(57)【要約】Ａ群連鎖球菌の種々の異なる血清型由来のＭタンパク質の免疫原性ペプチドを含む多価ハイブリッドポリペプチドの治療処方物およびそれに対する抗体を生成および使用するための組成物および方法が提供される。このようなハイブリッドポリペプチドをコードする核酸もまた提供される。このハイブリッドポリペプチド処方物は、例えば、微生物感染を処置または予防するための方法、ならびに組織交差反応性抗体の非存在下で広範に保護的なオプソニン抗体を有する保護的免疫応答を誘発するための方法において使用され得る。
2005523000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも６つの異なる連結された免疫原性ペプチドを含む、ハイブリッドポリペプチドであって、各ペプチドは、少なくとも３０アミノ酸の連鎖球菌Ｍタンパク質のアミノ末端部分を含み、該ポリペプチドは、カルボキシ末端ペプチドとして繰り返されるアミノ末端ペプチドを有し、該ポリペプチドは、少なくともＭ５、Ｍ６、Ｍ１４、Ｍ１９、Ｍ２４、およびＭ２９を含むＡ群連鎖球菌の１つより多い抗原に対する免疫応答を誘発し得る、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドの前記アミノ末端免疫原性ペプチドがＭ２４である、請求項１に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが組み換えポリペプチドであり、前記免疫原性ペプチドが直列に連結されており、該ポリペプチドは、Ｍ２４−Ｍ５−Ｍ６−Ｍ１９−Ｍ２９−Ｍ１４−Ｍ２４の構造を有する、請求項２に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも７つの異なる連結された免疫原性ペプチドを含む、ハイブリッドポリペプチドであって、各ペプチドは、少なくとも３５アミノ酸の連鎖球菌Ｍタンパク質のアミノ末端部分を含み、該ポリペプチドは、カルボキシ末端ペプチドとして繰り返されるアミノ末端ペプチドを有し、該ポリペプチドは、少なくともＭ２、Ｍ１１、Ｍ２２、Ｍ３３、Ｍ４３、Ｍ５９、およびＭ９４を含むＡ群連鎖球菌の１つより多い抗原に対する免疫応答を誘発し得る、ポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドの前記アミノ末端免疫原性ペプチドがＭ２である、請求項５に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが組み換えポリペプチドであり、前記免疫原性ペプチドが直列に連結されており、該ポリペプチドは、Ｍ２−Ｍ４３−Ｍ９４−Ｍ２２−Ｍ１１−Ｍ５９−Ｍ３３−Ｍ２の構造を有する、請求項６に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項９】
少なくとも７つの異なる連結された免疫原性ペプチドを含む、ハイブリッドポリペプチドであって、各ペプチドは、少なくとも４０アミノ酸の連鎖球菌Ｍタンパク質のアミノ末端部分を含み、該ポリペプチドは、カルボキシ末端ペプチドとして繰り返されるアミノ末端ペプチドを有し、該ポリペプチドは、少なくともＭ７５、Ｍ７６、Ｍ７７、Ｍ８９、Ｍ９２、Ｍ１０１、およびＭ１１４を含むＡ群連鎖球菌の１つより多い抗原に対する免疫応答を誘発し得る、ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドの前記アミノ末端免疫原性ペプチドがＭ８９である、請求項９に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが組み換えポリペプチドであり、前記免疫原性ペプチドが直列に連結されており、該ポリペプチドは、Ｍ８９−Ｍ１０１−Ｍ７７−Ｍ１１４−Ｍ７５−Ｍ７６−Ｍ９２−Ｍ８９の構造を有する、請求項１０に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項１３】
少なくとも７つの異なる直列に連結された免疫原性ペプチドを含む、ハイブリッドポリペプチドであって、各ペプチドは、少なくとも５０アミノ酸の連鎖球菌Ｍタンパク質のアミノ末端部分を含み、該ポリペプチドは、カルボキシ末端ペプチドとして繰り返されるアミノ末端ペプチドを有し、該ポリペプチドは、少なくともＳｐａ、Ｍ１．０、Ｍ１．２、Ｍ３、Ｍ１２、Ｍ１８、およびＭ２８を含むＡ群連鎖球菌の１つより多い抗原に対する免疫応答を誘発し得る、ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドの前記アミノ末端免疫原性ペプチドがＭ１．０である、請求項１３に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが組み換えポリペプチドであり、前記免疫原性ペプチドが直列に連結されており、該ポリペプチドは、Ｍ１．０−Ｍ１２−Ｓｐａ−Ｍ２８−Ｍ３−Ｍ１．２−Ｍ１８−Ｍ１．０の構造を有する、請求項１４に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項１７】
前記免疫原性ポリペプチドが制限酵素認識部位である核酸配列によりコードされる少なくとも２つのアミノ酸によって連結されている、請求項３、７、１１、および１５のいずれか１項に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項１８】
前記核酸配列が制限酵素認識部位であり；該認識部位が、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩのうちの少なくとも１つである、請求項１７に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、被験体において、組織交差反応性抗体ではない少なくとも１つのオプソニン抗体を誘発し得る、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項２０】
前記被験体がヒトまたは動物である、請求項１９に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項２１】
カルボキシ末端タグをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項２２】
前記カルボキシ末端タグが、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、６ヒスチジン、エピトープタグＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１８）、エピトープタグＤＬＹＤＤＤＤＫ（配列番号１９）、およびＧＳＴからなる群より選択される、請求項２１に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項２３】
前記カルボキシ末端タグが６ヒスチジンである、請求項２２に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項２４】
少なくとも１つのさらなるカルボキシ末端アミノ酸をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項２５】
前記さらなるカルボキシ末端アミノ酸が、Ｄ−アミノ酸である、請求項２４に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項２６】
前記さらなるカルボキシ末端アミノ酸が、システインである、請求項２４に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項２７】
少なくとも１つのさらなるカルボキシ末端アミノ酸をさらに含む、請求項２３に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項２８】
前記さらなるカルボキシ末端アミノ酸が、システインである、請求項２７に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号２、４、６、または８のアミノ酸配列を含む、ハイブリッドポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号２、４、６、または８のハイブリッドポリペプチドをコードする配列を含む、核酸分子。
【請求項３１】
配列番号２、４、６、または８のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現制御配列を含む、核酸発現構築物。
【請求項３２】
前記発現制御配列が、誘導性プロモーターである、請求項３１に記載の構築物。
【請求項３３】
前記誘導性プロモーターが、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ａｒａプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λファージプロモーター、Ｔ７ファージプロモーター、およびＴ５ファージプロモーターからなる群より選択される、請求項３２に記載の構築物。
【請求項３４】
前記誘導性プロモーターが、Ｔ５ファージプロモーターである、請求項３２に記載の構築物。
【請求項３５】
前記構築物が、プラスミド、ファージミド、シャトルベクター、コスミド、およびウイルスからなる群より選択される核酸発現ベクターを含む、請求項３１に記載の構築物。
【請求項３６】
前記構築物が核酸発現ベクターを含む、該ベクターがプラスミドである、請求項３１に記載の構築物。
【請求項３７】
前記プラスミドが、ｐＴ５（配列番号１７）である、請求項３６に記載の構築物。
【請求項３８】
請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の構築物を含む、宿主細胞。
【請求項３９】
前記宿主細胞が、細菌、酵母細胞、線虫類細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞からなる群より選択される、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
前記宿主細胞が細菌であり、該細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
ハイブリッドポリペプチドを生成する方法であって、配列番号２、４、６、または８のハイブリッドポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つの発現制御配列を含む核酸発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドの発現に十分な条件の下、該ポリペプチドの発現に十分な時間、培養する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
前記発現制御配列が、誘導性プロモーターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記誘導性プロモーターが、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ａｒａプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λファージプロモーター、Ｔ７ファージプロモーター、およびＴ５ファージプロモーターからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記誘導性プロモーターが、Ｔ５ファージプロモーターである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸発現ベクターが、ｐＴ５（配列番号１７）である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法によって生成された、ハイブリッドポリペプチド。
【請求項４７】
薬学的に受容可能なキャリア、ならびに請求項１〜１６、２９、および４６のいずれか１項に記載のハイブリッドポリペプチドを含む、組成物。
【請求項４８】
薬学的に受容可能なキャリア、ならびに請求項１、５、９、および１３に記載のハイブリッドポリペプチドの少なくとも２つの混合物を含む、組成物。
【請求項４９】
前記ポリペプチドが、直列に連結された免疫原性ペプチドを含み、前記少なくとも２つのポリペプチドが、Ｍ２４−Ｍ５−Ｍ６−Ｍ１９−Ｍ２９−Ｍ１４−Ｍ２４、Ｍ２−Ｍ４３−Ｍ９４−Ｍ２２−Ｍ１１−Ｍ５９−Ｍ３３−Ｍ２、Ｍ８９−Ｍ１０１−Ｍ７７−Ｍ１１４−Ｍ７５−Ｍ７６−Ｍ９２−Ｍ８９、またはＭ１．０−Ｍ１２−Ｓｐａ−Ｍ２８−Ｍ３−Ｍ１．２−Ｍ１８−Ｍ１．０の構造を含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
薬学的に受容可能なキャリア、ならびに請求項１３に記載のハイブリッドポリペプチドと、請求項１、５、または９のいずれか１項に記載のハイブリッドポリペプチドのうちの少なくとも１つとの混合物を含む、組成物。
【請求項５１】
前記ポリペプチドが、直列に連結された免疫原性ペプチドを含み、請求項１３に記載のポリペプチドが、Ｍ１．０−Ｍ１２−Ｓｐａ−Ｍ２８−Ｍ３−Ｍ１．２−Ｍ１８−Ｍ１．０の構造を含み、少なくとも１つの他のポリペプチドが、Ｍ２４−Ｍ５−Ｍ６−Ｍ１９−Ｍ２９−Ｍ１４−Ｍ２４、Ｍ２−Ｍ４３−Ｍ９４−Ｍ２２−Ｍ１１−Ｍ５９−Ｍ３３−Ｍ２、またはＭ８９−Ｍ１０１−Ｍ７７−Ｍ１１４−Ｍ７５−Ｍ７６−Ｍ９２−Ｍ８９の構造を含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
薬学的に受容可能なキャリア、ならびに請求項１、５、９、および１３に記載のハイブリッドポリペプチドのうちの少なくとも３つの混合物を含む、組成物。
【請求項５３】
前記ポリペプチドが、直列に連結された免疫原性ペプチドを含み、前記少なくとも３つのポリペプチドが、Ｍ２４−Ｍ５−Ｍ６−Ｍ１９−Ｍ２９−Ｍ１４−Ｍ２４、Ｍ２−Ｍ４３−Ｍ９４−Ｍ２２−Ｍ１１−Ｍ５９−Ｍ３３−Ｍ２、Ｍ８９−Ｍ１０１−Ｍ７７−Ｍ１１４−Ｍ７５−Ｍ７６−Ｍ９２−Ｍ８９、またはＭ１．０−Ｍ１２−Ｓｐａ−Ｍ２８−Ｍ３−Ｍ１．２−Ｍ１８−Ｍ１．０の構造を含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
薬学的に受容可能なキャリア、ならびに請求項４、８、１２、および１６に記載のハイブリッドポリペプチドの混合物を含む、組成物。
【請求項５５】
前記ポリペプチドが等モル量である、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ハイブリッドポリペプチドの少なくとも１つが、Ｓｐａ免疫原性ペプチドを含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５７】
アジュバントをさらに含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５８】
前記アジュバントが、ミョウバンまたはフロイントアジュバントである、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
アジュバントをさらに含み、該アジュバントがミョウバンである、請求項５４に記載の組成物。
【請求項６０】
微生物感染を予防する方法であって、１つ以上のハイブリッドポリペプチドに対して特異的な抗体を誘発するのに十分な用量で、請求項４７に記載の組成物を被験体に投与する工程を包含し、該抗体がオプソニン抗体であり、かつ組織交差反応性ではない、方法。
【請求項６１】
前記微生物感染が連鎖球菌感染である、請求項６０に記載の感染を予防する方法。
【請求項６２】
前記連鎖球菌感染がＡ群連鎖球菌感染である、請求項６０に記載の感染を予防する方法。
【請求項６３】
前記ハイブリッドポリペプチドが、経腸、非経口、経皮、経粘膜、吸入からなる群より選択される経路により投与される、請求項６０に記載の感染を予防する方法。
【請求項６４】
前記組成物がアジュバントをさらに含む、請求項６０に記載の感染を予防する方法。
【請求項６５】
前記アジュバントがミョウバンまたはフロイントアジュバントである、請求項６４に記載の感染を予防する方法。
【請求項６６】
前記被験体がヒトまたは動物である、請求項６０に記載の感染を予防する方法。
【請求項６７】
請求項６０に記載の方法により生成される、複数の抗体。
【請求項６８】
前記抗体が、ハイブリッドポリペプチドにおいて提示されないＭタンパク質抗原に特異的な少なくとも１つの抗体をさらに含む、請求項６７に記載の複数の抗体。
【請求項６９】
前記ハイブリッドポリペプチドにおいて提示されないＭタンパク質抗原がＭ４である、請求項６８に記載の複数の抗体。
【請求項７０】
微生物感染を処置または予防する方法であって、薬学的に受容可能なキャリア、および請求項６７に記載の複数の抗体を含む組成物を、被験体に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２００１年１０月２６日に出願された米国仮特許出願番号６０／３４８，４３４の利益を主張する。この仮出願は、その全体が本明細書で参考として援用される。
【０００２】
（政府の権利の記述）
本願は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより認定された認可番号第ＡＩ−１００８５の下での政府の支持、そしてＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎ  Ａｆｆａｉｒｓ，Ｍｅｒｉｔ  Ｒｅｖｉｅｗ基金からの支持によりなされた。政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、感染性疾患の予防に関し、そしてより具体的には、保護的免疫を惹起し得る免疫原性Ｍタンパク質およびＳｐａペプチドを有する多価ハイブリッドポリペプチドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
（関連技術の説明）
Ａ群連鎖球菌性咽頭炎は、学童における最も一般的な細菌感染の１つである。連鎖球菌性咽頭炎に加えて、関連する非化膿性続発症（例えば、急性リウマチ熱（ＡＲＦ））が存在し得る。ＡＲＦの発生数は、先進国において減少しているが、この疾患は、発展途上国において流行したままである（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ＷＨＯ  ｅｘｐｅｒｔ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎａｉｚａｔｉｏｎ．１９８６：７３２）。連鎖球菌性感染の別の形態は、侵襲性であり、毎年の数千人の子供および大人が苦しんでおり、しばしば死亡またはかなりの罹患率を生じる（Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２：Ｓ３６６、１９９９）。Ａ群連鎖球菌性感染を予防するワクチンの開発のための努力が、８０年以上にわたって続いている（Ｄｏｃｈｅｚら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．３０：１７９、１９１９；Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．４７：９１、１９２８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これゆえ、連鎖球菌性感染に対する治療的に有効な組成物、特に、ワクチンとして機能し得、そして保護的免疫を惹起し得る組成物を同定し、そして開発する必要性が存在する。さらに、異なる連鎖球菌性血清型による感染に対して保護または処置するために変化し得るワクチン処方物の必要性が存在する。本発明は、このような必要性に合致し、そして他の関連する利点をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、多価ハイブリッドポリペプチドの治療的処方物、特に、組織交差反応性抗体の非存在下において、広く保護的なオプソニン抗体を有する保護的免疫応答を惹起するのに有用なハイブリッドポリペプチドのカクテルの発見を提供する。本発明のハイブリッドポリペプチドは、少なくとも６つの異なる連結した免疫原性ペプチドを含み、ここで、各ペプチドは、少なくとも３０アミノ酸の連鎖球菌性Ｍタンパク質のアミノ末端部分を含み、そしてここで、このポリペプチドは、カルボキシ末端ペプチドのように反復されているアミノ末端ペプチドを有し、このポリペプチドは、１より多いＡ群連鎖球菌の血清型に対して免疫応答を惹起し得る。
【０００７】
１つの局面において、本発明は、少なくとも６つの異なる連結した免疫原性ペプチドを含むハイブリッドポリペプチドを提供し、ここで、各ペプチドは、少なくとも３０アミノ酸の連鎖球菌性Ｍタンパク質のアミノ末端部分を含み、そしてここで、このポリペプチドは、カルボキシ末端ペプチドのように反復されているアミノ末端ペプチドを有し、このポリペプチドは、少なくともＭ５、Ｍ６、Ｍ１４、Ｍ１９、Ｍ２４、およびＭ２９を含む１つより多いＡ群連鎖球菌の抗原に対して免疫応答を惹起し得る。他の実施形態において、このポリペプチドは、少なくともＭ２、Ｍ１１、Ｍ２２、Ｍ３３、Ｍ４３、Ｍ５９、およびＭ９４、または少なくともＭ７５、Ｍ７６、Ｍ７７、Ｍ８９、Ｍ９２、Ｍ１０１、およびＭ１１４、または少なくともＳｐａ、Ｍ１．０、Ｍ１．２、Ｍ３、Ｍ１２、Ｍ１８、およびＭ２８を含む１つより多いＡ群連鎖球菌の抗原に対して、または２７以上のＡ群連鎖球菌の抗原に対して免疫応答を惹起し得る。さらなる実施形態において、ハイブリッドポリペプチドのアミノ末端免疫原性ペプチドは、Ｍ２４、Ｍ１、Ｍ２、またはＭ８９である。なお他の実施形態において、このポリペプチドは、組換え型であり、そして免疫原性ペプチドは、直列に連結しており、このポリペプチドは、Ｍ２４−Ｍ５−Ｍ６−Ｍ１９−Ｍ２９−Ｍ１４−Ｍ２４、Ｍ２−Ｍ４３−Ｍ９４−Ｍ２２−Ｍ１１−Ｍ５９−Ｍ３３−Ｍ２、Ｍ８９−Ｍ１０１−Ｍ７７−Ｍ１１４−Ｍ７５−Ｍ７６−Ｍ９２−Ｍ８９、またはＭ１．０−Ｍ１２−Ｓｐａ−Ｍ２８−Ｍ３−Ｍ１．２−Ｍ１８−Ｍ１．０の構造を有する。さらに他の実施形態において、このハイブリッドポリペプチドは、配列番号２、４、６、または８のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、免疫原性ペプチドは、制限酵素認識部位である核酸配列によってコードされる少なくとも２つのアミノ酸によって連結され、ここで、この認識部位は、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩのうちの少なくとも１つを含む。さらなる実施形態において、前述の任意のハイブリッドポリペプチドは、被験体において組織交差反応性抗体ではない少なくとも１つのオプソニン抗体を惹起し得、ここで、この被験体は、ヒトまたは動物である。さらなる実施形態において、前述の任意のハイブリッドポリペプチドは、カルボキシ末端タグをさらに含み、ここで、このカルボキシ末端タグは、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、６ヒスチジン、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＸＰＲＥＳＳ（登録商標）、およびＧＳＴからなる群より選択される。なおさらなる実施形態において、前述の任意のハイブリッドポリペプチドまたは融合タンパク質は、少なくとも１つのさらなるカルボキシ末端アミノ酸をさらに含み、ここで、このさらなるカルボキシ末端アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸またはシステインである。
【０００８】
別の局面において、本発明は、前述の任意のハイブリッドポリペプチドまたは融合タンパク質を提供し、ここで、このポリペプチドは、合成されている。特定の実施形態において、合成ハイブリッドポリペプチドは、対応するＤ−アミノ酸へと改変された１以上のアミノ酸を有するか、またはアルカン（例えば、アクリルアミド）またはそのアナログもしくは誘導体に連結される。さらなる実施形態において、合成ハイブリッドポリペプチドは、リジンコア分枝ペプチドを形成するように連結された免疫原性ペプチドを有する。
【０００９】
なお別の局面において、本発明は、配列番号２、４、６、または８のハイブリッドポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子を含む。関連する実施形態において、配列番号２、４、６、または８のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現制御配列を含む核酸発現構築物が提供される。他の実施形態において、発現構築物は、プラスミド、ファージミド、シャトルベクター、コスミド、またはウイルスからなる群より選択される核酸発現ベクターを含む。１つの実施形態において、このベクターは、プラスミドｐＴ５（配列番号１７）である。なお別の実施形態において、前出の任意の核酸構築物を含む宿主細胞が提供される。なお他の実施形態において、この宿主細胞は、細菌、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞から選択される。１つの実施形態において、宿主細胞は、細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。
【００１０】
さらなる局面において、本発明は、２つ以上の異なる抗体を含む、複数の抗体を提供し、ここで、各抗体は、ハイブリッドポリペプチドの異なる免疫原性ペプチドに対して特異的であり、このポリペプチドは、直列に連結された少なくとも６つの異なる免疫原性ペプチドを含み、各ペプチドは、少なくとも３０アミノ酸を含み、そしてアミノ末端ペプチドは、カルボキシ末端ペプチドのように反復され、ここで、ポリペプチドは、少なくともＭ５、Ｍ６、Ｍ１４、Ｍ１９、Ｍ２４、およびＭ２９を含む１つより多いＡ群連鎖球菌の抗原に対して免疫応答を惹起し得る。他の実施形態において、複数の抗体は、少なくともＭ２、Ｍ１１、Ｍ２２、Ｍ３３、Ｍ４３、Ｍ５９、およびＭ９４、または少なくともＭ７５、Ｍ７６、Ｍ７７、Ｍ８９、Ｍ９２、Ｍ１０１、およびＭ１１４、または少なくともＳｐａ、Ｍ１．０、Ｍ１．２、Ｍ３、Ｍ１２、Ｍ１８、およびＭ２８を含む１つより多いＡ群連鎖球菌の抗原に対して特異的であり、または２７以上のＡ群連鎖球菌の抗原に対して特異的である。さらに他の実施形態において、前述の任意の抗体において、ハイブリッドポリペプチドは、配列番号２、４、６、または８のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、是術の任意の抗体は、オプソニンであり、かつ被験体において組織交差反応性ではない。１つの実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００１１】
なお別の局面において、ハイブリッドポリペプチドを産生するための方法が提供され、この方法は、配列番号２、４、６、または８のハイブリッドポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つの発現制御配列を含む前述の任意の核酸発現ベクターを含む宿主細胞を、ポリペプチドの発現のための条件下で、そのための十分な時間で培養する工程を包含する。関連する局面において、本発明は、前述の方法によって産生された前述の任意のハイブリッドポリペプチドを提供する。
【００１２】
別の局面において、薬学的に受容可能なキャリアおよび前述の任意のハイブリッドポリペプチドを含む組成物が提供される。他の局面において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアおよび少なくとも２つまたは３つの前述の任意のハイブリッドポリペプチドの混合物を含むカクテル組成物である。１つの実施形態において、このカクテル組成物は、Ｓｐａ免疫原性ペプチドを有する少なくとも１つのハイブリッドポリペプチドを含む。他の実施形態において、ハイブリッドポリペプチドが、等モル量で混合される前出の任意の組成物が提供される。さらなる実施形態において、前述の任意の組成物は、アジュバント（例えば、ミョウバンまたはフロイントアジュバント）をさらに含む。
【００１３】
なお別の実施形態において、本発明は、微生物感染を予防するための方法を提供し、この方法は、１つ以上のハイブリッドポリペプチドに特異的な抗体を惹起するのに十分な用量で、前述の任意の組成物を被験体に投与する工程を包含し、ここで、この抗体は、オプソニンであり、かつ組織交差反応性ではない。特定の実施形態において、予防される微生物感染は、連鎖球菌感染であり、関連する実施形態では、Ａ群連鎖球菌感染である。幾つかの実施形態において、前述の任意の組成物は、経腸的、非経口的、経皮的、経粘膜的、または吸入から選択される経路によって被験体に投与される。さらなる実施形態において、組成物は、ヒトまたは動物の被験体に投与され、そしてこの組成物は、アジュバント（例えば、ミョウバンまたはフロイントアジュバント）をさらに含む。別の関連する実施形態において、微生物感染を予防するための、前述の方法により産生された単離された抗体が提供される。特定の実施形態において、これらの方法によって産生される抗体は、ハイブリッドポリペプチドにおいて提示されないＭ血清型（例えば、Ｍ４）に特定的な少なくとも１つの抗体を含む。なお別の実施形態において、微生物感染を処置または予防するための方法が提供され、この方法は、薬学的に受容可能なキャリアおよび前述の任意の複数の抗体を含む組成物を、被験体に投与する工程を包含する。１つの実施形態において、被験体は、動物またはヒトである。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
上記のように、本発明は、一般に、連鎖球菌に対する保護抗体を惹起し得る、連鎖球菌性抗原のハイブリッドポリペプチドおよびその組成物に関する。さらに、この組成物は、単一のハイブリッドポリペプチドまたはいくつかの異なるハイブリッドポリペプチドの組み合わせを含み得、これらは、Ａ群連鎖球菌に対して免疫応答を引き起こすために有用であり得る。１つの局面において、１つ以上のハイブリッドポリペプチドが、いくつかの異なるＡ群連作球菌血清型による感染を処置または予防し、同時にこのハイブリッドポリペプチドにおいて提示されない血清型による感染を処置または予防するための組成物として処方され得る。本発明はまた、このようなハイブリッドポリペプチドをコードする単離された核酸、ならびにこのようなハイブリッドポリペプチドを発現および精製する方法を提供する。ハイブリッドポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、いくつかの異なる連結した免疫原性ペプチドを含み、ここで、各ペプチドは、例えば、連鎖球菌Ｍタンパク質のアミノ末端部分を含み、そして宿主組織と交差反応性の抗体を惹起することなく、特定のＡ群連鎖球菌血清型に特異的なオプソニン抗体を惹起し得る。
【００１５】
本発明はまた、ハイブリッドポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドの組み合わせに含まれる、各免疫原性ペプチド血清型に特異的な抗体、ならびにそのハイブリッドポリペプチドに含まれない血清型に特異的な抗体（すなわち、血清型間で交差保護を与える抗体）を提供する。従って、本発明は、一般に、非常に複雑な多価ハイブリッドポリペプチドに基づくワクチンが、いくつかの異なる連鎖球菌血清型に対する広範な保護抗体を、同時に惹起するために都合がよいという、驚くべき発見に関する。さらに、ワクチンとして使用される１つより多くの多価ハイブリッドポリペプチドのカクテルを含有する組成物は、予測不可能なことに、単一の多価ハイブリッドポリペプチドを含有する組成物が引き起こすよりずっと多くの効果的な抗体応答をヒトにおいて引き起こし、ここで、抗体応答の増加もまた、抗体機能の増加（すなわち、オプソニン作用および／または微生物の殺傷の増加した能力）を生じる。本明細書中において使用される場合、ハイブリッドポリペプチドの「カクテル」とは、本発明の少なくとも２つの異なるハイブリッドポリペプチドを含有する組成物をいう。従って、本発明はまた、一般に、多価ハイブリッドポリペプチドのカクテルが、保護的免疫応答である、より大きい抗体応答を引き起こすように、相乗的に機能し得るという、驚くべき発見に関する。従って、本発明の組成物および方法は、連鎖球菌感染を処置または予防するために、容易に使用され得る。本発明において使用するために適切なハイブリッドポリペプチドおよびその関連する組成物（混合物またはカクテルを含む）、ならびにこのようなハイブリッドポリペプチドおよび組成物を作製する例示的な方法、およびその治療的使用が、以下にさらに詳細に議論される。
【００１６】
（ハイブリッドポリペプチド）
本発明は、一般に、Ｍタンパク質およびＭ様タンパク質の、多価免疫原性ハイブリッドポリペプチド（他のタンパク質への融合体を含む）に関する。免疫原性Ｍペプチドおよび免疫原性Ｍ様ペプチドは、免疫原性であるＭタンパク質の任意の部分を含み得、これは、血清型特異性を与えても与えなくてもよい。複数の異なる多価免疫原性ハイブリッドポリペプチドは、保護免疫応答を引き起こす際に使用するためのカクテル組成物に混合されるかまたは組み合わせられ得る。本発明は、さらに、合成多価免疫原性ハイブリッドＭポリペプチドまたは組換え多価免疫原性ハイブリッドＭポリペプチド（融合タンパク質を含む）を生成するための方法を提供する。例えば、ハイブリッドポリペプチドをコードする核酸発現構築物を含む宿主細胞は、培養されて、組換えハイブリッドポリペプチドを産生し得る。ハイブリッドポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドの組み合わせ（融合タンパク質を含む）を使用して、微生物感染を処置もしくは予防するための方法、または免疫応答を引き起こすための方法もまた、企図される。
【００１７】
背景として、理論によって束縛されることを望まずに、連鎖球菌種は、それらの細胞壁多糖の免疫学的差異に基づいて群に分けられ、そして例えば、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群、Ｆ群、およびＧ群と命名される、グラム陽性細菌である。具体的には、Ａ群連鎖球菌（ＧｒＡＳ）は、咽喉および皮膚でコロニー形成する、臨床的に重要な微生物である。ＧｒＡＳは、種々の化膿性感染（例えば、ストレプ咽喉（ｓｔｒｅｐ  ｔｈｒｏａｔ）、壊死性筋膜炎）および非化膿性の続発症（例えば、急性リウマチ熱、反応性関節炎）の原因である（一般に、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３：４７０，２０００を参照のこと）。ＧｒＡＳは、表面に露出した２つの主要な食作用阻害性因子（カプセルおよびＭタンパク質）を有し、これらは、これらの生物が宿主においてコロニー形成および生存することを可能にする。ｅｍｍ遺伝子によってコードされるＭタンパク質は、細胞表面からαヘリックスのコイルドコイル二量体として伸び、これは、ＧｒＡＳの表面の原線維のように見える。Ｍタンパク質は、広範な群であり、これらは、Ｍタンパク質血清型に血清学的に分離されている。
【００１８】
現在、１２０より多くのＭタンパク質血清型が同定されており、そしていくつかの血清型のうちで、いくつかのサブタイプが同定されている。例えば、限定されないが、１型Ｍタンパク質は、関連するサブタイプ１．１〜１．１５を有し、そして１２型は、サブタイプ１２．１〜１２．９を有する。さらに、当該分野において公知であるように、分類されていない血清型が、最初の命名（例えば、ｓｔ２９６７）を有し得、そして最終的に、「最後の」分類を受けるか（例えば、ｓｔ２９６７は、現在、Ｍ  １１４型と分類されている）、または以前に分類されていた血清型が、異なる番号で再分類され得る（例えば、Ｍ１３Ｗは、現在、Ｍ９４と分類されている）。特定の実施形態において、血清型１〜１２０＋由来または未知の血清型由来の公知のＭタンパク質のいずれか１つ以上のアミノ末端部分が、本発明の多価免疫原性ハイブリッドポリペプチドに含まれるための免疫原性ペプチドを発生させるために使用され得る。本明細書中に列挙される任意の数値範囲は、（他に示されない限り）その範囲内の任意の整数、および適用可能である場合には（例えば、濃度）その分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むことが、理解されるべきである。
【００１９】
さらに、Ｍタンパク質は、タンパク質のスーパーファミリーの一部であり、このスーパーファミリーとしては、免疫グロブリン結合タンパク質（例えば、ＦｒｃＡ）、Ｍ様タンパク質（例えば、ＭｒｐおよびＳｐａ）ならびにＭタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本明細書中において使用される場合、「Ｍタンパク質」とは、任意の公知または未知のＭタンパク質（命名された血清型ありまたはなし）およびＭ様タンパク質を含むスーパーファミリー（例えば、Ｓｐａ（例えば、Ｄａｌｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１２６１，１９９９およびＭｃＬｅｌｌａｎら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：２９４３，２００１を参照のこと）、Ｍｒｐ（例えば、Ｂｏｙｌｅら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７７：９９１，１９９８を参照のこと）、免疫グロブリン結合タンパク質（例えば、Ｐｏｄｂｉｅｌｓｋｉら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：７２５，１９９４；ＷｈａｔｍｏｒｅおよびＫｅｈｏｅ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：３６３，１９９４を参照のこと）など）をいう。本明細書中に記載されるように、そして当該分野において理解されるように、Ｍタンパク質の血清型は、再分類されて、その結果、異なる型、新たな型、またはサブタイプにさえ変化し得る。また、本明細書中において使用される場合、「Ｍタンパク質血清型」または「Ｍ型」とは、その血清型に含まれる全てのＭタンパク質（全てのサブタイプ、関連するタンパク質などを含む）をいう。さらに、特定のＭ型に対する言及は、限定としてではなく例として、以下のように交換可能に適用され得る：血清型１Ｍタンパク質、１型、Ｍ１など。これらは、上記のように、全てのサブタイプを同様に含む。
【００２０】
上で議論されたように、Ａ群連鎖球菌は、ヒト宿主の抗菌防御のいくつかを回避する系を発生させる。カプセルおよびＭタンパク質を発現する連鎖球菌の株は、例えば、多型核白血球または好中球によって、食菌作用を回避し得、そして連鎖球菌に曝露されていない（すなわち、非免疫血液を有する）宿主において、増加し得る。しかし、宿主が連鎖球菌に対する保護抗体を産生し得る場合、被験体は、連鎖球菌感染に対する耐性を発生させ得る。ＧｒＡＳに対する保護は、一般に、型特異的Ｍタンパク質に対するオプソニン作用抗体の存在に相関し（例えば、Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８９：３０７、１９６２を参照のこと）、そして分泌抗体または粘膜抗体の発生は、連鎖球菌による最初のコロニー形成の防止において重要な役割を果たすと予想される。しかし、非化膿性の続発症のいくつかの病因は、連鎖球菌抗体との宿主組織の交差反応に起因し得る。本明細書中において使用される場合、「組織交差反応性」とは、宿主抗原が外来抗原（例えば、連鎖球菌抗原）と少なくとも１つのエピトープを共有することを意味する。例えば、異なる抗原は、同一のアミノ酸配列を共有し得るか、相同であるが同一ではないかもしれないか、または共有されるエピトープを有する類似しない分子（例えば、タンパク質および炭水化物、またはタンパク質および核酸分子）であり得る。従って、連鎖球菌感染に対する効果的なワクチンは、好ましくは、組織交差反応性ではない抗体を含む免疫応答を引き起こし（すなわち、自己免疫疾患を引き起こさない）、そして臨床的に重要な血清型の多くに対して保護的（すなわち、オプソニン性）である。
【００２１】
本発明は、Ｍタンパク質またはＭ様タンパク質由来の複数の免疫原性タンパク質を有する、ハイブリッドポリペプチドまたはその改変体、あるいはこのようなポリペプチドまたはその改変体をコードする核酸分子に関する。本明細書中において使用される場合、「免疫原性ペプチド」とは、免疫応答を引き起こし得る少なくとも１つのエピトープを有する、任意の連鎖球菌ペプチドまたはポリペプチドをいい、これらは、ハイブリッドポリペプチドの構成単位である。好ましくは、エピトープは、連鎖球菌Ｍタンパク質またはＳｐａタンパク質のアミノ末端部分内にあり、そしてより好ましくは、組織交差反応性抗体を惹起しない、オプソニン性エピトープである。
【００２２】
本発明はまた、多価ハイブリッドポリペプチドワクチンに含まれる連鎖反応Ｍタンパク質血清型の選択のための、信頼性のあるワクチン設計アプローチを提供する。使用され得るいくつかの基準としては、非代償性咽頭炎の頻繁な原因である、Ｍタンパク質血清型の同定、通常は滅菌の部位（すなわち、侵襲性株）から通常は回収される血清型の同定（例えば、有用なデータは、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎによって支持される、Ａｃｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｒｅ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｎｅｔｗｏｒｋから得られ得る；Ｂｅａｌｌら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：１２３１，１９９７；Ｓｃｈｕｃｈａｔら，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．７：９２，２００１もまた参照のこと）、ならびに現在または歴史的に「リウマチ原性（ｒｈｅｕｍａｔｏｇｅｎｉｃ）」であると考えられている血清型の同定（Ｂｉｓｎｏ  ＡＬ．Ｔｈｅ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎｒｈｅｕｍａｔｏｇｅｎｉｃ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ：Ｒｅｅｄ  ＳＥ，およびＪ．Ｂ．Ｚａｂｒｉｓｋｉｅ編，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８０：７８９−８０３）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｓｐａのアミノ末端ペプチドフラグメント（Ａ群連鎖球菌のいくつかの血清型によって発現される、新たな保護抗原）（Ｄａｌｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１２６１，１９９９）もまた、有用であるか、または保護抗体を惹起し得る任意の他の連鎖球菌抗原が使用され得る。
【００２３】
本明細書中に記載されるように、そして当該分野において公知であるように、ハイブリッドポリペプチドに含まれるために選択されるＭタンパク質のアミノ酸配列は、ＣＤＣ  ｅｍｍタイピングセンターウェブサイト（ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｎｃｉｄｏｄ／ｂｉｏｔｅｃｈ／ｓｔｒｅｐ／ｅｍｍｔｙｐｅｓ．ｈｔｍｌ）において、利用可能である。さらに、組織交差反応性の抗体の惹起の可能性を排除するために、成熟Ｍタンパク質およびＳｐａのアミノ末端領域は、公知のヒトタンパク質と比較されて、任意の相同性を検出し得る（例えば、ＢｌａｓｔＰを使用する）。好ましくは、ヒトタンパク質と５つ以上の連続するアミノ酸の一致を有する、アミノ末端Ｍタンパク質部分は、排除される。さらに、Ｍタンパク質およびＳｐａの選択された領域は、好ましくは、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓの方法（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４８３，１９８３）によって分析されて、親水性ピークの一体性を確認する。例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓの方法は、Ｍタンパク質アミノ末端由来の特定の免疫原性ペプチドが、他の免疫原性ペプチドの特定のサブセット融合し、そして他のものとは融合しないことが最良であり得るを予測する際に、役立ち得る。
【００２４】
好ましい実施形態において、ハイブリッドポリペプチドまたは改変体、およびこれらの組み合わせは、例えば、咽頭炎、猩紅熱、急性リウマチ熱、壊死性筋膜炎、蜂巣炎、髄膜炎、肺炎、トキシックショック症候群、菌血症、敗血症、敗血症性関節炎、膿皮症、皮膚感染、膿痂疹、丹毒、軟組織感染、腎炎、発熱性反応などに関連する連鎖球菌に特異的なワクチンであるように設計され得る。さらに、ワクチンは、特定の集団（例えば、免疫無防備状態の患者、小児、および老人）、特定の地図上の集団（例えば、オーストラリアアボリジニー）、および特定の地図上の位置（例えば、温帯またはスカンジナビアの国々）において、連鎖球菌感染を処置または予防するために設計され得る。好ましくは、免疫原性ペプチドを含む異なるＭタンパク質のアミノ末端部分は、宿主組織と交差反応しないオプソニン抗体を惹起し得る。
【００２５】
別の好ましい局面において、Ｍタンパク質血清型は、特定の疾患（例えば、咽頭炎または皮膚感染に関連する血清型）または続発症に関連することが現在公知である最も通常の連鎖球菌に対するその有病率に基づいて、選択される。さらに好ましい局面において、本発明は、流行連鎖球菌のシフトに指向され得るか、またはこのシフトをアドレスするための特定のグループ化に混合され得る、種々の異なる多価免疫原性ハイブリッドポリペプチドを設計および作製するために、使用され得る。例えば、当該分野において公知であるように、今日の疾患に関連している大部分の流行連鎖球菌血清型（例えば、ＡＲＦ）は、５年間、１０年間、または１５年間、流行もせず重要でもないかもしれない。別の例において、特定の連鎖球菌血清型は、欧州において流行し得、そして南米において突然重要になり得る。従って、多価ハイブリッドポリペプチドを含む免疫原性ペプチドは、変化され得るか、または異なる多価ハイブリッドポリペプチドが所望のカクテルを作製するために、混合および適合され得、このカクテルは、臨床的に最も関連する連鎖球菌を必要に応じて攻撃するために、特定の集団または位置における使用のために設計される。
【００２６】
特定の好ましい実施形態において、免疫原性ペプチドは、１０〜７０個の、またはこの範囲内の任意の整数のアミノ酸を有するＭタンパク質またはＳｐａタンパク質のアミノ末端部分を含み；より好ましくは、２０〜６５個のアミノ酸またはこの範囲内の任意の整数を有し；そして最も好ましくは、３０〜６０個のアミノ酸またはこの範囲内の任意の整数を有する。特に好ましい実施形態において、ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも６個または７個の異なる連結された免疫原性ペプチドを含み、ここで、各ペプチドは、連鎖球菌Ｍタンパク質の、少なくとも３０アミノ酸のアミノ末端部分を含み、そしてここで、このポリペプチドは、カルボキシ末端ペプチドとして反復するアミノ末端ペプチドを有し、そしてこのポリペプチドは、Ａ群連鎖球菌の１つより多い血清型に対して、免疫応答を引き起こし得る。好ましくは、ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも血清型５、６、１４、１９、２４および２９；または少なくとも血清型２、１１、２２、３３、４３、５９および９４；または少なくとも血清型７５、７６、７７、８９、９２、１０１および１１４；または少なくとも血清型１．０、１．２、３、１２、１８および２８に対する免疫応答を引き起こし得る。別の好ましい実施形態において、ハイブリッドポリペプチドは、血清型４のような、ハイブリッドポリペプチドにおいて提示されないＭ血清型に対して、免疫応答を引き起こし得る。
【００２７】
特定の実施形態において、ハイブリッドポリペプチドは、配列番号２、４、６、および８に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％〜１００％、またはこの範囲内の任意の整数のアミノ酸同一性；好ましくは、６０％〜９９％、またはこの範囲内の任意の整数の同一性、より好ましくは、７０％〜９７％、またはこの範囲内の任意の整数の同一性、そして最も好ましくは、８０％〜９５％、またはこの範囲内の任意の整数の同一性を有する。本明細書中において使用される場合、「同一性の百分率」または「同一性の％」とは、コンピュータで実行されるアルゴリズムを使用して、代表的にはデフォルトパラメータを用いて、対象のポリペプチド、ペプチド、またはその改変体の配列全体を、試験配列と比較することによって得られる百分率値である。配列比較は、任意の標準的なソフトウェアプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ｔＢＬＡＳＴ、ｐＢＬＡＳＴ、またはＭｅｇＡｌｉｇｎ）を使用して実施され得る。なお他のものとしては、ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって作製される、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅバイオインフォマティクス電算総合ソフトウェアにおいて提供されるものが挙げられる。ＡＬＩＧＮまたはＢＬＡＳＴのようなアルゴリズムに対する参照は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５，１９９１；またはＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９，１９９２に見出され得る。ＢＬＡＳＴは、ＮＣＢＩウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）において利用可能である。最適な整列を決定することによって複数のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に周知である（例えば、ＰｅｒｕｓｋｉおよびＰｅｒｕｓｋｉ，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）；Ｗｕら（編），「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２３−１５１頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）；ならびにＢｉｓｈｏｐ（編），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９８を参照のこと）。本明細書中において使用される場合、２つのペプチド間または２つのポリペプチド間の「類似性」は、一般に、一方のペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を、第二のペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列および保存的アミノ酸置換と比較することによって、決定される。本発明のハイブリッドポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成によって、対応する全長ハイブリッドポリペプチドを産生するために使用され得る；従って、これらのフラグメントは、全長ハイブリッドポリペプチドを産生するための中間体として使用され得���。同様に、本発明の核酸のフラグメントまたは部分は、本発明の全長核酸を合成するために使用され得る。
【００２８】
本発明のハイブリッドポリペプチドおよび対応する核酸は、好ましくは、単離された形態で提供され、そして特定の好ましい実施形態において、均一まで精製される。本明細書中において使用される場合、用語「単離された」とは、物質がその元の環境または天然の環境から除去されることを意味する。例えば、生存動物または細胞中に存在する、天然に存在する核酸分子またはポリペプチドは、単離されておらず、天然の系において共存する物質のいくらかまたはすべてから分離される場合に、この核酸分子またはポリペプチドは、単離されている。核酸分子は、例えば、ベクターの一部であり得、そして／またはこのような核酸またはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてこのようなベクターまたは組成物は、その天然の環境の一部ではないという点で、依然として単離されている。
【００２９】
本発明はまた、合成または組換えにより、好ましくは組換えにより、生成されたハイブリッドポリペプチドおよびそれらの改変体に関する。ハイブリッドポリペプチドの免疫原性ペプチド成分は、標準的な化学的方法（自動化手順による合成を含む）により合成され得る。一般に、免疫原性ペプチドは、カップリング剤としてＨＡＴＵを用いる標準的な固相Ｆｍｏｃ保護ストラテジーに基づいて合成される。免疫原性ペプチドは、適切なスカベンジャーを含有するトリフルオロ酢酸（これはまた、側鎖官能基を脱保護する）を用いて固相樹脂から切断される。粗免疫原性ペプチドは、分取逆相クロマトグラフィーを用いてさらに精製される。他の精製法（例えば、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動、またはイオン交換クロマトグラフィー）は使用され得る。当該分野で公知の他の合成技術（例えば、ｔＢｏｃ保護ストラテジー、異なるカップリング試薬の使用など）は、同様の免疫原性ペプチドを生成するために使用され得る。さらに、任意の天然に存在するアミノ酸またはそれらの誘導体（Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸、およびそれらの組み合わせを含む）が用いられ得る。特に好ましい実施形態では、本発明の合成ハイブリッドポリペプチドは、アミノ末端にＭ２、Ｍ１２、Ｍ２４、またはＭ８９の免疫原性ペプチドを有する。
【００３０】
本明細書中に記載のように、本発明のハイブリッドポリペプチドは、組換えであり得、ここでこのハイブリッドポリペプチドは、核酸発現構築物において発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された、所望のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから発現される。特に好ましい実施形態では、本発明の組換えハイブリッドポリペプチドは、アミノ末端にＭ２、Ｍ１２、Ｍ２４、またはＭ８９の免疫原性ペプチドを有する。いくつかの好ましい組換えハイブリッドポリペプチドは、Ｍ２４−Ｍ５−Ｍ６−Ｍ１９−Ｍ２９−Ｍ１４−Ｍ２４、Ｍ２−Ｍ４３−Ｍ９４−Ｍ２２−Ｍ１１−Ｍ５９−Ｍ３３−Ｍ２、Ｍ８９−Ｍ１０１−Ｍ７７−Ｍ１１４−Ｍ７５−Ｍ７６−Ｍ９２−Ｍ８９、またはＭ１．０−Ｍ１２−Ｓｐａ−Ｍ２８−Ｍ３−Ｍ１．２−Ｍ１８−Ｍ１．０およびこれらの任意の組み合わせの構造を縦に一列に有して連結された免疫原性ペプチドを含む。最も好ましくは、ハイブリッドポリペプチドは、配列番号２、４、６、または８のアミノ酸配列、およびそれらの改変体を含む。上記および本明細書中に記載のように、任意のＭ血清型が本発明において含まれ得、好ましくは、血清型１．０、１．２、２、３、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、３３、４３、５９、７５、７６、７７、８９、９２、９４、１０１、および１１４がハイブリッドポリペプチドに含まれる。本明細書中に記載されるような特定の好ましい実施形態では、本発明のハイブリッドポリペプチドは、被験体（ここで被験体は、動物またはヒトである）において組織交差反応性抗体ではない少なくとも１つのオプソニン抗体を惹起し得る。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、ハイブリッドポリペプチドは、制限酵素認識部位である核酸配列によりコードされる少なくとも２つのアミノ酸で連結され、ここでこの制限部位は、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩなどの任意の１つ以上であり得る。さらなるアミノ酸リンカーもまた、本明細書中に記載のように合成されて付加され得る。好ましくは、さらなるアミノ酸は、ヒトタンパク質の５アミノ酸ストレッチ内の配列においていかなる同一性も生じない。さらに、本発明のハイブリッドポリペプチドは、少なくとも１つのさらなるカルボキシ末端アミノ酸をさらに含み得、ここでこのさらなるアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸である。２０の天然に存在するアミノ酸またはそれらの誘導体（例えば、システイン、ヒスチジン、ロイシン、およびグルタミン酸）のいずれかが付加され得る。例えば、システインの付加は、他の構成要素（例えば、脂質、キャリアタンパク質など）を結合させるために有用であり得る。
【００３２】
本明細書中に記載のように、本発明はまた、さらなる機能的ポリペプチド配列または非機能的ポリペプチド配列に融合されたハイブリッドポリペプチドを含む、ハイブリッドポリペプチド融合タンパク質を提供する。このさらなるポリペプチド配列は、例えば、例示のためであって限定はしないが、ハイブリッドポリペプチド融合タンパク質の検出、単離、および／または精製を可能にする。例えば、さらなる機能的ポリペプチド配列は、タグ配列であり得、これは、特定の実施形態では、タンパク質−タンパク質アフィニティー法（例えば、レセプター−リガンド）、金属アフィニティー法、または電荷アフィニティー法によって検出、単離、および／または精製され得る融合タンパク質を含む。特定の他の実施形態では、ハイブリッドポリペプチド融合タンパク質は、プロテアーゼ認識配列を含む配列を有する融合タンパク質の特異的プロテアーゼ切断によって検出され得、従って、このハイブリッドポリペプチドがさらなるポリペプチド配列から分離可能であり得る。さらに、さらなるアミノ酸、キャリアタンパク質、またはタグ配列（これらは、アミノ酸末端またはカルボキシ末端のいずれかに位置し得る）を含むハイブリッドポリペプチドが、合成により作製され得る。特に好ましい実施形態では、例えば、組換えハイブリッドポリペプチドは、カルボキシ末端タグにインフレームに融合され、ここでこのタグは、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号１８）、またはＧＳＴなどのいずれか１つであり得る。最も好ましいのは、ハイブリッドポリペプチドのアフィニティー検出および単離を容易にするハイブリッドポリペプチド融合タンパク質であり、これは、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは規定の抗原性ペプチドエピトープ（米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら（１９８８  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４）に記載される、またはＸＰＲＥＳＳＴＭエピトープタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号１９；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含み得る。アフィニティー配列は、ベクターによって供給されるようなヘキサヒスチジンタグであり得る。例えば、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）ベクターは、特定の宿主（例えば、細菌）からの成熟タンパク質融合物の精製のためにポリヒスチジンタグを提供し得る。あるいは、アフィニティー配列は、合成で付加され得るか、または多価ハイブリッドポリペプチドの免疫原性ペプチドをコードする核酸配列を（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して）組換え生成するために使用されるプライマーに操作され得る。好ましくは、多価ハイブリッドポリペプチドは、ポリヒスチジンに融合され、そしてこのような融合タンパク質をコードする組換え核酸配列によってコードされる。
【００３３】
免疫原性ペプチドはまた、本明細書中に提供されるおよび当該分野で公知であるような、種々の方法によって、さらなるアミノ酸配列を含む所望のハイブリッドポリペプチドを形成するために化学的に連結され得る（一般には、Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：３５５、２０００を参照のこと）。組換えペプチドまたは合成ペプチドは、直鎖状（例えば、Ｌｅｃｌｅｒｃら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：２６、１９８７およびＦｒａｎｃｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：１６８、１９８７を参照のこと）または分枝鎖（例えば、Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：５５３、１９９６を参照のこと）構築物を形成するように連結され得るか、あるいは、エピトープの化学的連結を用いて連結され得る（例えば、ＴａｍおよびＳｐｅｔｚｌｅｒ、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １：１２３、１９９５；Ｒｏｓｅ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：３０、１９９４；およびＤａｗｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６、１９９４を参照のこと）。ペプチドはまた、分枝ハイブリッドポリペプチドを形成するために多重抗原ペプチド系を介して連結され得る（例えば、Ｔａｍ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５４０９、１９８８；米国特許第５，２２９，４９０号を参照のこと）。多重抗原ペプチド系は、コア分子上の各官能基が少なくとも２つの分枝を形成し、そしてその主要単位もまた多官能性である、多官能性コア分子を使用する。例えば、リジンは、コアペプチドとして使用され得る。なぜなら、それが１つのカルボキシル官能基および２つの（αおよびε）アミン官能基を有するからである。分枝中の各多官能単位は、さらなる成長のためのベースを提供し、樹状ポリマーの指数関数的成長を生じる。ペプチドは、次いで、連結分子（例えば、グリシン）を用いて樹状コアに接続され得る。多重抗原ペプチド系は、多数の合成ペプチドを、低分子容量で高濃度の合成ペプチドを提供する樹状コア分子の官能基に連結する。好ましくは、２つまたは３つのいずれかのレベルの幾何的に分枝したリジンが使用され、ここでこれらのリジンコアはそれぞれ、テトラマーコア構造およびオクタマーコア構造を形成する。多重抗原ペプチド系はまた、コア分子に結合された親油性足場部分を含み得、それにより、さもなければ免疫刺激のためにこれを必要とするペプチドワクチンにおいて処方されたアジュバントの必要性を除く（例えば、米国特許第５，５８０，５６３号を参照のこと）。１つの好ましい実施形態では、本発明のハイブリッドポリペプチドは、リジンコア分枝ポリペプチドを形成するように連結された免疫原性ペプチドを含む。
【００３４】
さらに、同様または異なる合成ペプチドは、アクリロイルクロリドを用いてアクリロイル（ＣＨ２＝ＣＨ−）基を有するペプチドのアミノ末端の誘導体化を介して制御された重合によって連結され得る（例えば、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １１９：１１８３、１９９７；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：１６９７、１９９７を参照のこと）。次いで、誘導体化されたペプチドは、鎖伸長のフリーラジカル開始によって、単独で、または同様に誘導体化されたペプチドと混合されて重合される。結果として、ペプチドは、そのペプチド決定基がアルカン骨格から張り出している側鎖を形成するポリマーにアセンブルされる。本明細書中に記載のハイブリッドポリペプチドおよび融合タンパク質は、上記のように構築され得る。１つの好ましい実施形態では、本発明のハイブリッドポリペプチドは、アルカン骨格によって連結された免疫原性ペプチドを含む。特定の実施形態では、アルカン骨格は、アクリルアミドまたはそれらのアナログもしくは誘導体である。
【００３５】
（治療処方物および使用方法）
本発明はまた、免疫応答を惹起するために使用され得る、１つ以上のハイブリッド多価ポリペプチドを含む薬学的組成物に関する。本発明はさらに、本明細書中に記載のように、１つ以上のハイブリッドポリペプチドに特異的な抗体を惹起するために十分な用量でハイブリッドポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチド混合物を、被験体に投与することにより、微生物感染を処置および予防するための方法に関する。ハイブリッドポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドのカクテルは、好ましくは、本発明の方法において使用される場合、薬学的組成物の一部である。
【００３６】
特定の局面では、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア、希釈液、または賦形剤、ならびに本発明の多価ハイブリッドポリペプチドのいずれかおよびそれらの任意の組み合わせを含む組成物を提供する。好ましい実施形態は、薬学的に受容可能なキャリア、および本発明の少なくとも２つまたは３つのハイブリッドポリペプチドの混合物である。なお別の好ましい実施形態では、縦に一列に連結された少なくとも７つの異なる免疫原性ペプチドを含むハイブリッドポリペプチド（ここで、各ペプチドは、少なくとも５０アミノ酸のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＭタンパク質のアミノ末端部分を含み、そしてここでこのポリペプチドは、カルボキシ末端ペプチドとして反復されるアミノ末端ペプチドを有し、かつこのポリペプチドは、少なくとも血清型１．０、１．２、３、１２、１８、および２８を含むＡ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの１つより多くの血清型に対する免疫応答を惹起し得る）は、本発明の少なくとも１つの他のハイブリッドポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアと組み合わされる。より好ましい実施形態では、組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、および配列番号２、４、６、および８のハイブリッドポリペプチドまたはそれらの改変体の混合物を含み、そして他の実施形態では、これらの４つのポリペプチドまたはそれらの改変体は、等モル量で混合され、そして少なくとも１つのハイブリッドポリペプチドは、Ｓｐａペプチドを有する。他の実施形態では、配列番号２、４、６、および８またはそれらの改変体には、ポリヒスチジンタグが提供されるか、または少なくとも１つのさらなるアミノ酸（例えば、システイン）をさらに含む。これらの処方物の各々は、アジュバント（例えば、ミョウバンまたはフロイントアジュバント）および希釈剤（例えば、水またはＰＢＳ）をさらに含み得る。さらに、本発明の治療組成物は、好ましくは、数ヶ月の間、安定であるべきであり、そして滅菌条件下で生成および維持され得る。
【００３７】
薬学的組成物は、１つ以上のハイブリッド多価ポリペプチドまたはそれらの融合タンパク質、ならびに必要に応じて他の成分に加え、少なくとも１つの薬学的に受容可能なビヒクル、キャリア、希釈剤、または賦形剤を含む。例えば、ハイブリッドポリペプチドまたはそれらの融合タンパク質、あるいは２つ以上のハイブリッドポリペプチドまたはそれらの融合タンパク質のカクテルの組成物と共に使用するために適した薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、増粘剤、緩衝剤、溶媒、湿潤剤、保存剤、キレート剤、アジュバントなど、およびそれらの組み合わせを含み得る。例示のアジュバントは、ミョウバン（水酸化アルミニウム、ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標））、リン酸アルミニウム、プロテオソームアジュバント（例えば、米国特許第５，７２６，２９２号および第５，９８５，２８４号）を参照のこと）、ビロソーム、リポソーム（リピドＡを有するかまたは有さない）、Ｄｅｔｏｘ（Ｒｉｂｉ／Ｃｏｒｉｘａ）、ＭＦ５９、または他の油エマルジョン型アジュバントおよび水エマルジョン型アジュバント（例えば、ナノエマルジョン）（例えば、米国特許第５，７１６，６３７号を参照のこと）およびサブミクロンエマルジョン（例えば、米国特許第５，９６１，９７０号を参照のこと）、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントである。治療用途のための薬学的に受容可能なキャリアは、製薬分野において周知であり、そして本明細書中、および、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、第１８版、１９９０）、およびＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｄｒｕｇ、ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ（Ｓ．Ｃ．Ｓｍｏｌｉｎｓｋｉ編、１９９２）に記載されたとおりである。
【００３８】
「薬学的に受容可能な塩」とは、このような化合物および有機酸もしくは無機酸（酸付加塩）または有機塩基もしくは無機塩基（塩基付加塩）の組み合わせに由来する、本発明の化合物の塩をいう。本発明の化合物は、両形態が本発明の範囲内であるとみなされる、遊離塩基または塩形態のいずれかで使用され得る。
【００３９】
さらに、薬学的組成物は、希釈剤（例えば、水またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））をさらに含み得る。好ましくは、希釈剤は、約０．１ｍＭ〜約１Ｍ、より好ましくは、約０．５ｍＭ〜約５００ｍＭ、さらにより好ましくは、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、そして最も好ましくは、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭの最終リン酸濃度範囲を有するＰＢＳであり、そして最終塩濃度は、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭであり、そして最も好ましくは、約１２５ｍＭ〜約１７５ｍＭの範囲である。好ましくは、最終ＰＢＳ濃度は、約５ｍＭホスフェートおよび約１５０ｍＭ塩（例えばＮａＣｌ）である。特定の実施形態では、本発明の多価ハイブリッドポリペプチドのカクテルを含む上記の薬学的組成物のいずれかは、好ましくは、無菌である。
【００４０】
組成物はまた、無菌環境下でそれらを調製することにより無菌であり得、かつ／またはそれらは、当該分野で利用可能な方法を用いて最後に滅菌され得る。多くの薬剤は、無菌であるように製造され、そしてこの規準は、ＵＳＰ  ＸＸＩＩ＜１２１１＞によって定義される。本実施形態における滅菌は、その産業において受容され、ＵＳＰ  ＸＸＩＩ＜１２１１＞に列挙された多数の手段によって達成され得る。このような手段としては、ガス滅菌、電離放射線、または濾過が挙げられる。滅菌は、ＵＳＰ  ＸＸＩＩ＜１２１１＞においてまた定義された、無菌処理（ａｓｃｅｐｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）と称されるものによって維持され得る。ガス滅菌のために使用される受容可能なガスとしては、エチレンオキシドが挙げられる。電離放射線法のために使用される受容可能な放射線タイプとしては、γ（例えば、コバルト６０源からの）および電子ビームが挙げられる。典型的なγ放射線の線量は、２．５ＭＲａｄである。適切な場合、濾過は、適切な孔サイズ（例えば、０．２２μｍ）を有し、および適切な材料（例えばＴｅｆｌｏｎ（登録商標）のフィルタを用いて達成され得る。用語「ＵＳＰ」は、Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ｗｗｗ．ｕｓｐ．ｏｒｇ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤを参照のこと）をいう。
【００４１】
本発明はまた、微生物感染を予防するための方法であって、被験体に、本発明の組成物を、１つ以上のハイブリッドポリペプチドに特異的な抗体を惹起するに十分な用量で投与する工程を包含し、ここで、この抗体は、好ましくは、オプソニン性であって組織交差反応性ではない、方法に関する。特定の実施形態では、感染は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染（例えば、Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染）である。ハイブリッドポリペプチド処方物での処置に適切な被験体は、疾患の発症の危険性のよく確立された指標または既存の疾患のよく確立された特徴によって同定され得る。例えば、感染の指標としては、熱、膿、微生物陽性培養、炎症などが挙げられる。本発明のハイブリッドポリペプチドで処置され得る感染としては、微生物によって、または微生物に起因して引き起こされる感染（その感染が原発性であるか、続発性であるか、日和見であるかなどに関わらない）が挙げられるが、これらに限定されない。微生物の例としては、グラム陽性細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。
【００４２】
１つ以上のハイブリッドポリペプチドを含む薬学的組成物は、この組成物が被験体（例えば、ヒトまたは動物）に投与されることを可能にする任意の形態であり得る。例えば、本発明の多価ハイブリッドポリペプチド組成物は、液体溶液として調製され、投与され得るか、固体形態（例えば、凍結乾燥）として調製され得、これは、固体形態で投与され得、投与と共に溶液中で再懸濁され得る。ハイブリッドポリペプチド組成物は、その中に含まれる活性成分が被験体もしくは患者へのこの組成物の投与の際に生体利用可能であるように、または徐放を介して生体利用可能であるように、処方される。被験体または患者に投与される組成物は、１つ以上の投薬単位の形態をとる。例えば、錠剤は、単一投薬単位であり得、そしてエアロゾル形態での本発明の１つ以上の化合物を含む容器が、複数の投薬単位を保持し得る。特定の好ましい実施形態では、本発明のハイブリッドポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドのカクテルを含む上記薬学的組成物のいずれかが、容器中に、好ましくは、無菌容器中に存在する。
【００４３】
１つの実施形態では、治療組成物は、経口投与され、そして本発明のハイブリッドポリペプチドまたはカクテル組成物は、細胞（例えば、腸の管腔に存在する細胞）によって取り込まれる。他の典型的な投与経路として、腸内、非経口、経皮／経粘膜、および吸入が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される用語「腸内」は、薬剤が胃腸管または口腔粘膜を通して吸収される投与経路であり、例えば、経口、直腸、および舌下が挙げられる。本明細書中で使用される用語「非経口」は、胃腸管を迂回する投与経路を記載し、動脈内、皮内、筋肉内、鼻内、眼内、腹腔内、静脈内、皮下、粘膜下、および膣内の注射または注入技術が挙げられる。本明細書中で使用される用語「経皮／経粘膜」は、薬剤が、皮膚を通じて、または皮膚を経由して投与される投与経路であり、局所が挙げられる。用語「吸入」は、薬剤が肺樹状部（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｒｅｅ）に導入される投与技術を包含し、肺内または経肺投与が挙げられる。好ましくは、本発明の組成物は、筋肉内投与される。
【００４４】
適用に依存して、組成物中のハイブリッドポリペプチドの用量は、投与範囲の任意の整数を含め、生物学的に受容可能な賦形剤、アジュバント、結合剤および／または希釈剤との組み合わせで、一般に、約１０μｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１００μｇ〜１ｍｇ、さらに好ましくは約１５０μｇ〜５００μｇ、そして最も好ましくは約２００μｇ〜約４００μｇで変動する。本明細書中で用いられる場合、用語「約」または「から本質的になる」とは、任意の示した構造、値、または範囲の±１０％をいう。ブースター免疫は、免疫応答を最大にするために、複数回、約２週間から約２４週間の範囲の所望の間隔で、好ましくは２週間、４週間および８週間の間隔で、そしてより好ましくは２週間、４週間および１６週間の間隔で、そしてさらにより好ましくは０週間、４週間および２４週間の間隔で与えられ得る。
【００４５】
本発明はさらに、被験体に、１以上のハイブリッドポリペプチドに特異的な抗体を惹起するに充分な用量で、本発明の組成物を投与する工程を包含する、微生物感染を予防するための方法によって産生される複数の抗体を提供し、ここで、この抗体は、オプソニン性であり、組織交叉反応性ではない。１つの実施形態では、この抗体は、ハイブリッドポリペプチド中に提示されないＭ血清型（例えば、４Ｍ型タンパク質）に特異的な少なくとも１つの抗体を含む。別の実施形態では、微生物感染を処置または予防するための方法は、被験体に、薬学的に受容可能なキャリアおよび複数の本発明の抗体を含む組成物を投与する工程を包含する。
【００４６】
（抗体およびアッセイ）
別の局面では、本発明のハイブリッドポリペプチドおよびその改変体を利用して、本明細書中に提供されるハイブリッドポリペプチド上に存在する少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体が惹起される。従って、本発明はまた、このような抗体を提供する。好ましい実施形態では、この抗体は、Ｍタンパク質上に存在する特定の防御エピトープに結合する。本発明に関して、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、モノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、それらのフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂフラグメント）ならびに組換えまたは合成によって産生された抗体を包含する。このような抗体は、モノクローナル抗体が特異的に結合するのを可能にする可変領域を取り込んでおり、このことは、抗体が、本発明のｅｍｍ配列またはｓｐａ配列から産生されたペプチドに選択的に結合し得ることを意味する。「に特異的」とは、タンパク質（例えば、抗体）が、本発明のｅｍｍ核酸分子もしくはｓｐａ核酸分子によってコードされるポリペプチドもしくはペプチドまたは合成ハイブリッドポリペプチドを特異的に結合する能力をいう。特定の抗原に対する抗体の会合または「結合」は一般に、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用および疎水性相互作用を包含する。これらのうちのいずれか１つまたはこれらの任意の組み合わせは、抗体とその抗原との間の結合において役割を果たし得る。このような抗体は一般に、抗原（例えば、Ｍタンパク質）と、少なくとも１０４、好ましくは少なくとも１０５、より好ましくは少なくとも１０６、さらにより好ましくは少なくとも１０７、そして最も好ましくは少なくとも１０８の親和性定数（Ｋａ）で会合する。親和性定数は、当業者によって、周知の技術（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４９を参照のこと）を用いて決定され得る。モノクローナル抗体または抗体の親和性は、当業者によって容易に決定され得る（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４９を参照のこと）。
【００４７】
さらに、用語「抗体」は、本明細書中で用いられる場合、天然に存在する抗体、および天然に存在しない抗体（例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体およびヒト化抗体を包含する）、ならびにそれらの抗原結合フラグメントを包含する。天然に存在しないこのような抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築され得るか、組換えによって産生され得るか、または例えば、可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーングすることによって入手され得る（Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９））。例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ−グラフト化抗体、単鎖抗体、および二機能性抗体を作製するこれらの方法および他の方法は、当該分野で周知である（ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：２４３，１９９３；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４，１９８９；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，１９９５；Ｈｉｌｙａｒｄら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２）。
【００４８】
好ましい実施形態では、複数の抗体は、２以上の異なる抗体を含み、ここで、各抗体は、ハイブリッドポリペプチドの異なる免疫原性ペプチドに特異的であり、このポリペプチドは、タンデムに連結された少なくとも６個の異なる免疫原性ペプチドを含み、各ペプチドは、少なくとも３０個のアミノ酸を含み、そしてアミノ末端ペプチドは、カルボキシ末端ペプチドとして反復され、ここでこのポリペプチドは、Ａ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの１より多くの血清型に対して免疫応答を惹起し得る。好ましくは、ハイブリッドポリペプチドは、以下に対して免疫応答を惹起し得る：少なくとも血清型５、６、１４、１９、２４および２９に対して；または少なくとも血清型２、１１、２２、３３、４３、５９および９４に対して；または少なくとも血清型７５、７６、７７、８９、９２、１０１および１１４に対して；または少なくとも血清型１．０、１．２、３、１２、１８および２８に対して。別の好ましい実施形態では、ハイブリッドポリペプチドは、ハイブリッドポリペプチド中に提示されないＭ血清型（例えば、血清型４）に対する免疫応答を惹起し得る。より好ましくは、この抗体は、個々のまたは組み合わせた、配列番号２、４、６および８のハイブリッドポリペプチドによって惹起され、そして最も好ましくは、少なくとも１つの抗体は、オプソニン性であり、被験体において組織交叉反応性ではない。本明細書中で用いられる場合、「オプソニン性」とは、エピトープを有する細胞または粒子の食作用を増強する任意のエピトープを意味する。当業者によって通常理解されるように、「オプソニン抗体」は、抗原を有する粒子（例えば、細菌細胞）の食作用活性を促進する抗体である。なお別の好ましい実施形態では、本発明のハイブリッドポリペプチドによって惹起される抗体はポリクローナルである。
【００４９】
ポリクローナル抗体は、種々の温血動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、七面鳥、ウサギ、マウス、またはラット）から当業者によって容易に作製され得る。手短に述べると、所望のハイブリッドポリペプチドもしくはハイブリッドポリペプチドの混合物、またはそれらの改変体を非経口注射、腹腔内注射、筋肉内注射、眼内注射、または皮下注射によって投与して、動物が免疫される。目的のハイブリッドポリペプチドの免疫原性は、アジュバント（例えば、ミョウバンならびにフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント）の使用によって増大され得る。数週間にわたる数回のブースター免疫後、少量の血清サンプルが採取され、そして所望のＭペプチドまたはＳｐａペプチドに対する反応性について試験される。特に好ましいポリクローナル免疫血清は、バックグラウンドよりも少なくとも３倍大きなシグナルを与える。一旦、この動物の力価が、このハイブリッドポリペプチドに対するその反応性に関してプラトーに達したら、より多量のポリクローナル免疫血清が、動物の週１回の採血または放血のいずれかによって容易に入手され得る。
【００５０】
例えば、配列番号２、４、６および８（図１を参照のこと）のハイブリッドポリペプチドを精製し、等モル濃度で混合し、そして各０．５ｍｌの用量において４００μｇの総タンパク質および７５０μｇのミョウバンを含むように、ミョウバンを用いて処方した。３匹のウサギの各々に、０、４、および８週間目にて、または０、４、および１６週間目にて、ハイブリッドポリペプチドカクテルの３回の筋肉内注射を受けさせ、そして免疫血清を１８週目に回収した。収集された血清を、より大きなワクチンポリペプチドの各々の精製組換え二量体ペプチド成分を用いて、本明細書中に記載されるように、ＥＬＩＳＡによって分析した。ＥＬＩＳＡ（ハイブリッド分子の精製組換え二量体免疫原性ペプチドを用いる）を用いて、０、４、および１６週目に免疫されたウサギ由来の免疫血清は、このカクテルのハイブリッドポリペプチドに含まれるＭペプチドおよびＳｐａペプチドの極めて大部分に対する高力価の抗体を含むことが見出された（図３）。特定の好ましい実施形態では、このポリクローナル抗体は、血清型５、６、１４、１９、２４および２９または血清型２、１１、２２、３３、４３、５９および９４、または血清型７５、７６、７７、８９、９２、１０１および１１４、または血清型１．０、１．２、３、１２、１８および２８のＡ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉに特異的である抗体を含む。
【００５１】
モノクローナル抗体はまた、周知の技術（米国特許第ＲＥ３２，０１１号、同第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、および同第４，４１１，９９３号を参照のこと；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ，およびＢｅｃｈｔｏｌ（編），１９８０、ならびにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８もまた参照のこと）を用いて容易に作製され得る。手短に述べると、１つの実施形態では、被験体動物（例えば、ラットまたはマウス）に、所望のタンパク質またはペプチドを注射する。所望の場合、より大きな抗体反応性を発生させるために、このタンパク質によって生じる、得られる免疫応答を増大させるために、種々の技術を用い得る。例えば、所望のタンパク質またはペプチドは、別のキャリアタンパク質（例えば、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはＥ．ｃｏｌｉ不安定毒素Ｂサブユニット）へとカップリングされ得るか、またはアジュバント（例えば、ミョウバンまたはフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）が使用されるなどであり得る。
【００５２】
一旦適切な抗体が得られたら、これらは、当業者に周知の多くの技術（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出を参照のこと）によって単離または精製され得る。適切な技術としては、ペプチドもしくはタンパク質アフィニティーカラム、ＨＰＬＣもしくはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡもしくはプロテインＧカラムでの精製、またはこれらの技術の任意の組み合わせが挙げられる。本発明に関しては、用語「単離された」は、抗体を定義するために用いられる場合、「他の血液成分を実質的に含まない」ことを意味する。
【００５３】
いくつかのアッセイが、本発明のハイブリッドポリペプチドによって惹起される抗体の活性を調べるために、本明細書中に記載されるとおり利用可能である。例示的なアッセイは、オプソニン食菌アッセイであり、このアッセイは、試験抗血清中に存在するオプソニン抗体の存在によって促進される貪食作用を検出する。手短に述べると、このアッセイは細菌細胞を、例えば、ハイブリッドポリペプチド免疫原に対して惹起された抗血清の存在下または非存在下で予備インキュベートした後、好中球による、選択された細菌細胞の貪食作用の量を測定する。免疫血清を用いた予備インキュベーションは、この細胞をＭタンパク質反応性抗体でコーティングし、これらの抗体のうちのいくつかは、Ｍタンパク質抗原上に存在するオプソニン性エピトープから惹起されたオプソニン抗体である。次いで、予備インキュベートされコーティングされた細胞は、動物（代表的には、オプソニン性防御が求められるべき哺乳動物（例えば、ヒト））由来の全血と混合されて、細菌細胞と会合した好中球の百分率（これは、オプソニン抗体によって促進された貪食活性の尺度である）が決定される。オプソニン抗体を含む用量免疫血清は、オプソニン抗体を欠く免疫血清が誘導するよりも高い百分率の、選択された細菌に関連した好中球を誘導する。この試験のバリエーションでは、免疫血清の細菌活性は、免疫血清を、より少ない細菌細胞とインキュベートし、より長い期間にわたって血中でインキュベートし、次いでこの混合物を培養培地上にプレーティングして、生存細菌についてスコア付けることによって試験され得る。免疫血清中のオプソニン抗体の存在は、貪食作用によって破壊される細菌数を増大させ、それゆえ、プレート培養において検出されるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を低下させる。別の例示的アッセイは、試験抗体の殺菌活性を分析する（実施例５を参照のこと）。
【００５４】
（核酸分子および宿主細胞）
本発明はまた、ハイブリッドペプチドをコードする配列を含む単離された核酸分子を包含し、ここで、各ペプチドは、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉのＭタンパク質のアミノ末端部分を含む（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６）。本発明によってまた提供されるのは、ハイブリッドポリペプチドおよびそれらの改変体をコードする核酸発現構築物（およびこのような核酸を含む宿主細胞）であり、これらのハイブリッドポリペプチドは、Ａ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの１より多くの血清型に対する免疫応答を惹起し得る。本発明のこの局面は、本明細書中に記載されるようなハイブリッドポリペプチド配列をコードする単離された核酸配列、ならびに単離された核酸分子から容易に誘導される配列（例えば、相補的配列、逆配列および逆配列の相補体）に関する。
【００５５】
「核酸」または「核酸分子」とは、任意のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製されたフラグメント、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼの作用およびエキソヌクレアーゼの作用によって作製されるフラグメントをいう。核酸は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）、天然に存在するヌクレオチドのアナログ（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）またはこの両方の組み合わせであるモノマーから構成され得る。改変されたヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に改変を有し得る。糖の改変としては、例えば、１以上のヒドロキシル基の、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による置換が挙げられるか、または糖は、エーテルもしくはエステルとして官能化され得る。さらに、糖部分全体が、立体構造的にまたは電子的に類似の構造体（例えば、アザ−糖および炭素環式糖アナログ）で置換され得る。塩基部分における改変の例としては、アルキル化プリンおよびアルキル化ピリミジン、アシル化プリンもしくはアシル化ピリミジン、または他の周知の複素環式置換が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこのような結合のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル結合のアナログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが挙げられる。用語「核酸」はまた、ポリアミド骨格に結合した、天然に存在する核酸塩基または改変された核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」を包含する。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
【００５６】
さらに、「単離された核酸分子」とは、別個のフラグメントの形態の、またはより大きな核酸構築物の構成要素としての、ポリヌクレオチド分子であって、その供給源細胞（通常それが存在する染色体を含む）から少なくとも１回、実質的に純粋な形態で分離されているポリヌクレオチド分子をいう。例えば、Ｓｐａのポリペプチド、ペプチドまたはそれらの改変体をコードするＤＮＡ分子であって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞のゲノムＤＮＡから分離されているＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子の別の例は、化学合成された核酸分子である。核酸分子は、広範な種々のヌクレオチド（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログ、またはこれらの何らかの組み合わせを包含する）から構成され得る。１つの好ましい実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１２、１４、または１６のハイブリッドポリペプチドをコードする配列を含む。
【００５７】
特定の局面では、本発明は、本発明の核酸配列を含む、核酸ベクターおよび構築物に関し、特に、上記に提供されるようなハイブリッドポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを含む「核酸発現構築物」；本発明のベクターおよび／または構築物を用いて遺伝子操作された宿主細胞；ならびに微生物感染を処置もしくは予防するための方法、または免疫応答を惹起するための方法における産生および使用に関する。ハイブリッドポリペプチドは、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞または他の細胞において、適切な発現制御配列の制御下で発現され得る。無細胞翻訳系をまた用い、本発明の核酸発現構築物から誘導されたＲＮＡを用いて、このようなタンパク質を産生し得る。原核生物宿主および真核生物宿主での使用についての適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）によって記載され、そしてプラスミド、コスミド、シャトルベクター、ウイルスベクターおよび本明細書中に開示されるような染色体複製起点を含むベクターが挙げられ得る。１つの好ましい実施形態では、核酸発現構築物は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現制御配列を含む。別の好ましい実施形態では、この核酸発現構築物は、誘導性プロモーターを有し、このプロモーターは、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ａｒａプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λファージプロモーター、Ｔ７ファージプロモーター、およびＴ５ファージプロモーターであり得、そしてより好ましくは、配列番号１７に示すとおりのＴ５ファージプロモーター／ｌａｃオペレーター発現制御配列である。この「発現制御配列」とは、宿主細胞における目的のタンパク質の発現を可能にするに充分な任意の配列をいい、発現制御配列としては、１以上のプロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列（例えば、ｌａｃＯ）などが挙げられる。特定の実施形態では、このハイブリッドポリペプチドをコードする核酸は、プラスミド中に存在し、より好ましくはプラスミドｐＴ５（配列番号１７）中に存在し、そして宿主細胞は細菌であり、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。
【００５８】
ハイブリッドポリペプチドをコードする核酸は、例えば、遺伝暗号の縮重に起因して、天然の配列の改変体（対立遺伝子改変体を包含する）であり得ることが理解されるべきである。手短に述べると、このような「改変体」は、天然の多型から生じてもよく、または（例えば、特定の宿主における発現についてコドン最適化を得るための）組換え方法論もしくは化学的合成によって合成されてもよく、そして１以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失などによって野生型ポリペプチドとは異なっていてもよい。保存的アミノ酸置換を含む改変体としては、例えば、１つの脂肪族アミノ酸による、別の脂肪族アミノ酸（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａ）の置換、または１つの極性残基による、別の極性残基の置換（例えば、ＬｙｓとＡｒｇとの間、ＧｌｕとＡｓｐとの間、またはＧｌｎとＡｓｎとの間）が挙げられる。このような置換は、同様の物理的特性および機能的活性（例えば、類似の抗体を惹起する能力または類似の抗体と交叉反応する能力）を有する改変体を提供することが当該分野で周知である。他の改変体としては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のアミノ酸同一性を有するハイブリッドポリペプチドをコードする核酸配列が挙げられる。好ましい実施形態は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列との９０％または９５％よりも大きな同一性を有する実施形態である。当業者によって認識されるように、ハイブリッドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその改変体は、コドンの縮重、ヌクレオチド多型、またはヌクレオチドの置換、欠失もしくは挿入に起因して、本明細書中に提示されるネイティブな配列とは異なり得る。従って、特定の局面では、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドおよびペプチドをコードする、全ての縮重核酸分子を包含する。別の局面では、含まれるのは、保存的アミノ酸置換もしくは保存的アミノ酸欠失、またはハイブリッドポリペプチド改変体が、１以上のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ血清型に特異的な抗体を惹起し得る少なくとも１つのエピトープを保持するような置換を有するハイブリッドポリペプチド改変体をコードする核酸分子である。
【００５９】
特定の局面において、核酸配列は、ハイブリッドポリペプチド改変体をコードするように改変され得、ここで、核酸配列の特定のコドンが、特定の宿主によって支持され、そして増強したレベルの発現を生じ得るコドンに変更されている（例えば、Ｈａａｓら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：３１５，１９９６；Ｙａｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：４５９２，１９９６を参照のこと）。例えば、連鎖球菌性Ｍタンパク質から得られる免疫原性ペプチドの特定のコドンは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける改善された発現のために、ペプチドの一次配列を変化させることなく、最適化された。説明として、限定ではなく、配列番号９に記載される６価ハイブリッドポリペプチドにおいて、ＡＧＧ／ＡＧＡの１３個のアルギニン（Ａｒｇ）コドンのうちの１１個が、配列番号１に記載されるＣＧＴ／ＣＧＣのＡｒｇコドンに変更された。同様に、配列番号１５の２０個のＡＧＧ／ＡＧＡのＡｒｇコドンのうちの１２個が、配列番号８に記載されるＣＧＴ／ＣＧＣコドンに最適化され；配列番号１１の１３個のＡＧＧ／ＡＧＡのＡｒｇコドンのうちの７個が、配列番号３に記載されるＣＧＴ／ＣＧＣコドンに最適化され；そして配列番号１３の９個のＡＧＧ／ＡＧＡのＡｒｇコドンのうちの５個が、配列番号５に記載されるＣＧＴ／ＣＧＣコドンに最適化された。当業者に公知なように、コドンは、ハイブリッドポリペプチドが発現される宿主（限定しないが、細菌、真菌、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞を含む）について最適化され得る。さらに、異なるアミノ酸をコードするコドンが同様に変更され得、ここで、異なるアミノ酸をコードする１つ以上のコドンが、特定の宿主に最も良く適するように、同時に変更され得る（例えば、アルギニン、グリシン、ロイシン、およびセリンに対するコドンは、全て、最適化され得るか、またはそれらの任意の組合せであり得る）。あるいは、コドン最適化は、１次アミノ酸配列における１つ以上の変化（例えば、保存的アミノ酸置換、付加、欠失、またはそれらの組合せ）を生じ得る。
【００６０】
ハイブリッドポリペプチドをコードする単離された核酸の特定の実施形態が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に示されるが、本発明の文脈において、１つ以上の単離された核酸に対する参照は、類似の構造を有し、そして配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のハイブリッドポリペプチドに含まれる少なくとも１つの免疫原性ペプチドサブユニットに対する血清特異的抗体を惹起する能力を有するネイティブなまたは非ネイティブなポリペプチドをコードする点で、実質的に類似するこれらの配列の改変体を含む。本明細書中で使用される場合、ヌクレオチド配列は、以下である場合、「実質的に類似する」とみなされる：（ａ）ヌクレオチド配列が、連鎖球菌から単離されたｅｍｍ遺伝子のコード領域（例えば、上記配列の一部、または上記配列の対立遺伝子改変体を含む）に由来し、そして組織交差反応性でない連鎖球菌に対して保護性のオプソニン抗体を惹起する実質的に同じ能力を有するＭタンパク質エピトープを含む場合；（ｂ）ヌクレオチド配列が、中程度または高いストリンジェンシーにおいて、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションし得る場合；（ｃ）ヌクレオチド配列が、遺伝子コードの結果として、（ａ）または（ｂ）に規定されるヌクレオチド配列に変性する場合（すなわち、異なるコドン配列を使用して同じアミノ酸をコードする配列）；あるいは（ｄ）ヌクレオチド配列が、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載される配列のいずれかの相補体である場合。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、２つのヌクレオチド配列は、実質的に相補的な核酸配列の間で安定なハイブリッドが形成される場合、特定のストリンジェンシーの条件下で「ハイブリダイズ」するといわれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ハイブリッドがアニールおよび洗浄される環境（代表的には、イオン強度および温度を含む）の説明をいう。ハイブリダイゼーションに影響し得る他の因子としては、プローブサイズ、およびハイブリッドが形成され得る時間の長さが挙げられる。例えば、「高」ストリンジェンシー、「中程度」ストリンジェンシー、および「低」ストリンジェンシーは、以下の条件またはそれらに対する等価な条件を包含する：高ストリンジェンシーは、０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃であり；中程度ストリンジェンシーは、０．２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃であり；そして低ストリンジェンシーは、１．０×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃である。本明細書中で使用される場合、用語「高ストリンジェンシー条件」とは、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９７％の同一性が配列間に存在する場合のみ、１つ以上の配列が、ハイブリダイズしたままであることを意味する。好ましい実施形態において、ハイブリッドポリペプチドコード核酸分子にハイブリダイズしたままである核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、および１５のうちの１つの核酸によってコードされるハイブリッドポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを保持するポリペプチドをコードする。
【００６２】
本発明のハイブリッドポリペプチドを産生するための方法は、同様に提供され、ここで、本明細書中に記載される核酸分子および宿主細胞のいずれかが使用され得る。好ましい実施形態において、ハイブリッドポリペプチドを産生するための方法は、ハイブリッドポリペプチド（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のうちのいずれか１つに記載されるハイブリッドポリペプチド）をコードする核酸分子に作動可能に連結される少なくとも１つの発現制御配列を含む核酸発現ベクターを含む宿主細胞を、ポリペプチドの発現に十分な条件および時間で、培養する工程を包含する。１つの特定の好ましい実施形態において、ハイブリッドポリペプチドは、この方法によって産生され、そしてより好ましくは、産生されるハイブリッドポリペプチドは、配列番号１０、１２、１４、または１６のポリペプチドであり、そしてより好ましくは、産生されるハイブリッドポリペプチドは、配列番号２、４、６、または８のポリペプチドである。
【００６３】
以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定ではない。
【実施例】
【００６４】
（実施例１）
（個々の組換え多価連鎖球菌タンパク質の作製）
一旦、各ｅｍｍ遺伝子およびｓｐａ遺伝子の特定の５’配列が、ワクチンにおける封入のために選択されると、これらは、４つのハイブリッド核酸分子を設計するために使用され、各々が、独特の制限酵素認識部位によってタンデムに連結される６〜７のｅｍｍコード配列および／またはｓｐａコード配列を含む（図１〜５）。４つのハイブリッド核酸分子は、５’末端に制限酵素部位を含むオリゴヌクレオチド順方向プライマーおよび逆方向プライマーを使用して、対応する血清型の連鎖球菌ゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産生ｅｍｍ核酸分子またはｓｐａ核酸分子を使用して構築された。ＰＣＲ産生フラグメントは、精製され、適切な制限酵素を用いて消化され、先に記載の方法（Ｄａｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２１８８，１９９３：Ｄａｌｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１９３，１９９９）を使用して連結され、次いで、発現ベクターｐＴ５に連続的にクローン化される。プラスミドｐＴ５（配列番号１７）は、ｌａｃオペロンに対して作動可能なバクテリオファージＴ５プロモーターを含み、これは、Ｔ５プロモーターからの発現が、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導され得ることを意味する。
【００６５】
５’ｅｍｍフラグメントは、各々のハイブリッド核酸分子の３’末端において反復し、これは、ハイブリッドポリペプチドのカルボキシ末端において反復するアミノ末端Ｍタンパク質が、隣接するＭタンパク質ポリペプチドの免疫原性を増強または保護するようであるという観察に基づく（Ｄａｌｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１９３，１９９９；ＷＯ９９／１３０８４を参照のこと）。さらに、ハイブリッド分子の３’末端にクローンするｅｍｍ核酸分子は、５’末端において、以下を含むように操作された：（ａ）少なくとも６個のヒスチジンコドン、（ｂ）ＸｈｏＩ制限酵素部位、（ｃ）必要に応じて、１つ以上のアミノ酸コドン（例えば、システイン）、および（ｄ）少なくとも１つの停止コドン（ＴＡＡまたはＴＡＧ）。６価および７価のポリペプチドの各々からのＡｒｇコドンのいくつかは、一次アミノ酸配列を変化させることなく、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について、最適化され（図２〜５を参照のこと）、ポリペプチド産生において、約２倍〜約１０倍の増加を生じる。ウサギおよび／またはヒトを免疫するための混合物を作製するために使用されるハイブリッドポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、配列番号１〜１６に記載される。ｐＴ５の各々の発現プラスミド構築物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５を形質転換した（遺伝子型Ｆ’ｔｒａＤ３６  ｌａｃＩｑΔ（ｌａｃＺ）Ｍ１５ｐｒｏＡ＋Ｂ＋／ｔｈｉ  ｒｐｓＬ（ｓｔｒｒ）ｅｎｄＡ  ｓｂｃＢ１５  ｓｂｃＣ？  ｈｓｄＲ４（ｒｋ−ｍｋ−）Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ））。ＪＭ１０５  Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換される各々のハイブリッドＤＮＡ分子の配列同一性は、両方の鎖を配列決定することによって、確認した。各々の成分融合タンパク質の発現は、１ｍＭ  ＩＰＴＧ誘導の前後に、細胞全体溶解物を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出された。
【００６６】
特定の被験体を免疫するために作製されたハイブリッド多価ポリペプチドに加えて、単一の血清型免疫ペプチドを含む組換えホモダイマーペプチドは、ハイブリッド連鎖球菌ポリペプチドによって惹起される免疫血清を試験するために発現および精製された。各々のｅｍｍ遺伝子フラグメントまたはｓｐａ遺伝子フラグメント（上記ハイブリッド核酸分子に含まれる）は、独立してＰＣＲによって増幅され、精製され、そして各々のコード配列間に制限酵素部位を有するインフレームダイマーとして、発現ｐＴ５に連続的にクローニングされた。各々のＰＣＲ産生された配列は、ダイマーコード核酸分子の両方の鎖を配列決定することによって、確認された。形質転換されたＪＭ１０５  Ｅ．ｃｏｌｉ中の各々のペプチドの発現は、上記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって検出された。
【００６７】
ハイブリッド核酸分子によってコードされる各々のハイブリッドポリペプチドは、さらに、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中のヒトタンパク質と有意に相同性がないことを保証するために、ＢｌａｓｔＰ（マトリクスＢＬＯＳＵＭ６２）によって分析された。ｅｍｍコード核酸分子および／またはｓｐａコード核酸分子との間の連結制限酵素部位は、潜在的なヒト組織交差反応性エピトープをコードする配列を作製することを避けるよう、選択された。詳細には、部位のそれぞれの側鎖上の６個の連続するＭタンパク質またはＳｐａ残基に沿って、各制限酵素部位によってコードされる２つのアミノ酸残基（合計で１４残基）は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中のヒトタンパク質との潜在的な相同性を検出するために、ＢｌａｓｔＰ（マトリクスＰＡＭ３０））を用いて検索された。ヒトタンパク質配列の４つより多く連続するアミノ酸と一致するいずれの制限酵素部位も、使用しなかった。
【００６８】
（実施例２）
（個々の組換え多価連鎖球菌タンパク質の精製）
各々のハイブリッドポリペプチドおよび個々のダイマーペプチドは、別々に精製された。Ｈｉｓタグハイブリッドポリペプチドを発現するＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５の細胞ペーストは、マイクロフルデーション（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄａｔｉｏｎ）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）によって、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で溶解された。遠心分離後、清澄化された溶解物を、ニッケル装填アフィニティーキレート樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）にバッチ吸収し、洗浄し、ＰＢＳ中の段階的勾配のイミダゾールを用いて溶出した。溶出されたハイブリッドポリペプチドを含む画分をプールし、５ｍｌのＨＩＴＲＡＰ（登録商標）Ｑアニオン交換カートリッジ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を通してポンプ上げし、スターセル（ｓｔｉｒ  ｃｅｌｌ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）において濃縮した。濃縮したハイブリッドポリペプチドを、ＰＢＳを用いて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（６００ｃｍ長、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。画分純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してモニターし、そして純粋なハイブリッドポリペプチドを含む画分をプールし、そして使用まで、−２０℃で保存した。ハイブリッドポリペプチドの純度、同一性および濃度を、逆相ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、およびエレクトロスプレー質量分析によってさらに評価した。
【００６９】
個々のダイマーペプチドは、同様に精製されたが、顕著な差があった。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５発現６×Ｈｉｓタグダイマーペプチドを、８Ｍ尿素を含むＰＢＳ中で３時間攪拌しながら溶解させた。遠心分離後、清澄化された溶解物をニッケル装填アフィニティーキレート樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ）にバッチ吸収させ、そして洗浄し、そしてＰＢＳ中の段階的勾配のイミダゾールを用いて溶出した。次いで、溶出されたダイマーペプチドを、調製用逆相Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）上に装填し、洗浄し、そして０．１％トリフルオロ酢酸を含む水中で、増加する濃度のアセトニトリルを用いて溶出した。溶出したダイマーペプチドの画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してモニターした。精製ダイマーペプチドを含む画分をプールし、そして−２０℃で保存する前に、ＰＢＳに対して透析した。
【００７０】
（実施例３）
（ハイブリッドポリペプチドカクテルの処方物およびウサギの免疫）
４つの多価ポリペプチド（Ｈｅｘａ  Ａ．１［配列番号１０］、Ｓｅｐｔａ  Ｂ．２［配列番号１６］、Ｓｅｐｔａ  Ｃ．２［配列番号４］、およびＳｅｐｔａ  Ｄ．１［配列番号１４］）を、等モル量で混合し、そしてミョウバン（ａｌｕｍ）（ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）、低粘度、Ｒｅｈｅｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＮＪ）に吸収させて、８００μｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度および１．５μｇ／ｍｌの最終ミョウバン濃度を達成した。免疫原性ポリペプチドのこのカクテルは、少なくとも２７個の抗原を表す。
【００７１】
Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギを、各々、０週、４週および８週、または０週、４週、および１６週のいずれかで、筋肉内経路で、４００μｇ（すなわち、約１００μｇの各多価ポリペプチド）のワクチンを用いて免疫した（Ｄａｌｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１９３，１９９９を参照のこと）。最初の注射の前、および最後の注射の２週間後に血清を得た。
【００７２】
（実施例４）
（免疫ウサギからの血清を使用するＥＬＩＳＡ）
型特異的抗体を、基本的に、以前に記載された方法（ＭｃＬｅｌｌａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：２９４３，２００１）による、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によって検出した。簡単に述べると、マイクロタイターウェルを、精製組換えダイマーＭペプチドでコートする（すなわち、ワクチンサブユニットをコピーし、そして固相抗原として使用される）。ペプチドを含まないが、他の全ての試薬を含むウェルをネガティブコントロールとして供給した。ＥＬＩＳＡを、免疫前ウサギ血清および免疫ウサギ血清を使用して、実行した。血清を０．０５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で連続的に希釈し、ウェルに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。ウェルを０．１５％生理食塩水−ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を用いて洗浄した。１：２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）対ウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ）（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）を添加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。次いで、ウェルを洗浄し、５−アミノサリチル酸を添加し、そして１５分後、ＭＲ６００マイクロプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）においてＡ４５０を記録した。
【００７３】
ウサギから得られた免疫血清（最後の免疫の２週間後に得られた）は、ワクチンに含まれるＭペプチドの大部分に対して高い力価の抗体を含んだ（図７）。抗体力価を、２６ＭペプチドおよびＳｐａ、Ａ群連鎖球菌の新規な保護抗原（Ｄａｌｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１３０：１２６１，１９９９）の各々について決定した。全ての免疫前力価は、２００未満であった。決定した８１の免疫血清力価（２７抗原×３ウサギ）のうち、６９（８５％）の力価が、免疫前レベルよりも４倍以上増加した（図７）。
【００７４】
（実施例５）
免疫ウサギ由来の血清を使用するオプソン化アッセイ）
オプソン抗体を、基本的に、先に記載される（Ｂｅａｃｈｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４５：１４６９，１９７７）ように、インビトロオプソン化アッセイによって決定した。試験混合物は、中間−対数期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）まで増殖された連鎖球菌の０．０５ｍｌの標準懸濁液、０．０５ｍｌの試験血清、および０．２ｍｌのヘパリン処理（１０Ｕ／ｍｌ）非免疫ヒト全血からなった。これらのアッセイについて、白血球当たりの連鎖球菌ＣＦＵの数は、約１０であった。チューブを４５分間、３７℃、端から端（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）に回転させた。次いで、ガラススライドにスメアをつけ、そしてＷｒｉｇｈｔ株（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて染色した。５０の連続した好中球を計数し、そして関連する連鎖球菌の割合（％オプソン化）を計算することによって定量化した。
【００７５】
３匹すべてのウサギ由来の免疫前血清が、試験された２６の血清型の各々について１０％以下のオプソン化を生じ（データは示さず）、これは、これらのアッセイについて使用されるドナー血液が、試験生物に対する抗体を含まないこと、および各々の生物が、非免疫血液においてオプソン化に対して完全に耐性であることを示す。ポジティブな閾値として、免疫血清の存在下で、３０％のオプソン化を使用する（すなわち、免疫前レベルの３倍以上）と、２６の血清型のうち１８の血清型（６９％）が、３つの免疫ウサギ血清のうちの少なくとも１つによってオプソン化された（図８）。
【００７６】
（実施例６）
（免疫化ウサギ由来の血清を使用した殺菌性アッセイ）
少量の細菌を含有する０．０５ｍｌのＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスを、０．１ｍｌの試験血清および０．３５ｍｌの血液に加え、そしてこの混合物を３７℃にて３時間回転させたこと以外は、殺菌性アッセイを、実施例５と同様に行った（Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１０６：５２５，１９５７）。次いで、この混合物の０．１ｍｌのアリコートを、溶解したヒツジの血液寒天に加え、鋳型プレートを調製し、そして生存可能な生物（ＣＦＵ）を、３７℃での一晩のインキュベーション後に計数した。試験した各血清型について、３つの異なる接種材料を使用して、予備免疫血清を含む血液中での増殖が最適でありかつ定量可能であることを確実にした。この結果を、死滅％として表した。この死滅％は、以下の式を使用して算出された：［（３時間の予備免疫血清での増殖後のＣＦＵ）−（３時間の免疫血清での増殖後のＣＦＵ）］／［３時間の予備免疫血清での増殖後のＣＦＵ］×１００。予備免疫血清の存在下で少なくとも８世代までの試験系統の増殖を生じるアッセイのみを使用して、免疫血清の存在下での殺傷％を表わした。
【００７７】
全ての研究において、予備免疫血清を含有する試験混合物は、８世代以上までの生物の増殖を生じた（データは示さず）。このことは、ヒト血液がこの試験系統に対するオプソニン抗体を含まず、そして各生物が、非免疫性血液における殺菌性殺傷に対して完全に耐性であることをさらに示した。予備免疫血清と比較した、免疫血清における３時間の回転後の増殖（殺傷％）の５０％の減少を使用して、試験した２６個の血清型のうちの２２個の血清型に対する殺菌性活性を観察した（図９）。オプソニン作用アッセイの結果と殺菌性アッセイの結果とを組み合わせた場合、試験した２６個の血清型のうち２４個の血清型（９２％）は、一方または両方のアッセイにおける免疫血清によって、オプソニン化された。
【００７８】
（実施例７）
（免疫化ウサギにおいて組織交差反応性抗体を指向するためのアッセイ）
４つの異なるハイブリッドポリペプチドのカクテルを含有する組成物（すなわち、２７価のワクチン）に対して惹起されるウサギ免疫血清を、ヒト心筋、腎臓、脳幹神経節、大脳皮質、および軟骨の凍結切片（４μｍ）を使用する間接的な免疫蛍光アッセイ（ＤａｌｅおよびＢｅａｃｈｅｙ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：１１３，１９８５）によって、組織交差反応性抗体の存在について試験した。これらの切片を、ゼラチンでコーティングされたスライド上に配置し、そして１％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。このスライドを、ＰＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳ中１：５に希釈した免疫血清とともに、室温にて３０分間インキュベートし、そしてＰＢＳで全体にわたって洗浄した。次いで、これらの切片を、ＰＢＳ中１：４０に希釈したフルオレセイン結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）とともに、室温にて３０分間インキュベートした。洗浄後、これらのスライドを、Ｇｅｌｖａｔｏｌに取り付け、そして蛍光顕微鏡で試験した。ヒト心筋、腎臓および脳と交差反応することが知られているウサギ抗血清を、ポジティブコントロールとして使用し、そしてウサギ予備免疫血清を、ネガティブコントロールとして使用した。
【００７９】
ハイブリッドポリペプチドは、試験した大部分のＧｒＡＳ血清型に対してオプソニン抗体を誘発したが、いずれのハイブリッドポリペプチドも、ヒト交差反応性抗体を誘発しなかった。このことは、このハイブリッドポリペプチドが、単独であっても組み合わされても、潜在的に有毒な抗免疫エピトープを含まないことを示している。
【００８０】
（実施例８）
（他の血清型に対する免疫化ウサギ由来の血清の殺菌性活性）
４型連鎖球菌属は、無併発性咽頭炎および侵襲性感染の比較的一般的な原因である。４型生物は、現在、米国で進行中のサーベイランスプログラム（パーソナル・コミュニケーション、Ｓ．Ｔ．Ｓｈｕｌｍａｎ）において、全侵襲性感染単離体の３．８％および全咽頭炎単離体の８．６％を占めている。理論に束縛されることを望まないが、精製された組換え４型Ｍタンパク質は、オプソニン抗体を誘発しないか、４型連鎖球菌系統は、オプソニン作用に対して耐性であるかのいずれかである。この理由のために、ｅｍｍ４遺伝子フラグメントは、以下の４つのハイブリッドポリペプチドを含有する組成物（すなわち、２７価のワクチン）中に含まれなかった：Ｈｅｘａ  Ａ．１（配列番号１０）、Ｓｅｐｔａ  Ｂ．２（配列番号１６）、Ｓｅｐｔａ  Ｃ．２（配列番号４）、およびＳｅｐｔａ  Ｄ．１（配列番号１４）。この２７価のワクチンによって誘発されるどの抗体が、４型連鎖球菌の表面上の交差反応性オプソニンエピトープに対して指向され得るかを決定するために、米国のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｐｈａｒｙｎｇｉｔｉｓ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍから得られる７つの臨床単離体を使用して、殺菌性アッセイを行った（図１０）。
【００８１】
興味深いことに、殺菌性活性は、４型連鎖球菌の７つの系統のうちの５つの系統に対して検出された。フロリダ州において患者から単離された系統（ＦＬ９）およびイリノイ州において患者から単離された系統（ＩＬ２３およびＩＬ１２）を、試験した２７価の抗血清の両方によってオプソニン化した。これら２つの抗血清のうちの一方は、カリフォルニア州由来の単離体（ＣＡ８およびＣＡ１２）の両方をオプソニン化したが、コネチカット州由来の系統（ＣＴ５）およびサウスダコタ州由来の単離体（ＳＤ３２）は、いずれの抗血清によってもオプソニン化されなかった（図１０）。これらの結果は、２７価のカクテルワクチンが、４型連鎖球菌の数種の系統の表面上の保護エピトープと交差反応する抗体を誘発し得ることを示唆する。さらに、これらのデータは、４型連鎖球菌の全てが型特異的Ｍ４タンパク質を発現したとしても、これらは、異なる保護エピトープを発現する生物の異種群であり得ることを示している。
【００８２】
（実施例９）
（ハイブリッドポリペプチドカクテルの処方およびヒトの免疫）
処方されるバルクワクチンは、４つの組換えタンパク質（Ｈｅｘａ  Ａ．３（配列番号２）、Ｓｅｐｔａ  Ｂ．３ａ（配列番号８）、Ｓｅｐｔａ  Ｃ．２（配列番号４）、およびＳｅｐｔａ  Ｄ．３（配列番号６））からなる。これらの組換えタンパク質を、水酸化アルミニウム（約１．５μｇ／ｍｌの最終ミョウバン濃度）上に吸着させ、そしてリン酸緩衝化生理食塩水を用いて、約４００μｇ／ｍｌまたは約８００μｇ／ｍｌ（各ハイブリッドポリペプチドの、それぞれ１００μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌ）の標的濃度まで希釈する。免疫原性ポリペプチドのこのカクテルは、少なくとも２７個の抗原を表す。
【００８３】
簡潔には、ＰＢＳ中で精製されたハイブリッドポリペプチドの算出容量を計算し、そしてそれを、滅菌ポリスチレン培地ボトルに加える。この混合物を、均一になるまで攪拌し、次いで等容量の注射用滅菌水で希釈する。この希釈工程は、混合物中のＮａ２ＨＰＯ４およびＮａＣｌの濃度を、所望の最終濃度（５ｍＭホスフェート、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）まで低下させる。次いで、プールされたＨＹＢＲＩＤポリペプチドを、ペリスタポンプを使用して、滅菌フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＡＫ（登録商標）２０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に通す。数種のペプチドが、均質化または希釈するためにいくらか特定の条件を必要とする場合、これらの溶液を別個に作製し、そして続いて、必要な場合、ｐＨを調整しながら混合する。
【００８４】
組換えハイブリッドポリペプチドの必要容量を計算し、そして処方ボトルに加える。ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）（低粘度、Ｒｅｈｅｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＮＪ）を、注射用水中で水酸化アルミニウムの滅菌懸濁液として受容し、そしてこれを、さらに精製することなく使用する。ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）の必要容量を計算し、そしてこれを、攪拌しながら処方ボトルに加える。この混合物のｐＨを測定し、そして１Ｍ  ＮａＯＨを使用して、ｐＨ７．５〜７．７に調整する。最終的には、正確な最終容量に達するように処方緩衝液を加え、そしてこの混合物を、室温にてさらに１６〜２０時間攪拌する。バルクワクチンを容器（滅菌）に分配し、サンプルを試験用に採取し、そして処方されたワクチンを、２〜８℃にて保存する。
【００８５】
ヒト志願者を選別し、１８〜５０歳の３０人の健康な被験体を登録した。筋肉内経路を介して、０日目、３０日目および１２０日目に、４００μｇのカクテルワクチン組成物で各被験体を免疫した。血清を、最初の注射の前、ならびに１４日目、３０日目、４４日目、６０日目、１２０日目、１３４日目および１５０日目に獲得した。
【００８６】
（実施例１０）
（免疫化ヒト被験体由来の血清を使用したＥＬＩＳＡ）
実施例４に記載される方法（ＭｃＬｅｌｌａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：２９４３，２００１もまた参照のこと）と同様に、型特異的抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。簡潔には、マイクロタイターウェルを、精製された組換え二量体Ｍペプチドでコーティングした（すなわち、ワクチンサブユニットを複写して、固相抗原として使用した）。ヒト血清を含まないが全ての他の試薬を含むウェルは、ネガティブコントロールとして作用した。収集されたヒト血清を使用して、ＥＬＩＳＡを行った。この血清を、０．１％  ＢＳＡおよび０．０５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を用いて、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に連続的に希釈し、ウェルに加え、そして３７℃にて２時間インキュベートした。このウェルを、ＰＳＡ−０．０５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で洗浄した。１：２，０００に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）：ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を加え、そして３７℃にて１時間インキュベートした。次いで、このウェルを洗浄し、１−ＳｔｅｐＴＭ  Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を加え、１Ｎ硫酸を３０分後に加えた。Ａ４５０／５９５を、ＶＭａｘ（登録商標）マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）に記録した。
【００８７】
ヒト被験体由来の全ての免疫血清（１３４日目（これは、１２０日目での３回目の注射から２週間後である）に得られる）は、全てのＭ抗原およびＳｐａ抗原に対する抗体力価の統計学的に有意な上昇（ｐ値＜０．００１）を示した（図１１）。全ての被験体は、図１１に示されるように（０日目、白棒）、数種の抗原に対してベースラインレベルの予備免疫（０日目）を有した。２７価のカクテルにおける全ての抗原に対する血清抗体の相乗平均倍増は、１２．６倍であり、最小倍増は、３倍であり、そして最大倍増は、６８倍であった。全体的に、２７個の抗原のうち２６個の抗原が、抗体力価の少なくとも４倍の平均増加を誘発して、ワクチン中に表れた。
【００８８】
（実施例１１）
（免疫化ヒト被験体由来の血清を使用した殺菌性アッセイ）
殺菌性アッセイを、実施例６（Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１０６：５２５，１９５７もまた参照のこと）に記載されるように、本質的に行った。０日目の血清の存在下で試験系統の増殖を生じるアッセイのみを使用して、１３４日目の血清の存在下での殺傷％を表した。
【００８９】
ベースラインレベルの予備免疫を超える抗体力価の上昇を示す全ての被験体はまた、ベースラインレベルの殺菌性活性を超える増加を示した（図１２）。相乗平均抗体力価増加を、実施例１０におけるように決定し、そして同じ免疫血清の機能的活性（殺菌性殺傷）との比較のために、対数正規型（Ｌｎ）に変換した。従って、抗体力価の増加と抗体が細菌殺傷を誘導する能力との間に、定量的な相関が存在する。
【００９０】
（実施例１２）
（免疫化ヒト被験体由来の血清において組織交差反応性抗体を指向するためのアッセイ）
ヒト被験体（これらのヒト被験体を、４つの異なるハイブリッドポリペプチド（Ｈｅｘａ  Ａ．３（配列番号２）、Ｓｅｐｔａ  Ｂ．３ａ（配列番号８）、Ｓｅｐｔａ  Ｃ．２（配列番号４）、およびＳｅｐｔａ  Ｄ．３（配列番号６））のカクテルを含有する２７価のワクチン組成物で免疫した）から収集された血清を、実施例７に本質的に記載されるように、組織交差反応性抗体の存在についてアッセイした。
【００９１】
ウサギにおいて観察された結果と同様に、いずれのハイブリッドポリペプチドも、ヒト交差反応性抗体を誘発しなかった。このことは、このハイブリッドポリペプチドが、単独であっても組み合わされても、潜在的に有毒な抗免疫エピトープを含まないことを示している。
【００９２】
（実施例１３）
（免疫化ヒト被験体に対して使用した、６価のワクチン  対  ２７価のカクテルワクチンの比較）
単一の６価のポリペプチドＨｅｘａ  １．２（これは、Ｍ２４−Ｍ５−Ｍ６−Ｍ１９−Ｍ１−Ｍ３−Ｍ２４の構造を有する（Ｄａｌｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１９３、１９９９；ＷＯ  ９９／１３０８４を参照のこと））を使用して、同様のヒト試験を行った。ヒト志願者を選定し、１１人の健康な被験体を、４つの異なるハイブリッドポリペプチド（Ｈｅｘａ  Ａ．３（配列番号２）、Ｓｅｐｔａ  Ｂ．３ａ（配列番号８）、Ｓｅｐｔａ  Ｃ．２（配列番号４）、およびＳｅｐｔａ  Ｄ．３（配列番号６））のカクテルを含有する２７価のワクチン組成物に使用するのと同じ処方緩衝液中１００μｇのＨｅｘａ  １．２を用いて３回、各人免疫した。Ｈｅｘａ  １．２（Ｍ２４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ１９、Ｍ１、およびＭ３）の６つ全てのＡ群連鎖球菌抗原は、２７価のワクチンを含む４つの多価ポリペプチドのうちの２つの多価ポリペプチド中に表れた。次いで、実施例１０に本質的に記載されるように、免疫化被験体由来の血清に対してＥＬＩＳＡを行って、Ｈｅｘａ  １．２抗原の各々に対する型特異的抗体を同定した。Ｈｅｘａ  １．２多価ポリペプチドを受容した１１人の被験体からの抗体力価、および２７価のカクテルにおける４つの異なる多価ポリペプチド臨床試験の３０人の被験体からの抗体力価をそれぞれ使用して、相乗平均力価を算出した（図１３）。抗体力価の倍増は、免疫化前の相乗平均力価と比較した場合の、免疫化後の相乗平均力価の倍増を表わす。
【００９３】
驚くべきことに、２７価の組成物で免疫された被験体は、６価の組成物を受容した被験体における抗体力価の倍増よりも、より高い抗体力価の倍増を示した（図１３）。２７価は、全てのＭ抗原に対してより高い倍増を示し、この倍増は、約１．１〜約４倍増の範囲であった。上述のように、抗体力価の増加はまた、殺菌性活性の増加と相関する。４つの多価ペプチドは、単一の６価ペプチドと比較した場合に、共に予想外に、免疫応答を誘発する際に相乗的な効果を示した。
【００９４】
前述から、本発明の特定の実施形態が、例示目的で本明細書中で記載されてきたが、種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によって以外には、制限されない。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、ワクチン接種剤として使用される４つのハイブリッドポリペプチドの概略図を示す。各血清型についてのＰＣＲにより５’ｅｍｍ遺伝子フラグメント（すなわち、免疫原性ペプチド）を増幅するのに使用されたオリゴヌクレオチドプライマーを、示された特有の制限酵素部位を含むように合成した。このオリゴヌクレオチドプライマーは、直列で（囲みの間の線によって示される）免疫原性ペプチドに連結するアミノ酸をコードする。各囲みは、アミノ末端Ｍタンパク質免疫原性ペプチドを表し、ここで、囲み内の数字は、血清型を指定し、各囲みの下の数字は、各免疫原性ペプチドを構成するアミノ酸の数を示す。血清型Ｍ１０１は、以前はｓｔＮＳ５を指定され、血清型Ｍ１１４は、以前はｓｔ２９６７を指定され、そして血清型Ｍ９４は、Ｍ１３ＷおよびＭ１３を以前は指定された。「６ｘＨｉｓ」は、任意である６ヒスチジンの存在をいう。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、ハイブリッドポリペプチド６価Ａ．３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位および各Ｍ血清型免疫原性ペプチドの開始点が、示される。１１個のＡｒｇコドンを、ＡＧＧ／ＡＧＡコドンをＣＧＴ／ＣＧＣコドンへと変異させる（変異塩基に下線を引く）ことによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化した。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、ハイブリッドポリペプチド６価Ａ．３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位および各Ｍ血清型免疫原性ペプチドの開始点が、示される。１１個のＡｒｇコドンを、ＡＧＧ／ＡＧＡコドンをＣＧＴ／ＣＧＣコドンへと変異させる（変異塩基に下線を引く）ことによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化した。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、ハイブリッドポリペプチド６価Ａ．３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位および各Ｍ血清型免疫原性ペプチドの開始点が、示される。１１個のＡｒｇコドンを、ＡＧＧ／ＡＧＡコドンをＣＧＴ／ＣＧＣコドンへと変異させる（変異塩基に下線を引く）ことによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化した。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、ハイブリッドポリペプチド６価Ｂ．３ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位および各Ｍ血清型免疫原性ペプチドの開始点が、示される。９個のＡｒｇコドンを、ＡＧＧ／ＡＧＡコドンをＣＧＴ／ＣＧＣコドンへと変異させる（変異塩基に下線を引く）ことによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化した。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、ハイブリッドポリペプチド６価Ｂ．３ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位および各Ｍ血清型免疫原性ペプチドの開始点が、示される。９個のＡｒｇコドンを、ＡＧＧ／ＡＧＡコドンをＣＧＴ／ＣＧＣコドンへと変異させる（変異塩基に下線を引く）ことによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化した。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、ハイブリッドポリペプチド６価Ｂ．３ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位および各Ｍ血清型免疫原性ペプチドの開始点が、示される。９個のＡｒｇコドンを、ＡＧＧ／ＡＧＡコドンをＣＧＴ／ＣＧＣコドンへと変異させる（変異塩基に下線を引く）ことによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化した。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、ハイブリッドポリペプチド６価Ｂ．３ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位および各Ｍ血清型免疫原性ペプチドの開始点が、示される。９個のＡｒｇコドンを、ＡＧＧ／ＡＧＡコドンをＣＧＴ／ＣＧＣコドンへと変異させる（変異塩基に下線を引く）ことによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化した。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、ハイブリッドポリペプチド６価Ｃ．２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位および各Ｍ血清型免疫原性ペプチドの開始点が、示される。７個のＡｒｇコドンを、ＡＧＧ／ＡＧＡコドンをＣＧＴコドンへと変異させる（変異塩基に下線を引く）ことによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化した。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃは、ハイブリッドポリペプチド６価Ｃ．２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位および各Ｍ血清型免疫原性ペプチドの開始点が、示される。７個のＡｒｇコドンを、ＡＧＧ／ＡＧＡコドンをＣＧＴコドンへと変異させる（変異塩基に下線を引く）ことによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化した。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、ハイブリッドポリペプチド６価Ｃ．２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位および各Ｍ血清型免疫原性ペプチドの開始点が、示される。７個のＡｒｇコドンを、ＡＧＧ／ＡＧＡコドンをＣＧＴコドンへと変異させる（変異塩基に下線を引く）ことによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化した。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、ハイブリッドポリペプチド６価Ｄ．３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位および各Ｍ血清型免疫原性ペプチドの開始点が、示される。５個のＡｒｇコドンを、ＡＧＧ／ＡＧＡコドンをＣＧＴ／ＣＧＣコドンへと変異させる（変異塩基に下線を引く）ことによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化した。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃは、ハイブリッドポリペプチド６価Ｄ．３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位および各Ｍ血清型免疫原性ペプチドの開始点が、示される。５個のＡｒｇコドンを、ＡＧＧ／ＡＧＡコドンをＣＧＴ／ＣＧＣコドンへと変異させる（変異塩基に下線を引く）ことによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化した。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃは、ハイブリッドポリペプチド６価Ｄ．３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位および各Ｍ血清型免疫原性ペプチドの開始点が、示される。５個のＡｒｇコドンを、ＡＧＧ／ＡＧＡコドンをＣＧＴ／ＣＧＣコドンへと変異させる（変異塩基に下線を引く）ことによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化した。
【図６】図６は、２０００年８月１２日と２００１年７月１６日との間に、米国において単離された、２８個の最も一般的な侵襲性のＡ群連鎖球菌Ｍ血清型の概要を示す。このデータは、Ａｃｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｒｅ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎにより実施された、進行中の研究の一部であった。これらの２８個の血清型は、この期間に提出された３，４２４個の侵襲性分離株の９２．１％を占めた。
【図７】図７は、ＥＬＩＳＡにより試験される場合に、型特異的Ｍタンパク質およびＳｐａ抗体が、４つの異なるハイブリッドポリペプチドのカクテルを含むワクチン接種剤（すなわち、２７価ワクチン）により惹起されたことを示す。各バーは、１羽のウサギからの血清を示す。
【図８】図８は、免疫血清を用いるインビトロでのオプソニン化アッセイの結果を示す。これらの免疫血清を、４つの異なるハイブリッドポリペプチドのカクテルを含む組成物（すなわち、２７価ワクチン）を用いてウサギにおいて惹起した。陽性応答は、免疫前でのオプソニン作用に対して少なくとも３倍の増加（すなわち、３０％より高いオプソニン作用）で考慮した。免疫前血清は、各連鎖球菌血清型について１０％未満のオプソニン作用を生じた。各バーは、１羽のウサギからの血清を示す。
【図９】図９は、免疫血清を用いる殺菌活性アッセイの結果を示す。これらの免疫血清を、４つの異なるハイブリッドポリペプチドのカクテルを含むワクチン接種剤（すなわち、２７価ワクチン）を用いてウサギにおいて惹起した。陽性応答を、少なくとも５０％死滅で考慮した。各バーは、１羽のウサギからの血清を示す。
【図１０】図１０は、殺菌活性を有する免疫応答が、２７価ワクチン接種剤において提示されない血清型であるＡ群連鎖球菌血清型４に対して惹起されることを示す。各バーは、１羽のウサギからの血清を示す。免疫血清は、０週、４週、および８週で免疫されたウサギ由来であり（斜線バー）、０週、４週、および１６週で免疫されたウサギ由来であった（白抜きバー）。血清型４連鎖球菌分離株は、フロリダ（ＦＬ）；イリノイ（ＩＬ）；カリフォルニア（ＣＡ）；コネチカット（ＣＴ）；およびサウスダコタ（ＳＤ）を含む５つの異なる地理的位置由来であった。
【図１１】図１１は、ＥＬＩＳＡによって決定される、ヒト被験体の免疫前（０日目）および免疫後（１３４日目）での相乗平均抗体力価を示す。このグラフは、ｌｏｇ１０スケールである。血清型Ｍ１０１は、以前はｓｔＮＳ５を指定されており、血清型ｓｔ２９６７は、現在Ｍ１１４を指定され、そして血清型Ｍ１３は、現在Ｍ９４を指定されている。
【図１２】図１２は、２６個の血清型での多形核細胞によるＡ群連鎖球菌死滅における％増加と比較した、ＥＬＩＳＡで決定された抗体力価（バー）における自然ｌｏｇ倍の増加を示す。血清型Ｍ１０１は、以前はｓｔＮＳ５を指定されており、血清型Ｍ１１４は、以前はｓｔ２９６７を指定され、血清型Ｍ１３は、現在Ｍ９４を指定されている。
【図１３】図１３は、４つのハイブリッド多価ポリペプチド（ヘキサＡ．３、セプタＢ．３ａ、セプタＣ．２、およびセプタＤ．３；図１を参照のこと）の２７価カクテルにより免疫されたヒト被験体における相乗平均抗体力価と比較した、６価ポリペプチド（ヘキサ１．２）により免疫されたヒト被験体での相乗平均抗体力価における倍増加を示す。相乗平均抗体力価を、両方のワクチンに存在する６つの血清型に対して、ＥＬＩＳＡに基づいて計算した。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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