(57)【要約】対象となる血液細胞は、その後方散乱サインによって血液サンプル中の他の血液細胞及び良く似た血球から容易に区別することができる。血液サンプル中の血小板を分化するための望ましい方法は、放射線ビーム（Ｂ’）で細胞及び血球を一度に１個ずつ照射し、後方散乱放射線（Ｄ’）を高利得光検出器（５６）例えば増倍型光電管に伝送するために複数の光ファイバ（５４）を用いて後方散乱（反射）放射線（Ｄ’）を検出する。このようにして得られる後方散乱信号は、対象となる細胞を分化するために、例えば規定される比較的狭い角度範囲内の前方散乱（ＦＳ）のレベルあるいは側方散乱放射線（ＳＳ）のレベルあるいはビームの中に被照射細胞または血球が在ることによって生じる細胞照射ビームの減衰のレベルあるいは被照射細胞または血球の電気インピーダンスを表す第二の信号と組み合わされる。本発明の方法及び装置は、特に血液サンプル中の血小板及び好塩基球を分化する際に有益である。
2005536742.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプル中の他の血液細胞及び／または血球から血液細胞の部分母集団を分化するための方法であって、
（ａ）その中で光軸に沿って伝搬する放射線ビームによって各血液細胞及び血球が照射される細胞インテロゲーション・ゾーンに、血液サンプルの個々の血液細胞及び血球を一度に１個ずつ通過させるステップと、
（ｂ）同時に（ｉ）後方散乱放射線を光検出器に伝送するために複数の光ファイバを用いて各被照射血液細胞及び血球からの後方散乱放射線のレベルを検出し、（ii）前記細胞インテロゲーション・ゾーンを通過する血液細胞または血球によって引き起こされる少なくとも１つの他の測定可能な効果を検出するステップと、
（ｃ）それぞれ前記検出される後方散乱放射線のレベル及び前記他の測定可能な効果に比例する第一及び第二の信号を生成するステップと、
（ｄ）前記第一及び第二の信号を用いて、前記血液サンプル中の前記他の血液細胞及び血球から前記血液細胞の部分母集団を分化するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
各前記光ファイバが、同じ公称後方散乱角度プラスマイナス約１度で後方散乱放射線を集めるように配置され、前記公称角度が前記光軸に対して測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記公称角度が約７度である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記血液細胞の部分母集団が、血小板及び好塩基球から成るグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記他の測定可能な効果が光学的効果である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記光学的効果が複数の光ファイバを通じて検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記光学的効果が予め決められた角度範囲内の前方散乱放射線の強さレベルである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記予め決められた角度範囲が約１１度を中心としてプラスマイナス約１度である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記予め決められた角度範囲が約１６度を中心としてプラスマイナス約１度である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記光学的効果が、被照射血液細胞または血球が照射ビームの中に在ることによって生じる前記ビームの光損失の強さレベルである、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記光学的効果が側方散乱放射線の強さレベルである、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記他の測定可能な効果が電気的効果である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記電気的効果が前記血液細胞及び血球と同時に前記インテロゲーション・ゾーンを通過する電流の変化である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記放射線ビームが、前記血球を照射すると、そうでなければ前記被照射血液細胞及び血球からの後方散乱放射線の検出を妨害するような他の物体からのその後のビーム反射を最小限に抑えるために拡散される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記放射線ビームが、前記血球を照射すると、拡散する前に固体材料に形成される細長い穿孔に向けられ、前記固体材料及び穿孔が、そうでなければ前記被照射血液細胞及び血球からの後方散乱放射線の検出を妨害するような拡散放射線を最小限に抑えるのに役立つ、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
血液サンプル中の他の血液細胞及び血球から血液細胞の部分母集団を分化するための方法であって、
（ａ）その中で光軸に沿って伝搬する放射線ビームによって各血液細胞及び血球が照射される細胞インテロゲーション・ゾーンに、血液サンプルの個々の血液細胞及び血球を一度に１個ずつ通過させるステップと、
（ｂ）前記血液サンプル中の血液細胞及び血球が前記細胞インテロゲーション・ゾーンを通過するとき前記ゾーンを流れる電流を生成するステップと、
（ｃ）同時に（ｉ）各被照射血液細胞及び血球からの後方散乱放射線のレベルを検出し、（ii）前記細胞インテロゲーション・ゾーンを通過する血液細胞または血球の電気インピーダンスによって引き起こされる前記電流の流れの変化を検出するステップと、
（ｄ）それぞれ前記検出される後方散乱放射線のレベル及び前記電流の流れの変化に比例する第一及び第二の信号を生成するステップと、
（ｅ）前記第一及び第二の信号を用いて、前記血液サンプル中の前記他の血液細胞及び血球から前記血液細胞の部分母集団を分化するステップと、
を含む、方法。
【請求項１７】
血液サンプル中の他の血液細胞及び血球から血液細胞の部分母集団を分化するための装置であって、
（ａ）血液サンプルの個々の血液細胞及び血球を一度に１個ずつ通すことができるオプティカル・フローセルと、
（ｂ）前記オプティカル・フローセルを通過する個々の血液細胞及び血球を照射するために光軸に沿って放射線ビームを向けるための光源と、
（ｃ）前記オプティカル・フローセルを通過する被照射血球からの後方散乱放射線を検出するための位置に配置される、検出される後方散乱放射線のレベルに比例する第一の信号を生成するための光学検波器であり、該光学検波器が、（ｉ）光検出器と、（ii）複数の光ファイバであり、各ファイバが集光端、相対する光放出端及び前記集光端によって集められる光を複数の内部反射によって前記光放出端に伝送するための介在光伝送領域を有し、前記光放出端が前記光検出器の感光面付近に配置される、複数の光ファイバと、（iii ）前記光ファイバのそれぞれの集光端を被照射血液細胞または血球からの前記後方散乱放射線を集めるための位置に配置するための光ファイバ・ホルダと、を含む、光学検波器と、
（ｄ）前記オプティカル・フローセルを通過する血球によって引き起こされる少なくとも１つの他の測定可能な効果を検出するための位置に配置される、前記他の測定可能な効果の検出レベルに比例する第二の電気信号を生成するための第二の検出器と、
（ｅ）前記第一及び第二の電気信号を受け取るため及び前記受け取った第一及び第二の電気信号に基づいて前記他の血液細胞及び血球から前記血液細胞の部分母集団を分化するための論理・制御装置と、
を備える、装置。
【請求項１８】
前記光ファイバ・ホルダが、各光ファイバの集光端が実質的に同じ角度範囲内の被照射血球からの後方散乱光を受けるように各ファイバの各集光端付近の直線部を支持するように設計される、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記後方散乱が約７度から２４度まで（プラスマイナス１度）の公称後方散乱角度で測定される、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記光ファイバの前記集光端が前記光軸を中心とする円形パターンに配列される、請求項１７に記載の装置。
【請求項２１】
前記光ファイバの支持される直線部のそれぞれの軸が前記血球照射ビームの前記光軸に対して平行に伸びる、請求項１８に記載の装置。
【請求項２２】
前記光ファイバの支持される直線部のそれぞれの軸が、前記光散乱源の予想される位置にまたはその付近に集まる、請求項１８に記載の装置。
【請求項２３】
前記第二の検出器が、前記放射線ビームによって前記血液細胞及び血球を照射した結果として生じる別の光学的効果を感知するために作用する第二の光学検波器である、請求項１７に記載の装置。
【請求項２４】
前記他の光学的効果が予め決められた角度範囲内における前方散乱放射線の強さレベルである、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記予め決められた角度範囲が約１１度プラスマイナス約１度である、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記予め決められた角度範囲が約１６度プラスマイナス約１度である、請求項２４に記載の装置。
【請求項２７】
前記他の光学的効果が被照射血液細胞または血球が前記ビームの中に在ることによって生じる照射ビームの光損失のレベルである、請求項２３に記載の装置。
【請求項２８】
前記他の光学的効果が側方散乱放射線の強さレベルである、請求項２３に記載の装置。
【請求項２９】
前記第二の検出器が、前記フローセルを血液細胞及び血球が通過することによって引き起こされる前記フローセルを流れる電流の変化を感知するために作用する、請求項１７に記載の装置。
【請求項３０】
前記血球を照射した後前記放射線ビームを拡散するための手段を備え、それによって、そうでなければ前記被照射血球からの後方散乱放射線の検出を妨害するような血球照射後生じるビームの反射が最小限に抑えられる、請求項１７に記載の装置。
【請求項３１】
前記第二の検出器が、前記放射線ビームが通過しかつ前記血球を照射した後前記拡散手段によって拡散されるとき通過する細長い穿孔を形成するハウジングを含み、前記ハウジングが、相当量の拡散放射線が前記第一または第二の検出器によって検出されるのを防止するのに役立つ、請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
前記第二の検出器が、
（ａ）複数の細長い光ファイバであり、その各々がその集光端で光を受け複数の内部反射を通じて前記光を相対する光放出端に伝送するように作用し、前記光放出端において前記伝送された光が放出され、該光ファイバの各々が該光ファイバを縦に伸びる中央光軸を有する、複数の光ファイバと、
（ｂ）放出された光を受け取り検出するために前記光ファイバのそれぞれの光放出端に隣接して配置される少なくとも１つの光検出器と、
（ｃ）前記ファイバの支持される部分のそれぞれの光軸が前記放射線ビームによって照射される血液細胞及び血球の外見上の位置に向かって集まるように各光ファイバのそれぞれの集光端付近の部分を支持するための光ファイバ・ホルダと、
を備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項３３】
前記光ファイバ・ホルダが、前記ファイバの部分を支持するために複数の穿孔が形成される凹状面を有するファイバ保持プレートを含む、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
血液サンプル中の他の血液細胞及び血球から血液細胞の部分母集団を分化するための装置であって、
（ａ）血液サンプルの個々の血液細胞及び血球を一度に１個ずつ通過させることができるオプティカル・フローセルと、
（ｂ）前記オプティカル・フローセルを通過する個々の血液細胞及び血球を照射するために光軸に沿って放射線ビームを向けるための光源と、
（ｃ）前記オプティカル・フローセルを通過する被照射血液細胞または血球からの後方散乱放射線を検出するための位置に配置される、検出される後方散乱放射線のレベルに比例する第一の電気信号を生成するための光学検波器と、
（ｄ）前記血液細胞または血球と同時に前記オプティカル・フローセルを通過する電流に対して各血液細胞及び血球が与える効果を検出するための第二の検出器と、
（ｅ）前記第一及び第二の電気信号を受け取るため及び前記受け取った第一及び第二の電気信号に基づいて前記他の血液細胞及び血球から前記血液細胞の部分母集団を分化するための論理・制御装置と、
を備える、装置。
【請求項３５】
血液サンプル中の他の血液細胞及び（または）血球から血液細胞の部分母集団を分化するための方法であって、
（ａ）その中で各血液細胞及び血球が光軸に沿って伝搬する放射線ビームによって照射される細胞インテロゲーション・ゾーンに、血液サンプルの個々の血液細胞及び血球を一度に１個ずつ通過させるステップと、
（ｂ）同時に、（ｉ）各照射血液細胞及び血球からの後方散乱放射線のレベルを検出し、（ii）各血液細胞及び血球が前記細胞インテロゲーション・ゾーンを通過することによって引き起こされる前記ゾーンを通過する電流の変化を検出するステップと、
（ｃ）それぞれ前記検出される後方散乱放射線のレベル及び電流の変化に比例する第一及び第二の信号を生成するステップと、
（ｄ）前記第一及び第二の信号を用いて、前記血液サンプル中の前記他の血液細胞及び血球から前記血液細胞の部分母集団を分化するステップと、
を含む、方法。
【請求項３６】
血液サンプル中の他の血液細胞及び（または）血球から好塩基球を分化するための方法であって、
（ａ）その中で各血液細胞及び血球が光軸に沿って伝搬する放射線ビームによって照射される細胞インテロゲーション・ゾーンに、血液サンプルの個々の血液細胞及び血球を一度に１個ずつ通過させるステップと、
（ｂ）同時に、（ｉ）各被照射血液細胞及び血球からの後方散乱放射線及び側方散乱放射線のレベルを検出するステップと、
（ｃ）それぞれ前記検出される後方散乱放射線及び側方散乱放射線のレベルに比例する第一及び第二の信号を生成するステップと、
（ｄ）前記第一及び第二の信号を用いて、前記血液サンプル中の前記他の血液細胞及び血球から好塩基球の部分母集団を分化するステップと、
を含む、方法。
【請求項３７】
血液サンプル中の他の血液細胞及び（または）血球から血小板を分化するための方法であって、
（ａ）その中で各血液細胞及び血球が光軸に沿って伝搬する放射線ビームによって照射される細胞インテロゲーション・ゾーンに、血液サンプルの個々の血液細胞及び血球を一度に１個ずつ通過させるステップと、
（ｂ）同時に、（ｉ）各被照射血液細胞及び血球からの後方散乱放射線のレベルと、（ii）各被照射血液細胞及び血球からの前方散乱、側方散乱あるいは軸方向光損失放射線のそれぞれのレベル、を検出するステップと、
（ｃ）それぞれステップ（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ii）において検出されるレベルに比例する第一及び第二の信号を生成するステップと、
（ｄ）前記第一及び第二の信号を用いて、前記血液サンプル中の前記他の血液細胞及び血球から血小板の部分母集団を分化するステップと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それぞれの光散乱サインに基づいて様々な血液細胞のタイプを分化するための方法及び装置に関するものである。より特定して言うと、本発明は、後方散乱サインに基づいて血液細胞特に血小板及び好塩基球を分化するための方法及び装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
様々なタイプの小さい粒子を分化するための手段として光散乱測定を使用することは周知である。例えば、ほぼ全ての高度な血液検査計器において、オプティカル・フローセルのインテロゲーション・ゾーンに血液細胞を一度に１個ずつ通過させることによって血液細胞の前方光散乱特性を測定することは一般的に行われている。インテロゲーション・ゾーンにおいて各細胞はレーザービームの照射を受け、戦略的にインテロゲーション・ゾーンの前方に配置される１台またはそれ以上の光検出器は、多くの場合予め決められたいくつかの角度範囲内で、前方散乱放射線のレベルを感知する。前方光散乱を測定する他に、一部の血液検査計器は、被照射細胞に直角に配置される別個の光検出器を用いて側方散乱も測定する。測定対象のある角度範囲内において同様の光散乱特性を有するサンプル内の他の細胞及び他の粒状物質からある特定のタイプの細胞をよりよく分化するために、これらの光散乱測定は、同時に行われる他の測定と組み合わせて使用されることが多い。これらの同時に行われる他の測定には、細胞の物理的質量、その導電率及び細胞が照射ビームの中に在ることにより照射ビームを減衰する効果（時に細胞の軸方向光損失-ＡＬＬ-と呼ばれる）を表す測定が含まれる。様々な細胞のパラメータ測定を行った後、計器は、測定された様々なパラメータが相互に関係付けてグラフ化される散布図を生成する。この散布図において、同じタイプの細胞の部分母集団がデータ・ポイント（各ポイントは個々の細胞を表す）の密な群れとして現れ、各群れが明白に識別される群れ間の間隔によって他の群れから容易に識別可能であることが理想である。このような場合、１つの群れの細胞と別の群れの細胞の間に「ゲート」を置き、ゲート内の各タイプの細胞を数えるのは単純なことである。残念ながら、多くの理由から１つのタイプの小さな率の細胞が他のタイプの細胞の空間領域に侵入して、対象となるタイプの細胞のカウントを多少不正確にするので、この理想を実現するのは時には難しい。下に述べる通り、血小板及び好塩基球の分化において特にこれが当てはまる。
【０００３】
Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ａ．Ａｕｌｔによる「血小板機能及び網目状血小板のフロー・サイトメトリー測定」（Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６７７：２９３−３０８（１９９３））と題する論文において、臨床における血小板分析の重要性が論じられている。この論文は、また、従来の光散乱法を用いて血小板を識別し計数することの問題についても論じている。通常の全血サンプルにおける血小板濃度は比較的高く、赤血球の濃度に次いで第二位である。１ミリリットルの血液に通常約２億５０００万個の血小板が含まれている。従って、血小板は赤血球の約２０分の１であるが、あらゆるタイプの白血球を合わせた数の約２５倍である。正常のサイズの範囲（１から４ミクロン）によって血液サンプルの他のタイプの正常な細胞から簡単に識別することができるが、散布図におけるその群れは、通常、その通常測定される質量及び前方散乱特性に関して血小板のように「見える」多量の細胞片（全ての細胞の断片）を含む。Ａｕｌｔは、前方及び側方散乱測定のみに基づいて血小板を細胞片から分化することの不確実性を指摘し、前方光散乱及び蛍光測定の両方に基づくもっと信頼できる技法について説明している。Ａｕｌｔが説明する光散乱/蛍光法は、上記の光散乱法だけより明白に血小板を識別するが、この技法のためには、直接あるいは蛍光マーカーでタグ付けされた適切なモノクローナル抗体を通じて、血小板に選択的に蛍光染料分子でタグ付けまたはラベル付けするステップを加える必要がある。このタグ付けステップは、当然、時間もコストもかかる。さらに、血小板のタグ付けは血小板をかなり攪拌または操作することになり、血小板の活性化に望ましくない影響を及ぼす。
【０００４】
Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ他に対する米国特許第６，０２５，２０１号において、血小板を分化し計数するためのいくつかの技法が示されている。この特許開示は、それぞれの乾燥質量及び屈折率を決定することによって血小板の活性化状態を査定するための方法に関するものである。望ましい方法は、２つの異なる光散乱範囲、すなわち１度から７度までの低い範囲及び５度から２０度までの高い範囲内においてレーザービームで照射された血小板の前方光散乱を測定するステップを含む。その代わりに、２つの望ましい散乱範囲のうちの１つの範囲内で測定される前方光散乱がＤＣ質量測定と組み合わされて、血小板計数及び分析のためにミー散乱理論に基づく分析が行われる。この血小板分析法は、蛍光タグ付けのためにオフラインでサンプルの準備をする必要なく完全自動化に役立つ点で上記のＡｕｌｔ法より有利であると考えられる。今日商業的に使用されている多くの完全自動化血小板分析についても、当然同じことが言える。これらの技法には、（ａ）血小板質量が、狭い開口を通過する血小板によって生じるこの開口の電気インピーダンスの変化を監視することによって決定される（本発明の譲受人が製造販売するＭｏｄｅｌ  ＳＴＫＳTM及びＭｏｄｅｌ  ＧＥＮ-ＳTM血液分析器に使用される）トータル・インピーダンス法、（ｂ）１つまたはそれ以上の角度範囲内において前方散乱光の強さが監視され、この散乱の強さが血小板質量に比例する（Ｂａｙｅｒが製造販売するＴＥＣＨＮＩＣＯＮ  Ｈ*  Ｓｙｓｔｅｍ計器及びＯｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓが製造販売するＯＲＴＨＯ  ＥＬＴ-８計器に使用される）全光散乱法、及び（ｃ）細胞質量が電気的（開口インピーダンスを通じて）及び光学的（前方光散乱を通じて）に同時に決定される（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓが製造販売する登録商標Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ  ４０００血液分析器に使用される）インピーダンス法及び光散乱法の組み合わせ、が含まれる。しかし、上述の通り、これらの構想はどれも、非血小板の交差汚染を受けやすく、報告されるデータにある程度の不確実性をもたらす。インピーダンス法は、正常な血小板の質量と同様の質量を有する細胞片が血小板として表示され計数される点で問題がある。前方散乱方は、血小板と同じサイズまたは質量の細胞片が血小板と同様の前方散乱サインを生じることによって、血小板として計数される点で問題がある。さらに、このような光散乱測定を行う際、散乱光を集めるために比較的表面積の大きい光検出器（ｐｉｎダイオードが典型的）が一般に使用される。残念ながら、この種の大型の検出器は、光学システム内の様々な表面によって反射される迷光も集め、それによって信号雑音比が比較的低い信号を生成する点で問題がある。迷光を集めないような形に作られても（例えば、照射ビーム軸を中心とする円形リングの形）、この種の光検出器は、散乱放射線を感知するために必要な利得を得るためにかなり大きな表面積を必要とし、表面積が大きければ大きいほど電気的応答時間は遅くなる。電気的測定法と光学的測定法を結合する構想は、それぞれの技法の持つ不利点と同じ不利点をもたらす。さらに、電気的測定及び光学的測定の両方を行うための装置を用意しなければならな���という不利点がある。
【０００５】
血液サンプル中の白血球の好塩基球部分母集団を識別しかつ定量化するための従来の技法に関しては、サンプル中のこの細胞の数が非常に少ないためばかりでなく（赤血球の母集団の１パーセントよりかなり少ない）、比較的豊富な単球及びリンパ球の部分母集団と物理的及び電気的特性が似ているため、報告される数が不確実になる可能性がある。一般に、前方角度光散乱、ＲＦ導電率及びＤＣインピーダンス測定の組み合わせは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．が製造販売するＳＴＫＳTM及びＧＥＮ-ＳTM血液分析器の場合のように、他の細胞タイプから好塩基球を分化するために使用される。その代わりに、前方角度測定は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓが製造販売するＣｅｌｌ-Ｄｙｎ血液検査計器の場合のように、好塩基球を分化するために分極側方散乱測定と組み合わされてきた。いずれの技法も最適とは言いがたい。前者は、細胞インテロゲーション・ゾーンを流れる高周波電流を確立し、それによって様々なインピーダンス特性を有する血液細胞及び（または）血球の通過によって引き起こされるこのゾーンを流れる電流の変化を監視するためにＲＦ回路を必要とする点で不利である。どちらの技法も、光散乱粒子と散乱光を検出するために一般に使用される大きな表面積の検出器の間の光学的結合効率が低い点で問題がある。
【０００６】
同心リングに配列される複数束の光ファイバを使用して、散乱面からの散乱放射線を散乱面から離れて配置される複数の光検出器（例えば、増倍型光電管及びフォトダイオード）に光学的に結合することができることは、すでに示唆されている。Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｇ．Ｅｉｓｅｒｔによる「吸収及び散乱に基づく細胞分化」（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１，ｐｐ４０４−４０９（１９７９））を参照のこと。Ｅｉｓｅｒｔが説明している通り、光ファイバは、それぞれの集光端が中央に配置される光ファイバの集光束を中心とする５つの同心リングを形成するように配置される。５つの同心リングの各々の個々のファイバの遠位端は５つの異なる増倍型光電管に光学的に結合され、中央束の個々のファイバの遠位端は、フォトダイオードに光学的に結合される。ファイバの中央束は光学的にビーム軸と整合され、個々のファイバが円形に配列される他の束も、ビーム軸に対して平行に配列される。このようにして、各リングのファイバは、ファイバの直径（またはリングの幅）、ビーム軸に対して相対的なファイバ端の半径方向の変位（すなわちリングの直径）及び散乱光源からのファイバ端の軸方向の距離によって決定される離散的な角度範囲の散乱光を集める。ビーム軸に配置される第六の中央の光ファイバの束は、細胞がこれを通過することによって引き起こされるビームの軸方向光損失を監視するのに役立つ。
【０００７】
Ｅｉｓｅｒｔが提案する上記の光ファイバ・カップラにおいては、全てのファイバのそれぞれの集光端は、細胞照射ビームの光軸に対して直角に配置される共通平面に配置される。従って、ファイバの開口数のせいで、散乱光の光ファイバへの光学的結合は散乱角度が増すにつれて低下することが分かるだろう。さらに、散乱角度が増すと、散乱光とファイバ端との間の入射角が増大し、それによって散乱光をファイバの一方の端から他方の端に伝送するために必要な内部反射の数が増す。この結合効率の問題は、比較的大きい散乱角度のとき散乱の強さが極端に減少することによって悪化する。
【０００８】
前方及び側方散乱測定の他に、血液細胞タイプを分化するのに後方散乱（すなわち、反射光）測定が有益であるかもしれないことはすでに示唆されている。「有核血液細胞からの弾性光散乱：高速数値分析」と題するＳｌｏｏｔ  ＆  Ｆｉｇｄｏｒの論文（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１９，１９８６年１０月１日）において、有核血液細胞の異質母体において様々な細胞タイプの検出を最適化するためには前方、側方及び後方の光散乱の強さを同時に検出することが必要であると記されている。ここでは、２つの同心球によって模倣される有核血液細胞の光散乱特性を計算するためのモデルが提示される。後方散乱の強さが核/細胞質比及び細胞質及び核の光学密度の変化によって決定されることが、提示される計算から（細胞の実際の測定は行われなかった）推論される。提示される分析は、核の透明性と後方散乱信号の強さとの間の直接的相関関係を強く示唆する。この論文においては、光散乱測定を行うためのハードウェアについは全く開示されていないが、その後の論文、Ｓｌｏｏｔ他による「フロースルー・システムにおいて測定される生物粒子の散乱行列要素：理論と実践」（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１０，１９８９年５月１５日）は、大きな表面積の散乱検出器の使用、及び比較的大きな表面の原因となる「大きな円錐の組み込み」を応用する必要性をほのめかしている。この論文は、血球を照射する前に血球照射レーザービームが通り抜ける中央開口を有する後方散乱検出器を略図的に示している。血球にぶつかると、後方散乱検出器の大きな面は大きな円錐角度すなわち大きな角度範囲の後方散乱光を集め、これを検出する。上述の通り、大きな表面積の検出器は、光学的利得の観点から見れば有利であるが、応答時間の観点から見ると非常に不利である。検出器の表面積が増大すると、検出器の応答時間は低下し、それによってシステムが細胞を解像する速度を制限する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上の論証を考慮して、本発明の目的は、血液サンプル中の他の血液細胞及び血球から血液細胞を分化するためのより効果的な方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、血液サンプル中の対象となる血液細胞を分化し計数するための改良された装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に従って、特定の血液細胞のタイプ、特に血小板及び好塩基球は、それぞれの後方散乱サイン（すなわち、一般的に照射源の方向に照射を反射する能力）によって血液サンプル中に存在する細胞片及びその他の良く似た細胞及び血球から容易に区別することができることが判明した。この後方散乱サインは、後方散乱放射線を複数の光ファイバを通じて高利得光検出器に光学的に結合することによって決定される。血小板を分化するために、この後方散乱情報は、被照射血球から同時に得られる他の情報、例えば、ビームの中に血球が在ることによって照射ビームを減衰する血球の効果（すなわち軸方向光損失-ＡＬＬ-パラメータ）またはある定められた角度で前方平面においてあるいは側方に光を散乱する血球の効果、と結び付けられる（すなわち、これらと関係付けられてグラフ化される）ことが望ましい。好塩基球を分化するために、後方散乱情報は、被照射血球から得られる側方散乱情報と結び付けられることが望ましい。その代わりに、各細胞からの後方散乱情報を細胞の質量またはその導電率を表す情報と結びつけることによって細胞を分化することができる。
【００１２】
このように、血小板及び非血小板血球の両方を含む血液サンプル中の血液細胞を分化するための望ましい方法は、（ａ）その中で各細胞が放射線ビームによって照射される細胞インテロゲーション・ゾーンに血液サンプルの個々の血球を一度に１個ずつ通過させるステップ、（ｂ）同時に（ｉ）後方散乱放射線を高利得光検出器に光学的に結合するよう配置される複数の光ファイバを通じて各被照射血球からの後方散乱放射線のレベルを検出し、（ii）細胞インテロゲーション・ゾーンを通過する血球によって引き起こされる別の測定可能な効果のレベルを検出するステップ、（ｃ）検出された後方散乱放射線及び他の測定可能な効果のそれぞれのレベルに比例する第一及び第二の信号を生成するステップ、及び（ｄ）第一及び第二の信号を用いて血液サンプル中の他の細胞及び血球から対象となる血液細胞を分化するステップ、を含む。上述の通り、被照射血球の他の測定可能な効果には、ある角度範囲内の前方散乱光のレベル、側方散乱光のレベル、被照射血球がビーム内に在ることによって生じる照射ビームの光損失の量またはインテロゲーション・ゾーンに細胞を通過させることによって引き起こされるインテロゲーション・ゾーンを通過するＤＣまたはＲＦ電流のレベルの変化が含まれる。
【００１３】
本発明の別の態様に従えば、血液サンプル中の他の細胞及び血球から対象となる細胞を分化するための装置は、（ａ）血液サンプルの個々の血球を一度に１個ずつ通過させることができるオプティカル・フローセル、（ｂ）オプティカル・フローセルを通過する個々の血球を照射するための放射線ビームを生成するための光源、（ｃ）オプティカル・フローセルを通過する被照射血球からの後方散乱光を検出するための位置に配置される、検出された後方散乱放射線のレベルに比例する第一の信号を生成するための光学検波器、（ｄ）フローセルを通過する血球によって引き起こされる別の測定可能な効果を検出するための位置に配置される、検出されたこの別の測定可能な効果のレベルに比例する第二の電気信号を生成するための第二の検出器、及び（ｅ）第一及び第二の電気信号を受信するため、及び受信した第一及び第二の電気信号に基づいて非血小板血球から血小板を分化するための論理・制御装置、を含む。光学検波器は、（ｉ）高利得光検出器、（ii）複数の光ファイバ、（iii ）光ファイバのそれぞれの集光端を被照射血液細胞または血球からの後方散乱放射線を集めるための位置に配置するための第一の光ファイバ・ホルダ、及び（iv）光ファイバの光放出端を光検出器に隣接する位置に配置するための第二の光ファイバ・ホルダ、を含むことが望ましい。
【００１４】
本発明及びその利点は、添付図面（図面においては、同様の参照符号は同様の部品を示す）を参照する以下の望ましい実施態様の詳細な説明からよりよく理解できるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
添付図面を参照すると、図１は、本発明の血液細胞分化を実施するのに適する電気光学システムＳを略図的に示している。システムＳは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．が製造販売する標準ＸＬTMフロー・サイトメーターに改良のために組み込まれるように設計される。システムＳは、前方散乱/軸方向光損失検出器Ｄ、後方散乱検出器Ｄ’、及び側方散乱検出器Ｄ”を含む。これらの検出器が生成するそれぞれの電気出力信号は、フロー・サイトメトリー計器を含む論理・制御装置（ＬＣＵ）の適切にプログラムされたマイクロプロセッサに与えられ、これによって処理される。この計器のプログラミングに基づいて、検出器Ｄ、Ｄ’及びＤ”によって検出される様々な血球パラメータが報告され、下に示される通り例えばヒストグラム及び散布図として表示される。
【００１６】
システムＳの中心は、中央に血球インテロゲーション・ゾーン１２が配置されるオプティカル・フローセル１０であり、このゾーンに個々の浮遊血球の流れを既知の方法で一度に１個ずつ通過させることができる。フローセルは、光学的に透明であり、クォーツで作られることが望ましく、インテロゲーション・ゾーンは横断面で約１００×１００ミクロンである。インテロゲーション・ゾーンを通過するとき、個々の血球はレーザー１４によって与えられるビームＢを照射される。４５度の半透明ミラー１８にぶつかった後ビームＢと同一線になる第二のビームＢ’を与えるために第二のレーザー１６が使用されることが望ましい。２つのビームは、異なる波長であることが望ましく、例えば、一方のビームは、例えばヘリウム・ネオン・レーザーによって与えられる赤色であり、他方のビームは、例えばアルゴン・レーザーによって与えられる青色である。後方散乱検出器Ｄ’（下に説明される）を含む集光光学システム５０に形成される小さい開口を通過すると、ビームはレンズ・ハウジング２６の相対する端において支持される１対の交差円柱レンズ２０、２２によって血球インテロゲーション・ゾーン１２の中心Ｃに焦点を結ぶ。集束ビームに照射されると、各血球は、照射ビームの波長、及びサイズ、屈折率、反射率、形状、内部構成を含めてそれぞれの血球の特性に基づく複雑な関数に従ってあらゆる方向に光を散乱させる。さらに、各被照射血球は、この場合にも血球の物理的及び光学的特性に応じて、照射ビームの強さを変化させる。前方光散乱ＦＳ、すなわち血球照射ビームの伝搬方向によって決定される被照射血球の前方に散乱する光は、下に説明する前方散乱/軸方向光損失検出器Ｄによって、複数の角度範囲内で検出される。その名前が示す通り、検出器Ｄは、下に説明する通り、血球がビームを通過する結果として照射ビームに生じる軸方向光損失ＡＬＬを検出するためにも作用する。この種の軸方向光損失は、レーザー１４及び１６のそれぞれの放射出力によって決定される様々な波長で検出されることが望ましい。後方散乱光ＢＳ、すなわち被照射血球から照射光源に向かって後ろ向きに散乱するすなわち反射される光は、下に詳細に説明する通り、上記の後方散乱検出器Ｄ’によって、予め決められた角度範囲内で検出される。ビームＢの方向に対して直角に散乱するビームは、側方散乱検出器Ｄ”によって検出される。
【００１７】
前方散乱/軸方向光損失検出器
図１及び２を参照すると、前方散乱/軸方向光損失検出器Ｄは、一般的に言って、（ｉ）１対の光ファイバ・ホルダ３０、３０’、（ii）複数の離散的な光ファイバ束３３−３８（６束として図には示されているが、これより多くても少なくても良い）、及び（iii ）同じ数の光検出器ＰＤ１−ＰＤ６、を含む。光検出器は各々高利得固体デバイスであることが望ましいが、増倍型光電管でも良い。各光ファイバ束は、少なくとも３本または４本の光ファイバを含むことが望ましく、ファイバ・ホルダ３０内で配列されるパターン及びファイバの直径に応じて５０本以上のファイバを含むことができる。各光ファイバは、使用中複数の内部反射を通じてファイバによって比較的離れた場所に伝送される放射エネルギーを集めるまたは受けるためにホルダ３０によって位置を定められる集光端、及び集められ伝送された光を放出する、相対する光放出端を有する。図２を参照すると、光ファイバ・ホルダ３０’は、垂直配列に配列される適切なサイズの穴で６つの光ファイバ束３３−３８の光放出端を支持するのに役立つ。６つの光検出器ＰＤ１−ＰＤ６も、それぞれの感光面がそれぞれの光ファイバの光放出端に隣接するような位置にホルダ３０’（図２で示される裏面）によって支持される。光ファイバ束の個々のファイバが、おそらく長さを除いて、全ての点で同じであることが望ましい。長さは、空間の制約に応じて束によって多少の変動があってもよい。各ファイバは約５００ミクロンの直径を持ち、かつ全てのファイバは共通の光学材料から作られることが望ましい。特に望ましいファイバは、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｆｉｂｅｒが市販するＳＩ  Ｂａｒｅ  Ｆｉｂｅｒである。
図３及び４から分かる通り、光ファイバ・ホルダ３０は、２つの相互に接続されるコンポーネントすなわち（１）各束が４つの異なる角度範囲のうちの１つの範囲内の前方散乱光ＦＳを集めるための位置に光ファイバ束のうち４つ３３、３４、３７、３８の集光端を支持する機能を果たす前方散乱集光コンポーネント３１、及び（２）その光路に血球が存在することによって強さが変わる軸方向の光を集めるための位置に残り２つの光ファイバ束の集光端を支持する機能を果たす軸方向集光コンポーネント３２、を支持し、これを納めるのに役立つ円筒形スリーブ６０を含む。スリーブ６０は、プラスティックで作られることが望ましく、直径は約１２．５ｍｍ、長さは約２０ｍｍである。
【００１８】
前方光散乱集光コンポーネント
光ファイバ・ホルダ３０の前方光散乱集光コンポーネント３１は、スリーブ６０内において軸方向集光コンポーネント３２の前方に配置される。コンポーネント３１は、それぞれ４つの同心リングＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ（図５Ｂに示される）を形成するように光ファイバ束３３、３４、３７及び３８のそれぞれの集光端を保持する機能を果たす。光ファイバ・ホルダの使用中、光ファイバ端の各リングは、照射ビームの光軸ＯＡを中心とし、リングの直径、散乱源（フローセルの中心）とファイバ端の間の軸方向の間隔及びファイバの直径によって決定される離散的角度範囲で前方散乱光を集める機能を果たす。上述の通り、ファイバ束３３、３４、３７及び３８の光放出端は、各光検出器が１つの束からのみ光を受け取るように光検出器ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ５及びＰＤ６に光学的に結合される。このように、各光検出器の出力は、各検出器が光学的に結合されるファイバの集光端の位置によって決定される４つの異なる角度範囲のうちの１つの範囲内の前方散乱光の強さを反映する。
【００１９】
図３及び４から分かる通り、前方光散乱集光コンポーネント３１は、円形のファイバ保持プレート６２を含み、保持プレートは、プレートの中央部から後ろ向きに伸びる円筒形ステム部６２Ａを有する。プレート６２は、上記の４つの同心リングＡ、Ｂ、Ｃ及びＤのパターンを形成するように複数のファイバ支持穿孔Ｈが穿たれる球状凹面の前面６２Ｓを有する。穿孔Ｈの円形パターンはステム６２Ａの長さ全体に軸方向に伸びる中央穿孔ＣＨを中心とする。各穿孔Ｈは、光ファイバ束３３、３４、３７及び３８の光ファイバのうちの１本の集光端部を受け入れて、その位置を適切に定める。中央穿孔ＣＨは、光ファイバを受け入れるためのものではなく、単に軸方向の非散乱ビームを下に説明する軸方向集光コンポーネント３２に伝送するためのものであることに留意すること。各穿孔Ｈは、それが受け入れる１本の光ファイバの公称直径（５００ミクロン）を僅かに上回る直径を有する。各穿孔は、（ａ）支持されるファイバ部分の集光端が実質的に凹面６２Ｓと実質的に同一平面上になるように、また（ｂ）支持されるファイバの縦光軸が光散乱源の「外見上の」位置すなわちファイバ集光端が散乱を見るときに介在するフローセルの透明な後壁の屈折特性を考慮に入れた散乱源の事実上の位置を指すように、１本の光ファイバの集光端部を支持することが望ましい。このように配列することによって、散乱光は、支持されるファイバ部分のそれぞれの集光端にファイバの軸Ａ’に対して実質的に平行の方向に入り、それによって、結合される光検出器への伝送のために最も効率よくそれぞれのファイバ内部に結合される。図５Ａ及び５Ｂから分かる通り、ファイバ支持穿孔Ｈは、プレート６２を完全に貫通するので、ファイバ端をプレート６２の裏面から穿孔に入れてプレートに適切に固定（例えば、エポキシによって）できるようにする。各穿孔Ｈは、ファイバの集光端から少なくとも２ｍｍの距離、ファイバ端部に軸方向の支持を与えるための長さを持つことが望ましい。
【００２０】
図５Ａを参照すると、プレート６２は面６２Ｓの曲率中心ＣＣがオプティカル・フローセル１０の裏面１０Ｓに位置するポジションに示される。フローセル中心Ｃ（散乱源が名目上位置するところ）をフローセルの光学的に透明の（クォーツ）後壁ＲＷを通して見ると、フローセル中心Ｃは実際にはフローセル壁内部の点Ｃ’にあるように見える。従って、穿孔Ｈを穿つとき、そのそれぞれの軸Ａ’（支持されるファイバの軸と一致する）が点Ｃ’に集まることが望ましい。望ましい実施態様においては、面６２Ｓの曲率半径は約０．２５インチであり、フローセル中心の外見上の位置は、フローセル壁内の面６２Ｓから約０．０３０インチ離れたところである。
【００２１】
上述の通り、面６２Ｓの穿孔の各リングは、光ファイバ束３３、３４、３７及び３８のうちの１つの光ファイバを支持する。従って、図５Ｂを参照すると、例えば、光ファイバ束３３のファイバの本数が１２本であれば、リングＡの１２の穿孔が、合計で１２本の光ファイバを支持する。同様に、光ファイバ束３８のファイバの本数が３４本であれば、リングＤの３４の穿孔が、合計で３４本のファイバを支持することができる。明らかにリングの直径が収納できる光ファイバの本数を決定する。前方光散乱が検出される公称角度は、穿孔のそれぞれの軸を通る中心線及び散乱源からのリングの軸方向の距離によって決定されるのと同様、各リングの直径によって決定される。散乱が検出される角度範囲は、各穿孔に１本のファイバがあると仮定して、各ファイバの直径によって決定される。本発明の特に望ましい実施態様に従えば、光ファイバ・リングＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの直径及び面６２Ｓの曲率半径は、公称散乱角度が１１度、１６度、２４度及び３２度となるように選択される。角度の関数としての前方散乱の強さ（振幅）が白血球の主要な３つの部分母集団（すなわち、リンパ球Ｌ，単球Ｍ及び顆粒球Ｇ）についてグラフ化される図１０を参照すると、望ましい角度約１１度、１６度及び２４度が３つの曲線の比較的適切な変位を示し、従って前方散乱角度のうち任意の２つが相互に関係付けてグラフ化される散布図においては、白血球の３つの部分母集団を容易に識別することができることが分かるだろう。面６２Ｓの約６．２ｍｍの曲率半径及び５００ミクロンのファイバ直径は、これらの角度を中心として約プラスマイナス２度の角度範囲をもたらす。
【００２２】
軸方向集光コンポーネント
光ファイバ・ホルダ３０の軸方向集光コンポーネント３２は、（１）遠隔に位置する光検出器に伝送するために軸方向のビームを受け取るための位置に１つまたはそれ以上の光ファイバ束のそれぞれの集光端を支持するため、並びに（２）このビームが後方散乱検出器Ｄ’に向かって逆反射するのを防ぐために、作用する。逆反射を防がないと、後方散乱検出器において比較的低レベルの後方散乱信号の収集及び検出を妨害するだろう。ビーム・ライトの逆反射を防止するために、コンポーネント３２は、伝送及び検出のためにビーム・ライトを集める前にビーム・ライトを拡散する機能を果たす。図４、６Ａ及び６Ｂを参照すると、コンポーネント３２は、前端に中央の円筒形開口６４Ａを有する円筒形ハウジング６４を含む。プレート６２のステム部６２Ａは、開口６４Ａに圧入され、それによってハウジング６４の支持となる。ハウジング６４の後部は反射面を有する円錐形内壁６４Ａを有する。壁６４Ａは部分的に光反射室６５を形成する。ハウジング６４から後方に伸びる円形フランジ６４Ｃは、第二光ファイバ・ホルダとして役立つ軸プラグ６６（図７Ａ及び７Ｂにおいて示される）を支持する円筒形開口６７を形成する。ハウジング６４の小さい中央の開口６９は、開口６４Ａと６７の間を連絡する。軸プラグ６６は、望ましくはＥ．Ｉ．Ｄｕｐｏｎｔの商標である登録商標Ｄｅｌｒｉｎで作られる、平面的な光拡散上面６６Ａを備える。穿孔Ｈ’の円形パターンがプラグ６６に形成され、穿孔は、相互に、またプラグの中央縦軸に対して平行である。これらの穿孔は、図１及び２に示される光ファイバ束３５または３６のどちらかから、望ましくは円形パターンの周りに交互に、光ファイバを受けるのに適する。束３５及び３６の光ファイバは、そのそれぞれの集光端が光拡散面６６Ａと同一平面上になるように穿孔Ｈ’内に配置される。このように、図４に示される通り、ステム６２Ａに形成される中央穿孔ＣＨを通り部材６４の中央開口６９を通る軸方向のビームＢは、プラグ６６の光拡散面６６Ａにぶつかる。従って、入射ビームはあらゆる方向に拡散し、拡散した光は、反射光の一部がプラグ６６によって支持される光ファイバの集光端にぶつかるまで反射室６５内で複数回反射する。軸方向のビーム・ライトはこのようにして集められ、ＰＤ３またはＰＤ４に伝送される。（ａ）中央穿孔ＣＨの比較的小さい直径（約１ｍｍ）、（ｂ）中央穿孔ＣＨの長さ（約１２ｍｍ）及び（ｃ）面６６Ａの光拡散効果、によって、前方散乱光及び後方散乱光の両方の検出の妨げとなるようなオプティカル・フローセル及び後方散乱検出器Ｄ’に向かって反射されるビーム・ライトは最小限に抑えられる。例えばビームＢが多色性の場合（血球の照射に２つの異なるレーザーが使用される場合のように）、２つの異なる波長で軸方向光損失を区別するために、１対の色吸収フィルタ４０及び４２が、それぞれ光ファイバ束３５及び３６の光放出端と光検出器ＰＤ３及びＰＤ４の感光面との間に配置されることが望ましい。
【００２３】
後方散乱検出器
図１、８Ａ及び８Ｂを参照すると、後方散乱検出器Ｄ’は、光ファイバ・ホルダ５０、光ファイバ束５４及び光検出器５６を含む。光ファイバは、上述のものと同じものが望ましく、光検出器は従来の増倍型光電管（ＰＭＴ）である。光ファイバ・ホルダ５０は、黒色のプラスティックで作られることが望ましく、Ｅ．Ｉ．Ｄｕ  Ｐｏｎｔの製品であるＤｅｒｌｉｎプラスティックで作られるのが最も望ましい。ホルダ５０は、長さ全体に沿って伸びる中央孔７１を有する比較的小さい中央管部７０を含む。中央管部７０は、その一端に円形ファイバ保持フランジ７２を、また相対する端に拡大管部７４を備える。中央管部７０は約２．５ｍｍの長さ及び約１．５ｍｍの外径を持つことが望ましい。孔７１の直径は約１．３ｍｍであり、血球照射ビームＢが孔を通過した後血球を照射できるようにビームを通すのに充分な大きさである。拡大管部７４は、約４．０ｍｍの長さ、約３．３ｍｍの外径及び約３．０ｍｍの内径を有する。管部７４の内径は、レンズ・ハウジング２６の端の外面にぴったりとはまるのに適するので、レンズ・ハウジングは、光ファイバ・ホルダ５０の全面的な支持となる。
【００２４】
図８Ｂから分かる通り、円形フランジ７２は、複数の穿孔Ｈ”を備え、その各々が上述のタイプの光ファイバの集光端部を受け入れこれを保持するのに適する直径を有する。従って、各穿孔Ｈ”は、ファイバ直径５００ミクロンを僅かに上回る直径を有する。穿孔Ｈ”は、円形パターンで配列されて、ホルダ５０の中央縦軸Ａを中心とするリングＲを形成する。使用中、軸Ａは光軸ＯＡと一致することに留意すること。リングＲは約１．７５ｍｍの直径を持つことが望ましい。フランジ７２の端（フローセル１０の前面１０Ａと接することになっている）と散乱源（すなわちフローセルの中心）との間に予想される間隔に基づいて、このリングの直径は、約２度から２４度の間の公称後方散乱角度を与え、５００ミクロンのファイバ直径は、約２度（公称後方散乱角度を中心として）の角度範囲を与える。望ましい公称後方散乱角度は約７度であるが、２４度程度の後方散乱角度で充分な信号強さが検出された。光ファイバのそれぞれの集光端のエリアは比較的小さいので、ファイバは、前方散乱検出器と後方散乱検出器との間に配置される様々な表面（例えば、オプティカル・フローセルの面）から反射するレーザー迷光をあまり集めない。従って、光ファイバを使用することによって、光検出器５６の信号雑音比は、対象となる後方散乱信号の他に対象となる細胞以外の源からの大量の後方散乱光を集める非指向性、広面積の先行技術の検出器に比べて、比較的高い値を維持する。
【００２５】
図８Ａに示される実施態様においては、光ファイバの集光端部は、各ファイバ軸がホルダ５０の軸Ａに対して実質的に平行に伸びるように支持されることが分かるだろう。図９Ａ及び９Ｂにおいては、本発明のさらに望ましい別の実施態様が示されており、この実施態様においては、ファイバ・ホルダ５０’は、そのそれぞれの軸ＦＡが散乱源の外見上の位置すなわちフローセルの屈折性前面を通じて見たときの事実上の位置を表す点Ｐに集中するように、ファイバ端を支持するのに役立つ。この図には、ファイバ収納穿孔Ｈが球状凹面Ｓに形成される（穿たれる）修正されたフランジ７２’が示されている。この配列によって、被照射血球からの後方散乱光は、ファイバ軸ＦＡに対して実質的に平行の方向からファイバの集光端に入る。従って、ファイバ内における複数の内部反射による光損失は減少する。これは、特に血球から受ける比較的弱い後方散乱光の場合に有利である。
【００２６】
側方散乱検出器
側方散乱検出器Ｄ”は、従来の設計のものであり、本発明の譲受人が販売する上述のＸＬTMフロー・サイトメーターに使用されるタイプのものであることが望ましい。この検出器は、一般的に言って、フローセル１０の側壁から出る側方散乱光ＳＳ（図１に示される）を集めるため及びこの光を視準して光検出器に焦点を合わせるためのレンズ・システム（図には示されていない）を含む。レンズ・システムは、フローセルに近接して配置され、比較的広い角度範囲例えば９０度プラスマイナス４５度の側方散乱光を受け入れる。側方散乱検出器のさらなる詳細は、市販の計器及びその操作マニュアルを参照することによって得ることができる。
【００２７】
上述のことから、血液サンプル中の各細胞は、上述の検出器を使って行われる測定の多様な組み合わせによって特徴付けられることが明らかである。たとえば、細胞の後方散乱特性を、光ファイバの４つの同心リングＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄによって与えられる４つの異なる角度範囲内における前方散乱特性と関係付けてグラフ化して、４つの異なる散布図を得ることができる。同様に後方散乱を２つの異なる波長の軸方向光損失と関係付けて、また側方散乱と関係付けてグラフ化することができる。個々のパラメータまたは特性は、他の測定パラメータのいずれとも関係付けてグラフ化することができることは明らかである。当然、その結果得られる散布図の全てが、血液サンプル中の他の細胞及び細胞片から対象となる細胞を分化するのに役立つわけではないだろう。しかし、特に血小板の後方散乱サイン、及びこれより狭い範囲であるが好塩基球の後方散乱サインは、他の同時に測定されるある種のパラメータと結び付けられると、これら特定の細胞タイプを分化するのに非常に有益であることが判明している。
【００２８】
図１１−１６を参照すると、図１１は、前述のタイプの前方散乱検出器が改良のために組み込まれるＸＬフロー・サイトメーターから得られる典型的な散布図である。この場合、血小板部分母集団は、計器の蛍光検出コンポーネントによって容易に検出可能な蛍光塗料（ＦＩＴＣ）で選択的にタグ付けされた。光ファイバ・リングＢによって１１度で行われた前方散乱（ＦＳ）測定を蛍光（ＦＬ）測定と関係付けてグラフ化することによって、血小板部分母集団Ｐを細胞片Ｄ並びに赤血球（ＲＢＣ）の主母集団及び血小板が付着する比較的小さい二次赤血球母集団ＲＢＣ-２から容易に分化されることが明らかである。上に指摘したとおり、血小板を分化するためのこの免疫表現型検査法は、正確ではあるが、時間及び材料に関してコスト高である。
【００２９】
次に図１２を参照すると、測定された後方散乱（ＢＳ）パラメータ（すなわち検出器Ｄ’の出力）を図１１に使用されるのと同じ前方散乱パラメータと関係付けてグラフ化した結果が、単一の血液サンプルについて示されている。図に示される通り、血小板部分母集団Ｐは、細胞片Ｄ及びＲＢＣ部分母集団から容易に識別でき、処理対象の血液サンプルにおける血小板の率を簡単に決定できるものにする。図１３に示される通り、血小板を分化するための光学だけによるこの方法は、血小板を分化するためのもっと複雑な免疫表現型法と非常によく相関する。図１３には、合計で２４の異なる希釈血液サンプルに認められた血小板の率が示されており、各々、上述の光学的方法（すなわちＢＳ  ｖｓ．約１１度でのＦＳ）及び標準的免疫表現型法（ＦＬ  ｖｓ．同じく約１１度でのＦＳ）によって同時に決定されている。相関係数は、印象的な値である０．９９９と決定された。
【００３０】
後方散乱パラメータは、約１１度で行われる前方散乱測定と関連付けてグラフ化されるとき血小板を識別するのに特に有益な手段であるが、側方散乱（ＳＳ）、軸方向光損失（ＡＬＬ）及び他の角度範囲内における前方散乱例えば約１６度を中心とする角度範囲の前方散乱と関係付けてグラフ化するとき血小板を識別するのに非常に有益であることも判明している。これらのパラメータの組み合わせの結果を示す散布図がそれぞれ図１４-１６に示されている。これらの全ての散布図において、血小板部分母集団が、従来の方法の結果を損なっていた細胞片から容易に区別されることは明白である。
【００３１】
上記の散布図を得るために上述の装置を使用する際、１ミリリットルの生理食塩水、望ましくは本発明の譲受人が製造販売するＩｓｏＦｌｏｗTM希釈剤が1マイクロリットルの全血に加えられる。全血の希釈サンプルの一部は、上述の検出器Ｄ及びＤ’が改良のために組み込まれるＸＬフロー・サイトメーターによって処理される。結果を免疫測定「基準」と比較するための、希釈サンプルをＣＤ４１/ＣＤ６１を含有する蛍光抗体溶液で培養することができる。検出器Ｄ、Ｄ’及びＤ”から前方、側方及び後方散乱情報を得るために約１０，０００個の血球または細胞が個別に照射される。上述の通り、軸方向光損失（ＡＬＬ）情報も、前方散乱検出器Ｄによって与えられる。同時に、明白に血小板を識別するために染色血小板について蛍光データを得ることができる。
【００３２】
白血球の好塩基球部分母集団の検出に関して、本発明の装置及び方法は、これらの細胞の後方散乱サインをその側方散乱サインと関係付けてグラフ化するとき、従来の方法と同程度の確実性でこれを識別できることが判明した。図１７において、後方散乱（ＢＳ）対側方散乱（ＳＳ）の散布図は、汚染することが多い単球（Ｍ）及びリンパ球（Ｌ）の群れから分離される好塩基球（Ｂ）の小さな離散した群れを示している。また、好中球部分母集団（Ｎ）及び細胞片（Ｄ）も図に示されている。好塩基球データは、好塩基球部分母集団を蛍光染料で染色するためにＣＤ２０３ｃ抗体を用いて同じサンプルについて得られた蛍光対側方散乱データとかなりよく相関する。
【００３３】
図１７の散布図を作成する際、１００マイクロリットルの全血がガラス瓶において蛍光塗料（ＰＥ）でタグ付けされた２０マイクロリットルのＣＤ２０３ｃ抗体と混合された。次に、この混合物を室温で１５分間暗所において培養した。培養後、溶解及び固定のためにガラス瓶をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．が製造販売するＱ-ＰｒｅｐTM細胞処理器に入れた。溶解され固定したサンプルを、次に、３回洗浄して、細胞を５００マイクロリットルの燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させた。その後直ちに、サンプルを、上述の後方散乱検出器Ｄ’が改良のために組み込まれたＸＬフロー・サイトメーターで処理した。
【００３４】
上記のことから、特に血液サンプル中の血小板及び好塩基球を分化するのに有益な、比較的単純な光散乱法が開示されていることが分かるだろう。他の純粋に光学的パラメータ（例えば、光散乱及び軸方向光損失パラメータ）とともに細胞の後方散乱パラメータを使用する細胞識別は、特に、光学的測定並びに電気的インピーダンス測定、または光学的測定並びに蛍光測定を必要とする従来のシステムに比べて有利である。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ他に与えられた同一出願者による米国特許第６，２２８，６５２号に開示されるタイプの多パラメータ・オプティカル・フローセルにおいて開示されるタイプの後方散乱検出器を使用することによって、Ｃｏｕｌｔｅｒ原理を用いるＤＣ及びＲＦインピーダンス測定を同時に行うことができる。その結果得られるＢＳ  ｖｓ．Ｚ（インピーダンス）散布図は、他のタイプの血液細胞をさらによく分化するのにも役立つことを証明するだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】血液細胞及びその他の小さい粒子の光散乱サインに基づいてこれらの細胞及び血球を分析するために使用されるシステムの一部の略図である。
【図２】本発明の望ましい装置の一部を構成する前方光散乱検出器の一部の斜視図である。
【図３】図２の装置の集光コンポーネントの一部の拡大斜視図である。
【図４】図３の装置の断面図である。
【図５Ａ】図３の装置の第一光ファイバ・ホルダ・コンポーネントの断面図である。
【図５Ｂ】図３の装置の第一光ファイバ・ホルダ・コンポーネントの前面図である。
【図６Ａ】図３の装置の軸方向光線反射器コンポーネントの前面図である。
【図６Ｂ】図３の装置の軸方向光線反射器コンポーネントの断面図である。
【図７Ａ】図３の装置の軸方向光線拡散器/第二光ファイバ・ホルダ・コンポーネントの前面図である。
【図７Ｂ】図３の装置の軸方向光線拡散器/第二光ファイバ・ホルダ・コンポーネントの断面図である。
【図８Ａ】図１の装置を構成する望ましい後方散乱検出器の断面図である。
【図８Ｂ】図１の装置を構成する望ましい後方散乱検出器の前面図である。
【図９Ａ】別の望ましい後方散乱検出器の斜視図である。
【図９Ｂ】別の望ましい後方散乱検出器の断面図である。
【図１０】リンパ球、単球及び顆粒球の前方光散乱特性を示す。
【図１１】対象となる細胞を明確に識別するための免疫表現型検査法の結果を示す散布図である。
【図１２】対象となる細胞を識別するための光散乱法の結果を示す散布図である。
【図１３】図１１及び１２において言及される技法の相関を示すグラフである。
【図１４】本発明の装置によって決定される様々な細胞パラメータを組み合わせた結果を示す散布図である。
【図１５】本発明の装置によって決定される様々な細胞パラメータを組み合わせた結果を示す散布図である。
【図１６】本発明の装置によって決定される様々な細胞パラメータを組み合わせた結果を示す散布図である。
【図１７】本発明の装置によって決定される様々な細胞パラメータを組み合わせた結果を示す散布図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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