(57)【要約】高コレステロール血症を減少させ、従って、心血管病のリスクを減少させる組成物および方法を提供する。そのような組成物は、単離された油体結合蛋白質を含んでいてもよい。加えて、１つ以上の油体結合蛋白質が添加された食品を提供する。さらに、本発明で使用される組成物は、例えば、サポニン、イソフラボン、リン脂質、消化に対して実質的に耐性のある炭水化物、またはその組合せといった添加剤化合物を含んでいてもよい。本発明の方法および組成物を使用して、対象のコレステロールおよび他の脂質レベルを低下させ、心血管病のリスクを減少させることを達成することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）選択された食品を得；次いで
（ｂ）単離された油体結合蛋白質を食品に添加し、ここに有効量の該食品を消費することにより、その必要がある対象の血清中コレステロールを減少させる工程を含む食品の製法。
【請求項２】
さらに、サポニン、フィトエストロゲン、リン脂質、および実質的に消化に対して耐性のある炭水化物よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物を添加することを特徴とする請求項１記載の製法。
【請求項３】
油体結合蛋白質がリポ蛋白質を含む請求項１記載の製法。
【請求項４】
油体結合蛋白質がオレオシンを含む請求項１記載の製法。
【請求項５】
食品が大豆をベースにしたものである請求項１記載の製法。
【請求項６】
添加の工程前に、食品が油体結合蛋白質を欠乏している請求項１記載の製法。
【請求項７】
添加の工程前に、食品が油体結合蛋白質を含む請求項１記載の製法。
【請求項８】
食品が、大豆粉、大豆グリット、大豆ミール、大豆フレーク、豆乳粉、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白質単離体および単離された大豆ペプチドよりなる群から選択される請求項５記載の製法。
【請求項９】
大豆蛋白質単離体が、プロテアーゼで処理された大豆材料の高分子量画分である請求項８記載の製法。
【請求項１０】
単離された大豆ペプチドが、β−コングリシニン、またはその断片を含む請求項８記載の製法。
【請求項１１】
単離された大豆ペプチドが、グリシニン、またはその断片である請求項８記載の製法。
【請求項１２】
（ａ）グリシニンおよび／またはβ−コングリシニン、またはその断片；および
（ｂ）油体結合蛋白質を含み、
ここにグリシニンおよび／またはβ−コングリシニンおよび油体結合蛋白質は、その必要がある対象の高コレステロール血症の治療または予防に対して相乗効果を供するのに有効な量で存在させることを特徴とする高コレステロール血症を治療または予防するための組成物。
【請求項１３】
グリシニンまたはβ−コングリシニンが、酵素または酵素の混合物によって、少なくとも部分的に加水分解された請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
グリシニン、またはその断片、および精製された油体結合蛋白質を含む請求項１２記載の組成物。
【請求項１５】
β−コングリシニン、またはその断片、および精製された油体結合蛋白質を含む請求項１２記載の組成物。
【請求項１６】
組成物が、約１％ないし約５％の油体結合蛋白質を含む請求項１２記載の組成物。
【請求項１７】
組成物が、約５％ないし約１０％の油体結合蛋白質を含む請求項１２記載の組成物。
【請求項１８】
組成物が、約１０％を超える油体結合蛋白質を含む請求項１２記載の組成物。
【請求項１９】
組成物が、約３０％ないし約５０％の油体結合蛋白質を含む請求項１２記載の組成物。
【請求項２０】
サポニン、フィトエストロゲン、リン脂質、および実質的に消化に対して耐性のある炭水化物よりなる群から選択される少なくとも１つの添加剤化合物を含む請求項１２記載の組成物。
【請求項２１】
フィトエストロゲンがイソフラボンを含む請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
イソフラボンが、ゲニステイン、ダイゼイン、イーコール、ビオカニンＡ、ホルモノネチン、およびそれらのそれぞれの天然に生じるグルコシドおよびグルコシドコンジュゲートよりなる群から選択される請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
炭水化物が、高アミロース澱粉、オリゴ糖、および大豆子葉繊維よりなる群から選択される請求項２０記載の組成物。
【請求項２４】
リン脂質が、レシチン、リゾレシチン、および修飾された脂肪酸組成を持つレシチンよりなる群から選択される請求項２０記載の組成物。
【請求項２５】
サポニンが、大豆サポニンＡ、サポニンＢ、サポニンＥ、サポゲノールＡ、サポゲノールＢ、およびサポゲノールＥよりなる群から選択される請求項２０記載の組成物。
【請求項２６】
油体結合蛋白質がリポ蛋白質を含む請求項２０記載の組成物。
【請求項２７】
リポ蛋白質が、哺乳動物リポ蛋白質、卵黄リポ蛋白質または脂肪小球膜蛋白質である請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
単離された油体結合蛋白質がオレオシンである請求項２０記載の組成物。
【請求項２９】
単離された油体結合蛋白質が、オレオシンの低分子量画分である請求項２０記載の組成物。
【請求項３０】
油体結合蛋白質が、両親媒性配列を含有するポリペプチド断片を含む請求項２０記載の組成物。
【請求項３１】
グリシニンが、グリシニンの基本的サブユニットである請求項１２記載の組成物。
【請求項３２】
グリシニンの基本的サブユニットがＢ−１ｂサブユニットである請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
β−コングリシニンがα’サブユニットまたはその断片である請求項１２記載の組成物。
【請求項３４】
さらに、４０％を超えるβ−コングリシニンまたはその断片を含む請求項１２記載の組成物。
【請求項３５】
さらに、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：９、配列番号：１０および配列番号：１１よりなる群から選択される１以上のポリペプチド配列を含む請求項１２記載の組成物。
【請求項３６】
（ａ）油体結合蛋白質を、選択された食品に添加し；次いで
（ｂ）その必要がある対象に、高コレステロール血症を治療または予防するのに十分な量の食品を供する工程を含む高コレステロール血症を治療または予防する方法。
【請求項３７】
さらに、サポニン、フィトエストロゲン、リン脂質、および実質的に消化に対して耐性のある炭水化物よりなる群から選択される食品に、少なくとも１つの化合物を添加することを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
油体結合蛋白質がリポ蛋白質を含む請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
油体結合蛋白質がオレオシンを含む請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
食品が大豆をベースにしたものである請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
添加の工程前に、食品が油体結合蛋白質を欠乏している請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
添加の工程前に、食品が油体結合蛋白質を含む請求項３６記載の方法。
【請求項４３】
食品が、大豆粉、大豆グリット、大豆ミール、大豆フレーク、豆乳粉、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白質単離体および単離された大豆ポリペプチドよりなる群から選択される請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
大豆蛋白質単離体が、プロテアーゼで処理された大豆材料の高分子量画分である請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
単離された大豆ポリペプチドが、β−コングリシニン、またはその断片を含む請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
単離された大豆ポリペプチドが、グリシニン、またはその断片である請求項４３記載の方法。
【請求項４７】
治療上有効量の精製された油体結合蛋白質を含む医薬組成物を、その必要がある対象に投与することを特徴とする高コレステロール血症を治療または予防する方法。
【請求項４８】
医薬組成物が、丸剤またはカプセル剤として投与される請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
医薬組成物が、栄養サプリメントとして投与される請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
全血清中コレステロールの濃度を減少させることによって、心血管病が予防される請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
低密度リポ蛋白質の濃度を減少させることによって、血清中コレステロール濃度が低下する請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
高密度リポ蛋白質の濃度を上昇させることによって、血清中コレステロール濃度が低下する請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
血清中の中性脂肪の濃度を減少させることによって、心血管病が予防される請求項４７記載の方法。
【請求項５４】
肝臓コレステロールの濃度を低下させることによって、心血管病が治療される請求項４７記載の方法。
【請求項５５】
配列番号：１のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％の配列相同性を有しかつそれと同じ生物学活性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００２年４月１８日に出願された米国特許仮出願シリアル番号６０／３７３，４６０の優先権を主張し、その全開示は、引用によって本明細書中に具体的に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、コレステロールレベルを低下させかつ心血管病のリスクを減少させるための新規組成物、ポリペプチドおよび方法に関する。さらに具体的には、本発明は、上昇したコレステロールおよび心血管病を予防および治療するための油体結合蛋白質を含む新規組成物およびその使用に関する。
【０００３】
発明の背景
心血管病は、ヒト人口内で、羅患率および死亡率の主な原因である。これは、特にアメリカ合衆国および西ヨーロッパの国々でそうである。数多くの原因となる要因が、心血管病の発症と関連付けられてきた。これらの要因のいくつかは、疾患に対する遺伝的素因、喫煙および食事といったライフスタイル要因、年齢、性別、高血圧症、および高コレステロール血症を含む高脂血症を含む。これらの要因の多く、特に高脂血症および高コレステロール血症は、心血管病の主要な原因であるアテローム硬化症の発症の一因となる。
【０００４】
高血中コレステロール濃度は、ヒトの心血管病の主なリスク要因の１つである。上昇した低密度リポ蛋白質コレステロール（「ＬＤＬ」）および全コレステロールは、冠動脈心疾患の増加するリスクに直接的に関係している(Andersonら, 1987)。全コレステロールおよびＬＤＬの高レベルは、アテローム硬化症および血管性疾患を発症させるリスク要因だが、高密度リポ蛋白質コレステロール（「ＨＤＬ」）の欠乏症は、最近、これらの疾患を発症させるさらなるリスク要因として認識されている。いくつかの臨床試験は、アテローム硬化症に対するＨＤＬの保護的役割の理論を支持する。１つのそのような研究は、女性において、血液中のＨＤＬの各１−ｍｇ／ｄｌの増加が、冠動脈心疾患のリスクを３％減少させることを示した(Gordonら, 1989)。
【０００５】
研究は、食事の変化がヒトにおけるコレステロールを減少させることができると示した。これらの中で、特定の研究は、摂取された蛋白質の質ならびに量は、血清中コレステロールレベルに大きな影響を及ぼすことを示した(Carol and Hamilton, 1975; Nagaokaら, 1992; Potter, 1995)。食事の際に、動物性蛋白質の代わりに、植物性蛋白質物質を摂取することは、心血管病のリスクの低下に関係しており、これは、血清中コレステロールレベルの減少を反映しているかもしれない。特に、大豆蛋白質、植物性蛋白質は、動物性蛋白質カゼインに対して、血清中コレステロールレベルを減少させることが示されている(Nagaokaら, 1999)。大豆蛋白質摂取がヒトの血清中脂質に及ぼす影響に関するより最近のメタ分析によって、食物大豆蛋白質は、ＨＤＬ−コレステロール濃度に有意な影響を及ぼすことなしに、ヒトにおける全コレステロールおよびＬＤＬの血清中濃度を低下させることに有意に関係していることが示されている(Andersonら, 1995)。
【０００６】
コレステロールを低下させる大豆蛋白質の能力の原因である剤の１つは、高分子量画分（ＨＭＦ）である。ＨＭＦは、大豆蛋白質の非−消化性蛋白質から成り、これは、タンパク分解性消化の後も無処置のまま残る。すなわち、この画分は、多くの異なるペプチドまたはペプチド断片で構成されている。事実、大豆蛋白質のＨＭＦは、動物およびヒト治験の両方において、血清中コレステロールを有意に減少させることを示した。非−消化性ＨＭＦは、刷子縁膜によるコレステロールの受動的な取り込みの阻止またはコレステロールの蛋白質−媒介性取り込みの阻止のいずれかによって、コレステロールの取り込みを防ぐと考えられている。対照的に、低分子量画分、大豆蛋白質の消化性画分は、実際に、血清中コレステロールを増加させることが示されている(Suganoら, 1988)。
【０００７】
コレステロール低下剤としての大豆蛋白質、特にＨＭＦの潜在的治療価値にもかかわらず、その非−消化性および低コレステロール血症活性の原因である具体的な成分は未だ決定されていない。すなわち、コレステロールを減少させ、かつ心血管病と関連している他のリスク要因を減少させるより強力な治療剤を提供するために、これらの活性成分を同定する必要性は依然として存在している。
【０００８】
発明の概要
１つの態様において、本発明は、（ａ）選択された食品を得；次いで（ｂ）単離された油体結合蛋白質を食品に添加し、ここに有効量の該食品を消費することにより、その必要がある対象の血清中コレステロールを減少させる工程を含む食品の製法を提供する。特定の具体例において、該方法は、さらに、サポニン、フィトエストロゲン、リン脂質、および実質的に消化に対して耐性のある炭水化物よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物を添加することを特徴とする。油体結合蛋白質は、リポ蛋白質および／またはオレオシンを含んでいてもよい。１つの具体例において、食品は大豆をベースにしたものである。組成物は、添加の工程前に、油体結合蛋白質を欠乏していてもあるいは含んでいてもよい。食品の例は、大豆粉、大豆グリット、大豆ミール、大豆フレーク、豆乳粉、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白質単離体および単離された大豆ポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の特定の具体例において、大豆蛋白質単離体は、プロテアーゼで処理された大豆材料の高分子量画分である。さらなる具体例において、単離された大豆ポリペプチドは、β−コングリシニン、またはその断片を含みおよび／またはグリシニン、またはその断片である。
【０００９】
もう１つの態様において、本発明は、（ａ）グリシニンおよび／またはβ−コングリシニン、またはその断片；および（ｂ）油体結合蛋白質を含み、ここにグリシニンおよび／またはβ−コングリシニンおよび油体結合蛋白質は、その必要がある対象の高コレステロール血症の治療または予防に対して相乗効果を供するのに有効な量で存在させることを特徴とする高コレステロール血症を治療または予防するための組成物を提供する。１つの具体例において、グリシニンまたはβ−コングリシニンは、酵素または酵素の混合物によって、少なくとも部分的に加水分解される。さらなる具体例において、組成物は、グリシニン、またはその断片、および精製された油体結合蛋白質を含み、もう１つの具体例において、それはβ−コングリシニン、またはその断片、および精製された油体結合蛋白質を含む。本発明の特定の具体例において、組成物は、油体結合蛋白質を、約１重量％ないし約５重量％、約５重量％ないし約１０重量％、約１０重量％以上、または約３０重量％ないし約５０重量％含んでいてもよい。
【００１０】
本発明によって提供される組成物は、さらに、サポニン、フィトエストロゲン、リン脂質、および消化に対して実質的に耐性のある炭水化物を含む少なくとも１つの添加剤化合物を含んでいてもよい。フィトエストロゲンの一例は、イソフラボンである。イソフラボンの例は、ゲニステイン、ダイゼイン、イーコール、ビオカニンＡ、ホルモノネチン、およびそれらのそれぞれの天然に生じるグルコシドおよびグルコシドコンジュゲートを含む。炭水化物の例は、高アミロース澱粉、オリゴ糖、および大豆子葉繊維を含む。本発明の１つの具体例において、リン脂質は、レシチン、リゾレシチン、および修飾された脂肪酸組成物を持つレシチンよりなる群から選択される。さらなる具体例において、サポニンは、大豆サポニンＡ、サポニンＢ、サポニンＥ、サポゲノールＡ、サポゲノールＢ、およびサポゲノールＥよりなる群から選択される。油体結合蛋白質は、哺乳動物リポ蛋白質、卵黄リポ蛋白質または脂肪小球膜蛋白質を含むリポ蛋白質を含む。また、油体結合蛋白質は、オレオシンの低分子量画分を含むオレオシンであってもよい。
【００１１】
本発明の１つの具体例において、油体結合蛋白質は、両親媒性配列を含有するポリペプチド断片を含む。組成物がグリシニンを含む場合、それは、Ｂ−１ｂサブユニットを含むグリシニンの基本的サブユニットを含んでいてもよい。また、組成物は、α’サブユニットまたはその断片を含むβ−コングリシニンを含んでいてもよい。さらに、組成物は、４０％を超えるβ−コングリシニンまたはその断片を含んでいてもよい。さらに、組成物は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：９、配列番号：１０および配列番号：１１よりなる群から選択される１以上のポリペプチド配列を含んでいてもよい。
【００１２】
もう１つの態様において、本発明は、ａ）油体結合蛋白質を、選択された食品に添加し；次いで（ｂ）その必要がある対象に、高コレステロール血症を治療または予防するのに十分な量の食品を供する工程を含む高コレステロール血症を治療または予防する方法を提供する。さらに、該方法は、サポニン、フィトエストロゲン、リン脂質、および消化に実質的に耐性のある炭水化物よりなる群から選択される食品に、少なくとも１つの化合物を添加することを特徴としていてもよい。１つの具体例において、油体結合蛋白質は、例えばオレオシンといったリポ蛋白質を含む。もう１つの具体例において、食品は大豆をベースにしたものである。食品の例は、大豆粉、大豆グリット、大豆ミール、大豆フレーク、豆乳粉、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白質単離体および単離された大豆ポリペプチドを含む。食品は、添加の工程前に、油体結合蛋白質を欠乏していてもあるいは含んでいてもよい。大豆蛋白質単離体は、プロテアーゼで処理された大豆材料の高分子量画分を含んでいてもよい。本発明の特定の具体例において、単離された大豆ポリペプチドは、β−コングリシニン、またはその断片を含んでおり、および／またはグリシニン、またはその断片である。
【００１３】
さらにもう１つの態様において、本発明は、高コレステロール血症を治療または予防する方法を提供し、これは、治療上有効量の精製された油体結合蛋白質を含む医薬組成物を、その必要がある対象に投与することを特徴とする。医薬組成物は、丸剤またはカプセル剤として、または栄養サプリメントとしてといった手段を含むいずれの手段で投与されてもよい。方法において、心血管病は、全血清および／または肝臓コレステロールまたは中性脂肪の濃度を減少させることによって予防することができる。血清コレステロール濃度は、低密度リポ蛋白質の濃度を減少させ、高密度リポ蛋白質の濃度を増加させることによって、低下させることができる。
【００１４】
さらにもう１つの態様において、配列番号：１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％配列相同性を有し、かつそれと同じ生物学的活性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが提供される。
【００１５】
発明の詳細な記載
本発明は、心臓血管の健康利益を有する組成物を同定することにより、従来技術の限界を克服する。特に、本発明の１つの態様は、油体結合蛋白質はコレステロールレベルを低下させることができるという発見に関する。大豆蛋白質といった植物構成成分は、低コレステロール血症活性を有することが知られていたが、この活性の原因である特定の成分は、今まで特徴付けられることがなかった。すなわち、本発明は、オレオシンおよび卵黄リポ蛋白質を含む油体結合蛋白質は、コレステロールを低下させる特有の能力を、植物性蛋白質に与えることができるという発見に関する。同様に、本発明は、これらの特有の構成成分と大豆食品といった植物性物質との相乗的組合せに属する。いずれの特定の理論に縛られることなしに言えば、油体結合蛋白質は、大豆材料中に存在する生理活性ペプチドの消化を妨げ、それにより、組成物の低コレステロール血症活性を相乗的に高めると考えられる。加えて、本発明は、大豆材料と、サポニン、フィトエストロゲン、リン脂質および消化に実質的に耐性のある炭水化物、またはそのいずれかの組合せよりなる群から選択される添加剤成分と組合せて、さらに該組合せの低コレステロール血症活性を高める組成物の相乗的組合せに関する。また、本発明は、単独で、あるいは他の化合物と組み合わせてこれらのペプチドを治療上で使用して、血液中の全コレステロール濃度を低下させ、特に、ＬＤＬ−コレステロール濃度を減少させ、心血管病の発症を阻害することも網羅する。
【００１６】
油体は小さく、球状の細胞下小器官であり、これは貯蔵されたトリアシルグリセリドを包含しており、多くの植物によって使用されるエネルギー貯蔵である。ほとんどの植物および異なる組織内で見受けられるが、それらは特に、脂肪種子の種子中に豊富であり、ここに、通常、それらは直径１ミクロン以下ないし数ミクロンのサイズの範囲である。油体は、典型的には、トリアシルグリセリドで構成され、リポ蛋白質および蛋白質に囲まれている。「油体結合蛋白質」は、これらの蛋白質およびリポ蛋白質のいずれかおよび全てを含み、これらは、物理的に油体に結合している。植物において、主要な油体結合蛋白質はオレオシンである。オレオシンは、トウモロコシ、セイヨウアブラナ、ニンジンおよび綿を含む多くの植物源からクローン化され、配列決定されてきた。異なる種からのオレオシンは、典型的には、高度に保存的である。
【００１７】
Ｉ．略語および定義
本発明の理解を容易にするため、本明細書中で使用される多くの用語および略語を、下記のとおり定義する：
ＨＭＦ＝高分子量画分
本明細書中で使用されるごとく、「高分子量画分」は、植物性蛋白質単離体の画分を指し、これは単離体の加水分解性消化または化学的消化の後も残り、４，０００ないし１０，０００ｘｇにて、１５ないし２０分間、ｐＨ６ないし７で遠心分離によって分離することができる。
【００１８】
本明細書中で使用するごとく、「添加剤化合物」は、本発明の組成物に添加される単一の化合物または化合物の群を集合的に指す。これらの化合物は、サポニン、フィトエストロゲン、リン脂質、および炭水化物よりなる群から選択される。
【００１９】
本明細書中で使用されるごとく、用語「アミノ酸」は、その最も広範囲な意味で使用され、アミノ酸類似体および誘導体を含む天然に生じるアミノ酸ならびに天然に生じないアミノ酸を含む。後者は、アミノ酸部位を含有する分子を含む。当業者は、この広範囲な定義を見れば、本明細書中でのアミノ酸への言及は、例えば、天然に生じる蛋白新生Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸類似体および誘導体のような化学的に修飾されたアミノ酸；ノルロイシンといった天然に生じる非−蛋白新生アミノ酸、（β−アラニン、オルニチン等）；およびアミノ酸の特徴として当該分野で知られる性質を有する化学的に合成された化合物を含むことを認識するだろう。
【００２０】
本明細書中で使用されるごとく、用語「蛋白新生」は、アミノ酸は、代謝経路を介して、細胞内のペプチド、ポリペプチド、または蛋白質に組み込まれ得ることを示す。
【００２１】
本明細書中で使用されるごとく、用語「医薬上許容される塩」は、アルカリ金属塩および遊離酸または遊離塩基の付加塩を形成するのに一般的に使用される塩を含む。塩の性質は、それが医薬上許容されれば、重要ではない。
【００２２】
本明細書中で使用されるごとく、「分泌配列」または「シグナルペプチド」または「シグナル配列」は、新たに合成された分泌蛋白質または膜蛋白質を、小胞体の膜へ向け、およびそれを介し、あるいは細菌の内膜を横切って細胞質からペリプラズムへ向け、あるいはミトコンドリアのマトリックスから内方空間へ向け、あるいはクロロプラストの間質からチラコイドへ向ける配列を意味する。そのような配列の異種宿主内で発現される遺伝子への融合は、宿主細胞からの再組換え蛋白質の分泌を確証する。
【００２３】
本明細書中で使用されるごとく、「ポリペプチド」および「オリゴペプチド」は、相互交換可能に使用され、ペプチド結合によって一緒に結合した少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを意味する。
【００２４】
本明細書中で使用されるごとく、「配列」は、例えばポリペプチド中のアミノ酸の順序またはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序といった直線的順序を意味し、ここに単量体は、ポリマー中で生じる。
【００２５】
本明細書中で使用されるごとく、「粉砕全大豆」は、例えば大豆の外皮および芽を含む全大豆をほぐすあるいはすりつぶすことによって形成された大豆材料を含む。粉砕全大豆材料は、大豆に固有な脂肪を含有していてもよく、あるいは脱脂されていてもよい。
【００２６】
本明細書中で使用されるごとく、「大豆粉」は、例えば、水分無し基準で、６５重量％未満の大豆蛋白質内容量を含有する大豆材料を含み、これは、外皮を取った大豆から形成され、１５０ミクロンまたはそれ未満の平均的粒子サイズを有する。用語「大豆粉」は、例えば豆乳粉を含んでいてもよい。大豆粉は、大豆に固有な脂肪を含有していてもよく、あるいは脱脂されていてもよい。
【００２７】
本明細書中で使用されるごとく、「大豆グリット」は、例えば、水分無し基準で、６５重量％未満の大豆蛋白質内容量を含有する大豆材料を含み、これは外皮を取った大豆から形成され、１５０ミクロンないし１０００ミクロンの平均的粒子サイズを有する。大豆グリットは、大豆に固有な脂肪を含んでいてもよく、あるいは脱脂されていてもよい。
【００２８】
本明細書中で使用されるごとく、「大豆ミール」は、例えば、水分無し基準で６５重量％未満の大豆蛋白質内容量を含有している大豆材料を含み、これは外皮のない大豆から形成され、大豆粉または大豆グリットの定義内に収まらない。大豆ミールは、大豆に固有な脂肪を含有していてもよく、あるいは脱脂されていてもよい。
【００２９】
本明細書中で使用されるごとく、「大豆フレーク」は、例えば、大豆蛋白質材料を含み、これは水分無し基準で６５重量％の大豆蛋白質内容量を含有するほぐされた大豆材料であり、外皮を取った大豆をほぐすことによって形成されたものである。大豆フレークは、大豆に固有な脂肪を含有していてもよく、あるいは脱脂されていてもよい。
【００３０】
本明細書中で使用されるごとく、「大豆蛋白質濃縮物」は、例えば、大豆蛋白質材料を含み、これは上質で傷んでおらず、清潔で、外皮のない大豆種子から調製される。大豆蛋白質濃縮物は、ほとんどの油脂および水溶性非−蛋白質構成成分を除去することによって調製することができ、典型的には、水分無し基準で６５％以上の蛋白質を含有する。また、もう１つの具体例において、「大豆蛋白質濃縮物」は、大豆蛋白質およびリン脂質の混合物をさらに含み、ここに、水分無し基準での全蛋白質は、約６５ないし約９０％蛋白質であると解釈されてもよい。典型的には、これは、３つの基本的な工程によって、外皮のない、脱脂された大豆から生成され、この３つの工程とは：酸ろ過（約ｐＨ４．５にて）、アルコールによる抽出（約５５ないし８０％）、次いで、水で抽出する前に湿気を含んだ熱で蛋白質を変性させることである。低水溶性（水性アルコール抽出）大豆蛋白質濃縮物は、熱（蒸気注入または噴流煮沸）および機械的作業（均質化）に付されて、溶解性および機能性を増加させる。水分無し基準で全蛋白質が６５および９０％蛋白質である大豆蛋白質およびリン脂質の混合物に言及する時、そのような材料は、大豆蛋白質単離体をリン脂質と組み合わせるか、大豆からリン脂質：蛋白質複合体を分画する（つまり、油体蛋白質および結合リン脂質）ことによって調製することができる。用語「大豆蛋白質濃縮物」は、例えば、豆乳粉を含む。
【００３１】
本明細書中で使用されるごとく、「大豆蛋白質抽出物」は、例えば、特定の大豆蛋白質中で濃縮された大豆蛋白質濃縮物または単離体を含む。全大豆蛋白質材料から分画された大豆蛋白質材料は、例えば、大豆蛋白質成分廃棄物または乳清流（アルコールまたは酸性水抽出工程）から調製できる。
【００３２】
本明細書中で使用されるごとく、「大豆蛋白質単離体」は、例えば、非−蛋白質化合物の大部分を除去することによって、外皮を取った大豆から調製された大豆の主要な蛋白質の画分である大豆蛋白質材料を含み、好ましくは、水分無し基準で９０％未満の蛋白質を含有しない。さらにもう１つの具体例において、「大豆蛋白質単離体」は、また、例えばβ−コングリシニン、グリシニンおよびオレオシンといった特定の型の大豆蛋白質中で濃縮された大豆蛋白質材料を含んでいると解釈されてもよく、あるいは、代わりに、オレオシンといった特定の型の大豆蛋白質を欠乏していると解釈されてもよい。典型的には、蛋白質は、加熱されていない脱脂された大豆フレークから、水または８ないし９のｐＨ範囲内の穏やかなアルカリで抽出され、引き続いて、遠心分離して、不溶性繊維性残留物を除去し；得られた抽出物をｐＨ４．５に調整し、ここにほとんどの蛋白質沈殿物は凝乳であり；溶解性オリゴ糖から遠心分離によって凝乳を分離し、引き続いて、何度も洗浄し、（より溶解性かつ機能性にするため）水酸化ナトリウムまたはカリウムで中和し、（例えば噴流煮沸器を用いて）加熱−処理し、噴射−乾燥させる。プロテアーゼを添加し、その後加熱−処理工程を行って、蛋白質を部分的に加水分解し、大豆蛋白質単離体の溶解性を改善することもできる。
【００３３】
本明細書中で使用されるごとく、「ペプチド」および「蛋白質」は相互交換可能に使用され、ペプチド結合によって結合している２つ以上のアミノ酸で構成される化合物を意味する。
【００３４】
本明細書中で使用されるごとく、「組換え蛋白質」は、天然あるいは突然変異体の一次アミノ酸配列で構成されているかどうかにかかわらず、遺伝子および／または蛋白質が天然に見受けられる細胞以外の細胞内の組換えＤＮＡ分子によって運ばれる遺伝子の発現によって、蛋白質が得られることを意味する。言い換えれば、遺伝子はそれが発現される宿主に対して異種性である。アフィニティー精製部位をコードするポリヌクレオチドを遺伝子に付加することを含めた、遺伝子のいずれの改変も、この定義の目的では該遺伝子を非天然にし、かくして、その遺伝子はいずれの細胞内でも「天然に」見受けられないことは注意するべきである。
【００３５】
本明細書中で使用されるごとく、「標的化配列」は、蛋白質またはペプチドの文脈内で意味し、「標的化配列」は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指し、この存在は、結果的に、蛋白質を細胞内の特定の目的地に導く。
【００３６】
用語「治療上−有効」は、典型的に代替療法と関連している有害な副作用を避けつつ、疾患の重症度を防ぐ、あるいは改善する剤の能力を示す。用語「治療上−有効」は、用語「治療または予防に対して有効」と同等であると理解されるべきであり、両方は、例えば、本発明の方法で使用される組成物の量を適性化するように意図され、これは、典型的に代替療法と関連している有害な副作用を避けつつ、心血管病のリスクを減少あるいは該疾患を予防するという目的を達成するだろう。
【００３７】
ＩＩ．本発明のポリペプチド
出願人らは、大豆材料、および低コレステロール血症活性を有する大豆材料のＨＭＦからより特異的に単離されたポリペプチドの配列を同定した。これらの配列は、グリシニンまたはβ−コングリシニンからのペプチドをコードする。蛋白質グリシニンおよびβ−コングリシニンは、種子貯蔵蛋白質である。グリシニンは、約３２０キロダルトン（「ｋＤａ」）の分子量を有し、６つのサブユニットで構成されていて、これらの各々は、酸性サブユニットおよび塩基性サブユニットより成る。さらに、β−コングリシニンは、約１５０ｋＤａの分子量を有し、可変の割合で、３つの異なる種類のサブユニット（α、α’、およびβ）で構成されている。グリシニンおよびβ−コングリシニン型蛋白質は、異なる植物種にわたり、高度に保存されている。
【００３８】
すなわち、本発明の１つの態様は、グリシニン蛋白質からの１ないしいくつかの単離されたポリペプチドまたはポリペプチド断片を網羅する。１つの具体例において、単離されたポリペプチドの配列は、配列番号：１で提供され、VFDGELQEGRVLIVPQNFVVAARSQSDNFEYVSFKに対応する。
【００３９】
本発明のさらなる態様において、β−コングリシニン蛋白質からの１ないしいくつかの単離されたポリペプチドまたはポリペプチド断片が提供される。１つの具体例において、単離されたポリペプチドの配列は、配列番号：２で提供され、LRMITLAIPVNKPGRFESFFLに対応する。もう１つの具体例において、単離されたポリペプチドの配列は、配列番号：３で提供され、IFVIPAGYPVVVNATSHLNFFAIGIに対応する。さらにもう１つの具体例において、単離されたポリペプチドの配列は、配列番号：４で提供され、LQESVIVEISKKに対応する。さらにもう１つの具体例において、単離されたポリペプチドの配列は、配列番号：５で提供され、QQQEEQPLEVRKに対応する。さらにもう１つの具体例において、単離されたポリペプチドの配列は、配列番号：６で提供され、NQYGHVRに対応する。さらにもう１つの具体例において、単離されたポリペプチドの配列は、配列番号：７で提供され、AIVILVINEGDANIELVGLに対応する。さらにもう１つの具体例において、単離されたポリペプチドの配列は、配列番号：８で提供され、NILEASYDTKFEEINKに対応する。さらにもう１つの具体例において、単離されたポリペプチドの配列は、配列番号：１１で提供され、IFVIPAGYPVVVNATSDLNFFAFGIに対応する。
【００４０】
また、出願人らは、低コレステロール血症活性を示すオレオシンの配列を同定した。オレオシンは、主に、植物油体の膜構成成分において見受けられる。オレオシン蛋白質は、３つのドメインで構成されている；蛋白質の２つの末端、Ｎ−およびＣ−末端は、非常に親水性であり、細胞基質に暴露された油体の表面に存在し、オレオシンの非常に疎水性の中心核は、膜およびトリアシルグリセリド内で、しっかりと固着している。また、オレオシンは、Ｃ−末端にて、あるいはその近くで、両親媒性のアルファ−らせん状ドメインを含有する。異なる種からのオレオシンは、蛋白質の小さい族を表し、これは特に蛋白質の中心領域でかなりのアミノ酸配列保存を示す。個々の種の中で、異なるイソ形態が少数存在してもよい。
【００４１】
すなわち、本発明のもう１つの態様は、オレオシン蛋白質からの１ないしいくつかの単離されたポリペプチドまたはポリペプチド断片を網羅する。１つの具体例において、オレオシンは、大豆（受託番号P29530; 配列番号：１２)からのＰ２４イソ形態Ａ（Ｐ８９）であり、これは図１に対応する。さらにもう１つの具体例において、オレオシンは、大豆（受託番号P29531; 配列番号：１３）からのＰ２４イソ形態Ｂ（Ｐ９１）であり、これは図２に対応する。さらにもう１つの具体例において、オレオシンは、トウモロコシ(Zea mays)（受託番号 AAA68066; 配列番号：１４)からの油体結合蛋白質１７ｋＤａオレオシン(oleo17)であり、これは図３に対応する。さらにもう１つの具体例において、オレオシンは、トウモロコシ(Zea mays)（受託番号AAA68065; 配列番号：１５）からの油体蛋白質１６ｋＤａオレオシン(oleo16)であり、これは図４に対応する。さらにもう１つの具体例において、オレオシンは、トウモロコシ(Zea mays)（受託番号AAA67699; 配列番号：１６)からのオレオシンＫＤ１８(KD18; L2)であり、これは図５に対応する。もう１つの具体例において、オレオシンは、H. annuus オレオシン(ヒマワリ)（受託番号CAA55348; 配列番号：１７)であり、これは図６に対応する。さらにさらなる具体例において、単離されたオレオシンポリペプチドの配列は、配列番号：９で提供され、VKFITAATIGITLLLLに対応する。さらにもう１つの具体例において、単離されたオレオシンポリペプチドの配列は、配列番号：１０で提供され、YETNSSLNNPPSRに対応する。
【００４２】
また、本発明には、ポリペプチドが含まれ、これは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％、さらにより好ましくは９９％のオレオシンとの配列相同性ならびに配列番号：１２、１３、１４、１５、１６、１７の配列を有する。本発明のさらなる具体例は、ポリペプチドを提供し、これは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％、さらにより好ましくは９９％の配列番号：１ないし１１の配列のいずれかとの配列相同性を有する。
【００４３】
「相同性」は、当該分野でよく理解されるように、配列を比較することによって決定されるごとく、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該分野において、「相同性」は、また、そのような配列のストリングの間のマッチングによって決定されるごとく、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列の関係性の度合いを意味する。「相同性」は、Computational Molecular Biology, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, 1987; Sequence Analysis Primer, 1991; および Carillo and Lipman, 1988に記載されるものを含むが、これらに限定されるものではない既知の方法によってすぐに計算することができる。相同性の決定方法は、テストされた配列の間の最大のマッチングを付与するように構築されている。さらに、相同性の決定方法は、公共的に入手可能なプログラムに集大成されている。２つの配列間の同一性／相同性を決定するのに使用されるコンピュータープログラムは、ＧＣＧ(Devereuxら, 1984);５つのＢＬＡＳＴプログラムのうち、ヌクレオチド配列照会用に設計された３つ（ＢＬＡＳＴＮ，  ＢＬＡＳＴＸ，およびＴＢＬＡＳＴＸ）ならびに蛋白質配列照会用に設計された２つ（ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮ)(Coulson, 1994; Birrenら, 1997)を含むが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の源(BLAST Manual; Altschulら, 1990)から、公共的に入手可能である。また、よく知られたSmith Watermanのアルゴリズムを使用して、相同性を決定することも可能である。
【００４４】
また、本発明は単離された蛋白質に関する。本明細書中で使用されるごとく、用語蛋白質は、グリシニン、β−コングリシニン、またはオレオシン蛋白質の断片、類似体および誘導体を含む。本発明の蛋白質は、天然の蛋白質、組換え蛋白質または合成蛋白質あるいはポリペプチドであってもよい。
【００４５】
当業者は、ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質のアミノ酸配列の修飾が、結果的に、同等の、恐らくは改良された、第二世代ペプチド等を導き、オリジナルのアミノ酸配列と比較すると、これが同等またはそれ以上の機能的特徴を見せることに気付く。従って、本発明は、そのような修飾されたアミノ酸配列を網羅する。そのような修飾によって生成されるペプチド配列が、本明細書中で開示する天然に生じる相対配列と実質的に同一の機能的性質を有するならば、改変は、アミノ酸挿入、欠失、置換、切断、融合、サブユニット配列のシャフリング等を含む。生物学的活性または機能は、例えば、下記の実施例で示されるように、全血清コレステロールを低下させる蛋白質の能力によって決定することができる。
【００４６】
そのような改変を行う際に検討され得る１つの要因は、アミノ酸の疎水性親水性指標指数である。蛋白質に相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性親水性指標アミノ酸指数の重要性は、KyteおよびDoolittle(1982)によって論議された。アミノ酸の相対的疎水性親水性指標の特徴は、得られた蛋白質の二次構造に寄与することは受け入れられている。その結果、これは酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等といった分子と蛋白質の相互作用に影響を及ぼす。
【００４７】
その疎水性および電荷性質に基づき、各アミノ酸は、次のように疎水性親水性指標指数を付けられた：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；  フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシニン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸／グルタミン／アスパラギン酸／アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００４８】
当該分野で知られるごとく、ペプチドまたは蛋白質の特定のアミノ酸は、同様の疎水性親水性指標指数またはスコアを有する他のアミノ酸に置換され、同様の生物学的活性を有する、つまり、依然として生物学的機能性を持つ得られたペプチドまたは蛋白質を生成することができる。そのような変更を行う際、±２内の疎水性親水性指標指数を有するアミノ酸がお互いに置換されるのが好ましい。より好ましい置換において、アミノ酸は±１内の疎水性親水性指標指数を有する。最も好ましい置換において、アミノ酸は±０．５内の疎水性親水性指標指数を有する。
【００４９】
同様に、アミノ酸も、また、親水性に基づいて置換され得る。米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるように、蛋白質の最大局所平均親水性は、蛋白質の生物学的性質と相関すると開示する。次の親水性値がアミノ酸に割り当てられた：アルギニン/リシン（＋３．０）；アスパラギン酸／グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン／グルタミン（＋０．２）；グリシニン（０）；スレオシン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン／ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン／イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。すなわち、ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質の１つのアミノ酸は、同様の親水性スコアを有するもう１つのアミノ酸によって置換され、依然として同様の生物学的活性を有する、つまり、依然として正確な生物学的機能を持つ得られた蛋白質を生成することができる。そのような変更を行う際、±２内の疎水性親水性指標指数を有するアミノ酸は、好ましくは、お互いに置換され、±１内のものは、より好ましく、±０．５内のものが最も好ましい。
【００５０】
上記で概要を述べたように、本発明のペプチドのアミノ酸置換は、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等といったアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づいていてもよい。結果的に、本ペプチド等内でサイレント変化を起こす保存的アミノ酸変化を生成するために様々な前述の特徴を考慮に入れる例示的置換は、天然に生じるアミノ酸が属するクラスの他員から選択され得る。アミノ酸は、次の４つの群に分けられる：（１）酸性アミノ酸；（２）塩基性アミノ酸；（３）中性極性アミノ酸；および（４）中性非−極性アミノ酸。これらの様々な群内の代表的なアミノ酸は、次のものを含むがこれらに限定されるものではない：（１）アスパラギン酸およびグルタミン酸といった酸性（負に荷電された）アミノ酸；（２）アルギニン、ヒスチジン、およびリシンといった塩基性（正に荷電された）アミノ酸；（３）グリシン、セリン、スレオニン、システイン、シスチン、チロシン、アスパルギン、およびグルタミンといった中性極性アミノ酸；および（４）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンといった中性非−極性アミノ酸。これらが結果的に機能配列の生成へと繋がるならば、有利ではないと予測される変化も、また、有用であり得る。
【００５１】
また、用語蛋白質は、１つ以上の置換基群が付加された蛋白質の形態を含む。置換基は、もう１つの原子または原子の群の置換によって分子に導入される原子または原子の群である。そのような群は、脂質、リン酸基、糖および炭水化物を含むが、これらに限定されるものではない。すなわち、用語蛋白質は、例えばリポ蛋白質、糖蛋白質、リン蛋白質およびリンリポ蛋白質を含む。
【００５２】
ＩＩＩ．  本発明の組成物および方法
本発明のもう１つの態様は、心血管病の治療または予防に有用な組成物を提供する。１つの具体例の組成物は、単離された油体結合蛋白質が添加された植物ベースの食品を網羅する。本発明の１つの具体例において、食品は大豆をベースにしたものである。さらにもう１つの具体例において、組成物は単離された大豆材料、単離された油体結合蛋白質、およびサポニン、フィトエストロゲン、リン脂質、および消化に対して実質的に耐性のある炭水化物よりなる群から選択される少なくとも１つの添加剤化合物を含む。本発明の特定の具体例において、単離された油体結合蛋白質は、植物性蛋白質から単離され精製された画分であってもよい。例えば、単離された油体結合蛋白質は、粗製植物性蛋白質と比較して、１、１０、１００、２００、１０００倍またはそれ以上豊富化されていてもよい。本発明の特定の具体例において、単離された油体結合蛋白質は、油体結合蛋白質につき、例えばＨＭＦといった精製された画分と比較して、１、５、１０、５０または１００倍あるいはそれ以上豊富化されていてもよい。
【００５３】
単離された大豆材料が所望の低コレステロール血症活性を呈するのに必要な成分を含有する限り、本発明で使用される単離された大豆材料は、いずれの大豆植物から調製され単離されてもよい。単離された大豆材料は、例えば、粉末にした全大豆、大豆粉、豆乳粉、大豆グリット、大豆ミール、大豆フレーク、大豆濃縮物、大豆蛋白質単離体、および大豆蛋白質抽出物を含む。１つの具体例において、大豆材料は、大豆濃縮物である。さらにもう１つの具体例において、大豆材料は、大豆蛋白質単離体である。なおさらなる具体例において、大豆材料は、大豆蛋白質抽出物である。本明細書中に記載される方法を含め、当該分野で知られるいずれの方法も、特定の大豆材料を単離するのに使用することができる。
【００５４】
本発明の１つの態様は、例えばβ−コングリシニン、グリシニンおよびオレオシンといった特定の大豆蛋白質またはペプチドで豊富化された単離された大豆材料を提供する。これらの大豆材料は、単離体、濃縮物、または単離および濃縮製造の廃棄物の流れから調製可能である。また、通常の２倍のレベルのβ−コングリシニンおよび低レベルのグリシニンを有する大豆といった修飾された蛋白質組成物を有する大豆からそれらを調製することができる（例えば、米国特許第６，１７１，６４０号記載）。
【００５５】
食品の調製は、当業者によく知られている。大豆の場合、通常の食物使用は、豆、もやし、焼き豆、ベーキングの様々な生成物で使用される全脂肪大豆粉、糖菓として使用されるいり豆、大豆バター、豆乳コーヒー、および東洋食品の他の大豆誘導体といった生成物を含むが、これらに限定されるものではない。大豆蛋白質食品（例えば、ミール）は、大豆粉濃縮物および単離体に分けられ、これは食物／摂食および産業上での使用目的の両方を持つ。大豆粉およびグリットは、しばしば、肉増量剤および類似体、ペットフード、ベーキング材料および他の食物生成物の製造に使用される。大豆粉および単離体から作られる食物生成物は、ベビーフード、キャンディー製品、シリアル、食物ドリンク、麺、酵母、ビール、エール等を含む。
【００５６】
本発明の特定の態様において、例えばオレオシンのような特定の型の大豆蛋白質を低量欠乏または含有している単離された大豆材料は、例えばオレオシンのような油体結合蛋白質で栄養価を高められ、それにより、大豆蛋白質または大豆蛋白質組成物の低コレステロール血症性質を改善または回復する。本発明のさらなる具体例において、油体結合蛋白質は、これらの濃度範囲内の全ての中間体を含めて、約０．５重量％、１重量％、３重量％、５重量％、１０重量％、２０重量％またはそれ以上の最終濃度に添加される。特定の適用によって、オレオシンなしの大豆材料、または減少した量のオレオシンを有する大豆材料は、非常に有益であり得る。例えば、オレオシンはフレーバーを結合し、大豆食品の比較的劣ったフレーバーの質に寄与するため、望ましくないと考えられ得る。さらに、また、オレオシンは、溶解性に乏しく、脱脂された豆乳が水中に分散される時、大きな粒子画分に寄与する。１つの具体例において、オレオシンは、オレオシンを含有する大きな粒子画分をタンク内に沈殿させることによって、あるいは限外ろ過膜を使用することによって除去することができる。別法として、オレオシンは、硫酸ナトリウムおよび塩化カルシウムの存在下で、ｐＨ２．８にて、大豆蛋白質単離体から沈殿させることができる(Samotoら, 1998)。
【００５７】
また、本発明は、大豆蛋白質単離体の高分子量画分（「ＨＭＦ」）である単離された大豆材料および単離された油体結合蛋白質を含む組成物を網羅する。本発明の組成物のいずれかで使用されたＨＭＦは、いずれの植物性蛋白質単離体から調製および単離されてもよく、ここにそれは画分が所望の低コレステロール血症の活性を有する程度まで天然に生じる。１つの具体例において、ＨＭＦは、大豆蛋白質源から調製される。ＨＭＦが調製され得る典型的な大豆材料は、大豆、皮のない大豆、大豆ミール、大豆粉、大豆グリット、豆乳粉、（脂肪分のあるおよび脱脂された）大豆フレーク、大豆糖蜜、大豆蛋白質濃縮物、大豆乳清、大豆乳清蛋白質、および大豆蛋白質単離体を含む。好ましい具体例において、ＨＭＦは大豆蛋白質単離体から調製される。
【００５８】
ＨＭＦを調製するために、選択された植物性蛋白質単離体は、加水分解的または化学的消化に付される。この消化プロセスに使用される典型的な剤は、ペプシンまたは菌プロテアーゼを含む。典型的には、例えば、大豆蛋白質を、ペプシン酵素で、１３ないし１７時間、インキュベートし（０．２％  ＮａＣｌ水性相中，  ３８℃，  ｐＨ１．１）（該ペプシン酵素は大豆蛋白質単離体の０．５ないし５％である)、２０分間、９０℃にて加熱処理し、ペプシンを不活性化させ、氷上で冷却し、Ｎａ２ＣＯ３でｐＨの６ないし７まで調整し、４，５００ｇにて、２０分間、遠心分離する。次いで、このペレットを、水で３度洗浄し、同定する。ペプシン酵素の使用の他の方法は、当該分野でよく知られている。
【００５９】
例えば、菌プロテアーゼは、Sumizyme FP(Aspergillus niger プロテアーゼ, 酵素活性 48800U/gm, Shin Nippon Kagaku Kabushiki Kaisha)でもよく、６０℃にて、５時間、大豆蛋白質でインキュベートされる。そのような溶液を使用する時、ｐＨを調整するよりも、溶液は水で希釈される。次いで、１０，０００ｘｇにての遠心分離を、１０分間行う。次いで、沈殿物を収集し、同定する。さらなる方法は、当該分野で知られている。例えば、Horiら(1999)を参照されたし。
【００６０】
次いで、ＨＭＦは当該分野で一般的に知られるいずれかの手段によって、消化された植物性蛋白質単離体から単離される。１つの具体例において、ＨＭＦは、遠心分離によって単離される。典型的には、単離プロセスは、例えば、菌プロテアーゼまたはペプシン（プロテアーゼは、全蛋白質の０．５ないし６％）で処理された大豆蛋白質単離体の水性懸濁液を遠心分離し、３０ないし７０℃にて、１ないし２０時間インキュベートした後に、画分を乾燥（例えば冷凍乾固）させることによって、行われる。さらなる方法は、当該分野でよく知られている。Nagoakaら(1999)を参照されたし。
【００６１】
さらに、ペプチドが所望の低コレステロール血症の活性を有する限り、ＨＭＦから単離されたいずれのペプチドも、本発明の組成物で使用できる。典型的には、しかしながら、組成物で使用されるペプチドは、少なくとも長さが１０アミノ酸残基であり、より典型的には、長さが約１０ないし１００アミノ酸残基であり、最も典型的には、長さが約３０ないし約８０アミノ酸残基である。また、一般的に言えば、ペプチドは、実質的に、元来、疎水性であり、約３０重量％以上ないし好ましくは約３５重量％を超える疎水性アミノ酸組成物を有する。加えて、使用されるペプチドは、０、１、またはそれ以上の両親媒性の領域を有していてもよい。さらに、使用されるペプチドは、疎水性表面または疎水性領域を有していてもよく、これは疎水性アミノ酸のストリングが原因ではなく、ペプチドのα−ラセン構造が原因である。
【００６２】
本発明のもう１つの具体例は、大豆材料から単離された単離された大豆ポリペプチドを含む組成物を提供し、ここに該大豆ポリペプチドは、β−コングリシニンおよびグリシニンを含む。β−コングリシニンおよびグリシニンの両方の構造は上記に詳細に記載され、それらの構造の詳細な概説は、Utsumiら(1997)に提供されている。出願人らを単一の理論に限定することなしに言えば、これらのペプチドは、消化に耐え、血流に吸収されるか、あるいは胆汁酸に結合するため、低コレステロール血症の活性を付与すると考えられる。また、β−コングリシニン内の両親媒性のα−ラセン領域の存在は、必要ではないが有益である。出願人らをいずれかの単一の理論に限定することなしに言えば、両親媒性のα−ラセン領域は、低コレステロール血症の活性を付与するのに重要な様々な受容体部位との相互作用を促進させる疎水性表面を形成するため、その存在は有益であると考えられる。
【００６３】
加えて、出願人らをいずれかの単一の理論に限定することなしに言えば、本発明の同定されたポリペプチドは、また、大腸内の有益な細菌に対して窒素の源として作用する。次いで、これらの細菌は、脂質代謝に積極的に影響を与えるプロピオン酸のような短鎖脂肪酸を生成することができる。短鎖脂肪酸は、肝臓内で脂肪酸の合成を阻害し、トリグリセリド分泌の率を低下させ、また、肝内コレステロール合成を減少させる。本発明の１つの態様は、大豆蛋白質ポリペプチドを使用して、大腸内の短鎖脂肪酸の生成を促進させ、血清コレステロールおよびトリグリセリドを減少させる。有益な大腸菌の成長を促進する際の消化されていない大豆ポリペプチドの有効性は、高アミロースコーンスターチといったヒト結腸ミクロフローラの重要な燃料である消化されていない炭水化物の存在に最も有意である。すなわち、本発明のもう１つの具体例は、大豆ポリペプチド成分を、消化されていない炭水化物の源と合わせて、血清コレステロールおよびトリグリセリドに対するポリペプチドの有益な効果を最適化する。
【００６４】
すなわち、本発明の１つの態様は、β−コングリシニンから単離された特定のポリペプチドを有する組成物を提供する。一般的に言えば、これらのポリペプチド配列は、アミノ酸配列の配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、および配列番号：１１のいずれか１に対応する。これらの配列は、例えば（１）大豆材料を酵素加水分解し、引き続いて、例えば遠心分離によって、高分子量画分を単離し、あるいは（２）大豆材料を酵素分解し、引き続いて、限外ろ過、イオン交換樹脂カラム、およびゲルろ過カラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、約２００ないし約５，０００キロダルトンの範囲の分子量のペプチドを得る、を含む方法によって、β−コングリシニンから単離できる（例えば、Yamauchi and Suetsuna(1993)記載の方法参照）。ペプチドは、イオン−交換クロマトグラフィーによって、さらに分画できる(Chenら, 1995)。別法として、特定のβ−コングリシニンサブユニットから個々の配列を単離するのではなく、β−コングリシニンの通常の２倍のレベルを有する大豆を使用して、単に大豆からβ−コングリシニンを単離することも可能である。同様に、同一の生殖質を使用することも可能であり、ここに、このサブユニットの粗製調製物を入手するために、特定のβ−コングリシニンサブユニットのみが発現される。次いで、活性ペプチドは、腸内でペプシンおよびパンクレアチンによる加水分解の結果として得られた粗製調製物の消費後に生成され、あるいは、細菌酵素を使用する成分製造の間に入手される。すなわち、本発明のもう１つの具体例は、オレオシン調製物と合わせたβ−コングリシニンの特定のサブユニットの粗製調製物を含む組成物を提供する。
【００６５】
さらに、本発明のもう１つの態様は、グリシニンから単離された特定のポリペプチドを有する組成物を提供する。１つの具体例において、該組成物は、グリシニンの基本的なサブユニットから単離されたポリペプチドを含有する。さらにもう１つの具体例において、該組成物は、グリシニンのＢ−１ｂサブユニットから単離されたポリペプチドを含む。好ましい具体例において、該組成物は、グリシニンから単離されたペプチドを含み、これは、アミノ酸配列の配列番号：１に対応する。典型的には、当該分野でよく知られる単離手順を用いて、グリシニンは蛋白質源から単離される。これらの単離手順の例は、上記に略述したように、他の蛋白質単離体を単離するのに使用されるものである。
【００６６】
また、本発明の組成物は、典型的には、油体結合蛋白質を含有する。本明細書中で使用されるごとく、用語「油体結合蛋白質」は、油体構造または細胞内脂質粒子と物理的に結合している蛋白質、リポ蛋白質またはペプチドのいずれかを含む。一般的に言えば、植物、哺乳動物、非−哺乳動物細胞、藻類および酵母といった種からの真核生物細胞の殆どは、細胞内脂質粒子を含有する。これらの粒子は、脂質体、脂質滴または、特に植物において、種によっては、油体、オレオソーム、またはスフェロソームとして知られている。真核生物細胞の脂質粒子は、非常に疎水性のある中性脂質の核、主にトリアシルグリセロールおよび／またはステリルエステルよりなり、これらは少量の蛋白質が包埋されたリン脂質単層によって囲まれている。トウモロコシから単離された油体の典型的な組成は、トリアシルグリセロール（９５％）、ジアシルグリセロール（４％）、リン脂質（０．９％）および蛋白質（１．４％）である。
【００６７】
本発明の組成物に有用な典型的な油体結合蛋白質は、アポ蛋白質の形態のオレオシン、リポ蛋白質および油体と結合する３４−ｋＤ大豆種子貯蔵空胞蛋白質といった油体蛋白質を含む。すなわち、本発明の１つの態様は、単離された大豆材料および油体結合蛋白質から単離されたペプチドを含む組成物を提供し、ここに、ペプチドは、オレオシンまたはオレオシンからのペプチド断片である。オレオシンは、配列番号：１２で提供され図１に対応するＰ２４オレオシンイソ形態Ａ(P89) 受託番号P29530、配列番号：１３で提供され図２に対応するオレオシンイソ形態Ｂ(P91) 受託番号P29531、配列番号：１４で提供され図３に対応する油体結合蛋白質１７ｋＤａオレオシン(oleo17) 受託番号AAA68066、配列番号：１５で提供され図４に対応する油体蛋白質１６ｋＤａオレオシン(oleo16)受託番号AAA68065、配列番号：１６で提供され図５に対応するオレオシンＫＤ１８(KD18; L2)受託番号AAA67699、配列番号：１７で提供され図６に対応するH. annuusオレオシン受託番号CAA55348の配列によって表すことができる。より典型的には、組成物に使用されるペプチドは、約１７キロダルトンの分子量を持つ低分子量オレオシンからのものである。特定の具体例において、ペプチドはオレオシンからのもので、配列番号：９または配列番号：１０のアミノ酸配列に対応するだろう。
【００６８】
本発明の組成物に使用されるオレオシンペプチドは、無処置の油体から単離することができる。その終わりにかけて、無処置の油体は、種子から、油体結合蛋白質の源として単離可能である。使用できる方法および種子タイプのリストは、例えば、ＷＯ  ００／３０６０２に提供されている。また、油体の製法は、日本国特許出願公開公報第２００２−１０１８２０号に記載されている。油は、油体からジエチルエーテルで抽出されてもよく、それにより、水性画分中に界面物質（オレオシンおよびリン脂質）が得られる。リン脂質は、クロロホルム／メタノール（２：１，  ｖｏｌ／ｖｏｌ)または他の適した有機溶媒を用いて抽出されてもよい。特に、オレオシンは、凝集画分として単離される(Tzen and Huang 1992)。加えて、もしＰ３４蛋白質が存在するなら、高ｐＨ抽出を使用して、それを除去することができる。Ｐ３４蛋白質は６．５未満の等電点ｐＨを有し、すなわち、オレオシンが等電点ｐＨを有し、沈殿する高ｐＨにて溶解性があるだろう。
【００６９】
また、オレオシンは、水に浸漬した全大豆または脱脂された大豆粉から単離可能である。オレオシンは、当該分野でよく知られる単離手順を用いて、蛋白質源から単離できる。これらの単離手順の例は、上記に略述したように、脱脂された大豆粉からオレオシンを単離するのに使用されるものである。もう１つの例は、全大豆からのオレオシンの単離である（ＪＰ  ２００２−１０１８２０）。オレオシンのさらなる源は、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞(Leberら, 1994)、細菌細胞(Pieper-Furstら, 1994)および藻類細胞(Roessler, 1988)を含む。本発明の好ましい具体例において、オレオシンは、植物細胞から入手され、これは、花粉、胞子、種子、および栄養植物器官を含み、ここには、オレオシンまたは油体様細胞小器官が存在する(Huang, 1992)。より好ましくは、本発明のオレオシンは、植物種子から入手され、最も好ましくは：アブラナ(Brassica spp.)、大豆(Glycine max)、ヒマワリ(Helianthus annuus)、ギネアアブラヤシ(Elaeis guineeis)、綿実(Gossypium spp.)、ピーナッツ(Arachis hypogaea)、ココナッツ(Cocus nucifera)、ヒマ(Ricinus cummunis)、ベニバナ(Carthamus tinctorius)、マスタード(Brassica spp. および sinapis alba)、コリアンダー(Coriandrum sativum)、カボチャ(Cucurbita maxima)、亜麻仁／亜麻(Linum usitatissumum)、ブラジルナッツ(Bertholletia excelsa)、ホホバ(Simmondsia chinensis)、トウモロコシ(Zea mays)、クランベ(Crambe abyssinica)、およびルッコラ(Eruca sativa)よりなる植物種の群から入手される。
【００７０】
本発明のさらにもう１つの態様は、単離された大豆材料および油体結合蛋白質から単離されたリポ蛋白質であるペプチドを含む組成物を網羅する。リポ蛋白質は、動物および植物細胞の両方で見受けられる中性脂質、リン脂質、および蛋白質の非共有結合性で非化学量論的粒状複合体である。１つの具体例において、リポ蛋白質は、哺乳動物のリポ蛋白質である。さらにもう１つの具体例おいて、リポ蛋白質は卵黄リポ蛋白質である（卵黄構造の概説については、例えばBringe(1997)を参照、その内容は、引用によって、本明細書中に組み込まれる）。さらにもう１つの具体例において、リポ蛋白質は、脂肪グロブリン膜蛋白質を含む。
【００７１】
リポ蛋白質は、当該分野でよく知られる手順を用いて、油体結合蛋白質源から単離できる。これらの単離手順の例は、上記に略述したように、脱脂された大豆粉から油体蛋白質またはオレオシンを単離するのに使用されるものである。さらに、卵黄リポ蛋白質は、当該分野でよく知られる単離手順を用いて、油体結合蛋白質源から単離可能である。
【００７２】
これらの単離手順の例のように、超臨界二酸化炭素（例えば、Bringe and Cheng, 1995参照）を用いて、トリグリセリドおよびこれステロールを抽出することによって、卵黄リポ蛋白質は単離できる。本発明のさらなる態様は、油体結合蛋白質および添加剤化合物と合わせた大豆材料を含む組成物を提供する。添加剤化合物は、組成物を治療上高めるいずれの化合物も含んでいてよい。しかしながら、典型的には、添加剤化合物は、サポニン、フィトエストロゲン、リン脂質、および消化に対して実質的に耐性のある炭水化物よりなる群から選択される。いずれかの特定の理論に制限されることなしに、一般的に言えば、これらの添加剤化合物は単離された大豆材料中のコレステロールを低下させるポリペプチドの消化を実質的に妨げることによって、組成物の低コレステロール血症の活性を高めると考えられている。これらの性質によって、本発明の添加剤化合物は、組成物の治療上の役割を高める。従って、好ましい具体例において、本発明の組成物は、単離された大豆材料および単離された油体結合蛋白質と合わせた上記同定された特定の添加剤成分のいずれかの組合せを有していてもよい。
【００７３】
すなわち、１つの具体例において、本発明の組成物は、添加剤化合物として、１ないしいくつかのサポニンを含んでいてもよい。サポニンは、植物源から単離することができ、ここに、Gurfinkelら(2002)の方法のようないずれの既知の方法によってもそれを天然に生じさせることが可能であり、あるいはそれはいずれの既知の方法によっても合成的に調製できる。選択された化合物が低コレステロール血症剤として使用する組成物の性質を高める限り、いずれのサポニンも本発明で使用するのに適している。しかしながら、典型的には、使用されるサポニンは、アルファルファまたは大豆植物といったマメ科植物から、またはオートムギあるいは他の植物種子から単離される。より典型的には、サポニンは大豆種子から単離され、より具体的には、大豆胚から単離される。サポニンの源は、例えば、大豆、キラヤ、アルファルファ、およびソープワートを含む。大豆サポニンは、例えば、サポニンＡ、Ｂ、Ｅ、およびサポゲノールＡ、Ｂ、およびＥを含む。
【００７４】
さらに、本発明の組成物は、添加剤化合物として、１ないしいくつかのフィトエストロゲンを含んでいてもよい。フィトエストロゲンは、植物源から単離することができ、ここに、それは、米国特許第５，８５５，８９２号またはＷＯ００／３０６６３記載の方法のようないずれの既知の方法によっても天然に生じさせることができ、あるいはそれはいずれの既知の方法によっても合成的に調製可能である。選択された化合物が低コレステロール血症剤として使用する組成物の性質を高める限り、いずれのフィトエストロゲンも本発明での使用に適している。典型的には、組成物で使用されるフィトエストロゲンは、イソフラボンである。より典型的には、イソフラボンは、ゲニステイン、ダイゼイン（その代謝物ｏ−デスメチルアンゴレンシン（o-desmethylangolensin）、ジヒドロクライゼイン（dihydroclaidzein）、およびイーコール）、ビオカニンＡ、ホルモノネチン、およびそれらのそれぞれの天然に生じるグルコシドならびに大豆またはクローバーに存在しているグルコシドコンジュゲートである。
【００７５】
また、本発明の組成物は、添加剤化合物として１ないしいくつかのリン脂質を含んでいてもよい。リン脂質は、様々な源からのものであるが、典型的には、例えば、種子から単離され、より典型的には、大豆植物の脂肪種子から単離される。これらは、レシチンおよびリゾ−レシチンを含む。加えて、修飾された脂肪酸組成を持つリン脂質を使用することができる。そのようなリン脂質は、酵素で修飾された大豆リン脂質であってもよい。酵素で修飾されたリン脂質は、例えば、大豆リン脂質(SLP; True Lecithin, Mie, Japan)から、ホスホリパーゼＡ２(Novo Industry, Bagsvaerd, Denmark)(Nagaokaら, 1999)で処理することによって、調製できる。加えて、修飾された脂肪酸組成を有するリン脂質は、植物または植物種子から入手可能であり、これらは、遺伝子工学的に修飾されて、修飾された脂肪酸組成を持つリン脂質を生成する。修飾された脂肪酸組成を持つリン脂質の例は、修飾された脂肪酸組成を有するレシチンである。また、当該分野でよく知られる他の方法を使用して、リン脂質の脂肪酸組成を修飾することもできる。
【００７６】
加えて、本発明の組成物は、１ないしいくつかの炭水化物も含んでいてもよい。選択された化合物が、低コレステロール血症剤として使用する組成物の性質を高める限り、いずれの炭水化物も本発明の組成物で使用できる。しかしながら、典型的には、使用される炭水化物は、消化に対して実質的に耐性がある。本明細書中で使用されるように、炭水化物を記述するのに使用される時、「消化に対して実質的に耐性がある」は、当該分野では、例えば、消化に対して約７０％を超える耐性を持つ、好ましくは消化に対して約８０％以上の耐性を持つ、さらに好ましくは、消化に対して約９０％を超える耐性を有する炭水化物を典型的に意味するように定義される。一般的に言って、アミローススターチまたは繊維に豊富な炭水化物は、組成物に使用するのに特に適している。１つの具体例において、例えば、組成物に使用される炭水化物は、高アミローススターチ、オリゴ糖、または大豆子葉繊維である。加えて、具体例は、例えば、物理的に隔絶されたスターチ（部分的に製粉された穀粒および種子）、抵抗性顆粒（生のジャガイモ、グリーンバナナ、いくつかのマメ科植物、および高アミローススターチ）、逆行性スターチ（調理されたおよび冷却されたジャガイモ、パン、およびコーンフレーク）、および化学的に修飾されたスターチ（エーテル化された、エステル化された、または交差結合したスターチ（加工食品で使用される））である(Topping and Clifton, 2001)。
【００７７】
少なくとも１つの添加剤化合物の存在あるなしに拘わらず、単離された大豆材料および単離された油体結合蛋白質のいずれの組合せも組み合わせて、本発明の組成物を形成できる。例えば、下記の表１は、本発明の組成物の異なる具体例に対する多くの典型的な形成を示す。
【表１−１】
2005523007.tif 000002
【表１−２】
2005523007.tif 000003
【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
2005523007.tif 000007
【表１−７】
2005523007.tif 000008
【００７８】
本発明の１つの具体例において、組成物は、組成物の５０重量％以上の単離された大豆材料含有量および組成物の０．５重量％以上の油体結合蛋白質含有量を有する。より具体的には、しかしながら、組成物は、組成物の約７０ないし約９０重量％以上の単離された大豆材料含有量および組成物の約１ないし約５重量％の油体結合蛋白質含有量を有する。典型的には、イソフラボンまたはサポニン化合物といった添加剤化合物は、存在する場合、組成物の１０ｍｇ／１００ｇ以上を含み、さらに組成物の約３０ないし３００ｍｇ／１００ｇを含んでいてもよい。さらに、典型的には、リン脂質または消化に対して実質的に耐性のある炭水化物といった添加剤化合物は、存在する場合、２重量％以上を含み、さらに組成物の約１０ないし５０重量％を含んでいても良い。
【００７９】
本発明の組成物は、剤として哺乳動物に投与されて、アテローム硬化症および心血管病の発症を予防または治療する。より具体的には、本発明の組成物は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与されて、全血清コレステロール濃度を減少させ、低密度リポ蛋白質濃度を減少させ、高密度リポ蛋白質濃度を増加させ、肝臓内のコレステロールの濃度を減少させ、血清トリグリセリドの濃度を減少させる。一般的には、いずれの特定の理論に制限されることなしに言えば、本発明の組成物は、コレステロール吸収を妨げ、胆汁酸の再吸収を実質的に阻害することによって、低コレステロール血症の活性を発揮し、および／または哺乳動物の大腸内の細菌によって、窒素源として、使用され得ると考えられる。
【００８０】
ＩＶ．  医薬組成物および投与
本発明の組成物のいずれも、医薬組成物または栄養組成物として処方可能である。そのような組成物は、経口的に、非経口的に、吸引スプレーによって、直腸内に、皮内に、経皮的に、または局所的に、従来の無毒で医薬上許容される担体、アジュバントおよびビヒクルを所望により含有している用量単位形態で、投与され得る。また、局所投与は、経皮パッチまたはイオン泳動デバイスといった経皮的投与の使用を含む。本明細書中で使用されるごとく、用語非経口は、皮下、静脈内、筋肉内、または胸内注射、または注入技術を含む。薬物の処方は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (1975)、およびLiberman and Lachman(1980)で論議されている。
【００８１】
例えば無菌の注射可能な水性懸濁液または油性懸濁液のような注射可能な調製物は、公知の技術に従い、適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて、処方できる。また、無菌の注射可能な調製物は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液または懸濁液であってもよい。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の不揮発性油は、慣習的に、溶媒または懸濁媒体として使用される。この目的のためには、いずれのブランドの不揮発性油も使用でき、それは合成モノ−またはジグリセリドを含む。加えて、オレイン酸のような脂肪酸は、注射液の調製に有用である。ジメチルアセトアミド、イオン性および非−イオン性洗浄剤を含む界面活性剤、およびポリエチレングリコールが使用可能である。また、上記したもののような溶媒および湿潤剤の混合物も、有用である。
【００８２】
本明細書中で論議される化合物の直腸投与用の坐剤は、活性剤を適した非−刺激性賦形剤と混合することによって調製でき、非−刺激性賦形剤は、例えば、カカオバター、合成モノ−、ジ−、またはトリグリセリド、脂肪酸、またはポリエチレングリコールであり、これは通常の温度では固体であるが、直腸温度では液体であり、すなわち、直腸で溶解して薬物を放出する。
【００８３】
経口投与用の固体用量形態は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤を含む。そのような固体用量形態において、通常、本発明の化合物は、示された投与経路に適した１つ以上のアジュバントと合わせられる。もし経口で投与されるなら、化合物はラクトース、スクロース、スターチ粉、カルボン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、ゼラチン、アカシアガム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、および／またはポリビニルアルコールと混合され、次いで、便利な投与のために、錠剤にしたり、カプセルに包んだりすることができる。ヒドロキシプロピルメチルセルロースにおける活性化合物の分散で提供されるように、そのようなカプセル剤または錠剤は、徐放性の処方を含有することができる。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、用量形態は、また、クエン酸ナトリウム、またはマグネシウムあるいは炭酸カルシウムまたは炭酸水素カルシウムといった緩衝剤を含むこともできる、錠剤および丸剤は、そのうえ、腸溶コーティングで調製することもできる。
【００８４】
治療目的のため、非経口投与用の処方は、水性または非−水性等張性無菌注射溶液または懸濁液の形態であってもよい。これらの溶液および懸濁液は、無菌粉または顆粒から調製可能であり、これらは経口投与用の処方での使用につき言及された１つ以上の担体または希釈剤を有する。化合物は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、綿実油、落花生油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、および／または様々な緩衝剤に溶解できる。他のアジュバントおよび投与方法は、医薬分野においてよく、広く知られている。
【００８５】
経口投与用の液体用量形態は、医薬上許容される乳濁液、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤を含んでいてもよく、これは水のような当該分野で通常使用される不活性希釈剤を含有する。また、そのような組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、ならびに甘味料、フレーバー料、および香料といったアジュバントを含んでいてもよい。
【００８６】
投与される治療上活性な化合物の量および本発明の化合物および／または組成物によって心血管病の状態を治療するための投与計画は、対象の年齢、体重、性別および健康状態、病気の重症度、投与経路および投与間隔、ならびに使用される特定の化合物を含む様々な要因によって決定され、すなわち、それらは著しく変動するだろう。一般的に許容されかつ有効な一日量は、約０．１ないし約６０００ｍｇ／Ｋｇ体重／日であり、より典型的には約１００ないし約２５００ｍｇ／Ｋｇ／日であり、最も好ましくは、約２００ないし約１２００ｍｇ／Ｋｇ／日である。
【００８７】
前記した詳細な記載は、当業者が本発明に関与するのを助けるために提供される。それでも、この詳細な記載は、本発明をむやみに制限するものとしてとらえられるべきではなく、本発明の発見の精神または範囲から逸脱することなしに、当業者によって、本明細書中で論議する具体例における修飾および変化を行うことが可能である。
【００８８】
各個々の公報、特許、特許出願または他の引用文献が、具体的かつ個々に、引用によって組み込まれていると示されるように、本出願に引用する全ての公報、特許、特許出願および他の引用文献は、その全文において、引用によって、本明細書中に組み込まれる。
【００８９】
さらに推敲することなしに、当業者は、先の記載を用いて、本発明をその最大限まで利用することが可能であると考えられる。すなわち、次の好ましい具体的な具体例は、単に説明的なものとしてとらえられるべきであり、いかなる方法においても残る開示を限定するものではない。
【実施例】
【００９０】
Ｖ．実施例
実施例１
大豆蛋白質からのＨＭＦの同定
大豆蛋白質のＨＭＦ中に存在するポリペプチドは、活性コレステロール−低下性質を有する（実施例２参照）。研究を実施して、これらのポリペプチドの起源および部分的配列を同定した。使用した方法は次の通りである：
【００９１】
Ａ．ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を、当該分野で知られる方法に従い、行った。いくつかの異なる方法を、本発明において使用した、それらは次の通りである：
【００９２】
Ｂ．トリス−グリシンドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
分析用に、大豆蛋白質試料を、無処置の大豆またはすりつぶした大豆を凍結し、それらを振動粉砕機中で製粉し（製粉は、大豆蛋白質単離体の場合は必要ない）、１時間、室温にて、ｐＨ＝８．０の０．０３Ｍ  トリス，  ０．０１Ｍ  ２−メルカプトエタノールを用いて、蛋白質を抽出することによって、調製する。ＳＤＳ可溶溶液（０．０６２５Ｍ  トリス，  ２．３％  ＳＤＳ，  ５％  β−メルカプトエタノール, １０％  グリセロール, ｐＨ６．８，追跡用色素としての痕跡量のブロモフェノールブルー)中にこれらの蛋白質の４ｍｇ／ｍｌ溶液を調製する。１０分間、７０℃にて、試料を加熱し、５分間冷却し、次いで、遠心分離して不溶物質をペレット化する。１０−２０％  全アクリルアミドゲル(Laemmli (1970)）によって記載されるように）に、５μＬ（２０μｇ）の各試料上澄みを負荷し、ゲル当たり１５ないし３０ｍＡ（一定の電流）または６０ないし１００ボルト（一定の電位）にて、電気泳動によって分離する。追跡用色素がゲルの底部の２ｍｍ以内になると、電気泳動を終了する。Maloneら(2001)における第２方法に従い、クーマシーの代わりに、ＳＹＰＲＯオレンジを代用してもよい。
【００９３】
Ｃ．  ＮｕＰＡＧＥゲル電気泳動によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
４ｘＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液（試料容量の１／４としてNOVEX カタログ# NP0003, および試料容量の１／１０として５００ｍＭジチオスレイトール）を用いて、トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥセクションに記載の通りに、試料を調製する。４μＬ（１６μｇ）の各試料上澄みを、Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  アクリルアミドビス−トリスゲルに負荷する。Ｎｏｖｅｘ  Ｘｃｅｌｌ  ２ミニ−ゲルタンクを、ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ流動緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ，  ５０ｍＭ  トリス，  ３．５ｍＭ  ＳＤＳ，  １．０２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ＝７．７）で満たし、追跡用色素がゲルの底部の位置に達するまで、２００ボルト（一定の電位）にて、電気泳動によって、蛋白質を分離する。トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥプロトコルに記載されるように、ゲルを染色する。
【００９４】
Ｄ．  大豆蛋白質の２−Ｄ  ＰＡＧＥ
トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥセクションに記載の通り、大豆蛋白質を抽出する。０．６ないし１．０５ｍｇの全蛋白質を含有する最終容量４５０μＬまで、８Ｍ  尿素、２％  ＣＨＡＰＳ、０．３５％  ジチオスレイトール、０．２％両性電解質、および１５％  イソプロパノールを含有するように、試料を補う。この溶液を４３０μＬ用いて、２４ないし３０時間、１８ｃｍのｐＨ３ないし１０の固定されたｐＨグラジエント（ＩＰＧ）乾燥ストリップを、再膨潤させる（再膨潤の間、ストリップは鉱油で覆われる）。水に浸漬された電極ストリップを用いて、（鉱油で覆われた）ＩＰＧストリップを、次の電圧ランピングアプローチを用いて、５０，０００ないし７０，０００ボルト−時間に焦点を合わせる。１時間１００ボルト（ｖ）で開始し、次いで、１時間２００ｖで、２時間４００ｖで、１４時間４００ないし１００００ボルトの直線状ランプで、次いで、最大で４８時間１００００ボルトで、最終ボルト−時間合計に達する。各ＩＰＧストリップを、１．５ｍＬの試料平衡溶液（６２．５ｍＭ  トリス，  ２．３％  ＳＤＳ，  ５％  ２−メルカプトエタノール，  ｐＨ６．８および追跡用色素として痕跡量のブロモフェノールブルー）に、３．５分間浸漬させる。ストリップを流し、次いで、各々を１０−２０％  アクリルアミドトリスグリシンゲル上に置き、平衡溶液中の温１％アガロースを用いて、その位置に固定する。第二の次元のゲルに流し、トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥセクションに記載の通り、それらを染色する。
【００９５】
Ｅ．アクリルアミドゲル中の蛋白質のイン・サイチュトリプシン処理
ゲルバンドまたはスポットを切り、それらを１５００μｌのシリコン処理したミクロ遠心管に入れる。５０％メタノールで二度洗浄して（３０分／洗浄）、染色を除去する。１５分間、５０％アセトニトリル（２００ｍＭの酢酸アンモニウム中ｐＨ＝８．０）中でゲル片を平衡化する。二度、洗浄を繰り返す。１５分間、１００％のアセトニトリルで洗浄し、次いで、Ｓｐｅｅｄｖａｃ内で乾燥するまで蒸発させる。１６ないし２０時間、３７℃にて、２００ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ−８．０中の１０％  アセトニトリル中の２０μｇ／ｍＬ配列決定グレードの修飾されたトリプシン(Promegaカタログ# V5111)を用いて、トリプシン処理する。Ｎｕｔａｔｏｒで撹拌しつつ、２０分間、５０％  アセトニトリル, ０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でペプチドを抽出する。２０分間、酢酸アンモニウム中の８０％  アセトニトリル０．１％  ＴＦＡを用いて、抽出を繰り返す。３０分間、最後の抽出を繰り返す。全ての上澄みを合わせ、Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃで抽出物を乾燥させる。
【００９６】
Ｆ．  所与のバンドに存在するポリペプチドのトリプシンポリペプチドを提供するためのバンドのトリプシン処理
ゲル中で所与のバンドに存在するポリペプチドのトリプシンポリペプチドを提供するために、次のプロトコルに従い、バンドのトリプシン消化を実施した：
１）ゲルスポットを切り出し、いずれの片の最大寸法も１ｍｍ未満とする。ゲル片を、１５００μｌのシリコン処理したミクロ遠心管に入れる。
２）ゲル片を、５０％メタノール（３０分／洗浄）の２回以上の洗浄（２００μｌ／管）で洗浄して、染色を除去する。クーマシーで染色されたゲルは、さらに何度か洗浄して、染色を除去してもよい。ゲル片は、この溶液中に保存されてもよい。管を、Ｎｕｔａｔｏｒを用いて撹拌する。
３）１洗浄につき１５分間、２００μｌの５０％アセトニトリル（２００ｍＭの酢酸アンモニウム中  ｐＨ  ＝８．０  −  ＮＨ４０Ｈで調整）中で、ゲル片を二度洗浄し、次いで、３０分間、もう一度洗浄する。Ｎｕｔａｔｏｒを用いて撹拌する。
４）１５分間、１００％アセトニトリルで洗浄する。
５）ゲル片から溶液を吸い取り、Ｓｐｅｅｄｖａｃ（１５分）内で乾燥するまで蒸発させる。
６）１ｍｌの１０％  アセトニトリル（２００ｍＭのＮＨ４０Ａｃ中，  ｐＨ７．８−８．３  −  ＮＨ４０Ｈで調整された）を、トリプシンの２０μｇバイアルに添加することによって、トリプシンストックを作る。（Promega配列決定グレードの修飾されたトリプシン - カタログ# V5111を使用）。
７）各管内で、カバーゲル片に、ちょうど十分なトリプシン溶液を添加することによって、蛋白質を消化する。典型的には、２０μｌで十分である。
８）片を３７℃にて、１６ないし２０時間、インキュベートする。
９）管を室温まで冷却し、管を遠心分離し、水分を底部まで持ってくる。
１０）Ｎｕｔａｔｏｒで撹拌しつつ、ペプチドを、２０分間、２００μｌの５０％  アセトニトリル, ０．１％  トリフルオロ酢酸  （ＴＦＡ）で抽出する。
１１）各管につき、上澄みを個々に保存し、次いで、Ｎｕｔａｔｏｒで撹拌しつつ、２００μｌの８０％  アセトニトリル，  ０．１％  ＴＦＡを用いて、再抽出する。
１２）上澄みを保存し、各管につき先に保存しておいたものに添加し、次いで、最後に一度、Ｎｕｔａｔｏｒで撹拌しつつ、２００μｌの８０％  アセトニトリル，  ０．１％  ＴＦＡを用いて、３０分間、抽出する。
１３）上澄みを保存し、各管につき先に保存しておいたものに添加する。抽出物を、Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ内で乾燥させる。
【００９７】
Ｇ．  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
バンドからのトリプシンポリペプチドを、（ＭＡＬＤＩにつき）レーザー脱着または（ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳにつき）熱スプレーを用いてイオン化して、質量スペクトルを作成した。ペプチドの質量は、混合物として、ＭＡＬＤＩを用いて測定する；そこにはトリプシンペプチドの分離はない。ＭＡＬＤＩ分析用に、わずかに修飾された公表された手順を用いて、試料を調製した(Shevchenkoら, 1996)。乾燥ペプチドを含有する各管に、１０μＬの０．１％  ＴＦＡを添加することによって、試料を復元した。アセトンおよびイソプロピルアルコールの１：１（ｖ：ｖ）混合物の１０ｍｇ／ｍＬのニトロセルロースおよび２０ｍｇ／ｍＬのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を溶解することによって、マトリックスを調製した。ＭＡＬＤＩプレート上に、０．５μＬのマトリックス溶液を送達することによって、マトリックスをスポットした。同様に、各試料からの１μＬの試料を、スポットされたマトリックス上に、沈積させた。試料を、マトリックス上で約１０分間乾燥させて、ペプチドがニトロセルロースに結合するのを確実なものにした。最後に、各スポット上に５μＬの５％ギ酸を沈積させ、すぐに真空ラインを用いてこの溶液を吸引することによって、三度水性洗浄を行った。次いで、ＭＡＬＤＩ質量分光測定分析のため、ＭＡＬＤＩ試料プレートを質量分光器に移した。反射モードのＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＳＴＲ(Perseptive Biosystems, Framingham, MA)を用いて、データを収集した。既知のトリプシン自己融解ピークを用いて、スペクトルを内部較正した。トリプシンペプチド質量のピークリストを発生させ、蛋白質を同定するために、ＭＳ−Ｆｉｔ検索ツールを用いて、ＮＣＢＩ非−反復性蛋白質配列データベースに対して、これらを検索した(Clauserら, (1999))。
【００９８】
時々、マッチは「境界線」上にあり、確認を必要とし、あるいはデータが弱いか、または単に有意なマッチが存在しない。こういった場合、ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用する。この方法において、消化混合物を、逆相カラム上に注射し、それによって、一度につき１つずつ（あるいは一度につき少なくとも２、３個）、ペプチドは分離され、質量分光器（この場合、熱スプレー、タンデム型質量分析）に導入される。質量分光器は、ペプチドの質量を測定し、最も豊富なものを、それ以外のもの全てを取り除くことによって単離し、ペプチドがＡｒガスと衝突する衝突セルにペプチドを送る。ペプチドは、アミド結合に対して断片化する傾向があり、そのため、断片はアミノ酸配列の指標になり得る。断片化データは、データベース検索ツールに送られ、これはデータを蛋白質配列データベースとマッチさせる。それは、部分的配列およびトリプシンペプチドのオリジナル質量を用いて、マッチングを得る。単一のトリプシンペプチドからのＭＳ／ＭＳデータを用いて、高い信頼性を持って、蛋白質を同定することができる。
【００９９】
Ｈ．ナノＨＰＬＣ
ナノＨＰＬＣを用いて、精製された蛋白質（電気泳動によって精製）からトリプシン断片を分離し、そうすることにより、１つの（または２、３の）ペプチドを、熱スプレー、タンデム型質量分析に、一度に導入する。試料を、自動試料採取器、グラジエントおよび補助的なポンプを備えたＣａｐＬＣ(Waters, Milford, MA)システムに注入した。５ミクロリットルを、「ミクロリットルピックアップ」モードを介して注入し、３００μｍｘ５ｍｍ  Ｃ１８トラッピングカートリッジ(LC Packings, San Francisco, CA)を介して、オンラインで脱塩した。試料を、３分間、高流速（３０μＬ／分）にて脱塩した。質量分光器への導入前に、１００μｍｘ１５０ｍｍ  ＭａｇｉｃＣ１８カラム(Michrom BioResources, Auburn, CA)上で、ペプチドを分離した。低ないし高有機物で、典型的な逆相グラジエントを、３０分以上にわたり、使用した。移動相Ａは０．１％ギ酸であり、Ｂは１００％アセトニトリル，０．１％ギ酸であった。また、流速を有機移動相と直線的に増加させた。システムは、小分割流速を使用し、それは結果的に、約３００ないし７００ｎＬ／分のカラム流速になった。
【０１００】
Ｉ．  ＭＳ／ＭＳ分析およびデータ処理
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳのために、分離工程（逆相ＬＣ）があり、それによって、一度につき１つずつ、トリプシンペプチドは質量分光器に導入される。まず、ペプチドの質量が測定され、次いで、このペプチドからの断片の質量が測定されるため、それはＭＳ／ＭＳ、またはタンデムＭＳと呼ばれる。トリプシンペプチドは、定常ガス（Ａｒ）との衝突によって、断片化され、該断片の質量を測定する。これは、たびたび、ペプチドの少なくとも部分的な配列を所与する。データ依存性ＭＳ／ＭＳ研究を、Ｑ−Ｔｏｆ質量分光器(Micromass, Beverly, MA)で実施した。注入口は、修飾されたナノスプレー源であり、これはピコチップ（picotip）(New Objective, Cambridge, MA)を保持するように構築されたものである。ＣＡＤに対して使用された衝突エネルギーは、ペプチドの質量および荷電状態に基づき決定した。データをProteinLynx version 3.4(Micromass, Beverly, MA)によって処理して、ピークリストファイルを発生させた。サーチエンジンＭＡＳＣＯＴ(Matrix Science, London, UK)を用いて、ＮＣＢＩ非−反復性蛋白質配列データベースに対して、データを検索した。サーチエンジンは、上位２０ヒットを報告した。このデータベースのいずれのエントリーともマッチしなかった配列データを、ＮＣＢＩからのｄｂＥＳＴデータベースならびに内部発生配列データベースに対して検索した。
【０１０１】
Ｊ．  研究１
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、ＯＢＡＰ−ｒｉｃｈと呼ばれる大豆蛋白質単離体からのＨＭＦを分離した。ゲルのバンドまたは領域を含有する５つのポリペプチドをトリプシン処理し、質量分光法を用いて、アミノ酸配列につき、分析した（図７）。バンドの起源を、表２のごとく、同定した：
【０１０２】
【表２】
2005523007.tif 000009
*グリシニン配列は、共に並んで、Ｇ１グリシニン（72296, AlaBx 前駆体）（配列番号：１）の基本的なサブユニットの残基401-435を作る。
(VFDGELQEGRVLIVPQNFVVAARSQSDNFEYVSFK)（配列番号：１）：
A      VFDGELQEGRおよびSQSDNFEYVSFK
B      Ａ記載の通りの２つおよび:VLIVPQNFVVAAR
【０１０３】
Ｋ．研究２
上記の推定上のオレオシン配列は、既知のオレオシン配列とマッチしなかった。低分子量大豆オレオシン（〜１８ｋＤａ）の配列は、未知であった。次の研究の目的は、上記「推定上のオレオシン」配列が１８ｋＤａ大豆オレオシンからのものであるかを決定することである。油体結合蛋白質（ｐ３４蛋白質およびオレオシン）を精製し、ポリアクリルアミドゲル上で分離した（図８）。バンドをトリプシン処理し、ＭＳによって分析した。
【０１０４】
疎水性領域に隣接したオレオシンの両親媒性のＮ−末端領域から放出されたトリプシンペプチドの存在を、ＨＭＦから単離された１２ｋＤａバンドにて確認した。平均質量／アミノ酸は、１１１．１ダルトンである。すなわち、１２ｋＤａペプチド中のアミノ酸の数は、約１０８アミノ酸である。つまり、ＨＭＦ中で発見されたペプチドは、オレオシンの疎水性領域の一部分も含有していなければならない。配列YETNNSSLNNPPSR（配列番号：１０）は、推定上のオレオシンの残基33-45を表し、これは蛋白質の疎水性核領域の始まりの直前にある。
結果：配列YETNSSLNNPPSR（配列番号：１０）が低分子量大豆オレオシンにあることを確認した。
【０１０５】
【表３】
2005523007.tif 000010
【０１０６】
Ｌ．研究３
研究１で特徴付けられたＨＭＦを、ベータ−コングリシニンをほとんど持っていない大豆蛋白質画分から作成した。これにより、ＨＭＦ中に存在するグリシニンサブユニットの同定が可能になった。次の研究を実施し、ベータ−コングリシニン配列が、もしあるならば、ＨＭＦ中で同定し得るかを決定した。Ｇ１グリシニンを欠乏している大豆を使用して、大豆蛋白質単離体を作り、単離体をペプシンで消化して、ＨＭＦを作成した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、ＨＭＦを分離し（図９）、バンドをトリプシン処理し、ＭＳを用いて特徴付けた。
結果：  ベータ−コングリシニンからのポリペプチド配列が同定された。
【０１０７】
【表４】
2005523007.tif 000011
*前駆体アルファ−プライムベータ−コングリシニン(121286): QNPSHNKCLR（配列番号：１８）および下記にリストした4191814の配列
*ベータ−コングリシニンのアルファ−プライムサブユニット(4191814): NQYGHVR（配列番号：６）、および下記にリストした7442025の配列
*ベータ−コングリシニンのアルファ−サブユニット(7442025):
NILEASYDTKFEEINK（配列番号：８）, LQESVIVEISKK（配列番号：４）, QQQEEQPLEVRK（配列番号：５）
【０１０８】
実施例２
コレステロール取り込みにおけるＨＭＦの効果
Ｃａｃｏ−２細胞系はヒト結腸直腸癌から由来し、通常、腸管上皮細胞生理学の研究に使用される。これらの細胞は、コレステロール、グルコース、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、胆汁酸および薬物伝達プロセスを研究するのに使用されてきた(Hidalgoら, 1989); Artursson, 1990; Homan and Hamelehle, 1998)。これらの細胞は、脂質およびステロール代謝酵素および伝達蛋白質を発現し、これらは腸細胞内にあるものと同様に制御される(Levyら, 1995)。また、それらはＳＲ−Ｂ１を発現すると知られており、これは最近同定された蛋白質であり、コレステロール吸収において役割(Werderら, 2001)ならびにＡＴＰ−結合カセットトランスポーター族中の様々な蛋白質を演じ、また、腸管上皮細胞による純コレステロール取り込みを媒介する役割も演じる(Taipalensuuら, 2001)。
【０１０９】
大豆蛋白質は、ＨＭＦの源である。簡潔には、大豆蛋白質を、ペプシンで、１７時間、インキュベートし（水性相中０．２％  ＮａＣｌ，  ３８℃，  ｐＨ１．１，  ペプシンは、大豆蛋白質単離体の５％であった）、２０分間、９０℃にて加熱処理して、ペプシンを不活化させ、氷で冷却し、ｐＨを６．２１まで０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３で調整し、４，５００ｇにて、２０分間遠心分離した。このペレットを、三度、水で洗浄し、ＨＭＦとして同定した。
【０１１０】
Ａ．  コレステロール吸収アッセイ用のＣａｃｏ−２細胞の培養
１．９６−ウェルＣｏｓｔａｒ固体白色組織−培養処理されたプレート(Costar #3917)を、マウスの尾のコラーゲンで、次の通りに先に覆う：
ａ）０．０２Ｎ酢酸中に、２０μｇ／ｍｌマウスの尾のコラーゲン溶液(Becton Dickinson/Collaborative Biomedical Products カタログ#40236)を調製する：
０．０２Ｎ酢酸：１１．５ｍｌの１７．４Ｎ酢酸／１０ｍ無菌Ｈ２Ｏを添加する
１０ｍｌの０．０２Ｎ酢酸につき、６０μｌのコラーゲン（３．３２ｍｇ／ｍｌ）を添加する
ｂ）９６ウェルプレートにつき、２５０μｌのコラーゲン溶液／ウェルを添加し、層状態で、一晩、室温にて静置させる
ｃ）１ｘ２５０μｌのＤＭＥＭで各ウェルを濯ぎ、引き続いて、１００ｍｌのＤＭＥＭで濯ぐ
２．Ｃａｃｏ−２細胞の２つのＴ−１５０フラスコ(Costart #430825)を、７０ないし８０％集密（４１および６０の間の継代数を持つ細胞を使用する）にて、Ｃａ２＋およびＭｇｔ２＋なしの１０ｍｌダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で濯ぐ。
３．６ｍｌの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を各フラスコに添加し、３７℃にて、５ないし１０分間、インキュベートする。
４．１０ｍｌピペットを使用して、Ｔ−１５０フラスコ内の細胞を洗い流して、細胞凝集塊を壊す。細胞懸濁液を５０ｍｌ管に移す。
５．１２ｍｌの完全培地ＤＭＥＭを、１０％のウシ胎児血清、１Ｘの非必須なアミノ酸、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンを、細胞懸濁液に添加し、２０００ｒｐｍ（Sorvall RT7)にて、５分間、遠心分離によって細胞を混合し、ペレットする。
６．培地を除去し、２０ｍｌの完全培地で置き換える。１０ｍｌのピペットを使用して、細胞を分散する。［〜８０％密集２ｘＴ１５０フラスコは、〜１０ｘ１０６細胞を発生させる］。
７．３２００細胞／１００μｌ／ウェルの密度にて、９６ウェルのコラーゲンで覆われたマイクロタイタープレートに、細胞をプレートする。
８．交互の日に、細胞に完全培地を与える。細胞は、プレート後、１３日で、コレステロール吸収に必要な表面受容体を発現するだろう。
【０１１１】
Ｂ．コレステロール吸収アッセイ
Fieldら(1991)によって報告された方法に修飾を加えたものによって、Ｃａｃｏ−２によるミセルコレステロールの取り込みを実施した。我々の方法を、次の通り記載する：
１．Ｃａｃｏ−２細胞内でコレステロール吸収を阻害する能力につきテストされる化合物／ペプチドを、原液として、ＤＭＳＯ中に溶解する。原液からのテスト化合物の希釈を、ペンタノール中で作成する。Ｃａｃｏ−２コレステロール吸収阻害アッセイで使用される化合物の希釈は、アッセイされる所望の最終希釈より、１０Ｘ高いべきである、つまり、ウェル中の２ｍＭ溶液をピペットして、アッセイの最後に２００μＭ得る。２００ｍＭ（０％コレステロール吸収対照）にて、最大阻害を有する対照コレステロール吸収阻害剤として、シトスタノール（Sitostanol）を使用する。溶媒のみを、１００％コレステロール吸収（高ｄｐｍ）として使用する。
２．三組のポリプロピレンの浅いウェルマイクロタイタープレート(Sigma M-4029)に、対照およびテスト化合物／ペプチドの希釈をピペットする。
３．プレートを、３５℃ないし４５℃の温度にて、一晩ＧｅｎｅＶａｃ器具内で乾燥させる。次の工程前に、プレートが完全に乾燥しているかチェックする。
４．３Ｈ−コレステロールミセル混合を、セプタライナーキャップのある(VWR カタログ番号15900-036)Trace-Cleanアンバーバイアル内で、次の通り調製した:
【０１１２】
１．０ｍｌの１０Ｘミセル原液（１０Ｘミセル原液＝５０ｍＭタウロコール酸，  １ｍＭオレイン酸，  １ｍＭコレステロール）に、３７．５μｌの３Ｈ−コレステロール(NEN カタログ番号NET-725)（０．７５ナノモルコレステロール）＝３７．５μＣｉ  ３Ｈ−コレステロール（溶液は、０．０７５％コレステロールを放射標識＝痕跡として含有する）を添加する。１．８ｍｌ／マイクロタイターアッセイプレートを調製して、被覆させる。
５．乾燥させたプレートの全ウェルに、１５μｌ／ウェルの希釈剤ＣＨ３Ｃｌ：ＭｅＯＨ（１：１）をピペットして、乾燥した残留物を溶媒和させる。このために、ポリプロピレン蓄積を使用し、氷上に蓄積を保存して、溶媒の蒸発を最小限にする。
６．氷上のポリプロピレン蓄積を用いて、同じプレートに、１５μｌの３Ｈ−コレステロール混合を各ウェルに添加して、放射標識溶液を含有させる。
７．約２０ないし３０分間、窒素ガスで流しつつ、先に加熱した３７℃蒸発チャンバー（ＶＷＲ）内でプレートを乾燥させる。
８．乾燥させたウェルを、５０μｌ／ウェルのエチルエーテルで濯ぎ、蒸発チャンバー内で再度乾燥させる。エーテルでもう一度濯ぎ、乾燥させる。
９．一晩、プレートを真空デシケーターに置く。
１０．Ｑｕａｄｒａ  ９６ワークステーションを用いて、各乾燥させたウェルに、１５０μｌの室温のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）(Sigma H-8264)をピペットする。ミセル脂質の最終濃度は次の通りである：５ｍＭのタウロコール酸、１００μＭのオレイン酸、１００μＭのコレステロールおよび３．７５μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−コレステロール（または約５μＭ）。
１１．粘着シーリングテープ(Packard TopSeal-A 粘着シーリングテープまたはSigma MylarシーリングテープT-2162)でプレートをシールし、室温にて、少なくとも３０分間、Labline plate shaker, Model 4625,（設定＝６）上で撹拌し、ミセルを溶解する。
１２．自動細胞洗浄器を用いて、５度、９６ウェルプレートにプレートされたＣａｃｏ−２細胞を洗浄する（上記の通り）。これを、工程１３の直前に行う。ペーパータオルで、プレートを叩いて、過剰脂質を全て除去し、その後、次の工程でミセルを添加する。
１３．Ｑｕａｄｒａ  ９６ワークステーションを用いて、適当にマークされたＣａｃｏ−２細胞プレートに、１００μｌの可溶化ミセルを移す。プレートを、３７℃インキュベーターに、４時間置く。
１４．自動細胞洗浄器を用いて、ＨＢＳＳ（１ｍＭ  ＴＣ）中の冷１ｍＭタウロコール酸で、５度、細胞を洗浄する。
１５．Ｑｕａｄｒａ  ９６ワークステーションを用いて、細胞プレートに、２００μｌ／ウェルのシンチレーションカクテル(Packard MicroScint 40, カタログ番号6013641)をピペットする。
１６．熱シーリングテープ(Packard TopSeal−S 熱シーリングフィルム)でプレートをシールし、少なくとも２０分間、プレートを撹拌して（設定＝少なくとも６）、細胞試料で蛍光を混合する。
１７．一晩、プレートを暗室に置く。
１８．Packard TopCount NXT器具を用いて、ｄｐｍを計数する。
１９．結果を、次の通り、対照（阻害剤なし）の％として計算する：
【０１１３】
対照の％＝テスト化合物／ペプチドｄｍｐ−２００μＭシトスタノールｄｐｍ  ｘ１００
対照（化合物なし）ｄｐｍ−２００μＭシトスタノールｄｐｍ
【０１１４】
様々な源からの大豆ＨＭＦは、Ｃａｃｏ−２細胞によるコレステロール取り込みの用量−依存性阻害を示した（例えば、図１０参照）。ベータ−コングリシニンテスト（４．７ｍｇ／ｍＬ）を除いては、コレステロール取り込みを５０％減少させるのに必要なＨＭＦの濃度は、１．２および２．９ｍｇ／ｍＬの間であった。
【０１１５】
実施例３
ＨＭＦの作用メカニズムの分子薬理学的特徴付け
テスト化合物／ペプチドが、コレステロール吸収アッセイ（方法については実施例２参照）用に調製されたミセル溶液への３Ｈ−コレステロールの溶解性に影響を及ぼすかどうかを決定するのに、次のアッセイを実施した：
１．実施例２の工程１１までの方法に記載の通りにミセルを調製する。
２．Ｑｕａｄｒａ  ９６ワークステーションを用いて、不透明なCostarプレート(Costar #3917)に、２０μｌの溶解化ミセルを移す。
３．Ｑｕａｄｒａ  ９６ワークステーションを用いて、マイクロタイタープレートウェルに、２００μｌ／ウェルのシンチレーションカクテル(Packard MicroScint 40, カタログ番号6013641)をピペットする。
４．プレートを熱シーリングテープ(Packard TopSeal S 熱シーリングフィルム)でシールし、プレートを少なくとも２０分間撹拌して（設定＝少なくとも６）、ミセル試料で蛍光を混合する。
５．一晩、プレートを暗室に置く。
６．Packard TopCount NXT器具を用いて、ｄｐｍを計数する。
７．結果を、対照の％（阻害剤なし）として、次の通り計算する：
対照の％＝テスト化合物／ペプチドｄｐｍ−２００μＭシトスタノールｄｐｍ  ｘ１００
対照（化合物なし）ｄｐｍ−２００μＭシトスタノールｄｐｍ
８．もし、テスト化合物/ペプチドがミセルからの３Ｈ−コレステロールを置き換えるなら、テスト化合物/ペプチドｄｐｍの減少が、テスト化合物/ペプチドのより高い濃度と共に見受けられるだろう。もしそうでないならば、溶解化ミセルのｄｐｍは、テストされたテスト化合物/ペプチドの希釈の範囲にわたり、比較的一定に留まるべきである。
図１１は、これをシトスタノールによるコレステロール阻害の主要なメカニズムと比較して示す。
【０１１６】
実施例４
大豆蛋白質ＨＭＦの特徴付け
低量の油体結合蛋白質（ＯＢＡＰ（−））、油体結合蛋白質の豊富な画分（ＯＢＡＰ（＋））および対照を有する大豆蛋白質単離体画分からのＨＭＦの収率の比較を行った。全て、同じ大豆（変種A2247)から作られた。
【０１１７】
簡潔に言えば、大豆蛋白質の画分を、１７時間（水性相中０．２％  ＮａＣｌ，  ３８℃，  ｐＨ１．４，  ペプシンは大豆蛋白質単離体の５％であった）ペプシンでインキュベートし、９０℃にて、２０分間加熱処理して、ペプシンを不活性化させ、氷上で冷却し、０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３でｐＨを６．２１に調整し、２０分間、４，５００ｇにて遠心分離した。ペレットを、水で二度洗浄し、凍結乾固した。乾燥ペレットの重量を、ＨＭＦの収率を決定するアッセイで使用した大豆蛋白質単離体の元々の量の重量と比較した［（最終重量/初期重量）ｘ１００］。ＯＢＡＰ（＋）および対照大豆蛋白質試料は、両方ともＨＭＦを生成した。しかしながら、ＯＢＡＰ（−）画分はいずれのＨＭＦも得ず、これはオレオシンおよびオレオシンと結合する成分（例えばサポニン、リン脂質）が、大豆蛋白質の吸収率を調節することを示す。
次のものは、大豆蛋白質を大豆蛋白質単離体（ＳＰＩ）に画分するのに利用した手順である：
【０１１８】
Ａ．手順１：ＯＢＡＰ（−）
１．１５ｋｇのＤＩ水に、１ｋｇの（Cargillからの）脱脂した大豆フレークを添加する。１Ｎ  ＮａＯＨで、ｐＨを７．５に調整する。室温にて、１時間、混合する。
２．１０分間、１０，０００ｇにて、混合物を遠心分離し、上澄みを収集する。
３．３０ｍＭの濃度にて、上澄みに、それぞれＮａ２ＳＯ４およびＣａＣｌ２を添加する。
４．２Ｎ  ＨＣｌで、工程３からの上澄みのｐＨをｐＨ２．８に調整する。１０分間、１０，０００ｇにて、混合物を遠心分離する。上澄みを収集する。
５．４回、ＤＩ水で、（工程４からの）上澄みを希釈する（例えば、１Ｌないし４Ｌ）。２ＮのＮａＯＨで、ｐＨを４．５に調整する。１０分間、１０，０００ｇにて遠心分離する。沈殿物を収集する。
６．ＤＩ水に、工程５からの沈殿物を再度溶解し、２ＮのＮａＯＨで、ｐＨを７．５に調整する。
７．注入口温度＝２００℃、吐出口温度＝９０ないし９５℃にて、中和蛋白質混合物をスプレー乾燥する。
【０１１９】
Ｂ．手順２：ＯＢＡＰ（＋）
１．１５ｋｇのＤＩ水に、１ｋｇの（Cargillからの）脱脂した大豆フレークを添加する。１ＮのＮａＯＨで、ｐＨを７．５に調整する。室温にて、１時間混合する。
２．１０分間、１０，０００８にて、混合物を遠心分離し、上澄みを収集する。
３．３０ｍＭの濃度にて、上澄みに、Ｎａ２ＳＯ４およびＣａＣｌ２をそれぞれ添加する。
４．工程３からの上澄みのｐＨを、２ＮのＨＣｌでｐＨ２．８に調整する。１０分間、１０，０００８にて、混合物を遠心分離する。沈殿物を収集する。
５．工程４からの沈殿物を、ＤＩ水に再度溶解し、２ＮのＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。
６．注入口温度＝２００℃、吐出口温度＝９０ないし９５℃にて、中和蛋白質混合物をスプレー乾燥する。
【０１２０】
Ｃ．手順３：対照
１．１５ｋｇのＤＩ水に、１ｋｇの（Cargillからの）脱脂大豆フレークを添加する。１ＮのＮａＯＨで、ｐＨを７．５に調整する。１時間、室温にて混合する。
２．１０分間、１０，０００ｇにて、混合物を遠心分離し、上澄みを収集する。
３．４回、（工程２からの）上澄みをＤＩ水で希釈する（例えば、１Ｌないし４Ｌ）。２ＮのＨＣｌでｐＨを４．５に調整する。１０分間、１０，０００ｇにて、遠心分離する。沈殿物を収集する。
４．工程５からの沈殿物を、ＤＩ水に再度溶解し、２ＮのＮａＯＨで、ｐＨを７．５に調整する。
５．注入口温度＝２００℃、吐出口温度＝９０ないし９５℃にて、中和蛋白質混合物をスプレー乾燥する。
【０１２１】
１つの研究では、試料の全蛋白質含有量は、ＯＢＡＰ（−）（９４．８％），  ＯＢＡＰ（＋）（９１．８％）および対照（６８％）（Official Methods of Analysis of the AOAC, 第１６版, 1995, 990.02, Locator #4.2.08)であった。各画分からのＨＭＦの収率を決定した。結果によれば、ＯＢＡＰ（−）試料からは、ＨＭＦは得られなかった（表５参照）。油体結合蛋白質は、ＨＭＦの大部分を占めるわけではないが、この研究は、ＯＢＡＰの重要性および／またはＨＭＦを得る際にこの画分と結合するリン脂質、イソフラボンおよびサポニンの重要性を示した。
【０１２２】
同じ研究で、ＯＢＡＰ（−）、ＯＢＡＰ（＋）、および対照大豆蛋白質単離体のトリプシン阻害活性は、それぞれ、２４、３１．５および４７．５ＴＩＵ／ｍｇであった(a standard AACC method, 1995, 第９版, method 71-10を用いる)。これらの活性は、試料からのＨＭＦの収率と相関関係はなく；すなわち、ＯＢＡＰ（−）単離体中のトリプシン阻害活性の欠乏が、ＨＭＦ形成の欠乏を引き起こしたという可能性を排除する。
また、大豆蛋白質試料のキモトリプシン阻害活性は、試料からのＨＭＦの収量とは関係していなかった（表５）(AACC, 第１０版, method 22-40)。
【０１２３】
【表５】
2005523007.tif 000012
【０１２４】
また、他の大豆画分を入手し（グリシニン、ベータ−コングリシニン、中間体）、アイオワ州立大学のパイロットプラント（１５ｋｇ  パイロットプラントプロセス#2; Wuら, 1999）で調製した。また、これらの試料中のオレオシンの量を、オレオシン抗体を用いて、ウエスタンブロッティングによって決定した（図１２参照）。再び、より高い量のオレオシンを持つ試料は、ＨＭＦのより高い収量を生成することが示された（表６）。
【０１２５】
ペプシン消化ＳＰＩ（ＯＢＡＰおよび対照）の試料、非消化ＳＰＩ試料（対照、ＯＢＡＰ（−）、ＯＢＡＰ（＋））、油体蛋白質調製物、および対照大豆ＩＡ−２０３２のひき豆試料を、１８％  トリス／グリシンゲルに溶解し、ＰＶＤＦ膜に移した。これらのブロットを、オレオシンへの抗血清で探索した（図１３）。QIAexpressionist(QIAGEN Inc., Valencia, CA)記載の通り、Ｅ．ｃｏｌｉで過剰発現しそれから精製した完全長オレオシン蛋白質を用いて、この抗血清を、ウサギ内で発生させた。これらのブロットは、より高い量のオレオシンを有する試料は、ＨＭＦのより高い収量を生成したことを示した（表６）。
【０１２６】
実施例５
ＨＭＦ収量に対するエタノールによる抽出の効果
どの程度まで、中間体画分の高収量が、リン脂質、サポニンおよびイソフラボン由来のものかを知るため、７０％エタノールを用いて、画分からこれらの成分を抽出し、画分をＨＭＦ収量につき、再度テストした。結果は、５０％低い収量であった。低収量画分（グリシニン）への抽出された画分の追加によって、該画分のＨＭＦの収量が改善された（８０％）。これらの結果（表６参照）は、ＨＭＦポリペプチドのプロテアーゼによる消化に抵抗する能力は、部分的に、サポニン、イソフラボンおよびリン脂質といったアルコール抽出可能成分の存在に依存していることを示唆する。先の実施例からの結果は、また、概要説明と一緒に、表６に含まれる。この概要からの結論は、オレオシン、ベータ−コングリシニン、アルコール抽出可能物（リン脂質、サポニン、イソフラボン）、および基本的なグリシニンサブユニットは、ＨＭＦの高収率に寄与し、これはコレステロール−低下物質として機能し得るということであった。最も重要な成分は、リポ蛋白質（オレオシンおよび結合リン脂質）である。ベータ−コングリシニンおよびグリシニンを含有する大豆蛋白質材料のコレステロール−低下性質は、植物からのリポ蛋白質（例えば、結合リン脂質を持つオレオシン）または他の源（例えば、卵黄リポ蛋白質）を添加することによって、高めることができると考えられている。
【０１２７】
【表６】
2005523007.tif 000013
【０１２８】
本明細書中で開示し主張した全ての組成物および方法は、本開示に鑑みて、過度な実験なしに作成され実施された。本発明の組成物および方法は、好ましい具体例に基づいて記載されてきたが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなしに、組成物および方法、ならびに本明細書中に記載した方法の工程または工程系列に、変更を適用できることが明らかだろう。より具体的には、同一または同様の結果を達成しつつ、化学的かつ生理学的に関係のある特定の剤が、本明細書中に記載した剤と置き換えられてもよいことは明らかであろう。当業者に明白な全てのそのような置換および修飾は、請求の範囲で定義されるごとく、本発明の精神、範囲および概念の内にあるものと考えられる。
【０１２９】
引用文献
次の引用文献は、それらが本明細書中に前記したものに補助的な例示的手順の記載または他の記載を提供する限り、引用によって、本明細書中に具体的に組み込まれる：
U.S. Patent 4,554,101
U.S. Patent 5,855,892
U.S. Patent 6,171,640
U.S. Patent 6,509,453
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【０１３０】
先の明細書、付属する請求の範囲および付随の図面に関して、本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、よりよく理解されるようになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】図１は、受託番号P29530の大豆からのオレオシン蛋白質Ｐ２４オレオシンイソ形態Ａ（Ｐ８９）の配列を表し、配列番号：１２に対応する。
【図２】図２は、配列番号：１３に対応し、受託番号P29531の大豆からのオレオシン蛋白質Ｐ２４オレオシンイソ形態B（Ｐ９１）の配列を表す。
【図３】図３は、トウモロコシ(Zea mays)(受託番号AAA68066)からの油体結合蛋白質１７ｋＤａオレオシン(oleo17)のアミノ酸配列を示し、配列番号：１４に対応する
【図４】図４は、トウモロコシ(Zea mays)(受託番号AAA68065）からの油体結合蛋白質１６ｋＤａオレオシン(oleo16)のアミノ酸配列を示し、配列番号：１５に対応する。
【図５】図５は、トウモロコシ(Zea mays)(受託番号AAA67699)からのオレオシンＫＤ１８(KD18; L2)のアミノ酸配列を示し、配列番号：１６に対応する。
【図６】図６は、H. annuus（ヒマワリ）オレオシン(受託番号CAA55348)のアミノ酸配列を示し、配列番号：１７に対応する。
【図７】図７は、ＯＢＡＰ（＋）と呼ばれる大豆蛋白質単離体からのＨＭＦのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離されたゲルのバンドを含有する５つのポリペプチドを示す。
【図８】図８は、ポリアクリルアミドゲルで精製され分離された油体結合蛋白質（Ｐ３４およびオレオシン）を示す。
【図９】図９は、Ｇ１グリシニンを欠乏している大豆から生成されたペプシン消化大豆蛋白質単離体からのＨＭＦを含有するゲルを示す。
【図１０】図１０は、ＯＢＡＰ（＋）対ＯＢＡＰ（−）大豆蛋白質単離体からの単離体ＨＭＦのＣａｃｏ−２細胞によるコレステロール取り込みの用量依存性阻害を描くグラフを示す。
【図１１】図１１は、シトスタノール存在下のコレステロール吸収対グリシニン−ｎｕｌｌおよびα/α' β−コングリシニン−ｎｕｌｌ  ＨＭＦの存在下のコレステロール吸収の間の差異を描くグラフを示し、それにより、メカニズムの差を示す。
【図１２】図１２は、各試料中のオレオシンの存在を示すゲルを表す。
【図１３】図１３は、示された試料中のオレオシンの存在または非存在を示すゲルを表す。
【配列表】
2005523007.tif 000014
2005523007.tif 000015
2005523007.tif 000016
2005523007.tif 000017
2005523007.tif 000018
2005523007.tif 000019
2005523007.tif 000020
2005523007.tif 000021
2005523007.tif 000022
【図１】
2005523007.tif 000023
【図２】
2005523007.tif 000024
【図３】
2005523007.tif 000025
【図４】
2005523007.tif 000026
【図５】
2005523007.tif 000027
【図６】
2005523007.tif 000028
【図７】
2005523007.tif 000029
【図８】
2005523007.tif 000030
【図９】
2005523007.tif 000031
【図１０】
2005523007.tif 000032
【図１１】
2005523007.tif 000033
【図１２】
2005523007.tif 000034
【図１３】
2005523007.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月7日(2004.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005523007000001.app
【国際調査報告】
2005523007.tif 000036