(57)【要約】  潜在的に感染性であるブタ内在性レトロウイルス（PERV）挿入部位に隣接するブタ核酸配列を同定し、単離した。ユニークな隣接配列には、PERV挿入部位の3'末端に隣接するブタ核酸配列、およびPERV挿入部位の5'末端に隣接するブタ核酸配列が含まれる。本発明は、試料中のPERV、特に感染力を有するPERVの存在を検出するための組成物および方法を提供する。また本発明は、異種移植組織として使用される、感染性PERVを含まないブタの育種またはブタ組織の選択に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性ブタ内在性レトロウイルス（PERV）挿入部位の3'末端隣接配列を含む単離されたブタ核酸配列。
【請求項２】
前記3'末端隣接配列が配列番号6を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項３】
前記3'末端隣接配列が配列番号7を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項４】
前記3'末端隣接配列が配列番号8を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項５】
前記3'末端隣接配列が配列番号9を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項６】
前記3'末端隣接配列が配列番号10を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項７】
前記3'末端隣接配列が配列番号11を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項８】
前記3'末端隣接配列が配列番号12を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項９】
前記3'末端隣接配列が配列番号13を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項１０】
前記3'末端隣接配列が配列番号14を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項１１】
前記3'末端隣接配列が配列番号15を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項１２】
前記3'末端隣接配列が配列番号16を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項１３】
前記3'末端隣接配列が配列番号17を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項１４】
前記3'末端隣接配列が配列番号18を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項１５】
前記3'末端隣接配列が配列番号19を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項１６】
前記3'末端隣接配列が配列番号20を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項１７】
前記3'末端隣接配列が配列番号21を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項１８】
前記3'末端隣接配列が配列番号22を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項１９】
前記3'末端隣接配列が配列番号23を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項２０】
前記3'末端隣接配列が配列番号24を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項２１】
前記3'末端隣接配列が配列番号25を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項２２】
前記3'末端隣接配列が配列番号26を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項２３】
前記3'末端隣接配列が配列番号27を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項２４】
前記3'末端隣接配列が配列番号28を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項２５】
前記3'末端隣接配列が配列番号29を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項２６】
前記3'末端隣接配列が配列番号30を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項２７】
前記3'末端隣接配列が配列番号31を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項２８】
前記3'末端隣接配列が配列番号32を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項２９】
前記3'末端隣接配列が配列番号33を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項３０】
前記3'末端隣接配列が配列番号34を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項３１】
前記3'末端隣接配列が配列番号35を含む、請求項1のブタ核酸配列。
【請求項３２】
配列番号8を含むまたはATCC番号 によって特定される感染性PERV挿入部位の単離された3'末端隣接配列。
【請求項３３】
配列番号24を含むまたはATCC番号 によって特定される感染性PERV挿入部位の単離された3'末端隣接配列。
【請求項３４】
配列番号33を含むまたはATCC番号 によって特定される感染性PERV挿入部位の単離された3'末端隣接配列。
【請求項３５】
感染性ブタ内在性レトロウイルス（PERV）挿入部位の5'末端隣接配列を含む単離されたブタ核酸配列。
【請求項３６】
前記5'末端隣接配列が配列番号101を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項３７】
前記5'末端隣接配列が配列番号102を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項３８】
前記5'末端隣接配列が配列番号103を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項３９】
前記5'末端隣接配列が配列番号104を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項４０】
前記5'末端隣接配列が配列番号105を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項４１】
前記5'末端隣接配列が配列番号106を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項４２】
前記5'末端隣接配列が配列番号107を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項４３】
前記5'末端隣接配列が配列番号108を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項４４】
前記5'末端隣接配列が配列番号109を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項４５】
前記5'末端隣接配列が配列番号110を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項４６】
前記5'末端隣接配列が配列番号111を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項４７】
前記5'末端隣接配列が配列番号112を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項４８】
前記5'末端隣接配列が配列番号113を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項４９】
前記5'末端隣接配列が配列番号114を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項５０】
前記5'末端隣接配列が配列番号115を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項５１】
前記5'末端隣接配列が配列番号116を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項５２】
前記5'末端隣接配列が配列番号117を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項５３】
前記5'末端隣接配列が配列番号118を含む、請求項35のブタ核酸配列。
【請求項５４】
感染性PERV挿入部位のブタ3'末端隣接配列に中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる単離された核酸配列。
【請求項５５】
ブタ3'末端隣接配列が、
配列番号8、
配列番号24、および
配列番号33
からなる群より選択される、請求項54の単離された核酸配列。
【請求項５６】
感染性PERV挿入部位のブタ5'末端隣接配列に中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる単離された核酸配列。
【請求項５７】
感染性PERV挿入部位のブタ3'末端隣接配列に対して少なくとも80％の配列一致度を有するDNAを含む単離された核酸配列。
【請求項５８】
感染性PERV挿入部位のブタ5'末端隣接配列に対して少なくとも80％の配列一致度を有するDNAを含む単離された核酸配列。
【請求項５９】
感染性PERV挿入部位のブタ3'末端隣接配列を含むベクター。
【請求項６０】
ブタ3'末端隣接配列が、
配列番号8、
配列番号24、および
配列番号33
からなる群より選択される、請求項59のベクター。
【請求項６１】
感染性PERV挿入部位のブタ5'末端隣接配列を含むベクター。
【請求項６２】
請求項59のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６３】
請求項60のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６４】
請求項61のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６５】
生物学的試料中の潜在的に感染性であるPERVの存在を検出するためのプローブであって、感染性PERV挿入部位のブタ3'末端隣接配列を含むプローブ。
【請求項６６】
さらにブタゲノムDNAを含む請求項65のプローブ。
【請求項６７】
さらにcDNAを含む請求項65のプローブ。
【請求項６８】
生物学的試料中の潜在的に感染性であるPERVの存在を検出するためのプローブであって、感染性PERV挿入部位のブタ5'末端隣接配列を含むプローブ。
【請求項６９】
さらにブタゲノムDNAを含む請求項68のプローブ。
【請求項７０】
さらにcDNAを含む請求項68のプローブ。
【請求項７１】
ブタ内在性レトロウイルス（PERV）を検出する方法であって、
PERVゲノム3'標的領域に特異的な核酸プローブを用意すること、
標的領域：核酸プローブ二本鎖を形成させること、および
前記標的領域：核酸プローブ二本鎖を検出すること、
を含む方法。
【請求項７２】
前記標的領域が、さらに、感染性PERV挿入部位のブタ3'末端隣接配列を含む、請求項71の方法。
【請求項７３】
標的領域：核酸プローブ二本鎖の前記検出がサザンブロット解析によって行われる、請求項71の方法。
【請求項７４】
標的領域：核酸プローブ二本鎖の前記検出がPCR解析によって行われる、請求項71の方法。
【請求項７５】
ブタ内在性レトロウイルス（PERV）を検出する方法であって、
PERVゲノム5'標的領域に特異的な核酸プローブを用意すること、
標的領域：核酸プローブ二本鎖を形成させること、および
前記標的領域：核酸プローブ二本鎖を検出すること、
を含む方法。
【請求項７６】
前記標的領域が、さらに、感染性PERV挿入部位のブタ5'末端隣接配列を含む、請求項75の方法。
【請求項７７】
標的領域：核酸プローブ二本鎖の前記検出がサザンブロット解析によって行われる、請求項75の方法。
【請求項７８】
異種移植片ドナーとして使用されるブタを選抜育種する方法であって、
ブタのPERV対立遺伝子多型プロファイルを決定すること、
ある特定PERV遺伝子座に関して陰性であるプロファイルを有するブタを選択すること、および
前記ブタを、特定PERV遺伝子座に関して陰性であるプロファイルを有する第2のブタと交配させて、前記特定PERV遺伝子座を含まないゲノムを有する子孫を得ること、
を含む方法。
【請求項７９】
前記特定PERV遺伝子座が、
G3遺伝子座、
G19遺伝子座、および
G28遺伝子座
からなる群より選択される、請求項78の方法。
【請求項８０】
請求項78の方法に従って選抜育種された、ある特定PERV遺伝子座に関して陰性のプロファイルを有するブタ。
【請求項８１】
特定PERV遺伝子座が、
G3遺伝子座、
G19遺伝子座、および
G28遺伝子座
からなる群より選択される、請求項80に記載のブタ。
【請求項８２】
潜在的に感染性であるPERVの存在を検出するのに適したプローブを作製する方法であって、
PERV組込み部位に隣接する核酸配列の単離、および
前記核酸配列がユニークな隣接配列であることの同定
を含む方法。
【請求項８３】
ユニークな隣接配列がユニークな3'隣接配列である、請求項82の方法。
【請求項８４】
ユニークな隣接配列がユニークな5'隣接配列である、請求項82の方法。
【請求項８５】
ユニークな隣接配列がDNA配列解析を使って同定される、請求項82の方法。
【請求項８６】
PERV組込み部位に隣接する核酸配列がラムダライブラリーから単離される、請求項82の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる2001年4月28日出願の米国特許出願第60/279,337号に基づく優先権を主張する。
【連邦政府後援の研究開発に関する記述】
【０００２】
該当なし。
【発明の背景】
【０００３】
１．発明の分野
本発明は、内在性レトロウイルスの存在を検出するための組成物および方法、特に、異種移植片として役立つ組織中のブタ内在性レトロウイルス（PERV）を検出するための組成物および方法に関する。
【０００４】
２．一般的背景および技術水準
移植用のドナー組織として現在使用されている組織の最も一般的な供給源は、同種異系移植片（同じ種の異なる個体）である。しかしドナー組織として使用するためのヒト器官およびヒト細胞の資源は不十分である。ヒトドナー材料が不足していることから、移植のために、代替策が考えられている。ヒト以外の動物から得られる生体組織を使用する異種移植は、実行可能な代替案の一つである。しかし代替供給源を使用する際には、倫理的、実用的、生物学的および経済的問題を考慮しなければならない。そこで、異種移植片としての使用に最も適した動物種の1つが、ブタである。
【０００５】
既に臨床試験で試験されているブタ組織の例には、糖尿病を処置するためのブタ胎仔膵島細胞（Grothら, Lancet 1994）、パーキンソン病を処置するためのブタニューロン細胞（Deaconら, Nat Med 1997）、および肝不全（Foleyら, Transplantation 2000, Levyら, Transpl. 2000. 69:272）または腎不全（Breimerら, Xenotransplantation 1996）を処置するための体外（エキソビボ）ブタ肝または腎灌流がある。しかし、成功の可能性に伴ってブタ組織の資源としての利用が増えるにつれて、ブタからレシピエントに感染因子が導入される可能性がますます懸念されるようになる。一部の病原体に関する危険性は特定病原体除去（SPF）動物コロニーの育種および使用によって低下させることができるが、このアプローチは内在性レトロウイルスによる感染を防止するには適さない。なぜなら、これらの病原体は全てのブタの生殖細胞系に存在するからである。
【０００６】
ブタ内在性レトロウイルス（PERV）は、ブタゲノムに永続的に組み込まれているC型レトロウイルスである。ブタゲノム中に存在するPERVは1細胞あたり25〜50コピーであると見積もられている。1970年代にさかのぼる初期の科学的報告では、培養増殖された一部のブタ細胞がC型レトロウイルス粒子を産生することが示された。これは、それらが感染性である可能性を示唆するものであった。しかし、ブタ組織から直接培養された細胞（初代培養）に関する他の研究では、感染力を示す証拠は見つからなかった。最近の報告では、ブタ細胞株PK15と共培養したヒト細胞に、PERV感染が低頻度で起こることが示されている（Le Tissierら, Nature 1997；Patienceら, Nature Medicine, 1997）。これにより、ブタ組織異種移植片のヒトレシピエントに対するPERV感染の潜在的危険に関する懸念が、再び強調されることになった。この危険を増大させるのは、レシピエントによる移植片拒絶を防止するために必要な免疫抑制療法の使用である。レシピエントの免疫系の抑制は、PERVによる感染に対するレシピエントの感受性を有意に増加させることにもなりうる。したがって、ブタの組織および細胞を感染性PERVの存在に関して検出し監視する方法が必要とされている。
【０００７】
現在のところ3種類のPERV（PERV-A、PERV-B、およびPERV-C）が知られている。これら3種類の間の相違は、主として、それらのエンベロープ遺伝子領域中の配列の相違に基づいている。最近、PERV配列が同定されたことにより、分子に基づく検出法を開発することが可能になっている。例えば、特定のDNA配列を検出することができるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの方法を使って、組織試料中のPERVの存在を同定することができる。すべてのブタゲノムはPERV配列を持っているが、PERVのすべてが感染性であるわけではないことに留意すると、移植組織を単にPERV配列の存在に関してプレスクリーニングするだけでは、その感染力の十分な指標にはならない。したがって、PERVの存在を検出するために現在使用されている方法には、どのPERV遺伝子座が感染性であるかを決定できないことからくる限界がある。
【０００８】
したがって、異種移植片としての使用に適したブタ組織からPERVが伝播する危険性を低下させうる方法および組成物が必要とされている。特に必要とされているのは、生物学的試料中の感染性PERVの存在を検出するための組成物および方法である。
【発明の要旨】
【０００９】
本発明は、ブタ内在性レトロウイルス（PERV）を検出するための組成物および方法を提供する。これらの方法および組成物は、感染性ウイルスを産生する能力を有するPERV遺伝子座の存在を検出するのに、とりわけ有効である。本発明は、異種移植に役立つ試料中のPERVの存在を検出する方法を提供する。
【００１０】
一実施態様として、本発明は、感染性PERV挿入部位に隣接するブタ配列を含む核酸配列を使って潜在的に感染性であるPERVを検出することができる組成物を提供する。ユニークな3'隣接配列またはユニークな5'隣接配列を使って、潜在的に感染性であるPERV遺伝子座に特異的な核酸プローブを得ることができる。また、3つの感染性PERV遺伝子座G3、G19およびG28のPERVゲノムに由来する核酸配列およびその部分配列を使って、プライマー（配列番号137〜139）を含む核酸プローブを得ることができる。そのようなゲノム配列は、潜在的に感染性であるPERV遺伝子座に特異的な核酸プローブを得るためにも使用することができる。
【００１１】
したがって、PERV遺伝子座に由来するユニークな3'隣接配列は、配列番号6〜35のいずれかを含むか、または適度にストリンジェントな条件下で配列番号6〜35のいずれかにハイブリダイズすることができる任意の核酸配列を含むことができる。さらに本発明は、感染性PERV挿入部位のブタ3'隣接配列に対して、適切な配列一致度（例えば少なくとも80％の配列一致度）を有する核酸配列も提供する。本発明の核酸配列およびプローブは、異種移植片としての使用に適した細胞、組織または器官における特定PERV遺伝子座の診断、モニタリングまたはスクリーニングに使用することができる。
【００１２】
潜在的に感染性であるPERV組込み部位に隣接する本発明のブタ配列は、生物学的試料中の潜在的に感染性であるPERVの存在を検出する方法に、プローブとして使用することができる。適切な検出アッセイには、PERVゲノム標的領域：プローブ二本鎖の形成と、試料中の前記標的領域：プローブ二本鎖の検出とを含むサザンブロット解析、PCR解析または他の分子生物学的アッセイにおけるPERVプローブの使用が含まれる。
【００１３】
さらに本発明は、潜在的に感染性であるPERVの存在を検出するのに適したプローブを作製する方法を提供する。そのような方法は、PERV組込み部位に隣接する核酸配列の単離、およびそれらの配列がユニークな隣接配列であることの同定を含む。PERV組込み部位に隣接する核酸配列の単離は、保存されたPERV配列を利用して、またはPERV配列のエンベロープ領域に由来する保存されたPERV配列を利用して行うことができる。ユニークな隣接配列はユニークな3'隣接配列であってもよいし、あるいは、ユニークな5'隣接配列であってもよい。ユニークな3'隣接配列またはユニークな5'隣接配列は、DNA配列解析を用いて同定することができる。したがって本発明は、ユニークな3'隣接配列またはユニークな5'隣接配列にハイブリダイズすることができる配列を検出する方法も提供する。
【００１４】
そのような方法は、PERV組込み部位に隣接する核酸配列の単離、およびそれらの配列がユニークな隣接配列であることの同定を含む。そのような方法は、PERV組込み部位に隣接する核酸配列の単離、およびそれらの配列がユニークな隣接配列であることの確認を含む。ユニークな隣接配列はユニークな3'隣接配列であってもよいし、あるいは、潜在的に感染性であるPERVの存在を検出するのに適したユニークな5'隣接配列であってもよい。
【００１５】
したがって、本発明の組成物は、異種移植組織から宿主またはレシピエントにPERVが伝播する危険性を低下させる方法も提供する。
【００１６】
したがって、本発明のもう一つの態様として、特定のPERV遺伝子座を含まない動物を選択する方法が提供される。特定のPERV遺伝子座または潜在的に感染性であるPERVに関して陰性のプロファイルを有するブタを使って、異種移植片ドナーとして使用されるブタを育種することができる。選抜育種法にはブタのPERV対立遺伝子多型プロファイルの決定が含まれるだろう。そうすれば、特定のPERV遺伝子座に関して陰性であるプロファイルを有するブタの選抜を行うことができる。陰性PERV遺伝子座プロファイルを有するものを育種して、1つまたは複数の特定PERV遺伝子座を含まないゲノムを有する子孫を得ることができる。したがって、本発明によって作出される動物は、G3（配列番号8）、G19（配列番号24）またはG28（配列番号33）遺伝子座などの潜在的に感染性であるPERV遺伝子座を含まない異種移植片組織の供給源として使用することができる。
【好ましい態様の詳細な説明】
【００１７】
本発明は、ブタ内在性レトロウイルス（PERV）を検出するための組成物および方法、ならびにPERVの検出用として好適なプローブの作製方法を包含する。特に、感染性内在性レトロウイルスに特異的な核酸配列などの分子プローブを含む組成物を提供する。また、そのようなプローブを作製し使用する方法、ならびにそのようなプローブを利用するアッセイも提供する。本発明は、感染性内在性レトロウイルスを含まないドナー移植組織、例えばブタ組織の選択または育種に応用することができる。上述の戦略を利用して、感染性であるまたは潜在的に感染性である任意の内在性レトロウイルス配列で、本発明の方法を実施することができるので、本発明は、PERV遺伝子座を作製し検出する方法および組成物だけに限定されるわけではなく、また本明細書に具体的に開示するPERV遺伝子座だけに限定されるわけでもない。本発明は以下の実施例に限定されるわけではないが、以下に述べる実施例の説明を通して、本発明のさまざまな態様が正しく理解されるだろう。
【００１８】
PERVは哺乳類のC型レトロウイルス類に属する。感染に先立って起こる宿主細胞へのレトロウイルスの付着は、レトロウイルス配列のエンベロープ（Env）遺伝子領域がコードするウイルス表面タンパク質によって媒介される。これらのウイルス表面タンパク質は宿主細胞表面タンパク質を結合する。Env遺伝子タンパク質は宿主域特異性の決定に関与する。今までのところ、3種類のPERVが、そのEnv遺伝子配列に基づいて同定されている。これらの配列は公表され、登録されている（Perv-A＝Genbankアクセッション番号：AF038601；Perv-B＝EMBLアクセッション番号：PERY17013；PERV-C＝Genbankアクセッション番号：AF038600）。
【００１９】
PERVはすべてのブタのゲノムに存在する。上述のように、一部の培養ブタ細胞がインビトロでヒト細胞を感染させる能力を有することから、異種移植に使用されるブタ組織はレシピエントに感染性PERVを伝播することができるのではないかという懸念が生じる。共培養アッセイでは、感染性であるブタ細胞が、培養ヒト細胞株を感染させるその能力によって、いくつか同定されているが、この技術は感度が低いので、信頼できるスクリーニングアッセイとしては使用することができない。例えば、あるトランスジェニックブタ供給源から得られた活性化リンパ球または肝細胞との共培養は、増殖性感染の証拠を何も示すことができなかった。これは、そのトランスジェニックブタの系統が感染性PERVを持っていなかったこと、または配列が活性化されなかったこと、またはこれらのブタに由来するPERV配列が、使用したヒト細胞株については、感染させる能力を持たなかったことを示しうる。
【００２０】
ブタゲノムには複数のPERVプロウイルス配列が存在する。これらの配列内のホモロジーは高いので、配列多型によってそれらを識別することは困難である。本発明の一実施態様は、ユニークな事象を表すブタゲノムへの各PERVプロウイルスの組込みに基づく。下記実施例に詳述するように、本発明者らの飼養群の一トランスジェニックブタに由来するDNAを使って構築したゲノムライブラリーから、PERVクローンを単離し、各PERV遺伝子の3'および5'領域に隣接するユニーク配列を同定した。これらのブタは既知であり、603-57トランスジェニック系統として記載されている（Byrneら 1997 Transplantation 63:149-155）。これらのブタはヒトCD59導入遺伝子およびヒトCD55導入遺伝子を持っている。ブタゲノムライブラリーのDNAドナーであるブタd711は、トランスジェニックファウンダーブタ（603-57）を非トランスジェニック雌ブタに掛け合わせることによって得られた。どちらのブタもケンボロー（Camborough）15系統（Pig Improvement Company, ケンタッキー州フランクリン）に由来する。ケンボロー15ブタは大ヨークシャー（Large White）25％、ランドレース（Landrace）25％およびデュロック（Duroc）50％である。別法として、PERVクローンは、所望により、異種移植への使用に適した器官または組織を有する任意のブタまたは任意のトランスジェニックブタのDNAを使ったゲノムライブラリーから単離することもできる。
【００２１】
本明細書で使用する「ユニークな」、「ユニークな隣接」または「ユニークな隣接配列」という用語は、PERV組込み部位に隣接し、かつ隣接配列多型に基づいて非PERV隣接ゲノム配列と区別することができる、ブタゲノム由来の配列を表す。
【００２２】
エンベロープ遺伝子を有するPERV遺伝子座は感染性遺伝子座として適格であるので、PERV配列のこの領域を使って、各PERV配列を単離するためのプローブを構築した。既知のPERVエンベロープ配列に基づいて、PERVエンベロープ遺伝子の膜貫通ドメインに対応する保存エンベロープ配列プローブ（env-cons）を構築した。PERV-A（1881〜2133bp, Y12238）（配列番号1）；PERV-B（2572〜2824bp, Y12239）（配列番号2）；およびPERV-C（7227〜7479bp, AF038600）（配列番号3）。ゲノムライブラリーのスクリーニングに使用した他のプローブには、PERV-A（94〜2133bp, Y12238）（配列番号4）およびPERV-B（794〜2823, Y12239）（配列番号5）が含まれる。しかし、PERV遺伝子座を単離するためのプローブの構築には、例えばPERV配列のgag、pol、シグナルまたはLTR領域からの配列など、PERV配列のどの領域でも使用することができるだろう。
【００２３】
下記実施例で説明するように、プローブはすべて、まずPCR増幅によって作製した。しかし、PERVプローブの作製には、どのヌクレオチド配列複製方法でも使用することができる。そのような方法としては、例えばリガーゼ連鎖反応、等温増幅法、またはより基本的なクローニング技術の使用、例えばクローニングベクターもしくはプラスミドの使用および細菌株からの増殖などが挙げられる。ヌクレオチド配列の増幅または複製技術に関するさらなる詳細および説明については、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience Publishers, 1995）；米国商務省/NOAA/NMFS/NWFSC分子生物学プロトコール集（URL：http://research.nwfsc.noaa.gov/protocols.html）またはプロトコールズ・オンライン（Protocols Online）（URL：www.protocol-online.net/molbio/index.htm）を参照されたい。
【００２４】
PERVエンベローププローブを使って、ブタゲノムライブラリーをスクリーニングし、PERV遺伝子座を単離した。各クローンを隣接するゲノムDNAまで配列解析することにより、各クローンがユニークであることまたはユニークではないことを確認した。実施例2〜4で説明するように、PERVクローン（G3-25（配列番号8）；G19-45（配列番号24）およびG28-402A（配列番号33）を作製した。したがって本発明は、クローンを取得する方法、およびユニークなPERV隣接配列を同定するためのプローブの構築にそれらを使用する方法を提供する。
【００２５】
さらに本発明は、組み込まれたPERV遺伝子に隣接する、新たに同定され単離された核酸配列（配列番号6〜35および101〜118）も提供する。次に、5'プライマー（5'G1〜5'G30）（配列番号36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、および94）と3'プライマー（3'G1〜3'G30）（配列番号37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、および95）とを使った増幅により、3'隣接PERV組込み配列に対応するプローブを得た。対にして増幅に使用したプライマーを実施例2、表1に列挙する。
【００２６】
ユニークなPERV遺伝子座の同定を可能とするのに十分なゲノム隣接配列のサイズまたは長さは、各個々のPERV遺伝子の下流（ユニークな3'隣接配列を同定する場合）または上流（ユニークな5'隣接配列を同定する場合）にあるDNA約300〜500bpだった。しかし、当業者にはわかるだろうが、隣接領域中の多型の程度、所望する比較の程度、または要求する配列弁別のレベルに応じて、必要であれば、およそ100bpより短い長さもしくは1000bpを超える長さまたは100〜2000bpの長さも、使用することができる。
【００２７】
DNA配列の解析および比較により、隣接配列がユニークであることを確認した。シークエンス反応および配列解析は標準的なシークエンス反応キット（PE Applied Biosystems, カリフォルニア州フォスターシティ）を使って行ったが、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual（ニューヨーク: Cold Spring Harbor Press, 1989）またはInnisら, PCR Strategies (Academic Press, Inc.: ニューヨーク, 1995)などに記載されている当分野で周知の他の方法によって行うこともできる。場合によっては、PERV遺伝子の上流（5'領域）に隣接するゲノムDNAから配列情報を得た。当業者には明らかだろうが、5'隣接配列に対して配列解析を行う場合は、配列を他の5'隣接配列と比較し、3'隣接配列とは比較しない。DNAの配列解析および比較に十分な隣接配列のサイズまたは長さは、3'隣接領域の場合と同様だった。
【００２８】
各PERV遺伝子座のユニークな3'隣接配列から、遺伝子座特異的な隣接プローブが得られる。下記実施例でさらに詳しく説明するように、各PERV遺伝子座から得たユニークな3'隣接配列に基づいて、各遺伝子座（本明細書ではこれらをG1〜G30ともいう）ごとに遺伝子座特異的プローブを得た（配列番号6〜35）。本明細書では「ユニークな3'隣接配列」という用語を使って、PERV組込み遺伝子座の3'末端に隣接するユニークな配列であるゲノムブタ配列を表す。本明細書で使用するユニークな3'隣接配列という用語は、各PERV遺伝子座（G1〜G30）について3'プローブとプライマーセットとを記載した表1に示す3'隣接配列（配列番号6〜35）に対して、少なくとも約80％、90％、95％、またはそれ以上のDNA配列一致度またはホモロジーを有する任意の核酸配列も表す。
【００２９】
【表１】
2005510202.tif 000002
【００３０】
本明細書では「ユニークな5'隣接配列」という用語を使って、PERV組込み遺伝子座の5'末端に隣接するゲノム配列を表す。本明細書で使用するユニークな5'隣接配列という用語は、PERV遺伝子座に対応する5'隣接配列（配列番号101〜118）または本明細書に記載の方法を使って同定される5'隣接配列に対して、少なくとも約80％、90％、95％、またはそれ以上のDNA配列一致度またはホモロジーを有する任意の核酸配列も表す。
【００３１】
さらに本発明は、感染力を有する内在性レトロウイルス配列遺伝子座も提供する。各個々のPERV遺伝子の感染性ウイルス産生能力を評価した。一つのPERV遺伝子と選択可能な薬物耐性マーカーとを含むプラスミドを293細胞にトランスフェクトした。薬剤耐性クローンから得た細胞上清をRT活性に関してアッセイした。次に、測定可能なRT活性を生じたすべてのクローンを、その上清を新たな293細胞と共培養することにより、感染性レトロウイルス産生能力に関して解析した。この培養物から得られる細胞上清をRT活性に関してアッセイし、週1回の頻度で集めた細胞を解析して、PERV組込みを検出した。今までのところ、3つのPERVクローン、すなわちG3-25（配列番号8）、G19-A45（配列番号24）およびG28-402A（配列番号33）が、293細胞にトランスフェクした場合に、上清中にRT活性をもたらす。上述のプローブ、スクリーニング方法および戦略を使って新規内在性レトロウイルス組込み部位を同定することにより、他の動物から、感染力を有する他の内在性レトロウイルス配列を同定することもできる。
【００３２】
さらに本発明は、器官、組織、細胞および体液を含む試料中の、潜在的に感染性である特定内在性レトロウイルスの存在を検出するためのアッセイも提供する。特定の感染性内在性レトロウイルス配列に関して陽性または陰性と同定される試料は、例えば特定PERV遺伝子に付随するユニークな3'隣接配列またはユニークな5'隣接配列などの新規隣接配列の有無を調べることによって決定される。
【００３３】
PERV遺伝子座または他の内在性レトロウイルス配列遺伝子座の解析は、サザンブロット解析、通常のPCR増幅などの方法によって行うことができる。例えば、Innisら, PCR Strategies（Academic Press, Inc.: ニューヨーク, 1995）；Dieffenbachら, PCR Primer: A Laboratory Manual（ニューヨーク: Cold Spring Harbor Press, 1995）、変性勾配ゲル電気泳動（Myersら, 1987. Meth. Enzymol. 155:501）、一本鎖高次構造解析（Hayashi, 1992. Genet Anal Biomol E9:73）、リガーゼ連鎖反応（Barany. 1991. Proc Natl Acad Sci 88:189）、等温増幅法（Fahyら 1991. PCR Methods Appl 1:25）、分岐鎖解析（Urdea. 1993. Clin Chem 39:725）、およびThird Wave社の線形増幅（linear amplification）法などのシグナル増幅技術を参照されたい。DNA配列解析は、変性剤を含むまたは変性剤を含まないゲルにおけるDNA断片の電気泳動移動度の変化を検出することによって行うこともできる。ユニークな3'隣接配列またはユニークな5'隣接配列に隣接したPERV挿入物を含む試料は、高分解能ゲル電気泳動によって可視化するか、またはDNA配列融解点の相違によって識別することもできる。例えばMyersら, Science, 230:1242（1982）を参照されたい。特定配列の存在を検出する方法には、例えば蛍光に基づく検出方法、RIAなどの免疫に基づくアッセイ、ウェスタンブロット解析またはインサイチューハイブリダイゼーションなどの抗体染色法など、本明細書に記載する配列に基づく適当に標識されたプローブを使った検出方法が含まれる。上述した方法および戦略を使用することにより、本明細書に明示する配列の他にも、任意のユニークな3'隣接配列またはユニークな5'隣接配列を同定し、PERVの存在を検出または解析するためのプローブとして、それらを使用することができる。
【００３４】
PERV対立遺伝子多型
本発明は、PERV遺伝子座対立遺伝子多型を決定することにより、試料中の、感染能力を有するPERVの存在に関してスクリーニングする方法も提供する。試料中の対立遺伝子多型の同定により、異種移植片組織ドナーとしての直接的な使用または種畜としての使用に適した動物を選択して、感染性であるまたは感染性である可能性を有するPERV配列に関して陰性である、またはそのようなPERV配列を含まない、異種移植片組織の供給源とすることが可能になる。PERV遺伝子座の存在を検出する方法の一つは、ユニークな3'隣接配列またはユニークな5'隣接配列などのユニークな隣接配列をプローブとして使用するサザンブロットによる対立遺伝子多型の解析である。サザンブロット解析を用いると、PERVが存在する場合には、PERVが両方の対立遺伝子上に存在するか、一方の対立遺伝子上に存在するか、どちらの対立遺伝子上にも存在しないかによって、異なるバンディングパターンが現れるだろう。3つの感染性PERV遺伝子座、すなわちG3（配列番号8、配列番号137（全G3 PERVゲノム）、図11も参照）、G19（配列番号24、配列番号138（全G9 PERVゲノム）、図12も参照）、およびG28（配列番号33、配列番号139（全G28 PERVゲノム）、図13も参照）をサザン解析すると（実施例5および6）、これら3つの遺伝子座はすべて、対立遺伝子多型を示すことがわかる。これらの多型ゲノム配列はRT活性を産生する。したがって、これらのPERV遺伝子座は、ゲノムおよび隣接配列を含めて、本発明のPERVおよびPERV遺伝子座配列から導かれるプローブを使って検出することができる。これにより、特定の遺伝子座の両対立遺伝子に関してホモ接合的に陰性である動物を、同じ遺伝子座の両対立遺伝子に関してホモ接合的に陰性である別の動物と交雑または交配させることによって、G3、G19および/またはG28に関して陰性である動物を育種することが可能になるだろう。あるいは、ヘミ接合型の動物をF0種畜として使用することもできる。後者の場合は、後で、G3、G19、および/またはG28遺伝子座に関してホモ接合的に陰性である子孫を同定するために、スクリーニングを行う必要があるだろう。
【００３５】
PERVの存在を検出するのに使用する適したプローブを構築するのに役立つ配列には、G1〜G30（配列番号6〜35）のいずれか、またはBlast検索により、ユニークな3'隣接配列（配列番号6〜35）に対して少なくとも約80％、90％、95％またはそれ以上の配列一致度またはホモロジーを有すると決定される任意の核酸配列が含まれる。本明細書に記載する配列に関して、「配列配列一致率（％）」または「配列ホモロジー率（％）」とは、最も高い配列一致率が得られるように配列を整列し、必要であればギャップを導入した後に、本明細書に開示する核酸残基（配列番号6〜35のいずれか）と同一である候補配列中の核酸残基の百分率であると定義され、保存的置換は配列一致の一部であるとはみなさない。配列の整列および配列一致度の決定を行う方法は、当分野では周知であり、必要以上の実験を行わなくても実施することが可能で、一致率（％）値の計算結果は、例えば、WU-BLAST-2などの利用可能なコンピュータープログラムを使って得ることができる（Altschulら, Methods in Enzymology 266:460-480（1996））。所望により、コンピュータソフトウェアプログラム（Blast検索、MacVectorおよびVector NTI）に設定されているデフォルトパラメータを使って整列を行ってもよい。
【００３６】
サザンブロットを、ユニークな隣接配列（例えばユニークな3'隣接配列）を認識するプローブとハイブリダイズさせる場合は、特定遺伝子座の制限酵素地図に基づいて、バンディングパターンを予測することができる。所望する感度のレベル、そのプローブの特徴、例えばプローブ長および/またはアニーリング温度など、またはプローブ配列とPERV遺伝子座の3'または5'領域に隣接するゲノム配列とのホモロジーの程度に応じて、使用するハイブリダイゼーションのストリンジェンシーのレベルは変わりうる。したがって、特定のアッセイに必要なハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、感度および特異性を考慮して決定されるだろう。
【００３７】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者であれば容易に決定することができ、一般的には、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に基づいて経験的に予測される。一般に、プローブが長ければ適正なアニーリングには高い温度が要求され、プローブが短ければ必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般に、融解温度未満で相補鎖が周囲に存在すれば再アニールするという変性DNAの能力に依存している。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間に所望するホモロジーの程度が高いほど、使用することができる相対温度は高くなる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに関するさらなる詳細および説明については、Ausubelら Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience Publishers, 1995）またはプロトコールズ・オンライン（Protocols Online）（URL: www.protocol-online.net/molbio/index.htm）を参照されたい。
【００３８】
本明細書に定義する「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」は、洗浄に低いイオン強度および高い温度（例えば65〜70℃で0.1×SSC、0.2％SDS）を使用する条件によって同定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の典型例として、以下の条件を挙げることができる。50％ホルムアミド、5×SSC、および1％SDS、42℃でインキュベートし、または5×SSC、1％SDS中、65℃でインキュベートし、0.2×SSCおよび0.1％SDS中、65℃で洗浄。
【００３９】
「中等度にストリンジェントな条件」は、Sambrookらの前掲書に記載されているように同定することができ、これには、上述したものよりもストリンジェンシーの低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば温度、イオン強度およびSDS濃度（％））の使用が含まれる。中等度にストリンジェントな条件の一例は、58〜65℃で0.2×SSC、0.1％SDSである。典型的な「中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、40％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDSの緩衝液中、37℃でのハイブリダイゼーション、および1×SSC中、45℃での洗浄が含まれる。例えばプローブ長、プローブと標的部位とのホモロジーの程度などの因子に対応するために、温度、イオン強度などを必要に応じて調節する方法は、当業者にはわかるだろう。したがって、本明細書に記載するユニークな3'隣接配列およびユニークな5'隣接配列だけでなく、本明細書に明記するもの（配列番号6〜35）とは異なる追加または代替プローブ配列も、感染力を有するPERV遺伝子座に関するスクリーニングには役立つだろうと考えられる。
【００４０】
特定のPERV組込みが含まれているまたは欠けている対立遺伝子の存在を決定するためのもう一つの方法ではPCR解析を利用する。例えば、試料中のPERV遺伝子座の有無は、既知の遺伝子型から得られる予想サイズ産物と比較して、増幅産物のサイズの変化を検出することによって決定することができる。試験試料から得られるゲノムDNAを、特定のPERV遺伝子座に隣接する特異的プライマーを使って解析する。適切なプライマーには、表2に記載するようにプライマー対として役立つ配列番号36〜95が含まれる。図3に、PCR解析法による対立遺伝子多型の同定の一例を示す。5'（フォワード）プライマーがPERV遺伝子の5'末端に隣接する配列（Gn-5'）に対応するように、プライマー対を選択する。3'（リバース）プライマーは、G3（配列番号8）、G19（配列番号24）またはG28（配列番号33）などのユニークな3'隣接配列の3'末端に隣接する配列に対応するだろう。PERV組込みを有する対立遺伝子を含む試料では、予想されるPCR産物のサイズ（約9KB）が大きいので、標準的な条件で実施した場合には、PCR反応はうまくいかないだろう。これより小さい（約300bp）PCR産物の増幅は、少なくとも一方の対立遺伝子にはPERVが存在しないことを示すだろう。陰性PCR産物をもたらす試料中にPERVが存在することは、PERV特異的プライマーと隣接配列に特異的なプライマーとを使って2回目のPCRを行うことによって確認するか、またはSambrookらの前掲書に記載されているような通常の手順で配列解析を行うことによって確認することができる。
【００４１】
本発明は、新規隣接配列を使ってPERV遺伝子座特異的な組込み部位の存在を検出することにより、特定のPERVによる感染の可能性を検出する方法を包含する。試験対象または解析対象となる試料は、潜在的に感染性であるPERVを有するすることがわかっているまたは持つと疑われる任意の生物学的供給源から得ることができ、好ましくは、ドナーとしての使用に先立って動物から採取される。例えば、試料は細胞試料、組織試料、または血液、尿、精液、唾液、喀痰、組織培養液、腹水、滑液などの生物学的液体などであることができる。試料は毛髪試料であってもよく、その場合は毛包からDNAを単離して解析することができる。細胞培養物または胚培養物などの実験研究試料も試験試料として使用することができる。当業者に周知の方法を使って試料を収集し、処理して、ゲノムDNAを得る。
【００４２】
PCRに基づくアッセイなど、本明細書に記載する分子的アッセイは、高度の感度および特異性を持ち、それゆえに偽陽性または偽陰性の結果をもたらす可能性が低い点で、理想的である。あるいは、ユニークな隣接配列（ユニークな3'隣接配列またはユニークな5'隣接配列）を使って、例えば通常のサザンブロットアッセイなどのDNA検出方法に使用されるプローブを開発することもできる。そのようなスクリーニングアッセイに適したプローブは、本明細書に開示するユニークな隣接配列をどれでも含むことができる。例えば、サザンブロットアッセイでの使用に適したプローブは、配列番号8、配列番号24または配列番号33などのユニークな3'隣接配列を含むだろう。さらに、潜在的に感染性であるPERV遺伝子座の検出は、本明細書に記載するユニークな隣接配列にハイブリダイズまたは複合体化する能力を有する配列を利用して、間接的に行うこともできる。サザンブロットアッセイを実施する方法は当分野では周知であり、Sambookらの前掲書に記載されている。したがって本発明は、試料中のPERV遺伝子座を検出するためのアッセイキットも提供する。このアッセイキットは、好ましくは、試料をPERV検出プローブと反応させるのに必要な試薬類およびツール類を含むだろう。
【００４３】
潜在的に感染性であるPERV組込み部位に隣接する本発明のブタ配列を使って、潜在的に感染性であるPERVを欠くゲノムを有するブタを作出することもできる。1つまたは複数の特定PERV遺伝子座を含まないゲノムを有するそのような「ノックアウト」ブタは、例えばRieleら「同質遺伝子DNAコンストラクトとの相同組換えによる胚幹細胞での高効率遺伝子ターゲティング（Highly efficient gene targeting in embryonic stem cells through homologous recombination with isogenic DNA constructs）」Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5128（1992）およびRulicke T.「トランスジェニック技術：概論（Transgenic technology : an introduction）」Int J Exp Pathol 77:243（1996）などに記載されている当分野で周知の標準的組換え技術により、ユニークな3'隣接配列またはユニークな5'隣接配列を使って作出することができる。特定のPERV遺伝子座または潜在的に感染性であるPERVに関して陰性のプロファイルを有する「ノックアウト」ブタは、ドナー組織の供給源として直接使用するか、あるいは異種移植片ドナーとして使用されるブタをさらに育種するために使用することができる。
【００４４】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４５】
実施例で言及する市販の試薬類は、別段の表示をしない限り、製造者の説明書に従って使用した。以下の実施例および本明細書の全体で挙げられている細胞の供給源はヒト293細胞（ATCC:CRL-1573）である。別段の注記がない限り、本発明では、組換えDNA技術の標準的な手法、例えばSambrookらの前掲書；Ausubelら Current Protocols in Molecular Biology On CD-ROM（Green Publishing AssociatesおよびWiley Interscience, ニューヨーク, 1993）；Ausubelら Short Protocols in Molecular Biology. 4TH Edition（Wiley Interscience, ニューヨーク, 1999）；Innisら, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（Academic Press, Inc.: ニューヨーク, 1990）；Gait, Oligonucleotide Synthesis（IRL Press: オックスフォード, 1984）；Freshney, Animal Cell Culture, 1987；セル・アンド・モレキュラー・バイオロジー・オンライン（Cell and Molecular Biology Online）（URL：www.cellbio.com/protocols.html）；プロトコールズ・オンライン（Protocols Online）（URL：www.protocol-online.net/molbio/index.htm）に記載されているものなどを使用する。
【００４６】
実施例１
以下の説明は、本発明の理解をさらに助けるために、典型例として記載するに過ぎない。本明細書による開示から明らかなように、当業者は、以下に例示し本明細書に説明する方法を使って、PERV遺伝子座のユニークな隣接配列に対して、任意のクローンまたはクローン群を作製し、使用し、または取得することができる。
【００４７】
ユニークな隣接配列のクローニング
ブタゲノムライブラリーの構築
以下のように構築したゲノムブタライブラリーから、ユニークな3'隣接配列クローンおよびユニークな5'隣接配列クローンを、すべて単離した。
【００４８】
トランスジェニック（CD59/DAF）雄ブタ（例えば大ヨークシャー、ランドレース、およびデュロックからなるF2外部交配個体）から得た高分子量（＞100kb）ゲノム肝DNAをSau3AIで部分消化し、ショ糖勾配超遠心によって9〜24KB断片を単離した。それらの断片を、ラムダFIX IIベクター（Stratagene, カリフォルニア州）にクローニングして、ブタゲノムライブラリーを構築した。
【００４９】
増幅したライブラリーの力価は5.2×109pfu/mlだった。いずれもPERVエンベロープ遺伝子を検出する数種類のプローブを使って、900万個のファージをスクリーニングした。PERVの細胞感染能力を担っているのは、PERV遺伝子のエンベロープ配列である。PERV配列の単離が感染力を有するPERV遺伝子座だけに限定されるように、すなわちエンベロープ遺伝子を含む配列に限定されるように、エンベローププローブを選択した。
【００５０】
ブタゲノムライブラリーのスクリーニングに使用したプローブ
PERVエンベロープ遺伝子を含むトランスジェニックブタライブラリー中のPERV遺伝子座を単離した。エンベロープ遺伝子を有するPERV遺伝子座は感染性遺伝子座として適格だろう。そこで、公表されたPERVエンベロープ配列を使って、さまざまなプローブを作製した。例えばAkiyoshiら（J. Virology 72:4503, 1998）およびLe Tisserら（Nature. 389:681, 1997）を参照されたい。
【００５１】
図1を参照して説明すると、PERVエンベロープ配列を使ったプローブを作製し、それらを使ってブタゲノムライブラリーをスクリーニングした。PERVプローブ「env-cons」はPERVエンベロープ遺伝子の膜貫通ドメインに対応し、GenBankに登録された配列Y12238、Y12239にあるとおり、PERV-AとPERV-Bの間で、高度（約99.6％）のホモロジーを持っている（Le Tisserら Nature, 389:681, 1997）。Akiyoshiら（J. Virology 72:4503, 1998）に記載されているように、PERV-AとPERV-Cのenv-cons領域の間には、GenBankの配列（それぞれGenbankアクセッション番号AF03860およびAF38600）によれば、80.6％のホモロジーがある。env-consプローブは、ゲノムDNAをテンプレートにして、公表された配列に基づくプライマーEnv5(1)（配列番号96）およびEnv4c（配列番号97）を使用するPCR増幅によって作製された。「PERV-A」（配列番号4）および「PERV-B」（配列番号5）と呼ぶプローブはPERV-AまたはPERV-Bに由来する全エンベロープ遺伝子に相当し、上述のように単離したクローンをテンプレートDNAに使用して、プライマー「5env」（配列番号98）および「Env4C」（配列番号97）を使用するPCR増幅によって作製された。これらのクローンは、元々は「env-cons」PERV-A（配列番号1）、PERV-B（配列番号2）またはPERV-C（配列番号3）を使って単離されたものであり、PERV-AファミリーまたはPERV-Bファミリーのどちらかに属することが確認されている。
【００５２】
PCRによってenv-consプローブを増幅するために、MacVectorプライマー設計プログラム（Oxford Molecular, ウィスコンシン州マディソン）を使ってプライマーを設計した。プライマーの合成はGibco BRL（Life Technologies, Inc., メリーランド州ロックビル）によって行われた。合成したプライマーは次の通りである。
Env5(1): 5'CTTCTATGTAGATCACTCAGGAGCC3'（配列番号96）
PERY17013ではenv停止コドンの290bp上流に位置する
Env4c: 5'CTGGACTGCACTCACTCGTTCTCT3'（配列番号97）
PERY17013ではenv停止コドンの56bp上流に位置する。
使用したPCR反応
ブタゲノムDNA  500ng
10×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液  5μl
dNTP類（各2.5mM）  4μl
Env5(1)（20pmol/μl）  1μl
Env4c（20pmol/μl）  1μl
Taq（5U/μl）  0.5μl
液量が合計50μlになるまでddH2Oを添加
PCRプログラム
95℃で3分間の初期変性の後、
95℃で0.5分
55℃で0.5分
72℃で0.5分
を35サイクル、
72℃で7分間の伸長。
【００５３】
PCRを使ってPERV-AまたはPERV-Bのエンベロープ遺伝子を増幅するために、MacVectorプライマー設計プログラム（Oxford Molecular, ウィスコンシン州マディソン）を使ってプライマーを設計した。プライマーの合成はGibco BRL（Life Technologies, Inc., メリーランド州ロックビル）によって行われた。
5env: 5'CAGTCTATGTTAGACGCCACCGTG3'（配列番号98）
（Toenjes（Czaudernaら, 2000. J. Virol. 4028-38）によってGenBankに登録されたPERY17013配列によればenv開始部位の93bp上流）
Env4c: 5'CTGGACTGCACTCACTCGTTCTCT3'（配列番号97）
（Toenjesによって登録されたPERY17013配列によればenv停止コドンの56bp上流）
使用したPCR反応
PERVラムダクローンDNA  50ng
10×Taq DNAポリメラーゼ  5μl
dNTP類（各2.5mM）  4μl
5env（20pmol/μl）  1μl
Env4c（20pmol/μl）  1μl
Taq（5U/μl）  0.5μl
液量が合計50μlになるまでddH2Oを添加
PCRプログラム
93℃で3分
95℃で0.5分
55℃で0.5分
72℃で2分
を35サイクル、
72℃で7分間、
4℃に保つ。
【００５４】
ユニークな3'ブタゲノム隣接配列によるPERV遺伝子座の同定
複数のPERVプロウイルス配列が存在して、類似するヌクレオチド配列を有することから、配列多型によってそれらを識別することは困難である。しかし、ブタゲノムへの各PERVプロウイルスの組込みはユニークな事象を表す。各PERV遺伝子に隣接するゲノムDNAの配列解析に基づいて、PERV遺伝子座がユニークであることを確認した。個々のPERV遺伝子の下流（3'隣接領域）にある約300〜500bpのゲノムDNAを、ABI自動シークエンサー（Perkin Elmer, カリフォルニア州フォスターシティ）を使って配列決定した。場合によっては、PERV遺伝子の上流5'隣接領域に隣接するゲノムDNAからも配列情報を得たので、それを以下に説明する。
【００５５】
ユニークな5'ブタゲノム隣接配列によるPERV遺伝子座の同定
ユニークな5'隣接配列を得るための戦略は、基本的にはユニークな3'隣接配列を得るために使用した戦略と実質的に同様であり、PERV遺伝子座の上流5'隣接領域に隣接するDNAを配列決定するためにLTR34C（配列番号99）またはLTR100C（配列番号100）などのリバースプライマーを使用した点が異なる。図9を参照して説明すると、ユニークな5'隣接配列は、gag3'およびT3またはT7オリゴヌクレオチドプライマーを使ってPERVラムダクローンDNAを増幅することによって決定した。これらのプライマー対を使った増幅により、PERVの5'LTRとgag配列の一部とを含む5'隣接配列に相当する断片が生成した。次に、LTR34C（配列番号99）またはLTR100（配列番号100）を使って、そのPCR産物を配列決定することにより、5'隣接配列を得た。Gn-FおよびGn-Rオリゴヌクレオチドプライマーを使って5'隣接プローブを増幅し、対立遺伝子多型解析にはプライマーとしてGn-5'（Gn-5'プライマー配列の一覧については下記表2を参照されたい）を使用することもできる。本明細書に記載する方法を使って、各PERV遺伝子座からユニークな5'隣接配列（配列番号101〜118）を同定した。
【００５６】
【表２】
2005510202.tif 000003
【００５７】
シークエンス反応は、PE Applied Biosystems（Perkin Elmer, カリフォルニア州フォスターシティ）のABI Prism dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kitを使って行った。20μlの配列反応液は、30〜1000ngのDNAテンプレート（ラムダDNA、プラスミドDNAまたはPCR産物）、8μlのターミネーター・レディ・リアクション・ミックス（terminator ready reaction mix）および4pmolの各プライマーからなった。PCRシークエンスプログラムは、96℃で1分の後、96℃で10秒、52℃で10秒および60℃で4分を35サイクルとした。セントリセップ（centri-sep）カラムを使用し、製造者のプロトコールに従って（Princeton Separations, Inc., ニュージャージー州アデルフィア）、PCR産物を精製し、ABI Prism 310ジェネティックアナライザー（Perkin Elmer, カリフォルニア州フォスターシティ）によって配列を解析した。
【００５８】
3'ゲノム隣接プローブ
各PERV遺伝子座から得たユニークな3'隣接配列に基づいて、遺伝子座特異的な3'隣接プローブを、特異的プライマー（配列番号36〜95）を使って増幅した。各プローブをTAクローニングベクター（Invitrogen, カリフォルニア州カールスバッド）にサブローニングし、配列を確認した。
【００５９】
データベースに対する3'隣接配列のBlast検索
上述のように同定された全PERV遺伝子座の3'隣接プローブの配列を、11のデータベース（nr、dbests、dbsts、mouse ests、human ests、other ests、pdb、patents、epd、gss、およびhtgs, Altschulら, 1997. Nucl. Acids Res. 3389-3402）に対して検索した。以下のPERV遺伝子座は、上に挙げたデータベースに登録されている配列のいずれとも有意なホモロジーを持っていなかった。G1-8、G10-12、G14-16、G19-22、G24-26およびG28-30。PERV G6、G9、G13、G17、G18、G23、およびG27は、下記表3に挙げるように、一部のデータベース配列に対してホモロジーを持っていた。
【００６０】
【表３】
2005510202.tif 000004
【００６１】
実施例２
ユニークな3'隣接配列G3-25（配列番号8）のクローニング
以下の説明は、当業者がユニークな3'隣接配列を有するPERVクローンを作製または取得する方法を例示するものである。以下の説明と教示を考慮すれば、当業者は下記の方法を応用して本明細書に記載するどのPERVクローンでも取得することができ、ある特定PERVクローンの単離には限定されない。ラムダライブラリーを実施例1で述べたように構築した。env-consプローブ（配列番号1）を使ってラムダFIX IIベクターから一つのPERVクローンを単離した。3'隣接配列を他とは異なるユニークな配列として（すなわちPERV遺伝子座として）識別するために、PERVラムダクローンをプライマー対env5(2)およびT3またはT7（図8参照）を使って増幅することにより、PERVのenv領域の末端からPERV LTRの3'領域に隣接するブタゲノム配列までに相当する産物を生成させた。次に、精製したPCR産物を、LTR530（PERV LTRの末端から100bp上流に位置する）オリゴヌクレチドを使って配列決定し、その結果得られた3'隣接配列に基づいて、G3遺伝子座に特異的なプライマー対を設計した。そのプライマー対（5'G3（配列番号40）/3'G3（配列番号41））を使ってG3プローブを増幅した。
【００６２】
次に、潜在的に感染性であるPERVの同定に適したユニークな3'隣接配列を含むG3-25クローンを、pZerO-2ベクター（Invitrogen, カリフォルニア州）のNotI部位にサブクローニングした（図10）。pZerO-2ベクターの骨格を、ベクターのStuI部位に挿入されたネオマイシン遺伝子で改変することにより（図10）、G3-25クローンインサートを含むプラスミドを選択できるようにした。
【００６３】
サブクローニングを終えたら、G3-25含有プラスミドをヒト293細胞（ATCC：CRL-1573）にトランスフェクトし、G418選択後に陽性トランスフェクタントを得た。次に、G3-25クローンを含む293細胞から得た上清を、ハイグロマイシン耐性293細胞（Hygr）と共培養し、ハイグロマイシン選択下で生育させた。
【００６４】
実施例３
ユニークな3'隣接配列G19-A45（配列番号24）のクローニング
以下の説明は、当業者がユニークな3'隣接配列を有するPERVクローンを作製または取得する方法を例示するものである。以下の説明と教示を考慮に入すれば、当業者は下記の方法を応用して本明細書に記載するどのPERVクローンでも取得することができ、ある特定PERVクローンの単離には限定されない。ラムダライブラリーを実施例1で述べたように構築した。PERV-Aプローブ（配列番号4）を使ってラムダFIX IIベクターから一つのPERVクローンを単離した。3'隣接配列を他とは異なるユニークな配列として（すなわちPERV遺伝子座として）識別するために、PERVラムダクローンをプライマー対env5(2)およびT3またはT7（図8参照）を使って増幅することにより、PERVのenv領域の末端からPERV LTRの3'領域に隣接するブタゲノム配列までに相当する産物を生成させた。次に、精製したPCR産物を、LTR530（PERV LTRの末端から100bp上流に位置する）オリゴヌクレチドを使って配列決定し、その結果得られた3'隣接配列に基づいて、G19遺伝子座に特異的なプライマー対を設計した。このプライマー対（5'G19（配列番号72）/3'G19（配列番号73））を使ってG19-A45プローブを増幅した。
【００６５】
次に、潜在的に感染性であるPERVの同定に適したユニークな3'隣接配列を含むG19-A45クローンを、pZerO-2ベクター（Invitrogen, カリフォルニア州）のNotI部位にサブクローニングした（図10）。pZerO-2ベクターの骨格を、ベクターのStuI部位に挿入されたネオマイシン遺伝子で改変することにより（図10）、G19-A45クローンインサートを含むプラスミドを選択できるようにした。
【００６６】
サブクローニングを終えたら、G19-A45含有プラスミドをヒト293細胞（ATCC：CRL-1573）にトランスフェクトし、G418選択後に陽性トランスフェクタントを得た。次に、G19-A45クローンを含む293細胞から得た上清を、ハイグロマイシン耐性293細胞（Hygr）と共培養し、ハイグロマイシン選択下で生育させた。
【００６７】
実施例４
ユニークな3'隣接配列G28-402A（配列番号33）のクローニング
以下の説明は、当業者がユニークな3'隣接配列を有するPERVクローンを作製または取得する方法を例示するものである。以下の説明と教示を考慮に入すれば、当業者は下記の方法を応用して本明細書に記載するどのPERVクローンでも取得することができ、ある特定PERVクローンの単離には限定されない。ラムダライブラリーを実施例1で述べたように構築した。PERV-Aプローブ（配列番号4）を使ってラムダFIX IIベクターから一つのPERVクローンを単離した。3'隣接配列を他とは異なるユニークな配列として（すなわちPERV遺伝子座として）識別するために、PERVラムダクローンをプライマー対env5(2)およびT3またはT7（図10参照）を使って増幅することにより、PERVのenv領域の末端からPERV LTRの3'領域に隣接するブタゲノム配列までに相当する産物を生成させた。次に、精製したPCR産物を、LTR530（PERV LTRの末端から100bp上流に位置する）オリゴヌクレチドを使って配列決定し、その結果得られた3'隣接配列に基づいて、G28遺伝子座に特異的なプライマー対を設計した。このプライマー対（5'G28（配列番号90）/3'G28（配列番号91））を使ってG28-402Aプローブを増幅した。
【００６８】
次に、潜在的に感染性であるPERVの同定に適したユニークな3'隣接配列を含むG28-402Aクローンを、pZerO-2ベクター（Invitrogen, カリフォルニア州）のNotI部位にサブクローニングした（図10）。pZerO-2ベクターの骨格を、ベクターのStuI部位に挿入されたネオマイシン遺伝子で改変することにより（図10）、G28-402Aクローンインサートを含むプラスミドを選択できるようにした。
【００６９】
サブクローニングを終えたら、G28-402A含有プラスミドをヒト293細胞（ATCC：CRL-1573）にトランスフェクトし、G418選択後に陽性トランスフェクタントを得た。次に、G28-402Aクローンを含む293細胞から得た上清を、ハイグロマイシン耐性293細胞（Hygr）と共培養し、ハイグロマイシン選択下で生育させた。
【００７０】
実施例５
PERV遺伝子座の対立遺伝子多型を同定するためのPCR解析
特定のPERV組込みを含むまたは含まない対立遺伝子の存在を決定する方法には、PCR解析の使用が含まれる。特定のPERV遺伝子座に隣接する特異的プライマーを使ってブタゲノムDNAを解析した。図3を参照して説明すると、使用する特異的プライマー対を、Gn-5'/3'-Gnという記号で示す。「n」は番号によって識別される各特定PERV遺伝子座を表す。当該PERV組込みを含まない対立遺伝子の場合は、このプライマー対により、約200〜400bpのサイズを有するDNA産物が増幅されるだろう。当該PERV組込みを有する対立遺伝子を含む試料では、通常の条件ではPCR反応がうまくいかないだろう。これは、予想されるPCR産物が約9Kb（使用するPCR条件では大きすぎて増幅がうまくいかないサイズ）だからである。小さい方の増幅産物（200〜400bp）を配列決定した。小さい方のPCR産物の配列解析により、遺伝子座特異的な組込み部位が明らかになった。G3（配列番号8）およびG19（配列番号24）PERV遺伝子座の対立遺伝子多型に関する典型的解析の結果を図5に示す。G28（配列番号33）遺伝子座の対立遺伝子多型に関する典型的解析の結果を図7に示す。
【００７１】
図5を参照して説明すると、内部対照として、G19-A45（配列番号25）遺伝子座に隣接するプライマー対を各試料に使用し、その結果を図5の最上段に示す。図5の下部にはオリゴヌクレオチドプライマーの位置を示す地図を記載する。図5の上側に記載する表の2段目に示すように、プライマー対G19-5'/3'G19（フォワードプライマー＝PERV遺伝子の5'末端；リバースプライマー＝ユニークな3'隣接配列の3'末端）から得られるPCR産物は、少なくとも一方の対立遺伝子上にPERV-G19が存在しないことを示している。Env5(2)/3'G19プライマー（フォワードプライマー＝PERV遺伝子の3'末端内；リバースプライマー＝ユニークな3'隣接配列の3'末端）を使ったPCR解析の結果も図5（中央）に示す。PCR産物の存在は、試料中の少なくとも一方の対立遺伝子がPERV-G19を有することを表す。
【００７２】
一連のトランスジェニックブタにおける対立遺伝子多型に関する遺伝子型解析の結果を図5の上側に示す。図5に示すように、合計11匹のブタから得たDNAの遺伝子型解析は、ブタP7665およびP7679から得たゲノムDNAが、潜在的に感染性であるPERV-G19遺伝子座を欠いていることを示した。これらのブタを種畜として使用すれば、異種移植ドナー組織の供給源として使用されるPERV-G19非含有ブタを作出するための選抜育種が可能になるだろう。
【００７３】
実施例６
PERV遺伝子座の対立遺伝子多型を同定するためのサザンブロット解析
PERV遺伝子座対立遺伝子多型を決定するもう一つの方法はサザンブロット解析による方法である。サザンブロットを各特定3'隣接ゲノム領域を認識するプローブとハイブリダイズさせた場合のバンディングパターンは、各遺伝子座の制限地図に基づいて予測することができる。PERVが存在する場合は、PERVが両方の対立遺伝子上に存在するか、一方の対立遺伝子上に存在するか、またはどちらの対立遺伝子上にも存在しないかによって、異なるバンディングパターンが現れるだろう。認められた多型は、使用した制限酵素部位での配列多型によるか、またはPERV組込み遺伝子多型によるものと考えられる。これは、複数の制限酵素を使用することによって検討することができる。特定PERV遺伝子座に関してさまざまな対立遺伝子多型を同定するために使用されるサザンブロット解析の一例を、図4および6に示す。
【００７４】
サザンブロット解析条件：
ブタゲノムDNAをさまざまな制限酵素で消化し、アガロースゲルでサイズ分画し、ナイロン膜に転写した。架橋後に、膜をハイブリダイゼーション緩衝液（1％ウシ血清アルブミン、1mM EDTA、0.5M NaHPO4、pH7.2、7％ドデシル硫酸ナトリウム）中、65℃で2時間プレハイブリダイゼーションした。次に、32P標識PERVプローブを含む新しいハイブリダイゼーション緩衝液を加え、65℃で一晩インキュベートした。プローブはT7 QuickPrime（Pharmacia, ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使って(32P)dCTPで標識した。ハイブリダイゼーション後に、ナイロン膜を、2×SSC/0.2％SDSで1回、0.2×SSC/0.2％SDSで1回、65℃で洗浄し、一晩オートラジオグラフィーにかけた。
【００７５】
G3-25 3'隣接プローブ（配列番号8）でプローブした場合、PERV-G3対立遺伝子が試料中に存在すれば、HindIIIでの制限消化によって1.3kbの断片が生じるだろう。PERV-G3対立遺伝子を含まない試料は3kbのサイズを有する断片をもたらすだろう。図4に、HindIII消化とG3-25プローブ（配列番号8）とを使ったサザンブロット解析を示す。レーン1、8、9、10、11および12のDNAは、両方の対立遺伝子上にPERV-G3を含んでいる（+/+）。レーン3、6および7のDNAは、どちらの対立遺伝子にもPERV-G3を含んでいない（-/-）。レーン2、4および5のDNAは一方の対立遺伝子だけにPERV-G3を含んでいる（+/-）。
【００７６】
PERV G19遺伝子座のサザンブロット解析によって得られた結果を図6に示す。PERV対立遺伝子が存在すれば、BamHIでの制限消化によって2kbの断片が生じるだろう。PERV G19が存在しない場合は3kbのサイズを有する産物が生成する。図6に示すように、試料L26-3、L26-4、L26-5、42-2および42-4は、PERV G19遺伝子座に関してホモ接合的に陰性（-/-）である。動物42−3および42−5はPERV G19遺伝子座を一方の対立遺伝子上に含み（+/-）、42-1は両方の対立遺伝子上にPERV-G19を持っている（+/+）。
【００７７】
PERV G28遺伝子座のPCRおよびサザンブロット解析によって得られた結果を図7に示す。PERV G28遺伝子座の遺伝子型解析は、ブタp7714、p7715およびp7721がPERV G28遺伝子座に関してホモ接合的に陰性（-/-）であることを示している。動物p7348、p7710およびp7711はPERV G28遺伝子座を一方の対立遺伝子上に含んでいる（+/-）。
【００７８】
これらの方法により、ブタ個体をスクリーニングして、一方または両方の対立遺伝子に特定のPERV組込みが起こっていないブタを同定することが可能になり、その結果として、感染性である可能性を有するPERV遺伝子座を含まない子孫を作出する目的でブタを育種することができるようになる。
【００７９】
上記の実施例に示したように、サザンブロットおよびPCR解析により、3つのPERV遺伝子座のすべてが対立遺伝子多型を示すことが証明された。したがって本発明は、G3、G19およびG28 PERV遺伝子座に関して陰性なブタの育種を可能にする。
【００８０】
物質の寄託
以下の物質は、米国20110-2209バージニア州マナッサス、ユニバーシティ・ブルバード10801のAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄託されている。
物質 ATCC受託番号 寄託日
プラスミドDNA(G3-25)                        2001年3月20日
プラスミドDNA(G19-A45)                      2001年3月20日
プラスミドDNA(G28-402A)                     2001年3月20日
【００８１】
これらの寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約および同条約に基づく規則（ブダペスト条約）の規定に基づいてなされた。これにより、寄託の日から30年間は、本寄託物の生育可能な培養物の維持が保証される。本寄託物は、関連米国特許の発行または米国もしくは外国特許出願の公開がなされた場合にはどちらが早くても直ちに公衆が本寄託物の培養物の子孫を永久かつ無制限に入手できることを保証すると共に、米国特許商標庁長官が35USC§122およびそれに準ずる長官規則（特に886 OG 638に関して37CFR§1.14を含む）に基づいて決定した者が前記子孫を入手できることを保証する、Nextran, Inc.とATCCとの取り決めに従い、ブダペスト条約に基づいて、ATCCにより、入手可能な状態に置かれるだろう。
【００８２】
本願の譲受人は、寄託された物質の培養物が適切な条件下で培養されている時に死滅するか、紛失するか、破壊された場合には、通知を受けた後直ちに、その物質を別の同物質と交換することに同意している。寄託物が入手可能であるということを、各政府当局によりその特許法に基づいて付与される権利に違反して本発明を実施することの許諾であると解釈してはならない。
【００８３】
本発明は、寄託されたコンストラクトによってその範囲を限定されないものとする。なぜなら、寄託された実施形態は本発明のある態様の一例として挙げたものであり、機能的に等価なコンストラクトはいずれも本発明の範囲に包含されるからである。ここでの物質の寄託は、本明細書に記載された説明が、本発明のいずれかの態様を、その最良の形態を含めて、実施可能とするには不十分であることの自白を構成するものではなく、また、本願特許請求の範囲を、当該寄託が表す具体例に限定するものであるとみなすべきでもない。実際、当業者には、本明細書に示し説明した実施形態の他にもさまざまな本発明の変更態様が、上述の説明から明白になり、それらの変更態様も本願特許請求の範囲に包含される。
【００８４】
本願では数多くの刊行物および特許に言及するが、それらはいずれも参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、プローブの開発に使用したPERV遺伝子の領域を表す。
【図２】図２は、PERVインサートを含むベクターの地図を表す。
【図３】図３は、PCR解析に役立つオリゴヌクレオチドプライマーの位置を示すPERV遺伝子座の地図を表す。
【図４】図４は、サザンブロット解析によるPERV遺伝子座の対立遺伝子多型を例示する図である。
【図５】図５は、PCR解析によるPERV遺伝子座の対立遺伝子多型を例示する図である。
【図６】図６は、PERV遺伝子座の対立遺伝子多型の同定を表す。
【図７】図７は、PERV遺伝子座の対立遺伝子多型の同定を表す。
【図８】図８は、3'隣接配列の決定に役立つオリゴヌクレオチドプライマーの位置を示すPERVクローンの地図を表す。
【図９】図９は、5'隣接配列の決定に役立つオリゴヌクレオチドプライマーの位置を示すPERVクローンの地図を表す。
【図１０】図１０は、PERV遺伝子座をサブクローニングする方法の流れ図を表す。
【図１１】図１１は、全G3 PERVゲノムを表す。
【図１２】図１２は、全G19 PERVゲノムを表す。
【図１３】図１３は、全G28 PERVゲノムを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
2005510202.tif 000023
【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【配列表】
2005510202000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成14年10月21日(2002.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる2001年3月28日出願の米国特許出願第60/279,337号に基づく優先権を主張する。
【連邦政府後援の研究開発に関する記述】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
【図１】図１は、プローブの開発に使用したPERV遺伝子の領域を表す。
【図２】図２は、PERVインサートを含むベクターの地図を表す。
【図３】図３は、PCR解析に役立つオリゴヌクレオチドプライマーの位置を示すPERV遺伝子座の地図を表す。
【図４】図４は、サザンブロット解析によるPERV遺伝子座の対立遺伝子多型を例示する図である。
【図５】図５は、PCR解析によるPERV遺伝子座の対立遺伝子多型を例示する図である。
【図６】図６は、PERV遺伝子座の対立遺伝子多型の同定を表す。
【図７】図７は、PERV遺伝子座の対立遺伝子多型の同定を表す。
【図８】図８は、3'隣接配列の決定に役立つオリゴヌクレオチドプライマーの位置を示すPERVクローンの地図を表す。
【図９】図９は、5'隣接配列の決定に役立つオリゴヌクレオチドプライマーの位置を示すPERVクローンの地図を表す。
【図１０】図１０は、PERV遺伝子座をサブクローニングする方法の流れ図を表す。
【図１１】図１１は、全G3 PERVゲノムを表す（配列番号137）。
【図１２】図１２は、全G19 PERVゲノムを表す（配列番号138）。
【図１３】図１３は、全G28 PERVゲノムを表す（配列番号139）。
【国際調査報告】
2005510202.tif 000027
2005510202.tif 000028
2005510202.tif 000029
2005510202.tif 000030
2005510202.tif 000031
2005510202.tif 000032