(57)【要約】血小板含有血液試料を安定化するのに特に望ましい安定化試薬組成物は、多種のホルムアルデヒド−アンモニウム複合体を生成させる試薬；少なくとも１つのホスファターゼ酵素活性阻害剤；及び少なくとも１つのプロテアーゼ酵素活性阻害剤、を含んで成る。血液試料及び他の組織は、この組成物によって安定化される。そのような安定化された試料は、当該試料を当該組成物と接触させることにより前記組織を安定化するための方法によって製造される。そのような安定化試薬の有効性を評価するための方法も本発明に含まれる。
2005536550.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化試薬組成物であって：
（ａ）多種のホルムアルデヒド−アンモニウム複合体を生成する反応物；
（ｂ）少なくとも１つのホスファターゼ酵素活性阻害剤；及び
（ｃ）少なくとも１つのプロテアーゼ酵素活性阻害剤、
を含んで成る組成物。
【請求項２】
血液試料が前記組成物で処理されてから少なくとも２４時間当該血液試料中の血小板上でのＣＤ６２ｐの発現を安定化させる能力を特徴とする、請求項１に記載の試薬組成物。
【請求項３】
前記血液試料が更に抗凝固剤又は凝固経路阻害剤を含む、請求項２に記載の試薬組成物。
【請求項４】
前記抗凝固剤又は阻害剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩、ヘパリン、フッ化ナトリウム及びヒルジン、並びにそれらの混合物から成る群から選択される、請求項３に記載の試薬組成物。
【請求項５】
前記複合体が、（ａ）ヘキサメチレンテトラミン、（ｂ）メチレンイミン、（ｃ）メチロール；（ｄ）ヘミヘキサミン、（ｅ）メチレンが架橋したアミノ、アミド及びグアニジル基を含むシクロトリメチレントリアミン；並びに（ｅ）細胞表面上のポリペプチド鎖又はタンパク質をメチレン架橋で架橋する複合体、並びに（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の組み合わせ、から成る群から選択される、請求項１に記載の試薬組成物。
【請求項６】
前記反応物が１〜４個の炭素原子の脂肪族アルデヒド及びアンモニウム塩溶液を含んで成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記反応物がホルムアルデヒド及びアンモニウム塩溶液を含んで成る、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記反応物がパラホルムアルデヒド及びアンモニウム塩溶液を含んで成る、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記反応物が、加水分解時にホルムアルデヒドを生成させる化合物及びアンモニウム塩溶液を含んで成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記化合物がエチレンオキシド又はプロピレンオキシドから成る群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記アンモニウム塩が、二塩基性のクエン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、フッ化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、過硫酸アンモニウム、スルファミン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、乳酸アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、チオシアン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、及び前記アンモニウム塩のうちのいずれかの組み合わせ、から成る群から選択される、請求項１に記載の試薬組成物。
【請求項１２】
前記プロテアーゼ阻害剤が、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、フッ化４−（２−アミノエチル）ベンジンスルホニル塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、抗トロンビン血漿タンパク質、ＡＰＭＳＦ、４−アミジノフェニルメタンスルホニル−フルオリド−ＨＣｌ（ＡＰＭＳＦ）、アプロチニン、ジイソプロピルホスホロフルオリダート（ＤＦＰ）、α−トルエンスルホニルフルオリド、アンチパイン、キモスタチン、ロイペプチン、Ｌ−１−クロロ−３−［４−トシル−アミド］−７−アミノ−２−ヘプタノン−ＨＣｌ（ＴＬＣＫ）、Ｌ−１−クロロ−３−［４−トシルアミド］−４−フェニル−２−ブタノン−ＨＣｌ（ＴＰＣＫ）、Ｅ−６４、アマスタチン、ベスタチン、ジプロチン、ＥＤＴＡ、ペプスタチン、及びそれらの組み合わせ、から成る群から選択される、請求項１に記載の試薬組成物。
【請求項１３】
前記ホスファターゼ阻害剤が、ピロリン酸塩、マイクロシスチンＬＡ、マイクロシスチンＬＲ、テトラミソール、Ｌ−４−ブロモテトラミソール、タウトマイシン(tautomycin)、オカダ酸、カリクリン、スリシフェリル−２３−アセテート、カンタリジン、バナジウム塩、オルトバナジン酸ナトリウム、酒石酸塩、フロリジン、モリブデン酸塩、イミダゾール、及びそれらの組み合わせ、から成る群から選択される、請求項１に記載の試薬組成物。
【請求項１４】
ｐＨ４．５〜８．０内に前記組成物のｐＨ範囲を調節するために無機性塩基性塩を更に含んで成る、請求項１に記載の試薬組成物。
【請求項１５】
ｐＨ４．５〜８．０内に前記組成物のｐＨ範囲を調節するために有機性塩基性塩を更に含んで成る、請求項１に記載の試薬組成物。
【請求項１６】
０．０１〜１Ｍの間のモル濃度を特徴とする、請求項１に記載の試薬組成物。
【請求項１７】
生理学的ｐＨを提供し、且つ前記組成物の安定化機能に有害に作用しない緩衝液を更に含んで成る、請求項１に記載の試薬。
【請求項１８】
前記緩衝液が：リン酸緩衝液、等張食塩水、トリス緩衝液、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−イミノ二酢酸、ピロリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、炭酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びそれらの組み合わせ、から成る群から選択される、請求項１７に記載の試薬。
【請求項１９】
２４時間後の前記安定化試料中の血小板上でのＣＤ６２ｐの前記の安定化された発現が、前記組成物の不在下で身体から回収された直後に測定される場合に前記血液試料中で見られるであろうＣＤ６２ｐポジティブ血小板数の±２０％である、請求項５に記載の試薬組成物。
【請求項２０】
前記試料が、前記処理後少なくとも２４時間前記試料中の血小板上でのＣＤ６２ｐの安定化された発現を特徴とし、前記の処理された試料が、前記試料が身体からの回収直後に処理無しで測定される場合に前記血液試料中で見られるであろうＣＤ６２ｐポジティブ血小板数の±２０％を維持する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物で処理された血小板含有安定化血液試料。
【請求項２１】
血小板含有血液試料中の血液細胞を安定化する方法であって：
前記試料を請求項１〜１９のいずれか１項に記載の試薬組成物と接触させる段階を含んで成り；前記試料中の細胞が、前記処理後少なくとも２４時間の、前記試料中の血小板上でのＣＤ６２ｐの安定化された発現を特徴とし、前記の処理された試料が、前記試料が身体から回収された直後に処理無しで測定される場合に前記血液試料中で見られるであろうＣＤ６２ｐポジティブ血小板数の±２０％を維持する、方法。
【請求項２２】
前記接触段階前にカルシウムキレート化抗凝固剤又は凝固経路阻害剤中に血液試料を引き込む段階を更に含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料と、血小板の物理的及び／又は酵素的変化並びにＣＤ６２ｐ発現の関連した増大を引き起こすことにより細胞応答を活性化させることが知られている活性化材料と接触させることにより血小板の活性化能を測定する段階；
前記試料を２０〜２５℃で７２時間貯蔵する段階；及び
前記試料中の血小板上でのＣＤ６２ｐの発現の変化を、前記試薬組成物で処理されていない試料中の血小板上でのＣＤ６２ｐの発現と比較して決定する段階、を更に含んで成り、前記の試薬で処理された試料中のＣＤ６２ｐ抗原を発現している血小板のパーセンテージが、同じ期間貯蔵された未処理試料中のパーセンテージより低い、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記活性化材料がホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）溶液である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＭＡが前記試料中０．００１〜５μＭの終濃度へと添加される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
安定化を示すＣＤ６２ｐ血小板のパーセンテージの前記変化が、フローサイトメトリーにより、式：
（パラメーターＣ−パラメーターＡ）＞（パラメーターＤ−パラメーターＢ）
に従い測定され、
ここで、パラメーターＡは、安定化試薬組成物を含まない、抗凝固処理された血液試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージであり；
パラメーターＢは、安定化試薬組成物と一緒に１時間インキュベートされた、抗凝固処理された血液試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージであり；
パラメーターＣは、前記ＰＭＡが０．００１μＭ〜５μＭの濃度へと添加され、且つ最大１時間インキュベートされている、安定化試薬組成物を含まない抗凝固処理された血液試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージであり；そして
パラメーターＤは、前記ＰＭＡが０．００１μＭ〜５μＭの濃度へと添加され、且つ最大１時間インキュベートされている、安定化試薬を含む抗凝固処理された血液試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
安定化試薬を含む血液中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージが、前記ＰＭＡの添加から最初の１時間２０％超変化しない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）第一の別個の成分として、液体又は粉末形態の１〜４個の炭素原子の脂肪族アルデヒド又は加水分解時にホルムアルデヒドを生成させる反応物；
（ｂ）第二の別個の成分として、アンモニウム塩溶液を含んで成る溶液、ここで、前記成分は、前記組成物の安定化機能に有害に作用しない生理学的ｐＨを有する；
（ｃ）少なくとも１つのホスファターゼ酵素活性阻害剤；
（ｄ）少なくとも１つのプロテアーゼ酵素活性阻害剤；及び
（ｅ）身体から回収してすぐの血小板含有血液試料と前記混合物を接触させる前に、前記成分（ａ）〜（ｄ）を混合するための説明書、
を含んで成るキット。
【請求項２９】
前記阻害剤（ｃ）が（ｂ）のアンモニウム塩溶液の一部として提供される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記阻害剤（ｄ）が（ｂ）のアンモニウム塩溶液の一部として提供される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
前記阻害剤（ｃ）が、成分（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）と異なる別個の成分として提供される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３２】
前記阻害剤（ｄ）が、成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）と異なる別個の成分として提供される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３３】
前記阻害剤（ｃ）及び（ｄ）が、成分（ａ）及び（ｂ）と異なる別個の成分の組み合わせで提供される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３４】
前記成分（ａ）が１％ホルムアルデヒド水溶液である、請求項２８に記載のキット。
【請求項３５】
前記成分（ｂ）が緩衝液を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３６】
血小板モノクローナル抗体−色素接合体を更に含んで成る、請求項２８に記載のキット。
【請求項３７】
血小板上のＣＤ６２ｐ抗原発現の測定を実施するための説明書及び試薬を更に含んで成る、請求項２８に記載のキット。
【請求項３８】
以下の、試料を含むのに適した容器、活性化した血小板の正常又は疾患に特有の値の適当なコントロール又は表；抗凝固剤又は凝固経路阻害剤、フローサイトメトリー解析の実施に適したモノクローナル抗体及びマーカー、並びにそれらの組み合わせ；前記試料にとって適当な希釈剤及び緩衝液、使い捨てのグローブ、除染用説明書、塗布用スティック又は容器、並びに試料調製カップ、から成る群から選択される追加の成分のうちの少なくとも１つを更に含んで成る、請求項２８に記載のキット。
【請求項３９】
血液細胞安定化試薬の有効性を評価するための方法であって：
（ａ）細胞安定化試薬組成物で処理した血液試料を、血小板の物理的／酵素的変化を引き起こすことによって細胞応答を活性化する活性化材料と接触させることにより血小板の活性化を測定する段階；
（ｂ）前記試料を２０〜２５℃で７２時間貯蔵する段階；及び
（ｃ）前記試料中の血小板上のＣＤ６２ｐ発現の変化を、前記安定化試薬組成物で処理されてない試料中の血小板上のＣＤ６２ｐの発現と比較して決定する段階、を含んで成り、前記の試薬で処理された試料中のＣＤ６２ｐ抗原を発現する血小板のパーセンテージが、同じ期間貯蔵された未処理試料中のパーセンテージより低い、方法。
【請求項４０】
前記細胞安定化試薬組成物が：
（ａ）多種のホルムアルデヒド−アンモニウム複合体を生成させる反応物；
（ｂ）少なくとも１つのホスファターゼ酵素活性阻害剤；及び
（ｃ）少なくとも１つのプロテアーゼ酵素活性阻害剤、
を含んで成る、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記活性化材料がホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）溶液である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＰＭＡが前記試料中０．００１〜５μＭの終濃度へと添加される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記血液試料が抗凝固剤又は凝固経路阻害剤で処理される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
安定化を示すＣＤ６２ｐ血小板のパーセンテージの前記変化が、フローサイトメトリーにより、式：
（パラメーターＣ−パラメーターＡ）＞（パラメーターＤ−パラメーターＢ）
に従い測定され、
ここで、パラメーターＡは、安定化試薬組成物を含まない、抗凝固処理された血液試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージであり；
パラメーターＢは、安定化試薬組成物と一緒に１時間インキュベートされた、抗凝固処理された血液試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージであり；
パラメーターＣは、前記ＰＭＡが０．００１μＭ〜５μＭの濃度へと添加され、且つ最大１時間インキュベートされている、安定化試薬組成物を含まない抗凝固処理された血液試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージであり；そして
パラメーターＤは、前記ＰＭＡが０．００１μＭ〜５μＭの濃度へと添加され、且つ最大１時間インキュベートされている、安定化試薬を含む抗凝固処理された血液試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージの差異が、式パラメーターＤ−パラメーターＢによって表される場合に、前記ＰＭＡの添加から最初の１時間以内に決定したその値の２０％未満である、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
細胞及び生物学的組織は、概して、体内でそれらの構造、機能、抗原の構成(makeup)及び化学成分を維持している。しかしながら、一旦身体の自然環境から取り除かれると、細胞及び組織は、これらの観点で急激な変化を受け始める。従って、身体から採取された細胞及び生物学的組織の完全性の保存及び保持は、医療の分野において、特に血液保存及び臓器移植の分野において継続されている挑戦である。
【背景技術】
【０００２】
循環している全血及び血液細胞は、身体の環境の中で維持される場合、通常極めて安定であり、そうでない場合には、小さな損傷でさえもが悲惨な影響を起こしうる。例えば、全血が身体から採取される場合、周囲の環境は、温度、ｐＨ、及び酸素レベルのようなパラメーターがすぐに変化する。体内の液体（血漿）及び細胞成分は、温度に応じて変化し、そして、例えば容器内に引き込まれた場合、外部の表面と接触する。通常、血液の血漿部分は、凝固順序の開始及びその後の血液凝固により環境条件下でのそのような変化に対応する。血液細胞、特に環境変化に対し最も活動的に応答する生理学的役割を有するものは、当該環境変化に応じて幾つかの必須な物理学的構成要素及び完全性を失う。血液中で最も感受性のある細胞因子は、組織の損傷及び外来の材料に直ちに応答する機能の短命な血液細胞、例えば顆粒球及び血小板である。
【０００３】
そのような細胞成分のin vivoでの状態は、モノクローナル抗体の使用によって決定した場合、しばしば細胞の抗原発現で表される。これらの抗原は造血細胞上に存在するクラスター分類抗原（ＣＤ）である。これらのＣＤ抗原の細胞上での出現又は不在は、細胞の同定、特徴付け及び多数の他の臨床的に有用な応用の基本である。細胞の変化は、（１）その膜を通過する過程、受容体結合又は表面接触、（２）細胞内に取り込まれ、そして酵素変化を引き起こす化学物質、例えば有毒な化学物質に対する曝露、（３）温度の低下又は増大のような物理的現象、を媒介する場合、種々の細胞酵素、例えばホスファターゼ、プロテアーゼ、オキシダーゼ、カルボキシラーゼ等の活性化によって通常開始される。身体からの採取時に血液細胞内に生じる細胞の変化は、活性化細胞の外観として通常表され、例えばしばしばモノクローナル抗体の使用で見られる。従って、血液のin vivoでの状態は、身体から採取した場合に維持されていない。
【０００４】
身体から抜き取られたときに迅速に変化する血液のこの傾向は、細胞分析及び治験研究のような分野において、そして特に病状の診断及びモニタリングにしばしば必要とされる血液分析において問題であることが証明されている。例えば、血液細胞上の活性化関連抗原の存在が生物学的なin vivoでの過程の幾つかの側面又は試料を得る当該in vitroでの過程によって引き起こされる人為的結果のいずれかに起因するものであるか否かを知ることは重要である。正確な研究及び診断の場合、血液及び組織を、最良なものがその組織のin vivoでの状態を表し、身体の環境からの採取、例えば容器又は試験管内への回収によって生じる変化を表さないように貯蔵し、且つ保存することが重要である。
【０００５】
身体からの採取時の全血の変化を防ぐための１つの古典的な手段には、保存料の使用がある。凝固順序の阻害は、常用の抗凝固保存料の主要な目的であった。血液分析のためのこれらの抗凝固剤の古典的な目的は、血液細胞が染色及び試験のためにスライドガラス上に据えることができるように血液を凝固させないことであった。前世紀において、これらの抗凝固剤は、細胞の幾つかの物理的特徴、例えばサイズ及び形状の維持における使用に適用された。しかしながら、保存剤は細胞の生存可能性を維持するが、それにも関わらずそれらは血液採取過程の刺激に応じた細胞の変化を許してしまう。従って、抗凝固剤の使用は、血漿が凝固するのを防ぐが、細胞因子において生じる変化を必ずしも防がない。最も一般的な抗凝固の基本は、直接的に、又は多数の酵素的な過程に必要とされるカルシウムイオンの除去を介しての、凝固酵素の阻害である。従って、血液細胞は、抗凝固処理血液中でさえも、身体から採取されてから時間とともに変化し、そして分析される場合、ドナーの血液のin vivoの状態を表さないことがある。抗凝固は、種々の物質、例えばクエン酸塩又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によるカルシウムイオンの結合又はキレート化によって最もよく達成されてきた。抗凝固の他の伝統的な方法は、回収された血液に、ヘパリン又はフッ化ナトリウム又はヒルジンのような凝固順序の天然の酵素阻害剤を添加することを伴っていた。そのような抗凝固剤又は保存料は、液体状態で血液を維持し、そして培養のために生存可能な細胞を単離するために一般に使用されるものであるが、典型的なin vivoでの状態で細胞抗原を維持するために設計されていない。細胞が抗凝固剤中で維持されるほど、細胞は抗凝固剤の効果及び保存の効果に起因して変化する。
【０００６】
血液及び組織の保存のための別のアプローチには、「固定」溶液、例えばホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドの使用があり、これらはタンパク質と反応して架橋し、それらを変性させて不溶性にする。この過程の変化は、脱水アルコール、ピクリン酸、水銀化合物、タンニン酸及び多数の他の化合物の使用に伴い生じる。これらの歴史的な過程は、皮製品の製造過程の変化であり、タンパク質の構造を修復不可能なほどに変化させる。確定したタンパク質構造に依存する抗原の構造（エピトープ）は通常破壊されており、そしてエピトープ特異的モノクローナル抗体と反応する相当の能力も同様である。低濃度であっても、これらの固定剤は、膜の完全性の喪失及び赤血球の溶解から表面活性抗原のアップレギュレーションに及ぶ細胞の変化を生じさせる。
【０００７】
従来技術において使用される血液及び組織の保存方法において、全血は赤血球を溶解させるために塩化アンモニウム組成物で処理される。酵素阻害剤が添加され、そして細胞がパラホルムアルデヒドで固定化される。保存された白血球が分離されることにより、細胞の抗原性を維持するＢｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒのＩｍｍｕｎｏ−Ｔｒｏｌ（商標）の細胞制御製品が製造される。しかしながら、パラホルムアルデヒドによる全血の固定は血小板を活性化させる。
【０００８】
自動細胞分析装置、例えばフローサイトメトリーの出現、及びモノクローナル抗体の発明により、細胞上での特異的細胞マーカーの同定及び細胞属性及びそれらの疾患に対する影響が、疾患の医学的診断及びその結果としての治療の重要な構成要素となっている。しかしながら、細胞の分析はここ数年で大きく変化したが、血液の保存の性質はほとんど変化していない。
【０００９】
例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２００２／００２８５１７号は、ＥＤＴＡ保存した試料中の血小板の数を、これから血小板アゴニスト、例えばコラーゲン、ＡＣＰ、エピネフリン及びリストセチン溶液を用いてＥＤＴＡの不在下で活性化された第二試料中の血小板の数を引いて比較し、そしてこの差異を血小板活性の指標として用いることによって血小板活性を決定するための電子インピーダンス細胞カウント技術を用いる方法を言及している。
【００１０】
同様に、米国特許第５，４８６，４７７号は、細胞膜透過性を固定することなく血液細胞を安定化させる血液希釈剤を言及しており、これは０．０１％〜０．１５％の濃度範囲のホルムアルデヒド、有機性緩衝液、水、並びに塩化ナトリウム及び硫酸ナトリウムを、ｐＨを調節する塩基と一緒に含むものである。この開示では、多くの添加物が白血球膜透過性を妨害しうるので、血液細胞の安定化を達成し、そして抗微生物剤として機能するのに追加の試薬は必要ないことが述べられている。
【００１１】
米国特許第５，４５９，０７３号は、ホルムアルデヒド自体ではなくホルムアルデヒド供与体、例えばジアゾリジニルウレア、イミダゾリジニルウレア、ジメチロール−５，５−ジメチルヒダントイン、ジメチロールウレア等を利用する低毒性の固定剤を言及している。
【００１２】
米国特許第６，１９７，５４０号及び第６，１９７，５３９号は、安定化した血液組成物及び血液試料から白血球を分離処理し、熟成した遷移金属溶液で当該白血球を処理し、そして前記血液試料中に当該処理白血球を再び戻すことを包含する方法、を言及している。
【００１３】
血液試料及び血液の細胞成分を安定化させる更に他の取り組みは変化している。例えば、米国特許第５，５１６，６９５号は、非第４級アンモニウム塩、１〜４Ｃの脂肪族アルデヒド、界面活性剤、例えばサポニン、非リン酸緩衝液、例えば酢酸緩衝液、及び水を含む全血の解析のための多試薬系を言及している。この試薬系は、同時にＲＢＣを溶解させてＷＢＣを固定し、一方でＷＢＣ膜及び表面抗原を保存する。
【００１４】
当業界には、身体からの採取の際に血液及び組織を安定化させるための方法及び組成物について、細胞の活性化及び環境変化に対する応答を、細胞の抗原構成を変化させることなく予防し、そして／あるいは低下させることの必要性が尚ある。当業界には、ドナーから抜き取られた血液のin vivoの表示における既存の抗凝固剤及び保存料を超える改善を提供することの必要性が尚ある。
【００１５】
本発明の要約
本発明は、生物学的細胞及び組織、特に血小板を含む血液試料を安定化させるための方法及び組成物を提供する。この方法及び組成物は、細胞の活性化及び環境の変化に対する応答を、細胞の抗原構成を変化させることなく予防し、そして／あるいは低下させる。この方法のある側面において、以下の実施例は本発明のモデル系としての血小板関連抗原の安定化及び保存を証明している。しかしながら、本明細書に記載の方法及び組成物はまた、他の生物学的細胞及び組織の完全性を維持するのに有用である。
【００１６】
ある側面において、本発明は、血液細胞の安定化、更に具体的には、血小板活性化の安定化における使用のための安定化試薬組成物を提供する。当該組成物は、多種のホルムアルデヒド−アンモニウム複合体を生成させる試薬；少なくとも１つのホスファターゼ酵素活性阻害剤；及び少なくとも１つのプロテアーゼ酵素活性阻害剤、を含む。
【００１７】
別の側面において、本発明は、本明細書に記載の安定化試薬組成物で処理した血小板を含む安定化血液試料を提供する。当該処理試料は、身体から回収してすぐに測定された未処理血液試料中で見られる血小板活性化と実質的に同じ状態を特徴とする。安定化剤の存在は、in vitroの環境条件による試料中の血小板の回収後の活性を予防する。未処理のままである場合、あるいは従来の他の安定化剤で処理した場合、活性化した血小板のパーセンテージは、前記の条件に起因して時間とともに増大する。前記試薬で処理した試料中の血小板上でのＣＤ６２ｐのこの安定化した発現は、前記処理から少なくとも２４時間維持される。１つの態様において、当該安定発現は、処理した試料中における、試料が身体からの回収直後に処理無しで測定される場合の血液試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板数の±２０％の存在として測定される。換言すると、血液試料中の前記安定化剤の存在は、血小板の活性化状態を安定化し、その結果、安定化した血液試料中のＣＤ６２ｐ血小板の存在が、回収してすぐに測定された血液試料中のＣＤ６２ｐ血小板のパーセンテージからわずかに２０％増大する。処理した試料が、身体から試料を回収した後に測定されたある時期の未処理の試料と比較した場合、処理試料は、未処理試料ほどＣＤ６２ｐを発現しない。
【００１８】
更なる側面において、本発明は、血小板を含む血液試料中の血液細胞を安定化させる方法を提供する。当該方法は、前記試料と本明細書に記載の試薬組成物とを接触させることを包含し；ここで、前記試料中の細胞は上述のように特徴付けられる。１つの態様において、前記試料はまた、前記安定化試薬組成物での処理の前に抗凝固剤又は凝固経路阻害剤で処理されうる。
【００１９】
更に別の側面において、本発明は、特に、液体又は粉末形態の１〜４個の炭素原子の脂肪族アルデヒド又は加水分解時にホルムアルデヒドを生成させる反応物を含んで成る第一の別個の成分； アンモニウム塩溶液、少なくとも１つのホスファターゼ酵素活性阻害剤を含んで成る第二の別個の成分；ここで、当該第二成分は当該組成物の安定化機能に有害に作用しない生理学的ｐＨを有する；及び身体から回収してすぐの血小板含有血液試料と混合物を接触させる前に、第一成分と第二成分とを混合するための説明書、を含むキットを提供する。
【００２０】
更に別の側面において、本発明は、血液細胞安定化試薬の有効性を評価するための方法を提供する。この方法は、本明細書に記載の細胞安定化試薬組成物で処理した血液試料を、血小板の物理的及び／又は酵素的変化を引き起こすことにより細胞応答を活性化させる活性化材料と接触させ；当該試料を２０〜２５℃で１〜７２時間貯蔵し；そして処理試料中の血小板上のＣＤ６２ｐの発現の変化を、前記試薬組成物で処理されていないが同じ時間貯蔵された試料中の血小板上のＣＤ６２ｐの発現と比較して決定すること、によって血小板の活性化を測定することを含む。細胞安定化試薬で処理した試料中のＣＤ６２ｐ抗原を発現している血小板のパーセンテージは、同じ時間貯蔵された未処理試料中のパーセンテージよりも低い。
【００２１】
本発明の他の側面及び利点は、それらの好ましい態様の以下の詳細な説明において更に説明する。
【００２２】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、安定化試薬組成物及び当該組成物を含むキット、並びに当該組成物を用いて生物学的組織を安定化させるための方法、を提供する。用語「生物学的組織」は、本明細書で使用する場合、全血、抹消血、血液の細胞成分を含む血液画分、血漿、並びに、血小板及び／又は他の血液細胞を含む、希釈して分離した、又は他の方法で操作した血液試料（例えば、細胞含有緩衝液のような溶液）、血小板含有培養物、他の血液細胞を含有する溶液又は培養物、及び他の非血液組織を含む溶液又は培養物、例えば尿、唾液、滑液、脳脊髄液若しくは他の流動分泌物を包含することが意図される。用語「組織」は、限定しないが、骨髄及びリンパ節、並びに他の組織試料を含むことがある。あるいは、当該試料は細胞系であってもよい。
【００２３】
血液試料又は画分又は他の血小板含有組織を安定化するために使用する場合、本発明の組成物及び方法は、血液又は血小板のドナーから血液又は血小板を回収するときに存在するものと実質的に同一の活性化状態で血小板活性を保存する。「血小板の活性化状態」又は「活性化能(activation potential)」とは、本明細書で使用する場合、ＣＤ６２ｐ抗原を発現する血小板のパーセンテージ、すなわち、フローサイトメトリーで実施した場合にＣＤ６２ｐ蛍光標識抗体に結合する血小板、又は試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージを意味する。ＣＤ６２ｐ抗原は、巨核球、血小板、及び内皮細胞分泌顆粒に特有の糖タンパク質抗原を表す。この抗原は、活性化した場合の血小板表面にのみ存在する。ＣＤ６２ｐ抗原の発現は、ＣＤ６２ｐが迅速に内部移行し、そしてすぐにリソソーム内で分解されるため、一過性である。
【００２４】
通常、「健康」な人において、血液試料は、身体から回収した瞬間にほとんど又は全くＣＤ６２ｐ血小板を含まない。in vitroでの環境条件、例えば温度、雰囲気圧、時間、夾雑物等は、回収された血液試料に、当該試料中のＣＤ６２ｐ血小板のパーセンテージを増大させることによって血小板を活性化させるようもたらす。従って、未処理の血液試料又は従来技術の組成物及び方法で安定化された血液試料は、未処理試料中の回収の際すぐに測定したＣＤ６２ｐ血小板のパーセンテージである、「基線」を超すＣＤ６２ｐ血小板のパーセンテージの増大を時間とともに示す。
【００２５】
不健康な人の血液試料は、身体から回収された瞬間に、非常に活性化されうる(hyper-activatable)血小板又は高いパーセンテージのＣＤ６２ｐ血小板を含むことがある。従って、不健康な人の基線は、高いパーセンテージのＣＤ６２ｐ血小板であってもよい。そのような人の血液試料は、時間とともに、in vitroで、細胞の抗原がin vitroでの環境条件に起因して減少するにつれＣＤ６２ｐ血小板のパーセンテージの低下を示す傾向がある。
【００２６】
本発明の組成物及び方法は、ドナーの回収された血液中の、ＣＤ６２ｐ血小板のパーセンテージを少なくとも２４時間安定化させる。本発明により処理された血液試料中のこのパーセンテージは、試験されたドナーの基線におけるＣＤ６２ｐ血小板のパーセンテージと実質的に同様である。「実質的に同様」とは、本発明により処理された血液試料中のＣＤ６２ｐ血小板のパーセンテージが、わずかに約１０〜３０％、好ましくはわずかに約２０％ドナーの基線のものと異なることを意味する。当該血液試料のこの安定化は、その結果評価前に貯蔵される血液試料中のＣＤ６２ｐ血小板のパーセンテージに基づいた疾患の正確な診断を可能にする。従って、健康なドナーの場合、本発明の方法及び組成物は、in vitroでの環境条件に起因する不当に高くない血小板の活性化状態を提供することによって、血液試料の評価を可能にする。不健康なドナーの場合、本発明の方法及び組成物は、in vitroでの環境条件に起因する不当に低くない血小板活性化状態を提供することによって血液試料の評価を可能にする。
【００２７】
本発明の方法及び組成物の他の利点を下文で考察する。
【００２８】
Ｉ．本発明の安定化試薬組成物
本発明の安定化試薬組成物は、以下の必須成分、すなわち、ホルムアルデヒド−アンモニウム複合体の多数の反応種を生成させる反応物；少なくとも１つのホスファターゼ酵素活性阻害剤；及び少なくとも１つのプロテアーゼ酵素活性阻害剤、によって特徴付けられる。当該試薬に導入されうる任意な成分には、緩衝液、保存料、塩、糖、界面活性剤、及びプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤以外の酵素阻害剤、が含まれる。
【００２９】
多種のホルムアルデヒド−アンモニウム複合体を生成させる反応物には、１〜４個の炭素原子の脂肪族アルデヒド及びアンモニウム塩溶液を含む。相互作用時に、これらの反応物は、生物学的組織の安定化に寄与する多数の複合体又は化学反応種を形成する。１つの態様において、当該種のうちの１つはヘキサメチレンテトラミンである。別の態様において、当該種のうちの１つはメチレンイミンである。更に別の態様において、化学反応複合体のうちの１つは、メチロールによって形成される。別の態様において、多数の化学反応種のうちの１つはヘミヘキサミンである。別の態様において、当該反応種のうちの１つは、メチレンが架橋したアミノ、アミド及び／又はグアニジル基を含むシクロトリメチレントリアミンである。反応時に存在する更に別の複合体は、細胞表面上のポリペプチド鎖又はタンパク質をメチレン基で架橋する複合体である。本発明の反応物は、これらの複合体のうちの幾つか又はそれらの組み合わせを形成しうる。アルデヒドとアンモニウムイオンとの反応によって形成される更に他の複合体には、K. H. Gustavson, "The Chemistry of Tanning Processes", Academic Press, Inc. , New York (1956) at pp. 244-282; J. R. Dahlgran and M. N.Jameson, 1988J. Assoc. Off. Anal. Chem., 71 (3): 560-563; N. M. Martyak and B. McDuffie, 1991 Trans. Inst. Metal Finish, 69 (2): 63-65; H. Puchtler and S. N. Meloan, 1985 Histochem., 82 : 201-204;及びJ. F. Walker, "Formaldehyde" Reinhold Publg. Corp. , New York 1944において論じられている複合体を含むことがあり、これらは引用によって本明細書に組み入れられる。下文の実施例１において生成され、論じられているＮＭＲデータも参照のこと。
【００３０】
望ましくは、１〜４個の炭素の脂肪族アルデヒド反応物は、ホルムアルデヒドガスを液体、例えば水の中で泡立てることによって、又はホルムアルデヒドを重合化して粉末パラホルムアルデヒドを形成させ、そしてそれを溶液中に供することによって形成されうる。あるいは、それは加水分解時にホルムアルデヒドを生成させる化合物、例えばエチレンオキシド、プロピレンオキシド又はブチレンオキシドであってもよい。上文の引用文献は、ホルマリンを含む、前記化合物からのホルムアルデヒド又は同等のアルデヒドの産生に関する更なる技術を提示している。
【００３１】
１つの態様において、１〜４Ｃの脂肪族アルデヒドは、パラホルムアルデヒド又はホルムアルデヒドの、当該アルデヒドが例えば重量体積当たり（グラム／１００ｍｌ）液体中に約０．０２〜１．０％ｗ／ｖの濃度で存在する水溶液である。別の態様において、当該アルデヒドは、最大約０．８％ｗ／ｖの濃度で存在する。この敵対は、望ましくは水又は緩衝液である。化学反応種又は複合体が不安定であるか、又は最大約１４日間しか安定でないことがあるので、この反応物を別々の成分として調製し、そしてそれを第二の反応物とほぼ使用時に混合するのが望ましい場合がある。
【００３２】
本発明の試薬組成物は、更に第二反応物としてアンモニウム塩を含んで成る。以下の実施例において、二塩基性クエン酸アンモニウムがその抗凝固特性及び性能特性のために応答曲面統計モデルに従い選択されたが、当該データは、他のアンモニウム塩が所望の複合体を形成する反応物として利用されうることを示した。従って、当該塩は、二塩基性のクエン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、フッ化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、過硫酸アンモニウム、スルファミン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、乳酸アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、チオシアン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、及びこれらのアンモニウム塩のうちのいずれかの組み合わせ、から成る群から選択されることがある。例えば、種々のアンモニウム塩が同じモル濃度で使用され、そして更に表５Ａ、５Ｂ及び６に記載された性能特性を維持された図１２Ａ及び図１２Ｂを参照のこと。
【００３３】
更に、アンモニウム塩の選択は、赤血球（ＲＢＣ）の溶解無しに全血を安定化させる安定化試薬を作り出すために操作され得る。例えば、安定化試薬の１つの態様において約６．５〜７．３の範囲内の生理学的ｐＨの維持を可能にする、安定化試薬におけるクエン酸アンモニウム又は硫酸アンモニウム塩の使用は、当該安定化試薬の使用によってＲＢＣの溶解を回避させる。あるいは、アンモニウム塩の適切な選択及びモル濃度は、ＲＢＣの溶解を生じさせ、そして更に血小板の抗原発現を保存することがある。当該安定化試薬における塩化アンモニウム、フッ化アンモニウム、シュウ酸アンモニウム又は硝酸アンモニウム塩の使用は、当該試薬のこの態様の使用によってＲＢＣの溶解をもたらすことを可能にし、更に血小板の抗原発現の保存を可能にする。従って、本発明における使用のためのアンモニウムイオン塩反応物の選択は、安定化剤の所望の性能に依存してなされ、そしてそれ故にこの試薬は、生物学的組織又は、全血に加え、血小板を含有する材料若しくは溶液の安定化のために有用である。アンモニウムイオン塩は、望ましくは本発明の安定化試薬組成物において約０．１Ｍ〜１．４Ｍの濃度で存在する。その範囲内での所望のモル濃度の選択は、本明細書で提示する技術を前提とすると、当業界の技術の範囲内である。
【００３４】
前記試薬組成物はまた、１又は複数のプロテアーゼ阻害剤を含む。望ましくは、当該組成物は、多数のそのような阻害剤を含む。本発明の安定化試薬組成物における使用のためのプロテアーゼ阻害剤の非排他的なリストには、セリンプロテアーゼ阻害剤、例えば、２３０．７の分子量を有し、且つプロテアーゼ活性部位の触媒活性を阻害するフッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）；血液凝固カスケードにおいてトロンビン及び他のセリンプロテアーゼを阻害する抗トロンビン血漿タンパク質（６０，０００ＭＷ）；又はトリプシン様セリンプロテアーゼの不可逆阻害剤４−アミジノフェニルメタンスルホニル−フルオリド−ＨＣｌ（ＡＰＭＳＦ、３５２．７ＭＷ）が含まれうる。更に他のセリンプロテアーゼには、セリンプロテアーゼの活性部位に強固に結合して当該酵素を阻害するアプロチニン（６５００ＭＷ）；セリンプロテアーゼ及びアセチルコリンエステラーゼの非常に毒性のある不可逆阻害剤ジイソプロピルホスホロフルオリダート（ＤＦＰ、１８４．２ＭＷ）；前記酵素の活性部位を化学的に修飾することによって作用する別の毒性不可逆阻害剤フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ、１７４．２ＭＷ）及びα−トルエンスルホニルフルオリドが含まれる。
【００３５】
前記安定化試薬において有用な他の適当なセリン及びシステインプロテアーゼ阻害剤には、プロテアーゼ及びＲＮＡ合成の不可逆阻害剤アンチパイン６７８．２ＭＷ）；幾つかのセリン及びシステインプロテアーゼ阻害剤キモスタチン（６００ＭＷ）；トリプシン様プロテアーゼの不可逆競合阻害剤ロイペプチン（４７５．６ＭＷ）；前記酵素活性部位を化学的に変化させることによって不可逆的に阻害するＬ−１−クロロ−３−［４−トシル−アミド］−７−アミノ−２−ヘプタノン−ＨＣｌ（ＴＬＣＫ、３６９．３ＭＷ）；及び前記酵素活性部位を化学的に変化させることによって不可逆的に阻害するＬ−１−クロロ−３−［４−トシルアミド］−４−フェニル−２−ブタノン−ＨＣｌ（ＴＰＣＫ、３５１．８ＭＷ）が含まれる。
【００３６】
本発明において有用な他の適当なシステインプロテアーゼ阻害剤には、システインプロテアーゼの非競合的不可逆阻害剤Ｅ−６４（３５７．４ＭＷ）が含まれる。他の適当なプロテアーゼ阻害剤は、メタロプロテアーゼを阻害する。例えば、アマスタチン（５１１ＭＷ）は非毒性の可逆阻害剤であり；ベスタチン（２４４．８ＭＷ）は、抗腫瘍特性及び免疫調節機能を有する多機能のメタロプロテアーゼ阻害剤であり；ジプロチン（３４１．５ＭＷ）は可逆阻害剤であり；ＥＤＴＡ（３７２．３ＭＷ）は、酵素補因子をキレート化することにより作用し、そして他の金属依存性生物学的過程を妨害しうる可逆阻害剤である。他のメタロプロテアーゼ阻害剤には、バナジウム、モリブデン酸塩、及び１，１０−フェナントロリンが含まれる。本発明における使用のための更に他の適当な阻害剤は、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤、例えば可逆阻害を提供するペプチド、ペプスタチン（６８５．９ＭＷ）である。
【００３７】
１つの態様において、本発明の安定化試薬には、単一のプロテアーゼ阻害剤が含まれる。別の態様において、本発明の安定化試薬には、２又はそれ以上の前記阻害剤の組み合わせが、単独で高濃度で使用した場合に毒性であるか又は他の不所望な効果を引き起こすこれらの阻害剤の少量の使用を可能にする。当該安定化試薬組成物中のプロテアーゼ阻害剤の濃度は、最大約１０ｍＭであることが望ましい。しかしながら、濃度範囲は、使用する阻害剤に専ら依存する。この範囲は、本明細書に記載のような、血小板活性化阻害の実験データに基づいて決定される。当業者は、本明細書に提示した技術を前提として、最少で且つ常用の程度の実験のみにより、前記安定化試薬において使用するそれぞれの特異的阻害剤についての所望の濃度を容易に決定することができるであろう。
【００３８】
前記安定化試薬組成物の更に別の成分は、１又は複数のホスファターゼ阻害剤である。適当なホスファターゼ阻害剤の非排他的なリストには、限定しないが、ピロリン酸塩、マイクロシスチンＬＡ、マイクロシスチンＬＲ、テトラミソール、Ｌ−４−ブロモテトラミソール、タウトマイシン(tautomycin)、オカダ酸、カリクリン、スリシフェリル−２３−アセテート、カンタリジン、バナジウム塩、オルトバナジン酸ナトリウム、酒石酸塩、フロリジン、モリブデン酸塩、及びイミダゾールが含まれる。他の適当な阻害剤については、Handbook of Enzyme Inhibitors, Melmward Sollner (1989), ISBN 3-527-26994-0; ISBN 0-89537-860-0を参照のこと。これらは引用によって本明細書に組み入れられる。
【００３９】
１つの態様において、本発明の安定化試薬には、単一のホスファターゼ阻害剤が含まれる。別の態様において、本発明の安定化試薬には、２又はそれ以上の前記阻害剤の組み合わせが、単独で高濃度で使用した場合に毒性であるか又は他の不所望な効果を引き起こすこれらの阻害剤の少量の使用を可能にする。当該安定化試薬組成物中のホスファターゼ阻害剤の濃度は、最大約１２０ｍＭであることが望ましい。しかしながら、濃度範囲は、使用する阻害剤に専ら依存する。この範囲は、本明細書に記載のような、血小板活性化阻害の実験データに基づいて決定される。当業者は、本明細書に提示した技術を前提として、最少で且つ常用の程度の実験だけで、前記安定化試薬において使用するそれぞれの特異的阻害剤についての所望の濃度を容易に決定することができるであろう。下文の実施例において、３つのそのような阻害剤、すなわち１０〜６０ｍＭの濃度のテトラミソール、最大１０ｍＭの濃度のＡＥＢＳＦ及び最大５０ｍＭのピロリン酸塩１０水和物（１０*Ｈ2Ｏ）が安定化溶液において使用される。
【００４０】
本発明の試薬は、特定の目的毎にその性能を最適化するように製剤において調節されうる。例えば、前記構成要素の選択に依存して、本発明の安定化試薬組成物は、４．５〜８．０の生理学的範囲内のｐＨを有する。当該試薬組成物はまた、有用な浸透圧(osmolarity)範囲によって特徴付けられる。成分の添加又は水による希釈は、血液及び尿の標準的な生理学的範囲内の浸透圧範囲、すなわち２５０〜１２００ｍＯｓｍｏを生成するように容易に達成されうる。通常、前記試薬は等張性であろう。好ましくは、浸透圧は約３１８〜約３４０ミリＯｓｍｏ／ｋｇ（ｍＯｓｍ／ｋｇ）である。更に好ましくは、浸透圧は約３２１〜約３３７ｍＯｓｍ／ｋｇであろう。最も好ましくは、浸透圧は約３２５〜約３３５ｍＯｓｍ／ｋｇであろう。しかしながら、前記試薬の浸透圧は、当該試薬がＲＢＣを溶解することを意図しているか否かによって変わりうる。しかしながら、当該試薬の体積は、血液試料と混合した場合、最適な最終浸透圧をもたらすよう調節されうる。適切なｐＨ及び浸透圧は、上述のような、前記組成物を形成するのに必要な反応物及びプロテアーゼによって達成されうる。あるいは、当該試薬組成物は、当該組成物のｐＨ範囲を、適切な範囲内に調節するために無機性塩基性塩又は有機性塩基性塩も含むことがある。従って、当該試薬は、生理学的ｐＨを提供し、且つ前記組成物の安定化昨日に有害に作用しない緩衝液を更に含んで成ることがある。
【００４１】
適当な緩衝液には、上文で論じたように、前記安定化試薬がＲＢＣを溶解するのに望ましいか否かによって、約４．５〜約９の範囲内の前記組成物のｐＨを維持するものが含まれる。更に好ましくは、約４．５〜８の範囲内のｐＨが得られる。当該緩衝液は、本発明の組成物において使用されるように当業者に知られている様々な緩衝液から選択されてもよく、限定しないが、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）又は等張食塩水、例えばＩＳＯＴＯＮ（商標）ＩＩ希釈剤、米国特許第３，６９２，１２５号、［Beckmann Coulter, Inc., Miami, Florida］、トリス緩衝液、有機性緩衝液Ｎ−（２−アセトアミド）−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、又はピロリン酸緩衝液あるいはそれらの組み合わせを含む。また、当業者によって容易に選択されうる多数のうち、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、炭酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、及びＨＥＰＥＳ緩衝液も有用である。更に他の緩衝液、例えばGood, N. E. et al. 1966 Biochemistry 5, 467及びGood, N. E. , and Izawa, S. 1972 Methods Enzymol. 24, 53において同定されているグッド緩衝液が、当業者によって決定されるような製剤の機能的必要性に依存して利用されうる。
【００４２】
更に、そのような緩衝液はまた、本発明の組成物の１又は複数の成分の濃度を調節するために使用されうる。本発明の安定化試薬組成物において、任意の緩衝液は、体積当たり最大５０％で存在することがある。当然ながら、前記アンモニウム塩溶液によって提供される緩衝が十分である場合、任意の緩衝液は安定化試薬において使用されない。
【００４３】
本発明の安定化試薬の更に他の任意な成分には、保存料、抗凝固剤、洗剤、色素、及び染色液が含まれうる。有用な保存料の非排他的なリストには、限定しないが、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、及び２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（商標ＰｒｏＣｌｉｎ３００又はＰｒｏＣｌｉｎ１５０）、メチルパラベン、プロピルパラベン、エチルブチルパラベン、イミダゾリジニルウレア、ジアゾリジニルウレア、ヨードプロピニルブチルカルバメート（例えば、ＧＥＲＭＡＬＬ（商標）の商標）が単独又は他のものと組み合わせて含まれる。
【００４４】
本発明の１つの態様において、前記アルデヒド反応物は、前記アンモニウムイオン塩溶液とのとの混合物のために別の溶液として調製される。通常、阻害剤が当該アンモニウムイオン塩溶液中に存在し得る。他の成分も別々に混合され、貯蔵されうる。このことは、最終消費者が、前記アルデヒド反応物とアンモニウムイオン塩反応物とを、生物学的組織と一緒の使用付近で混合することを可能にし、それによって、上述の最も有用な化学的に反応性のある複合体の完全性を保存することができる。本発明の安定化組成物の１つのそのような二部分の態様は、アンモニウムイオン塩溶液として試薬Ａを含み、これは、二塩基の、５７．０６ｍｇ／ｍＬのクエン酸アンモニウムを、アルカリホスファターゼ阻害剤（９．６３ｍｇ／ｍＬのテトラミソールＨＣｌ及び４４．６４ｍｇ／ｍＬのピロリン酸ナトリウム十水和物）、及びセリンプロテアーゼ阻害剤（０．０９６ｍｇ／ｍＬのＡＥＢＳＦ）と一緒に含む。試薬Ｂは、１０ｍｇ／ｍＬのパラホルムアルデヒド、０．４ｍＬ／ｍＬの水酸化ナトリウム（１Ｎ）、及び最適な緩衝液（６０．５ｍｇ／ｍＬのＴｒｉｓ）を含む。これらの試薬は、本発明の例示的な安定化剤を提供するために、１：１の体積比で混合される。
【００４５】
本発明の安定化試薬組成物は、上述のようにそれが影響を与える様式によって更に特徴付けられうる。例えば、この安定化試薬の使用は、細胞表面抗原ＣＤ６２ｐの、血液試料中又は他の血小板含有試料中の血小板上での発現を、基線、すなわち、ドナーから回収した直後に測定した場合の未処理血液試料のものと実質的に同様の状態へと安定化させる。２４時間後の安定化された試料は、ドナーから回収した直後に測定した場合の未処理血液試料中に存在したＣＤ６２ｐポジティブ血小板の±２０％の数を含む。
【００４６】
この測定値は、下文で詳細に説明するように達成されうる。事実、前記安定化試薬のこの機能的特徴は、血液試料が回収され、そしてすぐに測定され、あるいはドナーから回収され、抗凝固剤又は凝固経路阻害剤で処理され、そして抗原の存在について測定される場合に真実である。更に具体的には、健康なドナー由来の新鮮な全血が前記安定化試薬組成物中に回収される場合、血小板は活性化されない。当該安定化試薬での処理は、血小板が、それらが処理された時、例えば血小板がドナーの身体から回収された時、又は血小板がチューブ内に引き込まれた時、等からそれらの活性化状態を維持することを可能にする。前記試薬組成物による血小板活性を保存するこの能力はこの組成物の特徴であり、これは回収された血液試料中の全ての血小板を活性化しうる従来技術の組成物及び方法と完全に区別して存在する。
【００４７】
１つの態様において、後述する安定化試薬及び方法は、全血試料中に存在するヒト細胞を保存することができ、これは、当該血液試料中の当該細胞を、当該細胞が前記試薬を試料に導入した場合に特徴付けられた状態で「凍結」することによる。細胞のこの安定化は、機能的であって機械的でない。従って、安定化の後、安定化された細胞は新規な機能的状態へと誘導されえない。前記試薬は、時間の経過による細胞の変化を最小化し、そして通常他の既知の安定化方法よりも更に抗原を保存する。下文の比較例６及び７を参照のこと。しかしながら、前記試薬は全ての抗原を保存しうるものではなく、当該試薬は前記試料中へのその導入前に失われ／排出された抗原を回復させることもできない。
【００４８】
当該試薬はまた、生物学的試料中での顆粒の損失及び他の細胞内変化を最小化し、潜在的に、細胞成分を分析にとってより利用可能なものにする。細胞因子の存在は、その大部分につき、試料の年齢及び、当該試料のドナーが試料の安定性に影響を及ぼす幾つかの様式において異常であるか否か、に依存する。更に、光散乱特性に関して、当該試薬は、フローサイトメトリー様散乱(flow cytometry-like scatter(FALS及びSS))の保存において有用である。細胞及び組織における本発明の試薬組成物の使用は、経時的な細胞の解析において一貫性及び再現性を提供する。
【００４９】
従来技術の回収細胞における抗原発現の保持のための標準的なホルムアルデヒド単独での固定と対照的に、本発明の試薬組成物及び方法で保存された細胞は、より広範な解析に利用可能である。以下の実施例で証明するように、本発明の試薬は、細胞内の内部抗原を安定化し、且つ細胞上の外部（細胞表面）抗原を安定化する。当該試薬は、細胞に特有の光散乱及び組織試料中で減少した内因性ホスファターゼを保存する。従って、この試薬は、数ある使用の中でも、一般的な細胞保存剤として、ＤＮＡ及びＲＮＡ研究における試薬として、血小板列挙法において、血小板反応性の評価において、例えば、血小板／白血球凝集研究のために、抗細胞（自己）抗体及び血漿（可溶性）分析物において有用である。
【００５０】
ＩＩ．安定化された組織
本発明の別の態様は、それ故に、上文で定義したような、生物学的組織、好ましくは且つ液又は血小板含有溶液の、上述のように安定化組成物で処理されて安定化した試料である。当該試料は、低下した活性化、特に血小板の活性化の状態を特徴とする。前記試薬は、安定化試薬による処理から少なくとも２４時間、試料中の血小板上でのＣＤ６２ｐ抗原の安定化した発現も特徴とする。処理された試料中の存在として測定される安定化した発現は、基線、すなわち身体から回収した直後に測定された未処理試料におけるＣＤ６２ｐポジティブ血小板の±２０％の数である。
【００５１】
ＩＩＩ．組織を安定化する方法及び安定化の有効性を評価する方法
別の態様において、本発明は、血小板含有生物学的試料中の血液細胞を安定化する方法を提供する。１つの態様において、そのような試料は全血試料である。他の態様において、上述した通り、当該試料は血小板を含むことがあり、例えば血液画分又は溶液である。下文で更に詳細に、そして実施例で説明するように、全血は前記安定化試薬と接触され、そして約１時間インキュベートされる。このインキュベーション期間の後、血小板は、ＣＤ６２ｐ発現により測定した場合、もはやホルボールエステル活性化剤と反応することはなく、７日又はそれ以上同レベルのＣＤ６２ｐ発現を維持し続ける。
【００５２】
更に具体的には、前記方法は、上述のような試料と試薬組成物との接触を包含する。好ましくは、当該試料及び試薬組成物は１：１の比率である。当該安定化試薬の重要な特徴は細胞当たりの安定化試薬中の複合体の分子数であるので、当該安定化試薬は、例えば生理食塩水中で希釈され、そして尚も機能しうる。一例として、生理食塩水による大量の希釈液が作られることがあり、そして極少量の血液が細胞当たり同一の合計分子数であるが、はるかに低い絶対濃度の安定化試薬反応物を達成するよう添加されることがある。当該安定化試薬が低濃度である場合、大量に使用されることがあり、その結果、１：１００以上の比率が生じる。当該比率は通常研究室での使用にとって慣習的で且つ実用的なものに適合される。アルデヒド溶液が上述のように、接触段階の直前にアンモニウム塩溶液と混合される１つの態様において、所望量の試料、例えば血液は、前記組成物を血液試料に添加するよりもむしろ予め混合された安定化組成物に添加されることが望ましい。望ましくは、血液／試薬組成物は、おだやかに、例えば前記試料及び前記組成物両方を含有する適当な容器を約３回反転させることによって混合される。更に、混合された試料が少なくとも１時間室温、例えば約２８〜２４℃で前記組成物と接触されたままであることが好ましい。しかしながら、通常、阻害を起こすのに十分な時間は試料によって変化することがあり、そして、１時間で十分でない場合、あらゆる特定の試料について阻害を起こすのに必要な最大時間の最少のものがルーチンな実験によって決定されうる。
【００５３】
この方法は、生物学的試料、例えば血液試料を、ドナーからの回収及び前記試薬組成物との接触の際の試料に特有の活性化状態で安定化させる。予想される通り、当該試料は、回収されてからすぐに安定化試薬と接触されるべきであり、これは、生物学的試料、特に血液の活性化状態の変化がドナーから回収してほぼすぐに開始するからである。
【００５４】
前記試薬組成物及び方法は、伝統的な抗凝固剤から独立して、又はそれと協力して使用されてもよく、そして当該抗凝固剤単独の使用で起こるであろう抗原の活性化の変化を防ぐ細胞の安定化を提供しうる。この方法の代わりの又は追加の段階として、生物学的試料、例えば血液試料は最初に、試料を安定化試薬と接触させる前に、常用のカルシウムキレート化抗凝固剤又は凝固経路阻害剤中に取り込まれうる。常用の抗凝固剤又は凝固経路阻害剤には、限定しないが、一般的な市販の血液回収チューブ／容器において使用される場合、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はその塩、クエン酸塩、フッ化ナトリウム、ヒルジン及びヘパリン、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。
【００５５】
前記試料は、この方法で一旦処理されると、基線のものと実質的に同様の活性化状態及び処理から少なくとも２４時間血小板上の安定化されたＣＤ６２ｐの発現、を特徴とする細胞を含む。当該安定化された発現は、ドナーの身体からの回収直後に未処理で測定した場合の試料中に存在したＣＤ６２ｐポジティブ血小板の±２０％の数の当該試料中での存在として測定されうる。
【００５６】
別の態様において、この方法は、血小板の活性化状態を決定するための段階を追加することによって更に修飾されうる。あるいは、活性化状態を決定するための別個の方法が、任意の安定化試薬の有効性を評価するために実施されうる。血液細胞安定化試薬の有効性を評価し、又は安定化試薬の安定化効果を測定する本発明による方法は：
（ａ）細胞安定化試薬組成物で処理した血液試料、及び当該安定化剤で処理されてない試料を、血小板の物理的／酵素的変化を引き起こすことによって細胞応答を活性化する活性化材料と接触させることにより血小板の活性化を測定する段階。当該活性化剤は、血小板の活性化の可能性のある最大の状態を提供する；
（ｂ）前記試料を２０〜２５℃で７２時間貯蔵する段階；及び
（ｃ）前記処理試料中の血小板上でのＣＤ６２ｐ発現の変化を、前記安定化試薬組成物で処理されてないが、同じ時間貯蔵された試料中の血小板上でのＣＤ６２ｐの発現と比較して決定する段階、を含んで成る。この方法によると、安定化剤で処理した試料中で血小板が発現しているＣＤ６２ｐ抗原のパーセンテージは、未処理試料におけるパーセンテージよりも低い。一旦血液が安定化剤で処理されると、血小板は活性化材料に応答せず、そして活性化状態は基線のものと実質的に同様である。安定化剤で処理されていない血液は、更にＣＤ６２ｐを最大限発現させることによって活性化材料と応答するであろう。従って、安定化剤で処理した血液及び活性化材料は、安定化剤で処理されていない血液ほどＣＤ６２ｐを発現している血小板を有さないであろう。この場合、未処理試料及び「試薬処理」されていない試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板の数を増大させるために、活性化剤の添加が予想されよう。それ故に、安定化試薬は外因性の活性化を「予防」する。
【００５７】
このような血小板の活性化は、ドナーからの回収直後の生物学的組織試料に対し（安定化された試料であるか、又は安定化されていない試料であるかは、求められている測定に依存する）、血小板の物理的及び／又は酵素的変化を引き起こすことによって細胞応答を活性化する活性化材料を低下することによって測定されうる。好ましくは、この方法において使用する場合、活性化材料は、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）溶液である。ＰＭＡは、約０．００１〜５μＭの終濃度に当該試料で添加される。血小板研究にとって有用であることが知られている標準的な活性化剤、例えばコラーゲン、トロンビン、ＡＤＰ、カルシウムイオノフォア等が、ＰＭＡに加えて、又はその代わりに有用である。例えば、K. S. Authi et al, 1994 "Mechanisms of Platelet Activation and Control", Adv.Exp. Med.Biol., 344, Plenum Pub Corp; ISBN 0306446316；及びAlan Michelson, 2002 "Platelets", ISBN 0124939511を参照のこと。
【００５８】
前記活性化材料で一旦処理されると、試料は約２０〜２５℃で最大約７２時間貯蔵されうる。貯蔵時間は任意である。ドナーからラベルへの標本輸送に必要とされる通常の期間又は生物学的試料にとっての通常の郵送時間は、最適な貯蔵時間の範囲内であろうことが予想される。
【００５９】
ＣＤ６２ｐの発現は、典型的には、二重又は多重のパラメーター解析を用いるフローサイトメトリー解析によって、特に、試料を当該試料における血小板上のＣＤ６２ｐに結合する標識リガンドで染色することによって測定される。当該リガンドは、通常測定されるべき抗原に対するモノクローナル抗体である。典型的には、抗Ｃｄ６２ｐ抗体及び抗ＣＤ４１ｐ抗体は、適当に標識されたものが使用される。あるいは、血液学的な細胞上に存在することが知られているあらゆる細胞表面抗原に対する抗体が有用であり、限定しないが、これらにはＣＤ６１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ９、ＣＤ３６等に対する抗体が含まれる。例えば、本発明に従い使用されうる抗体のための、他の細胞表面抗原のリストついては、A. N. Barclay etal, The Leukocyte Antigen Facts Book,2nd edit., Academic Press, San Diego, CA, publ. (1997)を参照のこと。これらの抗体は、典型的には、蛍光標識、中でも例えばフィコシアニン、アロフィコシアニン、アロフィコシアニンＢ、フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトロシアニン、フィコエリトリン−テキサスレッド、ＰＥ−Ｃｙ７、アロフィコシアニン−Ｃｙ５、及びアロフィコシアニン−Ｃｙ７で標識される。
【００６０】
この方法によると、ドナー由来の安定化された試料における血小板上でのＣＤ６２ｐ抗原の発現の変化は、正常なドナー由来の未処理試料における血小板上でのＣＤ６２ｐの発現と比較され、両試料は同じ期間貯蔵される。４つのパラメーターが安定化された試料及び安定化されていない試料から得られる。パラメーターＡは、安定化無しに通常起こるであろう試料のin vitroでの活性化を表し、又は安定化試薬組成物を含まない、正常なドナー由来の抗凝固処理された血液試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージとして定義される。パラメーターＢは、安定化された試料のin vitroでの活性化の阻害、又は正常なドナー由来の、安定化試薬組成物と一緒に好ましくは約１時間インキュベートされた、同一の抗凝固処理された血液試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージ、を表すものとして定義される。パラメーターＣは、同一の正常な安定化されていない試料中の活性化に起因する最大のＣＤ６２ｐ発現、又はＰＭＡが０．００１μＭ〜５μＭの濃度へと添加され、且つ最大１時間インキュベートされている、安定化試薬組成物を含まない抗凝固処理された血液試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージ、として定義される。パラメーターＤは、安定化された試料における活性化剤の阻害を表し、そしてＰＭＡが０．００１μＭ〜５μＭの濃度へと添加され、且つ最大１時間インキュベートされている、安定化試薬を含む抗凝固処理された血液試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージである。
【００６１】
本発明の安定化試薬が処理試料中のＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージの活性化状態を安定化させるよう機能することは、式［パラメーターＣ（試料の最大活性化）−パラメーターＡ（当該試料のin vitroでの活性化）］が［パラメーターＤ（安定化された試料の最大活性化）−パラメーターＢ（安定化された試料のin vitroでの活性化）］よりも大きいことによって証明される。
【００６２】
この式は、未処理試料におけるＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージの差異（すなわち、パラメーターＣ−パラメーターＡ）が安定化された試料における当該差異（すなわち、パラメーターＤ−パラメーターＢ）よりも大きいことを証明している。更に具体的には、本発明の安定化試薬を用いる方法は、安定化された試料におけるＣＤ６２ｐポジティブ血小板のパーセンテージ（すなわち、Ｄ−Ｂ）が少なくとも２４時間基線又は迅速に安定化された試料の＋／−２０％に維持されることを証明する。当該ＣＤ６２ｐ値は、安定化された試料において基線から２０％超変化しない。正常な試料において、このＣＤ６２ｐはおそらく低い値であり、そして増大しないであろう。あるいは、異常な試料において、ＣＤ６２ｐの値は、おそらく、増大又は低下しないより大きな値であろう。
【００６３】
前記安定化試薬及び方法の有効性を証明する別の測定は、少なくとも２４時間（パラメーターＤ）−（パラメーターＢ）の差異を、ＰＭＡの添加から１時間以内に決定された元の値の８０％以内に維持している、安定化された試料によって表される。
【００６４】
従って、前記安定化試薬は、血液が活性化されているという最悪なシナリオ、すなわち臨床的に重大な状況においても、前記試料のin vitroでの状態のより良い表示を提供する。本発明の使用の１つの態様として、下文の実施例は、どのように本発明の組成物及び方法が血液の抜き取り後にＣＤ６２ｐ抗原の発現を維持することによってin vivoでの血液血小板活性化状態を決定する能力を向上させるのかを説明する。この安定化は、血液細胞解析の診断性能を向上させる。例えば、前記組成物及び方法は、血小板ＣＤ６２ｐ抗原に対するモノクローナル抗体の使用により証明する場合、血小板の活性化状態を安定化させるのに使用される。
【００６５】
当業者にとって、この方法が、測定される血小板細胞表面抗原の選択、活性化材料、選択される抗体及び標識（例えば、血小板モノクローナル抗体−色素接合体）、並びに前記方法のインキュベーション及び／又は処理パラメーターによって変更されうることは明白なはずである。当業者は、本発明から逸脱することなく当業界で利用可能な既知の材料及び方法を用いることによってこの方法を容易に改良しうる。
【００６６】
ＩＶ．本発明のキット
本発明の更に別の側面において、上述の方法を実施し、又は本発明の組成物を得るためにキットが供される。好ましくは、そのようなキットは本発明の診断方法を実施するために採用される。しかしながら、そのようなキットは、他の安定化試薬を開発し、そして評価する研究目的で組み立てられることがある。
【００６７】
前記安定化試薬、その成分、並びに上述の方法のあらゆる変更を実施するのに必要な成分が、簡便な使用のためにキット内に組み込まれるのが望ましいことがある。そのようなキットは、安定化試薬を形成するのに、又は２つの別個の成分として前記方法において使用するのに有用な反応物を含むことがある。例えば、別個の容器内に存在するある別個の成分は、液体又は粉末形態の１〜４個の炭素原子の脂肪族アルデヒド又は加水分解によりホルムアルデヒドを生成する反応物である。好ましい態様において、当該キットの第一成分は、０．５〜１％のホルムアルデヒド水溶液である。第二容器内に存在する第二の別個の成分は、アンモニウム塩を含んで成る溶液である。ホスファターゼ酵素阻害活性の阻害剤は、別個の成分として供されることもあり、あるいは前記成分を含有するアンモニウム塩溶液の一部として供されることもある。従って、前記キットの１つの態様において、第二の別個の成分は、アンモニウム塩溶液及び一方又は両方の型の阻害剤を含む。更に別の代わりのキットにおいて、ホスファターゼ阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤は、上述のホルムアルデヒド溶液成分及びアンモニウム塩溶液成分と区別される、単一の成分の組み合わせで供されることがある。上文で同定したあらゆる最適な成分も追加成分として第二成分中、又は追加の容器内に含まれることがある。第二（且つ、もしあるのであれば、追加の）成分は、反応物の成分が混合される場合に形成される前記組成物の安定化機能に有害に作用しない生理学的ｐＨを有する。１つの態様において、第二の成分は、アンモニウムの二塩基性塩並びに多数のプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤、並びに任意の緩衝液を含む。
【００６８】
あるいは、安定化試薬は、キットにおいて、単一の容器内で予め混合されて供されることがある。
【００６９】
そのようなキットは、更に、存在するのであれば別個の成分を、ドナーの身体から回収してすぐの一定量の血小板含有試料（例えば血液）を安定化試薬に添加する前に混合するための説明書を含む。当該キットは更に、ＣＤ６２ｐポジティブ血小板を測定するための血小板モノクローナル抗体−色素接合体、中でも例えばＣＤ６２ｐ−ＰＥ及びＣＤ４１−ＰＣ７を含むことがある。当該キットは更に、血小板上でのＣＤ６２ｐ抗原発現の測定を実施するための説明書及び試薬を含んで成る。
【００７０】
当該キットは更に、以下の、試料を含むのに適した容器、活性化した血小板の正常な又は疾患に特有の値の適当なコントロール又は表；抗凝固剤又は凝固経路阻害剤、フローサイトメトリー解析の実施に適した他の試薬及びそれらの組み合わせ；試料にとって適当な希釈剤及び緩衝液、使い捨てのグローブ、除染用説明書、塗布用スティック又は容器、並びに試料調製カップ、から成る群から選択される追加の成分のうちの少なくとも１つを含んで成る。
【００７１】
本発明のキットは、同一の又は異なる、いずれかの検出可能標識を含むことがあり、それにより、多数の試料が試験されうる。これらのキットは、追加として、前記試料を維持又は保存するのに必要な試薬を含んでもよい。更に重要なことに、当該キットは、前記試料を安定化する方法及び当該安定化効果を評価し、且つコントロールを調製する方法を実施するための説明書を含む。当該キットは、好ましくは、必要に応じて、必要な緩衝物質又は媒体も含む。当業者は、あらゆる特異的な細胞表面抗原及び標的細胞について、生物学的試料上で前記方法を実施し、そして当該結果をその細胞群についての基準と比較して血小板活性化状態における疾患又は異常の徴候を検出するのに必要な情報及び成分を有するあらゆるキットを組み立てることができる。
【実施例】
【００７２】
Ｖ．実施例
以下の実施例は、全血の安定化における本発明の組成物及び方法を示す。以下の実施例は、本発明の種々の側面を例示する。これらの実施例は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しない。
【００７３】
実施例１：安定化試薬中に存在する反応物によって形成される複合体の分析
本発明の安定化試薬組成物を生成するために実施される１つの実験において、当該試薬は、反応物としてクエン酸アンモニウム及びホルムアルデヒドを用いることによって生成した。それにより形成された複合体は、以下の表１において示されるＮＭＲデータにおけるシフトによって証明された。表１において、下線の水素原子は、測定したプロトンを例示する。Ｔ＝０は、当該シフトが、本発明の安定化試薬組成物の場合には混合直後に、そして個々の試薬成分の場合にはある時間に観察されたことを意味する。Ｔ＝１４は、本発明の試薬組成物の成分の混合から１４日間の貯蔵を示す。
【００７４】
【表１】
2005536550.tif 000003
【００７５】
これらの結果の要約は以下の通りである。ホルムアルデヒドは単独で測定され、そして観察されたシフトは、列記した成分の予測されたプロトン型において公表されている理論シフト値（理論シフト）との一致を証明した。クエン酸アンモニウムは単独で測定され、そしてクエン酸アンモニウムについて公表されているプロトン型との予測された一致も証明された。
【００７６】
クエン酸アンモニウムとホルムアルデヒド溶液が組み合わされて、必須の阻害剤と一緒に本発明の試薬組成物を形成する場合、クエン酸アンモニウム単独又はホルムアルデヒド単独のいずれかのＮＭＲ解析によって形成される成分／プロトンにとって典型的でなかった新規のプロトン型シフトを表す複数の新規なピークが見られた。従って、ＮＭＲスペクトルにおける新規ピークの出現によって証明されるように、ある化学反応がホルムアルデヒドとクエン酸アンモニウム溶液を混合してすぐに生じる。
【００７７】
当該ＮＭＲスペクトルにおける新規ピークのうちの幾つかは、ホルムアルデヒドとアンモニウム塩、具体的にはメチレンイミンとの反応において形成すると仮定されるものと一致する分子種に相当する。J. F. Walker,"Formaldehyde", Reinhold Publishing Corp, American Chemical Society Monograph Series (1944), from E. I. du Pont de Nemours & Company, Inc., pages 120-341を参照のこと。Walkerが提唱したメチレンイミン及びヘキサメチレンテトラミンの潜在的な産生は、表１のｔ＝０でのＮＭＲピークにおいては明らかではなかった。１４日間の貯蔵の後、仮定されたメチレンイミンに相当しうる幾つかの新規ピークが存在していた。あるいは、ホルムアルデヒドとアンモニウム塩との反応はメチロールを生成させ、これは進行してアミドとのメチレン架橋を形成し、これは本発明の試薬組成物の安定化にとって重要であると思われる。ＮＭＲスペクトルにおける追加のピークも、メチロールと一致している。
【００７８】
ＮＭＲスペクトルにおける最も劇的な変化は、混合してすぐに生じるようであるが、微妙な変化が２週間経過して観察された。主要な反応性成分及び機能的成分は迅速に形成され、そして維持されるが、これらのＮＭＲ変化は、当該反応が終点ではないことを示唆する。二部分の試薬の使用は、一貫した試薬の性能を維持するのに望ましい。前記機能的成分は、H. Puchtler and S. N. Meloan, 1985 Histochem., 82 : 201-204.で説明されているように形成される反応性メチロールと関連しうると推測される。理論に拘束されることを望むものではないが、生じた複合体は、下文の実施例において示すように、細胞抗原及び光散乱特性の保存において有効な成分であった。
【００７９】
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者は、おそらく、必要なプロテアーゼの存在下でのホルムアルデヒドとアンモニウム塩との反応が、アミンとのメチレン架橋を形成し、そしてそれ故に細胞の安定化にとって不可欠であると思われるメチロールを生成させると推測する。複数の実験において、ヘキサメチレンテトラミン単独の使用が細胞の安定化において有効でなく、一方、本発明のクエン酸アンモニウム／ホルムアルデヒド／阻害剤、の組み合わせが有効であったことが注目された。
【００８０】
統合したＮＭＲデータは、種々の化学反応種が、クエン酸アンモニウムとホルムアルデヒドの組み合わせから、前記阻害剤と更に組み合わせることで迅速に生じることを証明した。反応種又は複合体は、試薬組成物の性質及び濃度により変わり、そして時間とともにゆっくりと変化した。前記阻害剤と、本発明の試薬組成物において使用される任意の成分との組み合わせ、並びに他のアンモニウム塩の使用は、おそらく、追加の反応性化学種を産生する。細胞の安定化のための試薬の組み合わせ及び製剤の選択は、細胞の安定化の仕様に合致する最適化された試薬製剤の選択に基づいて実施された。従って、適切な機能的性能を有する試薬製剤は、前記組み合わせから具体的な化学性反応種を産生し、同定し、単離し、そして製造するのに容易に使用することができ、そして、細胞の安定化のために別個に使用することができる。
【００８１】
実施例２：試薬組成物の製法
追加の実験を設計して、Stat-Ease Corporation, Minneapolis MN 55413によって製造されたDesign-Expert Version 5.0.8統計ソフトウェアの利用を表示した。このような実験は、当該ソフトウェアアルゴリズムに含まれる最適化及びモデリングのプロセスのための応答曲面統計法を用いての前記安定化試薬組成物の最適化のための濃度及び成分の範囲を試験するのに使用した。試験した本発明の安定化試薬組成物の成分の歯にを表２に示す。
【００８２】
【表２】
2005536550.tif 000004
【００８３】
本発明の種々の安定化試薬組成物の製法において、加水分解により液体のホルムアルデヒド又はパラホルムアルデヒドを形成する反応物は異なることがある。下文に示すように、アンモニウムイオン源も異なることがある。同様に、アルカリホスファターゼとプロテアーゼの阻害剤及び／又はそれらの組み合わせの選択も異なることがある。多数のアルカリホスファターゼ阻害剤が、前記試薬組成物において、それらの毒性を低下させ、同時に所望の阻害を得るのに望ましいことが予想される。
【００８４】
以下の実験及び実施例３〜７において、溶液Ａは、クエン酸アンモニウム、ホスファターゼ阻害剤、及びプロテアーゼ阻害剤の組み合わせであり、具体的には、それらは二塩基の、５７．０６ｍｇ／ｍＬのクエン酸アンモニウムを、アルカリホスファターゼ阻害剤（９．６３ｍｇ／ｍＬのテトラミソールＨＣｌ及び４４．６４ｍｇ／ｍＬのピロリン酸ナトリウム十水和物）、及びセリンプロテアーゼ阻害剤（０．０９６ｍｇ／ｍＬのＡＥＢＳＦ）と一緒に含む。
【００８５】
溶液Ｂは、０．０５％ホルムアルデヒド溶液／リン酸緩食塩水である。
【００８６】
溶液Ｃは、１０ｍｇ／ｍＬのパラホルムアルデヒド、０．４ｍＬ／ｍＬの水酸化ナトリウム（１Ｎ）、及び６０．５ｍｇ／ｍＬのＴｒｉｓ緩衝液を含む。
【００８７】
コントロール又はＰＢＳはリン酸緩衝食塩水溶液である。
【００８８】
溶液Ａ＋Ｂ又はＡ／Ｂ又は「安定化試薬」は、下文で使用する場合、１容量部の溶液Ａと１容量部の溶液Ｂとの混合の結果である。
【００８９】
溶液Ａ＋Ｃ又はＡ／Ｃは、下文で使用する場合、本発明の別の安定化試薬を製造するための、１容量部の溶液Ａと１容量部の溶液Ｃとの混合の結果である。
【００９０】
本発明の安定化試薬に対する異なる緩衝液、ｐＨ及び浸透圧の効果を決定するために、新鮮な正常血液試料がＥＤＴＡ抗凝固剤中に引き抜かれ、続いて溶液Ａ単独、溶液Ｂ単独、コントロール、溶液Ａ＋Ｂ又は溶液Ａ＋Ｃのいずれかが引き込みの１時間以内に１：１で混合された。ｐＨ及び浸透圧の測定は、血液試料の混合直後に、又は混合してから１時間以上してから行われた。
【００９１】
７２時間２２℃で貯蔵された後、前記試料は、血小板活性化剤、すなわちホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）を終濃度１１．５８μＭの濃度で添加することによって強調した（実施例３を参照のこと）。当該試料は、血小板抗原ＣＤ４１に対するモノクローナル抗体（抗ＣＤ４１  ＦＩＴＣ）及び血小板顆粒マーカーＣＤ６２ｐに対する抗体（抗ＣＤ６２ｐ）で染色した。免疫血小板カウント（ＩＭＰＣ）は、上文で引用した国際血液学標準化評議会の方法に従い実施された。結果を以下の表３に例示する。
【００９２】
【表３】
2005536550.tif 000005
【００９３】
溶液ＡとＢ又は溶液ＡとＣの組み合わせは、当該溶液のいずれか単独又はコントロールＰＢＳよりも、７２時間に及ぶ保存でのＩＭＰＣ及びＣＤ６２ｐの発現の維持において優れている。この実験は、組み合わせた又は別個の試薬のｐＨを調節するための無機性又は有機性緩衝液の使用が、本発明の範囲又は実行を制限しないことを証明する。
【００９４】
表４は、血液試料との混合直後（０時間）又は混合してから１時間以上後に測定した、異なる溶液を含有する血液試料のｐＨ及び浸透圧の測定における変動を証明する。
【００９５】
【表４】
2005536550.tif 000006
【００９６】
任意の緩衝液は、単に前記組成物を生理学的ｐＨにするために含まれる。細胞保存のために許容される標準的なｐＨ範囲は約ｐＨ７．８〜ｐＨ５．０である。緩衝液についての適切な選択又は必要性は、それ故にこれらの技術を考慮すると当業者の技術の範囲内の容易なものである。
【００９７】
図９は、列記した成分の変動において作り出されたｐＨ範囲の一例である。従って、当業者は、本明細書に含まれる技術を考慮して、他の塩基性又は酸性の有機性化合物及び無機性化合物（ピロリン酸塩又は有機性緩衝液ｎ−（２−アセトアミド）−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）の使用により示す通り）が、所望により、当該範囲をより高い又はより低いｐＨにシフトさせるであろうことを予期する。
【００９８】
同様に、本発明の試薬にとって有用な浸透圧の範囲は変動しうる。成分の添加又は水による希釈は、血液及び尿の標準的な生理学的範囲内の浸透圧範囲、すなわち２５０〜１２００ｍＯｓｍｏを作り出すよう容易に達成されうる。例えば、図１０を参照のこと。
【００９９】
前記試薬が血液に添加される場合のＣＤ６２ｐ値の維持も、本発明の安定化試薬内に導入される前記成分の上記範囲内で、例えば成分添加、ｐＨ及び浸透圧環境で変動しうる。これらのＣＤ６２ｐ値は、統計学的に設計された実験内での選択された試薬の最適化を介して決定可能である。例えば、図１１Ａ及び１１Ｂは、この応答も統計学的に設計された実験内での選択された試薬の最適化を介して決定可能であることを証明している。図１１Ａ及び１１Ｂは、二塩基性クエン酸アンモニウム［（ＮＨ4）2］の使用が三塩基性クエン酸アンモニウム［（ＮＨ4）3］が提供するものより優れた安定化を提供することを示す。統計アルゴリズムは、本発明の安定化試薬が全血に対して試験され、且つ従来技術（例えばホルムアルデヒドのみ）又は市販の安定化溶液を用いる比較試験と対比されることを可能にした。
【０１００】
実施例３：従来技術の成分の比較
ＣＤ６２ｐの発現における血小板の機能的応答は、本発明の臨床的応用のうちの１つ及び本発明自体にとって主要なものである。
【０１０１】
１つの実験において、新鮮な正常血液が、溶液Ａ、溶液Ｂ、コントロール又は本発明の安定化試薬（Ａ＋Ｂ）と１：１で、抜き取りから１時間以内に混合され、そして赤血球（ＲＢＣ）の数及び血小板（ＰＬＴ）の数のパーセントの差異が０日目及び３日目に測定された。
【０１０２】
同一のプロトコールが活性化した血液試料に対して実施された。活性化は、血液及び関連する血小板が、十分立証され、十分明確にされ、広範囲の且つどこにでもある血小板活性化剤、すなわち、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）の終濃度１１．５８μＭでの添加によって強調されたことを意味する。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のＰＭＡストック溶液１００μｇ／ｍｌを使用した（０．１６２ｍＭの１２−ミリスチン酸１３−酢酸ＦＷ６１６．８）。２μｌのＰＭＡストック溶液／ｍｌ血液（１／５００希釈）は〜０．３２μＭの血中での終濃度をもたらす。活性化の過程は、１ｍｌの血液を２μｌのＰＭＡと一緒に１０分間インキュベートすることを包含する。血小板活性化能（ＰＡＰ）は、ＣＤ６２ｐ発現における変化によって表す場合、選択された活性化剤に対して応答する血小板の能力である。ＰＡＰは、２μｌの１／１００希釈（０．０３２４ｍＭ）のストックＰＭＡに１０μｌの抗体及び１００μｌの希釈剤（ＰＢＳ）及び２．５μｌの血液を添加したものを用いて評価し、そして１５分間インキュベートされた（１１．５８μＭの終濃度）。
【０１０３】
適切に安定化された細胞がこの活性化剤に対して応答しないであろうことが予測され、さもなければ、これらの同一の細胞は、貯蔵により時間とともに変化し、そしてそれ故に、分析時に、血液の天然のin vivo状態を適切に表さないことが予測されるであろう。
【０１０４】
以下の表５Ａ、５Ｂ及び６並びに図１Ａ〜８Ｂは、種々の実験的設計から派生した試薬の組み合わせが、新規で且つ独特な結果を生み出すことを証明する。
【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
【表６】
2005536550.tif 000008
【０１０７】
【表７】
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【０１０８】
個々の試薬Ａ及びＢ、そしてＰＢＳでさえもが赤血球（ＲＢＣ）及び血小板（ＰＬＴ）の正常細胞におけるカウントを維持したが、上文で列記した成分の組み合わせを含む本発明の安定化試薬のみが、表５Ａに見られるように、血小板及びＲＢＣのカウント並びにＣＤ６２ｐの発現を７２時間にわたり維持した。更に劇的な差異が、活性化した血小板を含む表５Ｂにおいて見られる。個々の成分、例えばホルムアルデヒド単独（溶液Ｂ）又は酵素阻害剤ピロリン酸塩、テトラミソール及びＡＥＢＳＦを含有するクエン酸アンモニウム（溶液Ａ）は、本発明の安定化試薬を形成する組み合わせほど有効ではなかった。それ故に、正常なドナー及び活性化した血小板を有するドナーの両方から得られた血液試料は、本発明の安定化試薬において、従来技術の種々の保存剤又は抗凝固剤で保存された試料中のものよりもin vivoでのそれらの血液状態をより表す状態で、それらのＣＤ６２ｐ発現を維持する。
【０１０９】
溶液Ａは、血小板の５％減少及びＣＤ６２ｐ発現における〜１．７％の減少を証明する。溶液Ｂは、おそらく試料中の赤血球数の赤血球の減少に関連している（これは免疫血小板カウントを算出するために使用される）、血小板数の１３％の見かけの増大、及びＣＤ６２ｐの８４％の減少を証明する。ＰＢＳ単独は、血小板の５２％の減少を証明し；残存する血小板上でのＣＤ６２ｐの発現のパーセントはそれ故に意味をなさない。
【０１１０】
実施例４：本発明の試薬で保存された新鮮なＥＤＴＡ処理血液は正常なＣＤ６２ｐ発現を示す
新鮮な正常血液がＥＤＴＡ抗凝固剤中に引き込まれ、続いて本発明の試薬（安定化剤、溶液Ａ＋Ｂ）と引き込みの１時間以内に混合された。この試料は、血小板抗原ＣＤ４１に対するモノクローナル抗体（抗ＣＤ４１  ＦＩＴＣ）及び血小板顆粒マーカーＣＤ６２ｐに対する抗体（抗ＣＤ６２ｐ）で染色された。フローサイトメトリーを用いて、ＩｇＧ１イソ型コントロールを基にした試料集合について２％でゲーティングすることにより、当該試料は分析された。
【０１１１】
生じたヒストグラムを図１Ａ及び図１Ｂに示す。表７は、２つの抗原マーカーＣＤ６２ｐ及びＣＤ４１の平均蛍光免疫蛍光(mean fluorescence immunofluorescence(MFI))を含む有意な因子を示す。ポジティブＣＤ６２ｐ血小板（抗ＣＤ６２ｐ抗体で標識した血小板）のパーセンテージは３．１％である。
【０１１２】
【表８】
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【０１１３】
実施例５：ＰＭＡで活性化され、且つ本発明の試薬中で維持された新鮮な血液はＣＤ６２ｐの血小板発現を示す
新鮮な正常血液がＥＤＴＡ抗凝固剤中に引き込まれ、そしてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のＰＭＡストック溶液１００μｇ／ｍｌを用いたホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）（０．１６ｍＭのＰＭＡ，式量６１６．８）により、２μｌ／ｍｌの血液（１／５００希釈）濃度で、〜０．３２μＭの血中での終濃度にして１０分間活性化された。この活性化した試料は、続いて本発明の試薬（安定化剤）中で１時間混合される。この試料は、血小板抗原ＣＤ４１に対するモノクローナル抗体（抗ＣＤ４１  ＦＩＴＣ）及び血小板顆粒マーカーＣＤ６２ｐに対する抗体（抗ＣＤ６２ｐ）で染色される。フローサイトメトリーを用いて、正常な未処理試料の場合２％のポジティブセットでＩｇＧ１イソ型コントロールを基にした試料集合についてゲーティングすることにより、当該試料は分析された。
【０１１４】
生じたヒストグラムを図２Ａ及び２Ｂに示す。表８は有意な因子を示す。ポジティブなＣＤ６２ｐポジティブのパーセンテージ（抗ＣＤ６２ｐ抗体で標識された血小板）は８０．２％である。注目すべきは、血液試料（ＲＢＣ及びＷＢＣも含む）中の血小板のパーセンテージが、活性化されてないＥＤＴＡ処理試料と同様なことである。
【０１１５】
【表９】
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【０１１６】
実施例６：市販の安定化溶液中で又は安定化溶液無しで維持された新鮮なＥＤＴＡ処理血液の比較
更なる比較のために、２つの市販の血液安定化組成物をこの実施例及び以下の実施例において使用し、ここで、市販の試薬Ａは、商品名StabilCyte Cell Stabilizationキット(BioE, St. Paul, MN)で販売されている。市販の試薬Ｂは商品名Cyto-Chex試薬(Streck Laboratories, La Vista, NE)で販売されている。
【０１１７】
Ａ．市販の試薬Ａ
市販の安定化試薬Ａを、取扱説明書に従いＥＤＴＡ中に回収された血液試料に添加した。１時間後、この試料を血小板抗原ＣＤ４１に対するモノクローナル抗体（抗ＣＤ４１  ＦＩＴＣ）及び血小板顆粒マーカーＣＤ６２ｐに対する抗体（抗ＣＤ６２ｐ）で染色される。フローサイトメトリーを用いて、試料の０．２％未満でＩｇＧ１イソ型コントロール集合又はＣＤ６２ｐ及びＣＤ４１ネガティブ赤血球群のすぐ上のゲートセットに基づき試料集合についてゲーティングすることにより、当該試料は分析された。
【０１１８】
生じたヒストグラムを図３Ａ及び３Ｂに示す。表９は有意な因子を示す。活性化剤は添加されてないが、４１％のポジティブＣＤ６２ｐ群を産生する血小板の活性化が存在している。また、赤血球（ＲＢＣ）数に関して約８８％の血小板の減少が存在する。
【０１１９】
【表１０】
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【０１２０】
Ｂ．市販の試薬Ｂ
市販の安定化試薬Ｂが、取扱説明書に従いＥＤＴＡ中に回収された血液試料に添加された。１時間後、この試料を血小板抗原ＣＤ４１に対するモノクローナル抗体（抗ＣＤ４１  ＦＩＴＣ）及び血小板顆粒マーカーＣＤ６２ｐに対する抗体（抗ＣＤ６２ｐ）で染色される。フローサイトメトリーを用いて、試料の０．２％未満でＩｇＧ１イソ型コントロール集合又はＣＤ６２ｐ及びＣＤ４１ネガティブ赤血球群のすぐ上のゲートセットに基づき試料集合についてゲーティングすることにより、当該試料は分析された。
【０１２１】
生じたヒストグラムを図４Ａ及び４Ｂに示す。表１０は有意な因子を示す。この結果は、ＣＤ６２ｐポジティブである血小板のうちの１０．１％に対してのドナーの血小板の活性化を例示している（図４Ｂを参照のこと）。光散乱においても変化があり、血小板集団ＣＤ４１／ＦＳ（前方散乱光）を分割して見てみると、血小板の一部が低下したＣＤ４１  ＦＩＴＣ（ＦＬ１  ｌｏｇ）発現を有している（図４Ａを参照のこと）。
【０１２２】
【表１１】
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【０１２３】
Ｃ．安定化試薬無し
血液試料をＥＤＴＡ抗凝固剤中に回収した。１時間後、この試料を血小板抗原ＣＤ４１に対するモノクローナル抗体（抗ＣＤ４１  ＦＩＴＣ）及び血小板顆粒マーカーＣＤ６２ｐに対する抗体（抗ＣＤ６２ｐ）で染色される。フローサイトメトリーを用いて、試料の０．２％未満でＩｇＧ１イソ型コントロール集合又はＣＤ６２ｐ及びＣＤ４１ネガティブ赤血球群のすぐ上のゲートセットに基づき試料集合についてゲーティングすることにより、当該試料は分析された。
【０１２４】
生じたヒストグラムを図５Ａ及び５Ｂに示す。表１１は有意な因子を示す。
【０１２５】
【表１２】
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【０１２６】
実施例７：安定化試薬で保存し、且つ７日間貯蔵した新鮮なＥＤＴＡ処理血液
Ａ：本発明の試薬
新鮮な正常血液がＥＤＴＡ抗凝固剤中に引き込まれ、続いて引き込みから１時間以内に本発明の試薬（安定化剤）と混合された。この試料を室温で７日間保持し、そして次に血小板抗原ＣＤ４１に対するモノクローナル抗体（抗ＣＤ４１  ＦＩＴＣ）及び血小板顆粒マーカーＣＤ６２ｐに対する抗体（抗ＣＤ６２ｐ）で染色した。フローサイトメトリーを用いて、試料の０．２％未満でＩｇＧ１イソ型コントロール集合又はＣＤ６２ｐ及びＣＤ４１ネガティブ赤血球群のすぐ上のゲートセットに基づき試料集合についてゲーティングすることにより、当該試料は分析された。
【０１２７】
生じたヒストグラムを図６Ａ及び６Ｂに示す。表１２は有意な因子を示し、これらには２つの抗原マーカーＣＤ６２ｐ及びＣＤ４１の平均蛍光免疫蛍光（ＭＦＩ）を含む。当該試料は、安定化してから１時間以内に見たＣＤ６２ｐ活性化レベルの５％未満内でその完全性を維持する（実施例４、図１Ａ及び１Ｂ並びに表７を参照のこと）。全細胞の血小板のパーセンテージ（５．３％）も５％内で維持される。
【０１２８】
【表１３】
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【０１２９】
Ｂ．市販の安定化試薬Ｂ
新鮮な正常血液がＥＤＴＡ抗凝固剤中に引き込まれ、続いて引き込みから１時間以内に溶液Ｂと混合された。この試料を室温で７日間保持し、そして次に血小板抗原ＣＤ４１に対するモノクローナル抗体（抗ＣＤ４１  ＦＩＴＣ）及び血小板顆粒マーカーＣＤ６２ｐに対する抗体（抗ＣＤ６２ｐ）で染色した。フローサイトメトリーを用いて、試料の０．２％未満でＩｇＧ１イソ型コントロール集合又はＣＤ６２ｐ及びＣＤ４１ネガティブ赤血球群のすぐ上のゲートセットに基づき試料集合についてゲーティングすることにより、当該試料は分析された。
【０１３０】
生じたヒストグラムを図７Ａ及び７Ｂに示す。表１３は有意な因子を示し、これらには２つの抗原マーカーＣＤ６２ｐ及びＣＤ４１の平均蛍光免疫蛍光（ＭＦＩ）を含む。溶液Ｂは血小板数及び低いＣＤ６２ｐ活性化（１．３％）を維持するようであるが、この値は１０．１％の１時間の値から有意に変化した（実施例５、図４Ａ及び４Ｂ並びに表８を参照のこと）。従って、ＣＤ６２ｐ％ポジティブ値は貯蔵された試料中で維持されず、そしてこの試料は正確な診断の解釈に適していないであろう。
【０１３１】
【表１４】
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【０１３２】
Ｃ．市販の安定化試薬Ａ
新鮮な正常血液がＥＤＴＡ抗凝固剤中に引き込まれ、続いて引き込みから１時間以内に溶液Ａと混合された。この試料を室温で７日間保持し、そして次に血小板抗原ＣＤ４１に対するモノクローナル抗体（抗ＣＤ４１  ＦＩＴＣ）及び血小板顆粒マーカーＣＤ６２ｐに対する抗体（抗ＣＤ６２ｐ）で染色した。フローサイトメトリーを用いて、試料の０．２％未満でＩｇＧ１イソ型コントロール集合又はＣＤ６２ｐ及びＣＤ４１ネガティブ赤血球群のすぐ上のゲートセットに基づき試料集合についてゲーティングすることにより、当該試料は分析された。
【０１３３】
生じたヒストグラムを図８Ａ及び８Ｂに示す。表１４は有意な因子を示し、これらには２つの抗原マーカーＣＤ６２ｐ及びＣＤ４１の平均蛍光免疫蛍光（ＭＦＩ）を含む。溶液Ａ中で貯蔵された血液試料は、血小板数又はＣＤ６２ｐ活性化（１１．５％）を維持せず；この値は４１％の１時間の値から有意に変化した（実施例６、図３Ａ及び３Ｂ並びに表９を参照のこと）。従って、この試料は正確な診断の解釈に適していないであろう。
【０１３４】
【表１５】
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【０１３５】
上文で引用した全ての文書が引用によって本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の安定化試薬溶液で保存された新鮮なＥＤＴＡ血液の正常なＣＤ４１（ＦＬ１ｌｏｇ／ＦＳｌｏｇ）発現を示すヒストグラムである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａのヒストグラムの成分のＣＤ４１／ＣＤ６２ｐ（ＦＬ１ｌｏｇ／Ｆｌ２ｌｏｇ）発現を示すヒストグラムである。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の安定化試薬中で維持された、ＣＤ４１（ＦＬ１ｌｏｇ／ＦＳｌｏｇ）の活性化した血小板の発現を示すヒストグラムである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａのヒストグラムの成分のＣＤ４１／ＣＤ６２ｐ（ＦＬ１ｌｏｇ／Ｆｌ２ｌｏｇ）発現を示すヒストグラムである。
【図３Ａ】図３Ａは、市販の安定化試薬Ａ中で維持された、ＣＤ４１（ＦＬ１ｌｏｇ／ＦＳｌｏｇ）の活性化した血小板の発現を示すヒストグラムである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａのヒストグラムの成分のＣＤ４１／ＣＤ６２ｐ（ＦＬ１ｌｏｇ／Ｆｌ２ｌｏｇ）発現を示すヒストグラムである。
【図４Ａ】図４Ａは、第二の市販の安定化試薬Ｂ中で維持された、ＣＤ４１（ＦＬ１ｌｏｇ／ＦＳｌｏｇ）の活性化した血小板の発現を示すヒストグラムである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａのヒストグラムの成分のＣＤ４１／ＣＤ６２ｐ（ＦＬ１ｌｏｇ／Ｆｌ２ｌｏｇ）発現を示すヒストグラムである。
【図５Ａ】図５Ａは、ＥＤＴＡのみで処理された正常な血液中で維持された、ＣＤ４１（ＦＬ１ｌｏｇ／ＦＳｌｏｇ）の活性化した血小板の発現を示すヒストグラムである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａのヒストグラムの成分のＣＤ４１／ＣＤ６２ｐ（ＦＬ１ｌｏｇ／Ｆｌ２ｌｏｇ）発現を示すヒストグラムである。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の安定化試薬で処理され、且つ２２℃で７日間貯蔵された正常な血液中で維持された、ＣＤ４１（ＦＬ１ｌｏｇ／ＦＳｌｏｇ）の活性化した血小板の発現を示すヒストグラムである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａのヒストグラムの成分のＣＤ４１発現を示すヒストグラムである。
【図７Ａ】図７Ａは、ＥＤＴＡ及び市販の安定化試薬Ｂで処理され、且つ２２℃で７日間貯蔵された正常な血液中で維持された、ＣＤ６２ｐの活性化した血小板の発現を示すヒストグラムである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａのヒストグラムの成分のＣＤ４１発現を示すヒストグラムである。
【図８Ａ】図８Ａは、ＥＤＴＡ及び市販の安定化試薬Ａで処理され、且つ２２℃で７日間貯蔵された血液中で維持された、ＣＤ６２ｐの活性化した血小板の発現を示すヒストグラムである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａのヒストグラムの成分のＣＤ４１発現を示すヒストグラムである。
【図９】図９は、アンモニウム塩溶液中の異なるアンモニウムイオン濃度での本発明の安定化試薬のｐＨ範囲である。このグラフは、当該ｐＨが使用するＮＨ4塩の型及びその濃度に関連することを証明する。前記試薬中で使用される塩濃度が正確なｐＨを生じさせない場合には任意の緩衝が有用である。
【図１０】図１０は、アンモニウム塩溶液中異なる濃度のアンモニウムイオンを含む試薬にとって有用な浸透圧範囲である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、二塩基性クエン酸アンモニウム（ＮＨ4）2が三塩基性クエン酸アンモニウム（ＮＨ4）3よりも優れたＣＤ６２ｐの安定化を提供することを示すグラフである。単位はＣＤ６２ｐのパーセンテージである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、アンモニウム塩溶液中の異なるアンモニウムイオン濃度での活性化能の変動を示すグラフである。このグラフは、アンモニウム塩の型及び濃度と関連させた、全ての他の因子を一定にしての、外部からの活性化剤、この場合にはＰＭＡに対する応答の阻害の程度を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、２２℃で７２時間貯蔵した後の血液試料中のＣＤ６２ｐ＋血小板（予め活性化されたもの）のパーセンテージの平均変化を示す棒グラフである。血液試料は、同一のモル濃度の異なるアンモニウム塩を用いて、本発明の安定化試薬で処理した。各溶液は、表５Ａ、５Ｂ及び６に記載の性能特性を維持した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、２２℃で７２時間貯蔵した後の血液試料中のＣＤ６２ｐ＋血小板（活性化されたもの）のパーセンテージの平均変化を示す棒グラフである。血液試料は、同一のモル濃度の異なるアンモニウム塩を用いて、本発明の安定化試薬で処理した。各溶液は、表５Ａ、５Ｂ及び６に記載の性能特性を維持した。
【図１３Ａ】図１３Ａは、貯蔵０日目及び３日目の、２２℃で７２時間貯蔵した後の、血液試料で測定された免疫血小板カウント（ＩＭＰＣ）を示す棒グラフである。ＣＤ６２ｐ＋血小板（活性化されたもの）のパーセンテージの平均変化を示す棒グラフである。血液試料は、溶液Ａ（二塩基性クエン酸アンモニウム、並びに酵素阻害剤テトラミソール、ＡＥＢＳＦ及びピロリン酸塩の組み合わせ）又は溶液Ｂ（水性ホルムアルデヒド）、溶液Ｃ（トリス緩衝ホルムアルデヒド）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、溶液ＡとＢの組み合わせ（これは本発明の安定化試薬を形成する）、及び溶液Ａと溶液Ｃの組み合わせ（これは本発明の別の安定化試薬を形成する）のいずれかで処理された。ＩＭＰＣは、国際血液学標準化評議会の方法(the International Council for Standardization in Haematology, Expert Panel on Cytometry and International Society of Laboratory Haematology Task Force on Platelet Counting, 2001"Platelet Counting by the RBC/platelet ratio method: a reference method", Am. J. Clin. Pathol., 115 : 460-464)により実施した場合の免疫血小板カウントである。溶液Ａと溶液Ｂの組み合わせ及び溶液Ａと溶液Ｃの組み合わせは、貯蔵７２時間の間のＩＭＰＣ及びＣＤ６２ｐの発現の維持において、単独で使用した場合の当該溶液のうちのいずれか又はコントロールのＰＢＳよりも優れている。組み合わせた又は別個の試薬のｐＨを調節するための有機性又は無機性の緩衝液の使用は、本発明の範囲又は実施を制限しない。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、０日目及び３日目の安定化された血小板のＩＭＰＣの平均を示す棒グラフである。０日目及び３日目で同一の血小板カウントを維持するという目標は、パラホルムアルデヒド溶液単独を添加するだけという共通の手順が実施される場合、又は単純にアンモニウムイオン溶液単独が使用される場合には達成されない。本発明の安定化試薬はこの目標を達成する。
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【国際調査報告】
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