(57)【要約】本発明は構造式Ｉで示される置換チオフェンカルボキサミド化合物ならびにその異性体、互変体、多形体、担体、プロドラッグおよび製薬上許容しうる塩を、またそうした化合物を含有する組成物を、さらにはキナーゼ活性に関連する疾患を治療する方法を提供する。本発明は特に種々のIKK関連疾患たとえば炎症、他の炎症関連疾患の治療方法を、疼痛や頭痛の鎮痛剤治療などを含めて、リウマチ様関節炎を含む関節炎、喘息、炎症性腸疾患などのような胃腸疾患、血管疾患、AIDSなどのウイルス感染症、およびがんの治療方法を、提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Ｉ：
【化１】
2005536518.tif 000064
｛式中:
Aは(CH2)mまたは(CH2)m-W-(CH2)nであり、随意に、スルファミル、ハロ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシルおよびハロアルキル、CF3、COCF3、CN、NO2、ヒドリド、OR3、OCOOR3、CO2H、CO2R3、CONH2、CONHR3、CON(R3)2、COR3、SR3、SOR3、SCOOR3、SO2R3、NH2、NHR3、NR3R3、NR3COR3、NR3CONHR3、NR3SO2R3、NR3SO2NHR3、SO2NHR3およびSO2N(R3)2からなる群より独立に選択される1つまたは複数の置換基をもつ;
Bは6員芳香族炭化水素環であり、随意に、OR3、SR4、SO2N(R4)2、NHR4、NHCOR4、NR4COR4、NHCO(OR4)、NR4CO(OR4)、NHCONHR3、NR3CONHR4、NR3SO2R4、NHSO2R4、NHSO2N(R4)2、NHCONR4R4、CO2R4、CON(R4)2、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環基、ハロ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、N-モノアルキルアミド、N-モノアリールアミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、N,N-ジアルキルアミド、N-アルキル-N-アリールアミド、ハロアルキル、ヒドリド、ヒドロキシル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、スルファミル、N-アルキルスルファミル、アミノ、アルキルアミノおよびニトロからなる群より独立に選択される1つまたは複数の置換基をもつ;
WはS(O)p、O、CH=N、N(O)=CHおよびNR4である;
mは0〜3である;
nは0〜3である;
pは0〜2である;
R1とR2は、ヒドリド、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、アルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミジン、グアニジン、CONHR5、NHR5およびNHCXNHR5(式中XはO、SまたはNR6である)からなる群より独立に選択される;
R3は、ヒドリド、アリール、ヘテロアリール、低級アルキル、アルケニル、アルキニルおよびヘテロアルキルからなる群より選択される;
R4は、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ハロアルキル、アリールアルキルアミノおよびヘテロアリールアルキルからなる群より選択されるが、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルは随意に、アルキル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、シアノ、ハロアルコキシ、アシル、カルボキシル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシおよびヘテロ環基より選択される1つまたは複数の基を置換基としてもつ;
R5は、ヒドリド、アルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキルおよびアシルからなる群より選択される;
R6は、ヒドリド、アルキル、シアノおよびニトロからなる群より選択される;
ただし、WがCH=Nでありmが0であるときには、CH=N中の窒素原子は環Bに直接結合しなければならない。｝
で表される化合物またはその異性体、互変体、多形体、担体、プロドラッグ、製薬上許容しうる塩。
【請求項２】
Aが(CH2)2である、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
Aが(CH2)3である、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
R1がNHR5である、請求項2または3に記載の化合物。
【請求項５】
R1がNHCOCH3である、請求項4に記載の化合物。
【請求項６】
R1がNHCONHR5である、請求項4に記載の化合物。
【請求項７】
R1がNHCONH2である、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
R2がCONHR5である、請求項2または3に記載の化合物。
【請求項９】
R2がCONH2である、請求項8に記載の化合物。
【請求項１０】
R1がNHCOCH3またはNHCONH2である、請求項8に記載の化合物。
【請求項１１】
次の化合物からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物:
3-アミノ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド;
3-アミノ-8-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド;
3-[(2-アミノエチル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド臭化水素酸塩;
3-[(3-アミノプロピル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド塩酸塩;
3-[(アミノカルボニル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド;
2-アミノ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボニトリル;
2-(アセチルアミノ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド; および
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド。
【請求項１２】
次の化合物からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物:
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6,7-ジメトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-イソプロピル-8-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-4,4-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-4-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-フルオロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-フルオロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-4-エチル-4-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-4,4-ジエチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-メトキシ-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-エトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7,8-ジメトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6,9-ジメトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7,9-ジメトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6,7-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-エチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7,8-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-tert-ブチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-プロピル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-エトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-ブチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-プロポキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-イソプロポキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-ブトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-イソブトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-sec-ブトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-メトキシ-6-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-メトキシ-9-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-イソプロピル-8-メトキシ-9-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-イソプロピル-6-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-イソプロピル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-ブロモ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5,5,8-トリメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-クロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-クロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-クロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6,8-ジクロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7,8-ジクロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-4,5,5-トリメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-ヘキシル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
6-(アセチルアミノ)-2-[(アミノカルボニル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-ブロモ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-フルオロ-9-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-4-エチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6,9-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-エトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-プロポキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-エトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-ヒドロキシ-8-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-ニトロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6,8-ジメトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-フルオロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-フルオロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-メトキシ-4-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-メトキシ-4-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-クロロ-7-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-(ヒドロキシメチル)-7-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-ブロモ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-ヨード-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-ブロモ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-ヨード-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6,8-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-(メチルチオ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-(メチルスルホニル)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-エチニル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-クロロ-5-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-(メチルチオ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-(メチルスルホニル)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-クロロ-5-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-(エチルチオ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-(エチルスルホニル)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-クロロ-5-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-(エチルチオ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-(エチルスルホニル)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-クロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-メトキシ-4,4-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-メトキシ-7-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-メトキシ-8-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-メトキシ-7-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-メトキシ-4-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6,7-ジエトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-エチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-イソプロピル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7,9-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-tert-ブチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-メトキシ-9-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6,8-ジフルオロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-イソプロポキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-クロロ-9-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7,9-ジクロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-(トリフルオロメチル)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-メトキシ-6-(メチルチオ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-メトキシ-6-(メチルスルホニル)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-エトキシ-9-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6,9-ジエトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8,9-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7,8-ジニトロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-ニトロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-メトキシ-4,7-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-メトキシ-5-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-ヨード-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-クロロ-8-ニトロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5,8-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5-エチル-8-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
ベンジル3-(アミノカルボニル)-2-[(アミノカルボニル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チエン-8-イルカルバマート;
8-アミノ-2-[(アミノカルボニル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
8-(アセチルアミノ)-2-[(アミノカルボニル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5-イソプロピル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6,9-ジクロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-tert-ブチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5,5,7-トリメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5-ブチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5-ブチル-7-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5-ブチル-7-フルオロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5-ブチル-7-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5-ブチル-7,8-ジメトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6,7-ジメトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-イソプロピル-8-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-4,4-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-4-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-フルオロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-フルオロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-4-エチル-4-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-4,4-ジエチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-メトキシ-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-エトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7,8-ジメトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6,9-ジメトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7,9-ジメトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6,7-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-エチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7,8-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-tert-ブチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-プロピル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-エトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-ブチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-プロポキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-イソプロポキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-ブトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-イソブトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-sec-ブトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-メトキシ-6-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-メトキシ-9-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-イソプロピル-8-メトキシ-9-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-イソプロピル-6-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-イソプロピル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-ブロモ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-5,5,8-トリメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-クロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-クロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-クロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6,8-ジクロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7,8-ジクロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-4,5,5-トリメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-ヘキシル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2,6-ビス(アセチルアミノ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-ブロモ4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-フルオロ-9-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-4-エチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6,9-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-エトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-エポキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-エトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-5-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-ヒドロキシ-8-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-ニトロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6,8-ジメトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-フルオロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-フルオロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-メトキシ-4-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-メトキシ-4-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-クロロ-7-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-(ヒドロキシメチル)-7-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-ブロモ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-ヨード-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-ブロモ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-ヨード-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6,8-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-(メチルチオ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-(メチルスルホニル)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-エチニル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-クロロ-5-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-(メチルチオ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-(メチルスルホニル)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-(エチルチオ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-(エチルスルホニル)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-クロロ-5-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-(エチルチオ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-(エチルスルホニル)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-クロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-メトキシ-4,4-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-メトキシ-7-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-メトキシ-8-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-メトキシ-7-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-メトキシ-4-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6,7-ジエトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-エチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-イソプロピル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7,9-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-tert-ブチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-メトキシ-9-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6,8-ジフルオロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-イソプロポキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-クロロ-9-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7,9-ジクロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-(トリフルオロメチル)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-メトキシ-6-(メチルチオ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-メトキシ-6-(メチルスルホニル)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-エトキシ-9-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6,9-ジエトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8,9-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7,8-ジニトロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-ニトロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-メトキシ-4,7-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-メトキシ-5-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-ヨード-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-クロロ-8-ニトロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-5,8-ジメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-5-エチル-8-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
ベンジル2-(アセチルアミノ)-3-(アミノカルボニル)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チエン-8-イルカルバマート;
2-(アセチルアミノ)-8-アミノ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2,8-ビス(アセチルアミノ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-5-イソプロピル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6,9-ジクロロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-tert-ブチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-5,5,7-トリメチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-5-ブチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-5-ブチル-7-メチル-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-5-ブチル-7-フルオロ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-5-ブチル-7-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-5-ブチル-7,8-ジメトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-クロロ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8,9-ジクロロ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-メトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-メトキシ-6,6-ジメチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-メトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8,10-ジメトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-メチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8,9-ジメトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-8-フルオロ-9-メトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7-メトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6,9-ジメチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-10-メトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-ブロモ-6-メチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-7,8-ジメトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-6-メチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-クロロ-6-メチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-フルオロ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-メチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-アミノ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9-ニトロ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-(アセチルアミノ)-9,10-ジメトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-クロロ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8,9-ジクロロ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-メトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-メトキシ-6,6-ジメチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-メトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8,10-ジメトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-メチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8,9-ジメトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-8-フルオロ-9-メトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7-メトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6,9-ジメチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-10-メトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-ブロモ-6-メチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-7,8-ジメトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-6-メチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-クロロ-6-メチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-フルオロ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-メチル-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
9-アミノ-2-[(アミノカルボニル)アミノ]-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9-ニトロ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド;
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-9,10-ジメトキシ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド。
【請求項１３】
請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12に記載の化合物と少なくとも1つの製薬上許容しうる担体とを含む組成物。
【請求項１４】
がん、炎症または炎症関連疾患を患っているまたは患いやすい患者に治療有効量の請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12に記載の化合物を投与するステップを含む、患者のがん、炎症または炎症関連疾患を治療する方法。
【請求項１５】
がん治療に用いる、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
炎症治療に用いる、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
炎症関連疾患の治療に用いる、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
炎症関連疾患が関節炎である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
炎症関連疾患が疼痛である、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
炎症関連疾患が熱病である、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
炎症関連疾患が喘息である、請求項17に記載の方法。
【請求項２２】
炎症関連疾患が炎症性腸疾患である、請求項17に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に抗炎症薬分野の発明であり、特に置換チオフェンカルボキサミド誘導体、該誘導体を含有する組成物、およびがん、炎症、および関節炎などの炎症関連疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術に関する以下の説明は本発明の理解の足しにすることが目的であり、本発明の先行技術として認めるまたは開示するという意味ではない。
【０００３】
NF-κBはユビキタスな転写因子であり、炎症性サイトカイン、細胞接着分子、成長因子、酵素および受容体などを含む多数の初期誘導遺伝子を調節することにより免疫系の活性化やストレス応答で突出した役割を果たす[Ghosh S., May, M.J., and Kopp E. (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 115-260; Zandi, E. and Karin, M, (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 4547-4551; Karin, M. (1999) J. Biol. Chem. 274, 27339-27342]。遺伝子発現の特異性は細胞レベルで、多様な外部刺激たとえばLPSを含む細菌産生物などやサイトカイン類特に腫瘍壊死因子-α(TNFα)やインターロイキン-β(IL1β)により、決定される。他転写因子との相乗的相互作用を通じて、きわめて多数の機能的関連遺伝子を協調的に誘導する大きな潜在力は維持しながら、さらなる特異性が実現されることもある。NF-κBはRelタンパク質ファミリーのホモ-およびヘテロ-二量体からなり、IκBファミリーメンバーの阻害タンパク質により細胞質内に不活性型として隔離されている[Ghosh S., May, M.J., and Kopp E. (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 115-260; Zandi, E. and Karin, M, (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 4547-4551; Karin, M. (1999) J. Biol. Chem. 274, 27339-27342]。IκBsはNF-κB上の核移行シグナルをマスクして、核移行を、ひいては応答性遺伝子のプロモーター領域へのDNAの結合を妨げる。NF-κBを活性化するアゴニストによる細胞刺激は一連の生化学シグナルをもたらし、ついにはIκBsのリン酸化、ユビキチン化および分解を、ひいてはNF-κBの解放と核移行を招く[Ghosh S., May, M.J., and Kopp E. (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 115-260; Zandi, E. and Karin, M, (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 4547-4551; Karin, M. (1999) J. Biol. Chem. 274, 27339-27342]。最近、IκBsをリン酸化しその分解を開始させる2種類のIκBキナーゼ(IKK1別名IKKαおよびIKK2別名IKKβ)が多数の研究施設でクローニングされ、解析された[Ghosh S., May, M.J., and Kopp E. (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 115-260; Zandi, E. and Karin, M, (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 4547-4551; Karin, M. (1999) J. Biol. Chem. 274, 27339-27342]。この触媒サブユニットIKK1およびIKK2は構造的にも酵素的にも類似しており、またIKKシグナル伝達複合体(IKK signalsome)という大きなタンパク質複合体中にヘテロ二量体として存在している[Regnier, C., Song, H., Gao, X., Goeddel, D., Cao, Z. and Rothe, M. (1997) Cell 90, 373-383; DiDonato, J.A., Hayakawa, M., Rothwarf, D.M., Zandi, E. and Karin, M. (1997) Nature 388, 548-554; Mercurio, F., Zhu, H., Murray, B.W., Shevchenko, A., Bennett, B.L., Li, J.W., Young, D.B., Barbosa, M., Mann, M., Manning, A. and Roa, A. (1997) Science 278, 860-866; Zandi, E. Rothwarf, D.M., Delhase, M., Hayadawa, M. and Karin, M. (1997) Cell 91, 243-252; Woronicz, J.D., Gao, X., Cao, Z., Rothe, M., and Goeddel, D.V. (1997) Science 278, 866-869]。第3のタンパク質NEMO(IKKγ, IKKAP1)はIKK活性化とキナーゼ活性に必要な調節性アダプタータンパク質である[Yamaoka, S., Courtois, G., Bessia, C., Whiteside, S.T., Weil, R., Agou, F., Kirk, H.E., Kay, R.J., and Ireal, A. (1998) Cell 93, 1231-1240; Rothwarf, D.M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. (1998) Nature 395, 297; Mercurio, F., Murray, B.W., Shevchenko, A., Bennet, B.L., Young, D.B., Li, J.W., Pascual, G., Motiwala, A., Zhu, H., Mann, M. and Manning, A.M. (1999) Mol. Cell. Biol. 2, 1526-1538]。IKK1とIKK2はほとんどの成人組織で、また種々の発達段階のマウス胚でも、同時発現する[Regnier, C., Song, H., Gao, X., Goeddel, D., Cao, Z. and Rothe, M. (1997) Cell 90, 373-383; DiDonato, J.A., Hayakawa, M., Rothwarf, D.M., Zandi, E. and Karin, M. (1997) Nature 388, 548-554; Mercurio, F., Zhu, H., Murray, B.W., Shevchenko, A., Bennett, B.L., Li, J.W., Young, D.B., Barbosa, M., Mann, M., Manning, A. and Roa, A. (1997) Science 278, 860-866; Zandi, E. Rothwarf, D.M., Delhase, M., Hayadawa, M. and Karin, M. (1997) Cell 91, 243-252; Woronicz, J.D., Gao, X., Cao, Z., Rothe, M., and Goeddel, D.V. (1997) Science 278, 866-869; Hu, M.C.T., and Wang, Y. (1998) Gene 222, 31-40]。このキナーゼ複合体は、TNFαやIL1βなどのサイトカイン類、LPSなどの細菌産生物、TAXなどのウイルスタンパク質、それにホルボールエステル、酸化剤およびセリン/チロシンホスファターゼなどをふくむ種々のアゴニストによる刺激を受ける多数のシグナル伝達経路ではNF-κB活性化の決定的な共通因子であるように見える[Ghosh S., May, M.J., and Kopp E. (1998) Annu. Rev. Immunol. 16, 115-260; Zandi, E. and Karin, M, (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 4547-4551; Karin, M. (1999) J. Biol.. Chem. 274, 27339-27342]。
【０００４】
IKK1[別名IKKα; Regnier, C., Song, H., Gao, X., Goeddel, D., Cao, Z. and Rothe, M. (1997) Cell 90, 373-383; DiDonato, J.A., Hayakawa, M., Rothwarf, D.M., Zandi, E. and Karin, M. (1997) Nature 388, 548-554; Mercurio, F., Zhu, H., Murray, B.W., Shevchenko, A., Bennett, B.L., Li, J.W., Young, D.B., Barbosa, M., Mann, M., Manning, A. and Roa, A. (1997) Science 278, 860-866]は、IκBキナーゼ活性の標準生化学精製法によりTNFα刺激HeLa S3細胞から、またyeast two-hybridスクリーン法でMAP3K、NF-κB誘導キナーゼ(NIK)との相互作用により、同時的にクローニングされた。IKK1は以前にクローニングされたセリン/トレオニンキナーゼ(CHUK)として同定された[Connelly, M., and Marcu, K. (1995) Cell. Mol. Biol. Res. 41, 537-549]。IKK1(別名IKKα)は85kDaの745アミノ酸タンパク質であり、N末端セリン/トレオニンキナーゼ触媒ドメイン、ロイシンジッパー様両親媒性ヘリックスおよびC末端ヘリックス-ループ-ヘリックスドメインを含む。IKK2 (別名IKKβ)もまた標準生化学精製法によりクローニングされ、TNFα刺激HeLa S3細胞からIKK1と同時精製し、またIKK1と配列相同性を有するESTクローンから公共データベースで同定された[Mercurio, F., Zhu, H., Murray, B.W., Shevchenko, A., Bennett, B.L., Li, J.W., Young, D.B., Barbosa, M., Mann, M., Manning, A. and Roa, A. (1997) Science 278, 860-866; Zandi, E. Rothwarf, D.M., Delhase, M., Hayadawa, M. and Karin, M. (1997) Cell 91, 243-252; Woronicz, J.D., Gao, X., Cao, Z., Rothe, M., and Goeddel, D.V. (1997) Science 278, 866-869]。IKK2は87kDaの756アミノ酸タンパク質であり、C末端の11アミノ酸延長部の追加を除けば全体としてIKK1と同じトポロジーである。IKK1とIKK2の相同性は全般で52%、キナーゼドメインで65%、C末端のタンパク質相互作用ドメインで44%である。哺乳動物での一過性発現分析を用いて、in vitro翻訳実験によって、またバキュロウイルス系での同時発現によって得たデータは、IKK1とIKK2がロイシンジッパーモチーフを介してヘテロ二量体として選択的に会合することを示す。これらの系ではホモ二量体についても記述されてきたが、哺乳動物細胞内でのキナーゼの生理的形態はヘテロ二量体であると考えられる[Zandi, E. Rothwarf, D.M., Delhase, M., Hayadawa, M. and Karin, M. (1997) Cell 91, 243-252; Li, J., Peet, G.W., Pullen, S.S., Schembri-King, J., Warren, T.C., Marcu, K.B., Kehry, M.R., Barton, R. and Jakes, S. (1998) J. Biol. Chem. 273, 30736-30741]。最後にNEMO(別名IKKγ)は、ロイシンジッパーを含む3つのαヘリカル領域を含み、IKK2と選択的に相互作用し、また二量体キナーゼ複合体の活性化のために必要とされるが、この活性化ではおそらく他タンパク質を巻き込んでシグナル伝達複合体(signalsome  complex)を形成する[Yamaoka, S., Courtois, G., Bessia, C., Whiteside, S.T., Weil, R., Agou, F., Kirk, H.E., Kay, R.J., and Ireal, A. (1998) Cell 93, 1231-1240; Rothwarf, D.M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. (1998) Nature 395, 297; Mercurio, F., Murray, B.W., Shevchenko, A., Bennet, B.L., Young, D.B., Li, J.W., Pascual, G., Motiwala, A., Zhu, H., Mann, M. and Manning, A.M. (1999) Mol. Cell. Biol. 2, 1526-1538]。
【０００５】
IKK1とIKK2のキナーゼ活性はリン酸化により調節され、また二量体形成のためにはインタクトなロイシンジッパー(LZ)をインタクトなヘリックスループヘリックス(HLH)ドメインと共に必要とするが、そのドメインは、たとえIKKタンパク質の残りの部分とトランスに発現する場合でも、キナーゼ活性に対して正の調節効果を及ぼすことができる[Regnier, C., Song, H., Gao, X., Goeddel, D., Cao, Z. and Rothe, M. (1997) Cell 90, 373-383; DiDonato, J.A., Hayakawa, M., Rothwarf, D.M., Zandi, E. and Karin, M. (1997) Nature 388, 548-554; Mercurio, F., Zhu, H., Murray, B.W., Shevchenko, A., Bennett, B.L., Li, J.W., Young, D.B., Barbosa, M., Mann, M., Manning, A. and Roa, A. (1997) Science 278, 860-866; Zandi, E. Rothwarf, D.M., Delhase, M., Hayadawa, M. and Karin, M. (1997) Cell 91, 243-252; Woronicz, J.D., Gao, X., Cao, Z., Rothe, M., and Goeddel, D.V. (1997) Science 278, 866-869; Dehase, M., Hayakawa, M., Chen, Y., and Karin, M. (1999) Science 284, 309-313]。両IKKサブユニットは、N末端付近に基本MAPKK活性化ループモチーフを含むが、それはNIKやMEKK1などのようなMAP3Ksによるリン酸化およびキナーゼ活性発動の標的である。ただしこれら2つの上流キナーゼによる生理的調節についてはさらなる特性解析がまたれる[Zandi, E. and Karin, M, (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 4547-4551; Karin, M. (1999) J. Biol.. Chem. 274, 27339-27342; Karin, M., and Delhase, M. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 9067-9069]。最後に、IKK2のC末端セリンのリン酸化はIKK活性の減退を招くが、アゴニストによる細胞刺激後に一時的なキナーゼ活性が見られるのはそのためと考えられる[Dehase, M., Hayakawa, M., Chen, Y., and Karin, M. (1999) Science 284, 309-313]。
【０００６】
IKK2はIκBαまたはIκBβを基質とし、IKK1よりも強いキナーゼ活性を示す[Mercurio, F., Zhu, H., Murray, B.W., Shevchenko, A., Bennett, B.L., Li, J.W., Young, D.B., Barbosa, M., Mann, M., Manning, A. and Roa, A. (1997) Science 278, 860-866; Zandi, E. Rothwarf, D.M., Delhase, M., Hayadawa, M. and Karin, M. (1997) Cell 91, 243-252; Woronicz, J.D., Gao, X., Cao, Z., Rothe, M., and Goeddel, D.V. (1997) Science 278, 866-869; Dehase, M., Hayakawa, M., Chen, Y., and Karin, M. (1999) Science 284, 309-313]。MAPKK活性化ループ内のリン酸受容体(phosphoacceptor)セリン残基の変異はIKK2キナーゼ活性を変化させる。すなわちセリン→アラニンの置換はキナーゼ活性を減退させるのに対して、セリン→グルタミン酸の置換は構成的に活性型のキナーゼをもたらす。IKK1では同様の変異はTNFαまたはIL1β刺激に応答した全IKK活性を低下させる結果とはならない[Dehase, M., Hayakawa, M., Chen, Y., and Karin, M. (1999) Science 284, 309-313]。IKK2がIKK複合体内の支配的活性源であるとの見方は、IKK1またはIKK2を欠くマウス由来線維芽細胞の分析からも裏付けられる。IKK1欠失線維芽細胞はサイトカイン類に応答した全IKK活性を保持する。それに対して、IKK2欠失線維芽細胞はサイトカイン類で刺激してもIKK活性を示さないし、NF-κBを活性化することもない。さらに、各IKKノックアウトの表現型は皮膚および骨格異常を伴うIKK欠失型に限られ、IKK2ノックアウトは肝細胞アポトーシスのため胚致死となる[Li, Q., Antwerp, D.V., Mercurio, F., Lee, K., and Verma, I.M. (1999) Science 284, 321-325; Takeda, K., Tekeuchi, O., Tsujimura, T., Itami, S., Adachi, O., Kawai, T., Sanjo, H., Yoshikawa, K., Terada, N., and Akira, S. (1999) Science 284, 313-316; Hu, Y., Baud, V., Delhase, M., Zhang, P., Deerinck, T., Ellisman, M., Johnson, R., and Karin, M. (1999) Science 284, 315-320; Li, Q., Lu, Q., Hwang, J.Y., Buscher, D., Lee, K., Izpisua-Belmonte, J.C., and Verma, I.M. (1999) Gene and Development 13, 1322-1328; Tanaka, M., Fuentes, M.E., Yamaguchi, K., Durnin, M.H., Dalrymple, S.A., Hardy, K.L., and Goeddel, D.V. (1999) Immunity 10, 421-429]。
【０００７】
周知のように、NF-κBはIL-6やIL-8などのサイトカイン類、ICAMやVCAMなどの細胞接着分子、それに誘導型NO合成酵素(iNOS)を含めたきわめて多数の炎症メディエーターの調節発現で重要な役割を果たす。そうしたメディエーターは炎症部位への白血球の動員に一役買うことが知られており、またiNOSの場合には若干の炎症性疾患や自己免疫疾患で臓器破壊を招くこともある。炎症性疾患でのNF-κBの重要性は、NF-κBの活性化を伴うことが判明している喘息を含む気道炎症の研究によりさらに強まった。この活性化はこれらの疾患に特徴的であるサイトカイン産生や白血球浸潤の増大の土台なのかもしれない。さらに、ステロイド剤吸入は気道過敏症を緩和し喘息気道の炎症反応を抑制することが知られている。グルココルチコイドによるNF-κB阻害に関する最近の研究成果に照らすと、これらの効果を仲介しているのはNF-κB阻害ではないかと推測されよう。炎症性疾患でのNF-κBの役割に関するさらなる証拠は、リウマチ滑膜の研究からもあがっている。NF-κBは通常、不活性の細胞質複合体として存在するものの、最近の免疫組織化学研究ではリウマチ滑膜を含む細胞ではNF-κBは核内に存在し、従って活性であるとされている。さらに、NF-κBはヒト滑膜細胞中でTNF-αの刺激に応答して活性化することも判明している。こうした分布はこの組織に特徴的であるサイトカイン産生や白血球浸潤の増大の土台なのかもしれない。Roshak, A.K., et al., J. Biol. Chem., 271, 31496-31501 (1996)を参照。
【０００８】
おそらくNF-κB/RelおよびIκBタンパク質もまた、細胞がん化で重要な役割を果たしているようである。ファミリーメンバーは過剰発現、遺伝子増幅、遺伝子再配列または転座に起因するin vitroおよびin vivo細胞形質転換に関連する(Gilmore TD, Trends Genet 7:318-322, 1991; Gilmore, TD, Oncogene 18:6926-6937, 1999; Rayet B. et al., Oncogene 18: 6938-6947, 1991)。加えて、これらのタンパク質をコードする遺伝子の再配列および/または増幅はある種ヒトリンパ腫瘍の20〜25%で見受けられる。アポトーシス、細胞周期の進行、浸潤および転移の調節におけるNF-κBの役割もまた報告されており(Bours V. et al., Biochemical Pharmacology 60: 1085-1090, 2000)、この転写因子の細胞増殖制御機能をさらに裏付ける。NF-κBの阻害はアポトーシスの促進によるTNFおよびがん療法を可能にすることが明らかにされた(Wang C-Y et al., Science 274: 784-787, 1996; Wang C-Y et al., Nat Med 5:412-417, 1999)。通常なら一過性に機能するIKKαとIKKβがヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV1)感染細胞(活性化CD4+Tリンパ球の高進行性・悪性度の病原体)では、構成的に発現することも明らかにされた(Chu Z-L et al., J. of Biological Chemistry 273: 15891-15894, 1998)。HTLV1形質転換および転写促進タンパク質(Tax)はMEKK1に結合することが明らかにされたし、またIKKβの活性を強めてIκBαのセリン残基のリン酸化を促進しその分解を招くようにする。
【０００９】
米国特許第4,999,436号明細書は炎症治療用の5-リポキシゲナーゼ阻害剤としてアリール-およびヘテロ環基-置換チオフェン誘導体を開示している。
米国特許第4,797,414号明細書は呼吸促進薬としてチエノベンゾチオピラン誘導体を開示している。
米国特許第5,468,750号明細書は酸素フリーラジカル生物効果の阻害剤として、ヘテロ環基結合型の置換ピロロ[3,2-C]ピリジン-2-カルボン酸を開示している。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の詳細な説明
本発明は、以下の式Ｉ：
【化１】
2005536518.tif 000002
で示される三環系化合物またはその異性体、互変体、多形体、担体、プロドラッグ、製薬上許容しうる塩を含有する新規の製剤組成物に関するが、式中:
Aは(CH2)mまたは(CH2)m-W-(CH2)nであり、随意に、スルファミル、ハロ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシルおよびハロアルキル、CF3、COCF3、CN、NO2、ヒドリド、OR3、OCOOR3、CO2H、CO2R3、CONH2、CONHR3、CON(R3)2、COR3、SR3、SOR3、SCOOR3、SO2R3、NH2、NHR3、NR3R3、NR3COR3、NR3CONHR3、NR3SO2R3、NR3SO2NHR3、SO2NHR3およびSO2N(R3)2からなる群より独立に選択される1つまたは複数の置換基をもつ;
【００１１】
Bは6員芳香族炭化水素環であり、随意に、OR3、SR4、SO2N(R4)2、NHR4、NHCOR4、NR4COR4、NHCO(OR4)、NR4CO(OR4)、NHCONHR3、NR3CONHR4、NR3SO2R4、NHSO2R4、NHSO2N(R4)2、NHCONR4R4、CO2R4、CON(R4)2、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環基、ハロ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、N-モノアルキルアミド、N-モノアリールアミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、N,N-ジアルキルアミド、N-アルキル-N-アリールアミド、ハロアルキル、ヒドリド、ヒドロキシル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、スルファミル、N-アルキルスルファミル、アミノ、アルキルアミノおよびニトロからなる群より独立に選択される1つまたは複数の置換基をもつ;
WはS(O)p、O、CH=N、N(O)=CH、CH2=CH2およびNR4である;
mは0〜3である;
nは0〜3である;
pは0〜2である;
【００１２】
R1とR2は、ヒドリド、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、アルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミジン、グアニジン、CONHR5、NHR5およびNHCXNHR5(式中XはO、SまたはNR6である)からなる群より独立に選択される;
R3は、ヒドリド、アリール、ヘテロアリール、低級アルキル、アルケニル、アルキニルおよびヘテロアルキルからなる群より選択される;
R4は、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ハロアルキル、アリールアルキルアミノおよびヘテロアリールアルキルからなる群より選択されるが、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルは随意に、アルキル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、シアノ、ハロアルコキシ、アシル、カルボキシル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシおよびヘテロ環基より選択される1つまたは複数の基を置換基としてもつ;
【００１３】
R5は、ヒドリド、アルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキルおよびアシルからなる群より選択される;
R6は、ヒドリド、アルキル、シアノおよびニトロからなる群より選択される;
ただし、WがCH=Nでありmが0であるときには、CH=N中の窒素原子は環Bに直接結合しなければならない。
【００１４】
定義
本発明は、本発明化合物の諸々の水和物、溶媒和物、錯体およびプロドラッグの使用を包含する。プロドラッグは、式Ｉで示される元の活性薬物をin vivoで放出するような任意の共有結合化合物である。不斉中心または他の異性体中心が本発明化合物に存在する場合には、そうした異性体の諸々の形態がエナンチオマーやジアステレオマーを含めて本発明に包含されるものとする。不斉中心をもつ化合物はラセミ体やエナンチオマー濃縮体として使用してもよいし、ラセミ体を周知の技法で分離し、個別エナンチオマーとして使用してもよい。不飽和炭素-炭素二重結合を含む化合物は、シス(Z)、トランス(E)両異性体が本発明の範囲に包含される。化合物が互変異性型として、たとえばケト-エノール互変体として、存在する場合には、各互変異性型が、平衡状態で存在しようが主として一方の型に片寄って存在しようが、本発明の範囲に包含されるものとする。
【００１５】
式Ｉまたはその任意の部分式中のある部分に出現する任意の置換基の意味は特に断らない限り、他の部分に出現する該置換基または他置換基の意味とは独立している。
【００１６】
用語「アルキル」は単独で、または「ハロアルキル」、「アルキルスルホニル」などのような他の用語の一部として、使用され、炭素原子数1〜20程度の、または好ましくは炭素原子数1〜12程度の直鎖または分岐鎖基を包含する。アルキル基は炭素原子数が1〜10程度の「低級アルキル」基であるのがなお好ましく、炭素原子数1〜5程度の低級アルキル基であるのが最も好ましい。そうした基の例はメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、オクチルなどである。
【００１７】
用語「ヒドリド」は単一水素原子(H)を意味する。このヒドリド基はたとえば1個の酸素原子と結合してヒドロキシル基を形成してもよいし、あるいは2つのヒドリド基が1個の炭素原子と結合してメチレン基(-CH2-)を形成してもよい。用語「ハロ」はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子などのハロゲンを意味する。用語「ハロアルキル」はアルキル基のうち任意の1つまたは複数の炭素原子が前述のハロに置換している場合をいう。特にモノハロアルキル、ジハロアルキル、およびポリハロアルキルがこれに包含される。一例として、モノハロアルキル基は内部にブロモ、クロロまたはフルオロ原子を1個もつ。ジハロ基は同じハロ原子を2個以上または異なるハロ基の組合せをもち、またポリハロアルキル基は同じハロ原子を2個以上または異なるハロ基の組合せをもつ。用語「ヒドロキシアルキル」は、炭素原子数1〜10程度であって、任意の炭素原子が1つまたは複数のヒドロキシル基に置換している直鎖または分岐鎖アルキル基を包含する。用語「アルコキシ」および「アルコキシアルキル」はそれぞれ酸素原子数1〜10程度の直鎖または分岐鎖の含オキシ基たとえばメトキシ基を包含する。用語「アルコキシアルキル」はまた、2個以上のアルコキシ基を結合させたアルキル基を、すなわちモノアルコキシアルキルおよびジアルコキシアルキル基を包含する。「アルコキシ」または「アルコキシアルキル」基は1つまたは複数のハロ原子たとえばフルオロ、クロロまたはブロモでさらに置換して「ハロアルコキシ」または「ハロアルコキシアルキル」基としてもよい。「アルコキシ」基の例はメトキシ、ブトキシ、トリフルオロメトキシなどである。用語「アリール」は単独で、または複合語として1、2または3個の環を含む炭素環式芳香族環系をいい、そうした環は側鎖として結合させてもよいし、縮合させてもよい。
【００１８】
用語「アリール」はフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダン、ビフェニルなどの芳香環基を包含する。用語「ヘテロ環基」は飽和、部分飽和および不飽和のヘテロ原子を含む環状基を包含し、ヘテロ原子は窒素、硫黄、酸素より選択される。飽和ヘテロ環基の例はピロリジルおよびモルホリニルなどである。用語「ヘテロアリール」は不飽和ヘテロ環基を包含する。不飽和ヘテロ環基は「ヘテロアリール」基ともいい、その例はチエニル、ピロリル、フリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリルおよびテトラゾリルなどである。この用語はアリール基と縮合したヘテロ環基にも使用する。そうした縮合二環系の例はベンゾフラン、ベンゾチオフェンなどである。用語「スルホニル」は単独で、またはアルキルスルホニルなどの複合語として、それぞれ二価の-SO2-基を意味する。［アルキルスルホニル」は前記の意味でのアルキル基と結合したスルホニル基を包含する。「アリールスルホニル」はアリール基で置換したスルホニル基を包含する。
【００１９】
用語「スルファミル」または「スルホンアミジル」は単独で、または「N-アルキルスルファミル」、「N-アリールスルファミル」、「N,N-ジアルキルスルファミル」および「N-アルキル-N-アリールスルファミル」などのような複合語で、アミンを置換基として有しスルホンアミド(-SO2NH2)を形成するスルホニル基を意味する。用語「N-アルキルスルファミル」および「N,N-ジアルキルスルファミル」はそれぞれ1個のアルキル基、シクロアルキル環または2個のアルキル基を置換基として有するスルファミル基を意味する。用語「N-アリールスルファミル」および「N-アルキル-N-アリールスルファミル」はそれぞれ1個のアリール基、および1個のアルキル基と1個のアリール基を置換基として有するスルファミル基を意味する。用語「カルボキシ」または「カルボキシル」基は単独で、または「カルボキシアルキル」などの複合語として、-CO2Hを意味する。用語「カルボキシアルキル」は前記の「カルボキシル」基をアルキル基に結合させて有する基を意味する。
【００２０】
用語「カルボニル」は単独で、または「アルキルカルボニル」などの複合語として、-C(=O)-を意味する。用語「アルキルカルボニル」はアルキル基を置換基として有するカルボニル基を意味する。「アルキルカルボニル」基の例はCH3-C(=O)-である。用語「アルキルカルボニルアルキル」は「アルキルカルボニル」基を置換基として有するカルボニル基を意味する。用語「アルコキシカルボニル」は前記の意味でのアルコキシ基を、酸素原子を介してカルボニル基(C=O)に結合させて含む基を意味する。そうした「アルコキシカルボニル」基の例は(CH3)3CO-C(=O)や-(O=)C-OCH3である。用語「アルコキシカルボニルアルキル」は前記の意味での「アルコキシカルボニル」を置換基として有するアルキル基を意味する。「アルコキシカルボニルアルキル」基の例は(CH3)3COC(=O)-(CH2)2-や-(CH2)2(O=)COCH3である。用語「アミド」は単独で、または「アミドアルキル」、「N-モノアルキルアミド」、「N-モノアリールアミド」、「N,N-ジアルキルアミド」、「N-アルキル-N-アリールアミド」、「N-アルキル-N-ヒドロキシアミド」および「N-アルキル-N-ヒドロキシアミドアルキル」などの複合語で、アミノ基を置換基として有するカルボニル基を包含する。
【００２１】
用語「N-アルキルアミド」および「N,N-ジアルキルアミド」はそれぞれ1個のアルキル基および2個のアルキル基を置換基として有するアミド基を意味する。用語「N-モノアリールアミド」および「N-アルキル-N-アリールアミド」はそれぞれ1個のアリール基、および1個のアルキル基+1個のアリール基を置換基として有するアミド基を意味する。用語「N-アルキル-N-ヒドロキシアミド」はヒドロキシル基とアルキル基を置換基として有するアミド基を包含する。用語「N-アルキル-N-ヒドロキシアミドアルキル」はN-アルキル-N-ヒドロキシアミド基を置換基とするアルキル基を包含する。用語「アミドアルキル」はアミド基を置換基とするアルキル基を包含する。用語「アミノアルキル」はアミノ基を置換基とするアルキル基を包含する。用語「アルキルアミノアルキル」は窒素原子をアルキル基で置換したアミノアルキル基を包含する。用語「アミジノ」は-C(=NH)-NH2基を意味する。用語「シアノアミジノ」は-C(=N)-CN)-NH2基を意味する。用語「ヘテロシクロアルキル」はピリジルメチルやチエニルメチルなどのようなヘテロ環置換アルキル基を包含する。
【００２２】
用語「アラルキル」はベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、フェネチル、ジフェネチルなどのようなアリール置換アルキル基を包含する。用語ベンジルおよびフェニルメチルは互換性がある。用語「シクロアルキル」は炭素原子数3〜10の基たとえばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルを包含する。用語「シクロアルケニル」は炭素原子数3〜10の不飽和基たとえぱシクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニルを包含する。用語「アルキルチオ」は炭素原子数1〜10の直鎖または分岐鎖アルキル基を二価の硫黄原子に結合させて含む基を包含する。「アルキルチオ」の例はメチルチオ(CH3S-)である。用語「アルキルスルフィニル」は炭素原子数1〜10の直鎖または分岐鎖アルキル基を二価-S(O)-原子に結合させて含む基を包含する。用語「N-アルキルアミノ」および「N,N-ジアルキルアミノ」はそれぞれ1個および2個のアルキル基を置換基として有するアミノ基を意味する。
【００２３】
用語「アシル」は単独で、または「アシルアミノ」などのような複合語として、有機酸からヒドロキシル基を除去した後の残基によって与えられる基を意味する。用語「アシルアミノ」はアシル基を置換基として有するアミノ基を包含する。「アシルアミノ」基の例はアセチルアミノ(CH3C(=O)-NH-)である。
【００２４】
式Ｉ化合物は、非限定的な例として患者の炎症の治療、および他の炎症関連疾患の治療に、たとえば疼痛や頭痛を緩和解消する鎮痛剤として、または熱を下げる解熱剤として、有用であろう。式Ｉ化合物はたとえば、リウマチ様関節炎、脊椎関節症、通風性関節炎、変形性関節症、全身性エリテマトーデス、若年性関節炎などを非限定的に含む関節炎の治療に有用であろう。式Ｉ化合物はまた喘息、気管支炎、生理痛、腱炎、滑液包炎、それに皮膚関連疾患たとえば乾癬、湿疹、火傷、皮膚炎などの治療にも有用であろう。式Ｉ化合物はまた、胃腸疾患たとえば炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎の治療や結腸直腸がんの予防にも有用であろう。式Ｉ化合物は血管疾患などの疾患たとえば血管炎、片頭痛、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、強皮症、リウマチ熱、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、サルコイドーシス、ネフローゼ症候群、ベーチェット症候群、多発性筋炎、歯肉炎、過敏症、結膜炎、負傷後の腫脹、心筋虚血などにおける炎症の治療に有用であろう。本発明の化合物はまた疼痛にも使用されよう。式Ｉ化合物は抗炎症薬として、たとえば関節炎の治療に有用であり、有害な副作用が著しく少ないといった追加の利点もある。式Ｉ化合物はがん治療薬または抗がん剤として有用である。式Ｉ化合物の作用はアポトーシス誘導、アポトーシス抑制、細胞周期進行抑制、浸潤抑制、増殖抑制、血管新生抑制、転移抑制であろう。前記のがんは結腸がん、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫であろう。
【００２５】
式Ｉ化合物は抗ウイルス薬として使用してもよい。本発明の化合物はプロテインキナーゼ阻害剤として機能しよう。本発明の化合物はIKK1および/またはIKK2、IKKα/IKKβヘテロ二量体、TBKまたはIKKiの阻害剤として機能しよう。本発明はIKK1に対してIKK2を選択的に阻害する化合物を含むのが好ましい。好ましくは、該化合物はIKK2 IC50が1μM未満であり、またIKK1阻害に対するIKK2阻害の選択比が少なくとも50、より好ましくは少なくとも100である。なお好ましくは該化合物のIKK1 IC50は10μM超であり、100μM超ならさらに好ましい。式Ｉ化合物はまた、血管新生関連の心血管疾患、がん疾患および骨粗鬆症の治療に使用してもよい。本発明の化合物はまた、膝の故障たとえばスポーツ外傷の治療に使用してもよい。
【００２６】
有効成分は原体として単独で投与することも可能であるが、製剤として投与するのが好ましい。本発明は、治療有効量の本発明化合物を少なくとも1つの製薬上許容しうる担体、アジュバントまたは希釈剤と共に含有する製剤組成物を含む。本発明はまた患者の炎症および炎症関連疾患を治療する方法を含むが、該方法は炎症または炎症関連疾患をわずらう該患者に治療有効量の本発明化合物を投与するステップを含む。本発明化合物のファミリーには該化合物の製薬上許容しうる塩もまた含まれる。用語「製薬上許容しうる塩」は、一般にアルカリ金属塩の形成や遊離酸または遊離塩基の付加塩の形成に使用される塩を包含する。
【００２７】
塩が製薬上許容しうる限りで、塩の性質自体は決定的に重要というわけではない。本発明化合物の製薬上許容しうる好適な酸付加塩は無機酸または有機酸いずれから調製してもよい。そうした無機酸の例は塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、リン酸などである。好適な有機酸は脂肪族系、脂環式系、芳香族系、芳香脂肪族系、ヘテロ環式系、カルボン酸系、スルホン酸系の有機酸から選択してよいが、その例はギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、サリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エボン酸(パモ酸)、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、ステアリン酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルギン酸、β-ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸などである。本発明化合物の製薬上許容しうる好適な酸付加塩はアルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛などに由来する金属塩、またはN,N’-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メルグミン(N-メチル-グルカミン)およびプロカインなどに由来する有機塩などである。これらの塩はいずれも、対応する本発明化合物から通常の手段により、たとえば本発明化合物に好適な酸または塩基を反応させることにより、調製することができる。
【００２８】
本発明には、1つまたは複数の本発明化合物を、1つまたは複数の無害の、製薬上許容しうる担体および/または希釈剤および/またはアジュバントおよび/または賦形剤(本願では一括して「担体」原料という)と共に、また必要なら他の活性成分と共に、含む製剤組成物もまた包含される。従って、本発明化合物は医薬の製造に使用してもよい。本願で開示した要領で調製した本発明化合物の製剤組成物は非経口投与用の溶液または凍結乾燥粉末として調剤してもよい。粉末は好適な希釈剤または他の製薬上許容しうる担体を加え、還元してから使用してもよい。液剤は緩衝等張水溶液でもよい。本発明化合物は任意好適な経路で、好ましくはそうした経路に適合させた製剤組成物の形で、所期治療のための有効用量を、投与する。
【００２９】
本発明の化合物および組成物はたとえば血管内、腹腔内、静脈内、皮下、筋内、髄内、経口、局所などの経路で投与しもてよい。経口投与では製剤組成物をたとえば錠剤、カプセル剤、懸濁液または液剤の形にしてもよい。活性成分を組成物として注射投与してもよいが、その場合には、好適な担体としてたとえば生理食塩水、標準5%ブドウ糖水溶液、または緩衝酢酸ナトリウムまたはアンモニウム溶液を使用してもよい。そうした製剤は非経口投与に特に好適であるが、経口投与や定量噴霧吸引器による吸引投与に使用してもよい。ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウムなどの賦形剤を加えるのが望ましい場合もある。製剤組成物は特定量の有効成分を含む単位用量剤形として製造するのが好ましい。そうした単位用量剤形の例は錠剤またはカプセル剤である。本発明の化合物および/または組成物による疾患治療のための活性成分の投与量および投与計画は種々の要因に(たとえば患者の年齢、体重、性別および健康状態、疾患の重症度、投与経路および頻度、具体的な使用化合物などに)依存するので、様々であろう。製剤組成物の活性成分含量は約0.1〜2000mgの範囲、好ましくは約0.5〜500mgの範囲、最も好ましくは1〜100mgであろう。適正な日用量は約0.01〜100mg/kg-体重、より好ましくは約0.1〜50mg/kg-体重、最も好ましくは1〜20mg/kg-体重であろう。この日用量は1〜4回/日で投与することができる。治療目的のために、本発明化合物は指定投与経路に適した1つまたは複数のアジュバントと混合するのが普通である。経口剤の場合には、本発明化合物は乳糖、ショ糖、でんぷん粉、カルボン酸セルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、ゼラチン、アカシアガム、アルギニン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、および/またはポリビニルアルコールと混和し、次いで投与に好都合なように打錠またはカプセル化する。そうしたカプセル剤または錠剤は、持続放出物質たとえば単独または含ワックスのモノステアリン酸グリセリン、ジステアリン酸グリセリン、ヒドロキシプロピルメタルセルロースなどに活性化合物を分散させた放出制御製剤を含んでもよい。
【００３０】
非経口剤の場合は、水性または非水性の等張滅菌注射液または懸濁注射液の形をとってもよい。これらの注射液および懸濁注射液は、前述の経口剤用担体または希釈剤を1つまたは複数混ぜた滅菌粉末または顆粒から調製してもよい。本発明化合物は水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、とうもろこし油、綿実油、落花生油、ごま油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、および/または種々の緩衝液に溶解してもよい。本発明の製剤は通常の製剤技法に従って製造するが、錠剤の場合には粉砕、混合、造粒および圧縮の各ステップを伴い、また硬質ゼラチンカプセル剤の場合には粉砕、混合および充填の各ステップを伴う。液体の担体を使用するとき、製剤はシロップ、エリキシル、乳液、または水性・非水性懸濁液の形をとろう。そうした液剤は経口投与してもよいし、軟質ゼラチンカプセルに充填してもよい。直腸投与では、本発明化合物をカカオバター、グリセリン、ゼラチンまたはポリエチレングリコールなどの賦形剤と混合し座剤に成形してもよい。本発明の方法は本発明化合物の局所投与を含む。局所投与は該化合物が血流中にほとんど入らない非全身投与を意味し、本発明化合物の表皮への塗布、口腔への塗布、および耳・眼・鼻への点滴注入などを含む。全身投与は経口、静脈内、腹腔内および筋内投与を意味する。局所投与で治療予防効果をあげるために必要とされる本発明化合物(以下、活性成分という)の量はもちろん選択した化合物、治療対象疾患及び対象動物の性質と重症度により変化しようが、最終的には医師の裁量になる。
【００３１】
本発明による局所製剤は動物用、人間用のいずれであれ、活性成分を、1つまたは複数の許容しうる担体と共に、また随意に他の任意の治療成分と共に、含む。該担体が「許容しうる」のは、該製剤の他成分と相溶性であり、その被投与者に対し無害であるという意味である。局所投与に適した製剤は、皮膚に浸透して治療が必要とされる部位に至るのに好適な液状または半固形製剤たとえば塗布薬、水薬、クリーム、軟膏または泥膏、それに眼・耳・鼻への投与に適した点滴製剤などである。局所製剤の活性成分含量は0.01〜5.0 wt%でもよい。
【００３２】
本発明による点滴製剤は滅菌水性または油性溶液または懸濁液を含んでもよいし、また抗菌および/または抗真菌剤および/または他の任意好適な防腐剤の、好ましくは界面活性剤を加えた、好適な水溶液に活性成分を溶解して調製してもよい。次いで、得られた溶液をろ過により浄化し、好適な容器に移し、容器を密封し、オートクレーブで殺菌するか、または90〜100℃に0.5時間維持する。あるいは、該溶液を滅菌ろ過して、無菌法で容器に移してもよい。点滴製剤に加えるための好適な抗菌剤および抗真菌剤の例は硝酸または酢酸フェニル水銀(0.00217c)、塩化ベンザルコニウム(0.01%)および酢酸クロルヘキシジン(0.01%)である。油性溶液調製のための好適な溶媒はグリセリン、希釈アルコール、およびプロピレングリコールなどである。
【００３３】
本発明による外用水薬は皮膚または眼への適用に適したものを含む。目薬は、随意に抗菌剤を加えた滅菌水溶液を含んでもよいし、また点滴製剤の調製の場合と類似の方法で調製してもよい。皮膚用の水薬または塗布薬はさらに、乾燥促進・皮膚清涼剤たとえばアルコールまたはアセトン、および/または保湿剤たとえばグリセリンまたはひまし油または落花生油などの油を含んでもよい。本発明によるクリーム、軟膏または泥膏は外用の半固形製剤であり、微細化または粉末化した活性成分を単独で、または溶液または水性または非水性懸濁液中に、好適な機械の助けを借りて、脂肪性または非脂肪性基剤と共に、混合して調製する。この基剤は炭化水素たとえば固形、軟質または流動パラフィン、グリセリン、みつろう、金属セッケン; 粘質物; 天然由来の油たとえばアーモンド油、とうもろこし油、落花生油、ひまし油またはオリーブ油; 羊毛脂またはその誘導体、または脂肪酸たとえばステアリン酸またはオレイン酸、それにアルコールたとえばプロピレングリコールまたはマクロゴールなどを含んでもよい。該製剤は任意好適な界面活性剤たとえば陰イオン、陽イオンまたは非イオン界面活性剤たとえばソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体を含んでもよい。さらに懸濁化剤たとえば天然粘性物質、セルロース誘導体または無機物たとえば珪質シリカ、それに他成分たとえばラノリンなどを含んでもよい。他のアジュバントおよび投与形態は技術上周知である。以上、本発明を具体的な実施態様から説明したが、これらの実施態様の細部は極限と解してはならない。
【００３４】
一般的合成法
ここで使用する出発物質は市販品であるか、または標準参考書たとえばCOMPENDIUM OF ORGANIC SYNTHETIC METHODS, Vol.Ｉ-VI(発行元: Wiley-Interscience)に記載されている技術上周知の常法によって合成する。
【００３５】
本発明の化合物は次の合成法スキームＩに従って合成することができるが、式中の置換基R1〜R4は特に断らない限り式Ｉの場合と同じである。
【化２】
2005536518.tif 000003
a) POCl3, DMF, 5℃〜RT(室温), 16 h(時間); b) Na2OH x HCl, NaOAc, EtOH (90%), 還流2h; c)酢酸無水物、ピリジン、還流; d) 2-メルカプトアセトアミド、NaOMe、還流。
【化３】
2005536518.tif 000004
R3=CONH2またはCN、R4=CH3またはNH2。
a) 硫黄、アミン塩基、EtOH、還流; b)シアン化Na /AcOH。
【００３６】
本願で引用する諸々の出版物、特許および特許出願の明細書についてはその全内容が参照により本願に組み込まれる。その効果はあたかも各個別出版物、特許および特許出願の明細書が参照により組み込まれることを個別に表示するかの如くである。以上、本発明につき理解の明確を期すために種々の例をあげてやや詳しく説明したが、本発明の教示に照らして、本発明の本質と範囲から逸脱することなく種々の変更や修正が可能であることは当業者には自明であろう。以下の実施例はもっぱら例示が目的であり、すでに大まかに述べた本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例1
3-アミノ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド
【化４】
2005536518.tif 000005
1-クロロ-3,4-ジヒドロナフタレン-2-カルバルデヒド 1a : N2導入管、温度計および添加用漏斗を取り付けた三口フラスコに、DMF (8.4g)とCH2Cl2(40mL)を入れた。氷浴で0〜5℃に冷却後、POCl3 (14g)を滴下した。添加完了後、混合物をRT(室温)で2 h(時間)撹拌した。次いで混合物を0〜5℃に冷却し、α-テトラロン(8.76g, 60mmol)/CH2Cl2 (50mL)溶液を加えた。添加完了後、混合物をRTで16h撹拌した。反応溶液を氷+NaHCO3(飽和、200mL))上に注ぎ、追加のCH2Cl2を加え、ガス発生が止むまで撹拌した。層を分離し、水性層をCH2Cl2 (250mL)で抽出した。CH2Cl2抽出物を合わせて水で洗い乾燥(Na2SO4)後、減圧濃縮して標記化合物を赤色液体として得た(11.7g、収率96%)。
【００３８】
1-クロロ-3,4-ジヒドロナフタレン-2-カルバルデヒドオキシム1b: 1(11.0g)、ヒドロキシルアミン塩酸塩(5.2g)、酢酸ナトリウム(11.75g)およびエタノール(90mL, 90%)の混合物を2h還流した。混合物をRTに冷却し、次いで氷水(90mL)中に注いだ。得られた沈殿をろ過回収して標記化合物を黄褐色固形物として得た(12g、収率100%)。
【００３９】
1-クロロ-3,4-ジヒドロナフタレン-2-カルボニトリル1c : 2(2.08g)、ピリジン(0.4mL)および酢酸無水物の混合物を10h還流した。反応溶液を冷却し、氷水中に注いだ。得られた沈殿をろ過回収して標記化合物を黄褐色固形物として得た(1.28g、収率68%)。
【００４０】
3-アミノ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド1 : 新規に調製したナトリウムメトキシド(5.27mmol)/メタノール(20mL)溶液に2-メルカプトアセトアミド(480mg, 5.27mmol)を加えた。得られた溶液をRTで15分間撹拌し、次いで3(1.0g, 5.27 mmol)を加えた。得られた溶液を一晩還流した。溶媒を減圧留去し残渣を酢酸エチル(50mL)+HCl(1N, 50mL)中に懸濁させた。得られた固形物をろ過回収し、メタノールから再結晶させて標記化合物をオフホワイトの固形物として得た(385mg, 32%)。標記化合物3-アミノ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミドをIKK-2 Resinアッセイで評価すると、10μM ≦ IC50 ≦ 20μMという結果になった。
【００４１】
実施例2
3-アミノ-8-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド
【化５】
2005536518.tif 000006
1-クロロ-7-メトキシ-3,4-ジヒドロナフタレン-2-カルバルデヒド2a: この化合物は実施例1aの方法により7-メトキシ-α-テトラロン(5g)から調製し、赤色液体として得た。この化合物はそのまま次のステップに使用した。
【００４２】
1-クロロ-7-メトキシ-3,4-ジヒドロナフタレン-2-カルバルデヒドオキシム2b: 2a(6.2g)、ヒドロキシルアミン塩酸塩(2.78g)、酢酸ナトリウム(6.15g)およびエタノール(50mL, 90%)の混合物を2.5h還流した。混合物をRTに冷却し、次いで氷水(50mL)中に注いだ。得られた沈殿をろ過回収して標記化合物を黄色固形物として得た(5.8g、7-メトキシ-α-テトラロンからの収率86%)。
【００４３】
1-クロロ-7-メトキシ-3,4-ジヒドロナフタレン-2-カルボニトリル2c : 2b(5.8g)、ピリジン(0.5mL)および酢酸無水物(50mL)の混合物を8h還流した。反応溶液を冷却し、氷水(250mL)中に注いだ。得られた沈殿をろ過回収して標記化合物を褐色固形物として得た(5.7g、収率68%)。
【００４４】
3-アミノ-8-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド2 :新規に調製したナトリウムメトキシド(23mmol)/メタノール(50mL)溶液に2-メルカプトアセトアミド(2.09g)を加えた。得られた溶液をRTで15分間撹拌し、次いで2c(5.0g)を加えた。得られた溶液を一晩還流した。溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチル(50mL)+HCl(1N, 50mL)中に懸濁させた。得られた固形物(6.0g)をろ過回収し、メタノールから再結晶させて標記化合物をオフホワイトの固形物として得た(1.1g, 17%)。標記化合物3-アミノ-8-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミドをIKK-2 Resinアッセイで評価すると、1μM ≦ IC50 ≦ 10μMという結果になった。
【００４５】
実施例3
3-[(2-アミノエチル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド臭化水素酸塩
【化６】
2005536518.tif 000007
1(732mg)と2-ブロモエチルアミン臭化水素酸塩(1.89g)のDMF溶液を80℃で16h加熱した。溶媒を留去し、残渣を逆相HPLCで精製して標記化合物を得た。標記化合物3-[(2-アミノエチル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド臭化水素酸塩をIKK-2 Resinアッセイで評価すると、1μM ≦ IC50 ≦ 10μMという結果になった。
【００４６】
実施例4
3-[(3-アミノプロピル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド塩酸塩
【化７】
2005536518.tif 000008
1(732mg)と2-ブロモプロピルアミン臭化水素酸塩(2g)のDMF溶液を80℃で16h加熱した。溶媒を留去し、残渣を逆相HPLCで精製した。残渣を1N HClから凍結乾燥させて標記化合物を得た。標記化合物3-[(3-アミノプロピル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド塩酸塩をIKK-2 Resinアッセイで評価すると、10μM ≦ IC50 ≦ 20μMという結果になった。
【００４７】
実施例5
3-[(アミノカルボニル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミド
【化８】
2005536518.tif 000009
1(512mg)、酢酸(35mL)および水(7mL)の撹拌溶液にシアン化ナトリウムを加えた。得られた溶液を16h撹拌し、得られた固形物をろ別した。固形物をエタノール(95%, 50mL)に懸濁させ、ろ取し、乾燥させて標記化合物を得た。標記化合物3-[(アミノカルボニル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-2-カルボキサミドをIKK-2 Resinアッセイで評価すると、10μM ≦ IC50 ≦ 20μMという結果になった。
【００４８】
実施例6
2-アミノ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボニトリル
【化９】
2005536518.tif 000010
β-テトラロン(22.6g, 0.154mol)、マロニトリル(20mL, 0.16mol)および硫黄(7.2g, 0.22mol)のエタノール(160mL)懸濁液に、モルホリン(5mL)を滴下した。反応混合物を15分間還流し、次いでさらに150mLのエタノールを加えた。熱懸濁液をろ過し、固形物をアセトン+エーテル混合液で処理した。残留硫黄をろ去し、ろ液を濃縮して13.3gの所期生成物を黄褐色固形物として得た(収率33%)。標記化合物2-アミノ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボニトリルをIKK-2 Resinアッセイで評価すると、10μM ≦ IC50 ≦ 20μMという結果になった。
【００４９】
実施例7
2-(アセチルアミノ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド
【化１０】
2005536518.tif 000011
β-テトラロン(11.3g, 0.077mol)、シアノアセトアミド(5.34g, 0.08mol)および硫黄(3.6g, 0.11mol)のエタノール(40mL)懸濁液に、室温でジエチルアミン(2.5mL)を滴下した。反応混合物を3h還流した後、冷却した。沈殿をろ取し、エーテルで洗い、風乾させて1.47gの2-アミノ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミドを淡黄色固形物として得た(収率8%)。この化合物(0.13g, 0.00053 mol)のAcOH(5mL)溶液に、シアン化ナトリウム(0.07g, 0.0011mol)の水(2mL)溶液を加えた。混合物を一晩室温で撹拌した。粗固形物をろ取し、分取HPLCで精製して0.01gの所期生成物を白色固形物として得た。標記化合物2-(アセチルアミノ)-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミドをIKK-2 Resinアッセイで評価すると、10μM ≦ IC50 ≦ 20μMという結果になった。
【００５０】
実施例8
2-[(アミノカルボニル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド
【化１１】
2005536518.tif 000012
2-アミノ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミド(0.5g, 0.002mol)のAcOH(10mL)溶液に、シアン化ナトリウム(0.135g, 0.004mol)の水(4mL)溶液を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。さらに4当量のシアン化ナトリウムを加え、溶液をさらに18h撹拌した。沈殿をろ取し、分取HPLCで精製して0.19gの所期生成物を黄褐色固形物として得た。この標記化合物2-[(アミノカルボニル)アミノ]-4,5-ジヒドロナフト[1,2-b]チオフェン-3-カルボキサミドをIKK-2 Resinアッセイで評価すると、IC50 ≦ 1μMという結果になった。
【００５１】
以下の本発明化合物は対応する出発物質から、スキームIII に従って、また実施例8の場合と類似の合成法に従って、合成することができる。
【化１２】
2005536518.tif 000013
a) シアノアセトアミド、硫黄、ジエチルアミノ; b) シアン化ナトリウム、AcOH。
【００５２】
【表１】
2005536518.tif 000014
【００５３】
【表２】
2005536518.tif 000015
【００５４】
【表３】
2005536518.tif 000016
【００５５】
【表４】
2005536518.tif 000017
【００５６】
【表５】
2005536518.tif 000018
【００５７】
【表６】
2005536518.tif 000019
【００５８】
【表７】
2005536518.tif 000020
【００５９】
【表８】
2005536518.tif 000021
【００６０】
【表９】
2005536518.tif 000022
【００６１】
【表１０】
2005536518.tif 000023
【００６２】
【表１１】
2005536518.tif 000024
【００６３】
【表１２】
2005536518.tif 000025
【００６４】
【表１３】
2005536518.tif 000026
【００６５】
【表１４】
2005536518.tif 000027
【００６６】
【表１５】
2005536518.tif 000028
【００６７】
【表１６】
2005536518.tif 000029
【００６８】
【表１７】
2005536518.tif 000030
【００６９】
【表１８】
2005536518.tif 000031
【００７０】
【表１９】
2005536518.tif 000032
【００７１】
【表２０】
2005536518.tif 000033
【００７２】
【表２１】
2005536518.tif 000034
【００７３】
【表２２】
2005536518.tif 000035
【００７４】
【表２３】
2005536518.tif 000036
【００７５】
【表２４】
2005536518.tif 000037
【００７６】
【表２５】
2005536518.tif 000038
【００７７】
【表２６】
2005536518.tif 000039
【００７８】
【表２７】
2005536518.tif 000040
【００７９】
【表２８】
2005536518.tif 000041
【００８０】
【表２９】
2005536518.tif 000042
【００８１】
【表３０】
2005536518.tif 000043
【００８２】
【表３１】
2005536518.tif 000044
【００８３】
【表３２】
2005536518.tif 000045
【００８４】
【表３３】
2005536518.tif 000046
【００８５】
【表３４】
2005536518.tif 000047
【００８６】
【表３５】
2005536518.tif 000048
【００８７】
【表３６】
2005536518.tif 000049
【００８８】
【表３７】
2005536518.tif 000050
【００８９】
【表３８】
2005536518.tif 000051
【００９０】
【表３９】
2005536518.tif 000052
【００９１】
【表４０】
2005536518.tif 000053
【００９２】
【表４１】
2005536518.tif 000054
【００９３】
【表４２】
2005536518.tif 000055
【００９４】
【表４３】
2005536518.tif 000056
【００９５】
【表４４】
2005536518.tif 000057
【００９６】
【表４５】
2005536518.tif 000058
【００９７】
【表４６】
2005536518.tif 000059
【００９８】
【表４７】
2005536518.tif 000060
【００９９】
【表４８】
2005536518.tif 000061
【０１００】
【表４９】
2005536518.tif 000062
【０１０１】
【表５０】
2005536518.tif 000063
【０１０２】
生物学的評価
材料
使用材料は次のとおり: SAM2 (登録商標) 96穴Biotin Captureプレート(Promega); 抗FLAGアフィニティーレジン、FLAG-ペプチド、NP-40(Nonidet P-40)、BSA、ATP、ADP、AMP、LPS(E.coli血清型0111:B4)およびジチオスレイトール(以上Sigma Chemicals); NEMO(IKKγ)(FL-419)、IKK1(H-744)、IKK(H-470)およびIκBα(C-21)の特異抗体(Santa Cruz Biotechnology); Ni-NTAレジン(Qiagen); ペプチド類(American Peptide Company); プロテアーゼインヒビターカクテル錠(Boehringer Mannheim); Sephacryl S-300カラム(Pharmacia LKB Biotechnology); 分子量カットオフ10kDaのCentriprep-10遠心式限外ろ過器および分子量カットオフ30kDaの限外ろ過用メンブレン(Amicon); [γ-33P]ATP (2500 Ci/mmol)および[γ-32P]ATP (6000 Ci/mmol)(Amersham); その他に市販の特級試薬類。
【０１０３】
クローニングと発現
ヒトIKK1およびIKK2のcDNAをヒト胎盤RNA(Clonetech)からRT(逆転写酵素)-PCR法で増幅した。hIKK1はpFastBac HTa (Life Technologies)中にクローニングし、N末端His6標識融合タンパク質として発現させた。hIKK2 cDNAは、IKK2コード領域(DYKDDDDKD)のC末端にFLAG-エピトープ標識のためのペプチド配列を組み込んだ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。このhIKK2:FLAG cDNAをバキュロウイルスベクターpFastBacにサブクローニングした。QuikChangeTM突然変異誘発キット(Stratagene)を使用して、野生型rhIKK2に使用したのと同じベクター中にrhIKK2変異体(S177S, E177E)を構築した。各コンストラクトのウイルスストックを使用して、40L浮遊培養で培養した昆虫細胞に感染させた。最大発現およびrhIKK活性が確認された時点で細胞を溶解した。細胞溶解物は-80℃で保存し、後述の組換えタンパク質精製に備えた。
【０１０４】
酵素の単離
精製手順は特に断らない限りすべて4℃で実施した。使用した緩衝液は次のとおりである。緩衝液A: 20mM Tris-HCl, pH 7.6に50mM NaCl、20mM NaF、20mM β-グリセロリン酸、500μMオルトバナジン酸ナトリウム、2.5mMメタ亜硫酸水素塩、5mMベンズアミジン、1mM EDTA、0.5mM EGTA、10%グリセリン、1mM DTT、1 x Complete(登録商標)プロテアーゼインヒビターを添加; 緩衝液B: 150mM NaCl以外は緩衝液Aと同じ; 緩衝液C: 500mM NaCl以外は緩衝液Aと同じ。
【０１０５】
rhIKK1ホモ二量体の単離
バキュロウイルス発現His標識IKK1の8L発酵に由来する細胞を遠心分離し、細胞ペレット(MOI=0.1, I=72hr)を100ml緩衝液C中に再懸濁させた。細胞を微小流動化し、100,000×gで45分間遠心分離した。上清を回収し、イミダゾールを添加して終濃度を10mMとし、Ni-NTAレジン25mlと2時間インキュベートした。上清を25mlカラムに注ぎ、250mlの緩衝液Cで洗い、次いで125mlの50mMイミダゾール/緩衝液Cで洗った。300mMイミダゾール/緩衝液Cを使用してrhIKK1ホモ二量体を溶出した。この酵素画分にBSAとNP-40を添加して終濃度を0.1%とした。該酵素を緩衝液B対して透析し、等分し、-80℃で保存した。
【０１０６】
rhIKK2ホモ二量体の単離
バキュロウイルス発現FLAG標識IKK2の10L培養液を遠心分離し、細胞ペレット(MOI=0.1, I=72hr)を100ml緩衝液A中に再懸濁させた。細胞を微小流動化し100,000×gで45分間遠心分離した。上清を、緩衝液Aで平衡化したG-25カラムに通した。タンパク質ピークを回収し、抗FLAGアフィニティーレジン/緩衝液Bとローテーター上で一晩インキュベートした。レジンを10〜15体積倍量の緩衝液Cでバッチ洗浄した。洗浄後のレジンをカラムに注ぎ、rhIKK1ホモ二量体を5体積倍量の含FLAG緩衝液Bを使用して溶出した。溶出した酵素に5mM DTT、0.1%NP-40およびBSAを加え(終濃度を0.1%とし)た後、30kDa分子量カットオフのAmiconメンブレンで濃縮した。該酵素を等分し、-80℃で保存した。
【０１０７】
rhIKK1/IKK2ヘテロ二量体の単離
このヘテロ二量体酵素はバキュロウイルス系での同時感染により産生させた(FLAG IKK2/IKK1 His; MOI=0.1, I=72hr)。感染細胞を遠心分離し、細胞ペレット(10.0g)を緩衝液A(50ml)中に再懸濁させた。このタンパク質懸濁液を微小流動化し、100,000×gで45分間遠心分離した。上清にイミダゾールを添加して終濃度を10mMとした。タンパク質を25mlのNi-NTAレジンに、2時間の混合により結合させた。このタンパク質-レジン懸濁液を25mlカラムに注ぎ、250mlの10mMイミダゾール/緩衝液Aで洗い、次いで125mlの50mMイミダゾール/緩衝液Aで洗った。次いで、300mMイミダゾール/緩衝液Aを使用して、タンパク質を溶出した。それを75mlプールし、NP-40を加えて終濃度を0.1%とした。次にこのタンパク質溶液を緩衝液Bに対して透析した。次いで、透析後のヘテロ二量体酵素を抗FALG M2アガロースアフィニティーゲル25mlに、一晩かき混ぜながら、結合させた。次いでこのタンパク質-レジン懸濁液を5分間、2000rpmで遠心にかけた。上清を回収し、レジンを、0.1%NP-40を含む100ml緩衝液C中に再懸濁させた。レジンを、0.1%NP-40を含む375ml緩衝液Cで洗った。タンパク質-レジンを25mlカラムに注ぎ、FLAGペプチドを含む緩衝液Bで酵素を溶出した。酵素画分(100ml)を回収し、分子量カットオフ30kDaのAmiconメンブレンを使用して20mlに濃縮した。この濃縮酵素にウシ血清アルブミンを加えて終濃度を0.1%とした。次いで該酵素を等分し、-80℃で保存した。
【０１０８】
細胞培養
野生型(wt)ヒト・プレB細胞株70Z/3とその変異型1.3E2はDr. Carol Sibleyより惜しみない提供を受けた。このwt70Z/3および1.3E2細胞を、7%規定ウシ血清(Hyclone)と50μM 2-メルカプトエタノールとを添加したRPMI 1640(Gibco)中で培養した。ATCCより入手したヒト単球性白血病THP-1細胞を、10%規定ウシ血清、10mM HEPES、1.0mMピルビン酸ナトリウムおよび50μM 2-メルカプトエタノールを添加したRPMI 1640中で培養した。実験では細胞を6穴プレートに1×106細胞/ml-新鮮培地の密度でプレーティングした。プレB細胞を10μg/ml LPSの添加により、0〜4 hr範囲内の種々の時間にわたり刺激した。THP-1細胞を10μg/ml LPSの添加により45分間刺激した。細胞をペレット化し、0.15M NaClを含む冷50mMリン酸ナトリウムpH 7.4で洗い、50mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、10mM β-グリセロリン酸、1mM NaF、1mM PMSF、1mM DTTおよび0.5% NP-40を含む20mM HEPES緩衝液(pH 7.6)(溶解緩衝液)に4℃で溶解した。10,000×gでの遠心で得られた細胞質画分を用時まで-80℃で保存した。
【０１０９】
免疫沈降法とウェスタン法
rhIKKを含むSF9細胞ペーストを遠心分離(100,000×g、10分)して残屑を除去し、上清からrhIKKを、3μgの抗NEMO抗体(FL-419)との結合とそれに続くプロテインAセファロースビーズとの結合により、免疫沈降させた(細胞ペースト100μg)。rhIKKは、アフィニティークロマトグラフィー精製タンパク質調製品(1μg)から、抗FLAG、抗Hisまたは抗NEMO抗体(1〜4μg)の使用とプロテインAセファロース結合という方法でも免疫沈降させた。天然型ヒトIKK複合体はTHP-1細胞ホモジネート(300μg/状態)から、抗NEMO抗体を使用して免疫沈降させた。免疫複合体をペレット化し、1mlの冷溶解緩衝液で3回洗浄した。免疫沈降rhIKKをSDS-PAGE(8% Tris-グリシン)で分離し、ニトロセルロース膜(Novex)に転写し、ケミルミネセンス法(SuperSignal)で特異的抗IKK抗体(IKK2 H-470, IKK1 H-744)を使用して検出した。細胞質溶解液(20〜80μg)由来の天然型IKK2、IκBαおよびNEMOタンパク質をSDS-PAGEで分離し、ケミルミネセンス法で特異抗体を使用して視覚化した。
【０１１０】
ホスファターゼ処理
免疫沈降rhIKKを、0.1mM EDTA、1mM DTT、1mM PMSFおよび2mM MnCl2を含む50mM Tris-HCl, pH 8.2で2回洗浄し、50μl中に再懸濁させた。ホスファターゼ(λPPase、1000U)を同じ緩衝液で予め希釈した後、IKKサンプルに加えた。室温で30分間、断続的にかき混ぜながらインキュベートし、次いで冷溶解緩衝液を加えて反応を停止させた。数回洗浄後、ビーズを10%、ウェスタン分析用に取り、残りの材料はペレット化し、in vitroキナーゼアッセイに使用する緩衝液100μl中に再懸濁させた。
【０１１１】
IKKαSAM酵素アッセイ
ビオチン標識IκBαペプチド(Gly-Leu-Lys-Lys-Glu-Arg-Leu-Leu-Asp-Asp-Arg-His-Asp-Ser32-Gly-Leu-Asp-Ser36-Met-Lys-Asp-Glu-Glu)、SAM2 (登録商標) 96穴Biotin Captureプレートおよび真空系を使用してIKKαキナーゼ活性を測定した。標準反応混合液は5μMビオチン標識IκBαペプチド、1μM [γ-33P]ATP(約1×105cpm)、1mM DTT、50mM KCl、2mM MgCl2、2mM MnCl2、10mM NaF、25mM HEPES緩衝液、pH 7.6および酵素溶液(1〜10μl)を含み、終容量は50μlであった。25℃で30分間インキュベートした後、反応混合液10μlを取り出し、SAM2 (登録商標) 96穴Biotin Captureプレートに加えた。次いで各穴を800μlの2M NaCl、1.2mlの1% H3PO4添加NaCl、400μlのH2Oおよび200μlの95%エタノールで順次洗った。次いでプレートをフード中、25℃で１時間乾燥させた後、各穴にシンチレーション液(Microscint 20)25μlを加えた。Top-Count NXT (Packard)を使用して[γ-33P]ATPの取込みを計測した。各アッセイ条件下で、IκBαペプチド基質のリン酸化の度合いはどの精製酵素でも時間および濃度に対して線形であった。このビオチン標識ペプチドアッセイの結果は、GST-IκBα1-54および[γ-32P]ATPを使用するSDS-PAGEキナーゼ反応解析により確認された。得られた放射性標識基質はPhosphoimager(Molecular Dynamics)で定量した。[γ-33P]ATPと基質としてのGST-IκBα1-54融合タンパク質とを使用してイオン交換樹脂アッセイも行った。各アッセイ系は各精製キナーゼアイソフォームのKmおよび比活性に関して一貫した結果をもたらした。1単位の酵素活性はATPからIκBαペプチドへの毎分1nmoleのリン酸転移を触媒するために必要とされる量と定義し、比活性は単位/mg-タンパク質として表示した。精製酵素のKmの決定に関する実験では、IκBαまたはATPいずれかの濃度を固定してATPまたはIκBαペプチドの濃度を種々変化させるアッセイを行った。IκBαペプチドKmを決定するアッセイでは、0.1μgの酵素、5μMのATMおよび0.5〜20μMのIκBαペプチドを使用した。ATP Kmの決定では0.1μgの酵素、10μMのIκBαペプチドおよび0.1〜10μMのATMを使用した。rhIKK1ホモ二量体のKmの決定では、それ自体が低活性であり、またIκBαペプチドが高Kmであるため、rhIKK1ホモ二量体(0.3μg)のアッセイを125μMのIκBαペプチドとATP Km実験(0.1〜10μM)の5倍の比活性のATPで、またIκBα Km実験の5μM ATMの5倍の比活性およびIκBα (5〜200μM)で、行った。
【０１１２】
IKKβ Resin酵素アッセイ
ビオチン標識IκBαペプチド(Gly-Leu-Lys-Lys-Glu-Arg-Leu-Leu-Asp-Asp-Arg-His-Asp-Ser32-Gly-Leu-Asp-Ser36-Met-Lys-Asp-Glu-Glu)(Amersham Peptide Co.)を使用してIKKβキナーゼ活性を測定した。20μlの標準反応混合液は5μMビオチン標識IκBαペプチド、0.1μCi/反応[γ-33P]ATP(Amersham)(約1×105cpm)、1μM ATP  (Sigma)、1mM DTT(Sigma)、2mM MgCl2(Sigma)、2mM MnCl2 (Sigma)、10mM NaF(Sigma)、25mM HEPES(Sigma)緩衝液、pH 7.6を含み、酵素溶液20μlと阻害剤10μlを加えて終容量を50μlとした。25℃で30分間インキュベートした後、150μlレジン(Dowex陰イオン交換樹脂AG1X8 200-400メッシュ)/900mMギ酸塩、pH 3.0を各穴に加えて反応を停止させた。レジンを1時間沈降させ、上清50μlをMicrolite-2平底プレート(Dynex)に移した。各穴にシンチレーション液(Microscint 40)(Packard)150μlを加えた。Top-Count NXT (Packard)を使用して[γ-33P]ATPの取込みを計測した。
【０１１３】
IKKヘテロ二量体レジン酵素アッセイ
ビオチン標識IκBαペプチド(Gly-Leu-Lys-Lys-Glu-Arg-Leu-Leu-Asp-Asp-Arg-His-Asp-Ser32-Gly-Leu-Asp-Ser36-Met-Lys-Asp-Glu-Glu)(Amersham Peptide Co.)を使用してIKKヘテロ二量体キナーゼ活性を測定した。20μlの標準反応混合液は5μMビオチン標識IκBαペプチド、0.1μCi/反応[γ-33P]ATP(Amersham)(約1×105cpm)、1μM ATP (Sigma)、1mM DTT (Sigma)、2mM MgCl2 (Sigma)、2mM MnCl2 (Sigma)、10mM NaF (Sigma)、25mM HEPES (Sigma)緩衝液、pH 7.6を含み、酵素溶液20μlと阻害剤10μlを加えて終容量を50μlとした。25℃で30分間インキュベートした後、150μlレジン(Dowex陰イオン交換樹脂AG1X8 200-400メッシュ)/ 900mMギ酸塩、pH 3.0を各穴に加えて反応を停止させた。レジンを1時間沈降させ、上清50μlをMicrolite-2平底プレート(Dynex)に移した。各穴にシンチレーション液(Microscint 40)(Packard)  150μlを加えた。Top-Count NXT (Packard)を使用して[γ-33P]ATPの取込みを計測した。
【国際調査報告】
2005536518.tif 000065
2005536518.tif 000066
2005536518.tif 000067
2005536518.tif 000068