(57)【要約】本発明は、免疫療法を実施するために使用することができるウイルスベクターを含む組成物、方法、およびキットを提供する。特に、本発明は、高い形質導入効率で抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)において導入遺伝子配列を発現するように構成されている、B亜群アデノウイルスカプシドファイバーを有するウイルスベクターを提供する。好ましくは、導入遺伝子配列はレトロゲンカセットであり、アデノウイルスカプシドファイバーはAd11ファイバーである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、およびAd50からなる群より選択されるB亜群アデノウイルスカプシドファイバーを含むアデノウイルスカプシド；ならびに
b）i）抗原タンパク質、
ii）該抗原タンパク質のN-末端に結合したリーダー配列、および
iii）抗原のC-末端に結合した細胞結合ドメイン
を含むレトロゲンタンパク質をコードするレトロゲンカセット配列を含む、核酸分子
を含むアデノウイルスベクターを含む、組成物。
【請求項２】
アデノウイルスカプシドファイバーがAd11ファイバーである、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
抗原タンパク質が腫瘍関連抗原である、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
抗原タンパク質がHBeAgである、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
樹状細胞をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
組成物が樹状細胞をさらに含み、かつアデノウイルスベクターが樹状細胞内に存在する、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
a）i）樹状細胞、ならびに
ii）A）Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、およびAd50からなる群より選択されるB亜群アデノウイルスカプシドファイバーを含むアデノウイルスカプシド、および
B）I）抗原タンパク質、
II）該抗原タンパク質のN-末端に結合したリーダー配列、および
III）該抗原タンパク質のC-末端に結合した細胞結合ドメイン
を含むレトロゲンタンパク質をコードするレトロゲンカセット配列を含む核酸分子
を含むアデノウイルスベクターを含む組成物
を提供する段階；ならびに
b）レトロゲンタンパク質が該樹状細胞の少なくとも30%によって発現されるような条件下において、少なくとも5のMOIで該樹状細胞を該組成物と接触させ、それによってレトロゲン発現樹状細胞を作製する段階であって、該抗原タンパク質が、MHCクラス-I抗原およびMHCクラス-II抗原として、レトロゲン発現樹状細胞によって提示される段階
を含む、方法。
【請求項８】
接触させる段階が5〜10のMOIで実施される場合、レトロゲンタンパク質が少なくとも35%の樹状細胞によって発現される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
接触させる段階が10〜100のMOIで実施される場合、レトロゲンタンパク質が少なくとも70%の樹状細胞によって発現される、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
接触させる段階がエクスビボにおいて実施される、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
アデノウイルスカプシドファイバーがAd11ファイバーである、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
抗原タンパク質が腫瘍関連抗原である、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
抗原タンパク質がHBeAgである、請求項7記載の方法。
【請求項１４】
c）レトロゲン発現樹状細胞を患者に投与する段階
をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項１５】
患者がHBV関連肝細胞癌またはHBV感染症を有する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
a）i）樹状細胞、ならびに
ii）A）Ad11カプシドファイバーを含むアデノウイルスカプシド、および
B）関心対象のタンパク質をコードする導入遺伝子配列を含む核酸分子
を含むアデノウイルスベクターを含む組成物
を提供する段階；ならびに
b）該関心対象のタンパク質が、該樹状細胞の少なくとも55%によって発現されるような条件下において、少なくとも5のMOIで樹状細胞を組成物と接触させ、それによって関心対象のタンパク質を発現する樹状細胞を作製する段階
を含む、方法。
【請求項１７】
接触させる段階によって樹状細胞が未成熟状態から成熟状態に進行する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
接触させる段階が10〜100のMOIで実施される場合、関心対象のタンパク質が樹状細胞の少なくとも70%によって発現される、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
接触させる段階が100〜500のMOIで実施される場合、関心対象のタンパク質が樹状細胞の少なくとも90%によって発現される、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
接触させる段階がエクスビボにおいて実施される、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
関心対象のタンパク質がHBeAgである、請求項16記載の方法。
【請求項２２】
c）関心対象のタンパク質を発現する樹状細胞を被験者に投与する段階
をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項２３】
被験者がHBV関連肝細胞癌またはHBV感染症を有する、請求項22記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照として本明細書に組み入れられる2002年4月30日提出の米国仮出願第60/376,498号の優先権を主張する。
【０００２】
本出願の実施例に含まれる研究の一部は、国立保健研究所（National Institute of Health）の助成金番号P01 HL53750の下で政府支援により一部資金の提供を受けた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、免疫療法を実施するために使用することができるウイルスベクターを含む組成物、方法およびキットに関する。特に、本発明は、高い形質導入効率で抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)において導入遺伝子配列を発現するように構成されているB亜群アデノウイルスカプシドファイバーを有するウイルスベクターに関する。好ましくは、導入遺伝子配列はレトロゲン(retrogen)カセットであり、アデノウイルスカプシドファイバーはAd11ファイバーである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
世界的に見て、米国の疾病対策センターは、約3億5000万人がヒトB型肝炎ウイルス(HBV)に感染していることを報告した。感染者の75%はアジアおよび西太平洋に住んでいる。効果的に治療しないと、HBV感染患者の平均5〜10%は慢性肝疾患に進行する。アジアでは、慢性HBV感染率は20〜30%である。中国の一部では、致死的な肝細胞癌(HCC)の80%は慢性HBV感染症によるものである。米国では、約100万人の患者が慢性HBV感染症を有する。この結果として、約15,000人が肝臓癌で死亡し、約20,000人が肝硬変で死亡する。慢性HBV感染とHCCの因果関係は明確に確立されている(参照として本明細書に組み入れられている、BeasleyおよびHwang、Semin. Liver Dis., 4: 113: 21, 1984)。HBVは細胞壊死性ウイルスではなく、肝障害は主にウイルスに感染した肝細胞に対する宿主免役応答、および炎症性サイトカインの産生によって媒介される。HBVに対する活発でポリクローナルかつ多特異性の細胞傷害性T細胞およびヘルパーT細胞は、急性の自己限定的なB型肝炎患者の末梢血において容易に検出可能であるが、慢性感染症またはHCC患者では、弱いか、抗原性が制限されているか、または検出不能である（Kagawaら、Cancer Res., 61: 3330-8, 2001を参照されたい（これは参照として本明細書に組み入れられる））。
【０００５】
慢性HBV感染症およびHBV関連HCCでは、CTLおよびTh活性並びにHCVに対する血清免疫は弱いかまたは存在しないので、HBVコア抗原に対するT細胞応答の治療による増強は、慢性HBV感染症を終結させ、HCCを攻撃する可能性を有する(Ferrariら、J. Immunol., 145: 3442-9, 1990；およびJungら、J. Virol., 69: 3358-68, 1995を参照されたい（これらは共に参照として本明細書に組み入れられる）)。HBV感染症のトランスジェニックマウスモデル、ウッドチャックモデル、またはチンパンジーモデルを用いた研究からのいくつかの証拠は、HBV免疫療法が慢性B型肝炎の治療に有効であることを示唆している（Manciniら、J. Immunol., 161: 5564-70, 1998；およびPancholiら、Hepatology, 33: 448-54, 2001を参照されたい（これらは共に参照として本明細書に組み入れられる））。この流れに沿って、2つの多施設無作為化対照試験により、HBV複製およびウイルス血症を低下させるのにHBVコア抗原免疫療法が有効であることが最近証明された（Polら、J. Hepatol 34: 917-21, 2001；およびLau, J. Gastoenterol. Hepatol. 15 Suppl: E46-52, 2000を参照されたい（これらは共に参照として本明細書に組み入れられる））。上記を考慮すると、慢性HBV感染を除去し、HCCを排除する免疫療法を実施するための改良された組成物および方法が必要とされている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、免疫療法を実施するために使用することができるウイルスベクターを含む組成物、方法およびキットを提供する。特に、本発明は、高い形質導入効率で抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)において導入遺伝子配列を発現するように構成されたB亜群アデノウイルスカプシドファイバーを有するウイルスベクターを提供する。好ましくは、導入遺伝子配列はレトロゲンカセットであり、アデノウイルスカプシドファイバーはAd11ファイバーである。
【０００７】
いくつかの態様において、本発明は、a）Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、およびAd50からなる群より選択されるB亜群アデノウイルスカプシドファイバーを含むアデノウイルスカプシド、ならびにb）i）抗原タンパク質と、ii)抗原タンパク質のN-末端に結合したリーダー配列(分泌配列)と、iii）抗原タンパク質のC-末端に結合した細胞結合ドメインとを含むレトロゲンタンパク質をコードするレトロゲンカセット配列を含む核酸分子、を含むアデノウイルスベクターを含む組成物を提供する。
【０００８】
ある態様において、核酸分子は左側および右側Ad ITR配列をさらに含む。特定の態様において、核酸分子はアデノウイルスカプシドファイバーコード配列(例えば、Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、およびAd50から選択されるアデノウイルスファイバーをコードする)をさらに含む。さらに別の態様において、核酸分子はAdパッケージング配列をさらに含む。いくつかの態様において、核酸分子は、L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、およびE3からなる群より選択される少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子を欠損している(例えば、E1および／またはE3)。さらに別の態様において、核酸分子は、L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、およびE3からなる群より選択される少なくとも5つのアデノウイルス遺伝子を欠損している(例えば、E1、E3、E2A、E2B、およびE4)。他の態様において、核酸分子は以下のアデノウイルス遺伝子L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、およびE3の全てまたはほとんど全てを欠損している(すなわち、「腑抜け（gutless）」)。
【０００９】
好ましい態様において、アデノウイルスファイバーはAd11ファイバーである（実施例に示すように、Ad11ファイバーは、Ad35ファイバーと比較しても形質導入効率が大きく改善される）。別の態様において、アデノウイルスカプシドはAd5非ファイバーカプシド成分をさらに含む（すなわち、カプシドからファイバーを除いたものがAd5である）。いくつかの態様において、アデノウイルスカプシドは、Ad11またはAd35非ファイバーカプシド成分をさらに含む。特定の態様において、核酸分子はアデノウイルスカプシド内に存在する（図1を参照されたい）。
【００１０】
別の態様において、抗原タンパク質は腫瘍関連抗原である。ある態様において、腫瘍関連抗原は、MAGE、GAGE、DAGE、前立腺特異的Ag、前立腺特異的膜Ag、チロシナーゼ、Gp100、α-フェトプロテイン、Igイディオタイプ、TCR、Bcr-abl融合産物、変異型p53、NY-ESO-1、Her-2/neu、およびMuc-1から選択される。好ましい態様において、抗原タンパク質はHBeAgまたはHBcAgである（例えば、アデノウイルスは樹状細胞を形質導入するために使用され、樹状細胞はHBV感染患者またはHCC患者に投与される）。
【００１１】
いくつかの態様において、細胞結合ドメインはFc領域(例えば、IgG1 Fc領域)を含む。他の態様において、本発明の組成物は、樹状細胞(例えば、未成熟または成熟樹状細胞)などの抗原提示細胞(APC)をさらに含む。ある態様において、本発明の組成物は抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)をさらに含み、アデノウイルスベクターはAPC(例えば、樹状細胞)内に存在する。
【００１２】
いくつかの態様において、本発明は、本発明のウイルスベクターによって形質導入された樹状細胞を含む組成物を提供する。このような組成物は、免疫療法を必要としている患者に投与することができる。いくつかの態様において、樹状細胞は、元々、形質導入された樹状細胞を投与する患者に由来する（例えば、PBMCを患者から回収し、未成熟樹状細胞が産生されるように培養し、本発明のウイルスベクターを形質導入する)。このような形質導入された樹状細胞は、患者が治療を受けに来るまで、凍結乾燥またはその他の方法で保存してもよい。特定の態様において、形質導入細胞は、患者の識別情報を印したバイアルで保存される。
【００１３】
いくつかの態様において、本発明は、a）i）樹状細胞、ならびにii）A）Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、およびAd50からなる群より選択されるB亜群アデノウイルスカプシドファイバーを含むアデノウイルスカプシド、ならびにB）I）抗原タンパク質と、II)抗原タンパク質のN-末端に結合したリーダー配列と、およびIII)抗原タンパク質のC-末端に結合した細胞結合ドメインとを含むレトロゲンタンパク質をコードするレトロゲンカセット配列を含む核酸分子、を含むアデノウイルスベクターを含む組成物を提供する段階；ならびにb）レトロゲンタンパク質が樹状細胞の少なくとも30%によって発現されるような条件下において、少なくとも5のMOI（すなわち、細胞あたり5プラーク形成単位(pfu)）で樹状細胞を組成物と接触させ、それによってレトロゲン発現樹状細胞を作製する段階であって、抗原タンパク質が、MHCクラスI抗原およびMHCクラスII抗原として、レトロゲン発現樹状細胞によって提示される段階、を含む方法を提供する。
【００１４】
ある態様において、接触させる段階が5〜10のMOIで実施される場合、レトロゲンタンパク質は少なくとも35%または少なくとも55%の樹状細胞によって発現される。特定の態様において、接触させる段階が10〜100のMOIで実施される場合、レトロゲンタンパク質は少なくとも70%の樹状細胞によって発現される(図2を参照されたい)。他の態様において、接触させる段階が100〜500のMOIで実施される場合、レトロゲンタンパク質は少なくとも90%の樹状細胞によって発現される(図2のAd11を参照)。
【００１５】
いくつかの態様において、接触させる段階はエクスビボにおいて実施される。特定の態様において、本発明の方法は、段階b）の前に、被験者(例えば、ヒト)から単球などの細胞を採取する段階、および細胞を(例えば、GM-CSFまたはIL-4と共に)培養して未成熟の樹状細胞を産生する段階をさらに含む。いくつかの態様において、樹状細胞は被験者から直接採取される。いくつかの態様において、PBMCは、白血球除去(leukophoresis)または他の好適な方法により被験者から採取される。次いで、採取した細胞はPBMC水簸法（elutriation）に供し、純粋な単球分画を採取することができる。次いで、未成熟なDCが得られるように、採取したこれらの細胞を培養することができる。
【００１６】
他の態様において、接触させる段階はインビボにおいて実施される。特定の態様において、被験者の樹状細胞の少なくとも一部が形質導入されるように、本発明のウイルスベクターを含む組成物を被験者に投与する。好ましい態様において、本発明のウイルスベクターは、患者の疾患の症状が軽減または排除されるような条件下において患者に投与される(または、本発明のウイルスベクターを含む樹状細胞が患者に投与される)。好ましくは、被験者内の形質導入された樹状細胞が、本発明のウイルスベクターによって発現される抗原に特異的なTh(例えば、CD4+ Th)およびCTL(例えば、CD8+ CTL)応答を刺激する。いくつかの態様において、接触させる段階は被験者に組成物を投与する段階を含む。
【００１７】
いくつかの態様において、核酸分子は、左側および右側Ad ITR配列をさらに含む。他の態様において、核酸分子は、アデノウイルスカプシドファイバーをコードする配列をさらに含む。ある態様において、核酸分子はAdパッケージング配列をさらに含む。別の態様において、核酸分子は、L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、およびE3からなる群より選択される少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子を欠損する(例えば、E1および／またはE3)。他の態様において、核酸分子は、L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、およびE3からなる群より選択される少なくとも5つのアデノウイルス遺伝子を欠損する(例えば、E1、E3、E2A、E2B、およびE4)。さらに他の態様において、核酸分子は以下のアデノウイルス遺伝子L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、およびE3の全てまたはほとんど全てを欠損している(すなわち、「腑抜け」)。
【００１８】
好ましい態様において、アデノウイルスファイバーはAd11ファイバーである。ある態様において、アデノウイルスカプシドはAd5非ファイバーカプシド成分をさらに含む。いくつかの態様において、アデノウイルスカプシドは、Ad11またはAd35非ファイバーカプシド成分をさらに含む。さらに他の態様において、核酸分子はアデノウイルスカプシド内に存在する(図1を参照されたい)。  
【００１９】
ある態様において、抗原タンパク質は腫瘍関連抗原である。他の態様において、腫瘍関連抗原は、MAGE、GAGE、DAGE、前立腺特異的Ag、前立腺特異的膜Ag、チロシナーゼ、Gp100、α-フェトプロテイン、Igイディオタイプ、TCR、Bcr-abl融合産物、変異型p53、NY-ESO-1、Her-2/neu、およびMuc-1から選択される。好ましい態様において、抗原タンパク質はHBeAgまたはHBcAgである。
【００２０】
いくつかの態様において、細胞結合ドメインはFc領域(例えば、IgG1 Fc領域)を含む。他の態様において、本発明の組成物は、樹状細胞(例えば、未成熟または成熟樹状細胞)などの抗原提示細胞(APC)をさらに含む。ある態様において、本発明の組成物は抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)をさらに含み、アデノウイルスベクターはAPC(例えば、樹状細胞)内に存在する。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明の方法は、c)患者にレトロゲン発現樹状細胞を投与する段階をさらに含む。特定の態様において、患者は疾患(例えば、感染症、癌、自己免疫疾患等)を有する。ある態様において、患者はHBV関連肝細胞癌またはHBV感染症を有する。特定の態様において、接触させる段階により樹状細胞は未成熟状態から成熟状態に移行する。
【００２２】
いくつかの態様において、本発明は、a）i）樹状細胞、ならびにii）A） Ad11カプシドファイバーを含むアデノウイルスカプシド、およびB）関心対象のタンパク質をコードする導入遺伝子配列を含む核酸分子、を含むアデノウイルスベクターを含む組成物を提供する段階；ならびにb) 関心対象のタンパク質が樹状細胞の少なくとも55%によって発現されるような条件下において、少なくとも5のMOIで樹状細胞を組成物と接触させ、それによって関心対象のタンパク質を発現する樹状細胞を作製する段階、を含む方法を提供する。
【００２３】
ある態様において、接触させる段階により、樹状細胞は未成熟状態から成熟状態に移行する。他の態様において、接触させる段階が10〜100のMOIで実施される場合、関心対象のタンパク質は少なくとも70%の樹状細胞によって発現される（図2を参照）。いくつかの態様において、接触させる段階が100〜500のMOIで実施される場合、関心対象のタンパク質は少なくとも90%の樹状細胞によって発現される（図2を参照）。
【００２４】
特定の態様において、導入遺伝子配列は、i)抗原タンパク質、ii)抗原タンパク質のN-末端に結合したリーダー配列、およびiii)抗原タンパク質のC-末端に結合した細胞結合ドメインを含むレトロゲンタンパク質をコードするレトロゲンカセット配列である。ある態様において、細胞結合ドメインはFc領域を含む。さらに別の態様において、抗原タンパク質は、関心対象のタンパク質を発現する樹状細胞によって、MHCクラスI抗原およびMHCクラスII抗原として提示される。
【００２５】
いくつかの態様において、接触させる段階はエクスビボにおいて実施される。他の態様において、本発明の方法は、段階b）の前に、被験者（例えば、ヒト）から単球などの細胞を回収し、細胞を(例えば、GM-CSFまたはIL-4と共に)培養して未成熟な樹状細胞を産生する段階をさらに含む。いくつかの態様において、樹状細胞は被験者から直接回収される。他の態様において、PBMCは、白血球除去(leukophoresis)または他の好適な方法により被験者から採取される。次いで、採取した細胞をPBMC水簸法に供し、純粋な単球分画を採取することができる。次いで、未成熟なDCが得られるように、採取したこれらの細胞を培養することができる。
【００２６】
他の態様において、接触させる段階はインビボにおいて実施される。特定の態様において、被験者の樹状細胞の少なくとも一部が形質導入されるように、本発明のウイルスベクターを含む組成物を被験者に投与する。好ましくは、被験者内の形質導入された樹状細胞は、本発明のウイルスベクターによって発現される抗原に特異的なTh(例えば、CD4+ Th)およびCTL(例えば、CD8+ CTL)応答を刺激する。いくつかの態様において、接触させる段階は被験者に組成物を投与する段階を含む。
【００２７】
いくつかの態様において、核酸分子は、左側および右側Ad ITR配列をさらに含む。他の態様において、核酸分子は、アデノウイルスカプシドファイバーをコードする配列をさらに含む。ある態様において、核酸分子はAdパッケージング配列をさらに含む。さらに別の態様において、核酸分子は、L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、およびE3からなる群より選択される少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子を欠損する(例えば、E1および／またはE3)。他の態様において、核酸分子は、L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、およびE3からなる群より選択される少なくとも5つのアデノウイルス遺伝子を欠損する(例えば、E1、E3、E2A、E2B、およびE4)。さらに他の態様において、核酸分子は以下のアデノウイルス遺伝子L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、およびE3の全てまたはほとんど全てを欠損している(すなわち、「腑抜け」)。
【００２８】
好ましい態様において、アデノウイルスファイバーはAd11ファイバーである。ある態様において、アデノウイルスカプシドはAd5非ファイバーカプシド成分をさらに含む。いくつかの態様において、アデノウイルスカプシドは、Ad11またはAd35非ファイバーカプシド成分をさらに含む。さらに他の態様において、核酸分子はアデノウイルスカプシド内に存在する。
【００２９】
ある態様において、抗原タンパク質は腫瘍関連抗原である。他の態様において、腫瘍関連抗原は、MAGE、GAGE、DAGE、前立腺特異的Ag、前立腺特異的膜Ag、チロシナーゼ、Gp100、α-フェトプロテイン、Igイディオタイプ、TCR、Bcr-abl融合産物、変異型p53、NY-ESO-1、Her-2/neu、およびMuc-1から選択される。好ましい態様において、抗原タンパク質はHBeAgまたはHBcAgである。
【００３０】
いくつかの態様において、本発明の方法は、c）関心対象のタンパク質を発現する樹状細胞を被験者に投与する段階をさらに含む。特定の態様において、被験者はHBV関連肝細胞癌またはHBV感染症を有する。
【００３１】
特定の態様において、本発明は、本発明のウイルスベクターをコードするか、または本発明のウイルスベクターの一部をコードする核酸配列を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、ウイルスベクターは少なくとも2つの核酸配列によってコードされる(例えば、ヘルパー依存型アデノウイルス配列およびヘルパーアデノウイルス配列、またはレトロゲンカセットなどの導入遺伝子配列を含有するヘルパー依存型アデノウイルス配列の発現を可能にするヘルパーアデノウイルス)。
【００３２】
ある態様において、本発明は、a）本発明のウイルスベクターまたは本発明のウイルスベクターを含む、形質導入樹状細胞、およびb）ウイルスベクターもしくは形質導入樹状細胞を使用して被験者の疾患を治療するための取扱説明書、または科学的研究にウイルスベクターもしくは形質導入樹状細胞を使用するための取扱説明書を含むキットを提供する。いくつかの態様において、本発明は、本発明のウイルスベクターをコードする核酸配列で安定にまたは一時的にトランスフェクトした細胞株を提供する。
【００３３】
定義
本発明の理解を容易にするために、数多くの用語を以下に定義する。
【００３４】
本明細書において使用する「被験者」および「患者」という用語は、イヌ、ネコ、鳥、家畜、および好ましくはヒトのような哺乳動物などの任意の動物をいう。好ましい態様において、被験者は、樹状細胞に基づく免疫療法による治療に反応する疾患を有する。
【００３５】
本明細書において使用する「形質導入」または「感染」という用語は、ウイルス内のウイルスDNAを宿主細胞（例えば、未成熟樹状細胞）に導入する方法をいう。
【００３６】
本明細書において使用する「非ファイバーカプシド成分」という句は、ウイルス(例えば、アデノウイルス)のカプシドからカプシドファイバーを除いたものをいう。
【００３７】
本明細書において使用する「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」、「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」、および「ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列」という用語は、特定のポリペプチドのコード領域を含む核酸配列を意味する。コード領域はcDNA、ゲノムDNA、またはRNA形態で存在してもよい。DNA形態で存在する場合には、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは1本鎖(すなわち、センス鎖)または2本鎖であってもよい。転写の適切な開始および／または一次RNA転写物の適切な処理を可能にする必要がある場合には、エンハンサー／プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナル等などの好適な調節要素を遺伝子のコード領域に近接して配置することができる。または、本発明の発現ベクターに使用されるコード領域は、内因性エンハンサー／プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナル等、または内因性および外因性調節要素の組み合わせを含有してもよい。
【００３８】
また、本明細書において使用する「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」という用語の間にはサイズの制限またはサイズの区別はない。両用語は、単純に、ヌクレオチドで構成される分子をいう。同様に、「ペプチド」、「タンパク質」、および「ポリペプチド」という用語間にサイズの区別はない。これらの用語は、単純にアミノ酸残基で構成される分子をいう。
【００３９】
本明細書において使用する「ヘルパー依存型ウイルスDNA」または「無力化（gutted）ウイルスDNA」という用語は、ウイルスの複製およびパッケージングに必要なシス作用性DNA配列を含有するが、概してウイルスコード配列を含有しないウイルスベクターをコードするウイルスDNAをいう（米国特許第6,083,750号を参照されたい（参照として組み入れられる））。これらのベクターは最高約36 kbの外因性DNAを収容することができ、複製に十分なウイルスタンパク質を発現することができない。ヘルパー依存型ウイルスベクターは、ヘルパー依存型ウイルスDNAが複製されうるように、単独でまたはパッケージング細胞株と共に必要なウイルスタンパク質をイン・トランスで（in trans）供給するヘルパーアデノウイルスの存在下において、ヘルパー依存型ウイルスDNAの複製によって産生される。無力化ベクターは米国特許第6,083,750号に記載されているように構築することができる。
【００４０】
本明細書において使用する「ヘルパーウイルスDNA」とは、無力化ウイルスが複製されうるように、単独でまたはパッケージング細胞株と共にウイルスタンパク質をイン・トランスで提供することができる、ヘルパーウイルスベクターをコードするウイルスDNAをいう。例えば、ヘルパーウイルスはカプシドにアデノウイルスB亜群ファイバーを供給することができる。「ヘルパーアデノウイルス」または「ヘルパーウイルス」は、特定の宿主細胞において複製能を持つアデノウイルスをいう。宿主は、例えば、E1タンパク質などのAd遺伝子産物を提供することができる。「ヘルパーウイルス」は、第2の自己複製不可能なウイルス（たとえば無力化ウイルスベクター）において欠損しているイン・トランス機能（in trans functions）（例えば、タンパク質）を供給するために使用される。従って、第1の自己複製可能なウイルスは第2の自己複製不可能なウイルスを「助ける（help）」と言われ、それによってヘルパーおよび第2のウイルスを含有する細胞における第2のウイルスゲノムの増殖を可能にする。ヘルパーウイルスは、ある種の機能不能化（crippling）剤の存在下においてヘルパーウイルスの複製を損なうことができる配列を含むことができる。機能不能化配列を有するヘルパーウイルスの例は(+)lox(+)polヘルパーウイルスである。(+)lox(+)polヘルパーウイルスは、Creリコンビナーゼを使用してネガティブに選択することができるE1-, E3-欠損ウイルスであり、E3領域にアルカリホスファターゼレポーター遺伝子を保持する。パッケージング要素I〜Vからなるパッケージングシグナルにはlox P部位が順反復方向（direct repeat orientation）に隣接しており、Cre(機能不能化剤)の存在下においてパッケージングシグナルの除去を可能にする。
【００４１】
「ウイルス」という用語は、自律複製できない偏性の超顕微鏡的細胞内寄生物をいう(すなわち、複製は宿主細胞の機構の使用を必要とする)。アデノウイルスは2本鎖DNAウイルスである。左側および右側の逆位末端反復配列(ITR)は、それぞれ鎖状Adゲノムの5'および3'末端に位置する短い要素であり、ウイルスDNAの複製に必要とされる。左側ITRは、一般にAdゲノムの1〜130 bpに位置する(0〜0.5 muともいわれる)。右側ITRは〜35,800 bpからゲノムの末端までに位置する(99.5〜100 muともいわれる)。2つのITRは互いの逆向きの配列である。
【００４２】
本明細書において使用する「関心対象の遺伝子」または「導入遺伝子配列」という用語は、その発現(関心対象のタンパク質の発現)が宿主細胞内で望まれる、ベクターまたはプラスミドに挿入された遺伝子をいう。導入遺伝子配列は治療的価値を有する遺伝子およびレポーター遺伝子を含む。好ましくは、導入遺伝子配列は、抗原(例えば、腫瘍関連抗原)である関心対象のタンパク質をコードする。
【００４３】
本明細書において使用する「治療（treatment）」という用語は、治療的治療（therapeutic treatment）および予防的または防止的手段をいう。治療を必要としている患者はすでに障害を有する患者および障害を予防すべき患者を含む。
【００４４】
「症状が軽減されるような条件下において」という句は、疾患からの回復速度(例えば、体重の増加速度)に対する検出可能な影響、腫瘍サイズの低下、または特定の疾患に通常関連する症状の少なくとも1つの軽減を含むが、これらに限定されない、ウイルス媒介性の樹状細胞に基づく免疫療法によって治療可能な任意の疾患の、検出可能な症状の任意の程度の質的または量的な低下をいう。
【００４５】
発明の説明
本発明は、免疫療法を実施するために使用することができるウイルスベクターを含む組成物、方法、およびキットを提供する。特に、本発明は、高い形質導入効率で抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)において導入遺伝子配列を発現するように構成された、B亜群アデノウイルスカプシドファイバーを有するウイルスベクターを提供する。好ましくは、導入遺伝子配列はレトロゲンカセットであり、アデノウイルスカプシドファイバーはAd11ファイバーである。本発明の説明は以下の節に分けて提供される：I）B亜群アデノウイルスファイバーを有するウイルスベクター、II）ウイルスベクターによって発現される関心対象のタンパク質、およびIII）ウイルスベクター樹状細胞に基づく免疫療法。
【００４６】
I.  B亜群アデノウイルスファイバーを有するウイルスベクター
本発明のウイルスベクターはB亜群アデノウイルスファイバーを有する。例えば、B亜群アデノウイルスファイバーはAd11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、Ad50、またはそれらの組み合わせであってもよい。図1は、アデノウイルスカプシドファイバーがAd11である本発明の一態様を示す。B亜群アデノウイルスファイバー(例えば、Ad11)を有する本発明のウイルスベクターは、ヒト樹状細胞の形質導入効率の増加および未成熟ヒト樹状細胞の成熟化などの重要な利点を有する。Ad11ファイバーを有するウイルスベクターは特に有利であることが示されている。例えば、Ad11ファイバーに基づくベクターの形質導入効率は、Ad5に基づくベクターおよびAd35などのB亜群ファイバーを有する他のウイルスベクターの劇的な改善を示した(図2を参照されたい)。本発明のウイルスベクターは、親和性改善の結果として非常に低いMOIで樹状細胞に形質導入するために使用することができる。これにより、ウイルスベクターは低いMOIで樹状細胞において関心対象のタンパク質（以下を参照されたい）を発現することができる。このようにMOIsが低いと、樹状細胞を形質導入するための用量をより低くすることができ、ヒト免疫療法プロトコールを改善することができる(以下を参照されたい)。
【００４７】
任意の種類のウイルスベクターを本発明に使用することができる。例えば、B亜群カプシドファイバーをすでに発現しているか、または(例えば、通常のファイバー遺伝子を欠損させ、それをグループBカプシドファイバーで置換することによって)B亜群カプシドファイバーを発現するように改変した、任意の種類の非エンベロープDNAウイルスまたはRNAウイルスを本発明に使用することができる。例えば、いくつかの態様において、ウイルスベクターはAd35またはAd11ファイバーを有するアデノウイルスベクターを含むが、アデノウイルスカプシドの残りはAd5である。これらのウイルスベクターはAd5/11またはAd5/35アデノウイルスベクターといわれる。このようなキメラベクターを作製する技法は当技術分野において以前に記載されている（例えば、Shayakhmetovら、J. of Virol., 74(6):2567-2583, 2000；ShayakhmetovおよびLieber, J. of Virol., 74(22): 10274-10286, 2000；並びに国際公開公報第0073478号を参照されたい（これらはすべて、全体が参照として本明細書に組み入れられる））。有用な構築物は、例えば、Shayakhmetovらの図5A並びに国際公開公報第0073478号の図16および18に提示されている。Ad11ファイバーをコードする配列が当技術分野において見出されていることも注目される(例えば、Genbankアクセッション番号L08231およびL08232；並びにMeiおよびWadell, Virology, 194: 453-462, 1993を参照されたい（参照として組み入れられる）)。他のキメラウイルスベクターを作製するために同様の技法を使用することができる。
【００４８】
上記のように、本発明は任意の特定の種類のウイルスベクターに限定されない。以下を含むが、これらに限定されない数多くの好適なベクターが当技術分野において既知である：アデノウイルスベクター、第二世代アデノウイルスベクター、無力化アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター；およびレンチウイルスベクター。これらのベクターは全て改変されたB亜群アデノウイルスファイバーであってもよい（またはB亜群アデノウイルスファイバーをすでに含有してもよい）。アデノウイルスベクターは本発明の好ましいウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは以下にさらに詳細に記載されている。
【００４９】
1.  アデノウイルスベクター
アデノウイルスベクターを本発明に使用するのが好ましい。A〜F亜群に分類される51のAd血清型がある。B亜群アデノウイルスベクターはB亜群アデノウイルスファイバーをすでに含有するが、AおよびC〜F群はB亜群アデノウイルスファイバーを含有するように改変することができる。自己増殖型アデノウイルス(Ad)ベクターは、インビトロおよびインビボにおいて多種多様の細胞種に外来遺伝子を送達するために広範に使用されている。「自己増殖型ウイルス」とは、1つのDNA片(組換えウイルスゲノム)を1つのパッケージング細胞株にトランスフェクションして、感染性ウイルスを作製することによって産生することができるものであり、自己増殖型ウイルスは増殖のためにヘルパーウイルスの使用を必要としない。第一世代のアデノウイルスベクターはE1およびE3遺伝子を欠損している。
【００５０】
2.  第二世代アデノウイルスベクター
第一世代のAdベクターに関連するウイルス複製問題に対処する試みにおいて、いわゆる「第二世代」Adベクターが開発された。第二世代も、B亜群アデノウイルスファイバーを含有するように改変することができる(またはB亜群アデノウイルスファイバーをすでに含有している)。第二世代Adベクターは、Adゲノムの初期領域(E2A、E2B、およびE4)をさらに欠失している。高度に改変された第二世代のAdベクターは、大規模ベクター調製中に複製能を持つウイルスを作製する可能性が低く、Adゲノムの複製を完全に阻止することにより後期遺伝子複製は消滅させられているはずである。従って、後期ウイルスタンパク質に対する宿主の免役応答は低下する［Amalfitanoら、J. Virol. 72: 926-933(1998)を参照されたい］。AdゲノムからE2A、E2B、およびE4遺伝子を排除してもクローニング能力が増加する。
【００５１】
3.  無力化アデノウイルスベクター
「無力化」、「腑抜けの」、またはヘルパー依存型Adベクターは、アデノウイルスの複製およびパッケージングを誘導するが、ウイルスコード配列を含有しないシス作用性DNA配列を含有する(全て参照として本明細書に組み入れられている、Fisherら、Virology 217: 11-22(1996)；Kochanekら、Hum. Gen. Ther., 10: 2451-9, 1999；および米国特許第5,994,132号を参照されたい)。無力化ベクターは、必要なウイルスタンパク質を全てイン・トランスで提供するヘルパーウイルスの存在下における複製によって作製される欠損ウイルスである。ヘルパーウイルスは、ウイルスカプシドを作製するのに必要な配列を提供することができる。本発明において、ヘルパーウイルスは、B亜群アデノウイルスファイバー(例えば、Ad11ファイバー)を有するカプシドを発現することができる。無力化ベクターは任意のウイルス遺伝子を含有しないので、ウイルスタンパク質の発現は不可能である。ヘルパー依存型ウイルス作製は当技術分野において記載されている［Hardyら、J. Virol. 71: 1842-1849(1997)、およびHartigan-O'Connerら、J. Virol. 73: 7835-7841(1999)を参照されたい］。無力化Adベクターは、最高約37 kbの外因性DNAを最大限収容することができるが、28〜30 kbがより典型的である。
【００５２】
II.  ウイルスベクターによって発現される関心対象のタンパク質
上記のように、本発明はB亜群アデノウイルスファイバーを有するウイルスベクター(例えば、Ad11ファイバーなどのB亜群アデノウイルスファイバーを有するヘルパー依存型アデノウイルスベクター)の産生に有用である。好ましい態様において、作製されるウイルスベクターは、ベクターが種々の用途(インビトロにおけるタンパク質発現、治療的用途、樹状細胞を用いる免疫療法等)に有用となりうるように、関心対象のタンパク質をコードする導入遺伝子配列(異種核酸配列)を含む。好適な異種DNA配列には、例えば、レシピエント被験者において欠損もしくは欠落しているタンパク質をコードする核酸配列、または望ましい生物学的もしくは治療的効果（例えば、抗菌、抗ウイルスまたは抗腫瘍機能）を有するタンパク質をコードする異種遺伝子が挙げられる。他の好適な異種核酸には、炎症性疾患、自己免疫疾患、AIDSなどの慢性感染性疾患、癌、高コレステロール血症、糖尿病などのインスリン障害、成長障害、種々の貧血、サラセミア、および血友病を含む種々の血液障害、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症、および肺気腫などの遺伝子欠損などの障害を含む、内分泌、代謝、血液、循環器系、神経、筋骨格、泌尿器、肺、および免疫の障害の治療に使用するタンパク質をコードするものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
好ましい態様において、導入遺伝子配列は抗原タンパク質をコードする。抗原は天然型タンパク質もしくはタンパク質断片、または合成タンパク質もしくはタンパク質断片もしくはペプチドを含んでもよい。抗原の例には、ウイルス性もしくは細菌性肝炎、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、小児麻痺、肺炎球菌、ヘルペス、呼吸器合胞体ウイルス、b型インフルエンザ菌、クラミジア、水痘帯状疱疹ウイルス、または狂犬病に対する免役応答を誘発することができるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
他の好ましい態様において、抗原タンパク質は腫瘍または癌関連抗原である。例えば、タンパク質抗原には、MAGE-1またはMAGE-3(黒色腫、肺癌、および直腸結腸癌治療用)、GAGE、DAGE、前立腺特異的Ag(前立腺癌治療用)、前立腺特異的膜Ag(前立腺癌治療用)、チロシナーゼ(黒色腫治療用)、Gp100(黒色腫治療用)、α-フェトプロテイン(肝臓癌治療用)、Igイディオタイプ(B細胞NHL、骨髄腫治療用)、TCR(T細胞NHL治療用)、Bcr-abl融合産物(CML治療用)、変異型p53(肺癌、直腸結腸癌、頭頚部癌治療用)、NY-ESO-1(黒色腫および乳癌治療用)、Her-2/neu(乳癌、肺癌、および卵巣癌治療用)、ならびにMuc-1(膵臓癌、肺癌、乳癌および直腸結腸癌治療用)由来のものが挙げることができるが、これらに限定されない。
【００５５】
特に好ましい態様において、抗原はHBVウイルス由来である。上記のように、HBV感染症およびHCCは世界的に大きな健康問題である。本発明のウイルスベクターは、HBV抗原をコードする導入遺伝子配列を含むことができ、(HBV感染症またはHCC患者を治療するために)樹状細胞を形質導入するために使用することができる。HBV由来の抗原の一例はB型肝炎コア抗原(HBcAg)である。HBV由来の別の抗原はHBeAgである(これらの抗原をコードする配列は当技術分野において既知である)。例えば、HBcAgのコード配列はGenbankアクセッション番号M38594に見られる。ヒトB型肝炎ウイルスは、表面抗原タンパク質が組込まれている外側の脂質エンベロープ、およびウイルスゲノムを含有する内側のタンパク質カプシドを含む。正二十面体のヌクレオカプシドは、B型肝炎コア抗原(HBcAg)の多数のサブユニットで構成される。HBcAgの非粒子型、HBeAgはHBV感染中に血清に分泌される。HBeAgはHBcAgのアミノ酸1〜149位を共有し、プレコア-コア(HBeAg)遺伝子のプレコア配列によってコードされる10アミノ酸からなるN-末端伸張部を含有する。HBcAgおよびHBeAgは共にほとんどの宿主において免疫原性が高く、マウスおよびマカクにおいて液性応答およびT細胞応答を刺激する。ある好ましい態様において、HBeAg遺伝子内では、HBeAg C-末端のアルギニンリッチアミノ酸残基(aa 150〜180位)が欠損している。
【００５６】
他の好ましい態様において、本発明のウイルスベクターの導入遺伝子配列はレトロゲンカセット配列である。レトロゲン技術は、ベクターの導入遺伝子としてレトロゲンカセットを使用する。レトロゲンカセットは、抗原のC-末端に細胞結合ドメイン配列(受容体媒介内部移行用)、および抗原のN-末端にリーダー配列／分泌配列(分泌を可能にする)を有する抗原(例えば、腫瘍関連抗原)をコードする配列で構成される。この技術は以前に記載されている(例えば、Youら、Cancer Research, 61: 197-205, 2001；およびChenらの国際公開公報第03025126号を参照されたい（これらは共に全体が参照として本明細書に組み入れられる）)。
【００５７】
MHC-クラスIへの抗原提示経路はMHC-IIへの経路とは顕著に異なるので、DCによって抗原をMHC-IおよびIIの両方に提示するのは困難である。例えば、形質導入したDCによって発現される細胞内抗原はMHC-Iによって効率的に処理されて提示されうるが、MHC-IIではされない。一方、形質導入したDCから発現される分泌タンパク質はMHC-Iによって提示されない。レトロゲンカセット技術によってMHCIおよびMHCIIの両方に抗原を提示することが可能になり、Th、CTLおよびB細胞を強力に活性化する(Youら、上記を参照されたい)。抗原のコード配列は、分泌を可能にするN-末端リーダー配列、ならびに例えば、Fc-γ-受容体を介するDCへの抗原の再取り込みおよびエンドサイトーシスを可能にするIgGのFc断片で改変される。次いで、改変した遺伝子をDCに形質導入して融合タンパク質(逆行性輸送／内部移行にちなんで「レトロゲン」と名づける)を産生、かつ分泌し、これは受容体媒介エンドサイトーシスによりDCによって取り込まれて、エンドソーム経路において処理され、MHC-IIの提示に対して外因性としてDCによって提示されてCD4+ Th細胞を誘導する。内部移行抗原はMHC-Iにも提示されてCTLを直接活性化することもできる(クロスプライミング(cross-priming))。FcがFcγRと相互作用すると、抗原提示に関与する表面分子およびサイトカインをアップレギュレートすることによってDCを活性化する。本発明のウイルスベクターを発現するアデノウイルスB亜群ファイバーとレトロゲンカセットとの組み合わせは、DC形質導入およびヒト免疫療法を実施するための強力な組み合わせを示す。
【００５８】
III.  ウイルスベクター樹状細胞形質導入に基づいた免疫療法
本発明のウイルスベクターは、好ましくは、樹状細胞が治療を必要としている患者のTh、CTL、および／またはB細胞応答を活性化するように、樹状細胞(例えば、ヒト樹状細胞)を形質導入するために使用される。アデノウイルスB亜群ファイバーを有する本発明のウイルスベクターは低MOIで樹状細胞を形質導入し(図2を参照されたい)、成熟化を活性化することが見出されている(図3を参照されたい)。好ましい態様において、本発明のウイルスベクターはAd11カプシドファイバーを含み、未成熟樹状細胞を形質導入するために使用される(図1を参照されたい)。以下は樹状細胞および免疫療法の詳細である。
【００５９】
樹状細胞(DC)は、先天性の細胞性および液性の免疫応答の仲立ち(bridge)として極めて重要な役割を果たす特殊化した抗原提示細胞である。生体内では、DCは、戦略上、病原菌が流入する可能性のある部位の界面に位置する。それらは抗原を捕獲して、二次的リンパ組織に遊走し、そこでヘルパーT細胞(Th)および細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を活性化することができる。それらはまた、B細胞およびおそらくNK細胞とも相互作用する。DCは骨髄(骨髄性)前駆細胞(CD34+)から末梢血前駆細胞(CD11c+)へと発生し、セレクチン(例えば、CD62L)、接着分子(例えば、LFA-1、VLA-4、CD44、CLA)、およびケモカイン受容体(例えば、CCR1、-5、-6)との相互作用により種々の末梢組織に遊走する。未成熟状態では、DCは効率的に抗原を取り込む。抗原を取り込み、ある種の感染菌、炎症性サイトカイン、またはCD40受容体の誘発を含む自然刺激に暴露されると、DCは排出リンパ管(draining lymphatics)を介して末梢リンパ器官に可動化されて遊走し、そこでT細胞に出会う。この遊走過程中に、DCは、多数のペプチド／MHCクラスIおよびII複合体を豊富な共刺激状況下で提示するのに特殊化した細胞に成熟する。DCの活性化および遊走にともなって、抗原取り込み活性および関連抗原受容体はダウンレギュレートされ、抗原取り込みから抗原提示に切り替わる。抗原は、CD8+ CTLおよびCD4+ Th細胞の活性化に必要な、それぞれクラスIおよびII MHC経路を介して処理される。CD4+細胞はサイトカイン／共刺激分子を産生し、これが次にCTLおよびB細胞を刺激する。CTLは直接腫瘍細胞を死滅させることができる。成熟期のDCはリンパ節においてアポトーシス死で死滅する。
【００６０】
本発明はDC媒介性免疫療法のための方法、特に本明細書に記載するウイルスベクターを使用する癌の免疫療法のための方法を提供する。単純な抗原タンパク質／ペプチドを使用する抗腫瘍ワクチン戦略では、ワクチン化が乏しいことが多く、T細胞の寛容化さえも生じる。T細胞に腫瘍抗原を提示するDCの能力を利用することによって、DCは癌の免疫療法的方法の中心的存在となることができる。腫瘍のDC媒介性免疫療法には2つの主要な方法が使用されている：DCの抗原タンパク質との同時培養(刺激(pulsing))、およびDCの遺伝的改変。DCはクラスI制限合成ペプチドもしくはタンパク質、または自己腫瘍から溶出させた天然ペプチドで刺激(pulsed)されている。このカテゴリーの方法はまた、全腫瘍溶解物またはアポトーシス小体、および腫瘍細胞とDCの融合物への暴露を含む。DCの遺伝的改変の方法は、ウイルスまたは非ウイルスベクターを使用して抗原DNAまたはRNAをDCに送達することに基づく(Nouri-Shiraziら、Immunol. Lett. 74: 5-10, 2000を参照されたい(参照として本明細書に組み入れられる))。所定の抗原を発現するように操作したDCは、i）比較的長期間にわたって大量の治療タンパク質を継続的に産生するので、ターンオーバー速度が比較的短いMHCクラスIとの複合体における提示に重要である；ii）抗原を内因的に産生および処理するので、MHCクラスI経路への到達および多数の未同定エピトープの提示を良好にすることが潜在的に可能である(一方、ペプチドの使用は、患者のHLAハプロタイプがわかっているかどうかに左右され、任意の所定の抗原のペプチドエピトープの使用を制限する)；およびiii）Th1およびTh2並びにT細胞およびB細胞応答が刺激される可能性がある、という点から抗原-刺激型(pulsed)DCを上回る重要な利点を提供する。癌のDC媒介性免疫療法の可能性は、一連の予備試験において証明されている(参照として本明細書に組み入れられている、Nestle, Oncogene, 19: 6673-9を参照されたい)。例えば、抗原／ペプチド負荷DCに基づく臨床試験において、悪性黒色腫、リンパ腫、腎細胞癌、および前立腺癌患者における完全寛解および部分寛解が頻繁に得られており、これは確立されている癌ワクチン法では以前には観察されていない(Dannullら、Onkologie, 23: 544-551, 200(参照として本明細書に組み入れられる))。
【００６１】
(Ad11などのアデノウイルスB亜群ファイバーを有する)本発明のウイルスベクターは、樹状細胞に導入遺伝子(例えば、レトロゲンカセット)を送達するために使用することができる。一般に、DCへの非ウイルス、エクスビボ遺伝子送達は効率が悪い。ウイルスベクターの中では、組換えレトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノウイルスがDC形質導入に使用されている(これらのウイルスは全て、本発明によるアデノウイルスB亜群ファイバーを含有するように改変することができる)。培養中のDCへのオンコレトロウイルスの形質導入率は非常に低い(参照として本明細書に組み入れられている、Westermannら、Gene Ther., 5: 264-71, 1998)。しかし、本発明のウイルスベクターは形質導入効率が高く、従って、樹状細胞の形質導入に最適である。
【００６２】
免疫療法への適用のために、本発明のDCをエクスビボまたはインビボで形質導入することができる。例えば、PBMCは、白血球除去(leukophoresis)または他の好適な方法により癌患者から採取することができる。次いで、水簸法または他の好適な方法によって単球を精製することができる。次いで、精製単球分画を、GM-CFS、IL-4または他の好適な作用物質と共に培養することによって樹状細胞に分化するように誘導することができる。次いで、例えば、腫瘍関連抗原を含みうる本発明のウイルスベクターで未成熟樹状細胞に形質導入して、成熟樹状細胞を得ることができる(図1を参照されたい)。次いで、患者の癌または他の疾患を治療するために、樹状細胞を患者に投与することができる。樹状細胞は患者のThおよびCTL応答(およびB細胞応答)の両方を最適に活性化する。樹状細胞の形質導入は、患者の樹状細胞が形質導入されるように本発明のウイルスベクターを患者に直接注射することによっても実施することができる。
【００６３】
実験
以下の実施例は、本発明のある好ましい態様および局面を実証し、さらに例示するために提供されており、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００６４】
以下の実験の開示において、以下の略語を適用する：M(モル濃度)、mM(ミリモル濃度)、nM(ナノモル濃度)、pM(ピコモル濃度)、mg(ミリグラム)、μg(マイクログラム)、pg(ピコグラム)、ml(ミリリットル)、μl(マイクロリットル)、℃(セ氏温度)、OD(吸光度)、nm(ナノメートル)、BSA(ウシ血清アルブミン)、およびPBS(リン酸緩衝生理食塩液)。
【００６５】
実施例1
Ad11およびAd35ファイバーを有するウイルスベクターによる、樹状細胞の高効率の形質導入、および樹状細胞成熟化の活性化
この実施例は、Ad11またはAd35カプシドファイバーのいずれかを有するアデノウイルスベクターがヒト樹状細胞に形質導入する能力を試験するために使用するアッセイ法にを記載する。この実施例はまた、これらの同じウイルスベクターがヒト樹状細胞の成熟化を活性化する能力も試験する。
【００６６】
この実施例において、ヒトDCはエクスビボ分化によって作製した。特に、ヒトDCは、骨髄性CD34+前駆細胞(死体骨髄由来)、およびG-CSFで可動化後の末梢血から単離したCD34+前駆細胞またはCD14+単球から、インビトロ分化によって作製した。GM-CSF、IL-4、fl3-リガンド、およびTNFによるCD34+前駆細胞のエクスビボ分化の標準的なプロトコールを使用した(Ferlazzoら、J. Immunol. 163: 3597-604, 1999を参照されたい(参照として本明細書に組み入れられる))。
【００６７】
この実施例に使用したアデノウイルスベクターは、(Ad5ファイバーの代わりに)Ad11またはAd35ファイバーと共にGFPを発現するように構成されている、第一世代アデノウイルスAd5ベクターであった。これらのウイルスベクターは、Ad5/11またはAd5/35アデノウイルスベクターと呼ばれる。このようなキメラベクターを作製する技法は当技術分野において以前に記載されている(例えば、Shayakhmetovら、J. of Virol., 74(6): 2567-2583, 2000、ShayakhmetovおよびLieber、J. of Virol., 74(22): 10274-10286, 2000および国際公開公報第0073478号を参照されたい(これらの全ては、全体が参照として本明細書に組み入れられる))。有用な構築物は、例えば、Shayakhmetovらの図5A並びに国際公開公報第0073478号の図16および18に提示されている。Ad11ファイバーをコードする配列が当技術分野において見出されていることも注目される(例えば、Genbankアクセッション番号L08231およびL08232；並びにMeiおよびWadell, Virology, 194: 453-462, 1993を参照されたい(参照として組み入れられる))。
【００６８】
Ad5/35およびAd5/11ベクター、並びにAd5ベクターは、未成熟ヒトDCに遺伝子導入するために使用した。形質導入は種々のMOIで37℃において3時間実施し、GFP発現は、感染の24時間後にフローサイトメトリーによって分析した。この形質導入の結果は、ヒトCD11c+ DCの37%および59%が、それぞれ、MOIが5(pfu/細胞)のAd5/35およびAd5/11で形質導入されたことを示している。同じMOIでは、骨髄性DCは1%未満しか標準的なAdベクターで形質導入されなかった。これらの結果を図2に示す。重要なことに、Ad5/35およびAd5/11ベクターの最大形質導入効率(85〜95%)は100のMOIで達成されたが、Ad5の最高用量試験(MOI 1000)ではわずか58%の形質導入しか達成されなかった。Ad5/35およびAd5/11ベクターから導入遺伝子の発現を駆動する数多くのプロモーターのうち、CMVプロモーターだけがDCにおけるGFP発現を与えたが、MSCVまたはRSVプロモーターは与えず、これらのプロモーターはヒトDCにおいて活性がないことを示している。Ad5/11およびAd5/35ベクターはマウスDCを形質導入することができない。Ad5/35およびAd5/11ベクターの形質導入動態は、Ad5ベクターと比較すると、大きく増加しており、ウイルスへの暴露後数時間以内に高効率の遺伝子発現を生じた。遺伝子発現は、LPSで誘導したDCのエクスビボ成熟化の間、高いままであった。
【００６９】
DC成熟化マーカーの発現に対するアデノウイルス感染の効果も検討した。未成熟DCにAd5-、Ad5/11-、およびAd5/35-CMV-GFPを感染させるか(MOI 10)、またはLPSで処理した。DC表面マーカーは24時間後にフローサイトメトリーで分析した。図3はこれらの結果を示す。図3は、これらの結果を未成熟DCと比較した表面マーカーの増加として報告する。モック(mock)はウイルス希釈緩衝液だけとインキュベーションした。図3のこれらの結果が示すように、Ad5/35およびAd5/11感染も、CD86、CD83、およびHLA-DR発現の増加に基づいて評価されるように、DC成熟化を誘発した(図3)。一方、10のMOIでのAd5ベクターによる感染は、成熟化マーカーの有意な上昇を誘導しなかった。さらに、(図3に示すものと同様のレベルの) DC成熟化は、未成熟DCと空のAd5/11カプシドとのインキュベーションによっても誘導され、推定Ad11受容体との相互作用および／または粒子取り込みが、DC成熟化を生じるシグナル伝達経路を刺激するのに十分であることを示している。比較のために、DC成熟化を誘導するために通常使用されているLPSを添加後に表面マーカーのアップレギュレーションを評価した。Ad11またはAd35ファイバーを有するAdベクターが、非常に低いMOIで成熟化の誘導と共にDCを効率的に形質導入する能力は、これらのベクターがヒト免疫療法における非常に有用なツールになるはずであることを示している(例えば、DCをインビボにおいて形質導入するか、またはDCをエクスビボにおいて形質導入し、次いで治療を必要としている患者に注射する)。
【００７０】
実施例2
Ad5およびAd5/11第一世代ベクターによって形質導入したHeLa細胞におけるHBeAg-レトロゲンの発現
この実施例は、Ad5およびAd5/11第一世代ベクターによって形質導入したHeLa細胞におけるHBeAg-レトロゲンの発現を記載している。この実施例は、Ad11ファイバーを有するベクターの使用と「レトロゲン」技術を組み合わせている。レトロゲン技術は、ベクターの導入遺伝子としてレトロゲンカセットを使用する。レトロゲンカセットは、抗原のC-末端に細胞結合ドメイン配列(受容体を介する内部移行用)、並びに抗原のN-末端にリーダー配列／分泌配列(分泌を可能にする)を有する抗原(例えば、腫瘍関連抗原)をコードする配列で構成される。この技術は以前に記載されている(例えば、共に全体の内容が参照として本明細書に組み入れられる、Youら、Cancer Research, 61: 197-205, 2001；およびChenらの国際公開公報第03025126号を参照されたい)。
【００７１】
この実施例では、レトロゲンカセットの抗原コード配列は、ヒトB型肝炎ウイルス(HBV)のHBeAg抗原であった。ヒトB型肝炎ウイルスは、表面抗原タンパク質が組込まれている外側の脂質エンベロープおよびウイルスゲノムを含有する内側のタンパク質カプシドを含む。正二十面体のヌクレオカプシドは、B型肝炎コア抗原(HBcAg)の多数のサブユニットを含む。HBcAgの非粒子型、HBeAgはHBV感染中血清に分泌される。HBeAgはHBcAgのアミノ酸1〜149位を共有し、プレコア-コア(HBeAg)遺伝子のプレコア配列によってコードされる10アミノ酸のN-末端伸張部を含有する。HBcAgおよびHBeAgは共にほとんどの宿主において免疫原性が高く、マウスおよびマカクにおいて液性応答およびT細胞応答を誘発する。この実施例において、HBeAg遺伝子内では、HBV感染中に切断されるHBeAg C-末端のアルギニンリッチアミノ酸残基(aa 150〜180)が欠失している。使用するHBeAgは「ayw」HBVサブタイプから誘導される。受容体媒介内部移行のために、切断型(分泌型)HBeAg(自身のリーダー配列、Lを有する)を、細胞結合ドメイン(ヒトIgG Fc cDNA)とC-末端で結合した。HBeAg遺伝子は、DCにおいて活性であることが既知のCMVプロモーターの制御下においた。転写は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(bPA)で停止する。このレトロゲンカセットを図4Aに略図で示す。
【００７２】
この実施例において、HeLa細胞に、GFPまたはHBeAgレトロゲン発現カセットを含有する第一世代Ad5およびAd5/11系ベクター(実施例1を参照されたい)を、10のMOIで感染させた。HeLa細胞は、GFP発現についてはフローサイトメトリーによって分析し、HBeAg発現については感染の48時間後にFITC-標識抗-Fcを用いて分析した。細胞は透過化処理(permealized)をしなかった。結果を図4Bに示す。同様のレベルの(細胞内)GFP発現およびレトロゲン発現は、レトロゲンが生細胞の膜において容易に検出できることを示している。HeLa細胞はAd5およびAd11受容体を発現することが注目される。
【００７３】
実施例3
Ad5およびAd5/35第一世代ベクターによって形質導入した樹状細胞におけるHBeAg-レトロゲンの発現
この実施例は、Ad5およびAd5/35第一世代ベクターによって形質導入したHBeAg-レトロゲンの発現を記載する。使用したレトロゲンカセットは実施例2に記載されており、アデノウイルスベクターは実施例1に記載されている。この実施例において、未成熟CD11c陽性DCにAd5およびAd5/35を感染させた。Ad5/35を感染させたDCは、Ad5感染細胞と比較して、HBeAgの発現の増加を示した。未成熟DCの感染は実施例1に記載されているように実施した。次いで、Ad5およびAd5/35 HBeAgを感染させたDCを、抗原を負荷した自己末梢T細胞と共にインキュベーションした。Ad5 HBeAg感染細胞と比較して、Ad3/35 HBeAg感染DCと共にインキュベーションしたT細胞において、T細胞増殖およびTh1サイトカインIFN-γ分泌の増加が観察された。ペプチド負荷DCと比較して、レトロゲンを発現するAd.5/35ベクターで形質導入したDCの状況下において、HBeAg特異的CTL活性がより強力であることも本発明者らは見出した。
【００７４】
合わせて考慮すると、これらの結果は、B群偽型(pseudotyped)アデノウイルスがより効率的なDC形質導入、成熟化、および抗原特異的免役応答を、毒性のない低いMOIで可能にすることを示している。
【００７５】
実施例4
B亜群カプシドファイバーを有するウイルスベクターを使用するヒト免疫療法
この実施例は、B亜群カプシドファイバーを有するウイルスベクターを用いてヒト免疫療法を実施することを記載する。特に、この実施例は、HBV感染による肝細胞癌(HCC)患者内、または患者由来の未成熟樹状細胞を形質導入することによって、免疫療法でヒトを治療することを記載する。
【００７６】
HCC患者は、レトロゲンカセットを発現するように構成されたB亜群カプシドファイバーを有するアデノウイルスベクターで治療することができる。例えば、HBeAgを発現するためのレトロゲンカセットを含有するAd11ファイバーを有するアデノウイルスベクターは、患者の未成熟DCを形質導入するために使用することができる。DC形質導入はエクスビボにおいて実施することができる。患者のDCを患者から単離し、次いでアデノウイルスベクターで形質導入することができる。または、アデノウイルスベクターを患者のDC集中部付近(例えば、リンパ節)または腫瘍付近に注射することができる。形質導入(インビボまたはエクスビボ)は、100のMOIまたは10のMOIなどの低いMOIで実施することができる。形質導入された未成熟DCは成熟化し、MHC I型およびII型抗原を患者のT細胞およびB細胞に提示する。Th、CTLおよびB細胞応答が患者のHCC腫瘍および患者のHBV感染症に対して開始されることが期待される。この免疫療法はHCCおよびHBV感染症の症状を軽減または排除するはずである。
【００７７】
上記の明細書に記載されている全ての刊行物および特許は、参照として本明細書に組み入れられる。記載されている本発明の方法および系の種々の改変および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなくなされることが当業者に明らかであると考えられる。本発明は具体的な好ましい態様に関して記載されているが、主張されている本発明はこのような具体的な態様に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、化学、医学、および分子生物学、または関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するために記載されている様式の種々の改変は、特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ウイルスベクターがAd11カプシドファイバーを有し、未成熟な樹状細胞を形質導入するために使用され、成熟した樹状細胞を生じる本発明の一態様を示す。
【図２】実施例1に記載するAd5、Ad5/11、およびAd5/35の未成熟樹状細胞の形質導入効率を示す。
【図３】実施例1に記載する樹状細胞成熟化に対するAd5およびAd5/11感染の効果を示す。
【図４】図4Aは、実施例2に使用するレトロゲンカセット配列を示す。図4Bは、実施例2に記載するAd5およびAd5/11で形質導入した樹状細胞における、GFPまたはレトロゲン発現の割合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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