【手続補正書】
【提出日】令和2年6月1日(2020.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有する腸内細菌ファージＲＢ４９  ＵｖｓＸリコンビナーゼのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体であって、
該ＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体が、配列番号１の位置２５６と位置的に同等である位置にリジン（Ｌｙｓ）残基へのアミノ酸置換変異を含み、かつ、配列番号８のアミノ酸配列を有する腸内細菌ファージＴ４のＵｖｓＸリコンビナーゼ、又は、配列番号１の位置６３におけるヒスチジン（Ｈｉｓ）残基からセリン（Ｓｅｒ）残基への置換を除いて、配列番号１の全てのアミノ酸配列を有する腸内細菌ファージＲＢ４９のＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体と比べて、増大したリコンビナーゼ活性を有する、ＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体。
【請求項２】
配列番号１の位置６３と位置的に同等である位置にさらにセリン（Ｓｅｒ）残基への置換変異を含む、請求項１に記載のＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体。
【請求項３】
Ｃ末端における１つ又は複数のグルタミン酸残基の付加、Ｃ末端における１つ又は複数のアスパラギン酸残基の付加、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１又は２に記載のＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、ＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列を有する腸内細菌ファージＲＢ４９  ＵｖｓＸリコンビナーゼのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、半保存的ドメインを含むＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体であって、
前記半保存的ドメインが、配列番号３、４、又は５の位置７にリジン（Ｌｙｓ）残基への置換を除いて、配列番号３、４、又は５のいずれかの全てのアミノ酸配列を含み、
前記ＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体が、配列番号８のアミノ酸配列を有する腸内細菌ファージＴ４のＵｖｓＸリコンビナーゼ、又は、配列番号１の位置６３におけるＨｉｓ残基からＳｅｒ残基への置換を除いて、配列番号１の全てのアミノ酸配列を有する腸内細菌ファージＲＢ４９のＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体と比べて、増大したリコンビナーゼ活性を有する、ＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列を有する腸内細菌ファージＲＢ４９  ＵｖｓＸリコンビナーゼのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、半保存的ドメインを含むＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体であって、
前記半保存的ドメインが、配列番号６又は７の位置１２にリジン（Ｌｙｓ）残基への置換を除いて、配列番号６又は７の全てのアミノ酸配列を含み、
前記ＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体が、配列番号８のアミノ酸配列を有する腸内細菌ファージＴ４のＵｖｓＸリコンビナーゼ、又は、配列番号１の位置６３におけるＨｉｓ残基からＳｅｒ残基への置換を除いて、配列番号１の全てのアミノ酸配列を有する腸内細菌ファージＲＢ４９のＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体と比べて、増大したリコンビナーゼ活性を有する、ＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体。
【請求項８】
配列番号１のアミノ酸配列の位置２５６におけるプロリン（Ｐｒｏ）残基からリジン（Ｌｙｓ）残基への置換を除いて、配列番号１の全てのアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体。
【請求項９】
Ｃ末端における１つ又は複数のグルタミン酸残基の付加、Ｃ末端における１つ又は複数のアスパラギン酸残基の付加、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体をコードする核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
標的核酸分子を増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、（ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体を第１及び第２の核酸プライマーと接触させて、第１及び第２の核タンパク質プライマーを形成するステップであり、前記核酸プライマーがその３’末端に一本鎖領域を含む、ステップと、（ｂ）前記第１及び前記第２の核タンパク質プライマーを前記標的核酸分子に接触させ、それによって、前記第１鎖の第１の部分において第１の二本鎖構造を形成し、前記第２鎖の第２の部分において第２の二本鎖構造を形成し、その結果、前記第１の核酸プライマーと前記第２の核酸プライマーの３’末端が同じ二本鎖の鋳型核酸分子上で互いに向かい合うステップと、（ｃ）１種又は複数のポリメラーゼ及びｄＮＴＰｓを使用して前記第１及び第２の核酸プライマーの３’末端を伸長させて、第１及び第２の二本鎖核酸並びに第１及び第２の核酸置換鎖を生成するステップと、（ｄ）所望の程度の増幅に達するまで（ｂ）及び（ｃ）を繰り返して反応を続けるステップとを含む、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１４】
前記標的核酸分子が二本鎖核酸を含む、請求項１３に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１５】
前記標的核酸分子が一本鎖のアダプター領域を含む、請求項１３に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１６】
リコンビナーゼローディングタンパク質の存在下で行われる、請求項１３に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１７】
前記リコンビナーゼローディングタンパク質が、Ｔ４  ＵｖｓＹ、大腸菌ｒｅｃＯ、大腸菌ｒｅｃＲ及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１６に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１８】
ｇｐ３２、大腸菌ＳＳＢタンパク質、Ｔ４  ｇｐ３２タンパク質及びこれらの誘導体から成る群から選択される一本鎖安定化剤の存在下で行われる、請求項１３に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１９】
ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリスチレン、フィコール、デキストラン、ＰＶＰ及びアルブミンを含む群から選択される密集化剤の存在下で行われ、その結果、前記密集化剤が増幅を促進する、請求項１３に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２０】
増幅部位のアレイ上で行われる、請求項１３に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２１】
各増幅部位が、前記標的核酸を増幅するための複数の増幅プライマーを含む、請求項２０に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２２】
前記増幅部位のアレイが、溶液中にビーズを含む又は表面上にビーズを含む、請求２０に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２３】
前記増幅部位のアレイがエマルジョンを含む、請求項２０に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２４】
等温で行われる、請求項１３に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体並びに以下の１つ又は複数：
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、
ＤＮＡポリメラーゼ、
ｄＮＴＰｓ又はｄＮＴＰｓとｄｄＮＴＰｓの混合物、
密集化剤、
緩衝液、
還元剤、
ＡＴＰ又はＡＴＰ類似体、
リコンビナーゼローディングタンパク質、
第１のプライマー及び第２のプライマー
を含む、リコンビナーゼポリメラーゼ反応を行うためのキット。
【請求項２６】
前記置換変異が、配列番号１の位置２５６と位置的に同等である位置におけるアミノ酸残基のＬｙｓ残基への置換であり、配列番号１の位置６３と位置的に同等である位置におけるアミノ酸残基のＳｅｒ残基への置換である置換変異をさらに含む、請求項１に記載のＵｖｓＸリコンビナーゼ変異体。