(57)【要約】骨形成タンパク質含有画分が骨から抽出され、限外ろ過およびクロマトグラフィーから選択される一連の濃縮ステップによって濃縮される、骨形成タンパク質を骨から単離する方法において、本発明は、高分子量成分を濃縮ステップの前に骨形成タンパク質含有画分から除去するという改善をもたらす。高分子量成分は、分子量が約１００ｋＤａ〜３００ｋＤａであり、コラーゲン、コラーゲン断片、コラーゲン凝集物およびそれらの混合物から選択される。
2005536489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成タンパク質含有画分が骨から抽出され、限外ろ過およびクロマトグラフィーから選択される一連の濃縮ステップによって濃縮される、骨形成タンパク質を骨から単離する方法において、高分子量成分を濃縮ステップの前に骨形成タンパク質含有画分から除去するという改善を特徴とする方法。
【請求項２】
高分子量成分が約１００ｋＤａ〜３００ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高分子量成分が、コラーゲン、コラーゲン断片、コラーゲン凝集物およびそれらの混合物から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
高分子量成分が限外ろ過によって除去される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
高分子量成分が１００ｋＤａ〜３００ｋＤａの見かけ分子量ポリスルホンメンブランによる限外ろ過によって除去される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
骨形成タンパク質含有画分が連続した限外ろ過ステップによって濃縮および脱塩される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
骨形成タンパク質、不溶性骨基質（ＩＣＢＭ）およびゼラチンを含む骨成長誘導組成物。
【請求項８】
骨形成タンパク質が、請求項１〜６のいずれか一項に記載される改善された方法によって調製される、請求項７に記載の骨成長誘導組成物。
【請求項９】
水和可能な粉末の形態である、請求項８に記載の骨成長誘導組成物。
【請求項１０】
骨形成タンパク質と、ｈＩＣＢＭと、ゼラチンとの質量比が０．４〜０．６：８００〜１２００：１００〜１０００である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の骨成長誘導組成物。
【請求項１１】
骨形成タンパク質、不溶性骨基質およびゼラチンを組み合わせるステップを含む、骨成長誘導組成物を調製する方法。
【請求項１２】
骨形成タンパク質が、請求項１〜６のいずれか一項に記載される改善された方法によって調製される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
骨形成タンパク質、不溶性骨基質およびゼラチンを備える骨成長誘導組成物と、前記組成物を処置部位に送達するための送達機構とを含む、哺乳動物において骨成長を誘導するためのデバイス。
【請求項１４】
骨形成タンパク質が、請求項１〜６のいずれか一項に記載される改善された方法によって得られる、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
送達機構がシリンジである、請求項１３または１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
組成物が水和可能な粉末である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、骨誘導性の生体材料に関する。詳細には、本発明は、骨形成性組成物、および治療における骨形成性組成物の使用に関する。
【背景の技術】
【０００２】
本発明の骨形成性組成物は、ヒトまたは哺乳動物の組織再生のために、また、骨成長を促進または誘導するために特に意図される。本明細書の目的のために、表現「骨形成タンパク質」は、哺乳動物骨タンパク質全体の分画化によって得られる物質で、骨形成を誘導することができる物質を示す。用語「骨形成（性の）」および用語「骨誘導（性の）」は同義的であると見なされる。骨生成は、成体哺乳動物における骨のデノボ形成を記述するために使用される用語であり、骨折の再生のときに成体において明瞭に示される。骨生成は、胚での骨生成と非常に類似するプロセスによって進行する。骨形成タンパク質には、他の未同定のタンパク質に加えて、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）が含まれる。これは、形態形成タンパク質のより大きなトランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーの一部として分類されている特徴づけられたタンパク質の１つのファミリーである。ＢＭＰファミリーは、哺乳動物において骨形成を誘導することができることが知られている１２個を超える個々のメンバーから構成される。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の第１の態様により、骨形成タンパク質含有画分が骨から抽出され、限外ろ過およびクロマトグラフィーから選択される一連の濃縮ステップによって濃縮される、骨形成タンパク質を骨から単離する方法において、高分子量成分を濃縮ステップの前に骨形成タンパク質含有画分から除去するという改善がもたらされる。
【０００４】
高分子量成分は、約１００ｋＤａ〜３００ｋＤａの分子量を有し得る。高分子量成分は、典型的には、コラーゲン、コラーゲン断片、コラーゲン凝集物およびそれらの混合物を含む。
【０００５】
本発明の方法は、高分子量成分を限外ろ過によって除去することを含むことができる。例えば、高分子量成分は、１００ｋＤａ〜３００ｋＤａの見かけ分子量メンブラン（例えば、１００ｋＤａ〜３００ｋＤａの見かけ分子量ポリスルホンメンブランなど）による限外ろ過によって除くことができる。
【０００６】
骨形成タンパク質含有画分は、カオトロピック溶液を使用して骨から抽出することができる。カオトロピック溶液は、尿素、塩化グアニジニウム、またはその組合せを含有することができる。
【０００７】
濃縮ステップは、クロマトグラフィー濃縮ステップが続くか、またはクロマトグラフィー濃縮ステップが間に入れられる、順次小さくなる見かけ分子量メンブランによる骨形成タンパク質含有画分の連続した限外ろ過を含むことができる。したがって、濃縮ステップは、１回以上のクロマトグラフィー濃縮ステップを含むことができる。
【０００８】
骨形成タンパク質含有画分は、連続した限外ろ過ステップによって濃縮および脱塩することができる。骨形成タンパク質含有画分は、１０ｋＤＡおよび５ｋＤＡの限外ろ過ステップによって濃縮および脱塩することができる。
【０００９】
クロマトグラフィー濃縮ステップは、ヘパリン−セファロースクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、逆相シリカクロマトグラフィー、およびこれらの任意の２つ以上の組合せの１つまたは２つ以上から選択することができる。
【００１０】
本発明の第２の態様により、骨形成タンパク質、不溶性骨基質（ＩＣＢＭ）およびゼラチンを含む骨成長誘導組成物が提供される。
【００１１】
骨成長誘導組成物は、水和可能な粉末の形態であり得る。
【００１２】
不溶性骨基質は、全骨粉末を酸で脱灰して、酸脱灰された全骨粉末または全骨基質を作製すること、可溶性成分を脱灰後の骨粉末または骨基質からカオトロピック剤（例えば、尿素水溶液またはグアニジニウム溶液など）で抽出すること、残渣を水で洗浄すること、その後、残渣を乾燥して、不溶性骨基質を作製することによって調製することができる。
【００１３】
ゼラチンは、不溶性骨基質を抽出して、可溶性のＩ型コラーゲンが濃縮された画分を作製すること、可溶性Ｉ型コラーゲンを沈殿させること、および、沈殿物を真空下で乾燥することによって得ることができる。
【００１４】
抽出は、精製沸騰水を用いて行うことができ、沈殿化は、エタノールを用いて行うことができる。
【００１５】
不溶性コラーゲン骨基質は哺乳動物性であり得る。不溶性コラーゲン骨基質は非ヒトまたはヒトの不溶性コラーゲン骨基質であり得る。不溶性コラーゲン骨基質は、好ましくは、ヒトの不溶性コラーゲン骨基質またはｈＩＣＢＭである。したがって、ゼラチンは、ヒトゼラチンであり得る。
【００１６】
骨形成タンパク質は、先に記載した方法によって調製することができる。
【００１７】
骨形成タンパク質と、ｈＩＣＢＭと、ヒトゼラチンとの質量比は約０．４〜０．６：８００〜１２００：１００〜１０００であり得る。
【００１８】
したがって、骨成長誘導組成物は、骨形成タンパク質を約４００μｇ〜６００μｇの量で、ｈＩＣＢＭを約８００ｍｇ〜１２００ｍｇの量で、ヒトゼラチンを約１００ｍｇ〜１０００ｍｇの量で含むことができる。好ましい実施形態において、骨成長誘導組成物は、骨形成タンパク質を約５００μｇの量で、ｈＩＣＢＭを約１０００ｍｇの量で、ヒトゼラチンを約２００ｍｇの量で含む。
【００１９】
本発明は、骨形成タンパク質が、先に記載した改善された方法によって調製される、先に記載した骨成長誘導組成物に拡張される。
【００２０】
本発明の別の態様により、骨形成タンパク質、不溶性骨基質およびゼラチンを組み合わせるステップを含む、骨成長誘導組成物を調製する方法が提供される。
【００２１】
不溶性コラーゲン骨基質は哺乳動物性であり得るし、非ヒトおよびヒトの不溶性コラーゲン骨基質から選択することができる。不溶性コラーゲン骨基質は、好ましくは、ヒトの不溶性コラーゲン骨基質またはｈＩＣＢＭである。ゼラチンはヒトゼラチンであり得る。
【００２２】
骨形成タンパク質は、先に記載した方法によって調製することができる。
【００２３】
骨形成タンパク質、ｈＩＣＢＭおよびヒトゼラチンは、０．４〜０．６：８００〜１２００：１００〜１０００の質量比で組み合わせることができる。
【００２４】
したがって、本発明の方法は、骨形成タンパク質を約４００μｇ〜６００μｇの量で、ｈＩＣＢＭを約８００ｍｇ〜１２００ｍｇの量で、ヒトゼラチンを約１００ｍｇ〜１０００ｍｇの量で組み合わせることを含むことができる。好ましい実施形態において、本発明の方法は、骨形成タンパク質を約５００μｇの量で、ｈＩＣＢＭを約１０００ｍｇの量で、ヒトゼラチンを約２００ｍｇの量で組み合わせることを含むことができる。
【００２５】
本発明の方法は、骨形成タンパク質を薄い酸性水溶液におけるｈＩＣＢＭと組み合わせること、得られた混合物を凍結乾燥して、乾燥粉末を作製すること、および、この粉末をヒトゼラチンと混合して、水和可能な物質を作製することを含むことができる。
【００２６】
本発明の別の態様により、哺乳動物において骨成長を誘導するためのデバイスで、骨形成タンパク質、不溶性骨基質およびゼラチンを備える骨成長誘導組成物と、該組成物を処置部位に送達するための送達機構とを含むデバイスが提供される。
【００２７】
骨形成タンパク質、不溶性骨基質およびゼラチンは、本明細書中上記に記載される通りであり得る。送達機構はシリンジであり得る。
【００２８】
詳細には、組成物は、シリンジに含有され得る本明細書中上記に記載される水和可能な粉末であり得る。したがって、生理的食塩水水溶液をシリンジの中に引き込むことによって、粉末物を、送達部位への注入のために水和させることができる。
【００２９】
本発明の別の態様により、骨格の欠陥を有する哺乳動物において骨形成を誘導する方法で、先に記載した骨誘導組成物を哺乳動物の骨格欠陥に埋め込むステップを含む方法が提供される。
【００３０】
本発明の別の態様により、哺乳動物において異所性骨の成長を誘導する方法で、先に記載した骨誘導組成物を哺乳動物の非骨性部位に埋め込むステップを含む方法が提供される。
【００３１】
本発明の別の態様により、哺乳動物において同種骨治癒を促進させる方法で、同種骨材を、先に記載した骨誘導組成物と一緒に、哺乳動物における同種骨治癒が要求される部位に埋め込むステップを含む方法が提供される。
【００３２】
同種骨材は、ヒトの皮質骨チップ、海綿質骨ブロック、海綿質骨粉末、全骨または脱灰骨基質を含む、組織バンクに預けられた骨であり得る。
【００３３】
本発明の別の態様により、哺乳動物において自家骨移植片治癒を促進させる方法で、自家骨材を、先に記載した骨誘導組成物と一緒に、哺乳動物における自家骨移植片治癒が要求される部位に埋め込むステップを含む方法が提供される。
【００３４】
自家骨材は腸骨稜自家骨であり得る。
【００３５】
本発明の別の態様により、骨格の欠陥を有する哺乳動物において骨形成を誘導する方法において使用される物質または組成物で、先に記載した骨成長誘導組成物を備える物質または組成物が提供され、また、該組成物を哺乳動物の骨格欠陥に埋め込むことを含む方法が提供される。
【００３６】
本発明の別の態様により、哺乳動物において異所性骨の成長を誘導する方法において使用される物質または組成物で、先に記載した骨成長誘導組成物を備える物質または組成物が提供され、また、該組成物を哺乳動物の非骨性部位に埋め込むステップを含む方法が提供される。
【００３７】
本発明の別の態様により、哺乳動物において同種骨治癒を促進させる物質または組成物で、先に記載した骨成長誘導組成物を備える物質または組成物が提供され、また、同種骨材を、該組成物と一緒に、哺乳動物における同種骨治癒が要求される部位に埋め込むステップを含む方法が提供される。
【００３８】
同種骨材は、ヒトの皮質骨チップ、海綿質骨ブロック、海綿質骨粉末、全骨または脱灰骨基質から選択される、組織バンクに預けられた骨であり得る。
【００３９】
本発明の別の態様により、哺乳動物において自家骨移植片治癒を促進させる物質または組成物で、先に記載した骨成長誘導組成物を備える物質または組成物が提供され、また、自家骨材を、該組成物と一緒に、哺乳動物における自家骨移植片治癒が要求される部位に埋め込むステップを含む方法が提供される。
【００４０】
自家骨材は腸骨稜自家骨であり得る。
【００４１】
本発明の別の態様により、骨格の欠陥を有する哺乳動物において骨形成を誘導する方法において使用される医薬品を調製する際の、先に記載した骨成長誘導組成物を備える物質または組成物の使用が提供される。
【００４２】
本発明の別の態様により、哺乳動物において異所性骨の成長を誘導する方法において使用される医薬品を調製する際の、先に記載した骨成長誘導組成物を含む物質または組成物の使用が提供される。
【００４３】
本発明の別の態様により、哺乳動物において同種骨治癒を促進させるための医薬品を調製する際の、先に記載した骨成長誘導組成物と、同種骨材とを含む物質または組成物の使用が提供される。
【００４４】
同種骨材は、ヒトの皮質骨チップ、海綿質骨ブロック、海綿質骨粉末、全骨または脱灰骨基質から選択される、組織バンクに預けられた骨であり得る。
【００４５】
本発明の別の態様により、哺乳動物において自家骨移植片治癒を促進させるための医薬品を調製する際の、先に記載した骨成長誘導組成物と、自家骨材とを備える物質または組成物の使用が提供される。
【００４６】
自家骨材は腸骨稜自家骨であり得る。
【００４７】
したがって、本発明は、哺乳動物の骨からの骨形成タンパク質の調製、および、骨修復における基質と一緒でのその使用に関する。
【説明】
【００４８】
哺乳動物の骨組織は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）と呼ばれる一群のタンパク質増殖分化因子および分化因子に対する母体である。これらのタンパク質は、若い哺乳動物および成体哺乳動物に埋め込まれたとき、新しい骨形成を誘導することができる。
【００４９】
ＢＭＰは、成体では別の目的で使用されて、胚での分化に非常に類似する機構を介して骨の再生を生じさせている。骨分化の発達カスケードは、間葉細胞の走化性、前駆体細胞の分化、軟骨の分化、血管侵入、骨形成、再構築、および最後に骨髄分化からなる（Ｒｅｄｄｉ、（１９８１）Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．、１：２０９〜２２６）。骨基質の天然の軟骨内骨分化活性が分離可能に引き出され、不活性な残渣基質とともに再構成されて、完全な骨誘導活性を回復させることができることが示されている（ＳａｍｐａｔｈおよびＲｅｄｄｉ（１９８１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：７５９９〜７６０３）。オステオゲニン（哺乳動物から得られた骨形成タンパク質）の精製がＳａｍｐａｔｈら（１９８７）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７１０９〜７１１３）によって開示されている。Ｕｒｉｓｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）、８１：３７１〜３７５）は、酸性ポリペプチドの性質および約１８ｋＤの分子量を有する、ウシの骨形態形成タンパク質抽出物を開示している。著者らは、このタンパク質が、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって分離される画分に存在すること、そして、このタンパク質により、マウスの後四頭筋における骨形成、ならびに、ラットおよびイヌの頭骨におけるトレフィン欠陥での骨再生が誘導されることを報告している。
【００５０】
欧州特許出願第１４８，１５５号（１９８５年１０月７日公開）には、ウシ起源、ブタ起源およびヒト起源に由来する骨形成タンパク質が開示される。これらのタンパク質の１つ（これは発明者によってＰ３タンパク質と命名され、２２ｋＤ〜２４ｋＤの分子量を有する）が、本質的に均一な状態に精製されたと報告されている。この物質は、動物に埋め込まれたとき、骨形成を誘導することが報告されている。
【００５１】
骨形成タンパク質を哺乳動物の骨組織から高収率で調製するための方法を提供することは本発明の目的の１つである。別の目的は、上記骨形態形成タンパク質に対する送達システムとしての基質に吸着させた骨形成タンパク質を備える骨誘導デバイスを提供することである。
【００５２】
本発明は、哺乳動物の骨格欠陥部位に埋め込まれたとき、骨の完全な再生、および、その結果としての欠陥治癒を埋め込み部位において誘導する骨形成デバイスを提供する。本発明のデバイスは、基質キャリア物質（これは下記に記載される）と、骨形成タンパク質（骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含有する抽出可能な総骨タンパク質の一画分）とを備える。
【００５３】
骨形成タンパク質は、その骨再生作用を発揮させるためには、適切な送達物質の存在が必要である。脱灰された骨基質から精製された基質は、そのような適切な物質であり、下記において更に詳しく記載される。
【００５４】
骨形態タンパク質を単離するために使用される方法では、一部で、Ｓａｍｐａｔｈら（１９８７）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７１０９〜７１１３）の発表された手順が利用される。この手順では、クロマトグラフィー担体マトリックスに固定化されたヘパリンおよびヒドロキシアパタイトに対するＢＭＰの親和性が、ＢＭＰ濃縮画分の単離を達成するために利用される。この手順では、脱灰骨の尿素抽出物のヘパリンクロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィー、その後のヒドロキシアパタイトカラムでのクロマトグラフィー、そして最後に、高分子量の混入物を除くためのゲル排除クロマトグラフィーを伴う。この手順は、骨形成能を有する画分の効果的な単離をもたらすが、骨形成タンパク質の精製量、精製収率および精製速度が、本発明の方法を使用したとき、大きく改善される。
【００５５】
本発明の骨形成タンパク質の調製は、Ｓａｍｐａｔｈら（１９８７）の手順に基づいており、しかし、新規かつ発明的な改変を含む。重要な改変は、総骨タンパク質抽出物を、精製プロセスの開始時、クロマトグラフィーの前に高分子量画分および低分子量画分に分画することを伴う。骨形態形成タンパク質は約３０ｋＤａの分子量を有しており、本明細書の目的のためには、低分子量ポリペプチドとして分類される。本明細書の目的のためには、高分子量ポリペプチドには、分子量が１００ｋＤａを超えるポリペプチド、特に３００ｋＤａを超えるポリペプチドが含まれる。高分子量画分には、コラーゲンおよびコラーゲン断片（約１００ｋＤａ）、ならびにコラーゲン凝集物（２００ｋＤａ以上）および他の未同定ポリペプチド（そのいくつかが、モルホゲン誘導による骨生成の阻害剤であると考えられる）が含まれる。本明細書の目的のためには、これらのコラーゲン類が、プロセス開始時、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーステップの前に低分子量画分から分離されることに留意することは重要である。
【００５６】
コラーゲンの除去は、下記の理由から重要である。第１に、Ｉ型コラーゲンは、ＢＭＰに対する親和性を有することが知られている（Ｒｅｄｄｉ  ＡＨ（１９８５）、軟骨形態形成：骨形態形成タンパク質および軟骨形態形成タンパク質、ホメオボックス遺伝子ならびに細胞外基質の役割、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．、Ｏｃｔ  １４（８）：５９９〜６０５；Ｗｉｎｎ  ＳＲ、Ｕｌｕｄａｇ  Ｈ、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ＪＯ．（１９９９）、骨形態形成タンパク質に対するキャリアシステム、Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ．、１９９９、Ｏｃｔ（３６７  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ９５〜１０６）。第２に、ペプチドは、カラムを詰まらせる傾向、および結合を妨害する方法でヘパリン分子上の結合部位とのＢＭＰの交換動力学を変化させる傾向を有する高ＭＷペプチドである。更には、抽出可能な総骨タンパク質の高分子量画分に存在する、骨形態形成タンパク質（骨形成タンパク質の活性な構成成分）の阻害剤が存在し得るようである。このことは、Ｉ型コラーゲンとヘパリンとの間でＢＭＰに対する競合的な結合が存在することを意味する。この競合的な結合妨害は、ヘパリンカラムでのＢＭＰのクロマトグラフィー精製のときに収率の低下をもたらすと考えられる。本発明の方法は、先行技術の方法を上回る、総骨形成活性の回収における著しい改善をもたらしている。
【００５７】
次に、本発明を、下記の実施例および図を参照して、例として説明する。
【実施例】
【００５８】
［実施例１］  骨形態形成タンパク質を含有するヒト骨形成タンパク質の精製
１．脱灰骨の調製
ヒト長骨骨幹から、付着している軟組織を除いた後、骨髄を除き、１ｃｍ〜４ｃｍの小片に切断した。数バッチのこの物質を、４℃〜８℃で１６時間〜２４時間、体積比で５０：５０のメタノールおよびクロロホルムを含む溶媒系で脱脂した。その後、骨を、４℃〜８℃で４８時間、無水アルコール中で脱水した。アルコールをデカンテーションにより除き、骨を、４８時間〜９６時間、換気フード内で風乾した。その後、骨を１０ミクロン〜４２５ミクロンの範囲の粒子サイズにハンマーミルにおいて粉砕した。
【００５９】
粒状物を室温で脱灰した。このとき、４容量〜５容量の０．５Ｍ  ＨＣｌを、ｐＨ変化が時間の経過とともに遅くなることによって判断されるように、骨のヒドロキシアパタイトとＨＣｌとの酸塩基反応がほぼ完了するまで、連続して添加した。脱灰された骨を薄い重炭酸ナトリウム溶液で中和し、精製水で洗浄して、脱灰骨基質を作製した。
【００６０】
２．脱灰骨基質の解離的抽出
上記ステップから得られた脱灰骨基質（ＤＢＭ）を、４℃〜８℃で２４時間、プロテアーゼ阻害剤（５ｍＭのベンズアミジン塩酸塩、０．１Ｍの６−アミノヘキサン酸、５ｍＭのＮ−エチルマレイミドおよび０．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する３容量〜４容量の８Ｍ尿素／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で２回抽出した。上清を多孔性ポリプロピレンフリットによるろ過によって集め、３ミクロンの公称サイズのカートリッジフィルター（Ｐｏｌｙｇａｒｄ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）でろ過した。
【００６１】
３．限外ろ過による高分子量成分の分画化
高分子量タンパク質およびコラーゲン類を、ステップ２から得られた上清をポリスルホンの３００ｋＤａの見かけ分子量メンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＣＤＵＦ００６ＴＭ）で限外ろ過することによって除いた。１００ｋＤａの見かけ分子量メンブランを場合により用いることができ、この場合には、総ＢＭＰ活性の収量が少し低くなるが、比活性がより大きくなる。この手順により、イオン強度がより低い条件のもとでＢＭＰと結合するコラーゲン類（特に、Ｉ型コラーゲン）が除かれた。濃縮液を６Ｍ尿素緩衝液／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）（緩衝液Ａ）で数回洗浄し、骨形成活性を含有する透析液を集めた。
【００６２】
４．限外ろ過での緩衝液交換による濃縮および脱塩
ステップ３からの、骨形成タンパク質（約３０ｋＤａの分子量）を含有する透析液を、１０ｋＤａのＰＬＧＣメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＫ１Ｐ００３Ｗ４）での限外ろ過によって脱塩および濃縮した。このステップにより、塩および他の低分子量成分が効果的に除かれ、次のクロマトグラフィーステップのための要求された条件が得られた。上記濃度の酵素阻害剤を含有するが、ｎ−エチルマレイミドを含まない緩衝液Ａの数容量を連続して、濃縮液の電導度が５．０ミリシーメンンス〜６．０ミリシーメンンスの間に達するまで濃縮後の濃縮液に加えた。
【００６３】
５．ヘパリン−セファロースクロマトグラフィー
ステップ４から得られた濃縮液を、０．１５ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａで平衡化されたヘパリン−セファロースＣＬ−６ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）でのクロマトグラフィーにより処理した。カラムを、０．１５ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａの３カラム容量で洗浄し、その後、０．５ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａで溶出した。２８０ｎｍにおける吸収を有する溶出ピークを集め、４℃で保存した。
【００６４】
６．ヘパリン−セファロース親和性画分の限外ろ過での交換
ステップ５から得られたヘパリン−セファロース親和性画分を、ＰＬＣＣ  ５ｋＤａメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＣＤＵＦ００１ＬＣ）での限外ろ過によって脱塩および濃縮した。このステップにより、塩および他の低分子量成分が効果的に除かれ、次のクロマトグラフィーステップのための要求された条件が得られた。１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する緩衝液Ａの数容量を連続して、濃縮液の電導度が５．０ミリシーメンンス〜６．０ミリシーメンンスの間に達するまで濃縮後の濃縮液に加えた。
【００６５】
７．ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィー
ステップ６から得られた濃縮液を、１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する緩衝液Ａで平衡化されたヒドロキシアパタイトカラム（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ、Ｂｉｏｓｅｐｒａ、フランス）でのクロマトグラフィーにより処理した。カラムを、１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する緩衝液Ａの３カラム容量で洗浄した。骨形成タンパク質濃縮画分が、１５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する緩衝液Ａで溶出された。２８０ｎｍにおける吸収を有する溶出ピークを集め、４℃で保存した。
【００６６】
８．ＨＡ親和性画分の１０ｍＭ  ＨＣｌへの交換
ステップ７から得られたＨＡ親和性画分を、排除限界が３ｋＤａのセルロースメンブラン（ＹＭ３、７６ｍｍ、再生セルロース、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）を付けたＡｍｉｃｏｎ撹拌型限外ろ過セル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）を使用して１０ｍＭ  ＨＣｌ溶液に交換した。
【００６７】
本発明の一実施形態では、代わりに、ＨＡ親和性画分がＣ−１８Ｖｙｄａｃシリカ型ＨＰＬＣカラム（粒子サイズ：５μｍ、細孔サイズ：３００Ａ）に負荷された。カラムを、０．１％トリフルオロ酢酸／１０％アセトニトリルで、１０カラム容量について洗浄し、結合したタンパク質を７０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸でステップ溶出した。この物質は凍結乾燥され、１０ｍＭのＨＣｌに再構成された。
【００６８】
タンパク質の値を伴うプロセスフローチャートが表１に示される。
【表１】
2005536489.tif 000003
【００６９】
実施例１のステップ８から得られた物質の５００μｇは、１．２グラムの基質で送達されたとき、ヒトでの不応性の長骨癒着不良部において新しい骨形成を誘導する。ステップ８から得られた物質は、Ｓ−２００ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって分析され、質量比で２０％の高分子量成分を含有することが見出された。これらは、必要に応じて、Ｓ−２００マトリックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのゲル排除クロマトグラフィーおよび８Ｍ尿素／１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）による溶出を用いる「仕上げ」ステップによって除くことができる。最終収量は、骨形成タンパク質が３０ｍｇ〜５０ｍｇの範囲である。これらの収量は、比較用の出発骨物質、ならびに、ヒドロキシアパタイトアフィニティークロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、およびＳ−２００マトリックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのゲル排除クロマトグラフィーでの方法を用いたヒヒ骨からの抽出について以前に報告されていた収量よりも約４倍大きい（Ｒｉｐａｍｏｎｔｉ  Ｕ、Ｍａ  ＳＳ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＮＳ、Ｙｅａｔｅｓ  Ｌ、Ｒｅｄｄｉ  ＡＨ（１９９３）、成体霊長類の頭蓋冠欠陥におけるオステオゲニン（骨形態形成タンパク質）および脱灰骨基質による骨−骨髄器官の再構築、Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、９１（１）：２７〜３６）。ヒトおよびヒヒの腸骨稜骨生検の比較組織形態計測研究により、２つの試料の間に顕著な程度の類似性が明らかにされた（Ｓｃｈｎｉｔｚｉｅｒ  ＣＭ、Ｒｉｐａｍｏｎｔｉ  ＵおよびＭｅｓｑｕｉｔａ  ＪＭ（１９９３）、拘束状態の成体オスヒヒにおける腸骨稜小柱骨の組織形態計測、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓ．Ｉｎｔ．、５２、４４７〜４５４）。
【００７０】
［実施例２］  骨形成タンパク質の骨形成活性の測定
ラットにおけるバイオアッセイ
骨形成活性を、ＳａｍｐａｔｈおよびＲｅｄｄｉ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（１９８３）８０：６５９１〜６５９５）によって記載されるようにバイオアッセイした。このアッセイは、不溶性骨基質およびヒト骨形成タンパク質を備える試験サンプルをエーテル麻酔下で受容ラットの皮下部位に埋め込むことからなる。垂直切開（１ｃｍ）が、胸部領域を覆う皮膚において無菌条件下で行われ、左右相称のポケットが鈍的剥離によって調製された。インプラントは、２５ｍｇのラットＩＣＢＭ、０．５Ｍ酢酸における５０ｍｇのラット尾のＩ型コラーゲン、および、様々な量での骨形成タンパク質を含んでいた。試験サンプルがそれぞれのポケットに左右総称的に埋め込まれ、切開部が数針縫うことにより閉じられた。この異所性部位により、骨性部位の使用から生じる曖昧さの可能性を伴わない骨誘導の研究が可能になった。
【００７１】
再生された組織が、記載（ＲｅｄｄｉおよびＳｕｌｌｉｖａｎ、１９８０、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１０７：１２９１〜１２９９）のように、埋め込み後１２日目に取り出され、アルカリホスファターゼ活性（骨形成に対するマーカー）についてアッセイされた。結果およびデータが表２に表される。
【表２】
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【００７２】
ラットにおけるこのインプラントモデルは、骨形成タンパク質により誘導される軟骨内骨発達の各段階を経由する制御された進行を示した。胎児期後のこの骨生成は、胚での骨発達の通常の経過で生じる事象を繰り返していると見なすことができる。新しい骨が、局所的な間葉系凝縮、軟骨相および細胞外基質の産生、血管侵入および石灰化、そして最後に、前骨芽細胞系統の分化による新しい骨の形成から生じた。
【００７３】
トルイジンブルーまたはヘモトキシリン／エオシンによる染色を用いた組織学的分析では、軟骨内骨の発達が明瞭に明らかにされた。１２日目のインプラントは、通常の場合、インプラントが骨誘導活性を示したかどうかを明らかにするために十分であった。
【００７４】
アルカリホスファターゼ活性は骨生成に対するマーカーとして使用することができる。この酵素活性は、インプラントをホモジネーションし、基質のｐ−ニトロフェニルホスファートをアルカリ性条件下で用いて酵素活性をアッセイした後、分光光度法により測定することができる。組織学による骨の発達を全く示さないインプラントは、これらのアッセイ条件のもとではアルカリホスファターゼ活性を有しないはずである（Ｒｅｄｄｉ  ＡＨおよびＳｕｌｌｉｖａｎ  ＮＥ（１９８０）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１０７、１２９１〜１２９９）。このアッセイは、アルカリホスファターゼの比活性および総活性を定量するために有用であり、その比活性および総活性は、その後、本明細書中に記載される調製された骨形成タンパク質の骨誘導能に対して相関させることができる。
【００７５】
アルカリホスファターゼ活性は、ＲｅｄｄｉおよびＳｕｌｌｉｖａｎ（１９８０）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１０７、１２９１〜１２９９）の方法にしたがって計算される。ラットインプラントによる１ユニット以上のアルカリホスファターゼの誘導により、効果的な骨生成が示される。
【００７６】
［実施例３］  ヒトゼラチンの調製
一定量のＩＣＢＭをホウケイ酸ガラスビンにおいて５容量〜１０容量の水と一緒にして、圧力釜において１時間加熱した。上清をＷｈａｔｍａｎ  ｎｏ．１ろ紙または２０ミクロンのステンレススチールメッシュでろ過した。ゼラチン溶液を２５℃に冷却し、５容量の冷却されたエタノール（−２０℃）を加えて、コラーゲンを沈殿させた。沈殿物を真空乾燥して、７５ミクロン〜４２５ミクロンのサイズ範囲に粉砕した。
【００７７】
［実施例４］  骨形成デバイスの製造
ヒトＩＣＢＭを、骨誘導性の複合生体材料を製造するための吸着性キャリア基質として使用した。十分な量の骨形成タンパク質がＩＣＢＭと一緒にされたとき、不活性なＩＣＢＭは生物学的活性が回復した。ＩＣＢＭの粒子サイズは新しい骨の量的応答に影響を及ぼしている。７５μｍ〜４２０μｍの間の粒子により、最大の応答が誘発される。一定量のＩＣＢＭを１０ｍＭ  ＨＣｌにおいて骨形成タンパク質と一緒にして、滅菌スパチュラで十分に混合した。この物質を凍結乾燥によって乾燥させた。
【００７８】
その後、この物質をヒトＩＣＢＭ由来コラーゲンと一緒にした。これらの成分は、均一に分布する組成物を得るために、十分に乾式混合混合された。ヒトゼラチンは、生体材料を押出し成形可能にする容易に水和し得る物質として作用した。複合物をシリンジに詰めた。骨誘導性複合物は使用時に再水和された。再水和は、一定量の滅菌された生理的食塩水または水がシリンジに引き込まれたときに達成された。約１０分が、再水和を生じさせるために考慮された。その後、この物質は、プランジャーを押し下げることによってシリンジから容易に押し出すことができる。これにより、手術時において欠陥部位にインプラントを正確に置くことができた。インプラントは更に、Ｓｐｏｎｇｏｓｔａｎ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国）などの標準的なゼラチンスポンジを使用してその場に封じ込めることができる。
【００７９】
キャリアは、生分解性合成基質または合成無機基質のいずれか（例えば、ＨＡＰ、コラーゲン、リン酸三カルシウム、または、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびそれらの様々な共重合体）によって置き換えることができる。
【００８０】
表３には、骨形成組成物の代表的な配合物が示される。
【表３】
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【００８１】
［実施例５］  ヒトにおける骨形成組成物の試験
１ｇの不溶性骨基質および２００ｍｇの凍結乾燥ヒトコラーゲンを備える複合基質に吸着させた５００マイクログラムのヒト骨形成タンパク質を含有するインプラントを調製した。部分的または完全な分節性欠陥を含む３４名の抵抗性癒着不良患者が骨形成複合体で処置された。このシリーズは１１名の女性および２３名の男性からなった。平均年齢は３６歳であった。すべての患者は、体内固定もしくは体外固定、ギブス包帯、および／または自家骨移植によって以前に様々に処置されていたが、癒着を達成することができなかった。手術前の症状は平均して２６ヶ月であった（１ヶ月〜２２８ヶ月の範囲）。インプラントが、体内固定または体外固定によって更に安定化された欠陥部位に水和インプラントを注入することによって手術時に組み込まれた。平均して２．４ｇの複合物が患者あたり使用された。１７名の患者には更に、海綿質骨粒子およびブロック形態の海綿状骨を含む追加の骨が与えられた。機能的結果が、手術後の１週間、８週間、１６週間および２４週間の追跡観察期間で、加重に耐える機能にしたがって評価された。０のスコアが、加重に耐えることが全く認められない場合に割り当てられ、１のスコアが、２本の松葉杖の助けで加重に耐えられる場合に割り当てられ、２のスコアが、１本の松葉杖で軽い加重に耐えられる場合に割り当てられ、３のスコアが、１本の松葉杖で加重に完全に耐えられる場合に割り当てられ、４のスコアが、松葉杖の助けなしで加重に完全に耐えられる場合に割り当てられた。平均スコアは、１７週の平均追跡観察期間（８週間〜３２週間の範囲）について３．２５であった。このスコアは、２．２２の手術前のスコアおよび０．５の手術後のスコア（１週目）よりも大きかった。再発した感染を受けた５名の患者のうち、２名が１８．５週の平均追跡観察期間で２を超えるスコアを得ることができなかった。架橋が、５段階評価（１＝癒着不良／無仮骨、２＝仮骨が架橋の非存在下で存在する、３＝中程度の架橋、４＝良好な架橋、５＝完全な癒着）にしたがって、訓練された臨床医によってＸ線撮影法で評価された。２０週間の追跡観察期間での処置群に対する平均スコアは、１．４４の処置前のスコアと比較して２．８０であった。これらの結果は、本発明の骨形成複合物インプラントが、困難な癒着不良の効果的な処置をもたらしていることを示している。異なる追跡観察期間で測定されたスコアが図１に示される。
【００８２】
本発明の骨形成生体材料複合物により誘導される骨の多段階発達カスケードが、生体材料へのフィブリンおよびフィブロネクチンの結合、細胞の走化性、繊維芽細胞の増殖、間葉の縮合、軟骨芽細胞への分化、軟骨生成、血管侵入、骨形成、再構築および骨髄分化を含むことは本発明の利点の１つである。
【００８３】
本発明の注入可能な生体材料は利点をいくつか提供する。本発明の注入可能な生体材料は、生物学的活性の顕著な低下を伴うことなく長期間にわたって室温で貯蔵することができる。本発明の注入可能な生体材料は手術時に容易に再水和させることができ、また、取り扱いが容易であり、必要とされるとき、骨形成材料を押し出すためにシリンジプランジャーを押し下げることが単に要求されるだけである。
【００８４】
臨床的理由から、本発明の骨形成生体材料複合物は下記の利点を提供する。本発明の骨形成生体材料複合物は骨形成性であり、骨を埋め込み部位において誘導する。本発明の骨形成生体材料複合物により、自己の骨を集めるための患者の股関節部での別の手術を行わなければならないことが回避され、また、組織バンクに預けられた骨を使用しなければならないことが回避される。これにより、伝染性疾患の危険性が低下する。
【００８５】
ＩＣＢＭは骨形成タンパク質と結合し、埋め込み部位において前駆体細胞を活性化するための徐放性の送達システムとして作用する。本発明の複合生体材料は、骨発達時の細胞応答の各段階を受け入れる。本発明の複合生体材料は生体適合性であり、骨生成時に再吸収され、宿主自身の骨によって置き換えられる。
【００８６】
記載された生体材料の幾何形状は、その粒子サイズによって測定されたとき、細胞の浸潤および分化を可能にすることにおいて最適である。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】時間の関数として、処置された癒着不良部のＸ線評価スコアを示す。
【図２】患者の骨が従来の処置の後では癒着不良であることを示す。
【図３】図２の患者の骨が本発明の方法による処置の後では完全に治癒していることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月23日(2005.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成タンパク質、キャリア基質およびゼラチンを含む骨成長誘導組成物であって、骨形成タンパク質が、骨から抽出された骨形成タンパク質含有画分を、限外ろ過、クロマトグラフィー、および、限外ろ過とクロマトグラフィーとの組合せから選択される一連の濃縮ステップによって濃縮することによって得られ、高分子量成分が濃縮ステップの前に骨形成タンパク質含有画分から除去される、骨成長誘導組成物。
【請求項２】
キャリア基質が、不溶性骨基質、生分解性合成基質および合成無機基質から選択される、請求項１に記載の骨成長誘導組成物。
【請求項３】
キャリア基質がヒト不溶性コラーゲン骨基質（ｈＩＣＢＭ）である、請求項２に記載の骨成長誘導組成物。
【請求項４】
ゼラチンがヒトゼラチンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の骨成長誘導組成物。
【請求項５】
高分子量成分が約１００ｋＤａ〜３００ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨成長誘導組成物。
【請求項６】
高分子量成分が、コラーゲン、コラーゲン断片、コラーゲン凝集物およびそれらの混合物から選択される、請求項５に記載の骨成長誘導組成物。
【請求項７】
高分子量成分が限外ろ過によって除去される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨成長誘導組成物。
【請求項８】
骨形成タンパク質含有画分が連続した限外ろ過ステップによって濃縮および脱塩される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の骨成長誘導組成物。
【請求項９】
水和可能な粉末の形態である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の骨成長誘導組成物。
【請求項１０】
キャリア基質がｈＩＣＢＭであり、ゼラチンがヒトゼラチンであり、骨形成タンパク質と、ｈＩＣＢＭと、ゼラチンとの質量比が０．４〜０．６：８００〜１２００：１００〜１０００の範囲である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の骨成長誘導組成物。
【請求項１１】
質量比が約０．５：１０００：２００である、請求項１０に記載の骨成長誘導組成物。
【請求項１２】
骨成長誘導組成物を調製する方法であって、骨形成タンパク質、キャリア基質およびゼラチンを組み合わせるステップを含み、骨形成タンパク質が、骨から抽出された骨形成タンパク質含有画分を、限外ろ過、クロマトグラフィー、および、限外ろ過とクロマトグラフィーとの組合せから選択される一連の濃縮ステップによって濃縮することによって得られ、高分子量成分が濃縮ステップの前に骨形成タンパク質含有画分から除去される、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載される骨成長誘導組成物を水和可能な形態で含有するシリンジを備える、哺乳動物において骨成長を誘導するためのデバイス。
【請求項１４】
骨格の欠陥を有する哺乳動物において骨形成を誘導する方法において使用される医薬品を調製する際の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載される骨成長誘導組成物の使用。
【請求項１５】
哺乳動物における異所性骨の成長を誘導する方法において使用される医薬品を調製する際の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載される骨成長誘導組成物の使用。
【請求項１６】
哺乳動物において同種骨治癒を促進させるための医薬品を調製する際の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載される骨成長誘導組成物と、同種骨材との使用。
【請求項１７】
同種骨材が、ヒトの皮質骨チップ、海綿質骨ブロック、海綿質骨粉末、全骨および脱灰骨基質から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
哺乳動物において自家骨移植片治癒を促進させるための医薬品を調製する際の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載される骨成長誘導組成物と、自家骨材との使用。
【請求項１９】
自家骨材が、少量ずつに分けられた腸骨稜自家骨である、請求項１８に記載の使用。
【国際調査報告】
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