(57)【要約】本発明は、治療剤の広範な分布、全身的発現、および持続性送達のための組成物と、天然の消化管経路を介した治療剤の投与方法とに向けられる。さらに詳細には、本発明は、経口遺伝子療法の投与のための組成物と、その生産および使用方法とを開示する。
2005536513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然の消化管経路を介して宿主に治療剤を投与するための組成物であって、
アミン基を含む少なくとも１種類の化合物と、
少なくとも１種類の遺伝物質とを含み、
前記消化管経路を介した広範な分布、全身的発現、および持続性送達を可能にするのに効果的な方法で、前記少なくとも１種類の化合物と前記少なくとも１種類の遺伝物質とを共役させ、
それによって、望ましい生物学的効果を得ることを特徴とする組成物。
【請求項２】
天然の消化管経路を介してターゲッティング細胞に治療剤を投与するための組成物であって、
前記天然の消化管経路を介して遺伝物質を輸送するために効果的な少なくとも１種類の輸送剤と、
望ましい生物学的効果を誘発するために効果的な少なくとも１種類の遺伝物質とを含み、
前記天然の消化管経路を通過した後の細胞内取り込みの結果として広範な分布、全身的発現、および持続性送達を可能にするのに効果的な方法で、前記輸送剤と前記少なくとも１種類の遺伝物質とを共役させることを特徴とする組成物。
【請求項３】
天然の消化管経路を介して宿主に遺伝物質を投与することによって、治療剤の細胞内発現を可能にするための組成物であって、
前記天然の消化管経路内で前記遺伝物質を保護するために効果的な少なくとも１種類の化合物と、
前記天然の消化管経路を介して遺伝物質を輸送するために効果的な少なくとも１種類の輸送剤と、
治療剤の細胞内発現に効果的な少なくとも１種類の遺伝物質とを組み合わせて含み、
前記天然の消化管経路を通過した後の細胞内取り込みの結果として広範な分布、全身的送達、および持続性発現を可能にするのに効果的な方法で、前記輸送剤と前記少なくとも１種類の遺伝物質とを共役させ、
それによって、前記細胞内取り込みの後に前記治療剤の細胞内発現が生じることを特徴とする組成物。
【請求項４】
前記輸送剤が、それと共役した前記遺伝物質の広範な生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）分布を促進するアミン基を含有する化合物であることを特徴とする請求項１または２または３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
前記輸送剤がポリペプチドであることを特徴とする請求項１または２または３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６】
前記遺伝物質が完全な転写単位を含むことを特徴とする請求項１または２または３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７】
前記完全な転写単位が前記治療剤の偏在性発現に効果的であることを特徴とする請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記完全な転写単位が組織特異的発現に効果的であることを特徴とする請求項６記載の組成物。
【請求項９】
天然の消化管経路を経由して宿主内で治療剤を発現させる方法であって、
前記天然の消化管経路を介して、輸送剤と共役する遺伝物質の広範な分布、全身的発現、および持続性送達を可能にするために効果的な少なくとも１種類の輸送剤を与えることと、
前記治療剤の細胞内取り込みのうえ、前記治療剤の細胞内発現を可能にするように構築および配置された少なくとも１種類の遺伝物質を与えることと、
前記消化管経路を介して細胞内吸収されて、広範な分布、全身的送達、および持続性発現を生むのに効果的な方法で、前記輸送剤と前記少なくとも１種類の遺伝物質とを共役させることによって、分布可能成分を形成することと、
前記分布可能成分を投与することと、
前記天然の消化管経路を介して生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で前記分布可能成分を輸送することによって前記成分が前記被験体の本質的に全ての細胞内に内包されることと、
細胞内吸収後に前記治療剤を発現させることとを含み、
望ましい生物学的効果が誘発されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記発現させるステップが偏在性であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記発現させるステップが組織特異的であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記天然の消化管経路内で前記遺伝物質を保護するために効果的な少なくとも１種類の化合物を与えることをさらに含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝物質が少なくとも１種類の完全な転写単位を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１４】
前記輸送剤がポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１５】
前記輸送剤がアミン基を含有する化合物であり、前記遺伝物質と共役して前記治療剤の広範な分布、全身的発現、および持続性送達を可能にするように構築および配置されていることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１６】
前記共役が静電結合を介するものであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、経口投与を介した生体への活性剤の投与に関し、特に、輸送剤と共役させた活性／治療剤の有効な投与に関する。さらに詳細には、ポリペプチド担体と効果的に共役させた際の経口投与を介した治療剤の広範な分布、全身的発現、および持続性送達とに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子療法は、種々の症状、特に、様々な細胞および組織に影響を及ぼす遺伝疾患および後天性疾患に対する現在利用可能な治療法に選択肢を与える。自己の遺伝子組み換え細胞のインプランテーションにもとづく生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）アプローチが存在する。ウイルス・ベクターにもとづく複数の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）遺伝子療法プロトコールが既知であるとはいえ、安全に関する問題がいくつかある。経口遺伝子送達が試みられているが、多くの場合、胃および消化管でのＤＮＡの大規模な分解のためにほとんど成功していない。リポソーム配合物を保護剤として使用することによる経口遺伝子療法の試みは、送達効率が比較的低いという点で制限はあるが成功を収めている。
経口投与を介したＤＮＡの分布を目的とした種々の方法が試みられてきたが、先当業者らは、経口投与を介して全ての器官および組織にわたるＤＮＡの広範な分布を可能にする方法および装置によって、持続的かつ効率的なタンパク質の発現を成し遂げることを発見していない。
【０００３】
従来技術の説明
クオング（Ｑｕｏｎｇ）他は、「キトサンまたはポリ−リジン被覆アルギニン酸塩ビーズ内での、カプセル外ヌクレアーゼからのＤＮＡ保護（ＡＤＮＡ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ｗｉｔｈｉｎ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｏｒ  Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ−ｃｏａｔｅｄ  Ａｌｇｉｎａｔｅ  Ｂｅａｄｓ＠）」と題された論文（バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、第６０巻、第１号、１０／９８、１２４〜１３４頁（非特許文献１）内で、カルシウムの内部または外部ソースのいずれかを用いて、アルギン酸塩マトリックス内でＤＮＡを固定した後にキトサンまたはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）で膜を被覆することを開示している。Ｑｕｏｎｇ他がおこなった研究によって、ＰＬＬ被覆が、非被覆ビーズと比べて、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でＤＮアーゼに対するＤＮＡの保護を高めることが結論付けられた。
【０００４】
ワード（Ｗａｒｄ）他（血液（Ｂｌｏｏｄ）、２００１年４月１５日、第９７巻、第８号、２２２１〜２２２９頁（非特許文献２）は、体循環が可能な静脈内形式の遺伝子療法を対象とする。ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）の複合体を、標的リガンドと該ＰＬＬとを共有結合させることによって生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で種々の細胞系を標的とさせ、導入遺伝子発現を生じる。Ｗａｒｄは、これらの複合体の循環半減期は乏しいので、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ではほとんど使用できないとして特徴付けている。Ｗａｒｄはさらに、複合体が生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でヒト補体を活性化して免疫系を刺激するので、このことが複合体の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での乏しい半減期の説明となる可能性が最も高いとして理論付けている。したがって、この研究によっては、この方法論を介したいずれの形式の広範な導入遺伝子分布または発現（タンパク質、抗体、または該導入遺伝子にコードされる産物の）も開示されていない。
【０００５】
ロスバード（Ｒｏｔｈｂａｒｄ）他（ネイチャー・メディスン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第６巻、第１１巻、２０００年１１月、１２５３〜１２５７頁（非特許文献３）は、アルギニンおよびシクロスポリン−Ａを複合して、角質層を越えることによって表皮に入る上で有用な化合物を形成することを開示している。開示されている方法は、シクロスポリン−Ａ単独のときとは異なり、真皮のＴリンパ球に到達し皮膚炎症を抑制することが可能な複合体を形成する上で有用である。この参考文献は、アルギニンへのＤＮＡの複合を教示または示唆しておらず、いずれの種類の複合アルギニンの経口摂取についても何ら考察していない。
【０００６】
ウエンダー（Ｗｅｎｄｅｒ）他（米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、１１／２１／２０００、第９７巻、第２４号、１３００３〜１３００８頁（非特許文献４）は、ポリグアニジンぺプトイド誘導体を開示しており、該ポリグアニジンぺプトイド誘導体は、細胞内取り込みによって明示されるような効率的な分子トランスポーターであるアルギニン・オリゴマーの側鎖の１，４−主鎖スペーシングを保存する。これらのぺプトイドが、細胞への薬剤、薬剤候補、および作用物質の分子送達に効果的なトランスポーターとして働くことが示唆される一方で、それにもかかわらず、この参考文献は、この経路を介した経口送達の概念には言及しておらず、活性成分（例えば、ＤＮＡまたは薬剤）とポリグアニジンぺプトイド誘導体との複合体の形成を開示していない。
【０００７】
本発明者らの１人は、遺伝子療法に関する一連の論文の共著者である。ヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）（６：１６５−１７５（１９９５年２月）（非特許文献５）アル・ヘンディー（Ａｌ−Ｈｅｎｄｙ他）内の論文では、成長ホルモン欠損スネル（Ｓｎｅｌｌ）矮小マウスへマウス成長ホルモンを分泌するカプセル化された筋芽細胞の使用を介した非自己体細胞の遺伝子療法が開示されている。免疫保護的アルギニン酸塩・ポリ−Ｌ−リジン・アルギン酸塩マイクロカプセルを用いて、組み換え型同種異系細胞をインプランテーション後の拒絶反応から保護した。経口遺伝子療法については、考察されておらず、示唆されてもいない。
【０００８】
血液（Ｂｌｏｏｄ）、第８７巻、第１２号、１９９６年６月１５日、５０９５〜５１０３頁（非特許文献６）で、ホルテラノ（Ｈｏｒｔｅｌａｎｏ）他は、カプセル化された組み換え型筋芽細胞の使用によるヒト第ＩＸ因子の送達を開示している。アルギン酸塩・細胞混合物の小滴は、塩化カルシウム溶液中で回収された。接触させると、該小滴はゲル化した。続いて、外側のアルギン酸塩層をポリ−Ｌ−リジン臭化水素塩（ＰＬＬ）と架橋結合し、その後別のアルギン酸塩層と架橋結合した。その後、残存する遊離アルギン酸塩コアをクエン酸ナトリウムで溶解し、細胞を含有するアルギン酸塩・ＰＬＬ・アルギン酸塩膜を有するマイクロカプセルを生成した。同様の技術は、アウレイＡｗｒｅｙ他、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、第５２巻、４７２〜４８４頁（１９９６）（非特許文献７）、ペイローン（Ｐｅｉｒｏｎｅ）他、  異なるアルギン酸マイクロカプセルへの種々の組み換え型ほ乳類細胞種のカプセル化法（Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｙｐｅｓ  ｉｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ａｌｇｉｎａｔｅ  Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ、ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアル・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）４２（４）：５８７−５９６，  １９９８（非特許文献８）、および血友病（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ）（２００１）、７、２０７−２１４（非特許文献９）に開示されている。これらの参考文献は、経口経路を介した遺伝子療法の送達用の免疫分離装置の使用については開示または示唆していない。
【０００９】
バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１７（２）（１９９９年２月（非特許文献１０）内のチャング（Ｃｈａｎｇ）他、チブテック／トレンズ（Ｔｉｂｔｅｃｈ／Ｔｒｅｎｄｓ）による「マイクロカプセル化組み換え細胞によるヘテロ・タンパク質のイン・ビボ送達」（”Ｔｈｅ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ”）と題された論文では、クレブシエラ・アエロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ウレアーゼ遺伝子を発現するように操作されたマイクロカプセル化大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）を用いて、経口投与をおこなった。消化管を経由した生存細菌の通過により、尿素の排除が可能になり、それによって血漿尿素濃度を低下させると判明したということが開示されている。この開示は、経口遺伝子療法の使用によって、経口経路を介したＤＮＡの広範な拡散が生じることを示唆していない。
【００１０】
ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）他「遺伝子および薬物送達剤としての新規アミノ酸をベースとした高分子ベシクルの予備的特性評価」（“Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｂａｓｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｓ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ａｇｅｎｔｓ”）（（バイオコンジュゲート・ケム）（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）２０００、１１、８８０−８９１（非特許文献１１）は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での細胞への遺伝子送達の手段としてポリエチレングリコール修飾を有するポリ−Ｌ−リジンを用いた両親媒性高分子マトリックスの形成を教示している。この開示は、ＰＬＬ・ＰＥＧ小胞内に組み込んで、生存細胞へＤＮＡを輸送することを対象とする。この開示は、経口投与について教示しておらず、本発明の教示にしたがったＤＮＡ輸送剤として使用するのに適したポリペプチドと組み合わせたＧＩ管（消化管）プロテクター（例えば、アルギン酸塩）の組合せについても教示していない。
【００１１】
レオング（Ｌｅｏｎｇ）他「キトサンＤＮＡナノ粒子による経口遺伝子送達がピーナッツ・アレルギーのネズミ・モデルで免疫保護を生ずる」（“Ｏｒａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｗｉｔｈ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ−ＤＮＡ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  Ｏｆ  Ｐｅａｎｕｔ  Ａｌｌｅｒｇｙ”）（ネイチャー・メディスン）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第５巻、第４号、１９９９年４月、３８７〜３９１頁（非特許文献１２）は、ピーナッツ抗原へのアレルギー応答を処置するために、プラスミドＤＮＡをキトサンと複合して合成された経口摂取用のキトサン／ＤＮＡナノ粒子について開示している。この参考文献は、染色が胃および小腸内での遺伝子発現のみしか示していないという点で広範な分布を示していない。
【００１２】
米国特許第６，２１７，８５９号（特許文献１）は、疾患が原因の望ましくない化学物質またはアミノ酸の除去のための患者への経口投与用の組成物を開示している。該組成物は、望ましくない化学物質またはアミノ酸を除去することができる補足またはカプセル化された微生物を含む。このカプセルは、キトサン・アルギン酸塩およびアルギン酸塩・ポリリジン・アルギン酸塩化合物を内包した種々の高分子、エラストマ−等を含む。
【００１３】
米国特許第６，１７７，２７４号（特許文献２）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）融合ポリ（Ｌ−リジン）および標的成分からなる標的遺伝子送達のための化合物を対象とする。この発明の同義遺伝子担体は、核酸との安定かつ可溶性の複合体を形成することができ、さらに該複合体は、細胞を効率的に形質転換することができる。この参考文献は、ＤＮＡを含む複合体について、あるいはその経口送達のために該複合体を使用することについても示唆または開示していない。
【００１４】
米国特許第６，２５８，７８９号（特許文献３）は、ほ乳類被験体の血流へ分泌タンパク質を送達する方法を対象とする。開示されている方法では、ほ乳類被験体の腸上皮細胞を遺伝子改変し、所望の効果を有するタンパク質を発現する遺伝子を作用自在に組み込む。この発明の方法は、好ましくは経口経路によって、消化管へＤＮＡを含有する配合物を投与することを含む。発現された組み換え型タンパク質は、血流に直接分泌される。特に興味深いことは、該発明の方法の用いることによって、短期間、例えば２ないし３日間、血流への遺伝子産物の送達が得られることである。
【００１５】
米国特許第６，２５５，２８９号（特許文献４）は、分泌腺細胞、特に膵臓および唾液腺細胞を遺伝子改変し、ほ乳類被験体に所望の治療効果を発揮するタンパク質を発現する遺伝子を作用自在に組み込む方法を開示している。発現されたタンパク質は消化管および／または血流に直接分泌され、該タンパク質の治療的血中濃度を得ることによって、このタンパク質を必要とする患者の処置をする。形質転換された分泌腺細胞によって、特定のタンパク質の欠損に関連する疾患またはタンパク質の過剰発現による処置に反応する疾患に対して長期間の治療学的治癒が得られる。
【００１６】
米国特許第６，２２５，２９０号（特許文献５）は、ほ乳類被験体の腸上皮細胞を遺伝子改変し、所望の治療効果を有するタンパク質を発現する遺伝子を作用自在に組み込む方法を開示している。主に裸ＤＮＡから構成される配合物を投与することによって腸細胞形質転換を達成する。経口投与経路または他の消化管内投与経路によって投与方法が得られ、一方で、裸核酸の使用によって、ウイルス・ベクターの使用に関連する合併症を回避して、遺伝子療法を達成する。発現されたタンパク質は、消化管および／または血流に直接分泌され、該タンパク質の治療的血中濃度を得ることによって、このタンパク質を必要とする患者の処置をする。形質転換された腸上皮細胞によって、特定のタンパク質の欠損に関連する疾患またはタンパク質の過剰発現による処置に反応する疾患に対する短期または恐らく長期の治療学的治癒（例えば、約２ないし４日までの短期間、一方で、腸管絨毛内での組み込みよって、恐らく数週間または数ヶ月の長期間続くと理論付けられている）が得られる。しかし、この発現は、消化管内に制限されているので、発現物の分布を血流に退け、そこで免疫系を介した該発現物の免疫原性応答およびその結果の中和が問題となることに注意する。
【００１７】
米国特許第５，８３７，６９３号（特許文献６）は、唾液腺発現による静脈内ホルモン・ポリペプチド送達を対象とする。分泌腺細胞、特に膵臓および唾液腺細胞を遺伝子改変し、ほ乳類被験体に所望の効果を発揮するタンパク質を発現する遺伝子を作用自在に組み込む。発現されたタンパク質は、消化管および／または血流に直接分泌されうる。形質転換された分泌腺細胞によって、特定のタンパク質の欠損に関連する疾患またはタンパク質の過剰発現による処置に反応する疾患に対する治療学的治癒が得られる。
【００１８】
米国特許第５，８８５，９７１号（特許文献７）は、分泌腺発現による遺伝子療法を対象とする。分泌腺細胞、特に膵臓および唾液腺細胞を遺伝子改変し、ほ乳類被験体に所望の治療効果を発揮するタンパク質を発現する遺伝子を作用自在に組み込む。発現されたタンパク質は消化管および／または血流に直接分泌され、該タンパク質の治療的血中濃度を得ることによって、このタンパク質を必要とする患者の処置をする。形質転換された分泌腺細胞によって、特定のタンパク質の欠損に関連する疾患またはタンパク質の過剰発現による処置に反応する疾患に対する長期の治療学的治癒が得られる。
【００１９】
米国特許第６，００４，９４４号（特許文献８）は、分泌腺発現を介したタンパク質送達を対象とする。分泌腺細胞、特に膵臓、肝臓、および唾液腺細胞を遺伝子改変し、ほ乳類被験体に所望の治療効果を発揮するタンパク質を発現する遺伝子を作用自在に組み込む。発現されたタンパク質は血流に直接分泌され、該タンパク質の治療的血中濃度を得ることによって、このタンパク質を必要とする患者の処置をする。形質転換された分泌腺細胞によって、特定のタンパク質の欠損に関連する疾患またはタンパク質の過剰発現による処置に反応する疾患に対する長期または短期の療法が得られる。
【００２０】
米国特許第６，００８，３３６号（特許文献９）は、圧縮させた核酸および細胞への該核酸の送達に関する。核酸を実質的に凝結なしで圧縮し、圧縮物質が投与される生体の標的細胞による取り込みを促進する。該核酸は、標的遺伝子が置換、修飾、または欠失されるように遺伝子発現、発現が望まれない内因性核酸へのハイブリダイゼーション、または部位特異的組み込みの結果として臨床効果を達成しうる。標的細胞結合部によって、ターゲッティングを高めることが可能である。核酸は、好ましくは、縮合状態に圧縮される。一実施形態では、核酸複合体は、単一の二本鎖ｃＤＮＡ分子および１個以上のポリリジン分子から本質的になり、上記ｃＤＮＡ分子は、少なくとも１種類の機能性タンパク質をコードし、上記複合体は、縮合球の形状で、１：１電荷比を与える上記単一のｃＤＮＡ分子と十分な数のポリリジン分子との複合体の理論上の最小直径の２倍未満の直径に圧縮され、該核酸複合体を脂質と結合させる。
【００２１】
米国特許第６，２８７，８１７号（特許文献１０）は、ｐＩｇＲおよびＡ１ＡＴに向けられる抗体からなるタンパク質複合体を開示しており、これは上皮細胞の側底表面から頂端表面に特異的に輸送され得る。このアプローチは、適当なリガンドでｐＩｇＲをターゲッティングすることによって治療用タンパク質を上皮の頂端表面へ直接送達する能力を提供する。
【００２２】
米国特許第６，２６１，７８７号（特許文献１１）は、治療用分子と、トランスサイトーシス受容体に特異的に結合するリガンドとからなる二機能性分子について記載している。上記ニ機能性分子は、上皮細胞の側底表面から頂端表面へと特異的に輸送されうる。このアプローチは、適切なリガンドでトランスサイトーシス受容体をターゲッティングすることによって、治療用分子を上皮の頂端表面に直接送達する能力を提供する。
【００２３】
米国特許第５，８７７，３０２号（特許文献１２）は、圧縮された核酸および細胞への該核酸の送達を対象とする。核酸を実質的に凝結なしで圧縮し、圧縮物質が投与される生体の標的細胞による取り込みを促進する。該核酸は、標的遺伝子が置換、修飾、または欠失されるように遺伝子発現、発現が望まれない内因性核酸へのハイブリダイゼーション、または部位特異的組み込みの結果として臨床効果を達成しうる。標的細胞結合部、例えばポリリジンによって、ターゲッティングを高めることが可能である。核酸は、好ましくは、縮合状態に圧縮される。
【００２４】
米国特許第６，１５９，５０２号（特許文献１３）は、微粒子用の経口送達系に関する。宿主の循環またはリンパ排液系への物質または物質群の経口送達のための複合体および組成物が開示されている。この発明の複合体は、少なくとも１つの担体と共役させた微粒子を含み、該担体は、宿主の粘膜上皮および微粒子捕捉またはカプセル化を介して循環またはリンパ排液系に上記複合体を輸送することができるか、あるいは上記物質（群）を捕捉またはカプセル化することができる。好適な担体の例は、粘膜結合タンパク質、細菌付着因子、ウイルス付着因子、毒素結合サブユニット、レクチン、カストル内因子に結合活性を保持するビタミンＢ１２およびビタミンＢ１２の類似体または誘導体である。この発明は、捕捉またはカプセル化を要する点で本発明はとは異なり、本開示の発明の新規特徴である広範な分布、全身的発現、または持続性送達を確保または可能にしない。  
【００２５】
米国特許第６，０１１，０１８号（特許文献１４）は、標的遺伝子の調節された転写および他の生物学的事象を開示している。タンパク質の二量体化およびオリゴマー化は、細胞膜受容体、転写因子、小胞融合タンパク質、ならびに細胞内および細胞外タンパク質の他のクラスの活性化に寄与する通常の生物的防除メカニズムである。特許権所有者は、細胞内タンパク質の調節された（誘導性の）ニ量体化またはオリゴマー化の基本手順を開発した。基本的に、任意の２種類の標的タンパク質を誘導して、該タンパク質を保有する細胞または生体の処置により細胞浸透性合成リガンドと結合させることができる。調節された細胞内タンパク質と、これらの細胞浸透性合成リガンドとの結合によって、生物学的研究および医学、特に遺伝子療法での新たな可能性が提供されると考えられている。遺伝子送達技術を用いて、これらの人工受容体を導入することによって、治療用タンパク質の過剰発現に至るシグナル伝達経路を、経口活性「二量体化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）」または「脱ニ量体化剤（ｄｅ−ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）」によってそれぞれ開始または停止可能であることが示される。異なるレシピエント由来の細胞を、種々の疾患で用いるための異なる治療用タンパク質を該経路が過剰発現するように構成することができるので、二量体化剤は、「万能薬剤（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｄｒｕｇ）」として働く潜在性を有する。該ニ量体化剤は、治療アンチセンス剤に対する、さもなければ静脈内注射または細胞内発現を要するタンパク質（例えば、ＬＤＬ受容体またはＣＦＴＲタンパク質）に対する、細胞浸透性の有機的代用物としてとらえることもできる。
【００２６】
当該技術分野に欠けているものは、ａ）ターゲッティング被験体の本質的に全ての細胞へのＤＮＡ等の治療剤の広範な送達および分布と、ｂ）全身にわたる実質的に全ての器官および細胞系での細胞内取り込みを介した、単一投与からの上記治療剤によって治療成分の持続性（例えば、非一過性）発現を与える（遍在的に、または組織特異的様式で）能力と、ｃ）不必要な免疫応答を誘発しないこととを達成することができる経口送達可能組成物である。
【特許文献１】米国特許第６，２１７，８５９号
【特許文献２】米国特許第６，１７７，２７４号
【特許文献３】米国特許第６，２５８，７８９号
【特許文献４】米国特許第６，２５５，２８９号
【特許文献５】米国特許第６，２２５，２９０号
【特許文献６】米国特許第５，８３７，６９３号
【特許文献７】米国特許第５，８８５，９７１号
【特許文献８】米国特許第６，００４，９４４号
【特許文献９】米国特許第６，００８，３３６号
【特許文献１０】米国特許第６，２８７，８１７号
【特許文献１１】米国特許第６，２６１，７８７号
【特許文献１２】米国特許第５，８７７，３０２号
【特許文献１３】米国特許第６，１５９，５０２号
【特許文献１４】米国特許第６，０１１，０１８号
【非特許文献１】クオング（Ｑｕｏｎｇ）他：バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、第６０巻、第１号、１０／９８、１２４〜１３４頁
【非特許文献２】ワード（Ｗａｒｄ）他：血液（Ｂｌｏｏｄ）、２００１年４月１５日、第９７巻、第８号、２２２１〜２２２９頁
【非特許文献３】ロスバード（Ｒｏｔｈｂａｒｄ）他：ネイチャー・メディスン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第６巻、第１１巻、２０００年１１月、１２５３〜１２５７頁
【非特許文献４】ウエンダー（Ｗｅｎｄｅｒ）他：米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、１１／２１／２０００、第９７巻、第２４号、１３００３〜１３００８頁
【非特許文献５】アル・ヘンディー（Ａｌ−Ｈｅｎｄｙ）他：ヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）（６：１６５−１７５（１９９５年２月）
【非特許文献６】ホルテラノ（Ｈｏｒｔｅｌａｎｏ）他：血液（Ｂｌｏｏｄ）、第８７巻、第１２号、１９９６年６月１５日、５０９５〜５１０３頁
【非特許文献７】アウレイＡｗｒｅｙ他：バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、第５２巻、４７２〜４８４頁（１９９６）
【非特許文献８】ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアル・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）４２（４）：５８７−５９６，  １９９８
【非特許文献９】血友病（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ）（２００１）、７、２０７−２１４
【非特許文献１０】チャング（）Ｃｈａｎｇ他：バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１７（２）（１９９９年２月）
【非特許文献１１】ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）他：バイオコンジュゲート・ケム（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）２０００、１１、８８０−８９１
【非特許文献１２】レオング（Ｌｅｏｎｇ）他：ネイチャー・メディスン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第５巻、第４号、１９９９年４月、３８７〜３９１頁
【非特許文献１３】アガルワル（Ａｇｇａｒｗａｌ）他：カナダ獣医学研究誌（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９９、６３：１４８−１５２
【非特許文献１４】マチオウィッツ（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ）他：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３８６巻、１９９７年３月、４１０〜４１４頁
【非特許文献１５】ゾウ（Ｚｈｏｕ）他：ウイルス学雑誌（Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）  １９９９年１１月；７３（１１）：９４６８−７７
【発明の開示】
【００２７】
発明の要約
本発明は、組成物と、治療剤の非侵襲性投与方法とを対象とする。さらに詳細には、本発明は、経口遺伝子療法の投与で用いるための組成物と、その生産および使用方法とを開示する。
様々な障害によって、効率的な経口遺伝子療法プロトコールが妨げられてきた。主な障害は、摂取されたＤＮＡの大規模な分解である。このかわりに、例えばキトサン、コラーゲン、アルギン酸塩等の使用を介して、消化管に位置する際の裸ＤＮＡを破壊から保護することによって、消化管を介したＤＮＡの限定的な吸収が可能になるとはいえ、送達範囲には制限があり、発現が乏しい。
【００２８】
経口投与を介して最大限の分布および効果を達成するためには、ＤＮＡが保護的な被覆を要することが確認されている。例えば、アルギン酸塩は、消化管内での保護を与える手段である。さらに、輸送中の不必要なまたは望ましくない免疫原性応答を誘発することなしに、天然の経路を介してＤＮＡを輸送することができる輸送剤が必要とされる。該輸送剤は、その最も広義では、上記天然消化管経路を通過した後の効果的かつ広範な分布および細胞内取り込みを生むために効果的な方法で、ＤＮＡ（または他の治療剤）と共役することができるアミン基を含有する任意の化合物でありうる。したがって、治療剤と輸送剤とのそのような共役は、その効果的かつ広範な吸収、分布、および発現を可能にする。特に好ましい実施形態では、輸送剤は、好ましくはポリペプチドまたはその修飾（例えばアミノ酸の修飾）であるが、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）分布を効果的に可能にするアミン基および酸性基を有する任意の化合物でもよい。治療剤、例えばＤＮＡの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での効率的かつ広範な分布を達成するためには、輸送剤が必要である。したがって、好ましい実施形態では、本開示の配合物は、例えば静電結合を介してＤＮＡをアミノ基と共役させ、一方で、例えばアルギン酸塩または等価の保護化合物を用いて消化管内での分解からＤＮＡを保護する。このような配合物としては、例えばナノ粒子形態でポリ−Ｌ−リジンと架橋結合させたアルギン酸塩が説明的に例示できる。本発明者らは、ＰＬＬなしでゼラチンまたはアルギン酸塩を用いることによって、または裸ＤＮＡの投与によってでさえも、ＧＩ管でＤＮＡを保護するだけで限定的な発現が可能であることを示したが、効果は明らかに大分低くなるので、保護剤および輸送剤（例えば、アルギン酸塩／ＰＬＬ）を内包することが最も好ましい。
【００２９】
ＤＮＡマイクロカプセルを作製するためには、最初に、ＤＮＡを、アルギン酸塩か、または該ＤＮＡに対してＧＩ管保護をもたらす同様の特性を有する化合物と混合し、その後、該カプセル内部でＤＮＡ・アルギン酸塩を物理的に形成し、続いて輸送剤（例えば、ＰＬＬ）を添加して、輸送剤が治療剤を特異的にカプセル化することがないが輸送剤とＤＮＡとの間で複合または共役が生じるような方法で、アルギン酸塩ビーズを架橋結合する。輸送剤、例えばＰＬＬの存在が欠けると、我々の実験によれば、広範な分布または送達がなく、全身的または持続性発現もないことが示されている。このことは、輸送剤と治療剤との相互作用または共役がカプセル内で生じるという理論を証明し、それによって、全ての主要器官へのＤＮＡの分布における本開示のマイクロカプセルの効果が説明される。
【００３０】
特異的な器官に遺伝子発現を制限する組織特異的な遺伝子調節因子（プロモーター）を用いることによって、治療用遺伝子の組織特異的発現を達成することができる。プロモーターを適切に用いることによって、発現度を特定の要求に合わせることが可能である。例えば、偏在性プロモーターであるβアクチンの使用によって、広範な発現を達成する。また、限定はされないが、アルブミン・プロモーター（肝臓発現）、筋肉発現のための筋肉クレアチン・キナーゼ（ＭＣＫ）、および角化細胞（皮膚発現）として例示される組織特異的な遺伝子調節因子（プロモーター）の使用によって、身体の特定の所望の部分でタンパク質を発現させる能力が提供される。
【００３１】
したがって、本発明の目的は、経口経路を介して、生体の実質的に全ての細胞に、完全な転写単位（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）または細胞内で完全な転写単位を可能にする成分（例えば、適当なプロモーターおよびとポリアデニル化シグナルと共役させたＦＩＸｃＤＮＡ）の全身的送達を提供することである。
【００３２】
本発明の別の目的は、適切なプロモーター選択と組み合わせた上記の完全な転写単位を介した治療成分の制御可能な発現（例えば、偏在性または組織特異的発現）を提供することである。
【００３３】
本発明のさらに別の目的は、治療成分の適当な発現と組み合わせた種々の器官へのＤＮＡおよびＲＮＡの所望どおりの送達を提供することであり、該種々の器官としては、限定はされないが、心臓、筋肉、肺、皮膚、腎臓、肝臓、脳、および脾臓が挙げられる。
【００３４】
本発明の別の目的は、遺伝子療法によって遺伝性の遺伝病（例えば、血友病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、糖尿病等）を処置する方法と、例えば標的成分の使用を介した治療用遺伝子または薬剤の送達、例えば腫瘍部位へ直接送達することによって、予防および処置が得られる後天性疾患、感染症、例えば癌、エイズ等に対する方法とを提供することである。
【００３５】
この発明の他の目的および利点は、この発明の特定の実施形態について図示および例によって説明する添付の図面と組み合わせた以下の記載から明らかになるであろう。図は、この明細書の一部分を構成し、本発明の好例の実施形態を含み、かつその種々の目的および特徴を説明する。
【００３６】
図面の簡単な説明
本発明の好例の実施形態を説明する添付図面は、
図１は、肝臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図２は、腎臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図３は、肺での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図４は、心臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図５は、筋肉での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図６は、皮膚での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図７は、血管での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図８は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイのグラフ分析を表す。
図９は、ＧＦＰ  ＤＮＡを供給され摂取後４２日目に屠殺されたマウスの器官のＰＣＲ増幅および分析のグラフ図である。
図１０は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた十二指腸での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図１１は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた空腸での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図１２は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた回腸での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図１３は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた結腸での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図１４は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた肝臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図１５は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた脾臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図１６は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた腎臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図１７は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた肺での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図１８は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた心臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図１９は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた筋肉での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図２０は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた膵臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図２１は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた脳での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図２２は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた生殖腺での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図２３は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた皮膚での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図２４は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた血管での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図２５は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた骨髄での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図２６は、処置マウスのｈＧＨの濃度を示すグラフ図である。
図２７は、ｈＧＨ生成後に抗ｈＧＨ抗体が検出されなかったことを示す。
図２８は、アルブミン・プロモーターを用いた肝臓での組織特異的発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図２９は、代替的な技術を用いて達成されたｈＧＨの濃度を比較する棒グラフである。
図３０は、代替的な技術を用いて達成されたｈＧＨの濃度の経時的なグラフ分析である。
図３１は、代替的な技術を用いて達成された種々の器官でのｈＧＨの存在を示す。
図３２は、代替的な技術を用いて達成されたｈＧＨ濃度に起因する体重増加を図示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
この発明の主な目的は、消化管を介して化合物（限定はされないが、本明細書で説明目的のためにＤＮＡとして例示される）を運搬し、かつ全身にわたるその広範な分布および全身的かつ持続性発現を可能にする目的の輸送剤の経口投与であり、該輸送剤は、限定はされないが、アミノ酸担体、例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、およびポリオルニチンとして例示される。
【００３８】
該化合物、例えばＤＮＡを、消化管を介して最も高い可能な程度の効果で分布可能にするためには、胃および小腸を通過する際の酵素分解および低ｐＨから化合物を保護するべきである。好ましい実施形態では、このことを、アルギン酸塩、ゼラチン（主にコラーゲン）等に例示される保護化合物を用いることによって達成する。
胃を通過する間に主要配合物（ＤＮＡ・アミノ酸複合体）を保護する上でのアルギン酸塩、ゼラチン、およびコラーゲンの役割は、ＤＮＡの完全性を確実にする（それによって、送達効果の達成を容易にする）ために重要であるが、キトサン、メタクリ酸塩、または代替的に、製薬業界に用いられる１種類以上の従来の経口送達系（例えば、分解可能カプセル、ゲル等）等の別の配合物ともに上記役割を達成することもできる。
【００３９】
本発明者らは、直鎖状非共役（Ａｎａｋｅｄ＠）ＤＮＡも、ゼラチン（コラーゲン）等で適当に保護される場合、腸壁を通って取り込まれ、全ての組織ではないが特定の組織で発現することを確認した。しかし、この場合、ａ）裸ＤＮＡの送達および発現の効果は、非常に低いことと、ｂ）従来技術で記載されるＤＮＡの経口送達を完全なものにするための試みと一致する該効果が長く続かないこととを識別することが重要である。したがって、本発明者らは、輸送剤への効果的な共役なしで限定的な成果を達成した一方で、このことは、依然として本発明の好ましくない実施形態である。さらに、好ましく、かつ最も効果的な消化管経路は、経口送達を介するものである一方で、実際は、消化管経路を介した投与の代替経路として直腸送達が本発明者らにより考察される。
【００４０】
上記で指摘したように、アルギン酸塩・ポリ−Ｌ−リジン・マイクロカプセル内のＤＮＡのカプセル化がすでに記載されているが、先当業者らは、上記天然の消化管経路を経由して通過後の効果的かつ広範な分布および細胞内取り込みを生むのに効果的な方法で、例えば静電結合によって治療剤を輸送剤と共役することの重要性を評価しなかった。本発明者らは、好ましくは負電荷を持つ治療剤（例えば、ＤＮＡ）と結合する正電荷を持つアミノ酸を用いることによって、静電結合を利用する実施形態を例示したが、本発明で使用するために別の結合技術が考察される。任意の輸送剤は、上記天然の消化管経路を経由して通過後の効果的かつ広範な分布および細胞内取り込みを生むのに効果的な方法で、治療剤と該輸送剤とを共役させることを提供する本発明の文脈で有用であると考えられている。この発明の文脈内で有用であると考察される別の輸送剤としては、限定はされないが、変化させた電荷を持つアミノ酸、化学的に修飾した化合物またはアミノ酸、あるいは本明細書に記載される天然の輸送経路を利用するための必要な機能分類を有する合成分子が挙げられる。
【００４１】
アガルワル（Ａｇｇａｒｗａｌ）他、カナダ獣医学研究誌（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９９、６３：１４８−１５２（非特許文献１３）およびマチオウィッツ（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ）他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３８６巻、１９９７年３月、４１０〜４１４頁（非特許文献１４）等の先当業者らはそれぞれ、ＤＮＡ等の作用物質を含有する遺伝物質の経口薬剤送達の手段として生物分解性ミクロスフィアおよび生物学的粘着性ミクロスフィアの使用について教示している。これらの当業者らは、本発明により概説されるような輸送剤の使用については認識または追及せず、本発明の概念の特徴である広範な、全身的、かつ持続性送達および発現を促進するように輸送剤と治療剤を共役させることの重要性を認識していなかった。対照的に、望ましい分布、送達、効果、または発現を達成していない一方で、それにもかかわらず、先当業者らは、本教示の発明を介して克服される必要条件である治療剤のカプセル化を要した。
【００４２】
マチオウィッツ（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ）他は、フマル酸およびセバシン酸の組合せのポリ無水物を用いて、プラスミドＤＮＡ（β−ガラクトシダーゼ）をカプセル化した。しかし、該論文の図５に明示されるように、組織抽出物内のβ−ガラクトシダーゼ活性の定量は、胃または肝臓で有意な活性を示さなかったが、腸内で測定可能な活性を示した。このことは、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚの技術が、他の器官内での送達および／または発現を可能にするように胃を介した輸送を証明することができないことを示す。
【００４３】
Ａｇｇａｒｗａｌの実施形態の相対的効果を確認するために、本発明（アルギン酸塩・ＰＬＬ・ＤＮＡ）ナノ粒子（以下、アルギン酸塩配合物と呼ぶ）にしたがった配合物と、Ａｇｇａｒｗａｌに記載されるような内部ゲル化によって作製されるアルギン酸塩・ＰＬＬマイクロカプセル（以下、カノーラ・カプセル（カノーラ油を用いて作製）と呼ぶ）との間で比較研究を実行した。
単一用量の本発明にしたがったアルギン酸塩・ＤＮＮ・ＰＬＬナノ粒子内のヒト成長ホルモンｃＤＮＡを含有するＤＮＡプラスミド１００マイクログラムをＣ５７ＢＬ／６マウスに経口投与した。マウス（ｎ＝３）の第２群は、カノーラ・カプセル内の同じプラスミドを受けた。これらのマウスそれぞれは、アルギン酸塩配合物で与えられた１００マイクログラムの代わりにＤＮＡ３００マイクログラム（３倍多いＤＮＡ）を受けたことに注意する。マウスの対照群は何も受けなかった。
【００４４】
マウスは、０日、３日、および５日目に出血した（アガルワル（Ａｇｇａｒｗａｌ）他により確認された結果を再現するために５日目までの発現を比較）。
処置後５日目のマウス血清内のヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の濃度をＥＬＩＳＡ（ＵＢＩ社（ＵＢＩ  Ｉｎｃ．，  ＮＹ））によって測定した。
アルギン酸塩配合物を受けたマウスは、血清中に比較的に高濃度のｈＧＨを有した。対照的に、カノーラ・カプセルを受けたマウス内では、この配合物を受けたマウスはアルギン酸塩配合物を受けたマウスよりも３倍多くＤＮＡを投与されたにもかかわらず、５日目にｈＧＨは検出されなかった。予想通りに、対照マウスは、血清中に検出可能なｈＧＨを持たなかった。
図２９に見られるこれらのデータは、アルギン酸塩配合物の効果がカノーラ・カプセルよりもかなり高いことを示す。
【００４５】
次に図３０を参照すると、このグラフは、３日および５日目のマウス血清中のｈＧＨの濃度を図示する。
カノーラ・カプセルを投与したマウスは、３日目に、非常に少なめではあるが検出可能なｈＧＨを有した。しかし、この送達は一過性であり、ｈＧＨは５日目には検出されなかった。このことは、Ａｇｇａｒｗａｌ他の論文に整合しており、該論文中では、５日目に循環ｈＧＨを検出するために、３日間毎日マウスに供給することが必要である。ｈＧＨ送達の一過性の性質は、本発明が教示するように、全身的なＤＮＡの分布よりむしろ腸によるＤＮＡの取り込みと整合している。
【００４６】
対照的に、アルギン酸塩配合物を投与したマウスは、３日目に、５日目まで上昇し続ける高ｈＧＨ濃度を示した。このことは、本発明者らの先行データ全てと整合しており、アルギン酸塩化合物が一過性ではない持続性の遺伝子発現に至ることを示す。
したがって、ＤＮＡの取り込みおよび発現は、両配合物で異なる。両配合物を用いたｈＧＨ送達の異なる動向によって、両配合物が異なる経路および／またはメカニズム（群）によって取り込まれることが示唆される。
【００４７】
図３１を参照すると、５日目に、マウスを屠殺し、種々の器官内のｈＧＨの存在を測定した。アルギン酸塩ＤＮＡ配合物を受けたマウス内で、このグラフに記載される器官中で高濃度のｈＧＨが記録された。対照的に、カノーラ・カプセルを受けたマウスは、前者の群よりも３倍多いＤＮＡを受けたにもかかわらず、上記器官のいずれでも検出可能なｈＧＨを有していなかった。
これらの結果は、アルギン酸塩配合物の投与後に、主要器官でのＤＮＡの広範な全身的分布を示す本発明者らの先行データと整合している。これらの結果は、従来技術に記載される配合物を用いるとＤＮＡの全身的分布に欠けることにも整合する。最終的には、これらの結果によって、両配合物間での効果の明らかな相違も強調される。
【００４８】
本発明にしたがった送達効果の更なる証拠として、効果的な濃度のｈＧＨの存在が原因の体重増加の比較を確認し、該比較は図３２の主題である。
ヒト成長ホルモンの送達は、体重増加を誘導することが既知である。しかし、ｈＧＨを送達する遺伝子療法実験は、非常に高濃度のｈＧＨが送達された（効果的な濃度）後に体重増加を実証しただけであった。
処置前の０日目および実験の５日の間、全てのマウスを計量した。カノーラ・カプセルを供給したマウスは、対照マウスほど体重が増加しなかった（ｐ＜０．１４５）。対照的に、アルギン酸塩配合物を供給したマウスは、５日目に１０９．７％の増加に達する体重増加があった。アルギン酸配合物を供給したマウスと、カノーラ・カプセルを受けたマウスとの間の体重増加での差異は、系統学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【００４９】
先当業者らは、ＰＬＬに結合させたＤＮＡを用いたが、動物に遺伝子を送達する上では効果的ではなかった。この理由は、彼らが経口送達の重要性を認識していなかったためである。先当業者らは、キトサンで保護した経口投与のＤＮＡを用いたが、ポリペプチド等の輸送および分布剤とＤＮＡを結合させなかったので、広範な分布を生むことができなかった。先当業者らは、アルギン酸塩・ＰＬＬマイクロカプセル内に封入したＤＮＡ（オリゴヌクレオチド・短セグメントのＤＮＡ、遺伝子全体または遺伝子調節配列を含まない）の経口送達も用いたが、排泄物からＤＮＡを回収することによって腸を通過してＤＮＡが突然変異したかどうかを測定する目的のため輸送剤と共役または複合しなかった（本発明で要求されるように）。これらの当業者らは、ＤＮＡが腸により取り込まれ発現するかどうかを認識または示唆しなかったため、本開示の経口遺伝子送達の産物または方法を認識できなかった。したがって、治療剤の全身的かつ持続性発現と組み合わせた広範な分布のためのＤＮＡの経口送達はこれまで達成されていない。
【００５０】
さらに、ＤＮＡに加えて、付加的な治療剤を同様に輸送することが考察され、該治療剤の非限定的な例としては、不必要なタンパク質の転写／翻訳を不活性化する能力のために商業的な関心があるＲＮＡと、ＡＩＤＳ等の感染症を処置する手段として送達されうるウイルスの細胞ＲＮＡ等の細胞ＲＮＡの特異的な配列を認識、結合、および切断する能力を有する触媒作用的ＲＮＡとして定義されるリボザイムとである。
【００５１】
ＤＮＡマイクロカプセル
以下に示すような本発明の多様な種の形成では、活性剤と輸送剤との結合、例えば複合を可能にするように、輸送剤として有用な分子が荷電分子（例えば、正または負の側鎖）を形成する能力を示すことが理解される。
【００５２】
ＤＮＡマイクロカプセル  −  実施例１  
特定の非限定的な実施形態では、導入遺伝子をコードするｃＤＮＡとプロモーター等の適当な遺伝子調節因子とを含有するＤＮＡプラスミドの形成を次のとおり実行する。注射器内で、１．５％アルギン酸カリウム（ケルマー（Ｋｅｌｍａｒ）、ケルコ社（Ｋｅｌｃｏ  Ｉｎｃ）、米国シカゴ）とＤＮＡの懸濁物を混合し、注射器ポンプを用いて２７Ｇ針を介して押し出す（３９．３ｍｌ／時間）。該針に同心の空気噴出は、ＤＮＡ／アルギン酸塩混合物の微細な小滴を生成し、この小滴を１．１％ＣａＣｌ２溶液内で回収する。接触させると、該アルギン酸塩／ＤＮＡ小滴はゲル化する。マイクロカプセルを押し出した後、下記の一覧表に示されるように該マイクロカプセルを洗浄する。Ｍｒ１５，０００ないし３０，０００範囲のポリ−Ｌ−リジン臭化水素塩（ＰＬＬ、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、米国セントルイス）と外側のアルギン酸塩層を６分間化学的に架橋結合させ、その後、別のアルギン酸塩層と架橋結合させる。最後に、残存する遊離アルギン酸塩コアをクエン酸ナトリウムで３分間溶解し、内部にＤＮＡを含有するアルギン酸塩・ＰＬＬ・アルギン酸塩膜を有するマイクロカプセルを生成する。標準的なマイクロカプセル・プロトコールは、６分間のクエン酸塩洗浄を用いる。本発明者らは、３分間クエン酸塩を用いて、カプセル・コアに残っているアルギン酸塩の濃度を増加させる。この手順は、ＤＮＡの共役に影響を及ぼすと思われる。
【００５３】
洗浄（特に言及のないかぎり、洗浄ステップは、合間にインキュベーション時間なしでおこなう）、すなわち、
１．１％塩化カルシウム
０．５５％塩化カルシウム
０．２８％塩化カルシウム
０．１％ＣＨＥＳ（２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、約３分間
１．１％塩化カルシウム
０．０５％ＰＬＬ、約６分間
０．１％ＣＨＥＳ（２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）  
１．１％塩化カルシウム
０．９％塩化ナトリウム
０．０３％アルギン酸カリウム、約４分間  
０．９％塩化ナトリウム
０．０５５Ｍ塩化ナトリウム、約３分間（標準的マイクロカプセル・プロトコールでは６分）
０．９％塩化ナトリウム
【００５４】
ＤＮＡマイクロカプセル  −  実施例２
濃度１μｇ／ｍｌの３００μｌ量ＤＮＡプラスミドを１．５％アルギン酸カルシウム６ｍｌと混合する。アルギン酸塩ビーズを、例えばポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）と架橋結合させ、内部にＤＮＡ・アルギン酸塩を含有するマイクロカプセルを生じる。その後、マイクロカプセルを１：１量の５０％ゼラチン溶液と混合し、投与可能な均一な混合物を得る。
【００５５】
ＤＮＡ・アルギン酸塩・ＰＬＬ粒子
濃度１μｇ／ｍｌの１００μｌ量ＤＮＡプラスミドを３％アルギン酸カルシウム５０μｌと混合し、穏やかに撹拌しながら３時間４℃で混合する。５０μｌ量のポリ−Ｌ−リジンを添加する。混合物を３０秒ボルテックスし、穏やかに撹拌しながらさらに１時間４℃で混合する。最後に、５０％ゼラチン溶液５０μｌを該混合物に添加して、投与可能な均一な混合物を得る。
【００５６】
ＤＮＡ・ＰＬＬ・アルギン酸塩粒子
ＤＮＡ・ＰＬＬ・アルギン酸塩マイクロカプセルの形成の好例の非限定的例では、濃度１μｇ／ｍｌの１００μｌ量ＤＮＡプラスミドをポリ−Ｌ−リジン５０μｌと混合し、穏やかに撹拌しながら３時間４℃で混合する。５０μｌ量の３％アルギン酸カルシウムを添加する。混合物を３０秒ボルテックスし、穏やかに撹拌しながらさらに１時間４℃で混合する。最後に、５０％ゼラチン溶液５０μｌを該混合物に添加して、投与可能な均一な混合物を得る。
【００５７】
ＤＮＡ・オルニチン・アルギン酸塩粒子
濃度１μｇ／ｍｌの１００μｌ量ＤＮＡプラスミドをポリ−Ｌ−オルニチン５０μｌと混合する。混合物を３０秒ボルテックスし、穏やかに撹拌しながら３時間４℃で混合する。５０μｌ量の３％アルギン酸カルシウムを添加して、穏やかに撹拌しながらさらに１時間４℃で混合する。最後に、５０％ゼラチン溶液５０μｌを該混合物に添加して、投与可能な均一な混合物を得る。
【００５８】
ＤＮＡ・アルギニン・アルギン酸塩粒子
濃度１μｇ／ｍｌの１００μｌ量ＤＮＡプラスミドをポリ−Ｌ−アルギニン５０μｌと混合する。混合物を３０秒ボルテックスし、穏やかに撹拌しながら３時間４℃で混合する。５０μｌ量の３％アルギン酸カルシウムを添加して、穏やかに撹拌しながらさらに１時間４℃で混合する。最後に、５０％ゼラチン溶液５０μｌを該混合物に添加して、投与可能な均一な混合物を得る。
【００５９】
コラーゲン内の裸ＤＮＡ
濃度１μｇ／ｍｌの１００μｌ量のＤＮＡプラスミドを５０％ゼラチン溶液５０μｌと混合し、完全に混合して、投与可能な均一の混合物を得る。
アミノ酸と共役したＤＮＡ等の化合物を送達するように、両親媒性化合物等と組み合わせて、様々な大きさのナノ粒子またはマクロ粒子として本発明の配合物を生産することも可能である。
リジン、アルギニン、およびオルニチンは、好例の輸送剤として本明細書で例示されているが、少なくとも必要な官能基を有し、かつ必要に応じて適当な電荷を持つ他の化合物および／または組成物も同様の様式で輸送剤として機能することが可能である。
【００６０】
特定の遺伝子調節因子（プロモーター）を内包することによって、本発明の組成物に生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での制御可能な発現の実用を付加する。特定の組織に遺伝子発現を制限する組織特異的遺伝子調節因子を用いることによって、治療用遺伝子の組織特異的発現を達成することができる。そのようなプロモーターの適切な使用によって、発現度を特定の要求に合わせることが可能である。
例えば、偏在性プロモーターβ−アクチンの使用によって、広範な発現を達成する。また、限定はされないが、アルブミン・プロモーター（肝臓発現）、筋肉発現のための筋肉クレアチン・キナーゼ（ＭＣＫ）、および角化細胞（皮膚発現）に例示される組織特異的遺伝子調節因子の使用によって、特定の所望の位置、例えば身体の特異的な部分、特異的な器官、または特異的な細胞または組織型でタンパク質を発現させる能力が提供される。
【００６１】
本発明にしたがえば、治療剤は、望ましい生物学的効果を誘発するために、宿主に導入される任意の遺伝物質を含む。そのような遺伝物質としては、限定はされないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス、ハイブリッド、一本鎖または二本鎖、あるいはその組合せが挙げられる。
本発明にしたがえば、望ましい生物学的効果としては、限定はされないが、遺伝子発現、遺伝子阻害、および遺伝子修正が挙げられる。上記生物学的効果としては、限定はされないが、経口送達後の治療剤の細胞内取り込みに直接関連する効果、例えばＦＩＸ生成に至るＦＩＸ  ＤＮＡが挙げられる。上記生物学的効果は、該細胞内取り込みの結果として、全身的発現、あるいは代わりに、特定の器官、系、またはターゲッティング細胞もしくは細胞群に特異的に向けられる発現を含むと理解されるターゲッティング発現の結果として直接生じることが可能である。上記生物学的効果は、限定はされないが、病状の調節によって例示され、この際、治療剤の発現が該病状の発症、過程、徴候、または重度を改変する。
【００６２】
本発明にしたがえば、全身的発現とは、細胞内での治療剤の測定可能な細胞内取り込みを意味すると理解され、該細胞としては、限定はされないが、全身の種々の器官で見出される上皮、結合、神経、および筋骨格組織の細胞が挙げられる。
本発明にしたがえば、持続性発現または持続性送達とは、単一の投与の結果として、少なくとも４０日間検出可能な所望の生物学的効果を誘発するのに十分な治療剤の測定可能な発現を意味すると理解される。該治療剤にコードされるタンパク質は細胞内または細胞外タンパク質でありうる。
本発明にしたがえば、広範な分布とは、本質的に全ての器官（表１および２ならびに添付図面に明示および例示されるような）への治療剤の分布を意味すると理解され、該器官としては、限定はされないが、中枢神経系、具体的には、脳、心臓、および骨髄が挙げられる。そのような分布は、例えば、腸上皮の基底膜を経由して、複数の器官部位へと至るようにおこなわれる。
【００６３】
その好ましい実施形態では、本発明は、分布可能成分の形成に向けられ、天然の消化管経路（例えば、経口経路または直腸経路）を介して遺伝物質の広範な分布、全身的発現、および持続性送達を可能にするために効果的な方法で、輸送剤と少なくとも１種類の遺伝物質との共役によって該成分を形成する。上記遺伝物質は、例えば、細胞内吸収後に所望の治療剤の発現を与えるのに十分なプロモーターおよび他の遺伝子調節因子と組み合わせた、発現が所望される治療剤をコードするＤＮＡの少なくとも特定の部分の組合せとして広義では定義される完全な転写単位でありうる。上記治療剤は、治療的重要性を示す任意の発現物を含んでよく、限定はされないが、タンパク質、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ，あるいはその特定の部分またはフラグメントを挙げることが可能である。
【００６４】
導入遺伝子の発現のためのプロモーターの使用は、本発明の特徴である全身的発現をうまく達成するためには必須であると考えられるが、目的が、存在する治療用産物の産生の阻害である（すなわち、ヒトでは肝炎またはＨＩＶ遺伝子）際は、プロモーターは必須ではない。さらに、組織特異的プロモーターを使用することによって、偏在性プロモーターとは対照的に、達成される全身的な発現度を目的に合わせる上である程度の自由が得られる。さらに、プロモーターを含まずに、アンチセンス核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）あるいはリボザイムの送達を達成することが可能である。
【００６５】
完全な転写単位が必要とされない本技術によって考察される別の適用は、一種の遺伝子療法を達成するために、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）およびエクステイン（ｅｘｔｅｉｎ）を適切に利用することに関係がある。
インテインは、前駆タンパク質内に組み込まれた挿入配列であり、該インテインは、インテイン配列を除去すると同時にフランキング・ポリペプチド（エクステインと呼ばれる）を連結するタンパク質スプライシングを受ける。本開示の技術によって別々に投与される２つの異なる成分に治療用遺伝子を分割することができる。
インテインを用いて、該遺伝子を別々に発現する二部分に分割した後に機能性タンパク質を生産した。２種類のタンパク質を生成した（翻訳）後に、インテイン部分を除去（独力で）して、隣接するエクステイン部分（１個は該遺伝子の第１の部分の末端に、２個目は遺伝子部分の第２の部分の最初の部分にある）を互いに結合させて、完全な機能性タンパク質を形成する。
しかし、１個の部分内のプロモーターの組み込みは、タンパク質の両部分を発現させるためのものである。
【００６６】
さらに、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）等の複数のベクターは、感染細胞内部でコンカテマーを形成する。その過程では、ベクターが自身を複製して、次々に配置される一連のベクター・コピーを生成する。この事実を利用して、本開示の輸送剤技術を用いて遺伝子を半分に分割して、両部分を別々に２個のベクターで発現させることができる。その後、両ベクターを同じ細胞の内部に輸送および導入する場合、両ベクターは物理的に一体となり、該細胞の内部で、完全なプロモーター・遺伝子関係を再確立することができる。また、ゾウ（Ｚｈｏｕ）他「アデノウイルス随伴環状ゲノムのコンカタメライゼーションが分子間組み換えの際に生ずる」（“Ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｏｃｃｕｒｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”）ウイルス学雑誌（Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）  １９９９年１１月；７３（１１）：９４６８−７７（非特許文献１５）に示されるように、プロモーターを１個のベクターに配置し、導入遺伝子を第２のベクターに配置することが可能であり、両ベクターを別々に投与する。
アミノ酸、それらの誘導体、および関連化合物についての以下の一覧表は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのＤＮＡの広範な分布に必要と考えられる必須の構造を含有する化合物の非限定的な例である。
【００６７】
アミノ酸および誘導体
脂肪族：アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリン
芳香族：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性：アルギニン、ヒスチジン、リジン
水酸基：セリン、トレオニン
硫黄含有：システイン、メチオニン
アミド化物（アミド基含有）：アスパラギン、グルタミン
ペプチド
２種類の個々のアミノ酸を結合して、反応の副産物としての水分子を持たないより大きな分子を形成することができる。２種類の別個のアミノ酸間で新たに生じたＣ−Ｎ結合は、ペプチド結合と呼ばれる。用語「ペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄ）」とは、文面で通常−ＣＯＮＨ−として記載されるペプチド基の存在を示唆する。
ジペプチド
ペプチド結合によって結合した２個の分子は、ジペプチドと呼ばれるものになる。
ポリペプチド
ポリペプチドは、複数のペプチド結合によって結合した複数の分子の鎖である。
タンパク質
タンパク質は、１個以上のポリペプチド鎖から構成され、該ポリペプチド鎖のそれぞれは、前述したアミノ酸からなる。
【００６８】
生存細胞がタンパク質を生成する際、１つのアミノ酸の水酸基は、別のアミノ酸のアミノ基と結合して、ペプチド結合を形成することが既知である。同様に、第２のアミノ酸の水酸基は、第３のアミノ基と結合するというように、ポリペプチドと呼ばれる長鎖が生成されるまで結合していく。タンパク質は、単一のポリペプチド鎖から形成されるか、または弱い分子結合によって互いに保持されている複数のそのような鎖からなることが可能である。アミノ酸サブユニットのＲ基は、タンパク質の最終形状およびその化学的特性を決定する。それによって、極めて多様なタンパク質が生成される。タンパク質を形成するアミノ酸に加えて、１５０を超えるほかのアミノ酸が天然に見出されており、該アミノ酸としては、結合して炭素原子を分離する水酸基およびアミノ基を有するものが挙げられる。これらの特殊な構造を有するアミノ酸は、最も多くの場合、菌類およびより高等の植物内で見出される。必要な機能分類を有し、かつ選択した治療剤に共役することができるものはいずれも本発明内で用いられると考察される。
【００６９】
本明細書で使用するように、用語デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とは、リン酸基によって結合されるヌクレオチドの長い高分子を意味すると理解され、ＤＮＡは、異なる細胞のそれぞれがその生存期間で産生するタンパク質の設計図を提供する遺伝物質である。ＤＮＡは、遊離水酸基を持たない５辺の糖（デオキシリボース）、２個のヌクレオチドに結合するリン酸基、および窒素塩基からなる二重らせんからなる。
本明細書で使用するように、用語リボ核酸（ＲＮＡ）とは、リン酸基を介して結合されたリボース（遊離水酸基を持つ５辺の糖）と窒素塩基との長い高分子を意味すると理解される。ＲＮＡは、ＤＮＡ鎖の１つと相補的であり、細胞によって特定化されるタンパク質を形成する。
本明細書で使用するように、用語両性イオンとは、水酸基およびアミノ基がそれぞれプロトンを差し出し、受け取る状態にある中性形態のアミノ酸を意味すると理解される。
【００７０】
タンパク質の発展および突然変異は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）での変化によって実現されうる。ＤＮＡは、リボ核酸（ＲＮＡ）を経由してタンパク質に翻訳される。全ての細胞は、全ての型の体組織に対する完全な指示を有するＤＮＡの同一コピーを含有するが、細胞型のそれぞれによって、特定のタンパク質のみが産生される。このように、異なる組織の細胞は、固有のタンパク質の産生によって多様な任務を果たすことができる。本発明の教示にしたがえば、治療剤、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを、経口投与を介して生体の全身にわたって広く分布させることによって、検出可能な変化を誘発する。この検出可能な変化が生体の全ての細胞に広く向けられることによって、疾患に対する治癒または特定の特性の増強を実行する。
また、器官または組織特異的プロモーターの適切な使用によって、検出可能な変化を所定の位置での発現に限定し、それによって、活性場所が特に制御される化学的または遺伝的な変性剤の経口投与のための安全かつ効果的な手段を提供することが可能である。
【００７１】
溶液中で荷電側鎖を形成するアミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸である。アスパラギン酸およびグルタミン酸は、それらのプロトンを放出して、正常なヒトの生理学的状態では負に荷電する一方で、リジンおよびアルギニンは、溶液中でプロトンを得て、正に荷電する。化合物のｐＫａは身体のｐＨに近いので、ヒスチジンは塩基性または酸性側鎖のいずれかを形成するためにユニークである。ｐＨが分子のｐＫａを超え始めるにつれて、その中性形態と酸性形態との間の平衡状態は、アミノ酸側鎖の酸性形態（脱プロトン化形態）に有利になり始める。別の言い方をすれば、プロトンが溶液中により放出されやすくなる。ヒスチジンの場合は、プロトンは、そのｐＫａ（６）よりｐＨが上に上がると放出されて塩基性ＮＨ２基を露出することができる。しかし、ヒスチジンは、ｐＨが６より下に低下する条件下では正に荷電することができる。ヒスチジンは、比較的中性状態では酸または塩基として作用することができるので、該ヒスチジンは、反応を触媒するために特定のｐＨを要する多くの酵素の活性部位で見出され、本発明で有用であると考察される。
【００７２】
アミノ酸は、極性または無極性でありうる。極性アミノ酸は、極性性質のために溶液中ではイオン化しないが水中では極めて安定であるＲ基を有する。該極性アミノ酸は、親水性または「水を好む（ｗａｔｅｒ  ｌｏｖｉｎｇ）アミノ酸としても知られる。このようなアミノ酸としては、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、およびシステインが挙げられる。無極性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、およびトリプトファンが挙げられる。無極性アミノン酸は、細胞膜等の無極性環境で安定であり、それらの「水を好まない（ｗａｔｅｒ  ｆｅａｒｉｎｇ）」特性のために疎水性分子と呼ばれる。これらの化合物は、電荷が誘導されうる場合または治療剤が共役効果を開始するように荷電させられる場合の使用が考察される。
【００７３】
実施例
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する経口ＤＮＡの体内分布
マウス（ｎ＝３）にアルギン酸塩／ＰＬＬ  ＧＦＰ  ＤＮＡナノ粒子の単一投与を実行した。３種類の配合物を試験した。すなわち、
１）ＤＮＡアルギン酸塩／ＰＬＬマイクロカプセル（カプセル）
２）アルギン酸塩／ＤＮＡ／ＰＬＬナノ粒子（アルギン酸塩）、および
３）ＰＬＬ／ＤＮＡ／アルギン酸塩ナノ粒子（ＰＬＬ）である。
９匹のマウスを処置し、４２日目に屠殺した。全てのマウス由来の組織試料を、図１ないし７として示した蛍光顕微鏡写真で例示する。図１は、肝臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真であり、図２は、腎臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真であり、図３は、肺での発現を示す蛍光顕微鏡写真であり、図４は、心臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真であり、図５は、筋肉での発現を示す蛍光顕微鏡写真であり、図６は、皮膚での発現を示す蛍光顕微鏡写真であり、図７は、血管での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【００７４】
ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）は、細胞内タンパク質であり、それが産生される細胞内に留まる。添付図面を検討することによって容易に明らかであり、かつ表１に概要を示すように、蛍光顕微鏡写真は、試験した全ての主要器官内の実質的に全ての細胞を緑色であるとして検出する（この際、「緑色（ｇｒｅｅｎ）」とは、図１ないし７、および図１０ないし２５、および図２８で黒背景に対して白色のコントラストによって表されている）。
【００７５】
【表１】
2005536513.tif 000003
【００７６】
これによって、輸送剤（ＰＬＬ）と複合させて、架橋結合アルギン酸塩／輸送剤を含むカプセル内部に取り込まれたマイクロカプセル形態のＤＮＡは、腸を通過し、全ての主要器官に輸送され、そこで該ＤＮＡは細胞に入り効率的に発現する。このことは、ＤＮＡの拡散を阻止／低下させる構造要素としてＰＬＬが作用した従来技術のカプセル化ＤＮＡと対照的である。
【００７７】
この技術の検証として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を増幅技術として用いて、組織試料の分析を実行した。
処置後４２日目に、マウスを屠殺した。種々の組織由来のＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、経口投与されたＤＮＡが試験した全ての主要器官で見出されたことが示された（表２）。この知見により、経口投与されたＤＮＡが全ての器官に取り込まれ、そこで該ＤＮＡが細胞に入ることがさらに確認される。
【００７８】
【表２】
2005536513.tif 000004
注記：骨髄および生殖腺由来のものはＰＣＲをおこなわなかった。
【００７９】
実施例
経口ＤＮＡの効率的発現に対するアルギン酸塩およびＰＬＬの重要性を確認するために、以下の実験を実行した。
アルギン酸塩／ＰＬＬ  ｈＦＩＸ  ＤＮＡナノ粒子の単一投与をマウス（Ｎ＝３）に与えた。３種類の配合物を試験した。すなわち、ＤＮＡアルギン酸塩／ＰＬＬナノ粒子（規則的対照）、アルギン酸塩／ＤＮＡナノ粒子（ＰＬＬ無し）、およびＰＬＬ／ＤＮＡナノ粒子（アルギン酸塩無し）である。
処置後３日、７日、および１４日目に、マウスは出血した。対照マウスは、血液中にｈＦＩＸを有していた（約７０ｎｇ／ｍｌ）。アルギン酸塩無しまたはＰＬＬ無しのマウスは、検出可能なｈＦＩＸを有さなかった（感度３ｎｇ／ｍｌ）。したがって、広範なＤＮＡ分布およびその後のタンパク質発現を確実にするためにはアルギン酸塩およびＰＬＬ両方が必要であることが結論付けられた。特定の動作理論に制限されることは望まないが、アルギン酸塩がＧＩ管内のＤＮＡを保護し、かつＰＬＬが全ての器官にＤＮＮを分布させるようである。
【００８０】
ＨＦＩＸを用いた実施例
得られる発現度を測定するために、追加の実験をおこない、ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）送達を実証した。
血友病マウスで、アルギン酸塩／ＰＬＬ  ＦＩＸ  ＤＮＡナノ粒子の単一投与を実行した。ＡＰＴＴ（血液凝固時間試験）をおこない、処置した血友病マウス内の疾患の矯正を測定した。図８にさらに例示するように、処置した血友病マウスは、少なくとも１８０日間、正常化された出血パターンを示した（実験は未だ進行中である）。
次に図９を参照すると、アルギン酸塩／ＰＬＬ  ＧＦＰ  ＤＮＡナノ粒子の摂取後４２日目に複数の器官から回収した組織試料に関して、ＰＣＲによるデータの増幅を実行した。全ての器官試料は、ＰＣＲ分析によって、陽性のＧＦＰの存在を示した。このデータは、上記表２内でさらに記載されている。
【００８１】
さらに実験をおこない、別の輸送剤を用いた分布および発現の効果を検証した。ポリ−オルニチンおよびポリ−アルギニンを、ＧＦＰおよびアルギン酸塩をコードするＤＮＡと複合し、ナノ粒子中に配合した。前述したような方法で、該ナノ粒子をマウス（ｎ＝３）に投与した。１０日目に、マウスを屠殺して、蛍光顕微鏡写真を撮った（図１０ないし２５）。図１０は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた十二指腸での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図１１は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた空腸での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図１２は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた回腸での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図１３は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた結腸での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図１４は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた肝臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図１５は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた脾臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図１６は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた腎臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図１７は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた肺での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図１８は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた心臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図１９は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた筋肉での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図２０は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた膵臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図２１は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた脳での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図２２は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた生殖腺での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図２３は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた皮膚での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図２４は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた血管での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図２５は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた骨髄での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図によって、緑色蛍光タンパク質の産生をコードするＤＮＡが全ての器官および組織全体にわたって分布し、好結果のタンパク質発現が生じたことが例示される。
【００８２】
実施例  マウスでのヒト成長ホルモンの送達
遺伝子療法によるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の持続性送達は非常に困難である。その主たる理由は、ｈＧＨの抗原性質が免疫応答性マウス内で強い抗体応答を誘発するためである。結果として、文献内で報告されるｈＧＨ送達は、常に少なく（１ないし３ｎｇ／ｍｌ）、事実上一過性（数日間続く）である。
アルギン酸塩・ＰＬＬ・ｈＧＨ  ＤＮＡナノ粒子をプロトコールに記載したように調製し、ジェロー（Ｊｅｌｌ−Ｏ）と混合した。成体免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２０週齢）にＤＮＡナノ粒子１００μｇを経口で与えた（ｎ＝３）。マウスは規則的に出血した。ｈＧＨの濃度をＥＬＩＳＡ（ＵＢＩ社（ＵＢＩ  Ｉｎｃ））によって測定した。ｈＧＨに対する抗体の存在をＥＬＩＳＡによって測定した。
処置したマウスは、高濃度のｈＧＨを有した（５０ｎｇ／ｍｌまでのピーク）。より重要なことには、ｈＧＨ送達は、少なくとも１２０日間持続した（図２６）。さらに、抗ｈＧＨ抗体は検出されなかった（図２７）。このデータによって、この技術が抗体応答を誘発することなくｈＧＨ等の治療用産物を持続性の濃度で送達することができることが示される。
【００８３】
実施例  マウスでの組織特異的様式での治療用産物の送達
処置後８５日目のｈＦＩＸの組織特異的送達
アルギン酸塩・ＰＬＬナノ粒子配合物内のＤＮＡ１００マイクログラムを各マウスに与えることによって、アルブミン・プロモーターの制御下のヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡを含有するプラスミドを血友病マウスに投与した。
該アルブミン・プロモーターは肝臓特異的である。
ｈＦＩＸは、処置したマウスの血液内で検出された。
免疫組織化学（ｈＦＩＸに特異的な抗体を用いて、種々の組織に存在するｈＦＩＸを検出した）によって、処置したマウス内のｈＦＩＸの発現は肝臓に制限されており、図２８に例示した他の組織では発現しないことが示された。
これによって、ＤＮＡの経口投与後の導入遺伝子の組織特異的発現の達成が確認される。
【００８４】
実験プロトコール
アルギン酸塩・ＰＬＬ・ｈＦＩＸ  ＤＮＡナノ粒子をプロトコールに記載したように調製し、ジェロー（Ｊｅｌｌ−Ｏ）と混合した。ｈＦＩＸの発現がアルブミン・プロモーターの制御下に置かれるようにヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）をプラスミド内でクローニングした。該アルブミン・プロモーターは、肝臓特異的である。したがって、ｈＦＩＸの発現は、肝臓細胞内のみであると予測され、その一方で、このプラスミドを保持する他の器官由来の細胞はｈＦＩＸを分泌できないと考えられる。成体免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２０週齢）のそれぞれに、ＤＮＡナノ粒子１００μｇを経口で与えた（ｎ＝３）。マウスは規則的に出血し、血漿内のｈＦＩＸの濃度をＥＬＩＳＡ（アフィニティ・バイオロジカルズ社（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））で測定した。処置したマウス全ては、血液内に治療的濃度のｈＦＩＸを有しており、その一方で、抗体は検出されなかった。
【００８５】
要約すると、経口投与したＤＮＡを、ＧＩ管を通過するようにアルギン酸塩（または任意の類似作用物質）によって保護し、かつ該ＤＮＡをポリペプチド（例えば、ＰＬＬ）と複合した場合、このＤＮＡは、腸を通って取り込まれ、全身に分布されることが本発明者らにより確認された。保護的な被覆またはポリペプチドを持たない配合物は、最小限の分布と、非常に低い効果および／またはタンパク質発現を示した。いずれの特定の動作理論にも制限されることを望まないが、ＤＮＡは、天然のアミノ酸分布メカニズムによって全ての器官に高い効率で輸送されることが理論付けられる。該ＤＮＡは、試験した全ての主要器官内の実質的に全ての細胞に入り、コードされる治療用産物は、種々の組織で産生される。偏在性または組織特異的のいずれかのプロモーターを内包することによって、タンパク質発現の精密な制御が可能になる。
送達は、長期間持続される（少なくとも１８０日間）。治療用産物は、細胞によって循環中に分泌されうる（分泌可能産物の場合）。また、非分泌可能タンパク質は、それらが産生される細胞内に残る。
【００８６】
この明細書内で言及された全ての特許および刊行物は、本発明が属する当該技術分野の当業者の水準を示すものである。個々の文献それぞれが明確かつ個々に援用されると示してある場合と同程度に、全ての特許および刊行物を本明細書で援用する。
本発明の特定の形態を例示した一方で、本発明は、本明細書に記載および表示した特定の形態または部分的機構に限定されるものではないことが理解される。本発明の範囲から逸脱せずに様々な変更がなされ、本発明が本明細書に表示および記載されるものに限定されないことは当業者には自明であるだろう。当業者は、本発明がその目的を実行し、言及した目標および利点と、それに固有のものとを得るために十分に適応されることを容易に認識するであろう。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連する化合物、方法、手順、および技術は、好ましい実施形態のうちの現在代表的なものであり、好例であること意図しており、範囲に制限を与えるものではない。それに関する変更および他の使用が当業者に見出され、本発明の精神に包括され、付随する請求項の記載の範囲により定義される。特定の好ましい実施形態を参照しながら本発明を説明してきたが、主張したように、本発明がそのような特定の実施形態に過度に制限されないことが理解されるであろう。実際には、当業者には自明である、本発明を実行するための記載される形態の様々な変更は、以下の請求項の記載の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
本発明の好例の実施形態を説明する添付図面は、
【図１】図１は、肝臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２】図２は、腎臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３】図３は、肺での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４】図４は、心臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】図５は、筋肉での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図６】図６は、皮膚での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図７】図７は、血管での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図８】図８は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイのグラフ分析を表す。
【図９】図９は、ＧＦＰ  ＤＮＡを供給され摂取後４２日目に屠殺されたマウスの器官のＰＣＲ増幅および分析のグラフ図である。
【図１０】図１０は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた十二指腸での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１１】図１１は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた空腸での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた回腸での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた結腸での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１４】図１４は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた肝臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１５】図１５は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた脾臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１６】図１６は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた腎臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１７】図１７は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた肺での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１８】図１８は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた心臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１９】図１９は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた筋肉での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２０】図２０は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた膵臓での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２１】図２１は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた脳での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２２】図２２は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた生殖腺での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２３】図２３は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた皮膚での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２４】図２４は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた血管での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２５】図２５は、アルギニン／オルニチン輸送剤を用いた骨髄での発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２６】図２６は、処置マウスのｈＧＨの濃度を示すグラフ図である。
【図２７】図２７は、ｈＧＨ生成後に抗ｈＧＨ抗体が検出されなかったことを示す。
【図２８】図２８は、アルブミン・プロモーターを用いた肝臓での組織特異的発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２９】図２９は、代替的な技術を用いて達成されたｈＧＨの濃度を比較する棒グラフである。
【図３０】図３０は、代替的な技術を用いて達成されたｈＧＨの濃度の経時的なグラフ分析である。
【図３１】図３１は、代替的な技術を用いて達成された種々の器官でのｈＧＨの存在を示す。
【図３２】図３２は、代替的な技術を用いて達成されたｈＧＨ濃度に起因する体重増加を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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