(57)【要約】本発明は、心筋梗塞、血栓溶解、血管形成術および冠状動脈バイパス手術に関連する心筋の虚血再潅流傷害を低下させるためのアレンオキシドシンターゼファミリーの酵素の使用に関係する方法および組成物に関する。本発明の方法は、脂質ヒドロペルオキシドを除去することができるアレンオキシドシンターゼを強力な心臓保護剤として投与するステップを備える。本発明は、重症な広範囲の虚血の後でのアレンオキシドシンターゼの投与により、心臓の回復が刺激されるという発見に基づいている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性傷害を処置する方法であって、
虚血性傷害を防止するために効果的な量でアレンオキシドシンターゼタンパク質を傷害部位に投与するステップを備える、方法。
【請求項２】
前記虚血性傷害が心筋梗塞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記虚血性傷害が脳血管性卒中である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
虚血性傷害を防止する方法であって、
虚血性傷害を防止するために効果的な量でアレンオキシドシンターゼタンパク質を潜在的な傷害部位に投与するステップを備える、方法。
【請求項５】
前記虚血性傷害が心筋梗塞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記虚血性傷害が脳血管性卒中である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
アレンオキシドシンターゼタンパク質および医薬的に許容され得るキャリアを備える医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋梗塞、血栓溶解、血管形成術および冠状動脈バイパス手術に関連する心筋の虚血再潅流傷害を低下させるためのアレンオキシドシンターゼファミリーの酵素の使用に関係する方法および組成物に関する。本発明の方法は、脂質ヒドロペルオキシドを除去することができるアレンオキシドシンターゼを強力な心臓保護剤として投与するステップを備える。本発明は、重症な広範囲の虚血の後でのアレンオキシドシンターゼの投与により、心臓の回復が刺激されるという発見に基づいている。
【発明の背景】
【０００２】
虚血は、酸素飢餓に対する臨床的用語であり、世界における主要な死因である。死をもたらす虚血の非常に一般的な様々な形態が血流の中断によって引き起こされる。心臓疾患、卒中、および外傷性傷害から生じる重度の血液喪失が、すべての死亡の５０％を超える原因となっている虚血の例である。
【０００３】
虚血の臨床的状況において、即座の目的は、できる限り迅速に血流を患者に回復することである。血流が適切な時間内で回復される場合、組織損傷を回避することができる。しかしながら、血流を回復することにおける著しい遅れは、虚血再潅流傷害として知られている別の状態をもたらす。再潅流傷害は、有害な反応性酸素化学種が虚血性エピソードの後で形成されるときに始まる。反応性酸素化学種は、脂質、タンパク質およびＤＮＡに損傷を与え、最終的には細胞を殺し得る複雑かつ自発的なフリーラジカル反応によって生じる。細胞膜における脂質は、極めて細胞傷害性である脂質過酸化物を生じさせる血中の酸素による攻撃の主要な初期の標的である（Ｋｉｌｇｏｒｅ  ＫＳおよびＬｕｃｃｈｅｓｉ  ＢＲ、１９９３、Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６：３５９〜７０；Ｋｌｏｎｅｒ  ＲＡ．、１９９３、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２１：５３７〜４５；Ｈｕｙｎｈ  ＴＴ等、１９９９、Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ、８４：２２３〜３２；Ｋｅｓａｖｕｌｕ  ＭＭ等、２００１、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ、５３：３３〜９）。
【０００４】
虚血再潅流傷害は、虚血事象の後、徐々に現れ得るし、組織に対する不可逆的な損傷を生じさせる場合がある。臨床例には、心筋梗塞（心臓発作）の後における心臓収縮機能不全、不整脈および不可逆的な筋細胞損傷（心臓細胞の死）が含まれる。現在、どの薬物も、虚血再潅流傷害を処置するために利用できないが、虚血再潅流傷害によって引き起こされる損傷は、いくつかの処置が時宜を得た様式で施される場合、防止可能であり、また復帰可能である。最も臨床的に適切な処置では、抗酸化剤の投与が伴う。内因性の抗酸化剤（例えば、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）およびカタラーゼなど）は一次防御機構として作用する。更に、食事性ビタミンＥは、虚血再潅流傷害を弱める際の二次的な役割を果たすことができる。再潅流前または再潅流後での外因性の抗酸化性補助物の投与は、ある程度の有用性が様々な実験系で示されている（Ａｂｕｎａｓｒａ  ＨＪ等、２００１、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．、２０：１５３〜８；Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ  Ｓ等、２００１、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  Ｍａｒ、５３：１３５〜５９；Ｄｈａｌｌａ  ＮＳ等、２０００、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ、４７：４４６〜５６；Ｇａｌａｎｇ  Ｎ等、２０００、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、１４８：１１１〜８；Ｈａｎｇａｉｓｈｉ  Ｍ等、２００１、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２８５：１２２０〜５；Ｋａｎａｍａｓａ  Ｋ等、２００１、Ａｃｔａ  Ｃａｒｄｉｏｌ、５６：１８１〜６；Ｌａｕｒｉｎｄｏ  ＦＲ等、１９９１、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８３：１７０５〜１５；Ｌｉ  Ｑ、２００１、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０３：１８９３〜８；Ｐｒａｓａｄ  Ｋ等、１９９６、Ｃａｎ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１２：１０８３〜９１；Ｒｏｗｌａｎｄ  ＲＴ等、１９９５、Ｓｕｒｇｅｒｙ、１１８：４４６〜５２；Ｖａｎ  Ｒｅｍｍｅｎ  Ｈ等、２００１、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２８１：Ｈ１４２２〜３２）。しかしながら、ＳＯＤ処置は、ヒト臨床試験において有益な効果を示すことに失敗している（Ｆｌａｈｅｒｔｙ  ＪＴ、１９９４、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８９：１９８２〜９１）。
【０００５】
アレンオキシドシンターゼは、脂質ヒドロペルオキシドを系から迅速に除去することによって抗酸化剤として役立つ（米国特許第６，１３２，７１１号；Ｐａｎ  Ｚ等、１９９８、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３：１８１３９〜１８１４５）。本発明は、アレンオキシドシンターゼの投与に基づく、虚血再潅流傷害を低下させるための新規な方法を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、心筋梗塞、血栓溶解、血管形成術および冠状動脈バイパス手術に関連する心筋の虚血再潅流傷害を低下させるためのアレンオキシドシンターゼファミリーの酵素の使用に関係する方法および組成物に関する。本発明の方法は、虚血再潅流傷害に対する強力な心臓保護剤としてアレンオキシドシンターゼを投与するステップを備える。本発明は、重症な広範囲の虚血の後でのアレンオキシドシンターゼの投与により、心臓の回復が刺激され得るという発見に基づいている。
【本発明の詳細な説明】
【０００７】
本発明は、アレンオキシドシンターゼファミリーの酵素を備える組成物、ならびに、心臓血管疾患の防止および／または処置のためのこのような組成物の使用を提供する。このような心臓血管疾患には、例えば、心筋梗塞、狭心症、血栓溶解、血管形成術、冠状動脈バイパス手術、血管性または心筋性の虚血、および心臓もしくは血管系の機能不全または心臓もしくは血管系に対する損傷、そして、特に、細胞傷害性の脂質ヒドロペルオキシドの蓄積に関係づけられる組織損傷を伴う、当業者によって知られている関係状態が含まれる。
【０００８】
更に、本発明の組成物および方法は、罹患した組織における細胞傷害性ヒドロペルオキシドの蓄積に関係する他のタイプの虚血を処置するために使用することができる。このような虚血には、腸間性虚血、脳（卒中）虚血、四肢虚血、眼虚血および肝性虚血が含まれるが、これらに限定されない。
【０００９】
多くのアレンオキシドシンターゼが知られており、従って、知られている出発物質から様々な知られている方法によって製造することができ、または、文献に記載されるようにアレンオキシドシンターゼを調製するために使用される様々な方法によって調製することができる。例えば、アレンオキシドシンターゼを、米国特許第６，１３２，７１１号に記載されるように組換え発現させることができる。あるいは、アレンオキシドシンターゼを市販品として得ることができる。本発明の目的のためには、選択された酵素が細胞傷害性の脂質ヒドロペルオキシドのレベルを低下させることができるならば、アレンオキシドシンターゼファミリーの任意のメンバーを利用することができる。
【００１０】
本発明は、アレンオキシドシンターゼを医薬的に許容され得るキャリアに備える医薬組成物を提供する。このようなキャリアには、任意の好適な生理学的な溶液または分散剤などが含まれ、例えば、生理的食塩水または緩衝化された生理的食塩水などが含まれる。キャリアにはまた、例えば、任意の希釈剤、賦形剤、懸濁化剤、滑剤、アジュバント、ビヒクル、送達システム、乳化剤、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料または甘味剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸着遅延剤などが含まれ得る。任意の従来の媒体、キャリアまたは薬剤に関する限り、有効成分との不適合性がある場合を除き、組成物におけるその使用が意図される。
【００１１】
本発明は更に、心臓血管疾患を防止および／または処置するための方法に関する。本発明は、冠状動脈バイパスなどの外科的手法との関連で特に有用であることが見出されている。このような場合、通常、アレンオキシドシンターゼは、このような手法の前に、また、必要ならばその後で投与される。アレンオキシドシンターゼは、自然に生じた虚血事象の後の虚血再潅流の前または虚血再潅流のときに使用することもできる。このような自然の事象には、冠状動脈閉塞を有する対象が含まれるが、これに限定されない。
【００１２】
本発明の方法は、脂質ヒドロペルオキシドのレベルを低下させることができる量のアレンオキシドシンターゼを虚血再潅流傷害の前および／または虚血再潅流傷害のときに対象に投与するステップ、および虚血再潅流傷害を低下させるために、アレンオキシドシンターゼを組織との効果的な接触状態にさせるステップを備える。本発明の組成物は、経口経路、肺経路、非経口経路（筋肉内注射、関節内注射、腹腔内注射、静脈内（ＩＶ）注射または皮下注射）、吸入経路（微粉末配合物または微細ミストを介して）、経皮経路、鼻腔経路、膣経路、直腸経路または舌下経路の投与（これらに限定されない）を含む様々な異なる方法を使用して投与することができ、また、それぞれの投与経路のために適切な投薬形態物に配合することができる。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態において、アレンオキシドシンターゼは、虚血再潅流傷害の前に、典型的にはアレンオキシドシンターゼの血流内への注入によって投与される。あるいは、アレンオキシドシンターゼは、虚血再潅流傷害のとき、および虚血再潅流傷害から生じる組織損傷が終了する前に投与される。アレンオキシドシンターゼが虚血再潅流傷害の開始後に投与される場合、投与は、この開始の５日以内に、より好ましくは開始後２４時間以内に、最も好ましくは傷害開始後１時間以内に行われなければならない。
【００１４】
投与される本発明の組成物の投薬量は、対象の種、年齢、体重および疾患状態、ならびに、表現型変化を必要とする特定の生理学的状態を含む様々なパラメーターを参照して決定される。投薬量は、好ましくは、分子アッセイまたは表現型変化によって測定されたとき、投与により、効果的な結果が生じるように選ばれる。このようなアッセイには、例えば、心臓機能（すなわち、収縮期圧および拡張期圧、収縮性ならびに心拍出量）の測定が含まれる。
【００１５】
６．実施例：アレンオキシドシンターゼは虚血後の心臓の機械的機能の回復を刺激する
【００１６】
６．１．材料および方法
［動物］
オスＷｉｓｔａｒラット（３００ｇ〜３５０ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。動物はケージあたり２匹で収容され、食物（標準的なラット用餌）および水を自由に摂取させた。この研究で使用された動物は、研究室動物の管理および使用に関する指針（国立衛生研究所、刊行物番号８５−２３、１９８６年改訂）における勧告に従って管理された。
【００１７】
［虚血プロトコル］
事前にＣＯ２ガスで窒息させ、断頭したラットから得られた心臓を潅流し、実験用心臓としてカニューレを挿管した。簡単に記載すると、心臓を素早く摘出し、氷冷した緩衝液に入れ、そして、（ｍＭ）単位で、ＮａＣｌ（１１８）、ＫＣｌ（４．７）、ＫＨ２ＰＯ４（１．２）、ＭｇＳＯ４（１．２）、ＣａＣｌ２（２．５）、ＥＤＴＡ（０．５）、ＮａＨＣＯ３（２５）、グルコース（１１）、Ｃａ２＋（１．７５）を含有するＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液（ｐＨ７．４、９５％Ｏ２−５％ＣＯ２のガスを通じる）を用いて大動脈から逆向きに直ちに潅流した。この潅流中に、心臓から過剰な組織を取り除き、左心房の開口部にカニューレを挿管した。その後、心臓を実験用モードに切り換え、そして、３％ウシ血清アルブミンに事前に結合させた、１１ｍＭグルコースおよび１．２ｍＭパルミタートを含有する再循環緩衝液系において、１１．５ｍｍＨｇの左心房充填圧および８０ｍｍＨｇの大動脈後負荷で潅流した。心臓はこの脂肪酸濃度で潅流された。これは、この濃度が、心臓手術に関連する虚血および再潅流の臨床的状況で観測された濃度に近似させているからである。１５分間の好気的潅流の後、心臓を、左心房充填ラインおよび大動脈後負荷ラインの両方をクランプで締めることによって３０分間の全体的な虚血に供した。虚血後、左心房および大動脈の流れを復活させ、心臓を３０分間再潅流した。アレンオキシドシンターゼを、使用されたときには、再潅流期間の１５分前に、２５０μｇの濃度で潅流液に直接加えた。再潅流が終了したとき、心臓をカニューレから外し、液体Ｎ２で凍結した。心臓機能を、Ｔｒａｎｓｏｎｉｃインラインフロープローブ（モデルＴ２０６）およびＤｉｇ  Ｍｅｄ  Ｈｅａｒｔ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（モデルＨＰＡ−ｔａｕ）を使用して記録した。潅流プロトコル全体を通して、水ジャケット付チャンバーにより、潅流液の温度が３７℃で保たれた。
【００１８】
［統計学的分析］
群平均の統計学的比較のために、スチューデントｔ検定が使用された。ｐ＜０．０５の値が有意であると見なされた。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして報告される。
【００１９】
６．２．結果
表１には、重度の全体的な虚血の後における心臓の再潅流回復に対するＡＤＳの影響が示される。好気的条件のもとで、機械的機能は、コントロール群に由来する心臓と、アレンオキシドシンターゼ処置群に由来する心臓との間で類似していた。しかしながら、３０分間の流れのない重度の虚血の後では、アレンオキシドシンターゼは機械的機能の回復について有益であった。実際、再潅流に入った５分もの早くから、アレンオキシドシンターゼ処置群における収縮期圧、拡張終期圧、収縮性およびＣＯの回復は、非処置の心臓と比較して、著しく改善された。再潅流期間の残り期間のすべてで、収縮期圧、収縮性および心拍出量に対するアレンオキシドシンターゼの有益な効果が観測された。
【００２０】
高レベルのパルミタートに曝された虚血心臓の再潅流のときに典型的には観測される酸素フリーラジカルの突発的放出により、心臓の機能不全がもたらされ得る。再潅流の開始前に加えられたアレンオキシドシンターゼが有益であることは明らかである。
【表１】
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【００２１】
本発明は、本明細書中に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されることはない。実際、本明細書中に記載される改変に加えて、本発明の様々な改変が、上記の説明から当業者には明らかになる。このような改変は、添付された請求項の範囲に含まれることが意図される。様々な参考文献が本明細書中に引用されているが、その開示内容はその全体が参照により組み入れられる。
【国際調査報告】
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