(57)【要約】本発明は、(a)MUC1と腫瘍進行因子(例えば、β-カテニン、c-Src、EGF-R、p120ctn、またはPKCδ)の間の物理的相互作用(結合)、および／または(b)MUC1のキナーゼ活性を伴う腫瘍進行因子(例えば、c-Src、EGF-R、またはPKCδ)によるリン酸化を阻害する化合物を同定する方法を特徴としている。本発明は、MUC1とβ-カテニンの間の相互作用を阻害する方法、および細胞においてMUC1または腫瘍進行因子の発現を阻害する方法も含む。2005510200.tif 000003
2005510200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
MUC1の腫瘍進行因子への結合を阻害する化合物を同定する方法であり：
(a)MUC1被験物質を提供する段階；
(b)MUC1被験物質に結合する腫瘍進行因子被験物質を提供する段階；
(c)MUC1被験物質を、被験化合物の存在下で、腫瘍進行因子被験物質と接触させる段階；および
(d)被験化合物が、MUC1被験物質の腫瘍進行因子被験物質への結合を阻害するかどうかを決定する段階
を含む方法。
【請求項２】
腫瘍進行因子被験物質が、c-Src被験物質である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
腫瘍進行因子被験物質が、p12Octn被験物質である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
腫瘍進行因子被験物質が、上皮増殖因子受容体(EGF-R)被験物質である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
腫瘍進行因子被験物質が、β-カテニン被験物質である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
腫瘍進行因子被験物質が、プロテインキナーゼCδ(PKCδ)被験物質である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
接触が無細胞系において行われる、請求項1記載の方法。
【請求項８】
接触が細胞内において起こる、請求項1記載の方法。
【請求項９】
MUC1のグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)への結合を増強する化合物を同定する方法であり：
(a)MUC1被験物質を提供する段階；
(b)MUC1被験物質に結合するGSK3β被験物質を提供する段階；
(c)MUC1被験物質を、被験化合物の存在下で、GSK3β被験物質と接触させる段階；および
(d)被験化合物が、MUC1被験物質のGSKβ被験物質への結合を増強するかどうかを決定する段階
を含む方法。
【請求項１０】
MUC1を発現する細胞において、MUC1または腫瘍進行因子の発現を阻害する、インビトロの方法であり：
(a)細胞がMUC1を発現することを確定する段階；および
(b)MUC1転写産物または腫瘍進行因子転写産物にハイブリダイズする、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、インビトロで該細胞を処置する段階を含み、ここで該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞においてMUC1または腫瘍進行因子の発現を阻害する方法。
【請求項１１】
腫瘍進行因子が、β-カテニン、c-Src、p120ctn、EGF-R、およびPKCδからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
細胞が癌細胞である、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
癌細胞が乳癌細胞である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
癌細胞が、肺癌、結腸癌、膵癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌、神経組織癌、黒色腫、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、膣癌、または膀胱癌の細胞からなる群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
処置段階が、核酸配列に機能的に連結された転写調節エレメント(TRE)を含む核酸を、細胞内へ導入することにより達成され、ここで該核酸配列は、細胞内において、アンチセンスオリゴヌクレオチドへ転写される、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
TREはDF3エンハンサーである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
MUC1を発現する癌細胞において、MUC1のβ-カテニンへの結合を阻害するインビボの方法であり：
(a)対象がMUC1を発現する癌を有することを確認する段階；および
(b)該対象に、化合物か、または化合物がポリペプチドである場合は、該ポリペプチドをコードしている核酸配列を含む核酸を投与する段階
を含み、ここで該化合物が、(i)腫瘍進行因子の、MUC1細胞質ドメインへの結合、または(ii)腫瘍進行因子によるMUC1細胞質ドメインのリン酸化を阻害する方法。
【請求項１８】
腫瘍進行因子が、β-カテニン、c-Src、EGF-R、およびPKCδからなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
化合物が、
(a)MUC1または(b)腫瘍進行因子
のペプチド断片である、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
化合物が、MUC1細胞質ドメインのペプチド断片である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
ペプチド断片が、配列番号：7からなるアミノ酸配列を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
ペプチド断片のアミノ酸配列が配列番号：7である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
対象がヒト対象である、請求項17記載の方法。
【請求項２４】
癌細胞が乳癌細胞である、請求項17記載の方法。
【請求項２５】
癌細胞が、肺癌、結腸癌、膵癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌、神経組織癌、黒色腫、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、膣癌、または膀胱癌の細胞からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項２６】
化合物がポリペプチドであり、かつ治療段階が、該ポリペプチドをコードしている核酸配列に機能的に連結されたTREを含む核酸を、細胞内へ導入することにより達成される、請求項17記載の方法。
【請求項２７】
TREがDF3エンハンサーである、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
腫瘍進行因子によるMUC1のリン酸化を阻害する化合物を同定する方法であり、：
(a)MUC1被験物質を提供する段階；
(b)MUC1被験物質をリン酸化する腫瘍進行因子被験物質を提供する段階；
(c)MUC1被験物質を、被験化合物の存在下で腫瘍進行因子被験物質と接触させる段階；および
(d)被験化合物が、腫瘍進行因子被験物質によるMUC1被験物質のリン酸化を阻害するかどうかを決定する段階
を含む方法。
【請求項２９】
MUC1を発現する癌細胞において、MUC1または腫瘍進行因子の発現を阻害するインビボの方法であり：
(a)対象がMUC1を発現する癌を有することを確認する段階；および
(b)アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドへ転写される核酸配列に機能的に連結されたTREを含む核酸を、該対象に投与する段階
を含み、ここで該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、(i)MUC1転写産物または腫瘍進行因子転写産物にハイブリダイズし、かつ(ii)該細胞におけるMUC1または腫瘍進行因子の発現を阻害する方法。
【請求項３０】
対象がヒト患者である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
癌細胞が乳癌細胞である、請求項29記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、細胞増殖の調節、より詳細に述べると癌増殖の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
DF3/MUC1遺伝子は、ムチン様外部ドメインを伴う、高分子量の膜結合糖タンパク質をコードしている。MUC1糖タンパク質は、分泌上皮細胞の頂端側境界上に発現され、並びに乳房、前立腺、肺および他の種類の癌腫細胞の表面全体に異常に高レベルで発現されている[Kufeら、Hybridoma、3:223-232(1984)；Pereyら、Cancer Res.、52:2563-2568(1992)]。毎年、MUC1を過剰発現している500,000例を超える新規腫瘍が診断されていることを示す評価がある。
【発明の開示】
【０００３】
発明の概要
本発明者らは、MUC1がその細胞質ドメイン(CD)を介して、c-Src、上皮増殖因子受容体(EGF-R)、p120ctn(p120)、およびプロテインキナーゼCδ(PKCδ)に結合していることを発見した。加えて、これらは、c-Src、EGF-R、およびPKCδは、MUC1のCDをリン酸化すること、これらのキナーゼによるMUC1のリン酸化は、β-カテニンのMUC1への増強された結合につながること、並びにEGF-Rによるリン酸化は、c-SrcのMUC1への増強された結合につながることが示された。従って本発明は、(a)腫瘍進行因子(例えば、β-カテニン、p120、c-Src、EGF-R、およびPKCδ)のMUC1への結合；並びに、(b)腫瘍進行因子(例えば、c-Src、EGF-R、およびPKCδ)によるMUC1のリン酸化を阻害する化合物を同定する方法を特徴としている。本発明は更に、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)によるMUC1への結合およびMUC1のリン酸化を増強する化合物を同定する方法を含む。加えて本発明は、細胞におけるMUC1および腫瘍進行因子の発現を阻害する方法、並びに細胞におけるMUC1のβ-カテニンへの結合を阻害する方法を特徴とする。
【０００４】
より詳細に述べると、本発明は、MUC1の腫瘍進行因子への結合を阻害する化合物を同定する方法を特徴としている。この方法は、(a)MUC1被験物質を提供する段階；(b)MUC1被験物質に結合する腫瘍進行因子被験物質を提供する段階；(c)MUC1被験物質を、被験化合物の存在下で、腫瘍進行因子被験物質と接触させる段階；および、(d)被験化合物が、MUC1被験物質の腫瘍進行因子被験物質への結合を阻害するかどうかを決定する段階に関連している。腫瘍進行因子被験物質は、例えば、c-Src被験物質、p120ctn被験物質、上皮増殖因子受容体(EGF-R)被験物質、β-カテニン被験物質、またはプロテインキナーゼCδ(PKCδ)被験物質であることができる。この接触は、無細胞系において行うか、または細胞内において発生することができる。
【０００５】
本発明の別の局面は、MUC1のグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)への結合を増強する化合物を同定する方法である。この方法は、(a)MUC1被験物質を提供する段階；(b)MUC1被験物質に結合するGSK3β被験物質を提供する段階；(c)MUC1被験物質を、被験化合物の存在下で、GSK3β被験物質と接触させる段階；および(d)被験化合物が、MUC1被験物質のGSK3β被験物質への結合を増強するかどうかを決定する段階を含む。この接触は、無細胞系において行うか、または細胞内において発生することができる。
【０００６】
更に本発明は、MUC1を発現している細胞における、MUC1または腫瘍進行因子の発現を阻害するインビトロの方法である。この方法は：(a)MUC1を発現している細胞を同定する段階；および、(b)この細胞を、インビトロにおいて、MUC1転写産物または腫瘍進行因子転写産物にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理する段階を含み、ここでこのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞におけるMUC1または腫瘍進行因子の発現を阻害する。この腫瘍進行因子は、例えば、β-カテニン、c-Src、p120ctn、EGF-R、またはPKCδであることができる。細胞は、癌細胞、例えば、乳癌、肺癌、結腸癌、膵癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌(例えば白血病またはリンパ腫)、神経組織癌、黒色腫、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、膣癌、または膀胱癌の細胞であることができる。細胞は、アンチセンスオリゴヌクレオチドそれ自身により処理されるか、または処理段階は、細胞においてアンチセンスオリゴヌクレオチドへ転写された核酸配列に機能的に連結される転写調節エレメント(TRE)(例えば、DF3エンハンサー)を含む核酸の細胞への導入により実現することができる。
【０００７】
別の本発明の態様は、MUC1を発現している細胞におけるMUC1のβ-カテニンへの結合を阻害するインビトロの方法である。この方法は：(a)細胞がMUC1を発現することを確定する段階；および、(b)この細胞をインビトロにおいて、(i)腫瘍進行因子のMUC1細胞質ドメインへの結合；または(ii)腫瘍進行因子によるMUC1細胞質ドメインのリン酸化を阻害する化合物で処理する段階を含む。腫瘍進行因子は、先に列記したもののいずれかであることができ、該化合物は、(a)MUC1または(b)腫瘍進行因子のペプチド断片であることができる。MUC1のペプチド断片は、MUC1細胞質ドメインのペプチド断片、例えば配列番号：7であるかまたはこれを含むアミノ酸配列を有するペプチド断片であることができる。この細胞は、癌細胞、例えば先に列記した癌細胞のいずれかであることができる。細胞は、この化合物それ自身により処理されるか、または化合物がポリペプチドである場合は、処理段階は、このポリペプチドをコードしている核酸配列へ機能的に連結されたTRE(例えば、DF3エンハンサー)を含む核酸の細胞への導入により達成することができる。
【０００８】
別の本発明の局面は、腫瘍進行因子によりMUC1のリン酸化を阻害する化合物を同定する方法である。この方法は：(a)MUC1被験物質を提供する段階；(b)MUC1被験物質をリン酸化する腫瘍進行因子被験物質を提供する段階；(c)MUC1被験物質を、腫瘍進行因子被験物質と被験化合物の存在下で接触させる段階；および、(d)被験化合物が、腫瘍進行因子被験物質によるMUC1被験物質のリン酸化を阻害するかどうかを決定する段階を含む。この腫瘍進行因子被験物質は、先に列記されたもののいずれかであり、かつ接触は、無細胞系において行うか、もしくは細胞内において発生することができる。
【０００９】
本発明は更に、MUC1を発現している癌細胞におけるMUC1のβ-カテニンへの結合を阻害するインビボの方法も具体化している。この方法は：(a)MUC1を発現する癌を有する対象を確定する段階；および、(b)この対象へ、化合物か、もしくは化合物がポリペプチドである場合は、このポリペプチドをコードしている核酸配列を含む核酸を投与する段階を含む。この化合物は、(i)腫瘍進行因子のMUC1細胞質ドメインへの結合、または(ii)腫瘍進行因子によるMUC1細胞質ドメインのリン酸化を阻害するものである。対象は、ヒト患者であり、および癌細胞は先に列記したもののいずれかであることができる。
【００１０】
更に本発明は、MUC1を発現している癌細胞におけるMUC1または腫瘍進行因子の発現を阻害するインビボの方法を特徴としている。この方法は、(a)対象がMUC1を発現する癌を有することを確定する段階；および、(b)この対象へ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードしている核酸配列に機能的に連結されたTREを含む核酸を投与する段階を含む。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、(i)MUC1転写産物または腫瘍進行因子転写産物へハイブリダイズし、かつ(ii)細胞におけるMUC1または腫瘍進行因子の発現を阻害するものである。対象は、ヒト患者であり、および癌細胞は先に列記したもののいずれかであることができる。
【００１１】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用され、長さまたは翻訳後修飾とは無関係に、アミノ酸の任意のペプチド連結鎖を意味する。本発明の方法のいずれかにおいて使用されるMUC-1、腫瘍進行因子、またはGSK3βの被験
試薬は、野生型であることができるか、または1種もしくは複数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40または50個)の保存的アミノ酸置換を有することができる。保存的置換は、典型的には下記群の置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニン；リシン、ヒスチジンおよびアルギニン；並びに、フェニルアラニンおよびチロシン。
【００１２】
本明細書において使用される「腫瘍進行因子」は、(a)β-カテニン、または(b)β-カテニンのMUC1への結合を増強するために、MUC1細胞質ドメイン中の1種または複数のアミノ酸残基(例えば、チロシンまたはトレオニン残基)を結合および／またはリン酸化するポリペプチドである。腫瘍進行因子は、例えば、β-カテニン、p120、c-Src、EGF-R、およびPKCδの結合を含む。別の関心のある腫瘍進行因子はErbB2である。
【００１３】
本明細書において使用される「腫瘍進行因子被験物質」は、(a)完全長(成熟または未熟)野生型腫瘍進行因子、(b)完全長腫瘍進行因子よりも短い腫瘍進行因子の断片、または(c)1種または複数の保存的置換(前記参照)を伴う(a)または(b)である。完全長野生型腫瘍進行因子以外の腫瘍進行因子被験物質は、MUC1細胞質ドメインに結合するまたはリン酸化する能力を、完全長野生型腫瘍進行因子の、少なくとも50％(例えば、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または100％もしくはそれ以上)有するであろう。腫瘍進行因子被験物質は、例えば、β-カテニン被験物質、p120被験物質、c-Src被験物質、EGF-R被験物質、およびPKCδ被験物質を含む。
【００１４】
本明細書において使用される「MUC1被験物質」は、(a)完全長(成熟または未熟)野生型MUC1、(b)完全長MUC1よりも短いMUC1の断片、または(c)1種または複数の保存的置換(前記参照)を伴う(a)または(b)である。MUC1の断片は、MUC1のCDの全てまたは一部を有するものを含み、かつ残りの成熟MUC1分子を含まないか、全てまたは一部含むかのいずれかである。完全長野生型MUC1以外のMUC1被験物質は、選択された腫瘍悪性化被験物質の作用によりまたはGSK3β被験物質により結合するまたはリン酸化される能力を、完全長野生型MUC1の、少なくとも50％(例えば、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または100％もしくはそれ以上)を有するであろう。
【００１５】
本明細書において使用される「GSK3β被験物質」は、(a)完全長野生型GSK3β、(b)完全長GSK3βよりも短いGSK3βの断片、または(c)1種または複数の保存的置換(前記参照)を伴う(a)または(b)である。完全長野生型GSK3β以外のGSK3β被験物質は、MUC1細胞質ドメインに結合するまたはリン酸化する能力を、完全長野生型GSK3βの、少なくとも50％(例えば、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または100％もしくはそれ以上)を有するであろう。
【００１６】
本明細書において使用される「機能的に連結した」は、発現制御配列が、対象となるコード配列の発現を効果的に制御するように遺伝子構築体に組込まれることを意味する。
【００１７】
特に規定しない限りは、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文書が支配するであろう。好ましい方法および材料を以下に説明するが、本明細書に説明したものと同様のまたは同等の方法および材料も、本発明の実践または試験において使用することができる。本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照として組み入れられている。本明細書において明らかにした材料、方法および実施例は、単なる例証であり、限定を意図するものではない。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点、例えば癌細胞増殖の阻害は、下記の説明、図面、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１９】
詳細な説明
本発明者らは、チロシンキナーゼc-Srcが、そのSH3ドメインを介して、ヒトムチン分子MUC1細胞質ドメイン(CD)に結合し、かつリン酸化することを発見した。他の部位に加え、c-Srcは、MUC1のCD(MUC1/CD)におけるYEKV部位、すなわち配列番号：1の46位のチロシン残基をリン酸化する。c-SrcのSH2ドメインは、リン酸化されたMUC1/CDには結合するが、リン酸化されないものには結合しないことがわかった。他方で、MUC1/CDのc-Srcを介したリン酸化は、MUC1/CDおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)の互いの物理的会合する能力の低下につながる。この知見は細胞内および無細胞系の両方にあてはまる。
【００２０】
GSK3βによるMUC1のリン酸化は、β-カテニンのMUC1への結合の低下につながることはこれまでに示されている[Liら、Mol. Cell Biol、18:7216-7224(1998)]。本発明者らは、MUC1のc-Srcによるリン酸化は、β-カテニンのMUC1/CDへの結合の増大につながること、およびMUC1/CD(配列番号：1)の46位におけるチロシン残基のリン酸化が、β-カテニンのMUC1/CDへの結合に必要であることを発見した。これらの知見は細胞内および無細胞系の両方において得られた。
【００２１】
本発明者らは、同じく、チロシン活性を伴う上皮増殖因子受容体(EGF-R)は、MUC1のCDに結合しかつリン酸化することも認めた。共焦点顕微鏡実験は、細胞の上皮増殖因子(EGF)への曝露前および後に、細胞膜におけるMUC1およびEGF-Rの共局在化(colocalization)を示した。その分布は、未刺激細胞においては均一であるが、EGFで刺激した細胞においては「むら」があった。EGF-RによるMUC1のCDのリン酸化は、配列番号：1の46位のチロシンに加え、他の部位においても生じる。更にEGF-RによるMUC1のCDのリン酸化は、MUC1とc-Srcおよびβ-カテニンの両方の間の増強された物理的会合をもたらし、この結合は、少なくとも一部は、配列番号：1の46位のチロシンリン酸化に依存している。
【００２２】
本発明者らの実験は更に、トレオニンキナーゼPKCδは、MUC1のCDに結合しかつリン酸化することを示した。更にPKCδによるMUC1のCDのリン酸化は、β-カテニンのMUC1のCDへの結合を増強する。この知見は、無細胞系および細胞内の療法にあてはまる。PKCδによるMUC1のCDドメイン(配列番号：1)の41位のリン酸化は、β-カテニンのMUC1のCDへの結合の増強に大きく寄与しているように思われた。
【００２３】
加えて本発明者らは、アルマジロ反復ドメインファミリーであるp120ctn(p120)のメンバーが、MUC1のCDを介してMUC1と会合していることも発見した。結合阻害実験は、p120が、アミノ酸配列MSEYPTYHTH(配列番号：7)を含むMUC1のCDの領域を介して、MUC1のCDに結合することを示している。天然にMUC1を発現しない細胞におけるMUC1の発現は、細胞核においてp120の増大したレベルを生じる。MUC1とp120の複合体が核に移行される可能性がある。
【００２４】
HCT116結腸癌細胞による組換え野生型MUC1の発現は、E-カドヘリンへのβ-カテニンの結合の低下に関連していた。更にHCT116細胞による野生型MUC1の発現は、これらの細胞の増大した足場-非依存性の増殖を生じた。
【００２５】
β-カテニンは、E-カドヘリンに結合し、得られる複合体の形状で、哺乳類上皮細胞のアドヘレンスジャンクションの成分である。p120は、細胞間結合にも局在化している。従って癌細胞におけるMUC1へのβ-カテニンおよび／またはp120の結合の増大は、細胞間結合の成分であるβ-カテニンおよび／またはp120のより低い利用可能性を生じ、これは次に、癌細胞と癌細胞の接着の結合力の低下を生じ、その結果関連性のある癌細胞の転移能を増強する。この概念は、野生型(しかし変異体ではない)MUC1が、β-カテニンのE-カドヘリンへの結合の減少に関連していることを示している前述の実験により裏付けられる。
【００２６】
加えて、β-カテニンおよびp120は両方とも、遺伝子活性化に関連している。β-カテニンおよびp120は両方とも、それらのMUC1との結合後、MUC1との複合体の形状で核へ輸送されるように見えるという事実を考慮し、MUC1のいずれかの結合は、増強された遺伝子活性化、結果的には増強された腫瘍増殖につながり得る。
【００２７】
従ってβ-カテニンおよび／またはp120のMUC1への結合は、腫瘍悪性化(増大された癌細胞増殖および転移能の両方による)を増大し得る。更に、(1)c-Src、EGF-R、およびPKCδのMUC1への結合、およびMUC1のリン酸化による、β-カテニンのMUC1への結合の増強の能力、並びに(2)EGF-RのMUC1への結合、およびMUC1のリン酸化による、c-SrcのMUC1への結合の調節の能力を考慮し、おそらくc-Src、EGF-R、およびPKCδは、癌細胞悪性化の増強に間接的に関与しているであろう。対照的に、GSK3βによるMUC1のリン酸化は、β-カテニンのMUC1への結合の低下につながるので、GSK3βは、おそらく癌細胞悪性化を阻害するであろう。
【００２８】
本発明者らは、MUC1をコードしているcDNAでトランスフェクトしこれを発現している正常3Y1マウス線維芽細胞をヌードマウスに注射した場合に、MUC1の発癌活性が腫瘍を形成したことを明らかにした。加えて、癌細胞増殖の増強におけるMUC1の役割が、前述のように、HCT116細胞による野生型MUC1の発現は、細胞の足場非依存性増殖の増大を生じたという事実により示されている。
【００２９】
化合物のスクリーニング法
本発明は、(a)腫瘍進行因子(例えば、β-カテニン、p120、c-Src、EGF-R、またはPKCδ)のMUC1への結合を阻害する；(b)GSK3βのMUC1への結合を増強する；並びに(c)腫瘍進行因子(例えば、c-Src、EGF-R、またはPKCδ)によるリン酸化を阻害するような、化合物(小分子または巨大分子)を同定するインビトロの方法を提供する。
【００３０】
これらの方法は、(a)単離されたMUC1被験物質、腫瘍進行因子被験物質、およびGSK3β被験物質；または(b)MUC1被験物質および1種または複数の腫瘍進行因子被験物質および／またはGSK3β被験物質を発現している細胞を用いて行うことができる。
【００３１】
前述のポリペプチド被験物質に関して適用された「単離された」という用語は、例えば膵臓、肝臓、脾臓、卵巣、精巣、筋肉、関節組織、神経組織、胃腸管組織または腫瘍組織のような組織内、または血液、血清、もしくは尿のような体液中で、天然の対応物を有さないか、または天然にはそれが付随している成分から分離され、または精製されたかのいずれかのポリペプチドまたはペプチド断片を意味する。典型的には、このポリペプチドまたはペプチド断片は、天然に会合されているタンパク質および他の天然の有機分子を含まず、乾燥質量で少なくとも70％である場合に「単離された」と見なされる。好ましくは、被験物質の調製物は、乾燥質量で被験物質の少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少なくとも99％である。化学合成されたポリペプチドは、その性質上、それが天然には付随している成分から分離されているので、合成ポリペプチド被験物質は「単離されている」。
【００３２】
単離されたポリペプチド被験物質は、例えば、天然の給源から(例えば組織から)の抽出；ポリペプチドをコードしている組換え核酸の発現；または、化学合成により得ることができる。それが天然に起源としている給源とは異なる細胞系において作成されたポリペプチド被験物質は、天然にはそれが付随している成分を必ずしも含まないので、「単離されている」。単離の程度または純度は、いずれか適当な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析により測定することができる。
【００３３】
試験前に、いずれかの被験物質は、当技術分野において公知の方法により、例えば、リン酸化またはグリコシル化のような修飾を受けることができる。リン酸化は、腫瘍進行因子(例えば、c-Srcおよびβ-カテニン)の一部のMUC1 CDへの結合を増大する。
【００３４】
単離されたMUC1の単離された腫瘍進行因子または単離されたGSK3βへの結合を、各々、阻害または増強する化合物のスクリーニング法において、MUC1被験物質は、1種または複数の濃度の被験化合物の存在下で、腫瘍進行因子被験物質またはGSK3β被験物質に接触され、かつ被験化合物の存在および非存在下での2種の被験物質間の結合が検出または測定される。このようなアッセイにおいて、被験物質はいずれも、検出可能に標識される必要はない。例えば、表面プラスモン共鳴現象の探索により、MUC1被験物質は、適当な固形基体に結合することができ、かつ腫瘍進行因子(またはGSK3β)被験物質は、関心のある化合物の存在および非存在下で、基体に結合したMUC1被験物質に曝される。固形基体上のMUC1被験物質に対する腫瘍進行因子(またはGSK3β)被験物質の結合は、表面プラスモン共鳴強度の変化を生じ、これは、例えばBiacore装置(Biacore International AB社、ラプスガタム、スウェーデン)のような適当な機器により、定性的または定量的に検出することができる。この実験は、逆方向に、すなわち、固形基体に結合した腫瘍進行因子(またはGSK3β)被験物質の、被験化合物の存在下でそれに添加されたMUC1被験物質により行うことができることは理解されるであろう。
【００３５】
更にMUC1への結合を阻害または増強を試験するアッセイ法は、例えば下記の使用に関連することができる：(a)検出可能に標識された、単独のMUC1特異的「検出」抗体；(b)非標識のMUC1特異的抗体および検出可能に標識された二次抗体；または(c)ビオチン化されたMUC1特異的抗体および検出可能に標識されたアビジン。加えて、当業者により知られているこれらの方法(「多層」アッセイを含む)の組合せを使用し、アッセイ感度を増強することができる。これらのアッセイ法において、腫瘍進行因子(またはGSK3β)被験物質は、例えば、被験物質を含有する試料アリコートの膜上への「スポッティング」により、ナイロンまたはニトロセルロース膜のような固形基体、またはその上で試料もしくは試料アリコートが電気泳動分離される電気泳動用ゲル上に固定されるか、膜へのブロッティングにより固定され得る。その後基体に結合した被験物質は、被験化合物の存在および非存在下でMUC1被験物質に曝される。得られた混合物を一定期間および対象となるシステムに最適化した温度でインキュベーションした後、固形基体上の腫瘍進行因子(またはGSK3β)試験に結合したMUC1被験物質の存在および／または量が、MUC1被験物質に結合する検出抗体を用い、かつ必要ならば、適当な検出可能に標識した二次抗体またはアビジンを用いてアッセイされる。腫瘍進行因子(またはGSK3β)被験物質の固形基体への結合の代わりに、MUC1被験物質がそれに結合することができることは理解されるであろう。この場合、腫瘍進行因子(またはGSK3β)被験物質の基体に結合したMUC1への結合は、基体に結合した腫瘍進行因子(またはGSK3β)被験物質に関して前述の方法の明らかな適応により試験される。
【００３６】
本発明は更に、「サンドイッチ」アッセイ法を特徴としている。これらのサンドイッチアッセイ法においては、前述の方法による被験物質の固形基体上への固定の代わりに、適当な被験物質が、固形基体の被験物質への曝露前に、当技術分野において公知の様々な方法のいずれかによる二次(「捕捉」)被験物質特異的抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル抗体(mAb))の固形基体への複合により、固形基体上に固定される。その後この被験物質は、固形基体へ複合された捕捉抗体への結合により、固形基体へ結合される。この手法は、本質的に、適当な被験物質が捕捉抗体の使用に関連しない技術により固形基体に結合される方法と同じ前述の方法で実行される。これらのサンドイッチアッセイ法において、捕捉抗体は、検出抗体とは同じエピトープ(またはポリクローナル抗体の場合はエピトープ範囲)には結合してはいけないことは理解される。従って、mAbが捕捉抗体として使用される場合は、検出抗体は、(a)捕捉mAbが結合するエピトープから完全に物理的に分離されたまたはこれに部分的にのみ重複しているエピトープに結合する別のmAb；または、(b)捕捉mAbが結合するもの以外のまたはこれに追加のエピトープに結合するポリクローナル抗体のいずれかであることができる。他方で、ポリクローナル抗体が捕捉抗体として使用される場合は、検出抗体は、(a)捕捉ポリクローナル抗体が結合するエピトープから完全に物理的に分離されたまたはこれに部分的に重複しているエピトープに結合するmAb；または、(b)捕捉ポリクローナル抗体が結合するもの以外のまたはこれに追加のエピトープに結合するポリクローナル抗体のいずれかであることができる。捕捉および検出抗体の使用に関連しているアッセイ法は、サンドイッチELISAアッセイ法、サンドイッチウェスタンブロットアッセイ法、およびサンドイッチ免疫磁気検出アッセイ法を含む。
【００３７】
捕捉抗体が結合することができる適当な固形基体は、マイクロタイタープレートのウェルのプラスチック底面および側面、ナイロン膜もしくはニトロセルロース膜のような膜、高分子(例えば、アガロース、セルロース、またはポリアクリルアミドであるが、これらに限定されるものではない)ビーズもしくは粒子を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
検出可能な標識の検出および／または定量の方法は、その標識の性質によって決まり、かつ当技術分野において公知である。適当な標識は、放射性核種(例えば、125I、131I、35S、3H、32P、または14C)、蛍光部分(例えば、フルオレセイン、ローダミン、またはフィコエリトリン)、ルミネセンス部分(例えば、Quantum Dot社(パロアルト、CA)から供給されるQdot(商標)ナノ粒子)、限定された波長の光を吸収する化合物、または酵素(例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ)を含むが、これらに限定されるものではない。適当な酵素により触媒された反応生成物は、蛍光性、ルミネセントまたは放射性であることができるが、これらに限定されるものではなく、またはこれらは可視光または紫外線を吸収することができる。検出器の例は、X線フィルム、放射能カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、ルミノメーター、およびデンシトメーターを含むが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
候補化合物は同じく、細胞中のMUC1の腫瘍進行因子(またはGSK3β)への結合を阻害または増強するそれらの能力についても試験される。これらの細胞は、関心のある適当なMUC1被験物質および／もしくは腫瘍進行因子(もしくはGSK3β)被験物質を天然で発現することができるか、またはこれらは被験物質のいずれかまたは両方を組換えにより発現することができるかのいずれかである。これらの細胞は、正常または悪性であってもよく、かつあらゆる組織型、例えば上皮細胞、線維芽細胞、リンパ系細胞、マクロファージ／単球、顆粒球、角化細胞、または筋細胞であることができるが、これらに限定されるものではない。適当な細胞株は、実施例に列挙されるもの、例えば乳癌細胞株または線維芽細胞株を含む。この被験化合物は、細胞を含有する溶液(例えば、培養培地)に添加するか、または化合物がタンパク質である場合は、細胞はこれを組換えにより発現することがことができる。これらの細胞は、細胞の化合物への曝露の前後に、任意に対象となる刺激(例えば、EGFのような増殖因子)に曝露することもできる。非存在または存在(任意に様々な濃度で)下での、対象となる被験物質を発現している細胞のインキュベーション後、これらの被験物質の間の物理的会合は、適当に標識された両被験物質に特異的な抗体を用い、顕微鏡的に、例えば共焦点顕微鏡により、決定することができる。あるいはこれらの細胞は、非解離条件下で溶解することができ、これらの溶解液は、物理的に会合した被験物質の存在について試験される。このような方法は、単離された被験物質を用い説明されたものの適応を含む。例えば、2種の被験物質の一方(被験物質1)に特異的な抗体は、固形基体(例えば、マイクロタイタープレートウェルの底面および側面、またはナイロン膜)と結合することができる。未結合の抗体の洗浄除去後、結合した抗体を伴う固形基体は、細胞溶解液と接触される。第二の被験物質(被験物質2)に結合したまたは結合していないこの溶解液中の被験物質1は、固形基体上の被験物質1に特異的な抗体に結合すると考えられる。未結合の溶解液成分の洗浄除去後、被験物質2(被験物質1および被験物質1に特異的抗体を介して固形基体へ結合した)の存在が、検出可能に標識された被験物質2に特異的な抗体(前記参照)を用いて試験される。あるいは、被験物質1は、被験物質1に特異的な抗体と共に免疫沈降され、免疫沈降された物質は、電気泳動により分離される(例えば、非解離条件下で行われるポリアクリルアミドゲル電気泳動)。電気泳動ゲルはその後、膜(例えばナイロンまたはニトロセルロース膜)上にブロッティングされ、膜上のいずれかの被験物質2が、前述の方法のいずれかにより、検出可能に標識された被験物質2に特異的な抗体(前記参照)により検出および／または測定される。前述のアッセイ法において、被験物質1は、MUC1被験物質または腫瘍進行因子(またはGSK3β)被験物質のいずれかまたはその逆であることは理解される。
【００４０】
本発明は更に、MUC1および／または腫瘍進行因子と相互作用し、それによりMUC1の適当な腫瘍進行因子と相互作用する能力を阻害する可能性のある化合物を予測またはデザインするための、MUC1被験物質および／または腫瘍進行因子被験物質の使用にも関する。当業者には、MUC1および／または腫瘍進行因子の上の適当な部位に結合する小分子を同定するための、標準の分子モデリングまたは他の技術の使用法が知られている。このような例のひとつは、Broughtonの論文(Curr. Opin. Chem. Biol.、1:392-398(1997))に提供されている。いずれかの分子上の適当な部位(例えば、アロステリック部位)への結合により、MUC1のGSK3βへの結合を増強するであろう化合物を予測またはデザインするために、同様の分子モデリング法も使用することができる。
【００４１】
本発明は更に、腫瘍進行因子によるMUC1のリン酸化を阻害する化合物の能力を試験する方法も提供する。キナーゼ活性を持つ腫瘍進行因子のMUC1への結合は一般にリン酸化が生じるのに必須であるので、MUC1と腫瘍進行因子の間の物理的相互作用を阻害する化合物の能力を試験する前述の方法は、被験化合物が腫瘍進行因子によるMUC1のリン酸化を阻害するかどうかの情報に富んでいる。しかし、リン酸化の阻害を直接試験するアッセイ法も実行することができる。結合の阻害／増強アッセイ法に関して、リン酸化の阻害を試験する方法も、単離された被験物質または細胞中の被験物質を用いて実行することができる。
【００４２】
単離された被験物質を使用する場合、対象となる2種の被験物質(すなわち、MUC1被験物質およびキナーゼ活性を伴う腫瘍進行因子被験物質、例えば、c-Src、EGF-R、またはPKCδ)、被験化合物(任意に様々な濃度で)、およびリンイオン給源(例えばATP)が混合される。この反応混合液は、当業者により容易に決定可能な条件下でインキュベーションされ、MUC1上のリン酸基の存在を、当技術分野において公知の様々な方法により試験することができる。MUC1被験物質(腫瘍進行因子物質を非含有または複合化した)は、反応混合液から、(例えば、当技術分野において公知の免疫沈降、電気泳動、または適当なクロマトグラフィー法により)分離することができ、MUC1被験物質上のリン酸基の存在は、当技術分野において公知の様々な方法により検出される。例えば、リン酸イオン給源(例えばATP)の一部または全ての分子が、リン酸イオン中に放射性核種(例えば32P)を含むならば、分離されたMUC1被験物質上のリン酸基は、放射能またはシンチレーションカウンターを用いて検出および／または測定することができる。あるいはこの反応混合液(免疫沈降を伴うまたは伴わない)は、電気泳動(例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE))により分離することができ、この電気泳動ゲルはX線フィルムに露光することができる。関連したMUC1被験物質のリン酸化は、X線フィルム上の適当な位置(MUC1被験物質の分子量により決定される)での暗色バンドの存在により証明される。MUC1被験物質バンドのリン酸化の程度は、デンシトメーターにより定量することができる。
【００４３】
別の方法において、リン酸イオンの給源(例えばATP)は、放射性核種を含む必要はない。この場合反応混合液、または反応混合液から分離されたMUC1試験される物質(例えば免疫沈降により)は、電気泳動にかけられる。リン酸化されたMUC1被験物質とリン酸化されないMUC1被験物質とは、純粋に移動度シフトを基に区別することができる。より多くのリン酸基がポリペプチド上にあると、ポリペプチドの移動がより遅くなる。あるいは電気泳動ゲルを膜上にブロッティングし、対象となるリン酸化されたアミノ酸に特異的な抗体により染色することができ；このようなアミノ酸は、チロシン、トレオニン、およびセリンを含む。更に別の方法において、反応混合液から分離された(例えば、免疫沈降または酸沈殿により)MUC1は、タンパク質分解酵素により消化し、得られた生成物に、例えば質量分析または薄層クロマトグラフィーを施すことができる。タンパク質のリン酸化の検出および／または測定の他の方法も、当技術分野において公知である。
【００４４】
リン酸化の阻害が細胞において試験される場合、これらの細胞は、説明されたように結合の阻害について試験することができる。試験混合液が外来性リン酸イオン給源(例えばATP)を含むことができ、または適当な分子の細胞内貯蔵に頼ることができる。MUC1被験物質の放射測定によるリン酸基の検出が望ましい場合、放射標識されたリン酸(例えば、[32P]-ATP)の自然の外因性の供給源が反応混合液に添加される。結合阻害アッセイ法に関して、被験化合物は、細胞を含有する溶液に添加することができ、またはこの細胞は組換えによりそれを発現することができる。
【００４５】
固定量の腫瘍進行因子被験物質へ結合する確定した任意レベル(defined arbitrary level)を達成するために、該化合物の非存在下で達成されるよりも、所定のMUC1被験物質の少なくとも1.5倍(例えば、2倍、4倍、6倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍、または100,000倍)多い存在が必要な候補化合物は、MUC1と関連する腫瘍進行因子の間の相互作用を阻害するのに有用であり、その結果癌の治療的物質として有用であることができる。あるいは、固定量のMUC1被験物質へ結合する確定した任意レベルを達成するために、該化合物の非存在下で達成されるよりも、所定の腫瘍進行因子被験物質の少なくとも1.5倍(例えば、2倍、4倍、6倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍、または100,000倍)多い存在が必要な候補化合物は、MUC1と関連する腫瘍進行因子の間の相互作用を阻害するのに有用であり、その結果癌の治療的物質として有用であることができる。
【００４６】
加えて、固定量のGSK3β被験物質へ結合する確定した任意レベルを達成するために、該化合物の非存在下で達成されるよりも、所定のMUC1被験物質の少なくとも1.5倍(例えば、2倍、4倍、6倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍、または100,000倍)少ない存在が必要な候補化合物は、MUC1とGSK3βの間の相互作用を増強するのに有用であり、その結果癌の治療的物質として有用であることができる。あるいは、固定量のMUC1被験物質へ結合する確定した任意レベルを達成するために、該化合物の非存在下で達成されるよりも、所定のGSK3β被験物質の少なくとも1.5倍(例えば、2倍、4倍、6倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍、または100,000倍)少ない存在が必要な候補化合物は、MUC1とGSK3βの間の相互作用を増強するのに有用であり、その結果癌の治療的物質として有用であることができる。
【００４７】
更に、MUC1被験物質のリン酸化の確定した任意レベルを達成するため(関連アッセイの条件下)に、該化合物の非存在下で達成されるよりも、所定の腫瘍進行因子被験物質の少なくとも1.5倍(例えば、2倍、4倍、6倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍、または100,000倍)多い存在が必要な候補化合物は、関連した腫瘍進行因子によるMUC1のリン酸化を阻害するのに有用であり、その結果癌の治療的物質として有用であることができる。
【００４８】
細胞におけるMUC1のβ-カテニンへの結合の阻害法
本発明は、細胞におけるMUC1のβ-カテニンへの結合を阻害する方法を特徴としている。この方法は、(a)腫瘍進行因子のMUC1への(例えば、MUC1細胞質ドメインへの)結合；および／または(b)MUC1(例えば、MUC1細胞質ドメイン内)のリン酸化を阻害する化合物の、細胞への導入に関連している。この化合物の細胞への導入前に、この細胞(または、処置される細胞が得られた対象からの別の癌細胞)は、任意にMUC1発現について試験することができる。これは、当技術分野において公知の多種多様な方法のいずれかにより、MUC1タンパク質またはMUC1 mRNAのいずれかの発現について試験することにより行うことができる。
【００４９】
この化合物は、前述の方法で同定されたものであることができる。この方法に有用な化合物は、(a)MUC1と腫瘍進行因子の間の結合を阻害する(従って、腫瘍進行因子がキナーゼ活性を有する場合は、MUC1の腫瘍進行因子によるリン酸化も阻害する)もの；並びに、(b)腫瘍進行因子の結合は必ずしも阻害しないが、MUC1の腫瘍進行因子によるリン酸化は阻害するものを含む。
【００５０】
(a)の範疇の化合物の例は、腫瘍進行因子に結合するMUC1のCDのペプチド断片(例えば、アミノ酸配列MSEYPTYHTH(配列番号：7)を含むまたはこれからなるペプチド断片)、並びにMUC1に結合する腫瘍進行因子断片(実質的にキナーゼ活性を欠いているかまたはMUC1(配列番号：1)のCDの46位のチロシン残基のリン酸化に作用する能力を欠いている)である。適当なMUC1のCDの断片は、アミノ酸配列YEKV(配列番号：11)を含むまたはこれからなるものである(例えば、アミノ酸配列DRAPYEKV；配列番号：12を含むまたはこれからなるペプチド)。YEKVアミノ酸配列を含むペプチドは、YEKV配列のいずれかの末端または両端に、最大50個(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、または50個)のMUC1残基または無関係の残基を含むことができる。腫瘍進行因子結合のインヒビターとして使用されるMUC1ペプチドはいずれも、任意にリン酸化されたリン酸化され易いアミノ酸残基を有することができる。適当な腫瘍進行因子の断片は、c-SrcのSH2および／またはSH3ドメインの全てまたは一部を含むまたはこれからなるペプチドを含む。
【００５１】
(b)の範疇の化合物の例は、あらゆる長さであるが完全長、成熟、野生型腫瘍進行因子よりも短い腫瘍進行因子の断片のいずれかであることができ、かつ断片内のキナーゼ活性を実質的に除去するために腫瘍進行因子が置換されたキナーゼ機能に必要なアミノ酸を有するまたは有しているような1種または複数のキナーゼドメインを欠いているドミナントサプレッサー分子を含む。あるいは、このようなドミナントサプレッサーは、完全長、成熟または未熟の腫瘍進行因子(または、成熟腫瘍進行因子であるがいくつかのシグナルペプチドアミノ酸を含む)を含むまたはそれであることができるが、しかし置換されたキナーゼ機能に必要なアミノ酸を有し、結果的にこの断片はキナーゼ活性を実質的に欠いている。腫瘍進行因子由来でかつ実質的にキナーゼ活性を欠いている化合物は、対応する完全長、成熟、野生型腫瘍進行因子よりも、少なくとも5倍(例えば、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも40倍、少なくとも100倍、少なくとも1,000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも100,000倍、または少なくとも106倍)低いキナーゼ活性を有し；この化合物は好ましくは検出可能なキナーゼ活性を有さないであろう。(b)の範疇の化合物の別の例は、腫瘍進行因子によるリン酸化を受けやすい部位(例えば、配列番号：1の46位のチロシンまたは配列番号：1の41位のトレオニンのような、1個または複数の残基)を含むMUC1のCDの断片である。このような化合物の例は、アミノ酸配列YEKV(配列番号：11)を含むまたはこれからなる先に説明されたペプチドである。このような化合物の別の例は、アミノ酸配列STDRS(配列番号：9)を含むまたはこれからなるペプチド(MUC1のCD由来)である(例えば、アミノ酸配列STDRSPYE(配列番号：13)を含むまたはからなるペプチド)。このようなペプチドは、STDRSアミノ酸配列のいずれかの末端または両端に、最大50個(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、または50個)のMUC1残基または無関係の残基を含むことができる。
【００５２】
適当な結合-阻害および／またはリン酸化-阻害活性のための化合物のデザイン、生成および試験の方法は、当業者に公知である。
【００５３】
概して本発明の方法を適用することができる細胞は、MUC1を発現するあらゆる細胞を含む。このような細胞は、正常上皮細胞のような正常細胞、またはその増殖が阻害されることが望ましいおよび／またはその隣接細胞へ接着する能力が増強されることが望ましいような癌細胞を含む。適当な癌細胞は、乳癌、肺癌、結腸癌、膵癌、直腸癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌(例えば、白血病またはリンパ腫)、神経組織癌、黒色腫、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、子宮頚癌、膣癌、または膀胱癌の細胞を含む。
【００５４】
これらの方法は、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで行うことができる。適当な化合物のインビトロ適用は、例えば、腫瘍細胞生物学の基礎的科学研究、例えば腫瘍細胞増殖および／または転移を促進することにおける本明細書に列記されたMUC1および／または腫瘍進行因子の作用機序の研究において、有用であることができる。加えて阻害性の化合物は、阻害活性を有する追加の化合物を同定する方法において「正の制御」として使用することができる(前記参照)。このようなインビトロの方法において、MUC1および1種または複数の腫瘍進行因子を発現している細胞は、様々な時間、様々な濃度の阻害性化合物と共にインキュベーションすることができる。当業者には公知である他のインキュベーション条件(例えば、温度、または細胞濃度)も、変動させることができる。結合および／またはリン酸化の阻害は、本明細書に記されたような方法により試験することができる。
【００５５】
本発明の方法は、インビボまたはエキソビボであることが好ましい。
【００５６】
MUC1と腫瘍進行因子の間の結合を阻害するおよび／またはMUC1の腫瘍進行因子によるリン酸化を阻害する化合物は、一般に癌細胞(例えば、乳癌細胞)の増殖-阻害療法または転移-阻害療法として有用である。これらは、哺乳類対象(例えば、ヒト乳癌患者)へ、単独でまたは他の薬物および／または放射線療法と併用して投与することができる。本明細書において使用される「治療的」化合物は、疾患症状の完全な排除または疾患症状の重症度の低下を引き起す化合物である。「予防」は、疾患(例えば、癌)症状が本質的に存在しないことを意味する。
【００５７】
これらの方法が癌を有する対象に適用される場合、化合物の投与前に、任意に癌は、当技術分野において公知の方法により、MUC1発現(MUC1タンパク質またはMUC1 mRNA発現)について試験され得る。このような方法は、対象から得られた癌細胞について、インビトロにおいて行うことができる。あるいは例えばMUC1に特異的な放射標識した抗体を使用するインビボ造影技術において、行うことができる。加えて癌の対象の体液(例えば、血液または尿)を、MUC1タンパク質またはMUC1タンパク質断片の上昇したレベルについて試験することができる。
【００５８】
本発明のこれらの方法は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラットおよびマウスのような、広範な種に適用することができる。
【００５９】
インビボの方法
ひとつのインビボの方法において、MUC1の腫瘍進行因子への結合またはMUC1の腫瘍進行因子によるリン酸化を阻害する化合物(前記参照)が、対象へ投与される。一般に、本発明の化合物は、薬学的に許容される担体(例えば、生理的食塩水)中に懸濁され、経口もしくは静脈内注入、または皮下、筋肉内、髄腔内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内または肺内への注射により投与される。これらは直接腫瘍細胞へ、例えば腫瘍または、残留する腫瘍細胞を殺傷するために腫瘍の外科的摘出後の腫瘍床へ、送達することができる。必要な用量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者疾患の性質；対象のサイズ、体重、表面積、年齢および性別；投与される他の薬物；並びに、担当医の判断に応じて決まる。適当な用量は、0.01μg/kg〜1g/kgである。必要な用量の広範な変動は、利用可能な様々な化合物および様々な投与経路の異なる効率を考慮し予想される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりもより高い用量が必要であると予想される。これらの用量レベルの変動は、当技術分野において周知のような最適化のための標準の経験的慣習を用いて調節することができる。投与は、単回または複数回(例えば、2倍、3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、50倍、100倍、150倍またはそれ以上)であることができる。適当な送達媒体(例えば、高分子マイクロ粒子または移植可能な装置)内の該ポリペプチドのカプセル封入は、特に経口送達について、送達効率を上昇させることができる。
【００６０】
あるいは、阻害性化合物がポリペプチドである場合、このポリペプチドをコードしている核酸配列を含有するポリヌクレオチドを、哺乳類の適当な細胞へ送達することができる。このコード配列の発現は、対象の体内のあらゆる細胞に対して指示することができる。しかし好ましくは、発現は、増殖が阻害されることが望ましい腫瘍細胞近傍の細胞に対して指示される。コード配列の発現は、腫瘍細胞それ自身に対して指示することができる。これは、例えば、当技術分野において公知である、高分子で生分解性のミクロ粒子またはマイクロカプセル送達装置の使用により達成することができる。
【００６１】
核酸の取込みを達成する別の方法は、標準の方法で調製されたリポソームの使用である。これらのベクターは、単独で、これらの送達媒体へ取込まれるか、または組織特異的抗体または腫瘍特異的抗体と共に取込まれる。あるいは、静電気力または共有結合力によりポリ-L-リシンに結合されたプラスミドまたは他のベクターで構成された分子複合体を調製することができる。ポリ-L-リシンは、標的細胞上の受容体に結合することができるリガンドに結合する[Cristianoら、J. Mol. Med.、73:479(1995)]。あるいは、組織特異的標的化は、当技術分野において公知である組織特異的転写調節エレメント(TRE)の使用により達成することができる。筋肉内、皮内または皮下部位への「裸のDNA」の送達(すなわち、送達媒体を伴わない)は、インビボ発現を実現する別の手段である。
【００６２】
関連したポリヌクレオチド(例えば、発現ベクター)において、開始因子メチオニンおよび任意に標的化配列を有する対象となるポリペプチドをコードしている核酸配列は、プロモーターまたはエンハンサー-プロモーター組合せと機能的に連結されている。短いアミノ酸配列は、タンパク質の特異的細胞内区画への方向付けのシグナルとして作用することができる。このようなシグナル配列は、米国特許第5,827,516号に詳細に開示されており、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている。
【００６３】
エンハンサーは、時間、位置、およびレベルに関して、発現特異性を提供する。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、プロモーターが存在するならば、転写開始部位から変動する距離に位置した場合に、機能することができる。同じくエンハンサーは、転写開始部位の下流に位置することができる。コード配列をプロモーターの制御下とするには、プロモーターの下流(3'側)の1〜約50個のヌクレオチド間にペプチドまたはポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を配置することが必要である。対象となるプロモーターは、サイトメガロウイルスhCMV前初期遺伝子、SV40アデノウイルスの初期または後期プロモーター、lacシステム、trpシステム、TACシステム、TRCシステム、ファージAの主要オペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、並びに酵母α-接合因子のプロモーター、アデノウイルスE1b最小プロモーター、またはチミジンキナーゼ最小プロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。DF3エンハンサーは、MUC1を天然に発現している細胞、例えば、正常上皮細胞または悪性上皮細胞(癌腫細胞)、例えば乳癌細胞における阻害性化合物の発現に特に有用であることができる[米国特許第5,565,334号および第5,874,415号参照]。発現ベクターのコード配列は、転写停止領域に機能的に連結される。
【００６４】
適当な発現ベクターは、プラスミド、並びに例えばヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化したワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターを含む。
【００６５】
ポリヌクレオチドは、薬学的に許容できる担体中で投与することができる。薬学的に許容できる担体は、例えば生理的食塩水またはリポソームのような、ヒトへの投与に適した生体適合性の媒体である。治療有効量は、治療した動物において医学的に望ましい結果(例えば、癌細胞増殖の低下)をもたらすことが可能であるポリヌクレオチドの量である。医療分野において周知であるように、いずれかの患者個人に関する用量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される具体的化合物、性別、投与の時間および経路、全身の健康状態、並びに同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因により左右される。用量は変動するが、ポリヌクレオチド投与に好ましい用量は、ポリヌクレオチド分子の約106〜約1012コピーである。この投与量は、必要ならば、反復投与することができる。投与経路は、前述のリストのいずれかであることができる。
【００６６】
エキソビボの方法
エキソビボの方法は、対象から得られた細胞の、MUC1の腫瘍進行因子への結合またはMUC1の腫瘍進行因子によるリン酸化を阻害するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドによるトランスフェクションおよび形質導入に関連している。このトランスフェクトおよび形質導入された細胞は、その後対象へ戻される。これらの細胞は、造血細胞(例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、T細胞、またはB細胞)、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、または筋細胞を含むが、これらに限定されるものではない、広範な種類のいずれかであることができる。このような細胞は、対象においてそれらが生存する限りは、阻害性ポリペプチドの給源として作用する。あるいは、腫瘍細胞は、好ましくは対象から得ることができるが、対象以外の個体からも得る可能性があり、これは阻害性ポリペプチドをコードしているベクターによりトランスフェクトまたは形質導入される。好ましくは増殖能を廃絶する物質により処理された(例えば、電離放射線)腫瘍細胞は、次に患者に導入され、そこでこれらは該ポリペプチドを分泌する。
【００６７】
エキソビボの方法は、細胞を対象から採取する段階、この細胞を培養する段階、これらを発現ベクターへ形質導入する段階、およびこれらの細胞をMUC1の腫瘍進行因子への結合またはMUC1の腫瘍進行因子によるリン酸化を阻害するポリペプチドの発現に適した条件下で維持する段階を含む。これらの方法は分子生物学の分野において公知である。形質導入段階は、エキソビボ遺伝子治療に関して使用されるいずれか標準の手段により達成され、これはリン酸カルシウム、リポフェクション、電気穿孔、ウイルス感染、および微粒子銃による遺伝子導入を含む。あるいは、リポソームまたは高分子マイクロ粒子を使用することができる。うまく形質導入された細胞は、例えば、コード配列または薬物耐性遺伝子の発現について選択することができる。これらの細胞はその後、致死的に放射線照射(望ましい場合)され、患者へ注射または移植される。
【００６８】
細胞におけるMUC1または腫瘍進行因子の発現を阻害する方法
本発明は、細胞におけるMUC1および／または腫瘍進行因子の発現を阻害する方法も含む。この方法は、(a)アンチセンスオリゴヌクレオチド、または(b)細胞においてアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドへ転写される核酸配列(nucleic sequence)に機能的に連結された転写調節エレメント(TRE)を含む核酸の、細胞への導入に関連している。アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への導入前に、この細胞(または処理される細胞が得られる対象由来の別の癌細胞)が、前述のようなMUC1の発現について任意に試験される。
【００６９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスRNAは、MUC1または腫瘍進行因子転写産物へハイブリダイズし、細胞内のMUC1または腫瘍進行因子の発現を阻害する作用を細胞において有する。細胞におけるMUC1または腫瘍進行因子の発現の阻害は、増殖を阻害および／または細胞の隣接細胞への接着を増強する。従ってこの方法は、癌細胞の増殖および／または癌細胞の転移の阻害において有用であることができ、かつその結果癌療法に適用することができる。
【００７０】
アンチセンス化合物は一般に、例えば、標的mRNA分子の翻訳を直接妨害すること、標的mRNAのRNAse Hを介した分解、mRNAの5'キャッピングによる妨害、5'キャップをマスキングすることにより標的mRNAへの翻訳因子の結合を妨げること、またはmRNAポリアデニル化を阻害することのいずれかにより、タンパク質発現を妨害するために使用される。タンパク質発現による妨害は、アンチセンス化合物のその標的mRNAとのハイブリダイズにより生じる。アンチセンス化合物との相互作用のための対象となる標的mRNA上の特異的標的化部位が選択される。従って例えばmRNA上の好ましい標的化部位のポリアデニル化の修飾のための標的は、ポリアデニル化シグナルまたはポリアデニル化部位である。mRNAの安定性または分解を減少するためには、不安定化(destabilizing)配列が、好ましい標的部位である。一旦1個または複数の標的部位が確定されたならば、望ましい作用を生じるために、この標的部位と十分に相補性があるオリゴヌクレオチドが選択される(すなわち、生理的条件下および十分な特異性で十分良くハイブリダイズする)。
【００７１】
本発明に関して「オリゴヌクレオチド」という用語は、RNA、DNA、またはいずれかの模倣物のオリゴマーまたはポリマーを意味する。この用語は、天然の核酸塩基、糖、および共有結合したヌクレオシド内(骨格)連結で構成されたオリゴヌクレオチドを含む。RNAおよびDNAの正常な連結または骨格は、3'から5'へのホスホジエステル結合である。しかしこの用語は更に、非天然の成分のみを含むオリゴヌクレオチドと同様に機能する非天然の成分で全体が構成された、または、これを含む部分を有するオリゴヌクレオチドも意味する。望ましい特性、例えば増強された細胞取込み、増強された標的配列への親和性、およびヌクレアーゼ存在下での増大された安定性のために、このような修飾され置換されたオリゴヌクレオチドが、未変性の型よりも好ましいことが多い。模倣物において、コア塩基(ピリミジンまたはプリン)構造は一般に保存されるが、(1)糖は修飾または他の成分と交換され、および／または(2)内部核酸塩基連結は修飾される。非常に有用であることが証明された核酸模倣物のひとつの種類は、タンパク質核酸(protein nucleic acid)(PNA)と称されるものである。PNA分子において、糖骨格は、アミド含有骨格により、特にアミノエチルグリシン骨格により交換されている。これらの塩基は維持され、かつ骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接結合されている。本発明において有用なPNAおよび他の模倣物は、米国特許第6,210,289号に詳細に開示されている。
【００７２】
本発明の方法において使用されるアンチセンスオリゴマーは一般に、約8〜約100個(例えば、約14〜約80個または約14〜約35個)の核酸塩基(または核酸塩基が天然のものであるヌクレオシド)を含む。
【００７３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはそれ自身細胞へ導入することができるか、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードしている核酸配列(TREへ機能的に連結された)を含む発現ベクターが、細胞へ導入される。後者の場合、この発現ベクターにより作出されたオリゴヌクレオチドは、RNAオリゴヌクレオチドであり、このRNAオリゴヌクレオチドは、全体が天然の成分で構成されるであろう。
【００７４】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボであることができる。この方法のインビトロ適用は、例えば、細胞増殖または細胞接着に関する基礎的科学研究において有用であることができる。このようなインビトロの方法において、適当な細胞(例えば、MUC1および／または腫瘍進行因子を発現しているもの)は、様々な濃度の(a)アンチセンスオリゴヌクレオチド、または(b)このアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードしている核酸配列を含む発現ベクターと共に、様々な時間インキュベーションされる。当技術分野において公知の他のインキュベーション条件(例えば、温度または細胞濃度)も変動することができる。MUC1または腫瘍進行因子発現の阻害は、当業者に公知の方法、例えば本明細書に説明されたような方法により試験され得る。しかし、本発明の方法は好ましくはインビボにおけるものである。
【００７５】
アンチセンス法は一般に、癌細胞(例えば、乳癌細胞)の増殖-阻害療法および／または転移-阻害療法において有用である。これらは、哺乳類対象(例えば、ヒト乳癌患者)へ、単独でまたは他の薬物および／または放射線療法と組合わせて投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの癌の対象への投与前に、癌を、前述のようにMUC1発現について試験することができる。用量、製剤化、投与経路、ベクター、および標的化は、細胞においてMUC1のβ-カテニンへの結合を阻害するためのインビボの方法において説明されたようなものである。当然、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードしている核酸配列を含む発現ベクターは、その増殖が阻害されることが望ましい細胞へ標的化されることが好ましいであろう。
【００７６】
本発明のアンチセンス法は、広範な種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラットおよびマウスなどに適用することができる。
【００７７】
本発明は、非アンチセンス機序による、MUC1遺伝子の転写またはMUC1 mRNAの翻訳を阻害する化合物(好ましくは小分子)の使用に関連するMUC1の発現を阻害するインビボおよびインビトロの両方法も含む。このような方法において、阻害性化合物は、本明細書に説明された細胞のいずれかとインビトロにおいて接触されるか、または対象へ本明細書に説明されたいずれかの用量および経路で投与されるかのいずれかである。対象は、好ましくは、癌を有する対象、例えばヒト癌患者である。本発明は特定の作用機序に限定されるものではないが、このような化合物は、結合および／もしくは転写因子の活性を阻害することにより、またはMUC1 mRNAの安定性を変更することにより作用するものであることができる。
【００７８】
本発明は下記実施例により例証されるが、限定されるものではない。
【００７９】
実施例
実施例1  材料および方法
細胞培養
ヒトZR-75-1乳癌細胞は、10％熱非働化ウシ胎児血清（HI-FBS）、100μg/mlのストレプトマイシン、100単位/mlペニシリン、および2mMのL-グルタミンを含むRPMI 1640培地中で培養した。293細胞およびHCT116大腸癌細胞は、10％のHI-FBS、100μg/mlのストレプトマイシン、および100単位/mlペニシリンを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で培養した。
【００８０】
いくつかの研究では、細胞を0.1％のHI-FBSを有する培地中で24時間培養し、次いで10ng/mlのEGF（Calbiochem-Novabiochem、San Diego、CA）で37℃において5分間刺激した。
【００８１】
溶解産物の調製
サブコンフルエントな細胞を、氷上で溶解緩衝液（50mMトリス-HCl、pH7.6、150mM NaCl、0.1％NP-40、10mg/mlロイペプチン、10mg/mlアプロチニン、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル、および1mMジチオトレイトール）中において30分間破壊した。溶解産物を14,000×gで20分間遠心分離することによって透明にした。
【００８２】
免疫沈降および免疫ブロッティング
細胞溶解産物由来の等量のタンパク質を、正常マウスもしくはウサギIgG、MUC1糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体（mAb）DF3（抗MUC1）、c-Srcタンパク質に特異的な抗体（抗c-Src）（Upstate Biotechnology、Lake Placid、NY）、EGF-Rに特異的な抗体（抗EGF-R）（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA）、Eカドヘリンに特異的な抗体（抗Eカドヘリン）（Santa Cruz Biotechnology）、またはPKCδに特異的な抗体（抗PKCδ）（Santa Cruz Biotechnology）と4℃において2時間インキュベートした。免疫複合体をプロテインGアガロースで沈殿した。溶解緩衝液で3回洗浄した後、免疫沈降物をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって分離して、ニトロセルロース膜に転写した。免疫ブロットは、500ng/mlの抗MUC1、1mg/mlの抗c-Src 抗EGF-R、ホスホチロシン残基に特異的な抗体（抗P-Tyr；RC20H；Transduction Laboratories、San Diego、CA）、またはβ-カテニンに特異的な抗体（抗β-カテニン；Zymed Laboratories, Inc.、San Francisco、CA）でプローブした。これらの抗体の結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体および化学発光（New Life Sciences Products, Inc.、Boston、MA）によって検出した。
【００８３】
その他の研究では、ZR-75-1細胞の溶解産物を抗MUC1またはp120に特異的な抗体による免疫沈降に供した（抗p-120；Transduction Laboratories）。マウスIgGを対照として使用した。免疫沈降物および免疫沈降していない溶解産物を抗p120または抗MUC1による免疫ブロッティングによって解析した。
【００８４】
MUC変異体の調製
MUC1/CD（Y46F）およびMUC1（Y46F）変異体は、部位特異的突然変異を使用して、野生型MUC1のMUC1細胞質ドメイン（MUC1/CD）から構成されるMUC1断片および全長野生型MUC1のTyr-46を、それぞれPheに変更することによって作製した。以下に述べたその他の変異体材料は、同様に標準的手順によって作製した。
【００８５】
インビトロリン酸化
精製した野生型および変異体MUC1/CDタンパク質を1.5単位の精製したc-Srcポリペチド（Oncogene Research Products、Cambridge、MA）、0.1単位の精製したEGF-R（Calbiochem-Novabiochem Co.、San Diego、CA）、または1.0単位のPKCδ（Pan Vera）と20μlのキナーゼ緩衝液（20mMトリス-HCl、pH 7.6、10mM MgCl2、5mMジチオトレイトール）中でインキュベートした。反応は、10μCi[γ-32P]ATPを添加することによって開始した。30℃において15分間インキュベーションした後、試料緩衝液を添加して、5分間煮沸することによって反応を停止した。リン酸化したタンパク質をSDS-PAGEで分離して、オートラジオグラフィーで解析した。
【００８６】
結合研究  
精製した野生型および変異体MUC1/CDタンパク質を、200mMのATPの存在下または非存在下において、1.5単位のc-Srcと30℃で30分間インキュベートした。グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、c-Srcに融合されたGST（GST-c-Src）、c-SrcのSH3ドメインに融合されたGST（GST-Src-SH3）、アミノ酸90-92を欠失させたc-Src SH3の変異型に融合されたGST（GST-Src-SH3De90/92）[Shiueら(1995) J. Biol. Chem. 270: 10498-10502](J. Brugge博士（ハーバードメディカルスクール）によって提供された)、c-SrcのSH2ドメインに融合されたGST（GST-Src-SH2）、またはβ-カテニンに融合されたGST（GST-β-カテニン）をグルタチオンビーズに結合した。次いで、ビーズをリン酸化反応混合液（上記）に添加して、4℃で1時間インキュベートした。洗浄後、タンパク質をSDS-PAGEにかけ、MUC1のCDに特異的な抗体（抗MUC1/CD）または抗P-Tyrによる免疫ブロット解析に供した。その他の研究では、グルタチオンビーズに結合したMUC1のCDに融合されたGST（GST-MUC1/CD）を、200μM ATPの存在下または非存在下において、1.5単位c-Srcと30℃で30分間インキュベートした後、0.1mgのGSK3β（New England Biolabs）を添加し、さらに1時間インキュベーションした。沈殿したタンパク質は、GSK3β（抗GSK3β）に特異的な抗体による免疫ブロッティングによって解析した。
【００８７】
その他の研究では、グルタチオンビーズに結合した、GST、GST-MUC1/CD、またはGST-MUC1/CD変異体を、精製した組換えPKCδ（PanVera、Madison、WI）とインキュベートした。吸着質を抗PKCδによる免疫ブロッティングによって解析した。加えて、精製したHis-タグの付いた野生型および変異体MUC1/CDタンパク質を200μM ATPの非存在下および存在下において、1.0単位のPKCδ（Calbiochem-Novabiochem）と30℃で30分インキュベートした。次いで、グルタチオンビーズに結合したGSTまたはGST-β-カテニンを添加して、この反応液を4℃で1時間インキュベートした。沈殿したタンパク質は、抗MUC1/CD（MUC1のCDに特異的な抗体）による免疫ブロット解析に供した。
【００８８】
一過性トランスフェクション研究
ZR-75-1細胞または293細胞には、発現可能な挿入物を持たないpCMV発現ベクター、MUC1をコードするヌクレオチド配列（pCMV-MUC1）を含むpCMV、またはc-Srcをコードするヌクレオチド配列を含むpCMV（pCMV-c-Src）（R. Rickles博士、ARIAD Pharmaceuticals, Inc.、Cambridge、MAによって提供された）を、エレクトロポレーション法を使用して一過性にトランスフェクトした。一過性トランスフェクションの効率は、ZR-75-1細胞について40％〜50％および293細胞について70％〜80％の範囲であった。トランスフェクションの48時間後に細胞溶解産物を調製した。
【００８９】
MUC-1を発現していない293細胞、またはMDA-MB-231細胞には、発現可能な挿入物を含まないか（pCMV）、MUC1をコードするcDNA配列（pCMV-MUC1）を含むか、CDを欠失したMUC1をコードするcDNA配列（pCMV-MUC1/dCD）を含むか、またはp120をコードするcDNA配列（pCMV-p120）を含む発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に細胞を回収し、これらから溶解産物を調製した。
【００９０】
40タンデムリピートを含む全長の野生型MUC1は、NdeIおよびEcoRI消化によりpCMV-MUC1[Liら(2001) J. Biol. Chem. 276: 6061-6064]から切り出して、哺乳類発現ベクターpIRESpuro2（Clontech、Palo Alto、CA）のNdeI/EcoRI部位に組み込んだ。pIRESpuro2-MUC1（Y46F）変異体ベクターは、pCMV-MUC1（Y46F）[Liら(2001) J. Biol. Chem. 276: 6061-6064]由来の3'末端領域を、MUC1の3'末端領域においてBsu36Iによって除去されたpIRESpuro2-MUC1に挿入することによって構築した。したがって、pIRESpuro2-MUC1（Y46F）の挿入物は、MUC-1CDの46位のチロシン残基がフェニルアラニンに変異した全長MUC1をコードした。
【００９１】
CDの41位のスレオニンがアラニン残基に変異したMUC1をコードする、cDNA配列を含む発現ベクター（pIRESpuro2-MUC1-（T41A））を作製した。また、発現ベクターは、(a)野生型PKCδ（pEGFP-PKCδ）または（b）378位のリジン残基がアルギニン残基に変異したPKCδ（pEFP-PKCo（K378R）をコードするcDNA配列をpEGFP-Clプラスミド中にクローニングすることによって作製した。
【００９２】
293細胞またはHCT116細胞には、pcDNA3.1/EGF-R（EGF-RをコードするcDNA挿入物を含む）、pIRESpuro2-MUC1、pIRESpuro2-MUC1（Y46F）、pIRESpuro2-MUC1（T41A）、pEGFP-PKCδ、および／またはpEGFP-PKCδ（K378R）をリポフェクトアミン（Life Technologies Inc.、Rockville、MD）によって一過性に、または安定してトランスフェクトした。細胞溶解産物は、トランスフェクションの48時間後に調製した。トランスフェクション効率は、293細胞について70％〜80％およびHCT116細胞について60％〜70％の範囲であった。
【００９３】
安定なトランスフェクタントは、0.4mg/mlのピューロマイシン（Calbiochem-Novabiochem Co、San Diego、CA）の存在下で選択した。
【００９４】
免疫蛍光顕微鏡分析
ZR-75-1細胞を4％のパラホルムアルデヒドで室温（RT）で10分間固定して、5％の脂肪酸遊離BSA（Sigma、St. Louis、MO）および5％の標準ヤギ血清（Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.、Westgrove、PA）（ブロッキング緩衝液）を含むリン酸緩衝食塩水（PBS）により、45分間室温でブロックした。抗MUC1（1：400）およびウサギ抗EGF-R（1：100）のブロッキング緩衝液溶液と4℃で14時間インキュベーションした後、細胞をPBSで洗浄してフルオレセイン結合抗ウサギIgG（1：100）またはテキサスレッド結合抗マウスIgG抗体(1：200）（Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.、Westgrove、PA）と室温で45分間インキュベートした。次いで、細胞スローフェードマウンティングキット（slow-fade mounting kit)(Molecular Probes、Eugene、OR）を使用してガラスカバー片上に載せ、共焦点顕微鏡（inverted Zeiss LSM 510）によって解析した。像は、63×倍率下でZ軸に沿って0.6ナノメートルの増分で捕らえ、ImageSpace 3.10ソフトウェア（Molecular Dynamics、Sunnyvale、CA）により、合成画像に変換した。
【００９５】
実施例2  c-Srcに対するMUC1の結合
MUC1がc-Srcと複合体を形成するかどうかを決定するために、ヒトZR-75-1細胞の溶解産物からの抗MUC1免疫沈降を、抗c-Srcによる免疫ブロッティングによって解析した。結果は、c-SrcがMUC1と共沈降したことを示す（図1A、左のパネル）。相互実験において、抗MUC1で免疫ブロッティングすることによる抗c-Src免疫沈降物の解析では、MUC1とc-Srcの会合を確認した（図1A、右のパネル）。結合が直接であるかどうかを評価するために、精製したヘキサヒスチジンタグを付けたMUC1細胞質ドメイン（His-MUCI/CD）を、c-Src SH3ドメインを含むGST融合タンパク質と共にインキュベートした。抗MUC1/CDで免疫ブロッティングすることによりグルタチオンビーズに対する吸着質を解析すると、GST-Src SH3に対してMUC1/CDが結合すること、およびGSTまたはGST-Src SH2融合タンパク質には結合しないことが示された（図1B）。さらなる対照として、His-MUC1/CDを、変異したc-Src SH3ドメイン（GST-Src SH3De90/92）を含むGST融合タンパク質とインキュベートした。MUC1/CDは、野生型c-Src SH3に結合するが、変異体には結合しないという所見は、MUC1およびc-Src間の直接の相互作用を支持した（図1C）。
【００９６】
実施例3  c-SrcはMUC1の細胞質ドメインをリン酸化する
MUC1/CDがc-Srcの基質であるかどうかを決定するために、MUC1/CDを、精製したc-Srcおよび[γ-32P]ATPとインキュベートした。SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによる反応産物の解析では、c-Srcを介したMUC1/CDのリン酸化が示された（図2A）。以前の研究では、GSK3βがMUC1/CDをDRSPYEKV部位（配列番号：12）のSer上でリン酸化することが証明されている[Liら(1998) Mol. Cell. Biol. 18: 7216〜7224]。YEKV（配列番号：11）配列は、c-Srcリン酸化のためのコンセンサスを表すので、MUC1/CDは、FEKV（配列番号：14）の変異（すなわち、YEKV配列の第1アミノ酸のYからFへの変異）によって作製した（図2B）。c-SrcとMUC1/CD（Y46F）のインキュベーションでは、野生型MUC1/CD（図2C）で見られるものと比較して、リン酸化の減少が示された。これらの所見は、c-SrcがMUC1/CDのYEKV部位、並びにその他の部位をリン酸化していることを示す。c-Src SH2ドメインは、好適なpYEEI配列と相互作用するので[Songyangら(1993) Cell 72: 767〜778]、c-Srcを介したMUC1/CDにおけるYEKVのリン酸化は、c-Src SH2結合のための可能な部位を提供する。c-Src SH2ドメインが、リン酸化されたMUC1/CDに結合するかどうかを決定するために、MUC1/CDをc-SrcおよびATPとインキュベートして、次いでGST-Src SH2との結合を評価した。結果は、GST-Src-SH2がリン酸化したMUCI/CDと結合するが、リン酸化されていないMUC1/CDとは結合しないことを示す（図2D）。さらに、MUC1/CDと比較して、c-SrcおよびATP（図2D）とインキュベートしたMUC1/CD（Y46F）変異体に対するGST-Src SH2の結合は、実質的に少なかった。これらの結果は、c-Srcを介したMUC1/CDのリン酸化、およびこれによるc-Src SH2ドメインとリン酸化されたMUC1/CDとの、直接的な相互作用を支持する。
【００９７】
実施例4  MUC1とc-Srcの相互作用は、MUC1に対するGSK3βの結合を阻害する
MUC1/CDにおけるc-Srcリン酸化部位は、GSK3βの結合部位およびリン酸化部位の隣に存在する[Liら(1998) Mol. Cell. Biol. 18: 7216-7224]ので、c-SrcとMUC1/CDの相互作用が、GSK3βとの結合に影響を及ぼすかどうかを試験するために実験を行った。GST-MUC1/CDをc-SrcおよびATPとインキュベートした後、GSK3βを添加した。グルタチオンビーズによって沈殿されたタンパク質の解析では、c-Srcを介したMUC1/CDのリン酸化が、MUC1/CDおよびGSK3βの結合の減少と関連することが示された（図3A）。インビボにおけるMUC1/CDとGSK3βの相互作用に対するc-Srcの効果を評価するために、ZR-75-1細胞に空ベクターまたはc-Srcをトランスフェクトして、発現させた。抗MUC1免疫沈降物を抗GSK3βで免疫ブロッティングすることによって解析した。結果は、c-SrcがインビボにおいてMUC1およびGSK3の相互作用を減少させることを示す（図3B）。これらの所見は、GSK3がc-Src依存的な機構によってMUC1/CDと相互作用することを示す。
【００９８】
実施例5  c-SrcによるMUC1細胞質ドメインのリン酸化は、MUC1に対するβ-カテニンの結合を増大させる
GSK3βによるMUC1のリン酸化は、インビトロにおいてMUC1のβ-カテニンへの結合を減少させる[Liら(1998) Mol. Cell. Biol. 18: 7216-7224]。c-Srcを介したMUC1のリン酸化がβ-カテニンとMUC1の相互作用に影響を及ぼすかどうかを決定するために、MUC1/CDをc-SrcおよびATPとインキュベートした。次いで、リン酸化された、およびリン酸化されていないMUC1/CDを、GSTまたはGST-β-カテニンとインキュベートした。同様の研究をMUC1/CD（Y46F）変異体で行った。抗MUC1/CDで免疫ブロッティングすることにより、グルタチオンビーズに結合したタンパク質を解析すると、c-Srcを介したMUC1/CDのリン酸化がGST-β-カテニンに対するMUC1/CDの結合を増大させることが示された（図4A)。対照的に、GSTに対する、リン酸化されたまたはリン酸化されていないMUC1/CDの検出可能な結合はなかった（図4A）。MUC1/CD（Y46F）で行った研究では、MUC1/CDのYEKV部位におけるc-Src依存的なリン酸化がMUC1/CD-β-カテニン複合体の形成に必要であることが示された（図4A）。c-SrcがMUC1およびβ-カテニンのインビボにおける相互作用に影響を及ぼすかどうかを評価するために、MUC1-陽性ZR-75-1細胞には、pCMVまたはpCMV-c-Srcをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞から調製した抗MUC1免疫沈降物を、抗c-Src、抗P-Tyr（ホスホチロシン残基に特異的な抗体）、および抗β-カテニンによる免疫ブロット解析に供した。結果は、c-Srcが細胞内でMUC1と結合してMUC1のチロシンリン酸化を誘導することを示す（図4B）。加えて、c-Srcの発現は、MUC1およびβ-カテニンの相互作用を誘導した（図4B）。これらの所見を拡張するために、MUC1-陰性293細胞[Liら(1998) Mol. Cell. Biol. 18: 7216-7224]に、MUC1、またはCD YEKV部位（配列番号：11）がFEKV（配列番号：14）に変異したMUC1（Y46F）をトランスフェクトして発現させた。内因性c-Srcに対するMUC1の明らかな結合はなかったが、MUC1およびc-Srcの共トランスフェクションは、検出可能なMUC1-c-Src複合体と関連していた。MUC1およびc-Srcの共トランスフェクションは、MUC1のチロシンリン酸化の増加、ならびにMUC1およびc-Srcの結合に関連していた（図4C）。対照的に、MUC1（Y46F）とc-Srcの共トランスフェクションの結果、MUC1（Y46F）に対してc-Srcはほとんど結合しなかった（図4C）。さらに、MUC1（Y46F）のチロシンリン酸化はあるとしてもわずかであった（図4C）。重要なことに、c-SrcとMUC1の共トランスフェクションにより、MUC1とβ-カテニンの結合が誘導されたが、MUC1（Y46F）では誘導されなかった（図4C）。これらの所見は、c-Srcを介したMUC1 YEKV部位のリン酸化が、細胞においてMUC1とβ-カテニンの相互作用を増大させることを示す。
【００９９】
実施例6  p120はMUC1の細胞質ドメインに結合する
MUC1がp120と結合するかどうかを決定するために、ZR-75-1細胞に由来する抗MUC1免疫沈降物を、抗p120による免疫ブロット解析に供した。結果は、p120がMUC1と共沈降することを示す（図5A）。対照的に、マウスIgG（図5A）によって調製した対照免疫沈降物では、検出可能なp120はなかった。相互実験において、抗MUC1で免疫ブロッティングすることによって抗p120免疫沈降物を解析すると、MUC1とp120の会合が確認された（図5B）。これらの所見は、MUC1膜貫通タンパク質とp120との相互作用を支持した。
【０１００】
さらにMUC1とp120との間の相互作用を確認するために、MUC1-陰性293細胞[Liら(1998) Mol. Cell. Biol. 18: 7216-7224]には、MUC1または細胞質ドメインを欠失させたMUC1（MUC1/dCD）を発現するベクターをトランスフェクトした（図6A）。抗p120による抗MUC1免疫沈降物の免疫ブロット解析では、MUC1とp120の共沈降が示された（図6B）。対照的に、p120とMUC1/dCDの検出可能な会合はなかった（図6B）。これらの所見は、p120がMUC1/CDと相互作用することを示した。会合が直接であるかどうかを決定するために、精製したMUC1/CDをGSTまたはGST-p120融合タンパク質とインキュベートした。吸着質を抗MUC1で免疫ブロッティングすることによって解析した。MUC1/CDはGST-p120に結合するが、GSTに結合しないという証明は、直接の相互作用を支持した（図6C）。
【０１０１】
p120に結合するMUC1/CDの部位を同定するために、全長MUC1/CDおよびN末端およびC末端断片（図7A）を、精製したGST-p120とインキュベートした。グルタチオンビーズによる沈降および抗MUC1/CDを用いた免疫ブロッティングによる沈降物の解析では、全長MUC1/CDおよび両断片に対して、p120が結合することが示された（図7B）。これらの結果は、p120がN末端およびC末端断片に共通な領域部位に結合することを示唆した。さらに部位を突き止めるために、重なり合う領域に由来する2つのペプチドを調製した。MUC1/CDおよびGST-p120とペプチドとのインキュベーションにより、MSEYPTYHTHはMUC1-p120複合体の形成を阻害するが、GRYVPPSSTDR（配列番号：8）は阻害しないことが証明された（図7C）。これらの所見は、p120がMUC1におけるMSEYPTYHTH部位（配列番号：7）と相互作用することを示す。
【０１０２】
実施例7  MUC1の発現の結果、核のp120レベルが増加する
MUC1-p120相互作用の機能上の有意性を評価するために、MUC1-陰性293細胞にMUC1をトランスフェクトして発現させ、次いで細胞質および細胞核におけるp120の分布を解析した。結果は、MUC1の発現は、細胞質画分におけるp120レベルに対して、あるとしてもわずかな効果しか及ぼさないことを明示する（図8）。対照的に、MUC1の発現は、核におけるp120レベルの増大と関連した（図8A）。アクチンと比較して（対照として）、核のp120は、293細胞におけるMUC1の発現により、ほぼ5倍に増加した。これらの所見を拡張するために、MUC1-陰性MDA-MB231乳癌細胞に、MUC1をトランスフェクトして発現させた。免疫ブロット解析では、MUC1が細胞質におけるp120の発現に対して明らかな効果を有さないが、3倍より多く核のp120を増大させることが示された（図8B）。同様の結果は、3回の別々の実験において得られた。これらの所見は、MUC1がp120の核での発現を調節することを証明する。
【０１０３】
実施例8  MUC1はEGF-Rと結合する
MUC1がEGF-Rと複合体を形成するかどうかを決定するために、ヒトZR-75-1細胞の溶解産物からの抗MUC1免疫沈降物を、抗EGF-Rによる免疫ブロッティングで解析した。結果は、EGF-RがMUC1と共沈することを示す（図9A）。対照IgGで調製した免疫沈降物中に、検出可能なEGF-Rはなかった（図9A）。相互実験において、抗MUC1による抗EGF-R免疫沈降物の解析では、EGF-RがMUC1と結合することを確認した（図9B)。これらの所見を拡張するために、低レベルのEGF-Rを発現し、MUC1を発現しない293細胞[Liら(1998) Mol. Cell. Biol. 18: 7216-7224]に、EGF-RおよびMUC1をトランスフェクトして発現させた。抗MUC1免疫沈降物の抗EGF-Rによる免疫ブロット解析では、MUC1とEGF-Rが共沈することが示された（図9C）。抗EGF-R免疫沈降物を抗MUC1による免疫ブロッティングで分析したときにも、同様の結果が得られた（図9D）。これらの所見は、MUC1が恒常的にEGF-Rと結合することを証明する。
【０１０４】
実施例9  EGF-RおよびMUC1の細胞膜に対する共局在
MUC1およびEGF-Rの細胞下の局在を評価するために、ウサギ抗EGF-R抗体およびマウス抗MUC1抗体によって染色したZR-75-1細胞で、共焦点顕微鏡分析を行った。対照ZR-75-1細胞において、EGF-Rは一様に細胞膜上に分布した（図1OA、左)。同様の所見は、MUC1の分布について得られた（図10A、中央）。EGF-R（赤色）およびMUC1（緑色）シグナルのオーバーレイは、共局在を支持した（赤色+緑色->黄色）（図10A、右)。EGF刺激後、EGF-Rは、細胞膜においてパッチ中にクラスター形成することが見出された（図10B、左)。同一のパターンは、MUC1について観察された（図10B、中央）。さらに、シグナルのオーバーレイでは、EGF-RおよびMUC1が細胞膜においてクラスター中に共局在することが示された（図1OB、右)。共免疫沈降研究による対照およびEGF-刺激された細胞の解析により、EGF-RとMUC1との間の結合には、検出可能な相違は明示されなかった（データ示さず）。これらの所見および共沈降研究において得られた所見は、MUC1とEGF-Rが恒常的に細胞膜で結合することを明示する。
【０１０５】
実施例10  EGF-RはインビトロおよびインビボにおいてMUC1をリン酸化する
EGF-RがMUC1をリン酸化するかどうかを決定するために、対照およびEGF刺激したZR-75-1細胞からの抗MUC1免疫沈降物を、抗P-Tyrによる免疫ブロッティングにより解析した。結果は、対照細胞において検出可能なレベルのチロシンがリン酸化されたMUC1を示す（図11A）。さらに、EGF刺激は、MUC1におけるチロシンのリン酸化の増加に関与していた(図11A）。また、EGFで誘導されるMUC1のチロシンリン酸化は、EGF-RおよびMUC1をトランスフェクして発現させた293細胞において観察された（図11B）。72アミノ酸のMUC1細胞質ドメイン（MUC1/CD）は、7つのチロシンを含む（図12Dの概要を参照）。EGF-Rリン酸化の可能な部位を規定するために、MUC1細胞質ドメイン断片（MUC1/CD）をEGF-Rおよび[γ-32P]ATPとインキュベートした。反応産物の解析により、EGF-RがMUC1/CDをリン酸化することが示された（図11C）。MUC1/CDのY8部位のFへの変異では、MUC1/CDのEGF-Rを介したリン酸化に対して検出可能な効果を及ぼさなかった（図11C)。Y20またはY35部位がFに変異されたときも、リン酸化に対して明らかな効果はなかった（図11C）。対照的に、EGF-RとMUC1/CD（Y46F）のインキュベーションは、野生型MUC1/CDで見られるものと比べて、リン酸化の著しい減少に関与していた（図11C）。Y26の変異の結果も、リン酸化が減少したが、Y46Fで得られたものよりも少ない程度であった（図11C）。Y46部位が細胞においてリン酸化されるかどうかを決定するために、ヒトHCT116細胞（この細胞は、EGF-Rを発現し、MUC1を発現しない）に、空のベクター、野生型MUC1、またはMUC1（Y46F）変異体を安定にトランスフェクトして発現させた。抗P-Tyrによる抗MUC1の免疫沈降解析により、EGFを介したMUC1（Y46F）のリン酸化が、野生型MUC1で得られたものと比較して減少することが示された（図11D）。これらの所見は、EGF-Rがインビトロおよび細胞において、Y46でMUC1をリン酸化することを示す。
【０１０６】
実施例11  EGF-Rはc-Srcおよびβ-カテニンとMUC1の相互作用を調節する
EGF-Rを介したリン酸化がc-Srcおよびβ-カテニンとMUC1との相互作用を調節するかどうかを決定するために、MUC1/CDをEGF-RおよびATPとインキュベートし、次いでGST-Src SH2およびGST-β-カテニンに対する結合を評価した。抗MUC1/CDを用いた、グルタチオンビーズに対する吸着質の免疫ブロット解析により、リン酸化の後、GST-Src SH2がMUC1/CD EGF-Rに結合することが示された（図12A）。加えて、EGF-RおよびATPとインキュベートしたMUC1/CD（Y46F）変異体に対するGST-Src SH2の結合は、MUC1/CDと比較して実質的に少なかった（図12A）。同様の所見は、GSTβ-カテニンの結合についても得られた（図12A）。EGF-Rを介したMUC1のリン酸化が、細胞におけるc-Srcおよびβ-カテニンに対するMUC1の結合を誘導するかどうかを評価するために、ZR-75-1細胞に由来する抗MUC1免疫沈降物を抗c-Srcまたは抗β-カテニンを用いて免疫ブロッティングすることによって解析した。対照ZR-75-1細胞に由来する溶解産物の解析では、c-Srcおよびβ-カテニンとMUC1との、弱いが検出可能な相互作用が示された（図12B）。インビトロにおける結果と合わせて、EGFによるZR-75-1細胞の刺激は、c-Srcおよびβ-カテニンとMUC1との相互作用を誘導した（図12B）。MUC1のY46部位の関与を確かめるために、野生型MUC1またはMUC1（Y46F）を安定して発現しているHCT116細胞をEGFで刺激した。抗c-Srcによる抗MUC1免疫沈降物の免疫ブロット解析では、野生型MUC1と比較して、EGFで誘導される、c-Srcに対するMUC1（Y46F）の結合が少ないことが示された（図12C）。同様の所見は、β-カテニンについても得られた（図12C)。これらの結果は、EGF-Rを介したMUC1 Y46のリン酸化がc-Srcおよびβ-カテニンとMUC1との相互作用を誘導することを示す。
【０１０７】
実施例12  MUC1はPKCδに直接結合する
MUC1がPKCδと結合するかどうかを決定するために、ヒトZR-75-1細胞に由来する溶解産物を、抗MUC1および対照として正常IgGを用いる免疫沈降に供した。抗PKCδによる免疫沈降物の免疫ブロット解析では、MUC1-PKCδ複合体の存在が示された（図13A、左)。相互実験において、抗MUC1による抗PKCδ免疫沈降物の免疫ブロット解析では、MUC1がPKCδと結合することを確認した（図13A、右)。対照的に、MUC1とその他の3つのプロテインキナーゼC分子、すなわちPKCβII、PKCηおよびPKCμとの間の検出可能な相互作用はなかった（図13B）。これらの所見を拡張するために、MUC1を発現していない293細胞に、MUC1またはMUC1およびPKCδをトランスフェクトして発現させた。抗PKCδによる抗MUC1免疫沈降物の免疫ブロット解析では、内因性PKCδとMUC1の結合が示された（図13C）。さらに、MUC1およびPKCδの共発現の結果、MUC1-PKCδ複合体の形成が増大した（図13C）。結合が直接的であるかどうかを評価するために、GSTまたはMUC1 CDを含むGST融合タンパク質（GST-MUC1/CD）を、組換えPKCδとインキュベートした。グルタチオンビーズに対する吸着質を、抗PKCδによる免疫ブロット解析に供した。PKCδは、GST-MUC1/CDに結合するが、GST単独には結合しないという所見は、直接の相互作用を支持した（図13D）。
【０１０８】
実施例13  PKCδはMUC1のCDの41位でスレオニンをリン酸化する
MUC1/CDがPKCδの基質であるかどうかを決定するために、精製されたHis-MUC1/CDを組換えPKCδおよび[γ-32P]ATPとインキュベートした。SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによる反応産物の解析では、MUC1 CDのリン酸化が示された（図14A)。MUC1/CDのSTDRS部位（配列番号：9）は、PKCリン酸化のための好適なS/T-X K/Rモチーフと一致する。STDRS配列におけるT残基は、MUC1のCDにおける41位である（すなわち、配列番号：1)。STDRSがPKCδによってリン酸化されるかどうかを決定するために、MUC1/CD中のこの部位をSA41DRS（配列番号：15）に変異した（図14B）。MUC1/CD（T41A）におけるPKCδを介したリン酸化は、野生型MUC1/CDで得られるものと比較して減弱された（図14B）。対照的に、PKCδによるMUC1のリン酸化は、隣接するセリンのいずれかまたは両方の、SからAへの変異による影響を受けなかった（図14B)。以前の研究では、GSK3βによるMUC1/CD S44部位のリン酸化により、MUC 1/CDとβ-カテニンとの間の相互作用が減少されることが示された。PKCδを介したMUC1/CDのリン酸化の効果を評価するために、MUC1/CDをATPの存在下および非存在下において、PKCδとインキュベートした。MUC1/CDのリン酸化の後、GSTまたはGST-β-カテニンを反応混合液に添加して、さらに4℃において1時間インキュベートした。グルタチオンビーズによって沈殿したタンパク質を、抗MUC1/CDによる免疫ブロッティングで解析した。MUC1/CDは、GST-β-カテニンに結合し、GSTには結合しない。PKCδおよびATPとMUC1/CDのプレインキュベーションは、PKCδまたはATPの非存在下で得られるよりも高レベルの、GST-β-カテニンに対するMUC1/CDの結合に関連していた（図14D）。対照的に、PKCδおよびATPとMUC1/CD（T41A）のプレインキュベーションは、β-カテニンに対するMUC1/CD（T41A）の結合に検出可能な影響を及ぼさなかった（図14D）。これらの所見は、PKCδがMUC1/CDをT41でリン酸化し、これによりMUC1/CDおよびβ-カテニンの結合を増大させることを示す。
【０１０９】
実施例14  PKCδは細胞におけるβ-カテニンとMUC1の相互作用を調節する
PKCδが細胞におけるMUC1とβ-カテニンの相互作用を調節するかどうかを決定するために、MUC1を発現しない293細胞において、トランスフェクション研究を行った。MUC1およびPKCδに融合した緑色蛍光タンパク質（GFP）（GFP-PKC6）、またはキナーゼ不活性PKCδ（K378R）変異体に融合したGFP（GFP-PKCδ（K-R））を発現するベクターをトランスフェクトした後、溶解産物を抗MUC1による免疫沈降に供した。抗β-カテニンによる免疫沈降物の免疫ブロット解析では、PKCδがMUC1とβ-カテニンの間の相互作用を増大させることが示され；これは、GFP-PKCδ（K378R）をコードするcDNAでトランスフェクトした細胞においては、見られなかった（図15A）。これらの結果を合わせて、GFP-PKCδは、MUC1（T41A）変異体に対するβ-カテニンの結合に、わずかな（あるとしても）効果を及ぼした（図15A）。この解析を拡張するために、MUC1-非発現HCT116細胞に、対照ベクターをトランスフェクトして安定に発現させるか、または野生型MUC1もしくはMUC1（T41A)を発現するベクターをトランスフェクトして、それぞれHCT116V、HCT116/MUC1、およびHCT116/MUC1（T41A）をトランスフェクトしたクローンを作製した（図15B）。HCT116/V、HCT116/MUC1およびHCT116/MUC1(T41A)細胞に由来する抗MUC1免疫沈降物を、抗β-カテニンによる免疫ブロッティングに供した。これらの結果は、MUC1はβ-カテニンに結合するが、MUC1(T41A)は結合しないことを示す（図15B）。これらの細胞にGFP-PKCδをトランスフェクトして発現した場合、抗β-カテニンによる抗MUC1免疫沈降物の免疫ブロット解析では、PKCδが野生型MUC1に対するβ-カテニンの結合を誘導するが、MUC1（T41A）変異体への結合は誘導しないことが示された（図15B）。PKCδ（K378R）をコードする発現ベクターのトランスフェクションでは、MUC1-β-カテニン複合体の誘導に対して明らかな効果は及ぼさなかった（データ示さず）。これらの所見は、PKCδによるMUC1 T41のリン酸化がMUC1とβ-カテニンとの結合を誘導することを示す。MUC1（T41A）変異体の発現が、Eカドヘリンに対するβ-カテニンの結合に影響を及ぼすかどうかを決定するために、抗Eカドヘリン免疫沈降物を、抗β-カテニンによる免疫ブロッティングにより解析した。野生型MUC1の発現は、Eカドヘリンおよびβ-カテニンの結合の減少と関連していた（図15C）。対照的に、MUC1（T41A）の発現では、Eカドヘリンとβ-カテニンの相互作用に対して、野生型MUC1（HCT116/MUCI細胞において）よりも少ない効果を及ぼした（図15C）。GFP-PKCδをコードする核酸配列を含む発現ベクターをトランスフェクトした後でも、同様の結果が得られた（図15C）。これらの所見は、PKCδが細胞におけるMUC1とβ-カテニンの間の相互作用を調節し、これによりβ-カテニンとEカドヘリンが結合することを示した。
【０１１０】
実施例15  足場非依存性増殖に対するMUC1の効果は、T41A変異によって抑制される
MUC1とPKCδ（HCT116/V）間の相互作用の機能的有意性を評価するために、HCT116/V、HCT116/MUC1、およびHCT116/MUC1（T41A）細胞を足場非依存的に増殖させるために軟寒天にまいた。野生型MUC1トランスフェクタントは、HCT116/V細胞によって得られたものより、実質的に大きなコロニーを形成した（図16A）。対照的に、対照HCT116/V細胞においてみられるものと同様に、MUC1（T41A）の発現は、コロニー形成に関連していた（図16A）。同様の結果は、トランスフェクトした細胞の独立して選択されたクローンにおいても得られた（図16A）。また、HCT116/MUC1細胞によって得られるコロニー数は、HCT116/VおよびHCT116/MUC1(T41A)細胞で見られるものよりも多かった（図16B）。これらの所見は、野生型MUC1の発現が足場非依存性の増殖に寄与し、MUC1のCDにおけるPKCδリン酸化部位の変異がこの効果を排除することを示す。
【０１１１】
本発明の多くの態様を記載した。それにもかかわらず、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、種々の修正がなされてもよいことが理解されるであろう。したがって、その他の態様も特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１Ａ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞由来の溶解産物を、対照マウスIgG（両パネルの左レーン）、MUC1特異的抗体（「抗MUC1」；左のパネルの中央レーン）、またはc-Src特異的抗体（「抗c-Src」；右のパネルの中央レーン）で免疫沈降した。免疫沈降物は、抗c-Src（左のパネル）または抗MUC1（右のパネル）による免疫ブロット解析に供した。また、免疫沈降を行わなかった溶解産物のアリコートを免疫ブロット解析によって解析した（「溶解産物」；両パネルの右レーン）。免疫ブロットにおけるc-SrcおよびMUC1の位置を示す。
【図１Ｂ】免疫ブロット写真である。精製した組換えMUC1/CD（MUC1の細胞質ドメイン）を単独(「MUC-1/CD」)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）（「MUC1/CD+GST」）、c-SrcのSH2ドメインに融合されたGST（「MUC1/CD+GST-Src SH2」）、またはc-SrcのSH3ドメインに融合されたGST（「MUC1/CD+GST-Src SH3」）と共にインキュベートした。グルタチオンセファロース4B（商標）ビーズを用いて、これらの混合液から沈殿したタンパク質を、MUC1/CD（「抗MUC1/CD」）特異的な抗体による免疫ブロット解析に供した。MUC1/CDの免疫ブロットにおける位置を示す。
【図１Ｃ】免疫ブロット写真（左のパネル）、およびクーマシーブルー染色したドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲル（右のパネル）の写真である。精製した組換えMUC1/CD（MUC1の細胞質ドメイン）を単独（「MUC-1/CD（インプット）」）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）（「MUC1/CD+GST」）、c-SrcのSH3ドメインに融合されたGST（「MUC1/CD+GST-Src SH3」）、またはアミノ酸90位〜92位が欠失したc-SrcのSH3ドメインに融合されたGST（「MUC1/CD+GST-Src SH3De90/92」）と共にインキュベートした。グルタチオンセファロース4B（商標）ビーズを用いて、これらの混合液から沈殿したタンパク質を、抗MUC1/CDによる免疫ブロット（IB）（「IB：抗MUC1/CD」）に供した。免疫ブロットにおけるMUC1/CDの位置を示す。免疫ブロット解析のために使用したSDS-PAGEゲルをクーマシーブルーで染色して、野生型（「GST-Src SH3」）および変異体（「GST-Src SH3De90/92」）SH3ドメインのゲル上のローディングを評価した。
【図２Ａ】2つのリン酸化反応混合物（上段パネル）および2つのリン酸化反応混合物のSDS-PAGEゲルのオートラジオグラム（下段パネル）の成分を示す表である。オートラジオグラムにおける、リン酸化されたc-Src（円内のP）およびMUC1/CDの位置を示す。
【図２Ｂ】MUC1分子の概略図であり、MUC1/CDの野生型および変異体の構造を示す。野生型（「MUC1/CD（WT）」）（配列番号：1）および変異体（「MUC1/CD（Y46F）」）（配列番号：2）MUC1 CDのアミノ酸42位〜50位の配列、並びに野生型（配列番号：3）および変異体（配列番号：4）をコードするcDNAのヌクレオチド配列を示す。数字は、MUC1/CD（配列番号：1）におけるアミノ酸の位置を示す。TR、タンデムリピートドメイン；TM、膜貫通領域；CD、細胞質ドメイン。
【図２Ｃ】3つのリン酸化反応混合物（上段パネル）の成分；3つのリン酸化反応混合物のSDS-PAGEゲルのオートラジオグラム（中段パネル）；およびクーマシーブルー染色したSDS-PAGEゲルの写真（下段パネル）を示す表である。オートラジオグラムにおけるリン酸化された（円内のP）c-SrcおよびMUC1/CDの位置を示す。オートラジオグラムを作製するために使用したSDS-PAGEゲルをクーマシーブルーで染色して、MUC1/CDのゲル上のローディングを評価した。
【図２Ｄ】基質、および4つのリン酸化反応混合物におけるATPの存在または不在（上段パネル）、並びにリン酸化反応混合物の免疫ブロット解析の2つの写真（中央および下段パネル）を示している。中段パネルに示した免疫ブロットは、抗MUC1/CDで染色した（「IB：抗MUC1/CD」）。下段パネルに示した免疫ブロットは、ホスホチロシン残基に特異的な抗体で染色した（「IB：抗P-Tyr」）。MUC1およびリン酸化された（円内のP）MUC1/CDの免疫ブロットにおける位置を示す。
【図３Ａ】2つのリン酸化反応混合液の成分（上段パネル）およびリン酸化反応混合液のSDS-PAGEゲルに由来する免疫ブロットの写真（下段パネル）を示す表である。免疫ブロットは、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β（GSK3β)に特異的な抗体で染色した（「IB：抗GSK3β」）。GSK3βの免疫ブロットにおける位置を示す。
【図３Ｂ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞に、対照発現ベクター（「ZR-75-1/ベクター」）、またはc-Src（「ZR-75-1/c-Src」）をコードするcDNAを含む発現ベクターを一過性にトランスフェクトした。これらの細胞に由来する溶解産物を抗MUC1（「IP：抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。c-Srcを発現するベクターをトランスフェクトした細胞に由来する溶解産物を、正常マウスIgG（「IgG」）でも免疫沈降した。これらの免疫沈降物、並びにc-Src発現ベクターをトランスフェクトした細胞に由来する溶解産物（「溶解産物」）を、抗c-Src（「IB：抗c-Src」）（上段パネル）または抗GSK3β（「IB：抗GSK3β」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるIgG、c-Src、およびGSK3の位置を示す。
【図４Ａ】一対の免疫ブロット写真である。上部パネルの上には、8つのリン酸化反応混合液の成分を示す。8つの異なる反応混合液中のタンパク質をGSTまたはβ-カテニンに融合されたGST（「GST-β-Cat」）と共にインキュベートした。生じた混合液をグルタチオン-セファロース4B（商標）ビーズとインキュベートした。ビーズで沈殿されたタンパク質を、抗MUC1/CD（「IB：抗MUC1/CD」）（上段パネル）またはβ-カテニンに特異的な抗体（「IB：抗カテニン」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるMUC1/CDおよびβ-カテニン（「β-Cat」）の位置を示す。
【図４Ｂ】一連の3つの免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞には、対照発現ベクター（「ZR-75-1/ベクター」）またはc-Src（「ZR-75-1/c-Src」）をコードするcDNAを含む発現ベクターを一過性にトランスフェクトした。これらの細胞に由来する溶解産物を正常マウスIgG（「IgG」）または抗MUC1（「IP：抗MUC1」）のいずれかで免疫沈降した（IP）。これらの免疫沈降物、並びにc-Src発現ベクターをトランスフェクトした細胞に由来する非免疫沈降溶解産物（「溶解産物」）を、抗c-Src（「IB：抗c-Src」）（上段パネル）もしくは抗P-Tyr（「IB：抗P-Tyr」）（中段パネル）、または抗β-Cat（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるc-Src、リン酸化された（円内のP）MUC1、およびβ-カテニン（「β-Cat」）の位置を示す。
【図４Ｃ】一連の3つの免疫ブロット写真である。293細胞には以下を一過性にトランスフェクトした：MUC1をコードするcDNAを含む発現ベクター（「293/MUC1」）；MUC1をコードするcDNAを含む発現ベクターとc-Srcをコードする発現ベクター（「293/MUC1+c-Src」）；またはCDの46位のチロシン残基をフェニルアラニンに変異したMUC1をコードするcDNAを含む発現ベクターとc-Srcをコードする発現ベクター（「293/MUC1（Y46F）+c-Src」）。これらの細胞に由来する溶解産物を、正常マウスIgG（「IgG」）または抗MUC1のいずれかで免疫沈降した（「IP：抗MUC1」）。免疫沈降物並びにc-Src発現ベクターをトランスフェクトした細胞に由来する非免疫沈降溶解産物（「溶解産物」）を、抗c-Src（「IB：抗c-Src」）（上段パネル）もしくは抗P-Tyr（「IB：抗P-Tyr」）（中段パネル）、または抗β-Cat（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるc-Src、リン酸化された（円内のP）MUC1、およびΒ-カテニン(「β-Cat」）の位置を示す。
【図５Ａ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞の溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）または対照IgG（「IgG」）で免疫沈降した（「IP」）。生じた免疫沈降物および非免疫沈降溶解産物を、p120に特異的な抗体（「IB：抗p120」）（上段パネル）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるp120およびMUC1の位置を示す。
【図５Ｂ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞の溶解産物を抗p120（「抗p120」）または対照IgG（「IgG」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物および非免疫沈降溶解産物を、抗p120（「IB：抗p120」）（下段パネル）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（上段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるp120およびMUC1の位置を示す。
【図６Ａ】野生型MUC1（「MUC1」）およびその細胞質ドメインを欠いているMUC1（「MUC1/dCD」）の構造の概略図である。TR、タンデムリピートドメイン；TM、膜貫通ドメイン；CD、細胞質のドメイン。
【図６Ｂ】ベクター、および293細胞の5つのアリコートに一過性にトランスフェクトするために使用した発現ベクターの量（μg）（上段パネル）；および3つの免疫ブロット写真を示す表である。使用したベクターは、対照発現ベクター（「ベクター」）、MUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「MUC1」）、MUC1/dCDをコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「MUC1/dCD」）、およびp120をコードするcDNA配列を含む発現ベクターであった。トランスフェクションの48時間後、5つのトランスフェクトした細胞集団を溶解した。各溶解産物のアリコートを抗MUC1で免疫沈降して（「IP：抗MUC1」）、免疫沈降物を抗p120による免疫ブロット解析に供した（「IB：抗p120」）（上段免疫ブロット）。各溶解産物のアリコートを、直接に抗MUC1（「IB：抗DF3-E」）（中段免疫ブロット）または抗p120（「IB：抗p120」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるMUC1、MUC1/dCD、およびp120の位置を示す。
【図６Ｃ】免疫ブロット写真である。精製した組換えMUG1/CDをGST（「GST」）またはp120に融合したGST（「GST-p120」）とインキュベートした。生じた混合液をグルタチオン-セファロース4B（商標）ビーズとインキュベートし、ビーズによって沈殿したタンパク質を抗MUC1/CDによる免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるMUC1/CDの位置を示す。
【図７Ａ】MUC1/CD（配列番号：1）（上段配列）、MUC1/CDのN末端領域（「N-MUC1/CD」）（配列番号：5）（中段配列）、およびMUC1/CDのC末端領域（「C-MUC 1/CD」）（配列番号：6）（下段配列）のアミノ酸配列の記載である。数字は、MUC1/CDにおけるアミノ酸の位置を示す（配列番号：1)。β-カテニン結合部を囲った。GSK3β-結合部位およびリン酸化部位には、一重下線を引き、p120結合部には、二重下線を引いた。
【図７Ｂ】免疫ブロット写真である。表中で、免疫ブロットの上には、GSTおよびGST-p120をMUC1/CD（N-MUC1/CD）またはC-MUC1/CD組換えタンパク質のいずれかとインキュベートしたものを示した。タンパク質の混合液を含む4つの試料を抗MUC1/CDによる免疫ブロット解析に供した（「IB：抗MUC1/CD」）。
【図７Ｃ】一対の免疫ブロット写真である。表中で、免疫ブロットの上には、阻害剤ペプチドの非存在下で（両免疫ブロットの第1および第4レーン）、またはアミノ酸配列MSEYPTYHTHを有するペプチド（配列番号：7）もしくはアミノ酸配列GRYVPPSSTDR（配列番号：8）を有するペプチドのいずれかの存在下でインキュベートした、MUC1/CD、GST-p120、およびGSTの混合液を示す。4つの混合液をグルタチオン-セファロース4B（商標）ビーズとインキュベートして、ビーズによって沈殿したタンパク質を抗MUC1/CD（「IB：抗MUC1/CD」）（上段免疫ブロット）、または抗p120（「IB：抗p120」）（上段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるMUC1/CDおよびp120の位置を示す。
【図８Ａ】一連の免疫ブロット写真である。293細胞には、対照発現ベクター（「ベクター」）、または野生型MUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「MUC1」）を一過性にトランスフェクトした。可溶化した細胞質画分（「Cyto」）および核画分（「Nuc」）を、トランスフェクトした細胞から調整して、抗p120（「IB：抗p120」）（上段の2つの免疫ブロット）、抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（中段の2つの免疫ブロット）、またはアクチン特異的な抗体（「IB：抗アクチン」）（下段の2つの免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるp120、MUC1およびアクチンの位置を示す。
【図８Ｂ】一連の免疫ブロット写真である。MDA-MB-231細胞には、対照発現ベクター（「ベクター」）または野生型MUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「MUC1」）を、一過性にトランスフェクトした。可溶化した細胞質画分（「Cyto」）および核画分（「Nuc」）を、トランスフェクトした細胞から調製して、抗p120（「IB：抗p120」）（上段の2つの免疫ブロット）、抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（中段の2つの免疫ブロット）、またはアクチン特異的な抗体（「IB：抗アクチン」）（下段の2つの免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるp120、MUC1およびアクチンの位置を示す。
【図９Ａ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞を溶解して、溶解産物を正常IgG（「IgG」）または抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降しなかった溶解産物（「溶解産物」）の免疫沈降物およびアリコートを、上皮細胞成長因子受容体（EGF-R）に特異的な抗体（「IB：抗EGF-R」）（上段免疫ブロット）、または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるEGF-RおよびMUC1の位置を示す。
【図９Ｂ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞を溶解して、溶解産物を正常IgG（「IgG」）または抗EGF-R（「抗EGF-R」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降しなかった溶解産物（「溶解産物」）の免疫沈降物およびアリコートを、上皮細胞成長因子受容体（EGF-R）に特異的な抗体（「IB：抗EGF-R」）（下段免疫ブロット）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（上段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるEGF-RおよびMUC1の位置を示す。
【図９Ｃ】一対の免疫ブロット写真である。293細胞には、EGF-RをコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「293/EGF-R」）、またはEGF-RをコードするcDNA配列を含む発現ベクターおよびMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「293/EGF-R+MUC1」）のいずれかを、一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を溶解して、溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降しなかったEGF-RおよびMUC1をコードするベクターでトランスフェクトした細胞の溶解産物の免疫沈降物およびアリコートを、抗EGF-R（「IB：抗EGF-R」）（上段免疫ブロット）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるEGF-RおよびMUC-1の位置を示す。
【図９Ｄ】一対免疫ブロットの写真である。293細胞には：EGF-RをコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「293/EGF-R」）；またはEGF-RをコードするcDNA配列を含む発現ベクター、およびMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「293/EGF-R+MUC1」）を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を溶解して、溶解産物を抗EGF-R（「抗EGF-R」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物を抗EGF-R（「IB：抗EGF-R」）（下段免疫ブロット）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（上段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるEGF-RおよびMUC-1の位置を示す。
【図１０】上皮細胞成長因子（EGF）の非存在下（「-EGF」；図1OA）または存在下（「+EGF」；10ng/ml；図1OB）において、5分間培養したZR-75-1乳癌細胞の一連の顕微鏡写真である。抗EGF-R（緑色蛍光を放射する蛍光団で標識した）または抗MUC1（赤色蛍光を放射する蛍光団で標識した）で細胞を二重染色した。左の2つのパネルにおいて、緑色蛍光（「抗EGF-R」）が視覚化され、中央の2つのパネルにおいて、赤色蛍光（「抗MUC1」）が視覚化され、かつ右の2つのパネルにおいて、緑色蛍光イメージを赤色蛍光イメージ上に（「オーバーレイ」）オーバーレイした。
【図１１Ａ】一対の免疫ブロット写真である。EGFの非存在下（「ZR-75-1」）または存在下（「EGF」；10ng/ml）において5分間培養したZR-75-1乳癌細胞を可溶化して、溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物を抗P-Tyr（「IB：抗P-Tyr」）（上段免疫ブロット）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるリン酸化された（円内のP）MUC1およびMUC1の位置を示す。
【図１１Ｂ】一対の免疫ブロット写真である。293細胞には、EGF-RをコードするcDNA配列を含む発現ベクター、およびMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「293/EGF-R+MUC1」）を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をEGFの非存在下（「ZR-75-1」）または存在下（「EGF」；10ng/ml）において5分間培養し、次いで溶解した。溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物を抗P-Tyr（「IB：抗P-Tyr」）（上段免疫ブロット）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるリン酸化されたMUC1およびMUC1の位置を示す。
【図１１Ｃ】オートラジオグラム（上段パネル）およびクーマシーブルー染色したSDS-PAGEゲル（下段パネル）の写真である。精製した組換え野生型タンパク質（「Wt」）および変異体MUC1/CDタンパク質（下記参照）を、精製した組換えEGF-Rおよび[γ-32P]ATPとインキュベートした。反応産物をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィー（上段パネル）によって解析した。オートラジオグラフィーに使用したゲルは、クーマシーブルーでも染色して、タンパク質のゲルへのローディングの相対的レベルを評価した（下段パネル）。変異体MUC1/CDタンパク質では、MUC1/CD（配列番号：1）の46位（「Y46F」）、8位（「Y8F」）、20位（「Y20F」）、26位（「Y26F」）、および35位（「Y35F」）のチロシン残基がフェニルアラニンに変異していた。
【図１１Ｄ】一対の免疫ブロット写真である。HCT116細胞には以下を一過性にトランスフェクトした：対照発現ベクター（「HCT116/ベクター」；免疫ブロットの最初の2レーン）；MUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「HCT116/MUC1」；免疫ブロットの中央の2レーン）；またはMUC1/CDの46位のチロシン残基がフェニルアラニン変異したMUC1をコードする、cDNA配列を含む発現ベクター（「HCT116/MUC1（Y46F）」；免疫ブロットの最後の2レーン）。トランスフェクトした細胞をEGF（10ng/ml）の非存在下（関連するトランスフェクション細胞の頭字語によって示したレーン）、または存在下（「+EGF」によって示したレーン）で5分間培養し、次いで溶解した。溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物を抗P-Tyr（「IB：抗P-Tyr」）（上段免疫ブロット）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおいてリン酸化された（円内のP）MUC1およびMUC-1の位置を示す。
【図１２Ａ】一連の5つの免疫ブロットおよびクーマシーブルー染色したSDS-PAGEゲルの写真である。精製した組換え野生型MUC1/CDまたは精製した組換え変異体MUC1/CD（Y46F）を、図の上部の表に示したとおりに、精製した組換えEGF-Rの存在下または非存在下、およびATPの存在下または非存在下でインキュベートした。GST-Src-SH2（上段の3つの写真）またはGST-β-カテニン（下段の2つの写真）をこれらの反応混合液に添加した。反応混合液をグルタチオン-セファロース4B（商標）ビーズとインキュベートして、ビーズによって沈殿したタンパク質を抗P-Tyr（「IB：抗P-Tyr」）（第1のパネル）、抗MUC1/CD（「IB：抗MUC1/CD」）（第2および第4のパネル）、または抗β-カテニン（「IB：抗(β-カテニン」）（第5のパネル）による免疫ブロット解析に供した。SDS-PAGEゲルのレーンにタンパク質が等しく添加されていることは、第2のパネルに示した免疫ブロット解析に使用した、クーマシーブルー染色されたゲルによって、および第5のパネルに示した免疫ブロットによって示される。免疫ブロットおよびクーマシーブルー染色したゲルにおける、リン酸化されたMUC1/CD、MUC1/CD、GST-Src-SH2、およびβ-カテニンの位置を示す。
【図１２Ｂ】一連の3つの免疫ブロット写真である。EGFの非存在下（「ZR-75-1」）または存在下（「EGF」；10ng/ml）で5分間培養したZR-75-1乳癌細胞を溶解して、溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物は、抗c-Src（「IB：抗c-Src」）（上段免疫ブロット）、抗β-カテニン（「IB：抗β-カテニン」）（中段免疫ブロット）、または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるc-Src、β-カテニン、およびMUC1の位置を示す。
【図１２Ｃ】一連の3つの免疫ブロット写真である。HCT116細胞には以下を一過性にトランスフェクトした：対照発現ベクター（「HCT116/ベクター」；免疫ブロットの最初の2レーン）；MUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「HCT116/MUC1」；免疫ブロットの中央の2レーン）；またはMUC1/CDの46位のチロシン残基がフェニルアラニンに変異したMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「HCT116/MUC1（Y46F）」；免疫ブロットの最後の2レーン）。トランスフェクトした細胞をEGFの非存在下（関連するトランスフェクション細胞の頭字語によって示したレーン）または存在下（「+EGF」によって示したレーン；10ng/ml）で5分間培養し、次いで溶解した。溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物を抗c-Src（「IB：抗c-Src」）（上段免疫ブロット）、抗β-カテニン（「IB：抗β-カテニン」）（中段免疫ブロット）、または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるc-Src、β-カテニン、およびMUC-1の位置を示す。
【図１２Ｄ】MUC1/CDのアミノ酸配列（配列番号：1）の記載である。8位、20位、26位、35位、および46位のチロシン残基（Y）は、太字で示して下線を引いた。GSK3βの結合部位およびリン酸化部位（STDRS；配列番号：9）、c-Src結合配列（YEKV；配列番号：10）、およびβ-カテニン結合配列（SAGNGGSSLS；配列番号：11）を示す。
【図１３Ａ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞を対照マウスIgG（両パネルにおける左のレーン）、抗MUC1（「抗MUC1」；中央レーン、左パネル）、またはPKCδに特異的な抗体（「抗PKCδ」；中央レーン、右パネル）で免疫沈降した。免疫沈降物を抗PKCδ（左パネル）（「IB：抗PKCδ」）または抗MUC1（右パネル）（「IB：抗MUC1」）による免疫ブロット解析に供した。免疫沈降にかけなかった溶解産物のアリコートを免疫ブロット解析によっても解析した（「溶解産物」；両パネルの右レーン）。免疫ブロットにおけるPKCδおよびMUC1の位置を示す。
【図１３Ｂ】一連の3つの免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞に由来する溶解産物を、対照マウスIgG（3つのパネル全てにおいて、左レーン）または抗MUC1（「抗MUC1」；3つのパネル全てにおいて、中間レーン）で免疫沈降した。免疫沈降物は、プロテインキナーゼCβIIに特異的な抗体（上段パネル）（「IB：抗PKCβII」）、プロテインキナーゼCηに特異的な抗体（中段パネル）（「IB：抗PKCη」）、またはプロテインキナーゼCμに特異的な抗体（下段パネル）（「IB：抗PKCμ」）による免疫ブロット解析に供した。免疫沈降にかけなかった溶解産物のアリコートを免疫ブロット解析によっても解析した（「溶解産物」；3つのパネル全ての右レーン）。免疫ブロットにおけるPKCβII、PKCη、およびPKCμの位置を示す。
【図１３Ｃ】一対の免疫ブロット写真である。293細胞には以下を一過性にトランスフェクトした：MUC1（「MUC1」）をコードするcDNA配列を含む発現ベクター；またはMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター；およびPKCδをコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「MUC1+PKCδ」）。トランスフェクトした細胞を溶解して、溶解産物をマウスIgG（「IP」）（「IP：IgG」）（両パネルの第1レーン）または抗MUC1（「IP：抗MUC1」）（両パネルの第2および第3のレーン）で免疫沈降した。免疫沈降物を、抗PKCδ（「IB：抗PKCδ」）（上段パネル）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫沈降にかけなかった溶解産物のアリコートを免疫ブロット解析によっても解析した（「溶解産物」；両パネルの第4レーン）。免疫ブロットにおけるPKCδおよびMUC-1の位置を示す。
【図１３Ｄ】免疫ブロット写真である。精製した組換えPKCδ（「PKCδ+」）をGSTまたはMUC1/CDに融合されたGST（「GST-MUC1/CD」）とインキュベートした。グルタチオン-セファロース4B（商標）ビーズによりこれらの混合液から沈殿するタンパク質を、抗PKCδ（「IB：抗PKCδ」）による免疫ブロット（「IB」）解析に供した。免疫ブロットにおけるPKCδの位置を示す。
【図１４Ａ】オートラジオグラム写真である。精製した組換えPKCδ（「+PKCδ」）を、[γ-32P]ATPおよびGSTまたはGST-MUC1/CDと共にインキュベートした。反応産物をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって解析した。オートラジオグラムにおけるPKCδおよびリン酸化された（円内のP）GST-MUC1/CDの位置を示す。
【図１４Ｂ】野生型MUC1の構造の概略図およびMUC1/CDのアミノ酸38位〜45位の配列の記載であり、これらは：野生型MUC1（「MUC1/CD（WT）」）（配列番号：16）；MUC1/CDの41位のスレオニン残基がアラニンに変異されたMUC1（「MUC1/CD（T41A）」）（配列番号：17）；MUC1/CDの44位のセリン残基がアラニンに変異されたMUC1（「MUC1/CD（S44A）」）（配列番号：18）；MUC1/CDの40位のセリン残基がアラニンに変異されたMUC1（「MUC1/CD（S40A）」）（配列番号：19）；並びにMUC1/CDの40位のセリン残基および44位のセリン残基が、アラニンに変異されたMUC1（「MUC1/CD（S40A/S44A）」）（配列番号：20）として存在する。また、これらのアミノ酸配列の各々の上に示したのは、アミノ酸配列（配列番号：21〜25)をコードするヌクレオチド配列である。数字は、MUC1/CD（配列番号：1）におけるアミノ酸位置を示す。TR、タンデムリピートドメイン；TM、膜貫通ドメイン；CD、細胞質ドメイン。
【図１４Ｃ】オートラジオグラム（上段パネル）およびクーマシーブルー染色したSDS-PAGEゲル（下段パネル）の写真である。精製した組換えPKCδを、野生型MUC1/CD、または4つの変異体MUC1/CDタンパク質のうちの1つ（図14Bに示した変異体を含む）、および[γ-32P]ATPと共にインキュベートした。反応産物をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって解析した（上段パネル）。オートラジオグラフィーに使用したゲルは、クーマシーブルーでも染色して、タンパク質のゲルへのローディングの相対的レベルを評価した。オートラジオグラムおよびクーマシーブルー染色したSDS-PAGEゲルにおける、PKCβおよびMUC1/CDの位置を示す。
【図１４Ｄ】一対の免疫ブロット写真である。上段の免疫ブロットの上の表は、一連の6つのリン酸化反応混合液のさまざまな成分[PKCδ、ATP、野生型MUC1/CD（「MUC1/CD+PKCδ」）、および変異体MUC1/CD（T41A）（「MUC1/CD（T41A）+PKCδ」）]の存在（「+」）または非存在（「-」）を示す。表に示したように、リン酸化反応の完了後に、全ての反応混合液にGST-β-カテニンを添加した。次いで、反応混合液をグルタチオン-セファロース4B（商標）ビーズとインキュベートして、ビーズによって沈殿したタンパク質を抗MUC1/CD（「IB：抗MUC1/CD」）（上段パネル）または抗PKCδ（「IB：抗PKCδ」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。
【図１５Ａ】一対の免疫ブロット写真である。293細胞には以下を一過性にトランスフェクトした：MUC1をコードするcDNAを含む発現ベクター、およびPKCδに融合された緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする発現ベクター（「MUC1+GFP-PKCδ」）；MUC1をコードするcDNAを含む発現ベクター、およびキナーゼ不活性PKCδ変異体PKCδ（K378R）に融合されたGFPをコードする発現ベクター（「MUC1+GFP-PKCδ（K-R））;またはCDの41位のスレオニン残基がアラニンに変異したMUC1をコードするcDNAを含む発現ベクター、およびPKCδに融合されたGFPをコードする発現ベクター（「MUC1（T41A）+GFP-PKCδ」）。これらの細胞に由来する溶解産物を抗MUC1で免疫沈降した（「IP：抗MUC1」）。免疫沈降物を抗β-カテニン（「IB：抗カテニン」）（上段パネル）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるβ-カテニン、IgG、およびMUC1の位置を示す。
【図１５Ｂ】一対の免疫ブロット写真である。HCT116細胞には以下を安定にトランスフェクトした：対照発現ベクター（「HCT116/V」）；MUC1（「HCT116/MUC1」）をコードするcDNA配列を含む発現ベクター；またはMUC1/CDの41位のスレオニン残基がアラニンに変異されたMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「HCT116/MUC1（T41A））。トランスフェクトした細胞から調製した溶解産物を抗MUCで免疫沈降し、免疫沈降物を抗MUC1（「IB：抗MUC 1」）（上段パネル）または抗β-カテニン（「IB：抗β-カテニン」）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるMUC-1およびβ-カテニンの位置を示す。
【図１５Ｃ】一対の免疫ブロット写真である。HCT116細胞には以下を安定にトランスフェクトした：対照発現ベクター（「HCT116/V」）；MUC1（「HCT116/MUC1」）をコードするcDNA配列を含む発現ベクター；またはMUC1/CDの41位のスレオニン残基がアラニンに変異したMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「HCT116/MUC1（T41A））。免疫ブロットの左の3本のレーンは、これらのトランスフェクトした細胞から免疫沈降された物質（以下に記載したとおり）を含む。免疫ブロットの右の3本のレーンは、左の3本のレーンに記載したとおりにトランスフェクトしたが、さらにGFP-PKCδ（「+GFP-PKCδ」）をコードするcDNA配列を含む発現ベクターをトランスフェクトした細胞から、免疫沈降された物質（以下に記載したとおり）を含む。トランスフェクトした細胞から調製した溶解産物を抗Eカドヘリン（「IP：抗Eカドヘリン」）で免疫沈降し、免疫沈降物を抗β-カテニン（「IB：抗β-カテニン」）（上段パネル）または抗Eカドヘリン（「IB：抗Eカドヘリン」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるβ-カテニンおよびEカドヘリンの位置を示す。
【図１６Ａ】一連の顕微鏡写真である。HCT116/V、HCT116/MUC1、およびHCT116/MUC1（T41A）細胞（図15Cを参照）を軟寒天中で3週間インキュベートした。解析は、2つの独立して選択した各トランスフェクタント細胞株のクローン（「1」および「2」）について行った。
【図１６Ｂ】図16Bに示した各トランスフェクタントクローンの、3つの培養皿で得られたコロニー数を示す棒グラフである。V-1、HCT116/Vのクローン1；V-2、HCT116/Vのクローン2；MUC1-1、HCT116/MUC1のクローン1；MUC1-2、HCT116/MUC1のクローン2；T41A-1、HCT116/MUC1（T41A）のクローン1;T41A-2、HCT116/MUC1（T41A）のクローン2。
【図１６Ｃ】MUC1/CD（配列番号：1）のアミノ酸配列の記載である。PKCδリン酸化部位（T41）、GSK3βリン酸化部位（S44）、EGF-Rとc-Src SH2の結合モチーフの開始点（Y46）、およびβ-カテニン結合部位を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月4日(2004.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
【図１Ａ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞由来の溶解産物を、対照マウスIgG（両パネルの左レーン）、MUC1特異的抗体（「抗MUC1」；左のパネルの中央レーン）、またはc-Src特異的抗体（「抗c-Src」；右のパネルの中央レーン）で免疫沈降した。免疫沈降物は、抗c-Src（左のパネル）または抗MUC1（右のパネル）による免疫ブロット解析に供した。また、免疫沈降を行わなかった溶解産物のアリコートを免疫ブロット解析によって解析した（「溶解産物」；両パネルの右レーン）。免疫ブロットにおけるc-SrcおよびMUC1の位置を示す。
【図１Ｂ】免疫ブロット写真である。精製した組換えMUC1/CD（MUC1の細胞質ドメイン）を単独(「MUC-1/CD」)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）（「MUC1/CD+GST」）、c-SrcのSH2ドメインに融合されたGST（「MUC1/CD+GST-Src SH2」）、またはc-SrcのSH3ドメインに融合されたGST（「MUC1/CD+GST-Src SH3」）と共にインキュベートした。グルタチオンセファロース4B（商標）ビーズを用いて、これらの混合液から沈殿したタンパク質を、MUC1/CD（「抗MUC1/CD」）特異的な抗体による免疫ブロット解析に供した。MUC1/CDの免疫ブロットにおける位置を示す。
【図１Ｃ】免疫ブロット写真（左のパネル）、およびクーマシーブルー染色したドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲル（右のパネル）の写真である。精製した組換えMUC1/CD（MUC1の細胞質ドメイン）を単独（「MUC-1/CD（インプット）」）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）（「MUC1/CD+GST」）、c-SrcのSH3ドメインに融合されたGST（「MUC1/CD+GST-Src SH3」）、またはアミノ酸90位〜92位が欠失したc-SrcのSH3ドメインに融合されたGST（「MUC1/CD+GST-Src SH3De90/92」）と共にインキュベートした。グルタチオンセファロース4B（商標）ビーズを用いて、これらの混合液から沈殿したタンパク質を、抗MUC1/CDによる免疫ブロット（IB）（「IB：抗MUC1/CD」）に供した。免疫ブロットにおけるMUC1/CDの位置を示す。免疫ブロット解析のために使用したSDS-PAGEゲルをクーマシーブルーで染色して、野生型（「GST-Src SH3」）および変異体（「GST-Src SH3De90/92」）SH3ドメインのゲル上のローディングを評価した。
【図２Ａ】2つのリン酸化反応混合物（上段パネル）および2つのリン酸化反応混合物のSDS-PAGEゲルのオートラジオグラム（下段パネル）の成分を示す表である。オートラジオグラムにおける、リン酸化されたc-Src（円内のP）およびMUC1/CDの位置を示す。
【図２Ｂ】MUC1分子の概略図であり、MUC1/CDの野生型および変異体の構造を示す。野生型（「MUC1/CD（WT）」）（配列番号：1）および変異体（「MUC1/CD（Y46F）」）（配列番号：2）MUC1 CDのアミノ酸42位〜50位の配列、並びに野生型（配列番号：3）および変異体（配列番号：4）をコードするcDNAのヌクレオチド配列を示す。数字は、MUC1/CD（配列番号：1）におけるアミノ酸の位置を示す。TR、タンデムリピートドメイン；TM、膜貫通領域；CD、細胞質ドメイン。
【図２Ｃ】3つのリン酸化反応混合物（上段パネル）の成分；3つのリン酸化反応混合物のSDS-PAGEゲルのオートラジオグラム（中段パネル）；およびクーマシーブルー染色したSDS-PAGEゲルの写真（下段パネル）を示す表である。オートラジオグラムにおけるリン酸化された（円内のP）c-SrcおよびMUC1/CDの位置を示す。オートラジオグラムを作製するために使用したSDS-PAGEゲルをクーマシーブルーで染色して、MUC1/CDのゲル上のローディングを評価した。
【図２Ｄ】基質、および4つのリン酸化反応混合物におけるATPの存在または不在（上段パネル）、並びにリン酸化反応混合物の免疫ブロット解析の2つの写真（中央および下段パネル）を示している。中段パネルに示した免疫ブロットは、抗MUC1/CDで染色した（「IB：抗MUC1/CD」）。下段パネルに示した免疫ブロットは、ホスホチロシン残基に特異的な抗体で染色した（「IB：抗P-Tyr」）。MUC1およびリン酸化された（円内のP）MUC1/CDの免疫ブロットにおける位置を示す。
【図３Ａ】2つのリン酸化反応混合液の成分（上段パネル）およびリン酸化反応混合液のSDS-PAGEゲルに由来する免疫ブロットの写真（下段パネル）を示す表である。免疫ブロットは、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β（GSK3β)に特異的な抗体で染色した（「IB：抗GSK3β」）。GSK3βの免疫ブロットにおける位置を示す。
【図３Ｂ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞に、対照発現ベクター（「ZR-75-1/ベクター」）、またはc-Src（「ZR-75-1/c-Src」）をコードするcDNAを含む発現ベクターを一過性にトランスフェクトした。これらの細胞に由来する溶解産物を抗MUC1（「IP：抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。c-Srcを発現するベクターをトランスフェクトした細胞に由来する溶解産物を、正常マウスIgG（「IgG」）でも免疫沈降した。これらの免疫沈降物、並びにc-Src発現ベクターをトランスフェクトした細胞に由来する溶解産物（「溶解産物」）を、抗c-Src（「IB：抗c-Src」）（上段パネル）または抗GSK3β（「IB：抗GSK3β」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるIgG、c-Src、およびGSK3の位置を示す。
【図４Ａ】一対の免疫ブロット写真である。上部パネルの上には、8つのリン酸化反応混合液の成分を示す。8つの異なる反応混合液中のタンパク質をGSTまたはβ-カテニンに融合されたGST（「GST-β-Cat」）と共にインキュベートした。生じた混合液をグルタチオン-セファロース4B（商標）ビーズとインキュベートした。ビーズで沈殿されたタンパク質を、抗MUC1/CD（「IB：抗MUC1/CD」）（上段パネル）またはβ-カテニンに特異的な抗体（「IB：抗カテニン」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるMUC1/CDおよびβ-カテニン（「β-Cat」）の位置を示す。
【図４Ｂ】一連の3つの免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞には、対照発現ベクター（「ZR-75-1/ベクター」）またはc-Src（「ZR-75-1/c-Src」）をコードするcDNAを含む発現ベクターを一過性にトランスフェクトした。これらの細胞に由来する溶解産物を正常マウスIgG（「IgG」）または抗MUC1（「IP：抗MUC1」）のいずれかで免疫沈降した（IP）。これらの免疫沈降物、並びにc-Src発現ベクターをトランスフェクトした細胞に由来する非免疫沈降溶解産物（「溶解産物」）を、抗c-Src（「IB：抗c-Src」）（上段パネル）もしくは抗P-Tyr（「IB：抗P-Tyr」）（中段パネル）、または抗β-Cat（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるc-Src、リン酸化された（円内のP）MUC1、およびβ-カテニン（「β-Cat」）の位置を示す。
【図４Ｃ】一連の3つの免疫ブロット写真である。293細胞には以下を一過性にトランスフェクトした：MUC1をコードするcDNAを含む発現ベクター（「293/MUC1」）；MUC1をコードするcDNAを含む発現ベクターとc-Srcをコードする発現ベクター（「293/MUC1+c-Src」）；またはCDの46位のチロシン残基をフェニルアラニンに変異したMUC1をコードするcDNAを含む発現ベクターとc-Srcをコードする発現ベクター（「293/MUC1（Y46F）+c-Src」）。これらの細胞に由来する溶解産物を、正常マウスIgG（「IgG」）または抗MUC1のいずれかで免疫沈降した（「IP：抗MUC1」）。免疫沈降物並びにc-Src発現ベクターをトランスフェクトした細胞に由来する非免疫沈降溶解産物（「溶解産物」）を、抗c-Src（「IB：抗c-Src」）（上段パネル）もしくは抗P-Tyr（「IB：抗P-Tyr」）（中段パネル）、または抗β-Cat（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるc-Src、リン酸化された（円内のP）MUC1、およびΒ-カテニン(「β-Cat」）の位置を示す。
【図５Ａ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞の溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）または対照IgG（「IgG」）で免疫沈降した（「IP」）。生じた免疫沈降物および非免疫沈降溶解産物を、p120に特異的な抗体（「IB：抗p120」）（上段パネル）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるp120およびMUC1の位置を示す。
【図５Ｂ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞の溶解産物を抗p120（「抗p120」）または対照IgG（「IgG」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物および非免疫沈降溶解産物を、抗p120（「IB：抗p120」）（下段パネル）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（上段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるp120およびMUC1の位置を示す。
【図６Ａ】野生型MUC1（「MUC1」）およびその細胞質ドメインを欠いているMUC1（「MUC1/dCD」）の構造の概略図である。TR、タンデムリピートドメイン；TM、膜貫通ドメイン；CD、細胞質のドメイン。
【図６Ｂ】ベクター、および293細胞の5つのアリコートに一過性にトランスフェクトするために使用した発現ベクターの量（μg）（上段パネル）；および3つの免疫ブロット写真を示す表である。使用したベクターは、対照発現ベクター（「ベクター」）、MUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「MUC1」）、MUC1/dCDをコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「MUC1/dCD」）、およびp120をコードするcDNA配列を含む発現ベクターであった。トランスフェクションの48時間後、5つのトランスフェクトした細胞集団を溶解した。各溶解産物のアリコートを抗MUC1で免疫沈降して（「IP：抗MUC1」）、免疫沈降物を抗p120による免疫ブロット解析に供した（「IB：抗p120」）（上段免疫ブロット）。各溶解産物のアリコートを、直接に抗MUC1（「IB：抗DF3-E」）（中段免疫ブロット）または抗p120（「IB：抗p120」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるMUC1、MUC1/dCD、およびp120の位置を示す。
【図６Ｃ】免疫ブロット写真である。精製した組換えMUG1/CDをGST（「GST」）またはp120に融合したGST（「GST-p120」）とインキュベートした。生じた混合液をグルタチオン-セファロース4B（商標）ビーズとインキュベートし、ビーズによって沈殿したタンパク質を抗MUC1/CDによる免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるMUC1/CDの位置を示す。
【図７Ａ】MUC1/CD（配列番号：1）（上段配列）、MUC1/CDのN末端領域（「N-MUC1/CD」）（配列番号：5）（中段配列）、およびMUC1/CDのC末端領域（「C-MUC 1/CD」）（配列番号：6）（下段配列）のアミノ酸配列の記載である。数字は、MUC1/CDにおけるアミノ酸の位置を示す（配列番号：1)。β-カテニン結合部を囲った。GSK3β-結合部位およびリン酸化部位には、一重下線を引き、p120結合部には、二重下線を引いた。
【図７Ｂ】免疫ブロット写真である。表中で、免疫ブロットの上には、GSTおよびGST-p120をMUC1/CD（N-MUC1/CD）またはC-MUC1/CD組換えタンパク質のいずれかとインキュベートしたものを示した。タンパク質の混合液を含む4つの試料を抗MUC1/CDによる免疫ブロット解析に供した（「IB：抗MUC1/CD」）。
【図７Ｃ】一対の免疫ブロット写真である。表中で、免疫ブロットの上には、阻害剤ペプチドの非存在下で（両免疫ブロットの第1および第4レーン）、またはアミノ酸配列MSEYPTYHTHを有するペプチド（配列番号：7）もしくはアミノ酸配列GRYVPPSSTDR（配列番号：8）を有するペプチドのいずれかの存在下でインキュベートした、MUC1/CD、GST-p120、およびGSTの混合液を示す。4つの混合液をグルタチオン-セファロース4B（商標）ビーズとインキュベートして、ビーズによって沈殿したタンパク質を抗MUC1/CD（「IB：抗MUC1/CD」）（上段免疫ブロット）、または抗p120（「IB：抗p120」）（上段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるMUC1/CDおよびp120の位置を示す。
【図８Ａ】一連の免疫ブロット写真である。293細胞には、対照発現ベクター（「ベクター」）、または野生型MUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「MUC1」）を一過性にトランスフェクトした。可溶化した細胞質画分（「Cyto」）および核画分（「Nuc」）を、トランスフェクトした細胞から調整して、抗p120（「IB：抗p120」）（上段の2つの免疫ブロット）、抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（中段の2つの免疫ブロット）、またはアクチン特異的な抗体（「IB：抗アクチン」）（下段の2つの免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるp120、MUC1およびアクチンの位置を示す。
【図８Ｂ】一連の免疫ブロット写真である。MDA-MB-231細胞には、対照発現ベクター（「ベクター」）または野生型MUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「MUC1」）を、一過性にトランスフェクトした。可溶化した細胞質画分（「Cyto」）および核画分（「Nuc」）を、トランスフェクトした細胞から調製して、抗p120（「IB：抗p120」）（上段の2つの免疫ブロット）、抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（中段の2つの免疫ブロット）、またはアクチン特異的な抗体（「IB：抗アクチン」）（下段の2つの免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるp120、MUC1およびアクチンの位置を示す。
【図９Ａ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞を溶解して、溶解産物を正常IgG（「IgG」）または抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降しなかった溶解産物（「溶解産物」）の免疫沈降物およびアリコートを、上皮細胞成長因子受容体（EGF-R）に特異的な抗体（「IB：抗EGF-R」）（上段免疫ブロット）、または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるEGF-RおよびMUC1の位置を示す。
【図９Ｂ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞を溶解して、溶解産物を正常IgG（「IgG」）または抗EGF-R（「抗EGF-R」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降しなかった溶解産物（「溶解産物」）の免疫沈降物およびアリコートを、上皮細胞成長因子受容体（EGF-R）に特異的な抗体（「IB：抗EGF-R」）（下段免疫ブロット）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（上段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるEGF-RおよびMUC1の位置を示す。
【図９Ｃ】一対の免疫ブロット写真である。293細胞には、EGF-RをコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「293/EGF-R」）、またはEGF-RをコードするcDNA配列を含む発現ベクターおよびMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「293/EGF-R+MUC1」）のいずれかを、一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を溶解して、溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降しなかったEGF-RおよびMUC1をコードするベクターでトランスフェクトした細胞の溶解産物の免疫沈降物およびアリコートを、抗EGF-R（「IB：抗EGF-R」）（上段免疫ブロット）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるEGF-RおよびMUC-1の位置を示す。
【図９Ｄ】一対免疫ブロットの写真である。293細胞には：EGF-RをコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「293/EGF-R」）；またはEGF-RをコードするcDNA配列を含む発現ベクター、およびMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「293/EGF-R+MUC1」）を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を溶解して、溶解産物を抗EGF-R（「抗EGF-R」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物を抗EGF-R（「IB：抗EGF-R」）（下段免疫ブロット）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（上段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるEGF-RおよびMUC-1の位置を示す。
【図１０Ａおよび１０Ｂ】上皮細胞成長因子（EGF）の非存在下（「-EGF」；図1OA）または存在下（「+EGF」；10ng/ml；図1OB）において、5分間培養したZR-75-1乳癌細胞の一連の顕微鏡写真である。抗EGF-R（緑色蛍光を放射する蛍光団で標識した）または抗MUC1（赤色蛍光を放射する蛍光団で標識した）で細胞を二重染色した。左の2つのパネルにおいて、緑色蛍光（「抗EGF-R」）が視覚化され、中央の2つのパネルにおいて、赤色蛍光（「抗MUC1」）が視覚化され、かつ右の2つのパネルにおいて、緑色蛍光イメージを赤色蛍光イメージ上に（「オーバーレイ」）オーバーレイした。
【図１１Ａ】一対の免疫ブロット写真である。EGFの非存在下（「ZR-75-1」）または存在下（「EGF」；10ng/ml）において5分間培養したZR-75-1乳癌細胞を可溶化して、溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物を抗P-Tyr（「IB：抗P-Tyr」）（上段免疫ブロット）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるリン酸化された（円内のP）MUC1およびMUC1の位置を示す。
【図１１Ｂ】一対の免疫ブロット写真である。293細胞には、EGF-RをコードするcDNA配列を含む発現ベクター、およびMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「293/EGF-R+MUC1」）を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をEGFの非存在下（「ZR-75-1」）または存在下（「EGF」；10ng/ml）において5分間培養し、次いで溶解した。溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物を抗P-Tyr（「IB：抗P-Tyr」）（上段免疫ブロット）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるリン酸化されたMUC1およびMUC1の位置を示す。
【図１１Ｃ】オートラジオグラム（上段パネル）およびクーマシーブルー染色したSDS-PAGEゲル（下段パネル）の写真である。精製した組換え野生型タンパク質（「Wt」）および変異体MUC1/CDタンパク質（下記参照）を、精製した組換えEGF-Rおよび[γ-32P]ATPとインキュベートした。反応産物をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィー（上段パネル）によって解析した。オートラジオグラフィーに使用したゲルは、クーマシーブルーでも染色して、タンパク質のゲルへのローディングの相対的レベルを評価した（下段パネル）。変異体MUC1/CDタンパク質では、MUC1/CD（配列番号：1）の46位（「Y46F」）、8位（「Y8F」）、20位（「Y20F」）、26位（「Y26F」）、および35位（「Y35F」）のチロシン残基がフェニルアラニンに変異していた。
【図１１Ｄ】一対の免疫ブロット写真である。HCT116細胞には以下を一過性にトランスフェクトした：対照発現ベクター（「HCT116/ベクター」；免疫ブロットの最初の2レーン）；MUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「HCT116/MUC1」；免疫ブロットの中央の2レーン）；またはMUC1/CDの46位のチロシン残基がフェニルアラニン変異したMUC1をコードする、cDNA配列を含む発現ベクター（「HCT116/MUC1（Y46F）」；免疫ブロットの最後の2レーン）。トランスフェクトした細胞をEGF（10ng/ml）の非存在下（関連するトランスフェクション細胞の頭字語によって示したレーン）、または存在下（「+EGF」によって示したレーン）で5分間培養し、次いで溶解した。溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物を抗P-Tyr（「IB：抗P-Tyr」）（上段免疫ブロット）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおいてリン酸化された（円内のP）MUC1およびMUC-1の位置を示す。
【図１２Ａ】一連の5つの免疫ブロットおよびクーマシーブルー染色したSDS-PAGEゲルの写真である。精製した組換え野生型MUC1/CDまたは精製した組換え変異体MUC1/CD（Y46F）を、図の上部の表に示したとおりに、精製した組換えEGF-Rの存在下または非存在下、およびATPの存在下または非存在下でインキュベートした。GST-Src-SH2（上段の3つの写真）またはGST-β-カテニン（下段の2つの写真）をこれらの反応混合液に添加した。反応混合液をグルタチオン-セファロース4B（商標）ビーズとインキュベートして、ビーズによって沈殿したタンパク質を抗P-Tyr（「IB：抗P-Tyr」）（第1のパネル）、抗MUC1/CD（「IB：抗MUC1/CD」）（第2および第4のパネル）、または抗β-カテニン（「IB：抗(β-カテニン」）（第5のパネル）による免疫ブロット解析に供した。SDS-PAGEゲルのレーンにタンパク質が等しく添加されていることは、第2のパネルに示した免疫ブロット解析に使用した、クーマシーブルー染色されたゲルによって、および第5のパネルに示した免疫ブロットによって示される。免疫ブロットおよびクーマシーブルー染色したゲルにおける、リン酸化されたMUC1/CD、MUC1/CD、GST-Src-SH2、およびβ-カテニンの位置を示す。
【図１２Ｂ】一連の3つの免疫ブロット写真である。EGFの非存在下（「ZR-75-1」）または存在下（「EGF」；10ng/ml）で5分間培養したZR-75-1乳癌細胞を溶解して、溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物は、抗c-Src（「IB：抗c-Src」）（上段免疫ブロット）、抗β-カテニン（「IB：抗β-カテニン」）（中段免疫ブロット）、または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるc-Src、β-カテニン、およびMUC1の位置を示す。
【図１２Ｃ】一連の3つの免疫ブロット写真である。HCT116細胞には以下を一過性にトランスフェクトした：対照発現ベクター（「HCT116/ベクター」；免疫ブロットの最初の2レーン）；MUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「HCT116/MUC1」；免疫ブロットの中央の2レーン）；またはMUC1/CDの46位のチロシン残基がフェニルアラニンに変異したMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「HCT116/MUC1（Y46F）」；免疫ブロットの最後の2レーン）。トランスフェクトした細胞をEGFの非存在下（関連するトランスフェクション細胞の頭字語によって示したレーン）または存在下（「+EGF」によって示したレーン；10ng/ml）で5分間培養し、次いで溶解した。溶解産物を抗MUC1（「抗MUC1」）で免疫沈降した（「IP」）。免疫沈降物を抗c-Src（「IB：抗c-Src」）（上段免疫ブロット）、抗β-カテニン（「IB：抗β-カテニン」）（中段免疫ブロット）、または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段免疫ブロット）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるc-Src、β-カテニン、およびMUC-1の位置を示す。
【図１２Ｄ】MUC1/CDのアミノ酸配列（配列番号：1）の記載である。8位、20位、26位、35位、および46位のチロシン残基（Y）は、太字で示して下線を引いた。GSK3βの結合部位およびリン酸化部位（STDRS；配列番号：9）、c-Src結合配列（YEKV；配列番号：11）、およびβ-カテニン結合配列（SAGNGGSSLS；配列番号：10）を示す。
【図１３Ａ】一対の免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞を対照マウスIgG（両パネルにおける左のレーン）、抗MUC1（「抗MUC1」；中央レーン、左パネル）、またはPKCδに特異的な抗体（「抗PKCδ」；中央レーン、右パネル）で免疫沈降した。免疫沈降物を抗PKCδ（左パネル）（「IB：抗PKCδ」）または抗MUC1（右パネル）（「IB：抗MUC1」）による免疫ブロット解析に供した。免疫沈降にかけなかった溶解産物のアリコートを免疫ブロット解析によっても解析した（「溶解産物」；両パネルの右レーン）。免疫ブロットにおけるPKCδおよびMUC1の位置を示す。
【図１３Ｂ】一連の3つの免疫ブロット写真である。ZR-75-1乳癌細胞に由来する溶解産物を、対照マウスIgG（3つのパネル全てにおいて、左レーン）または抗MUC1（「抗MUC1」；3つのパネル全てにおいて、中間レーン）で免疫沈降した。免疫沈降物は、プロテインキナーゼCβIIに特異的な抗体（上段パネル）（「IB：抗PKCβII」）、プロテインキナーゼCηに特異的な抗体（中段パネル）（「IB：抗PKCη」）、またはプロテインキナーゼCμに特異的な抗体（下段パネル）（「IB：抗PKCμ」）による免疫ブロット解析に供した。免疫沈降にかけなかった溶解産物のアリコートを免疫ブロット解析によっても解析した（「溶解産物」；3つのパネル全ての右レーン）。免疫ブロットにおけるPKCβII、PKCη、およびPKCμの位置を示す。
【図１３Ｃ】一対の免疫ブロット写真である。293細胞には以下を一過性にトランスフェクトした：MUC1（「MUC1」）をコードするcDNA配列を含む発現ベクター；またはMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター；およびPKCδをコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「MUC1+PKCδ」）。トランスフェクトした細胞を溶解して、溶解産物をマウスIgG（「IP」）（「IP：IgG」）（両パネルの第1レーン）または抗MUC1（「IP：抗MUC1」）（両パネルの第2および第3のレーン）で免疫沈降した。免疫沈降物を、抗PKCδ（「IB：抗PKCδ」）（上段パネル）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫沈降にかけなかった溶解産物のアリコートを免疫ブロット解析によっても解析した（「溶解産物」；両パネルの第4レーン）。免疫ブロットにおけるPKCδおよびMUC-1の位置を示す。
【図１３Ｄ】免疫ブロット写真である。精製した組換えPKCδ（「PKCδ+」）をGSTまたはMUC1/CDに融合されたGST（「GST-MUC1/CD」）とインキュベートした。グルタチオン-セファロース4B（商標）ビーズによりこれらの混合液から沈殿するタンパク質を、抗PKCδ（「IB：抗PKCδ」）による免疫ブロット（「IB」）解析に供した。免疫ブロットにおけるPKCδの位置を示す。
【図１４Ａ】オートラジオグラム写真である。精製した組換えPKCδ（「+PKCδ」）を、[γ-32P]ATPおよびGSTまたはGST-MUC1/CDと共にインキュベートした。反応産物をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって解析した。オートラジオグラムにおけるPKCδおよびリン酸化された（円内のP）GST-MUC1/CDの位置を示す。
【図１４Ｂ】野生型MUC1の構造の概略図およびMUC1/CDのアミノ酸38位〜45位の配列の記載であり、これらは：野生型MUC1（「MUC1/CD（WT）」）（配列番号：16）；MUC1/CDの41位のスレオニン残基がアラニンに変異されたMUC1（「MUC1/CD（T41A）」）（配列番号：17）；MUC1/CDの44位のセリン残基がアラニンに変異されたMUC1（「MUC1/CD（S44A）」）（配列番号：18）；MUC1/CDの40位のセリン残基がアラニンに変異されたMUC1（「MUC1/CD（S40A）」）（配列番号：19）；並びにMUC1/CDの40位のセリン残基および44位のセリン残基が、アラニンに変異されたMUC1（「MUC1/CD（S40A/S44A）」）（配列番号：20）として存在する。また、これらのアミノ酸配列の各々の上に示したのは、アミノ酸配列（それぞれ配列番号：21〜24および15)をコードするヌクレオチド配列である。数字は、MUC1/CD（配列番号：1）におけるアミノ酸位置を示す。TR、タンデムリピートドメイン；TM、膜貫通ドメイン；CD、細胞質ドメイン。
【図１４Ｃ】オートラジオグラム（上段パネル）およびクーマシーブルー染色したSDS-PAGEゲル（下段パネル）の写真である。精製した組換えPKCδを、野生型MUC1/CD、または4つの変異体MUC1/CDタンパク質のうちの1つ（図14Bに示した変異体を含む）、および[γ-32P]ATPと共にインキュベートした。反応産物をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって解析した（上段パネル）。オートラジオグラフィーに使用したゲルは、クーマシーブルーでも染色して、タンパク質のゲルへのローディングの相対的レベルを評価した。オートラジオグラムおよびクーマシーブルー染色したSDS-PAGEゲルにおける、PKCβおよびMUC1/CDの位置を示す。
【図１４Ｄ】一対の免疫ブロット写真である。上段の免疫ブロットの上の表は、一連の6つのリン酸化反応混合液のさまざまな成分[PKCδ、ATP、野生型MUC1/CD（「MUC1/CD+PKCδ」）、および変異体MUC1/CD（T41A）（「MUC1/CD（T41A）+PKCδ」）]の存在（「+」）または非存在（「-」）を示す。表に示したように、リン酸化反応の完了後に、全ての反応混合液にGST-β-カテニンを添加した。次いで、反応混合液をグルタチオン-セファロース4B（商標）ビーズとインキュベートして、ビーズによって沈殿したタンパク質を抗MUC1/CD（「IB：抗MUC1/CD」）（上段パネル）または抗PKCδ（「IB：抗PKCδ」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。
【図１５Ａ】一対の免疫ブロット写真である。293細胞には以下を一過性にトランスフェクトした：MUC1をコードするcDNAを含む発現ベクター、およびPKCδに融合された緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする発現ベクター（「MUC1+GFP-PKCδ」）；MUC1をコードするcDNAを含む発現ベクター、およびキナーゼ不活性PKCδ変異体PKCδ（K378R）に融合されたGFPをコードする発現ベクター（「MUC1+GFP-PKCδ（K-R））;またはCDの41位のスレオニン残基がアラニンに変異したMUC1をコードするcDNAを含む発現ベクター、およびPKCδに融合されたGFPをコードする発現ベクター（「MUC1（T41A）+GFP-PKCδ」）。これらの細胞に由来する溶解産物を抗MUC1で免疫沈降した（「IP：抗MUC1」）。免疫沈降物を抗β-カテニン（「IB：抗カテニン」）（上段パネル）または抗MUC1（「IB：抗MUC1」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるβ-カテニン、IgG、およびMUC1の位置を示す。
【図１５Ｂ】一対の免疫ブロット写真である。HCT116細胞には以下を安定にトランスフェクトした：対照発現ベクター（「HCT116/V」）；MUC1（「HCT116/MUC1」）をコードするcDNA配列を含む発現ベクター；またはMUC1/CDの41位のスレオニン残基がアラニンに変異されたMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「HCT116/MUC1（T41A））。トランスフェクトした細胞から調製した溶解産物を抗MUCで免疫沈降し、免疫沈降物を抗MUC1（「IB：抗MUC 1」）（上段パネル）または抗β-カテニン（「IB：抗β-カテニン」）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるMUC-1およびβ-カテニンの位置を示す。
【図１５Ｃ】一対の免疫ブロット写真である。HCT116細胞には以下を安定にトランスフェクトした：対照発現ベクター（「HCT116/V」）；MUC1（「HCT116/MUC1」）をコードするcDNA配列を含む発現ベクター；またはMUC1/CDの41位のスレオニン残基がアラニンに変異したMUC1をコードするcDNA配列を含む発現ベクター（「HCT116/MUC1（T41A））。免疫ブロットの左の3本のレーンは、これらのトランスフェクトした細胞から免疫沈降された物質（以下に記載したとおり）を含む。免疫ブロットの右の3本のレーンは、左の3本のレーンに記載したとおりにトランスフェクトしたが、さらにGFP-PKCδ（「+GFP-PKCδ」）をコードするcDNA配列を含む発現ベクターをトランスフェクトした細胞から、免疫沈降された物質（以下に記載したとおり）を含む。トランスフェクトした細胞から調製した溶解産物を抗Eカドヘリン（「IP：抗Eカドヘリン」）で免疫沈降し、免疫沈降物を抗β-カテニン（「IB：抗β-カテニン」）（上段パネル）または抗Eカドヘリン（「IB：抗Eカドヘリン」）（下段パネル）による免疫ブロット解析に供した。免疫ブロットにおけるβ-カテニンおよびEカドヘリンの位置を示す。
【図１６Ａ】一連の顕微鏡写真である。HCT116/V、HCT116/MUC1、およびHCT116/MUC1（T41A）細胞（図15Cを参照）を軟寒天中で3週間インキュベートした。解析は、2つの独立して選択した各トランスフェクタント細胞株のクローン（「1」および「2」）について行った。
【図１６Ｂ】図16Bに示した各トランスフェクタントクローンの、3つの培養皿で得られたコロニー数を示す棒グラフである。V-1、HCT116/Vのクローン1；V-2、HCT116/Vのクローン2；MUC1-1、HCT116/MUC1のクローン1；MUC1-2、HCT116/MUC1のクローン2；T41A-1、HCT116/MUC1（T41A）のクローン1;T41A-2、HCT116/MUC1（T41A）のクローン2。
【図１６Ｃ】MUC1/CD（配列番号：1）のアミノ酸配列の記載である。PKCδリン酸化部位（T41）、GSK3βリン酸化部位（S44）、EGF-Rとc-Src SH2の結合モチーフの開始点（Y46）、およびβ-カテニン結合部位を示す。