(57)【要約】  本発明は、CTL応答を増強するための免疫原性物質に有用な、β-鎖抗菌性ペプチドの線状誘導体に結合した抗原のコンジュゲートに関する。２群の好適なペプチドは、抗菌性プロテグリンとタキプレシンに由来する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-鎖抗菌性ペプチド(antibiotic peptide)の線状誘導体に結合した抗原のコンジュゲート。
【請求項２】
β-鎖抗菌性ペプチドの線状誘導体は、構造：Nter-Mid-Cter、ここでMidは式(I)：
X1/3-(X1/2または結合)-(Xまたは結合)-X3-(X1または結合)-X1-X-X1/2-(X2/3または結合)-Db-(X2/3または結合)-X1/3  （配列番号１）；
ここで、DbはX3-X3またはX1-X1であり；および
ここで、NterはN末端またはX1/X3-X1-X1/2-X1-X3  （配列番号２）であり；および
ここで、CterはＣ末端またはX1/2-X1/2-X2/3-X1/2-X1-X3  （配列番号３）であり、
ここで
各X1は同じかまたは異なり、側鎖が非極性のアミノ酸残基であり；
各X2は同じかまたは異なり、側鎖が極性のアミノ酸残基であり；そして
各X3は同じかまたは異なり、側鎖が塩基性のアミノ酸残基であり；
Xは、X1、X2およびX3のいずれか１つであり；
ここで、該ペプチドは線状であり、哺乳動物膜を通過する能力を保持する；
ペプチドであるか；
または、哺乳動物膜を通過する能力を保持するその断片、である請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３】
請求項２記載のコンジュゲートであって、X1は、グリシン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンから選択され、X2は、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンから選択され、X3は、アルギニンおよびリジンから選択される、上記コンジュゲート。
【請求項４】
ペプチドが、式：
R-(Xa)-R-L-X1/2-Y-X2/3-Db-(Rまたは結合)-F-X1/2-X1/2-X2/3-X1/2-X1-R  （配列番号４）を有し、ここで、XaはX1-X1または結合である、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項５】
ペプチドが、式：
R-(Xa)-R-L-(G/S/A)-Y-(R/S)-Db-R-F-(G/S/A)-X1-(R/S)-(V/T)-G-R  （配列番号５）
を有する、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項６】
ペプチドが、式：
R-(Xb)-R-L-(G/S/A)-Y-(R/S)-R-R-R-F-(G/S/A)-(T/I/V)-(R/S)-(V/T)-G-R  （配列番号６）を有し、ここでXbは、A-A、G-G、または結合である、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項７】
ペプチドが、
R-G-G-R-L-S-Y-S-R-R-R-F-S-V-S-V-G-R  （配列番号７）
R-A-A-R-L-A-Y-R-L-L-R-F-A-I-R-V-G-R  （配列番号８）
R-A-A-R-L-G-Y-R-nL-nL-R-F-G-Z-R-V-G-R  （配列番号９）
R-G-G-R-L-S-Y-S-R-R-R-F-S-T-S-T-G-R  （配列番号10）および
R-R-L-S-Y-S-R-R-R-F  （配列番号11）、
の群から選択され、ここで、nLはノルロイシンであり、Zはノルバリンである、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項８】
ペプチドが、式：
X1/X3-X1-X1/2-X1-R-X1-X1/2-X2-R-X1-X1-S/R-X2-Db-X2/3-X2/3  （配列番号12）
を有する、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項９】
ペプチドが、式：
(R/K/A)-W-(S/A)-F-R-X1-(S/A)-Y-R-X1-X1-(S/R)-Y-Db'-(R/S)-(R/L/nL)  （配列番号13）を有し、Db'は、L-L、nL-nLおよびR-R（ここでnLはノルロイシンである）から選択される、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
ペプチドが、式：
(R/K/A)-W-(S/A)-F-R-V-(S/A)-R-G-I-(S/R)-Y-R-R-R-(R/L)  （配列番号14）
を有する、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
ペプチドが、
K-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R  （配列番号15）；
R-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R  （配列番号16）；
K-W-A-F-R-V-A-Y-R-G-I-R-Y-L-L-R-L  （配列番号17）；および
A-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R  （配列番号18）
の群から選択される、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
抗原が、ペプチド、全体タンパク質、およびタンパク質サブユニットよりなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
ペプチド、タンパク質またはタンパク質サブユニット抗原の供給源が、ウイルス、細菌、自己タンパク質および癌タンパク質よりなる群から選択される、請求項１２記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
ウイルスが、インフルエンザウイルス；アデノウイルス；Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルス；黄熱病ウイルス；デング熱ウイルス；HIV-1およびHIV-2；HSV1およびHSV2；エプスタインバーウイルス；後腹膜線維関連ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、カポジ肉腫ヘルペスウイルス、およびサイトメガロウイルス（CMV）よりなる群から選択される、請求項１３記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
細菌が、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、尋常性ざ瘡(Acne vulgaris)、瘡プロピオニバクテリウム（Propionibacterium acnes）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）、バベシア・ミクロチ（Babesia microti）、エーリキア・リスチシイ（Ehrlichia risticii）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、リーシュマニア・エチオピカ（Leishmania aethiopica）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans ）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、化膿性ブドウ球菌（Staphylococcus pyogenes）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロピチカス（Staphylococcus sapropyticus）、およびトリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）よりなる群から選択される、請求項１３記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
癌が、急性骨髄性白血病（AML）、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、ヘアリーセル白血病、骨髄腫、およびすべての組織型のすべての固形腫瘍よりなる群から選択される、請求項１３記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のコンジュゲートを哺乳動物に投与することを含んでなる、抗原に対する哺乳動物の免疫応答を増強する方法。
【請求項１８】
抗原に対する哺乳動物の免疫応答を増強する方法において使用される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
薬剤学的に許容される担体中に請求項１〜１６のいずれか１項に記載のコンジュゲートを含む組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のコンジュゲートの製造方法であって：
(a) 該コンジュゲートをコードする核酸配列を宿主細胞中で発現する工程、
(b) 該宿主から該コンジュゲートを回収する工程を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、免疫学およびワクチン技術の分野に関する。さらに詳しくは本発明は、ワクチン接種および予防に使用される細胞の免疫応答を増強するために細胞に抗原を導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主の免疫系は、優れた防御機構を与え、これは外来物質（例えば、感染性物質または新生物）を認識し体から排除することを可能にする。正しく機能している時は、有効な免疫系は外来侵入者と宿主自体の組織を区別する。外来物質に対する最初の応答は、微生物物質を認識し、阻止しそして破壊することができる抗体の分泌である。しかし、ウイルス粒子のような場合に、病原体は、抗体が到達できない標的細胞中に速やかに入ることにより、Ｂ細胞抗体応答を逃れることができるため、この応答はしばしば充分ではない。次に病原体は細胞内で複製し、他の末梢細胞に感染することができる。科学者に対する課題は、微生物物質に対するＴ細胞応答を増強することである。Ｔ細胞応答は、感染された細胞を特異的に認識しこれを破壊することができる特殊な型のリンパ球［CD4+、CD8+］を作成する免疫系の能力である。Ｔ細胞応答のこの機構は、Ｂ細胞抗体応答に相補的であるが、効率的な免疫応答を誘発するには両方が必要である。例えば、HIV感染に対する有効なワクチンは、種々のワクチン候補に対するCTL応答を作成することが困難なため、時間のかかるプロセスである。
【０００３】
樹状細胞（DC）は、効率的な抗原提示細胞（APC）であり、クラスＩおよびII MHCに関連するペプチド抗原に対する免疫応答を開始する（Freudenthal, P.S.とSteinman, R.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7698, 1990; Steinman, R.M., Ann. Rev. Immune. 9:271, 1991）。DCは、広く分布した骨髄由来の白血球の小さい亜集団であり、未変性のＴ細胞を抗原刺激（プライム）できる天然の唯一の抗原提示細胞である。これらは、CD4+ およびCD8+ Ｔリンパ球の１次免疫応答を活性化し、２次免疫応答を刺激するのに少なくとも単球のような他のAPCと同程度に有効である（Petersら、Immunol. Today L7:273, 1997）。
【０００４】
Ｔリンパ球応答を刺激するために、ワクチン中に含まれる抗原からのペプチド断片はまず、抗原提示細胞（APC）の表面上で抗原性ペプチドを示すペプチド結合受容体（主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスＩとII分子）に結合しなければならない。Ｔリンパ球は、外来ペプチドの存在についてAPCの表面を監視するために使用する抗原受容体を産生する。抗原処理およびＴリンパ球への抗原提示の現在のモデルは、２つの主要な経路が存在することを示唆する。簡単に説明すると、外因性抗原は、APCの細胞内コンパートメント中にインターナライズされ、そこでペプチドに加水分解され、その一部はMHCクラスII分子に結合する。成熟MHCクラスII／ペプチド複合体は次に、細胞表面に移送されて、クラスII制限CD4+ Ｔリンパ球に提示される。これに対して、MHCクラスＩ分子については、内因性抗原は、細胞質中でタンパク質分解活性粒子（プロテアソームとして知られている）の作用により分解され、次に小胞体内に移送され、そこで発生期のMHCクラスＩ分子と結合する。安定なクラスＩ／ペプチド複合体は、ゴルジ体を介してCD8+ CTLの細胞表面に運搬される。多くのウイルスまたは寄生体感染および一部の腫瘍細胞に対する防御のために、CTL応答は決定的に重要であるため、いくつかの新しいワクチン法が提唱されている：1) 免疫刺激複合体（Takahasciら、1990, Nature 344:873）；2) 抗原を担ったpH感受性リポソーム（Nairら、1992, J. Exp. Med. 175:609)；3) 外来抗原を発現する組換え細菌（Tunerら、1993, Infect. Immun. 61:5374； Ikonomidisら、1994, J. Exp. Med. 180:2209）；4) CTLエピトープに融合した細菌毒素（Donnellyら、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3530）；5) 粒子抗原（Schirmbeckら、1994, Eur. J. Immunol. 24:2068、Laytonら、1993, J. Immunol. 151:1097）；6) 種々のベクターの使用（Schutze-Redelmeierら、1996, J. Immunology 157:650-655；Schuluesener 1996, J Neurosci Res 46:258-262）；および7) 筋肉細胞に注入された裸のDNA（Ulmerら、1993, Science 259:1745）。この種の方法は、細胞内に抗原を導入してCTL応答を誘発することの本質的な困難さを反映している。多くの場合に、これらのアプローチは、in vivoの有効性が低く、安全性への考慮、ベクターに対する免疫応答、およびコストにより制限される。
【０００５】
免疫系以外に、哺乳動物は、直接的な抗微生物活性を有する小ペプチドを産生することが知られている。これらのペプチドのほとんどは、原核生物の膜を直接溶解することにより作用する。これらのペプチドの大きなファミリーは、ジスルフィド結合により結合したβ-鎖抗菌性ペプチドである。このファミリーのメンバーには、ディフェンシン（defensins）（Lehrerら、1991, Cell 64:229-230；Lehrerら、1993, Ann. Rev. Immunol. 11:105-128）、プロテオグリン（proteogrins）（Kokryakovら、1993, FEBS 337:231-236）、およびタキプレシン（tachyplesins）（Nakamuraら、1988, J. Biol. Chem. 236:16709-16713；Miyataら、1989, J. Biochem. 106:663-668）がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらのクラスのペプチドは、哺乳動物細胞の膜を通過できることが知られているが、細菌膜と哺乳動物細胞膜の差により、ペプチドは哺乳動物細胞には非毒性である。
【０００７】
WO99/07728号は、細胞への物質の導入のためのまたは物質が脳血液関門を通過するためのベクターとして、これらのペプチドの多くの誘導体を記載する。これらの誘導体は、ペプチドがジスルフィド結合を持たない線状誘導体を含む。ジスルフィド結合の欠如は、システイン残基の置換または末端チオール基の阻止によりもたらされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願人らは驚くべきことに、WO99/07728号のペプチドに基づくペプチドベクターを使用して抗原を結合する時、得られる生成物は、抗原提示細胞により取り込まれ、これは次に抗原を処理し、抗原をその表面にCTL応答を促進するように提示することを見いだした。抗原単独の使用と比較して、CTL応答が増強していることがわかっている。
【０００９】
第１の態様において本発明は、β-鎖抗菌性ペプチドの線状誘導体に結合した抗原のコンジュゲートを提供する。好ましくはこれらの線状誘導体は、抗細菌活性を示さない。
【００１０】
本発明はまた、薬剤学的に許容される担体中に該コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
別の態様において本発明は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、β-鎖抗菌性ペプチドの線状誘導体に結合した該抗原のコンジュゲートの有効量を、哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、哺乳動物において該抗原に対する免疫応答を増強するための医薬の製造のための、β-鎖抗菌性ペプチドの線状誘導体に結合した抗原のコンジュゲートの使用を提供する。
【００１３】
本発明はまた、哺乳動物において該抗原に対する免疫応答を増強するための方法で使用される、β-鎖抗菌性ペプチドの線状誘導体に結合した抗原のコンジュゲートを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
β-鎖抗菌性ペプチドの線状誘導体
この用語は、システイン残基の間で形成された内部ジスルフィド結合を除去するように修飾された、およびペプチドが哺乳動物細胞の膜を横断する能力を保持するように、置換、挿入または欠失によりさらに随時修飾された、任意の哺乳動物β-鎖抗菌性ペプチドを意味する。
【００１５】
ジスルフィド結合を除去するための修飾は、チオール基を化学的にブロック（例えば、メチル−チオのようなR-チオ基への変換）することにより、またはシステイン残基を別のアミノ酸（例えば、セリン、アラニン、またはグリシン）により置換することにより行われる。
【００１６】
ジスルフィド結合は２つのシステイン残基を必要とするため、ペプチド中に１つの修飾しない残基を残して（好適ではないが）、ダイマー形成を避けることは可能である。
【００１７】
ある態様においてこの線状ペプチドは、構造：Nter-Mid-Cter、ここでMidは式(I)：
X1/3-(X1/2または結合)-(Xまたは結合)-X3-(X1または結合)-X1-X-X1/2-(X2/3または結合)-Db-(X2/3または結合)-X1/3  （配列番号１）；
ここで、DbはX3-X3またはX1-X1である；および
ここで、NterはN末端またはX1/X3-X1-X1/2-X1-X3  （配列番号２）である；および
ここで、CterはＣ末端またはX1/2-X1/2-X2/3-X1/2-X1-X3  （配列番号３）である、
ここで
−  各X1は同じかまたは異なり、側鎖が非極性のアミノ酸残基である；
−  各X2は同じかまたは異なり、側鎖が極性のアミノ酸残基である；そして
−  各X3は同じかまたは異なり、側鎖が塩基性のアミノ酸残基である；
−  Xは、X1、X2およびX3のいずれか１つである；
ここで、該ペプチドは線状（すなわち、分子内ジスルフィド結合を含有しない）であり、哺乳動物膜を通過する能力を保持する；
のペプチドであるか；
または、哺乳動物膜を通過する能力を保持するその断片、として定義される。
【００１８】
上記ペプチドにおいて、「X1または結合」として示すものが結合なら、「X2/3または結合」の最初の場所（Ｎ末端からＣ末端への方向）として示される位置に残基X2またはX3がある。同様に、後者が結合であるなら、前者はX1であることが好ましい。
【００１９】
非極性側鎖を有するアミノ酸には、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、ノルロイシン、システインACm、ペニシラミン、プロリン、ノルバリン、フェニルグリシン、Abu、カルボキシリックアミノ-1-シクロヘキサン酸、Aib、カルボキシリック2-アミノテトラリン、4-ブロモフェニルアラニン、tert-ロイシン、4-クロフェニルアラニン、3,4-ジクロロフェニルアラニン、4-フルオロフェニルアラニン、ホモロイシン、4-メチルフェニルアラニン、1-ナフチルアラニン、2-ナフチルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、3-ニトロチロシン、3-ピリジルアラニン、［2-チエニル］アラニンがある。
【００２０】
好適な非極性側鎖アミノ酸は、グリシン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンである。
【００２１】
極性側鎖を有するアミノ酸には、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、シトルリン、ホモシトルリン、イソアスパラギン、β-ホモグルタミン、β-ホモグルタミンβ-グルタミン、β-ホモセリン、β-ホモスレオニン、ホモセリン、イソセリンがある。
【００２２】
好適なそのようなアミノ酸は、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンである。
【００２３】
塩基性側鎖を有するアミノ酸には、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、ジアミノ酢酸、ジアミノ酪酸、およびジアミノプロピオン酸がある。好適なそのようなアミノ酸には、アルギニンとリジンがある。アルギニンが特に好ましい。
【００２４】
すなわち好適な実施形態において、X1は、グリシン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンから選択され、X2は、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンから選択され、X3は、アルギニンとリジンから選択される。
【００２５】
上記式の特定のサブクラスにおいて、ペプチドは式：
R-(Xa)-R-L-X1/2-Y-X2/3-Db-(Rまたは結合)-F-X1/2-X1/2-X2/3-X1/2-X1-R  （配列番号４）；
ここで、XaはX1-X1または結合である、
のプロテグリン誘導体、または少なくとも７アミノ酸のその断片である。
【００２６】
好ましくは、XaがX1-X1の場合、２つの基は同じである。
【００２７】
さらに好ましくは、式は：
R-(Xa)-R-L-(G/S/A)-Y-(R/S)-Db-R-F-(G/S/A)-X1-(R/S)-(V/T)-G-R  （配列番号５）；
および最も好ましくは、式は：
R-(Xb)-R-L-(G/S/A)-Y-(R/S)-R-R-R-F-(G/S/A)-(T/I/V)-(R/S)-(V/T)-G-R  （配列番号６）、
ここでXbは結合またはA-AまたはG-Gである。
【００２８】
上記式のペプチドの例には、以下がある：
R-G-G-R-L-S-Y-S-R-R-R-F-S-V-S-V-G-R  （配列番号７）
R-A-A-R-L-A-Y-R-L-L-R-F-A-I-R-V-G-R  （配列番号８）
R-A-A-R-L-G-Y-R-nL-nL-R-F-G-Z-R-V-G-R  （配列番号９）
R-G-G-R-L-S-Y-S-R-R-R-F-S-T-S-T-G-R  （配列番号10）
R-R-L-S-Y-S-R-R-R-F  （配列番号11）
ここで、nLはノルロイシンであり、Zはノルバリンである。
【００２９】
別の好適な実施形態において、ペプチドは式：
X1/X3-X1-X1/2-X1-R-X1-X1/2-X2-R-X1-X1-S/R-X2-Db-X2/3-X2/3  （配列番号12）
のタキプレシン誘導体、または少なくとも７アミノ酸のその断片である。
【００３０】
好ましくは、Dbの２つの残基は互いに同じである。
【００３１】
好ましくはこの式は：
(K/R/A)-W-(S/A)-F-R-X1-(S/A)-Y-R-X1-X1-(S/R)-YDb'-(R/S)-(R/L/nL)  （配列番号13）
ここで、Db'はL-L、nL-nLおよびR-R（ここでnLはノルロイシンである）から選択される。
【００３２】
さらに好ましくはこの式は：
(K/R/A)-W-(S/A)-F-R-V-(S/A)-Y-R-G-I-(S/R)-Y-R-R-R-(R/L)  （配列番号14）である。
【００３３】
ペプチドの例には以下がある：
K-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R  （配列番号15）；
R-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R  （配列番号16）；
K-W-A-F-R-V-A-Y-R-G-I-R-Y-L-L-R-L  （配列番号17）；および
A-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R  （配列番号18）。
【００３４】
上記ペプチドの式において曖昧さを避けるために、天然に存在するアミノ酸を示すのに標準的１文字アミノ酸コードが使用される。他の文字は、定義したように使用される。１つの位置の代替残基の存在は、「／」として示し、すなわちX1/2は、ペプチド中の残基がX1またはX2であることを意味し、同様にR/Sは、記載の位置にアルギニンまたはセリンが存在することを示す。
【００３５】
本発明のすべてのペプチドは、L-型またはD-型のアミノ酸を含んでよい。さらにL-またはD-ペプチドは逆型でもよく、すなわち、Ｎ末端からＣ末端の順序が逆転してもよい。そのようなペプチドの例には以下がある：
R-S-R-R-Y-S-I-G-R-Y-S-V-R-F-S-W-A  （配列番号19）
これは、前記段落に示す最初のタキプレシン由来ペプチドの逆型である。
【００３６】
断片
哺乳動物膜を通過するペプチドの能力を保持する上記配列の断片もまた使用される。一般に、断片は少なくとも７アミノ酸のサイズであろう。好ましくはペプチドは、７〜24アミノ酸の範囲のサイズ、例えば10〜24、例えば10〜20のサイズである。この中で典型的な範囲は、12〜20アミノ酸のサイズである。
【００３７】
塩基性残基
本発明のペプチドと断片は、多くのアミノ酸X3（これは好ましくはアルギニンまたはリジンである）を含有する。ペプチドと断片は、少なくとも４、好ましくは少なくとも５、さらに好ましくは少なくとも６残基のX3を含有することが好ましい。
【００３８】
ペプチドのＮ末端とＣ末端の伸長
本発明のペプチド（断片を含む）は、抗原に対する免疫応答の増強のためのベクターとして機能するであろう。抗原がペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合している場合、抗原は直接アミド結合により、または間接にリンカーを介して結合してもよい。後者の場合、リンカーは１〜25アミノ酸であり、任意の適当なペプチド配列からなる。リンカーは、抗体の重鎖と軽鎖を１本鎖抗体中に連結するのに使用される型の可撓性のあるリンカーでもよい。
【００３９】
ペプチドベクターのＮ末端またはＣ末端が抗原に結合していない場合、これは例えば遺伝子操作の分野で従来から存在する理由により存在してもよい、少量の追加の配列（例えば１〜25残基）を随時含有してもよい。例えば配列は、精製または同定目的の短いタグを形成しても、またはペプチド抗原融合体が産生される宿主細胞から外に移送するための切断可能なプレ配列を形成してもよい。
【００４０】
ペプチドのＮ末端が、追加の配列の存在により伸長されない場合、または抗原に連結していない場合、ペプチドのＮ末端は一般にアミノ基を含むが、この基への修飾（例えば、ペプチドの化学合成により生じるもの）が存在してもよい。同様にペプチドのＣ末端は、修飾されたカルボキシ末端、例えばアミド化カルボキシ基などでもよい。
【００４１】
哺乳動物膜を通過する能力を保持する
この用語は、ペプチドは、37℃で１μMの（両方の）濃度でペプチドSynB3により達成される貫通の少なくとも50％、好ましくは少なくとも75％（培養60分後に測定）まで、培養哺乳動物細胞の細胞膜を通過できることを意味する。哺乳動物細胞は、初代細胞株、癌細胞株、または当該分野で一般に入手できる任意の細胞株（例えば、K562細胞）でもよい。
【００４２】
抗原
ペプチドに結合した抗原は、宿主哺乳動物で、それに対する免疫応答を誘導することが好ましい任意の抗原でよい。
【００４３】
抗原には、ペプチド、全タンパク質、およびタンパク質サブユニットがある。
【００４４】
抗原は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または例えば自己免疫疾患もしくは癌の治療に使用される自己組織のタンパク質由来でもよい。
【００４５】
ウイルス抗原の例には、特に限定されないが、インフルエンザウイルス；アデノウイルス；Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルス；黄熱病ウイルス；デング熱ウイルス；HIV-1およびHIV-2；HSV1およびHSV2；エプスタインバーウイルス；後腹膜線維関連ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、カポジ肉腫ヘルペスウイルス、およびサイトメガロウイルス（CMV）由来の抗原がある。
【００４６】
細菌抗原の例には、特に限定されないが、感染性細菌、例えば結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、尋常性ざ瘡(Acne vulgaris)、瘡プロピオニバクテリウム（Propionibacterium acnes）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）、バベシア・ミクロチ（Babesia microti）、エーリキア・リスチシイ（Ehrlichia risticii）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、リーシュマニア・エチオピカ（Leishmania aethiopica）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans ）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、化膿性ブドウ球菌（Staphylococcus pyogenes）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロピチカス（Staphylococcus sapropyticus）、およびトリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）がある。
【００４７】
自己抗原には、自己免疫疾患または癌の発症に関連した細胞に現れる抗原がある。抗原の例は、以下の癌に関連している：急性骨髄性白血病（AML）、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、ヘアリーセル白血病、骨髄腫、およびすべての組織型のすべての固形腫瘍。
【００４８】
実施例は、結核菌（M. tuberculosis）由来のちょうど９アミノ酸のペプチド抗原および8.4kDaタンパク質の使用を例示する。従って、ペプチドベクターは、広範囲の抗原、例えば約６アミノ酸の単一のペプチドエピトープからタンパク質または少なくとも200kDaのそのサブユニット（100Kda以下が好ましい）とともに使用される。
【００４９】
抗原はまた、ワクチン受容体のin vivoトランスフェクトされた細胞中で、抗原をコードする発現プラスミドDNAからその未変性のコンフォメーションで、免疫原性タンパク質が発現される、DNAベースのワクチン接種に使用できるDNAまたはオリゴヌクレオチドを含む。
【００５０】
哺乳動物
「哺乳動物」とは、ヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。本発明のコンジュゲートは、ヒト医学におけるのと同様に獣医学で有用であり、例えば家畜や家禽またはペットのワクチン接種に有用である。
【００５１】
免疫応答の増強
本発明のコンジュゲートは、コンジュゲート中の抗原量に等しい非コンジュゲート抗原量の投与により、哺乳動物中で達成される免疫応答より大きい免疫応答を、被験体哺乳動物で誘発するのに有用であろう。これを行うコンジュゲートの能力は、当該分野で公知の多くの方法で測定される。実施例に例示されるマウスでCTL応答を測定するためのアッセイは、そのような方法の１つである。
【００５２】
コンジュゲートの調製
コンジュゲートは、化学合成または分子生物学的技術を使用して調製される。抗原物質は、活性および関連物質とペプチドの化学的性質、サイズおよび数を考慮した任意の許容される結合手段により、本発明の組成物中のペプチドベクターに結合される。これらは、共有結合、疎水性結合またはイオン結合であるか、または生理学的媒体もしくは細胞内の切断可能なもしくは切断不可能な結合でもよい。
【００５３】
結合は、官能基（例えば、-OH、-SH、-COOH、-NH2）が天然に存在するかまたは導入されている、ペプチドベクター中の任意の部位で行われる。すなわち抗原分子は、Ｎ末端またはＣ末端で、またはペプチド側鎖中でペプチドに結合してもよい。
【００５４】
同様に結合は、例えば官能基（例えば、-OH、-SH、-COOH、-NH2）が天然に存在するかまたは導入されている、抗原分子中の任意の部位で行われる。
【００５５】
抗原の結合はまた、非共有結合手段でも起きる。例えばベクターペプチドは、抗原（例えばビオチン）に結合した同種の群に結合する群（例えば、ストレプトアビジン）を含んでよい。ペプチドベクターと抗原に結合したイオン性基はまた、適当な結合を提供する。リンカーは、抗原のプロセシングと提示を促進するように、APC内で切断可能なように設計される。例えば、ジスルフィド結合のリンカーは一般に血漿中で安定であり、細胞中で低下しているため、ジスルフィド結合が使用される。
【００５６】
２つ以上の抗原を各ベクターペプチドに結合させることが可能であり、および／または逆も可能である。これは、ある程度ベクターと抗原の相対的サイズに依存するであろう。すなわち、１コンジュゲート当たりのペプチドベクター分子対抗原分子の比は、10：１〜１：10、好ましくは５：１〜１：５と変動する。
【００５７】
ペプチドベクターと抗原がＣ末端とＮ末端融合（いずれの方向でもよい）により結合される場合、融合体は、組換え手段により単一の融合タンパク質として調製してもよい。
【００５８】
従って、本発明の別の態様は、そのような融合体をコードする核酸分子である。核酸はDNAまたはRNAでもよく、制御配列（例えば、プロモーター）に結合しているかおよび／またはベクター中に挿入されてもよい。使用されるベクターは、それが移動される宿主と適合性があるように選択され、融合タンパク質の発現を可能にする。これらのベクターの調製、ペプチドの産生もしくは発現、または宿主中の(II)型式を有する化合物の産生は、当業者に公知の分子生物学や遺伝子操作技術を使用して行われる。
【００５９】
すなわち別の実施形態において本発明は、該コンジュゲートをコードする核酸配列を宿主細胞培養物中で発現し、培養物から該コンジュゲートを回収することを含んでなる、上記コンジュゲートの作成方法を提供する。
【００６０】
組成物
本発明の組成物は、本発明のコンジュゲートと薬剤学的に許容される担体とを含む。組成物は、任意の適当な経路と投与手段で処方される。薬剤学的に許容される担体または希釈剤には、経口、直腸、鼻、局所的（頬および舌下を含む）、膣、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下および硬膜外）投与に適した調製物で使用されるものを含む。調製物は、単位投与型で提供してもよく、薬剤学の分野で公知の任意の方法により調製することが便利である。そのような方法には、活性成分を１つ以上の付属成分を構成する担体と一緒にする工程を含む。一般に調製物は、活性成分を、液体担体もしくは微細固体担体または両方と、均一かつ密接に混合し、次に必要であれば製品に成形して調製される。
【００６１】
固体組成物について、従来の非毒性の固体担体には、例えば薬剤グレードのマンニトール、乳糖、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが使用される。上記活性化合物は、例えばポリアルキレングリコール、アセチル化トリグリセリドなどを担体として使用して、坐剤として調製してもよい。液体で投与できる医薬組成物は、例えば上記の活性化合物および随時の薬剤学的補助剤を、担体（例えば、水、食塩水、ブドウ糖水溶液、グリセロール、エタノールなど）に溶解、分散などして調製できる。所望であれば、投与される医薬組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、酢酸ナトリウムトリエタノールアミン、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなど）のような少量の非毒性の補助物質を含有してもよい。そのような剤形を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかであろう；例えば、レミントンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）、マックパブリッシング社（Mack publishing Company）（ペンシルバニア州イーストン）、第15版、1975年を参照されたい。投与される組成物または調製物は、治療すべき被験体の症状を緩和するのに有効な量で活性化合物を含有するであろう。
【００６２】
0.25〜95％の範囲の活性成分を含有し残りは非毒性担体である剤形または組成物を調製してもよい。
【００６３】
経口投与には、薬剤学的に許容される非毒性の組成物は、通常使用される任意の賦形剤（例えば、薬剤グレードのマンニトール、乳糖、セルロース、セルロース誘導体、クロスカルメロースナトリウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなど）を取り込んで作成される。そのような組成物は、溶解剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出性製剤などの形を取る。そのような組成物は、１％〜95％の活性成分、さらに好ましくは２〜50％、最も好ましくは５〜８％を含有してもよい。
【００６４】
非経口投与は一般に、注射（皮下、筋肉内または静脈内）が特徴である。注射剤は、液体溶解剤または懸濁剤、注射前の液体への溶解または懸濁に適した固体型、または乳剤のような従来型で調製することができる。適当な賦形剤は、例えば水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどである。さらに所望であれば、投与すべき医薬組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、酢酸ナトリウムトリエタノールアミンなど）のような少量の非毒性の補助物質を含有してもよい。
【００６５】
非経口投与のための最近考案されたアプローチは、一定レベルの投与量が維持されるように、遅延放出または持続放出系の移植を利用する。例えばUS Patent No. 3,710,795を参照されたい。
【００６６】
そのような非経口組成物中に含有される活性化合物のパーセントは、その具体的な性質、ならびに化合物の活性、および被験体の必要性に大きく依存する。しかし溶液中0.1％〜10％の活性成分が使用可能であり、組成物が固体ならより高く、これは次に上記パーセントに希釈されるであろう。好ましくは組成物は、溶液中0.2〜２％の活性物質を含む。
【００６７】
投与量と投与経路
例えば上記の型の組成物中の本発明のコンジュゲートは、異なる経路で投与され、例えば経口、直腸、鼻、局所的（頬および舌下を含む）、膣、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下および硬膜外）投与がある。
【００６８】
投与される本発明のコンジュゲートの有効量は、具体的な被験体（例えば、ヒト患者または動物モデル）の疾患の重症度および被験体の全身症状を考慮して、最終的に医師により判断されるであろう。適当な用量は典型的には、１μg〜10mgの抗原、さらに好ましくは10μg〜１mgの抗原、さらに好ましくは100μg〜１mgの抗原であろう。
【００６９】
哺乳動物被験体で免疫応答を誘導するために、例えば、繰り返し間隔で追加用量を提供するために、コンジュゲートは繰り返し投与される。
【００７０】
コンジュゲートは、特定の症状を有する患者の免疫を増強するために、または特定の症状に対する免疫応答を提供するために使用してもよい。好ましくはコンジュゲートは、症状に対して防御性免疫応答を与える。
【００７１】
本発明の他の利点と特徴は、本発明のペプチドエピトープとタンパク質抗原がペプチドベクターに結合している(II)型の式を有する化合物の調製と、細胞取り込みの増強およびCTL応答に関する以下の例を読んだ後に、明らかとなるであろう。
【００７２】
実施例
プロトコール
ペプチド合成
すべてのペプチドは、AMS 422（アビメド（ABIMED）、ドイツ）を使用してFmoc-tBu法に従って合成した。NBDプローブ（4-フルオロ-7-ニトロベンゾフラザン）を有するペプチドのＮ末端の標識は、別に（Gazitら、1995 Biochemistry 34:11479-11488）記載されたように行った。ペプチドの精製は、逆相HPLCにより行った。精製は、220nmと460nmのUV吸収の基準によりｓ、すべてのペプチドについて95％を超えた。
【００７３】
組換えタンパク質rDPVへのSynBベクターの結合
まずrDPVタンパク質のＮ末端アミンを2-イミニチオラン（2IT）で誘導体化して、陽性荷電を保持しながら遊離のチオールを持たせた。ゲルろ過により、タンパク質から過剰の2-IT試薬を除去した。次に2IT-rDPVをチオピリジウム活性化3MP-SynBペプチドとインキュベートして、2IT-DPVの遊離のチオールにより3MP-ペプチドからチオピリジニウムを排除して、ジスルフィド結合を形成させた。排除されたチオピリジニウムを、ゲルろ過によりタンパク質コンジュゲートから除去した。すべての誘導体化工程は、MALDI-TOF質量スペクトル法を使用して追跡した。
【００７４】
細胞取り込み
細胞結合は、FACScan（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、アメリカ合衆国）を使用してフローサイトメトリーにより測定した。遊離のまたはベクター化した化合物を、K562細胞（５×105細胞／ml）とOptimem培地で37℃で種々の時間インキュベートした。次に、細胞を２回洗浄し、次にFACS分析のために0.5mlの氷冷PBSに再懸濁した。細胞に結合した蛍光物質を488nmで励起し、蛍光を525nmで測定した。細胞（１×104）当たりの蛍光強度のヒストグラムを得て、計算したこの分布の平均（平均蛍光強度）を、細胞結合ペプチド量の代表値と見なした。
【００７５】
in vivoモデル系
マウス（Balb/c）を、遊離のまたはベクター化した抗原で免疫し、15μgのヘパリンを有する各調製物と混合した。試薬を混合し、次にこれを使用して、それぞれのわき腹に皮下免疫した。０日目にマウスを免疫し、３週間後マウスを屠殺し、脾臓を取り出し、単一細胞懸濁物を調製した。３日後、刺激したBalb/c由来LPS芽細胞（デキストラン硫酸とLPSを使用して）を放射線照射し、抗原とインキュベートした。脾臓細胞（６×106/ml）とLPS芽細胞（３×106/ml）を一緒に７日間インキュベートした。パルスしていないかまたは抗原を標的としてパルスしたCr51標識P815細胞を使用して、６日目に細胞障害性Ｔ細胞活性を測定した。７日目に、残存する細胞を、20U/mlのIL-2を添加して、抗原パルスしたP815細胞で再刺激した。すべてのデータから、非特異的抗P815細胞CTLを引いた。
【実施例】
【００７６】
2005510484.tif 000002
【００７７】
細胞取り込み
flu NPエピトープを、SynB3とSynB4ベクターに結合させた。まず我々は、遊離および結合したflu NPの細胞取り込みを比較した。flu NPエピトープをSynB3とSynB4ベクターに結合させて、蛍光基（NBD）で標識した。化合物をK562細胞と種々の時間インキュベートし、細胞取り込みをフローサイトメトリーを使用して測定した。
【００７８】
細胞を遊離のflu NPエピトープとインキュベートすると、平均蛍光強度で判断した取り込みは非常に低かった（図１）。しかし、flu NPペプチド抗原にSynB3またはSynB4ベクターを結合したものは、その細胞貫通が有意に上昇した。細胞貫通は、最初の30分間に非常に速く、以後プラトーになった。インターナリゼーションの増強は、使用したベクターにより２倍〜５倍であった。45分で、SynB4／flu NPの細胞取り込みは、遊離のflu NPで観察されたものより約５倍高かった。
【００７９】
免疫試験
Balb/cマウス（H-2d、メス、６〜８週）を、皮内経路（尾の基部）により等モル量の遊離のまたは結合したflu NPペプチドで免疫した。具体的には、各マウスに25μgのflu NPペプチドを、遊離で、不完全フロイントアジュバント（IFA）と混合して、または結合させて、投与した。結合したペプチド群には、15μgのヘパリンも投与した。３週間後脾臓を採取した。CTL応答は、51Cr放出アッセイを使用して、遊離のペプチドで２回in vitro刺激した脾細胞を用いて測定した。
【００８０】
図２は、flu NP実験の結果を示す。具体的には、未処置マウスならびにflu NPペプチドのみを投与されたマウスは、特異的CTL応答を示さなかった（それぞれａとｂ）。IFA中のflu NPペプチドで免疫した３匹のマウスのうちの２匹は、弱いCTL応答を示した（ｃ）。これに対して、SynB3/flu NP（ｄ）またはSynB4/flu NPコンジュゲート（ｅ）で免疫したすべてのマウスは、特異的なCTL応答を誘発し、６匹のうち５匹のマウスは強いCTL応答を誘発した。図２は、flu NPペプチドコンジュゲートにより誘発された応答が、IFA（強力なアジュバント）中の遊離のペプチドもしくは遊離のペプチドにより誘発されたものより明らかに強いことを示す。
【００８１】
2005510484.tif 000003
【００８２】
細胞取り込み
我々はまた、rDPVタンパク質をSynB3とSynB4ベクターに結合させた。結合法は、プロトコールに記載されている。まず我々は、遊離のrDPVと結合したrDPVの細胞取り込みを比較した。rDPVを蛍光基（NBD）で標識して、その取り込みを測定した。化合物をK562細胞と種々の時間インキュベートし、細胞取り込みをフローサイトメトリーを使用して測定した。
【００８３】
細胞を遊離のrDPVとインキュベートすると、平均蛍光強度で判断した取り込みは非常に低かった（図３）。しかし、rDPVタンパク質にSynB3またはSynB4ベクターを結合したものは、その細胞貫通が有意に上昇した。インターナリゼーションの増強は、使用したベクターにより３倍〜７倍であった。ペプチドエピトープについて観察されたように、SynB4ベクターは、rDPV細胞貫通をSynB3よりわずかに強く増強した。rDPV-SynB3の細胞取り込みは、rDPV-SynB4によるものより速く（30対100分）飽和に達した。
【００８４】
免疫試験
C57Bl/6/cマウス（メス、６〜８週）を、５μgのDPVタンパク質、SynB3/rDPVコンジュゲート、またはSynB4/rDPVコンジュゲートを用いて、皮内経路（尾の基部）により免疫した。注入容量は100μlであり、15μgのヘパリンを含有した。動物を０日目と21日目に免疫し、42日目にその脾臓を採取して、DPV特異的CTL応答を測定した。CTL応答は、51Cr放出アッセイを使用して、２回in vitro刺激した脾細胞を用いて測定した。
【００８５】
図４は、このrDPV実験の平均CTL応答を示す。未処置マウス（◆）は、特異的CTL応答を示さなかった（有効応答は＞10％特異的溶解として定義した）が、rDPVタンパク質単独を投与されたマウスは、弱いCTL応答を示した（●）。これに対して、SynB3/rDPVまたはSynB4/rDPVコンジュゲートで免疫したマウスは、強いCTL応答を誘発した（それぞれ黒塗り逆三角と■）。図４は、rDPVコンジュゲートにより誘発された応答が、遊離のタンパク質により誘発されたものより明らかに強いことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】対照fluNPペプチドとともに、K562細胞によるコンジュゲートSynB3-fluNPとSynB4-fluNPの取り込みを示す。ｘ軸は時間（分）であり、ｙ軸は平均蛍光強度を示す。
【図２】対照（(a)、(b)および(c)）と本発明のコンジュゲート（(d)と(e)）で免疫したマウスから誘発されたCTL応答を示す。
【図３】対照DPVタンパク質とともに、K562細胞によるコンジュゲートSynB3-DPVとSynB4-DPVの取り込みを示す。ｘ軸は時間（分）であり、ｙ軸は平均蛍光強度を示す。
【図４】対照と本発明のDPVコンジュゲートで免疫したマウスから誘発されたCTL応答を示す。
【配列表】
2005510484.tif 000004
2005510484.tif 000005
2005510484.tif 000006
2005510484.tif 000007
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2005510484.tif 000020
2005510484.tif 000021
2005510484.tif 000022
【図１】
2005510484.tif 000023
【図２】
2005510484.tif 000024
【図３】
2005510484.tif 000025
【図４】
2005510484.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月4日(2004.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-鎖抗菌性ペプチド(antibiotic peptide)の線状誘導体に結合した抗原のコンジュゲート。
【請求項２】
β-鎖抗菌性ペプチドの線状誘導体は、構造：Nter-Mid-Cter、ここでMidは式(I)：
X1/3-(X1/2または結合)-(Xまたは結合)-X3-(X1または結合)-X1-X-X1/2-(X2/3または結合)-Db-(X2/3または結合)-X1/3  （配列番号１）；
ここで、DbはX3-X3またはX1-X1であり；および
ここで、NterはN末端またはX1/X3-X1-X1/2-X1-X3  （配列番号２）であり；および
ここで、CterはＣ末端またはX1/2-X1/2-X2/3-X1/2-X1-X3  （配列番号３）であり、
ここで
各X1は同じかまたは異なり、側鎖が非極性のアミノ酸残基であり；
各X2は同じかまたは異なり、側鎖が極性のアミノ酸残基であり；そして
各X3は同じかまたは異なり、側鎖が塩基性のアミノ酸残基であり；
Xは、X1、X2およびX3のいずれか１つであり；
ここで、該ペプチドは線状であり、哺乳動物膜を通過する能力を保持する；
ペプチドであるか；
または、哺乳動物膜を通過する能力を保持するその断片、である請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３】
請求項２記載のコンジュゲートであって、X1は、グリシン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンから選択され、X2は、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンから選択され、X3は、アルギニンおよびリジンから選択される、上記コンジュゲート。
【請求項４】
ペプチドが、式：
R-(Xa)-R-L-X1/2-Y-X2/3-Db-(Rまたは結合)-F-X1/2-X1/2-X2/3-X1/2-X1-R  （配列番号４）を有し、ここで、XaはX1-X1または結合である、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項５】
ペプチドが、式：
R-(Xa)-R-L-(G/S/A)-Y-(R/S)-Db-R-F-(G/S/A)-X1-(R/S)-(V/T)-G-R  （配列番号５）
を有する、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項６】
ペプチドが、式：
R-(Xb)-R-L-(G/S/A)-Y-(R/S)-R-R-R-F-(G/S/A)-(T/I/V)-(R/S)-(V/T)-G-R  （配列番号６）を有し、ここでXbは、A-A、G-G、または結合である、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項７】
ペプチドが、
R-G-G-R-L-S-Y-S-R-R-R-F-S-V-S-V-G-R  （配列番号７）
R-A-A-R-L-A-Y-R-L-L-R-F-A-I-R-V-G-R  （配列番号８）
R-A-A-R-L-G-Y-R-nL-nL-R-F-G-Z-R-V-G-R  （配列番号９）
R-G-G-R-L-S-Y-S-R-R-R-F-S-T-S-T-G-R  （配列番号10）および
R-R-L-S-Y-S-R-R-R-F  （配列番号11）、
の群から選択され、ここで、nLはノルロイシンであり、Zはノルバリンである、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項８】
ペプチドが、式：
X1/X3-X1-X1/2-X1-R-X1-X1/2-X2-R-X1-X1-S/R-X2-Db-X2/3-X2/3  （配列番号12）
を有する、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項９】
ペプチドが、式：
(R/K/A)-W-(S/A)-F-R-X1-(S/A)-Y-R-X1-X1-(S/R)-Y-Db'-(R/S)-(R/L/nL)  （配列番号13）を有し、Db'は、L-L、nL-nLおよびR-R（ここでnLはノルロイシンである）から選択される、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
ペプチドが、式：
(R/K/A)-W-(S/A)-F-R-V-(S/A)-Y-R-G-I-(S/R)-Y-Xc-(R/L)  （配列番号14）
を有し、XcはR-R-SまたはL-L-Rのいずれかである、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
ペプチドが、
K-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R  （配列番号15）；
R-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R  （配列番号16）；
K-W-A-F-R-V-A-Y-R-G-I-R-Y-L-L-R-L  （配列番号17）；および
A-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R  （配列番号18）
の群から選択される、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
抗原が、ペプチド、全体タンパク質、およびタンパク質サブユニットよりなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
ペプチド、タンパク質またはタンパク質サブユニット抗原の供給源が、ウイルス、細菌、自己タンパク質および癌タンパク質よりなる群から選択される、請求項１２記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
ウイルスが、インフルエンザウイルス；アデノウイルス；Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルス；黄熱病ウイルス；デング熱ウイルス；HIV-1およびHIV-2；HSV1およびHSV2；エプスタインバーウイルス；後腹膜線維関連ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、カポジ肉腫ヘルペスウイルス、およびサイトメガロウイルス（CMV）よりなる群から選択される、請求項１３記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
細菌が、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、尋常性ざ瘡(Acne vulgaris)、瘡プロピオニバクテリウム（Propionibacterium acnes）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）、バベシア・ミクロチ（Babesia microti）、エーリキア・リスチシイ（Ehrlichia risticii）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、リーシュマニア・エチオピカ（Leishmania aethiopica）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans ）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、化膿性ブドウ球菌（Staphylococcus pyogenes）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロピチカス（Staphylococcus sapropyticus）、およびトリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）よりなる群から選択される、請求項１３記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
癌が、急性骨髄性白血病（AML）、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、ヘアリーセル白血病、骨髄腫、およびすべての組織型のすべての固形腫瘍よりなる群から選択される、請求項１３記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のコンジュゲートを哺乳動物に投与することを含んでなる、抗原に対する哺乳動物の免疫応答を増強する方法。
【請求項１８】
抗原に対する哺乳動物の免疫応答を増強する方法において使用される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
薬剤学的に許容される担体中に請求項１〜１６のいずれか１項に記載のコンジュゲートを含む組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のコンジュゲートの製造方法であって：
(a) 該コンジュゲートをコードする核酸配列を宿主細胞中で発現する工程、
(b) 該宿主から該コンジュゲートを回収する工程を含んでなる、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
さらに好ましくはこの式は：
(R/K/A)-W-(S/A)-F-R-V-(S/A)-Y-R-G-I-(S/R)-Y-Xc-(R/L)  （配列番号14）である。
ここで、XcはR-R-SまたはL-L-Rのいずれかである。
【国際調査報告】
2005510484.tif 000027
2005510484.tif 000028
2005510484.tif 000029
2005510484.tif 000030