(57)【要約】  核酸の固体支持体上へのスポッティングにおいて、核酸の固定化能を向上させながら、均一なスポット形状を保つための固体支持体を提供する。  基材と、基材上に形成された核酸を静電的に引き寄せる静電層と、静電層上に形成されたカルボキシル基とを有する基板であって、その表面のＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で得られるＣ１ｓスペクトルにおける（ＣＯＯピーク強度）／（Ｃ−Ｃピーク強度）比が０．１０〜０．２０である基板のカルボキシル基を活性エステル化してなる、核酸を固定化するための固体支持体。
2011030823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、基材上に形成された核酸を静電的に引き寄せる静電層と、静電層上に形成されたカルボキシル基とを有する基板であって、その表面のＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で得られるＣ１ｓスペクトルにおける（ＣＯＯピーク強度）／（Ｃ−Ｃピーク強度）比が０．１０〜０．２０である基板のカルボキシル基を活性エステル化してなる、核酸を固定化するための固体支持体。
【請求項２】
カルボキシル基の活性エステル化によって形成されるＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有する、請求項１記載の固体支持体。
【請求項３】
静電層が、基材をアンモニアガス雰囲気でプラズマ処理することにより形成されたものである、請求項１又は２記載の固体支持体。
【請求項４】
基材が表面にカーボン層を有し、その上に静電層が形成されている請求項１〜３のいずれか１項記載の固体支持体。
【請求項５】
基材をアミノ基含有化合物で処理することにより核酸を静電的に引き寄せる静電層を形成させ、静電層上に１０〜７０ｇ／ｌの濃度の多価カルボン酸溶液を接触させてカルボキシル基を導入し、カルボキシル基を活性化させて活性エステル基を形成することにより得られる、核酸を固定化するための固体支持体。
【請求項６】
活性エステル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である、請求項５記載の固体支持体。
【請求項７】
多価カルボン酸がポリアクリル酸である請求項５又は６記載の固体支持体。
【請求項８】
基材をアンモニアガス雰囲気でプラズマ処理することにより静電層を形成させる、請求項５〜７のいずれか１項記載の固体支持体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の固体支持体に核酸が固定化されてなる、核酸固定化固体支持体。
【請求項１０】
核酸を固定化するための固体支持体の製造方法であって、
基材をアミノ基含有化合物で処理することにより核酸を静電的に引き寄せる静電層を形成する工程、
静電層上に１０〜７０ｇ／ｌの濃度の多価カルボン酸溶液を接触させてカルボキシル基を導入する工程、及び
カルボキシル基を活性化させて活性エステル基を形成する工程
を含む、前記方法。
【請求項１１】
活性エステル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
多価カルボン酸がポリアクリル酸である請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
基材をアンモニアガス雰囲気でプラズマ処理することにより静電層を形成させる、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ等の核酸を固定化するための固体支持体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が進んでおり、その解析手段として、マイクロアレイが利用されている。マイクロアレイは通常、スライドガラス等の固体支持体に多数の核酸断片を整列固定化させた形態にあり、マイクロアレイに固定化されている核酸断片と相補性を持つ核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってマイクロアレイ上に固定化し、検出する方法に利用される。形成されたハイブリッドの検出手段としては、核酸断片試料に予め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もしくは導電性基を持つインターカレータを利用する方法などが知られている。【０００３】
マイクロアレイを作製するには、固体支持体表面で直接核酸を合成する方法（オン・チップ法という）と、予め調製した核酸断片を固体支持体表面に固定する方法などがある。前者のオン・チップ法は、光照射で選択的に除去される保護基を使用し、半導体製造に用いられるフォトリソグラフィ技術と固相合成技術を利用して、固体支持体上の多数の微小なマトリックスで組合せ反応（コンビナトリアル・シンセシス）を行うことにより、多種類の核酸を同時に合成する方法である。【０００４】
一方、後者の方法は、予め調製した核酸断片試料などを固体支持体表面にスポッティングすることにより共有結合又はイオン結合を利用して結合固定する方法である。このような方法としては、核酸断片試料をマイクロアレイ作製装置に備えられたスポット装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した固体支持体表面にスポッティングし、核酸試料の荷電を利用して固体支持体に静電結合させて固定化する方法、予め反応活性基を導入した核酸を合成し、これらを表面処理した固体支持体表面にスポット装置を用いてスポッティングし、共有結合を介して固定化させる方法、ならびに固体支持体表面に、核酸と共有結合を形成する活性エステル基等の反応活性基を導入して、核酸を共有結合を介して固定化させる方法などが挙げられる。また、基板と、基板上に形成された核酸を静電的に引き寄せる静電層と、静電層上に形成された核酸と共有結合しうる官能基とを有する固体支持体表面に、核酸を静電的に引き寄せ、共有結合を介して固定化させる方法も知られている（特許文献１）。【０００５】
固体支持体表面に核酸を固定化して多数のスポットを形成するには、ピン先端を固体支持体表面に機械的に接触させるピン方式や、インクジェットプリンタの原理を利用したインクジェット方式などによる各種のスポット装置が用いられている。このように固定化されたスポットは形状にばらつきが多い。例えば、スポットが三日月状やドーナツ状になっていたり、又はスポットが流れてしまっているものなどである。スポットの形が一定でないとシグナルの強度にもばらつきが出てしまい、信頼性の低いデータとなってしまう。従って、マイクロアレイによる解析精度を向上させるためには、いずれの装置を用いた場合であっても、固体支持体上に形成されたスポットにおいて、核酸が固体支持体表面にしっかりと固定化されるとともに、その形状や大きさができるだけ揃っていて、再現性が良いことが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２９２４８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、核酸の固体支持体上へのスポッティングにおいて、核酸の固定化能を向上させながら、均一なスポット形状を保つための固体支持体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、静電層上に活性エステル基を有する固体支持体の製造において、静電層を有する基材上にカルボキシル基を導入する際、Ｘ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で得られるＣ１ｓスペクトルにおける（ＣＯＯピーク強度）／（Ｃ−Ｃピーク強度）比として測定されるカルボキシル基の量が適切な値となるように調整することで、核酸の固定化能を向上させながら、均一なスポット形状を保つことが可能になることを見出した。【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。【００１０】
（１）基材と、基材上に形成された核酸を静電的に引き寄せる静電層と、静電層上に形成されたカルボキシル基とを有する基板であって、その表面のＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で得られるＣ１ｓスペクトルにおける（ＣＯＯピーク強度）／（Ｃ−Ｃピーク強度）比が０．１０〜０．２０である基板のカルボキシル基を活性エステル化してなる、核酸を固定化するための固体支持体。【００１１】
（２）カルボキシル基の活性エステル化によって形成されるＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有する、（１）記載の固体支持体。【００１２】
（３）静電層が、基材をアンモニアガス雰囲気でプラズマ処理することにより形成されたものである、（１）又は（２）記載の固体支持体。【００１３】
（４）基材が表面にカーボン層を有し、その上に静電層が形成されている（１）〜（３）のいずれかに記載の固体支持体。【００１４】
（５）基材をアミノ基含有化合物で処理することにより核酸を静電的に引き寄せる静電層を形成させ、静電層上に１０〜７０ｇ／ｌの濃度の多価カルボン酸溶液を接触させてカルボキシル基を導入し、カルボキシル基を活性化させて活性エステル基を形成することにより得られる、核酸を固定化するための固体支持体。【００１５】
（６）活性エステル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である、（５）記載の固体支持体。【００１６】
（７）多価カルボン酸がポリアクリル酸である（５）又は（６）記載の固体支持体。【００１７】
（８）基材をアンモニアガス雰囲気でプラズマ処理することにより静電層を形成させる、（５）〜（７）のいずれかに記載の固体支持体。【００１８】
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の固体支持体に核酸が固定化されてなる、核酸固定化固体支持体。【００１９】
（１０）核酸を固定化するための固体支持体の製造方法であって、
基材をアミノ基含有化合物で処理することにより核酸を静電的に引き寄せる静電層を形成する工程、
静電層上に１０〜７０ｇ／ｌの濃度の多価カルボン酸溶液を接触させてカルボキシル基を導入する工程、及び
カルボキシル基を活性化させて活性エステル基を形成する工程
を含む、前記方法。【００２０】
（１１）活性エステル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である、（１０）記載の方法。【００２１】
（１２）多価カルボン酸がポリアクリル酸である（１０）又は（１１）記載の方法。【００２２】
（１３）基材をアンモニアガス雰囲気でプラズマ処理することにより静電層を形成させる、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の方法。【００２３】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-209489号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、核酸の固体支持体上へのスポッティングにおいて、核酸の固定化能を向上させながら、均一なスポット形状を保つことが可能になる。また、外観の良好な固体支持体が得られる。その結果、マイクロアレイによる解析精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】カルボキシル基が導入された基板をＸ線光電子分光分析機で測定して得られたＣ１ｓスペクトルのチャートを示す。
【図２】固体支持体に蛍光標識ＤＮＡを固定化し、スポット形状をＣＣＤカメラで撮影した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明に用いる基材の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステン及びそれらの化合物などの貴金属、及びグラファイト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。基材の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
【００２７】
本発明の固体支持体をマイクロアレイに用いる場合は、集積化の観点から、微細な平板状の構造を有する基材、例えば２〜５ｍｍ四方の平板状の基材が好ましく用いられる。そして、微細な平板状の構造を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基材を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基材がより好ましい。単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での乱れ（格子欠陥）が含まれているものも包含される。
【００２８】
基材としては表面にカーボン層を有するものを用いることが好ましい。カーボン層を形成することにより、静電層やカルボキシル基を基材上に強固に固定化することができる。カーボン層としては、特に制限されないが、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、又はそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の静電層やカルボキシル基の導入や核酸の結合における反応に耐えることができる点において有利である。また、核酸との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。基材自体がカーボン層からなるものを用いてもよい。
【００２９】
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザー蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。カーボン層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。
【００３０】
また、基材の表面又は裏面に、反射層としてＴｉ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、Ｃｒ、ＴｉＣ、ＴｉＮ等の単層又はこれらの複合膜を製膜してもよい。反射層の厚みは、全体に均一であることが必要なため、好ましくは１０ｎｍ以上、更に好ましくは１００ｎｍ以上である。
【００３１】
基材としてガラスを用いる場合、その表面は、Ｒａ（ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１）で１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基材の表面積が増えて、多量の核酸を高密度で固定化できる点で好都合である。
【００３２】
基材には、核酸を静電的に引き寄せるために静電層が形成される。静電層としては、核酸を静電的に引き寄せ、核酸の固定化量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。
【００３３】
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えば、アンモニア、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、又はこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシン、ポリアリルアミンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００３４】
静電層は、例えば、基材をアンモニアガス雰囲気でプラズマ処理することにより形成できる。あるいは、静電層は、カーボン層を製膜する際にアミノ基含有化合物（例えば、アンモニアガス）を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜として製膜してもよい。
【００３５】
静電層と基材との親和性、即ち密着性を高める点で、基材上に、アミノ基含有化合物と炭素化合物を蒸着させた後、カルボキシル基を導入してもよい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。
【００３６】
基材に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いでアミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基材と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成してもよい。
【００３７】
静電層上にカルボキシル基を導入する反応（例えば、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、静電層を形成した後、カルボキシル基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、Ｎ−メチルピロリドン、エタノール、及びこれらの混合物が挙げられる。
【００３８】
基材を、アミノ基含有化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成することもできる。その場合に、アミノ基含有化合物として多価アミン、特にポリアリルアミンを用いると、基材との密着性に優れ、核酸の固定化量がより向上する。
【００３９】
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
【００４０】
前記のようにして、基材表面に形成された静電層上にカルボキシル基を導入することにより基板を作製する。カルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ１−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ１は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ２は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ３−ＣＯ−Ｒ４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ４は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸又はアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ５は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。好ましくは多価カルボン酸、より好ましくはポリアクリル酸を用いる。多価カルボン酸を用いる場合、カルボキシル基が静電層のアミノ基と縮合してアミド結合を形成することから、強固な結合を介してカルボキシル基を導入することができる。また、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させる効果も有する。
【００４１】
カルボキシル基は、静電層を有する基材を、上記化合物、好ましくは多価カルボン酸、より好ましくはポリアクリル酸の溶液と接触させることにより導入することができる。溶液の溶媒としては、水やアルコールなどの有機溶媒、例えば、エタノール、ＩＰＡ、メタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド、アセトン、ジオキサン、アルコール及びこれらの混合物を使用できる。
【００４２】
上記のようにして得られる、静電層上にカルボキシル基が導入された基板は、Ｘ線光電子分光分析（ＸＰＳ）による炭素の化学結合状態の分析で得られるＣ１ｓスペクトルにおける（ＣＯＯピーク強度）／（Ｃ−Ｃピーク強度）比が０．１０〜０．２０、好ましくは０．１２〜０．１８である。この強度比は、Ｘ線光電子分光分析において、Ｃ１ｓスペクトル（横軸が束縛エネルギー、縦軸がエネルギー強度）において、束縛エネルギーが２８８．８ｅＶ（ピークトップ）に表れるカルボキシル基（ＣＯＯ（Ｈ）結合）に由来するピークの強度（ＣＯＯピーク強度）と、束縛エネルギーが２８４．７ｅＶ（ピークトップ）に現れるＣ−Ｃ結合に由来するピーク強度（Ｃ−Ｃピーク強度）との比で表される。
【００４３】
この条件を満たすようにカルボキシル基の量を調整することにより、カルボキシル基の活性化後の固体支持体において、核酸の固定化能を向上させながら（核酸の検出において良好なシグナル強度が得られる）、均一なスポット形状を保つことができる。また、固体支持体にしみができるのを防止することもでき、良好な外観が得られる。
【００４４】
カルボキシル基の量は、カルボキシル基の導入方法に基づき上記ピーク強度比が得られるように適宜調整することができる。例えば、静電層を有する基材を、カルボキシル基を導入するために用いられる化合物の溶液と接触させる場合は、当該化合物の溶液の濃度を調整することにより、カルボキシル基の量を調整することができる。多価カルボン酸、より好ましくはポリアクリル酸の溶液を用いる場合は、１０〜７０ｇ／ｌ、好ましくは１０〜３５ｇ／ｌの濃度の多価カルボン酸溶液を用いることにより、Ｘ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で得られるＣ１ｓスペクトルにおける（ＣＯＯピーク強度）／（Ｃ−Ｃピーク強度）比が上記の値となるように調整することができる。
【００４５】
前記のようにして導入されたカルボキシル基を活性化して活性エステル基とする（活性エステル化する）ことにより、本発明の固体支持体が得られる。活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。活性エステル基としては、具体的には、ｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等が挙げられ、特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基が、核酸を固定化する上で好ましい。
【００４６】
活性エステル基の導入（活性エステル化）は、例えば、前記のように導入したカルボキシル基を、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる（例えば、特開２００１−１３９５３２号公報）。
【００４７】
本発明の固体支持体には、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれの核酸も固定化することができる。通常１〜２００塩基、好ましくは５〜１５０塩基の核酸が固定化される。ＤＮＡは一本鎖、二本鎖のいずれも固定化することができる。
【００４８】
本発明において核酸には人工核酸も包含される。人工核酸としては、核酸中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された核酸誘導体、核酸中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミダイト結合に変換された核酸誘導体、核酸中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換された核酸誘導体、核酸中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された核酸誘導体、核酸中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された核酸誘導体、核酸中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された核酸誘導体、核酸中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシンで置換された核酸誘導体、核酸中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された核酸誘導体、核酸中のリボースが２’−Ｏ−メトキシリボースで置換された核酸誘導体、及び核酸中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された核酸誘導体等を挙げることができる。
【００４９】
本発明の固体支持体に核酸を固定化する方法は、特に制限されない。例えば、核酸をバッファーに溶解して溶液を作成し、スポッター装置で核酸溶液を固体支持体上にスポットした後、加熱したオーブン中で一定時間ベーキングを行い、その後洗浄によって固定化していない核酸を除去する。スポッター装置を用いることにより他種類の核酸を固体支持体上の異なる位置に固定化できるため一度に多数の試験を実施することができる。
【００５０】
本発明の固体支持体に核酸が固定化されてなる核酸固定化固体支持体は、例えば、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。以下、本発明の固体支持体を用いた核酸試料の検出方法について説明する。まず、標識した核酸試料を用意する。核酸試料（標的核酸）としては通常、その配列や機能が未知であるＤＮＡ又はＲＮＡが用いられる。
【００５１】
標識した核酸試料は、遺伝子発現を調べる目的では一般に、真核生物であればその細胞や組織サンプルからｍＲＮＡを抽出した後、逆転写反応により、標識ｄＮＴＰを取り込ませながら、ｃＤＮＡとすることにより得られる。細菌などの原核生物であれば、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難であるので全ＲＮＡを抽出する。ゲノムを試料とする場合には、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することができる。赤血球を除く任意の組織は、例えば抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等である。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によっても異なるが、通常は数μｇ以下である。なお、ｍＲＮＡをアンチセンスＲＮＡとして用いる方法もある。標識ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性の点から、標識ｄＣＴＰを用いることが好ましい。また、固体支持体上に固定化したプローブとしての核酸がオリゴヌクレオチドである場合には、核酸試料を低分子化しておくことが望ましい。
【００５２】
標識した核酸試料は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、一般に標識プライマー又は標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行うことにより得られる。
【００５３】
標識としては、ＲＩ標識と非ＲＩ標識（蛍光法、ビオチン法、化学発光法等）が知られているが、蛍光標識を用いることが好ましい。蛍光標識としては、Ｃｙ３及びＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなどが挙げられ、放射能標識としては、α−３２Ｐ、γ−３２Ｐ、３５Ｓなどが挙げられる。
【００５４】
次いで、上記の標識核酸試料をＳＳＣなどの水性媒体に溶解又は分散して、試料の水溶液を調製する。この水溶液を、核酸を固定化した固体支持体に接触させた後インキュベートして、ハイブリダイゼーションを行う。インキュベーションは、室温〜１００℃の範囲の温度で、１〜２４時間の範囲の時間で実施することが好ましい。これにより、固体支持体上のプローブ核酸と、プローブ核酸と相補的な塩基配列をもつ核酸とがハイブリッドを形成する。
【００５５】
ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤の溶液と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の核酸試料を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウムを用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、又はグッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００５６】
次に、固体支持体上に形成されたハイブリッドからの蛍光シグナルを検出器により検出する。検出器としては、例えば蛍光レーザー顕微鏡、冷却ＣＣＤカメラ及びコンピュータを連結した蛍光スキャニング装置が用いられ、固体支持体上の蛍光強度を自動的に測定することができる。ＣＣＤカメラの代わりに共焦点型又は非焦点型のレーザーを用いてもよい。これにより、画像データが得られる。得られたデータから、固体支持体上に固定化されたプローブ核酸に対して相補性を有する標的核酸を同定することができ、これに基づいて遺伝子発現プロファイルを作成したり、核酸試料の塩基配列を決定することができる。さらに、データ解析ソフトや外部データベースを利用することにより、遺伝子の変異や多型などのより複雑な解析を行うことも可能である。あるいは、試料として互いに異なる蛍光物質によって標識した核酸試料を複数種類用意し、これらを同時に用いることにより、一個の固体支持体上で発現量の比較や定量を行うことも可能である。
【００５７】
本発明の固体支持体は、核酸、例えば、ＤＮＡの伸長反応に用いることもできる。この場合、まず、固体支持体上にプライマーを固定化して、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせる。その後、ＤＮＡ伸長反応によりプライマーにハイブリダイズしたＤＮＡと相補的なＤＮＡを伸長させる。プライマーとしては、長さ及び配列が明らかな一本鎖又は二本鎖の核酸を使用する。長さは特に限定されないが、好ましくは５〜２００塩基、さらに好ましくは１０〜１００塩基である。従来の固体支持体では、伸長反応における熱処理によってプライマーが剥離することがあるが、本発明の固体支持体では、熱を加えてもプライマーが剥離せず、プライマーを固体支持体に固定化した状態で伸長反応を進行させることができる。
【００５８】
この伸長反応の時に、標識した核酸を取り込ませ、伸長反応後、標識に由来するシグナルを読みとることによって、プライマーに特定のＤＮＡがハイブリダイズして伸長反応が進行したか否かを検出することができる。従って、試験した試料中に、固定化支持体上のプライマーにハイブリダイズしうるＤＮＡが含まれているかどうかを判定することができ、研究及び医療における有用な検出手段となりうる。標識及び検出については上記と同様である。
【００５９】
本発明の固体支持体はまた、核酸の増幅反応にも用いることができる。ＰＣＲ反応により増幅させる場合には、例えば、まず、固体支持体上にフォワードプライマーを固定化して、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせ、その後酵素反応で相補鎖ＤＮＡを伸長する。更に１）アニーリング、２）ハイブリダイゼーション、３）伸長反応という工程を連続で行うことによって、いわゆるＰＣＲ反応が進行する。従来の固体支持体では、ＰＣＲ反応における熱処理によってプライマーが剥離したり、サーマルサイクルの制御がうまくいかないといった問題があったが、本発明の固体支持体では、熱を加えてもプライマーが剥離せず、さらに、反応を容器の中ではなく固体支持体上にＤＮＡを固定化した状態で行うため、ＰＣＲ反応における温度制御が正確で、増幅される核酸の配列の正確性に影響が出たり、目的外のＤＮＡが複製される可能性も低く、効率的にＤＮＡを増幅することができる。
【００６０】
さらに、上記の標識核酸を用いた検出とＰＣＲによる増幅とを組み合わせることにより、固体支持体上のプライマーにハイブリダイズしうるＤＮＡが試料中に少量しか含まれていない場合であっても、上記のようにＤＮＡが複製され、結果的に多量のＤＮＡが固体支持体上のプライマーにハイブリダイズし、その相補鎖が伸長されるため、検出感度を増大させることが可能になる。
【００６１】
あるいは、伸長反応に使用する酵素として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを選択し、リバースプライマーを加えることによって、サーマルサイクルを経ることなく定温で、ＤＮＡを固体支持体上で増幅することができる。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとは、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成していく過程で、伸長方向に二本鎖領域があった場合その鎖を解離しながら、相補鎖合成を継続できるＤＮＡ合成酵素である。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アマシャムバイオサイエンス）等が挙げられる。
【００６２】
ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを対象とすることにより、ＲＮＡも上記態様の対象となりうる。この場合には、ｍＲＮＡから逆転写反応を利用してｃＤＮＡを得るが、ｃＤＮＡを得ると同時に固体支持体に固定化させることができる。まず、固体支持体の活性エステル基に逆転写プライマーを結合させる。プライマーとしては、一般にオリゴｄＴプライマー、特定塩基配列に相補的なプライマー、ランダム６塩基プライマーが用いられるが、中でもＲＮＡの５’末端のｐｏｌｙ（Ａ）＋配列に対応させてＴ（チミン塩基）が１０〜２０個程度連なった配列からなるオリゴｄＴプライマーを用いることが望ましい。オリゴｄＴプライマーを用いる場合には、鋳型となるＲＮＡの５’末端のｐｏｌｙ（Ａ）部分をアニーリングさせる。これに逆転写酵素を作用させ、鋳型ＲＮＡに対し相補的なｄＮＴＰをプライマーの３’末端に順々に重合させることで、５’から３’の方向にｃＤＮＡを合成する。この逆転写反応のプライマーの結合、アニーリング、逆転写酵素による相補鎖重合は、定法に従い温度制御（サーマルサイクル）を行うことによって実施できる。このように逆転写反応を行うと同時に固体支持体への固定も可能であることから、本発明の方法によればいわゆるＲＴ−ＰＣＲを効率よく行うことができ、ｍＲＮＡの定量用としても有用である。
【００６３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６４】
２．５インチシリコンウエハー（（株）新陽製、ｎ Ｔｙｐｅ）を３ｍｍ角にダイシング加工を施したシリコン基材にイオン化蒸着法を用いて、下記の条件で２層のＤＬＣ層の製膜を行った。【００６５】
【表１】
2011030823.tif 000003
【００６６】
得られた表面にＤＬＣ層を有するシリコン基材を、下記の条件でアンモニアガス雰囲気化でプラズマ処理することにより、アミノ基を導入した。【００６７】
【表２】
2011030823.tif 000004
【００６８】
アミノ基を導入した基材をポリアクリル酸水溶液（濃度１、１０、５０、７０、１００又は５００ｇ／ｌ）へ浸漬（１０分×室温）して純水にて洗浄を行い、Ｎ２ガスによる吹き付け乾燥を実施した。なお、本実施例では、和光純薬工業（株）社製のポリアクリル酸水溶液（２５重量％）を使用し、これを水で希釈することで上記濃度とした。カルボキシル基が導入された基板をＸ線光電子分光分析機（アルバックファイ製  ＥＳＣＡ５１００、Ｘ線源：Ｍｇ、分析領域：φ３ｍｍ）で測定し、Ｃ１ｓスペクトルを得た。得られたチャートを図１に示す。そして、束縛エネルギー２８８．８ｅＶに表れるカルボキシル基（ＣＯＯ（Ｈ）結合）に由来するピークの強度と束縛エネルギー２８４．７ｅＶに現れるＣ−Ｃ結合に由来するピークの強度の比を算出した。【００６９】
その後、ＥＳＣＡの測定を実施していない部分について０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによってカルボキシル基を活性化し（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基の導入）、固体支持体を得た。【００７０】
得られた固体支持体に、２２ｍｅｒのＣｙ３標識オリゴＤＮＡ（５μＭ）をスポッティングし、８０℃のオーブンで１時間加熱後、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで、室温にて１５分及び７０℃にて５分洗浄し、水洗後、遠心乾燥（１５００ｒｐｍ×１分）することにより、蛍光標識ＤＮＡを固体支持体上に固定化した。スポット形状をＣＣＤカメラ（×２０）で撮影した（図２）。また、ＦＬＡ−８０００（富士フイルム株式会社）で蛍光強度を測定した。結果を以下の表に示す。【００７１】
【表３】
2011030823.tif 000005
【００７２】
以上から、Ｃ１ｓスペクトルにおける（ＣＯＯピーク強度）／（Ｃ−Ｃピーク強度）比が０．１０〜０．２０である基板のカルボキシル基を活性エステル化して得られる固体支持体は、標識核酸固定化後のシグナル強度が強く、核酸固定化能が高いこと、ならびにスポット形状が均一で良好であるとともに、外観も良好であることがわかる。【００７３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
2011030823.tif 000007
【国際調査報告】
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