(57)【要約】  メスマウスにおけるロードシス反射を亢進してマウスの繁殖効率を高める作用を有するフェロモンであって、ESP1を含むマウスフェロモン。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メスマウスにおけるロードシス反射を亢進するフェロモンであって、ESP1を含むマウスフェロモン。
【請求項２】
ESP1がESP1遺伝子でコードされる全長ポリペプチドに含まれる部分ポリペプチドであって、少なくとも全長ポリペプチドのアラニン(36：開始メチオニンを1とする)からグリシン(99)までのポリペプチドを含む部分ポリペプチドである請求項１に記載のフェロモン。
【請求項３】
マウスの交尾効率改善剤であって、ESP1を有効成分として含む改善剤。
【請求項４】
メスマウスのオスマウスに対する受け入れ行動の増長剤であって、ESP1を有効成分として含む増長剤。
【請求項５】
マウスの交尾効率を改善する方法であって、ESP1をメスマウスに作用させる工程を含む方法。
【請求項６】
メスマウスのオスマウスに対する受け入れ行動を増長する方法であって、ESP1をメスマウスに作用させる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウスのフェロモンに関する。より具体的には、雌マウスにおけるロードシス反射を亢進する作用を有するマウスフェロモンに関する。
【背景技術】
【０００２】
動物の個体から発せられた後にその物質を受容した同種の動物の行動や内分泌状態の変化を引き起こす機能性物質を「フェロモン」と呼ぶ(Nature, 183, pp.55-56, 1956)。動物において外界の化学物質は鼻腔の中に存在する嗅覚システムで受容されることから、嗅覚システムはフェロモンのセンサーとして機能している。ヒトや一部のサルを除く陸生動物は鼻腔内に2種類の独立した嗅覚システム(主嗅覚系及び鋤鼻系)を有しており、外界の化学物質の受容に用いているが、げっ歯類はこの2つの嗅覚システムを最も発達させている哺乳類である。このような観点から、主にげっ歯類を用いてフェロモンの探索やフェロモンの効果の検討が行われており、特に分子生物学的手法を用いることができるという利点から、マウスを用いた研究が盛んに行われている。【０００３】
マウスのフェロモンを介した行動や内分泌状態の変化については詳細が明らかにされつつあり(Nat. Rev. Neurosci., 4, pp.551-562, 2003; Curr. Biol., 14, pp.R81-89, 2004)、多様な化学物質がそれぞれオスのマウント行動や攻撃行動、母親マウスの攻撃行動などの行動変化や、性成熟の促進又は抑制、メスの発情や性周期変化、流産の誘発などの内分泌状態の変化を引き起こすことが解明されている(マウスなどのフェロモンに関して、総説として細胞工学, 26, pp.885-889, 2007; 細胞工学, 25, pp.393-397, 2006; 日本生殖内分泌学会誌, 13, pp.5-8, 2008を参照のこと)。【０００４】
マウスにおいては嗅神経細胞や鋤鼻神経細胞で受容される揮発性のフェロモン候補物質が尿や包皮腺などから同定されており(Nat. Rev. Neurosci., 4, pp.551-562, 2003; Curr. Biol., 14, pp.R81-89, 2004)、メスの嗅神経細胞を活性化してメスに対して誘引作用を示すフェロモンMTMT(メチルチオメタンチオール)がオスの尿から同定されている(Nature, 434, pp.470-477, 2005)。また、マウスの尿や涙に含まれるMUP(Major urinary protein: J. Biol. Chem., 274, pp.4655-4662, 1999)、MHCペプチド(Science, 306, pp.1033-1037, 2004)、ESP(exocrine gland secreting peptide: Nature, 437, pp.898-901, 2005)などペプチド性の物質が鋤鼻神経細胞で受容されることも解明されている。【０００５】
ESPについては、さらにオスの涙腺から分泌された7-kDaのオス固有のペプチドであるESP1 (exocrine gland secreting peptide 1)が顔のすり合せなどメスとの直接接触により涙液とともにメスの鋤鼻系システムに移行して鋤鼻神経細胞のV2R受容体に作用すること、及びこのESP1がオス特異的な物質であり、マウスフェロモン候補物質であることも報告されている(Nature, 437, pp.898-901, 2005)。しかしながら、上記刊行物にはESP1が特定のフェロモン作用を有することは記載されておらず、特にこのESP1がメスのロードシス反射を亢進させる作用を有するマウスフェロモンであることについては開示がない。また、ESP1が鋤鼻上皮で神経応答を引き起こすこと、及びマウス系統によってmRNAの転写量に違いがあることが報告されている(Current Biology, 17, pp. 1879-1884, 2007)。【０００６】
一方、実験用に用いられるマウスのほとんどは近交系(一般的には20世代以上の同系交配を続けたもの)又は純系(一般的には,99%以上ホモの遺伝子型をもつもの)であり、多くの実験用マウスは野生型マウスに比べて繁殖力に乏しい。このため、実験用マウスからノックアウトマウスや病態モデルマウスなどを作成した場合に効率よく繁殖させることができないという問題が生じていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nat. Rev. Neurosci., 4, pp.551-562, 2003
【非特許文献２】Curr. Biol., 14, pp.R81-89, 2004
【非特許文献３】Nature, 434, pp.470-477, 2005
【非特許文献４】J. Biol. Chem., 274, pp.4655-4662, 1999
【非特許文献５】Science, 306, pp.1033-1037, 2004
【非特許文献６】Nature, 414, pp.631-634, 2001
【非特許文献７】Nature, 437, pp.898-901, 2005
【非特許文献８】Current Biology, 17, pp. 1879-1884, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題はマウスの繁殖効率を高める作用を有するフェロモンを提供することにある。より具体的には、雌マウスにおけるロードシス反射を亢進する作用を有するマウスフェロモンを提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、上記刊行物(Nature, 437, pp.898-901, 2005)に記載されたESP1がメスマウスにおいてロードシス反射を亢進する作用を有しており、メスのオスに対する受け入れ行動を増長させて交尾確率を高めるマウスフェロモンとして利用可能であることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。【００１０】
すなわち、本発明により、メスマウスにおけるロードシス反射を亢進するフェロモンであって、ESP1を含むマウスフェロモンが提供される。
この発明の好ましい態様によれば、ESP1がESP1遺伝子でコードされる全長ポリペプチドに含まれる部分ポリペプチドであって、少なくとも全長ポリペプチドのアラニン(36：開始メチオニンを1とする)からグリシン(99)までのポリペプチドを含む部分ポリペプチドである上記のフェロモンが提供される。【００１１】
また、別の観点からは、マウスの交尾効率改善剤であって、ESP1を有効成分として含む改善剤；及びメスマウスのオスマウスに対する受け入れ行動の増長剤であって、ESP1を有効成分として含む増調剤が本発明により提供される。
さらに別の観点からは、マウスの交尾効率を改善する方法であって、ESP1をメスマウスに作用させる工程を含む方法；及びメスマウスのオスマウスに対する受け入れ行動を増長する方法であって、ESP1をメスマウスに作用させる工程を含む方法も本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のマウスフェロモンはメスマウスにおけるロードシス反射を亢進する作用を有しており、マウスの交尾効率を改善する作用を有している。従って、本発明のマウスフェロモンをメスマウスに作用させることにより、交尾効率が低い実験用の近交系マウスなどの交尾効率を改善することができる。例えば、実験用の近交系マウスから実験モデルマウスとして作成したノックアウトマウスや病態モデルマウスなどに本発明のマウスフェロモンを作用させることにより、効率的な繁殖が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】C57BL/6メス個体とSLC:ICRオス個体とのメス型の性行動試験の結果を示した図である。オス個体のメス個体へのマウント行動の回数（A）、オス個体のマウント行動に対するメス個体のロードシス反射の割合（B）、メス個体のオス個体への匂い嗅ぎ行動（C）を示した。（B）において群間に有意な差が認められた。（A）及び（C）においては群間に有意な差は認められなかった。*: p＜0.05を示す。
【図２】Balb/cメス個体とSLC:ICRオス個体とのメス型の性行動試験の結果を示した図である。オス個体のメス個体へのマウント行動の回数（A）、オス個体のマウント行動に対するメス個体のロードシス反射の割合（B）、メス個体のオス個体への匂い嗅ぎ行動（C）を示した。（B）において群間に有意な差が認められた。（A）及び（C）においては群間に有意な差は認められなかった。*: p＜0.05を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のマウスフェロモンはESP1を含み、メスマウスにおけるロードシス反射を亢進する作用を有することを特徴としている。
【００１５】
ESP1についてはNature, 437, pp.898-901, 2005に記載されており、当業者は上記刊行物を参照することにより容易にESP1を入手することが可能である。ESP1をコードする遺伝子の構造及びESP1遺伝子によりコードされる全長ポリペプチド配列については上記刊行物の図4bに詳細に説明されている。本発明のマウスフェロモンの有効成分であるESP1としては、ESP1をコードするESP1遺伝子の全長でコードされるポリペプチド（シグナルペプチドである22アミノ酸残基：MTSLPVLLFLIILLLPSMITEGを含む102アミノ酸残基の全長ポリペプチド)のほか、シグナルペプチドを除いたポリペプチド(80アミノ酸残基)又はその部分ポリペプチドを用いてもよい。このような部分ポリペプチドとしては、例えば、上記刊行物に開示されているように、全長ポリペプチドに含まれるアラニン(36：開始メチオニンを1とする)からグリシン(99)までの部分ポリペプチドを用いることができる。また、シグナルペプチドの一部を含む部分ポリペプチドを用いてもよく、例えば、グリシン(22)から末端のリジン(102)までの部分ポリペプチドなどを用いることもできる。
【００１６】
さらにシグナルペプチドを除いたポリペプチド(アルギニン(23)〜リジン(102)までの80アミノ酸残基)に含まれる活性ドメインを用いてもよい。活性ドメインはシグナルペプチドを除いたポリペプチドのうち、該ポリペプチドと同様のロードシス反射亢進作用を有する最小単位のポリペプチドを意味する。例えば、シグナルペプチドを除いたポリペプチド(80アミノ酸残基)の片端又は両端から1個ずつのアミノ酸残基を除いたポリペプチドを調製してロードシス反射の有無を調べることにより、活性ドメインを容易に確認することができる。このようにして確認された活性ドメイン自体、又は活性ドメインを部分配列として含むポリペプチドを本発明のマウスフェロモンとして用いてもよい。例えば、全長ポリペプチドに含まれるアラニン(36：開始メチオニンを1とする)からグリシン(99)までの部分ポリペプチドや、グリシン(22)から末端のリジン(102)までの部分ポリペプチドは活性ドメインを部分配列として含むポリペプチドの典型例である。
【００１７】
ESP1としてはオスマウスから分離・精製した天然ポリペプチドを用いることもできるが、遺伝子組み換えにより製造したリコンビナントESP1を用いてもよい。オスマウスからの天然ポリペプチドの分離・精製方法、及びリコンビナントESP1の製造方法についても上記刊行物に具体的に示されている。また、ESP1としては天然由来のESP1において1個ないし数個、好ましくは1個ないし10個程度、さらに好ましくは1個ないし5個程度のアミノ酸残基が欠失、及び／又は置換、及び／又は挿入されたポリペプチドであって、メスマウスにおいてロードシス反射を亢進する作用を有するポリペプチド(改変ESP1と呼ぶ)を用いてもよい。例えば、上記刊行物に記載されたアラニン(1)からグリシン(64)までのポリペプチドのアミノ酸配列において1個ないし数個、好ましくは1個ないし10個程度、さらに好ましくは1個ないし5個程度のアミノ酸残基が欠失、及び／又は置換、及び／又は挿入されたポリペプチドを用いることができる。改変ESP1が所望のロードシス反射亢進作用を有することは、本明細書の実施例に具体的に記載された方法により容易に確認することができる。
【００１８】
従って、本明細書において用いられる「ESP1」の用語は、EPS1遺伝子によりコードされる全長ポリペプチドのほか、活性ドメインを含むその部分ペプチド、又は改変ESP1などを含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００１９】
本明細書において「ロードシス反射」の用語はメスマウスにおける発情期の反射を意味しており、オスマウスによる交尾行動をメスマウスが受け入れる行動として、一般的にはメスマウスが不動化し、その後オスマウスのマウント行動に対して脊柱を背屈させる行動として確認される反射である。本発明のマウスフェロモンはメスマウスに作用する性特異的なフェロモンであり、メスマウスにおいてロードシス反射を亢進させることにより、交尾効率を高める作用を有している。
【００２０】
本発明のマウスフェロモンの使用方法は特に限定されないが、本発明のマウスフェロモンはメスマウスの鋤鼻系システムにおいて鋤鼻神経細胞の受容体に作用することから、メスマウスの嗅覚システム、特に鋤鼻系システムに接触できるように使用することが望ましい。例えば、マウス飼育用ケージ内に水溶液を噴霧する方法や、メスマウスの顔全体又は鼻付近に水溶液を噴霧する方法、飼育用の床敷き材や巣材に水溶液を含浸させる方法、あるいは水又は飼料に添加する方法などを例示することができるが、これらに限定されることはなく、メスマウスの嗅覚システムに作用できる態様であれば任意の使用方法を選択することができる。マウスフェロモンの使用量は特に限定されないが、例えば、メスマウス1匹あたり0.1〜100μg、好ましくは1〜20μg程度を作用させることが望ましい。
【００２１】
本発明のマウスフェロモンは、野生型のマウスのほか、近交系又は純系マウスなどの任意のメスマウスに作用してロードシス反射を亢進することができる。以下の実施例に具体的に示すように、近交系、クローズドコロニー系統、及び野生型マウス系統にはオスマウスの涙液にESP1が含まれていない系統も存在しているが、このようなマウス系統におけるメスマウスに対してもESP1はロードシス反射を亢進する作用を有している。これらのマウス系統では、オスマウスの涙液にESP1が含まれていないことから、一般的には交尾効率が低く、繁殖効率が悪いが、本発明のマウスフェロモンを用いることにより、これらのマウス系統においても交尾効率を改善することが可能である。
【００２２】
例えば、一般的に実験に汎用されるマウス系統のうちC57BL/系統やC3H/系統のマウスは繁殖効率が悪いことが知られており、これらのマウスから作成されたノックアウトマウスや病態モデルマウスの繁殖が困難になる場合があるが、これはオスマウスの涙液にESP1が含まれていないことが一因であると考えられる。このような系統のマウスに対して本発明のマウスフェロモンを用いることによって、交尾効率を改善して高い繁殖効率を確保することが可能になる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例1：ESP1の調製
BALB/cマウス由来ESP1のcDNA (exon3)からESP1(24-102)（開始メチオニンを1とする）をコードする遺伝子をPCR法にて増幅し、pET-28aベクター（Novagen社）へNdeIとEcoRIの制限酵素サイトを用いてサブクローニングした。上記発現ベクターを用いて発現するタンパク質において、トロンビン消化サイトのカルボキシ末端側にNdeIサイト由来のアミノ酸配列His-Metが含まれるため、これをコードする遺伝子配列をESP1本来のGly-Arg (22-23)をコードする遺伝子配列へQuikChange（Stratagene社）を用いて置換し、ESP1(22-102)の発現ベクターとした。【００２４】
ESP1発現ベクターを用いて大腸菌BL21 (DE3)（タカラバイオ社）を形質転換し、LBプレート（最終濃度50 μg/mL カナマイシン添加）上に塗布した。37℃で12時間培養し、プレート上に生じたコロニーをLB培地1 L（最終濃度50 μg/mL カナマイシン添加）に植え継ぎ、37℃、130 rpmで終夜培養した。3000 Gで10分間遠心分離して集菌し、菌体をLB培地2 L（最終濃度50 μg/mL カナマイシン添加）×5本（計10 L）に植え継ぎ、37 ℃、130 rpmで培養した。OD600=1.2でIPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)（最終濃度1 mM）を添加し、4時間後に5000 Gで10分間遠心分離して集菌した。【００２５】
1 L分の菌体を氷上にてSonication Buffer (20 mM Sodium Phosphate Buffer (pH 7.4)/500 mM NaCl）を用いて最終的に30 mLになるように共洗いしながら50 mL ガラスビーカーに移した。超音波破砕器（BRANSON社）にフラットチップを装着し、氷上にて１分間×８回（Power: 3, Duty cycle: 50%）の超音波破砕を行った。過熱を防ぐため、各回の間に１分間の休止を入れた。その際に100 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)を加え、最終濃度1 mMとした（37.5 μL×８回、計300 μL）。超音波破砕した溶液を4 ℃にて35000 Gで50分間遠心して上清と沈澱に分離し、上清をニッケルアフィニティー精製に供した。【００２６】
ニッケルアフィニティー精製は以下の方法で行った。すべての操作は4℃にて行った。ゲルの前処理は、Ni Sepharose 6 Fast Flow gel（GEヘルスケア社）4 mL bed volumeをEconoPakカラム（バイオラッド社）へ入れ、超純水12 mLを2回、Sonication Buffer 5 mLを2回通すことにより行った。上清を0.45 μmのフィルターに通し、カラムにロードした。段階的にSonication Bufferのイミダゾール濃度を上げ、最終的に500 mMまで溶出した。SDS-PAGEで溶出位置を確認し、MWCO 3500の透析膜に入れ、さらに50〜100ユニットのトロンビン（GEヘルスケア社）を加えて終夜透析した。【００２７】
不溶性画分（菌体破砕後の1回目と2回目の遠心分離の沈澱）は、Gdm-HCl Buffer （20 mM Sodium Phosphate Buffer (pH 7.4)/6 M  Guanidinium-HCl）に溶解して最終的に20 mLとした後、4℃にて35000 Gで50 分間遠心した。上清について、同様にニッケルアフィニティー精製及び透析を行った。【００２８】
イオン交換クロマトグラフィー精製は以下の方法で行った。すべての操作は4℃にて行った。ゲルの前処理は、Q-Sepharose gel（GEヘルスケア社）1 mL bed volumeをカラムへ入れ、超純水10 mLを2回、Dialysis Buffer (20 mM Sodium Phosphate Buffer (pH 7.4)) 5 mLを2回通した。透析液を50 mLファルコンチューブに移し、PMSFを最終濃度1 mMとなるよう加えた。沈澱を3000 Gで10分間遠心して除き、上清をゲルにロードした。Dialysis Bufferで洗浄した後、Sonication Buffer(1.5 mL×2回)で溶出した。【００２９】
ゲルろ過および逆相クロマトグラフィー精製は以下の方法で行った。すべての操作は4℃にて行った。イオン交換クロマトグラフィーで溶出したESP1を、Gel filtration Buffer (20 mM Sodium Phosphate Buffer (pH 7.4)/300 mM NaCl）で平衡化したSuperdex 75 (26/60)（GEヘルスケア社）にロードし、溶出した。さらにSymmetry300 C4 5μm(Particle size) 4.6×250 mm column（Waters社）カラムを用いた逆相クロマトグラフィーに付した。溶出条件は、流速1.5 mL/分、A液: 超純水（0.1% TFA）、B液: アセトニトリル（0.1% TFA）とし、以下のグラジエントを用いた。
B液: 0 % （4.0 column volume）
B液: 0 → 33 % （0.5 column volume）
B液: 33 → 41 % （14 column volume）
B液: 100 % （0.1 column volume）
B液: 0 % （2.0 column volume）
溶出されたESP1のピーク画分を凍結乾燥して、以下の試験に供した。【００３０】
例2：メスマウスにおけるロードシス反射試験
(1)材料と方法
(a)動物
供試動物として、SLC:ICR オスマウス（日本SLC 株式会社、静岡）、Balb/c オスマウス（日本SLC 株式会社、静岡）、C57BL/6 メスマウス（日本SLC 株式会社、静岡）、BALB/c メスマウス（日本SLC 株式会社、静岡）を用いた。オス個体は本実験前に、性経験ありの卵巣摘出術処置されたメス個体と性行動トレーニングを1 日おきに合計4 回行い、全性行動トレーニングでのマウント回数の平均が20 回以上の安定した性行動を示すオス個体のみを供試した。【００３１】
(b)飼育環境
動物を温度23℃、湿度50％、明期12 時間、暗期12 時間（6 時点灯、18 時消灯）に調整された動物室内で中ケージ（17.5cm×24.5cm×12.5cm）で飼育し、床敷きにはコーン・コブ（Shepherd's Cob: SHEPHERD）、巣材にはパルマスαＮ（鍋林フジサイエンス株式会社）を用いた。動物には飼育用固形飼料（MM-3: 株式会社船橋農場）を給餌し、水は自由摂取とした。【００３２】
(c)卵巣摘出術
供試動物のメス個体に対して、動物飼育室へ導入の1 週間後、卵巣摘出術を行った。ジエチルエーテル（和光純薬工業株式会社）で麻酔処置し、背部をハサミにより切開、切開部からハサミを入れ、外皮と腹膜の結合を引き離した。腹膜を切り、腹腔内から脂肪とともに、卵巣を引き出し、子宮上部で切除した。その後、卵巣を腹腔内に戻し、皮膚をミヘル針(小、吉野医科機器製作所)で閉口した。手術後、新しい床敷き・巣材の中ケージに戻し、動物飼育室にて1 週間の回復期を設けた。【００３３】
(d)性ステロイドホルモン処置
実験開始の48 時間前および24 時間前、各マウス個体の頸部へ27G×3/4"の注射針（TERUMO）を用いて、コーン油（和光純薬工業株式会社）を用いて濃度調整したエストロゲン（0.02mg/0.05ml）を0.05ml で皮下注射した。実験開始の4〜6 時間前、各個体の頸部へ27G×3/4"の注射針（TERUMO）を用いて、コーン油（和光純薬工業株式会社）を用いて濃度調整したプロゲステロン（和光純薬工業株式会社、0.3mg/0.03ml）を0.03ml 皮下注射した。【００３４】
(e)尿採取
尿は、実験開始以前に、供試動物とは別の本研究室にて繁殖飼育している10 週齢以降で未去勢のBalb/cAJ オス個体の背中を保定して採取した。採取の際に、膀胱周辺をピンセットあるいは指によりマッサージを行うことで排尿を促した。採取後は、提示量ごとに分注し、-20℃の冷凍庫に保存した。実験に利用する量のみを実験開始2 時間前に解凍し、利用した。すべての採尿は、明期に行い、同一個体で1 日あたり11 時・15時の2 度行った。【００３５】
(f)塗布物質およびフェロモン候補物質
Tris-HCl は、ESP1及びOBPα1(Gene, 212, pp. 49-55, 1998)の溶媒として使用したものと同濃度の20mM（pH7.5）を、ESP1 およびOBPα1 は濃度200ug/mg（20mM Tris-HCl (pH7.5))を100μlずつ分注したものを用いた。オス尿は、上述した方法で採取したものを使用した。
(g)試験
開始の1 時間前に脱脂綿へTris-HCl、ESP1、OBPα1 を各100μl ずつ塗布し、尿塗布用の脱脂綿を含む全脱脂綿を38℃に設定したインキュベーター（ICV-300、アスワン株式会社）内で静置した。【００３６】
(h)脱脂綿によるフェロモン候補物質の前提示
卵巣除去術後、1 週間の回復期をはさんで、メス型の性行動試験を行った。試験開始の1 時間前に、メス個体をテストケージに移動し、テストケージに馴化させた。試験は、動物飼育室（温度23℃、湿度50％）で、暗期（18 時以降）に赤色灯の下行った。試験開始時に、テストケージ内でメス個体と対極の位置にフェロモン候補物質の塗布された脱脂綿を静かに導入し、30 分間の行動をビデオに撮影した。オス尿は、提示直前に脱脂綿へ塗布した。【００３７】
(i)メス型の性行動試験
試験開始時に、テストケージ内でメス個体と対極の位置にオス個体を静かに導入し、1 時間の行動をビデオに撮影した。録画したビデオより、Excel イベントレコーダー（東京大学獣医動物行動学研究室卒業生赤川直人氏およびChuo Ito Technoscience 山本武氏作製）を用いて、オス個体のメス個体に対するマウント行動の回数（Mount frequency）、テストケージ導入後最初のマウント行動の発現までの潜時(Mount latency)、メス個体のオス個体のマウント行動に対するロードシス反射の回数(Lordosis frequency)、オス個体による最初のマウント行動から最初のロードシス反射が発現するまでの潜時(Lordosis latency)、全マウント回数におけるロードシス反射の割合(Lordosis score)を解析した。【００３８】
(j)統計解析
すべての統計処理は、SPSS Statistics 17.0 （SPSS）を用いて行い、有意水準は5％とした。メス型の性行動試験の結果に関して、群間の比較に一元配置分析（one-wayANOVA）を用いて行い、有意な差が検出された項目について、Tukey-Kramer を行った。【００３９】
(2)結果
SLC:ICR オス個体（n=25）に対するC57BL/6 メス個体のメス型性行動の解析結果を表1及び図1 に示す。ロードシス反射の回数において有意な差が認められ（p<0.01）、テストケージにESP1 を塗布した脱脂綿を前提示した群では、その他の全ての群と比較してロードシス反射の回数の増加を示した。【００４０】
【表１】
2011030895.tif 000002
【００４１】
また、Balb/c メス個体（n=26）のメス型の性行動の解析結果を表2及び図2 に示す。C57BL/6メス個体の場合と同じように、ロードシス反射の回数において有意な差が認められ（p<0.01）、テストケージにESP1 を塗布した脱脂綿を前提示した群では、その他の全ての群と比較してロードシス反射の回数の増加を示した。【００４２】
【表２】
2011030895.tif 000003
【００４３】
例3：近交系および野生マウス涙におけるESP1発現解析
(1)方法
(a)動物
10週齢雌雄の近交系およびクローズドコロニー系統BALB/c Cr Slc、C57BL/6 Cr Slc、Slc:ICR、129X1/SvJ Jms SlcおよびCBA/N SlcマウスはSLCから購入し、BALB/c A Jcl、BALB/c By Jcl、FVB/N Jcl、129 +Ter/Sv Jcl、C3H/He J Jcl、C3H/He N Jcl、DBA/2 J JclおよびJcl:ICRは日本チャールズリバーから購入した。10週齢雌雄の野生由来マウス系統BFM/2Ms、MSM/Ms、PGN2/Ms、CHD/Ms、SWN/Ms、KJR/Ms、BLG2/Ms、NJL/MsおよびHMI/Msは国立遺伝学研究所城石博士より分譲を受けた。これらのマウスを明期10:00-22:00、暗期22:00-10:00、23±2℃で飼育した。【００４４】
(b)涙の採取
PBSで10倍希釈したソムノペンチル注射液（登録商標、ペントバルビタールナトリウム注射液、大日本住友製薬株式会社）を150 μl / 10 g体重で腹腔内投与した。p-20チップ（eppendorf）の先を2 cm残して切ったものを用いて、麻酔下マウスの眼に2 mM CaCl2、2 mM MgCl2を加えたPBSを5ul注ぎ入れ、2〜3回ピペッティングをすることによって洗眼し、涙を含む溶液を氷上のプラチナチューブ（登録商標、BMBio）に回収した。この操作を両眼で3回ずつ繰り返し、約30μlの涙液を得た。涙液は使用するまで-80 ℃で凍結保存した。【００４５】
(c)タンパク定量
涙液に含まれるタンパク質量を、NanoDrop Protein A280を用いて定量した。2 μlの涙を用い、280 nmの吸光度を測定し、1 Abs = 1 mg/mlモードを使用してタンパク質量を算出した。【００４６】
(d)SDS-PAGE
5μgのタンパク質を含む涙液をサンプルバッファーで希釈し、15 %のアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。電気泳動後のゲルからPVDF膜にタンパク質を転写させ、膜に5%スキムミルク溶液を作用させた後、ウサギ抗ESP1抗体を、室温で１時間反応させた。さらに、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗-ウサギIgG抗体を反応させ、NBT/BCIP（Promega）で発色させた。【００４７】
(2)結果
抗ESP1抗体を用いて、様々なマウス涙液のウエスタンブロットを行った。その結果、近交系およびクローズドコロニー系統では、BALB/c Cr Slc、BALB/c A Jcl、BALB/c By Jcl、およびDBA/2 J Jclの涙液からESP1が検出された。C57BL/6 Cr Slc、Slc:ICR、129X1/SvJ Jms Slc、CBA/N Slc、FVB/N Jcl、129 +Ter/Sv Jcl、C3H/He J Jcl、C3H/He N JclおよびJcl:ICRの涙液からESP1は検出されなかった。また、野生由来マウス系統では、BFM/2Ms、MSM/Ms、PGN2/Ms、CHD/Ms、SWN/Ms、KJR/Ms、BLG2/Ms、NJL/Msの涙液からESP1が検出された。HMI/Msの涙液からESP1は検出されなかった。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年4月4日(2011.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メスマウスにおけるロードシス反射の亢進剤であって、ＥＳＰ１を有効成分として含む亢進剤。
【請求項２】
ＥＳＰ１がＥＳＰ１遺伝子でコードされる全長ポリペプチドに含まれる部分ポリペプチドであって、少なくとも全長ポリペプチドのアラニン（３６：開始メチオニンを１とする）からグリシン（９９）までのポリペプチドを含む部分ポリペプチドである請求項１に記載の亢進剤。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
メスマウスのオスマウスに対する受け入れ行動の増長剤であって、ＥＳＰ１を有効成分として含む増長剤。
【請求項５】
メスマウスにおけるロードシス反射を亢進する方法であって、ＥＳＰ１をメスマウスに作用させる工程を含む方法。
【請求項６】
メスマウスのオスマウスに対する受け入れ行動を増長する方法であって、ＥＳＰ１をメスマウスに作用させる工程を含む方法。
【国際調査報告】
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