(57)【要約】本発明は、細胞の培養に使用する種々のマイクロスケールバイオリアクター(微小発酵槽)およびマイクロスケールバイオリアクターレイを提供する。これらの微小発酵槽は、細胞を培養するための容器およびその容器の内部に細胞増殖を支援するために十分な濃度で酸素を提供するための手段を含む。本発明の実施形態によっては、この微小発酵槽の容器は、約１ml未満の種々の内容積を有し得る。この微小発酵槽は、通気膜および能動的に種々の検出装置を含み得る。本発明はさらに、この微小発酵槽および微小発酵槽アレイを収納して環境制御を提供するチャンバを提供する。この微小発酵槽のいくつかは、例えば、酸素、栄養、pHなどの制御を培養容器に提供するためおよび／または代謝産物などを除去するために使用され得る第二のチャンバを含む。例えば、最適な株または最適なバイオプロセスパラメータを選定するための、この微小発酵槽の使用の種々の方法が、提供される。
2005523717.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロスケールバイオリアクターであって、該マイクロスケールバイオリアクターは、２００μＬ未満の内容積を有する容器；ならびに
細胞増殖を支持するのに十分な濃度で該容器に酸素を提供する手段
を備える、マイクロスケールバイオリアクター。
【請求項２】
前記容器から延びるか、または該容器と接続している、少なくとも１つのチャネルをさらに備える、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項３】
前記容器に構成要素を導入する手段またはチャネル経由で該容器からサンプルを取り出す手段をさらに備える、請求項２に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項４】
内容積が、約１００μＬと約２００μＬとの間（端点を含める）である、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項５】
前記内容積が、約５０μＬと約１００μＬとの間（端点を含める）である、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項６】
前記内容積が、約５μＬと約５０μＬとの間（端点を含める）である、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項７】
前記内容積が、約５μＬである、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項８】
前記酸素を提供する手段が、容器壁に一体化されている、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項９】
前記酸素を提供する手段が、バイオリアクターの構造構成要素を形成する、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項１０】
前記酸素を提供する手段が、通気膜を備え、そして、ここで、酸素が前記容器中に該膜を介して拡散する、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項１１】
前記膜が、フルオロポリマーおよびシリコーンからなる群より選択され材料を含む、
請求項１０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項１２】
前記膜が、ポリジメチルシロキサンまたはＴｅｆｌｏｎ  ＡＦ  ２４００を含む、請求項１０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項１３】
前記膜が、約８００Ｂａｒｒｅｒの透過率を有する、請求項１０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項１４】
前記膜が、約６００Ｂａｒｒｅｒと約８００Ｂａｒｒｅｒとの間の透過率を有する、請求項１０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項１５】
前記膜が、約４００Ｂａｒｒｅｒと約６００Ｂａｒｒｅｒとの間の透過率を有する、請求項１０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項１６】
前記膜が、約２００Ｂａｒｒｅｒと約４００Ｂａｒｒｅｒとの間の透過率を有する、請求項１０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項１７】
前記膜が、約８０Ｂａｒｒｅｒと約２００Ｂａｒｒｅｒとの間の透過率を有する、請求項１０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項１８】
前記膜が、生体適合性である、請求項１０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項１９】
前記膜が光学的透明である、請求項１０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項２０】
前記バイオリアクターが、少なくとも６時間の期間で細胞増殖を支持する、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項２１】
前記バイオリアクターが、少なくとも約１０時間の期間で細胞増殖を支持する、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項２２】
前記バイオリアクターが、少なくとも約２．５時間の期間で指数関数的細胞増殖を支持する、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項２３】
前記バイオリアクターが、細胞増殖を支持して、少なくとも１０９細胞／Ｌの生存細胞密度を達成する、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項２４】
前記バイオリアクターが、細胞増殖を支持して、少なくとも１０１０細胞／Ｌの生存細胞密度を達成する、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項２５】
前記バイオリアクターが、細胞増殖を支持して、少なくとも１０１１細胞／Ｌの生存細胞密度を達成する、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項２６】
前記バイオリアクターが、細胞増殖を支持して、少なくとも１０１２細胞／Ｌの生存細胞密度を達成する、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項２７】
前記細胞増殖が、細菌細胞増殖である、請求項２０から請求項２６のいずれかに記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項２８】
前記容器の少なくとも１つの内表面、あるいは、該容器から延びるかまたは該容器と接続しているチャネルの少なくとも１つの内表面が、細胞の吸着を変化させる物質で被覆されている、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項２９】
前記物質が、細胞の吸着を減少させる、請求項２８に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項３０】
前記物質が、細胞の吸着を増大させる、請求項２８に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項３１】
前記物質が、シラン含有フィルムである、請求項２８に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項３２】
前記表面が、グリニヤール試薬を使用して改変される、請求項２８に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項３３】
前記表面が、フィルムを形成するために開環複分解重合反応を使用して改変される、請求項２８に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項３４】
前記物質が、ポリマーである、請求項２８に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項３５】
前記ポリマーが、骨格およびその骨格に結合する複数のポリマー側鎖を含む櫛型ポリマーである、請求項３４に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項３６】
前記骨格が、基材に吸着するように選択される、請求項３４に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項３７】
前記ポリマー側鎖が、タンパク質、細胞またはその両方の吸着を抑制するように選択される、請求項３４に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項３８】
前記ポリマーが、ポリ（アクリル酸）骨格を含む、請求項３４に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項３９】
前記ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）を含む、請求項３４に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項４０】
前記容器中でバイオマスの定量のための手段をさらに含む、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項４１】
前記バイオマスの定量のための手段が、光学的検出手段を含む、請求項４０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項４２】
前記バイオマスの定量のための手段が、光源および光ファイバーを備える、請求項４０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項４３】
前記容器中の溶存酸素を測定するための手段をさらに備える、請求項１または請求項４０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項４４】
前記容器中の溶存酸素を測定するための手段が光学的センサを含む、請求項４３に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項４５】
前記光学的センサが、蛍光発光またはルミネセンスが酸素濃度に依存して変化する化合物を含む、請求項４４に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項４６】
前記化合物がルテニウム化合物である、請求項４５に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項４７】
前記化合物が、ルテニウム（ＩＩ）トリス（４，７−ジフェニル−１，１−フェナントロリン）２＋である、請求項４５に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項４８】
請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクターであって、前記容器中のバイオマスの定量のための手段；前記容器中の溶存酸素を測定するための手段：ならびに
前記容器中の少なくとも１つの他のパラメータを測定するための手段
をさらに備える、マイクロスケールバイオリアクター。
【請求項４９】
請求項４８に記載のマイクロスケールバイオリアクターであって、
前記少なくとも１つの他のパラメータが、以下：
温度、ｐＨ、二酸化炭素濃度、炭素原濃度、イオン種の濃度および細胞代謝物の濃度
からなる群より選択される、マイクロスケールバイオリアクター。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの他のパラメータが、ｐＨである、請求項４９に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項５１】
前記手段の少なくとも１つが、光学的化学センサである、請求項４８に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項５２】
少なくとも１つの導波管センサをさらに備える、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項５３】
自己組織型センサをさらに備える、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項５４】
前記自己組織型センサは、電場応答性チオール試薬を含む、請求項５３に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項５５】
前記容器中の温度を制御するための手段をさらに備える、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項５６】
前記容器中の温度を制御するための手段が、抵抗加熱器を備える、
請求項５５に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項５７】
前記容器中の培養物のｐＨを制御するための手段をさらに備える、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項５８】
前記容器に栄養素を送達するための手段をさらに備える、請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項５９】
少なくとも１つの導波管センサを備える、マイクロスケールバイオリアクター。
【請求項６０】
前記導波管センサが、光検出器を組み込んでいる、請求項５９に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項６１】
前記光検出器が、単光子アバランシュダイオードを含む、請求項６０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項６２】
バイオリアクターシステムであって、該システムは、以下：
請求項１に記載のマイクロスケールバイオリアクター；および
マイクロスケールバイオリアクターを適応させるのに十分な大きさのチャンバ；
を備え、ここで、該チャンバは、少なくとも１つの環境因子を制御する手段を提供する、
バイオリアクターシステム。
【請求項６３】
前記チャンバが、前記マイクロスケールバイオリアクターによって感知された、温度もしくは湿度またはそれらの両方のいずれかを制御する、
請求項６２に記載のマイクロスケールバイオリアクターシステム。
【請求項６４】
請求項６２に記載のマイクロスケールバイオリアクターシステムであって、
該システムは、光学的励起を前記バイオリアクターに対して指向するように位置づけられた光学的励起源
および
該バイオリアクターによって伝達されるかまたは放射される光を感知するように位置づけられた光検出手段
をさらに備える、マイクロスケールバイオリアクターシステム。
【請求項６５】
前記光学的検出手段が、ラマン分光器を含む、請求項６４に記載のマイクロスケールバイオリアクターシステム。
【請求項６６】
前記光学的励起源、前記光学的検出手段、またはその両方が、光ファイバーを含む、
請求項６４に記載のマイクロスケールバイオリアクターシステム。
【請求項６７】
複数の発酵を並行して実施するためのバイオリアクターアセンブリであって、請求項１、４０、５２、または５５のいずれかに記載されるような、複数のマイクロスケールバイオリアクターを備える、バイオリアクターアセンブリ。
【請求項６８】
請求項４３に記載されるような複数のマイクロスケールバイオリアクターを備える、複数の発酵を並列して実施するためのバイオリアクターアセンブリ。
【請求項６９】
微小発酵槽システムであって、以下：
附属型マクロ流体構成要素を必要に応じて伴う、１以上の請求項１に記載されるようなマイクロバイオリアクター、またはこのようなマイクロスケールバイオリアクターの１以上のアレイ、ならびに以下の1以上：
必要に応じた附属型マイクロ流体構成要素を伴って、マイクロバイオリアクターまたはマイクロスケールバイオリアクターアレイが備えつけられるかまたは収容される１以上のプレートまたはプラットフォーム；
該微小発酵槽または微小発酵槽アレイ、微小発酵槽プレート、または微小発酵槽プラットフォームが、囲われるチャンバ；
ポンプ；
感知手段；
検出手段；
エネルギー送達手段；
励起手段；
分析装置；
ロボット装置；
ソフトウェア；およびコンピュータ
を備える、システム。
【請求項７０】
マイクロスケールバイオリアクターであって、細胞培養のための１ｍｌ以下の内容積を有する第１の容器；および酸素および二酸化炭素に対しては透過性である膜によって少なくとも部分的に該第１の容器とは分離した第２の容器を備える、マイクロスケールバイオリアクター。
【請求項７１】
前記膜が、細胞生成物および栄養素に対しては透過性であるが、細胞に対しては透過性でない、請求項７０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項７２】
前記第２の容器を通して液体または気体を流すための手段をさらに備える、請求項７０に記載のマイクロスケールバイオリアクター。
【請求項７３】
所望の生成物を産生するかまたは所望しない化合物を分解する株を選択するための方法であって、該方法は、以下の工程：
複数の様々な株を培養する工程であって、該複数の株の各々は、請求項１、４０、５２、または５５のいずれかに提供されるような個別のマクロスケールバイオリアクター中にある、工程；
該マイクロバイオリアクターの各々の中の該所望する生成物または所望しない生成物を測定する工程；ならびに
最適量の所望の生成物を産生するかまたは最大量の所望しない化合物を分解する株を選択する工程；
を包含する、方法。
【請求項７４】
バイオプロセスパラメータを選択するための方法であって、該方法は、以下の工程：
請求項１，４０、５２、または５５のいずれかに提供される複数のマクロバイオリアクター中で生物体の型を培養する工程であって、ここで、該マイクロスケールバイオリアクターは、バイオプロセスパラメータの値が変化する条件下で操作され、そして、ここで、該生物体は、生成物を産生するかまたは化合物を分解する、工程；
該マクロバイオリアクターの各々でバイオマスをモニタリングする工程；および
最適なバイオマス、最適な生成物形成、または最適な化合物分解を生じるバイオプロセスパラメータの値を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項７５】
前記バイオプロセスパラメータが、能動的に制御される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
バイオマスに加え、少なくとも１つのバイオプロセスパラメータをモニタリングする工程をさらに包含する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
発酵を実施する方法であって、該方法は、以下：
請求項７３に記載の方法に従って、細胞株を選択する工程；および
製造スケール発酵器中で該細胞株を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項７８】
発酵を実施する方法であって、該方法は、製造スケール発酵器中で細胞を培養する工程を包含し、ここで、製造スケール発酵器のための１以上のバイオプロセスパラメータが請求項７４に記載の方法に従って選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６０／３７６，７１１号（２００２年５月１日出願）の優先権を主張し、本明細書で参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
バイオプロセスの科学および技術における調査を陰で支える重要な推進力は、例えば、生物系およびバイオプロセスの操作の間の相互作用を評価するために使用し得る、迅速でありかつ正確な分析情報のための需要であり続ける。一つの重要な課題は、多数の試験を迅速にかつ効率的に実行することである。この問題は、特に重要であり、なぜなら、分子生物学における多数の進展により、現在、進化した生物触媒、新規経路設計、および多様な供給源からの種々の独特の生物有機体を含む多数の潜在的生物系へと導かれるからである。
【０００３】
バイオプロセス開発技術は、生物系における発見および遺伝子操作の現在の比率に追い着くことが出来ずにいた。現在設計し得る何十万もの遺伝学的順列および過程の順列のうち、小画分だけを、標準的なバイオプロセスの実施を使用して試験し得る。２〜１０リットルの典型的な容積を有する、ベンチスケールのバイオリアクターは、生物系についての十分なデータを得るために要する時間、そのデータを得るための労力、およびこれらの系の高費用を含むいくつかの理由のために制限を受ける。現在では、市販される最小のバイオリアクターは、約０．５リットルの稼動容積を有し（Ｓｉｘｆｏｒｓ，Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）、６つの並列しての発酵を実施させることを可能にする。
【０００４】
並列した発酵を通じて迅速な試験、過程の開発、および最適化を実施させることを可能にする基本骨格に対する需要が、存在する。特に、費用の増加を伴わずに複数の試験を並列して実施させることを可能にするマイクロスケールバイオリアクターに対する需要が、存在する。さらに、そのマイクロスケールバイオリアクターにおける試験の条件および結果が、予想されるラージスケールのバイオプロセス操作に換算し得るマイクロスケールバイオリアクターに対する需要が、存在する。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、小容積のバイオリアクターにおいて細胞培養を実施すること、例えば、株の最適化、バイオプロセスパラメータの最適化などを試験することが可能になることにより、従来の生産スケールの発酵槽またはベンチスケールの発酵槽において実施される発酵と比較して顕著な有利性が提供されることの認識を包含する。従って、本発明は、種々のマイクロスケールバイオリアクター（微小発酵槽）、微小バイオリアクターアレイ、ならびに、それらの使用のための関連する装置および方法を提供する。
【０００６】
一つの局面においては、本発明は、２００マイクロリットルより小さい内容積を有する容器およびその容器に細胞増殖を支援するために十分な濃度で酸素を提供するための手段を含むマイクロスケールバイオリアクター（微小発酵槽）を提供する。能動的に、その微小発行槽は、その容器から延長されてかつその容器と連結した少なくともひとつの流路、および／または成分をその容器の中に導入するかもしくは流路を通じてその容器から試料を採取するための手段を含む。本発明のある実施形態に従って、酸素を提供するための手段は、酸素がその膜を通じてその容器の中に拡散する、通気膜を含む。その膜は、例えば、フッ化高分子またはケイ素樹脂を含み得る。
【０００７】
別の局面においては、本発明は、上記のようでありかつ、例えば、その培養培地の吸光度の測定による、細胞代謝産物の濃度の測定による、などによる生物量の定量のための手段を有するマイクロスケールバイオリアクターを提供する。能動的に、そのマイクロスケールバイオリアクターは、その培養容器の中の溶解酸素濃度を測定するための手段、および／または少なくとも一つのほかのパラメータ（それは、例えば、温度、ｐＨ、二酸化炭素濃度、炭素源濃度、イオン種の濃度、および細胞代謝物の濃度であり得る）を測定するための手段を含み得る。
【０００８】
本発明のある実施形態に従って、生物量および／またはバイオプロセスパラメータを測定するための手段は、光学検出器、例えば光学的化学検出器を含む。本発明のある実施形態では、導波管検出器を、使用する。本発明のある実施形態に従って、ラマン分光計を、一つ以上のバイオプロセスパラメータ、例えば、その培地に存在する種々の有機化合物の濃度を測定するために使用する。
【０００９】
本発明のある局面においては、そのマイクロスケールバイオリアクターは、その培養容器の中の温度および／またはｐＨを制御するための手段を含む。本発明のそのマイクロスケールバイオリアクターは、栄養素を送達するための手段および／またはその培養容器から細胞産生物を採取するための手段もまた含み得る。
【００１０】
別の局面においては、本発明は、細胞を培養するための１ｍｌ以下の内容積を有する第一の容器ならびに、その第一の容器から、少なくとも部分的に酸素および二酸化炭素に対して透過性である膜で分離された第二の容器を含む、二槽式マイクロスケールバイオリアクターを提供する。本発明のある実施形態では、その膜は、細胞産生物および／または栄養素に対して透過性であるが、細胞に対しては透過性でない。これらのマイクロスケールバイオリアクター系は、その第二の容器を通じて液体または気体を流動させるための手段をさらに含む。
【００１１】
別の局面においては、本発明は、そのマイクロスケールバイオリアクターおよびそのマイクロスケールバイオリアクターレイを収納するために十分な大きさのチャンバを提供し、そこにおいてそのチャンバは、温度または湿度のような少なくとも一つの環境パラメータを制御するための手段を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、複数の発酵を並列して実施するためのバイオリアクター集合体（バイオリアクターアレイ）を提供する。
【００１３】
他の局面においては、本発明は、マイクロスケールバイオリアクターおよびマイクロスケールバイオリアクターアレイを使用するための種々の方法を含む。例えば、本発明は、（ａ）複数の異なる株の、おのおのの個々のマイクロスケールバイオリアクターの中での培養；（ｂ）おのおののそのマイクロスケールバイオリアクターの中におけるその望まれる産生物もしくは不要な産生物の量の測定；および（ｃ）最適な量の望まれる産生物を産生する株もしくは最大量の不要な化合物を分解する株の選別、の段階を含む、望まれる産生物を産生する株もしくは不要な化合物を分解する株を選別する方法を提供する。本発明はさらに、（ａ）複数のマイクロスケールバイオリアクター（そのマイクロスケールバイオリアクターを、そのバイオプロセスパラメータが変動する条件下で操作して、その生物体が、産生物を産生するかまたは化合物を分解する）の中での生物体株の培養；（ｃ）各マイクロスケールバイオリアクターの中の生物量のモニタリング；および（ｄ）最適な生物量、最適な産生物生成、もしくは最適な化合物分解の結果を生じるバイオプロセスパラメータ値の同定、の各段階を含む、バイオプロセスパラメータを選定する方法を提供する。生物量に加えて、他のバイオプロセスパラメータをもまた、モニターし得、複数のパラメータは、変動し得る。本発明のある実施形態に従って、そのバイオプロセスパラメータを、活動的に制御する。
【００１４】
本明細書で触れられるすべての論文、書物、特許などの内容は、参考として本明細書に援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（ある実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．概要）
本発明は、マイクロスケールバイオリアクター（微小発酵槽）により、生物系およびバイオプロセスの操作の間の相互作用を容易に評価するために使用し得る迅速でありかつ正確な分析情報のための、バイオプロセスの科学および技術における継続した需要に対処する手段が提供されることの認識を包含する。さらに、そのような系により、現代の生物学の手段（例えば、遺伝学、酵素額、分子生物学、およびバイオインフォマティクス）を、バイオプロセスのスクリーニングおよび開発を改良するために効率的に援用するための基本骨格が提供される。例えば、マイクロスケールバイオリアクターにより、天然物の合成から微生物環境浄化にわたる応用のための株および代謝経路の迅速なスクリーニングが可能となる。バイオプロセス技術は、多数の医薬品およびワクチンの開発ならびに大量生産に寄与してきた。さらに、バイオプロセスは、食料品産業、廃棄物処理などに利用される。
【００１６】
代謝経路工学は、（例えば、新規の天然物の合成を通じて（２））創薬と同様に多様な範囲の深在性の衝撃、必需化学物質（例えば、アスコルビン酸および乳酸（３）、１，３−プロパンジオール（４））と同様に多様な範囲の深在性の衝撃、および有毒な汚染物質の生物分解（５）と同様に多様な範囲の深在性の衝撃、を与えている。代謝工学は、産生物の生成または細胞特性の、生化学反応の改変を通じて標的化した改良を包含する。それゆえ、代謝工学は、ある代謝産物の最大の産出率の制御を提供する酵素を決定すること（代謝制御分析もしくはＭＣＡ）、その後の（例えば分子生物学を通じて）これらの酵素の活性を変化させることおよび／または産出量を操作するために関連する反応条件を変化させることに焦点を合わせる。ＭＣＡは、数学的モデルの作製、炭素追跡、ならびに不明な代謝産物のためのアッセイの開発および代謝流量の理解における補助を包含し得る。酵素活性の変更には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、遺伝子ライブラリー構築、スクリーニング、クローニング、および他の分子生物学手法を包含し得る。微小発酵槽技術は、いかにバイオプロセス開発および代謝工学研究を実行するかについて、ならびにまた、いかに迅速に研究をバイオプロセスの中への改良へと変換し得るかについての両方に多大な衝撃をもたらし得る。
【００１７】
本発明は、細胞を培養するための２００μｌより小さい内容積を有する容器および細胞の増殖を十分に支援するようにその容器に酸素を提供するための手段を含むマイクロスケールバイオリアクターを提供する。用語「内容積」および「稼動容積」は、本明細書で相互交換可能に使用される。さらに、本発明は、マイクロスケールバイオリアクターおよび環境制御を提供するチャンバを含むマイクロスケールバイオリアクター系を提供する。本発明は、並列して操作され得る、マイクロスケールバイオリアクターのアレイを含むバイオリアクター集合体をもまた提供する。大多数のバイオリアクターの並列した操作が可能になることで、多数の独自の有用性が提供される。例えば、その微小発酵槽アレイにより、（ｉ）多数のパラメータ（例えば、温度、栄養素の構成、ｐＨなど）の中の一つ以上の変化による、所定の任意の表現形上の特徴、例えば、特定の株の増殖率、代謝産物産生もしくは化合物生体内変換能などの上における効果の系統的な評価、または（ｉｉ）環境条件を一定に保持したままでの多数の異なる株の特徴（例えば、代謝産物）の系統的な評価を可能にする。
【００１８】
マイクロスケールバイオリアクターの開発には、現在有用な発酵槽技術からスケールダウンすることのみが要求される。例えば、従来の発酵槽において採用された大容量では、酸素濃度、生物量などのようなパラメータをモニターすることが、適切な時間においてその発酵槽から試料を採取することにより可能となる。逐次的な試料回収は、マイクロスケールバイオリアクターの文脈において非実用的であり得、あるいは別々におよび小さいスケールで実施される必要があり得る。大きな内部配置検出器は、微小発酵槽の文脈において実用的でない。従って、多くの応用のための要求項目である、バイオプロセスパラメータの正確なモニタリングにとって、代替方法の開発が要求される。さらに、散布および／または撹拌のような従来の技術を使用する酸素送達は、小体積においては問題となり得る。
【００１９】
上で議論した課題に加え、小体積を有する発酵槽の使用により、多数の潜在的な有利性が提供される。例えば、微小的組立て技術を、多数の同一な微小発酵槽を効率的に生産するために使用し得る。微小的組立てにより、検出装置のそのバイオリアクターの構造的構成要素の中への積載が可能となり、それにより、多数のデータを効率的な方法で得る可能性が、より強くなる。従って本発明の好ましい実施形態では、少なくとも一つの検出装置が、その微小発酵槽の構造的構成要素の中へ積載される。
【００２０】
発酵槽プロセスのマイクロリットルスケールへの縮小化は、従来の手順からの大きな出発を意味する。本発明者らは、以下の重大な問題に取り組む必要性を認識してきた：（ｉ）材質の選択および表面改質を含む、設計技術および組立て技術；（ｉｉ）バイオプロセスパラメータ制御；（ｉｉｉ）検出器技術の選択、開発、および集積；および（ｉｖ）適切な感応性の分析装置。さらに、本発明者らは、その微小発酵槽の性能を評価するために適切な生物系および微小発酵槽を従来のバイオプロセシング方法論と比較するために適切な生物系を利用することの重要性を認識してきた。従来の発酵槽および微小発酵槽の間の大きな違いとして、例えば（ｉ）壁面面積対体積比；（ｉｉ）微小発酵槽におけるより重大な蒸発による損失；（ｉｉｉ）微小発酵槽の従来の酸素送達方法との不適合性。
【００２１】
本発明の実施例により詳細に記載されるように、本発明者らは、５μｌの稼動容積を有するマイクロスケールバイオリアクターを構築して、そのマイクロスケールバイオリアクターが細菌細胞の増殖を支援し得ることを示してきた。１０時間より長く引き続いた、その発酵槽反応の終了時において、その細胞は、まだ生存していた。結果は、その微小発酵槽における細胞増殖が、従来の発酵槽における細胞増殖に匹敵することを呈示する。本発明者らは、その微小発酵槽内部への成功した酸素の送達および毒性の欠如を呈示した。
【００２２】
次の章では、関連する定義を提供し、本発明が前述の懸念などを解消する方法を記載し、ならびに本発明の微小発酵槽および微小発酵槽アレイを使用するための方法を記載する。
【００２３】
（ＩＩ．定義）
バイオリアクター操作戦略：当該分野で一般に是認され、および（５４）に記載される用語法に従って、バイオリアクター操作戦略は、三つの一般的なモデル、例えば、バッチ操作もしくはフェッド−バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）操作、半継続的戦略もしくはカット−アンド−フィード（ｃｕｔ−ａｎｄ−ｆｅｅｄ）戦略（これは、セミ−バッチ（ｓｅｍｉ−ｂａｔｃｈ）とも呼ばれ得る）、および灌流培養の中の一つに分類され得る。バッチ培養は、本明細書に記載のマイクロリアクターの場合には、撹拌を実施し得、または実施し得ないにもかかわらず、通常は撹拌タンクバイオリアクターの中で懸濁培養細胞を使用して実施される。産生物を、そのバッチサイクルの終了時に培地から回収する。フェッド−バッチ培養は、そのバッチサイクルの間に栄養素を継続的または定期的のどちらかで添加する点において、バッチ培養と異なる。その半継続的戦略またはカット−アンド−フィード戦略もまた、一般には撹拌タンク、均一に混合したバイオリアクターを使用する。この操作戦略では、バイオリアクターに、細胞を接種し、その細胞は、その後ある程度の期間、大抵はその培養物が初期定常期に到達するまで増殖することが可能となる。通常は７０〜９０％の単位で、その細胞培養物培養液の大部分を、その後回収して、そのバイオリアクターに、新鮮な培地を補充した。そのサイクルを、その後繰り返す。灌流操作では、細胞がそのリアクターに保持され、一方で無細胞副流が回収可能となる；それらは、その灌流ケモスタット（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｓｔａｔ）のような均一系あるいは、中空繊維または流動床バイオリアクターのような不均一系の、二つの範疇に細分化され得る。これらの定義が、任意の方法においても本発明または本発明の操作様式を制限するものではないことを意図すること、ならびにそれらが、本明細書に記載の微小発酵槽の文脈に見合って解釈され得ることを、理解し得る。
【００２４】
チャンネル：用語「チャンネル」は、物体を通過する一定のまたは系統的に変化する横断面領域の孔を指す。一般に、チャンネルは、定義された横断面の幾何学的形状を有し、その幾何学的形状は、長方形、卵形、円形、または、ギザギザ形などのような、課されたより良好な特徴を伴ってのこれらの幾何学的形状であり得る。
【００２５】
発酵：用語「酵母する」、「発酵」などは、一般に細胞の培養物を呈示することとして広く理解され得る。その用語は、任意の特定の環境的条件または代謝過程を意味しない。典型的に、それらの用語は、細菌細胞（例えば真性細菌）の培養物を指す一方で、それらは、古細菌または真核細胞（例えば、酵母あるいは哺乳動物細胞）にもまた適用し得る。名詞として、「発酵」または「発酵反応」あるいは「発酵槽反応」は、細胞を発酵槽において培養する期間を指す。
【００２６】
マイクロスケールバイオリアクター：本明細書で使用されるように、用語「マイクロスケールバイオリアクター」は、１ｍｌ未満の内容積を有するバイオリアクター（すなわち、細胞を培養するための装置）を記載するために使用される。用語「マイクロスケールバイオリアクター」および「微小発酵槽」は、本明細書において相互転換可能に使用される。
【００２７】
並列（同時並行）：発酵槽反応は、その発酵槽反応の反応時間が重なり合う場合に「並列で」実行される。その反応を、本質的に同時に開始および／または終了させ得るが、しかしそのようにさせる必要はない。その反応は、同じ長さの時間で、または異なる長さ時間で、続き得る。
【００２８】
株：広義では、細胞またはウィルスは、それらが一つ以上の表現型または遺伝子型の特徴において互いに異なる場合、異なる株であると考えられ得る。一般に、「株」は、一つの細胞から継承されて、その細胞の表現型および遺伝子型の特徴を維持する生物体集団である。頻繁に細菌（ｍｉｃｒｏｂｅ）（すなわち、微生物（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｏｒｇａｎｉｓｍ））を指すために使用されるが、その用語は、本明細書において任意の型の細胞を指すために使用され得る。
【００２９】
（ＩＩＩ．設計および組立て）
（Ａ．設計）
本発明のある実施形態では、そのマイクロスケールバイオリアクターは、細胞を培養するための容器およびその容器に細胞増殖を支援するために十分な濃度で酸素を提供するための手段を含む。本発明のある実施形態では、その容器は、１ｍｌ未満の内容積を有する。本発明のある実施形態では、その容器は、２００μｌ未満の内容積を有する。本発明のある好ましい実施形態では、稼動体積は、５０μｌ以上で１００μｌ以下である。本発明のある好ましい実施形態では、稼動体積は、５μｌ以上で５０μｌ以下である。本発明のある好ましい実施形態では、稼動体積は、５μｌ以上で１０μｌ以下である。本発明のある好ましい実施形態では、稼動体積は、約７．５μｌまたは約１０μｌである。本発明のある好ましい実施形態では、稼動体積は、約５μｌである。（一般に、本明細書において使用される用語「約」は、文脈に依存して、数値が±１％、±５％、±１０％で変化し得ることを示す。）少ない稼動体積により、多数の有利性が提供される。例えば、その少ない稼動体積では、効率的な気体液体間接触により溶解酸素濃度（ＤＯ）のレベルを制御することが可能となる。少ない稼動体積は、より少ない拡散時間をもまた意味し、それにより、気体の交換が補助される。さらに、５μｌ〜５０μｌの範囲の稼動体積を有するマイクロスケールバイオリアクター、または、５０μｌ〜１００μｌの範囲の稼動体積を有するマイクロスケールバイオリアクターを、微細加工を使用して、より多い稼動体積を有するものより容易に生産し得る。微細加工により、非常に高密度の個々の微小発酵槽を備えた微小発酵槽アレイの生産が容易となる。さらに、微細加工により、非常に大きい特異的な気体液体間接合面を備えた配置が可能となる。特に、活発な通気をとり行うマイクロスケールバイオリアクターの文脈において、微細加工により、マイクロスケールバイオリアクターが、大きい物質移動係数（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）（ｋＬａ）を達成することが可能となる。例えば、本発明者らは、接触の仕組みの正確な設計により気体−液体−固体反応系のための物質移動係数における二桁より大きい増加を達成した（８）。さらに、小さい系の寸法により、その容器の体積を横切るより速い拡散、およびそれによるより均一なその中の条件が、容易に起こる。更に、より小さい寸法（例えば、約１００μｌより少ない内容積を生じる寸法）は、培養容器の上面を形成する通気膜に対する適切な支持を確実にするために望ましくあり得る。
【００３０】
図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の微小発酵槽の一つの実施形態の図案の上面図および側面図を示す。図１Ａに見られるように、本発明のこの実施形態では、その容器は、全体的に円筒型の配置を有し、水平面で円形の断面を有する。その微小発酵槽の底は、その構造の残りの部分を支持して安定化させるのに十分な強さの、強固な基板（例えば、シリコン、ガラス、プラスチック（例えば、ポリカーボネート、プレキシガラス）など）から形成される。本発明のある実施形態では、その微小発酵槽の少なくとも一つの壁面（例えば、側壁面、上壁面、または底壁面）に、光学的なアクセスを可能にするための透明な材料が含まれる。しかしながら、本発明のある実施形態では、導波管を、光を中へまたは外へ導くために使用し得る場合、透明な材料の使用は、必要ではない（以下を参照のこと）。
【００３１】
図１に示されるように、本発明の好ましい実施形態では、一つ以上のチャンネルが、容器から延長される。例えば、バッチ形式で操作する本発明の実施形態では、そのチャンネルは、発酵の開始に先立ちその容器に培地および接種原（すなわち、細胞）を導入するために、単独で使用される。しかしながら、本発明のある実施形態では、そのようなチャンネルは、他の目的のために、例えば、発酵過程の間に、例えば、サンプルを採取するため、栄養素、緩衝液のような追加成分を導入するために使用され得る。そのチャンネルは、例えば、その容器の中に成分を導入するために、および／またはサンプルを採取するために、ロボット装置と接続して利便的に使用され得る。ロボット装置は、例えば、微小発酵槽あるいは微小発酵槽アレイを、例えば、マイクロタイタープレート（そのマイクロタイタープレートから発酵槽の中へ物質が移動され得るか、またはそのマイクロタイタープレートの中へサンプルが配置され得る）と接続するために使用され得る。そのチャンネルは、ポンプ、レザバなどに接続され得る。マイクロ流体技術を、使用し得る。
【００３２】
さらに下に記載されるように、その微小発酵槽は、その容器に酸素を送達するための手段を含む。本発明の好ましい実施形態では、その微小発酵槽容器の一つ以上の壁は、少なくとも部分的に、増殖中の培養物の酸素添加のための気体透過膜からなる。その気体透過膜は、さらに代謝の間に産出される気体の分散においても役立ち得る。実施例１に記載される本発明のある実施形態では、その膜は、通気膜およびその微小発酵槽の構造的材料の両方として機能する。例えば、図１の中で示されるように、微小発酵槽の一つの実施形態の上壁面および側壁面の両方は、ポリマー素材であるポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）から作製される。本発明のある実施形態では、その微小発酵槽は、複数の膜を含む。これらの膜は、同じ材料から作製され得、あるいは、異なる材料、例えば、気体拡散率および気体溶解度のような異なる特性を有する材料から作製され得る。
【００３３】
適切な酸素添加が、細胞増殖にとっては主要な考慮すべき点であるので、適切な微小発酵槽の寸法および膜材料の選択は、酸素送達系の特性を考慮に入れる酸素輸送モデルにより導かれ得る。そのようなモデルの使用は、実施例２により詳細に記載される。その中での計算を、酸素拡散率および酸素溶解度のようなパラメータが既知である、任意の所定の材料に容易に適用し得る。本発明のある実施形態では、酸素に対するその膜の透過率（すなわち、拡散率および溶解度の積）は、ＰＤＭＳの透過率、すなわち、８００Ｂａｒｒｅｒ（１Ｂａｒｒｅｒ＝１０−１０ｃｍ３（ＳＴＰ）・ｃｍ／ｃｍ２・ｓ・ｃｍ  Ｈｇ）（４４）にほぼ等しい。本発明のある他の実施形態では、その膜の酸素に対する透過率は、８００Ｂａｒｒｅｒより大きい。本発明のある他の実施形態では、その膜の酸素に対する透過率は、約６００〜８００Ｂａｒｒｅｒ、約４００〜６００Ｂａｒｒｅｒ、約２００〜４００Ｂａｒｒｅｒ、または、約８０〜２００Ｂａｒｒｅｒのいずれかである。
【００３４】
本発明は、二つの容器が膜により分離された種々のマイクロスケールバイオリアクター系を提供する。第一の容器は、細胞培養容器として機能する一方、第二の容器は、酸素、栄養素、緩衝液などのような一つ以上の成分の供給源として機能する液体を含む。種々の異なる配置が、可能である。
【００３５】
図２Ａは、発酵容器が上段にある本発明の一つのそのような実施形態の側面図を示す。マイクロスケールバイオリアクターの二つの容器は、上段の容器の中に水および酸素の自由な輸送が可能となる膜（膜２）により分離される。本発明のある実施形態では、この膜は、栄養素、産生物および／または塩の逆拡散を防ぎ、一方で本発明の他の実施形態では、その膜は、これらの成分に対して透過性である。（図の中の疑問符は、栄養素、産生物、および塩が膜２を通過して拡散してもよく、（または）拡散しなくてもよいことを示す。）脱塩適用において典型的に使用されるような膜は、この目的のために使用され得る。栄養素、産生物、塩および細胞の輸送を制御するために使用され得る広範囲にわたる種類の膜は、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ．より入手可能である。細孔の大きさ、疎水性のような表面の特性、および能動的または受動的な輸送のためのチャンネルの存在のような要因が、望まれる輸送特性を達成するために当業者によって選択され得る。
【００３６】
図２Ａの中で描かれた設計図では、上面膜（膜１）は、水および気体の拡散を可能にする。塩は、揮発性ではないため、上面膜（膜１）から蒸発しない一方、大部分の産生物は、十分に大きいため上面膜を通じて容易に拡散しない。下側の容器と連絡するチャンネルにより、酸素化された水が下側の容器を通じて流れることが可能となり、酸素および水の連続的な供給を膜２を横切って拡散するように提供する。循環を、ポンプを使用して達成し得る。その液体は循環して補充され得るので、下側の容器の容積は、上部の容器の容積に比べて小さくあり得、また、本発明のある実施形態では、下側の容器の容積は、そのチャンネルと同様の高さのチャンバのみからなる。
【００３７】
本発明のある実施形態では、図２Ａの中で示されるように下側の容器を通じて液体を循環させるよりむしろ、上部の容器の容積に比べて大きい（例えば、上部の容器の容積の少なくとも二倍の）容積を有する下側の容器が、使用されて、それにより成分のレザバを提供する。そのレザバの内容物は、定期的に交換され得る。細胞培養容器と連絡したチャンネル（示さず）もまた、例えば、細胞および培養培地の導入、サンプルの採取などを可能にするために存在し得る。
【００３８】
この設計は、とりわけ、以下の特徴および利点を提供する：（１）蒸発による水の損失が、下部容器からの浸透作用により交換され得る；（２）酸素添加が、上面および底面の両方から供給され得る（最大許容深度が増加する）；（３）中性ｐＨの水または培地の大きいレザバとの接触により、発酵槽の中で中性ｐＨを維持することが可能となる；（４）気体および水のみが膜を透過する場合、そのプロセスはバッチのままであり、一方、膜が栄養素、産生物などが透過することを可能にする場合、プロセスは、セミ−バッチまたは継続的へと変化する；（５）センサが、微小発酵槽が組立てられる元となるガラスまたは他の材料上に集積され得るため、センサは、発酵培地から現在分離される。このことにより、センサのための別々の較正が可能となり、さらにセンサを滅菌する必要性が取り除かれもする（例えば、いくつかのセンサはＵＶ感受性または温度感受性である）；（６）設計により、培養容器の下部の水中酸素含有量、および培養容器の上部の空気を制御することによる培養容器内の酸素勾配の制御が可能となる。
【００３９】
図２Ｂは、二槽式微小発酵槽の設計の別の実施形態を示す。この実施形態では、培養容器は、空気とは接触しない。その代わりに、酸素は、培養容器と、酸素添加を受けた液体、例えば水のレザバを含む第二の容器とを分離する膜を経由して提供される。その分離膜により、水および酸素の培養容器への自由な輸送が可能となる。本発明のある実施形態では、この膜により、栄養素、産生物および／または塩の逆拡散が防止され、一方、本発明の他の実施形態では、この膜は、これらの成分に対して透過性である。（本図の中の疑問符は、栄養素、産生物および塩が、膜を通過して拡散してもよく、（または）拡散しなくてもよいことを示す。）酸素添加を受けた液体は、図示されるように、チャンネルを経由して上側容器を通過して流れ得る。この設計では、上側容器から下側容器への拡散は、重力と同じ方向で生じる。
【００４０】
この設計は、とりわけ、以下の特徴および利点を提供する：（１）蒸発による水の損失が、水で満たされた容器との接触により防止され得る；（２）中性ｐＨの水または培地の大きいレザバとの接触により、その発酵槽の中で中性ｐＨを維持することが可能となる；（３）気体および水のみが膜を透過する場合、そのプロセスはバッチのままであり、膜が栄養素、産生物などもまた透過することを可能にする場合、プロセスは、セミ−バッチまたは継続的へと変化する。
【００４１】
図２Ａおよび図２Ｂでは、その二つの容器を分離する透過性の膜は、容器の構造的要素として描画したが、この透過性の膜は、必ずしもこの通りである必要はない。その透過性の膜は、その代りに、より低い透過性の材料で作製される分離層の一部分を形成し得る。
【００４２】
要約すると、二槽式の設計は、例えば、加湿されない環境において生じ得る、蒸発による損失の潜在的な問題に対応する。さらに、これらの設計により、発酵のための酸素の第二の供給源を提供し、その結果、より大きい体積対表面積比を有する、より深い培養容器が、利用可能となり得る。これらの設計により、例えば、水素イオンおよび水酸化物イオンの拡散を可能にすることにより、ｐＨの制御もまた可能となる。さらに、ｐＨ制御は、適切な緩衝液を、第二の（非培養物の）容器に満たされる液体の中へ提供することにより、強化され得る。
【００４３】
図３は、微小発酵槽のさらに別の実施形態の設計を示す。図３の上部は、単一の微小発酵槽ユニットを示す。おのおのの微小発酵槽は、細胞がその中で培養される容器、およびその容器から延長するチャンネルを含む。そのチャンネルにより、栄養性流体がその容器に入ることが可能となり、さらに、その容器の内部と種々のセンサデバイスとの間の接触手段が提供される。微小発酵槽のこの実施形態では、通気を、微小発酵槽の容器内部と外部の通気チャンバの間の連絡を可能にするチャンネルにより提供する。このチャンバは、例えば、酸素供給源と接続され得、撹拌機を含み得るなどする。複数の個々の微小発酵槽ユニットは単一の通気装置に接続されるか、または、おのおののユニットは、個々に専用の通気装置ユニットを有し得る。
【００４４】
本発明の目的の一つは、複数の発酵を並列して（すなわち、同時に）実行し得る、効率的なプラットフォームを提供することである。従って、本発明は、微小発酵槽アレイ（多数の物理的に接続された微小発酵槽を意味する）を含む系を提供する。その微小発酵槽は、典型的には、互いに直角な並びのような規則的な幾何学的形状で整列されるが、このことは、必要事項ではない。微小発酵槽は、それらが、単一の基板上もしくは基板内で整列され、共通の基底部に取り付けられ、および／あるいは、互いにまたは中央の貯蔵容器もしくはチャンバに（例えば、チャンネル経由で）接続される場合に、「物理的に接続される」と理解される。微小発酵槽アレイは、任意の個数の個々の微小発酵槽ユニットを含み得る。例えば、本発明のある実施形態では、微小発酵槽アレイは、少なくとも１０個の微小発酵槽を含む。本発明のある実施形態では、微小発酵槽アレイは、少なくとも１００個の微小発酵槽を含むか、少なくとも１０００個の微小発酵槽を含むか、または少なくとも１０，０００個の微小発酵槽を含む。図３の下部は、微小発酵槽アレイ（その中で、図３の上部に示される個々の微小発酵槽ユニットが、使用される）の実施形態の概略を示す。（図示の目的のために、カラムは互いからずれている）。
【００４５】
本発明のある実施形態に従って、その系は、おのおの生物分析デバイスを積載して、並列して操作される、複数の微小発酵槽から成る。この系は、生物系とバイオプロセス操作との間の相互作用を迅速に評価するために使用し得る、速くて正確な分析情報に関するバイオプロセス科学およびバイオプロセス工学において継続的な要求に取り組む。さらに、微小発酵槽により、バイオプロセスのスクリーニングおよび開発を改良するために、生物学の現代的手法（例えば、遺伝学的プロファイリング、酵素触媒作用、およびバイオインフォマティクス）を効率的に組み込むためのプラットフォームが提供される。
【００４６】
図４Ａは、互いに直角な縦および横の並びの個々の単位からなる微小発酵槽のアレイを含む系の概略図である。本明細書に記載される任意の微小発酵槽は、図４Ａに描画されるプレートのウェル内に設置され得るか、または、ウェル自身が、個々の微小発酵槽容器として機能し得るかの、どちらかである。本発明のある実施形態に従って、その系により、複数の微小発酵槽の、流体の送達ならびに光学的検出要素および電気的検出要素による並列の操作を集積することが可能となる。その微小発酵槽では、バッチ、フェッドバッチ、および連続型を含む異なる様式で反応し得る。本発明のある実施形態に従って、微小発酵槽単位を、オートクレーブし得て交換し得る。
【００４７】
そのプレートは、複数の、並列の発酵実施のためのチャンバを有する。図４Ｂに示されるように、例えば、培地に接種ために、ｐＨを制御ために、栄養素を添加するために、または細胞培養物の一部分を採取するために必要な流体接合面要素は、プレート上に、およびその系の接合面の中に積載され得る。この積載は、滅菌が必要とされる機械的操作および構成物を最小化することのような方法で実施され得る。そのプレート上またはそのプレートの中に存在する要素は、典型的にはチャンネル、弁および系の接合面などへの単純な接続を含み得る。他の要素をもまた、含み得る。流体制御要素および送達方法（例えばポンプ）は、系自身の中に収容され得る。
【００４８】
同様に、本発明のある実施形態に従って、再使用可能な検出要素はその系の中の任意の場所に設置され、一方で、
しかし、一度限りで使用可能な構成物は、そのプレート上またはそのプレートの中で組込まれる。例えば、溶解酸素濃度のための蛍光色素およびｐＨ測定のための蛍光色素は、プレートの中に組込まれ得る一方で、光ファイバー、レンズおよび光学的検出装置は、系の連続型発酵実施のために繰り返し使用され得るために、接合面に位置し得る。本発明のある実施形態に従って、他の手段、例えば、生物種からの蛍光および発光を測定するための光学的手段は、本明細書に記載される系に援用される。類似して、本発明のある実施形態に従って、電気的検出手段および電気的自動化手段は、その系自体に援用され、一方で、単純な駆動部および検出要素（例えば、電気化学および静電容量）は、プレートに援用される。
【００４９】
本発明のある実施形態に従って、そのプレートは製造の時点で包装され、プレ滅菌され得る。並列の発酵を始める場合に、そのプレートを、包装から取り出して、容易その系に取り付ける。
【００５０】
プレートおよび／または他の系の構成物を、熱エンボス加工（ｈｏｔ  ｅｍｂｏｓｓｉｎｇ）、注入式塑造法（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｍｏｌｄｉｎｇ）、電気メッキ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｌａｔｉｎｇ）、微小電極放電機械加工（ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｄｉｓｃｈａｒｇｅ  ｍａｃｈｉｎｉｎｇ）などを含むが、それらに限定されない、種々の標準的な微小組立て技術、またはそれらの組み合わせにより組立て得る。本発明の種々の実施形態に従って、そのプレートは、例えば、それの特定の適用目的に依存して、使い捨てであるかまたは再使用可能である。
【００５１】
図４Ｂは、個々の微小発酵槽におけるパラメータに対する制御が可能となるマイクロ流体のチャンネルを有する、微小発酵槽アレイを含む系の概略図である（下記のバイオプロセス制御の議論を参照のこと）。
図４Ｂに描画される手段に従って、そのアレイの異なる次元方向を横切る、おのおのの複数のパラメータを変えることにより、組み合わせの効果は、達成される。例えば、そのアレイの二つの次元方向を横切る、溶解酸素濃度についての４つの異なる値および栄養素組成物についての４つの異なる値を採用することにより、合計１６の異なる培養条件を、試験し得る。本発明の種々の実施形態に従って、単一のバイオプロセスパラメータは、そのアレイの単一の次元方向を横切って変化する。本発明のある他の実施形態に従って、多くのバイオプロセスパラメータは、そのアレイの一つ以上の次元方向を横切って変化する。
【００５２】
複数の実質的に同一の微小発酵槽が並列で作動する微小発酵槽アレイにより、多数の長所が提供される。例えば、複数の微小発酵槽を並列して操作すること、所定のおのおのの時点で一つ以上の微小発酵槽の発酵槽反応を終了すること、および微小発酵槽の内容物の大部分もしくは全部を分析に供することが、可能である。
これにより、従来のベンチスケール発酵槽または工場スケールの発酵槽で典型的に行われ得たような、単一の微小発酵槽から複数の試料を採取する手段に対しての代替法が、提供される（この手段が、本発明の微小発酵槽の場合にもまた採用され得るにもかかわらず）。それゆえ、複数の微小発酵槽を並列して操作することの有効性により、分析についてのより高い柔軟性が提供される。
【００５３】
複数の微小発酵槽を並列して操作することが可能になることは、複数の実質的に同一の発酵槽反応を簡便に実施すること（例えば、同一条件もしくは実質的に同一な条件下での複数の反応、および／または、同一の有機体を使用する反応）、および複数のそのような発酵槽反応の結果を分析することが可能となり得ることを意味し、このことにより、その結果における裏付けが大幅に増強され得る。条件が「実質的に同一である」と考慮するために同様であり得る程度は、考慮中の適用目的および特定の条件に依存して変化し得る。例えば、二つの発酵反応は、そのパラメータが、その二つの反応の間で、例えば、特定のパラメータ、その発酵反応の目的に依存して約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％、未満または約０．１％未満で変化する場合、特定のパラメータに関して「実質的に同一条件」の下で起こると考慮され得る。一つまたはほんの数個の大容量の発酵から得られる結果に依存するよりむしろ、本発明の微小発酵槽アレイにより、増加した統計学的優位性を伴うデータを得る可能性ならびに、例えば、異なる培養条件により引き起こされる傾向および変化を信頼できる形で同定する可能性が提供される。
【００５４】
本発明のある実施形態では、微小発酵槽および／または検出器は、分析設備（例えば、ＨＰＬＣ、ＧＣ／ＭＳ、ＦＴＩＲなど）を備えた、および／またはデータ収集系を備えた、標準的な研究室用ロボット装置と接続される。
特に、本発明のある実施形態では、光学顕微鏡をそのセル単位と接続することにより、細胞形態の光学的モニタリングが可能となる。本発明のある実施形態では、微小発酵槽および微小発酵槽アレイは、使い捨てである。
【００５５】
本発明の微小発酵槽、微小発酵槽アレイおよび微小発酵槽系は、基底部の上に設置され得るかもしくは基底部に付けられ得、および／または、適切な筐体の中に格納され得る。筐体には、例えば、ワイヤ、ケーブル、チューブなどの出入りを可能にするための連絡口が提供され得る。本明細書で使用されるように、本発明の種々の実施形態に従って、「微小発酵槽系」には、本明細書に記載されるような一つ以上の微小発酵槽または微小発酵槽アレイ（能動的に、関連するマイクロ流体構成物を備える）、および、以下の中の一つ以上が含まれる：
さらに一つの微小発酵槽または微小発酵槽アレイ（能動的に関連するマイクロ流体工学適用物を備える）を設置もしくは格納するプレートもしくは基本骨格；
その微小発酵槽もしくは微小発酵槽アレイ、プレートもしくは基本骨格を中に格納し得るチャンバ；
ポンプ；検出手段および／または検知手段；分析設備；ロボット装置；例えば、データ収集および／もしくはバイオプロセス制御のための、ソフトウェアおよびコンピュータ；ならびに、任意の上記の系の構成物の操作のために必要となる、任意のワイヤ、ケーブル、ファイバー、電子部品など。その系には、その系の任意の構成物にエネルギーを送達するための手段、例えば電源、および／または、光または他の形式の電磁気エネルギーのような励起をその系に送達するための手段を含み得る。
【００５６】
（Ｂ．組立て技術）
多種多様の組立て技術を、本発明の微小発酵槽を構築するために使用し得る。実施例１により詳細に記載されるように、本発明のある実施形態では、ソフトリソグラフィーを使用する微小的組立が採用される。この技術により、多数の有利性が提供される。例えば、ソフトリソグラフィーにより、異なる形状および大きさを有する微小発酵槽の迅速な生産が可能となり、これらのパラメーターの効率的な最適化が可能となる。
【００５７】
本発明のある実施形態では、例えば、大規模スケールの組立ての目的のために、代替技術または代替材質を選択することが、好ましくあり得る。例えば、本発明のある実施形態では、その微小発酵槽は、少なくとも一部分は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、またはポリテトラフルオロエチレン（ＴＥＦＬＯＮ）、芳香族とポリオレフィンとの共重合体のようなポリマー材質から組立てられ、それらのポリマー材質は、自由造形塑造法（ｆｒｅｅ−ｆｏｒｍ  ｍｏｌｄｉｎｇ）、微小塑造法（ｍｉｃｒｏｍｏｌｄｉｎｇ）、注入式塑造法（例えば、反応型注入式塑造法もしくは熱可塑性注入式塑造法、パンチングなど）、熱エンボス加工、ＣＮＣ機械加工（ＣＮＣ  ｍａｃｈｉｎｉｎｇ）、レーザー直接書込み法（ｌａｓｅｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｗｒｉｔｅ）、微小電極放電機械加工などのような標準的方法を使用して、加工され得る。例えば（７８）を参照のこと。通気膜は、微小発酵槽の容器の構造的構成要素として、または容器壁の中へ組込み得る。組込みは、容器の残りの部分の組立ての間に起こり得るか、または、その通気膜を、その後付け加え得る。例えば、通気膜は、例えば接着融合、熱融合などによる、任意の種々の技術を使用して取り付けられ得る。
【００５８】
本発明のある実施形態では、微小発酵槽および微小発酵槽アレイを、例えば、（７７）に記載されるような標準的な半導体製造技術を使用して、組立てる。例えば、シリコンウエハー（それは、ガラスまたはプラスチックのような強固な基板上に設置され得る）を、微小発酵槽のより低部層を形成するために使用し得、その後、その低部層を、細胞の増殖のための容器として機能するウェルを形成させるためにエッチングし得る。窒化ケイ素のような半導体材質の付加的な層は、低部層に（例えば、化学的蒸着、物理学的蒸着、および電着により）沈着し得、ウェルおよびチャンネルがこれらの層の中の一つ以上の中にエッチングされる。上に記載されるように、複数のウェルを含む微小発酵槽アレイが、形成され得て、そのウェルは、チャンネルを経由して、互いに、ウエハーの端に、または中央の貯蔵容器（その中央の貯蔵容器は、ウェルの内部に栄養素、酸素もしくは細胞を供給し、および／または、試料を採取するために使用され得る）に接続され得る。
【００５９】
本発明のある実施形態では、その微小発酵槽のいくつかまたはすべての構造的構成要素（例えば、細胞が中で培養され得る容器を形成するのに必要な、底面壁、上面壁および側壁のような構成物）および、一つ以上の機能的構成物（例えば、酸素送達手段、検出器など）の実質的に集積されかつ同時の組立てを可能にする組立て技術が、選択される。本発明のある実施形態では、その微小発酵槽の基板もしくは基底部の上に直接ある、いくつかまたはすべての構造的構成要素の組立てを可能にする、組立て技術が、選択される。そのような手段は、例えば、容器の一部分（例えば、側壁）を組立てて、次に、その部分を基底部に取り付けるために必要とされる組立て技術と、対比をなす。
【００６０】
（Ｃ．材料および表面の改変）
本発明の特定の好ましい実施形態では、生物適合性材料（すなわち、細胞の生存能および増殖を有意に阻害もしくは悪影響を与えないか、そして／または、細胞により産生された代謝産物のような他の生物学的成分に悪影響を与えない材料）が、細胞に接する微小発酵槽の部分のために使用されるか、または、その容器に細胞もしくは他の物質を送達するために使用される。適切な材料として、シリコン、二酸化ケイ素（例えば、ガラス）、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリカーボネート、アクリレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン）、または他の生物適合性ポリマー（例えば、シリコーン樹脂（例えばＰＤＭＳ）、フッ化高分子）などが挙げられる。さらに、非生物適合性材料（例えば、特定の金属）を、それらを生物適合性材料でコーティングすることを前提に、使用し得る。
【００６１】
ＰＤＭＳは、多くの理由で、微小発酵槽の組立てに対する（通気膜のために、そして微小発酵槽自体の構造的材料として）魅力的な選択枝を呈示する。ＰＤＭＳは、気体に対して高い透過性を有し、このことにより、酸素が培地の中に十分に拡散することが可能となり、一方で同時に、二酸化炭素および他の気体が出て行くことをことが可能となる。ＰＤＭＳは、極めて疎水性であり、このことにより、蒸発に対する水の損失が最小限となる。ＰＤＭＳは、生物適合性であり、オートクレーブ温度に耐性であり得、そして、可視光に対して透明である。
【００６２】
その微小発酵槽の小さいサイズ、およびこれらの系の中の他の特徴により、従来のマイクロスケール操作における値を上回る表面積−対−体積比が導かれ、操作について適合性をもつ界面を供給することの重要性が強調される。タンパク質変性および非特異的吸着により、その微小発酵槽の能力を潜在的に変化し得る経路が提供される。従って、本発明の特定の実施形態では、細胞および／または細胞により産生された代謝産物のような生物学的成分に接する表面は、これらの効果を弱めるように変化を受ける。そのような表面には、細胞または細胞産物のような他の生物学的成分のいずれかと接触し得る、その微小発酵槽の容器の内部および任意のチャンネルの両方などが挙げられ得る。
【００６３】
本発明の特定の実施形態では、細胞または他の生物学的成分と接する表面は、細胞接着を阻害もしくは促進するように変化を受ける。例えば、細菌細胞の場合には、微小発酵槽の表面への細胞の接着は望ましくなく、そして、細胞に接する表面は、それゆえ細胞接着を減少されるために改変され得る。同様に、タンパク質のような細胞産物の接着は、望ましくなくあり得る。接着により、通気膜の効率およびセンサの精度が減少し得る。さらに、接着は、細胞産物の変性およびそのような産生物の効率的な回収における困難に寄与し得る。
【００６４】
その微小発酵槽の接触する表面、およびその系の種々の生物学的成分に対して接続する任意のマイクロチャンネル化ネットワークの接触表面の吸着特性を変化させるために、多くの異なるアプローチを、使用し得る。本発明の特定の実施形態では、表面は、ポリマーで覆われる。本発明の特定の実施形態では、表面は、ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）１１ＳｉＣｌ３（ｎ＝２〜４）から調製される自己組織化分子フィルムにより誘導される（１４に記載）。これらの試薬は、金属酸化物の表面上に、配向的に化学吸着した単分子フィルムを生成する。これらのフィルムは、密に充填されて、表面でオリゴ（エチレンオキシド）単位を露出し、オリゴ（エチレンオキシド）単位は、水との低い界面エネルギーを有する中程度に親水性の界面を提供する。図５を参照のこと。これらのフィルムの注目すべき特徴は、それらのフィルムが、（インシュリン、アルブミン、およびリゾチームなどのような）タンパク質およびオリゴヌクレオチドの非特異的吸着を抑制して細胞の吸着を大幅に減少させることができることである。
【００６５】
細胞の吸着性の特性のさらなる縮小は、より親水性の表面（すなわち、水とのさらにより低い界面エネルギーを有する表面）の生成、および吸着に対するより大きいエントロピー寄与により達成され得る。そのような表面の生成のための戦略として、アセテート末端化オリゴ（エチレンオキシド）シラネート化試薬（その後、表面上で脱保護化されて水酸基を露出する）の使用、またはより長いオリゴ（エチレンオキシド）鎖を有する試薬の使用が挙げられる。例えば、試薬ＣＨ３ＣＯ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３（ＣＨ２）１１ＳｉＣｌ３は、集合してアセテート保護化オリゴ（エチレングリコール）表面を形成し、その表面上で、ＬｉＡｌＨ４による脱保護化により、グリコール末端を生成する。この表面は、水とのより低い界面エネルギーを呈示し、不必要な非特異的吸着現象を減少させ、そして反応性アルコール末端（本発明者らは、その反応性アルコール末端を、カルボニルジイミダゾールを使用したカップリング反応によりタンパク質を固定化するために使用してきた）を提供する。図６を参照のこと。
【００６６】
表面を誘導体化するための相補的な戦略は、グリニャール試薬（Ｇｒｉｇｎａｒｄ  ｒｅａｇｅｎｔ）（ＲＭｇＢｒ）と水素末端化シリコン表面との間の反応である（１５、１６）。後者は、フツ化水素酸でシリコン表面を処理することにより容易に形成される。この反応により、強固なシリコン−炭素結合によりその表面と接続される、グラフトした有機鎖が生成される。この戦略は、シラネート化試薬を使用する場合より、基礎的な解決策、および広いセットの加工との適合性を提供する。そのようなフィルムが使用される本発明の特定の実施形態に従って、ある量の表面の官能化は、組立てプロセスの間に（特にウエハー結合工程に先立って）実施され、それにより、チップの中のパターン化された表面を生成する可能性が提供される。さらに、この反応は、多孔性のシリコン支持体により良好に作動し、系の中の高い表面の領域を改変する可能性を提供し（９）、通気のために使用される気体−液体界面の特性を調整する手段が提供される。
【００６７】
本発明の特定の実施形態に従って、開環複分解重合（ＲＯＭＰ）を使用する、表面開始重合過程は、表面の上に、より厚いグラフトしたフィルムを産出するための手段として（１７）、およびフィルムに官能基を組み込むための手段として使用される。これらのフィルムは、室温で形成され、反応時間に依存して、１０〜１００ｎｍの範囲で変動し得る厚さを有する。手短に言うと、本発明者らは、ノルボルネントリクロロシラン（ＮＴＣＳ）を、酸化物表面上の単分子層コーティングを組立てるために使用した。このプライマー層の触媒溶液への曝露およびその後のモノマー溶液への順次的な曝露により、数十ナノメートルの厚さを有する接着ポリマーフィルム形成が導かれる。この重合反応においてＮＴＣＳをモノマーとして使用することにより、反応性官能基を含むポリマー性フィルムが、生成された。その側鎖トリクロロシラン基を、種々の酸化物支持体上でこのポリマーのグラフトした鎖を産生するために、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とともに反応させた。例えば、本発明の一つの実施形態では、フィルムを、分子量３００のＰＥＧで処理して、その後エチレングリコールで処理した。ＰＥＧの変種および誘導体もまた、使用され得る。本発明の特定の実施形態に従って、メトキシキャップ化ＰＥＧが、使用される。
【００６８】
ＲＯＭＰ化学により、広範囲の官能基がフィルムへ導入されることが可能となるという事実により、広範囲の表面にアクセスするための合成反応の柔軟性および簡便性、ならびに、そのコーティングの中の成分として種々のアミノ酸または糖を導入する能力が提供される。本発明の特定の実施形態では、この化学物質を、その微小発酵槽および／またはチャンネルの内表面上のより強固なコーティングを組立てるために、ならびにある範囲の界面の特性を導入および制御するために使用する。図７は、水和された金属酸化表面からＲＯＭＰが開始される表面の略図を示す。その表面は、まず始めにノルボルネニル基を露出するように誘導体化され、その後［Ｒｕ］触媒を固定化するように処理される。この表面がモノマー溶液で処理される場合、ＲＯＭＰポリマーは、基板からグラフトしたフィルムとして成長する。
【００６９】
別のアプローチに従って、櫛型ポリマー（すなわち、ポリマーの骨格に統合されたポリマー側鎖を含むポリマー）のようなポリマーは、表面に吸着されるか、またはそうでなければ表面に適用される。本発明の特定の好ましい実施形態では、櫛型ポリマーの骨格は、コーティングされる表面に吸着するために選択され、そして、その側鎖はタンパク質および／または細胞の吸着を抑制するように選択される。その骨格ポリマーの適切な選択は、一般に、かくして、コーティングされる特定の表面に依存する。例えば、その表面がガラスである本発明の特定の実施形態では、ポリ（アクリル酸）を骨格として含むポリマーの改変体を調製し、均質なＰＥＧ、またはポリ（エチレングリコール−ｒ−プロピレングリコール）のような、不均質な分子の混合物を含むポリマーのいずれかの鎖にグラフトする。その側鎖は、したがって、同一であり得るか、または非同一であり得る。
【００７０】
図２２は、Ｅ．ｃｏｌｉが何もしないガラス表面に暴露した場合の細胞の振る舞い（左上のパネル）と、ポリ（アクリル酸）骨格および一定範囲の異なる示されるＰＥＧ含有量（０％、１６％、２４％、５０％）を有する櫛型ポリマーで処理されたガラス表面に暴露した場合の細胞の振る舞いを比較した著しい差を示す。細胞を、ベンチスケールのバイオリアクターにおいて３日間、未コーティングのガラス表面、および種々の櫛型ポリマーでコーティングされたガラス表面の存在下で培養した。図２２から明らかであるように、櫛型ポリマーの存在により、細胞吸着が大幅に減少した。櫛型ポリマーの分子式を、本図の上部の中央に示す。パーセント数は、ＰＥＧ−ＰＰＧグラフトを含むポリ（アクリル）酸骨格における（平均での）ＣＯ２Ｈ基のパーセントに相当する。例えば、ポリ（アクリル酸）分子がその構造において１００モノマー単位のアクリル酸を含む場合、１６％とは、各ポリマー分子が、（平均で）ＰＥＧ−ＰＰＧポリマー鎖へのアミド連結を有する１６個のＣＯ２Ｈ基、および８４個の遊離した非誘導体化ＣＯ２Ｈ基を含むことを呈示する。
【００７１】
本発明者らは、内部表面上のコーティングを施すためにこれらの種々の化学プロセスを使用することの有利性とは、それらを、組立てられた系の上に、単に要求された種の溶液をそのデバイスを通過して流すかまたはその装置上に流すことにより形成し得ることであることを認識した。流体工学に対する制御により、異なるデバイス（またはデバイスの部分）が異なる表面化学を呈示することを可能にし得る。例えば、（例えば通気操作のために）空気との低い界面エネルギーを有する区別された領域を生成することが望ましくあり得、この領域は、水との低い界面エネルギーを有し（そこではタンパク質および細胞の吸着が最小限となる）、そして（たとえば検出操作のために）特定の種の特異的な吸着のために固定化された認識要素を提供する。
【００７２】
自己組織化は、微細加工されたデバイスの中の操作を制御およびモニタリングのために強力な戦略が提供する。表面の反応性の違い（金属について  対  酸化物について  対  シリコンについて）および反応物の流体的動きをデバイスの特定の領域へ導く能力は、所望される生化学的操作を達成するためのこれらのマイクロスケールバイオリアクターの中の、表面の化学の複雑なパターンおよび進行を生成する能力を提供する。
【００７３】
細菌細胞とは対照的に、特定の哺乳動物細胞の場合には、基板への接着は、細胞増殖を促進して、さらに不可欠であり得る。したがって、哺乳動物細胞の増殖のために最適化された本発明のそれらの実施形態では、細胞接着を促進するための表面の改変が、使用され得る。本発明の特定の実施形態では、いくらかの表面または表面の部分を、細胞、タンパク質などの接着を減少させるために改変し、一方で、他の部分を、接着を増加させるために改変する。Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６，１９７，５７５は、細胞、タンパク質などの接着を促進するかまたは阻害するために使用され得る種々の表面の改変を記載し、および種々の製造技術の記載もまた含む。
【００７４】
表面の改変に対する種々の他のアプローチが、使用され得る。例えば、二次元もしくは三次元のスタンピングまたは密着焼付けが、上記の方法の代わりに、または上記の方法と共に使用され得る。（例えば、米国特許番号５，５１２，１３１、ＷＯ９６／２９６２９、同第６，１８０，２３９号、同第５，７７６，７４８号を参照のこと）。あるいは、化学蒸着が使用され得る。化学蒸着は、気相中におけるフィルムの形成を可能にして、三次元デバイスに適用可能である。他の利点の中でもとりわけ、化学蒸着により、空洞の中のフィルムの沈着が可能となる。例えば、（７９）およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／９１２，１６６（種々のポリマー材料（例えば、パラシクロファン）の、ポリエチレン、シリコン、金、ステンレス鋼およびガラスを含む種々の基板上への化学蒸着について記載される）を参照のこと。そのポリマーは、反応性ポリマーおよび／または官能基化ポリマーであり得る。本発明の特定の実施形態では、微小発酵槽の容器および／またはチャンネルの表面は、ポリマー材料でコーティングされ、そのポリマー材料は、リガンドを組込み得る。そのリガンドは、細胞もしくは分子の接着を促進し得るかまたは阻害し得る。
【００７５】
（ＩＶ．センサ技術）
バイオプロセスモニタリングの分野における調査は、しばしば、プロセスを確立するために必要とされる費用および時間を減少させるために、培養条件、培養時間、および産物回収時間を最適化するために利用され得る、正確な分析情報の迅速な獲得を目標とする。さらに、最も現代的な産業用バイオプロセスが、微生物のバッチ培養または連続供給バッチ培養であり、そこではパラメータの制御が最適化されたプロセスを維持するために必要とされ、そのプロセスのオンラインモニタリングが、非常に望まれる。バイオプロセスを最適化するために、そして最適化されたバイオプロセスを実施するために、発酵の過程の間に、バイオマスおよび環境変数（例えば、ｐＨ、酸素濃度、代謝産物濃度）を含むがこれらに限定されない種々のパラメータを、例えば所望される産物の収量を最大化する発酵条件の選択を可能にするために、モニタリングし得ることが、望ましい。従来の発酵槽では、このことは、その発酵槽のインサイチュモニタリングによるか、または（連続的にまたは高頻度で）その内容物の滅菌試料を採取してそれらを分析にかけることによるかの、いずれかで達成され得る。
【００７６】
通常、複雑な成分の混合物を含有する培地の中で、単一の化合物の濃度についての直接の情報を獲得するために、標的分子用に対して高選択性を示す分析装置が、代表的に要求される。現在まで、これは、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析装置のような種々のオンラインクロマトグラフィー手順の利用によってのみ達成され、いくつかの化合物の同時検出を可能にしてきた。しかしながら、これらの型のプロセスは、特定のセットの化合物を分析するために３０〜６０分を費やし得る、高価なマルチチャンネルデバイスを必要とする。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも一つの分析センサが、微小発酵槽に一体化される。一体化された分析センサは、その微小発酵槽の容器の中の目的の変数（例えば、分析物）のモニタリング（それは、検知および／または測定を含み得る）を、その容器の内容物の試料を採取する必要なく、可能にするセンサである。目的のパラメータは、以下であり得るが、これらに限定されない：バイオマス、ｐＨ、溶解酸素、溶解二酸化炭素、グルコース、乳酸、アンモニア、リン酸もしくは金属イオンのようなイオン、任意の細胞代謝物（それはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質などであり得る）、温度。本発明の特定の実施形態では、分析センサは、その微小発酵槽から回収されるべき細胞産物、または採取されるか、もしくは細胞により代謝される化合物を、検知および／または測定する。本発明の特定の実施形態では、分析センサは、代謝副産物、例えば毒素もしくは増殖阻害性副産物である細胞産物を検知および／または測定する。
【００７８】
本発明の特定の好ましい実施形態では、一つ以上の光学的センサが使用される。光学的センサは、他のセンサ群を超えるいくつかの長所を有する。それらは、電磁気的干渉および相互干渉からは免れており、高温において非侵襲性で、速く、および機能的であり、かつ、ヒトの血清および発酵培地のような厳しい条件においてさえも分析物の連続的なモニタリングが可能である。さらに、（例えば、光学的化学センサを使用する）光学的センサの別の望ましい特徴は、そのセンサが、一般に、測定されるプロセスと干渉しないことである。さらに、その材料は、通常安価であり、使い捨ての微小発酵槽へのそれらの組み込みが可能となる。
【００７９】
一般に、光学的センサは、培地の吸収特性、発光特性、または蛍光特性の誘起される変化（すなわち、分析物の存在により誘起された変化）を検知すること、すなわち測定することにより作動するデバイスである（化学的センサ）。一般に、光学的センサを使用する系は、光源（すなわち、光学的励起の供給源）および光を検知する手段を含む。供給源から放出された光学的励起は、光学的化学センサを励起させ、その光学的化学センサは、その後、発光するかまたは光を吸収する。その化学センサからの発光またはその化学センサに吸収された光の量は、分析物の濃度に依存して変化する。（検知器により測定された）発光または吸収された光の量の変化は、その分析物の濃度の変化を反映する。その化学センサは、多数の任意の異なる方法で提供され得る。例えば、本発明の特定の実施形態では、化学センサはその培養培地の中に存在するか、またはその培養培地に添加される。本発明の特定の実施形態では、化学センサは、ゾル−ゲルまたはポリマーマトリックスまたはフィルムの成分として提供され、それらの成分は、容器壁の少なくとも一つの部分を覆い得、またはその微小発酵槽の構造的構成要素を形成し得る。例えば、（６７）を参照のこと。
【００８０】
適切な光源として、とりわけ、発光ダイオード、レーザー、白熱灯または蛍光灯、グロー放電などが挙げられる。光を検知する適切な手段として、分光計、光センサ、電荷結合素子、ダイオードアレイ、光電子増倍管などが挙げられる。光学的検出系はまた、光を収集するための手段および／またはその光を供給源からもしくはそのセンサへ伝達するための手段を含み得る。さらに、そのような系は、励起光または放射光のいずれかをフィルターに通すために適切に位置したフィルタを含み得る。本発明の特定の実施形態では、光ファイバーデバイスが、供給源から、および／または検知手段へと光を送信するために使用される。用語「光ファイバー」は、情報のガラスまたはプラスチックワイヤーあるいはファイバーに沿った光の衝撃としての送信に関連した媒体および技術を指す。
【００８１】
光学的検出系に加えて、または光学的検出系の代わりに、任意の多種の他の技術プラットフォームが使用され得る。それゆえ、本発明の特定の実施形態では、化学検出系または電気化学検出系は、その微小発酵槽とともにおよび／またはその微小発酵槽に一体化して使用し得る。例えば、本発明者らは、赤外線光音響分光装置が、好ましくは小型化された大きさをとり、そしてＣＯ２を含む、広範囲の赤外線活性気体について敏感な道具として使用され得ることを示してきた（１１）。
【００８２】
（Ａ．酸素検出）
（１．統合型酸素センサ）
本発明の特定の実施形態では、その微小発酵槽システムは、その容器の中の溶存酸素（ＤＯ）をモニタリングする手段を含む。本発明の特定の好ましい実施形態では、酸素検出手段は、その微小発酵槽の構造的構成要素の中に、例えば、微小発酵槽の壁の中に統合される（すなわち、その微小発酵槽の構造的整合性を崩さずに、構造的構成要素から分離可能でない）。本発明の特定の好ましい実施形態では、その酸素検出手段は、光学的センサを含む。実施例４および（２３）により詳細に記載されるように、酸素を、フルオロフォアの上で酸素により産生される消光を利用する蛍光技術により検知し得る。適切な化合物として、ルテニウムＩＩトリス（４，７−ジフェニル−１，１−フェナントロリン）２＋が挙げられる。それの蛍光は、酸素存在下で消滅し、そして溶解酸素濃度および蛍光強度の関係は、ほとんど線形であることが示されてきた（３３）。さらに、この化合物は、滅菌可能であり（３４）、ポリマー（３４）およびゾル−ゲルマトリックス（３５）の両方に組込まれてきた。そのような特徴は、フルオロフォアが光学的センサにおいて使用されるために望ましい。もちろん、任意の多数の他の酸素感受性化合物を使用し得る。本発明の特定の実施形態に従って、そのような化合物は、その微小発酵槽の構造的構成要素の中に、例えば、光学的に透明な底壁、上壁または側壁面の中に組込まれます。例えば、実施例４により詳細に記載されるように、その化合物は、微小発酵槽の構造的構成要素（この場合微小発酵槽の基盤を形成するスライドガラス）に適用されるゾル−ゲルに組込まれ得る。その代わりに、その化合物は、支持体とともにまたは支持体なしでその微小発酵槽の底面、上面および／または内部の一つ以上の側面に適用され得、そして、この位置で固定化され得る。その化合物もまた、構造的構成要素が製造される材料に、直接組み入れられ得る。
【００８３】
（Ｂ．ｐＨおよび分析物のモニタリング）
本発明の特定の実施形態では、その微小発酵槽システムは、その微小発酵槽の内容物のｐＨをモニターする手段を備える。本発明の特定の実施形態では、その微小発酵槽システムは、酸素に加えて、または酸素の代わりに、一つ以上の分析物の存在をモニターする手段を含む。市販の血中気体（ｐＨ、ＣＯ２、Ｏ２）センサの状況において使用された方法を、その微小発酵槽における使用に適応され得る。そのようなセンサにおいて、ｐＨは、発色団により検知され、その発色団は、ｐＨの関数として自体の光学のスペクトルが変化する。吸収および蛍光に基づいた光ファイバーセンサを、使用し得る。二酸化炭素は、間接的に検知される、なぜなら、そのファイバーの先端上に固定された炭酸溶液の中でのその二酸化炭素の拡散がｐＨを変化させ、その結果、二酸化炭素濃度をｐＨの測定により測定し得るからである。
【００８４】
ヒドロゲル（親水性ポリマーの架橋されたネットワーク）をもまた、ｐＨ検出のために使用し得る。これらのヒドロゲルは、水の存在下で膨潤し、そして、それらの膨潤率がそれらの環境に依存して大規模な変化を遂げる、種々のヒドロゲルが、合成されてきた。ｐＨに加えて、温度、光、電場、圧力、炭水化物の存在、および抗原の存在を含む種々の他の環境的条件を検出、反応するヒドロゲルが、開発されてきた。ｐＨ依存性膨潤は、ポリマー骨格上の弱い塩基性基または酸性基の取り込みにより達成される。
【００８５】
二つの効果により、変化するｐＨ応答性ヒドロゲル膨潤の定量が可能となる。第一の効果は、膨潤におけるヒドロゲルの光学特性の変化である。この目的のために、直径で１ｐｍの埋め込まれた微粒子を含むヒドロゲル膜を、合成する。その膜は、そのヒドロゲルとその微粒子との間の屈折率の相違のために混濁する。その膜の濁度は、その微粒子の膨潤により酸性培地において減少し、その微粒子は、自体の屈折率を低下させて、それ自体の屈折率をヒドロゲルの屈折率に近付ける。濁度の変化を、光学的に検知し得る（４７）。
【００８６】
定量の第二の方法として、ヒドロゲルの導電性の変化を測定することが挙げられる。導電性の変化は、水和したゲルの中のイオン移動度の差異を反映することが見出されてきた（４８、４９）。この効果を、導電測定ｐＨセンサを微細加工するために使用されてきた（５０、５１）。生理的ｐＨ付近においてｐＨ単位当たり４５％の大きさのセンサ抵抗の変化が、報告されてきた。そのセンサの操作が、イオン移動度の変化に基づくので、それは、高いイオン強度の溶液の中で最良に動作する。
【００８７】
検出、例えば、種々の分析物の光学的検出、を実施するための多数の他の方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．２００２００２５５４７；６，３７７，７２１；６，２８５，８０７および本明細書の参考を参照のこと。ファイバー−光学デバイスおよび／または光学的化学センサの使用に向けた他の手段は、例えば、（３６−３９）に、および本明細書の参考に見出される。
【００８８】
（Ｃ．温度検出）
本発明の特定の実施形態では、温度制御は、温度センサおよび抵抗ヒーターを、例えば、（９）に記載されるような設計に組み入れることにより達成される。本明細書に記載されるように、本発明者らは、微小機械システムの文脈において、反応容積を一様に加熱し、その間正確に温度をモニターすることが可能であることを示した。光学的化学センサを使用する温度をモニターする方法は、当業者に公知である。
【００８９】
（Ｄ．バイオマスのモニタリング）
多数の技術を、バイオマス（例えば、細胞密度）を検出し定量するために使用し得る。本発明の特定の実施形態では、バイオマスを、吸光度を使用してモニターする。吸光度の検出を、現在実験室用分析で行われるように、６００ｎｍでの吸光度測定を使用して実施し得る。吸光度測定を、その微小発酵槽の容器壁の透明な部分を通過して、または導波管を使用して実施し得る。実施例４は、光源が、その微小発酵槽の一つの側（この場合は、底面）に光を供給し、そして、その微小発酵槽を通過して送信された光が、異なる側（この場合は、上面）で捕らえられる、一つの実施形態を記載する。適切な光源、検知器および光送信デバイスは、上に記載される。レンズ、フィルタ、ビームスプリッター、ダイクロイックス（ｄｉｃｈｒｏｉｃｓ）、プリズムおよび鏡のような設備を、検知および正確さを増強するために組込まれ得る。本発明の特定の実施形態に従って、容易にモニターされるレポーター酵素、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質または発光タンパク質を産生する細胞が使用される。
【００９０】
本発明は、バイオマスをモニターする代替手段または補足的手段として、とりわけ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（内因性発色団があり、それゆえ蛍光指示薬として機能し得る、ピリジンヌクレオチド）を含む、細胞代謝物の検知をもまた、包含する（５２、５３）。
【００９１】
本発明の特定の実施形態に従って、一つ以上のパラメータまたは分析物を、ラマン分光計を使用して測定する（８０、８１）。この技術は、有機化合物、例えば、栄養素、細胞の代謝産物など、を測定するのに特に適切であり得る。
【００９２】
（Ｅ．自己組織型センサ）
金属表面においては、自己組織化を、化学検出能力を有する改変された電極を産生するために使用し得る。例えば、チオールは、シリコン（酸化物）基板上にパターン化された金の微小電極上に吸着し得、そして、選択的に電極を官能化し得て背景基板を官能化し得ない（１８）。電場応答性チオール試薬（特に、キノンチオールおよびフェロセンチオール）の使用により、単純な製造方法論により金電極からｐＨセンサを生成することの可能性が提供された（１９）。例えば、その微小発酵槽の製造の間に、種々の微小電極は、容易にその微小発酵槽の構造の中に戦略的に導入し得、そして、自己組織を、引き続いてそれらの表面を官能化して、そのデバイスの中の内蔵化学センサを産生するために使用し得る。現在の能力により、ｐＨ、ハロゲン化物検知、グルコースモニタリング、および少数の他の種のための電気化学センサの調製が可能となり、その能力を、所定の他の分析物のための局所的プローブを提供するために拡張し得る。
【００９３】
（Ｆ．センサの感度の増強）
本発明は、統合化光学的構成要素を使用することによる生物センサの感度を増強するための種々の手段を包含する。そのような一つの手段として、導波管の中に光を放出する蛍光指示薬のための路長とエバネッセント波分光計（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  ｗａｖｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）の吸収路長（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐａｔｈ  ｌｅｎｇｔｈ）との相互作用の増強が挙げられる。これは、シリコン／二酸化ケイ素の中の平面導波管の使用により実現される。第二の手段は、二酸化ケイ素導波管にシリコンアバランシェフォトダイオード（ａｖａｌａｎｃｈｅ  ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ）を統合することにより蛍光検知プロセスの感度を増強することである。最近、これらのアバランシェフォトダイオードにより、水流の中の単分子検知が可能となった（２１）。
【００９４】
（１．導波管センサ）
ファイバー光学的センサは、一般的に導波管センサとして指し示され得るものの中で唯一の実現物である。一般に、これらのセンサは、導波管コアと導波管クラッドとの間の屈折率差に依存して光を閉じ込める。そのコア表面に非常に接近して存在する、光子場（ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｉｅｌｄ）は、エバネッセント波と呼ばれ、ならびに、周囲の培地の吸収を探知するために使用され得るか、または、蛍光により励起し得る。クラッドを剥ぎ取って、導波管を、蛍光指示薬の溶液の中へ浸す場合、導波管コアの中の光により励起された蛍光のみが、露出したコアを囲むシース（ｓｈｅａｔｈ）の中の色素分子から出現し得る。その蛍光の中のいくつかは、導波管への中に戻って結合して終端に現れ得る。
【００９５】
本発明の特定の実施形態に従って、長方形の断面を有する平面導波管は、マイクロスケールバイオリアクタープラットフォームに統合される。これらのデバイスにより、その導波管が分析物を通過し得る蛇行経路の効果により、相互作用路長における劇的な増強が可能となる。例えば、蛇行した導波管により、１平方センチメートルの表面領域上で１メートルの光路長を圧縮し得る（図８を参照のこと）。より重要なこととして、この導波管の総体積は、１ナノリットル未満であり得る。それゆえ、平面導波管により、微視的な分析物容積を通過する巨視的な光学的断面積が実現し得る。本発明の特定の実施形態では、導波管センサを組込むマイクロスケールバイオリアクターは、１ｍｌ以下の内容積を有する。本発明の特定の実施形態では、導波管センサを組込むマイクロスケールバイオリアクターは、２００μｌ未満の内容積を有する。本発明の特定の好ましい実施形態では、その稼動体積は、５０μｌ以上で１００μｌ以下である。本発明の特定の好ましい実施形態では、その稼動体積は、５μｌ以上で５０μｌ以下である。本発明の特定の好ましい実施形態では、その稼動体積は、５μｌ以上で１０μｌ以下である。本発明の特定の好ましい実施形態では、その稼動体積は、約７．５μｌまたは約１０μｌである。本発明の特定の好ましい実施形態では、その稼動体積は、約５μｌである。導波管センサを、任意の適切な技術を使用して製造得る。（いくつかの手段について、例えば、米国特許番号６，３５５，１９８を参照のこと）
（２．単光子アバランシェダイオード）
マイクロスケールバイオリアクターの少ない容積は、分析を小容積の分析物上で実施すべきであることを、必然的に意味する。その導波管生物センサが、利用可能な分析物による最大の相互作用を有し得る一方、本発明の特定の実施形態では、さらなる感度は、導波管を有する光センサの直接の統合により実現される。フローセルの中の単分子検知における最近の進歩は、高い量子収量および低い時間変動を有する単光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）の開発により、可能となった。ＳＰＡＤにより提供された増加した蛍光検知効率により、単一の発色団分子の検知が可能となった（２３）。
【００９６】
４００〜８００ｎｍの波長について９０％の量子収量を有するシリコンアバランシェフォトダイオードは、市販される。これらのデバイスは、アバランシェプロセスにより４０〜１００の内部電気利得を有し、そして、極めて低い雑音および高いダイナミックレンジを呈示する。微細加工されたＳＰＡＤを、容易に導波管生物センサに統合し得る。この方法では、蛍光を、生化学において使用される実質的にすべての可視マーカーおよび近赤外マーカーについての少数の分子からさえも、モニターし得る。
【００９７】
（３．バイオリアクターにおける光学的背景）
光学的センサを発酵プロセスに連結することに対する重大な障害は、培地からの干渉である。このことは、細胞および他の不透明な成分を含有する、発酵培地の内容物が原因となる。これらの材料は、光を吸収し、および光を散乱させ、それにより、その光学的信号を干渉する。本発明は、バイオプロセスモニタリングの複雑さに対処するための三つの手段を包含する。
【００９８】
第一には、導波管の検出表面に沿って微孔フィルタを統合させることである。最近、ナフィオン（Ｎａｆｉｏｎ）の中でのルテニウム複合体の固定化に基づく、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの発酵においてｐＨをモニターするための、導波管ベース光学的センサが、呈示された。培地からの干渉を、その検出フィルムの上面上での黒い微孔フィルタ膜の追加により除去した（２４）。これらのフィルタ膜を、導波管の加工の後に沈着し得るか、またはそのセンサプロセスの間に直接微細加工し得るかのいずれかである。
【００９９】
第二の手段は、蛍光寿命分光のために高速ＳＰＡＤを使用することである。蛍光寿命法が、光学的検出において成功して適用し得ることは、十分に文書化されてきた。これらの方法は、強度に基づく方法においてかなりの長所を有する。指示薬の蛍光寿命は、固有特性であり、そして、光源強度、検知器感度、光学システムの光処理能力、検出層の厚さおよび指示薬濃度の変動に、実質的に依存しない（２５）。このことは、吸収方法とは対照的に、参照測定システムが必要ではないこと、および、蛍光強度測定とは対照的に、機器のパラメータの変化に対する補正が必要ではないことを意味する。寿命に基づくセンサは、再較正を必要とせず数年にわたり安定であり得る（２６）。
【０１００】
（Ｇ．複数の検出手段）
使用された検出方法論にかかわらず、本発明の特定の実施形態では、マイクロスケールバイオリアクターは、複数の（すなわち、少なくとも２、３、４、５個、またはさらにそれ以上の）センサを組込み、それゆえ、複数のバイオプロセスパラメータのモニタリングが可能となる。本発明の特定の実施形態では、その微小発酵槽は、酸素をモニターするためにセンサを組込む。本発明の特定の実施形態では、その微小発酵槽は、酸素ならびに、少なくとも一つの他の分析物またはパラメータをモニターするためのセンサを組込む。本発明の特定の実施形態では、その微小発酵槽は、酸素およびｐＨモニターするためのセンサを組込む。本発明の特定の実施形態では、その微小発酵槽は、酸素、温度ならびに、少なくとも一つの他の分析物またはパラメータをモニターするためのセンサを組込む。それらのセンサは、同じ技術プラットフォームに基づき得（例えば、それらのセンサは、すべて光学的化学センサであり得る）、または、異なる技術プラットフォームに基づき得る。本発明の特定の実施形態では、バイオマスおよび少なくとも一つの追加のパラメーター（例えば、溶解酸素濃度）を、光学的にモニターする。本発明の特定の実施形態では、その追加のパラメータを、光学的化学センサを使用してモニターする。モニタリングを、継続的に実施し得、そして、複数のパラメータを、同時にモニターし得る。光学的センサが使用される場合、可能な限りセンサの混信を回避することは、重要である。例えば、吸光度測定のための吸光読み取りが典型的には６００ｎｍおいてなされるという事実を考慮することは、重要であり得る。
【０１０１】
モニタリングにより得られた情報を、微小発酵槽条件を制御するために、および／または微小発酵槽条件を変化させるために使用し得る。そのようなモニタリングおよび変化を、適切なソフトウェア（例えば、ＬａｂＶｉｅｗ  ｓｙｓｔｅｍ）により制御し得る。微小発酵槽アレイの場合には、おのおのの微小発酵槽を、個々にモニターして制御し得る。図２１は、吸光度センサ、溶解酸素濃度センサ、およびｐＨセンサを統合した微小発酵槽の概略図を示す。図２１に示されるように、その微小発酵槽および関連する光学技術は、バイオプロセスパラメータを測定および／または制御するための機器ならびにコンピューターソフトと接続される（以下を参照のこと）。
【０１０２】
（Ｖ．バイオプロセスパラメーターコントロール）
本明細書に記載したように、本発明の特定の実施形態において、バイオプロセスパラメータのモニタリングに加えて、一つ以上のこれらのパラメータが、能動的に制御され得、および／または変えられ得る。
【０１０３】
（Ａ．ガス交換）
本発明の特定の実施形態において、酸素送達および／または二酸化炭素のような廃棄ガスの除去は、ガス透過性膜により、達成される。好ましくは、このような膜は、培養培地の構成成分に対して、比較的、不透過性である。通気孔膜（例えば、ポリプロピレン（ＰＰ）およびポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ））および拡散膜（例えば、ＰＤＭＳ）のような培養物を通気するために代表的に使用される二つのカテゴリの膜が、一般に微少発酵槽を通気するために使用され得る。
【０１０４】
多孔性膜は、２ｍｍ〜１０μｍの直径の細孔を含むポリマー性マトリックスからなる。多くの細孔の幾何学的形状が存在し、幅広い範囲の細孔サイズと共に、クヌーセン拡散（小さい孔）および粘性流（大きい孔）を含むいくつかの異なるＯ２輸送体制を生じる（５９）。拡散膜（分子細孔を含む）を介した大量運搬は、熱力学パラメータ、溶解度Ｓおよび動力学的パラメータ、拡散率Ｄの関数である。これらのパラメータのいずれかが、これら二つの間の相互作用の性質に基づいて、所定のポリマーおよび浸透液の大量運搬を支配する。
【０１０５】
膜に対する適切な材料としては、例えば、微小孔膜テフロン（登録商標）（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ  ＡＦ２４００、ＤｕＰｏｎｔ）といったフッ素ポリマー、Ｇｏｒｅｔｅｘ、酢酸セルロース、細孔性ガラス（例えば、Ｖｙｃｏｒ）、微小孔セラミック膜（例えば、ゾル−ゲル技術により作製される）、ゼオライト膜およびシリコーン（例えば、拡散膜ＰＤＭＳ）が挙げられる。ＰＤＭＳおよびＴｅｆｌｏｎ  ＡＦ２４００の適切な浸透性、溶解性および拡散性パラメータが、表１、２および３（６０〜６６のデータ）に示される。
【０１０６】
【表１】
2005523717.tif 000003
【０１０７】
【表２】
2005523717.tif 000004
【０１０８】
【表３】
2005523717.tif 000005
【０１０９】
表２では、溶解性Ｓは、二相間の数密度の割合として定義され、膜の両側の大部分（ｂｕｌｋ）の溶液中の濃度を与えるポリマー界面の濃度を計算するために使用される。次いで、浸透性Ｐは、拡散性Ｄの単位を有し、「調整された」拡散性として、考えられ得る。これは、通常浸透性に与えられる単位（表１）とは対照的に、以下：
Ｐ＝ＤＳ
および
Ｎ＝Ｄ／ｔ（Ｃ１−Ｃ２）
の関係から生じ、ここで、Ｎは膜を介した浸透流量である。当業者は、水、酸素、二酸化炭素および他の浸透物に対する適切な拡散性および溶解性を有する膜材料を選択し得る。
【０１１０】
好ましい材料は、生物適合性の比較的強く、かつ薄膜（例えば、微小発酵槽の厚さに類似した厚さを有する膜）に形成され得るものである。膜の外表面（すなわち、微小発酵槽の内容物と接触しない面）は、微小発酵槽培養容器中の酸素濃度より高い酸素濃度を有する酸素源と接触する。この酸素源は、気体または液体であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、その酸素源は、気中より高い酸素含有量を有する気体である。微小発酵槽中の細胞に酸素を供給するために、酸素は、膜を越えて拡散する。本発明のいくつかの実施形態において、２つ以上の分離膜が、微小発酵槽に組み入れられる。第二膜の外表面は、微小発酵槽容器の内容物より低い酸素濃度を有する気体または液体と接触し得る。この方法では、微小発酵槽容器を越えた酸素勾配が構築され、それは、酸素添加を促進する。膜の外表面が接触する相対酸素濃度を変化することにより、微小発酵槽中の酸素濃度を制御することが可能である。
【０１１１】
通気膜が、微小発酵槽系の好ましい実施形態中で使用されるが、本発明はまた、酸素を供給する他の方法（例えば、小型化電磁攪拌機、通気の泡立ち作用、圧電性振動または酸素の化学的産生（この場合、有毒な副産物の形成を避けることが好ましい））の使用も含む。
【０１１２】
本発明の好ましい実施形態において、標準的発酵過程（例えば、約１０１２細胞／リットル）で使用される細胞濃度に相当する細胞濃度で好気性代謝を受ける細菌細胞の生存および増殖を補助するために、微小発酵槽の内部に十分な酸素が供給される。本発明のいくつかの実施形態において、例えば、約１０６細胞／ｌまで、約１０７細胞／ｌまで、約１０８細胞／ｌまで、約１０９細胞／ｌまで、約１０１０細胞／ｌまで、約１０１１細胞／ｌまで、約１０１２細胞／ｌまで、または約１０１３細胞／ｌまでの細胞濃度の範囲で、好気性代謝を受ける細菌細胞の指数関数的な増殖を補助するために、十分な酸素が供給される。当該分野で周知であるように、哺乳動物細胞は、代表的には、酸素摂取速度が好気性細菌より低い。
【０１１３】
（Ｂ．雰囲気制御）
（１．温度制御）
上で記載したように、本発明のいくつかの実施形態において、温度制御は、微小発酵槽の設計に、温度センサおよび抵抗性ヒーターを組み込むことにより達成される。例えば、発明者らは、微小機械系の文脈において、温度（９）を正確にモニタリングする間に、反応容量を均一に加熱することが可能であることを示した。さらに、本発明のいくつかの実施形態では、加熱および冷却に対する熱交換機が、（１０）に記載された様式と類似した様式で、微小発酵槽に組み込まれる。微細加工熱交換機の例が、図９に示される。小寸法微細加工デバイスの卓越した熱交換特性は、良好な温度均一性および小さい時定数を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、その温度は、±２℃以内に制御される。本発明のいくつかの実施形態では、その温度は、±１℃以内に制御される。本発明のいくつかの実施形態では、その温度は、±０．１℃以内に制御され得る。
【０１１４】
本発明の特定の実施形態では、温度制御は、微小発酵槽を温度制御環境下に設置することにより（例えば、微小発酵槽を実施例３に記載の温度制御インキュベーターまたは温度制御チャンバ内に設置することにより）、達成される。温度制御は、例えば、チャンバの底に、所望の温度の水を流すことによって達成され得る。
【０１１５】
（２．エバポレーション制御）
本発明のいくつかの実施形態では、適切な湿度は、微小発酵槽を湿度制御環境下に設置することにより維持される。例えば、実施例３に記載されるように、微小発酵槽は、開放性の水用レザバを有するチャンバ中に設置され得る。あるいは、加湿した空気が、チャンバ内に流され得る。本発明の好ましい実施形態では、チャンバは密閉される。微小発酵槽に通じるチャンネルを密閉することもまた、エバポレーションを最小化する。さらに、微小発酵槽の構造的構成要素に対する材料の適切な選択（例えば、疎水性材料の選択）は、エバポレーションを減少する。
【０１１６】
本発明のいくつかの実施形態では、一つ以上の膜（その一方の側は、微小発酵槽容器の内部に接触し、もう一方の側は、加湿した空気または水に接触する）は、少なくともエバポレーションによる減少の一部を補償する。加湿した空気または水は、膜を越えて流され得る。上に記載したように、気体浸透膜により分離された二つの容器を組み入れた種々の設計が使用され得る。
【０１１７】
（Ｃ．ｐＨ制御）
多くの部分では、タンパク質の構造および活性がｐＨ依存的であるために、細胞輸送プロセス、反応およびそれ故に増殖速度もｐＨに依存する。進行中の代謝活性のような因子は、培養培地中のｐＨを変化させ得る。従って、本発明のいくつかの実施形態は、ｐＨを制御する手段を含む。本発明のいくつかの実施形態では、ｐＨ制御は、適切な緩衝液を供給することにより、達成される。その緩衝液は、培養培地中に供給され得る。あるいは、外部の緩衝液源が使用され得、その場合、本発明は、外部緩衝液源と微小発酵槽容器の内部との間の接触を含む。多くの細菌に関して、増殖速度は代表的には、ｐＨの範囲が６．５〜７．５の範囲で最大に達する（５５）。代表的には、最適ｐＨの１．５〜２．０単位上か下かで、ごく少量の増殖が生じる。多くの真核細胞は、ｐＨの変化に対して、さらに敏感に反応する。従って、本発明のいくつかの実施形態では、微小発酵槽系は、細胞の増殖に対して最適ｐＨの±０．１ｐＨ単位内で、ｐＨを制御する手段を含む。本発明のいくつかの実施形態では、微小発酵槽系は、細胞の増殖に対して最適ｐＨの±０．２ｐＨ単位内で、ｐＨを制御する手段を含む。本発明のいくつかの実施形態では、微小発酵槽系は、細胞の増殖に対して最適ｐＨの±０．５ｐＨ単位内で、ｐＨを制御する手段を含む。本発明のいくつかの実施形態では、微小発酵槽系は、細胞の増殖に対して最適ｐＨの±１ｐＨ単位内で、ｐＨを制御する手段を含む。本発明のいくつかの実施形態では、微小発酵槽系は、細胞の増殖に対して最適ｐＨの±１．５ｐＨ単位内で、ｐＨを制御する手段を含む。本発明のいくつかの実施形態では、微小発酵槽系は、細胞の増殖に対して最適ｐＨの±２ｐＨ単位内で、ｐＨを制御する手段を含む。当業者は、科学的文献を参照することにより、および／または、他のパラメータを一定に保持しながら、異なるｐＨ条件下で、体系的に細胞を培養することにより、細胞増殖に対する最適ｐＨを容易に決定することが可能である。最適ｐＨは、他の培養パラメーター（例えば、栄養分供給、温度など）に依存して、変化し得る。
【０１１８】
（Ｄ．栄養分制御）
本発明のいくつかの実施形態に従って、栄養分、賦活薬、緩衝液などの添加は、外部圧力に駆動される流れ（例えば、シリンジポンプのようなポンプによって生み出される）の使用を介して達成される。（４０）およびそれに含まれる参考文献もまた参照のこと。可能な場合、能動的な流量制御要素が使用され得る。このような要素（例えば、バルブ）の開発は、現在、微小電子機械系コミュニティで進行中であり、本明細書に記載された微小発酵槽の関係で、容易に適用される。
【０１１９】
あるいは、栄養分は、膜を通した拡散により（例えば、より大きなレザバから成分が一定に再生されるように）、供給され得る。上に記載したいくつかの二容器設計は、この特性を可能にする。
【０１２０】
（Ｅ．攪拌）
本発明のいくつかの実施形態では、懸濁液中の細胞の維持を補助するために、および微小発酵槽の底への細胞の沈殿を防止するために攪拌が使用される。微小発酵槽内の液体は、微小発酵槽を可動表面に接触することにより（振盪フラスコ攪拌を用いる場合）
、攪拌され得る。攪拌の代替方法（例えば、圧電性効果、磁気ビーズを用いた攪拌など）もまた、使用される。
【０１２１】
（Ｆ．微小発酵槽アレイにおけるバイオプロセスコントロール）
本発明は、一つ以上のバイオプロセスパラメータが制御されている多数の微小発酵槽を含む微小発酵槽系を提供する。例示的な実施形態は、図４Ｂ中に示される。本発明のいくつかの実施形態に従って、その系は、個々にアドレス可能なウェルを含み、それにより各ウェルは、固有の入力の組み合わせを受け得る。本発明のいくつかの実施形態に従って、各ウェルは、一つの次元に沿った入力を受け、アレイの第二の次元に沿った異なる入力を受ける。このアプローチは、二つの次元に限定されず、むしろ任意の数の異なる入力が提供され得る。本発明のいくつかの実施形態に従って、微小発酵槽は、マイクロ流体チャンネルによりアクセスされる。ウェルは、プレートまたは多層を含むプラットフォーム内に内蔵され得、それらの一つ以上は、ウェルに接続するチャンネルを含み得る。ウェルは、また、電子的にアドレスされ得る（例えば、そこから延びるワイヤにより）。電子的アドレスは、ウェル内の成分をコントロールするために、使用され得る。例えば、電子的アドレスは、温度を調節するために、ウェル内で抵抗を制御するために使用され得る。さらに、データは、各ウェルから独立に集められ得る。
【０１２２】
（ＶＩ．微小発酵槽および微小発酵槽アレイを使用する方法）
（Ａ．導入）
発酵は、薬学的産業、食品産業および化学産業で使用される生物学的製品の重要な供給源である（５４、６８〜７３）。これらの製品としては、一次および二次代謝物、酵素、組換えタンパク質、ワクチンおよび細胞それら自体（例えば、酵母）が挙げられる。商業的発酵過程の特徴（例えば、製造規模の発酵槽中で実施されるプロセス、ここで、製造規模の発酵槽とは、１０リットルと３００，０００リットルとの間の有効体積を有する発酵槽を意味する）は、株の改良および／または発酵条件の最適化を介して、これらの工業製品の増強された製造を促進する試みであった。
【０１２３】
株の改良は、代表的には、いくつかの手順（突然変異、遺伝的組換えおよび遺伝的操作）の内の一つを介して達成され、これらは全て、ＤＮＡ配列に変化を生じる。これらの技術は、多くの場合、所望の目的に到達するために、互いに組み合わせて使用される。現在、改良された株は、突然変異、スクリーニングおよびアッセイの３つの基本的要素の反復サイクルを使用して選択される。手引書のスクリーニング操作は、代表的には、振盪フラスコまたは試験管中で行われる。変異体は、一次スクリーニング中で培養され、的中したものは、産生された全産物を、アッセイ（例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または、ますます一般的になった酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ））を使用して測定することにより同定される。次いで、同定された的中物は、さらに進め、確認のためのさらなるスクリーニングを受ける。
【０１２４】
さらに、発酵および細胞培養は、他の生物における遺伝子機能の解明において、重大な役割を演じ得る。最も一般的な方法としては、クローニングおよび適切な宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母）内でのゲノム発現、それに続くバイオリアクター中での発酵が挙げられる。発酵は、遺伝子発現ならびに次いで発現されるタンパク質の生成最適化を調節する条件の同定を可能にする。細菌、真菌および植物を含む多種の生物に対する完全なゲノム配列が、現在利用可能であり、そして、ゲノム配列データの量は、急速に増加している（例えば、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｇｅｎｏｍｅを有するウェブサイトに利用可能である配列を参照のこと）。特に、最近のヒトゲノム配列の完成は、特に、この分野における労働集約的な課題を提供する。改良株のスクリーニングに対して上で同定された同一の課題は、ここにも関連し、そしてここには、培養条件の小型化に対する好機が存在する。
【０１２５】
（Ｂ．細胞型）
本発明のマイクロスケールバイオリアクターは、微生物（例えば、細菌（例えば、真正細菌、古細菌）、糸状菌または非糸状菌（例えば、酵母）、原生動物およびまた、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞などを含む任意の型の細胞を培養し、かつモニタリングするために、使用され得る。細菌は、好気性菌、通性嫌気性菌または嫌気性菌であり得、そして、以下の属：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、およびＰａｒａｃｏｃｃｕｓのメンバーが挙げられ得るが、これらに限定されない（使用され得る細菌の一覧については、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｂａｃｔｅｒｉｏ．ｃｉｃｔ．ｆｒ／ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ．ｈｔｍｌおよびｗｗｗ．ｂａｃｔｅｒｉｏ．ｃｉｃｔ．ｆｒ／ａｒｃｈａｅａ．ｈｔｍｌを有するウェブサイトを参照のこと）。酵母としては、以下：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、ＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＹａｌｌｏｗｉａの属のメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。昆虫細胞、例えば、バキュロウイルスの増殖を補助する細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｓｆ９細胞）（米国特許第４，７４５，０５１号を参照のこと）が使用され得る。このような細胞は、組換えタンパク質の産生に、特に有用である。哺乳動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＣＯＳ細胞などが使用され得るが、これらに限定されない。（７６）を参照のこと。以下に記載された方法の好ましい実施形態のいくつかにおいて、細胞は、市販のバイオプロセスで現在使用される型の細胞である。
【０１２６】
細胞は、新規に単離されるか、または天然に生じる株もしくは変異体とも呼ばれる改変体として同定される。細胞はまた、例えば、所望の表現形に対して選択され得る。細胞は、遺伝的に（例えば、組換えＤＮＡ技術を使用して）改変され得る。例えば、細胞または改変体株または変異体は、適切なヌクレオチド変化を生物のＤＮＡに導入することにより調製され得る。その変化としては、例えば、目的の核酸配列中のヌクレオチドの欠失、挿入または置換が挙げられ得る。その変化としては、また、その株またはその細胞型には天然に見出されないＤＮＡ配列の導入が、挙げられ得る。当業者は、改変される特定の細胞型に依存した適切な方法を容易に選択し得る。このような変化を導入するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、オリゴヌクレオチド仲介突然変異生成、トランスポゾン突然変異生成、ファージ形質導入、形質転換、ランダム突然変異誘発（変異原性化合物、Ｘ線、ＵＶ光などの照射などに曝露することにより誘導され得る）、ＰＣＲ仲介突然変異誘発、ＤＮＡトランスフェクト、エレクトロポレーションなどが挙げられる。
【０１２７】
多数の細菌種を含む多数の異なる生物に対して、完全ゲノム配列が利用可能である。ゲノム配列の利用可能性は、突然変異体のパネルの作製を促進し、その内のそれぞれは、一つ以上の遺伝子またはオープンリーディングフレーム中の機能喪失型突然変異を有する（４２）。いくつかの場合、機能喪失型突然変異を有する特定の遺伝子は、「タグ化され（ｔａｇｇｅｄ）」、混合された集団中で特定の突然変異体を同定することを可能にする。
【０１２８】
当業者は、適切な培養培地および任意の特定の細胞型に対する環境条件を選択することが可能である。例えば、酸素送達、温度およびｐＨなどのようなパラメータは、適切なものに変化され得る。さらに、微小発酵槽の特性（例えば、表面特性、容器サイズなど）は、培養される特定の細胞型の特性に依存して改変され得る。
【０１２９】
（Ｂ．最適な株のスクリーニング）
本発明のマイクロスケールバイオリアクターは、バイオプロセスを行うための最適な生物を同定するために使用され得る。微小発酵槽は、複数の発酵を類似条件または同一条件下で、並行して行うことを可能にするので、それらは、最適には、このような条件下で行う細胞型（例えば、最大量の所望の産物を産生する細胞型、特定の栄養分を必要としない細胞型など）の選択における特定の使用を見出す。類似したかまたは同一の条件としては、増殖培地（炭素源、窒素源、前駆物質および例えばビタミン、ミネラル、塩類などの栄養分）、温度、ｐＨ、酸化還元電位、攪拌速度、通気速度、イオン強度、浸透圧、水分活性、静水圧、溶解酸素濃度または溶解二酸化炭素濃度、誘導因子および抑制因子の濃度などが挙げられ得るが、これらに限定されない。微小発酵槽は、天然に存在する株、突然変異体の集合、遺伝的に改変された生物の集合などのパネルのスクリーニングに有用である。複数の異なる細胞型または株が、類似または同一の条件下で平行に培養され得る。同一の細胞型は、異なる細胞濃度の範囲で、増殖され得る。特定の目的の株、突然変異体または改変体としては、栄養要求性株、調節解除突然変異体、フィードバック阻害に耐性の突然変異体、抑制に耐性の突然変異体などが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる考察は、（６８）を参照のこと。
【０１３０】
種々の基準に基づいて最適な株が選択され得る。例えば、最適な株は、所定の時間内に所望の産物を最大量生成する株；特定の開始材料を使用して所望の産物を産生し得る株（例えば、安価な開始材料）；特定の構成成分を欠如する培地中で増殖し得る株；培養中の有害代謝物または阻害代謝物の蓄積に耐性のある株；増殖条件（例えば、ｐＨ、酸素濃度など）の広い範囲に耐性のある株；高い細胞密度を達成し得る株などであり得るが、これらに限定されない。
【０１３１】
（Ｃ．最適なバイオプロセスパラメータ）
本発明のマイクロスケールバイオリアクターは、所定のバイオプロセスを実施するための最適なバイオプロセスパラメータの同定に有用である。微小発酵槽は、多数の可変物（例えば、生物量、酸素濃度など）の制御および／またはモニタリングを可能にするので、それらは、これらの可変物に対するどの値が所望の代謝物の最適な産生または所望ではない化合物の最適な除去につながるかを決定するために使用され得る。例えば、その最大増殖速度は、このような目的に対して最適な増殖速度ではないかもしれない。最大増殖速度より遅く増殖する細胞は、生物の増殖または代謝にネガティブに影響する副産物の蓄積の最小限化を補助し得る。
【０１３２】
変動され得るパラメータとしては、増殖培地（炭素／エネルギー源（例えば、グリセロール、コハク酸塩、乳酸塩および糖（例えば、グルコース、ラクトース、スクロースおよびフルクトース））、窒素源、前駆物質および栄養物（例えば、ビタミンおよびミネラル、塩類）など））、温度、ｐＨ、酸化還元電位、攪拌速度、通気速度、イオン強度、浸透圧、水分活性、静水圧、溶解酸素濃度または溶解二酸化炭素濃度、誘導因子および抑制因子の濃度などが挙げられるが、これらに限定されない。任意のこれらのパラメータは、平行に作動する個々の微小発酵槽中で、種々の方法で変えられ得、故に、パラメータの変更の時間最適な方法が同定され得、その方法は、例えば、プロセスを最適化するために、パラメータを変動する方法であり、その最適化は、例えば、所望の代謝物の生成を最大化することまたは所望でない化合物の除去を最大化することである。さらなる考察については、（６８）を参照のこと。
【０１３３】
多くの微小発酵槽の利用可能性（例えば、微小発酵槽アレイとして）は、他のパラメータを一定に保持しながら、一つのパラメータを広い範囲の値にわたって、体系的に変動することを可能にする。おそらく、より重要なことは、多数の微小発酵槽の利用可能性が、値の範囲にわたって多数のパラメータを同時に変動することの効果の評価を可能にすることである。所望の出力（例えば、培養培地からの生成物量または所望でない化合物の除去量）に対する効果の点で、これらのパラメータのいずれが重要かを決定するために、適切な数学的技術（これらは、おそらく、ソフトウェアで統合される）が、使用され得る。ソフトウェアパッケージ（例えば、ＪＭＰ（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、Ｎ．Ｃ．、ＵＳＡ）の使用および実験的設計（例えば、Ｐｌａｃｋｅｔｔ−Ｂｕｒｍａｎスクリーニング設計、分画要因計画、反応表面方法論、Ｂｏｘ−Ｗｉｌｓｏｎ中心複合設計法など）の使用を記載する、６８およびその中の参考文献を参照のこと。複数の微小発酵槽が、データの信頼性および統計的有意性を大きく増加させ得るバイオプロセスパラメータの各セットの下で、作動され得る。
【０１３４】
一旦、マイクロスケールバイオリアクターを使用して、一つ以上の細胞株および／またはバイオプロセスパラメータが、選択されると、スケールアップ（例えば、製造規模の発酵槽）が実施され得る。スケールアップの実施において、当業者は、因子（例えば、微小発酵槽と製造スケール発酵槽との間の酸素添加技術における違い、異なる形状、異なる剪断応力など）を配慮する（６８、７４、７５を参照のこと）。
（Ｄ．追加の適用）
マイクロ発酵槽およびマイクロ発酵槽アレイはまた、細胞におけるそれらの影響を決定するために、化合物のスクリーニングで用途を見出す。例えば、これらの発酵槽は、細胞増殖を阻害する化合物かまたは減少させる化合物かを同定するために使用され得、そして／または細胞への他の悪影響（例えば、ＤＮＡ損傷）を与えるのに使用され得る。細胞への潜在的な悪影響についてのスクリーニングは、任意の広範囲の用途（植物、動物および／またはヒトが化合物に曝露される）において、化合物の試験および／または開発に必要な工程である。さらに、細胞生存率および／または細胞増殖を減少するか、または阻害する化合物は、医薬品（消毒薬など）に有用であり得る。マイクロ発酵槽およびマイクロ発酵槽アレイはまた、細胞増殖を増大するかまたは亢進する化合物（細胞が所望の代謝産物を産生するか、または所望でない生成物を除去する能力を増大する）を同定するのに使用され得る。    
【０１３５】
本発明は、化合物に対する細胞応答を決定するためのマイクロ発酵槽およびマイクロ発酵槽アレイの使用を包含する。「応答」は、例えば：生存度、増殖率、代謝産物または他の生合成産物の産生、化合物の生体内変換、遺伝子の転写、タンパク質の発現などのパラメータの変化を含むが、これらに限定されない。一般に、マイクロ発酵槽およびマイクロ発酵槽アレイを用いる方法は、目的の化合物の存在下で、細胞を培養する工程、および化合物の存在下における目的のパラメータ値と化合物の非存在下または異なる濃度の化合物の存在下におけるパラメータ値とを比較する工程を包含する。
【０１３６】
（ＶＩＩ．マイクロ発酵槽の評価および従来の発酵槽技術との比較）
本発明の特定の実施形態において、マイクロ発酵槽の結果は、例えば、市販の発酵槽のスケールへとバイオプロセスをスケールアップすることによって得られる結果を、確実に予想する。例えば、本発明の特定の実施形態において、マイクロ発酵槽で培養される場合、最適な菌株として同定される菌株はまた、従来の発酵槽で実質的に同じ条件下で培養される場合、最適な菌株である。本発明の特定の実施形態において、特定のタイプの細胞がマイクロ発酵槽で培養される場合、生合成産物の産生または代謝産物の産生を最大に導くか、あるいは所望でない化合物の生体内変換または除去を最大に導く条件はまた、同じタイプの細胞が従来の発酵槽（例えば、少なくとも０．５Ｌ容積の培養器を有するベンチスケールの発酵槽、または製造スケールの発酵槽（この発酵槽は、数百Ｌの容積か、または何千Ｌの容積を有し得る））で培養される場合、生合成産物の産生または代謝産物の産生を最大に導くか、あるいは所望でない化合物の生体内変換または除去を最大に導く。しかし、マイクロ発酵槽の最適条件が、従来の発酵槽における最適条件と正確に対応するか、または与えられたセットの条件下における割合（例えば．化合物の産生率もしくは除去率、栄養流動率、ガスもしくは熱の輸送率など）が、従来の発酵槽において実質的に同じ条件下で得られる割合と正確に対応することは必ずしも必要ではない。むしろ、本発明の特定の実施形態において、細胞がマイクロ発酵槽で増殖される場合に得られた条件および／または割合が、このプロセスがスケールアップされる場合の挙動を予測するのに使用され得るのであれば重要である。
【０１３７】
マイクロスケールバイオリアクターの条件が、大きいスケールのバイオリアクターの条件において、どのように対応するか、またはどのように移すかを最初に決定する目的について、例えば、異なる条件下における生理現象および挙動においてよく特徴付けられる細胞型または菌株を使用することは望ましい。マイクロスケールバイオリアクターの実施およびスケールアップを分析する用途において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは、魅力的な原核細胞の選択を意味する。異なる反応条件下で、この生物の生理現象（例えば、4１を参照のこと）およびその挙動について記載する一連の文献がある。さらに、この生物は現在、小分子の産生および遺伝子ライブラリーのスクリーニングを含め、市販のプロセスの範囲内で使用される。この生物の化学組成は、元素組成および主要な生化学のフラックスに関して非常によく理解されている。最終的に、この生物は遺伝子レベルで広範囲に研究されている；変異体の膨大な収集は、多くの有益な特性で利用可能であり、そして、この種の完全なゲノム配列が決定されている。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの出芽における比較可能な情報度は利用可能であり、マイクロスケールバイオリアクターの性能およびスケールアップの分析における使用について、この酵母を魅力的な真核細胞型にさせる。
【０１３８】
多くの生物では、種々のプロモーターが、結合した遺伝子からの転写を増減することによって、異なる環境条件（例えば、温度、イオン濃度、酸素濃度など）、または生理的損傷（例えば、ＤＮＡ損傷、酸化的ストレスなど）に反応することが公知である。マイクロ発酵槽に培養される細菌が、生理学上のストレスに直面するかどうか決定するために、そして、マイクロ発酵槽内の増殖特性とより大きいスケールの発酵槽内の増殖特性とを比較するために、レポーター遺伝子を有する菌株（このようなプロモーターは、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）の発現を制御する）が使用され得る。
【０１３９】
本明細書に記載された本発明の種々の改変および変化は、当業者に明らかであり、特許請求の範囲内にもある。
【実施例】
【０１４０】
（実施例１）
（マイクロスケールバイオリアクターの製造）
生物学的な適合性および可視域における光透過性のために、一部のマイクロ発酵槽製造物質として、ポリ（ポリジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）を選択した。この物質の高ガス透過率はまた、通気膜の物質として使用されることを許容する。この透明度および剛性のために、マイクロ発酵槽のベースとして、ガラスを選択した。
【０１４１】
使用した製造手順を図１０に示す。マイクロ発酵槽の製造は、（５８）に記載されるように、ソフトリソグラフィーを用いて実施した。製造過程の第１工程において、ケイ素および感光性のエポキシＳＵ−８からネガティブマスタを製造するのに、写真リソグラフィーを使用した。次いで、マイクロ発酵槽の本体は、ネガティブマスタと硬化ＰＤＭＳおよび不動態化（シラン化）ＰＤＭＳの断片との間の液体ポリマーを圧搾することによって、ＰＤＭＳで鋳造した。液体ポリマーをスピンコーティングすることによって、ブランクウエハ上に通気膜を作製した。その後、エポキシまたは他の適当な接着剤（例えば、シリコーン接着剤）を用いたガラススライドに、本体および膜を結合させ、そして付着させた。（発酵槽本体に膜を接合するために、初めに、エアプラズマ密閉を使用した。しかし、この方法は、マイクロ発酵槽含量から高いエバポレーション率をもたらすと思われた（おそらく、表面親水性を示すＰＤＭＳの表面上のＳｉＯ−基の生成に起因する）。蒸発は、例えば、加湿したチャンバにおいて、マイクロ発酵槽を維持することによって、避け得る。）フェノールレッドで満たした完成したマイクロ発酵槽の平面を図１１に示す。マイクロ発酵槽は、約５ｍｍの直径および約３００μｍの深さを有する。マイクロ発酵槽容器の仕事量は、約５μｌである。３００μｍ×３００μｍの正方形断面を有するチャンネルは、容器内部から外部へ伸長し、容器内部に通じている。
【０１４２】
（実施例２）
（マイクロスケールバイオリアクター内の通気モデル）
マイクロ発酵槽への酸素拡散のモデルは、膜および培地の１次元抵抗性連続モデル（ｏｎｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｉｎ−ｓｅｒｉｅｓ  ｍｏｄｅｌ）を使用して実施し、酸素消費をゼロ次反応項（一定の酸素消費／生細胞）であるとみなした。３５℃における計算について、３．４×１０−５ｃｍ２／ｓのＰＤＭＳにおける酸素拡散率および０．１８ｃｍ３（ＳＴＰ）／ｃｍ３／ａｔｍの溶解度が予想された（４４）。水中の酸素に関しては、２．５×１０−５ｃｍ２／ｓの拡散率および７ｍｇ／ｌの溶解度が使用され（４５）、そして、培養培地に関する値は、ほとんど同じであると推定される。代表的な３０（ｍｍｏｌ  Ｏ２）／（乾燥細胞重量（グラム）／ｈ）のＥ．ｃｏｌｉ酸素吸収速度（ＯＵＲ）が推定された（４６）。
【０１４３】
このモデルは、淀んだ培地（混合なし）を推定した。何らかの混合方法を実施する場合、最大のマイクロ発酵槽の深さは増加する。このモデルは、定常状態の条件を推定する（増殖の間における、酸素輸送の非定常解析については以下を参照のこと）。細胞がマイクロ発酵槽容積（均質の場合）中に均一に拡散される場合に関して、以下の方程式を得た：
【０１４４】
【数１】
2005523717.tif 000006
【０１４５】
ここで：Ｒｖは、体積消費の項であり、
Ｄは、ＰＤＭＳおよびＨ２Ｏ各々における酸素の拡散率であり、
Ｃｒ（図１２中のＣ＊）は、これより下では細菌が嫌気的代謝経路（Ｃｒ＝０．００８２ｍｍｏｌ  Ｏ２／Ｌ）を作動させる、決定的な酸素濃度である（５５から）。
【０１４６】
水への酸素溶解度が、主な限界（そして、ＰＤＭＳ膜の透過率でない）であるので、このモデルは、培地だけを考慮することによって、簡素化し得る。
【０１４７】
【数２】
2005523717.tif 000007
【０１４８】
この方程式において、上記のＣは、ｘにおける濃度であり、そして、ｘはマイクロ発酵槽の深さに沿った座標軸である。
培地中の酸素濃度プロフィールの結果を示すプロットを図１３Ａに示す。
全ての細胞がマイクロ発酵槽の底面にあり、そして、消費量が不均質である場合において（境界条件）、以下の拡散方程式が適用される：
【０１４９】
【数３】
2005523717.tif 000008
【０１５０】
このＦは、マイクロ発酵槽の底面における酸素の流量であり、１単位面積あたりの酸素消費に対応している。率（Ａ／Ｖ）を掛けることによって、体積の項に変換される。
【０１５１】
上記で検討した均質な場合のように、限定因子はやはり水への酸素溶解度であるので、最大流動はわからない。これは、図１３Ｂ（ＰＤＭＳおよびその培地自体における酸素濃度プロフィールを示す）であり得る。この図についての条件は、さらに約１０１１細胞／Ｌの細胞集団であり、３０ｍｍｏｌ  Ｏ２／Ｌ／ｈの対応ＯＵＲである。１００μｍの膜厚、および３００μｍのマイクロ発酵槽の深さを使用した。
【０１５２】
図１３Ｂに示されるように、拡散プロセスは、最初に、膜と水との間の酸素濃度における急激な減少によって証明されるように、水への低い酸素溶解度によって制限される。各相におけるプロフィールの傾きが比較的浅いほど、両相における酸素の拡散率は十分に高い。この場合、ＰＤＭＳにおいて高い可溶性と組み合わされた高い酸素拡散率は、より薄い膜を使用することで同様の結果が達成されたことを示唆した。
【０１５３】
このモデルは、ＰＤＭＳにおける高い酸素溶解度に起因して、膜を介した酸素の拡散率が、より小さい規模になり得、さらに適切な酸素添加を供給し得ることを示す。従って、ガスの拡散率がＰＤＭＳで１０倍低かった場合でさえ、高い酸素溶解度を有する任意の膜は、設計と適合する。あるいは、拡散率がＰＤＭＳと同じくらい高い場合、溶解度は低いスケールであり得た。
透過率の項において：
Ｐ＝ＤＳ
ＰＤＭＳの透過率は、８００バール（１バール＝１０−１０ｃｍ３（ＳＴＰ）・ｃｍ／ｃｍ２・ｓ・ｃｍ  Ｈｇ）である（４４）。
【０１５４】
このモデルは、＞８０バールの酸素透過性を有する任意の膜が設計と連携し、透過率はおそらくより低くなり得る（比較的高い拡散率であるが、溶解度は低くなり得る）。
上記で記載したモデルは、定常状態の解析に基づくマイクロ発酵槽設計の可能性を確立する。増殖の間、酸素輸送の非定常解析によって、マイクロ発酵槽の設計をさらに有効にし得る。図２３は、マイクロ発酵槽における２つの酸素輸送領域を示す（使用されるパラメータは、表４に示す）。一過性のモデルは、等質に分散している細胞の指数増殖（最も多くの酸素を要求する増殖期）を推定し、そして、これは以下の３つの方程式に基づく。
【０１５５】
【数４】
2005523717.tif 000009
【０１５６】
図２４は、増殖時における膜とマイクロバイオリアクターとを横断する酸素濃度プロフィールを示す。前述の実施例のように、物質移動に対する主な耐性は、水への低い酸素溶解度の結果、膜というよりむしろ培地で起こる。３００μｍの深さは、十分な酸素添加により約１０１２細胞／Ｌの最終細胞数に達することが可能であることを見出した。この図から、酸素が徐々に枯渇する場合、濃度勾配が培地内に存在することもまた、明らかである。
【０１５７】
【表４】
2005523717.tif 000010
【０１５８】
【表５】
2005523717.tif 000011
【０１５９】
（実施例３）
（マイクロスケールバイオリアクター系の設定）
図１４は、光学励起および検出源に関連するマイクロスケールバイオリアクター系の構造図を示す。光ファイバーは、発酵槽の底面に光を伝える。上記の収集レンズに伝えられた光量を測定することによって、バイオマスをモニターする。
【０１６０】
発酵の間、環境制御を容易にするように設計された囲まれたチャンバに、マイクロ発酵槽を置く。チャンバはアルミニウムから作製し、回して取り付ける蓋（Ｏ−リングで密閉し得る）を有する。図１５Ａは、マイクロ発酵槽内部を有するチャンバを示す。図１５Ｂは、より明確にマイクロ発酵槽を示す、第２の光景である。（マイクロ発酵槽の基部を形成するスライドが透明であることに注意。）この系において、マイクロ発酵槽からの蒸発は、気密チャンバを作製することによって、そして、高湿（例えば、１００％の湿度）でチャンバ内に空気を維持することによって制御される。これは、チャンバ内のマイクロ発酵槽の横に水の開放レザバを置くことによって達成される。マイクロ発酵槽の容積と比較する場合、大きいチャンバ容積（約１９０ｃｍ３）は、実施全体に渡って、細菌を増殖させる必要性を供給するために、十分な酸素が存在することを保証する。利用可能な酸素の１％未満が、１２時間の発酵の経過の間に、細菌が呼吸することによって消費される。このチャンバは、その後、加熱サーキュレータ（ＤＣ−１０，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈａａｋｅ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、チャンバ基部内のチャンネルを介して、ウオーターバスから加熱された水を流すことによって一定の所望の温度に維持する。
光ファイバーは、チャンバーカバーおよびチャンバーベース（マイクロ発酵槽上およびマイクロ発酵槽直下の各々）の中心を通る。これらのファイバーは、伝達可能な光学的測定および反射的な光学的測定の両方を成功させる。マイクロ発酵槽の上に置かれたファイバーは、収集レンズ（Ｆ２３０ＳＭＡ−ａ，ＴｈｏｒＬａｂｓ）（マイクロ発酵槽の下にあるファイバーから放射され、その発酵槽の中を通って伝えられる光の捕獲の立体角を増強する）に取り付けられる。
【０１６１】
（実施例４）
（マイクロスケールバイオリアクターにおいて培養した細胞のバイオプロセスパラメータのモニタリング）
（細胞の調製および接種）
グルコースの添加有無のＬＢ培地（＋ａｍｐ）において、Ｅ．ｃｏｌｉを３７℃で１２時間培養した（４３）。マイクロ発酵槽への細胞の導入直前に、５％の接種物を、新鮮な培地に導入した。接種前に、ＵＶ光（２５４ｎｍの波長）に６０秒露出することによって、マイクロ発酵槽を滅菌した。チャンネルを介して、そして容器内部へ液体を駆動するために、シリンジを用いて細胞の接種を実施した。次いで、蒸発を最小にするために、エポキシを使用することによって、チャンネル孔（大きい範囲を自身で密閉する）をさらに密閉した。細胞との接触に起因する悪影響の証拠がない状態で、種々のエポキシおよび接着剤（例えば、Ｅｐｏｘｙ−ＩＴＷ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，部分番号：４６４０９／２０８４５，シリコーン接着剤−Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｅａｌａｎｔｓ，Ｉｎｃ．，ＡＳＩ＃５０２  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ）を使用した。しかし、接着剤の生物学的な適合性は、検討材料であり得る。一旦いっぱいになると、マイクロ発酵槽をチャンバに置き、基部に固定した。次いで、気密シールでチャンバを閉じ、そして、迷光による後の測定の干渉を防ぐために、光学的に密閉した。
【０１６２】
（バイオマスの測定）
バイオマスの定量化は、マイクロ発酵槽を介した光の透過に基づいた。光源は、６０９ｎｍのピーク波長を有するオレンジのＬＥＤか、または６３６ｎｍのピーク波長を有するヘリウムネオン（ＨｅＮｅ）レーザーである。上記で記載されるように、この光は、６００μｍの光ファイバーと結合される。マイクロ発酵槽上の６００μｍのファイバーは、分光光度計（ＯＣＳ−ＰＤＡ，Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）に透過光を運ぶ。光源から一時的な出力のドリフトについてチェックするために、光検出器（ＰＤＡ５５，ＴｈｏｒＬａｂｓ）を使用する。
光学密度（ＯＤ）は、以下を用いて計算する：
ＯＤ＝ｌｏｇ１０（１／Ｔ）
ここで、Ｔ＝強度（Ｉ）から計算された光の透過率であって、以下：
Ｔ＝Ｉｓｉｇｎａｌ／Ｉｒｅｆ
を使用する。
【０１６３】
従来の分光光度計によってキュベット内を測定する場合、光学密度に関する曲線は、発酵培地のサンプルを１０倍希釈することによって得られ、その結果、この曲線は分光光度計範囲の直線的な部分に入った。次いで、他の全ての希釈において、光学密度のこの値は、実際の光学密度を決定するのに使用した。
【０１６４】
（酸素溶解度の測定）
ルテニウムＩＩトリス（４，７−ジフェニル−１，１−フェナントロリン）２＋の蛍光消光を、マイクロ発酵槽の底面における溶存酸素を測定するために使用した。マイクロ発酵槽の基部を形成するガラススライドを、この化合物を含むゾル−ゲルでコーティングした。これらのスライドは、市販されている（Ｆｏｘｙ  ｓｏｌ−ｇｅｌ  ｓｌｉｄｅｓ，Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ）。分岐ケーブルは、励起波長の光をマイクロ発酵槽の基部まで運ぶ。光源は、ＵＳＢ−ＬＳ−４５０，Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓである。次いで、光ファイバーによって捕獲される放射光は、分光光度計（ＵＳＢ２０００−ＦＬ，Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ）に戻され、溶存酸素パーセントは、ＯＯＩＳｅｎｓｏｒｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ）を用いて計算する。
【０１６５】
（結果）
マイクロ発酵槽内のＬＢ＋ａｍｐ培地（グルコース添加無し）で増殖しているＥ．ｃｏｌｉについて、代表的な生細胞の計測（透過データから計算された光学密度に基づく）は、約４×１０９細胞／ｍＬ（４×１０１２細胞／Ｌ）の細胞濃度を示し、大きなスケールの発酵プロセスで利用されたものに匹敵する。
【０１６６】
図１６は、マイクロ発酵槽内のＬＢ＋ａｍｐで培養されたＥ．ｃｏｌｉのバッチ発酵から得られた、光学密度のデータおよび溶存酸素のデータを示す。酸素は、ＰＤＭＳ膜を介して供給され、そして、培地の積極的な撹拌は実施されなかった。溶存酸素は、Ｒｕベースの酸素センサーを用いて測定された。３つの異なる増殖期は、図１６で観察され得る。第一段階の間、細菌は対数増殖期に存在し、そして、３０分の見かけの倍加時間で増加している。（上記に記載した結果に従い、光学密度は、実際のバイオマスを予想通り過小評価するので、倍加時間は「見かけ」という。）この第一段階の間、十分な酸素は、この速い増殖を支持するために、拡散によって供給される。培地における可測酸素のレベルがゼロ付近に下がる場合に第２段階に到達し、そして、酸素は、マイクロ発酵槽容器に酸素が拡散するのと同じくらい早く、細菌によって利用される。この段階の間、細菌は直線的増殖に切り替わる。最終的に、第３段階は、細菌が定常期に達することを示す。この段階の間、酸素濃度は飽和に戻る。飽和に達するのに必要な時間は、非定常段階の一次元拡散方程式から予測され得る：
【０１６７】
【数５】
2005523717.tif 000012
【０１６８】
これは、３００μｍの深さまで、マイクロ発酵槽を完全に再酸素添加するために必要とされる、分の次数における推定値である。この時間は、図１７に示された２．５時間の測定時間よりも短いが、必要とされたより長い再酸素添加時間は、バイオマスにおいて観測された付随的な増加と一致する。図１７は、３０ｇ／Ｌグルコースを含むＬＢ／ａｍｐで培養されたＥ．ｃｏｌｉについての、比較曲線を示す。図１８Ａおよび図１８Ｂは、３７℃、５００ＲＭＰ、通気２ＶＶＭ（５０％  Ｏ２、５０％  Ｎ２）で、０．５Ｌのベンチスケールの発酵槽（Ｓｉｘｆｏｒｓ）内に３０ｇ／Ｌグルコースを含むＬＢ／ａｍｐで培養されたＥ．ｃｏｌｉの発酵を示す。増殖曲線およびマイクロスケールバイオリアクター中の酸素濃度曲線は、ベンチスケールの発酵槽中で獲得されるものと同様の傾向を示す。
（実施例５）
図１９は、本発明の実施形態の概略図を示し、ここでバイオマス、溶存酸素、およびｐＨが同時に測定され得る。マイクロ発酵槽は、実施例３および実施例４に記載されるように、基本的にチャンバから構築され、そして格納される。光学密度は、バイオマスの尺度として使用された。溶存酸素を測定するために、上記に記載したフルオロフォア（この蛍光は、酸素の存在下でクエンチされる）は、ＬＥＤによって励起され、そして、この発光の強度は、分光光度計を用いて読まれた。溶存酸素はまた、蛍光寿命測定を用いて測定され得る。マイクロ発酵槽中に設置されたｐＨセンサーホイル（Ｐｒｅｓｅｎｓ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において、蛍光寿命の変化を検出することによって、ｐＨは測定された。蛍光の寿命は、ロックイン（ｌｏｃｋ−ｉｎ）増幅器を用いて、強度調節されたＬＥＤに関連する蛍光の位相のずれを検出することによって、測定された。分岐光ファイバーは、種々の光学的測定が実施されるのを可能にするようにチャンバの底部と上部に挿入された。
【０１６９】
実施例４に記載したように、溶存酸素およびバイオマスが測定され、そして、同様の結果が得られた。図２０は、マイクロ発酵槽および０．５Ｌベンチスケール発酵槽（Ｓｉｘｆｏｒｓ）におけるｐＨ曲線を比較するグラフである。ベンチスケールの発酵槽内のｐＨは、約２時間後に下がり、そして６時間後に約５のｐＨに達する。同様の傾向がマイクロ発酵槽で観察され得る（このｐＨは５時間後に約５まで下がる）。
【０１７０】
（実施例６）
（マイクロスケールバイオリアクターレイを用いた菌株選択）
キシリトール（天然に存在する糖アルコール）は、ショ糖よりも低カロリーを有し、さらに匹敵する甘味を示す有望な低カロリー甘味料である。これは、現在、虫歯予防の甘味料であり、また、糖尿病の処置における輸液療法での使用も見出す。これらの理由のため、キシリトールの需要が今後増えると予想される。従って、キシリトールの需要は、将来増えると予想される。
【０１７１】
現在、キシリトールの工業生産は、米国特許第４，００８，２８５で開示されるように、主にＤ−キシロースの水素添加に依存する。新しい物質として使用されるＤ−キシロースは、木、わら、トウモロコシの穂軸、オート麦外皮および他のキシランが豊富な物質などの植物物質の加水分解によって獲得される。しかし、このようなＤ−キシロース（植物物質の加水分解によって産生される）は、かなり高価であり、かつ低い純度を有する。出発物質としてＤ−アラビトールを利用する他の生産方法は、複雑であり、多くの工程を包含する。キシリトールを産生するための改良された能力を有する微生物を開発するために、遺伝子工学を使用する試みは、限定的な成功を得ただけであった。従って、他の糖類および糖アルコールの産生で使用されるように、グルコースから開始する発酵による単一工程を介して、キシリトールを産生し得る微生物を同定することが望ましい。
【０１７２】
この必要性に立ち向かうために、好濃性微生物は、集積培養によって天然から回収される。２０％  Ｄ−グルコース、１％  酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）および０．１％  尿素を含有する培地を、４ｍｌ量の試験管に各々導入し、そして１２０℃で２０分間滅菌する。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ地域）の種々の位置から回収した土壌サンプルを、培地に接種し、振盪しながら３０℃で４〜７日間培養する。細菌増殖が観察される場合、同じ組成を有する寒天プレートにこの培養物を置き、３０℃で１〜３日間インキュベートする。単一コロニーを単離した。
【０１７３】
上記に記載されるように得られた約２０００の好濃性細菌の菌株は、マイクロ発酵槽アレイ内の個々のマイクロ発酵槽において、３０℃で１２時間から５日間の範囲の間で、２０％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコース、０．１％尿素および０．５％酵母抽出物を含む培地で培養する。マイクロ発酵槽は、５μｌの稼動体積を有し、バイオマスおよび酸素濃度をモニターする手段を備えている。各マイクロ発酵槽は、ＰＤＭＳ通気膜を介して、マイクロ発酵槽容器の内部に酸素を送達する。アクセスチャネルを用いて、１８個のマイクロ発酵槽に各菌株を導入する。各菌株あたり６つの時点の各々で３つの培養を、終結させる。マイクロ発酵槽アレイは、実施例３に記載するように、チャンバで維持され、これは、温度および湿度を制御する。バイオマスと溶存酸素濃度は、培養の期間モニターされ、そして、このデータは、適切なソフトウェアプログラムを用いて集積される。適切な培養期間（１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間または１２０時間）の後に、その時点で終結させるように、各マイクロ発酵槽から全ての培地を除去し、そして、キシリトールを産生する能力を有する菌株をスクリーニングするために、ＨＰＬＣで分析する。
【０１７４】
（実施例７）
（菌株特性およびマイクロスケールバイオリアクターレイを用いたプロセスパラメターの最適化）
（１）種々の炭素源を用いた酸産生の測定および細胞増殖の測定
個々のマイクロ発酵槽に種々の炭素源（１％）のうちの１つを含む培地中で、実施例６のように同定されたキシリトール産生株を各々培養し、形成される酸の存在を決定する。以下の炭素源を試験する：キシロース、アラビノース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、ソルボース（ｓｏｒｂａｓｅ）、ショ糖、麦芽糖、ラムノース、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、乳糖、デンプンおよびエタノール。この菌株を、フラスコ内のＹＰＧ培地で、２８℃１日間前培養し、次いで、０．５％酵母抽出物溶液で洗浄する。５つの菌株および１６個の炭素源を試験するので、合計８０の組み合わせがある。
【０１７５】
マイクロ発酵槽アレイ内の３０個のマイクロ発酵槽は、各菌株／炭素源の組み合わせ（合計２４００個のマイクロ発酵槽を作製する）について、ＹＰＣ培地中に細胞を接種する。各菌株あたり３つの時点の各々で１０個の培養物を終結させる。（ＹＰＣは、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、および、１％の種々の炭素源のうちの一つ（１２０℃で２０分間加熱することによって滅菌した後、無菌の炭素源を添加する）を含む培地である。特定のｐＨセンサーに依存し、培地は、ブロモクレゾールパープルのようなｐＨ感受性の染料を含み得る。マイクロ発酵槽は、５μｌの稼動容積を有し、バイオマス、酸素濃度、およびｐＨを光学的にモニターする手段を備えている。各マイクロ発酵槽は、ＰＤＭＳ通気膜を介して、マイクロ発酵槽容器の内部に酸素を送達する。
【０１７６】
マイクロ発酵槽アレイは、実施例３に記載するように、チャンバに維持され、これは、温度および湿度を制御する。バイオマス、溶存酸素濃度およびｐＨは、培養の期間モニターされ、そして、このデータは、適切なソフトウェアプログラムを用いて集積される。培養は、２８℃で４日、５日または６日間維持する。適切な培養期間の後に、その時点で終結させるように、各マイクロ発酵槽から全ての培地を除去し、そして、キシリトール産生量を決定するために、ＨＰＬＣで分析する。キシリトールの産生における産生スケールの発酵工程について、適切な菌株と培地を選択するために、このデータが使用され得る。
【０１７７】
(２）増殖におけるＮａＣｌ、酢酸またはエタノールの添加の効果
実施例６で同定されたキシリトール産生株を、増殖において、単一または組み合わせにおけるこれらの添加物の効果を決定するために、一定範囲の濃度のＮａｃｌ、エタノールおよび／または酢酸を含むＹＰＭ培地中で、個々のマイクロ発酵槽で、各々培養する。キシリトール産生株およびコントロールとしてＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ株ＮＣＩＢ  ８６２１を、ＹＰＧ培地（１％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１％ペプトンを１２０℃で２０分間加熱により滅菌し、その後Ｄ−グルコースを７％まで添加する）中で２８℃で１日間プレインキュベートし、洗浄し、そして、一定範囲の濃度で一つ以上の種々の添加物を有する培地へ再懸濁する。各添加物について、５つの異なる濃度を試験する。
【０１７８】
３０個のマイクロ発酵槽は、各添加物／濃度の組み合わせについて接種される（同一の１０個の培養物をそれぞれの３つの時点で終結させる）。マイクロ発酵槽は、５μｌの稼動容積を有し、そして、バイオマス、酸素濃度、およびｐＨを光学的にモニターする手段を備えている。各マイクロ発酵槽は、ＰＤＭＳ通気膜を介してマイクロ発酵槽容器の内部に酸素を送達する。マイクロ発酵槽は、実施例３に記載されるように、チャンバ中に維持されて、これは、温度および湿度を制御する。バイオマス、溶存酸素濃度およびｐＨは、培養期間中、モニターされ、そして、このデータは、適切なソフトウェアプログラムを用いて集積される。培養は、２８℃で４日間、５日間または６日間維持される。適切な培養期間の後に、その時点で終結させるように、各マイクロ発酵槽から全ての培地を除去し、そして、キシリトール産生量を決定するために、ＨＰＬＣで分析する。キシリトールの産生における産生スケールの発酵工程について、適切な菌株と培地を選択するために、このデータが使用され得る。
【０１７９】
【数６−１】
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【０１８０】
【数６−２】
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【０１８１】
【数６−３】
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【０１８２】
【数６−４】
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【０１８３】
【数６−５】
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【０１８４】
【数６−６】
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【０１８５】
【数６−７】
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【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１Ａ】図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の微小発酵槽の一つの実施形態の図案の上面図および側面図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の微小発酵槽の一つの実施形態の図案の上面図および側面図を示す。
【図２−１】図２Ａは、その発酵容器が外的環境に接触する二槽式微小発酵槽の側面図を示す。
【図２−２】図２Ｂは、その発酵容器が閉鎖された二槽式微小発酵槽の側面図を示す。
【図３】図３（上部）は、構成要素がその微小発酵槽の外側に提供される微小発酵槽の実施形態の図案を示す。図３（下部）は、本図の上部に描かれた微小発酵槽の微小発酵槽アレイの概略図を示す。
【図４−１】図４Ａは、集積された微小発酵槽アレイおよび関連するシステム構成要素についての基本骨格の概略図を示す。
【図４−２】図４Ｂは、微小発酵槽アレイおよび関連するマイクロ流体工学適用物（その中で、バイオプロセスパラメータが、個々の微小発酵槽の間において変動する）についての基本骨格の概略図を示す。
【図４−３】図４Ｃは、微小発酵槽アレイのロボット化された注入工程および試料抽出工程の概略図を示す。
【図５】図５は、金属酸化物表面上のオリゴ（エチレンオキシド）自己組織化単層膜の形成の略図を示す。
【図６】図６は、認識要素を組み込む自己組織化フィルムを産生するための戦略図を示す。
【図７】図７は、水和された金属酸化物表面からの表面開始型開環複分解ポリマー化反応の略図を示す。
【図８】図８は、直線型導波管（上）および蛇行型導波管（下）を示す。
【図９】図９は、微小的に組立てられた熱交換器の例を示す。
【図１０】図１０は、本発明の一つの実施形態において採用された組立て手順の流れ図を示す。
【図１１】図１１は、図１０に概要を示すように立てられて、フェノールレッドで充填された、完成した微小発酵槽の上面図を示す。
【図１２】図１２は、微小発酵槽の中への酸素拡散をモデル化するために使用した、その膜およびその培地の、一次元直列抵抗モデルを例示する。
【図１３−１】図１３Ａは、その培地全体にわたって均一に拡散した細胞集団を想定して得られた、一次元直列抵抗モデルを使用して計算された定常状態酸素濃度を示す。
【図１３−２】図１３Ｂは、１００μｍの膜の厚さ、３００μｍの微小発酵槽の深さ、および、細胞がその微小発酵槽の底面に存在する状態（不均一な場合）での、１０１１ｃｅｌｌｓ／Ｌの細胞集団を想定して得られた、膜および培地の一次元直列抵抗モデルを使用して計算された定常状態酸素濃度プロファイルを示す。
【図１４】図１４は、付随する光学的な励起および検出の供給源およびを伴うマイクロスケールバイオリアクター系の概略図を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、微小発酵槽が環境制御チャンバの中に設置される微小発酵槽システムの二方向からの図を示す。透明なスライドガラスは、容易には見えない。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、微小発酵槽が環境制御チャンバの中に設置される微小発酵槽システムの二方向からの図を示す。透明なスライドガラスは、容易には見えない。
【図１６】図１６は、グルコース欠損培地における微小発酵槽の中のＥ．ｃｏｌｉのバッチ発酵より得られた吸光度および溶解酸素濃度のデータを示す。
【図１７】図１７は、３０ｇ／Ｌグルコース含有培地における微小発酵槽の中のＥ．ｃｏｌｉのバッチ発酵より得られた吸光度および溶解酸素濃度のデータを示す。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、ベンチスケールの発酵槽の中のＥ．ｃｏｌｉのバッチ発酵より得られた吸光度および溶解酸素濃度のデータを示す。
【図１９】図１９は、生物量、溶解酸素濃度、およびｐＨを同時に測定し得る本発明の実施形態の概念図を示す。
【図２０】図２０は、その微小発酵槽におけるｐＨ曲線および０．５Ｌのベンチスケールの発酵槽（Ｓｉｘｆｏｒｓ）におけるｐＨ曲線を比較するグラフである。
【図２１】図２１は、吸光度検出器、溶解酸素濃度検出器、およびｐＨ検出器を積載した微小発酵槽ならびにそれに伴う関連する計測機器及びコンピューターソフトウェアの概略図を示す。
【図２２】図２２は、非コートガラス表面に曝露されるかまたは種々の櫛型ポリマーでコートされたガラス表面に曝露されるかどちらかの細胞の画像を示す。本図の上部中央のパネルは、そのポリマーの分子式を示す。
【図２３】図２３は、微小バイオリアクターにおける酸素移動の直列抵抗としてのモデル図を示す。
【図２４】図２４は、ＰＤＭＳおよび膜を横切ってのｔ＝０，１，２時間でのモデル化された酸素濃度プロファイルを示す（細胞増殖を対数増殖としてモデル化した）。
【図１Ａ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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