(57)【要約】本発明は、（ｉ）医薬として許容できる担体と（ｉｉ）プロモーターと機能可能に連結した、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列とを含むアデノウイルスベクターを含む医薬組成物の投与量をヒトに投与することを含むヒトの癌治療方法であって、投与量は、約１ｘ１０６〜約４ｘ１０１２粒子ユニット（ｐｕ）の複製欠損アデノウイルスベクターを含み、それによって、ヒトの癌は治療される、上記方法を提供する。本発明は更に、複数の腫瘍用のヒトの治療方法であって、第１腫瘍と、上記医薬組成物の投与量とを接触させ、それによって、第１腫瘍と１つ以上の更なる腫瘍に関し、ヒトが治療されることを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）医薬として許容できる担体と（ｉｉ）プロモーターと機能可能に連結した、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターとを含む医薬組成物の投与量をヒトに投与することを含むヒトの癌治療方法であって、投与量は、約１ｘ１０６〜約４ｘ１０１２粒子ユニット（ｐｕ）のアデノウイルスベクターを含み、それによって、ヒトの癌が治療される、上記方法。
【請求項２】
医薬組成物が、約１０週間までを含む治療期間中少なくとも１度ヒトに投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
医薬組成物が腫瘍と接触し、腫瘍内の腫瘍細胞が破壊される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍のサイズが減少する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍に電離放射線の投与量を投与することを更に含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
治療期間の継続期間中、腫瘍に電離放射線の投与量を投与することを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍に化学療法剤の投与量を投与することを更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
医薬組成物の投与量が、約３〜１０週間を含む治療期間中、１週に約１度腫瘍に投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
医薬組成物の投与量が、約５〜１０週間を含む治療期間中、１週に約１度腫瘍に投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
プロモーターが、化学誘導性である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
プロモーターが、放射線誘導性である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
放射線誘導性プロモーターが、ＥＧＲ−１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
電離放射線の投与量が、治療期間の継続期間中に投与される約２０グレイ（Ｇｙ）〜約７０Ｇｙを含む、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍が、固形腫瘍である、請求項３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍が、乳癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、頭部／頚部癌、又は非小細胞肺癌と関連している、請求項３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍が、膀胱癌、甲状腺癌、下顎骨癌、皮膚癌、又は腎臓癌と関連している、請求項３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍が、食道癌、前立腺癌、肝臓癌、又は副腎癌と関連している、請求項３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
治療期間が６週間までを含み、方法が、１〜２週目で医薬組成物の２回投与量を投与し、治療期間の各々の次なる週で医薬組成物の１回投与量を投与することを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
医薬組成物が、１〜５回の注射により腫瘍に投与される、請求項３〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
医薬組成物が、２〜５回の注射により腫瘍に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍が、柔組織肉腫である、請求項３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
治療期間が５週間までを含み、方法が、１週目で医薬組成物の２回投与量を投与し、治療期間の各々の次なる週で医薬組成物の１回投与量を投与することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
医薬組成物が、１〜２０回の注射により腫瘍に投与される、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
医薬組成物が、３〜８回の注射により腫瘍に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
複数の腫瘍用のヒトの治療方法であって、第１腫瘍と、（ｉ）医薬として許容できる担体及び（ｉｉ）プロモーターと機能可能に連結した、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターを含む医薬組成物の投与量とを接触させることを含む方法であって、投与量は、約１ｘ１０６〜約４ｘ１０１２粒子ユニット（ｐｕ）アデノウイルスベクターを含み、それによって、ヒトは、第１腫瘍と１つ以上の更なる腫瘍に関し治療される、上記方法。
【請求項２８】
医薬組成物が、約１０週間までを含む治療期間中、少なくとも１度投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
第１腫瘍と１つ以上の更なる腫瘍内の腫瘍細胞が破壊される、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
第１腫瘍と１つ以上の更なる腫瘍のサイズが減少する、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
投与量が、約１ｘ１０７〜約４ｘ１０１２粒子ユニット（ｐｕ）のアデノウイルスベクターを含む、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
投与量が、約１ｘ１０７〜約４ｘ１０１１粒子ユニット（ｐｕ）のアデノウイルスベクターを含む、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
治療期間の継続期間中、腫瘍に電離放射線の投与量を投与することを更に含む、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
プロモーターが、構成性プロモーターである、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
プロモーターが、ＥＧＲ−１である、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトの癌の治療方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌研究の所望は、１つ又は幾つかの異なるタイプの癌に有効な治療の識別である。米国対癌協会は単独で、多種の癌タイプの機構を解明するのに働いている癌研究者に昨年、約１０億ドルを分配した。それなのに、該疾患への広範な研究にかかわらず、有効な癌治療は、医学社会でつかまえどころのないままである。臨床家は、現在の標準的な治療法：化学療法、放射線療法及び手術によって、限定された成功を実現した。しかし、各治療は、固有の限界を有する。化学療法及び放射線療法は、このような治療を異常組織（例えば、腫瘍）へ向ける努力にもかかわらず、正常な健康組織に広範なダメージを引き起こす。手術は、癌細胞の塊を除去するのに有効でありうる；しかし、最も才能のある外科医でさえ、冒された組織の完全除去を保証しえないし、解剖学的位置にある全ての腫瘍が容易く手術除去されるわけではない。現存の治療法の限界は、全ての癌を含めて、５年相対的生存率６０％に反映されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ＆  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２００１，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。
【０００３】
臨床家は、現存の癌治療に対する可能性ある代替策として、治療用核酸配列の送達に注目してきた。インビボで標的部位で生物的に有意なレベルで、治療用薬剤の局所産生が起き、それによって、正常組織への毒性が減少することは、通常の治療と連関する限界の一部に取り組む。多数の遺伝子が、抗腫瘍効果につき試験された。最も有望な抗腫瘍薬剤の１つは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、特にＴＮＦ−αであり、それは、多くの癌細胞系に活性を示した。ＴＮＦ−αは、マクロファージ及び単球によって分泌される１７ｋＤａポリペプチドである。ＴＮＦ−αは、腫瘍血管系を選択的に破壊し、無数の免疫細胞を活性化し、並びに、幾つかの腫瘍細胞タイプのアポトーシスを誘導する（Ｂａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，２９１７−２９２４（１９９９），及びＭａｕｃｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＩ，３２２，２２５−２２８（１９９８））。しかし、ヒトでの抗癌剤としてのＴＮＦの使用は、低血圧や呼吸器不全を含む重度の全身的影響によって限定されてきた（Ｍａｕｃｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。更に、例えば、膵臓癌（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，１０，３７６−３７８（１９９１））、胃癌（Ｍｕｇｇｉａ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，３，２１１−２１７（１９９２））、転移性乳癌（Ｂｕｄｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，６８，１６９４−１６９５（１９９１））、結腸直腸癌（Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ，１３，４４４−４４７（１９９０））などの多くの癌タイプは、ＴＮＦ−α蛋白質による治療に難治性である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、患者で種々の癌タイプの治療での使用に適した組成物、並びに、癌治療のための組成物の送達方法の必要性が依然として存在する。特に、ＴＮＦなどの抗癌剤の局所効果を最適化するが、毒性を最小化する組成物及び方法の必要性が依然として存在する。本発明は、このような組成物及び方法を提供する。本発明の、これらの、及び他の利点、並びに更なる発明的性質は、本明細書記載の本発明の説明から明白となろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の簡単な概要
本発明は、ヒトの癌の治療方法を提供する。該方法は、（ｉ）医薬として許容できる担体と（ｉｉ）プロモーターと機能可能に連結した、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターとを含む医薬組成物の投与量をヒトに投与することを含み、投与量は、約１０週までを含む治療期間中少なくとも１度、約１ｘ１０6〜約４ｘ１０12粒子ユニット（ｐｕ）のアデノウイルスベクターを含む。方法はさらに好ましくは、治療期間の持続期間中、電離放射線の投与量を投与することを含み、それによって、ヒトの癌が治療される。医薬組成物は好ましくは、例えば、腫瘍の異なる点に多重注射によって、腫瘍に直接投与される。
【０００６】
本発明は、複数の腫瘍用のヒトの治療方法であって、約１０週までを含む治療期間中少なくとも１度、第１腫瘍を、医薬組成物の投与量と接触させることを含む方法であって、それによって、ヒトは第１腫瘍と１つ以上の更なる腫瘍に関し治療される、上記方法を更に提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト（例えば、このような治療の必要のある患者）の癌の治療方法を提供する。該方法は好ましくは、放射線療法と組合せて、腫瘍へのＴＮＦ−αの送達、好ましくは、腫瘍への直接的送達を含み、それによって、腫瘍のサイズが減少する。特に、方法は、治療の必要のあるヒトに、医薬として許容できる担体中にＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含む、アデノウイルスベクター、好ましくは、複製欠損アデノウイルスベクターを含有する医薬組成物を投与することを含む。方法は好ましくは、ヒトに電離放射線の投与量を投与することを更に含む。特に、放射線送達と組合せての、ＴＮＦ−αコーディング配列の送達は、局所効果を最適化し、全身毒性を最小化することによって、可溶性ＴＮＦ蛋白質を用いる以前に記載された処置方法に対する改良を提供する。事実、患者への顕著な毒性無しに腫瘍サイズが減少し得るという驚くべき発見に、本発明は部分的に基づく。更に、本発明の方法は、ＴＮＦ−α蛋白質による治療に難治性であった腫瘍のサイズを減少させることが示された。本発明の方法の種々の局面を以下に考察する。各パラメーターは個別に論じられるが、本発明の方法は、癌に関しヒトを治療するために、下記のパラメーターの組合せを含む。従って、パラメーターの任意の組合せは、本発明の方法に基づき使用できる。
【０００８】
アデノウイルスベクター
本発明の方法は、医薬として許容できる担体中、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物を、ヒトに投与することを含む。アデノウイルス（Ａｄ）は、３６ｋｂ二重鎖ＤＮＡウイルスであり、種々の異なる標的細胞タイプに、インビボでＤＮＡを効率的に転移できる。該ベクターは、高力価で産生でき、複製及び非複製細胞にＤＮＡを効率的に転移できる。任意のサブタイプ、サブタイプの混合物、又はキメラアデノウイルスは、アデノウイルスベクターのウイルスゲノムの源として使用できるが、ヒトアデノウイルスが好適である。アデノウイルスの源として使用できるアデノウイルスストックは、アデノウイルス血清型１〜５１まで増幅でき、それらは、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から、又は、任意の他の源から利用できるアデノウイルスの任意の他の血清型から現在利用できる。例えば、アデノウイルスは、Ａ亜群（例えば、血清型１２，１８，３１）、Ｂ亜群（例えば、血清型３，７，１１，１４，１６，２１，３４，３５）、Ｃ亜群（例えば、血清型１，２，５，６）、Ｄ亜群（例えば、血清型８，９，１０，１３，１５，１７，１９，２０，２２−３０，３２，３３，３６−３９，及び４２−４７）、Ｅ亜群（血清型４）、Ｆ亜群（血清型４０，４１）、又は任意の他のアデノウイルス血清型でありうる。好ましくは、アデノウイルスベクターは、Ｃ亜群、特に血清型２又は５である。
【０００９】
ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターは、標的組織内で該ベクターの複製が制限されるように理想的には操作される。例えば、医薬組成物のアデノウイルスベクターは、条件付き複製アデノウイルスベクターでありえ、それは、専門家によって予め定められた条件下複製するように操作されている。例えば、複製に必須な遺伝子機能（例えば、アデノウイルス初期領域によってコードされる遺伝子機能）は、誘導性、抑制性、又は組織特異的な転写制御配列（例えば、プロモーター）と機能可能に連結されうる。この実施態様は、複製には、転写制御配列と相互作用する特定の因子の存在又は非存在が必要である。アデノウイルスベクターの複製は、標的組織に限定され得、それによって、該組織中へのベクターのより大きな分布が可能となり、複製サイクル中細胞を溶解するアデノウイルスの天然の能力が開発され、それによって、腫瘍細胞を破壊する更なる様式が提供される。条件付き複製アデノウイルスベクターは、米国特許５，９９８，２０５に更に記載されている。
【００１０】
好ましくは、アデノウイルスベクターは複製欠損である。「複製欠損」は、アデノウイルスベクターが、少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能を欠くゲノムを含むことを意味する。本明細書で使用する、遺伝子、遺伝子機能、又は遺伝子もしくはゲノム領域の欠損は、遺伝子の核酸配列が、全体又は部分的に欠失した遺伝子の機能を損なう、又は消滅するために、ウイルスゲノムの十分な遺伝子物質の欠失として定義される。複製に必須な遺伝子機能は、複製（例えば、増殖）に必要な遺伝子機能であって、例えば、アデノウイルス初期領域（例えば、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４領域）、後期領域（例えば、Ｌ１〜Ｌ５領域）、ウイルスパッケージングに関与する遺伝子（例えば、ＩＶａ遺伝子）、ウイルス関連ＲＮＡ（例えば、ＶＡ−ＲＮＡ１及び／又はＶＡ−ＲＮＡ−２）によってコードされる遺伝子機能である。好ましくは、複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの１つ以上の領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能を欠損したアデノウイルスゲノムを含む。好ましくは、アデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの遺伝子機能が欠損している（Ｅ１欠損アデノウイルスベクターと示される）。Ｅ１領域でのこのような欠損に加えて、組換えアデノウイルスはまた、国際特許出願ＷＯ００／００６２８に記載のように、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）での変異を有しうる。より好ましくは、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能及び非必須Ｅ３領域の少なくとも一部（例えば、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）で欠損である（Ｅ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと示される）。Ｅ１領域に関し、アデノウイルスベクターは、Ｅ１Ａ領域の少なくとも一部及びＥ１Ｂ領域の少なくとも一部、例えば、Ｅ１Ａ領域とＥ１Ｂ領域の各々の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能で欠損でありうる。
【００１１】
好ましくは、アデノウイルスベクターは、「多重欠損」であり、それは、アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの２つ以上の領域の各々で、ウイルス複製に必要な１つ以上の遺伝子機能で欠損であることを意味する。例えば、Ｅ１欠損又はＥ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能で更に欠損でありうる（Ｅ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターと示される）。Ｅ４領域全部が欠失したアデノウイルスベクターは、より低い宿主免疫応答を発揮しうる。
【００１２】
あるいは、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの遺伝子機能及びＥ２領域の少なくとも１つの遺伝子機能で欠損である（Ｅ１／Ｅ２欠損アデノウイルスベクターと示される）。本発明のアデノウイルスベクターが、Ｅ２Ａ領域の１つの複製に必須な遺伝子機能で欠損しているならば、ベクターは好ましくは、Ｅ２Ａ領域の完全欠失を含まず、それは、長さが約２３０塩基対未満である。一般的に、アデノウイルスのＥ２Ａ領域は、ＤＢＰ（ＤＮＡ結合蛋白質）、即ち、ＤＮＡ複製に必要なポリペプチドをコードする。ＤＢＰは、ウイルス血清型に依存して４７３〜５２９アミノ酸からなる。ＤＢＰは、延びたＮｔドメインをもった球状Ｃｔからなる長球楕円形として存在する非対称蛋白質であると考えられている。研究が示すところでは、Ｃｔドメインは、核酸と結合し、亜鉛と結合し、ＤＮＡ鎖伸長のレベルでＤＮＡ合成で機能するＤＢＰの能力に寄与している。しかし、Ｎｔドメインは、転写レベルと転写後レベルの両方で後期遺伝子発現で機能すると考えられ、該蛋白質の効率的な核内局在に寄与し、またそれ自身の発現の増大に関与しうる。アミノ酸２〜３８の間でのＮｔドメインにおける欠失は、この領域がＤＢＰ機能に重要であることを示した（Ｂｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９６，２６９−２８１（１９９３））。ＤＢＰのＣｔ領域をコードするＥ２Ａ領域での欠失は、ウイルス複製に何の影響も持たないが、ＤＢＰのＮｔドメインのアミノ酸２〜３８をコードするＥ２Ａ領域での欠失は、ウイルス複製を損なう。任意の多重複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のこの部分を含むことが好ましい。特に、例えば、保持されるべきＥ２Ａ領域の所望部分は、Ｅ２Ａ領域の５’末端によって規定されるアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の部分、特に、血清型Ａｄ５のアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のＡｄ５（２３８１６）〜Ａｄ５（２４０３２）である。アデノウイルスゲノムのこの部分は望ましくは、アデノウイルスベクターに含まれる。それは、ウイルス増殖の所望レベルを提供するように、現在のＥ２Ａ細胞系で相補されないからである。
【００１３】
特に好適な実施態様では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域とＥ４領域の各々の１つ以上の複製に必須な遺伝子機能に欠損のあるアデノウイルスゲノムを含み（即ち、アデノウイルスベクターはＥ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターである）、好ましくは、Ｅ４領域の全コード領域が、アデノウイルスゲノムから欠失している。換言すれば、Ｅ４領域の全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が除去されている。アデノウイルスベクターのＥ４領域は好ましくは、天然Ｅ４プロモーター、ポリアデニル化配列、及び／又は右側逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を保持する。
【００１４】
多重複製欠損が、特に、Ｅ１領域とＥ４領域の複製に必須な遺伝子機能に多重複製欠損があるとき、アデノウイルスベクターは好ましくは、単一の複製欠損アデノウイルスベクター、特にＥ１領域で１つの欠損を含むアデノウイルスベクターによって達成されるものと類似の相補細胞系でのウイルス増殖を提供するスペーサー要素を含む。スペーサー要素は、長さが少なくとも約１５塩基対（例えば、約１５〜約１２，０００塩基対）、好ましくは、約１００〜約１０，０００塩基対、より好ましくは、約５００〜約８，０００塩基対、より一層好ましくは、約１，５００〜約６，０００塩基対、最も好ましくは、約２，０００〜約３，０００塩基対の配列などの所望の長さである任意の配列（単数又は複数）を含み得る。スペーサー要素配列は、コード又は非コード、及びアデノウイルスゲノムに関し天然又は非天然でありうるが、複製に必須な機能を欠損領域に回復させない。スペーサーの非存在下、多重複製欠損アデノウイルスベクターのファイバー蛋白質の産生及び／又はウイルス増殖は、単一複製欠損アデノウイルスベクターのものと比べて減じられている。しかし、欠損アデノウイルス領域の少なくとも１つへの（好ましくは、Ｅ４領域）、スペーサーの導入は、ファイバー蛋白質の産生及びウイルス増殖でのこの減少を妨げ得る。アデノウイルスベクターでのスペーサーの使用は、米国特許５，８５１，８０６に記載されている。
【００１５】
アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域のみ、アデノウイルスゲノムの後期領域のみ、アデノウイルスゲノムの初期領域と後期領域の両方の、複製に必須な遺伝子機能に欠損でありうる。アデノウイルスベクターはまた、本質的に全部のアデノウイルスゲノムが除去されうる。その場合、少なくとも、ウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と１つ以上のプロモーター、又はウイルスＩＴＲとパッケージングシグナルのいずれかが無傷で残る（即ち、アデノウイルスアンプリコン）ことが好ましい。除去されるアデノウイルスゲノムの領域が大きい程、ゲノムに挿入できる外来核酸配列の断片は大きくなる。例えば、ウイルスＩＴＲと１つ以上のプロモーターを無傷に残すことによって、アデノウイルスゲノムが３６ｋｂであることを考えれば、アデノウイルスの外来インサートの収容能力は約３５ｋｂである。あるいは、ＩＴＲとパッケージングシグナルのみを含む多重欠損アデノウイルスベクターは、約３７〜３８ｋｂの外来核酸配列の挿入を有効に可能とする（アデノウイルスは、野生型アデノウイルスゲノムのサイズの約１０５％までＤＮＡをパッケージできる）。勿論、欠損アデノウイルス領域の任意の、又は全部でのスペーサー要素の包含は、大きなインサートのためのアデノウイルスベクターの能力を減少させよう。多重欠損アデノウイルスベクターを含む適切な複製欠損アデノウイルスベクターは、米国特許５，８５１，８０６及び５，９９４，１０６並びに国際特許出願ＷＯ９５／３４６７１及びＷＯ９７／２１８２６に開示されている。複製欠損アデノウイルスベクターはまた、米国特許５，８７２，００５、６，０４０，１７４、６，１３３，０２８、及び国際特許出願ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９５／２７０７１、ＷＯ９６／１４０６１に開示されている。本発明の方法での使用に特に好適なアデノウイルスベクターは、国際特許出願ＷＯ０２／００９０６に記載されているものである。
【００１６】
本発明の方法での使用に好適なＥ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターでは、Ｌ５ファイバー領域は保持され、スペーサーは、Ｌ５ファイバー領域と右側ＩＴＲの間に位置する。より好ましくは、このようなアデノウイルスベクターにおいて、Ｅ４ポリアデニル化配列は単独で、又は、非常に好ましくは、他の配列と組合せて、Ｌ５ファイバー領域と右側ＩＴＲの間に存在し、右側ＩＴＲから保持されたＬ５ファイバー領域を十分に分離する。このようなベクターのウイルス産生は、単一複製欠損アデノウイルスベクター、特にＥ１欠損アデノウイルスベクターのものに近づくようにする。
【００１７】
アデノウイルスゲノムに挿入されたスペーサー要素は、プロモーター可変発現カセットを含み得、それは、任意のプロモーター（細胞又はウイルス）、外来核酸配列、及び／又はポリアデニル化配列を含み得る。好ましくは、Ｅ４領域に挿入されたスペーサー要素の場合（Ｅ４領域のコード配列は除去された）、Ｅ４ポリアデニル化配列とＥ４プロモーターは、ベクター中に残る。このような実施態様では、スペーサー要素は、Ｅ４ポリアデニル化部位とＥ４プロモーターの間に存在するか、又はＥ４プロモーターがベクター中に存在しなければ、スペーサー要素は、右側（３’）ＩＴＲの近傍である。
【００１８】
スペーサー要素は、任意の適切なポリアデニル化配列を含み得る。適切なポリアデニル化配列の例として、合成最適化配列、並びに、ＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタイン  バール  ウイルス）、パピローマウイルス（ヒトパピローマウイルス及びＢＰＶ（ウパピローマウイルス）を含む）のポリアデニル化配列が挙げられる。好ましくは、スペーサー要素として、ＳＶ４０（ヒト肉腫ウイルス４０）ポリアデニル化配列が挙げられる。ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、多重欠損アデノウイルスベクターのより高いウイルス産生レベルを可能とする。スペーサー要素が、コード配列の全部又は一部を含み、遺伝子産物の産生が非所望ならば、スペーサー要素は、ポリアデニル化配列に隣接し得る。
【００１９】
外来コード配列はまた、アデノウイルスゲノムのＥ４欠損領域でスペーサー要素として機能しうる。外来コード配列は、ベクターが収容できるインサートの大きさのみによって限定され、任意の適切なコード配列でありうる。適切なコード配列の例として、ｐＧＵＳ、分泌性アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びヒト抗トリプシン；治療用因子；Ｂ３−１９Ｋ，Ｅ３−１４．７，ＩＣＰ４７，ｆａｓリガンド，ＣＴＬＡ４などの潜在性免疫修飾剤；生物不活性配列（例えば、（ｉ）転写されず、産物を産生しない配列、（ｉｉ）欠陥のある、又は生物学的に不活性な産物をコードする配列）；及び、グルクロニダーゼ遺伝子などの他の無害の配列；などのマーカー蛋白質をコードするコード配列が挙げられるが、それに限定されない。
【００２０】
アデノウイルスベクターの異なる領域の欠失は、哺乳動物の免疫応答を変更しうることを理解すべきである。特に、異なる領域の欠失は、アデノウイルスベクターによって生じる炎症応答を減少しうる。更に、国際特許出願ＷＯ９８／４０５０９に記載されているように、野生型コート蛋白質に向けられた中和抗体によって認識されるアデノウイルスベクターの能力又は無能力を減少させるように、アデノウイルスベクターのコート蛋白質は修飾されうる。
【００２１】
同様に、アデノウイルスベクターのコート蛋白質は、潜在性宿主細胞上のウイルスレセプターへの、アデノウイルスベクターの結合特異性又は認識を変えるように操作されうる。このような操作として、ファイバー、ペントン、ヘキソン、ｐＩＩＩａ、ｐＶＩ、及び／又はｐＩＸの領域の欠失、コート蛋白質の部分への種々の天然又は非天然のリガンドの挿入などが挙げられる。コート蛋白質の操作は、アデノウイルスベクターが感染する細胞の範囲を拡げ得、又は特定の細胞タイプへのアデノウイルスベクターのターゲティングを可能としうる。アデノウイルスコート蛋白質は、非天然アミノ酸配列（例えば、リガンド）が添えられる完全長アデノウイルスコート蛋白質を含み得る。あるいは、アデノウイルスコート蛋白質は、内部で、又はＣ末端及び／又はＮ末端で短縮されうる。
【００２２】
例えば、１実施態様では、アデノウイルスベクターは、キメラコート蛋白質を含み（例えば、ファイバー、ヘキソン、ｐＩＸ、ｐＩＩＩａ、又はペントン蛋白質）、それは、非天然アミノ酸配列（例えば、非天然リガンド）の導入（好ましくは、カルボキシル末端で、又は近傍で）によって野生型（即ち、天然）コート蛋白質とは異なる。好ましくは、非天然アミノ酸配列は、内部コート蛋白質配列中、又はその代わりに挿入される。非天然アミノ酸配列は、内部コート蛋白質配列内に、又は内部コート蛋白質配列末端で挿入されうる。生じるキメラウイルスコート蛋白質は、キメラウイルスコート蛋白質よりもむしろ野生型ウイルスコート蛋白質を含むことを除いて同一であるアデノウイルスベクターの細胞への侵入よりも効率的なコート蛋白質を含むアデノウイルスベクターの細胞への侵入を命ずることができる。好ましくは、キメラコート蛋白質は、野生型コート蛋白質を含むアデノウイルスベクターによっては認識されない、又は貧弱にしか認識されない、細胞表面上に存在する新規内因性結合部位に結合する。侵入のこの増大した効率の１つの直接的結果は、野生型コート蛋白質を含むアデノウイルスが典型的には、入ることができない、又はほんの低い効率でしか入ることができない細胞タイプに、該アデノウイルスベクターは結合し、入ることができるということである。
【００２３】
好ましくは、アデノウイルスコート蛋白質は、αｖβ３インテグリン又はαｖβ６インテグリンと結合する非天然リガンドを含む。組換えアデノウイルスコート蛋白質の非天然リガンドは、コート蛋白質を含むアデノウイルスベクターが、非天然リガンド無しの対応するアデノウイルスによって天然には感染されない宿主細胞（対応する野生型アデノウイルスによっては感染されない宿主細胞）と結合し、望ましくは、それに感染することを可能とし、非天然リガンド無しの対応するアデノウイルスよりも大きなアフィニティをもって、対応するアデノウイルスによって天然に感染される宿主細胞に結合することを可能とし、又は非標的細胞よりも大きなアフィニティをもって、特定の標的細胞に結合することを可能とする。例えば、非天然リガンドは、αｖβ３インテグリンなどの基質と優先的に結合し、アデノウイルスベクターに、インテグリンを提示する細胞を標的とさせる。ターゲティング効率を増加させるために、コクサッキー及びアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）などの天然アデノウイルス細胞表面レセプターへのアデノウイルスコート蛋白質の天然結合は除去されうる。「優先的に結合する」は、非天然リガンドが、例えば、αｖβ１インテグリンなどの異なるレセプターと結合するよりも、例えば、αｖβ３インテグリンなどのレセプターと約３倍大きいアフィニティをもって（例えば、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３５倍、４５倍、又は５０倍大きいアフィニティ）結合する。好ましくは、非天然リガンドがαｖβ３インテグリンと結合するとき、非天然リガンドがαｖβ１インテグリンと結合するよりも少なくとも約１０倍大きいアフィニティをもってそうする。結合アフィニティは、任意の適切なアッセイの使用により測定できる。それらの種々のアッセイは公知である。望ましくは、宿主細胞のトランスダクションレベルは、相対的結合効率を測定するのに利用される。従って、例えば、細胞表面上にαｖβ３インテグリンを提示する宿主細胞（例えば、ＭＤＡＭＢ４３５細胞）は、組換えコート蛋白質を含むアデノウイルスベクターと、非天然リガンド無しの対応する野生型アデノウイルスに曝され得、次いで、トランスダクション効率を比較して、相対的結合アフィニティを測定できる。同様に、細胞表面上にαｖβ３インテグリンを提示する宿主細胞（例えば、ＭＤＡＭＢ４３５細胞）と、細胞表面上にαｖβ１を主に提示する宿主細胞（例えば、２９３細胞）は、組換えコート蛋白質を含むアデノウイルスベクターに曝され、次いで、トランスダクション効率を比較して、結合アフィニティを測定できる。
【００２４】
所望ならば、アデノウイルスコート蛋白質、例えば、ファイバー及び／又はペントンベースの天然結合は除去できる。アデノウイルスコート蛋白質の２つ以上は、細胞表面への接着を仲介すると考えられている（例えば、ファイバー、ペントンベースなど）。宿主細胞への天然結合を変える任意の適切な技術が使用できる。例えば、細胞への天然結合を除去するための異なる長さのファイバーの開発は、ペントンベース又はファイバーノブへの結合配列の付加により達成できる。この付加は、二重特異性又は多重特異性の結合配列により、直接的又は間接的に行える。別の実施態様では、天然基質結合と連関した核酸残基を変異させて（例えば、国際特許出願ＷＯ００／１５８２３参照）、その結果、変異核酸残基を取り込んだアデノウイルスベクターは、天然基質（例えば、ＣＡＲ）と結合することがよりできなくなるようにできる。同様に、インテグリン分子と結合する能力を減少させるために、例えば、ＲＧＤ配列を破壊することによって、アデノウイルスベクターのペントンベースを変異させることができる。
【００２５】
別の実施態様では、アデノウイルスベクターは、特定タイプの真核細胞に選択的ではないキメラウイルスコート蛋白質を含む。キメラコート蛋白質は、内部コート蛋白質配列に、又はその代わりに、非天然アミノ酸配列を挿入することによって、野生型コート蛋白質とは異なる。例えば、約５個〜約９個のリジン残基（好ましくは、７個のリジン残基）を含むリガンドは、非コードスペーサー配列を介しアデノウイルスファイバー蛋白質に接着する。この実施態様では、該キメラコート蛋白質は、国際特許出願ＷＯ９７／２００５１に記載のものなどの野生型ウイルスコートよりも、より広い範囲の真核細胞に効率的に結合する。腫瘍は癌細胞の均一集団を含まないという点で、このようなアデノウイルスベクターは特に好適である。
【００２６】
所定細胞へのアデノウイルスベクターの結合の特異性はまた、米国特許５，９６２，３１１に考察されるように、短いシャフトのアデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスの使用によって調整できる。短いシャフトのアデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスの使用は、その細胞表面レセプターへのアデノウイルスファイバー結合のレベル又は効率を減少させ、細胞表面レセプターへのアデノウイルスペントンベース結合を増加させ、それによって、所定細胞へのアデノウイルスベクターの結合の特異性を増加させる。あるいは、短いシャフトのファイバーを含むアデノウイルスの使用は、ペントンベース又はファイバーノブへの非天然アミノ酸配列の導入によって、所望の細胞表面レセプターへのアデノウイルスのターゲティングを可能とする。
【００２７】
勿論、潜在性宿主細胞を認識するアデノウイルスベクターの能力は、コート蛋白質の遺伝子操作無しで、即ち、二重特異性分子の使用により調節できる。例えば、ペントンベース−結合ドメイン及び特定の細胞表面結合部位と選択的に結合するドメインを含む二重特異性分子とアデノウイルスを複合体形成させることにより、特定の細胞タイプへのアデノウイルスベクターのターゲティングが可能となる。
【００２８】
アデノウイルスベクターへの適切な修飾は、米国特許５，５５９，０９９、５，７３１，１９０、５，７１２，１３６、５，７７０，４４２、５，８４６，７８２、５，９２６，３１１、５，９６５，５４１、６，０５７，１５５、６，１２７，５２５及び６，１５３，４３５並びに国際特許出願ＷＯ９６／０７７３４、ＷＯ９６／２６２８１、ＷＯ９７／２００５１、ＷＯ９８／０７８６５、ＷＯ９８／０７８７７、ＷＯ９８／５４３４６、ＷＯ００／１５８２３、ＷＯ０１／５８９４０に記載されている。アデノウイルスベクターの構築は、当分野で十分に理解されている。アデノウイルスベクターは、例えば、米国特許５，９６５，３５８及び国際特許出願ＷＯ９８／５６９３７、ＷＯ９９／１５６８６、ＷＯ９９／５４４４１に記載の方法を用いて、構築及び／又は精製できる。更に、多数のアデノウイルスベクターは市販されている。
【００２９】
高力価のウイルスベクターストックを産生するために、複製欠損アデノウイルスベクターに存在しないが、適切なレベルでウイルス増殖に必要な遺伝子機能を提供する相補細胞系中で、複製欠損アデノウイルスベクターは典型的に産生される。好適な細胞系は、複製欠損アデノウイルスに存在しない少なくとも１つの、そして好ましくは、全部の複製に必須な遺伝子機能を相補する。相補細胞系は、全てのアデノウイルス機能を含む、初期領域、後期領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルス結合ＲＮＡ領域、又はそれらの組合せによってコードされる少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能での欠損を相補することができる（例えば、アデノウイルスアンプリコンの増殖を可能とするために）。最も好ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能（例えば、２つ以上の複製に必須な遺伝子機能）での欠損、特に、Ｅ１ＡとＥ１Ｂ領域の各々の複製に必須な遺伝子機能での欠損を相補細胞系は相補する。更に、アデノウイルスゲノムのＥ２領域（特に、アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼ及び末端蛋白質に関し）及び／又はＥ４領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能での欠損を相補細胞系は相補できる。望ましくは、Ｅ４領域での欠損を相補する細胞は、Ｅ４−ＯＲＦ６遺伝子を含み、Ｅ４−ＯＲＦ６蛋白質を産生する。このような細胞は望ましくは、アデノウイルスゲノムの少なくともＯＲＦ６を含み、Ｅ４領域の他のＯＲＦは含まない。アデノウイルスベクターと非重複様式で相補遺伝子を含み、それは、ベクターゲノムと細胞ＤＮＡとの組換えの可能性を最小化し、実際的には除去するという点において、細胞系は好ましくは、更に特徴付けられる。従って、ベクターストックで避けられるならば、複製能のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）の存在は最小化され、従って、それは、ある治療目的、特に遺伝子治療目的に適している。ベクターストックでのＲＣＡの欠如は、非相補細胞系でのアデノウイルスベクターの複製を避ける。このような相補細胞系の構築は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），及び  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載のものなどの標準分子生物学と細胞培養技術を含む。遺伝子導入ベクター（例えば、アデノウイルスベクター）を産生するための相補細胞系として、２９３細胞（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６，５９−７２（１９７７）に記載）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、国際特許出願ＷＯ９７／００３２６並びに米国特許５，９９４，１２８及び６，０３３，９０８に記載）、及び２９３−ＯＲＦ６細胞（例えば、国際特許出願ＷＯ９５／３４６７１及びＢｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１，９２０６−９２１３��１９９７）に記載）が挙げられるが、それらに限定されない。幾つかの例では、相補細胞は、全ての必要なアデノウイルス遺伝子機能は相補しないであろう。ヘルパーウイルスを用いて、アデノウイルスベクターの複製を可能とするために、細胞ゲノム又はアデノウイルスゲノムによってコードされない遺伝子機能をトランスに提供できる。
【００３０】
ＴＮＦをコードする核酸配列
アデノウイルスベクター、好ましくは、複製欠損アデノウイルスベクターは、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含む。ＦａｓリガンドやＣＤ４０リガンドなどのＴＮＦファミリーの蛋白質の他のメンバーは、幾つかの疾患の治療に有用性を有するが、ＴＮＦ−αは、有効な抗癌剤であることが証明された。癌に対するＴＮＦ−αの効果は、アポトーシスや腫瘍壊死の導入を含めて多機能性である。間接的なＴＮＦ−αの全身効果は、サイトカイン分泌誘導や血管凝固系の活性化を含む免疫エフェクター細胞の活性化を含む。ＴＮＦ−αは、好中球や血小板への血管内皮の付着を誘導し、トロンボモジュリン産生を減少させる（Ｋｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６８，１１０４−１１１３  （１９９５））。結果は、腫瘍新生血管系でのクロット形成と、腫瘍の次なる出血性壊死である。ＴＮＦ−αをコードする核酸配列は、米国特許４，８７９，２２６に詳細に記載されている。
【００３１】
ＴＮＦ−αをコードする核酸配列は、米国特許４，８７９，２２６に記載されているものが好ましいが、核酸配列の多くの修飾やバリエーションが可能であり、本発明で適切である。例えば、遺伝子コードの縮重は、コードされたポリペプチドの変更無しに、ポリペプチドコード領域中と、翻訳終結シグナルでのヌクレオチドの置換を可能とする。このような置換可能配列は、ＴＮＦ−αの公知のアミノ酸配列又はＴＮＦ−αをコードする公知の核酸配列から導かれ得、通常の合成方法又は部位特異的変異誘発方法によって構築できる。合成ＤＮＡ方法は、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８，１０５６−１０６３（１９７７），及びＣｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，５７６５−５７６９（１９７８）の手順に実質的に従って実施できる。部位特異的変異誘発方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２ｄ  ｅｄ．１９８９）に記載されている。あるいは、核酸配列は、ＴＮＦ−αペプチドが抗腫瘍活性を保持する限り、該蛋白質のＮ末端又はＣ末端での延長を有するＴＮＦ−αペプチドをコードできる（米国特許４，６５０，６７４、５，７９５，９６７、５，９７２，３４７並びに欧州特許１６８，２１４、１５５，５４９に記載されているものなど）。
【００３２】
更に、ＴＮＦ−αのホモログ〔即ち、該蛋白質にアミノ酸レベルで約７０％を超えて同一（好ましくは、約８０％を超えて同一、より好ましくは、約９０％超えて同一、最も好ましくは、約９５％超えて同一）であって、ＴＮＦ−αの抗癌活性と同一レベルを示す任意の蛋白質〕をコードする核酸配列を、アデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）中に組み込むことができる。アミノ酸同一の程度は、ＢＬＡＳＴ配列データベースなどの当分野公知の任意の方法を用いて測定できる。更に、該蛋白質のホモログは、少なくとも中程度の、好ましくは、高いストリンジェント条件下、該蛋白質とハイブリダイズし、抗癌活性を保持する、任意のペプチド、ポリペプチド、又はその部分でありうる。代表的な中程度のストリンジェント条件として、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム），５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液，１０％硫酸デキストラン，２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で３７℃、一晩インキュベーション、次いで、約３７〜５０℃で１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄、又は実質的に同様の条件、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記、に記載されている中程度のストリンジェント条件が挙げられる。高いストリンジェント条件は、例えば、（１）洗浄用に５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの低イオン強度及び高温を使用する、（２）ハイブリダイゼーションの際、４２℃で、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム含有５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５を有するホルムアミド、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドなどの変性剤を用いる、又は（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％リン酸ナトリウム、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ'ｓ溶液、音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストランを用い、（ｉ）０．２ｘＳＳＣ中、４２℃、（ｉｉ）５０％ホルムアミド中５５℃、及び（ｉｉｉ）０．１ｘＳＳＣ中（好ましくは、ＥＤＴＡと組み合わせて）５５℃で洗浄する条件である。更なる詳細及びハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの説明は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記、に記載されている。
【００３３】
核酸配列は、ＴＮＦ−αの機能性部分、即ち、測定可能なレベルで、天然起源の完全長の該蛋白質の生物活性を保持する蛋白質の任意の部分、をコードできる。アデノウイルスベクター、好ましくは、複製欠損アデノウイルスベクターの核酸配列の発現によって産生される機能性ＴＮＦ−αフラグメントは、標準的な分子生物学や細胞培養技術を用いて同定できる（該蛋白質フラグメントをコードする核酸配列によって一過性にトランスフェクトされたヒト細胞での、該フラグメントの生物活性をアッセイするなど）。
【００３４】
あるいは、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を操作して、ＴＮＦ−α活性を変更（好ましくは、増大）できる。核酸配列を操作して、ＴＮＦ−αの分泌を増大でき、あるいは、核酸配列を操作して、細胞表面に結合したままであるＴＮＦ−α蛋白質をコードできる。核酸配列を操作して、ＴＮＦ−α蛋白質の安定性を増大できる（例えば、有害条件下でも、適切な３次元コンホメーションを保持する）し、あるいはＴＮＦレセプターの活性化のためにＴＮＦ−α蛋白質の力価を増大できる。従って、本発明は、米国特許４，８７９，２２６での具体的な核酸配列に限定されず、核酸配列の修飾は本明細書中で考えられている。
【００３５】
核酸配列は望ましくは、発現カセット、即ち、核酸配列のサブクローニングと回収（例えば、１つ以上の制限部位）又は核酸配列の発現（例えば、ポリアデニル化又はスプライス部位）を容易にする機能を有する特定の塩基配列、の部分として存在する。ＴＮＦ−αをコードする核酸配列は好ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域に位置する（たとえば、全体的に、又は部分的に、Ｅ１領域に置換する）。例えば、Ｅ１領域は、例えば、図１と２（それらは、それぞれ、非修飾及び修飾アデノウイルスベクターゲノムを示す）で示されるように、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むプロモーター可変発現カセットによって置換されうる。Ｅ１領域（１０）は、放射線誘導性プロモーター（１４）、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列（１５）及びポリアデニル化配列（１６）を含む発現カセット（１３）によって置換されうる。発現カセットは好ましくは、３’−５’配向で挿入される、例えば、発現カセットの転写の方向は、周りのアデノウイルスゲノムのものとは反対であるように配向される。ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含む発現カセットに加えて、アデノウイルスベクターは、他の産物をコードする核酸配列を含む発現カセットを含みうる。該カセットは、アデノウイルスゲノムの欠失領域の任意のものに換わりうる。アデノウイルスゲノム（例えば、ゲノムのＥ１領域）中への発現カセットの挿入は、公知の方法によって（例えば、アデノウイルスゲノムの所定位置でユニークな制限部位の導入によって）容易にされることができる。上記のように、好ましくは、アデノウイルスベクターのＥ３領域（１１）は欠失し（１７）、Ｅ４領域（１２）はスペーサー要素（１８）によって置換されている。
【００３６】
好ましくは、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列は、ＴＮＦ−αコード配列の３’に位置するポリアデニル化配列などの転写終結領域を（コード配列の転写方向で）更に含む。合成最適化配列、並びに、ＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタイン  バール  ウイルス）、パピローマウイルス（ヒトパピローマウイルス及びＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）を含む）のポリアデニル化配列を含む任意の適切なポリアデニル化配列を使用できる。好適なポリアデニル化配列は、ＳＶ４０（ヒト肉腫ウイルス４０）ポリアデニル化配列である。
【００３７】
好ましくは、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列は、例えば、プロモーター可変発現カセットの一部として、１つ以上のプロモーター及び／又はエンハンサー要素と機能可能に連結する（即ち、その転写制御下にある）。配列と機能可能的に連結する技術は、当分野周知である。任意の適切なプロモーター又はエンハンサー配列が、本発明で使用できる。更に、転写を増強するために、任意のエンハンサー配列は、任意のプロモーター配列と共に使用できる。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー配列は、下記のプロモーターの任意のものなどの任意のプロモーターと共に使用できる。適切なウイルスプロモーターとして、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ極初期プロモーター（例えば、米国特許５，１６８，０６２に記載）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター（ＨＩＶ長末端リピートなど）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（ＲＳＶ長末端リピートなど）、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＳＶプロモーター（Ｌａｐ２プロモーター又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなど（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８，１４４−１４５（１９８１））、ＳＶ４０又はエプスタイン  バール  ウイルス由来のプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーター（ｐ５プロモーターなど）などが挙げられる。核酸配列が機能可能に連結する制御配列はまた、組織特異的プロモーター、即ち、所定の組織で優先的に活性化されるプロモーターであって、活性化される組織で遺伝子産物、特にＴＮＦ−α、が産生されるプロモーター、を含みうる。例えば、内皮細胞又は間質細胞で選択的に活性な制御配列は、癌細胞の環境で外来性核酸配列を発現するのに理想的である。
【００３８】
上記プロモーターの多くは構成性プロモーターである。構成性プロモーターの代わりに、プロモーターは、誘導性プロモーター、即ち、適切なシグナルに応答してアップ及び／又はダウンレギュレートされるプロモーター、でありうる。例えば、化学療法剤によってアップ−レギュレートされる発現制御配列は、癌適用に特に有用である（例えば、化学誘導性）。更に、発現制御配列は、放射エネルギー源又は細胞を抑圧する物質によってアップ−レギュレートされうる。例えば、発現制御配列は、超音波、光活性化化合物、無線周波数、化学療法、低温凍結によってアップ−レギュレートされうる。本発明の好適なアデノウイルスベクターは、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列に機能可能に連結した化学誘導性又は放射線誘導性プロモーターを含む。放射線誘導性プロモーターの使用は、例えば、アデノウイルスベクターを含む細胞又は宿主への放射線の投与によって、ＴＮＦ−α産生の局在化制御を可能とし、それによって、全身毒性を最小化する。任意の適切な放射線誘導性プロモーターが、本発明で使用できる。本発明で使用される好適な放射線誘導性プロモーターは、初期増殖領域−１（ＥＧＲ−１）プロモーター、特にＥＧＲ−１プロモーターのＣＡｒＧドメインである。放射線誘導性に寄与しそうなＥＧＲ−１プロモーターの領域は、ヌクレオチド−５５０〜−５０塩基対の間に位置する。ＥＧＲ−１プロモーターは、米国特許５，２０６，１５２及び国際特許出願ＷＯ９４／０６９１６に詳細に記載されている。別の適切な放射線誘導性はプロモーターは、ｃ−Ｊｕｎプロモーターであり、それは、Ｘ線によって活性化される。放射線誘導性に寄与しそうなｃ−Ｊｕｎプロモーターの領域は、ヌクレオチド−１．１ｋｂ〜７４０塩基対の間に位置すると信じられている。ｃ−ＪｕｎプロモーターとＥＧＲ−１プロモーターは、例えば、米国特許５，７７０，５８１に更に記載されている。プロモーターは、任意の適切な方法（アデノウイルスゲノムの所定領域でのユニークな制限部位の使用など）によってアデノウイルスゲノムに導入されうる。あるいは、プロモーターは、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含む発現カセットの部分として挿入されることができる。
【００３９】
他のアデノウイルスベクター考慮
記載されたアデノウイルスベクターは、ＴＮＦ−αをコードするもの以外の核酸配列、例えば、肺気腫、喘息、成人呼吸窮迫症候群及び慢性気管支炎などの慢性肺疾患、並びに冠動脈性心臓疾患、癌と関連する通常の合併症、並びに遺伝子治療、ワクチン接種などによって適切に治療又は予防される他の病気を含むが、それらに限定されない他の同様の、又は異なる疾患及び／又は病気を治療する核酸配列、を含みうる。更なる追加の核酸配列（即ち、導入遺伝子）が予防的又は治療的利益を与えるならば、核酸配列は、ＲＮＡ又は蛋白質のレベルでその効果を発揮しうる。あるいは、追加の核酸配列は、アンチセンス分子、リボザイム、スプライシングもしくは３’プロセシング（例えば、ポリアデニル化）に影響を与える蛋白質、又は、転写後制御でｍＲＮＡ蓄積又は輸送又は変化の変更された速度を仲介することによってなどによって、細胞内で別の遺伝子の発現レベルに影響を与える蛋白質（即ち、そこでは、遺伝子発現は、転写の開始からプロセシングされた蛋白質の産生までの全ての過程を含むと広く考えられる）をコードしうる。追加の核酸配列は、組合せ治療法用のキメラ蛋白質をコードしうる。更なる核酸配列はまた、ＴＮＦ−αとは異なる標的に作用する因子をコードし得、それによって多因子性癌治療が提供される。あるいは、追加の核酸配列は、ＴＮＦ−αの効果を増強する因子をコードしうる。このような因子の例はＰＫＲ、即ち、二重鎖ＲＮＡ依存性蛋白質キナーゼ、であり、それは、癌細胞にアポトーシスを起こし易くさせる（例えば、米国特許５，９７６，８００参照）。
【００４０】
アデノウイルスベクターは、ＴＮＦ−α以外の抗血管形成物質をコードする更なる核酸配列を含みうる。抗血管形成物質は、血管形成を予防あるいは改善する任意の生物学的因子である。抗血管形成物質は、血管形成の部分的もしくは完全的な予防及び改善を生じ、治療効果を達成しうる。抗血管形成物質として、例えば、抗血管形成因子、血管形成因子に特異的なアンチセンス分子、リボザイム、血管形成因子のレセプター、血管形成因子のレセプターと結合する抗体が挙げられる。腫瘍の拡大につながり得る、周りの組織中への血管漏出を防止するために、アデノウイルスベクターは、アンジオポエチン（Ａｎｇ，例えば，Ａｎｇ−１及びＡｎｇ−２），ミドカイン（ＭＫ），ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ，ヘパリン結合好中球因子（ＨＢＮＦ，ヘパリン結合増殖因子としても知られる）などの血管成熟因子をコードする更なる核酸配列を含みうる。免疫抑制因子をコードする核酸配列はまた、アデノウイルスベクター中に組み込まれ得、アデノウイルスベクターが宿主に投与される結果としてのそれへの任意の不適切な免疫応答を減少しうる。
【００４１】
アデノウイルスベクターは、インターフェロン（ＩＮＦ  α、β、γ）、コロニー刺激因子、又はインターロイキン（ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ−１３，ＩＬ−１５など）などのサイトカインをコードする核酸配列を更に含みうる。更なる核酸配列は、ＨＳＶチミジンキナーゼ（例えば、国際特許出願ＷＯ０１／２４６８４参照）などのプロドラッグ変換酵素をコードしうる。更なる核酸配列は好ましくは、哺乳動物の癌細胞に有害な蛋白質（即ち、「有害蛋白質」）をコードする。癌細胞に有害な蛋白質をコードする核酸配列は当分野公知であり、その例として、ｐ５３、Ｆａｓ、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＦａｓＬＭ４５（プロテアーゼ切断部位に欠失を有するＦａｓＬの誘導体）、デスドメインをもったＦａｓ関連蛋白質（ＦＡＤＤ；レセプター誘導毒性のメディエーターとしても知られる（ＭＯＲＴ−１））、Ｎ末端欠失を含むＢｃｌ−２の細胞死誘導コード配列、Ｎ末端欠失を含むＢｃｌ−ｘの細胞死誘導コード配列、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１（インターロイキン−１β−変換酵素（ＩＣＥ））、カスパーゼ３、カスパーゼ８（ＭＡＣＨ／ＦＬＩＣＥ（ＦＡＤＤ−ホモローガスＩＣＥ−ＣＥＤ３−様プロテアーゼ）／Ｍｃｈ５）、及びカスパーゼ１０（Ｍｃｈ４））、レセプターと相互作用する蛋白質（ＲＩＰ）、セル・デス・アブノーマル（ＣＥＤ４）、Ａｐａｆ−１、関連ＩＣＨ−１／デスドメインをもったＲＩＰ−ＣＥＤ−３−ホモローガス蛋白質（ＲＡＩＤＤ）／カスパーゼ及びデスドメインをもったＲＩＰアダプター（ＣＲＡＤＤ）、ＮＦ−κＢのインヒビター（ＩκＢ）、ＤＮＡ断片化因子（ＤＦＦ）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ；ａｐｏ２リガンド（Ａｐｏ２Ｌ））、デスレセプター（ＤＲ４）、ＤＲ５、ｂａｘ、ｂａｋ、ｂｉｄ、ｂａｄ、ｂｉｋ、ｂｉｆ−２、ｃ−ｍｙｃ、ＪＵＮ、ドミナントネガティブＪＵＮ産物、プロテアーゼ、蛋白質キナーゼ、転写活性化因子、シグナル伝達蛋白質、プロテインキナーゼＣ、ＰＩＴＳＬＲＥキナーゼ、ＤＡＰキナーゼ、ＪＵＮ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）／ＳＡＰＫ、Ｄａｘｘ、ｒａｓ、Ｒａｆ、ＮＩＫ、ＭＥＫＫ１、ＡＳＫ１、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、Ｒｂ１９４、アデノウイルスＥ１Ａ産物、アデノウイルスＥ２Ｆ産物、アデノウイルスＥ２Ｆ産物の合成細胞周期非依存性形態、アデノウイルスＥ４／ＯＲＦ４産物、アポプチン、上記の任意のもののアポトーシス活性部分、及び上記の２つ以上の組合せをコードする核酸配列が挙げられる。
【００４２】
更なる核酸配列は、緑蛍光蛋白質又はルシフェラーゼなどのマーカー蛋白質をコードしうる。このようなマーカー蛋白質は、ベクター構築やベクター移動の測定に有用である。治療の広範な区域を提供するために医薬組成物の注射の間隔を効率的に空けるために、注射点を決定するのにもマーカー蛋白質は使用できる。あるいは、核酸配列は、選択因子（例えば、抗生物質耐性因子）をコードし得、それはまた、ベクター構築プロトコルにおいて有用である。所望ならば、更なる核酸配列は、発現カセットの一部でありうる。
【００４３】
本明細書で記載した核酸配列の任意のものは、治療効果を増加させるために、それらの天然形態から変更しうる。例えば、治療用遺伝子産物の細胞質形態は、コードされた遺伝子産物中にシグナルペプチドを挿入することによって、分泌形態に変換しうる。遺伝子産物はまた、ペプチドとＶＰ２２との融合によって隣接細胞に取り込まれるように操作できる。
【００４４】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、医薬として許容できる担体と、ＴＮＦ−αをコードする核酸を含むアデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）を含む。任意の適切な医薬として許容できる担体が、本発明内で使用でき、このような担体は当分野で周知である。担体の選択は、部分的には、医薬組成物を投与する特定部位及び医薬組成物を投与するのに使用される特定方法によって決定されよう。
【００４５】
適切な製剤として、水性及び非水性溶液、等張滅菌溶液（それらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、意図された受容者の血液もしくは他の体液と製剤を等張にする溶質を含みうる）、並びに、水性及び非水性滅菌懸濁液（それらは、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、保存剤を含有しうる）が挙げられる。好ましくは、医薬として許容できる担体は、緩衝液と塩を含有する液体である。製剤は、アンプルやバイアルなどの、単位投与量又は多重投与量の密封容器で提出されることができ、使用直前に、滅菌液体担体、例えば、水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存できる。即時調製溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、錠剤から調製できる。好ましくは、医薬として許容できる担体は、緩衝化生理食塩水溶液である。
【００４６】
より好ましくは、投与前にアデノウイルスベクターをダメージから防御するために、医薬組成物は、製剤化される。特定の製剤化は望ましくは、アデノウイルスベクターの光感受性及び／又は温度感受性を減少させる。事実、医薬組成物は、種々の期間維持されよう、従って、投与時に安定性と最大活性を確保するために製剤化されるべきである。典型的には、医薬組成物は、０℃を超える温度で、好ましくは、４℃以上（例えば、４〜１０℃）に維持される。一部の実施態様では、医薬組成物を、温度１０℃以上（例えば、１０〜２０℃）、２０℃以上（例えば、２０〜２５℃）、又は３０℃以上（例えば、３０〜４０℃）でさえも、維持するのが望ましい。医薬組成物は、上記温度で、少なくとも１日（例えば、７日（１週間）以上）維持しうるが、典型的には、患者に投与前に、期間は、より長く、例えば、少なくとも３、４、５、もしくは６週、又は一層長く、例えば、少なくとも１０、１１、もしくは１２週であろう。その期間の間、アデノウイルス遺伝子導入ベクターは最適には、活性を全く、又はほぼ全く失わないが、活性の一部の損失は許容でき、特に、比較的保存温度が高い、及び／又は比較的保存時間が長いときはそうである。好ましくは、アデノウイルスベクター組成物の活性は、上記したいずれの期間の後でも、約２０％以下、好ましくは、約１０％以下、より好ましくは、約５％以下しか減少しない。
【００４７】
この目的のために、医薬組成物は好ましくは、例えば、上記のものなどの医薬として許容できる液体担体、及びポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、α−Ｄ−グルコピラノシル  α−Ｄ−グルコピラノシド二水和物（通常、トレハロースとして知られる）、及びそれらの組合せからなる群から選択される安定化剤を含有する。より好ましくは、安定化剤は、トレハロース、又はポリソルベート８０と組合せてのトレハロースである。安定化剤は、医薬組成物中で任意の適切な濃度で存在しうる。安定化剤がトレハロースであるとき、トレハロースは望ましくは、医薬組成物の約２〜１０％（重量／体積）、好ましくは、約４〜６％（重量／体積）の濃度で存在する。トレハロースとポリソルベート８０が医薬組成物中に存在するとき、トレハロースは好ましくは、約４〜６％（重量／体積）、より好ましくは、約５％（重量／体積）の濃度で存在するが、ポリソルベート８０は望ましくは、約０．００１〜０．０１％（重量／体積）、より好ましくは、約０．００２５％（重量／体積）の濃度で存在する。安定化剤、例えば、トレハロース、が医薬組成物に包含されるとき、医薬として許容できる液体担体は好ましくは、トレハロース以外の糖を含む。医薬組成物の適切な製剤化は、米国特許６，２２５，２８９及び国際特許出願ＷＯ００／３４４４４に更に記載されている。
【００４８】
医薬組成物は更に製剤化されて、ガラス器具、注射器、カテーテル又は針などの、発現ベクターを調製、保存、又は投与するのに使用されるデバイスでのアデノウイルスベクターの吸着損失を減少できる。このような医薬組成物の使用は、医薬組成物の保存寿命を延長し、投与を容易にし、本発明の方法の効力を増加させよう。この点に関し、標的組織中のアデノウイルスベクターの広がりを増大させ、及び／又はトランスダクション効率を増大させるために、医薬組成物はまた、製剤化できる。この目的のために、医薬組成物はまた、アデノウイルスベクターの取り込みを増大させることが示されたヒアルロニダーゼを含みうる。医薬組成物へのプロテアーゼの添加は、腫瘍中のアデノウイルスベクターの広がりを増大できる。アデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）は、標的組織に留まり、周りの正常組織に漏出しない、即ち、標的組織での医薬組成物の保持を増加させるように、組成物を製剤化することが望ましい。従って、刺激感受性ポリマーなどの医薬組成物の粘度を増加する薬剤を包含させることができる。あるいは、医薬組成物のアデノウイルスベクターは、サイズのために標的組織に留まる、粒子状担体（例えば、ビーズ、ウェファーなど）などの生体適合性固体担体に結合しうるし、又はゲルやフォームなどのマトリックス中に組み込まれうる。
【００４９】
更に、医薬組成物は、更なる治療剤又は生物活性剤を含みうる。例えば、特定の徴候の治療に有用な治療因子が存在しうる。イブプロフェンやステロイド類などの炎症を制御する因子は、医薬組成物の一部となり、アデノウイルスベクターのインビボ投与及び生理的窮迫に関連した腫脹や炎症を減少しうる。免疫系抑制因子を医薬組成物と共に投与して、アデノウイルスベクターそれ自体への免疫応答又は疾患に関連した免疫応答を減少できる。あるいは、免疫増大因子を医薬組成物に包含させて、疾患に対する身体のもともとの防衛をアップレギュレートできる。更に、ＴＮＦ−α以外のサイトカインを医薬組成物と共に投与して、腫瘍部位に免疫エフェクター細胞を引きつけることができうる。
【００５０】
可溶性増殖因子レセプター（例えば、ｓｆｌｔ）、増殖因子アンタゴニスト、即ち、アンジオテンシン、などの抗血管形成因子はまた、医薬組成物の一部となりうる。同様に、ビタミン類やミネラル類、抗酸化剤、及び微量栄養素は、医薬組成物と共投与できる。抗生物質、即ち、殺微生物剤や殺真菌剤は、遺伝子導入方法及び他の障害に関連した感染の危険性を減少する為に存在し得る。医薬組成物への化学療法剤の添加は、腫瘍減少を生じさせる更なる機構を提供できる。
【００５１】
標的組織
本発明の方法は、本明細書記載のアデノウイルスベクターなどのアデノウイルスベクターによってトランスダクションできる任意の標的組織（例えば、腫瘍組織）に、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を送達するのに使用できる。好ましくは、標的組織は、ＴＮＦ−αが組織でその生物活性を発揮できるようにＴＮＦ−αレセプターを含む。理想的には、標的組織は、ヒトにおける腫瘍、例えば、固形腫瘍又は軟組織と関連した腫瘍（即ち、軟組織肉腫）、である。腫瘍は、口腔と咽頭、消化器系、呼吸器系、骨と関節（例えば、骨転移）、軟組織、皮膚（例えば、メラノーマ）、乳房、性器系、泌尿器系、眼と眼窩、脳と神経系（例えば、グリオーマ）、又は内分泌系（例えば、甲状腺や副腎）の（即ち、そこに局在する）癌と関連し得、必ずしも原発性の腫瘍ではない。口腔と関連した組織として、舌及び口組織が挙げられるが、それらに限定されない。癌は、例えば、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓（例えば、肝胆道系癌）、胆嚢、膵臓を含む消化器系の組織で生じうる。呼吸器系の癌は、喉頭、肺、気管支を冒し得、例えば、非小細胞肺癌が挙げられる。腫瘍は、男性及び女性性器系を構成する、子宮頚部、子宮体部、卵巣、外陰、膣、前立腺、精巣、ペニスで生じ得、泌尿器系を含む、膀胱、腎臓、腎盂、尿管で生じ得る。標的組織はまた、リンパ腫（例えば、ホジキン病や非ホジキン病リンパ腫）、多発性ミエローマ、又は白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病など）と関連しうる。
【００５２】
腫瘍は如何なる段階のものでもありえ、他の治療を受け得る。本発明の方法は、放射線耐性腫瘍などの、癌治療の他の形態に耐性であることが証明された腫瘍を治療するのに有用である（即ち、腫瘍細胞の破壊又は腫瘍サイズの減少）。腫瘍はまた、如何なるサイズでもありうる。実際、本発明は、部分的には、最初に大きかった腫瘍のサイズ（例えば、４２ｃｍ2又は４４００ｃｍ3）を有意に減少するという本発明の方法の驚くべき能力に基づく。理想的には、ヒトの癌の治療の際に、本発明の方法により、癌（腫瘍）細胞死及び／又は腫瘍サイズの減少が生じる。腫瘍細胞死は、例えば、支持細胞の存在、血管新生、線維状マトリックスのために、腫瘍サイズの実質的な減少無しに起こり得る。従って、腫瘍サイズの減少が好ましいが、癌の治療には必要ではない。
【００５３】
投与方法
本発明の方法は、癌治療のために、ヒトに医薬組成物を投与することを含む。抗癌剤／抗腫瘍剤としてヒトでのＴＮＦ−αの使用は、治療の結果として生じる重度の全身影響によって制限されてきた。従って、このような負の副作用を減衰又は防止するために、ＴＮＦ−αを必要とする組織（即ち、腫瘍）にＴＮＦ−αをコードする核酸配列のみを投与する、又は、少なくとも、腫瘍組織で該核酸配列の発現を主に促進することが望ましい。従って、ＴＮＦ−αが、標的組織内で、又は近傍で産生されるような任意の手段によって、医薬組成物は投与できる。
【００５４】
標的組織に、局所的様式で、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）を含む医薬組成物を投与することによって、標的組織に接触させることを、本発明は好ましくは含む。腫瘍に医薬組成物を投与する任意の適切な手段が、本発明内で使用できるが、好ましくは、腫瘍への局所投与が、腫瘍内に、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターを含む医薬組成物を直接的に注射することによって達成される。用語「注射すること」は、医薬組成物が、標的組織中に強制的に導入されることを意味する。
【００５５】
医薬組成物は望ましくは、腫瘍塊の全域で均一様式で投与される。従って、注射を介し医薬組成物を投与するとき、腫瘍内の分布を最大化するように注射は行われる。例えば、注射デバイスの針が、腫瘍組織表面を刺し（通常、腫瘍体積に依存して、約１ｃｍ〜約５ｃｍの深さ、好ましくは、約２ｃｍ〜約４ｃｍ（例えば、３ｃｍ）の深さ）、そして針が組織からゆっくりと除去されるとき、医薬組成物は送達デバイスから発射され、その結果、ベクターが、針の通路に沿って放出される。更に、腫瘍に医薬組成物を一様に送達するように、各注射のタイミングは制御されうる。換言すれば、周りの組織によるアデノウイルスベクターの効率的な取り込みのために、医薬組成物は注射デバイスからゆっくりと発射されうる（例えば、注射当たり約５秒、好ましくは、注射当たり約１０秒、より好ましくは、注射当たり約１５秒）。１実施態様では、医薬組成物約１μｌ〜約１０μｌを、１０分かけて腫瘍に投与する。あるいは、ベクター取り込みを強制するために、医薬組成物を、注射デバイス（例えば、「スプレー」で）から素早く、強制的に発射されうる。実際、標的組織に接触する前に、医薬組成物が正常組織を横断するように、医薬組成物は投与され得る。勿論、標的組織を横切っての医薬組成物の均一分布は必要ではない。
【００５６】
腫瘍が、皮膚を通し容易には可視できない場合、腫瘍を可視化し、腫瘍体積を見積り、注射配置をガイドするために、臨床家は医学装置を使用できる。癌診断の画像化技術は非常に進歩している。超音波及びコンピュータ化トモグラフィ（ＣＴ）装置は、腫瘍塊を検出するのに通常使用される。しかし、より進歩した画像化技術が開発されてきており、陽電子放射トモグラフィ（ＰＥＴ）（それは、組織の代謝活性を示す）、単一光子放射コンピュータ化トモグラフィ（ＳＰＥＣＴ）、スパイラルＣＴ、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、内視鏡的超音響分析（それは、プローブに装着したファイバー−光学内視鏡を用いる）などが挙げられる。
【００５７】
任意の適切な注射デバイスが、本発明内で使用できる。例えば、通常の医学用注射器を用いて、皮下腫瘍に医薬組成物を直接的に注射できる。勿論、標準的な医学用注射器を用いて、皮膚下に、直接的ではなく、標的組織（例えば、腫瘍）に注射できる。腫瘍が容易には接近可能でなければ、注射を可能とするために、腫瘍は、手術方法の間、曝され得る。しかし、侵襲性最小のデバイスは、侵襲的医学手法無しで、医薬組成物の投与を可能とする。このようなデバイスは、皮膚を通り直接的には接近可能ではない標的組織に、例えば、５インチ未満の小切開を介し接近できる。侵襲性最小の注射デバイスは、柔軟性で、可動性のインジェクターチップを備え、器官、例えば、肝臓の曲がった外表面に小切開を介し接近を可能とする。非侵襲性注射の別の手段として、Ｂｉｏｊｅｃｔ，  Ｉｎｃ．から入手可能なＢｉｏｊｅｃｔｏｒ  ２０００  Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）などの注射針無しの注射デバイス  が挙げられる。カテーテルを用いて、医薬組成物は、標的組織に投与できる。例えば、経カテーテル化学塞栓術は、皮膚での小切開を通じ標的組織にカテーテルを挿入することを含む。アンギオグラフィーを用いて、標的組織に供給する血管系中にカテーテルをガイドし、その結果、治療剤は、標的組織への血液流をブロックする粒子状物質と一緒に放出される。治療剤は周囲の組織に逃れず、腫瘍は、栄養素が枯渇する。内視鏡は、カテーテル操作と同様であるが、医薬組成物を投与しながら、標的組織の可視化を可能とする。カテーテルは、腫瘍に供給する血液流に医薬組成物を放出することと、及び腫瘍組織で医薬組成物を注入することの両方で有用である。特定のジオメトリーをもった多重注射を可能とするために、マーキングシステムを用いることができて、その結果、以前の注射部位が十分に表され得る。医薬組成物が、異なる幾何パターンでの多重適用により腫瘍組織に投与されるとき、増大した腫瘍と注射の可視化が特に保証される。
【００５８】
腫瘍組織中に医薬組成物を直接的に注射することに加えて、医薬組成物は、腫瘍組織に局所的に適用できる。例えば、腫瘍組織を、医薬組成物に浸すことができ、それによって、組織表面と周囲の環境に遺伝子導入が生じうる。勿論、例えば、医薬組成物が注射され、腫瘍組織に局所的に投与されるように、２以上の投与経路が使用できる。医薬組成物に腫瘍を浸すことを含む局所投与は、注射で通常可能な時間よりも長い時間、アデノウイルスベクターへの関連組織の暴露を可能とする。長時間の医薬組成物への組織の暴露は、標的細胞と支持細胞での取り込みレベルを増加し得る。同様に、任意の適切な送達デバイス、例えば、カテーテルを用いて、標的組織を、医薬組成物である時間灌流することができる。トランスダクションが起こる限り、腫瘍を、任意の期間にわたって、医薬組成物で灌流できる。例えば、約１分〜約２０時間（例えば、約１分〜約１２時間）、好ましくは、約１５分〜約１０時間（例えば、約１５分〜約６時間）、より好ましくは、約３０分〜約５時間（例えば、約３０分〜約３時間）、より好ましくは、約１〜２時間。
【００５９】
それほど好ましくはないが、投与の他の経路を使用して、医薬組成物を投与できる。実際、２以上の経路を使用して医薬組成物を投与できるが、特定の経路は、別の経路よりも、より即時で、より有効な反応を提供できる。例えば、特に好適ではないが、医薬組成物は、体腔に適用でき、又は染み込ませ得、皮膚を通して吸収され得、吸入され得、又は、筋肉内、静脈内、腹膜もしくは動脈内投与により非経口で投与され得る。好ましくは、患者に非経口的に投与される医薬組成物のアデノウイルスベクターは、特定の細胞、例えば、癌細胞を特に標的とする。領域的送達に関し、医薬組成物は、動脈内又は静脈内に、例えば、肝臓への送達のために肝動脈を介し、又は脳への送達のために冠動脈を介し、投与できる。脳への投与に関し、腫瘍内送達カテーテル、リザーバー（例えば、Ｏｍａｙａリザーバー）に連結した心室シャントカテーテル、点滴ポンプを用いて、医薬組成物を腫瘍組織内に導入することができ、又は、腫瘍切除空洞内に導入できる（例えば、グリアサイト，Ｐｒｏｘｉｍａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓなど）。連続的点滴カテーテルを用い、対流により、又は脳脊髄液を通り、医薬組成物を投与することによって、脳の腫瘍組織はまた接触できる。あるいは、医薬組成物は、肺への送達のために胸腔へ、又は中皮腫のために腹腔に投与できる。更に、リンパ系は、リンパ節への送達のために、例えば、腫瘍内注射後、アクセスできる。領域的送達に関し、医薬組成物は好ましくは、標的組織に供給する動脈内に直接的に送達される。本明細書で考察されるように、潜在性宿主細胞上のレセプターに関し、アデノウイルスベクターの結合特異性又は認識を変更するように、アデノウイルスベクターは修飾されることができる。アデノウイルスに関し、このような操作として、ファイバー、ペントンもしくはヘキソンの領域の欠失、コート蛋白質の部分内への種々の天然もしくは非天然のリガンドの挿入などが挙げられる。非経口投与は、適当な宿主細胞へ医薬組成物のアデノウイルスベクターを有効に送達するために、大用量の投与量又は多重投与を必要としうる。
【００６０】
血流を介する医薬組成物の投与に通常関連した限定は、宿主免疫系、特に細網内皮系（ＲＥＳ）によって仲介される、身体からのアデノウイルスベクターの急速なクリアランスである。投与後直ぐのアデノウイルスベクターのクリアランスは、患者での治療効果を達成するために、投薬戦略を著しく複雑化する。理想的には、医薬組成物が投与され、長時間、例えば、１日、血流中でアデノウイルスベクターの最大量が保持される。驚くべきことに、腹腔内投与によるアデノウイルスベクターの全身的放出により、血流中でのベクター保持が増大することが発見された。腹腔内注射１日後、アデノウイルスベクターの投与量の約１％〜約１０％が血流中で検出でき、全身投与の他の経路と比較して、ベクター保持のかなりの増加が示される。本発明の方法の医薬組成物の投与前に、宿主に、アデノウイルスベクター組成物を前投与でき、それはまた、ＲＥＳを避けることの助けとなると考えられている。同様に、ベクターが腹腔内に投与されるとき起こるように、血流中に直接的に医薬組成物をゆっくりと放出することはまた、身体でのアデノウイルスベクター保持時間を改善しうる。
【００６１】
一部の例では、治療効果を実現するために、医薬組成物は、標的組織と直接的に接触する必要はない。例えば、医薬組成物は支持組織に投与でき、それによって、アデノウイルスベクター又は生じるＴＮＦ−αは、標的組織に伝達され、そこで生物効果を発揮する。例えば、本発明の方法に従って腫瘍組織への医薬組成物の直接的投与は、身体の他の領域に位置する病巣の治療を促進できる。換言すれば、腫瘍への医薬組成物の送達は、身体の他の場所に位置する更なる（即ち、１つ以上の他の）腫瘍（例えば、転移）の退縮を促進できる。従って、本発明の方法は、複数の（即ち、２つ以上）腫瘍のためにヒトを治療できる。好ましくは、ヒト身体での複数の腫瘍のサイズを減少することによってである。特に、身体の異なる領域に存在する複数の腫瘍（例えば、肩の第１腫瘍及び腹部の第２腫瘍）は、第１腫瘍への医薬組成物の送達によって治療できる。この実施態様では、医薬組成物は、第１腫瘍に投与され、それは、第１腫瘍、及び、更に、医薬組成物を直接的には投与しなかった１つ以上の他の腫瘍の治療を可能とする。好ましくは、第１腫瘍及び１つ以上の更なる腫瘍内の腫瘍細胞は破壊される。また好ましくは、第１腫瘍及び１つ以上の更なる腫瘍のサイズが減少する。従って、全身的生物効果は、医薬組成物の局所（直接的）又は領域的送達（例えば、領域的リンパ又は血液供給への直接的送達）により達成できる。
【００６２】
医薬組成物は、アデノウイルスベクターの制御された、又は持続性の放出を可能とするデバイス（スポンジ、生体適合性網、機械的リザーバー、又は機械的インプラントなど）中で、又はその上で投与できる。インプラント（例えば、米国特許５，４４３，５０５参照）、デバイス（例えば、米国特許４，８６３，４５７参照）（移植可能デバイスなど、例えば、機械的リザーバー、又は、ポリマー組成物からなるインプラントもしくはデバイス）は、アデノウイルスベクターの投与に特に有用である。本発明の方法の医薬組成物はまた、例えば、ゲル  フォーム、ヒアルロン酸、ゼラチン、硫酸コンドロイチン、ポリホスホエステル（ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（ＢＨＥＴ）など）、及び／又はポリ乳酸−グリコール酸を含有する放出持続型製剤（例えば、米国特許５，３７８，４７５参照）の形態で投与できる。
【００６３】
医薬組成物はまた、ガラスもしくは磁気ビーズなどの他の材料中に組み込まれ得、又は、それを被覆でき、それらは、次いで、患者に投与される。例えば、ＦＤＡは、隠された組織（例えば、侵襲性癌、体腔内深い腫瘍）への濃縮放射治療を送達するための放射活性ガラスビーズの使用の研究を承認した。このようなビーズは、医薬組成物を含み得るし、又はそれで被覆できる。あるいは、医薬組成物で被覆された磁気ビーズは、患者に投与でき、腫瘍の近傍に磁石を置くことによって標的組織に指向し得る。ビーズは、強制的に除去されなければ、身体に留まりそうであるが、生分解性送達デバイスは、身体から自然に除去される非毒性最終産物に溶解する。例えば、Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標）ウェファーは、グリオブラストーマの部位に化学療法薬剤を送達するのに現在使用されている。このような生分解性マトリックスは、移植されると、マトリックスの分解によりＴＮＦ−αをコードするアデノウイルスベクターを放出でき、それによって、臨床家の処置無しに関連部位に治療剤が送達される。
【００６４】
単回投与量の多重適用
医薬組成物の投薬は、単回適用（例えば、単回注射又は標的組織への単回局所適用）により達成できるが、好ましくは、単回投与量は、標的腫瘍の異なる点へ医薬組成物の多重適用により投与される。多重適用は、腫瘍のサイズと場所に依存して、約２適用〜約５０適用もしくはそれを超える（２〜５０の全ての整数を含む）どの数でもありうる。例えば、単回投与量は、４０の別個の注射又はそれを超えて、関連組織に投与できる。好ましくは、医薬組成物の単回投与量は、２，３，４，５，６，７，８，９，１０又はそれを超えての適用（例えば、１５，２０，２５，３０，３５，４０，又は４５適用）、より好ましくは、約２〜８適用、より一層好ましくは、約２〜５適用で投与される。適用数は、腫瘍個所、腫瘍サイズ、腫瘍タイプなどに依存する。例えば、軟組織肉腫に投与するならば（それは、典型的には非常に大きい（例えば、最大寸法で７８ｃｍ））、好ましくは、単回投与量は約３〜８適用で投与される。より小さい、又はよりコンパクトな固形腫瘍では、ほんの１〜５適用（例えば、２〜５適用）が好ましい。各適用が投与される腫瘍個所によって規定される特定のジオメトリーのようなパラメーターによって操作できるという点で、多重適用は、単回適用に対し利点を提供する。医薬組成物の単回投与量の投与は、多重適用を用いてより良く制御され、所定の投与量が投与される有効性は、最大化されうる。こうして、アデノウイルスベクター、そして、ひいては、ＴＮＦ−α産生は、腫瘍内で均一に分布しうる。
【００６５】
多重適用の特定のジオメトリーは、２次元又は３次元空間で、標的組織上の場所（そこに、医薬組成物の各適用が投与される）によって規定される。各適用の場所は、腫瘍タイプと体積によって決定されよう。適用のパターンは、腫瘍に複製欠損アデノウイルスベクター、ひいては、産生されたＴＮＦ−α蛋白質の広い分配を生じるように選択される。２次元空間での多重適用の特定のジオメトリーに関し、特定のジオメトリーは、多重適用が存在する平面（即ち、標的組織の断面）によって規定される。多重適用によって規定される平面は、標的組織の表面から一定の距離に存在しうる（即ち、標的組織の表面にほぼ並行）、又は、平面は、標的組織の表面に対し斜めに存在しうる。更に、多重適用は、任意の適切なパターン又は特定のジオメトリーを規定しうる。従って、２次元空間で、多重適用は正方形を規定しえ、３次元空間で、多重適用は立方体を規定しうる。本発明の方法は、治療の多重ラウンドを含むという点で（即ち、下記で考察するように、ある期間にわたって（治療期間）医薬組成物の多重投与量の投与）、望ましくは、多重適用のジオメトリーは、治療期間にわたって医薬組成物の最大分布を達成するために回転し、あるいはシフトされる。医薬組成物の一定のパターン化した適用の助けのために、グリッド又は鋳型オーバーレイは、注射をガイドする助けとなり、マーキングデバイスは、以前の注射点を記録でき、画像化技術を用いて、標的組織を可視化できる。
【００６６】
医薬組成物を固形腫瘍に直接的に投与するとき、好ましくは、医薬組成物の単回投与量は、腫瘍周辺の周りで多重適用により投与される。特に、投与デバイス、例えば、針は、腫瘍塊で約１〜約５ｃｍの深さ、好ましくは、約２ｃｍ〜約４ｃｍ（例えば、約３ｃｍ）の深さに挿入される。理想的には、多重適用は、図３Ａと３Ｂに示すように、周辺（外周）の周りで等間隔で、例えば、時計回り又は反時計回りパターンで（例えば、１２時、３時、６時、９時位置で）、そして、前部−後部もしくは背側−尾側位置で腫瘍に投与される。図３Ａと３Ｂは、固形腫瘍への医薬組成物の単回投与量の多重適用のための好適なパターンの図示を有する、それぞれ、固形腫瘍の正面図と側面図を示す。次いで、多重適用のジオメトリーは、次なる投薬にシフトされる。例えば、特に好適な実施態様では、本発明の方法は、以下のパターンで医薬組成物を投与することを含む：（ａ）週１で各投与に関し、１２時（３１）、３時（３２）、６時（３３）、９時（３４）位置及び前部−後部もしくは背側−尾側位置（３５）；（ｂ）週２で第１投与に関し、１時、４時、７時、１０時位置及び前部−後部もしくは背側−尾側位置；（ｃ）週２で第２投与に関し、２時、５時、８時、１１時位置及び前部−後部もしくは背側−尾側位置；及び（ｄ）並行注射（３６）を用いて、腫瘍の周辺の周りで（ａ）−（ｃ）を繰り返すこと（各々の後続投薬をもって）。
【００６７】
医薬組成物を、軟組織肉腫と関連したものなどの散在性の、あるいは大きな腫瘍に投与するとき、腫瘍の外周内への投与は可能ではない。従って、注射は、図４で示すように、一連の平行線を含むパターンで投与される。図４は、軟組織肉腫への医薬組成物の単回投与量の多重適用（４２）に関する好適なパターンの図示を有する、軟組織肉腫（４１）の正面図を示す。あるいは、注射は、同心円で投与できる。いずれの場合でも、適用の特定の形状は、アデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）の広範な送達の目標により選択される。いくつかの実施態様では、医薬組成物の投与量が腫瘍組織に直接投与されないで、腫瘍の広がりを避けるために、腫瘍の周辺細胞／組織に局所的に投与される。
【００６８】
操作できる多重適用の別のパラメーターは、各適用間の時間差である。好ましくは、多重適用の各々は、お互い約１０分以内（例えば、約０．５〜１０分）、より好ましくは、お互い約８分以内（例えば、約１〜８分）、より一層好ましくは、お互い約６分以内（例えば、約３〜６分）で投与される。最も好ましくは、単回投与量の多重適用の全ては、上記時間枠内で投与される。
【００６９】
投与量
医薬組成物の投与量、特に、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターの量は、腫瘍サイズ、副作用の程度、特別の投与経路などを含む多くの因子に依存しよう。投与量は、ＴＮＦ−αと関連した負の副作用が最小化されるようなものであるべきである。望ましくは、医薬組成物の単回投与量は、少なくとも約１ｘ１０5粒子（粒子ユニットとも言われる）〜少なくとも約１ｘ１０13粒子のアデノウイルスベクターを含む。好ましくは、投与量は、少なくとも約１ｘ１０6粒子、より好ましくは、少なくとも約１ｘ１０7粒子、より好ましくは、少なくとも約１ｘ１０8粒子（例えば、約４ｘ１０8〜４ｘ１０11粒子）、最も好ましくは、少なくとも約１ｘ１０9粒子〜少なくとも約１ｘ１０10粒子（例えば、約４ｘ１０9〜４ｘ１０10粒子）のアデノウイルスベクターである。あるいは、医薬組成物の投与量は、約１ｘ１０14粒子以下、好ましくは、約１ｘ１０13粒子以下、より一層好ましくは、約１ｘ１０12粒子以下、より一層好ましくは、約１ｘ１０11粒子以下、最も好ましくは、約１ｘ１０10粒子以下（例えば、約１ｘ１０9粒子以下）を含む。換言すれば、医薬組成物の単回投与量は、約１ｘ１０6粒子ユニット（ｐｕ），４ｘ１０6ｐｕ，１ｘ１０7ｐｕ，４ｘ１０7ｐｕ，１ｘ１０8ｐｕ，４ｘ１０8ｐｕ，１ｘ１０9ｐｕ，４ｘ１０9ｐｕ，１ｘ１０10ｐｕ，４ｘ１０10ｐｕ，１ｘ１０11ｐｕ，４ｘ１０11ｐｕ，１ｘ１０11ｐｕ，４ｘ１０11ｐｕ，１ｘ１０12ｐｕ又は４ｘ１０12ｐｕのアデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）を含み得る。単回投与量のための多重適用プロトコルの各適用は、個々の適用の合計が、上記した単回投与量に等しくなるように全体を概算で分けることを含むだろう。つまり、ある投与量の医薬組成物が５適用あるならば、各適用でアデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）の量は望ましくは、上記のように、単回投与量の１／５である。
【００７０】
本明細書で記載した投与量は、標的組織の任意の体積に関して投与できる。体積は通常、例えば、ＣＡＴスキャンを用いて、２次元画像化により見積られる。本明細書で記載した投与量は、断面積が、約３ｃｍ2〜約３００ｃｍ2（例えば、約５ｃｍ2，７ｃｍ2，８ｃｍ2又は９ｃｍ2），典型的には、約１０ｃｍ2〜約２００ｃｍ2（例えば、約１５ｃｍ2，２０ｃｍ2，２５ｃｍ2，３０ｃｍ2，３５ｃｍ2，４０ｃｍ2，４５ｃｍ2，又は５０ｃｍ2）、より典型的には、約５０ｃｍ2〜約１２５ｃｍ2（例えば、７５ｃｍ2，８０ｃｍ2，８５ｃｍ2，９０ｃｍ2，又は１１０ｃｍ2）の標的組織に適切であるが、３ｃｍ2より小さい、又は３００ｃｍ2より大きい腫瘍が本発明の方法で治療することができる。
【００７１】
医薬組成物を標的組織中に直接的に注射するとき、単回適用は、医薬組成物を約１００μｌ〜約２０ｍｌ、好ましくは、約２５０μｌ〜約１０ｍｌ、より好ましくは、約５００μｌ〜約５ｍｌ（例えば、１ｍｌ，２ｍｌ，又は３ｍｌ）を含み得る。理想的には、注射により単回投与量の多重適用を投与するとき、各適用は、医薬組成物を約１ｍｌ含む。更に、組成物の体積は、腫瘍塊中で、ＴＮＦ−αの最大産生と該治療ペプチドの最大活性を達成するように決定できる。１実施態様では、投与当たり投与される組成物の体積は、腫瘍体積の約１０％以下（例えば、腫瘍体積の５．５％，６％，６．５％，７％，７．５％，８％，８．５％，９％，９．５％）、好ましくは、腫瘍体積の８％以下（例えば、腫瘍体積の約４％〜約８％）、より好ましくは、腫瘍体積の５％以下（例えば、腫瘍体積の０．５％，１％，１．５％，２％，２．５％，３％，３．５％，４％，又は４．５％）である。例えば、３０ｃｍ3腫瘍は、希釈剤約１．５ｍｌ以下で希釈された、ＴＮＦ−αをコードするアデノウイルスベクターの適当量を含む医薬組成物の投与量を受け取ろう。医薬組成物の全体積が１．５ｍｌ（腫瘍体積の５％）を超えない限り、医薬組成物の投与量は、任意数の注射で投与できる。
【００７２】
別の実施態様では、任意の体積の腫瘍に対し、投与当たり同一体積の組成物が投与される。例えば、サイズが約１ｃｍ3〜約６０００ｃｍ3の腫瘍（例えば、サイズが約２０ｃｍ3〜約１０００ｃｍ3の腫瘍）に対し、医薬組成物１ｍｌが投与される。医薬組成物２ｍｌを含む投与量は、サイズが約１ｃｍ3〜約６０００ｃｍ3の腫瘍（例えば、サイズが約４０ｃｍ3〜約２０００ｃｍ3の腫瘍）に投与できる。医薬組成物３ｍｌを含む投与量は、サイズが約１ｃｍ3〜約６０００ｃｍ3の腫瘍（例えば、サイズが約６０ｃｍ3〜約３０００ｃｍ3の腫瘍）に投与できる。医薬組成物４ｍｌを含む投与量は、サイズが約１ｃｍ3〜約６０００ｃｍ3の腫瘍（例えば、サイズが約８０ｃｍ3〜約４０００ｃｍ3の腫瘍）に投与できる。医薬組成物５ｍｌを含む投与量は、サイズが約１ｃｍ3〜約６０００ｃｍ3の腫瘍（例えば、サイズが約１００ｃｍ3〜約５０００ｃｍ3の腫瘍）に投与できる。医薬組成物８ｍｌを含む投与量は、サイズが約１ｃｍ3〜約６０００ｃｍ3の腫瘍（例えば、サイズが約１６０ｃｍ3〜約６０００ｃｍ3の腫瘍）に投与できる。各場合に、医薬組成物の全体積は、数回の適用を用いて投与できる（例えば、１〜４回注射）。勿論、医薬組成物においてより大容量の希釈剤を用いることができる。
【００７３】
更に別の実施態様では、任意の断面積をもった腫瘍に対し、投与当たり同一体積の組成物を投与する。例えば、医薬組成物１〜１０ｍｌ（例えば、医薬組成物の２ｍｌ，３ｍｌ，４ｍｌ，５ｍｌ，６ｍｌ，７ｍｌ，８ｍｌ又は９ｍｌ）を、断面積が約１ｃｍ2〜約５００ｃｍ2の腫瘍（例えば、断面積が約２．２５ｃｍ2〜約３００ｃｍ2の腫瘍）に投与できる。各場合に、医薬組成物の全体積は、数回の適用を用いて投与できる（例えば、１〜４回注射）。説明するために、ＴＮＦ−αをコードするアデノウイルスベクター４ｘ１０9ｐｕを含む医薬組成物２ｍｌを、断面積が約１５ｃｍ2〜約４０ｃｍ2の膵臓腫瘍（推定腫瘍体積約２５ｃｍ3〜約１００ｃｍ3に対応）に対し投与できる。これらのパラメーターを用いて投与される医薬組成物の体積は、膵臓腫瘍の体積の約２〜８％である。
【００７４】
従って、例えば、ＥＧＲ−１プロモーターの制御下、ヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ／Ｅ３／Ｅ４欠損アデノウイルスベクター（国際特許出願ＷＯ０２／００９０６に記載されたものなど）を含む医薬組成物の単回投与量で、約１ｘ１０8〜１ｘ１０12のアデノウイルス粒子が、推定体積が約３ｃｍ2〜約１５０ｃｍ2の腫瘍に対し投与される。これらの条件下、かなりのレベルのＴＮＦ−α産生が、ＴＮＦ−α蛋白質の全身投与と関連した負の副作用を産生すること無く、標的組織で達成される。
【００７５】
放射線療法
大部分のタイプの癌について治療の典型的コースは放射線療法である。放射線療法は、Ｘ線やガンマ線などの高エネルギー粒子又は波のビームを使用して、細胞ＤＮＡに変異を誘導することによって、癌細胞を撲滅する。癌細胞は、正常細胞よりも急速に分裂するという点で、腫瘍組織は、正常組織よりも放射線に対し感受性である。放射線はまた、暴露された細胞で外来性ＤＮＡ発現を増大することが示された。好適な実施態様では、本発明の方法は、治療期間中、患者に投与量の放射線を投与することを更に含む。ＴＮＦ−αをコードする核酸配列の腫瘍内送達と腫瘍部位への共焦点放射線照射により、２つの強力な抗癌治療様式の局所的送達が生じる。ＴＮＦ−αをコードする核酸配列が、放射線誘導性プロモーターと機能可能に連結するとき、腫瘍細胞を除去する際に観察される放射線とＴＮＦ−αとの相加効果又は相乗効果に加えて、放射線療法の期間中絶えず、腫瘍部位で、放射線はＴＮＦ−α産生を強め、ＴＮＦ−αの治療レベルを維持する（例えば、Ｈｅｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２，１２４−１３１（１９９５），及びＫａｗａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１０，１５０９−１５１９（１９９９）参照）。
【００７６】
有意な負の副作用無しに、放射線の投与に患者が耐えられる限り、任意のタイプの放射線が患者に投与できる。適切なタイプの放射線療法として、例えば、電離（電磁気）放射線療法（例えば、Ｘ線又はガンマ線）又は粒子ビーム放射線療法（例えば、高リニアエネルギー放射線）が挙げられる。電離放射線は、イオン化する（即ち、電子を獲得又は喪失するために）、十分なエネルギーをもつ粒子又は光子を含む放射線として定義される（例えば、米国特許５，７７０，５８１に記載されているように）。放射線の効果は、少なくとも部分的には臨床家によって制御されうる。好ましくは、放射線の投与量は、標的細胞暴露と毒性減少が最大限となるように分割される。放射線は、腫瘍細胞を殺すことを増強する放射線感受性剤、又は放射線の有害な影響から健康組織を防御する放射線防御剤（例えば、ＩＬ−１又はＩＬ−６）と同時に投与できる。同様に、熱の適用、即ち、温熱療法、又は化学療法は、放射線に組織を感受性にする。
【００７７】
放射線源は、患者にとって外部にあっても又は内部にあってもよい。外部放射線療法は、最も普通であり、例えば、線形加速器を用いて、皮膚を通過し、腫瘍部位に高エネルギー放射線のビームを向けることを含む。放射線のビームは腫瘍部位に局在化するが、正常で健康な組織の暴露を避けることは、ほぼ不可能である。しかし、外部放射線は通常、患者が十分に耐えられる。内部放射線療法は、ビーズ、ワイヤー、ペレット、カプセルなどの放射線放射源を、腫瘍部位に、又はその近傍で体内に移植することを含む。このようなインプラントは、治療後、除去でき、又は体内に不活性のまま残す。内部放射線のタイプとして、近接照射療法、間質性放射線治療、腔内放射線療法が挙げられるが、それらに限定されない。本発明の方法の医薬組成物は、移植される構造中に、又はその上に組み込まれ得、それによって、癌治療の２つの形態の投与を同時に可能とする点で、内部放射線療法は、アデノウイルスベクターを用いる癌治療に特に適している。内部放射線療法のより一般的ではない形態は、放射線免疫療法であって、それでは、放射活性物質に結合した腫瘍特異性抗体が患者に投与される。抗体は腫瘍抗原を探し求め、それと結合し、それによって、関連組織への放射線の投与量を有効に投与する。
【００７８】
投与方法が何であれ、好ましくは、本発明で患者に投与される放射線の全投与量は、約５グレイ（Ｇｙ）〜約７０Ｇｙである。より好ましくは、約１０Ｇｙ〜約６５Ｇｙ（例えば、約１５Ｇｙ，２０Ｇｙ，２５Ｇｙ，３０Ｇｙ，３５Ｇｙ，４０Ｇｙ，４５Ｇｙ，５０Ｇｙ，５５Ｇｙ，又は６０Ｇｙ）を、治療のコースにわたって投与する。放射線の全投与量が、１日のコースで投与できるが、理想的には、全投与量は、分割し、数日にわたって投与する。望ましくは、放射線療法は、少なくとも約３日、例えば、少なくとも５，７，１０，１４，１７，２１，２５，２８，３２，３５，３８，４２，４６，５２又は５６日（約１〜８週）のコースにわたって投与する。従って、放射線の１日投与量は、約１〜５Ｇｙ（例えば、約１Ｇｙ，１．５Ｇｙ，１．８Ｇｙ，２Ｇｙ，２．５Ｇｙ，２．８Ｇｙ，３Ｇｙ，３．２Ｇｙ，３．５Ｇｙ，３．８Ｇｙ，４Ｇｙ，４．２Ｇｙ又は４．５Ｇｙ），好ましくは、１〜２Ｇｙ（例えば１．５〜２Ｇｙ）を含もう。放射線誘導性プロモーターに機能可能に連結しているならば、放射線の１日投与量は、核酸配列の発現を誘導するのに十分であるべきである。期間が延びるならば、放射線は毎日は投与しないことが好ましく、それによって、患者を休息させ、治療効果を実現する。例えば、望ましくは、放射線は、治療の各週につき、５連続日に投与し、２日は投与しない、それによって、週当たり２日の休息を可能とする。しかし、治療への患者の応答及び起こり得る副作用に応じて、放射線は、１日／週、２日／週、３日／週、４日／週、５日／週、６日／週、又は７日全部／週に投与できる。放射線療法は、治療期間中任意の時点で開始できる。好ましくは、放射線は、１週目又は２週目で開始し、治療期間の残りの継続期間投与される。例えば、固形腫瘍の治療のために、例えば、６週を含む治療期間の１〜６週又は２〜６週で放射線を投与する。あるいは、５週を含む治療期間の１〜５週又は２〜５週で放射線を投与する。
【００７９】
ＴＮＦ−αをコードする核酸配列が、放射線誘導性プロモーターに機能可能に連結している場合などの一部の実施態様では、本発明の方法は、プロモーターの活性をアップレギュレートするのに十分な投与量で医薬組成物を投与した直後、腫瘍を放射線に曝すことを含むが、放射線暴露と医薬組成物の投与の間は２ヶ月迄経過できる。腫瘍又は医薬組成物の投与から生じる創傷（即ち、潰瘍）は、治癒されるか、過剰の放射線暴露から遮蔽されるように注意すべきである。望ましくは、放射線の少なくとも１つの適用は、医薬組成物を投与するその日に投与する。特に、放射線誘導性プロモーターの活性と引き続くＴＮＦ−αの産生が最大限にアップレギュレートできるように、アデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）が放射線誘導性プロモーターに機能可能に連結しているＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含む場合、最も好ましくは、医薬組成物の投与後、標的部位は、放射線に約３０分〜約６時間（例えば、約３時間）、好ましくは、約１〜４時間（例えば、約１〜２時間）曝される。勿論、内部源の放射線を用いるとき（例えば、近接照射療法又は放射線免疫療法）、典型的には、暴露時間は、放射線強度の対応する減少と共に増加しよう。
【００８０】
投与のタイミング
癌の増殖性は、身体からの該疾患の完全除去を妨害する。治療が何であれ、治療剤の単回投与量では、完全な抗癌効果を達成しそうもない。生存癌細胞が急速に複製するからである。実際、大部分の慢性疾患のように、治療剤の多重投与量を含む長い治療が必要であり得る。従って、１実施態様では、本発明の方法は、ある期間にわたって（即ち、治療期間）医薬組成物の多重投与量の送達を含む。
【００８１】
本発明に関し２つのタイミング問題が存在する：全治療期間、換言すれば、治療が行われる時間の全長、及び、医薬組成物の投与量の投与及び／又はアジュバント治療の間の時間。理想的には、治療期間は、長さが約１０週間以下である（長さが約１〜１０週間を含む治療期間など）が、１週間未満（例えば、１，２，３，４，５又は６日）又は１０週間を超えて（例えば、１２，１４，１６，又は１８週）もよい。好ましくは、治療期間は、約２〜９週間（即ち、２，３，４，５，６，７，８又は９週）、より好ましくは、約３〜８週間（例えば、４〜７週）、最も好ましくは、約５〜６週間である。５〜７週間の治療期間は、癌を有効に攻撃するのに十分な時間を提供するが、患者の遵守を危うくするほどには長くない。
【００８２】
医薬組成物の多重投与量の投与に関し、好ましくは、１投与量は、治療期間を通し１週に約１度投与される。治療の開始は、より頻繁の投与を必要としうる。例えば、単回投与量が、２日／週、３日／週、４日／週、５日／週、６日／週、又は７日／週（毎日の投与）投与される。理想的には、少なくとも２投与量が、治療期間の１週目の間に投与され、必要ならば、２週目の間もそうである。その後、医薬組成物の単回投与量は、治療期間の残りの各週投与しうる。しかし、投与のタイミングは、治療への患者の寛容、疾患の程度、臨床家のアベイラビリティなどの幾つかの因子に依存するであろうから、投与間の間が１週間より長くなることも許容できる。例えば、１投与量を、１０日毎、２週毎、１８日毎、３週毎、２５日毎、１月に１回、又は２月毎、投与できる。好ましくは、ＴＮＦ−αのレベルが、治療期間中、バックグラウンドレベルを超えて留まるように、医薬組成物の多重投与量は投与される。
【００８３】
実際、遺伝子発現（即ち、ＴＮＦ−αコード配列の発現）が起こり、所望の生物効果が実現するように、投与のタイミングが選択される。従って、投与のタイミングは、特定の腫瘍タイプを減少するために最適化できる。例えば、腫瘍が大きく、散在性であるならば（軟組織肉腫など）、望ましくは、治療期間は、最大５週間を含み、１週目で医薬組成物の２投与量が投与され、各々の次なる週（例えば、２〜５週）で、医薬組成物の１投与量が投与される。より小さなコンパクトな固形腫瘍では、望ましくは、治療期間は、最大６週間を含み、１〜２週目で医薬組成物の２投与量が投与され、各々の次なる週（例えば、３〜６週）で医薬組成物の１投与量が投与される。どちらの場合も、医薬投与の２投与量が１週間で投与されるとき、好ましくは、投与量は、治療の１日目と４日目に投与される。
【００８４】
一部の実施態様では、長期間にわたって、１投与量が標的組織に絶えず投与される、医薬組成物の投与方法を用いることは利点がありうる。例えば、医薬組成物による標的組織の連続的灌流は望ましくあり得る。従って、本発明の方法は、治療期間中、少なくとも１度、標的組織（例えば、腫瘍）と接触させることを含み得る。換言すれば、医薬組成物の１投与量の単回投与は、例えば、１〜１０週間などの長期間にわたって送達されるが、１週未満（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週又は９週）又は１０週を超えて（例えば、１２、１４、１６又は１８週）いてもよい。このような送達戦略は、例えば、患者への、持続放出デバイスもしくはリザーバー中の医薬組成物の組み込み及び移植により達成できる。
【００８５】
他の考慮
本発明の方法は、疾患の予防的又は治療的処置のために、ヒトへのＴＮＦ−αの送達のための効率的で安全な投与計画を提供する。理想的には、本発明の方法は、腫瘍細胞増殖の阻害、腫瘍の血管新生の阻害、腫瘍細胞の撲滅、及び／又は少なくとも１つの腫瘍のサイズの減少を促進し、その結果、ヒトの癌は治療される。「癌の治療」とは、全体的又は部分的な癌の軽減を意味する。アデノウイルス媒介遺伝子導入を用いてヒト患者にＴＮＦ−αを投与するのに考えるべき幾つかのパラメーターを本明細書で論ずる。特定の状況に関しパラメーターの適切な組合せは、臨床家によって確立されうる。癌治療（例えば、腫瘍サイズの減少又は癌細胞の撲滅）における本発明の方法の進歩は、腫瘍サイズ及び癌進行を探知するクリニックで現在使用される方法などの任意の適切な方法を用いて確認できる。腫瘍サイズは、寸法の測定や利用できるコンピュータソフトウエア（腫瘍体積の正確な見積りを可能とするＷａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ大学で開発されたＦｒｅｅＦｌｉｇｈｔソフトウエアなど）を用いる腫瘍体積の推定などの任意の適切な技術を用いて計算できる。腫瘍サイズは、例えば、ＣＴ、超音波、ＳＰＥＣＴ、スパイラルＣＴ、ＭＲＩ、写真などを用いる腫瘍可視化によって測定できる。腫瘍サイズの測定、新規腫瘍の検出、腫瘍抗原、又はマーカー（例えば、ＣＥＡ，ＰＳＡ又はＣＡ−１２５）、バイオプシー、手術ダウンステージング、ＰＥＴスキャンなどは、ヒトの癌の全体の進行（あるいは退縮）を指摘できる。腫瘍によって産生される、及び／又は腫瘍と関連するマーカー（抗原）（腫瘍マーカー）、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の血清レベルを用いて、腫瘍の位置を決定し、段階づけるために、放射線免疫検出（ＲＡＩＤ）を用いる。それは、治療前診断の判定及び治療後の再発の診断の指標の両方として有用でありうる。内視鏡検出システムと組合せてのＲＡＩＤ技術は効率的に、小腫瘍を周囲組織から区別する（例えば、米国特許４，９３２，４１２参照）。バイオプシーは、組織内の癌細胞の撲滅を検出するのに特に有用である。
【００８６】
好ましくは、本発明の方法は、腫瘍のサイズを少なくとも約５％（例えば、少なくとも約１０％，１５％，２０％又は２５％）減少させる。より好ましくは、腫瘍サイズは、少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３５％，４０％，４５％，５０％，５５％，６０％又は６５％）減少させる。より一層好ましくは、腫瘍サイズは、少なくとも約７０％（例えば、約７５％，８０％，８５％，９０％又は９５％）減少させる。最も好ましくは、腫瘍は完全に除去される。更に、好ましくは、ヒトで顕著な有害事象無くして、本発明の方法の結果として腫瘍サイズが減少する。有害事象は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＮＣＩ）の癌治療法評価プログラム（ＣＴＥＰ）によって分類されるか、又は「等級付け」される。等級０は、最小の有害副作用を示し、等級４は、最重度有害事象を示す。ＮＣＩ毒性スケール（１９９９年４月刊行）及び共通毒性基準マニュアル（１９９９年８月更新）は、ＮＣＩから、例えば、ＮＣＩインターネットウェブサイト  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｔｅｐ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖから、又はＮＣＩ、癌治療及び診断部門がスポンサーの研究薬剤の臨床トライアルの関係者のためのｔｈｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９８年３月更新）中で利用できる。望ましくは、本発明の方法は、ＣＴＥＰ／ＮＣＩによって等級付けされる最小有害事象、例えば、等級０、等級１又は等級２の有害事象と関連する。しかし、本明細書で論ずるように、腫瘍の実際のサイズは、腫瘍細胞の撲滅にもかかわらず、縮小しないという点で、好適ではあるが、腫瘍サイズの減少は必要ない。癌細胞の撲滅は、治療効果を実現するために十分である。同様に、腫瘍サイズの減少は、治療効果を実現するために十分である。
【００８７】
ヒトでの種々の癌の検出、モニタリング、評価は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２００１，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，及び国際特許出願ＷＯ０１／２４６８４に更に記載されている。従って、臨床家は標準試験を用いて、癌治療における本発明の方法の種々の実施態様の効力を決定できる。しかし、腫瘍サイズと広がりに加えて、臨床家はまた、治療の効力の評価で、患者の生活の質や生存を考慮すべきである。
【００８８】
患者で所望の生物学的効果を達成するために、本発明の方法は、他の治療方法と組合せて行いうる。１実施態様では、腫瘍の手術切除の前、間、又はその後、医薬組成物を投与する。腫瘍組織の完全な手術除去は、周囲の組織への腫瘍組織の侵襲及び塊の不明確なへりによってしばしば複雑になる。本明細書で記載するように、本発明の方法を用いる腫瘍の治療により、腫瘍縮小が生じ、それは、切除を容易にする。更に、医薬組成物の手術後投与（本発明の方法を用いて）は、残りの腫瘍細胞を除去できる。
【００８９】
手術切除のように、化学療法は、大部分の癌タイプに関し標準的治療である。従って、本発明の方法は、化学物質ベースの治療と並行して、その前、又は、その後に行われ得る。理想的には、本発明の方法は、患者への化学療法剤の投与量の投与を含む。通常の化学療法剤として、アドリアマイシン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブシル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトテシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキシラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、フロキスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メプルハラン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロスウレア、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、トランスプラチナム、５−フルオロウラシルなどが挙げられるが、それらに限定されない。化学療法剤の適当な投与量は、ルーチンな投与量応答試験を用いて医師によって決定でき、また特定の化学療法剤の製造業者によってしばしば推奨される。
【００９０】
本発明の方法は、ホルモン療法と共に行い得るが、それは、疾患を治療するための、身体のホルモンレベルの操作である。多くの癌ではどういうわけか、身体中のホルモンのレベルによって影響され、ホルモン療法と関連した典型的治療剤、例えば、タモキシフェンは、循環するホルモンのレベルを減少し、及び／又は、ホルモンレセプターへのホルモン結合を妨害するように働く。
【００９１】
定義によると、温熱療法は、治療手段として体温を増加させる。研究の示すところでは、温熱療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法の効果を増大することによる有効なアジュバント療法である（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，８（９），６４９−６５４（２００１））。腫瘍部位などの身体の特定療法の温度は、加熱デバイス（例えば、マイクロ波を放射するデバイス）、又は毒素を投与して、熱もしくは炎症を誘導することによって、上げられる。治療領域が局在化され、内部的であるように、熱を発するように誘導される粒子もまた患者に投与できる。磁気粒子は、ヒステリシス損失による交互磁場（ＡＭＦ）下に熱を産生することが示されている（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，上記）。これらのようなミクロン以下の粒子を、標的組織に投与でき、ＡＭＦによって活性化され得る。所望ならば、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列は、熱又はＡＭＦ照射に応答性のプロモーターに機能可能に連結でき、それによって、ＴＮＦ−α産生は標的組織に局在化されるという点で、更なる安全手段を提供する。
【００９２】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、勿論、その範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００９３】
実施例１
本実施例は、（ｉ）医薬として許容できる担体、及び（ｉｉ）放射線誘導性プロモーターと機能可能に連結した、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクター；を含む本発明の医薬組成物であって、投与量が、臨床的に関連する動物モデルで、約４ｘ１０9〜約４ｘ１０11粒子ユニット（ｐｕ）のアデノウイルスベクターを含む上記医薬組成物の安全性と効力を示す。
【００９４】
ヒトＳＱ−２０Ｂ扁平上皮癌異種移植片を有するヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）（ｎ＝８０）と、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝１００）で、前臨床毒素学研究を行った。合計８０マウスで、４群について１０匹ｎｕ／ｎｕマウス／性別／群を研究で用いた。４群は以下からなった：１）ビヒクル対照、２）ビヒクル対照＋放射線、３）４ｘ１０9ｐｕのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物＋放射線、４）４ｘ１０10ｐｕのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物＋放射線。ビヒクル又はアデノウイルスベクターを含む医薬組成物の投与量は、直径０．４ｃｍ〜０．６ｃｍの樹立されたＳＱ−２０Ｂヒト扁平上皮腫瘍中に腫瘍内注射（２部位中に２０μｌ、合計４０μｌ）によって投与された。合計１００マウスで、５群について１０匹Ｂａｌｂ／ｃマウス／性別／群を研究で用いた。群は、以下を含んでいた：１）ビヒクル対照、２）ビヒクル＋放射線対照、３）４ｘ１０9ｐｕのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物＋放射線、４）４ｘ１０10ｐｕのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物＋放射線、５）４ｘ１０11ｐｕのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物＋放射線。ビヒクル又は医薬組成物の投与量は、（ｉ）各Ｂａｌｂ／ｃマウスの右後肢中への皮下（ｓ．ｃ．）注射によって、又は（ｉｉ）注射後４時間で始めて、０〜４日目及び７〜１１日目の１日に投与される５Ｇｙ／フラクションの放射線投与量（合計投与量５０Ｇｙ）と共に、０、３、７、１０日目でｎｕ／ｎｕマウスで腫瘍内に、投与された。放射は、（ｉ）Ｂａｌｂ／ｃマウスの右後肢、又は（ｉｉ）ｎｕ／ｎｕマウスで腫瘍部位、であり、身体の残りは遮蔽された。
【００９５】
アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域に位置し、ＥＧＲ−１プロモーターと機能可能に連結したヒトＴＮＦ−αのコード配列を含むＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ／Ｅ３／Ｅ４欠損アデノウイルス血清型５ウイルスバックボーンを含んでいた。アデノウイルスベクターは、さらにＥ４領域にスペーサー配列を含んでいた。臨床的ケージ−サイド観察、食物消費、血液学と化学、臨床病理学を評価した。被験体は、１４日目と２８日目で検死した。
【００９６】
更に、ヌードマウス（ｎ＝３３）で薬理動力学研究を行った。上記のように放射線療法がある場合と無い場合の両方で、０〜２日に、又は平日５日／週で２週間、４ｘ１０9ｐｕのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物の投与量を、マウスの腫瘍内に注射した。被験体は３日目又は２８日目で供死させた。血漿と腫瘍組織内のＴＮＦ−αレベルをＥＬＩＳＡで定量した。
【００９７】
臨床研究で推奨される最大投与量の３５０倍までの投与量（ｋｇ重量当たりに基いて）は、顕著な毒性無しに十分に耐えられた。全ての投与群での注射部位での皮膚の紅斑は、Ｂａｌｂ／ｃとｎｕ／ｎｕマウスの両方で観察され、ヒトで可溶性組換えヒトＴＮＦの皮下投与後報告された紅斑と一致する。観察された他の毒性の大半は、最大投与量群（４ｘ１０11ｐｕ）で見られ、放射線に非依存的であった。これらの毒性は、潰瘍化、脱毛、皮膚脱色を含む局所反応からなっていた。治療群をビヒクル処理対照と比較したとき、いずれの観察された全身反応も、統計的に有意に異なっていた；しかし、正常レベルと比較して、これらのパラメーターの変化は、毒性の有意性とは考えなかった。５０Ｇｙの放射線と組合せて、４ｘ１０9又は４ｘ１０10ｐｕのアデノウイルスベクターを含む医薬組成物を投与したとき、マウスは死亡せず、又は有意な毒性を有しなかった。更に、放射線療法と組合せて医薬組成物の腫瘍内送達は、血漿内に「こぼれる」ことなしに、腫瘍ホモジネート中で有意で、持続したＴＮＦ−αのレベルが生じ、顕著な抗腫瘍活性を示した。実際に、放射線は、ＴＮＦ−αの腫瘍内レベルを１２倍増加した。
【００９８】
上記結果は、ヒトでの成功を合理的に予測するとして当分野で認められた動物モデルでの本発明の医薬組成物及び方法の安全性と効力を示す。
【実施例２】
【００９９】
実施例２
本実施例は、腫瘍塊のサイズ減少によって示される、ヒトで癌を治療的に処置するための本発明の方法の使用を説明する。
【０１００】
反復腫瘍内注射が可能な固形腫瘍を有する患者が、本発明の方法を用いる治療のために選択された。これらの患者は、１以上、従来の治療に失敗していた。最大６週間の治療期間にわたって、実施例１に記載したＴＮＦ−αコード配列含有アデノウイルスベクターの５投与量レベル（１／２ｌｏｇ増分で４ｘ１０9〜４ｘ１０11ｐｕ）の１つを含む医薬組成物でもって、患者は腫瘍内注射を受けた。幾人かの患者は、放射線のみによって治療される病巣を含んでいたが、それは、対照として役立った。治療期間の１週目と２週目の１日目と４日目に、そして、３〜６週目では１週に１度、医薬組成物の単回投与量が、腫瘍に多重注射を介し投与された。各投与に関し、腫瘍の周辺で等しく間隔を置いて注射されるようなパターンで、多重注射は投与された。例えば、注射は、以下のパターンで腫瘍内に投与された：１週目で各投与について、１２時、３時、６時、９時の位置及び前部−後部もしくは背側−尾側位置；（ｂ）２週目で第１投与に関し、１時、４時、７時、１０時位置及び前部−後部もしくは背側−尾側位置；（ｃ）２週目で第２投与に関し、２時、５時、８時、１１時位置及び前部−後部もしくは背側−尾側位置；及び、各々の次なる投与量投与をもって、腫瘍の周辺で（ａ）−（ｃ）を繰り返すこと。付随する放射線療法は、２週目で開始し、治療期間の各々の残りの週で、５連続日投与され、２日間投与されず、全投与量３０〜７０Ｇｙが達成された。腫瘍サイズは、治療終点で計算され、可能ならば、治療後２〜３月で計算された。
【０１０１】
癌のタイプ（「癌指標」）、病巣部位、治療患者の各々についての腫瘍応答を、表１に示す。表１では、以下の略語は、示された意味を有する：ＮＳＣＬＣ−非小細胞肺癌；ＰＲ−部分応答、注射した病巣の体積の５０％を超える減少；ＰＤ−進行性疾患、病巣は、研究前の値の１２５％を超えるまでに成長した；ＣＲ−完全応答、記録した日付から少なくとも４週間、病巣の完全消失；ＳＤ−安定な疾患、腫瘍は、治療前の値の７５〜１２５％である；ＭＲ−治療前の値の５０〜７５％までの減少。ＰＲ及びＣＲは、ルーチンに「客観的腫瘍応答」と見なせる。
【０１０２】
【表１】
2005536447.tif 000002
【０１０３】
２コホートの患者は、上記同一治療投薬計画後、アデノウイルスベクターのより低投与量（例えば、４ｘ１０7ｐｕ又は４ｘ１０8ｐｕ）を受けた。癌のタイプ（「癌指標」）、病巣部位、治療患者の各々のための腫瘍応答を、表２に示す。表２では、略語は、表１に関し上記と同一の意味を有する。
【０１０４】
【表２】
2005536447.tif 000003
【０１０５】
安全性に関して、投与量を限定する毒性は、試験したアデノウイルスベクターの範囲にわたって観察されなかった。薬剤関連の重大な有害事象を、患者は受けなかったが、注射部位の疼痛と悪寒を含む最小の有害事象は受けた。ベースラインを超える血清でのＴＮＦ−αの有意な増加は、試験した全ての時点で観察されなかった（１〜５０ｐｇ／ｍｌ）。血液又は尿から採った培養物でウイルスは検出されず、試験した８患者のうち７患者ではこのベクターに対する抗体価は上昇しなかった。
【０１０６】
客観的腫瘍応答は、４ｘ１０9〜４ｘ１０11ｐｕのアデノウイルスを投与された試験患者の５７％で観察され、患者の２８．５％は、完全応答を示し、患者の２８．５％は、部分的応答を示した。客観的腫瘍応答は、４ｘ１０7又は４ｘ１０8ｐｕのアデノウイルスを投与された患者の１２．５％で観察された。幾分かの腫瘍縮小は、大部分の患者で達成され、４ｘ１０9〜４ｘ１０11ｐｕのアデノウイルスを注射された病巣で、平均５４％のサイズの減少であった。対照病巣で縮小は観察されなかった。これらの結果は、身体中の位置にかかわらず、広範囲の固形腫瘍を治療する本発明の方法の有効性を証明する。
【実施例３】
【０１０７】
実施例３
本実施例は、軟組織肉腫と関連した腫瘍のサイズを減少するための、本発明の方法の使用を説明する。
【０１０８】
四肢軟組織肉腫を有する患者を、本発明の方法を使用する治療のために選択した。５週間の治療期間にわたって、実施例１に記載のＴＮＦ−αコード配列含有アデノウイルスベクターの２投与量レベル（４ｘ１０9ｐｕ又は４ｘ１０10ｐｕ）の１つを含む医薬組成物を、患者の腫瘍内に注射した。治療期間の１週目の１日目と４日目で、２〜５週目に関しては週１度、医薬組成物の単回投与量を多重注射を介し投与した。各投与に関し、多重注射は、平行線で腫瘍に投与された。付随する放射線療法は、１週目で開始し、治療期間の各週で、５連続日投与され、２日間投与されず、全投与量３０〜７０Ｇｙが達成された。
【０１０９】
応答指標（腫瘍応答と病理学）と共に、各治療患者の四肢軟組織肉腫のタイプを表３に記載する。
【０１１０】
【表３】
2005536447.tif 000004
【０１１１】
客観的腫瘍応答は、試験患者の７１％で観察され、患者の２８．６％は、完全応答を示し、患者の４２．８％は、部分的応答を示した。幾分かの腫瘍応答は、大部分の患者で達成された。これらの結果は、身体中の位置にかかわらず、広範囲の固形腫瘍を治療する本発明の方法の有効性を証明する。
【実施例４】
【０１１２】
実施例４
標的腫瘍の体積の約５％である医薬として許容できる担体の体積中のアデノウイルスベクターの投与が、アデノウイルスベクターの等投与量を含む組成物のより大きな体積の投与と比較して、結果的に導入遺伝子活性が増加することを、以下の実施例は示す。
【０１１３】
皮下Ｃ６グリオーマを、ヌードマウスで１ｃｍ3まで成長させた。医薬として許容できる担体３０μｌ，１２０μｌ又は４８０μｌ中で希釈された、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＥ１，Ｅ４欠損アデノウイルスベクターの投与量（ＡｄＬ，１ｘ１０10ｐｕ）を腫瘍内に注射した。アデノウイルスベクターの各投与量は、単回腫瘍内注射（例えば、組成物３０μｌを１回注射）又は３つの別個の注射に分割して（例えば、合計３０μｌの組成物の１０μｌを３回注射）、腫瘍内に投与した。注射１日後、腫瘍を回収し、ルシフェラーゼ活性を分析した。
【０１１４】
多重低体積注射は、組成物の同一合計体積の単回注射と較べて、ルシフェラーゼ活性のより大きなレベルを与えた。多重注射によりまた、注射体積と腫瘍内ルシフェラーゼ活性との間の逆相関が起こった。換言すれば、低体積の組成物の投与により、組成物のより大きい合計体積の投与と較べて、導入遺伝子活性が増加した。組成物体積、注射回数、及び導入遺伝子活性の間の同様な関連性は、ヌードラットで樹立された１０ｃｍ3 のサイズの腫瘍で観察された。
【０１１５】
多重注射からなる投与戦略と組合せて、減少した注射体積、例えば、標的腫瘍の体積の５％以下の医薬組成物の体積により、大きい腫瘍と小さい腫瘍の両方で導入遺伝子活性が増加することを、本実施例は示す。
【０１１６】
本明細書で引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が引用により含まれるように個々に、及び具体的に示され、本明細書にその全体が記載されているかのような程度まで、引用により本明細書に含まれるものである。
【０１１７】
本発明の説明の文脈において（特に、以下のクレームの文脈において）、用語“ａ”及び“ａｎ”及び“ｔｈｅ”及び同様の指示語の使用は、本明細書で違うように記載されるか、文脈によって明確に否定されなければ、単数と複数の両方を包含するように解釈されるべきである。本明細書で値の範囲の記載は、本明細書で違うように記載されていなければ、その範囲内の各々の分離した値へ個々に言及することの略記方法として役立つことが単に意図され、各々の分離した値は、それが本明細書に個々に記載されているかのように本明細書に含まれるものである。本明細書で記載される方法の全ては、本明細書で違うように記載されるか、文脈によって明確に否定されなければ、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で提供される任意の、及び全ての例、又は例示的言葉（例えば、“などの”）の使用は、本発明をより良く明瞭にすることが単に意図され、違うようにクレームされていなければ、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書の如何なる言葉も、本発明の実施に必須なものとしてクレームされていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【０１１８】
本発明を実施するのに本発明者らが知っている最良の形態を含む、本発明の好適な実施態様を本明細書で記載する。勿論、上記説明を読むと、それらの好適な実施態様のバリエーションが当業者に明白となろう。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを期待し、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されたものとは異なるように実施されることを意図する。それ故、本発明は、適用法によって許されるように、本明細書に添えられたクレームに記載の主題の全ての改変及び均等物を含むものである。更に、本明細書で違うように記載されていないか、文脈によって違うように明瞭に否定されていなければ、その全ての可能なバリエーション中の上記要素の任意の組合わせも本発明に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、非修飾アデノウイルスベクターゲノムの模式図である。
【図２】図２は、本発明の１実施態様に基く、修飾アデノウイルスゲノムと遺伝子要素を含むアデノウイルスベクターの模式図である。
【図３Ａ】図３Ａは、固形腫瘍への医薬組成物の単回投与量の多重適用に関し、好適パターンの図示をもった、固形腫瘍の正面図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、固形腫瘍への医薬組成物の単回投与量の多重適用に関し、好適パターンの図示をもった、固形腫瘍の側面図である。
【図４】図４は、軟組織肉腫への医薬組成物の単回投与量の多重適用に関し、好適パターンの図示をもった、軟組織肉腫の正面図である。
【図１】
2005536447.tif 000005
【図２】
2005536447.tif 000006
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年8月9日(2005.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト癌治療用の医薬組成物であって、
（ｉ）医薬として許容できる担体、（ｉｉ）プロモーターと機能可能に連結した、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターを含み、
アデノウイルスベクターの投与量は、約１ｘ１０６〜約４ｘ１０１２粒子ユニット（ｐｕ）である、組成物。
【請求項２】
組成物が腫瘍内の腫瘍細胞の破壊剤であり、組成物が腫瘍との接触に適切であるように製剤化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物が腫瘍のサイズの減少剤である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
組成物が腫瘍に対する電離放射線との併用剤である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
組成物が化学療法剤を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
プロモーターが、化学誘導性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
プロモーターが、放射線誘導性である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
放射線誘導性プロモーターが、ＥＧＲ−１である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
電離放射線の投与量が、約２０グレイ（Ｇｙ）〜約７０Ｇｙである、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
腫瘍が、固形腫瘍である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
腫瘍が、乳癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、頭部／頚部癌、又は非小細胞肺癌と関連している、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
腫瘍が、膀胱癌、甲状腺癌、下顎骨癌、皮膚癌、又は腎臓癌と関連している、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
腫瘍が、食道癌、前立腺癌、肝臓癌、又は副腎癌と関連している、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物のセットであって、
１〜２週目投与用の２回投与量の医薬組成物、および治療期間におけるその後の各週投与用の１回投与量の医薬組成物を含み、
治療期間が６週間までを含む、セット。
【請求項１７】
医薬組成物が、１〜５回の注射剤に製剤化されている、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の組成物又は請求項１６に記載のセット。
【請求項１８】
医薬組成物が、２〜５回の注射剤に製剤化されている、請求項１７に記載の組成物又はセット。
【請求項１９】
腫瘍が、柔組織肉腫である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組成物のセットであって、
１週目投与用の２回投与量の医薬組成物、および治療期間におけるその後の各週投与用の１回投与量の医薬組成物を含み、
治療期間が５週間までを含む、セット。
【請求項２１】
医薬組成物が、１〜２０回の注射剤に製剤化されている、請求項１９に記載の組成物又は請求項２０に記載のセット。
【請求項２２】
医薬組成物が、３〜８回の注射剤に製剤化されている、請求項２１に記載の組成物又はセット。
【請求項２３】
ヒトにおける複数の腫瘍の治療用医薬組成物であって、
（ｉ）医薬として許容できる担体、（ｉｉ）プロモーターと機能可能に連結した、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターを含み、
アデノウイルスベクターの投与量は、約１ｘ１０６〜約４ｘ１０１２粒子ユニット（ｐｕ）であり、
該組成物は、第１腫瘍との接触に適切であるように製剤化されており、
それによって、ヒトは、第１腫瘍と１つ以上の更なる腫瘍に関し治療される、組成物。
【請求項２４】
組成物が第１腫瘍と１つ以上の更なる腫瘍内の腫瘍細胞の破壊剤である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
組成物が第１腫瘍と１つ以上の更なる腫瘍のサイズの減少剤である、請求項２３又は２４に記載の組成物。
【請求項２６】
投与量が、約１ｘ１０７〜約４ｘ１０１２粒子ユニット（ｐｕ）である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
投与量が、約１ｘ１０７〜約４ｘ１０１１粒子ユニット（ｐｕ）である、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
組成物が腫瘍に対する電離放射線との併用剤である、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
プロモーターが、構成性プロモーターである、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
プロモーターが、ＥＧＲ−１である、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【国際調査報告】
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