(57)【要約】注目のグルコサミノグリカンを含んでなる発酵液に2価の塩を添加し、その後微生物および/または高分子量汚染物質を除去することを含んでなり、ここで前記微生物は注目のグルコサミノグリカンを産生する、発酵液から微生物を凝集しおよび/または高分子量汚染物質を除去する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
注目のグルコサミノグリカンを含んでなる発酵液に2価の塩を添加し、その後微生物および/または高分子量汚染物質を除去することを含んでなり、ここで前記微生物は注目のグルコサミノグリカンを産生するものである、発酵液から微生物を凝集しおよび/または高分子量汚染物質を除去する方法。
【請求項２】
前記微生物が原核生物または真核生物である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記原核生物がバシラス (Bacillus) 細胞である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記グルコサミノグリカンがヒアルロン酸である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記グルコサミノグリカンが10,000ダルトン〜15,000,0000ダルトンの分子量を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記2価の塩がカルシウム塩および/またはマグネシウム塩である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記2価の塩を微生物の乾燥質量1 g当たり0.1〜25 gの濃度で添加する、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物を濾過により除去する、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記2価の塩の添加の前に、それと同時に、またはその後に、発酵液を水で希釈する、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記発酵液を100〜500 %(w/w) の水で希釈する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記発酵液を100〜400 %(w/w) の水で希釈する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記発酵液をpH 6.5〜14に調節する、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵液をpH 7.5〜8.5に調節する、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記発酵液をpH 5.5以下に調節した後、高分子量汚染物質を除去する、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記発酵液を30℃〜60℃に加熱する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
さらに1種または2種以上の他の凝集剤を発酵液に添加する、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、注目のグルコサミノグリカン、例えばヒアルロン酸を産生する微生物を発酵液から凝集する、簡単かつ有効な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸(HA)は、自然に広く分布する、生物学的由来のムコイド多糖である。例えば、ヒアルロン酸は動物組織、例えば、臍帯、滑液、ガラス体液、雄鶏冠、および種々の結合組織、例えば、皮膚および軟骨の中に存在することが知られている。
ヒアルロン酸は、高分子量で、粘性であり、そしてゼリー状態を維持し、潤滑剤として作用し、細菌の侵襲を防止し、そして水を保持することができる。
【０００３】
前述の性質のために、ヒアルロン酸は技術的用途および化粧品の用途を有し、例えば、ヒアルロン酸は皮膚の張度および弾性を保持することができる。ヒアルロン酸の薬学上の用途は、例えば、眼のガラス質媒質として、眼の手術における支持媒質として、または関節流体の代替物として、文献に広く記載されている。
ヒアルロン酸は、また、高度に親水特質を有するので、化粧品、例えば、ローションおよびクリームにおいて使用することができる。
ヒアルロン酸は、例えば、臍帯から、雄鶏冠からまたはAおよびBグループのストレプトコッキ (Streptococci) から抽出し、精製することができる。
【０００４】
ヒアルロン酸は、また、宿主細胞、例えば、細菌細胞または真菌細胞における組換え生産により製造することができる。
ヒアルロン酸を微生物の発酵により製造するとき、細胞塊は高度の希釈における濾過または遠心により好都合に除去される。凝集はいっそう効率よい細胞の除去を可能とし、またより広い範囲の細胞除去技術 (例えば、ドラム濾過、デッド・エンド (dead end) 濾過、遠心およびその他) の使用を可能とする。しかしながら、凝集用化学物質は生成物に悪影響を及ぼすか、あるいは下流の処理方法を妨害することがある。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
注目のグルコサミノグリカンを産生する微生物を、非常に効率よい方法で凝集させることができることを我々は発見した。2価の塩を添加すると、小さい綿状沈降物が生成し、これらは細胞ブロスから容易に分離できると同時に、生成物の収率を減少しないか、あるいは引き続く下流の操作を妨害しないことが示された。
本発明は、注目のグルコサミノグリカンを含んでなる発酵液に2価の塩を添加し、その後微生物および/または高分子量汚染物質を除去することを含んでなり、ここで前記微生物は注目のグルコサミノグリカンを産生する、発酵液から微生物を凝集しおよび/または高分子量汚染物質を除去する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、発酵液に2価の塩を添加し、その後微生物を除去することを含んでなる、注目のグルコサミノグリカンを産生する微生物を発酵液から凝集する方法を提供する。
【０００７】
グルコサミノグリカン
本発明によれば、グルコサミノグリカンは少なくとも10,000ダルトンの分子量、好ましくは少なくとも20,000ダルトンの分子量、より好ましくは少なくとも30,000ダルトンの分子量を有する任意の炭水化物ポリマーであることができる。
好ましいグルコサミノグリカンはヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、およびケラチン硫酸である。ヒアルロン酸はD‐グルクロン酸およびN‐アセチル‐D‐グルコサミンの交互および反復単位により構成されており、15,000,000ダルトンまでの分子量を有する線状連鎖を形成している。
【０００８】
本発明による好ましいグルコサミノグリカンは、10,000ダルトン〜15,000,0000ダルトンの分子量を有するグルコサミノグリカンである。
この出願および特許請求の範囲における「ヒアルロン酸」という用語は、その酸形態または塩形態のヒアルロン酸、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸カルシウム、またはその他を普通に意味することに注目すべきである。
【０００９】
発酵液
グルコサミノグリカンは任意の発酵液から得ることができる。さらに、グルコサミノグリカンは、宿主細胞を培養することを含んでなる方法により製造可能なものであることができる。
【００１０】
宿主細胞は微生物であることが好ましい。微生物は単細胞微生物、例えば、原核生物、または非単細胞微生物、例えば、真核生物であることができる。有用な単細胞は細菌細胞、例えばグラム陽性菌である。これらは以下のものを包含するが、これらに限定されない：バシラス (Bacillus) 細胞、例えば、バシラス・アルカロフィルス (Bacillus alkalophilus)、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・ブレビス (Bacillus brevis)、バシラス・サーキュラン (Bacillus circulans)、バシラス・クラウシイ (Bacillus clausii)、バシラス・コアギュランス (Bacillus coagulans)、バシラス・フィルムス (Bacillus firmus)、バシラス・ラウツス (Bacillus lautus)、バシラス・レンツス (Bacillus lentus)、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム (Bacillus megaterium)、バシラス・プミラス (Bacillus pumillus)、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus)、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis)、およびバシラス・スリンジェンシス (Bacillus thuringiensis); またはストレプトマイセス (Streptomyces) 細胞、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス (Streptomyces lividans) またはストレプトマイセス・ムリヌス (Streptomyces murinus)、またはグラム陰性菌、例えば、大腸菌 (E. coli) およびシュードモナス (Pseudomonas) 種。
【００１１】
好ましい態様において、細菌宿主細胞はバシラス・レンツス (Bacillus lentus) 細胞、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) 細胞、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) 細胞またはバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) 細胞である。組換え発現に特に適合する突然変異体バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) 細胞は、WO 98/22598に記載されている。
【００１２】
宿主細胞は真核生物、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞であることができる。有用な哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞、HeLa細胞、ベイビーハムスター腎 (BHK) 細胞、COS細胞、または任意の多数の他の不死化細胞系統、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection) から入手可能な細胞である。形質転換法、選択可能なマーカー遺伝子および発現構築物の任意の他の部分を、よく知られておりかつ当業者に入手可能なものから選択することができる。
【００１３】
宿主細胞は真菌細胞であることができる。「真菌」は、本明細書において使用するとき、子嚢菌門 (Ascomycota)、担子菌門 (Basidiomycota)、ツボカビ門 (Chytridiomycota)、および接合菌門 (Zygomycota) ならびに卵菌門 (Oomycota) およびすべて栄養胞子性真菌を包含する。子嚢菌門 (Ascomycota) の代表的なグループは下記のものを包含する：例えば、ニューロスポラ (Neurospora)、エウペニシリウム (Eupenicillium) (=ペニシリウム (Penicillium))、エメリセラ (Emericella) (=アスペルギルス (Aspergillus))、コウジカビ (Eurotium) (=アスペルギルス (Aspergillus))、および下に列挙する真の酵母。
【００１４】
担子菌門 (Basidiomycota) の例は、例えば、キノコ、サビ病、およびクロホ菌を包含する。ツボカビ門 (Chytridiomycota) の代表的なグループは下記のものを包含する：例えば、 アロマイセス (Allomyces)、ブラストクラジエラ (Blastocladiella)、ケロモミセス (Coelomomyces)、および水生真菌。卵菌門 (Oomycota)の代表的なグループは、例えば、サプロレグニオミセタス (Saprolegniomucetous) 水生真菌 (水カビ)、例えば、アキリア (Achlya) を包含する。栄養胞子真菌の例は、アスペルギルス (Aspergillus)、ペニシリウム (Penicillium)、カンジダ (Candida)、およびアルテルナリア (Alternaria) である。接合菌門 (Zygomycota) の代表的なグループは、例えば、リゾプス (Rhizopus) およびケカビ (Mucor) を包含する。
【００１５】
真菌宿主細胞は酵母細胞であることができる。「酵母」は、本明細書において使用するとき、子嚢胞子を生ずる酵母 (エンドミセタレス目 (Endomycetales))、担子胞子を生ずる酵母、および不完全菌類 (Fungi Imperfecti)(ブラストミセテス (Blastomycetes)) に属する酵母を包含する。子嚢胞子を生ずる酵母はスペルモフトラセエ科(Spermophthoraceae)およびサッカロミセタセエ科(Saccharomycetaceae) に分割される。後者は4つの亜科、すなわち、シゾサッカロマイコイデアエ (Schizosaccharomycoideae) (例えば、シゾサッカロマイセス (Schizosaccharomyces) 属)、ナドソニオイデア (Nadsonioideae)、リポミコイデア (Lipomycoideae)、およびサッカロミコイデア (Saccharomycoideae) (例えば、クライベロマイセス (Kluyveromyces)、ピキア (Pichia)、およびサッカロマイセス (Saccharomyces) 属) から構成されている。
【００１６】
担子胞子を生ずる酵母は、レイコスポリジム (Leucosporidim)、ロドスポリジウム (Rhodosporidium)、スポリジオボラス (Sporidiobolus)、フィロバシヂウム (Filobasidium)、およびフィロバシジエラ (Filobasidiella) 属を包含する。不完全菌類 (Fungi Imperfecti) に属する酵母は、次の2つの科に分割される：スポロボロミセタセタセエ (Sporobolomycetacetaceae) (例えば、スポロボロミセス (Sporobolomyces) およびブルレラ (Bullera) 属) およびクリプトコッカセエ (Cryptococcaceae) (例えば、カンジダ (Candida)属)。
【００１７】
他の態様において、真菌宿主細胞はフィラメント状真菌細胞である。「フィラメント状真菌」は、細分真菌門 (Eumycota) および卵菌門 (Oomycota) のすべてのフィラメント状形態を包含する。フィラメント状真菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖から構成された菌糸体壁により特徴づけられる。栄養増殖は菌糸の伸長であり、そして炭素異化作用は無条件的に好気性である。
【００１８】
対照的に、酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) による栄養増殖は単細胞葉状体の出芽により、そして炭素異化作用は発酵的である。より好ましい態様において、フィラメント状真菌宿主細胞は以下を包含するが、これらに限定されない種の細胞である：アクレモニウム (Acremonium)、アスペルギルス (Aspergillus)、フザリウム (Fusarium)、フミコラ (Humicola)、ケカビ (Mucor)、ミセリオフトラ (Myceliopthora)、ニューロスポラ (Neurospora)、ペニシリウム (Penicillium)、チエラビア (Thielavia)、トリポクラジウム (Tolypocladium)、およびトリコデルマ (Trichoderma) 。
【００１９】
真菌細胞は、それ自体知られている方法におけるプロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換、および細胞の再生を包含するプロセスにより形質転換することができる。
【００２０】
注目のグルコサミノグリカンを産生する微生物は、この分野において知られている方法を使用する、グルコサミノグリカンの産生に適当な栄養培地中で培養する。例えば、微生物は、実験室において震蘯フラスコ培養、小規模または大規模の発酵 (連続的、バッチ式、供給‐バッチ式または固体状態の発酵を包含するが、これらに限定されない) または工業的発酵槽により培養することができる。培養は、この分野において知られている手法により、炭素源、窒素源および無機塩を含んでなる適当な栄養培地中で実施される。適当な培地は商業的供給会社から入手可能であるか、あるいは発表された組成 (例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection) のカタログにおいて) に従い調製することができる。
【００２１】
高分子量の汚染物質/不純物
注目のグルコサミノグリカンそれ自体と同一であるか、あるいはそれより高い分子量範囲の非グルコサミノグリカン物質は、下記のものを包含するが、これらに限定されない：レバン、グルタミン酸、核酸、細胞の破片および成分およびその他。
本発明の方法を使用することによって、高分子量の汚染物質/不純物を除去することができる；また、注目のグルコサミノグリカンの無細胞調製物から、-これらの不純物を除去することができる。
【００２２】
凝集
本発明の方法は、未処理発酵液に適用するか、あるいは処理した発酵液に適用することができ、このような処理はpH調節、温度調節、および/または水希釈を包含するが、これらに限定されない。
本発明によれば、発酵液に2価の塩を添加すると、細胞ブロスから容易に分離することができる小さい綿状沈降物を含む凝集物が生ずることが発見された。
【００２３】
綿状沈降物の大きさの評価は、通常、観測された綿状沈降物を種々の綿状沈降物の大きさの写真と比較することによって実施する。
2価の塩の添加の前に、それと同時に、またはその後に発酵液を希釈することはしばしば好都合であろう。グルコサミノグリカンの収率および必要な粘度に依存して、発酵液の100〜500 %(w/w) の水を使用する希釈、好ましくは発酵液の100〜400 %(w/w) の水を使用する希釈は適当であろう。
【００２４】
注目のグルコサミノグリカンの収率および必要な粘度に依存して、2価の塩の添加の前に、それと同時に、またはその後に、発酵液を加熱すること、または希釈前に、それと同時にまたはその後に、発酵液を加熱することはしばしば好都合であろう。発酵液を10℃以上の温度、特に30℃〜60℃の温度に加熱することは好ましい。
2価の塩の添加および/または希釈の前に、それと同時にまたはその後に、発酵液のpHを調節することはしばしば好都合であろう。発酵液をpH 6.5〜14、特にpH 7.5〜8.5に調節することは好ましい。
【００２５】
2価の塩
本発明によれば、驚くべきほどにすぐれた凝集剤は2価の塩、特にカルシウム塩および/またはマグネシウム塩である。好ましい2価の塩はリン酸塩、硫酸塩または塩化物、例えば、塩化カルシウムである。好ましい態様はカルシウム塩である。
【００２６】
凝集する2価の塩の最小量は、発酵液の微生物、発酵液の構成成分および塩それ自体の種類および濃度に依存する。また、2価の塩の過度の添加は収率を減少させることがあることに注意すべきである。2価の塩は発酵液の微生物の乾燥質量1 g当たり少なくとも0.1 gの2価の塩の量で添加すべきであり、好ましくは2価の塩は発酵液の微生物の乾燥質量1 g当たり0.5〜25 gの範囲の量で添加することができ、より好ましくは2価の塩は発酵液の微生物の乾燥質量1 g当たり0.5〜15 gの範囲の量で添加することができ、最も好ましくは2価の塩は発酵液の微生物の乾燥質量1 g当たり0.5〜8 gの範囲で添加することができ、特に2価の塩は発酵液の微生物の乾燥質量1 g当たり0.5〜3.5 gの範囲で添加することができる。
【００２７】
2価の塩の投与は、典型的には、インラインでまたは混合槽中で実施するか、あるいはこの分野において知られている任意の他の方法により実施する。
2価の塩に加えて、1種または2種以上の凝集剤、例えば、アルミン酸塩、例えば、NaAlO2、またはカチオンまたはアニオンポリマーを添加することが好都合であることがある。
2価の塩、および必要に応じて他の凝集剤を添加した後、微生物をこの分野において知られている方法により除去する。ここで、このような方法は濾過、例えば、ドラム濾過、膜濾過、フィルタープレス、デッド・エンド濾過、クロス・フロー濾過、または遠心であるが、これらに限定されない。
【００２８】
引き続く下流操作
生ずるグルコサミノグリカンはこの分野において知られている方法によりさらに単離することができる。例えば、グルコサミノグリカンは、下記のものを包含するが、これらに限定されない慣用法により回収することができる：濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、沈降または結晶化。次いで、単離されたグルコサミノグリカンは、この分野において知られている種々の方法によりさらに精製および/または変性することができる。ここで、このような方法は、以下の方法を包含するが、これらに限定されない：クロマトグラフィー (例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除クロマトグラフィー)、電気泳動手法 (例えば、調製用等電点電気泳動)、分別溶解 (例えば、硫酸アンモニウム沈降)、または抽出。
【００２９】
下記の非限定的実施例により、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、限定を意図しない。
【実施例】
【００３０】
実施例１．HA凝集の実施例
源：GMM バシラス・サチリス (B. subtilis)、同時係属米国特許出願: US 60/342644に記載されているようにして調製されたヒアルロン酸カセットを含有する。 
【００３１】
発酵：
1500リットルの規模を使用した；唯一の天然源として無機窒素および炭素源としてスクロース投与を用いる規定された培地を使用した。
発酵液中の最終乾燥細胞質量は、乾燥細胞重量基準でほぼ15〜20 g/lであった。(ブロス粘度が高いために、正確に評価することは困難であった)。
発酵液中のヒアルロン酸はほぼ10 g/lであり、平均分子量はほぼ1,400,000ダルトンであった。(それぞれ、ELISAおよびGPC‐MALLSにより測定した)。
【００３２】
細胞分離：
希釈：水を使用する200% (3中の1) の希釈
温度：10℃
pH 7.0
凝集：培養ブロスに関して2重量％の塩化カルシウム、または乾燥細胞1 g当たりほぼ1.0〜1.3 gの塩化カルシウム。
【００３３】
細胞の除去：
凝集した細胞は、ヒアルロン酸を含有するブロスから通常の装置操作条件およびフラックス下に、下記の方法の1または2以上により、収率をほとんど低下させないで、容易に除去された：
a.     デッド・エンド「ナッチ (nutch)」濾過。通常の操作条件。
b.     50 mlの遠心管中のベンチスケール遠心。通常の操作条件。
c.     ドラム濾過 (2.5 m2の面積)。通常の操作条件。
d.     パイロットスケールの遠心。通常の操作条件。
【００３４】
(a)〜 (d) を試験し、そして各場合において、もとの発酵液中のヒアルロン酸の大部分を含有する、顕著に透明な、わら色の液体が得られた。
分離の平易さは、細胞分離が他の細胞分離装置 (例えば、フィルタープレス、精密濾過、およびその他) でまた改良されるであろうことを示唆する。
【００３５】
実施例２．HA凝集の実施例パイロットスケール、pH 6.5
源：GMM バシラス・サチリス (B. subtilis)、同時係属米国特許出願: US 60/342644に記載されているようにして調製されたヒアルロン酸カセットを含有する。 
【００３６】
発酵：
1500リットルの規模を使用した；唯一の天然源として無機窒素および炭素源としてスクロース投与を用いる規定された培地を使用した。
発酵液中の最終乾燥細胞質量は、乾燥細胞重量基準でほぼ10〜15 g/lであった。(ブロス粘度が高いために、正確に評価することは困難であった)。
発酵液中のヒアルロン酸はほぼ12 g/lであり、平均分子量はほぼ1,000,000ダルトンであった。(それぞれ、ELISAおよびGPC‐MALLSにより測定した)。
【００３７】
細胞分離：
希釈：水を使用する300% (4中の1) の希釈
温度：35℃
凝集：培養ブロスに関して2重量％の塩化カルシウム、または乾燥細胞1 g当たりほぼ1.3〜2.0 gの塩化カルシウム。
pH 6.5
【００３８】
細胞の除去：
凝集した細胞は、ヒアルロン酸を含有するブロスから通常の装置操作条件およびフラックス下に、下記の方法の1または2以上により、収率をほとんど低下させないで、容易に除去された：
a.     デッド・エンド「ナッチ」濾過。通常の操作条件。
c.     50 mlの遠心管中のベンチスケール遠心。通常    の操作条件。
d.     ドラム濾過 (2.5 m2の面積)。通常の操作条件。
e.      パイロットスケールの遠心。通常の操作条件。
【００３９】
(a)〜 (d) を試験し、そして各場合において、もとの発酵液中のヒアルロン酸の大部分を含有する、顕著に透明な、黄わら色の液体が得られた。
分離の平易さは、細胞分離が他の細胞分離装置 (例えば、フィルタープレス、精密濾過、およびその他) でまた改良されるであろうことを示唆する。
【００４０】
実施例３．HA凝集の実施例プロセススケール、pH 8
源：GMM バシラス・サチリス (B. subtilis)、同時係属米国特許出願: US 60/342644に記載されているようにして調製されたヒアルロン酸カセットを含有する。
【００４１】
発酵：
20,000リットルの規模を使用した；唯一の天然源として無機窒素および炭素源としてスクロース投与を用いる規定された培地を使用した。
発酵液中の最終乾燥細胞質量は、乾燥細胞重量基準でほぼ8〜10 g/lであった。
発酵液中のヒアルロン酸はほぼ10 g/lであり、平均分子量はほぼ1,000,000ダルトンであった。(それぞれ、ELISAおよびGPC‐MALLSにより測定した)。
【００４２】
細胞分離：
希釈：水を使用する400% (5中の1) の希釈
温度：45℃
pH 8.0
凝集：培養ブロスに関して2重量％の塩化カルシウム、または乾燥細胞1 g当たりほぼ2.0〜2.5 gの塩化カルシウム。
【００４３】
細胞の除去：
凝集した細胞は、ヒアルロン酸を含有するブロスから通常の装置操作条件およびフラックス下に、下記の方法の1または2以上により、収率をほとんど低下させないで、容易に除去された：
a.      デッド・エンド「ナッチ」濾過。通常の操作条件。
b.      50 mlの遠心管中のベンチスケール遠心。通常    の操作条件。
c.     ドラム濾過 (プロセススケール)。通常の操作条件。
d.      フィルタープレス (パイロットスケール)。通常の操作条件。
(a)〜 (d) を試験し、そして各場合において、もとの発酵液中のヒアルロン酸の大部分を含有する、顕著に透明な、わら色の液体が得られた。高分子量の汚染物質 (処理の前後においてGPCによりならびに酵素的消化により評価して) は包括的に除去された。
【００４４】
分離の平易さは、細胞分離が他の細胞分離装置 (例えば、精密濾過、およびその他) でまた改良されるであろうことを示唆する。この希釈度および温度における操作は、フラックス速度が実施例1および2におけるよりも高いように、粘度を減少させた。さらに、細胞および他の汚染物質のクリアランス (細胞計数および濁り度により測定する) もまた実施例1または2におけるより高かった。
【００４５】
実施例４．HA凝集の実施例パイロットスケール、汚染物質除去の実験
源：GMM バシラス・サチリス (B. subtilis)、同時係属米国特許出願: US 60/342644に記載されているようにして調製されたヒアルロン酸カセットを含有する。
【００４６】
発酵：
1500リットルの規模を使用した；唯一の天然源として無機窒素および炭素源としてスクロース投与を用いる規定された培地を使用した。
発酵液中の最終乾燥細胞質量は、乾燥細胞重量基準でほぼ8〜10 g/lであった。
発酵液中のヒアルロン酸はほぼ10 g/lであり、平均分子量はほぼ1,000,000ダルトンであった。(それぞれ、ELISAおよびGPC‐MALLSにより測定した)。
【００４７】
細胞分離：
希釈：水を使用する300% (4中の1) の希釈
温度：15〜60℃
pH 5.0〜10.0
凝集：培養ブロスに関して2重量％の塩化カルシウム、または乾燥細胞1 g当たりほぼ2.0〜2.5 gの塩化カルシウム。
【００４８】
細胞の除去：
凝集した細胞は、ヒアルロン酸を含有するブロスから通常の装置操作条件およびフラックス下に、デッド・エンド「ナッチ」濾過、通常の操作条件により、収率をほとんど低下させないで、容易に除去された。塩化カルシウムを使用しない対照は、処理した培養ブロスを濾過することまたは清浄化することができなかった。
収集した濾液をGPC‐MALLS、酵素的消化および他の分析により研究すると、高分子量汚染物質の除去の程度をpHによりコントロールすることができ、最高度の除去はpH 5.5以下かつ>pH 7.5であり、pH 8はプロセス操作に好ましい値であることが明らかにされた。高分子量汚染物質の除去の程度は、温度または希釈に対して独立であることが発見された。
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月1日(2004.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
注目のグルコサミノグリカンを含んでなる発酵液に2価の塩を添加し、その後バシラス (Bacillus) 細胞および/または高分子量汚染物質を除去することを含んでなり、ここで前記バシラス (Bacillus) 細胞は注目のグルコサミノグリカンを産生するものである、発酵液からバシラス (Bacillus) 細胞を凝集しおよび/または高分子量汚染物質を除去する方法。
【請求項２】
前記グルコサミノグリカンがヒアルロン酸である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記グルコサミノグリカンが10,000ダルトン〜15,000,0000ダルトンの分子量を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記2価の塩がカルシウム塩および/またはマグネシウム塩である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記2価の塩を微生物の乾燥質量1 g当たり0.1〜25 gの濃度で添加する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物を濾過により除去する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記2価の塩の添加の前に、それと同時に、またはその後に、発酵液を水で希釈する、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記発酵液を100〜500 %(w/w) の水で希釈する、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記発酵液を100〜400 %(w/w) の水で希釈する、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記発酵液をpH 6.5〜14に調節する、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記発酵液をpH 7.5〜8.5に調節する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記発酵液をpH 5.5以下に調節した後、高分子量汚染物質を除去する、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵液を30℃〜60℃に加熱する、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
さらに1種または2種以上の他の凝集剤を発酵液に添加する、請求項1に記載の方法。
【国際調査報告】
2005536196.tif 000002
2005536196.tif 000003
2005536196.tif 000004
2005536196.tif 000005