(57)【要約】本発明は４官能基コポリマーを核酸と結合させる医薬組成物に関する。前記コポリマーは式（I）を有し（すなわちポロキサミン）、好ましくはその陽イオン性鉱物塩または有機塩の１つの形態を有する。本組成物を用いてin vivo遺伝子伝達を改善することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つ核酸と陽イオン形で用いられる下記式（I）の４官能基コポリマーの少なくとも１つの有機塩または鉱物塩を結合させることを特徴とする医薬組成物：
【化１】
2005522433.tif 000006
式中、xおよびｙはそれぞれ別個に１から500の間の整数を表し、ｘは前記分子が少なくとも30質量％のエチレンオキシドユニットを含む値を有する。
【請求項２】
前記組成物がまた少なくとも１つの塩を含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記塩が塩化カルシウムであることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記塩が塩化マグネシウムであることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記塩が塩化カリウムであることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記塩が塩化リチウムであることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記塩がチオシアン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物がタイロード液、すなわち140ｍMのNaCl、6ｍMのKCｌ、3mMのCaCl2、2mMのMgCl2、10ｍMのHepes（pH7.4）および10ｍMのグルコースとともにフォーミュレートされることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
一般式（I）の化合物が85質量％を越えないエチレンオキシドユニットを有することを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
一般式（I）の化合物が約35から50質量％のエチレンオキシドユニットを有することを特徴とする請求項１から10のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
一般式（I）の化合物が、少なくとも800g/mol、より好ましくは1000から25000g/molの分子量を有することを特徴とする請求項１から11のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
EO/PO比が0.5から1.5、好ましくは１±0.2のオーダーのユニット比を有する請求項１から12のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記分子が、EO/PO比15：16については分子量1650g/mol、EO/PO比50：56については分子量5500g/mol、およびEO/PO比61：68については分子量6700g/molを有する分子から選択されることを特徴とする請求項１から13のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
一般式（I）の化合物が、0.005から15質量/容積％、より好ましくは0.01から10質量/容積％の割合で存在することを特徴とする請求項１から14のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
一般式（I）の化合物がまた、少なくとも１つの細胞内または細胞外ターゲテッィングユニットを含むことを特徴とする請求項１から15のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記核酸がデオキシリボ核酸であることを特徴とする請求項１から16のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記核酸がリボ核酸であることを特徴とする請求項１から16のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記核酸が化学的に改変されることを特徴とする請求項１から18のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
前記核酸がアンチセンスであることを特徴とする請求項１から16のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
前記核酸が干渉RNAであることを特徴とする請求項１から16のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
前記核酸が治療遺伝子を含むことを特徴とする請求項１から21のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物がまたターゲッティング成分を結合させることを特徴とする請求項1から22のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
前記核酸および300mMのNaClを含有する溶液並びに４官能基コポリマーを含有する２倍より高く濃縮した水溶液を容積対容積で混合することによって調製される請求項1から23のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記核酸および２倍濃縮タイロード液を含有する溶液並びに４官能基コポリマーを含有する２倍より高く濃縮した水溶液を容積対容積で混合することによって調製される請求項1から23のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２６】
少なくとも１つの核酸のin vivo細胞伝達を提供することを意図する組成物の調製を目的とする請求項１から25のいずれかに記載の一般式（I）の化合物の使用。
【請求項２７】
前記in vivo伝達が筋肉細胞への伝達である請求項26に記載の使用。
【請求項２８】
前記in vivo伝達が心臓細胞への伝達である請求項26に記載の使用。
【請求項２９】
式（I）の化合物が、タイロード液、すなわち140ｍMのNaCl、6ｍMのKCｌ、3mMのCaCl2、2mMのMgCl2、10ｍMのHepes（pH7.4）および10ｍMのグルコースとともにフォーミュレートされたポロキサミン304であることを特徴とする請求項28に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、主として核酸の細胞伝達、より具体的にはin vivoでの筋肉細胞または心臓細胞への伝達を促進する医薬組成物を目的とする。
【０００２】
本発明で熟慮される問題は、細胞内で問題の遺伝子をタンパク質に翻訳させるために、細胞（より具体的にはその核）内に遺伝子情報を伝達することに関する問題である。
現在のところ、主として２つの技術が細胞の遺伝子伝達に用いられる。第一は、リコンビナントウイルスであるアデノ附随ウイルス（AAV）を用いる。第二は電気的伝達であり、前記は、問題の細胞にDNAを注入した後で細胞を電場に置くものである。前記２つの方法は満足なレベルの遺伝子伝達効率を得ることを可能にしたが、他方、それら方法は毒性に関しては短所をもつ。おまけに、今日AAVは、その調製、精製および／または性状決定に関して多くの技術的困難をもたらし、さらにホスト細胞ゲノムへの組み込みという潜在的リスクは癌化事象を生じる可能性がある。最後に心筋への遺伝子伝達は、生存の理由から電気的伝達技術によって達成させることができない。
本事例では、本発明は、骨格筋、平滑筋および心筋細胞へのトランスフェクションについて明らかに利点を有する。
【０００３】
合成ベクターに関しては、例えば陽イオン脂質と同様にそれらはin vivoでは非効率的であることが判明した。裸出DNAのみが骨格筋および心筋への注入後にタンパク質を発現させることができる。残念ながら、裸出DNAの筋肉内注入後に合成されるタンパク質量は臨床で用いることを考えれば不十分である。実際、筋肉組織への遺伝子伝達に裸出DNAを用いることの主要な問題の１つはその効率の低さであり、前記は注入DNAの増量によって改善されない。現状では、便利であるという理由のため、特に入手し易さという観点から、これらの筋肉内で局所的または全身的治療で重要なタンパク質の発現を促進することは特に都合よいであろう。
したがって、遺伝子治療に理想的なベクター、すなわち免疫反応を誘発せず、さらにタンパク質の最適な発現（所望されるその治療効果）を得ることを可能にする無毒なベクターが今日強く希求されている。
【０００４】
本発明の目的は、固有の化学分子であってそれらに結合させたDNAのトランスフェクション効率を顕著に増大させる前記化学分子の使用を正確に述べることである。
より正確には、本発明は医薬組成物に関し、前記組成物は、少なくとも１つの核酸と下記式（I）の４官能基コポリマー、またはその有機もしくは鉱物塩もしくは誘導体の１つを結合させる（combine）ことを特徴とする：
【０００５】
【化１】
2005522433.tif 000002
【０００６】
式中、xおよびｙはそれぞれ別個に１から500の間の整数を表し、ｘは前記分子が少なくとも30質量％のエチレンオキシドを含む値を有し、さらに式（I）の化合物は好ましくは陽イオン形で用いられる。
上記の分子（特定のポロキサミンである）は、疎水性セグメント（指数yをもつプロピレンオキシド）、親水性セグメント（指数ｘをもつエチレンオキシド）および陽性荷電をもつ中心のエチレンジアミン成分（NCH2-CH2N）から成る。
本発明者らは、これらのポロキサミン（そのときまで非イオン性ポリマーとして提示されていた（WO00/47186））は実際に陽イオン形を採ることができることをより具体的に示した。
それどころか驚くべきことに、中心のエチレンジアミン成分上にこれら陽性荷電が出現することによって細胞の伝達効率は全く阻害されない。実際のところ、陽イオン性脂質、タンパク質および陽イオン性ペプチド型の陽イオン化学分子は、裸出DNAに関して筋肉組織内の遺伝子伝達を改善しない（M.M. Lluis et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96:4262-4267）。
本発明のある特徴は、したがって、少なくとも１つの核酸と、下記式（I）の４官能基コポリマーの少なくとも１つの有機もしくは鉱物塩を結合させることを特徴とする医薬組成物である： 
【０００７】
【化２】
2005522433.tif 000003
【０００８】
式中、xおよびｙはそれぞれ別個に１から500の間の整数を表し、ｘは前記分子が少なくとも30質量％のエチレンオキシドを含む値を有し、さらに式（I）の化合物は好ましくは陽イオン形で用いられる。
【０００９】
したがって、一般式（I）の化合物は、好ましくはその塩のうちの１つの形態、より好ましくは陽イオン形で用いられる。前記を実施するために、本発明の組成物は前記化合物と好ましくは鉱物塩、より好ましくはアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を結合させる。前記は、特に塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化リチウムおよびチオシアン酸ナトリウム、より好ましくは塩化カルシウム（CaCl2）または塩化マグネシウム（MgCl2）から選択することができる。
前記塩は等張、低張または高張量で導入することができる。
本発明者らはまた、式（I）のコポリマーがその陽イオン形として存在していることを担保するために、前記処方物のpHおよび／またはイオン組成を管理することが有利であることを明らかにした。
pH6.5から８、好ましくは７から7.8、より好ましくは7.4が特に有利であることが判明した。
【００１０】
本発明の好ましい実施態様にしたがえば、前記組成物は、以下を含むタイロード液と称される媒体中でフォーミュレートされる：3mMのCaCl2、2mMのMgCl2、6mMのKCｌ、140mMのNaCl、10mMのグルコースおよび10ｍMのHepes（pH7.4）（Tyrode Pharmacology. Philadelphia, 1908, 2nd Ed., 1912）。タイロード液の存在によって、前記処方物のイオン組成およびpHの制御が可能になり、結果として陽イオン形の式（I）の化合物の使用が可能になる。
作用メカニズムのいずれにも拘束されるものではないが、実際のところ、本発明では、特にタイロード液の存在下で陽イオン形で使用されるポロキサミンはDNAの濃縮を可能にすることが観察される。
【００１１】
予期せぬことであったが、本発明者らはまた、一般式（I）の化合物（エチレンオキシドユニットが少なくとも30質量％の割合で存在する）が結合遺伝子のin vivo伝達に特に効率的であることを示した。この効率は以下の実施例１で特に示されている。好ましい変型例にしたがえば、本発明の化合物は85質量％を越えない（no more than 85% by weight）エチレンオキシドユニットを含む。より好ましくはそれらは約35から50質量％、さらに好ましくは約40質量％のエチレンオキシドユニットを有する。
本発明の好ましい変型例にしたがえば、一般式（I）の化合物分子はまた少なくとも800g/mol、より好ましくは1000から25000g/molの分子量を有する。
本発明の好ましい実施態様にしたがえば、一般式の化合物は0.5から1.5のEO/POユニット比、好ましくは１±0.2のオーダーのユニット比を有する。
本発明に特に最適な一般式（I）の化合物としてより具体的にそれぞれ以下を有する分子を列挙することができる：EO/PO比50：56については分子量5500g/mol（例えばポリキサミン304）、EO/PO比15：16については分子量1650g/mol（例えばポリキサミン704）、およびEO/PO比61：68については分子量6700g/mol（例えばポリキサミン904）。
【００１２】
本発明の目的の場合、“誘導体”という用語は、一般式（I）の化学構造を有するが、また二次的な化学的もしくは生物学的機能、またはそれらに補足的特性を付与することができる性質も有する化合物を包含することを意図している。特にこれら誘導体の代表は、一般式（I）の化合物であって、少なくとも１つの細胞内もしくは細胞外ターゲッティングユニットがまたその中に存在する化合物である。前記ターゲッティングユニットの非限定例を示せば、核内分泌配列を有するペプチド、またはある種の細胞表面に存在するレセプターを認識するペプチドを特に列挙することができる。
好ましい実施態様にしたがえば、本組成物はリン酸ナトリウムおよび／またはグルコースを含まない。
本発明の目的の場合、“核酸”という用語はデオキシリボ核酸およびリボ核酸の両方を包含する。
【００１３】
この場合、前記は天然または人工起源の配列であり、特にゲノムDNA、cDNA、mRNA、tRNA、rRNA、小型の干渉RNA（iRNA）ハイブリッド配列、またはオリゴヌクレオチドの合成もしくは半合成配列（前記は改変されてあってもなくてもよい）であろう。前記の核酸はヒト、動物、植物、細菌、ウイルスなどを起源とするであろう。前記は、当業者に既知の任意の技術、特にライブラリーのスクリーニング、化学合成、または混合方法（ライブラリースクリーニングによって得た配列の化学的もしくは酵素的改変を含む）によって入手することができる。前記を化学的に改変してもよい。
特にデオキシリボ核酸に関しては、前記は一本鎖でも二本鎖でもよく、短いオリゴヌクレオチドでも長い配列であってもよい。これらのデオキシリボ核酸は、治療遺伝子、転写もしくは複製のための調節配列、改変もしくは未改変アンチセンス配列、他の細胞成分と結合する領域などを保持することができる。前記は、特に感染因子に対して特異的なポリペプチドを合成することができ、または遺伝的もしくは後天的欠損を治療することができる。
【００１４】
本発明の目的の場合、“治療遺伝子”という用語は、特に治療効果を有するタンパク質生成物をコードする任意の遺伝子を意味する。したがってコードされるタンパク生成物は、タンパク質、ペプチドなどであろう。前記タンパク生成物は標的細胞に関して相同であろう（すなわち、前記細胞が病的状態を示していないとき、通常は標的細胞で発現される生成物）。この場合、前記タンパク質の発現は、細胞の不十分な発現、または改変のために活性をもたないかもしくは活性が弱いタンパク質の発現を代償するか、または前記タンパク質の過剰発現を可能にする。前記治療遺伝子はまた、安定性が増加しているか、改変活性を有するなどの細胞タンパク質変異体をコードすることができる。前記タンパク生成物はまた標的細胞に関して異種であってもよい。この場合、発現されるタンパク質は、例えば不完全な活性を細胞に添加または導入して病的状態と戦わせるか、または免疫反応を刺激させることができる。
【００１５】
本発明の目的の治療生成物の中では特に以下を列挙することができる：酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン（例えばインターロイキン、インターフェロン、TNFなど）、増殖因子（例えば血管内皮増殖因子、インスリン様増殖因子および線維芽細胞増殖因子）、神経伝達物質もしくはそれらの前駆物質またはそれらを合成する酵素、栄養因子（例えばBDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5およびHARP/プレイオトロフィン、ジストロフィンもしくはミニジストロフィン、ユトロフィン）、嚢胞性繊維症関連CFTRタンパク質、腫瘍抑制遺伝子（例えばp53、Rb、Rap1A、DCCおよびk-rev）、血液凝固に必要な因子（例えばVII、VIIIおよびIX）をコードする遺伝子、DNA修復に必要な遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）、ヘモグロビンまたは他のタンパク質輸送因子の遺伝子、脂質代謝に必要なタンパク質に対応する遺伝子、アポリポタンパク質A-I、A-II、A-IV、B、C-I、C-II、C-III、D、E、F、G、H、Jおよびアポ(A)から選択されるアポリポタンパク質タイプの遺伝子、代謝酵素（例えばリポタンパク質リパーゼ、肝リパーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、コレステロール7-α-ヒドロキシラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼまたは脂質伝達タンパク質（例えばコレステリルエステル伝達タンパク質およびリン脂質伝達タンパク質）、HDL-結合タンパク質または他のレセプター（例えばLDL-レセプター、カイロミクロン-レムナントレセプターおよびスカベンジャーレセプターから選択される）、エリスロポエチン、タンパク質キナーゼC-3など。
【００１６】
前記治療核酸はまた、アンチセンス遺伝子または配列であってもよい。標的細胞における前記の発現は、遺伝子発現または細胞mRNA転写の制御を可能にする。そのような配列は、例えば標的細胞内で細胞ｍRNAと相補的なRNAに転写され、したがって細胞ｍRNAのタンパク質への翻訳を阻害することができる。治療遺伝子はまたリボザイムをコードする配列を含む（リボザイムは選択的に標的RNAを破壊することができる）。
上記に示したように、核酸はまた、ヒトまたは動物で免疫反応を生じることができる抗原性ペプチドをコードする1つもしくは２つ以上の遺伝子を含むことができる。したがってこの実施態様では特に、本発明は、ヒトまたは動物に特に微生物、ウイルスまたは癌に対して用いることができるワクチンまたは免疫的治療をもたらすことを可能にする。前記は特に、エプスタイン=バーウイルス、HIVウイルス、B型肝炎ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、合胞体形成ウイルスもしくは他のウイルスに特異的な抗原性ペプチド、または他の腫瘍特異的抗原性ペプチドであろう。
【００１７】
好ましくは、前記核酸はまた、所望の細胞または器官で治療遺伝子の発現および／または抗原性ペプチドをコードする遺伝子の発現を可能にする配列を含む。前記配列は、問題の遺伝子が感染細胞で機能することができるときにその発現が本来必要となる配列であろう。前記配列はまた異なる起源の配列であってもよい（他のタンパク質の発現に必要であるか、または合成配列であってもよい）。特に、前記配列は真核細胞またはウイルス遺伝子のプロモーター配列であろう。例えば、それらは、感染させたい細胞のゲノム由来のプロモーター配列でもよい。同様に、前記はウイルスのゲノムに由来する配列でもよい。これに関しては、例えばE1A、MLP、CMVおよびRSV遺伝子のプロモーター、並びに組織特異的プロモーター（例えばミオシン鎖プロモーターなど）を挙げることができる。さらにまた、これらの発現配列を活性化配列、調節配列などの添加によって改変することができる。それらはまた誘発可能または抑制可能なプロモーターを含むこともできる。
さらに、前記核酸はまた、特に治療遺伝子の上流に、合成された治療生成物を標的細胞の分泌経路内に誘導するシグナル配列を含むことができる。このシグナル配列は前記治療生成物の本来のシグナル配列であってもよいが、また任意の他の機能的シグナル配列でも人工的なシグナル配列でもよい。前記核酸はまた、合成された治療生成物を特定の細胞内区画に誘導するシグナル配列を含むことができる。
【００１８】
一般式（I）の化合物の他に、本発明の組成物は１つまたは２つ以上のアジュバント（特に界面活性剤）を含むことができる。
前記アジュバントを提示すれば、セルロース（例えばカルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシプロピルセルロース）、ヒアルロン酸もしくはアルギン酸塩、ペクチン、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、キトサン、ポリビニルアルコール、プロピレングリコール、ポリビニルアセテート、レシチン、ポリ乳酸およびポリヒドロキシ酪酸、並びにプルロニクス（登録商標）のポロキサマー（PEO-PPO-PEO）および逆プルロニクス（登録商標）（PPO-PEO-PPO）シリーズが挙げられる。
【００１９】
本発明の組成物はまた、核酸複合体を細胞表面のレセプターまたはリガンドに誘導するために１つまたは２つ以上のターゲッティング成分を用いることができる。例示すれば、本発明の組成物は、細胞表面分子に対して作製された１つまたは２つ以上の抗体、また別には１つまたは２つ以上の膜レセプターリガンド、例えばインスリン、トランスフェリン、葉酸もしくは他の増殖因子、サイトカインまたはビタミンを含むことができる。有利には、前記組成物は、細胞表面または近傍の細胞外マトリックス上の特定の多糖類を標的とするために改変されたまたは未改変レクチンを用いることができる。RGDユニットを含むタンパク質、タンデムRGDユニットを含むペプチド（前記は環状でも環状でなくてもよい）およびポリリジンペプチドまたはリガンドペプチド（前記は天然でも合成でもよい）もしたがって用いることができる。
一般式（I）の化合物は、前記組成物の0.005から15質量/容積％、より好ましくは0.01から10質量/容積％の割合で含有される。
【００２０】
本組成物は、問題の核酸を少なくとも１つの一般式（I）の化合物とin vivo投与に適合する溶液中で混合することによって得られる。実例を示せば、これらの組成物は以下のプロトコルを用いて調製することができる：300ｍMのNaClまたは２X（２倍濃縮(two-times concentrated)）タイロード溶液で２倍に濃縮された核酸（特にDNA）を含む溶液および一般式（I）の化合物を含む２倍より高く濃縮した（two-times more concentrated）水溶液を容積対容積で混合する。混合物全体を好ましくはVORTEXを用いて攪拌する。
したがって、本発明の一般式（I）の化合物は、裸出DNAと比較して５から20の範囲の率で筋肉によって合成されるタンパク質量を増加させることができることが観察された。さらにまた、本発明の組成物に関して、トランスジーンの発現は通常の細胞培養法を用いたin vitro培養の細胞では観察されなかった。
【００２１】
本発明の医薬組成物は、特に所望の器官への直接注入のためまたは局所投与（例えば皮膚および／または粘膜）のために、好ましくは注入可能フォーミュレーションのために医薬的に許容できる担体を含む。それらは特に滅菌等張溶液または乾燥（特に凍結乾燥）組成物であろう。後者は、事例に応じて滅菌水または生理学的食塩水を添加することによって注入可能な溶液を構成することができる。
注入に用いられる核酸の用量さらにまた投与の回数は、種々のパラメーター手段によって、特に考慮される投与方法、中心的に関与する病的状態、発現されるべき遺伝子の性質、または所望の治療期間の関数として調節できることは明白である。
投与方法に関してより具体的に言えば、前記は組織もしくは循環系への直接注入または培養細胞の処理後注入もしくは移植片によるin vivoでの再移植を含むことができる。
本発明の組成物は内部投与に対し特に有利であることが判明した。
【００２２】
本発明の目的の場合、“内部投与”という用語は、本発明の組成物が器官組織、例えば筋肉への皮内または皮下投与に適合していることを示す。さらにまた、局所、経口、肺、鼻および粘膜（例えば頬部、膣または直腸）投与を用いることができる。
本発明の組成物は治療的観点から特に利点を有する。
したがって、潜在的適用は遺伝子治療の分野にあり、特に局所的または全身的治療に重要なタンパク質の筋肉組織による産生に適用される。
実際のところ、一般式（I）をもつ少なくとも１つの分子の存在下で筋肉内に遺伝子を伝達した後、前記器官は、局所的に（血管形成因子など）または全身的に（凝固因子、増殖因子、インスリンなど）作用する異種タンパク質の合成のための貯蔵所として機能することができる。その上、本発明の組成物は裸出DNAで発生するプラトー効果の排除を可能にすることができる。特に、筋肉内に注入されるDNA量が増加するとき、前記トランスフェクションは一定の用量まで直線的態様で増加し、続いて発現されるタンパク質の量は最大に達する。他方、本発明のフォーミュレーションにより発現されるタンパク質量は、筋肉内に注入されるDNA量の増加とともに指数関数的に増加する。
【００２３】
また別の適用は免疫分野からもたらされる。この場合には、細菌抗原、ウイルス抗原または他の抗原をコードするDNAが細胞、好ましくは筋肉細胞に注入される。本発明の組成物がトランスフェクトされた細胞によって合成されるタンパク質の量を増加させることについて特に有利であるかぎり、より高濃度の抗体および細胞毒性Tリンパ球を得ることが可能である。
本発明の目的は、本発明にしたがって定義される少なくとも１つの核酸のin vivo細胞伝達のためのベクターとして、一般式（I）の化合物またはその有機もしくは鉱物塩の１つを使用することである。
少なくとも１つの核酸のin vivo細胞伝達を提供することを目的とする組成物の調製のために、上記に定義した一般式（I）の化合物を使用することもまた本発明に包含される。
【００２４】
本発明はまた少なくとも１つの核酸のin vivo細胞トランスフェクションのための方法に関し、前記方法は、上記に定義した一般式（I）の少なくとも１つの化合物またはその有機もしくは鉱物塩の１つとともに前記核酸が投与されることを特徴とする。
前記投与は、局所的に、問題の細胞に直接、または上記で考察した投与経路の１つの手段によって実施することができる。
本発明の好ましい変型例にしたがえば、標的細胞は筋肉細胞または心筋細胞である。
本発明の好ましい実施態様にしたがえば、ポロキサミン304が、筋肉細胞または特に心筋細胞へのin vivo核酸伝達にベクターとして用いられる。
有利には、ポロキサミン304はタイロード液を含む組成物中でフォーミュレートされる。
本発明は、非限定的例示と考えられるべき下記の実施例および図面によってさらに詳細に記載されるであろう。
材料：検査される一般式（I）の化合物は下記の表に列挙される。前記表はそれらの物理化学的特性を示している。
表１
2005522433.tif 000004
【００２５】
実施例１
一般式（I）の化合物の存在下における筋肉内へのin vivo遺伝子伝達
＊サンプル調製：
被検生成物の各々について最適化した２つの濃度を考えた。
各試験で、２つの異なる濃度の式（I）の被検化合物と結合させた50μLのNaCl（150mM）中の15μgのDNAを用いた。
被検濃度は、それぞれ化合物904については0.01％および0.1％、化合物704については0.25％および0.5％、さらに化合物304については５％および10％である。
コントロールDNAサンプルは一般式（I）の化合物の非存在下でフォーミュレートされる。
前記のようにフォーミュレートした各サンプルを７週齢のスイスマウスの前肢脛側部に注入する。７日後に、前記マウスを殺し、注入を実施した前肢脛側部を切断し、続いて溶解緩衝液中でプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnostics）の存在下ですりつぶす。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイシステム（Luciferase Assay Sysytem（登録商標））アッセイキット（Promega, Charbonnieres, France）を用い、ルミノメトリー（ベクター２（Perkin Elmer, Les Ulis, France））により上清でアッセイする。
図１は得られた結果を示している。
一般式（I）の化合物の存在は、ルシフェラーゼ活性の発現を10から15の範囲の倍率で顕著に改善できることが観察される。
【００２６】
実施例２
β-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の骨格筋への伝達
実施例１と同じ態様で、裸出DNA（A）の注入、または、化合物304を５％（B）もしくは10％（C）、または化合物904を0.01％（D）もしくは0.1％（E）含む本発明のフォーミュレーションの注入をマウスの前肢脛側で実施した。
注入7日後に、β-ガラクトシダーゼの発現が本発明のフォーミュレーションを投与された筋肉の肉眼観察で認められる。前記筋肉は、β-ガラクトシダーゼを発現する繊維の領域を示し、前記は筋肉を１mg/mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-d-ガラクトピラノシドの存在下で以下を含む溶液（２mMのMgCl2、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、５mMのPBS（pH７））の浸漬による暴露後に青色になる。前記溶液で37℃で24時間インキュベートした後で筋肉を撮影する。裸出DNAのみを投与された筋肉は目に見えるβ-ガラクトシダーゼを発現させることはできない。
図２はこれらの結果を示している。
【００２７】
実施例３
50μgの裸出DNA（A）または本発明にしたがってフォーミュレートされた50μgのDNAの注入７日後の緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現についての組織学的分析
調べた本発明のフォーミュレーションは以下のとおりである：
−５％（w/v）の化合物304（B）；
−0.25％（w/v）の化合物704（C）；
−0.1％（w/v）の化合物904（D）；および
−0.001％（w/v）の化合物908（E）。
GFP発現は、前記フォーミュレーションの注入7日後に、組織切片をスライドとカバースリップの間にマウントし続いて蛍光顕微鏡で調べることにより認められる。図３によって、GFPを発現する筋繊維の数は、DNAを５％の304（B）、0.25％の704（C）および0.1％の904（D）とともにフォーミュレートした時にはるかに多くなることが観察できる。特に0.001％の908（E）とともにフォーミュレートされたDNAの場合は、トランスフェクトされた繊維の数は裸出DNAにより得られた繊維の数と等価であることが認められる。
結果として、本発明のフォーミュレーションはトランスフェクションを可能にし、前記は裸出DNAと少なくとも同じ効率であるか、または裸出DNAよりも優れている。これらの結果によって、局所的または全身的治療で重要なタンパク質の発現のための本発明のフォーミュレーションの利点が確認される。
【００２８】
実施例４
エレクトロトランスファーに関して本発明のフォーミュレーションの筋肉へのトランスフェクション効率の比較
エレクトロトランスファー条件で、β-ガラクトシダーゼをコードする50μgのDNAを８週齢スイスマウスの頭部唇状筋（cranial labial muscle）に注入し、前記筋肉を下記の条件に付した。前記フォーミュレーションに関しては、50μgのPCMV-βgalDNAを304、704および904と混合し、続いてマウスの頭部唇状筋に注入した。
エレクトロトランスファー技術は、骨格筋へのin vivoトランスフェクションを改善することができる専ら非ウイルス性の方法の１つである。
この比較テストにおけるエレクトロトランスファー技術では、筋肉は、200v/cmの電場で周波数２Hzで20ms、８パルスに付される。このテストは、筋肉内でのβ-ガラクトシダーゼの発現により実証される。
【００２９】
図４は得られた結果を示している。エレクトロトランスファーを実施した筋肉に裸出DNAを注入することによって、注入７日後に筋肉は10μgのβ-ガラクトシダーゼを合成することができる。10％（w/v）の304によるDNAのフォーミュレーションおよび0.25％（w/v）の704によるDNAのフォーミュレーションによって、それぞれ14および11μgのβ-ガラクトシダーゼ／筋肉が合成される。
本発明のフォーミュレーションは、エレクトロトランスファーによるDNAのトランスフェクション効率と少なくとも同じか、それよりも高い効率を得ることを可能にする。さらにまた、本発明は、何らの特別な装置も要求せず、さらに化合物（I）とプラスミドを混合するだけで十分であるので実施がはるかに簡単であるという明らかな利点を有する。最後に、エレクトロトランスファーは、本発明のフォーミュレーションとは異なり心筋への遺伝子トランスファーに適用できないことを強調することは重要である。
さらにまた、エレクトロトランスファーは痛みを伴う技術であり、全身麻酔でなくとも局所麻酔は必要である。
【００３０】
実施例５
凍結電子顕微鏡法によって可視化したフォーミュレーション媒体の関数としてのポロキサミン／DNA粒子の形態
ポロキサミン904／DNA粒子をNaCl（150mM）またはタイロード液（3mMのCaCl2、2mMのMgCl2、6mMのKCｌ、140mMのNaCl、10mMのグルコースおよび10ｍMのHepes（pH7.4）を含む媒体）のいずれかとともにフォーミュレートした。
例えば、タイロード液中のポロキサミン904のゼータ電位の測定は＋9.5mVの値を示し、これは、前記がタイロード液の存在下でDNAと結合するときポロキサミンの陽イオンを使用することを示している。
続いて粒子の形態を凍結電子顕微鏡法によって可視化した。図5は前記可視化を示している。
NaCl（150mM）でフォーミュレートされたとき、DNA分子はポロキサミン904の存在下で互いに凝集して極めて“ルーズな”大きい構造物を形成し、一方、タイロード液でフォーミュレートされたときは、DNA分子はポロキサミン904との小さな球状粒子を形成する（図5C、DおよびE）。同じことが、ポロキサミン304で観察することができる。
したがって、媒体のpHおよびイオン組成を制御することによって、特にCaCl2の存在によって、小さな球状粒子が生成され、前記はおそらく組織内での拡散能力が高まっているであろう。
【００３１】
実施例６
NaClまたはタイロード液中のポロキサミン／DNAのトランスフェクション効率に対するフォーミュレーション媒体の影響
ルシフェラーゼをコードする15μgのプラスミドDNAを含むフォーミュレーションの50μLを8週齢のスイスマウスの前肢脛側に注入する。前記筋肉を7日後に取り出してすり潰し、ルシフェラーゼ活性をアッセイする。
下記の表は、骨格筋によって産生されるタンパク質の量は、フォーミュレーションがタイロード液中で実施されるときに明瞭に多いことを示している。
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【００３２】
実施例７
一般式（I）の化合物の存在下でのβ-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の心臓へのin vivo伝達
サンプルの調製：各試験には、200μgのβ-ガラクトシダーゼコード遺伝子含有プラスミドDNAおよび700μLのタイロード液中のポリマーを用いる。コントロールサンプル用のポリマーPE6400、並びにポロキサミン304、704および904をそれぞれ0.5％、2.5％、0.75％および0.1％の濃度（w/v）でテストした。
体重が約200gの成獣ラットの心嚢に横隔膜を貫通させた後、前記のフォーミュレーションで調製した各サンプルを注入する。注入後7日で心臓を取り出し、β-ガラクトシダーゼ活性を明らかにするために組織学的に分析する。ポロキサミン基剤フォーミュレーションのみが左心室の心筋にトランスフェクトさせることができ、特にポロキサミン304は最良の結果を示した。ポロキサミン304に関しては、β-ガラクトシダーゼ発現心筋細胞（したがって青色に染色される）は心室塊の2/3の深さまで存在し、このことはポロキサミン304の顕著な拡散性能を示している。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明にしたがってフォーミュレートしたDNAを筋肉内注入した後のルシフェラーゼの発現を示す。
【図２】マウス前肢脛側に本発明にしたがってフォーミュレートしたDNAを注入した後のβ-ガラクトシダーゼ活性の肉眼的観察を示す。
【図３】筋肉細胞内のGFP発現の蛍光顕微鏡による観察を示す。
【図４】前記DNAまたは本発明にしたがってフォーミュレートした前記DNAをエレクトロトランスファーにより注入した後のマウス前肢脛側のβ-ガラクトシダーゼ発現を示す。
【図５】凍結電子顕微鏡法による可視化を示す。10％のポロキサミン904を0.15mg/mLのDNAと、150ｍLのNaCl（A、B）またはタイロード液（140ｍMのNaCl、6ｍMのKCｌ、3mMのCaCl2、2mMのMgCl2、10ｍMのHepes（pH7.4）および10ｍMのグルコース）（C、D、E）中で混合する。縮尺棒は100nmを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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