(57)【要約】【課題】  本発明は、結晶化して高分解能構造をもたらすことができる野生型配列の220位または222位にプロリン残基を導入するように改変されたチトクロム2C9タンパク質を提供する。【解決手段】これらの構造を、2C8、2C18、2C19などの他のチトクロムP450構造の相同モデリング、およびリガンドとP450の相互作用の分析に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型配列の残基31〜490を含み、以下の変化を含む、すなわち、
220位または222位がプロリンであり、
場合によっては最大で30個の他の位置が変更されているP450 2C9タンパク質であって、
31位よりN末端側の領域が野生型以外であるP450 2C9タンパク質。
【請求項２】
221位がプロリンではない、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記最大で30個の他の位置は、他のチトクロムP450分子中の対応する位置に存在する残基が導入されるように変更されている、請求項1または2に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記別のチトクロムP450分子が2C19、2C18および2C8からなる群から選択される、請求項3に記載のタンパク質。
【請求項５】
配列番号（2x＋2）（式中、xは1〜52の整数である）からなる群から選択される、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項６】
結晶状の前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
リガンドと複合体形成した2C9 P450タンパク質を含む結晶化可能な組成物。
【請求項８】
三方晶系空間群P321を有するP450 2C9タンパク質の結晶。
【請求項９】
単位格子寸法が、
a＝b＝165.46Å±5%、およびc＝111.70Å±5%と、
a＝b＝161.35Å±5%、およびc＝110.75Å±5%と、
a＝b＝163.95Å±5%、およびc＝111.06Å±5%とからなる群から選択される、請求項8に記載の結晶。
【請求項１０】
3.1Åよりも優れた分解能を有するP450 2C9タンパク質の結晶。
【請求項１１】
表1、2、3または8の座標によって規定される構造を有するP450タンパク質の結晶。
【請求項１２】
P450 2C9タンパク質結晶を生成させる方法であって、0〜0.2M Tris-HCl（pH8〜9）、0〜0.25M Li2SO4、0〜20%PEG 4000を含む沈殿剤溶液を用いる懸滴蒸気拡散技法を含む方法。
【請求項１３】
分子構造とP450構造との相互作用を分析するためのコンピュータ・ベースの方法であって、
表1、2、3、8または18のP450構造またはその選択座標を準備するステップと、
前記P450構造またはその選択座標に一致させる分子構造を準備するステップと、
前記分子構造を前記P450構造に一致させるステップとを含む方法。
【請求項１４】
前記選択座標が表4の1つまたは複数の残基からの原子を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記原子の少なくとも1つが表6の残基に由来する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記分子構造を有する化合物を入手または合成するステップと、
前記化合物をP450タンパク質と接触させて前記P450と相互作用する前記化合物の能力を決定するステップとをさらに含む、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記分子構造を有する化合物を入手または合成するステップと、
2C9 P450タンパク質と前記化合物の複合体を形成するステップと、
X線結晶学によって前記複合体を解析して、前記P450と相互作用する前記化合物の能力を決定するステップとをさらに含む、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記分子構造を有する化合物を入手または合成するステップと、
前記化合物が前記P450構造体によってどのように代謝されるかを決定または予測するステップと、
前記化合物構造と前記P450との相互作用を変えるように前記化合物構造を改変するステップとをさらに含む、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項18の方法を用いて同定された改変構造を有する化合物。
【請求項２０】
未知構造のP450ホモログまたはアナログの3次元構造を予測する方法であって、
未知3次元構造の標的P450タンパク質のアミノ酸配列の表示を表1、2、3、8または18のP450のアミノ酸配列と整列させて前記各アミノ酸配列の相同領域を一致させるステップと、
未知構造の前記標的P450における一致した相同領域の構造を、表1、2、3、8または18によって規定されるP450構造の対応する領域を基にしてモデリングするステップと、
前記一致した相同領域の構造を実質的に保存する未知構造を有する前記標的P450のコンホメーションを決定するステップとを含む方法。
【請求項２１】
前記標的P450タンパク質が、2C8、2C18および2C19からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
P450 2C9タンパク質の基質特異性と実質的に同じ基質特異性をもたらす結合空隙を有するキメラ・タンパク質であって、
前記キメラ・タンパク質結合空隙に、P450 2C9結合空隙に沿って並ぶ選択されたP450 2C9原子に対応する複数の原子が並び、前記複数の原子の相対位置が、表1、2、3または8によって規定される前記選択されたP450 2C9原子の相対位置に対応する、キメラ・タンパク質。
【請求項２３】
タンパク質の構造を決定する方法であって、
表1、2、3、8もしくは18の座標、またはその選択座標を準備するステップと、
（a）前記タンパク質の構造をもたらすように、前記タンパク質の結晶単位格子中に前記座標を配置するステップ、または（b）前記座標を操作することによって前記タンパク質のNMRスペクトル・ピークを割り当てるステップのどちらかとを含む方法。
【請求項２４】
P450タンパク質に結合する化合物の構造を決定する方法であって、
P450タンパク質の結晶を準備するステップと、
前記結晶に前記化合物をソーキングして複合体を形成するステップと、
表1、2、3、8もしくは18のデータまたはその一部を使用することによって前記複合体の構造を決定するステップとを含む方法。
【請求項２５】
P450タンパク質に結合する化合物の構造を決定する方法であって、
P450タンパク質を前記化合物と混合するステップと、
P450タンパク質-化合物複合体を結晶化させるステップと、
表1、2、3、8もしくは18のデータまたはその一部を使用することによって複合体の構造を決定するステップとを含む方法。
【請求項２６】
P450 2C9タンパク質と相互作用する化合物の能力を評価する方法であって、
前記化合物を入手または合成するステップと、
P450 2C9タンパク質と前記化合物の結晶化複合体を形成させ、前記複合体がX線を回折して3.1Åよりも優れた分解能で前記複合体の原子座標を決定するステップと、
前記複合体をX線結晶学的に解析して、前記P450 2C9タンパク質と相互作用する前記化合物の能力を決定するステップとを含む方法。
【請求項２７】
P450、P450ホモログもしくはアナログ、P450と化合物の複合体、またはP450ホモログもしくはアナログと化合物の複合体に対して相互作用する化合物の構造を生成しおよび/または最適化を実施するためのコンピュータ・システムであって、
（a）P450の3次元構造または少なくともその選択座標を規定する表1、2、3、8または18による原子座標データと、
（b）表1、2、3、8または18の前記原子座標データから導出可能であるP450の構造因子データと、
（c）表1、2、3、8または18の前記データに基づく標的P450タンパク質の相同モデリングによって作成される前記標的P450タンパク質の原子座標データと、
（d）表1、2、3、8または18の前記データを参照してX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成される標的P450タンパク質の原子座標データと、
（e）（c）または（d）の原子座標データから導出可能である構造因子データ
の1つまたは複数を含むコンピュータ読取り可能なデータを含むコンピュータ・システム。
【請求項２８】
前記原子座標データが、表4の残基によって与えられる原子の少なくとも1つに対するものである、請求項27に記載のコンピュータ・システム。
【請求項２９】
（i）前記コンピュータ読取り可能なデータがコード化されたデータ記憶材料を含むコンピュータ読取り可能なデータ記憶媒体と、
（ii）前記コンピュータ読取り可能なデータを処理するための命令を保存するワーキング・メモリと、
（iii）前記コンピュータ読取り可能なデータを処理し、それによって構造を作成しかつ/または合理的なドラッグ・デザインを実施する、前記ワーキング・メモリおよび前記コンピュータ読取り可能なデータ記憶媒体に接続された中央処理装置とを備える、請求項27または28に記載のコンピュータ・システム。
【請求項３０】
前記中央処理装置に接続されて前記構造を表示するディスプレイをさらに含む請求項29に記載のコンピュータ・システム。
【請求項３１】
P450、P450ホモログもしくはアナログ、P450と化合物の複合体、またはP450ホモログもしくはアナログと化合物の複合体に対して相互作用する化合物の構造を生成しおよび/または最適化を実施するためのデータを提供する方法であって、
（i）（a）P450の3次元構造、またはP450の複数の原子の座標を規定する表1、2、3、8もしくは18による原子座標データと、（b）表1、2、3、8もしくは18の原子座標データから導出可能であるP450の構造因子データと、（c）表1、2、3、8または18のデータに基づく標的P450ホモログまたはアナログの相同モデリングによって作成される前記標的P450ホモログまたはアナログの原子座標データと、（d）表1、2、3、8または18のデータを参照してX線結晶学的データまたはNMRデータを解釈することによって作成されるタンパク質の原子座標データと、（e）（c）または（d）の原子座標データから導出可能である構造因子データのうちの少なくとも1つを含むコンピュータ読取り可能なデータを含む遠隔装置との通信を確立するステップと、
（ii）前記コンピュータ読取り可能なデータを前記遠隔装置から受信するステップとを含む方法。
【請求項３２】
コンピュータ読取り可能なデータをコード化したデータ記憶材料を含むコンピュータ読取り可能な記憶媒体であって、前記データが、
（a）P450の3次元構造または少なくともその選択座標を規定する表1、2、3、8または18による原子座標データと、
（b）表1、2、3、8または18の原子座標データから導出可能であるP450の構造因子データと、
（c）表1、2、3、8または18のデータに基づく標的P450タンパク質の相同モデルによって作成される前記標的P450タンパク質の原子座標データと、
（d）表1、2、3、8または18のデータを参照してX線結晶学的データまたはNMRデータを解釈することによって作成される標的P450タンパク質の原子座標データと、
（e）（c）または（d）の原子座標データから導出可能である構造因子データとによって規定されるコンピュータ読取り可能な記憶媒体。
【請求項３３】
前記原子座標データが表4の残基によって与えられる原子の少なくとも1つに対するものである、請求項32に記載のコンピュータ読取り可能な記憶媒体。
【請求項３４】
コンピュータ読取り可能なデータをコードするデータ記憶材料を含むコンピュータ読取り可能な記憶媒体であって、前記データが表1、2、3、8もしくは18のP450タンパク質の構造座標のすべてもしくは一部、またはP450のホモログによって規定され、前記ホモログが表1、2、3、8または18の骨格原子からの二乗平均平方根偏差が2.0Å以下である骨格原子を含む、コンピュータ読取り可能な記憶媒体。
【請求項３５】
表1、2、3、8または18によるP450タンパク質の構造座標の少なくとも一部のフーリエ変換を含む第1のセットのコンピュータ読取り可能なデータがコード化されたデータ記憶材料を含むコンピュータ読取り可能な記憶媒体であって、前記データが、未知構造の分子または分子複合体のX線回折パターンを含む第2のセットの機械読取り可能なデータと組み合わされたときに、前記第1のセットのデータおよび前記第2のセットのデータを使用するための命令がプログラムされた機械を用いて、第2のセットの機械読取り可能なデータに対応する構造座標の少なくとも一部を決定することができる、コンピュータ読取り可能な記憶媒体。
【請求項３６】
請求項1から5のいずれか一項に記載の2C9タンパク質をコードする配列を含む核酸。
【請求項３７】
プロモーターに作動可能に結合された請求項36に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３８】
請求項37に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３９】
タンパク質を発現する条件下で請求項38の宿主細胞を培養するステップと、前記タンパク質を回収するステップとを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のタンパク質を調製する方法。
【請求項４０】
（a）宿主細胞培養物中で前記チトクロム2C9  P450分子を発現するステップと、
（b）前記培養物から前記細胞を回収し、導電率が12〜110mS/cmの塩緩衝液中に前記細胞を懸濁させるステップと、
（c）前記細胞を溶解し、細胞片を除去して高塩濃度溶解物を準備するステップと、
（d）界面活性剤を前記溶解物に添加して（例えば、0.015%〜1.2%v/v）高塩濃度界面活性剤溶解物を準備するステップと、
（e）前記P450を前記溶解物から回収するステップとを含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（e）が、
（e（i））前記2C9 P450を親和性担体に結合させるステップと、
（e（ii））前記担体を高塩濃度界面活性剤ですすぐステップと、
（e（iii））高塩濃度界面活性剤緩衝液中の前記2C9 P450を取り出してP450-高塩濃度界面活性剤調製物を準備するステップとによって実施され、その後
（f）サイズ排除クロマトグラフィによって、緩衝液を、界面活性剤を含まない低イオン強度緩衝液に交換してP450-低濃度塩調製物を準備するステップが実施される、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記タンパク質を結晶化するステップをさらに含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質が請求項12に記載の懸滴法によって結晶化されて結晶を与える、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
前記結晶のX線回折パターンを得るステップをさらに含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
リガンドに結合したチトクロムP450分子のコンピュータによって作成される構造を提供するための表1、2、3、8または18のいずれか1つの原子座標データまたはその選択座標の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト・チトクロムP450タンパク質2C9、その結晶化方法、そのX線結晶構造、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
チトクロムP450（CYP450）は、微生物、植物および動物の多数の種において、生理学的に重要な化合物を代謝するヘムタンパク質の極めて巨大で複雑な遺伝子スーパーファミリーを形成している。チトクロムP450は、ステロイド、胆汁、脂肪酸、プロスタグランジン、ロイコトリエン、レチノイド、脂質などの多種多様な内因性化合物の酸化、過酸化および還元代謝に重要である。これらの酵素の多くは、薬物、環境化合物（environmental compounds）および汚染物質を含めた広範な生体異物も代謝する。それらの薬物代謝への関与は広範にわたり、既知の全薬物の50%が、CYP450酵素の作用による何らかの影響を受けていると推定される。それらの薬物とCYP450酵素との有害な相互作用を避けるために、医薬業界は、薬物候補を最適化するためのかなりのリソースを使用している。これらの酵素が個体間および人種間で異なる組織分布および多型を示すということからも、別なレベルで複雑な状況が生じている。
【０００３】
ほとんどの哺乳動物のP450は肝臓内にあるが、腸壁、肺、腎臓、副腎皮質および鼻上皮を含めて他の器官および組織も高濃度のある種のチトクロムP450を有する。哺乳動物は、約50個の独特なCYP450遺伝子を有する。各ファミリーのメンバーは、大きさが45〜55KDaであり、酸素の2電子活性化（two-electron activation）を触媒するヘム骨格を含有している。電子の供給源を使用して、CYP450を分類することができる。電子が、レダクターゼを含有するフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）から、鉄-硫黄タンパク質に、次いでP450に流れる3つのタンパク質からなる鎖（three protein chain）において電子を受け取るCYP450は、クラスI P450のグループに属し、大部分の細菌酵素がこれに含まれる。クラスII P450は、FADおよびフラビンモノヌクレオチド（FMN）の両方を含有するレダクターゼから電子を受け取り、薬物代謝の主原因であるミクロソームP450を含んでいる。哺乳動物のミクロソームのチトクロムP450は、N末端膜貫通αヘリックスによって固定された内在性膜タンパク質である。これらは、切断不可能なシグナル配列として膜への挿入のために働く疎水性が極めて高く短いN末端セグメントによって、小胞体膜に挿入される。哺乳動物のチトクロムP450タンパク質の残りの部分は、細胞質空間に突出した球状構造である。したがって、酵素の大部分は脂質二重層の細胞質表面に面している。P450は、活性になるためには、フラビンタンパク質NADPH-チトクロムP450オキシドレダクターゼ、およびいくつかの例ではチトクロムb5を含めた他の膜形成性の酵素成分が必要である。単一のチトクロムP450オキシドレダクターゼは、P450と直接相互作用し必要な2つの電子をNADPHから移動させることによって、すべての哺乳動物のミクロソーム酵素の活性を支えている。チトクロムP450は、O2分子の2つの酸素原子のうちの一方を、2つの電子による他方の酸素原子のH2Oへの還元と同時に、多種多様な基質に組み込むことができる。チトクロムP450は、ヒドロキシル化、エポキシ化、N-、S-およびO-脱アルキル、N-酸化、スルホキシド化、脱ハロゲン化などの反応を触媒することが知られている。
【０００４】
P450スーパーファミリーの遺伝子は、ファミリー・メンバーの系統的な命名法を提案したNelson等（Pharmacogenetics、6;1〜42、1996）によって分類されている。この命名法は当分野で広範に用いられており、本明細書でもこれを採用する。Nelson等は、P450配列の配列データベース記入事項に相互参照を設けている。
【０００５】
ホモ・サピエンスは、17個のチトクロムP450遺伝子ファミリーおよび42個のサブファミリーを有し、配列の決定されたアイソフォームは合計50個を超える。ファミリー1、2および3からのチトクロムP450は、薬物代謝の主要経路を構成する。多数の薬物が、循環からの排除および薬理学的不活性化を、チトクロムP450による肝臓代謝に頼っている。逆に、P450によってそれらの薬理学的に活性な代謝産物に体内で転化されなければならない薬物もある。多数の有望なリード化合物が、1つまたは複数のP450との相互作用のために開発段階で終了している。創薬における最大の問題の1つは、薬物リードの代謝または改変に対するチトクロムP450の役割を予測することである。化学リード系（chemical lead series）に関連する代謝の問題を早期に発見することは、医薬産業にとって最も重要である。ヒトの主要な薬物代謝チトクロムP450の結晶構造を求めることは、P450酵素が薬物分子および薬物結合様式をどのように認識するかについての詳細な情報がもたらされるので、ドラッグ・デザインに極めて貴重である。これによって、製薬会社が代謝クリアランスを修正し、開発における化合物の損耗率（attrition rate）を減少させる戦略を展開することが可能になる。
【０００６】
薬物代謝に関与する主要なヒトCYP450アイソフォームは、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6およびCYP3A4である。これらのファミリー・メンバー間の配列の同一性レベルは約20〜80%であり、その変動の多くは基質認識に関与する残基にある。CYP450酵素は細菌でも存在し、基質認識に関する理解の多くは、細菌CYP450酵素で得られた結晶構造に由来する。
【０００７】
タンパク質を結晶化させることが、なんら成功する明確な見込みのない不確かで困難なプロセスであることは、タンパク質化学の分野では周知である。現在、タンパク質結晶化がタンパク質構造決定における主要な障害であることは明らかである。このため、タンパク質結晶化は、それ自体が研究主題となっており、タンパク質結晶学者の研究室の単なる延長ではない。タンパク質結晶の成長に関連する難点を記載した多数の参考文献がある。例えば、Kierzek，A.M.およびZielenkiewicz，P.、（2001）、Biophysical Chemistry、91、1〜20、Models of protein crystal growth、およびWiencek，J.M.（1999）Annu.Rev.Biomed.Eng.、1、505〜534、New Strategies for crystal growthである。
【０００８】
溶液からのタンパク質分子の結晶化が、タンパク質構造を決定するプロセスにおける主要な障害であると一般に考えられている。その理由は、多くのタンパク質が複雑な分子であり、溶液中の他のタンパク質分子および小分子との特異的および非特異的相互作用を含めた微妙なバランスを予測することが困難なためである。
【０００９】
各タンパク質は、独特な諸条件下で結晶化するが、これらを予め予想することは不可能である。タンパク質を単に過飽和させて溶液から析出させるだけではうまくいかず、その結果、ほとんどの場合で非晶質の沈殿物が得られる。多種の沈殿剤が用いられており、一般的な沈殿剤は種々の塩およびポリエチレングリコールであるが、他の沈殿剤も知られている。また、金属、界面活性剤などの添加剤を添加して溶液中のタンパク質の挙動を調整することができる。多数のキットが（例えば、Hampton Researchから）利用可能であり、それらは結晶化空間におけるできるだけ多くのパラメータを網羅しようとしている。しかし、多くの場合、これらのキットでは回折分析に不適切である結晶沈殿物および結晶を最適化するための出発点にすぎない。溶解性、正確な折りたたみまたは活性のための金属イオン依存性、他の分子との相互作用に関するタンパク質挙動の知識、および入手可能な他の情報の助けによって結晶化が成功する。それでも、タンパク質の結晶化は、厄介なプロセスと考えられることが多く、したがってその後の実験は過去の試行の知見に基づいている。
【００１０】
タンパク質結晶が得られる場合、これらは必ずしも常に回折分析に適切であるとは限らず、分解能が制限されることがあり、その後、分析に要する分解能で回折するまでに改善することは困難である。結晶の分解能が制限されるのは、いくつかの原因による。それは結晶内でのタンパク質の固有の易動度による場合もあり、これは、他の結晶形でも解決することが困難なことがある。結晶内の溶媒含量が高く、したがって散乱が弱いためである場合もある。あるいは、結晶格子内の欠陥によって、回折X線が格子内の単位ごとに完全には位相があっていないためである場合もある。これらのいずれか1つまたはこれらの組合せによって、結晶が構造決定に不適切になり得る。
【００１１】
いくつかのタンパク質は決して結晶化せず、妥当な試行の後、タンパク質自体を調べ、個々のドメイン、異なるNまたはC末端切断、または点突然変異を生成させることが可能かどうかを考える必要がある。結晶性が改善されるようにタンパク質をどのように再構築するかを予測することは困難なことが多い。結晶化機構の本発明者らの理解はまだ不完全であり、結晶性に関与するタンパク質構造の要因は十分理解されていない。
【００１２】
2000年の時点で、8つのチトクロムP450構造がX線結晶学によって解明され、公開ドメインで利用可能である。構造が解明されたチトクロムP450はすべて大腸菌中で発現された。6つの構造は細菌チトクロムP450に対応する。すなわち、P450cam（CYP101 Poulos等、1985、J.Biol.Chem.、260、16122）、P450BM3（CYP102、Ravichandran等、1993、Science、261、731）のヘムタンパク質ドメイン、P450terp（CYP108、Hasemann等、1994、J.Mol.Biol.236、1169）、P450eryF（CYP107A1、Cupp-VickeryおよびPoulos、1995、Nature Struct.Biol.2、144）、P450 14α-ステロールデメチラーゼ（CYP51、Podust等、2001、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、98、3068）、およびArchaeon sulfolobus solfataricus由来の好熱性チトクロムP450（CYP119）の結晶構造（Yano等、2000、J.Biol.Chem.275、31086）が解明された。チトクロムP450norの構造が、脱窒素菌Fusarium oxysporum（Shimizu等、2000、J.Inorg.Biochem.81、191）から得られた。第8の構造は、ウサギ2C5アイソフォームの構造であり、哺乳動物チトクロムP450（Williams等、2000、Mol.Cell.5、121）の最初で唯一の構造である。
【００１３】
細菌と比べ哺乳動物のチトクロムP450が特に結晶化が困難である理由は、これらのタンパク質の性質にある。細菌チトクロムP450は可溶性であるのに対し、哺乳動物のP450は膜関連タンパク質である。したがって、哺乳動物のチトクロムP450に関する構造研究では、単一のチトクロムP450を高濃度で発現させる異種発現システムと、これら溶液状態のタンパク質の溶解性および挙動を改善する配列改変とを組み合わせて用いることができる。
【００１４】
細菌タンパク質およびウサギ・タンパク質の両方の配列との差がかなりあるため、薬物代謝におけるヒトCYP450酵素の役割を十分に理解するには、ヒト・アイソフォームの結晶構造が依然として必要である。
【００１５】
Ibeanu等、（1996）、J Biol Chem、Vol.271、12496〜12501には、Ser 220およびPro 221を含めたある種の残基が変化した酵母中での改変2C9タンパク質の生産が記載されている。これらの変化したタンパク質は、オメプラゾールに対して2C19類似の活性を示すことが判明した。これらのタンパク質は、野生型N末端配列を保持していた。
【非特許文献１】Nelson等、Pharmacogenetics、6;1〜42、1996
【非特許文献２】Kierzek，A.M.およびZielenkiewicz，P.、（2001）、Biophysical Chemistry、91、1〜20、Models of protein crystal growth
【非特許文献３】Wiencek，J.M.（1999）Annu.Rev.Biomed.Eng.、1、505〜534、New Strategies for crystal growth
【非特許文献４】Poulos等、1985、J.Biol.Chem.、260、16122
【非特許文献５】Ravichandran等、1993、Science、261、731
【非特許文献６】Hasemann等、1994、J.Mol.Biol.236、1169
【非特許文献７】Cupp-VickeryおよびPoulos、1995、Nature Struct.Biol.2、144
【非特許文献８】Podust等、2001、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、98、3068
【非特許文献９】Yano等、2000、J.Biol.Chem.275、31086
【非特許文献１０】Shimizu等、2000、J.Inorg.Biochem.81、191
【非特許文献１１】Williams等、2000、Mol.Cell.5、121
【非特許文献１２】Ibeanu等、（1996）、J Biol Chem、Vol.271、12496〜12501
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ある命名法を採用してチトクロムP450において認められる2次構造を記述した。P450の最初の構造であるP450camの著者は、N末端からC末端方向への12個のヘリックスセグメントをA〜Lと表しており、この命名は、別の構造を決定するときにも続けられた。また、いくつかのP450構造では、これよりも多いヘリックスがあり、例えば、P450 BM3の記述では、15個のヘリックス（A、B、B'、C、D、E、F、G、H、I、J、J'、K、K'、L）が列挙されており、追加のヘリックスは'記号で示されている。
【００１７】
各ヘリックスは、一般に6アミノ酸長（2C5におけるヘリックスH）から32アミノ酸長（BM3におけるヘリックスI）である。ヘリックスは、β鎖、短いリンカー、および最長30アミノ酸長の長い柔軟なループによって連結されている。
【００１８】
これらの柔軟な構造のうち、最も目立つ構造の1つは、FとGのヘリックス間のループ（「F-Gループ」）である。このループは、おそらく、基質アクセス・チャネル（substrate access channel）に関与し、移動して活性部位において基質を収容することができる。このループは、N末端ドメインと共に、膜へのチトクロムP450の固定に関与することも記述されている。
【００１９】
2C5構造（PDB ID 1DT6）において、ヘリックスFは残基206で終了し、ヘリックスGは残基228で始まり、したがってその間のループは残基207〜227である（2次構造割当プログラムDSSP（KabschおよびSander、Biopolymers 22（1983）2577〜2637）からの定義）。これらの21残基のうち12個は2C5構造では見られない。これらは、その柔軟性を示すものである。本発明者らは、残りの2Cファミリーおよび他のヒトP450も同様であると予想している。この領域は、インビボでの酵素の膜結合および基質アクセス・チャネルの配向に関与すると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らが開発したモデルを用いて、本発明者らは、2C9のF-GループがLeu208〜Pro227であることを予測した。この領域は20残基を含み、そのうち11個は疎水性に分類することができることから、示唆されているように、この領域が膜に埋め込まれるか、または凝集に関与しているという仮説がさらに支持される。本発明の2C9構造から、（DSSPからの定義）、ヘリックスFとGの間のループは、実際に209で始まり227で終了する。
【００２１】
本発明は、本明細書に記載する改変ヒト2C9 P450タンパク質、およびこのようなタンパク質をコードする核酸を提供し、ならびにこれらのタンパク質製造にこれらの核酸を利用する。
【００２２】
本発明は、さらに、本発明の2C9 P450タンパク質を製造し精製するための方法を提供する。
【００２３】
本発明は、本発明の改変2C9 P450タンパク質の結晶も提供する。
【００２４】
本発明は、さらに、ヒトCYP450 2C9の結晶構造に関し、それによってこの酵素における基質の結合位置を調べ測定することが可能になる。
【００２５】
一般的な態様においては、本発明は、P450構造の提供、およびこの構造を有する分子構造体、例えば医薬化合物候補の相互作用のモデリングへのその使用に関する。
【００２６】
本発明の上記態様は、単独でも組み合わせても、すべて本発明の有利な特徴に寄与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
A.2C9タンパク質およびそれらの生産
2C9の配列は、当分野で、例えばNelson等、1996、同上に引用されたいくつかのデータベース源から利用可能である。これには、SwissProtデータベースが含まれ、そこでの2C9の登録番号はP11712である。
【００２８】
2C9 P450タンパク質は、望ましくは、そのN末端領域において切断されて、疎水性膜貫通ドメイン、および短い（例えば、1つまたは複数（例えば、3、4または5））の正に帯電したアミノ酸を含有する8〜12アミノ酸配列によって置換された領域が欠失している。ヒト2C9 P450を発現させる場合、本発明者らは、N末端29アミノ酸残基の代わりに、大腸菌中でのこのタンパク質の発現を増大させ、溶解性を増大させるN末端配列MAKKTSSKGR（配列番号114）を使用した。
【００２９】
2C9 P450は、場合によっては、C末端ポリヒスチジン・タグなどのタグを有するものであっても良く、このタンパク質の回収および精製を可能にすることができる。
【００３０】
本発明者らは、F-Gループにおけるプロリン残基の位置が、P450結晶の形成に重要な役割を果たすと考えられることを見出した。特に、2C9における220位または222位のプロリンの有無が、結晶化の発生に重要であると考えられる。
【００３１】
野生型2C9では、221位にプロリン残基がある。2C9において、220位をプロリンで置換し、Pro221を除去することによって（他の任意の残基、好ましくはアラニンまたはトレオニンで置換することによって）、プロリン残基を220位に移動すると、結晶化が促進される。あるいは、プロリンを222位に移動し、221位を同様に置換することができる。
【００３２】
2C9において、本発明者らは220位および221位を変え、場合によっては他の位置も変えた。他の位置を変えた場合、これらは、I215V、C216Y、I222LおよびI223Lであったが、結晶化を可能にするためにこれらのいずれかまたはすべてを変えることは必須ではない。
【００３３】
本発明者らの実験は、配列番号2および図10に示す特定のN末端切断型2C9を使用することに基づいている。このタンパク質は、C末端にポリヒスチジン・タグも含んでいる。N末端切断およびタグはどちらも、当業者が通常の技術を用いて変化させることができる特徴である。例えば、別のN末端配列を、例えば大腸菌以外の宿主細胞における生産のために利用することができる。同様に、別のタグを下記タンパク質の精製のために使用することができる。これらのNおよびC末端の改変を、図10に示す野生型配列の残基31〜490のコア配列を保持する2C9タンパク質に対して行うことができる。
【００３４】
本発明は、以下の変化を含むP450 2C9タンパク質を提供する。すなわち、この変化は、
220位または222位がプロリンであり、
場合によっては最大で30、例えば最大で25、例えば最大で10、例えば最大で5の他の位置の変更である。220位および222位は、野生型2C9に従って番号が付けられている。この番号付けを図10に示す。
【００３５】
この変更は220位に対してであることが好ましい。
【００３６】
上記の考察から、2C9タンパク質が、野生型配列の残基31〜490を、場合によってはタンパク質の発現および回収を促進するように設けられたNおよび/またはC末端配列と共に含むタンパク質を意味することは理解されよう。
【００３７】
N末端配列は、存在する場合、野生型配列ではないことが好ましい。N末端配列は、（30アミノ酸である）野生型配列よりも短いことが好ましい。残基31に結合しているN末端領域は、後述する実施例に示す切断部であり、すなわち配列番号114と、それと残基31（やはりプロリン）との間のプロリン残基とを加えたものであることが好ましい。このタイプのN末端配列によって、2C9が膜および凝集体に会合する傾向が野生型配列よりも減少する。
【００３８】
C末端配列は、存在する場合、好ましくは30以下、好ましくは10以下のアミノ酸サイズである。
【００３９】
好ましい態様においては、最大で30の変化の1つは、221位がプロリンでないことである。しかし、上述した変化の1つが含まれる限り、221位にプロリンを有する結晶を得ることができることを本明細書（クローン1078）で示すように、これは必須ではない。
【００４０】
本発明のタンパク質の特別な利点は、それらが結晶化可能であることである。すなわち、本発明者らは、本発明者らがX線を回折する結晶を形成させることができ、したがってこれらの結晶を解析して3.1Åまたはそれよりも優れた分解能で構造座標データを提供できることを見出した。
【００４１】
本発明の別の有利な特徴は、本発明者らがリガンドの非存在下でP450タンパク質の結晶を得ることができることである。このような結晶は、コ・コンプレックス（co-complex）構造を決定する目的でリガンドをスクリーニングするのに有用である。2C9の分子構造の決定は、コンピュータ・ベースのイン・シリコ・リガンド・スクリーニングに使用することもできる。
【００４２】
本発明者らは、220〜222位のいずれかにおける変化に加えて、2C9野生型配列への追加の変化を導入できることも示した。いくつかの具体的変化を、後述の実施例に示した2C9のクローンにおいて説明する。これらには、以下が含まれる。
【００４３】
・FGループ領域に対する変化。いくつかのクローンは、クローン2C9-FGループ（3つの変化）、クローン1363（3つの変化）、クローン1361、1362、1364、1369（2つの変化）、およびクローン1366、1371（1つの変化）を含めた変化を有する。
【００４４】
・2C9の表面領域に対する変化。このような変化は、クローン1123（3つの変化）、クローン1102、1340、1397、1443（2つの変化）、およびクローン1081、1082、1085、1097、1100、1101、1115、1116、1117、1118、1121、1122、1165、1339、1391、1392、1394、1396（1つの変化）によって本明細書に示されている。これらの表面変化を、FGループ変化に追加することができる。
【００４５】
・220位および221位に対する変化に加えて全部で最大20までの変化。例えば、クローン1595（20個の変化）、1600（13）および1632（11）。
【００４６】
したがって、クローン1595は、全部で22個、すなわち、FGループの（220、221位を含めて）6つ、活性部位の3つ、表面の12個が変化した形の野生型を有する。これらのうち9つは保存された変化であり、13個は非保存の変化である。
【００４７】
本発明者らのデータは、結晶化可能であるタンパク質を依然として提供しつつ、特定の220または222位に加えて様々な他の位置の変化がなされ得ることを示している。
【００４８】
一態様においては、導入することができる変化は、別のチトクロムP450分子において対応する位置に見出される残基を導入する変化である。この対応する位置は、一方のP450分子を2C9野生型の配列と整列させて両者の相同性を最大にすることによって見つけることができる。これらの変化は、特に、2C19、2C18および2C8からなる群から選択される別のチトクロムP450分子から誘導することができる。下記実施例21は、2C19からの残基が置換されて2C9配列になったタンパク質の生産について説明している。
【００４９】
実施例25〜27は、タンパク質2C19、2C18および2C8それぞれの相同モデリングを示す。これらの実施例に付随する表を用いて、置換されて2C9になるこれらのタンパク質の残基を同定することができる。
【００５０】
別の態様においては、本発明は、配列番号（2x＋2）（xは1〜52の整数である）からなる群から選択されるタンパク質を提供する。これらのタンパク質はすべて、2C9の結晶化を促進する220位または222位のプロリン残基の導入という特徴を共有している。
【００５１】
P450の発現および回収
本発明の2C9 P450タンパク質は、組換えDNA技術によって生産される。野生型P450タンパク質をコードする核酸配列が当分野で利用可能であり、当業者は通常の方法、例えば部位特異的突然変異誘発を用いて、コード変化を核酸配列に導入して本発明のP450をコードする核酸を準備することができる。
【００５２】
したがって、別の態様においては、本発明は、本発明の2C9 P450タンパク質をコードする単離された核酸を提供する。核酸としては、（ゲノムおよびcDNAの両方を含めた）DNAおよびRNAが挙げられる。本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである。
【００５３】
本発明の核酸は、組換え用の複製可能なベクターに組み込むことができる。このベクターを使用して、適合性の宿主細胞中で核酸を複製することができる。したがって、別の実施形態においては、本発明は、本発明の核酸を複製可能なベクターに導入し、そのベクターを適合性の宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす諸条件下でその宿主細胞を増殖させることによって、本発明の核酸を作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収することができる。
【００５４】
ベクター中の本発明の核酸は、宿主細胞によってコード配列が発現され得る対照配列に作動可能に結合されることが好ましい。すなわち、ベクターは発現ベクターである。
【００５５】
「作動可能に結合され」という用語は、記述した成分が意図したように機能できる関係にあるように並べることを指す。コード配列に「作動可能に結合され」た対照配列は、コード配列の発現が対照配列に適合した条件下で得られるように連結される。
【００５６】
プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニレーション配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を含めて、適切な制御配列を適宜含む適切なベクターを選択し、または構築することができる。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス、例えばファージ、ファージミドまたはバキュロウイルス、コスミド、YAC、BAC、またはPACとすることができる。
【００５７】
ベクターは、複製開始点、場合によっては前記ポリヌクレオチドの発現用プロモーター、および場合によってはプロモーターの制御因子を備えることができる。ベクターは、1つまたは複数の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、哺乳動物ベクターの場合はネオマイシン耐性遺伝子を含むことができる。ベクターは、インビトロで、例えばRNAの生産用に使用することができ、または宿主細胞に形質導入し、または宿主細胞を形質転換するのに使用することができる。様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。
【００５８】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現ベクターがそれ用に設計されている宿主細胞に適合するように選択することができる。例えば、細菌プロモーターとしては、lacZプロモーターが挙げられ、酵母プロモーターとしては、S.cerevisiae GAL4およびADHプロモーター、S.pombe nmt1およびadhプロモーターが挙げられ、哺乳動物プロモーターとしては、メタロチオネイン・プロモーター、SV40ラージT抗原プロモーターまたはアデノウイルス・プロモーターが挙げられる。
【００５９】
さらなる詳細は、例えば、Molecular Cloning:a Laboratory Manual:3rd edition、Sambrook等、2001、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのDNAの導入および遺伝子発現、およびタンパク質の分析における、核酸の操作のための多数の既知技術および手順が、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel等編、John Wiley ＆ Sons、1992に詳細に記載されている。
【００６０】
本発明の別の実施形態は、本発明の核酸を複製および発現するために、ベクターで形質転換された宿主細胞、またはベクターで形質導入された宿主細胞を提供する。これらの細胞は、前記ベクターと適合するように選択され、例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞とすることができる
本発明の2C9 P450タンパク質は、当業者が実験の都合で使用することを所望する任意の適切な宿主細胞中で発現させることができる。チトクロムP450分子は大腸菌中で広範に発現され、この宿主細胞には、使用することができる多数のベクター・システムがある。
【００６１】
他の宿主細胞としては、酵母、例えばS.cerevisiae、昆虫または哺乳動物細胞、例えばCHO細胞などがある。これらおよび多数の他のタイプの宿主細胞用発現システムが、当分野で広範に利用可能である。
【００６２】
宿主細胞は、2C9 P450が恒常的に発現され、または誘発されるように構築することができる。
【００６３】
細胞は、2C9 P450を発現させるために培養した後、当分野で利用可能な標準技術によって回収することができる。好都合な手段は、細胞が無傷でペレット化されるように低速で遠心分離して回収することである。
【００６４】
本発明の方法は、バッチ細胞培養に適切であり、100mlから数、例えば10リットルの細胞のバッチを、現行の研究室装置によって扱うことが好都合であるが、より大きなバッチ、例えば10〜100リットルも除外されない。
【００６５】
本発明は、本発明の2C9ヒト・チトクロムP450を宿主細胞から発現させ回収する方法も提供する。この方法は、
（a）宿主細胞培養物中で前記チトクロム2C9 P450分子を発現させるステップと、
（b）前記培養物から前記細胞を回収し、前記細胞を導電率が12〜110mS/cmである塩緩衝液に懸濁させるステップと、
（c）前記細胞を溶解させ、細胞片を除去して高塩濃度溶解物を準備するステップと、
（d）界面活性剤を前記溶解物に添加して（例えば、0.015%〜1.2%v/v）高塩濃度界面活性剤溶解物を準備するステップと、
（e）前記P450を前記溶解物から回収するステップとを含む。
【００６６】
好ましい実施形態においては、この方法は、
（a）大腸菌中で前記チトクロム2C9 P450分子を発現させるステップと、
（b）前記細胞を回収し、200mM〜1000mMの塩緩衝液に懸濁させるステップと、
（c）前記細胞を溶解させ、細胞片を除去して高塩濃度溶解物を準備するステップと、
（d）界面活性剤を前記溶解物に添加して（例えば、0.015%〜1.2%v/v）高塩濃度界面活性剤溶解物を準備するステップと、
（e）前記P450を前記溶解物から回収するステップとを含む。
【００６７】
回収ステップとしては、高濃度の塩が存在するため、別法のイオン交換精製ステップが使用できないので、高塩濃度界面活性剤溶解物から2C9 P450を親和性精製することが含まれる。
【００６８】
しかし、P450をアフィニティー・クロマトグラフィによって精製した後、その生成物をさらに精製して結晶化を実施できるようにするために、塩を除去しなければならない。従来技術においては、脱塩は、一般に、透析によって実施される。しかし、本発明者らは、数時間にわたって徐々に塩を除去するこの方法は、P450の会合および変性を引き起こし、したがって望ましくないことを見出した。本発明者らは、迅速な脱塩によってこの問題がかなり軽減されることを見出した。
【００６９】
したがって、別の態様においては、上記ステップ（e）を、
（e（i））前記2C9 P450を親和性担体に結合させるステップと、
（e（ii））前記担体を高塩濃度界面活性剤ですすぐステップと、
（e（iii））高塩濃度界面活性剤緩衝液中の前記2C9 P450を取り出してP450-高塩濃度界面活性剤調製物を準備するステップとによって実施することができ、および
（f）サイズ排除クロマトグラフィによって、緩衝液を、界面活性剤を含まない低イオン強度緩衝液に交換してP450-低濃度塩調製物を準備するステップ。
【００７０】
上記ステップe（i）〜（iii）によって、精製プロセスの初期段階を通して高塩濃度界面活性剤緩衝液中に2C9 P450が維持され、P450の回収に役立つ。
【００７１】
この調製物を、陽イオン交換クロマトグラフィ、場合によってはその後さらにサイズ排除クロマトグラフィまたは疎水性相互作用クロマトグラフィなどの追加の精製および清浄化操作にかけて、より精製されたタンパク質調製物を得ることができる。
【００７２】
塩緩衝液
これは、細胞を懸濁させるために使用する高イオン強度の緩衝液である。これは、容易に溶解して導電率が12〜110mS/cmの緩衝液を与える塩を含む緩衝液である。このような緩衝液は、濃度が200〜1000mMの塩であることが望ましい。塩は、アニオンのカリウムまたはナトリウム塩であることが好ましい。アニオンは、塩化物またはリン酸塩であることが望ましい。リン酸カリウム（KPi）が特に好ましい。
【００７３】
好ましい塩濃度は、導電率が25〜35mS/cm、例えば約30mS/cmとなるように選択される。特に好ましい塩濃度は、約500mM、例えば500＋50mMである。
【００７４】
緩衝液は、6.5〜8.0、好ましくは7.0〜7.6のpH範囲に維持される。緩衝液は、グリセリン、β-メルカプトエタノール、デオキシリボヌクレアーゼ、pH緩衝剤、ヒスチジン、イミダゾール、プロテアーゼ阻害剤などのタンパク質精製に当分野で従来用いられた他の試薬を含むことができる。
【００７５】
細胞溶解
細胞は、細胞壁が破壊され、細胞の内容物が塩緩衝液中に分散するように、超音波処理などの物理的手段、あるいはフレンチ・プレスまたは連続流細胞破砕装置（continuous flow cell disruptor）によって溶解させることができる。フレンチ・プレスでこれを達成するため、フレンチ・プレスを10000〜20000psiで操作することができる。
【００７６】
細胞片は除去される（例えば、約10000〜25000g（例えば、約22000gでの低速遠心分離、または70000gまでの短時間の高速遠心分離;すなわち、膜画分ではなくホールセルがペレット化されるように）。細胞片（例えば、ペレット化細胞）は、さらなる溶解ラウンドにかけることができ、このさらなるラウンドからの細胞片のない溶解物を先に得られた溶解物と混合することができる。
【００７７】
次いで、この溶解物を、プロセスの次の段階に直接使用することができ、超遠心分離によって膜画分を分離する必要がない。
【００７８】
界面活性剤の使用
溶解物が得られた後、実験準備の制約を考慮して、界面活性剤をできるだけ速やかに溶解物に添加することが望ましい。これは、細胞片のない溶解物の調製から1時間以内、好ましくは30分以内に溶解物に界面活性剤を添加することを意味する。
【００７９】
使用することができる界面活性剤は、生物学的材料の回収および処理に分子生物学および細胞生物学の分野で従来から使用されている界面活性剤である。多数の異なるタイプの界面活性剤がこの目的で利用可能である。これらの界面活性剤の多くは、分子量が400〜800など約350〜1000の範囲にある界面活性剤である。これらの界面活性剤としては、コール酸またはその塩（例えば、ナトリウム塩）、デオキシコール酸またはその塩（例えば、ナトリウム塩）などのアニオン界面活性剤、CHAPS（3-［（3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］-1-プロパンスルホン酸）などの双生イオン界面活性剤などがある。
【００８０】
特に好ましい界面活性剤の種類は、非イオン界面活性剤である。当分野で利用可能である多種多様の非イオン界面活性剤がある。非イオン界面活性剤としては、オクチル-β-D-グルコピラノシド、ポリエチレングリコールのC2〜10アルキルフェノールエーテルなどのエーテルなどがある。このような化合物は、500〜800Daの分子量とすることができ、市販のNonident（商標）P40、IGEPAL CA630、Triton（商標）X-100などがある。
【００８１】
界面活性剤は、溶解物中の界面活性剤が0.015%〜1.2%v/vの通常濃度になるように添加される。添加される界面活性剤の量は、好ましくは0.1〜1.2%、より好ましくは約0.3%などの約0.2〜0.4%である。
【００８２】
界面活性剤は、望ましくは塩濃度またはイオン強度が10%を超えて減少しない量が添加される。
【００８３】
精製2C9 P450の回収
本発明者らは、本発明によって調製される上記高塩濃度界面活性剤溶解物によって、会合体が減少し、これまで当分野で得られたよりも極めて高いレベルで2C9 P450タンパク質を回収することが可能になることを見出した。上述したように、高濃度塩緩衝液が存在することによって、イオン交換クロマトグラフィ・ステップを直接使用することができないが、親和性精製を次のステップとして実施することができる。
【００８４】
親和性精製は、2C9 P450用リガンドが付着した親和性担体マトリックスを備える形をとることができる。担体は、樹脂、ビーズ（例えば、ガラスまたはポリスチレンなどのポリマー）、磁気ビーズなどとすることができる。2C9 P450がタグを含む場合、リガンドは、タグと同族であり、例えばヒスチジン・タグに対するNi-NTA、ストレプトアビジン・タグに対するビオチンなどである。リガンドを、HAタグなどのエピトープ・タグに対する抗体、または2C9 P450のエピトープに対する抗体とすることもできる。
【００８５】
溶解物を、2C9 P450が担体に結合する諸条件下で、親和性担体と接触させる。結合後、担体をリンスする。リンス緩衝液は、高塩濃度界面活性剤緩衝液とすべきであり、これは溶解物緩衝液と同じでも異なっていてもよい。リンス緩衝液は、溶解物緩衝液と同じであることが好ましい。異なる場合、依然として、上で指定した塩および界面活性剤の濃度を有する。
【００８６】
リンス後、2C9 P450を担体から取り出す。これは、バッチでも、担体をカラムに充填し2C9 P450をそのリガンドから取り除くように改変された高塩濃度界面活性剤緩衝液を用いて2C9 P450を溶出させることによっても実施することができる。例えば、Ni-NTAの場合、緩衝液は、2C9 P450のHisタグを置換するのに十分な過剰濃度のヒスチジンまたはイミダゾールを含むことができる。適切な競合相手を、他のタイプのタグに対して使用することができる。
【００８７】
脱塩
得られたP450溶液のイオン強度は、迅速な脱塩プロセスによって低減される。本発明者らは、サイズ排除カラムが、2C9 P450を、高い塩濃度から10〜30分以内、好ましくは10分以内に分離させるような流速でこの目的に使用できることを見出した。2C9 P450をカラムに充填し、低塩濃度緩衝液を用いてカラムを通して溶出させる。
【００８８】
特定の理論に拘泥するつもりはないが、本発明者らは、例えば透析による緩やかな脱塩が、チトクロム2C9 P450の会合および変性をもたらすのに対し、迅速な脱塩プロセスは、凝集をかなりの程度減少させることを見出した。
【００８９】
低塩濃度緩衝液は、上述の高塩濃度緩衝液に類似した塩であることが好ましく、例えば塩化物またはリン酸塩などのナトリウムまたはカリウム塩であり、リン酸カリウムがやはり好ましい。「低塩」とは、50mM未満、好ましくは20mM未満、好ましくは約10mMを意味する。この段階では、緩衝液中に界面活性剤を維持する必要はない。
【００９０】
さらなる精製
脱塩ステップの後、調製物を迅速に、すなわち試料を貯蔵も凍結もせずに、さらに精製することが望ましい。これは、脱塩した溶出物を直接さらなる精製カラムにかけることによって実施することができる。そうでない場合、脱塩プロセスからの溶出物を収集し、1時間以内にカラムにかける。タンパク質調製物のさらなる精製または濃縮に対していくつかの技術がそれ自体として当分野で既知であり、これらの例を後述の実施例に概説する。これらのカラムとしては、カルボキシメチル-Sepharose（商標）、BioRex（商標）70、カルボキシメチル-Biogel（商標）などの弱い陽イオン交換カラム、界面活性剤をさらに除去するために使用することができるMonoSなどの強い陽イオン交換カラムなどがある。例えば、脱塩したチトクロムP450を、10mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、0.2〜2.0mM DTT、1mM EDTA（「緩衝液1」）で予め平衡にしたCM Sepharose（商標）カラム（例えば、5ml HiTrapカラム、Pharmacia）に直接かけることができる。次いで、以下のステップの溶出手順をAKTA FPLCシステムで運転することができ、痕跡量の界面活性剤を除去するために、10〜20カラム体積の緩衝液1、続いて10〜20カラム体積の10mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、0.2〜2.0mM DTT、1mM EDTA、75mM KClまたはNaClで洗浄する。次いで、KClまたはNaCl濃度を500mMに増加させた上述の後者の緩衝液でP450を溶出させる。
【００９１】
場合によっては、この後にサイズ排除カラム、例えば、Superose（商標）、Superdex（商標）、Sephacryl（商標）などが続く。陽イオン交換またはサイズ排除ステップから回収されたタンパク質を濃縮して結晶化または他の使用に適切な溶液を提供することができる。本発明を使用して、20〜120、例えば20〜80mg/mlの濃度を達成することができる。
【００９２】
B.2C9タンパク質の結晶化
タンパク質結晶を得るためのいくつかの方法がそれ自体として当分野で既知である。好都合には、最終のタンパク質は、市販の濃縮装置を用いて、高濃度塩（例えば、500mM NaClまたはKCl）と共に10〜100mMリン酸カリウム中で10〜60、例えば20〜40mg/mlに濃縮される。タンパク質は、20%グリセリン、2.0mM DTTおよび1mM EDTAの存在下で濃縮することができる。
【００９３】
タンパク質は、蒸気拡散によって一連の緩衝液組成に対して5〜25℃で結晶化する。結晶は、Hampton Research、Emerald Biostructure、Molecular Dimensionなどから購入されるポリエチレングリコール（PEG）/イオン・スクリーン、PEGグリッド、硫酸アンモニウム・グリッド、PEG/硫酸アンモニウム・グリッドなどの市販のスクリーニング・キットを用いて調製することができる。
【００９４】
一般に、蒸気拡散緩衝液は、0〜27.5%、好ましくは2.5〜27.5%のPEG 1K〜20K、好ましくは1〜8KもしくはPEG 2000MME〜5000MME、好ましくはPEG 2000MME、または0〜10%Jeffamine M-600、および/または5〜20%、例えば10〜20%のプロパノールもしくは15〜20%エタノールもしくは約15%〜30%、例えば約15%の2-メチル-2，4-ペンタンジオール（MPD）を含み、場合によっては、0.01M〜1.6Mの塩、および/または0〜0.15、例えば0〜0.1Mの緩衝液、および/または0〜15%など0〜35%のグリセリン、および/または0〜35%PEG300〜400を含み、好ましくは、
10〜25%のPEG 1K〜8KもしくはPEG 2000MME、または0〜10%Jeffamine M-600、および/または5〜15%、例えば10〜15%のプロパノールもしくはエタノール、場合によっては0.1M〜0.2Mの塩、および/または0〜0.15、例えば0〜0.1Mの緩衝液、および/またはPEG400を含み、より好ましくは、
15〜20%のPEG 3350もしくはPEG 4000もしくはPEG 2000MME、または0〜10%Jeffamine M-600、または5〜15%、例えば10〜15%のプロパノールもしくはエタノール、場合によっては0.1M〜0.2Mの塩、および/または0〜0.15Mの緩衝液を含む。
【００９５】
本明細書に記載する2C9タンパク質の特に好ましい結晶化諸条件は、
0.05〜0.1MTris-HCl pH8.0〜8.8、0.1〜0.2M硫酸リチウム、10〜15%PEG 4000;
0.1MTris pH8.0〜8.8、15〜30%PEG 400、5%PEG 8000、10%グリセリン;および
0.1〜0.4M KH2PO4、0〜25%PEG 3350、0〜10%グリセリンである。
【００９６】
塩は、ハロゲン化物（例えば臭化物、塩化物またはフッ化物）、酢酸、ギ酸、硝酸、硫酸、酒石酸、クエン酸またはリン酸のアルカリ金属（特に、リチウム、ナトリウムおよびカリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウムまたはカルシウム）、アンモニウム、第二鉄、第一鉄または遷移金属塩（例えば亜鉛）とすることができる。これには、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化アンモニウム、酢酸アンモニウム、酢酸リチウム、酢酸マグネシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム、酢酸亜鉛、塩化アンモニウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、臭化カリウム、ギ酸マグネシウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸カリウム、ギ酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸リチウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸ナトリウム、酒石酸二ナトリウム、酒石酸ナトリウムカリウム、酒石酸二アンモニウム、リン酸二水素カリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三カリウム、酢酸亜鉛、塩化第二鉄、塩化カルシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、クエン酸三リチウム、塩化ニッケル、ヨウ化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウムなどがある。
【００９７】
緩衝液が存在する場合、これには、例えば、Hepes、Tris、イミダゾール、カコジレート、クエン酸三ナトリウム/クエン酸、クエン酸三ナトリウム/HCl、酢酸/酢酸ナトリウム、リン酸塩-クエン酸塩、リン酸ナトリウムカリウム、2-（N-モルフォリノ）-エタンスルホン酸/NaOH（MES）、CHES、ビス-トリスプロパン、CAPS、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウムなどがある。
【００９８】
pH範囲は、望ましくはpH4.2〜10.5、好ましくは4.2〜8.5、より好ましくは4.7〜8.5、最も好ましくは6.5〜8.5に維持される。
【００９９】
結晶は、Hampton Research Screeningキット、ポリエチレングリコール（PEG）/イオン・スクリーン、PEGグリッド、硫酸アンモニウム・グリッド、PEG/硫酸アンモニウム・グリッドなどを用いて調製することができる。
【０１００】
結晶化は、P450の阻害剤または基質、例えばフルオロキサミン（fluoroxamine）または2-フェニルイミダゾールの存在下で実施することもできる。
【０１０１】
添加剤は、結晶化に影響すると確認された結晶化条件に加えることができる。添加剤Screenは、添加剤の存在によって試料の結晶化が助けられ、添加剤によって結晶の質が向上し得る予備結晶化条件の最適化中に使用され、例えば、タンパク質結晶化においてグリセリン、ポリオール、および他のタンパク質安定化剤を使用するHamptonの添加剤Screen（R.Sousa.Acta.Cryst.（1995）D51、271〜277）または二価のカチオン（Trakhanov，S.およびQuiocho，F.A.Protein Science（1995）4、9、1914〜1919）である。
【０１０２】
C.結晶
したがって、別の態様においては、本発明は、ヒト2C9 P450タンパク質分子の結晶、およびヒト2C P450分子の結晶構造を得る方法を提供する。この方法は、前記結晶をX線に曝すステップと、得られた回折パターンを分析して前記2C9 P450の原子の3次元座標を決定するステップとを含む。
【０１０３】
したがって、本発明は、三方晶系空間群P321および単位格子寸法165.46Å、165.46Å、111.70Å、90°、90°、120°であるP450の結晶を提供する。この結晶は、表1、2、3および8においてAおよびBで示される非対称単位の2C9の2つのコピーを含む。すべての寸法で単位格子の5%のばらつきが観測されることがある。
【０１０４】
このような結晶は、後述の実施例に記載した方法を用いて得ることができる。
【０１０５】
この結晶は、以下の変更、すなわち、
220位または222位がプロリンであり、
場合によっては最大で21、例えば最大で10、例えば最大で5個の他の位置が変わっている以外は、配列番号2の配列を含む2C9タンパク質であり得る。これらの位置は野生型2C9に従って番号が付けられている。この結晶は本明細書の後述の実施例に記載する配列を含んでいる。
【０１０６】
本明細書に示すP450結晶を準備するために使用する方法を用いて、一般に、少なくとも3.1Å、好ましくは少なくとも3Åの分解能で解像できるヒトP450結晶を提供することができる。
【０１０７】
したがって、本発明は、さらに、本明細書に記載する、少なくとも3.1Å、好ましくは少なくとも3Åの分解能を有するP450タンパク質の結晶を提供する。
【０１０８】
別の態様においては、本発明は、本明細書に記載するP450タンパク質のタンパク質結晶を作製する方法を提供する。この方法は、カリウム塩およびPEG沈殿物を含有する貯蔵緩衝液（reservoir buffer）を用いた蒸気拡散によって結晶を成長させるステップを含む。結晶の成長は、蒸気拡散により、貯蔵緩衝液を含有するウェル上のカバーガラスに懸滴として一定分量の溶液を置くことによって実施される。カリウム塩はリン酸カリウム、特に0.05〜0.2Mリン酸カリウムが好ましい。PEG沈殿物濃度は、好ましくは10〜30%PEG（より好ましくは、10〜20%PEG）である。PEG 2000〜PEG 4000の範囲の高分子量PEGを使用することができる。PEG 3350を使用することが好ましい。この一定分量には、一般に、タンパク質溶液1部と貯蔵緩衝液1部の比率でタンパク質溶液および貯蔵緩衝液が含有されている。タンパク質溶液は0.7mMであった。最も好ましくは、貯蔵緩衝液は0.2M二塩基性リン酸カリウムおよび20%PEG 3350である。別の結晶化条件は、（i）0〜0.2M Tris-HCl（pH8〜9.5、好ましくはpH8.4〜8.8）、0〜20%PEG 400、0〜20%PEG 8000、0〜20%グリセリン、または（ii）0〜0.2M Tris-HCl（pH8〜9）、0〜0.25M Li2SO4、0〜20%PEG 4000、特に（iii）0.1M Tris-HCl（pH8.8）、15%PEG 400、5%PEG 8000、10%グリセリン、（iv）0.1M Tris-HCl（pH8.5）、0.2M Li2SO4、15%PEG 4000、または（v）0.1M Tris-HCl（pH8.4）、15%PEG 400、5%PEG 8000、10%グリセリンを含むものである。条件（iv）が特に好ましい。
【０１０９】
第1の構造の解明に適切な3.0Åデータセットを得るために、全部で2648個の結晶化ウェルを設置した。2.6Åまで解像可能な結晶を得るためにさらに1584個のウェルを設置した。これは、構造解析に適切な分解能の結晶を得ることが困難であることを示している。設定すべき諸条件を決定するための結晶化スクリーンの解釈およびその後の結果の分析には、かなりの経験を要する。
【０１１０】
本発明の他の結晶としては、選択された結合ポケット座標を有する結晶が含まれ、これら選択座標に関連するアミノ酸残基は、表1、2、3または8のこれらアミノ酸の空間配置に対応する相対的空間配置にこれらのアミノ酸を保持するタンパク質のフレームワーク中に位置する。「対応する」とは、2.0Å未満、好ましくは1.5Å未満、より好ましくは1.0Å未満、さらにより好ましくは0.64Å未満、最も好ましくは0.5Å未満の二乗平均平方根偏差（R.S.M.D.）内にあることを意味する。選択座標を与えるアミノ酸は、好ましくはP450の結合ポケットの一部を形成するアミノ酸から選択され、本明細書の以下でさらに規定される表5または6のアミノ酸またはそれらの組合せを含む。
【０１１１】
本発明の結晶には、以下のセクションFおよびGでさらに規定される2C9突然変異体およびキメラの結晶も含まれる。
【０１１２】
本発明は、さらに、P450タンパク質と化合物の相互作用能力を評価する方法も提供する。この方法は、
前記化合物を入手または合成するステップと、
P450タンパク質と前記化合物の結晶化複合体を形成させ、前記複合体がX線を回折し、3.1Å、好ましくは少なくとも3Åよりも優れた分解能で前記複合体の原子座標を決定するステップと、
X線結晶学によって前記複合体を解析してP450タンパク質との前記化合物の相互作用能力を決定するステップとを含む。
【０１１３】
D.構造の記述
本発明において得られた結晶を分析して、ヒトP450の分子構造の詳細な分析が可能になった。チトクロムP450 2C9は、小さい方の主にβ鎖ドメインと大きい方の主にαヘリックス状のドメインとの2つのドメイン・タンパク質であり、全体として三角形の配置をとると考えられる。これまで解明されたすべてのP450構造は、全体として同じ形態を有し、文献によって採用された命名法によってP450構造内の個々のαヘリックスおよびβ鎖が記述される（定義は、Ravichandran等、Science、1993、261、731〜736を参照されたい）。精製されたタンパク質は、残基19〜494（完全長2C9由来の番号付け）からなり、これらの残基のうち最初と最後の数個を除いたすべてが、電子密度によって識別可能である。β鎖ドメインは、βシート1および2ならびにαヘリックスAおよびBからなる。これらの構造要素は、ポリペプチド鎖（残基30〜90）のN末端領域、およびヘリックスKとK'の間の残基によって形成される。これらの残基は、ヘリックスBとCとの間のループ、およびヘリックスFとGとの間のループ（本明細書ではB-CループおよびF-Gループと称する）と共に、タンパク質がその固有の膜形成性の形をしているとき、哺乳動物のP450と膜との相互作用に関与する。これらのループは、個々のP450に反応特異性の一部を付与し、配列の最も異なる領域の1つである。
【０１１４】
αヘリックス状ドメインは、ヘリックスC〜Lからなる。ヘム骨格は、αヘリックスとβ鎖ドメインの間に位置し、ヘリックスI（残基284〜315）の上にある。ヘムに対する単一のタンパク質リガンドであるシステイン435は、最後のαヘリックス前のループ中にある。P450が代謝する化合物の範囲を考慮すると、これらの酵素の基質結合ポケットは、様々な形およびサイズを収容することができる。ヘム基へのアクセスおよびヘム基からのアクセスは、基質結合部位を形成するループの位置によって調節することができ、酵素の開いたコンホメーションおよび閉じたコンホメーションがもたらされる。突然変異データおよび活性データによって、機能する配列領域をマッピングすることが可能になった。
【０１１５】
全部で6つの基質認識部位（SRS）がGotohによって提案された（Gotoh、J.Biol.Chem.、267（1992）、83〜90）。2C9構造の結合ポケットに沿って並ぶ残基のいくつかは、これら予想されたSRS内の残基を含み、タンパク質の突然変異体内の特異性および反応速度の両方の変化に関連するいくつかの残基を含む。ワルファリンの位置特異的なヒドロキシル化は、ヘム基の上および片側に存在する残基359における多型と関連し、ワルファリンおよびジクロフェナクのヒドロキシル化速度を変化させることが示された残基114は、ヘム基の上およびもう一方の側にある。
【０１１６】
本発明の構造から、従来技術において他の方法（例えば、配列アラインメントおよび突然変異誘発）によってSRS残基候補と推測された残基の多くが、本発明者らの構造に見られる様々なSRSにおいて見出されることが確認される。本発明者らは、多数のP450基質と相互作用可能な側鎖を与える可能性が高い多数の他の残基も同定した。例えば、本発明者らの構造は、いくつかの残基、特に疎水性の側鎖を有する残基が、SRS領域にあることを示している。
【０１１７】
P450構造の選択座標を使用することができる本明細書に記載する本発明の実施形態においては、これらの座標は、これらの残基のいくつかまたはすべてを含むことができる。
【０１１８】
2C5と2C9構造の重なりから、タンパク質の全体的特徴は、2つのタンパク質間でおおかた保存されているものの、いくつかの興味深い差があることが示されている。電子密度において第1の解像可能な残基は残基30であり（番号付けはすべて完全長タンパク質と関連している）、最後の残基は残基490である。したがって、N末端には電子密度が不明な10個の残基があり、4つのヒスチジンC末端タグも解像不能である。
【０１１９】
2つのタンパク質は、N末端から始まり、残基48で同じ位置をとる。N末端方向へ戻るポリペプチド鎖に続いて、2つの配列の位置は1残基ずれ、末端方向で2残基ずれるものの、2つのタンパク質の骨格の軌跡は極めて近い。この領域における配列の同一性は特に高いので、このような差異はやや意外である。これはおそらく2C5構造の分解能が比較的低いためであり、N末端における正確な配列の割り当てが困難になっている。2C9構造の分解能が高いと、この領域における配列の帰属がより曖昧でなくなる。したがって、2C9のこの構造は、おそらく、2C5および2C9の両方のN末端の真のコンホメーションをより代表している。
【０１２０】
2つのタンパク質が実質的に異なる第1の領域は、BとCヘリックスの間の領域（残基99〜111）である。2C5の残基99と109の間の鎖の温度因子は高く（この範囲内のすべての原子の平均B因子は99.1Å2である）、この領域における移動度が大きいことを意味しており、したがって、それらの位置の信頼性は低い。これに対し、2C9における残基99〜111のすべての原子の平均B因子は55.5Å2である。
【０１２１】
2C9構造において、残基101〜106は、細菌P450構造において認められたヘリックス構造（ヘリックスB'）をとる。これらの残基は、SRS 1の一部を形成し、したがってP450の活性部位に寄与する。電子密度によって、この領域におけるすべての側鎖の位置の解釈が明確になった。この領域における注目すべき特徴は、活性部位における重要なカチオンであることが提案されているArg97である（2C9基質は主に酸性である）。2C5における等価な残基（Arg97）は、異なるコンホメーションをとり、その結果、活性部位の一部を形成しない。His99は、オメプラゾール活性に関与し（Ibeanu等、（1996）、J Biol Chem、Vol.271、12496〜12501）、2C9と2C19の間で保存されていないSRS 1における唯一の残基であり（2C9ではIleであり、2C19ではHisである）、2C19におけるこの残基の突然変異のみが、得られた突然変異体タンパク質にオメプラゾール活性を付与する。2C9構造から、この残基が活性部位の一部を形成することが確認される。
【０１２２】
2C9構造において、Arg97の側鎖の位置は明瞭に分離されており、ヘムおよびVal113との相互作用を形成している。Phe114は活性部位を向き、いくつかのグループによって示唆されたように基質とπ-πスタッキング相互作用を形成するのに良好な位置にある。Phe110は近接しているが、Phe114において露出していない。
【０１２３】
活性部位内のカチオン部位に寄与しているとやはり示唆されているArg105およびArg108は、両方とも空隙から離れた方向を向いている。
【０１２４】
2C5と2C9構造の次の相違領域は、FヘリックスとGヘリックスの間の領域である。F-Gループの一部を形成する残基212〜222（212と222を含む）は、公表された2C5構造には存在しなかった。これらの残基は、2C9構造では良好に解析されており、2回りのヘリックスを形成している（2次構造の割当はすべてプログラムDSSP（KabschおよびSander、Biopolymers 22（1983）2577〜2637）を用いて行われた）。残基220および221は、活性部位には寄与しないものの、F-Gループの位置を左右することによって、あきらかに活性部位への接触性になんらかの影響を及ぼしている。基質接触に関与する配列のマッピング領域の欠点の1つは、（活性部位に沿って並ぶことによって）基質に直接接触する領域と、基質がP450との間で有する相互作用を酵素内の構造要素を調節することによって左右する領域とを識別できないことである。2C9構造によって、基質特異性および活性に対する個々の残基の直接的影響と間接的影響を区別することが可能になる。2C9との相互作用を亢進または除去する化合物の再設計は、あきらかにこの区別によって単純化される。
【０１２５】
286位および289位の残基は、基質特異性に関与する（Klose等、（1998）、Arch.Biochem.Biophys.、Vol.357、240〜248）。実際には、残基289のみが活性部位に沿って並ぶが、両方ともB-CループのPhe110に近接しており、したがって基質特異性におけるそれらの役割は、おそらく、基質接触を通した直接的なものではなく、構造要素のパッキングを介した間接的なものと考え得る。
【０１２６】
ヘリックスHおよびIは、2つのタンパク質において同じ空間コンホメーションをとり、2つのヘリックス間のループは3残基長く、電子密度が明瞭に分離されている。
【０１２７】
Phe476は、活性部位においてPhe100、Leu102、Leu208、Leu362，およびLeu366と共に疎水性パッチを形成する。
【０１２８】
現在同定され、アミノ酸置換体を有する、2C9の4つの他の対立遺伝子がある。2C9＊2はR144C、2C9＊3はI359L、2C9＊4はI359T、2C9＊5はD360Eを有する。Ile359は、活性部位には存在しないが、Thr305およびThr361の近くにある。化合物を触媒する能力に対するこの残基の直接的効果を予想することは容易ではないが、他の残基に対して記述したように、ここでの突然変異は、構造要素のシフトを引き起こす可能性があり、それによって活性部位が影響を受ける。同様の効果がAsp360でも起こり得る。Arg144は、2C9の結合ポケットの一部を形成しない。しかし、2C9 R144C対立遺伝子バリエーションを有する個体によって示される薬物代謝特性の変動は、P450とレダクターゼの相互作用の変化によるものであると一般に考えられている。2C9の構造においてこの残基が周辺部に位置することから、この主張は支持されるはずである。
【０１２９】
2量体界面
非対称単位における2つのコピー間の回転角は180°ではなく、その結果、2つのコピー（本明細書ではAおよびBと称する）間の界面は、非対称である。界面には、分子AのヘリックスDと分子BのG-Hループ、分子AのG-Hループと分子BのC末端およびヘリックスD、AのC末端と分子BのG-Hループにおける残基間のいくつかの水素結合が含まれる。
【０１３０】
E.結晶座標
さらに別の態様においては、本発明は、表1、2、3または8の3次元原子座標を有するP450の結晶も提供する。この原子座標によって規定される構造の有利な特徴は、それが高い分解能を有することである（表1では約3Å、表2では約2.6Å、表3では約3.1Å、および表8では約2.6Å）。
【０１３１】
本発明の別の有利な特徴は、それがヘリックスFとGの間のループ（FGループ）に関係する原子座標データを提供することである。FGループは、哺乳動物と細菌P450酵素とで形態上最も相違した領域の1つである。したがって、FGループは、モデリング・テンプレートとして細菌構造を使用したときに、モデル化が困難な哺乳動物酵素の部分の1つである。P450BM3の構造（Ravichandran等、1993、ibid）は、ヒト体（human forms）をモデル化するための構造テンプレートとして当分野で広く使用されている。P450BM3は、FGループ中にちょうど12個の残基を有し、2Cアイソフォームにおける21残基とは対照的である。公開ドメインにおける唯一の哺乳動物のP450構造は、ウサギ2C5アイソフォームのものであり、X線結晶学によって分解能3.0Åまで分離されている（Williams等、Mol Cell（2000）、5、121〜131）。2C5構造は、細菌構造と比較したときに、改良されたモデリング・テンプレートを提供するものの、FGループの位置は、結晶構造において解像不能であった。これに対して、本明細書に記載する2C9構造は、FGループを含んでいる。FGループ内の残基は、P450の基質選択性に広範には関与せず、Gotoh（Gotoh，O、J.Biol.Chem、267;83〜90（1992））によって同定された基質認識部位（SRS）の外部にある。FGループ内の残基は、2C9の化合物結合特異性を改変することが示された（Tsao等、Biochemistry（2001）、40、1937〜1944）。この効果が、FGループ内の残基と化合物の直接的な相互作用、またはこれらの残基と酵素の基質認識部位（SRS）内にあるポケット内の残基との相互作用によって引き起こされる副次的な効果のどちらによるかは明らかではなかった。本発明者らの構造から、FGループの残基は結合ポケットに寄与しないことはもはや明らかである。したがって、2C9の構造によって、化合物と2C9の直接的相互作用と間接的相互作用の識別が容易になる。
【０１３２】
別の有利な特徴は、全B因子が58.6Å2である2C5構造に対して、2C9構造の平均B因子が43.9Å2であり、その結果、構造内の大部分の側鎖がより良好に規定されることである。これは、座標のすべての用途、特にイン・シリコ研究、分子置換および相同モデリングに有利である。
【０１３３】
本明細書に記載する2C9構造の別の利点は、それらが配位されておらず、アポ構造（apo structure）であることである。これによって、リガンドにソーキング（soaking）するのに、したがってコ・コンプレックス構造を決定するのに特に適切になり、リガンドからのコンホメーション上の偏りがないので、相同モデリングの目的のためにも理想的である。
【０１３４】
BCおよびFGループは、チトクロムP450の最も変動する特徴の1つである。両方のループは、酵素触媒サイクルに寄与する。すなわち、BCループは、活性部位の一部を形成し、特異性および活性相互作用を媒介する残基を与えることによって直接寄与し、FGループは、基質の移入および退去を可能にする動きによって寄与する。2C5構造とは対照的に、この高分解能2C9構造においては、これらのループの両方が十分に分離される。
【０１３５】
表1、2、3および8に、P450 2C9の原子座標データを示す。表1、2、3および8において、第3列は原子を示し、第4列は残基タイプを示し、第5列は鎖の識別（AかBか）であり、第6列は残基番号（原子は、完全長野生型タンパク質に対して番号付けされている）であり、第7列、第8列および第9列は、目的原子のそれぞれX、Y、Z座標であり、第10列は原子の占有率であり、第11列は原子の温度因子であり、第12列（存在する場合）は鎖の識別であり、最後は原子タイプである。
【０１３６】
表1、2、3および8の座標によって、原子の位置の目安がオングストロームで小数点以下3桁まで与えられる。座標は、3次元で形状を画成する相対的な1組の位置であるが、当業者は、異なる原点および/または軸を有するまったく異なる座標セットによって類似または同一の形状が画成されることを理解されよう。また、当業者は、残基骨格原子（すなわち、タンパク質アミノ酸残基の窒素-炭素-炭素骨格原子）の二乗平均平方根偏差が、残基骨格原子に対して表1、2、3または8に与えられた座標上で重ね合わせられたときに、2.0Å未満、好ましくは1.5Å未満、より好ましくは1.0Å未満、さらにより好ましくは0.64Å未満、最も好ましくは0.5Å未満になるように構造原子の相対的原子位置を変化させると、一般に、P450-相互作用分子構造の構造ベースの分析に対するその構造的諸特性および有用性の両方の点で表1、2、3または8の構造と実質的に同じ構造になることを理解されよう。
【０１３７】
同様に、当業者は、表1、2、3または8の水分子および/または基質分子の数および/または位置を変えることは、一般に、P450-相互作用構造の構造ベースの分析に対するこの構造の有用性に影響を及ぼさないことを理解されよう。したがって、本発明の態様として本明細書に記載する目的のために、表1、2、3または8の座標が異なる原点および/または軸に移され;残基骨格原子に対して表1、2、3または8に与えられた座標上で重ね合わせられたときに、残基骨格原子の二乗平均平方根偏差が、2.0Å未満、好ましくは1.5Å未満、より好ましくは1.0Å未満、さらにより好ましくは0.64Å未満、最も好ましくは0.5Å未満になるように、構造原子の相対的原子位置が変えられ;かつ/または水分子および/または基質分子の数および/または位置が変えられた場合、それも本発明の範囲内である。
【０１３８】
したがって、本明細書で言及する表1、2、3または8などの座標データには、表の1つまたは複数の個々の値がこのように変わる座標データが含まれる。「二乗平均平方根偏差」とは、平均からの偏差の2乗の相加平均の平方根を意味する。
【０１３９】
したがって、例えば、構造原子の原子位置を最大で約0.5Å、好ましくは最大で約0.3Åどの方向に変えても、例えば分子構造ベースの分析に対して、その構造特性および有用性の両方について表1、2、3または8の構造と実質的に同じ構造になる。
【０１４０】
当業者は、本発明の多数の用途において、表1、2、3または8のすべての座標を利用する必要がなく、単にそれらの一部を利用するだけでよいことを理解されよう。例えば、以下に記述するように、P450を基に候補化合物を設計する方法においては、2C9の選択座標を使用することができる。
【０１４１】
「選択座標」とは、2C9構造の例えば、少なくとも5個、好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも50個、さらにより好ましくは少なくとも100個、例えば少なくとも500個または少なくとも1000個の原子を意味する。同様に、相同モデリングおよび構造解析、ならびにデータ貯蔵および座標のコンピュータ支援操作を含めて、本明細書に記載する本発明の他の用途では、表1、2、3または8の座標のすべてまたは一部（すなわち、選択座標）を利用することもできる。選択座標は、本明細書の以下に記載する2C9 P450結合ポケットに存在する原子を含むことができ、または原子からなることができる。
【０１４２】
F.キメラ
所望の諸特性を得るためにキメラ・タンパク質を使用することは、現在、科学文献では一般的である。例えば、Sieber等（Nature Biotechnology（2001）19、456〜460）は、1A2の特異性を有し、BM3の望ましい発現および溶解特性を有するタンパク質を調製するために、ヒト・チトクロムP450アイソフォーム1A2と細菌P450 BM3のハイブリッドを作製した。活性部位キメラも記載されている。例えば、Swairjo等（Biochemistry（1998）37、10928〜10936）は、HIV-1およびHIV-2プロテアーゼのループ・キメラを作製して阻害剤結合特異性の決定因子を理解しようとした。
【０１４３】
特に関連するのは、活性部位が、構造情報を得るための代用を提供するように改変されている場合である。すなわち、Ikuta等（J Biol Chem（2001）276、27548〜27554）は、構造データを得ることができるcdk2の活性部位を改変して、X線構造を現在利用できないcdk4の活性部位に近似させた。このようにして、彼らは、cdk4阻害剤設計に有用であるキメラ・タンパク質からタンパク質/リガンド構造を得ることができた。同様にして、極めて関係性の高いアイソフォーム（2C19など、または2D6までも）の1次配列の比較に基づいて、2C9タンパク質の活性部位をこれらのアイソフォームに似せて改変することができる。キメラ・タンパク質のタンパク質構造またはタンパク質/リガンド構造を、その関係するP450アイソフォームの基質である化合物の代謝の構造ベースの変更に使用することができる。
【０１４４】
哺乳動物のP450間のアミノ酸配列同一性の割合が20〜80%であっても、哺乳動物のP450全体の折りたたみは、極めて類似し、構造要素の空間分布は同じであると予想される。また、このクラスの酵素は、ポリペプチド鎖の非隣接部に位置する限定された数の残基にのみ依拠する明確な基質特異性を示す。P450の基質結合ポケットは、一般に、Gotoh（Gotoh，O、J.Biol.Chem、267;83〜90（1992））によって定義されたSRS領域（基質認識部位）およびその分子のループ内に存在する残基で構成される。
【０１４５】
したがって、本発明の態様は、活性部位が関係するアイソフォームの活性部位を模倣するようなP450タンパク質の改変に関する。例えば、本明細書に記載するヒト2C9タンパク質の活性部位の構造および残基の知見から、かつ以前に公表されたウサギ2C5タンパク質の知見から、当業者は、その活性部位がヒト2C9の活性部位を模倣するように2C5タンパク質を改変することができる。次いで、このタンパク質を用いて、キメラ2C5タンパク質を用いたタンパク質/リガンド複合体構造の決定を通して化合物結合についての情報を得ることができる。
【０１４６】
例えば、一態様においては、本発明は、P450 2C9タンパク質の基質特異性と実質的に同じ基質特異性を与える結合空隙を有するキメラ・タンパク質を提供する。ここで、キメラ・タンパク質結合空隙は、P450 2C9結合空隙に沿って並ぶ選択されたP450 2C9原子に対応する複数の原子がそれに沿って並び、その複数の原子の相対位置は、選択されたP450 2C9原子の表1、2、3または8によって定義される相対位置に対応している。
【０１４７】
70%を超えるアミノ酸同一性を示すP450アイソフォームの基質特異性を相互変換するために、ほんの数個の変化しか必要としないと仮定することができる。例えば、2C9と2C19は、490アミノ酸のうちわずか43しか異ならないが、基質特異性が明らかに違う。1パネルの2C9/2C19キメラ・タンパク質を用いて、Jung等（Jung，F.Biochemistry、37、16270〜16279（1998））は、2C9の極めて強力で特異的な阻害剤であるスルファフェナゾールに対する高い親和性結合を2C19に与える配列差を同定した。部位特異的突然変異誘発実験によって、2C19から2C9様タンパク質への転化が、限られた数の置換を2C19アミノ酸配列に導入することによって可能になることが判明した。これらの突然変異は、このタンパク質のSRS3およびSRS4領域に位置する。Klose等（Arch.Biochem.Biophys.357、240〜248（1998））およびTsao等（Biochemistry、40、1937〜1944、（2001））によって実施された同様の研究から、SRS領域を突然変異させることによって2C9と2C19の間で基質特異性の移動が可能になることが示された。
【０１４８】
酵素の基質特異性は、一般に、ポリペプチド鎖の非隣接部に位置する限られた数の残基にのみ依拠する。これらのアイソフォームの基質特異性は、部位特異的突然変異誘発によりこれらの残基を置換することによって解析することができる。別のタンパク質を2C9様キメラに転化させるのに要する最小限の変化は、表4から選択された少なくとも2つのアミノ酸とすることができる。これらの突然変異を、例えばStratagene QuikChange（商標）部位特異的突然変異誘発キットまたはカセット突然変異誘発法（Ausubel，F.M.、Brent，R.、Kingston，R.E.等編.Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley＆Sons，Inc.、New York、Sambrook，J.、Fritsch，E.F.およびManiatis，T.（1989）.Molecular Cloning:a Laboratory Manual.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY.）を用いた部位特異的突然変異誘発によって導入することができる。したがって、本発明は、表4の残基によって定義される1つまたは複数の結合ポケットを有するキメラ・タンパク質を提供する。
【０１４９】
この戦略は、明らかに、基質特異性が重なっていてもいなくても高い配列相同性を示す異なる種からのタンパク質に適用することができる。ウサギ2C5およびヒト2C9および2C19 P450は、プロゲステロンの様々な速度の代謝に関与することが報告されている。ウサギ・アイソフォームが明らかに最も効率的な酵素である。2C5および2C9に対して解析された結晶構造を使用することによって、これらのタンパク質の基質ポケットにおけるプロゲステロン分子の結合モードの特性を明らかにすることが可能になる。これによって、それらを効率的なプロゲステロン代謝酵素に転化するためにヒト・アイソフォームにおいて改変される残基を同定することが可能になる。
【０１５０】
一実施形態においては、2Cサブファミリーの別の酵素のアイソフォームであるキメラ2C9酵素が生産される。例えば、2C9を、数個のアミノ酸変化によって2C19様アイソフォームに転化することができる。2C9および2C19アイソフォームについて実施された構造/活性研究に関する文献から利用可能な情報、およびヒト2C9の構造分析に基づいて、本発明者らは、2C9タンパク質を、2C19に起因する基質特異性を有する2C19様タンパク質に転化できると仮定している。
【０１５１】
突然変異される残基は、
2C19のSRS 1で2C9のSRS 1を置換（導入されるアミノ酸変化はI99Hである）、および/または
2C19のSRS 3で2C9のSRS 3を置換（導入されるアミノ酸変化はV237LおよびK241Eである））、および/または
2C19のSRS 4で2C9のSRS 4を置換（導入されるアミノ酸変化はS286N、E288V、N289I、V292AおよびF295Lであり、重要な変化はS286N、N289I、V292AおよびF295Lである）、および/または
2C9へ2C19のSRS5を移動（アミノ酸L362Iが導入される）の1つまたは複数である。
【０１５２】
2C9を2C19に転化するのに必要となる最小限の変化は、I99H、K241E、S286N、N289I、V292A、F295LおよびL362Iとすることができ、I99H、S286N、N289I、V292AおよびF295Lである可能性が高い。これらの突然変異は、本明細書に記載した部位特異的突然変異誘発法またはカセット突然変異誘発法によって導入することができる。
【０１５３】
2C19様キメラは、I99H、S286N、E288V、N289I、V292A、F295Lを変化させることによって作製することもできる。別の最小限の変化は、I99H、S286N、N289Iである。
【０１５４】
このようなキメラの結晶化およびそれらの3次元構造の決定は、本発明者らの2C9タンパク質の、高分解能で回折する結晶を生成する能力にかかっている。その目的は、タンパク質の結晶化を可能にするタンパク質の外殻を改変せずに、内部または2C9を改変して2C19の新しい基質結合部位を生成させることである。
【０１５５】
G.相同モデリング
本発明は、他のタンパク質（以下、標的P450タンパク質と称する）の相同モデリング手段も提供する。「相同モデリング」とは、X線結晶データ、または表1、2、3または8の座標データの操作に基づくコンピュータ支援の新規構造予測のいずれかを基にした関係するP450構造の予測を意味する。
【０１５６】
表1、2、3または8に示すP450構造は、本明細書でさらに詳細を説明するように、2量体構造である。本願のこのセクションおよび他のセクションに記載する様々なイン・シリコ・モデリング技術は、表1、2、3または8の2量体構造のいずれか、またはサブユニットAまたはBのどちらかを利用することができる。不必要な反復を避けるために、本明細書の表1、2、3または8の座標データを参照されたい。ただし、これは、両方のサブユニットまたはサブユニットの単なる1つのどちらかのデータを意味することを理解されたい。
【０１５７】
「相同モデリング」は、後述の実施例においてその構造が決定された2C9 P450タンパク質のアナログまたはホモログである標的P450タンパク質に拡張される。「相同モデリング」は、2C9タンパク質自体のP450タンパク質突然変異体にも拡張される。
【０１５８】
一般に、この方法は、アミノ酸配列を整列させることによって、表1、2、3または8の2C9 P450タンパク質のアミノ酸配列を標的P450タンパク質と比較するステップを含む。次いで、これらの配列中のアミノ酸を比較し、相同であるアミノ酸のグループ（好都合には、「対応領域」と称する）をグループ化する。この方法によって、ポリペプチドの保存領域が検出され、アミノ酸の挿入または欠失が明らかになる。
【０１５９】
アミノ酸配列間の相同性は、市販のアルゴリズムを用いて決定することができる。BLAST、ギャップドBLAST、BLASTN、PSI-BLASTおよびBLAST 2配列プログラム（National Center for Biotechnology Informationによって提供される）は、この目的のために当分野で広範に使用され、2つのアミノ酸配列の相同領域を整列させることができる。これらを、デフォルトのパラメータで使用して、表1、2、3または8のタンパク質と設計しようとする他の標的P450タンパク質とのアミノ酸配列間の相同の程度を決定することができる。
【０１６０】
アナログは、類似した3次元構造および/または機能を有し、配列レベルにおいて共通の祖先である証拠がほとんどないタンパク質と定義される。
【０１６１】
ホモログは、共通の祖先の証拠を有する、すなわち進化の分岐の結果である可能性が高いタンパク質として定義され、配列同一性（通常、百分率で表される）の程度に基づく遠隔、中距離および近接の細区画に分けられる。
【０１６２】
ホモログは、本明細書では、少なくとも15%の配列同一性を有するタンパク質、または2C9に特徴的な少なくとも1つの機能性ドメインを有するタンパク質と定義される。これには、2C9の多型も含まれる。
【０１６３】
ホモログには、オルソログとパラログの2つのタイプがある。オルソログは、異なる生物における相同遺伝子と定義され、すなわち、それらの遺伝子は、それらを生成した種分化が同時に起きた共通の祖先を有している。パラログは、遺伝子/染色体/ゲノム複製に由来する同じ生物、すなわち、最後の種分化後に発生したそれらの遺伝子の共通の祖先における相同遺伝子と定義される。
【０１６４】
突然変異体は、野生型2C9からの少なくとも1つのアミノ酸の置換または欠失を特徴とする2C9である。このような突然変異体は、例えば部位特異的突然変異誘発または天然もしくは非天然アミノ酸の導入によって調製することができる。
【０１６５】
本発明は、「突然変異体」を企図する。「突然変異体」とは、自然の2C9または合成2C9において少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換することによって得られるポリペプチド、および/または自然のポリペプチド内もしくは2C9に対応するポリペプチドのN末端および/またはC末端においてアミノ酸残基を付加および/または欠失させることによって得られるポリペプチド、およびそれが由来する2C9と実質的に同じ3次元構造を有するポリペプチドを指す。実質的に同じ3次元構造を有するとは、突然変異体が由来する2C9の原子構造座標と重ね合わせたとき、2C9のCα原子の少なくとも約50%〜100%が重ね合わせに含まれるときに、約2.0Å以下の二乗平均平方根偏差（r.m.s.d.）を有する1組の原子構造座標を有することを意味する。突然変異体は、酵素活性または触媒活性があってもなくてもよい。
【０１６６】
ホモログまたは突然変異体を生産するために、前記タンパク質中に存在するアミノ酸を、類似した諸特性、例えば疎水性、疎水性モーメント、抗原性、α-ヘリックスまたはβ-シート構造を形成または破壊する性質などを有する他のアミノ酸で置換することができる。タンパク質の置換変異体は、タンパク質配列中の少なくとも1つのアミノ酸が取り除かれ、異なる残基がその場所に挿入されるものである。アミノ酸置換体は、一般に、単一の残基であるが、例えば結晶接触（crystal contact）における機能上の制約に応じてクラスターを形成することができる。アミノ酸置換体は、保存的なアミノ酸置換体を含むことが好ましい。挿入アミノ酸変異体は、1つまたは複数のアミノ酸が導入されたものである。これは、アミノ末端および/またはカルボキシ末端融合、ならびに配列内とすることができる。アミノ末端および/またはカルボキシ末端融合の例は、親和性タグ、MBPタグおよびエピトープ・タグである。
【０１６７】
2C9の3次元構造とさほど干渉しないアミノ酸置換、欠失および付加は、置換、付加または欠失が起こる2C9の領域に部分的に依存する。すなわち、分子の高度可変領域、非保存的置換、および保存的置換は、分子の3次元構造をさほど乱さず、許容される。高度保存領域、またはかなりの2次構造を含む領域においては、保存的アミノ酸置換が好ましい。
【０１６８】
保存的アミノ酸置換は、当分野で周知であり、これには、含まれるアミノ酸残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性および/または両親媒性における類似性に基づいてなされる置換が含まれる。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあり、正に帯電したアミノ酸としては、リジン、アルギニンなどがあり、親水性の類似した値を有する非帯電極性頭部基を含むアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン;グリシン、アラニン;アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン;フェニルアラニン、チロシンなどがある。他の保存的アミノ酸置換は当分野で周知である。
【０１６９】
ある場合には、ポリペプチドをコードするcDNAにおいて好都合なクローニング部位を提供し、ポリペプチドなどの精製を助けるために、2C9結合ポケットまたは触媒残基にアミノ酸残基を置換し、欠失しかつ/または付加することが特に有利または好都合なことがある。2C9の3次元構造を実質的に変えないこのような置換、欠失および/または付加は、当業者には明白である。
【０１７０】
本明細書で企図する突然変異体は、酵素活性を示す必要がないことに留意されたい。実際、2C9の触媒活性を妨害するが、触媒領域の3次元構造をさほど変えないアミノ酸置換、付加または欠失は、本発明で特に企図される。このような結晶ポリペプチド、またはそこから得られる原子構造座標を用いて、タンパク質に結合する化合物を同定することができる。
【０１７１】
既知および未知の構造を有するポリペプチドのアミノ酸配列を整列させた後、既知構造を有するポリペプチドのコンピュータ表示における保存アミノ酸の構造を、構造が未知であるポリペプチドの対応するアミノ酸に移す。例えば、既知構造のアミノ酸配列におけるチロシンを、未知構造のアミノ酸配列において対応する相同アミノ酸であるフェニルアラニンで置換することができる。
【０１７２】
非保存領域に位置するアミノ酸の構造は、標準ペプチドの幾何学的配置を用いて、または分子動力学などの分子シミュレーション技術を用いて手作業で割り当てることができる。プロセスの最終段階は、分子動力学および/またはエネルギー最小化によって全体構造を精緻化して達成される。
【０１７３】
相同モデリング自体は、当業者に周知の技術である（例えば、Greer、Science、Vol.228、（1985）、1055、およびBlundell等、Eur.J.Biochem、Vol.172、（1988）、513参照）。これらの文献に記載されているこの技術、および当分野で一般に利用可能である他の相同モデリング技術を、本発明を実施するのに使用することができる。
【０１７４】
したがって、本発明は、
（a）3次元構造が未知である標的P450タンパク質のアミノ酸配列表示を、表1、2、3または8のP450のアミノ酸配列と整列させて、アミノ酸配列の相同領域を一致させるステップと、
（b）構造が未知である前記標的P450の一致した相同領域の構造を、表1、2、3または8によって定義されるP450構造の対応する領域を基にしてモデリングするステップと、
（c）前記一致した相同領域構造を実質的に保存する未知構造の前記標的P450のコンホメーションを（例えば、都合の良い相互作用が未知構造の標的P450内に形成されるように、かつ/または低エネルギー・コンホメーションが形成されるように）決定するステップとを含む、相同モデリング方法を提供する。
【０１７５】
ステップ（a）〜（c）の1つまたはすべてをコンピュータ・モデリングによって実施することが好ましい。
【０１７６】
哺乳動物の構造におけるFGループのコンホメーションについては現在当分野で何も分かっていないので、本発明者らの構造におけるFGループの存在は、細菌P450よりも長いFGループを有する他のP450、特に哺乳動物のP450のモデリングに特に有利である。これは、化合物でこの構造またはモデル構造を作るのに有利である。
【０１７７】
表1、2、3または8のデータは、他のヒトP450タンパク質、特に2C8、2C18、2C19、2D6、3A4、1A1、1A2、2E1などのヒトP450の相同モデリングに特に有利である。これらのタンパク質は、上述した本発明の方法における標的P450タンパク質とすることができる。
【０１７８】
特に好ましい態様においては、相同モデルは、2C19、2C18および2C8からなる群から選択される。後述の実施例に、これらのタンパク質の相同モデルを提供するために、2C19の完全な相同モデル、ならびに2C9または2C19の構造中に導入することができる2C18および2C8の座標を示す。得られた相同モデルは、本明細書の以下のセクションH、IおよびJに記載する方法に使用することができる。
【０１７９】
H.構造解析
ヒト2C9 P450の構造を用いて、2C9、2C9の突然変異体、コ・コンプレックスの他の結晶形を含めた他の標的P450タンパク質の結晶構造を解析することもできる。これらの標的P450タンパク質のX線回折データが生成されると、構造を与えるためにその解釈が必要になる。
【０１８０】
2C9の場合、このタンパク質は、複数の結晶形で結晶化する場合もある。本発明によって提供される2C9またはその一部の構造座標は、2C9の他の結晶形の構造を解析するために特に有用である。それらは、2C9突然変異体、2C9コ・コンプレックス、または2C9の任意の機能性ドメインと有意なアミノ酸配列相同性を有する任意の他のタンパク質の結晶形の構造を解析するためにも使用することができる。
【０１８１】
他の標的P450タンパク質、特に上記のセクションDで言及したヒトP450タンパク質の場合、本発明によって、X線回折の生データが生成する場合、このような標的の構造がより容易に得られるようになる。
【０１８２】
したがって、X線結晶学またはNMR分光データが未知3次元構造の標的P450に対して提供される場合、表1、2、3、8または18によって定義されるP450の構造を用いて、そのデータを解釈して、当分野で周知の技術、例えばX線結晶学におけるフェージング（phasing）およびNMRスペクトルにおける支援ピーク帰属（assisting peak assignments）によって、他のP450の可能な構造を提供することができる。
【０１８３】
これらの目的で使用することができる1つの方法は、分子置換である。この方法において、未知結晶構造は、それが2C9、2C9突然変異体、または2C9コ・コンプレックスの他の結晶形でも、または2C9の任意の機能性ドメインに相同なアミノ酸配列を有する標的P450タンパク質の結晶でも、本明細書に提供される本発明の2C9構造座標を用いて決定することができる。この方法によって、未知結晶の正確な構造形態が、最初からこのような情報を決定しようとするよりも迅速かつ効率的に提供される。
【０１８４】
分子置換を実施するための当分野で既知のコンピュータ・プログラムの例は、CNX（Brunger A.T.;Adams P.D.;Rice L.M.、Current Opinion in Structure Biology、Volume 8、Issue 5、October 1998、Pages 606〜611（Accelerys San Diego、CAからも市販されている）またはAMORE（Navaza，J.（1994）.AMoRe:an automatedパッケージfor molecular replacement.Acta Cryst.A50、157〜163）である。
【０１８５】
したがって、さらに別の態様においては、本発明は、タンパク質の構造を決定する方法を提供する。この方法は、
表1、2、3または8の座標を準備するステップと、
前記タンパク質の構造を提供するように、前記タンパク質の結晶単位格子における座標の位置を決定するステップとを含む。
【０１８６】
本発明の好ましい態様においては、これらの座標を用いて、標的P450、特に2C9のホモログ、例えば2C19、2C8、2C18の構造を解析する。
【０１８７】
本発明は、表1、2、3または8のデータを操作することによって、このようなタンパク質のNMRスペクトルのピークを帰属させるために使用することもできる。
【０１８８】
I.コンピュータ・システム
別の態様においては、本発明は、システム、特にコンピュータ・システムを提供する。このシステムは、（a）P450の3次元構造またはその少なくとも選択座標を規定する、表1、2、3、8または18による原子座標データ、（b）表1、2、3、8または18の原子座標データから導出可能であるP450の構造因子データ（構造因子は回折波の振幅および位相を含む）、（c）表1、2、3、8または18のデータに基づいた標的の相同モデリングによって作成される標的P450タンパク質の原子座標データ、（d）表1、2、3または18のデータを参照してX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成される標的P450タンパク質の原子座標データ、または（e）（c）または（d）の原子座標データから導出可能である構造因子データのいずれかを含む。
【０１８９】
原子座標データは、表全体のデータ、またはその選択された一部とすることができる。
【０１９０】
上記の（c）に関して、表18自体は、本発明の2C9構造を相同モデリングすることによって得られる2C19の原子座標データであり、表18のデータおよびその使用も、本発明の別の態様を形成することを理解されたい。
【０１９１】
本発明は、標的P450タンパク質の原子座標データを含むそのようなシステムも提供する。そのようなデータは、本明細書に記載する本発明の方法に従って、表1、2、3、8または18によって提供される出発データに基づき作成される。
【０１９２】
このようなデータは、P450タンパク質の作用の機序を分析し、および/またはP450によって代謝される化合物などP450と相互作用する化合物の合理的なドラッグ・デザインを実施するための構造の作製を含めて、いくつかの目的に有用である。
【０１９３】
別の態様においては、本発明は、（a）P450の3次元構造またはその少なくとも選択座標を規定する、記録された表1、2、3、8または18による原子座標データ、（b）表1、2、3、8または18の原子座標データから導出可能である、記録されたP450の構造因子データ、（c）表1、2、3、8または18のデータに基づいた標的の相同モデリングによって作成される標的P450タンパク質の原子座標データ、（d）表1、2、3、8または18のデータを参照してX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成される標的P450タンパク質の原子座標データ、または（e）（c）または（d）の原子座標データから導出可能である構造因子データのいずれかを含む、コンピュータ読取り可能な記憶媒体を提供する。
【０１９４】
原子座標データは、表全体のデータ、またはその選択された一部とすることができる。
【０１９５】
本明細書で使用する「コンピュータ読取り可能な記憶媒体」とは、コンピュータによって直接読取りおよびアクセス可能な任意の媒体を指す。このような媒体としては、フロッピー（登録商標）・ディスク、ハードディスク記憶媒体、磁気テープなどの磁気記憶媒体;光ディスク、CD-ROMなどの光記憶媒体;RAM、ROMなどの電気的記憶媒体;磁気/光記憶媒体などこれらのカテゴリのハイブリッドなどがあるが、これらだけに限定されない。
【０１９６】
このような記憶媒体を提供することによって、P450またはその選択座標を作成するために常法に従って原子座標データにアクセスすることができる。例えば、RASMOL（Sayle等、TIBS、Vol.20、（1995）、374）は、構造決定および/または合理的なドラッグ・デザインのための原子座標データのアクセスおよび分析を可能にする公開されたコンピュータ・ソフトウエア・パッケージである。
【０１９７】
一方、構造因子データは、原子座標データから導出可能であり（例えば、Blundell等、Protein Crystallography、Academic Press、New York、London and San Francisco、（1976））、例えば差分フーリエ電子密度マップ（difference Fourier electron density map）を計算するために特に有用である。
【０１９８】
本明細書で使用する「コンピュータ・システム」とは、本発明の原子座標データを解析するために使用されるハードウェア手段、ソフトウエア手段およびデータ記憶手段を指す。本発明のコンピュータ・ベースのシステムの最小限のハードウェア手段は、一般に、中央処理装置（CPU）、ワーキング・メモリおよびデータ記憶手段、および例えば入力手段、出力手段などを含む。構造データを可視化するためにモニターを備えることが望ましい。データ記憶手段は、RAMまたは本発明のコンピュータ読取り可能な媒体にアクセスする手段とすることができる。このようなシステムの例は、Silicon Graphics IncorporatedおよびSun Microsystemsから入手可能であるUnix（登録商標）ベース、Windows（登録商標） NTまたはIBM OS/2オペレーティング・システムで動くマイクロコンピュータ・ワークステーションである。
【０１９９】
別の態様においては、本発明は、コンピュータ読取り可能なデータがコード化されたデータ記憶材料を含むコンピュータ読取り可能な記憶媒体を提供する。データは、表1、2、3もしくは8の2C9、または表18の2C19の構造を含めた2C9のホモログの構造座標のすべてまたは一部（すなわち、本明細書で定義する選択座標）によって定義される。前記ホモログは、表1、2、3または8の骨格原子（窒素-炭素α-炭素）からの二乗平均平方根偏差が2.0Å以下（好ましくは、1.5Å以下）である骨格原子を含む。
【０２００】
本発明は、表1、2、3もしくは8による2C9または表18の2C19の構造座標の少なくとも一部（すなわち、本明細書で定義する選択座標）のフーリエ変換を含む第1のセットのコンピュータ読取り可能なデータがコード化されたデータ記憶材料を含むコンピュータ読取り可能なデータ記憶媒体も提供する。これは、未知構造の分子または分子複合体のX線回折パターンを含む第2のセットの機械読取り可能なデータと組み合わされたときに、前記第1のセットのデータおよび前記第2のセットのデータを使用するための命令がプログラムされた機械を用いて、第2のセットの機械読取り可能なデータに対応する構造座標の少なくとも一部を決定することができる。
【０２０１】
本発明の別の態様は、構造を作製するデータを提供する方法、および/または2C9、2C9ホモログまたはアナログ、2C9と化合物の複合体、または2C9ホモログまたはアナログと化合物の複合体を用いてドラッグ・デザインを実施する方法を提供する。この方法は、
（i）（a）2C9の3次元構造、2C9の3次元構造の少なくとも1つのサブドメイン、または2C9の複数の原子の座標を規定する表1、2、3または8による原子座標データと、（b）表1、2、3または8の原子座標データから導出可能である2C9の構造因子データと、（c）表18のデータなどの、表1、2、3または8のデータに基づく標的の相同モデリングによって作製される標的2C9ホモログまたはアナログの原子座標データと、（d）表1、2、3または8のデータを参照してX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成されるタンパク質の原子座標データと、（e）（c）または（d）の原子座標データから導出可能である構造因子データのうちの少なくとも1つを含むコンピュータ読取り可能なデータを有する遠隔装置との通信を確立するステップと、
（ii）前記コンピュータ読取り可能なデータを前記遠隔装置から受信するステップとを含む。
【０２０２】
したがって、本発明の別の態様は、構造を作製するデータを提供する方法、および/または2C19、2C19ホモログまたはアナログ、2C19と化合物の複合体、または2C19ホモログまたはアナログと化合物の複合体を用いてドラッグ・デザインを実施する方法を提供する。この方法は、
（i）（a）2C19の3次元構造、2C19の3次元構造の少なくとも1つのサブドメイン、または2C19の複数の原子の座標を規定する表18による原子座標データと、（b）表18の原子座標データから導出可能である2C19の構造因子データと、（c）表18のデータに基づく標的の相同モデリングによって作製される標的2C19ホモログまたはアナログの原子座標データと、（d）表18のデータを参照してX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成されるタンパク質の原子座標データと、（e）（c）または（d）の原子座標データから導出可能である構造因子データのうちの少なくとも1つを含むコンピュータ読取り可能なデータを有する遠隔装置との通信を確立するステップと、
（ii）前記コンピュータ読取り可能なデータを前記遠隔装置から受信するステップとを含む。
【０２０３】
したがって、遠隔装置は、例えば、本発明の先の態様の1つのコンピュータ・システムまたはコンピュータ読取り可能な記憶媒体を含むことができる。この装置を、コンピュータ読取り可能なデータが受信される場所とは異なる国または法域に置くことができる。
【０２０４】
通信は、インターネット、イントラネット、電子メールなどによることができる。一般に、通信は、本質的に電子的なものであるが、通信経路のいくつかまたはすべてを光学的なもの、例えば、光ファイバーとすることができる。
【０２０５】
J.本発明の構造の使用
本発明によって得られる結晶構造（表1、2、3、8および18の構造、ならびに本明細書に記載する方法によって得られる標的P450タンパク質の構造）は、いくつかの方法でドラッグ・デザインに使用することができる。例えば、多数の薬物または薬物候補が、P450タンパク質との有害な相互作用、その結果として体からの薬物の迅速なクリアランスのために臨床への使用に失敗している。本発明によって、当業者が、これらの構造ベースの化学戦略に従うことによって開発からこのような化合物を救済しようとすることが可能になる。
【０２０６】
薬物分子がP450によって代謝される場合、共結晶、ソーキング、または結合ポケットにおける薬物の結合配向のコンピュータによるドッキングのいずれかによって結合配向についての情報を決定することができる。これによって、薬物とタンパク質の相互作用を仲介または制御するように設計された化学構造に対して特定の改変が導かれる。このような改変は、P450による薬物代謝を減少させ、その治療上の作用を向上させる目的で設計することができる。
【０２０７】
結晶構造は、薬物-薬物相互作用を理解するためにも有用であり得る。患者が他の医薬品をすでに服用している間に投与された場合の薬物に対する有害反応が記録された多数の例が存在する。この有害でしばしば危険である薬物-薬物相互作用シナリオの背後にある機序は、おそらく、1つの薬物がP450の阻害剤として振る舞うときに、ほとんどまたはまったく代謝が起こらないために、他の薬物の蓄積が毒性レベルになるものである。そのような阻害剤（インビトロまたはイン・シリコで）に組み合わせられた本発明の結晶構造は、阻害剤がもはや阻害しないように、またはより僅かしか阻害しないように改変し、あるいはP450により良好に結合することができ（したがって、代謝されるようになる）、阻害剤を置換することができるように第2の薬物を改変する合理的な改変も可能になる。
【０２０８】
P450は、患者の人種に応じてかなりの多型変化を示す。これは、いくつかの薬物に対する患者集団のいくつかのセグメントからの有害反応となって表れる。薬物の結合モードに関して関連する突然変異をマッピングするために本発明の結晶構造を用いることによって、薬物を化学改変してタンパク質の可変領域との相互作用を避けることもできる。これによって、そのような集団の部分に対する薬物からのより一貫した治療上の価値が確保され、危険な副作用が避けられる。
【０２０９】
いくつかの医薬化合物は、P450によって活性な代謝産物に転化される。このような化合物の場合、このような化合物がP450によりどのように転化されるかをより良く理解することによって、化合物の改変が可能になり、化合物を異なる速度で転化させることが可能になる。例えば、転化速度を上げることによって、より迅速に所望の治療効果をもたらすことが可能になるのに対し、転化速度を低下させるとによって投与用量を増し、または例えば異なる速度で代謝されて同じ活性代謝産物を形成する化合物の混合物を含む徐放性医薬調製物を開発することが可能になる。
【０２１０】
したがって、P450の3次元構造を決定することによって、新規な方法でP450と相互作用する新しい化合物の設計の基礎が与えられる。例えば、P450の3次元構造が分かれば、コンピュータ・モデリング・プログラムを用いて、P450の結合部位または他の構造的もしくは機能的特徴などの可能なまたは確認された活性部位と相互作用することが予想される異なる分子を設計することができる。
【０２１１】
（i）結晶複合体の取得および分析
1つの手法においては、P450に結合する化合物の構造を、実験によって決定することができる。これによって、P450に結合する化合物を分析する出発点が提供され、それによって特定の化合物がP450と相互作用する仕方およびそれが代謝される機序に関する詳細な見通しが当業者に提供される。
【０２１２】
上述した構造ベースのドラッグ・デザインに対する多数の技術および手法が、なんらかの段階で、リガンド-タンパク質複合体におけるリガンドの結合位置を同定するためにX線分析に依拠している。これを実施する一般的な方法は、複合体のX線結晶学を実施し、差分フーリエ電子密度マップを作成し、特定の電子密度パターンをリガンドと関連付けることである。しかし、マップを作成するためには（例えば、上述のBlundell等によって説明されるように）、タンパク質3D構造（または、少なくともタンパク質の構造因子）を前もって知る必要がある。したがって、P450構造を決定することによって、P450-化合物複合体の差分フーリエ電子密度マップの作成、および薬物の結合位置の決定も可能になり、したがって、合理的なドラッグ・デザイン・プロセスの大きな助けとなり得る。
【０２１３】
すなわち、本発明は、P450に結合する化合物の構造を決定する方法を提供する。前記方法は、
本発明による2C9 P450の結晶を準備するステップと、
この結晶に前記化合物をソーキングするステップと、
表1、2、3、8または18のデータを使用することによって、前記2C9 P450化合物複合体の構造を決定するステップとを含む。
【０２１４】
あるいは、P450および化合物は、共結晶化することができる。したがって、本発明は、P450に結合する化合物の構造を決定する方法を提供する。前記方法は、
タンパク質を化合物と混合するステップと、タンパク質-化合物複合体を結晶化させるステップと、表1、2、3、8または18のデータを参照して前記P450-化合物複合体の構造を決定するステップとを含む。
【０２１５】
このような構造の分析は、（i）複合体からのX線結晶学回折データ、および（ii）P450の3次元構造またはその少なくとも選択座標を使用して、複合体の差分フーリエ電子密度マップを作成することができる。3次元構造は、表1、2、3または8による原子座標データによって規定される。次いで、差分フーリエ電子密度マップを解析することができる。
【０２１６】
したがって、このような複合体を、結晶化し、例えばGreer等、J.of Medicinal Chemistry、Vol.37、（1994）、1035〜1054に記載された手法に従いX線回折方法によって解析することができる。差分フーリエ電子密度マップは、ソーキングまたは共結晶化されたP450、および複合体を形成していないP450の解明された構造のX線回折パターンに基づいて計算することができる。次いで、これらのマップを解析して、例えば特定の化合物がP450に結合するかどうか、どこで結合するかを決定し、および/または特定の化合物がP450のコンホメーションを変更するかどうか、どこを変更するかを決定することができる。
【０２１７】
電子密度マップを、CCP4コンピューティング・パッケージ（Collaborative Computational Project 4.The CCP4 Suite:Programs for Protein Crystallography、Acta Crystallographica、D50、（1994）、760〜763.）からのプログラムなど、プログラムを用いて計算することができる。マップの可視化およびモデル設定のために、「O」（Jones等、Acta Crystallographica、A47、（1991）、110〜119）などのプログラムを使用することができる。
【０２１８】
また、本発明によれば、2C9突然変異体は、既知の2C9基質または阻害剤または新規化合物とのコ・コンプレックスで結晶化することができる。次いで、一連のこのような複合体の結晶構造を分子置換によって解析し、表1、2、3または8の2C9の結晶構造と比較することができる。したがって、酵素の様々な結合部位内の改変可能部位を同定することができる。この情報によって、例えば、2C9と化学物質または化合物との疎水性相互作用の増大など、最も効率的な結合相互作用を決定するさらなるツールが提供される。
【０２１９】
例えば、自然の2C9とはわずか1または2アミノ酸置換しか異ならない2C9対立遺伝子があり、それでもこれらの対立遺伝子変異体を発現する個体は、極めて異なる薬物代謝プロファイルを示し得る。これらの対立遺伝子タンパク質を生成し、化合物とのコ・コンプレックスを決定することによって、化合物との対立遺伝子相互作用をより良く理解することができる。
【０２２０】
上述した複合体はすべて、周知のX線回折技術を用いて検討することができ、CNX（上述）X-PLOR（Yale University、（（著作権）1992、Accelerysによって配布された-例えば、Blundell等;Mothods in Enzymology、vol.114＆115、H.W.Wyckoff等編、Academic Press（1985）（23））も参照されたい）などのコンピュータ・ソフトウエアを用いて、分解能1.5〜3.5ÅのX線データについてR値約0.30以下に改良することができる。
【０２２１】
したがって、この情報を用いて、既知クラスの2C9基質または阻害剤を最適化することができ、より重要なことには、新規クラスの2C9阻害剤を設計して合成し、P450代謝が改変された薬物を設計することができる。
【０２２２】
（ii）イン・シリコ分析および設計
本発明は、P450およびP450と相互作用する化合物を含む実際の結晶構造の決定を促進するものであるが、現在のコンピュータ技術によって、このような結晶を生成し、回折デートを作成し分析する必要性に対して強力な別法が提供されている。したがって、本発明の特に好ましい態様は、本発明のP450構造と相互作用する化合物の分析および開発のためのイン・シリコ方法に関する。
【０２２３】
したがって、P450の3次元構造が決定された結果、合理的なドラッグ・デザインのためのより純粋に計算的な技術を用いて、そのP450との相互作用がより良く理解される構造を設計することもできる（これらの技術の概要については、例えば、Walters等（Drug Discovery Today、Vol.3、No.4、（1998）、160〜178を参照されたい）。例えば、標的受容体の原子座標について正確な情報を必要とする自動リガンド-受容体ドッキング・プログラム（例えば、Jones等、Current Opinion in Biotechnology、Vol.6、（1995）、652〜656によって考察された）を使用することができる。
【０２２４】
P450イン・シリコ構造を利用する本明細書に記載する本発明の態様は、表1、2、3または8の2C9構造、および本発明の他の態様によって得られる標的P450タンパク質のモデルの両方に等しく適用することができる。したがって、上述の方法によってP450のコンホメーションが決定されれば、このようなコンホメーションを、本明細書に記載する合理的なドラッグ・デザインのコンピュータ・ベースの方法に使用することができる。また、P450 2C9の構造の有効性によって、仮想的なライブラリ・スクリーニングまたは化合物設計のための高確度の予測的ファルマコフォア・モデルを作成することができる。
【０２２５】
したがって、本発明は、ある分子構造と本発明のP450構造との相互作用を分析するためのコンピュータ・ベースの方法を提供する。この方法は、
本発明のP450の構造を準備するステップと、
前記P450構造に一致する分子構造を準備するステップと、
その分子構造をP450構造に一致させるステップとを含む。
【０２２６】
本発明のP450構造は、表1、2、3、8または18のいずれか1つの構造、またはその選択座標とすることができる。
【０２２７】
別の態様においては、本発明の方法は、この構造が結合するポケットを設計するために、推定される分子構造結合領域の近傍にあるP450の目的原子の座標を利用することができる。これらの座標を用いて空間を規定し、それを「イン・シリコ」で分析する。したがって、本発明は、分子構造を分析するためのコンピュータ・ベースの方法を提供する。この方法は、
本発明のP450構造の少なくとも2つの原子の座標（「選択座標」）を準備するステップと、
前記座標に一致する分子構造を準備するステップと
その構造をP450の選択座標に一致させるステップとを含む。
【０２２８】
実際には、結合ポケットを表す表1、2、3、8または18の座標によって規定される十分な数のP450原子を設計することが望ましい。結合ポケット、およびP450と補助因子の相互作用の他の特徴は、後述の実施例に記載されている。したがって、本発明のこの実施形態においては、P450構造の少なくとも500または少なくとも1000原子などの少なくとも5、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも50、さらにより好ましくは少なくとも100個の選択された原子の座標が提供されることが好ましい。
【０２２９】
P450によって代謝される様々な化合物のすべてが、タンパク質の結合ポケットの異なる部分と相互作用することができるが、このP450の構造によって、P450と薬物候補の相互作用の多くに関与する可能性が高いいくつかの特定部位を同定することができる。それらの残基を、後述の実施例に示す。したがって、本発明のこの態様においては、選択座標は、これらの残基のいくつかまたはすべての座標を含むことができる。
【０２３０】
本発明のP450構造に一致させる化合物の3次元構造を提供するために、その化合物構造を、この目的のための市販ソフトウエアを用いて3次元で設計することができ、あるいは、その結晶構造が利用可能であれば、その構造の座標を用いて本発明のP450構造に一致させるための化合物を表示させることができる。
【０２３１】
「一致」とは、自動または半自動手段によって、ある分子構造の少なくとも1つの原子と本発明のP450構造の少なくとも1つの原子との相互作用とを決定し、このような相互作用の安定度を計算することを意味する。相互作用としては、電荷、立体的要件などによってもたらされる引力、反発などがある。一致のための様々なコンピュータ・ベースの方法を、本明細書にさらに記載する。
【０２３２】
より具体的には、化合物とP450の相互作用を、GRAM、DOCKまたはAUTODOCK（Walters等、Drug Discovery Today、Vol.3、No.4、（1998）、160〜178、およびDunbrack等、Folding and Design、2、（1997）、27〜42参照）などのドッキング・プログラムを用いたコンピュータ・モデリングを使用して検討することができる。この手順には、その化合物の形状および化学構造がP450にいかに良く結合するかを確認するためのP450への化合物のコンピュータ・フィッティングが含まれ得る。
【０２３３】
また、P450の活性部位構造のコンピュータ支援による手作業の試験を実施することができる。分子と様々な官能基および酵素表面との有望な相互作用部位を決定するプログラムであるGRID（Goodford、J.Med.Chem.、28、（1985）、849〜857）などのプログラムを使用して、活性部位を分析して、例えば、化合物の代謝速度を変える改変のタイプを予測することもできる。
【０２３４】
コンピュータ・プログラムを使用して、2つの結合相手（すなわち、P450と化合物）の引力、反発、および立体障害を推定することができる。
【０２３５】
複数のP450活性部位が特徴付けられ、複数のそれぞれのより小さな化合物が設計されまたは選択される場合、活性部位におけるそれぞれの化合物の相対的位置および配向を維持する大きな化合物にそれぞれの小化合物を連結させることによって、化合物を形成させることができる。より大きな化合物は、実際の分子でも、コンピュータ・モデリングによって形成させてもよい。
【０２３６】
次いで、化合物とP450の結合についての詳細な構造情報を得ることができ、この情報を考慮して、例えばそのP450との相互作用を変えるために、化合物の構造または官能基を調整することができる。上記ステップは、繰り返すことができ、必要に応じてさらに繰り返すことができる。
【０２３７】
上述したように、本発明のP450構造に一致させることができる分子構造としては、医薬品候補として開発中の化合物などがある。これらの医薬品を一致させて、P450の作用によって医薬品がどのように改変されかを決定し、P450によって異なる速度で代謝される候補薬剤を設計するための基礎を提供することができる。
【０２３８】
本発明において使用可能である分子構造は、通常、医薬用途に開発中の化合物である。一般にこのような化合物は、分子量が一般に約100〜2000Da、より好ましくは約100〜1000Daの有機分子である。このような化合物としては、ペプチドおよびその誘導体、ステロイド、抗炎症薬、抗癌薬、抗細菌薬または抗ウイルス薬、神経薬などがある。原則的には、その開発を促進しまたはその諸特性を改善するためのさらに合理的なドラッグ・デザインを可能にするために、薬学分野で開発中のあらゆる化合物を本発明において使用することができる。
【０２３９】
単一のレダクターゼによって、触媒サイクルに必要な電子を有するP450のいくつかの異なるアイソフォームが提供される。したがって、P450上のチトクロムP450レダクターゼ（CPR）結合部位の知見およびその諸特性から、P450 CPR相互作用を媒介することによって触媒速度を変える手段が提供される。2C9の構造によって、P450-CPR界面における重要な残基をイン・シリコで同定することが可能になる。
【０２４０】
（iii）化合物および代謝産物の分析および改変
医薬化合物候補または実際の医薬化合物の1次代謝産物が既知であり、この代謝産物がP450の作用によって生産される場合、この薬剤と相互作用するP450の残基をより良く決定するために、この薬剤の構造およびその代謝産物の両方をモデル化して、互いに比較することができる。いずれにしても、本発明は、同じ所望の活性を有する出発化合物とは異なる速度でP450によって代謝される所望の活性を有する医薬化合物候補を予測する方法を提供する。この方法は、
出発化合物を本発明のP450構造またはその選択座標に一致させるステップと、
前記化合物が前記P450構造によってどのように代謝されるを決定または予測するステップと、
化合物構造を改変して、それとP450の相互作用を変えるステップとを含む。
【０２４１】
構造の改変が、通常、イン・シリコで起こり、改変された構造がP450とどのように相互作用するかについての予想が可能になることは、当業者であれば理解されるはずである。
【０２４２】
改変は、熟練した医薬品化学者には当分野で既知のものであり、例えば、本発明のP450構造のアミノ酸側鎖基と相互作用する残基を含む基の置換または除去が含まれる。例えば、置換には、試験化合物における基の電荷を減少または増加させるための基の付加または除去、反対電荷の基による帯電基の置換、親水基による疎水基の置換またはその逆などがある。これらは新しい医薬化合物の開発において医薬品化学者が考える置換のタイプの単なる例に過ぎず、出発化合物およびその活性の性質に応じて他の改変がなされ得ることを理解されたい。
【０２４３】
通常、P450による代謝を防止するように化合物を変えること、または少なくともP450が化合物を代謝する速度を低下させることが望ましいが、本発明は、出発化合物よりも迅速に代謝される化合物を、例えばそのような化合物が他の薬物の代謝を妨害している場合に開発することも含む、
出発化合物を本発明のP450構造に一致させることによって潜在的改変化合物を開発し、変更された代謝速度を有する改変化合物をそれから予測する場合、本発明は、その活性および/またはその代謝速度を決定するために、さらに、改変化合物を合成し、インビボまたはインビトロの生物学的系においてそれを試験するステップを含む。
【０２４４】
本発明の上述のプロセスは、改変化合物自体がさらなる化合物設計の基礎になり得る点で反復することができる。
【０２４５】
（iv）断片の連結および成長
本発明の結晶構造が提供されることによって、断片連結または断片成長手法に基づいてP450の結合ポケット領域と相互作用（例えば、P450の阻害剤として作用するために）する化合物の開発も可能になる。
【０２４６】
例えば、1つまたは複数の分子断片の結合を、タンパク質結合ポケットにおいてX線結晶学によって決定することができる。分子断片は、一般に、分子量100〜200Daの化合物である。次いで、これによって、構造ベースの手法を用いて相互作用を最適化するための医薬品化学の出発点が提供され得る。断片をテンプレート上に結合させ、または阻害剤を「成長させ」てタンパク質の他のポケットにするための出発点として使用することができる。断片は、P450の結合ポケット中に配置することができ、次いで、「成長して」利用可能な空間を埋め、分子認識に関与する静電気相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用または水素結合相互作用が調べられる。したがって、本来の弱く結合している断片の効力を、構造ベースの化学合成を反復させて迅速に向上させることができる。
【０２４７】
断片成長手法における1つまたは複数のステージでは、化合物を合成し、生物学的系中でその活性を試験することができる。これを用いて、さらなる断片の成長を誘導することができる。
【０２４８】
2つの断片結合領域が同定された場合、所望の諸特性を有し得るより大きな連結構造を得るために、連結断片手法は、2つの断片を直接連結させる試み、あるいは1つまたは両方の断片を上述の方式で成長させることに基づくことができる。
【０２４９】
（v）本発明の化合物
出発化合物を本発明のP450構造に一致させることによって潜在的改変化合物を開発し、変更された代謝速度（より遅い、より速いまたは速度ゼロを含めて）を有する改変化合物をそれから予測する場合、本発明は、その活性および/または代謝速度を決定するために、さらに、改変化合物を合成し、インビボまたはインビトロの生物学的系においてそれを試験するステップを含む。
【０２５０】
別の態様においては、本発明は、上述した本発明の方法によって同定された化合物を含む。
【０２５１】
このような化合物の同定に続いて、それを製造および/または調製、すなわち、医薬品、薬学的組成物、薬物などの組成物の製造または処方に使用することができる。これらを個体に投与することができる。
【０２５２】
したがって、本発明は、本発明によって提供される化合物だけでなく、薬学的組成物、医薬品、薬物、または例えば（予防治療を含めた）疾患治療用化合物を含めた他の組成物;このような組成物を患者、例えば疾患治療のために投与することを含む方法;例えば疾患の治療のために投与する組成物の製造におけるこのような阻害剤の使用;ならびにこのような阻害剤を薬学的に許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体、および場合によっては他の諸成分と混合することを含む薬学的組成物を作製する方法など様々な態様に及ぶ。
【実施例】
【０２５３】
実施例の要約
本発明を実施例により説明する。実施例は以下のように本発明を説明する。
【０２５４】
実施例1では、2C9trunc、2C9-FGループ、2C9-FGループK206Eおよび2C9P220をコードするDNAの生産について示す。
【０２５５】
実施例2では、細菌における2C9P220および2C9-FGループの発現およびタンパク質の回収について示す。
【０２５６】
実施例3では、実施例2のタンパク質の品質アッセイについて示す。
【０２５７】
実施例4では、2C9-FGループの結晶を得るために使用する結晶化条件について示す。
【０２５８】
実施例5では、2C9P220の結晶を得るために使用する結晶化条件について示す。
【０２５９】
実施例6では、2C9-FGループのさらなる生産、ならびに回収されたタンパク質の質量分析データおよび活性データについて示す。
【０２６０】
実施例7では、2C9-FGループの結晶の生成について示す。
【０２６１】
実施例8では、2C9-FGループK206Eの発現および回収、ならびに回収されたタンパク質の質量分析データおよび活性データ、およびタンパク質の結晶化について示す。
【０２６２】
実施例9では、表1に示す分解能3Åにおける2C9-FGループK206Eの結晶化および構造分析について示す。
【０２６３】
実施例10では、2C9-FGループK206Eのさらなる結晶化について示す。
【０２６４】
実施例11では、2C9-FGループK206Eの高分解能（2.6Å）構造の生成について示す。
【０２６５】
実施例12では、2C9-FGループの高分解能（3.1Å）構造の生成について示す。
【０２６６】
実施例13では、P450結合ポケットの残基を特定し、本発明の実施におけるそれらの使用について記述する。
【０２６７】
実施例14では、本発明の構造を用いたモデリング技術の使用について記述する。
【０２６８】
実施例15では、ドッキング実験について概説する。
【０２６９】
実施例16では、2C9-FGループK206E構造の精緻化について示す。
【０２７０】
実施例17では、さらなる2C9タンパク質の生産について示す。
【０２７１】
実施例18では、2C9タンパク質の生産について示す。
【０２７２】
実施例19では、本発明の2C9タンパク質の活性について示す。
【０２７３】
実施例20では、2C9タンパク質の結晶化について示す。
【０２７４】
実施例21では、2C9-2C19キメラについて記述する。
【０２７５】
実施例22では、2C9-2C19キメラの生産について示す。
【０２７６】
実施例23では、2C9-FGループK206Eの検証について示す。
【０２７７】
実施例24では、2C9-2C19キメラの活性について示す。
【０２７８】
実施例25では、2C9-2C19キメラ・タンパク質の結晶化について示す。
【０２７９】
実施例26では、2C19の相同モデリングについて示す。
【０２８０】
実施例27では、2C18の相同モデリングについて示す。
【０２８１】
実施例28では、2C8の相同モデリングについて示す。
【０２８２】
〔実施例１〕  2C9タンパク質をコードするDNAの生産
概要
チトクロムP450 2C9の結晶化を目的とした。N末端膜貫通ドメインを除去することによって、この固有の膜形成性タンパク質をより水可溶性の形に転化した後に結晶化を実施した。
【０２８３】
文献に詳細に記載されているいくつかのN末端切断を用いて、（2E1、2D6、2B1などを含めた）N切断型チトクロムP450を生産した。しかし、これらのN末端切断のほとんどでは、十分な可溶性タンパク質が生産せず、ほとんどの場合、切断型P450は依然として膜に結合したままであった。
【０２８４】
2C9（残基2〜29）に存在する膜アンカー・ドメインMDSLVVLVLCLSCLLLLSLWRQSSGRGKL（配列番号113）を、短い親水性ペプチドMAKKTSSKGR（配列番号114）で置換した。このタンパク質のN末端に高度に帯電したポリペプチドを導入すると、これらのタンパク質と膜の結合性が大きく減少した。lacZ発現系中の第2のコドンの性質が、発現レベルに影響を及ぼし（Looman等、EMBO J.、6;2489〜24992、1987）、かつ第2位のアラニンが大腸菌において良好な発現をもたらすことも見出された。
【０２８５】
チトクロムP450は、大きな会合体を形成する傾向が高い。チトクロムP450のN末端欠失によって、会合が防止され、多分散性が減少した。これによって、これらのタンパク質の結晶化が促進される。
【０２８６】
高塩濃度緩衝液における精製を容易にするために、4つのヒスチジン・タグを2C9のC末端に挿入した。
【０２８７】
市販スクリーニング・キットの諸条件を用いた本発明者らの予備的結果から、アポおよび自然のN末端切断型2C9である2C9truncが、なんら有用な結晶を生成しないことが示された。したがって、結晶化を促進し、より重要なことには、有用な結晶の生成を促進するためには、タンパク質をさらに改変する必要がある。そこで、タンパク質のFGループの改変を考えた。
【０２８８】
F-Gループにおける改変の設計は、ウサギ・チトクロムP450の結晶化に関して公表された結果に基づいた。この結果は、FおよびGヘリックスが結晶接触の形成に関与していることを示している。本発明者らは、タンパク質2C9truncにおけるF-Gループの相対位置が、FおよびGヘリックスの結晶接触構成能力を妨害し得ることを予測した。細菌P450 BM3中に見出される対応物よりも長くより移動性であるF-Gループは、6つのアミノ酸置換体:Ile215Val、Cys216Tyr、Ser220Pro、Pro221Ala、Ile222LeuおよびIle223Leuによって安定化またはコンホメーション的に変更しうることが提案された。得られた構築物の2C9-FGループにおいて、プロリン220の位置は、1残基だけ移動する。プロリン残基は、しばしば2次構造の変化を惹起すると報告されているが、F-Gループのコンホメーション変化を誘発し、結晶接触の形成を促進させ得る。タンパク質2C9-P220の生成において、プロリンは、2C9野生型に見られる221位から2C19野生型に見られる220位に移動する。したがって、セリン220はプロリンに変異し、プロリン221はトレオニンに変異した。これらの2つの変化を導入するだけで、結晶化を促進させるには十分であった。プロリンを221位に保持するS220Pの単一の突然変異も、結晶化には十分であった。
【０２８９】
タンパク質1424の生成において、プロリンは、2C9野生型に見られる221位から222位に移動する。これは、プロリンが221位のどちらの側にも1アミノ酸移動して十分な結晶化を促進できることを示している。
【０２９０】
本発明者らは、220位または222位にプロリンを有すること、好ましくはプロリン220が、2C9の結晶化に極めて重要な決定因子であると考えている。特に、これは、2C9のアポ結晶を得るためには極めて重要な決定因子である。これは、回折品質の2C9結晶を得るためにも重要である。残基221は、アラニンでもトレオニンでもよく、プロリンでもセリンでもよい。
【０２９１】
ヒト2C9チトクロムP450の突然変異誘発を、カセット突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発または特異的クローニング手順を含めて様々な標準組換えDNA技術によって実施した。カセット突然変異誘発の場合、突然変異を有する相補オリゴヌクレオチドが、PCR突然変異誘発によってP450 cDNAに導入された天然の制限酵素切断部位を用いて、アニーリングされクローニングされた。これらの構築体を、制限酵素地図とそれに続く完全な配列決定によって確認した。他の技術も本明細書に記載する。他の技術は、それ自体当業者には周知である。
【０２９２】
P450のN末端切断
University of Oregon、Eugene、Oregon、USAのF.W.Dahlquist教授によって提供された発現ベクターpCWOri＋を用いて、切断型ヒト・チトクロムP450を大腸菌菌株XL1 Blue（Stratagene）で発現させた。チトクロムP450 2C9をコードする完全長cDNAをPCR増幅用テンプレートとして用いて、5'末端を欠失させ、サイレントな制限酵素切断部位を挿入し、4ヒスチジン・タグをC末端に挿入した。
【０２９３】
NotI制限酵素切断部位（下線部）を、以下の5'オリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅によって2C9の位置87に導入した。
【０２９４】
5'-ATAAGAATGCGGCCGCCTGGCCCCACTCCTCTCCCAGTGATTGGAAATATC-3'（配列番号115）
SalIクローニング部位（下線部）および4ヒスチジン・タグ（小文字）を有する3'オリゴヌクレオチド
5'-TGCGGTCGACTCAgtggtggtggtgGACAGGAATGAAGCAGAGCTGGTAG-3'（配列番号 116）を使用した。94℃1分、52℃1分および72℃2分で合計30サイクルし、その後72℃で10分伸長させた。1420-bpのPCR断片をNotI/SalIで二重消化し、ゲル・アガロース溶出および抽出によって精製した。
【０２９５】
NdeIおよびNotIオーバーハング制限酵素切断部位（下線部）を含む相補オリゴヌクレオチド
5'-TATGGCTAAGAAAACGAGCTCTAAAGGGC-3'（配列番号117）および
5'-GGCCGCCCTTTAGAGCTCGTTTTCTTAGCCA-3'（配列番号118）
を、ヒト・チトクロムP450 2C9の未変性N末端の残基2〜29を、短いAKKTSSKGRポリペプチドで置換するように設計した。各オリゴヌクレオチド10μgを水100μlに混合し、100℃で5分間加熱し、室温に徐冷することによって、このオリゴヌクレオチドをアニーリングした。
【０２９６】
1420-bpのPCR断片を二本鎖オリゴヌクレオチドに混合し、予めNdeIおよびSalIで消化したベクターpCWori＋中で連結させた。この連結生成物の一定分量を用いて、大腸菌XL1 Blue菌株を形質転換して、アミノ末端切断2C9をコードするプラスミドpCW-2C9truncを得た。
【０２９７】
切断2C9を用いて、さらなる結晶化実験のためにタンパク質を調製した。
【０２９８】
2C9-FGループの構築
プラスミドpCW-2C9truncを、FGループにおける6つのアミノ酸置換体Ile215Val、Cys216Tyr、Ser220Pro、Pro221Ala、Ile222LeuおよびIle223Leuの挿入用テンプレートとして用いた。pCW-2C9truncをNdeIおよびBamHI制限酵素で消化して、P450遺伝子の5'末端に対応する579-bpをゲル・アガロース抽出および溶出によって精製した。6つのアミノ酸置換体がFGループに導入されるように設計された二本鎖オリゴヌクレオチドを、オーバーハングBamHIおよびXmaI制限酵素切断部位（下線部）および6つの突然変異コドン（小文字）を含む相補オリゴヌクレオチド5'-GATCCAGgtctacAATAATTTCcctgctctccttGATTATTTC-3'（配列番号119）および5'-CCGGGAAATAATCaaggagagcaggGAAATTATTGtagacCTG-3'（配列番号120）をアニーリングして作製した。579-bp断片と二本鎖オリゴヌクレオチドを、予めNdeIおよびXmaIで消化したベクターpCW-2C9trunc中で連結させた。この連結体の一定分量を用いてXl1 Blue大腸菌を形質転換し、プラスミドpCW-2C9-FGループを得た。
【０２９９】
2C9-P220の構築
2C9-P220は、突然変異S220PおよびP221Tを有する2C9trunc突然変異体である。この突然変異体を、Stratagene Quikchange（商標）突然変異誘発キット（カタログ番号＃200518）を用いて、製造元指示書に従って作製した。Quikchange（商標）突然変異誘発法では、ねじれ型ニックを有する突然変異プラスミドが生成し、DpnI消化を使用してすべての親DNAが除去される。反応緩衝液5.0μLx10、pCW-2C9truncプラスミドDNA5〜50ng、dNTP1.0μL、および突然変異塩基を小文字で示し2つのアミノ酸変化を下線で示した以下のオリゴヌクレオチドプライマー125ngを導入して反応させた。
【０３００】
5'CCAGATCTGCAATAATTTTcCgaCcACATTGATTACTTCCC 3'（配列番号121）
5'GGGAAGTAATCAATGATgGtcGgAAAATTATTGCAGATCTGG 3'（配列番号122）
反応物を滅菌水で50μLにし、次いで、2.5U Pfu Turboを添加し、反応物を鉱油30μLで覆った。次いで、熱サイクルを次のように実施した:95℃、30秒（1サイクル）、95℃、30秒、55℃、1分、68℃13.5分（18サイクル）、および最後に4℃で保持。オリゴヌクレオチドプライマーの代わりに水を使用した対照反応も実施した。
【０３０１】
熱サイクル後、鉱油レベル下の各反応物にDpnI 10Uを添加した。次いでこれらの反応物を静かに混合し、その後ベンチトップ型マイクロ遠心分離装置で1分間、13，000rpmで遠心分離し、37℃で3時間インキュベートした。次いで、消化した生成物（1μL）を用いてコンピテントな大腸菌XL1-Blue細胞50μLを形質転換した。次いで、全形質転換体を100μg/mlカルベニシリンを含有するLuria寒天プレート上に蒔き、反転させ、終夜37℃でインキュベートした。コロニーを単離し、プラスミドDNA pCW-2C9-P220を単離し、配列を決定して突然変異が正しく挿入されたかどうかを調べた。
【０３０２】
2C9-FGループ-K206Eの構築
プラスミドpCW-2C9-FGループをテンプレートとして用いてLys206Gluを置換した（番号付けは完全長野生型2C9 SwissProt:P11712のものであり、配列番号2または4の配列ではない）。プライマーを、突然変異領域全体にわたるように設計した。
【０３０３】
5'-GGAAAAGTTGAATGAAAACATCgagATTTTGAGCAGCCCCTGG-3'（配列番号123）
5'-CCAGGGGCTGCTCAAAATctcGATGTTTTCATTCAACTTTTCC-3'（配列番号124）
突然変異コドンを小文字で示した。次いで、これらのプライマーを、手短に要約するQuikchange（商標）突然変異誘発（Stratagene）の操作に用いた。
【０３０４】
プライマーを、125ng/μlで再分散させ、PCR反応に用いて、変異原性プライマーからのプラスミドの周りに伸長させた。次いで、メチル化によってテンプレートを優先的に分解するメチル化特異的制限エンドヌクレアーゼであるDpnIでテンプレートDNAを消化した。DpnI処理後、得られた試料1μlを大腸菌XL1 Blue菌株に形質転換した。コロニーを採取し、その配列を決定した。突然変異を含むプラスミドを選択し制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびSalIで消化した。次いで、2C9-FGループK206E突然変異体のコード配列に対応するNdeI SalI DNA断片を、NdeIおよびSalIで消化したpCWベクターにサブクローニングした。これは、Quickchange突然変異誘発のPCR段階で導入されるあらゆる誤差を除去するために役立つ。
【０３０５】
〔実施例２〕  2C9P220および2C9-FGループの発現
細菌発現
XL1 blue細胞の単一アンピシリン耐性コロニーを、Terrific Broth（TB）中37℃で終夜振とうしながら飽和近くまで増殖させ、それを用いて新鮮なTB培地を接種した。細菌を、2リットル・フラスコの100μg/mlアンピシリンを含有するTBブロス1リットル中185rpmで37℃でOD600nm＝0.4まで増殖させた。ヘム前駆体デルタアミノレブリン酸（80mg/l）を、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導する30分前に添加し、温度を30℃に下げた。細菌培養を撹拌下30℃で48〜72時間続けた。
【０３０６】
（a）タンパク質精製
細胞を10000gで10分間でペレット化し、500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Calbiochem）、10mMイミダゾール、0.01mg/mlDNase1 および5mM MgSO4を含有する緩衝液に再懸濁させた。
【０３０７】
細胞を12000psiでConstant Systems Cell Homogeniserに2回通して溶解させた。次いで、70000gで4℃で30分間遠心分離して細胞片を除去した。
【０３０８】
界面活性剤IGEPAL CA630（Sigma）を10%ストック溶液から最終濃度0.3%（v/v）で溶解物に滴下した。溶解物を、予め洗浄したNiNTA樹脂（Qiagen）と共に終夜4℃で撹拌しながらインキュベートした。タンパク質が結合したNiNTA樹脂を2000gで2分間4℃で遠心分離してペレット化した。この樹脂を、20樹脂体積の500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、10mMイミダゾール、1:1000希釈プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.3%（v/v）IGEPAL CA630で洗浄し、2000xgで2分間4℃で遠心分離してペレット化した。次いで、この樹脂を、10樹脂体積の500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、20mMイミダゾール、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤、0.3%IGEPAL CA630で洗浄し、上述したように遠心分離して回収した。洗浄ステップを、上述したように50mMイミダゾールを含有する緩衝液を用いて繰り返した。この樹脂を4℃のカラムに充填し、500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、300mMイミダゾール、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.3%（v/v）IGEPAL CA630でチトクロムP450を溶出させた。
【０３０９】
（b）タンパク質精製の別法は以下の通りである。
細胞を10000gで10分間ペレット化し、500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Calbiochem）、0.01mg/ml DNase1および5mM MgSO4を含有する緩衝液に再懸濁させた。
【０３１０】
細胞を80MPa（12000psi）のConstant Systems Cell Homogeniserに2回通して溶解させた。次いで、細胞片を、70000gで4℃で30分間遠心分離して除去した。
【０３１１】
界面活性剤IGEPAL CA630（Sigma）を10%ストック溶液から最終濃度0.3%（v/v）で溶解物に滴下した。溶解物を、予め洗浄したNiNTA樹脂（Qiagen）と共に終夜4℃で撹拌しながらインキュベートした。NiNTA樹脂を2000gで2分間4℃で遠心分離してペレット化し、上述したように、20樹脂体積の500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、50mMグリシン0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤、0.3%IGEPAL CA630で洗浄し、その後10樹脂体積の500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、7.5mMヒスチジン、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤、0.3%IGEPAL CA630で洗浄した。この樹脂を洗浄ステップ間で遠心分離して回収し、次いで4℃のカラムに充填した。タンパク質を、500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、100mMヒスチジン、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.3%（v/v）IGEPAL CA630を用いて溶出させた。
【０３１２】
どちらかの溶出手順でNiNTAカラムから得られたチトクロムP450を、HiPrep 26/10脱塩カラム（Pharmacia）を用いて、10mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、0.2mM DTT、1mM EDTA中に流量5ml/minで素早く脱塩し（＜10分）、16mlの画分を回収した。脱塩したチトクロムP450を、10mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、0.2mM DTT、1mM EDTAで予め平衡にしたCM Sepharoseカラム（Pharmacia）に直接かけた。以下の溶出ステップを適用した:10カラム体積の10mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、0.2mM DTT、1mM EDTAで洗浄し、痕跡量の界面活性剤を除去するために75mM KClを含む上述の緩衝液で洗浄し、次いでKCl濃度を500mMに増加させた上述の緩衝液で溶出させた。タンパク質を結晶化アッセイのために微量濃縮器を用いて最大で40mg/mlに濃縮した。
【０３１３】
この段階で、タンパク質を、場合によってはゲルろ過カラムにかけてさらに精製することができる。濃縮P450試料を、Superose 6 HR10/30ゲルろ過カラム（Pharmacia）の上部に入れ、100mM KPi、pH7.4、300mM KCl、20%グリセリン、0.2mM DTTを含有する緩衝液を用いて0.2ml/minで溶出させた。タンパク質を回収し、上述したように、結晶化および品質アッセイのために最大で40mg/mlに濃縮した。
【０３１４】
〔実施例３〕  品質アッセイ
実施例2の最終タンパク質試料の品質を以下のようにして評価した。
【０３１５】
（a）SDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法
これを市販のゲル（Nugen）を用いて実施し、その後CBB（クーマシー・ブリリアント・ブルー）染色を製造元指示書に従って実施した。ゲルのデジタル画像を走査して推定した純度は、少なくとも95%であった。
【０３１６】
（b）ゲルろ過クロマトグラフィ
これを、Superose 6 HR10-30カラム（Pharmacia）を用いて実施して凝集状態を評価した。このカラムの分画範囲は、5×103〜5×106Daであり、したがって大きな複合体の分解能に十分適合している。このカラムを、100mM KPi、pH7.4、300mM KCl、20%グリセリン、0.2mM DTT、1mM EDTAを含有する緩衝液を用いて0.2ml/minで溶出させた。濃度約40mg/mlのタンパク質試料0.2mlを使用した。280nmにおける吸光度をモニターし、ピークを収集し、動的光散乱によって分析した。
【０３１７】
（c）光散乱
CM Sepharoseカラムおよび/またはゲルろ過カラム後に収集された試料（0.15ml）をDLSにより蛍光計石英セル中90°で830.3nmのレーザ放射を用いて分析した。広いダイナミック・レンジに及ぶ可変拡張の対数相関器（log correlator）を用いてデータを収集した。すべての測定を、ゲルろ過カラムから直接収集した試料を用いて20℃で実施した。測定は平均10回各10秒であった。分子量を推定するために、本発明者らは摩擦比（frictional ratio）1.26および偏比容0.726を用いた。
【０３１８】
本発明者らの新しい精製方法を用いて調製した試料は、次に示すように、溶解性が良好で、有意な凝集はなかった。
【０３１９】
・ファー・チャネル外挿（far channel extrapolation）と実測平均散乱の比は常に0.999〜1.003であった。
【０３２０】
・平均計数率はさほど変わらず、約1%の標準偏差であった。
【０３２１】
・二重指数（bi exponential）フィッティングを用いた自己相関関数の分析から、2C9が約180KDaの推定Mrを有し、多くとも4つのサブユニットからなるオリゴマーであることが示された。
【０３２２】
・20℃での試料の（24時間にわたる）安定性は良好であった。
【０３２３】
公表された手順によって調製した試料は、極度に会合する徴候を示した。
【０３２４】
・散乱光強度が大きく変動し、標準偏差は10%を超えた。
【０３２５】
・自己相関関数の分析は極めて緩やかな指数関数的減衰を示し、多数のP450サブユニットからなる大きな会合体（Mr＞106Da）が示唆された。これらの試料は、高度の多分散性も示した。
【０３２６】
・試料は、時間の関数としてさらなる会合も示した。
【０３２７】
公表された方法によって調製した試料におけるこれら極度の凝集の徴候は、直径20nmの細孔を通した試料ろ過または200，000gでの30分間の遠心分離後も依然として存在した。
【０３２８】
（d）質量分析法
質量分析法を、単一の四重極質量分析計（platformII、Micromass UK Ltd.）で実施した。試料（25〜60mg/mlの精製タンパク質25μl）を、マイクロセル透析装置（Pierce）を用いて、0.1M酢酸アンモニウムで4℃で4時間透析した。試料をメタノール:0.1%ギ酸水溶液1:1v/vで100分の1に希釈し、次いで、質量分析計のイオン化源に流量20μL/minで注入した。
【０３２９】
質量分析計は、標準エレクトロスプレー・イオン化源を装備していた。正のエレクトロスプレー・イオン化をプローブ・チップ電圧3.5kVおよび対極電圧0.5kVで作用させた。窒素を、噴霧ガス流量20L/hおよび乾燥流量200L/hの噴霧および乾燥ガスとして使用した。サンプリング・コーン電圧を40Vに維持した。適切なm/z範囲にわたってデータを取得し、続いて可能な限り成分を手作業で同定して処理し、その後Maximum Entropy処理技術によるより容易な同定のために真の分子量スケールに置き換えた。分析したタンパク質に対して得られた質量確度は質量の0.01%であった。
【０３３０】
（e）機能性アッセイ
P450 2C9の活性アッセイを、Fluoroscan Ascent FL Instruments（Labsystem）により、蛍光性基質としてメトキシ-4-（トリフルオロメチル）-クマリンを用いて、96ウェル・プレート・アッセイ形式で実施した。
【０３３１】
P450 15pmolを、140μM基質メトキシ-4-（トリフルオロメチル）-クマリン、0.15mM NADP＋、0.38mMグルコース-6-リン酸塩、および最終体積170μlの25mM KPi、pH7.4、0.38mM MgCl2中2.9単位/mlのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを含むNADPH再生システムの存在下、精製ヒト・オキシドレダクターゼ0.1単位で還元した。インキュベーションを37℃で数分間実施し、7-ヒドロキシ-4-（トリフルオロメチル）-クマリンを代謝産物標準として用いて代謝速度を決定した。使用した励起波長および発光波長はそれぞれ409および530nmであった。
【０３３２】
〔実施例４〕  2C9-FGループの結晶化条件
P450 2C9-FGループの結晶化を、10〜60mg/mlのタンパク質で、10mMリン酸カリウム、pH7.4;0.5MKCl;0.2mM DTT;1.0mM EDTA;20%グリセリン中下記諸条件で実施した。結晶を2週間にわたり下記の形態で成長させた。
【０３３３】
外観:針状および棒状
格子寸法:a＝161Å、b＝161Å、c＝110Å、α＝90°、β＝90°、γ＝120°
空間群:P321
0.2Mフッ化ナトリウム、20%PEG 3350
0.2Mフッ化カリウム、20%PEG 3350
0.2Mフッ化アンモニウム、20%PEG 3350
0.2M塩化リチウム、20%PEG 3350
0.2M塩化マグネシウム、20%PEG 3350
0.2M塩化ナトリウム、20%PEG 3350
2.0M塩化ナトリウム、10%PEG 6K
0.2M塩化カルシウム、20%PEG 3350
0.2M塩化カリウム、20%PEG 3350
0.2M塩化アンモニウム、20%PEG 3350
0.2M硝酸リチウム、20%PEG 3350
0.2M硝酸マグネシウム、20%PEG 3350
0.2M硝酸ナトリウム、20%PEG 3350
0.2M硝酸カリウム、20%PEG 3350
0.2M硝酸アンモニウム、20%PEG 3350
0.2Mギ酸マグネシウム、20%PEG 3350
0.2Mギ酸ナトリウム、20%PEG 3350
0.2Mギ酸カリウム、20%PEG 3350
0.2Mギ酸アンモニウム、20%PEG 3350
0.2M酢酸リチウム、20%PEG 3350
0.2M酢酸マグネシウム、20%PEG 3350
0.2M酢酸ナトリウム、20%PEG 3350
0.2M酢酸ナトリウムpH4.6、10〜20%PEG 4000
0.2M酢酸カルシウム、20%PEG 3350
0.2M酢酸カリウム、20%PEG 3350
0.2M酢酸アンモニウム、20%PEG 3350
0.2M酢酸アンモニウムpH4.6、10〜20%PEG 4000
0.2M硫酸ナトリウム、20%PEG 3350
0.2M硫酸マグネシウム、20%PEG 3350
0.2M硫酸カリウム、20%PEG 3350
0.2M硫酸アンモニウム、20%PEG 3350
0.2M酒石酸二ナトリウム、20%PEG 3350
0.2M酒石酸ナトリウムカリウム、20%PEG 3350
0.2M酒石酸二アンモニウム、20%PEG 3350
0.2Mリン酸二水素ナトリウム、20%PEG 3350
0.2Mリン酸水素二ナトリウム二水和物、20%PEG 3350
0.2Mリン酸二水素カリウム、20%PEG 3350
0.2Mリン酸水素二カリウム、20%PEG 3350
0.2Mリン酸二水素アンモニウム、20%PEG 3350
0.2Mリン酸水素二アンモニウム、20%PEG 3350
0.2Mクエン酸三リチウム、20%PEG 3350
0.2Mクエン酸三ナトリウム、20%PEG 3350
0.2Mクエン酸三カリウム、20%PEG 3350
15%PEG 1500
30%PEG 1500
0.1M MES pH6.0、5〜20%PEG 6000
0.1M MES pH6.5、12%PEG 20，000
0.1Mクエン酸pH5.0、10%PEG 6000
0.1Mナトリウムカコジレート、pH6.6、10〜25%PEG 1500
0.1Mナトリウムカコジレート、pH6.4〜6.8、0.05〜0.2M酢酸マグネシウム、10〜20%PEG 8000
0.05〜0.1Mリン酸二水素カリウム、10〜20%PEG 8000
0.2Mリン酸二水素カリウム、20%PEG 3000
0〜0.2M塩化ナトリウム、0.1Mリン酸二水素カリウム/リン酸水素二ナトリウムpH5.8〜6.6、5〜20%PEG 8000
0〜0.2M塩化ナトリウム、0.1Mリン酸二水素カリウム/リン酸水素二ナトリウムpH5.8〜6.6、20%PEG 1000
0〜0.2M塩化ナトリウム、0.1Mリン酸二水素カリウム/リン酸水素二ナトリウムpH5.8〜6.6、20%PEG 3350
0〜0.2M塩化ナトリウム、0.1Mリン酸二水素カリウム/リン酸水素二ナトリウムpH5.8〜6.6、15〜20%PEG 5000MME
0.5M硫酸アンモニウム、0.1MHEPES pH7.5、30%2-メチル-2，4-ペンタンジオール
0.01M塩化ニッケル（II）、0.1M Tris pH8.5、20%PEG MME 2000
0.05〜0.2M酢酸カルシウム、0.1M Tris HCl pH7.0〜7.6、10〜22.5%PEG 3000
0.1Mリン酸塩-クエン酸塩、pH4.2、0.05M硫酸リチウム、20%PEG 1000
0.025〜0.25Mリン酸水素二カリウム、pH7.0〜7.8
0.2Mリン酸水素二カリウム、pH8.4、17.5%PEG 3350
0.2Mヨウ化アンモニウム、20%PEG 3350
0.2Mクエン酸水素二アンモニウム、20%PEG 3350
0.2M硫酸リチウム、20%PEG 3350
0.05〜0.2M K2HPO4、10%PEG 4000
0.05〜0.2M K2HPO4、6.25%〜20%PEG 3350
0.2M K2HPO4、3.75〜25%PEG 3350
0.2〜0.35M K2HPO4、20%PEG 3350
0.1〜0.15M K2HPO4、10%MPEG 2000
0.2M K2HPO4、3.75〜10%MPEG 2000
0.5M K2HPO4、10%MPEG 2000
0.1〜0.15M K2HPO4、10%PEG 1000
0.2M K2HPO4、3.75〜10%PEG 1000
0.5M K2HPO4、10%PEG 1000
0.1M クエン酸塩-HCl pH5.6、20%PEG 3000
0.1M Tris-HCl pH7.0、20%MPEG 2000
0.1M HEPES pH7.5、0.2M塩化ナトリウム、20%PEG 3000
0.1Mイミダゾール-HCl pH8.0、0.2M酢酸カルシウム、10%PEG 8000
0.1Mイミダゾール-HCl pH8.0、10%イソプロパノール
0.1Mイミダゾール-HCl pH6.5、0.5M酢酸ナトリウム
0.1Mナトリウムカコジレート pH6.6、20%PEG 3350
0.1Mクエン酸塩-HCl pH5.6、10%PEG 4000、10%イソプロパノール
0.1M Tris-HCl pH7.0〜7.6、0.1〜0.2M酢酸カルシウム、15〜20%PEG 3000
0.1Mリン酸塩-クエン酸塩pH4.2、0.2M硫酸リチウム、10%2-プロパノール
0.1Mクエン酸塩pH5.5、0.2M硫酸リチウム、15%エタノール
0.1M HEPES pH7.5、0.2M塩化マグネシウム、15%エタノール
20%PEG 300、10%グリセリン、0.1M Tris pH8.5、5%PEG 8000
〔実施例５〕  2C9P220の結晶化条件
P450 2C9P220の結晶化を、10〜60mg/mlタンパク質で、10mMリン酸カリウム、pH7.4;0.5MKCl;0.2mM DTT;1.0mM EDTA;20%グリセリン中下記諸条件で実施した。結晶を2週間にわたり下記の形態で成長させた。
【０３３４】
外観:球状クラスター
0.1M Tris-HCl pH8.5、0.2M酢酸ナトリウム、15%PEG 4000
0.1M Tris-HCl pH8.5、4%PEG 8000
0.1Mクエン酸三ナトリウム二水和物 pH5.6、10%イソプロパノールPEG 4000
0.1M HEPES pH7.5、0.2M塩化ナトリウム、20%PEG 3000
0.1M リン酸Na/K pH6.2、10%PEG 3000
0.1M Tris pH7.0、0.2M酢酸カルシウム、20%PEG 3000
0.1M Tris pH8.5、20%PEG 1000
0.1M HEPES pH7.5、0.2M塩化ナトリウム、30% PEG 400
0.2M酒石酸二ナトリウム、20%PEG 3350
0.2Mリン酸水素二ナトリウム二水和物、20%PEG 3350
0.2Mリン酸水素二カリウム、20%PEG 3350
0.2Mクエン酸三リチウム、20%PEG 3350
0.2Mクエン酸三ナトリウム、20%PEG 3350
0.2Mクエン酸三カリウム、20%PEG 3350
0.1M Tris-HCl pH7.0、0.2M酢酸カルシウム、20%PEG 3000
0.2M K2HPO4、15%PEG 3350
0.2M K2HPO4、15%PEG 3350
0.1M Tris-HCl pH7.2、0.2M酢酸カルシウム、20%PEG 3000
0.1M Tris-HCl pH7.2、0.2M酢酸カルシウム、15%PEG 3000
0.2M K2HPO4、17.5%PEG 3350
0.2M K2HPO4、20%PEG 3350
0.3M K2HPO4、20%PEG 3350
0.2M K2HPO4、22.5%PEG 3350
0.2M K2HPO4、25%PEG 3350
0.1M Tris-HCl pH7.6、0.2M酢酸カルシウム、20%PEG 3000
0.1M Tris-HCl pH7.6、0.2M酢酸カルシウム、15%PEG 3000
0.1Mクエン酸三ナトリウム二水和物 pH5.0、5%PEG 4000
0.1M HEPES 7.0、5%PEG 4000
0.1M Tris pH8.0、5%〜15%PEG 4000
0.1Mビス-Trisプロパン pH9.0、5%〜10%PEG 4000
〔実施例６〕  2C9-FGループのさらなる生産
2C9-FGループを、上記実施例2（a）に記載した細菌発現システム中で調製し、そこから回収し、質量分析法および活性アッセイによってさらに分析した。
【０３３５】
質量分析法
質量分析を、Bruker「BioTOF」エレクトロスプレー飛行時間型装置を用いて実施した。試料を、貯蔵緩衝液から直接メタノール/水/ギ酸（50:48:2v/v/v）に1000分の1に希釈し、またはC4カラムを用いた逆相HPLC分離にかけた。ボンベシンおよびアンジオテンシンIを用いて2＋および1＋電荷状態で較正を実施した。データを、m/z200〜2000の範囲で取得し、続いてBrukerのX-massプログラムで処理した。質量の確度は、一般に10 000につき1未満であった。
【０３３６】
2C9-FGループの質量スペック:53967Da（実測）
53963.72Da（予測）
機能性アッセイ
P450 2C9の活性アッセイを、Fluoroscan Ascent FL Instruments（Labsystem）により、蛍光性基質としてメトキシ-4-（トリフルオロメチル）-クマリンを用いて、96ウェル・プレート・アッセイ形式で実施した。
【０３３７】
P450 15pmolを、140μM基質メトキシ-4-（トリフルオロメチル）-クマリン、0.15mM NADP＋、0.38mMグルコース-6-リン酸塩、および最終体積170μlの25mM KPi、pH7.4、0.38mM MgCl2中2.9単位/mlのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを含むNADPH再生システムの存在下、精製ヒト・オキシドレダクターゼ0.1単位で還元した。インキュベーションを37℃で数分間実施し、7-ヒドロキシ-4-（トリフルオロメチル）-クマリンを代謝産物標準として用いて代謝速度を決定した。使用した励起波長および発光波長はそれぞれ409および530nmであった。2C9-FGループの活性は、2C9基質で0.110pmol/min/pmol P450であった。
【０３３８】
〔実施例７〕  2C9-FGループの結晶
2C9-FGループの結晶を、懸滴蒸気拡散法によって成長させた。実施例6からの10mM Kpi pH7.4、0.5MKCl、2mM DTT、1mM EDTA、20%グリセリン中40mg/mlのタンパク質を、0.5μl液滴で貯蔵溶液と1:1で混合した。2C9-FGループの結晶を、0.1M Tris-HCl、pH8.8;15%PEG 400;5%PEG 8000;10%グリセリンを含有する貯蔵溶液で成長させた。結晶は25℃で1〜7日以内に形成され、六方晶系針状および棒状の形態を有した。第1の実験においては、第1の結晶（「1」）は、おおよそ161Å、161Å、110Å、90°、90°、120°の格子寸法を有することが判明した。第2の実験においては、第2の結晶（「2」）は、おおよそ164Å、164Å、111Å、90°、90°、120°の格子寸法を有することが判明した。これは、上述した5%のばらつき内の典型的な変動範囲である。
【０３３９】
結晶を、80%貯蔵溶液、10%PEG 400および10%グリセリンを凍結保護剤として用いて、液体窒素で急速冷凍した。
【０３４０】
2C9-FGループ結晶から、European Synchrotron Radiation Sourceのビーム・ラインID14.1（波長0.933Å）でQuantum4 CCD検出器を用いて単結晶から100Kで分解能3.3Åまでのデータを収集した。結晶は、空間群P321に属する。結晶1は格子寸法が161.35Å、161.35Å、110.75Å、90°、90°、120°であり、結晶2は寸法が163.95Å、163.95Å、111.06Å、90°、90°、120°であることが判明し、結晶データを3.0Åまで収集した。
【０３４１】
表1または2の座標を用いて、分子置換によって2C9-FGループ構造を解明することができる。
【０３４２】
〔実施例８〕  2C9-FGループK206Eの結晶化および構造分析
上述した2C9-FGループK206Eベクターで形質転換された大腸菌を増殖させ実施例2に記載した。
【０３４３】
タンパク質精製
細胞を10000gで10分間ペレット化し、500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Calbiochem）、10mMイミダゾール、40U/mlDNase1および5mM MgSO4を含有する緩衝液に再懸濁させた。
【０３４４】
細胞を12000psiでConstant Systems Cell Homogeniserに2回通して溶解させた。次いで、70000gで4℃で30分間遠心分離して細胞片を除去した。
【０３４５】
界面活性剤IGEPAL CA630（Sigma）を10%ストック溶液から最終濃度0.3%（v/v）で溶解物に滴下した。溶解物を、予め洗浄したNiNTA樹脂（Qiagen）と共に終夜4℃で撹拌しながらインキュベートした。タンパク質が結合したNiNTA樹脂を2000gで2分間4℃で遠心分離してペレット化した。この樹脂を、20樹脂体積の500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、10mMイミダゾール、1:1000希釈プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.3%（v/v）IGEPAL CA630で洗浄し、2000xgで2分間4℃で遠心分離してペレット化した。次いで、この樹脂を、10樹脂体積の500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、20mMイミダゾール、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤、0.3%IGEPAL CA630で洗浄し、上述したように遠心分離して回収した。
【０３４６】
この樹脂を4℃のカラムに充填し、500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、300mMイミダゾール、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.3%（v/v）IGEPAL CA630でチトクロムP450を溶出させた。
【０３４７】
どちらかの溶出手順でNiNTAカラムから得られたチトクロムP450を、HiPrep 26/10脱塩カラム（Pharmacia）を用いて、10mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、0.2mM DTT、1mM EDTA中に流量5ml/minで素早く脱塩し、17mlの画分を回収した。
【０３４８】
脱塩したチトクロムP450を、10mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、0.2mM DTT、1mM EDTAで予め平衡にしたCM Sepharoseカラム（Pharmacia）に直接かけた。以下の溶出ステップを適用した:10カラム体積の10mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、0.2mM DTT、1mM EDTAで洗浄し、痕跡量の界面活性剤を除去するために75mM KClを含む上述の緩衝液で洗浄し、次いでKCl濃度を500mMに増加させた上述の緩衝液で溶出させた。
【０３４９】
タンパク質を結晶化アッセイのために微量濃縮器を用いて最大で40mg/mlに濃縮した。タンパク質の特性を明らかにするため、最終試料の品質を以下のようにして評価した。
【０３５０】
（a）SDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法
これを市販のゲル（Nugen）を用いて実施し、その後CBB染色を製造元指示書に従って実施した。ゲルのデジタル画像を走査して推定した純度は、少なくとも95%であった。
【０３５１】
（b）質量分析法
質量分析を、Bruker「BioTOF」エレクトロスプレー飛行時間型装置を用いて実施した。試料を、貯蔵緩衝液から直接メタノール/水/ギ酸（50:48:2v/v/v）に1000分の1に希釈し、またはC4カラムを用いた逆相HPLC分離にかけた。ボンベシンおよびアンジオテンシンIを用いて2＋および1＋電荷状態で校正を実施した。データを、m/z200〜2000の範囲で取得し、続いてBrukerのX-massプログラムで処理した。質量の確度は、一般に10 000につき1未満であった。
【０３５２】
2C9-FGループ-K206Eの質量スペック:53966Da（実測）
53964.67Da（予測）
（c）機能性アッセイ
P450 2C9の活性アッセイを、Fluoroscan Ascent FL Instruments（Labsystem）により、蛍光性基質としてメトキシ-4-（トリフルオロメチル）-クマリンを用いて、96ウェル・プレート・アッセイ形式で実施した。
【０３５３】
P450 15pmolを、140μM基質メトキシ-4-（トリフルオロメチル）-クマリン、0.15mM NADP＋、0.38mMグルコース-6-リン酸塩、および最終体積170μlの25mM KPi、pH7.4、0.38mM MgCl2中2.9単位/mlのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを含むNADPH再生システムの存在下、精製ヒト・オキシドレダクターゼ0.1単位で還元した。インキュベーションを37℃で数分間実施し、7-ヒドロキシ-4-（トリフルオロメチル）-クマリンを代謝産物標準として用いて代謝速度を決定した。使用した励起波長および発光波長はそれぞれ409および530nmであった。2C9-FGループ-K206Eの活性は、2C9基質で0.083pmol/min/pmol P450であった。
【０３５４】
2C9-FGループ-K206Eの結晶化
2C9-FGループ-K206Eの結晶を、懸滴蒸気拡散法によって成長させた。10mM Kpi pH7.4、0.5MKCl、2mM DTT、1mM EDTA、20%グリセリン中40mg/mlのタンパク質を、0.5μl液滴で貯蔵溶液と1:1で混合した。2C9-FGループ-K206Eの結晶を、0.2M二塩基性リン酸カリウムおよび20%PEG 3350（0.1M Tris-HCl、pH8.5;0.2M LiSO4;15%PEG 4000の別の条件も使用した）を含有する貯蔵溶液で成長させた。結晶は25℃で1〜7日以内に形成され、六方晶系針状および棒状の形態を有した。結晶の格子寸法の概略は、165Å、165Å、112Å、90°、90°、120°であった。結晶を、80%貯蔵溶液、10%PEG 400および10%グリセリンを凍結保護剤として用いて、液体窒素で急速冷凍した。
【０３５５】
〔実施例９〕  2C9-FGループK206Eの構造
（実施例8に記載したようにして調製した）2C9-FGループ-K206E結晶から、European Synchrotron Radiation Sourceのビーム・ラインID14.1（波長0.933Å）でQuantum4 CCD検出器を用いて単結晶から100Kで分解能3.0Åまでのデータを収集した。全部で90枚の1度振動画像を収集し、MOSFLM 6.11（Leslie，A.G.W.（1992）.Jnt CCP4/ESF-EACMB Newslett.Protein Crystallogr.26）を用いて処理し、SCALA 4.1を用いて測定し、CCP4プログラム・スイート（Collaborative Computational Project、Number 4、（1994）.The CCP4 suite:Programs for Protein Crystallography.Acta Cryst.D50、760〜763）を用いて換算した。
【表１】
2005522989.tif 000002
【０３５６】
結晶は、空間群P321に属し、格子寸法が165.46Å、165.46Å、111.70Å、90°、90°、120°である。非対称単位の2つのコピーがあり、結晶の溶媒含量は68%である。2C5構造（pdbid 1DT6）（Williams，P A;Cosme，J;Sridhar，V;Johnson，E F;McRee，D E、Molecular Cell、Volume 5、Issue 1、January 2000、Pages 121〜131）およびプログラムAMORE（Navaza，J.（1994）.AMoRe:an automated package for molecular replacement.Acta Cryst.A50、157〜163）を用いて分子置換によって構造を解析し、相関係数67.8%およびR因子38.9%を得た。この構造の座標を表1に示す。非対称単位の2つのコピーは、Z軸の回りの145°回転によって関係づけられる。初期のマップ（平均したものと平均していないもの）は比較的クリーンであり、検索モデルからは省略されたヘム基に対する明白な電子密度を含んでいた。この溶液を、プログラムCNX（同上）を用いた精緻化の出発点として用いた。
【０３５７】
〔実施例１０〕  2C9-FGループK206Eのさらなる結晶化
細菌発現
上述した2C9-FGループK206E-発現プラスミドで形質転換したXL1 blue細胞の単一アンピシリン耐性コロニーを、Terrific Broth（TB）中37℃で終夜振とうしながら飽和近くまで増殖させ、それを用いて新鮮なTB培地を接種した。細菌を、2リットル・フラスコのアンピシリン100μg/mlを含有するTBブロス1リットル中185rpmで37℃でOD600nm＝0.4まで増殖させた。ヘム前駆体デルタアミノレブリン酸（80mg/l）を、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導する30分前に添加し、温度を25℃に下げた。細菌培養を撹拌下25℃で72時間続けた。
【０３５８】
タンパク質精製
細胞を10000gで10分間でペレット化し、500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Calbiochem）、10mMイミダゾール、40U/mlデオキシリボヌクレアーゼ1 および5mM MgSO4を含有する緩衝液に再懸濁させた。
【０３５９】
細胞を10000psiでConstant Systems Cell Homogeniserに2回通して溶解させた。次いで、細胞片を、22000xgで4℃で30分間遠心分離して除去した。
【０３６０】
界面活性剤IGEPAL CA630（Sigma）を10%ストック溶液から最終濃度0.3%（v/v）で溶解物に滴下した。溶解物を、予め洗浄したNiNTA樹脂（Qiagen）と共に終夜4℃で撹拌しながらインキュベートした。タンパク質が結合したNiNTA樹脂を2000gで2分間4℃で遠心分離してペレット化した。この樹脂を、30樹脂体積の500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、10mMイミダゾール、1:1000希釈プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.3%（v/v）IGEPAL CA630で洗浄し、2000xgで2分間4℃で遠心分離してペレット化した。次いで、この樹脂を、15樹脂体積の500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、20mMイミダゾール、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤、0.3%IGEPAL CA630で洗浄し、上述したように遠心分離して回収した。
【０３６１】
この樹脂を4℃のカラムに充填し、500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、300mMイミダゾール、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.3%（v/v）IGEPAL CA630でチトクロムP450を溶出させた。
【０３６２】
NiNTAカラムから得られたチトクロムP450を、HiPrep 26/10脱塩カラム（Pharmacia）を用いて、10mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、0.2mM DTT、1mM EDTA中に流量5ml/minで素早く脱塩した。
【０３６３】
脱塩したチトクロムP450を、10mM KPi、pH7.0、20%グリセリン、0.2mM DTT、1mM EDTAで予め平衡にしたCM Sepharoseカラム（Pharmacia）に直接かけた。以下の溶出ステップを適用した:20カラム体積の10mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、0.2mM DTT、1mM EDTAで洗浄し、痕跡量の界面活性剤を除去するために75mM KClを含む上述の緩衝液で洗浄し、次いでKCl濃度を500mMに増加させた上述の緩衝液で溶出させた。
【０３６４】
タンパク質を結晶化アッセイのために微量濃縮器を用いて最大で40mg/mlに濃縮した。
【０３６５】
2C9-FGループK206Eの結晶化
2C9-FGループ-K206Eの結晶を、懸滴蒸気拡散法によって成長させた。10mM Kpi pH7.0、0.5MKCl、2mM DTT、1mM EDTA、20%グリセリン中40mg/mlのタンパク質を、0.5μl液滴で貯蔵溶液と1:1で混合した。2C9-FGループ-K206Eの結晶を、0.1M Tris-HCl pH8.4、15%PEG 400、5%PEG 8000、10%グリセリンを含有する貯蔵溶液で成長させた。
【０３６６】
棒状結晶が25℃で1日以内に形成された。結晶を、貯蔵溶液を凍結保護剤として用いて、液体窒素で急速冷凍した。結晶の格子寸法の概略は、164.9Å、164.9Å、111.1Å、α＝90°、β＝90°、γ＝120°であった。
【０３６７】
〔実施例１１〕  2C9-FGループK206Eの分解能2.6Åの構造の作製
（実施例4に記載したようにして調製した）2C9-FGループ-K206E結晶から、European Synchrotron Radiation Sourceのビーム・ライン14.1でQuantum4 CCD検出器を用いて単結晶から100Kで分解能2.6Åまでのデータを収集した。結晶を、0.1M Tris pH8.4、15%PEG 400、5%PEG 8000、10%グリセリンの貯蔵溶液で成長させ、貯蔵溶液から直接凍結させた。全部で50枚の画像を収集し、MOSFLM（Leslie，A.G.W.（1992）.Jnt CCP4/ESF-EACMB Newslett.Protein Crystallogr.26）を用いて処理し、SCALAを用いて測定し、CCP4プログラム・スイート（Collaborative Computational Project、Number 4、（1994）.The CCP4 suite:Programs for Protein Crystallography.Acta Cryst.D50、760〜763）を用いて換算した。
【表２】
2005522989.tif 000003
【０３６８】
このデータを精緻化に用い、初期の3.0Åデータに対する精緻化によって作成されたモデルを使用して、表2の座標を作成した。反射データの5%の一貫したセットをFree R計算のフラッグとし、より高い分解能に拡張させた。プログラムCNX（Brunger等、Current Opinion in Structure Biology、Vol.8、Issue 5、October 1998、606〜611。Accelerys、San Diego、CAからも市販されている）およびREFMAC（Collaborative Computational Project、Number 4、（1994）.The CCP4 suite:programs for protein crystallography.Acta Cryst.D50、760〜763）を用いて精緻化をR因子21.9%およびRフリー因子（R free factor）25.0%まで続けた。
【０３６９】
〔実施例１２〕  2C9-FGループの構造
（実施例7に記載したようにして調製した）2C9-FGループ結晶2から、European Synchrotron Radiation Sourceのビーム・ラインID14.1（波長0.933Å）でQuantum4 CCD検出器を用いて、結晶化溶液（0.1M Tris-HCl pH8.8、15%PEG 400、5%PEG 8000、10%グリセリン）から100Kで直接凍結させた単結晶から分解能3.1Åまでのデータを収集した。結晶は、空間群P321に属する。結晶2は、格子寸法163.95Å、163.95Å、111.06Å、90°、90°、120°を有することが判明した。
【０３７０】
合計100度のデータを収集し、MOSFLMを用いて処理し、SCALAを用いて測定し、CCP4プログラム・スイートをさらに用いて換算した。2C9-FGループの構造を、プログラムAMOREおよび探索モデルとして2.6Å2C9-FGループ-K206E構造（表2）を用いた分子置換によって解析した。この構造を、プログラムCNXを用いた厳密な非結晶学的対称を使用して改良して表3の座標を作成した。最終構造は、30〜3.1Åの全データに対してR因子26.8%およびFree  R因子29.8%であった。
【表３】
2005522989.tif 000004
【０３７１】
〔実施例１３〕  P450結合ポケット残基の同定および使用
2C9の結晶構造によって、酵素の結合部位に沿って並ぶすべての残基の正確な同定が初めて可能になった（表4）。様々なソースによって触媒部位にあると提案されたいくつかの残基は、結合ポケット残基ではなく、所定の位置に触媒残基を保持する残基であることが今回判明した。
【表４】
2005522989.tif 000005
【０３７２】
結晶構造の助けを借りて、2C9結合ポケットに沿って並ぶことが今回判明した、モデリング（例えば、相同モデリング、SRS案（SRS proposals）、3D/4D-QSAR、配列アラインメントまたは突然変異誘発研究）から結合部位に存在するとこれまで推測された残基を表5に示す。
【表５】
2005522989.tif 000006
【０３７３】
結合ポケット中にあるいくつかの残基は、これまで結合部位残基としては決して同定されなかった。これらを表6に記載する。これらが同定されたことによって、化合物結合のモデリングが大いに促進されるはずである。
【表６】
2005522989.tif 000007
【０３７４】
したがって、本発明の好ましい態様においては、本発明の方法に使用される選択座標は、表5または6のどちらかから選択されるアミノ酸残基の少なくとも1つの座標、好ましくは少なくとも1つの側鎖座標を含む。
【０３７５】
選択座標は、表5または6からの少なくとも1つのアミノ酸に関係する表1、2、3または8のすべての原子の座標を含むことが好ましい。
【０３７６】
特定のアミノ酸のすべてが選択されようと単なるいくつかの原子が選択されようと、選択座標の少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも5つ、最も好ましくは少なくとも10個は、対応する数の異なるアミノ酸残基からの側鎖残基であることも好ましい。これらは、表5または6のどちらかから、またはそれらの組合せからもっぱら選択することができる。表6の少なくとも1つの側鎖残基座標が含まれることが好ましい。
【０３７７】
〔実施例１４〕  他のP450構造のモデリング
表5および6の残基のいくつかは、天然のヒト2C9において表に示される配列位置に存在しない残基、または他のヒトP450構造では異なる残基である。特にこれらの残基の場合、分子モデリング技術（分子置換またはコンピュータ支援の半自動の方法を含むが、これらだけに限定されない）を用いて、異なる残基がこのような場所において提供されるモデルを得ることができる。例えば、タンパク質2C9-FGループの位置206（上記表5に挙げられた）はリジンであり、これは正の電荷を含む。2C9-FGループK206EのX線回折データを用いて、本発明者らは2C9-FGループ・タンパク質をモデル化してこのタンパク質の座標データを提供した。
【０３７８】
この座標データは、残基206に対するデータ以外は表1に対応し、以下のとおりである。
【表７】
2005522989.tif 000008
【０３７９】
CB炭素原子、すなわち側鎖中の第1の炭素原子は、表1のGlu CB炭素原子とほとんど同じ位置にあるのに対し、側鎖の残りの原子（CD、CEおよびNZ）は、リジン側鎖の低エネルギー配置に基づく位置にあり、CA炭素原子への側鎖の結合を考慮していることが認められる。したがって、分子モデリングの当業者であれば、2C9-FGループK206Eの1つまたは複数の残基が同様に置換されたP450のモデルにたどり着くことは比較的簡単である。2C9-FGループの座標データを表3に示す。空間群P321において、2つの方法のうちの1つで回折データにインデックスを付けることが可能であることを、当業者は理解されたい。データは、1つのインデクシングからもう一方のインデクシングに演算子k、h、-lを用いて変換することができる。3.0Åの2C9-FGループK206Eの場合（表1）、これらのデータは、2.6Åの2C9-FGループK206Eのデータ（表2）または2C9-FGループのデータ（表3）とは異なるインデックスが付けられ、したがって、タンパク質の結晶形は実質的に同一であるものの、それらの結晶構造は同じ絶対空間にはない。したがって、表3におけるGlu206の座標データは、上記表1においてモデル化されて示されたものとは数値的に等価ではない。これにより、当業者は、残基206の上記データを変換することができる。
【０３８０】
したがって、化合物またはその代謝産物と本発明のP450構造との相互作用をモデル化する場合、位置206の残基がその特定の代謝産物との相互作用に関与することができ、残基206に対する上記データを206Gluのデータの代わりに表1で使用できることが分かる。これは、その差異から生じる電荷の変化を考慮したものである。P450の他の領域と相互作用することが判明した化合物または代謝産物の場合、おそらく、このようにして表1を修正する必要はない。
【０３８１】
しかし、P450の他の部分に対して類似したモデリングを実施することができ、化合物とタンパク質のこれらの部分の結合ポケットとの潜在的相互作用を特に問題にすることは重要である。したがって、特に残基Pro220、Ala221、Leu222およびLeu223は、P450構造における野生型残基側鎖の座標を予測するために上で考察したのと同様に再構築される。
【０３８２】
2C9野生型タンパク質のモデル化座標は、表7に挙げられた残基が表1、2、3または8の対応する残基に取って変わる以外は、表1、2、3または8に含まれるものと同じである。
【０３８３】
したがって、本発明は、215、216、220、221、222および223位の1つまたは複数の残基の原子および対応する座標が表7の野生型残基の原子および対応する座標で置換される以外は、座標が表1、2、3または8のものであり、イン・シリコで使用される2C9の構造を包含する。したがって、本発明の先の態様が表1、2、3または8に関係する程度に、それらは、表7に挙げられた野生型残基の原子および対応する座標によって置換された215、216、220、221、222および223位の1つまたは複数の残基の原子および対応する座標を含む表1、2、3または8にも関係する。
【０３８４】
〔実施例１５〕  ドッキング実験
2C9の結晶構造を用いてコンピュータによって薬物分子を結合ポケットに合体させた。ヒト2C9の既知基質である薬物ジクロフェナクが生成され、対話型コンピュータ・グラフィックスを用いて2C9結合ポケットに配置された。観測した相互作用を用いて、今度は、構造ベースの設計戦略によってジクロフェナクを化学的に改変して、ヒト2C9との相互作用を媒介し、その潜在的治療能力を向上させることができる。
【０３８５】
〔実施例１６〕  2C9-FGループK206E構造の精緻化
実施例11で作成されたデータをさらに改良して表8（図5）を作成した。合計147個の水分子を添加し（手動および自動的に）、精緻化に算入した。その結果、R因子は20.7%であり、Rフリー因子は25.9%であった。
【０３８６】
〔実施例１７〕  2C9タンパク質のさらなる生産
2C9trunc、2C9P220（1072とも称する）、2C9-FGループ（1015）および2C9-FGループK206E（1155）をコードする核酸を用いて、カセット突然変異誘発（CM）または部位特異的突然変異誘発（QC）によって、2C9をコードする核酸をさらに生産させた。Site-Directed Mutatgenesis（PCR突然変異誘発）を、Stratagene Quikchange（商標）突然変異誘発キット（カタログ番号＃200518）を用いて、製造元指示書に従って実施した。Quikchange（商標）突然変異誘発法によって、ねじれ型ニックを有する突然変異プラスミドが生成し、DpnI消化を用いてすべての親DNAが除去される。10X反応緩衝液5.0μL、テンプレート・プラスミドDNA5〜50ng、dNTP混合物1.0μLおよびオリゴヌクレオチドプライマー125ngを導入する反応を実施した。各構築物に使用したプライマーおよびテンプレートを下表に示す。
【０３８７】
反応物を滅菌水で50μLにし、次いで、2.5U Pfu Turboを添加し、反応物を鉱油30μLで覆った。次いで、熱サイクルを次のように実施した:95℃、30秒（1サイクル）、95℃、30秒、55℃、1分、68℃13.5分（18サイクル）、および最後に4℃で保持。オリゴヌクレオチドプライマーの代わりに水を使用した対照反応も実施した。熱サイクル後、鉱油レベル下の各反応物にDpnI 10Uを添加した。次いでこれらの反応物を静かに混合し、その後ベンチトップ型マイクロ遠心分離装置で1分間、13，000rpmで遠心分離し、37℃で3時間インキュベートした。
【０３８８】
次いで、消化した生成物（1μL）を用いてコンピテント大腸菌XL1-Blue細胞（Stratagene）50μLを形質転換した。次いで、全形質転換体を100μg/mlカルベニシリンを含有するLuria寒天プレート上に蒔き、反転させ、終夜37℃でインキュベートした。プラスミドDNAを個々のコロニーから調製し、配列を決定して突然変異が正しく挿入されたかどうかを調べた。
【０３８９】
カセット突然変異誘発を、この領域に存在する2つの独特な天然の制限酵素切断部位であるBamHIおよびXmaI部位を利用して、2C9 FG領域（残基215〜226）で実施した。5'BamHIおよび3'XmaIオーバーハング制限酵素切断部位を有する相補オリゴヌクレオチドを、FG領域（表9、10および14）に突然変異を導入するように設計した。相補オリゴヌクレオチドの混合物10μgを100℃で5分間水100μl中で加熱し、25℃で徐冷して二本鎖オリゴヌクレオチドを調製した。二本鎖オリゴヌクレオチドを、BamHIおよびXmaI制限酵素で開いた精製プラスミドpCW-2C9 wtに連結し、一定分量の連結体（ligation）を用いてXl1 Blue  大腸菌を形質転換した。
【０３９０】
上記方法で生産された本発明の2C9タンパク質を表9に示す。使用したプライマーも示す。これらのタンパク質の結晶はすべて、表11（実施例20参照）に示す様々な条件下で得られた。
【０３９１】
対照として、220位にプロリンのない2C9タンパク質を同じ技術により作製した。作製したタンパク質を表10に示す。試験した一連の諸条件下で、タンパク質結晶は回収されなかった。
【表８】
2005522989.tif 000009
2005522989.tif 000010
2005522989.tif 000011
【表９】
2005522989.tif 000012
【０３９２】
〔実施例１８〕  2C9タンパク質の生産
細菌発現
実施例17の2C9タンパク質を細菌発現システムで生産させた。XL1 blue細胞の単一アンピシリン耐性コロニーを、Terrific Broth（TB）中37℃で終夜振とうしながら飽和近くまで増殖させ、それを用いて新鮮なTB培地を接種した。細菌を、2リットル・フラスコの100μg/mlアンピシリンを含有するTBブロス1リットル中185rpmで37℃でOD600nm＝0.4まで増殖させた。ヘム前駆体デルタアミノレブリン酸（80mg/l）を、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導する30分前に添加し、温度を25℃に下げた。細菌培養を撹拌下25℃で72時間続けた。
【０３９３】
タンパク質精製
細胞を10000gで10分間ペレット化し、500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Calbiochem）、10mMイミダゾール、40U/mlデオキシリボヌクレアーゼ1および5mM MgSO4を含有する緩衝液に再懸濁させた。
【０３９４】
細胞を10000psiでConstant Systems Cell Homogeniserに2回通して溶解させた。次いで、22000xgで4℃で30分間遠心分離して細胞片を除去した。
【０３９５】
界面活性剤IGEPAL CA630（Sigma）を10%ストック溶液から最終濃度0.3%（v/v）で溶解物に滴下した。溶解物を、予め洗浄したNiNTA樹脂（Qiagen）と共に終夜4℃で撹拌しながらインキュベートした。タンパク質が結合したNiNTA樹脂を2000gで5分間4℃で遠心分離してペレット化した。この樹脂を、30樹脂体積の500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、10mMイミダゾール、1:1000希釈プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.3%（v/v）IGEPAL CA630で洗浄し、2000xgで5分間4℃で遠心分離してペレット化した。次いで、この樹脂を、15樹脂体積の500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、20mMイミダゾール、0.1%（v/v）プロテアーゼ阻害剤、0.3%IGEPAL CA630で洗浄し、上述したように遠心分離して回収した。
【０３９６】
この樹脂を4℃のカラムに充填し、チトクロムP450を500mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、10mMメルカプトエタノール、300mMイミダゾール、1:1000（v/v）プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.3%（v/v）IGEPAL CA630で溶出させた。
【０３９７】
NiNTAカラムから得られたチトクロムP450を、HiPrep 26/10脱塩カラム（Pharmacia）を用いて、10mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、2.0mM DTT、1mM EDTA中に流量5ml/minで素早く脱塩した。
【０３９８】
脱塩したチトクロムP450を、10mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、2.0mM DTT、1mM EDTAで予め平衡にしたCM Sepharoseカラム（Pharmacia）に直接かけた。以下の溶出ステップを適用した:20カラム体積の10mM KPi、pH7.4、20%グリセリン、2.0mM DTT、1mM EDTAで洗浄し、痕跡量の界面活性剤を除去するために75mM KClを含む上述の緩衝液で洗浄し、次いでKCl濃度を500mMに増加させた上述の緩衝液で溶出させた。
【０３９９】
タンパク質を結晶化アッセイのために微量濃縮器を用いて最大で40mg/mlに濃縮した。最終試料の品質を以下のようにして評価した。
【０４００】
（a）SDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法
これを市販のゲル（Nugen）を用いて実施し、その後CBB染色を製造元指示書に従って実施した。ゲルのデジタル画像を走査して推定した純度は、少なくとも95%であった。
【０４０１】
（b）質量分析法
質量分析を、Bruker BioTOF IIエレクトロスプレー飛行時間型装置を用いて実施した。試料を、貯蔵緩衝液から直接メタノール/水/ギ酸（50:48:2v/v/v）に1000分の1に希釈し、またはメタノール/水/ギ酸に希釈する前にC4 Millipore「zip-tip」またはC4 HPLCカラムを用いた逆相分離にかけた。ボンベシンおよびアンジオテンシンIを含有するペプチド混合物の2＋および1＋電荷状態を測定することによって、またはウマ・ミオグロビンの複数の電荷状態を用いることによって較正を実施した。データを、m/z200〜2000の範囲で取得し、続いてBrukerのX-massプログラムで処理した。質量の確度は、10000につき1（100ppm）未満と予測された。
【０４０２】
タンパク質の予測および実測質量分析データを表12に記載する。
【表１０】
2005522989.tif 000013
【０４０３】
〔実施例１９〕  本発明の2C9タンパク質の活性
P450 2C9の活性アッセイを、Fluoroscan Ascent FL Instruments（Labsystem）により、蛍光性基質として7-メトキシ-4-（トリフルオロメチル）-クマリンを用いて、96ウェル・プレート・アッセイ形式で実施した。
【０４０４】
精製P450 15pmolを、137μM基質7-メトキシ-4-（トリフルオロメチル）-クマリン、ならびに最終体積180μlの25mM KPi、pH7.4中0.14mM NADP＋、0.37mMグルコース-6-リン酸塩、0.38mM MgCl2、および2.8単位/mlグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを含むNADPH再生システムの存在下、精製ヒト・オキシドレダクターゼ0.1単位で還元した。インキュベーションを37℃で40分間実施し、代謝産物標準7-ヒドロキシ-4-（トリフルオロメチル）-クマリン37.5pmolを用いて代謝速度を決定した。使用した励起波長および発光波長はそれぞれ409および530nmであった。試験したクローンの結果を表13に示す。
【表１１】
2005522989.tif 000014
【０４０５】
対照として、タンパク質2C9trunc（野生型）および1365（両方とも220位にプロリンがない）の活性を決定し、それぞれ0.47および0.43であることが判明した。
【０４０６】
〔実施例２０〕  2C9タンパク質の結晶化
2C9突然変異体の結晶を、懸滴蒸気拡散法によって成長させた。10mM Kpi pH7.4、0.5MKCl、2mM DTT、1mM EDTA、20%グリセリン中10〜60mg/ml（通常40mg/ml）のタンパク質を、0.5μl滴下によって、貯蔵溶液と1:1で混合した。以下の貯蔵溶液条件下で、いくつかの異なる本発明の2C9タンパク質が結晶を形成した。
【０４０７】
0.05〜0.1M Tris-HCl pH8.0〜8.8、0.1〜0.2M硫酸リチウム、10〜15%PEG 4000;
0.1M Tris pH8.0〜8.8、15〜30%PEG 400、5%PEG 8000、10%グリセリン;および
0.1〜0.4M KH2PO4、0〜25%PEG 3350、0〜10%グリセリン。
【０４０８】
表11（図6）に記載した諸条件を含む別の貯蔵溶液を用いて、本発明の様々な異なる2C9タンパク質の別の結晶も得られた。表11において、カラムに記載した構成要素を含む貯蔵溶液を用いることによって、クローン数によって確認されるクローンの結晶化が得られた。これらの構成要素は以下のとおりである。
【０４０９】
緩衝液（M）-緩衝液の（Mで表示した）モル濃度
緩衝液-緩衝液タイプ
pH-使用した緩衝液のpH
塩（M）-塩の（Mで表示した）モル濃度
塩-塩タイプ
Ppt（M）-沈殿剤の（Mで表示した）モル濃度
Ppt-沈殿剤タイプ
Ppt 2（M）-沈殿剤2の（Mで表示した）モル濃度
Ppt 2-用いた沈殿剤2
Add M-添加剤の（Mで表示した）モル濃度
添加剤-用いた添加剤
〔実施例２１〕  2C9-2C19キメラ
7つの別の2C9タンパク質が、2C19中に存在する残基の2C9への置換に基づいて生成した。上記実施例17に記載した部位特異的突然変異誘発によって、かつ下記表14に挙げたプライマーを用いて、3つのキメラ（1661、1662および1664）が生成した。4つの他のキメラ、1595、1600、1610および1632が、以下のクローニング方法によって生成した。
【０４１０】
キメラ1595
突然変異体1155 I99Hが、Quikchange（商標）突然変異誘発法により、表14に記載したオリゴヌクレオチドを用いて生成された。次いで、2C19のXmaI/SphI 339-bp DNA断片を、同じ制限酵素で開いたプラスミドpCW-1155 I99Hにクローニングすることによって、構築体1155 I99H中の残基227〜339を、チトクロムP450 2C19（クローン1026）中に存在する残基で置換して、キメラ1595を得た。
【０４１１】
キメラ1600
残基1〜282を1155 I99H構築体中の残基で置換することによって、キメラ1595からキメラ1600を得た。サイレントな制限酵素切断部位EcoRI（下線部）を、以下の5'オリゴヌクレオチド、すなわち、
5'ctttcaatagtgaattcagatggttggttgtgc3'（配列番号226）および
5'tatggctaagaaaacgagctctaaagggc3'（配列番号225）（EcoRI制限酵素切断部位を下線で示した）を用いてPCR増幅によって、1155 I99H構築体の784位に導入した。94℃30秒、55℃1分および72℃1分の合計28サイクルの後に、72℃10分の伸長を行った。795-bp PCR断片を、NotI/EcoRIで二重消化し、アガロース・ゲル抽出および溶出で精製した。次いで、NotI/EcoRI DNA断片をNotI/EcoRI制限酵素で開いたプラスミド1595にクローニングして、1155 I99H/1595キメラを得た。最後に、Quikchange（商標）突然変異誘発法によって、表14に記載したオリゴヌクレオチドを用いて、1155 I99H/1595キメラにL362I変化を導入してキメラ1600を得た。
【０４１２】
キメラ1610
キメラ1600中に存在する残基で残基215〜328を置換することによって構築体1155からキメラ1610を得た。BamHI/AffIII DNA断片をキメラ1600から単離し、BamHI/AffIII制限酵素で開いたプラスミドpCW-1155にクローニングした。
【０４１３】
キメラ1632
構築体1155中に存在する残基で1600中の残基329〜476を置換することによって、キメラ1600から構築体1632を得た。AffIII/SalI DNA断片を構築体1155から単離し、AffIII/SalI制限酵素で開いたプラスミドpCW-1600にクローニングした。表14にこれらのキメラを示す。
【表１２】
2005522989.tif 000015
【０４１４】
〔実施例２２〕  2C9-2C19キメラの生産
上述したように上記実施例18の2C9タンパク質に対してこれらのタンパク質が生産された。タンパク質の予測および実測質量分析データを表15に記載する。
【表１３】
2005522989.tif 000016
【０４１５】
〔実施例２３〕  2C9-FGループK206Eの確認
ジクロフェナクを基質として用いた代謝アッセイを、文献に報告された2C9の6つの基質/阻害剤を用いた阻害アッセイと組み合わせて実施することによって、2C9-FGループK206Eの基質特異性の特徴を明らかにした。
【０４１６】
Mancy等によって記載された方法（Biochemistry（1999）38、14264〜14270）に従って決定される4-ジクロフェナクヒドロキシラーゼ・アッセイ（図11）から、ジクロフェナクに対する2C9-FGループK206E突然変異体のKm値が自然のN切断型2C9に対して得られるKm値と類似しており、自然の完全長2C9に対して文献に報告されている値の範囲内にあることが示されている。しかし、チトクロムP450 2C9-FGループK206Eは、そのレドックス相手との相互作用の変化を反映し得るVmax値が1/2になる。阻害研究（表16）の結果から、2C9-FGループK206Eの阻害プロファイルが、自然のN切断型酵素と比較して変わらず、文献に報告されている値に厳密に一致するKiおよびIC50値を有することも示されている。
【０４１７】
これらの結果はともに、FGループ領域に導入された、2C9の結晶化を促進する突然変異によって、基質特異性が変わらず、基質-結合ポケットの完全性も変わらないことを明瞭に示している。したがって、2C9-FGループK206Eは、化学化合物の活性部位へのビンジング（binging）・モードを研究するために適切な自然の2C9モデルである。
【表１４】
2005522989.tif 000017
【０４１８】
〔実施例２４〕  2C9-2C19キメラの活性
文献に報告された2C19および2C9の6つの基質/阻害剤を用いた阻害アッセイを実施することによって、実施例22で生産されたタンパク質の基質特異性の特徴を明らかにした。
【０４１９】
2C9-2C19キメラ・タンパク質について活性および阻害アッセイを実施し、その結果を表17に示す。
【表１５】
2005522989.tif 000018
【０４２０】
表から分かるように、1632および1661は、2C19と類似した活性を示す。したがって、以下の変化I99H S286N E288V N289I V292A F295Lを起こすことによって2C9-2C19キメラも生産させることができる。別の最小の突然変異体は、I99H S286N N289Iである。
【０４２１】
〔実施例２５〕  2C9-2C19キメラ・タンパク質の結晶化
上記実施例20に記載したように結晶を調製した。以下の諸条件を含む貯蔵溶液で結晶を成長させた。
【０４２２】
0.05〜0.1M Tris-HCl pH8.0〜8.8、0.1〜0.2M硫酸リチウム、10〜15%PEG 4000;
0.1M Tris pH8.0〜8.8、15〜30%PEG 400、5%PEG 8000、10%グリセリン;および
0.1〜0.4M KH2PO4、0〜25%PEG 3350、0〜10%グリセリン。諸条件を表11（図6）にも示す。
【０４２３】
〔実施例２６〕  2C19の相同モデリング
相同モデリングを用いて、2C19タンパク質のモデルを作成した。CLUSTALWを用いた2C9テンプレート構造と標的配列のアラインメントからこのモデルを構築した。PSIPRED2次構造プログラムからの情報を用いてアラインメントを調節し、手作業で最適化した。プログラムMODELLERを用いて、3次元モデルを構築して最適化し、最低エネルギーを有しプログラムによって生じる制約を厳密に満たすモデルを最終モデルとした。作成した2C19モデルを表18（図7）に示す。
【０４２４】
〔実施例２７〕  2C18の相同モデリング
これを、2C18において2C19とは異なる残基を決定し、実施例25に記載した技術を用いてこれらの残基の座標を決定することによって実施した。表19（図8）に示すこれらの座標を、2C9または2C19座標の表に置き換えることができる。
【０４２５】
〔実施例２８〕  2C8の相同モデリング
これを、2C8において2C19とは異なる残基を決定し、実施例25に記載した技術を用いてこれらの残基の座標を決定することによって実施した。表20（図9）に示すこれらの座標を、2C9または2C19座標の表に置き換えることができる。
【０４２６】
要約
本発明を、上述した例示的な実施形態に関連して説明してきたが、この開示がなされたときには、当業者には多数の等価な改変形態および変化形態が明らかなはずである。したがって、本発明が示す例示的な実施形態は、説明のためのものであり限定するためのものではないとみなせる。上述した実施形態は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々に変更することができる。
【０４２７】
表の説明
表1（図1参照）は、実施例9で得られた2C9構造の座標である。
【０４２８】
表2（図2参照）は、実施例11で得られた2C9-FGループK206E構造の座標である。
【０４２９】
表3（図3参照）は、実施例12で得られた2C9-FGループの座標である。
【０４３０】
表4（実施例13）は、2C9の結合部位に沿って並ぶ残基のリストである。
【０４３１】
表5（実施例13）は、結合部位に存在するとこれまで推測された残基のリストである。
【０４３２】
表6（実施例13）は、新たに同定された結合ポケット残基のリストである。
【０４３３】
表7（図4参照）は、2C9野生型タンパク質の残基215、216、220、221、222および223のモデル化座標である。
【０４３４】
表8（実施例16および図5）は、改良された2C9-FGループK206E構造である。
【０４３５】
表9（実施例17）は、さらに、本発明の2C9タンパク質、ならびにそれらを得るために使用されるプライマーおよび方法である。
【０４３６】
表10（実施例17）は、対照2C9タンパク質、ならびにそれらを得るために使用されるプライマーおよび方法である。
【０４３７】
表11（実施例20および24、および図6）は、本発明のタンパク質の結晶化条件である。
【０４３８】
表12（実施例18）は、2C9タンパク質の質量分析データである。
【０４３９】
表13（実施例19）は、本発明の2C9タンパク質の活性データである。
【０４４０】
表14（実施例21）は、本発明の2C9-2C19キメラ、ならびにそれらを得るために使用されるプライマーおよび/または方法である。
【０４４１】
表15（実施例22）は、2C9-2C19キメラ・タンパク質の質量分析データである。
【０４４２】
表16（実施例23）は、2C9-FGループK206E（1155）の活性を示す表である。
【０４４３】
表17（実施例24）は、本発明の2C9-2C19キメラの活性を示す表である。
【０４４４】
表18（実施例25および図7）は、2C19の相同モデルである。
【０４４５】
表19（実施例26および図8）は、2C18置換座標である。
【０４４６】
表20（実施例27および図9）は、2C8置換座標である。
【０４４７】
配列の説明
配列番号1は、2C9truncのDNA配列である。
【０４４８】
配列番号2は、2C9truncのアミノ酸配列である。
【０４４９】
配列番号3は、2C9-P220（1072とも称する）のDNA配列である。
【０４５０】
配列番号4は、2C9-P220のアミノ酸配列である。
【０４５１】
配列番号5は、2C9-FGループ（1015とも称する）のDNA配列である。
【０４５２】
配列番号6は、2C9-FGループのアミノ酸配列である。
【０４５３】
配列番号7は、2C9-FGループK206E（1155とも称する）のDNA配列である。
【０４５４】
配列番号8は、2C9-FGループK206Eのアミノ酸配列である。
【０４５５】
配列番号（2x＋7）および（2x＋8）（xは、1〜49の整数である）は、クローン1078、1081、1082、1085、1097、1100、1101、1102、1115、1116、1117、1118、1121、1122、1123、1165、1220、1319、1339、1340、1361、1362、1363、1364、1366、1367、1368、1369、1370、1371、1372、1391、1392、1394、1396、1397、1424、1443、1444、1475、1477、1491、1595、1600、1610、1632、1661、1662および1664と称する各2C9タンパク質のそれぞれDNAおよびアミノ酸配列である。したがって、クローン1078をコードするDNA配列は配列番号9であり、その対応するアミノ酸配列は配列番号10である。クローン1664の場合、DNAは配列番号105であり、対応するアミノ酸配列は配列番号106である。
【０４５６】
配列番号107は、クローン1039（対照クローン）のDNA配列である。
【０４５７】
配列番号108は、クローン1039のアミノ酸配列である。
【０４５８】
配列番号109は、クローン1365（対照クローン）のDNA配列である。
【０４５９】
配列番号110は、クローン1365のアミノ酸配列である。
【０４６０】
配列番号111は、クローン1423（対照クローン）のDNA配列である。
【０４６１】
配列番号112は、クローン1423のアミノ酸配列である。
【０４６２】
さらなる配列については、添付のテキスト中で特定する。
【図面の簡単な説明】
【０４６３】
【図１−１】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−２】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−３】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−４】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−５】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−６】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−７】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−８】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−９】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−１０】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−１１】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−１２】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−１３】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−１４】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−１５】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−１６】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−１７】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−１８】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−１９】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−２０】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−２１】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−２２】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−２３】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−２４】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−２５】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−２６】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−２７】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−２８】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−２９】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−３０】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−３１】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−３２】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−３３】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−３４】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−３５】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−３６】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−３７】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−３８】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−３９】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−４０】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−４１】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−４２】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−４３】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−４４】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−４５】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−４６】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−４７】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−４８】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−４９】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−５０】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−５１】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−５２】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−５３】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−５４】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−５５】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−５６】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−５７】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−５８】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−５９】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−６０】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−６１】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−６２】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−６３】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−６４】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−６５】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−６６】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−６７】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−６８】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−６９】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−７０】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−７１】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−７２】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−７３】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−７４】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−７５】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−７６】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−７７】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−７８】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−７９】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−８０】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−８１】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−８２】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−８３】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−８４】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−８５】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−８６】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−８７】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−８８】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−８９】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−９０】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−９１】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−９２】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−９３】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−９４】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−９５】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−９６】2C9構造の座標を示す表1である。
【図１−９７】2C9構造の座標を示す表1である。
【図２−１】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−２】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−３】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−４】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−５】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−６】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−７】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−８】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−９】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−１０】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−１１】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−１２】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−１３】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−１４】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−１５】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−１６】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−１７】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−１８】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−１９】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−２０】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−２１】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−２２】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−２３】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−２４】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−２５】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−２６】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−２７】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−２８】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−２９】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−３０】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−３１】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−３２】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−３３】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−３４】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−３５】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−３６】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−３７】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−３８】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−３９】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−４０】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−４１】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−４２】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−４３】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−４４】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−４５】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−４６】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−４７】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−４８】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−４９】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−５０】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−５１】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−５２】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−５３】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−５４】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−５５】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−５６】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−５７】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−５８】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−５９】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−６０】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−６１】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−６２】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−６３】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−６４】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−６５】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−６６】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−６７】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−６８】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−６９】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−７０】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−７１】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−７２】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−７３】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−７４】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−７５】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−７６】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−７７】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−７８】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−７９】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−８０】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−８１】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−８２】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−８３】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−８４】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−８５】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−８６】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−８７】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−８８】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−８９】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−９０】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−９１】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−９２】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−９３】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−９４】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−９５】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−９６】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−９７】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−９８】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図２−９９】2C9-FGループK206E構造の座標を示す表2である。
【図３−１】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−２】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−３】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−４】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−５】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−６】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−７】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−８】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−９】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−１０】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−１１】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−１２】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−１３】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−１４】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−１５】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−１６】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−１７】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−１８】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−１９】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−２０】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−２１】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−２２】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−２３】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−２４】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−２５】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−２６】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−２７】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−２８】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−２９】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−３０】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−３１】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−３２】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−３３】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−３４】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−３５】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−３６】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−３７】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−３８】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−３９】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−４０】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−４１】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−４２】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−４３】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−４４】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−４５】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−４６】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−４７】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−４８】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−４９】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−５０】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−５１】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−５２】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−５３】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−５４】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−５５】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−５６】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−５７】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−５８】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−５９】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−６０】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−６１】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−６２】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−６３】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−６４】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−６５】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−６６】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−６７】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−６８】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−６９】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−７０】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−７１】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−７２】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−７３】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−７４】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−７５】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−７６】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−７７】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−７８】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−７９】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−８０】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−８１】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−８２】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−８３】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−８４】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−８５】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−８６】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−８７】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−８８】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−８９】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−９０】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−９１】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−９２】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−９３】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−９４】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−９５】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−９６】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−９７】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−９８】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−９９】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図３−１００】2C9-FGループ構造の座標を示す表3である。
【図４−１】2C9野生型タンパク質の残基215、216、220、221、222および223のモデル化座標を示す表7である。
【図４−２】2C9野生型タンパク質の残基215、216、220、221、222および223のモデル化座標を示す表7である。
【図５−１】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−２】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−３】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−４】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−５】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−６】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−７】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−８】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−９】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−１０】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−１１】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−１２】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−１３】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−１４】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−１５】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−１６】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−１７】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−１８】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−１９】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−２０】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−２１】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−２２】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−２３】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−２４】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−２５】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−２６】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−２７】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−２８】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−２９】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−３０】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−３１】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−３２】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−３３】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−３４】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−３５】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−３６】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−３７】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−３８】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−３９】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−４０】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−４１】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−４２】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−４３】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−４４】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−４５】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−４６】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−４７】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−４８】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−４９】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−５０】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−５１】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−５２】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−５３】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−５４】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−５５】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−５６】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−５７】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−５８】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−５９】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−６０】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−６１】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−６２】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−６３】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−６４】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−６５】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−６６】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−６７】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−６８】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−６９】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−７０】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−７１】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−７２】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−７３】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−７４】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−７５】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−７６】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−７７】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−７８】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−７９】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−８０】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−８１】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−８２】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−８３】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−８４】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−８５】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−８６】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−８７】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−８８】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−８９】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−９０】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−９１】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−９２】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−９３】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−９４】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−９５】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−９６】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−９７】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−９８】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−９９】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−１００】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図５−１０１】2C9-FGループK206Eの改良構造を示す表8である。
【図６−１】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−２】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−３】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−４】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−５】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−６】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−７】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−８】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−９】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−１０】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−１１】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−１２】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−１３】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−１４】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−１５】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−１６】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−１７】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−１８】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−１９】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−２０】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−２１】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−２２】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−２３】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−２４】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−２５】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−２６】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−２７】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−２８】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−２９】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−３０】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−３１】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−３２】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−３３】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−３４】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−３５】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−３６】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−３７】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−３８】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−３９】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図６−４０】本発明のタンパク質の結晶が得られる諸条件を示す表11である。
【図７−１】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−２】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−３】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−４】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−５】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−６】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−７】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−８】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−９】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−１０】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−１１】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−１２】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−１３】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−１４】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−１５】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−１６】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−１７】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−１８】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−１９】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−２０】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−２１】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−２２】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−２３】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−２４】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−２５】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−２６】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−２７】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−２８】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−２９】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−３０】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−３１】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−３２】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−３３】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−３４】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−３５】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−３６】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−３７】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−３８】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−３９】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−４０】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−４１】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−４２】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−４３】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−４４】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−４５】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−４６】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−４７】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−４８】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−４９】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−５０】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図７−５１】2C19の相同モデルを示す表18である。
【図８−１】2C18置換座標を示す表19である。
【図８−２】2C18置換座標を示す表19である。
【図８−３】2C18置換座標を示す表19である。
【図８−４】2C18置換座標を示す表19である。
【図８−５】2C18置換座標を示す表19である。
【図８−６】2C18置換座標を示す表19である。
【図８−７】2C18置換座標を示す表19である。
【図８−８】2C18置換座標を示す表19である。
【図８−９】2C18置換座標を示す表19である。
【図８−１０】2C18置換座標を示す表19である。
【図９−１】2C8置換座標を示す表20である。
【図９−２】2C8置換座標を示す表20である。
【図９−３】2C8置換座標を示す表20である。
【図９−４】2C8置換座標を示す表20である。
【図９−５】2C8置換座標を示す表20である。
【図９−６】2C8置換座標を示す表20である。
【図９−７】2C8置換座標を示す表20である。
【図９−８】2C8置換座標を示す表20である。
【図９−９】2C8置換座標を示す表20である。
【図９−１０】2C8置換座標を示す表20である。
【図９−１１】2C8置換座標を示す表20である。
【図９−１２】2C8置換座標を示す表20である。
【図１０】N末端切断2C9変異体および2C9truncと公表された2C9野生型配列（Meehan等、1988、Am. J.Hum. Genet. 42、26）の配列アラインメントを示す図である。
【図１１】4-ジクロフェナクヒドロキシラーゼ・アッセイのデータを示す図である。
【配列表】
2005522989.tif 000019
2005522989.tif 000020
2005522989.tif 000021
2005522989.tif 000022
2005522989.tif 000023
2005522989.tif 000024
2005522989.tif 000025
2005522989.tif 000026
2005522989.tif 000027
2005522989.tif 000028
2005522989.tif 000029
2005522989.tif 000030
2005522989.tif 000031
2005522989.tif 000032
2005522989.tif 000033
2005522989.tif 000034
2005522989.tif 000035
2005522989.tif 000036
2005522989.tif 000037
2005522989.tif 000038
2005522989.tif 000039
2005522989.tif 000040
2005522989.tif 000041
2005522989.tif 000042
【図１−１】
2005522989.tif 000043
【図１−２】
2005522989.tif 000044
【図１−３】
2005522989.tif 000045
【図１−４】
2005522989.tif 000046
【図１−５】
2005522989.tif 000047
【図１−６】
2005522989.tif 000048
【図１−７】
2005522989.tif 000049
【図１−８】
2005522989.tif 000050
【図１−９】
2005522989.tif 000051
【図１−１０】
2005522989.tif 000052
【図１−１１】
2005522989.tif 000053
【図１−１２】
2005522989.tif 000054
【図１−１３】
2005522989.tif 000055
【図１−１４】
2005522989.tif 000056
【図１−１５】
2005522989.tif 000057
【図１−１６】
2005522989.tif 000058
【図１−１７】
2005522989.tif 000059
【図１−１８】
2005522989.tif 000060
【図１−１９】
2005522989.tif 000061
【図１−２０】
2005522989.tif 000062
【図１−２１】
2005522989.tif 000063
【図１−２２】
2005522989.tif 000064
【図１−２３】
2005522989.tif 000065
【図１−２４】
2005522989.tif 000066
【図１−２５】
2005522989.tif 000067
【図１−２６】
2005522989.tif 000068
【図１−２７】
2005522989.tif 000069
【図１−２８】
2005522989.tif 000070
【図１−２９】
2005522989.tif 000071
【図１−３０】
2005522989.tif 000072
【図１−３１】
2005522989.tif 000073
【図１−３２】
2005522989.tif 000074
【図１−３３】
2005522989.tif 000075
【図１−３４】
2005522989.tif 000076
【図１−３５】
2005522989.tif 000077
【図１−３６】
2005522989.tif 000078
【図１−３７】
2005522989.tif 000079
【図１−３８】
2005522989.tif 000080
【図１−３９】
2005522989.tif 000081
【図１−４０】
2005522989.tif 000082
【図１−４１】
2005522989.tif 000083
【図１−４２】
2005522989.tif 000084
【図１−４３】
2005522989.tif 000085
【図１−４４】
2005522989.tif 000086
【図１−４５】
2005522989.tif 000087
【図１−４６】
2005522989.tif 000088
【図１−４７】
2005522989.tif 000089
【図１−４８】
2005522989.tif 000090
【図１−４９】
2005522989.tif 000091
【図１−５０】
2005522989.tif 000092
【図１−５１】
2005522989.tif 000093
【図１−５２】
2005522989.tif 000094
【図１−５３】
2005522989.tif 000095
【図１−５４】
2005522989.tif 000096
【図１−５５】
2005522989.tif 000097
【図１−５６】
2005522989.tif 000098
【図１−５７】
2005522989.tif 000099
【図１−５８】
2005522989.tif 000100
【図１−５９】
2005522989.tif 000101
【図１−６０】
2005522989.tif 000102
【図１−６１】
2005522989.tif 000103
【図１−６２】
2005522989.tif 000104
【図１−６３】
2005522989.tif 000105
【図１−６４】
2005522989.tif 000106
【図１−６５】
2005522989.tif 000107
【図１−６６】
2005522989.tif 000108
【図１−６７】
2005522989.tif 000109
【図１−６８】
2005522989.tif 000110
【図１−６９】
2005522989.tif 000111
【図１−７０】
2005522989.tif 000112
【図１−７１】
2005522989.tif 000113
【図１−７２】
2005522989.tif 000114
【図１−７３】
2005522989.tif 000115
【図１−７４】
2005522989.tif 000116
【図１−７５】
2005522989.tif 000117
【図１−７６】
2005522989.tif 000118
【図１−７７】
2005522989.tif 000119
【図１−７８】
2005522989.tif 000120
【図１−７９】
2005522989.tif 000121
【図１−８０】
2005522989.tif 000122
【図１−８１】
2005522989.tif 000123
【図１−８２】
2005522989.tif 000124
【図１−８３】
2005522989.tif 000125
【図１−８４】
2005522989.tif 000126
【図１−８５】
2005522989.tif 000127
【図１−８６】
2005522989.tif 000128
【図１−８７】
2005522989.tif 000129
【図１−８８】
2005522989.tif 000130
【図１−８９】
2005522989.tif 000131
【図１−９０】
2005522989.tif 000132
【図１−９１】
2005522989.tif 000133
【図１−９２】
2005522989.tif 000134
【図１−９３】
2005522989.tif 000135
【図１−９４】
2005522989.tif 000136
【図１−９５】
2005522989.tif 000137
【図１−９６】
2005522989.tif 000138
【図１−９７】
2005522989.tif 000139
【図２−１】
2005522989.tif 000140
【図２−２】
2005522989.tif 000141
【図２−３】
2005522989.tif 000142
【図２−４】
2005522989.tif 000143
【図２−５】
2005522989.tif 000144
【図２−６】
2005522989.tif 000145
【図２−７】
2005522989.tif 000146
【図２−８】
2005522989.tif 000147
【図２−９】
2005522989.tif 000148
【図２−１０】
2005522989.tif 000149
【図２−１１】
2005522989.tif 000150
【図２−１２】
2005522989.tif 000151
【図２−１３】
2005522989.tif 000152
【図２−１４】
2005522989.tif 000153
【図２−１５】
2005522989.tif 000154
【図２−１６】
2005522989.tif 000155
【図２−１７】
2005522989.tif 000156
【図２−１８】
2005522989.tif 000157
【図２−１９】
2005522989.tif 000158
【図２−２０】
2005522989.tif 000159
【図２−２１】
2005522989.tif 000160
【図２−２２】
2005522989.tif 000161
【図２−２３】
2005522989.tif 000162
【図２−２４】
2005522989.tif 000163
【図２−２５】
2005522989.tif 000164
【図２−２６】
2005522989.tif 000165
【図２−２７】
2005522989.tif 000166
【図２−２８】
2005522989.tif 000167
【図２−２９】
2005522989.tif 000168
【図２−３０】
2005522989.tif 000169
【図２−３１】
2005522989.tif 000170
【図２−３２】
2005522989.tif 000171
【図２−３３】
2005522989.tif 000172
【図２−３４】
2005522989.tif 000173
【図２−３５】
2005522989.tif 000174
【図２−３６】
2005522989.tif 000175
【図２−３７】
2005522989.tif 000176
【図２−３８】
2005522989.tif 000177
【図２−３９】
2005522989.tif 000178
【図２−４０】
2005522989.tif 000179
【図２−４１】
2005522989.tif 000180
【図２−４２】
2005522989.tif 000181
【図２−４３】
2005522989.tif 000182
【図２−４４】
2005522989.tif 000183
【図２−４５】
2005522989.tif 000184
【図２−４６】
2005522989.tif 000185
【図２−４７】
2005522989.tif 000186
【図２−４８】
2005522989.tif 000187
【図２−４９】
2005522989.tif 000188
【図２−５０】
2005522989.tif 000189
【図２−５１】
2005522989.tif 000190
【図２−５２】
2005522989.tif 000191
【図２−５３】
2005522989.tif 000192
【図２−５４】
2005522989.tif 000193
【図２−５５】
2005522989.tif 000194
【図２−５６】
2005522989.tif 000195
【図２−５７】
2005522989.tif 000196
【図２−５８】
2005522989.tif 000197
【図２−５９】
2005522989.tif 000198
【図２−６０】
2005522989.tif 000199
【図２−６１】
2005522989.tif 000200
【図２−６２】
2005522989.tif 000201
【図２−６３】
2005522989.tif 000202
【図２−６４】
2005522989.tif 000203
【図２−６５】
2005522989.tif 000204
【図２−６６】
2005522989.tif 000205
【図２−６７】
2005522989.tif 000206
【図２−６８】
2005522989.tif 000207
【図２−６９】
2005522989.tif 000208
【図２−７０】
2005522989.tif 000209
【図２−７１】
2005522989.tif 000210
【図２−７２】
2005522989.tif 000211
【図２−７３】
2005522989.tif 000212
【図２−７４】
2005522989.tif 000213
【図２−７５】
2005522989.tif 000214
【図２−７６】
2005522989.tif 000215
【図２−７７】
2005522989.tif 000216
【図２−７８】
2005522989.tif 000217
【図２−７９】
2005522989.tif 000218
【図２−８０】
2005522989.tif 000219
【図２−８１】
2005522989.tif 000220
【図２−８２】
2005522989.tif 000221
【図２−８３】
2005522989.tif 000222
【図２−８４】
2005522989.tif 000223
【図２−８５】
2005522989.tif 000224
【図２−８６】
2005522989.tif 000225
【図２−８７】
2005522989.tif 000226
【図２−８８】
2005522989.tif 000227
【図２−８９】
2005522989.tif 000228
【図２−９０】
2005522989.tif 000229
【図２−９１】
2005522989.tif 000230
【図２−９２】
2005522989.tif 000231
【図２−９３】
2005522989.tif 000232
【図２−９４】
2005522989.tif 000233
【図２−９５】
2005522989.tif 000234
【図２−９６】
2005522989.tif 000235
【図２−９７】
2005522989.tif 000236
【図２−９８】
2005522989.tif 000237
【図２−９９】
2005522989.tif 000238
【図３−１】
2005522989.tif 000239
【図３−２】
2005522989.tif 000240
【図３−３】
2005522989.tif 000241
【図３−４】
2005522989.tif 000242
【図３−５】
2005522989.tif 000243
【図３−６】
2005522989.tif 000244
【図３−７】
2005522989.tif 000245
【図３−８】
2005522989.tif 000246
【図３−９】
2005522989.tif 000247
【図３−１０】
2005522989.tif 000248
【図３−１１】
2005522989.tif 000249
【図３−１２】
2005522989.tif 000250
【図３−１３】
2005522989.tif 000251
【図３−１４】
2005522989.tif 000252
【図３−１５】
2005522989.tif 000253
【図３−１６】
2005522989.tif 000254
【図３−１７】
2005522989.tif 000255
【図３−１８】
2005522989.tif 000256
【図３−１９】
2005522989.tif 000257
【図３−２０】
2005522989.tif 000258
【図３−２１】
2005522989.tif 000259
【図３−２２】
2005522989.tif 000260
【図３−２３】
2005522989.tif 000261
【図３−２４】
2005522989.tif 000262
【図３−２５】
2005522989.tif 000263
【図３−２６】
2005522989.tif 000264
【図３−２７】
2005522989.tif 000265
【図３−２８】
2005522989.tif 000266
【図３−２９】
2005522989.tif 000267
【図３−３０】
2005522989.tif 000268
【図３−３１】
2005522989.tif 000269
【図３−３２】
2005522989.tif 000270
【図３−３３】
2005522989.tif 000271
【図３−３４】
2005522989.tif 000272
【図３−３５】
2005522989.tif 000273
【図３−３６】
2005522989.tif 000274
【図３−３７】
2005522989.tif 000275
【図３−３８】
2005522989.tif 000276
【図３−３９】
2005522989.tif 000277
【図３−４０】
2005522989.tif 000278
【図３−４１】
2005522989.tif 000279
【図３−４２】
2005522989.tif 000280
【図３−４３】
2005522989.tif 000281
【図３−４４】
2005522989.tif 000282
【図３−４５】
2005522989.tif 000283
【図３−４６】
2005522989.tif 000284
【図３−４７】
2005522989.tif 000285
【図３−４８】
2005522989.tif 000286
【図３−４９】
2005522989.tif 000287
【図３−５０】
2005522989.tif 000288
【図３−５１】
2005522989.tif 000289
【図３−５２】
2005522989.tif 000290
【図３−５３】
2005522989.tif 000291
【図３−５４】
2005522989.tif 000292
【図３−５５】
2005522989.tif 000293
【図３−５６】
2005522989.tif 000294
【図３−５７】
2005522989.tif 000295
【図３−５８】
2005522989.tif 000296
【図３−５９】
2005522989.tif 000297
【図３−６０】
2005522989.tif 000298
【図３−６１】
2005522989.tif 000299
【図３−６２】
2005522989.tif 000300
【図３−６３】
2005522989.tif 000301
【図３−６４】
2005522989.tif 000302
【図３−６５】
2005522989.tif 000303
【図３−６６】
2005522989.tif 000304
【図３−６７】
2005522989.tif 000305
【図３−６８】
2005522989.tif 000306
【図３−６９】
2005522989.tif 000307
【図３−７０】
2005522989.tif 000308
【図３−７１】
2005522989.tif 000309
【図３−７２】
2005522989.tif 000310
【図３−７３】
2005522989.tif 000311
【図３−７４】
2005522989.tif 000312
【図３−７５】
2005522989.tif 000313
【図３−７６】
2005522989.tif 000314
【図３−７７】
2005522989.tif 000315
【図３−７８】
2005522989.tif 000316
【図３−７９】
2005522989.tif 000317
【図３−８０】
2005522989.tif 000318
【図３−８１】
2005522989.tif 000319
【図３−８２】
2005522989.tif 000320
【図３−８３】
2005522989.tif 000321
【図３−８４】
2005522989.tif 000322
【図３−８５】
2005522989.tif 000323
【図３−８６】
2005522989.tif 000324
【図３−８７】
2005522989.tif 000325
【図３−８８】
2005522989.tif 000326
【図３−８９】
2005522989.tif 000327
【図３−９０】
2005522989.tif 000328
【図３−９１】
2005522989.tif 000329
【図３−９２】
2005522989.tif 000330
【図３−９３】
2005522989.tif 000331
【図３−９４】
2005522989.tif 000332
【図３−９５】
2005522989.tif 000333
【図３−９６】
2005522989.tif 000334
【図３−９７】
2005522989.tif 000335
【図３−９８】
2005522989.tif 000336
【図３−９９】
2005522989.tif 000337
【図３−１００】
2005522989.tif 000338
【図４−１】
2005522989.tif 000339
【図４−２】
2005522989.tif 000340
【図５−１】
2005522989.tif 000341
【図５−２】
2005522989.tif 000342
【図５−３】
2005522989.tif 000343
【図５−４】
2005522989.tif 000344
【図５−５】
2005522989.tif 000345
【図５−６】
2005522989.tif 000346
【図５−７】
2005522989.tif 000347
【図５−８】
2005522989.tif 000348
【図５−９】
2005522989.tif 000349
【図５−１０】
2005522989.tif 000350
【図５−１１】
2005522989.tif 000351
【図５−１２】
2005522989.tif 000352
【図５−１３】
2005522989.tif 000353
【図５−１４】
2005522989.tif 000354
【図５−１５】
2005522989.tif 000355
【図５−１６】
2005522989.tif 000356
【図５−１７】
2005522989.tif 000357
【図５−１８】
2005522989.tif 000358
【図５−１９】
2005522989.tif 000359
【図５−２０】
2005522989.tif 000360
【図５−２１】
2005522989.tif 000361
【図５−２２】
2005522989.tif 000362
【図５−２３】
2005522989.tif 000363
【図５−２４】
2005522989.tif 000364
【図５−２５】
2005522989.tif 000365
【図５−２６】
2005522989.tif 000366
【図５−２７】
2005522989.tif 000367
【図５−２８】
2005522989.tif 000368
【図５−２９】
2005522989.tif 000369
【図５−３０】
2005522989.tif 000370
【図５−３１】
2005522989.tif 000371
【図５−３２】
2005522989.tif 000372
【図５−３３】
2005522989.tif 000373
【図５−３４】
2005522989.tif 000374
【図５−３５】
2005522989.tif 000375
【図５−３６】
2005522989.tif 000376
【図５−３７】
2005522989.tif 000377
【図５−３８】
2005522989.tif 000378
【図５−３９】
2005522989.tif 000379
【図５−４０】
2005522989.tif 000380
【図５−４１】
2005522989.tif 000381
【図５−４２】
2005522989.tif 000382
【図５−４３】
2005522989.tif 000383
【図５−４４】
2005522989.tif 000384
【図５−４５】
2005522989.tif 000385
【図５−４６】
2005522989.tif 000386
【図５−４７】
2005522989.tif 000387
【図５−４８】
2005522989.tif 000388
【図５−４９】
2005522989.tif 000389
【図５−５０】
2005522989.tif 000390
【図５−５１】
2005522989.tif 000391
【図５−５２】
2005522989.tif 000392
【図５−５３】
2005522989.tif 000393
【図５−５４】
2005522989.tif 000394
【図５−５５】
2005522989.tif 000395
【図５−５６】
2005522989.tif 000396
【図５−５７】
2005522989.tif 000397
【図５−５８】
2005522989.tif 000398
【図５−５９】
2005522989.tif 000399
【図５−６０】
2005522989.tif 000400
【図５−６１】
2005522989.tif 000401
【図５−６２】
2005522989.tif 000402
【図５−６３】
2005522989.tif 000403
【図５−６４】
2005522989.tif 000404
【図５−６５】
2005522989.tif 000405
【図５−６６】
2005522989.tif 000406
【図５−６７】
2005522989.tif 000407
【図５−６８】
2005522989.tif 000408
【図５−６９】
2005522989.tif 000409
【図５−７０】
2005522989.tif 000410
【図５−７１】
2005522989.tif 000411
【図５−７２】
2005522989.tif 000412
【図５−７３】
2005522989.tif 000413
【図５−７４】
2005522989.tif 000414
【図５−７５】
2005522989.tif 000415
【図５−７６】
2005522989.tif 000416
【図５−７７】
2005522989.tif 000417
【図５−７８】
2005522989.tif 000418
【図５−７９】
2005522989.tif 000419
【図５−８０】
2005522989.tif 000420
【図５−８１】
2005522989.tif 000421
【図５−８２】
2005522989.tif 000422
【図５−８３】
2005522989.tif 000423
【図５−８４】
2005522989.tif 000424
【図５−８５】
2005522989.tif 000425
【図５−８６】
2005522989.tif 000426
【図５−８７】
2005522989.tif 000427
【図５−８８】
2005522989.tif 000428
【図５−８９】
2005522989.tif 000429
【図５−９０】
2005522989.tif 000430
【図５−９１】
2005522989.tif 000431
【図５−９２】
2005522989.tif 000432
【図５−９３】
2005522989.tif 000433
【図５−９４】
2005522989.tif 000434
【図５−９５】
2005522989.tif 000435
【図５−９６】
2005522989.tif 000436
【図５−９７】
2005522989.tif 000437
【図５−９８】
2005522989.tif 000438
【図５−９９】
2005522989.tif 000439
【図５−１００】
2005522989.tif 000440
【図５−１０１】
2005522989.tif 000441
【図６−１】
2005522989.tif 000442
【図６−２】
2005522989.tif 000443
【図６−３】
2005522989.tif 000444
【図６−４】
2005522989.tif 000445
【図６−５】
2005522989.tif 000446
【図６−６】
2005522989.tif 000447
【図６−７】
2005522989.tif 000448
【図６−８】
2005522989.tif 000449
【図６−９】
2005522989.tif 000450
【図６−１０】
2005522989.tif 000451
【図６−１１】
2005522989.tif 000452
【図６−１２】
2005522989.tif 000453
【図６−１３】
2005522989.tif 000454
【図６−１４】
2005522989.tif 000455
【図６−１５】
2005522989.tif 000456
【図６−１６】
2005522989.tif 000457
【図６−１７】
2005522989.tif 000458
【図６−１８】
2005522989.tif 000459
【図６−１９】
2005522989.tif 000460
【図６−２０】
2005522989.tif 000461
【図６−２１】
2005522989.tif 000462
【図６−２２】
2005522989.tif 000463
【図６−２３】
2005522989.tif 000464
【図６−２４】
2005522989.tif 000465
【図６−２５】
2005522989.tif 000466
【図６−２６】
2005522989.tif 000467
【図６−２７】
2005522989.tif 000468
【図６−２８】
2005522989.tif 000469
【図６−２９】
2005522989.tif 000470
【図６−３０】
2005522989.tif 000471
【図６−３１】
2005522989.tif 000472
【図６−３２】
2005522989.tif 000473
【図６−３３】
2005522989.tif 000474
【図６−３４】
2005522989.tif 000475
【図６−３５】
2005522989.tif 000476
【図６−３６】
2005522989.tif 000477
【図６−３７】
2005522989.tif 000478
【図６−３８】
2005522989.tif 000479
【図６−３９】
2005522989.tif 000480
【図６−４０】
2005522989.tif 000481
【図７−１】
2005522989.tif 000482
【図７−２】
2005522989.tif 000483
【図７−３】
2005522989.tif 000484
【図７−４】
2005522989.tif 000485
【図７−５】
2005522989.tif 000486
【図７−６】
2005522989.tif 000487
【図７−７】
2005522989.tif 000488
【図７−８】
2005522989.tif 000489
【図７−９】
2005522989.tif 000490
【図７−１０】
2005522989.tif 000491
【図７−１１】
2005522989.tif 000492
【図７−１２】
2005522989.tif 000493
【図７−１３】
2005522989.tif 000494
【図７−１４】
2005522989.tif 000495
【図７−１５】
2005522989.tif 000496
【図７−１６】
2005522989.tif 000497
【図７−１７】
2005522989.tif 000498
【図７−１８】
2005522989.tif 000499
【図７−１９】
2005522989.tif 000500
【図７−２０】
2005522989.tif 000501
【図７−２１】
2005522989.tif 000502
【図７−２２】
2005522989.tif 000503
【図７−２３】
2005522989.tif 000504
【図７−２４】
2005522989.tif 000505
【図７−２５】
2005522989.tif 000506
【図７−２６】
2005522989.tif 000507
【図７−２７】
2005522989.tif 000508
【図７−２８】
2005522989.tif 000509
【図７−２９】
2005522989.tif 000510
【図７−３０】
2005522989.tif 000511
【図７−３１】
2005522989.tif 000512
【図７−３２】
2005522989.tif 000513
【図７−３３】
2005522989.tif 000514
【図７−３４】
2005522989.tif 000515
【図７−３５】
2005522989.tif 000516
【図７−３６】
2005522989.tif 000517
【図７−３７】
2005522989.tif 000518
【図７−３８】
2005522989.tif 000519
【図７−３９】
2005522989.tif 000520
【図７−４０】
2005522989.tif 000521
【図７−４１】
2005522989.tif 000522
【図７−４２】
2005522989.tif 000523
【図７−４３】
2005522989.tif 000524
【図７−４４】
2005522989.tif 000525
【図７−４５】
2005522989.tif 000526
【図７−４６】
2005522989.tif 000527
【図７−４７】
2005522989.tif 000528
【図７−４８】
2005522989.tif 000529
【図７−４９】
2005522989.tif 000530
【図７−５０】
2005522989.tif 000531
【図７−５１】
2005522989.tif 000532
【図８−１】
2005522989.tif 000533
【図８−２】
2005522989.tif 000534
【図８−３】
2005522989.tif 000535
【図８−４】
2005522989.tif 000536
【図８−５】
2005522989.tif 000537
【図８−６】
2005522989.tif 000538
【図８−７】
2005522989.tif 000539
【図８−８】
2005522989.tif 000540
【図８−９】
2005522989.tif 000541
【図８−１０】
2005522989.tif 000542
【図９−１】
2005522989.tif 000543
【図９−２】
2005522989.tif 000544
【図９−３】
2005522989.tif 000545
【図９−４】
2005522989.tif 000546
【図９−５】
2005522989.tif 000547
【図９−６】
2005522989.tif 000548
【図９−７】
2005522989.tif 000549
【図９−８】
2005522989.tif 000550
【図９−９】
2005522989.tif 000551
【図９−１０】
2005522989.tif 000552
【図９−１１】
2005522989.tif 000553
【図９−１２】
2005522989.tif 000554
【図１０】
2005522989.tif 000555
【図１１】
2005522989.tif 000556
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月21日(2003.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２における残基12〜471に相当し、野生型における220位または222位をプロリン置換することで修飾された、野生型配列の残基31〜490を含み、
場合によっては最大で30個の他の位置が変更され、31位よりN末端側の領域が図10の野生型以外である
P450 2C9タンパク質変異体。
【請求項２】
221位がプロリンではない、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記最大で30個の他の位置は、他のチトクロムP450分子中の対応する位置に存在する残基が導入されるように変更されている、請求項1または2に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記別のチトクロムP450分子が2C19、2C18および2C8からなる群から選択される、請求項3に記載のタンパク質。
【請求項５】
配列番号（2x＋2）（式中、xは1〜52の整数である）からなる群から選択される、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項６】
結晶状の前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
リガンドと複合体形成した2C9 P450タンパク質を含む結晶化可能な組成物。
【請求項８】
三方晶系空間群P321を有するP450 2C9タンパク質の結晶。
【請求項９】
単位格子寸法が、
a＝b＝165.46Å±5%、およびc＝111.70Å±5%と、
a＝b＝161.35Å±5%、およびc＝110.75Å±5%と、
a＝b＝163.95Å±5%、およびc＝111.06Å±5%とからなる群から選択される、請求項8に記載の結晶。
【請求項１０】
3.1Åよりも優れた分解能を有するP450 2C9タンパク質の結晶。
【請求項１１】
表1、2、3または8の座標によって規定される構造を有するP450タンパク質の結晶。
【請求項１２】
P450 2C9タンパク質結晶を生成させる方法であって、0〜0.2M Tris-HCl（pH8〜9）、0〜0.25M Li2SO4、0〜20%PEG 4000を含む沈殿剤溶液を用いる懸滴蒸気拡散技法を含む方法。
【請求項１３】
分子構造とP450構造との相互作用を分析するためのコンピュータ・ベースの方法であって、
表1、2、3、8または18のP450構造またはその選択座標を準備するステップと、
前記P450構造またはその選択座標に一致させる分子構造を準備するステップと、
前記分子構造を前記P450構造に一致させるステップとを含む方法。
【請求項１４】
前記選択座標が表4の1つまたは複数の残基からの原子を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記原子の少なくとも1つが表6の残基に由来する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記分子構造を有する化合物を入手または合成するステップと、
前記化合物をP450タンパク質と接触させて前記P450と相互作用する前記化合物の能力を決定するステップとをさらに含む、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記分子構造を有する化合物を入手または合成するステップと、
2C9 P450タンパク質と前記化合物の複合体を形成するステップと、
X線結晶学によって前記複合体を解析して、前記P450と相互作用する前記化合物の能力を決定するステップとをさらに含む、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記分子構造を有する化合物を入手または合成するステップと、
前記化合物が前記P450構造体によってどのように代謝されるかを決定または予測するステップと、
前記化合物構造と前記P450との相互作用を変えるように前記化合物構造を改変するステップとをさらに含む、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項18の方法を用いて同定された改変構造を有する化合物。
【請求項２０】
未知構造のP450ホモログまたはアナログの3次元構造を予測する方法であって、
未知3次元構造の標的P450タンパク質のアミノ酸配列の表示を表1、2、3、8または18のP450のアミノ酸配列と整列させて前記各アミノ酸配列の相同領域を一致させるステップと、
未知構造の前記標的P450における一致した相同領域の構造を、表1、2、3、8または18によって規定されるP450構造の対応する領域を基にしてモデリングするステップと、
前記一致した相同領域の構造を実質的に保存する未知構造を有する前記標的P450のコンホメーションを決定するステップとを含む方法。
【請求項２１】
前記標的P450タンパク質が、2C8、2C18および2C19からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
P450 2C9タンパク質の基質特異性と実質的に同じ基質特異性をもたらす結合空隙を有するキメラ・タンパク質であって、
前記キメラ・タンパク質結合空隙に、P450 2C9結合空隙に沿って並ぶ選択されたP450 2C9原子に対応する複数の原子が並び、前記複数の原子の相対位置が、表1、2、3または8によって規定される前記選択されたP450 2C9原子の相対位置に対応する、キメラ・タンパク質。
【請求項２３】
タンパク質の構造を決定する方法であって、
表1、2、3、8もしくは18の座標、またはその選択座標を準備するステップと、
（a）前記タンパク質の構造をもたらすように、前記タンパク質の結晶単位格子中に前記座標を配置するステップ、または（b）前記座標を操作することによって前記タンパク質のNMRスペクトル・ピークを割り当てるステップのどちらかとを含む方法。
【請求項２４】
P450タンパク質に結合する化合物の構造を決定する方法であって、
P450タンパク質の結晶を準備するステップと、
前記結晶に前記化合物をソーキングして複合体を形成するステップと、
表1、2、3、8もしくは18のデータまたはその一部を使用することによって前記複合体の構造を決定するステップとを含む方法。
【請求項２５】
P450タンパク質に結合する化合物の構造を決定する方法であって、
P450タンパク質を前記化合物と混合するステップと、
P450タンパク質-化合物複合体を結晶化させるステップと、
表1、2、3、8もしくは18のデータまたはその一部を使用することによって複合体の構造を決定するステップとを含む方法。
【請求項２６】
P450 2C9タンパク質と相互作用する化合物の能力を評価する方法であって、
前記化合物を入手または合成するステップと、
P450 2C9タンパク質と前記化合物の結晶化複合体を形成させ、前記複合体がX線を回折して3.1Åよりも優れた分解能で前記複合体の原子座標を決定するステップと、
前記複合体をX線結晶学的に解析して、前記P450 2C9タンパク質と相互作用する前記化合物の能力を決定するステップとを含む方法。
【請求項２７】
P450、P450ホモログもしくはアナログ、P450と化合物の複合体、またはP450ホモログもしくはアナログと化合物の複合体に対して相互作用する化合物の構造を生成しおよび/または最適化を実施するためのコンピュータ・システムであって、
（a）P450の3次元構造または少なくともその選択座標を規定する表1、2、3、8または18による原子座標データと、
（b）表1、2、3、8または18の前記原子座標データから導出可能であるP450の構造因子データと、
（c）表1、2、3、8または18の前記データに基づく標的P450タンパク質の相同モデリングによって作成される前記標的P450タンパク質の原子座標データと、
（d）表1、2、3、8または18の前記データを参照してX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成される標的P450タンパク質の原子座標データと、
（e）（c）または（d）の原子座標データから導出可能である構造因子データ
の1つまたは複数を含むコンピュータ読取り可能なデータを含むコンピュータ・システム。
【請求項２８】
前記原子座標データが、表4の残基によって与えられる原子の少なくとも1つに対するものである、請求項27に記載のコンピュータ・システム。
【請求項２９】
（i）前記コンピュータ読取り可能なデータがコード化されたデータ記憶材料を含むコンピュータ読取り可能なデータ記憶媒体と、
（ii）前記コンピュータ読取り可能なデータを処理するための命令を保存するワーキング・メモリと、
（iii）前記コンピュータ読取り可能なデータを処理し、それによって構造を作成しかつ/または合理的なドラッグ・デザインを実施する、前記ワーキング・メモリおよび前記コンピュータ読取り可能なデータ記憶媒体に接続された中央処理装置とを備える、請求項27または28に記載のコンピュータ・システム。
【請求項３０】
前記中央処理装置に接続されて前記構造を表示するディスプレイをさらに含む請求項29に記載のコンピュータ・システム。
【請求項３１】
P450、P450ホモログもしくはアナログ、P450と化合物の複合体、またはP450ホモログもしくはアナログと化合物の複合体に対して相互作用する化合物の構造を生成しおよび/または最適化を実施するためのデータを提供する方法であって、
（i）（a）P450の3次元構造、またはP450の複数の原子の座標を規定する表1、2、3、8もしくは18による原子座標データと、（b）表1、2、3、8もしくは18の原子座標データから導出可能であるP450の構造因子データと、（c）表1、2、3、8または18のデータに基づく標的P450ホモログまたはアナログの相同モデリングによって作成される前記標的P450ホモログまたはアナログの原子座標データと、（d）表1、2、3、8または18のデータを参照してX線結晶学的データまたはNMRデータを解釈することによって作成されるタンパク質の原子座標データと、（e）（c）または（d）の原子座標データから導出可能である構造因子データのうちの少なくとも1つを含むコンピュータ読取り可能なデータを含む遠隔装置との通信を確立するステップと、
（ii）前記コンピュータ読取り可能なデータを前記遠隔装置から受信するステップとを含む方法。
【請求項３２】
コンピュータ読取り可能なデータをコード化したデータ記憶材料を含むコンピュータ読取り可能な記憶媒体であって、前記データが、
（a）P450の3次元構造または少なくともその選択座標を規定する表1、2、3、8または18による原子座標データと、
（b）表1、2、3、8または18の原子座標データから導出可能であるP450の構造因子データと、
（c）表1、2、3、8または18のデータに基づく標的P450タンパク質の相同モデルによって作成される前記標的P450タンパク質の原子座標データと、
（d）表1、2、3、8または18のデータを参照してX線結晶学的データまたはNMRデータを解釈することによって作成される標的P450タンパク質の原子座標データと、
（e）（c）または（d）の原子座標データから導出可能である構造因子データとによって規定されるコンピュータ読取り可能な記憶媒体。
【請求項３３】
前記原子座標データが表4の残基によって与えられる原子の少なくとも1つに対するものである、請求項32に記載のコンピュータ読取り可能な記憶媒体。
【請求項３４】
コンピュータ読取り可能なデータをコードするデータ記憶材料を含むコンピュータ読取り可能な記憶媒体であって、前記データが表1、2、3、8もしくは18のP450タンパク質の構造座標のすべてもしくは一部、またはP450のホモログによって規定され、前記ホモログが表1、2、3、8または18の骨格原子からの二乗平均平方根偏差が2.0Å以下である骨格原子を含む、コンピュータ読取り可能な記憶媒体。
【請求項３５】
表1、2、3、8または18によるP450タンパク質の構造座標の少なくとも一部のフーリエ変換を含む第1のセットのコンピュータ読取り可能なデータがコード化されたデータ記憶材料を含むコンピュータ読取り可能な記憶媒体であって、前記データが、未知構造の分子または分子複合体のX線回折パターンを含む第2のセットの機械読取り可能なデータと組み合わされたときに、前記第1のセットのデータおよび前記第2のセットのデータを使用するための命令がプログラムされた機械を用いて、第2のセットの機械読取り可能なデータに対応する構造座標の少なくとも一部を決定することができる、コンピュータ読取り可能な記憶媒体。
【請求項３６】
請求項1から5のいずれか一項に記載の2C9タンパク質をコードする配列を含む核酸。
【請求項３７】
プロモーターに作動可能に結合された請求項36に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３８】
請求項37に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３９】
タンパク質を発現する条件下で請求項38の宿主細胞を培養するステップと、前記タンパク質を回収するステップとを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のタンパク質を調製する方法。
【請求項４０】
（a）宿主細胞培養物中で前記チトクロム2C9  P450分子を発現するステップと、
（b）前記培養物から前記細胞を回収し、導電率が12〜110mS/cmの塩緩衝液中に前記細胞を懸濁させるステップと、
（c）前記細胞を溶解し、細胞片を除去して高塩濃度溶解物を準備するステップと、
（d）界面活性剤を前記溶解物に添加して（例えば、0.015%〜1.2%v/v）高塩濃度界面活性剤溶解物を準備するステップと、
（e）前記P450を前記溶解物から回収するステップとを含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（e）が、
（e（i））前記2C9 P450を親和性担体に結合させるステップと、
（e（ii））前記担体を高塩濃度界面活性剤ですすぐステップと、
（e（iii））高塩濃度界面活性剤緩衝液中の前記2C9 P450を取り出してP450-高塩濃度界面活性剤調製物を準備するステップとによって実施され、その後
（f）サイズ排除クロマトグラフィによって、緩衝液を、界面活性剤を含まない低イオン強度緩衝液に交換してP450-低濃度塩調製物を準備するステップが実施される、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記タンパク質を結晶化するステップをさらに含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質が請求項12に記載の懸滴法によって結晶化されて結晶を与える、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
前記結晶のX線回折パターンを得るステップをさらに含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
リガンドに結合したチトクロムP450分子のコンピュータによって作成される構造を提供するための表1、2、3、8または18のいずれか1つの原子座標データまたはその選択座標の使用。
【国際調査報告】
2005522989.tif 000557
2005522989.tif 000558
2005522989.tif 000559
2005522989.tif 000560
2005522989.tif 000561
2005522989.tif 000562