(57)【要約】本発明は、被検者から得た試料中の分析物を、高度な機器を必要とせずに診断する高速かつ簡単なｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を提供する。本発明の方法は一般に、流体試料中の分析物の検出を含み、この方法は、流体試料を、結合対の第１の構成要素であって、結合対の第２の構成要素である分析物と結合することができる捕獲剤を含む試薬と混合することを含み、その結果、流体試料中に分析物が存在する場合に結合対からなる微粒子が形成され、さらに、前記混合の結果として前記微粒子が形成された場合に、前記微粒子の薄層が固体基質上に形成されるように前記混合物を処理すること、薄層の光学画像を得ること、及び前記光学画像を分析して、結合対間の会合の結果として形成された微粒子の存在の有無を前記画像から決定し、又は前記微粒子の少なくとも１つのパラメータを前記画像から決定することを含み、試料中に微粒子が存在することが試料中に前記分析物が存在することを指示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体試料中の分析物を検出する方法であって、
（ａ）前記流体試料を、結合対の第１の構成要素であって、前記結合対の第２の構成要素である分析物と結合することができる捕獲剤を含む試薬と混合して、前記流体試料中に前記分析物が存在する場合に前記結合対からなる微粒子が形成すること、
（ｂ）前記混合の結果として前記微粒子が形成された場合に、前記微粒子の薄層が固体基質上に形成されるように前記混合物を処理すること、
（ｃ）前記薄層の光学画像を得ること、及び
（ｄ）前記光学画像を分析して、前記結合対間の会合の結果として形成された微粒子の存在の有無を前記画像から判定し、前記試料中に微粒子が存在することは前記試料中に前記分析物が存在することを指示し、又は前記微粒子の少なくとも１つのパラメータを前記画像から決定すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記分析物が少なくとも２つの認識部位を含み、前記捕獲剤が少なくとも２つの捕獲部分を含み、その結果、前記分析物の認識部位と前記捕獲剤の捕獲部分の会合によって結合対の微粒子が形成される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記パラメータが、微粒子の粒径；前記微粒子の粒径分布；微粒子の数；前記微粒子の形状；及び前記微粒子の空間分布から選択されたパラメータである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記画像が前記混合物の前記薄層の拡大画像である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記拡大が光学顕微鏡レンズの使用によって達成される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記分析物が、捕獲剤と会合することができ、これによって前記結合対の微粒子を形成する認識部位の２つ以上のコピーをその表面に含む粒子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子が、その表面に前記認識部位を提示した細胞又は微生物である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記認識部位が抗原であり、前記捕獲剤が、前記抗原に対して親和性を有する抗体である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記試薬が、捕獲部分の２つ以上のコピーを担持した検知界面を有するマイクロビーズを含み、その結果、前記流体試料中に前記分析物が存在する場合に、前記マイクロビーズ上の前記捕獲部分と前記分析物の認識部位との会合によって結合対の微粒子が形成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記検知界面が同じ捕獲部分の２つ以上のコピーを担持している、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記検知界面が異なる捕獲部分の２つ以上のコピーを担持している、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記マイクロビーズがアフィニティーマイクロビーズである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイクロビーズがイムノビーズである、請求項１３記載の方法。
【請求項１４】
前記薄層が、前記結合対の微粒子の単分子層を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を実行するシステムであって、
（ａ）微粒子の薄層を担持している固体基質を保持する保持手段、
（ｂ）前記固体基質上の前記薄層の画像を取り込む光学画像取得装置、
（ｃ）前記画像取得装置に結合され、前記画像取得装置によって得られた画像を分析する画像分析装置、
を含むシステム。
【請求項１６】
拡大装置をさらに含む、請求項１５記載のシステム。
【請求項１７】
前記拡大装置が光学顕微鏡レンズを含む、請求項１６記載のシステム。
【請求項１８】
前記拡大装置が光学顕微鏡である、請求項１７記載のシステム。
【請求項１９】
前記光学画像取得装置がカメラである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２０】
前記画像取得装置が拡大装置に結合されている、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２１】
前記画像分析が、前記薄層の中に形成された微粒子の１つ又は複数のパラメータの決定を含み、前記パラメータが、微粒子の粒径、微粒子の粒径分布、微粒子の数、微粒子の形状及び形成された前記微粒子の空間分布から選択された、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２２】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法で使用するキットであって、
（ａ）結合対の第１の構成要素であり、前記結合対の第２の構成要素である分析物が検査流体試料中に存在する場合に前記分析物がそれに結合する少なくとも２つの捕獲部分を含む捕獲剤を含む少なくとも１種類の試薬、
（ｂ）微粒子の薄層を担持する固体基質、
を備えたキット。
【請求項２３】
前記固体基質が顕微鏡スライド又は検査チャンバである、請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
前記固体支持体が、光学画像取得装置とともに使用されるように適合されている、請求項２２又は２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記薄層を生み出す手段を備えた、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物を含む凝集体の薄層の形成による流体試料中の分析物の検出、及びこのように形成された凝集体の分析、好ましくは画像分析を使用した該凝集体の分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
活動性疾患の早期検出は、治療を成功させるために不可欠な要素である。迅速かつ正確な診断が確立された場合には、病気の進行を遅らせ、時には病気を治癒させることができる。
【０００３】
感染症を検出するための従来の方法には、血清学検定、例えば補体結合（ＣＦ）、間接及び直接蛍光抗体（ＩＦＡ及びＤＦＡ）、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）、ラテックス凝集反応；急性感染期の患者から回収した感染性微生物を培養し識別する培養検定；並びに感染因子に対して特異的なモノクローナル抗体の使用を含む検定などがある。
【０００４】
病気の検出にはフローサイトメトリ分析も使用される。この分析は、懸濁液中の細胞又は粒子が１つずつ検知点を通過するときに、細胞のサイズ、形状及び内部の複雑さ、又は蛍光化合物によって検出することができる他の細胞成分を含む、細胞又は粒子のある物理的及び化学的特性を測定することを含む。検出方法に対するフローサイトメトリの使用は、例えばＷＯ９９／４７９３３に記載されている。この文献には、抗体を結合したビーズを検査試料と接触させることによって表面抗原を検出する方法が記載されている。試料中に標的抗原が存在する場合にはビーズ−抗体−抗原複合体が形成され、この複合体をフローサイトメトリによって検出する。
【０００５】
米国特許第６，１５９，７４８号には、血清試料中の抗体をフローサイトメータを使用して検出するキットが記載されている。具体的にはこのキットは、一連の抗原でコーティングされたビーズを含む。このビーズはそれぞれ異なるサイズを有し、異なる抗原を担持している。このビーズを、自己抗体を含むさまざまな抗体の検出に使用する。
【０００６】
当業者には理解されることだが、フローサイトメトリ機器を利用するときには、特別な訓練を積んだ技術者が、細胞試料の調製、データ収集及びデータ分析を実行しなければならない。フローサイトメトリ機器はレーザ及び複雑な光学系、高性能コンピュータ並びに電気及び流体系を含む。フローサイトメトリ機器を構成する諸システムには、適切な保守及び較正を定期的かつ頻繁に実施しなければならない。機器の高いコスト及びこのような機器を正確に操作するために必要な専門技術が、フローサイトメトリによる検出を複雑かつ高価なものにしている。明らかに、この理屈は、とりわけ酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）を含む他の多くの検査及び機器にも当てはまる。
【０００７】
ＷＯ０１／３３２１５及びＷＯ０２／７９７４９は、体液試料の微粒子成分のプロファイルを生成するシステムを記載している。これらのシステムは概して、体液試料の制御された流れを基質上に生じさせる装置を含み、体液試料のこの制御された流れが基質上に微粒子成分の示差的な分布を生み出し、拡大装置が、基質上の示差的に分布した微粒子状成分の拡大画像を提供する。この拡大画像は、体液試料の微粒子状成分のプロファイルを表す。記載されたシステムはさらに、体液試料中の微粒子成分のプロファイルを分析する画像分析器を含むことができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、流体試料中の分析物を光学画像分析器を利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出する、実行が容易な高速かつ高感度の方法を提供することにある。本発明の方法は、好ましくは治療的診断を対象とするが、他の応用、例えば生態学応用、環境応用などに対しても適当である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、本発明は、流体試料中の分析物を検出する方法を提供する。この方法は、
（ａ）前記流体試料を、結合対の第１の構成要素であって、前記結合対の第２の構成要素である分析物と結合することができる捕獲剤を含む試薬と混合して、流体試料中に分析物が存在する場合に結合対からなる微粒子が形成すること、
（ｂ）前記混合の結果として前記微粒子が形成された場合に、前記微粒子の薄層が固体基質上に形成されるように前記混合物を処理すること、
（ｂ）薄層の光学画像を得ること、及び
（ｃ）前記光学画像を分析して、結合対間の会合の結果として形成された微粒子の存在の有無を前記画像から判定し、試料中に微粒子が存在することは試料中に前記分析物が存在することを指示し、又は前記微粒子の少なくとも１つのパラメータを前記画像から決定することを含む方法。
【００１０】
本発明に基づくパラメータは、結合対間の会合の結果として形成された微粒子の粒径又は微粒子の粒径分布；微粒子の数；微粒子の形状；及び／又は形成された微粒子の空間分布とすることができる。ただしこれらに限定されるわけではない。
【００１１】
本発明はさらに、本発明の方法を実行するシステムを提供する。このシステムは、
（ａ）微粒子の薄層を担持している固体基質を保持する保持手段と、
（ｂ）固体基質上の薄層の画像を取り込む光学画像取得装置と、
（ｃ）前記画像取得装置に結合され、画像取得装置によって得られた画像を分析する画像分析装置とを備える。
【００１２】
このシステムは任意選択で拡大装置を備える。
【００１３】
本発明はさらに、本発明の方法で使用するキットを提供する。このキットは、
（ａ）結合対の第１の構成要素であり、結合対の第２の構成要素である分析物が流体試料中に存在する場合に分析物がそれに結合する少なくとも２つの捕獲部分を含む捕獲剤を含む少なくとも１種類の試薬を備え、
（ｂ）微粒子の薄層を担持する固体基質を備える。
【００１４】
次に、本発明の理解を提供し、本発明を実際に実施する方法を示すために、添付図を参照していくつかの実施形態を非限定的な例として説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、分析物、好ましくは被検者から得た生体流体試料中の分析物を診断する高速かつ簡単なｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、試料の分析に高度な機器又は専門技能を必要としない方法を提供する。加えて、本発明の方法は感度が高く、病気を初期の段階で検出することができ、この方法は、患者の特定の病気の発症から回復までを追跡し、病気に対して選択された治療の効果を監視するツールとなる。本発明の方法の高い感度は、分析試料中に分析物が存在する場合に（適当な試薬との混合後に）分析される試料中に形成される微粒子の薄層の生成に基づく。この薄層の形成は、微粒子の正確な画像分析によって、分析物に関する定性的及び定量的決定を得ることを可能にする。
【００１６】
上記の全体的な記述及び以下の具体的ないくつかの実施形態の記述はともに単に説明のために示したものであり、これらを、請求の発明を限定するものと解釈してはならないことを理解されたい。
【００１７】
したがって、本発明の一態様によれば、流体試料中の分析物を検出する方法が提供される。この方法は、
（ａ）前記流体試料を、結合対の第１の構成要素であって、前記結合対の第２の構成要素である分析物と結合することができる捕獲剤を含む試薬と混合することを含み、
その結果、流体試料中に分析物が存在する場合に結合対からなる微粒子が形成され、さらに、
（ｂ）前記混合の結果として前記微粒子が形成された場合に、前記微粒子の薄層が固体基質上に形成されるように前記混合物を処理すること、
（ｃ）前記薄層の光学画像を得ること、及び
（ｄ）前記光学画像を分析して、前記結合対間の会合の結果として形成された微粒子の存在の有無を前記画像から決定し、又は前記微粒子の少なくとも１つのパラメータを前記画像から決定することを含み、
試料中に微粒子が存在することが試料中に前記分析物が存在することを指示する。
【００１８】
本明細書で使用する用語「検出する」又は「検出」は、試料中の分析物の存在の定性的決定と定量的決定の両方をひとまとめに指す。
【００１９】
したがって、本発明の方法はさらに、流体試料中の標的分析物の分析的（定量的）検出を提供する。この実施形態すなわち定量的検出によれば、結合対の会合の結果形成された微粒子を特徴づける１つ又は複数のパラメータが決定される。このようなパラメータは当業者が容易に定義することができ、これには例えば、結合対の第１の構成要素と第２の構成要素の間の会合の結果形成された微粒子の粒径、微粒子の粒径分布、形成された微粒子の数（微粒子数）、分布パターンなどの決定が含まれる。上記のパラメータを分析的に決定するためには、後に説明するように、流体試料と試薬からなる薄層の形成が不可欠である。
【００２０】
本発明によれば、分析物と対応する捕獲剤との間の会合（結合又は複合体化）の結果、複合体が形成される。捕獲剤と分析物は一体として結合対を構成する。この結合対は例えば、レセプタ−リガンド、糖−レクチン及び抗体−抗原からなるグループから選択された１つの結合対である（用語「抗体」は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、可変の抗原−ビオチン結合部分を含む抗体の一部分などを指すものと理解しなければならない）。
【００２１】
本発明の第１の態様によれば、用語「分析物」は、タンパク質（例えば抗体、サイトカイン、レセプタ）、糖タンパク質、ペプチド、低分子量化合物などの細胞成分又は微生物成分を指し、被検者から得られた試料中でのこれらの成分の検出は、被検者が特定の病気又は障害を有しているかどうかを指示する。用語「分析物」が、合成又は天然の化学物質、薬物又は毒素を指すこともある。本発明のこの態様に基づく分析物は、２つの別個の捕獲剤がそれに結合することができる少なくとも２つの結合部位（認識部位）を含む。分析物のそれぞれの結合部位が個々の捕獲剤に結合すると、結合対の凝集体（本明細書ではこれを「微粒子」と呼ぶことがある）が形成される。
【００２２】
他の実施形態によれば、分析物が、その表面に少なくとも２つの結合（認識）部位を提示した粒子を指す。例えば分析物は、捕獲剤が結合する特定の抗原の２つ以上のコピーをその表面に提示した抗原提示粒子、例えば抗原提示細胞、ウイルス又は他の感染性微生物を含む。
【００２３】
本発明に基づく用語「捕獲剤」は、試料中の２つ以上の分析物に好ましくは特異的に結合することができ、これによって結合対からなる凝集体を形成する任意の二官能性又は多官能性剤を指す。したがって、捕獲剤は、流体試料中の分析物に独立に結合することができる捕獲部位をそれぞれ２つ、３つ又は４つ以上提示した二量体、三量体又は多量体分子を含む。捕獲剤は例えば、リンカーによって橋かけされたジペプチド又は二タンパク質（ｄｉｐｒｏｔｅｉｎ）とすることができる。好ましい一実施形態によれば、捕獲剤が、特定の捕獲部分でコーティングされたマイクロビーズである。捕獲剤は、原則として分析物がそれに対して親和性を有する結合部位である「捕獲部分」を含み、捕獲剤と分析物の間の会合は、捕獲剤の前記捕獲部分（部位）と分析物の認識部位との間の会合の結果である。以上の用語の意味は、以下の非限定的な実施例を検討すればさらに理解することができる。
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、捕獲剤が少なくとも２つのエピトープを含む粒子、分析物が、異なる捕獲剤の抗原エピトープが結合する（２つの結合部位を含む）抗体であり、或いはその逆に、捕獲剤が（２つの認識部位を含む）抗体、分析物が、２つの以上の抗体がそれに結合することができる少なくとも２つの抗原エピトープを含む抗原、又は２つ以上の抗体がそれに結合することができる少なくとも２つの抗原エピトープをその表面に提示した粒子である。
【００２５】
本発明の方法の第２の態様によれば、捕獲剤が、捕獲部分でコーティングされたマイクロビーズである。このマイクロビーズは、その検知界面に１種類の捕獲剤を含み、又はこのコーティングされたマイクロビーズをさまざまな検出検定で使用できるように数種類の捕獲剤を含むことができる。好ましくは「検知界面」は、微粒子の形成が可能なように１種又は数種の捕獲剤でコーティングしたビーズの外面を指す。
【００２６】
本発明に従って使用されるマイクロビーズは、単純な吸着によって、又は橋かけ剤の助けを借りて、或いは捕獲剤をマイクロビーズに接合させる当業者に周知の他の方法によって捕獲剤でコーティングした、ポリスチレン、ラテックスなどのポリマーからなることができる。本発明に基づくマイクロビーズをアフィニティービーズ（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｅａｄ）と呼ぶことができ、一実施形態によればマイクロビーズがイムノビーズ（ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ）である。
【００２７】
本発明に基づく試料は好ましくは生体流体試料を指し、より好ましくは、血液（血漿及び血清）、唾液、尿、体液由来の細胞部分（例えば血球）を含む任意の体液、或いは組織又は体腔から得ることができ、次いで本発明の方法によって検出するために適当な媒質中に懸濁させることができる細胞成分を指す。それでも、本発明に基づく試料を、例えば下水、貯水池、化学溶液などの中の分析物を検出するために他の起源からの試料とすることもできる。したがって、以下の実施例では生体試料に言及するが、本発明は、化学物質などの非生体試料中の分析物の検出にも適用されると解釈しなければならない。
【００２８】
得られる光学画像を試料の薄層の拡大像とすることができ、この拡大は、光学顕微鏡レンズの使用によって達成することができる。
【００２９】
光学顕微鏡レンズは、光学顕微鏡装置の中に構築し、又は試料中の微小像を光学的に見るための当技術分野で周知の他の技術手段の中に構築することができる。光学顕微鏡レンズは光学画像取得装置に結合することができる。
【００３０】
本明細書において（結合対を形成する）捕獲剤と分析物上の認識部位とに関して使用される用語「会合する」又は「会合」は、結合対からなる光学的に検出可能な微粒子状物質がその結果形成される、結合対の第１の構成要素と第２の構成要素の間の任意の結合を指す。したがって、用語「会合する」は全てのタイプの化学結合、例えばイオン結合、共有結合、金属結合、水素結合、ファンデルワールス結合及び電気双極子を含む。したがって、結合対間の会合は強い会合（例えば共有結合の場合）でも、又はウイーク会合（例えば水素結合）でもよく、いずれにしてもこの会合は、形成された微粒子を画像化することができる十分に安定なものである。
【００３１】
本発明の方法によれば、分析物が試料中に存在する場合に流体試料中に形成される微粒子状物質の光学画像化及び分析を可能にするために、流体試料中の分析物と試薬の混合物から得られた微粒子状物質の薄層が固体基質上に形成されることが不可欠である。
【００３２】
本発明に基づく「薄層」は、捕獲剤（結合対の第１の構成要素）と分析物（結合対の第２の構成要素）の間の会合の結果として形成された結合対からなる凝集体／微粒子の実質的に均一な層を指す。実質的に均一な層とは、１つの結合対（又は結合対を含む微粒子）が別の結合対（又は結合対を含む微粒子）の上に実質的に重なっておらず、層の垂直次元に微粒子／物体／凝集体が実質的に１つだけある層を意味する。本発明の一実施形態によれば薄層が単分子層である。
【００３３】
本発明に基づいて形成される層などの微粒子からなる実質的に均一な層又は単分子層を得る方法はいくつかある。微粒子の薄層は例えば、固体基質に微粒子を固定することによって、例えば試料−試薬混合物を担持した固体基質をスプレー式固定剤で飽和させ、又は適当な固定液に試料−試薬混合物を浸漬することによって；固体基質に対して不動化された捕獲剤を使用することによって；高比重捕獲剤（例えば捕獲部分でコーティングされた、重力によって検査チャンバの底に沈降する高比重ビーズ）を使用することによって；磁気捕獲剤を使用することによって（例えば捕獲部分でコーティングされた磁気ビーズ）；試料−捕獲剤混合物に機械的圧力をかける（例えば固体カバーをかける）ことによって；遠心力を使用して物質、一般に細胞を分離しその単分子層をスライド上に堆積させ、同時に物質の完全性を維持するサイトスピン（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ）技術を使用することによって得ることができる。
【００３４】
結合対が形成され、結合対からなる微粒子状物質の薄層が生み出された場合、本発明の方法は、担体流体から薄層を分離する追加のステップを含むことができる。担体流体から薄層を分離する方法は、例えばＬａＭｉｎａ社（米ヴァージニア州アーリントン（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ）、例えば米国特許第６，４２３，２３７号、６，１０６，４８３号、６，０９１，４８３号等。これらの特許は参照によって本明細書に組み込まれる）によってすでに開発されている。
【００３５】
本発明はさらに、本発明の方法を実行するシステムを提供する。このシステムは、
（ａ）微粒子の薄層を担持している固体基質を保持する保持手段と、
（ｂ）固体基質上の薄層の画像を取り込む光学画像取得装置と、
（ｃ）前記画像取得装置に結合され、画像取得装置によって得られた画像を分析する画像分析装置とを備えている。
【００３６】
このシステムはさらに拡大装置を備えることができる。好ましい一実施形態によれば、拡大装置は光学顕微鏡レンズを備え、より好ましい実施形態によれば拡大装置は光学顕微鏡である。
【００３７】
光学画像取得装置は、光学画像化の分野で知られている任意の光学画像取得装置とすることができるが、カメラであることが好ましい。拡大装置が存在する場合、画像取得装置は前記拡大装置に結合される。
【００３８】
一実施形態によれば、画像の分析は、試料中の分析物の存在及び濃度を指示する１つ又は複数のパラメータの決定を含む。パラメータは例えば、試料中の分析物と捕獲剤の間の相互作用の結果として形成された微粒子の粒径分布；前記相互作用の結果として形成された微粒子の数；前記微粒子の形状；及び／又は形成された微粒子の空間分布のなかから選択される。
【００３９】
本発明のシステムは任意選択で固体基質を備える。本発明に基づく固体基質は、検出対象試料を担持する任意の担体を含むことができ、試料中に分析物が存在する場合には、この上で、捕獲剤を含む試薬と分析物の間の会合を実施することができる。固体基質は、結合対の微粒子の薄層がその上に形成されるように設計される。したがって固体基質は顕微鏡スライド又は検査チャンバとすることができる。ただしこれらに限定されるわけではない。この点に関して、流体試料と試薬の混合を別の担体で実施し、次いで、形成された微粒子の薄層を固体基質に移して分析することができることを理解されたい。
【００４０】
或いは固体基質を、薄層の形態の微粒子が底に蓄積する容器とすることもできる。
【００４１】
光学画像取得装置（画像化センサ）は当技術分野ではよく知られており、したがってこれをさらに詳細に述べることはしない。装置の一例は、ビデオカメラ（例えばＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラ）を含み、これを顕微鏡に取り付けることができる。得られた画像をデータ処理ユニットに送り、これを周知の画像分析ソフトウェア（例えばイスラエルＢｅｉｔ−ＨａｅｍｅｋのＧａｌａｉ社によって開発された画像分析ソフトウェア又は特別に設計されたソフトウェア）によって分析して、凝集の結果形成された凝集体の数及び微粒子の粒径分布を決定することができる。微粒子の粒径分布は、検査検体中の分析物の濃度、及びインキュベーションの結果として捕獲剤と分析物の間に形成された複合体の数と相関していた。
【００４２】
本発明はさらに、本発明の方法で使用するキットを提供する。このキットは、
（ａ）結合対の第１の構成要素である捕獲剤を含む少なくとも１種類の試薬を備え、
前記捕獲剤が、結合対の第２の構成要素である分析物が検査流体試料中に存在する場合に分析物がそれに結合する少なくとも２つの捕獲部分を含み、さらに、
（ｂ）微粒子の薄層を担持する固体基質を備えている。
【００４３】
このキットはさらに、流体試料と捕獲剤とを含む混合物の薄層を生み出す手段を含むことができる。この手段は、使用する固体基質及び／又は捕獲試薬のタイプによって決まる。例えば、顕微鏡スライド又は検査チャンバを固体基質として使用する場合には、試料−試薬混合物の上にカバースライドをかけることによって薄層を生み出すことができる。このようにして流体試料に適用された圧力によって試料−試薬混合物の薄層が形成される。或いはこのキットは、固体基質上に捕獲剤を固定／不動化して薄層構造とする固定試薬を含むことができる。また、捕獲剤が磁性体からなる場合には、磁力を使用して薄層にすることもできる。
【００４４】
次に、添付図を参照し、以下の非限定的な実施例によって本発明を例示する。
【実施例１】
【００４５】
以下の実施例は、Ｄ−二量体に対する抗体でコーティングしたラテックスマイクロビーズ（Ｂｉｏｐｏｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、スウェーデンＵｍｅａ、カタログ番号１５０７０９、実施例１．１）、又はヘパリン／ＰＦ４複合体でコーティングされたポリマービーズ（ＤｉａＭｅｄ−ＩＤ  ＰａＧＩＡ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｇｅｌ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ）、カタログ番号０５００５１、ＤｉａＭｅｄ  ＡＧ社、１７８５  Ｃｒｅｓｓｉｅｒ  ｓ／Ｍｏｒａｔ、スイス、実施例１．２）を使用して実施した。
【００４６】
概要を説明する。血漿試料を、特定の捕獲剤でコーティングしたマイクロビーズとともに所定の時間インキュベートした。インキュベーション後、それぞれの試料にカバーをかけて混合物の薄層を形成し、光学顕微鏡スライドの上に置き、光学顕微鏡によって調べた。得られた薄層の画像を、顕微鏡に取り付けたビデオカメラ（ＣＣＤカメラ）によって撮影した。このようにして得た画像を、画像分析ソフトウェア（Ｇａｌａｉ社、イスラエルＢｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ）によって分析して、凝集の結果形成された凝集体の数及び微粒子の粒径分布を決定した。微粒子の粒径分布は、検査検体中の分析物の濃度、及びインキュベーションの結果として捕獲剤と分析物の間に形成された複合体の数と相関していた。
【００４７】
実施例１．１
血漿試料中のＤ−二量体の存在を決定するためＤ−二量体キット（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ社）を使用し、メーカの説明書に従って操作した。この特定の検定では、３つの血漿試料：（ｉ）非常に低濃度のＤ−二量体を含む血漿試料、（ｉｉ）中間的な濃度のＤ−二量体を含む血漿試料、又は（ｉｉｉ）高濃度のＤ−二量体を含む血漿試料について、Ｄ−二量体に対する抗体でコーティングされたマイクロビーズを使用してＤ−二量体の存在を調べた。マイクロビーズをそれぞれの試料とともに１分間インキュベートし、その後、（混合物の薄層を形成するため）試料にカバースライドを被せ、顕微鏡プレートに移し、先に記述したとおりに分析した。
【００４８】
得られた結果を図１Ａ〜１Ｃ及び２Ａ〜２Ｃに示す。具体的には、マイクロビーズとともにインキュベートした後の試料（ｉ）からとった顕微鏡検体は、顕微鏡によって観察される微粒子を実質的に形成しなかった（図１Ａ）。さらに、この検体から得られた画像の分析から、Ｄ−二量体とマイクロビーズの間の複合体化によって形成された微粒子の平均粒径は２１．６±１．８μｍ２であることが明らかになった（図２Ａ）。
【００４９】
中間的な濃度のＤ−二量体を含む試料（ｉｉ）からとった顕微鏡検体は、顕微鏡で見ることができる凝集体を生成した（図１Ｂ）。さらに、この検体から得られた画像の分析から、微粒子の粒径分布が移動し、微粒子の平均粒径は４８．３±２７．２μｍ２であることが明らかになった（図２Ｂ）。
【００５０】
最後に、高濃度のＤ−二量体を含む試料（ｉｉｉ）からとった検体もまた、顕微鏡で見ることができる凝集体を生成し（図１Ｃ）、この検体から得られた画像の分析から、微粒子の粒径分布が（図２Ｂと比べて）さらに移動し、微粒子の平均粒径は１５６±１５５μｍ２であることが明らかになった（図２Ｃ）。
【００５１】
凝集体の粒径分布の検出から得られたこれらの結果は、試験試料中のＤ−二量体の濃度と相関している。
【００５２】
さらに、血漿試料中のＤ−二量体濃度の滴定曲線を求めた。具体的には、異なる濃度のＤ−二量体を含む血漿試料を、抗Ｄ−二量体抗体でコーティングしたビーズとともに１分間インキュベートし、その後、これらの試料からとった検体を光学顕微鏡を使用して分析した。図３は、インキュベーション期間終了直後に得た滴定曲線を表し、この図は、試料中に存在するＤ−二量体分子とこの試料とともにインキュベートしたマイクロビーズとの間の複合体化の結果として形成された凝集体の平均粒径と試料中のＤ−二量体濃度との間には直線的な相関関係があることを示している。これらの結果は、本発明の方法は定性的決定に使用できるだけでなく、定量的決定用の分析的ツールとしても使用できることを示唆している。
【００５３】
実施例１．２
ＨＩＴ症候群は、ヘパリン治療を受けている一部の患者の血小板膜の表面に位置するヘパリンと血小板第４因子（ＰＦ−４）の複合体に対する免疫反応に起因する。この反応の結果は、免疫によって媒介された血小板減少であり、又は、数は少ないが皮膚又は他の器官の血栓症である。以下の検定では、ヘパリン及びＰＦ−４でコーティングしたビーズを使用する。このビーズは患者の血漿と相互作用する。陽性反応の場合、ビーズの凝集体が捕捉される。
【００５４】
この目的のため、この検定では、ＤｉａｍｅｄのＨＩＴキット（ＤｉａＭｅｄ社、スイスＣｒｅｓｓｉｅｒ）を使用し、メーカの説明書にしたがって操作して、陽性試料及び陰性試料を決定した。概要としては、血漿試料をＩＤ−ＰａＧＩＡポリマー粒子と混合比５：１で混合し、室温で５分間インキュベートした。それぞれの試料から検体を得、先に記述したとおりに分析した。
【００５５】
１４の血漿試料を検査した。Ｄｉａｍｅｄキットによればうち４試料は陰性、１０試料は陽性であった。画像分析器によって得られた微粒子の平均粒径を図４に示す。この図は、陰性対照群の微粒子の平均サイズが１１．６±１．２μｍ２であり、陽性群のそれが３９．７±４．４μｍ２であることを示している。このデータの不対（ｕｎｐａｉｒｅｄ）スチューデントｔ検定分析は、陰性対照群と陽性群との間のｐ＜０．００２の有意の差を示した。
【実施例２】
【００５６】
本発明の方法をさらに血液型の型別に適用した。血液試料は（血液型不明の）供血者から採取した。これらの血液試料を抗凝固剤（ＥＤＴＡ）で処理し、血液希釈緩衝液（０．９％ＮａＣｌ／２％ウシアルブミン）で希釈した（１００倍）。この希釈血液数滴（１０μｌ）を、抗体で予めコーティングしておいたスライドに載せた。このコーティングは、抗Ａ型抗体又は抗Ｂ型抗体（濃度０．２から０．５ｍｇ／ｍｌの抗体１０μｌ）をスライドに載せ、このスライドを空気乾燥させることによって達成した。
【００５７】
代替手順では、血液試料を抗凝固剤（ＥＤＴＡ）で処理し、血液希釈緩衝液で希釈した（５０倍）、次いで、希釈した血液試料（５μｌ）を抗Ａ型抗体又は抗Ｂ型抗体（５μｌ、０．２から０．５ｍｇ／ｍｌ）と混合し、混合したそれぞれの試料滴をスライドに載せた。
【００５８】
いずれの場合も分析前に検査混合物の薄層が生じた。
【００５９】
対照として、抗凝固剤で処理した血液試料を、抗Ａ型抗体も抗Ｂ型抗体も存在しないコーティングしていないスライドに載せた。他の対照として、血液型既知の血液試料を、他の血液型に対する抗体と混合した（例えばＡ型血液を抗Ｂ型抗体と混合した）。
【００６０】
これらの血液試料（対照又は抗体と混合した試料）を１５秒間インキュベートし、次いで試料滴の上にカバーガラスを載せて試料の薄層を形成させた（カバーガラスはスライドに直接接触させず、例えばスライドから０．５〜１．０ｍｍの距離をおいた）。次いで、カバーされた血液滴試料の中心を軽く１０回押し、画像分析器（Ｇａｌａｉ社）に接続されたＣＣＤカメラを使用して光学画像を得た。
【００６１】
図５Ａに陰性反応の光学画像を示す。このケースでは特にＡ型血液と抗Ｂ抗体の間の反応が示されている。図５Ｂに、陽性反応の画像である、Ａ型血液と抗Ａ抗体の間の反応を示す。この反応は、２つの捕獲剤を担持した抗体と対応する複数の抗原を担持した血球との間の会合の結果として形成された目に見える微粒子（凝集体）によって示されている。
【００６２】
さらに、スライド上の凝集体の平均粒径及び表面被覆率を求めた。結果を表１及び図６に示す。この表及び図から血液型が導き出された。
【００６３】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】Ｄ−二量体に対する複数の抗体でコーティングしたマイクロビーズとともにインキュベートした光学顕微鏡像を示す。血漿試料は、非常に低い濃度のＤ−二量体（図１Ａ）、中間的な濃度のＤ−二量体（図１Ｂ）又は高濃度のＤ−二量体を含有する。
【図２】Ｄ−二量体に対する抗体でコーティングしたマイクロビーズにＤ−二量体が結合した結果形成された微粒子の粒径分布を示す棒図である。Ｄ−二量体に対する複数の抗体でコーティングしたマイクロビーズを、低濃度のＤ−二量体（図１Ａ）、中間的な濃度のＤ−二量体（図２Ｂ）又は高濃度のＤ−二量体（図２Ｃ）を含有する血漿試料とともにインキュベートした。
【図３】さまざまな濃度のＤ−二量体を含む血漿試料の滴定の結果得られた微粒子の平均粒径を示す。
【図４】ヘパリン誘導性血小板減少（ＨＩＴ）試料を用い、Ｄｉａｍｅｄキットを使用して得られた微粒子の平均粒径を示す（陰性試料（ｎ＝４）及び陽性試料（ｎ＝１０））。
【図５】希釈緩衝液（０．９％ＮａＣｌ／２％ウシアルブミン）と混合して１００倍の最終希釈率を与える、ＥＤＴＡ抗凝固剤で処理したＡ型血液試料の光学顕微鏡像を示し、抗Ａ型抗体（図５Ａ）又は抗Ｂ型抗体（図５Ｂ）を、最終濃度が０．１から０．２５ｍｇ／ｍｌになるように加え、次いでこの混合物を穏やかにかき混ぜながら１分間インキュベートし、その後、光学顕微鏡によって調査した。図５Ｂは陰性反応の画像を示す一方、図５Ａは陽性反応の画像を示す。
【図６】本発明の方法を実行することによって取得し決定した、抗Ａ型抗体又は抗Ｂ型抗体とともにインキュベートしたＯ、Ａ及びＡＢ型血液の凝集体の平均粒径を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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