(57)【要約】抗体やヌクレオチドなどの生物学的に活性のある分子で機能化されたシリカ被覆ナノ粒子を用いて、細胞を標識し、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子を検出し単離して、異なる核酸分子の混合物を分離する。
2005523027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子へ特異的に結合可能な少なくとも一つの官能基と結合しているシリカ表面を含むナノ粒子を準備するステップ（ａ）と、少なくとも一つの前記官能基が前記標的分子へ結合可能な条件下で、前記ナノ粒子と前記標的分子を共に混合するステップ（ｂ）とを包含することを特徴とするナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項２】
前記ナノ粒子は、さらに前記シリカ表面によって被覆されたコアを包含することを特徴とする請求項１記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項３】
前記コアは、金属からなることを特徴とする請求項２記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項４】
前記金属は、磁性であることを特徴とする請求項３記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項５】
前記コアは、染料からなることを特徴とする請求項２記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項６】
前記染料は、有機染料であることを特徴とする請求項５記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項７】
前記染料は、無機染料であることを特徴とする請求項５記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項８】
前記染料は、ＲｕII／２，２'― ジピリジル、Ｅｕ3+／２，２'―ジピリジル、ローダミン６Ｇ、テトラメチル  ローダミン、及びフルオレセインからなるグループから選ばれることを特徴とする請求項５記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項９】
前記官能基は、タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項１０】
前記タンパク質は、抗体であることを特徴とする請求項９記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項１１】
前記タンパク質は、酵素であることを特徴とする請求項９記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項１２】
前記タンパク質は、アビジンであることを特徴とする請求項９記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項１３】
前記タンパク質は、ビオチンであることを特徴とする請求項９記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項１４】
前記官能基は、核酸であることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項１５】
前記核酸は、ＤＮＡであることを特徴とする請求項１４記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項１６】
前記核酸は、分子標識の形態をとることを特徴とする請求項１４記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項１７】
前記分子標識は、蛍光剤と結合していることを特徴とする請求項１６記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項１８】
前記分子標識は、さらに前記蛍光剤の消光剤と結合していることを特徴とする請求項１７記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項１９】
前記官能基は、ビオチン−アビジン結合を介して、前記シリカ表面へ結合していることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項２０】
前記標的分子は、細胞内に存在することを特徴とする請求項１記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項２１】
前記標的分子は、細胞表面上に存在することを特徴とする請求項２０記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項２２】
前記標的分子は、細胞内部に局在していることを特徴とする請求項２０記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項２３】
前記細胞は、真核細胞であることを特徴とする請求項２０記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項２４】
前記真核細胞は、哺乳細胞であることを特徴とする請求項２３記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項２５】
前記哺乳細胞は、癌細胞であることを特徴とする請求項２４記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項２６】
前記細胞は、原核細胞であることを特徴とする請求項２０記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項２７】
前記原核細胞は、細菌であることを特徴とする請求項２６記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項２８】
前記標的分子が、液体中に含まれることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項２９】
前記方法は、さらに前記ナノ粒子の前記標的分子への結合を検出するステップ（ｃ）を包含することを特徴とする請求項１記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項３０】
前記ナノ粒子の前記標的分子への結合は、前記ナノ粒子の特性の変化を観察することによって、検出されることを特徴とする請求項２９記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項３１】
前記特性が発光であることを特徴とする請求項３０記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項３２】
前記標的分子が混合物中に含まれる場合、前記方法はさらに、前記標的分子へ結合した前記ナノ粒子を含む複合体を、前記混合物中から分離するステップ（ｃ）を包含することを特徴とする請求項１記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【請求項３３】
前記方法は、さらに複合体から前記標的分子を分離するステップ（ｄ）を包含することを特徴とする請求項３２記載のナノ粒子を標的分子へ誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連特許）
本出願は、２００２年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／３７５，１２２号と第６０／３７４，４０５号の利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府委託研究に関する宣言）
本発明は、海事研究事務所（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｎａｖａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により付与された助成番号Ｎ０００１４−９８−１−０６２１、国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって付与された助成番号ＤＢＩ−９８７１８８０，ＣＴＳ−００８７６７６，ＣＨＥ−９７３３６５０、及び国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって付与された助成番号ＣＡ９２５８１とＮＳ３９８９１の下、合衆国政府の支援によってなされた。合衆国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、概してナノ粒子及びナノ粒子の製造方法と使用方法の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は生物学的に活性な物質で被覆されたナノ粒子及びそのようなナノ粒子の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
ナノ粒子は、一般的に、直径が１ナノメートル位から数百ナノメートル位までのサイズの非常に小さい粒子である。その小さなサイズのため、ナノ粒子は、例えば、多くの異なる生物学的及び医学的用途で有用な道具を含む、さまざまな製品を製造するために利用可能である。
【発明の開示】
【０００５】
（要約）
本発明は、核酸，抗体，及び酵素などの生物学的に活性のある分子を一つ以上結合したナノ粒子の開発に基づいている。本発明のナノ粒子を、超感受性細胞の標識化ならびに核酸分析及び分離のためのシグナルプローブと分離手段として、用いてもよい。
【０００６】
従って、本発明はナノ粒子を標的分子へ誘導する方法を特徴とする。本発明は、標的分子に特異的に結合可能な少なくとも一つ以上の官能基を結合しているシリカ表面を有するナノ粒子を準備するステップと、次いで少なくとも一つ以上の官能基が標的分子へ結合できる条件下で、ナノ粒子と標的分子を混合するステップとを含んでいる。
【０００７】
用いるナノ粒子は、シリカで表面を被覆されたコアを有してもよい。コアは、金属（例えば、磁性金属）、又は染料（例えば、有機染料、無機染料）であってもよい。シリカ表面に結合した官能基は、例えば抗体，酵素，アビジン，又はビオチンのようなタンパク質であってもよい。また、シリカ表面に結合した官能基は、ＤＮＡのような核酸であってもよい。核酸は、分子標識の形であってもよい（例えば、蛍光剤とその消光剤を結合した核酸）。ビオチンとアビジンの結合を介してシリカ表面に官能基を結合してもよい。
【０００８】
ナノ粒子が誘導する標的分子は、細胞内の分子（細胞表面上の分子、細胞内部の分子）であってもよい。細胞は、哺乳動物細胞（例えば、癌細胞）のような真核細胞であってもよく、或いは細菌のような原核細胞であってもよい。また標的分子は液体中に含まれているものであってもよい。
【０００９】
さらに、本発明の方法は、ナノ粒子の標的分子への結合を検出するステップ、例えば、ナノ粒子の性質（例えば、光の放射）の変化を観察することによって、ナノ粒子の標的分子への結合を検出するステップを含む。混合物中に標的分子を含む場合には、本発明の方法は、混合物中から標的分子に結合したナノ粒子を含む複合体を単離するステップ、複合体から標的分子を分離するステップを含んでもよい。
【００１０】
ここで用いられているように、語句「ナノ粒子」は、約１と１０００ｎｍの間の直径を有する粒子を意味する。ナノ粒子の「サイズ」の表示は、それはナノ粒子の最大の直線寸法を意味する。例えば、完全に球形のナノ粒子のサイズは、その直径である。
【００１１】
ここで用いられている「核酸」や「核酸分子」は、ＲＮＡ（リボ核酸）とＤＮＡ（デオキシリボ核酸）のような２本以上のヌクレオチドの鎖を意味する。「精製された」核酸分子は、実質的に、核酸が自発的に発生する細胞や生物内において他の核酸配列から分離、又は単離したものである（例えば、３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，９５，９６，９７，９８，９９，１００％混入物がない）。
【００１２】
ここで用いる「タンパク質」や「ポリペプチド」は、その長さや翻訳後の修飾（例えば、糖鎖付加，リン酸化）に関わらず、同意語としてアミノ酸のペプチド結合鎖を意味する。
【００１３】
ある核酸の他の核酸へのハイブリダイゼーションに言及するとき、「低緊縮条件」（ｌｏｗ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）は、４２℃の１０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中を意味する（その後５０℃の１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で洗浄する）。「中緊縮条件」（ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）は、４２℃の５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中を意味する（その後６５℃の０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で洗浄する）。「高緊縮条件」（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）は、４２℃の５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中を意味する（その後６５℃の０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する）。「緊縮ハイブリダイゼーション条件」（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）という語句は、低緊縮条件、中緊縮条件、高緊縮条件を意味する。
【００１４】
ここで用いる「配列同一性」は、二つの配列をサブユニットのマッチングが最大になるように、すなわち、隙間と挿入を考慮して並べたとき、二つの配列に対応する位置で同一なサブユニットの百分率を意味する。二つの配列の双方におけるサブユニット位置が同じヌクレオチドやアミノ酸によって占められた場合、例えば、各二つのＤＮＡ分子においてアデニンが所定位置を占めたならば、その時その二つの分子がその位置で同一である場合、配列同一性が存在する。例えば、もし２種のＤＮＡ分子のそれぞれでアデニンが所定の位置を占めていれば、分子はその位置において同一である。例えば、長さ１０ヌクレオチドの配列における７つの位置が、第二の１０ヌクレオチドの配列の相当する位置と同一であると、その２つの配列は７０％の配列同一性を持っている。配列同一性は、一般的に、配列分析ソフトウェア（例えば、遺伝子コンピューターグループの配列分析ソフトウェアパッケージ、ウィンスコンシン大学生物工学センター、ＷＩ５３７０５、マディソン、ユニバーシティーアベニュー１７１０）を用いて測定される。
【００１５】
ここで用いる語句「抗体」は、抗体フラグメントばかりでなく正常なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。
【００１６】
語句「特異的に結合する」は、試料で一分子が特定の第ニ分子を認識し、付着するということを意味するが、その試料中に存在する別の分子に実質的に認識または付着しないことを意味する。一般的に、第二の分子に「特異的に結合する」第一の分子は、約１０5から１０6モル／リットルより大きな結合親和性で第二の分子と結合する分子である。
【００１７】
ここで用いる語句「官能基」は、化学基を有する物体（例えば、ナノ粒子）へ特定の機能を与える化学基を意味する。例えば、官能基は、特定の分子へ結合することが知られている抗体，オリゴヌクレオチド，ビオチン，又はストレプトアビジンなどの生物学的に活性のある物質、或いはアミン，カルボン酸塩などの小さい化学基が含まれる。
【００１８】
「結合した」は、共有結合や非共有結合した，又は他に、例えば直接的な又は間接的な結合によって、近接して安定に結合することを意味する。例えば、アビジン−ビオチン結合を介して、ビオチンを導入した抗体とアビジン被覆ナノ粒子を結合することができる。
【００１９】
他に定義しなければ、ここで用いる全ての技術用語は、本発明の属する分野の通常の知識を有するものによって理解されるものと同様な意味を有する。ここで説明することと類似又は同等の方法と物質は、本発明の実施や試験で使用可能であるが、適した方法と物質は以下で説明される。すべての出版物、特許出願、特許、及びここで言及された参考文献は、引用して完全に援用される。抵触の場合は、定義を含む本明細書が法的に規制するであろう。さらに、以下に論じた特定の実施形態は、一実施例であって、これに制限されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（詳細な発明）
生物学的に活性のあるシリカ被覆ナノ粒子を、シリカシェルにより包まれたコアから構成される均一なサイズのナノ粒子が得られる、油中水型マイクロエマルジョン法を用いて調製する。そのマイクロエマルジョンは、水などの比較的極性な液体、液体アルカンなどの比較的無極性な液体、等方性の熱力学的に安定した単相系を形成するために一つ以上の界面活性剤を混合することによって作製される。この系は、ナノ粒子のコアを生成するための反応器としての役目を果たす、多数の非常に小さい球形のウォータープール（すなわち、逆ミセル）から構成される。コアを生成した後、テトラエチルオルトケイ酸塩（ＴＥＯＳ）などのシリカ被覆剤を用いて、コアをシリカで被覆する。これらの生物学的に活性のあるシリカ被覆ナノ粒子を作製するために、シリカ被覆を、核酸やポリペプチドなどの生物学的に活性のある一つ以上の官能基と結合させる。以下に記述される好適な実施形態は、本発明の様々な適応例を示している。しかしながら、この実施形態の記述から、以下で論じられる構成を少し調整又は修正することによって、本発明の別の側面を容易に作り出すことができる。
【００２１】
（ナノ粒子の特性）
図１を参照して概要を簡単に説明すると、本発明の好適なナノ粒子10は、コア12，コア12を被覆するシェル14，シェル１４上に誘導される１つ以上の官能基16を備えている。ナノ粒子10の直径は、約１ｎｍから約１０００ｎｍ以上までの範囲に及ぶが、多くの用途に関して、好ましくは約１０ｎｍから約３００ｎｍの間（例えば、約１０，１５，２０，２５，３０，３５，５０，７５，１００，１５０，２００，２５０，３００ｎｍ）である。多数のナノ粒子10の分散の中で、サイズの分布は、好ましくは、多数のナノ粒子10の平均直径（又は最大の直線寸法）の約２５％以下（例えば、１，２，３，５，１０，１５，２０，２５％）の標準偏差を有している。
【００２２】
図１に示すナノ粒子10は固体である（すなわち、実質的に孔隙がない）。多くの用途のためにこの形状は好ましいが、本発明のナノ粒子は多孔性であってもよい。以下で述べるようにコア12をシェル14で均一に被覆することによって、固体の形状を準備することができる。腐食剤（例えば、シェル14がシリカで構成される場合には、非常に塩基性の高い溶液）で固体のナノ粒子を腐食させ、状況に応じてシリカでコア12を再被覆することによって、多孔性の形状を作成することができる。一般に、外部環境からコア12を隔離したいときに、固体の形状は好ましい。一方、外部環境と接するシェル14の表面積を増加させたいとき（例えば、ナノ粒子10を触媒として使用する場合）、又はさまざまな物質を単離するために（例えば、孔内に物質を「捕捉」するために）ナノ粒子10を使用するとき、多孔性の形状は好ましい。ナノ粒子10の孔は、ナノ粒子10の直径より小さい、任意の適切なサイズとしてもよい。例えば、その孔は、サイズを平均して約０．２，０．５，１，２，３，５，１０，２０，５０，１００ｎｍにしてもよい。
【００２３】
コア12は、シェル14と相性の良い任意の物質から構成可能である。コア12がナノ粒子10に機能的な特性を与えるように、当業者は、組成の既知の特性に基づき、ナノ粒子10に意図される特定の用途に適合したコア12の組成を選択可能である。例えば、ナノ粒子10を磁性にしたい場合の好適な実施形態において、コア12を、磁鉄鉱（Ｆｅ3Ｏ4）、磁赤鉄鉱（γＦｅ2Ｏ3）、グリグ鉱（Ｆｅ3Ｓ4）などの磁性金属から作製する。本実施例においてコア12の組成は、ナノ粒子10を磁気に基づいた用途（例えば、細胞分離／精製）に使用可能な磁気特性をナノ粒子10に与える。
【００２４】
別の用途として、コア12は、非磁性金属や金属塩（例えば、金，銀，硫化カドミウムなど）から作製可能である。例えば、シリカで被覆された硫化カドミウム（ＣｄＳ）コアを有するナノ粒子を、蛍光性又は発光性の高いプローブとして用いてもよい。別の実施例として、染料又は顔料ナノ粒子を製造するためのコア12としては、「顔料なし」の顔料、例えばユーロピウム塩，トリス（２、２'―ビピリジル）ジクロロルテニウム（Ｒｕ／Ｂｐｙ），過マンガン酸カリウム、二クロム酸カリウム，硫酸ニッケル，塩化コバルト，塩化鉄（III），硝酸銅などの調製に有用な無機塩が挙げられる。
【００２５】
またコア12は、蛍光性又は発光性の有機染料から構成されていてもよい。多くのそのような有機染料が知られている。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．を参照。有用な染料の特定の例としては、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ），カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＭＲ），及びフルオレセインが挙げられる。光安定性試験で、純Ｒ６Ｇの強度は徐々に減少することが示された。一方、ナノ粒子内の同じＲ６Ｇの蛍光強度は、同じ条件下で著しく変化しなかった。そのような染料がドープされたナノ粒子の改善された光安定性は、光退色を最小限にし、そのような蛍光試薬を利用する測定の精度を向上させる。コア12はまた、異なる物質の混合物から構成してもよい。例えば、磁性で、染料が塗布されたナノ粒子を製造したい場合には、コア12は磁性金属と染料の両方から構成してもよい。
【００２６】
コア12は、ナノ粒子10のサイズより小さい任意のサイズとすることができる。したがって、コア12は、１ｎｍ未満と１０００ｎｍの間の範囲の直径を有する。多くの用途のために、コア12の直径は、好ましくは約１ｎｍから約２００ｎｍの範囲内である。一例として、動物は約１００ｎｍ未満のサイズのナノ粒子を排泄することができるが、１００ｎｍを超える粒子を保持する（主に肝臓や脾臓中に）ので、ナノ粒子が被験体に保持されないことが望まれる診断や治療の用途においては、ナノ粒子に組み込まれるために十分に小さい１００ｎｍ未満のサイズのコアが好ましい。
【００２７】
マイクロエマルジョンのナノ粒子製造技術（以下を参照）によって製造した場合、通常、コア12は球状の形状を有する（従来の逆ミセルは球状である）。しかし、コア12は、球状の形状に限定されない。例えば、完全に丸いよりもむしろ、ナノ粒子10は長円や管状の、多くの磁性の用途に好適な形状であってもよい。コア12が結晶形状である場合は、ナノ粒子10は直方体形状のような、規則的又は不規則な多面体形状であってもよい。
【００２８】
シェル14は、コア12を被覆する物質である。それは、本発明の方法を用いてコア12上に被覆される、任意の相性の良い材料から構成される。例えば、シェル14は、ポリマー（例えば、ポリスチレン，ポリエチレン，ポリ塩化ビニル，アクリル系ポリマーなど），デキストランなどの多糖類，アルミナやシリカなどの無機酸化物，前述のものの混合物から構成可能である。現在の好適な実施例において、シェル14は部分的に又は全体がシリカから構成される。シリカは、多くの環境下で比較的不活性であり、生物学的適合性を有し、分散の際に他のナノ粒子との凝塊形成を抑え、多数の異なる官能基で容易に誘導化できるので、種々の用途において好適である。そして、図１は単層で構成されたシェル14を示しているが、それは多層であってもよい。例えば、シェル14は、シリカ被覆をしてコア12と直接隣接する第一層と、そのシリカ層を被覆する第二層を含んでいてもよい。この第二層は、第一層上に被覆される任意の物質から構成される。例えば、薬を染み込ませた生体分解可能な物質（例えば、糖質やポリマー）から第二の層を構成してもよい。その生体分解可能な物質と薬は、動物に導入されると、その動物の中へ徐々に溶解する。その他の用途において、シェル14は３，４，５層又はさらに分離した層から構成可能である。
【００２９】
図１に示される好適な実施例において、シェル14は、完全にコア12を包み、したがって、外部環境からコア12を隔離して示されている。この形状は、外部因子とコア12の相互作用を防止するのが望ましい場合に好適である。例えば、シリカ被覆は、鉄をベースとしたコアの腐食を防止できる。同様に、完全なシリカ被覆は、溶媒中において顔料の劣化や分解を防ぎ、又は酸化による劣化や分解を防ぐことで、ナノ粒子をベースにした顔料の貯蔵寿命を増すことができる。ある変形例においては、ナノ粒子10は、シェル14を備えないか、シェル14の一部分だけ被覆される（例えば、シェル14が部分的に分解され劣化してコア12から離れた場合）。
【００３０】
シェル14は、ナノ粒子10の製造方法に適した任意の厚さ（すなわち、コア12の外表面からシェル14の外表面までの長さ）としてよい。本発明の好適な方法を用いれば、シェル14を約１ｎｍ未満から約３００ｎｍを超える範囲の厚さにすることができる。ナノ粒子10が使用される特定の用途によって、好適なシェル14の厚さは異なるであろう。例えば、比較的厚いシェルは通常、ナノ粒子の凝集作用（コアが別のコアを引き付ける場合）やシェルの劣化（例えば、苛性溶媒中において）を抑えることが求められる場合に好まれる。一方、コアの特性（例えば、顔料の色）を増すことが求められているとき、比較的薄いシェルが一般に好まれる。
【００３１】
図１で示すように、官能基16はシェル14の表面上に誘導される。官能基16は、シェル14を介してナノ粒子10に付着することができる化学基または生物学基の形状をとることができる。例えば、官能基16は、生物学的に活性のある物質としてもよい（例えば、抗体（モノクローナル，ポリクローナル），酵素，ビオチン，ストレプトアビジンなどのタンパク質；核酸（例：ＲＮＡやＤＮＡ）；アミンとカルボン酸塩などの生化学基）。
【００３２】
（ナノ粒子の製造方法）
ナノ粒子の製造方法 図２を参照すると、ナノ粒子の好適な製造方法は、以下のステップを含む：マイクロエマルジョンを準備するステップ50；反応剤の水溶液を準備するステップ52；この水溶液をマイクロエマルジョンの等分部分に添加するステップ54；この等分部分を混合し、ナノ粒子コアを形成する反応混合物を形成するステップ56；このコアに被覆剤を添加し、被覆ナノ粒子を形成するステップ58。
【００３３】
ステップ50のマイクロエマルジョンは、少なくとも一つの界面活性剤の存在下で少なくとも二つの非混和液を一緒に混合することによって作成でき、熱力学的に安定で光学的に等方的な、一つ又は両方の液体が他方の液体中にあるナノサイズの小滴の分散を形成する。その分散は、二つの液の界面で表面張力を低下させる界面活性剤によって安定化されている。マイクロエマルジョンは、油中水型（すなわち、逆ミセルまたは水滴が油中で分散した），水中油型（すなわち、ミセルまたは油滴が水中で分散した），又は二つの非混和液の同程度の量を含む二連続系のどれかである。ある場合において、マイクロエマルジョンは、極わずかな相互可溶性しか有しない異なる極性の二つの非水溶液を一緒に混合することによって作成できる。本発明で使用される油中水型のマイクロエマルジョンは、水溶液中で固体を沈殿させるための非常に多くの既知の化学反応と相性がよいので、現在のところ好まれている。
【００３４】
ステップ50で使用される非混和液は、一般に、比較的極性（例えば、疎水性）の液体と比較的非極性（例えば、親水性）の液体を含む。多様な極性／非極性液体の混合液は本発明に有用なマイクロエマルジョンを作成するために使用可能であり、作られようとしているナノ粒子の種類に依存して、利用される特定の液体が選択される。熟練した当業者は、本発明において用いるマイクロエマルジョンを作成する既知の方法を適用することによって、特別な用途に使われる特定の液体を選択することができる。現在、好ましい比較的極性の液体は水であるが、他の極性液体も使用可能である。水は、安価で，容易に入手でき，毒性がなく，取り扱いまた保管しやすく，多数の異なる沈殿反応に相性がよく，多数の非極性溶媒に混和しないので好ましい。適切な非極性液体の一例としては、アルカン（例えば、ヘキサン，ヘプタン，オクタン，ノナン，デカン，ウンデカン，ドデカンなどの液状のもの），シクロアルカン（例えば、シクロペンタン，シクロヘキサンなど），芳香族炭化水素（例えば、ベンゼン，トルエンなど），そして前記の混合物（例えば、石油，石油誘導体）が含まれる。通常、マイクロエマルジョンを形成するために用いられるほかの成分と相性がよく、関連する沈殿反応を妨げない限り、このような非極性溶液を用いることができる。
【００３５】
ステップ50では、マイクロエマルジョンを形成するために少なくとも一つの界面活性剤が必要である。界面活性剤は、マイクロエマルジョン中に分散した非常に小さいミセルや逆ミセルを熱力学的に安定化させる表面活性剤である。一般に、界面活性剤は、それが油相と水相の間で非常に低い表面張力を有する薄膜を形成することを可能にする両親媒性構造を有する。したがって、比較的極性の液体と比較的非極性の液体の界面の表面張力を低下させ、本発明の別の特徴と相性のよい物質であれば、ナノ粒子の作成に用いられるマイクロエマルジョンの形成に用いることができる。界面活性剤の選択は、使用される特定の液体と作成されるナノ粒子の種類に依存する。特別な用途に適する特定の界面活性剤は、既知のマイクロエマルジョンの作成方法又は既知の界面活性剤の特性から選択することができる。例えば、非イオン界面活性剤は通常、イオン反応剤がマイクロエマルジョン製造工程で使用されてイオン界面活性剤がそのイオン反応剤と結合又はそのイオン反応剤に干渉するであろう場合に好まれる。
【００３６】
非常に多くの適当な界面活性剤が知られている。完全に網羅していないが、リストにはオレイン酸カリウム，オレイン酸ナトリウムなどのような石鹸；エアゾール（登録商標）ＯＴ，コール酸ナトリウム，カプリル酸ナトリウムなどのような陰イオン界面活性剤；塩化セチルピリジニウム，臭化アルキルトリメチルアンモニウム，塩化ベンズアルコニウム，臭化セチルジメチルエチルアンモニウムなどのような陽イオン界面活性剤；Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸およびＣＨAＰＳのような両性イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンエステル，ポリオキシエチレンエーテル，ポリオキシエチレンソルビタンエステル，ソルビタンエステル，様々なトリトン（例えば、ＴＸ−１００，ＴＸ−１１４）などのような非イオン界面活性剤が含まれる。
【００３７】
ステップ50で使用される界面活性剤の濃度は、選ばれた特定の界面活性剤，使用された液体，作成されるナノ粒子の種類を含む多くの要因に依存する。適切な濃度は実験的に、すなわち、特定の用途で最適に機能する濃度が見つかるまで異なる濃度の界面活性剤を試すことによって決められる。適切な濃度の範囲は、既知の臨界ミセル濃度からも決めることができる。
【００３８】
好適な実施例において、ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウム塩（エアゾール（登録商標）ＯＴ，ＡＯＴ）は、水とイソオクタンのマイクロエマルジョンを作成するため用いられる；臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴAＢ）は、ｎ−ヘキサン，ｎ−ヘキサノール，と水のマイクロエマルジョンを作成するため用いられる；トリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）は、シクロヘキサン，ｎ−ヘキサノール，と水のマイクロエマルジョンを作成するため用いられる。ほとんどの用途において、本発明のステップ50はマイクロエマルジョンを安定化させるための一つの界面活性剤のみを用いているが、一つ以上の共界面活性剤も使用できる。共界面活性剤の使用は、時々、逆ミセル系を安定にするために好都合である。例えば、油と水の混合物に石鹸のような水溶性界面活性剤を添加すると乳白色の乳化が生じる。中間鎖長のアルコールのような共界面活性剤を添加すると、乳白色のエマルジョンは油中に分散した非常に小さい球状の水滴の形成によって自然に澄んでくる。このような共界面活性剤は、相間の界面張力をさらに低下させることによって、分散した相の非常に小さい粒子の形成を促進するように機能する。本発明で使用される好適な共界面活性剤は、ヘキサノール，ブタノール，ペンタノール，オクタノール，及び同様の中間鎖長のアルコールを含む。ステップ50のマイクロエマルジョンは、比較的極性の液体，比較的非極性の液体，及び一つ以上の界面活性剤を一緒に単に混合することによって調製できる。油中水型のマイクロエマルジョン（水溶性逆ミセルを有する）を調製する場合、比較的非極性の液体の体積は比較的極性の液体の体積をかなり上回る（例えば、非極性液体と極性液体の体積比は約１００００対１と１００対１の間）。界面活性剤を添加することによって、更に攪拌することなくマイクロエマルジョンを時々生じさせることが可能であるが、通常、その混合液はマイクロエマルジョンを形成するため機械的（例えば、磁気的）に攪拌されるか超音波処理される。本発明で有用な多くのマイクロエマルジョンは、加熱せずに室温（すなわち、約２０℃）で調整できる。別の場合では、液体中の界面活性剤の溶解度を高めることによってマイクロエマルジョンの形成を早めるため、原料の混合物を約２５〜８０℃の間まで時々熱する（例えば、加熱板を用いて）。
【００３９】
図２を再度参照すると、反応剤の水溶液を準備するステップ52と、マイクロエマルジョンの個々の等分部分にステップ52の水溶液を添加するステップ54は、上述したように調製された油中水型のマイクロエマルジョンを用いて行われる。ステップ52とステップ54は、まず、第一の水溶性反応剤（反応剤Ａ）と第二の水溶性反応剤（反応剤Ｂ）とを準備し、つぎに反応剤Ａを油中水型マイクロエマルジョンの第一の等分部分に添加し反応剤Ｂを油中水型マイクロエマルジョンの第二の等分部分に添加することで達成される。反応剤Ａが第一の等分部分の各々の逆ミセル（逆ミセルは、マイクロエマルジョンの中で絶え間なく形成、融合、分離するので、そこへ反応剤を含有させ逆ミセルの中へ均一に分布させる）中で平衡分布に達し、反応剤Ｂが第二の等分部分の各々の逆ミセル中で平衡分布に達するまで、この二つの等分部分は別々に混合される。ステップ56において、溶解した物質の分布を平衡させた後、この二つの等分部分を一緒に混合する。逆ミセルの衝突と融合のため、反応剤Ａの陽イオンと反応剤Ｂの陰イオンが互いに接して反応し、ナノ粒子コアとなる沈殿物を形成する。
【００４０】
反応剤ＡとＢは、一般に、それらが反応してマイクロエマルジョンの逆ミセルの中で沈殿物を形成できるように選ばれる。通常、それらは水溶性逆ミセル中に溶けやすく、固体，液体，または気体であってもよい。好適な実施例において、反応剤Ａは、マイクロエマルジョンの第一の等分部分の逆ミセルの中で水溶性陽イオン（例えば、Ａ+）に溶解する塩（例えば、仮定上の式Ａ+Ｙ-を有する）であり、反応剤Ｂは、マイクロエマルジョンの第二の等分部分の逆ミセルの中で水溶性陰イオン（例えば、Ｙ-）に溶解するもう一つの塩（例えば、仮定上の式Ｂ+Y-を有する）である。反応剤Ａの陽イオンと反応剤Ｂの陰イオンは、水溶液中で一緒に混合されときに沈殿物（Ａ+Ｙ-）を形成するように選ばれる。前述では本発明の好ましい方法を説明したが、マイクロエマルジョンを使用したナノ粒子コアの別の製造方法も本発明の範囲内である。これらの多くは、記載された好ましい方法にわずかな修正を施すことによって行うことができる。例えば、マイクロエマルジョンの二つの異なる等分部分を一緒に混合するのではなく、マイクロエマルジョンの一つの等分部分を使用してコア形成反応を実施できる。この場合、反応剤を一つの等分部分に添加し、溶解してマイクロエマルジョンの逆ミセルの中で平衡させる。続いて、液体又は気体（例えば、水素，ヒドラジン，ＮＨ4ＯＨ）の形の沈殿（例えば、還元又は酸化）剤を一つの等分部分に添加し、逆ミセルに溶解した反応剤を沈殿させる。
【００４１】
ナノ粒子コアは、アセトンやエタノールのような溶媒をマイクロエマルジョンへ添加し、そして、ナノ粒子を分離するためにその混合物を濾過及び／又は遠心分離することによってマイクロエマルジョンから分離される。濾過に関し、フィルターはナノ粒子より小さいサイズの孔を有する。遠心分離に関し、混合液を１５分またはそれ以上の間マイクロ遠心分離機中で１０，０００ＲＰＭまたはそれ以上で回転させてナノ粒子をペレット状とし、上清をデカンテーションする。この方法で分離されたナノ粒子は、一回以上アセトン又はエタノール水溶液で洗浄し、界面活性剤やその他のマイクロエマルジョン成分を除去する。分離、洗浄されたナノ粒子はアセトンを通して乾燥させる。使用または官能基化の前に、ナノ粒子を適切な液体で再懸濁する。
【００４２】
油中水型のマイクロエマルジョン技術を使用して、ナノ粒子のコアサイズを高度に制御できる。コアサイズは通常逆ミセルのサイズと関係するが、コアサイズが各々の逆ミセルにもともと存在する反応剤の量と常に相関するわけではないので、このことは必ずしも厳密な関連性はない。例えば、小さなナノ粒子コア（例えば、２ｎｍから５ｎｍの粒径をもつ）でさえ約３００〜１０００個の原子を含み、ほとんどの場合において小さなナノ粒子コアは反応前に各々のミセルに存在する多くの反応剤分子よりかなり大きい。このことは、ミセルの小さな画分内にナノ粒子コア核が最初に生成し、これらがつぎに衝突結合過程を経由して別のミセル中の反応剤を消費していることを示している。
【００４３】
したがって、ナノ粒子コアの製造において考慮すべき因子は、ナノ粒子コアが形成する速さである。ナノ粒子コアが形成する速さは、逆ミセルが合体する速さと直接関連する。それゆえ、選択された特定の界面活性剤はコア形成速度に強く影響を及ぼし、逆ミセルの合体速度を制御する。すなわち、結果としてマイクロエマルジョンの２つの非混和液間の比較的硬い界面となる界面活性剤は、コア形成速度を減少させ、一方、結果として流動的な界面となる界面活性剤は、その速度を増加させる。イオン強度，ｐH，温度などのマイクロエマルジョンの別の特性もまた、コア形成速度を制御するために操作可能である。
【００４４】
最初の反応剤濃度とマイクロエマルジョン組成パラメータの実験的な調節を経て、ナノ粒子は均一なサイズ分布（例えば、コアサイズにおける百分率標準偏差は約１から５％である（例えば、１，２，３，４，５％））と約１ｎｍ〜約３００ｎｍ以上の範囲の平均粒径を有するコアを形成する。大きいサイズのコア（例えば、約１ミクロン）は、（i）反応媒体（例えば、マイクロエマルジョンの逆ミセル）に高濃度の試薬を添加する、及び／又は（ii）マイクロエマルジョン以外の適した溶媒に単離したコアを音響化学的に（すなわち、超音波処理によって）分散して均一なコア懸濁液を形成し、つぎにその懸濁液に追加の試薬を添加することによって調製できる。後者の方法においては、個々のコアが融合することが多い。
【００４５】
多くの場合、上述の油中水型マイクロエマルジョン技術に従って製造したナノ粒子のコアは、長球形状（従来の逆ミセルは長球である）を有する。コア形成過程で様々なパラメータを変化させることによって、別の形状を有するコアを製造することが可能である。例えば、非常に高濃度のドデシル硫酸ナトリウムをマイクロエマルジョンへ添加することによって、長円や管状形状のコアを作成できる。別の例として、形成されるコアが結晶性の構造を有するように反応剤が選択された場合、規則的又は不規則的な多面形状を有するナノ粒子コアを作成できる。
【００４６】
磁性ナノ粒子は、コアの一部に磁鉄鉱，磁赤鉄鉱，グリグ鉱のような磁性材料を用いることによって作成することができる。磁性コアの全体のサイズと形状を変化させることによって、これらを超常磁性又は安定なシングルドメイン（磁界から離された後、安定した磁気モーメントを保持する粒子）とすることができる。コアのサイズは、磁性ナノ粒子が超常磁性又はシングルドメインかどうかに関連する。したがって、比較的等寸法の超常磁性粒子は、通常５０未満から８０ｎｍのサイズのコアを有する。この範囲の上方を超える粒子サイズにおいては、粒子の磁性は内部磁気エネルギーを最小化するために異なる磁気ベクトルの領域へ分割される。図２を再度参照すると、本発明におけるナノ粒子の製造方法は、被覆剤を添加し、被覆されたナノ粒子 を形成するステップ58を特徴とする。ステップ58で用いられる被覆剤は、ナノ粒子コアの表面上に堆積されるシリカ（又は別の物質）を与えるものである。現在好まれる試薬には、テトラエチルオルトケイ酸塩（ＴＥＯＳ）やアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＳ）（両方ともセントルイスのシグマ社から入手可能）などの反応性のケイ酸塩が含まれる。コアを被覆するために、水酸化アンモニウムや水酸化ナトリウムなどの還元剤とともに、この反応性のケイ酸塩をナノ粒子の溶液（例えば、コアが調製されたマイクロエマルジョン）へ単に添加する。この混合物を適当な時間攪拌し、コアをシリカで被覆できる。
【００４７】
シリカ被覆の厚さとシリカ被覆形成の反応速度は、反応性のケイ酸塩の添加量，反応時間，還元剤の添加量，逆ミセルのサイズ（油中水型のマイクロエマルジョン中で被覆を実施する場合）に依存する。反応性のケイ酸塩濃度（例えば、[ＴＥＯＳ]）に対する還元剤濃度（例えば、[ＮＨ4ＯＨ]）を増加させると、通常、所定の反応時間後、より厚い被覆が形成される。反応性のケイ酸塩の濃度に対する極性液体（例えば、水）の濃度を増加させると、通常、所定の反応時間後、より薄い被覆が形成される。被覆の厚さを制御するための正確な反応条件は、使用される特定の試薬、コアの材料などによって、変化する。しかしながら、これらは、試薬の濃度と反応時間と条件を変化させる簡単な実験によって実験的に決めることができる。
【００４８】
本発明の方法は、上述のように作成された被覆ナノ粒子を官能基化（つまり、一つ以上の官能化学基を誘導する）するステップをも含む。シリカに官能基を付ける既知の方法の多くは、本発明の用途に適合可能である。例えば、Iler, R.,  The Chemistry of Silica: Solubility, Polymerization, Colloid and Surface Properties and Biochemistry, Wiley-Interscience, NY, 1979; VanDerVoort, P. and Vansant, E., Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 19:2723-2752, 1996; Weetall, M. ed., Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies, and Peptides: Preparation and Characterization, M. Dekker, NY, 1975）。シリカ被覆されたナノ粒子 に官能基を付加させる典型的な方法は、ナノ粒子のシリカ表面と反応して化学基を結合させるシラン化剤によるナノ粒子の処理を伴う。この化学基は、それ自身、官能基になることができ、又は官能基が結合することができる基質として機能する。
【００４９】
例えば、典型的な方法として、上述のようにシリカ被覆されたナノ粒子を調製し、シリカ表面に第一級アミン基を付けるシラン化剤であるトリメチルシリルプロピルジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）を用いて粒子表面をシラン化する。そして臭化シアン（ＣＮＢＲ）法を用いて、シラン化された表面に抗体や別のタンパク質を共有結合させることができる。一例として、予めＤＥＴＡでシラン化されたシリカ被覆ナノ粒子を２Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液中に懸濁し、この混合物を超音波処理し粒子懸濁液を作成することによって、ＣＮＢＲが仲介する結合を達成できる。次に、その粒子懸濁液にＣＮＢＲ溶液（例えば、２ｇＣＮＢＲ／１ｍｌアセトニトリル）を添加し、ナノ粒子を活性化する。中性緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ｐＨ８）でこのナノ粒子を洗浄後、活性化したナノ粒子懸濁液に抗体溶液を添加すると、抗体がナノ粒子に結合する。残留した未反応部位を塞ぐため、抗体を被覆したナノ粒子にグリシン溶液を添加してもよい。
【００５０】
他の方法では、ナノ粒子を官能基化するため、ビオチン−ストレプトアビジン結合を用いる。例えば、最初、ナノ粒子のシリカシェルをストレプトアビジンで被覆し、グルタルアルデヒド架橋結合を用いて、シリカ表面でアビジンを安定化させる。それから従来の方法によって、官能基（例えば、抗体や核酸分子）をビオチン化する。そしてビオチン化された官能基をアビジン被覆ナノ粒子と混合し、官能基で被覆されたナノ粒子を形成する。
【００５１】
（ナノ粒子の使用方法）
多様な用途に、本発明のナノ粒子を用いることができる。例えば、抗体で被覆された蛍光性ナノ粒子を用いて、細胞を特異的に標識化してもよい。核酸で被覆された蛍光性ナノ粒子を用いて、特定のポリヌクレオチドを検出してもよい。さらに、核酸で被覆された磁性ナノ粒子を用いて、混合物から、ＤＮＡとＲＮＡを含む特定のポリヌクレオチドを分離し収集してもよい。
【００５２】
（細胞の標識化）
本発明のナノ粒子を用いて、細胞（例えば、真核細胞や原核細胞）を標識化してもよい。その一つの方法を図３に図示する。図３Ａを参照すると、抗体が誘導され染料がドープされたナノ粒子10が、容器30の中で標的細胞20（例えば、癌細胞，哺乳動物細胞，ヒト細胞，細菌細胞など）と非標的細胞21と一緒に混合していることが図示されている。標的細胞20は、その表面上に標的抗原22を発現しているが、非標的細胞21は発現していない。示されたナノ粒子において、コア12は、例えばＲ６Ｇ，フルオレセイン，Ｒｕ／Ｂｐｙ又はＴＭＲなどの蛍光性／発光性物質を含み、官能基16は、標的抗原22に特異的に結合できる抗体を含む。図３Ｂを参照すると、ナノ粒子10は、官能基16と標的抗原22の相互作用によって標的細胞20と物理的に結合して示されている。この結合は、抗体と抗原が結合する条件下（例えば、ほぼ室温、低塩の緩衝液中の中性から若干塩基性のｐＨ）で、ナノ粒子10と標的細胞20が容器30中に一緒に混合されているときに、自然に生じる。非標的細胞21は、標的抗原22を発現しないのでナノ粒子10に特異的に結合しない。
【００５３】
（核酸の検出）
本発明はまた、サンプル中の特定の標的核酸分子の存在を検出するための方法を提供する。その一つの方法として、所定の反応条件下（例えば、緊縮ハイブリダイゼーション条件）で、特異的な標的核酸分子の特定ヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションする官能基（例えば、標的核酸の一部か全部の相補体であるオリゴヌクレオチド）を結合した、発光性又は蛍光性のナノ粒子を利用する。この方法では、発光性又は蛍光性のナノ粒子を、特定のヌクレオチド配列を有する標的核酸分子を含むサンプルへ添加し、ナノ粒子と、特定のヌクレオチド配列を有する標的核酸分子との間の結合を、例えば、発光や蛍光を分析することによって、検出する。
【００５４】
図４を参照すると、サンプル中の核酸分子の存在を検出する別の方法は、担体へ固定された核酸分子を利用する。この方法では、シリカで被覆された石英の表面などの適切な担体に捕捉核酸分子を固定する。次に、捕捉核酸分子へハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を有する標的核酸分子を含んでいる場合、標的核酸分子が捕捉核酸分子へ結合するように、サンプルを担体へ加える。この相互作用を検出するために、担体を、発光性又は蛍光性のナノ粒子へ結合したプローブ核酸分子と作用させる。プローブ核酸分子は、標的核酸にハイブリダイゼーションするが、捕捉核酸分子へハイブリダイゼーションしないヌクレオチド配列を有する。標的核酸がサンプル中に存在すると、担体上の蛍光や発光の増加が（例えば、分光法によって）検出される。
【００５５】
（ＭＢを用いた核酸の検出）
核酸分子の存在を検出及び／又は核酸の混合物から核酸を分離する別の方法は、ガラスプレートやナノ粒子などの担体に固定された分子標識（ＭＢ）を利用する。ＭＢは、それらの標的ＤＮＡ配列が存在しないとき、これらの分子がステム・アンド・ループ（ｓｔｅｍ―ａｎｄ―ｌｏｏｐ）構造をとるように設計されている一本鎖のオリゴヌクレオチドプローブである（Tyagi S and Kramer FR, Nature Biotechnology, 14, 303-308, 1996）。この分子のループ部分は、特定の相補的な標的核酸とハイブリダイゼーションするように設計されている。標識の両端における塩基は、ステムを形成して、互いに相補的である。ステムの一端を蛍光剤へ結合させ、ステムの他の一端を消光剤へ結合させている。標的ＤＮＡが存在しないと、分子のヘアピン形状によって、蛍光剤と消光剤とは近接する。この構造において、蛍光剤によって捕捉された光エネルギーは、消光剤へ転移される。消光剤は、蛍光剤から受け取ったエネルギーを熱として消費する非蛍光性の発色団が好ましく、その結果としてヘアピン構造におけるプローブの蛍光強度は、プローブが開いている構造又は直線構造であるときよりかなり小さい。
【００５６】
蛍光剤と消光剤をステムの両端に標識したＭＢは図５に図式的に示されている。プローブが適切な標的ＤＮＡ分子に遭遇すると、そのループ部分は、ステムより、長く安定したハイブリッドを形成する。標的ＤＮＡ配列と形成されたハイブリッドの厳密さと長さのため、ステムハイブリッドが継続的に存在できない。したがって、標的ＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションに基づいて、ＭＢは、ステムを強制的に離して、蛍光剤と消光剤を移動させて離す自発的な立体構造の再構成を受ける。次に消光剤からの蛍光剤の分離は、消光を一転して、蛍光剤が発する蛍光の検出を可能にする。したがって、ＭＢは、標的分子にハイブリダイゼーションされた時、ハイブリダイゼーションされなかった時より、より強い蛍光信号を発する。ハイブリダイゼーションの研究のためにＭＢは成功して用いられている（Tyagi S and Kramer FR, Nature Biotechnology, 14, 303-308, 1996; Tyagi S, Bratu D, Kramer FR, Nature Biotechnology, 16, 49-53, 1998; Kostrikis LG, Tyagi S, Mhlanga MM, Ho DD, Kramer FR, Science 279, 1228-1229, 1998; Giesendorf BAJ, Vet JAM, Tyagi S, Mensink EJMG, Trijbels FJM, Blom HJ, Clinical Chemistry; 44: 482-486, 1998.）。異なるＭＢを設計することによって、ループのサイズとその内容を変更できる。また、特定の用途に従って、蛍光剤と消光剤を変更できる。
【００５７】
図５を参照すると、本発明は、特定のヌクレオチド配列を有する標的核酸分子に特異的に結合させるための、固体プレートやナノ粒子などの担体へ固定されたＭＢを提供する。図５に図示されているように、この方法の実施で好ましいＭＢは、プローブオリゴヌクレオチドを含む（ステムーループ構造で示されている）。オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子へハイブリダイゼーションできるヌクレオチド配列を有する。また、それは、蛍光剤（例えば、フロオロセイン又はローダミン系染料）とその蛍光剤の消光剤（例えば、ＤＡＢＣＹＬ）の両方を結合している。蛍光剤が消光剤に近接すると蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が起き、蛍光剤の発光スペクトルの変化が検出できる限り、任意の適当な蛍光剤―消光剤の組み合わせを用いてもよい（例えば、ＴＭＲとＤＡＢＣＹＬ（以下の実施例を参照））。非蛍光性の発色団であるＤＡＢＣＹＬ[ ４−（４'―ジメチルアミノファニルアゾ安息香酸）]は、ＭＢにおける任意の蛍光剤のための普遍的な消光剤として有用であるので、多くの用途に好ましい（Tyagi S, Bratu D, Kramer FR, Nature Biotechnology, 16, 49-53, 1998）。
【００５８】
図５に示されたモデルにおいては、蛍光剤をプローブオリゴヌクレオチドの一端（例えば、５' 末端）へ結合させ、消光剤をプローブオリゴヌクレオチドの反対の端（例えば、３' 末端）へ結合させる。標的核酸分子が存在しないと、プローブオリゴヌクレオチドは、蛍光剤が消光剤に近接することを特徴とするステム−ループ構造（ＦＲＥＴにより、蛍光剤からの蛍光放射を減少させる立体構造）を（自己ハイブリダイゼーションのために）取る。そのようなステム−ループ構造を形成できるオリゴヌクレオチドの設計方法はよく知られている。標的核酸分子が存在すると、それはプローブにハイブリダイゼーションし、蛍光剤と消光剤が分離されたとき起こるＦＲＥＴの減少や消去のために、蛍光放出が増加することを特徴とするプローブの直線構造への再構成を引き起こす。このため、蛍光の増加を測定することによって、標的核酸の存在を決定する。
【００５９】
（ＭＢの固定）
既知の化学的方法を適用することによって、ナノ粒子やスライドなどの担体へＭＢを固定してもよい。例えば、ビオチン−アビジン系を用いて固体表面に生体分子を固定してもよい（Anzai, J., Hoshi, T. and Osa, T. Trends in Analytical Chemistry, 13, 205-210, 1994; Narasaiah, D., Nowall, W. B. and Kuhr, W.G. Anal. Chem.69, 2619-2625, 1997）。例えば、本発明の一実施形態において、ビオチン分子はＭＢの構造内に組み込まれる。次に、ビオチン−アビジン結合を介して、アビジン被覆表面にビオチン化したＭＢを結合できる。
【００６０】
ビオチン官能基をＭＢへ結合には、ＭＢの一本鎖ループ領域の中の相補的なＤＮＡと、標的ＤＮＡ分子の最適なハイブリダイゼーションを可能にする、結合部位の位置決めが必要となる。ビオチンの結合のために、ループ配列，ステムの蛍光剤側上の第二の塩基対の位置，及びステムの消光剤側上の第二の塩基対の位置という異なる位置を調べた。ビオチンをステムの消光剤側に結合する立体構造は、ビオチンがＭＢの蛍光性，消光性及びハイブリダイゼーション性能に与える効果を最小にした。１８塩基対のループ配列を有するＭＢを用いて、ビオチンとその配列の間にスペーサーを挿入した。ループ配列とハイブリダイゼーションする標的ＤＮＡ分子のための容易な接近を行うために、ビオチン−チミジン（ｄＴ）を用いた。そして、アビジンとＤＮＡ配列の間の潜在的な相互作用を最小限にするための適当な分離を行うために、ビオチン−チミジン（ｄＴ）を用いた。
【００６１】
（ゲノ磁性のナノ捕捉）
ＭＢが結合したナノ粒子を用いて、サンプル（例えば、ただ一つの塩基だけ標的と異なるオリゴヌクレオチドを含むサンプル、ＤＮＡとタンパク質の混合物を含むサンプル）から特定の標的核酸分子を分離する方法も本発明の範囲内である。この方法の一変形例において、磁性ナノ粒子を、標的核酸（例えば、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で）にハイブリダイゼーションするＭＢと結合させる。これらの結合した磁性ナノ粒子は、ゲノ磁性ナノ捕捉（Ｇｅｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｎａｎｏｃａｐｔｕｒｅｓ（ＧＭＮＣ））と名付けられた。図６を参照すると、ＭＢが、標的核酸（つまりＤＮＡ１'）と、ただ一つの塩基が異なる標的核酸（つまりＤＮＡ２'）とハイブリダイゼーションでき、蛍光画像によってハイブリダイゼーションされた配列を検出できる条件下で、ＭＢ−ＧＭＮＣをサンプルへ加える。この方法の他の実施形態において、ＭＢ−ＧＭＮＣは、細胞溶解物を含む複合混合物から微量のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を分離するために用いてもよい。選択されたＤＮＡやＲＡＮの標的物とＭＢのハイブリダイゼーションの後に、マグネットを用いて、標的核酸に結合したＭＢ−ＧＭＮＣをサンプルから取り除く。次に、ハイブリダイゼーションされた核酸を分離するための従来の技法（例えば、温度を増加させる，又はＭＢ−ＧＭＮＣを含む水溶液の塩濃度を増加させる）を用いて、標的核酸をＭＢ−ＧＭＮＣから分離してもよい。蛍光剤や消光剤を結合していないＭＢを用いて、前述のことを行ってもよい。一方、その結合したＭＢの使用は、蛍光分析による分離過程の観察を可能にする。
【００６２】
（実施例）
（実施例１  ドープされたナノ粒子の調製）
（Ａ）臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）／ｎ−へキサン／ｎ−ヘキサノール（共界面活性剤）／水の油中水型マイクロエマルジョン中におけるＥｕ／Ｂｐｙ（Ｅｕ３+／２，２'―ジピリジル）でドープされたシリカナノ粒子の調製。磁性攪拌機を用いて、２．９１６ｇのＣＴＡＢ，７５ｍｌのｎ−へキサン，１５ｍｌのｎ−ヘキサノール及び８８０μｌの水を一緒に混合して、油中水型のマイクロエマルジョンの原液を９０ｍｌ調製した。１０ｍｌの原液を、二つの５ｍｌの等分分量へ均等に分割した。５０μｌのＴＥＯＳと５μｌの０．１ＭのＥｕ／Ｂｐｙ（水溶液）を一つの５ｍｌの等分部分に添加し、この混合液を１時間攪拌し、ＴＥＯＳ／Ｅｕ／Ｂｐｙ溶液を作成した。別の５ｍｌの等分部分に１３７μｌのＮＨ4ＯＨを添加し、この混合液を１時間攪拌し、ＮＨ4ＯＨ溶液を作成した。次に、このＮＨ4ＯＨ溶液をＴＥＯＳ／Ｅｕ／Ｂｐｙ溶液に滴下方式で加え、得られた混合溶液を一晩攪拌した。この混合溶液の界面活性剤に対する水のモル比は１５（水：界面活性剤）であった。２５ｍｌのアセトンを混合溶液のマイクロエマルジョンへ添加し、その結果生じた混合液をマイクロ遠心分離機で１５分間１０，０００ＲＰＭの回転数で遠心分離しナノ粒子を沈殿させ、その上清を除いて、残りのナノ粒子をアセトンやエタノール／水溶液で数回洗浄し、さらに界面活性剤と他のマイクロエマルジョン成分を除去することによって、Ｅｕ／Ｂｐｙでドープされたシリカナノ粒子を粉末の形状で分離した。次に洗浄したナノ粒子を、アセトンを用いて乾燥した。
【００６３】
（Ｂ）Ｒｕ／Ｂｐｙ［ＲｕII（Ｂｐｙ）3］でドープされたナノ粒子の調製。磁性攪拌機を用いて、７．５ｍｌのシクロヘキサン，１．８ｍｌのｎ−ヘキサノール，１．７７ｍｌのＴＸ−１００，３４０μｌの水及び１４０μｌの０．１ＭのＲｕII（Ｂｐｙ）3（水溶液）を１時間混合することによって、１０ｍｌの油中水型マイクロエマルジョンを調製した。次に、この結果得られた溶液を二つの５ｍｌの等分部分に分けた。１００μｌのＴＥＯＳを一つの等分部分に添加し、この混合液を３０分間攪拌し、ＴＥＯＳ溶液を作成した。別の５ｍｌの等分部分に６０μｌのＮＨ4ＯＨを添加し、この混合液を３０分間攪拌して、ＮＨ4ＯＨ溶液を作成した。次に、このＮＨ4ＯＨ溶液をＴＥＯＳ溶液に１０分間かけて滴下方式で添加し、得られた混合溶液を一晩攪拌した。上記実施例１Ａで述べたようにして、Ｒｕ／Ｂｐｙでドープされたシリカナノ粒子を分離した。
【００６４】
（Ｃ）テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）でドープされたナノ粒子の調製。酢酸（水）中において、１．７７ｍｌのトリトンＸ１００（界面活性剤），１．８ｍｌのｎ−ヘキサノール（共界面活性剤），７．５ｍｌのシクロヘキサン（油），及び０．４８ｍｌの１．２ｍＭ  ＴＭＲを混合することによって、油中水型マイクロエマルジョン溶液を調製した。前駆体（１００μｌのＴＥＯＳ）をマイクロエマルジョン溶液へ加え、その後それを３０分間攪拌した。２４時間攪拌することによって、シリカの重合反応を完成させた。マイクロエマルジョン系を壊し、さらにその溶液からナノ粒子を分離するために、２０ｍｌのアセトンをマイクロエマルジョン溶液へ添加した。超音波処理とボルテックス処理した後、溶液を遠心分離してＴＭＲでドープされたナノ粒子を得た。この結果得られたナノ粒子を９５％エタノールで４回、アセトンで１回洗浄した。各々の洗浄後、超音波処理と攪拌を用いて、溶液中にナノ粒子を完全に分散させた。
【００６５】
ナノ粒子形成の間、ＴＭＲ分子のドープされたものにおける、酢酸の機能を明らかにするため、無機酸（つまり、塩酸（ＨＣｌ））を酢酸と比較した。一定量のＴＭＲを異なる濃度のＨＣｌへ加え、ウォータープールを形成した。純水の場合と同じように、ウォータープールでＨＣｌを用いると、ＴＭＲを含まないシリカナノ粒子になった。この結果は、シリカ基質内部に捕捉されたＴＭＲは、ｐＨの変化によって起こるのではなく、有機酸中におけるＴＭＲの溶解性の結果であることを示している。
【００６６】
酢酸はまた、マイクロエマルジョン系においてＴＭＲでドープされたナノ粒子の合成の間、ＴＥＯＳの加水分解のための触媒の働きをした。重合過程は、６０μｌのＮＨ4ＯＨをマイクロエマルジョン系へ添加することによって改善された。さらに、大きな粒子形成の可能性を小さくするために、合成過程の後、エタノールとアセトンを用いて、この結果得られたナノ粒子を洗浄した。マイクロエマルジョン法によって製造されたＴＭＲがドープされたシリカナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察は、ナノ粒子の最終的なサイズが球状のウォータープールのサイズに大きく依存することを明らかにした。界面活性剤に対する水の比（Ｗ0）の値を変化することによって、異なるサイズのナノ粒子を得ることができた。例として、Ｗ0値１０の実施では、６０±４ｎｍの直径を有するナノ粒子となった。
【００６７】
ＴＭＲをドープしたものに対する酢酸濃度の効果。ウォータープールにおける酢酸濃度は、ナノ粒子内部へ捕捉されたＴＭＲ分子の量に大きく影響を与えた。酢酸濃度が１０．０Ｍより低い場合、ナノ粒子の低い蛍光強度に示されるようにほとんどのＴＭＲ分子をドープしなかった。ウォータープールにおいて酢酸濃度が１０．０Ｍより高い場合、ドープされたＴＭＲの量は飛躍的に増加した。
【００６８】
ナノ粒子の蛍光強度におけるＴＭＲ濃度の影響。ＴＭＲでドープされたナノ粒子の蛍光強度は、シリカマトリックス内部にドープされたＴＭＲ分子の数に依存していた。自己消光のため、ナノ粒子の蛍光強度は、染料でドープされた分子の数に比例しない。最大蛍光強度を得ることができた、ナノ粒子の特定のサイズのための最適な染料の濃度があった。ＴＭＲの最適な濃度を決定するために、ウォータープールの全体積で０から４ｍＭの染料濃度を変化させる条件下で、ＴＭＲでドープされたシリカナノ粒子を合成した。５５０ｎｍの励起光と５７５ｎｍの発光で分光蛍光光度計を用いて０．１ｍｇ／ｍｌのナノ粒子を含む溶液中における、この結果得られたナノ粒子の蛍光強度を検出した。結果は、ＴＭＲでドープされたナノ粒子の最も高い蛍光強度は、１．２ｍＭのＴＭＲ濃度で起こることを示した。さらなるＴＭＲ分子の負荷は、ＴＭＲ分子の自己消光のため、ナノ粒子の蛍光強度を減少させた。
【００６９】
ＴＭＲでドープされたナノ粒子の蛍光信号の増幅。無機的な染料がドープされたナノ粒子と比べて、ＴＭＲでドープされたナノ粒子で達成可能な信号増加の程度を決定した。上記のように同じマイクロエマルジョン法を用いて、ＲｕＢｐｙでドープされたナノ粒子を合成した。顕微鏡と感度のよい分光蛍光光度計を用いて、溶液中のナノ粒子と、固体表面に固定されたナノ粒子の両方の蛍光信号を検出した。二種類のナノ粒子サンプルを同じ方法で処理した。
【００７０】
溶液での検出のために、分光蛍光光度計を用いて、０．１μｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの範囲のいくつかのナノ粒子の濃度を分析した。ナノ粒子の密度に基づいて、各々のサンプル中のナノ粒子の数を計算し、ただ一つナノ粒子の平均蛍光信号を得た。この結果は、一つのＴＭＲナノ粒子の蛍光強度が、一つのＲｕＢｐｙナノ粒子のそれより４０倍より高いことを示した。
【００７１】
第二の比較、すなわち、一つのＴＭＲでドープされたナノ粒子と、一つのＴＭＲ分子との比較を同じ方法で行なった。この結果は、ＴＭＲナノ粒子対ＴＭＲ分子では１５０００倍のシグナル増加があることを示した。さらに、異なった実験方法を用いて、増幅の確認を得た。顕微鏡を用いて、ガラス表面上の蛍光画像に基づいて一つのナノ粒子の蛍光強度を検出した。頻繁に使用される超音波処理とボルテックス処理を用いて、サンプル中にナノ粒子の凝集がほとんどない点までナノ粒子溶液を希釈した（結果はＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）によって証明された）。したがって、顕微鏡画像中の各々の蛍光スポットは、単一のナノ粒子に相当した。ＩｍａｇｅＪのソフトウェアを用いて、ＴＭＲナノ粒子の平均蛍光強度を統計的に得た。そして、得られた結果は、分光蛍光光度計の結果と相関関係があった。
【００７２】
ＴＭＲがドープされたナノ粒子の安定性。ナノ粒子の光安定性を証明するために、純粋なＴＭＲ分子を、溶液中のＴＭＲでドープされたシリカナノ粒子と比較した。２０分間５５０ｎｍの連続的な光照射の後、純粋な染料分子の蛍光強度は約８５％減少した。なお、ナノ粒子の蛍光強度は一定を保った。
【００７３】
水溶液におけるＴＭＲでドープされたナノ粒子の長期間の安定性。この分析は、長期間、溶液中において浸漬されたシリカマトリックスからの染料分子の漏出の可能性について着目した。３日と７ヶ月の間、ＴＭＲでドープされたナノ粒子をそれぞれ水溶液中に浸漬し、その後溶液の蛍光強度を検出した。サンプルを遠心分離して、ナノ粒子から浸出したＴＭＲ分子を含んでいる上清から、ＴＭＲでドープされたナノ粒子を分離した。沈殿物を、その元の体積の水で再懸濁し、蛍光強度を検出した。遠心分離前後の蛍光強度の比較では、３日後の水溶液において、マトリックスからＴＭＲ分子の漏出はないことがわかった。７ヶ月保管した後、８．５％のＴＭＲのみがシリカマトリックスから漏出した。これらの結果は明らかに、いったんシリカマトリックス内部にＴＭＲ分子が捕捉されると、それらはナノ粒子内に強く組み込まれたままでいることを示した。
【００７４】
（Ｄ）Ｒ６Ｇでドープされたナノ粒子の調製。エタノール中の１ｍＭの染料溶液３ｍｌを、１．０ｍｌフェニルトリエトキシシラン（ＰＴＥＳ）と混合した。塩酸又は水酸化アンモニウムをこの結果得られた溶液に加えて、ＰＴＥＳの加水分解を開始した。数時間後、一つの相の系の形成によって、反応の終了が示された。次に、加水分解された溶液（０．５ｍｌ）へ１００μｌのＴＥＯＳを添加し、エタノールで５．０ｍｌにして溶解し、さらにストーバー工程（Stober et al., J Colloid and Interface Sci. 26:62, 1968）を経て、さらに水酸化物アンモニウムで反応させた。連続的な超音波処理と頻繁に使用されるボルテックス処理をして、０℃で１時間、反応させた。過剰量のアセトンを混合物へ添加することによって、ナノ粒子の形成を終了させた。
【００７５】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）と走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）は、上記の工程が、直径が１００ｎｍ前後の有機染料でドープされたナノ粒子の生産をもたらすことを示した。１２時間以上反応を進行させると、マイクロメートルの範囲の粒子となった。
【００７６】
ＰＴＥＳの量は、ナノ粒子におけるＲ６Ｇの捕捉のための重要な因子である。ＰＴＥＳの量の増加は、蛍光強度の増加に見られるように、ドープされた染料分子の収量の増加に対応する結果となった。異なるＰＴＥＳ：ＴＥＯＳの体積比 [（１ＳＲ１）０．２５：１、（１ＳＲ２）０．５：１、（１ＳＲ３）１：１] を有するサンプルについて蛍光強度の比較を行った。沈殿が形成され始める、極限比が存在することを明らかにした。ＰＴＥＳ濃度が高すぎると、高い疎水性を有するナノ粒子が得られた。２：１かそれより低い比の場合、水溶性のナノ粒子産物が得られることがわかった。溶液中におけるＲ６Ｇの濃度の効果は、一定量のＰＴＥＳとＴＥＯＳの条件下で決めた。Ｒ６Ｇのわずかな濃度の増加とともに、蛍光強度の増加を観察した。１ｍｌの溶液中に分散された１ｍｇのサンプルの蛍光強度を、さまざまな濃度の純Ｒ６Ｇと比較した。純Ｒ６Ｇ分子を用いて設定された検量線に基づいて１％より小さくなるように、ナノ粒子に捕捉されているＲ６Ｇの量を計算した。ナノ粒子内部に１％のＲ６Ｇ濃度があると、ナノ粒子は、好ましくは２０％の染料を含んでいるＲｕＢｐｙでドープされたナノ粒子より、高い発光強度を示した。
【００７７】
いったん染料分子がシリカマトリックス内部に捕捉されると、アセトンと水でナノ粒子を洗浄した。ドープされた染料分子は、水溶液中で最小限の漏出を示した。溶液中に３日間サンプルを浸漬し、遠心分離前後の溶液の蛍光を比較した。
この３日目の水溶液を遠心分離し、上清から染料でドープされたナノ粒子を分離した。その沈殿は再び水中において元の体積で再懸濁し、元の溶液の蛍光強度と再懸濁した沈殿の蛍光強度を比較した。有意な強度の差は観察されず、染料分子のほとんどがナノ粒子のマトリックスの中に捕捉されたままであることを示していた。これは、おそらくＰＴＥＳの疎水性の性質のためである。
【００７８】
光退色を評価するために、純粋な染料と、染料でドープされたナノ粒子の光安定性を比較した。１０００秒間サンプルに継続的に照射して、固体状の分光蛍光光度計を用いて蛍光強度を観察した。実験的な不安定性を最小限にするため、観察の間、２つのカバースリップの間にサンプルをはさんだ。結果は、純Ｒ６Ｇの強度は急激に減少するのに対して、ナノ粒子の内部にあるＲ６Ｇの蛍光強度は同じ条件下、有意に変化しないことを示した。ナノ粒子中の有機染料のより改善した光安定性は、生物学的検定法の光退色を最小限にし、その結果、これらのナノ粒子を用いる生物学的検定法の精度を上げる。
【００７９】
（実施例２  抗体が結合したナノ粒子を用いた細胞検出）
細胞の認識や標識のための有用性を示す様々な用途において、シリカで被覆されたナノ粒子を用いた。一実施形態として、シリカで被覆されたナノ粒子を抗体に結合させた。実施例１（Ａ）で述べられたように、最初、ＤＥＴＡ（第一級アミンをシリカ表面へ結合させるシラン化剤）で粒子表面をシラン化することによって、調製されたナノ粒子を抗体で誘導化した。フルオレサミン（第一級の脂肪族アミン基と反応させることに基づいて、高い蛍光性を示すようになる非蛍光性の分子）（Cordek et al., 1999; Chung, 1997）を用いて、ナノ粒子の表面にあるアミン基を確かめた。ＤＥＴＡで表面をシラン化した後、臭化シアン（ＣＮＢＲ）法を用いて、シラン化されたシリカ表面上に抗体（マウス抗ヒトＣＤ１０）を固定化した。上記のように染料でドープされた粒子を調製し、乾燥させ、超音波処理機を用いて９．０ｍｌの２Ｍ炭酸ナトリウム溶液（活性化緩衝液）中で懸濁した。次に、ＣＮＢＲのアセトニトリル溶液（０．５ｍｌのアセトニトリル中に溶解した１．０ｇｍのＣＮＢＲ）を滴下方式で５分間、室温で攪拌しながらナノ粒子懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ）へ添加した。結果として生じたＣＮＢＲ活性化型ナノ粒子を、氷水で２回、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。次に、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈した４０μｌの抗体を、表面の修飾された粒子へ添加し、４℃で２４時間攪拌し続けた。それから、この結果生じた抗体が誘導されたナノ粒子を１０ｍｌの０．０３Ｍグリシン溶液で３０分間処理し、残っている再活性部位を塞いだ。その最終産物を洗浄し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で再懸濁し、今後の使用のために４℃で保存した。ナノ粒子の光学的性質と分光学的性質において変化が観察されなかった。
【００８０】
細胞培養培地上の懸濁液として、単核リンパ球細胞（約二百万の細胞／ｍｌ）を得た。２時間、抗ＣＤ１０が固定されたナノ粒子と細胞懸濁液をインキュベートした。インキュベートした後、細胞懸濁液を光学顕微鏡と蛍光顕微鏡の両方で撮像した。顕微鏡での分析により、（染料でドープされた粒子の明るい放射によって示された）細胞のほとんどが標識化されたことがわかった。光学的画像は、蛍光画像とよく相関した。非抗体で誘導化され染料でドープされたナノ粒子を用いた対照実験においては、細胞の標識化は観察されなかった。標識化細胞において、シグナル・ノイズ比（つまり、蛍光画像における明るい領域の強度と暗い領域の強度との間の比）は、５００より大きかった。
【００８１】
（実施例３  タンパク質が結合したナノ粒子を用いた方法）
ＰＤＧＦ結合ナノ粒子。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体の検出のためのナノ粒子の有用性を評価するために、ナノ粒子への共有結合性の固定化の方法によって、ＰＤＧＦを（実施例１で述べられたように調製された）ＴＭＲ−ナノ粒子へ結合させた。ＴＭＲでドープされたシリカナノ粒子の表面を最初、化学的に修飾した。ナノ粒子の表面上にアミン官能基を形成するために、シリカナノ粒子を１Ｍ酢酸中の１％ＤＥＴＡと３０分間、室温で連続的な攪拌をして反応させた。アミンを官能基化されたナノ粒子を蒸留脱イオン水で３回十分に洗浄した。ＤＭＦで洗浄した後、ナノ粒子を、ＤＭＦ溶液中の１０％の無水コハク酸と窒素ガスの下で６時間連続的な攪拌をしながら、反応させた。十分な水での洗浄後、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）中の１００ｍｇ／ｍｌのＥＤＣと１００ｍｇ／ｍｌのＮＨＳを用いて、２５分間室温で連続的な攪拌をしながらナノ粒子を活性化させた。水で洗浄したナノ粒子を０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．３）中に分散させた。ＰＤＧＦをナノ粒子表面へ共有結合性の固定をするため、ナノ粒子を１０ｎＭのＰＤＧＦと３時間、室温で連続的な攪拌をしながら反応させ、この結果生じる共役ナノ粒子―タンパク質を形成し、その後、ＰＢＳ緩衝液中で洗浄した。次の反応で非特異的な結合の効果を減少させるために、タンパク質が結合したナノ粒子を１％ＢＳＡと反応させ、使用前に０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．３）中で洗浄した。
【００８２】
ＨＴＢ−２６（乳癌細胞株）を用いて、ＰＤＧＦ−ナノ粒子の結合を調べた。この測定のために、ＨＴＢ−２６細胞の懸濁液をＰＤＧＦ−ＴＭＲ−ナノ粒子で３０分間、３７℃で５％の二酸化炭素とともにインキュベートした。光学顕微鏡と蛍光顕微鏡で分析した結果により、ＨＴＢ−２６細胞（ＰＤＧＦ−ＴＭＲ−ナノ粒子でインキュベートされた細胞）におけるＰＤＧＦ受容体の存在を示す、明るく標識された細胞が明らかになった。対照として、ＰＤＧＦなしのＴＭＲ−ナノ粒子でインキュベートした細胞は、蛍光性ではなかった。これらの結果より、細胞の蛍光性の標識は、ＰＤＧＦ−ＴＭＲ−ナノ粒子の細胞表面上のＰＤＧＦ受容体への結合のためであることがわかった。これらの結果は、細胞の研究のための高い蛍光性と光安定性の生物指標としての、ＴＭＲでドープされたナノ粒子の用途（受容体への結合を含む）の明らかな例を提供する。この方法の他の例として、ＰＤＧＦ受容体を発現する腺癌細胞（ＭＤＡ―ＭＢ−２３１）をＰＤＧＦが結合しＴＭＲでドープされたナノ粒子とインキュベートした。蛍光顕微鏡は、細胞表面に、ＰＤＧＦが結合しＴＭＲでドープされたナノ粒子が結合したことを再度明らかにした。
【００８３】
ＧＤＨ結合ナノ粒子。酵素（つまりグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ））をナノ粒子表面へ固定化することによって、グルタミン酸の検出のためのバイオセンサーとしてのＲ６Ｇでドープされたナノ粒子を調べた。述べられた方法（Cordek J. et al., Anal. Chem. 71: 1529, 1999; Qhobosheane S.et al, Analyst 126: 1274, 2001）の修正を用いて、ＧＤＨをナノ粒子上へ固定した。つまり、酵素との生物接合（bioconjugation）のため、ナノ粒子を、１ｍＭ中の酢酸中のアミノサリン、Ｎ1−[３−（トリメトキシシリル）プロピル]ジエチレントリアミンの２％溶液を用いて修飾した。次のステップである酵素（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ））への結合の前に、この結果生じたナノ粒子を二機能の架橋剤であるグルタル酸ジアルデヒドでさらに処理した。適切な洗浄が各々のステップの後に続いた。酵素反応（ＮＡＤ+＋グルタミン酸→ＮＡＤＨ＋α―ケトグルタル酸）を用いて、ナノ粒子へ固定化されたＧＤＨの分子の活性を調べた。ＮＡＤＨの蛍光をグルタミン酸の分析のために調べた。
【００８４】
固定化された分析物を検出するためのＢＳＡで被覆されたナノ粒子。アビジンを、シリカで被覆しＲ６Ｇでドープされたナノ粒子と、ガラスプレートとの表面へ物理的に吸収させた。次にそのアビジンをグルタルアルデヒドと架橋させ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に保存した。その被覆されたガラスプレートを、二つの異なる濃度のビオチン化されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理した。各々のＢＳＡ分子は平均で９のビオチン分子を有していた。アビジンで被覆されたナノ粒子を、ガラスプレート上の有効性ビオチン分子と結合させて、ビオチンーアビジン相互作用を調べた。ローダミン６Ｇの５２０ｎｍの励起光と５５０ｎｍの発光に選択的なフィルターセットを用いて、蛍光顕微鏡によって、この実験を行った。増加した数のナノ粒子が、ビオチン化されたＢＳＡを最も高い濃度（２ｍｇ／ｍｌ）で含んでいるガラス表面に付着した。一方、修飾がないＢＳＡを含んでいる対照のガラスプレート上には、ほとんど結合が観察されなかった。
【００８５】
（実施例４  核酸の検出）
Ｒｕ／Ｂｐｙでドープされたシリカナノ粒子を特異的なＤＮＡ分子を、検出するためのプローブとして用いた。３つの異なるオリゴヌクレオチド（つまり、ＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３）をサンドイッチ測定で用いることを特徴とする方法の概略を図４に示す。ＤＮＡ１（ビオチン化された捕捉ＤＮＡ）をアビジンで被覆されたガラス担体へ固定した。次に、ハイブリダイゼーションが促進する条件下で、ＤＮＡ２（標的ＤＮＡ）を担体へ作用させた。ＤＮＡ３と結合した染料でドープされたシリカナノ粒子もまた担体へ添加した。ＤＮＡ１とＤＮＡ３は、ＤＮＡ２（標的ＤＮＡ）の異なる位置に相補的であるヌクレオチド配列を含む。倒立顕微鏡を用いて発光信号を検出した。そして、ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）を用いてナノ粒子プローブの担体表面への結合を確認した。
【００８６】
石英ガラス担体へのＤＮＡの固定。１０Ｍの水酸化ナトリウムで一晩中浸され洗浄したカバースリップを１２時間、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の１ｍｇ／ｍｌのアビジン（Molecular Probes, Eugene, OR）溶液でインキュベートした。アビジンの層をグルタルアルデヒド（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.）（１時間、室温で１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中の１％のグルタルアヒド）で架橋し、次に１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でインキュベートをすることによって安定化させた。２０μＭのビオチン化されたＤＮＡ１（５' ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＡＡ  ＴＣＣ  Ｔ  ３'；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（IDT, Coralville IA）の２５０ｎｌの等分分量を担体へスポットし、それから担体を１２時間、加湿空気室でインキュベートした。
【００８７】
ナノ粒子―プローブ上へのＤＮＡの固定。Ｒｕ−Ｂｐｙでドープされたシリカ被覆ナノ粒子のサンプル１０ｍｇを１ｍｌのアビジン溶液（Fang et al., Anal. Chem. 72: 747A, 2000）でインキュベートした。アビジンの被覆を１％のグルタルアルデヒドで架橋し、ナノ粒子をＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液中においてインキュベートした。次に、ナノ粒子を１ｍｌの２０μＭのＤＮＡ３中において、１２時間インキュベートし、ＤＮＡ３（５' ＴＡＴ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  Ｔ  ３'；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をナノ粒子の表面へ固定化した。厳密な洗浄と遠心分離が各々のステップの後に続いた。インキュベートするためのＤＮＡ３濃度が１μＭのとき、この結果生じるナノ粒子を０．５ｍｇ／ｍｌの終濃度で再懸濁した。
【００８８】
ＤＮＡハイブリダイゼーション。標的溶液[ ＤＮＡ２（５' ＧＧＡ  ＴＴＡ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＴＴＡ  ＧＡＴ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ３'；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）]（IDT, Coralville IＡ）の等分分量を５０℃で加温し、担体上に固定されたＤＮＡ１の部位へ置き、４時間インキュベートした。緩衝液を用いた厳密な洗浄の後、ＤＮＡ３が結合したナノ粒子を担体へ添加して、４時間、加湿空気室でハイブリダイゼーションできるようにした。厳密な洗浄が各々のステップの後に続いた。インキュベーションを行った。標的ＤＮＡ２の濃度を１０-12から１０-6までの範囲で変化をさせて、分析をした。等濃度のプローブＤＮＡと捕捉ＤＮＡをすべての実験で用いた。
【００８９】
光学試験と画像化。強化された電荷結合装置（ＩＣＣＤ）を備えた倒立蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ｍｏｄｅｌ  ＩＸ７０８Ｆ）を用いて、発光の画像を得た。Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ−４０００  ＦＥ−ＳＥＭを用いて、ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）画像を撮影した。発光強度データに依存した濃度を用いて、検出限界を評価した。同様な方法で選択的な実験を行った。相補的な標的と、一つの塩基が不一致しているＤＮＡの両方からの発光信号を比較した。
【００９０】
上記の方法を用いて、ＤＮＡ１をアビジン被覆ガラス担体上に固体化させた。次に、固定化されたＤＮＡ１をＤＮＡ２の一端にハイブリダイゼーションできるようにした。ＤＮＡ２のハイブリダイゼーションしなかった１５塩基を、Ｒｕ／Ｂｐｙでドープされたシリカ被覆ナノ粒子へ結合したビオチン化されたＤＮＡ３とハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションしていないＤＮＡプローブと、物理的に吸収されたナノ粒子を洗浄した後、担体表面を画像化した。蛍光画像とＳＥＭ画像の両方により、ナノ粒子が担体表面へ結合したことを確かめた。そのことより、３種類の異なるＤＮＡのハイブリダイゼーションが発生していることがわかった。
【００９１】
ハイブリダイゼーション過程における温度の影響を調べるために、前述の測定を２５℃、３５℃、４５℃、５５℃で繰り返した。温度自動調節機の制御を用いて、温度平衡を達成した。４５℃まで温度の増加とともに、発光強度が増加し、それより高い温度では、強度の減少が観察された。以下で述べる実験のほとんどは、便宜のため２５℃を用いた。
【００９２】
ＤＮＡ標的物の高感度の分析。異なる範囲の標的ＤＮＡ（ＤＮＡ２）（つまり、１０-12Ｍから１０-6Ｍまでの濃度）に対しての蛍光画像技術を用いることによって、シグナルの濃度依存性を調べた。１０-11Ｍから１０-9Ｍまでと１０-9Ｍから１０-6Ｍまでの検量線を書いた。画像ソフトウェアを用いて、各々のサンプルの平均信号強度を得た。全体として、最も高い濃度の範囲（１μＭ以上）を除いて、標的ＤＮＡ濃度と発光信号の間には、優れた直線関係があった。５×１０-7Ｍと１×１０-6Ｍで推測される飽和状態が観察された。この濃度依存性は、蛍光発光画像とＳＥＭ画像の両方で明らかであった。ＳＥＭ画像により、標的ＤＮＡ濃度が増加するにつれて、ナノ粒子の密度が増加することがわかった。この実験において、捕捉ＤＮＡとプローブＤＮＡの濃度は一定に保たれた。特に、この検定のための検出限界は、３×１０-12Ｍであった。
【００９３】
Ａ―ＴとＧ−Ｃの間の不一致の区別。上記の方法はとても感受性があるので、２７塩基対の直線ＤＮＡにおける一つの塩基のミスマッチも区別できる。図７Ａに示されたように、相補的なＤＮＡ（つまり、ＤＮＡ２）から得られたものと、一つの塩基が不一致である標的ＤＮＡ（つまり、等濃度のｘＤＮＡ２（５' ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＴＴＡ  ＧＡＴ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ３'；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４））から得られたものとの間に発光強度の大きな違いがあった。さらに、図７Ｂを参照すると、染料でドープされたナノ粒子によって与えられるシグナルの増幅はとても大きかったので、Ａ−Ｔの不一致でさえＧ−Ｃの不一致と区別できた。
【００９４】
（実施例５  固定化された分子標識を用いた核酸の検出と分離）
試薬と装置。すべての生化学試薬を購入し、入手しだい使用した。リゾチーム（Ｌｙｓ）、ヘモグロビン（Ｈｂ）及びＢＳＡはシグマ社（St. Louis, MO）から購入した。塩化第二鉄、塩化第一鉄、トリトンＸ−１００、イソオクチルフェニルエーテル、４−（Ｃ8Ｈ17）Ｃ6Ｈ4（ＯＣＨ2ＣＨ3）nＯＨ（ｎ〜１０）、及びＴＥＯＳは、アルドリッチ化学社（Milwaukee, WI) から購入した。シクロへキサン、ｎ−ヘキサノール、水酸化ナトリウムは、フィッシャ  サイエンティフィック社（Pittsburgh, PA）から入手した。磁性ナノ粒子の合成における全ての水溶液の調製のため、蒸留脱イオン水（Easy Pure LF）を用いた。磁性ナノ粒子の合成と性質決定のため、ＦＳ２０超音波装置（フィッシャ  サイエンティフィック社）、遠心分離機５８１０Ｒ（Eppendorf）、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７０００透過型電子顕微鏡（日本）とＭＰＭＳ−５Ｓ超伝導量子干渉装置（SQUID）磁気化学メーターを用いた。異なる温度での蛍光強度を検出するため、Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ  ＴＡＵ−３分光蛍光光度計（Jobin Yvon-Spex, Instruments S. A., Inc.）を用いた。
【００９５】
（Ａ）表面へ結合させるためのビオチン化されたＭＢの調製
ビオチン化されたＭＢの合成。アビジン−ビオチン結合に基づいて、表面への結合のため適切なＭＢを設計した。合計２８塩基対で、そのうち１８塩基対が興味のループ配列である、ＭＢのヌクレオチド配列を設計した。互いに相補的である５塩基対がステムを形成した。選択された蛍光剤はＴＭＲであって、消光剤はＤＡＢＣＹＬであった（両方ともMolecular Probes, Eugene, ORから）。標的ＤＮＡは以下の配列を有していた：５' ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）。標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションするように設計したビオチン化されたＭＢは、１００７６の分子量を有し、以下の配列を有す。
５'-ＧＣＡ  ＣＧＴ  ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  Ｇ（ビオチンｄＴ）ＧＣ-３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、および、５'末端にＴＭＲを、３'末端にＤＡＢＣＹＬをそれぞれ結合させた。
【００９６】
開始物質としてＤＡＢＣＹＬ−ＣＰＧ（制御された微細孔ガラス）を用いて、ビオチン化されたＭＢを合成した。合成は４つの重要なステップを含んでいた。始めに、ＣＰＧ固体支持体をＤＡＢＣＹＬで誘導化し、３'末端で合成を開始するために用いた。次に、標準的なシアノエチルホスホラミダイト化学を用いて、環のＣ５炭素へ結合したビオチンを有するビオチンｄＴ残基（Glen Research）を含む残留ヌクレオチドを添加した。ビオチンの目的は、表面に結合しているアビジン分子への連結を与えることである。第二に、ヌクレオチドの５' 末端を（ＣＨ2）6−ＮＨリンカーアームに結合させ、５' 末端に第一級アミン基を形成した。５' 末端の第一級アミン基を６つの炭素スペーサーアームによってリン酸ジエステル結合へ連結させた。トリチル保護基が、アミン基を保護する最終５' 末端にある。第三に、逆相ＨＰＬＣによって、オリゴヌクレオチドを精製し、ナトリウム塩の形へ変換した。最後に、精製したオリゴヌクレオチドを一晩中、重炭酸／ＤＭＦ緩衝液中のＴＭＲで標識した。酢酸で一時間処理し、その後真空状態で一晩中乾燥させることによって、５' 末端のトリチル基を除いた。標識化の後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５上のゲル濾過クロマトグラフィーによって、過剰の染料を除いた。それから設計したビオチン化されたＭＢに相当するオリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣで精製し、主要なピークを集めた。
【００９７】
溶液中のビオチン化されたＭＢを用いたハイブリダイゼーションの研究。新しく合成したビオチン化されたＭＢを用いて、溶液におけるＤＮＡハイブリダイゼーションの特性を評価した。ＳＰＥＸ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｆ−１１２Ａ分光蛍光光度計で行われる蛍光測定を用いて、ハイブリダイゼーションの特性を調べた。ハイブリダイゼーションの実験のため、サブマイクロ石英セルを用いた。以下を含む３つの溶液を調製した：ＭＢのみ、ＭＢとその５倍モルの過剰量の相補的な標的ＤＮＡ、ＭＢとその５倍モルの過剰量の非相補的なＤＮＡ。全３溶液のＭＢの終濃度は、５０ｎｍであった。溶液（２００μｌ）を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2（ｐＨ８．０）を含む緩衝溶液で２０分間インキュベートした。励起光５１５ｎｍ、室温で発光スペクトルを記録した。
【００９８】
標的ＤＮＡ分子と反応させたとき、溶液でハイブリダイゼーションしたビオチン化されたＭＢは、１０倍より大きい蛍光信号の増加を示した。非相補ＤＮＡの溶液は、同じ条件下で増加を示さなかった。ビオチン化されたＭＢのハイブリダイゼーションの原動力を、ビオチンがないＭＢを用いて得たそれと比較した。両方の場合において、同様な結果を得た。
【００９９】
（Ｂ）固体プレート上に固定されたＭＢの調製と使用
ビオチン化されたＭＢのシリカプレート上への固定。シリカで被覆された表面を調製するために、始めシリカガラスカバースリップをＨＣｌ：水＝１：１の水溶液で２時間洗浄した。水で十分にリンスをした後、カバースリップを一晩中１０Ｍ水酸化ナトリウム中に置き、水で再びリンスした。次に、処理したカバースリップをアビジン溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）で１２時間インキュベートした。物理的に吸収されたアビジンを、１時間、１％グルタルアルデヒド緩衝溶液中で架橋させることによって安定させ、その後１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）で３時間インキュベートした。次に、アビジンで被覆されたカバースリップをリン酸緩衝液で洗浄し、窒素下で乾燥した。ＭＢで被覆された表面を作るために、ビオチン化されたＭＢ溶液（１×１０―6Ｍ：緩衝液中）を一滴、アビジンで被覆されたカバースリップへ添加した。アビジン−ビオチン結合時間は、数分間から３０分までの範囲になった。それからカバースリップをハイブリダイゼーション溶液中（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ８．０）で洗浄し、結合してないあらゆるＭＢを除いた。結合過程は、早く効率的であった。数分以内に、被覆率が平衡に達した。緩衝溶液中に数日間浸した後でさえ、固定されたＭＢはアビジンで被覆された表面へ結合したままだった。
【０１００】
プレートに固定したビオチン化されたＭＢを用いたハイブリダイゼーションの研究。異なるハイブリダイゼーションの条件下でＭＢの蛍光強度を観察した。前に述べられたように（Fang, X and Tan, W, Anal. Chem. 71, 3101-3105, 1999）、蛍光顕微鏡、ＩＣＣＤ、アルゴンイオンレーザー、および顕微鏡の台への光透過のための光学ファイバープローブを用いて、蛍光信号の観察を行った。まず始めに、励起レーザー光線（５１４ｎｍ）を、５０μｍのコアを持った光学ファイバープローブへ向け、次に顕微鏡の台に置いたプリズムへ結合させた。ＭＢで固定化したシリカプレートガラスで挟持されたプリズムの表面に消えてゆく領域を生じさせ、それを用いて固定化されたＭＢを励起させた。したがって、生成した蛍光信号を対物レンズによって集め、ＩＣＣＤへ向けた。
【０１０１】
シリカプレート上に固定されたＭＢがその相補的なＤＮＡ標的分子と相互作用したとき、二重鎖のＤＮＡの二本鎖を形成し、したがって、ＭＢへ結合された蛍光剤から蛍光信号を増加させた。相補ＤＮＡ分子の異なる濃度（５ｎＭから６００ｎＭまでの範囲）でＭＢプローブ調査を行った。その結果は、ＭＢが固定化されたプレートを用いて、ナノモルの範囲の標的ＤＮＡ分子を検出できることを示した。非相補ＤＮＡ分子を用いたとき、蛍光信号に増加はなかった。補足実験は、ハイブリダイゼーション後、プレートに固定されたＭＢは再生可能で、したがって、ＤＮＡ検出と相互作用の研究のため、プレートの複数回の再利用が可能であることを示した。
【０１０２】
（Ｃ）ナノ粒子表面に固定化されたＭＢの調製
ビオチン化されたＭＢの設計と合成。ナノ粒子の表面に固定化されたＭＢの研究における使用のため、上記の（１５-ヌクレオチドループと５-ヌクレオチドアームを有する）方法を用いてＭＢを設計し、合成した。ループ配列（５'-ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＡＴＴ  ＴＡＡ  ＣＡＡ-３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）は、炭疽菌の致死因子をコードするＤＮＡに相補的であった。ＭＢとのＤＮＡハイブリダイゼーションの研究のために、４つの異なるＤＮＡ標的配列を調製した：ＤＮＡ１'： ５'-ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＡＴＴ  ＧＡＴ-３' （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＤＮＡ２'：５'-ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＡＴＴ  ＧＡＴ-３' （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＤＮＡ３'：５'-ＴＡＧ  ＴＴＡ  ＴＡＡ  ＡＴＴ  ＧＴＴ-３' （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＤＮＡ４'：５'-ＴＡＧ  ＴＴＡ  ＴＡＡ  ＡＴＴ  ＡＴＴ-３' （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）。蛍光剤としてフルオレセインを、消光剤としてＤＡＢＣＹＬをビオチン化されたＭＢ中で利用した。上記設計にしたがって合成したＭＢを用いて、磁性ナノ粒子の表面へ固定化をした。
【０１０３】
磁性ナノ粒子表面へのＭＢの固定。上記の油中水型のマイクロエマルジョン法を用いて、シリカで被覆された磁性ナノ粒子を合成した。トリトンＸ１００界面活性剤を用いて、マイクロエマルジョンを調製した。ＦｅＣｌ2、ＦｅＣｌ3を用いて、鉄酸化物ナノ粒子を形成した。ＴＥＯＳをマイクロエマルジョンへ添加することによって、シリカ層を形成した。アビジン−ビオチン結合を介して、磁性ナノ粒子の表面にＭＢを固定した。つまり、まず始めに、アビジン溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．３中で２ｍｇ／ｍｌ）中でシリカで被覆された磁性ナノ粒子を１４時間、冷蔵庫でインキュベートすることによって、アビジンをナノ粒子の表面へ被覆した。次に、アビジンで被覆されたナノ粒子を３回、０．５ｍｌの緩衝液で洗浄した。被覆されたナノ粒子を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液中の１％グルタルアルデヒドで１時間、室温で架橋することによって、アビジン層を安定化させた。それから、アビジンで被覆されたナノ粒子を、０．５ｍｌの１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７）で３回洗浄した後、冷蔵庫中でＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で３時間インキュベートした。
【０１０４】
ＭＢを、アビジンで被覆した磁性ナノ粒子の表面に固定化するために、ナノ粒子を１２時間、冷蔵庫で１．０×１０-6Ｍのビオチン化されたＭＢを含む溶液でインキュベートした。各々のアビジン分子は４つのビオチン結合部位を有する。各々の露出したビオチン基がアビジン分子へ結合したことを確かめるために、アビジンを過剰に用いた。ナノ粒子を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ2緩衝液（ｐＨ＝８）で３回洗浄し、表面にＭＢが結合した磁性ナノ粒子（ＭＢ−ＧＭＮＣｓ）を今後の使用のために冷蔵庫で保存した。
【０１０５】
インキュベートされたＭＢの上清溶液、洗浄溶液、及びＭＢ−ＧＭＮＣｓのそれぞれの蛍光強度を比較し、ＭＢ固定化の手法の効率を調べた。これらの３つの溶液の各々へ、６倍の過剰量の相補ＤＮＡ１'を添加した。ＤＮＡ１'のＭＢへの添加は、フルオレセインとＤＡＢＣＹＬ分子の間の蛍光エネルギー転移のため、蛍光消光を減少させた。ＧＭＮＣサンプルは、上清又は洗浄溶液より、かなり蛍光性を有しており、ＭＢのほとんど（ある実験では９２．２％）がＧＭＮＣに結合し、ＧＭＮＣに結合しているＭＢは標的ＤＮＡに結合可能な能力を保持していることを示した。
【０１０６】
（Ｄ）標的ＤＮＡの分離と収集のためのＭＢ−ＧＭＮＣｓの使用
分離手段の設計とステップ。上記のように調製したＭＢ−ＧＭＮＣｓに対して、ポリヌクレオチドの複合混合物（ある場合においては、タンパク質が存在している）から選択的に標的ＤＮＡを捕捉する能力を調べた。図６を参照すると、分離過程における全体の設計とステップが概略的に図示されている。混合物中でＤＮＡとタンパク質の両方を組み入れている試験で、選択された混合物は、微量の標的ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'、多量の任意のＤＮＡ３'とＤＮＡ４'（１００倍の濃度）、及び１０００倍の濃度のいくつかのタンパク質（つまり、ＢＳＡ、Ｈｂ、及びＬｙｚ）を含んでいた。ＤＮＡ１'は完全にＭＢのループ配列に相補的な標的物であり、一方、ＤＮＡ２'は一つの塩基が不一致した配列であった。
【０１０７】
試験を始めるため、ＭＢ−ＧＭＮＣｓを１８℃で３０分間、複合ＤＮＡ−タンパク質混合物へ添加し、ＤＮＡ標的物をＭＢ−ＧＭＮＣｓへ結合させた。分離過程は、３つのステップを含んでいた。第一のステップは、複合混合物から標的配列（ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'）を分離し、収集するステップであった。ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'は、ＧＭＮＣ表面上でＭＢと特異的にハイブリダイゼーションしたが、任意のＤＮＡ配列とタンパク質はしなかった。混合物を磁石にさらし、微量のＤＮＡ１'とＤＮＡ２'を有するＧＭＮＣｓを集め、混合物から分離した。
【０１０８】
第二のステップは、ＤＮＡ２'からＤＮＡ１'の分離である。ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'との分離は、ＭＢと形成された二本鎖の融解温度の違いに基づいている。２０μｌ体積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ2緩衝液をＧＭＮＣｓへ添加した。ＧＭＮＣ緩衝液の温度を３２℃まで１５分間あげることによって、ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'を分離した。この温度では、ＤＮＡ２'はＧＭＮＣから完全に分離し、一方、ＤＮＡ１'はＧＭＮＣ表面上に結合したままであった。それから溶液を磁界へ再びさらして、ＤＮＡ１'と結合しているＧＭＮＣｓを除いた。上清はＤＮＡ２'を含んでいた。このため、ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'を、混合物からと互いからの両方から分離した。
【０１０９】
分離過程の最後のステップは、ＭＢ−ＧＭＮＣｓからＤＮＡ１'の収集であった。２０μｌ体積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ2緩衝液をＤＮＡ１'と結合したＭＢ−ＧＭＮＣへ添加した。その溶液の温度を５２℃まであげて、１５分間保持した。その結果、ＭＢ―ＧＭＮＣｓからＤＮＡ１'を完全に分離した。それから、印加磁場を使用して、ＭＢ―ＧＭＮＣｓを溶液から取り除いた。
【０１１０】
ＤＮＡ分離と収集のための融解温度の選択。図６に示した分離手段の第二のステップは、ＭＢと標的ＤＮＡ配列の間に形成されたＤＮＡ二本鎖の融解温度の違いに基づいて、密接に関連したＤＮＡ配列の分離を包含する。ＭＢ−ＧＭＮＣｓの表面に結合した、完全に一致した（つまり相補的な）ＤＮＡ配列（例えば、ＤＮＡ１'）と、一塩基が不一致なＤＮＡ配列（例えば、ＤＮＡ２'）との異なる分離のための最適な温度を決定するために、試験を行った。これは、相補的な配列（ＤＮＡ１'）とＭＢのハイブリダイゼーションが安定であるのに対して、塩基が不一致なＤＮＡ配列（ＤＮＡ２'）へのハイブリダイゼーションは安定でない、温度範囲を決定することを伴った。ＭＢと同じループ配列を有する直線ＤＮＡプローブを用いると、相補的なＤＮＡと、一塩基が不一致なＤＮＡの間の融解温度の差は、７℃であることがわかった。対照的に、ＭＢのループ配列と同じ配列を用いると、温度の差は２１℃であった。
【０１１１】
ＧＭＮＣｓ上へ固定化されているか、又は固定されていないＭＢへのＤＮＡ１'とＤＮＡ２'の結合における温度の効果を、温度の範囲にわたってさらに調べた。その結果を図８に示す。図８Ａは、ＧＭＮＣｓに固定化されたＭＢを用いた結果を示している。６倍の過剰量のＤＮＡ１'（０．６μＭ、曲線１）又はＤＮＡ２'（０．６μＭ、曲線２）を、ＭＢ―ＧＭＮＣｓを含有する溶液へ添加した。温度の働きとして、溶液の蛍光強度を検出した。８℃から７５℃まで温度を徐々に増加させ、平衡状態とするために、各温度間隔で５分間の持続時間を２℃毎にとった。図８Ａに見られるように、低い温度では、ＧＭＮＣ表面上のＤＮＡ１'―ＭＢとＤＮＡ２'―ＭＢの両方の二重鎖はよく蛍光を示した。このことは、ＭＢが、ハイブリダイゼーションのため、開（直線）構造をとることを示していた。温度が上昇するにつれて、蛍光放出は両方のサンプルで減少した。しかし、最も低い温度でさえ、一塩基の不一致なサンプル（ＤＮＡ２'）は、相補的なＤＮＡ（ＤＮＡ１'）と比較して、相当低い蛍光強度を示した。この不一致な二重鎖は、１８℃より大きいと不安定となり、３２℃では完全に分離した。対照的に、ＤＮＡ１'二重鎖は３２℃ではまだ安定でわずか３％が分離しただけである。したがって、温度を３２℃まで上昇することによって、ＤＮＡ２'からＤＮＡ１'を分離することができた。この温度では、ＤＮＡ２'の１００％が分離するのに対して、わずか３％のＤＮＡ１'が溶液中へ分解した。
【０１１２】
また、ＧＭＮＣに結合していないＭＢ二重鎖の（つまり溶液中の）融解温度の特性を調べた。図８Ｂは、溶液中における遊離型のＭＢと、それらの標的配列の間のハイブリダイゼーションの結果である。条件と実験手法は、図８Ａにおけるそれと同じであった。ＤＮＡ１'溶液は、０．６μＭ  ＤＮＡ１'と０．１μＭ  ＭＢ（曲線１）を含んでいた。ＤＮＡ２'溶液は、０．６μＭ  ＤＮＡ２'と０．１μＭ  ＭＢ（曲線２）を含んでいた。曲線３は、溶液中のＭＢのみを示した対照である。図８Ａと図８Ｂの結果を比較すると、ＧＭＮＣの表面に固定化されたＭＢによって形成される二重鎖の融解特性（図８Ａ）と、溶液中におけるそれ（図８Ｂ）との間に顕著な違いが見られた。ＭＢをＧＭＮＣ表面へ固定したとき、ＤＮＡ１'を持ったＭＢ二重鎖と、ＤＮＡ２'を持ったＭＢ二重鎖の両方についての融解温度の特性がより高い温度へ移動したことは明らかであった。この点は、図８Ｃでさらに図示されており、図８Ｃでは２つの条件下（つまり、ＧＭＮＣ表面上に固定されたＭＢ（曲線１）と、緩衝溶液中のＭＢ（曲線２））で、ＭＢとＤＮＡ２'の間で形成する二重鎖の融解特性の直接の比較を示している。図８Ｃで示されているように、ＤＮＡ２'―MB二重鎖が分離し始める温度は、溶液中におけるＭＢの１０℃から、ＧＭＮＣに結合したＭＢの１８℃へシフトした。
【０１１３】
（Ｅ）複合ＤＮＡ−タンパク質混合物からの微量の標的ＤＮＡの収集のためのＭＢ−ＧＭＮＣｓの使用
さらにＭＢ−ＧＭＮＣｓの能力を調査するために、複合タンパク質／ポリヌクレオチド混合物からの微量の標的ＤＮＡの収集の効率を調べた。ＭＢ―ＧＭＮＣｓがその標的ＤＮＡ（つまりＤＮＡ１'とＤＮＡ２'）に結合する能力を阻害する能力に関して、３つの異なる一般的なタンパク質（Ｈｂ、ＢＳＡ、Ｌｙｓ）と、２つの１５塩基の任意のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ３'とＤＮＡ４'）を分析した。１０-7ＭのＨｂ、ＢＳＡ、Ｌｙｓ、１０-8ＭのＤＮＡ３'とＤＮＡ４'、及び３ｆｍｏｌ（３．１３×１０-10Ｍ）のＤＮＡ１'とＤＮＡ２'を含んでいる溶液（９．９０ｍｌ体積）を調製し、ＭＢ−ＧＭＮＣ含有溶液の０．１ｍｌ等分部分を添加した。上記のステップに従って、分離を行った。
【０１１４】
ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'はＧＭＮＣの表面上のＭＢと特異的にハイブリダイゼーションしたが、任意のＤＮＡ配列とタンパク質はしなかった。磁性によるＭＢ−ＧＭＮＣｓの分離後、ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'の蛍光信号を測定した。図９に示されるように、ＭＢ−ＧＭＮＣｓは、オリゴヌクレオチドとタンパク質の複合混合物から微量（つまり、３ｆｍｏｌ）の標的物ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'を捕捉できた。これらの研究では、３×１０-15Ｍの濃度で相補的なＤＮＡ１'を収集し、約９×１０-15Ｍの濃度で一塩基が不一致なＤＮＡ２'を収集した。この例で従来の分光計のみを用いて、研究を行った。より感度の良い分析方法（例えばFang and Tan, Anal. Chem. 71, 3101-3105, 1999とZhang and Tan, Chem-Eur. J. 6, 1087-1092, 2000を参照）を用いて、さらに低い濃度の標的の捕捉が検出可能であろう。
【０１１５】
（Ｆ）ＭＢ―ＧＭＮＣｓを用いたＤＮＡ標的物の捕捉のための効率。
上記のＤＮＡ−タンパク質複合混合物中においてＤＮＡ１'とＤＮＡ２'を用いて、相補的ＤＮＡと、一塩基が不一致であるＤＮＡの収集と分離のためのＭＢ−ＧＭＮＣｓの効率をさらに調べた。一連の試験において、ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'の溶液（両方とも２５ｎＭの濃度）を、過剰のＭＢ−ＧＭＮＣｓとハイブリダイゼーションし、二つの溶液の蛍光スペクトルを分光分析によって得た。同時に、２５ｎＭのＤＮＡ１'と２５ｎＭのＤＮＡ２'の混合物を調製し、上記の手法とステップに従って、ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'を前記混合物から分離した。ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'の分離と収集の後、過剰のＭＢ−ＧＭＮＣｓ（分離前に使用されるのと同じ濃度）を分離されたＤＮＡ１'とＤＮＡ２'溶液へそれぞれ添加し、蛍光を測定した。分離と収集の前後において、ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'の量の違いは観察されなかった。結果より、２５ｎＭ（２．５×１０-10Ｍ）の濃度でＤＮＡ標的を用いると分離と収集の効率は９７％より大きいことがわかった。
【０１１６】
標的物の他の濃度における方法の収集の効率を決定するために、より低い濃度（つまり、ピコモルの範囲で）のＤＮＡ１'とＤＮＡ２'を有する複合サンプルを、ＭＢ−ＧＭＮＣｓを用いて調べた。それぞれの条件で５回の実験を繰り返し平均した結果を表１に要約した。それぞれの混合物中で、潜在的な阻害物の濃度は同じであった。８．２５×１０-12Ｍの標的ＤＮＡ１'とＤＮＡ２'の濃度でさえ、収集の効率は９５％に近い又は９５％より大きかった。
【表１】
2005523027.tif 000003
【０１１７】
（Ｇ）混合物からｍＲＮＡの捕捉のためのＭＢ−ＧＭＮＣｓの使用
分子標識の合成。第一の分子標識（ＭＢ１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を１５ヌクレオチドのループと５ヌクレオチドのアームを有するように上記のように設計した。蛍光剤としてフルオレセイン、及び消光剤としてＤＡＢＣＹＬ [４−（４'−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸]を選択した。第二のＭＢ（ＭＢ２）を１８塩基のループと５塩基のアームを有するように設計した。このループ配列は、ラットの２０４ヌクレオチド（ｎｔ）のγ―アクチンｍＲＮＡの部分と相補的である。直線のＤＮＡプローブを分子標識と比較するため、ＭＢ１のループ配列と同じ配列を有する１５塩基の直線ＤＮＡプローブを、蛍光剤としてフルオレセインを有するように設計した。直線ＤＮＡプローブへの標的物に、消光剤としてＤＡＢＣＹＬで標識した。デザイナーＭＢと直線プローブを有するＤＮＡハイブリダイゼーションの研究のためにいくつかの異なる標的ＤＮＡ配列を設計した。全配列を表２に示す。
【表２】
2005523027.tif 000004
【０１１８】
γ―アクチンｍＲＮＡの調製。ラットの肺組織からＲＮＡを分離し、次にｃＤＮＡサイクルキット（Introgen BV）を用いて、オリゴ（ｄＴ）プライマーを有するｃＤＮＡへ逆転写した。ＰＣＲでの増幅のために、プライマー対、５'-ＧＣＧ  ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＡＧＡ-３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）と５'-ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＴＣＣ-３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）を用いた。反応を２５サイクルさせた。ＰＣＲ２．１ベクター（TA Cloning Kit, Invitrogen）を用いて、２０４塩基対のＤＮＡフラグメントのＰＣＲ産物をクローニングした。次に、組み換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＩＮＶα細胞へ形質転換をした。ＤＮＡのミニプレップを調製し、ＢａｍＨＩで直線化した。γ―アクチンＲＮＡを生成するために、Ｔ７転写反応のため、Ａｍｂｉｏｎ  Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔにおいて１．０μｇの直線化したプラスミドＤＮＡテンプレートを用いた。精製後、２０４ｎｔのラットγ―アクチンｍＲＮＡを生産した。
【０１１９】
混合物からの微量ｍＲＮＡの捕捉。混合物からｍＲＮＡとＰＣＲ産物を収集するＭＢ−ＧＭＮＣｓの能力を決定するため、２０４ｎｔのラットγ―アクチンｍＲＮＡフラグメント（塩基７８２−９８５中の塩基８１５−８３２、ＭＢ２のループ配列に相補的である）を含有する人工的な混合物を調製した。混合物中のタンパク質と任意のＤＮＡの配列は、上記実施例５Ｅで記されたそれと同じであった。
【０１２０】
ＤＮＡ分離過程。純ＭＢ２とｍＲＮＡを用いて、ｍＲＮＡ濃度を変化させての蛍光強度の標準曲線を書いた。室温でハイブリダイゼーションした後、完全に相補的な標的ＤＮＡ５とＭＢ２のハイブリダイゼーションするのと同じ方法で、ＭＢの蛍光強度が増加した。この結果は、標的配列がＭＢよりも１０倍より長くとも、ＭＢは標的ｍＲＮＡとハイブリダイゼーションできることを示している。これらの実験の結果はまた、ｍＲＮＡ濃度がかなり低い場合、ｍＲＮＡがその標的にハイブリダイゼーションの時間がより長くなることを示していた。
【０１２１】
較正の後、異なる濃度のｍＲＮＡを含む混合物をＭＢ−ＧＭＮＣ溶液へ添加した。低いｍＲＮＡ濃度のサンプルのため、６０分のハイブリダイゼーションの時間を用いて、全ｍＲＮＡが検出されたことを確かめた。ＤＮＡ分離研究に関して上述された分離手法を用いた後、印加磁場を用いてＭＢ−ＧＭＮＣｓを混合物から分離した。ＭＢ−ＧＭＮＣｓをｍＲＮＡへハイブリダイゼーションした後、溶液の蛍光強度を検出することによって、収集したｍＲＮＡの量を調べた。ｍＲＮＡのためのＭＢ−ＧＭＮＣｓの収集効率を表３に示す。
【表３】
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【０１２２】
（Ｈ）細胞からｍＲＮＡの捕捉のためのＭＢ―ＧＭＮＣｓの使用
ＭＢ―ＧＭＮＣｓを用いて、培養したＨＴＢ−２６細胞から１５６塩基のｍＲＮＡ配列を収集した。供給者の指示に従ってＨＴＢ−２６（American Type Culture Collectionから得た）を９０ｍｍフラスコで培養した。１分間の連続的なボルテックス処理をしながら、抽出／ＢＭE緩衝液を細胞へ添加することによって、細胞溶解を行った。細胞残屑のホモジェネートを除き、タンパク質を沈殿させるために、溶解物を１２０００×ｇで１０分間室温で遠心分離をした。ｍＲＮＡを含む上清をデカンテーションし、７０℃で５分間変性させた。ＭＢ−ＧＭＮＣｓを１％βメルカプトエタノール希釈緩衝液中で細胞溶解物と混合した。次に、混合物を磁場にかけることによって、ＭＢ−ＧＭＮＣｓを溶液から分離し、次いで蛍光強度を直接検出した。ｍＲＮＡ配列中の１８塩基をＭＢ２ループ配列と完全に相補的であった。ＨＴＢ−２６細胞内に同じ１８塩基を有する他のｍＲＮＡ分子はなかった。
【０１２３】
培養細胞からのｍＲＮＡの捕捉。細胞からｍＲＮＡの抽出後、ＭＢ−ＧＭＮＣｓによってｍＲＮＡ分子を特異的に捕捉した。細胞溶解物から分離したＭＢ−ＧＭＮＣｓにおいて検出可能な明らかな蛍光信号によってこれを証明した（図１０、曲線ａ）。２つの対照実験の結果は、蛍光信号は標的ｍＲＮＡとＭＢのハイブリダイゼーションが確かに起因していることを確かめた。細胞を溶解する前にＭＢ−ＧＭＮＣｓを添加し、その後、磁性分離し洗浄することによって一つの対照実験を行った。曲線ａと同じ条件で分析したとき、曲線ｂに示されるように、ＭＢ−ＧＭＮＣ溶液において蛍光が検出できなかった。加えて、ＭＢ２の配列と異なる配列を持つＭＢを、同じ条件下で、ＨＴＢ−２６細胞溶解物とインキュベートしたとき、蛍光信号はＭＢ−ＧＭＮＣ溶液の中には観察されなかった（図１０、曲線ｃ）。
【０１２４】
（実施例６  細菌の標識）
染料でドープされたナノ粒子を、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｏ１５７：Ｈ７に特異的な抗体と結合させた。抗体が抗原と結合するのに十分な時間、これらの抗体が結合したナノ粒子と、結合していないナノ粒子（ネガティブコントロールとして）を、別々にＥ．ｃｏｌｉ株Ｏ１５７：Ｈ７を含有する溶液と混合した。次に混合物をろ過し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）と蛍光顕微鏡によって分析した。ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）と蛍光顕微鏡の両方とも、抗体が結合したナノ粒子は細菌と結合し、抗体が結合してないナノ粒子は細菌と結合していないことを示した。
【０１２５】
（他の実施形態）
上記の明細書には多くの詳述が含まれるが、これらは本発明の範囲を限定するものと解されるべきではなく、正しくはその好適な実施形態の一例として解されるべきである。多くの別の変形が可能である。したがって、本発明の範囲は説明された実施形態によって決定されるべきではなく、添付した請求項とそれらの法的な均等により決定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】本発明で有用なナノ粒子の断面図である。
【図２】本発明で有用なナノ粒子の製造方法に含まれる一般的なステップを示すフローチャートである。
【図３】ナノ粒子を用いる細胞の標識化の方法を示す２種の概略図（ＡとＢ）である。
【図４】核酸分子の存在を検出する方法の概略図である。
【図５】特定のヌクレオチド配列を有する標的核酸分子に特異的に結合し、検出するための分子標識（ＭＢ）の実施の詳しい概略図である。
【図６】核酸とタンパク質の複合混合物から重要なポリヌクレオチド（ＤＮＡ１'）を分離することを含むステップの概略図である。
【図７】本発明の核酸の検出方法における一塩基の不一致の選択性を示す二つのグラフである。（Ａ）完全に相補的である核酸からの信号：一塩基が不一致な核酸からの信号。（Ｂ）Ａ−Ｔの一塩基の不一致からの信号：Ｇ−Ｃの一塩基の不一致からの信号。
【図８】ＭＢをゲノ磁性ナノ捕捉へ固定させた（ＭＢ―ＧＭＮＣｓ）、又はＭＢを溶液中に遊離させた条件下で、標的ＤＮＡ配列と二本鎖になったＭＢの融解温度特性を示す一連のグラフである。
【図９】ＭＢ−ＧＭＮＣｓが、複合ＤＮＡ−タンパク質混合物から、微量のＤＮＡ標的物を捕捉する能力を示したグラフである。
【図１０】ＭＢ−ＧＭＮＣｓが、細胞溶解物から、微量の標的ｍＲＮＡを捕捉する能力を示したグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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