【手続補正書】
【提出日】令和2年5月29日(2020.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（ａ）未分化の多能性幹細胞の増殖又は維持に好都合な条件下に培養された、分化した細胞の調製物を準備すること；
（ｂ）第１の染色及び第２の染色を該調製物に適用することであって、
ここで該第１の染色は、第１の胚性幹細胞マーカーを検出し、そして該第２の染色は、第２の胚性幹細胞マーカーを検出し、
そしてここで、該第１の染色が第１の光条件の下で検出可能であり、該第２の染色が第２の光条件の下で検出可能であり、第１及び第２の染色が、目視により互いに区別可能であること；
（ｃ）該第１の染色及び該第２の染色に関して陽性である何れかの細胞を未分化の多能性幹細胞として識別すること；
を含む、多能性幹細胞から分化した細胞の集団における未分化の多能性幹細胞の存在を検出する、又は非存在を確認する方法。
【請求項２】
工程（ｂ）の第１の胚性幹細胞マーカーおよび第２の胚性幹細胞マーカーが、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ステージ特異的胚性抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、ステージ特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、Ｓｏｘ２、成長分化因子３（ＧＤＦ３）、低下発現１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＳＡＬＬ４、Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、クラスター指定３０（ＣＤ３０）、Ｃｒｉｐｔｏ（ＴＤＧＦ−１）、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ又はｃ−Ｋｉｔリガンド）よりなる群から選択され、ここで、第１の胚性幹細胞マーカーがアルカリホスファターゼである場合、第２の胚性幹細胞マーカーはＯｃｔ−４ではなく、第２の胚性幹細胞マーカーがＯｃｔ−４である場合、第１の胚性幹細胞マーカーはアルカリホスファターゼではないことを条件とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該未分化の多能性幹細胞が、胎生期癌（ＥＣ）細胞；胚性幹（ＥＳ）細胞；および、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該未分化の多能性幹細胞が胚性幹細胞であり該分化した細胞集団が該胚性幹細胞から分化した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であり、
好ましくは、該未分化の多能性幹細胞および分化したＲＰＥ細胞は、ヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該未分化の多能性幹細胞が誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞であり該分化した細胞集団が該誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞から分化したＲＰＥ細胞であり、
好ましくは、該未分化の多能性幹細胞および分化したＲＰＥ細胞は、ヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該第１の染色が可視光下に観察可能であり、該第２の染色が紫外光下に観察可能である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
該第１の染色がナフトールＡＳ−ＢＩホスフェート；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）；ＢＣＩＰ試薬及びＩＮＴＸ試薬；ナフトールＡＳ−ＢＩ及びファーストレッドバイオレットＬＢ；テトラゾリウム塩；ジアゾ化合物；ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｒｅｄ；ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｂｌｕｅ；ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｂｌａｃｋ；及びｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）よりなる群から選択されるアルカリホスファターゼ基質を含み、好ましくは、該第１の染色がＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｒｅｄ又はＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｂｌｕｅを含む、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
該第１の染色が該第１の胚性幹細胞マーカーに特異的に結合する第１の一次抗体を含み、該第１の一次抗体が可視光下に観察可能な第１の試薬に直接又は間接的にカップリングし、必要に応じて、可視光下に観察可能な該第１の試薬が金粒子、銀粒子、又はラテックス粒子を含むか、又は
該第１の染色が該第１の胚性幹細胞マーカーに特異的に結合する第１の一次抗体を含み、該第１の一次抗体が可視光下に観察可能な生成物を生成する反応を触媒する第１の酵素に直接又は間接的にカップリングし、必要に応じて、該第１の酵素がベータガラクトシダーゼ及びパーオキシダーゼよりなる群から選択され、好ましくは、該第１の抗体がカップリングする該パーオキシダーゼがセイヨウワサビパーオキシダーゼを含むか、又は
該第１の染色が該第１の胚性幹細胞マーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、該一次抗体が金粒子に直接又は間接的にカップリングし、そして該方法が更に該金粒子上に銀沈殿を形成することを含む、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
該第２の染色は紫外光下に検出可能であり、該第２の染色が該第２のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、そして該一次抗体が蛍光標識に直接又は間接的にカップリングされ、必要に応じて該第２の染色が二次抗体を更に含み、必要に応じて該二次抗体が蛍光標識を含み、必要に応じて該蛍光標識がＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７９０、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド（商標）、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）Ｆｌｕｏｒｓ、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、テキサスレッド（商標）染料、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレジルファーストバイオレット、クレジルブルーバイオレット、ブリリアントクレジルブルー、ｐ−アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ＴＥＴ（６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン）、Ｊｏｅ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、Ｔａｍｒａ（テトラメチルローダミン）、６−カルボキシローダミン、Ｒｏｘ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、Ｒ６Ｇ（ローダミン６Ｇ）、フタロシアニン類、アゾメチン類、シアニン類（例えばＣｙ（商標）３、Ｃｙ（商標）３．５、Ｃｙ（商標）５）、キサンチン類、スクシニルフルオレセイン類、Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−（５’−アゾベンゾトリアゾリル）−フェニルアミン、アミノアクリジン及び量子ドットよりなる群から選択されるか、又は
該第２の染色が該第２のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、そして該一次抗体が可視光下に観察可能な試薬に直接又は間接的にカップリングし、必要に応じて、可視光下に観察可能な該試薬が金粒子、銀粒子、又はラテックス粒子を含むか、又は
該第２の染色が該第２のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、そして該一次抗体が可視光下に観察可能な生成物を生成する反応を触媒する酵素に直接又は間接的にカップリングし、必要に応じて、該酵素がベータガラクトシダーゼ、及びパーオキシダーゼよりなる群から選択され、好ましくは該パーオキシダーゼがセイヨウワサビパーオキシダーゼを含むか、又は
該第２の染色が該第２のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、該一次抗体が金粒子に直接又は間接的にカップリングし、そして該方法が更に該金粒子上に銀沈殿を形成することを含む、請求項１および６〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
該細胞集団中の細胞の概数を測定することを更に含むか、又は
該細胞集団中の細胞の少なくとも９０％を可視光下に検査することにより該第１の胚性幹細胞マーカーに関して陽性である細胞を検出し、必要に応じて、該第１の胚性幹細胞マーカーに関して陽性である各細胞が、その細胞が該第２の胚性幹細胞マーカーに関して陽性であるかどうかを調べるために検査されるか、又は
該細胞集団が少なくとも１０５個の細胞、少なくとも１０６個の細胞、少なくとも１０７個の細胞、少なくとも１０８個の細胞、少なくとも１０９個の細胞、少なくとも１０１０個の細胞、又は１０５〜１０１０個の細胞を含有する、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
該分化した細胞がヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であり、
該ＲＰＥ細胞が下記工程：
（ａ）多能性幹細胞を準備することであって、必要に応じて、該多能性幹細胞が誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成人幹細胞、造血幹細胞、胎児幹細胞、間葉性幹細胞、分娩後幹細胞、複能性幹細胞、胚性生殖細胞、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞であること；
（ｂ）多能性幹細胞を培養することにより多能性幹細胞の多層集団又は多能性幹細胞を含む胚様体を形成すること；
（ｃ）細胞培養物中にＲＰＥ細胞が出現するために十分な期間、多層集団又は胚様体を培養すること；及び、
（ｄ）培養物からＲＰＥ細胞を単離すること；
を含む方法により作製され、
必要に応じて、工程（ｃ）の期間が少なくとも約７〜１０日間、または少なくとも約２週間、または少なくとも約３週間、または少なくとも約４週間、または少なくとも約５週間、または少なくとも約６週間である、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
該多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞またはヒトｉＰＳ細胞であり、該細胞集団は該多能性幹細胞からインビトロで分化したＲＰＥ細胞を含む、請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
該細胞集団に０．０００８％の希少量で存在する標的細胞を検出する、請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
標的細胞を含む第２の細胞集団をプレーティングすること、及び、工程（ａ）の該分化した細胞の調製物と同じ方法により該第２の細胞集団を分析することにより該方法の検出限界を明確化することを更に含み、必要に応じて、該第２の細胞集団が該標的細胞の細胞よりなるか又は本質的になり、
必要に応じて、該第２の細胞集団が細胞の第１の群及び細胞の第２の群の混合物を含み、細胞の該第１の群が標的細胞と同じ型のものであり、
必要に応じて、細胞の該第２の群が工程（ａ）の該分化した細胞の調製物と本質的に同じコンスティテュエンシーを有し、又は
必要に応じて、細胞の該第１の群及び細胞の該第２の群における細胞の数の比が１：１０；１：１００；１：１，０００；１：１０，０００；１：１００，０００；１：１，０００，０００；１：１０，０００，０００；１：１００，０００，０００；１：１，０００，０００，０００；１：１０と１：１００との間；１：１０と１：１，０００との間；１：１０と１：１０，０００との間；１：１０と１：１００，０００との間；１：１０と１：１，０００，０００との間；１：１０と１：１０，０００，０００との間；１：１０と１：１００，０００，０００との間；１：１０と１：１，０００，０００，０００との間；１：１００と１：１，０００との間；１：１００と１：１０，０００との間；１：１００と１：１００，０００との間；１：１００と１：１，０００，０００との間；１：１００と１：１０，０００，０００との間；１：１００と１：１００，０００，０００との間；１：１００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１，０００と１：１０，０００との間；１：１，０００と１：１００，０００との間；１：１，０００と１：１，０００，０００との間；１：１，０００と１：１０，０００，０００との間；１：１，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１，０００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１０，０００と１：１００，０００との間；１：１０，０００と１：１，０００，０００との間；１：１０，０００と１：１０，０００，０００との間；１：１０，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１０，０００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１００，０００と１：１，０００，０００との間；１：１００，０００と１：１０，０００，０００との間；１：１００，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１００，０００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１，０００，０００と１：１０，０００，０００との間；１：１，０００，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１，０００，０００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１０，０００，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１０，０００，０００と１：１，０００，０００，０００との間；及び１：１００，０００，０００と１：１，０００，０００，０００との間よりなる群から選択され、そして／又は
必要に応じて、該第２の細胞集団中の標的細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％が標的細胞の該第１のマーカー及び該第２のマーカーに関して陽性として検出され、必要に応じて、該第２の細胞集団中の該標的細胞が標的細胞又はそれらの子孫を識別するさらなるマーカーを発現する、請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
該細胞集団に第３の染色を適用すること、ここで該第３の染色は自身の発現が標的細胞の存在を示す第３のマーカーを検出すること；該細胞集団の細胞を顕微鏡観察することにより該第３のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を検出すること；及び該第１のマーカー、該第２のマーカー及び該第３のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を標的細胞として識別することを更に含み、
必要に応じて、該第３の染色が該第１の染色から、及び該第２の染色から目視により区別可能であり、そして／又は、
必要に応じて、該第３の染色が可視光下又は紫外光下に検出可能である請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。