(57)【要約】ＰｒＰ遺伝子のターゲティングによる変化により、ウシ海綿状脳症に耐性のウシを生成する方法を開示する。培養細胞のＰｒＰ遺伝子を、その翻訳を妨げ又は優性の病気耐性型のタンパク質をコードするように変化させて、その変化させた細胞の核を用いて、創出動物をクローン化する。一具体例において、変化を含む一本鎖ＤＮＡ断片を、一本鎖の短い断片の相同性置換において利用してＰｒＰ遺伝子を変化させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシをウシ海綿状脳症に耐性にする方法であって、下記を含む当該方法：
ａ）１００〜１０００ｂｐの長さを有し且つ本質的にＰｒＰタンパク質の翻訳を妨げるように改変されたウシＰｒＰ遺伝子の配列を有するＤＮＡ断片を含む改変用組成物を用意し；
ｂ）この改変用組成物を、雌ウシ又は雄ウシに由来する体細胞に導入し、その細胞を培養して、改変ＰｒＰ遺伝子を有する細胞を生成し；
ｃ）該改変された細胞を未改変ＰｒＰ遺伝子を有する細胞から分離し；そして
ｄ）該分離した細胞からコンピテントなウシの生殖系列細胞に核をトランスファーしてこの生殖系列細胞に由来する創出雌ウシ又は雄ウシを生成する。
【請求項２】
ＤＮＡ断片が、一本鎖であって且つ改変用組成物が、実質的に、その断片に相補的なＤＮＡを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一本鎖断片の長さが、２００〜８００ｎｔである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法を含み、更に、創出雌ウシと創出雄ウシとを交雑させるステップを含む、ウシをウシ海綿状脳症に耐性にする方法。
【請求項５】
一本鎖断片の長さが、２００〜８００ｎｔである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
改変細胞を、結合した検出を利用して分離する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
１００〜１０００ｎｔの長さを有し且つ本質的にＰｒＰタンパク質の翻訳を妨げるように改変されたウシＰｒＰ遺伝子の配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片を含む組成物であって、実質的に、その断片に相補的なＤＮＡを含まない当該組成物。
【請求項８】
一本鎖断片の長さが、４００〜８００ｎｔである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ウシをウシ海綿状脳症に耐性にする方法であって、下記を含む当該方法：
ａ）１００〜１０００ｂｐの長さを有し且つ本質的に優性の病気耐性のＰｒＰタンパク質をコードするように改変されたウシＰｒＰ遺伝子の配列を有するＤＮＡ断片を含む改変用組成物を用意し；
ｂ）この改変用組成物を、雌ウシ又は雄ウシに由来する体細胞に導入し、その細胞を培養して、改変ＰｒＰ遺伝子を有する細胞を生成し；
ｃ）該改変された細胞を未改変ＰｒＰ遺伝子を有する細胞から分離し；そして
ｄ）該分離した細胞からコンピテントなウシの生殖系列細胞に核をトランスファーしてこの生殖系列細胞に由来する創出雌ウシ又は雄ウシを生成する。
【請求項１０】
優性の病気耐性のＰｒＰタンパク質が、アミノ酸１７８において、グルタミンからアルギニンへの置換を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡ断片が一本鎖であって且つ改変用組成物が実質的に、この断片に相補的なＤＮＡを含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
一本鎖断片の長さが、２００〜８００ｎｔである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法を含み、更に、創出雌ウシと創出雄ウシとを交雑させるステップを含む、ウシをウシ海綿状脳症に耐性にする方法。
【請求項１４】
一本鎖断片の長さが、２００〜８００ｎｔである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
改変細胞を、結合した検出を利用して分離する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
１００〜１０００ｎｔの長さを有し且つ本質的に優性の病気耐性のＰｒＰタンパク質をコードするように改変されたウシＰｒＰ遺伝子の配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片を含む組成物であって、実質的に、その断片に相補的なＤＮＡを含まない当該組成物。
【請求項１７】
一本鎖断片の長さが、４００〜８００ｎｔである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
雌ウシ及び雄ウシの子孫のウシ海綿状脳症耐性について試験する方法であって、下記を含む当該方法：
ａ）雌ウシ及び雄ウシの子孫から核酸試料を得(少なくとも一親が、ウシ海綿状脳症に対する耐性を与える改変ＰｒＰ遺伝子を運ぶ)；そして
ｂ）改変ＰｒＰ遺伝子が試料中に存在するかどうかを測定する。
【請求項１９】
野生型ＰｒＰ遺伝子が、試料中に存在するかどうかを測定することを更に含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
細胞のゲノムの改変は、原理的に、完全な遺伝子をそのゲノムに、ランダムな位置に導入するか又は既存の天然の遺伝子に特定の変化を起こすことにより達成することができる。哺乳動物細胞においては、１０年より長期にわたって、相同組換えを達成する内因性酵素を利用して、特定の遺伝子に破壊が導入されてきた。この技術は、相同組換え依存性の遺伝子破壊(ｈｒｄＧＴ)と呼ばれる。Doetschman, T.等、1987, Nature 330, 576-78；Thomas K.R.及びCapecchi, M.R., 1987, Cell 51, 503-12。これらの努力は、二本鎖ＤＮＡの大きい切片(数キロ塩基(ｋｂ))を、相同組換えとランダムな挿入とを識別する遺伝的選択システムの存在下で細胞に導入することを含む。
【０００２】
別法の利用が、哺乳動物細胞において記載されている。この技術は、一本鎖の短い断片の相同組換え(ｓｓＳＦＨＲ)と呼ばれる。中位のサイズの(典型的には、４００〜８００ｂｐ)ＤＮＡ断片を、プラスミドベクターからの切り出しにより生成し、或は、ＰＣＲによってテンプレートから合成する。この短い断片を、熱により変性させて、それら相補鎖を、適宜、互いから精製することができる。この技術は、D.C.Gruenertの米国特許第６，０１０，９０８号、及び科学文献に記載されている。Kapsa, R. 等、2001, Human Gene Therapy 12, 629-42 (repair of murine dystrophin, unseparated strands)；Colosima, A.等、2001, Mol.Therapy Vol.3,No.3(episomal DNA in mammalian cells, unseparated strands)；Goncz, K.K.等、1998, Hum.Mol.Genetics 7, 1913-19(human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), unseparated strands)；Kunzelman, K.等、1996, Gene Therapy 3, 859-867 (murine CFTR, unseparated strands)。
【０００３】
このｓｓＳＦＨＲ技術は、ｈｒｄＧＴとは、幾つかの点で異なっている。この核酸は、ｈｒｄＧＴの数ｋｂと比較して一層短く(４００〜８００ｎｔ)；ｓｓＳＦＨＲにおいては、外因性ポリヌクレオチドを変性させ、即ち、一本鎖化するが、少数の突然変異誘発遺伝子ヌクレオチドを除いて標的遺伝子と相同であり；ｈｒｄＧＴにおいては、外来遺伝子を外因性核酸中に埋め；そしてｈｒｄＧＴにおいては、相同組換えと変則的組換えを区別する選択システムを利用し、ｓｓＳＦＨＲでは、変則的組換えが相同組換えに匹敵する割合では起きないのでかかる選択は必要とされない。
【０００４】
本発明は、ウシがウシ海綿状脳症(ＢＳＥ)に耐性になるようにウシのゲノムを改変するための、ｓｓＳＦＨＲの利用に関係する。ＢＳＥは、一種のいわゆる伝染性海綿状脳症(ＴＳＥ)であり、ヒツジスクラピー及びヒトクロイツフェルト−ヤーコプ病(ＣＪＤ)並びに他の疾患が含まれる。英国で発生した１７０，０００症例にわたるＢＳＥの最近の流行は、少なくとも１３０症例のヒトへの伝染を生じた。この流行は、ウシ用の加工動物食餌の製造にスクラピーに感染したヒツジを使用したことにより引き起こされたと考えられている(１９８８年に中止された結果、症例数の減少を生じた加工)。Pattison, J., 1998, Emerg Infect.Dis.4,390-4；Nathanson, N.等、Am.J Epidemiol.45,959-69。
【０００５】
ＴＳＥは、ユニークな感染症であり、核酸ベースの病気の有機体によっては伝染しない。むしろ、ＴＳＥは、異常なコンホメーションの脳タンパク質であるプリオンタンパク質(ＰｒＰ)から生じる。Prusiner, S.B.,1991,Science 252,1515-22。病原性のコンホメーションは、主としてβプリーツシートコンホメーションを採用しているＰｒＰの１４２アミノ酸断片よりなり、この形態は、病原性コンホメーションを採用するように他のＰｒＰの変換を触媒する。Peretz, D.,2001, Protein Science 10,854-63；Wadsworth, J.D.等、1999, Curr Opin Genet Dev 9, 338-45。ＴＳＥがＰｒＰの感染性コンホメーション変化から生じるという仮説は、英語圏以外では一般に受け入れられていない(例えば、Lasmezas, C.I.等、1997,Science 275,402-5参照)にもかかわらず、それは、酵母の遺伝するタンパク質コンホメーションの例により広く受け入れられ且つ確認されている。Lindquist,S.,1996,Mol.Psychiatry 1,376-9；Lindquist,S.,1997,Cell 89,495-8。
【０００６】
不明確なものが何かしら、ＴＳＥの病因論について残りうるが、宿主のＰｒＰ遺伝子の切除は、この病気に耐性の動物を生成する。Prusiner, S.B.等、1993,PNAS 90,10608-12；Weissmann, C.,及びAguzzi, A., 1999, Science 286,914-15。加えて、アミノ酸置換を有するＰｒＰの優性の病気耐性のアレルは、ヘテロ接合体として、この病気に対する耐性を与えることができる。Perrier,V.等、2002,PNAS 99,13079-84。ある種の生化学的及び形態学的異常は、ＰｒＰ除去された状態と関係しているが、これらの動物は、正常に発生して、健康に見える。Miele,G.等、2002,BBRC 291,372-77；White,A.R.等、1999,Am J.Path.155,1723-30。
【０００７】
発明の概要
この発明は、ウシのＰｒＰ遺伝子の除去により、ウシをＢＳＥ耐性にする方法を提供する。ウシのＰｒＰ遺伝子の断片を、細菌中にクローン化して、位置指定突然変異導入法の公知技術によって変異させる。この変異させたクローン化遺伝子をテンプレートとして利用して、２００〜１０００ｂｐの、好ましくは４００〜８００ｂｐの短い断片(以後「ＳＦ」と称す)を、慣用のオリゴヌクレオチドでプライムするポリメラーゼ連鎖反応による増幅を利用して生成させる。ＳＦ中には、コードされる１つより多くの遺伝的変化があってよいが、これらの変化は、大きさと程度が、ＳＦの４つ以下の連続するヌクレオチドが標的遺伝子と相同にならないように制限されるべきである。生理的効果を伴わない第二の変化を導入して、その後のＳＦを相同組換えした変異体細胞の分離を容易にすることができる。このＳＦの配列と標的遺伝子の配列との間の差異(「ヘテロロジー」)は、ミスマッチ、挿入又は欠失であってよい。除去は、フレームシフト変異又は多数の停止コドンの挿入によって引き起こされる。
【０００８】
このＳＦは、一本鎖ＳＦ(「ｓｓＳＦ」)に変換されてから、鎖分離形態(「ｓ4ＳＦ」)に変換される。このＳＦの配列を試験して、好ましくは、大規模な自己相補的二次構造を生じる自己相補的配列を決定する。
【０００９】
一度形成されれば、このｓ4ＳＦを、ＰｒＰ遺伝子の除去を誘導するように、体細胞典型的には繊維芽細胞に導入することができる。変異したクローンの選択は、クローニング及びＰＣＲスクリーニングによって行なわれる。ＰＣＲスクリーニングを促進するために、除去変異が、容易に認めうる制限部位を造り、それで変異体クローンがスクリーニングなしで同定されうることは、好ましいことである。この変異したＰｒＰ遺伝子を組み込んだウシは、卵母細胞への核トランスファーによって、公知技術を利用して回収することができる。
【００１０】
発明の詳細な説明
ｓ4ＳＦの調製及び変異型ＰｒＰ遺伝子の生成。一具体例において、この発明は、ウシＰｒＰ遺伝子の断片と相同な(同一の)２００〜１０００ｎｔの一層好ましくは４００〜８００ｎｔの一本鎖ＤＮＡの短い断片(ＳＦ)の利用よりなるが、但し、除去変異をＰｒＰ遺伝子に導入するためにデザインされた位置は、数が限られており、典型的には１０未満であって、適宜、改変ＰｒＰ遺伝子座のアレル特異的ＰＣＲと二次的検出の結合による同定を容易にするように更なる変化を生じる。このウシＰｒＰ遺伝子の配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ受入れ番号ＡＪ２９８８７８で見出され、ＰｒＰｃＤＮＡの配列は、受入れ番号ＡＢ００１４６８として見出されうる(これらを参考として本明細書中に援用する)。
【００１１】
所望の変異した配列の構築は、イン・ビトロ位置指定突然変異導入法によって最も容易に達成することができる。これらの含まれる技術は、当分野で公知である。Perrin, S.及びGilliland, G.,1990, Nucleic Acids Research 18,7433；Landt,O.,1990, Gene 96,125-8；Nassal M.及びRieger,A, 1989, Nucleic Acids Research 18,3077-8；Hemsley,A.等、1989, Nucleic Acids Research 17,6545-51。これらの技術の実施は、標的遺伝子又は遺伝子の断片(改変されるべき配列を包含する)が組換え体クローンにおいて利用可能であることを必要とする。適当な所望の配列を構築したならば、ＳＦ自体を日常的なポリメラーゼ連鎖反応(「ＰＣＲ」)によって合成することができる。ｓ4ＳＦを利用すべきである場合には、この合成には、１つの５’−ビオチン化プライマーと１つの非誘導体化プライマーを利用する。これらの鎖を、下記のように分離する。５’−ビチオン化プライマーの合成は、周知である。CooK,A.F.,等、1988,Nucleic Acids Research 16,4077-95;Connolly,B.A.,1988,Nucleic Acids Research 15,3131-9。
【００１２】
ＳＦが二本鎖形態即ちこの断片がその相補鎖にワトソン−クリック結合された形態で合成された後に、一本鎖ＳＦを製造することができる。この製法は、熱変性(９５℃まで加熱)後４℃まで急冷することによって最も簡単に達成することができる。この方法は、分子間ワトソン−クリック塩基対合を有しないか又は本質的に有しない両極性の鎖の混合物を生じる。しかしながら、この混合物の高温での連続的インキュベーションは、分子内のワトソン−クリック対合の形成を生じうる。
【００１３】
相補的鎖の分離は、ＳＦのＰＣＲ合成で利用する２つのプライマーの一方をビオチン化した場合に、容易に達成されうる。この生成物の分離は、下記のように、ビオチン化した鎖を固定化したアビジンに結合させることにより達成することができる：
--二本鎖ＳＦ(ｄｓ−ＳＦ)産物を、２つのプライマーを利用するＰＣＲにより生成することができ、その一方は、ビオチンを５’末端に含んだ。
--一本鎖を、ビオチン化したＰＣＲ生成物をアビジン−磁気ビーズ(Dyonex)に結合させることにより生成した。
--流浪(displaced)鎖(ビオチンを含まないＤ−ｓｓＳＦ)を、結合したｄｓＰＣＲ断片を高ｐＨ(０．５Ｍ  ＮａＯＨ)で、１〜２分間変性させることにより分離した。
--この「流浪鎖」(上清)を、磁気又は遠心分離を利用して、ビーズから除去し、酸(５００：１０．５Ｍ ＮａＯＨ当たり２７μｌ ｃＨＣＬ)で中和して、透析した(１０００倍容 ０．１Ｍ トリス ｐＨ７．０、その後、１０００倍容の水で２回)。この流浪鎖を、次いで、エタノール沈殿又はスピンコンセントレーターにより濃縮した。
--このビーズに結合された固定化鎖(Ｂ−ＳＦ)を、２回のトリス ０．１Ｍ ｐＨ７．０での洗浄とその後の２回の水洗浄により中和した。この固定化された鎖を水中で磁気ビーズから除去してから、熱処理(９５℃)した。
流浪及び固定化された両鎖は、個々に、活性を有する。
典型的には、流浪鎖は、一層活性であった。このコード鎖又は非コード鎖を利用して、修飾を標的遺伝子に導入することができる。
【００１４】
このｓ4ＳＦを、ウシの細胞例えば繊維芽細胞に、二本鎖ＤＮＡを細胞に導入するために利用することのできる任意の方法によって導入することができる。好適方法は、マイクロインジェクションによるものであり、これは、予め選択した接着細胞への制御された様式での個別の接種を可能にする。
【００１５】
改変された標的遺伝子を含む細胞を、クローニング及びクローン化した細胞を、全動物の再生の前にＰＣＲ試験することによって分離することができる。幾つかの方法を採用して、ＳＦがＰｒＰ遺伝子座を変化させた細胞のクローンを同定することができる。
【００１６】
変化した細胞の頻度が低い場合に適した特定の方法は、「結合した検出」(ＣＤ)と呼ばれ、出願人共通の、R.Metzの米国特許出願第１０／２９８，８５９号(２００２年１１月１８日出願)(参考として、そっくりそのまま、本明細書中に援用する)に記載された。ＣＤにおいては、２つの変化(典型的には、５０〜１００ヌクレオチド離れている)が、単一ＳＦを利用して導入される。推定上改変された細胞を含む集団が得られた後に；その集団を複製サブグループに分割する。ＰＣＲ反応を、標的配列を増幅させるがＳＦを増幅させないＰＣＲプライマーを利用して、各サブグループの複製物に由来するゲノムＤＮＡについて行なう。この反応の生成物を希釈して、第２のＰＣＲ反応のためのテンプレートとして利用する。この第２のＰＣＲ反応を、野生型配列よりも変化物の一つの配列に優先的にアニールするＰＣＲプライマー及び非選択的第２プライマーを利用して行なう。このＰＣＲ反応は、生成物が第２の変化の部位を含むようにデザインされる。適当なアニーリング温度の選択は、変化した断片の野生型と比較して優先的な増幅を生じる。この優先的な増幅は、ＰＣＲ生成物中の第２の変化の検出による、数千のサブグループ中の変化した遺伝子型の単一コピーの容易な検出を可能にする。制限酵素認識を造り又は削除し、それで変異型遺伝子座の存在が制限酵素消化によって検出できる第２の変化は、検出の容易さの故に、特に好ましい。
【００１７】
ＣＤを利用すると、大きい細胞集団を容易にスクリーニングして、希少な細胞を検出することができる。このスクリーニングは、これらの集団をサブグループ又は約５，０００に細分することにより行なう。希少な改変細胞の単一コピーを含むサブグループに由来するこれらの複製物を更に細分して培養する。細分、複製生成及び検出の連続サイクルを利用して、希少な改変細胞を集団から分離することができる。
【００１８】
一層少なく好適な方法においては、野生型と比較して変異型配列に優先的にアニールするＰＣＲプライマーを利用して、細胞集団に由来するゲノム断片を、変異型配列(存在するならば)だけが生成物を生じるような温度条件下でＰＣＲ増幅する。
【００１９】
別の具体例においては、ウシのＰｒＰ遺伝子における変化を生じさせて、可溶性形態のＰｒＰタンパク質の相対的安定性を増大させることができる。この安定性を増大させる変異は、ヒツジの種々の系統のスクラピーに対する罹病率をヒツジのＰｒＰ遺伝子の多型と比較することによって同定された。１３６、１５４及び１７１位の変異は、保護的であることが見出された。Drogenmuller, C.等、2001, Vet.Res.149,349-52。同じ変異をウシのＰｒＰ遺伝子に、この発明の別の具体例において導入することができる。
【００２０】
更に別の具体例において、ウシのＰｒＰ遺伝子の、優性の病気耐性の表現型を与える突然変異による変化を、ウシのＰｒＰ遺伝子に導入して、動物が、この病気に耐性であるために変化したＰｒｐ遺伝子についてホモ接合である必要がないようにすることができる。
【００２１】
ＢＳＥ耐性ウシの生成。位置特異的変異を含む家畜の生成は、最近の体細胞からコンピテントな生殖系列細胞即ち卵母細胞又は胚盤胞(卵割球)への核移植の進歩により可能となった。これらの技術は、実務家が遺伝的に同じ個体を移植された体細胞から作ることを可能にするので、一般に、「クローニング」又は「動物クローニング」と呼ばれる。これらの技術は、米国特許第６，１４７，２７６号及び６，２５２，１３３号に詳細に記載されている。
【００２２】
この技術を記載している科学刊行物は、幾つかの種特異的な適応によって、これらの技術が、ヒツジ、ウシ及びブタにおいて成功したことを教示している。Schnieke,A.E.等、1997,Science 278,2130-33；Wilmut,I.等、1997,Nature 385,810-3；Polejaeva,I.A.等、2000,Nature 407,29-30。この分野の現在の総説は、Kuhholtzer,B.及びPrather,R.S.,2000,Proc.Soc.Exp.Med.224,240-45に見出すことができる。
【００２３】
元々変異していた体細胞の核は、ＰｒＰ変異についてヘテロ接合であろうということが予想される。従って、ＢＳＥ耐性系統の生成は、ＰｒＰ遺伝子の変化をデザインしてその翻訳を防止する場合に、ホモ接合形態の変異を分離するために、創出系統の交配を必要とするであろう。ＰｒＰ病耐性アレルを有する両親の子孫における改変されたＰｒＰの存在を、当分野で一般に公知の技術例えばＲＦＬＰマッピング、ＳＮＰ検出、サザーンブロット、ＰＣＲ増幅及び直接配列決定が含まれうるＤＮＡベースのアッセイによって測定することができる。ＰｒＰ遺伝子の変化についてホモ接合の動物を生成する別法として、核トランスファークローニングの第１ラウンドにおいて誘導された胚から調製された細胞株をＳＦＨＲにより再ターゲティングして第２のＰｒＰアレルを変えることができる。この第２のアレルの変化は、第１のアレルの変化と同じであってよいし或は、改変された両ＰｒＰアレルを有する細胞の同定において助成するように異なってもよい。ヘテロ接合の変化したＰｒＰアレルについてホモ接合であるこれらの変異型細胞株は、所望のＰｒＰ遺伝子変異についてホモ接合の動物を再クローン化するのに利用することができる。
【００２４】
ＳＦＨＲのためのＤＮＡ断片を、２段階の過程において、ウシＰｒＰのエキソン３が挿入された市販のベクターを利用するＰＣＲによって合成する。２種類のプライマーを利用する。変異用プライマーを利用して、ベクター中のＰｒＰ配列を変化させる。
【００２５】
この変異を導入した後に、生成用プライマーを利用して、ＳＦＨＲ二本鎖ＤＮＡを、変異したベクターをテンプレートとして利用するＰＣＲにより作成する。
【００２６】
生成用フォワード及びリバースプライマー(ＦＰ及びＲＰ)並びにアミノ酸配列中の突然変異の位置によって標識された変異用プライマーを、以下に列記する。
【００２７】
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【実施例】
【００２８】
実施例：伝染性海綿状脳症(ＴＳＥ)又はウシ海綿状脳症(ＢＳＥ)に耐性の動物の生成へのアプローチは、２つの並行する道において進行する。非機能的ＰｒＰアレルが、ウシの一次細胞株において、ＳＦＨＲ(GenEdit)分子を利用して生成される(ＰｒＰ０−１及び／又はＰｒＰ０−２、オープンリーディングフレームを破壊する他の分子例えばＰｒＰ−０−３、−４、−５、−６なども又、企図されうる)。加えて、突然変異誘発用ＰＣＲプライマーを利用して、点突然変異を、上記の変異の何れかの１００ヌクレオチド以内の制限酵素認識配列内に挿入する。変異型配列が相同組換えにより組み込まれた変異型細胞が生成され、これらの細胞のクローンが、変異型配列の存在についてスクリーニングされる。複製サブ培養を生成して、ＰＣＲ増幅用にＤＮＡを調製する。我々の感度を及び選択性を増すために、２ラウンドのＰＣＲ増幅を行なう。最初の反応は、ＰｒＰ標的領域に隣接するプライマーセットを利用する。第一ラウンドの反応の生成物を、１０，０００倍に希釈して、アレル富化ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして利用する(一方のプライマーを、変異型配列に優先的に結合して、ＰｒＰ変異を含む配列が選択的に富化されるようにデザインする)。次いで、アレル富化ＰＣＲ生成物を、認識部位が変異した制限酵素で消化する。未切断ＰＣＲ生成物は、変異型配列を含むものであり、他方、２つの断片の存在は、野生型ＰｒＰの存在を表す。ＰｒＰの変異型を含むサブ培養を、更に、細分して、変異型ＰｒＰをスクリーニングする過程を、改変された変異型細胞を含む純粋なサブ培養が分離されるまで反復する。
【００２９】
この改変細胞株から、核トランスファー技術を利用して、動物を生成する。機能的ＰｒＰアレルの減少は、遺伝子産物の減少に基づく保護性を有しうる。ホモ接合ＰｒＰ−０動物(ＰｒＰ−０／ＰｒＰ−０)は、ＰｒＰ−０ヘテロ接合体の戻し交配により生成することができる。同様にして、ＢＳＥ耐性アレルは、ＴＳＥ(ＢＳＥ)に対する多型バリヤーを導入するためのＳＦＨＲ分子(耐性表現型に影響するｂＰｒＰ ＡＡＲ及び／又は他の分子)を利用して、種畜に導入される。ＴＳＥ(スクラピー)に対する多型バリヤーの現在の証拠は、アラニン(Ａ)、アルギニン(Ｒ)及びアルギニン(Ｒ)を、それぞれコドン１３６、１５４及び１７１に含むヒツジのスクラピー耐性群について記載されている。ウシの配列は、耐性関連アミノ酸を、１３６及び１５４に相同な位置に含み、そして該アミノ酸を１７１にだけ含む(改変されている必要がある)。ホモ接合体ＰｒＰＡＲＲ／ＰｒＰＡＡＲ又はＰｒＰＡＲＲ／ＰｒＰ−０動物は、標準的戻し交配及び適当なホモ接合／ヘテロ接合動物との交雑育種ストラテジーを利用して生成することができる。
【００３０】
幾つかのヌルアレルを含んで生成することのできる幾つかの変異。下記は、３つのナンセンス及び２つのフレームシフトヌル変異の例である。ウシＰｒＰ−ＡＲＲを生成する塩基置換も又、与える。ＳＦＨＲ分子は、一本鎖のコード鎖若しくは非コード鎖であり、又は変性された二本鎖である。すべてのヌル生成ＳＦＨＲ分子は、イントロン２に至り、エキソン３(ＰＲＰのコード領域)で終結する。このＰｒＰ−ＡＲＲアレルは、エキソン３に配列が含まれるＳＦＨＲ分子を必要とする。
【００３１】
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【国際調査報告】
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