(57)【要約】デジタルイメージを処理し、セグメント化し、特徴正規化することに関するコンピュータプログラム、システム等である。イメージは細胞のものであり、方法は細胞内の悪性腫瘍関連変化（ＭＡＣ）の検出に有用であり、それは癌の検出に使用されることができる。このプログラムおよび方法はある組織中の癌を、関連性のある組織または関連性のない組織のような別の組織中のＭＡＣを検出することにより検出する。関連性のある組織の例には、乳癌を検出するためのニップルアスピレイトまたはダクタルウォッシング、ならびに肺癌を検出するための痰または気管支洗浄したものが含まれる。関連性のない組織の例には、肺癌または乳癌を検出するための口内の粘膜が含まれる。
2005536752.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性腫瘍に関連した変化（ＭＡＣ）を決定するための細胞特徴の解析のためにデジタルイメージを測光法的に補正するコンピュータ実施方法において、
（ａ）ＤＮＡ着色細胞のサンプルの１以上のデジタルイメージを提供し、そのサンプルはある定まったＤＮＡ含有量を有する細胞の基準ポピュレーションを決定するのに十分な細胞を含んでおり、
（ｂ）その定まったＤＮＡ含有量の細胞の光学測定値を、ＭＡＣの存在または不在を示す光学測定値を含む基準データセット内の光学測定値に対応した予め定められたターゲット値に実質的に調節する測光法的補正ファクタを決定し、
（ｃ）その測光法的補正ファクタをデジタルイメージの所望の画素に適用して、正規化されたデジタルイメージを提供し、
（ｄ）その正規化されたデジタルイメージから光学的特徴を計算し、
（ｅ）正規化されたデジタルイメージから決定された光学的特徴を基準データセットと比較して、そのサンプルがＭＡＣを含んでいるか否かを決定するステップを含んでいる方法。
【請求項２】
定まったＤＮＡ含有量の細胞は二倍性細胞であり、測光法的補正ファクタは、サンプル中の二倍性細胞および基準データセット中の二倍性細胞の補正されたＤＮＡ含有量の尺度が約１の相対値を有すると共に、四倍性細胞の補正されたＤＮＡ含有量の尺度が約２の相対値を有するように決定される請求項１記載の方法。
【請求項３】
サンプルがＭＡＣを含んでいるか否かを決定するステップをさらに含んでいる請求項１記載の方法。
【請求項４】
光学測定は積分された光学濃度（ＩＯＤ）の測定を含み、基準データセットはターゲットＩＯＤを含み、測光法的補正ファクタはターゲットＩＯＤ／測定されたＩＯＤとして決定される請求項１記載の方法。
【請求項５】
デジタルイメージは光学強度情報を含み、光学強度は光学強度と測光法的補正ファクタを乗算することによって補正される請求項１記載の方法。
【請求項６】
測光法的補正ファクタをイメージ内のオブジェクト中の少なくとも所望の画素に適用するステップおよび光学濃度および積分された光学濃度の少なくとも一方について調節された画素値を与えるステップの少なくとも一方をさらに含んでいる請求項１記載の方法。
【請求項７】
サンプル中の非常に多くの細胞が解析されたときに、少なくともステップ（ｂ）および（ｃ）を１回以上繰返すことにより改善された補正係数を提供するステップをさらに含んでいる請求項１記載の方法。
【請求項８】
サンプル中において約２００個より多くの細胞の付加的なグループが与えられたときに、少なくともステップ（ｂ）および（ｃ）を２回以上繰返し、それによって改善された補正係数を提供するステップをさらに含んでいる請求項７記載の方法。
【請求項９】
改善された調節された画素値を提供すると共に１以上の光学的特徴の改良された決定を行うために改善された補正係数を使用して少なくともステップ（ｄ）および（ｅ）を繰返すステップをさらに含んでいる請求項７記載の方法。
【請求項１０】
着色されるＤＮＡは、フォイルゲン着色方法で着色される請求項１記載の方法。
【請求項１１】
着色されるＤＮＡは、吸光着色剤で着色される請求項１記載の方法。
【請求項１２】
既知の光学濃度を有する既知の物質の１以上のデジタルイメージを提供するステップを含む１以上の制御サンプルを提供するステップをさらに含んでいる請求項１記載の方法。
【請求項１３】
制御サンプルを組織サンプルと実質的に同時に着色するステップをさらに含んでいる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
調節された画素値から複数の光学的特徴を決定するステップをさらに含んでおり、複数の光学的特徴の少なくとも１つが非線形関数を使用して決定される請求項１記載の方法。
【請求項１５】
基準データセットはさらに基準細胞のデジタルイメージを含んでいる請求項１記載の方法。
【請求項１６】
測光法的補正ファクタをイメージ中のオブジェクト中の実質的に全ての画素に適用するステップをさらに含んでいる請求項１記載の方法。
【請求項１７】
サンプルは選択された悪性腫瘍を潜在的に有している患者からのものであり、また、サンプルは関連性のない組織からのものである請求項１記載の方法。
【請求項１８】
選択された悪性腫瘍は体内の癌であり、関連性のない組織は入手可能な組織である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
選択された悪性腫瘍は肺癌であり、関連性のない組織は口内の粘膜を含んでいる請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
選択された悪性腫瘍は乳癌であり、関連性のない組織は口内の粘膜、ニップルアスピレイト(nipple aspirates)およびダクタルウォッシング(ductal washings)の少なくとも１つを含んでいる請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
実質的に癌に罹っていない組織のサンプルは人体である請求項１記載の方法。
【請求項２２】
細胞のデジタルイメージを提供するイメージサイトメータと、請求項１記載の方法を実施するコンピュータ実施プログラミングを含む実施可能なリンクされた制御装置とを備えているコンピュータ制御されるシステム。
【請求項２３】
請求項１記載の方法を実施するコンピュータ実施プログラミングを含むコンピュータ。
【請求項２４】
ＭＡＣと関連した判別イメージサイトメトリック特徴を含むデータセットを形成する方法において、
（ａ）比例して着色されたＤＮＡを含む細胞のサンプルのデジタルサイトメトリックイメージを提供し、そのサンプルはある定まったＤＮＡ含有量を有する細胞のＤＮＡ含有量尺度を提供するのに十分な細胞を含んでおり、
（ｂ）その定まったＤＮＡ含有量を有する細胞を解析して、ＤＮＡ含有量の光学強度、光学濃度（ＯＤ）および積分された光学濃度（ＩＯＤ）値の少なくとも１つを決定し、それによって初期ＤＮＡ含有量尺度を提供し、
（ｃ）初期ＤＮＡ含有量尺度を調節する測光法的補正ファクタを決定して、その定まったＤＮＡ含有量細胞の補正されたＤＮＡ含有量尺度を提供し、補正されたＤＮＡ含有量尺度は、基準データセット中の実質的に等価なＤＮＡ含有量の細胞に対する基準ＤＮＡ含有量尺度に実質的に等しい相対値を有し、基準データセットはＭＡＣに関連した判別イメージサイトメトリック特徴を含んでおり、
（ｄ）その測光法的補正ファクタをイメージの少なくとも所望の画素に適用して、イメージを正規化し、それによって少なくとも光学濃度スケールで調節された画素値を提供し、
（ｅ）調節された画素値から決定された光学的特徴を基準データセットと比較し、そこからサンプルがＭＡＣを含んでいることを決定し、
（ｆ）調節された画素値からの光学的特徴と基準データセットを組合せて、改善された基準データセットを提供するステップを含んでいる方法。
【請求項２５】
サンプルがＭＡＣを含んでいることが知られるようにサンプルを予め選択するステップをさらに含んでいる請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
定まったＤＮＡ含有量の細胞は二倍性細胞であり、測光法的補正ファクタは、サンプル中の二倍性細胞および基準データセット中の二倍性細胞の補正されたＤＮＡ含有量の尺度が約１の相対値を有すると共に、四倍性細胞の補正されたＤＮＡ含有量の尺度が約２の相対値を有するように決定される請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
測光法的補正ファクタをイメージ内のオブジェクト中の少なくとも所望の画素に適用するステップをさらに含んでいる請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
サンプル中の非常に多くの細胞が解析されたときに、少なくともステップ（ｂ）および（ｃ）を１回以上繰返すことにより改善された補正係数を提供するステップをさらに含んでいる請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
改善された調節された画素値を提供すると共に１以上の光学的特徴の改良された決定を行うために改善された補正係数を使用して少なくともステップ（ｄ）および（ｅ）を繰返すステップをさらに含んでいる請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
比例して着色されるＤＮＡは、フォイルゲン着色剤で着色される請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
調節された画素値から複数の光学的特徴を決定するステップをさらに含んでおり、複数の光学的特徴の少なくとも１つが非線形関数を使用して決定される請求項２４記載の方法。
【請求項３２】
調節された画素値から複数の光学的特徴を決定するステップをさらに含んでおり、複数の光学的特徴の少なくとも１つが線形関数を使用して決定される請求項２４記載の方法。
【請求項３３】
細胞ポピュレーション内における細胞核内部のクロマチン分布を測定する細胞ポピュレーションの値における少なくとも１つのシフトを決定するステップをさらに含んでいる請求項２４記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）ＭＡＣを示す組織サンプルのデジタルサイトメトリックイメージを提供し、
（ｂ）ある定まったＤＮＡ含有量を有するサンプル中の細胞を解析して、ＤＮＡ含有量の光学強度、光学濃度（ＯＤ）および積分された光学濃度（ＩＯＤ）値の少なくとも１つを決定し、それによって初期ＤＮＡ含有量尺度を提供し、
（ｃ）初期ＤＮＡ含有量尺度を調節する測光法的補正ファクタを決定して、その定まったＤＮＡ含有量細胞の補正されたＤＮＡ含有量尺度を提供し、補正されたＤＮＡ含有量尺度は、基準データセット中の実質的に等価なＤＮＡ含有量の細胞に対する基準ＤＮＡ含有量尺度に実質的に等しい相対値を有し、基準データセットはＭＡＣに関連した判別イメージサイトメトリック特徴を含んでおり、
（ｄ）その測光法的補正ファクタをイメージの少なくとも所望の画素に適用して、少なくとも光学濃度スケールで調節された画素値を提供し、それによってＭＡＣに関連した判別イメージサイトメトリック特徴を表す調節されたデータを含む調節されたイメージを提供し、
（ｅ）調節されたデータと基準データセットを組合せて、改善された基準データセットを提供するステップを含んでいるＭＡＣと関連した判別イメージサイトメトリック特徴を含むデータセットを形成する方法。
【請求項３５】
請求項２４記載の方法を実施するコンピュータ実施プログラミングを含んでいるコンピュータ。
【請求項３６】
請求項３４記載の方法を実施するコンピュータ実施プログラミングを含んでいるコンピュータ。
【請求項３７】
請求項２４記載の方法を実施するコンピュータ実施プログラミングを含んでいるコンピュータ読出し可能なメモリ。
【請求項３８】
請求項３４記載の方法を実施するコンピュータ実施プログラミングを含んでいるコンピュータ読出し可能なメモリ。
【請求項３９】
請求項２４記載の方法にしたがって生成されるデータセット。
【請求項４０】
請求項３４記載の方法にしたがって生成されるデータセット。
【請求項４１】
請求項３９記載のデータセットを含むコンピュータ読出し可能なメモリを備えているコンピュータ。
【請求項４２】
請求項４０記載のデータセットを含むコンピュータ読出し可能なメモリを備えているコンピュータ。
【請求項４３】
請求項３９記載のデータセットを含むコンピュータ読出し可能なメモリ。
【請求項４４】
請求項４０記載のデータセットを含むコンピュータ読出し可能なメモリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍に関連した変化を検出するための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的材料のデジタルイメージのコンピュータ解析はイメージサイトメトリとして知られている。イメージサイトメトリにおいて、コンピュータ制御されたカメラが細胞材料の拡大されたイメージを撮影し、その後そのデジタルイメージを解析してオブジェクトの位置を突きとめると共にそれに続いてこれらのオブジェクトの一部を細胞と識別（分類）する。その後、細胞は、その細胞が健康であるか、あるいは癌に罹っているかを決定するような、種々の目的のために検査される。典型的に、生物学的材料は最初に、細胞構造または化学組成をさらによく見えるようにするために着色される。ある着色剤または蛋白質はとくに、細胞のある部分またはそれらの構成成分、たとえば、表面蛋白質またはＤＮＡ等に比例的に結合する。これの１つの例はフォイルゲン着色であり、それはある着色剤をＤＮＡに比例的に結合させ、これは、存在するＤＮＡが多くなるとそれだけ一層暗く着色することを意味する。いくつかの例においては、化学量論的に、と呼ばれることのできるＤＮＡの比例した着色がなされると、１つの細胞の核の中のＤＮＡの全体量および相対的な分布が測定されることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
イメージサイトメトリはＤＮＡ着色細胞を走査して解析するために使用され、それによって、たとえば、その細胞が悪性腫瘍に関連した変化（ＭＡＣ）を有しているか否かを決定することができる；ＭＡＣは癌に罹っていない細胞の中のＤＮＡの空間分布に関連した変化であり、ＭＡＣ変化は、ある癌が別の細胞内に存在しているときに高い頻度で現れる。ＭＡＣは、たとえば、Finch氏他による文献［Malignancy Associated Changes in Buccal Smears,Acta Cytologica 15:46-49(1971)］、およびKlawe氏他による文献［Malignancy Associated Changes(MAC) in Cell of Buccal Smears detected by means of Objective Image Analysis,Acta Cytologica 18:30-33(1974)］、米国特許第 5,889,881号明細書および米国特許第 6,026,174号明細書に記載されている。しかしながら、ＭＡＣの存在を高い信頼性により評価することは困難である。たとえば、フォイルゲン方法を使用したＤＮＡ着色は依然として比例的であるが、しかし温度、化学的濃度、加水分解時間、クロマチンコンパクトネス(compactness)またはその他の要因のちょっとした変化のためにバッチ間において全体的な暗さが異なる可能性がある。
【０００４】
したがって、着色による変化の補正し、あるいは減少させることのできるイメージサイトメトリに適した改善されたコンピュータ実施プログラムが必要とされている。細胞中のＭＡＣを検出する信頼性の高い方法もまた必要とされている。本発明は、これらおよびその他の利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
コンピュータにより実施され、あるいは自動化されたイメージサイトメトリは複雑であるが、しかし有用な解析ツールである。上述したように、サンプルの間の着色のバリエーションは、１つのサンプルを別のものと直接比較し、あるいはあるサンプルを標準と比較することを困難にする。このような着色のバリエーションを克服することにより、細胞核中におけるＤＮＡ分布のかすかな変化および、したがってＭＡＣを検出する能力が増強される。ＭＡＣは、サンプル中の癌に罹った細胞の存在にもっぱら依存する必要なしに患者の癌の確率を検出する可能性を提供する。これにより、癌の診断または検査はさらに実用的で、侵襲性の低い、痛みの少ない、廉価で迅速なものになる。本発明は、強化されたイメージ解析および、したがってＭＡＣの強化された検出を行うコンピュータ、方法システム等を提供する。したがって、これは、癌が初期の、より治療可能な段階で検出される可能性を高め、癌患者および癌検査を受ける患者の負担を軽くする。
【０００６】
１つの特徴において、悪性腫瘍に関連した変化（ＭＡＣ）を決定するための細胞特徴の解析のためにデジタルイメージを測光法的に補正するコンピュータ実施方法が提供される。この方法は、（ａ）ＤＮＡ着色細胞のサンプルの１以上のデジタルイメージを提供し、そのサンプルはある定まったＤＮＡ含有量を有する細胞の基準ポピュレーションを決定するのに十分な細胞を含んでおり、（ｂ）その定まったＤＮＡ含有量の細胞の光学測定値を、ＭＡＣの存在または不在を示す光学測定値を含むことのできる基準データセット内の光学測定値に対応した予め定められたターゲット値に実質的に調節する測光法的補正ファクタを決定し、（ｃ）その測光法的補正ファクタをデジタルイメージの所望の画素に適用して、正規化されたデジタルイメージを提供し、（ｄ）その正規化されたデジタルイメージから光学的特徴を計算し、（ｅ）正規化されたデジタルイメージから決定された光学的特徴を基準データセットと比較して、そのサンプルがＭＡＣを含むことができるか否かを決定するステップを含んでいる。
【０００７】
これおよびその他の実施形態（そうでないと明白に述べられていないか、あるいは文脈から明らかでない限り、本発明の全ての実施形態、アスペクト、特徴等は任意の所望の方法で混合およ調和、組合せおよび置換を行われることができる）において、その定まったＤＮＡ含有量の細胞は二倍性細胞であることが可能であり、測光法的補正ファクタは、サンプル中の二倍性細胞および基準データセット中の二倍性細胞の補正されたＤＮＡ含有量の尺度が約１の相対値を有すると共に、四倍性細胞の補正されたＤＮＡ含有量の尺度が約２の相対値を有するように決定されることができる。この方法はさらに、サンプルが確かにＭＡＣを含んでいるか否かを決定するステップを含むことができる。光学測定は、積分された光学濃度（ＩＯＤ）を測定するステップを含むことが可能であり、基準データセットはターゲットＩＯＤを含むことが可能であり、測光法的補正ファクタはターゲットＩＯＤ／測定されたＩＯＤとして決定されることが可能である。デジタルイメージは光学強度情報を含むことが可能であり、光学強度は光学強度と測光法的補正ファクタを乗算することによって補正されることが可能である。
【０００８】
この方法はさらに、測光法的補正ファクタをイメージ内のオブジェクト中の少なくとも所望の画素に適用するステップおよび光学濃度および積分された光学濃度の少なくとも一方に調節された画素値を与えるステップの少なくとも一方を含むことができる。サンプル中の非常に多くの細胞、たとえば、約２００個多くの細胞の付加的なグループが解析されることができたときに、少なくともステップ（ｂ）および（ｃ）を１回以上繰返すことにより、改善された補正係数が提供されることができる。少なくともステップ（ｄ）および（ｅ）は、改善された調節された画素値を提供すると共に１以上の光学的特徴の改良された決定を行うために改善された補正係数を使用して繰返されることができる。着色されるＤＮＡは、フォイルゲン着色方法またはそうでなければ、吸光、蛍光等の着色剤で着色されることができる。
【０００９】
この方法はさらに、たとえば、既知の光学濃度を有する既知の物質の１以上のデジタルイメージを提供するステップ等の、１以上の制御を提供するステップを含むことができる。制御は、それが着色可能な制御であるならば、組織サンプルと実質的に同時に着色されることができる。この方法はさらに、調節された画素値から複数の光学的特徴を決定するステップを含むことが可能であり、複数の光学的特徴の少なくとも１つが線形または非線形関数を使用して決定される。基準データセットはさらに、基準細胞のデジタルイメージを含むことができる。この方法はさらに、測光法的補正ファクタをイメージ中のオブジェクトの実質的に全ての画素に適用するステップを含むことができる。
【００１０】
サンプルは選択された悪性腫瘍を潜在的に有している患者からのものであることが可能であり、また、サンプルは関連性のない組織からのものであることが可能であり、患者は、体内の癌を有していることが可能であり、関連性のない組織は入手可能または入手不可能な組織であることができる。たとえば、選択された悪性腫瘍は肺癌であることが可能であり、関連性のない組織は口内の粘膜を含んでいることが可能であり、あるいは選択された悪性腫瘍は乳癌であることが可能であり、関連性のない組織は口内の粘膜、ニップルアスピレイト(nipple aspirates)およびダクタルウォッシング(ductal washings)の少なくとも１つを含んでいることが可能である。患者および、したがって実質的に癌に罹っていない組織サンプルは人間であることが可能である。
【００１１】
別の特徴において、ＭＡＣと関連した判別イメージサイトメトリック特徴を含むデータセットを形成する方法が提供される。この方法は、（ａ）比例して着色されたＤＮＡを含む細胞のサンプルのデジタルサイトメトリックイメージを提供し、そのサンプルはある定まったＤＮＡ含有量を有する細胞のＤＮＡ含有量尺度を提供するのに十分な細胞を含んでおり、（ｂ）その定まったＤＮＡ含有量を有する細胞を解析して、ＤＮＡ含有量の光学強度、光学濃度（ＯＤ）および積分された光学濃度（ＩＯＤ）値の少なくとも１つを決定し、それによって初期ＤＮＡ含有量尺度を提供し、（ｃ）初期ＤＮＡ含有量尺度を調節する測光法的補正ファクタを決定して、その定まったＤＮＡ含有量細胞の補正されたＤＮＡ含有量尺度を提供し、その補正されたＤＮＡ含有量尺度は、基準データセット中の実質的に等価なＤＮＡ含有量の細胞に対する基準ＤＮＡ含有量尺度に実質的に等しい相対値を有し、基準データセットはＭＡＣに関連した判別イメージサイトメトリック特徴を含んでおり、（ｄ）その測光法的補正ファクタをイメージの少なくとも所望の画素に適用して、イメージを正規化し、それによって少なくとも光学濃度スケールで調節された画素値を提供し、（ｅ）調節された画素値から決定された光学的特徴を基準データセットと比較し、そこからサンプルがＭＡＣを含むことができることを決定し、（ｆ）調節された画素値からの光学的特徴と基準データセットを組合せて、改善された基準データセットを提供するステップを含んでいる。
【００１２】
この方法はさらに、サンプルがＭＡＣを含んでいることが知られることができるようにサンプルを予め選択するステップを含むことができる。この方法はまた、細胞ポピュレーション内における細胞核内部のクロマチン分布を測定する細胞ポピュレーションの値における少なくとも１つのシフトを決定するステップを含むことができる。
【００１３】
ＭＡＣと関連した判別イメージサイトメトリック特徴を含むデータセットを形成する方法もまた提供される。この方法は、（ａ）ＭＡＣを示す組織サンプルのデジタルサイトメトリックイメージを提供し、（ｂ）ある定まったＤＮＡ含有量を有するサンプル中の細胞を解析して、ＤＮＡ含有量の光学強度、光学濃度（ＯＤ）および積分された光学濃度（ＩＯＤ）値の少なくとも１つを決定し、それによって初期ＤＮＡ含有量尺度を提供し、（ｃ）初期ＤＮＡ含有量尺度を調節する測光法的補正ファクタを決定して、その定まったＤＮＡ含有量細胞の補正されたＤＮＡ含有量尺度を提供し、補正されたＤＮＡ含有量尺度は、基準データセット中の実質的に等価なＤＮＡ含有量の細胞に対する基準ＤＮＡ含有量尺度に実質的に等しい相対値を有し、基準データセットはＭＡＣに関連した判別イメージサイトメトリック特徴を含んでおり、（ｄ）その測光法的補正ファクタをイメージの少なくとも所望の画素に適用して、少なくとも光学濃度スケールで調節された画素値を提供し、それによってＭＡＣに関連した判別イメージサイトメトリック特徴を表す調節されたデータを含む調節されたイメージを提供し、（ｅ）調節されたデータと基準データセットを組合せて、改良された基準データセットを提供するステップを含むことができる。
【００１４】
別の特徴においては、コンピュータ制御されるシステムが提供される。このシステムは、細胞のデジタルイメージを提供するイメージサイトメータと、この明細書に記載されている方法を実施するコンピュータ実施プログラミングを含む実施可能なリンクされた制御装置とを備えている。この明細書に記載されている方法を実施し、あるいはデータセットまたは別の情報を含むコンピュータ実施プログラミングおよびコンピュータ読出し可能なメモリを備えているコンピュータもまた提供される。このような方法にしたがって生成されたデータセットもまた提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のこれらおよびその他の観点、特徴および実施形態は、以下の詳細な説明および添付図面を含むこの明細書内に記載されている。さらに、この明細書には、あるシステム、装置、方法およびその他の情報を詳細に説明する種々の引用が記載されており、このような引用は全て、それがこの明細書中に記載されているか否かにかかわらず、それらの全文ならびにそれらの教示および開示の全てがここにおいて参考文献とされている。  
黒色腫（皮膚癌）のようないくつかの癌に関して、その癌から細胞を直接得ることは必ずしも困難ではないし、患者に対して侵襲的なものでもない。しかしながら、他の多くの癌では、癌から細胞を直接得ることは困難である可能性が高く、また、たとえば、乳癌、肺癌、胃癌および脳癌のような体内の癌については侵襲的なものである。したがって、関連性のあるまたは関連性のない組織中のＭＡＣの検出によって癌を間接的に検出することのできるコンピュータ実施システムを提供することは有効である。本発明は、関連性のあるまたは関連性のない組織中のＭＡＣを測定し、デジタルイメージ中の別の特徴を見出すコンピュータ実施方法およびコンピュータシステムを提供する。
【００１６】
ここで使用される関連性のある組織とは、典型的に、検査されている組織の細胞を含んでいる生物学的サンプルのことである。たとえば、肺からの痰には典型的に肺から剥離した細胞が含まれている。肺癌を検査するとき、痰サンプルは関連性のある組織とみなされる。関連性のある組織の別の例は、乳癌の検出に使用される場合では、ブレストアスピレイトまたはブレストウォッシングである。
【００１７】
ここで使用される関連性のない組織とは、典型的に、検査されている組織の細胞を含んでいない生物学的サンプルのことである。たとえば、乳癌を検出するために痰が使用された場合、肺癌を検出するためにブレストアスピレイトが使用された場合、あるいは肺癌を検出するために口内の粘膜（唇の回り、頬または口の内面をおおう膜）が使用された場合、これらは関連性のない組織とみなされる。
【００１８】
図１は、サンプルを獲得してそれをＭＡＣに関して解析するためのフローチャートの１実施形態を示している。最初に、口内粘膜細胞のような細胞のサンプルが癌の疑いのある患者から獲得される（102）。その後、その細胞が懸濁液中に固定され（104）、その後、顕微鏡スライドのような受け面上において、たとえば、分散されたまたは近似的に単分子層で沈殿させられる（106）。所望ならば、別の処理プロトコルが使用されることができる。ここで使用される着色されたＤＮＡとは、たとえば、ＤＮＡの合計量および、典型的に、細胞核内におけるＤＮＡの空間分布が測定されることを可能にする可視、蛍光、またはその他の着色剤、抗体、ラベルまたはその他のマーカを結合することによって生成された相応して着色されたＤＮＡのことである。このような着色剤の１例は、着色剤としてチオニン（登録商標）を使用するフォイルゲン方法である。一般に、ＤＮＡは、ＤＮＡの量および典型的にはその空間分布ならびにサイズ、形状、テクスチャ等の種々の細胞の特徴が光とサンプルとの間の相互作用に基づいて測定されるように着色される。このような相互作用は、細胞の特徴にアクセスするために透過（たとえば、ＤＮＡ吸光着色剤）、放出（たとえば、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ）等の蛍光着色剤または発光（ルミネセンス）を示すもの）、反射またはその他の放射の形態をとってもよい。
【００１９】
その後、ＤＮＡの量およびＤＮＡの空間分布がイメージサイトメータのような装置によって着色剤を走査して解析することにより細胞単位で決定されることができるように、ＤＮＡは化学量論的にあるいはそうでなければ比例的に着色される（108）。サンプルは細胞の任意のサンプルであることができ、それは典型的に試験管内の細胞であるが、生体内または元の位置の細胞もまた可能である。
【００２０】
ここで使用される制御サンプルとは、細胞ライン、正常な上皮細胞、前に解析されたサンプルまたは較正ビーズ（ｂｅａｄｓ）のような既知の特性を有する生物学的または人工的な材料のサンプルのことである。制御サンプルは、測定システムを含むその方法のある特徴を質的に制御するために使用されることができる。制御サンプルは、たとえば、ＭＡＣを含んでいることが知られている細胞、あるいはＭＡＣを含んでいないことが知られている細胞であることができる。そのような生物学的制御サンプルは成長中の細胞を含んでいることができる。このような場合において、主要な細胞ポピュレーションは典型的に二倍性となるが、いくつかの細胞はＤＮＡ合成が発生している期間中有糸分裂を経験している可能性がある。有糸分裂の完了前に、四倍性細胞が存在し、それは２倍のＤＮＡを有している。これらの四倍性の細胞は典型的に２つの娘細胞に分裂する。ある制御サンプルが着色され（110）、検査サンプルにより処理され、全体的な着色のような方法エラーを示すために使用されてもよい。同様に、制御サンプルは、たとえば、細胞特徴の測定等の測定システムの中の問題を示すために使用されてもよい。その後、サンプルおよび制御サンプルは、サイズ、形状、テクスチャ、ＤＮＡ含有量およびＤＮＡ分布のようなデジタルイメージから細胞特徴を識別するのに十分な測光法的および空間分解能でイメージ化される（112）
たとえば、いくつかの実施形態において、イメージサイトメータは、各画素が幅がほぼ０．３６マイクロメータであり、したがってほぼ０．１μｍ2の０．３６μｍ×０．３６μｍの面積を提供する細胞のデジタルまたは画素化（ｐｉｘｅｌａｔｅ）されたイメージを提供する。正常な細胞はサイズが広範囲にわたって様々であり、したがって核または細胞に対応したデジタルイメージの中の画素の数もそれに応じて様々である。たとえば、正常な上皮細胞核は直径がほぼ８-１０μｍであり、したがってこの分解能における典型的な核のデジタルイメージはほぼ９００画素（３０×３０）を有することができる。所望に応じて、もっと大きいまたは小さいサイズの画素だけでなく、もっと広いまたは狭い面積の細胞もまた使用されることが可能である。
【００２１】
その後、測光法的補正ファクタが計算される（114）。このファクタは、各検査サンプルに対して、サンプルのグループに対して、あるいはそうでなければ所望に応じて独立して計算されることができる。
【００２２】
ここで使用されている光学強度（ＯＩ）とは、たとえば、透過、反射、蛍光、ルミネセンスまたはその他の方法を介して１つのサンプルによって放射された光の生の量の測定値のことである。ＯＩは、１つのオブジェクトのデジタルイメージについて画素単位で測定された生の光を示している。
【００２３】
ここで使用されている光学濃度（ＯＤ）とは、オブジェクトのイメージ画素のＯＩ（背景より小さい値）により除算されたローカル背景のＯＩ（典型的に、比較的大きい値）の値の対数として計算されたＯＤの測定値を意味している。ＯＤ＝ｌｏｇ（ＯＩ 背景／ＯＩ オブジェクト 画素）である。
【００２４】
ここで使用されている積分された光学濃度（ＩＯＤ）とは、オブジェクトイメージの２以上の画素に対するＯＤの和のことである。たとえば、ＩＯＤは、イメージ画素のあるラインまで加算されたＯＤとして、あるいはＤＮＡ着色核のようなあるイメージのある部分に対する全ての画素ＯＤ値の和として計算されることができる。
【００２５】
ある細胞核の内部のＤＮＡの量は、着色された核を通って透過した光の比率を決定することによって測定される（所望ならば、反射率または蛍光のような別のシステムも使用されることが可能である）。その後、光学濃度のようなＤＮＡ含有量のヒストグラムまたはその他の表示がサンプル中の複数の細胞に対して行われる。ある実施形態においては、サンプル当り２００個乃至数千個の細胞が収集され、解析される。その後、そのサンプルは、種々のＤＮＡ量を有する細胞を識別するために、とくに、既知のまたは期待される量のＤＮＡを有する二倍性ピークまたは別のターゲットポピュレーションの積分された光学濃度（ＩＯＤ）を識別するために、たとえば、ヒストグラム等を使用して解析される。
【００２６】
ここで使用されている基準ポピュレーションとは、少なくとも１つの細胞特徴によって決定される１つのサンプル中の細胞のサブポピュレーションのことである。たとえば、サイズ、形状またはテクスチャまたはその組合せにより、正常な上皮細胞のポピュレーションを識別することができる。このような基準ポピュレーションは、基準ＩＯＤのような基準量を決定するために使用されることができる。基準ポピュレーションを決定するために使用されたサンプルはまた、細胞ライン、既知の特性を有する別の細胞または材料のような、サンプルに意図的に追加される細胞のような制御サンプルを含んでいてもよい。
【００２７】
ここで使用されている基準ＩＯＤとは、基準ポピュレーションから得られたＩＯＤ値を意味している。基準ＩＯＤ値は、基準ポピュレーションから導出された平均、モード、中央値または別の値から測定されてもよい。例示のために、このような基準ＩＯＤ値は、ＤＮＡ着色細胞のＩＯＤ対周波数のようなヒストグラムで示されてもよい。
【００２８】
典型的に、サンプルの二倍性ピークは、細胞の最も有力なポピュレーションを表すが、しかしながら、四倍性ピークのような基準ポピュレーションから得られた別の基準ポイントもまた使用されることができる。ここで説明されているように、種々の理由のために、サンプル間あるいはサンプルのバッチ間で着色バリエーションが生じる可能性が高い。したがって、これらのサンプルの中の細胞のイメージを正規化するか、あるいはそうでなければ調節して、それらのＤＮＡ含有量、ＤＮＡ分布またはその他の細胞特徴が直接比較されることを可能にするプロセスを使用して、これらの着色バリエーションを調節することが望ましい。
【００２９】
ここで使用されているターゲットＩＯＤとは、便宜上、計算の容易さのために、あるいはその他の実用的な事項を考慮して選択されたＩＯＤの値、たとえば、１００のＩＯＤのような実験用の定数のことである。ターゲットＩＯＤはまた、既知のまたは期待される特徴を有する制御サンプル、基準ポピュレーションまたは別の有用な材料から得られることもできる。ターゲットＯＩまたはターゲットＯＤのようなその他のターゲット基準もまた適している。
【００３０】
イメージ正規化を行うために、測光法的補正ファクタが所望の各サンプルに対して計算される。たとえば、検査サンプル（基準ポピュレーション）の二倍性ピークで測定されたＩＯＤは１２０であると仮定すると、測光法的補正ファクタは、ターゲットＩＯＤ／その基準ポピュレーションの測定されたＩＯＤとして計算される。この例において、計算は１００／１２０となり、この検査サンプルに対してほぼ０．８３３の測光法的補正ファクタが得られる。この測光法的補正値は、デジタルイメージを正規化し、したがってたとえば、着色バリエーション等による他の細胞特徴（ここで使用されているように、細胞特徴とは細胞のイメージから決定される光学的特徴のことである）だけでなくＤＮＡ含有量に対してもまた補正する方法を提供する。
【００３１】
ここで使用されている基準データセットとは、細胞核のイメージのような情報、またはＭＡＣの存在を示すサイズ、形状、テクスチャ等の単独またはその組合せのような細胞核のイメージから計算された特徴を含む任意の既知のデータセットのことである。このような基準データセットは、コンピュータメモリ中に、ディスクまたは任意の他の有用なデータ記憶媒体上に記憶されていてもよい。たとえば、基準データセットは、細胞特徴の集まり、または細胞特徴の組合せ、あるいは癌に罹っていない個体から得られた種々のサンプルに関して測定された判別関数解析の結果であることができる。このような基準データセットは、たとえば、検査サンプルのＭＡＣ値の比較に使用されることができる。
【００３２】
基準データセットに関する光学濃度または別の光学強度測定は、検査中のサンプルと相関される。
【００３３】
ＭＡＣの判別に適した光学特徴は、実験室で決定されることが可能であり、あるいは上述したFinch氏他による文献、Klawe氏他による文献、米国特許第 5,889,881号明細書、米国特許第 6,026,174号明細書のような文献または特許明細書を参照とすることにより決定されることができる。
【００３４】
その後、測光法的補正ファクタを検査サンプル中の所望の各細胞に対するデジタルイメージの各所望の画素または画素グループのＯＤに適用することによりデジタルイメージの正規化が行われる（116）。このようにしてデジタルイメージは正規化され（116）、それに続いて、正規化されたデジタルイメージから計算された全ての所望の各細胞特徴が自動的に正規化される。これらの正規化された細胞特徴は、細胞を解析して分類し（118）、基準データセットにより表される癌に罹っていない個体と検査サンプルとの間でＭＡＣの存在を比較するために使用されることができる。測光法的補正ファクタは、セグメント化された細胞に、またはそうでなければイメージの残りのものから分離された細胞に、あるいはイメージの中の全てのオブジェクトに、もしくはそうでなければ所望されるイメージに適用されることができる。光学濃度に関して、オブジェクトは、背景より大きい測定値の画素または画素のグループによってイメージで示される。オブジェクトはまた、それら自身がこのような光学密度のものではないが、核の外辺部のようなある構造または定められた境界内にその位置が突きとめられた画素を含んでいる。たとえば、ある細胞内の実質的に空の細胞室に対応した画素は低い光学濃度を有し、したがって実質的に背景の光学濃度に類似しているが、それらの位置は細胞膜内において突きとめられるため、依然としてあるオブジェクト内のものである。なお、この細胞膜はルーチンセグメンテーション技術によって識別されることができる。ＯＤはいくぶん詳細に説明されているが、デジタルイメージを補正し、ＯＩまたはＩＯＤとして表されるデジタルイメージを正規化するために、説明されたような類似の方法が適用されてもよい。同様に、ある例ではＯＤおよび吸光着色剤、ならびに測光法的補正ファクタを求めることが説明されているが（デジタルイメージの正規化を使用してフォイルゲン方法に対する着色バリエーションを補正するために適用されることのできる補正ファクタの一例として）、ここに説明されているコンピュータ化された方法は一般的な方法およびアルゴリズムを提供して、着色のような方法変数を減少させ、とくに、ＤＮＡおよびしたがってＭＡＣの評価（たとえば、診断上使用され、癌を検出し、健康等を評価するための）を改善する。
【００３５】
調節係数とも呼ばれることのできる測光法的補正ファクタをイメージの中のオブジェクト中の所望の画素に適用することにより、少なくとも光学濃度スケールで調節された画素値が与えられ、したがって調節されたイメージが提供される。その後、調節された画素値からのデータまたは光学特徴は、サンプル中の光学特徴を判別し、そこからそのサンプルがＭＡＣを含んでいるか否かを決定するために基準データセット中の光学特徴と比較されることができる。所望ならば、測光法的補正ファクタはまた、光学強度スケールで調節された画素値を提供するために決定され、および、または適用されることが可能であり、これは図１において全体的な特徴の正規化（116）として示されている。その後、イメージは分類され（118）、ＭＡＣがサンプル細胞に関して測定されることができる（120）。所望ならば、さらに、その細胞内の正常な発現パターンを補正するためにＭＡＣ発現データがポピュレーション統計と比較され、しきい値化されることができる（122）。
【００３６】
図２は、本発明の特徴正規化または補正アスペクトの１実施形態に関するフローチャートを示している。最初に、意図された解析に適した十分な測光法的および空間分解能で捕捉された細胞学的材料の少なくとも１つのデジタルイメージが提供される（202）。このイメージは適切な疑わしい組織からのものであることができる。ＭＡＣの決定に関しては、組織は典型的に実質的に癌に罹っていない組織から選択されるが、本発明の方法およびシステムのあるアスペクトは、癌に罹ったまたは癌に罹っていない組織の一方または両方を含むサンプルに適用されることができる。そのサンプルは、サイズ、形状、テクスチャ、ＤＮＡ含有量等のような細胞特徴を測定して、その細胞のある基準ポピュレーションを識別するのに十分な、比例的に着色されたＤＮＡを有する細胞を含んでいる。
【００３７】
細胞が解析され、１以上の細胞特徴または細胞特徴の組合せに基づいてオブジェクトイメージがグループ化される（たとえば、基準ポピュレーションを規定するために）（204）。その後、たとえば、二倍性細胞のような基準ポピュレーションが、その基準ポピュレーションの平均、モード、ピークまたは中央値ＩＯＤのようなポピュレーション値から測定された基準ＩＯＤを決定するために解析される（206）。
【００３８】
次に、測光法的補正ファクタのような調節係数が決定される（208）。この例において、測光法的補正ファクタは、ターゲットＩＯＤ／基準ＩＯＤから計算される。続いて、この測光法的補正ファクタがサンプルからの所望の各デジタルイメージの所望の画素に適用される（210）。この例の中の調節係数の例（測光法的補正ファクタ）は所望のデジタルイメージを正規化し、したがってその細胞中のＤＮＡの量による光学濃度の差とは対照的に、着色バリエーションまたは別の人為結果による光学濃度または着色剤の濃さの差を補正するであろう。所望の画素は典型的に、所望ならば、もっと大きいまたは小さいサブセットが選択されることが可能であるが、１つの細胞核のデジタルイメージのような、１つのオブジェクト境界内の全ての画素または所望のグループの画素である。
【００３９】
次に、ステップ212において、細胞特徴が調節された画素（正規化されたイメージ）から計算される。イメージ正規化の結果、正規化されたイメージから計算された全ての細胞特徴は自動的に補正される。これらの補正された特徴は、その後細胞または細胞のグループをさらに識別する分類手段を形成するために単独でまたは組合せて使用される。その後、分類手段によって達成された細胞または細胞のグループから得られた値は、サンプル中の１以上の細胞の中のＭＡＣの存在または不在のような診断情報を決定するために基準データセットと比較される（214）。ＭＡＣの決定は、個々の細胞または細胞のポピュレーションについての細胞特徴または細胞特徴の組合せの解析を含むことができ、したがって基準データセットと比較されることができる。その後、ＭＡＣの決定により、悪性腫瘍が患者の中に認められたか否かが決定され、その患者がＭＡＣ特性の増加を示した場合、その患者が肺癌、乳癌、皮膚癌、脳癌またはその他の癌のような癌に罹っている可能性が高くなる。
【００４０】
図３ａおよび３ｂは、補正前および後の積分された光学濃度（ＤＮＡ含有量）ヒストグラムを示すグラフである。図３および４に示されているように、光学的評価は、細胞の積分された光学濃度に基づくことが可能である。別の実施形態においては、光学的評価は、１つのライン、列または別の有用な組合せの中におけるもののような所望の画素の光学濃度、光学強度または積分された光学濃度に基づくことが可能である。
【００４１】
図３ａにおいて、細胞のＤＮＡ含有量ヒストグラム301は二倍性領域302を有し、この二倍性領域302のピーク305の両側には２つのＳＤが広がっている。示されているサンプルにおいては、大部分の細胞は二倍性領域302の範囲に入っている。いくつかの細胞はＤＮＡ合成303内にあり、さらに別のものはＤＮＡ合成を完了しており、四倍性領域304の範囲に入っている。化学量論に基づくと（および測定装置に対して線形性であると仮定すると）、ピークポピュレーションＩＯＤ304の値は、二倍性ピーク305の２倍のピーク値のＩＯＤになり、所望ならば非線形的な関係が定められることが可能であり、それにしたがって種々の方法が採用される。制御サンプル（基準）のピークＩＯＤは、符号306により示されている。
【００４２】
図３ｂは、ＤＮＡ二倍性ピーク305が２０％下方に補正されてターゲットＩＯＤ値306と一致するように測光法的補正ファクタにより補正された図３ａのＤＮＡヒストグラムを示している。それ故、この検査サンプルにはほぼ０．８３３（すなわち、１００／１２０）の測光法的補正ファクタが必要とされ、この測光法的補正ファクタはそれに続いて、ヒストグラム301において表されているあらゆる所望の細胞のＩＯＤ測定に適用され、それによって符号307で示されているように検査サンプル中の全ての所望の細胞に対する補正されたＩＯＤを提供することができる。
【００４３】
したがって、サンプルおよびターゲットＩＯＤの基準ポピュレーションの相対的な強度値は、細胞中のＤＮＡの量に基づいて細胞の光学濃度に関して実質的に等しくされる。
【００４４】
ヒストグラムの統計学的な正確さは、付加的なデータが収集されるにしたがって変化する。それ故、いくつかの実施形態において、サンプルＩＯＤは繰返し補正されることができる。このような繰返しは、所望ならば、ある条件が満足されるまで続けられることができる。たとえば、測光法的補正は、２００個の細胞のグループが二倍性領域またはピークにおいて累算された後に行われ、そのサンプルからの２００個の細胞の、この領域における位置が突きとめられるまで続けられてもよい。この迅速なプロセスの１つの利点は、イメージ獲得およびしきい値化を修正して残骸（ｄｅｂｒｉｓ）の獲得を減少させるか、そうでなければデータ収集および解析の効率を改善することができることである。
【００４５】
図４は、セルテクスチャ特徴を決定する一例を示している。光学濃度（ＯＤ）は細胞核のデジタルイメージ402に沿って測定され、画素ＯＤはライン404に沿って合計される。示されている積分のライン404は矢印406によって示された方向に左から右にイメージを横切って移動し、それによってプロファイル408を形成し、完成したものは完成プロファイル410として示されている。
【００４６】
図５のａおよびｂは、図４において走査されたもののようなＤＮＡ着色細胞核の対応したデジタルイメージ図502と、516とを示している。
【００４７】
図５のａの典型的なデジタルイメージ502において、全てのイメージ画素は光学濃度（ＯＤ）を有している。同じＯＤを有する典型的な画素グループ506は、そのデジタルイメージにわたって分布されているものとして示されている。解析ライン504は、合計される画素の列を示し、したがってその列に対する積分された光学濃度（ＩＯＤ）を発生する。解析ライン504がデジタルイメージ502を横切って移動するにしたがって、各列に対するＩＯＤ値が計算され、ヒストグラム508に与えられる。下方のテーブル510には、デジタルイメージ502から採取され、ヒストグラム508によって表されたこれらのＩＯＤ値の数値表現が示されている。
【００４８】
種々の細胞特徴がデジタルイメージから計算されることができる。この例においては、ＩＯＤ値の隣接した列の間の数値の差が合計され、これらの値のそれぞれが２乗される。ヒストグラム508の中の隣接したものの間のＩＯＤ差が計算される（たとえば、ＡＢの差は１２０−７２＝４８である）。その後、この例示的な細胞特徴計算において、これらの差が２乗されて合計され、その結果単一の典型的な特徴値512を生成し、それはこの例において１２，０５６の値を有する細胞特徴である。
【００４９】
図４からの０．８３３のような補正ファクタがこの２乗されて合計された値（１２，０５６）と乗算することにより適用された場合、結果的に１０，０４３の値を有する新しい特徴値514が得られる。
【００５０】
図５のｂは、デジタルイメージ502を正規化することにより、あるいは測光法的に補正することにより得られた調節されたデジタルイメージ516を示している。このイメージは、特徴計算の前に測光法的補正ファクタ（０．８３３）により画素ＯＤおよび合計されたＩＯＤを調節することにより補正された。
【００５１】
図５のｂは、デジタルイメージ502中の所望の各画素ＯＤが０．８３３の補正ファクタと乗算されて正規化されたデジタルイメージ516を生成することを示している。このプロセスはさらにＯＤ520を有する典型的な画素値について見られ、このＯＤ520は、処理されたデジタルイメージ516中においてＯＤ値518を生成するように補正される。補正ファクタがデジタルイメージ502の全ての所望の画素のそれぞれに適用されると（全体的なイメージ正規化と呼ばれるプロセス）、結果的に得られるデジタルイメージ516は正規化されていると言うことができる。
【００５２】
図５のａにおけるように、図５のｂの正規化されたデジタルイメージ516中の画素の各列に対するＯＤ値は合計されて、その列に対するＩＯＤ値を生成する。これはさらに、デジタルイメージの下方に示されているＩＯＤヒストグラム520によって表されている。その後、ＩＯＤヒストグラム520に表され、テーブル522に数値形態で示された正規化されたデジタルイメージ516から得られたＩＯＤ値に対して、図５のａにおいて適用された同じ計算が適用される。この例において、この計算は同じ典型的な細胞特徴に対して８，４００の値524を生成し、これは、１２０５６の値512または１００４３の値を有する直接補正された特徴514とは異なっており、また、それよりも典型的である。イメージ正規化に続いて、計算された細胞特徴は自動的に正規化され、したがって着色によるバリエーションの影響を受けないイメージの光学アスペクトをさらに厳密に表す。これらの正規化された（または  補正された）細胞特徴はそれらの判別パワーを保持し、サンプルの間の差がさらに良好に測定されることを可能にする。細胞核中のＤＮＡの空間分布の測定により部分的に示される悪性腫瘍に関連した変化のようなかすかな細胞特徴の測定を試みるとき、このような測光法的補正およびデジタルイメージ正規化はとくに適したものとなる可能性がある。同様に、着色バリエーションを補正することに加えて、一般的な方法は、別の方法に関連した変数を補正するのを助ける調節係数を計算する方法を提供する。
【００５３】
イメージデータの調節と同様に、基準データセットは、正常なまたはＭＡＣ細胞（または調べられている別の特徴）から付加的な情報が得られたときに続いて正規化、調節、更新を不連続的にあるいは連続的に行われてもよいイメージまたは特徴を含むことができる。したがって、所望ならば、基準データセットおよびサンプルイメージの両者が迅速に、不連続的に、あるいは連続的に、もしくはそうでなければ所望に応じて更新されることができる。
【００５４】
図６は、肺癌を検出するために、たとえば、口内粘膜等におけるＭＡＣを決定するための計算ステップを含むフローチャートを示している。この図は、細胞特徴の１つのタイプの計算を示しており、別の多くの細胞特徴は典型的に計算されてグループ化され、決定が行われることを可能にする判別関数（たとえば、細胞分類手段）を形成し、上皮細胞のような細胞タイプを識別するために、たとえば、形状、サイズおよび示されている細胞テクスチャ特徴が使用されてもよい。図６においては、イメージデータ収集（602）に続いて、基準ポピュレーションの決定（603）および測光法的補正ファクタの計算（604）が行われる。これらは、この明細書の他の箇所において、たとえば図１および２を参照して説明されており、以下においてさらに詳細に説明される。決定ポイント606においては、少なくとも１つの選択された基準が満足されたか否かが決定される。満足された場合、示されている実施形態においては、イメージが全体的なイメージ正規化608を適用され、続いて特徴計算610が行われる。決定ポイント612において、そのオブジェクトは細胞であるか、あるいは人為結果であるかが決定され、それが細胞ならば、決定ポイント614において、その細胞が解析され、それが、たとえば、二倍性特徴を有する正常な上皮細胞等の、捜し求められている細胞のタイプであるか否かが決定される。示されている実施形態においては、その後、ＭＡＣスコアが細胞ごとに計算され（616）、また、スライドごとにポピュレーション統計に基づいて計算される（618）。ＭＡＣスコアのようなスライドに対して計算された統計は、基準データセットと比較され（619）、結果が出力され（620）、それによってサンプル中におけるＭＡＣの存在または不在を示し、あるいは別の診断情報を出力する。
【００５５】
ある実施形態の別の説明によると、本発明は、イメージ認識においてあるいは別の目的に有用である細胞またはさらに一般的には光学特徴を決定するためのコンピュータ実施方法に関する。ある実施形態においては、この方法は、実質的に癌に罹っていない組織サンプルのデジタルサイトメトリックイメージの解析および、所望ならば、捕獲を含んでいる。組織サンプルは、たとえば、バイオプシを介して切除された組織から獲得され、細い針による吸引によって痰、組織をこすり取ったもの、ニップルアスピレイトから獲得され、あるいは、そうでなければ、所望に応じて獲得されることができる。サンプルは、癌に罹っている可能性のある患者から、治療を監視するためにフォローアップの一部として患者から、残りの疾病の検出または健康の評価を行うために患者から、あるいは喫煙者のような高リスクのグループを検査するために、もしくはそうでなければ所望に応じて獲得されることができる。この方法はまた全ての組織およびその他種々の化学種に適用されることができる。
【００５６】
サンプルは、あるＤＮＡ含有量を有する細胞の基準ポピュレーションを決定するのに十分な細胞を含んでいる。その細胞は典型的に、着色剤の量が細胞中のＤＮＡの量に比例するように比例的に着色されている。このような化学量論的着色剤の例には、フォイルゲン着色剤およびその他の着色剤、ラベル、マーカ等が含まれる。
【００５７】
１つの特徴において、本発明はＭＡＣ指示特徴を含む基準データセットを提供し、この場合、ＭＡＣを示した細胞からデータを累算することにより時間と共に基準データセットが生成される。細胞のデジタル化されたイメージは、ここで上述した方法にしたがって、あるいはそれらが基準データセット中に取り入れられて改善されたデータセットを提供することによって正規化される。したがって、ＭＡＣを決定する方法に加えて、本発明はさらに、コンピュータ実施プログラミング、コンピュータ読出し可能なメモリ、ならびにこのようなプログラミングおよびメモリを備えたコンピュータを提供する（ここで使用されているように、コンピュータまたは制御装置は個々のコンピュータ、あるネットワークの一部であるコンピュータ、周辺機器を備えたコンピュータ、または本発明による使用に適したその他の任意の論理実施装置を備えている）。したがって、基準データセットは、ＭＡＣに関連した判別イメージ化サイトメトリック特徴を含んでいる。
【００５８】
測光法的補正ファクタは、二倍性細胞が基準データセットと相対的に同じであり、たとえば、それぞれが１または１００で設定され、四倍性ピークを有する二倍性細胞に対しては２または２００で設定されたＤＮＡ含有量の値を有するように光学測定値を調節する。したがって、あるＤＮＡ含有量の細胞の光学測定値は、ＭＡＣの存在または不在を示す光学測定値を含む基準データセット内の光学測定値に対応した予め定められたターゲット値に実質的に調節される。さらに、基準データセットは、直接的に、あるいはこのような特徴に関するデータセットを参照することによってＭＡＣに対する判別特徴を含むことができる（たとえば、測光法的補正ファクタはＭＡＣを含む基準データセット自身に直接的に、あるいはサンプルおよびＭＡＣデータセットが共に正規化される中間データセットを介して適用されることができる）。これは新しいサンプルの着色レベルを、観察され、あるいは平均化され、そうでなければサンプルデータセット中の獲得された着色のレベルに一致させる。
【００５９】
その後、測光法的補正ファクタは、イメージの中の任意の所望の画素に適用され、少なくとも光学濃度スケールで調節された画素値を提供し、それによって正規化されたデジタルイメージを提供する。典型的に、所望の画素はオブジェクト中においてその位置を決定され、これは背景より低い強度レベルを有する（すなわち、背景より透過率が低い）イメージ内の何か、あるいは細胞膜またはその他の部分的または全体的な周囲の外辺部のような任意の領域内の何かを示している。たとえば、核、核仁または細胞質のイメージにおいては、イメージのいくつかは背景と実質的に同じである強度レベルまたは光学濃度を有する可能性があるが、しかしながら、画素は１つのオブジェクト内に位置されており、したがって実際にはある細胞の一部である。典型的に、調節された画素値は最初に光学濃度スケールで計算され、その後、所望された場合に光学強度スケールで計算される。その後、これは調節されたイメージを提供する。次に、調節された画素値またはイメージからのデータまたは光学特徴は、サンプル中の光学特徴を弁別するために基準データセットと比較される。このような光学特徴から、そのサンプルがＭＡＣを含んでいる可能性が決定されることができる。換言すると、光学特徴は正規化されたデジタルイメージから計算され、その後正規化されたイメージから決定された光学特徴は、そのサンプルがＭＡＣを含んでいるか否かを決定するために基準データセットと比較される。
【００６０】
典型的に、光学強度、光学濃度、ＩＯＤ、補正されたＤＮＡ含有量の尺度等は、所定の尺度または値を測光法的補正ファクタにより乗算することによって補正されてもよい。光学測定は、積分された光学濃度（ＩＯＤ）の測定を含むことができ、基準データセットはターゲットＩＯＤを含むことができ、測光法的補正ファクタはターゲットＩＯＤ／測定されたＩＯＤとして決定されることができる。デジタルイメージは光強度情報を含み、その光強度は測光法的補正ファクタと乗算されて補正される。
【００６１】
ある実施形態においては、その方法の種々の特徴は繰返し適用されることができる。たとえば、初期ＤＮＡ含有量尺度を決定するためにＤＮＡ含有量細胞を解析し、測光法的補正ファクタを決定することは少なくとも１回繰返されることができる。これは、所望された数の追加の細胞が走査されるか、あるいはイメージ化され、したがって解析の準備が整うためである。たとえば、このような細胞グループは、イメージ化される細胞を約５０、１００、２００、５００、または１０００個多くサンプル中に含むことができる。
【００６２】
所望された場合には、測光法的補正ファクタをオブジェクト中の所望の画素に適用して調節された画素値からのデータを基準データセットと比較する特徴もまた、各繰返しにより反復されることができる。所望された場合、その方法の種々のアスペクトの繰返しの反復は、１対１の割合で繰返されることが可能であり、あるいはある特徴は別の特徴より多いまたは少ない頻度で繰返されることができる。このような繰返しにより、調節された画素値が改善されると共に、ＭＡＣに関連した少なくとも１つの光学特徴および、好ましくは、ＭＡＣに関連した複数の光学特徴の決定が改善されることができる。
【００６３】
典型的に、調節は、イメージ内のオブジェクト中の実質的に全ての画素、さらに好ましくは、このようなオブジェクト中の全ての画素に測光方法的補正ファクタを適用することにより行われる。所望ならば、測光方法的補正ファクタは、イメージ内の全ての画素がオブジェクト中のものであろうがなかろうが、それらに適用されることができる。
【００６４】
ある実施形態においては、１以上の制御サンプルが提供されることができる。制御サンプルは、既知の光学濃度を有する既知の物質の少なくとも１つのピクセレート（ｐｉｘｅｌａｔｅ）されたサイトメトリックイメージを提供する。制御サンプルは、サンプルとは別に保持されることもできるし、あるいはサンプルと同時にまたは連続して着色されることもできる。制御サンプルは、着色可能な物質であってもよいし、あるいはそうでなくてもよい。ＭＡＣに関連した光学特徴は、非線形関数または線形関数のいずれかを使用して決定されることができる。所望ならば、別の関数もまた使用されることができる。ＭＡＣの決定には、細胞ポピュレーション内における細胞核内のクロマチン分布を測定する細胞ポピュレーションの値における少なくとも１つのシフトを決定することが含まれてもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態において、患者は特定の選択された悪性腫瘍を有するのではないかと疑われることが可能であり、サンプルは関連性のある、または関連性のない組織からのものであることができる。たとえば、選択された悪性腫瘍は体内の癌であることができ、これは、その位置が身体内に確認され、外科医による侵襲的な処置なしでは容易に到達することのできない癌を示す。例示的な体内の癌には肺癌および乳癌が含まれるが、しかし皮膚または唇の癌は含まれない（黒色腫または唇の癌が皮下深くに位置しているために、健康な組織を著しい破壊することを必要とするか、あるいはその癌のサンプルを獲得するために患者に著しい苦痛を与えるのでない限り）。利用可能な組織は、たとえば、皮膚、口内粘膜、ニップルアスピレイトおよびダクタルウォッシング等の、外科医が容易に入手できる組織を示している。いくつかの実施形態においては、集合性の悪性腫瘍は肺癌であり、関連性のない組織は口内粘膜であり、一方別の実施形態においては、選択された悪性腫瘍は乳癌であり、関連性のない組織は口内粘膜、ニップルアスピレイトおよびダクタルウォッシングズの任意の１つである。患者は任意の適切な動物であることができるが、しかし典型的に人間である。
【００６６】
さらに、本発明は、細胞のピクセレートされたイメージを提供するイメージサイトメータと、この明細書に記載された方法を実施するコンピュータ実施プログラミングを含む実施可能にリンクされた制御装置とを備えたコンピュータ制御されたシステムを提供する。この明細書に記載された処理手順を含み、これを実施し、およびまたはここに記載された基準データセットを含み、これを実施するコンピュータメモリだけでなく、コンピュータまたは制御装置自身もまた提供される。
【００６７】
ここで使用されている全ての用語は、文脈または定義がそうでないことを示さない限り、それらの通常の意味にしたがって使用される。また、請求の範囲内を除いて、そうでないことが示されない限り、“または”の使用は“および”を含み、その逆もそうである。非制限的な用語は、明白に述べられない限り、制限するものとして解釈されてはならない（たとえば、“含む”、“有する”および“備える”は、そうではないと明白に述べられない限り、“制限無しに含む”を意味する）。
【００６８】
本発明の技術的範囲には、手段プラス機能とステッププラス機能の両概念が含まれている。しかしながら、この明細書に記載されている用語は、“手段”という単語がある請求項の中でとくに記載されない限りは請求の範囲において“手段プラス機能”関係を示すものとして解釈されてはならず、また、“手段”という単語がある請求項の中でとくに記載されている場合は請求の範囲において“手段プラス機能”関係を示すものとして解釈されるべきである。同様に、この明細書に記載されている用語は、“ステップ”という単語が請求項の中でとくに記載されない限りは、方法またはプロセスの請求項において“ステッププラス機能”関係を示すものとして解釈されてはならず、また、“ステップ”という単語がある請求項の中でとくに記載されている場合は請求の範囲において“ステッププラス機能”関係を示すものとして解釈されるべきである。
【００６９】
上記のように、ここでは説明のために本発明の特定の実施形態が説明されているが、本発明の技術的範囲を逸脱することなく種々の変更が可能であることが認識されるであろう。したがって、本発明はこのような変更ならびにこの明細書に記載されている内容の置換および組合せを含んでおり、添付された請求の範囲による以外には何等制限を受けない。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ＭＡＣの決定のフローチャート。
【図２】イメージサイトメータからのイメージ中の画素の調節に関するフローチャート。
【図３ａ】口内粘膜の細胞のＤＮＡ含有量ヒストグラム。
【図３ｂ】図３ａのＤＮＡ含有量ヒストグラムの測光法的補正を示すグラフ。
【図４】細胞のサイトメトリックイメージ化、およびそのイメージ化により行われる光学濃度走査を示す概略図。
【図５】コンピュータにより実施されるイメージおよび特徴正規化の前（ａ）および後（ｂ）に示される細胞のデジタルイメージの概略図。
【図６】細胞サンプル内のＭＡＣを決定する決定ツリーのフローチャート。
【図１】
2005536752.tif 000003
【図２】
2005536752.tif 000004
【図３ａ】
2005536752.tif 000005
【図３ｂ】
2005536752.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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