(57)【要約】体重を減少させる医薬、内臓脂肪を減少させる医薬、肝臓におけるトリグリセリドを減少させる医薬、および肥満および脂肪肝を改善する医薬をスクリーニングする方法を提供すること。候補物質のスフィンゴミエリン合成酵素の阻害活性を測定する工程を包含する方法であって、該候補物質がスフィンゴミエリン合成酵素の阻害活性を有する場合、該候補物質が抗肥満薬、内臓脂肪減少薬、脂肪肝処置薬およびアディポネクチン発現上昇剤からなる群より選択される少なくとも１つの機能を有すると判定される方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングする方法であって、被験物質のスフィンゴミエリン合成酵素の阻害活性を測定し、該被験物質がスフィンゴミエリン合成酵素の阻害活性を有する場合、該被験物質がメタボリックシンドロームの処置または予防のために有効であると判定される方法。
【請求項２】
前記メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質は、糖尿病薬、抗肥満薬、内臓脂肪減少薬、脂肪肝処置薬およびアディポネクチン発現上昇薬からなる群より選択される少なくとも１つの機能を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記阻害活性の測定は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれか一方の遺伝子をノックアウトした細胞を用いて行なうことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害活性の測定は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞を用いて行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞にシクロデキストリンを与え、前記被験物質が細胞増殖の遅延または細胞死を引き起こす場合、該被験物質が前記少なくとも１つの機能を有すると判定される請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素は、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２またはＳＭＳ１およびＳＭＳ２の両方である請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素はＳＭＳ２である請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項８】
スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれか一方の遺伝子をノックアウトした細胞を含む、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングするためのキット。
【請求項９】
スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞を含む、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングするためのキット。
【請求項１０】
前記物質は、糖尿病薬、抗肥満薬、内臓脂肪減少薬、脂肪肝処置薬およびアディポネクチン発現上昇薬からなる群より選択される少なくとも１つの機能を含む、請求項８または請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
シクロデキストリンをさらに含む請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素は、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２またはＳＭＳ１およびＳＭＳ２の両方である請求項８または請求項９に記載のキット。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素はＳＭＳ２である請求項８または請求項９に記載のキット。
【請求項１４】
スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれかの一方の遺伝子をノックアウトした、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングするための細胞。
【請求項１５】
スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製薬、機能性食品においてメタボリックシンドローム改善のスクリーニングに利用可能な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満の誘発は、ニューロペプチドY5受容体またはメラノコルチン受容体など視床下部発現タンパク質を介した摂食促進作用、またはアシルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）などを介した脂肪酸合成促進作用の関与などが知られている。現在、抗肥満薬として、ニューロペプチドＹ５受容体拮抗剤、メラノコルチン受容体拮抗剤およびＡＣＣ阻害剤などが開発されている。しかし、現在のところ、有効な抗肥満薬は見出されていないのが現状である。【０００３】
脂肪肝は、肝臓において中性脂肪が蓄積する疾患であり、肥満が主要な発症原因とされている。しかし、抗肥満薬同様、有効な脂肪肝処置薬は見出されていないのが現状である。また、メタボリックシンドロームの代表例とされ、肥満や循環器系疾患のような生活習慣病の根本的原因であるとされる糖尿病については、スルホニル尿酸薬、ビグアナイド、αグルコシダーゼ、およびアゾリジン誘導体などが開発されているが、副作用および有効性に問題がある。したがって、より有効な処置薬の開発が期待されている。【０００４】
スフィンゴミエリン合成酵素（ＳＭＳ）は、細胞膜に最も多量に存在するスフィンゴ脂質であるスフィンゴミエリン（ＳＭ）を合成する酵素であり、細胞死および生存に重要な役割を果たしている（非特許文献１および２参照）。ＳＭＳは、２００４年に同定され、ＳＭＳ１およびＳＭＳ２の２種類が存在することが知られている。ＳＭＳ１はゴルジ体に発現し、ＳＭのｄｅ  ｎｏｖｏ合成に関与することが知られている。一方、ＳＭＳ２はゴルジ体および細胞膜に発現し、生理機能については詳細が不明であり（非特許文献３参照）、非特許文献４〜６において動脈硬化への関与の可能性が示唆されているにすぎない。【０００５】
これまで中性脂質の代謝／吸収阻害剤や阻害物質、中性脂質の代謝を促進する物質等を用いてメタボリックシンドロームを改善する方法が試みられている。具体的には核内受容体ＰＰＡＲｓの合成リガンドによる高脂血症、ＩＩ型糖尿病改善薬、スタチン系薬剤によるコレステロール合成阻害を介した高脂血症改善薬等である。【０００６】
現在のところ、スフィンゴ脂質の合成制御を介した肥満誘発作用は知られていない。また、糖尿病薬や、抗肥満薬または脂肪肝処置薬として開発されているＳＭＳ阻害剤も存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yamaokaら、The  Journal  of  Biological  Chemistry,279, 18688-18693, (2004)
【非特許文献２】Huitemaら、The  EMBO  Journal,23, 33-44, (2004)
【非特許文献３】Tafesseら、The  Journal  of  Biological  Chemistry,281, 29421-29425, (2006)
【非特許文献４】Parkら、Circulation,110, 3465-3471, (2004)
【非特許文献５】Liuら、Arteriosclerosis, Thrombosis, and  Vascular  Biology, 29, 850-856,(2009)。
【非特許文献６】Liuら、Circulation  Research,105, 295-303, (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一つの側面は、スフィンゴ脂質の合成を抑制することにより体重を減少させること、内臓脂肪を減少させること、肝臓におけるトリグリセリドを減少させること、および肥満および脂肪肝を改善することに関する。本発明の別の側面は、スフィンゴ基質合成を阻害することにより肥満および脂肪肝を改善する、糖尿病薬、抗肥満薬および脂肪肝処置薬等のメタボリックシンドロームに対する薬のスクリーニング方法を提供することに関する。さらに、本発明の別の側面は、前記スクリーニング方法に用いる細胞に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題は、スフィンゴミエリンの合成酵素を制御することで、上記疾患に関する処置予防をすることができることを見出し、本発明を完成した。したがって、本発明は、以下を提供する。
（項目１）メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングする方法であって、被験物質のスフィンゴミエリン合成酵素の阻害活性を測定し、該被験物質がスフィンゴミエリン合成酵素の阻害活性を有する場合、該被験物質がメタボリックシンドロームの処置または予防のために有効であると判定される方法。
（項目２）前記メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質は、糖尿病薬、抗肥満薬、内臓脂肪減少薬、脂肪肝処置薬およびアディポネクチン発現上昇薬からなる群より選択される少なくとも１つの機能を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）前記阻害活性の測定は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれか一方の遺伝子をノックアウトした細胞を用いて行なうことを特徴とする項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）前記阻害活性の測定は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞を用いて行うことを特徴とする項目１〜項目３のいずれかに記載の方法。
（項目５）前記細胞にシクロデキストリンを与え、前記被験物質が細胞増殖の遅延または細胞死を引き起こす場合、該被験物質が前記少なくとも１つの機能を有すると判定される項目３または項目４に記載の方法。
（項目６）前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素は、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２またはＳＭＳ１およびＳＭＳ２の両方である項目３〜項目５のいずれかに記載の方法。
（項目７）前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素はＳＭＳ２である項目３〜項目６のいずれかに記載の方法。
（項目８）スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれか一方の遺伝子をノックアウトした細胞を含む、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングするためのキット。
（項目９）スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞を含む、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングするためのキット。
（項目１０）前記物質は、糖尿病薬、抗肥満薬、内臓脂肪減少薬、脂肪肝処置薬およびアディポネクチン発現上昇薬からなる群より選択される少なくとも１つの機能を含む、項目８または項目９に記載のキット。
（項目１１）シクロデキストリンをさらに含む項目１０に記載のキット。
（項目１２）前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素は、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２またはＳＭＳ１およびＳＭＳ２の両方である項目８〜１１のいずれかに記載のキット。
（項目１３）前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素はＳＭＳ２である項目８〜１２のいずれかに記載のキット。
（項目１４）スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれかの一方の遺伝子をノックアウトした、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングするための細胞。
（項目１５）スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞。
あるいは、本発明は、以下を提供する。
（項目Ａ１）候補物質のスフィンゴミエリン合成酵素の阻害活性を測定する工程を包含する方法であって、該候補物質がスフィンゴミエリン合成酵素の阻害活性を有する場合、該候補物質が抗肥満薬、内臓脂肪減少薬、脂肪肝処置薬およびアディポネクチン発現上昇剤からなる群より選択される少なくとも１つの機能を有すると判定される方法。
（項目Ａ２）前記阻害活性の測定は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞を用いて行うことを特徴とする項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ３）前記阻害活性の測定は、前記細胞にシクロデキストリンを与え、前記候補物質が細胞増殖の遅延または細胞死を引き起こす場合、該候補物質が前記少なくとも１つの機能を有すると判定される項目Ａ２に記載の方法。
（項目Ａ４）前記シクロデキストリンがメチルβシクロデキストリンである項目Ａ３に記載の方法。
（項目Ａ５）前記細胞は、不死化したマウス繊維芽細胞である項目Ａ２〜Ａ４のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ６）前記遺伝子導入は、レトロウイルスにより行われる項目Ａ２〜Ａ５のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ７）前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素は、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２またはＳＭＳ１およびＳＭＳ２の両方である項目Ａ２〜Ａ６のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ８）前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素はＳＭＳ２である項目Ａ２〜Ａ７のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ９）スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞を含む、抗肥満薬、内臓脂肪減少薬、脂肪肝処置薬およびアディポネクチン発現上昇剤からなる群より選択される少なくとも１つの機能を有する薬をスクリーニングするためのキット。
（項目Ａ１０）シクロデキストリンをさらに含む項目Ａ９に記載のキット。
（項目Ａ１１）前記シクロデキストリンがメチルβシクロデキストリンである項目Ａ１０に記載のキット。
（項目Ａ１２）前記細胞は、不死化したマウス繊維芽細胞である項目Ａ９〜Ａ１１のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ１３）前記遺伝子導入は、レトロウイルスにより行われる項目Ａ９〜Ａ１２のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ１４）前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素は、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２またはＳＭＳ１およびＳＭＳ２の両方である項目Ａ９〜Ａ１３のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ１５）前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素はＳＭＳ２である項目Ａ９〜Ａ１４のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ１６）スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞。
（項目Ａ１７）前記細胞は、不死化したマウス繊維芽細胞である項目Ａ１６に記載の細胞。
（項目Ａ１８）前記遺伝子導入は、レトロウイルスにより行われる項目Ａ１６またはＡ１７に記載の細胞。
（項目Ａ１９）前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素は、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２またはＳＭＳ１およびＳＭＳ２の両方である項目Ａ１６〜Ａ１８のいずれかに記載の細胞。
（項目Ａ２０）前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素はＳＭＳ２である項目Ａ１６〜Ａ１９のいずれかに記載の細胞。【００１０】
本発明に関して、メタボリックシンドロームは複合的な要因で起こることが知られている。よって新しい作用機序を持つ医薬品の登場は、これまでの医薬品の弱点を補うことができる可能性がある。【００１１】
本発明者らは、スフィンゴ脂質の代謝を制御する事で、間接的に中性脂質合成／代謝に影響を与えるというこれまでに無かった作用機序でメタボリックシンドロームを改善する方法を開発し、またそれらを標的にした阻害剤のスクリーニング法も開発するにいたった。【００１２】
本発明者らは、スフィンゴ脂質の一つスフィンゴミエリンの合成酵素ＳＭＳ２などのスフィンゴミエリン合成酵素を制御することでトリアシルグリセロールの合成量に影響を与え、それによってメタボリックシンドロームを改善する方法を提案する。ＳＭＳはスフィンゴミエリンを合成する際に等モル量のジアシルグリセロールを生成する。本明細書において例示した実験からこのジアシルグリセロールは代表的な中性脂質であるトリグリセロール合成の原料となる可能性が示された。具体的には、例示的な例として、ＳＭＳ２遺伝子を欠損したマウスに高脂肪食を負荷した際の体重増加が、対照群に比べて有意に減少し、通常食を負荷した際の体重により近かった。【００１３】
つまりＳＭＳの活性を制御することでトリアシルグリセロールの合成量を制御し結果的にメタボリックシンドロームを改善する。また、本発明者らが開発したＳＭＳ２の遺伝子欠損マウス及び、そのマウスから単離／作製した細胞株を用いてメタボリックシンドローム改善効果を持つＳＭＳ２の阻害剤をスクリーニングすることができる。
【発明の効果】
【００１４】
従来、スフィンゴ脂質の合成制御を介したメタボリックシンドローム改善薬は存在しない。したがって、本発明により全く新しいコンセプトに基づいた創薬が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１におけるＳＭＳｓノックアウト（ＫＯ）マウスの作製に用いたターゲティングベクターの概略を示す。左は、ＳＭＳ１遺伝子のノックアウトに用いたターゲティングベクターの概略を示し、右は、ＳＭＳ２遺伝子のノックアウトに用いたターゲティングベクターの概略を示す。図中、ＥはＥｃｏＲＩ、ＰはＰｓｔＩ、ＳはＳａｌＩ、ＳｐはＳｐｅＩ、ＳｍａはＳｍａＩ、ＸｈｏはＸｈｏＩの制限酵素切断部位を示す。
【図２】図２は、実施例１における体重に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）および対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ノックアウトマウスに投与した際の９週間にわたる体重（ｇ）の変動を示す。高脂肪食を投与した野生型マウス（ＷＴ／ＨＦＤ）は体重が増加したが、高脂肪食を投与したＳＭＳ２−ＫＯマウス（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ）の体重増加は、通常食を投与した野生型マウス（ＷＴ／ＮＤ）および通常食を投与したＳＭＳ２−ＫＯマウス（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ）と差がなく、体重増加が有意に抑えられた。三角；ＷＴ／ＨＦＤ、菱形；ＷＴ／ＮＤ、丸；ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ、四角；ＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ、である。
【図３】図３は、実施例１における白色脂肪細胞量（ＷＡＴ）に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、精巣上体に付着した脂肪重量（ｍｇ）の比較を示す。ＷＴ／ＨＦＤ群（左）に比べて、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群（右）では白色脂肪細胞量（ＷＡＴ）に減少傾向は見られるものの、有意な差ではなかった。図には示さないが、対照通常食（ＮＤ）を並行して与えた同様の実験も行っており、ＷＴ／ＨＦＤ群に比べてＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群では白色脂肪細胞量（ＷＡＴ）が減少していた。一方、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群とＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ群との間には有意差は見られなかったことがわかっている。
【図４】図４は、実施例１における肝トリグリセリド量に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、肝ホモジネート中のトリグリセリド量（ｍｇ／ｍｇタンパク質）の比較を示す。ＷＴ／ＨＦＤ群（左）に比べてＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群（右）では有意にトリグリセリド量が減少していた。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例１における肝トリグリセリド量に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）および対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、肝ホモジネート中のトリグリセリド量（ｍｇ／ｍｇタンパク質）の比較を示す。ＷＴ／ＨＦＤ群（左）に比べてＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群（右）では有意にトリグリセリド量が減少していた。一方、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群とＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ群との間には有意差は見られなかった。
【図５】図５は、実施例１におけるアディポネクチン量に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、脂肪組織でのアディポネクチンｍＲＮＡの相対的な発現量の比較を示す。ＷＴ／ＨＦＤ群（左）ではアディポネクチンの発現が抑制されているが、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群（右）では、比較的高い発現量が維持されていた。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例１におけるアディポネクチン量に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）および対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、脂肪組織のアディポネクチンｍＲＮＡの相対的な発現量の比較を示す。図５Ａでは、左から順に、野生型に通常食を与えた群（ＷＴ／ＮＤ）、野生型に高脂肪食を与えた群（ＷＴ／ＨＦＤ）、ＳＭＳ２―ＫＯマウスに通常食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ）、およびＳＭＳ２―ＫＯマウスに高脂肪食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ）を示す。Ｙ軸は、ｍＲＮＡの相対量を示す。ＷＴ群では、高脂肪食を付与することにより、アディポネクチンの発現が抑制されるが、ＳＭＳ２  ＫＯ群では、高脂肪食を付与しても、比較的高い発現量が維持されていた。
【図５Ｂ−１】図５Ｂ−１は、実施例１における脂肪組織におけるインスリン受容体に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）および対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに投与した際のインスリン受容体の相対的な発現量の比較を示す。左から順に、野生型に通常食を与えた群（ＷＴ／ＮＤ）、野生型に高脂肪食を与えた群（ＷＴ／ＨＦＤ）、ＳＭＳ２―ＫＯマウスに通常食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ）、およびＳＭＳ２―ＫＯマウスに高脂肪食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ）を示す。Ｙ軸は、ｍＲＮＡの相対量を示す。野生型のマウスでは、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を与えるとインスリン受容体の発現量が低下するけれども、ＳＭＳ２―ＫＯマウスでは高脂肪食によるインスリン受容体の発現低下はおこっておらず、対照通常食を与えた場合とほぼ同程度の発現量であった。また、ＳＭＳ２―ＫＯマウスに対して高脂肪食を投与した場合のインスリン受容体の発現量は、野生型のマウスに対して高脂肪食を投与した場合と比較して有意に高かった。以上の結果から、ＳＭＳ２ＫＯマウスの脂肪組織において、野生型のマウスでみられるような高脂肪食によるインスリン受容体の発現低下がおこっておらず、インスリン抵抗性にはなっていないことが示唆された。
【図５Ｂ−２】図５Ｂ−２は、実施例１における脂肪組織におけるＧｌｕｔ４に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）および対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに投与した際のＧｌｕｔ４の相対的な発現量の比較を示す。左から順に、野生型に通常食を与えた群（ＷＴ／ＮＤ）、野生型に高脂肪食を与えた群（ＷＴ／ＨＦＤ）、ＳＭＳ２―ＫＯマウスに通常食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ）、およびＳＭＳ２―ＫＯマウスに高脂肪食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ）を示す。Ｙ軸は、ｍＲＮＡの相対量を示す。野生型のマウスでは、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を与えるとＧｌｕｔ４の発現量が低下するけれども、ＳＭＳ２―ＫＯマウスでは高脂肪食によるＧｌｕｔ４の発現低下については抑制が抑えられており、対照通常食を与えた場合とほぼ同程度の発現量であった。また、ＳＭＳ２―ＫＯマウスに対して高脂肪食を投与した場合のＧｌｕｔ４の発現量は、野生型のマウスに対して高脂肪食を投与した場合と比較して有意に高かった。以上の結果から、ＳＭＳ２―ＫＯマウスの脂肪組織において、野生型のマウスでみられるような高脂肪食によるＧｌｕｔ４の発現低下がおこっておらず、インスリン抵抗性にはなっていないことが示唆された。
【図５Ｃ】図５Ｃは、実施例１における血糖値に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）および対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに９週間投与した後に２４時間絶食させた後、マウスの腹腔内に２ｇ／ｋｇのグルコースを投与し、投与直前、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に血糖値を測定した。投与直前には、４つの群で有意差はなかったが、投与後１２０分後には、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群はＷＴ／ＨＦＤ群に比べて有意に血糖値が低下していた。白三角はＷＴ／ＮＤを示し、薄い四角はＷＴ／ＨＦＤを示し、塗りつぶした三角はＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤを示し、濃い四角はＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤを示す。Ｙ軸は血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示し、Ｘ軸は時間（分）を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、図５Ｃのグラフの下の面積を棒グラフで表したもの（ＡＵＣ（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｃｕｒｖｅ））である。左から順に、野生型に通常食を与えた群（ＷＴ／ＮＤ）、野生型に高脂肪食を与えた群（ＷＴ／ＨＦＤ）、ＳＭＳ２―ＫＯマウスに通常食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ）、およびＳＭＳ２―ＫＯマウスに高脂肪食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ）を示す。ＷＴ／ＨＦＤとＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤとの間には有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。Ｙ軸は、ＧＴＴ  ＡＵＣ（面積＝ＡＵ、単位はｍ２（面積単位））でその相対値を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、実施例１における血中インスリン量に対する通常食（ＮＤ）の影響を検討した結果を表す。野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに通常食を４週間投与した後、２４時間絶食させ、その後通常食を投与し、２４時間絶食時および通常食投与後１時間経過時の血中インスリン濃度を測定した。左は絶食時および右は食後１時間経過時のものを示し、それぞれのうち、左側（濃い部分）が野生型（ＷＴ）を示し、右側（薄い部分）がＳＭＳ２  ＫＯを示す。Ｙ軸は、血中インスリン濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスの間において、２４時間の絶食時および通常食投与後１時間経過時いずれにおいても血中インスリン濃度に有意差は見られなかった。この実験からは、ＳＭＳ２をＫＯしても、インスリンの量および食事に対するインスリン分泌応答そのものについては、影響がないといえる。したがって膵ベータ細胞の異常によるインスリンの分泌異常の結果、惹起されることが予想される体重減少および血糖値の低下などの懸念は払拭できた。
【図５Ｆ】図５Ｆは、実施例１における血糖値に対する高脂肪食の影響を検討した結果を表す。４週齢の野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに２週間高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を投与し、高脂肪食投与前に４時間絶食させたときおよび２週間高脂肪食を投与した後に４時間絶食させて血糖値を測定した。左の群は、０日目を示し、右の群は、１５日目を示す。黒い棒はＳＭＳ２―ＫＯマウスを示し、白い棒は野生型（ＷＴ）を示す。Ｙ軸は血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示す。高脂肪食を投与する前には、野生型のマウスとＳＭＳ２−ＫＯマウス間において、血糖値に有意差は見られないけれども、高脂肪食を２週間投与した後は、野生型のマウスの血糖値は、ＳＭＳ２−ＫＯマウスと比較して有意に血糖値が高かった（ｐ＜０．０５）。この結果、ＳＭＳ２−ＫＯマウスでは、有意差をもって、血糖値が低下していたことを意味する。図５Ｅの結果をあわせみると、ＳＭＳ−２をＫＯすれば、インスリン抵抗性の糖尿病にはならないといえる。
【図５Ｇ】図５Ｇは、実施例１における血中インスリン量に対する高脂肪食の影響を検討した結果を表す。野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を２週間投与した後、４時間絶食させ、血中インスリン量を測定した。左は野生型（ＷＴ）を示し、右はＳＭＳ２−ＫＯマウス（ＫＯ）を示す。Ｙ軸は、血中インスリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。その結果、ＳＭＳ２−ＫＯマウスでは、野生型のマウスと比較して、有意差をもって、血中インスリン量が低下していた。
【図５Ｈ−１】図５Ｈ−１は、実施例１におけるインスリンに対する血中グルコース濃度を検討した結果を表す。４週齢の野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに６週間高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を投与し、６週間経過時に腹腔内にインスリンを０．５Ｕ／ｋｇで投与し、投与前および投与後１５、３０、６０、９０、１２０分での血中グルコース濃度を測定した結果を示す。特に、投与後、３０、６０、９０分後には、ＳＭＳ２−ＫＯマウスは、野生型のマウスと比較して、有意に血中グルコース濃度が低下していたので、ＳＭＳ２―ＫＯマウスはインスリンに対してより感受性であることが明らかとなった。白丸は、野生型（ＷＴ）を示し、黒丸はＳＭＳ２−ＫＯマウスを示す。＊および＊＊はいずれも有意（それぞれ、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）を示す。Ｙ軸は血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示し、Ｘ軸は投与後経過時間（分）を示す。
【図５Ｈ−２】図５Ｈ−２は、図５Ｈ−１のグラフの下の面積（ＡＵＣ）の野生型（ＷＴ）に対する比（ＷＴ＝１）を棒グラフで表す。ＳＭＳ２−ＫＯマウスにおいては、野生型のマウスと比較して、２０％程度有意に減少していたので、インスリンに対してより感受性であることが明らかになった。以上の結果から、図５Ｆ，Ｇ、Ｈ−１、Ｈ−２より、ＳＭＳ−２をＫＯすれば、ＷＴと比較してインスリン抵抗性の糖尿病にはなりにくいといえる。
【図６】図６は、実施例２において作製した、ＳＭＳ１およびＳＭＳ２を欠失させたＺＳ２細胞、ＳＭＳ１を過剰発現する細胞（ＺＳ２／ＳＭＳ１）、およびＳＭＳ２を過剰発現する細胞（ＺＳ２／ＳＭＳ２）について、抗Ｖ５モノクローナル抗体を用いて行ったウェスタンブロッティングの結果を示す。ＺＳ２細胞においてはバンドが検出されなかったが、ＺＳ２／ＳＭＳ１およびＺＳ２／ＳＭＳ２において、抗Ｖ５  ｍａｂで検出されるＳＭＳ１、ＳＭＳ２のバンドがそれぞれ確認された。
【図７】図７は、実施例３において行ったＺＳ２細胞、ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞のＳＭＳ活性についての検討結果を示す。ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞（左）およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞（中央）がＳＭＳ活性を有していたのに対し、ＺＳ２細胞（右）はＳＭＳ活性がなかった。グラフの縦軸は、ＳＭＳ活性（単位：ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質）を示す。
【図８】図８は、実施例３において行ったＺＳ２細胞、ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞のＴＧ合成についての検討結果を示す。ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞（左）およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞（中央）におけるＴＧ量と、ＺＳ２細胞（右）におけるＴＧ量との間には有意差があった（各々、ｐ＜０．００５およびｐ＜０．０２）。グラフの縦軸は、［１４Ｃ］ＴＧの対照（ＺＳ２細胞）に対する割合（％）を示す。
【図９】図９は、実施例２において作製したＺＳ２／ＳＭＳ２細胞のスフィンゴ脂質の合成阻害剤のＭｙｒｉｏｃｉｎを用いたＭｅβＣＤ感受性の変化を検討した結果を表す（ｎ＝３）。左から３群示し、１群において、左は、何も加えないもの右はＭｙｒｉｏｃｉｎ  ５μＭを加えたものを示す。各群は左から２ｍＭ  ＭｅβＣＤのみを加えたもの、セラミド（Ｃｅｒ）および２ｍＭ  ＭｅβＣＤを加えたもの、ならびにスフィンゴミエリン（ＳＭ）および２ｍＭ  ＭｅβＣＤを加えたものを示す。この細胞にＭｙｒｉｏｃｉｎを加えると生存率に有意差が見られるけれども（左端の２つ）、培地にセラミド（Ｃｅｒ）またはスフィンゴミエリン（ＳＭ）を添加すると、Ｍｙｒｉｏｃｉｎによる生存率に有意差が見られなくなるので、Ｍｙｒｉｏｃｉｎによるスフィンゴミエリンの減少によりＭｅβＣＤ感受性が上昇していることが確認された。なお、Ｙ軸は、ＭｅβＣＤを入れないときについて、Ｍｙｒｉｏｃｉｎありなしの場合の平均値を１００％とした数値である（なお、Ｍｙｒｉｏｃｉｎありなしでは有意差がなく、これらの平均を１００％とした。結果を図９に示す。
【図１０】図１０は、実施例２において作製したＺＳ２およびＺＳ２／ＳＭＳ１、２細胞のＭｅβＣＤに対する感受性を検討した結果を表す。左は、ＺＳ２細胞を示し、右はＺＳ２／ＳＭＳ１，２細胞を示す。Ｙ軸は細胞増殖（％）（ＺＳ２／ＳＭＳ１，２細胞＝１００％）を示す。ＺＳ２細胞は、ＺＳ２／ＳＭＳ１，２細胞に比べて有意にＭｅβＣＤに対して感受性であった。
【図１１】図１１は、実施例２において作製したＺＳ２およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞のＭｅβＣＤに対する感受性を検討した結果を表す。左は、ＺＳ２細胞を示し、右はＺＳ２／ＳＭＳ２細胞を示す。Ｙ軸は細胞増殖（％）（ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞＝１００％）を示す。ＺＳ２細胞は、ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞に比べて有意にＭｅβＣＤに対して感受性であった。
【図１２】図１２は、実施例２において作製したＺＳ２およびＺＳ２／ＳＭＳ１細胞のＭｅβＣＤに対する感受性を検討した結果を表す。左は、ＺＳ２細胞を示し、右はＺＳ２／ＳＭＳ１細胞を示す。Ｙ軸は細胞増殖（％）（ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞＝１００％）を示す。ＺＳ２細胞は、ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞に比べて有意にＭｅβＣＤに対して感受性であった。
【図１３】図１３は、ＳＭＳ１に対するｓｉＲＮＡのＳＭＳ１−ｉ４がＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞でＳＭＳ１の発現を抑制するのかを検討した結果を表す（ｎ＝１）。Ｙ軸はＳＭＳ１／Ｇ３ＰＤＨの相対的なｍＲＮＡ量（％）（ＣＴＲ＝１００％）を示す。ＳＭＳ１−ｉ４を投与した細胞は、コントロールのｓｉＲＮＡを投与した細胞と比べてＳＭＳ１の発現が抑制されていた。なお、ｍＲＮＡレベルでの特異性についても、ＳＭＳ２の発現が抑制されていないことを確認しており、実験データによりＳＭＳ１に対する特異性が確認されている。
【図１４】図１４は、ＳＭＳ２に対するｓｉＲＮＡのＳＭＳ２−ｉ１１がＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞でＳＭＳ２の発現を抑制するのかを検討した結果を表す（ｎ＝１）。Ｙ軸はＳＭＳ２／Ｇ３ＰＤＨの相対的なｍＲＮＡ量（％）（ＣＴＲ＝１００％）を示す。ＳＭＳ２−ｉ１１を投与した細胞は、コントロールのｓｉＲＮＡを投与した細胞と比べてＳＭＳ２の発現が抑制されていた。なお、ｍＲＮＡレベルでの特異性についても、ＳＭＳ１の発現が抑制されていないことを確認しており、実験データによりＳＭＳ２に対する特異性が確認されている。
【図１５】図１５は、ＳＭＳ２に対するｓｉＲＮＡのＳＭＳ２−ｉ１１が実施例２において作製したＺＳ２／ＳＭＳ２細胞でＳＭＳ２の発現を抑制するのかを検討した結果を表す（ｎ＝１）。Ｙ軸はＳＭＳ２／Ｇ３ＰＤＨの相対的なｍＲＮＡ量（％）（ＣＴＲ＝１００％）を示す。ＳＭＳ２−ｉ１１を投与した細胞は、コントロールのｓｉＲＮＡを投与した細胞と比べてＳＭＳ２の発現が抑制されていた。。
【図１６】図１６は、ＳＭＳ１に対するｓｉＲＮＡのＳＭＳ１−ｉ４を、実施例２において作製したＺＳ２／ＳＭＳ１細胞に対して投与することによって、ＭｅβＣＤに対する感受性が変化するのかを検討した結果を表す。左はコントロールのｓｉＲＮＡ（ＣＴＲ−ｉ）を示し、右はＳＭＳ１−ｉ４を示す。Ｙ軸は細胞増殖（％）（ＣＴＲ−ｉ＝１００％）を示す。ＳＭＳ１−ｉ４を投与した細胞は、コントロールのｓｉＲＮＡを投与した細胞と比べて有意に（ｐ＜０．０１）ＭｅβＣＤに対して感受性であった。
【図１７】図１７は、ＳＭＳ１に対するｓｉＲＮＡのＳＭＳ１−ｉ４を、実施例２において作製したＺＳ２／ＳＭＳ２細胞に対して投与することによって、ＭｅβＣＤに対する感受性が変化するのかを検討した結果を表す。左は、コントロールであるＣＴＲ−ｉを示し、右はＳＭＳ１−ｉ４を示す。Ｙ軸は細胞増殖（％）（ＣＴＲ−ｉ＝１００％）を示す。ＳＭＳ１−ｉ４を投与した細胞およびコントロールのｓｉＲＮＡを投与した細胞間において、ＭｅβＣＤに対する感受性には有意差はなかった。
【図１８】図１８は、ＳＭＳ２に対するｓｉＲＮＡのＳＭＳ２−ｉ１１を、実施例２において作製したＺＳ２／ＳＭＳ２細胞に対して投与することによって、ＭｅβＣＤに対する感受性が変化するのかを検討した結果を表す。左は、コントロールであるＣＴＲ−ｉを示し、右はＳＭＳ２−ｉ１１を示す。Ｙ軸は細胞増殖（％）（ＣＴＲ−ｉ＝１００％）を示す。ＳＭＳ２−ｉ１１を投与した細胞は、コントロールのｓｉＲＮＡを投与した細胞と比べて有意に（ｐ＜０．０１）ＭｅβＣＤに対して感受性であった。
【図１９】図１９は、ＳＭＳ２に対するｓｉＲＮＡのＳＭＳ２−ｉ１１を、実施例２において作製したＺＳ２／ＳＭＳ１細胞に対して投与することによって、ＭｅβＣＤに対する感受性が変化するのかを検討した結果を表す。左は、コントロールであるＣＴＲ−ｉを示し、右はＳＭＳ２−ｉ１１を示す。Ｙ軸は細胞増殖（％）（ＣＴＲ−ｉ＝１００％）を示す。ＳＭＳ２−ｉ１１を投与した細胞およびコントロールのｓｉＲＮＡを投与した細胞間において、ＭｅβＣＤに対する感受性には有意差はなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に本発明の好ましい形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１７】
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１８】
本明細書において、「スフィンゴミエリン合成酵素」（本明細書において「ＳＭＳ」ともいう。）とは、スフィンゴミエリン（本明細書において「ＳＭ」ともいう。）を合成する酵素であって、ホスファチジルコリン（本明細書において「ＰＣ」ともいう。）の存在下で、セラミドをスフィンゴミエリンへと変換する酵素をいい、細胞死および生存に重要な役割を果たしている（非特許文献１および２参照）。ここで、ホスファチジルコリンは、変換後ジアシルグリセロールに変換される。スフィンゴミエリン合成酵素としては、代表的に、ＳＭＳ１およびＳＭＳ２が知られており、このほかにもホモログがあることが知られている（非特許文献1および２参照）。ＳＭＳ１はゴルジ体に発現し、ＳＭのｄｅ  ｎｏｖｏ合成に関与することが知られている。一方、ＳＭＳ２はゴルジ体および細胞膜に発現し、生理機能については詳細が不明である（非特許文献３参照）。なお、ＳＭＳ１のＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号は、ＮＭ＿１４７１５６（ヒト）、ＮＭ＿１４４７９２（マウス）であり、ＳＭＳ２は、ＢＣ０２８７０５．１（ヒト）、ＢＣ０４１３６９．２（ヒト）、ＮＭ＿０２８９４３（マウス）である。
【００１９】
本明細書において「候補物質」または「被験物質」とは、交換可能に使用され、いずれも、スクリーニングの対象となる任意の物質をいい、例えば、低分子化合物（例えば、コンビナトリアルケミストリーなどで合成されたものも含む）、有機化合物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、核酸、脂質、およびこれらの複合体等を挙げることができるがこれに限定されない。
【００２０】
本明細書において、「阻害活性」とは、ある物質について、その物質が、酵素などの機能物質（例えば、スフィンゴミエリン合成酵素）の活性を少なくとも低減または消失させる活性をいう。本発明では、たとえば、このような阻害活性の測定は、本発明の細胞等にシクロデキストリン等の細胞死誘導剤を与え、測定対象の候補物質が細胞増殖の遅延または細胞死を引き起こすかどうかを観察することができる。
【００２１】
本明細書において「メタボリックシンドローム」または「メタボリック疾患」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味で用いられ、内臓脂肪型肥満を共通の要因として高血糖、脂質異常、高血圧が引き起こされる状態をいい、従前は、「生活習慣病」、「成人病」などと呼ばれており、これらの用語はすべて、本明細書において交換可能に使用される。メタボリックシンドロームまたはメタボリック疾患は、本明細書では特に糖尿病、肥満、内臓脂肪（脂質異常症（内臓脂肪過多））、脂肪肝およびアディポネクチン発現低下の少なくとも１つを含む。また、メタボリックシンドロームになった結果、それが原因で何年か後に動脈硬化になることも多いことから、「メタボリックシンドローム」には、動脈硬化一般が含まれるのではないが、上記メタボリックシンドローム（たとえば糖尿病、肥満など）により惹起される動脈硬化も含まれることが理解される。
【００２２】
本明細書において「糖尿病薬」とは、糖尿病を処置（たとえば、抑制、予防など）しうる薬剤をいう。糖尿病は、当該分野において通常使用される意味で用いられ、血糖値（血液中のグルコース濃度）が病的に高い状態をいい、糖尿病は、膵臓からインスリン分泌されないことで引き起こされる１型糖尿病と、インスリンの働きが低下することにより引き起こされる２型糖尿病に大別される。本明細書では、型にとらわれることなく、Ｉ型、ＩＩ型を含む。そして、本明細書では、特にＩ型についていう場合「Ｉ型糖尿病薬」といい、ＩＩ型についていう場合「ＩＩ型糖尿病薬」ということがある。
【００２３】
ここで、インスリン抵抗性症候群とは糖尿病の主原因（特に２型糖尿病）であり、肥満や循環器系疾患のような生活習慣病の根本的原因である。インスリン抵抗性とは末梢組織がインスリンに対する応答が鈍化した状態を意味し、インスリンに対する応答が鈍化した結果、末梢組織がインスリンに応答できないため、血中グルコースを取り込めず、血糖値の高い状態が維持されることとなる。膵臓は血糖を低下させるために大量のインスリンを放出するので、血中インスリン濃度が高い値となる。
【００２４】
したがってインスリン抵抗性の改善により血糖値が低下し、上記生活習慣病の治療や予防に有用である。インスリン抵抗性改善の指標は血中インスリン濃度を測定し、低下していること、さらに血中アディポネクチン濃度が上昇していることが一つの指標となる。以上のことからアディポネクチンを上昇させる薬や、血糖値を正常レベルに維持しながらなおかつ血中インスリン濃度を低下させる薬はインスリン抵抗性改善薬となり、それに起因する糖尿病や肥満、循環器病（動脈硬化や高血圧など）やメタボリックシンドロームの治療にも有効である。
【００２５】
本明細書において「抗肥満薬」とは、肥満を処置（たとえば、抑制、予防など）しうる薬剤をいう。肥満状態としては、例えば、体重過多、脂肪過多などを挙げることができる。体格指数として測定されるＢＭＩが２５以上の場合肥満とされる。体脂肪率の場合は、１８％以上を基準とする。肥満の処置効果は、体重の測定、脂肪の測定、脂肪中に蓄えられたトリグリセリドの測定などで判定することができる。
【００２６】
本明細書において「体重減少薬」とは、体重を減少させるかあるいは節食を抑制させる薬剤をいう。本明細書において「体重減少」または「体重を減少させる」とは、現在の体重を減少させる場合のほか、体重増加を抑制して現在の体重を維持する場合を含めて最も広義に解釈しなければならない。体重減少は、体重の測定、脂肪の測定、脂肪中に蓄えられたトリグリセリドの測定、または節食量の測定で判定することができる。
【００２７】
本明細書において「内臓脂肪減少薬」とは、内臓脂肪を減少させるかあるいは内臓脂肪の増加を防止する薬剤をいう。内臓脂肪は、当該分野において通常使用される意味で用いられ、体脂肪のうち、内臓の周囲に付いた脂肪をいう。内臓脂肪の減少は、白色脂肪細胞重量を測定すること、腹部ＣＴ画像により測定すること、などで判定することができる。
【００２８】
本明細書において「脂肪肝処置薬」とは、脂肪肝を処置（たとえば、抑制、予防）し得る薬剤をいう。脂肪肝とは、当該分野において通常使用される意味で用いられ、肝臓に多量の脂肪が蓄積する状態をいう。その原因としては、アルコール性・栄養性・糖尿病性・薬剤性などが知られている。脂肪肝になると、その一部は肝硬変に移行するといわれる。その意味では、本発明は、肝硬変の予防剤と捉えることもできる。脂肪肝処置の効果は、脂肪中のトリグリセリド（ＴＧ）を測定すること、肝重量を測定すること、肝臓を肉眼的観察することなどで判定することができる。
【００２９】
本明細書において「アディポネクチン発現上昇剤」とは、アディポネクチンの発現を上昇させる薬剤をいう。アディポネクチンは、当該分野において通常使用される意味で用いられ、脂肪細胞から分泌される分泌タンパク質であり、内臓脂肪量に逆相関するといわれており、いわゆるメタボリック疾患の指標となるといわれている。アディポネクチン発現上昇は、たとえば、脂肪を採取しｍＲＮＡを抽出し、アディポネクチンｍＲＮＡの発現量を測定すること、抗アディポネクチン抗体を用いての免疫学的測定、などで判定することができる。
【００３０】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００３１】
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
【００３２】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【００３３】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【００３４】
本明細書において、「トランスジェニック」とは、特定の遺伝子をある生物（または細胞等）に組み込むことまたはそのような遺伝子が組み込まれたかまたは欠失もしくは抑制された生物（例えば、動物（マウスなど）を含む）（または細胞等）をいう。トランスジェニック生物（または細胞等）のうち、ある遺伝子が欠失または抑制されているものをノックアウト生物（または細胞等）という。したがって「ノックアウト」とは、動物または細胞等について言及するとき、標的となる生来の遺伝子を機能しない状態または発現しない状態となっていることをいう。
【００３５】
本明細書において「遺伝子導入」は、目的となる遺伝子を細胞、組織、または動物中に導入することをいい、概念として、「形質転換」、「形質導入」および「トランスフェクション」などを包含するものであり、当該分野において公知の任意の手法によって実現することができる。また、「遺伝子導入」には導入部位を限定しない導入および導入部位を限定する相同組換による導入のいずれも含むものである。遺伝子導入の手法としては、たとえば、レトロウイルス、プラスミド、ベクター等を用いた手法、あるいは、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法、リン酸カルシウム法が挙げられるがそれに限定されない。遺伝子導入に使用される細胞は、どのような細胞でもよいが、未分化細胞（たとえば、繊維芽細胞など）を利用することが好ましい。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ物質（例えば、医薬）などを、特定の操作および／または評価方法で多数の候補から選抜することをいう。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた医薬またはその候補もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。
【００３７】
本明細書において、「予防」するとは、本発明の標的とする疾患、障害または症状が発生する前に、何らかの手段により、その疾患、障害または症状を生じさせないかまたは少なくとも遅延させること、あるいは疾患、障害または症状の原因自体が生じたとしてもそれが原因の障害が生じないような状態にすることをいう。
【００３８】
本明細書において、「治療」するとは、既に発症している本発明の標的とする疾患、障害または症状の進行を食い止めるか、または完全または部分的に拘わらず、本発明の標的とする疾患、障害または症状の進行が止まるか、または改善することをいう。
【００３９】
本明細書において「処置」とは、疾患、障害または症状に対して何らかの影響を与えるか、そのような疾患、障害または症状になることを防止することをいい、治療および予防の両方を含みうる。狭義には、「処置」は、「予防」に対して、発症後の上記行為をさす。
【００４０】
本明細書において「細胞死誘導剤」とは、細胞死を誘導しうる任意の薬剤をいう。本発明では、細胞膜のコレステロールと結合することにより細胞膜を破壊して細胞死を誘導ことができる薬剤であれば、いかなる物質をも使用することができる。ＳＭＳが欠損した細胞では、シクロデキストリン類を使用して細胞死を誘導することができるが、これに限定されないことが理解される。本明細書で「シクロデキストリン」という場合、広義に使用され、数分子のＤ−グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合し環状構造をとった任意の環状オリゴ糖およびその誘導体をいい、置換（例えば、置換基として、アルキル基、ヒドロキシアルキル基等が挙げられるがこれらに限定されない）または非置換のシクロデキストリン類の任意の一つを指す。細胞死誘導剤として使用しうるシクロデキストリンとしては、たとえば、メチルαシクロデキストリン、メチルβシクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、αシクロデキストリン、βシクロデキストリンなどを挙げることができる（参考として、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２９，１７２５０−１７２５６，１９９５；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，４４，３４０２８−３４０３４；特開２００７−３３２１２８などを参照。）。
【００４１】
本明細書において「再構成細胞」とは、ある細胞について、必要に応じてノックアウトにより特定の遺伝子を欠失させた後、目的となる遺伝子を導入して生産した細胞をいう。再構成細胞としては、本発明のスフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のみを発現する細胞（例えば、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素（例えば、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２またはＳＭＳ１およびＳＭＳ２の両方）を遺伝子導入させた細胞）などを挙げることができる。
【００４２】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【００４３】
（医薬探索方法）
１つの局面において、本発明は、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングする方法提供する。この方法は、候補物質または被験物質のスフィンゴミエリン合成酵素の阻害活性を測定する工程を包含する方法であって、該候補物質または被験物質がスフィンゴミエリン合成酵素の阻害活性を有する場合、該候補物質または被験物質がメタボリックシンドロームの処置、治療または予防に有効な物質（例えば、糖尿病薬、抗肥満薬、内臓脂肪減少薬、脂肪肝処置薬およびアディポネクチン発現上昇剤からなる群より選択される少なくとも１つの機能を有する物質）であると判定される方法を提供する。
【００４４】
この方法において、スフィンゴミエリン合成酵素の阻害活性の測定は、当該分野において公知または本明細書において説明する任意の手法によって実現することができる。たとえば、公知の方法としては、酵素だけを取り出してきてアッセイすることがあるが、これは実用的ではないことから、ラボレベルとしては、蛍光標識したセラミド（ＳＭＳの基質）を細胞に取り込ませ、細胞から粗脂質を抽出し、ＴＬＣで分離し、生成した蛍光ＳＭを定量する方法が利用され得る。あるいは、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のみを発現する細胞（例えば、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれか一方のみの遺伝子をノックアウトした細胞）、またはスフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞等の、本発明の再構成細胞を用いて、細胞死誘導剤を与え、細胞が死滅または増殖阻害が起こったかどうかを確認してもよい。
【００４５】
本発明では、スフィンゴミエリン合成酵素、特に、ＳＭＳ２が、ノックアウト動物を用いた実験によって、糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性症候群、耐糖能障害）、肥満（体重増加）、内臓脂肪増加、脂肪肝、アディポネクチンの発現減少に関連することが示された。したがって、スフィンゴミエリン合成酵素、特に、ＳＭＳ２を阻害することによって、メタボリックシンドローム、特に、糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性症候群、耐糖能障害）の改善、治療または予防、肥満処置または防止、体重減少または増加防止、内臓脂肪の減少または増加の防止、脂肪肝の処置または予防、アディポネクチンの発現上昇または低下の防止の効果を実現することが理解される。
【００４６】
理論に束縛されることを望まないが、ＳＭＳはスフィンゴミエリンを合成する際に等モル量のジアシルグリセリドを生成するが、本発明によりこのジアシルグリセロールは代表的な中性脂質であるトリグリセロール合成の原料となりうることが示された。具体的には、ＳＭＳ２遺伝子を欠損したマウスに高脂肪食を負荷した際の体重増加が、対照群に比べて有意に減少し、通常食を負荷した際の体重により近かったことが示された。したがって、理論に束縛されることを望まないが、ＳＭＳの活性を制御することでトリアシルグリセロールの合成量を制御することで、結果的に、糖尿病（特に、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性症候群、耐糖能障害）、肥満、内臓脂肪増加、脂肪肝等のメタボリックシンドロームを改善することができることが理解される。メタボリックシンドロームは本明細書において上記のように定義したとおりであるが、動脈硬化は血管の閉塞による種々症状が表れた状態（例えば狭心症、心筋梗塞、脳こうそくおよび糖尿病による網膜症および血管閉塞など）である。ＳＭＳ２のジアシルグリセロールとの関係でこれらをあえて区別するとしたら、ＳＭＳ２ＫＯによりジアシルグリセロールの産生阻害により肝臓でのトリアシルグリセロールの合成阻害が起こり、それにより脂肪肝、糖尿病、肥満等の発症が抑制されるということが考えられる。メタボリックシンドロームになった結果、それが原因で何年か後に動脈硬化になることも多いことから、「メタボリックシンドローム」には、動脈硬化一般が含まれるのではないが、上記メタボリックシンドローム（たとえば糖尿病、肥満など）により惹起される動脈硬化も含まれることが理解される。ここで、非特許文献４〜６等に記載される従来技術では、抗炎症作用により動脈硬化を抑制することを目的とされていたことから、メタボリックシンドロームに着目したのではなく、本発明は、このようにメタボリックシンドロームの抑制メカニズムとして、ジアシルグリセロールの産生阻害により肝臓でのトリアシルグリセロールの合成阻害を見出した点において顕著に異なるといえる。
また、ＳＭＳ２の遺伝子欠損マウス等の動物、およびそのマウスから単離／作製した細胞株を用いてメタボリックシンドローム改善効果を持つＳＭＳ２の阻害剤をスクリーニングすることができる。細胞を用いる場合は、実施例に例示され、下記に説明するように、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれか一方の遺伝子をノックアウトした細胞またはノックアウト細胞にさらに目的とするＳＭＳ２遺伝子を導入した細胞、またはスフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞等を用いて実現することができる。動物自体を使用する場合、例えば、マウスの場合では、野生型マウスに阻害剤を投与し、ノックマウスを陽性対照として同様の表現型が出るか比較して、実施することができる。
【００４７】
ＳＭＳの酵素は、ゴルジ体や細胞膜に６回貫通した複雑な構造をとっているため、現在のところ、酵素だけを取り出してきてアッセイすることは難しいとされている。本発明では、蛍光標識したセラミド（ＳＭＳの基質）を細胞に取り込ませ、細胞から粗脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などで分離し、生成した蛍光ＳＭを定量する工程を包含する方法が利用されうる。
【００４８】
１つの実施形態では、本発明において、阻害活性の測定は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のみを発現する細胞（スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれか一方の遺伝子のみをノックアウトした細胞）、またはスフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞等を用いて行うことができる。上述のような蛍光標識したセラミド（ＳＭＳの基質）を細胞に取り込ませる方法では、この手法はラボレベルでは簡便なのであるが、大規模に阻害剤をスクリーニングする際には、脂質抽出やＴＬＣで展開などといった操作があるので難しいとされていることから、このような細胞系を用いることが操作上有利であり、好ましい。この実施形態のように細胞を用いた場合は、増殖能に差が出ることから、たとえば増殖を計る試薬を加えて、プレートリーダーで阻害の有無を確認することができる。このように、従来技術と比べると「ハイスループット」であるという利点があり、大規模化も可能である。
【００４９】
１つの実施形態では、阻害活性の測定は、前記細胞に細胞死誘導剤（たとえば、メチルβシクロデキストリンのようなシクロデキストリン）を与え、前記候補物質が細胞増殖の遅延または細胞死を引き起こす場合、該候補物質が前記少なくとも１つの機能を有すると判定される。ここで、使用可能である細胞死誘導剤は、細胞膜のコレステロールと結合することにより細胞膜を破壊して細胞死を誘導するものであれば、どのようなものでもよく、シクロデキストリン類を用いることができる。αシクロデキストリン、メチルβシクロデキストリン等は、すでにＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２９，１７２５０−１７２５６，１９９５；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，４４，３４０２８−３４０３４；特開２００７−３３２１２８においてアッセイ系が開発されており、これらの文献に記載された手法を用いて本願発明を実施することができるが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明において用いられる細胞は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のみを発現する細胞であれば、どのような細胞を用いてもよい、そのような細胞を生産する原料細胞としては、例えば、ノックアウトすることができ、遺伝子導入することができる限り、どのような細胞でもあっても用いることができる。たとえば、幹細胞、繊維芽細胞のような未分化細胞でもよく、分化細胞でもよく、特に限定されない。１つの例としては、繊維芽細胞（たとえば、ＳＭＳ１，２を共に欠損したダブルノックアウトの胎児からマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）とも称される。）が用いられる。繊維芽細胞は、たとえば、新培養細胞実験法（羊土社）第４章  初代培養（１）線維芽細胞ｐ６６−７０を参酌することによって、調製することができる。あるいは、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のみを発現する細胞としては、ＳＭＳ１または２のみを欠損したマウスの胎児から採取した胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）とも称される。）などを用いることができる。そして、このようなノックアウト細胞を用いて、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれか一方の遺伝子をいずれかの一方の遺伝子をノックアウトした細胞を生産することができ、このような細胞は、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングするための細胞を生産することができることが理解される。
【００５１】
１つの実施形態では、使用する細胞は不死化していてもよい。不死化することにより、安定的にスクリーニングすることができるからである。不死化の手法としては、当該分野において公知の任意の手法を用いることができ、たとえば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．８５，ｐｐ．６４６０−６４６４，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９８８に記載されるようなＳＶ４０Ｔを用いる手法、新培養細胞実験法  羊土社、ｐ２７７に記載されるようなＨＰＶを用いる方法などを利用することができるがこれに限定されない。たとえば、プラスミドｐＭＦＧ−ＳＶ４０Ｔｓｔを安定的に保持した２９３Ｔ細胞の培養上清に出てきたレトロウイルスをＳＭＳ１，２を共に欠損したダブルノックアウトの胎児ＭＥＦに感染させＭＥＦを不死化することができる。
【００５２】
本発明において用いられるウイルス産生細胞としては、当該分野において公知のものが用いられる。たとえば、ＮＩＨ３Ｔ３  エコトロピック・プロデューサー細胞ΨＣＲＥ−ＭＦＧｔｓＴ（ＳＶ４０  Ｔ抗原発現ウイルス産生細胞；理化学研究所（http://www2.brc.riken.jp/lab/cell/detail.cgi?cell_no=RCB1119&type=1）から入手可能）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な各種ウイルス産生細胞を用いることができる。
【００５３】
１つの不死化の例としては、ΨＣＲＥ−ＭＦＧｔｓＴ細胞はＳＶ４０ｔｓＴを発現するレトロウイルスを培地中に放出し、マウス宿主細胞に感染する。このレトロウイルスを用いてＭＥＦにＳＶ４０ｔｓＴ遺伝子を導入することにより実現される。
【００５４】
本発明において使用する細胞の生産過程において、必要な場合、不死化した細胞のクローニングは、当該分野において公知の手法を用いて実現することができる。
【００５５】
本発明において、遺伝子導入は、当該分野において公知の任意の手法を用いることができ、たとえば、レトロウイルス、プラスミド、ベクター等を用いた手法、あるいは、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法、リン酸カルシウム法などにより行うことができるがこれに限定されない。たとえば、ＳＭＳ１、２発現ベクターはＲｅｔｒｏ−ＸＴＭ  Ｑ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｅｔ（クロンテック社）内のｐＱＣＸＩＰを用い、Ｒｅｔｒｏ−ＸＴＭ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（クロンテック社）を用いて産生／感染させることによって、達成することができる。
【００５６】
本発明が用いる細胞では、遺伝子導入する少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素は、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２またはＳＭＳ１およびＳＭＳ２の両方、あるいは、これらのホモログであってもよい。１つの実施形態では、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素はＳＭＳ２である。なお、実施例において示すように、ＳＭＳ２は、糖尿病薬（例えば、ＩＩ型糖尿病薬、インスリン抵抗性改善薬（インスリン抵抗性症候群、耐糖能障害等を改善する））、抗肥満薬、内臓脂肪減少薬、脂肪肝処置薬およびアディポネクチン発現上昇剤との関連がノックアウトマウスで実証されている。
【００５７】
１つの例示的実施形態では、細胞の生存率および増殖速度に関するアッセイは、非特許文献１に記載されるようにして行うことができる。具体的には、１×１０６個のＭＥＦ細胞を洗浄し、１ｍｌの無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地中に再懸濁させ、適切な濃度のＭｅβＣＤで処理し、そして、５％  ＣＯ２、３７℃にて５分間培養する。２ｍｌの通常培地を加えた後、細胞をさらに１２時間培養する。たとえば、細胞内脱水素酵素により還元され、水溶性のホルマザンを生成する物質であるＷＳＴ−８含む生細胞数測定試薬（ナカライテスク社）を用いて細胞の生存率を測定することができる。
【００５８】
この例示的実施形態では、以下のような結果となることが理解される。
【００５９】
【表１Ａ】
2011036878.tif 000002
【００６０】
上記の表に示すように、ＳＭＳ１，２を両方発現した細胞（ＳＭＳ１（＋／＋）かつＳＭＳ２（＋／＋））を死滅させるかまたは細胞増殖を遅延させ、ＳＭＳ２のみを発現した細胞（ＳＭＳ１（−／−）かつＳＭＳ２（＋／＋））およびＳＭＳ１のみを発現した細胞（ＳＭＳ１（＋／＋）かつＳＭＳ２（−／−））を死滅させる試験化合物は、ＳＭＳｓ阻害剤の候補であり、ＳＭＳ１，２のみを発現した細胞およびＳＭＳ１細胞は生存可能とするが、ＳＭＳ２のみを発現した細胞は死滅させる試験化合物は、ＳＭＳ２選択的阻害剤の候補であり、ＳＭＳ１，２を発現した細胞およびＳＭＳ２のみを発現した細胞は生存可能とするが、ＳＭＳ１のみを発現した細胞は死滅させる試験化合物は、ＳＭＳ１選択的阻害剤の候補であると判定することができる。
【００６１】
（医薬スクリーニングキット）
別の局面において、本発明は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のみを発現する細胞を含む、糖尿病薬（例えば、ＩＩ型糖尿病薬、インスリン抵抗性改善薬（インスリン抵抗性症候群、耐糖能障害等を改善する））、抗肥満薬、内臓脂肪減少薬、脂肪肝処置薬およびアディポネクチン発現上昇剤からなる群より選択される少なくとも１つの機能を有する薬をスクリーニングするためのキットを提供する。あるいは、本発明は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞を含む、糖尿病薬（例えば、ＩＩ型糖尿病薬、インスリン抵抗性改善薬（インスリン抵抗性症候群、耐糖能障害等を改善する））、抗肥満薬、内臓脂肪減少薬、脂肪肝処置薬およびアディポネクチン発現上昇剤からなる群より選択される少なくとも１つの機能を有する薬をスクリーニングするためのキットを提供する。このキットは、従来の蛍光標識したセラミド（ＳＭＳの基質）を細胞に取り込ませる方法において、大規模に阻害剤をスクリーニングする際には、脂質抽出やＴＬＣで展開などといった操作があるので難しいとされていたという課題を解決し大規模化に適用可能という点で好ましい。この実施形態のように細胞を用いた場合は、増殖能に差が出ることから、たとえば増殖を計る試薬を加えて、プレートリーダーで阻害の有無を確認することができる。このように、従来技術と比べると「ハイスループット」であるという利点がある。そして、本キットにおいて使用される細胞は、本明細書において（医薬探索方法）の節において説明した任意の実施形態を採用することができる。
【００６２】
１つの実施形態では、本発明のキットは、シクロデキストリン（たとえば、メチルβシクロデキストリン）などの細胞死誘導剤とともに提供されてもよい。
【００６３】
本発明のキットは、その使用方法を明示した指示書が添付されていてもよい。本明細書において「指示書」は、本発明のスクリーニング方法などを利用者に対して記載したものである。この指示書は、本発明の細胞などを例えば、どのように候補物質または被験物質（たとえば、有機低分子のライブラリー）に暴露し、どのように、細胞死誘導剤を導入して細胞死または成長鈍化を測定し、評価するべきかを指示する文言が記載されている。この指示書は、必要に応じて、本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００６４】
また、指示書には、（医薬探索方法）の節において説明したような、判定方法に関する説明がなされていてもよい。
【００６５】
（細胞）
別の局面において、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２の少なくともいずれかの一方の遺伝子をノックアウトした細胞を提供する。このような細胞は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれか一方の遺伝子のみをノックアウトした細胞でありうる。このスフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２の少なくともいずれかの一方の遺伝子をノックアウトした細胞は、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングするために使用されうる。したがって、本発明では、このようなスフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２の少なくともいずれかの一方の遺伝子（例えば、ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれか一方の遺伝子のみ）をノックアウトした、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングするための細胞が提供される。あるいは、本発明は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞を提供する。したがって、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２の少なくともいずれかの一方の遺伝子をノックアウトした細胞は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞であってもよい。本発明の細胞は、本明細書において（医薬探索方法）の節において説明した任意の実施形態を採用することができる。
【００６６】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、糖鎖科学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ，１０１５８（２０００）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３０、２４２、２４７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００６７】
本発明で使用される培養方法は、例えば、動物培養細胞マニュアル、瀬野ら編著、共立出版、１９９３年などに記載され支持されており、本明細書においてこのすべての記載を援用する。
【００６８】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例で用いた動物の取り扱いは、北海道大学において規定される基準を遵守した。【００７０】
使用した略語は以下のとおりである。
ＳＭＳ：スフィンゴミエリン合成酵素
ＳＭＳ１、ＳＭＳ２：遺伝子名
ＫＯ：ノックアウト
ｗＫＯ：ダブルノックアウト
ＭＥＦ：マウス胚性繊維芽細胞
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地
ＴＧ：トリグリセリド
ＳＭ：スフィンゴミエリン
ＭｅβＣＤ：メチルβシクロデキストリン
ＨＦＤ：高脂肪食
ＮＤ：通常食
ＷＡＴ：白色脂肪細胞量
ＷＴ：野生型【００７１】
（実施例１：ＳＭＳ２の抑制による肝臓への中性脂肪蓄積の抑制）
１）ＳＭＳｓノックアウトマウスの作製
マウスのＳＭＳはこれまでに、発現クローニング法によって単離されたＳＭＳ１と、そのホモログとして同定されたＳＭＳ２、ＳＭＳｒの３つのアイソフォームが見つかっている。ＳＭＳ１ノックアウト（ＳＭＳ１−ＫＯ）マウス、ＳＭＳ２ノックアウト（ＳＭＳ２−ＫＯ）マウスはともに、図１に示すターゲティングベクターを用いて、一般的なノックアウトマウス作製方法に則してエキソン１を欠損させて、作製した。【００７２】
２）体重に対する６０％脂肪食投与の影響の検討
４週齢の雄の野生型マウス（ＷＴ；Ｃ５７ＢＬ６）とＳＭＳ２−ＫＯマウスにそれぞれ高脂肪食（ＨＦＤ；５８Ｙ１，ｔｅｓｔＤｉｅｔ社）と対照通常食（ＮＤ；ＡＩＮ７６Ａ，ｔｅｓｔＤｉｅｔ社）を投与し、その後の体重変動を９週に渡って計測した。その結果、図２に示すように、ＳＭＳ２  ＫＯマウスにＨＦＤを付加した場合、ＷＴに同様のＨＦＤを投与した場合と比較して、体重増加が有意に抑えられた。【００７３】
３）白色脂肪細胞量（ＷＡＴ）に対する６０％脂肪食投与の影響の検討
２）と同様にＨＦＤを投与したＷＴとＳＭＳ２  ＫＯマウス（１２週後）を開腹し、精巣上体に付着した脂肪を採取しその重量を計測した。その結果、図３に示すように、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤでは、白色脂肪細胞量（ＷＡＴ）に減少傾向は見られるものの有意な差ではなかった。図には示さないが、対照通常食（ＮＤ）を並行して与えた同様の実験も行っており、ＷＴ／ＨＦＤ群に比べてＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群では白色脂肪細胞量（ＷＡＴ）が減少していた。一方、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群とＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ群との間には有意差は見られなかったことがわかっている。【００７４】
４）肝トリグリセリド量に対する６０％脂肪食投与の影響の検討
２）と同様にＨＦＤを投与したＷＴとＳＭＳ２  ＫＯマウス（１２週後）を開腹し、肝臓を採取した。肝ホモジネート中のトリグリセリドをＴｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  Ｑｕａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社）にて定量した。方法はキットの説明書に従った。ホモジネート中の蛋白質量をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて定量し、トリグリセリド量の補正に用いた。その結果、図４に示すように、ＷＴ／ＨＦＤ群に比べてＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群では有意にトリグリセリド量が減少していた。【００７５】
さらに、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）および対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、肝ホモジネート中のトリグリセリド量（ｍｇ／ｍｇタンパク質）の比較をした結果を図４Ａに示す。その結果、図４Ａに示すように、ＷＴ／ＨＦＤ群（左）に比べてＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群（右）では有意にトリグリセリド量が減少していた。一方、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群とＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ群との間には有意差は見られなかった。【００７６】
５）アディポネクチン量に対する６０％脂肪食投与の影響の検討
２）と同様にＨＦＤを投与したＷＴとＳＭＳ２  ＫＯマウス（１２週後）を開腹し、精巣上体に付着した脂肪を採取しｍＲＮＡを抽出し、ＱＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  ＴＰ８００，タカラバイオ社）によってアディポネクチンのｍＲＮＡ発現量を計測した。その際に同サンプル中のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正を行った。試薬は、第１鎖ｃＤＮＡ合成には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を、ＱＰＣＲには、ＳＹＢＲ  ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＩＩ（タカラバイオ社）を用いた。ＰＣＲプライマーは、
フォワード（Ｆｗ）プライマー：ＧＴＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＣＡＡ（配列番号１）；
リバース（Ｒｖ）プライマー：ＡＴＧＣＣＴＧＣＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧ（配列番号２）
を用いた。【００７７】
その結果、図５に示すように、ＷＴ／ＨＦＤではアディポネクチンの発現が抑制されているが、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤでは、比較的高い発現量が維持されていた。さらに、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）および対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、アディポネクチンの相対的な発現量の比較をした。その結果、図５Ａに示すように、ＷＴ群では、高脂肪食を付与することにより、アディポネクチンの発現が抑制されるが、ＳＭＳ２  ＫＯ群では、高脂肪食を付与しても、比較的高い発現量が維持されていた。【００７８】
以上の結果から、ＳＭＳ２の阻害によって、肝臓への中性脂肪の蓄積が抑えられる可能性があることが分かった。【００７９】
６）インスリン抵抗性に関する実験
６−１）インスリン受容体の発現分析
次にＷＴおよびＳＭＳ２ＫＯマウスでの脂肪組織におけるインスリン受容体のｍＲＮＡの発現量を定量的ＰＣＲにて分析した。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）および対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに投与した際のインスリン受容体の相対的な発現量を調べた。使用したプライマー配列とコントロールプライマー配列を示す。定量的ＰＣＲは、５）に記載のものと同様の手法で行った。
インスリン受容体（ＩＲ）
フォワード（Ｆｗ）：ＣＡＧＣＴＣＧＡＡＡＣＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧ（配列番号３）
リバース（Ｒｖ）：ＧＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＡＣＡＧＧＡＡ（配列番号４）【００８０】
結果を図５Ｂ−１に示す。図５Ｂ−１に示すように、野生型のマウスでは、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を与えるとインスリン受容体の発現量が低下するけれども、ＳＭＳ２―ＫＯマウスでは高脂肪食によるインスリン受容体の発現低下はおこっておらず、対照通常食を与えた場合とほぼ同程度の発現量であった。また、ＳＭＳ２―ＫＯマウスに対して高脂肪食を投与した場合のインスリン受容体の発現量は、野生型のマウスに対して高脂肪食を投与した場合と比較して有意に高かった。【００８１】
以上から、ＳＭＳ２―ＫＯマウスでは野生型にみられるようなＨＦＤによるインスリン受容体の発現低下はおこっておらず、ＮＤとほぼ同程度の発現量であった。以上の結果からＳＭＳ２―ＫＯマウスの脂肪組織において、ＷＴでみられるようなＨＦＤによるインスリン受容体の発現低下がおこっておらず、インスリン抵抗性にはなっていないことが示唆された（図５Ｂ−１）。【００８２】
６−２）Ｇｌｕｔ４の発現分析
次に、脂肪組織におけるＧｌｕｔ４に対する６０％脂肪食投与の影響を検討し、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）および対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに投与した際のＧｌｕｔ４の相対的な発現量の比較した。使用したプライマー配列とコントロールプライマー配列を示す。
ＧＬＵＴ４：  
フォワード（Ｆｗ）：ＣＴＧＴＡＡＣＴＴＣＡＴＴＧＴＣＧＧＣＡＴＧＧ（配列番号５）
リバース（Ｒｖ）：ＡＧＧＣＡＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＧＴＣＡＡＡＣ（配列番号６）
内在性コントロール遺伝子であるヒポキサン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）：
フォワード（Ｆｗ）：ＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＣＴＴＧＡＣＴＡ（配列番号７）
リバース（Ｒｖ）：ＡＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＡＣＴＡ（配列番号８）【００８３】
その結果を図５Ｂ−２に表す。図５Ｂ−２から明らかなように、野生型のマウスでは、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を与えるとＧｌｕｔ４の発現量が低下するけれども、ＳＭＳ２―ＫＯマウスでは高脂肪食によるＧｌｕｔ４の発現低下については抑制が抑えられており、対照通常食を与えた場合とほぼ同程度の発現量であった。また、ＳＭＳ２―ＫＯマウスに対して高脂肪食を投与した場合のＧｌｕｔ４の発現量は、野生型のマウスに対して高脂肪食を投与した場合と比較して有意に高かった。以上の結果から、ＳＭＳ２―ＫＯマウスの脂肪組織において、野生型のマウスでみられるような高脂肪食によるＧｌｕｔ４の発現低下がおこっておらず、インスリン抵抗性にはなっていないことが示唆された。【００８４】
６−３）耐糖能試験
上記「２）体重に対する６０％脂肪食投与の影響の検討」において記載される対照通常食（ＮＤ）または高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を野生型（ＷＴ）またはＳＭＳ２ＫＯマウスに投与し、さらに９週間成育させたマウスを用いて耐糖能試験を行った。２４時間絶食させた当該マウスの腹腔内に２ｇ／ｋｇのグルコースを投与し、投与直前、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に血糖値を尾静脈からの採血により測定した。測定にはグルコメーターを使用した。その結果、高脂肪食を投与した野生型およびＳＭＳ２―ＫＯマウス間において１２０分の時点で、ＳＭＳ２―ＫＯマウスで有意に血糖値が低下することが判明した（Ｐ＜０．０５；図５Ｃ）。この耐糖能試験のグラフのグラフ下の面積を比較したところ（ＧＴＴ  ＡＵＣ；図５Ｄ）、高脂肪食を投与した野生型およびＳＭＳ２―ＫＯマウス間において、ＳＭＳ２―ＫＯマウスで有意に面積（ＡＵＣ）が低下していた（Ｐ＜０．０５）。【００８５】
図５Ｄには、図５Ｃのグラフの下の面積（ＡＵＣ）を棒グラフで表したものであるが、このように表現しても、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群はＷＴ／ＨＦＤ群に比べて有意に血糖値が低下していることが理解できる。【００８６】
以上の結果から、グルコース負荷にたいして有意に感受性になっていることが確認できた。【００８７】
次に血漿インスリン量を測定した。野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに通常食を８週齢の時点から４週間投与した後、２４時間絶食させ、その後通常食を投与し、２４時間絶食時および通常食投与後１時間経過時の血中インスリン濃度を測定した。その結果を図５Ｅに示す。図５Ｅから明らかなように、野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスの間において、２４時間の絶食時および通常食投与後１時間経過時いずれにおいても血中グルコース濃度に有意差は見られなかった。したがって、野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスの両者で血中インスリン濃度および応答性に有意差は認められなかったといえる。以上の結果よりＳＭＳ２―ＫＯマウスのインスリン産生能およびグルコースによる応答性に異常がないことが確認でき、したがって膵臓β細胞の異常は認められなかった。【００８８】
次に、血糖値に対する高脂肪食の影響を検討した。４週齢の野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに２週間高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を投与し、高脂肪食投与前に４時間絶食させたときおよび２週間高脂肪食を投与した後に４時間絶食させて血糖値を測定した。図５Ｆに示されるように、高脂肪食を投与する前には、野生型のマウスとＳＭＳ２−ＫＯマウス間において、血糖値に有意差は見られないけれども、高脂肪食を２週間投与した後は、野生型のマウスの血糖値は、ＳＭＳ２−ＫＯマウスと比較して有意に高かった。【００８９】
次に、血中インスリン量に対する高脂肪食の影響を検討した。野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を２週間投与した後、４時間絶食させ、血中インスリン量を測定した。その結果、図５Ｇに示されるように、ＳＭＳ２−ＫＯマウスでは、野生型のマウスと比較して、有意差をもって、血中インスリン量が低下していた。【００９０】
次に、インスリンに対する血中グルコース濃度を検討した。４週齢の野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに６週間高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を投与し、腹腔内にインスリンを０．５Ｕ／ｋｇで投与し、投与前および投与後１５、３０、６０、９０、１２０分での血中グルコース濃度を測定した結果を図５Ｈ−１示す。図５Ｈ−１に示されるように、特に、投与後３０、６０、９０分後には、ＳＭＳ２−ＫＯマウスは、野生型のマウスと比較して、有意に血中グルコース濃度が低下していたので、ＳＭＳ２ＫＯマウスはインスリンに対して感受性であることが明らかとなった。【００９１】
また、図５Ｈ−１のグラフの下の面積（ＡＵＣ）を棒グラフで表す図５Ｈ−２からも明らかなように、ＳＭＳ２−ＫＯマウスにおいては、野生型のマウスと比較して、２０％程度減少していたので、インスリンに対して感受性であることが明らかになった。【００９２】
ＳＭＳ２―ＫＯマウスではＷＴと比較して、血漿インスリン量が有意に低下していた。したがってＳＭＳ２ＫＯマウスではインスリン抵抗性になっていないことが実証された。したがってＳＭＳ２―ＫＯマウスではインスリンに対して感受性であり、野生型のマウスのようにインスリン抵抗性が惹起されていなかった。（特に、図５Ｅ、図５Ｆおよび図５Ｇ参照）。【００９３】
以上の結果から、ＳＭＳ２の阻害によって、糖尿病の治療、特にインスリン抵抗性を改善することができる可能性があることが分かった。【００９４】
（実施例２：ＳＭＳｓ再構成細胞の作製）
１）不死化ＭＥＦ細胞の作製
新培養細胞実験法（羊土社）第４章  初代培養  線維芽細胞  ｐ．６６−７０に記載されるようにして、実施例１において作製したＳＭＳ１−ＫＯマウスとＳＭＳ２−ＫＯマウスとを交配させて得た、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２を共に欠損したダブルノックアウト（ＳＭＳ１，２−ｗＫＯ）の胎児からＭＥＦ（マウス胚性線維芽細胞）を単離した。ｐＭＦＧ−ＳＶ４０Ｔｓｔを安定的に保持した２９３Ｔ細胞の培養上清に放出されたレトロウイルスをこのＭＥＦに感染させて、ＭＥＦを不死化した。【００９５】
ａ）ウイルス液の調製
ウイルス産生細胞としてＮＩＨ３Ｔ３エコトロピック・プロデューサー細胞  ΨＣＲＥ−ＭＦＧｔｓＴ（ＲＣＢ１１１９；ＳＶ４０  Ｔ抗原発現ウイルス産生細胞；http://www2.brc.riken.jp/lab/cell/detail.cgi?cell_no=RCB1119&type=1を参照のこと）を使用した。ΨＣＲＥ−ＭＦＧｔｓＴ細胞は、ＳＶ４０ｔｓＴを発現するレトロウイルスを培地中に放出し、マウス宿主細胞に感染する。サブコンフルエントのΨＣＲＥ−ＭＦＧｔｓＴ細胞を１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、上清をウイルス液として回収し、０．２０ｍｍシリンジフィルター（ＣＯＲＮＩＮＧから入手可能）で濾過した。【００９６】
ｂ）ウイルス感染および細胞株のクローニング
ＭＥＦの培養物において、１０％  ＦＢＳ、ウイルス原液１ｍＬを含むＤＭＥＭ  ５ｍＬで培地を置換し、３４℃、５％  ＣＯ２の条件下で２４時間培養してウイルスに感染させた後、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ  ５ｍＬを加えてさらに一晩培養した。翌日、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ  １０ｍＬに培地交換した。２〜３日ごとに培地を交換し、ＭＥＦの不死化細胞株を樹立し、さらに不死化したＭＥＦからいくつかの細胞株をクローニングし、その一つをＺＳ２と命名した。【００９７】
２）ＳＭＳ１およびＳＭＳ２を過剰発現した不死化ＭＥＦ細胞の作製
ｐＱＣＸＩＰ（クロンテック社）に、Ｃ末端にＶ５タグを付加したＳＭＳ１およびＳＭＳ２を組み込み、レトロウイルスベクターを作製した。このプラスミドとＧＰ２−２９３細胞（クロンテック社）を用いて、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２をそれぞれ発現するレトロウイルスを作製し、クロンテック社の説明書に従って、１）でクローニングした細胞株の一つＺＳ２細胞に感染させた。４μｇ／ｍｌのピューロマイシンで非感染細胞を除き、ＳＭＳ１を過剰発現した細胞ＺＳ２／ＳＭＳ１、およびＳＭＳ２を過剰発現した細胞株ＺＳ２／ＳＭＳ２を得た。これら３つの細胞株について、抗Ｖ５  ｍａｂ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体を用いてウエスタンブロティングを行った。ＳＭＳ１およびＳＭＳ２を発現させた細胞では、図６に示すように、抗Ｖ５  ｍａｂで検出されるＳＭＳ１、ＳＭＳ２のバンドがそれぞれ確認された。【００９８】
（実施例３：ＺＳ２、ＺＳ２／ＳＭＳ１およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞の機能の検討）
実施例２で作製したＺＳ２、ＺＳ２／ＳＭＳ１およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞の機能、特に、ＳＭＳ活性およびＴＧ合成について検討した。【００９９】
１）ＳＭＳ活性
実施例２で作製した細胞（２×１０５細胞／ウェル）を各々６ウェルプレートに播き、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で一晩培養した後、血清を含まないＤＭＥＭに培地を交換し、最終濃度が１μＭとなるように調製したＢＯＤＩＰＹ−Ｃ５−セラミド（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ社）を加えて、３７℃で３０分間反応させた。ピペッティングで細胞を剥がした後、１００μｌの溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１×ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ社）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で溶解させ、タンパク量をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ社）で測定した。溶解液からＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法で脂質を抽出し、ＨＰＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて、ＢＯＤＩＰＹ−セラミドと生成したＢＯＤＩＰＹ−Ｃ５−スフィンゴミエリンを、Ｆｌａ７０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ）で定量し、ＳＭＳ活性を算出した。ＳＭＳ活性は蛋白質量で補正した。図７に示すように、ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞がＳＭＳ活性を有していたのに対し、ＺＳ２細胞はＳＭＳ活性がなかった。【０１００】
２）ＴＧ合成
実施例２で作製した細胞（２×１０５細胞／プレート）を６ウェルプレートに播き、ＤＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ中で一晩培養後、血清を含まないＤＭＥＭに培地を交換し、最終濃度が１μＣｉの［１４Ｃ］オレイン酸（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を加えて、３７℃で３０分間反応させた。ピペッティングで細胞を剥がした後、１００μｌの溶解バッファー（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１×ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ社）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で溶解させ、蛋白量をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ社）で測定した。溶解液からＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法で脂質を抽出し、ＨＰＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて［１４Ｃ］オレイン酸と、生成した［１４Ｃ］オレイン酸−トリグリセリドを、Ｆｌａ７０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ）で定量し、ＴＧ量を算出した。図８に示すように、ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞におけるＴＧ量と、ＺＳ２細胞におけるＴＧ量との間には有意差があった（各々、ｐ＜０．００５およびｐ＜０．０２）。【０１０１】
（実施例４：ＳＭＳ１，２−ｗＫＯマウス由来のＭＥＦを用いたＳＭＳ阻害剤探索法の開発）
ＳＭ量が低下した細胞では、シクロデキストリンにより細胞死を誘導することができる（Ｙａｍａｏｋａら、上掲、図２Ｄを参照）ことから、ＭｅＣＤの存在下でＺＳ２／ＳＭＳ１，２細胞、ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞およびＺＳ２／ＳＭＳ１細胞を培養し、この培養物に各種試験化合物を添加して、細胞の生存率および増殖速度に関するアッセイを行うことで、ＳＭＳ阻害剤を探索することができると考えられる。【０１０２】
細胞の生存率および増殖速度に関するアッセイは、非特許文献１に記載されるようにして行う。具体的には、１×１０６個のＭＥＦ細胞を洗浄し、１ｍｌの無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地中に再懸濁させ、適切な濃度のＭｅβＣＤで処理し、そして、５％  ＣＯ２、３７℃にて５分間培養する。各種化合物を含有する２ｍｌの通常培地を加えた後、細胞をさらに１２時間培養する。ＷＳＴ−８を含む生細胞数測定試薬（ナカライテスク社）を用いて細胞の生存率を測定することができる。【０１０３】
あるいは、別の方法を実施することができる。本実施例では、４８ウエルプレートデッシュに評価する細胞５０００個／０．２ｍｌ／ウエルで撒いた。細胞培養は０．３％ＦＣＳ／ＯＰＴＩＰＲＯ  ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ）を用いた。２４時間後に、ＭｅｂＣＤを最終濃度０〜７ｍＭになるように添加し、さらに５％  ＣＯ２，３７℃にて１６時間培養した。ＷＳＴ８を含む生細胞数測定試薬（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を１０μＬ／ウエルで添加し、さらに１〜６時間５％  ＣＯ２，３７℃にて培養した。生細胞数はプロトコル通りに測定した。【０１０４】
【表１Ｂ】
2011036878.tif 000003
【０１０５】
上記の表に示すように、ＺＳ２／ＳＭＳ１，２細胞（ＳＭＳ１（＋／＋）かつＳＭＳ２（＋／＋））を死滅させるかまたは細胞増殖を遅延させ、ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞（ＳＭＳ１（−／−）かつＳＭＳ２（＋／＋））およびＺＳ２／ＳＭＳ１細胞（ＳＭＳ１（＋／＋）かつＳＭＳ２（−／−））を死滅させる試験化合物は、ＳＭＳｓ阻害剤の候補であり、ＺＳ２／ＳＭＳ１，２細胞およびＺＳ２／ＳＭＳ１細胞は生存可能とするが、ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞は死滅させる試験化合物は、ＳＭＳ２選択的阻害剤の候補であり、ＺＳ２／ＳＭＳ１，２細胞およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞は生存可能とするが、ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞は死滅させる試験化合物は、ＳＭＳ１選択的阻害剤の候補である。【０１０６】
（実施例５：ＳＭＳ１，２−ｗＫＯマウス由来のＭＥＦを用いたＳＭＳ阻害剤探索法の確認）
ＳＭの前駆体の合成を阻害し、結果的に細胞のＳＭ量を減少させることが知られているｍｙｒｉｏｃｉｎ（ＩＳＰ−１；Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＬ−２２６）を用いて、実施例４の探索法が機能するかどうかを確認する。【０１０７】
１×１０６個のＭＥＦ細胞を洗浄し、１ｍｌの無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地中に再懸濁させ、適切な濃度のＭｅβＣＤで処理し、そして、５％  ＣＯ２、３７℃にて５分間培養する。ｍｙｒｉｏｃｉｎを含有する２ｍｌの通常培地を加えた後、細胞をさらに１２時間培養する。ＷＳＴ−８を含む生細胞数測定試薬（ナカライテスク社）を用いて細胞の生存率を測定する。【０１０８】
より詳細には、４８ウエルプレートデッシュに実施例２において作製したＺＳ２／ＳＭＳ２細胞５０００個／０．２ｍｌ／ウエルで撒く（Ｎ＝３）。細胞培養は０．３％ＦＣＳ／ＯＰＴＩＰＲＯ  ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ）を用いた。この際Ｍｙｒｉｏｃｉｎ（最終濃度５μＭ）を添加、あるいはＭｙｒｉｏｃｉｎ＋セラミド（１０μＭ）またはＭｙｒｉｏｃｉｎ＋スフィンゴミエリン（１５μＭ）を添加した。２４時間後に、ＭｅｂＣＤを最終濃度２ｍＭになるように添加し、さらに５％  ＣＯ２，３７℃にて１６時間培養する。ＷＳＴ８を含む生細胞数測定試薬（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を１０μＬ／ウエルで添加し、さらに１時間５％  ＣＯ２，３７℃にて培養した（ＷＳＴアッセイ）。生細胞数はプロトコル通りに測定した。結果を図９に示す。なお、Ｙ軸は、ＭｅβＣＤを入れないときについて、Ｍｙｒｉｏｃｉｎありなしの場合の平均値を１００％とした数値である（なお、Ｍｙｒｉｏｃｉｎありなしでは有意差がなく、これらの平均を１００％とした。結果を図９に示す。【０１０９】
図９に示されるように、この細胞にＭｙｒｉｏｃｉｎを加えると生存率に有意差が見られるけれども（左端の２つ）、培地にセラミド（Ｃｅｒ）またはスフィンゴミエリン（ＳＭ）を添加すると、Ｍｙｒｉｏｃｉｎによる生存率に有意差が見られなくなるので、Ｍｙｒｉｏｃｉｎによるスフィンゴミエリンの減少によりＭｅβＣＤ感受性が上昇していることが確認された。【０１１０】
その結果ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞は２ｍＭのＭｅｂＣＤ添加により細胞増殖が約５０％に低下し、さらにＭｙｒｉｏｃｉｎ（２ｍＭ）の添加により、細胞増殖が約２０％まで低下した。この際ＣｅｒａｍｉｄｅまたはＳＭを添加しておくと、Ｍｙｒｉｏｃｉｎによって惹起される細胞増殖抑制効果をほぼ完全に抑制し、生細胞数はＭｙｒｉｏｃｉｎ未添加の生細胞数までもどった（有意差検定はすべてＰ＜０．０１）。以上の結果よりこの系でＭｙｒｉｏｃｉｎなどのＳＭ合成経路の阻害剤により、生細胞数が減少することが示され、またこの効果は培地にＣｅｒａｍｉｄｅまたはＳＭを添加することで元に戻ることから、ＳＭの合成阻害により細胞死が惹起されていることが証明された。したがってこの系を用いると、一連のＳＭ合成経路に関連する酵素の阻害剤が細胞死を指標に単離できることが示された。【０１１１】
このように、実施例４の探索法は、ＳＭＳ阻害剤の有用な探索法であることがわかる。【０１１２】
次にこの探索系を用いて実施例４に記載したような効果が得られるか、つまりＭｅβＣＤは、ＺＳ２細胞には細胞死を誘導するが、ＳＭＳを遺伝子導入したＺＳ２細胞には細胞死を誘導しないことを示す。【０１１３】
４８ウエルプレートデッシュにＺＳ２，ＺＳ２／ＳＭＳ１，２またはＺＳ２／ＳＭＳ１またはＺＳ２／ＳＭＳ２細胞を５０００個／０．２ｍｌ／ウエルになるように撒く（Ｎ＝３）。細胞培養は０．３％ＦＣＳ／ＯＰＴＩＰＲＯ  ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ）を用いる。２４時間後に、ＭｅｂＣＤを最終濃度５ｍＭになるように添加し、さらに５％  ＣＯ２，３７℃にて１６時間培養する。ＷＳＴ８を含む生細胞数測定試薬（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を１０μＬ／ウエルで添加し、さらに６時間５％  ＣＯ２，３７℃にて培養する。生細胞数はプロトコル通りに測定する。【０１１４】
その結果ＺＳ２細胞と比較し、ＺＳ２／ＳＭＳ１，２，ＺＳ２／ＳＭＳ１及びＺＳ２／ＳＭＳ２のいずれの細胞も７０％〜９０％細胞増殖が亢進しており、ＭｅｂＣＤによって惹起される細胞死に耐性になっていることが証明された（有意差検定はすべてＰ＜０．０１）（図１０〜１２）。図１０には、ＺＳ２／ＳＭＳ１，２  とＺＳ２細胞との対比を示し、図１１には、ＺＳ２／ＳＭＳ２  とＺＳ２細胞との対比を示し、図１２には、ＺＳ２／ＳＭＳ１  とＺＳ２細胞との対比を示す。【０１１５】
次にＳＭＳ１またはＳＭＳ２特異的阻害剤が実際このスクリーニング系で単離可能か否かを検証する。具体的にはＳＭＳｓ特異的阻害剤を各ＳＭＳｓに対するｓｉＲＮＡで代用し、上記ＭｅｂＣＤ感受性試験を行い、各ｓｉＲＮＡがそのＳＭＳｓのみをノックダウンした場合にのみ細胞死を惹起できることを確認することで、特異的阻害剤が単離できることを証明する。【０１１６】
用いるＳＭＳ１またはＳＭＳ２に対する２本鎖ｓｉＲＮＡの配列情報を列記する。
マウスＳＭＳ１に対する特異的ｓｉＲＮＡ  ＳＭＳ１−ｉ４の対応するセンス鎖ＤＮＡ配列
５’−ｇｇａａｔｔｇｔａｃｃｔｃｇａｔｃｔｔａ−３’（配列番号９）
マウスＳＭＳ２に対する特異的ｓｉＲＮＡ  ＳＭＳ２−ｉ１１に対応するセンス鎖ＤＮＡ配列
５’−ｇｇｃｔｃｔｔｃｔｇｃｇｔｔａｃａａ−３’（配列番号１０）【０１１７】
コントロールとして使用したｓｉＲＮＡ  ＣＴＲ−ｉに対応するセンス鎖ＤＮＡ配列
５’−ｔｔｃｔｃｃｇａａｃｇｔｇｔｃａｃｇｔ−３’（配列番号１１）【０１１８】
マウスＧ３ＰＤＨ，  ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のｍＲＮＡを定量的ＰＣＲにより検出するために使用する各種プライマー配列。
Ｇ３ＰＤＨ
フォワード（Ｆｗ）：５’−ｃａａｃｔｃｃｃａｃｔｃｔｔｃｃａｃｃｔｔｃ−３’（配列番号１２）
リバース（Ｒｖ）：５’−ｃｔｔａｃｔｃｃｔｔｇｇａｇｇｃｃａｔｇｔａｇ−３’（配列番号１３）
ＳＭＳ１
フォワード（Ｆｗ）：５’−ｔａｃａｃｔｇｔｇｇａｃｇｔｇｇｔｇｇ  −３’（配列番号１４）
リバース（Ｒｖ）：５’−ｇｇｇｃｃａａｔｇｇｔａａｇａｔｃｇａ  −３’（配列番号１５）
ＳＭＳ２
フォワード（Ｆｗ）：５’−ｔｃａａｔｇｇａｇａｃｔｃｔｃａｇｇｃ  −３’（配列番号１６）
リバース（Ｒｖ）：５’−  ｃｃｇｃｔｇａａｇａｇｇａａｇｔｃｔｃ−３’（配列番号１７）【０１１９】
マウス肝実質細胞株であるＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞（ＡＴＣＣ）及びＺＳ２／ＳＭＳ１又はＺＳ２／ＳＭＳ２細胞を用いてｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性を評価した。１２ウエルデッシュに１ｘ１０４個の細胞を撒き、２４時間後に市販の形質転換試薬であるＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、業者のプロトコルに従い形質転換を行った。ｓｉＲＮＡは最終濃度１００ｎＭで行った。４８時間後に細胞を０．５ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で溶解し、プロトコルにしたがいＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡへの逆転写は市販のキットであるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて定法通り行った。定量的ＰＣＲは上記プライマーを使用し、市販のキット（ＡＢＩ社）を用いて行った。【０１２０】
その結果ＳＭＳ１に対するｓｉＲＮＡであるＳＭＳ１−ｉ４により、ＳＭＳ１の発現は９０％以上ノックダウンされていた（図１３）。同様にＳＭＳ２に対するｓｉＲＮＡであるＳＭＳ２−ｉ１１により、ＳＭＳ２の発現も９０％以上ノックダウンされていた（図１４）。さらにＺＳ２／ＳＭＳ２細胞を用いた場合にも、同様の方法により、ＳＭＳ２  の発現は８０％程度ノックダウンされることを確認した（図１５）。図１３〜図１５は、すべて内在性コントロールとしてＧ３ＰＤＨの発現量をもとに、サンプル間のcDNA量を補正した場合の発現量比較のデータを示している。なお、図１３においてはＳＭＳ２の発現が抑制されていないことを確認しており、図１４においてはＳＭＳ１の発現が抑制されていないことを確認しているので、ｍＲＮＡレベルでの特異性についても確認している。【０１２１】
６ウエルデッシュにＺＳ２／ＳＭＳ１またはＺＳ２／ＳＭＳ２細胞２ｘ１０ｅ５個を２ｍｌの１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地にサスペンドして撒き、各種ｓｉＲＮＡを最終濃度１００ｎＭになるように、市販の形質転換試薬と混合後に添加する。用いた形質転換試薬はＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）であり、業者のプロイコルに従い形質転換した。その後２４時間後に培地を０．３％ＦＣＳ／ＯＰＴＩＰＲＯ  ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ）に置き換えて、４８ウエルデッシュに均等に撒きなおす。培地量は２００μＬ／ウエルである。さらに２４時間培養後に、ＭｅｂＣＤを最終濃度５ｍＭになるように添加し、さらに５％  ＣＯ２，３７℃にて１６時間培養する。ＷＳＴ８を含む生細胞数測定試薬（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を１０μＬ／ウエルで添加し、さらに６時間５％  ＣＯ２，３７℃にて培養する。生細胞数はプロトコル通りに測定する。【０１２２】
ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞に対してＳＭＳ２をノックダウンすると、ＭｅｂＣＤに感受性になり、細胞増殖が４０％程度まで低下するが（有意差検定でＰ＜０．０１）（図１８）、ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞に対してＳＭＳ２をノックダウンしてもＭｅｂＣＤ感受性はまったく変化なかった（図１９）。同様にＺＳ２／ＳＭＳ１細胞に対してＳＭＳ１をノックダウンするとＭｅｂＣＤに感受性になり、細胞増殖が２０％程度まで低下するが（有意差検定でＰ＜０．０１）（図１６）、ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞に対してＳＭＳ１をノックダウンしてもＭｅｂＣＤ感受性はまったく変化なかった（図１７）。以上の結果、ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞を用いた実験の結果について、ＳＭＳ２の発現細胞で特異的にＳＭＳ２をノックダウンすることで、ＭｅｂＣＤに感受性になることから、ｓｉＲＮＡの効果はＳＭＳ２の発現に依存しており、したがっていわゆるオフターゲット効果が排除できている。またＳＭＳ２特異的阻害剤を単離する方法として、このように、ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞がＭｅｂＣＤ感受性になり、ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞はＭｅｂＣＤ感受性にならないような化合物をスクリーニングすることで、ＳＭＳ２特異的阻害剤を単離することが可能であることが確認できた。【０１２３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。【０１２４】
本出願は、日本国出願特願２００９−２１９７５１ に対して優先権を主張するものであり、その全体の内容は、具体的に本明細書に記載されているのと同様に本明細書の一部を構成するものとして援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明は、メタボリック疾患の治療・予防剤の効率的なスクリーニング方法を提供する。
【配列表フリーテキスト】
【０１２６】
配列番号１：実施例１（アディポネクチン）で使用したフォワード（Ｆｗ）プライマーの配列である。
配列番号２：実施例１（アディポネクチン）で使用したリバース（Ｒｖ）プライマーの配列である。
配列番号３：実施例１（インスリン受容体）で使用したＦｗプライマーの配列である。
配列番号４：実施例１（インスリン受容体）で使用したＲｖプライマーの配列である。
配列番号５：実施例１（ＧＬＵＴ４）で使用したＦｗプライマーの配列である。
配列番号６：実施例１（ＧＬＵＴ４）で使用したＲｖプライマーの配列である。
配列番号７：実施例１（内在性コントロール遺伝子ＨＰＲＴ）で使用したＦｗプライマーの配列である。
配列番号８：実施例１（内在性コントロール遺伝子ＨＰＲＴ）で使用したＲｖプライマーの配列である。
配列番号９：ｓｉＲＮＡ  ＳＭＳ１−ｉ４の対応するセンス鎖ＤＮＡ配列
配列番号１０：ｓｉＲＮＡ  ＳＭＳ２−ｉ１１に対応するセンス鎖ＤＮＡ配列
配列番号１１：ｓｉＲＮＡ  ＣＴＲ−ｉに対応するセンス鎖ＤＮＡ配列
配列番号１２：マウスＧ３ＰＤＨのｍＲＮＡ検出用ＰＣＲ（フォワード（Ｆｗ）プライマー
配列番号１３：マウスＧ３ＰＤＨのｍＲＮＡ検出用ＰＣＲ（リバース（Ｒｖ）プライマー
配列番号１４：マウスＳＭＳ１のｍＲＮＡ検出用ＰＣＲ（フォワード（Ｆｗ）プライマー
配列番号１５：マウスＳＭＳ１のｍＲＮＡ検出用ＰＣＲ（リバース（Ｒｖ）プライマー
配列番号１６：マウスＳＭＳ２のｍＲＮＡ検出用ＰＣＲ（フォワード（Ｆｗ）プライマー
配列番号１７：マウスＳＭＳ２のｍＲＮＡ検出用ＰＣＲ（リバース（Ｒｖ）プライマー
【図１】
2011036878.tif 000004
【図２】
2011036878.tif 000005
【図３】
2011036878.tif 000006
【図４】
2011036878.tif 000007
【図４Ａ】
2011036878.tif 000008
【図５】
2011036878.tif 000009
【図５Ａ】
2011036878.tif 000010
【図５Ｂ−１】
2011036878.tif 000011
【図５Ｂ−２】
2011036878.tif 000012
【図５Ｃ】
2011036878.tif 000013
【図５Ｄ】
2011036878.tif 000014
【図５Ｅ】
2011036878.tif 000015
【図５Ｆ】
2011036878.tif 000016
【図５Ｇ】
2011036878.tif 000017
【図５Ｈ−１】
2011036878.tif 000018
【図５Ｈ−２】
2011036878.tif 000019
【図６】
2011036878.tif 000020
【図７】
2011036878.tif 000021
【図８】
2011036878.tif 000022
【図９】
2011036878.tif 000023
【図１０】
2011036878.tif 000024
【図１１】
2011036878.tif 000025
【図１２】
2011036878.tif 000026
【図１３】
2011036878.tif 000027
【図１４】
2011036878.tif 000028
【図１５】
2011036878.tif 000029
【図１６】
2011036878.tif 000030
【図１７】
2011036878.tif 000031
【図１８】
2011036878.tif 000032
【図１９】
2011036878.tif 000033
【配列表】
2011036878000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年3月7日(2012.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングする方法であって、被験物質のスフィンゴミエリン合成酵素の阻害活性を測定し、該被験物質がスフィンゴミエリン合成酵素の阻害活性を有する場合、該被験物質がメタボリックシンドロームの処置または予防のために有効であると判定される方法。
【請求項２】
前記メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質は、糖尿病薬、抗肥満薬、内臓脂肪減少薬、脂肪肝処置薬およびアディポネクチン発現上昇薬からなる群より選択される少なくとも１つの機能を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記阻害活性の測定は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれか一方の遺伝子をノックアウトした細胞を用いて行なうことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害活性の測定は、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞を用いて行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞にシクロデキストリンを与え、前記被験物質が細胞増殖の遅延または細胞死を引き起こす場合、該被験物質が前記少なくとも１つの機能を有すると判定される請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素は、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２またはＳＭＳ１およびＳＭＳ２の両方である請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素はＳＭＳ２である請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項８】
スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれか一方の遺伝子をノックアウトした細胞を含む、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングするためのキット。
【請求項９】
スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた細胞を含む、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングするためのキット。
【請求項１０】
前記物質は、糖尿病薬、抗肥満薬、内臓脂肪減少薬、脂肪肝処置薬およびアディポネクチン発現上昇薬からなる群より選択される少なくとも１つの機能を含む、請求項８または請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
シクロデキストリンをさらに含む請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素は、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２またはＳＭＳ１およびＳＭＳ２の両方である請求項９に記載のキット。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素はＳＭＳ２である請求項９に記載のキット。
【請求項１４】
スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１またはＳＭＳ２のいずれかの一方の遺伝子をノックアウトした、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングするための細胞。
【請求項１５】
スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素を遺伝子導入させた、メタボリックシンドロームの処置または予防のために有効である物質をスクリーニングするための細胞。
【国際調査報告】
2011036878.tif 000034
2011036878.tif 000035
2011036878.tif 000036
2011036878.tif 000037