製ヒアルロン酸類の製造方法では、原料である平均分子量が１０万以下であるヒアルロン酸類を含むｐＨ３以下の溶液に水溶性有機溶媒を添加することにより、懸濁液を得る。
【００２８】
本発明において、「懸濁液」とは、固体の微粒子が液体中に分散している混合物である。例えば、懸濁液では、液中に固体が分散していて液が濁っている状態であってもよいし、懸濁相と上澄み相とに分離していてもよい。後の工程において精製ヒアルロン酸類が沈殿しやすい点で、懸濁液は懸濁相と上澄み相とに分離していることが好ましい。
【００２９】
原料であるヒアルロン酸類を含む溶液の溶媒は水であることが好ましい。また、原料であるヒアルロン酸類を含む溶液は食塩等の無機塩を２％以下（好ましくは１％以下）含むものであってもよく、より好ましくは前記溶液の無機塩の濃度は１％未満である。
【００３０】
原料であるヒアルロン酸類を含む溶液において、ヒアルロン酸類の濃度は特に限定するものではないが、回収の効率を高める観点から、０．１〜３０％が好ましく、１〜１０％がより好ましい。
【００３１】
懸濁液を得る工程において、水溶性有機溶媒は、溶液が懸濁液へと変化するのに少なくとも必要な量が添加されればよい。水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどのアルコール系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等を挙げることができ、これらを単独でまたは組み合わせて使用することができる。このうち、エタノールが好ましい。
【００３２】
水溶性有機溶媒の添加量は、ヒアルロン酸類を含む溶液１部に対して、１部以上、好ましくは１．５〜５０部、より好ましくは１．５〜２０部である。この場合、水溶性有機溶媒の添加量がヒアルロン酸類を含む溶液１部に対して１部未満であると、懸濁が生じ難くなる。
【００３３】
また、懸濁液を得る工程において、水溶性有機溶媒を添加する前の溶液はｐＨ３以下であり、好ましくはｐＨ０．１〜２．５、より好ましくはｐＨ０．１〜２である。水溶性有機溶媒を添加する前の溶液のｐＨが３を超えると、水溶性有機溶媒を加えても懸濁が生じにくく、後の工程で溶液のｐＨを３．５〜８に調整しても、精製ヒアルロン酸類が沈殿しにくい。また、水溶性有機溶媒を添加する前の溶液のｐＨが低すぎると、後の工程で溶液のｐＨを３．５〜８に調整する際に多量の塩が生成するため、好ましくない場合がある。
【００３４】
１．３．ヒアルロン酸類を沈殿させる工程
本実施形態に係る精製ヒアルロン酸類の製造方法において、懸濁液をｐＨ３．５〜８に調整して、精製ヒアルロン酸類を沈殿させる。この場合、懸濁液のｐＨが３．５〜８の範囲を外れると、精製ヒアルロン酸類が沈殿するのが困難になる。また、より高い回収率を達成できる点で、懸濁液をｐＨ４〜７に調整するのが好ましく、ｐＨ４〜６に調整するのがより好ましい。
【００３５】
２．実施例
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【００３６】
２．１．試験方法
本実施例において、（精製）ヒアルロン酸類の平均分子量は、上述の実施形態で説明された方法で測定された。また、（精製）ヒアルロン酸類の含有量は、カルバゾール硫酸法によって測定されたグルクロン酸定量値から算出された。
【００３７】
２．２．実施例１
水２Ｌに塩酸を加えて、ｐＨを０．３に調整し、７０℃まで加温した。７０℃達温後、ヒアルロン酸（平均分子量３０万、キユーピー株式会社製）１００ｇを投入し、７０℃で２時間酸分解させた。その後、反応液を常温まで冷却し、エタノール５Ｌを少しずつ加えてヒアルロン酸を懸濁相と上澄み相に分離させた。次いで、水酸化ナトリウムでｐＨを５．０に調整し、ヒアルロン酸を沈殿させ、沈殿物をろ過にて回収し、８０％（ｖ/ｖ）エタノール５００ｍＬで３回洗浄した。得られた沈殿物を６０℃で真空乾燥させて、精製ヒアルロン酸を得た。
【００３８】
実施例１で得られた精製ヒアルロン酸の平均分子量は８，０００であり、ヒアルロン酸含有量は９５．４％であった。なお、エタノール添加前の処理液のｐＨは０．３であった。
【００３９】
２．３．実施例２
ヒアルロン酸含有量が９１．１％であるヒアルロン酸（平均分子量３，０００、キユーピー株式会社製）５．０ｇを水５００ｍＬに溶解させ、塩酸にてｐＨ１．０に調整した。次いで、エタノール１０Ｌを撹拌しながらゆっくり添加し、ヒアルロン酸を懸濁相と上澄み相に分離させた。次いで、水酸化ナトリウムでｐＨを５．０に調整し、ヒアルロン酸を沈殿させ、沈殿物をろ過にて回収し、８０％（ｖ/ｖ）エタノール１００ｍＬで３回洗浄した。得られた沈殿物を６０℃で真空乾燥させて、精製ヒアルロン酸を得た。
【００４０】
実施例２で得られた精製ヒアルロン酸の平均分子量は３，０００であり、ヒアルロン酸含有量は９７．１％であった。
【００４１】
２．４．試験例１
実施例２において、原料として用いるヒアルロン酸の平均分子量およびエタノール添加前の処理液のｐＨ、沈殿前の処理液のｐＨを表１に示すものにした以外は、実施例２と同様の方法で精製ヒアルロン酸（Ｎｏ．１〜１８、実施例２の精製ヒアルロン酸はＮｏ．３）を製した。なお、処理液のｐＨ調整は、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて行った。また、沈殿が生じたＮｏ．１〜５、Ｎｏ．８〜１２、Ｎｏ．１５〜１７の精製ヒアルロン酸のヒアルロン酸含有量はいずれも９５％以上であり、平均分子量は原料ヒアルロン酸のそれと変わらないものであった。
【００４２】
Ｎｏ．１〜１８の精製ヒアルロン酸の水溶性有機溶媒添加後およびｐＨ調整後それぞれにおける処理液の状態を以下の指標にて評価した。
Ａ  ：水溶性有機溶媒添加後に懸濁相と上澄み相に分離し、ｐＨ調整後に沈殿した。
Ｂ１：水溶性有機溶媒添加後に懸濁相と上澄み相に分離し、ｐＨ調整後にやや沈殿し難かったが問題とならない程度であった。
Ｃ１：水溶性有機溶媒添加後に懸濁相と上澄み相に分離せず、ｐＨ調整後も沈殿しなかった。
Ｂ２：水溶性有機溶媒添加後に懸濁相と上澄み相に分離したが、溶液がややゲル化し、ｐＨ調整後にやや沈殿し難かったが問題とならない程度であった。
Ｃ２：水溶性有機溶媒添加後に懸濁相と上澄み相に分離せず、溶液がゲル化し、ｐＨ調整後も沈殿しなかった。
Ｃ３：水溶性有機溶媒添加直後に懸濁相と上澄み相に分離したが、ｐＨ調整後に沈殿しなかった。
【００４３】
【表１】
2011070948.tif 000002
【００４４】
２．５．実施例３
実施例１の精製ヒアルロン酸の製造方法において、反応液を冷却した後に加えたエタノールをアセトンに変更した以外は実施例１と同様の方法で精製ヒアルロン酸を製した。
【００４５】
実施例３で得られた精製ヒアルロン酸の平均分子量は８，０００であり、ヒアルロン酸含有量は９６．０％であった。
【００４６】
２．６．実施例４
実施例２の精製ヒアルロン酸の製造方法において、原料として用いるヒアルロン酸を溶解する水を１％食塩水に変更した以外は、実施例２と同様の方法で精製ヒアルロン酸を製した。
【００４７】
実施例４で得られた精製ヒアルロン酸の平均分子量は３，０００であり、ヒアルロン酸含有量は９４．０％であった。
【００４８】
２．７．実施例５
実施例２の精製ヒアルロン酸の製造方法において、原料として用いるヒアルロン酸を溶解する水を２％食塩水に変更した以外は、実施例２と同様の方法で精製ヒアルロン酸を製した。なお、実施例１〜３でエタノール添加前の処理液の食塩濃度は１％未満である。
【００４９】
実施例５で得られた精製ヒアルロン酸の平均分子量は３，０００であり、ヒアルロン酸含有量は９１．９％であった。
【００５０】
２．８．実施例６
１Ｌ容ビーカーに、ヒアルロン酸ナトリウム（キユーピー株式会社製、平均分子量８０００）２０ｇ、５％水酸化ナトリウム２０ｍＬ、水１８０ｍＬ、およびグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＴＡ（有効成分約８０％、水分約２０％））３０ｍＬを添加し、撹拌子を用いて撹拌しながら、４０℃で１時間反応させた。
【００５１】
反応終了後、塩酸にてｐＨ１．０に調整した。次いで、エタノール８００ｍＬを撹拌しながらゆっくり添加し、ヒアルロン酸を懸濁相と上澄み相に分離させた。次いで、水酸化ナトリウムでｐＨを４．０に調整し、ヒアルロン酸を沈殿させ、沈殿物をろ過にて回収し、８０％エタノール５００ｍＬで３回洗浄した。得られた沈殿物を６０℃で真空乾燥させて、精製カチオン化ヒアルロン酸を得た。
【００５２】
実施例６で得られた精製カチオン化ヒアルロン酸の平均分子量は６，０００であり、カチオン化ヒアルロン酸の含有量は９５．６％であった。
【００５３】
本発明に係る実施の形態の説明は以上である。本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【手続補正書】
【提出日】平成23年7月26日(2011.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製ヒアルロン酸類の製造方法であって、
ヒアルロン酸類は平均分子量が４００〜１０万であって、かつ、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはこれらの塩であり、
前記ヒアルロン酸類は、
ｐＨ３以下の溶液に溶解する性質と、
該ヒアルロン酸類が溶解した該ｐＨ３以下の溶液１質量部に対して２．５〜２０質量部の範囲内のいずれかの量の水溶性有機溶媒を添加した場合に該ｐＨ３以下の溶液が懸濁する性質と、
を有し、
前記ヒアルロン酸類が溶解したｐＨ３以下の溶液に水溶性有機溶媒を添加して、懸濁液を得る工程と、
前記懸濁液をｐＨ３．５〜８に調整して、精製ヒアルロン酸類を沈殿させる工程と、
を含み、
前記水溶性有機溶媒は、アルコール系溶媒および／またはケトン系溶媒である、精製ヒアルロン酸の製造方法。
【請求項２】
前記水溶性有機溶媒を添加する前の前記溶液がｐＨ２以下である、請求項１記載の精製ヒアルロン酸類の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
反応終了後、塩酸にてｐＨ１．０に調整した。次いで、エタノール８００ｍＬを撹拌しながらゆっくり添加し、懸濁相と上澄み相に分離させた。次いで、水酸化ナトリウムでｐＨを４．０に調整し、沈殿物を生じさせ、該沈殿物をろ過にて回収し、８０％エタノール５００ｍＬで３回洗浄した。得られた沈殿物を６０℃で真空乾燥させて、精製カチオン化ヒアルロン酸を得た。
【国際調査報告】
2011070948.tif 000003
2011070948.tif 000004
2011070948.tif 000005
2011070948.tif 000006