(57)【要約】  所望の免疫抗原性を発揮し、ワクチン等の医薬品として有用な組換えバキュロウイルスを高純度で製造するための方法、及び当該組換えバキュロウイルスの製造に用いられるトランスファーベクター及びその製造方法の提供。  少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターの製造方法であって、前記ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列を改変すること及び／又は当該タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失するようにポリヌクレオチド配列を改変することを特徴とするトランスファーベクターの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターの製造方法であって、前記ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列を改変すること及び／又は当該タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失するようにポリヌクレオチド配列を改変することを特徴とするトランスファーベクターの製造方法。
【請求項２】
少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターの製造方法であって、前記ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列を改変することを特徴とするトランスファーベクターの製造方法。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｃ）及び／又は（ｄ）〜（ｅ）を行う、請求項１記載の方法。
（ａ）ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列の改変を行い、ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドの核酸配列情報を得る工程
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸配列情報に基づきポリヌクレオチドを合成する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
（ｄ）ウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失した当該タンパク質の部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は当該部分ポリペプチドのアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されたポリヌクレオチドを合成する工程
（ｅ）前記工程（ｄ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
【請求項４】
融合遺伝子が、その上流にウイルス粒子構成タンパク質由来のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含むものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子、1型ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質遺伝子、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質遺伝子、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニン遺伝子、B型インフルエンザウイルスヘマグルチニン遺伝子、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子又はマウス肝炎ウイルスSタンパク質遺伝子のいずれかである請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子である請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子が、マラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原、SARSウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、HIV抗原、HCV抗原、リューシマニア抗原、トリパノソーマ抗原、ロイコチトゾーン抗原及び癌抗原から選ばれる抗原の遺伝子、もしくはこれらの抗原遺伝子群から選ばれる少なくとも１種とサイトカインとの融合抗原の遺伝子である請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
トランスファーベクターが、脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターとバキュロウイルスのプロモーターが連結したデュアル・プロモーターの下流に融合遺伝子が連結されたものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項９】
前記脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ＣＡＧプロモーター、エロンゲーションファクター1αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター及びMHCクラスプロモーターのいずれかから選択され、バキュロウイルスのプロモーターがポリヘドリンプロモーター、ｐ10プロモーター、IE1プロモーター、p35プロモーター、p39プロモーター及びgp64プロモーターのいずれかから選択されるものである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスDNA領域の間に免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域が挿入されたトランスファーベクターの製造方法であって、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域と融合しているN末端側、及び／又はC末端側のウイルスDNA領域のポリヌクレオチド配列を、天然由来の同一ウイルスDNA領域のポリヌクレオチド配列に対して、同一性が低下するように改変すること、及び／又はウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失するように当該ポリヌクレオチド配列を改変することを特徴とするトランスファーベクターの製造方法。
【請求項１１】
少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターを用いた組換えバキュロウイルスの製造方法であって、前記ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにそのポリヌクレオチド配列を改変してなる、及び／又は当該タンパク質を構成するアミノ酸配列の一部が欠失するようにそのポリヌクレオチド配列を改変してなるトランスファーベクターと、バキュロウイルスDNAとを昆虫の宿主細胞にコトランスフェクションすることを特徴とする組換えバキュロウイルスの製造方法。
【請求項１２】
少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターであって、前記ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されていること及び／又は当該タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失するようにポリヌクレオチド配列が改変されていることを特徴とするトランスファーベクター。
【請求項１３】
少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターであって、前記ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されていることを特徴とするトランスファーベクター。
【請求項１４】
下記（ａ）〜（ｃ）及び／又は（ｄ）〜（ｅ）を行うことにより製造される、請求項１２記載のトランスファーベクター。
（ａ）ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列の改変を行い、ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドの核酸配列情報を得る工程
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸配列情報に基づきポリヌクレオチドを合成する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
（ｄ）ウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失した当該タンパク質の部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は当該部分ポリペプチドのアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されたポリヌクレオチドを合成する工程
（ｅ）前記工程（ｄ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
【請求項１５】
融合遺伝子が、その上流にウイルス粒子構成タンパク質由来のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドが連結されたものである、請求項１２又は請求項１３記載のトランスファーベクター。
【請求項１６】
ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子、1型ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質遺伝子、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質遺伝子、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニン遺伝子、B型インフルエンザウイルスヘマグルチニン遺伝子、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子又はマウス肝炎ウイルスSタンパク質遺伝子のいずれかである請求項１２又は請求項１３記載のトランスファーベクター。
【請求項１７】
ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子である請求項１２又は請求項１３記載のトランスファーベクター。
【請求項１８】
免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子が、マラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原、SARSウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、HIV抗原、HCV抗原、リューシマニア抗原、トリパノソーマ抗原、ロイコチトゾーン抗原及び癌抗原から選ばれる抗原の遺伝子、もしくはこれらの抗原遺伝子群から選ばれる少なくとも１種とサイトカインとの融合抗原の遺伝子である請求項１２又は請求項１３記載のトランスファーベクター。
【請求項１９】
脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターとバキュロウイルスのプロモーターが連結したデュアル・プロモーターの下流に融合遺伝子が連結されたものである請求項１２又は請求項１３記載のトランスファーベクター。
【請求項２０】
前記脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ＣＡＧプロモーター、エロンゲーションファクター1αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター及びMHCクラスプロモーターのいずれかから選択され、バキュロウイルスのプロモーターがポリヘドリンプロモーター、ｐ10プロモーター、IE1プロモーター、p35プロモーター、p39プロモーター及びgp64プロモーターのいずれかから選択されるものである請求項１９記載のトランスファーベクター。
【請求項２１】
少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスDNA領域の間に免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域が挿入されたトランスファーベクターであって、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域と融合しているN末端側、及び／又はC末端側のウイルスDNA領域のポリヌクレオチド配列が、天然由来の同一ウイルスDNA領域のポリヌクレオチド配列に対して、同一性が低下するように改変されていること、及び／又はウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失するように当該ポリヌクレオチド配列が改変されていることを特徴とするトランスファーベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望の純度を保持する組換えウイルスの製造方法、当該組換えウイルスを得るためのトランスファーベクター及びその製造方法、特に組換えバキュロウイルスの製造時における目的外の組換え体の発生が抑制された組換えウイルスの製造方法、当該組換えウイルスを得るためのトランスファーベクター及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス粒子上に免疫原性外来蛋白質を融合抗原として提示可能なウイルス粒子遺伝子として、バキュロウイルスgp64遺伝子、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子、１型ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質遺伝子、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質遺伝子、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニン遺伝子、B型インフルエンザウイルスヘマグルチニン遺伝子、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子、又はマウス肝炎ウイルスSタンパク質遺伝子が知られている。【０００３】
一方、感染症や癌などに対するワクチン用の免疫原性外来タンパク質抗原としては、マラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原、SARSウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、HIV抗原、HCV抗原、リューシマニア抗原、トリパノソーマ抗原、ロイコチトゾーン抗原及びCEA、WT1、MAGEなどの癌抗原が知られている。またヒトの生体内に存在するIL-2、IL-12、IL-6、又はIFN-γなどのサイトカイン遺伝子と免疫原性外来タンパク質遺伝子が融合した免疫原性タンパク質が知られている。これらウイルス粒子遺伝子と免疫原性遺伝子とを融合させて、発現した融合抗原がワクチンの用途に利用されている。【０００４】
他方、バキュロウイルスを用いたタンパク質発現系は、目的タンパク質の工業生産で利用されている。また、近年、バキュロウイルスが昆虫細胞のみならず、哺乳動物にも外来遺伝子を導入できることが分かり、遺伝子治療ベクターの可能性が見出されている。【０００５】
例えば、特許文献1には、バキュロウイルスの初期遺伝子由来プロモーターにウイルス非構造タンパク質をコードする遺伝子を含むDNA領域と後期遺伝子由来のプロモーターにウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を含むDNA領域からなる複数の独立したプロモーターを有する組換えバキュロウイルス発現ベクターが開示されている。【０００６】
また、特許文献２には、バキュロウイルスを用いた遺伝子組換え技術によるタンパク質の生産方法が開示され、バキュロウイルスのgp64遺伝子と所望のタンパク質をコードする遺伝子とを結合させた融合遺伝子を発現させて、所望のタンパク質をウイルス粒子に融合させた形で生産し、所望のタンパク質が融合されたウイルス粒子を回収し、該ウイルス粒子から所望のタンパク質を切断するタンパク質の生産方法が開示されている。【０００７】
特許文献３には、改良された導入遺伝子の発現方法において、外来DNAのヌクレオチドコドン使用頻度を最適化して、外来DNA配列が発現される宿主細胞のコドン使用頻度に変更し、所望の蛋白を宿主細胞で発現する方法が開示されている。【０００８】
特許文献４には、子宮頚癌に関連付けられているHPV31L1遺伝子により発現されるタンパク質産物を酵母により得るために、酵母により認識される内部転写終結シグナルを含有せず、酵母細胞内での高レベル発現のためにコドン最適化されたHPV31L1をコードする合成ポリヌクレオチドが開示されている。【０００９】
特許文献５には、タンパク質の発現を目的としてヌクレオチド配列を最適化する方法及びその装置について、発現する宿主細胞系に適したコドン最適化方法が開示されている。【００１０】
特許文献６には、殺虫剤として使用するために非相同のペプチドのシグナル配列と殺虫性毒素をコードする遺伝子をそのゲノム内に取り込んだ組換えコナガバキュロウイルスについて、殺虫性毒素をコードするコドン最適化遺伝子が昆虫細胞タンパク質によりより効率に利用されるよう代替コドンと置換えられた殺虫性毒素をコードする発現カセットが開示されている。【００１１】
特許文献７には、細菌のリステリア菌において発現する融合タンパク質をコードする組換え核酸分子が開示され、該核酸分子は、細菌本来のペプチドのシグナル配列をコードする第一のポリヌクレオチドであって、該第一のポリヌクレオチドは細菌における発現に対してコドン最適化されている第一のポリヌクレオチド、及び外来抗原のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドであって、ここに該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある、第二のポリヌクレオチドを含み、ここに組換え核酸分子がペプチドのシグナル配列及びポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸分子、発現カセット、及び発現ベクターを含む細菌、並びに該細菌を含むワクチン組成物について開示されている。そして、外来抗原のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドが細菌における発現に対してコドン最適化されている組換え核酸分子が開示されている。
このように、目的とするタンパク質の宿主における発現効率を高めたり、低下させたりする目的で、遺伝子のコドン変換が行われている現状である。【００１２】
本発明者らは、先に免疫抗原性タンパク質のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドと発現細胞のウイルス粒子のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを融合させたトランスファーベクターを作製し、例えばバキュロウイルス等の所望のウイルスDNAとの相同組換えを行って作製した組換えウイルスをワクチン等の医薬組成物として利用することを報告している(特許文献８)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特許第３３６６３２８号公報
【特許文献２】特開２００２−２５３２６３号公報
【特許文献３】国際公開第２００６／０２４８６７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００４／０８４８３１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００４／０５９５５６号パンフレット
【特許文献６】国際公開第１９９９／５８７０５号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００５／０７１０８８号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００７／０９１６２４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、組換えウイルス、特に組換えバキュロウイルスの製造時において起こる目的外の組換えウイルスの発生を抑制することにより、所望の免疫抗原性を発揮し、ワクチン等の医薬品として有用な組換えウイルスを高純度で製造するための方法、及び当該組換えウイルスの製造に用いられるトランスファーベクターの製造方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上述のとおり、昆虫細胞中および脊椎動物細胞中の両者において所望の免疫原性外来タンパク質とウイルス粒子を構成するタンパク質を融合タンパク質として発現可能なトランスファーベクター及びこれを用いて製造される組換えバキュロウイルスについて先に特許出願したが(特許文献８)、当該トランスファーベクターを用いて組換えバキュロウイルスを製造した場合、目的の免疫抗原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域が欠失した目的外の組換えバキュロウイルス（以下、「変異ウイルス」とも云う）が製造した組換えバキュロウイルス中に含まれることがあり、目的とする組換えバキュロウイルスを含む医薬品の純度低下を引き起こすことが懸念された。【００１６】
そこで、本発明者らは、斯かる問題について鋭意検討したところ、トランスファーベクターに連結する融合遺伝子のうちウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子配列を、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列を改変、及び／又は当該タンパク質を構成するアミノ酸の一部を欠失させるようにポリヌクレオチド配列を改変し、当該トランスファーベクターを用いてバキュロウイルスDNAと共に昆虫細胞中でコトランスフェクションした場合に、前記変異ウイルスの発生を顕著に抑制することができ、結果として所望の組換えバキュロウイルスを高純度で製造できることを見出した。【００１７】
すなわち、本発明は、下記１）〜２１）に係るものである。
１）少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターの製造方法であって、前記ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列を改変すること及び／又は当該タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失するようにポリヌクレオチド配列を改変することを特徴とするトランスファーベクターの製造方法。
２）少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターの製造方法であって、前記ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列を改変することを特徴とするトランスファーベクターの製造方法。
３）下記（ａ）〜（ｃ）及び／又は（ｄ）〜（ｅ）を行う、上記１）の方法。
（ａ）ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列の改変を行い、ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドの核酸配列情報を得る工程
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸配列情報に基づきポリヌクレオチドを合成する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
（ｄ）ウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失した当該タンパク質の部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は当該部分ポリペプチドのアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されたポリヌクレオチドを合成する工程
（ｅ）前記工程（ｄ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
４）融合遺伝子が、その上流にウイルス粒子構成タンパク質由来のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含むものである、上記１）又は２）の方法。
５）ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子、1型ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質遺伝子、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質遺伝子、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニン遺伝子、B型インフルエンザウイルスヘマグルチニン遺伝子、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子又はマウス肝炎ウイルスSタンパク質遺伝子のいずれかである上記１）又は２）の方法。
６）ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子である上記１）又は２）の方法。
７）免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子が、マラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原、SARSウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、HIV抗原、HCV抗原、リューシマニア抗原、トリパノソーマ抗原、ロイコチトゾーン抗原及び癌抗原から選ばれる抗原の遺伝子、もしくはこれらの抗原遺伝子群から選ばれる少なくとも1種とサイトカインとの融合抗原の遺伝子である上記１）又は２）の方法。
８）トランスファーベクターが、脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターとバキュロウイルスのプロモーターが連結したデュアル・プロモーターの下流に融合遺伝子が連結されたものである上記１）又は２）の方法。
９）前記脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、CAGプロモーター、エロンゲーションファクター1αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター及びMHCクラスプロモーターのいずれかから選択され、バキュロウイルスのプロモーターがポリヘドリンプロモーター、p10プロモーター、IE1プロモーター、p35プロモーター、p39プロモーター及びgp64プロモーターのいずれかから選択されるものである上記８）の方法。
１０）少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスDNA領域の間に免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域が挿入されたトランスファーベクターの製造方法であって、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域と融合しているN末端側、及び／又はC末端側のウイルスDNA領域のポリヌクレオチド配列を、天然由来の同一ウイルスDNA領域のポリヌクレオチド配列に対して、同一性が低下するように当該ポリヌクレオチド配列を改変すること、及び／又はウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失するように当該ポリヌクレオチド配列を改変することを特徴とするトランスファーベクターの製造方法。
１１）少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターを用いた組換えバキュロウイルスの製造方法であって、前記ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにそのポリヌクレオチド配列を改変してなる、及び／又は当該タンパク質を構成するアミノ酸配列の一部が欠失するようにそのポリヌクレオチド配列を改変してなるトランスファーベクターと、バキュロウイルスDNAとを昆虫の宿主細胞にコトランスフェクションすることを特徴とする組換えバキュロウイルスの製造方法。
１２）少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターであって、前記ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されていること及び／又は当該タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失するようにポリヌクレオチド配列が改変されていることを特徴とするトランスファーベクター。
１３）少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターであって、前記ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されていることを特徴とするトランスファーベクター。
１４）下記（ａ）〜（ｃ）及び／又は（ｄ）〜（ｅ）を行うことにより製造される、上記１２）のトランスファーベクター。
（ａ）ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列の改変を行い、ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドの核酸配列情報を得る工程
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸配列情報に基づきポリヌクレオチドを合成する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
（ｄ）ウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失した当該タンパク質の部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は当該部分ポリペプチドのアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されたポリヌクレオチドを合成する工程
（ｅ）前記工程（ｄ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
１５）融合遺伝子が、その上流にウイルス粒子構成タンパク質由来のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドが連結されたものである、上記１２）又は１３）のトランスファーベクター。
１６）ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子、1型ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質遺伝子、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質遺伝子、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニン遺伝子、B型インフルエンザウイルスヘマグルチニン遺伝子、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子又はマウス肝炎ウイルスSタンパク質遺伝子のいずれかである上記１２）又は１３）のトランスファーベクター。
１７）ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子である上記１２）又は１３）のトランスファーベクター。
１８）免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子が、マラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原、SARSウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、HIV抗原、HCV抗原、リューシマニア抗原、トリパノソーマ抗原、ロイコチトゾーン抗原及び癌抗原から選ばれる抗原の遺伝子、もしくはこれらの抗原遺伝子群から選ばれる少なくとも1種とサイトカインとの融合抗原の遺伝子である上記１２）又は１３）のトランスファーベクター。
１９）脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターとバキュロウイルスのプロモーターが連結したデュアル・プロモーターの下流に融合遺伝子が連結されたものである上記１２）又は１３）のトランスファーベクター。
２０）前記脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、CAGプロモーター、エロンゲーションファクター1αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター及びMHCクラスプロモーターのいずれかから選択され、バキュロウイルスのプロモーターがポリヘドリンプロモーター、ｐ10プロモーター、IE1プロモーター、p35プロモーター、p39プロモーター及びgp64プロモーターのいずれかから選択されるものである上記１９）のトランスファーベクター。
２１）少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスDNA領域の間に免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域が挿入されたトランスファーベクターであって、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域と融合しているN末端側、及び／又はC末端側のウイルスDNA領域のポリヌクレオチド配列が、天然由来の同一ウイルスDNA領域のポリヌクレオチド配列に対して、同一性が低下するように改変されていること、及び／又はウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失するように当該ポリヌクレオチド配列が改変されていることを特徴とするトランスファーベクター。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のトランスファーベクターを用いれば、相同組換え技術により所望の組換えウイルスを作製するコトランスフェクションの際に、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域が欠失した発生物(変異ウイルスDNA)の生成を抑制でき、標的細胞から所望の組換えウイルスを高純度で製造することができる。すなわち、本発明によれば、マラリア、インフルエンザウイルス、結核、肝炎等の感染症や癌、自己免疫疾患等の治療及び／又は予防薬として、或いは細胞医療やワクチン製剤として有用な組換えウイルス、特に組換えバキュロウイルスを、効率よく製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】継代培養によるバキュロウイルスの純度低下と変異ウイルスDNAの増加を示す図面である。
【図２】ウイルス溶液中に存在している変異ウイルスがgp64遺伝子の変異ウイルスであることを示す図面である。
【図３】ウイルス粒子構成タンパク質をコードするウイルスDNA領域が当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないように改変されるか、或いは前記DNA領域が一部欠失したDNA領域からなる融合構築物において変異ウイルスが検出されないか、或いは検出され難いことを示す図面である。
【図４】ウイルス粒子構成タンパク質をコードするウイルスDNA領域が一部欠失したDNA領域からなる融合構築物において抗原遺伝子の違いに関わらず変異ウイルスが、検出され難いことを示す図面である。
【図５】ウイルス粒子構成タンパク質をコードするウイルスDNA領域が当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないように改変されるか、或いは前記DNA領域が一部欠失したDNA領域からなる融合構築物において高純度の組換えバキュロウイルスが得られることを示す図面である。
【図６】シングル・プロモーター及びデュアル・プロモーターの違いに関わらず、変異ウイルスが出現することを示す図面である。
【図７】GP64タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変したgp64遺伝子を組込んだバキュロウイルスでも所望の遺伝子とgp64遺伝子由来の融合タンパクを発現させることができることを示した図面である。
【図８】図７で用いた組換えバキュロウイルスにおいて、変異ウイルスが発生していないことを確認した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、IUPAC-IUBの規定[IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature、 Eur. J. Biochem.、 138:9(1984)]、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」(特許庁編)および当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００２１】
本明細書において、DNA分子とは、２本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖という各１本鎖DNAを包含する趣旨であり、またその長さに制限されるものではない。従って、本発明の免疫原性外来タンパク質をコードするポリヌクレオチド(DNA分子)には、特に言及しない限り、ゲノムDNAを含む２本鎖DNAおよびcDNAを含む１本鎖DNA(センス鎖)並びに該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖DNA(アンチセンス鎖)および合成DNA、それらの断片のいずれもが含まれる。
【００２２】
また、本明細書において、ポリヌクレオチド、DNA分子は、機能領域の別を問うものではなく、発現抑制領域、コード領域、リーダー配列、エキソンおよびイントロンのいずれか少なくともひとつを含むことができる。
また、ポリヌクレオチドには、RNAおよびDNAが含まれる。特定アミノ酸配列からなるポリペプチドおよび特定DNA配列からなるポリヌクレオチドには、それらの断片、同族体、誘導体および変異体が含まれる。例えば、変異体DNAには、天然に存在するアレル変異体；天然に存在しない変異体；欠失、置換、付加および挿入がなされた変異体等が含まれる。
【００２３】
本発明においては、相同組換え技術によりトランスファーベクターから所望の組換えウイルスを作製する工程において、分析すると出現することがある予想外のPCR産物について、免疫抗原性タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域が欠失した発生物を特に変異ウイルスDNAということがある。
【００２４】
本発明において、「タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようなポリヌクレオチド配列の改変」とは、タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチドの配列同一性を低下させることが挙げられ、例えば、天然由来のアミノ酸をコードするコドンを、遺伝暗号表等を目視して任意に選択するか、或いは、コンピュータ・ソフトを利用して機械的に選択するかして、天然由来のアミノ酸をコードするコドンとは異なるコドンを選択し、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と全体の配列同一性を低下させることが挙げられる。
以下、本発明のトランスファーベクター、組換えウイルス、特に組換えバキュロウイルスについて説明する。
【００２５】
本発明のトランスファーベクターは、少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が挿入され、バキュロウイルスDNAと相同組換えを起こすことが可能であるDNAを当該融合遺伝子の上流及び下流に有するプラスミドである。また、トランスファーベクターは、プロモーターとして、少なくとも昆虫細胞で発現が可能なバキュロウイルスのプロモーターを保有していることが必要であるが、単一のプロモーターだけではなく、脊椎動物プロモーター（哺乳動物プロモーター及び鳥類のプロモーター）とバキュロウイルスのプロモーターが連結したデュアル・プロモーターを保有していてもよい。
【００２６】
脊椎動物プロモーター(脊椎動物細胞で機能し得るプロモーター)としては、哺乳動物プロモーターや鳥類のプロモーター等のプロモーターを例示できる。哺乳動物プロモーター(哺乳動物細胞で機能し得るプロモーター)としては、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、CAGプロモーター、エロンゲーションファクター1αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター、MHCクラスプロモーター等を例示できる。鳥類のプロモーターとしては、アクチンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、エロンゲーションファクタープロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーターを例示できる。
【００２７】
バキュロウイルスプロモーターとしては、ポリヘドリン（Polh）プロモーター、ｐ10プロモーター、IE1プロモーター、p35プロモーター、p39プロモーター、gp64プロモーター等を例示できる。
【００２８】
また、デュアル・プロモーターとしては、脊椎動物のプロモーターとして、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、CMVプロモーターが改良されたCAGプロモーター、又はCMVエンハンサーにユビキチン（UBB）のプロモーターが接合したプロモーターと、バキュロウイルスプロモーターとしてポリヘドリン（Polh）プロモーターが連結されたプロモーターが好適に例示できる。
【００２９】
連結される脊椎動物のプロモーター、特に哺乳動物プロモーターとバキュロウイルスプロモーターの２つのプロモーターのポリヌクレオチド配列は、直接連結してもよいし、互いのプロモーターのDNA配列の間に介在DNA配列が存在してもよい。
また、連結される脊椎動物のプロモーター、特に哺乳動物プロモーターとバキュロウイルスプロモーターは、プロモーター領域においていずれが発現させる遺伝子に近い方に配置されてもよい、後記実施例においては、バキュロウイルスプロモーターが哺乳動物プロモーターよりも発現させる遺伝子に近い方に位置する構造で作製されている。
【００３０】
本発明の融合遺伝子のDNAを構成する、ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子配列は、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列と比較して、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにヌクレオチドが改変されたポリヌクレオチド配列、又はウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失するようにヌクレオチドが改変されたポリヌクレオチド配列（更に当該ポリヌクレオチド配列が当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないように改変されていてもよい）によって特定することができる。
【００３１】
ウイルス粒子構成タンパク質(そのアミノ酸の一部が欠失した部分ポリペプチドを含む)をコードするポリヌクレオチド配列に対して行われる、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないような改変は、ウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードするウイルスDNA領域を含むポリヌクレオチド配列を、天然(由来)のポリヌクレオチド配列と比較することにより行うことができるが、改変前後において全体の塩基配列の同一性が、85%以下、更に80%以下、更に70%以下となるように行って、ポリヌクレオチド配列情報を決定するのが、コトランスフェクションの際の免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域が欠失した発生物(変異ウイルスDNA)の生成を抑制し、高純度の組換えウイルスを作製できる点で好ましい。
ここで、ポリヌクレオチド配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435,(1985))等によって計算すればよく、例えば、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ver.5.1.1；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出される。
【００３２】
また、ウイルス粒子構成タンパク質として、バキュロウイルスGP64タンパク質のように、バキュロウイルスのウイルス構成タンパク質を用いる場合は、ウイルスゲノムDNAの中に当該タンパク質をコードする天然のDNA配列（内在性ウイルスDNA配列）が存在することから、当該ポリヌクレオチド配列と比較することより天然由来のウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列を改変して、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列に対して、全体のポリヌクレオチド配列の同一性を低下させることが必要である。
【００３３】
天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列の当該アミノ酸配列を変更しないヌクレオチドの改変は、公知の遺伝暗号表を参照して視認によって特定することができるし、或いはソフトウェアなどを使用することにより、医薬組成物として投与される対象となるヒト細胞での発現改良を考慮した各々の遺伝子のポリヌクレオチド配列に特定してもよい。
【００３４】
天然由来のウイルス粒子構成タンパク質の遺伝子配列を当該アミノ酸配列が変更しないヌクレオチドの改変によって得られたポリヌクレオチド配列を含む融合遺伝子のポリヌクレオチド配列は、例えば実施例1の配列番号34のポリヌクレオチド配列で示されるものを例示できる。このポリヌクレオチド配列は、改変の前後で、配列の同一性が77%以下に低下したものであり、斯かる場合においては、より確実に、コトランスフェクションの際の免疫抗原性遺伝子のDNA領域が欠失した変異ウイルスDNAの産生を抑制でき、所望の融合タンパク質をウイルス粒子上に発現させることができた（実施例7、8、及び10参照）。
【００３５】
また、「ウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失するようにヌクレオチドを改変する」とは、ウイルス粒子構成タンパク質のアミノ酸の一部が欠失したポリペプチド（部分ポリペプチド）を生じるようなポリヌクレオチド配列の改変を意味し、ウイルス粒子構成タンパク質をコードする天然(由来)のポリヌクレオチドの塩基を一部欠失させることが挙げられる。また、当該改変されたポリヌクレオチドに、部分ポリペプチドを構成するアミノ酸が変更しないポリヌクレオチド配列の改変が更に為されていても良い。
【００３６】
ここで、部分ポリペプチドとしては、昆虫細胞においてウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質として発現可能なものであればよく、例えば、ウイルス粒子構成タンパク質のN末端側のアミノ酸が削除されて全長アミノ酸配列に対して、例えば、55〜1％、好ましくは35〜1％、より好ましくは15〜1％の長さになったものが挙げられ、好ましくは、融合される免疫原性外来タンパク質の全長配列より、短い長さのポリペプチドが挙げられる。
例えば、ウイルス粒子構成タンパク質としてバキュロウイルスGP64タンパク質を用いた場合の例を挙げると、後記実施例で示すように、シグナル配列(20アミノ酸配列)を含む全長配列が512アミノ酸配列長に対して、免疫原性外来タンパク質のアミノ酸配列長が330アミノ酸(残基)長である場合、261アミノ酸配列長(51%)からなる融合体、66アミノ酸配列長(13%)からなる融合体となるようにヌクレオチドを改変した場合に、変異ウイルスDNAの出現をかなり抑制でき、所望の高純度のDNA融合体を得ることができた。
従って、ウイルス粒子構成タンパク質としてバキュロウイルスGP64タンパク質を用いた場合は、シグナル配列（1-20）を除いたGP64タンパク質を構成するアミノ酸（21-512）のN末端側のアミノ酸を、例えば251個、446個を削除した部分ペプチドが挙げられ、より具体的には、272-512、467-512のアミノ酸からなる部分ペプチドが挙げられる。
なお、GP64タンパク質のアミノ酸配列のGenBankアクセッション番号はAAA66758(配列番号62)である。
【００３７】
ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子としては、ウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子が挙げられ、例えば、バキュロウイルスGP64タンパク質(GenBank Accession No.L22858)、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質G(VSVG：GenBank Accession No.M27165)、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(KOS：GenBank Accession No.K01760)、1型ヒト免疫不全ウイルスgp120(GenBank Accession No.U47783)、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質(GenBank Accession No.M86651)、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質(GenBank Accession No.U38242)等の遺伝子、或いはバキュロウイルスに近縁のウイルスエンベロープタンパク質等の遺伝子を例示でき、このうち、バキュロウイルスGP64タンパク質遺伝子が好ましい。
【００３８】
上記のウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドの製造は、天然由来のウイルス粒子構成タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子について、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレチド配列を改変することによって得られたポリヌクレオチド、又はウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失した当該タンパク質の部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（当該部分ポリペプチドを構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレチド配列が改変されたポリヌクレオチドを含む)の核酸配列情報に基づいて合成(化学的DNA合成法)、すること等により容易に製造、取得することができる。
【００３９】
本発明の融合遺伝子のDNAを構成する、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列は、免疫原性外来タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の天然(由来)の核酸配列情報によって特定できるが、上記ウイルス粒子構成タンパク質と同様に、当該ポリヌクレオチド配列について、天然由来の免疫原性外来タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されたポリヌクレオチドであってもよく、当該ポリヌクレオチド配列の核酸配列情報に基づいて合成(化学的DNA合成法)すること等により容易に製造、取得することができる。
【００４０】
免疫原性外来タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列と免疫原性外来タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないポリヌクレオチド配列のヌクレオチド改変は、公知の遺伝暗号表を参照して視認によって特定することができるし、或いはGene Designer(DNA2.0社:Gene Designer:https://www.dna20.com/index.php?pageID=220)、又はOptimizer（http://genomes.urv.es/OPTIMIZER）のソフトを使用すること等により、脊椎動物細胞、更には哺乳動物細胞、特にヒト細胞での発現改良を考慮した各々の遺伝子のポリヌクレオチド配列に特定してもよい。
【００４１】
本発明において、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子としては、哺乳動物の場合は、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、マウス、イヌ、ネコ等の感染症等の抗原タンパク質をコードする遺伝子が例示でき、鳥類の場合は、ニワトリ、カモ、ハト、七面鳥、ホロホロチョウ、オウム等の感染症等の抗原遺伝子(例えばトリインフルエンザＳ抗原）が例示でき、ここで、「外来」遺伝子とは、外部から導入した遺伝子を意味し、同一の遺伝子が細胞内にあったとしても、「外来」遺伝子に該当する。
前記の哺乳動物と鳥類の感染症との関連が報告されている病原体遺伝子はGenbank等の病原体遺伝子が登録されている公共のデータを保存している機関から容易に入手できる。このうち、哺乳動物の場合は、具体的にはマラリア、インフルエンザウイルス、結核等の感染症、自己免疫疾患、癌等の予防・治療のためのワクチン療法を含めた免疫療法の免疫原となる抗原タンパク質をコードする遺伝子が例示できる。
【００４２】
ここで、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子としては、CSPタンパク質、MSP1タンパク質、LSA1タンパク質、SERAタンパク質、TRAMPタンパク質、AMA1タンパク質等のタンパク質をコードする遺伝子を例示できる。
【００４３】
インフルエンザウイルス抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子としては、HA抗原(ヘマグルチニン抗原)、NA抗原(ノイラミニダーゼ抗原)、M2抗原（マトリックスプロテイン抗原）、NP抗原（ヌクレオプロテイン抗原）等のタンパク質をコードする遺伝子が例示できる。
【００４４】
結核に対する抗原タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子としては、HSP65(65-kDa heat shock protein)、α抗原(Antigen85A、Antigen85B、Antigen85C)、Mtb72f、MDP-1、ESAT-6、MPB51、Mtb8.8、Mtb9.9、Mtb32、Mtb39及びMtb11等のタンパク質をコードする遺伝子を例示できる。
【００４５】
癌に対する抗原タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子としては、CEA、WT1、MAGE、HER2/neu、SART等のタンパク質をコードする遺伝子を例示できる。
【００４６】
また、本発明において、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子は、上記のようなヒト生体外に存在する免疫抗原のほか、ヒト生体内に存在するサイトカイン遺伝子、例えばIL-12遺伝子、IL-6遺伝子、IL-6レセプター遺伝子、IL-2遺伝子、IL-18遺伝子、IFN−γ遺伝子、M-CSF遺伝子等のサイトカイン遺伝子、或いは免疫原性を有する任意の抗原と上記抗原タンパク質の遺伝子とが遺伝子組換え技術を用いて融合した融合遺伝子も、外部から導入する限り、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子として取り扱うものとする。
【００４７】
なお、本発明において利用されるポリヌクレオチド配列は、前記免疫原性を有する抗原タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の全長配列に限定されず、ポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のタンパク質が抗原性を有する限り、部分アミノ酸配列、または反復した部分アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、或いはタンパク質の部分アミノ酸配列同士が融合した部分アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であっても構わない。
【００４８】
上記で免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子の天然由来のポリヌクレオチド配列、或いは当該天然由来の免疫原性外来タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないように改変されたポリヌクレオチド配列は、当該配列に相当するDNAをそのまま合成することにより(化学的DNA合成法)、容易に製造・取得することができる。この製造には、一般的遺伝子工学的手法が適用できる[例えば、Molecular Cloning 2d Ed、 Cold Spring Harbor Lab. Press(1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法I、II、III」、日本生化学会編(1986)等参照]。
【００４９】
また、該ポリヌクレオチドの合成方法としては、リン酸トリエステル法、リン酸アミダイト法等の化学合成手段[J. Am. Chem. Soc.、 89、 4801(1967)；同91、 3350(1969)；Science、 150、 178(1968)；Tetrahedron Lett.、 22、 1859(1981)；同24、 245(1983)]およびそれらの組合せ方法が例示できる。より具体的には、該ポリヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法によって化学合成することもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置を利用して合成することもできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該相補鎖を化学合成した一本鎖とアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを用いて該相補鎖を化学合成した一本鎖に付加することによって得ることができる。
【００５０】
また、天然由来の免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドは、遺伝子工学的手法により製造することができる、より具体的には、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドが発現される適当な起源より、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該ライブラリーから免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNAに特有の適当なプローブや発現物に対する抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる[Proc. Natl. Acad. Sci.、 USA.、 78、 6613(1981)；Science、 222、 778(1983)等参照]。
【００５１】
上記において、ゲノムDNAの起源としては、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNAを発現する各種細胞、組織、これらに由来する培養細胞等を例示することができる。特に、インフルエンザウイルス感染細胞抽出物やマラリア原虫が感染した感染赤血球抽出物や結核菌抽出物等を起源とするのが望ましい。該起源からの全DNAやRNAの抽出および分離、mRNAの分離および精製、cDNAの取得およびそのクローニング等は、いずれも常法に従って実施することができる。
【００５２】
免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNAの製造は、上述したとおり、前記抽出物を起源として、免疫原組織・細胞のmRNAを抽出・分離・精製して得られる各免疫原のcDNAライブラリーを用いて実施する他にも、例えば上記各免疫原のmRNAを抽出後、当該RNAにポリAを付加した後、当該ポリA付加RNAを集め、逆転写酵素を用いてcDNAを製造し、当該cDNAの両端に制限酵素部位を付加後、ファージに組み込んで調製したファージライブラリーを用いても実施することができる。
【００５３】
免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNAをcDNAのライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的方法としては、例えばcDNAによって産生されるタンパク質に対する特異抗体(例えば、抗マラリア抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗結核菌抗体)を使用した免疫的スクリーニングによって対応するcDNAクローンを選択する方法；目的のDNA配列に選択的に結合するプローブを用いるプラークハイブリダイゼーション法；コロニーハイブリダイゼーション法等；およびこれらの組合せを例示することができる。
【００５４】
上記各ハイブリダイゼーション法において用いられるプローブとしては、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA配列に関する情報を基にして化学合成されたDNA断片等が一般的である。また、既に取得された免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子およびその断片のDNA配列も上記プローブとして有利に利用できる。更に、免疫原性外来遺伝子のDNA配列情報に基づき設定したセンス・プライマーおよびアンチセンス・プライマーを、上記スクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００５５】
プローブとして用いられるDNA(ヌクレオチド)は、免疫原性外来遺伝子のDNA配列に対応する部分DNA(ヌクレオチド)であって、少なくとも15個の連続したDNA、好ましくは少なくとも20個の連続したDNA、より好ましくは少なくとも30個の連続したDNAを有するものである。前記したDNAの製造のための陽性クローン自体もプローブとして用いることができる。
【００５６】
免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNAの取得に際しては、PCR法[Science、 230、 1350(1985)]によるDNA/RNA増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のcDNAが得難い場合には、RACE法[Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6)、 35(1994)]、特に5'-RACE法[M. A. Frohman、 et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci.、 USA.、 8、 8998(1988)]等の採用が好適である。
【００５７】
PCR法に用いられるプライマーは、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA配列情報に基づいて適宜設定し、常法に従って合成することができる。尚、このプライマーとしては、後記実施例に示すように、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNAが組み込まれたベクタープラスミドの該DNAの両端に付加したDNA部分(SP6プロモーター・プライマーおよびT7ターミネーター・プライマー)も使用することができる。
【００５８】
尚、PCR法で増幅させたDNA断片の単離精製は、常法に従い例えばゲル電気泳動法等によって実施することができる。
上記の如くして得られる免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA或いは各種DNA断片は、常法、例えばジデオキシ法[Proc. Natl. Acad. Sci.、 USA.、 74、 5463(1977)]、マキサム-ギルバート法[Methods in Enzymology、 65、 499(1980)]等に従って、また簡便に市販のシークエンスキット等を用いて、そのDNA配列を決定することができる。
【００５９】
本発明の融合遺伝子のポリヌクレオチド配列は、これらの上記２種の遺伝子を直接連結したポリヌクレオチド配列からなるものであってもよいし、これらの間に介在DNA配列が存在していてもよい（ただし、この場合には下流側の遺伝子と上流側の遺伝子がフレームシフトを起こさないように配置される必要がある）。所望の免疫原性外来タンパク質の抗原提示領域が、ウイルス粒子構成タンパク質と融合されることが好ましいことから、所望の免疫原性外来タンパク質をウイルス粒子構成タンパク質から切り離すことなく該タンパク質と融合された形態で用いることが必要である。例えば、本実施例で例示した組換えウイルスでは、バキュロウイルスGP64タンパク質は、N末端が粒子の外側に露出し、C末端が粒子の内側に露出するので、所望の免疫原性外来タンパク質をGP64タンパク質のN末端側に融合させれば、昆虫細胞においてウイルス粒子の構成成分としてウイルスタンパク質粒子の外側にその全体が露出することになり、より抗原提示し易くなりワクチン製剤としての目的に適うものといえる。
【００６０】
また、本発明の少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子は、発現したタンパク質の宿主外分泌を促すためのシグナル・ペプチド（シグナル配列）をコードするポリヌクレオチドをその上流に含むものであるのが好ましい。
シグナル配列は、発現するウイルス粒子構成タンパク質のシグナル配列であるのが好ましいが、ウイルスが増殖できる細胞内で機能するタンパク質のシグナル配列であってもよい。
シグナル配列として、発現するウイルス粒子構成タンパク質由来のものが用いられる場合、本発明の融合遺伝子は、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列がシグナル配列をコードするポリヌクレオチドとウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列との間に挟まれた(挿入された)構造体となり得る。すなわち、本発明の好適な融合遺伝子としては、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列が、シグナル配列を含むウイルス粒子構成タンパク質の当該シグナル配列をコードするポリヌクレオチドとウイルス粒子構成タンパク質をコードするポリヌクレオチドの間に挿入された構造体であり、シグナル配列を含むウイルス粒子構成タンパク質の全長アミノ酸配列をコードする天然由来のポリヌクレオチド配列のヌクレオチドを天然由来のウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列を改変させたものが挙げられる。
換言すれば、本発明のトランスファーベクターには、少なくとも一つのウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスDNA領域の間に免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域が挿入されたトランスファーベクターであって、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のDNA領域と融合しているN末端側、及び／又はC末端側のウイルスDNA領域のポリヌクレオチド配列が、天然由来の同一ウイルスDNA領域のポリヌクレオチド配列に対して、同一性が低下するように当該ポリヌクレオチド配列を改変された、及び／又はウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失するようにポリヌクレオチド配列が改変されたものが包含される。
【００６１】
上記融合遺伝子のトランスファーベクターへの導入は、本発明の融合遺伝子のポリヌクレオチド配列を予め形成し、これをベクターに組み込んでも良いし、先にいずれか一方の遺伝子のポリヌクレオチド配列をベクターに組み込み、次いで、他の遺伝子のポリヌクレオチド配列をベクターに組み込んでベクター内で融合遺伝子として形成してもよい。
【００６２】
本発明のトランスファーベクターは、上記融合遺伝子が、単独のバキュロウイルスのプロモーター、或いは一方が脊椎動物のプロモーター、特に哺乳動物プロモーターで、他方がバキュロウイルスのプロモーターである連結したデュアル・プロモーターの下流に連結されてなるものである。
本発明のトランスファーベクターの構成の一部である脊椎動物のプロモーター、特に哺乳動物プロモーターやバキュロウイルスプロモーター等のプロモーター領域やウイルス粒子構成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を既に有する市販の発現ベクターをそれぞれ使用し、任意に制限酵素で切り出し、別のプロモーターを組み込む等して、該ベクターのクローニング領域に所望の免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子と、上述した本発明の改変されたウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子（天然由来のウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されたポリヌクレオチド、又はウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失した当該タンパク質の部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（当該部分ポリペプチドのアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されたポリヌクレオチドを含む））が融合した融合遺伝子のポリヌクレオチド配列を挿入するか、或いは所望の免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を、既にプラスミドに組み込まれた本発明の改変されたウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子に連結すればよい。ここで、前記免疫原性を有する抗原タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、その全長配列に限定されず、ポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のタンパク質が抗原性を有する限り、部分アミノ酸配列、または反復した部分アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、或いはタンパク質の部分アミノ酸配列同士が融合した部分アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であっても構わない。
【００６３】
上記で免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子（当該免疫原性外来タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されたポリヌクレオチドを含む）と改変されたウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子との連結は、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を改変されたウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子のN末端側に挿入する等して、必要な構成要素を挿入することができる。
また、本発明の昆虫細胞と脊椎動物細胞、特に哺乳動物細胞の両者の細胞において所望の免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を抗原タンパク質として発現可能な構造を有するプラスミドベクターの、これら一部を既に満足する構成を有する市販のプラスミドを用いて製造してもよい。
また、脊椎動物細胞内で酵素により融合タンパク質を開裂させるためのペプチドのアミノ酸配列を介在させてもよい。
【００６４】
また、本発明のトランスファーベクターは、プロモーター領域の上流には、脊椎動物、特に哺乳動物細胞における転写活性を上昇させるためのエンハンサーを配置しても良い。また、融合発現させる遺伝子の下流には、例えば脊椎動物細胞において有効なラビツトβグロブリンターミネーターのような脊椎動物ターミネーター領域を転写終了のために有するものであってもよい。
【００６５】
本発明のトランスファーベクターの一具体例を挙げれば、脊椎動物のプロモーター、特に哺乳動物プロモーターとしてCAGプロモーターとバキュロウイルスプロモーターとしてポリヘドリン(Polh)のプロモーターが連結され、その下流に融合遺伝子として、インフルエンザウイルス抗原遺伝子や熱帯熱マラリア抗原遺伝子(当該ポリヌクレオチド配列が天然由来の免疫原性外来タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないように改変されたものであってもよい)と、gp64を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されたgp64遺伝子、あるいはgp64を構成するアミノ酸の一部が欠失したgp64の部分ポリペプチドをコードする遺伝子（gp64の部分ポリペプチドを構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列が改変されたものを含む）が挿入された構造からなるトランスファーベクターである。例として、pCAP-HA1/Vietnam/51、pCAP-HA1/Vietnam/101、pCAP-HA1/Vietnam/154、pCAP-HA1/Vietnam/201、pCAP-HA1/Vietnam/272、pCAP-HA1/Vietnam/467、pCAP-HA1/Anhui、pCAP-HA1/Anhui/272、pCAP-HA1/Anhui/467、pCAP-HA1/Vietnam/OG、pCAP-CO/full/OG、pCAP-CO/76/OG、pCAP-CO/205/OG、及びpCAP-CO/76/467等が挙げられ、このうち特に好適なものについて、その構成塩基配列を示す（表１）。
【００６６】
【表１】
2011099541.tif 000002
【００６７】
かくして、本発明のトランスファーベクターを製造することができるが、その手順の一例を示せば、下記（ａ）〜（ｃ）及び／又は（ｄ）〜（ｅ）を行う工程が挙げられる。
（ａ）ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のポリヌクレオチド配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列の改変を行い、ウイルス粒子構成タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドの核酸配列情報を得る工程
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸配列情報に基づきポリヌクレオチドを合成する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
（ｄ）ウイルス粒子構成タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失した当該タンパク質の部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は当該部分ポリペプチドのアミノ酸が変更しないようにヌクレオチド配列が改変されたポリヌクレオチドを合成する工程
（ｅ）前記工程（ｄ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
【００６８】
本発明の組換えバキュロウイルスは、前記トランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとを宿主細胞にコトランスフェクションすることにより、得ることができる。
【００６９】
バキュロウイルスは、昆虫に感染を起す昆虫病原ウイルスで環状の二本鎖DNAを遺伝子として保有するDNAウイルスの一群(バキュロウイルス科)である。その中で、核多角体病ウイルス(Nucleopolyhedrovirus:NPV)といわれる一群のウイルスは感染後期には感染細胞の核内に多角体と呼ばれる封入体を作る。多角体遺伝子の代わりに発現したい外来遺伝子を挿入してもウイルスは問題なく感染、増殖し、所望の免疫原性外来遺伝子産物を大量に産生することから、近年所望のタンパク質の製造に応用されている。
【００７０】
斯かるバキュロウイルスとしては、オートグラファカリフォニカ核多角体病ウイルス(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus:AcNPV)、およびカイコガ核多角体病ウイルス(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus:BmNPV)、オルギア・シュードツガタ核多角体病ウイルス（Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus:OpNPV）、マイマイガ核多角体病ウイルス(Lymantria disper multiple nucleopolyhedrovirus:LdNPV)を例示できる。
【００７１】
本発明において用いられるバキュロウイルスDNAは、本発明のトランスファーベクターとの相同組換えを起こすことができるものであればよい。ここで、バキュロウイルスDNAとしては、野生型、変異型、或いは組換えバキュロウイルスDNAの何れでもよい。
バキュロウイルスDNAは、市販品を用いてもよく、例えば、AcNPVよりポリへドリン遺伝子が除かれているBacVector-1000 DNAやBacVector-2000 DNA(Novagen社製)等を使用できる。
【００７２】
相同組換えを起こすためには、トランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとの重量比は、例えば1：1〜10：1程度で混合するのがよい。
【００７３】
トランスファーベクターの宿主細胞への導入法およびこれによる形質転換法としては、特に限定されず一般的なこの分野で周知慣用技術となっている各種方法を採用することができ、例えば通常の遺伝子組換え技術(例えば、Science、 224、1431(1984);Biochem. Biophys. Res. Comm.、130、692(1985);Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 80、5990(1983))に従って調製することができる。トランスファーベクターの発現方法は、大野らの「タンパク実験プロトコール１機能解析編、細胞工学別冊、実験プロトコールシリーズ、1997年、秀潤社」を参考に製造することができる。また、昆虫細胞の取扱い方、遺伝子組換え、コトランスフェクションの一般的手法は、周知の昆虫細胞の組換えウイルス作製法と同様の手法を用いることができる(松浦善治、タンパク核酸酵素、37、 211-222(1992)、 松浦善治、 細胞、 33(2) 30-34(2001))。
尚、コトランスフェクションは、市販のベクタートランスフェクションキット(BacVector Transfection Kits:Novagen社製)を用いて、該ベクタートランスフェクションキットに付属の取扱書に従い実施することができる。
【００７４】
より具体的には、上記で製造されたトランスファーベクターと相同組換えを行うためのバキュロウイルスDNAとをSpodoptera frugiperda由来のSf9細胞、Sf21細胞、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)由来のTn5細胞(High Five細胞：Invitrogen社製)等の昆虫細胞を宿主細胞とする細胞中にコトランスフェクションすることにより行われる。
【００７５】
コトランスフェクション工程により昆虫細胞に同時に導入後、培養した後、前記培養上清からウイルスのプラークを作製し、培養液に浮遊させ、ボルテックスして寒天よりウイルスを溶出させ、遠心分離し、組換えウイルスを含む溶液を得る。
【００７６】
例えば、上記組換えバキュロウイルスの製造方法に従い、pCAP-HA1/Vietnam、pCAP-HA1/Vietnam/51、pCAP-HA1/Vietnam/101、pCAP-HA1/Vietnam/154、pCAP-HA1/Vietnam/201、pCAP-HA1/Vietnam/272、pCAP-HA1/Vietnam/467、pCAP-HA1/Anhui、pCAP-HA1/Anhui/272、pCAP-HA1/Anhui/467、pCAP-HA1/Vietnam/OG、pCAP-CO/full/OG、pCAP-CO/76/OG、pCAP-CO/205/OG、及びpCAP-CO/76/467のトランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとを用いてSf9昆虫細胞においてコトランスフェクションし、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HA1/Anhui、AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272、AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/OG、AcNPV-CAP-CO/full/OG、AcNPV-CAP-CO/76/OG、AcNPV-CAP-CO/205/OG、及びAcNPV-CAP-CO/76/467の組換えバキュロウイルスを得ることができる。
【００７７】
他の組換えバキュロウイルスの作製方法としては、全バキュロウイルスゲノムを組み込んだファージミド（バクミド）にトランスポゾンを利用して、大腸菌体内で効率よく外来遺伝子を挿入できる方法も使用できる。当該方法によればウイルス遺伝子を持ったバクミドを菌体から抽出し、昆虫細胞にトランスフェクトするだけで容易に組換えバキュロウイルスを製造し、回収することができる。
【００７８】
かくして、製造されたトランスファーベクターがバキュロウイルスDNAと共にSf9細胞等の昆虫細胞にコトランスフェクトされ、組換えバキュロウイルスを得ることができる。
得られた組換えバキュロウイルスは、公知のウイルス精製法を用いて精製することができる。例えば、Sf9細胞等の昆虫細胞(1×10７個/10cm皿)に、上記組換えバキュロウイルスの製造方法で得られたストックウイルス(通常1×10７-8pfu/ml)を0.5〜1.0ml接種し、感染数日(4日)後に培養上清を回収した後、遠心分離(25000rpm、60分間、4℃の条件)して得られたウイルスペレットをPBS等の緩衝液に懸濁する。得られた懸濁液を10〜60%のショ糖密度勾配遠心分離にかけ、ウイルスバンドとして回収する。回収物を更にPBSに懸濁後、続いて遠心分離し、得られた精製組換え体ウイルスのペレットをPBS等の緩衝液中に4℃で保存する。
なお、上記で得られた精製組換えバキュロウイルスの感染価は、Sf9細胞等の昆虫細胞を用いて、プラークアッセイにて測定（Fields VIROLOGY 4th Edition, p29-32, 2001）できる。
【００７９】
得られた組換えバキュロウイルスは、常法に従い培養でき、該培養により、免疫原性外来タンパク質とウイルス粒子構成タンパク質とが融合した融合物（発現物）が、昆虫細胞の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産(蓄積、分泌)される。
【００８０】
培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。これらの実施例は、単なる例示であり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８１】
実施例1：トランスファーベクタープラスミドおよびその製造法
（1）トランスファーベクタープラスミドpBACsurf-HA1/PR8の作製
（1.1）プラスミドpBACsurf-Hsp65の構築
結核菌H37RvのゲノムDNAを鋳型に、プライマーphsp65-F1(5’-AATAATAGATCTAATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA-3’(配列番号1):BglIIサイトは下線で表示)とphsp65-R1(5’-AATCCAATGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC-3’(配列番号2);NotIは下線で表示)を用いてPCRを行った。
PCR産物を精製した後、制限酵素BglIIとNotIで切断し、制限酵素BamHIとNotIで切断したpcDNA3.1(+)(Invitrogen社)に挿入し、プラスミドpcDNA-Ighsp65を構築した。pcDNA-Ighsp65を鋳型としてプライマーphsp65-F2(5’-CACCCCTGCAGG[ACTACAAGGACGACGATGACAAG]GAATTCATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCC-3’(配列番号3):Sse8387I、 EcoRIサイトは下線、FLAG配列は［  ］で表示)とphsp65-R2(5’-CCCGGGCGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC-3’(配列番号4):XmaIサイトは下線で表示)を用いてPCRを行い、得られたHsp65遺伝子DNA断片をpENTR/D-TOPO(Invitrogen社)にクローニングした後、制限酵素Sse8387IとXmaIで切断し、制限酵素PstIとXmaIで切断したpBACsurf-CSP(Yoshida et al.Virology 316:161-70， 2003)に挿入し、プラスミドをpBACsurf-Hsp65を構築した。【００８２】
（1.2）プラスミドpBACsurf-HA1/PR8の構築
インフルエンザウイルスPR8/34株が感染したMDCK細胞上清よりQIAamp MiniElute Virus Spin Kit(QIAGEN社)を用いてRNAを抽出し、プライマーHA-f(5’-CCTGCAGGTATGAAGGCAAACCTACTGGTC-3’(配列番号5):SbfIサイトは下線で表示)とHA-r(5’-GCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3’(配列番号6):SbfIサイトは下線で表示)と用いてRT-PCRを行い、インフルエンザウイルスHA遺伝子断片をpCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen社)にクローニングした。得られたプラスミドをpCR-Blunt-HAと名付けた。
pCR-Blunt-HAを鋳型に、プライマーpHA-F1(5’-CACCGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACCATGCG-3’(配列番号7):EcoRIサイトは下線で表示)とpHA-R1(5’-CCCGGGCACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG-3’(配列番号8):XmaIサイトは下線で表示)を用いてPCRを行い、得られたH1N1/HA1遺伝子DNA断片を制限酵素EcoRIとXmaIで切断し、制限酵素EcoRIとXmaIで処理したpBACsurf-Hsp65に挿入し、プラスミドpBACsurf-HA1/PR8を構築した。【００８３】
(2）トランスファーベクタープラスミドpCAP-HA1/PR8の作製 
pBACsurf-HA1/PR8を鋳型にPolh-f RsrII(5’-GGGCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCG-3’(配列番号9):RsrIIサイトは下線表示)とGP64-r DraIII(5’-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3’(配列番号10):DraIIIサイトは下線表示)を用いてPCRを行なった。得られたDNA断片を制限酵素RsrIIとDraIIIで処理し、pTriEx-1.1（Novagen社）を制限酵素RsrIIとDraIIIで切断したベクターに挿入し、プラスミドpCAP-HA1/PR8を構築した。【００８４】
（3）トランスファーベクタープラスミドpCAP-HA1/Vietnam、pCAP-HA1/Vietnam/51、pCAP-HA1/Vietnam/101、pCAP-HA1/Vietnam/154、pCAP-HA1/Vietnam/201、pCAP-HA1/Vietnam/272、pCAP-HA1/Vietnam/467の構築
インフルエンザウイルスH5N1/VietnamのHemagglutininのHA1領域のアミノ酸配列から人工合成遺伝子配列を作製した(配列番号11)。この人工配列を鋳型にVN-F1(5’-CAGTCTGCAGGACCAGATCTGTATC-3’(配列番号12):PstIサイトは下線で表示)とVN-R4(5’-CAGTCCCGGGCTCTCTTCTTCCTGC-3’(配列番号13):XmaIサイトは下線で表示)を用いてPCRを行い、制限酵素PstIとXmalで切断し、制限酵素PstIとXmalで処理したpCAP-HA1/PR8に挿入した。構築したプラスミドをpCAP-HA1/Vietnamと名付けた。
さらに、pCAP-HA1/PR8を鋳型にgp64(51)-f(5’-GACTCCCCGGGTGGAAATCACCATCGTGGAGACG-3’(配列番号14):Xmalサイトは下線部で表示)、もしくはgp64(101)-f(5’-GACTCCCCGGGATTTGCTTATGTGGAGCATCAGG-3’(配列番号15):Xmalサイトは下線部で表示)、もしくはgp64(154)-f(5’-GACTCCCCGGGCGCACCACACGTGCAACAAATCG-3’(配列番号16):Xmalサイトは下線部で表示)、もしくはgp64(201)-f(5’-GACTCCCCGGGACACTGTGCTTCATCGAGACGGC-3’(配列番号17):Xmalサイトは下線部で表示)、もしくはgp64(272)-f(5’-GACTCCCCGGGTCGAGCACCGAGTCAAGAAG-3’(配列番号18):Xmalサイトは下線表示)、もしくはgp64(467)-f(5’-GACTCCCCGGGACATCACTTCCATGGCTGAA-3’(配列番号19):Xmalサイトは下線表示)とGP64-r DraIII(5’-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3’(配列番号20):Dralllサイトは下線表示)を用いてPCRを行い、得られたそれぞれのDNA断片を制限酵素XmalとDraIIIで切断し、制限酵素XmaIとDraIIIで処理したpCAP-HA1/Vietnamに挿入した。構築したプラスミドをpCAP-HA1/Vietnam/51、pCAP-HA1/Vietnam/101、pCAP-HA1/Vietnam/154、pCAP-HA1/Vietnam/201、pCAP-HA1/Vietnam/272、pCAP-HA1/Vietnam/467と名付けた。
なお、インフルエンザウイルスA/Vietnam/1203/2004(H5N1)ヘマグルチニンのアミノ酸配列のGenBankアクセッション番号はAAW80717である。【００８５】
(4)トランスファーベクタープラスミドpCAP-HA1/Anhui、pCAP-HA1/Anhui/272、pCAP-HA1/Anhui/467の構築
インフルエンザウイルスH5N1/Anhui/1/05のHemagglutininのHA1領域のアミノ酸配列から人工合成遺伝子配列を作製した(配列番号21)。この人工配列を鋳型にAH-F1(5’-CAGTCTGCAGGACCAGATTTGCATC-3’(配列番号22):PstIサイトは下線で表示)とAH-R4(5’-CAGTCCCGGGCTCTCTTGCGCCTGC-3’(配列番号23):XmaIサイトは下線で表示)を用いてPCRを行い、得られたDNA断片をそれぞれ制限酵素PstIとXmalで切断し、制限酵素PstIとXmalで処理したpCAP-HA1/Vietnam、pCAP-HA1/Vietnam/272、pCAP-HA1/Vietnam/467に挿入した。構築したプラスミドをpCAP-HA1/Anhui、pCAP-HA1/Anhui/272、pCAP-HA1/Anhui/467と名付けた。
なお、インフルエンザウイルスA/H5N1/AnhuiのHemagglutininのアミノ酸配列のGenBankアクセッション番号はABD28180である。【００８６】
(5)所望の遺伝子がgp64遺伝子と融合していないトランスファーベクタープラスミドの構築
pCAP-bGalの構築
pCMV-SPORT-βGal(インビトロジェン社製)鋳型に、フォワードプライマーにbGal-F PstI F189-105(ACTGCTGCAGATGTCGTTTACTTTGACCAACAAG)(配列番号24)、リバースプライマーにbGal_Rev(Dra3)(ACTGCACTTAGTGTTTTTGACACCAGACCAACTGG)(配列番号25)を用いてPCRをかけ、得られたDNA断片をpCAP-HA1/AnhuiのPstI、DraIIIサイトにクローニングした。構築したプラスミドをpCAP-bGalと名付けた。【００８７】
pCAP-Rlucの構築
pRL-SV40(プロメガ社製)を鋳型に、フォワードプライマーにRluc F PstI F189-134(ACTGCTGCAGATGACTTCGAAAGTTTATGATCC)(配列番号26)、リバースプライマーにRluc R DraIII F189-134(ACTGCACTTAGTGTTATTGTTCATTTTTGAGAACT)(配列番号27)を用いてPCRをかけ、得られたDNA断片をpCAP-HA1/AnhuiのPstI、DraIIIサイトにクローニングした。構築したプラスミドをpCAP-Rlucと名付けた。【００８８】
pCAP-Lucの構築
pLuc-MCS(ストラタジーン社製)を鋳型に、フォワードプライマーにRluc F PstI F189-105(ACTGCTGCAGATGGGAGCTCGAATTCCAGCTTG)(配列番号28)、リバースプライマーにRluc-Rev2 F189-127(ACTGCACTTAGTGTTACAATTTGGACTTTCCGCCC)(配列番号29)を用いてPCRをかけ、得られたDNA断片をpCAP-HA1/AnhuiのPstI、DraIIIサイトにクローニングした。構築したプラスミドをpCAP-Lucと名付けた。【００８９】
pCAP-AFPの構築
pQBI25-fA1(エムビーバイオメディカル社製)を鋳型に、フォワードプライマーにAFP-F F189-77(ACGCCTGCAGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTCTTCA)(配列番号30)、リバースプライマーにAFP-Rev2 F189-127(ACTGCACTTAGTGTCAATCGATGTTGTACAGTTCA)(配列番号31)を用いてPCRをかけ、得られたDNA断片をpCAP-HA1/AnhuiのPstI、DraIIIサイトにクローニングした。構築したプラスミドをpCAP-AFPと名付けた。【００９０】
pCAP-Neoの構築
pcDNA3.1(+)(インビトロジェン社製)を鋳型に、フォワードプライマーにNeo-F SbfI F189-105(ACTGCCTGCAGGTGATTGAACAAGATGGATTGCAC)(配列番号32)、リバースプライマーにNeo-Rev2 F189-127(ACTGCACTTAGTGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGG)(配列番号33)を用いてPCRをかけ、得られたDNA断片をpCAP-HA1/AnhuiのPstI、DraIIIサイトにクローニングした。構築したプラスミドをpCAP-Neoと名付けた。【００９１】
（6）トランスファーベクタープラスミドpCAP-HA1/Vietnam/OGの作製
（6.1）トランスファーベクタープラスミドpCAP-OGの作製
pCAP-HA1/Vietnamを制限酵素SpeIとDraIIIで切断し、同じく制限酵素SpeIとDraIIIで切断した人工合成したgp64遺伝子配列(配列番号34）を導入することで構築したプラスミドはpCAP-OGと命名した。【００９２】
（6.2）トランスファーベクタープラスミドpCAP-HA1/Vietnam/OGの作製
pCAP-HA1/Vietnamを制限酵素PstIとXmaIで切断して生じたHA1遺伝子を含む断片を、制限酵素PstIとXmaIで消化したpCAP-OGに挿入し、構築したプラスミドをpCAP-HA1/Vietnam/OGと命名した。【００９３】
(7)トランスファーベクタープラスミドpCAP-CO/full/OG、pCAP-CO/76/OG、pCAP-CO/205/OG、及びpCAP-CO/76/467の作製
Plasmodium falciparum 3D7株のCSPのアミノ酸配列から人工合成遺伝子配列を作製した(配列番号35、：PfCSP(3D7)_opt)。この人工配列を鋳型にPfCSP_opt-f(5’-GACTCTGCAGATGATGCGAAAATTGGCCATACTG-3’:PstIサイトは下線部で表示、配列番号36)とPfCSP_opt-r(397)(5’-CGATCCCGGGCATTGAGGAACAGAAAGGAAAGAACCATG-3’:XmaIサイトは下線部で表示、配列番号37)、PfCSP_opt-f(76)(5’-GACTCTGCAGGACGACGGAAATAATGAGGACAACG-3’:PstIサイトは下線部で表示、配列番号38)とPfCSP_opt-r(373)(5’-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3’:XmaIサイトは下線部で表示、配列番号39)、及びPfCSP_opt-f(205)(5’-GACTCTGCAGAATGCAAACCCAAATGCCAATCCAAACGC-3’:PstIサイトは下線部で表示、配列番号40)とPfCSP_opt-r(373)(5’-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3’:XmaIサイトは下線部で表示、配列番号39)を用いてPCRを行い、得られたDNA断片をそれぞれPstIとXmaIで切断し、PstIとXmaIで処理したpCAP-HA1/AnhuiもしくはpCAP-HA1/Anhui/467に挿入した。構築したプラスミドをpCAP-CO/full、pCAP-CO/76、pCAP-CO/76/467、pCAP-CO/205と名付けた。
なお、Plasmodium falciparum 3D7株のCSPのアミノ酸配列のGenBankアクセッション番号はNC_000521である。【００９４】
実施例２  本発明組換えバキュロウイルスおよびその製造法
組換えバキュロウイルスは、組換えバキュロウイルス作製キット(BacVector-2000 Transfection Kit、Novagen社)を用い、上記実施例１で構築されたトランスファーベクター：pBACsurf-HA1/PR8、pCAP-HA1/PR8、pCAP-HA1/Vietnam、pCAP-HA1/Vietnam/51、pCAP-HA1/Vietnam/101、pCAP-HA1/Vietnam/154、pCAP-HA1/Vietnam/201、pCAP-HA1/Vietnam/272、pCAP-HA1/Vietnam/467、pCAP-HA1/Anhui、pCAP-HA1/Anhui/272、pCAP-HA1/Anhui/467、pCAP-HA1/Vietnam/OG、pCAP-bGal、pCAP-Rluc、pCAP-Luc、pCAP-AFP、及びpCAP-Neoの各々とBacVector-2000 DNAをSf9細胞にコトランスフェクト(co-transfection)することにより作製した。
作製した組換えバキュロウイルスは各々、AcNPV-Pol-HA1/PR8、AcNPV-CAP-HA1/PR8、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HA1/Anhui、AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272、AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/OG、AcNPV-CAP-bGal、AcNPV-CAP-Rluc、AcNPV-CAP-Luc、AcNPV-CAP-AFP、及びAcNPV-CAP-Neoと名付けた。
作製した組換えバキュロウイルスはSf9細胞を150mm細胞培養用プレート(スミロン：秋田住友ベーク社製)あたり2×107cellsになるように培養し、上述の組換えバキュロウイルス各々を感染重複度約0.1で感染させた。５日後、培養液を10,000×g、4°Cで25分間遠心して回収し、さらにベックマン超遠心機(SW28スウィングローター)で25,000rpm、4°Cで90分遠心することでウイルス粒子を得た。【００９５】
実施例３  組換えバキュロウイルスの継代培養
上記実施例２で得られた各組換えバキュロウイルスを実施例２と同様にBacVector-2000kit(ノバジェン社製)を用いてトランスフェクションを行い、培養５日後に上清を回収し、プラーク純化を２回行った。
２回目の単離プラークを48ウェルプレートに播種したSf9細胞に感染させ、培養５日後に上清を回収した。この上清を25cm2フラスコに感染重複度約0.1で感染させ、培養７日後に上清を回収した(これをP2ストックウイルスとする)。P2ストックウイルスをさらに感染重複度約0.1でSf9細胞に感染させて7日間培養した培養上清をP3ストックウイルスとする。なお、トランスフェクションと48ウェル感染時にはBacVector Insect Cell Medium(ノバジェン社製)の培地を、プラーク純化では1.3×Sf900II培地(インビトロジェン社製)を、25cm2フラスコ時にはTNM-FH Insect cell medium（ベクトン・ディッキンソン社製）を使用した。【００９６】
実施例４  組換えバキュロウイルスからのウイルスゲノムDNAの回収、及びウイルスDNAのPCR解析
ウイルス溶液50μlにDNA抽出バッファー（50mMトリス−塩酸(pH8.0)、20mM EDTA、0.1M NaCl、1% SDS）400μlとプロティナーゼK(20mg/ml)8μlを加え、50℃で3時間インキュベートした。室温まで溶液を冷ました後、458μlのフェノール・クロロホルム(TE飽和フェノール：クロロホルム=1:1和光純薬社製)処理を行い、得られた上清からエタノール沈殿によりウイルスゲノムDNAを回収した。【００９７】
(1)ウイルスDNAのPCR解析
ウイルスから回収したウイルスゲノムDNA１ngを鋳型にPCRを行った。
PCR反応サイクルは、94℃、2分反応させ、98℃、10秒、60℃、30秒、及び68℃、5分を30サイクル行った後、4℃に戻した。そしてPCR反応液から10μlをアガロースゲルにロードし、電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色によりDNAを染色した。
PCR反応において用いたプライマーの各組み合わせを以下に示す、フォワードプライマーPol h-F(5’−CCATCTCGCAAATAAATAAGTA−3’（配列番号41）)及びリバースプライマーPol A-f(5’−AGAAGTCAGATGCTCAAG−3’（配列番号42）)、フォワードプライマーCAG-F-FseI(5’−CTAGTTATTAATAGTAAT−3’（配列番号43）)及びリバースプライマーGP64-R2(5’−CATCGCCACGATTTGTTGCAC−3’（配列番号44）)、フォワードプライマーPol h-F(5’−CCATCTCGCAAATAAATAAGTA−3’（配列番号41）及びリバースプライマーGP64-R2(5’−CATCGCCACGATTTGTTGCAC−3’（配列番号44）)のとおりである。【００９８】
PCR産物のアガロースゲルからの抽出は、エチジウムブロマイドで染色したゲルをUVに照射し、映し出された目的のDNAバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いてゲルからDNAを抽出した。
また、PCR産物のDNAの配列決定は、PCRで増幅した目的DNAをゲルから抽出し、抽出物をそのままシークエンス解析の鋳型として用いるか、或いは一度ゼロブラントTOTOPCRクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いてクローニングし、シークエンス解析の鋳型として用いた。鋳型には5−300ngのDNAを用いビッグダイ・ターミネータァーv3.1(BigDye Terminator v3.1:アプライドバイオシステムズ社製)を用いて、サイクル反応を行った。プライマーには、Pol h-F(5’-CCATCTCGCAAATAAATAAGTA-3’（配列番号41）)、Pol A-f（5’-AGAAGTCAGATGCTCAAG-3’（配列番号42））を用いた。
シークエンサーはアプライド・バイオシステムズ3130xl ジェネティック・アナライザー(Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer:アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。【００９９】
次いで、後記実施例のサザンブロット解析において、制限酵素処理されたウイルスDNA断片を検出するためにHA1/VNプローブ(抗原遺伝子HA1とgp64遺伝子の融合遺伝子を検出できる)、gp64プローブ(抗原遺伝子HA1とgp64遺伝子の融合遺伝子、この融合遺伝子から抗原遺伝子が脱落した遺伝子(変異ウイルスDNA)及び内在性のgp64遺伝子を検出できる)、及びプロモーター・プローブ(抗原遺伝子HA1とgp64遺伝子の融合遺伝子、及びこの融合遺伝子から抗原遺伝子が脱落した遺伝子が検出できる。前記gp64プローブでは、天然由来のgp64遺伝子のポリヌクレオチド配列から改変したポリヌクレオチドのウイルスDNAやgp64遺伝子のDNA配列を短くしたウイルスDNAに結合できないのでこのプローブを作製した)にしたい遺伝子断片の増幅をPCRにより行った。なお、増幅した遺伝子断片の濃度を測定し、10mlのハイブリバッファーに対して、50-100ngの遺伝子断片を各プローブとして用いた。【０１００】
(2)実施例5に用いるプローブの作製Ｉ
HA1/VNプローブのDNA断片を得るために、10μMのフォワードプライマーVN-F2(5’-GTGTCCAGCGCCTGCCCCTACCAGG-3’（配列番号45）)及び10μMのリバースプライマーVN-R3(5’-CCGTACTCCAGTTCTGACTTCATG-3’（配列番号46）)、鋳型DNAとして、トランスファープラスミドpCAP-HA1/vietanamを用いてPCRをかけた。gp64プローブ作製のために、10μMのフォワードプライマーGP64-271-F(5’-ACCGAGTCAAGAAGCGGCC-3’（配列番号47）)及び10μMのリバースプライマーpol A-f(5’-AGAAGTCAGATGCTCAAG-3’（配列番号42）)、鋳型DNAとして、トランスファープラスミドpCAP-HA1/PR8を用いてPCRをかけた。これらのPCRによりプローブ作製用の遺伝子断片を得た。各DNA断片の核酸配列を配列番号50、51に示す。
これら遺伝子断片を用いてAlkPhos Direct Labelling and Detection System(GEヘルスケア社製)キットによりプローブを作製した。【０１０１】
(3)実施例8に用いるプローブの作製II
HA1/VNプローブ、gp64プローブは、上記実施例5と同じものを使用した。プロモーター・プローブ作製のため、10μMのフォワードプライマーCAP-PromF F213-22(5’-GCCTCTGCTAACCATGTTCATGC-3’（配列番号48）)及び10μMのリバースプライマーCAP-PromRF213-22(5’-CTTGCTTGTGTGTTCCTTATTGAAGCC-3’（配列番号49）)、鋳型DNAとしてトランスファープラスミドpCAP-HA1/Vietnamを用いてPCRをかけた。
かくして、所望のHA1/VNプローブのDNA断片、gp64プローブのDNA断片、及びプロモーター・プローブ作製用の遺伝子断片を得た。各DNA断片の核酸配列を配列番号50、51及び52に示す。
これら遺伝子断片を用いてAlkPhos Direct Labelling and Detection System(GEヘルスケア社製)キットによりプローブを作製した。【０１０２】
実施例３のように組換えウイルスを継代培養し、PCRによりウイルスDNAの産生量を確認すると所望の抗原発現量が減少することがウエスタンブロットにより観察された。
そこで、この発現量の低下の原因を調べるためプロモーター配列と抗原配列を含むようなプライマーセット（CAG-F-FseI x GP64-R2）でウイルスから調製したウイルスゲノムDNAを鋳型(5μl)にしたPCRをおこなった。PCR後、アガロースゲル電気泳動を行ったところ図１に示されるように推定サイズ(上段)とは異なるサイズに予想外のバンド(下段)が出現していた。この予想外のバンドをゲルから切り出し、配列を確認したところ、抗原遺伝子の含まれないプロモーターの配列とgp64遺伝子の配列が連結した配列が確認された。このことから組換えウイルス中に抗原遺伝子が脱落した変異ウイルスが存在することが示唆された。【０１０３】
ポジティブコントロールとしてプラスミドpCAP-HA1/PR8を用いた(レーン１、２)。また、SF９細胞由来のゲノムDNA100ngを鋳型に用いてもそのようなバンドが得られないことから(レーン８）、得られた予想外のバンドは組換えバキュロウイルス由来である可能性が考えられた。このことは、医薬の有効成分となる組換えウイルスの純度が低下していることが確認されたことにもなる。
なお、アガロースゲル電気泳動は、鋳型量5μlに対して50μl反応液中で、10μlをアガロースゲルにロードした。【０１０４】
図１は、アニーリング温度60℃でPCRをかけた結果である。レーン１は5pgのプラスミドpCAP-HA1/PR8を、レーン２は0.5pgのプラスミドpCAP-HA1/PR8を、レーン３は分子量マーカー(1kb Plus DNA ladder（インビトロジェン社）)を、レーン４はP2ストックウイルスから調製したウイルスDNAを鋳型にPCRを行った結果、レーン５〜７はレーン４に用いたウイルスを１代継代した後に調製したウイルス(P3ストックウイルス)のDNAを鋳型にPCRを行った結果をそれぞれ示す。【０１０５】
実施例５  サザンブロット分析による変異ウイルスの確認
上記実施例３で継代培養した組換えバキュロウイルスAcNPV-CAP-HA1/VietnamのP3ストックウイルスから、さらに1代継代培養したウイルスから得られたウイルスDNA0.2μgを制限酵素SwaI(NEB社製)及びXbaI(NEB社製)で消化し、全量を用いてアガロースゲル電気泳動を行った。【０１０６】
ゲルを0.25MのHCl溶液、変性緩衝液（0.5M NaOH、1.5M NaCl）、中和緩衝液（1M トリス−塩酸(pH7.5)、1.5M NaCl）で処理し、ターボブロッター（ワットマン社製）を用いてDNAをメンブレンにトランスファーし、UVクロスリンク（1200 x 100uj/cm2）によりDNAをメンブレンに固着させた。【０１０７】
続いて、メンブレンをハイブリバッファーに浸し、プレハイブリダイゼーション（ハイブリバッファー10ml/6 x 11cmメンブレン）を行った（65℃、30分間）。
なお、ハイブリバッファーは、AlkPhos Direct Labelling and Detection System（GEヘルスケア）キットに添付のハイブリバッファーを添付の説明書に従い使用した。【０１０８】
上記のハイブリダイゼーション液に、実施例４で作製したHA1/VNプローブ、及びgp64プローブを加え、65℃で４時間以上ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、メンブレンを洗浄し、CDP-star detection reagent（GEヘルスケア社製）を用いてバンドの検出を行った。
シグナルを検出したのち、リプローブの操作を行い、さらに１kb plus DNA ladderプローブ（１kb plus DNA ladder(インビトロジェン社製)20-100ngをAlkPhos Direct Labelling and Detection System（GEヘルスケア社製）キットを用いてラベリングして作製したプローブ）を用いて再度ハイブリダイゼーションを行い、バンドのサイズを確認した。その結果を図２(A)及び(B)にそれぞれ示す。【０１０９】
図２中、(A)は、HA1/VNプローブを用いた結果、そして(B)は、gp64プローブを用いた結果を示し、レーン１はAcNPV-CAP-HA1/Vietnamのクローン１を、レーン２はAcNPV-CAP-HA1/Vietnamの別クローン（クローン２）を、レーン３は分子量マーカー(1kb plus DNA ladder（インビトロジェン社製）)を、レーン４はAcNPV-CAP-HA1/Vietnamのクローン１を、レーン５はAcNPV-CAP-HA1/Vietnamのクローン２を、レーン６は分子量マーカー(1kb plus DNA ladder（インビトロジェン社製）)をそれぞれ示す。
その結果、図２（A)に示されるようにHA遺伝子が該当サイズに検出され、図２（B)ではHA1とgp64遺伝子の融合遺伝子のバンドと内在性gp64遺伝子のバンド(共に正ウイルス)が検出されるだけでなく、HA1遺伝子が欠損したgp64遺伝子のバンド（変異ウイルス）が検出された。このことから変異ウイルスがウイルス溶液中に存在していることが明らかとなった。【０１１０】
実施例６  変異ウイルス産生を回避するためのgp64遺伝子修飾体のサザン解析
上記変異ウイルスの存在が明らかとなったので、変異ウイルス産生を回避するためのGP64修飾体として実施例１で作製したトランスファーベクター(天然由来のGP64タンパク質のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列とGP64タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチド配列の同一性を約77%に低下させたポリヌクレオチドを含むプラスミドベクター)を用いて作製した組換えバキュロウイルス(AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/OG）を作製した。さらに細かく解析するためにGP64の一部を部分的に短くした配列を持つ幾つかのGP64修飾体を用いて同様のPCR実験をおこなった。
即ち、上記実施例３で継代培養したP3ストックウイルスAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/OG、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272、及びAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467を実施例４に従いウイルスDNAを得、各プライマーを用いてウイルスDNAのPCR解析を行った。その結果を図３に示す。【０１１１】
図３中、レーン１は分子量マーカー(1kb plus DNA ladder(インビトロジェン社製))を、レーン２はAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/OGのウイルスDNAのバンドを、レーン３はAcNPV-CAP-HA1/VietnamのウイルスDNAのバンドを、レーン４はAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51のウイルスDNAのバンドを、レーン５はAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101のウイルスDNAのバンドを、レーン６はAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154のウイルスDNAのバンドを、レーン７はAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201のウイルスDNAのバンドを、レーン８はAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272のウイルスDNAのバンドを、そしてレーン９はAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467のウイルスDNAのバンドをそれぞれ示す。【０１１２】
図３から明らかなように、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/OGのgp64遺伝子のポリヌクレオチド配列を天然由来のGP64タンパク質のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列と比較して、GP64タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないように、それををコードするポリヌクレオチドの配列同一性を約77%に低下させた修飾体と、GP64タンパク質を構成するアミノ酸の一部(それぞれ49%、87%アミノ酸配列が欠失したもの)が欠失するようにポリヌクレオチド配列を改変させたAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272及びAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467のgp64遺伝子の一部を短くした修飾体は、変異ウイルスの検出が殆ど認められないか、検出が認められなかった。【０１１３】
実施例７  変異ウイルス産生を回避するためのgp64遺伝子修飾体構築物のサザン解析
上記の結果、変異ウイルスの産生を回避、或いは抑制するためには、gp64遺伝子のヌクレオチドを天然由来のGP64タンパク質のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列と比較して、GP64タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないようにポリヌクレオチドを改変した修飾体のトランスファーベクターを構築するか、GP64タンパク質を構成するアミノ酸の一部が欠失するようにポリヌクレオチドを改変してgp64遺伝子の一部を短くした修飾体のトランスファーベクターを構築することにより、変異ウイルスの検出を回避できるか、ほとんど検出が認められないことが明らかとなった。
そこで、さらに免疫抗原蛋白を別のインフルエンザ抗原に代えた場合について、gp64遺伝子の一部を短くした修飾体のトランスファーベクターを構築した場合の変異ウイルス産生について検討した。
即ち、上記実施例３で継代培養したP3ストックウイルスAcNPV-CAP-HA1/Vietnam、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HA1/Anhui、AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272、およびAcNPV-CAP-HA1/Anhui/467を実施例４に従いウイルスDNAを得、各プライマーを用いてウイルスDNAのPCR解析を行った。その結果を図４に示す。【０１１４】
図４中、レーン１は分子量マーカー(1kb plus DNA ladder（インビトロジェン社製）)を、レーン２はAcNPV-CAP-HA1/VietnamのウイルスDNAのバンドを、レーン３はAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272のウイルスDNAのバンドを、レーン４はAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467のウイルスDNAのバンドを、レーン５はAcNPV-CAP-HA1/AnhuiのウイルスDNAのバンドを、レーン６はAcNPV-CAP-HA1/Anhui/272のウイルスDNAのバンドを、レーン７はAcNPV-CAP-HA1/Anhui/467のウイルスDNAのバンドを、そしてレーン８は過去に変異ウイルスが検出されたAcNPV-CAP-HA1/Vietnam(陽性コントロール)のバンドを、レーン９〜１３は、それぞれ所望の遺伝子にgp64遺伝子が融合していないトランスファーベクター（pCAP-bGal、pCAP-Rluc、pCAP-Luc、pCAP-AFP、pCAP-Neo）を用いて作製したバキュロウイルスAcNPV-CAP-bGal、AcNPV-CAP-R-Luc、AcNPV-CAP-Luc、AcNPV-CAP-AFP及びAcNPV-CAP-NeoのゲノムDNAを鋳型にPCRにかけた場合のDNAのバンドを、そしてレーン１４は、分子量マーカー(1kb plus DNA ladder（インビトロジェン社製）)をそれぞれ示す。【０１１５】
図４から明らかなように、GP64タンパク質のN末端側のアミノ酸配列長をそれぞれ51%、13%に遺伝子レベルで短く修飾したAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272、およびAcNPV-CAP-HA1/Anhui/467は、GP64タンパク質のアミノ酸配列長を遺伝子レベルで短くする前の構築物に比べて変異ウイルス由来のバンドが明らかに減少していた（レーン３、４、６、７）。また、gp64遺伝子が融合していない外来タンパクをコードする遺伝子を持つ５クローン（レーン９〜１３）ではそのような変異ウイルスは検出されなかった。更に、免疫抗原蛋白を別のインフルエンザ抗原に代えた場合であっても変異ウイルスの検出が認められなかった。【０１１６】
実施例８  サザンブロット分析による組換えウイルス及び変異ウイルス量の確認
上記実施例３で継代培養したP3ストックウイルスをさらにもう1代継代培養した組換えバキュロウイルスAcNPV-CAP-HA1/Vietnam、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/OG、および野生型バキュロウイルス(AcNPV)から得られたウイルスDNAを制限酵素SwaI(NEB社製)及びXbaI(NEB社製)で消化し、アガロースゲル電気泳動を行った。【０１１７】
2μgのウイルスDNAを制限酵素SwaI(NEB社製)及びXbaI(NEB社製)を用いて、消化させた後、エタノール沈殿を行った。得られたペレットをTEバッファーに溶解し、0.8%アガロースゲルで分解した。【０１１８】
次いで、ゲルを0.25MのHCl溶液、変性緩衝液（0.5M NaOH、1.5M NaCl）、中和緩衝液（1M トリス−塩酸(pH7.5)、1.5M NaCl）で処理し、ターボブロッター（Whatman社製）を用いてゲルの中に含まれているDNAをメンブレンにトランスファーし、UVクロスリンク（1200 x 100 uj/cm2）によりDNAをメンブレンに固着させた。
続いて、メンブレンをハイブリバッファーに浸し、65℃、30分間でプレハイブリダイゼーション（ハイブリバッファー10ml/6 x 11cmメンブレン）を行った。なお、ハイブリバッファーは、AlkPhos Direct Labelling and Detection System(GEヘルスケア社製)キットに添付のハイブリバッファーを添付の説明書に従い使用した。
上記のハイブリダイゼーション液に、実施例４で作製したプロモーター・プローブを加え、65℃で４時間以上ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、CDP-star detection reagent（GEヘルスケア社製）を用いてバンドの検出を行った。
シグナルを検出したのち、リプローブの操作を行い、さらに１kb plus DNA ladderプローブを用いて再度ハイブリを行い、バンドのサイズを確認した。その結果を図５及び表２にそれぞれ示す。【０１１９】
図５中、レーン１はコントロールのpCAP-HA1/Vietnamプラスミドの濃度1 x 10８コピー（0.84ng）を、レーン２はコントロールのプラスミドの濃度3 x 10７コピー（0.252ng）を、レーン３はコントロールのプラスミドの濃度1 x 10７コピー（0.084ng）を、レーン４は野生型バキュロウイルスのウイルスDNAのバンドを、レーン５はAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/OGのウイルスDNAのバンドを、レーン６はAcNPV-CAP-HA1/VietnamのウイルスDNAのバンドを、レーン７はAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272のウイルスDNAのバンドを、レーン８はAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467のウイルスDNAのバンドをそれぞれ示す。【０１２０】
図５から明らかなように天然由来のGP64タンパク質のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列と比較して、GP64タンパク質を構成するアミノ酸が変更しないように、GP64タンパク質のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を改変した本発明の組換えバキュロウイルス(AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/OG)やGP64タンパク質を構成するアミノ酸配列のN末端側の一部分をかなり短くした修飾体(AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467)では変異ウイルスは検出されなかった。しかし、AcNPV-CAP-HA1/VietnamやAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272では変異ウイルス由来のバンドが検出された。
そこで、正ウイルスのバンドと変異ウイルスのバンドをプラスミドコントロールの濃度比から、変異ウイルスの出現量を定量化した。その結果を表２に示す。【０１２１】
【表２】
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【０１２２】
表２から明らかなようにgp64遺伝子のポリヌクレオチド配列の相同性を低下させていないAcNPV-CAP-HA1/Vietnamでは約９％のウイルスが変異しており、GP64タンパク質のN末端側のみアミノ酸配列を短くしたAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272では0.8％のウイルスが変異を起こしていることが分かった。そしてAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/OGやGP64タンパク質のN末端側のアミノ酸配列をかなり短くしたAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467では変異ウイルスが検出限界以下であったので、ND（No detection)とした。【０１２３】
即ち、AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/OGやAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467では変異ウイルス発生が抑制されており、免疫抗原遺伝子とgp64遺伝子が融合した融合物を発現する組換えバキュロウイルスを医薬の有効成分とする医薬物質を高い純度で維持できることが分かる。純度低下による融合物の一方である免疫抗原の発現量低下は、投与される抗原の感作量の低下に繋がり、結果として治療効果が不十分となる問題があるが、本発明の製造方法の適応により、これらの問題を解決できる。【０１２４】
実施例９  バキュロウイルス感染Sf9細胞を用いたウエスタンブロット分析
トランスファーベクターのプロモーターがシングル・プロモーターとデュアル・プロモーターで変異ウイルス産生量が異なるかどうかについて比較試験を行った。
実施例２で作製したシングル・プロモーターを有する組換えバキュロウイルスAcNPV-Pol-HA1/PR8とデュアル・プロモーターを有する組換えバキュロウイルスAcNPV-CAP-HA1/PR8を用いてプラークを発生させ、それぞれ８プラークをピック・アップし、そのうち一部を４８ウェルプレートにまいたSf9細胞に感染させ、４８ウェルプレート（コーニング社製）上で培養したSf9細胞に感染させた。感染５日後に上清を回収し、プレートに残ったSf9細胞に12を含む2 x SDSサンプル・バッファー（5mMトリス−塩酸(pH7.0)、20%グリセロール、4%SDS、 0.004%BPB(ブロムフェノール・ブルー)、10% 2-メルカプトエタノール）を加えて、細胞を溶かし、エッペンチューブに移した後、５分間煮沸した。【０１２５】
この溶液を、SDS-PAGEにかけ、Immubilon-Pメンブレン(ミリポア社製)にタンパクをトランスファーした後、抗GP64抗体（eBioscience、5000倍希釈）と二次抗体Goat Anti-Mouse IgG(H+L) HRP コンジュゲート（BIORAD社製、5000倍希釈）を用いたウエスタンブロットを行い、GP64と抗原の融合タンパクと内在性のGP64タンパクを検出した。
なお、SDS-PAGE泳動緩衝液は、25mMトリス、192mMグリシン、及び1% SDSを、ブロッティング緩衝液には、48mMトリス(pH9.2)、39mMグリシン、0.038% SDS、及び20%メタノールを用い、検出試薬には高感度化学発光検出ECL plus(GEヘルスケア社製)を用いた。ウェスタン分析の結果を図６に示す。【０１２６】
図６左図、レーン１−８は、トランスファーベクターがデュアル・プロモーターを有する構築物の組換えウイルスAcNPV-CAP-HA1/PR8のクローン１〜８を、レーン９−１６は、トランスファーベクターが単一プロモーターとしてのポリヘドリン・プロモーターを有する構築物の組換えウイルスAcNPV-Pol-HA1/PR8のクローン１〜８を示す。【０１２７】
また、上記で単離したクローンから調製したウイルスDNAを用いたPCR解析の結果を図６右上図及び右下図にそれぞれ示す。図６右の上下図において、レーン１７及び２７は分子量マーカーを、レーン１８−２４はデュアル・プロモーターを有する構築物の組換えウイルスAcNPV-CAP-HA1/PR8のクローン２〜８を（クローン１は別の実験に用いたのでここには含まれない）、レーン２８−３４はトランスファーベクターが単一プロモーターのポリヘドリンを有する構築物の組換えウイルスAcNPV-Pol-HA1/PR8のクローン２〜８を（クローン１は別の実験に用いたのでここには含まれない）、レーン２５、３５は陽性コントロールを、そしてレーン２６、３６は陰性コントロールをそれぞれ示す。
その結果、AcNPV-CAP-HA1/PR8及びAcNPV-Pol-HA1/PR8を比較するとプロモーターの種類に関係することなく、変異ウイルスの出現が確認された。【０１２８】
実施例10  ヒト・マラリア(Plasmodium falciparum)のCSP抗原を組込んだバキュロウイルスによるgp64遺伝子コドン改変バキュロウイルスの性状解析
マラリア抗原を含む組換えバキュロウイルス(P3ストックウイルスをさらに継代培養したウイルス)AcNPV-CO/full/OG、AcNPV-CO/76/OG、AcNPV-CO/205/OG、及びAcNPV-CO/76/467を精製し、2 x SDSサンプル・バッファーで変性させたものSDS-PAGEに供し、メンブレンに転写した後、抗GP64抗体（e-バイオサイエンス社製、5000倍希釈）と二次抗体羊抗マウスIgG(H+L)HRPコンジュゲート(バイオ・ラド社製、5000倍希釈）を用いた免疫染色を行い、GP64タンパクと抗原の融合タンパクと内在性のGP64タンパクを検出した。また、高感度にGP64タンパクと抗原の融合タンパクを検出するために抗CSP抗体MRA-183（MR4、10,000倍希釈）と二次抗体二次抗体羊抗マウスIgG(H+L)HRP コンジュゲート(バイオ・ラド社製、5000倍希釈）を用いた免疫染色を行い、GP64タンパクと抗原の融合タンパクを検出した。【０１２９】
図7は、１−４は抗GP64抗体を用いた免疫染色の結果、５−８は抗CSP抗体を用いた免疫染色の結果を示しており、１、５はAcNPV-CAP-CO/full/OG、２、６はAcNPV-CAP-CO/76/OG、３、７はAcNPV-CAP-CO/205/OG、４．８はAcNPV-CAP-CO/76/467がロードされている。このように内在性GP64タンパクとの相対的な量は抗原により差があるが、gp64遺伝子のコドンを置換した場合においても全てのクローンでGP64タンパクと抗原の融合タンパクの発現が確認できた。【０１３０】
これらの組換えウイルスでは変異ウイルスが出現していないことを確かめるため、それぞれのウイルスからゲノムDNAを調製し、Pol h-fプライマーおよびPol A-fプライマーを用いてPCRをかけた。その結果を図８に示す。レーン１は1kb Plus DNA ladder、レーン２はAcNPV-CAP-CO/full/OG、レーン３はAcNPV-CAP-CO/76/OG、レーン４はAcNPV-CAP-CO/205/OG、レーン５はAcNPV-CAP-CO/76/467、レーン６は陰性コントロールとしてAcNPV-CAP-HA1/Vietnam/OGを用い、レーン７は陽性コントロールとしてAcNPV-CAP-HA1/Vietnamを用いた。その結果、陽性コントロール以外では変異ウイルスが検出されていないことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年1月27日(2012.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
少なくとも一つのバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターの製造方法であって、下記（ａ）〜（ｃ）及び／又は（ｄ）〜（ｅ）を行う、トランスファーベクターの製造方法。
（ａ）バキュロウイルスｇｐ６４タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更されずに塩基配列の同一性が８５％以下になるようにポリヌクレオチド配列の改変を行い、当該改変されたバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドの核酸配列情報を得る工程
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸配列情報に基づきポリヌクレオチドを合成する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
（ｄ）バキュロウイルスｇｐ６４タンパク質を構成するアミノ酸のうちシグナル配列を除いたＮ末端側のアミノ酸が削除されて全長アミノ酸配列に対して５５〜１％のアミノ酸長となった当該タンパク質の部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は当該部分ポリペプチドのアミノ酸が変更されずに塩基配列の同一性が８５％以下になるようにポリヌクレオチド配列が改変されたポリヌクレオチドを合成する工程
（ｅ）前記工程（ｄ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子が、マラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原、ＳＡＲＳウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、ＨＩＶ抗原、ＨＣＶ抗原、リューシマニア抗原、トリパノソーマ抗原、ロイコチトゾーン抗原及び癌抗原から選ばれる抗原の遺伝子、もしくはこれらの抗原遺伝子群から選ばれる少なくとも１種とサイトカインとの融合抗原の遺伝子である請求項３記載の方法。
【請求項８】
トランスファーベクターが、脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターとバキュロウイルスのプロモーターが連結したデュアル・プロモーターの下流に融合遺伝子が連結されたものである請求項３記載の方法。
【請求項９】
前記脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ＣＡＧプロモーター、エロンゲーションファクター１αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター及びＭＨＣクラスプロモーターのいずれかから選択され、バキュロウイルスのプロモーターがポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター、ＩＥ１プロモーター、ｐ３５プロモーター、ｐ３９プロモーター及びｇｐ６４プロモーターのいずれかから選択されるものである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも一つのバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ領域の間に免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ領域が挿入されたトランスファーベクターの製造方法であって、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ領域と融合しているＮ末端側、及び／又はＣ末端側のバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質をコードするウイルスＤＮＡ領域のポリヌクレオチド配列を、天然由来の同一ウイルスＤＮＡ領域のポリヌクレオチド配列に対して、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更されずに塩基配列の同一性が８５％以下になるように改変すること、及び／又はバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質を構成するアミノ酸のうちシグナル配列を除いたＮ末端側のアミノ酸が削除されて全長アミノ酸配列に対して５５〜１％のアミノ酸長となるように当該ポリヌクレオチド配列を改変することを特徴とするトランスファーベクターの製造方法。
【請求項１１】
少なくとも一つのバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターを用いた組換えバキュロウイルスの製造方法であって、前記バキュロウイルスｇｐ６４タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更されずに塩基配列の同一性が８５％以下になるようにそのポリヌクレオチド配列を改変してなる、及び／又は当該タンパク質を構成するアミノ酸のうちシグナル配列を除いたＮ末端側のアミノ酸が削除されて全長アミノ酸配列に対して５５〜１％のアミノ酸長となるようにそのポリヌクレオチド配列を改変してなるトランスファーベクターと、バキュロウイルスＤＮＡとを昆虫の宿主細胞にコトランスフェクションすることを特徴とする組換えバキュロウイルスの製造方法。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
少なくとも一つのバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターであって、下記（ａ）〜（ｃ）及び／又は（ｄ）〜（ｅ）を行うことにより製造される、トランスファーベクター。
（ａ）バキュロウイルスｇｐ６４タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更されずに塩基配列の同一性が８５％以下になるようにポリヌクレオチド配列の改変を行い、当該改変されたバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドの核酸配列情報を得る工程
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸配列情報に基づきポリヌクレオチドを合成する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
（ｄ）バキュロウイルスｇｐ６４タンパク質を構成するアミノ酸のうちシグナル配列を除いたＮ末端側のアミノ酸が削除されて全長アミノ酸配列に対して５５〜１％のアミノ酸長となった当該タンパク質の部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は当該部分ポリペプチドのアミノ酸が変更されずに塩基配列の同一性が８５％以下になるようにポリヌクレオチド配列が改変されたポリヌクレオチドを合成する工程
（ｅ）前記工程（ｄ）において合成したポリヌクレオチドに免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドを連結又は挿入する工程
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子が、マラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原、ＳＡＲＳウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、ＨＩＶ抗原、ＨＣＶ抗原、リューシマニア抗原、トリパノソーマ抗原、ロイコチトゾーン抗原及び癌抗原から選ばれる抗原の遺伝子、もしくはこれらの抗原遺伝子群から選ばれる少なくとも１種とサイトカインとの融合抗原の遺伝子である請求項１４記載のトランスファーベクター。
【請求項１９】
脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターとバキュロウイルスのプロモーターが連結したデュアル・プロモーターの下流に融合遺伝子が連結されたものである請求項１４記載のトランスファーベクター。
【請求項２０】
前記脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ＣＡＧプロモーター、エロンゲーションファクター１αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター及びＭＨＣクラスプロモーターのいずれかから選択され、バキュロウイルスのプロモーターがポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター、ＩＥ１プロモーター、ｐ３５プロモーター、ｐ３９プロモーター及びｇｐ６４プロモーターのいずれかから選択されるものである請求項１９記載のトランスファーベクター。
【請求項２１】
少なくとも一つのバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスＤＮＡ領域の間に免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ領域が挿入されたトランスファーベクターであって、免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ領域と融合しているＮ末端側、及び／又はＣ末端側のウイルスＤＮＡ領域のポリヌクレオチド配列が、天然由来の同一ウイルスＤＮＡ領域のポリヌクレオチド配列に対して、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更されずに塩基配列の同一性が８５％以下になるように改変されていること、及び／又はバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質を構成するアミノ酸のうちシグナル配列を除いたＮ末端側のアミノ酸が削除されて全長アミノ酸配列に対して５５〜１％のアミノ酸長となるように当該ポリヌクレオチド配列が改変されていることを特徴とするトランスファーベクター。
【請求項２２】
少なくとも一つのバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質をコードする遺伝子と免疫原性外来タンパク質をコードする遺伝子を含む融合遺伝子が連結されたトランスファーベクターを用いた組換えバキュロウイルスの製造方法において、前記バキュロウイルスｇｐ６４タンパク質をコードする遺伝子について、天然由来のバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質の遺伝子配列と比較し、当該タンパク質を構成するアミノ酸が変更されずに塩基配列の同一性が８５％以下になるようにそのポリヌクレオチド配列を改変してなる、及び／又は当該タンパク質を構成するアミノ酸配列のうちシグナル配列を除いたＮ末端側のアミノ酸が削除されて全長アミノ酸配列に対して５５〜１％のアミノ酸長となるようにそのポリヌクレオチド配列を改変してなるトランスファーベクターと、バキュロウイルスＤＮＡとを昆虫の宿主細胞にコトランスフェクションすることを特徴とする、変異ウイルスの生成抑制方法。
【国際調査報告】
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