(57)【要約】本発明は、新規胎盤由来幹細胞を特徴とし、そして胎盤由来幹細胞、あるいは所望の細胞型の産生をもたらすのに十分な量で、受容宿主内に所望の組織型、すなわち肝組織、膵臓組織、ニューロン組織又は神経組織への分化を誘導された胎盤由来幹細胞の治療的使用のための方法及び組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎盤由来幹細胞を含む組成物であって、上記細胞が、以下の：ｃ−ｋｉｔ、Ｔｈｙ−１、ＯＣＴ−４、ＳＯＸ２、ｈＴＥＲＴ、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０及びＴＲＡ１−８１から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する前記組成物。
【請求項２】
ＡＴＣＣ登録番号××××として寄託される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記幹細胞が、患者を治療するのに有効な量で治療用タンパク質を産生するように遺伝子操作される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
肝臓病、血管疾患、神経組織疾患又は膵臓病を患う患者を治療するのに有効な量で請求項１に記載の組成物を含む医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の幹細胞を、適当な条件下、デキサメタゾン、ＥＧＦ又はＴＧＦ−α含有培地中で肝細胞の分化を誘発するのに十分な期間培養する方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法によって得られる肝細胞であって、以下の：アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、Ａ１ＡＴ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ４及びＣ／ＥＢＰ−αから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する前記肝細胞。
【請求項７】
請求項５に記載の方法によって得られる肝細胞を、肝臓病を患う患者を治療するのに有効な量で含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項５に記載の方法によって得られる肝細胞であって、上記細胞に対する毒性効果を検出するのに十分な時間、試験物質と上記肝細胞を接触させるステップ、そして上記肝細胞に対する毒性効果を測定するステップを含む、試験物質が肝細胞に対して毒性を有するか否かを決定するために使用される前記肝細胞。
【請求項９】
請求項５に記載の方法によって得られる肝細胞であって、試験物質が代謝されるのに十分な時間、試験物質と上記肝細胞を接触させるステップ、そして代謝された産物の存在を検出するステップを含む、試験物質の代謝産物を決定するために使用される前記肝細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載の幹細胞を、適当な条件下、マトリゲル上で血管内皮細胞分化を誘発するのに十分な期間培養する方法。
【請求項１１】
血管疾患を患う患者を治療するのに有効な量で請求項１０に記載の方法によって得られる血管内皮細胞を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求１０に記載の方法によって得られる血管内皮細胞であって、上記細胞に対する毒性効果を検出するのに十分な時間、試験物質と上記血管内皮細胞を接触させるステップ、そして上記血管内皮細胞に対する毒性効果を測定するステップを含む、試験物質が血管内皮細胞に対して毒性を有するか否かを決定するために使用される前記血管内皮細胞。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法によって得られる血管内皮細胞であって、試験物質が代謝されるのに十分な時間、試験物質と上記血管内皮細胞を接触させるステップ、そして代謝された産物の存在を検出するステップを含む、試験物質の代謝産物を決定するために使用される前記血管内皮細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載の幹細胞を、適当な条件下、デキサメタゾン、ＩＴＳ及びマトリゲル含有培地中で膵臓細胞分化を誘発するのに十分な期間培養する方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法によって得られる膵臓細胞であって、以下の：Ｐａｘ６、Ｐｄｘ１及びインシュリンから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する前記膵臓細胞。
【請求項１６】
膵臓病を患う患者を治療するのに有効な量で請求項１４に記載の方法によって得られる膵臓細胞を含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法によって得られる膵臓細胞であって、上記細胞に対する毒性効果を検出するのに十分な時間、試験物質と上記膵臓細胞を接触させるステップ、そして上記膵臓細胞に対する毒性効果を測定するステップを含む、試験物質が膵臓細胞に対して毒性を有するか否かを決定するために使用される前記膵臓細胞。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法によって得られる膵臓細胞であって、試験物質が代謝されるのに十分な時間、試験物質と上記膵臓細胞を接触させるステップ、そして代謝された産物の存在を検出するステップを含む、試験物質の代謝産物を決定するために使用される前記膵臓細胞。
【請求項１９】
請求項１に記載の幹細胞を、適当な条件下、ＦＧＦ−４含有培地中で神経組織細胞への分化を誘発するのに十分な期間培養する方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法によって得られる神経組織細胞であって、以下の：ＧＦＡＰ、ＦＬＴ１、ＣＮＰ及びβ−チュブリンＩＩＩから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する前記神経組織細胞。
【請求項２１】
神経組織疾患を患う患者を治療するのに有効な量で請求項１９に記載の方法によって得られる神経組織細胞を含む医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法によって得られる神経組織細胞であって、上記細胞に対する毒性効果を検出するのに十分な時間、試験物質と上記神経組織細胞を接触させるステップ、そして上記神経組織細胞に対する毒性効果を測定するステップを含む、試験物質が神経組織細胞に対する毒性を有するか否かを決定するために使用される前記神経組織細胞。
【請求項２３】
請求項１９に記載の方法によって得られる神経組織細胞であって、試験物質が代謝されるのに十分な時間、試験物質と上記神経組織細胞を接触させるステップ、そして代謝された産物の存在を検出するステップを含む、試験物質の代謝産物を決定するために使用される前記神経組織細胞。
【請求項２４】
動物臓器への胎盤由来幹細胞の移植を含むヒト化臓器の誘導方法であって、上記幹細胞が動物臓器を再生及び再増殖させてヒト化臓器を製造する前記方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法によって得られるヒト化臓器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．序
本発明は、さまざまな異なる細胞型へと分化する能力をもつ新規の胎盤由来幹細胞を提供する。本発明は同様に、さまざまな異なる細胞型への分化能力をもつ胎盤由来の幹細胞の長時間培養の方法をも提供する。本発明の方法及び組成物は、移植、バイオ人工臓器の開発又は薬物の有効性及び安全性をテストするように設計された薬物スクリーニング検定において使用可能である幹細胞又は分化するように誘発された幹細胞を提供する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
胚幹細胞は、かなり以前から、異なる細胞型を発生させることのできる全能性幹細胞供給源として認識されてきた。これらの細胞は受精した及び発育中の胚の内細胞塊から誘導される。かかる細胞の使用は、倫理的及び宗教的の両方の理由で論議を呼んできた。その上、連邦規定は現在、入手困難ないくつかの確立した細胞系統に胚幹細胞の使用を制限している。最近の研究は、幹細胞の代替的供給源に焦点をあててきた。これらには、骨髄又は末梢血から得られる造血幹細胞が含まれる。しかしながら、個体からこのような幹細胞を単離することは、観血的で痛みを伴う。
【０００３】
発達中の胚は、生き延びるために胎盤と胚体外膜により媒介される母親と胚の間の相互作用を必要とする。胎盤と絨毛膜は、羊膜腔が内細胞塊の外胚葉に源を発し胚体外中胚葉の単層から成っているのに対し、受精から８日目という早い時期に内細胞塊から分化し始める栄養膜に由来している。
【０００４】
近年になって、幹細胞の代替的供給源として胎盤、羊膜及び臍帯血が研究されてきている。羊膜は、子宮内で胎児が発達するにつれて胎児を完全にとり囲む上皮細胞の単層から成る構造である。羊膜上皮（ＡＥ）細胞は、それを細胞移植にとって潜在的に有用なものにしている独特の特長を有している。このような特長の１つは、ＡＥ細胞がＭＨＣ表面抗原をその細胞表面上で発現できないことにある（Akle et al., I：ボランティアの体内への移植後のヒト羊膜上皮細胞の免疫原性。The Laut １００３−１００５，１９８１；Sakuragawa et al., ヒト羊膜上皮細胞の免疫染色：先天性代謝異常のための遺伝子療法におけるトランス遺伝子担体としての使用可能性。細胞移植４：３４３−３４６，１９９５；Tohyama et al., 起点障害あるＳＶ４０ Ｔ−抗原遺伝子での形質転換を受けたヒト羊膜上皮細胞の特徴づけ。Tohoku J.Med. １８２：７５−８２,.１９９７）。
【０００５】
ＡＥ細胞表面上のＭＨＣ発現の欠如は、かかる細胞が移植療法において有用であり得るということを表わしていた。例えば、Akle et al.は、羊膜組織移植片が、拒絶の徴候なく最高５４日間にわたり７人のボランティアによって寛容されたということを報告していた（Akle et al., I：ボランティアの体内への移植後のヒト羊膜上皮細胞の免疫原性。The Lacet １００３−１００５，１９８１）。さらに、羊膜組織移植のいくつかの臨床試験が、先天的代謝異常患者において実施されてきた。移植後の明確な臨床的利点は観察されなかったものの、Ｂ型ニーマン・ピック病のために移植を受けた１人の患者は除外される可能性はあるが、どの患者においても移植片対宿主反応は記述されていない（Scaggiante et al., ヒト羊膜の生着によるニーマン・ピック病の成功した療法。移植４４；５９−６１，１９８７）。
【０００６】
移植における胎盤由来の羊膜由来細胞の使用を妨げる最大の問題点は、培養におけるその長期増殖ならびに肝細胞又はその他の望ましい細胞型への胎盤由来細胞の分化を誘発するための信頼性及び再現性あるメカニズムに関連したむずかしさにある。胎盤由来細胞の回収の成否は往々にして可変的であり、出発材料によって左右される。
【０００７】
Terada et al.,は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ、５０ng／ml）又は表皮成長因子（ＥＧＦ、５０ng／ml）のいずれかでの１０％のＦＢＳを含む基本培地の補足が、初期培養から得ることのできる細胞数を２〜７倍増大させるということを報告した。しかしながら、１１日間の培養後、ＨＧＦ又はＥＧＦ及びＦＢＳの存在下でさえいかなる増殖性応答もみられなかった（Terada et al.,細胞療法のためのヒト羊膜上皮（ＨＡＥ）細胞の増殖誘発。「細胞移植」９：７０１−７０４、２０００）。
【０００８】
複製期を延長させる試みとして、羊膜上皮細胞はＳＶ４０大型Ｔ細胞で不死化されてきた。細胞系統は良く成長したが、移植時点で細胞が腫瘍形成性となったことからその実験的価値は制限あるものでしかなかった（起点障害あるＳＶ４０Ｔ−抗原遺伝子で形質転換されたヒト羊膜上皮細胞の特徴づけ。Tohoku J.Med・１８２；７５−８２．，１９９７）。
【０００９】
Hu et al.は、胎盤からの羊膜の除去による羊膜上皮細胞の単離、培養及び低温保存、及び羊膜上皮細胞の機械式又は酵素的除去について示した（ＷＯ００／７３４２１）。彼らは、細胞を凍結し解凍することはできたものの、細胞の長時間培養又は任意の胚細胞、多能性幹細胞又は分化した細胞のマーカーの発現を実証してはいない。
【００１０】
その他の研究者は、胎生組織工学において使用するためのヒトの胎盤及び羊水の両方からの胎児間葉細胞及び場合によっては胎児間葉幹細胞の単離について記述してきた（Kaviani et al., 胎生組織工学のための細胞供給源としての羊水。J. Pediatr Surg, ３６：１６６２−１６６５，２００１，Kaviani et al., 胎生組織工学における細胞源としての胎盤、J. Pediatr Surg. ３７：９９５〜９９９．２００２）。
【００１１】
免疫組織学的技術を用いて、Sakuragawa et al.は、ＡＥ細胞上の神経細胞及びグリア細胞の両方のためのマーカーの発現について実証した（Sakuragawa et al., ヒト羊膜上皮細胞内の神経及びグリア細胞の両方のためのマーカーの発現。Neuroscience Lett. ２０９：９−１２，１９９６）。かかるニューロンマーカーとしては、ニューロフィラメントタンパク質（ＮＦ）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）、ＭＡＰ２キナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）及び環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼが含まれる。その後の研究は同様に、ＡＥ細胞がコリンアセチルトランスフェラーゼｍＲＮＡを発現し、アセチルコリン（Sakuragawa et al.神経病のための脳内同種移植に適用可能な、ヒト羊膜上皮細胞内での活性アセチルコリン代謝の証拠、Neurosci Lett. ２３２−５３−５６，1９９７）、痴呆といったような神経病のための脳内同種移植に適用可能な、ヒト羊膜上皮細胞内での活性アセチルコリン代謝の証拠（Neurosci Lett. ２３２−５３−５６，1９９７；ＥＰ８１５８６７）及びカテコールアミン（Elwan 及びSakuragawa, ヒト羊膜上皮細胞によるカテコールアミンの合成及び放出についての証拠）を合成し放出する、ということも示した。ＡＥ肝細胞特異的タンパク質発現の証拠が報告されている。例えば、培養されたＡＥ細胞は、マウスの肝臓内への移植の後と同様、インビトロでヒト・アルブミン（Ａｌｂ）及びαフェトプロテイン（ＡＦＰ）に対する抗体と免疫反応性を有することが示された（Sakuragawa et al., ヒト羊膜上皮細胞が肝臓内への同種異系細胞の移植のための有望なトランス遺伝子担体である。J. Hum Genet ４５；１７１−１７６，２０００）。
【００１２】
さらに、Kobayashi et al.は、大部分がサイトケラチン陽性細胞であったヒト羊膜から羊膜上皮細胞及び間葉細胞を単離した。これらの細胞は、その新血管形成阻害能力について特徴づけされ、新血管形成の効能ある阻害物質を含有するものと考えられた。新血管形成を伴う角膜疾患の治療におけるこれらの細胞の使用は、Kobayashi et al.の中で提案された（ヒト羊膜細胞の培養上清による角膜新血管形成の抑制。Cornea２１；６２−６７，２００２）。
【００１３】
Sachier et alは、例えば軟骨及び血管移植片を失った関節内の罹病した又は損傷を受けた組織の治療に適用されるべき羊膜上皮細胞を単離した（米国特許第５，６１２，０２８号、ＥＰ３３３３２８号）。
【００１４】
一部の群は同様に、胎盤組織の放出及びその後の灌流を通したその他の幹細胞様の細胞の収集に焦点をあててきた（ＵＳ２００２／０１２３１４１，ＵＳ２００３／００３２１７９）。これらの細胞は主として、臍帯血から単離される。これらは、造血幹細胞マーカーを発現し、多能性あると考えられている（ＵＳ２００２／０１２３１４１，ＵＳ２００３／００３２１７９）。しかしながら、報告書から、これらの細胞は、多能性及び組織型への分化能力を示すのではなくむしろ組織からの分化された細胞と融合するということがわかってきた（Wang et al.「細胞融合は、骨髄由来の肝細胞の主要な供給源である」Nature, ２００３年３月３０日、電子出版；Vassilopoulos et al.,「移植された骨髄は、細胞融合により肝臓を再生する」Nature, ２００３年３月３０日、電子出版）。
【００１５】
従って、肝臓、膵臓、内皮及び神経組織を含めたさまざまな組織へと分化でき、かくして有用な治療法を提供する幹細胞の代替的な議論の余地のない供給源に対するニーズが存在している。
【発明の開示】
【００１６】
３．発明の概要
本発明は、新規の胎盤由来の幹細胞（例えば、胎盤の羊膜、絨毛膜又は脱落膜に由来する幹細胞）に関する。好ましい細胞は、ヒトの胎盤から得られる。その他の好ましい胎盤由来の幹細胞は、ｃ−ｋｉｔ、Ｔｈｙ−１、ＯＣＴ−４、ＳＯＸ２、ｈＴＥＲＴ、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０及びＴＲＡＩ−８１から成る群の中から選択されたバイオマーカーを発現する。さらに、細胞は通常ＣＤ３４の発現について陰性である。特に好ましい細胞は、 付けでＡＴＣＣに寄託されＡＴＣＣ登録番号を割当てられている細胞である。その他の好ましい胎盤由来細胞は、一般に有効量の治療用タンパク質を発現するように遺伝子操作されてきた。
【００１７】
本発明はさらに細胞表面で発現された幹細胞マーカーを認識する抗体を利用して胎盤由来幹細胞を高めた集団を誘導する方法を提供している。かかる方法は、特異的細胞表面マーカーを発現する胎盤幹細胞を検出するための螢光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の使用を内含している。
【００１８】
本発明はさらに、移植された細胞の生存度及び成長を増強させる目的での移植に先立つマトリクスに対する胎盤由来の細胞のインビトロ付着にも関する。さらにマトリクスは、その他のタイプの細胞又は生物学的に活性な分子を含む付加的な材料で構成されていてもよい。
【００１９】
もう１つの態様においては、本発明は、細胞を増殖させるべく胎盤幹細胞を培養し分化させるための方法をも提供している。１つの実施形態においては、細胞は、肝細胞へと分化するのに十分な期間適当な条件下で培養される。このように誘導された肝細胞様の細胞は、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＩＡＴ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ４及びＣ／ＥＢＰ−αから成る群の中から選択された少なくとも１つのマーカーを発現することがわかっている。特に好ましいＣＹ様細胞は、 付けで米国標準培養収集機関に寄託され というＡＴＣＣ登録番号が割当てられた細胞である。このように誘導された有効量の肝細胞を、肝臓病を治療するために患者に投与することができる。
【００２０】
本発明のもう１つの実施形態においては、肝細胞は、肝臓病を患う患者が使用するためのバイオ人工肝臓を形成するのに使用することができる。さらに、該幹細胞は、バイオ人工肝臓として使用できるヒト化された動物の肝臓を形成するために使用可能である。かかるバイオ人工肝臓の使用には、バイオ人工肝臓を通しての患者の血液又は血漿の灌流が関与する。血液灌流プロトコルにおいては、患者の血液又は血漿は抜き取られ、肝細胞培養と接触させられる。かかる通過の間、ビリルビンといったような患者の血液又は血漿中に溶解した分子が取り上げられ、肝細胞培養により代謝させられる。さらに、培養された肝細胞は、通常肝組織により供給される因子を提供することになる。
あるいは、肝細胞様細胞は、薬物毒性検定において有用であり得る。
【００２１】
もう１つの態様では、本発明は、血管内皮細胞分化を誘発するのに十分な期間、適当な条件下で胎盤由来の幹細胞を培養するための方法を提供する。有効量で胎盤幹細胞からこのように誘導された血管内皮様細胞を、血管疾患を治療する目的で患者に有効量投与することができる。
【００２２】
もう１つの態様では、本発明は、膵臓細胞分化を誘発するのに十分な期間、適当な条件下で胎盤由来の幹細胞を培養するための方法を提供する。特に好ましい膵臓様細胞は、 付けで米国標準培養収集機関に寄託され というＡＴＣＣ登録番号が割当てられた細胞である。このとき、膵臓病を治療するために有効量の膵臓細胞を患者に投与することができる。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、神経組織の細胞への分化を誘発するのに十分な期間、胎盤由来の幹細胞を培養するための方法を提供している。神経系の疾患又は障害を治療するために患者に対し有効量の神経細胞を投与することができる。
【００２４】
胎盤由来の幹細胞は、肝臓、膵臓、内皮及び神経組織を含むさまざまな組織へと分化できる幹細胞の議論の余地のない供給源を提供する。本発明のその他の特長及び利点は、以下の詳細な説明と請求の範囲から明らかになることだろう。
５．発明の詳細な説明
本発明は、胎盤の羊膜、絨毛膜又は脱落膜層から得ることのできる新規の胎盤由来の幹細胞に関する。細胞例は、米国標準培養収集機関、１０８０１，University Blud. Manassas, Va.２０１１０−２２０９に２００３年 付けで寄託され、 というＡＴＣＣ登録番号が割当てられた。本発明の胎盤由来細胞は、ｃ−ｋｉｔ、Ｔｈｙ−１、ＯＣＴ−４、ＳＯＸ２、ｈＴＥＲＴ、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０及びＴＲＡＩ−８１を内含する（ただしこれらに制限されるわけではない）胚幹細胞と通常結びつけられるマーカーを発現する。
【００２５】
さらに、これらの胎盤由来細胞は、造血、肝臓、膵臓、神経及び内皮組織を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）さまざまな組織型へと分化する能力をもつことが発見されてきた。かかる細胞は、移植療法又は組織工学を介して罹患組織内の機能を回復させ、薬物送達活動における化合物の代謝及び毒性を研究するために特に有用である。
【００２６】
発明の一実施例においては、胎盤由来の幹細胞は、新しい組織又は代謝修復を必要とする患者に対して投与される。胎盤由来幹細胞は、受容体の体内に直接移植することができ、そこで該細胞は増殖し分化してその組織が通常提供する生理学的方法を提供する新しい組織を形成することになる。あるいは、胎盤由来幹細胞は、分化した細胞集団として移植可能である。
【００２７】
発明の胎盤由来幹細胞は、同様に動物の臓器をヒト化するためにも使用できる。実施例１２は、マウスの肝臓内への本発明の幹細胞の移植及び、マウスの肝臓内部のヒト肝細胞への細胞の分化を示すデータを実証している。このメカニズムにより、ヒト胎盤由来幹細胞は、肝臓、膵臓又は脳といったような動物の臓器内に移植され得る。動物の臓器は、移植前にその未変性細胞が涸渇していてもいなくてもよい。ヒトの機能をもつ動物の臓器を再構築するように動物の臓器を再生し再増殖（repopulate）させるための該幹細胞を使用することができると思われる。マウス、ラット、サル、ブタ又はイヌといったような動物の「ヒト化された」臓器が、特定の疾病を患う人々の体内への臓器移植のために有用であり得る。ヒト化された動物モデルは同様に、薬物代謝、毒物学的研究そして産生研究についてはウイルス又は細菌生体の複製及び療法に関する（ただしこれらに制限されるわけでない）診断又は調査目的で使用することもできる。キメラ・ヒト肝臓を形成するヒト肝細胞が移植されたマウスは、すでに、ヒトの肝細胞内でのみ成長する肝炎ウイルスの研究のために使用されつつある（Dandri M et al. ヒト肝細胞でのマウス肝臓の再増殖及びＢ型肝炎ウイルスでのインビボ感染．３３：９８１−９８８，２００１；及びMercer ＤＦ et al. キメラ・ヒト肝臓でのマウス内のＣ型肝炎ウイルスの複製。Nature Med. ７；９２７−９３３，２００１）。
【００２８】
胎盤由来幹細胞又はそこから分化した細胞は、好ましくは、受容患者の体内に細胞及び流体を注射するため例えばカテーテルといった管のような送達装置を介して、患者の体内の標的部位内に注入又は生着させることができる。好ましい実施形態においては、管は付加的に、患者の体内の所望の場所にそれを通して発明の細胞を導入できる例えば注射器のように針を有している。本発明の始原細胞は、異なる形態で例えば注射器などのかかる送達装置内に挿入可能である。例えば、かかる送達装置内に収納された時点で細胞を溶液中に懸濁させるか又は支持マトリクス内に包埋させることができる。本書で使用されている「溶液」という語は、本発明の細胞が生存可能な状態にとどまる医薬として許容される担体又は希釈剤を内含する。医薬として許容される担体及び希釈剤としては、食塩水、緩衝水溶液、溶剤及び／又は分散媒体が含まれる。かかる担体及び希釈剤の使用は、当該技術分野において周知である。溶液は好ましくは無菌であり、容易に注射可能性である程度に流動的である。好ましくは、溶液は製造及び貯蔵条件下で安定しており、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用を通して、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用に対し保護されている。本発明の溶液は、本書に記述されているような始原細胞を医薬として許容される担体又は希釈剤そして必要とあらば以上に列挙したその他の成分を取込みその後フィルタを滅菌することによって調製可能である。
【００２９】
さらに、胎盤由来幹細胞は、移植に先立ち細胞のための支持体を提供する天然又は合成のマトリクスインビトロで付着させることができる。該マトリクスは、それが受容宿主に投与された時点で不利な又はアレルギー反応を生成しない形態であるという点において、生体適合性あることに一般に付随全ての特長を有することになる。例えば肝臓、膵臓又は神経組織の成長及び再生を刺激する能力をもつ成長因子を同様に、マトリクス内に取込むことができる。かかるマトリクスは、天然又は合成の材料の両方から形成され得、長時間にわたる成長因子の持続放出を可能にするように設計可能である。かくして、適当なマトリクスは、両方共成長因子を提供し、かつ又、内部で胎盤由来幹細胞が分化し問題の新しい組織まで増殖することになるｉｎ  ｓｉｔｕの足場としても作用することになる。好ましい実施形態においては、体内に再吸収される能力をもつ生物分解性マトリクスが最も有用である確率が高いであろうと考えられている。
【００３０】
マトリクスに対する胎盤由来幹細胞の接着及び胎盤由来幹細胞の生存及び機能を改善するためには、任意には該マトリクスを、細胞の接着、成長又は存続を助長するべく当該技術分野において既知の因子でその外部表面をコーティングすることもできる。かかる因子には、細胞接着分子、細胞外マトリックス分子又は成長因子が含まれる。
【００３１】
本発明は同様に、インビボの組織対応物と類似の構造を形成するための３次元細胞及び組織培養システム内での胎盤由来幹細胞の使用にも関する。結果として得られた組織は長時間存続し、受容宿主内への移植の後組織特異的機能を果たすことになる。かかる構造を産生するための方法が、本書に全体が内含されている米国特許第５，６２４，８４０号の中で記述されている。
【００３２】
本発明はさらに、肝臓組織対応物と類似の構造を形成するため３次元肝細胞培養システムの生成のためのマトリックス／肝細胞培養の使用にも関する、３次元マトリックス上で培養された細胞は、多重層で成長して、ダクト、プレート及び正弦曲線部域に似たプレート間の空間といったような三次元で発生する臓器型構造を発生させ、かくして新しい肝臓組織を形成することになる。かくして、好ましい態様においては、本発明は、三次元、多層細胞及び組織培養システムを提供する。結果として得られた肝臓組織培養システムは、長時間存続し、灌流装置としての使用又はその後の受容宿主内への移植のための肝臓特異的機能を果たす。
【００３３】
本書に記述されている当該方法及び組成物は、患者を治療するべく治療用タンパク質を産生できるようにするべく遺伝子操作された胎盤由来幹細胞を利用することができる。患者の体内の代謝不全を矯正するために、該治療用タンパク質を使用することができる。本書で使用する「治療用タンパク質」には、成長因子、酵素、ホルモン、サイトカイン、サイトカイン阻害物質、血液凝固因子、ペプチド成長及び分化因子を含む（ただしこれらに制限されるわけでない）機能的に活性な広範囲の生物学的に活性のタンパク質が含まれる。膵臓細胞は消化酵素を再生するために工学処理され得る。酵素阻害物質、Ａ１ＡＴを産生するか又は血友病を治療するための凝固因子を産生するために、肝細胞を工学処理することができる。さらに、化学的伝達物質を産生するように神経細胞を工学処理することができる。
【００３４】
適当な転写／翻訳制御シグナルにリンクされた問題のタンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターを構築するために、当業者にとって周知の方法を使用することができる。例えばSambrook et al., １９９２，分子クローニング、実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 及びAusebel et al., １９８９、分子生物学の現行プロトコル、 Greene Publishing Associates & Wiley Interscience N.Yの中で記述されている技術を参照のこと。
【００３５】
ベクター又はプラスミドを胎盤由来幹細胞内に移入するための適当な方法には、米国特許第５，５７８，４７５；５，６２７，１７５；５，７０５，３０８；５，７４４，３３５；５，９７６，５６７；６，０２０，２０２；及び６，０５１，４２９に記述されたものといったような脂質／ＤＮＡ複合体が含まれる。適当な試薬としては、膜ろ過された水中のポリ−カチオン脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）（化学抄録登録名；Ｎ−［２−（２，５−ビス〔（３−アミノプロピル）アミノ〕−１−オキシペンチル）アミノ）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート）と中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の３：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤であるリポフェクタミンが含まれる。例としては、製剤リポフェクタミン２０００ＴＭ（Gibco／Life Technologies＃１１６６８０１９より入手可）がある。その他の試薬には、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６トランスフェクション試薬（Roche Diagnostics Corp.＃１８１４４４３から入手可能な８０％エタノール中の非リポソーム形態の脂質とその他の化合物のブレンド）；及びLipoＴＡＸＩＴＭトランスフェクション試薬（Invitrogen Corpからの脂質製剤が所望の生物学的に活性のタンパク質を産生する。＃２０４１１０）。胎盤由来幹細胞のトランスフェクションは、例えばＭ.Ｌ. Roach及びＪ.Ｄ.McNeish（２００２）Methods in Mol.Biol. １８５：１内で記述されているように、電気穿孔によって実施可能である。安定した遺伝子改変を伴う幹細胞を産生するための適当なウイルスベクターシステムは、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス及びその他のウイルスに基づくものであってよく、又、市販のウイルス成分を用いて調製できる。
【００３６】
本発明の組成物は同様に、新しい組織を必要とする受容宿主内への投与のため医薬として許容される担体内に、胎盤由来幹細胞又は分化誘発された胎盤由来幹細胞を内含する。かくして本発明に従って患者に対し投与するための細胞組成物は、薬学的に使用できる調製物への化合物の処理を容易にする賦形剤及び助剤を含む単数又は複数の生理学的に受容可能な担体を用いて任意の従来の要領で処方することができる。適当な処方は、選択された投与経路によって左右される。医薬用処方における一般原則については、読者諸氏には、G.Morstyn & W.Sheridan編による「細胞療法：幹細胞移植、遺伝子療法及び細胞免疫療法」、Cambridge University Press, １９９６；及び「造血幹細胞療法」E.D.Ball, J.Lister & P. Law, churchill Livingstone, ２０００を参照されたい。組成物は、組織再生及び治療上重要な代謝機能の回復における細胞の使用のための説明書と共に包装され得る。胎盤由来幹細胞は同様に、単数又は複数の生理学的に受容可能な担体中に入った形で受容体に投与することもできる。これらの細胞のための担体としては、生理学的濃度で塩の混合物を含む乳酸加リンゲル溶液又はリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）が含まれ得るが、これらに制限されるわけではない。
【００３７】
５．１．胎盤由来幹細胞の成長と培養
本発明は、胎盤の羊膜、絨毛膜又は脱落膜層から得ることのできる新規の胎盤由来幹細胞を提供する。本発明の特定の１実施形態においては、胎盤由来幹細胞は羊膜及び付随する間葉から単離される（図１及び２）。これは、当業者にとって既知の技術を用いて容易に達成可能である。例えば、羊膜細胞は羊水から吸引することができる。あるいは、絨毛膜及びその他の胎盤組織を含まずに羊膜組織を切開することもできる。羊膜層は、鉗子及び無菌メスを用いて下にある絨毛膜層から穏やかに剥ぎ取ることができる。羊膜層を機械的に離解させかつ／又は隣接する細胞間の連結を弱化させるキレート化剤及び／又は消化酵素で処理して個々の細胞の組織懸濁を分散させることを可能にすることができる。本発明のさらにもう１つの実施形態においては、胎盤の絨毛膜又は脱落膜を本発明のための胎盤幹細胞の供給源として使用することもできる。
【００３８】
一定数の消化酵素のうちの任意のもので羊膜層を処理することによって、酵素解離を実施することができる。かかる酵素には、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ及び／又はヒラウロニダーゼが含まれるがこれらに制限されるわけではない。本発明の好ましい実施形態においては、単離された羊膜組織は、個々の細胞を解離させるためトリプシン処理される。より好ましい実施形態においては、組織のインキュベーションのためのトリプシン濃度は０．０５％である。本発明の１実施形態においては、組織は、好ましくは１０〜４０分の間、最も好ましくは３０分間という変動する期間、酵素での消化に付される。組織を酵素での多数の処理に付すこともできる。組織離解技術の再考は、例えば「動物細胞の培養、基本技術の手引き」、第２版、Ａ.Ｒ.Ｌiss, Inc, New York, １９８７，第９章 ｐ１０７〜１２６の中で提供されている。
【００３９】
単細胞懸濁液の調製に続いて、血清、ホルモン、成長因子、サイトカイン抗生物質、微量元素及びその他の添加物が補足された基本培地を含有する培地の中で、細胞を培養することができる。成長因子及びサイトカインには、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）又はオンコスタチンＭが含まれる可能性がある。培地に対する添加物には、インシュリン、トランスフェリン、セレン（ＩＴＳ）、グルコース、インターロイキン６及びブチル酸ナトリウム又はトリコスタチンＡといったヒストンデアセチラーゼ阻害物質が含まれる可能性がある。
【００４０】
本発明の特定の実施形態においては、胎盤由来細胞は、ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ＥＧＦ（１０ng／ml）、インシュリン（１０μｇ／ml）、トランスフェリン（５．５μｇ／ml）、セレン（６．７ng／ml）及びエタノールアミン（２μｇ／ml）を伴う皿の上に平板固定される。さらに、ピルビン酸ナトリウム及び可欠アミノ酸（１％）を培地に添加することができる。当業者であれば、幹細胞の成長を支持するために培地に対する置換又は添加物として単数又は複数の市販の物質を使用できるということも認識することであろう。ジメチル化又は脱分化を誘発するためには、５−アザシチジン及び／又はＢＭＰ阻害物質を培地に添加することもできる。細胞は低温保存され得、解凍時点で機能及び生存度を保持することができる。
【００４１】
細胞を組織培養皿上で平板固定させるか又はフラスコ内で細胞懸濁液中で成長させ、回転楕円面の細胞体を形成させることができる。組織培養皿上で成長させられた時点で、表面を静電気で又は細胞外マトリックス成分でコーティングすることができる。接触阻害を回避し増殖成長条件を維持するべく皿の上で集密性に達する前に細胞を継代培養させることができる。
【００４２】
さらに、細胞を胎盤の間質細胞との培養又は異なる臓器及び組織から誘導された始原細胞又は分化細胞との同時培養により成長させることが可能である。
【００４３】
さらに、細胞をフィーダ層上で成長させることもできる。本発明の細胞を培養するにあたっては、フィーダ細胞又はフィーダ細胞から誘導された細胞外マトリックスの使用により、幹細胞の成長を促し、かつ／又はかかる細胞の分化速度を阻害するのに必要な単数又は複数の物質が提供されると考えられている。かかる物質には、細胞により周囲の培地中に分泌される膜結合及び／又は可溶性細胞産物が含まれると考えられる。例えば、胎盤由来幹細胞を、マウス胚繊維芽細胞、ＳＴＯ細胞、ヒト繊維芽細胞又はヒト上皮細胞から成る群の中から選択された基質上で成長させることができる。かくして、当業者であれば、同等の効果に至るまで細胞培地と共に付加的な細胞系統を使用することができ、かかる付加的な細胞系統を標準的な方法及び材料を用いて同定できるということを認識するだろう。さらに、当業者であれば、フィーダ細胞によって産生された又は細胞外マトリックス内に含まれた単数又は複数の物質を同定し本発明の細胞培地に添加してかかるフィーダ細胞及び／又はかかる細胞外マトリックスに対するニーズを無くすることができる、ということも認識するだろう。
【００４４】
さらに、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、Ｔhy−１及びｃ−ｋｉｔといったような細胞表面マーカーを用いて、さまざまな方法により細胞の高められた集団を精製することができる。かかる手順には、抗−ＳＳＥＡ１、抗−ＳＳＥＡ３、抗−ＳＳＥＡ４、抗−ＴＲＡ１−６０、抗−ＴＲＡ１−８１、抗−Ｔｈｙ−1、又は抗ｃ−ｋｉｔ抗体を含むカラム全体にわたる標本細胞の通過又は磁気ビーズ接合された抗−ＳＳＥＡ１、抗−ＳＳＥＡ３、抗−ＳＳＥＡ４、抗−ＴＲＡ１−６０、抗−ＴＲＡ１−８１、抗−Ｔｈｙ−1、又は抗ｃ−ｋｉｔに対する細胞の結合又は抗−ＳＳＥＡ１、抗−ＳＳＥＡ３、抗−ＳＳＥＡ４、抗−ＴＲＡ１−６０、抗−ＴＲＡ１−８１、抗−Ｔｈｙ−1、又は抗ｃ−ｋｉｔ抗体でコーティングされた平板をパンし結合済みの細胞を収集することによるものといった正の選択が関与している。あるいは、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、Ｔｈｙ−1、又はｃ−ｋｉｔ細胞表面抗原に免疫特異的に結合する標識づけされた抗体に対して単細胞懸濁液を露呈することができる。ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、Ｔｈｙ−1、又はｃ−ｋｉｔ抗体とのインキュベーションの後、細胞を緩衝液内で洗い流して、未結合抗体をことごとく除去する。ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、Ｔｈｙ−1、又はｃ−ｋｉｔ細胞表面抗原を発現する細胞は次に、例えばBecton Dickinson ＦＡＣＳ  ｔａｒフローサイトメータなどを用いて、螢光活性化された細胞選別により細胞選別することができる。
【００４５】
一部の実施形態においては、一例として組織特異的な調節領域の制御下にあるマーカーを胎盤由来幹細胞に安定した形でトランスフェクションすることができ、そのため分化の間にマーカーは特異的細胞中で選択的に発現され、かくしてマーカーを発現しない細胞との関係において特異的な細胞の選択が可能となるようになっている。マーカーは例えば、細胞表面タンパク質又はその他の検出可能マーカー、又は抗生物質耐性遺伝子といったようにそのマーカーが無ければ細胞が死滅する条件に対する耐性を該細胞に付与することのできるマーカーであり得る。これらの方法はさらに、例えば米国特許第６，０１５，６７１号中で記述されている。
【００４６】
受容宿主内への移植に先立ち、胎盤由来幹細胞を細胞の増殖、分化及び遺伝子発現に影響を及ぼし得る一定数の異なる成長因子と接触させることができる。かかる成長因子には、例えば表皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、肝細胞成長因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）又は繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）といった（ただしこれらに制限されるわけでない）幹細胞の増殖及び／又は分化を刺激する能力をもつものが含まれる。
【００４７】
５．２．分化された肝細胞及びその使用方法
肝細胞を製造するために胎盤由来幹細胞を培養することができる。本書中で使用される「肝細胞」という語は、肝臓から得られた上皮細胞の特徴をもつ細胞、例えば、アシアログリコプロテインレセプタ（ＡＳＧＲ）、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、アルブミン、肝細胞核因子（ＨＮＦ１及びＨＮＦ４）及びＣＹＰ遺伝子（１Ａ１，１Ａ２，２Ｃ８，２Ｃ９，２Ｄ６，３Ａ４）を発現する細胞を意味する。ＣＹのためのその他の有利なマーカーとしては、α１−アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、トランスフェリン、ＣＫ７、γ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＨＮＦ１β、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ−４α、トランスサイレチン、ＣＦＴＲ、アポＥ、グルコキナーゼ、インシュリン成長因子（ＩＧＦ）１及び２、ＩＧＦ−１レセプタ、インシュリンレセプタ、レプチン、アポＡＩＩ、アポＢ、アポＣＩＩＩ、アポＣＩＩ、アルドラーゼＢ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、Ｌ型脂肪酸結合タンパク質、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）及び凝固因子、例えば第Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＶＸ及びＸ因子がある。
【００４８】
肝細胞は同様に、機能検定によって立証されるように、以下の生物学的活性をも表示する可能性がある。すなわち該細胞は、ジベンジルフルオレセイン（ＤＢＦに対する正の応答を有し、例えばデキストロメトルファン及びクマリンといった或る種の薬物を代謝する能力を有し；薬物流出ポンプ活性（例えばＰ糖タンパク質活性）を有し；例えば肝細胞のみに見られその他の細胞には見られない、例えばペントキシレゾルフィン（ＰＲＯＤ）検定などによって測定される通りのフェノバルビタールによるＣＹＰ活性のアップレギュレーションを示し（例えばSchwartz et al.,（２００２）J.Clin. Invest.１０９；１２９１参照）；ＬＤＬ、例えばDil−acil−ＬＤＬを取り上げ（例えばSchwartz et al., 前出を参照）；細胞の過ヨウ酸−シッフ（パス）染色などによって決定されるようにグリコーゲンを貯蔵し（例えば前出Schwartz et al.,を参照）；尿素及びアルブミンを産生し（例えば前出Schwartz et al.,を参照）、グルコース−６−ホスファターゼ活性の徴候を呈する可能性がある。
【００４９】
本発明の特定の実施形態においては、単離された胎盤由来幹細胞は、肝細胞へと分化を促進するため、最適な分化培地中で培養される。かかる細胞分化を促進するため、さまざまな成長因子又は因子の組合せで補足された培地を使用することができる。肝細胞への胎盤由来幹細胞の分化を促進するためには、ＥＧＦ（０．１〜１００ng／ml）、デキサメタゾン（０．１〜１００μＭ）、ＨＧＦ（０．１〜１００ng／ml）、ＩＴＳ（インシュリン）（０．１〜１００μg／ml）、トランスフェリン（０．１〜１００μｇ／ml）、セレン（０．１〜１００ng／ml）、エタノールアミン（０．１〜１００μｇ／ml）といった成長因子のうちの単数又は複数のもので補足された基本培地の中で細胞を培養することができる。好ましくは、肝細胞への最適な分化の能力のある胎盤由来幹細胞を得るためには、１０ng／mlのＥＧＦ、１μＭのデキサメタゾン、１０μg／mlのインシュリン、５．５μg／mlのトランスフェリン、６．７ng／mlのセレン及び２μg／mlのエタノールアミンの中で細胞を培養する。
【００５０】
付加的な実施形態においては、本発明は、肝細胞様の細胞の高められた集団を提供している。細胞集団例には、少なくとも約５０％；好ましくは少なくとも約６０％；７０％；８０％；９０％；９５％；９８％及び最も好ましくは９９％の肝細胞が含まれる。肝細胞は、細胞表面マーカーのためのフロー免疫細胞化学、細胞内又は細胞表面マーカーのための免疫組織化学（例えば固定した細胞又は組織切片の）、細胞抽出物のためのウエスタンブロット分析及び培地中に分泌された産物又は細胞抽出物のための酵素結合免疫検定といったような免疫学的技術による組織特異的マーカーの検出によって高められ得る。組織特異的遺伝子産物の発現は、標準的増幅方法における配列特異的プライマを用いた逆転写酵素により開始されるポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、又はノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析によって、ｍＲＮＡレベルでも検出可能である。
【００５１】
肝細胞に分化された胎盤由来幹細胞は、人工肝臓装置（ＢＡＬ−バイオ人工肝臓）内又は肝細胞移植片用といったような肝臓病の治療において投与され得る。本書で使用する「肝臓病」という語は、肝硬変、肝臓の代謝性疾患、例えばα１−アンチトリプシン欠乏症及びオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、アルコール誘発性肝炎、慢性肝炎、原発性硬化性胆管炎、α１−アンチトリプシン欠乏症及び肝ガンを含むが、これらに制限されるわけではない。
【００５２】
本発明の幹細胞は、その意図された目的を達成するため有効量で受容体に投与される。より特定的には、有効量というのは、新しい組織の発達及び組織機能の回復を導き、かくして遺伝子欠損又は組織損傷の結果としての障害に付随する症候を軽減するのに十分な量を意味する。
【００５３】
本発明の目的を達成するために必要とされる細胞の数は、組織損傷度及び宿主のサイズ、年令及び体重に応じて変動することになる。有効量の決定は、当業者の能力の範囲内に十分入る。有効量は、組織機能の回復を検出するように設計されたさまざまな異なる検定を使用して決定可能である。より特定的に言うと、特異的代謝経路の活性を検出するために検定を使用することができる。移植片受容体の経過は、肝臓機能検査として知られている血液検出を含む検定を用いて決定することができる。かかる肝臓機能検査には、肝臓由来凝固因子のアルカリホスフェート、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ及びピルビン循環レベルについての検定及び凝固時間の決定が含まれる。さらに、受容体は、例えば黄疸、貧血、白血球減少、血小板減少、心拍数増加及び高インシュリンレベルといったような通常肝臓病に付随する特長の存在又は消失についても検査される可能性がある。さらに、特定の代謝性障害における欠乏症を測定するのに特異的な検定も使用することができる。さらに、超音波、コンピュータ断層法（ＣＡＴ）及び磁気共鳴（ＭＲ）を使用して肝臓機能について検定することもできる。
【００５４】
さらに、細胞培養は、インビトロ培養中の肝臓細胞成長に対する支持を提供する天然又は合成マトリクスの存在下で、増殖させられる。本発明の実践において使用可能なマトリクスのタイプは、事実上無限である。マトリックスは、それが受容宿主に投与された時点で不利な又はアレルギー反応を生成しない形態にあるという点で、「生体適合性」あることに一般に付随する全ての特長を有することになる。バイオ人工肝臓を形成する目的で、マトリックスは、肝細胞及び非実質細胞が付着し増殖することになる適当なあらゆる材料で構成されていてよい。
【００５５】
さらに、肝細胞の接着、増殖又は存続を改善するためには、マトリクスはその外部表面に、細胞の接着、成長又は存続を促進するものとして当該技術分野において既知の因子でコーティングを受けることができる。かかる因子には、細胞接着分子、細胞外マトリクス分子及び／又は肝細胞のための成長因子が含まれる。マトリクスは、長時間にわたる成長因子の持続放出を可能にするように設計可能である。かくして、適当なマトリクスは理想的には、肝細胞の接着、成長又は存続を促進すると同時に培養された細胞がその上で分化し増殖する支持体としても作用するものとして知られている因子を提供することになる。
【００５６】
長期マトリクス−細胞培養の条件は、好ましくは、肝機能を維持しながら肝細胞の増殖を増強するべく最大限にされる。細胞数、播種技術、培地、インキュベーション温度及びインキュベーション時間の或る種の変動を利用することもできるが、かかる変動は、当業者にとっては日常的なことであり、本発明により包含されている。
【００５７】
本発明はさらに、肝臓組織の対応物と類似した構造を形成するための３次元肝細胞培養システムの生成を目的とするマトリクス／肝細胞培養の使用にも関する。本発明の方法は、３次元構造を形成するべく細胞の増殖を可能にするのに有効な条件下で、又そのために十分な時間中、インビトロで３次元マトリクス上において肝細胞を成長させることを含んでいる。
【００５８】
使用すべき３次元マトリクスは、組織形成方法を導くため、細胞用足場を提供する構造的マトリックスである。３次元マトリックス上で培養された細胞は、正弦部域に似たプレート間の空間、プレート、ダクトといったような３次元内で起こる臓器型構造を発達させ、かくして新しい肝臓組織を形成するように、多重層で成長することになる。かくして、好ましい態様では、本発明は、３次元、多重層細胞及び組織培養システムを提供する。
【００５９】
バイオ人工肝臓を形成するためには、本発明の３次元肝細胞細胞培養は、その内部での患者の血液の通過のための入力及び出力口を含む格納容器の中で成長させられる。バイオ人工肝臓はさらに、従来のぜん動ポンプに作動的に連結された血液入力ラインをも内含している。血液出力ラインも同じく内含されている。入力及び出力ラインは、例えば患者の前腕内に生着させられる適当な動静脈瘻に接続される。さらに、格納容器は、その内部での連続的細胞培養のための肝細胞への適当な成長培地の循環用の入力及び出力口を含んでいてよい。
【００６０】
このようなバイオ人工肝臓の使用には、バイオ人工肝臓を通しての患者の血漿の灌流が関与する。灌流プロトコルにおいては、患者の血液又は血漿は引き出され、肝細胞細胞培養と接触するべく移行する。かかる通過の間、ビリルビンといったような患者の血液中に溶解した分子は取り上げられ肝細胞培養により代謝させられる。さらに、培養された肝細胞は、通常肝臓組織により供給される因子を提供する。
【００６１】
本発明の肝細胞は、それが意図された組織に移植され機能的に欠損した部域を再構築又は再生することができるようにするような形で、投与され得る。直接的投与によって、又は患者の肝臓組織が激症肝不全の後に自己再生している間一時的な肝臓機能を提供する生体補助装置の一部として、療法内で肝細胞を使用することができる。
【００６２】
本発明の肝細胞は、肝臓の損傷を修復する能力について動物モデルにおいて評価可能である。かかる例の１つは、Ｄ−ガラクトースアミンの腹腔内注射によってひき起こされる損傷である（Dabeva et al., Am.J.Pathol.１４３；１６０６，１９９３）。治療の効果は、肝細胞マーカーのための免疫細胞化学染色、成長する細胞の中に細管状構造が形成するか否かの顕微鏡による決定、及び肝臓特異的タンパク質の合成を回復させるその治療の能力によって決定可能である。
【００６３】
もう１つの実施形態においては、分化した肝細胞は、先導薬物化合物といったような検査薬が肝細胞に対し負の生物学的効果を有するか否かをテストするために使用することができる。例えば、肝細胞細胞調製物は、化合物が細胞に対し細胞毒性をもち得るか否かを見極めるのに十分な時間、テスト化合物の存在又は不在下でインキュベートされる。さまざまな濃度のテスト化合物で細胞をインキュベートすることができる。１実施例においては、細胞は、例えば０μＭ；０．０１μＭ；０．１μＭ；１μＭ；１０μＭ；１００μＭ；１ｍＭ；１０ｍＭ及び１００ｍＭといった異なる濃度のテスト化合物が添加されるマルチウエル平板のウエル内に平板固定される。細胞は、例えば１分、１０分、１時間、２時間、５時間、１０時間、２４時間、３６時間以上といったさまざまな時間インキュベート可能である。
【００６４】
測定される生物学的効果は、細胞死（すなわち細胞毒性又は肝細胞毒性）の誘発；細胞静止作用；又は例えば細胞の遺伝子型又は表現型に対する効果によって決定されるような細胞に対する形質転換効果であり得る。細胞に対する細胞毒性は、例えば、トリパンブルーといったような生体染色液と共に細胞をインキュベートすることによって決定され得る。かかるスクリーニング検定は、高処理量検定に容易に適合させることができる。
【００６５】
本発明の分化した胎盤由来幹細胞から誘導される肝細胞は同様に、メタボリック・プロファイリングのために使用することもできる。１実施形態においては、細胞又はその画分、例えばミクロソーム画分は、潜在的に異なる濃度で、異なる時間中、検査薬と接触させられ、培地は収集され、検査薬の代謝された形態を検出するために分析される。任意には、ブフラロールといったような対照分子も同じく使用される。例えば、患者が特定の薬物を代謝するか否か、そしてもしするならばその薬物がいかに代謝されるかを見極めるために、メタボリック・プロファイリングを使用することができる。
【００６６】
５．３．分化された膵臓細胞及びその使用方法
本発明の特定の実施形態においては、本発明は同様に、膵臓様細胞へと胎盤由来幹細胞を分化する方法をも提供している。本書で使用されているように、「膵臓様細胞」という語は、４つのタイプの細胞から成る。α細胞は、膵島内に見られる細胞の約２０％を構成し、ホルモングルカゴンを産生する。グルカゴンは、摂食間の間隔においてエネルギーの利用を可能にするべく複数の組織に作用する。肝臓では、グルカゴンは、グリコーゲンの崩壊をひき起こし、アミノ酸前駆物体からのグルコース新生を促進する。δ細胞は、グルカゴン放出を阻害し膵臓外分泌を減少させるように作用するソマトスタチンを産生する。ホルモン膵臓ポリペプチド（ＰＰ）は、ＰＰ細胞内で産生される。このホルモンは、重炭酸塩及び酵素の膵臓外分泌を阻害し、胆のうの弛緩をひき起こし、胆汁の分泌を減少させる。細胞の６０〜８０％を構成する、膵島内で最も豊富な細胞は、インシュリンを産生するβ細胞である。インシュリンは、摂食中及びその直後に発生する余剰の栄養素の貯蔵をひき起こすものとして知られている。インシュリンの主要な標的臓器は、肝臓、筋肉及びエネルギー貯蔵専用の脂肪臓器である。分化した膵島細胞は、Ｎｋｘ−２，２、グルカゴン、Ｐａｘ６、Ｐｄｘ１、及びインシュリンといったようなマーカーについて陽性でありうる。
【００６７】
発明の一実施形態においては、膵臓細胞分化を促進するため最適な分化培地中で、単離された胎盤細胞を培養することができる。細胞を約７日間標準成長培地中に維持し、その後トリプシン処理及びMatrigelTM（ＭＧ）でコーティングされた培養基質上への播種を行なうことができる。培養基質は、２０％〜１００％（培地に対するＭＧの体積／体積％）のＭＧでコーティングを受けることができる。細胞は、予めＭＧでコーティングされた平板内に播種され、デキサメタゾン（０．１μｍ）及びＩＴＳで補足された標準培地中でさらに１４日間培養される。
【００６８】
本発明は同様に、膵臓の機能不良に関連するさまざまな疾病の治療のために療法上用いることのできる胎盤由来幹細胞から誘導された膵臓細胞をも提供している。本書で使用される「膵臓病」という語は、膵臓ガン、インシュリン依存性（１型）糖尿病（ＩＤＤＭ）及び非インシュリン依存性（２型）糖尿病（ＮＩＤＤＭ）といったようなインシュリン欠乏性障害、Ｃ型肝炎感染症、外分泌及び内分泌膵臓病を内含しうるがこれらに制限されるわけではない。
【００６９】
実施例１４は、膵島細胞マーカー特にインシュリンを発現する培養された胎盤由来幹細胞の結果を示している。これらの培養細胞内のインシュリンの発現は、それらが療法上使用される潜在性を有するということを表わす。これらの細胞は、糖尿病の治療に向けての使用のためにインシュリンを分泌するか又は分泌するよう誘発され得る。
【００７０】
胎盤由来幹細胞は、例えば膵臓の一部分の切除といった部分的膵切除術後の修復のために、分化した膵臓細胞の集団を産生するのに使用することができる。同様にして、かかる細胞集団は、例えば物質内への酵素の逸脱によってひき起こされる膵臓組織の自己溶解に起因する条件などの膵炎といった膵臓組織の破壊などの膵組織崩壊に起因する膵臓組織損失を再生又は交換するために使用することができる。膵臓細胞は、膵臓内又は肝臓、肝臓又は腸付近といった（ただしこれらに制限されるわけでない）異所性部位に移植することができる。
【００７１】
投与方法には、生着可能な中空繊維内でインシュリンを産生する分化したβ膵島細胞を封入することが含まれる。かかる繊維は、予備紡績されるか又はその後本発明の分化したβ膵島細胞での充てんを受けている（Aebischer et al. 米国特許第４，８９２，５３８号、Aebischer et al. 米国特許第５，１０６，６２７号、Hoffman et al.（１９９０）Expt. Neurobiol.１１０：３９−４４；Jaeger et al.（１９９０）Prog. Brain Res. ８２：４１−４６；及びAebischer et al.（１９９１）J.Biomech. Eng.１１３：１７８−１８３）か又はβ膵島細胞のまわりで重合体コートを形成するように作用する重合体と同時押出し成形されている（Lim 米国特許第４，３９１，９０９号；Sefton 米国特許第 ３５３，８８８号；Sugamori et al.（１９８９）Trans. Am. Artif. Intern. Organs ３５：７９１−７９９；Sefton et al.（１９８７）Biotehnol. Bioeng.２９：１１３５−１１４３；及びAebischer et al.（１９９１）Biomaterials１２：５０−５５）可能性がある。
【００７２】
５．４．神経組織の分化された細胞及びその使用
本発明の１つの実施例においては、神経組織細胞への分化を促進するため最適な分化培地の中で、単離された胎盤由来幹細胞が培養される。本書で使用する「神経組織」という語には、ニューロン、グリア細胞、乏突起膠細胞及び星状細胞を含む中枢及び末梢神経組織からの細胞が内含され得るが、これらに制限されるわけではない。かかる細胞は、ＧＦＡＰ、β−チュブリン、ＣＮＰ又はＦＬＴ１といったようなマーカーの存在によって特徴づけされ得る。
【００７３】
本発明は同様に、さまざまな神経病の治療のための、胎盤由来幹細胞から誘導された神経組織細胞の投与をも提供している。「神経病」という語は、体内の神経組織統合系全体すなわち脳、脳幹、脊髄、神経及び神経節の中の何らかの欠陥に付随する疾病又は身体条件を意味する。例としては、パーキンソン病、ハンチントン病、舞踏病性症候群、失調症性症候群、及び麻痺が含まれているがこれらに制限されるわけではない。
【００７４】
細胞は、ＥＧF（０．１−１００ng／ml）、デキサメタゾン（０．１−１００μＭ）、ＨＧＦ（０．１−１００ng／ml）、ＩＴＳ（インシュリン（０．１−１００μg／ml）、トランスフェリン（０．１−１００μg／ml）、セレン（０．１−１００ng／ml）、エタノールアミン（０．１−１００μg／ml）といった成長因子のうちの単数又は複数のもの、特に好ましくは１０ng／mlの範囲内のＦＧＦ−４で補足された基本培地の中で培養され得る。
【００７５】
５．５．分化された血管内皮細胞及びその使用方法
一部の実施形態においては、本発明は、血管内皮細胞の製造を含む（ただしこれらに制限されるわけでない）胎盤由来幹細胞の培養方法に関する。もう１つの実施形態においては、本発明は、血管内皮細胞の分化を誘発するのに適した条件下でそのために十分な期間胎盤由来幹細胞がマトリゲル含有培地中で培養される方法を提供している。本書で使用される「血管内皮細胞」という語は、血管の内部をライニングし、血管反応性の変調及び血漿流体及びタンパク質に対する半透性障壁の提供を含む必須生理学機能をもつ内皮細胞を意味する。血管内皮細胞は以下のように特徴づけすることができる。これらは、図２０に示されている細胞の表現型に類似する表現型を有することができる。１つの実施形態例においては、血管疾患を患う患者を治療するために、有効量で胎盤幹細胞から誘導された血管内皮細胞を含む医薬組成物を使用することができる。本書で使用される「血管疾患」というのは、ヒトの血管系の疾患を意味する。その例としては、末梢動脈疾患、腹部大動脈瘤、頸動脈疾患、静脈疾患がある。
【００７６】
５．６．胎盤由来細胞の低温保存
胎盤幹細胞は、識別できる機能損失が全くない状態で、低温保存し解凍することができる。胎盤由来細胞は、記述された通りに羊膜から単離され７〜１０日間又は培養が集密性に至るまで成長してしまうまで、基本培地中で培養した。細胞をトリプシン処理し、１回洗浄してトリプシンを除去し計数した。ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）（１０％ｖ/ｖ）で補足された基本培地（９０％）内で単離した細胞を懸濁させることにより、胎盤幹細胞低温保存した。−８０℃の冷凍庫に入れた場合に細胞を一分あたり約１℃の速度で細胞を冷却する細胞冷凍庫コンテナの中に置くことによって、細胞を低温保存した。細胞を必要となるまで−８０℃で貯蔵した。予め３７℃に暖めた水浴にバイアルを入れることで、細胞を急速に解凍した。完全に解凍した時点で、細胞をクライオバイアルから傾瀉させ、予め暖めた（３７℃）少なくとも３体積の基本培地に添加した。５分間１００ｘｇで細胞を遠心分離した。細胞を基本培地中で再懸濁させ、計数し生存度についてチェックし、標準サイズの培養皿上で平板固定した。解凍した細胞の生存度は、胎盤由来細胞の異なるバッチの凍結において７０〜９５％の範囲内であった。これは、数多くの細胞培養者が使用している標準的な低温保存技術である。グリセロールを５〜４０％の範囲内の濃度でＤＭＳＯの代りに使用することができ、ＤＭＳＯは、５〜３５％の範囲内の濃度で使用でき、ここで使用されている基本培地の代わりに異なる培地を使用することができる。異なる培地には、ＨＢＳＳといったような平衡塩類溶液、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｆ１２といったようなあらゆる完全組織培地が含まれ得るが、これらに制限されるわけではない。低温保存溶液は、BelzerのＵＷ溶液又はＨＫＴ又は／及びその等価物といったような移植からの臓器の低温貯蔵及び輸送のために用いられる溶液から成る。一分あたり約１度という低温保存速度は、標準速度であるが、プログラマブル細胞冷凍庫の使用を通して許容可能な異なる速度を使用することによって、低温保存の結果を改善することが可能である。低温保存から回収された細胞は、平板固定された培養に付着し、予め冷凍されていない細胞と識別可能なほどには異ならない速度で成長する。
【実施例】
【００７７】
６．実施例：胎盤組織は、全能性幹細胞のマーカーを伴う細胞を含有する
６．１．材料と方法
６．１．１．胎盤の異なる切片からの胎盤由来細胞の単離
胎盤由来細胞の集団は、胎盤のさまざまな切片から単離される。胎盤由来細胞が、胎盤本体から容易に剥離される羊膜から単離され（図１）、これは、羊膜上皮細胞及び支持間質層を含有する（図２）。間質層は間葉細胞又は繊維芽細胞ならびにその他の細胞型を含有する。羊膜は胎盤から剥ぎ取られ、トリプシン処理されて羊膜上皮細胞を放出した。トリプシン処理の後に残っている組織から誘導された細胞を、羊膜繊維芽細胞（ＡＭＦ）と標識付けする。研究のこの時点で、この画分は、組織化学的に定義づけされた細胞型によってではなくむしろ細胞が誘導された組織及び細胞を放出するメカニズムによってより作動的に定義づけされる。この間質層内の正確な細胞型は十分に特徴づけ及び定義づけされていないが、言い回しを単純にするためそしてこの出願の目的では、それらを羊膜繊維芽細胞（ＡＭＦ）と呼ぶことにする。ただしここでＡＭＦ画分と我々が呼んでいるものの中には繊維芽細胞以外の細胞型が含まれる確率がきわめて高いということを十分に了解すべきである。
【００７８】
羊膜は胎盤から剥離されトリプシン処理されて羊膜上皮細胞を放出した。トリプシン処理の後に残っている組織から誘導された細胞は、羊膜繊維芽細胞（ＡＭＦ）と標識づけされている。羊膜層を剥離し、残った羊膜をコラゲナーゼで消化した。残りの組織から誘導された細胞はＲＭと標識づけした。各画分の細胞（ＡＥ、ＡＭＦ、ＲＭ）を、プラスチックの培養皿の上で基本平板固定培地中で平板固定した。平板固定から２０時間後に、培養を検査した。一部の細胞は培養皿に付着し、接着性画分と呼ばれた（図３）。プラスチックに接着しなかった残りの細胞を収集し、これは、図３に非接着性（ＮＡ）として表わされている。或る種の組織内の幹細胞は非接着性画分の中に常在すると思われることから、幹細胞マーカーを伴う細胞が胎盤からのこれらの画分の各々の中に見い出され得るということは有意なことである。各画分からの幹細胞特性をもつ細胞が同一であるか否かはわかっていない。胎盤画分の各々からの接着細胞及び非接着細胞から全ＰＣＲＮＡを収集した。
【００７９】
ＲＮＡＡＷＩＺ（Ambion）で全ＲＮＡを抽出した。２つの分離されたエキソンにまたがるように設計されたヒト・アルブミン特異的プライマを用いてSuper Script７ステップＲＴ−ＰＣＲシステム（ＧＩＢＣＯ、１０９２８−０１８）でＲＴ−ＰＣＲを実施した。内部対照として、β−アクチン特異的プライマを用いたＲＴ−ＲＣＲも実施した。
【００８０】
６．１．２．ＦＡＣＳ分析
異なる抗原に対する抗体を、単離した胎盤由来細胞と共にインキュベートし、フローサイトメトリ分析装置、Beckman-Coulter Epics ＸＬサイトメータ上で、結果としての細胞懸濁液を分析した。付加的な細胞を、これらの研究において使用された最高の抗体濃度と同じインキュベーション中の濃度でマウスＩｇＧと共にインキュベートすることによってバックグラウンド螢光について分析した。
【００８１】
６．２．結果
胎盤由来細胞がＯｃｔ−４、ＧＦＡＰ及びＦＬＴ１を発現する細胞の小集団を含有するという考察により、胎盤幹細胞が複数の系列に沿って分化する能力を有し多能性であるということが示唆された。これらの結果は、胎盤内にＥＳ様の細胞が存在するということを示唆している。これらの細胞は、身体の細胞型及び組織の全てを発生させることができると思われる。その成長及び分化の異なる時期にあるＥＳ細胞は、発生期特異的胚抗原と呼ばれるものを発現する。これらのタンパク質に対する抗体は、発生期特異的胚抗原（ＳＳＥＡ１−４）と呼ばれる少なくとも２つの異なる抗原及びＴＲＡ１−６０及びＴＲＡ１−８１と呼ばれる付加的な抗原を識別する。これらの抗原は、ＥＳ幹細胞の上に一般に見られる。胎盤由来細胞を、ＦＡＣＳ分析によりＳＳＥＡ１−４及びＴＲＡ抗原の発現について検査した。
【００８２】
胎盤由来細胞内のＯｃｔ−４、ＳＯＸ２及びｈＴＥＲＴの発現は同様に、ＲＴ−ＲＣＲ分析によっても検査された。神経幹細胞は、ＳＯＸ２を発現することから、胎盤由来細胞は、ＳＯＸ２発現についても評価された。完全な結果は表１に列挙されている。表１内のデータは、実施された２つの実験についての結果を提示している。
【００８３】
【表１】
2005523328.tif 000002
【００８４】
図４は、ＡＥ由来細胞内のＳＳＥＡ−３及び４の発現のＦＡＣＳ分析を示す。表１に表わされているように、ＡＥ由来細胞は同様にＯｃｔ−４及びＳＯＸ２をも発現する。これらの結果は、ＡＥ由来細胞がＳＳＥＡ１、３、及び４及びＴＲＡ１−６０そしてＴＲＡ１−８１を発現することを表わしている。
【００８５】
さらに、表１に示されているようにＲＴ−ＰＣＲによりＯｃｔ−４、ＳＯＸ２及びｈＴＥＲＴの発現について、胎盤のさまざまな部分から誘導された胎盤由来細胞を分析した。ＥＳ細胞といったような全能性幹細胞のみがＯｃｔ−４を発現するものと考えられている。胎盤由来細胞上でのＯｃｔ−４の発現は、それらが、ＥＳ細胞のように機能し身体の中の細胞及び組織型の全てを発生させることのできる全能性又は究極の幹細胞であることを示唆している。ＥＳ様の全能性幹細胞を裏付ける付加的な証拠は、胎盤由来細胞内のテロメラーゼの低いものの検出可能な発現である。テロメラーゼ発現は同様に、ＥＳ様幹細胞の１つの特徴である。
【００８６】
羊膜上皮細胞の接着性及び非接着性画分の両方、羊膜繊維芽細胞（ＡＭＦ）の非接着性画分及び残留膜（ＲＭ）の接着性画分は、ＳＯＸ２及びＯｃｔ−４（図３）を両方共発現する細胞を含有する。両方の画分からの羊膜上皮（ＡＥ）細胞は、ＳＯＸ２及びＯｃｔ−４を強く発現し、一方その他の画分は主としてＳＯＸ２（図３）を発現する。２つの独立した幹細胞マーカー遺伝子のこれらの異なる発現パターンは、異なるタイプの幹細胞がこれらの画分からの単離能力をもつことを示している。神経幹細胞はＳＯＸ２を発現することから、ここでの結果は、胎盤の羊膜上皮画分ならびに羊膜繊維芽細胞画分が神経幹細胞を含有することを示唆している。これらの細胞は、パーキンソン病又はアルツハイマー病又はＡＬＳといったような疾病のための神経学的研究及び臨床的移植にとって有用であり得る。図１９には、本書に記述されている細胞単離及び培養手順の生物学的有効性を確認する異なるＣＮＳ細胞型への胎盤由来細胞の分化についての証拠が提示されている。
【００８７】
図２、４及び６及び表１に提示されている結果は、胎盤組織及び羊膜が特に、全能性幹細胞の特性をもつ細胞を含有するということを表わすデータを示している。細胞は、Ｏｃｔ−４、ｈＴＥＲＴ、ＳＳＥＡ１、３及び４そしてＴＲＡ１−６０及びＴＲＡ１−８１といったようなＥＳ様の細胞と通常関連するマーカーを発現する。これらの結果は、ＥＳ様の細胞が胎児組織の胎盤側に存在し、容易に単離、培養及び固定可能であるということを表わしている。我々の培養条件下での異なる時期についての培養中の細胞の分子分析は、ＥＳ様の特性をもつ細胞が連続的に存在していることを示している。ＡＥ由来の幹細胞は、身体の全ての組織及び細胞型へと分化する潜在性を有する。
【００８８】
７．実施例：ヒト胎盤由来細胞の単離
複雑でない計画的帝王切開からヒトの胎盤を得た。胎盤全体を、滅菌した１０００ml入りカップに入れ、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ml）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ml）及びアンフォテリシンＢ（０．２５μｇ／ml）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した。臍帯を切断し、胎盤全体を臍帯の付着点で半分に切断した。切断縁部（胎盤本体の中央）から出発して外向きに作業を進めて、滅菌したメスで穏やかに剥がすことにより、下にある胎盤の絨毛膜層から羊膜層を剥離させた。羊膜をＨＢＳＳで洗浄し（抗生物質無し）、０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡで洗い流した。５０cc入りのファルコンチューブ内に組織の体積の約２倍まで、０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡを添加した。組織を０．０５％のトリプシンＥＤＴＡを伴う新しいチューブに移す。
【００８９】
トリプシン処理を停止させるため、チューブ内の残留上清に対して培地を添加し、４℃で１０分間８００rpmで遠心分離した。ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、ＥＧＦ（１０ng／ml）、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ml）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ml）及びアンフォテリシンＢ（０．２５μｇ／ml）中にペレットを再懸濁させた。最高合計３回、トリプシン処理ステップを反復した。各々のトリプシン処理によって放出された細胞を、１００μｍの細胞ストレーナに通した後で別々に平板固定させるか又は１本のチューブ内に混合した。ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ＥＧＦ（１０ng／ml）、インシュリン（１０ng／ml）−トランスフェリン（５．５μｇ／ml）−セレン（６．７ng／ml）−エタノールアミン（２μｇ／ml）（ＩＴＳ）と共に皿上に細胞を平板固定した。約２〜４時間で、底面に細胞が接着した時点で培地を交換した。培地は、２日毎に交換し、細胞を５日毎か又は培養が８０％以上の集密度に達した時点で通過させた（４．中１）。約０．５〜２×１０8個の細胞（本書では羊膜上皮細胞すなわちＡＥ細胞と呼ばれる）を各胎盤から得ることができる。
【００９０】
８．実施例：培養された胎盤由来細胞の中での幹細胞、上皮細胞及び肝細胞マーカーの発現
８．１．材料と方法
８．１．１．胎盤由来細胞の免疫組織化学分析
実施例７で上述した通りに、羊膜組織を正常な胎盤から得、トリプシンで解離させた、標準培地（ＤＭＥＭ）を１０％のＦＢＳ、ＩＴＳ及びＥＧＦ（１０ng／ml）で補足した。単離から約５日後に、胎盤由来細胞をトリプシン処理し、コラーゲンでコーティングしたカバースリップ上で再度平板固定し、１２ウェルの培養平板内に挿入し、２〜５日間培養し、次にＨＢＳＳで２回洗浄し、１０％の緩衝ホルマリンで固定した。
【００９１】
細胞単離に先立ち、約１cm×１cmといった少量の組織を胎盤組織から切断し、１０％の緩衝ホルマリン内で固定させ、パラフィン内に包埋し薄切りにした。
厚み５μｍに薄切りされたパラフィン包埋胎盤組織及びコラーゲンコーティングされたガラスのカバースリップ上で培養させた胎盤由来細胞を、ＡＥ１／ＡＥ３、ＣＫ１９、ＣＫ１８、ｃ−ｋｉｔ、Ｔｈｙ−１、Ａ１ＡＴ、ＡＦＰに対する一次抗体での免疫組織化学分析のため１０％の緩衝ホルマリンにより固定させた。ビオチンに接合されたヤギ抗マウス免疫グロブリンを用いて、抗体の局在化を実施した。基質としてＤＡＢ（Vector）を用いるアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体方法を用いて、陽性標本上に褐色乃至オレンジ色を発色させた。ヘマトキシリン対比染色を実施した。
【００９２】
ヒトＨＮＦ−４ａのための免疫組織化学分析を、ウサギ抗ヒトＨＮＦ−４ａ（Ｈ１７１／１：２５０）抗体を用いて準備した（Santa Cruz, sc−８９８７）。
８．１．２．アルカリホスファターゼ活性
ベクターレッドアルカリホスファターゼ基質キット（Vector, ＳＫ−５１００）（４−ａ；×１００，４−ｂ；×４００）によりアルカリホスファターゼ活性を決定した。胎盤由来細胞を３回ＨＢＳＳで洗浄し、２時間緩衝１０％ホルマリンによって固定した。アルカリホスファターゼの陽性を表わす赤色を３７℃で４５分のインキュベーションと共にメーカーの指示事項に従って発色させた。
【００９３】
８．１．３．ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをＲＮＡＷＩＺ（Ambion）で抽出した。２つの分離されたエクソンにまたがるように設計されたヒト・アルブミン特異的プライマを用いて、Super Script One-step ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｇ１ＢＣｏ，１０９２８−０１８）でＲＴ−ＰＣＲを実施した。内部対照として、β−アクチン特異的プライマでＲＴ−ＰＣＲを実施した。負の対照として、ＨｅＬａ 細胞から抽出された合計ＲＮＡを抽出し、培養されたヒト肝細胞からのＲＮＡを正の対照として使用した。
【００９４】
８．１．４．ウェスタンブロッティング
胎盤由来細胞を、２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（１％のトリトンＸ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．２ｍＭのバナジウム酸ナトリウム、０．５％のＮＰ−４０）の中で均質化し、標本を３０分間２００Ｖで１０％のプレキャストポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル（Bio−Rad）上での電気泳動に付し、ニトロセルロース膜に電気的に移送し、マウス抗ヒト・アルブミン及び抗−Ａ１ＡＴ抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。
【００９５】
８．２．結果
図７は、胎盤組織及び培養された胎盤由来細胞についての免疫組織学的分析を示している。左欄の写真は、羊膜上皮細胞層上の染色を示す拡大した挿入部を伴う胎盤組織を通る断面を示す。右欄に提示された写真は、単離された培養胎盤由来細胞での結果を示す。
単離され培養された細胞及び胎盤組織の上側にある細胞の小さい単一の列である羊膜組織の両方が、サイトケラチン混合物に対する抗体（ＡＥ１／ＡＥ３）及びサイトケラチン１８及び１９に対する抗体と強く反応し、胎盤由来細胞が上皮細胞であることを示した。サイトケラチン８及び１８の発現は、肝細胞系列の細胞のマーカーである。肝臓細胞内のサイトケラチン１９の発現は、胆管系列の特徴である。
【００９６】
培養されたヒト胎盤由来細胞は、抗ｃ−ｋｉｔ抗体と強く反応しており、これは、これらの細胞がこの成長因子レセプタを発現することを示唆している。造血成長因子、幹細胞因子（幹細胞Ｆ）に対するレセプタであるｃ−ｋｉｔは、造血性及び肝臓幹細胞によって発現される。
【００９７】
羊膜組織は、Ｔｈｙ−１発現について陰性であったが、培養された胎盤由来細胞はこの抗原を発現した。造血幹細胞及びラット肝臓始原細胞は、Ｔｈｙ−１抗原を発現する（Petersen B.E, Bowen W.C, Patrene K.D, Mars W.M, Sullivan A.K, Murase N, Boggs S.S, Greenberger J.S, Goff J.P：「肝臓卵形細胞の潜在的供給源としての骨髄」Science １９９９，２８４：１１６８−１１７０；Petersen et al.,「肝臓卵形細胞が、ラット体内で造血幹細胞マーカーＴｈｙ−１を発現する」。Hepatology １９９８，２７：４３３−４４５）。胎盤由来細胞内でのＴｈｙ−１の発現は、これらの細胞が造血又は肝臓系列のいずれの細胞にでも分化しうるということを表わしている。培養細胞は同様に、ＣＤ３４発現についても陰性である。
【００９８】
培養された胎盤由来細胞は、Ａ１ＡＴに対する抗体と反応したが、一方羊膜組織は、Ａ１ＡＴ発現についてきわめて弱いか又は陰性であった。α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）は、成熟した肝細胞によって発現され分泌されたタンパク質であり、肝細胞分化のマーカーである。
【００９９】
羊膜組織は、ＡＦＰ発現について陰性であり、一方、培養細胞は、ＡＦＰ発現について非常に弱い陽性である。α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）は、アルブミンの胎児形態であり、胎児肝細胞によりそれらの成熟前に発現される。これらの結果は、培養細胞がＡＦＰを発現するものとして示されていたSakuragawa et al.,の報告書と対照的である（Sakuragawa et al., ヒト羊膜上皮細胞は、肝臓内への同種細胞移植のための有望なトランス遺伝子担体である。J Hum Genet ４５：１７１−１７６，２０００）。
【０１００】
培養細胞の小集団も又、アルカリホスファターゼ活性について強く染色した。結果は、アルカリホスファターゼ発現に関して２つの培養細胞集団すなわち、アルカリホスファターゼを強く発現したもの（図８ａ及びｂ）及び弱い又は陰性の発現しか示さなかったもの（図示せず）が存在することを表わしている。アルカリホスファターゼは、未分化の全能性胚幹細胞（ＥＳ）のマーカーである。ヒトＥＳ細胞が分化して胚様体を形成する場合、アルカリホスファターゼの発現は低減又は損失する。この結果は、ＥＳ細胞のような培養中の胎盤由来細胞の分化にはアルカリホスファターゼの発現における改変が随伴するということを示唆している。
【０１０１】
培養細胞は同様に、肝細胞分化のマーカーであるアルブミンを発現することが観察された（図８ｃ−Ｆ）。集団中のアルブミンの局在化は、完全に陰性である細胞の次にアルブミン発現について強い陽性を示す細胞が存在することを明確に示している。培養された胎盤由来細胞の最高３０％がアルブミンを発現した。強いアルブミン陽性度を示した細胞の一部分が、成熟肝細胞の特徴である２つの核を有していたことは興味深い。
【０１０２】
ＲＮＡ及びタンパク質レベルでアルブミンの発現を確認するために、培養細胞を用いてＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロット分析を実施した。ヒト・アルブミンＲＮＡを、培養細胞から単離したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを用いて検出し（図９Ａ）、培養細胞からの細胞抽出物についてのウェスタンブロットを用いてヒト・アルブミン・タンパク質を検出した（図９Ｂ）。
【０１０３】
成熟肝細胞の基準尺度であるα−１アンチトリプシンも、ウェスタンブロット分析を用いて培養細胞からの細胞抽出物内で検出された。しかしながら羊膜組織から調製された細胞抽出物は、アルブミン又はＡ１ＡＴに対する抗体と反応せず、これは、羊膜組織がアルブミン又はＡ１ＡＴをインビボで発現しないことを示唆していた。これらの結果は、以上で特定された条件下で培養された細胞が肝臓系列に沿って増殖及び分化するということを示唆した。これらのデータは、培養された胎盤由来細胞がインビボで分化された状態に「ロック」されず、むしろこれらの細胞内の遺伝子発現が柔軟なものであるということを表わしていた。
【０１０４】
【表２】
2005523328.tif 000003
【０１０５】
細胞が分化する経路を制御するマスタースイッチが存在している。或る種の系列に沿った遺伝子発現を調節する最も重要なステップの中には、組織の高められた転写因子の発現段階がある。肝臓の発達において、肝細胞核因子（ＨＮＦ）の発現は、かかる遺伝子である。肝細胞系列に沿って、アルブミンといったような肝臓特異的遺伝子の発現は、アルブミンプロモータに結合するＨＮＦによって制御される。ＨＮＦ１及びＨＮＦ３の発現が欠如している肝細胞ガン細胞系統においては、肝細胞分化の徴候は全く存在しない。しかしながら、ＨＮＦ４のトランスフェクションがＨＮＦ１発現及び肝臓特異的遺伝子発現を活性化する（Spath及びWeiss, 肝細胞核因子発現が脱分化したヘパトーマ細胞内の肝臓表現型の抑制を克服する。Mol. Cell Biol １７：１９１３−１９２２，１９９７）。
【０１０６】
培養された胎盤由来細胞内のＨＮＦ１及び４の発現は、免疫組織化学分析を用いて分析された。ヒト肝細胞及び培養細胞の両方において、ＨＮＦ４が核に局在化していた（図１０）。細胞の約２５％が検出可能なＨＮＦ４を示した。ＨＮＦ１で類似の結果が得られた。細胞のこの相対的割合は、上述のアルブミン陽性細胞の割合と相関関係を有していた。これらの結果は同様に、培養胎盤由来細胞の柔軟性について、つまり、これらの細胞が全肝機能に必要とされる遺伝子及び転写因子を発現できるということについての強力な裏づけを提供した。
【０１０７】
ＨＮＦ４発現は肝臓に制限されるわけではない。ＨＮＦ４発現は、消化管、肝臓、腸及び膵島内の分化及び発達にとってきわめて重要である。ＨＮＦ４は、膵臓β細胞における分化の重要な調節因子である。膵臓ならびに肝臓内で、ＨＮＦ３転写因子系統群はＨＮＦ４の発現を調節する。インシュリンは、ＨＮＦ３βの発現を増大させ、ＨＮＦ４及びグルコース代謝に関与する複数のその他の遺伝子の発現の増加を導くことができる。ＨＮＦ４の突然変異は、早期発症の２型糖尿病を導く可能性がある。肝臓に加えて、ＨＮＦ４の発現は、膵臓β細胞の正常な発達にとってもきわめて重要である。培養された胎盤由来細胞がＨＮＦ４を発現するという観察事実は、培養された細胞がインシュリンへと分化してβ細胞を産生する能力をもつ可能性もある、ということを表わしている。
【０１０８】
９．実施例：培養胎盤由来細胞内での分化した肝細胞細胞マーカーの発現
９．１．材料と方法
９．１．１．細胞の単離及び培養条件
羊膜組織を、実施例７に記されているように、正常な胎盤から得た。細胞を、表３に掲示されている通りにStrom及びMiki培地中で培養した。細胞の単離及び培養条件は、Sakuragawa et alによって記述され（Sakuragawa et al.,ヒト羊膜上皮細胞は、肝臓内への同種細胞移植のための有望なトランス遺伝子担体である。J Hum Genet ４５；１７１−１７６，２０００）。かつ表３に同じく列挙されているものとは異なっている。これらの技術は、トリプシンの濃度、消化時間、培地及び基本培地中の培地補充物が変動している（表３）。
【０１０９】
この実施例に記述されている胎盤由来細胞の単離のためには、細胞は、２つの異なる技術を用いて同じ胎盤から単離された。細胞はそのそれぞれの培地の中で約１０日間培養された。
【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
細胞単離及び培養における差異は、Sakuragawaの技術を用いて単離されかつ／又は増殖したものとは異なる細胞型の単離を導く可能性がある。
【０１１２】
９．１．２．ＲＴ−ＰＣＲ
培養実時間での特異的遺伝子の発現を見極めるために、定量的実時間ＰＣＲ分析を実施した。ＲＮＡを培養細胞から単離し、遺伝子発現について定量的ＰＣＲにより検査した。実時間ＰＣＲは、正常なＰＣＲ反応を行ない螢光染料を用いて実時間で産生された産物を測定することによって、遺伝子発現の定量的分析を行なうことのできる方法である。染料は、反応において余剰に存在し、かくしてそれがＤＮＡと相互作用した時点で、螢光がＤＮＡの量に正比例するようになっている。もとの溶液中のＲＮＡ又はＤＮＡの量の定量的測定値を得ることができるのは、このメカニズムによってである。ＲＮＡ計量のためには、正規のＰＣＲを通してその後増幅できるＤＮＡへとＲＮＡを転換するための逆転写酵素段階から始める。これらの検定は、Applied Biosystemsにより供給された実時間ＰＣＲ機上で行なわれ、定量的ＰＣＲのための完全なプロトコルが、製品番号４３１０２５１及び４３０４４４９として供給される。各ケースにおいて、指示された遺伝子の相対的発現レベルは、内部対照であるβ−アクチンの発現と比較される。
【０１１３】
９．１．３．遺伝子アレイ
その他の人々により報告された単離及び培養条件に対処するため、本発明の条件及びSakuragawaの条件の下で数多くの遺伝子の発現が比較された（表３）。細胞からの単離されたＲＮＡは、遺伝子アレイ上で分析された。これらのアレイは、何千もの遺伝子に特異的なＤＮＡ配列を含有しており、かくして数千の遺伝子の遺伝子発現の分析を一度に行なうことができるようになっている。２つのアレイが実行された。１つは、Sakuragawaの方法に基づき単離された細胞及びそれに基づく培養からのＲＮＡで、そしてもう一方はStrom及びMikiの条件を用いて同じ胎盤から単離された細胞でのものであった（表３）。細胞は各々の条件下で２週間培養された。５分間１０００rpmで細胞をこすり取り遠沈させた。ペレット化した細胞を液体窒素でスナップ凍結させ、分析まで−８０℃で保管した。全ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡを精製してＤＮＡマイクロアレイに対しハイブリッド形成させた（Affymetrix Ｕ１３３Ａ）。２つの条件の間で異なるレベルで発現された遺伝子を同定するため、Affymetrix ＭＡＸ４．０ソフトウェアを用いて、走査されたアレイを分析した。
【０１１４】
９．２．結果
９．２．１．細胞増殖
図５は、Sakuragawa et al.,の中で記述されている通りの単離方法及び培地技術を用いる（図５ａ）か又は本発明の単離方法及び培地技術を用いて（図５ｂ）同じ胎盤から単離した胎盤由来細胞を示す光学顕微鏡写真である。指示されているように、本発明の培地の中で培養された細胞は、大規模に増殖して皿を満たす。対照的に、Sakuragawa et alの技術及び培地を用いて培養された胎盤由来細胞は、ほとんど細胞増殖がないことを裏づけている。
【０１１５】
９．２．２．肝臓−特異的マーカーの発現
Sakuragawa et alの条件又は本発明の方法を用いて培養された胎盤由来細胞内の複数の肝臓特異的遺伝子の発現を、実時間ＰＣＲを用いて検査した（図６）。ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、Ｏｃｔ４、Ａ１ＡＴ、ＡＦＰ、ＨＮＦ４、ＧＦＡＰ、ＦＬＴ１、及びＭＤＲ１という肝臓特異的遺伝子の発現について、培養細胞を検査した。ＣＹＰ遺伝子は、肝臓中で発現された薬物代謝酵素についてコードする。かかる肝臓代謝酵素の胎盤由来細胞中での発現が望ましく、これは、患者の移植片のための肝細胞の製造、バイオ人工肝臓（ＢＡＬ）、又は薬物代謝又は毒物学の目的で特に有用である。
【０１１６】
検査対象の１３の異なる遺伝子のうち、ＭＤＲ１のみ又は、多薬物耐性遺伝子及びＣＹＰ２Ｃ９が、Sakuragawaの培養条件と本発明の条件の間で類似のレベルで発現された（図６）。培養された細胞は、特にＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、及びＣＹＰ３Ａ４について、遺伝子発現の有意な差異を示した。この不一致は、本発明の方法を用いて培養された細胞が、Sakuragawa et alの方法を用いて単離された細胞に比べてはるかに優れた肝細胞へと分化する能力を示す、ということを示唆している。
【０１１７】
Ｏｃｔ−４、α−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、ＧＦＡＰ及びＦＬＴ−１といったようなその他の遺伝子も同様に、本発明の培養条件下でのみ発現される（図６）。Ａ１ＡＴ及びＨＮＦ４は、分化した肝細胞のマーカーである。肝臓は、Ａ１ＡＴを産生し分泌し、ＨＮＦ４は、分化した肝臓機能の維持に必要とされる転写因子である。
【０１１８】
ＧＦＡＰは、神経グリア細胞のためのマーカーであるグリア線維性酸性タンパク質であり、ＦＬＴ−１は、血管内皮細胞上で発現された表面レセプタである。ＧＦＡＰ及びＦＬＴ−１は共に、本発明の条件下で単離され培養された胎盤由来細胞の中で検出可能である（図６）。胎盤由来細胞内のそれらの発現は、これらの細胞がニューロン及び内皮系列に沿ってならびに肝細胞細胞系列に向かって分化できるということを示唆している。一般に異なる組織型上に見い出されるこれらのマーカーが、我々の培養中で異なる細胞上で発現されるか又は同じ細胞上で発現されるかは明白ではない。同じ培養中の分化した神経膠細胞、分化した肝細胞及び血管内皮細胞のマーカーの存在は、本発明の単離条件が、異なる分化潜在能力をもつ細胞の単離のための１つの手段を提供するということを表わしている可能性がある。あるいは、本発明の培地及び成長条件は、同じ細胞型からのより広範囲の分化潜在能力を提供することができる。
【０１１９】
異なる細胞型の単離についての１つの論拠は、本発明の単離及び培養条件を使用することのみによりＯｃｔ−４陽性細胞が存在するという観察事実にある。Ｏｃｔ−４の発現は、ＥＳ細胞といったような全能性幹細胞に制限されると考えられている。本発明の細胞培養中にＯｃｔ−４が存在しSakuragawa et alのものには存在しないという事実は、本発明の単離条件による異なる細胞型の単離又はSakuragawaの技術を用いて得られた培養からのこの細胞型の急速な損失を表わしている。
【０１２０】
９．２．３．遺伝子アレイ
合計２９２９個の遺伝子が、Strom及びMikiの条件とSakuragawaの条件の間で著しく異なるレベルで発現されることが発見された。この分析においては、８８５の遺伝子がStrom及びMikiのプロトコルの下で高い発現を示し、一方、２０４４の遺伝子が、Sakuragawaの条件下でのものに比べ低いレベルで発現された。ヒトゲノムは、約３０，０００個の遺伝子しか含まず、肝臓といった組織は５０００の全遺伝子しか発現しない可能性があることから、２９２３個の遺伝子という発現差は、全発現済み遺伝子の大きな割合を占める。Strom−Mikiの条件とSakuragawaの条件下で著しくアップレギュレートされたトップ５０の遺伝子の表が、表４及び５の中でそれぞれ要約されている。表６は、表４及び５内に列挙されたトップ５０を超える、Strom及びMikiの条件下で同じく著しくアップレギュレートされている遺伝子を列挙している。これらの選択された遺伝子は、神経、肝臓、膵臓及び腸細胞にとって数多くの重要な遺伝子を含んでいる。
【０１２１】
強調表示された遺伝子は、肝細胞特異的又は肝臓関連の遺伝子であった（表４及び５）。遺伝子は、対数スケール内のシグナル強度によってランク付けされ、かくして、１．０として示されている遺伝子は、もう一方の条件に比べ１０倍のレベルで発現されることになり、３という数字は、２つの条件の間の１０００倍（すなわち１０の３乗）異なるレベルでその遺伝子が発現されたことを表わすことになる。肝臓関連遺伝子（影付き）の多くが、Sakuragawaのものに比べStrom−Miki条件下で１００００〜１億倍高い（表４で８．０）レベルで発現されていることは明白である。Strom−Miki条件下でアップレギュレートされた１７の（トップ５０の遺伝子の３４％）が肝臓関連のものであり、一方肝臓関連とみなすことのできるわずか１つの遺伝子のみがSakuragawaの条件下でアップレギュレートされた。
【０１２２】
【表４】
2005523328.tif 000005
【０１２３】
【表５】
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【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
１０．実施例：分化培地が、培養胎盤由来細胞中で肝細胞の分化を促進する
１０．１．材料及び方法
実施例７で記述されている通りに胎盤由来細胞を単離し、細胞の平板固定及び１０〜１４日間の細胞の拡張のため表３に見られる基本培養条件を用いて培養した。細胞を７〜１０日間又は培養が集密性に至るまで成長するまで培養した。細胞をトリプシン処理し、６ウェルの平板内に再度播種した。細胞を、ＤＭＥＭ又はＭＥＭベースの培地を補足するさまざまな成長因子を有する各図に示された通り異なる培養条件に付した。さらに１４日間、胎盤由来細胞を培養した。１４日の終りで、ヒト・アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、Ａ１ＡＴ又はＣ／ＥＢＰ−αの発現についてＣＥを評価した。
ＲＴ−ＰＣＲも同様に、細胞から単離したＲＮＡ上で、実施例６に記された通りに実行した。
【０１２６】
１０．２．結果
肝臓特異的遺伝子の増強された発現のための最適な培地を同定するため胎盤由来細胞を培養するのに、さまざまな成長因子及び／又はその組合せで補足された培地パネルを使用した。ヒト・アルブミン（図１１）、ＣＹＰ３Ａ４（図１２）、ＡＩＡＴ（図１３）及びＣ／ＥＢＰ−α（図１４）の発現について、培養した細胞を分析した。結果は、或る一定の培養条件下で、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、Ａ１ＡＴ及びＣ／ＥＢＰαの発現が、図６に報告された初期値全体にわたり著しく増大するということを表わしている。特に、ＥＧＦ及びデキサメタゾン（Ｄex）の内含が、肝臓特異的遺伝子発現を増強することが示された。培養中の少なくともこれらの時点で、培地に肝細胞成長因子ＨＧＦ又は繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）２．４又は７をさらに補足しても肝臓特異的遺伝子発現が増強することはなかった。表１１〜１４に提示されたデータは、表３に列挙された基礎成長培地からの培養条件から、各図中に示された分化培地条件への修正によって、肝臓特異的遺伝子の発現を増強させることができる、ということを表わしている。これらの結果は、肝臓特異的遺伝子発現が本書に記述されている分化培地の使用によって増強されるということを示唆している。ＨＧＦ及び繊維芽細胞成長因子は、肝細胞経路に沿った分化を増強するようには思われなかったが、これらの成長因子は、ニューロン、膵臓又は筋肉細胞の分化といったような、培養細胞からその他の細胞型への分化を促進する可能性がある。
【０１２７】
１１．実施例：培養された胎盤由来の肝細胞は代謝機能を示す
１１．１．材料と方法
ヒト肝細胞を、Engymology２７２：３８８−４０１内のStrom et al １９９６の方法の条件を用いて培養した。
【０１２８】
酵素ＣＹＰ１Ａ１又は１Ａ２により肝臓内のＣＹＰ１Ａ１又はＣＹＰ１Ａ２の発現を検出するために、エトキシレゾルフィンからヒドロキシレゾルフィンへの転換を測定するＥＲＯＤ検定を使用した。Kelley et al, ２０００Ｊ．Biomolecular Screening５：２４９−２５３。
【０１２９】
肝臓内のＣＹＰ３Ａ４の発現は、テストステロンから６−β−ヒドロキシ代謝産物への特異的転換として測定された。Kostrubsky el al., １９９，Drug Metab. dispos２７：８８７−８９４。
【０１３０】
インドシアニングリーン（ＩＣＧ）の摂取は、肝機能について検定するために利用可能なもう１つの臨床試験である。患者の体内で、ＩＣＧは血流中に注入され、肝臓を通過するにつれて、肝臓に特異的な輸送タンパク質により染料が摂取される。ＩＣＧの摂取に関与する輸送体タンパク質は、ＯＡＴＰ（有機アニオン輸送体タンパク質）及び肝臓特異的有機アニオン輸送体（ＬＳＴ）と呼ばれる。
【０１３１】
１１．２．結果
ヒト肝細胞内のＣＹＰ１Ａ１及びＣＹＰ３Ａ４活性の分析は通常、異なるＣＹＰ４５０遺伝子のための基質である特異的物質又は薬物を代謝する細胞の能力を測定することによって達成される。ＡＥ由来の肝細胞内でのこれらの酵素プロセスのレベルは、ＥＲＯＤ検定、６−β−ヒドロキシ代謝産物の存在及びインドシアニングリーンの摂取を用いて評価された。
【０１３２】
図１５に提示したデータは、エトキシレゾルフィン検定（図１５Ａ）及びテストステロンの代謝（図１５Ｂ）の結果を示している。図１５Ａに示されているように、ＡＥ由来の肝細胞がエトキシレゾルフィンを代謝する。比較のため、全臓器移植には使用されなかったドナー肝臓から単離された真正ヒト肝細胞に対してもＥＲＯＤ検定が実施された。ヒトの肝臓（ＨＨ１００８）の場合にそうであったように、胎盤由来の肝細胞は基本条件下ではさほど酵素活性を発現しない。肝細胞及び胎盤由来の肝細胞の両方の場合、ＥＲＯＤ活性は、細胞を予めβ−ナフトフラボン（ＢＮＦ）に露呈することによって誘発される。肝臓内及び培養肝細胞内のＣＹＰ１Ａ１／２発現を刺激するその能力に基づいて、この研究のためにβ−ナフトフラボンが選択された。該データは、胎盤由来の肝細胞内のＣＹＰ／Ａ１／２の発現が真正ヒト肝細胞内で見られる活性の約６０％に等しいことを表わしている。
【０１３３】
図１５Ｂに提示したデータは、胎盤由来の肝細胞内で産生された、テストステロン代謝産物の高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分離を示している。胎盤由来肝細胞による６−βヒドロキシテストステロンの明確な産生が存在する。図１５に提示したデータは、胎盤由来肝細胞が特異的Ｐ４５０遺伝子についてのＲＮＡを発現するばかりでなく該細胞が実際にタンパク質を翻訳し活性な薬物代謝酵素を作ることをはっきりと実証している。かかる代謝機能の存在は、薬物代謝又は毒物学研究、人工肝臓装置又は臨床肝細胞移植片のためのかかる細胞の有用性を確認する。
【０１３４】
胎盤由来肝細胞によるＩＣＧの摂取も又、胎盤由来細胞が肝細胞機能を示したことを決定するために検査された。ヒト肝細胞における４６．４％に比べて、胎盤由来肝細胞の１３．９％が、ＩＣＧの摂取を示す。これらのデータは、胎盤由来肝細胞上の肝臓特異的薬物及び化学的輸送体の存在を表わし、さらに薬物代謝及び毒物学研究ならびに人工肝臓装置及び肝細胞移植片のための胎盤由来肝細胞の有用性を立証している。
【０１３５】
１２．実施例：マウスの肝臓内への培養された胎盤由来細胞の移植及びヒト肝細胞への分化
１２．１．材料と方法
脾臓を介して肝臓内に胎盤由来細胞を移植した。肝臓又は門脈内への細胞の直接的移植の後の出血の問題のため、脾臓に移植された細胞の約５０％が５分以内に肝臓まで転位することになるということが立証されてきた（Ponder et al.,「マウスの肝細胞が、脾臓内移植後無制限に肝臓パラクローム機能まで移動する」Genetics ８８；１２１７（１９９１））。ひとたび肝臓に入ると、移植された肝細胞は、肝細胞板内に合体し、長時間存続する。胎盤由来細胞を肝細胞として用い、移植された細胞の推移を追跡調査した。移植後１ヵ月目に写真を撮影した。
【０１３６】
肝細胞の代りに胎盤由来細胞を移植し、移植細胞の推移を肝臓内で追跡調査した。図１６〜１８内の写真は、脾臓内への２００万個の細胞の移植の１ヵ月後に撮影されたものである。図１６においてのみ、胎盤由来細胞をまず、移植前に細胞を標識づけするためにＧＦＰを含有するアデノウイルスベクターで感染させた。移植の時点で、８５％を上回る胎盤由来細胞を緑色螢光タンパク質で標識づけした。受容動物は、ＳＣＩＤ又はＲag−２ノックアウト動物であった。これらのマウス株は、免疫障害をもち、該動物が外来性組織／細胞を直ちに拒絶しないことからヒトの組織又は細胞の移植調査のために定期的に使用されている。
【０１３７】
１２．２．結果
図１６〜１８に示されているように、胎盤由来細胞は、脾臓から肝臓まで転位し、肝細胞板と一体化し、正常な肝臓に付随する遺伝子及び肝細胞の形態を発現する。図１６に要約された実験においては、胎盤由来細胞はウイルスベクター発現緑色螢光タンパク質（ＧＦＰ）で標識づけされ、脾臓を介して肝臓内に細胞を移植した。図１６に示されているように、これらの動物の肝臓の切片中には、標識づけされた細胞が観察できる。肝臓切片内には５つの標識づけされた細胞が存在する（図１６ａ）。図１６ｂは、図１６ａに示された２つの標識づけされた細胞の４００倍顕微鏡写真を示している。螢光標識づけされた細胞は、肝細胞板内に取込まれた正常な肝細胞の形態を示している。肝細胞板内に合体しない細胞は死滅し、３〜７日以内に肝臓マクロファージから急速に除去され、従って図１６〜１８に提示した結果は、マウスの肝臓内に安定した形で取込まれた状態になった細胞のみを表わしている。肝臓内への胎盤由来細胞の組込みの頻度は、肝臓から回収された標識づけされた細胞の数から算出できる。組込み頻度は、正常な肝細胞に比べて胎盤由来肝細胞について非常に高い。出版された報告書では、肝細胞の移植後、組込み頻度は、移植された細胞の０．１％〜１０％の範囲である。胎盤由来肝細胞の組込みは、移植された細胞の約５１％である。これらのデータは、胎盤由来細胞が肝細胞移植研究にとって有用であることを示している。
【０１３８】
免疫障害をもつマウスの体内への実際のヒト肝細胞の移植片は、事実上、胎盤幹細胞の移植後に本書で示したものと同一の結果を提供する（Dandri, M, Burda, M, Torok, E, Pollok, JM, Iwanska, A, Sommer, G, Rogiers, X, Rogler, CE, Gupta, S, Will, H, Greten, H, Petersen, J.「ヒト肝細胞でのマウスの肝臓の再増殖及びＢ型肝炎ウイルスでのインビボ感染」Hepatol. ３３；９８１−９８８，２００１，及びMercer, DF, Schiller, DE, Elliott, JF, Douglas, DN, Hao, C., Rinfret, A, Addison, WR, Fischer, KP, Churchill, TA, Lakey, JRT, Tyrell DLJ, Kneteman, NM. Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human livers. Nature Med. ７：９２７−９３３，２００１）。これらのデータは、移植された幹細胞が受容体の肝臓の中でヒト肝細胞まで成熟することを表わしている。
【０１３９】
単離された胎盤由来細胞も同様に、免疫不全マウスの肝臓内に移植された。移植から１ヵ月後に、動物を屠殺し、移植された動物の肝臓から切片を作った。ヒト・α−１アンチトリプシン（実施例１７）又はヒト・アルブミン（図１８）に対する抗体を用いて、移植された細胞について肝臓切片を検査した。図１７及び１８に提示したデータは、ヒトＡ１ＡＴ（図１７）又はヒト・アルブミン（図１８）に対する抗体と反応する肝臓切片内の肝細胞の形態を伴う細胞を明確に示している。これらのデータは、免疫不全マウスの肝臓内に移植されたヒト胎盤由来細胞が肝細胞板と一体化し、正常なヒト肝細胞の形態を有し、正常な肝臓内で通常発現される遺伝子を発現する、ということを確認している。
【０１４０】
１３．実施例： 神経及び血管内皮細胞への胎盤由来幹細胞の分化
１３．１．材料と方法
胎盤由来細胞を、約１４日間ＦＧＦ−４（１０ng／ml）の存在下で培養した。異なる遺伝子の発現の免疫組織化学的分析を、ヒト・タンパク質に特異的な抗体を用いて実施した。
細胞を両方の成長モードで約１０日間培養し、MatrigelTMがコーティングされた皿上で平板固定した（１００％ｕ/ｕ上で２０Ｔ）。同じくGrant et al及びKazuya et alの中で開示されている通りに、Matrigel上で胎盤由来細胞を培養した（Grant, DS, Lelkes, PI, Fukuda, K, Kleinman HK..「インビトロでの基底膜誘発された血管分化に関与する細胞内メカニズム」In Vitro Cell Dev. Biol２７Ａ：３２７−３３６，１９９１；及びKazuya, M and Kinsella, JL,「基底膜複合体（Matrigel）上での内皮索様構造の再組織：転質転換成長因子β１の関与」J.Cell Physiol １６１：２６７−２７６，１９９４）。
【０１４１】
１３．２．結果
図１９は、培養胎盤由来細胞が乏突起膠細胞のマーカーであるグリア線維性酸性タンパク質、ＧＦＡＰ、星状細胞のためのマーカーであるβー−チュブリンＩＩＩ、及びニューロンのためのマーカーであるＣＮＰを発現することを示している。ＦＧＦ−４の存在下で、胎盤由来細胞は、ニューロン形状を呈し、さまざまなニューロンマーカーを発現する。これらの結果は、培養された胎盤由来細胞が多能性であることすなわちニューロン、乏突起膠細胞及び星状細胞系列に沿って分化できるということを表わしている。
【０１４２】
マトリゲルと呼ばれる培養基質上で、血管内皮細胞は、くもの巣様の構成体へと凝集し、開放管腔と細胞を形成する（図２０）。これらの形態学的変化は、血管通路の発達における第１段階を表わす。マトリゲル上の細胞及び真正血管内皮細胞を連想させる観察されたくもの巣様の構成体が、図２０に示されている。より高い倍率（４００×）で、細長い毛管様構造が明確に見られる（図２０）。透過型電子顕微鏡（４０００×）が、血管通路の原始的な形成を示している（図２０）。これらのデータは、培養されたＡＥ由来の細胞が、内皮細胞通路に沿って分化し、ヒト血管系の形成、再構築又は修復のための幹細胞としてこれを使用できるということを表わしている。
【０１４３】
１４．実施例：胎盤由来幹細胞の膵臓細胞への分化
１４．１．材料と方法
胎盤由来細胞を７日間標準成長培地中に維持し、次にトリプシン処理し、基底膜タンパク質の市販の形態であるマトリゲル（ＭＧ）で予めコーティングされた培養上に播種した。培養を、２０％（ｖ/ｖ；マトリゲル対培地）又は１００％のマトリゲルでコーティングした。２０％のマトリゲル実験からのデータがここに示されている。細胞を、ＭＧで予めコーティングした平板上に播種し、標準濃度のＩＴＳ及びデキサメタゾン（０．１マイクロモル）で補足された標準培地の中でさらに１４日培養した。１０日後に細胞を溶解させ、ＲＮＡを単離させ、Ｐａｘ６、ＰＤＸ−１、Ｎｋｘ２、２、インシュリン、グルカゴン及び内部対照βアクチンに特異的なＰＣＲプライマを用いて１段階逆転写酵素ＰＣＲ分析を行なった。
【０１４４】
１４．２．結果
膵臓細胞への分化のための潜在能力を調査するために、７日間基本培地中に胎盤由来細胞を培養し、例えばＰａｘ６及びＰｄｘ１といったような膵臓β−細胞分化に必要な転写因子及びインシュリンの発現について検査した。図２１は、培養細胞がＰａｘ６、Ｐｄｘ１及びインシュリンを発現することを示している。Ｐｄｘ１の発現は弱いものの、インシュリンの発現はかなり強い。この要領で処理された。胎盤幹細胞は、内分泌細胞分化を促進するＰＤＸ−１、Ｐａｘ６及びＮｄｘ２、２ならびにβ細胞（インシュリン）又はα細胞（グルカゴン）に特異的なマーカーを内含する膵臓分化マーカーを発現する。これらの結果は、胎盤幹細胞が膵臓細胞に分化する能力を有することを表わしている。これらの培養細胞内のインシュリンの発現は、それらが膵島細胞として使用される潜在能力をもつことを表わしている。これらの細胞は、糖尿病の治療に向けて使用するためのインシュリンを分泌する。αならびにβ細胞についての膵臓マーカーの発現は、膵臓の大部分の又は全ての細胞型の再生が本発明の胎盤幹細胞を用いて可能でありうるということを示唆している。
【０１４５】
本発明は、本書に記述された特定の実施形態によって範囲が制限されるものではない。実際、本書に記述されたものに加えて本発明のさまざまな修正が、以上の記述及び随伴する図から当業者にとって明らかになることだろう。かかる修正は、添付のクレームの範囲内に入るように意図されている。本書にはさまざまな参考文献が列挙されており、その開示は全体が参考として内含される。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】胎盤から単離されたさまざまな細胞型供給源を示す。
【図２】羊膜、絨毛膜、脱落膜層が標識付けされた状態にあるヒトの胎盤を通した横断面の光学マイクロ写真を示す。挿入部分は、間葉細胞の支持間質細胞を伴う羊膜のさらに拡大した図を示す。
【図３】幹細胞マーカー、Ｏｃｔ−４及び神経幹細胞マーカーＳＯＸ−２を発現する胎盤から誘導された接着細胞及び非接着細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図４】胚抗原、ＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４を発現する培養された胎盤由来の細胞のＦＡＣＳ分析を示す。
【図５】Sakuragawaの中で記述されている単離方法及び培地（図５ａ）又は本発明の単離方法及び培地（図５ｂ）を用いて同じ胎盤から単離された胎盤由来の細胞の光学マイクロ写真を示す。
【図６】Sakuragawaの中で記述されている単離方法及び培地又は本発明の単離方法及び培地を用いて単離された胎盤由来の細胞内のさまざまな肝特異的マーカーのＲＮＡ発現の相対的差異を示す棒グラフである。
【図７】ヒト胎盤組織及び培養細胞内のＡＥ１／ＡＥ３、ＣＫ１９、ＣＫ１８、ｃ−ｋｉｔ、Ｔｈｙ−１、Ａ１ＡＴ、ＡＦＰに対する抗体での胎盤由来細胞の免疫組織学的染色を示す。
【図８】ヒト胎盤組織及び培養細胞内のアルカリホスファターゼ（ａ、ｂ）及びヒト血清アルブミン（ｃ−ｆ）の胎盤由来細胞発現を示す。
【図９】胎盤由来細胞内のアルブミンｍＲＮＡ（ａ）、アルブミンタンパク質（ｂ）及びα１アンチトリプシンタンパク質（ｃ）の発現を示す。
【図１０】ヒト肝細胞（ａ）及び胎盤由来細胞（ｂ）内のヒトＨＮＦ−４に対する抗体での胎盤由来細胞の免疫組織学的染色を示す。
【図１１】さまざまな培地中で培養された培養胎盤由来細胞内のヒト・アルブミンのＲＮＡ発現の相対的差異を示す棒グラフである。
【図１２】さまざまな培地中で培養された培養胎盤由来細胞内のＣＹＰ３Ａ４のＲＮＡ発現の相対的差異を示す棒グラフである。
【図１３】さまざまな培地中で培養された培養胎盤由来細胞内のＡ１ＡＴのＲＮＡ発現の相対的差異を示す棒グラフである。
【図１４】さまざまな培地中で培養された培養胎盤由来細胞内のＣ／ＥＢＰαのＲＮＡ発現の相対的差異を示す棒グラフである。
【図１５ａ】培養胎盤由来細胞がβーナプトフラボン誘発時点でのＣＰＹ１Ａ１／ＣＰＹ１Ａ２活性を呈することを示す棒グラフである。
【図１５ｂ】胎盤由来肝細胞内で産生されたテストステロン代謝産物の高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分離を示す。
【図１６ａ】マウスの肝臓内に取込まれた移植された螢光ＧＦＰ発現胎盤由来細胞の螢光顕微鏡写真である。
【図１６ｂ】図１６ａ内の細胞の４００倍顕微鏡写真である。
【図１７】ヒト・α−１−アンチトリプシンを発現する免疫不全マウスの肝臓内に取込まれた移植された胎盤由来細胞を示すマウス肝臓切片の顕微鏡写真である。
【図１８】ヒト・アルブミンを発現する免疫不全マウス内に取込まれた移植された胎盤由来細胞を示すマウス肝臓切片の顕微鏡写真である。
【図１９】神経細胞マーカー、ＧＦＡＰ、β−チュブリンＩＩＩ及びＣＮＰを発現する培養された胎盤由来細胞を示す顕微鏡写真を示す。
【図２０】血管内皮細胞の特性を実証するマトリゲル上で培養された培養胎盤由来細胞の光学及び電子顕微鏡写真を示す。
【図２１】膵島細胞マーカー、Ｐａｘ６、インシュリン、Ｐｄｘ１、Ｎｋｘ−２．２及びグルカゴンを発現する培養された胎盤由来細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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