(57)【要約】  本発明は、新規な腎臓病診断用マーカー及びその利用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコール酸；
N5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン；
５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸；
トリメチルグリシンと、グリコール酸、N5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン、グアニジノ酢酸、４-グアニジノ酪酸、N6-アセチルリシン、N1-アセチルヒスチジン及びヒスチジンから選択されるいずれか１つとからなる組合せ；
グリコール酸と、N5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン、シチジン、バリン、キヌレニン、２-オキソグルタル酸、グリコシアミジン及びコリンから選択されるいずれか１つとからなる組合せ；
シスチンと、N1-アセチルヒスチジン、ヒスチジン、グリシン、トリプトファン及びメチオニンから選択されるいずれか１つとからなる組合せ；及び
トリプトファンとオルニチンとからなる組合せ；
の少なくとも１つから選択される腎臓病の診断用マーカー。
【請求項２】
腎臓病が、糖尿病性腎症である、請求項１に記載の診断用マーカー。
【請求項３】
コンピュータに、
腎臓病が疑われる被験者から採取された尿及び／又は血漿に含まれる、請求項１に記載の腎臓病の診断用マーカーの濃度を取得するステップ；
取得された濃度に基づいて、前記被験者が腎臓病であるか否かを判定するステップ；及び
判定結果を出力するステップ；
を実行させるためのコンピュータプログラム。
【請求項４】
コンピュータに、取得ステップにより取得されたマーカーの濃度の値と、閾値とを比較するステップをさらに実行させ、
取得ステップが、腎臓病が疑われる被験者から採取された尿又は血漿に含まれる、グリコール酸、N5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン及び５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸から選択される少なくとも１つのマーカーの濃度の値を取得するステップであり、
判定ステップが、比較ステップにより得られた比較結果に基づいて、被験者が腎臓病であるか否かを判定するステップである、
請求項３に記載のコンピュータプログラム。
【請求項５】
コンピュータに、
取得ステップにより取得された尿中及び血漿中のマーカーの濃度の値から、前記マーカーの尿中の濃度と血漿中の濃度との比に関する値を算出するステップ；及び
算出された前記マーカーの尿中の濃度と血漿中の濃度の比に関する値と、閾値とを比較するステップ；
をさらに実行させ、
取得ステップが、腎臓病が疑われる被験者から採取された尿及び血漿に含まれる、グリコール酸、N5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン及び５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸から選択される少なくとも１つ物質の濃度の値を取得するステップであり、
判定ステップが、比較ステップにより得られた比較結果に基づいて、被験者が腎臓病であるか否かを判定するステップである、
請求項３に記載のコンピュータプログラム。
【請求項６】
コンピュータに、
取得ステップにより取得された尿中及び／又は血漿中の２つの物質の組合せからなる腎臓病の診断用マーカーの一方の物質の濃度と他方の物質の濃度とから、２つの物質の濃度の比に関する値を算出する算出ステップ；及び
算出された２つの物質の濃度の比に関する値と、閾値とを比較する比較ステップ；
をさらに実行させ、
取得ステップが、腎臓病が疑われる被験者から採取された尿及び血漿に含まれる、２つの物質の組合せからなる腎臓病の診断用マーカーから選択される少なくとも１つのマーカーの物質の濃度の値を取得するステップであり、
判定ステップが、比較ステップにより得られた比較結果に基づいて、被験者が腎臓病であるか否かを判定するステップである、
請求項３に記載のコンピュータプログラム。
【請求項７】
腎臓病の診断用マーカーが、トリメチルグリシンと、N5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン又はグアニジノ酢酸との組合せである、請求項６に記載のコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓病診断用マーカー及び該マーカーを用いる腎臓病の診断のためのコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓病とは、腎臓の各組織における病変に起因して生じる疾患である。腎臓病には主に、１）血液濾過を担う糸球体の病変による糸球体腎炎、２）原尿から水分・電解質などの再吸収を担う尿細管の病変による尿細管・間質性腎炎、３）腎血管病変による細動脈硬化症などがある。【０００３】
腎臓病が進行して腎不全に陥ると、治療を開始しても腎機能の回復及び維持は困難であるので、透析治療が必要になる。近年、透析治療を必要とする患者数は増加しており、それに伴う医療費の増加が問題となっている。
したがって、正確な診断により腎臓病の患者を早期に発見することが重要である。【０００４】
現在、腎臓病の診断においては、糸球体濾過値（glomerular filtration rate：GFR）を測定することにより、腎機能の評価が行われている。
また、腎臓病の診断マーカーとして、尿中微量アルブミン、IV型コラーゲン、トランスフェリン、IgG、ラミニン、フィブロネクチン、α-１ミクログロブリン、β-２ミクログロブリン、シスタチンC、N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ（NAG）、L型脂肪酸結合タンパク（L-FABP）、グリコシアミジン及びその誘導体なども用いられている（特許文献１及び２参照）。【０００５】
しかしながら、より高精度に腎臓病を診断するためには、GFRの測定や上記の診断マーカーだけでは十分ではない。そのため、腎臓病の診断に有用な新規マーカーのさらなる開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平２−２８８８６７号公報
【特許文献２】特開２００１−１７４４５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規な腎臓病診断用マーカーを提供することを目的とする。また、本発明は、該腎臓病診断用マーカーを用いる腎臓病の診断のためのコンピュータプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、健常者及び腎臓病患者から得た検体について、キャピラリー電気泳動−質量分析法（CE-MS法）による解析を行った結果、新たな腎臓病診断用マーカーを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明によれば、
グリコール酸；
N5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン；
５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸；
トリメチルグリシンと、グリコール酸、N5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン、グアニジノ酢酸、４-グアニジノ酪酸、N6-アセチルリシン、N1-アセチルヒスチジン及びヒスチジンから選択されるいずれか１つとからなる組合せ；
グリコール酸と、N5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン、シチジン、バリン、キヌレニン、２-オキソグルタル酸、グリコシアミジン及びコリンから選択されるいずれか１つとからなる組合せ；
シスチンと、N1-アセチルヒスチジン、ヒスチジン、グリシン、トリプトファン及びメチオニンから選択されるいずれか１つとからなる組合せ；及び
トリプトファンとオルニチンとからなる組合せ；
の少なくとも１つから選択される、腎臓病の診断用マーカーが提供される。【００１０】
また、本発明によれば、コンピュータに、
腎臓病が疑われる被験者から採取された尿及び／又は血漿に含まれる、上記の診断用マーカーの濃度を取得する取得ステップ；
取得された濃度に基づいて、被験者が腎臓病であるか否かを判定する判定ステップ；及び
判定結果を出力する出力ステップ；
を実行させるためのコンピュータプログラムが提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、より精度の高い診断に有用な腎臓病の診断用マーカーを提供できる。本発明の腎臓病の診断用マーカーを用いれば、被験者が腎臓病であるか否かを診断できるだけではなく、該被験者が腎臓病の治療を受けている場合は、その症状の改善の程度や治療の有効性などの評価を行うこともできる。
さらに、本発明によれば、上記の腎臓病診断用マーカーを用いる腎臓病の診断のためのコンピュータプログラムを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】腎臓病の各病態における本発明の腎臓病の診断用マーカーの濃度又は濃度の比の変動パターンを示す図である。a）及びc）は、健常から顕性腎症期まで濃度などの増加又は減少が継続する場合を示し、b）及びd）は、健常から早期腎症期までは濃度などの増加又は減少が継続するが、早期腎症期から顕性腎症期までは変化がない場合を示す。
【図２】物質群をキャピラリー電気泳動（CE）で分離したときのチャートの一例を示す図である。
【図３】CEで分離した物質を質量分析（MS）測定したときのチャートの一例を示す図である。
【図４】同定対象の物質と標準物質とをMS/MS測定したときのチャートの一例を示す図である。
【図５】健常者及び各患者群における尿中のグリコール酸の定量値を示す図である。
【図６】健常者及び各患者群における尿中の５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸の定量値を示す図である。
【図７】健常者及び各患者群におけるN5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン（以下、「ADMA」ともいう）の定量値を示す図であり、（a）は尿中の定量値、（b）は血漿中の定量値、（c）は尿中の定量値と血漿中の定量値との比率を示す。
【図８】健常者及び各患者群における尿中のトリメチルグリシン（以下、「TMG」ともいう）と尿中のグアニジノ酢酸との比率を示す図である。
【図９】健常者及び各患者群における尿中のTMGと尿中のグリコール酸との比率を示す図である。
【図１０】健常者及び各患者群における尿中のTMGと尿中のADMAとの比率を示す図である。
【図１１】健常者及び各患者群における尿中のTMGと尿中の４-グアニジノ酪酸との比率を示す図である。
【図１２】健常者及び各患者群における尿中のTMGと尿中のN6-アセチルリシンとの比率を示す図である。
【図１３】健常者及び各患者群における尿中のTMGと尿中のN1-アセチルヒスチジンとの比率を示す図である。
【図１４】健常者及び各患者群における尿中のTMGと尿中のヒスチジンとの比率を示す図である。
【図１５】健常者及び各患者群における血漿中のコリンと尿中のグリコール酸との比率を示す図である。
【図１６】健常者及び各患者群における尿中のバリンと尿中のグリコール酸との比率を示す図である。
【図１７】健常者及び各患者群における血漿中のキヌレニンと尿中のグリコール酸との比率を示す図である。
【図１８】健常者及び各患者群における尿中のグリコシアミジンと尿中のグリコール酸との比率を示す図である。
【図１９】健常者及び各患者群における血漿中のADMAと尿中のグリコール酸との比率を示す図である。
【図２０】健常者及び各患者群における血漿中の２-オキソグルタル酸と尿中のグリコール酸との比率を示す図である。
【図２１】健常者及び各患者群における尿中のシチジンと尿中のグリコール酸との比率を示す図である。
【図２２】健常者及び各患者群における尿中のシスチンと尿中のヒスチジンとの比率を示す図である。
【図２３】健常者及び各患者群における尿中のシスチンと尿中のグリシンとの比率を示す図である。
【図２４】健常者及び各患者群における尿中のシスチンと尿中のN1-アセチルヒスチジンとの比率を示す図である。
【図２５】健常者及び各患者群における尿中のシスチンと尿中のトリプトファンとの比率を示す図である。
【図２６】健常者及び各患者群における尿中のシスチンと尿中のメチオニンとの比率を示す図である。
【図２７】健常者及び各患者群における血漿中のオルニチンと血漿中のトリプトファンとの比率を示す図である。
【図２８】腎臓病の診断を実行するためのコンピュータシステムのブロック図である。
【図２９】実施形態１の腎臓病の診断方法をコンピュータに実現させる場合に、ＣＰＵによって実行されるフローチャートである。
【図３０】実施形態２の腎臓病の診断方法をコンピュータに実現させる場合に、ＣＰＵによって実行されるフローチャートである。
【図３１】実施形態３の腎臓病の診断方法をコンピュータに実現させる場合に、ＣＰＵによって実行されるフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の腎臓病の診断用マーカーとして用いられる物質の名称及びそれらの構造式を、以下の化１〜５に示す。本発明の腎臓病の診断用マーカーは、化１〜５に示される１つの物質又は２つの物質の組合せを含む。
【００１４】
【化１】
2011136228.tif 000002
【００１５】
【化２】
2011136228.tif 000003
【００１６】
【化３】
2011136228.tif 000004
【００１７】
【化４】
2011136228.tif 000005
【００１８】
【化５】
2011136228.tif 000006
【００１９】
２つの物質の組合せからなる腎臓病の診断用マーカーとしては、以下の組合せ１〜４に示す物質の組合せが挙げられる。なお、これらの組合せ１〜４を、それぞれ表１〜４でより具体的に示す。すなわち、本発明の２つの物質の組合せからなる腎臓病の診断用マーカーは、各表に示す物質Aと物質Bとの組合せから選択される。
【００２０】
（組合せ１）
トリメチルグリシン（TMG）である物質Aと、グリコール酸、N5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン（ADMA）、グアニジノ酢酸、４-グアニジノ酪酸、N6-アセチルリシン、N1-アセチルヒスチジン及びヒスチジンから選択されるいずれか１つである物質Bとの組合せ。
【００２１】
【表１】
2011136228.tif 000007
【００２２】
（組合せ２）
グリコール酸である物質Aと、ADMA、シチジン、バリン、キヌレニン、２−オキソグルタル酸、グリコシアミジン及びコリンから選択されるいずれか１つである物質Bとの組合せ。
【００２３】
【表２】
2011136228.tif 000008
【００２４】
（組合せ３）
シスチンである物質Aと、N1-アセチルヒスチジン、ヒスチジン、グリシン、トリプトファン及びメチオニンから選択されるいずれか１つである物質Bとの組合せ。
【００２５】
【表３】
2011136228.tif 000009
【００２６】
（組合せ４）
トリプトファンである物質Aとオルニチンである物質Bとの組合せ。
【００２７】
【表４】
2011136228.tif 000010
【００２８】
本発明において、腎臓病は、腎臓の各組織における病変に起因して生じる疾患であれば、特に制限されない。腎臓病としては、例えば糖尿病性腎症、糸球体腎炎及び尿細管・間質性腎炎などが挙げられる。
本発明の腎臓病の診断用マーカーは、上記の腎臓病の中でも、糖尿病に伴って発症する糖尿病性腎症の診断用マーカーとして好適に用いることができる。
【００２９】
本発明の腎臓病の診断用マーカーを用いることによって、腎臓病の診断を行うことが可能である。そのような診断の方法は、腎臓病が疑われる被験者から採取された尿及び／又は血漿に含まれる上記の腎臓病の診断用マーカーを測定して行われるものであれば、特に制限されない。例えば、腎臓病が疑われる被験者から採取された尿及び／又は血漿中の上記の腎臓病の診断用マーカーの濃度を測定し、得られた測定結果に基づいて腎臓病の診断を行うことができる。なお、腎臓病の診断としては、腎臓病の確定診断及び腎臓病のスクリーニング検査、並びに腎臓病の治療効果の評価などが挙げられ、特に腎臓病のスクリーニング検査が好ましい。
【００３０】
上記の被験者から採取される尿は、該被験者の体調、食事及び服薬の有無、採取時期などによって特に限定されないが、好ましくは早朝尿（第１尿）である。上記の被験者から採取される血漿も、該被験者の体調、食事及び服薬の有無、採取時期などによって特に限定されず、該被験者から採取した血液から得られる血漿であればよい。
【００３１】
本発明のマーカーを用いる腎臓病の診断方法の具体例を以下に示す。
【００３２】
以下の実施形態１及び実施形態２は、１つの物質からなる腎臓病の診断用マーカーを用いる場合の腎臓病の診断方法である。
（実施形態１）
（１）腎臓病が疑われる被験者から採取された尿又は血漿に含まれるマーカーの濃度を測定する；
（２）測定されたマーカーの濃度の値と、閾値とを比較する；
（３）比較結果に基づいて、該被験者が腎臓病であるか否かを判定する。
【００３３】
（実施形態２）
（１）腎臓病が疑われる被験者から採取された尿及び血漿に含まれるマーカーの濃度を測定する；
（２）測定された該マーカーの尿中の濃度と血漿中の濃度との比に関する値を取得する；
（３）取得した該マーカーの尿中の濃度と血漿中の濃度との比に関する値と、閾値とを比較する；
（４）比較結果に基づいて、該被験者が腎臓病であるか否かを判定する。
【００３４】
実施形態２において、マーカーの尿中の濃度と血漿中の濃度との比に関する値としては、「血漿中の濃度／尿中の濃度」及び「尿中の濃度／血漿中の濃度」の値が挙げられる。
【００３５】
上記の実施形態１及び実施形態２に用いる腎臓病の診断用マーカーとしては、グリコール酸、ADMA及び５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸のいずれかが好適である。
【００３６】
以下の実施形態３は、２つの物質の組合せからなる腎臓病の診断用マーカーを用いる場合の腎臓病の診断方法である。
（実施形態３）
（１）腎臓病が疑われる被験者から採取された尿及び／又は血漿に含まれる２つの物質の各濃度を測定する；
（２）測定された該２つの物質の濃度の比に関する値を取得する；
（３）取得した該２つの物質の濃度の比に関する値と、閾値とを比較する；
（４）比較結果に基づいて、該被験者が腎臓病であるか否かを判定する。
【００３７】
実施形態３において、２つの物質の濃度の比に関する値としては、マーカーを構成する２つの物質をそれぞれ物質A及び物質Bとする場合、「A（血漿中）／B（血漿中）」、「A（血漿中）／B（尿中）」、「A（尿中）／B（血漿中）」、「A（尿中）／B（尿中）」、「B（血漿中）／A（血漿中）」、「B（血漿中）／A（尿中）」、「B（尿中）／A（血漿中）」及び「B（尿中）／A（尿中）」の値が挙げられる。
なお、「A（血漿中）」及び「A（尿中）」は、それぞれ血漿中及び尿中の物質Aの濃度を示し、「B（血漿中）」及び「B（尿中）」は、それぞれ血漿中及び尿中の物質Bの濃度を示す。
【００３８】
実施形態３に用いる腎臓病の診断用マーカーとしては、上記の組合せ１〜４から選択されるマーカーが好適である。
【００３９】
なお、上記の閾値は、例えば次のようにして設定できる。まず、従来技術により腎臓病でないことが予め確認されている者（すなわち、健常者）から尿及び／又は血漿を採取する。次いで、これらについて、本発明の腎臓病の診断用マーカーの濃度を測定し、さらに該濃度の値及び濃度の比に関する値を取得する。そして、得られた結果を所定の閾値として設定する。このようにして設定された閾値により、本発明の腎臓病の診断用マーカーを用いて診断される被験者が、健常であるか、又は腎臓病であるかの判定を可能にする。
また、上記の閾値は、健常者から採取した尿及び／又は血漿に代えて、糖尿病性腎症第１又は第２期の患者からの尿及び／又は血漿を用いて設定することもできる。この場合、その閾値により、本発明の腎臓病の診断用マーカーを用いて診断される被験者が、糖尿病性腎症第１又は第２期であるか、或いはより重症の腎臓病であるかの判定を可能にする。
なお、閾値の設定において、検体を採取される健常者及び／又は糖尿病性腎症第１又は第２期の患者の人数は、複数であることが好ましい。
【００４０】
上記の腎臓病の診断用マーカーの尿中及び血漿中の濃度の測定方法は特に制限されず、各マーカーが有する物質としての物理的又は化学的性質に応じて、適宜選択できる。
例えば、腎臓病が疑われる被験者から採取された尿又は血漿から測定されるべきサンプルを調製する。次に、該サンプルに含まれるマーカーを高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロマトグラフィー（GC）、キャピラリー電気泳動（CE）などで分離する。そして、分離したマーカーを、UV検出法、蛍光検出法、質量分析法（MS）などによる測定系に付すことによって、尿中又は血漿中のマーカーの濃度を測定できる。
或いは、該被験者から採取された尿又は血漿に含まれるマーカーと、該マーカーを基質とする酵素とを接触させて、酵素反応により生じた物質を、酸化還元電極法、比色法などによる測定系に付すことによって、尿中又は血漿中のマーカーの濃度を測定できる。
【００４１】
ここで、腎臓病の各病態における本発明の腎臓病の診断用マーカーの濃度又は濃度の比の変動パターンを、図１に例示する。なお、この図において、「健常」とは健常者を示し、「糖尿」とは糖尿病性腎症第１期（腎症前期）の患者を示し、「早期」とは糖尿病性腎症第２期（早期腎症期）の患者を示し、「顕性」とは糖尿病性腎症第３及び第４期（顕性腎症期）の患者を示す。
【００４２】
図１a）は、「健常」から「顕性」まで腎臓病の段階が進行するにしたがって、マーカーの濃度又は濃度の比が増加する傾向にある変動パターンである。
図１b）は、「健常」から「早期」までマーカーの濃度又は濃度の比が増加傾向を示すが、「早期」から「顕性」まではほぼ一定である変動パターンである。
図１c）は、「健常」から「顕性」まで腎臓病の段階が進行するにしたがって、マーカーの濃度又は濃度の比が減少する傾向にある変動パターンである。
図１d）は、「健常」から「早期」までマーカーの濃度又は濃度の比が減少傾向を示すが、「早期」から「顕性」まではほぼ一定である変動パターンである。
このように、本発明の腎臓病の診断用マーカーの濃度又は濃度の比は、「健常」から「早期」にかけて、増加又は減少する変動パターンを示す。そのため、閾値として、「早期」を判別できる、腎臓病の診断用マーカーの濃度又は濃度の比を設定することで、腎臓病の診断を行うことができる。
【００４３】
腎臓病の診断用マーカーとしてグリコール酸を用いて診断を行なう場合、診断方法としては尿中の濃度を用いる「実施形態１」が好ましい。この場合、尿中のグリコール酸の濃度は、図１c）のように「健常」から「早期」にかけて減少する変動パターンを示す。
したがって、被験者から採取された尿に含まれるグリコール酸の濃度の値が、所定の閾値より低い場合、該被験者が腎臓病であると診断できる。
【００４４】
腎臓病の診断用マーカーとして５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸を用いて診断を行なう場合、診断方法としては尿中の濃度を用いる「実施形態１」が好ましい。この場合、尿中の５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸の濃度は、図１c）のように「健常」から「早期」にかけて減少する変動パターンを示す。
したがって、被験者から採取された尿に含まれる５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸の濃度の値が、所定の閾値より低い場合、該被験者が腎臓病であると診断できる。
【００４５】
腎臓病の診断用マーカーとしてN5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン（ADMA）を用いて診断を行なう場合、診断方法としては尿中の濃度を用いる「実施形態１」及び尿中及び血漿中の濃度を用いる「実施形態２」が好ましい。
実施形態１の場合、尿中のADMAの濃度は、図１c）のように「健常」から「早期」にかけて減少する変動パターンを示す。
したがって、被験者から採取された尿に含まれるADMAの濃度の値が、所定の閾値より低い場合に、該被験者が腎臓病であると判定することができる。
また、実施形態２の場合、ADMAの血漿中の濃度／尿中の濃度の値は、図１a）のように「健常」から「早期」にかけて増加する変動パターンを示す。
したがって、ADMAの血漿中の濃度／尿中の濃度の値が、所定の閾値より高い場合に、該被験者が腎臓病であると判定することができる。
【００４６】
上記の「組合せ１」に示される腎臓病の診断用マーカーを用いて「実施形態３」により診断を行なう場合、２つの物質の濃度の比は、好ましくは尿中のトリメチルグリシンの濃度と、尿中の表１に記載される物質Bの濃度との比である。
【００４７】
上記の「組合せ２」に示される腎臓病の診断用マーカーを用いて「実施形態３」により診断を行なう場合、２つの物質の濃度の比に関する値は、好ましくは尿中のグリコール酸の濃度と、血漿中又は尿中の表２に記載される物質Bの濃度との比の値である。
特に、物質BがADMA、キヌレニン、２-オキソグルタル酸又はコリンである場合、２つの物質の濃度の比に関する値は、より好ましくは尿中のグリコール酸の濃度と、血漿中の該物質Bの濃度との比の値である。また、物質Bがバリン、シチジン又はグリコシアミジンである場合、２つのマーカーの濃度の比に関する値は、より好ましくは尿中のグリコール酸の濃度と、尿中の該物質Bの濃度との比の値である。
【００４８】
上記の「組合せ３」に示される腎臓病の診断用マーカーを用いて「実施形態３」により診断を行なう場合、２つの物質の濃度の比に関する値は、好ましくは尿中のシスチンの濃度と、尿中の表３に記載される物質Bの濃度との比の値である。
【００４９】
上記の「組合せ４」に示される腎臓病の診断用マーカーを用いて「実施形態３」により診断を行なう場合、２つの物質の濃度の比に関する値は、好ましくは血漿中のトリプトファンの濃度と、血漿中のオルニチンの濃度との比の値である。
【００５０】
本発明のコンピュータプログラムについて、以下に説明する。
【００５１】
本発明のコンピュータプログラムは、上記の本発明の腎臓病の診断用マーカーを用いる診断方法、好ましくは上記の実施形態１〜３の腎臓病の診断方法をコンピュータに実現させるためのコンピュータプログラムである。
本発明のコンピュータプログラムは、腎臓病が疑われる被験者から採取された尿及び／又は血漿に含まれる、本発明の腎臓病の診断用マーカーの濃度を取得するステップ（以下、「取得ステップ」ともいう）；
取得された濃度に基づいて、該被験者が腎臓病であるか否かを判定するステップ（以下、「判定ステップ」ともいう）；及び
判定結果を出力するステップ；
をコンピュータに実行させることができる。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態において、コンピュータプログラムは、コンピュータに、取得ステップにより取得されたマーカーの濃度の値と、閾値とを比較するステップをさらに実行させる。この実施形態では、取得ステップを、腎臓病が疑われる被験者から採取された尿又は血漿に含まれる、グリコール酸、N5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン及び５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸から選択される少なくとも１つのマーカーの濃度の値を取得するステップとし、判定ステップを、比較ステップにより得られた比較結果に基づいて、被験者が腎臓病であるか否かを判定するステップとする。これにより、本発明のコンピュータプログラムは、上記の実施形態１の診断方法をコンピュータに実現させることができる。
【００５３】
本発明の別の好ましい実施形態において、コンピュータプログラムは、コンピュータに、取得ステップにより取得された尿中及び血漿中のマーカーの濃度の値から、該マーカーの尿中の濃度と血漿中の濃度との比に関する値を算出するステップ；及び算出された該マーカーの尿中の濃度と血漿中の濃度の比に関する値と、閾値とを比較するステップをさらに実行させる。この実施形態では、取得ステップを、腎臓病が疑われる被験者から採取された尿及び血漿に含まれる、グリコール酸、N5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン及び５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸から選択される少なくとも１つ物質の濃度の値を取得するステップとし、判定ステップを、比較ステップにより得られた比較結果に基づいて、被験者が腎臓病であるか否かを判定するステップとする。これにより、本発明のコンピュータプログラムは、上記の実施形態２の診断方法をコンピュータに実現させることができる。
【００５４】
本発明の別の好ましい実施形態において、コンピュータプログラムは、コンピュータに、取得ステップにより取得された尿中及び／又は血漿中の２つの物質の組合せからなる腎臓病の診断用マーカーの一方の物質の濃度と他方の物質の濃度とから、２つの物質の濃度の比に関する値を算出する算出ステップ；及び算出された２つの物質の濃度の比に関する値と、閾値とを比較する比較ステップをさらに実行させる。この実施形態では、取得ステップを、腎臓病が疑われる被験者から採取された尿及び血漿に含まれる、２つの物質の組合せからなる腎臓病の診断用マーカーから選択される少なくとも１つのマーカーの物質の濃度の値を取得するステップとし、判定ステップを、比較ステップにより得られた比較結果に基づいて、被験者が腎臓病であるか否かを判定するステップとする。これにより、本発明のコンピュータプログラムは、上記の実施形態３の診断方法をコンピュータに実現させることができる。
なお、より好ましい実施形態においては、上記の尿中及び／又は血漿中の２つの物質の組合せは、トリメチルグリシンと、N5-[(ジメチルアミノ)イミノメチル]-オルニチン又はグアニジノ酢酸との組合せである。
【００５５】
本発明の範囲には、上記のコンピュータプログラムを格納したコンピュータ読み取り可能な記憶媒体も含まれる。
【００５６】
そのような本発明のコンピュータプログラムが作動するコンピュータのシステムの一例を、図２８に示す。
【００５７】
コンピュータ１００は、本体１１０と、表示部１２０と、入力デバイス１３０とから主として構成される。本体１１０において、ＣＰＵ１１０ａと、ＲＯＭ１１０ｂと、ＲＡＭ１１０ｃと、ハードディスク１１０ｄと、読出装置１１０ｅと、入出力インターフェース１１０ｆと、画像出力インターフェース１１０ｇとは、バス１１０ｈによって互いにデータ通信可能に接続されている。
【００５８】
ＣＰＵ１１０ａは、ＲＯＭ１１０ｂに記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ１１０ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＲＯＭ１１０ｂは、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成され、ＣＰＵ１１０ａにより実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。
ＲＡＭ１１０ｃは、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭなどによって構成される。ＲＡＭ１１０ｃは、ＲＯＭ１１０ｂ及びハードディスク１１０ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、ＲＡＭ１１０ｃは、ＣＰＵ１１０ａがこれらのコンピュータプログラムを実行するときの作業領域として利用される。
【００５９】
ハードディスク１１０ｄには、オペレーティングシステム及びアプリケーションシステムプログラムなどの、ＣＰＵ１１０ａに実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。後述する実施形態１〜３の腎臓病の診断方法をコンピュータ１００に実現させるためのコンピュータプログラム１４０ａ及び上記の実施形態１〜３で用いられる閾値も、ハードディスク１１０ｄにインストールされている。
【００６０】
読出装置１１０ｅは、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ又はＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成され、可搬型記憶媒体１４０に記録されたコンピュータプログラム又はデータを読み出すことができる。
可搬型記憶媒体１４０は、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ又はＤＶＤ−ＲＯＭなどの当該技術においてそれ自体公知の記憶媒体である。可搬型記憶媒体１４０には、被験者が腎臓病であるか否かのコンピュータによる判定に係るコンピュータプログラム１４０ａが、コンピュータに読み取り可能に記録されている。ＣＰＵ１１０ａは、可搬型記憶媒体１４０からコンピュータプログラム１４０ａを読み出し、これをハードディスク１１０ｄにインストールすることも可能である。
【００６１】
ハードディスク１１０ｄには、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するWindows（登録商標）などのグラフィカルユーザインターフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。
以下の説明において、腎臓病の判定に係るコンピュータプログラム１４０ａは、該オペレーティングシステム上で動作するものとする。
【００６２】
入出力インターフェース１１０ｆは、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェースなどから構成される。入出力インターフェース１１０ｆには、キーボード及びマウスからなる入力デバイス１３０が接続されている。そのため、ユーザーが該入力デバイス１３０を使用することにより、コンピュータ本体１１０に被験者から採取された尿及び血漿に含まれる腎臓病の診断マーカーの濃度のデータを入力できる。また、入出力インターフェース１１０ｆに、被験者から採取された尿及び血漿に含まれる腎臓病の診断マーカーの濃度の測定が可能な測定装置２００を接続することもできる。この場合、測定装置２００から、コンピュータ本体１１０に、腎臓病の診断マーカーの濃度のデータを入力できる。
【００６３】
画像出力インターフェース１１０ｈは、ＬＣＤ又はＣＲＴなどで構成される表示部１２０に接続されており、ＣＰＵ１１０ａから与えられる画像データに応じて映像信号を表示部１２０に出力する。表示部１２０は、入力された映像信号にしたがって、画像データを出力する。また、表示部１２０は、後述するＣＰＵ１１０ａから与えられた判定結果を出力する。
【００６４】
以下に、本発明のコンピュータプログラムに従ってコンピュータが実行する処理手順について、図面を用いて詳細に説明する。
図２９は、上記の実施形態１の腎臓病の診断方法をコンピュータ１００に実現させる場合に、ＣＰＵ１１０ａによって実行されるフローチャートを示す図である。
【００６５】
ＣＰＵ１１０ａは、被験者から採取された尿に含まれるグリコール酸の濃度の値が、ユーザーにより入力デバイス１３０を介して入力されると、入出力インターフェース１１０ｆを介してグリコール酸の濃度の値をＲＡＭ１１０ｃ及びハードディスク１１０ｄに記憶させる（ステップＳ11）。
【００６６】
ＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄに予め記憶させていた閾値（＝28.4）を呼び出して、グリコール酸の濃度の値と比較する（ステップＳ12）。
【００６７】
ＣＰＵ１１０ａは、グリコール酸の濃度の値が閾値よりも低ければ、該被験者が腎臓病であると判定する（ステップＳ13）。また、ＣＰＵ１１０ａは、グリコール酸の濃度の値が閾値以上であれば、該被験者が腎臓病ではないと判定する（ステップＳ14）。
【００６８】
ＣＰＵ１１０ａは、上記の判定結果を、ハードディスク１１０ｄに記憶させるとともに、画像出力インターフェース１１０ｇを介して表示部１２０に出力する（ステップＳ15）。
【００６９】
ここで、図２９に示される実施形態１では、上記のとおり、腎臓病の診断マーカーとしてグリコール酸を用いたが、これに限られない。例えば、腎臓病の診断マーカーとして、５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸及び／又はADMAを用いることもできる。
【００７０】
図３０は、上記の実施形態２の腎臓病の診断方法をコンピュータ１００に実現させる場合に、ＣＰＵ１１０ａによって実行されるフローチャートを示す図である。
【００７１】
ＣＰＵ１１０ａは、被験者から採取された尿及び血漿に含まれるADMAの濃度の値が、ユーザーにより入力デバイス１３０を介して入力されると、ADMAの濃度の値をＲＡＭ１１０ｃ及びハードディスク１１０ｄに記憶させる（ステップＳ21）。
【００７２】
ＣＰＵ１１０ａは、ＲＡＭ１１０ｃに記憶させた尿及び血漿に含まれるADMAの濃度の値を読み出し、ADMAの「血漿中の濃度／尿中の濃度」の値を算出し（ステップＳ22）、ＲＡＭ１１０ｃに記憶させる。
【００７３】
ＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄに予め記憶させていた閾値（＝0.094）を呼び出して、ADMAの「血漿中の濃度／尿中の濃度」の値と比較する（ステップＳ23）。
【００７４】
ＣＰＵ１１０ａは、ADMAの「血漿中の濃度／尿中の濃度」の値が閾値よりも高ければ、該被験者が腎臓病であると判定する（ステップＳ24）。また、ＣＰＵ１１０ａは、ADMAの「血漿中の濃度／尿中の濃度」の値が閾値以下であれば、該被験者が腎臓病ではないと判定する（ステップＳ25）。
【００７５】
ＣＰＵ１１０ａは、上記の判定結果を、ハードディスク１１０ｄに記憶させるとともに、画像出力インターフェース１１０ｇを介して表示部１２０に出力する（ステップＳ26）。
【００７６】
図３１は、上記の実施形態３の腎臓病の診断方法をコンピュータ１００に実現させる場合に、ＣＰＵ１１０ａによって実行されるフローチャートを示す図である。
【００７７】
ＣＰＵ１１０ａは、被験者から採取された尿に含まれる、TMGの濃度の値及びグリコール酸の濃度の値が、ユーザーにより入力デバイス１３０を介して入力されると、入出力インターフェース１１０ｆを介してこれらの濃度の値をＲＡＭ１１０ｃ及びハードディスク１１０ｄに記憶させる（ステップＳ31）。
【００７８】
ＣＰＵ１１０ａは、尿中のTMGの濃度の値及びグリコール酸の濃度の値から、「尿中のTMGの濃度／尿中のグリコール酸の濃度」の値を算出する（ステップＳ32）。
【００７９】
ＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄに予め記憶させていた閾値（＝0.64）を呼び出して、算出した「尿中のTMGの濃度／尿中のグリコール酸の濃度」の値と比較する（ステップＳ33）。
【００８０】
ＣＰＵ１１０ａは、「尿中のTMGの濃度／尿中のグリコール酸の濃度」の値が閾値よりも高ければ、該被験者が腎臓病であると判定する（ステップＳ34）。また、ＣＰＵ１１０ａは、「尿中のTMGの濃度／尿中のグリコール酸の濃度」の値が閾値以下であれば、該被験者が腎臓病ではないと判定する（ステップＳ35）。
【００８１】
ＣＰＵ１１０ａは、上記の判定結果を、ハードディスク１１０ｄに記憶させるとともに、画像出力インターフェース１１０ｇを介して表示部１２０に出力する（ステップＳ36）。
【００８２】
ここで、図３１に示される実施形態３では、上記のとおり、腎臓病の診断マーカーとしてTMGとグリコール酸との組合せを用いたが、これに限られない。すなわち、腎臓病の診断マーカーとして、表１〜４に示される組合せ１〜４の腎臓病の診断マーカーを用いることができる。また、濃度の比に関する値として、TMGとグリコール酸との尿中比率（「尿中のTMGの濃度／尿中のグリコール酸の濃度」の値）を用いたが、これに限られない。濃度の比に関する値は、腎臓病の診断マーカーとして使用する物質の組合せにより適宜設定できる。より具体的には、使用する腎臓病の診断マーカーに応じて、後述する実施例２の表７〜１０に示される濃度の比に関する値を設定できる。
【００８３】
なお、マーカーの濃度はユーザーにより入力デバイス１３０を介して入力されたが、これに限定されない。例えば、入出力インターフェース１１０ｆを介して接続された測定装置２００からマーカーの濃度を入力しても良い。また、測定装置２００で測定されたマーカーの濃度を可搬型記憶媒体１４０に記憶させ、読出装置１１０ｅが可搬型記憶媒体１４０からマーカーの濃度を読み出すようにしてもよい。
【００８４】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８５】
実施例１
以下のようにしてメタボローム解析を行った。
（１）サンプル
健常者20名と以下の患者群40名の計60名から同一日に採取した血漿及び早朝尿を検体として用いた。
患者群は、糖尿病患者19名、糖尿病性腎症第２期（早期腎症期）患者12名、糖尿病性腎症第３及び第４期（顕性腎症期）患者７名、並びに慢性腎臓病（CKD）患者２名であった。
なお、慢性腎臓病患者とは、非糖尿病性腎症の患者である。すなわち、慢性腎臓病患者から得られたデータを陽性対照とすることにより、本実施例で得られた結果が糖尿病に起因するものではないことが示される。【００８６】
（２）サンプルの調製
（2-1）血漿サンプル
内部標準物質としてL-メチオニンスルホン及びD-カンフル-10-スルホン酸の両方を終濃度10μMで含むメタノール溶液450μLに、血漿50μLを添加して撹拌した。これにクロロホルム500μLと蒸留水200μLを加えて攪拌し、遠心分離（2,300×g、４℃、５分）を行った。そして、水相を限外ろ過チューブ（ウルトラフリーMCPBCC遠心式フィルターユニット５kDa：MILLIPORE社製）に移し（200μL×２本分）、限外ろ過処理（9,100×g、４℃、120分）した。ろ液を乾固させ、これを蒸留水25μLに溶解して、血漿サンプルを得た。なお、後述する測定には２倍希釈したサンプルを用いた。【００８７】
（2-2）尿サンプル
尿20μLに、上記の内部標準物質を終濃度250μMで含む蒸留水80μLを加えて撹拌した後、これを限外ろ過チューブ（ウルトラフリーMCPBCC遠心式フィルターユニット５kDa：MILLIPORE社製）に移し取った。これを限外ろ過処理（9,100×g、４℃、60分）した。ろ液を乾固させ、これを蒸留水25μLに溶解して、尿サンプルを得た。なお、後述するカチオン測定及びアニオン測定には、それぞれ10倍希釈及び５倍希釈したサンプルを用いた。【００８８】
（３）CE-MSによる測定
装置として、Agilent CE−TOF/MS system（Agilent Technologies社）を用い、キャピラリーとして、Fused silica capillary i.d.50μm×80 cmを用いた。
また、測定条件は、以下のとおりである。
CE voltage：カチオン；27 kV、アニオン；30 kV
MS ionization：ESI Positive or Negative
MS capillary voltage：カチオン；4,000 V、アニオン；3,500 V
MS scan range：m/z 50〜1,000
Sample injection：カチオン；50 mbar、10秒、アニオン；50 mbar、25秒【００８９】
（４）物質の同定
各物質の同定は、以下の手順で行った。
CEにより物質群をイオン強度に伴って分離し（図２参照）、連続してMS測定した（図３参照）。各物質はCEの移動時間（分）（以下、MTと略称する場合がある）及び質量電荷比（m/z）（小数点以下第４位までの値；以下、m/zと略称する場合がある）の情報を取得した。そして、同定対象の物質の質量電荷比から、精密質量を求めた。また、同定対象の物質の精密質量に基づいて、推定の化学構造をもつ物質（標準物質）を探索し、標準物質のCE-MS測定を行った。
さらに、部分構造情報（プロダクトイオン）を得るために、標準物質のMS/MS測定を行った（図４参照）。そして、同定対象の物質と標準物質とのMT、m/z及びMS/MSデータを照合した。それぞれのデータが一致した場合に、同定対象の物質が、標準物質と同一であると判定した。同定された各物質のMT値及びm/z値を、表５に示す。【００９０】
【表５】
2011136228.tif 000011
（５）マーカー候補物質の選出基準
CE-MSにより得られた各サンプルの測定結果が、図１に示すような腎臓病の各病態の濃度又は濃度の比の変動パターンを示す物質を、マーカー候補物質とした。【００９１】
（６）マーカー候補物質の選出結果
上記の（３）のCE-MSによる測定で得られたMSピークの数は、血漿サンプルでは700ピーク、尿サンプルでは902ピークであった。これらについて、血漿サンプルでは内部標準物質により補正し、尿サンプルでは内部標準物質及び尿クレアチニンにより補正した相対ピーク面積値を用いて、マーカー候補物質の選出を行った。結果を図５〜７に示す。また、単独でマーカーとなり得る物質を表６に示す。【００９２】
【表６】
2011136228.tif 000012
【００９３】
尿中のグリコール酸又は５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸の測定値は、図１c）に示されるように「健常」から「早期」にかけて減少する変動パターンを示す。
したがって、被験者から採取された尿に含まれるグリコール酸又は５-オキソ-２-テトラヒドロフランカルボン酸の濃度の値を用いて、被験者が腎臓病であるか否かを判定できることが示された。
また、尿中と血漿中とのADMAの比率は、図１a）に示されるような「健常」から「早期」にかけて増加する傾向を示す。
したがって、被験者から採取された尿及び血漿において血漿中の濃度／尿中の濃度の値を用いて、該被験者が腎臓病であるか否かをと判定できることが示された。【００９４】
実施例２
実施例１で同定された物質について、組み合わせによりマーカーとなり得る物質の選出を行った。健常者及び各症例の腎臓病患者における各物質の尿中及び血漿中の濃度の組み合わせについて検討した。
２つの物質の組合せにおいて、一方の物質の濃度の値を他方の物質の濃度の値で除して得た比率が、図１に示すような腎臓病の各病態の濃度の比の変動パターンを示す組合せをマーカー候補の組合せとした。
得られた結果を図８〜２７に示す。また、２つの物質の組合せからなるマーカーの濃度の比に関する値と、腎臓病の各病態における濃度の比に関する値の変動パターンとの関係を、表７〜１０に示す。【００９５】
【表７】
2011136228.tif 000013
【００９６】
表７に示される２つの物質（物質A及び物質B）の組合せにおいて、尿中のトリメチルグリシン（物質A）の濃度の値を、尿中の物質Bの濃度の値で除して得た値（A（尿中）／B（尿中））は、いずれも図１a）又はb）に示されるような「健常」から「早期」にかけて増加する傾向を示す。
したがって、被験者から採取された尿において、表７に示される２つの物質のA（尿中）／B（尿中）の値を用いて、該被験者が腎臓病であるか否かを判定できることが示された。【００９７】
【表８】
2011136228.tif 000014
【００９８】
表８に示される２つの物質の組合せにおいて、血漿中又は尿中の物質Ｂの濃度の値を、尿中のグリコール酸（物質A）の濃度の値で除して得た値（B（血漿中）／A（尿中）又はB（尿中）／A（尿中））は、いずれも図１a）又はb）に示されるような「健常」から「早期」にかけて増加する傾向を示す。
したがって、被験者から採取された尿及び血漿において、表８に示される２つの物質のB（血漿中）／A（尿中）又はB（尿中）／A（尿中）の値を用いて、該被験者が腎臓病であるか否かを判定できることが示された。【００９９】
【表９】
2011136228.tif 000015
【０１００】
表９に示される２つの物質の組合せにおいて、尿中のシスチン（物質A）の濃度の値を、尿中の物質Bの濃度の値で除して得た値（A（尿中）／B（尿中））は、いずれも図１b）に示されるような「健常」から「早期」にかけて増加する傾向を示す。
したがって、被験者から採取された尿において、表９に示される２つの物質のA（尿中）／B（尿中）の値を用いて、該被験者が腎臓病であるか否かを判定できることが示された。【０１０１】
【表１０】
2011136228.tif 000016
【０１０２】
表１０に示される２つの物質の組合せにおいて、血漿中のオルニチン（物質B）の濃度の値を、血漿中のトリプトファン（物質A）の濃度の値で除して得た値（B（血漿中）／A（血漿中））は、いずれも図１a）に示されるような「健常」から「早期」にかけて増加する傾向を示す。
したがって、被験者から採取された尿において、表１０に示される２つの物質のB（血漿中）／A（血漿中）の値を用いて、該被験者が腎臓病であるか否かを判定できることが示された。【０１０３】
本出願は、２０１０年４月２７日に出願された日本国特許出願特願２０１０−１０２３７４号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【符号の説明】
【０１０４】
１００    コンピュータ
１１０    本体
１１０ａ  ＣＰＵ
１１０ｂ  ＲＯＭ
１１０ｃ  ＲＡＭ
１１０ｄ  ハードディスク
１１０ｅ  読出装置
１１０ｆ  入出力インターフェース
１１０ｇ  画像出力インターフェース
１１０ｈ  バス
１２０    表示部
１３０    入出力デバイス
１４０    可搬型記憶媒体
１４０ａ  コンピュータプログラム
２００    測定装置
【図１】
2011136228.tif 000017
【図２】
2011136228.tif 000018
【図３】
2011136228.tif 000019
【図４】
2011136228.tif 000020
【図５】
2011136228.tif 000021
【図６】
2011136228.tif 000022
【図７】
2011136228.tif 000023
【図８】
2011136228.tif 000024
【図９】
2011136228.tif 000025
【図１０】
2011136228.tif 000026
【図１１】
2011136228.tif 000027
【図１２】
2011136228.tif 000028
【図１３】
2011136228.tif 000029
【図１４】
2011136228.tif 000030
【図１５】
2011136228.tif 000031
【図１６】
2011136228.tif 000032
【図１７】
2011136228.tif 000033
【図１８】
2011136228.tif 000034
【図１９】
2011136228.tif 000035
【図２０】
2011136228.tif 000036
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2011136228.tif 000041
【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
2011136228.tif 000045
【図３０】
2011136228.tif 000046
【図３１】
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【国際調査報告】
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