(57)【要約】本発明は、抗菌及び免疫賦活活性を有する分子、特に魚に由来するカセリシジン(cathelicidin)ファミリーの分子に関する。本発明は、新規のカセリシジン分子、フラグメント、誘導体及びこれらの使用、及びコードする核酸を供給する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列PRG-G/V-GS-X-I/P-G（配列番号１９）を含む、抗菌活性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列PRG-G/V-GS-X-I/P-G（配列番号１９）の2から4の反復配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
1以上の前記反復配列が、配列番号１２、１４、１６又は１８のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１２、１４、１６及び１８のそれぞれを含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
分子内ジスルフィド架橋を形成することができる一対のシステイン残基を更に含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
抗カビ又は抗細菌活性を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１０又は２７に記載されたアミノ酸配列、又は、これらと約40％を超えて一致する、好ましくは約50％を超えて一致する配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の抗菌活性を有する部分、及び、プロテアーゼによって抗菌活性を有する部分から切断されうるプロペプチド部分を含む、ポリペプチド。
【請求項９】
前記プロペプチド部分が、少なくとも1のカセリン特徴的配列を含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記カセリン特徴的配列が配列番号６、８又は２５を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記プロペプチド部分が、配列番号６、８及び２５の2つを含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記プロペプチド部分が、分子内ジスルフィド架橋を形成することができる少なくとも一対のシステイン残基を含む、請求項８から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記プロテアーゼがエラスターゼである、請求項８から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記プロペプチド部分が、配列番号４又は２３に記載されたアミノ酸配列、又は、これらと約30％を超えて一致する、好ましくは約40％を超えて一致する配列を含む、請求項８から１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２又は２１に記載されたアミノ酸配列、又は、これらと約40％を超えて一致する、好ましくは約50％を超えて一致する配列を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号６、８又は２５のアミノ酸配列を含むカセリン特徴的配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号６、８及び２５の2つを含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
分子内ジスルフィド架橋を形成することができる少なくとも一対のシステイン残基を含む、請求項１６又は１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
分子内ジスルフィド架橋を形成することができる少なくとも二対のシステイン残基を含む、請求項１８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号４又は２３に記載されたアミノ酸配列、又は、これらと約30％を超えて一致する配列を含む、請求項１６から１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項２２】
請求項１から２０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項２３】
配列番号９又は２６に記載された核酸配列、又は、これらと約40％を超えて一致する配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項２４】
配列番号３又は２２に記載された核酸配列、又は、配列番号９又は２６に記載された核酸配列、又は、どちらかと約40％を超えて一致する配列を含む、請求項８から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項２５】
配列番号３又は２２に記載された核酸配列、又は、これらと約40％を超えて一致する配列を含む、請求項１６から２０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項２６】
機能的なシグナルペプチドをコードする配列を更に含む、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２７】
請求項２２から２６のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載の発現ベクターを含むホスト細胞。
【請求項２９】
少なくとも16から24の近接する、配列番号１又は２０、又は図１５記載のヌクレオチド、又はこれらの相補鎖、又はいずれかに縮重的に均等な配列を含む、核酸プライマー又はプローブ。
【請求項３０】
配列番号１１、１３、１５又は１７に記載されたヌクレオチド配列、又はアミノ酸配列PRG-G/V-GS-X-I/P-G（配列番号１９）をコードするヌクレオチド配列、又はこれらの相補鎖、又はいずれかに縮重的に均等な配列を含む、請求項２９に記載の核酸プライマー又はプローブ。
【請求項３１】
配列番号３、５、７、９、２２、２４又は２６の配列、又はこれらの相補鎖、又はいずれかに縮重的に均等な配列を含む、請求項２９に記載の核酸プライマー又はプローブ。
【請求項３２】
請求項２９から３１のいずれか一項に記載の核酸プライマー又はプローブを使用し、カセリシジンポリペプチド又はこれらの部分をコードする核酸を単離する方法。
【請求項３３】
(a) 標的生物から核酸調製物を供給する工程；
(b) 請求項２９から３１のいずれか一項に記載の核酸プライマー又はプローブを供給する工程；
(c) 前記プライマー又はプローブと、前記核酸調製物を接触させる工程；
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
(d) 前記プライマー又はプローブとハイブリダイズさせる前記調製物中の核酸を同定する工程；
を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
(a) 標的生物から核酸調製物を供給する工程；
(b) プライマーの少なくとも1つが、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の核酸プライマー又はプローブである、一対の核酸プライマーを供給する工程；
(c) PCRの実施条件下において、前記プライマーと前記核酸調製物を接触させる工程；
(d) PCRを実施し、増幅した核酸が存在するか又は存在しないかを求める工程；
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的生物が魚である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
医学的治療方法において使用するための、請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項２３又は２４に記載の核酸。
【請求項３８】
微生物によって引き起こされる病状の治療、炎症の治療、又は創傷治癒の促進のための薬の製造における、請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項２３又は２４に記載の核酸の使用。
【請求項３９】
前記薬が、魚を含む水への添加用である、請求項３８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌及び免疫賦活活性を有する分子、特にカセリシジン(cathelicidin)ファミリーの抗菌及び免疫賦活ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物は、細菌の感染に対応する幅広いメカニズムを発達させてきた。これらは、専門の食細胞を有する細胞による、活性酸素種のような無機的な殺菌性の分子の産生だけでなく、より洗練された酵素又は細胞を介した防御システムを含む。
【０００３】
哺乳類は、主に微生物の細胞膜と相互作用して効果を与える、様々な抗菌ペプチドを産生することが知られている。
【０００４】
カセリシジンは、骨髄性細胞においてプレプロペプチドとして合成され、シグナルペプチドの除去を経て、好中性白血球の細胞質顆粒においてプロペプチドとして貯蔵される。プロペプチドは、カセリシジンファミリーに特徴的な、よく保存されたカセリシジンドメインを含み、それ自身は抗菌性を有さない。高保存の理由は不明だが、プロ配列が、プロ配列を顆粒に向かわせる役割又は適切な蛋白質分解されるようにする役割を有しているかもしれない。
【０００５】
抗菌活性が成熟ペプチドに備わっており、この成熟ペプチドは、エラスターゼによってプロペプチドから切断されて遊離する。エラスターゼ切断は、顕著にC末端のバリン残基で生じ、時々アラニン残基の後で生じる。
【０００６】
カセリシジンファミリーは、配列が非常に可変である、抗菌活性を有する成熟ペプチドの構造によって、5つの異なるグループに分かれる。このファミリーは、2つのジスルフィド結合を有するペプチド（プロテグリン類）、1つのジスルフィド結合を有するペプチド（環状ドデカペプチド）、タンデムリピートが並んだ短い部分を有する、プロリン及びアルギンが多いペプチド（バクテネシン類、PR-39、プロフェニン類）、トリプトファン残基が多いペプチド（インドリシジン、PMAP-23）、及びα-へリックス構造を有するペプチド（PMAP-36及び-37、CAP18、FALL-39）を含む(Zanetti et al., 1995)。
【０００７】
ウシのバクテネシン類は、1つの疎水性アミノ酸によって一定の間隔に配置された複数のPro-Arg-Proトリプレットによって特徴付けられる十四量体の、3つのタンデムリピートを含む(Frank et al., 1990)。ブタのプロフェニン類は、十量体FPPPNFPGPRの3つの完全な反復を含む(Harwig et al., 1995)。
【０００８】
これらのペプチドの活性機構は、グラム陰性細菌において、迅速にバクテリア膜に浸透することから、巨大分子合成を阻害することまで様々である。微生物活性に加えて、いくつかのペプチドは、ホストの保護の一環として、LPSの効果を中和し、傷を修復し、組織の分解を阻害することができる。プロテグリン-1のアナログは、複数菌による口腔粘膜炎の治療のために、臨床試験にある(Chen et al., Biopolymers (Peptide Science) 55:88-98 (2000))。
【０００９】
[参考文献]
2005536182.tif 000002
2005536182.tif 000003
2005536182.tif 000004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本出願の発明者は、最初の例である非哺乳類のカセリシジンをコードすると確信される、ニジマス由来のcDNAをクローニングした。この結果は、ニジマスにおけるIL-1β関連遺伝子の存在について研究している間に、思いもよらずに得ることができた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記のように、カセリシジンは、一般的にin vivoでプレプロペプチドとして合成され、シグナルペプチド、プロペプチド部分及び成熟ペプチド部分を有する。本実施例で示す特定のカセリシジンは、図９で示す一般的な構造に従っている；cDNA配列及び予想されるアミノ酸配列を、図８及び配列番号１及び２、並びに、２０及び２１に示す。
【００１２】
得られたcDNAクローンは不完全であるが、予想されるポリペプチド配列の最初の20は、シグナルポリペプチドの特徴を有しており、このことから、オープンリーディングフレームの大部分は完全であるが、クローニングすべき配列が少量残っていることが示唆された。配列番号２０（ヌクレオチド5から655）で示された完全長のORFの配列によって、このことが確かめられ、完全長のORFは、図８で示される配列よりも2つだけ多いアミノ酸を有する配列をコードしていた。
【００１３】
全長のORFの配列決定によって、4つの一塩基多型の存在が明らかになり、そのうちの3つによって、コードアミノ酸のバリエーションがもたらされると考えられる。ここで示す配列は、1以上の多型を含み、これらの多型によって生じる全ての個々の配列の並び替え（permutations）は開示され、本発明の一部を形成すると考えられる。
【００１４】
本出願においては、特に言及する以外、ヌクレオチド又はアミノ酸残基は、図８、配列番号１及び配列番号２のように番号が付される。
【００１５】
蛋白質切断部位はまだ確認できていないが、配列番号２のアミノ酸21から148がプロペプチド領域を、アミノ酸149から214が“成熟”抗菌ペプチドを構成していると確信している。
【００１６】
予想されるプロペプチド領域（配列番号３及び４、２２及び２３）は、残基28から44（配列番号５及び６）及び残基75から97（配列番号７及び８）に、2つのカセリン特徴的(cathelin signature)配列を含む。プロペプチド領域における多型によって、配列番号２４及び２５で示すような、残基28から44のカセリン特徴的な別の配列が供給される。プロペプチド領域は、更には、配列番号２のシステイン残基82と93及び104と128の間に、2つの分子内ジスルフィド結合を含むと予想される。プロペプチド領域は、任意の公表されている哺乳類のカセリシジン配列とアミノ酸レベルでたった29％の類似性しか示さない。
【００１７】
66アミノ酸の抗菌ペプチド領域（配列番号９及び１０、２６及び２７）は、哺乳類のカセリシジン類の2つのグループと類似性を有する。12ペプチドグループに特徴的な、配列番号２の残基151と157の間の分子内ジスルフィド結合を有していると予想され、プロフェニングループに見られる反復配列に似た、九量体のコンセンサス配列RPG-G/V-GS-X-I/P-Gのタンデムリピートも4つ含んでいる。結果として、本発明によって、このポリペプチドはプロフェニングループに分類され、“trout bactenecin”と命名した。
【００１８】
それゆえ、本発明の1つの側面においては、非哺乳類のカセリシジンポリペプチド、特に魚のカセリシジンを供給する。
【００１９】
本発明のカセリシジンは、配列番号２又は２１のアミノ酸配列の全体又は一部を含みうる。これは、配列番号１のヌクレオチド1から647の全て又は一部、配列番号２０の全て又は一部、又は、配列番号３又は２２、又は、９又は２６の全て又は一部を含む核酸配列、又は、これらのミュータント、バリアント、誘導体(derivative)、アレル(allele)、ホモログ、オルソログ又はパラログによってコードされうる。コードされているポリペプチド配列（又はそれらの一部）は、配列番号２、２１、４、２３、１０又は２７と約40％より高い相同性を示すことができ、これらの配列の任意の1つと約50％より高い相同性を、約60％より高い相同性を、約70％より高い相同性を、約80%より高い相同性を、約90％より高い相同性を、又は、約95より高い相同性を示すことができる。
【００２０】
“相同性”という単語は、本明細書の全体を通し、二つの配列の間で一致している割合を指す。一致している割合は、BLAST又はBestFitのようなプログラムを用いて、ウィスコンシン大学から入手できるGenetics Comuputer Group (GCG) Version 10 software packageで（デフォルトパラメーターを用いて）計算することができる。
【００２１】
カセリシジンのサブ領域(subregion)が独立して利用しうることは、明らかであろう。これらのサブ領域は、独立したドメイン、サブドメイン、又は、例えば完全な分子、プロペプチド領域又は成熟ペプチドから得られるペプチドとしうる。
【００２２】
このため、本発明は、更に、非哺乳類のカセリシジン、例えば魚のカセリシジンに由来する抗菌活性を有する部分を含む、単離されたペプチド又はポリペプチドを供給する。
【００２３】
本出願における抗菌とは、1以上の真核又は原核微生物、例えば、酵母のような真菌類又は細菌の増殖を遅らせる、又は、殺す能力を意味する。抗菌活性を求めるアッセイは、例えば、PCT/US00/22781、US-B-6,172,185、EP-A-665 239、Genarro et al. (1989)、及びGennaro et al. (1998)に記載されている方法を用いることができる。
【００２４】
抗菌活性を有する部分は、アミノ酸配列RPG-G/V-GS-X-I/P-G（配列番号１９）、例えば、アミノ酸配列RPG-G/V-GS-X-I/P-G（配列番号１９）の2から4つの反復を含みうる。これらの反復のうち1以上は、配列番号１２、１４、１６又は１８の配列を有しうる。1つの実施態様においては、抗菌活性を有する部分は、それぞれ配列番号１２、１４、１６及び１８の1つを含みうる。
【００２５】
抗菌活性を有する部分は、更に、分子内ジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基の対を含みうる。
【００２６】
1つの実施態様においては、抗菌活性を有する部分は、配列番号１０又は２７のアミノ酸配列を含む。その代わりに、抗菌活性を有する部分は、配列番号１０又は２７と約40％より高い相同性、これらと約50％より高い相同性、約60％より高い相同性、約70％より高い相同性、約80％より高い相同性、約90％より高い相同性又は約95％より高い相同性を示しうる。
【００２７】
単離したポリペプチドは、更に、抗菌活性を有する部分から、プロテアーゼによって切断することができるプロペプチド部分を含みうる。単離したポリペプチドは、それ自体で抗菌活性を持ちうる。その代わりに、抗菌活性を有する部分は、プロペプチド部分から切断された場合にのみ、抗菌活性を示すようになりうる。
【００２８】
1つの実施態様においては、プロテアーゼはエラスターゼである。エラスターゼによる蛋白質分解は、C末端のバリン又はアラニンのような小分子で無電荷の残基、典型的なC末端のバリン残基で生じる。結果として、プロペプチドのC末端残基は、一般的に、バリンであろう。
【００２９】
一般的に、プロペプチド部分は、1つ以上のカセリン特徴的配列を含みうる；例えば、プロペプチド部分は、1つ以上の配列番号６、２５及び８、好ましくは２つの配列番号６、２５及び８を含みうる。
【００３０】
更に又はその代わりに、プロペプチド部分は、分子内ジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基の対を少なくとも1つ含みうる。1つの実施態様において、プロペプチド部分は、分子内ジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基の対を少なくとも2つ含みうる。
【００３１】
特定の実施態様においては、プロペプチド部分は、配列番号４又は２３のアミノ酸配列を含みうる。その代わりに、ポリペプチド配列のプロペプチド部分は、配列番号４又は２３と約40％より高い相同性、これらと約50％より高い相同性、約60％より高い相同性、約70％より高い相同性、約80％より高い相同性、約90％より高い相同性又は約95％より高い相同性を示しうる。
【００３２】
哺乳類のカセリシジンのプロペプチドは、特定のファミリーにおいて非常に高い頻度で保存されていることが知られている。実施例で記載されているプロペプチドは、既知のカセリシジンとアミノ酸レベルでたった29％の類似性しか有していないが、非哺乳類のカセリシジン（例えば魚のカセリシジン）のような、まだ同定されていないカセリシジンのプロペプチド領域と著しく高い相同性を示しうる。それゆえ、本発明により、非哺乳類、例えば魚類から新規のカセリシジンポリペプチド及びコード配列を同定することができる。
【００３３】
その代わりに、本発明は、抗菌活性を有する部分、及び、抗菌活性を有する部分からプロテアーゼによって切断されるプロペプチド部分（当該プロペプチド部分は1つ以上の配列番号６、２５及び８、好ましくは2つの配列番号６、２５及び８を含む）を含む、単離したポリペプチドを更に供給する。
【００３４】
プロペプチド部分は、更に、分子内ジスルフィド架橋を形成することができる少なくとも1つのシステイン残基対、好ましくは、分子内ジスルフィド架橋を形成することができる少なくとも2つのシステイン残基対を含みうる。
【００３５】
プロペプチド部分は、配列番号４又は２３の核酸配列を含みうるか、又は、配列番号４と約40％より高い相同性、これらと約50％より高い相同性、約60％より高い相同性、約70％より高い相同性、約80％より高い相同性、約90％より高い相同性又は約95％より高い相同性を示しうる。
【００３６】
未だ同定されていないカセリシジンが、本出願で供給されたtrout bactenesin分子のプロペプチドのホモログでありうるという予想により、当該プロペプチドそれ自身が更なるカセリシジンを同定するのに用いることができるという可能性が提起される。例えば、当該ポリペプチドは、関連する分子の発現ライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる抗体を調製するのに用いることができる（以下を参照）。当該ポリペプチドは、特に抗原エピトープを求める初歩的なアッセイに用いることができる。そして、抗体を調製する目的のために、これらのエピトープを独立して合成又は発現することができる。その代わりに、本発明により、また、抗原部分だけでなく、非哺乳類のカセリシジン由来の単離したプロペプチド領域、例えば、魚のカセリシジン由来の単離したプロペプチド領域が供給される。
【００３７】
単離したプロペプチド又はこれらの部分は、少なくとも1つの、好ましくは2つの配列番号６、２５及び８を含みうる。更には、分子内ジスルフィド架橋を形成することができる少なくとも1つのシステイン残基対、好ましくは、分子内ジスルフィド架橋を形成することができる少なくとも2つのシステイン残基対を含みうる。
【００３８】
1つの実施態様においては、単離したポリペプチドは、配列番号４又は２３のアミノ酸配列を含みうる、又は、これらと約40％より高い相同性、約50％より高い相同性、約60％より高い相同性、約70％より高い相同性、約80％より高い相同性、約90％より高い相同性又は約95％より高い相同性を示しうる。
【００３９】
本出願で示す単離したポリペプチド及びペプチドは、一般的に、必然的に関連している物質から遊離又は実質的に遊離しているであろう。その物質は、例えば、カセリシジン以外の、魚の又は他の生理学上のホストのポリペプチドである。更に又はその代わりに、例えば原核生物又は他のリコンビナントホスト細胞において発現させた場合、本来行われるグリコシル化が欠いているであろう。例えば、別の方法によるグリコシル化又はグリコシル化が行われない。更なる代わりになるものとして、本発明のポリペプチド又はペプチドは、化学合成、この業界の当業者によく知られている方法によって産生しうる。
【００４０】
本発明のポリペプチド及びペプチドは、C末端でアミド化することができ、又は、遊離の酸の形態とすることができる。これらは、本出願で記載されている任意のペプチド配列、例えば、配列番号２、２１、４、２３、６又は２５と比較して、５’末端又は３’末端を伸張させうる。リコンビナントホスト細胞で発現させたときに、適切に分泌させるために、例えば、オープンリーディングフレームは、全長の本来有するシグナルペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸1から20として示される配列をコードする、推定上の切断されるシグナルペプチドの伸張した形態）、配列番号２１のアミノ酸1から22、異種シグナルペプチド、又はこれらの組み合わせのような、シグナルペプチドをコードする配列を含みうる。
【００４１】
特にリコンビナントホストからの発現によって産生させる場合、本発明のペプチド又はポリペプチドは、シグナルペプチドを含みうる。リコンビナントホスト細胞で発現させたときに、適切に分泌させるために、このシグナルペプチドは、配列番号２１のアミノ酸1から22、異種シグナルペプチドのような、全長の本来有するシグナルペプチド（例えば、配列番号２のアミノ酸1から20として示される推定上の切断されるシグナルペプチドの伸張した形態）としうる。
【００４２】
更なる側面においては、本発明は、本出願で記載するペプチド及びポリペプチドをコードする核酸を供給する。それゆえ、本発明は、非哺乳類のカセリシジンをコードする核酸を供給する。好ましい実施態様においては、核酸は、魚のカセリシジンをコードする。
【００４３】
核酸は、全体を又は一部分を合成しうる。特に、天然に見られない（隣接して存在することができない）核酸配列がライゲーションされている、又は他の方法で人工的に結合しているリコンビナントとしうる。その代わりに、例えば、自動化した合成機を用いて、直接合成することができる。
【００４４】
本発明による核酸は、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドとすることができ、cDNA、RNA、ゲノムDNA（genomic DNA(gDNA)）及び修飾した核酸又は核酸アナログを含みうる。例えば、図又は配列番号に関連して、DNA配列を指定している場合、もしも文脈が別のものを必要としていないならば、必要な部位でTの代わりにUで置換されているRNA相当物が包含される。
【００４５】
核酸は、本出願で開示する任意の配列（遺伝子、ゲノムクローン又は他の配列、cDNA、又はORF又は任意のこれらのエキソン等である配列）を含むことができ、前記任意の配列からなることができ、前記任意の配列から必須になることができる。例えば、gDNAが開示されている場合、任意のgDNA由来の任意の1以上のイントロン又はエキソンを含む核酸も包含される。同様に、cDNAが開示されている場合、翻訳される領域（開始コドンから終結コドンまで）のみを含む核酸も包含される。
【００４６】
本発明の核酸（又はヌクレオチド配列）が本出願で述べられる場合、この核酸（又はヌクレオチド配列）の相補鎖も、本発明によって包含されるであろう。それぞれの場合における“相補鎖”は、リファレンスと同じ長さであるが、各ヌクレオチドが対をなす塩基とペアになる塩基であることによって（すなわちGとC、及びAとT又はU）、100％相補性である。
【００４７】
本発明の核酸は、示される配列の1以上のヌクレオチド（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50以上のヌクレオチド）の1以上の付加、挿入、欠失及び置換である変化によって、本出願に記載されている特異的な配列と異なるであろう。ヌクレオチド配列への変化によって、蛋白質レベルでアミノ酸に変化が生じる、又は、生じない。これは、遺伝子コードの縮重によって求まる。
【００４８】
一方、コードされたポリペプチドは、前記で論じたように、本出願で示すアミノ酸配列と1以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含みうる。本発明によって、本出願で示す配列のアミノ酸配列変異体(variant)、誘導体、アレル、ミュータント、ホモログ、オルソログ又はパラログであるポリペプチドをコードする核酸を供給する。このようなポリペプチドをコードする核酸は、任意の本出願で示すコード配列と約40％より高い相同性、例えば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４又は２６と約50％より高い相同性、約60％より高い相同性、約70％より高い相同性、約80％より高い相同性、約90％より高い相同性又は約95％より高い相同性を示しうる。
【００４９】
本発明によるポリペプチド又はペプチドをコードする核酸のオープンリーディングフレームは、本発明で示す任意の配列（例えば、配列番号１のヌクレオチド1から644、配列番号３又は配列番号９）に比べて、5’末端又は3’末端で伸張しうる。リコンビナントホスト細胞で発現させたときに、適切に分泌させるために、オープンリーディングフレームは、全長の本来有するシグナルペプチド（例えば、配列番号１のヌクレオチド1から62として示される配列をコードする、推定上の切断されるシグナルペプチドの伸張した形態）、異種シグナルペプチド、又はこれらの組み合わせのような、シグナルペプチドをコードする配列を含みうる。例えば、ORFは、図１５又は配列番号２０として示されうる。
【００５０】
“オルソログ”という単語は、本出願では、異なる種の特定の遺伝子と、同等な染色体上の遺伝子座に存在する遺伝子のことを指す。“パラログ”という単語は、同じ又は異なる種において、特定の遺伝子と、異なる染色体上の遺伝子座に存在する遺伝子を指すが、その遺伝子のホモログであり、遺伝子重複によって関係付けられている。
【００５１】
本発明の核酸は、ベクターの一部として供給されうる。そして、本出願で供給されるのは、本出願で記載する核酸を含むベクター、特に、ポリペプチドを適切な条件下で発現することができるベクターであり、任意のこのようなベクター又は核酸を含むホスト細胞である。
【００５２】
“ベクター”は、とりわけ、自身で伝染性を有する又は移動性を有し又は有さず、細胞ゲノムに組み込まれることによって又は染色体の外に存在すること（例えば、複製開始点を有する自立複製プラスミド）によって、原核生物又は真核生物のホストを形質変換することができる、二本鎖又は一本鎖の直鎖又は環状形態の、任意のプラスミド、コスミド、ファージ又はアグロバクテリウムバイナリーベクターを含んで定義される。
【００５３】
一般的に、この業界における当業者は、リコンビナント遺伝子発現のために、ベクターを構築し、プロトコールをデザインすることができる。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化された配列、エンハンサー配列を含む適切な制御配列、マーカー遺伝子及び他の配列を適切に含むように、適切なベクターを選択又は構築することができる。更に詳細は、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press or Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992を参照せよ。
【００５４】
具体的には、2つの異なるホスト生物（この生物は、放線菌及び関連する種、細菌及び真核生物（例えば、高等植物、哺乳類、酵母又はカビ細胞）から選択することができる）で複製することができる、天然の又はデザインされた、DNAのベヒクルを意味する、シャトルベクターを含む。
【００５５】
本発明による核酸を含むベクターは、特に、もしも、ゲノム内への組み込みのために、核酸を細胞内へ導入するのにベクターが用いられる場合は、プロモーター又は他の制御配列を含むことは必要でない。
【００５６】
好ましくは、ベクター内の本発明の核酸配列は、適切なプロモーター、又は、微生物（例えば細菌）又は植物細胞のようなホスト細胞における転写のための他の制御因子で制御され、実施可能にリンクされている。当該ベクターは、複数のホストで機能する、バイファンクショナル(bi-functional)な発現ベクターとしうる。ゲノムDNAの場合、ベクターは、自分自身のプロモーター又は他の制御因子を含むことができ、cDNAの場合、ベクターは、適切なプロモーター、又は、ホスト細胞で発現させるための他の制御因子で制御することができる。
【００５７】
“プロモーター”は、作用的にリンクしている下流のDNAの転写を開始することができる（すなわち、二本鎖DNAのセンス鎖上で3’の方向へ）、ヌクレオチド配列を意味する。
【００５８】
“作用的にリンクしている”とは、適切な部位に、プロモーターから転写が開始されるような方向で、同じ核酸分子の一部として結合していることを意味する。プロモーターに作用的にリンクしているDNAは、プロモーターの“転写開始の制御の下”にある。
【００５９】
好ましい実施態様においては、プロモーターは誘導性プロモーターである。
【００６０】
プロモーターに用いられている“誘導性”という単語は、この業界における当業者によって理解されている。要するに、誘導性プロモーターの制御を受けた発現は、適用される刺激に応答して、“スイッチがオンになる”又は増大する。刺激の種類は、プロモーターによって様々である。いくつかの誘導性のプロモーターは、適切な刺激が存在しなければ、ごく少量の又は検出できないレベルの発現しか示さない（又は全く発現しない）。他の誘導性のプロモーターは、適切な刺激が存在しなくても、検出可能な恒常的な発現を示す。刺激が存在していない状況におけるどんな発現レベルであっても、的確な刺激の存在下では、任意の誘導性プロモーターによる発現が増す。
【００６１】
それゆえ、本発明のこの側面によって、trout bactenecin遺伝子又はそのバリアントのような、本発明によって供給されるヌクレオチド配列に作用的にリンクしている（任意に誘導できる）プロモーターを含む、遺伝子コンストラクト、好ましくは複製可能なベクターが供給される。
【００６２】
本発明は、また、記載のポリペプチド又はペプチドの製造方法を包含し、当該方法は、コードしている核酸（大部分の実施態様においては本発明による核酸であるであろう）由来の前記ポリペプチド又はペプチドを発現する工程を含む。この方法は、便利なことに、当該ポリペプチドを発現できる又は発現を導く適切な条件下で、培地内において、このようなベクターを含むホスト細胞を増殖させることによって達成しうる。当業者にとって明らかなように、ポリペプチド又はペプチドは、また、in vivoシステムでも発現しうる。
【００６３】
様々なホスト細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現システムは、良く知られている。適切なホスト細胞は、哺乳類の細胞、魚細胞及び酵母のような真核細胞、細菌、及びバキュロウィスルシステムを含む。異種ポリペプチドの発現のために、この業界で利用可能な哺乳類の細胞ラインは、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、COS細胞及び多くの他の細胞を含む。魚の細胞ラインの候補としては、マスの繊維芽細胞ラインRTGがある。一般的で、好ましい細菌のホストは、大腸菌である。しかしながら、一般的に、発現蛋白質又はペプチドの収率を損なわないように、発現蛋白質の抗菌効果によって悪影響を受けないホストが選択されるであろう。それゆえ、ホストの選択は、発現させるペプチド又は蛋白質の特定の活性に依存するであろう。
【００６４】
それゆえ、本発明の更なる側面によって、本出願で記載の異種の核酸を含むホスト細胞を供給する。
【００６５】
本発明の核酸は、ホスト細胞のゲノム（例えば染色体）へ組み込むことができる。組み込みは、標準的な方法に従い、ゲノムとの組み換えを促進する配列が含まれていることによって促進される。核酸は、細胞内の染色体外ベクター上に存在することができ、又は、他の方法として細胞にとって外来性のベクター又は同一視できる異種のベクター上に存在することができる。
【００６６】
より更なる側面によって、当該核酸をホスト細胞に導入する方法を提供する。導入（制限するわけではないが、（特にin vitroでの導入においては）一般的には“形質転換”と言われる）には、任意の可能な方法を使用できる。真核細胞において、適切な方法は、リン酸カルシウム法による感染、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション、リポソームを用いた感染及びレトロウィスル又は他のウィルス（例えば、ワクチン又は、昆虫細胞に用いるバキュロウィルス）を用いた形質導入を含みうる。細菌細胞において、適切な方法は、塩化カルシウム法による形質転換、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを用いた形質移入を含みうる。代わりの方法として、核酸の直接注入を用いることもできる。
【００６７】
この業界においてよく知られているように、抗生物質耐性又は感受性のようなマーカー遺伝子を、対象とする核酸を含むクローンを同定するのに使用することができる。
【００６８】
当該導入の後に、核酸から発現させることができる、又は、発現を導くことができる。例えば、遺伝子を発現するのに適した条件で、ホスト細胞（実際に形質転換された細胞を含みうるが、当該細胞は、形質転換された細胞の子孫である確率が高い）を培養することによって、結果としてコードされているポリペプチド（又はペプチド）は産生される。もしもポリペプチドが、適切なシグナルリーダーペプチドと結合して発現するならば、このポリペプチドは、細胞から培養培地に分泌されうる。発現による産生に続き、ポリペプチド又はペプチドは、ホスト細胞及び／又は培養培地から単離及び／又は精製することができ、場合によっては、要望どおりその後に、例えば、1つ以上の更なるコンポーネント（例えば、1つ以上の医薬上許容できる賦形剤、ベヒクル又は担体（例えば以下参照）を含む医薬組成物）を含むことができる組成物の形態で使用することができる。
【００６９】
本発明による、trout bactenesin分子のクローニングによって、更に、更なるカセリシジン、特に非哺乳類、特に魚類のカセリシジンの同定及び単離に使用するのに有用な物質を供給する。
【００７０】
それゆえ、もう1つの側面において、本発明は、プローブ又はプライマーとして使用するための単離した核酸を供給する。当該核酸は、少なくとも長さが約16から24の独特なヌクレオチド配列を含む。当該独特なヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド1から815において、又は配列番号20の任意の配列において、図１５で示すヌクレオチド配列（配列番号２８）の任意の配列において、及び、特にこれらのコード領域において、又はこれらに相当する配列、又はいずれかの相補鎖において存在する。
【００７１】
本出願における独特な配列とは、本出願で供給されるtrout bactenecin配列に由来する配列であり、異種起源の核酸の調製（例えば、ゲノムDNA、cDNA、RNAの調製）において、配列番号１又は２０、又は図１５（配列番号２８）、及び、好ましくはこれらのコード配列と選択的に又は特異的にハイブリダイズできる配列である。このような分子は、ニジマス、他の魚類、又は任意の他の標的種由来の核酸調製物から、機能的に関連する配列（例えば、他のカセリシジン遺伝子配列）を同定するのにも使用することができる。
【００７２】
当該独特な配列は、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500以上の連続した、本出願で示すヌクレオチド配列又はこれらに縮重的に均等な配列、又はいずれかの相補鎖を含みうる。
【００７３】
それゆえ、当該独特な配列は、配列番号１又は２０のオープンリーディングフレーム、すなわち、TAG停止コドンを含む、配列番号１のヌクレオチド1から647又は配列番号２０のヌクレオチド5から655に由来の配列に由来することができる。更に又はその代わりに、当該独特な配列は、全体又は一部を、配列番号１のヌクレオチド648からの3’の非翻訳領域、又は、任意の配列番号２０及び図１５で示す非コード配列に由来しうる。
【００７４】
いくつかの実施態様においては、当該独特の配列は、任意のカセリン特徴的配列（配列番号６、８、２５）の全体又は一部を含みうる。当該独特の配列は、成熟ペプチドに由来する九量体の反復配列をコードしている配列番号１１、１３、１５、１７の1つ以上の全部又は一部を、又は、九量体のコンセンサス配列RPG-G/V-GS-X-I/P-Gをコードする核酸配列の1つ以上の全部又は一部を、又は、任意の前記配列又はこれらの相補鎖に縮重的に均等な任意の配列を含みうる。
【００７５】
前記に記した配列は、1つ以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入又は欠失によって修飾することができ、好ましくは、配列番号１又は２０、又は図１５の配列を有する核酸と選択的にハイブリダイズできなくなるということはなく修飾される。ここで、前記配列の1つを有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの相同性は、十分に高い。当該独特の配列は、配列番号１又は２０、又は図１５の配列の全体又は一部と、例えば、配列番号３，５，７，９，２２，２４又は２６、又はこれらと縮重的に均等な配列、又はこれらの相補鎖と約40％より高い相同性、約50％より高い相同性、約60％より高い相同性、約70％より高い相同性、約80％より高い相同性、約90％より高い相同性又は約95％より高い相同性を有しうる。
【００７６】
ストリンジェンシーが低い条件でのハイブリダイズによって、初歩的な実験を行いうる。プロービングのための好ましい条件は、更に調べることができるポジティブとして同定される少量がハイブリダーゼーションする、単純なパターンとなるのに十分なストリンジェントである条件である。
【００７７】
例えば、Sambrook et al.の方法（以下）に従い、5X SSC(“SSC”=0.15 M 塩化ナトリウム；0.15 M クエン酸ナトリウム；pH7)、5X Denhardt’s試薬、0.5-1.0% SDS、100 ug/ml 変性させ断片化したサケの精子DNA、0.05% ピロリン酸ナトリウム及び50%未満のホルムアミドを含むハイブリダーゼーション溶液を用いて、ハイブリダイゼーションを行いうる。ハイブリダイゼーションは、37-42℃で少なくとも6時間行う。ハイブリダイゼーションに続き、30分毎に溶液を変えながら、フィルターを以下のように洗浄する：(1)5分間室温で2X SSC及び1% SDS中で洗浄；(2)15分間室温で2X SSC及び0.1% SDS中で洗浄；(3)30分間-1時間37℃で1X SSC及び1% SDS中で洗浄；(4)2時間42-65℃で1X SSC及び1% SDS中で洗浄。
【００７８】
特定の配列相同性の核酸分子の間でハイブリダイゼーションを行うのに必要なストリンジェンシー条件を計算するための、1つの一般的な公式は：
Tm = 81.5℃ + 16.6Log[Na+] + 0.41 (% G+C) - 0.63 (% ホルムアミド) - 600/#bp（二本鎖中）：である(Sambrrok et al., 1989)。 
【００７９】
前記公式に示すように、[Na+] = [0.368]及び50-%ホルムアミドを用いて、42%のGC含量及び平均的なプローブサイズが200塩基では、Tmは57℃である。相同性が1%減少すると、DNA二本鎖のTmは、1-1.5℃下がる。それゆえ、ハイブリダイゼーション温度を42℃にすると、約75%より高い配列一致性を示す標的が観察される。このような配列は、実質的に、本発明の核酸配列に対するホモログであると考えられる。
【００８０】
唯一数個のポジティブなクローンが得られるまで、除去にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増していくことが、この業界でよく知られている。他の適切な条件は、例えば、約80-90%一致する配列を検出するためには、一晩42℃で、0.25 M Na2HPO4、pH 7.2、6.5% SDS、10%硫酸デキストラン中でのハイブリダイゼーション、及び、55℃で0.1X SSC、0.1% SDS中での最後の洗浄を含む。約90％を超えて一致する配列の検出のために、適切な条件は、一晩65℃で、0.25 M Na2HPO4、pH 7.2、6.5% SDS、10%硫酸デキストラン中でのハイブリダイゼーション、及び、60℃で0.1X SSC、0.1% SDS中での最後の洗浄を含む。
【００８１】
本発明によって、カセリシジン又はその一部をコードする核酸を単離する方法も供給される。前記方法は、本発明の単離した核酸を使用する。
【００８２】
本発明の当該方法は：
(a) 標的生物から核酸調製物を調製する工程；
(b) 本出願で記載される核酸プライマー又はプローブを調製する工程；
(c) 前記核酸調製物を前記プライマー又はプローブと接触させる工程；及び
(d) 前記プライマー又はプローブとハイブリダイズする前記調製物中の核酸を同定する工程を含みうる。
【００８３】
当該核酸調製物は、例えばゲノムDNA、RNA又はcDNAを含みうる。プライマー又はプローブと核酸調製物との間の接触、又はハイブリダイゼーションは、任意の適切な条件で行いうる。ハイブリダイゼーションの条件を制御して、非特異的な結合を最小にすることができ、適切なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい。当業者は、Sambrook et al (1989)及びAusubel et al (1992)のようなテキストを参考にして、オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基の組成、温度等を考慮し、適切なプローブを容易にデザインすることができ、それらを容易に標識することができ、ハイブリダイゼーション反応のための適切な条件を容易に考え出すことができる。
【００８４】
多くの例が当業者に知られている、任意の適切な方法によって、プライマー又はプローブとハイブリダイズした核酸の検出及び同定を行うことができる。例えば、プローブは、放射線活性標識、蛍光標識又は酵素標識することができる。
【００８５】
プロービングには、標準的なサザンブロッティング方法を使用しうる。例えば、DNAを細胞から抽出し、異なる制限酵素で切断しうる。その後、アガロース電気泳動によて、制限断片を分離し、変性する前に、ニトロセルロースフィルターに転写することができる。標識したプローブを、フィルター上のDNAフラグメントにハイブリダイズさせることができ、結合したものを求める。プロービングのためのDNAは、細胞に由来するRNA調製物から調製することができる。
【００８６】
プローブの標識を行わない他の方法は、制限断片長多型、PCRを用いた増幅、RNAase切断及びアレル特異的オリゴヌクレオチドプロービングの実験を含む。
【００８７】
例えば、同定方法は、ポリメラーゼ連鎖反応を含みうる。この場合、当該方法は：
(a) 標的生物から核酸調製物を調製する工程；
(b) 少なくとも1つの核酸プライマーが本出願記載の核酸であり、一対の核酸プライマーを調製する工程；
(c) PCRを行う条件で、前記核酸調製物を前記プライマーと接触させる工程；及び
(d) PCRを行い、増幅した核酸が存在するか又は存在しないかを求める工程を含みうる。
【００８８】
当該方法は、更に、増幅した核酸をクローニングする工程を含みうる。クローニングにおいては、ライゲーションすべき1以上の遺伝子フラグメントとして、全長のコード配列を産生する必要があるかもしれない。全長のコード核酸分子が得られない場合でも、完全な分子の一部を提示する、より小さな分子を、全長のクローンを得るために使用することができる。部分的なcDNAクローンから挿入断片が得られ、cDNAライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。単離された全長のクローンを発現ベクターにサブクローニングし、適切なホスト細胞への形質移入によって、例えばレポータープラスミドを用いて、活性を測定することができる。
【００８９】
本発明は、更に、前記の方法で同定された核酸をコードするペプチド又はポリペプチドの製造方法を含む。この方法は：
(a) カセリシジンポリペプチド又はその一部をコードする核酸を単離する工程；
(b) 前記核酸を適切なホスト細胞に導入する工程；
(c) 前記適切なホスト細胞内で、前記核酸を発現させる又は発現を導く工程を含みうる。
【００９０】
このような発現に適した方法は、前記した。
【００９１】
新規のtrout bactenecinペプチド及びポリペプチドの供給によって、初めて、これらのポリペプチド、フラグメント及び活性を有する部分に特異的に結合することができる抗体の産生が可能となる。したがって、本発明の更なる側面によって、本発明の任意のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体が供給される。このような抗体は、結合できるポリペプチドと、全く結合親和性を有しない又は実質的に結合親和性を有しない（例えば、結合親和性が約1000倍弱い）他のヒトのポリペプチドとの間を区別できるという意味で、特異的であろう。特異的な抗体は、特定の分子上のエピトープ（他の分子上には存在しない、又は、アクセスできないエピトープ）に結合する。本発明による抗体は、ワイルドタイプのポリペプチドに特異的でありうる。本発明による抗体は、特定のミュータント、バリアント、アレル又は誘導体ポリペプチドに対して、ワイルドタイプのポリペプチドよりも特異的でありうることから、結果として、以下に記すように予後及び診断方法に有用である。抗体は、また、抗体が結合するポリペプチドを精製（例えば、コード核酸からのリコンビナント発現による産生の後に続く精製）するのに有用である。
【００９２】
本発明による好ましい抗体は、他のポリペプチドと結合しうる抗体のような混入物質及び／又は血清成分を含まないという意味で、単離される。モノクローナル抗体がいくつかの目的のために好ましいが、ポリクローナル抗体も本発明の範囲内である。
【００９３】
抗体を製造する方法は、哺乳類又は鳥（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル又はニワトリ）を、当該蛋白質又はそのフラグメントで免疫することを含む。抗体は、この業界において知られている任意の様々な方法を用いて、免疫動物から得ることができ、スクリーニングすることができる。好ましくは、スクリーニングは、対象とする抗原に対して抗体を結合させることによって行う。その代わりに、対象とする抗原をコードするDNAで、動物を免疫することができる(Donnelly, J. J., Ulmer, J. B., Shiver, J. W. & Liu, M. A. (1997). DNA vaccines. Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648)。
【００９４】
例えば、ウェスタンブロッティング方法又は免疫沈降を使用することができる(Armitage et al, 1992, Nature 357: 80-82)。抗体はポリクローナル又はモノクローナルとしうる。
【００９５】
多くの方法で、抗体を修飾しうる。実際、“抗体”という単語は、必須の特異性を備えた結合ドメインを有する任意の特異的な結合物質をカバーすると解釈すべきである。それゆえ、この単語は、天然由来であるか合成されたかにかかわらず、イムノグロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体フラグメント、誘導体、機能的に均等なもの及び抗体のホモログをカバーする。それゆえ、他のポリペプチドに結合した、イムノグロブリン結合ドメイン、又は均等なものを含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、EP-A-0120694及びEP-A-0125023に記載されている。完全な抗体のフラグメントは、抗原結合機能を有することができると示されている。結合フラグメントの例としては、(i) VL、VH、CL及びCH1ドメインからなるFabフラグメント；(ii) VH及びCH1ドメインからなるFdフラグメント；(iii)1つの抗体のV1及びVHドメインからなるFvフラグメント；(iv) VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989))；(v) 単離されたCDR領域；(vi) 2つの結合したFabフラグメントを含む二価フラグメントである、F(ab’)2フラグメント；(vii) VHドメインとVLドメインが、ペプチドリンカー（抗原結合部位を形成するようにこの2つのドメインを結び付けているペプチドリンカー）によって結合している、一本鎖Fv分子（scFv）（Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1998）(viii) 二重特異性一本鎖Fvダイマー(PCT/US92/09965)及び(ix) “diabodies”、遺伝子の融合によって構築した多価又は多重特異的なフラグメント (WO94/13804; P Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993)がある。
【００９６】
diabodiesは、ポリペプチドのマルチマーであり、それぞれのポリペプチドは、イムノグロブリン軽鎖の結合領域を含む第一ドメイン及びイムノグロブリン重鎖の結合領域を含む第二ドメインを含む。この2つのドメインは、結合している（例えば、ペプチドリンカーによって結合）が、抗原結合部位を形成するために、お互いが関連しあうというわけではない：マルチマー内の1つのポリペプチドの第一ドメインと、マルチマー内の他のポリペプチドの第二ドメインが関連することによって、抗原結合部位を形成する(WO94/13804)。
【００９７】
哺乳類に免疫することに代わるもの又は補完するものとして、適切な結合特異性を有する抗体は、組み換え体として産生させた、発現させたイムノグロブリンの可変ドメインのライブラリーから得ることができる。例えば、機能を有するイムノグロブリン結合ドメインを表面に提示した、ラムダバクテリオファージ又は繊維状バクテリオファージを用いる（例えば、WO92/01047を参照）。
【００９８】
ポリペプチド又はペプチドから得られた抗体は、バリアントポリペプチド、及びそのコード遺伝子を同定及び／又は単離するのに用いることができる。それゆえ、本発明は、（前記したような）カセリシジンペプチド、ポリペプチド又はこれらのバリアントを同定又は単離する方法を供給する。当該方法は、前記カセリシジンペプチド、ポリペプチド又はこれらのバリアントに結合することができる、又は、好ましくはこのようなポリペプチドに対して結合特異性を有する、抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチド（例えば、抗体全体又はそのフラグメント）で、候補ポリペプチドをスクリーニングすることを含む。抗体、並びに、カセリシジンペプチド、ポリペプチド又はこれらのミュータント又は誘導体に結合する、及び、好ましくは特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドのような、特異的に結合できるメンバーも、本発明の更なる側面を表し、これらの使用、及び、これらを用いた方法も同様である。
【００９９】
スクリーニングに用いる候補ポリペプチドは、例えば、対象とするプラント由来の核酸を用いて作製した発現ライブラリーの生成物とすることができ、又は、天然物から精製して得られた生成物とすることもできる。抗体に結合したポリペプチドは単離することができ、その後、アミノ酸配列決定に供することができる。任意の適切な方法が、ポリペプチドの全体又は一部の配列を求めるのに使用しうる（例えば、ポリペプチドのフラグメントの配列を決定することができる）。例えば、候補核酸にハイブリダイズさせるプローブ又はプライマーとして用いるため、1以上のオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドのdegenerateプール）をデザインすることによって、又は、コンピューターのデーターベース配列を検索することによって、アミノ酸配列情報は、ポリペプチドをコードする核酸を得るのに使用しうる。
【０１００】
本発明のポリペプチド又はペプチドは、治療への適用に使用しうる。例えば、抗菌活性を有するペプチド又はポリペプチドは、微生物によって引き起こされる病状（例えば、カビ又は細菌の感染）の治療に役立ちうる。例えば、いくつかのカセリシジンは、多くの菌株に対して活性を示し、菌株は、薬剤耐性菌、例えばE. coli、Salmonella enteritides、Acinetobacter baumannii、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniae、Serratia marcescens、Burkholderia cepacia、Staphylococcus aureus (MRSA - すなわちメチシリン耐性)、Staphylococcus epidermidis、Enterococcus faecalis (VREF - すなわちバンコマイシン耐性)及びStreptococcus agalactiaeを含む。また、カビに対しても活性を示し、カビとしては、例えば、Candida albicans、Candida glabrata及びCryptococcus neoformans (Gennaro, R & Zanetti, M. (2000). Structural features and biological activities of the cathelicidin-derived antimicrobial peptides. Biopolymers 55: 31-49)がある。trout bactenesin分子は、任意の上記の種、及び同じ属の異なる細菌に対して活性となりうる。魚の病原体に対しても活性となりうる。例えば、Aeromonas、Vibrio、Yersinia、Flexibacter、Pasteurella、Flavobacterium、Renibacterium又はPiscirickettsia、例えばAeromonas salmonicida、Aeromonas hydrophila、Vibrio anguillarum、Vibrio salmonicida、Yersinia ruckeri、Flexibacter maritimus、Pasteurella piscicida、Flavobacterium psychrophilum、Renibacterium salmoninarum、又はPiscirickettsia salmonisに対して活性となりうる。
【０１０１】
しかしながら、多くのカセリシジンは、種によってより幅広く様々なものが存在する蛋白質のような分子ではなく、微生物の膜との相互作用を含む、比較的に非特異的な作用メカニズムを有しているので、微生物によって媒介される多くの他の症状の治療にも適用しうる。
【０１０２】
成熟カセリシジンペプチドは、また、免疫調整、細菌のエンドトキシンの中和及び創傷治癒を行うこともできると考えられている。例えば、ヒトCAP-18に由来するLL-37ペプチドは、中和エンドトキシンに結合することができ(Larrick, J. W. et al. (1994), J. Immunol. 152: 231-240)、ヒスタミン放出及び肥満細胞内の細胞内カルシウム動員を誘導し(Niyonsaba, F. et al. (2001). Eur. J. Immunol. 31: 1066-1075)、好中球、単球及びT細胞に対して走化作用を有するが、樹状細胞に対しては走化作用を有しない(Lillard Jr, J. W. et al. (1999). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 651-656)。エンドトキシンに対する活性を中和することは、グラム陰性菌への可能性ある治療としての提案が導かれる。
【０１０３】
ブタのPR-39は、とりわけ創傷治癒に従事する、シンデカンと呼ばれるヘパラン硫酸プロテオグリカンの発現を上方制御することができ(Gallo, R. L. et al. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11035-11039)、活性酸素種の産生の減少のような抗炎症活性、好中球の接着等を含む、多くの他の活性を有している(レビューとして、Zhang, G. L., Ross, C. R. & Blecha, F. (2000). Vet. Res. 31: 277-296; Gennaro, R & Zanetti, M. (2000). Structural features and biological activities of the cathelicidin-derived antimicrobial peptides. Biopolymers 55: 1-49を参照)。
【０１０４】
したがって、更なる側面においては、本発明は、医療治療方法に使用するための、前記ペプチド、ポリペプチド及び核酸を供給する。
【０１０５】
特に、ペプチド、ポリペプチド及び核酸は、細菌のエンドトキシンの活性の調整（例えば、グラム陰性菌において）、免疫調整（例えば、炎症の治療）及び創傷治癒を促進して、微生物によって引き起こされる症状の治療に使用されうる。
【０１０６】
細菌のエンドトキシンの活性の調整（例えば、グラム陰性菌において）、免疫調整（例えば、炎症の治療）及び創傷治癒を促進して、微生物によって引き起こされる症状の治療するための薬の製造における、このようなペプチド、ポリペプチド及び核酸の使用も供給する。
【０１０７】
本発明は、更には、本発明のペプチド、ポリペプチド又は核酸を含む医薬組成物を供給する。これらの組成物は、前記物質に加えて、製薬上許容できる賦形剤、担体、バッファー、安定剤又はこの業界の当業者によく知られている他の物質を含みうる。このような物質は、非毒性であるべきであり、活性成分に効果を妨げるべきでない。担体又は他の物質の厳密な特性は、投与方法（例えば、経口、静脈内、皮膚又は皮下、鼻腔、筋肉内、腹腔内投与）に依存する。魚への投与のためには、当該医薬組成物は、魚を含む水への添加用とすることができる。
【０１０８】
経口投与用の医薬組成物は、タブレット、カプセル、粉末又は液体の形状とすることができる。タブレットには、ゼラチン又はアジュバンドのような固体の担体が含まれるであろう。液体の医薬組成物は、一般的に、水、石油、動物油又は植物油、ミネラルオイル又は合成油のような液体の担体が含まれるであろう。生理的食塩水、ブドウ糖又は他の糖類の溶液、又は、エチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールのようなグリコールが含まれうる。
【０１０９】
静脈、皮膚又は皮下注射、又は病変部位への注射のためには、当該活性成分は、非経口で許容可能な水溶性の溶液（発熱物質を含まず、適切なpHで、等張性及び安定性を有する溶液）の形態としうる。この業界における適切な当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、Ringer注射液、Lactated Ringer注射液のような等張性のベヒクルを用いて、適切な溶液を調製することができる。防腐剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤及び／又は他の添加物を、必要に応じて加えることができる。
【０１１０】
個人に投与されるのが、本発明によるポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、又は、小分子又は他の医薬上有用な化合物であるかに関わらず、好ましくは“予防するのに効果的な量”又は“治療するのに効果的な量”（場合によっては、予防が治療とみなされる場合もあるが）で投与される。これは、個人に対して有用性を示すには十分である。実際の投与量、並びに、投与速度及び投与の時間的経過は、治療すべきものの特質及び重症度に依存するであろう。例えば投与量の決定といった、治療の指示は、一般的な熟練者、他の医者及び獣医の責任の範囲内にあり、一般的に、治療すべき病気、患者のコンディション、吸収部位、投与方法及び熟練者に知られている他の要素を考慮しなければならない。前記の方法及びプロトコールの例としては、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980において見出せる。
【０１１１】
ペプチドは、例えば、注射によって投与でき、又は、例えば、経皮吸収して投与することができる。これらは、この業界で知られている方法にしたがって達成されうる。一般的に、経皮吸収は、選択した皮膚の領域に化合物をゆっくりと吸収させる、経皮“パッチ”の使用を含む。このようなパッチは、一般的に、化合物の浸透性の吸収を行うのに用いられるが、特定部位への伝達（site-directed delivery）が、組織の選択した領域において化合物の濃度を増すのみ用いられると考えられる。経皮パッチ吸収システムの例は、U.S. Pat. No. 4,655,766 (fluid-imbibing osmotically driven system)、U.S. Pat. No. 5,004,610 (rate controlled transdermal delivery system)によって示されている。
【０１１２】
ペプチドの経皮吸収は、好ましくは、U.S. Pat. No. 5,032,109 (electrolytic transdermal delivery system)、及びU.S. Pat. No. 5,314,502 (electrically powered iontophoretic delivery device)に記載されているような、イオン注入方法(iontophoretic method)を用いて実施されうる。
【０１１３】
経皮吸収においては、脂溶性物質（例えば、脂肪族カルボン酸、脂肪族アルコール）又は水溶性物質（例えば、エチレングリコール、1,3-プロパンジオール、グリセロール、プロピレングリコール等のようなアルカンポリオール）のような、浸透促進物質を含むことが望ましいであろう。更には、U.S. Pat. No. 5,362,497に示すように、更に経皮吸収を促進するために、“高吸水性樹脂”を経皮製剤に加えることができる。このような樹脂の例には、制限するものでないが、ポリアクリル酸、ケン化酢酸ビニル-アクリル酸エステルコポリマー、架橋したポリビニルアルコール-無水マレイン酸コポリマー、ケン化ポリアクリノニトリルグラフトポリマー、デンプン-アクリル酸グラフトポリマー等が含まれる。このような製剤は、対象領域への閉鎖された包帯剤として供給され、又は、前記の1以上の経皮パッチ形状で供給されうる。
【０１１４】
他の治療法においては、この業界で知られている方法に従い、調整因子を経口又は経鼻吸入法にて投与することができる。ペプチドの投与においては、この業界で知られている方法に従って、このようなペプチドを、経口又は経鼻吸収に適したマイクロカプセル内に封入することが好ましいであろう。
【０１１５】
本発明によって、また、微生物の増殖を制御する方法を供給する。当該方法は、微生物を、本発明による抗菌活性を有する部分を含むペプチド又はポリペプチドと接触させる工程を含む。好ましい実施態様においては、微生物の増殖は、いくつかの又は全ての微生物を殺すことによって制御される。それゆえ、微生物を、本発明による抗菌活性を有する部分を含むペプチド又はポリペプチドと接触させる工程を含む、微生物を殺す方法も供給する。
【０１１６】
抗菌活性を有する部分を含むペプチド又はポリペプチドを、前記微生物又は微生物群に、in vivo又はin vitroで投与することができる。
【０１１７】
それゆえ、本発明による抗菌活性を有する部分を含むペプチド又はポリペプチドを投与することによって微生物感染を治療する方法を供給する。治療できる生物は、本発明のペプチド又はポリペプチドが抗菌活性を有する微生物に、感染されうる任意の生物であり、例えば、哺乳類、鳥類又は魚類としうる。
【０１１８】
更に、表面又は物体を、本発明による抗菌活性を有する部分を含むペプチド又はポリペプチドと接触させる工程を含む、表面又は物体を消毒する方法を供給する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１９】
本発明の特定の実施態様は、添付の図を参照して説明される。
【実施例】
【０１２０】
物質及び材料
1.1  ライブラリー
2つの異なるニジマスcDNAライブラリーを、λZAP Express kit (Stratagene)を用いて構築した。フィトヘムアグルチニン（PHA）で4時間刺激させたマスの前腎の白血球からRNAを抽出し (Davidson et al., 1999)、Aeromonas salmonicidaで誘発した魚から単離した前腎のマクロファージからRNAを抽出した(Hardie et al., 1998)。RNAをcDNAへ逆転写して、ラムダZAP-CMVベクターへライゲーションした。コンストラクトをファージ(Stratagene)へパッケージし、SMバッファー及びクロロホルム中で、4℃で保存した。
【０１２１】
PCRにより、β-アクチン、IL-1β1及びIL-1β2遺伝子を増幅することによって、ライブラリーの質をテストした。β-アクチンは、全ての細胞タイプで恒常的に発現しているハウスキーピング遺伝子である。IL-1β1及びIL-1β2は、免疫応答で誘導される代表的な遺伝子として用いた。β-アクチン用のプライマーは、
フォワード(5’-ATCGTGGGGCGCCCCAGGCACC-3’)及び
リバース（5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’）とし、
IL-1β1用のプライマーは、フォワードF10(5’-GGATTCACAAGAACTAAGGAC-3’)及び
リバースR3（5’-CTTAGTTGTGGCGCTGGATG-3’）とし、
IL-1β2用のプライマーは、フォワードF4(5’-ACTACAAAACAGCCAACTACAAACC-3’)及び
リバースR8（5’-CTCTGCTGCTGGCTTCAGT-3’）とした。
【０１２２】
PCR反応混合液は以下に従う：1又は2 ulのcDNAライブラリー、1 ulの10 mM dNTPs mix、0.25 ulの5 units/ul Taq DNAポリメラーゼ、5 ulの10X NH4バッファー、1.5 ulの50 mM MgCl2、2 ulのフォワードプライマー、2 ulのリバースプライマー及び35.25 ulのdH2O。サイクリングプロトコールは以下に従う：94℃で5分間初期変性後、94℃で1分間、57℃で1分間、72℃で1分30秒間を35サイクルし、72℃で10分間最終伸張。PCR生成物の予期されるサイズは、β-アクチンで〜500bp、IL-1β1で843bp、IL-1β2で323bpであった。
【０１２３】
1.2  ホスト細胞の調製
ホスト細菌XL-1 Blue MRF’菌株(Stratagene)のグリセロールストックをストリークして、12.5 ug/mlのテトラサイクリン(Sigma)を加えたLB-agarペトリディッシュ上(1 LのdH2O中、10 g NaCl、10 gトリプトン、5 g酵母抽出物、20 g寒天、pH7.0)で、一晩37℃で培養した。その後、シングルコロニーを、10 mM MgSO4及び0.2%(w/v)マルトースを加えた6 mlのLB培地(1 LのdH2O中、10 g NaCl、10 gトリプトン、5 g酵母抽出物、pH7.0)中で、一晩30℃、180 rpmで培養した。細胞を2000 rpm、4℃で10分間遠心分離し、ペレットを6 mlの10 mM MgSO4で懸濁した。
【０１２４】
1.3  ライブラリーのタイター
ライブラリーのタイターを調べるために、1.2で調製した0.6 mlの細胞を、ライブラリーのグリセロールストックの連続した1 ulの希釈液（10-1、10-2、10-3）とともに15分間37℃で培養した。当該混合液に、6.5 mlの溶解させたNZY Top agar (0.7%(w/v)アガロースを加えた、1 LのdH2O中、5 g NaCl、2 g MgSO4・7H2O、5 g酵母抽出物、10 g NZアミン、pH7.5)に加え、150 mm NZY寒天プレート(1 LのdH2O中、5 g NaCl、2 g MgSO4・7H2O、5 g酵母抽出物、10 g NZアミン、15 g寒天、pH7.5)に注ぎ、37℃で細菌の溶菌が生じるまで培養した（約5時間）。プラークをカウントし、pfu(プラーク形成単位(plaque forming unit))を計算した。
【０１２５】
1.4  プラーク転写
1.2で調製した0.6 mlの細胞を、1.5X105 pfuとともに、15分間37℃で培養し、1.3のようにプレート培養した。5時間後、プレートを4℃に移した。ニトロセルロースメンブレンを、それぞれNZY寒天プレート上に2分間置き、ファージプラークをメンブレンに転写した。複写を行い、これらをアガロースプレート上に4分間置いた。方向付けのために、メンブレンにインクが付いた針で印をつけた。メンブレンを2分間、変性溶液(1.5 M NaCl、0.5 M NaOH)に浸し、5分間、中和溶液（1.5 M NaCl、O.5 M Tris-HCl pH 8.0）に浸し、最終的に、30秒間、0.2 M Tris-HCl pH 7.5及び2X SSCバッファーでリンスした。メンブレンを引き上げて、Whatman（登録商標）3MM上で風乾し、UVライト下でクロスリンクさせて、ファージDNAをメンブレンに固定した。プレートは4℃で保管した。
【０１２６】
1.5  マスのIL-1βプローブの調製
鋳型としてPHAで刺激したライブラリーを用い、マスのIL-1βのコード領域の3’末端を含むフラグメントを、フォワードプライマーF8（5’-TCTGAGAACAAGTGC-3’）及びリバースプライマーR3(5’-CTTAGTTGTGGCGCTGGATG-3’)を用いたPCRで増幅させた。PCR反応混合液は以下に従う：3 ulのcDNAライブラリー、1 ulの10 mM dNTPs mix、0.25 ulの5 units/ul Taq DNAポリメラーゼ、5 ulの10X NH4バッファー、1.5 ulの50 mM MgCl2、2 ulのフォワードプライマー、2 ulのリバースプライマー及び35.25 ulのdH2O)。サイクリングプロトコールは以下に従う：94℃で5分間初期変性後、94℃で45秒間、57℃で45秒間、72℃で1分間を35サイクルし、72℃で10分間最終伸張。PCR生成物の予期されるサイズは、454bpであった。生成物は、0.8%アガロースゲル上で分離した。バンドを可視化するために、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、正しい分子量を有していることを確認した。その後、QIAGEN gel extraction kitを用いて、アガロースゲルからPCR生成物を抽出し、濃縮物をTEバッファーで25 ng/mlに希釈した。抽出したDNA由来のサンプルの配列を読み、ヌクレオチド配列がIL-1βであることを確認した。
【０１２７】
ハイブリダイゼーションに先立ち、DNA labeling kit (-dCTP) Ready To Go (Pharmacia Biotech)を用いてIL-1βプローブを32P標識した。反応混合液のチューブには、dATP、dGTP、dTTP、FPLC pure（登録商標）クレノーフラグメント(4-8 units)及びランダムオリゴデオキシリボヌクレオチド（主として9塩基長）からなる不透明なペレットを含んでいた。チューブの中身に20 ulの蒸留水を加えて再懸濁させて、1時間氷上に置く。この間に、50 ngのDNAプローブを25 ulのTEバッファーで希釈し、2-3分間、95-100℃で加熱することによって変性させた。その後、DNAを2分間氷上に戻し、簡単に遠心分離後、再び調製した反応混合液を加えた。5 ulの（α-32P）-dCTP (300 Ci/mmol)を混合液に加え、37℃で5-15分間反応させた。その後、プローブを準備した。
【０１２８】
1.6  ハイブリダイゼーション及び放射線によるスクリーニング
1.4で得られたメンブレンを、ガラスシリンダーに入れ、20 mlのプレハイブリダイゼーションバッファー(Amersham Pharmacia)中で、1時間65℃で、攪拌しながらプレハイブリダイゼーションを行った。その後、50 ulの32P標識IL-1βプローブ（1.5参照）をシリンダーに加えて、オーブン中で55℃4時間、攪拌しながら反応させた。過度の非特異的なハイブリダイゼーションを減らすために、60℃で、SDS（Sigma）を加えた異なる濃度のSSC(20X SSC: 3 M NaCl、0.5 Mクエン酸ナトリウム pH7)を用いて、以下のように厳しく洗浄した：2X (2X SSC + 0.1% SDS  20分間)、2X (0.2X SSC + 0.1 % SDS 20分間)、及び最終洗浄0.1X SSC + 0.1% SDS  15分間。その後、メンブレンをクリーンなフィルムでラップし、カセット内でKodakフィルムに露光した。フィルムを24時間後に現像した。
【０１２９】
1.7  ポジティブファージの選択及び抽出
位置づけしたマーカーに従って、それぞれのメンブレンの現像したフィルムを複製物の上にのせた。両方のフィルムに存在するドットが、IL-1βハイブリダイゼーションのポジティブであり、残りは、擬似ポジティブである。ポジティブファージに対応するエリアを選択し、滅菌した100 ulチップの先端を用いて、寒天プレートから取り出した。20 ulのクロロフォルム(Sigma)を加えた500 ulのSMバッファー(lリットル：5.8 g NaCl、2.0 g MgSO4・7H2O、50 ml 1M Tris-HCl pH 7.5、5ml 2%(w/v)ゼラチン、H2Oで1リットルに定容)を含むエッペンドルフチューブ内に、それぞれの円筒寒天を入れた。ファージ粒子の放出を容易にするために、チューブをボルテックスにかけ、その後、一晩4℃で培養した。
【０１３０】
1.8  ポジティブファージのPCRスクリーニング
放射線スクリーニングで得られたポジティブドットに対応するエリアから取り出したファージミックスをPCRでスクリーニングし、既知のIL-1β1又はIL-1β2のcDNAを含むファージミックスを除いた。この目的のために、ファージのタイターを増加させなければならなかった。
【０１３１】
XL-1 Blue MRF’菌株(Stratagene)細胞を、一晩、LB培地中37℃で、200 rpmで培養した。次の日、培地を1500 rpmで10分間遠心分離して細胞をペレットにし、昨晩に使用した培地の倍の量で再懸濁した。150 ulの細胞懸濁液を、SMバッファー中のファージストック（1.7参照）に加え、37℃で15分間培養し、ファージを細胞に吸着させた。混合液を、1 mM MgCl2を加えた2.5 mlのLB培地加え、37℃、200 rpmで、全体の細菌が溶菌するまで（約4-6時間）培養した。粘度を下げるために、25 ngのDNase I (Sigma)を用いて30分間37℃で混合液を反応させ、溶菌の間に溶出される細菌DNAを分解した。
【０１３２】
その後、2.5 mlの10 mM Tris-HCl pH8を加え、溶菌液を2500 rpmで30分間遠心分離して、残骸をペレットにした。放出されたファージを含む上清を、新しいチューブに入れ、クロロホルムを滴下して4℃で保存した。
【０１３３】
これらの上清は、IL-1β遺伝子を含むファージを同定及び排除するためのPCR反応における鋳型として用いた。用いたプライマーは、IL-1β1及びIL-1β2遺伝子を両方増幅することができる、フォワードF4(5’-CGAATTCATGGATTTGAGTCA-3’)及びリバースR3（5’-CTTAGTTGTGGCGCTGGATG-3’）とした。PCR反応混合液は以下に従う：5 ulのファージミックス、1.5 ulの10 mM dNTPs mix、0.125 ulの5 units/ul Taq DNAポリメラーゼ、2.5 ulの10X NH4バッファー、0.75 ulの50 mM MgCl2、1.5 ulのフォワードプライマー、1.5 ulのリバースプライマー及び12.125 ulのdH2O。サイクリングプロトコールは以下に従う：95℃で5分間初期変性後、94℃で1分間、58℃で1分間、72℃で1分30秒間を35サイクルし、72℃で10分間最終伸張。PCR生成物の予期されるサイズは、784bpであった。
【０１３４】
1.9  放射線スクリーニングの第二ラウンド
IL-1βプローブとハイブリダイズするが、PCRスクリーニングではネガティブな結果となるファージ（すなわち、IL-1β1又はIL-1β2遺伝子を含まない）を、32P標識したIL-1βプローブを用いて二回目のスクリーニングを行い、シングルクローンを得た。1.7で得られたストックファージを、dH2Oで1:100に希釈し、1 ulの希釈液を、1.2で調製した200 ulの細胞に加えた。混合液を37℃で15分間培養し、1 mlのNZY top agarに加え、NZY寒天ペトリディッシュに注いだ。ペトリディッシュを37℃で、溶菌が観察されるまで静置し、その後、4℃に移した。プラーク転写を1.4のように行い、前記のようにIL-1βプローブを用いてメンブレンをハイブリダイズした。複写物との比較により、ポジティブファージの同定を行うことができ、その後、1.7のように、寒天から取り出した。
【０１３５】
1.10  PCRスクリーニングの第二ラウンド
放射線スクリーニングの第二ラウンドの結果として得られたシングルファージを、再び、PCRに供して、前記のように、IL-1β1又はIL-1β2遺伝子のcDNAを含むファージではないことを確認した。更なるPCR反応を行い、IL-1β1/2の増幅が見られなかった場合に、ラムダZAP-CMV XRベクターが存在しているかを確認した。用いたプライマーは、T3(5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’)及びT7(5’-CATTATGCTGAGTGATATCCCG-3’)とした。PCR反応混合液は以下に従う：5 ulのファージミックス、1.5 ulの10 mM dNTPs mix、0.125 ulの5 units/ul Taq DNAポリメラーゼ、2.5 ulの10X NH4バッファー、0.75 ulの50 mM MgCl2、1.5 ulのフォワードプライマー、1.5 ulのリバースプライマー及び12.125 ulのdH2O。サイクリングプロトコールは以下に従う：94℃で4分間初期変性後、94℃で1分間、62℃で1分間、68℃で15分間を10サイクルし、その後、94℃で40秒間、62℃で40秒間、68℃で15分間+20秒間/サイクルを22サイクルし、68℃で10分間最終伸張。ラムダZAP-CMV XRベクターが10 kpの長さまでの配列を挿入することができることから、著しく長い伸張時間が必要であった。
【０１３６】
それゆえ、IL-1β1/2にネガティブであるが、ベクターにはポジティブであるクローンは、ベクター中に挿入断片（IL-1β1/2のcDNAでない挿入断片）を含んでいた。
【０１３７】
1.11  切断
ラムダZAP-CMV XRベクターに挿入されたDNAを解析し配列を決定するために、フラグメントを、ファージミドとしてベクターから切断しなければならない。ExAssistヘルパーファージをXLOLR菌株とともに用いて、効率的に、ラムダZAP-CMV XRベクターからpCMVScript EXファージミドベクターを切断した。ExAssistヘルパーファージは、XLOLR細胞内での複製を妨げる変異を有しているので、唯一、切断されたファージミドのみがホスト内で複製されるであろう。
【０１３８】
XL-1 Blue MRF細胞を、1.2のように一晩培養した。220 ulのMRF、1.9で得られた250 ulのファージストック、及び1 ulのExAssistヘルパーファージを、37℃で15分間培養し、感染を行った。その後、混合液を3 mlのNZYブロスに加え、37℃で一晩培養し、MRF細胞中でラムダベクターから挿入断片がin vivoで切断できるように、ExAssistファージに時間を与えた。次の日、培地を70℃で20分間加熱処理して、ラムダファージを溶菌した。ファージミドは、この処理によって影響を受けなかった。その後、培地を15分間1000 gで遠心分離し、ファージミドを含む培地を集めた。
【０１３９】
XLOLR菌株培養液を30℃、200 rpmで、NZYブロス（1L: 5g NaCl、2 g MgSO4・H2O、5 g酵母抽出物、10 g NZアミン（カゼイン加水分解物）、pH 7.5）中で一晩培養した。24時間後、細胞をスピンダウンし、一晩培養した時に用いたのと同じ容量の10 mM MgSO4・H2O中で再懸濁した。その後、10 ulの上清を、200 ulの新しく調製したXLOLR細胞と、37℃で15分間培養し、感染を行った。これに、300 ulのNZYブロスを加え、37℃で45分間保った。200 ulの混合液を、カナマイシン(50 ug/ml)を加えたLBプレートにまき、一晩37℃で放置した。カナマイシンによって、ファージミドを含むクローンが選択されるであろう。更に、プレートにつき4つのクローンを、ユニバーサルプライマーT3及びT7を用いたPCRによって解析した。PCR混合液及びサイクリングプロトコールは1.10と同じとした。これらのクローンを、5 ml LB-カナマイシン培地に移し、一晩37℃で培養した。Miniprep kit (QIAGEN)を用いて、DNAファージミドをXLOLR細菌から抽出した。DNAを、250 ng/mlになるように抽出し、ABI 377 自動シークエンサー(Applied Biosystems, UK)を用いて配列決定した。
【０１４０】
1.12  配列解析
配列は、一連のFASTA (Pearson and Lipman, 1988)及びBLAST (Altschul et al., 1990)プログラムを用いて、既知の配列との類似性で解析した。DNA配列とIL-1βの直接の比較は、Wisconsin Genetics Computer Group (GCG) Sequence Analysis Software Package (Version 9.1, 1997)において、GAPプログラム (Needlleman and Wunsch, 1970)を用いて行った。複数の配列のアライメントは、Clustal W (version 1.74, 1997; (Thompson et al., 1994)を用いて行った。蛋白質構造の解析は、web-based tool SMART (Schults et al., 2000; Schults et al., 1998)を用いて行った。
【０１４１】
1.13  抗菌ペプチド発現実験
100 umナイロンメッシュを通して前腎組織をバラバラにすることによって、ニジマスの前腎白血球をを得た。洗浄後、白血球をL15倍地 (Gibco)で懸濁し、以下のように刺激を与えた：
(A) LPS時間経過：細胞を5 ug/mlのE. coli O127：リポ多糖（LPS、Sigma）で、異なる時間（0、0.5時間、1時間、2時間、3時間、4時間）刺激した。
(B) 転写/翻訳阻害：LPS誘導(5 ug/ml)3時間後に、StreptomycesのアクチノマイシンD (Sigma)を100 ng/mlで細胞に加え、転写を阻害した。その代わりに、LPS誘導(3時間後に（前記のように）、10 ug/mlのシクロヘキシミドを細胞に加え、翻訳を阻害した。
(C) 異なる誘導因子：5 ug/mlのフィトヘムアグルチニン (PHA, Sigma)、25 ng/mlのホルボールミリステートアセテート(PMA, Sigma)単独、又は5X10-7 Mのカルシウム・イオノフォア (Sigma)との組み合わせを細胞に約4時間加えた。
【０１４２】
当該時間の終了時に、取扱説明書に従いRNAzol B (Biogenesis)を用いて、約2X107細胞からトータルRNAを単離した。その後、RNAを逆転写してcDNAとし、生成物を、マスのカセリシジン遺伝子及びβ-アクチンのポジティブコントロールとしてPCRの鋳型に用いた。カセリシジン遺伝子の増幅に用いたプライマーは、fF1 (5’-CATCCTGCTCGCTGTGGCTGTCC-3’)及びR1 (5’-CCTCCAGAATCGGATGTCTGACC-3’)、及びβアクチン用としては、フォワード(5’-ATGGAAGATGAAATCGCC-3’)及びリバース(5’-TGCCAGATCTTCTCCATG-3’)とした。PCR反応混合液は以下に従う：5 ulのファージミックス、1.5 ulの10 mM dNTPs mix、0.125 ulの5 units/ul Taq DNAポリメラーゼ、2.5 ulの10X NH4バッファー、0.75 ulの50 mM MgCl2、1.5 ulのフォワードプライマー、1.5 ulのリバースプライマー及び12.125 ulのdH2O。サイクリングプロトコールは以下に従う：94℃で4分間初期変性後、94℃で45秒間、62℃で45秒間、72℃で1分間を30サイクルし、72℃で10分間最終伸張。生成物の予想されるサイズは、カセリシジン遺伝子で320bpであり、β-アクチンで260bpであった。
【０１４３】
結果
用いたcDNAライブラリーの質を評価するために、鋳型としてライブラリーを用いたPCRによって、3つの遺伝子を増幅した。第一の遺伝子、β-アクチンは、全ての細胞のタイプで恒常的に発現しているハウスキーピング遺伝子である。IL-1β1及びIL-1β2は、免疫応答の間に誘導される代表的な遺伝子として用いられた。ライブラリー中にIL-1βのcDNAが存在することは、IL-1βとよく似た条件下で誘導される他の遺伝子由来のcDNAが存在するであろうことを示唆する。
【０１４４】
図１で示すように、PHAで刺激した白血球由来のライブラリー及び魚の病原菌Aeromonas salmonicidaで誘発したマクロファージから得られたライブラリーの両方で、β-アクチンが存在した。IL-1β1及びIL-1β2のcDNAも、両方のライブラリーから増幅された。
【０１４５】
実験を続けるのに、PHAライブラリーを選択した。タイターを求めたところ、1.45X108 pfu/mlであった。
【０１４６】
2.1   IL-1βプローブを用いた第一ラウンドのスクリーニング
トータルで6プレート(14 cm φ)を解析した。ハイブリダイゼーション後の擬似ポジティブとポジティブを区別するために、1枚のプレートにつき2枚の複製メンブレンを得た。フィルムを現像し、位置確認の印で合わせた後に複製フィルムを比較してみると、プレートあたり約160のポジティブドットが得られた。図２に、IL-1βプローブでハイブリダイズした後の一枚のプレートから得られた複製フィルムの例を示す。矢印は、位置確認の印を示し、いくつかのポジティブクローンを○で示す。このことは、ストックライブラリー中の約1％のファージが、実験で定められた条件で、IL-1βプローブにハイブリダイズすることを示す。
【０１４７】
トータルのポジティブファージが多い（960）という理由から、ナンバー1プレートのみ次の工程で用いた。フィルム上でポジティブドットに対応する、寒天プレート上のエリアを取り出し、SMバッファー及びクロロホルム中に入れた。
【０１４８】
2.2  第一ラウンドPCRスクリーニング
選択したエリアがIL-1β1又はIL-1β2を含んでいないことを確認するために、SMバッファー中のファージストックサンプル（2.1参照）を増やして溶菌し、前記遺伝子についてのPCRを行えるようにした。プレートあたりのポジティブの数が大変多いので、38ファージストックのみ解析した。
【０１４９】
プライマーF4/R3（図３）を用いたIL-1β1/2についてのPCRにより、トータル38のファージストックから21がポジティブの結果となったので、これらを捨てた。この値により、IL-1β1にハイブリダイズしたファージの約55％がIL-1β1又はIL-1β2のcDNAを保持していることが示された。
【０１５０】
2.3   IL-1βプローブを用いた第二ラウンドスクリーニング
個々のファージを単離するために、第二ラウンドを行った。SMバッファー中に入れたストック（2.1参照）の10-2希釈液により、プレートあたり適度な数のプラークが得られたが、寒天からファージを取り出す際、コンタミを避けるのに十分に分離していた。フィルム中のポジティブドットに対応するエリアから取り出したストック（2.1参照）であり、IL-1β1/IL-1β2のPCRでネガティブ（2.2参照）であった10のみを、第二ラウンドスクリーニングに供した。これらのストックは、全てプレートナンバー1由来の、6、7、9、10、12、14、19、20、22及び24であった。多くのポジティブが必要でないので、第二ラウンドは小さなペトリディッシュで行った。プレートあたりのプラークの数が少なく、ドットがプラークに対応しているか否かを判明するのは容易であることから、この場合、複製は必要なかった。トータル79のポジティブファージが観察された。第二ラウンドスクリーニング後の二枚のプレートに由来するフィルムの例を図４に示す。ポジティブクローンを、ドットで示す。
【０１５１】
2.4  第二ラウンドPCRスクリーニング
2.3で得られたポジティブファージを寒天プレートから取り出し、SMバッファー及びクロロホルム中に入れ、溶菌液について、第一ラウンドのようにPCRを用いてIL-1β1/IL-1β2の存在を解析した。今回は、全てのプラークがPCRで増幅しなかった。このことは、IL-1βプローブにハイブリダイズするので、それぞれのファージに含まれるcDNAはIL-1βに類似しているが、IL-1β1/2に特異的なプライマーを用いたPCRで増幅されないことから（図５）、挿入された配列はIL-1β1又はIL-1β2のcDNAではないことを示している。
【０１５２】
IL-1β1/2についてのPCRにおけるネガティブな結果が、ファージの取り出し、増殖又は溶菌の際の問題に起因する、ファージDNAが存在していないことが原因でないことを確認するために、ラムダZAP-CMV XRベクターにおける挿入部位に近接する配列をコードするユニバーサルプライマーT3及びT7を用いて、別のPCRを行った（図６）。ほとんど全てのサンプルについて、バンドが増幅された。このことは、既知のIL-1β遺伝子に対応しない、cDNA挿入断片を有するファージベクターが存在していることを示している。
【０１５３】
2.5  切断
ファージ内の挿入断片を切断し、ファージミドとしてクローニングした。この形態において、ファージミドは感染でき、XLOLR細胞内で増殖できる。カナマイシン選抜下では、ファージミドを含む細胞のみアガロースプレート上で増殖する。ファージミド中に存在する挿入断片のサイズを評価するために、ユニバーサルプライマーT3及びT7を用いたPCRによって、プレートあたり4つのクローンを解析した（図７）。
【０１５４】
2.6  配列解析
DNAファージミドXLOLR細胞から取り出し、配列を決定した。ヌクレオチド配列及びその翻訳について、同定するために、3つの異なる読み枠で、データーベースに存在する他の配列と比較した。得られた配列をIL-1βプローブ配列とアライメントし、最も良くアライメントした領域について、ヌクレオチドの同一性を比較した。高度に一致（98%）していることを示したIL-1β1遺伝子の先端が切り取られた形態を除き、得られた値の幅は、32%と44%の間で変動した。
【０１５５】
2.7  マスの抗菌ペプチド（Trout Bactenecin）
配列を決定した41のクローンのうち1つ（クローン6-3とする）は、図８で示す配列を有していた。FASTA検索により、この配列はカセリシジンファミリーに属することが示された。ブタ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、マウス及びヒトを含むことが知られているが、このことは、このファミリーの非哺乳類の最初の例であると考えられる。
【０１５６】
配列を決定したクローンのトータルの長さは、833bPであり、不完全な5’末端、ライブラリーからクローニングされた遺伝子において頻度が高い、+793でのポリアデニル化部位を含む3’UTR、及び18bpの長さのpoly A tailを有していた。当該クローンは、214のアミノ酸プレプロペプチドをコードする不完全なオープンリーディングフレームを含む。最初の20のアミノ酸はシグナルペプチドと特徴付けられ、少量のオープンリーディングフレームがこのクローンから欠落していることが示された。
【０１５７】
当該プロペプチドは、Q21残基から始まり、2つのカセリン特徴的配列（28-44、75-97；配列番号６及び８）を含む。図９は、以下の既知のカセリシジンから得られた配列とのカセリン特徴的配列のアライメントを示す。
【０１５８】
【表１】
2005536182.tif 000005
【０１５９】
当該プロペプチドは、更に、部位82-93及び104-128のシステイン残基を結合させる、2つのジスルフィド結合を含むことが予想される。これらは、概略図として、図１０に示す。ジスルフィド結合によって、当該分子になるように構造的な制約を課していると考えられる。カセリシジンのプロペプチドは、通常、C末端のバリン残基で、エラスターゼによって切断され、活性な成熟ペプチドが得られる。Val127は、同じファミリーの他の既知ペプチドの他のバリン残基と位置が合うが、この部位での切断には、フリーな成熟ペプチドが生成するために、残基104と128の間のジスルフィド結合を切断する必要がある。それゆえ、Val148が、エラスターゼ切断部位であるかもしれない。プロペプチド領域は、カセリシジンファミリーの他の哺乳類のプロペプチド領域と、29%未満のアミノ酸類似性を有していることがわかった。
【０１６０】
それゆえ、成熟ペプチドはArg149で始まることが予想され、長さが66アミノ酸であることが予想される。他のカセリシジンの成熟ペプチドと、予想されるマスのカセリシジン成熟ペプチドとのアライメントを、図１１で示す。
【０１６１】
当該マスのペプチドは、カセリシジンファミリーの5つのサブグループのうちの、2以上のサブグループの特徴を有する。このペプチドは、ドデカペプチドファミリーの特徴である、分子内ジスルフィド結合と、プロピン及びアルギニンが多いペプチド（ブタのプロフェニン類、並びに、ウシ及びヒツジのバクテネシン類）の特徴である、プロリン及びアルギニンが多い九量体配列(PRG-G/V-GS-X-I/P-G)の4つのタンデムリピートの両方を有している。結果として、マスのカセリシジンは、プロリン及びアルギニンが豊富なペプチドに分類され、tourt bactenecinと命名した。
【０１６２】
2.8  全長ORFの配列
cDNAの5’末端は、GeneRacer (商標) kit (Invitrogen Corp. Cat. No. L1500-01)を用いた5’RACER PCRによって得られた。cDNAの鋳型は、腹腔内注射によって細菌のCpGオリゴヌクレオチドで刺激したマスから得られた前腎白血球から抽出したmRNAを用いた。用いたフォワードプライマーは、当該キットに付属のものとしたが、リバースプライマーは、ACAATTTTTGCCTCTGGAGCATATTCT(一回目のPCR用)及びCACAAACAAATGTAGACAGGTCAGTGTT（ネストPCR用）とした。得られた全長配列を配列番号２０として示し、予想されるアミノ酸配列を配列番号２１として示す。これらの配列は、ORFで同定された一塩基多型を示す。
【０１６３】
2.9  ゲノムDNAの配列
Universal GenomeWalker（商標）kit (CLONTECH Inc. Cat. No. K1807-1)を用いたGenomeWalker PCRにより、ゲノム配列を求めた。DNAの鋳型は、ニジマスの前腎から抽出した。フォワードプライマーはキットに付属のものとし、リバースプライマーは5’RACER PCRで用いたのと同じものとした（前記参照）。得られた配列を図１５で示す。
【０１６４】
遺伝子は、4つのエキソン/3つのイントロンを有することが示され、既知の哺乳類の配列から予想されるように、予想される機能を有するペプチドは、完全にエキソン4の中に存在する。5’フランキング（恐らくはプロモーター）配列は、予想されるTATAボックスを含む。
【０１６５】
2.10  発現実験
trout bactenecin遺伝子の発現がどのように制御されているかを研究するために、時間を経過させて実験を行った。マスの前腎のトータル白血球を一匹の魚から単離し、5 ug/mlのLPSで刺激した。刺激した細胞から調製したcDNAについて、trout bactenecin遺伝子に特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行ったところ（パラグラフ1.13）、LPSを添加して2時間後に遺伝子の発現が最大になり、その後迅速に減少した（図１２参照）。このことにより、mRNAが非常に厳密に制御され、迅速に分解されることが示された。
【０１６６】
ホルボールミリステートアセテート（PMA）、PNA + カルシウム・イオノフォア(PMA + CaI)、及びフィトヘムアグルチニン（PHA）についても、白血球におけるtrout bactenecin発現誘導能のテストを行った（図１３）。唯一PMA + カルシウム・イオノフォアでの誘導後4時間においてのみ、発現が誘導されるという結果が得られた。以前の実験では、LPS刺激では4時間後に検出されなかったので、この結果は興味深いものであった。
【０１６７】
更にこのことを調べるために、LPSで刺激した前腎のトータル白血球に対する、アクチノマイシンD（Act D）を用いた転写阻害及びシクロヘキシミド(CHX)を用いた転写阻害の影響を調べる実験を行った。
【０１６８】
結果を図１４に示す。レーンは以下のようにマーク付けした；4LPS - LPSでの4時間培養；7LPS - LPSでの7時間培養。Act D及び／又はCHXで治療するために、LPS刺激3時間後に、細胞に以下を加えた：4Act -アクチノマイシン（1時間）；7Act -アクチノマイシン（4時間）；4CHX -シクロヘキシミド（1時間）；7CHX -シクロヘキシミド（4時間）；7A-CHX - アクチノマイシン及び1時間遅れでシクロヘキシミド（3時間）。上のゲルは、β-アクチンコントロールを示し、下のゲルはtrout bactenecinを示す。
【０１６９】
この場合、LPS刺激後の最大の発現は、7時間後に検出された。LPSの時間経過から得られた結果によると、発現には2つのピークが存在し、最初はLPS添加後たった2時間という非常に早期に見られ（本実験では検出できず）、次はLPS刺激の7時間後に検出された。
【０１７０】
LPS刺激後3時間でアクチノマイシンDを加えると、trout bactenecinの発現を完全に阻害した。このことから、LPSを用いた刺激後7時間で観察された転写は、新たに転写されたものであることが示唆された。このことは、4時間LPSでは発現が見られないことから予想される。シクロヘキシミド（翻訳阻害剤）は、bactenecin遺伝子の過誘導を引き起こすことはなく、このことから、如何なる不安定な抑制剤もbactenecin発現の制御に従事していないことが示唆された。転写及び翻訳の両方が阻害されている場合、発現の迅速な減少が観察されることから、bactenecinの発現は、主に新規に転写されたmRNAに依存し、いったん合成されると容易に分解されやすいことが示唆された。観察された低い発現は、mRNAの分解に従事する酵素の合成が欠如するために、わずかにmRNAが安定になることが原因であろう。
【０１７１】
前記の発明は、明確にして理解するために、説明及び実施例を通して詳細に記載したが、本発明の技術に照らして、この業界における当業者が、本請求の範囲の精神又は範囲を離れることなく、特定の変化や修飾を行いうることは容易に明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１は、本研究で用いられるcDNAライブラリーの質をテストするための、β-アクチン、IL-1β1及びIL-1β2用のプライマーを用いたPCRの結果を示す。
【図２】図２は、メンブレンを放射線標識したIL-1βプローブとハイブリダイゼーションさせた後の、1つのプレートから複製したファージプラーク転写メンブレンのX線撮影用のフィルムを示す。
【図３】図３は、IL-1β1及びIL-1β2遺伝子を含むサンプルを同定するための、IL-1β1及びIL-1β2に特異的なプライマーを用いた、第一ラウンドのファージのPCRスクリーニングを示す。
【図４】図４は、放射線標識したIL-1βプローブを用いた、ファージプラーク転写の第二ラウンドスクリーニング後の、二枚の異なるプレートからのフィルムを示す。
【図５】図５は、IL-1β1及びIL-1β2遺伝子を含む任意の遺伝子を同定するための、第二ラウンドのファージのスクリーニングを示す。
【図６】図６は、ファージDNAの存在を確認するための、フランキングファージ配列に特異的なプライマーT3及びT7を用いたファージ挿入断片のPCR増幅を示す。
【図７】図７は、挿入断片のサイズを解析するための、フランキングファージ配列に特異的なプライマーT3及びT7を用いたファージ挿入断片のPCR増幅を示す。
【図８】図８は、cDNAクローン6-3のヌクレオチド配列及び予想されるアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、既知のカセリシジンとマスのカセリン特徴的配列のアライメントを示す。
【図１０】図１０は、マスのカセリシジンの構造の略図である。
【図１１】図１１は、既知のカセリシジンの成熟ペプチドとマスのカセリシジン成熟ペプチドのアライメントを示す。
【図１２】図１２は、LPSで刺激させたマスの前腎の白血球における、β-アクチン及びマスのカセリシジンの発現のRT-PCR解析を示す。
【図１３】図１３は、ホルボールミリステートアセテート、ホルボールミリステートアセテート＋カルシウム・イオノフォア、又はフィトヘムアグルチニンで刺激させたマスの前腎の白血球における、β-アクチン及びマスのカセリシジンの発現のRT-PCR解析を示す。
【図１４】図１４は、LPSで刺激させたマスの前腎の白血球における、β-アクチン及びマスのカセリシジンの発現に対するアクチノマイシンD及びシクロヘキシミドの影響を示す。
【図１５】図１５は、コード配列、イントロン及びフランキング領域とともに、ゲノム配列及びマスのカセリシジン遺伝子の組成を示す。非コードヌクレオチド配列は小文字で示し、コード配列は大文字で示す。予想される、エキソンのアミノ酸配列は影をつける。推定されるTATAボックスは輪郭をつける。
【図１】
2005536182.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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