(57)【要約】  超突然変異性の細胞および生物体を作製するためにヒトミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を用いることができる。これらの遺伝子を細胞およびトランスジェニック動物に導入することによって、新規で且つ有用な性質を有する新しい細胞系および動物変種を自然突然変異率に依存するより効率よく製造することができる。対象遺伝子における突然変異を作製する方法およびインビボでミスマッチ修復を阻害するための化学物質の使用によって様々な細胞をミスマッチ修復欠損にする方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞をミスマッチ修復の阻害剤にさらすことを含んでなる超突然変異性（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｂｌｅ）細胞を製造する方法であって、ここで、該阻害剤がアントラセン、ＡＴＰアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、もしくはミスマッチ修復タンパク質をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドである方法。
【請求項２】
該阻害剤がアントラセンである請求項１の方法。
【請求項３】
該アントラセンが式：
【化１】
2005510199.tif 000063
ここで、Ｒ１−Ｒ１０は独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、置換されたアリールオキシ、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、グアニジノ、カルボキシ、アルコール、アミノ酸、スルホネート、スルホン酸アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、アルデヒド基、エステル、エーテル、クラウンエーテル、ケトン、有機硫黄化合物、有機金属基、カルボン酸、有機ケイ素化合物、または１個もしくはそれ以上のアルキル化ヒドロキシル基を場合により含有する炭水化物であり；
ここで、該ヘテロアルキル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールは、酸素、硫黄、金属原子、リン、ケイ素もしくは窒素である少なくとも１個のヘテロ原子を含有し；そして
ここで、該置換されたアルキル、置換されたアルケニル、置換されたアルキニル、置換されたアリール、および置換されたヘテロアリールの該置換基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルキルオキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり；
そしてここで、該アミノ基はアシル基、または１〜３個のアリールもしくは低級アルキル基で場合により置換されていてもよい、
を有する請求項２の方法。
【請求項４】
Ｒ５およびＲ６が水素である請求項３の方法。
【請求項５】
Ｒ１−Ｒ１０が独立して水素、ヒドロキシル、アルキル、アリール、アリールアルキルもしくはヒドロキシアルキルである請求項３の方法。
【請求項６】
Ｒ１−Ｒ１０が独立して水素、ヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トリル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピルもしくはヒドロキシブチルである請求項３の方法。
【請求項７】
該アントラセンが１，２−ジメチルアントラセン、９，１０−ジメチルアントラセン、７，８−ジメチルアントラセン、９，１０−ジフェニルアントラセン、９，１０−ジヒドロキシメチルアントラセン、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン、ジメチルアントラセン−１，２−ジオール、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン−１，２−ジオール、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン−３，４−ジオールおよび９，１０−ジ−ｍ−トリアントラセンよりなる群から選択される請求項３の方法。
【請求項８】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０が水素である請求項３の方法。
【請求項９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が水素である請求項３の方法。
【請求項１０】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が水素である請求項３の方法。
【請求項１１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９およびＲ１０が水素である請求項３の方法。
【請求項１２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が水素である請求項３の方法。
【請求項１３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０が水素である請求項３の方法。
【請求項１４】
該ＡＴＰアーゼ阻害剤がＡＭＰ−ＰＮＰのようなＡＴＰの非加水分解性形態である請求項１の方法。
【請求項１５】
該ヌクレアーゼ阻害剤がN−エチルマレイミドの類似体、ヘテロダイマー型のアデニン−チェーン−アクリジン（ａｄｅｎｉｎｅ−ｃｈａｉｎ−ａｃｒｉｄｉｎｅ）化合物、もしくはヘリキノマイシン（Ｈｅｌｉｑｕｉｎｏｍｙｃｉｎ）のようなキニロンである請求項１の方法。
【請求項１６】
該ポリメラーゼ阻害剤がアフィジコリンの類似体、１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−ベータ−Ｌ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル（Ｌ−ＦＭＡＵ）もしくは２’，３’−ジデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸である請求項１の方法。
【請求項１７】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ミスマッチ修復タンパク質のコーディング鎖に相補的な約１５個の連続したヌクレオチドを含んでなり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが生理的条件下で該ミスマッチ修復タンパク質の該コーディング鎖に特異的に結合し、そして該ミスマッチ修復タンパク質のミスマッチ修復活性を阻害する請求項１の方法。
【請求項１８】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが該ミスマッチ修復タンパク質の該コーディング鎖上の調節部分に特異的に結合する請求項１７の方法。
【請求項１９】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドがＭＭＲ遺伝子メッセージの最初の６個のコドンに対して向けられる請求項１７の方法。
【請求項２０】
ミスマッチ修復の該阻害剤がインビトロで真核細胞の増殖培地に導入される請求項１の方法。
【請求項２１】
ミスマッチ修復の該阻害剤がインビトロで原核細胞の増殖培地に導入される請求項１の方法。
【請求項２２】
ミスマッチ修復の該阻害剤が植物の成長培地に導入される請求項１の方法。
【請求項２３】
対象遺伝子を含んでなる細胞を化学ミスマッチ修復阻害剤にさらすことおよび該対象遺伝子が突然変異を含んでなるかどうかを決定するために該細胞を試験することを含んでなる対象遺伝子における突然変異を生成する方法。
【請求項２４】
該試験することが、該対象遺伝子のポリヌクレオチド配列を分析することを含んでなる請求項２３の方法。
【請求項２５】
該試験することが、該対象遺伝子によってコードされるタンパク質を分析することを含んでなる請求項２３の方法。
【請求項２６】
該試験することが、該細胞の表現型を分析することを含んでなる請求項２３の方法。
【請求項２７】
該細胞が哺乳動物細胞であり、そして該哺乳動物細胞をミスマッチ修復の阻害剤にさらすことによって該哺乳動物細胞をミスマッチ修復欠損にする請求項２３の方法。
【請求項２８】
該対象遺伝子が突然変異を含んでなることを決定した後にミスマッチ修復の化学阻害剤（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を取り除くことをさらに含んでなる請求項２７の方法。
【請求項２９】
該試験することが、該対象遺伝子のポリヌクレオチド配列を分析することを含んでなる請求項２７の方法。
【請求項３０】
該試験することが、該対象遺伝子によってコードされるタンパク質を分析することを含んでなる請求項２７の方法。
【請求項３１】
該試験することが、該細胞の表現型を分析することを含んでなる請求項２７の方法。
【請求項３２】
動物をミスマッチ修復の化学阻害剤にさらすことおよび対象遺伝子が突然変異を含んでなるかどうかを決定するために該動物を試験することを含んでなる対象遺伝子における突然変異を生成する方法。
【請求項３３】
該動物が哺乳動物である請求項３２の方法。
【請求項３４】
該試験することが、該対象遺伝子のポリヌクレオチド配列を分析することを含んでなる請求項３２の方法。
【請求項３５】
該試験することが、該対象遺伝子によってコードされるタンパク質を分析することを含んでなる請求項３２の方法。
【請求項３６】
該試験することが、該細胞の表現型を分析することを含んでなる請求項３２の方法。
【請求項３７】
該哺乳動物をミスマッチ修復の阻害剤にさらすことによって該哺乳動物をミスマッチ修復欠損にする請求項３３の方法。
【請求項３８】
該対象遺伝子が突然変異を含んでなることを決定した後にミスマッチ修復の該阻害剤を取り除くことをさらに含んでなる請求項３７の方法。
【請求項３９】
請求項３３の方法によって作製される超突然変異性トランスジェニック哺乳動物。
【請求項４０】
植物をミスマッチ修復の阻害剤にさらすことを含んでなるミスマッチ修復欠損植物を作製する方法。
【請求項４１】
対象遺伝子を含んでなる植物を育てること、該植物をミスマッチ修復の阻害剤にさらすこと、および該対象遺伝子が突然変異を含んでなるかどうかを決定するために該植物を試験することを含んでなる対象遺伝子における突然変異を生成する方法。
【請求項４２】
該試験することが、該対象遺伝子のポリヌクレオチド配列を分析することを含んでなる請求項４１の方法。
【請求項４３】
該試験することが、該対象遺伝子によってコードされるタンパク質を分析することを含んでなる請求項４１の方法。
【請求項４４】
該試験することが、該植物の表現型を分析することを含んでなる請求項４１の方法。
【請求項４５】
該植物をミスマッチ修復の阻害剤にさらすことによって該植物をミスマッチ修復欠損にする請求項４１の方法。
【請求項４６】
請求項４０の方法によって作製される超突然変異性植物。
【請求項４７】
該植物が単子葉植物である請求項４６の植物。
【請求項４８】
該植物が双子葉植物である請求項４６の植物。
【請求項４９】
生物体を候補化合物にさらすことおよびマイクロサテライト不安定性に関して該生物体のＤＮＡをスクリーニングすることを含んでなるミスマッチ修復の化学阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項５０】
該生物体が哺乳動物である請求項４９の方法。
【請求項５１】
該生物体が微生物である請求項４９の方法。
【請求項５２】
該生物体が植物である請求項４９の方法。
【請求項５３】
該スクリーニングが、内在性マイクロサテライトをモニターすることを含んでなる請求項４９の方法。
【請求項５４】
該スクリーニングがレポーター発現遺伝子の使用を含んでなり、該レポーター発現遺伝子が該レポーター遺伝子のコーディング領域内にポリヌクレオチド反復を含んでなる請求項４９の方法。
【請求項５５】
該レポーター遺伝子がβ−グルクロニダーゼである請求項５４の方法。
【請求項５６】
細胞をアントラセン化合物にさらすことを含んでなるインビボでミスマッチ修復活性を阻害する方法。
【請求項５７】
該アントラセンが式：
【化２】
2005510199.tif 000064
ここで、Ｒ１−Ｒ１０は独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、置換されたアリールオキシ、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、グアニジノ、カルボキシ、アルコール、アミノ酸、スルホネート、スルホン酸アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、アルデヒド基、エステル、エーテル、クラウンエーテル、ケトン、有機硫黄化合物、有機金属基、カルボン酸、有機ケイ素化合物、または１個もしくはそれ以上のアルキル化ヒドロキシル基を場合により含有する炭水化物であり；
ここで、該ヘテロアルキル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールは、酸素、硫黄、金属原子、リン、ケイ素もしくは窒素である少なくとも１個のヘテロ原子を含有し；そして
ここで、該置換されたアルキル、置換されたアルケニル、置換されたアルキニル、置換されたアリール、および置換されたヘテロアリールの該置換基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルキルオキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり；
そしてここで、該アミノ基はアシル基、または１〜３個のアリールもしくは低級アルキル基で場合により置換されていてもよい、
を含んでなる請求項５６の方法。
【請求項５８】
Ｒ５およびＲ６が水素である請求項５７の方法。
【請求項５９】
Ｒ１−Ｒ１０が独立して水素、ヒドロキシル、アルキル、アリール、アリールアルキルもしくはヒドロキシアルキルである請求項５７の方法。
【請求項６０】
Ｒ１−Ｒ１０が独立して水素、ヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トリル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピルもしくはヒドロキシブチルである請求項５７の方法。
【請求項６１】
該アントラセンが１，２−ジメチルアントラセン、９，１０−ジメチルアントラセン、７，８−ジメチルアントラセン、９，１０−ジフェニルアントラセン、９，１０−ジヒドロキシメチルアントラセン、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン、ジメチルアントラセン−１，２−ジオール、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン−１，２−ジオール、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン−３，４−ジオールおよび９，１０−ジ−ｍ−トリアントラセンよりなる群から選択される請求項５７の方法。
【請求項６２】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０が水素である請求項５７の方法。
【請求項６３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が水素である請求項５７の方法。
【請求項６４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が水素である請求項５７の方法。
【請求項６５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９およびＲ１０が水素である請求項５７の方法。
【請求項６６】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が水素である請求項５７の方法。
【請求項６７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０が水素である請求項５７の方法。
【請求項６８】
該細胞を突然変異誘発物質にさらすことをさらに含んでなる請求項２３の方法。
【請求項６９】
該動物を突然変異誘発物質にさらすことをさらに含んでなる請求項３２の方法。
【請求項７０】
該突然変異誘発物質がＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸、ジメチルスルホン酸、Ｏ−６−メチルベンザジン、エチルメタンスルホン酸、メチルニトロソ尿素およびエチルニトロソ尿素よりなる群から選択される請求項６８もしくは６９の方法。
【請求項７１】
化学物質が、ＭＭＲに堪能な（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）細胞ではマイクロサテライト不安定性を誘発するがＭＭＲ欠損細胞では高められたマイクロサテライト不安定性を誘発しないＭＭＲ阻害剤である請求項４９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、突然変異誘発の分野に関する。特に、本発明は、特定のＤＮＡ修復プロセスを阻害する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）は、ゲノム複製後に存在する変異ＤＮＡ配列の複製後修復に関与する保存されたＤＮＡ修復プロセスである。該プロセスは、誤対合したモノ、ジおよびトリ−ヌクレオチド、点突然変異を修正するためにそして正しい相同的組換えをモニターするために協力して働くｍｕｔＳ相同物ＧＴＢＰ、ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ３並びにｍｕｔＬ相同物ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１およびｈＰＭＳ２を包含する一群の遺伝子産物を含む（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３および非特許文献４）。このプロセスに関与する遺伝子のいずれかにおける生殖細胞系列突然変異は、宿主細胞のゲノムの全体にわたって、広範囲の点突然変異、並びにモノ、ジおよびトリ−ヌクレオチド反復の不安定性（マイクロサテライト不安定性（ＭＩ）と呼ばれる特徴）をもたらす。ヒトでは、ＭＭＲにおける遺伝子欠損は、腫瘍が二倍体ゲノムを保持するが広範囲に及ぶＭＩを有する疾患である遺伝性非腺腫性大腸癌になりやすい素因をもたらす（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９および非特許文献１０）。ＭＭＲ欠損に起因するミューテーター欠陥は任意のＤＮＡ配列に影響を及ぼすことができるが、マイクロサテライト配列はＭＭＲ異常に特に感受性である（非特許文献１１）。従って、マイクロサテライト不安定性は、欠損ＭＭＲの有用な指標である。ＨＮＰＣＣ患者において生じる実質的に全ての腫瘍におけるその存在に加えて、ＭＩは、欠損ＭＭＲのためである独特な分子的および表現型特性を有するほんのわずかの散発性腫瘍に見出される（非特許文献１２）。
【０００３】
ＭＭＲ欠損は、宿主細胞のゲノムの全体にわたって起こることができる広範な突然変異（点突然変異、挿入、欠失、組換えなど）をもたらす。この影響は、細菌および酵母のような単細胞微生物から、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）並びにマウスおよびヒトを包含する哺乳動物のようなさらに複雑な生物体まで多岐にわたるがこれらに限定されるものではない多様な一連の生物体にわたって存在することが見出されている（非特許文献１３および非特許文献１４）。通常の宿主細胞もしくは生物体においてＭＭＲを阻害できることは、農業、製薬、化学薬品製造および特殊品のようなしかしこれらに限定されるものではない用途にとって望ましいアウトプット形質（ｏｕｔｐｕｔ  ｔｒａｉｔｓ）を有する遺伝子的に改変された子孫もしくは同胞細胞の生成をもたらすことができる。ＭＭＲプロセスを阻害することができる化学的手法は、商業的に有用なアウトプット形質を有する遺伝子的に改変された宿主を作製するのに有益である。インビボでＭＭＲを阻害する化学的戦略は、遺伝子的に改変された宿主生物体を作製するための組換え手法より優れた大きな利点を与える。一つの利点は、化学的手法が、宿主に外来ＤＮＡを導入する必要性を回避し、ＭＭＲを不活性にし、そして遺伝子的に多様な子孫もしくは同胞細胞を生成せしめる迅速な手法をもたらすことである。さらに、いったん所望のアウトプット形質を有する宿主生物体が生じると、化学物質を宿主から取り除きそしてそのＭＭＲプロセスを回復させ、このようにして、遺伝子改変を後の世代において固定するという点で化学プロセスは高度に制御される。本明細書に記述する本発明は、ＭＭＲを阻害し、従って、ＭＭＲ欠損の特質である（非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７および非特許文献１８）ＭＩを有する宿主生物体をもたらすことができる小分子の発見に関する。さらに、ＭＩを示す宿主生物体を次に、突然変異体核酸分子、ポリペプチド、生化学試薬、微視的および／もしくは巨視的レベルでの外見、または全生物体における表現型改変のようなしかしこれらに限定されるものではない新しいアウトプット形質を有するサブタイプを同定するために選択する。さらに、化学剤によってＭＭＲ欠損宿主細胞を開発できることは、製品開発のために遺伝子的に改変された細胞宿主を作製する有用な方法を提供する。本明細書に記述する本発明は、インビボで化学剤を用いるＭＭＲの阻害による遺伝子的に改変された細胞宿主の作製に関する。
【０００４】
本発明の利点は、本書類内に記述する実施例および図面においてさらに記述する。
【非特許文献１】Ｂｒｏｎｎｅｒ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：２５８−２６１
【非特許文献２】Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１６２５−１６２９
【非特許文献３】Ｌｅａｃｈ，Ｆ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：１２１５−１２２５
【非特許文献４】Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：７５−８０
【非特許文献５】Ｂｒｏｎｎｅｒ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：２５８−２６１
【非特許文献６】Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１６２５−１６２９
【非特許文献７】Ｌｅａｃｈ，Ｆ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：１２１５−１２２５
【非特許文献８】Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：７５−８０
【非特許文献９】Ｈａｒｆｅ  Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｓ．Ｊｉｎｋｓ−Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（２０００）Ａｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３４：３５９−３９９
【非特許文献１０】Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９５９−１９６０
【非特許文献１１】Ｐｅｉｎａｄｏ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１００６５−１００６９
【非特許文献１２】Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７：６７５−６８４
【非特許文献１３】Ｈａｒｆｅ  Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｓ．Ｊｉｎｋｓ−Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（２０００）Ａｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３４：３５９−３９９
【非特許文献１４】Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９５９−１９６０
【非特許文献１５】Ｐｅｉｎａｄｏ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１００６５−１００６９
【非特許文献１６】Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７：６７５−６８４
【非特許文献１７】Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３７：５８８−５９２
【非特許文献１８】Ｈｏａｎｇ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３００−３０３
【発明の要約】
【０００５】
本発明は、化学剤でＭＭＲ活性を阻害することによって細胞を超突然変異性にする方法を提供する。
【０００６】
本発明はまた、ミスマッチ修復の阻害によって導入された突然変異を有する遺伝子的に改変された細胞系も提供する。
【０００７】
本発明はさらに、細胞における高められた遺伝子超突然変異率をもたらす方法を提供する。
【０００８】
本発明は、細胞における対象遺伝子を変異させる方法、新しい表現型を有する細胞を作製する方法、並びに新しい表現型および安定なゲノムを有する細胞を作製する方法を包含する。
【０００９】
本発明はまた、遺伝子的に改変された全生物体を作製する方法および新しい表現型を有する全生物体を作製する方法も提供する。
【００１０】
本発明のこれらおよび他の目的は、以下に記述する一つもしくはそれ以上の態様によって提供される。
【００１１】
本発明の一つの態様として、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。コーディング領域にアウト・オブ・フレームのポリヌクレオチド反復を含有するＭＭＲ感受性レポーター遺伝子をＭＭＲに堪能な細胞に導入する。細胞を化学物質の存在下で増やす。ポリヌクレオチド反復の遺伝子構造を改変する化学物質は、生物学的に活性のレポーター遺伝子産物をもたらす。ポリヌクレオチド反復を壊す化学物質をＭＭＲ阻害剤と見なす。
【００１２】
本発明の別の態様として、単離されたＭＭＲ阻害化学物質を提供する。該化学物質は、宿主細胞のＭＭＲを阻害することができ、高められた超突然変異率を示す細胞をもたらす。
【００１３】
本発明の別の態様として、対象遺伝子に突然変異を導入する方法を提供する。ミスマッチ修復を阻害する化学物質を細胞系の培養物に加える。細胞は、化学物質の導入の結果として超突然変異性になる。細胞はさらに対象遺伝子を含んでなる。細胞を培養し、そして対象遺伝子が突然変異を保有するかどうかを決定するために試験する。
【００１４】
本発明の別の態様として、細胞の新しい表現型をもたらす方法を提供する。ミスマッチ修復を阻害する化学物質を細胞培養物に加える。細胞は、化学物質の導入の結果として超突然変異性になる。細胞を培養し、そして新しい表現型の発現を試験する。
【００１５】
本発明の別の態様として、ミスマッチ修復が化学剤によって阻害される細胞における遺伝子安定性を回復させる方法を提供する。化学物質を細胞培養物から取り除き、そして細胞はその遺伝子安定性を回復する。
【００１６】
本発明の別の態様として、阻害されたミスマッチ修復および新たに選択された表現型を有する細胞における遺伝子安定性を回復させる方法を提供する。化学剤を細胞培養物から取り除き、そして細胞はその遺伝子安定性を回復し、そして新しい表現型は安定である。
【００１７】
本発明の別の態様として、植物におけるＭＭＲを阻害する化学的手法を提供する。植物を化学剤の存在下で育てる。植物は成長し、そして高められた超突然変異率を示す。
【００１８】
本発明の別の態様として、インビボで植物におけるＭＭＲの化学阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。ＭＭＲ感受性植物発現ベクターを設計する。レポーターベクターを植物宿主に導入する。植物を化学剤の存在下で育てる。改変されたレポーター遺伝子機能に関して植物をモニターする。
【００１９】
本発明の別の態様として、植物における対象遺伝子に突然変異を導入する方法を提供する。ミスマッチ修復を阻害する化学物質を植物に加える。植物は、化学物質の導入の結果として超突然変異性になる。植物はさらに対象遺伝子を含んでなる。植物を育てる。対象遺伝子が突然変異を保有するかどうかを決定するために植物を試験する。
【００２０】
本発明の別の態様として、植物の新しい表現型をもたらす方法を提供する。ミスマッチ修復を阻害する化学物質を植物に加える。植物は、化学物質の導入の結果として超突然変異性になる。植物を育て、そして新しい表現型の発現に関して試験する。
【００２１】
本発明の別の態様として、ミスマッチ修復が化学剤によって阻害される植物における遺伝子安定性を回復させる方法を提供する。化学物質を植物培養物から取り除き、そして植物はその遺伝子安定性を回復する。
【００２２】
本発明の別の態様として、阻害されたミスマッチ修復および新たに選択された表現型を有する植物における遺伝子安定性を回復させる方法を提供する。化学剤を植物培養物から取り除き、そして植物はその遺伝子安定性を回復し、そして新しい表現型は安定である。
【００２３】
本発明のこれらおよび他の態様は、微生物、原生生物綱の生物、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物および動物において高められた突然変異性をもたらすことができる方法を当該技術分野に提供し、同様に、潜在的に有用な突然変異を保有する細胞、植物および動物を提供する。
【発明の詳細な記述】
【００２４】
様々な定義が本明細書において与えられる。大部分の単語および用語は、当業者によってこれらの単語に帰される意味を有する。本明細書において特に定義する単語もしくは用語は、概して本発明との関連において与えられ、そして当業者によって典型的に理解されるような意味を有する。単語もしくは用語の当該技術分野で理解される定義と本明細書において特に教示するような単語もしくは用語の定義間のあらゆる不一致は、後者を優先して解決されるものとする。本明細書において用いる表題は便宜上であり、そして限定すると解釈されるべきではない。
【００２５】
本明細書において用いる場合、「アントラセン」という用語は、化合物アントラセンをさす。しかしながら、「複数のアントラセン（ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｓ）」、「一つのアントラセン（ａｎ  ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）」もしくは「そのアントラセン（ｔｈｅ  ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）」のような一般的な意味でさす場合、そのような用語は、置換の程度にかかわらず、アントラセンの縮合トリフェニルコア構造、すなわち、
【００２６】
【化１】
2005510199.tif 000002
【００２７】
を含有する任意の化合物を示す。
【００２８】
本発明のある好ましい態様として、アントラセンは式：
【００２９】
【化２】
2005510199.tif 000003
【００３０】
ここで、Ｒ１−Ｒ１０は独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、置換されたアリールオキシ、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、グアニジノ、カルボキシ、アルコール、アミノ酸、スルホネート、スルホン酸アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、アルデヒド基、エステル、エーテル、クラウンエーテル、ケトン、有機硫黄化合物、有機金属基、カルボン酸、有機ケイ素化合物、または１個もしくはそれ以上のアルキル化ヒドロキシル基を場合により含有する炭水化物であり；
ここで、該ヘテロアルキル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールは、酸素、硫黄、金属原子、リン、ケイ素もしくは窒素である少なくとも１個のヘテロ原子を含有し；そして
ここで、該置換されたアルキル、置換されたアルケニル、置換されたアルキニル、置換されたアリール、および置換されたヘテロアリールの該置換基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルキルオキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり；
そしてここで、該アミノ基はアシル基、または１〜３個のアリールもしくは低級アルキル基で場合により置換されていてもよく；
もしくはここで、Ｒ１−Ｒ１０の任意の二つは一緒になってポリエーテルを形成することができ；
もしくはここで、Ｒ１−Ｒ１０の任意の二つはアントラセンコアの介在する炭素原子と一緒になってクラウンエーテルを形成することができる、
を有する。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「アルキル」は、１〜約２０個の炭素原子を含有する炭化水素をさす。アルキル基は、直鎖状、分枝鎖状、環式、もしくはその組み合わせであることができる。従って、アルキル基には、ほんの一例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、シクロペンチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチルなどが包含される。同様に「アルキル」の定義内に包含されるのは、例えばアダマンタンのような縮合および／もしくは多環式脂肪族環式環系である。本明細書において用いる場合、「アルケニル」という用語は、少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を有するアルキル基を示す。本明細書において用いる場合、「アルキニル」という用語は、少なくとも一つの炭素−炭素三重結合を有するアルキル基を示す。
【００３２】
ある好ましい態様として、上記のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールオキシおよびヘテロアリール置換基は、１個もしくはそれ以上のさらなる置換基を保有することができ；すなわち、それらは「置換」されることができる。ある好ましい態様として、これらの置換基は、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素）、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、アラルキルオキシ基、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノ基を包含することができる。さらに、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニルおよびアリールオキシカルボニル基のアルキルおよびアリール部分もまたそのような置換基を保有することができる。従って、ほんの一例として、置換されたアルキル基には、例えば、アルキル基、フルオロ−、クロロ−、ブロモ−およびヨードアルキル基、アミノアルキル基、並びにヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチルなどのようなヒドロキシルアルキル基が包含される。ある好ましい態様として、そのようなヒドロキシアルキル基は１〜約２０個の炭素を含有する。
【００３３】
本明細書において用いる場合「アリール」という用語は、フェニル、ビフェニルおよびナフチルのような、５〜約２０個の炭素原子を有しそして少なくとも１個の芳香環を含有する基を意味する。好ましいアリール基には、非置換のもしくは置換されたフェニルおよびナフチル基が包含される。「アリールオキシ」という用語は、酸素原子を介して結合しているアリール基、例えば、フェノキシ基を示す。
【００３４】
一般に、「ヘテロ」という接頭辞は、ある好ましい態様として独立して１〜３個のＯ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉもしくは金属原子である、少なくとも１個のヘテロ（すなわち、非炭素）原子の存在を示す。従って、「ヘテロアリール」という用語は、１個もしくはそれ以上の環炭素原子がそのようなヘテロ原子で置換されるアリール基を示す。好ましいヘテロアリール基には、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、フリル、チエニルおよびイミダゾリル基が包含される。
【００３５】
「アラルキル」（もしくは「アリールアルキル」）という用語は、アリール基を保有するアルキル基からなる、６〜１５個の炭素を有する基を示すものとする。アラルキル基の例には、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルおよびナフチルメチル基が包含される。
【００３６】
「アルキルアリール」（もしくはアルカリル）という用語は、アルキル基を保有するアリール基からなる、６〜１５個の炭素を有する基を示すものとする。アラルキル基の例には、メチルフェニル、エチルフェニルおよびメチルナフチル基が包含される。
【００３７】
「アリールスルホニル」という用語は、スルホニル基を介して結合するアリール基、例えばフェニルスルホニルを示す。「アルキルスルホニル」という用語は、スルホニル基を介して結合するアルキル基、例えばメチルスルホニルを示す。
【００３８】
「アルコキシカルボニル」という用語は、Ｒがアルキル、アルケニルもしくはアルキニルである場合の式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒの基を示し、ここで、そのアルキル、アルケニルもしくはアルキニル部分は、本明細書に記述するように場合により置換されていてもよい。
【００３９】
「アリールオキシカルボニル」という用語は、Ｒがアリールである場合の式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒの基を示し、ここで、そのアリール部分は、本明細書に記述するように場合により置換されていてもよい。
【００４０】
「アリールアルキルオキシ」もしくは「アラルキルオキシ」という用語は同等であり、そして式−Ｏ−Ｒ’−Ｒ”の基を示し、ここで、Ｒ’は本明細書に記述するように場合により置換されていてもよいアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、そしてＲ”はアリールもしくは置換されたアリール基を示す。
【００４１】
「アルキルアリールオキシ」もしくは「アルカリルオキシ」という用語は同等であり、そして式−Ｏ−Ｒ’−Ｒ”の基を示し、ここで、Ｒ’はアリールもしくは置換されたアリール基であり、そしてＲ”は本明細書に記述するように場合により置換されていてもよいアルキル、アルケニルもしくはアルキニルである。
【００４２】
本明細書において用いる場合、「アルデヒド基」という用語は、式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈの部分を保有する基を示す。「ケトン」という用語は、式−Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ＝の基を含有する部分を示し、ここで、ＲおよびＲ＝は独立してアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルもしくはアルカリルであり、これらの各々は本明細書に記述するように置換されることができる。
【００４３】
本明細書において用いる場合、「エステル」という用語は、式−Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ＝もしくは−Ｒ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ＝の基を有する部分を示し、ここで、ＲおよびＲ＝は独立してアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルもしくはアルカリルであり、これらの各々は本明細書に記述するように置換されることができる。
【００４４】
「エーテル」という用語は、式−Ｒ−Ｏ−Ｒ＝の基を有する部分を示し、ここで、ＲおよびＲ＝は独立してアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルもしくはアルカリルであり、これらの各々は本明細書に記述するように置換されることができる。
【００４５】
「クラウンエーテル」という用語は、数個の酸素原子を含有する環式エーテルのその通常の意味を有する。本明細書において用いる場合、「有機硫黄化合物」という用語は、脂肪族もしくは芳香族硫黄含有化合物、例えば、チオールおよびジスルフィドを示す。「有機金属基」という用語は、少なくとも１個の金属原子を含有する有機分子を示す。
【００４６】
「有機ケイ素化合物」という用語は、脂肪族もしくは芳香族ケイ素含有化合物、例えば、アルキルおよびアリールシランを示す。
【００４７】
「カルボン酸」という用語は、アミノ酸以外の、カルボキシル基を有する部分を示す。
【００４８】
本明細書において用いる場合、「アミノ酸」という用語は、アミノ基およびカルボキシル基の両方を含有する分子を示す。ある好ましい態様として、アミノ酸は、それらの立体異性体およびラセミ化合物を包含する、α−、β−、γ−もしくはδ−アミノ酸である。本明細書において用いる場合、「Ｌ−アミノ酸」という用語は、α−炭素の周りのＬ立体配置を有するα−アミノ酸、すなわち、Ｌ−立体配置を有する、一般式ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ２）−（側鎖）のカルボン酸を示す。「Ｄ−アミノ酸」という用語は、同様に、α−炭素の周りのＤ−立体配置を有する、一般式ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ２）−（側鎖）のカルボン酸を示す。Ｌ−アミノ酸の側鎖には、天然に存在する部分および天然に存在しない部分が包含される。天然に存在しない（すなわち、非天然の）アミノ酸側鎖は、例えばアミノ酸類似体において、天然に存在するアミノ酸側鎖の代わりに用いられる部分である。例えば、引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第二版，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ，１９７５，ｐ．７２−７７を参照。アミノ酸置換基は、それらのカルボニル基を介してその酸素もしくはカルボニル炭素を介して、またはそれらのアミノ基を介して、またはそれらの側鎖部分上に存在する官能基を介して結合されることができる。
【００４９】
本明細書において用いる場合、「ポリヌクレオチド」は核酸分子をさし、そしてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどが包含される。
【００５０】
本明細書において用いる場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、対象の標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的でありそして生理的条件下で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする核酸分子をさす。
【００５１】
本明細書において用いる場合、「ミスマッチ修復の阻害剤」は、細胞のミスマッチ修復系の少なくとも一つの機能を妨げそしてそれにより細胞を突然変異に対していっそう感受性にする作用因子をさす。
【００５２】
本明細書において用いる場合、「超突然変異性」は、インビトロもしくはインビボの細胞がミスマッチ修復系の喪失もしくは欠損により突然変異に対していっそう感受性になる状態をさす。
【００５３】
本明細書において用いる場合、「作用因子」、「化学物質」および「阻害剤」は、ＭＭＲの阻害と関連して用いる場合に、ＭＭＲの正常な機能を妨げる化学物質、オリゴヌクレオチド、天然の基質の類似体などをさす。
【００５４】
宿主の保存されているミスマッチ修復（ＭＭＲ）プロセスを利用することによって、超突然変異性の細胞および全生物体を開発する方法が見出された。ＭＭＲ遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子は、細胞もしくはトランスジェニック動物に導入されると、ＤＮＡ修復の効果を下げることによって自然突然変異の比率を上げ、そしてそれにより細胞もしくは動物を超突然変異性にする。次に、超突然変異性の微生物、原生動物、昆虫、哺乳動物細胞、植物もしくは全動物を、対象遺伝子における新しい突然変異を開発するために利用することができる。ＭＭＲを阻害しそしてそれにより細胞を超突然変異性にする化学物質は、対象の細胞および遺伝子における突然変異を導入する効率のよい方法であることが見出された。ＭＭＲ活性を阻害する化学物質にさらした細胞のゲノムを不安定化することに加えて、それを一時的に行うことができ、細胞を超突然変異性になるようにし、そして所望の効果（例えば対象遺伝子における突然変異）が得られた後に化学物質にさらすことを取り除く。本発明における使用に適当なＭＭＲ活性を阻害する化学物質には、アントラセン誘導体、非加水分解性ＡＴＰ類似体、ＡＴＰアーゼ阻害剤、ミスマッチ修復タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にアニールするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、およびエキソヌクレアーゼ阻害剤が包含されるが、これらに限定されるものではない。これらの化学物質は、ＭＭＲの不活性化のために突然変異の比率を高め、改変された生化学的性質を有するクローンもしくはサブタイプをもたらすことができる。インビボでＭＭＲを阻害する化合物を同定する方法もまた本明細書に記述する。
【００５５】
ミスマッチ校正とも呼ばれるＭＭＲのプロセスは、細菌からヒトまで多岐にわたる細胞において一群のタンパク質複合体によって行われる（Ｈａｒｆｅ  Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｓ．Ｊｉｎｋｓ−Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（２０００）Ａｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３４：３５９−３９９；Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９５９−１９６０）。ＭＭＲ遺伝子は、そのようなミスマッチ修復複合体のタンパク質の一つをコードする遺伝子である。作用機構のいかなる特定の理論によっても拘束されることを所望するものではないが、ＭＭＲ複合体は、ヌクレオチド塩基の非相補的対合に起因するＤＮＡらせんの歪みを見つけると考えられる。新しいＤＮＡ鎖上の非相補的塩基は切り取られ、そして切り取られた塩基は、古いＤＮＡ鎖に相補的な適切な塩基で置き換えられる。このようにして、細胞は、ＤＮＡ複製における誤りの結果として存在する多数の突然変異を取り除く。
【００５６】
優性ネガティブ対立遺伝子は、同じ細胞における野生型対立遺伝子の存在下でさえＭＭＲ欠損表現型をもたらす。ＭＭＲ遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子の例は、コドン１３４に切断変異を保有するヒト遺伝子ｈＰＭＳ２−１３４（配列番号：２５）である（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）。この突然変異は、この遺伝子の産物を１３４番目のアミノ酸の位置で異常に終結させ、Ｎ末端の１３３アミノ酸（配列番号：２４）を含有する短縮ポリペプチドをもたらす。そのような突然変異は、ＤＮＡ複製後に細胞に蓄積する突然変異の比率の増加を引き起こす。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子の発現は、野生型対立遺伝子の存在下でさえ、ミスマッチ修復活性の減損をもたらす。
【００５７】
ＭＭＲプロセスは、ＡＴＰの非加水分解性形態の使用によって阻害されることが示されている（Ｇａｌｉｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２７：２３２５−２３３１；Ａｌｌｅｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：４４６７−４４７６；Ｂｊｏｒｎｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：３１７６−３１８３）。しかしながら、化学物質が細胞におけるＭＭＲ活性を阻害できることは実証されていない。そのような化学物質は、欠損ＭＭＲ活性に関して細胞をスクリーニングすることによって同定することができる。細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、動物およびヒトからの細胞を欠損ミスマッチ修復に関してスクリーニングすることができる。ＭＭＲ阻害化合物の存在下で増やした細胞もしくは生物体において任意の細胞からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡを野生型配列からの変異に関して分析することができる。様々なスクリーニング技術を用いることができる。超突然変異性細胞、昆虫、真菌、植物もしくは動物を同定することにおける使用のためのそのようなスクリーニングアッセイの適合性は、天然であろうと人工であろうと、それがＭＭＲ阻害剤であるかどうかを決定するために、化合物もしくは化合物の混合物によってもたらされるミスマッチ修復活性を試験することにより評価することができる。
【００５８】
ミスマッチ修復の化学阻害剤が試験されている細胞、微生物、または昆虫、真菌、植物もしくは動物のような全生物体は、超突然変異性になる。これは、そのような細胞もしくは全生物体の自然突然変異率が、そのような処理なしの細胞もしくは動物と比較して高められることを意味する。自然突然変異率の上昇の程度は、通常の細胞もしくは動物のものの少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍もしくは１０００倍であることができる。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、メタンスルホン酸、ジメチルスルホン酸、Ｏ６−メチルベンザジン、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、メチルニトロソ尿素（ＭＮＵ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）などのようなしかしこれらに限定されるものではない化学的突然変異誘発物質の使用は、ＭＭＲ欠損自体のもののさらに１０〜１００倍比率を上げるためにＭＭＲ欠損細胞もしくは全生物体において用いることができる。
【００５９】
本発明の一つの態様によれば、ＭＭＲの化学阻害剤を同定するスクリーニングアッセイを開発し、そして用いる。化合物は、アミノ酸、ステロイド、芳香族もしくは脂質前駆体の多岐にわたるがこれらに限定されるものではない任意の形態もしくは種類であることができる。化合物は天然に存在することができ、もしくは実験室において製造することができる。スクリーニングアッセイは、宿主生物体のゲノム内の改変された内因性反復を探すことのような自然であることができ（図４および５において実証するように）、もしくはＭＭＲ感受性レポーター遺伝子を用いて実験室において行うことができる（図１−３において実証するように）。
【００６０】
化合物は、増殖培地に補足することによって、または微量注入もしくはキャリア化合物を用いることのような、しかしこれらに限定されるものではない細胞内送達によって細胞に導入することができる。
【００６１】
本発明の別の態様によれば、アントラセン類からの化合物をＭＭＲに堪能な細胞もしくは全生物体宿主にさらすことができ、該宿主を増やし、そして新しい生化学的特徴を有する遺伝子的に改変された遺伝子を含有するサブタイプに関してスクリーニングする。
【００６２】
本発明における使用に適当なアントラセン化合物には、式：
【００６３】
【化３】
2005510199.tif 000004
【００６４】
ここで、Ｒ１−Ｒ１０は独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、置換されたアリールオキシ、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、グアニジノ、カルボキシ、アルコール、アミノ酸、スルホネート、スルホン酸アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、アルデヒド基、エステル、エーテル、クラウンエーテル、ケトン、有機硫黄化合物、有機金属基、カルボン酸、有機ケイ素化合物、または１個もしくはそれ以上のアルキル化ヒドロキシル基を場合により含有する炭水化物であり；
ここで、該ヘテロアルキル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールは、酸素、硫黄、金属原子、リン、ケイ素もしくは窒素である少なくとも１個のヘテロ原子を含有し；そして
ここで、該置換されたアルキル、置換されたアルケニル、置換されたアルキニル、置換されたアリール、および置換されたヘテロアリールの該置換基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルキルオキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり；
そしてここで、該アミノ基はアシル基、または１〜３個のアリールもしくは低級アルキル基で場合により置換されていてもよく；
もしくはここで、Ｒ１−Ｒ１０の任意の二つは一緒になってポリエーテルを形成することができ；
もしくはここで、Ｒ１−Ｒ１０の任意の二つはアントラセンコアの介在する炭素原子と一緒になってクラウンエーテルを形成することができる、
を有するアントラセンが包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
本発明の方法はまた、Ｒ５およびＲ６が水素でありそして残りの置換基が上記のとおりである上記の式のアントラセンでＭＭＲを阻害することも包含する。
【００６６】
ある態様として、アントラセン化合物において、Ｒ１−Ｒ１０は独立して水素、ヒドロキシル、アルキル、アリール、アリールアルキルもしくはヒドロキシアルキルである。別の態様として、Ｒ１−Ｒ１０は独立して水素、ヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トリル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピルもしくはヒドロキシブチルである。
【００６７】
本発明の特定の態様として、アントラセンには１，２−ジメチルアントラセン、９，１０−ジメチルアントラセン、７，８−ジメチルアントラセン、９，１０−ジフェニルアントラセン、９，１０−ジヒドロキシメチルアントラセン、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン、ジメチルアントラセン−１，２−ジオール、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン−１，２−ジオール、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン−３，４−ジオール、９，１０−ジ−ｍ−トリアントラセンなどが包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
アントラセンの側鎖のキラル位置は特に限定されず、そして任意のキラル位置および任意のキラル類似体であることができる。アントラセンはまたアントラセンの立体異性体を含んでなることもでき、そして任意の異性の類似体を含む。
【００６９】
宿主の例は、ヒト、霊長類、哺乳動物、げっ歯類、植物、魚類、爬虫類、両生類、昆虫、真菌、酵母もしくは原核生物起源の微生物からの細胞もしくは全生物体であるがこれらに限定されるものではない。
【００７０】
本発明のさらに別の態様は、ＭＭＲに必要とされるＡＴＰアーゼ活性を阻害することができるＡＴＰ類似体の使用である。インビボでＭＭＲを阻害することができる化合物を同定するためにＭＭＲレポーター細胞をＡＴＰ化合物ライブラリーでスクリーニングする。ＭＭＲ活性を阻害することにおいて有用なＡＴＰ類似体の例には、ＡＭＰ−ＰＮＰおよびＡＴＰ［ガンマ］ＳのようなＡＴＰの非加水分解性形態が包含されるが、これらに限定されるものではない（Ｇａｌｉｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２３２５−２３３１；Ａｌｌｅｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：４４６７−４４７６；Ｂｊｏｒｎｓｏｎ  Ｋ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：３１７６−３１８３）。
【００７１】
本発明のさらに別の態様は、ＭＭＲ生化学経路のエキソヌクレアーゼ活性を阻害することができるヌクレアーゼ阻害剤の使用である。インビボでＭＭＲを阻害することができる化合物を同定するためにＭＭＲレポーター細胞をヌクレアーゼ阻害剤化合物ライブラリーでスクリーニングする。ＭＭＲ活性を阻害することにおいて有用なヌクレアーゼ阻害剤の例には、N−エチルマレイミドの類似体、エンドヌクレアーゼ阻害剤（Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１６：４８５）、ヘテロダイマー型アデニン−チェーン−アクリジン化合物、エキソヌクレアーゼＩＩＩ阻害剤（Ｂｅｌｍｏｎｔ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ（２０００）１０：２９３−２９５）、並びにヘリカーゼ阻害活性を有する（Ｃｈｉｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ）（１９９８）５１：４８０−４８６）ヘリキノマイシンのような抗生物質化合物が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
本発明の別の態様は、ミスマッチによりもたらされる修復に必要とされる重合を阻害することができるＤＮＡポリメラーゼ阻害剤の使用である。インビボでＭＭＲを阻害することができる化合物を同定するためにＭＭＲレポーター細胞をＤＮＡポリメラーゼ阻害剤化合物ライブラリーでスクリーニングする。ＭＭＲ活性を阻害することにおいて有用なＤＮＡポリメラーゼ阻害剤の例には、アクチノマイシンＤ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１８５９）、アフィジコリン（Ｋｕｗａｋａｄｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：１９０９）の類似体、１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−ベータ−Ｌ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル（Ｌ−ＦＭＡＵ）（Ｋｕｋｈａｎｏｖａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９８）５５：１１８１−１１８７）、および２’，３’−ジデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（ｄｄＮＴＰｓ）（Ｏｎｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ（１９８４）３８：３８２−３８９）が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
本発明のさらに別の態様として、ミスマッチ修復プロセスの少なくとも一つの機能を破壊するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与する。アンチセンスポリヌクレオチドは、ＭＭＲポリヌクレオチドにハイブリダイズする。全長およびアンチセンスポリヌクレオチドフラグメントの両方が使用に適している。本発明の「アンチセンスポリヌクレオチドフラグメント」には、ＭＭＲをコードするＲＮＡに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（他の既知の分子をコードするヌクレオチドへのＭＭＲをコードするヌクレオチドの配列比較によって決定されるような）が包含されるが、これらに限定されるものではない。ＭＭＲをコードするポリヌクレオチドに実質的に固有である配列の同定は、任意の公的に利用可能な配列データベースの分析によってそして／もしくは任意の市販されている配列比較プログラムで確かめることができる。アンチセンス分子は、化学合成、インビトロ転写反応における発現、アンチセンス分子を生産するように転写されることができるベクターを含んでなる形質転換細胞における発現によって、制限消化および単離によって、ポリメラーゼ連鎖反応によってなどが包含されるがこれらに限定されるものではない任意の手段により作製することができる。
【００７４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはそのフラグメントは、例えば、配列番号：１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７および２９に示すヌクレオチド配列またはそれに相補的もしくは相同な配列を含むことができる。当業者は、本発明が任意のＭＭＲ遺伝子を用いて予測できることを認識する。特に、アンチセンス核酸分子は、少なくとも約１０、１５、２５、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチドまたは全ＭＭＲをコードする配列に相補的な配列を含んでなる。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＭＲをコードする配列のコーディング鎖の約１５個の連続したヌクレオチドに相補的な配列を含んでなる。
一つの態様として、アンチセンス核酸分子は、ＭＭＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「コーディング領域」にアンチセンスである。コーディング鎖はまた、ＭＭＲ配列の調節領域を含むこともできる。「コーディング領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含んでなるヌクレオチド配列の領域をさす（例えば、ヒトＰＭＳ２のタンパク質コーディング領域は、コーディング領域配列番号：１７に相当する）。別の態様として、アンチセンス核酸分子は、ＭＭＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」にアンチセンスである。「非コーディング領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないコーディング領域に隣接する５’および３’配列をさす（すなわち、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）とも呼ばれる）。
【００７５】
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、開始コドン、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー配列などが包含されるがこれらに限定されるものではない、ＭＭＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列の調節領域、もしくはそれに対応するｍＲＮＡに対して向けられる。本明細書に提供するコーディング鎖配列を与えられれば、本発明のアンチセンス核酸をワトソン・クリックもしくはフーグスティーン塩基対合の規則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＭＭＲ  ｍＲＮＡの全コーディング領域に相補的であることができるが、より好ましくは、ＭＭＲ  ｍＲＮＡのコーディングもしくは非コーディング領域の一部のみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＭＲ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的であることができる。アンチセンスオリゴヌクオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０ヌクレオチドの長さであることができる。
【００７６】
スクリーニングは、化合物を細胞もしくは全生物体にさらす任意の方法である。スクリーニングの方法は、全動物、植物、昆虫、微生物を用いるがこれらに限定されるものではなくまたは培養する一つもしくはそれ以上の単離された細胞の懸濁液を用いることによって実施することができる。細胞は、例えば、ヒトもしくは他の霊長類、哺乳動物もしくは他の脊椎動物、無脊椎動物、および原生動物、酵母もしくは細菌のような単細胞生物から単離される細胞を包含する、任意のタイプの真核もしくは原核細胞であることができる。
【００７７】
一般に、スクリーニングは、複数の細胞もしくは単一の細胞の懸濁液を用いて実施するが、単離された細胞を増やしそして利用することができるように十分な割合の処理細胞もしくは組織がさらされる限り他の方法を適用することもできる。化学スクリーニングの技術は、当業者に周知である。利用可能なスクリーニング技術には、細胞に基づくアッセイ、分子アッセイ、および全生物体に基づくアッセイが包含される。細胞においてＭＭＲを阻害することができる作用因子を同定するために本発明のスクリーニングアッセイに化合物を加えることができる。
【００７８】
本発明のスクリーニングアッセイは、一つの細胞、複数の細胞もしくは全生物体を候補化合物と接触させそして次にミスマッチ修復が不都合に影響を受けているかどうかを決定するために試験する系を提供する。ＭＭＲを分析する方法は、ＭＭＲ遺伝子の分子配列の分析、被験体のゲノムにおける内因性反復を分析することが包含されるが、これらに限定されるものではない任意の既知の方法であることができる。さらに、本発明は、細胞にトランスフェクションしたレポーター遺伝子に対する候補作用因子の影響を分析するために都合のよいアッセイを提供する。
【００７９】
本発明の方法によって同定されるＭＭＲ阻害剤は、一つもしくはそれ以上の対象遺伝子における新しい突然変異を作製するために用いることができる。対象遺伝子は、細胞系、微生物もしくは全生物体によって生来プロセシングされる任意の遺伝子であることができる。ＭＭＲを阻害するために組換え技術よりむしろ化学物質を使用する利点は、プロセスがより迅速であることであり；ノックアウトされたＭＭＲ遺伝子を有する安定なクローンもしくは優性ネガティブＭＭＲ遺伝子対立遺伝子を発現するクローンを製造する必要がない。別の利点は、組込まれたノックアウトターゲッティングベクターもしくは優性ネガティブＭＭＲ遺伝子対立遺伝子の安定な発現に関して宿主生物体をスクリーニングする必要がないことである。最後に、いったん細胞、植物もしくは動物をＭＭＲ阻害化合物にさらし、そして新しいアウトプット形質を生成せしめると、化合物の除去によってＭＭＲプロセスを回復させることができる。突然変異は、細胞もしくは全生物体の遺伝子型を分析にすることによって、例えば、対象遺伝子と関連するゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡもしくはアミノ酸の配列を調べることによって検出することができる。突然変異はまた、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）復帰突然変異体のような新しいアウトプット形質に関してスクリーニングすることにより検出することもできる。突然変異体ポリペプチドは、電気泳動移動度の変化、分光学的性質、または突然変異体遺伝子によってコードされるタンパク質の他の物理的もしくは構造的特徴を同定することにより検出することができる。また、単離された形態において、もしくはモデル系において、インサイチューでタンパク質の改変された機能に関してスクリーニングすることもできる。対象遺伝子の機能と関連する細胞、植物もしくは動物の任意の性質の改変に関してスクリーニングすることができる。
【００８０】
ＭＮＮＧ、ＭＮＵおよびＥＭＳのような一般的なＤＮＡ損傷剤と異なりインビボでＭＭＲを阻害することによって遺伝子突然変異を作製することにはいくつかの利点がある。ＭＭＲ欠損を有する細胞は、ＭＮＮＧ、ＭＮＵ、ＥＭＳのようなＤＮＡ損傷剤および電離放射線と異なりそれらの全ゲノムにわたって分散する広範囲の突然変異を有する。別の利点は、ＭＭＲ欠損に起因する突然変異体細胞が本質的に二倍体でありそしてＥＭＳ、ＭＮＵのようなＤＮＡ損傷剤および電離放射線の場合のように染色体の大きいセグメントを失わないことである（Ｈｏｎｍａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．３７４：８９−９８）。この独特な特徴は、わずかな遺伝子変化につながる宿主のゲノムの全体にわたるわずかな変化を可能にし、商業的に重要なアウトプット形質を有する遺伝子的に安定な宿主をもたらす。
【００８１】
本発明はまた、インビボおよびインビトロでＭＭＲを阻害すること並びに遺伝子突然変異の発生率を上げるために化学的突然変異誘発物質に細胞もしくは生物体をさらにさらすことも包含する。
【００８２】
本発明はまた、いったん所望の突然変異体遺伝子型もしくは表現型を生成せしめると、その後に突然変異が安定なゲノムにおいて維持されるように、ミスマッチ修復の阻害剤にさらすことをやめることも包含する。
【００８３】
上記の開示は、本発明を一般的に記述する。さらに完全な理解は、以下の特定の実施例を参照することによって得ることができ、これらは、説明のためにのみ本明細書に提供し、そして本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８４】
実施例１：インビボでミスマッチ修復を不活性化することができる化学物質を同定するための細胞に基づくスクリーニングアッセイの作製
ＭＭＲ欠損の特質は、宿主細胞のゲノムにおける不安定なマイクロサテライト反復の生成である（Ｐｅｉｎａｄｏ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１００６５−１００６９；Ｓｔｒａｎｄ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：２７４−２７６；Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：１２２７−１２３６）。この表現型は、マイクロサテライト不安定性（ＭＩ）と呼ばれる（Ｈａｒｆｅ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓ．Ｊｉｎｋｓ−Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（２０００）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３４：３５９−３９９；Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９５９−１９６０；Ｐｅｉｎａｄｏ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１００６５−１００６９；Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７：６７５−６８４；Ｈｏａｎｇ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３００−３０３；Ｓｔｒａｎｄ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：２７４−２７６）。ＭＩは、宿主細胞の全ゲノムにわたる反復的モノ、ジおよび／もしくはトリヌクレオチド反復配列内の欠失および／もしくは挿入からなる。真核細胞の詳細な遺伝子分析により、ＭＩをもたらすことができる唯一の生化学的欠損は欠損ＭＭＲであることが見出されている（Ｈａｒｆｅ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓ．Ｊｉｎｋｓ−Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（２０００）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３４：３５９−３９９；Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９５９−１９６０；Ｐｅｉｎａｄｏ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１００６５−１００６９；Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７：６７５−６８４；Ｈｏａｎｇ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３００−３０３；Ｓｔｒａｎｄ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：２７４−２７６）。マイクロサテライト不安定性を促進することに対して欠損ＭＭＲが有するこの独特な特徴を考慮して、現在、内因性ＭＩは、宿主細胞内のＭＭＲ活性の欠如を調べるための生化学マーカーとして用いられる（Ｈｏａｎｇ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３００−３０３）。
【００８５】
真核細胞におけるＭＭＲ欠損を検出するために用いる方法は、フレームシフトのためにそのリーディングフレームを壊すコーディング領域内に挿入されたポリヌクレオチド反復を有するレポーター遺伝子を用いることである。ＭＭＲに欠損がある場合、レポーター遺伝子はポリヌクレオチド反復内に無作為な突然変異（すなわち、挿入および／もしくは欠失）を獲得し、オープンリーディングフレームを有するレポーターを含有するクローンを生成せしめる。このレポーター遺伝子は、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、グリーン蛍光タンパク質などのようなしかしこれらに限定されるものではない任意の生化学経路のものであることができる。ＭＭＲ感受性レポーターの概略図を図１に示し、ここで、ポリヌクレオチド反復は、モノ、ジ、トリもしくはテトラヌクレオチドからなることができる。我々は、マウスハイブリドーマ細胞系であるＨ３６細胞におけるＭＭＲ活性を測定するためにβ−ガラクトシダーゼＭＭＲ感受性レポーター遺伝子の使用を用いた。使用するレポーター構築物をｐＣＡＲ−ＯＦと称し、これは、ハイグロマイシン耐性（ＨＹＧ）遺伝子に加えてコーディング領域の５’末端に挿入された２９ｂｐのアウトオブフレームのポリＣＡ領域を有するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。ｐＣＡＲ−ＯＦレポーターは、フレームを回復する突然変異（すなわち、挿入もしくは欠失）がトランスフェクション後に起こらない限り、β−ガラクトシダーゼ活性をもたらすことができない。この系は、不活性化されたＭＭＲに感受性であることが示されており、ここで、優性ネガティブＭＭＲ遺伝子対立遺伝子を用いることにより、この状況はβ−ガラクトシダーゼの生産をもたらすことが見出された（未公開データ）。優性ネガティブＰＭＳ１３４対立遺伝子を用いるこれらのデータの例を表１に示す。簡潔に言えば、以下のプロトコルを用いて二重反復反応においてＰＭＳ１３４対立遺伝子を含有する発現ベクター（ＨＢ１３４と称する）もしくは空ベクターおよびｐＣＡＲ−ＯＦベクターでＨ３６細胞を各々トランスフェクションした。ＰＭＳ１３４遺伝子をｐＥＦ発現ベクターにクローン化し、これは、哺乳動物ポリアデニル化シグナルが続くクローニング部位の上流に伸長因子プロモーターを含有する。このベクターはまた、このプラスミドを保持するものを同定するためにＧ４１８における細胞の選択を可能にするＮＥＯｒ遺伝子も含有する。簡潔に言えば、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってポリリポソームを用いて細胞を１μｇのＰＭＳ１３４もしくは空ベクターでトランスフェクションした。次に、細胞を０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８において１０日間選択し、そしてＧ４１８耐性細胞を遺伝子発現に関して分析するために一緒にプールした。ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットによって決定した（示さない）ＰＭＳ１３４陽性細胞を増やし、そして上記のプロトコルを用いてレポーターとしてハイグロマイシン（ＨＹＧ）耐性遺伝子を含有するｐＣＡＲ−ＯＦレポーター遺伝子でトランスフェクションした。ＭＭＲエフェクターおよびｐＣＡＲ−ＯＦレポータープラスミドの両方を保��する細胞を選択するために細胞を０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８および０．５ｍｇ／ｍｌのＨＹＧにおいて選択した。ｐＣＡＲベクターでトランスフェクションした全ての培養物は、同様な数のＨＹＧ／Ｇ４１８耐性細胞をもたらした。次に、培養物を増やし、そしてインサイチューにおいて並びに細胞抽出物の生化学分析によりβ−ガラクトシダーゼ活性に関して試験した。インサイチュー分析には、１００，０００個の細胞を採取し、そして１％グルタルアルデヒドにおいて固定し、リン酸緩衝食塩水溶液において洗浄し、そして２４ウェルプレートにおいて１ｍｌのＸ−ｇａｌ基質溶液［０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３．３ｍＭ  Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、３．３ｍＭ  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、０．２％  Ｘ−Ｇａｌ］中３７℃で２時間インキュベーションした。反応を５００ｍＭ重炭酸ナトリウム溶液において止め、そして分析のために顕微鏡スライドに移した。ＭＭＲ不活性化を評価するために各２００個の細胞の３視野を青色（β−ガラクトシダーゼ陽性細胞）もしくは白色（β−ガラクトシダーゼ陰性細胞）に関して計数した。表１は、これらの研究からの結果を示す。β−ガラクトシダーゼ陽性細胞はＨ３６空ベクター細胞において認められなかったが、ＨＢ１３４培養物では視野当たり１０％の細胞がβ−ガラクトシダーゼ陽性であった。
表１．ｐＣＡＲ−ＯＦレポーターベクターでトランスフェクションしたＨ３６空ベクターおよびＨＢ１３４細胞のβ−ガラクトシダーゼ発現。細胞をｐＣＡＲ−ＯＦレポータープラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクション細胞をＨＹＧおよびＧ４１８において選択し、増やし、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性（青色に着色した細胞）を測定するためにＸ−ｇａｌ溶液で染色した。各２００個の細胞の３視野を顕微鏡検査によって分析した。以下の結果は、これらの実験の平均＋／−標準偏差を示す。
【００８６】
【表１】
2005510199.tif 000005
【００８７】
以前に記述されているように（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）β−ガラクトシダーゼ活性を測定するために細胞抽出物を用いて生化学アッセイにより培養物をさらに分析することができる。
【００８８】
表１に記述するデータは、ＭＭＲに堪能な細胞宿主のＭＭＲ活性を阻害することによりＭＩをもたらすことができ、そしてｐＣＡＲ−ＯＦベクターにおけるマイクロサテライトの改変が機能性β−ガラクトシダーゼ酵素を生産する細胞をもたらすことを示す。Ｈ３６ｐＣＡＲ−ＯＦ細胞系の使用は、今回、Ｈ３６細胞系のＭＭＲを阻害することができる化学物質をスクリーニングするために用いることができる。
実施例２：ＭＭＲの化学阻害剤を同定するためのスクリーニングアッセイ
本実施例では、実施例１に記述するＨ３６ｐＣＡＲ−ＯＦ細胞系を用いて化学物質ライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。この細胞系は、ＭＭＲを特異的に阻害する化学物質の自動スクリーニングのための９６ウェルマイクロタイタープレートに体裁を整えることができる強く安定な系である。スクリーニング方法の概要を図２に示すが、しかしながら、この方法は本実施例内の仕様に限定されるものではない。簡潔に言えば、全容量０．１ｍｌの増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０に加えて１０％のウシ胎仔血清）中１０，０００個の細胞を任意の様々な化合物を含有する９６ウェルマイクロタイタープレートに加える。細胞を５％ＣＯ２において３７℃で１４−１７日間増やす。次に、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＮａＰＯ４および０．６ｍｇ／ｍｌクロロフェノール−レッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ，Ｒｏｃｈｅ）を含有する５０μｌの溶解バッファーで増殖培地において細胞を溶解させる。反応物を１時間インキュベーションし、５０μｌの０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３の添加によって終結させ、そして５７６ｎｍで分光測光により分析する。
【００８９】
増加したβ−ガラクトシダーゼ活性を有するものを同定するために実験ウェルを未処理もしくは賦形剤処理ウェルと比較する。次に、下記のアッセイを用いて内因性マイクロサテライトを不安定性に関して分析することによりＭＭＲに堪能な宿主におけるＭＩによって決定されるようなＭＭＲを阻害する能力を測定するためにｐＣＡＲ−ＯＦプラスミドを含有する異なる細胞系を用いてＭＭＲ阻害活性をもたらす化合物をさらに分析する。
実施例３：ＭＭＲを阻害する化学物質を特定すること
ＭＭＲの化学阻害剤の同定は、ＭＭＲの阻害によってゲノムの不安定性を誘発するものから標準的な突然変異誘発物質であるものを決定することにおいて困難であり得る。本実施例は、より一般的な突然変異誘発物質からＭＭＲの阻害剤を決定する方法を教示する。いったん化合物が上記のアッセイにおいて同定されると、ＭＭＲに堪能な細胞およびＭＭＲ欠損であるコントロールサブクローンにおける突然変異率をモニターすることにより化合物が一般的な突然変異誘発物質か特異的ＭＭＲ阻害剤かを決定することができる。ＭＭＲ欠損の一つの特徴は、突然変異誘発物質にさらした際に高められた突然変異率を与えるＤＮＡアルキル化剤の毒性に対する増大した耐性である（Ｌｉｕ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９６）５６：５３７５−５３７９）。この独特な特徴は、ＭＭＲ欠損系に対するＭＭＲに堪能な系における突然変異を誘発する化合物の高められた活性を測定するためのＭＭＲに堪能な細胞およびコントロール系の使用を可能にする。化合物がＭＭＲの真の阻害剤である場合、ＭＭＲに堪能な細胞では遺伝子突然変異が起こるはずであり、一方、すでにＭＭＲ欠損の細胞では「高められた」突然変異率は見出されない。これらの規準を用いて、哺乳動物細胞においてフレームシフト突然変異を誘発するＩＣＲ１９１のような化学物質は、すでにＭＭＲ欠損の細胞系において高められた突然変異率をもたらすその能力のためにＭＭＲ阻害化合物とみなされない（Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（２０００）９２：４８０−４８５）。これらのスクリーニング系には、実施例１に記述するもののような優性ネガティブＭＭＲ遺伝子が導入されているものもしくは記述されているように（Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（２０００）９２：４８０−４８５）ＨＣＴ１１６のような生来ＭＭＲ欠損の細胞が相補ＭＭＲ遺伝子の導入によって回復されているものが包含されるがこれらに限定されるものではない。
実施例４：インビボにおけるＭＭＲの化学阻害剤の同定
ＭＭＲは、細胞分裂後に反復配列における点突然変異および挿入／欠失を修復する保存された複製後ＤＮＡ修復機構である。ＭＭＲは、開始複合体認識およびＤＮＡ転座にＡＴＰアーゼ活性を必要とする。インビボアッセイにより、ＡＭＰ−ＰＮＰおよびＡＴＰ［ガンマ］ＳのようなＡＴＰの非加水分解性形態の使用はＭＭＲ活性を阻害することが示されている（Ｇａｌｉｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２３２５−２３３１：Ａｌｌｅｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：４４６７−４４７６；Ｂｊｏｒｎｓｏｎ  Ｋ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：３１７６−３１８３）。
【００９０】
インビボで内因性ＭＭＲを阻害する化学物質の使用は、公知の事実として識別されていない。インビボでＭＭＲを阻害することができる化学物質を同定しようと試みて、我々は、ＭＭＲ欠損のためにのみ引き起こすことができる結果であるマイクロサテライト不安定性およびｐＣＡＲ−ＯＦベクターからのβ−ガラクトシダーゼ活性の回復をもたらすことができる化学物質をスクリーニングするために我々のＨ３６ｐＣＡＲ−ＯＦスクリーニングアッセイを用いた。我々のスクリーニングアッセイにおいて、我々は、ポンタステロン（ｐｏｎｔａｓｔｅｒｏｎｅ）のようなステロイドからＥＭＳのような強力なアルキル化剤まで、キナーゼおよび他の酵素阻害剤まで多岐にわたる様々な種類の化合物を用いた。スクリーニングにより、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞をもたらすことができる一つの種類の化学物質が同定された。これらの分子はアントラセン類から得られた。本願の目的のための一つのそのようなアントラセン誘導体の例は、９，１０−ジメチルアントラセンと呼ばれる分子であり、今後、ＤＭＡと称する。図３は、ｐＣＡＲ−ＯＦレポータープラスミドを変えることにおけるＤＭＡの影響を示す。それに反して、ＥＭＳもしくはＭＮＮＧのような一般的なＤＮＡアルキル化剤は、ＭＩおよび／もしくはｐＣＡＲ−ＯＦレポーターにおけるポリヌクレオチド領域の変化をもたらさなかった。
【００９１】
β−ガラクトシダーゼ活性の相違の最も適当な説明は、ＤＭＡ化合物がＭＭＲ活性を阻害し、ｐＣＡＲ−ＯＦレポーター内のいっそう高い頻度の突然変異をもたらし、そしてＯＲＦを回復するということであった。ＭＭＲが改変されたという仮説を直接試験するために、我々は、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）によって記述されているような個々のクローンでのＭＭＲの生化学アッセイを用いる。核抽出物をクローンから調製し、そして以前に記述されている条件下で／ＣＡ＼挿入−欠失もしくはＧ／Ｔミスマッチのいずれかを含有するヘテロ二本鎖基質とインキュベーションする。／ＣＡ＼およびＧ／Ｔヘテロ二本鎖は、記述されているように（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）それぞれ、３’および５’方向からの修復を試験するために用いる。
ミスマッチ修復の生化学アッセイ
酵素修復アッセイ：
核抽出物におけるＭＭＲ活性は、２４ｆｍｏｌの基質を用いて、記述されているように実施する（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）。相補性アッセイは、１００μｇの核抽出物に〜１００ｎｇの精製されたＭｕｔＬａもしくはＭｕｔＳａ成分を加え、最終ＫＣｌ濃度を１００ｍＭに調整することにより行う（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）。これらの実験に使用する基質は、ミスマッチの１８１ヌクレオチド５’もしくは１２５ヌクレオチド３’に鎖切断を含有する。
生化学活性アッセイ：
ＭＭＲタンパク質に対する小分子の直接的影響を実証するために、ミスマッチ結合およびＭＭＲ複合体形成のような分子アッセイを薬剤の有無で行う。簡潔に言えば、以前に記述されているように（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）Ｔ７プロモーターおよびコザック翻訳シグナルを含有するセンスプライマーと任意の種からの既知のＭＭＲタンパク質ＭＳＨ２（配列番号：２０）、ＧＴＢＰ（配列番号：２６）、ＭＬＨ１（配列番号：２２）、ヒトＰＭＳ２（配列番号：１６）、マウスＰＭＳ２（配列番号：１４）、ＰＭＳ１（配列番号：１８）およびＭＨＳ３（（配列番号：２８）の全コーディング領域を包含するプライマーを用いてＭＭＲ遺伝子ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する。既知のＭＭＲタンパク質のコーディング領域には、マウスＰＭＳ２（配列番号：１５）、ヒトＰＭＳ２（配列番号：１７）、ヒトＰＭＳ１（配列番号：１９）、ヒトＭＳＨ２（配列番号：２１）、ヒトＭＬＨ１（配列番号：２３）およびヒトＭＳＨ３（配列番号：２９）の表３に示す配列が包含される。ＴＮＴ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて生成物を転写しそして翻訳する。ＰＣＲプライマーおよびインビトロ転写−翻訳反応の例を以下に記載する。
インビトロ転写−翻訳：
ｈＰＭＳ２（配列番号：１７）およびｈＭＬＨ１（配列番号：２３）ｃＤＮＡ配列を含有する線状ＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって製造し、インビトロ転写および翻訳のための配列をセンスプライマーに導入した。全長ｈＭＬＨ１フラグメントは、野生型ｈＭＬＨ１  ｃＤＮＡクローンを鋳型として用いて、センスプライマー５’−ｇｇａｔｃｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａｃｃａｃｃａｔｇｔｃｇｔｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇ−３’（配列番号：１）（コドン１−６）およびアンチセンスプライマー５’−ｔａａｇｔｃｔｔａａｇｔｇｃｔａｃｃａａｃ−３’（配列番号：２）（３’非翻訳領域、ｎｔ２４１１−２４３３に位置する）を用いて製造した。全長ｈＰＭＳ２フラグメントは、クローン化されたｈＰＭＳ２  ｃＤＮＡを鋳型として用いて、センスプライマー５’−ｇｇａｔｃｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａｃｃａｃｃａｔｇｇａａｃａａｔｔｇｃｃｔｇｃｇｇ−３’（配列番号：３）（コドン１−６）およびアンチセンスプライマー５’−ａｇｇｔｔａｇｔｇａａｇａｃｔｃｔｇｔｃ−３’（配列番号：４）（３’非翻訳領域、ｎｔ２６７０−２６９０に位置する）を用いて製造した。これらのフラグメントを共役転写−翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってタンパク質を生産するために用いた。反応物に３５Ｓで標識したメチオニンもしくは標識していないメチオニンを補足した。低分子量のバンドは、分解産物および／もしくは代わりの内部メチオニンから翻訳されたポリペプチドであると推測される。
【００９２】
ＭＭＲ阻害剤の影響を調べるために、免疫沈降（ＩＰ）が後に続く、ＴＮＴ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）において生産されるポリペプチドを用いて化合物の有無でＭＬＨ１およびＰＭＳ２の形成を測定するアッセイを用いる。ＩＰを容易にするために、標識をＰＭＳ２タンパク質のＣ末端に置いて抗体結合に用いることができ、もしくはＭＭＲタンパク質自体に向けられる抗体をＩＰに用いることができる。
免疫沈降：
免疫沈降は、４００μｌのＥＢＣバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．５％  ＮＰ４０）において１μｇのＭＬＨ１特異的モノクローナル抗体（ｍＡＢ）ＭＬＨ１４（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、上記のｈＰＭＳ２のコドン２−２０に対して作製したポリクローナル抗体、もしくはｈＰＭＳ２のコドン８４３−８６２に対して作製したポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）と翻訳反応物とを混合することによってインビトロ翻訳タンパク質に対して行う。４℃で１時間インキュベーション後に、プロテインＡセファロース（Ｓｉｇｍａ）を１０％の最終濃度に加え、そして反応物を４℃で１時間インキュベーションする。プロテインＡに結合したタンパク質をＥＢＣにおいて５回洗浄し、そして４−２０％  Ｔｒｉｓ−グリシンゲル上で電気泳動によって分離し、次にこれらを乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーを行う。
【００９３】
ｍｕｔＳもしくはｍｕｔＬタンパク質のヘテロ二量化を阻害する化合物は、今回、このアッセイを用いて同定することができる。
実施例５：化学ＭＭＲ阻害剤の使用は、ヒト細胞においてマイクロサテライト不安定性をもたらす
宿主細胞および生物体におけるＭＭＲの化学阻害剤の広範囲の能力を実証するために、ヒトＨＥＫ２９３細胞（２９３細胞と称する）をＤＭＡで処理し、そしてＢＡＴ２６診断マーカー（Ｈｏａｎｇ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３００−３０３）を用いて内因性遺伝子座のマイクロサテライト不安定性に関して測定した。簡潔に言えば、１０５個の細胞をコントロール培地もしくは無毒であることが判明している濃度の５０μＭのＤＭＡにおいて１４〜１７日間増やした。次に、細胞を採取し、そして塩析法（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：６１６６−６１７６）を用いてゲノムＤＮＡを単離する。
【００９４】
我々のマイクロサテライト試験の感度を決定するためにＨＣＴ１１６（ヒト結腸上皮細胞系）および２９３からの様々な量の試験ＤＮＡを最初に用いた。ＢＡＴ２６対立遺伝子は、これら二つの細胞系間で異種であることが既知であり、そして生成物は異なる分子量に移動する（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ個人的観察）。アッセイの感度のレベルを決定するためにＤＮＡを限界希釈によって希釈した。記述されているような（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０：１９５−２０６）バッファーにおいてＢＡＴ２６Ｆ：５’−ｔｇａｃｔａｃｔｔｔｔｇａｃｔｔｃａｇｃｃ−３’（配列番号：４３）およびＢＡＴ２６Ｒ：５’−ａａｃｃａｔｔｃａａｃａｔｔｔｔｔａａｃｃｃ−３’（配列番号：４４）プライマーを用いてＤＮＡをＰＣＲ増幅した。簡潔に言えば、１ｐｇ〜１００ｎｇのＤＮＡを以下の条件：９４℃３０秒間、５８℃３０秒間、７２℃３０秒間を３０サイクルを用いて増幅した。ＰＣＲ反応物を１２％ポリアクリルアミドＴＢＥゲル（Ｎｏｖｅｘ）もしくは４％アガロースゲル上で電気泳動し、そして臭化エチジウムで染色した。これらの研究により、０．１ｎｇのゲノムＤＮＡが我々の条件を用いる検出の限界であることが見出された。
【００９５】
ＤＭＡの有無で増やした２９３細胞におけるマイクロサテライト安定性を測定するために、ＤＭＡで処理したもしくはコントロールの２９３細胞からの０．１ｎｇのＤＮＡを上記の反応条件を用いて増幅した。マイナー（ｍｉｎｏｒ）対立遺伝子を測定するために各サンプルに対して４０の個々の反応を実施した。図４Ａは、ＤＭＡで処理したおよび未処理の細胞からＢＡＴ２６対立遺伝子を増幅しそして１２％  ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で分析したこれらの研究からの典型的な結果を示す。ＤＭＡで処理した細胞からの対立遺伝子は、野生型対立遺伝子と異なって移動する改変された対立遺伝子（星印）の存在を示した。ＭＩはＭＭＲ欠損細胞宿主においてのみ起こるので、予想されるようにＭＭＲに堪能なコントロール細胞では改変された対立遺伝子は見出されなかった。これらのデータを確認するために、単離されたＢＡＴ２６生成物を用いてＰＣＲを繰り返した。プライマーおよび条件は、反応物を２０サイクルにわたって増幅したことを除いて上記と同じであった。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そしてＴ−尾部（Ｔ−ｔａｉｌｅｄ）ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）に製造業者が勧めるようにクローン化した。ＤＭＡで処理したおよびコントロールの細胞からの組換えクローンをＢＡＴ２６プライマーを用いて再びＰＣＲによってスクリーニングした。生菌のアリコートをＰＣＲミックスに直接加えることによって５０個の細菌コロニーをＢＡＴ２６構造に関して分析した。ＰＣＲ反応を上記のように実施し、そして生成物を４％アガロースゲル上で電気泳動し、そして臭化エチジウムで染色した。図４Ｂに示すように、ＤＭＡで処理した細胞からのマイクロサテライトは、マーカーの長さをコントロール細胞に存在する野生型対立遺伝子より大きくもしくは小さくする改変（星印）を有した。
【００９６】
分子量のこれらの違いは、欠損ＭＭＲの特質であるポリヌクレオチド反復内の変化のためであったことを確かめるために、ＡＢＩ自動シーケンサーを用いてＴ−尾部ベクターバックボーンに位置するＭ１３−Ｒプライマーで各サンプルからの５個のクローンを塩基配列決定した。配列分析により、我々の研究に用いるコントロール細胞クローンは２６ｎｔのポリＡ反復を有するＢＡＴ２６対立遺伝子のホモ接合体であることが明らかになった。ＤＭＡで処理した細胞は、２６のポリＡ反復を有する野生型から短い対立遺伝子（２４のポリＡ反復）および大きい対立遺伝子（２８のポリＡ反復）まで多岐にわたる複数の対立遺伝子を見出した（図５）。
【００９７】
これらのデータは、実施例１および３におけるＨ３６ｐＣＡＲデータを裏付け、そして各種宿主において化学物質でＭＭＲを阻害できることを実証する。
実施例６：ＭＭＲの化学阻害剤は、植物におけるＤＮＡ超突然変異性および新しい表現型をもたらす。
【００９８】
ＭＭＲの化学阻害剤は多様な一連の生物体を越えて働くかどうかを決定するために、我々は、ＭＭＲ欠損、ゲノム改変、および新しいアウトプット形質をもたらすことに対するＤＭＡの影響を調べるための植物モデル系として、カラシ植物科のメンバーであるアラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＡＴ）に対するＤＭＡの活性を調べた。
【００９９】
簡潔に言えば、ＡＴ種子をストレートの市販用漂白剤で殺菌し、そして１００個の種子を増加する量のＤＭＡ（１００μｍ〜５０ｍＭにおよぶ）を有する１００ｍｍムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）植物寒天（ｐｈｙｔａｇａｒ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）プレートにおいて平板培養した。同様の量の種子をＭＳ植物寒天のみの上でもしくはＡＴ種子を突然変異させるために一般に用いられる突然変異誘発物質である（ＭｃＣａｌｌｕｍ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：４５５−４５７）増加する量のＥＭＳ（１００μＭ〜５０ｍＭ）を有するＭＳ植物寒天において平板培養した。プレートを温度制御された、蛍光灯を点灯した給湿装置（パーシヴァルグロースチャンバー（Ｐｅｒｃｉｖａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃｈａｍｂｅｒ））において１０日間生育した。１０日後に、各化合物の毒性レベルを決定するために種子を計数した。表２は、根形成および苗条形成によって決定されるような健康な細胞／処理の数を示す。未処理の種子と同一である苗は、健康と評点した。成長の止まった根もしくは苗条形成を有する種子は、中間（中間）と評点した。発芽しない種子は、死亡と評点した。
【０１００】
【表２】
2005510199.tif 000006
【０１０１】
表２のデータは、ＤＭＡ毒性が１０ｍＭの連続培養で生じ、一方、ＥＭＳでは毒性が２５０μＭで生じることを示す。次に、５０個の種子を２ｍＭ  ＤＭＡ、２５０μＭ  ＥＭＳを含有するかもしくは薬剤を含有しない２枚の１５０ｍｍ皿において平板培養した。種子を１０日間育て、そして次に各プレートからの１０植物を土壌に移した。全ての植物は、色および高さが同様のようであった。植物を１８時間の光および６時間の闇の日周期で室温で育てた。４５日後に長角果から種子を採取し、そしてデシケーターにおいて４℃で７２時間保存する。次に、種子を殺菌し、そして各植物からの１００個の種子を水飽和した土壌に直接まき、そして１８時間の光および６時間の闇の日周期で室温で育てる。１０日目に１１８のＤＭＡ処理のうち７つにおいて表現型的に異なる植物が見出され、一方、１５０のＥＭＳ処理もしくは１５０のコントロール植物において表現型の違いは認められなかった。これらの７つの改変された植物は色が薄緑色であり、そしてゆっくり成長するようであった。図６は、ＤＭＡ改変植物およびコントロール間の典型的な違いを示す。ＤＭＡにさらした植物は、野生型植物においていつも見られる濃緑色と異なり外見上は黄色である子孫をもたらした。さらに、黄色の植物は背も低かった。３０日後に、大部分の野生型植物は花および長角果を生じ、一方、７つの突然変異体はちょうど開花し始めた。４５日後に、コントロール植物を採取し、一方、突然変異体植物はその１０〜１５日後に採取した。そのような影響は、ＥＭＳで処理した植物からの１５０の苗においては認められなかった。
【０１０２】
ＭＭＲに対するＤＭＡの影響を、植物ゲノム内の内因性ポリヌクレオチド反復マーカーの構造をモニターすることによって確かめた。製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従ってＤＮＡｚｏｌ法を用いてＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、ＤＭＡ、ＥＭＳもしくは未処理の植物から２枚の葉を採取し、そしてＤＮＡを抽出した。ＤＮＡは、ＢｉｏＲａｄ分光光度計を用いて光学密度によって定量した。アラビドプシスにおいて、一連のポリＡ（Ａ）ｎ、（ＣＡ）ｎおよび（ＧＡ）ｎマーカーは、アラビドプシスゲノム塩基配列決定プロジェクトの結果として作製されたＤＮＡ配列データのＥＭＢＬおよびＧｅｎＢａｎｋデータベース検索の結果として見出された。記述されているプライマー（Ｂｅｌｌ，Ｃ．Ｊ．ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｅｃｋｅｒ（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９：１３７−１４４）を用いてマイクロサテライト安定性をモニターするために天然に存在する２つのマーカー、ＡＴＨＡＣＳおよびＮｇａ１２８を用いる。ＡＴＨＡＣＳは、一続きの３６個のアデニン反復（Ａ）３６を有し、一方、Ｎｇａ１２８は、１９回繰り返されるジヌクレオチドＡＧ反復（ＡＧ）１９を特徴とし、一方、Ｎｇａ２８０マーカーは、１５個のジヌクレオチドを有するポリＡＧ反復マーカーを含有する。これらのマーカーのＤＭＡによりもたらされる改変をＰＣＲアッセイによって測定する。簡潔に言えば、ゲノムＤＮＡを１−１０ｎｇの植物ゲノムＤＮＡを用いて上記のＰＣＲ反応バッファーにおいて特定のプライマーで増幅する。各マーカーのプライマーを以下に記載する：
ｎｇａ２８０：
ｎｇａ２８０−Ｆ：５’−ＣＴＧＡＴＣＴＣＡＣＧＧＡＣＡＡＴＡＧＴＧＣ−３’（配列番号：５）
ｎｇａ２８０−Ｒ：５’−ＧＧＣＴＣＣＡＴＡＡＡＡＡＧＴＧＣＡＣＣ−３’（配列番号：６）
ｎｇａ１２８：
ｎｇａ１２８−Ｆ：５’−ＧＧＴＣＴＧＴＴＧＡＴＧＴＣＧＴＡＡＧＴＣＧ−３’（配列番号：７）
ｎｇａ１２８−Ｒ：５’−ＡＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＡＧＧＧＡＧＧＧ−３’（配列番号：８）
ＡＴＨＡＣＳ：
ＡＴＨＡＣＳ−Ｆ：５’−ＡＧＡＡＧＴＴＴＡＧＡＣＡＧＧＴＡＣ−３’ （配列番号：９）
ＡＴＨＡＣＳ−Ｒ：５’−ＡＡＡＴＧＴＧＣＡＡＴＴＧＣＣＴＴＣ−３’ （配列番号：１０）
サイクリング条件は、これら２つのマーカーを効率よく増幅することが実証されている条件（個人的観察、Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ）、９４℃１５秒間、５５℃１５秒間そして７２℃３０秒間である。ＰＣＲ産物をＴｒｉｓ−アセテート−ＥＤＴＡバッファーにおいて３．５％メタファー（ｍｅｔａｐｈｏｒ）アガロースゲル上で分析し、続いて臭化エチジウムで染色する。
【０１０３】
植物宿主のＭＭＲのこの生化学活性を実証するために用いる別の方法は、実施例１および図１に記述するものと同様な、ポリヌクレオチド反復によって壊されるレポーター遺伝子の使用による。高い内因性β−ガラクトシダーゼバックグラウンドのために、我々は、開始コドンのすぐ下流に挿入されたモノヌクレオチド反復を有するβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子からなる植物適合性のＭＭＲ感受性レポーター遺伝子を設計した。２つのレポーター構築物を作製した。ｐＧＵＳ−ＯＦは、フレームシフトをもたらす開始メチオニンのすぐ下流に挿入された２０塩基のアデニン反復を含有し、従って、非機能性酵素を生産した。第二のｐＧＵＳ−ＩＦは、オープンリーディングフレームを保持する１９塩基のアデニン反復を含有し、そしてβ−グルクロニダーゼ活性のコントロールの役割を果たした。両方の構築物を、鋳型としてｐＢＩ−１２１ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＰＣＲによって作製した。アンチセンスプライマーは、ｐＢＩ−１２１プラスミド内に含まれるノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）ポリ終結配列の３’末端に向けられ、そしてｐＢＩ−１２１バイナリーベクターバックボーンへのベクターのクローニングを容易にするために唯一のＥｃｏＲＩ制限部位を含有した。センスプライマーは、ｐＢＩ−１２１バイナリーベクターバックボーンへのキメラＧＵＳレポーター遺伝子のクローニングを容易にするために唯一のＢａｍＨＩ制限部位を含有した。各レポーターを作製するために用いるプライマーは：
１．ｐＧＵＳ−ＩＦのセンスプライマー（ｕｉｄＡ−ＡＴＧ−ポリＡ−ＩＦ）：
５’−ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＧＴ  ＣＣＴ  ＧＴＡ  ＧＡＡ  ＡＣＣ−３’（配列番号：１１）
２．ｐＧＵＳ−ＯＦのセンスプライマー（ｕｉｄＡ−ＡＴＧ−ポリＡ−ＯＦ）：
５’−ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＣＧ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  Ｃ−３’（配列番号：１２）
３．アンチセンスプライマー（Ｎｏｓ−ｔｅｒｍ）：
５’−ＣＣＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＴＡＧ  ＡＴＧ−３’（配列番号：１３）
である。
【０１０４】
ＰＣＲ増幅は、上記の反応バッファーを用いて実施した。反応は、鋳型として１ｎｇのｐＢＩ−１２１ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および適切な対応するプライマーを用いて行った。増幅は、９４℃３０秒間、５４℃６０秒間そして７２℃６０秒間で２５サイクルにわたって行った。予想される分子量のＰＣＲ産物をゲル精製し、Ｔ−尾部ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、そして真の配列を裏付けるために以下のプライマーを用いて塩基配列を決定した：ＣａＭＶプロモーターからＧＵＳ  ｃＤＮＡの５’末端への塩基配列決定のためのＣａＭＶ−ＦＯＲＷ．［＝５’−ｇａｔ  ａｔｃ  ｔｃｃ  ａｃｔ  ｇａｃ  ｇｔａ  ａｇ−３’］（配列番号：３０）；ＮＯＳターミネーターの塩基配列決定のためのＮＯＳｐＡ−４２Ｆ［＝５’−ｔｇｔ  ｔｇｃ  ｃｇｇ  ｔｃｔ  ｔｇｃ  ｇａｔ  ｇ−３’］（配列番号：３１）；ＮＯＳターミネーターからＧＵＳ  ｃＤＮＡの３’末端への塩基配列決定のためのＮＯＳｐＡ−Ｃｅｎｄ−Ｒ［＝５’−ｃｃｃ  ｇａｔ  ｃｔａ  ｇｔａ  ａｃａ  ｔａｇ  ａｔｇ−３’］（配列番号：３２）；全長ＧＵＳ  ｃＤＮＡの配列のためのＧＵＳ−６３Ｆ［＝５’−ｃａｇ  ｔｃｔ  ｇｇａ  ｔｃｇ  ｃｇａ  ａａａ  ｃｔｇ−３’］（配列番号：３３）、ＧＵＳ−４４１Ｆ［＝５’−ｇｇｔ  ｇａｔ  ｔａｃ  ｃｇａ  ｃｇａ  ａａａ  ｃｇ−３’］（配列番号：３４）、ＧＵＳ−８２５Ｆ［＝５’−ａｇｔ  ｇａａ  ｇｇｇ  ｃｇａ  ａｃａ  ｇｔｔ  ｃｃ−３’］（配列番号：３５）、ＧＵＳ−１２２４Ｆ［＝５’−ｇａｇ  ｔａｔ  ｔｇｃ  ｃａａ  ｃｇａ  ａｃｃ−３’］（配列番号：３６）、ＧＵＳ−１５９６Ｆ［＝５’−ｇｔａ  ｔｃａ  ｃｃｇ  ｃｇｔ  ｃｔｔ  ｔｇａ  ｔｃ−３’］（配列番号：３７）、ＧＵＳ−２６５Ｒ［＝５’−ｃｇａ  ａａｃ  ｇｃａ  ｇｃａ  ｃｇａ  ｔａｃ  ｇ−３’］（配列番号：３８）、ＧＵＳ−６４６Ｒ［＝５’−ｇｔｔ  ｃａａ  ｃｇｃ  ｔｇａ  ｃａｔ  ｃａｃ  ｃ−３’］（配列番号：３９）、ＧＵＳ−１０３３Ｒ［＝５’−ｃａｔ  ｇｔｔ  ｃａｔ  ｃｔｇ  ｃｃｃ  ａｇｔ  ｃｇ−３’］（配列番号：４０）、ＧＵＳ−１４２５Ｒ［＝５’−ｇｃｔ  ｔｔｇ  ｇａｃ  ａｔａ  ｃｃａ  ｔｃｃ−３’］（配列番号：４１）およびＧＵＳ−１７８３Ｒ［＝５’−ｃａｃ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｔｃａ  ｔｇｃ  ｃａｇ−３’］（配列番号：４２）。ＧＵＳ  ｃＤＮＡのＯＦもしくはＩＦバージョンのいずれにおいても突然変異は見出されず、そして両方のｃＤＮＡの予想されるフレームもまた確かめられた。続いて、ｐＣＲ−ＩＦ−ＧＵＳおよびｐＣＲ−ＯＦ−ＧＵＳプラスミドをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化して、ＮＯＳターミネーターと一緒にＧＵＳ  ｃＤＮＡを含有するＤＮＡフラグメントを生成せしめた。これらのフラグメントを、野生型ＧＵＳ  ｃＤＮＡを取り除くために同じ酵素で切断することによってクローニングのために調製したｐＢＩ−１２１プラスミドのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位に連結した。得られる構築物（ｐＢＩ−ＩＦ−ＧＵＳおよびｐＢＩ−ＯＦ−ＧＵＳ）を次にＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化してＣａＭＶプロモーター、ＩＦもしくはＯＦ  ＧＵＳ  ｃＤＮＡ、およびＮＯＳターミネーターを含むＤＮＡフラグメントを遊離させた。最後に、これらのフラグメントをｐＧＰＴＶ−ＨＰＴバイナリーベクター（ＡＴＣＣ）に存在する対応する制限部位に連結してｐＣＭＶ−ＩＦ−ＧＵＳ−ＨＰＴおよびｐＣＭＶ−ＯＦ−ＧＵＳ−ＨＰＴバイナリーベクターを得た。
【０１０５】
得られるベクター、ＣＭＶ−ＯＦ−ＧＵＳ−ＨＰＴおよびＣＭＶ−ＩＦ−ＧＵＳ−ＨＰＴは、今回、ＮＯＳターミネーターおよびポリアデニル化シグナルが後に続くＧＵＳ遺伝子を動かすカリフラワーモザイク３５ＳウイルスからのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含有する（図７）。さらに、このベクターはまた、このレポーターを含有する植物を選択するために用いる選択可能なマーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子も含有する。
ＧＵＳレポーターを発現するアラビドプシス・サリアナトランスジェニック植物の作製
植物にバイナリー発現ベクターを往復させるためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細菌を用いる。β−グルクロニダーゼを発現するアラビドプシス・サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）植物を作製するために、当業者が既知である方法を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞（株ＧＶ３１０１）をＣＭＶ−ＯＦ−ＧＵＳ−ＨＰＴもしくはＣＭＶ−ＩＦ−ＧＵＳ−ＨＰＴバイナリーベクターで電気穿孔した。簡潔に言えば、５％ショ糖、０．０５％シルウェット（ｓｉｌｗｅｔ）およびバイナリーベクターで形質転換したアグロバクテリウム細胞を含有する溶液に１０秒間浸すことによって一ヶ月齢のアラビドプシス・サリアナ（生態型コロンビア）植物を感染させた。次に、これらの植物を１６時間の昼および８時間の闇の光周期下で２５℃で育てた。４週後に、種子（Ｔ１と称する）を採取し、そして５日間乾燥させた。ＣＭＶ−ＯＦ−ＧＵＳ−ＨＰＴもしくはＣＭＶ−ＩＦ−ＧＵＳ−ＨＰＴで形質転換した１０植物からの３０，０００個の種子を２０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（ＨＹＧ）の存在下で固体ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地プレートにまいた。３００の植物がＨＹＧ耐性であることが見出され、そしてＧＵＳを発現する植物に相当した。これらの植物を３００のコントロール植物と一緒にＭＳ培地において２週間育て、そして次に土壌に移した。植物を標準的な条件下でさらに４週間育て、この時点でＴ２種子を採取した。
【０１０６】
植物ゲノムにおけるＧＵＳベクターの組込みおよび安定性を確かめるために、遺伝子分離およびＰＣＲ分析を行った。一般に、アグロバクテリウム技術によって形質転換した４つのＴ１植物のうち３つは、単一の遺伝子座内に挿入されたベクターを保有すると予想され、それ故、組込まれた遺伝子に関してヘテロ接合体であると考えられる。Ｔ１植物の大部分から生じる種子（Ｔ２）の約７５％はＨＹＧ耐性であると見出され、そしてこれは、自家受粉条件において、それぞれ、ヌル（ＧＵＳを含有しない植物）、ヘテロ接合体、およびホモ接合体植物の予想される１：２：１の比率と一致した。これらの植物がＧＵＳ発現ベクターを含有したことを確かめるために、上記のようなＤＮＡｚｏｌによる技術を用いてＴ１植物の葉からゲノムＤＮＡを単離した。ＧＵＳベクターの存在を確かめるために１ｎｇのゲノムＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって分析した。ＰＣＲは、上記のプライマーを用いて以下のパラメーター：９５℃３０秒間；５４℃１分間；そして７２℃２分間で２５サイクルにわたって実施した。陽性反応は、ＣＭＶ−ＯＦ−ＧＵＳ−ＨＰＴおよびＣＭＶ−ＩＦ−ＧＵＳ−ＨＰＴで形質転換した植物からのＤＮＡにおいて認められ、そしてコントロール（未感染）植物からは認められなかった。
【０１０７】
Ｔ１植物におけるＧＵＳの発現を評価するために、Ｔ１植物から葉組織を集め、ガラス乳棒を用いて液体窒素において均質化し、そしてＲＬＴ溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ，ＲＮｅａｓｙ植物ＲＮＡ抽出キット）に懸濁した。５μｇの全ＲＮＡを製造業者の勧めるプロトコルに従って精製し、そして次に１．２％アガロースゲル（１ｘ  ＭＯＰＳバッファー、３％ホルムアルデヒド）上に載せ、電気泳動によってサイズ分画し、そしてＮ−Ｈｙｂｏｎｄ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に移した。製造業者の使用法に従って、ＰＣＲ増幅によって作製した１００ｎｇのＧＵＳ、チューブリンもしくはＨＹＧプローブを含有する１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（Ｎｏｒｔｈ２Ｓｏｕｔｈラベリングキット，Ｐｉｅｒｃｅ）中５５℃で各膜をインキュベーションした。膜を５５℃で２ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにおいて３回、そして周囲温度で２ｘＳＳＣにおいて３回洗浄した。検出は、増幅化学発光（ＥＣＬ）を用いて行った。ＧＵＳメッセージは、分析した１０のトランスジェニック系統のうち３つにおいて検出され、一方、コントロール植物ではシグナルは見出されなかった。総合的に、これらの研究は、ＧＵＳを発現するトランスジェニックアラビドプシス・サリアナ植物の作製を実証した。
【０１０８】
宿主植物におけるＭＭＲ活性の状態を決定するために、β−ｇｌｕ活性に関して植物葉もしくは根をインサイチューで染色することによって機能性β−グルクロニダーゼの生産を測定することができる。簡潔に言えば、植物組織を水で２回洗浄し、そして４ｍｌの０．０２％グルタルアルデヒドにおいて１５分間固定する。次に、組織を水ですすぎ、そしてＸ−ｇｌｕ溶液［０．１Ｍ  ＮａＰＯ４，２．５ｍＭ  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６，２．５ｍＭ  Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ＧＬＵ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドナトリウム塩）（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）］中３７℃で６時間インキュベーションする。次に、組織をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液において２回、７０％エタノールにおいて１回洗浄し、そして葉緑素を取り除くために８時間メタノール：アセトン（３：１）において４時間インキュベーションする。次に、組織をＰＢＳにおいて２回洗浄し、そして５０％グリセロールを有するＰＢＳにおいて保存する。機能性ＧＵＳ活性を有する植物組織は青色に染まる。
【０１０９】
ＣＭＶ−ＩＦ−ＧＵＳ−ＨＰＴ植物におけるＧＵＳ活性の存在は、ポリＡ反復のインフレームのＮ末端挿入がＧＵＳタンパク質機能を壊さないことを示す。ＤＭＡ、ＥＭＳで処理するかもしくは未処理のＣＭＶ−ＯＦ−ＧＵＳ−ＨＰＴ植物を、これらの植物がＧＵＳ活性をもたらすかどうかを決定するために試験する。ＤＭＡで処理した植物におけるＧＵＳ活性の存在は、ポリＡ反復が改変され、その結果、フレームを回復する突然変異をもたらすことを示す。アルキル化によりＤＮＡに損傷を与えることが既知であるＥＭＳのような作用因子は、ポリヌクレオチド反復の安定性に影響を及ぼすことができない。このデータは、植物が、ＭＩを引き起こすことが既知である唯一のプロセス、ＭＭＲに欠損があることを示す。
【０１１０】
これらのデータは、標準的なＤＮＡ損傷剤を用いては可能でない高度の遺伝子改変をもたらすためにＭＭＲの化学阻害剤を用いることの有用性および能力を実証する。さらに、本願は、植物宿主のＭＭＲ活性をモニターするための植物におけるＧＵＳ−ＯＦのようなレポーター遺伝子の使用を教示する。
実施例７：化学ＭＭＲ阻害剤の使用は、微生物におけるマイクロサテライト不安定性をもたらす。
【０１１１】
広範囲の宿主においてＭＭＲを阻害する化学阻害剤の能力を実証するために、実施例５に記述するものと同様のｐＧＵＳ−ＯＦレポーター系を含有するピチア（Ｐｉｃｈｉａ）酵母の使用を用いた。簡潔に言えば、タンパク質のＮ末端にポリＡ反復を含有するＧＵＳ−ＯＦおよびＧＵＳ−ＩＦ遺伝子をｐＣＲ−ＩＦ−ＧＵＳおよびｐＣＲ−ＯＦ−ＧＵＳプラスミドから選択可能なマーカーとしてゼオシン耐性遺伝子を含有する構成的に発現される酵母ベクターであるｐＧＰベクターのＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。ｐＧＰ−ＧＵＳ−ＩＦおよびｐＧＰ−ＧＵＳ−ＯＦベクターを当業者が既知である標準的な方法を用いてコンピテントピチア細胞に電気穿孔した。１００μｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤ寒天（１０ｇ／Ｌ酵母エキス；２０ｇ／Ｌペプトン；２％グルコース；１．５％バクト寒天（ｂａｃｔｏａｇａｒ））プレート上で細胞を平板培養した。次に、１００μｇ／ｍｌのゼオシンに加えて１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇｌｕ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−グルクロニドナトリウム塩）を含有するＹＰＤ寒天プレート上でレプリカ培養することにより組換え酵母をＧＵＳ発現／機能に関して分析し、そして３０℃で１６時間増殖させる。ＧＵＳ−ＩＦを発現する酵母の１００％上で、Ｘ−ｇｌｕ基質の存在下で青色に変わることが見いだされ、一方、コントロール酵母はいずれも青色に変わらなかった。ＧＵＳ−ＯＦを含有する酵母はいずれも、通常の増殖条件下でＸ−ｇｌｕ基質の存在下で青色に変わらなかった。
【０１１２】
酵母においてＭＭＲを阻害する化学物質の能力を実証するために、ＧＵＳ−ＯＦおよびコントロール細胞を３００μＭのＤＭＡ、ＥＭＳと、もしくは化学物質なしに４８時間インキュベーションした。インキュベーション後に、酵母をＹＰＤ−ＺＥＯ−Ｘ−ＧＬＵプレート上で平板培養し、そして３０℃で１６時間増殖させた。インキュベーション後に、ＧＵＳ−ＯＦを発現する酵母の小集団は青色のサブクローンを含有し、一方、ＥＭＳもしくはコントロール細胞では何も認められない。これらのデータは、新しいアウトプット形質を有するサブクローンをもたらすようにインビボで微生物のＭＭＲを阻害する化学物質の能力を実証する。
実施例８：インビボでＭＭＲを阻害することができる他の化学物質の種類
アントラセン化合物の発見は、インビボで宿主生物体のＭＭＲ活性を阻害する新しい方法を提示する。９，１０−ジメチルアントラセン（ＤＭＡ）は、細胞宿主においてＭＭＲを阻害することが見出されたが、この種類からの同様の化学組成を有する他の類似体もまた本発明において請求する。これらには、アントラセン並びに９，１０−ジフェニルアントラセンおよび９，１０−ジ−Ｍ−トリルアントラセンのような関連類似体が包含される。Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５１：１４４１−１４４５）は、高濃度で、ＤＭＡは有力な弱い突然変異誘発物質として働き、一方、ＤＭＡの代謝された形態は突然変異を促進することにおいて「有効な」成分であることを開示した。この発見は、アントラセンに基づく化合物の代謝産物もまたインビボでＭＭＲの有効な阻害剤として働き得ることを示唆する。例えば、ミクロコッカス種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）およびバチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）微生物によるアントラセンおよび９，１０−ジメチルアントラセンの代謝により、多数のアントラセンおよび９，１０−ジメチルアントラセン代謝産物が形成されることが見出されている。これらには、アントラセン並びに９，１０−ジメチルアントラセンシス−ジヒドロジオール、ヒドロキシ−メチル誘導体および様々なフェノール化合物が包含される。細菌は、哺乳動物のシトクロムＰ−４５０モノオキシゲナーゼと異なるジオキシゲナーゼ酵素系を用いて炭化水素を代謝する。これらの発見は、さらなるＭＭＲ阻害化合物のためのアントラセンおよびＤＭＡを生体内変化させる細菌の使用を示唆する（Ｔｒａｃｚｅｗｓｋａ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｃｔａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｏｌ．４０：２３５−２４１）。ラット肝臓ミクロソーム調製物によるＤＭＡの代謝研究により、この分子は９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン（９−ＯＨＭｅＭＡ）および９，１０−ジヒドロキシメチル−アントラセン（９，１０−ＤｉＯＨＭｅＡ）に転化されることが見出されている（Ｌａｍｐａｒｃｚｙｋ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ５：１４０５−１４１０）。さらに、ＤＭＡのトランス−１，２−ジヒドロ−１，２−ジヒドロキシ誘導体（ＤＭＡ１，２−ジオール）は、クロマトグラフィー、紫外線（ＵＶ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および質量スペクトル性質によって決定する場合に主要な代謝産物であることが見いだされた。ＤＭＡ１，２−ジオールはまた、アスコルビン酸−硫酸鉄−ＥＤＴＡ系におけるＤＭＡの酸化によっても生じた。代謝によりＤＭＡから形成される他のジヒドロジオールは、９−ＯＨＭｅＭＡのトランス−１，２−および３，４−ジヒドロジオール（９−ＯＨＭｅＭＡ１，２−ジオールおよび９−ＯＨＭｅＭＡ３，４−ジオール）であり、一方、ＤＭＡ１，２−ジオールのさらなる代謝はこれらのジヒドロジオールの両方をもたらすことができる。最後に、９−ＯＨＭｅＭＡがさらに代謝されると、２種の主要な代謝産物が形成され；一方は９，１０−ＤｉＯＨＭｅＡと��定され、そしてもう一方は９−ＯＨＭｅＭＡ３，４−ジオールであるようであった。
【０１１３】
真菌による９−メチルアントラセン（９−ＭＡ）、９−ヒドロキシメチルアントラセン（９−ＯＨＭＡ）および９，１０−ジメチルアントラセン（９，１０−ＤＭＡ）の代謝もまた報告されている（Ｃｅｒｎｉｇｌｉａ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：６６１−６６８）。これらの化合物もまた、ＭＭＲを阻害することができるＤＭＡ誘導体を生成せしめるために有用である。化合物９−ＭＡおよび９，１０−ＤＭＡは二つの経路によって代謝され、一方はメチル基（１個もしくは複数）の初期ヒドロキシル化を含み、そしてもう一方は、１，２−および３，４−芳香族二重結合位置のエポキシ化を含み、その後に酵素的水和が続いてヒドロキシメチルトランス−ジヒドロジオールを生成せしめる。９−ＭＡ代謝では、同定される主要な代謝産物は、９−ＭＡおよび９−ＯＨＭＡのトランス−１，２−ジヒドロ−１，２−ジヒドロキシおよびトランス−３，４−ジヒドロ−３，４−ジヒドロキシ誘導体であり、それにより９−ＯＨＭＡはトランス−１，２−および３，４−ジヒドロジオール誘導体にさらに代謝されることができる。円偏光二色性スペクトル分析により、各ジヒドロジオールの主要な鏡像異性体は、哺乳動物の酵素系によって形成されるトランス−ジヒドロジオールの主にＲ，Ｒの立体配置と異なり、主にＳ，Ｓの立体配置であることが明らかになった。これらの結果は、セノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）が、ラット肝臓ミクロソームに報告されるものと異なる非常に立体選択的な方法でメチル化アントラセンを代謝することを示す。
【０１１４】
上記のような類似体は、ＭＭＲ阻害を引き出すことができるアントラセン誘導化合物の例を提供するが、これらに限定されるものではない。ＭＭＲを阻害することに潜在的に有用なさらなる類似体を図８に示す。
インビボでＭＭＲを阻害することができる低分子量化合物の他の種類
ＭＭＲは、ミスマッチ塩基もしくは改変された反復配列を見つけ、そして突然変異体塩基を分解しそして正しいヌクレオチドでＤＮＡを修復する酵素とこれらの突然変異とを連結するタンパク質複合体の形成を伴う多段階プロセスである。第一に、ミスマッチＤＮＡは、ＭＳＨ２およびＧＴＢＰタンパク質からなるｍｕｔＳへテロ二量体複合体によって認識される。次に、ＤＮＡに結合したｍｕｔＳ複合体は、ＰＭＳ２およびＭＬＨ１タンパク質からなるｍｕｔＬへテロ二量体複合体によって認識される。ｍｕｔＬ複合体は、ミスマッチＤＮＡ部位とエキソヌクレアーゼとを連結し、このようにして、この特殊化したＤＮＡ修復プロセスを開始すると考えられる。ミスマッチ塩基が取り除かれた後、ＤＮＡはポリメラーゼで修復される。
【０１１５】
ＭＭＲを阻害するために低分子量化合物によって標的とすることができる通常のプロセスにおけるいくつかの工程がある。本願は、これらの工程およびこのプロセスを阻害するために用いることができる化合物のタイプを教示する。
ＡＴＰアーゼ阻害剤：
ＡＴＰの非加水分解性形態はインビトロでＭＭＲを抑制することができるという発見もまた、このタイプの化合物の使用がインビボにおけるＭＭＲの阻害および宿主生物体のゲノムの変異変異をもたらすことができることを示唆する（Ｇａｌｉｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２３２５−２３３１；Ａｌｌｅｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：４４６７−４４７６；Ｂｊｏｒｎｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：３１７６−３１８３）。インビボでミスマッチ修復のＡＴＰ依存性工程を阻害するＡＴＰ類似体を同定するために本願内に記述する様々なスクリーニング方法を用いることができる。
ヌクレアーゼ阻害剤：
ミスマッチ塩基の除去は、有効なＭＭＲに必要とされる工程である（Ｈａｒｆｅ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓ．Ｊｉｎｋｓ−Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（２０００）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３４：３５９−３９９）。これは、この工程を阻害することができる化合物がインビボにおけるＭＭＲの阻害および宿主生物体のゲノムの突然変異をもたらすことができることを示唆する。インビボでミスマッチ修復のヌクレアーゼ工程を阻害するヌクレアーゼ阻害剤類似体を同定するために本願内に記述する様々なスクリーニング方法を用いることができる。ヌクレアーゼ阻害剤のタイプの例は、Ｎ−エチルマレイミドの類似体、エンドヌクレアーゼ阻害剤（Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１６：４８５）、ヘテロダイマー型アデニン−チェーン−アクリジン化合物、エキソヌクレアーゼＩＩＩ阻害剤（Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ（２０００）１０：２９３−２９５）、並びにヘリカーゼ阻害活性を有する（Ｃｈｉｎｏ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ）（１９９８）５１：４８０−４８６）ヘリキノマイシンのような抗生物質化合物であるが、これらに限定されるものではない。
ポリメラーゼ阻害剤：
短いおよび長いパッチ修復は、有効なＭＭＲに必要とされる工程である（Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９５９−１９６０）。これは、ＭＭＲに関連する重合を阻害することができる化合物がインビボにおけるＭＭＲの阻害および宿主生物体のゲノムの突然変異をもたらすことができることを示唆する。インビボでミスマッチ修復の重合工程を阻害するポリメラーゼ阻害剤類似体を同定するために本願内に記述する様々なスクリーニング方法を用いることができる。ＭＭＲ活性を阻害することにおいて有用なＤＮＡポリメラーゼ阻害剤の例には、アクチノマイシンＤ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１８５９）、アフィジコリン（Ｋｕｗａｋａｄｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：１９０９）の類似体、１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−ベータ−Ｌ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル（Ｌ−ＦＭＡＵ）（Ｋｕｋｈａｎｏｖａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９８）５５：１１８１−１１８７）、および２’，３’―ジデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（ｄｄＮＴＰｓ）（Ｏｎｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ（１９８４）３８：３８２−３８９）が包含されるが、これらに限定されるものではない。
ミスマッチ修復遺伝子発現の化学阻害剤
ＭＭＲは、ｍｕｔＳ相同物、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＧＴＢＰ；ｍｕｔＬ相同物、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＬＨ１；並びにＭｕｔＨおよびＭｕｔＹのようなエキソヌクレアーゼおよびヘリカーゼのようなしかしこれらに限定されるものではないいくつかのタンパク質の協調を必要とする複数タンパク質プロセスである（Ｈａｒｆｅ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓ．Ｊｉｎｋｓ−Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（２０００）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３４：３５９−３９９；Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９５９−１９６０）。これらの遺伝子の発現を阻害することができる化学物質は、ＭＭＲの阻害をもたらすことができる。ＭＭＲ遺伝子発現を阻害することができる化学物質の例は、Ｃｈａｕｈａｎ  ＤＰ，ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２０００）６：３８２７−３８３１）によって記述されているようなＭＭＲ遺伝子メッセージおよびタンパク質生産に特異的に結合しそして壊すことができるオリゴデオキシヌクレオチドである。インビボでＭＭＲ遺伝子の発現および／もしくは機能を阻害する阻害剤を同定するために本願内に記述する様々なスクリーニング方法を用いることができる。
説明
本明細書に記述する結果は、遺伝子突然変異をもたらすためのインビボで宿主生物体のミスマッチ修復を阻害することができる化学物質の使用を実証する。これらの結果はまた、宿主生物体のＭＭＲを阻害することができる化学物質をスクリーニングすることに有用な宿主細胞および生物体におけるレポーター系の使用も実証する。さらに、これらの結果は、新しいアウトプット形質を有する生物体を製造するための哺乳動物細胞、微生物および植物におけるＭＭＲを阻害する化学阻害剤の使用を実証する。本明細書に提示するデータは、化学物質でＭＭＲを阻害することによって商業用途のためのアウトプット形質を有する遺伝子的に改変された植物、微生物および哺乳動物細胞を製造する新規な方法を提供する。この方法は、ＭＭＲを阻害するためにもしくは外来遺伝子の発現によって新しいアウトプット形質をもたらすために組換え技術の使用を必要とするものより優れた利点を与える。
【０１１６】
この方法は、農業、化学薬品製造、製薬、および環境用途のために遺伝子的に改変された宿主生物体を製造することにおいて有用である。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
【表４】
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【０１１９】
【表５】
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【０１２０】
【表６】
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【０１２１】
【表７】
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【０１２２】
【表８】
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【０１２３】
【表９】
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【０１２４】
【表１０】
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【０１２５】
【表１１】
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【０１２６】
本明細書に引用する各参考文献は、その全部が引用することにより本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】ミスマッチ修復（ＭＭＲ）感受性レポーター遺伝子の図を示す。
【図２】ＭＭＲを阻害する化学物質を同定するスクリーニング方法を示す。
【図３】インビボでＭＭＲを阻害しそしてｐＣＡＲ−ＯＦベクターを遺伝子的に改変する小化学物質の同定を示す。
【図４】ＭＭＲの化学阻害剤によって誘発されるヒト細胞における内因性マイクロサテライトの変化を示す。
【図５】改変された反復を有するＭＭＲの化学阻害剤で処理した細胞からのマイクロサテライトの配列分析を示す。
【図６】ＭＭＲの化学阻害剤を用いる新しい表現型を有する宿主生物体の作製を示す。
【図７】植物用のＭＭＲ感受性レポーター遺伝子の概略図を示す。
【図８】インビボにおけるＭＭＲの阻害剤である先導化合物の誘導体を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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