(57)【要約】  穏和な条件にて短時間で標的材料を効率良く単離することができるアビジン又はストレプトアビジンとビオチン誘導体の解離方法及び解離剤を提供する。  アビジン又はストレプトアビジンとビオチン誘導体の解離方法は、アビジン又はストレプトアビジンとデスチオビオチンの結合体と、ビオチン又はその誘導体が結合した水溶性高分子を混合することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アビジンとアビジンに対する親和性がビオチンよりも低いビオチン誘導体（１）の結合体又はストレプトアビジンと前記ビオチン誘導体（１）の結合体（以下、総称して「アビジン−ビオチン複合体」という。）と、ビオチン又はその誘導体（２）が結合した水溶性高分子（以下、「解離剤」という。）を混合する工程を有する、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン誘導体（１）を解離させる方法。
【請求項２】
前記ビオチン誘導体（１）が、ビオチンの環状構造部分においてビオチンと相違する誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビオチン誘導体（１）が、デスチオビオチン、２−イミノビオチン、３，４−ジアミノビオチンから選択される１種以上である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記解離剤の分子量が、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーで測定したポリスチレン換算数平均分子量として１，０００〜１，０００，０００である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記解離剤が、１分子当たり平均で２〜２，０００個のビオチン又はその誘導体（２）が結合した水溶性高分子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記解離剤は、水溶性タンパク、水溶性多糖又は水溶性有機合成高分子のいずれかとビオチン又はその誘導体（２）の結合体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ビオチン誘導体（２）が、ビオチンの環状構造部分についてはビオチンと同一の構造を有する誘導体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アビジン−ビオチン複合体は、不溶性担体に固定化したアビジン若しくはストレプトアビジンとビオチン誘導体の結合体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
標的物質を分離する方法であって、
捕捉用担体と標的物質とを水系溶剤中で混合して混合液１を得る工程、
混合液１とビオチン又はその誘導体（２）が結合した水溶性高分子とを混合して混合液２を得る工程、
混合液２から標的物質を分離する工程を含む、方法。
ただし、捕捉用担体は、下記（Ａ）と（Ｂ）との結合物である。
（Ａ）不溶性担体に固定化したアビジン若しくはストレプトアビジン
（Ｂ）標的物質に対して特異的親和性を有する物質（以下、「プローブ分子」という。）に固定化した、アビジンに対する親和性がビオチンよりも低いビオチン誘導体（１）
【請求項１０】
前記標的物質が細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ビオチン又はその誘導体（２）が結合した水溶性高分子を含有する、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン誘導体（１）を解離するために用いられる解離剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン誘導体の解離方法及び解離剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アビジン又はストレプトアビジン（以下、「アビジン等」という。）がビオチン又はビオチン誘導体と強い特異的親和性を有しており、両者を生理的条件下に混合すると容易に結合（アビジン等とビオチンとの結合又はアビジン等とビオチン誘導体との結合を総称して「ＡＢＣ結合」という。）を形成してアビジン等とビオチンとの結合体を形成することを利用して、細胞などの標的物質（「標的材料」ともいう。）を分離する技術が利用されている（特許文献１）。
例えば、標的物質と結合性を有する抗体等のプローブ分子にビオチンを予め結合させたビオチン標識プローブ分子と、アビジン等が固定化された不溶性担体とを生理的条件下に混合してＡＢＣ結合を形成させることにより標的物質の捕捉用担体を調製し、この捕捉用担体を用いて標的物質を捕捉することが可能であり、その後にＡＢＣ結合又はプローブ分子と標的物質の結合を切断することができれば標的物質を分離することが可能である（特許文献１）。【０００３】
しかし、アビジン等とビオチンとの親和性は極めて高いため、生理的条件下でＡＢＣ結合を切断することは非常に困難であり、アビジン等とビオチン誘導体を解離させるには、例えば、ｐＨ１．５程度のグアニジン塩酸塩で処理するか、還元剤を添加したＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動用の緩衝液を用いて煮沸するなど、過激な条件が必要である。このため、タンパクや細胞など、極端なｐＨや熱や塩濃度、あるいは物理的な剪断力によってダメージを受けるような標的物質を分離対象とする場合には、生理活性を保持した状態で標的物質を分離することは、一般に困難であった。
このため、標的物質を分離し易くするため、アビジン等に対する親和性がビオチンよりも低いビオチン誘導体を用いる方法（特許文献２）、ビオチンに対する親和性がアビジンよりも低いアビジン変異体を用いる方法（特許文献３）が知られている。例えば、ビオチンに替えて、アビジン等に対する親和性がビオチンよりも低いデスチオビオチンなどのビオチン誘導体（特許文献２）を用いて上記捕捉用担体を調製し、標的物質を捕捉した後、大量のビオチンを添加することによって、ＡＢＣ結合を切断し、標的物質を分離する方法が知られている。この場合、ビオチンは、デスチオビオチンとアビジン等の結合に対する競合阻害剤として機能しているものと考えられている。しかし、ビオチンを競合阻害剤として用いるこの方法では、ＡＢＣ結合を効率良く切断することは難しく、標的物質を効率良く分離することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１０−５１２５３７号公報
【特許文献２】特開平０２−１８４６７７号公報
【特許文献３】特開平１０−０２８５８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、穏和な条件にて短時間でアビジン等と前記親和性がビオチンよりも低いビオチン誘導体を効率良く解離させる方法及びその解離剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、アビジン等と前記親和性がビオチンよりも低いビオチン誘導体とを効率良く解離させる手段を見出すべく種々検討した結果、全く意外にも、ビオチン等を結合させた水溶性高分子を解離剤として用いれば、穏和な条件下で極めて効率良く、アビジン等と前記親和性がビオチンよりも低いビオチン誘導体とが解離することを見出し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、アビジンとアビジンに対する親和性がビオチンよりも低いビオチン誘導体（１）の結合体又はストレプトアビジンと前記ビオチン誘導体（１）の結合体（以下、総称して「アビジン−ビオチン複合体」という。）と、ビオチン又はその誘導体（２）が結合した水溶性高分子（以下、「解離剤」という。）を混合する工程を有する、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン誘導体（１）を解離させる方法を提供するものである。【０００８】
また本発明は、標的物質を分離する方法であって、
（ａ）捕捉用担体と標的物質とを水系溶剤中で混合して混合液１を得る工程、
（ｂ）混合液１とビオチン又はその誘導体（２）が結合した水溶性高分子とを混合して混合液２を得る工程、
（ｃ）混合液２から標的物質を分離する工程を含む、方法を提供するものである。
ただし、捕捉用担体は、下記（Ａ）と（Ｂ）との結合物である。
（Ａ）不溶性担体に固定化したアビジン若しくはストレプトアビジン
（Ｂ）標的物質に対して特異的親和性を有する物質（以下、「プローブ分子」という。）に固定化した、アビジンに対する親和性がビオチンよりも低いビオチン誘導体（１）【０００９】
さらに、本発明は、ビオチン又はその誘導体（２）が結合した水溶性高分子を含有する、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン誘導体（１）を解離するために用いられる解離剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明方法によれば、アビジン等とビオチン誘導体（１）との結合を穏和な条件にて短時間で効率良く切断してアビジン等とビオチン誘導体（１）を解離させることができる。また、同方法を標的物質の分離に適用することにより、捕捉用担体に結合させて得た標的物質を容易に分離することができる。標的物質がタンパクや細胞など温度条件やｐＨ条件などに対して不安定である場合であっても、本発明方法を用いることによりその活性を保持した状態で標的物質を分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一態様において用いられる捕捉用担体が標的細胞と結合した状態を示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の一実施形態に係るアビジン等とビオチン誘導体（１）の解離方法及び解離剤について、具体的に説明する。
（アビジン等とビオチン誘導体の解離方法）
本発明の一実施形態に係るアビジン等とビオチン誘導体（１）の解離方法は、アビジン−ビオチン複合体と、ビオチン又はその誘導体（２）が結合した水溶性高分子とを混合する工程を有する。本発明の解離方法は、通常、水を主成分とする溶媒中で行われる。その場合、アビジン−ビオチン複合体は当該溶媒に溶解していることが好ましいが、アビジン−ビオチン複合体が不溶性の担体に結合している場合等においてはアビジン−ビオチン複合体はその担体と共に溶媒中に分散されていてもよい。
【００１３】
（アビジン−ビオチン複合体）
本発明で使用されるアビジン−ビオチン複合体は、アビジン又はストレプトアビジンと、アビジンに対する親和性がビオチン（下記式（３）で表される化合物）よりも低いビオチン誘導体（３）の結合体である。ここで、アビジン又はストレプトアビジンは、一般に市販されているものを用いることができ、これらは、自然界に存在するものを分離・精製したものでもよく、あるいは、遺伝子工学的技術によって人工的に生産されたものであってもよく、ビオチンに対する結合能を失わない範囲で改変されたアビジン又はストレプトアビジンの誘導体であってもよい。アビジン又はストレプトアビジンの誘導体としては、例えば、スクシニル化等の化学的に修飾したアビジン又はストレプトアビジン、通常は４量体であるアビジン又はストレプトアビジンの単量体等が挙げられる。
【００１４】
【化１】
2011034115.tif 000002
【００１５】
ビオチン誘導体（１）としては、アビジンに対する親和性がビオチンよりも低いビオチン誘導体であれば特に限定されない。アビジンに対する親和性がビオチンよりも低いことにより、アビジン−ビオチン複合体をビオチン又はその誘導体（２）が結合した水溶性高分子と混合することにより効果的にアビジン等とビオチン誘導体（１）を解離することができる。
このようなビオチン誘導体（１）としては、例えば、デスチオビオチン（下記式（４）で表される化合物）、２−イミノビオチン（下記式（５）で表される化合物）、３，４−ジアミノビオチン（下記式（６）で表される化合物）等のビオチンの環状構造部分においてビオチンと相違する誘導体、及びこれらの化学修飾物等が挙げられる。
【００１６】
【化２】
2011034115.tif 000003
【００１７】
アビジンに対する親和性がビオチンよりも低いとは、結合定数がアビジンとビオチンのそれ（１０１５Ｍ）よりも１オーダー以上小さいことを意味する。例えば上記式（４）〜（６）で表される化合物とアビジンとの結合定数は１０６Ｍ〜１０１３Ｍである。
【００１８】
（不溶性担体に固定化されたアビジン−ビオチン複合体）
本発明で使用されるアビジン−ビオチン複合体は、アビジン等を介して不溶性担体に固定化されていてもよい。アビジン−ビオチン複合体が不溶性担体に固定化されていることにより、アビジン−ビオチン複合体を含む分散液から遠心分離、ろ過等の方法によりアビジン−ビオチン複合体を容易に分離することができる。
アビジン等を固定化するために使用する不溶性担体としては、その形状は特に限定されないが、例えば、有機若しくは無機の粒子、平板状基板、微細流路を有する基板、マイクロウェルプレート等が挙げられる。このうち、有機粒子としては、平均粒子径が０．５〜１０μｍのポリスチレン等を主成分とする有機合成高分子からなる粒子が好ましい。さらに、磁気による分離が可能である点で、粒子は磁性粒子であることが好ましい。
磁性粒子の市販品としては、例えば、Dynabeads M-450 Tosylactivated（Invitrogen社製）や、Magnosphere MS300/Carboxyl（ＪＳＲ株式会社製）等が挙げられる。磁性粒子は、公知の方法（例えば、特公平０５−０１０８０８号、又は、特開２００７−２８８１３３号など参照）に従って製造されることが好ましく、タンパクや細胞などの非特異吸着を低減することができる。
【００１９】
アビジン等の不溶性担体への固定化方法としては、特に限定されず、公知の方法（例えば特開２００１−１５８８００号公報参照）を用いることができる。例えば、カルボキシル基を表面に有する不溶性担体を用いる場合、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤の存在下で、アビジン等の分子中のアミノ基を、担体表面のカルボキシル基に反応させてアミド結合を形成することにより、アビジン等を不溶性担体に固定化することができる。このような方法においては、予め、担体が有するカルボキシル基に脱水縮合剤を反応させ、その後、アビジン又はストレプトアビジンを加えて反応させることもできる。
【００２０】
（捕捉用担体）
本発明で使用されるアビジン−ビオチン複合体は、下記（Ａ）と（Ｂ）との結合物（以下、「捕捉用担体」という。）であってもよい。
（Ａ）不溶性担体に固定化したアビジン若しくはストレプトアビジン
（Ｂ）標的物質に対して特異的親和性を有する物質（以下、「プローブ分子」という。）に固定化したビオチン誘導体（１）
【００２１】
プローブ分子としては、特に限定されないが、例えば、標的物質に対する抗体、レクチン、酵素等のタンパクの他、糖類等が挙げられる。プローブ分子は、標的物質と特異的に結合しうる性質を有し、ビオチン誘導体（１）と結合している。プローブ分子とビオチン誘導体（１）は、直接に結合していてもよいし、スペーサーを介して結合していてもよい。
プローブ分子に固定化するビオチン誘導体（１）は、アビジンに対する親和性が、アビジン−ビオチン複合体の項に記載したビオチンよりも低いビオチン誘導体（１）である。
プローブ分子にビオチン誘導体（１）を結合する方法としては、特に限定されないが、例えば、上述のアビジン等を担体の表面に固定化する方法と同様の方法を用いることができる。例えば、アミノ基を有するプローブ分子を用いる場合、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤の存在下で、ビオチンの分子中のカルボキシル基を、プローブ分子中のアミノ基に反応させてアミド結合を形成することにより、ビオチン結合プローブ分子を得ることができる。
【００２２】
アビジン−ビオチン複合体として分離用担体を用いることにより、アビジン−ビオチン複合体が標的物質に特異的に結合するため、捕捉用担体に結合した標的物質を特異的に分離することができる。
図１に、標的物質と結合した捕捉用担体の概念図を示す。
【００２３】
（標的物質）
標的物質としては、特に限定されないが、例えば、細胞（例えば、細菌、真菌、動物又は植物の各種細胞）、ウイルス、タンパク（例えば、各種抗原又は抗体、酵素）、１本鎖若しくは２本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ等の核酸、エストロゲン等のステロイド脂質、糖脂質、多糖等が挙げられる。標的物質である細胞（以下、「標的細胞」という。）の具体例としては、特に限定されないが、例えば、正常細胞（例えば造血幹細胞などの幹細胞、白血球などの血球細胞等）、がん細胞（例えば、乳がんや肺がんなどに由来する末梢血中の循環がん細胞、大腸がんなどに由来する糞便中に存在する剥離がん細胞、子宮がんなどに由来する経血中のがん細胞、尿中に存在する膀胱がんなどに由来するがん細胞等）が挙げられる。本発明の標的物質を分離する方法によって、標的物質の分離を効率よく行うことができる。
【００２４】
（解離剤）
本発明のアビジン等とビオチン誘導体（１）の解離方法において、アビジン−ビオチン複合体と、ビオチン又はその誘導体（２）が結合した水溶性高分子（以下、「解離剤」ともいう。）を混合することにより、アビジン等とビオチン誘導体（１）との結合を切断して、アビジン等とビオチン誘導体（１）を解離させることができる。
【００２５】
解離剤としては、ビオチンが結合した水溶性高分子が最も好ましい。
解離剤において用いることができるビオチン誘導体（２）としては、ビオサイチン（biocytin：ビオチン−ε−Ｎ−リジン；下記式（７）で表される化合物）、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（下記式（８）で表される化合物）、下記式（９）で表される化合物（Biotinyl-3,6,9-trioxaundecanediamine）等のビオチンの環状構造部分についてはビオチンと同一の構造を有する誘導体又はアビジン−ビオチン誘導体の項に記載したビオチンの環状構造部分においてビオチンと相違する誘導体を挙げることができる。これらの中では、ビオチンの環状構造部分についてはビオチンと同一の構造を有する誘導体が、アビジンとの親和性が強いため好ましい。
【００２６】
【化３】
2011034115.tif 000004
【００２７】
アビジン等とビオチン誘導体（１）を解離させるためには、例えば、アビジン−ビオチン複合体を含有する液状試料に、生理的条件下で解離剤を添加して混和すればよい。生理的条件下としては、例えば、２０〜４０℃、約１気圧、ｐＨ５〜９等の条件が好ましい。
【００２８】
本発明の解離剤を用いることにより、アビジン等とビオチン誘導体（１）を効率的に解離させることができる。アビジン−ビオチン複合体を含有する水系試料に解離剤を添加すると、解離剤に含まれるアビジン又はその誘導体（２）がアビジン等に結合しているビオチン誘導体（１）と競合して、アビジン等とビオチン誘導体（１）を解離させることができる。そして、ビオチン又はその誘導体（２）が水溶性高分子に結合した解離剤は、理由は必ずしも明らかではないが、水溶性高分子等に結合していないビオチン又はその誘導体（２）よりも効率的にアビジン等とビオチン誘導体（１）を解離させることができる。
【００２９】
水溶性高分子としては、水溶性の高分子であってビオチン又はその誘導体（２）と結合することができる限り特に限定されないが、ビオチンの有するカルボキシル基を用いて水溶性高分子と結合するためのアミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシル基等の官能基を有する水溶性高分子が好ましく、例えば、水溶性タンパク、多糖の他、アミノ基等の反応性官能基を有する有機合成高分子が挙げられる。水溶性タンパクとしては、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）などが好ましい。多糖としては、例えば、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、キトサンなどが挙げられる。反応性官能基を有する有機合成高分子としては、例えば、ＰＡＡ（ポリアクリル酸）、ポリアリルアミンなどの合成高分子、ポリリジン、ポリアスパラギン酸などのポリアミノ酸が好ましい。
【００３０】
本発明において、「水溶性」とは、１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したときに、白濁することなく溶解する性質をいう。
【００３１】
また、ビオチン結合水溶性高分子の分子量には特に制限は無いが、１,０００〜１００万であることが好ましい。ビオチン結合水溶性高分子の分子量を上記範囲内とすることで、アビジン−ビオチン複合体を高効率に解離することができる。ビオチン結合水溶性高分子の分子量は、例えばゲルパーミエーションクロマトグラフィーで測定することができる。
【００３２】
水溶性高分子１分子当たりに結合しているビオチン又はその誘導体（２）の分子数の平均値は、水溶性が失われない範囲で、可能な限り多いことが好ましく、２〜２，０００個であることがより好ましく、５〜１，０００個であることがさらに好ましく、１０〜１００個であることが特に好ましい。水溶性高分子１分子当たりに結合するビオチン又はその誘導体（２）が多いほど、アビジン等とビオチン誘導体（１）の解離効率を高めることができる。水溶性高分子１分子当たりに結合しているビオチン又はその誘導体（２）の分子数の平均値は、後述する実施例に記載された方法（ＨＡＢＡ法）にて測定することができる。
【００３３】
水溶性高分子にビオチン又はその誘導体（２）を結合する方法としては、例えば、カルボキシル基及びアミノ基のうち少なくとも１種を有する水溶性高分子に、ビオチン又はその誘導体（２）を反応させて得る方法が挙げられる。水溶性高分子がアミノ基を含む場合、水溶性高分子中のアミノ基とビオチンのカルボキシル基とを脱水縮合する方法が挙げられる。水溶性高分子がカルボキシル基を含む場合、水溶性高分子中のカルボキシル基と、アミノ基を持つビオチン誘導体のアミノ基とを脱水縮合する方法が挙げられる。
【００３４】
（標的物質を分離する方法）
本発明の標的物質を分離する方法は、（ａ）捕捉用担体と標的物質とを水系溶剤中で混合して混合液１を得る工程、（ｂ）混合液１とビオチン又はその誘導体（２）が結合した水溶性高分子とを混合して混合液２を得る工程、（ｃ）混合液２から標的物質を分離する工程を含む。ここで、捕捉用担体は、
（Ａ）不溶性担体に固定化したアビジン若しくはストレプトアビジンと（Ｂ）標的物質に対して特異的親和性を有する物質（以下、「プローブ分子」という。）に固定化したビオチン誘導体（２）との結合物である。
【００３５】
（捕捉用担体と標的物質とを水系溶剤中で混合して混合液１を得る工程）
本工程は、捕捉用担体と標的物質を結合させる工程である。具体的には、捕捉用担体と標的物質とを混合することにより、捕捉用担体に含まれるプローブ分子と標的物質又は標的物質中に含まれるプローブ分子と親和性を有する分子が特異的に結合する。
捕捉用担体及び標的物質については、前述の通りである。水系溶剤としては、ｐＨ５〜９の水を主たる溶媒として含む溶剤が好ましく、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液などの緩衝液がさらに好ましい。
捕捉用担体と標的物質を混合するには、水系溶剤に分散した捕捉用担体と、同一又は異なる水系溶剤に溶解又は分散した標的物質とを混合することが好ましい。混合後は、１０〜４０℃で１〜６０分間混和することが好ましい。このような条件で混和することにより、捕捉用担体と標的物質が効率よく結合する。
混合する捕捉用担体の量は、試料中に含まれる標的物質の量により適宜調節することができる。
【００３６】
（混合液１とビオチン又はその誘導体が結合した水溶性高分子とを混合して混合液２を得る工程）
本工程は、解離剤を添加して捕捉用担体中のアビジン等とビオチン誘導体（１）との結合を切断し、アビジン等とビオチン誘導体（１）を解離させる工程である。混合液１と解離剤を混合するには、水系溶剤に溶解した解離剤の溶液と混合液１を混合することが好ましい。混合後は、１０〜４０℃で１〜６０分間混和することが好ましい。このような条件で混和することにより、アビジン等とビオチン誘導体（１）が効率よく解離する。
本工程は、混合液２から捕捉用担体を分離する工程を含んでもよい。捕捉用担体が磁性粒子を含む場合には、磁気スタンドを用いて簡便に捕捉用担体を分離することができる。
【００３７】
（混合液２から標的物質を分離する工程）
本工程は、混合液２に含まれる標的物質を分離する工程であり、本工程により標的物質は不溶性担体等から分離される。本工程は、任意の方法により行うことができるが、捕捉用担体が磁性粒子を含む場合には、磁気スタンドを用いて簡便に捕捉用担体を分離することができる。捕捉用担体が磁性粒子を含まない場合には、標的物質を沈降させない程度の遠心条件で遠心分離する方法や、標的物質を捕捉しない程度の孔径を有するフィルターでろ過する等の方法を用いることができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。【００３９】
［調製例１］：デスチオビオチン結合プローブ分子（抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体）の作製
デスチオビオチン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）５ｍｇを０．５ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。この溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ塩酸塩）を各５．３６ｍｇ（デスチオビオチンのカルボキシル基に対して１．２等量）加え、室温で６０分間反応した。この反応液から３μｌを分け取り、１ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解した上皮特異抗原であるＥｐ−ＣＡＭに対する抗体（抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体：clone Ber-EP4、ダコインターナショナル社より購入）２ｍｇに加え、さらに室温で３．５時間反応した。未反応のデスチオビオチンを限外ろ過で除去し、デスチオビオチン結合抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体を得た。【００４０】
［調製例２］：アビジン−ビオチン複合体（捕捉用担体）の調製
ストレプトアビジン磁性粒子（Invitrogen社 Dynabeads M-280 Streptavidin）１ｍｇ及び調製例１で得られたデスチオビオチン結合抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体２μｇをテストチューブに取り、ＰＢＳ中で３０分間混合し、ストレプトアビジンとデスチオビオチンを結合させた。次いで、磁気スタンドを使って反応液中から磁気粒子を分離し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄して未反応のデスチオビオチン結合プローブ分子を除去して、デスチオビオチン結合プローブ分子とストレプトアビジン磁性粒子が結合したアビジン−ビオチン複合体（捕捉用担体）を得た。【００４１】
［調製例３］：解離剤の調製（１）（ビオチンが結合したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の合成）
ビオチン（分子量：２４４．３１）２００ｍｇをジメチルスルホキシド２．７６ｍｌに溶解し、ＮＨＳ及びＥＤＣ塩酸塩を１７３ｍｇ（ビオチンのカルボキシル基に対して１．１等量）加えて６０分間室温で反応した。この反応液から０．５０８ｍｌ、１．２７ｍｌを分け取り、それぞれ１ｇのＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に溶解した溶液に加え、さらに室温で３．５時間反応した。未反応のビオチンを限外ろ過で除去し、水溶性のビオチン結合ＢＳＡを得た。以上により、ＢＳＡ１分子当たり平均で、それぞれ６分子のビオチンが結合した解離剤（ＢＳＡ−Ｂｉｏｔｉｎ６という。）及び１０分子のビオチンが結合した解離剤（ＢＳＡ−Ｂｉｏｔｉｎ１０という。）が得られた。ＢＳＡに結合したビオチン量は、グリーンらによるＨＡＢＡ法（4-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid、N.M.Green, Methods in Enzymology, vol.18, p418-424, 1970）に従って定量した。【００４２】
［調製例４］：解離剤の調製（２）（ビオチン誘導体が結合したポリアクリル酸の合成）
分子量２５万のポリアクリル酸（ＰＡＡ、和光純薬工業製）０．１ｇを５ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に溶解し、ＥＤＣ塩酸塩を１３３ｍｇ（ポリアクリル酸のカルボキシル基に対して０．５等量）加えた。続いて、アミノ基を有するビオチン誘導体である前記式（７）で表される化合物（Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ−ＬＣ−Ａｍｉｎｅ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のジメチルスルホキシド溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．８３５ｍｌ又は１．６７ｍｌ加え、さらに室温で３．５時間反応した。未反応のビオチンを限外ろ過で除去し、水溶性のビオチン結合ＰＡＡを得た。ＰＡＡに結合したビオチンの定量をＨＡＢＡ法に従って行った。以上により、ＰＡＡ１分子当たり平均で１５分子のビオチン誘導体が結合した解離剤（ＰＡＡ−Ｂｉｏｔｉｎ１５という。）、ＰＡＡ１分子当たり平均で４０分子のビオチン誘導体が結合した解離剤（ＰＡＡ−Ｂｉｏｔｉｎ４０という。）が得られた。【００４３】
［調製例５］標的細胞の調製
ＨＴ−２９細胞（標的細胞）を培養している培養皿から培地を取り除き、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ１ｍｌを加え、３７℃で５分間保持して細胞を培養皿から剥がした後、ピペッティングで単細胞に分離し、ＰＢＳで希釈して２．０×１０５細胞／ｍｌの細胞濃度の細胞分散液を得た。ＨＴ−２９細胞は、Ｅｐ−ＣＡＭ抗原を発現している。【００４４】
［細胞数の測定］
細胞数は、ゲノムＤＮＡ量を定量ＰＣＲ法により測定して求めた。
（１）捕捉用担体に結合した細胞数の測定
各実施例・比較例で得られた捕捉用担体と標的細胞の結合体の全量に０．８ｍｇ／ｍｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（タンパク分解酵素；ＱＩＡＧＥＮ社製）の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）溶液を５０μｌ加え、５５℃で１５分加熱し、ＤＮＡを溶出させた。続いて、９５℃で２０分間加熱してＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを失活させた。得られたＤＮＡ溶液２０μｌを３０μｌの定量ＰＣＲ用カクテル(ロシュ社、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ使用)に加えて定量ＰＣＲを実施した。検量線には、一定数量の細胞から同法により回収したＤＮＡ溶液を用いた。定量ＰＣＲ用の装置は、Applied Biosystems社7500 Real-Time PCR Systemを使用した。
（２）捕捉用担体から分離した細胞数の測定
捕捉用担体と標的細胞の結合体の全量に替えて、各実施例・比較例で解離剤（比較例においてはビオチン）を用いて得られた解離後の細胞分散液全量２５０μ中の１００μｌを用いた他は、捕捉用担体に結合した細胞数の測定と同様にして測定し、解離後の細胞分散液全量中の細胞数を測定した。【００４５】
［解離効率］
アビジン等とビオチン誘導体の解離効率は、下式により求めた。
解離効率（％）＝捕捉用担体から分離した細胞数÷捕捉用担体に結合した細胞数×１００【００４６】
［実施例１］
調製例２で得られた捕捉用担体各１ｍｇ分をテストチューブに取り分け、０．６質量％クエン酸及び０．５質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ１ｍｌ分散させて捕捉用担体液を得た。この捕捉用担体液に調製例５で得られた細胞分散液５０μｌを加え、４℃で３０分間混和して、捕捉用担体とＨＴ−２９細胞を結合させた。次いで、磁気スタンドを使って捕捉用担体を分離し、ＰＢＳで３回洗浄することによって、捕捉用担体に結合した標的細胞を未結合細胞やその他の溶質成分から分離した。分離した捕捉用担体に結合していた細胞数を測定したところ、実施例に供した細胞の８５％の８,５００細胞であった。
標的細胞に結合した捕捉用担体に、調製例３で得られた０．２質量％ＢＳＡ−Ｂｉｏｔｉｎ６のＰＢＳ溶液２５０μｌを添加し、室温で２０分間穏やかに混和した。その後、磁気スタンドを使って粒子を分離し、上清中の解離したＨＴ−２９細胞を回収した。光学顕微鏡により観察したところ、上清中の前記細胞はその形態を保持した状態で存在していた。
標的細胞の解離効率を表１に示す。なお、表１において、「解離溶液中のビオチン濃度」とは、解離剤の濃度と解離剤のビオチン化度から計算されたビオチンの質量％の値である。【００４７】
［実施例２〜４］
ＢＳＡ−Ｂｉｏｔｉｎ６に替えて表１に記載の解離剤を用いた他は実施例１と同様にして解離効率を求めた。【００４８】
［比較例１］
０．２質量％ＢＳＡ−Ｂｉｏｔｉｎ６のＰＢＳ溶液に替えて１０ｍＭビオチンのＰＢＳ溶液を用いた他は実施例１と同様にして解離効率を求めた。【００４９】
【表１】
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【００５０】
表１に示されるように、解離剤としてビオチンが結合した水溶性高分子を用いた実施例１〜４においては、解離剤に替えてビオチンを用いた比較例１と比較して、解離溶液中のビオチン濃度が極めて小さいにもかかわらず、極めて高い効率でアビジン等とビオチン誘導体を解離させ、標的細胞を分離できることが確認された。
【図１】
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【国際調査報告】
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