(57)【要約】  本発明は、光レセプター特異的調節配列、膜結合ポリペプチド、および光レセプター外側セグメント標的化シグナルをコードする核酸を含むトランスジーン構築物を提供する。例えば、本発明は、ロドプシンプロモーター、膜結合ポリペプチド、および杆状体外側セグメント（ＲＯＳ）標的化シグナルをコードする核酸を含むトランスジーン構築物を提供する。さらに、本発明は、杆状体外側セグメント（ＲＯＳ）標的化シグナル含むポリペプチドコードするトランスジーンを含む遺伝子標的化構築物を提供する。このトランスジーンは、ロドプシン遺伝子に相同的な５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列に隣接している。この構築物とロドプシン遺伝子との間の相同性組換えは、トランスジーンとロドプシン特異的調節配列との間の作動可能な連結を生じる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジーン構築物であって、該構築物は、光レセプター特異的調節配列、膜結合ポリペプチド、および光レセプター外側セグメント標的化シグナルをコードする核酸を含み、ここで、該ポリペプチドがオプシンではない、構築物。
【請求項２】
前記光レセプターが、杆状体細胞である、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記光レセプターが、錐状体細胞である、請求項１に記載の構築物。
【請求項４】
前記光レセプター特異的調節配列が、ロドプシンプロモーターである、請求項１に記載の構築物。
【請求項５】
前記光レセプター特異的調節配列が、錐状体色素プロモーターである、請求項１に記載の構築物。
【請求項６】
前記光レセプター特異的調節配列が、脊椎動物に由来する、請求項１に記載の構築物。
【請求項７】
前記光レセプター特異的調節配列が、カエルに由来する、請求項６に記載の構築物。
【請求項８】
前記光レセプター特異的調節配列が、マウスに由来する、請求項６に記載の構築物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）である、請求項１に記載の構築物。
【請求項１０】
前記ＧＰＣＲが、カンナビノイドレセプターである、請求項９に記載の構築物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、融合ポリペプチドである、請求項１に記載の構築物。
【請求項１２】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、配列番号４を含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項１３】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、配列番号１０を含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項１４】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、カエルロドプシン遺伝子またはカエル錐状体色素遺伝子に由来する、請求項１に記載の構築物。
【請求項１５】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、マウスに由来する、請求項１に記載の構築物。
【請求項１６】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、マウスロドプシン遺伝子またはマウス錐状体色素遺伝子に由来する、請求項１５に記載の構築物。
【請求項１７】
請求項１の構築物を含むベクター。
【請求項１８】
請求項１の構築物を含む細胞。
【請求項１９】
脊椎動物の細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
カエルの細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
マウスの細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２２】
前記細胞がマウスの体内にある、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２３】
前記細胞が、マウスから単離される、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２４】
杆状体細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２５】
錐状体細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２６】
請求項２４に記載の細胞からの抽出物であって、該抽出物が、該細胞の外側セグメント膜を含む、抽出物。
【請求項２７】
請求項２５に記載の細胞からの抽出物であって、該抽出物が、該細胞の外側セグメント膜を含む、抽出物。
【請求項２８】
実質的に精製されたトランスジーンポリペプチドであって、該ポリペプチドは、請求項２４に記載の細胞またはそれらの抽出物から単離される光レセプター外側セグメント標的化シグナルを含む、ポリペプチド。
【請求項２９】
実質的に精製されたトランスジーンポリペプチドであって、該ポリペプチドは、請求項２５に記載の細胞またはそれらの抽出物から単離される光レセプター外側セグメント標的化シグナルを含む、ポリペプチド。
【請求項３０】
前記細胞が、オプシン遺伝子の機能的破壊をさらに含む、請求項１８に記載の細胞。
【請求項３１】
そのゲノムが、請求項１に記載の構築物を含む脊椎動物。
【請求項３２】
前記脊椎動物がマウスである、請求項３１に記載の脊椎動物。
【請求項３３】
前記脊椎動物がカエルである、請求項３１に記載の脊椎動物。
【請求項３４】
請求項３１の脊椎動物から単離される、杆状体細胞またはその外部膜抽出物。
【請求項３５】
実質的に精製されたトランスジーンポリペプチドであって、該ポリペプチドは、請求項３１に記載の脊椎動物に由来する、光レセプター細胞またはその抽出物から単離される、光レセプター外側セグメント標的化シグナルを含む、ポリペプチド。
【請求項３６】
遺伝子標的化構築物であって、該構築物は、光レセプター外側セグメント標的化シグナルを有する膜結合ポリペプチドをコードするトランスジーンを含み、ここで、該トランスジーンは、ロドプシン遺伝子に相同的な５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列に隣接しており、
ここで、該構築物とロドプシン遺伝子との間の相同性組換えが、該トランスジーンとロドプシン特異的調節配列との間の作動可能な連結を生じ、そして該ポリペプチドがロドプシンではない、構築物。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）である、請求項３６に記載の構築物。
【請求項３８】
前記ＧＰＣＲが、カンナビノイドレセプターである、請求項３７に記載の構築物。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、融合タンパク質である、請求項３６に記載の構築物。
【請求項４０】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、配列番号４を含む、請求項３６に記載の構築物。
【請求項４１】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、配列番号１０を含む、請求項３６に記載の構築物。
【請求項４２】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、カエルロドプシン遺伝子またはカエル錐状体色素遺伝子に由来する、請求項３６に記載の構築物。
【請求項４３】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、マウスロドプシン遺伝子またはマウス錐状体色素遺伝子に由来する、請求項３６に記載の構築物。
【請求項４４】
ポジティブ選択マーカーをさらに含む、請求項３６に記載の構築物。
【請求項４５】
前記ポジティブ選択マーカーが、ネオマイシン耐性遺伝子である、請求項４４に記載の構築物。
【請求項４６】
前記ポジティブ選択マーカーが、ｌｏｘＰ部位に隣接する、請求項４４に記載の構築物。
【請求項４７】
ネガティブ選択マーカーをさらに含む、請求項３６に記載の構築物。
【請求項４８】
前記ネガティブ選択マーカーが、ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子である、請求項４７に記載の構築物。
【請求項４９】
前記ロドプシン特異的調節配列が、ロドプシンプロモーターを含む、請求項３６に記載の構築物。
【請求項５０】
前記５’隣接ＤＮＡ配列が、マウスロドプシンプロモーターを含む、請求項３６に記載の構築物。
【請求項５１】
前記３’隣接ＤＮＡ配列が、マウスロドプシンのエキソン１の一部分を含む、請求項３６に記載の構築物。
【請求項５２】
前記３’隣接ＤＮＡ配列が、マウスロドプシンのエキソン２を含む、請求項３６に記載の構築物。
【請求項５３】
請求項３６に記載の構築物を含む、ベクター。
【請求項５４】
請求項３６に記載の構築物を含む、細胞。
【請求項５５】
ゲノムが、以下：
ａ）内因性ロドプシン遺伝子対立遺伝子の一方またはその両方の機能的分裂、および
ｂ）ロドプシン特異的調節配列と作動可能に連結した光レセプター外側セグメント標的化シグナルを含む膜結合ポリペプチドをコードするトランスジーン、
を含むマウス細胞であって、
ここで、該ポリペプチドがロドプシンではない、マウス細胞。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが、ＧＰＣＲである、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５７】
前記ＧＰＣＲが、カンナビノイドレセプターである、請求項５６に記載の細胞。
【請求項５８】
前記ポリペプチドが、融合タンパク質である、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５９】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、配列番号４を含む、請求項５５に記載の細胞。
【請求項６０】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、配列番号１０を含む、請求項５５に記載の細胞。
【請求項６１】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、カエルロドプシン遺伝子またはカエル錐状体色素遺伝子に由来する、請求項５５に記載の細胞。
【請求項６２】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、マウスロドプシン遺伝子またはマウス錐状体色素遺伝子に由来する、請求項５５に記載の細胞。
【請求項６３】
前記ゲノムが、内因性ロドプシン遺伝子対立遺伝子の一方またはその両方の機能的分裂を含む、請求項５５に記載の細胞。
【請求項６４】
前記トランスジーンが、内因性ロドプシン遺伝子対立遺伝子の一方またはその両方へと挿入される、請求項５５に記載の細胞。
【請求項６５】
胚性幹細胞である、請求項５５に記載の細胞。
【請求項６６】
前記細胞がマウスの体内にある、請求項５５に記載の細胞。
【請求項６７】
前記細胞が、マウスから単離される、請求項５５に記載の細胞。
【請求項６８】
杆状体細胞である、請求項５５に記載の細胞。
【請求項６９】
前記細胞の外側セグメント膜を含む、請求項６８に記載の細胞の抽出物。
【請求項７０】
実質的に精製されたトランスジェニックポリペプチドであって、該ポリペプチドは、請求項６８に記載の杆状細胞またはそれらの抽出物から単離される光レセプター外側セグメント標的化シグナルを含む、ポリペプチド。
【請求項７１】
以下：
ａ）内因性ロドプシン遺伝子対立遺伝子の一方またはその両方の機能的分裂、および
ｂ）ロドプシン特異的調節配列と作動可能に連結した光レセプター外側セグメント標的化シグナルを含む膜結合ポリペプチドをコードするトランスジーン、
を含むゲノムを有するマウスであって、
ここで、該ポリペプチドがロドプシンではない、マウス。
【請求項７２】
前記ポリペプチドが、ＧＰＣＲである、請求項７１に記載のマウス。
【請求項７３】
前記ＧＰＣＲが、カンナビノイドレセプターである、請求項７２に記載のマウス。
【請求項７４】
前記ポリペプチドが、融合タンパク質である、請求項７１に記載のマウス。
【請求項７５】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、配列番号４を含む、請求項７１に記載のマウス。
【請求項７６】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、配列番号１０を含む、請求項７１に記載のマウス。
【請求項７７】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、カエルロドプシン遺伝子またはカエル錐状体色素遺伝子に由来する、請求項７１に記載のマウス。
【請求項７８】
前記光レセプター外側セグメント標的化シグナルが、マウスロドプシン遺伝子またはマウス錐状体色素遺伝子に由来する、請求項７１に記載のマウス。
【請求項７９】
前記ゲノムが、内因性ロドプシン遺伝子対立遺伝子の両方の機能的分裂を含む、請求項７１に記載のマウス。
【請求項８０】
前記トランスジーンが、内因性ロドプシン遺伝子対立遺伝子の一方またはその両方に挿入される、請求項７１に記載のマウス。
【請求項８１】
請求項７１に記載のマウスから単離された、杆状体細胞、またはそれらの外膜抽出物。
【請求項８２】
実質的に精製されたトランスジェニックポリペプチドであって、該ポリペプチドは、請求項８１に記載の杆状体細胞またはそれらの抽出物から単離されるＲＯＳ標的化シグナルを含む、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般的に、タンパク質構造生物学および医薬設計に関し、より具体的には、同種のタンパク質を生成および単離するために適切なＤＮＡ構築物、細胞および動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景情報）
膜タンパク質は、細胞連絡、電気的バランスおよびイオンバランス、細胞の構造完全性、細胞接着、および他の機能に重要である。膜タンパク質のうち、レセプターと結合したＧタンパク質（ＧＰＣＲ）が、特に注目されている。なぜなら、それらは、レセプタータンパク質の最も大きくかつ最も多様性のある群のうちの１つを形成するからである。ヒトゲノム中の４００より多くの非感覚性（ｎｏｎｏｓｅｎｓｏｒｙ）ＧＰＣＲは、種々の生理学的プロセスの調節に関与する。数百の他のＧＰＣＲは、光、臭いおよび味の感知に関与する。市販薬の総売上の４０％より多くは、ＧＰＣＲを標的とし、そしてＧＰＣＲは、医薬産業全体で活発に研究されている。
【０００３】
タンパク質の構造モデルは、リガンド結合の機構の予測、疾患原因変異体の効果の予測、ならびに薬物設計の支持において有用であることが証明されている。しかし、膜タンパク質の原子分解構造を得ることは、技術的に努力を必要とし、これは、大量の所望のタンパク質を得るために従来的に使用されてきた組織培養系における膜タンパク質の発現が、ネイティブのタンパク質において見出される手特定の翻訳後修飾（例えば、脂肪アシル化、リン酸化ならびにＮ結合グリコシル化およびＯ結合グリコシル化）を欠くか、またはネイティブのタンパク質と比較して、このような修飾の変化したパターンを有するタンパク質が生じることが、主な理由である。これらの相違は、タンパク質の安定性に影響し得、溶解可能な形態での単離を困難なものにしている。さらに、正確な翻訳後修飾は、組織培養系中の分子ごとに異なる。この不均質性は、構造研究のために適切な結晶の形成する能力に有害に影響する。例えば、組換え哺乳動物細胞株またはバキュロウイルス細胞／昆虫細胞のいずれかから精製されるＧＰＣＲウシロドプシンは、ウシ杆状体細胞から単離されたロドプシンと比較してＮグリコシル化の量の差を呈し、そしてまた、電気泳動ゲル上のより拡散したバンド（不均質性を示す）を呈する（Ｒｅｅｖｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１４８７−１１４９２（１９９６））。
【０００４】
今日まで、ウシロドプシンの単一のＧＰＣＲ結晶構造のみが決定されている（Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：７３９−７４５（２０００））。ロドプシンは、網膜における光シグナルの伝達に関与するＧＰＣＲである。高品質の結晶を調製するために、ロドプシンを、ウシ網膜の杆状体外側セグメントの膜から単離し、ここで、ロドプシンは、全タンパク質内容物の約９０％を構成する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
不運にも、類似の豊富性および純度のほとんどの他の膜タンパク質の天然の供給源は、入手可能でない。さらに、上記のように、組織培養物中の組換え供給源から単離されたタンパク質は、一般的に均質であり、従って、構造研究には適切であるとは証明されていない。従って、高い豊富性、純度および均質性のタンパク質、特に膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）を生成するための方法についての必要性が存在する。このようなタンパク質は、構造研究および他の研究ならびに治療適用に使用され得る。本発明は、この必要性を満たし、そして関連する利点をも提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、光レセプター特異的調節配列、膜結合ポリペプチド、および光レセプター外側セグメント標的化シグナルをコードする核酸を含むトランスジーン構築物を提供する。例えば、本発明は、ロドプシンプロモーター、膜結合ポリペプチド、および杆状体外側セグメント（ＲＯＳ）標的化シグナルをコードする核酸を含むトランスジーン構築物を提供する。さらに、本発明は、光レセプター特異的調節配列、膜結合ポリペプチド、および光レセプター外側セグメント標的化シグナルをコードする核酸を含むトランスジーン構築物を有する細胞または脊椎動物を提供する。さらに、本発明は、光レセプター特異的調節配列、膜結合ポリペプチド、および光レセプター外側セグメント標的化シグナルをコードする核酸を含むトランスジーン構築物によってコードされるポリペプチドを含む細胞抽出物または実質的に精製されたトランスジェニックポリペプチドを提供する。
【０００７】
本発明はまた、光レセプター外側セグメント標的化シグナルを有するポリペプチドをコードするトランスジーンを含む遺伝子標的化構築物を提供し、ここで、トランスジーンは、ロドプシン遺伝子に相同的な５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列と並んでおり、ここで、この構築物とロドプシン遺伝子との間の相同性組換えは、このトランスジーンと光レセプター特異的調節配列との間の作動可能な連結を生じる。
【０００８】
さらに、本発明は、杆状体外側セグメント（ＲＯＳ）標的化シグナルを含むポリペプチドをコードするトランスジーンを含む遺伝子標的化構築物を提供する。このトランスジーンは、マウスロドプシン遺伝子に相同的な５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列と並んでいる。この構築物とマウスロドプシン遺伝子との間の相同性組換えは、このトランスジーンと杆状体特異的調節配列との間の作動可能な連結を生じる。
【０００９】
本発明はまた、ゲノムが、内因性ロドプシン遺伝子対立遺伝子の一方またはその両方の機能的分裂を含むマウス細胞、および杆状体特異的調節配列と作動可能に連結したＲＯＳ標的化シグナルを含むポリペプチドをコードするトランスジーンを提供する。
【００１０】
さらに、ゲノムが、内因性ロドプシン遺伝子対立遺伝子の一方またはその両方の機能的分裂を含むマウス、および杆状体特異的調節配列と作動可能に連結したＲＯＳ標的化シグナルを含むポリペプチドをコードするトランスジーンを提供する。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、光レセプター細胞中にトランスジェニックポリペプチドを発現する動物ならびにこのような動物を調製するのに適切な細胞および構築物を提供する。例えば、本発明は、杆状体細胞の外側セグメント膜中にトランスジェニックポリペプチドを発現する動物ならびにこのような動物を調製するのに適切な細胞および構築物を提供する。本発明の構築物は、ホモ接合性の動物が杆状体細胞中で内因性のロドプシンをほとんどまたは全く生成しないように、有利に設計され得る。従って、杆状体外側セグメント（ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ：ＲＯＳ）膜中に発現されるトランスジェニックポリペプチドは、全ＲＯＳ膜タンパク質含量の大きなパーセンテージを含み、そして多量で容易に精製され得る。トランスジェニックポリペプチドはまた、これらの翻訳後修飾において実質的に同質である。従って、本発明の動物および方法によって生成されたポリペプチドは、これらの分子メカニズムおよびリガンド相互作用を解明するための構造研究に有用であり、それによって、薬物設計についての有用な情報を提供する。ＲＯＳ膜発現タンパク質はまた、高品質のタンパク質調製物が必要とされるかまたは有利である当該分野で公知の他の適用（機能研究；リガンド、アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング；抗体の調製および医薬の調製を含む）に有用である。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明は、トランスジェニック構築物（光レセプター特異的調節配列、膜結合ポリペプチドおよび光レセプター外側セグメント標的化シグナルをコードする核酸を含む）を提供する。例えば、本発明は、トランスジェニック構築物（ロドプシンプロモーター、膜結合ポリペプチドおよび杆状体外側セグメント（ＲＯＳ）標的化シグナルをコードする核酸を含む）を提供する。さらに、本発明は、トランスジェニック構築物（光レセプター特異的調節配列、膜結合ポリペプチドおよび光レセプター外側セグメント標的化シグナルをコードする核酸を含む）を有する細胞または脊椎動物を提供する。さらに、本発明は、細胞抽出物または実質的に精製されたポリペプチド（トランスジェニック構築物（光レセプター特異的調節配列、膜結合ポリペプチドおよび光レセプター外側標的化シグナルをコードする核酸を含む）によってコードされたポリペプチドを含む）を提供する。
【００１３】
本発明はまた、光レセプター外側セグメント標的化シグナルを有するポリペプチドをコードするトランスジーンを含む遺伝子標的化構築物を提供し、このトランスジーンは、ロドプシン遺伝子に相同な５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列に隣接され、構築物とロドプシン遺伝子との間の相同性組換えは、トランスジーンと光レセプター特異的調節配列との間の作動可能な会合を生じる。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、ポリペプチド（杆状体外側セグメント（ＲＯＳ）標的化シグナルを含む）をコードするトランスジーンを含む遺伝子標的化構築物を提供する。このトランスジーンは、ロドプシン（オプシンまたは杆状体オプシンとしてもまた公知である）遺伝子に相同な５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列に隣接され得る。構築物とロドプシン対立遺伝子との間の相同性組換え後、トランスジーンおよび杆状体特異的調節配列は、作動可能に会合され、そしてロドプシン対立遺伝子は、機能的に破壊される。本発明の遺伝子標的化構築物を有利に使用して、例えば、杆状体外側セグメント膜中に、タランスジーンによってコードされたポリペプチドを発現する動物を調製し、そしてこのような動物の作製において使用するための適切なＥＳ細胞を調製し得る。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「トランスジーン」とは、ロドプシン遺伝子座で天然に存在しないＤＮＡ配列をいう。トランスジーンは、杆状体外側セグメント膜中での発現が望ましく、そしてコード配列が公知であるかまたは決定され得る、任意のポリペプチドをコードし得る。ヒトポリペプチドおよび非ヒトポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が、当該分野で公知であり（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の配列データベースを参照のこと）、そして他のものは容易に決定され得る。ｍＲＮＡの安定性および翻訳に重要な非翻訳配列と共に適切なコード部分は、標準的な組換え分子生物学方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（最も最近の補遺）；などを参照のこと）によって合成され得るか、またはクローニングされ得る。
【００１６】
例として、トランスジーンは、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）（例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、非哺乳類の脊椎動物、無脊椎動物（例えば、昆虫または線虫）、酵母、細菌または植物由来のＧＰＣＲ）をコードし得る。ＧＰＣＲは、リガンドに応答して、Ｇタンパク質結合シグナルを伝達する７回膜貫通ドメインポリペプチドである。異なるＧＰＣＲの天然のリガンドとしては、以下が挙げられる：ペプチド、生体アミン、糖タンパク質、ヌクレオチド、イオン、脂質、アミノ酸、光および臭気物質。構造的に、ＧＰＣＲは、３つの主要なサブファミリーに分類され得、これらは各々、オーファンレセプターならびにそのリガンドが、特徴付けられたレセプターを現在含む（Ｇｅｔｈｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２１：９０−１１３（２０００）に総説される）。
【００１７】
ＧＰＣＲのロドプシン／β２アドレナリン作用性レセプター様ファミリーの例示的なメンバーとしては、以下が挙げられる：生体アミン（アドレナリン作用性、セロトニン、ドパミン、ムスカリン様、ヒスタミンなど）、ＣＣＫ、エンドセリン、タキキニン、神経ペプチドＹ、ＴＲＨ、ニューロテンシン、ボンベシン、成長ホルモン分泌促進薬、脊椎動物および無脊椎動物のオプシン、ブラジキニン、アデノシン、カンナビノイド、メラノコルチン、嗅覚シグナル、ケモカイン、ｆＭＬＰ、ｃ５Ａ、ＧｎＲＨ、エイコサノイド、ロイコトリエン、ＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨ、ｆＭＬＰ、ガラニン、ヌクレオチド、オピオイド、オキシトシン、バソプレシン、ソマトスタチンおよびメラトニンならびにプロテアーゼによって活性化されたＧＰＣＲ。
【００１８】
ＧＰＣＲのグルカゴン／ＶＩＰ／カルシトニンレセプター様ファミリーの例示的なメンバーとしては、以下が挙げられる：カルシトニン、ＣＧＲＰ、ＣＲＦ、ＰＴＨ、ＰＴＨｒＰ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、ＧＩＰ、ＧＨＲＨ、ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰ、セクレチンおよびラトロトキシンのレセプター。
【００１９】
ＧＰＣＲの代謝生成物産性神経伝達物質／カルシウムレセプターファミリーの例示的なメンバーとしては、以下が挙げられる：代謝生成物産性グルタミン酸レセプター、代謝生成物産性ＧＡＢＡレセプター、カルシウムレセプター、鋤鼻フェロモンレセプターおよび味覚レセプター。
【００２０】
多数の哺乳動物ＧＰＣＲ（オーファンＧＰＣＲを含む）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列へのリンクを含むデータベースは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄａｒｍｓｔａｄｔ．ｇｍｄ．ｄｅ／〜ｇｐｃｒｄｂ／またはｗｗｗ．ＧＰＣＲ．ｏｒｇで利用可能である。本発明は、任意のＧＰＣＲ（公知のＧＰＣＲの改変体および変異体を含む）または任意の所望のそのフラグメントをコードするトランスジーンを用いて行われ得る。
【００２１】
７回膜貫通（７ＴＭ）トポロジーを超えて、これらの３つのＧＰＣＲファミリー間でほとんど同定できない配列同一性が存在する。全体的な配列同一性は比較的に低いが、７ＴＭ内の保存された構造的「ミクロドメイン」の存在は、ロドプシンと他のＧＰＣＲとの間の進化的な関係を支持する。鋳型としてロドプシン構造を使用するＧＰＣＲ薬物標的の３Ｄ構造の分子モデリングは、コンピューター支援ＧＰＣＲ薬物設計の最も重要なものとなっている（Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６０：１−１９（２００１）；Ｖｉｓｉｅｒｓ，ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３４３：３２９−７１（２００２）；ＧｅｒｓｈｅｎｇｏｒｎおよびＯｓｍａｎ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４２：２−１０（２００１））。しかし、ロドプシン構造に基づくＧＰＣＲのモデリングは、全体的に低い配列同一性、分岐した構造モチーフの存在（Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓら、前出）ならびに分岐らせん内（ｉｎｔｅｒｈｅｌｉｃａｌ）ループの配列および長さにおける類似性の欠損によって複雑化され、従って、ＧＰＣＲは、これらのセグメントがほとんどのＧＰＣＲの重要なリガンド結合部位であるとしても、ロドプシン結晶で見出されるループ構造に基づいてモデリングされ得ない。従って、ＧＰＣＲ薬物設計に対する構造ベースのアプローチは、最小のいくつかのＧＰＣＲ（例えば、カンナビノイドレセプター、これは他の密接に関連するＧＰＣＲ対して価値のある鋳型となる）の解明によって改善される。さらに、非ロドプシンＧＰＣＲの構造は、これらの構造的完全性および機能的完全性をになう、このスーパーファミリーの重要な保存された特性の特徴付けを可能にする。
【００２２】
あるいは、本発明は、ＧＰＣＲ以外の膜タンパク質をコードするトランスジーンを用いて実施され得る。膜タンパク質としては、サイトカイン、増殖因子、およびホルモン（血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子、肝細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、インターロイキン、インターフェロンなどが挙げられる）に対するレセプターが挙げられる。膜タンパク質はまた、接着分子（例えば、インテグリン、カドヘリンなど）；免疫分子（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント、Ｔ細胞レセプター、ＭＨＣ分子、細胞表面決定基など）；イオンチャンネル；トランスポーター；膜プロテアーゼ；デスレセプター；核レセプター；多剤耐性タンパク質；膜シクラーゼ；チロシンキナーゼ；膜ホスファターゼ；またはギャップジャンクションタンパク質も挙げられる。
【００２３】
本発明はまた、通常は膜局在化しないポリペプチドをコードするトランスジーンを用いて実施され得る。このような適用のために、膜局在化シグナルが、一般的には、トランスジェニックポリペプチド中またはＲＯＳターゲッティングシグナル中に、以下にさらに記載されるように含まれる。従って、このトランスジーンは、目的の任意のポリペプチド（例えば、酵素（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、ポリメラーゼなど）；結合タンパク質（例えば、転写因子、ドッキングタンパク質、レセプターアゴニストまたはレセプターアンタゴニストなど）；または構造タンパク質（例えば、細胞骨格タンパク質、骨格タンパク質など））をコードし得る。
【００２４】
ＲＯＳ膜において発現されるポリペプチドは、有利には、比較的均一な翻訳後修飾を有する。従って、本発明は、広範な翻訳後修飾（複数のジスルフィド結合、Ｎ結合型グリコシル化もしくはＯ結合型グリコシル化、脂肪アシル化、またはリン酸化を含む）を含むポリペプチドをコードするトランスジーンを用いて実施され得る。
【００２５】
適切なトランスジーンは、目的とする任意の種（例えば、ヒト、非ヒト動物、他の脊椎動物、昆虫、線虫、他の非脊椎動物、植物、酵母、他の真核生物、細菌、または他の原核生物に由来する、天然に存在するポリペプチド（上記に列挙された例示的ポリペプチドを含む）をコードし得る。有利なことには、このトランスジーンは、ヒトの遺伝疾患に関係する変異を有するポリペプチドをコードし得、その結果、これらの変異の構造的結果または機能的結果が決定され得る。
【００２６】
このトランスジーンはまた、天然に存在しないポリペプチド（例えば、天然に存在する配列に対して１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含む、ポリペプチド）をコードし得る。このような改変体ポリペプチドは、例えば、そのポリペプチドの重要な機能的残基（例えば、リガンド結合部位およびエフェクター結合部位）を特徴付けるため、および適切な治療リガンドの設計を補助するために、使用され得る。あるいは、天然に存在しないポリペプチドは、特定の領域の構造研究または機能研究を容易にするために、目的とする特定のフラグメントまたはドメインのみからなり得る。
【００２７】
トランスジェニックポリペプチドはまた、有利な特性を付与するさらなる配列を、中間位置、Ｎ末端位置、またはＣ末端位置に必要に応じて含み得る。そのような配列としては、例えば、そのポリペプチドに膜局在性を付与する配列；そのポリペプチドの単離もしくは同定を容易にする配列；またはそのポリペプチドの機能を調節するか、構造を安定化するか、もしくは折畳みを促進する、配列が挙げられ得る。
【００２８】
例えば、下記のように、杵状体外側セグメント（ＲＯＳ）ターゲッティングシグナルは、膜局在化シグナルとともに機能して、ＲＯＳ膜にポリペプチドを局在化させる。従って、そのポリペプチドが膜局在化シグナルを通常は含まない場合、そのトランスジーンは、コードされるポリペプチドが膜局在化シグナルを含むように組換え法によって改変され得る。適切な膜局在化シグナルおよび組換えポリペプチドを調製する際のその膜局在化シグナルの使用方法は、当該分野で周知であり、例えば、ミリスチル化シグナル、パルミトイル化シグナル、ファルネシル化シグナル、プレニル化シグナル、ＧＰＩアンカーシグナル、および膜貫通配列が挙げられる。
【００２９】
トランスジェニックポリペプチドの同定または単離を容易にする適切な配列は、当該分野で公知であり、抗体が入手可能であるかもしくは抗体を生成し得るエピトープタグ（例えば、ＨＡ、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリＨｉｓ配列、蛍光タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質）、生体発光タグ（例えば、ルシフェラーゼ）などが挙げられ得る。
【００３０】
トランスジェニックポリペプチドの機能を調節するか、構造を安定化するか、または折畳みを促進する配列としては、例えば、通常はリガンド、アダプター、エフェクター、または骨格分子として機能する分子に対応する、配列が挙げられる。これらの配列を目的のポリペプチドとの融合物として発現することによって、その２つの分子の近さおよび適切な立体化学が、保証される。さらに、その融合配列は、ポリペプチドを、特定の適用のために望ましいように、その活性な立体構造または不活性な立体構造にて安定化し得、それにより、活性化のために重要な構造特徴の同定を可能にし得る。
【００３１】
例えば、ＧＰＣＲは、そのペプチドリガンドと、アレスチンと、またはＧタンパク質αサブユニットとの融合物として発現され得る。機能的ＧＰＣＲ−Ｇα融合物を組換え調製する方法は、当該分野で公知である（Ｓｅｉｆｅｒｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０：３８３〜３８９（１９９９）に概説される）。他の望ましい融合タンパク質をコードする構築物は、慣用的な分子生物学的方法によって生成され得る。
【００３２】
特定の適用のために、別個の翻訳産物または融合物のいずれかとして、ＲＯＳターゲッティングシグナルを含む２つ以上のポリペプチドをコードするトランスジーンを構築することが、有利であり得る。例えば、トランスジーンは、ＲＯＳターゲッティングシグナル（例えば、２つ以上の異なるＧＰＣＲ）を含む２つ以上の異なるレセプターポリペプチドをコードし得る。同様に、トランスジーンは、ＲＯＳターゲッティングシグナルを含む１つのポリペプチドと、ＲＯＳターゲッティングシグナルを含む別のポリペプチドとをコードし得、この２つのポリペプチドは、通常は関連している。従って、上記のように、一方のポリペプチドが、他方のポリペプチドのリガンド、アダプター、エフェクター、または骨格分子であり得る。例えば、一方のポリペプチドがアレスチンまたはＧαサブユニットであり得、他方のポリペプチドがＧＰＣＲである。この２つ以上のポリペプチドは、例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイにおいて一緒に有利に使用され得るか、または当該分野で公知の方法によって（例えば、融合配列間のタンパク質分解性切断によってか、もしくは免疫学的分離方法によって）、互いに分離され得る。
【００３３】
特定の実施形態において、例えば、ターゲッティング構築物、細胞または動物においてトランスジーンによってコードされるポリペプチドは、オプシンではない。排除されるポリペプチドに関して使用される場合、用語「オプシン」とは、任意の種由来の天然に存在するオプシンポリペプチド、ならびに本出願の優先日当時に当該分野で記載されたその任意の改変体形態もしくは変異体形態を指す。オプシンとしては、例えば、杆状オプシン（ロドプシン）および錐体オプシン（例えば、青色顔料、緑色顔料、および赤色顔料（Ｎａｔｈａｎｓ，Ｊ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：１６３〜１９４（１９８７））が挙げられる。さらに、例えば、オプシンとしては、メラノプシン（Ｐｒｏｖｅｎｃｉｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：６００〜６０５（２０００））、エンセファロプシンまたはパノプシン（ＢｌａｃｋｓｈａｗおよびＳｎｙｄｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：３６８１〜３６９０（１９９９）；Ｈａｌｆｏｒｄら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７２：２０３〜２０８（２００１））およびペロプシン（Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：９８９３〜９８９８（１９９７））が挙げられる。
【００３４】
特定の実施形態において、例えば、ターゲッティング構築物、細胞または動物においてトランスジーンによってコードされるポリペプチドは、ロドプシンではない。排除されるポリペプチドに関して使用される場合、用語「ロドプシン」とは、任意の種由来の天然に存在するロドプシンポリペプチド、ならびに本出願の優先日当時に当該分野で記載されたその任意の改変体形態もしくは変異体形態を指す。用語「ロドプシン」とは、杆状オプシンとしても公知であるアポプロタンパク質と、共有結合した染色体を含むタンパク質のいずれかを指すために本明細書中で使用される。排除されるロドプシンは、ロドプシンＮ末端アミノ酸配列とＣ末端ＲＯＳターゲッティングシグナルとを連続配列として含む。具体的に示されない限り、排除されるロドプシンポリペプチドは、異種ポリペプチド（例えば、アレスチンまたはＧαサブユニット）に融合されたロドプシンではない。
【００３５】
具体的に排除されるロドプシンの例としては、野生型のＸｅｎｏｐｕｓ、マウス、ラット、ヒト、ブタおよびウシのロドプシン、ならびに網膜障害（例えば、色素性網膜炎（Ｐ２３Ｈ、Ｖ２０Ｇ、Ｐ２７Ｌ；種々のＣ末端欠失および置換）、光レセプター変性（Ｋ２９６Ｅ）および先天性夜盲症（Ｇ９０Ｄ）（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌａｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４２：８２６−８３３（２００１）；Ｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３５５１−３５５５（１９９５）；Ｓｉｅｖｉｎｇら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：５４４９−５４６０（２００１）；など））の動物モデルとして働く変異ロドプシンが挙げられる。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明は、トランスジーン構築物を提供し、このトランスジーン構築物は、光レセプター特異的調節配列、膜結合ポリペプチド、および光レセプター外側セグメント（ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ）標的化シグナルをコードする核酸を含む。例えば、本発明は、トランスジーン構築物を提供し、このトランスジーン構築物は、ロドプシンプロモーター、膜結合ポリペプチド、および杆状体外側セグメント（ＲＯＳ）標的化シグナルをコードする核酸を含む。トランスジーンまたは本発明の標的化構築物において、このトランスジーンは、目的の動物種由来のロドプシン遺伝子に相同な５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列に隣接し得る。都合のよいことには、この動物種は、マウスである。しかし、本発明は、遺伝子標的化手順に影響を受けやすい他の種（例えば、ラット、モルモット、ウシ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ、ヒト、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌおよび非ヒト霊長類）に由来するロドプシン遺伝子を用いて実施され得ることも企図される。
【００３７】
ロドプシン遺伝子配列に「相同な」隣接ヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列と宿主細胞中の内因性ロドプシン遺伝子配列との間の相同組換えを可能にするように、ロドプシン遺伝子配列に対して十分な同一性を有するヌクレオチド配列をいう。代表的には、隣接する相同性領域のこのヌクレオチド配列は、相同組換えのために標的化される内因性ロドプシン遺伝子のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％）同一である。有利なことには、相同組換え頻度を高めるために、隣接する相同性領域は、標的化される内因性対立遺伝子と同系であり得、このことは、隣接する領域のＤＮＡが、標的化構築物が導入される細胞と同じ遺伝的バックグラウンドの細胞から単離されることを意味する。
【００３８】
マウスロドプシンゲノムＤＮＡ配列は、当該分野で公知の方法を用いて、マウスゲノムＤＮＡライブラリーから単離され得る（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１５：２１６−２１９（１９９７）およびＬｅｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７３６−７４１（１９９９）を参照のこと）。他の種に由来するロドプシンゲノムＤＮＡは、同様に得られ得る。例えば、所望の種に由来するゲノムライブラリーは、その種に由来するロドプシンｃＤＮＡ、または種間の高い程度の相同性を考慮して、別の種に由来するロドプシンｃＤＮＡからプローブでスクリーニングして、標的化構築物において使用するためのロドプシンゲノムＤＮＡが単離され得る。次いで、ゲノムＤＮＡの制限マップが作成され、トランスジーンの挿入に適した領域が、決定され得る。
【００３９】
隣接する相同性ＤＮＡ配列は、この構築物が細胞に導入される場合に、標的化構築物と、細胞中の内因性ロドプシン遺伝子との間で起こる相同組換えのために十分長い。一般に、相同性隣接配列が長いほど、相同組換えの効率は高くなる。５’隣接配列の適切な長さは、少なくとも約１ｋｂであり、代表的には、約１．５ｋｂ〜約１５ｋｂであり、例えば、約５ｋｂ〜約１０ｋｂである。同様に、３’隣接配列に適切な長さは、少なくとも約１ｋｂであり、代表的には、約１．５ｋｂ〜約１５ｋｂ、例えば、約５ｋｂ〜約１０ｋｂである。
【００４０】
トランスジーンに隣接する相同な配列は、相同組換え後にトランスジーンをロドプシン対立遺伝子内の所望の位置に指向するように選択される。例えば、ネイティブロドプシン調節配列を使用するトランスジーンの発現を駆動することが所望される場合、その５’相同な配列は、有利なことには、これらの配列を含み得、その結果、そのトランスジーンは、組換わった対立遺伝子中の調節配列の３’側にある。トランスジーンに隣接する相同性領域はまた、組換えられたロドプシン対立遺伝子において改変（例えば、挿入、欠失および置換）を作製するために選択され得る。例えば、相同組換えによってロドプシン遺伝子の一部（例えば、ネイティブの５’調節エレメント、１つ以上のエキソン、１つ以上のイントロン）を欠失させることが所望される場合、これらの領域は、トランスジーンに隣接するＤＮＡ配列中に含められない。内因性ロドプシン遺伝子の一部の欠失は、機能的ロドプシンポリペプチドが、杆状体細胞において発現されないことを確実にするために有用である。
【００４１】
杆状体細胞においてトランスジーンの転写、そして最終的には、翻訳をもたらすために、構築物は、トランスジーンが、ロドプシン対立遺伝子との相同組換えの後に、杆状体特異的調節配列と作動可能に結合されるように設計される。本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に結合される」は、杆状体特異的調節配列およびトランスジーンが、杆状体特異的調節配列の制御下でトランスジーンの転写を可能にする様式にて、配置されることを示す。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「光レセプター特異的調節配列」とは、光受容細胞におけるトランスジーンの転写を指向するに十分なシス作用性ＤＮＡエレメントをいう。光受容細胞は、杆状体細胞または錐状体細胞であり得る。用語「光レセプター特異的」とは、トランスジーンが、少なくとも光受容細胞において発現されるが、トランスジーンがもっぱら光受容細胞において発現される必要はないことを意味する。光レセプター特異的調節配列は、光受容細胞における遺伝子発現を指向するプロモーター配列、および必要に応じて、これらの細胞における遺伝子発現のレベルを調節するエンハンサー配列を含む。
【００４３】
光レセプター特異的調節配列のいくつかの例は、当該分野で公知であり、例えば、膜タンパク質および可溶性タンパク質のプロモーターが挙げられる。膜タンパク質の光レセプター特異的プロモーターとしては、例えば、ペリフェリン（ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｎ）／ｒｄｓ（Ｍｏｒｉｔｚら，Ｇｅｎｅ  ２９８：１７３−１８２（２００２））、およびグアニル酸シクラーゼ−Ｅ（Ｄｕｄａら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：６３−７０（１９９８）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，Ｇｅｎｅ  １９３：２１９−２２７（１９９７））が挙げられる。可溶性タンパク質の光レセプター特異的プロモーターとしては、例えば、杆状体トランスデューシンのαサブユニット（Ａｈｍａｄら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６２：３９６−３９９（１９９４））およびアレスチン（Ｍａｎｉら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７４：１５５９０−１５５９７（１９９９）；Ｋｉｋｕｃｈｉら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３：４４００−４４０８（１９９３））が挙げられる。錐状体特異的プロモーターのいくつかの例としては、例えば、赤色および緑色視覚色素のプロモーター配列（ＳｈａａｂａｎおよびＤｅｅｂ，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３９：８８５−８９６（１９９８））、および錐状体アレスチン（Ｚｈｕら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５２４：１１６−１２２（２００２））が挙げられる。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「杆状体特異的調節配列」とは、杆状体細胞においてトランスジーンの転写を指向するに十分なシス作用性ＤＮＡエレメントをいう。用語「杆状体特異的」とは、トランスジーンが、少なくとも杆状体細胞において発現されるが、そのトランスジーンが、もっぱら杆状体細胞において発現される必要がないことを意味する。遺伝子標的化構築物における使用のために、杆状体特異的調節配列は、一般に、トランスジーンに隣接する５’ＤＮＡ配列に含まれる内因性ロドプシン調節配列である（図１を参照のこと）。しかし、杆状体特異的調節配列は、代わりに、他の種に由来するロドプシン調節配列または杆状体細胞において発現される他の遺伝子（例えば、アレスチン、トランスデューシンα、β、γのサブユニット、ホスホジエステラーゼα、β、γのサブユニット、またはリカバリン）に由来する調節配列であり得る。杆状体特異的調節配列は、杆状体細胞における遺伝子発現を指向するプロモーター配列、必要に応じて、杆状体細胞における遺伝子発現のレベルを調節するエンハンサー配列を含む。
【００４５】
ロドプシン遺伝子に由来する調節配列は、種にまたがって、杆状体細胞におけるトランス作用性因子によって認識される。例えば、ウシおよびヒト両方のロドプシン調節エレメントは、マウス光受容細胞へトランスジーンの発現を指向することが示された（Ｚａｃｋら，Ｎｅｕｒｏｎ  ６：１８７−１９９（１９９１）；Ｎｉｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６６７−２６７５（１９９６））。杆状体特異的調節配列は、従って、任意の脊椎動物種（例えば、マウス、他の齧歯類、ウシ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、ヒト、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類、Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）に由来するロドプシンの調節性エレメントを含み得、非ネイティブＤＮＡ配列を含み得る。
【００４６】
ロドプシン調節配列（プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントを含む）は、多数の種（Ｘｅｎｏｐｕｓ（Ｍａｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８：３６５５７−３６５６５（２００１））、マウス（Ｌｅｍら、Ｎｅｕｒｏｎ  ６：２０１−２１０（１９９１））およびウシ（Ｎｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６６７−２６７５（１９９６）を含む）において特徴付けられている。これらの研究は、ウシロドプシンｍＲＮＡ開始部位に対して、−２１７４〜＋７０ｂｐ；−７３５〜＋７０ｂｐ；−２２２〜＋７０ｂｐ；および−１７６〜＋７０ｂｐのフラグメントがトランスジェニックマウス中での光レセプター特異的遺伝子発現を指向し得ることを示し（Ｎｉｅら、前出（１９９６））、このことは、最小の細胞特異的プロモーターが、ウシロドプシン転写開始部位の領域−１７６〜＋７０ｂｐ内に位置することを示す。同様に、マウスロドプシン遺伝子由来の４．４ｋｂフラグメントおよび０．５ｋｂフラグメントは、トランスジェニックマウス中での光レセプター特異的遺伝子発現を指向し得（Ｌｅｍら、前出（１９９１））、最小の細胞特異的プロモーターがマウスロドプシン転写開始部位の５’側の約５００ｂｐ内に位置することを示す。さらに、ウシ、ヒト、マウスおよびラットのロドプシン遺伝子の転写開始部位の５’側の約１０２ｂｐ、約２ｋｂの高度に保存された領域は、転写エンハンサー領域として同定されている（Ｎｉｅら、前出（１９９６））。
【００４７】
所望である場合、杆状体特異的調節エレメントは、組織特異性または発現レベルを増強するようにネイティブ配列から改変され得る。例えば、ネガティブ調節エレメントは、杆状体細胞特異性を変化することなく、発現レベルを増加するために除去され得る（Ｍａｎｉら、前出（２００１））。さらに、エンハンサーエレメントの複数コピーが、必要に応じて含まれ得、そしてプロモーターエレメントとエンハンサーエレメントとの間の配列は、必要に応じて消去され得る。杆状体特異的ポジティブ調節エレメントおよび杆状体特異的ネガティブ調節エレメントの知識に基づいて、当業者は、トランスジーンの発現を杆状体細胞に指向するための適切な配列を決定し得る。
【００４８】
特定の調節配列が杆状体特異的遺伝子発現または光レセプター特異的遺伝子発現を指向することを確認するための簡便なアッセイは、トランスジェニックＸｅｎｏｐｕｓが作製され得る容易さを考慮する。検出可能なレセプター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼ）（または所望のトランスジーン）は、候補杆状体特異的調節配列または光レセプター特異的調節配列および標準的な方法によって授精されたＸｅｎｏｐｕｓの胚へとトランスフェクトされた構築物に、作動可能に連結され得る。得られたオタマジャクシの杆状体細胞または光レセプター細胞中のレポーター遺伝子（または所望のトランスジーン）の発現は、調節配列が杆状体特異的遺伝子発現または光レセプター特異的遺伝子発現を指向することを確認する（Ｍａｎｉら、前出（２００１）を参照のこと）。
【００４９】
トランスジーンによって発現されるポリペプチドはまた、光レセプター外側セグメント膜にポリペプチドを局在化させるような光レセプター外側セグメント標的化シグナルを含む。例えば、脊椎動物の杆状体細胞は、毛様体突起によって内側セグメントに結合されたロドプシン含有ディスク膜のスタックを含む外側セグメントからなる。本明細書中に使用される場合、用語「光レセプター外側セグメント標的化シグナル」とは、光レセプター外側セグメント膜に対して異種ポリペプチドの局在化を与えるペプチド配列をいう。受容可能な光レセプター外側セグメント標的化シグナルは、光レセプター外側セグメント膜に対して排他的なポリペプチドの局在化を与える必要がない。ポリペプチドが光レセプター外側セグメント膜で大量に発現される限り、光レセプター細胞の外側部分におけるポリペプチドの少量の発現は、有害でない。
【００５０】
トランスジーンによって発現されるポリペプチドはまた、杆状体外側セグメント（ＲＯＳ）膜にポリペプチドを局在化させるように杆状体外側セグメント標的化シグナルを含み得る。脊椎動物の杆状体細胞は、毛様体突起によって内側セグメントに結合されたロドプシン含有ディスク膜のスタックを含む外側セグメントからなる。内側セグメントは、細胞の代謝性機構（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）（例えば、ミトコンドリアおよびゴルジ体）を含む。本明細書中で使用される場合、用語「杆状体外側セグメント標的化シグナル」とは、ＲＯＳ膜に対して異種ポリペプチドの局在化を与えるペプチド配列をいう。受容可能なＲＯＳ標的化シグナルは、ＲＯＳ膜に対して排他的なポリペプチドの局在化を与える必要がない。ポリペプチドがＲＯＳ膜において大量に発現される限り、杆状体細胞の他の部分（内側セグメント、核またはシナプス体（ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｂｏｄｙ）を含む）におけるポリペプチドの少量の発現は、有害でない。
【００５１】
脊椎動物のＲＯＳ標的化シグナルの必要な特徴および十分な特徴は、Ｘ．ｌａｅｖｉｓロドプシンプロモーターのコントロール下で、異種ポリペプチドとＸ．ｌａｅｖｉｓロドプシンの領域との間でキメラを発現させることによってトランスジェニックＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓにおいて決定される。これらの研究は、Ｘ．ｌａｅｖｉｓロドプシンのＣ末端の８アミノ酸（ＳＳＳＱＶＳＰＡ；配列番号１）が、膜結合シグナルを含む異種ポリペプチド上の外側セグメントの膜標的化を与えるのに十分であることを示す。Ｘ．ｌａｅｖｉｓロドプシンのＣ末端の２５アミノ酸（ＤＥＤＧＳＳＡＡＴＳＫＴＥＡＳＳＶＳＳＳＱＶＳＰＡ；配列番号２）を含むペプチドはまた、膜結合シグナルを含む異種ポリペプチドに外側セグメントの膜標的化を効果的に与える。しかし、これらの配列は、細胞質ポリペプチドにＲＯＳ標的化を与えるのに十分でなかった（Ｔａｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５１：１３６９−１３８０（２０００））。
【００５２】
ロドプシンのシステインパルミトイル化シグナルを含むより長い配列（例えば、Ｘ．ｌａｅｖｉｓロドプシンのＣ末端の４４アミノ酸（ＫＱＦＲＮＣＬＩＴＴＬＣ＊Ｃ＊ＧＫＮＰＦＧＤＥＤＧＳＳＡＡＴＳＫＴＥＡＳＳＶＳＳＳＱＶＳＰＡ；配列番号３））は、それ自体膜結合配列を有さないポリペプチドを標的化する外側セグメント膜を与える能力を有する（Ｔａｍら、前出（２０００））。Ｘ．ｌａｅｖｉｓのＣ末端ＲＯＳ配列中でパルミトイル化された２つのシステイン残基は、星印によって示される。
【００５３】
シグナルを標識するＲＯＳは、種を越えて認識され得る。例えば、ヒトロドプシンは、ロドプシンノックアウトマウスにおいてマウス杆状体光レセプターを機能的に救出し得る（ＭｃＮａｌｌｙら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．８：１３０９−１３１２（１９９９））。従って、シグナルを標識化するＲＯＳは、任意の脊椎動物種（例えば、マウス、他のげっ歯類、ウシ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、ヒト、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類、ゼブラフィッシュ）からのロドプシン由来の天然に存在するＲＯＳであり得るか、または天然に存在しない配列であり得る。種々の種由来のロドプシンの配列は、当該分野で公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ｇｉ：１２９２０７（ヒト）；ｇｉ：２２３６５９（ウシ）；ｇｉ：１２９２１０（マウス））。従って、ＲＯＳ標的化シグナルは、任意の脊椎動物種（例えば、マウス、他のげっ歯類、ウシ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、ヒト、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類、ゼブラフィッシュ）からのロドプシン由来のネイティブのＣ末端配列を含み得るか、または天然に存在しない配列（例えば、多数の種由来のＲＯＳ配列を整列させることによって決定される、コンセンサス配列）であり得る。
【００５４】
例えば、ＲＯＳ標的化シグナルは、マウス、ヒトおよびウシのロドプシンによって共有される、（８）（ＥＴＳＱＶＡＰＡ；配列番号４）または（９）（ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ；配列番号５）のＣ末端残基（これは、ｒｈｏ１Ｄ４モノクローナル抗体によって認識される）を含み得る（Ｍｏｌｄａｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：６５３−６６０（１９８３）；ＭａｃＫｅｎｚｉｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：６５４４−６５４９（１９９４）；Ｍｏｌｄａｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：７７６−７８１（１９８５））。ＲＯＳ標的化シグナルとして１Ｄ４エピトープを含むトランスジェニックポリペプチドの発現は、有利に検出され得、そしてこのポリペプチドは、ｒｈｏ１Ｄ４抗体を使用する標準的な免疫学的アッセイによって、単離され得る。別の簡便なＲＯＳ標的化配列は、ウシロドプシン（ＳＴＴＶＳＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ；配列番号６）由来の１５のＣ末端残基を含む。他の適切なＲＯＳ標的化配列は、脊椎動物ロドプシンのＣ末端アミノ酸（例えば、約８〜約５０アミノ酸）に対応する。
【００５５】
光レセプター特異的調節エレメントおよび杆状体特異的調節エレメントに関して上記されるように、候補光レセプター外側セグメント標的化シグナルまたはＲＯＳ標的化シグナルの機能を確認するための簡便なアッセイは、それらの光レセプターまたは杆状体細胞においてポリペプチド／標的化シグナル融合を発現する（および必要に応じて、検出可能な部分をさらに含む）トランスジェニックＸｅｎｏｐｕｓを調製し、そしてこのトランスジェニックポリペプチドの、光レセプターまたは杆状体外側セグメント膜への局在化を顕微鏡によって観察することである（例えば、Ｍｏｒｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２８２４２−２８２５１（２００１）；およびＴａｍら、前出（２０００））。
【００５６】
１つの実施形態において、本発明は、トランスジーン構築物を提供する。この構築物は、光レセプター特異的調節配列、膜結合ポリペプチド、および光レセプター外側セグメント標的化シグナルをコードする核酸を含む。例えば、光レセプターは、杆状体細胞または錐状体細胞であり得る。１つの実施形態において、光レセプター特異的調節配列は、ロドプシンプロモーターまたは錐体視物質プロモーターである。さらなる実施形態において、光レセプター調節配列は、脊椎動物（例えば、カエルまたはマウス）由来である。いくつかの実施形態において、トランスジーンによってコードされる膜結合ポリペプチドは、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）（例えば、カンナビノイドレセプター）である。さらに、膜結合ポリペプチドは、融合タンパク質であり得る。１つの実施形態において、光レセプター外側セグメント標的化シグナルは、カエルロドプシンまたは錐体視物質遺伝子から誘導される。さらに、光レセプター外側セグメント標的化シグナルは、マウスまたはカエルから誘導され得るか、または配列番号４もしくは配列番号１０として参照される配列を含み得る。
【００５７】
以下でさらに記載されるように、本発明は、トランスジーン構築物を含むベクターを提供し、これは、光受容特異的調節配列、膜結合ポリペプチド、および光レセプター外側セグメント標的化シグナルをコードする核酸を有する。このベクターは、当該分野で公知でありかつ本明細書中で記載される標準的な手順を使用して、トランスジーン構築物を含む細胞を作製するために利用され得、これは、光レセプター特異的調節配列、膜結合ポリペプチド、および光レセプター外側セグメント標的化シグナルをコードする核酸を有する。１つの実施形態において、細胞は、脊椎動物細胞（例えば、カエル細胞またはマウス細胞）である。さらなる実施形態において、この細胞は、マウスの細胞であるか、またはマウスから単離される。なおさらなる実施形態において、この細胞は、杆状体細胞または錐状体細胞である。さらに、本発明は、細胞抽出物または実質的に精製されたトランスジェニックポリペプチドを提供し、このトランスジェニックポリペプチドは、光レセプター特異的調節配列、膜結合ポリペプチド、および光レセプター外側セグメント標的化シグナルをコードする核酸を含むトランスジーン構築物によってコードされるポリペプチドを含む。例えば、本発明は、細胞抽出物または光レセプター外側セグメント標的化シグナルを含む実質的に精製されたトランスジェニックポリペプチドを提供する。
【００５８】
さらに、本発明は、光レセプター特異的調節配列、膜結合ポリペプチド、および光レセプター外側セグメント標的化シグナルをコードする核酸を有するトランスジーン構築物を含む、脊椎動物（例えば、カエルまたはマウス）を提供する。１つの実施形態において、杆状体細胞が単離され得るか、または杆状体細胞の外膜抽出物が、これらのトランスジェニック脊椎動物から作製され得る。このような抽出物を使用して、光レセプター外側セグメント標的化シグナルを含む、実質的に精製されたトランスジェニックポリペプチドを精製し得る。
【００５９】
本発明はまた、光レセプター外側セグメント標的化シグナルを有するポリペプチドをコードするトランシジーンを含む遺伝子標的化構築物を提供する。ここで、このトランスジーンは、ロドプシン遺伝子と相同である５’側および３’側のＤＮＡ配列に隣接しており、ここで、この構築物とロドプシン遺伝子との間の相同組換えの結果、このトランスジーンと光レセプター特異的調節配列との間に作動可能な結合が生じる。１つの実施形態において、膜結合ポリペプチドは、ＧＰＣＲ（例えば、カンナビノイドレセプター）である。別の実施形態において、この膜結合ポリペプチドは、融合ポリペプチドである。さらに上記のように、光レセプター外側セグメント標的化シグナルは、配列番号４または配列番号１０を含み得るか、あるいはカエルもしくはマウスのロドプシンまたはカエルもしくはマウスの錐体視物質から誘導され得る。さらなる実施形態において、本発明は、遺伝子標的化構築物を提供する。この遺伝子標的化構築物は、杆状体外側セグメント（ＲＯＳ）標的化シグナルを有するポリペプチドをコードするトランスジーンを含む。ここで、このトランシジーンは、マウスロドプシン遺伝子に相同である５’側および３’側のＤＮＡ配列に隣接しており、ここで、この構築物とマウスロドプシン遺伝子との間の相同組換えの結果、このトランスジーンと杆状体特異的調節配列との間に作動可能な結合が生じる。
【００６０】
本発明はさらに、遺伝子標的化構築物を提供する。この遺伝子標的化構築物は、光レセプター外側セグメント標的化シグナルを有するポリペプチドをコードするトランシジーンを含む。ここで、このトラスジーンは、上記のようなロドプシン遺伝子に相同である５’側および３’側のＤＮＡ配列に隣接しており、かつポジティブ選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）をさらに含む。１つの実施形態において、このポジティブ選択マーカーは、ｌｏｘＰ部位に隣接する。別の実施形態において、この遺伝子標的化構築物は、ネガティブ選択マーカー（例えば、ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子）をさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子構築物の５’側隣接ＤＮＡ配列は、ロドプシンプロモーター（例えば、マウスまたはカエルのロドプシンプロモーター）を含む。さらに、３’側隣接配列は、マウスロドプシンのエキソン１の一部またはマウスロドプシンのエキソン２の一部を含み得る。さらに、本発明は、遺伝子標的化構築物を含むベクターまたは細胞を提供する。この遺伝子標的化構築物は、光レセプター外側セグメント標的化シグナルを有するポリペプチドをコードするトランスジーンを有する。ここで、このトランスジーンは、上記のようなロドプシン遺伝子に相同である５’側および３’側のＤＮＡ配列に隣接している。
【００６１】
１つの実施形態において、本発明は、ロドプシンプロモーター、膜結合ポリペプチド、および杆状体外側セグメント（ＲＯＳ）標的化シグナルをコードする核酸を含むトランスジーン構築物を提供する。例として、図２に示すように、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓロドプシン遺伝子プロモーターは、配列番号５に示される９アミノ酸のＲＯＳ標的化シグナルに融合されるヒト全長カナビノイドレセプター２（ＣＢ２）をコードするヌクレオチド配列の前に挿入され得る。さらに、例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓロドプシン遺伝子プロモーターは、配列番号１０に示される１５アミノ酸のＲＯＳ標的化シグナルに融合されるヒト全長カナビノイドレセプター２（ＣＢ２）をコードするヌクレオチド配列の前に挿入され得る。構築物は、Ｘｅｎｏｐｕｓの胎芽にトランスフェクトされ得、おたまじゃくし型のＲＯＳ膜におけるポリペプチド発現が、ＣＢ２抗体を用いた免疫学的局在決定によって確認される。本明細書中に記載されるさらなる例は、非ロドプシンＧＰＣＲＳ（例えば、緑色蛍光タンパク質に融合されたＣＢ２レセプターおよびＥＤＧ２レセプター）が、トランスジェニックＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ中の網膜細胞の外側杆状体セグメントに正確に標的化され得ることを示す（実施例ＩＶ）。
【００６２】
本発明は、光レセプター特異的プロモーター、膜結合ポリペプチドおよび光レセプター外側セグメント標的化配列（例えば、ＲＯＳ標的化配列）をコードする核酸を含むトランスジーン構築物をさらに提供する。光レセプター特異的プロモーターのいくつかの例は、当該分野で公知であり、例えば、膜タンパク質のプロモーターおよび可溶性タンパク質のプロモーターが挙げられる。膜タンパク質の光レセプター特異的プロモーターとしては、例えば、ペリフェリン／ｒｄｓ（Ｍｏｒｉｔｚら、Ｇｅｎｅ  ２９８：１７３−１８２（２００２））および、グアニル酸シクラーゼ−Ｅ（Ｄｕｄａら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：６３−７０（１９９８）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｇｅｎｅ  １９３：２１９−２２７（１９９７））が挙げられる。可溶性タンパク質の光レセプター特異的プロモーターとしては、例えば、杆体トランスデューシンのαサブユニット（Ａｈｍａｄら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６２：３９６−３９９（１９９４））およびアレスチン（Ｍａｎｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７４：１５５９０−１５５９７（１９９９）；Ｋｉｋｕｃｈｉら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３：４４００−４４０８（１９９３））が挙げられる。錐体特異的プロモーターのいくつかの例としては、例えば、赤視物質および緑視物質のプロモーター配列（ＳｈａａｂａｎおよびＤｅｅｂ，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３９：８８５−８９６（１９９８））および錐体アレスチンのプロモーター配列（Ｚｈｕら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５２４：１１６−１２２（２００２））が挙げられる。
【００６３】
本発明はさらに、構成性プロモーター、膜結合ポリペプチドおよびＲＯＳ標的化配列をコードする核酸を含むトランスジーン構築物を提供する。構成性プロモーターの例は、当該分野で周知であり、これらとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＳＶ４０  Ｔ  抗原プロモーター配列が挙げられる。この例において、膜結合ポリペプチドは、光レセプター特異的プロモーター配列またはロドプシンプロモーター配列が使用される場合よりも、広い発現パターンを有し得る。しかし、この例示的な構築物において、ＲＯＳ標的化配列は、発現パターンにおける同一の制限を提供し得る。
【００６４】
本発明は、光レセプター外側セグメントもＲＯＳ標的化配列も有さない、ロドプシンプロモーターおよび膜結合ポリペプチドをコードする核酸を含むトランスジーン構築物をさらに提供する。例えば、膜結合ポリペプチドは、膜チャネルポリペプチドまたはＧＰＣＲ（例えば、カナビノイドレセプター）であり得る。この例において、膜結合ポリペプチドは、ロドプシンを発現する細胞（例えば、光レセプター細胞）に標的化される。膜結合ポリペプチドは、細胞内に杆状体外側セグメントおよび他の位置を含み得る細胞全体にわたって発現され得る。光レセプター細胞は、大量のポリペプチドの適切な折りたたみおよび分類のために、広範囲なＧｏｌｇｉおよび小胞体を含む。膜結合ポリペプチドは、全細胞抽出物または桿体外側セグメントのような細胞の部分に由来する抽出物から、精製され得る。
【００６５】
トランスジーンまたは遺伝子標的化構築物はまた、１つ以上の選択マーカーを含み得る。構築物は、一般的に、少なくとも１つのポジティブ選択マーカーを含み、標的化細胞のゲノムにおけるこの選択マーカーの存在は、構築物のゲノム中への挿入を示し、この挿入は、ランダム挿入または相同組換えによる挿入であり得る。有利には、構築物はまた、ネガティブ選択マーカーを含み得、これは、相同性領域の外側である、線状化標的構築物の５’末端または３’末端に位置する。標的化細胞のゲノム中のネガティブ選択マーカーの非存在は、ポジティブ選択マーカーの存在と共に、この構築物が、ランダム挿入ではなく相同組換えによってゲノム中に挿入されたようである細胞を濃縮する。遺伝子標的化構築物に対して適切なポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーは、当業者によって選択され得、これらの使用のための方法は、当該分野において周知である。
【００６６】
ポジティブ選択マーカーは、細胞を生存させる発現可能な遺伝子（例えば、薬物ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはヒスチジノールに対して耐性を付与する遺伝子）を含む。あるいは、ヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）が欠損しているＥＳ細胞株が入手可能なので、発現可能なＨＰＲＴ遺伝子は、ＨＡＴ培地中で選択されるポジティブ選択マーカーおよびトランスフェクタントとして働く（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖｅｌ．８２：３−２１（１９９９））。
【００６７】
ネガティブ選択マーカーとしては、細胞に対して直接的または間接的に毒性である発現可能な遺伝子が挙げられる。例示的なネガティブ選択マーカーは、ジフテリア毒素−Ａフラグメント（ＤＴα）をコードする発現可能な遺伝子である。別のネガティブ選択マーカーは、毒性ヌクレオチドアナログ（例えば、ガンシクロビルまたはＦＩＡＵ）に対して感受性を付与する単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）である。代替的なネガティブ選択マーカーは、産物が免疫毒性結合体によって認識され得る発現可能な遺伝子（例えば、産物が組換え免疫毒素抗−Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ４０によって認識されるＩＬ−２レセプター遺伝子）である（Ｍｕｌｌｅｒ、上述（１９９９）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３６５３−３６５５（１９９６））。
【００６８】
図１に示される例示的な遺伝子標的化構築物において、トランスジーンの５’相同配列（Ｃ末端ＲＯＳ標的化シグナルを含むＧＰＣＲをコードする）は、ネイティブな５’制御エレメントを含む約１〜５ｋｂのマウスロドプシン遺伝子を含む。トランスジーンの３’相同配列は、エキソン１および必要に応じてエキソン２の一部を含む、マウスロドプシン遺伝子の約１〜５ｋｂを含む。５’相同配列および３’相同配列の全長は、一般的に、４ｋｂと８ｋｂとの間である。５’相同配列および３’相同配列は、一般的に１．５ｋｂ以上であり、より通常には、２ｋｂ以上であり、その長さは、一部、適切な制限部位の利用可能性に依存する。構築物はまた、ネガティブ選択マーカーとして、発現可能なジフテリア毒素Ａ遺伝子（ＤＴα）およびポジティブ選択マーカーとして、トランスジーンの３’に発現可能なフロックストネオ遺伝子を含む。この構築物とマウスロドプシン対立遺伝子との間の相同組換えの後、トランスジーンおよびフロックストネオ配列は、ロドプシン制御配列の３’に挿入され、エキソン１の一部を除去する。従って、ネイティブなマウスロドプシン制御配列は、桿体細胞中のトランスジーンの発現を指向し、ＲＯＳ標的化シグナルは、ＲＯＳ膜中にコードされるポリペプチドを局在化させる。ロドプシン対立遺伝子でのトランスジーンの挿入は、ロドプシン遺伝子発現を機能的に破壊する。従って、標的化された対立遺伝子に対して同型接合である動物において、ロドプシンは、低いレベルまたは検出不可能なレベルで発現され、トランスジーンは、ＲＯＳ膜中に発現される。
【００６９】
本発明はまた、遺伝子標的化構築物を含むベクターおよび遺伝子標的化構築物を含む宿主細胞を提供する。適切なベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ＢＡＣまたは大きなＤＮＡの断片が挿入され得る他のクローニングベクターであり得る。ベクターは、宿主細胞中で構築物を増幅するための複製起点を一般的に含む。ベクターはまた、有利には、ベクターを含む宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み得る。ベクターを増幅するために、宿主細胞は、代表的には、細菌細胞であるが、代替的には、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である。ベクターを宿主細胞に導入する方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら、上述（最新の補遺）を参照のこと）。
【００７０】
遺伝子標的化適用に使用するために適切なベクターは、市販されている（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．製）。遺伝子標的化用ベクターは、哺乳動物細胞中での使用のために適切なポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを、相同遺伝子配列およびトランスジェニック配列の挿入に対して適切なクローニング部位と共に、都合よく含む。
【００７１】
特定の適用について、標的化された細胞またはトランスジェニック動物のゲノムからポジティブ選択マーカーを除去し得ることが望ましい。従って、遺伝子標的化構築物は、ゲノムからのその切断を容易にする１つ以上の配列について、操作可能に位置決めされたポジティブ選択マーカーを含み得る。特定のＤＮＡ配列の除去を容易にするために適切な配列は、部位特異的レコンビナーゼに対する認識部位を含む。種々の部位特異的レコンビナーゼ（バクテリオファージ、細菌および酵素由来の酵素を含む）およびこれらの認識部位は、当該分野において公知である（Ｋｉｌｂｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．９：４１３−４２１（１９９３）において概説される）。当業者は、ポジティブ選択マーカーの選択的除去に対して適切な配列および対応する酵素を選択し得る。
【００７２】
特定のＤＮＡ除去のための例示的な系は、Ｃｒｅ／ｌｏｘ組換え系である。Ｃｒｅ／ｌｏｘ組換え系は、３４ｂｐ長のｌｏｘＰ（ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｘ  ｉｎ  Ｐ１）といわれる部分的に回文の標的配列を認識しそれに結合する、ファージＰ１由来の部位特異的レコンビナーゼＣｒｅ（ｃａｕｓｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）の使用を含む。ｌｏｘＰ配列は、配列番号７（５’−ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ−３’）のように示される。Ｃｒｅレコンビナーゼは、２つのｌｏｘＰ部位の間に同じ相対的方向で配置される任意の配列を、分子内組換えによって、効率的に除去する能力を有する。２つのｌｏｘＰ部位の間の同じ相対的方向のＤＮＡ配列は、「フロックスト」配列と呼ばれる。Ｃｒｅ活性の結果として、１つのｌｏｘＰ部位が、ゲノム内に残り、１つのｌｏｘＰ部位は、除去された環状化されたフラグメント上に見出される（図１を参照のこと；概説のために、Ｍｕｌｌｅｒ、上述（１９９９）；およびＫｉｌｂｙら、上述（１９９３）を参照のこと）。
【００７３】
標的化対立遺伝子から、フロックストＤＮＡ配列（例えば、ポジティブフロックスト選択マーカー）を除去する方法は、当該分野において公知である。１つの方法は、標的化胚性幹（ＥＳ）細胞中の発現カセットからＣｒｅを一過的に発現し、ＥＳクローンをスクリーニングして、フロックスト配列の欠失を確認することである（Ｘｕら、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３０：１−６（２００１）；Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０３−１０６（１９９４）を参照のこと）。代替的方法は、ＥＩＩａ−Ｃｒｅ遺伝子を保有するトランスジェニックマウスと、ゲノムがフロックスト配列を含むトランスジェニックマウスを交配することである（Ｘｕら、上述（２００１）；Ｌａｋｓｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５８６０−５８６５（１９９６））。さらなる代替的方法は、フロックスト配列を保有するトランスジェニック動物由来の受精卵の前核にＣｒｅ発現プラスミドを注入することである（Ｘｕら、上述（２００１））。後者２つの方法において、フロックスト配列が欠失された妊娠マウスは、スクリーニングによって同定される。当業者は、標的化対立遺伝子からフロックスト配列を除去するさらなる方法を決定し得る。
【００７４】
本発明はまた、ゲノムが、１つまたは両方の内因性ロドプシン対立遺伝子の機能的破壊を含む細胞を提供し、この細胞は、杆状体特異的制御配列と作動可能に連結されたＲＯＳ標的化シグナルを含むポリペプチドをコードするトランスジーンをさらに含む。ゲノムが、１つまたは両方の内因性ロドプシン対立遺伝子の機能的破壊を含む動物もまた提供され、この動物は、杆状体特異的制御配列と作動可能に連結されたＲＯＳ標的化シグナルを含むポリペプチドをコードするトランスジーンをさらに含む。
【００７５】
特定の実施形態において、細胞は、マウス細胞であり、動物は、マウスである。しかし、本発明は、遺伝子標的化手順の影響を受けやすい他の種（例えば、ラット、モルモット、ウシ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、ヒト、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類またはＺｅｂｒａｆｉｓｈ）で実施され得ることが企図される。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、ロドプシン対立遺伝子に関する用語「機能的破壊」は、対立遺伝子が、コードされるポリペプチドの正常な機能を阻害する変異（例えば、正常なロドプシンポリペプチドの発現を阻害するか、またはロドプシンポリペプチドの正常な量の発現を阻害する変異）を含むことを意味する。用語「機能的破壊」および「ノックアウト」は、本明細書中で同義として使用される。機能的破壊を引き起こす変異は、挿入、欠失または点変異であり得る。
【００７７】
１つの実施形態において、ロドプシン遺伝子対立遺伝子の両方は、機能的に破壊され、その結果、ロドプシン遺伝子産物の発現が、動物細胞において実質的に減少するか実質的に存在しなくなる。用語「実質的に減少される」は、正常な量の５０％未満のロドプシンが、動物の桿体細胞中で産生されることを意味することを意図される一方、用語「実質的に非存在」は、本質的に検出不可能な量のロドプシンが、動物の桿体細胞において産生されることを意味することが意図される。ロドプシンのレベルが実質的に減少されたかまたは実質的に非存在である動物は、代表的にロドプシン遺伝子のコード領域を破壊することによって作製され得るが、代替的アプローチは、遺伝子のシス制御性エレメントを破壊し、その結果、遺伝子の転写がダウンレギュレートされることである。
【００７８】
当業者は、ゲノムが、ロドプシン遺伝子の機能的破壊および特定のトランスジーン両方を含む細胞または動物を作製する種々の方法が存在することを理解する。例えば、このような細胞または動物は、トランスジーンを含む遺伝子標的化構築物と内因性ロドプシン遺伝子との間での相同組換えの結果として得られ、その結果、トランスジーンが、ロドプシン対立遺伝子に挿入される（「遺伝子ノックイン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）」と呼ばれる）。あるいは、このような細胞または動物は、直接またはノックアウト動物とトランスジェニック動物を交差交配するかのいずれかで、トランスジーンを、ロドプシン遺伝子ノックアウトバックグラウンドにランダムに挿入した結果として得ることができる。
【００７９】
本発明の細胞は、動物への移植の前に得られる細胞（例えば、胚性幹細胞、生殖細胞または胚細胞）；トランスジェニック動物またはその子孫に存在するままの細胞；およびその細胞（例えば、器官、組織、単離された一次細胞または確立された細胞株）のトランスジェニック動物または子孫から得られるかまたはこれらに由来する細胞を含むことが意図される。
【００８０】
本発明の細胞は、必要に応じて、トランスジェニックポリペプチドを発現する。例えば、細胞は、トランスジェニック動物に存在するままの桿体細胞であり得るか、またはトランスジェニック動物もしくはその細胞の子孫から単離された桿体細胞（例えば、確立された桿体細胞株）であり得る。本発明のトランスジェニック動物から単離された桿体細胞は、一般的に、桿体細胞中での転写を指向する桿体特異的制御エレメントおよびポリペプチドをＲＯＳ膜に局在化するＲＯＳ標的化シグナルに起因して、トランスジェニックポリペプチドを発現する。
【００８１】
ノックインアプローチにおける使用のために適切な遺伝子標的化構築物は、上記されてきた。遺伝子標的化構築物を使用する細胞および動物を調製するための方法は、当該分野で周知である。簡潔には、標的化構築物は、当該分野で公知のいくつかの技術（エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、微量注入、リポフェクションなどが挙げられる）のいずれかによって、適切な細胞（例えば、胚性幹細胞）に導入される。次いで、細胞は、一定の期間、導入された標的化構築物と内因性ロドプシン遺伝子との間の相同組換えを可能にするのに十分な条件下で、培養される。挿入されたＤＮＡを含む細胞が、例えば、上記されるポジティブ選択方法またはポジティブ／ネガティブ選択方法によって同定される。次いで、選択された細胞が、内因性ロドプシン遺伝子座における相同組換えについて、標準的な技術（例えば、内因性対立遺伝子を組換え対立遺伝子から区別するプローブまたはプライマー対を使用する、サザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ）によってスクリーニングされ得る。
【００８２】
育種工程なしに、ロドプシン遺伝子破壊についてホモ接合性の細胞を作製することが所望される場合、ヘテロ接合性細胞に対する薬物上昇が使用され得る（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：２３９１−２３９５（１９９２））。あるいは、野生型細胞の第１の対立遺伝子は、１つのマーカー（例えば、ネオマイシン耐性）で選択される第１の相同組換え事象によって破壊され得、次いで、ヘテロ接合性細胞の第２の対立遺伝子が、異なるマーカーで選択される第２の相同組換え事象（例えば、ハイグロマイシン耐性）によって破壊され得る。
【００８３】
ノックイン動物を作製するために、組み換え対立遺伝子を含む胚性幹（ＥＳ）細胞を、胚盤胞に導入するか、または桑実胚とともに凝集し、胚盤胞または桑実胚を、偽妊娠代理母に移植し、胚を、出産まで発生させた。得られた動物は、その胚性幹細胞からの子孫である細胞を有するキメラである。胚性幹細胞が動物の生殖細胞に寄与しているキメラ動物を、全ての体細胞および生殖細胞においてノックイン遺伝子に対してヘテロ接合性の動物を生成するために、野生型動物と交配させ得る。次いで、ヘテロ接合性動物を交配して、ホモ接合性動物を作り出し得る。相同組換えのためにＥＳ細胞および他の適切な細胞を得て、培養し、そして操作するための方法、ならびに組換え対立遺伝子についてキメラの、ヘテロ接合性の、またはホモ接合性の動物を作りだし、同定するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｓｅｄｉｖｙら，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｊｏｙｎｅｒ（編）Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第２版（１９９８）；およびＬｅｄｅｒｍａｎｎ，Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５：６０３−６１３（２０００））において総説されている。
【００８４】
ノックインストラテジーの代わりとして、本発明の細胞および動物は、ロドプシン遺伝子が機能的に破壊されている遺伝的背景に適切なトランスジェニック構築物を導入することによって作製され得る。ロドプシン遺伝子が機能的に破壊されたマウスの系統は、当該分野で記載されており（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１５：２１６−２１９（１９９７）；Ｌｅｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７３６−７４１（１９９９）を参照のこと）、これらのマウスの子孫が得られるか、またはノックアウト動物のさらなる系統が、類似の方法によって作り出される。
【００８５】
トランスジーンを挿入するための適切な構築物は、杆状体特異的調節配列に作動可能に連結されたトランスジェニックポリペプチドおよびＲＯＳシグナルをコードするＤＮＡ配列を含む。適切なポリペプチド、ＲＯＳシグナルおよび杆状体特異的調節配列は、上記に記載される。トランスジェニック構築物において使用するための例示的杆状体特異的調節性配列は、マウスロドプシンに由来する２．１ｋｂの５’ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（Ｇｅｉｇｅｒら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３５：２６６７−２６８１（１９９４））である。
【００８６】
トランスジェニック動物を作り出すための方法は、当該分野で周知である。代表的な方法の例として、トランスジェニックＤＮＡ構築物を、受精卵（接合体）の雄性前核に導入し、次いで、この受精卵を、偽妊娠雌性レシピエント動物に移植する。胚を出産日まで成長させ、トランスジーンを含む子孫（ヘテロ接合性創始動物）を、サザンブロッティングまたはＰＣＲにより同定する。異なる創始動物は、遺伝子発現に影響を与え得るトランスジーン組み込みの異なる部位を有する。杆状体細胞においてトランスジェニックポリペプチドが適切に発現される動物の系統が同定され得、同じ挿入物を有するより多くの動物を生成するために野生型動物と交配され得る（Ｓｅｄｉｖｙら，前出（１９９２）；Ｈｏｇａｎら，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９４）を参照のこと）。
【００８７】
当該分野で公知の代替的方法は、トランスジーンを動物に導入して、トランスジェニック動物の創始系統を作り出すために使用され得る（例えば、Ｈｏｇａｎら，前出，１９９４；米国特許第５，６０２，２９９号；同第５，１７５，３８４号；同第６，０６６，７７８号；および同第６，０３７，５２１号を参照のこと）。このような方法としては、例えば、生殖系列へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５２（１９８５））；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））；および精子媒介性遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら，Ｃｅｌｌ  ５７：７１７−７２３（１９８９））が挙げられる。
【００８８】
ロドプシンノックアウトバックグラウンドにおいてトランスジーンを有する動物を作り出すために、一般に、トランスジェニック動物は、ノックアウト動物と交配される。あるいは、このトランスジーンを、ロドプシンノックアウト対立遺伝子を含有する接合体へ導入し得、この接合体を、上記のように出産まで成長させ得る。いずれかの方法によって、所望の遺伝子型の子孫が同定され、交配によって、さらなる動物が作り出される。
【００８９】
本発明の動物（そのゲノムは、内因性ロドプシン対立遺伝子の一方または両方の機能的破壊を含み、杆状体特異的調節配列と作動可能に結合したＲＯＳ標的化シグナルを含むポリペプチドをコードするトランスジーンをさらに含む）は、有利には、種々の適用において使用され得る。例えば、実質的に精製される多量のトランスジェニックポリペプチドは、動物の眼の杆状体細胞の外側セグメント膜から単離され得る。このような目的のために、内因性ロドプシンの発現が、両方の内因性ロドプシン対立遺伝子の機能的破壊に起因して、実質的に存在しない動物が好ましく、その結果、ロドプシンでのＲＯＳ膜の汚染が最小にされ、精製が簡略化される。さらに、トランスジェニックポリペプチドを含むインタクトな杆状体細胞およびその抽出物は、本明細書中に記載の適用において使用され得る。
【００９０】
１つの実施形態において、本発明の細胞および動物は、本発明のトランスジーン構築物を含み得、内因性ロドプシン遺伝子を保持し得る。例えば、実施例ＩＶにおいて生成されるトランスジェニックＸｅｎｏｐｕｓは、内因性ロドプシン遺伝子をノックアウトしていないトランスジーン構築物を含む。この場合において、このトランスジーン構築物は、内因性ロドプシンとともにトランスジェニックＸｅｎｏｐｕｓの杆状体細胞において発現される、ＣＢ２レセプターまたはＥＤＧ２レセプターを含んだ。
【００９１】
通常の動物において、杆状体外側セグメント円板状膜（ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｄｉｓｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）のタンパク質含有量の約９０％は、ロドプシンである。本発明の動物において、トランスジーンの杆状体細胞特異的発現およびコードされるポリペプチドにおけるＲＯＳ標的化シグナルを含めることに起因して、杆状体外側セグメント円板状膜のタンパク質含有量の実質的な割合（例えば、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％またはそれ以上）は、むしろ、トランスジェニックポリペプチドであることが予測される。
【００９２】
通常の動物において、精製ロドプシンの代表的収量は、マウスの眼１つあたり約０．１〜１．０ｎｍｏｌである（Ｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３５５１−３５５５（１９９５）；Ｖａｎ  Ｈｏｏｓｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８６２３−８６２８（２０００））。本発明の動物において、類似の量のトランスジェニックポリペプチドが、類似のサイズの眼から調製され得、実際の量は、動物種に依存することが予測される。
【００９３】
当業者は、トランスジェニックポリペプチドを本発明の動物の杆状体細胞から実質的に精製する適切な方法を決定し得る。一般に、網膜は、適切な数の動物から切り出され、杆状体外側セグメントが、Ｐａｐｅｒｍａｓｔｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８１：４８−５２（１９８２）またはＯｋａｄａら，Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６７：４９５−４９９（１９９８）によって記載されるように単離される。例えば、網膜を、スクロース緩衝液中でホモジナイズし得、粗製ＲＯＳを、低速遠心分離によって沈澱させ得、実質的に精製されたＲＯＳを、密度勾配遠心分離により単離し得る。特定の適用のためには、トランスジェニックポリペプチドを実質的に精製するための出発供給源として、杆状体細胞抽出物、網膜抽出物、または眼の抽出物を使用することがより簡便であり得る。
【００９４】
トランスジェニックポリペプチドは、適切な界面活性剤を使用して、ＲＯＳ膜から可溶化され得る。可溶化条件は、有利には、このポリペプチドの一工程精製を提供するように最適化され得る。例えば、二価カチオンと組み合わせて、適切な親水性−親油性バランスを有するアルキル（チオ）グルコシド（例えば、オクチルチオグルコシド）は、ＲＯＳからのロドプシンの一工程精製を提供した（Ｏｋａｄａら，前出（１９９８））。あるいは、可溶化ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドの生物学的特性および免疫学的特性、ならびに特定の適用に必要とされる純度の程度に依存して、標準的な生化学的手順および免疫学的手順（これらは、当業者により選択され得る）を使用するさらなる精製に供され得る。有利には、１Ｄ４エピトープを含むＲＯＳ標的化シグナルを含むポリペプチドは、１Ｄ４モノクローナル抗体によって認識され得る。従って、このトランスジェニックポリペプチドは、当該分野で公知の、および本明細書中で記載される（実施例ＶＩを参照のこと）標準的な免疫アフィニティー手順によって単離され得る。
【００９５】
トランスジェニックポリペプチドは、十分な濃度で得られ得、Ｘ線結晶学による構造分析に適切な結晶を調製するために使用されるように、精製され得る。先に記載されるように、組織培養物において発現されるポリペプチドとは対照的に、ＲＯＳにおいて発現されるポリペプチドは、翻訳後修飾に関して比較的均一であり、このことによって、結晶化は非常に容易になる。高品質の結晶を生成するための条件は、ポリペプチド自体に依存する。しかし、ロドプシンから結晶を調製するための例示的条件は、Ｏｋａｄａら，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．１３０：７３−８０（２０００）に記載されており、多くのトランスジェニックＧＰＣＲおよびＲＯＳ膜から単離された他のトランスジェニックポリペプチドに適していることが予測される。簡潔には、結晶は、約３０ｍＭ  ＭＥＳまたは酢酸ナトリウム、５〜７ｍＭ  β-メルカプトエタノール、６５〜９０Ｚｎ（ＯＡｃ）２、０．５５〜０．７５％  ＨＴＰＯ、０．４５％〜０．５５％  ノニルグルコシドおよび０．８４〜０．８６Ｍ  硫酸アンモニウムを含有する緩衝液中に少なくとも約５ｍｇ／ｍｌのポリペプチドを含む溶液からの懸濁拡散蒸着（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ  ｖａｐｏｒ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）によって調製され得る。代替的な結晶化緩衝液および結晶化を改善するために使用され得る添加物は、当該分野で公知である（例えば、Ｒｅｅｓら，編，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２）を参照のこと）。
【００９６】
実質的に精製されたトランスジェニックポリペプチドはまた、抗体を調製するために使用され得る。このような抗体は、そのネイティブ形態であり、そのネイティブの翻訳後修飾を有するポリペプチドを認識することにおいて有利であり得る。必要に応じて、このような目的で、トランスジェニックポリペプチドを、キャリアタンパク質に結合体化し得、そして／またはその免疫原性を増大させるためのアジュバントとともに処方され得、そしてこれを使用して、適切な動物を免疫し得る。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにこれらの抗原結合フラグメント（例えば、ＶＬ、ＶＨおよびＦｄ；一価のフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦａｂ’；二価のフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２；単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；ならびにＦｃフラグメント）などを調製する方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｄａｙ，Ｅ．Ｄ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９０）；ならびにＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）において記載される。
【００９７】
実質的に精製されるトランスジェニックポリペプチドについてのさらなる適用は、医薬品の調製物である。例えば、そのトランスジェニックポリペプチドが抗体である場合、毒素に結合体化され得、対応する抗原を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）を特異的に標的化するために個体に投与され得る。さらなる例として、このトランスジェニックポリペプチドが、レセプターアゴニストまたはレセプターアンタゴニストである場合、病的状態と関連したレセプターシグナル伝達を調節するために個体に投与され得る。種々のポリペプチドの薬学的適用は、当該分野で公知であるか、または決定され得る。実質的に精製されたポリペプチドは、薬学的に受容可能な賦形剤とともに処方され得る。ポリペプチドの量および正確な処方物は、このポリペプチドの性質および生物学的活性、ならびに意図される投与経路に依存する。医薬品を処方するための適切な方法および賦形剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，最新版）に記載される。
【００９８】
ＧＰＣＲは、現在利用可能な薬物の販売合計の４０％を超えるものが標的としている。ＧＰＣＲ（例えば、ＣＢ１レセプター）の構造の解明は、ＣＢ１レセプター、および他の構造的に関連するレセプター（例えば、ＣＢ２）に対する薬物発見の試みを支持し得る。このＣＢ１レセプターは、薬物発見標的であった。なぜなら、カンナビノイドの精神作用性効果は、ＣＢ１レセプターによって媒介され得るからである。このＣＢ２レセプターは、免疫系の細胞において発現され、自己免疫および他の障害の標的であり得る（ＧｕｒｗｉｔｚおよびＫｌｏｏｇ，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  ４：１９６−２００（１９９８））。
【００９９】
このトランスジェニックポリペプチドはまた、薬物スクリーニング適用において使用され得る。例えば、杆状体細胞、ＲＯＳ膜抽出物、または実質的に精製されたポリペプチドは、候補化合物と接触され得、この化合物がポリペプチドに結合する能力が決定され得る。このポリペプチドに結合する化合物は、このポリペプチドの候補リガンド、アゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニスト（ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｇｏｎｉｓｔ）である。この化合物の機能的効果は、引き続き、特定のポリペプチドに適切な機能的アッセイによって決定され得る。スクリーニングアッセイにおいて使用するための適切な候補化合物としては、単純な有機分子または複雑な有機分子、金属含有化合物、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、抗体などのような化学的分子または生物学的分子が挙げられ、このような化合物のライブラリーは、容易に調製され得るか、または市販され得る。種々の結合アッセイ（ハイスループット結合アッセイを含む）が、当該分野で公知であり、以下のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る：シンチレーション近接アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ）（ＳＰＡ）、ＵＶ架橋または化学架橋、競合結合アッセイ、生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、質量分析法（ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、および蛍光分極アッセイ（ＦＰＡ）が挙げられる。当業者は、特定のスクリーニング適用について適切な化合物およびアッセイを決定し得る。
【０１００】
トランスジェニックポリペプチドを発現するトランスジェニック動物に由来するインタクトな細胞（その動物の網膜内の杆状体細胞およびその動物から単離された杆状体細胞が挙げられる）はまた、上記に類似の結合アッセイおよび機能ベースのスクリーニングアッセイを含む、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用され得る。適切な機能ベースのスクリーニングアッセイは、このポリペプチドの正常な機能に依存する。例えば、このトランスジェニックポリペプチドがレセプターである場合、この化合物に応じたレセプターを介するシグナル伝達が、決定され得る。例示的なシグナル伝達アッセイは、レセプターの性質に依存するが、例えば、変化した生成または変化した二次メッセンジャーのターンオーバー、ＮＴＰ加水分解、イオンまたはアミノ酸の流入または流出、変化した膜電位、増大または減少したタンパク質リン酸化、変化した酵素活性、変化したタンパク質−タンパク質相互作用、細胞内のタンパク質の再局在化、あるいは遺伝子発現の誘導を決定することを包含し得る。関連するエフェクター分子またはレセプター遺伝子が、杆状体細胞に通常は存在しない特定の機能的アッセイについては、動物ゲノムは、これらの成分を発現するように、ノックイン方法またはトランスジェニック方法によってさらに改変され得る。天然に存在する変異および人工的な変異のトランスジェニックポリペプチド活性に対する効果は、機能ベースのアッセイによって、同様に決定され得る。
【０１０１】
本発明のトランスジェニック動物、細胞および実質的に生成されたトランスジェニックポリペプチドについてのさらなる適用は、当業者によって決定され得る。
【０１０２】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するのであって、限定することを意図するのではない。
【実施例】
【０１０３】
（実施例Ｉ）
この実施例は、マウス網膜のロドプシンを、Ｇタンパク質結合レセプターに交換するための遺伝子ターゲティングの構築物の構築を示す。
【０１０４】
マウスロドプシンの５つのエキソン全て、およびその調節エレメントを含む遺伝子フラグメントを、Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：２１６〜２１９（１９９７）に記載される方法によって獲得する。要するに、ロドプシンｃＤＮＡプローブを使用して、λファージライブラリーから１２９Ｓｖ由来のマウスゲノムフラグメントを含むクローンを単離する。この断片の関連する制限酵素認識部位を示す制限酵素マップを、図１（最上位）に示す。最初のゲノムフラグメントに由来する１１ｋｂのＢａｍＨ１フラグメントを、ｐＫＯ  Ｓｃｒａｍｂｌｅｒ  Ｖ９０７ベクター（Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）中に、サブクローン化して図１に示されるゲノムクローンを生成した。
【０１０５】
Ｃ末端を１Ｄ４タグ（ｔａｇ）標識したＧタンパク質結合レセプターｃＤＮＡおよび、二つのｌｏｘＰ部位で挟んだネオマイシン耐性遺伝子を含むトランスジェニックカセットを、標準的な分子生物学的方法によって構築した。要するに、ＰＣＲによって、ＧＰＣＲのｃＤＮＡの終結コドンを、９アミノ酸の１Ｄ４エピト−プタグ（ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ；配列番号５）に続く終止コドンにインフレームの配列コードによって置換した。
【０１０６】
標識されたＧＰＣＲを、Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：３６６７〜３６７２（１９９８）に記載されるように調整される、ｐｌｏｘＰ−ｎｅｏ−ｌｏｘＰ（「ｆｌｏｘｅｄ  ｎｅｏ」）カセットにライゲーションする。ＧＰＣＲの発現が、ロドプシンプロモーターによって駆動されるように、ＧＰＣＲ／ｆｌｏｘｅｄ  ｎｅｏカセットを、次いで、ロドプシンプロモーターとエキソン１との間のロドプシンゲノムクローンに連結する。これにより、エキソン１コード配列の一部が欠損する。
【０１０７】
ジフテリア毒素Ａ鎖カセット（Ｌａｂａｒｃａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：２７８６〜２７９１（２００１））をまた、図１に示す標的化構築物を提供するために、構築物の３’末端に連結する。従って、この構築物は、ＥＳ細胞における相同組み換えの選択に使用するための削除可能なポジティブ選択マーカー（ｎｅｏ）および、ネガティブ選択マーカー（ＤＴα）の両方を含む。
【０１０８】
マウスロドプシン遺伝子の他のトランスジーンへの交換に適する標的化構築物を、同じ方法で作製する。
（実施例ＩＩ）
この実施例は、網膜のマウスロドプシンをヒトカンナビノイドレセプター２に交換するための遺伝子標的化構築物の構築を示す。
【０１０９】
ヒトカンナビノイドレセプター２（ＣＢ２）ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ７４３２８）を、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーからクローン化する。９アミノ酸の１Ｄ４タグを、センスプライマー５’−ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣ（配列番号８）およびアンチセンスプライマー５’−ＴＴＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＣＴＣ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＡＧＡ  Ｇ（配列番号９）を使用するＰＣＲによって、ＣＢ２のＣ末端に付加する。ＣＢ２／１Ｄ４融合がインフレームであることを確認するために、接合部の配列決定を行う。ネオマイシン耐性カセット（ｎｅｏ）を、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナルとともにｌｏｘＰ部位に挟んで、ＣＢ２／１Ｄ４融合の下流に挿入する。標的化構築物（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ）は、ロドプシン遺伝子のＸｈｏ１部位の間のＤＮＡセグメントをＣＢ２−ｎｅｏカセットに交換することによって作製し、転写開始部位の１５ｂｐ上流およびロドプシン遺伝子の始めの１１１コドンを欠損する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する、ジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴα）遺伝子を、ネガティブ選択を提供するために、標的化構築物の３’末端に挿入した。
（実施例ＩＩＩ）
この実施例は、遺伝子標的化構築物の胚性幹（ＥＳ）細胞への導入およびトランスジェニックマウスの産生を示す。
【０１１０】
実施例Ｉまたは実施例ＩＩに記載した遺伝子標的化構築物を、１２９Ｓｖ  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、そしてそのＥＳ細胞を、ネオマイシンアナログＧ４１８の存在下で培養する。正しく標的化したＥＳクローンは、図１または図２に示されるように変化したロドプシン遺伝子座を有し、Ｇ４１８に耐性である。不正確に標的化したクローンは、ＤＴα遺伝子の発現によって死滅する。Ｇ４１８耐性クローン由来のＤＮＡは、相同組み換えを確認するために、ＰＣＲ分析およびサザンブロッティングによってスクリーニングした。
【０１１１】
ＥＳ細胞を、サイトメガロウイルス−ＣｒｅプラスミドのようなＣｒｅリコンビナーゼ発現ベクターで一時的にトランスフェクトし、そして隣接するｌｏｘ部位でのｎｅｏｒ遺伝子のＣｒｅ媒介による切り出しを、ＰＣＲ増幅遺伝子セグメントの配列分析によって確認する。
【０１１２】
ｎｅｏｒ遺伝子が切り出された正しくターゲットしたＥＳ細胞クローンを、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞に微量注入し、その後偽妊娠の雌マウスに移植する。キメラオス子孫を、混合した毛の色で確認し、そして雌と交配し、そしてターゲットされた対立遺伝子に対してヘテロ接合体である子孫をＰＣＲ分析およびサザンブロッティングによって確認する。その後、ヘテロ接合体を交雑し、ホモ接合体のマウスを作製する。
【０１１３】
ホモ接合体マウスは、杆体細胞の外部セグメント膜でロドプシンの代わりにトランスジェニックポリペプチドを生成する。
（実施例ＩＶ）
この実施例は、トランスジェニックＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓの杆体細胞における二つの非ロドプシンＧＰＣＲである、ＣＢ２レセプターおよびＥＤＧ２レセプターの発現を示す。
【０１１４】
ヒトＣＢ２レセプターまたはヒトのリゾホスファチジン酸２型（ＥＤＧ２）レセプターに融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む融合構築物を生成した。さらに、マウスロドプシン由来の１５アミノ酸のＣ末端セグメント、ＳＡＴＡＳＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１０）を杆体外部セグメントターゲティングシグナルとしてＧＦＰに融合した。本明細書中で配列番号１１として参照されるＸｅｎｏｐｕｓのロドプシンプロモーター断片（ＸＯＰ）を、融合タンパク質の直接的な発現のために使用した（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ０７７７０（これは、プロモーター配列の一部を含む）およびＭａｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：３６５５７〜３６５６５（２００１）もまた参照のこと）。最終的な構築物は、５’から３’の方向で、Ｘ．ｌａｅｖｉｓオプシンプロモーター（ＸＯＰ）、ヒトＣＢ２またはＥＤＧ２レセプター、ＧＦＰ、および杆体外部セグメントターゲティングシグナルとしてマウスロドプシンに由来する１５アミノ酸Ｃ末端セグメント（ＩＤ４）を含んだ。
【０１１５】
ｐＸＯＰ−ＣＢ２−ＧＦＰ−１Ｄ４およびｐＸＯＰ−ＥＤＧ２−ＧＦＰ−１Ｄ４とそれぞれ呼ばれる融合構築物を線状化し、そして数百のＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に注入した。７日までまたはそれよりも長く（発生段階４２または以降）生き残ったオタマジャクシの中で、ＣＢ２−ＧＦＰ−１Ｄ４ポリペプチドおよびＥＤＧ２−ＧＦＰ−１Ｄ４ポリペプチドが発現され、そしてトランスジェニックＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ杆体において外部杆体セグメントに輸送された。緑色蛍光を、２０％のトランスジェニックＸｅｎｏｐｕｓのオタマジャクシの網膜で確認した。異なるオタマジャクシ間で緑色蛍光の強さは変化するが、ほとんどの場合、この強さは、可溶性ＧＦＰ−１Ｄ４融合タンパク質のみ発現するトランスジェニックＸｅｎｏｐｕｓのオタマジャクシにおけるよりも強かった。
【０１１６】
ＣＢ２−ＧＦＰ−１Ｄ４ポリペプチドおよびＥＤＧ２−ＧＦＰ−１Ｄ４ポリペプチドの細胞内での位置を、オタマジャクシの網膜凍結切片の共焦点顕微鏡によってさらに分析した。この顕微鏡研究によって、ＣＢ２−ＧＦＰ−１Ｄ４ポリペプチドおよびＥＤＧ２−ＧＦＰ−１Ｄ４ポリペプチドが膜結合型であり、この主要なものが杆状体外側セグメントの円盤中で発現しており、そして少量の融合ポリペプチドが杆状体内側セグメントおよびシナプスの外側原形質膜に位置づけられることを示した（図３）。ポリペプチドが、小胞体およびゴルジ装置に集積することは殆どなく、このことは、この融合ポリペプチドが適切に折りたたまれ、そしてその膜の表面に存在することを示している。この観察によって、そのロドプシンプロモーターに結合するＣＢ２レセプターの過剰発現が、網膜において天然に発現されているＣＢ２レセプターにとっての折りたたみ機構を飽和しなかったことが示された。これらの結果は、多量のＧＰＣＲの発現のために視覚系を使用するという考えに確証を与えるものである。
【０１１７】
ヒトＣＢ２レセプターのクローン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７４３２８）を、レセプターのコード配列に対するプライマーを利用するＰＣＲによって、ヒトゲノムＤＮＡのプール（Ｎｏｖａｇｅｎ）から増幅した。このＰＣＲ生成物（ＣＢ２：１０８３ｂｐ）を、Ｔａｑｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して生成して、そして、ｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。このＰＣＲ生成物を、配列決定して、変異がＰＣＲ増幅によって導入されていないことを確認した。ヒトＥＤＧ２クローンを、供給業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ）から取得した。
【０１１８】
ｐＸＯＰ−ＣＢ２−ＧＦＰ−１Ｄ４およびｐＸＯＰ−ＥＤＧ２−ＧＦＰ−１Ｄ４の発現プラスミドを、以下のように構築した：ｐＸＯＰ−Ｃ１−ＥＧＦＰベクター（Ｔｅｄ  Ｗｅｎｓｅｌ博士（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）から取得した）を、ＡｇｅＩ／ＡｃｃＩＩＩによって切断して、ＥＧＦＰ配列を除去し、そして、再連結して、ｐＸＯＰ−Ｃｌｍｉｎｕｓプラスミドを生成した。マウスオプシンの最後の１５アミノ酸をコードするポリリンカー、およびＡＦＰ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）配列を、ｐＸＯＰ−Ｃｌｍｉｎｕｓ中に挿入してｐＸＯＰ−Ｎ１−ＧＦＰ−１Ｄ４を作製した。ＣＢ２配列特異的プライマーまたはＥＤＧ２配列特異的プライマーを使用して、このＣＢ２レセプターおよびＥＤＧレセプターをコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＣＲＩＩ−ＣＢ２およびベクターｐＣＤＮＡ３．ｌｇｓ−ＥＤＧ２から、それぞれ増幅した。Ｋｏｚａｋ配列を、これらのフラグメントの開始コドンに加えた。この増幅された生成物を、ｐＸＯＰ−Ｎ１−ＧＦＰ−１Ｄ４のＳｒｆＩ部位に挿入して、発現プラスミドのｐＸＯＰ−ＣＢ２−ＧＦＰ−１Ｄ４およびｐＸＯＰ−ＥＤＧ２−ＧＦＰ−１Ｄ４を作製した。得られたプラスミドを配列決定して、正しいコードフレームを確認した。
【０１１９】
トランスジェニック作製のために、ＤＮＡを、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  ｍａｘ−ｐｒｅｐプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、そして、ｐＸＯＰ−ＣＢ２−ＧＦＰ−１Ｄ４およびｐＸＯＰ−ＥＤＧ２−ＧＦＰ−１Ｄ４をＮｏｔＩおよびＦｓｐＩを用いて消化した。この直線状の４．７ｋｂ（ＸＯＰ−ＣＢ２−ＧＦＰ−１Ｄ４）または４．９ｋｂ（ＸＯＰ−ＥＤＧ２−ＧＦＰ−１Ｄ４）のフラグメントを、消化（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）の後に精製して、水中の最終溶出物を得た。トランスジェニックＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ胚を、ＫｒｏｌｌおよびＡｍａｙａ（ＫｒｏｌｌおよびＡｍａｙａ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：３１７３〜３１８３（１９９６））によって記載されるように、制限酵素媒介性の組み込みによって調製した。制限酵素媒介性の組み込みを、６％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌｌを含む０．４３ＭＭＲ中で実施した。１３ＭＭＲは、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、および５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含む。胚を、４〜８細胞期で、０．１３ＭＭＲ（６％  Ｆｉｃｏｌｌ）に移した。適切な原腸胚形成胚を、約４２期まで０．１３ＭＭＲ中で育て、次いで、脱塩素処理した水の中に移した。オタマジャクシを、０．０１％  ３−アミノ安息香酸エチルエステル（Ｓｉｇｍａ）中で麻酔し、そして、オリンパス製の蛍光解剖顕微鏡を使用して緑蛍光タンパク質発現についてモニタリングした。
【０１２０】
トランスジェニックＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓの共焦点顕微鏡観察を、以下のように実施した。トランスジェニックオタマジャクシ（第４８期からそれ以降）を、４℃にて一晩、４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．５）中で固定した。オタマジャクシを、４℃にて、２時間から一晩に亘って、３０％スクロース−ＰＢＳ中で凍結防止処理し、このサンプルをＯＣＴ：Ｉｍｍｕｍｏｕｎｔ（２：１）媒体中に固定し、そして１２〜１４μｍの冷凍切片をミクロトームで調製した。切片を、４８８ｎｍレーザーバンドおよび５０５バンドパスフィルターを使用するＺｅｉｓｓ５１０共焦点顕微鏡を用いて分析して、ＣＢ２−ＧＦＰ−１Ｄ４およびＥＤＧ２−ＧＦＰ−１Ｄ４を可視化した。
【０１２１】
（実施例Ｖ）
本実施例は、ヒトＣＢ１レセプター標的化構築物の構築を示す。
【０１２２】
ロドプシン遺伝子座におけるＣＢ１−１Ｄ４ノックインマウスを作製するために、標的化構築物を作製し、ここで、ロドプシンエキソン１を、ＣＢ１−１Ｄ４融合物＋ｌｏｘＰに隣接するネオマイシン耐性カセット（ｎｅｏ）カセットによって置換した（図１を参照のこと）。ＥＳ細胞に、この標的化構築物をエレクトロポレートし、Ｇ４１８抗生物質に対する耐性について選択した。陽性ＥＳ細胞を、そのロドプシン遺伝子座における相同性組換えについて、ＰＣＲおよびサザンブロットによって選択する。
【０１２３】
マウスオプシンゲノムフラグメントを、以下のようにクローニングした。テンプレートしてロドプシンｃＤＮＡを使用し、数個のラムダファージクローンをマウス１２９ｓｖ由来ゲノムＤＮＡライブラリーから単離し、種々の制限酵素で消化し、そして、この遺伝子構造が、それまでの研究報告（ａｌ−Ｕｂａｉｄｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２０５６３〜２０５６９（１９９０））と整合することを確認した。ＣＢ１−１Ｄ４融合構築物および標的化構築物の作製は以下の通りであった。このマウスロドプシン１Ｄ４タグをＣＢ１のＣ末端に付加し、このＣＢ１  ｃＤＮＡを、そのレセプターの終止コドンのすぐ上流にあるマウスロドプシンの最後の１５個のアミノ酸を挿入するために設計されたプライマーを使用して、Ｐｆｕポリメラーゼによって増幅した。２つのＳｍａＩ制限部位およびＫｏｚａｋ配列もまた、この構築物の末端に組み込んだ。このことは、このフラグメントが遺伝子標的化構築物にサブクローニングされることを容易にする。この接合部を配列決定して、ＣＢ１／１Ｄ４融合物がインフレームであることを確認した。ネオマイシン耐性カセット（ｎｅｏ）は、ホスホグリセレートキナーゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを有しており、ｌｏｘＰ部位に隣接している。このカセットを、ＣＢ１／１Ｄ４融合物の下流に挿入した。ＣＢ１−ｎｅｏカセットを伴うロドプシン遺伝子のＸｈｏ１部位の間にＤＮＡセグメントを置換し、ロドプシンの翻訳開始部位の上流の１５ｂｐおよび最初の１１１コドンを除去することによって、この標的化構築物を作製した。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有するジフテリア毒素α鎖（ＤＴα）遺伝子を、その標的化構築物の３’末端に導入して、ネガティブ選択を提供する。変更された遺伝子座は、マウスオプシンプロモーターを使用して１Ｄ４−タグ化ヒトＣＢ１レセプターを発現し得、他方、内因性ロドプシンは不活性化され得る。
【０１２４】
（実施例ＶＩ）
本実施例は、杆状体外側セグメントからのＧＰＣＲの精製のための方法を示す。
【０１２５】
ＧＰＣＲ（例えば、マウスの網膜の杆状体外側セグメントで発現されたＣＢ１レセプターおよびＣＢ２レセプター）の精製を、本明細書において記載された２工程でのロドプシン精製のための方法に基づいてモデル化し得る。網膜抽出物から杆状体外側セグメントを単離するために、スクロース勾配遠心分離に基づいた、信頼性の高い方法が存在する（Ｐａｐｅｒｍａｓｔｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，８１：４８〜５２（１９８２）を参照のこと）。この方法は、密度勾配媒体としてＯｐｔｉｐｒｅｐを使用してマウス網膜に適合されている（Ｔｓａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１７〜１２１（１９９８））。この杆状体外側セグメントの濃縮プロトコルは、トランスジェニックマウスの杆状体外側セグメントにおいて発現されたＧＰＣＲのＧＰＣＲ精製における第１の工程であり得る。さらに、ＧＰＣＲの各々は、ＲＯＳ標的化配列（例えば、ＳＡＴＡＳＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１０））（これは、そのポリペプチドが杆状体外側セグメントに輸送されるために必要である）を有するＣ末端でタグ化されるので、その配列と反応性の抗体は、精製プロトコルのために使用され得る。Ｍｏｌｄａｙの１Ｄ４モノクローナル抗体は、この配列に対して非常に高い親和性を示し、そして、これは、ロドプシンの精製のため、そして、他の１Ｄ４タグ化ＧＰＣＲに対して使用されてきた（Ｓｈｉｍａｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３１７７４〜３１７８０（２００２）；Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：６４９〜６５４（２０００）；Ｗｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５７：５７〜１０２（１９９７））。
【０１２６】
図４において示されるように、１Ｄ４免疫親和性クロマトグラフィーによって精製されたロドプシンは、比率Ａ２８０／Ａ５００＝１．６−１．７を示し（図４Ｂ）、このことは、このサンプル中のロドプシンが、純粋であり、かつ機能性であることを示す。一貫して、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動して、クマシーブルーを用いて染色したとき、２つのバンド（モノマーおよびダイマー）のみが、観測された。２０ｃｍ長カラム上で免疫親和性クロマトグラフィーによって精製されたロドプシンは、最も濃縮された画分において約２ｍｇ／ｍＬに達する（図４Ａ）。遠心分離濃縮機において３〜４倍に濃縮した後、そのロドプシン濃度は、結晶化試験について十分なものである。
【０１２７】
イムノアフィニティーカラムを以下の通りに調製した。１Ｄ４タグ（ロドプシンの９個のＣ末端残基）に対するモノクローナル抗体を、１Ｄ４ハイブリドーマ細胞によって産生した。この抗体を、２つのクロマトグラフィー工程において均質になるまで精製した。最初に、１．５Ｌのハイブリドーマ上清を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８）に対して透析し、５５ｇのＤＥＡＥセルロースを含むカラム中にローディングし、そして１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８）中の０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配を用いて溶出させた。これらの画分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析し、そして抗体を含む画分をプールし、そしてプロテイン−Ａ結合緩衝液（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）（Ａ）ＩｇＧ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ製）で１：１希釈した。この抗体溶液を５ｍＬ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にローディングし、そして０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．８）を用いて溶出させた。画分を、１０％の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８）を用いて直ちに中和した。最終的に、この抗体を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液に対して透析し、そして製造業者の示唆するプロトコルに従って、臭化シアン活性化アガロースマトリクス（ＡｍｉｎｏＬｉｎｋ  Ｐｌｕｓ  Ｇｅｌ、Ｐｉｅｒｃｅ製）に、ゲル１ｍＬあたり１０ｍｇ抗体の密度でカップリングさせた。
【０１２８】
ロドプシンの精製のための全ての手順を、薄暗い赤色光下で実施した。第１工程は、スクロース勾配遠心分離（Ｐａｐｅｒｍａｓｔｅｒ，前出）によって暗順応ウシ網膜抽出物から富化された杆細胞外側セグメントからなっていた。続いて、この杆外側セグメント調製物を、２０ｍＭ  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含む緩衝液１（２０ｍＭ  Ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン，ｐＨ７．４，５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中に可溶化し、そして１Ｄ４アフィニティーカラムにローディングした。溶出を、緩衝液２（２０ｍＭ  Ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中の、ロドプシンの９つのＣ末端残基（ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ）に相当する競合ペプチド（０．１ｍＭ）の添加によって達成した。最も濃縮された画分の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
【０１２９】
（実施例ＶＩＩ）
本実施例は、１Ｄ４タグ化カンナビノイドレセプター１の特徴付けを示す。
【０１３０】
異種の系におけるカンナビノイドレセプターの発現は、精製プロトコルを試験するために、およびこれらのレセプターの異常な挙動（例えば、塊状凝集、精製のために用いられる界面活性剤における不安定性、または精製の際の特定のリガンド（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）に関する結合特性の喪失）を調査するために、有用であり得る。それゆえ、１Ｄ４タグ化ＣＢ１レセプターの安定な発現のためのＨＥＫ２９３細胞株を作製し、そして特徴付けした。
【０１３１】
ＣＢ１−１Ｄ４融合ポリペプチドを、１Ｄ４抗体を用いた免疫ブロッティングによって検出した。ロドプシンについても観察されたように、いくつかの二量体形成もまた検出された。このポリペプチド集団における不均質性は、脱グリコシル（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）によって有意に低減され得る。
【０１３２】
プラスミドの構築および哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞へのプラスミドのトランスフェクションは以下の通りであった。１Ｄ４タグを有するヒトＣＢ１  ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そして配列決定した。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位を、これらのプライマー中に組み込み、次いでこれは、ｐＣＤＮＡ３．１／Ｚｅｏのマルチプルクローニング部位へのこのフラグメントのサブクローニングを促進した。安定なトランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて発現ベクターでトランスフェクトした。Ｇ４１８を用いた抗生物質選択およびクローン選択の後、クローンを、１Ｄ４抗体を用いて免疫ブロッティングすることにより、このレセプターの発現について分析し、そして高レベルのＣＢ１を発現する安定な細胞株を選択した。
【０１３３】
ポリペプチドの発現を、以下の通りの免疫ブロッティングによって検出した。１００万個のＣＢ１発現ＨＥＫ２９３細胞を、プロテアーゼインヒビター、エンドヌクレアーゼ、および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む低張緩衝液中で溶解した。室温での５分間のインキュベーション後、破砕された膜を、遠心分離によって収集した。ＰＢＳ緩衝液を用いた２回の洗浄後、この膜を、ＰＢＳ緩衝液中の１％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（１００μＬ）中に溶解し、そして遠心分離して、不溶性物質を除去した。１μＬのエンドグリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＳＩＧＭＡ製）を５０μＬのサンプルに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。サンプル（１０μＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて泳動し、次いでこのゲルからのポリペプチドをニトロセルロースメンブレンに転写した。このメンブレンを、５％脱脂粉乳を１時間にわたって用いて、非特異的結合をブロックし、そして０．２μｇ／ｍＬの１Ｄ４一次抗体とともに１時間インキュベートした。洗浄後、このメンブレンを、０．１μｇ／ｍＬのＨＲＰ結合体化二次抗体とともに１時間インキュベートし、洗浄、化学発光基質とともに５分間インキュベートし、そしてこのシグナルをカメラを用いて検出した。
【０１３４】
カッコ内または他の箇所で、上記に提供した全ての雑誌論文、参考文献および特許引用物は、予め言及されたのであろうとそうでなかろうと、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１３５】
本発明は、上記に提供された実施例を参照して記載されてきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく、種々の改変が行われ得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、マウス網膜杆状体外側セグメント（ＲＯＳ）膜におけるトランスジェニックポリペプチドを発現するための、例示的な遺伝子標的化構築物および標的化方策を示す。このゲノムクローンは、マウスロドプシン遺伝子（オプシン遺伝子または杆状体オプシン遺伝子としても知られる）の５つのエキソン（Ｅ１〜Ｅ５）を含む。このトランスジーンは、ＲＯＳ標的化シグナル（影のついた四角）を有するＣ末端上でタグ化されたＧタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）である。トランスジーンの発現は、マウスロドプシンプロモーター（矢印の５’側）の制御下にある。興奮性（ｅｘｃｉｓａｂｌｅ）ポジティブ選択マーカー（ｌｏｘＰ部位に隣接するｎｅｏ）およびネガティブ選択マーカー（ＤＴα）が、示される。
【図２】図２は、トランスジェニックＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓの杆状体外側セグメントにおけるヒトカンナビノイドレセプター２（ＣＢ２）を発現するための例示的な構築物の概略図を示す。
【図３】図３は、（Ａ）ＥＤＧ２−ＧＦＰ−ＩＤ４ポリペプチドを発現するトランスジェニックオタマジャクシの眼におけるＧＦＰ融合ポリペプチドの蛍光視野画像、（Ｂ）明視野画像および蛍光視野画像を組み合わせて使用する、ＥＤＧ２−ＧＦＰ−１Ｄ４ポリペプチドを発現する別のトランスジェニックオタマジャクシの眼の側方図、（Ｃ）杆状体細胞の外側セグメント（ＯＳ）中の緑色蛍光を示す網膜セクションにおけるＥＤＧ２−ＧＦＰ−１Ｄ４トランスジェニックアフリカツメガエルの共焦点画像、および（Ｄ）網膜セクションにおけるＣＢ２−ＧＦＰ−１Ｄ４ポリペプチドを発現するトランスジェニックアフリカツメガエルの共焦点画像を示す。緑色蛍光は、杆状体細胞の外側セグメントにおいて見出され得る。ＩＳ：内側セグメント、Ｎ：核、バー  １０μＭ。
【図４】図４は、（Ａ）固定化された１Ｄ４抗体を有するアガロースゲルを用いる、ロドプシンの免疫親和性精製、（Ｂ）Ａ部分における最も濃縮されたフラクションからの精製されたロドプシンの吸収スペクトル、ならびに（Ｃ）杆状体外側セグメント抽出物（レーン１）およびＡ部分における最も濃縮されたフラクションからの精製されたロドプシン（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【配列表】
2005510231.tif 000002
2005510231.tif 000003
2005510231.tif 000004
【図１】
2005510231.tif 000005
【図２】
2005510231.tif 000006
【図３】
2005510231.tif 000007
【図４】
2005510231.tif 000008
【国際調査報告】
2005510231.tif 000009
2005510231.tif 000010
2005510231.tif 000011