(57)【要約】化学化合物によって誘導される５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子（ＡＬＡＳ１）の発現を媒介する核酸配列を開示する。前記配列は、少なくともＤＲ−４結合部位を含んでなる。さらに、ヘムおよび／またはＰ４５０チトクローム合成の調節に関して化学化合物を試験するインビトロ方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともＤＲ−４核内受容体結合部位を含んでなる単離核酸配列であって、前記核酸配列が、５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子の転写エンハンサーとして機能を果たす単離核酸配列。
【請求項２】
前記配列が、配列番号８から１０に記載されている配列を含んでいないという条件で請求項１に記載の核酸配列。
【請求項３】
前記配列が、配列番号１に記載されている配列を含んでなる請求項１または２に記載の核酸配列。
【請求項４】
前記核酸配列が、核因子１結合部位（ＮＦ−１）および／またはＤＲ−５核内受容体結合部位をさらに含んでなる請求項１または２に記載の核酸配列。
【請求項５】
前記核酸配列が、化学化合物に誘導された転写活性を媒介する請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸配列。
【請求項６】
前記化学化合物が、治療使用目的の候補化合物または薬物である請求項４に記載の核酸配列。
【請求項７】
前記配列が、配列番号２から７よりなる群から選択される配列を含んでなる請求項１、２および請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸配列。
【請求項８】
レポーター分子をコードする核酸に操作可能に結合した請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸配列を含んでなる遺伝子作成物。
【請求項９】
前記レポーター分子が酵素活性を有する請求項８に記載の遺伝子作成物。
【請求項１０】
前記レポーター分子活性を、比色定量法、放射活性法、蛍光法または化学発光法により検出できる請求項９に記載の遺伝子作成物。
【請求項１１】
前記レポーター分子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼおよび緑色蛍光蛋白質よりなる群から選択される請求項８〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子作成物。
【請求項１２】
請求項８〜１１に記載の遺伝子作成物を含んでなる好適な細胞と試験化合物との接触、およびレポーター遺伝子をコードする核酸配列の発現および／または転写の増強または抑制の検出を含んでなるヘムおよび／またはＰ４５０チトクローム合成の調節に関して化合物を試験する方法。
【請求項１３】
前記化合物が、治療使用目的の候補薬物または薬物である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記レポーター遺伝子をコードする核酸配列の発現増強が、比色定量法、蛍光法、放射活性法または化学発光法により検出される請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記レポーター遺伝子をコードする核酸の転写増強が、定量的ＰＣＲにより検出される請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞は、レグホーンオス肝癌(Leghorn Male Hepatoma)（ＬＭＨ）細胞、他の肝癌細胞、サル腎細胞（ＣＶ−１、ＣＯＳ−１）またはヒト腎細胞である請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ヘムおよび／またはＰ４５０チトクローム合成のモジュレーターとしての化学化合物の試験、特に配列番号８から１０および３９よりなる群から選択される配列に関して請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸の使用。
【請求項１８】
ヘムおよび／またはＰ４５０チトクローム合成のモジュレーターとしての化学化合物の試験に関して請求項８〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子作成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子（ＡＬＡＳ１）の転写エンハンサー、ならびにヘムおよび／またはＰ４５０合成のインデューサーとしての化学化合物を試験する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人は、食物中、環境中、また臨床的に処方された薬剤（例えば、リファンピシンおよびフェノバルビタール）として多くの外因性化学物質（生体異物）に曝露される。これらの曝露に応じて、哺乳動物は、生体異物の解毒化に関与する蛋白質を誘導する機構を発達させてきた。フェーズＩ酵素、特にヘム含有モノオキシゲナーゼチトクロームＰ４５０による代謝は、このような生体異物に対する第一の防衛線であることが多い。これらの解毒酵素活性により、治療用薬物のインビボ半減期が制限され、その結果、治療効果の持続時間が制限されることとなる。
【０００３】
薬物および化学物質による薬物代謝酵素の誘導は、不活性、活性または毒性代謝物への薬物変換を含み、重要な臨床的結果をもたらす。これらの結果として、薬物−薬物相互作用や肝性ポルフィリン症などのある一定の疾患の促進が挙げられる。薬物、化学物質、ホルモン類および栄養源による５−アミノレブリン酸合成酵素の誘導は、肝性ポルフィリン症の急性発作、神経精神病症状の急性発作を特徴とする稀な遺伝性代謝疾患の１つの特徴となっている。
【０００４】
したがって、新規治療用薬物の開発時に、新規有効化合物をそれらの解毒作用酵素を誘導する能力に関してスクリーニングすることが望ましい。
【０００５】
先行技術としては、分解酵素の生体異物誘導を測定できる試験方法を記載している。国際特許出願国際公開第９９／６１６２２号パンフレットには、代謝分解に感受性を有する可能性のある新規薬物をスクリーニングするシステムを記載している。前記方法は、ヒト遺伝子Ｐ４５０ＣＹＰ３Ａ４の転写エンハンサーに基づいている。前記エンハンサーは、治療用薬物を含む生体異物インデューサーによるＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写誘導をもたらす。
【０００６】
国際公開第９９／４８９１５号パンフレットは、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現を誘導する能力に関して試験化合物をスクリーニングする方法を記載している。この記載された方法は、例えば、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子調節領域内のリファンピシン／デキサメタゾン応答成分に結合するヒトプレグナンＸ受容体（ｈＰＸＲ）と呼ばれるオーファン核内受容体の単離に基づいている。前記ｈＰＸＲ受容体の結合は、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写を調節する。ＣＹＰ３Ａ４酵素は、多くのものが、同様のまたは異なるエンハンサー領域によって誘導できる５５種のヒトＣＹＰ酵素のうちの１種にすぎない。
【０００７】
例えば、新規治療用薬物などの生体異物により分解酵素誘導の評価を可能にする試験システムは既に存在するが、任意の薬物代謝酵素を誘導する能力に関して新規治療用薬物の簡便で安価な試験を可能にする代替手段および方法が依然として必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それゆえ、少なくともＤＲ−４核内受容体結合部位を含んでなる単離核酸配列を提供することが本発明の一般的な目的であり、前記核酸配列は、５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子の転写エンハンサーとして機能を果たす。前記核酸配列の活性化は、ＣＹＰ３Ａ４のだけではなく、任意のチトクロームＰ４５０遺伝子の誘導に係るマーカーである。
【０００９】
好ましい実施形態において、前記核酸配列は、核因子１結合部位（ＮＦ−１）および／またはＤＲ−５核内受容体結合部位をさらに含んでなるか、または配列番号１に記載されている配列を有する。
【００１０】
核因子１結合部位を包含する本発明の核酸配列は、配列番号２から７よりなる群から選択される配列を含んでなることが好ましい。
【００１１】
さらに好ましい実施形態において、前記核酸配列は、化学化合物に誘導された転写活性化を媒介する。前記化学化合物は、治療使用目的の候補化合物または治療薬であることが好ましい。
【００１２】
本発明の他の目的は、レポーター分子をコードする核酸に操作可能に結合される本発明の核酸配列を含んでなる遺伝子作成物である。前記レポーター分子は、酵素活性を有していることが好ましく、前記レポーター分子の活性は、比色定量法、放射活性法、蛍光法または化学発光法により検出できることがより好ましい。
【００１３】
前記レポーター分子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼおよび緑色蛍光蛋白質よりなる群から選択されることが好ましい。
【００１４】
本発明の第３の目的は、ヘムおよび／またはＰ４５０チトクローム合成の調節に関して化合物を試験する方法である。前記方法は、以下のステップを含んでなる：本発明の遺伝子作成物を含んでなる好適な細胞と試験化合物とを接触させること、およびレポーター遺伝子をコードする核酸配列の発現および／または転写の増強／低減を検出すること。レポーター遺伝子の発現および／または転写の増強または抑制が検出されることにより、ヘムおよび／またはＰ４５０合成を高めるか、または抑制される化合物が示される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
好ましい実施形態において、前記試験化合物は、治療使用目的の候補薬物または治療薬である。
【００１６】
本法のさらに好ましい実施形態において、レポーター遺伝子をコードする核酸配列の発現増強は、比色定量法、蛍光法、放射活性法または化学発光法により検出される。
【００１７】
特に好ましい実施形態において、レポーター遺伝子をコードする核酸の前記転写増強は、定量的ＰＣＲにより検出される。
【００１８】
本発明の方法の使用に好ましい細胞は、レグホーンオス肝癌(Leghorn Male Hepatoma)（ＬＭＨ）細胞、他の肝癌細胞、サル腎細胞（ＣＶ−１、ＣＯＳ−１）またはヒト腎細胞である。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、ヘムおよび／またはＰ４５０合成のモジュレーターとしての化学化合物の試験を目的とした、本発明の核酸またはその断片の使用に関する。
【００２０】
本発明はさらに、ヘムおよび／またはＰ４５０チトクローム合成のモジュレーターとしての化学化合物の試験を目的とした、本発明の遺伝子作成物の使用に関する。
【００２１】
以下の詳細な本発明の説明が考慮されると、本発明はより良く理解され、上記以外の目的が明らかになるであろう。上記の説明は、以下の添付の図面を参照している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
ヘムは、酸素輸送および生体系の代謝における必須成分である。非赤血球形成細胞において、経路における第１の律速酵素である５−アミノレブリン酸合成酵素（ＡＬＡＳ１）は、その生合成を調節する。正常な生理学的条件下では、ヘムの取り込まれていない細胞濃度が増すにつれて毒性が生じ得るので、遊離のヘム濃度は、低くまた緊密に調節されている。フェノバルビタール（ＰＢ）などの薬物または他の原型ＣＹＰインデューサーの投与後、ヘム濃度が肝臓内で上昇し、ヘム依存酵素濃度の上昇を調節する。これは、ＡＬＡＳ１の誘導により達成され、例えば、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）などの機能性チトクロームホロ蛋白質の産生のため、十分かつ明らかに配位されたヘムの供給が保証される。
【００２３】
本発明の範囲内において、発明者らは、ＡＬＡＳ１遺伝子転写のエンハンサーとして働くＡＬＡＳ１をコードする遺伝子の５’フランキング領域の核酸エレメントを同定し、特性化した。前記同定核酸エレメントは、化学化合物に誘導されたＡＬＡＳ１遺伝子の転写をもたらす。
【００２４】
前記核酸エレメントは、少なくとも１つのＤＲ−４核内受容体結合部位を含んでなる。本明細書中に用いられる用語「ＤＲ−４核内受容体結合部位」とは、直接的反復−４ヘキサマー反復を称す。このような結合部位は、半分部位間が４つのヌクレオチドによって分離された直接的反復として配列されたヘキサマーの半分部位により特徴付けられている。この半分部位は、以下の標準的配列ＡＧ（Ｔ／Ｇ）ＴＣＡを有する。本明細書中に用いられるこの用語は、また、標準的配列すなわち、例えば、ＣＡＲ（構成的アンドロスタン受容体）／ＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）ヘテロダイマーなどの核内受容体に対する結合部位として依然として機能を果たすことができる半分部位配列変異体の機能性等価体を含んでなる。
【００２５】
好ましい実施形態において、前記ＡＬＡＳ１遺伝子エンハンサーは、ＮＦ−１結合部位をさらに含んでなる。本明細書中に用いられる用語「ＮＦ−１結合部位」とは、転写因子のうち核因子−１系統のメンバーへの結合部位として役立つＤＮＡエレメントを称し、前記用語は、その機能的等価体、すなわち、転写因子のうち核因子−１（ＮＦ−１）系統のメンバーへの結合部位としてさらに機能を果たすことができる配列変異体を包含する。前記ＮＦ−１結合部位は、以下のコンセンサス配列：ＴＧＧＣ（Ｎ4）ＧＣＣＡ（Ｎ＝任意のヌクレオチド）を有する。当業者にとって、本発明の配列が、上記に同定された結合部位の２つ以上のコピーを含んでなり得ることは明白である。
【００２６】
本発明の範囲において、化学化合物誘導ＡＬＡＳ１遺伝子の転写を与える以下の配列は：配列番号１（ニワトリ）、配列番号２（ニワトリ）、配列番号３から７（ハツカネズミ筋）、配列番号８から１０および３９（ヒト）に特徴付けられる。配列番号８から１０および３９に記載されている核酸配列は、本出願の出願日前にデータバンクの一部に存在していたが、これらの配列は特性決定されておらず、またこれらの機能／活性は未知であった。
【００２７】
本明細書中に用いられる用語の核酸配列は、本発明の配列１から１０の断片、変異体または誘導体を包含することを理解すべきである。ＡＬＡＳ１の開示されたエンハンサー配列および、例えば、サンブルック(Sambrook)ら、「分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」、ニューヨーク：コールドスプリングハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、２００１年に記載されている周知の分子生物学法に基づいて、当業者は、化学化合物誘導ＡＬＡＳ１遺伝子の転写／発現を与えるさらなる配列を単離することができる。
【００２８】
本発明の遺伝子作成物の構築は、例えば、サンブルック(Sambrook)ら、「分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」、ニューヨーク：コールドスプリングハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、２００１年に記載されている標準的分子生物学法を用いて行うことができる。
【００２９】
試験法に用いられる細胞は、化学化合物誘導アッセイの実施を可能にする任意の好適な細胞であってよい。本発明の方法に使用するための特に好ましい細胞系は、レグホーンオス肝癌(Leghorn male hepatoma)（ＬＭＨ）細胞系である。遺伝子作成物を、例えば、化学的形質移入、電気的形質移入またはウィルス性形質移入などの周知の形質移入法により細胞に導入できる。前記宿主細胞は、ゲノム遺伝子座、または発現ベクターから本発明の遺伝子作成物を発現できる。典型的に発現ベクターは、宿主細胞における転写と発現を達成するために必要な調節配列を含んでなり、エピソーム状態で存在するためにプラスミド複製に求められる必要な配列を含有してもよく、あるいは染色体取込みのためにデザインされてもよい。好適なベクターは、例えば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を含んでなるｐＧＬ３ＬＵＣｐｒｏ（プロメガ）である。
【００３０】
本発明のヘムおよび／またはＰ４５０合成の調節のための化合物を試験する方法は、以下のステップを含んでなる：本発明の遺伝子作成物を宿らせる好適な細胞と、試験化合物とを接触させレポーター遺伝子発現、および／または転写の増強または抑制を検出する。レポーター遺伝子転写／発現の増強または抑制を検出する方法は、使用されるレポーター遺伝子に依存し、例えば、定量的ＰＣＲを用いて転写濃度で行うか、あるいはレポーター遺伝子産物を検出することにより行うことができる。レポーター遺伝子産物の好ましい検出方法は、例えば、ルシフェラーゼアッセイ、ＣＡＴアッセイまたはβ−ガラクトシダーゼアッセイなどの比色定量アッセイ、蛍光アッセイまたは化学発光アッセイである。
【実施例】
【００３１】
ここで本発明を実施例によってさらに説明する。
【００３２】
ニワトリ５−アミノレブリン酸遺伝子の薬物応答エンハンサーの単離と特性化
ニワトリＡＬＡＳ１遺伝子にまたがっている長さが約３５ｋｂの挿入体および１５ｋｂの５’−フランキング領域を含有するコスミドクローンを単離し、その配列を分析した。３２８２ｂｐ  ＳｍａＩ断片、５０５６ｂｐセグメントおよび７９７３ｂｐ  ＥｃｏＲＩセグメントを含む３種の主要なサブクローンを、転写開始部位の上流領域から生成した（図１Ａ）。ＳｍａＩクローンは、−１６７ｂｐから−３４４９ｂｐに延長しており、一方、ＥｃｏＲＩ細断片は、それぞれ−２３４７ｂｐから−７４０２ｂｐに、また−７４０３ｂｐから−１５３７６ｂｐにまたがっている。材料と方法の節で記載されているように、これらの細断片を、ＳＶ４０プロモータを含有するｐＬｕｃＭＣＳ修飾ルシフェラーゼベクターにクローン化した。薬物誘導性を、６００μＭ  ＰＢで処理された一過性形質移入ＬＭＨ細胞において測定し、コントロール値と比較した。この結果、７９７３ｂｐ細断片はＰＢにより高度に誘導性であることが明らかとなり、コントロール値に比して転写活性が２８倍増加することを示した。それと比較して、５０５６ｂｐ細断片と３２８２ｂｐ細断片とは、薬物処理に応答して転写活性を事実上示さなかった（図１Ｃ）。７９７３ｂｐ細断片（−１５３７６／−７４０３）は、さらなる分析用に選択され、ｐＬｕｃＭＣＳレポーターベクターにおける多数のサブクローンに分けられ、その結果、１７６ｂｐ  Ｓａｕ３ＡＩ−ＳｍａＩエレメントおよび１６７ｂｐ  ＰｖｕＩＩ−ＨａｅＩＩＩエレメントが単離された（図１Ａおよび１Ｂ）。ＬＭＨ細胞においてＰＢに暴露すると、これらの配列は遺伝子アッセイにおいて常に、レポーターコントロール値の２５〜６０倍の誘導を示す（図１Ｃ）。７９７３ｂｐ断片の他の全ての部分もまた、サブクローン化されたが、ＬＭＨ細胞で試験すると薬物応答を示さなかった。１７６ｂｐ（配列番号２）断片および１６７ｂｐ（配列番号１）断片は、プロモーターからの配向または距離にかかわらず高い薬物応答を保持するので、これらは、アミノレブリン酸合成酵素薬物応答エンハンサー配列（ＡＤＲＥＳ）エレメントと称される。
【００３３】
最近の発見から、薬物媒介酵素誘導においてＮＲ類が関係していることが判っている（２、３、８）。この理由のため、本発明者らは、公表された機能性ヘキサマーの半分部位から編集された加重ヌクレオチド分布マトリックスを基準にし、コンピュータアルゴリズムを用いて潜在的な核内受容体応答部位に係る応答エレメントを精査した。オーファンＮＲ類に係る２つの潜在的結合部位を、１７６ｂｐ配列内の半分部位間が４つのヌクレオチド（ＤＲ４）で分離および５つのヌクレオチド（ＤＲ５）で分離された２つの直接反復体および１６７ｂｐ配列中の半分部位間に４つのヌクレオチド（ＤＲ４）分離された２つの直接反復体を有する各ＡＤＲＥＳエレメントにおいて同定した（図１Ｂ）。明快にするために、３つのＤＲ４結合部位を、遺伝子におけるこれらの出現に従って分類し、転写開始部位から最も遠い上流をＤＲ４−１と呼び、開始部位の最も近い部位をＤＲ４−３と呼んだ。推定のＤＲ４−１は、それぞれ−１４１８６／−１４１８１および−１４１７６／−１４１７１において１つの完全な半分部位（ＡＧＧＴＣＡ）および１つの不完全な半分部位（ＡＧＴＴＧＡ）により定義され、一方、ＤＲ５部位は、それぞれ−１４２５１／−１４２４６および−１４２４０／−１４２３５における１つの不完全な上流の半分部位（ＡＧＣＴＧＡ）および１つの完全な下流の半分部位（ＡＧＧＴＣＡ）により特徴付けられる。１６７ｂｐ配列において、ＤＲ４−２は、−１３５６３／−１３５５８および−１３５５３／−１３５４８における１つの不完全な上流の半分部位（ＧＧＡＴＧＡ）および１つの完全な下流の半分部位（ＡＧＴＴＣＡ）からなり、ＤＲ４−３は、−１３５２６／−１３５２１および−１３５１６／１３５１１における２つの不完全な半分部位（ＧＴＧＴＣＡおよびＧＧＧＧＣＡ）を有する。１７６ｂｐ  ＡＤＲＥＳはまた、核因子１に関するｂｐ−１４２５５からｂｐ−１４２４２にまたがる推定結合部位を含有し、ＤＲ５に重なっているが、一方、１６７ｂｐ  ＡＤＲＥＳはそれを含有しないことが認められることは興味深い。
【００３４】
次に本発明者らは、レポーター遺伝子アッセイからのＡＤＲＥＳ媒介ＡＬＡＳ１誘導濃度と生理学的系における転写刺激との比較することを望んだ。したがって、ＡＬＡＳ１のｍＲＮＡ濃度を、血清なしの培地中で種々の化学インデューサーに曝露して１６時間培養したＬＭＨ細胞中で定量し、ＡＤＲＥＳの一過性形質移入において同一の化合物で観察された誘導パターンと比較した（図２）。調べた化合物としては、ＰＢ（６００μＭ）とＰＢ様インデューサーＰＩＡ（２５０μＭ）、グルテチミド（５００μＭ）、および強力なマウスＣＹＰ２Ｂインデューサーの１，４−ビス［２−（３，５−ジクロロピリジル−オキシ）］ベンゼン（ＴＣＰＯＢＯＰ）（１０μＭ）が挙げられる。さらに、共通のＣＹＰ３Ａインデューサーであるデキサメタゾン（５０μＭ）、メチラポン（４００μＭ）、および１０μＭミフェプリストン（ＲＵ−４８６）を比較のために使用した。本発明者らはまた、ＰＸＲ活性ならびにＣＹＰ３Ａ誘導に対する種特異的効果のため、１０μＭの５−プレグネン−３β−オール−２０−オン−１６α−カルボニトリル（ＰＣＮ）およびリファンピシン（１００μＭ）に興味をもった。メッセンジャーＲＮＡは逆転写され、ＡＬＡＳ１のｃＤＮＡの濃度は、材料と方法の節に記載されるように、タクマン(Taqman)のリアルタイムＰＣＲ定量化システムを用いて定量化された。ＰＢは、ＬＭＨ細胞におけるＡＬＡＳ１の強力なインデューサーであり、基準的な転写濃度に比してＲＮＡ濃度を平均１６倍増加させた（図２）。この値は、１００％誘導を表すために選択され、それに対して他の全ての値を比較する。一般的なインデューサーのＰＩＡおよびグルテチミドならびに３Ａ−特異的インデューサーのメチラポンは、ＡＤＲＥＳエレメントに対して最も強力な効果を示し、ＰＢ処理から得られた過剰濃度で転写を刺激した。それに比較して、デキサメタゾン、ＰＣＮ、ＲＵ−４８６およびリファンピシンは、ｍＲＮＡ濃度またはＡＤＲＥＳ活性化のいずれに関しても小さな効果しかなかったか、または全く効果がなかった。さらに、マウス特異的化合物ＴＣＰＯＢＯＰは、レポーターアッセイにおいてｍＲＮＡ転写またはＡＤＲＥＳの刺激に対する応答を引き出さなかった。２つのＡＤＲＥＳエレメントの誘導プロフィールを互いに比較すると、違いはほとんど示されていない。１６７ｂｐ（配列番号１）は、１７６ｂｐエレメント（配列番号２）と比較すると、２倍の活性でＰＢに応答する。また、１７６ｂｐは、メチラポンよりもグルテチミドに関して僅かに親和性を有し、一方１６７ｂｐエレメントはグルテチミドよりもメチラポンに強い反応を示す。これらの実験は、レポーター遺伝子アッセイにおけるＡＤＲＥＳエレメントの相対的活性化においてアッセイ相互に、また化学的に誘導されたＬＭＨ細胞のｍＲＮＡ転写濃度に対して高度の類似性を示している。
【００３５】
薬物応答をＡＤＲＥＳエレメントに与える際に推定ＤＲ５およびＤＲ４の認識配列内で特異的ヌクレオチド類の役割を調べるために、部位特異的変異誘発を用いた（図３）。材料と方法の節に記載されるように、推定ＮＲ結合部位を破壊するＤＲ４およびＤＲ５のコア認識部位の変異作成物を産生した。簡潔に言えば、ＤＲ５の５’および３’の半分部位を、それぞれＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に変換するためにＰＣＲと組合わせて、プライマー類を使用した。同様に、ＤＲ４−３の半分部位を、ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に変換した。エム・ポドビネック(M.Podvinec)の実験室により開発された半分部位に関するヌクレオチド分布マトリックスからのデータを、変異を受けた半分部位が、機能性の半分部位にほとんど似ていないことを確認するために適用した。ＤＲ４−１の半分部位は、ＡＧＧＴＣＡおよびＡＧＴＴＧＡをそれぞれ非保存性のＡＣＴＣＧＡおよびＡＴＡＣＣＡ塩基に変換することにより末梢された。同様に、ＤＲ４−２の半分部位は、ＧＧＡＴＧＡおよびＡＧＴＴＣＡの双方のヌクレオチドをＣＣＣＣＡＣ塩基に変換した。図３に示されるように、両方のＡＤＲＥＳエレメント内で個々に、また両方のＮＲ結合部位で変異を受けた作成物を産生するために、プライマー類を用いた。
【００３６】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおいて６００μＭ  ＰＢに対する応答に関して修飾エンハンサー類を調べ、この結果を図３に示している。１７６ｂｐ  ＡＤＲＥＳにおけるＤＲ５およびＤＲ４双方の認識部位ならびに完全薬物応答を引き出すために１６７ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメントにおけるＤＲ４の双方の認識部位が必須であることを、これらの知見は示している。ＤＲ５の変異は、ＰＢによって４４倍から６.４倍へ活性化された１７６ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメントを８５％超低減し、一方、ＤＲ４−１における変化は、４４倍から１６倍へ刺激を６０％超制限した（図３Ａ）。図３Ｂに示されるように、１６７ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメントにおけるＤＲ４−２部位およびＤＲ４−３部位の双方が、ＰＢによる完全活性に必要であることが判った。ＤＲ４−２部位の変化は、６０倍から５.４倍へＰＢ応答が９０％超減少させた。ＤＲ４−３部位における変異は、６０倍から１５倍へ誘導のＰＢ応答が７５％減少を引き起こした。これらの研究は、ＡＤＲＥＳエレメントのＰＢ活性に対して推定ＤＲ４およびＤＲ５  ＮＲ結合部位内配列の寄与が必須であることを立証している。
【００３７】
ＤＲ５は、ＮＦ１、すなわち薬剤誘導を修飾する際に関係があるとされている転写因子の推定結合部位に重なるので、本発明者らは、ＤＲ５に対するＮＲ類の結合ではなく、ＮＦ１が１７６ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメントに活性化を与える可能性を試験した（５）。推定ＮＦ１部位をコンセンサス鳥類ＮＦ１結合部位に変換し、したがってＤＲ５の第１の半分部位を破壊する変異作成物を産生し、ルシフェラーゼアッセイにおいて試験した。図３Ａに見られるように、ＮＦ１コンセンサス配列は、１７６ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメントの薬物に対する応答を増大させない。むしろこの誘導は、恐らくＤＲ５  ＮＲ結合部位の破壊のため、４４倍から１５倍へ誘導が６６％減少する。これらの知見を確認するために、ニワトリＮＦ１−Ａを、ＬＭＨ細胞から産生したｃＤＮＡライブラリにより増幅し、ｐＳＧ５発現ベクターにクローン化した。コード化配列の忠実度を、配列決定により確認したが、この作成物は、ＬＭＨ細胞における誘導実験およびＣｏｓ−１細胞におけるトランス活性化の双方で共に形質移入され、誘導またはトランス活性において何ら変化を生じなかった。
【００３８】
最近の知見では、チトクロームＰ４５０の薬物導入において多数のオーファンＮＲ類に関係している（レビューに関して（６、１０、１１）を参照）。本発明者らのグループでは、クローン化に成功してニワトリＣＸＲを発現し、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ類）においてＣＹＰエンハンサーとＣＸＲ−ＲＸＲとの相互作用を立証した（２）。ＤＲ４およびＤＲ５部位は、ＡＤＲＥＳエレメントにより示された転写活性化に明らかに寄与しているので、ＣＸＲが応答エンハンサーに結合するかどうかを決定するためにゲル易動度シフトアッセイを使用した（図４）。インビトロ転写／翻訳ニワトリＣＸＲまたはニワトリＲＸＲ単独のいずれも、32Ｐ−放射標識１７６ｂｐ  ＡＤＲＥＳ（図４Ａ、レーン２および３）または１６７ｂｐ  ＡＤＲＥＳ（図４Ｂ、レーン２および３）に結合しなかった。これとは対照的に、ＣＸＲ／ＲＸＲヘテロダイマー類は、薬物応答エンハンサーに結合し、これらの複合体は、抗ＲＸＲ抗体と共にスーパーシフトできた（図４Ａおよび４Ｂ、レーン４および５）。シフト成分およびスーパーシフト成分（図４Ｂ、レーン６および７）のバンド強度減少により立証されるとおり、二重の変異ＤＮＡ配列を使用する場合、１６７ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメントに結合する核内受容体は減少した。さらに、ＣＸＲ／ＲＸＲヘテロダイマー類の結合は、１７６ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメント内の双方の結合部位が変異した場合（図４Ａ、レーン６および７）、事実上除去された。これらの知見により、ＤＲ４およびＤＲ５結合部位を介したＣＸＲ／ＲＸＲヘテロダイマーとＡＤＲＥＳエレメントとの相互作用が立証されている。
【００３９】
ＡＤＲＥＳエレメントの活性化におけるＣＸＲの役割を確認するために、トランス活性化実験を、Ｃｏｓ−１サル腎細胞において行った。これらの細胞は、ＲＸＲを発現するが、正常な条件下では誘導応答を示さない。材料と方法の節に記載されるように、野生型と変異１７６ｂｐエレメントの４つのコピーまたは変異および野生型１６７ｂｐエレメントの単一コピーを、ｔｋ最小プロモーターを含有するｐＢＬＣＡＴ５プラスミドにクローン化した。ＣＡＴは、ルシフェラーゼより安定な発現を提供し、より高い薬物応答を示したので、ＣＡＴベクターをトランス活性化用に用いた。これらの作成物は、ＣＸＲに関するコード配列を含有するｐＳＧ５発現ベクターおよびβ−ガラクシトダーゼ発現作成物と共に共形質移入して形質移入効率における変異を補正した。ＣＸＲを発現させるために温置２４時間後、野生型および変異配列の導入を、図２で同定された３種の最良インデューサーであるグルテチミド、メチラポンおよびＰＩＡを用いて試験した。図５に示されるように、１７６ｂｐおよび１６７ｂｐのＡＤＲＥＳエレメントの双方がＣＸＲによりトランス活性化される。１７６ｂｐエレメントにおいて、誘導は、変異ＤＲ５  ＮＲ結合部位を担持する作成物において１０〜２５％減少した。ＤＲ４−１結合部位における変異により、全ての薬物による誘導が１.６倍未満に減少した。さらに、１７６ｂｐエレメントにおける双方のＮＲ結合部位の変化により、薬物応答の完全消失が生じた。１６７ｂｐエレメントは、１７６ｂｐエレメントよりもトランス活性化において薬物に対し良好に応答することが判明し、したがって単一コピーで十分であった。野生型配列の誘導は、３種全ての薬物に関して強力であり、非誘導レベルの４.０倍から８.３倍の範囲であった（図５Ｂ）。ＤＲ４−２変異体は、薬物曝露後、より低い誘導を示し、野生型値と比較すると、５８〜６６％減少した。同様にＤＲ４−３変異体配列は、１６７ｂｐ活性の５５〜６６％を示す減少量で薬物に応答した。二重変異体１６７ｂｐエレメントは、薬物に対し応答せず、ＤＲ４およびＤＲ５  ＮＲ結合部位を介したＡＤＲＥＳエレメント活性化におけるＣＸＲの役割が確認された。
【００４０】
材料と方法
試薬
デキサメタゾン、メチラポン（２−メチル−１，２−ジ−３−ピリジル−プロパドン）、５−プレグネン−３β−オール−２０−オン−１６α−カルボニトリル（ＰＣＮ）およびリファンピシンは、シグマ化学会社(Sigma chemical company)より購入した。プロピルイソプロピルアセトアミド（ＰＩＡ）は、ピーター・シンクレア(Peter Sinclair)博士（退役軍人局病院(Veterans Affairs Hospital)、バーモント州ホワイトリバー・ジャンクション(White River Junction,VT)所在）より贈呈された。グルテチミドはアルドリッチ(Aldrich)より購入した。ミフェプリストン（ＲＵ−４８６）は、ルセル・ユークラフ(Roussel-UCLAF)から入手した。１，４−ビス［２−（３，５−ジクロロピリジルオキシ）］ベンゼン（ＴＣＰＯＢＯＰ）は、ユー・シュミット(U.Schmidt)（バイエル、毒性学研究所(Institute of Toxicology,Bayer)、ドイツ国ブッペルタール(Wuppertal)所在）により恵与された。フェノバルビタールナトリウム塩（５−エチル−５−フェニル−バルビタール酸ナトリウム塩）は、フルカ(Fluka)より購入した。組織培養試薬、培地および血清は、ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)より購入した。他の全ての試薬および供給は、標準的供給源から入手した。
【００４１】
プラスミド類
ＳＶ４０プロモーターを含有するｐＧＬ３ＬＵＣルシフェラーゼレポーターを、プロメガ(Promega)から購入した。レポータープラスミドは、ＳａｃＩをｐブルースクリプトＳＫベクター（ストラタジーン(Stratagene)）の複数クローニング部位のうちのＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にまたがる断片をｐＧＬ３ＬＵＣベクターに添加して修飾することにより、新規のｐＬｕｃＭＣＳレポーターのクローニング多用性を大いに高めた。ｐＢＬＣＡＴ５クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼレポーターベクターは、以前に記載されていた（１）。以前に記載されたように（２）、ニワトリＣＸＲおよびＲＸＲをｐＳＧ５発現ベクター（ストラタジーン）にクローン化した。形質移入実験の規格化に用いられたｐＲＳＶβ−ガラクトシダーゼベクターは、アナスタシア・クラリ(Anastasia Kralli)（スイス国バーゼル所在バーゼル大学(University of Basel,Basel)、バイオゼントラム(Biozentrum)）より恵与された。
【００４２】
コスミド単離
ＡＬＡＳ１遺伝子への特異的プローブを、テンプレートとしてニワトリ胎芽肝臓遺伝子ＤＮＡおよび前方プライマー５’−ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＣＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡ−３’（配列番号３１）および逆方向プライマー５’−ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＡＧＣ  Ａ−３’（配列番号３２）を用いてＰＣＲにより産生した。プローブは、製造元の取り扱い説明書に従って無作為プライマー標識キット（ロッシュ分子バイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)）を用いて32Ｐ−放射標識した。成体オスレグホーンニワトリ肝臓から産生したゲノムコスミドライブラリは、クローンテック・ラボラトリーズ(Clontech Laboratories)より購入した。ＡＬＡＳ１プローブは、ＡＬＡＳ１遺伝子を含有する個々のコスミドクローンを同定するために用いられ、少なくとも１５ｋｂの５’−フランキング領域が単離され、配列決定により確認された。
【００４３】
ベクター類の作成
ＡＬＡＳ１遺伝子およびフランキング領域を含有するコスミドをＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化し、約３５ｋｂの新規配列の細断片をｐＬｕｃＭＣＳベクターのＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。長さが１０ｋｂから９００ｂｐのサイズの範囲である８種の断片をクローン化した。さらに、ＡＬＡＳ１プロモーター領域および近位の５’−フランキング領域をコードする３２８２ｂｐ  ＳｍａＩ断片をｐＬｕｃＭＣＳにクローン化した。次に薬物応答８ｋｂ  ＥｃｏＲＩ領域を、標準的サブクローニング法および制限エンドヌクレアーゼを用いてさらに再分割され、Ｓａｕ３ＡＩ−ＳｍａＩ１７６ｂｐエレメントおよびＰｖｕＩＩ−ＨａｅＩＩＩ１６７ｂｐエレメントを単離した。１７６ｂｐと１６７ｂｐの野生型および変異エレメントの単一コピーを、ＢａｍＨＩとＢｇ１ＩＩ制限エンドヌクレアーゼとで望ましい配列を含有する２２２ｂｐ断片を切除し、これらをＢａｍＨＩ−線形化ｐＢＬＣＡＴ５ベクターに連結することによりｐＢＬＣＡＴ５にクローン化した。１７６ｂｐ野生型および変異エレメントの複数反復体は、２２２ｂｐ断片をＢａｍＨＩ−線形化ｐＢＬＣＡＴ５ベクターに連続４回挿入させることによりサブクローン化した。
【００４４】
細胞培養
レグホーンオス肝癌（ＬＭＨ）細胞は、アメリカンタイプ・カルチャーコレクション(American Type Culture Collection)から得られ、１０％ＦＣＳ、１％グルタミン（２ｍＭ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（５０ＩＵ／ｍｌ）で補足されたウィリアムス(Williams)Ｅ培地中、１０ｃｍ皿内で培養した。プラスチックプレート表面上に細胞を正しい位置に載せて補助するために、０.１％ゼラチンで被覆された皿をＬＭＨ細胞のルーチン的培養に使用した。形質移入に関しては、細胞を１２ウェルのファルコン３０４３皿に接種し、７０〜８０％の表面密度に拡張させた。次に細胞を、製造元のプロトコルに従って、血清なしのウィリアムス(Williams)Ｅ培地中に２４時間保持し、ＦｕＧＥＮＥ６形質移入試薬（ロッシュ分子バイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)）を用いて形質移入した。
【００４５】
レポーター遺伝子発現の分析
細胞を薬物また媒体と共に１６時間処理し、収穫した。ルシフェラーゼアッセイに関して、溶菌は、１ウェル当たり２００μｌの受動的溶菌用緩衝液(Passive Lysis Buffer)（プロメガ）で実施し、抽出物を１分間遠心分離してペレット細胞細片にした。ルシフェラーゼアッセイは、ルシフェラーゼアッセイキット（プロメガ）およびミクロライト(Microlite)ＴＬＸ１ルミノメータ（ダイナテック(Dynatech)）を用いて上澄液上で実施した。相対的なβ−ガラクトシダーゼ活性を、記載された（４）とおり測定した。ＣＡＴアッセイに関しては、細胞を１ウェル当たり６００μｌＣＡＴ溶菌用緩衝液で溶菌し、抽出物を１分間遠心分離してペレット細胞細片にした。アッセイは、製造元のプロトコルに従ってＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキット（ロッシュ分子バイオケミカルズ）を用いて実施した。
【００４６】
部位特異的変異誘発
推定ＮＲ結合部位における変異を、標準的重なり法を用いてＰＣＲによりＡＤＲＥＳエレメントに導入した。簡潔に言うと、細断片は、望ましい変異を担うプライマー類とベクタープライマー類とを重ねて増幅させた。次にこれらの細断片を合わせて、完全長変異断片を増幅させるためにベクタープライマーを用いて第２のＰＣＲにおけるテンプレートとして用い、引き続きこれを、適切な酵素で消化し、ｐＬｕｃＭＣＳにクローン化した。正ベクタープライマーはＲＶプライマー３であり、逆ベクタープライマーは、ｐＧＬ３ルシフェラーゼベクター（プロメガ）内のＧＬプライマー２であった。全ての変異を太字で示す。ＤＲ４−１二重変異作成物は、５’−ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＣＧＡ  ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＡＴＡ  ＧＣＡ  ＡＴ−３’正（配列番号１５）プライマーおよび５’−ＣＴＡ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＴＡＴ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＣＣＴ  Ｇ−３’逆（配列番号１６）プライマーにより生産した。ＤＲ５二重変異体を、５’−ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  Ｃ−３’正（配列番号１７）プライマーおよび５’−ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＣ  ＣＴＣ−３’逆（配列番号１８）プライマーにより増幅させた。ＤＲ４−２二重変異体は、５’−ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＡＣＴ  ＣＧＴ  Ｇ−３’正（配列番号１９）プライマーおよび５’−ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＧＧ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  Ｇ−３’逆（配列番号２０）プライマーにより生産した。ＤＲ４−３二重変異体は、５’−ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＡＴＣ  ＡＧＣ−３’正（配列番号２１）プライマーおよび５’−ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＣＧＡ  Ｇ−３’逆（配列番号２２）プライマーを用いて生産した。鳥類ＮＦ１コンセンサス配列は、５’−ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＡＡＡ−３’（配列番号２３）および５’−ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  Ｃ−３’（配列番号２４）の正および逆プライマーを用いて生産した（９）。重なりＰＣＲ後、生産物を、Ｂｇ１ＩＩおよびＥｃｏＲＩまたはＮｏｔＩのいずれかの制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ｐＬｕｃＭＣＳにクローン化した。全ての作成物を配列決定により証明した。
【００４７】
定量的ＰＣＲ
ＬＭＨ細胞を、１２ウェルのプレート上で平板培養し、７０〜８０％の表面密度に拡張し、血清なしの培地中で２４時間温置した。次に製造元のプロトコルに従って、細胞を薬物または媒体のいずれかに曝露させ、ＲＮＡをトリゾール試薬（ギブコ(Gibco)ＢＲＬ）で単離した。１μｇの全ＲＮＡを、モロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素キット（ロッシュ分子バイオケミカルズ）を用いて逆転写した。ＰＣＲは、タクマン(Taqman)ＰＣＲコア試薬キット（ＰＥアプライド・バイオシステムス(Applied Biosystems)）を用いて実施し、転写濃度は、ＡＢＩプリズム７７００配列検出システム（ＰＥアプライド・バイオシステムス）により定量化した。相対的転写濃度は、ΔΔＣｔを測定する相対的定量化法を用いて決定した。以下のプライマー類およびプローブ類をこれらの反応に用いた。ＡＬＡＳ１：プローブ、５’−ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＣＴＴ−３’（配列番号２５）；正プライマー、５’−ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  Ｔ−３’（配列番号２６）；逆プライマー、５’−ＴＣＧ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ−３’（配列番号２７）。グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）：プローブ、５’−ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＧＣＣ  ＣＡＴ  ＴＧＡ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ−３’（配列番号２８）；正プライマー、５’−ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  Ｔ−３’（配列番号２９）；逆プライマー、５’−ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＡ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＡ−３’（配列番号３０）。転写濃度は、別々のチューブで測定し、ＧＡＰＤＨ値をＡＬＡＳ１値の規格化に用いた。
【００４８】
ゲル易動度シフトアッセイ
ニワトリＣＸＲおよびＲＸＲ蛋白質は、製造元のプロトコルに従ってＴＮＴ  Ｔ７クィックカップル化翻訳システム（プロメガ）を用いて発現した。プローブ類は、放射標識［α−32Ｐ］ＡＴＰの存在下、クレノウ反応により標識され、バイオスピン(Biospin)６クロマトグラフィーカラム上で精製した。以前に記載されたとおり（２、７）、１００，０００ｃｐｍに相当する標識オリゴヌクレオチド量を、０.２μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）および２.５μｌのインビトロ合成蛋白質を含有する１０ｍＭトリス−ＨＣＬ（８.０）／４０ｍＭ  ＫＣｌ／０.０５％ノニデットＰ４０／６％グリセロール（容量／容量）／１ｍＭ  ＤＴＴ中で各反応に用いた。スーパーシフトを試験するために、０.５μｌモノクローナル抗マウスＲＸＲウサギ抗体（フランス国イルカーチ(Illkirch)所在ルイ・パスツール大学(Universite Louis Pasteur)、ピー・シャンボン(P.Chambon)により恵与される）を反応混合物に加えた。この抗体は、ニワトリＲＸＲとの相互作用に関してウェスタンブロットにおいて以前に試験されている（データは示していない）。反応混合物を室温で２０分間温置し、０.５×トリス／ホウ酸／ＥＤＴＡ緩衝液中、６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行い、次いでオートラジオグラフィを行った。
【００４９】
トランス活性化
ＡＬＡＳ−１の誘導に対する核内受容体ＣＸＲの寄与を決定する実験は、以前に記載された方法（２）に従って、Ｃｏｓ−１サル腎細胞（スイス国バーゼル所在バーゼル大学バイオゼントラム(Biozentrum)、エイ・クラリ(A.Kralli)により恵与される）中で試験した。簡潔に言うと、細胞を、１０％活性炭−ストリップトＦＢＳで補足し、フェノールレッドなしでＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ギブコＢＲＬ）中、１０ｃｍファルコン３００３皿上で３日間拡張させた。次に細胞を６ウェル皿上で平板培養し、さらに約３０％密度まで一晩拡張させた。次に、細胞をＰＢＳですすぎ、添加なしでオプティメム(Optimem)（ギブコＢＲＬ）中、形質移入のために維持した。１μｇのレポータープラス８００ｎｇのｐＳＶβ−ガラクトシダーゼ作成物および５０ｎｇのＣＸＲ発現ベクターの形質移入を、製造元のプロトコルに従って１ウェル当たり３ｍｌのリポフェクトアミン(LipofectAMINE)（インビトロゲン）を用いて実施した。２４時間温置後、細胞をＰＢＳでリンスし、薬物または媒体のいずれかを含有する１０％脱脂活性炭−ストリップトＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を加えた。１６時間温置後、細胞をＰＢＳでリンスし、６００μｌのＣＡＴ溶菌用緩衝液で溶菌し、ＣＡＴ−ＥＬＩＺＡキット（ロッシュ分子バイオケミカルズ）を用いてＣＡＴ酵素に関してアッセイした。次にＣＡＴ濃度を、β−ガラクトシダーゼ濃度に対して規格化して形質移入効率おける変異を補正した。
【００５０】
マウス５−アミノレブリン酸遺伝子の薬物応答エンハンサーの単離および特性化
ｍＡＬＡＳ１の５’フランキング領域のクローニング
ｍＡＬＡＳ１の塩基対配列情報は数百しか知られていないので、５’フランキング領域を単離する方式は、サザンブロッティングによる「染色体ウォーキング」であった。この目的のために、１１３および２６６と呼ばれる２つの細菌性人工染色体（ＢＡＣ）クローンを用いた（ＢＡＣ１１３ｄ２２および２６６ｎ１８、米国ミズーリ州セントルイス所在、ゲノムシステムズ(Genome Systems Inc.,St.Louis,MO)社からのマウスＣ５７  Ｂ／６）。前記方法の適用により、フランキング領域の約１７ｋｂにわたっている４種の異なるクローンを同定した。これらのクローンのうち、２.６ｋｂ断片は、レポーター遺伝子アッセイにおいて「誘導性」であった。
【００５１】
２.６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片（−１４.７ｋｂから−１７.３ｋｂ）は以下のとおりクローン化された：３μｇ  ＢＡＣ２６６をＨｉｎｄＩＩＩにより一晩消化した。０.７％ゲルを、９０Ｖで６時間操作し、２.６ｋｂバンドを抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩ切断体に連結し、脱リン酸化し、ゲル精製ｐＢＳブルースクリプト（米国カリフォルニア州ラジョラ所在、ストラタジーン）およびヒートショックで変換した。ｐＧＬ３ＬＵＣｐｒｏ＋ＭＣＳへのサブクローニングを、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩを用いて行った結果、断片は正方向であった。ＬＭＨ（レグホーンオス肝癌）細胞系を用いるルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、前記作成物は、薬物誘導性を示した。
【００５２】
２.６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片における薬物応答エンハンサー配列（ＤＲＥＳ）の同定
本発明の発明者らは、２.６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片と呼ばれる先行出願ＰＣＴ／ＩＢ０２／０１２５８における配列は、ゲノム中に２.８ｋｂの長さを実際に有することを見出した。細菌における断片のクローニングは、機能的結果を伴わない０.２ｋｂの消失となった。
【００５３】
２.６ｋｂ断片は完全に配列決定された。この断片は、２６０４ｂｐの長さを有している。方向付けを容易にするため、前記断片の５’末端を１として出発し番号付けされた。以下の断片は、テンプレートとして２.６ｋｂ断片を用いて増幅された：２８０ｂｐ断片（３９８から６７７）（配列番号４）、３２１ｂｐ断片（３９８から７１８）（配列番号５）、３２８ｂｐ断片（３５０から６７７）（配列番号６）および３６９ｂｐ断片（３５０から７１８）（配列番号７）。
以下のプライマー対が使用される：
２８０ｂｐ断片：ｍＡＬＡＳ−１６.６ＦｗｄＫｐｎ（配列番号１１）およびｍＡＬＡＳ−１６.３５ｒｖＸｈｏＩ（配列番号１２）。
３２８ｂｐ断片：ｍＡＬＡＳ−１６.６５ｆｗｄＫｐｎ（配列番号１３）およびｍＡＬＡＳ−１６.３５ｒｖＸｈｏＩ（配列番号１２）。
３２１ｂｐ断片：ｍＡＬＡＳ−１６.６ｆｗｄＫｐｎ（配列番号１１）およびｍＡＬＡＳ−１６.３ｒｖＸｈｏＩ（配列番号１４）。
３６９ｂｐ断片：ｍＡＬＡＳ−１６.６５ｆｗｄＫｐｎ（配列番号１３）およびｍＡＬＡＳ−１６.３ｒｖＸｈｏＩ（配列番号１４）。
【００５４】
１７５ｂｐ断片（４４１から６１５）（配列番号３）は、２.６ｋｂ断片をＳａｃＩ／ＸｂａＩで消化することにより単離した。全断片は、ｐＧＬ３ＬＵＣｐｒｏ＋ＭＣＳベクターにおいてサブクローンし、生じた作成物をＬＭＨレポーター遺伝子アッセイにおける誘導性に関して試験した（図６）。５種全ての断片は、インデューサーとしてメチラポン５００μＭによる誘導性増強を示した。３６９ｂｐ断片は、薬物応答エンハンサー配列ＤＲＥＳと呼ばれた。
【００５５】
３６９ｂｐ  ＤＲＥＳ配列と発見された推定核内受容体部位は、図８に示されている。推定核内受容体部位は、０.８のコア類似性および０.８５のマトリックス類似性を用いてマトインスペクター(MatInspector)により発見された。推定結合部位としては、上流刺激因子（ＵＳＦ）、活性化蛋白質１／４（ＡＰ１／ＡＰ４）、核因子１（ＮＦ−１）、ＣＡＲ／ＣＸＲ／ＰＸＲ（ＤＲ４）、ｅｔｓ−１、エストロゲン受容体（ＥＲ）、ＲＡＲ関連オーファン受容体アルファ１（ＲＯＲＡ１）、ＰＰＡＲ（ＤＲ１）、核因子κＢ（ＮＦκＢ）、ｃ−Ｒｅ１、ステロール応答エレメント結合蛋白質（ＳＲＥＢＰ）、刺激蛋白質１（ＳＰ１）が挙げられる。ＳａｃＩおよびＸｂａＩは、１７５ｂｐコア断片の制限部位である。太字矢印は、コアＳａｃＩ／ＸｂａＩ断片を拡張したことからクローンの５’および３’末端を示す。
【００５６】
ＬＭＨルシフェラーゼ受容体遺伝子アッセイにおける３６９ｂｐ  ＤＲＥＳの薬物誘導パターン
３６９ｂｐ  ＤＲＥＳを他の誘導性断片と比較するために、一連の各種薬物をインデューサーとして用いた：クロトリマゾール（Ｃｌｏ、１０μＭ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ、５０μＭ）、グルテチミド（ＧＥ、５００μＭ）、メチラポン（Ｍｅｔ、５００μＭ）、フェノバルビタール（ＰＢ、５００μＭ）、ＰＣＮ（１０μＭ）、プロピルイソプロピルアセトアミド（ＰＩＡ、２５０μＭ）、リファンピシン（Ｒｉｆ、１０μＭ）、ＲＵ４８６（１０μＭ）、ＴＣＰＯＢＯＰ（１０μＭ）。
【００５７】
図７は、各種薬物による３６９ｂｐ  ＤＲＥＳの誘導を示している。示されたデータは、２つの独立した実験に由来する。２.８ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩクローンに関して既に認められたように、メチラポンは、グレテチミドやＰＩＡと共に最強のインデューサーである。
【００５８】
ＤＲ４の変異誘発
今まで行われた全ての実験により、ＤＲ４部位を含む領域は、何らかの誘導を得るためには絶対に必要であることが示された。ＤＲ４部位（ＤＲ４−１およびＤＲ４−２）の直接の関与を示すために、これらを以下の方法において変異させた（３６９ｂｐの出現箇所）：
ＤＲ４の半分の部位は、個々におよび双方共、変異させた（図９参照）。変異を受けた塩基対には、下線が引かれ、イタリック体である。
【００５９】
好結果をもたらす変異誘発に便利な分析手段を有するために、ＮＲ１の半分の部位をＥｃｏＲＩ部位に、またＮＲ２の半分の部位をＰｓｔＩ部位に変異させた。
【００６０】
変異誘発／クローニング
第１の変異誘発において、各ヘキサマーの半分部位は、個々に変異させた。第１のＰＣＲは、テンプレートとして３６９ｂｐ−ＬＵＣクローンを用い、ｒｖｐ３プラスミドおよびＤＲ４ｍｔ１ｒｖ（配列番号３３）およびｇｌｐ２プラスミドおよびＤＲ４ｍｔ１ｆｗｄ（配列番号３４）［ＤＲ４−２／ｈｓ１］、ＤＲ４ｍｔ２ｒｖ（配列番号３５）およびＤＲ４ｍｔ２ｆｗｄ（配列番号３６）［ＤＲ４−２／ｈｓ２］プライマー対を用いて実施した。ＰＣＲは、１.５％寒天ゲル上で操作し、バンドを抽出した。第２のＰＣＲは、テンプレートとして第１のＰＣＲからのＰＣＲ産物（各産物２０μｌから１μｌ）を使用して実施し、また外部のプライマーｒｖｐ３およびｇｌｐ２と共にＰＣＲを操作して実施した。ＰＣＲを１.２％寒天ゲル上で操作し、バンドを抽出した。次に、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ消化をその断片上で実施し、精製後、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ切断体ｐＧＬ３ＬＵＣｐｒｏ＋ＭＣＳ（消化後、クローニングに適合性の付着末端を有する１つだけの断片であったことから、バンドのゲル分離を必要としなかった）に直接連結し、ヒートショックで変換した。ＤＮＡのミニプレップをＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ消化（挿入断片）およびＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ（ＤＲ４−２／ｈｓ１、変異チェック）またはＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ（ＤＲ４−２／ｈｓ２、変異チェック）消化により分析した。最後に、クローンを配列決定して望ましい変異および他のｂｐ変異のないことを確認した。
【００６１】
第２のステップにおいて、双方の半分部位を変異させた。二重変異体ＤＲ４−２／ｈｓ１、２に関して、３６９ＤＲ４ｍｔ２−ＬＵＣを第１のＰＣＲ用にテンプレートとして用い、プライマーＤＲ４ｍｔ２ｍｔ１ｆｗｄ（配列番号３７）およびＤＲ４ｍｔ２ｍｔ１ｒｖ（配列番号３８）を使用したこと以外、上記と同様の方法であった。この作成物は、３６９ＤＲ４ｍｕｔ−ＬＵＣと短縮して呼ばれる。
【００６２】
ＬＭＨレポーター遺伝子アッセイにおける誘導性
図１０は、ＬＭＨ細胞のルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるマウス３６９ＤＲＥＳのＤＲ４変異体作成物の誘導を示す。インデューサーとしてメチラポン５００μＭを用いた。示されたデータは、３つの独立した実験に由来する。
【００６３】
トランス活性化アッセイにおけるマウスＣＡＲおよびマウスＰＸＲによるＡＬＡ合成酵素薬物応答エンハンサー配列の誘導性
図１４：トランス活性化
転写活性化に対する変異効果を試験するために、マウスＰＸＲとマウスＣＡＲとこれらそれぞれのインデューサーＰＣＮおよびＴＣＰＯＢＯＰを有するＣＶ−１細胞におけるトランス活性化を実施した（図１４）。誘導性ＤＮＡ作成物を、ＣＡＴ５レポーターベクターにサブクローン化し、ＣＶ−１細胞における核内受容体転写因子によりトランス活性化される能力に関して試験した。ｐＳＧ５発現ベクターにクローン化された領域をコードするマウスＰＸＲ（Ａ）およびマウスＣＡＲ（Ｂ）を、コントロールとしてｐＳＶ  β−ガラクトシダーゼを発現するベクターと共に共形質移入した。次に細胞を、薬物（Ａ、ＰＣＮ；Ｂ、ＴＣＰＯＢＯＰ）または媒体コントロールのいずれかと１６時間処理し、細胞抽出物をβ−ガラクトシダーゼ濃度に対して規格化されたＣＡＴ発現に関して分析した。実験を少なくとも３回繰り返し、エラーバーは標準偏差値を表している。
【００６４】
図１４Ａに見られるように、ＤＲ４−１結合部位における単一変異は、ＰＣＮによる誘導がそれぞれ２.７倍と２.０倍に減じ、一方、二重変異は、１.９倍の活性化を示した。ＤＲ４−２における単一変異は、それぞれ５.８倍と５.３倍の活性化を示し、５.６倍の野生型値に比して有意に誘導が減少せず、一方、二重変異は２.５倍の誘導に減少した。３６９ｂｐエレメントにおけるＮＲ結合部位双方の変化により、ＰＸＲ媒介薬物応答が消滅する結果となった。図１４Ｂにおいて、ＤＲ４−１単一変異および二重変異のＣＡＲトランス活性化は、ＴＣＰＯＢＯＰに対して応答を示さず、基本的なＣＡＲ活性さえも消滅した。それと比較して、ＤＲ４−２／ｈｓ１とＤＲ４−２／ｈｓ２の単一変異体は、それぞれ２.５倍と１.９倍およびアンドロスタノール処理濃度を超えた基本的発現を依然として示した。ＴＣＰＯＢＯＰ誘導は、ＤＲ４−２／ｈｓ１作成物においてあまり大きくない１.４倍で基本的濃度を超えたが、一方、ＤＲ４−２／ｈｓ２作成物あるいは二重変異体のいずれも誘導は観察されなかった。ＤＲ４−１、２／ｈｓ１、２の四重変異体に関しては、アンドロスタノールの非存在下においてＣＡＴ発現の基本的増加は認められず、誘導能力は完全に消滅した。
【００６５】
３６９ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメントにおけるＤＲ４−１およびＤＲ４−２双方の部位が、ＰＣＮまたはＴＣＰＯＢＯＰによる完全活性化に必要であることが判明した。共にデータは、ＤＲ４−１がＣＡＲまたはＰＸＲを介したＮＲ媒介誘導に必須であることを示し、一方、ＤＲ４−２は、３６９ｂｐ  ＡＤＲＥＳの総合的活性化に、より間接的な様式で寄与していると思われる。これらの研究は、推定ＤＲ４  ＮＲ結合部位内配列のＡＤＲＥＳエレメントの薬物誘導に対する本質的な寄与を証明している。
【００６６】
マウスＲＸＲおよびマウスＣＡＲがエンハンサー内のどこに結合しているかを決定するゲルシフトアッセイ
両ＤＲ４−１およびＤＲ４−２結合部位は、トランス活性化におけるＡＤＲＥＳエレメントにより示される転写活性化に明らかに寄与しているので、ＰＸＲおよびＣＡＲがエンハンサー内のどこに結合し得るかを決定するためにゲル易動度シフトアッセイを用いた（図１５）。マウスＣＡＲ、ＰＸＲおよびＲＸＲ蛋白質は、製造元のプロトコルに従ってＴＮＴ  Ｔ７クイックカップル化翻訳システム（プロメガ）を用いて発現させた。ＤＮＡ断片標識に関して、末端は、放射標識［α−32Ｐ］ＡＴＰの存在下、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレナウ断片により補充され、ビオスピン(Biospin)６クロマトグラフィカラム上で精製した。以前に記載されているとおり（１０、１２）、１００，０００ｃｐｍに相当する標識オリゴヌクレオチド量を、０.２μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）および２.５μｌのインビトロ合成蛋白質を含有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（８.０）／４０ｍＭ  ＫＣｌ／０.０５％ノニデットＰ４０／６％グリセロール（容量／容量）／１ｍＭ  ＤＴＴ中で各反応に用いた。反応混合物を室温で２０分間温置し、０.５×トリス／ホウ酸／ＥＤＴＡ緩衝液中、６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行い、次いでオートラジオグラフィを行った。
【００６７】
３６９ｂｐ野生型および変異体作成物を、マウスＲＸＲおよびマウスＰＸＲ（図１５Ａ）またはマウスＣＡＲ（図１５Ｂ）の存在下で調べた。インビトロ転写／翻訳マウスＲＸＲまたはマウスＰＸＲ単独は、32Ｐ放射標識３６９ｂｐ  ＡＤＲＥＳに結合させたが（図１５Ａ、レーン１と２）、一方、ＰＸＲ／ＲＸＲヘテロダイマーは、野生型薬物応答エンハンサーと結合する（図１５Ａ、レーン３）。３６９ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメントに結合するＰＸＲ／ＲＸＲは、それぞれレーン４、５および６にバンドの無いことが示すように、ＤＲ４−１／ｈｓ１およびＤＲ４−１／ｈｓ２の単一変異体ならびにＤＲ４−１／ｈｓ１、２の二重変異体ＤＮＡ配列において消滅した。興味深いことに、ＤＲ４−２／ｈｓ１、２作成物は、レーン７に見られるように、ＰＸＲ／ＲＸＲヘテロダイマーに依然として結合していた。さらに、ＰＸＲ／ＲＸＲヘテロダイマーの結合は、ＤＲ４−１、２／ｈｓ１、２の四重変異体（レーン８）では存在しなかった。同様の様式で、マウスＣＡＲおよびＲＸＲは、ホモダイマーとして３６９ｂｐ  ＡＤＲＥＳに結合できなく、一方、シフトは、ＲＸＲ／ＣＡＲヘテロダイマーの存在下で観察されている（図１５Ｂ、レーン１〜３）。ＣＡＲ／ＲＸＲ結合はまた、ＤＲ４−１／ｈｓ１およびＤＲ４−１／ｈｓ２の単一変異体ならびにＤＲ４−１／ｈｓ１、２の二重変異体ＤＮＡ配列において消滅しているが（それぞれレーン４〜６）、ＤＲ４−２／ｈｓ１、２の二重変異体ではまだ存在している（レーン７）。予想外ではないが、ＤＲ４−１、２／ｈｓ１、２の四重変異体は、レーン８に観察されるようにＣＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーに結合しない。要約すると、これらの知見は、ＰＸＲ／ＲＸＲおよびＣＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーとＤＲ４−１との相互作用を立証するが、３６９ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメントにおけるＤＲ４−２結合部位との相互作用を示さない。
【００６８】
ヒトハウスキーピングＡＬＡ合成酵素（ＡＬＡＳ１）遺伝子の薬物調節
コンピュータ支援スクリーニングアプローチおよび公的に利用できる配列情報を用いて、ＡＬＡＳ１の５’フランキング領域の幾つかの領域は、核内受容体を介してヒトハウスキーピングＡＬＡＳ遺伝子の薬物誘導の潜在的メディエータとして定義された。定義された領域は、この遺伝子の３０ｋｂの上流領域を含有するＢＡＣクローンから単離され、遺伝子活性化のためのレポーターとしてホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーターベクターに導入された。これらの作成物は、ＬＭＨニワトリ肝癌細胞にて試験され、公知の連続分割細胞系のみが薬物媒介誘導を保持した。
【００６９】
これら最初のスクリーニングアプローチにおいて、原型のインデューサー薬物に応答した２つの領域が定義された。
【００７０】
十分に特性化されたこれらの領域は、ｈＡ７９５（配列番号９）と呼ばれ、転写開始部位から約２０ｋｂ上流に位置する。この断片を開裂することにより、本発明者らは、ＬＭＨ細胞における誘導を与えるのに十分であるサイズが１７４ｂｐ（配列番号８）の短いエレメントを定義することができた。このエレメントは、ｈＡ１７４と呼ばれた。このｈＡ１７４断片内のＤＲ−４タイプの核内受容体認識部位が、部位特異的変異誘発実験において薬物誘導に必要であることが判った。
【００７１】
第２の薬物誘導断片は、ｈＡ８（配列番号１０）と呼ばれ、長さが９１７ｂｐであり、転写開始部位から約１６ｋｂ上流に位置する。これは、少なくとも予測されたＤＲ−３およびＤＲ４−タイプの核内受容体応答エレメントを含有する。
【００７２】
異種細胞系（サル腎細胞ＣＶ−１）およびヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２におけるトランス活性化アッセイにおいて、本発明者らは、どの核内受容体が観察された活性を担うのかを評価した。２つの候補受容体、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）および構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）をこれらの断片に対して試験した。両断片およびｈＡ１７４細断片で、ヒトＰＸＲによる誘導ならびにマウスおよびヒトＣＡＲによる活性化が観察された。ｍＣＡＲ誘導活性は、逆作動薬３αーアンドロステノールにより約５０％に抑制でき、この抑制は、直接的作動薬ＴＣＰＯＢＯＰ（１，４−ビス［２−（３，５−ジクロロピリジルオキシ）］ベンゼン）により可逆的である。
【００７３】
結果
ヒトＡＬＡＳ１遺伝子の各種断片の薬物誘導
断片をｐＧＬ３ルシフェラーゼ受容体ベクター（プロメガ社）にクローン化し、原型ｈＡＬＡＳ１インデューサーのフェノバルビタール（ＰＢ）およびプロピルイソプロピルアセトアミド（ＰＩＡ）による誘導性に関して試験した。ＬＭＨ細胞の作成物による形質移入４時間後、細胞を薬物に２４時間曝露し、その後ルシフェラーゼ活性を評価した。結果を、共形質移入されたβ−ガラクトシダーゼ活性を評価することにより形質移入効率を規格化した。示されたデータは、１つの代表的な実験である（図１１）。
【００７４】
ｈＡ７９５エレメントに対する薬物効果は、ＤＲ−４モチーフの存在に依存する
コンピュータ分析によりｈＡ７９５断片（配列番号９）の配列内に、推定ＤＲ−４タイプ核内受容体応答エレメントが見出された。このエレメントの部位特異的変異誘発によって、ＬＭＨ細胞のレポーター遺伝子アッセイにおけるこの断片の誘導性は消滅した。実験は、上記のとおり実施した（図１２）。
【００７５】
ＤＲ−４エレメントにわたるコア配列は、ＬＭＨ細胞における薬物誘導媒介に十分である
ｈＡ７９５断片から、ｈＡ１７４断片は誘導される（配列番号８）。これは長さが１７４ｂｐであり、その配列内にＤＲ−４応答エレメントが含まれている。野生型ｈＡ１７４またはＤＲ−４が破壊された変異体の直接的反復を、ｐＧＬ３レポーターベクターにクローン化し、ＬＭＨ細胞において試験した（図１３）。データは、１つの代表的な実験に由来する。
【００７６】
図１６は、薬物媒介転写活性をＬＭＨ細胞内のレポーター遺伝子に付与するｈＡ７９５断片から誘導されたｈＡ１７４コアエレメントを示す。本発明者らは、種々の応答エレメントの半分部位がこのエレメントにより媒介される薬物誘導に対し寄与することを、より詳細に調査した。ｈＡ１７４エレメント内で、３つの核内受容体応答エレメントの半分部位の配列が見出され、これによって、ＤＲ−４タイプならびにＤＲ−５タイプの応答エレメントが予測される（図１８Ａを参照）。部位特異的変異誘発により、本発明者らは、これら半分部位の各々が薬物誘導に関与することを調べた。２ｘｈＡ１７４レポーター作成物の箇所において、各単一の半分部位は、ｈＡ１７４エレメントの両コピーにおいて変異させた。野生型および変異作成物を、引き続き上記のとおり、ＬＭＨ細胞におけるレポーター遺伝子活性に関して試験した。細胞を、４００μＭフェノバルビタール（ＰＢ）または２５０μＭプロピルイソプロピルアセトアミド（ＰＩＡ）で誘導した。コントロールとして、媒体単独（０.１％ＤＭＳＯ）を細胞に添加した。２４時間後、ルシフェラーゼ活性を評価し、形質移入効率を補正するために共形質移入したβ−ガラクトシダーゼ活性に対して規格化した。ＨＳ１またはＨＳ２の半分部位の変異誘発により、この断片の誘発性は消滅するが、一方、ＨＳ３の半分部位の変化は、単に誘導レベルを減じるだけである。このことから、本発明者らは、ＨＳ１およびＨＳ２の半分部位からなるＤＲ−４エレメントは、薬物誘導に必須であることを結論付けた。ＨＳ３の半分部位の変異誘発により認められた誘導における変化は、薬物誘導において半分部位単独またはＨＳ２との組合わせたＤＲ−５として調節の役割を示すと思われる。示されたデータは、３つの独立した実験の平均＋１ＳＤである。
【００７７】
図１７は、ｈＡ８薬物応答エレメント（配列番号１０）の細断片化を示す。
【００７８】
誘導性を保持するコア配列を定義するために、その末端にＰＣＲ導入ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ制限部位を担持するｈＡ８断片（配列番号１０）を、ＳａｃＩおよびＮｓｉＩで消化した。生じた４種の断片１００ｂｐ  ＫｐｎＩ／ＳａｃＩ断片、３７４ｂｐＳａｃＩ／ＮｓｉＩ断片、２４０ｂｐ  ＮｓｉＩ／ＮｓｉＩ断片、および２３１ｂｐ  ＮｓｉＩ／ＸｈｏＩ断片を、レポーター遺伝子ベクターにクローン化し、引き続きＬＭＨ細胞における薬物誘導に関して試験した。これらの断片のうち、２４０ｂｐ断片（ｈＡ２４０と呼ばれる）（配列番号３９）のみが、薬物に応答して転写活性を伝達することができた。コアｈＡ２４０断片内で、本発明者らは次に、予測されたＤＲ−４エレメントの両半分部位を変異させ（図１８Ｂ参照）、薬物誘導に対するこの変異効果を観察した（２４０ｍｕｔＤＲ４）。ＤＲ４エレメントの半分の部位の変化は、ＬＭＨ細胞のレポーター遺伝子アッセイにおいて薬物誘導を消滅させた。示されたデータは、３つの独立した実験の平均＋１ＳＤである。
【００７９】
図１８は、ヒトＡＬＡＳ１遺伝子内の２つの薬物応答領域のコアエレメントを詳細に描写している。位置番号は、ヒトＡＬＡＳ１転写体の転写開始部位に関するヒトゲノムにおけるこれらの配列の位置を言う。応答エレメントは、グレイで囲っており、個々の半分部位は、上部に矢印で記され、必要な場合は、区別するために配列の下部に標識している。Ａにおいて、ｈＡ１７４ｂｐコア（配列番号８）を描写している。グレイボックスは、３つの個々の半分部位からなるＤＲ−４／ＤＲ−５部位クラスターを示している。Ｂにおいて、２４０ｂｐコアを、グレイボックスにより、機能性ＤＲ−４エレメントは矢印で示している（配列番号３９）。
【００８０】
図１９は、ｈＡ１７４およびｈＡ２４０エレメントに結合するヒトＰＸＲおよびヒトＣＡＲの能力をアッセイする電気泳動移動度シフトアッセイの結果を示す。これら核内受容体の結合は、ヒト９−シスレチノイン酸受容体ＲＸＲαとのヘテロダイマー状態で生じる。受容体蛋白質は、ヒトＲＸＲα、ＲＸＲまたはＣＡＲをコードする発現プラスミドから、ＴＮＴ網状赤血球溶菌液と転写／翻訳システム（プロメガ社）とを組合わせて用い、インビトロで作成された。
【００８１】
図１９Ａは、放射標識ｈＡ１７４野生型断片または半分部位２が変異された（図１８Ａ参照）ｈＡ１７４断片を用いるアッセイを示している。レーン１〜４：野生型ｈＡ１７４を、受容体なしで（モック転写／翻訳）、またはＲＸＲα、ＰＸＲまたはＣＡＲ単独と共に温置した。複合体は、単一受容体を用いては見られない。レーン５および７：野生型ｈＡ１７４を、ＲＸＲαとＰＸＲまたはＲＸＲαとＣＡＲとで温置すると、その際、放射標識プローブと蛋白質との間で複合体形成が見られる。レーン６および８：レーン５および７と同一の条件であるが、野生型ｈＡ１７４の代わりに、半分部位２が変異された放射標識プローブを用いた。もはや複合体は形成されない。
【００８２】
図１９Ｂ：ｈＡ１７４断片の代わりに、野生型またはＤＲ４−変異体ｈＡ２４０断片を放射標識し、プローブとして用いた。レーン１〜４：野生型ｈＡ２４０を、受容体なしで（モック転写／翻訳）、またはＲＸＲα、ＰＸＲまたはＣＡＲ単独と共に温置した。複合体は、単一受容体を用いては見られない。レーン５および７：野生型ｈＡ２４０を、ＲＸＲαとＰＸＲまたはＲＸＲαとＣＡＲとで温置すると、放射標識プローブと蛋白質との間で複合体形成が見られる。レーン６および８：レーン５および７と同一の条件であるが、野生型プローブの代わりに、放射標識ｈＡ２４０ＤＲ４（２）変異体を用いた。複合体は形成されない。
【００８３】
使用される約語は以下のとおりである：ＡＬＡＳ、５−アミノレブリン酸合成酵素；ＡＤＲＥＳ、アミノレブリン酸薬物応答エンハンサー配列；ＰＢ、フェノバルビタール；ＤＲ、ヘキサマー半分部位直接反復；ｈ、時間；
ｂｐ、塩基対；ＬＭＨ，レグホーンオス肝癌；ｋｂ、キロベース；ＮＦ１、核因子１；ＣＹＰ、チトクロームＰ４５０；ＣＸＲ、ニワトリ生体異物受容体；ＰＸＲ、プレグナンＸ受容体；ＣＡＲ、構成的アンドロスタン受容体；ＲＸＲ、９−シス−レチノイン酸受容体；ＰＩＡ、プロピルイソプロピルアセトアミド；ＰＣＮ、５−プレグナン−３β−オール−２０−オン−１６α−カルボニトリル；ＴＣＰＯＢＯＰ、１，４−ビス［２−（３，５−ジクロロピリジル−オキシ）］ベンゼン；ＬＵＣ、ルシフェラーゼ；ミフェプリストン(mifepristone)、ＲＵ−４８６；クロトリマゾール(clotrimazole)、１−［ｏ−クロロトリチル］−イミダスゾール；ＥＭＳＡ、電気泳動移動度シフトアッセイ；ｃｐｍ、１分当たりのカウント；ＦＣＳ、ウシ胎仔血清。
【００８４】
ここに本発明の好ましい実施形態を示し、記載しているが、本発明はそれに限定されず、請求項の範囲内でその他種々に具現化でき、また実行できることを明白に解すべきである。
【００８５】
参照文献
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１１．ディー・ワックスマン(Waxman,D.J.)、１９９９年、「構造的に多様な生体異物によるＰ４５０遺伝子誘導：核内受容体ＣＡＲ、ＰＸＲ、およびＰＰＡＲの中心的役割(P450 gene induction by structurally diverse xenochemicals:central role of nuclear receptors CAR,PXR, and PPAR)」、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３６９：１１〜２３頁。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１Ａ】制限エンドヌクレアーゼ消化およびサブクローニングによるニワトリＡＬＡＳ１転写開始部位の上流内にある最初の１５ｋｂ内の１７６ｂｐおよび１６７ｂｐ薬物応答性エンハンサー配列の単離を示す図である。断片は、ＳＶ−４０プロモーターを含有するｐＬｕｃＭＣＳルシフェラーゼレポーターベクターにクローン化した。
【図１Ｂ】１７６および１６７ｂｐエンハンサーのＤＮＡ配列を示す図である。番号付けは、ニワトリＡＬＡＳ１遺伝子の転写開始部位に対する配列位置を称す。実線は、ＤＲ４およびＤＲ５  ＮＲ結合部位を特定する。網掛け枠は、個々の半分部位を含有する。斜め線はＮＦ１結合部位を印している。
【図１Ｃ】断片のレポーター遺伝子アッセイを示す図である。作成物は、ＬＭＨ細胞中にβ−ガラクトシダーゼを発現する形質移入−コントロール作成物と共に形質移入された。次に細胞を６００μＭ  ＰＢで１６時間処理し、ルシフェラーゼアッセイを細胞抽出物に対して実施した。相対的なルシフェラーゼ濃度は、挿入断片を含有していないベクターで形質移入した細胞に対して基準化され、誘導倍率として表されている。実験は、少なくとも３回繰り返し、三重に試験された代表的な実験データを、ここに示している。エラーバーは、標準偏差を表している。
【図２】異なる薬物によるＡＤＲＥＳおよびｍＲＮＡの活性化の比較を示す図である。相対的なルシフェラーゼ濃度は、挿入断片を含有していないベクターで形質移入された細胞に対して基準化され、誘導倍率で示される。実験は、少なくとも３回繰り返し、三重に試験された代表的な実験データを、ここに示している。エラーバーは、標準偏差を表している。
【図３Ａ】１７６ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメント内のＤＲ４部位およびＤＲ５部位の部位特異的変異を示す図である。１７６ｂｐ配列のＤＲ４の半分部位およびＤＲ５の半分部位における変異は、ＰＣＲに基づく部位特異的変異を経て導入された。変異は、スキーム中の左欄に標識され、×印で示されている。相対的なルシフェラーゼ濃度は、挿入断片を含有していないベクターで形質移入された細胞に対して基準化され（コントロールを１．０に設定）、また１７６  ＡＤＲＥＳのパーセンテージとして表されている。実験は、少なくとも３回繰り返し、三重に試験された代表的な実験データを、ここに示している。エラーバーは、標準偏差を表している。
【図３Ｂ】１６７ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメント内のＤＲ４部位の部位特異的変異を示す図である。１６７ｂｐ配列のＤＲ４の半分部位における変異は、ＰＣＲに基づく部位特異的変異を経て導入された。変異は、スキーム中の左欄に標識され、×印で描写されている。この実験法は、図３Ａに記載されたものと同じであった。
【図４Ａ】ＣＸＲが１７６ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメントに結合することを証明するゲル易動度シフトアッセイを示す図である。放射標識ＡＤＲＥＳ野生型（レーン１から５）および変異体（レーン６から７）配列を、示されるようにインビトロ転写／翻訳ＣＸＲ（レーン３から７）とニワトリＲＸＲ（レーン２と４から７）と抗ＲＸＲ抗体（レーン５と７）とで温置した。矢印は、未結合プローブ、シフトしたＣＸＲ−ＲＸＲ−プローブ複合体およびスーパーシフトしたＣＸＲ−ＲＸＲ−プローブ−抗ＲＸＲ抗体複合体を表している。
【図４Ｂ】ＣＸＲが１６７ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメントに結合することを証明するゲル易動度シフトアッセイを示す図である。放射標識ＡＤＲＥＳ野生型（レーン１から５）および変異体（レーン６から７）配列を、示されるようにインビトロ転写／翻訳ＣＸＲ（レーン３から７）とニワトリＲＸＲ（レーン２と４から７）と抗ＲＸＲ抗体（レーン５と７）とで温置した。矢印は、未結合プローブ、シフトしたＣＸＲ−ＲＸＲ−プローブ複合体およびスーパーシフトしたＣＸＲ−ＲＸＲ−プローブ−抗ＲＸＲ抗体複合体を表している。
【図５Ａ】ＣＸＲによる１７６ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメントのトランス活性化を示す図である。Ｃｏｓ−１細胞は、野生型、チミジンキナーゼ最小プロモーターを含有するｐＢＬＣＡＴ５ベクターにクローン化されたＤＲ４−１、ＤＲ５およびＤＲ４−１／ＤＲ５変異体の４反復を含有する作成物により形質移入された。ｐＳＧ５発現ベクターにクローン化されたニワトリＣＸＲコード領域を、コントロールとしてｐＳＶ  β−ガラクトシダーゼを発現するベクターと一緒に共形質移入した。次に細胞を、薬物または媒体コントロールのいずれかで１６時間処理し、抽出物を、材料と方法の節で記載されるように、β−ガラクトシダーゼ濃度に対して基準化されたＣＡＴ発現に関して分析した。実験は、少なくとも３回繰り返し、三重に試験された代表的な実験データを、ここに示している。作成物の全ては、配列決定により立証され、エラーバーは、標準偏差を表している。
【図５Ｂ】ＣＸＲによる１６７ｂｐ  ＡＤＲＥＳエレメントのトランス活性化を示す図である。Ｃｏｓ−１細胞は、野生型、チミジンキナーゼ最小プロモーターを含有するｐＢＬＣＡＴ５ベクターにクローン化されたＤＲ４−２、ＤＲ４−３およびＤＲ４−２／ＤＲ４−３変異体の単一コピーを含有する作成物により形質移入された。この実験法は、図５Ｂのもとで記載されたものと同じであった。
【図６】ＬＭＨ細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおいて拡張マウスコア断片の誘導を示す図である。インデューサーのメチラポン５００μＭ．
【図７】種々の薬物によるマウス３６９ｂｐ  ＤＲＥＳの誘導を示す図である。
【図８】３６９ｂｐマウスＤＲＥＳ配列および発見された推定核内受容体結合部位を示す図である。
【図９】３６９ｂｐ  ＤＲＥＳ配列のＤＲ４−１部位およびＤＲ４−２部位に導入された変異を示す図である。この半分部位は、個々に、また双方とも一緒に変異させた。変異化塩基対には下線が引かれ、イタリック体である。
【図１０】ＬＭＨ細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおいてマウス３６９ＤＲＥＳのＤＲ４変異体作成物の誘導を示す図である。
【図１１】ヒトＡＬＡＳ１遺伝子の種々の断片の薬物誘導を示す図である。断片を、ｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）にクローン化し、原型のｈＡＬＡＳ１インデューサーのフェノバルビタール（ＰＢ）およびプロピルイソプロピルアセトアミド（ＰＩＡ）による誘導性に関して試験した。ＬＭＨ細胞を前記作製物との形質移入の４時間後、細胞を薬物に２４時間曝露させ、その後、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果は、共形質移入されたβーガラクトシダーゼの活性をアッセイすることにより形質移入効率に関して基準化された。示されたデータは、代表的な実験の一つである。
【図１２】ｈＡ７９５エレメントに対する薬物効果が、ＤＲ−４モチーフの存在に依存することを示す図である。ｈＡ７９５断片の配列内に、推定のＤＲ−４タイプの核内受容体応答エレメントがコンピュータ分析により見出された。このエレメントの部位特異的変異によって、ＬＭＮ細胞におけるレポーター遺伝子アッセイにおけるこの断片の誘導性が消滅した。実験は、図８のもとで記載されたとおり実施された。
【図１３】ＤＲ−４エレメントにわたっているコア配列は、ＬＭＨ細胞における薬剤誘導の媒介に十分であることを示す図である。ｈＡ７９５断片から、ｈＡ１７４断片が誘導された。それは、長さが１７４ｂｐでその配列内にあり、ＤＲ−４応答エレメントを含有している。ＤＲ−４が破壊された野生型ｈＡ１７４または変異体の直接的反復を、ｐＧＬ３レポーターベクターにクローン化し、ＬＭＨ細胞において試験した。
【図１４Ａ】ＡＬＡ合成酵素薬物応答エンハンサー配列が、トランス活性化アッセイにおいてマウスＰＸＲ（１４Ａ）およびマウスＣＡＲ（１４Ｂ）により誘導性であることを示す図である。
【図１４Ｂ】ＡＬＡ合成酵素薬物応答エンハンサー配列が、トランス活性化アッセイにおいてマウスＰＸＲ（１４Ａ）およびマウスＣＡＲ（１４Ｂ）により誘導性であることを示す図である。
【図１５Ａ】３６９ｂｐ  ＡＤＲＥＳとＰＸＲ（１５Ａ）およびＣＡＲ（１５Ｂ）とのゲルシフトアッセイの結果を示す図である。
【図１５Ｂ】３６９ｂｐ  ＡＤＲＥＳとＰＸＲ（１５Ａ）およびＣＡＲ（１５Ｂ）とのゲルシフトアッセイの結果を示す図である。
【図１６】薬物媒介転写活性をＬＭＨ細胞中のレポーター遺伝子に付与するｈＡ７９５断片から誘導されるｈＡ１７４ｂｐコアエレメントを示す図である。
【図１７】ｈＡ８薬物応答エレメントの細断片を用いたＬＭＨ細胞における薬物誘導アッセイの結果を示す図である。
【図１８Ａ】ヒトＡＬＡＳ１遺伝子内の薬物応答エレメントのｈＡ１７４ｂｐコアエレメントを表す図である。
【図１８Ｂ】ヒトＡＬＡＳ１遺伝子内の薬物応答エレメントのｈＡ２４０ｂｐコアエレメントを表す図である。
【図１９Ａ】ヒトＰＸＲおよびヒトＣＡＲがｈＡ１７４ｂｐエレメントおよびｈＡ２４０ｂｐエレメントに結合する能力をアッセイする電気泳動移動度シフトアッセイの結果を表す図である。
【図１９Ｂ】ヒトＰＸＲおよびヒトＣＡＲがｈＡ１７４ｂｐエレメントおよびｈＡ２４０ｂｐエレメントに結合する能力をアッセイする電気泳動移動度シフトアッセイの結果を表す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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