(57)【要約】  本発明は、“エーテル・ア・ゴーゴー（ether-a-go-go）”（ＥＲＧ）カリウム（Ｋ＋）チャネル、特にヒトのＥＲＧ（ｈＥＲＧ）カリウムチャネルでの化合物のアフィニティーを、内向きに整流するカリウムチャネル（ＩＫＲ）の標識した遮断薬を用いて定めるアッセイに関する。本アッセイはヒトにおける心臓の再分極への有害な影響、特に心電図のＱＴ間隔を延長する恐れのある化合物を同定するために有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
ａ）ＥＲＧ発現細胞、またはＥＲＧ発現細胞由来の膜、またはＥＲＧ発現組織由来の膜を、標識ＩＫＲ遮断薬と共に、検査化合物または検査化合物の混合物の存在下または不在下で、アッセイバッファー中でインキュベーションすること；
ｂ）特異的に結合した標識ＩＫＲ遮断薬の決定；
ｃ）検査化合物または検査化合物の混合物による標識ＩＫＲ遮断薬の結合の阻害の算出、
を含む、またはからなるアッセイ。
【請求項２】
アッセイバッファーがＫＣｌを含有するＴｒｉｓを基本とするバッファーである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
アッセイバッファーが３０から１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、５から２０ｍＭ  ＫＣｌ、および所望により０．６から２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、またはからなる請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
アッセイバッファーが３０から７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、６から１５ｍＭ  ＫＣｌ、および所望により０．６から１．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、またはからなる請求項２に記載のアッセイ。
【請求項５】
アッセイバッファーが４０から６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、７．５から１２．５ｍＭ  ＫＣｌ、および所望により０．８から１．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、またはからなる請求項２に記載のアッセイ。
【請求項６】
アッセイバッファーが４５から５５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、８．５から１１．５ｍＭ  ＫＣｌ、および所望により０．９から１．３ｍＭ  ＭｇＣｌ２または１．０から１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、またはからなる請求項２に記載のアッセイ。
【請求項７】
アッセイバッファーが５０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１０ｍＭ  ＫＣｌを含む、またはからなる請求項２に記載のアッセイ。
【請求項８】
アッセイバッファーが５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、および１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、または５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、および１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、またはからなる請求項２に記載のアッセイ。
【請求項９】
アッセイバッファーが室温でｐＨ７．２およびｐＨ７．６の間である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１０】
アッセイバッファーが室温でｐＨ７．４である請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１１】
ＥＲＧがヒトＥＲＧである、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１２】
標識ＩＫＲ遮断薬が標識ドフェチリドまたは標識ＭＫ−４９９である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１３】
標識ドフェチリドまたは標識ＭＫ−４９９が放射能標識である、請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１４】
放射能標識がトリチウム（３Ｈ）である、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１５】
以下のさらなる（複数の）ステップ：
（ｄ）検査化合物または検査化合物の混合物のＩＣ２０の算出、および所望により
（ｅ）検査化合物または検査化合物の混合物のＩＣ２０値を、化合物の所望の治療効果に必要な濃度とin vivoで比較すること、
を有する、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１６】
アッセイをフィルター結合アッセイとして行う、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１７】
アッセイをシンチレーション近似アッセイとして行う請求項１から１５のいずれか１項に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は“エーテル・ア・ゴーゴー（ether-a-go-go）”（ＥＲＧ）カリウム（Ｋ＋）チャネル、特にヒトＥＲＧ（ｈＥＲＧ）カリウムチャネルでの化合物のアフィニティーを、急速活性型遅延整流カリウムチャネル（rapid delayed rectifying potassium channel）（ＩＫＲ）の、標識した遮断薬、例えば[３Ｈ]−ドフェチリドまたは[３Ｈ]−ＭＫ−４９９を用いて定めるアッセイに関する。本アッセイはヒトにおける心臓の再分極への有害な影響、特に心電図のＱＴ間隔を延長する恐れのある、ひいてはトルサード・ド・ポワントを引き起こし得る化合物を同定するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
近年、治療への使用を目的として提案された一部の化合物の開発が、ヒトにおける心臓の再分極への有害な影響が検出されたために治験後期の薬剤開発の段階で断念されている。これらの薬剤の影響は心電図（ＥＣＧ）のＱＴ間隔について評価されている。ＱＴ間隔は、心室の脱分極開始から心室の再分極終了までの時間を表す、ＥＣＧの一部分である。ＱＴ間隔は、心拍数が減少すると長くなり、心拍数が増加すると短縮されるという影響を受け得るため、ＱＴはしばしば心拍数で “補正”して、ＱＴｃ間隔とする。稀な場合には、薬剤分子の投与がヒトのＥＣＧのＱＴ間隔の延長に至ることもある。これらの患者のＥＣＧは、ＱＴ延長症候群として知られている遺伝性疾患の人のものとよく似ている。これらの場合には、薬剤誘発性心室細動が結果的に突然死を引き起こす可能性がある（Morganroth J et al. (1993） Am J Cardiol. 72, 26B-31B; De Ponti F. et al., (2000) Eur J. Clin. Pharmacol. 56. 1-18)。Ｅ−４０３１，シサプリド、およびテルフェナジンを含む多数の薬剤分子が、ヒトの心電図のＱＴ間隔を延長することはよく知られている（Fuliki A, et al. (1994), Cardiovascular Pharmacol. 23: 374-378; Van Haarst AD et al., (1998) Clin Pharmacol. Ther. 64: 542-546,; Honig P.K. et al. (1993) J.A.M.A. 269; 1513-1518）。
【０００３】
心毒性の副作用の可能性が検出されないまま新薬を打ち出すことは、危険な結果をはらむ可能性があり、患者の致死的な心律動異常の引き金となる可能性がある。薬理学的対象の化合物により誘発されるＱＴ延長の検出が遅れることは、薬剤の発見およびプログラムの開発を妨げ、その結果プログラムの結果に深刻な衝撃をもたらし得る。従って、化合物の潜在的な心毒性の副作用についての検査を薬剤開発の早い段階で行うことが望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明により、以下のステップを含む、または以下のステップからなるアッセイを提供する：
ａ）ＥＲＧ発現細胞、またはＥＲＧ発現細胞由来の膜、またはＥＲＧ発現組織由来の膜を、標識ＩＫＲ遮断薬と共に、様々な量の検査化合物または検査化合物の混合物の存在下または不在下で、アッセイバッファー中でインキュベーションすること；
ｂ）特異的に結合した標識ＩＫＲ遮断薬の決定；
ｃ）検査化合物または検査化合物の混合物による標識ＩＫＲ遮断薬の結合の阻害の算出。
【０００５】
本アッセイは、ヒトにおいてＱＴ間隔を延長する恐れのある化合物を同定するための、前臨床段階での予測指標として有用である。本アッセイは、ＥＲＧ  Ｋ＋チャネル（エーテル・ア・ゴーゴーＫ＋チャネル、当明細書ではＥＲＧと呼ぶ）から標識ＩＫＲ遮断薬をはずして置き換わる、検査化合物または化合物の混合物の能力を測定する、競合的結合アッセイである。本アッセイはハイスループット検査システムで行うことができる。構造活性相関（ＳＡＲ）を組み合わせて、標識ＩＫＲ遮断薬を用いてのリガンド結合アッセイを、ＥＲＧ、特にヒトＥＲＧ（ｈＥＲＧ）へのアフィニティーの低下を伴わない、または伴う新薬のデザインの一助とするために使用することができる。
【０００６】
使用するアッセイのバッファーは、ＩＫＲ遮断薬または検査化合物（複数）のＥＲＧへの結合を至適化するため、特に重要である。至適なアッセイは、カリウム（Ｋ＋）イオンを含むＴｒｉｓを基本とするバッファー（室温で、ｐＨ７．２から７．６、好ましくはｐＨ７．４）を用いて達成できることを発見した。アッセイバッファー中のカリウムイオンは、例えば塩化カリウム（ＫＣｌ）として提供することができる。アッセイバッファー中のカリウムイオンの濃度が、アッセイの予測値を決定する。７．５から１２．５ｍＭ  ＫＣｌ、好ましくは８．５から１１．５ｍＭ  ＫＣｌ、最も好ましくは１０ｍＭ  ＫＣｌを含むアッセイバッファー中で行うアッセイが、ＱＴ延長の開始を予測するＩＣ２０値を提供するために特に有用である。
【０００７】
本発明のアッセイバッファーは好ましくはＴｒｉｓ．ＣｌおよびＫＣｌを含む、またはからなる。所望によりＭｇＣｌ２をアッセイバッファーに含んでもよい。
アッセイバッファーのＴｒｉｓ．Ｃｌの濃度は、好ましくは３０ｍＭから１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、より好ましくは３０ｍＭから７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、なおより好ましくは４０ｍＭから６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、さらに好ましくは４５ｍＭから５５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、最も好ましくは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌである。
【０００８】
アッセイバッファーのＫＣｌの濃度は、好ましくは５から２０ｍＭ  ＫＣｌ、より好ましくは６から１５ｍＭ  ＫＣｌ、なおより好ましくは７．５から１２．５ｍＭ  ＫＣｌ、さらに好ましくは８．５から１１．５ｍＭ  ＫＣｌ、最も好ましくは１０ｍＭ  ＫＣｌである。
【０００９】
特に好ましい態様においてアッセイバッファーは、３０から１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌおよび５から２０ｍＭ  ＫＣｌ、好ましくは３０から７０ｍＭまたは３０から１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌおよび６から１５ｍＭ  ＫＣｌ、なおより好ましくは４０から６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌおよび７．５から１２．５ｍＭ  ＫＣｌ、さらに好ましくは４５から５５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌおよび８．５から１１．５ｍＭ  ＫＣｌを含む、またはからなる。
【００１０】
アッセイバッファーは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌおよび１０ｍＭ  ＫＣｌを含む、またはからなることが特に好ましい。
アッセイバッファー中にＭｇＣｌ２を含む場合、ＭｇＣｌ２の濃度は好ましくは０．６ｍＭから２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、より好ましくは０．６ｍＭから１．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、なおより好ましくは０．８ｍＭから１．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、さらに好ましくは０．９ｍＭから１．３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、なおさらに好ましくは１．０ｍＭから１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、最も好ましくは１．０ｍＭまたは１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２である。
【００１１】
好ましい態様において使用するアッセイバッファーは、３０から１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、５から２０ｍＭ  ＫＣｌ、および０．６から２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、好ましくは３０から１００ｍＭもしくは３０から７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、６から１５ｍＭ  ＫＣｌ、および０．６から１．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、なおより好ましくは４０から６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、７．５から１２．５ｍＭ  ＫＣｌ、および０．８ｍＭから１．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、さらに好ましくは４５から５５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、８．５から１１．５ｍＭ  ＫＣｌおよび０．９から１．３ｍＭ  ＭｇＣｌ２もしくは１．０から１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、またはからなる。
【００１２】
アッセイバッファーは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌおよび１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；または５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌおよび１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、またはからなってもよい。
【００１３】
アッセイバッファーは、室温でｐＨ７．２および７．６の間であることが好ましい；アッセイバッファーは室温でｐＨ７．４であることが特に好ましい。
ＥＲＧ遺伝子（ｃＤＮＡ）は脊椎動物源または無脊椎動物源由来とすることができる；脊椎動物に関してはＥＲＧ遺伝子は哺乳類の源（例えばヒト、類人猿、ウシ、ブタ、イヌ、ウサギ、モルモット、ラット、またはマウス）または無脊椎動物源、例えば昆虫源（例えばショウジョウバエ）由来とすることができる。哺乳類のＥＲＧについての原核生物の相同体を使用してもよい。ＥＲＧ遺伝子は哺乳類のＥＲＧ、特にヒトＥＲＧ（ｈＥＲＧ）またはイヌＥＲＧ（ｃＥＲＧ）であることが好ましい。
【００１４】
ＥＲＧ遺伝子を哺乳類の細胞株、例えばＨＥＫ−２９３（ヒト胚性腎）細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞；ＣＨＬ（チャイニーズハムスターの肺）細胞、ＣＳＯ（サル）細胞；または昆虫の細胞株、例えばＳＦ９で発現させることができる。バキュロウイルスベクター系を、適合する昆虫細胞株内でのＥＲＧの発現に使用することができる。あるいはＥＲＧを酵母細胞または細菌細胞内で発現させることもできる。ＥＲＧ遺伝子をｈＥＲＧまたはｃＥＲＧとし、ＨＥＫ−２９３細胞、ＣＨＯ細胞またはＣＨＬ細胞のいずれかで発現させることが好ましい。
【００１５】
アッセイは、ＥＲＧ発現細胞全体、またはＥＲＧ発現細胞由来の膜調製物(preparation)、またはＥＲＧ発現組織由来の膜調製物を用いて行うことができる。
ドフェチリドはＩＫＲ遮断薬（遅延整流カリウムチャネルの電流の速い成分の選択的阻害剤）で、濃度に依存して活動電位の持続時間、および事実上の不応期を延長する。臨床試験は、ドフェチリドが心室性不整脈と同様に心房性不整脈の患者の治療に有効であることを示した。ドフェチリドは以下の式Ｉを有する。
【００１６】
【化１】
2005510691.tif 000003
【００１７】
ドフェチリドは欧州特許ＥＰ０２４５９９７においてクレームされ、その製造が記載されている。
ＭＫ−４９９（Merck）はＩＫＲ遮断薬として作用するメチルスルホンアミドの抗不整脈薬である。ＭＫ−４９９は以下に示す式ＩＩを有する。
【００１８】
【化２】
2005510691.tif 000004
【００１９】
本アッセイで使用するＩＫＲ遮断薬は、検出可能な標識、例えば放射能標識タグまたは蛍光標識タグで標識する。本発明の好ましい態様において、本アッセイで使用する標識ＩＫＲ遮断薬は、標識ドフェチリド、好ましくは放射能標識ドフェチリド、最も好ましくはトリチウム化ドフェチリド（[３Ｈ]−ドフェチリド）である。本発明のもうひとつの態様において、本アッセイで使用する標識ＩＫＲ遮断薬は、標識ＭＫ−４９９、好ましくは放射能標識ＭＫ−４９９、最も好ましくはトリチウム化ＭＫ−４９９（[３Ｈ]−ＭＫ−４９９）である。
【００２０】
好ましいアッセイの構成としてフィルター結合技術を含み、この方法により標識ＩＫＲ遮断薬、例えば標識ドフェチリドまたは標識ＭＫ−４９９；好ましくは放射能標識ドフェチリドまたは放射能標識ＭＫ−４９９；最も好ましくは[３Ｈ]−ドフェチリドまたは[３Ｈ]−ＭＫ−４９９の結合したものと結合していないものとをろ過により分離する。このアッセイは、放射能標識ＩＫＲ遮断薬、例えば放射能標識ドフェチリドまたは放射能標識ＭＫ−４９９、好ましくは[３Ｈ]−ドフェチリドまたは[３Ｈ]−ＭＫ−４９９を用いて、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）技術を利用して行うことができる。
【００２１】
フィルター結合技術の場合は、ＥＲＧ発現細胞、またはＥＲＧ発現細胞由来の膜、またはＥＲＧ発現組織由来の膜を、アッセイバッファー中で、標識ＩＫＲ遮断薬、例えば[３Ｈ]−ドフェチリドまたは[３Ｈ]−ＭＫ−４９９と共に、検査化合物または検査化合物の混合物の存在下（検査）または不在下（コントロール）でインキュベーションする。インキュベーションは好ましくは室温で６０分から１２０分間、好ましくは９０分間行う。非特異的な結合は標識しないＩＫＲ遮断薬、例えば１０μＭ  ドフェチリドまたは１０μＭ  ＭＫ−４９９の存在下で決定する。フィルターマットを通してまたはマルチウェルフィルタープレート上で濾過することにより、結合した標識ＩＫＲ遮断薬を、結合していないＩＫＲ遮断薬から分離する。フィルターマットまたはフィルタープレートを洗浄して結合していない標識ＩＫＲ遮断薬を取り除き、結合した標識ＩＫＲ遮断薬を、例えばトリチウム化ＩＫＲ遮断薬、例えば[３Ｈ]−ドフェチリドまたは[３Ｈ]−ＭＫ−４９９に対して、放射能用の適当なカウンターを用いたシンチレーション分光法により定量する。
【００２２】
シンチレーション近接アッセイ（登録商標）（ＳＰＡ）システム（Amersham Biosciences）の場合は、ＥＲＧ発現細胞、またはＥＲＧ発現細胞由来の膜、またはＥＲＧ発現組織由来の膜と結合させるために、ビーズを用いる。様々なタイプのビーズが本発明によるＳＰＡアッセイの使用に適しており、これらにはＰＶＴ小麦胚芽凝集素、酸化イットリウムポリリジンビーズ、またはケイ酸イットリウムビーズ（ＹＳｉ）（Amersham Biosciences）例えばＹＳｉポリリジンまたはＹＳｉ小麦胚芽凝集素を含む。本発明のＳＰＡアッセイに使用するための最適なビーズのタイプは、使用する細胞または細胞膜に依存する；細胞とビーズまたは膜とビーズとの結合を評価して、使用する細胞または細胞膜用の最適なビーズのタイプを同定してもよい。ＥＲＧ素材（全細胞、細胞膜調製物、または組織膜調製物）と結合したビーズを、標識ＩＫＲ遮断薬、例えば[３Ｈ]−ドフェチリドまたは[３Ｈ]−ＭＫ−４９９と共に、検査化合物または検査化合物の混合物の存在下（検査）または不在下（コントロール）でアッセイバッファー中でインキュベーションする。検査化合物または検査化合物の混合物が、結合した放射能標識ＩＫＲ遮断薬と置き換わる能力を、例えばＳＰＡ技術と共に使用できる標準的なカウンターを用いて、発光を検出することにより決定する。
【００２３】
アッセイはまた下記の1つまたはそれ以上のステップも含んでもよい：ドフェチリドの結合を２０％阻害する検査化合物（複数）の濃度（ＩＣ２０）の算出、ドフェチリドの結合を５０％阻害する検査化合物（複数）の濃度（ＩＣ５０）の算出、Ｋｉとしての化合物のアフィニティーの算出またはｐＫｉとしての化合物のアフィニティーの算出。
【００２４】
ＩＫＲ遮断薬の結合、例えば[３Ｈ]−ドフェチリドの結合と競合的に置き換わることから得られるＩＣ２０値は、ヒトにおいてＱＴ延長に関与する遊離の薬剤の濃度に匹敵する。したがって本アッセイを用いて、有害な心臓の副作用の影響の原因になる恐れのある化合物の濃度を予測することができる。
【００２５】
化合物または化合物の混合物が、ヒトの心電図のＱＴ間隔を延長する可能性があるかどうかを評価するため、以下のステップを行う：
ａ）本発明に従ってアッセイを行う。
ｂ）ＩＣ２０値を得る；この値は、ヒトにおいてＱＴ延長が起こると思われる、遊離の薬剤の実際の濃度または推定濃度を示す。
ｃ）ＩＣ２０値を、化合物または化合物の混合物の所望の治療効果に必要な遊離の薬剤の濃度と、in vivoで比較する。
【００２６】
化合物または化合物の混合物の所望の治療効果に必要な遊離の薬剤の濃度が、アッセイにおける化合物または化合物の混合物のＩＣ２０値の１０倍から３０倍の範囲内である場合、同化合物または化合物の混合物は、ヒトにおいてＱＴ間隔の延長を示す可能性がある。
【００２７】
本発明のアッセイは、現行のアッセイ、例えばＨＥＲＧパッチクランプ法に比して、薬剤分子によるＱＴ延長の影響をin vivo でより的確に予測する方法である。
【実施例】
【００２８】
実施例
実施例１：ヒトＥＲＧまたはイヌＥＲＧを発現するＨＥＫ−２９３細胞からの膜の調製
ヒトＥＲＧを発現する付着細胞株ＨＥＫ−２９３(Zhou, Z et al (1998) Biophys. J. 74, 230-241)は、Dr. Craig January, University of Wisconsin, USAから提供を受けた；この細胞株は“January”細胞株と命名された。細胞株１５と命名されたこれに代わる付着細胞株ＨＥＫ−２９３（２９３Ｓ−ＨＥＲＧクローン１５）は、Zhou, Z et al (1998)に記載された方法により作成した。ヒトＥＲＧの完全長のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１(Invitrogen)のＣＭＶプロモーターの下流に挿入した、このベクターはまたネオマイシン耐性遺伝子の発現を管理するＳＶ４０プロモーターも有する。コンストラクトをヒト胚性腎細胞２９３Ｓ（ＨＥＫ−２９３）にトランスフェクションした。安定な形質転換体をＧ４１８(Gibco)を用いて選択した。細胞株１５は細胞株JanuaryよりｈＥＲＧの発現がわずかに低いが、その成長特性を改善した。
【００２９】
細胞株１５（２９３Ｓ−ＨＥＲＧ（クローン１５））は2002年6月26日に、Budapest Treaty 1977 の条項にしたがって、寄託アクセッション番号０２０６２６７８にて、ＥＣＡＣＣ（CAMR Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, UK）に寄託した。
【００３０】
ヒトＥＲＧを発現する付着細胞ＨＥＫ−２９３は、１０％ウシ胎児血清(PAA Laboratories)、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン(Sigma)、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム(Sigma)、０．４ｍｇ/ｍｌ  Ｇ４１８（Life technologies）を補ったMEM Earles 培地（Life technologies）に、、１×非必須アミノ酸（Life technologies）を加えて培養した。細胞は３７℃で、５％ＣＯ２の高湿の環境下で、Ｔ２２５ｃｍ３フラスコ中で培養した。細胞は８０％の集密に達した後、細胞解離溶液（Sigma, cat no:C5914 in 2001）により１：３から１：５に分け、その後８５０ｃｍ２のＣＯ２ガスを満たしたローラーボトル（Corning, cat no: 430849 in 2001）内にＧ４１８の非存在下で植えつけた。
【００３１】
膜を調製するため、ローラーボトルから細胞をはがして集め、そしてＰＢＳ（Life Technologies, cat no: 14190-094 in 2001）に再懸濁した。すべての細胞をペレット状にし、ＰＢＳで２回洗浄し、ドライアイス上で小分けして凍結した後、必要になるまで−８０℃で保存した。
【００３２】
イヌＥＲＧを発現するＨＥＫ−２９３細胞株は、ＨＥＫ細胞の一過性トランスフェクションにより作成した。ｃＥＲＧ  ｃＤＮＡを完全にコードする配列（Zehlein et al (2001) Pflugers Archiv. European Journal of Physioligy. 442(2): 188-191）はProfessor Zehelein University of Heidelberg, GermanyよりpBluescript（登録商標）ベクター(Stratagene)中にて提供を受けた。 pBluescriptコンストラクトにおいて、ｃＥＲＧ  ｃＤＮＡは複数のＢａｍＨＩサイトに隣接して組み込まれていた。最初の実験は、所望のベクター、ｐｃＤＮＡ３．１内へのｃＥＲＧ  ＢａｍＨＩフラグメントの直接挿入に関しては、挿入効率が低いことを示した。この点を克服するため、クローニングベクターｐＳＰ７３（Promega）を用いての、間接的なクローニング法を考案した。ｃＥＲＧ/pBluescriptコンストラクトおよびｐＳＰ７３ベクターをＢａｍＨＩで消化し、連結反応におけるpBluescript  ＢａｍＨＩフラグメントの存在による干渉を低減させるために、ｃＥＲＧ/pBluescriptのＢａｍＨＩで消化した材料をまたＳｃａＩで消化してpBluescriptを切断し、アガロースゲルでｃＥＲＧ  ＢａｍＨＩフラグメントがより有効に分離していることを確認した。制限分解の混合物をアガロースゲル電気泳動にかけ、ｃＥＲＧ  ＢａｍＨＩおよびｐＳＰ７３  ＢａｍＨＩフラグメントを含むバンドを、臭化エチジウム染色およびＵＶ照射により視覚化した。ｃＥＲＧバンドおよびｐＳＰ７３バンドを切り出し、QIAgen MinElute Gel抽出キットを用いて、製品の指示書にしたがってゲルから溶出させた。連結反応中のｐＳＰ７３  ＤＮＡの複数のＢａｍＨＩ末端の再度の連結反応を防ぐため、プラスミドＤＮＡフラグメントを標準的なプロトコルによりＣＩＰ処理した。ｃＥＲＧ  ＢａｍＨＩフラグメントを、標準的な連結プロトコルによりｐＳＰ７３  ＢａｍＨＩフラグメントに連結させた。反応後、連結混合物を標準的な形質転換プロトコルにより、ｃＪＭ１０９コンピテント大腸菌細胞内に形質転換した。形質転換体をアンピシリン（５０μｇ/ｍｌ）を含むＬＢアガー（Millers）上にプレーティングすることにより選択し、３７℃でオーバーナイト、インキュベーションした。形質転換した細胞のオーバーナイト培養したものを使用して、QIAgen Miniprep キットを用いて製品の指示書にしたがって、ｃＥＲＧ/ｐＳＰ７３ＤＮＡの少量調製(mini preparation)を行った。得られたＤＮＡを、制限酵素で切断しアガロースゲル電気泳動を行い、ポジティブのクローンであることを同定した。
【００３３】
ｃＥＲＧ  ｃＤＮＡをＸｈｏｌ（５’）ＥｃｏＲＩ（３’）フラグメントとしてｃＥＲＧ/ｐＳＰ７３から切り出し、このフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１の逆向きのポリリンカーの形をとるＸｈｏｌ/ＥｃｏＲＩフラグメント、すなわちｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｘｈｏｌ/ＥｃｏＲＩに連結した。この場合逆向きのポリリンカーの形を使用したのは、選択したｃＥＲＧ/ｐＳＰ７３クローンがｃＥＲＧの逆向きの配向を含有したからである。ｐｃＤＮＡ３．１（−）内への連結後、ｃＥＲＧの５’末端はヒトサイトメガウイルス（ＣＭＶ）由来のエンハンサー−プロモーター配列に隣接して位置した。連結混合物を標準的な形質転換プロトコルを用いて、ｃＪＭ１０９コンピテント大腸菌細胞内に形質転換し、形質転換体をアンピシリン（５０μｇ/ｍｌ）を含むＬＢアガー（Millers）上にプレーティングして選択し、必要なコントロールと共に３７℃でオーバーナイトインキュベーションした。ｃＥＲＧ/ｐｃＤＮＡ３．１（−）プレートからランダムに取り出したコロニーを、アンピシリン（５０μｇ/ｍｌ）を含むＬＢ培地  ５ｍｌに播種し、３７℃、２００ｒｐｍでオーバーナイトインキュベーションした。次にこれらのオーバーナイト培養液を用いて、QIAgen Miniprep キットを使用してＤＮＡの少量調製を行った。得られたＤＮＡをＸｈｏｌおよびＥｃｏＲＩで２重に消化し、１％アガロースゲル上で分析を行った。少数のクローンのみからのＤＮＡを少量調製法により分析したという事実と、連結反応の挿入効率の低さとがあいまって、ポジティブなｃＥＲＧ/ｐｃＤＮＡ３．１（−）クローンは同定されなかった。したがってコロニーＰＣＲ法を用いて、ポジティブなクローンについてより多数のコロニーのスクリーニングを行った。
【００３４】
コロニーＰＣＲのプロトコルにより、ｃＥＲＧ/ｐｃＤＮＡ３．１（−）クローンの迅速な検出を行うことができた。ＰＣＲプロトコルで使用するため、３種のプライマーをデザインし、作成した。
【００３５】
プライマー１：コーディング配列の６０１−６２０のヌクレオチドの位置で、ｃＥＲＧとハイブリッド形成する‘ＣＥＲＧ０１’（配列番号１）：
５’−ＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＧＧＣＡＣＡＧ−３’
プライマー２：ヌクレオチドの位置８８６−９１０（Ｎｈｅ１クローニングサイトに隣接するマルチクローニングサイトに含まれる）で、ｐｃＤＮＡ３．１（−）とハイブリッド形成する‘ＮＨＥ  ＰＣＤＮ３’（配列番号２）：
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧ−３’
プライマー３：コントロールとして使用する、およびｃＥＲＧ/ｐＳＰ７３を産生することがわかっているコロニーに対して使用する‘Ｔ７ＳＰ７３’ （配列番号３）。このプライマーは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列に含まれる、ヌクレオチドの位置９８−１２１でｐＳＰ７３とハイブリッド形成した：
５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’
９５個のｃＪＭ１０９コロニーをＬＢアガー形質転換プレートから選び、アンピシリン（５０μｇ/ｍｌ）を補ったLB broth、１ｍｌ/ウェルを含む滅菌９６ウェルディープウェルプレートに移した。コントロールとして、ｃＥＲＧ/ｐＳＰ７３プラスミドを含むことがわかっているコロニーをLB-amp brothを含む最後の９６番目のウェルに移した。プレートをカバーして、３７℃、オーバーナイト２００ｒｐｍでインキュベーションした。各少量培養(mini-culture)の７０μｌのアリコートを９６ウェルＰＣＲプレートに移し（０．５ｍｌ/ウェル）、Beckman Allegra 6R 遠心分離機に設置し、２８００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心した。上清を捨て、３分間プレートの水分を切った。ＰＣＲ反応混合液を調製し、細菌ペレットを含むＰＣＲプレートに以下のように加えた：
【００３６】
【表１−１】
2005510691.tif 000005
【００３７】
細菌ペレットをＰＣＲ反応液に再懸濁した。ＰＣＲ反応はTaqman Gold PCR キット(Applied Biosystems, 1999 版)の製品プロトコルに指定されているように、以下のように行った：
【００３８】
【表１−２】
2005510691.tif 000006
【００３９】
各ウェルのＰＣＲ産物を次に、１００ｂｐＤＮＡラダーマーカーを用いて１．５％アガロースゲルの電気泳動により１×ＴＡＥバッファーで、１００Ｖ、２５分間にて分離し、ＵＶ光で視覚化した。ポジティブと推定されるクローンを同定し、これらのＰＣＲ反応混合物からのサンプルを第二の分離用１．５％アガロースゲルに１００Ｖで１時間流し、ＰＣＲ産物のサイズを調べた。
【００４０】
増幅したＰＣＲ産物を与えた少量培養を、元の各９６ウェルディープウェルプレートから、５０μｇ/ｍｌのアンピシリンを含むLB broth  ５ｍｌを入れた滅菌チューブに植えつけ、３７℃でオーバーナイト２００ｒｐｍでインキュベーションした。次にオーバーナイト培養液を用いて、QIAgen Miniprep キットを使用してＤＮＡの少量調製を行った。得られたＤＮＡをＸｈｏｌおよびＥｃｏＲＩで２重に消化し、ｃＥＲＧ/ｐｃＤＮＡ３．１（−）の存在について調べた。制限酵素消化物を、１％アガロースゲルで１ｋｂＤＮＡラダーマーカーと共に１００Ｖで１時間流して（２０μｌのサンプルを２μｌのゲルローディング溶液と共にロードした）分析した。さらに制限酵素消化分析を行い、形質転換細胞から精製されたプラスミドが、本当にｃＥＲＧ/ｐｃＤＮＡ３．１（−）であることを確認した。
【００４１】
トランスフェクションを行わなかったＨＥＫ−２９３細胞は、１０％（ｖ/ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１ｍＭ非必須アミノ酸を補った５０ｍｌのMinimum Essential Medium (MEM)中で、定期的に維持した。細胞は２２５ｃｍ２の換気可能なキャップ付のフラスコに植え付け、５％ＣＯ２を含む高湿の環境下で維持した。本研究に使用したＨＥＫ−２９３細胞は継代数を３９−４８の間とした。細胞は典型的には３日おきに１：３の比率で８０−９０％飽和密度（confluency）のフラスコから継代を行った；１０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、細胞解離液でフラスコからはがした後、新しい培地を加えた。
【００４２】
ｃＥＲＧ/ｐｃＤＮＡ３．１（−）コンストラクトを、２２５ｃｍ２の換気可能なフラスコ中で８０−９５％飽和密度に成長させたＨＥＫ−２９３に、以下の方法によりトランスフェクションを行った。内毒素を含まないｃＥＲＧ/ｐｃＤＮＡ３．１（−）ＤＮＡ（９４μｇ）およびLipofectamine2000 (Gibco BRL)（９４μｇ）を、１０ｍｌの滅菌遠心試験管に入れたＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ培地(Gibco BRL)２．２５ｍｌに加えた；室温で５分間インキュベーションした後、混合した。その後Lipofectamine2000/ＤＮＡ/ＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉの混合液を室温で２０分間インキュベーションし、さらに１０．５ｍｌのＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉを加えた。ＨＥＫ−２３９細胞を１０ｍｌのＰＢＳで洗浄して、Lipofectamine2000/ＤＮＡ/ＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ混合液を加え、５％ＣＯ２を含む高湿の環境下で３７℃で３．５時間インキュベーションした。インキュベーション後、５０ｍｌ  ＭＥＭ（１０％（ｖ/ｖ）ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、および１ｍＭ  非必須アミノ酸を補ったもの）を加えた。ＨＥＫ−２９３細胞を３７℃で２４時間インキュベーションした。トランスフェクションした細胞を２４時間後にＰＢＳで洗浄し、１０ｍｌ  ＰＢＳ中で細胞をかき取り、１０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心して集めた。得られたｃＥＲＧ/ｐｃＤＮＡ３．１（−）をトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞のペレットを必要になるまで−８０℃で保存した。
【００４３】
ヒトＥＲＧおよびイヌのＥＲＧを発現するＨＥＫ−２９３細胞からの膜の調製
細胞膜分画を細胞の凍結アリコートから調製した。すべての作業は他に記述がなければ４℃で行った。細胞の凍結アリコートを室温で解凍し、アッセイバッファー（例えば５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１から１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４または５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。次に細胞をOmni LabTekホモジェナイザーで２０，０００ｒｐｍ、３０秒間ホモジェネートして破砕した。ホモジェネートを４８．０００×ｇで２０分間（４℃、Sorvall RC5B 遠心分離機）遠心し、上清を除いた。得られたペレットをアッセイバッファーに再懸濁し、上記のように１０秒間ホモジェネートした。遠心してペレットを集め、この最終的なペレットをアッセイバッファーに再懸濁した。タンパク質含有量を、クーマシーブルーに基づくタンパク質アッセイキットを用いて決定した。アリコートを必要になるまで−８０℃で保存した；これらの条件下で保存した場合、細胞膜分画の結合活性は少なくとも４ヶ月間は安定であることが証明された。
【００４４】
実施例２：[３Ｈ]−ドフェチリドによるフィルター結合アッセイ
[３Ｈ]−ドフェチリド（８０−８３Ｃｉ/ｍｍｏｌ）は触媒によるトリチウム化（例えばAmersham Life Scienceの提供によるカスタムサービス）により合成した。しかし、当業者公知の他の検出可能な標識、例えば蛍光標識タグ、その他の放射能標識タグ、抗体等を、３Ｈの代わりに使用することもできる。
【００４５】
アッセイ当日、検査化合物を５０％ＤＭＳＯまたは１００％ＤＭＳＯ中に１ｍＭ濃度で溶解し、その後アッセイバッファー中で所望の濃度（例えば１００μＭまで、または化合物の溶解度の限度まで）に希釈した。アッセイのインキュベーションのＤＭＳＯの最終濃度は、至適アッセイ条件については好ましくは１．０から１．５％またはそれ未満である。
【００４６】
インキュベーションは他に記載がなければ、アッセイバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．０ｍＭから１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）中に５０μｇ/ｍｌの膜のホモジェネート、 [３Ｈ]−ドフェチリド（４から７ｎＭ）、および検査化合物または検査化合物の混合物またはコントロール担体を含むものとした。濾過によるアッセイは室温で９０分間インキュベーションを行った。非特異的な結合は１０μＭドフェチリドの存在下で決定し、通常全結合の１５％未満であった。結合したリガンドは、例えばBrandel細胞ハーベスター(cell harvester)を用いたＧＦ/Ｂガラス繊維フィルターマットを通して、またはPackard Filtermate９６ハーベスターを用いたＧＦ/Ｂユニフィルター（Unifilter）９６ウェルフィルタープレート(Packard)上で迅速に濾過することにより、遊離のリガンドから分離した。フィルターマットおよびフィルタープレートは５％  ＰＥＩ（ｗ/ｖ）に６０分間予め浸しておき、細胞を集めた後、氷冷のアッセイバッファー１ｍｌで３回洗浄した。ユニフィルタープレートは、最低でも３７℃で１．５時間空気乾燥し、Microscint-0 (Packard)を加えた。結合した[３Ｈ]−ドフェチリドは適当なカウンター、例えばユニフィルタープレートの場合はPackard TopCount Scintillation Counter (NXT Counter)またはWallac Counter (Trilux)、フィルターマットを使用した場合はWallac Big Spot Counterを用いて液体シンチレーション分光法により決定した。
【００４７】
各実験において一律に３回ずつアッセイを行い、データを平均した。特異的な結合はGraphPad Prism ソフトウェア(GraphPad, San Diego)を用いて非線形回帰モデルにフィットさせて分析した。ＩＣ５０値はＰＲＩＳＭを用いて４パラメータロジスティックモデルにフィットさせて算出し、ChengとPrusoffの式を用いてＫｉ値に変換した；ＩＣ２０値はグラフより外挿した。
【００４８】
実施例３：シンチレーション近接アッセイ
シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．０ｍＭから１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４からなるアッセイバッファー中で、または５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４からなるアッセイバッファーを使用して行った。ビーズの膜への結合を評価して、使用する細胞株に最適なビーズのタイプを決定した。January ＨＥＫ−２９３  ｈＥＲＧ発現細胞株由来の細胞膜にはＹＳｉ小麦胚芽凝集素ビーズを使用した；Cell Line 15（ＨＥＫ−２９３  ｈＥＲＧ発現細胞株）由来の膜を使用する研究ではＹＳｉポリリジンビーズを使用した。ビーズおよび細胞膜ホモジェネート濃度に関して条件を至適化し、ＥＲＧの薬理学的特性を決定した。インキュベーション（９６ウェルプレートでは１ウェル当たり総容量２００μｌ、３８４ウェルプレートでは１ウェル当たり総容量６０μｌ）は、ビーズ１ｍｇ当たり細胞膜ホモジェネート２５μｇを含むものとした。膜ホモジェネートは、ＹＳｉ小麦胚芽凝集素ビーズまたはＹＳｉポリリジンビーズの懸濁液と、４℃でローラー式震盪機(roller shaker)上で約２時間、予めカップルさせておいた。競合的結合アッセイのため、膜ホモジェネートビーズ懸濁液は、底が白色透明の９６ウェルまたは３８４ウェルプレート中で、競合物質、すなわち検査化合物または検査化合物の混合物の不在下および存在下で、５ｎＭ  [３Ｈ]−ドフェチリドと共にインキュベーションした。プレートは室温でインキュベーションし、約１時間震盪した。ビーズを最低３０分間は静置した後、残った放射能についてTopCount NXT シンチレーションカウンターでプレートのカウントをした。非特異的結合、すなわちバックグラウンドのカウントは、１０μＭドフェチリドを加えることにより決定した。バックグラウンドのカウントは、通常全結合の１５％未満であった。飽和を検討するため、[３Ｈ]−ドフェチリドの特異的結合を、コールドの（すなわち標識していない）１０μＭドフェチリドの不在下または存在下で、一定範囲の濃度（５から５００ｎＭ）にわたり決定した。
【００４９】
実施例４：アッセイの至適化
ａ）ドフェチリドの結合におけるＨｅｐｅｓまたはＴｒｉｓを基本とするバッファーの効果
ＥＲＧを含む細胞膜のホモジェネートへのドフェチリドの特異的結合を至適化するため、[３Ｈ]−ドフェチリドの細胞膜調製物との相互作用を、Ｈｅｐｅｓを基本とするバッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）およびＴｒｉｓを基本とするバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭまたは１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）の存在下で調べた。これらのバッファー中での特異的結合の比較により、特異的結合の比率はＴｒｉｓ基本およびＨｅｐｅｓ基本のバッファー双方において類似することが明らかになった。しかし表１に示したように、特異的結合のカウントはＨｅｐｅｓ基本のバッファーで検出されたものに比して、Ｔｒｉｓ基本のバッファーの存在下では２倍の高値であった。
【００５０】
【表１−３】
2005510691.tif 000007
【００５１】
全結合および非特異的結合のデータは、タンパク質濃度  ７５μｇ/ｍｌおよび平均[３Ｈ]−ドフェチリド濃度  ６．７ｎＭで行った、２つのアッセイにわたり分割した各バッファー当たり１４の個々のウェルの算出平均±標準誤差を表す。インキュベーションは室温で６０分行った。ｃｃｐｍ＝１分当たりの補正カウント数。
【００５２】
最大の特異的結合ウインドウが達成できるように、実施例１から８で使用したアッセイバッファーはＴｒｉｓを基本とするインキュベーションバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）とした。さらにフィルター結合アッセイおよびＳＰＡ結合アッセイのための、細胞膜タンパク質濃度およびビーズ濃度を至適化するため、実験を行った。
【００５３】
ｂ）飽和結合
結合活性のための至適インキュベーション時間を決定するため、経時変化を検討した。インキュベーション時間はフィルター結合アッセイおよびＳＰＡアッセイの双方で類似していた。フィルター結合アッセイでは９０分で平衡に達し、ＳＰＡでは６０分を要した。フィルター結合アッセイおよびシンチレーション近似アッセイの双方において、ＥＲＧへの[３Ｈ]−ドフェチリドの結合は飽和性であり、フィルター結合アッセイではＫＤ  ５．０８±１．０ｎＭ、ならびに、９６および３８４フォーマットシンチレーション近似アッセイではＫＤ値はそれぞれ、８．９±０．６ｎＭおよび９．１±１．８ｎＭであった（図１ａ−ｃ、図１ａはフィルター結合アッセイの結果を示す、図１ｂは９６ウェルフォーマットのＳＰＡの結果を、そして図１ｃは３８４ウェルフォーマットのＳＰＡの結果を示す）。このデータの非線形カーブフィッティングは、結合が１つのサイトであることを示した。フィルター結合から、[３Ｈ]−ドフェチリドに関してＢｍａｘ  ７．４±０．７ｐｍｏｌ/ｍｇタンパク質が得られた（図１）。シンチレーション近似アッセイではｄｐｍ（１分当たりの崩壊）値を正確に決定できないので、ＳＰＡについてのＢｍａｘは見積もっていない。
【００５４】
ｃ）ＳＰＡおよびフィルター結合技術の比較
ＳＰＡおよびフィルター結合技術の比較は、結果が非常によく一致することを明らかにした。アフィニティー値は２つのアッセイのタイプ間で非常に良い相関を示し、化合物のアフィニティーの強さのオーダーも、図２（フィルター結合アッセイおよびＳＰＡ結合アッセイから得られたｐＫｉ値を比較する相関プロット）に示したように一致する。
【００５５】
ｄ）競合的結合の研究
ヒトにおいてＱＴ間隔を延長することが知られているｈＥＲＧ遮断薬を含む一連の化合物が、[３Ｈ]−ドフェチリドと競合的に置き換わることについて調べた。Ｅ４０３１，ドフェチリド、テルフェナジン、およびシサプリドは、表２にまとめたアフィニティーの算出値の範囲で特異的結合を完全に阻害することを示した。
【００５６】
【表２】
2005510691.tif 000008
【００５７】
データはｐＫｉ値（５ｎＭ  [３Ｈ]−ドフェチリドの結合の５０％置き換わる競合的リガンドのモル濃度の対数の負の値）として表した。データは少なくともｎ＝３の実験の平均値である。
【００５８】
実施例５：ヒトにおける化合物のＱＴ間隔延長効果の予測
図３に、Ｅ−４０３１（図３ａ）、ドフェチリド（図３ｂ）、テルフェナジン（図３ｃ）、およびシサプリド（図３ｄ）を含む一連の化合物ついて示したように、本発明のアッセイを用いて、[３Ｈ]−ドフェチリドの結合と競合的に置き換わることから得られたＩＣ２０値は、ヒトにおいてＱＴ延長に関与する遊離の薬剤の濃度に匹敵する。各化合物について、結合アッセイ（フィルター結合技術）におけるドフェチリドの結合の阻害と、ｈＥＲＧパッチクランプアッセイにおける同結合の阻害とを、ヒトにおいてのＱＴ間隔延長に関与する遊離の薬剤の濃度（Fuliki A, et al. (1994) Cardiovascular Pharmacol, 23: 374-378; Van Haarst AD et al. (1998) Clin Pharmacol. Ther. 64: 542-546; Honig PK, et al. (1993) J.A.M.A. 269: 1513-1518）と比較した。
【００５９】
ＥＲＧパッチクランプアッセイはＥＲＧチャネルを通る電流を測定し、１つの細胞に存在するイオンチャネルの数を示す。しかしＱＴ間隔を延長する恐れのある多数の公知のｈＥＲＧ遮断薬によりin vivoで示された、パッチクランプの研究で観察された状態依存性の遮断の現象（Walker, B. D. et al(1999) British J. Pharmacol 128, 444-450）のため、リガンド結合アッセイの方がｈＥＲＧパッチクランプ技術より、薬剤のin vivo ＱＴ延長効果のより良い予測方法を提供する（図３ｄ）。
【００６０】
化合物または化合物の混合物が、ヒトの心電図のＱＴ間隔を延長する可能性があるかどうかを評価するために、以下のステップを行う：
ａ）本発明に従って、例えば実施例２または実施例３で記載したように結合アッセイを行い、ＥＲＧに対する、好ましくはｈＥＲＧまたはｃＥＲＧに対する化合物または化合物の混合物のアフィニティーを検査する；
ｂ）例えば実施例２の最後に記載したように、ＩＣ２０を得る；ＩＣ２０は、ヒトにおけるＱＴ延長を起こす、遊離の薬剤の実際の濃度または推定濃度である；
ｃ）ＩＣ２０値を、in vivoでの化合物の所望の治療効果に必要な遊離の薬剤の濃度と比較する。
【００６１】
化合物の所望の治療効果に必要な遊離の薬剤の濃度が、本発明のアッセイの化合物のＩＣ２０の１０倍から３０倍の範囲内である場合は、同化合物はヒトにおいてＱＴ間隔延長の原因となる可能性が高い。
【００６２】
実施例６：ｃＥＲＧまたはｈＥＲＧをトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞で行ったドフェチリド結合アッセイの比較
ドフェチリド結合アッセイは実施例２に記載したように、ヒトＥＲＧまたはイヌＥＲＧのいずれかをトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞を用いて行った。結果を図４に示すが、この結果からドフェチリドのＩＣ５０がイヌＥＲＧおよびヒトＥＲＧで類似しており、各々１３．９ｎＭおよび１５．６ｎＭであることがわかる。ドフェチリドのＩＣ２０値はイヌＥＲＧおよびヒトＥＲＧについて、各々１．９２ｎＭおよび２．１５ｎＭであった。
【００６３】
実施例７：ｃＥＲＧまたはｈＥＲＧでトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞を使用してのテルフェナジンの競合アッセイの比較
ドフェチリドの結合アッセイを、検査化合物としてテルフェナジンを用いて行った。一過性トランスフェクションを行ったｃＥＲＧ  ＨＥＫ−２９３細胞膜（２００μｇ/ウェル）、または安定なｈＥＲＧ  ＨＥＫ−２９３細胞膜（１００μｇ/ウェル）を、１２の異なる濃度のテルフェナジンおよび５ｎＭ  [３Ｈ]−ドフェチリドと共に９０分間室温でインキュベーションした。全結合および非特異的結合は、１０％ＤＭＳＯおよび１０μＭの標識していないドフェチリドと共に、総アッセイ容量を２００μｌとしてインキュベーションすることにより測定した。膜をPackardユニフィルター細胞ハーベスターで濾過して集め、放射能（ｃｐｍ）を測定した。ｃＥＲＧおよびｈＥＲＧを発現する細胞膜の各サンプルについて、２つの飽和実験を行った。各実験は３回ずつ行った。図５は各細胞のタイプ（ｃＥＲＧまたはｈＥＲＧのトランスフェクション）についての実験の平均値を示すが、テルフェナジンのＩＣ５０がｃＥＲＧおよびｈＥＲＧで類似しており、各々７７．２ｎＭおよび８８．９ｎＭであることを示している。テルフェナジンのＩＣ２０値はイヌＥＲＧおよびヒトＥＲＧで各々１０．７ｎＭおよび１２．３ｎＭであった。
【００６４】
実施例８：ｃＥＲＧまたはｈＥＲＧでトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞におけるＥ４０３１の競合アッセイの比較
ドフェチリドの結合アッセイを、検査化合物としてＥ４０３１を用いて行った。一過性トランスフェクションを行ったｃＥＲＧ  ＨＥＫ−２９３細胞膜（２００μｇ/ウェル）、または安定なｈＥＲＧ  ＨＥＫ−２９３細胞膜（１００μｇ/ウェル）を、１２の異なる濃度のＥ４０３１および５ｎＭ  [３Ｈ]−ドフェチリドと共に９０分間室温でインキュベーションした。全結合および非特異的結合は、１０％ＤＭＳＯおよび１０μＭの標識していないドフェチリドと共に、総アッセイ容量を２００μｌとしてインキュベーションすることにより測定した。膜をPackardユニフィルター細胞ハーベスターで濾過して集め、放射能（ｃｐｍ）を測定した。ｃＥＲＧおよびｈＥＲＧを発現する細胞膜の各サンプルについて、２つの飽和実験を行った。各実験は３回ずつ行った。図６は各細胞膜のタイプ（ｃＥＲＧまたはｈＥＲＧのトランスフェクション）についての実験の平均値を示すが、Ｅ４０３１のＩＣ５０がｃＥＲＧおよびｈＥＲＧで類似しており、各々２７．３ｎＭおよび３５．４ｎＭであることを示している。Ｅ４０３１のＩＣ２０はイヌＥＲＧおよびヒトＥＲＧで各々３．８ｎＭおよび４．９ｎＭであった。
【００６５】
ＩＣ５０（またはＩＣ２０）値を、検査した化合物で比較すると、それらの値はｃＥＲＧおよびｈＥＲＧで非常に類似していることが見出された。このことは、ｃＥＲＧまたはｈＥＲＧのいずれかを本発明のアッセイで使用して、ヒトにおいてＱＴ延長の開始を予測することができることを示唆している。
【００６６】
実施例９：さらなるアッセイの至適化の研究
ｈＥＲＧを含む細胞膜のホモジェネートに対するドフェチリドの特異的結合に関するアッセイをさらに至適化するため、[３Ｈ]−ドフェチリドと細胞膜調製物との相互作用を、ＫＣｌまたはＭｇＣｌ２のいずれかを含むＴｒｉｓを基本とするバッファーを用いての、ＳＰＡアッセイのフォーマットで調べた。ＳＰＡアッセイは、アッセイバッファーとして５０ｍＭＴｒｉｓ．Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４または５０ｍＭＴｒｉｓ．Ｃｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４中で、実施例３に従って行った。アッセイは検査化合物としてドフェチリドまたはテロジリンを使用して行った。これらのバッファーの条件下で検出された特異的結合の比較により、使用するアッセイバッファーが５０ｍＭＴｒｉｓ．Ｃｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４の場合には、特異的結合が認められないことが明らかになった；特異的結合は、５０ｍＭＴｒｉｓ．Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４からなるアッセイバッファーでは観察された。アッセイバッファーとして５０ｍＭＴｒｉｓ．Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４で行ったアッセイについて、ＩＣ５０値およびＩＣ２０値を各検査化合物について得た。ドフェチリドのＩＣ５０値の平均値は８．６９±０．４５ｎＭ、テロジリンのＩＣ５０値の平均値は１．８７±０．００μＭであった。ドフェチリドのＩＣ２０値の平均値は１．２ｎＭ、テロジリンのＩＣ２０値の平均値は０．２４８μＭであった。
【００６７】
【表３】
2005510691.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１：（ａ）フィルター結合法、（ｂ）ＳＰＡの９６ウェルフォーマット、および（ｃ）ＳＰＡの３８４ウェルフォーマットにおける、[３Ｈ]−ドフェチリドのＨＥＲＧへの結合に関する代表的な飽和曲線データ。
【図２】図２：フィルター結合アッセイおよびＳＰＡ結合アッセイから得られたｐＫｉ値を比較する相関プロット：（ａ）９６ウェルｈＥＲＧ[３Ｈ]ドフェチリドＳＰＡアッセイおよび放射性リガンド結合アッセイ間の相関、（ｂ）ｈＥＲＧ[３Ｈ]ドフェチリドＳＰＡアッセイの９６ウェルおよび３８４ウェル間の相関。
【図３−１】図３：（ａ）Ｅ−４０３１、（ｂ）ドフェチリド、（ｃ）テルフェナジン、および（ｄ）シサプリドに関する、ｈＥＲＧへの[３Ｈ]−ドフェチリドの結合の阻害、ｈＥＲＧパッチクランプ法、およびヒトにおいてＱＴ間隔の延長を誘発することが知られている遊離の薬剤の濃度の比較。
【図３−２】図３：（ａ）Ｅ−４０３１、（ｂ）ドフェチリド、（ｃ）テルフェナジン、および（ｄ）シサプリドに関する、ｈＥＲＧへの[３Ｈ]−ドフェチリドの結合の阻害、ｈＥＲＧパッチクランプ法、およびヒトにおいてＱＴ間隔の延長を誘発することが知られている遊離の薬剤の濃度の比較。
【図４】図４：ヒトＥＲＧ（ｈＥＲＧ(▲)）またはイヌＥＲＧ（ｃＥＲＧ（■））でトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞由来の細胞膜で行ったドフェチリド結合アッセイにおけるドフェチリドＩＣ５０の比較。
【図５】図５：ｃＥＲＧまたはｈＥＲＧをトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞膜でのドフェチリド結合アッセイにおけるテルフェナジンのＩＣ５０の比較。
【図６】図６：ｃＥＲＧまたはｈＥＲＧをトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞膜でのドフェチリド結合アッセイにおけるＥ４０３１のＩＣ５０の比較。
【図７】図７：アッセイバッファー５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４を用いたトリチウム化ドフェチリドＳＰＡアッセイにおける（ａ）ドフェチリドおよび（ｂ）テロジリンに関する平均濃度（ｎ＝２）での効果を示す曲線。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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