(57)【要約】本発明は、トコトリエノールに富んだ調整物を製造する方法に関するものであって、植物種子を電解質栄養溶液と共に培養してトコトリエノールに富んだ植物種苗を形成するステップと、植物種苗を収穫するステップと、その収穫した植物種苗から、特に、その収穫した植物種苗のぬかおよび胚芽（胚種）からトコトリエノールを含有する調整物を抽出するステップとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トコトリエノール富化調整物を製造する方法であって、次のステップ：
−植物種子を電解質栄養溶液と共に培養してトコトリエノールが富化した植物胚芽を形成するステップ、
−前記植物胚芽を回収するステップ、および
−前記回収した植物胚芽、特に前記回収した植物胚芽のぬかおよび胚種(germs)からトコトリエノールを含有する調整物を抽出するステップ
により特徴づけられる方法。
【請求項２】
前記植物種子が、クルミ、コムギ、ヒマワリ、ヤシ、ライムギ、オオムギ、オートムギ、アマランス、キノア、イネの種子またはこれら種子の混合物から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物胚芽を抽出する前に乾燥することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物胚芽を抽出する前に粉砕することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抽出を、油状抽出物を得ることにより行うことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抽出を、超臨界ＣＯ2またはヘキサンを用いて実施することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
培養を、１０から４０℃まで、好ましくは１５から３０℃、特に１９から２１℃の温度で行うことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１リットルの栄養溶液が、バナジウムイオン、セレン酸イオン、モリブデン酸イオン、コバルトイオン、クロム（ＩＩＩ）イオン、マンガンイオン、ストロンチウムイオン、リチウムイオン、銅鉄（ＩＩＩ）イオン、亜鉛イオン、グルコン酸イオン、クエン酸イオン、乳酸イオン、またはこれらイオンの組合せを、０．１から１０００ｍｇまで、好ましくは１から５００ｍｇまで、特に３から１００ｍｇまでの量で含有することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抽出を、オートクレーブおよび圧力分離装置を用い、互いに独立して、オートクレーブの圧力を、１００バール以上、好ましくは２００バール以上、特に２５０バール以上とし、分離装置の圧力を、２０バール以上、好ましくは３０バール以上、特に４５バール以上とし、オートクレーブの温度を、３０℃以上、好ましくは４０℃以上、特に５０℃以上とし、分離装置の温度を、２０℃以上、好ましくは３０℃以上、特に４０℃以上として行うことを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
培養を少なくとも１回、好ましくは前記栄養溶液を交換して少なくとも２回、特に少なくとも３回行うことを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法によって得られるトコトリエノール富化植物胚芽またはトコトリエノール富化調整物。
【請求項１２】
トコトリエノール富化コムギ胚芽またはトコトリエノール富化コムギ胚芽調整物であって、それらが、乾燥材料のｋｇ当り５００ｍｇ以上、好ましくは乾燥材料のｋｇ当り１０００ｍｇ、特に乾燥材料のｋｇ当り２０００ｍｇのトコトリエノール含量を有することを特徴とするコムギ胚芽またはコムギ胚芽調整物。
【請求項１３】
トコトリエノール富化オオムギ胚芽またはトコトリエノール富化オオムギ胚芽調整物であって、それらが、乾燥材料のｋｇ当り１５００ｍｇ以上のトコトリエノール、好ましくは乾燥材料のｋｇ当り５００ｍｇのγ−トコトリエノール、特に乾燥材料のｋｇ当り２００ｍｇのβ−トコトリエノール含量を有することを特徴とするオオムギ胚芽またはオオムギ胚芽調整物。
【請求項１４】
請求項１１から１３のいずれか一項に記載のトコトリエノール富化植物胚芽またはトコトリエノール富化調整物を含むトコトリエノール含有調整物。
【請求項１５】
医薬活性物質、医薬補助薬、食品技術製品、または食品技術添加剤をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載のトコトリエノール含有調整物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トコトリエノール富化調整物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ数十年間、一般的な栄養科学は、主として栄養素（タンパク質、炭化水素、脂肪、ビタミン、ミネラル物質、および微量栄養素）をそれら「栄養に関する」特性についてアッセイすることのみ（すなわち、構成上のおよび利用できる代謝作用を確定すること）に限られていたが、近年、栄養科学の関心は、次第に、いわゆる第２の植物性物質（植物化学物質）に集中している。これらの天然物質は、定義によれば伝統的な栄養素の中には数えられないが、それらは、それにもかかわらず、多くの生物学的作用を有しており、それ故、それらはまた「生物活性植物性物質」とも呼ばれる。
【０００３】
トコトリエノールは、この範疇の植物性物質に属するが、わずかながらもビタミンＥ活性を示すために、ビタミン類の中に数えられる。このビタミンＥ活性とは別に、トコトリエノールは、コレステロール低下特性、細胞保護特性、および抗酸化特性を有している。抗酸化物質は、分子レベルでパートナー分子に電子を移動する能力があることを特徴とし、所定の個々の分子の化合物に電子を移動するこの能力は、いわゆる標準酸化還元電位により定量化され、さらに、抗酸化性混合物に対しては、いわゆる抗酸化能（還元能）により表現される。合成トコフェロール類と比較して、トコトリエノール類の抗酸化潜在能力は−評価媒体および評価方法により−５０倍から１，０００倍高いことが記述されている。
【０００４】
それらの分子構造により、トコトリエノール類は、主に油脂に溶解し、ヒトおよび動物組織中で主として脂肪親和性のコンパートメント（細胞内および細胞外の生体膜）内で生物活性を発揮する。脂肪親和性の抗酸化物質は、したがって、核（遺伝物質）、ミトコンドリア（細胞エネルギー供給）、小胞体（細胞合成能力）の範囲内にあって、ならびに細胞膜に対して、重要な生物学的役割（組織の安定性および寿命）を果たす。この理由から、トコトリエノールは、それらの基本的な栄養の目的以上に、遺伝物質の保護（過酸化物、ラジカルおよび生体異物に損傷を与えることによる突然変異に対する保護）、最適な細胞エネルギー供給（免疫細胞および臓器細胞の能力）、細胞合成能（免疫系および組織の再生の可能性）、ならびにすべての体細胞の機能および寿命に極めて重要なものである。特に、神経系統もまた、中枢神経系は、５０％より多くが類脂質物質からなる末梢神経系と同じように、脂肪親和性の抗酸化物質によるその構造の十分且つ恒久的保護を当てにしている。トコトリエノール類を応用する栄養医療分野は、したがって、免疫系（アレルギー、癌）と、同時に、循環系（狭心症、心筋梗塞予防およびアフターケア）、筋肉／腱／関節系（変形性ミオパシーおよび関節症）、解毒臓器としての肝臓（環境が引き起こす疾患）、皮膚（アトピー性疾患、老化）、そして最後に、神経系統の退行変性過程（多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄および末梢神経疾患および外傷の続発症）を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、トコトリエノールを含有する生産物、とりわけ、特に高いトコトリエノール含量を有する天然産物を提供することへの要求がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、トコトリエノール富化調整物を製造する方法に関するものであって、前記方法は、次のステップ、
−植物種子を電解質栄養溶液と共に培養してトコトリエノールが富化した植物胚芽を形成するステップ、
−前記植物胚芽を回収するステップ、および
−前記回収した植物胚芽、特に前記回収した植物胚芽のぬかおよび胚種(germs)からトコトリエノールを含有する調整物を抽出するステップ
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
植物胚芽のトコトリエノール含量は、他の密接に関係する例えばトコフェロール類等の抗酸化性の第２の植物性物質の一部分が、発芽中、特に本発明により生じる発芽の間に大幅に減少するが、本発明による方法によって決定的に増加させることが可能であることが示された。基本的には、発芽の過程で、発芽する種子の材料および抗酸化性保護分子をこの進行のために構築することの必要性が増大すること、さらにこの増大した必要性が、存在する物質または新しく形成される物質のいずれかによって即座に賄われることが一般に想定される。一定の特に価値ある種類の化合物、すなわちトコトリエノール類が、電解質を豊富にした栄養溶液中での培養によって選択的に富化することができたことは、大きな驚きであった。
【０００８】
植物種子の電解質栄養液中での発芽については、例えば、ＥＰ  ０  ７７０  ３２４  ＡおよびＥＰ  ０  ７９９  ５７８  Ａに記載されている。そこで得られた植物胚芽は、電解質含量の増加を示しこそすれ、抗酸化性保護分子の消費もまた増加し、植物胚芽中のそれらの含量がしたがって減少することが知られている。
【０００９】
ＵＳ  ５  ９０８  ９４０  Ａによれば、「トコール（Ｔｏｃｏｌ）」生産物（トコトリエノール、トコフェロール，およびトコトリエノールに似た化合物類）を調製する独特の方法が記載されており、そこでは、植物の原料を、８０〜１５０℃で３０分から４時間の乾式加熱を行い、その上で、所望の成分を抽出している。植物の出発材料としては、多数のほとんどの種類の材料が挙げられている。けれども、出発材料の発芽（電解質富化植物胚芽を用意するため）、あるいは出発材料の無機栄養物質による富化のいずれも示されていない。もっと正確に言えば、そこに記載されている方法は、トコフェロール類およびトコトリエノール類の劣化を防ぐために熱の作用によって植物酵素を不活性にすることを目的としている。まさにトコトリエノール類が、特別の電解質富化植物胚芽中で増加した収量で取り出すことが可能であるが、同時にトコフェロール含量は低下する、という本発明の中心的な驚くべき態様は、この文献から明らかでもないし、この文献により明らかにされてもいない。
【００１０】
ＥＰ  ０  ６１６  ８１０  Ａｌは、特に癌の予防および治療用の医薬品として発芽中のイネを使用することに関するものである。この文献には、しかしながら、トコトリエノールに対する一般的な言及もなされていないし、正確に（イネの）胚芽中に増加したトコトリエノールの含量を見出すことができる何らかのヒントをそこから読み取ることもできない。その上、電解質を豊富にした媒体中での発芽は、この文献から明らかではない。
【００１１】
電解質栄養溶液は、互いに独立して、亜鉛、鉄、カリウム、および／またはマグネシウムイオンを、１ｍｇ／ｌ以上、好ましくは１０ｍｇ／ｌ以上、特に５０ｍｇ／ｌ以上と、銅、マンガン、ストロンチウム、および／またはリチウムイオンを、０．５ｍｇ／ｌ以上、好ましくは５ｍｇ／ｌ以上、特に２５ｍｇ／ｌ以上と、セレン、モリブデン、クロム、ヒ素、バナジウム、および／またはコバルトイオンを、０．１ｍｇ／ｌ以上、好ましくは１ｍｇ／ｌ以上、特に５ｍｇ／ｌ以上を、含有することが好ましい。
【００１２】
原理上、本発明による方法は、多くの異なるタイプの植物種子に適用可能であるが、しかし、本発明によれば、当然ながら、特に高いトコトリエノール含量が得られる種子、または本発明による方法の大規模な産業上の実現に特によく適する植物の種子のいずれかが好ましい。したがって、好ましくは、植物種子は、クルミ、コムギ、ヒマワリ、ヤシ、ライムギ、オオムギ、オートムギ、アマランス、キノア、イネの種子またはこれら種子の混合物から選択する。
【００１３】
好ましくは、植物胚芽は、抽出の前に乾燥させる。これにより、それらの貯蔵可能性が増すだけでなく、本発明によって得られた植物胚芽を多くの大規模な用途に適するようにする。
【００１４】
さらに、植物胚芽を抽出の前には粉砕するのが好ましく、その場合は、それらの価値を決めるトコトリエノールおよびぬかおよび胚中のその他の脂肪親和性の抗酸化物質ならびに必須脂肪酸の含量が最も高いためである。このようにして、植物胚芽は、特に圧力分離装置を備えたタイプのよく整備された（油）抽出工場に具合よく移送でき、そこで抽出することができる。
【００１５】
それらの化学構造により、トコトリエノール調整物は好ましくは油として回収される。したがって、抽出は、好ましくは油状抽出物を得ることによって実施する。有機溶媒を用いるか（たとえ食品技術的に無害の有機溶媒でも）、または（水性）懸濁液（例えば、ミセルとなどによる）中に抽出することも可能であるが、それは好ましくない。なぜなら、本発明によれば、本発明のトコトリエノール調整物は、好ましくはできるだけ本来の変造されていない生物学的に価値があるものとして提供すべきであるためである。このため、ヒトに適用する間にできるだけ高度の生物学的作用が得られるように、できるだけ多くのトコトリエノールの本来の反応パートナーを共に抽出することもまた適切である。
【００１６】
したがって、特に、好ましくは本発明による抽出は、超臨界ＣＯ2により実施する。また一方で、油脂に溶解する成分は、ヘキサンまたはその他の有機溶媒により抽出してもよい。
【００１７】
栄養溶液を用いる培養があまり長く続く場合、植物胚芽のトコトリエノール含量が再び減少する可能性があるので、栄養溶液を用いる培養の継続時間は、各タイプの種子に対して最適化することが必要である。しかしながら、これは、当業者にとっては、例えば、以下の実施例の項に開示されている培養および分析の方法により容易に可能であろう。好ましくは、培養の継続時間は、トコトリエノールの最適の含量が得られるように選択する。好ましくは、トコトリエノール含量が、それらの発芽していない種子中の含量に対して、少なくとも１００％、特に少なくとも３００％増加するまでそれを培養する。
【００１８】
培養は、選択したタイプの種子の通常の発芽に適するかまたは成功が証明された温度および条件の下で実施する。好ましい実施形態によれば、本発明による培養は、１０から４０℃まで、好ましくは１５から３０℃、特に１９から２１℃の温度で行う。
【００１９】
植物の種子を培養する電解質栄養溶液は、好ましくは、バナジウムイオン、セレン酸イオン、モリブデン酸イオン、コバルトイオン、クロム（ＩＩＩ）イオン、マンガンイオン、ストロンチウムイオン、リチウムイオン、銅イオン、鉄（ＩＩＩ）イオン、亜鉛イオン、グルコン酸イオン、クエン酸イオン、乳酸イオン、またはこれらイオンの組合せを、０．１から１０００ｍｇまで、好ましくは１から５００ｍｇまで、特に３から１００ｍｇまでの量で含有する。
【００２０】
本発明による抽出は、それぞれ選択された種子または植物胚芽にそれぞれ適合する多数の適当な装置および方法により達成することができる。本発明によれば、オートクレーブおよび圧力分離装置を用いる抽出が特に適することが証明された。その抽出は、好ましくは、独立して、オートクレーブの圧力を、１００バール以上、好ましくは２００バール以上、特に２５０バール以上とし、分離装置の圧力を、２０バール以上、好ましくは３０バール以上、特に４５バール以上とし、オートクレーブの温度を、３０℃以上、好ましくは４０℃以上、特に５０℃以上とし、分離装置の温度を、２０℃以上、好ましくは３０℃以上、特に４０℃以上として運転することができる。
【００２１】
培養の継続時間および栄養溶液の消費によって、好ましい事例における培養は、少なくとも１回、好ましくは栄養溶液を取り換えて少なくとも２回、特に少なくとも３回行う。
【００２２】
他の態様において、本発明は、本発明による方法で得られたトコトリエノール富化植物胚芽またはトコトリエノール富化調整物に関する。特に好ましいのは、乾燥材料のｋｇ当り５００ｍｇ以上、好ましくは乾燥材料のｋｇ当り１０００ｍｇ、特に乾燥材料のｋｇ当り２０００ｍｇのトコトリエノール含量を有するトコトリエノール富化コムギ胚芽またはトコトリエノール富化コムギ胚芽調整物である。さらに、また、乾燥材料のｋｇ当り１５００ｍｇ以上のトコトリエノール、好ましくは乾燥材料のｋｇ当り５００ｍｇのγ−トコトリエノール、特に乾燥材料のｋｇ当り２００ｍｇのγ−トコトリエノール含量を示すトコトリエノール富化オオムギ胚芽またはトコトリエノール富化オオムギ胚芽調整物も好ましい。
【００２３】
本発明のトコトリエノール富化植物胚芽またはトコトリエノール富化調整物から、トコトリエノールを含有する調整物を調製することが可能であり、それは、栄養的・科学的に特に重要な側面を提起し、かつそれは特に生物学的に価値のある有効な酸化防止剤として作用することができる。その理由は、その中で増加したトコトリエノール含量が単一の（増加した）トコトリエノール投与量として作用するのみでなく、本発明によれば、それらの本来の作用のパートナー（特に、酸化還元パートナー）と共に投与することが可能で、これらのパートナーにより、またさらにずっと、それらの作用が効果的となるためである。
【００２４】
それぞれの要求によって、本発明によるトコトリエノール含有調整物は、好ましくは、医薬品活性物質、医薬品補助薬、食品技術調整物、または食品技術添加剤をさらに含む。しかしながら、そうすることの中でそのような添加によってトコトリエノールと上記の本来の作用のパートナーの間の「本来のバランス」が実質的に不利な影響を受けないように、望ましくは注意を払うべきである。
【実施例】
【００２５】
本発明を以下の実施例によりより詳細に説明するが、それに限定されるものではない。
実施例１
発芽している穀物からトコトリエノールが豊富な油を回収する方法：
クルミ油、コムギの胚種油、またはヒマワリ油などのある特定の植物油は、特にトコフェロール類、とりわけＤ，Ｌ−β−トコフェロールが豊富であるものと考えられる。抗酸化性のトコトリエノール類の高含量は、しかしながら、ヤシ油中、ならびにライムギ、オオムギ、オートムギ、コムギのぬか、およびイネ中に見出される。発芽している穀物およびマメ科種子は、それらのビタミン含量を内生の形で増加することが知られており、それが、発芽が進行する間に合成能力が増大する主な原因となる。
【００２６】
さらに、増加する新たな細胞形成の過程でもまた、新たな細胞形成のための十分な生物学的に価値のある「構築材料」を提供するように、不飽和結合の多い脂肪酸類が５０％近くも増加する。不飽和結合の多い脂肪酸類は、しかしながら、光と酸素に対して非常に酸化されやすく、そのため発芽中の種子は、これらの生物学的に価値のある脂肪酸類を保護するための適当な量の脂肪親和性の抗酸化物質（トコトリエノール類）をも合成する。本試験は、発芽が進行する間のトコフェロールおよびトコトリエノール含量の質と量に関する変化を測定すること、および意図的に特に抗酸化性のトコトリエノール類を発芽過程中に増加させることが可能な方法を探究することを目的としている。
【００２７】
次の表１は、表５に示す「栄養溶液で２４時間発芽させたオオムギのぬか油」をガスクロマトグラフで測定した（高度に）不飽和の脂肪酸類の含量を示す。
【００２８】
【表１】
2005536191.tif 000002
【００２９】
発芽試験：
発芽性のコムギおよびオオムギの種子を交互に蒸留水および栄養溶液で２４時間または９６時間それぞれ発芽させた。
【００３０】
その栄養溶液は、次の溶解した栄養塩（ｍｇ／ｌのデータ）を含有していた：
【００３１】
【表２】
2005536191.tif 000003
【００３２】
発芽段階が整う前に、穀物種子をそれぞれの溶液に１２時間浸した。発芽は、室温（１９〜２１℃）と通常の昼／夜光の条件下で排液手段付きの透明な重ね合わせのプラスチック皿からなる市販の発芽力試験装置中で実施した。発芽中、植物胚芽は、１日に２回それぞれの溶液（すなわち、それぞれ、各２５０ｍｌ／９０ｇの蒸留水または栄養溶液）で濯いだ。それらを収穫した後、その植物胚芽を２倍の蒸留水（３回、約８００ｍｌ）で完全に濯ぎ、続いて６０℃の温風のもとで乾燥した。乾燥工程の後、発芽した種子を粉砕し、そこから得られたぬかを超臨界ＣＯ2を用いて抽出した。
【００３３】
穀物胚芽およびぬかからの油状部分を回収する抽出条件は：
試験サンプル１〜４については次の表３に掲げた。
【００３４】
表３
抽出時間：              ＞２１０分
オートクレーブ圧：      ＞２８０バール
圧力分離装置１：        ６５バール
圧力分離装置２：        ４２バール
オートクレーブ温度：    ６５℃
分離装置１の温度：      ４３℃
分離装置２の温度：      ２６．８℃
ぬかの油含量は、２．２から３．６重量％であった。
【００３５】
試験サンプル５〜７については次の表４に掲げた。
【００３６】
表４
単一段階抽出分離による単一段階抽出
オートクレーブ圧：      ２６０バール
圧力分離装置：          ５０バール
オートクレーブ温度：    ４５〜５０℃
分離装置温度：          ３５℃
全体のＣＯ2およびＣＯ2流は、使用したそれぞれの粗材料に依存する。
実施例２
発芽油およびぬか油中のトコフェロールおよびトコトリエノールの測定：
サンプルの材料を鹸化した後、そしてｎ−ヘキサンに抽出した後、そのトコフェロールおよびトコトリエノールを、ＨＰＬＣを用いて分離し、蛍光検出器による保持時間から検出した。外部標準法によるピーク面積の比較により定量的な評価を実施した。固定相として、ＨＰＬＣカラム、２５０×４．６ＭＭＸ１／４”ＶＡＬＣＯ、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ  Ｓｉ６０−５を使用し、移動相として、ｎ−ヘキサンとジオキサン（９５：５）の混合物を使用し、比較標準として、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社のトコフェロールおよびトコトリエノールを使用した。
【００３７】
【表３】
2005536191.tif 000004
【００３８】
分析の結果から次のことが示される：
−発芽中にトコトリエノールが増加するにつれてトコフェロールは減少し、このことは、発芽プロセスの間に細胞状ビタミンＥ活性は低下し、それと同時に、抗酸化物質の必要性が増大することを示している。細胞レベルでは、「発芽」とは、酵素レベルにおける活性の増加を意味する。その植物細胞は、多数の生物学的に非常に価値のある構築材料、すなわち不飽和度の高い脂肪酸類ならびに細胞材料の新たな形成すなわち成長のためのリン脂質を必要とする。この非常に価値のある生物学的材料の温度および酸素感応性のために、抗酸化性保護分子の必要性も増加する。本分析結果は、植物細胞が、トコフェロールをトコトリエノールに転化することによって、この増加する保護の必要性を満たすことを示している。
−発芽の前および途中の必須無機質微量栄養素の供給により発芽種子中の内生トコトリエノール合成が刺激されること：植物細胞は、ヒトの細胞とは違って、その生命に関わる有機物質（ビタミン類、抗酸化物質、高不飽和脂肪酸類）の必要性をそれ自身の合成能力によって自律的に満たすことができるが、それは、丁度ヒトと同じように、無機物（無機物、微量栄養素）の外来栄養の供給に依存している。本試験が示すように、発芽種子のトコトリエノール含量は、無機微量栄養素を供給することによって、通常の発芽方法（すなわち、水による発芽）と比較して、著しく増加させることができる。
−オオムギのぬかの例で実証されているように、発芽の継続時間を増すことにより、トコフェロールおよびトコトリエノール含量が減少すること。
実施例３
天然トコトリエノール混合物の生物学的品質の分析：
生体外器内試験の枠組み内で、トコトリエノールが豊富なコムギぬか油の抗酸化能を、コムギ胚芽油、酢酸トコフェロール、およびＤ−α−トコフェロールと比較する。この試験方法においては、ヒトの血清を所定量のｐ−ベンゾキノンの酸化的ストレスにさらす。試験すべき所定量の抗酸化物質（コムギぬか油の天然トコトリエノール混合物、コムギ胚芽油、酢酸トコフェロール，Ｄ−α−トコフェロール）を添加することにより、試験サンプルの抗酸化荷重負担能力を、ｐ−ベンゾキノンから還元されたｐ−ジヒドロキノンの比色定量によってその量を正確に計る。この試験を経て、発芽したコムギぬかのトコトリエノール混合物は、酢酸トコフェロールと比較して５００倍増加した抗酸化能、およびＤ−α−トコフェロールに対しては１０００倍増加した抗酸化能を有していた。
【００３９】
これらの試験は、以下のようにして行った：
添加剤なしでヒトの供血を血管から取り出し、冷蔵庫（約＋４℃〜＋７℃）内に１時間静置した後８００〜１０００ｇで遠心分離装置にかける。分離した血清部分を移してプールする。その血清は−２２℃で約２週間保存することができるが、さもなければ、必要な測定のために直ちに使用する。
【００４０】
抗酸化物質の抗酸化能を測定するために、その血清に段階的なラジカル負荷をかける。ラジカルの形成には、ｐ−ベンゾキノンを使用した。
【００４１】
生理環境において（ｐＨ＝若干アルカリ性）、この物質はキンヒドロンシステムの比較的安定なラジカルアニオンに転化する。その際に、ｐ−ベンゾキノンの１つの水素原子（１プロトン／１電子）が取り上げられる。
【００４２】
安定な最終生成物のｐ−ジヒドロキノンへのさらなる反応が、反応環境の抗酸化物質含量（還元剤）に反比例し、ｐＨ６．９〜７．４で数分以内に、本質的に直線的に起こる。
【００４３】
したがって、典型的に着色した物質であるので、最終生成物（ジヒドロキノン）を測定するための、ランベルト−ベールの法則を適用する条件が満たされた。
【００４４】
その比較的安定なラジカルアニオン（キンヒドロン）は、第２の還元段階において、他の電子（有効な抗酸化物質からの水素）を取り上げることによってジヒドロキノンに転化する。その反応は、完全に還元された物質（ジヒドロキノン）への移行が顕著な色の強化を伴うので、比色分析でモニターすることができる。
【００４５】
最終生成物の量の比色分析による測定は、λ＝５００ｎｍで実施する。この波長における吸光度は、そのとき、反応最終生成物の量と、さらに、ラジカル中間体段階の転化のために反応した抗酸化物質の量にそれぞれ正比例する。
【００４６】
直線的な吸光度の増加および直線的に大きくなる抗酸化性活性物質の消費により、反応した部分は、化学量論的反応条件から正確に計算することができる。
【００４７】
それぞれ、ミカエリス／カルカー（Ｋａｌｋａｒ）およびポーリングによれば、（Ｈｏｌｌｅｍａｎ−Ｗｉｂｅｒｇ；Ｌｅｈｒｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ａｎｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ，ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９５））、ジヒドロキノンまでの反応の強さは、酸化された濃度対還元された濃度の比によって決まる。すなわち、還元剤（抗酸化物質）の供給が多ければ多いほど反応はより抑制され、ジヒドロキノンの形成は減少する。したがって、この反応は、活性が減少する物質を微細に投与したものを定量的に測定するための酸化還元系で使用するのに最適である。
【００４８】
手順：
３つの平行した一連の測定において、プールしておいた血清のサンプル（各５００ｍｌ）に３段階（１０、２０、および３０μｇ）でｐ−ベンゾキノンを加える。３０、６０、９０、および１８０秒の反応時間を経て、λ＝５００ｎｍにおけるそれぞれの吸光度値を測定する。計算する反応量において、６０秒の平均値は、所定の力価（＝３分の１の反応）に相当する。この数値は、吸光度曲線として平均値のグラフを描くことによって正確に得られる。抗酸化物質を添加する他の試験はすべて、抗酸化物質添加なしの血清プールのこの確定された較正値と対比する（すなわち、血清中の抗酸化物質の供給が増すに従って、ジヒドロキノンに対する吸光度は下がるはずである）。
【００４９】
血清サンプルの３つの平行した一連の測定を本発明による調整物を５００μｇ／ｍｌ添加して行い、本発明によるトコトリエノールが豊富なコムギぬか油の抗酸化能を測定した。その結果、処理してない血清と比較して、吸光度値（λ＝５００ｎｍ／６０秒）に平均０．０１７単位の減少が認められた。
【００５０】
無添加の比較用血清の吸光度値曲線および適用した化学量論的反応条件（血清の決定／ｐ−ベンゾキノンの濃度／血清希釈のｍｌ当りの量）を参照することにより、吸光度対ラジカル阻害の換算係数がこの較正システムから発生する。
【００５１】
比較用血清サンプルを１／５０に希釈して使用すること、および使用した分子の数（ロシュミット数による容積単位当りのｐ−ベンゾキノン濃度から計算される）の３分の１を反応させること（吸光度の比較）により、キンヒドロンラジカルへの換算係数がもたらされる。これにより、０．０１７の吸光度単位は、ｍｌ／秒当り、０．０１７・１０・２８．０８＝４．９１４μｇラジカルに相当する。
【００５２】
製剤では：
本発明による調整物３ｍｇを６ｍｌの血清に入れ、その０．５ｍｌを１：１０の等張液（生理食塩水）で希釈して５ｍｌ中の２５０μｇを生じさせる。本発明による調整物の７５μｇの量に相当するその１．５ｍｌ中に、ｐ−ベンゾキノンをそれぞれ１０、２０、および３０μｇ添加して、吸光度の測定を行った。
【００５３】
本発明による調整物の解毒性能としては、
本発明の調整物７５μｇ＝ｍｌ／秒当りラジカル４．９１４μｇ、
本発明の調整物１ｍｇ＝ラジカル６５．５２μｇ、ならびに
本発明の調整物１ｇ＝毎秒１ｍｌ当りラジカル６５．５２ｍｇ
である。
【００５４】
この活性は、ロシュミット数を用いて所望どおり酸素のステージに対応して計算することができる：
発明油の１ｇ＝２３．２８・１０20ＯＨ−ラジカル（原子量＝１７）
または
１２．３７・１０20Ｏ2−ラジカル（原子量＝３２）の解毒
抗酸化（保護）作用を評価する他の基準は、酸化還元緩衝作用（への影響）である。抗酸化作用を有する生理活性物質は、ラジカル負荷が増加するにもかかわらず、生物学的酸化還元システム（例えば血清）の酸化力のある負荷に耐える適応力（ローディング）を安定化または増大する。
【００５５】
本発明による調整物の、生体系の酸化力のある負荷に耐える適応力を安定化するための活性度を測定するために、再び、３つの試験シリーズを検討し、そこから平均値を割り出す：
１．本発明による調整物を含まないヒトの完全な（生きている）血清（ブランクの血清）
各０．５ｍｌ容量の血清サンプルにｐ−ベンゾキノンを、１０、２０、または３０μｇそれぞれ加える。３０分間（２０℃）培養した後、酸化還元電位（ｍＶ）を測定し、ブランクの電位の値（ｐ−ベンゾキノンを含まない）と比較し、緩衝曲線としてグラフで示す。緩衝作用が、ｐ−ベンゾキノンによる、それぞれ、１０、２０、および３０μｇの負荷に対する電位点の間で直線的な作用として生じる。
【００５６】
２．本発明の調整物をｍｌ当り５００μｇ含むヒトの完全な（生きている）血清
各０．５ｍｌの血清サンプルに、同様に、ｐ−ベンゾキノンを、１０、または２０、および３０μｇそれぞれ加えた。３０分間培養した後、酸化還元電位を測定し、ｐ−ベンゾキノンを含まない電位の値と比較したグラフで示した。ここでもまた、緩衝作用が、ｐ−ベンゾキノンの１０、２０、および３０μｇの点をつなぐ一次方程式(linear equation)として生じる。
【００５７】
結果：
本発明の調整物を添加した血清に対しては、＋０．３５ｍＶの緩衝曲線における率の上昇が生じる。本発明の調整物を含まないと、緩衝の線形関数の上昇率は、わずか−０．３５ｍＶである。
【００５８】
したがって、本発明による生成物は、生理的条件下においても（体内においても）非常に有効な抗酸化物質である。
【００５９】
その生成物の品質をより包括的に評価するためには、他の抗酸化物質との比較が必要である。このために、以下の生成物について同じように３つの分析シリーズを上記のようにして行った：
コムギ胚芽油（バージン品、１００％最高純度の薬用品質）、
Ｄ，Ｌ−α−トコフェロール酢酸エステル（合成品、５０％）−（ｖｉｓ−ｖｉｔａｌｉｓ（ＡＴ））、
α−トコフェロール（天然品、５０％）−（ｖｉｓ−ｖｉｔａｌｉｓ（ＡＴ））。
【００６０】
その結果を次の表６にまとめる。
【００６１】
【表４】
2005536191.tif 000005
【００６２】
試験全体から以下のことを記述することができる：
本発明による調整物は、抗酸化性保護生成物として非常に有効であり、同様に、生理的条件下においてもまた、生物学的酸化還元システムの酸化還元緩衝作用（ローディング）が増すことによって超酸化に対して高い保護機能を展開する。
【００６３】
結論：
トコフェロール類とは違って、トコトリエノール類が有するビタミンＥ活性は低いけれども、それらは際立って高い抗酸化性能を有する。脂肪親和性抗酸化物質の抗酸化能は、免疫、心臓／循環器系、筋肉／関節、肝臓、皮膚、および神経の病気のためのそれらの栄養・医療用途における重要な品質のパラメーターである。穀類およびマメ科の種子からの胚芽およびぬかは、トコフェロールは低いけれども、非発芽種子と比較すると高いトコトリエノール含量を有している。蒸留水と比較すると、本発明の必須無機微量栄養素の添加によって、発芽の過程での植物のトコトリエノールの合成が著しく刺激されることが理解できる。
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月20日(2004.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トコトリエノール富化調整物を製造する方法であって、次のステップ：
−植物種子を電解質栄養溶液と共に培養してトコトリエノールが富化した植物胚芽を形成するステップ、
−前記植物胚芽を回収するステップ、および
−前記回収した植物胚芽、特に前記回収した植物胚芽のぬかおよび胚種(germs)からトコトリエノールを含有する調整物を抽出するステップ
により特徴づけられる方法。
【請求項２】
前記植物種子が、クルミ、コムギ、ヒマワリ、ヤシ、ライムギ、オオムギ、オートムギ、アマランス、キノア、イネの種子またはこれら種子の混合物から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物胚芽を抽出する前に乾燥することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物胚芽を抽出する前に粉砕することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抽出を、油状抽出物を得ることにより行うことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抽出を、超臨界ＣＯ2またはヘキサンを用いて実施することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
培養を、１０から４０℃まで、好ましくは１５から３０℃、特に１９から２１℃の温度で行うことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１リットルの栄養溶液が、バナジウムイオン、セレン酸イオン、モリブデン酸イオン、コバルトイオン、クロム（ＩＩＩ）イオン、マンガンイオン、ストロンチウムイオン、リチウムイオン、銅イオン、鉄（ＩＩＩ）イオン、亜鉛イオン、グルコン酸イオン、クエン酸イオン、乳酸イオン、またはこれらイオンの組合せを、０．１から１０００ｍｇまで、好ましくは１から５００ｍｇまで、特に３から１００ｍｇまでの量で含有することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抽出を、オートクレーブおよび圧力分離装置を用い、互いに独立して、オートクレーブの圧力を、１００バール以上、好ましくは２００バール以上、特に２５０バール以上とし、分離装置の圧力を、２０バール以上、好ましくは３０バール以上、特に４５バール以上とし、オートクレーブの温度を、３０℃以上、好ましくは４０℃以上、特に５０℃以上とし、分離装置の温度を、２０℃以上、好ましくは３０℃以上、特に４０℃以上として行うことを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
培養を少なくとも１回、好ましくは前記栄養溶液を交換して少なくとも２回、特に少なくとも３回行うことを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法によって得られる植物胚芽からのおよび／または植物胚芽のぬかからのトコトリエノール富化調整物。
【請求項１２】
植物胚芽からのおよび／またはコムギ胚芽のぬかからのトコトリエノール富化コムギ胚芽調整物であって、それらが、乾燥材料のｋｇ当り５００ｍｇ以上、好ましくは乾燥材料のｋｇ当り１０００ｍｇ、特に乾燥材料のｋｇ当り２０００ｍｇのトコトリエノール含量を有することを特徴とするコムギ胚芽またはコムギ胚芽調整物。
【請求項１３】
植物胚芽からのおよび／またはオオムギ胚芽のぬかからのトコトリエノール富化オオムギ胚芽調整物であって、それらが、乾燥材料のｋｇ当り１５００ｍｇ以上のトコトリエノール、好ましくは乾燥材料のｋｇ当り５００ｍｇのγ−トコトリエノール、特に乾燥材料のｋｇ当り２００ｍｇのβ−トコトリエノール含量を有することを特徴とするオオムギ胚芽またはオオムギ胚芽調整物。
【請求項１４】
請求項１１から１３のいずれか一項に記載のトコトリエノール富化調整物を含むトコトリエノール含有調整物。
【請求項１５】
医薬活性物質、医薬補助薬、食品技術製品、または食品技術添加剤をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載のトコトリエノール含有調整物。
【国際調査報告】
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