(57)【要約】本願は、Ｙ特異的な成長遺伝子GCYを包含するＹ染色体由来の単離された領域及び遺伝子に関する。プローブ及びプライマーも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｙ特異的な成長遺伝子GCYを包含する、SKY1とsY83との間のＹ染色体の単離した領域。
【請求項２】
大きさが約700Kbである請求項１に記載の単離した領域。
【請求項３】
前記Ｙ染色体はヒト染色体である請求項１又は２に記載の単離した領域。
【請求項４】
SKY8とsY83との間にある請求項１又は３に記載の単離した領域。
【請求項５】
sY79とsY81との間にある請求項１又は３に記載の単離した領域。
【請求項６】
SKY1とsY83との間内のY染色体の領域によってコードされる、単離したGCYタンパク質。
【請求項７】
SKY8とsY83との間内の領域によってコードされる請求項６に記載の単離したGCYタンパク質。
【請求項８】
sY79とsY81との間の領域によってコードされる請求項７に記載の単離したGCYタンパク質。
【請求項９】
ADLY又はその機能的な断片である請求項８に記載の単離したGCYタンパク質。
【請求項１０】
表２、５、６、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ又は８に示す核酸配列から選択された核酸配列を有する核酸プライマー。
【請求項１１】
GCYの局在を調査するか、又は身長と関係するGCY遺伝子を同定する方法であって、請求項１０記載のプライマーを使用して、核酸分子の領域を選択的に増幅するか、又は検出することを含む、前記GCYの局在を調査するか、又は身長と関係するGCY遺伝子を同定する方法。
【請求項１２】
請求項６〜９項のいずれか１項に記載のGCYタンパク質との相同性が65％より大きく、かつヒトにおいて性に関連した身長差をもたらす、単離したタンパク質。
【請求項１３】
身長と関係するGCY遺伝子が存在するか、又は欠如しているかを特定するために、SKY8マーカーとsY83マーカーとの間のＹ染色体の単離した領域の一部、又はそれと相補的な配列を少なくとも含む核酸分子を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヒトにおける性に関連した身長差は、２種の成分によって主に引き起こされると考えられており、１つは、生物活性性腺ステロイドの性の二形性によって決められるホルモン成分であり、もう１つは、Ｙ特異的成長遺伝子に帰属する遺伝子成分であり、GCYと称されている（Tannerら，1996；Smithら，1985；OgataとMatsuo，1992）。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＹ染色体上におけるこの遺伝子に対する広範囲にわたるマッピングが試みられているにもかかわらず（Ogataら 1995，Saloら 1995，Rousseaux-Prevostら， 1996，De Rosaら 1997）、その正確な位置は未知のままである。Ｙ染色体の末端欠失のキャラクタリゼーションにおける不適切な細胞発生の方法によって、GCYの重要な領域を解明することにおけるいくつかの問題が生じることが最近の証拠によって示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これらの問題を解決するために、本発明者らは、Ｙ染色体上におけるGCYの分析のために新規の中間部欠失を示す患者のみ考慮した（Kirschら 2000）。このアプローチによって、末端欠失を有する患者においてX0モザイク現象及び／又はi(Yp)及びidic(Yq11)染色体の存在を除くことなく、GCYを特定の染色体の区間に割り当てることが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
正常な身長を有する７人の成人男子と、境界線上の身長を有する１人の男子と、大きな中間部欠失を有し、低身長症である１人の患者における重複する中間部欠失を直接比較した結果、DYZ3マーカーとDYS11マーカーとの間にGCYの重要な区間が確認された。この領域は、1.6-1.7MbのゲノムDNAをおおよそ包含する。セントロメアに近い当該領域の解像度を改善するために、本発明者らは、細菌の人工染色体である（BAC）/P1由来人工染色体（P1-derived artificial chromosome，PAC）コンティグを用いて、染色体のこの部分に特異的な新しいSTSマーカーをさらに構築した。これらの新しいＹ染色体のSTSを用いた分子欠失分析によって、本発明者らは、前記重要な区間を700kbのゲノム領域に絞り込むことができた。
【０００５】
前記領域は、定められた領域のそれぞれの側における染色体領域を除外したものであるのが好ましい。
【０００６】
前記領域は、SKY1とsY83の間にあることが好ましい。該領域は、SKY1領域とsY83領域のうち１つ又はそれら両方を含んでもよい。前記領域は、SKY8とsY83の間（好ましくは、SKY8領域とsY83領域のうち１つ若しくはそれら両方を含む）、又はSKY1とSKY4の間にあることが好ましい。
【０００７】
本発明は、GCYを包含する、DYZ3とDYS11の間のＹ染色体の単離した領域を提供する。Ｙ染色体は、ヒトＹ染色体であることが好ましい。
【０００８】
好ましい領域は、sY79とsY81の間にあり、染色体のその領域の外側のＹ染色体領域を除外したものであるものが好ましい。
【０００９】
GCYの研究に用いるプライマーも提供される。
【００１０】
本発明は、さらに、ヒトにおける性に関連した身長差をもたらす単離した遺伝子／偽遺伝子配列を提供する。これらは、１又はそれ以上の図面において特定される１種又はそれ以上の遺伝子配列若しくは偽遺伝子配列であってもよい。
【００１１】
本発明は、さらに、GCYタンパク質と同じ機能を有し、GCYに対して、65％以上の相同性、70％以上の相同性、75％以上の相同性、80％以上の相同性、85％以上の相同性、好ましくは90％以上の相同性、最も好ましくは95％以上の相同性を有するタンパク質を包含する。このタンパク質は、GCY遺伝子活性を有することが好ましく、例えば、該タンパク質は、オスの哺乳類動物において発現した際に、該哺乳類動物の身長に効果を生じる。
【００１２】
GCY領域を検出するか、又は増幅するのに使用するプライマーも提供される。該プライマーを、本技術分野において既知である放射活性又は非放射活性の標識を用いて、よく知られている方法を用いて標識してもよい。これらの方法として、PCR、サザンブロッティング又はノーザンブロッティングがある。
【００１３】
実験の証拠について、図面を参照して以下に詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
表１は、患者及び彼らの兄弟姉妹達の成人身長を比較したものである。
【００１５】
表２は、新規Ｙ染色体のSTSの表である。
【００１６】
表３は、AZFc領域内の配列ファミリー変異体のPCR／制限消化分析結果の表である。
【００１７】
表４は、物理地図の作成の際に同定したBACクローン及びPACクローンの概要である。
【００１８】
表５は、特発性の低身長症である成人男子における微小欠失のスクリーニングに用いるゲノムプライマーの概要である。
【００１９】
表６は、単離したエキソン・トラップ・クローンの配列の概要である。
【００２０】
表７Ａは、予想遺伝子に対するプライマー対の概要であり、表７Ｂは、アドリカン（Adlican）のＹの複製（ADLY）に特異的なプライマー対の概要であり、表７ｃは、ADLYに対するRT-PCRプライマー配列の概要である。
【００２１】
表８は、エキソン・トラップ・クローンに対するRT-PCRプライマー配列である。
【００２２】
表９ａ及び表９ｂは、ADLXとADLYとの間のエキソンの相同性を示す表である。
【００２３】
表１０は、GCY領域由来の遺伝子／偽遺伝子の配列の相違とそれらの相同性の概要である。
【００２４】
（図１  ヒトＹ染色体の長腕における欠失マッピング）
左にYpテロメアを、右にYqテロメアを有するヒトＹ染色体の略図を上に示す。正常な身長を有する又は低身長症である成人男子のＹ染色体の低解像度の分析の結果が下に示されている。一番上の縁に沿って、95のＹ染色体のSTSを記載した。SKY3とSKY8を除いて（詳しくは表２参照）他のSTSは全て以前に報告されている（Vollrathら，1992，Jonesら，1994，Reijoら，1995）。余白又は灰色の四角は、検定が行われていないマーカーの推測される欠如又は存在を示す。アスタリスクは、試験することができなかった各限界点（breakpoint）領域内のマーカーを示す。患者の以前に発表されたデータを再調査したすべての場合において、最初の分析に用いた同一のDNAサンプルを調べた。（患者＃293の中間部欠失の近位のみならず遠位の限界点（breakpoint）もサテライトII型配列内に存在することに留意されたい。）
【００２５】
（図２  遠位のYq11.23内のヒトDAZ座位における配列ファミリー変異体（sequence family variant，SFV）の分類）
Ａ．ヒトDAZクラスターの近傍におけるヒトＹ染色体の概要及び単位複製配列構造。各単位複製配列を、特異的なバンド（Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｘ）によって表す。互いに、単位複製配列ファミリーの各メンバーの方向を示す矢印が上に示されている。バンドＸで示された単位複製配列は、DAZクラスターの遠位端に転位され、一部複製された染色体１の一部から生じた。
Ｂ．ヒトＹ染色体の物理地図に従った、選ばれたＹ特異的STS及びSFVの正確な位置。マーカーsY157は、多重PCR分析（詳しくは、本文参照）によって唯一の複製に存在すると推測されることから、強調されている。
Ｃ．ヒトDAZクラスター領域内にＹ染色体の再配列を有する患者におけるSTS及びSFV分析の概要。灰色の四角は、マーカーの推測される欠如又は存在を示す。
Ｄ．患者＃1972のゲノムDNAにおけるSKY10及びSKY12の配列ファミリー変異体の分類。検定は、表３に記載する。右の方に、断片の大きさ（bp）を記載する。産物を、3％NuSieveアガロース（３：１）における電気泳動によって分離し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。
【００２６】
（図３  ヒトＹ染色体の長腕のセントロメア周囲の領域の機構の略図）
Ａ．主なタンデム反復のブロックの分布及び配列相同性の全体的な機構を示す図。基本的に、３つの別個の区間に領域を再分割することができ、該３つの区間は、5bpのサテライト配列を特徴とする近位の領域（G）、染色体１との相同性が高い中央の領域（O）、及びX/Y相同配列から構成される遠位の領域（B）である。この領域における新しく構築したSTSマーカー及び以前に公表されたSTSマーカーの正確な位置を下に図示する。下の縁に、新規STSマーカーを用いて構築したPAC/BACコンティグを示す。接頭語のRP1、5は、PACクローンを示し、RP11は、BACクローンをそれぞれ示す。
Ｂ．低身長症である患者、及び正常な身長を有する患者における高解像度のSTSマッピングによって明らかにしたGCYの重要な区間の局在。黒色の四角は、各STSが存在することを、白色の四角は、各STSが欠如していることを示す。縞模様の四角は、限界点（breakpoint）が存在する遺伝子量が未知の領域を表す。
【００２７】
（図４）GCYの重要な領域の分子キャラクタリゼーション。ａ．２人の最も致命的な患者における欠失の略図。クローンY0308が、その境界の１つとしてSKY1を特徴付ける異なる欠失（図３参照）を有することが分かったので、SKY1とsY83はその境界を定める。GCY領域の遠位に隣接したAZFa領域が示されている。ｂ．別個の相同性を有する３つの区分への構造上の区分化。5bpの繰り返しから構成される区分を緑色で、染色体の部分区間である1q43と相同の区分を橙色で、Xp22と相同の区分を青色で示す。ｃ．GCY領域のゲノム配列の出所を示す注釈付きのBACクローンの詳述。ｄ．エキソンの増幅用の基質として用いたPACクローンの正確な位置決め。ｅ．全てのエキソン・トラップ・クローンの位置。大きさが小さく、エキソン・トラップ・クローン内に含まれる単一複製の内容物に制限されるため、eta1は更なる実験分析のために処理することができなかった。ｆ．遺伝子モデル（方向；エキソン／イントロン構造）−明らかな偽遺伝子（エキソン／イントロン構造；方向）−プロモーターという層における全てのコンピューター内で生成したデータ・セットの資料。色（赤色：セントロメアへの方向；青色：テロメアへの方向）によって遺伝子モデルの方向を推論することができる。CITB-144J01，CITB-298B15及びCITB-203N13に覆われた染色体の領域は、Sargentら 1999において既に集中的に調べられていることに留意されたい。
【００２８】
（図５）GCY領域の遺伝子／偽遺伝子とその機能的な前駆体との間の相同性の比較。Ｙ染色体の複製の正確な位置を示す。遺伝子対に特異的な相同性と、実際の構造遺伝子のサブ染色体の位置を青で示す。
【００２９】
（図６）KIAA1470の進化の歴史。左には、染色体の動向が図示されている。上側の横の棒は、1p36における機能的な前駆体のエキソン／イントロンの構造を示す。連続的な縮重によって、KIAA1470は、1q43及びYq11上の２種の偽遺伝子となるよう形成される。1q43とYq11上の両複製は、98％の核酸配列の相同性を互いに共有し、KIAA1470遺伝子ファミリーの12種のレトロポゾンのうち最も高いものであった。それらは、マスター遺伝子と77％及び79％の相同性を示した。
【００３０】
（図７）Ｘ特異的及びＹ特異的アドリカン（adlican）遺伝子／偽遺伝子の構造上の特色の比較。ADLXの翻訳領域のエキソンを四角として図示する。ADLYの対応する推定エキソン（四角として図示）を相同性検索によって同定した。ADLYの想定される転写単位における主要な再配列を、黒色の三角として強調した。mRNA及びORFの大きさをADLX及びADLYについて示した。RT-PCR検定で使用したプライマーをそれらの各々の位置に示す。分離線の上と下の同一の着色は、両転写物に対する選択性がないことを示す。線の下に単独で示されたRT-PCRプライマーは、ADLYに特異的である。
【００３１】
（材料及び方法）
（GCYの重要な領域の決定）
患者の選択
＃293、JOLAR、＃28、＃63及び＃95の患者についての臨床上の詳細は、他の文献に記載されている（Skareら 1990；Maら 1993；Forestaら 1998；Kleimanら 1999）。患者Y0308は、Pryorら 1997の研究におけるケース１に対応する。T.M.、＃1947及び＃1972の患者は、特発性の不妊症を患っている表現型的には正常な男子である。ゲノムDNAサンプルを末梢血白血球（＃28、＃63、＃95、Y0308、T.M.、＃1947、＃1972）から、又はリンパ芽球細胞系（＃293、JOLAR）から抽出した。正常な男子及び女子の末梢血白血球から単離したDNAは内部コントロールとなる。
【００３２】
身長の評価
個体が全て様々な種族的出身のものであるので、身長を、各国民の身長標準と比較した（表１）。患者は、同様の年齢幅のものである。可能である場合、患者と兄弟姉妹達との間で成人身長を比較することに特に注意した。データを、身長の標準偏差スコア（SDS）と共に表１にまとめた。SDSを計算するために、平均成人身長及び標準偏差を、対応する国民の身体発育調査から得た。
【００３３】
PCR分析
1.0mMの各オリゴヌクレオチドプライマー、鋳型である100ngのゲノムDNA、5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ（Eurogentec）及び1mMの各dNTPを含む全容積が50μlの（75mM Tris/HCl pH9.0、20mM (NH4)2SO4、0.1％（w/v）Tween 20、1.5mM MgCl2）溶液中で、サーモサイクラー（MJ Research，Inc.）にて以下のように反応を行った。すなわち、95℃で5分間、最初の変性工程の後、サンプルを、94℃で30秒、60℃で30秒、及び72℃で1分から成る30回のサイクルに続いて72℃で5分の最後の延長工程で処理した。多重PCRを、Henegariuら 1994に記載されたものに少し変更を加えて行った。Alu-Alu PCR反応を、原則としてNelsonら 1991に記載されているとおりに行った。1kbより小さい増幅産物を、1xTBE（0.089M Tris-ホウ酸／0.089M ホウ酸／20mM EDTA，pH8.0）溶液中で、3％NuSieveアガロース／1％SeaKem GTGアガロース（FMC）上で分離した。1kbより大きい増幅産物とAlu-Alu-PCRの産物については、1xTBE溶液中の1.5％SeaKem GTGアガロースゲルを分離に用いた。
【００３４】
PCRプライマー
Y特異的なSTS、遺伝子座及びPCR条件は、既に報告されている（Vollrathら 1992；Jonesら 1994；Reijoら 1995）。新規Ｙ染色体のSTSの配列を表２に記載する。SKYと称するＹ特異的なSTSを、YAC、BAC及びPACの末端配列から、又はAluプライマーの種々の組み合わせによって増幅したクローン内部配列から得た。マーカーであるSKY10、11、12及び13についてプライマーを設計して、“配列ファミリー変異体（sequence family variant，SFV）”を検出するために、ゲノムのDAZ遺伝子座内の独特の制限部位に及ぶ断片（RP11-487K20（AC024067）、RP11-70G12（AC006983）、RP11-141N04（AC008272）、RP11-366C06（AC015973）、RP11-560I18（AC053522）、RP11-175B09（AL359453）由来のSKY10、RP11-245K04（AC007965）、RP11-100J21（AC017005）、RP11-506M09（AC016752）、RP11-589P14（AC025246）由来のSKY11及びSKY12、並びにRP11-100J21（AC017005）、RP11-589P14（AC025246）、RP11-823D08（AC073649）、RP11-251M08（AC010682）、RP11-978G18（AC073893）由来のSKY13）を増幅した。
【００３５】
PCR産物の制限分析
PCR産物をアガロースゲル上で分離し、適当なゲルのバンドを切り取り、GFX（登録商標）PCR DNA and Gel Band Purification Kit（Amersham Pharmacia Biotech，Inc.）で製造業者のプロトコールに従ってDNAを単離した。SKY5とSKY6から増幅した断片をTaqIとBsmIでそれぞれ消化した。SKY10、SKY11、SKY12及びSKY13におけるSFVを検出するために、PCR産物を、表３に記載した制限酵素で消化した。
【００３６】
BAC/PAC/YAC末端断片の配列決定
末端配列決定のために選択されたBAC/PACクローン由来のDNAを、Nucleobond PC100 Kit（Macherey-Nagel）で製造業者の取扱説明書に従って精製した。Thermosequenase Fluorescent Labelled Primer Cycle Sequencing Kit（Pharmacia）を用いて末端断片を直接配列決定し、Pharmacia A.L.F. express（Amersham Pharmacia Biotech）で分析した。Alu/ベクター−ポリメラーゼ連鎖反応でYAC末端断片を生成し、TOPO-TA cloning Kit（Invitrogen）でpCR2.1にサブクローニングした。記述されているとおりに配列決定を行った。
【００３７】
蛍光in situハイブリダイゼーション
一次血液サンプル又は不死化細胞系のいずれかから分裂中期スプレッド（metaphase spreads）を得た。標準プロトコール（LichterとCremer 1992）に従ってプレパラートを作成した。ビオチン-16-dUTP（La Roche）を用いたニックトランスレーションによってコスミド及びプラスミドDNAを標識した。分裂中期スプレッド（metaphase spreads）を持つスライドを、70％エタノール中に4℃で１週間保存した。200〜300ngの標識プラスミド又はコスミドDNAと、20〜30μgのヒトCot-1 DNA（GIBCO BRL）と、ハイブリダイゼーション緩衝液（50％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン、及び2xSSC，pH7.0）を混合し、75℃で5分間変性させ、37℃で30分間予めアニールした。70％ホルムアミドと2xSSC，pH7.0の溶液中で、72℃で2分間スライドを変性させた（Riedら  1992）。37℃の加湿室で、予めアニールしたプローブを一晩ハイブリダイズした。スライドを洗浄し、アビジン結合フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）で染色した。ビオチン化抗アビジンを用い、続いてアビジン-FITCで染色することによってシグナルを増幅した。プローブである全てのヒトテロメア（Oncor）について、製造業者によって与えられた指示は以下のとおりである。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロライド（4',6-diamidino-2-phenylindol dihydrochloride，DAPI）で染色体を対比染色した。冷却した電荷結合素子カメラシステム（Photometrics，Tucson AZ，USA）を用いて画像を別々に撮った。Macintosh Quadra 900を、ソフトウェアパッケージのNu200 2.0（Photometrics）を用いたカメラコントロールと‘TIF’形式のデジタル画像収集に使用した。個々のグレー・スケールの蛍光画像を各蛍光色素について記録した。画像をコンピューター上でオーバーレイし、さらに、Adobe Photoshopソフトウェアを用いて加工した。
【００３８】
（身長遺伝子の検索）
微小欠失スクリーニング
エキソンの増幅
（PACクローンのpSPL3Bへのショットガン・サブクローニング）
Ｙ染色体特異的PACクローン由来のゲノムDNAをSau3AIで部分的に消化した。100ngの4〜10Kbの範囲内で単離した断片を、BamHIで消化し、脱リン酸した100ngのpSPL3Bとライゲーションした。ライゲーション反応物を、スーパーコンピテント（supercompetent）E.coli Xl-1 blue細胞（Stratagene）に形質転換し、各形質転換物の一定分量を選択培地（アンピシリン）に蒔いた。続いて、生じたコロニーを、プラスミドDNAの単離のためにプールした。
【００３９】
（細胞の培養及びエレクトロポレーション）
COS7細胞を、10％熱不活化ウシ血清を追加したDME培地で増殖させた。トランスフェクションのために、５継代から15継代の間のCOS7細胞を、約75％コンフルエントとなるまで培養し、トリプシン処理し、遠心によって回収し、氷冷したDulbecco's PBSで洗浄した。次に、4x109個の細胞を、冷却した0.7mlのDulvecco's PBSに再懸濁し、15μgのDNAを含む0.1mlのDulbecco's PBSと共に、予冷したエレクトロポレーション・キュベット（0.4cmの容器（chamber），BioRad）に入れた。10分間氷上に置いた後、細胞を、穏やかに再懸濁し、BioRad Gene Pulser 2でエレクトロポレーションし（1.2kV，25μf）、再び氷上に置いた。10分後、予熱し、CO2で予め平衡化した10mlの培養培地が入っている組織培養皿（100mm）に細胞を移した。
【００４０】
（RNAの単離、RT-PCR、及びクローニング）
細胞質RNAを、72時間のトランスフェクション後に単離し（QIAGEN RNeasy Kit）、最初の鎖の合成を、製造業者が推奨する方法を少し変更して以下のように行った。5μgのRNAを、10mMの各dNTPと2μMのオリゴヌクレオチドSA2を含む溶液に添加した。混合物を、5分間、65℃に加熱し、次に、少なくともさらに１分間氷上に置いた。10xPCR緩衝液（Perkin-Elmer Cetus）、25mM MgCl2、0.1M DTT及びRNAsin（35U/μl）を含む反応混合物を添加した後、逆転写反応を、42℃に2分間移行させた（transferred）。次に、1μlのSuperScript II RT（200U/μl；Gibco BRL）を添加し、反応を、42℃で90分間、50℃で30分間インキュベートした。次に、全cDNA合成反応を、以下の100μlの反応混合物においてPCRの増幅サイクルを制限することによって、２重鎖DNAに転換した。前記反応混合物は、1xPCR緩衝液（Perkin-Elmer Cetus）と、1.5mM MgCl2と、200μM dNTPsと、1μM SA2と、1μM SD6と、2.5U Taqポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus）の混合物である。６回の増幅サイクルを用い、該増幅サイクルは、94℃で1分間、60℃で1分間、72℃で5分間から成るものであった。ベクターのみの産物及び偽陽性の産物を除去するために、50UのBstXI（New England Biolabs）を反応物に直接添加し、続いて55℃で一晩インキュベートした。
【００４１】
次に、10μlの消化物を、以下の100μlの反応混合物中において内部プライマーを用いた第２のPCR増幅に用いた。前記反応混合物は、lxPCR 緩衝液（Perkin-Elmer Cetus）と、 1. 5mM MgCl2と、200μM dNTPsと、1μM (CAU)4-SD2と、1μM (CUA)4-SA4と、2.5U Taq ポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus）の混合物である。25回の増幅サイクルを用い、該増幅サイクルは、94℃で1分間、60℃で1分間、72℃で3分間から成るものであった。電気泳動によって産物を分離し、純粋なSD2/SA4 RT-PCR産物より大きい断片を切り取り、製造者のプロトコールに従って、pAMP1にサブクローニングした（CloneAmp pAMP1 System；Gibco BRL）。次に、ライゲーション反応物を、ウルトラコンピテントE.coli XL-2 blue（Stratagene）に形質転換し、X-Gal/IPTGを含む選択培地に蒔いた。
【００４２】
（候補のエキソンの同定）
白色コロニーを取り、選択培地が入っている384ウェルのマイクロタイタープレートに移し、37℃で一晩インキュベートした。384ピンの移動装置（transfer device）を用いて、正電荷を持つナイロン膜（Amersham）がその上にある24.5x24.5mmの培養プレートと該ナイロン膜がない該培養プレートに接種し、37℃で一晩インキュベートした。培養プレートで培養したコロニーを、プラスミド調整のためにプールし、ナイロン膜上のコロニーを、コロニー・リフト（lift）に用いた。プラスミド挿入物を切り取り、精製し、本来の基質として用いたPACクローンのEcoRI消化物を含むナイロン膜にハイブリダイズした。次に、強調するバンドを単離し、コロニー・リフト（lift）にハイブリダイズして、候補のエキソンを同定した。候補のエキソンを単離し、Sequitherm EXCEL II DNA Sequencing Kit（Epicentre technologies）によって配列決定した。配列を自動的に分析し、ALFExpress DNAシークエンサーで読み取った。表６に、単離したエキソントラップクローンの配列を記載する。
【００４３】
（エキソン・トラッピング）
Ｙ染色体特異的PAC（P1由来人工染色体）クローンである、RP1-148J07、RP5-1160A12、RP1-301P22、RP4-532I07及びRP1-114A11由来のDNAをSau3AIで部分的に消化し、4〜10Kbの範囲内の断片をpSPL3Bに個々にサブクローニングした。COS7細胞をトランスフェクションし、72時間後に、細胞質RNAを、QIAGEN RNeasy Kitを用いて回収した。cDNA合成を、製造業者（Gibco-BRL）によって推奨されている通りに行った。クローニングサイトに隣接するプライマーを用いて、純粋なSD2/SA4 RT-PCR産物より大きい産物を同定した。これらの断片を切り取り、pAMP1にサブクローニングし（CloneAmp pAMP1 System；Gibco BRL）、配列決定した。エキソン・トラップ・クローンを、ランダム・プライミングによって32P-dCTPで標識し、サザンブロットのハイブリダイゼーション・プローブとして用いた。ハイブリダイゼーションは、標準ハイブリダイゼーション緩衝液（SinghとJones 1984）内で、65℃で16時間行った。洗浄は、0.1xSSC，0.1％SDSで、65℃で20分間をそれぞれ３回行った。
【００４４】
（コンピューターでの遺伝子の予測）
BACクローンである、RP11-75F05、RP11-461H06、RP11-333EO9、RP11-558M10、CITB-298B15及びCITB-144J01 由来の完全なゲノム配列を、NIX（http://menu.hgmp.mrc.ac.uk）と Rummage（http://genl00.imb-jena.de）のソフトウェア・パッケージを用いて、既知の遺伝子及び仮想遺伝子内容物との相同性について分析した。FirstEF（http://www.cshl. org/mzhanglab）にBAC配列をかけること（submitting）によって、プロモーターと最初のエキソンの計算的な同定を達成した。
【００４５】
（逆転写したpolyA+-RNA及びcDNAライブラリー）
16種の胎児及び成人の組織のヒトpolyA+-RNAを、Clontech又はInvitrogenの一方から購入した。３個の骨肉種及び１種の骨髄繊維芽細胞株由来のヒトpolyA+-RNAをQIAGEN Oligotex kitで単離した。第１鎖cDNAの合成を、基本的に、前述した（Raoら 1997）通りに行った。14種のcDNAライブラリーを、Clontech又はStratageneの一方から得た。また、Resource Center of the German Human Project（RAPD）によって、40種のcDNAライブラリーの収集も行われた。完全なリストが要望に応じて利用できる。
【００４６】
（可能性のある転写単位のキャラクタリゼーション）
エキソン・トラップ・クローンの相同性の比較と翻訳領域（ORF）分析の後に、RT-PCR増幅のためにプライマーを設計した。配列を、表８にまとめる。エキソン・トラップ・クローンが１つのエキソンのみから成る場合、２種のエキソン特異的プライマーを、cDNAライブラリーに特異的なプライマーと、半ネステッドPCR（semi-nested PCR）において併用する。予測された遺伝子モデルからからプライマーを設計して、エキソン／イントロンの境界をはさんで増幅した。転写の証拠を示すために、プライマーを用いて、cDNAライブラリーとpolyA+-RNAのパネル（panel）（上記参照）をスクリーニングした。相同の転写物から共に増幅した可能性がある場合、プライマーは、Ｙ特異的制限部位に隣接する。
【００４７】
（進化論的階層の分類）
GCY領域の遺伝子／偽遺伝子及びその機能的若しくは非機能的な前駆体間の配列の相違をLi，1993の記載に従って決定した。すべての偽遺伝子に関する配列をゲノム配列から抽出し、該抽出した配列は、BACクローンRP11-75F05（AC011293）由来のKIAA1470PY、BACクローンRP11-498M14（AL445675）由来のKIAA1470P1、BACクローンRP11-333EO9（AC011302）由来のADLY、BACクローンCITB-144J01（AC004772）由来のARSFP及びRPS24P1、BAC クローンRP11-418N20（AC119620）由来のRPS24PX 、BACクローンRP11-461H06（AC012502）由来のASSP6、及びBACクローンGS1-536K07（AC004616）由来のASSP4である。他のすべての遺伝子に関する配列を、公表されているcDNAから得、そのジェンバンク（GenBank）のアクセッション番号は、ADLX（AF245505）、ARSF（XM_035467）、RPS24（NM_033022）、ASS（X01630）、KIAA1470（AB040903）である。THC604695PYは、その最も末端のエキソンの部分（ほとんど全てが3'UTRから成る）のみしかX染色体のESTクラスター（AA662182及びAA662138）との比較に利用できないので分析しなかった。
【００４８】
（結果）
（中間部欠失のマッピング）
本来、特発性不妊症について生殖センターの診察を受けているが、その他の点では概して健常である９人の成人男子のDNAを調べた。９人の男子のうち、７人は成人の身長について注意をひくものはなかった。身長が157cmの患者である＃293は、低身長症を示し（SDS−2.9）、身長が165.5cmの患者であるY0308は、境界線上の身長を示し、正常な米国の身長標準の３番目のパーセンタイルであった（SDS −1.7）。その患者の両親と兄弟姉妹達の成人身長は正常な範囲内にあり（表１）、その兄弟は該両親より20.5cm背が高い。前記患者の目標の身長（178cm）及び目標の範囲（169-187cm）と比較すると、前記患者は背が低いと考えることができる。Ｙ染色体上の大きい新規の中間部欠失の発生のみに基づいて全ての男子を確認した。患者のうち２人のみ、先の染色体調査を受けた。
【００４９】
GCY遺伝子座を特定の場所に限定するために、Ｙ染色体の長腕のその部分に着目し、該部分を低身長症である患者の中間部欠失の境界によって区切った（図１）。最近になって、758の順序付けられたSTSと199の完全に配列決定されたBACクローンを含むヒトＹ染色体の詳細な物理地図が構築された（Tilfordら 2001）。少し変更したPCR多重システム（Henegariuら 1994）を用いて、Ｙ染色体長腕由来の28のDNA遺伝子座が欠如しているか又は存在しているかについて試験した。更なるPCR分析のために十分なDNAを利用できる患者において、更なるSTSについて試験した。その結果、９種の中間部欠失の限界点（breakpoint）のうち８種を位置付けることができた（図１）。身長が正常であるJOLAR、＃28、＃63、＃95、T.M及び＃1947の患者の欠失は重複するので、Ｙ染色体の長腕の大半はGCYにとって重要な領域としては除外することができる。
【００５０】
＃1972の患者の欠失の遠位の限界点（breakpoint）は、Ｙ染色体の長腕の特定の部分内に存在しないので、欠失の種類（末端又は中間部）は、不明なままであった。＃1947及びT.M.の患者の欠失と、その患者の欠失との重複も全くなかった。STSに基づいた中間部欠失のマッピング戦略によって得られた結果のみを基にし、GCTにとって可能性のある重要な領域としてsY158から遠い領域を形式上除外することはできなかった。しかしながら、多重PCR分析では、常に、STS sY157（sY158のすぐ近くのＹ由来マーカー）に対するあまり強くない増幅産物が示された。この問題に対応するために、患者＃1972の再配列したＹ染色体をより詳細に調査した。
【００５１】
（蛍光in situハイブリダイゼーション及び患者＃1972の配列ファミリー変異体の分類）
患者＃1972由来のＹ染色体全体の完全な状態を、コスミドであるLLOYNC03"M"34F05（PAR1）とLLOYNC03"M"49B02（PAR2）に加えてＹセントロメアに特異的なプローブY-97とテロメアに特異的なプローブ‘全てのヒトテロメア（all human telomeres）'のFISHによって明らかにした（データ図示せず）。ヒトDAZ遺伝子座の複雑な構造の構成を知って、配列ファミリー変異体（sequence family variants，SFVs）について特に探索した。配列の誤りを単一の核酸の違いとして誤って判断することを防ぐために、PCR/制限消化アッセイを、少なくとも２種の重複するBACクローンに存在するSFVsからのみ構築（develop）した。これらのSFVsの局在を図２Ｂに示す。これらのSFVsは対立遺伝子の変異体に相当するので、10人の血縁関係を持たない正常なドイツ人の男子を分類した。すべての事例において、予測した断片のパターンをＹ染色体由来配列について検出することができた。対照的に、第１染色体由来のBACクローンであるRP11-560I18のゲノム配列から推定した断片パターンを確認できなかった（詳細は表３を参照）。SFVに特異的なPCRと制限消化をそれぞれ対応するBACクローンにおける存在／欠如と比較した。
【００５２】
４種の配列ファミリー変異体（SKY10/Tsp509I、SKY11/NlaIII、SKY12/MseI及びSKY13/Cac8I+TfiI）すべてについての患者＃1972のゲノムDNAを分類することによって、１つのＹ由来非対立遺伝子配列の変異体が欠如していることが明らかとなった（表３及び図２Ｃ、２Ｄ）。SKY10の場合、遠位の複製が削除されている。驚くべきことではないが、他の全ての分類実験において、各SFVsのより近位の複製が削除されていることが示された。
【００５３】
次に、最も遠位の限界点（breakpoint）を有する２人の患者（＃95及び＃1947）におけるこれらのSFVsを調べた。ゲノムDNAを用いて、SKY11、SKY12及びSKY13の非対立遺伝子の変異体と、SKY10の１つの非対立遺伝子の変異体の両方が患者＃1947に存在せず、試験したすべてのSFVsについて１つの非対立遺伝子の変異体が患者＃95に存在しないことが決定された。
【００５４】
総合すると、これらの結果によって、患者＃1972のＹ染色体に存在する中間部欠失の近位の限界点（breakpoint）は、患者＃1947の中間部欠失内に存在し、それによってこのゲノム領域が可能性のあるGCYにとって重要な区間としては除外される証拠が得られた。
【００５５】
（GCYの重要な区間の精製）
ヒトＹ染色体の長腕の中心周囲の領域の分子分析（WilliamsとTyler-Smith 1997）に基づいて、マーカーである、sY78（DYZ3）とsY83（DYS11）によって定めた、GCYの重要な領域の物理的な伸長は、1.6〜1.7MbのDNA（図３Ａ）を構成することが推定された。この領域のうち最も近位の400kbは、もっぱら、Alu配列のみによってＹセントロメアから分離した5bpのサテライト配列のみからなる。したがって、このヒトＹ染色体の定常の部分は、コード配列を含まないと思われる。GCYの重要な領域の残部は、ＸとＹの間で相同であるだけでなく、常染色体とＹの間で相同である配列ブロックから構成される。本研究の開始において、YACクローン内の限られた範囲のみこの領域に使用可能であった。GCYの重要な区間を精製し、遺伝子発見基質を生成するためには、この領域のBAC/PACコンティグを確立する必要があった。
【００５６】
BAC、PAC及びYACクローンの末端断片だけでなく、Alu-Aluオリゴヌクレオチドプライマー対の種々の組み合わせによって増幅したクローン内部の配列を配列決定することによって主に25種のマーカーをさらに生成した。それらの内、７種のみがＹ特異的であることが判明した（SKY1、SKY2及びSKY4-8）（詳細は表２参照）。物理地図の作成中に同定したBACクローン及びPACクローンを表４にまとめる。その一方で、これらのクローンのうちいくつかは、ヒトＹ染色体を配列決定するためのタイリング・パス（tiling path）の一部を形成するので、完全に配列決定されている（Tilfordら 2001）。sY78マーカーとSKY6マーカーの間のクローニングした領域の近位の部分は、これまでに配列決定されていなかった。完全なGCYの重要な領域をカバーするクローンの選別を図３に表す。
【００５７】
BAC RP11-295P22とBAC RP11-322K23との間の重複を確認することは、コンティグ構築のプロセスにおいて最も重要な段階であると思われた。両クローンの反対の末端断片から得たＹ特異的マーカーは、同じ5bpのサテライト領域内の２種の異なる遺伝子座から同一の大きさの断片を増幅すると推測される。コンセンサス配列(TGGAA)nから成る5bpのサテライト内を高い頻度で切断することが知られているいくつかの制限酵素を試験することによって、遺伝子座に特異的なPCR/制限消化アッセイを構築した（developed）。適切なPCR／制限消化アッセイを用いて、この配列のブロックにマッピングするすべてのBACクローンを分類することによって、それらを正確に位置付けることができ、それによってそれらの重複を確認することができる。
【００５８】
GCY遺伝子の重要な区間を絞り込むために、患者＃293、Y0308及びJOLAR内における新しく生成したSTSの存在について試験した。これらの結果によって、GCY遺伝子における小さな領域を定めることができた（図３及び図４）。直接配列を比較することによって、配列決定したBACクローンであるRP11-322K23、RP11-75F05、RP11-461H06、RP11-333E09、RP11-558M10、CITB-298B15、及びCITB-203M13が、Y-STSであるSKY8とsY83（DYS11）の間のマッピングした領域を完全にカバーすることが示され、このことは、約700kbを包含することを示唆する。基本的には、前記領域を、5bpの繰り返しを特徴とする近位の領域と、染色体１に対して高い相同性を有する中央の領域と、XとYで相同である配列から成る遠位の領域の、３つの別個の区間に分割することができる。GCYの重要な領域の最も遠位の部分（BACクローンであるCITB-144J01のbp1で始まる）は、すでにAZFaの重要な領域のキャラクタリゼーションの過程中での広範囲にわたる調査の対象であって、機能的な遺伝子を全く宿さないことが示されており（Sargentら 1999）、更に詳細なゲノムDNA分析から除外された。GCYの重要な領域の最も近位な部分は、もっぱら5bpのコンセンサス配列(TGGAA)nのサテライトのタイプ３配列から構成され、したがって、どの遺伝子も含まないことが想定される。これらの２種の領域を考慮から除くことで、より小さい区間である420kbのDNAに全力を注ぐことができた。Advanced PipMakerソフトウェアで大型の配列を比較することによって、Ｙ特異的な配列は、染色体１及び／又は染色体Ｘと相同な領域内に全く組み入れられていないことが示された。
【００５９】
420kbのDNA全体に渡って均一に点在する新規なＹ特異的なマーカーも確立された（表５）。
【００６０】
（GCYの重要な領域におけるエキソン・トラッピング）
GCY領域の境界を、２人の欠失患者JOLARとY0308によって定める（図３）。PACクローンであるRP1-148J07は、サテライト・タイプ３の5bpの繰り返しのみから成るゲノム断片にまで達する。非常に遠位のPACクローンであるRP1-83D22は、sY82から遠い領域はAZFa領域の転写可能性を定める過程において既に分析された（Sargentら 1999）ので、実験の分析に含めなかった。GCYをコードする可能性のある転写物を同定するために、GCY領域由来の5種のPACクローンをエキソン・トラッピングの基質として使用した（RP1-148J07からRP1-114A11まで、図４）。GCY領域由来の５種のPACクローンを、それぞれ個々にサブクローニングし、エキソン・トラッピングを行った。トラップした産物より特定された９種の異なるエキソン・トラップ・クローンの核酸配列決定をしたところ、それらのうち２種のエキソン・トラップ・クローンが２種のエキソンから構成されていた（図４、表６）。すべてのエキソン・トラップ・クローンをいくつか複製した状態で単離した。11種すべての推定されるエキソンのエキソン／イントロンの境界は、スプライス部位のコンセンサスと一致する。GCY領域にマッピングした捕捉した産物を、PCRを用いて、男子、女子、及び低身長症のGCY欠失男子においてそれらが存在しているか、欠如しているかを確認した。すべてのエキソン・トラップ・クローンが、サザンブロット上で唯一の男子特異的な断片を明らかにした。
【００６１】
（注釈付きのBACクローンのコンピューター上での分析）
NIXとRummageのソフトウェア・パッケージによってアセンブルされた遺伝子予測プログラムを用いて完全なGCY領域のゲノム配列を分析した。BLASTN又はFASTAアルゴリズムを用いて、ジェンバンクの非重複性（non-redundant，nr）データベースにおいて、相同配列も分析した。例えば、BAC RP11-75F05は、染色体1p36上の転写単位KIAA1470に対して77％の相同性を有する1kbのセグメントを含む（図５）。例えば、BAC RP11-461H06上における2.5kbの長さの配列は、染色体9q34上のASS遺伝子と88％の相同性を示し、CITB-144J01上における1kbの長さの配列は、染色体10q22上のRPS24遺伝子と81％の相同性を示した。しかしながら、Ｙ染色体の複製であるASSP6とRPS24P1は、偽遺伝子を示し、Ｙ染色体に転座されるXp22上の前駆体を有する。RP11-333E09とCITB-144J01上の偽遺伝子、並びにTHC604695PYとARSFP上の偽遺伝子は、Xp22の特異的な遺伝子の欠失した複製を示す。
【００６２】
BAC RP11-333E09には、染色体Xp22上にアドリカン（adlican）遺伝子（ADLX）の欠失した重複（ADLY）がある。ADLXは、骨関節炎の組織において上方制御されていることが以前に示されており、したがって、骨の代謝に関与していると思われる。したがって、Ｙ染色体の複製は、成長に関与する遺伝子の重要な候補となる。染色体内の組み換えの結果としてエキソン３と４が欠損しているにもかかわらず、その基本的な構造組織（図７）と
ADLXに対する配列相同性（表９ａ）によって、同様の分子の性質を有する機能的なタンパク質を依然としてコードすることが可能であった。ADLYの統合され、予測された遺伝子モデルを用いて、すべての遺伝子発見プログラムによってこのような観測を実施した（cf1；図４）。予測したADLYプロモーターの機能性は当然であると考え、ADLYは、Ｘ染色体上でも用いられるATGコドンから始まるとすれば、+359の位置でのインフレームの終止コドンによって、早すぎる終結がもたらされる。１つの更なるプロモーターが、ADLYの最後のイントロンのセンス鎖において予測された。しかしながら、プロモーターの位置と可能性のあるADLYの発現にとって重要なものとの明らかな相関は全くなかった。
【００６３】
種々の遺伝子発見プログラムを用いて、GCY領域における17個の遺伝子モデルを検出した（図４ｆ）。５個（ar1、cf1、cr1）のみ相同性検索によって同定された転写単位と重複した。14個のモデルの概念上の翻訳物は、タンパク質が一つも一致しないことを明らかにした。位置と方向について、FirstEFによって予測されたプロモーターは、KIAA1470P、ADLY、RPS24P1及びARSFPに帰属することができた。
【００６４】
結論として、エキソン・トラップ・クローン及び遺伝子モデル／相同性、又は偽遺伝子である、KTAA1470PY、ASSP6及びTHC604695PYの同一性は全くなかった。ADLYを、GCY遺伝子座の最も魅力的な候補として考えて、Ｙ及びＸ由来の複製のエキソン／イントロンの境界を直接比較した（表９ｂ）。ADLXのエキソン３及び４は、Ｙ複製上で欠失している。残存する３個の内部のエキソンは、正確な5'及び3'のスプライス部位を依然として持つ。
【００６５】
（転写単位の検索）
すべてのエキソン・トラップ・クローンを用いて行った相同性検索とジェンバンクのdbESTセグメントと対照して予測した遺伝子モデルによって、Ｙ特異的なESTは１つも得られなかった。すべての想定される転写単位に対応するプライマーを用いたPCR及びPCR／制限消化アッセイを行った。最も傑出したGCY候補である、ADLYのすべてのエキソン由来のプライマー（表７Ｂ、７Ｃ）を用いて、骨肉種及び骨髄線維芽細胞の細胞株から逆転写したpolyA+-RNAを検索した。ADLXは、試験したすべての細胞株（神経細胞組織を除く）において発現されていることが示されたが、ADLYに特異的な転写物は全く検出できなかった。種々の成人及び胎児の組織由来のpolyA+-RNAをより広範囲にわたってスクリーニングすると、基本的に同じ結果がもたらされた。GCY領域におけるすべての想定される転写単位を、21種の組織と49種のcDNAライブラリー由来のpolyA+-RNAにおいて発現しているかどうか試験した。RT-PCRアッセイは、転写された遺伝子の証拠を示さなかった。
【００６６】
（GCYの重要な領域の進化の特徴）
他の染色体領域に対するＹ染色体の高い配列相同性は、それらの領域からＹ染色体への進化的に最近の転位と一致する。相同な遺伝子対の同義の核酸の相違（Ks）におけるより微妙な違いによって、それらの積分が、明確な進化の階層である、グループ１−４となることが可能となる（LahnとPage 1999）。GCY領域内のすべての遺伝子対について計算したKs値を、異なる階層の参考遺伝子からのKs値と共に表６に示す。すべてのＸ−Ｙ遺伝子対におけるKs値を、3000〜5000万年前にＸとＹの区別を始めた最も新しい進化の階層に分類することができることに注目した。この分類は、Ｘ染色体遺伝子の実際の機能状態と無関係である。GCY領域内のＹ複製とその機能的な前駆体との間のKs値を比較すると、ＸとＹの組み換えが生じる前に、Ｘ染色体の複製の崩壊が生じたことがはっきりと示された。染色体１−染色体Ｙの遺伝子対におけるKs値の違いがさらに傑出している。KIAA1470P1とKIAA1470PYの遺伝子対における低いKs値は、ヒトＹへの非常に新しい転位を示す（図５）。それを支持する証拠は、約500〜600万年前のときまでこのことを描写する霊長類における蛍光in situハイブリダイゼーションによってもたらされる（Wimmerら 2002）。KIAA1470PYと1p36内のその機能的な前駆体との比較におけるKs値によって、根本的な染色体内の転位の年代が、おおよそで、約1億5000〜1億7000万年前と定められる。
【００６７】
非同義の置換の頻度（Ka）は、進化の時間とコードするタンパク質上における選択的な束縛の両方の関数であるので、束縛の程度は、比率Ks/Kaに反映することができ（Li，1993）、すなわち、ある値より大きい値は、両ホモログ上における束縛の存在を示し、ある値に近い値は、少なくとも１つのホモログ上において束縛が欠如していることと一致する。すべての決定されたKs/Kaの比率は、Ｙ複製上における自然淘汰は継続せず、それによってその偽遺伝子の状態が強調されることを示唆する。
【００６８】
ホモロジー・トランジション（homology transition）とGCY領域の遠位の境界を用いて、ジェンバンクのnrデータベース検索して、染色体の部分区間であるlq43及びXp22上における相同性領域の物理的な範囲を正確に決定した。高度に保存されたセグメントを同定するために、Advanced PipMarker（Schwartzら 2000，http://bio.ces.psu.edu）を対応するDNAを比較するために使用した。複合ドット・プロット（compound dot plot）を調べることによって、相同性配列にないGCY領域の位置を同定することが可能になる。保存された領域におけるY/1及びY/Xの全体の相同性は、既に94〜97％及び96〜99％の範囲内であるので、想定されるタンパク質翻訳領域のエキソンは、非翻訳領域の環境より高い平均百分率の同一性を示すとは期待されない。念入りなドット・プロット分析によって、その常染色体又はＸ染色体の対応するものから分離した後、Ｙ上のGCY領域内に蓄積したすべての新規な配列は、もっぱら反復開始点のものであることが示された。詳細には、統合したLINEファミリーのメンバーが主に優勢であることが明らかであった。
【００６９】
（考察）
Ｙ特異的な成長遺伝子（GCY）の存在に関する問題が最初に生じて以来、その正確な位置を定めるいくつかの試みがあった。最初の研究は、何の異論もなくＹ染色体の長腕の共通領域（common region）に向けられ（Saloら 1995）、より最近の調査によって、２種の重複しない重要な区間が同定された（Rousseaux-Prevostら 1996、Ogataら 1995、De Rosaら 1997）。FISH分析によって、これら最初の調査に用いた患者の材料が45,X10細胞及び／又はi(Yp)もしくはidic（Yq11）染色体を含むという明らかな証拠を示すことで、この明らかな矛盾が解決された（Kirschら 2000）。遺伝子的パラメータの両方とも、ある個体の成人身長に影響を及ぼし、それによって、そのような患者がGCYを喪失しているか否か予測することを不可能にする。したがって、新たな中間部欠失を有する患者による研究は、GCYの局在の問題に対応するのにはるかに良く適している。
【００７０】
セントロメアにとりわけ近い小さな中間部欠失を有する患者に関する文献を選び出す過程で、そのような患者が非常に珍しいことが明らかとなった。このことは、実際の成人身長に関係なく、大きい新規な中間部欠失を有する患者の探索を拡大することを促すものである。９人の成人患者について調査し、そのうち７人が正常な身長を示した。さらに、重複欠失を示すことができ、それによってＹ特異的マーカーであるDYS11と偽常染色体領域２（PAR2）との間に存在するGCYが除かれる。２人の患者、＃293とY0308は、約700kbのDNAにGCYの重要な領域を限定することが可能である中間部欠失を示した。したがって、この領域は、正常なヒトの成長に必要とされる１種又はそれ以上の遺伝子を宿すことが予測される。
【００７１】
（GCY領域におけるエキソンの増幅及び遺伝子モデリング）
Yq11における種々の無精子症（azospermia，AZF）の重要な領域のみならず、Yにコードされる精巣特異的な又は遍在的に発現した遺伝子も非常に注目されているが、GCY領域は、今まで、転写単位について体系的に検索されていなかった。エキソンの増幅、相同性検索、及びコンピューター内での遺伝子予測を用いて、この領域内の想定される遺伝子を同定した。この情報によって、ヒトの線形の成長調節に候補遺伝子が関与するかについて試験する手段が提供された。現在まで、GCY遺伝子を定める上での大きな問題は、ヒトＹ染色体のこの位置に帰属する可能性のある転写単位が欠けていることであった。本研究の前には、GCYの重要な領域に位置付けられたRPS24P1とARSFPという２種の偽遺伝子があるのみであった（Sargentら 1999）。
【００７２】
エキソンの増幅によって、９種の異なるエキソン・トラップ・クローンを単離し、そのうち２種は２つのエキソンから構成されていた。ヒトゲノムプロジェクトによってGCY領域を並行して配列決定することが試みられたことによって、GCY領域内の可能性のある転写単位のカタログを完成することができた。Ｙ特異的なESTは１つも前記領域に帰属しなかった。Nix and Rummageソフトウェアプログラムを用いて、完全なBACの配列データを分析して、配列内の可能性のある遺伝子を予測した。４種の新規な遺伝子／偽遺伝子、及び17種の遺伝子モデルを同定した。17種の遺伝子モデルのうち、５種の遺伝子モデルのみが同定した遺伝子／偽遺伝子に対して相同性を有する。ADLY（cf1）に相同な遺伝子モデルは、すべての遺伝子発見プログラムによって一律に予測された。しかしながら、種々の遺伝子発見プログラムによって得られた可能性は、遺伝子モデルcf1に関して過大評価されている可能性がある。ADLYに存在する非常に大きいエキソンは、あまり正確に予測されたものではないと思われるが、完全に見落とされている可能性は最も低い。したがって、実際の偽遺伝子を機能的な遺伝子として分類する傾向は大きなエキソンの存在により増大する。たとえ正確なスプライス部位を有していても、想定されるADLYの転写単位のエキソンを捕捉することができなかったことは、Ｙ染色体の配列の固有の特徴である。エキソン・トラッピング実験に用いたコスミド／P1クローン内のAZFc領域を完全に表すこと（Reijoら 1995）によって、この領域内に位置付けることが可能な８種の遺伝子／遺伝子ファミリーの中から唯一の遺伝子としてDAZが欠失していることが導かれた（Kuroda-Kawaguchiら 2001）。
【００７３】
驚くべきことに、遺伝子モデルとエキソン・トラップ・クローンとの間に一致するものが全くないことが認められた。エキソンの増幅は、ゲノム配列における機能的なスプライス部位の存在に左右される一方で、遺伝子モデリングは、同相の六量体の測定（Rogicら 2001）、すなわち、特異的な翻訳領域内における長さが６つのオリゴヌクレオチドの発生率を決定する方法に主に基づいていることが考えられる。他方で、正確なスプライス部位を予測することは、そのようなシグナル・センサーは情報量が少なく、通常は縮退しているので、あまり重要ではない。したがって、エキソン・トラップ・クローンは、１つの予測した遺伝子モデルの必要な部分である必要はないが、捕捉したエキソンの実質的な部分（7/11）は、75〜200個の核酸から成り、この75〜200個の核酸は、エキソンが最も正確に予測されている長さの範囲である。同様に、別個の遺伝子モデルに構築されている想定されるエキソンは実際のエキソンを必ずしも表すとは限らない。
【００７４】
GCY領域における遺伝子の最終的な数は、エキソン・トラップ・クローン及び／又は遺伝子モデルが同じ転写物の一部であるか、又は全く遺伝子を表さないことが判明しているので、より小さいものであると考えられる。しかしながら、領域内の可能性のある転写単位の数にかかわらず、重要なものを探索することは、GCY遺伝子座の変異によって生じた形質の影響を正確に定めることは困難であるという事実によって未だに困難となっている。これによって、特に遺伝子機能が未知である場合、発現の特性を予測することが困難となる。ヒトの線形成長は多因子性の形質であるので、成長不全は非常に多く見られる。少なくとも９個の成長調節遺伝子が現在までに同定されているが、少数の事例のみ、その遺伝子内に疾患を引き起こす変異を示す。特に、遺伝子／偽遺伝子の全長が単離されているので、領域内の転写単位を決定することによって、変異の研究が容易となるべきである。
【００７５】
逆転写したpolyA+-RNA及びcDNAライブラリーは広く選別されているが、Ｙに特異的な転写物は全く検出されなかった。このことによって、我々のアプローチが適切であるかどうかの問題が生じる。その有用性を評価するために、GenePage（http://genome-www5.stanford.edu）において、骨の発達に不可欠であることが知られている20個の遺伝子の発現パターンを検証した。スクリーニングを試みることによって、各選択した遺伝子について少なくとも2倍存在していることが保証された。このことによって、非常に限られた空間的及び／又は一時的な発現パターンを有する異常な遺伝子の存在が確証される。
【００７６】
（GCY遺伝子座の手がかりとしての進化の特徴）
GCYの重要な領域の分子起源に関するより多くの見識を得るために、２つの方法を用いた。第１に、GCY領域内の遺伝子／偽遺伝子と、その直接及び機能的な前駆体を比較することによって、遺伝子／偽遺伝子の機能的な状態を確認した。すべての遺伝子対は、１〜２のKs/Kaの比率を示し、むしろ、Yの複製が偽遺伝子であることを示した。この結果によって、Ｘ−Ｙの遺伝子対は、それらすべての遺伝子対は共通の進化の歴史を持つので、非常に良く適合する進化の階層４に帰属する。それでも、このクラスの中の遺伝子対であるAMELX/Yしか機能的なＸ及びＹの複製をコードしない（Salidoら 1992）。KIAA1470のＹの複製は、1p36上のその機能的な前駆体と比較することによって、偽遺伝子として明確に分類することができた。第２に、GCY領域の部分区間と、Xp22及び1q43におけるそれと相同な対応する部分との間の可能性のある差異を同定するために、大規模な配列比較を用いた。分子環境を超える保存レベルを有する小領域も、GCYの重要な領域に新たに組み込まれた小さなゲノム断片もいずれも検出することができなかった。さらに、相同なゲノム配列上で同時に行ったプロモーターの予測によっても、違いはまったく示されなかった。このことは、GCYの重要な領域内における実質的な再配列を明らかに除外するものであり、男子に特異的な制御機構の根底にある遺伝子を支持するものである。
【００７７】
【表１】
2005523694.tif 000002
【００７８】
【表２】
2005523694.tif 000003
【００７９】
【表３】
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【００８０】
【表４】
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【００８１】
【表５】
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【００８２】
【表６】
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【００８３】
【表７−１】
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【００８４】
【表７−２】
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【００８５】
【表７−３】
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【００８６】
【表８】
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【００８７】
【表９】
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【００８８】
【表１０】
2005523694.tif 000013
【００８９】
（参考文献）
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【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、ヒトＹ染色体の長腕における欠失マッピングを示す図である。
【図２】図２は、遠位のYq11.23内のヒトDAZ座位における配列ファミリー変異体（sequence family variant，SFV）の分類を示す図である。
【図３】図３は、ヒトＹ染色体の長腕のセントロメア周囲の領域の機構の略図である。
【図４】図４は、GCYの重要な領域の分子キャラクタリゼーションの結果を示す図である。
【図５】図５は、GCY領域の遺伝子／偽遺伝子とその機能的な前駆体との間の相同性の比較を示す図である。
【図６】図６は、KIAA1470の進化の歴史を示す図である。
【図７】図７は、Ｘ特異的及びＹ特異的アドリカン（adlican）遺伝子／偽遺伝子の構造上の特色の比較を示す図である。
【図１】
2005523694.tif 000014
【図２】
2005523694.tif 000015
【図３】
2005523694.tif 000016
【図４】
2005523694.tif 000017
【図５】
2005523694.tif 000018
【図６】
2005523694.tif 000019
【図７】
2005523694.tif 000020
【国際調査報告】
2005523694.tif 000021
2005523694.tif 000022
2005523694.tif 000023