(57)【要約】様々な実施形態で、結果依存的取得ストラテジーを利用して、試料を分析するための方法を提供する。様々な実施形態で、試料を分析する方法を提供し、初めに、該試料をＭＡＬＤＩおよびＭＳによって分析し、第１の結果を提示し、その後、該第１の結果を用いて、第２の分析を決定し、該第２の分析を用いて、ＭＡＬＤＩおよびＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによって該試料を再度分析して、第２の結果を提示する。様々な態様で、生体分子を含有する試料を分析するための方法を提供する。様々な実施形態で、該方法は、生体分子を含んでいる試料中の生体分子の同定を容易にする。様々な実施形態で、該方法は、結果主導型取得ストラテジーを利用して、生体試料中の生体分子を同定および／または特徴付けすることを容易にする。
2005536728.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を含有する試料を分析するための方法であって、
生体分子を含有する試料の複数の試料部分を提供する工程と、
該試料部分のうちの少なくとも１つの１つ以上の質量スペクトルを取得する工程と、
発現依存にもとづく分析、質量分析データにもとづく分析、および検索結果にもとづく分析の少なくとも１種類を用いて、該１つ以上の質量スペクトルを分析する工程と、
該１つ以上の質量スペクトルの該分析にもとづいて、１つ以上の質量電荷比範囲を選択する工程と、
該選択された１つ以上の質量電荷比範囲のうちの１つ以上にある該試料部分のうちの少なくとも１つのフラグメンテーション・スペクトルを取得する工程と、
該選択された１つ以上の質量電荷比範囲のうちの少なくとも１つの該フラグメンテーション・スペクトルを、既知または予測のフラグメンテーション質量スペクトルのデータベースと比較する工程と、
該比較にもとづいて、生体分子が該試料中に存在するかを決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記生体分子がタンパク質およびペプチドの少なくとも１つを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の質量スペクトルを取得する工程が、
マトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いて、試料部分中の前記生体分子の少なくとも一部分をイオン化する工程と、
質量分析計を用いて、１つ以上の質量スペクトルを取得する工程と、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記質量分析計が飛行時間質量分析計を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上の質量スペクトルを分析する工程が、前記試料部分中の１つ以上の差次的標識生体分子間の発現レベル比を決定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の質量電荷比範囲を選択する工程が、前記１つ以上の質量スペクトル中の質量信号の発現レベル比にもとづいて、１つ以上の質量電荷比範囲を選択することを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
１つ以上の発現レベル比中の試料バイアスを補正する工程をさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の質量スペクトルを分析する工程が、１つ以上の質量スペクトル中の前記１つ以上の質量信号に対して、信号強度および信号対雑音比を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上の質量電荷比範囲を選択する工程が、前記１つ以上の質量スペクトル中のうちの１つ以上の質量信号に対する前記信号強度および信号対雑音比にもとづいて、１つ以上の質量電荷比範囲を選択することを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の質量スペクトルを分析する工程が、前記１つ以上の質量スペクトルの１つ以上の少なくとも一部分を、１つ以上の既知または予測の質量スペクトルと比較して、前記１つ以上の質量スペクトル中の１つ以上の質量信号の潜在的同定として１つ以上の生体分子を割り当てることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の質量電荷比範囲を選択する工程が、前記１つ以上の質量スペクトル中の１つ以上の質量信号の潜在的同定として割り当てられた前記１つ以上の生体分子に関連する信頼水準にもとづいて、１つ以上の質量電荷比範囲を選択することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の質量スペクトルを分析する工程が、前記１つ以上の質量スペクトルのうちの１つ以上の少なくとも一部分を、１つ以上の既知または予測の質量スペクトルと比較して、ペプチド・マス・フィンガープリント法技術を用いて、前記１つ以上の質量スペクトル中の１つ以上の質量信号の潜在的同定として、１つ以上の生体分子を割り当てることを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記フラグメンテーション・スペクトルを取得する工程が、
マトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いて、試料部分中の前記生体分子の少なくとも一部分をイオン化して、試料イオンを生成する工程と、
第１の質量分析計を用いて、試料イオンを分離する工程と、
前記選択された１つ以上の質量電荷比範囲中の前記試料イオンの少なくとも一部分をフラグメント化する工程と、
第２の質量分析計を用いて、フラグメンテーション・スペクトルを取得する工程と、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の質量分析計および第２の質量分析計がタンデム飛行時間質量分析計系を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
コンピュータ可読媒体を含む、製造物であって、請求項１記載の方法を実行するためのコンピュータ可読命令を該コンピュータ可読媒体に組み込む、製造物。
【請求項１６】
タンパク質を含有する試料を分析するための方法であって、
ペプチドおよびタンパク質の少なくとも１つを含有する第１の試料と、ペプチドおよびタンパク質の少なくとも１つを含有する第２の試料とをそれぞれが含む複数の試料部分を提供する工程であって、該第１の試料および該第２の試料中の該生体分子の少なくとも一部が同位体コード試薬で差次的に標識される工程と、
該試料部分のうちの少なくとも１つの１つ以上の質量スペクトルを取得する工程と、
該試料部分中の１つ以上の差次的標識生体分子間の発現レベル比を決定する工程と、
該１つ以上の質量スペクトル中の質量信号の発現レベル比にもとづいて、１つ以上の質量電荷比範囲を選択する工程と、
該選択された１つ以上の質量電荷比範囲のうちの１つ以上にある該質量部分のうちの少なくとも１つのフラグメンテーション・スペクトルを取得する工程と、
該選択された１つ以上の質量電荷比範囲のうちの少なくとも１つの該フラグメンテーション・スペクトルを、既知または予測のフラグメンテーション質量スペクトルのデータベースと比較する工程と、
該比較にもとづいて、生体分子が該試料中に存在するか否かを決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項１７】
前記１つ以上の質量スペクトルを取得する工程が、
マトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いて、試料部分中の前記生体分子の少なくとも一部分をイオン化する工程と、
質量分析計を用いて、１つ以上の質量スペクトルを取得する工程と、
含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記質量分析計が飛行時間質量分析計を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上の発現レベル比中の試料バイアスを補正する工程をさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の質量スペクトル中の１つ以上の質量信号に対して、信号強度および信号対雑音比を測定する工程をさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の質量電荷比範囲を選択する工程が、前記質量スペクトル中の１つ以上の質量信号に対する前記信号強度および信号対雑音比にもとづいて、１つ以上の質量電荷比範囲を選択することをさらに含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上の質量スペクトルのうちの１つ以上の少なくとも一部分を、１つ以上の既知または予測の質量スペクトルと比較して、前記１つ以上の質量スペクトル中の１つ以上の質量信号の潜在的同定として１つ以上の生体分子を割り当てる工程をさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の質量電荷比範囲を選択する工程が、前記１つ以上の質量スペクトル中の１つ以上の質量信号の潜在的同定として割り当てられた前記１つ以上の生体分子に関連する信頼水準にもとづいて、１つ以上の質量電荷比範囲を選択することをさらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上の質量スペクトルを分析する工程が、前記１つ以上の質量スペクトルのうちの１つ以上の少なくとも一部分を、１つ以上の既知または予測の質量スペクトルと比較して、ペプチド・マス・フィンガープリント法技術を用いて、前記１つ以上の質量スペクトル中の１つ以上の質量信号の潜在的同定として、１つ以上の生体分子を割り当てることを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記フラグメンテーション・スペクトルを取得する工程が、
マトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いて、試料部分中の前記生体分子の少なくとも一部分をイオン化して、試料イオンを生成する工程と、
第１の質量分析計を用いて、試料イオンを分離する工程と、
前記選択された１つ以上の質量電荷比範囲中の前記試料イオンの少なくとも一部分をフラグメント化する工程と、
第２の質量分析計を用いて、フラグメンテーション・スペクトルを取得する工程と、
を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の質量分析計および第２の質量分析計がタンデム飛行時間質量分析計系を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
コンピュータ可読媒体を含む、製造物であって、請求項１６記載の方法を実行するためのコンピュータ可読命令を前記コンピュータ可読媒体に組み込む、製造物。
【請求項２８】
少なくとも１つの生体分子に関して試料を分析するための方法であって、
固体支持体上で少なくとも１つの試料部分を堆積させる工程と、
マトリックス支援レーザー脱離イオン化によって、該試料部分の少なくとも一部分を気化して、第１の気化されたイオン化試料を形成する工程と、
質量分析装置を用いて、該第１の気化されたイオン化試料の少なくとも一部分を処理して、該第１の気化されたイオン化試料のイオン質量電荷比の関数としてのイオン存在量のリストを含む第１のデータ・セットを決定する工程と、
該第１のデータ・セットを、イオン質量電荷比の関数としてのイオン存在量によって生体分子を同定する第２のデータ・セットの少なくとも１つと比較する工程と、
該比較にもとづいて、１つ以上のイオン質量電荷比範囲を更なる分析のために選択する工程と、
マトリックス支援レーザー脱離イオン化によって、該生体試料の少なくとも別の部分を気化して、第２の気化されたイオン化試料を形成する工程と、
該第１のデータ・セットにもとづいて調整された質量分析装置を用いて、該第２の気化されたイオン化試料の少なくとも一部分を処理することによって、該第２の気化されたイオン化試料のイオン質量電荷比の関数としてのイオン存在量のリストを含む第３のデータ・セットを決定する工程と、
該第３のデータ・セットを、イオン質量電荷比の関数としてのイオン存在量によって生体分子を同定する第４のデータ・セットと比較する工程および該同定された生体分子データをおよび第１のデータ・セットを用いて該試料中の該１つ以上の生体分子に関する定量情報を得る工程の少なくとも１種類を実行する工程と、
を含む、方法。
【請求項２９】
前記試料中で低濃度を持つ少なくとも１つの第１の気化された生体分子を、前記第１の気化された生体分子より前記試料中で高い濃度を持つ生体分子を処理する前に、第２の気化されたイオン化試料として処理する、請求項２８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
コンピュータ可読媒体を含む、製造物であって、請求項２８記載の方法を実行するためのコンピュータ可読命令を前記コンピュータ可読媒体に組み込む、製造物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
質量分析法（ＭＳ）は、試料中の分子の存在を測定するための分析技術である。質量分析計中の試料は気化され、イオン源でイオン化され、結果として生じるイオンの質量電荷比が測定される。飛行時間質量分析計（ＴＯＦ  ＭＳ）は、試料中の所定のイオンが電界に補助されてイオン源から検出器まで飛行するのにかかる時間の量を測定することによって、イオンの質量電荷比を決定する。イオンが検出器に到達するために要する時間は、その質量の一次関数およびその電荷の逆関数である。試料は、単一の構成要素分子またはほぼ無限数の分子を含有することが可能である。試料中の分子の存在は、該試料の質量スペクトルに含まれる情報を該分子に対して公知または理論上の質量スペクトルと相関させることによって、あるいは新規の分子の構造を測定することによって測定されうる。
【０００２】
質量分析法は、疾患または遺伝子発現機構等の生物学的過程を特徴付けるための生体試料中のタンパク質発現の測定を含むプロテオーム分析の分野では極めて重要である。タンパク質発現を理解することは、生物系を完全に理解するために重要である。遺伝子発現および代謝研究とともに用いられて、タンパク質発現研究は、生物系を理解して、新しい診断法と治療法を展開する上で鍵となるツールである。
【０００３】
ディスポーサブルなメッセンジャーとして作用するだけのｍＲＮＡとは異なって、タンパク質は、ほぼ全ての制御された生体機能を実行し、結果として、正常細胞活性、疾患経過、および薬剤応答等の機能に不可欠である。しかし、タンパク質発現は、確実に予測可能でない。第１に、ｍＲＮＡ転写物レベルがタンパク質レベルと強く相関していないので、タンパク質発現はｍＲＮＡ発現マップから予測可能ではない。第２に、タンパク質は、遺伝情報から予測可能でない方法で、環境要因によって生物系で動的に修飾される。したがって、薬剤等の刺激または疾患等の状態への生物系の応答についての知識には、通常、多くの「正常（ｎｏｒｍａｌ）」試料と対応する「異常（ａｂｎｏｒｍａｌ）」試料との比較が必要となる。このように、プロテオーム分析は、種々の試料に存在するタンパク質の測定を必要とする。
【０００４】
現在、大部分のＭＳプロセスは、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）から生じるイオン化試料をＭＳ装置中に導入するための手段として、エレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）イオン源を利用する。ＥＳＩのいくつかの望ましい特徴のうちの１つは、クロマトグラフィー・カラムから得た画分がＨＰＬＣからＥＳＩイオン源に直接移ることができるということである。しかし、ＨＰＬＣからの流出液の流れを止めて、クロマトグラフィー分離度をモニターすることが難しいため、ＥＳＩのこの望ましい特徴は、試料の所定の部分（例えば、カラムから得た特定の画分）を再サンプリングすることが一般的に可能でないことを意味する。したがって、オペレータは、通常、イオン化スプレーとしてＥＳＩノズルを出ている最中の組成物のその部分だけをＭＳ分析にかけることに限定される。このように、オペレータは、試料の情報取得を止めることができず、分析サイクルの間または後に得られる試料特徴付けについての知識にもとづいて、該試料の予め避けた部分に関する付加的な情報取得を求めることができない。そのような場合、オペレータは、一部が残ると想定して、組成物をＨＰＬＣに再注入しなければならないだろう。しかし、ＨＰＬＣへの組成物の各注入は、ＨＰＬＣ再現性の問題（例えば、同じ保持速度を維持することの困難等の）のため、異なる試料とみなされうる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
生命科学への対象となる多くの試料では、質量分析法の１次元によって発生する質量スペクトルは、あまりに多くのピークを有するので、該スペクトルから有用な情報を引き出すことが難しい。したがって、例えば、タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）、または、より一般的には、多次元質量分析法（ＭＳｎ）等の質量分析法の多次元を利用するアプローチが、しばしば用いられる。ＭＳ／ＭＳモードでの分析は、通常、第１の質量分析計（しばしば、質量分析法の第１の次元と言及される）を用いて分子イオン（しばしば、「親イオン（ｐａｒｅｎｔ  ｉｏｎ）」または「前駆イオン（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｏｎ）」と言及される）を選択して、イオン・フラグメンター（例えば、親イオンが不活性ガスと衝突する衝突セル）に親イオンを導くことによって達成される。該親イオンは、フラグメンター中で一連のフラグメント・イオン（しばしば、「娘イオン（ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｉｏｎ）」と言及される）にフラグメント化される。その後、該娘イオンは、通常、第２の質量分析計（しばしば、質量分析法の第２の次元と言及される）中に導かれて、親イオンのフラグメンテーション・パターン（しばしば、フラグメンテーション・スペクトルと言及される）を分解する。
【０００６】
様々な態様で、生体分子を含有する試料を分析するための方法を提供する。様々な実施形態で、該方法は、生体分子を含んでいる試料中の生体分子の同定を容易にする。様々な実施形態で、該方法は、結果主導型取得ストラテジーを利用して、生体試料中の生体分子を同定および／または特徴付けすることを容易にする。様々な実施形態で、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる更なる分析のために試料の質量を選択するための取得ストラテジーを、該試料の１つ以上の部分の初期質量スペクトルの１つ以上の発現にもとづく分析、質量分析データ分析、検索結果にもとづく分析、またはそれらの組合せの結果によって駆動する。例えば、１つ以上の初期質量スペクトルは、１つ以上のＭＡＬＤＩ試料プレート上の１つ以上の試料スポットで得られる質量スペクトルでありうる。
【０００７】
様々な実施形態で、結果主導型取得ストラテジーを、例えば、種々のワークフローおよびワークフローの組合せで実行することができる。発現依存的結果の分析にもとづくワークフローを用いることができる。質量分析データ依存的結果主導型ストラテジーにもとづくワークフローを用いることができる。様々な実施形態で、検索結果依存的結果を用いることができる。発現依存的、質量分析データ依存的、および検索結果依存的結果の２種類以上を用いることができる。
【０００８】
様々な実施形態で、該方法は、ＭＳ操作のため、かつＭＳ／ＭＳ同定のために使用されるプロセス・パラメータの１つ以上を含むリレーショナル・データベースまたはオブジェクト指向データベース中の複数の取得からの結果を保存および統合する結果依存的ワークフローを利用する。該方法は、ＭＳ定量化、ＭＳ／ＭＳ同定、およびリレーショナル・データベースとのμＬＣのオフライン結合を利用して、同定および定量化のために用いられるプロセス・パラメータを含む複数の取得からの結果を保存および統合することができる。
【０００９】
別の態様では、本発明の方法の機能がコンピュータ可読媒体に組み込まれた製造物を提供し、該コンピュータ可読媒体としては、例えば、限定はされないが、フロッピー（登録商標）・ディスク、ハード・ディスク、光学ディスク、磁気テープ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、あるいはコンピュータまたはプロセッサ・メモリ中の常駐物がある。該方法の機能を、例えば、ＦＯＲＴＲＡＮ、ＰＡＳＣＡＬ、Ｃ、Ｃ＋＋、ＢＡＳＩＣ、およびアセンブリ言語等の任意数のコンピュータ可読命令または言語で、コンピュータ可読媒体に組み込むことができる。さらに、該コンピュータ可読命令を、例えば、スクリプト、マクロに書き込むことができ、あるいは市販のソフトウェア（例えば、ＥＸＣＥＬまたはＶＩＳＵＡＬ  ＢＡＳＩＣ）に機能的に組み込むことができる。
【００１０】
本発明の前述および他の態様、実施形態、ならびに特徴は、添付の図面とともに、以下の説明からより完全に理解されうる。図面中では、同様の参照符号は、一般に、様々な図の全体を通じて同様の特徴および構造要素を指す。図面は、必ずしも一定の倍率であるというわけではなく、代わりに、本発明の原則を説明する上で強調されている。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
様々な態様で、本教示は、生体試料中の生体分子の同定および／または分析を容易にする。予備分離技術を含む予備処理に生体試料をかけることができる。例えば、細胞または組織を抽出して、異なる細胞下画分（例えば、細胞の異なる部分で見出されるタンパク質または薬剤）中の生体分子の別々の分析のために細胞下分画にかけることができる。免疫沈降を実行して、タンパク質等の抗原性に関連する生体分子を同定することができる。
【００１２】
本明細書で用いられるように、用語「生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、生体試料中に存在する任意の有機分子を指し、限定はされないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、オリゴ糖、脂質、ステロイド、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、および核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）が挙げられる。したがって、様々な実施形態で、該方法は、結果主導型取得ストラテジーを用いて、生体試料中のタンパク質を同定および／または特徴づけすることを容易にする。本明細書で用いられるように、用語「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」としては、限定はされないが、非修飾タンパク質および修飾タンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質および非グリコシル化タンパク質）両方が挙げられる。
【００１３】
本明細書で用いられるように、用語「生体試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅ）」とは、任意の生物から得られるか、排出されるか、または分泌される任意の固体または液体試料を指し、該生物としては、限定はされないが、単細胞微生物（例えば、細菌および酵母）および多細胞生物（例えば、植物、および健康または外見上健康なヒト被験体あるいは診断または検査すべき症状または疾患に冒されたヒト患者を含む動物）が挙げられる。例えば、生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄液、房水、ガラス体液、または任意の体分泌物、濾出液、浸出液（例えば、膿瘍あるいは感染または炎症の任意の他の部位から得られる液体）、または関節から得られる液体（例えば、正常関節、あるいは関節リウマチ、変形性関節症、痛風、または化膿性関節炎等の疾患に冒された関節）から得られる生体液でありうる。生体試料は、任意の器官または組織（生検または剖検検体を含む）から得られる試料でもありうるか、あるいは細胞（１次細胞または培養細胞）または任意の細胞、組織、もしくは器官によって条件づけられる培地を含むことができる。
【００１４】
適当な試料調製手順としては、限定はされないが、ＭＡＬＤＩ法によって処理されることが可能な試料アレイを生成する手順が挙げられる。例えば、液体クロマトグラフィー、１Ｄ電気泳動、２Ｄ電気泳動、タンパク質分離、組織レーザー顕微解剖、およびプロテオリシスの１種類以上を用いて、生体試料をその構成要素成分に分離して、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ分析をおこなうことができるようにＭＡＬＤＩプレート上の連続試料としてまたは別々の試料部分として堆積のための試料を生成することができる。例えば、実質的に全体のタンパク質、ペプチド（例えば、生体試料中のタンパク質のプロテオリシスによって産生される）、またはそれらの組合せに関してＭＡＬＤＩ  ＭＳ分析をおこなうことができる。
【００１５】
例えば、連続的またはオンラインＭＡＬＤＩ  ＭＳ系で用いるための試料を形成する１つの適当なアプローチについては、米国特許第６，１７５，１１２号（２００１年１月１６日発行）に開示されており、その開示全体を本明細書に援用する。キャピラリー液体クロマトグラフィー装置等の注入装置から基板上に液体試料を連続的に析出して、試料を提供する狭い幅の固体トレースを形成し、ここで、例えば、その一部分を、その後、パルス・レーザー光等で脱離させ、ＭＳによって分析されうるイオン化気体試料を形成することができる。
【００１６】
様々な実施形態で、該方法は、生体分子を含有する試料をＭＡＬＤＩによるイオン化に適した複数の試料部分として提供する。該複数の試料部分は、別々の部分（例えば、一連のスポット）、実質的に隣接する部分（例えば、試料の連続バンド）、または両方の組合せでありうる。該試料部分は、ＭＡＬＤＩ質量分析計とともに用いるのに適した基板上で提供される。該方法は、１つ以上の試料部分の１つ以上の質量スペクトルを取得して、質量信号（質量ピークとも言及される）のリストを含む第１のデータ・セットを生成する。各質量信号は、関連する強度（イオンの存在量に関連する）および関連する質量（イオンの質量電荷（ｍ／ｚ）比に関連する）を有する。発現にもとづく分析、質量分析データ分析、および検索結果にもとづく分析の１種類以上を用いて第１のデータ・セットを分析して、前駆体選択基準の第１のセットを生成する。その後、前駆体選択基準の第１のセットにもとづいて、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる更なる分析のために１つ以上のｍ／ｚ範囲を選択する。該方法は、前駆体選択基準の第１セットにもとづいて更なる分析のために選択された１つ以上のｍ／ｚ範囲に対する１つ以上のフラグメンテーション・スペクトルを取得する。様々な実施形態で、フラグメンテーション・スペクトルの１つ以上を分析して、試料中の１つ以上の生体分子を同定する。様々な実施形態で、該方法は、発現依存的データ中の試料バイアスを補正することを含む。
【００１７】
本明細書で用いられるように、「発現にもとづく分析（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」とは、例えば、検査中の試料中か、検査中の試料と対照試料との間か、または両方の生体分子の差次的発現にもとづく分析を指す。
【００１８】
発現にもとづく分析を用いる様々な実施形態で、更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析質量信号に対する質量信号の選択は、発現比にもとづく。発現にもとづく分析を用いるペプチドおよびタンパク質の分析の様々な実施形態では、該方法は、同位体コード・アフィニティー・タグ（ＩＣＡＴ）を含む定量化方法論を用いて、定量情報（すなわち、差次的標識対の相対的存在量）を提供する。様々な実施形態で、同位体質量信号間の発現の相対的相違にもとづいて、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる付加的なＭＳ処理のために質量信号を選択する。例えば、様々な実施形態で、相対的発現比で３倍より大きい相違を有する同位体質量信号を選択して、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる付加的なＭＳ処理にかける。様々な実施形態で、質量信号は、該質量信号が上方制御されるか、または下方制御されるかにもとづいて選択される。
【００１９】
実験試料および対照試料を用いる様々な実施形態では、該実験試料（検査中の試料）と対照試料との間で変化しない、生体試料中の大部分のタンパク質を表す中央発現比を算出することができる。様々な実施形態で、中央または平均発現比を用いて、例えば、不同量の出発材料または試料取り扱い上の間違いが原因である、研究での発現レベルに影響する系統的バイアスを補正することができる。例えば、発現にもとづく分析を用いる様々な実施形態で、中央発現比からの２より大きい標準偏差の発現比を持つ各重軽（ＨＬ）対由来の最も強度のピークを選択して、付加的なＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ処理にかける。
【００２０】
本明細書で用いられるように、「質量分析データにもとづく分析（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄａｔａ  ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」とは、例えば、質量信号の信号強度にもとづく分析を指す。本明細書で、用語「信号強度（ｓｉｇｎａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）」とは、強度が絶対的信号強度であるか、補正された信号強度であるか、相対的信号強度であるか、または信号対雑音（Ｓ／Ｎ）パラメータであるかに関わらず、質量信号に関連する強度を指すことを意味する。様々な実施形態で、質量分析データにもとづく分析は、（１）絶対的質量信号強度、（２）相対的質量信号強度、（３）Ｓ／Ｎ閾値を基準とした質量シグナル強度、および（４）質量信号ピーク面積の１種類以上にもとづいて、更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のために質量電荷比範囲を選択する。
【００２１】
様々な実施形態で、質量分析データにもとづく分析は、より低い強度を用いて検出される更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のための質量ピークを選択することを含む。例えば、より低い強度を用いて検出される各試料部分中の少量成分の同定は、初めに、試料の多くが消費される前に、該少量成分の同定を容易にする。更なる試料の消費に応じて、より低い強度を用いて生体分子を検出することがより難しくなるので、より低い強度を用いて検出される質量強度の以降のＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析を優先させることが望ましい。様々な実施形態で、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のために、一質量スペクトル当たりｎ個の最も強度のピークを選択する。ｎに対する数値の例としては、限定はされないが、約１から約６の範囲のｎの数値が挙げられる。ｎに対する数値を、例えば、コンピュータ・リソースにもとづいて選択することができる。例えば、質量スペクトルが１個の９６ウェルＭＡＬＤＩ試料プレート上の各試料スポットに考えられる場合、ｎ＝４を用いると、３８４個のピークが選択されることになりうる。質量スペクトルが１０個の９６ウェルＭＡＬＤＩプレート上の各試料スポットに考えられる場合、３０００個を上回るピークが選択されうる。様々な実施形態で、１つの質量スペクトルからすでに選択されたピークは、他の質量スペクトルでｎ個の最も強度のピークのうちの１つとして、考慮から除かれる。様々な実施形態で、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のための選択されたｍ／ｚ比範囲のリストを校正して、重複するｍ／ｚ比範囲を除外する。
【００２２】
例えば、対応する第１の質量電荷比範囲を有する第１の質量信号は、２つ以上の質量スペクトルでｎ個の最も強度の基準を満たす。様々な実施形態で、（１）第１の質量信号が質量スペクトル中でｎ個の最も強度のピークのうち最も弱いものである場合、（２）第１の質量信号が質量スペクトル中でｎ個の最も強度のピークのうち最も強いものである場合、（３）第１の質量信号が最高の絶対的信号強度を有し、かつ質量スペクトル中でｎ個の最も強度のピークのうちの１つである場合、または（４）第１の質量信号が最低の絶対的信号強度を有し、かつ質量スペクトル中でｎ個の最も強度のピークのうちの１つである場合に、該第１の質量信号を、質量スペクトル中「のみ（ｏｎｌｙ）」でｎ個の最も強度のピークのうちの１つとみなす。
【００２３】
様々な実施形態で、一質量スペクトル当たりｎ個の最も強度のピークを最初に選択し、対応する質量電荷比範囲上で、最初に選択されたピークの最も弱いものから最も強いものへ、あるいは最初に選択されたピークの最も強いものから弱いものへとＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析を開始する。様々な実施形態で、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析の結果を用いて、１つ以上の質量信号に生体分子アイデンティティを割り当て、どの質量電荷比範囲をＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析にかけるかを校正する。
【００２４】
例えば、１つ以上の試料部分から第１の質量電荷比範囲に対して１つ以上のフラグメンテーション・スペクトルを得ることができ、該１つ以上のフラグメンテーション・スペクトルにもとづいて、生体分子アイデンティティを対応する質量信号と、該第１の質量電荷比範囲に対応する該質量信号に割り当てた生体分子源（例えば、ペプチド生体分子同定のための親タンパク質）とに割り当てる。生体分子源割り当てにもとづいて、１つ以上の他の初めに選択されたピークのアイデンティティも、これらの他のピークの質量電荷比範囲のＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析なしで割り当てる。様々な実施形態で、これらの他のピークの１つ以上に対応する質量電荷比範囲は、更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析にかけない。
【００２５】
様々な実施形態で、最も強度の質量ピークの約８０％未満の強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、最も強度の質量ピークの約７０％未満の強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、中央質量ピーク強度の約８０％未満の強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、中央質量ピーク強度の約７０％未満の強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、平均質量ピーク強度の約８０％未満の強度を持つ質量ピークを選択する。様々な実施形態で、平均質量ピーク強度の約７０％未満の強度を持つ質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約１より多い標準偏差で、中央質量ピーク強度より低い強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約２より多い標準偏差で、中央質量ピーク強度より低い強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約３より多い標準偏差で、中央質量ピーク強度より低い強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約４より多い標準偏差で、中央質量ピーク強度より低い強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約１より多い標準偏差で、平均質量ピーク強度より低い強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約２より多い標準偏差で、平均質量ピーク強度より低い強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約３より多い標準偏差で、平均質量ピーク強度より低い強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約４より多い標準偏差で、平均質量ピーク強度より低い強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。
【００２６】
様々な実施形態で、質量分析データにもとづく分析は、より高い強度を用いて検出される更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のための質量ピークを選択することを含む。例えば、様々な検査では、試料中に存在する最も多数を占める生体分子を同定することが望ましい。様々な実施形態で、最も強度の質量ピークの約９０％より大きい強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、最も強度の質量ピークの約８０％より大きい強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、中央質量ピーク強度の約９０％より大きい強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、中央質量ピーク強度の約８０％より大きい強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、平均質量ピーク強度の約９０％より大きい強度を持つ質量ピークを選択する。様々な実施形態で、平均質量ピーク強度の約８０％より大きい強度を持つ質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約１より多い標準偏差で、中央質量ピーク強度より大きい強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約２より多い標準偏差で、中央質量ピーク強度より大きい強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約３より多い標準偏差で、中央質量ピーク強度より大きい強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約４より多い標準偏差で、中央質量ピーク強度より大きい強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約１より多い標準偏差で、平均質量ピーク強度より大きい強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約２より大きい標準偏差で、平均質量ピーク強度より大きい強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約３より多い標準偏差で、平均質量ピーク強度より大きい強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約４より多い標準偏差で、平均質量ピーク強度より大きい強度を持つ１つ以上の質量ピークを選択する。
【００２７】
本明細書で用いられるように、「検索結果にもとづく分析（ｓｅａｒｃｈ  ｒｅｓｕｌｔ  ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」とは、例えば、既知または予測の質量スペクトルとＭＳ分析によって生成される１つ以上の質量スペクトルの１つ以上の少なくとも一部分との比較にもとづく試料中の１つ以上の生体分子の推定上の同定にもとづく分析を指す。様々な実施形態で、既知または予測の質量スペクトルの基準データと測定された質量を比較する。例えば、ペプチド・マス・フィンガープリント法（ＰＭＦ）技術を用いて、推定上の同定を提供することができる。様々な実施形態で、データベース中の質量スペクトルへのマッチ（特定の信頼区間内の）に関連する１つ以上の質量シグナルを更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のために選択する。例えば、マッチしたピークを選択し、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによってさらに分析して、データベースによって決定された推定上の同定を確認することができる。様々な実施形態で、初期検索結果が決定的でない場合、例えば、決定的でないマッチに対応するより高い強度質量信号、決定的でないマッチに対応するより低い強度質量信号、または両方の組合せをＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる更なる分析のために選択する。様々な実施形態で、データベース中の質量スペクトルへのマッチ（特定の信頼区間内の）に関連する１つ以上の質量信号は、更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析に対する考慮から除かれる。例えば、マッチしたピークを考慮から除くことができ、ｍ／ｚ比範囲に関連する残りのマッチしていないピークの１つ以上をＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のために選択することができる。
【００２８】
様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応するｎ個の最も強度の質量ピークをＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる更なる分析のために選択する。ｎに対する数値の例としては、限定はされないが、約１から約６の範囲のｎの数値が挙げられる。ｎに対する数値を、例えば、コンピュータ・リソースにもとづいて選択することができる。様々な実施形態で、１つの質量スペクトルからすでに選択されたピークは、他の質量スペクトルでｎ個の最も強度のピークのうちの１つとして、考慮から除かれる。
【００２９】
例えば、対応する第１の質量電荷比範囲を有する第１の質量信号は、２つ以上の質量スペクトルでｎ個の最も強度の基準を満たすとみなす。様々な実施形態で、（１）第１の質量信号が質量スペクトル中でｎ個の最も強度のピークのうち最も弱いものである場合、（２）第１の質量信号が質量スペクトル中でｎ個の最も強度のピークのうち最も強いものである場合、（３）第１の質量信号が最高の絶対的信号強度を有し、かつ質量スペクトル中でｎ個の最も強度のピークのうちの１つである場合、または（４）第１の質量信号が最低の絶対的信号強度を有し、かつ質量スペクトル中でｎ個の最も強度のピークのうちの１つである場合に、該第１の質量信号を、質量スペクトル中「のみ（ｏｎｌｙ）」でｎ個の最も強度のピークのうちの１つとみなす。
【００３０】
様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する最も強度の質量ピークの約９０％より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する最も強度の質量ピークの約８０％より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する中央質量ピーク強度の約９０％より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する中央質量ピーク強度の約８０％より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する平均質量ピーク強度の約９０％より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する質量ピークを選択する。様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する平均質量ピーク強度の約８０％より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約１より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する中央質量ピーク強度より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約２より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する中央質量ピーク強度より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約３より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する中央質量ピーク強度より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約４より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する中央質量ピーク強度より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約１より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する平均質量ピーク強度より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約２より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する平均質量ピーク強度より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約３より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する平均質量ピーク強度より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約４より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する平均質量ピーク強度より大きい強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。
【００３１】
様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチに対応するｎ個の最も強度でない質量ピークをＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる更なる分析のために選択する。ｎに対する数値の例としては、限定はされないが、約１から約６の範囲のｎの数値が挙げられる。ｎに対する数値を、例えば、コンピュータ・リソースにもとづいて選択することができる。様々な実施形態で、１つの質量スペクトルからすでに選択されたピークは、他の質量スペクトルでｎ個の最も強度のピークのうちの１つとして、考慮から除かれる。例えば、対応する第１の質量電荷比範囲を有する第１の質量信号は、２つ以上の質量スペクトルでｎ個の最も強度の基準を満たすとみなす。様々な実施形態で、（１）第１の質量信号が質量スペクトル中でｎ個の最も強度のピークのうち最も弱いものである場合、（２）第１の質量信号が質量スペクトル中でｎ個の最も強度のピークのうち最も強いものである場合、（３）第１の質量信号が最高の絶対的信号強度を有し、かつ質量スペクトル中でｎ個の最も強度のピークのうちの１つである場合、または（４）第１の質量信号が最低の絶対的信号強度を有し、かつ質量スペクトル中でｎ個の最も強度のピークのうちの１つである場合に、該第１の質量信号を、質量スペクトル中「のみ（ｏｎｌｙ）」でｎ個の最も強度のピークのうちの１つとみなす。
【００３２】
様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する最も強度の質量ピークの約８０％未満の強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する最も強度の質量ピークの約７０％未満の強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する中央質量ピーク強度の約８０％未満の強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する中央質量ピーク強度の約７０％未満の強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する平均質量ピーク強度の約８０％未満の強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する質量ピークを選択する。様々な実施形態で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する平均質量ピーク強度の約７０％未満の強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約１より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する中央質量ピーク強度より低い強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約２より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する中央質量ピーク強度より低い強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約３より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する中央質量ピーク強度より低い強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約４より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する中央質量ピーク強度より低い強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約１より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する平均質量ピーク強度より低い強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約２より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する平均質量ピーク強度より低い強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約３より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する平均質量ピーク強度より低い強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。様々な実施形態で、約４より多い標準偏差で、決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する平均質量ピーク強度より低い強度を持つ決定的でないマッチまたはマッチ無しに対応する１つ以上の質量ピークを選択する。
【００３３】
様々な実施形態で、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラムから溶出する生体試料の画分を、ＭＡＬＤＩ手順によるＭＳ装置中への導入用の基板上で、異なる試料としてまたは連続試料として、処理および析出する。該試料を飛行時間質量分析計（ＴＯＦ−ＭＳ）によって分析して、複数の生体分子のアイデンティティおよび相対的存在量を表す質量ピークの１つ以上のスペクトルを生成することができる。ＭＳプロセスによって生成される１つ以上のスペクトルにもとづいて、どの生成ピークが以降のＭＳ／ＭＳプロセスによる更なる分析の根拠となるかの決定をおこなうことができる。検索結果にもとづく分析の様々な実施形態では、質量スペクトルのピーク・リストをコンピュータに保存することができ、既知または理論上の質量スペクトルと試料質量スペクトルに含まれる情報を相関させることによって、１つ以上のピークに対応する生体分子を同定することができる。同定結果にもとづいて、１つ以上のピークに関連する生体分子を更なるＭＳ／ＭＳ分析および同定のために選択することができる。発現にもとづく分析の様々な実施形態および質量分析にもとづく分析の様々な実施形態では、ＭＳプロセスを利用して、更なるＭＳ／ＭＳ分析および同定のために選択されうる生体分子の相対的存在量を表す質量ピークの１つ以上のスペクトルを生成することができる。試料の複数の部分を基板上で析出する（例えば、異なる試料として、または増量された試料として）ので、試料の初期の部分を分析したのと同じ方法で、試料の別の部分をＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳプロセスによって再分析することができる。例えば、単一のスポットまたはＭＡＬＤＩ試料プレートは、複数の再分析のための十分な材料を含有することができる。初期分析で得られる知識にもとづいて、例えば、取得またはピーク検出のためのレーザー・ショットの数を調整すること、あるいは再処理または以降の分析のための設定を脱同位体化する（ｄｅｉｓｏｔｏｐｉｎｇ）こと等の調整を以降の分析中でおこなうことができる。したがって、初期分析から得られる結果にもとづいて、所定の試料の分析を繰り返すことができる。
【００３４】
本発明の方法を実行するための適当な器具としては、限定はされないが、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ器具およびＭＡＬＤＩ  ＭＳｎ器具が挙げられる。適当な器具は、ＭＳ関連データを管理および保存するためのリレーショナル・データベースまたはオブジェクト指向データベース含むことができる。適当な器具は、ＬＣ装置を含むことができ、該ＬＣ装置では、別々のスポットまたは別々のスポットのセットが従来からのクロマトグラフィー画分に対応するように、ＭＡＬＤＩプレート上に、ＬＣ装置から生じた液体画分を１次元または多次元マイクロキャピラリー液体クロマトグラフィー（μＬＣ）等の注入装置から直接析出して適当なマトリックスと混合することができる。様々な実施形態で、該従来からのクロマトグラフィー画分は、生体分子の異なる試料に対応する。
【００３５】
試料を装着した後、質量分析計中のイオン源室にＭＡＬＤＩプレートを置くことができ、パルス・レーザー光等で該試料の一部分を脱離して、ＭＳによって分析されうるイオン化気体試料を形成して、質量スペクトルを生じることができる。該ＭＡＬＤＩプレート上および他のＭＡＬＤＩプレート上の他の試料部分に対して、プロセスを繰り返して、更なる質量スペクトルを生じることができる。これらの質量スペクトルの１つ以上にもとづいて、その後、１つ以上のｍ／ｚ範囲をＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる更なる分析のために選択する。試料中の１つ以上の生体分子の同定に対する確実な結果を導き出すことができるまで、修正されたプロセス・パラメータを持つ試料の他の部分を用いて、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ走行、定量化、ならびに同定のプロセスを繰り返すことができる。
【００３６】
様々な実施形態で、試料調製は、試料の構成要素を標準の構成要素と比較することによってどのように該試料が標準と差異を生じるかの決定を提供するように、試料に対して、検出可能な標識（例えば、同位体標識等の）で差次的に標識される標準を用いる。標準は、内部標準（例えば、試料と混合されるか、または試料とともにマトリックス中で共析出される）、外部標準（例えば、試料として実質的に同条件下で調製されるか、あるいは試料部分とは別の１つ以上の部分で、ＭＡＬＤＩプレート上で析出される）、または両方の組合せでありうる。
【００３７】
様々な実施形態で、検査中の試料がどのように標準試料または対照試料と差異を生じるかの決定は、例えば、（１）試料が、例えば、病状を示すかどうか、（２）試料が薬剤、環境的変化等の刺激に対してどのように反応するか、（３）質量スペクトルの質量尺度の較正についての情報、（４）質量スペクトルの強度尺度の較正についての情報、および（５）１つ以上の質量スペクトルまたはフラグメンテーション・スペクトルにもとづいた生体分子同定に対する信頼度を評価するため、または信頼度閾値を設定するための情報の１種類以上に関する情報を提供することができる。
【００３８】
様々な態様で、本教示は、生体分子を含有する試料を分析するための方法を提供し、該方法は、様々な実施形態で、生体分子を含有する試料中の生体分子の同定を容易にする。図１を参照すると、生体分子を含有する試料を分析するための方法の様々な実施形態を説明する流れ図１００が示される。様々な実施形態で、該方法は、生体分子を含有する試料の複数の試料部分を提供することによって開始（１０２）する。様々な実施形態で、１つ以上の試料に対する１つ以上の試料部分の質量スペクトルを取得（１０４）し、様々な実施形態で、質量信号のリスト１０６を含むデータ・セットを生じる。
【００３９】
該データ・セットをデータベースに（例えば、質量分析器具のコンピューター・システム中に、またはコンピュータ可読媒体上で）保存することができる。該データベースを用いて、例えば、スペクトルを得た試料部分の位置情報および質量スペクトルを得る際用いられる実験パラメータ等のプロセス情報を保存することもできる。例えば、質量スペクトルは、通常、試料プレート上の同じ試料位置に向けられる多数のレーザー・ショットの平均である。様々な実施形態で、バーコード等によって、各試料プレートをコード化することができ、ｘおよびｙ座標によって、プレートの各試料をアドレス指定して、データベースに保存されたピーク・リストに相関されうるプレートの端から端までの試料に対する固有位置を定義することができる。例えば、位置情報を保存することは、固有のアドレス指定可能な位置によって、特定の試料の以降のＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析、あるいはＭＳ再分析を容易にする。
【００４０】
図１を再び参照すると、発現にもとづく分析１１０、質量分析データにもとづく分析１１２、および検索結果にもとづく分析１１４の１種類以上を用いて、１つ以上の質量スペクトルを分析（１０８）して、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる分析のための１つ以上の質量電荷比（ｍ／ｚ）範囲を選択（１１６）する。様々な実施形態で、１つ以上の質量スペクトルの分析１０８は、該１つ以上の質量スペクトルの分析１０８で生成されるデータにもとづいて、前駆イオンのｍ／ｚ範囲を選択するための選択基準の第１のセットを生成する。発現にもとづく分析１１０、質量分析データにもとづく分析１１２、および検索結果にもとづく分析１１４の２種類以上による質量スペクトルの分析１０８を、実質的に平行してか、連続してか、あるいはそれらの組合せでおこなうことができる。例えば、質量スペクトルの電子コピーおよび／または質量信号の対応するデータ・セットを分析のために実質的に平行して送信することができる。１つの分析の結果は、別の分析を開始または改良するための基礎でありうる。例えば、質量分析データにもとづく分析１１２の結果を用いて、検索結果にもとづく分析１１４を開始または改良（１１８）することができる（例えば、異なるパラメータを用いた再分析によって）。例えば、検索結果にもとづく分析１１４の結果を用いて、質量分析データにもとづく分析１１２および／または発現にもとづく分析１１０を開始または改良することができる（例えば、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析に対する考慮から特定のピークを除くことによって）。様々な実施形態で、１つ以上の質量スペクトルの分析１０８の結果は、付加的な質量スペクトルの取得１２０を開始するための基礎でありうる。例えば、付加的な質量スペクトル取得して、初期の質量スペクトルに付加して、信号対雑音（Ｓ／Ｎ）を向上することができる。
【００４１】
様々な実施形態で、初期の１つ以上の質量スペクトルは、単一のレーザー・パルスによって生成されるスペクトルでありえ、結果として生じる質量スペクトルに対する特定の質計量に達するまで、付加的な質量スペクトルを１つ以上の初期の質量スペクトルに付加することができる。例えば、所定の信号対雑音比を超えるピーク数または所定の全イオン計数を超えるスペクトルの画分等の基準にもとづいて、各質量スペクトルに対して、質計量を生じることができる。
【００４２】
図１を再び参照すると、様々な実施形態で、発現にもとづく分析１１０は、差次的標識試料の発現比を決定すること１２２を含み、試料バイアスを補正すること１２４を含むことができる。試料バイアスは、系統的誤差から生じえ、該系統的誤差としては、限定はされないが、不同量の出発材料または試料取り扱い上の間違いが挙げられる。中央発現比または平均発現比を用いて発現比を調整することによって、バイアスに対して、発現比を補正することができる。様々な実施形態で、発現にもとづく分析１１０は、１つ以上の質量スペクトルに対する定量情報（すなわち、差次的標識対１２６の相対的存在量）１２６のデータ・セットを生成する。
【００４３】
様々な実施形態で、発現にもとづく分析は、前駆体選択基準、すなわち、更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のための質量電荷比範囲を選択するための基準を生成し、該前駆体選択基準は、質量電荷比範囲に関連する質量信号（ＭＳ質量スペクトルの質量信号）によって満たされる以下の基準、すなわち、（１）質量信号がその差次的標識パートナーを基準にして、発現レベルで２倍より大きい変化を示すこと、（２）質量信号およびそのパートナーの発現レベル比が平均発現レベル比分布から２より多い標準偏差離れていること、（３）質量信号発現レベル（例えば、信号強度）が特定の信号対雑音（Ｓ／Ｎ）閾値より大きいこと、（４）質量信号がその差次的標識対の最も強度のピークであること、（５）質量信号が上方制御されること、および（６）質量信号が下方制御されることの１種類以上を必要とする。
【００４４】
様々な実施形態で、質量分析データにもとづく分析は、質量電荷比範囲に関連する質量信号（１つ以上のＭＳ質量スペクトルの質量信号）に対する以下の基準、すなわち、（１）絶対的質量信号強度、（２）相対的質量信号強度、（３）Ｓ／Ｎ閾値を基準にした質量信号強度、および（４）質量信号ピーク面積の１つ以上にもとづく前駆体選択基準を生成する。
【００４５】
様々な実施形態で、質量分析にもとづく分析は、質量除外リストを含み、例えば、対象ではない質量範囲、質量カットオフを下回るまたは上回る質量、既知の夾雑物に関連する質量、付加物、および検索結果にもとづく分析によって同定（特定の信頼区間内で）された質量信号を除外することができる。様々な実施形態で、質量分析にもとづく分析は、成功的に析出されたＭＡＬＤＩスポット中の特定の質量許容差ウィンドウ内のピーク質量から生じうる対応するピークのＬＣ溶出プロファイルによって測定された一連の質量スペクトルにわたるピーク・クラスタ面積の強度にもとづいて、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる更なる分析のための質量信号を選択する。
【００４６】
図１を再び参照すると、検索結果にもとづく分析１１４は、既知または予測の質量スペクトルと１つ以上の質量スペクトルの少なくとも一部分とを比較して、１つ以上の質量スペクトル中の１つ以上の質量信号に潜在的アイデンティティを割り当てること（１２８）を含む。一質量信号当たり１つより多い潜在的アイデンティティを割り当てることができる。例えば、ペプチド・マス・フィンガープリント法（ＰＭＦ）技術を用いて、１つ以上の質量スペクトル中の質量信号に潜在的アイデンティティを割り当てることができる。様々な実施形態で、アイデンティティ割り当てをランク付けするか、信頼水準に割り当てるか、また両方をおこなう。様々な実施形態で、検索結果にもとづく分析１１４は、質量信号のリストおよびそれらのアイデンティティ割り当て１３０を含むデータ・セットを生成する。質量信号のリストおよびそれらのアイデンティティ割り当て１３０を含むデータ・セットは、割り当てのランクおよび／または信頼水準に関する情報をさらに含む。
【００４７】
様々な実施形態で、検索結果にもとづく分析は、前駆体選択基準を生成し、該前駆体選択基準は、質量電荷比範囲に関連する質量信号（１つ以上のＭＳ質量スペクトルの質量信号）によって満たされる以下の基準、すなわち、（１）約９５％より大きい信頼水準で同定されること、（２）約９０％より大きい信頼水準で同定されること、（３）約９０％未満の信頼水準で同定されること、（４）約８０％未満の信頼水準で同定されること、（５）約８０％より大きく約９０％未満の信頼水準で同定されること、（６）２つ以上の生体分子で同定されること、（７）対象である１つ以上の生体分子で同定されること、および（８）生体分子で同定またはマッチされないことの１種類以上を必要とする。
【００４８】
図１を再び参照すると、発現にもとづく分析、質量分析データにもとづく分析、および検索結果にもとづく分析の１種類以上によって生成される１つ以上の基準を用いて、前駆イオン（ｍ／ｚ範囲）をＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる更なる分析のために選択することができる。例えば、検索結果にもとづく分析で９５％の信頼閾値を上回るＰＭＦ検索結果スコアを有し、かつ１０を超える信号対雑音および１０００を超えるクラスタ面積を有する質量信号のｍ／ｚ範囲を前駆イオンとして選択した。
【００４９】
図１を再び参照すると、選択された前駆イオンｍ／ｚ範囲の１つ以上にある試料部分のうちの少なくとも１つのフラグメンテーション・スペクトルを取得（１４０）する。ＭＳ／ＭＳ取得および処理をＭＡＬＤＩタンデムＴＯＦ上で実行することができる。ＭＳ／ＭＳおよび／またはＭＳｎを実行するための様々な他の適当な質量分析系についても後述する。
【００５０】
様々な実施形態で、フラグメント（娘）イオンの質量ピーク・リストを表すフラグメンテーション・スペクトルを親イオンのスペクトルと関連付け、データベース１４２に保存する。所定の信号対雑音比を超えるピーク数、所定の全イオン計数を超えるスペクトルの画分、所定の質量値にあるイミニウム・イオンの存在、あるいはリシンまたはアルギニンがペプチド・カルボキシ末端にあることを示すｙ１イオンの存在、あるいはＩＣＡＴ試薬由来質量の存在等の基準にもとづいて、各フラグメンテーション・スペクトルに対して質計量を生じることができる。
【００５１】
１つ以上のフラグメンテーション・スペクトルの少なくとも一部分を既知または予測の質量スペクトルと比較して、試料中の１つ以上の生体分子に潜在的アイデンティティを割り当てる（１４４）。様々な実施形態で、フラグメンテーション・スペクトル・ピーク・リストを１つ以上のフラグメンテーション・スペクトルから生成し、ＭＳ／ＭＳイオンおよび配列データベースと比較して、１つ以上の質量信号に潜在的生体分子アイデンティティを割り当てる。１つ以上の質量信号の割り当てられた生体分子同定のリストをで生成（１４６）することができ、該リストは、例えば、定量情報を含むことができる。
【００５２】
割り当てられた生体分子同定にもとづいて、様々な決定（１５０）をおこなうことができる。様々な実施形態で、割り当てられた生体分子同定を用いて、生体分子が試料に存在するかを決定（１５０）することができる。様々な実施形態で、同定での十分な信頼が得られる（１５２）場合、生体分子を含有する試料の分析を完了することができる。例えば、データベース検索１４４またはＭＡＬＤＩ再分析を修正されたパラメータを用いて開始することができ、これは、直ちに、または後で実行されうる。例えば、アミノ酸組成、質量タグ、または配列タグを考慮し、配列決定アルゴリズムを用いて、結果を確認（１５４）することができる。依然として確信をもって同定されないか、または同定されていないスペクトルを、例えば新規配列決定アルゴリズム１５４に送信した後、ＭＳ−ＢＬＡＳＴ検索をし、類似のタンパク質配列を同定することができる。
【００５３】
様々な実施形態で、反復ＭＳ取得１５５、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ取得１５６、および／あるいはＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ同定も可能である。第１のパスで高信頼度で同定されたタンパク質を選択した後、検索パラメータの新規セットを用いて、すでに同定されたタンパク質のサブセットに対する検索１４４をおこなうことによって、反復データベース検索を実行することができる。様々な実施形態で、検索パラメータ反復をおこない、データ・セット中のより多くのピークを説明することを容易にし、かつ／または結果に対する信頼度を得る。例えば、見逃した、または非特異的な酵素切断、あるいは予想外の化学的および翻訳後修飾が原因で、複数のスペクトルが第１のパスで同定されない。タンパク質（同定済み）の相対的小セットに対して、第２のパス・データベース検索を実行することができるが、より多くの化学的および翻訳後修飾またはアミノ酸置換でさえを考慮して実行する。データベース配列と観察された配列との相違は、ＤＮＡシーケンシング誤り、突然変異または多型、選択的スプライシング形態、あるいはより広範な進化的変化が原因であり、データベース・エントリーは、真性のタンパク質ではないが異なる種由来の関連する配列でありうる。
【００５４】
様々な実施形態で、割り当てられた生体分子同定と定量情報を比較して、検索結果に矛盾があるかを評価することができる。定量情報と潜在的生体分子を割り当てる検索結果との間に矛盾があるとき、定量情報を補正（１６０）することができる。
【００５５】
様々な実施形態で、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ取得および分析の第１のラウンドで高信頼度で同定された生体分子（例えば、ペプチド）の理論上の質量を用いて、ＭＳデータを再較正（１６０）することができる。様々な実施形態で、μＬＣペプチド溶出プロファイルに沿った成功的に析出されたスポット中の特定の許容差ウィンドウ内で、ピーク質量を同定することによって、ＭＡＬＤＩプレート・ウェルの端から端までの再較正に対する基準質量の数を各理論上の質量に対して増加させることができる。再較正された前駆体に対してより厳格な検索許容差を設定することによって、かつ再較正されていないものに対して元の検索許容差を保つことによって、フラグメント・スペクトル検索１４４を繰り返して、付加的な、またはより高い信頼度ヒットを得るが、より少ない偽陽性同定を得ることも容易にすることができる。データベース検索スペースを増加させて、タンパク質にコンピューター（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で由来するペプチドのばらつきを含むことによって、再較正されたＭＳ質量をさらに検査して、さまざまな実施形態で、その後、以降のＭＳ／ＭＳまたなＭＳｎ分析によって、推定的に同定されたペプチドおよび修飾を検証することができる。
【００５６】
様々な実施形態で、例えば、ＩＣＡＴＴＭ試薬法等の同位体コード・アフィニティー試薬での生体分子の標識を用いて、質量スペクトルの発現にもとづく分析のための発現依存的データを提供することができる。様々な実施形態で、同位体標識タンパク質反応試薬（例えば、同位体コード・アフィニティー・タグ等の）を用いて発現にもとづく分析のための発現依存的データを提供することによって、ＭＡＬＤＩ質量分析法（例えば、ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ）を用いて、発現試料中の１つ以上のタンパク質の同定および定量化のための質量スペクトルを提供することができる。様々な実施形態で、発現にもとづく分析は、プロテオームの定量分析を容易にする。
【００５７】
様々な実施形態で、試料調製は、公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ００／１１２０８４（その全内容を本明細書に援用する）に記載されるように、複合混合物から、ペプチド・フラグメントまたは所定のタンパク質との反応産物（例えば、酵素反応産物）の選択的単離を可能にする差次的同位体標識タンパク質反応試薬を利用する。様々な実施形態で、単離されたペプチド・フラグメントまたは反応産物は、それらの混合物中で、それぞれ、タンパク質の存在またはタンパク質機能、例えば、酵素活性の存在の特徴でありうる。質量分析技術によって、単離されたペプチド、反応産物、または両方を特徴付けて、細胞および組織で、タンパク質発現プロファイルの定量分析を可能にする。タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）技術または多次元的（ＭＳｎ）技術を用いて、単離されたペプチドの配列を決定することができる。例えば、種々の前駆イオンに対するフラグメンテーション・スペクトルを含むデータベース（例えば、ＭＳ／ＭＳイオンおよび配列データベース）を検索することによって、シーケンシングされたペプチドが由来するタンパク質を同定する。様々な実施形態で、差次的同位体標識タンパク質反応試薬は、単離されたペプチドまたは反応産物の差次的同位体標識を可能にし、該差次的同位体標識は、質量分析法による異なる試料中のタンパク質の相対量の定量的測定を容易にする。様々な実施形態で、差次的同位体標識試薬は、試料中に存在する１つ以上のタンパク質または反応産物の絶対量の定量的測定を容易にする内部標準として機能することができる。
【００５８】
様々な実施形態で、同位体コード・アフィニティー標識タンパク質反応試薬は、３つの部分、すなわち、同位体標識リンカーを含む切断可能なリンカー基（Ｌ）を介してタンパク質反応基（ＰＲＧ）に共有結合的に連結されるアフィニティー標識（Ａ）を有する。該リンカーをタンパク質反応基（ＰＲＧ）に直接結合することができる。アフィニティー標識タンパク質反応試薬は、式
Ａ−Ｌ−ＰＲＧ
を有することができる。例えば、リンカー中の１つ以上の原子をその安定同位体で置換することによって、該リンカーを差次的に同位体標識することができる。例えば、水素を重水素（２Ｈ）で置換することができ、かつ／または１２Ｃを１３Ｃで置換することができる。１３Ｃの利用は、逆相クロマトグラフィー中の重同位体および軽同位体の共溶出を促進する。
【００５９】
アフィニティー標識（Ａ）は、多次元液体クロマトグラフィー（ＭＤＬＣ）等によって、試料中の反応タンパク質を未反応タンパク質から分離するための手段として機能する。様々な実施形態で、アフィニティー標識はビオチンを含む。タンパク質と試薬のＰＲＧ部分との反応後、ＭＤＬＣを用いて、ＰＲＧ部に結合された反応タンパク質から、試料の未標識成分を分離することができる。その後、切断可能なリンカー（Ｌ）の切断を、例えば、化学的、酵素的、熱的、または光化学的等におこなって、ＭＳ分析のための単離された材料を放出することができる。様々な実施形態で、リンカーは酸により切断可能でありうる。ＭＳ分析の前に、結合タンパク質を消化して、ＭＳによって分析されうる結合ペプチドを含むペプチドを形成することができる。タンパク質消化工程は、切断可能なリンカーの切断の前または後におこなうことができる。
【００６０】
様々な実施形態で、酸性の切断可能なリンカーの挿入は、より小さく、かつより安定な標識を生じることができる。より小さく、かつより安定なリンカーは、より確実なタンパク質同定およびより広範なプロテオーム適用範囲を生じる強化ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションをもたらすことができる。
【００６１】
様々な実施形態で、ビオチン標識システイン含有ペプチドは選択的に単離されるので、ビオチン・アフィニティー標識を用いることは、ペプチド混合物の複雑性を有意に減少させることができる。例えば、ＮＣＢＩｎｒデータベース（ｖ０２．１３．２００３）は、９８２１個のＳ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））配列を含むが、トリプシンペプチド含有する３０，０９５個の固有のシステインだけを含む。この数は、全Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母プロテオーム（６，１１３個のタンパク質）の理論上のトリプシン分解物によって産生される、システイン残基を含有する予測の３０，６１９個のペプチド（３４４，８５５個のペプチドから）と整合している。
【００６２】
ＰＲＧ基の例としては、限定はされないが、（ａ）タンパク質官能基と選択的に反応して特定の部位でタンパク質をタグする共有または非共有結合を形成する基と、（ｂ）タンパク質の作用によって変換されるもの、例えば、酵素に対する基質であるものとが挙げられる。様々な実施形態で、ＰＲＧは、特定のタンパク質基に対する特異的な反応性（例えば、スルフヒドリル基に対する特異性）を有する基でありうる。そのようなＰＲＧは、例えば、一般的に、複合混合物中のタンパク質を選択的にタグするために有用でありうる。例えば、スルフヒドリル特異的試薬は、システインを含有するタンパク質をタグする。同位体コード・アフィニティー標識タンパク質反応試薬の付加的な実施形態については、前述のＰＣＴ特許出願に記載されており、更なる詳細を望む場合、該ＰＣＴ特許出願を参照することができる。
【００６３】
様々な実施形態で、ペプチド中で通常見出される特定の基（例えば、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシ、ホモセリン、ラクトン基）と選択的に反応するＰＲＧ基を、タンパク質を含有する混合物に導入することができる。様々な実施形態で、ＰＲＧとの反応後に、複合混合物中のタンパク質を、例えば、酵素的に、多数のペプチドへ切断する。様々な実施形態で、結果として生じるペプチドをＭＤＬＣによって単離し、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＡＬＤＩ）等によって分析する。様々な実施形態で、その後、１つ以上のタグされたペプチドの配列をＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ技術によって測定して、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎデータのデータベースを検索することによって、混合物に存在する１つ以上のタンパク質を同定することができる。いくつかの実施形態で、例えば、タンパク質が相対的に小さい場合、消化工程（例えば、酵素切断）は必要ではないかもしれない。
【００６４】
様々な実施形態で、タンパク質混合物を含有する１つ以上の異なる試料（例えば、生体液、細胞または組織溶解物等）中の定量的相対量のタンパク質を、同位体標識リンカー基を持つタンパク質反応基と切断可能に連結されるアフィニティー標識を含む化学的に同一かつ差次的同位体標識試薬で標識する。異なる試料から生じる標識ペプチドを差次的に同位体標識する。異なる試料とは、例えば、対照試料対異なる時間点由来の実験試料（例えば、組織学的配列を形成するための）、疾患試料対正常試料、実験試料対疾患試料等でありうる。様々な実施形態で、その後、処理試料を組合せ、組み合わせた試料中のタンパク質を、必要に応じて、酵素的に消化して、ペプチドを生成する。様々な実施形態で、異なる試料を実質的に等しい量で組み合わせる。様々な実施形態で、アフィニティー・クロマトグラフィーを用いるＭＤＬＣによって、標識ペプチドを単離し、リンカーから切断して、ＬＣ／ＭＡＬＤＩ  ＭＳによって分析する。ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ技術を用いて、ペプチドのタンパク質起源に特有のペプチドをシーケンシングして、試料中に含有されるタンパク質のペプチドを同定することができる。様々な実施形態で、発現にもとづく分析は、各試料中の所定のタンパク質の相対量を、そのタンパク質に由来する差次的標識ペプチドから生じるイオンの相対存在量を比較することによって測定する。様々な実施形態で、発現にもとづく分析は、タンパク質発現レベルを示すことができる異なる試料中の既知のタンパク質の相対量を評価する。
【００６５】
様々な実施形態で、ペプチドのサブクラス（例えば、リン酸化）および／または多重化に焦点を当てる同位体コード・アフィニティー標識タンパク質反応試薬を用いることができるので、１回の実験走行内で、例えば、複数の突然変異菌株を野生型と比較することができるか、あるいは時間経過シナリオで、複数の投与量レベルを基線に対して評価することができるか、あるいは癌組織の異なる単離物を正常組織に対して評価することができる。
【００６６】
様々な実施形態で、同位体コード・アフィニティー標識タンパク質反応試薬を用いる発現にもとづく分析を用いて、例えば、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる更なる分析のためにＰＴＭ、定存在量のタンパク質、または両方を選択することを容易にする前駆体選択基準を決定することによって、例えば、翻訳後修飾（ＰＴＭ）を明らかにすることと、付加的な（相対的に）低存在量のタンパク質を同定することとができる。様々な実施形態で、発現にもとづく分析を用いる前駆体選択基準の決定は、分析器具リソースおよび時間を対象のタンパク質を研究することに集中させる。様々な実施形態で、そのような選択アプローチ対ショットガン・アプローチ（例えば、全ての質量ピーク上でＭＳ／ＭＳを実行する）は、試料スループットを増加させることができる。
【００６７】
様々な実施形態で、発現依存的分析を適用して、細胞、組織、または生体液中で差次的発現を示すタンパク質をスクリーニングおよび同定することができる。様々な実施形態で、発現依存的分析は、差次的発現データにもとづいて、前駆体選択基準を決定する。様々な実施形態で、ＭＳ分析によって取得された質量スペクトル中の対応する質量ピークのセットに対する強度の相違は、試料中の大部分のタンパク質の予測の一定生物学的発現プロファイルからの相違を明らかにすることができる。
【００６８】
例えば、図２Ａは、名目上等しい量のノックアウトおよび野生型試料材料を比較する場合の、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ減衰（ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ  （ＮＭＤ））２ノックアウト菌株を基準にした、野生型のサッカロマイス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のタンパク質差次的発現レベルの分布２００を表にする。図２Ａは、様々な相対的発現レベル比２０６（野生型：ＮＭＤ２）を有するタンパク質の数２０４を表にする。野生型および突然変異試料由来の発現レベルは厳密に等しくはないことと、分布の平均２０８は、１．２付近であり、標準偏差が０．２９３であることとに注記する。バイアスは、例えば、不同量の出発材料または試料取り扱い上の誤りが原因でありうる。様々な実施形態で、中央発現比または平均発現比を用いて発現比を調整することによって、発現比をバイアスに対して補正することができる。
【００６９】
様々な実施形態で、発現依存的データにもとづいて、基準（前駆体選択基準）のセットを用いて選択されたピーク上で、ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、またはＭＳｎを用いる更なる分析を実行することができる。様々な実施形態で、発現にもとづく分析で選択されるピークは、２倍閾値（例えば、０．５を下回るか、または２．０を上回る発現レベル比）を上回る発現変化を立証するピーク、発現比が平均値からの一定の標準偏差（σ）であることを立証するピーク、またはこれら両方のピークのみである。例えば、図２Ｂは、図２Ａの分布２１０の中心付近の様々な標準偏差帯域内にあるタンパク質の数を表にする。図２ａは、１の標準偏差２１４内、１ないし２の標準偏差（σ）２１６、２ないし３のσ２１８、３ないし４のσ２２０、４ないし５のσ２２２、および５ないし６のσ２２４にあるタンパク質２１２の数を表にする。図２Ａおよび２Ｂでは、４の標準偏差は、発現レベルの２倍変化にほぼ対応する。
【００７０】
様々な実施形態で、以下の基準、すなわち、（１）質量信号が、その同位体パートナーを基準にして、発現レベルで２倍より大きい変化を示すこと、（２）質量信号およびその同位体パートナーの発現レベル比が平均発現レベル比分布から２より多い標準偏差離れていること、（３）質量信号発現レベル（例えば、信号強度）が特定の信号対雑音（Ｓ／Ｎ）閾値より大きいこと、（４）質量信号がその同位体対の最も強度のピークであること、（５）質量信号が上方制御されること、および（６）質量信号が下方制御されることの１種類以上が質量電荷比範囲に関連する質量信号（１つ以上のＭＳ質量スペクトルの質量信号）によって満たされる場合、発現にもとづく分析は、更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のために質量電荷比範囲を選択する。
【００７１】
図３を参照すると、発現依存的分析の発現依存的データを用いるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる更なる検査のためのピークの選択に対する様々な実施形態を説明することができる。図３は、一連の仮説的軽／重同位体対（ａ〜ｇ）を示す。例示されるように、質量対ｂ３０１および質量対ｆ３０３は、平均比から２より多い標準偏差離れる同位体比を有し、質量対ｂ３０１は、発現レベルの２倍より大きい変化を示す唯一の対である。直前の段落中の（１）の前駆体選択基準を用いる様々な実施形態では、対ｂ３０１の質量信号に関連する質量電荷比範囲のみを更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のために選択する。直前の段落中の（２）の前駆体選択基準を用いる様々な実施形態では、対ｂ３０１および対ｆ３０３の質量信号に関連する質量電荷比範囲のみを更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のために選択する。直前の段落中の（３）の前駆体選択基準を用いる様々な実施形態では、Ｓ／Ｎ閾値３０４より上の質量信号に関連する質量電荷比範囲のみを更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のために選択する（ここでは、質量対ａおよびｃないしｇと、対ｂの軽同位体質量３０５と）。直前の段落中の（１）および（４）３０１の前駆体選択基準を用いる様々な実施形態では、質量対ｂ３０１の最も強度の質量信号（軽同位体）３０５に関連する質量電荷比範囲のみを更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のために選択する。直前の段落中の（２）および（４）の前駆体選択基準を用いる様々な実施形態では、質量対ｂ３０１の最も強度の質量信号（軽同位体）３０５および質量対ｆ３０３の最も強度の信号（重同位体）３０７に関連する質量電荷比範囲のみを更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のために選択する。直前の段落中の（１）、（２）、および（４）の前駆体選択基準を用いる様々な実施形態では、質量対ｂ３０１の最も強度の質量信号（軽同位体）３０５に関連する質量電荷比範囲のみを更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のために選択する。
【００７２】
図４を参照すると、様々な実施形態で、発現データ依存的ワークフローのための方法が流れ図４００中で示され、該流れ図４００では、左欄４０２は、一連の工程を説明し、右欄４０４は、工程を達成するためのツールの比限定的な例を説明する。図４中の発現データ依存的ワークフローは、データ処理工程の様々な実施形態を提示するものであり、例えば、上流試料調製、試料標識、試料プーリング、試料消化（例えば、トリプシンを用いて）、強カチオン交換（ＳＣＸ）による分画、またはアフィニティー単離および切断を説明するものではない。図４については、タンパク質を含有する試料の前後関係で論じられる。種々のソフトウェア・ツールについて、図４の前後関係で論じられる。Ｐｅａｋ  ＰｉｃｋｅｒＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｐｅａｋ  ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＴＭ、ＰａｒｓｅｒＴＭ、およびＱｕａｎｔＦｉｘｅｒＴＭは、Ｍａｓｃｏｔ配列検索プログラムによって同定されるペプチドおよびタンパク質を定量およびオーガナイズし、リレーショナル・データベースにＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、定量化、および同定に関連する情報をリンクおよび保存するために用いられうるソフトウェア・ツールである。
【００７３】
図４を参照すると、様々な実施形態で、発現データ依存的ワークフローは、ＩＣＡＴ試薬法を用いる試料調製を含む。アフィニティー単離および切断後に保持されるペプチド混合物をμＬＣによってさらに分離（４０６）して、画分収集器４０７によってＭＡＬＤＩプレート上に収集する。その後、ＭＳ分析４０８をＭＡＬＤＩタンデムＴＯＦ４０９上で実行し、ＭＳモードで操作して、１つ以上の質量スペクトルを取得する。定量化のための再現性相対ピーク存在量を生成するために、レーザー・ショット数および検索パターン位置を最適化することができる。更なるＭＳ／ＭＳ分析のための前駆体を選択するためのＭＳデータの定量化および発現にもとづく分析４１０をＰｅａｋ  Ｐｉｃｋｅｒソフトウェア・ツール４１１を用いて実行することができる。
【００７４】
【表１】
2005536728.tif 000003
ｉ：＝２ないしＮ、Ｎ＝閾値（例えば、＞９５％、ｐ＜０．０５）より大きいＭＳ／ＭＳイオン検索信頼度に関連するペプチドの数
ｊ：＝２ないしＭ、Ｍ＝ペプチド溶出プロファイルに沿った対の数、ここでＩ軽（ｊ）＋Ｉ重（ｊ）＞０
ＸＰｅｐｔｉｄｅ（ｊ）＝（Ｉ重（ｊ）／Ｉ軽（ｊ））／η
νｊ＝Ｉ軽（ｊ）＊Ｉ重（ｊ）／（Ｉ軽（ｊ）＋Ｉ重（ｊ））、または定数＝１に設定することができる。
ωＩ＝最大（所定の信頼度閾値より大きい軽／重ペプチド対のＭＳ／ＭＳイオン検索スコア）
Ｉ軽（ｊ）＝軽ペプチド対ｊの統合同位体クラスタ面積
Ｉ重（ｊ）＝重ペプチド対ｊの統合同位体クラスタ面積
η＝標準化因子（例えば、全てのＩ重（ｊ）／Ｉ軽（ｊ）推定ペプチド比の中央値）
標準化比ＸＰｅｐｔｉｄｅ（ｊ）への質量の寄与を、該質量が他のペプチドの特定の質量ウィンドウ内にある場合、計算から除外することができる。これによって、最終的な平均結果から、オーバーラップするペプチド・ピーク由来の潜在的干渉を除くことができる。
【００７５】
様々な実施形態で、Ｐｅａｋ  Ｐｉｃｋｅｒソフトウェア・ツールを次のように用いることができる。隣接するスポットからＨＬ比の強度加重平均を得ることによって、ＩＣＡＴ試薬発現値を計算することができ、この際、例えば、Ｉ重が重同位体質量の強度を表し、かつＩ軽がＨＬ対の軽同位体質量の強度である表１の方程式２および２．１を用いてＨＬ対が識別できる。様々な実施形態で、プログラムは、ＨＬ対の全ての組合せに対してピーク・リストを、すなわち、１つのシステイン（ｃｙｓ）を含有するペプチドに対して９ａｍｕＨＬＨＬ対を、２つのｃｙｓを含有するペプチドに対して１８個ａｍｕ対をというように検索する。不同量の出発材料または試料取り扱い上の誤りが原因となりうる、研究での発現レベルに影響する系統的バイアスを中央発現比ηを用いた標準化によって補正することができる。例えば、表１の方程式２．１を用いて比の対数を得ることによって、標準化された対の対称的に中央に置かれた発現分布を生成することができる。発現にもとづく分析の様々な実施形態では、発現閾値（例えば、２倍以上の変化、平均値または中央値からの２より大きいσの発現比）をパスする質量信号のみを前駆体とみなす。さらに、基準をフィルタリングする１つ以上の信号対雑音比、最小限のピーク面積、質量範囲、除外、および付加物を満たす非差次的発現対または／および単集合ピークを更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のために包含することができる。例えば、ＩＣＡＴ試薬ＨＬ対の最も強度のもののみ、すなわち、常に、軽いものか、重いものかを更なるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析のための前駆体として選択することができる。
【００７６】
様々な実施形態で、Ｐｅａｋ  Ｐｉｃｋｅｒソフトウェア・ツールは、フラグメンテーションのために送信すべき前駆体質量のリストを生成し、ＭＡＬＤＩプレート・ウェル・スポットを決定し、そこから、各前駆体質量に対するフラグメンテーション・スペクトルを得る（例えば、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ分析によって）。様々な実施形態で、各質量に対してこれを達成するために、該Ｐｅａｋ  Ｐｉｃｋｅｒソフトウェア・ツールは、初めに、成功的に析出されたＭＡＬＤＩスポット中の特定の許容差ウィンドウ内でピーク質量を探索することによって、μＬＣ溶出プロファイルを動的に生成する。例えば、ペプチドに対する測定された溶出プロファイルが１分であり、画分収集器が２０秒毎にスポットする場合、考えられる保持時間窓中の質量スペクトルの数は３である。問題の質量を欠如させられている連続スポットの最小数を特定するギャップを定義することもできる。その後、例えば、各溶出プロフィル内の最大クラスタ強度によって、前駆体を選択し、優先することができる。一スポット当たりの前駆体の数が、例えば、４に制限される場合、該方法は、アルゴリズムを用いて、次に最も強度のピークを帰納的に決定することができ、所定の制約下、最大の強度でプレートの端から端まで全ての前駆体が均一に分布されるまで、予め選択された前駆体全てを同時に考慮する。様々な実施形態で、ＭＳ／ＭＳ分析のための別々の最適化取得および処理方法を分析の目標に応じて、例えば、目標が全てのペプチド、非差次的発現ペプチドのみ、または単集合を同定することであるかに応じて、生成することができる。
【００７７】
図４を再び参照すると、タンデムＭＳモード４１３でＭＡＬＤＩタンデムＴＯＦを用いるＭＳ／ＭＳ分析によって、選択された前駆体質量電荷比範囲の１つ以上のフラグメンテーション・スペクトルを取得（４１２）する。定量情報（すなわち、ＨＬ標識ペプチド対の相対存在量）を、ＭＡＬＤＩタンデムＴＯＦに送信されるＭＳ／ＭＳジョブに協調してパスさせ、ここで、ＭＳ／ＭＳデータを取得および処理することができる。差次的および非差次的発現成分のために、かつアフィニティー選択工程によって非特異的に保持されるペプチドを表すことができる単集合のために、取得パラメータの特定の組合せを用いることができる。様々な実施形態で、ＭＳ／ＭＳピーク・リストを抽出して、ＩＣＡＴ試薬特異的質量を取り出し、フィルタリングしたピーク・リストをＭａｓｃｏｔ汎用ファイルに置き、タンパク質をＭＳ／ＭＳイオンおよび配列データベースと比較して、潜在的タンパク質およびペプチド・アイデンティティ４１４を、それぞれ、Ｐｅａｋ  ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎプログラムおよびＭａｓｃｏｔ検索エンジン４１５を用いて割り当てる。この時点で、定量情報をコメント・ラインに保存することができる。
【００７８】
様々な実施形態で、例えば、Ｐａｒｓｅｒソフトウェア・ツール４１７を用いてＯｒａｃｌｅデータベース中にＭａｓｃｏｔ結果をパースすること等によって、生体分子を含有する試料の分析から得られる情報の少なくとも一部分を、リレーショナル・データベース中の情報に関連させる（４１６）。様々な実施形態で、Ｐａｒｓｅｒソフトウェア・ツールは、Ｍａｓｃｏｔ検索結果ファイルのコメント・ラインから、定質（ペプチドおよびタンパク質アイデンティティ）および定量結果を抽出し、それらをリレーショナル・データベースに置く。
【００７９】
様々な実施形態で、定量情報（すなわち、ＨＬ標識ペプチド対の相対存在量）を潜在的タンパク質およびペプチド・アイデンティティと比較（４１８）して、例えば、ＱｕａｎｔＦｉｘｅｒソフトウェア・ツール４１９を用いて、検索結果に矛盾があるかを評価することができる。様々な実施形態で、定量情報とタンパク質およびペプチド・アイデンティティ４１４を割り当てる検索結果との間に不一致があるとき、ＱｕａｎｔＦｉｘｅｒソフトウェア・ツール４１９を用いて、定量情報を補正することができる。
【００８０】
様々な実施形態で、例えば、Ｐｅａｋ  Ｐｉｃｋｅｒソフトウェア・ツール用いて、定量化をＭＳレベルで実行することができる。例えば、同位体パートナー・ピークに対する１つより多い選択は、複合スペクトルで可能である。例えば、低強度、付加イオン、および／または複数のオーバーラップするペプチド信号が原因で、ＨＬ対を構成する質量が不正確に同定されたという可能性がありうる。様々な実施形態で、ＭＳ分析段階で収集される定量情報は、天然では推定的でありうる。様々な実施形態で、ＱｕａｎｔＦｉｘｅｒソフトウェア・ツールを用いて、各ペプチド上の仮のＩＣＡＴ修飾の数と、ＭＳ／ＭＳ分析のために選択されたピークが重または軽であると考えられるかとを記録する。ペプチドを潜在的アイデンティティに割り当てた後、例えば、ＱｕａｎｔＦｉｘｅｒソフトウェア・ツールを用いて、両方の結論を再評価する。様々な実施形態で、推定ＨＬ対割り当てがペプチド同定によって提供される情報と一致しないとき、ＱｕａｎｔＦｉｘｅｒソフトウェア・ツールを用いて、正確なピーク面積情報を抽出し、発現レベル比を補正する。補正された発現レベル比にデータベースでコメントをつけることができ、例えば、同定されないままである考えられる第２のオーバーラップするＩＣＡＴ対による真の比に関する不確定性を示す。
【００８１】
様々な実施形態で、ＱｕａｎｔＦｉｘｅｒソフトウェア・ツールを使用して、例えば、タンパク質およびペプチド・レベルでの平均比、標準偏差、および信頼区間の計算および標準化のために用いられうる表１の方程式を用いて各関連ペプチドの検索結果スコア加重平均を得ることによって、各タンパク質に対して発現値を計算する。
【００８２】
様々な実施形態で、既知または予測の質量スペクトルとの、ＭＳ分析によって生成された１つ以上の質量スペクトルの１つ以上の少なくとも一部分の比較を用いて、質量スペクトルの検索結果にもとづく分析のための検索結果依存的データを提供することができる。例えば、ペプチド・マス・フィンガープリント法（ＰＭＦ）技術を用いて、試料中の生体分子の推定上の同定を提供することができる。
【００８３】
図５を参照すると、検索結果データ依存的ワークフローを用いて生体分子を含有する試料を分析するための方法の様々な実施形態の流れ図５００が示されている。図４の前後関係で論じられる種々のソフトウェア・ツールの様々な実施形態を用いることもできる。Ｐｅａｋ  Ｐｉｃｋｅｒ、Ｐｅａｋ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ、Ｐａｒｓｅｒ、およびＱｕａｎｔＦｉｘｅｒは、Ｍａｓｃｏｔ配列検索プログラムによって同定されるペプチドおよびタンパク質を定量およびオーガナイズし、リレーショナル・データベースまたはオブジェクト指向データベースにＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、定量化、および同定に関連する情報をリンクおよび保存するために用いられうるソフトウェア・ツールである。
【００８４】
ＭＳによる分析のための試料部分を任意の数の方法で提供することができる。様々な実施形態で、当該技術分野で公知の任意の方法（例えば、ＬＣにもとづくワークフロー、２Ｄゲルにもとづくワークフロー）で、別々の試料を、例えば、９６穴プレート等のマルチウェル・プレート中に析出（５０２）する。様々な実施形態で、Ｓｙｍｂｉｏｔ（商標）ロボット・ワークステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）等のロボット試料移動装置を利用して、質量分析系内に配置されうるＭＡＬＤＩプレートに試料を移動（５０４）およびスポット（５０６）することができる。様々な実施形態で、Ｐｒｏｂｏｔ（商標）等の画分収集器をＨＰＬＣ系に接続して、ＭＡＬＤＩプレート上（５０６）へＨＰＬＣ画分を直接スポット（５０７）することができる。
【００８５】
その後、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて、１つ以上の質量スペクトルを１つ以上の試料の１つ以上の試料部分から取得（５０８）する。１つ以上の生成質量スペクトル（ペプチド質量ピークのスペクトルを表すことができる）を既知または理論上の質量スペクトルと比較（５１０）して、試料部分中の１つ以上の生体分子に対する推定上の同定を提供する。
【００８６】
様々な実施形態で、例えば、ペプチド・マス・フィンガープリント法（ＰＭＦ）技術等の技術を用いるデータベース検索によって、比較をおこなうことができる。複数の検索可能なデータベースが当該技術分野で公知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒＴＭ（Ｕ．  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、Ｍａｓｃｏｔ（登録商標）（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ．）がある。様々な適当なＰＭＦ技術について、本出願に共通に指定される同時系属米国特許出願番号第０９／７４５９２０号（その開示を本明細書に援用する）に記載されている。
【００８７】
図５を再び参照すると、比較５１０にもとづいて、推定上の同定を持つ質量信号の予備リストを生成（５１２）する。検索結果にもとづいて、１つ以上の質量ピーク（前駆体）に対応する質量電荷比範囲をＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる更なる分析のために選択（５１４）する。様々な実施形態で、以下の基準、すなわち、（１）高信頼水準で同定されること、（２）低信頼水準で同定されること、（３）類似の信頼水準を持つ２つ以上の生体分子で同定されること、（４）対象の１つ以上の生体分子で同定されること、および（５）生体分子で同定またはマッチされないことの１種類以上を満たす質量信号に対応するｍ／ｚ範囲を選択する。
【００８８】
図５を再び参照すると、選択された前駆体ｍ／ｚ範囲の１つ以上のフラグメンテーション・スペクトルを取得（５１６）する。様々な実施形態で、ＭＳ／ＭＳピーク・リストを１つ以上のフラグメンテーション・スペクトルから生成し、ＭＳ／ＭＳイオンおよび配列データベースと比較（５１８）して、１つ以上の質量信号に生体分子アイデンティティを割り当てる（５２０）。この情報を利用して、試料中の対象の生体分子を同定または特徴付けする上で対象となるタンパク質またはペプチドの改良されたリストを生成することができる。様々な実施形態で、１つ以上の質量信号に対する生体分子同定の割り当てが提供されないか、不確定であるか、またはより高い信頼水準を所望されるかもしれない。例えば、不確定であるか、提供されないか、またはより高い信頼水準が所望される同定は、質量信号自体の同定または源生体分子の同定でありうる。例えば、質量信号がペプチドである場合、不確定であるか、提供されないか、またはより高い信頼水準が所望される同定は、ペプチドの親タンパク質のペプチド自体の同定でありうる。
【００８９】
様々な実施形態で、１つ以上の質量信号の同定が不確定である（例えば、１つより多い生体分子とマッチする）か、提供されないか、またはより高い信頼水準が所望される場合（決定５２２に対して「否定（ＮＯ）」）、１つ以上のフラグメンテーション・スペクトル由来の１つ以上の質量信号を配列決定物５２４、５２６（例えば、類似のペプチドおよび／またはタンパク質配列を同定するための新規の配列決定アルゴリズム後のＭＳ−ＢＬＡＳＴ検索）に送信することができる。この配列決定物アプローチ５２６は、適当な基準タンパク質配列データベースが利用可能でない不完全に特徴付けられたゲノムの研究で重要であるだろう。様々な実施形態で、１つ以上の質量信号の同定が不確定であるか、提供されないか、またはより高い信頼水準が所望される場合（決定５２２に対して「否定（ＮＯ）」）、１つ以上の前駆体ｍ／ｚ範囲をＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎによる分析のために選択（５２８）する。付加的な検索および／またはＭＳ／ＭＳ分析のプロセスを繰り返すことができる。様々な実施形態で、質量信号が十分に確定的である場合（決定５２２に対して「肯定（ＹＥＳ）」、同定された質量信号を最終リストに保存（５３２）することができる。
【００９０】
様々な実施形態で、発現にもとづく分析、質量分析にもとづく分析、および検索結果にもとづく分析の１種類以上を用いる生体分子を含有する試料の分析から得られる情報を用いて、リレーショナル・データベースまたはオブジェクト指向データベースにこの情報の少なくとも一部分を関連させることによって、試料中の１つ以上の生体分子または生体分子の組合せを特徴付けることができる。例えば、リレーショナル・データベースまたはオブジェクト指向データベース中の情報との関連にもとづいて、１つ以上の生体分子または生体分子の組合せを、例えば、危険因子、診断、および／または予後をスクリーニングするための、例えば、薬剤標的、毒性応答、および／または生物マーカーとして特徴づけることができる。
【００９１】
図６を参照すると、様々な実施形態で、基礎をなすＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、タンパク質、およびｍＲＮＡに関連する実験結果をリレーショナル・データベース６００中に置くことができる。ペプチド結果６０２をタンパク質結果６０４と関連付けることができる。タンパク質結果６０４を、基準リスト６０６を介して、対応する遺伝子およびオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）に関連付けることができ、コドン・バイアス６０８、遺伝子オントロジー情報６１０（生物学的過程、分子機能、および細胞下位置等の）（ＭＩＰＳ：ｈｔｔｐ：／／ｍｉｐｓ．ｇｓｆ．ｄｅ／またはＳＧＤ：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ／で入手可能）、およびｍＲＮＡデータ６１２に関連させることができる。ｍＲＮＡおよびタンパク質比は、再スケーリング、例えば、それぞれの比の中央値で割ることによって比較可能にされうる。図７は、例えば、図６で用いられうる様々な関係７００を示す。
【００９２】
多種多様な質量分析計および質量分析計系を用いて、本明細書に記載される方法および製造物をとともに用いるのに適当な質量スペクトルおよびフラグメンテーション・スペクトルを取得することができる。ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎに適した質量分析計系としては、イオン・フラグメンターおよび２つ以上の質量分析計が挙げられる。ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、またはＭＳｎのための適した質量分析計としては、限定はされないが、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計、四重極質量分析計（ＱＭＳ）、およびイオン移動度分光計（ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＩＭＳ））が挙げられる。適当なイオン・フラグメンターの例としては、限定はされないが、衝突セル（その中で、イオンを中性気体分子と衝突させることによって、イオンをフラグメント化する）、光解離セル（その中で、イオンに光子の光線を照射することによって、イオンをフラグメント化する）、および表面解離フラグメンター（その中で、イオンを固体または液体表面と衝突させることによって、イオンをフラグメント化する）が挙げられる。適当な質量分析計系は、イオン・リフレクターも含むことができる。
【００９３】
適当な飛行時間質量分析計系の例と、質量スペクトルおよびフラグメンテーション・スペクトルを得るための方法とについては、例えば、米国特許第６，３４８，６８８号（１９９９年１月１９日申請、２００２年２月１９日発行）、米国出願番号第１０／０２３２０３号（２００１年１２月１７日申請）、米国出願番号第１０／１９８，３７１号（２００２年７月１８日申請）、および米国出願番号第１０／３２７，９７１号（２００２年１２月２０日申請）に記載されており、それら全ての全内容を本明細書に援用する。様々な実施形態で、例えば、米国特許第５，６２５，１８４号（１９９５年５月１９日申請、１９９７年４月２９日発行）、第５，６２７，３６９号（１９９５年６月７日申請、１９９７年５月６日発行）、第６，００２，１２７号（１９９８年４月１０日申請、１９９９年１２月１４日発行）、第６，５４１，７６５号（１９９８年５月２９日申請、２００３年４月１日発行）、第６，０５７，５４３号（１９９９年７月１３日申請、２０００年５月２日発行）、および第６，２８１，４９３号（２０００年３月１６日申請、２００１年８月２８日発行）、ならびに米国出願番号第１０／３０８，８８９号（２００２年１２月３日申請）（それら全ての全内容を本明細書に援用する）に記載されるように、遅延摘出を実行して、タイムラグ集束を提供して、ＭＡＬＤＩによって生成されたイオンの初期試料イオン速度分布に対して補正をおこなう。
【００９４】
様々な実施形態で、質量分析計系は、１次イオンを選択するため、かつ／またはそのフラグメント・イオンを検出および分析するための三連四重極質量分析計を含む。様々な実施形態で、第１の四重極は、１次イオンを選択する。イオンのいくつかをフラグメントにする複数の低エネルギー衝突が生じるように、第２の四重極を十分に高い圧力および電圧に維持する。第３の四重極を走査して、フラグメント・イオン・スペクトルを分析する。
【００９５】
様々な実施形態で、質量分析計系は、１次イオンを選択するため、かつ／またはそのフラグメント・イオンを検出および分析するための２つの四重極質量フィルターおよびＴＯＦ質量分析計を含む。様々な実施形態で、第１の四重極は、一次イオンを選択する。イオンのいくつかをフラグメントにする複数の低エネルギー衝突が生じるように、第２の四重極を十分に高い圧力および電圧に維持し、ＴＯＦ質量分析計は、フラグメント・イオン・スペクトル検出および分析する。
【００９６】
様々な実施形態で、質量分析計系は、２つのＴＯＦ質量分析部およびイオン・フラグメンター（例えば、ＣＩＤまたはＳＩＤ等の）を含む。様々な実施形態で、第１のＴＯＦは、イオン・フラグメンター中の導入のための一次イオンを選択し、第２のＴＯＦ質量分析計は、フラグメント・イオン・スペクトルを検出および分析する。ＴＯＦ分析部は、線形または反射型分析部でありうる。
【００９７】
様々な実施形態で、質量分析計系は、飛行時間質量分析計およびイオン・リフレクターを含む。イオン・リフレクターをＴＯＦのフィールド・フリー・ドリフト領域の末端に配置し、該イオン・リフレクターを用いて、イオンの飛行経路を修正することによって初期の運動エネルギー分布の効果を補正する。様々な実施形態で、イオン・リフレクターは、加速電圧よりわずかに大きいレベルまで増加する電位でバイアスをかけられた一連のリングからなる。動作では、イオンがリフレクターに進入するにつれて、フィールドの方向のそれらの速度がゼロになるまで該イオンを減速する。０速度点で、イオンは、方向を逆転させて、リフレクターを介して元へと加速される。入射エネルギーと同一のエネルギーを持つが、反対方向の速度を持つイオンは、リフレクターを出る。より大きなエネルギーを持つイオンは、より深部までリフクレクターに進入して、結果的に、より長い時間リフレクター中に残る。リフクレクターで用いられる電位を選択して、同様の質量および電荷のイオンが実質的に同時に検出器に到達するようにイオンの飛行経路を修正する。
【００９８】
様々な実施形態で、質量分析計系は、対象の１次試料イオンを選択するための時限イオン・セレクター、試料イオン・フラグメントを生成するためのフラグメンテーション室（またはイオン・フラグメンター）、フラグメント・イオンを分析するための質量分析部を有する第１のフィールド・フリー・ドリフト領域を含むタンデムＭＳ−ＭＳ器具を含む。様々な実施形態で、時限イオン・セレクターは、パルス・イオン・デフレクターを含む。様々な実施形態で、第２のイオン・デフレクターをこのタンデムＭＳ／ＭＳ器具のバージョンでのパルス・イオン・デフレクターとして用いることができる。動作の様々な実施形態では、該パルス・イオン・デフレクターは、選択された質量電荷比範囲内のイオンのみをイオン・フラグメンテーション室に送ることを可能にする。様々な実施形態で、質量分析部は、飛行時間質量分析計である。質量分析部は、イオン・リフレクターを含むことができる。様々な実施形態で、フラグメンテーション室は、イオンのフラグメンテーションを引き起こして、抽出を遅延させるように設計された衝突セルである。様々な実施形態で、フラグメンテーション室は、飛行時間質量分析法によるフラグメント・イオンの分析のための遅延抽出イオン源として機能することもできる。
【００９９】
様々な実施形態で、質量分析計系は、パルス・イオン源によって生成される複数のイオンの経路に沿って配置される第１、第２、および第３のＴＯＦ質量セパレーターを有するタンデムＴＯＦ−ＭＳを含む。第１の質量セパレーターは、パルス・イオン源によって生成される複数のイオンを受けるために配置される。第１の質量セパレーターは、パルス・イオン源によって生成される複数のイオンを加速させ、該複数のイオンをそれらの質量電荷比にしたがって分離して、該複数のイオンから、イオンの第１の群をそれらの質量電荷比にもとづいて選択する。第１の質量セパレーターは、該イオンの第１の群の少なくとも一部分のフラグメント化もする。第２の質量セパレーターは、第１の質量セパレーターによって生成されたイオンの第１の群およびそれらのフラグメントを受けるために配置される。第２の質量セパレーターは、イオンの第１の群およびそのフラグメントを加速させ、該イオンの第１の群およびそのフラグメントをそれらの質量電荷比にしたがって分離して、該イオンの第１の群およびそのフラグメントから、イオンの第２の群をそれらの質量電荷比にもとづいて選択する。第２の質量セパレーターは、イオンの第２の群の少なくとも一部分をフラグメント化もする。第１および／または第２の質量セパレーターは、イオン・ガイド、イオン集束素子、および／またはイオン・ステアリング素子を含むことも可能である。様々な実施形態で、第２のＴＯＦ質量セパレーターは、イオンの第１の群およびそのフラグメントを減速させる。様々な実施形態で、第２のＴＯＦ質量セパレーターは、フィールド・フリー領域と、実質的に第２の所定範囲内にある質量電荷比を有するイオンを選択するイオン・セレクターとを含む。様々な実施形態で、第１および第２のＴＯＦ質量セパレーターのうちの少なくとも１つは、フラグメント化イオンを選択する時限イオン・セレクターを含む。様々な実施形態で、第１および第２の質量セパレーターのうちの少なくとも１つは、イオン・フラグメンターを含む。第３の質量セパレーターは、第２の質量セパレーターによって生成されたイオンの第２の群およびそのフラグメントを受けるために配置される。第３の質量セパレーターは、イオンの第２の群およびそのフラグメントを加速させ、該イオンの第２の群およびそのフラグメントをそれらの質量電荷比にしたがって分離する。様々な実施形態で、第３の質量セパレーターは、パルス加速を用いて、該イオンの第２の群およびそのフラグメントを加速させる。様々な実施形態で、イオン検出器は、イオンの第２の群およびそのフラグメントを受けるために配置される。様々な実施形態で、イオン・リフレクターをフィールド・フリー領域中に配置させ、イオンの第１および第２の群ならびにそれらのフラグメントがイオン検出器に到達するまえに、該イオンの第１および第２の群ならびにそれらのフラグメントのうちの少なくとも１つのエネルギーを補正する。
【０１００】
様々な実施形態で、質量分析計系は、複数の飛行経路、時間的に同時に実行されうる複数の動作モード、または両方を有するＴＯＦ質量分析部を含む。このＴＯＦ質量分析部は、第１のイオン経路、第２のイオン経路、または第３のイオン経路に沿って質量分析部に入る試料イオンの束から選択されたイオンを導く経路選択イオン・デフレクターを含む。いくつかの実施形態では、さらにより多くのイオン経路を用いることが可能である。様々な実施形態で、第２のイオン・デフレクターを経路選択イオン・デフレクターとして用いることができる。時間依存的電圧を経路選択イオン・デフレクターに適用して、利用可能なイオン経路間で選択をおこない、所定の質量電荷比範囲内の質量電荷比を有するイオンを、選択されたイオン経路に沿って広めることが可能である。
【０１０１】
例えば、複数の飛行経路を有するＴＯＦ質量分析部の動作の様々な実施形態では、第１の所定質量電荷比範囲に対応する第１の所定時間間隔の間、第１の所定電圧を経路選択イオン・デフレクターに適用することによって、第１の質量電荷比範囲内のイオンを第１のイオン経路に沿って広める。様々な実施形態で、この第１の所定電圧はゼロであり、該イオンが初期の経路に沿って広がり続けることを可能にする。第２の所定質量電荷比範囲に対応する第２の所定時間間隔の間、第２の所定電圧を経路選択イオン・デフレクターに適用することによって、第２の質量電荷比範囲内のイオンを第２のイオン経路に沿って広める。第３、第４等を含む付加的な時間範囲および電圧を用いて、特定の測定のために必要とされる数だけイオン経路を収容することができる。第１の所定電圧の振幅および極性を選択して、第１のイオン経路中にイオンを偏向させ、第２の所定電圧の振幅および極性を選択して、第２のイオン経路中にイオンを偏向させる。第１の時間間隔を選択して、第１の所定質量電荷比範囲内のイオンが経路選択イオン・デフレクターを介して広がっている間の時間に対応させ、第２の時間間隔を選択して、第２の所定質量電荷比範囲内のイオンが経路選択イオン・デフレクターを介して広がっている間の時間に対応させる。第１のＴＯＦ質量セパレーターは、第１のイオン経路に沿って広がっている第１の質量電荷比範囲内のイオンの束を受けるために配置される。第１のＴＯＦ質量セパレーターは、第１の質量電荷比範囲内のイオンをそれらの質量にしたがって分離する。第１の検出器は、第１のイオン経路に沿って広がっているイオンの第１の群を受けるために配置される。第２のＴＯＦ質量セパレーターは、第２のイオン経路に沿って広がっているイオンの束の部分を受けるために配置される。第２のＴＯＦ質量セパレーターは、第２の質量電荷比範囲内のイオンをそれらの質量にしたがって分離する。第２の検出器は、第２のイオン経路に沿って広がっているイオンの第２の群を受けるために配置される。いくつかの実施形態では、第３、第４等を含む付加的な質量セパレーターおよび検出器は、対応する経路に沿って導かれるイオンを受けるために配置されうる。一実施形態では、第３の所定質量範囲内のイオンを破棄する第３のイオン経路を用いる。第１および第２の質量セパレーターは、任意の種類の質量セパレーターでありうる。例えば、第１および第２の質量セパレーターのうちの少なくとも１つは、フィールド・フリー・ドリフト領域、イオン加速器、イオン・フラグメンター、または時限イオン・セレクターを含むことができる。第１および第２質量セパレーターは、複数の質量分離装置も含むことができる。様々な実施形態で、イオン・リフレクターは、イオンの第１の群を受けるために包含および配置され、それによって、該イオン・リフレクターは、該イオンの第１の群に対するＴＯＦ質量分析部の分解能を向上する。様々な実施形態で、イオン・リフレクターは、イオンの第２の群を受けるために包含および配置され、それによって、該イオン・リフレクターは、該イオンの第２の群に対するＴＯＦ質量分析部の分解能を向上する。
【０１０２】
図８を参照すると、様々な実施形態で、遅発抽出を用いるタンデム飛行時間質量分析計系１０は、パルス・イオン発生器１２を含む。パルス・イオン発生器１２は、レーザー２７および源抽出グリッド３６を含む。時限イオン・セレクター１４は、イオン発生器１２と連絡することができる。イオン・セレクター１４は、フィールド・フリー・ドリフト管１６およびパルス・イオン・デフレクター５２を含む。フィールド・フリー・ドリフト管１６は、イオン・ガイドを含むことができる。
【０１０３】
イオン・フラグメンテーション室１８は、イオン・セレクター１４と連絡することができる、図４に示されるイオン・フラグメンテーション室は、衝突セル４４を含む。しかし、フラグメンテーション室１８は、光解離室または表面誘起解離室等の当該技術分野で公知の任意の種類のフラグメンテーション室でありうる。パルス・イオン・デフレクター５２への入口にある小開口５４は、フラグメンテーション室１８へのイオン・ビームの自由通過を可能にするが、中性ガスの流れを制限する。フラグメンテーション室１８は、イオン・ビームの自由通過を可能にするが、中性ガスの流れを制限する。
【０１０４】
一実施形態では、グリッド・プレート５３を衝突セル４４に隣接させて配置し、バイアスをかけて、フィールド・フリー領域５７を形成することができる。フィールド・フリー領域５７は、イオン・ガイド５７’を含むことができる。フラグメンター抽出グリッド５６を、分析部２４への入口５８に、グリッド・プレート５３に隣接して配置することができる。別の実施形態では、フラグメンター抽出グリッド５６を出口開口に直接隣接させて配置することができ、グリッド・プレート５３を省く。この実施形態を測定に用いることができ、衝突セル４４中でフラグメンテーションを実質的に完了することができる。分析部２４は、イオン・ミラー６４と連絡する第２のフィールド・フリー・ドリフト管１６’を含む。第２のフィールド・フリー・ドリフト管１６’は、イオン・ガイドを含むことができる。検出器６８は、反射されたイオンを受けるために配置されうる。
【０１０５】
パルス・イオン発生器１２およびドリフト管１６を真空ハウジング２０に封入し、それをガス出口２２を介して真空ポンプ（図示せず）に接続できる。または、フラグメンテーション室１８およびパルス・イオン・デフレクター５２を真空ハウジング１９に封入し、それをガス出口４８を介して真空ポンプ（図示せず）に接続することができる。同様に、分析部２４をガス出口２８を介して真空ポンプ（図示せず）に封入することができる。同様に、分析部２４を真空ハウジング２６に封入することができ、それをガス出口２８を介して真空ポンプ（図示せず）に接続することができる。真空ポンプは、真空ハウジング２０、１９、および２６中の中性ガスのバックグラウンド圧力を十分に低く維持し、該真空ハウジング２０、１９、および２６中の中性ガスとイオンの衝突が生じることは起こりそうにない。
【０１０６】
動作では、イオンのパルスを生成するパルス・イオン発生器１２によって、分析すべき試料３２をイオン化することができる。一実施形態では、パルス・イオン発生器１２はＭＡＬＤＩを利用する。この実施形態では、レーザー光２７’は、入射レーザー光２８の波長を選択的に吸収することが可能なマトリックスと混合した試料３２を有する試料プレートに衝突する。
【０１０７】
イオン化後の所定の時間に、試料３２と源抽出グリッド３６との間および源抽出グリッド３６とドリフト管１６との間で放出電位を用いることによって、イオンを加速させる。一実施形態では、ドリフト管が大地電位にあることができる。この加速の後、イオンは、それらの質量電荷比の平方根にほぼ比例する速度で、ドリフト管を通って飛行する。すなわち、より重いイオンほどより遅く飛行する。したがって、ドリフト管１６内では、イオンは、より高い質量のイオンがより低い質量のものより遅く飛行することで、それらの質量電荷比にしたがって分離する。
【０１０８】
パルス・イオン・デフレクター５２は、イオン化後の所定の時間に、時間窓を開く。これによって、パルス・イオン・デフレクター５２が衝突セル４４へのアクセスを可能にする間の所定の時間窓内でパルス・イオン・デフレクター５２に到達する選択された質量電荷比をもつイオンのみが送られることを可能にする。したがって、所定のイオン（選択された質量電荷比を有するもの）のみが、パルス・イオン・デフレクター５２によって衝突セル４４に入ることが可能になる。より高いまたはより低い質量の他のイオンは却下される。
【０１０９】
衝突セル４４に入る選択されたイオンは、入口４０を介して入る中性ガスと衝突する。衝突は、イオンのフラグメント化を引き起こす。衝突のエネルギーは、試料３２および衝突セル４４に適用されたものの間の電位差に比例する。一実施形態では、衝突セル４４中の中性ガスの圧力を約３ないし４トールに維持し、衝突セル４４を囲む空間の圧力は約５ないし１０トールである。ガス出口４８に接続される真空ポンプ（図示せず）によって、イオン入口開口４６およびイオン出口開口５０を介して衝突セル４４から拡散するガスを促進することができる。別の実施形態では、高速パルス値（図示せず）を、イオンがフラグメンテーション室１８に到達する時間中に中性ガスの高圧パルスを生成するように、ガス入口４０に配置することができ、その時間の残りの間、フラグメンテーション室１８を真空に維持する。中性ガスは、ヘリウム、窒素、アルゴン、クリプトン、またはキセノン等の任意の中性ガスでありうる。
【０１１０】
一実施形態では、フラグメント・イオンがグリッド・プレート５３中の開口５０’を通過し、グリッド・プレート５３と抽出グリッド５６との間のほぼフィールド・フリーの領域５９に入るまで、グリッド・プレート５３およびフラグメンター抽出グリッド５６に、衝突セル４４と実質的に同じ電位でバイアスをかける。イオンがグリッド・プレート５３を通過した後の所定の時間に、グリッド・プレート５３の電位を高電圧に迅速に切り換えることによって、イオンを加速させる。加速されたイオンは、分析部２４への入口５８を通過して、第２のフィールド・フリー・ドリフト管１６’中に入り、次にイオン・ミラー６４中に入り、さらに反射されたイオンを受けるために配置される検出器６８に入る。
【０１１１】
グリッド・プレート５３の電位を切り換える時間から始まり、検出器６８によるイオン検出で終わるイオン・フラグメントの飛行時間を測定する。測定時間からイオン・フラグメントの質量電荷比を決定する。フラグメンテーション室１８がイオン・フラグメントの遅延抽出源として機能するように動作パラメータを適切に選択することによって、質量電荷比を非常に高い分解度で決定することができる。動作パラメータとしては、（１）グリッド・プレート５３中の開口５０’を介したフラグメント・イオンの通過とグリッド・プレート５３への加速電位の適用との間の遅延、および（２）グリッド・プレート５３とフラグメンター抽出グリッド５６との間の抽出フィールドの振幅が挙げられる。
【０１１２】
別の実施形態では、グリッド５３を用いないか、またはグリッド５３が存在しない。フラグメンテーションが衝突セル４４で実質的に完了される測定のために、この実施形態を用いることができる。使われることができる。この実施形態では、フラグメンター抽出グリッド５６に、衝突セル４４と実質的に同じ電位でバイアスをかける。イオンが衝突セル４４を出た後の所定の時間に、衝突セル４４への高電圧接続を、第２の高電圧供給（図示せず）に迅速に切りかえることによって、イオンを加速させる。加速されたイオンは、分析部２４への入口５８を通過して、第２のフィールド・フリー・ドリフト管１６’中に入り、次にイオン・ミラー６４中に入り、さらに反射されたイオンを受けるために配置される検出器６８に入る。
【０１１３】
衝突セル４４の電位を切り換える時間から始まり、検出器６８によるイオン検出で終わるイオン・フラグメントの飛行時間を測定する。測定時間からイオン・フラグメントの質量電荷比を決定する。フラグメンテーション室１８がイオン・フラグメントの遅延抽出源として機能するように動作パラメータを適切に選択することによって、質量電荷比を非常に高い分解度で決定することができる。動作パラメータとしては、（１）イオンが衝突セル４４を出た後から、高電圧を第２の高電圧に迅速に切り換える前までの所定の時間、および（２）衝突セル４４とフラグメンター抽出グリッド５６との間の抽出フィールドの振幅が挙げられる。
【実施例】
【０１１４】
以下の実施例は説明のためのものであり、本発明を制限することを意図するものではない。実施例１ないし実施例４では、実質的に次のように、分析のために生体試料を調製した。酵母（サッカロマイス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の２つの菌株を実施例１ないし実施例４で用いた。我々が本明細書で「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）」と記載する菌株は、ＨＦＹ１２００と命名された（Ｈｅ  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ，  ２００１）。該ＨＦＹ１２００は、該酵母を制限培地で増殖させるときに作用し始めるａｄｅ２、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、およびｃａｎ１の突然変異株を有する。ＵＰＦ１ノックアウト菌株は、ＨＦＹ８７１と命名された（Ｈｅ  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ，  ２００１）。該ＵＰＦ１ノックアウト菌株は、ＨＦＹ１２００と同じ遺伝的背景を持つが、Ｕｐｆ１遺伝子の代わりにＨｉｓ３遺伝子が挿入されている。発酵槽中３０℃で、ＹＰＤ培地２リットル中で、酵母試料（野生型およびＵｐｆ１突然変異菌株両方）を対数期中期（例えば、ＯＤ６００＝０．７）まで増殖させ、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の光学濃度が０．５ないし０．７になったとき回収した。以降の手順を４℃で実行した。酵母細胞を５分間４０００ｇの遠心によって回収し、水２００ｍＬで洗浄し、その後、５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５（緩衝液Ａ）２００ｍＬで洗浄した。液体窒素（ＬＮ２）粉砕法を用いて、酵母抽出物を調製した。細胞ペレットを１／１０量の緩衝液Ａで再懸濁し、その後、ＬＮ２に慎重に混合して、ビーズを形成した。予備冷凍した乳鉢および乳棒を用いて、ＬＮ２中でビーズをすりつぶし微粉末に粉砕した。微粉末を−７０℃で保存した。微粉末を氷上で１５分間解凍し、その後、マイクロ遠心機を用いた５分間１４，０００ｒｐｍでの遠心分離で上清を回収することによって、酵母抽出物の可溶性画分を調製した。ブラッドフォード・アッセイを用いて、可溶性画分のタンパク質濃度を測定した。各２リットルの培養物は、約４ｇの細胞ペレットを産生し、各可溶性画分に対する推定収率は、約４００ｍｇである。
【０１１５】
試料の調製された可溶性部分を酸で切断可能なＩＣＡＴ（商標）試薬で標識し、この際、野生型を軽同位体で標識し、突然変異体を重同位体で標識した。該試薬は、ＨＰＬＣでのペプチド対の共遊走を容易にするための１３Ｃ重同位体を特徴とした。６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．５（緩衝液Ｂ）中で、各菌株由来の２つの５００μｇアリコートを再懸濁した。その後、５０ｍＭトリカルボキシエチルホスフィン１０μｌの添加によってタンパク質を還元し、１０分間１００℃で沸騰させた。５分間室温まで冷却した後、アセトニトリルで溶解したＩＣＡＴ軽試薬１ｍｇを野生型に添加して、一方で、ＩＣＡＴ重試薬１ｍｇをＵｐｆ１ノックアウト試料に添加した。３７℃２時間のインキュベーション後、２つのアリコートを組み合わせて、アセトン（６：１のアセトン量：試料量）で沈殿させた。沈殿させたタンパク質を１３，０００ｇで１０分間遠心分離し、アセトンをデカントして、ペレットをアセトニトリル１００μｌで再懸濁した。その後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ８．５、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０％アセトニトリルの９００μｌで試料を希釈した。ブタ・トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）１２μｇを添加して、試料を３７℃で２時間インキュベートして、その後、さらにブタ・トリプシン１２μｇを添加した後、一晩消化した。
【０１１６】
実施例３および実施例４では、野生型１ミリグラム（ｍｇ）およびＵｐｆ１突然変異体１ｍｇを用いた。実施例１および実施例２では、野生型および突然変異体両方を１００マイクログラム用いた。標識野生型および突然変異体試料を組み合わせて、トリプシンで消化した。実施例３および実施例４では、その後、強カチオン交換を用いて消化混合物を２０個の画分に分画し、ＶｉｓｉｏｎＴＭＢｉｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）上で、該画分を回収した。実施例１および実施例２では、その後、強カチオン交換を用いて消化混合物を３５個の画分に分画した。
【０１１７】
実施例１ないし実施例４では、実質的に次のように、イオン交換クロマトグラフィーを実行した。１０ｍＭ  Ｋ３ＰＯ４、２５％ＡＣＮ、ｐＨ約２．５（緩衝液Ｃ）で試料（１ｍＬ）を１０ｍｌに希釈した。２つのバッチでは、４．６×１００ｍｍポリスルホエチルＡカチオン交換カラムに、試料を流速１ｍｌ／分で注入した。高塩濃度緩衝液は、３５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｋ３ＰＯ４、２５％ＡＣＮ、ｐＨ約２．５を含有していた（緩衝液Ｄ）。ペプチドをできるだけ能率よく分離するために、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて、４つの線形勾配セグメントにわたってペプチドを分離した。すなわち、１０％緩衝液Ｄに２分、２０％緩衝液Ｄに１５分、４５％緩衝液Ｄに３分、および１００％緩衝液Ｄに１０分であった。通常最初の４分で、１．５ｍＬからなる画分を勾配中に回収した。アフィニティー・クロマトグラフィーの前に、１００ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４、１５００ｍＭ  ＮＡＣｌ、ｐＨ１０の２５０μｌを各画分に添加して、ｐＨを約７．２にした。
【０１１８】
アフィニティー選択クロマトグラフィーを実行して、システイン含有ペプチドを選択した。システイン含有ペプチドを、スルフヒドリル特異的含有基で誘導体化されたビオチン親和性基で標識した。その後、標識されたシステイン含有ペプチドを精製用アビジン・カラム上で単離した。ＩＣＡＴ試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に供給される単量体アビジン・ビーズを用いて、イオン交換画分を別々に精製し、かつ指示にしたがって精製した。その後、実質的にＩＣＡＴ試薬キットの指示にしたがって、該ペプチドを切断した。減圧を用いて、各溶出物を完全に乾燥させた。ＩＣＡＴ試薬キットから得たＩＣＡＴ切断試薬の２００μｌアリコートを添加した後、３７℃で２時間インキュベーションした。逆相分離の時間まで、もう一度、減圧下で試料を乾燥させた。その時、２％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡの１００μｌ中で各試料を再懸濁した。
【０１１９】
その後、アビジン・カラム上に保持されたペプチド混合物をマイクロボアＨＰＬＣによってさらに分離し、Ｐｒｏｂｏｔ（商標）画分収集器（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（商標），  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）によってＡＢ  ４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ質量分析計系の試料プレート上に回収した。キャピラリーＲＰ−ＨＰＬＣからの流出物をマトリックスと混合し、ＭＡＬＤＩターゲット・プレート上にスポットした。実施例１、３および４では、画分を２０秒毎に回収し、実施例２では、画分を５秒毎に回収した。実施例３および実施例４では、Ｕｌｔｉｍａｔｅ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（商標），  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）上の０．１ｘ１５０ｍｍ５ミクロン２００オングストロームＭａｇｉｃ  Ｃ１８カラム（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）を用いて、画分４ないし１９個を逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）にかけた。
【０１２０】
ＧＰＳ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒバージョン１．０を備えた４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いるＭＡＬＤＩと、ＱＳｔａｒ（商標）Ｐｕｌｓａｒ  Ｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いるＥＳＩとによって、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳを実行した。Ｐｒｏ  ＩＣＡＴ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）ソフトウェアを利用して、初めに、ＥＳＩ実験のためのペプチド信号を同定および定量し、使用したデータベースは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔリリース３６．  Ｔｈｅ  Ｍａｓｃｏｔ（商標）配列検索プログラム（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫ）であり、ＭＡＬＤＩ対して、かつデータ統合のための基礎を提供するために、ＥＳＩペプチドおよびタンパク質同定に対しても使用したデータベースは、９７２２個のサッカロマイス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）配列を含有する２００３年６月１日リリースのＭＳＤＢであった。
【０１２１】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母ゲノムに対応するＳ９８アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）を用いたｍＲＮＡアレイ分析によって、転写物発現レベルの分析も実行した。
【０１２２】
（実施例１  質量分析データにもとづく前駆体選択）
図９は、種々の溶出物画分を示すマイクロボアＨＰＬＣクロマトグラフ９０１を示し、複数の生体分子が単一の画分中に存在することができ、所定の生体分子が複数の画分に存在することができることが理解される。様々な実施形態で、画分が溶出するにつれて、該画分をＭＡＬＤＩ試料プレート９０５上にスポット（９０３）できる。溶出の長さおよびサンプリング率に応じて、単一の画分をＭＡＬＤＩ試料プレート上の複数のスポット９０４としてスポット（９０３）することができ、例えば、ＭＡＬＤＩおよびＴＯＦ質量分析法を用いて、質量スペクトルを取得（９０６）することができる。様々な保持時間（ここでは、複数のスポット）から得た複数の溶出物の質量スペクトルから、生体試料中で、タンパク質を同定（９０７）することができるか、または単一の保持時間で十分にタンパク質を同定（９０９）することができる。
【０１２３】
結果として生じる質量スペクトルの例を、それぞれ、図１０Ａないし図１０Ｆ中のスポット数７２ないし７７に対して示す。この例では、対応するピークの溶出プロファイルによって測定された一連の質量スペクトルにわたったピーク・クラスタ面積の強度にもとづいて、更なる分析のためにピークを選択した。例えば、スポット数７２ないし７７（図１０Ａないし図１０Ｆ）に対する該一連の質量スペクトルは、ＨＰＬＣカラムからの溶出物の配列に、すなわち、ここでは、スポット７３の試料の前に溶出するスポット７２の試料に、スポット７４の試料の前に溶出するスポット７３の試料にというように対応する。この例では、ペプチドの溶出プロファイルに関連する質量スペクトルの数を、特定の許容差内にある各ピーク質量に対して動的に測定した。その後、各溶出プロファイル内の最大クラスタ強度にもとづいて、前駆体を選択した。例えば、ペプチドに対して測定された溶出プロファイルが１分であり、画分収集器が２０秒毎にスポットした場合、考えられる時間窓中の質量スペクトルの数は３であった。同様に、ペプチドでありうる（例えば、溶出率、サンプリング率等が原因で）質量スペクトルの数が１０であった場合、更なる分析走行を選択するために用いられるクラスタ強度の数は、１０であった。
【０１２４】
図１１ないし図１１Ｆは、ピークが、更なるＭＳ分析のために１１０１、１１０８、１１１０、１１１２、１１１４を選択（例えば、前駆体を選択する）したことを示し、この際、選択基準は、特定の保持時間および質量許容差ウィンドウ内で異なるとみなされうる１０を上回る信号対雑音および１０００を上回るクラスタ面積を持つ最も強度のピークのみを選択した（クラスタ強度にもとづいて）。例えば、対象でない質量範囲、カットオフ質量、既知の夾雑物に関連する質量等にもとづいて、更なる考慮に対して特異的に除外された質量１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３も示される。その後、選択された質量を更なるＭＳ分析にかけて、質量ピークに関連するペプチドを同定する。その後、複数のペプチド同定を用いて、生体試料に存在するタンパク質を同定した。
【０１２５】
（実施例２  発現にもとづく分析前駆体選択）
図１２は、ＩＣＡＴ定量化を用いる発現依存にもとづく選択の別の例を示す。結果は、ＨＳ刺激線維芽細胞細胞核に対するものである。平均中央軽：重比は約２．５であった。この例では、平均軽：重比を持つペプチドを実質的に制御（１２０３）し、一方で、高軽：重比を持つペプチドを上方制御（１２０６）し、低軽：重比を持つペプチドを下方制御（１２０９）する。その後、観察された制御にもとづいて、ピークを更なる分析のために選択する。例えば、上方制御された質量、下方制御された質量、制御されていない質量、またはそれらの組合せ関してのみに、更なるＭＳ分析をおこなうことができる。さらに、制御の定質的性質に関してだけではなく、定量的基礎に関しても、更なる分析のためのピークを選択することができる。
【０１２６】
図１３を参照すると、ＩＣＡＴ比の分布１３００を用いて、更なる分析のためのピークを決定することができる。例えば、非差次的発現１３０１または差次的発現１３０３の証拠にもとづいて、ピークを選択することができる。さらに、例えば、ピークが分布１３００の平均値または中央値からの特定数の標準偏差であるかにもとづいて、ピークを選択することができる。図１３では、平均発現レベル比は、０．６３であった。
【０１２７】
さらに、図１４Ａないし図１４Ｆおよび図１５を参照すると、同位体比情報を持続時間にもとづく情報と組み合わせることができる。図１４に例示されるように、約１６９５の低質量ピーク・クラスタおよび約１７０４の高質量クラスタを持つ非差次的発現対の共溶出を示す一連の質量スペクトル１４１０、１４２０、１４３０、１４４０、１４５０、１４６０（ここでは、図１０Ａないし図１０Ｆおよび図１１Ａないし図１１Ｆのスポット数に対応しないスポット数７３ないし７８）がある。対の低または／および高質量ピークが更なる分析のために選択される場合、示される溶出プロファイル内で、スポット数７５中の最も高いクラスタ強度を有する質量を更なる分析のために選択する。図１４では、平均発現レベル比は、０．０２の標準偏差で０．６３であった。図１５は、重１５０２および軽１５０４標識を持つペプチドの溶出プロフィルの類似性を説明する。これら６つの５秒ＨＰＬＣ画分にわたるピーク比のばらつきは、この例では３％未満である。これらの条件下では、タンパク質の定量化は、ＭＳスペクトル中の相対イオン存在量の測定に還元する。同位体信号の変化は、菱形で表される軽クラスタ信号１５０４および四角形で表される重クラスタ信号１５０２に対して、スポット数１５０６の関数（すなわち、保持時間）として図１５に示される、
（実施例３  推定発現値の補正）
図１６は、ピーク定量化がペプチド同定と整合しない場合の推定発現値の補正の様々な実施形態を説明する。図１６は、ＭＳスペクトル１６００の表であり、この際、質量は、ｍ／ｚ１６０１を単位にしており、質量信号強度は、％強度１６０３およびＳ／Ｎ比１６０５両方で与えられる。この質量スペクトルは、５より大きいＳ／Ｎ比の初期ピーク検出閾値１６１０より上の２つのピーク１６０６、１６０８を含む。
【０１２８】
ＭＳスペクトルは、ＩＣＡＴ対および単集合ピークを示す。初めに、質量１２５４．５７９のピーク１６０８は、２つのｃｙｓを必要とする１２３６．５１９のピーク１６０６の重形態と間違って割り当てられ、１２６３．６０９のピーク１６１２は、ピーク検出に対する閾値より下であった。最初のパスでは、このＩＣＡＴ対は、上方制御を意味する２．６８の比を有しており、中央比が０．５（重／軽）であったと考えられる。データベース検索は、１つのｃｙｓのみを含有するペプチドＹＬＡＴＣＡＤＤＲの１２Ｃ軽形態として１２５４．５７９のピークを同定した。そして、それは１つのシステインだけを含む。１２５４ａｍｕのピーク１６０８を、２つの１３Ｃｃｙｓ残基の代わりに１つの１２Ｃシステイン残基を含有するペプチドとマッチさせたとき、強度閾値は低下し、１２６３の新規ピーク１６１２の検出と、ＩＣＡＴ試薬比の再計算とを生じた。この新しい情報を用いて、ＱｕａｎｔＦｉｘｅｒプログラムは、１２６３．６０８のピークを同定して、下方制御を意味する０．２９２の重／軽比を算出する。補正された発現レベル比に、データベース中でコメントをつけて、同定されないままである考えられる第２のオーバーラップするＩＣＡＴ対（単集合によって立証されるような）による真の比についての不確定性を示す。
【０１２９】
（実施例４  発現にもとづく分析および発現データ依存的ワークフロー）
発現データ依存的ワークフローを仮説主導型系生物学研究の一部として用いて、サッカロマイス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のナンセンス媒介ｍＲＮＡ減衰に関与する潜在的転写および翻訳制御因子を同定した。ＮＭＤは、早期停止コドンを含有するｍＲＮＡ、細胞質に入るスプライシングされていないプレｍＲＮＡ、上流ＯＲＦを持つＲＮＡ、伸張された３’非翻訳領域を持つ転写物、および乏しい翻訳開始コンテクストを持つ転写物の急速なターンオーバーを担う重要な生物学的過程である。Ｕｐｆ１のノックアウトを含有するＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の新規菌株、すなわち、ＮＭＤ過程の制御に関与することが知られる因子を、メッセージ（伝達暗号）レベルおよびタンパク質レベル両方で野生型菌株と比較した。
【０１３０】
ＮＭＤ等の細胞過程の複雑性をよりよく理解するために、補足的な技術は、相互作用の機構、シグナル伝達の経路、および制御のネットワークを明らかにするために必要な詳細を提供することができる。この例では、ｍＲＮＡアレイ分析によって得られた転写物発現レベルを用いた比較を可能にするために、２つのＭＳイオン化技術ＥＳＩおよびＭＡＬＤＩを利用して、タンパク質適用範囲の深さを拡大した。
【０１３１】
タンパク質およびｍＲＮＡレベルでの発現の相違を広範に検査するために、非差次的発現のもの、差次的発現のもの、および単集合をＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ分析のために選択した。
【０１３２】
この例は、サッカロマイス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｎｒｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のＮＭＤを検査し、複数のレベルで、例えば、トランスクリプトーム・レベルおよびプロテオーム・レベル両方で、細胞の発現プロファイルを定量的に試験する。タンパク質発現は、通常、ｍＲＮＡ存在量に十分に相関せず、この理由は、恐らくｍＲＮＡ分解、選択的スプライシング、共翻訳および翻訳後修飾、ならびに遺伝子発現の転写後発現制御がｍＲＮＡからタンパク質プロファイルおよび細胞機能までを推定することを困難にしているためである。したがって、差次的発現タンパク質をｍＲＮＡレベルで共誘導または共抑制することが可能ではない。
【０１３３】
この例は、アルギニン生合成のＧＯ生物学的プロセスに関与するＣＰＡ１（Ｐ０７２５８）が、Ｕｐｆ１ノックアウト菌株中で伝達暗号およびタンパク質レベルで上方制御されることを明らかにする。
【０１３４】
Ｐｅａｋ  Ｐｉｃｋｅｒソフトウェア・ツールは、中央発現レベル比から２より多いσで変化する観察されたＩＣＡＴ試薬標識質量信号の約８％を報告した。ＭＳ／ＭＳ分析ならびにＭＳ／ＭＳイオンおよび配列データベース検索によるペプチド同定と、Ｑｕａｎｔｆｉｘｅｒソフトウェア・ツールを用いた推定発現値の補正工程との後に、ペプチドの約４％のみが２より多いσで差次的に発現していると確認された。
【０１３５】
これらの代表的なパーセント値の相違は、試料の複雑性、分画のレベル、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの質、ピーク検出、ペプチド同定、および基準データベースの完全性等の多数の因子によって影響される。雑音フィルター閾値（より低い偽陰性率）に低信号を設定することによって、ＩＣＡＴ試薬修飾ペプチド見逃す可能性を低下させることができるが、同定可能でないＨＬ対信号（例えば、新規に数えられたＨＬ対は、雑音信号、すなわちＭＳ／ＭＳ同定には弱すぎる信号へのランダム・マッチによって説明可能である）を増加させること、あるいは特に複合試料中または不十分な分画に関して複雑に入り組んだ状態からうまく脱することができないオーバーラップするピークを増加させることを代価にする。雑音信号およびオーバーラップするピークへのＨＬ対割り当ては、Ｑｕａｎｔｆｉｘｅｒソフトウェア・ツールによって確認されることができないか、または解釈可能ではないかもしれない極端なＨＬ比を生じうる。第２のケースでは、定量値に確実ではないとしてフラグを立てなければならない。ＭＳ／ＭＳスペクトルの数をかなり減少させること（５８５０のシグナル比からの４６６が２より多いσで変化する）によって、発現依存的ワークフローはより効率的になりうる。ＭＳ／ＭＳイオン検索同定レベルで、偽陽性非ペプチド前駆信号をフィルタ・アウトすることができる。σにもとづく閾値は、比が広範囲にわたるときは適当ではないかもしれない。その後、比の倍変化は、より有効でありうる。
【０１３６】
基礎をなすＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、タンパク質、およびｍＲＮＡに関連する実験結果をリレーショナル・データベースに置いた。ｍＲＮＡ比およびタンパク質比を、それぞれの比の中央値で割ることによって比較可能にした。基準リストを介して、タンパク質を対応する遺伝子およびオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）に関連づけ、コドン・バイアスおよび遺伝子オントロジー情報（生物学的過程、分子機能、および細胞下位置等の）（ＭＩＰＳ：ｈｔｔｐ：／／ｍｉｐｓ．ｇｓｆ．ｄｅ／またはＳＧＤ：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ／で入手可能）に関連させた。
【０１３７】
図６は、図１９Ａないし図２１Ｂを生成することを容易にするために用いられた表を概説する。図７は、図６の表とともに用いられる様々な関係を概説する。包含されたＳＱＬ例は、タンパク質登録番号Ｎｒ、ＯＲＦ，タンパク質およびｍＲＮＡ発現値、ならびにアルギニン生合成に関与する生物学的機能を持つ全てのタンパク質に対するコドン・バイアスを抽出する。
【０１３８】
図１７は、酵母ＮＭＤ系生物学研究で、一ＳＣＸ画分１７０１当たりのＩＣＡＴ試薬対の数１７０３を示す図１７００である。ヒストグラムは、ＳＣＸ画分数１７０１および時間１７０５の関数としてＭＡＬＤＩによって観察されるＩＣＡＴ試薬対を説明する。合計で１０，８０１個の対（３つの初期画分１７０６のそれぞれ中でほぼ１６００個）を観測した。ヒストグラムの上部に重なっているのは、ＳＣＸ走行に対するＵＶトレース１７０８である。ＵＶ信号（２８０ｎｍ）は、大部分のＩＣＡＴ試薬対の位置に一致するということがわかる。
【０１３９】
Ｐｅａｋ  Ｐｉｃｋｅｒソフトウェア・プログラムの動的排除アルゴリズムは、観察された１０，８０１個の推定ＩＣＡＴ試薬対を５，８５０個の対まで減少させた。１０，８０１個のＩＣＡＴ試薬対は、１近く（０．９７２）の中央比および０．２２９のσを有する。このことは、最も多く観察されたＩＣＡＴ試薬対がＵｐｆｌ変異体と野生菌株との間で変わらないことを強調する。この厳格な分布は、技術の高い精度も反映する。この例では、観察された信号の８％までは、２より多いσで変化する（４０％までの上方または下方制御）。ＱｕａｎｔＦｉｘｅｒを用いた定量化補正工程の後、１１２１個の固有同定ペプチドから４１個のみ（２より大きいσの発現を持つ４％まで）が確実であると考えられる。
【０１４０】
図１８は、酵母ＮＭＤ系生物学研究の重／軽比のヒストグラムと、差次的発現の画分を示す円グラフとを示す（１８００）。１０，８０１個のＩＣＡＴ試薬対は、１近く（０．９７２）の中央比および０．２２９（約２０％）のσを有する。このＭＡＬＤＩ分析では、観察された信号の９２％は、２未満のσで変化している（４０％までの上方または下方制御）。合計で８９８個の固有タンパク質をＭＡＬＤＩおよびＥＳＩによって同定および定量した（図１９Ａおよび１９Ｂを参照せよ）。両方のイオン化技術によって同定されたタンパク質間のオーバーラップは、５１．７％であり、両方のイオン化技術が用いられるとき、より多くのタンパク質が同定および定量されうることが示された。
【０１４１】
コドン・バイアスは、予測タンパク質存在量の尺度であり、コドン・バイアス値を考慮すると、１６７個のタンパク質が低存在量（＜０．１）であると考えられる（図２０Ａないり２０Ｂを参照せよ）。しかし、同定された８９８個のタンパク質は、恐らく、最も容易に同定可能であるタンパク質を表す。したがって、この例の技術は、有利なペプチド特性のため、複数の低存在量タンパク質を検出することができる。または、タンパク質存在量とコドン・バイアスとの良好な相関は、最も多量の２００個のタンパク質またはそのようなものへとのみ及ぶことが可能である。
【０１４２】
図１９Ａおよび図１９Ｂは、それぞれ、酵母ＮＭＤ系生物学研究で同定されたペプチドおよびタンパク質を説明する。ＭＡＳＣＯＴ（ｐ＜０．０５、すなわちイオン・スコア＞２０、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（ｖ０２．１３．２００３））によって、８９８個のＭＡＬＤＩおよびＥＳＩタンパク質と、２０７６個のペプチドとを定量および同定した。タンパク質が少なくとも１つの有意な同定ペプチドを含有した場合、タンパク質を考慮した。
【０１４３】
図２０Ａおよび図２０Ｃは、報告された酵母タンパク質および実験的に観察された酵母タンパク質のコドン・バイアス比較を示す。図２０Ａおよび２０Ｃ中の各箱は、コドン・バイアス目盛に沿って０．１単位からなる。予測どおりに、同定されたタンパク質は、通常より高いコドン・バイアスを有する傾向がある。しかし、コドン・バイアス＜０．１を持つ複数のタンパク質が同定された。
【０１４４】
図２０Ｂおよび図２０Ｄは、報告された酵母タンパク質および実験的に観察された酵母タンパク質の細胞下位置を説明する。この例では、細胞下位置によって、ＭＩＰＳおよびＳＧＤでの報告された酵母タンパク質の全てを分類した。図２０Ｂおよび図２０Ｄは、全ての酵母タンパク質と比較した、この研究で同定されたタンパク質の分布を示す。これは、この例の発現データ依存的技術が、２Ｄゲルを用いた検出が困難な膜タンパク質を含む全てのクラスからタンパク質を検出することを説明する。
【０１４５】
総括して言えば、ＵＰＦ１遺伝子のノックアウト上で発現レベルが変化したタンパク質はほとんどなかった。Ｕｐｆ１タンパク質自体は、検出の境界線にあって、ノックアウト中では実際はより低かった。残念なことに、この例では、Ｕｐｆ１の発現の絶対的レベルはあまりに低かったので、Ｕｐｆ１タンパク質が、Ｕｐｆ１ペプチドの重形態の位置中のバックグラウンド信号のために少なくとも５倍に下方制御されたということしか測定できなかった。ノックアウトに関しては、それは完全に存在すべきではない。観察された他の有意な定量的変化の大部分は、タンパク質が、ＧＯ遺伝子オントロジー系を用いて、生物学的過程、分子機能または細胞区画によって分類されるかどうかに関係なく、互いに明確な機能的な関係がない考えられるタンパク質中であった。この理由は、全てのタンパク質（６，１１３個の遺伝子から予測）の１／６未満が測定されたためであるかもしれない。
【０１４６】
図２１Ａは、アルギニン生合成酵素のＩＣＡＴ試薬およびｍＲＮＡ比を説明する。ＣＰＡ１、ＡＲＧＩ、ＣＰＡ２、およびＡＲＧ４は、伝達暗号レベルおよびタンパク質レベル両方で共上方制御を示す。図２１Ｂは、アルギニン生合成酵素ペプチドのＩＣＡＴ試薬およびｍＲＮＡ比を説明する。４つの異なるアルギニン生合成酵素由来の全てのペプチドは、＞１．４のＩＣＡＴ比を持つ。１の比は、差次的発現が無いことを示す。
【０１４７】
この一般化に対する例外は、アルギニン生合成のＧＯ生物学的過程中であり、この際、列挙された５つのタンパク質のうち４つが観察された。４つ全ては、Ｕｐｆ１ノックアウト菌株中で発現を増加させた。これらの４つのタンパク質に対しては、１．４のＩＣＡＴ試薬比を下回る不整合の測定はなかった。これらのタンパク質のうちの１つは、すなわちカルバモイルリン酸シンテターゼの小サブユニットをコードするＣＰＡ１（Ｐ０７２５８）は、我々のデータに整合して、Ｕｐｆ１遺伝子の突然変異株上で発現が増加する。我々のデータは、カルバモイルリン酸シンテターゼ（ＣＰＡ２）の大サブユニットのタンパク質レベルでの発現もＵＰＦ１ノックアウト菌株で増加することも示す。カルバモイルリン酸シンテターゼの両方のサブユニットは、サッカロマイス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）中で共制御されることが示された。
【０１４８】
表２は、ＭＡＬＤＩおよびＥＳＩを用いて観察されたアルギニン生合成酵素のペプチドおよびタンパク質ＩＣＡＴ試薬発現比を列挙し、該比は、標準化されたｍＲＮＡ比とともに列挙される。
【０１４９】
【表２】
2005536728.tif 000004
ここで、表２中の上付き文字は、以下のことを示す。すなわち、
ａ）Ｈ／Ｌタンパク質比および標準偏差は、式（１）にしたがって計算され、少なくとも１度、Ｍａｓｃｏｔ（ｐ＜０．０５、すなわち、イオン・スコア＞２０の閾値、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（ｖ０２．１３．２００３））によって有意に同定されたペプチド中のみで考慮された。比の最大イオン・スコアおよびイオン・スコア加重平均を得て、ＭＡＬＤＩおよびＥＳＩによって同定されたペプチドのイオン・スコアおよびＨ／Ｌ比を統合した。ｂ）ＭＡＬＤＩ  Ｈ／Ｌペプチド比は、νｊ＝１を加重して表１の式（２）を適用して計算され、ＥＳＩ  Ｈ／Ｌペプチド比は、Ｐｒｏ  ＩＣＡＴソフトウェアによって決定された。ｃ）標準偏差は、ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩによって同定された複数のペプチド定量値にもとづく。ｄ）のいくつかの例では、ペプチドは、同定されたが、比が低強度のために決定されなかった。
【０１５０】
（実施例５  検索結果にもとづく分析、検索結果依存的ワークフロー、および再較正）
様々な実施形態で、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ取得および分析の第１のラウンドで高信頼度で同定される生体分子（例えば、ペプチド）の理論上の質量を用いて、ＭＳデータを較正することができる。様々な実施形態で、μＬＣペプチド溶出プロファイルに沿った成功的に析出されたＭＡＬＤＩスポット中の特定の許容差ウィンドウ内で、ピーク質量を同定することによって、ＭＡＬＤＩプレート・ウェルの端から端までの再較正に対する基準質量の数を各理論上の質量に対して増加させることができる。再較正された前駆体に対してより厳格な検索許容差を設定することによって、かつ再較正されていないものに対して元の検索許容差を保つことによって、フラグメント・スペクトル検索を繰り返して、付加的な、またはより高い信頼度ヒットを得るが、より少ない偽陽性同定も得ることを容易にすることができる。図２２および２３は、有意なタンパク質ヒットの数（ｐ＜０．０５）を５０％に増加させることができ、これを用いて、そのようなアプローチの考察および原則を説明する例である。
【０１５１】
図２２は、ペプチド配列ＴＰＴＬＴＳＩＹＣＲを持つ推定転写因子ＰＭＬ（Ｐ２９５９０）の検索結果依存的較正、定量化、および同定を説明する。ＭＳスペクトル２２００は、１つの強カチオン交換画分のＣ１８  ＲＰ−ＬＣ勾配走行から回収された２０秒画分を表し、複数のＨＬ対を示す。ｍ／ｚ値は、軽変異体のみに対して表示される。１つのシステインを含有するＨＬ対の成分間の質量差は、約９．０３Ｄａである。実験試料（重試薬で標識）から対照試料（軽試薬で標識）までの成分の中央比は、０．１４の標準偏差で約０．５である（ＳＣＸ画分中の１０００個までの対全てから決定）。中央値への標準化の後、１３８１／１３９０の対２２１０は差次的に制御されるという点で際立っている。前駆体１３８１．７のＭＳ／ＭＳスペクトル２２５０は、挿入で示される。このスペクトル２２５０に関連する２３のＭａｓｃｏｔスコアは、有意性（Ｍａｓｃｏｔによって求められた２５の閾値、ｐ＜０．０５）を下回るが、ＭＳ／ＭＳスペクトル中のいくつかの特徴、すなわち、複数のトレオニン残基、強ｙ１、ａ２、およびｂ２フラグメントの存在を示唆する異常に大量のトレオニン・イミニウム・イオンは、付加的な確実性をこの情報に与える。＊を持つフラグメントは、ＩＣＡＴ試薬標識システイン残基自体に由来する。前駆体の質量に関して、２００ｐｐｍ許容差を用いて、Ｍａｓｃｏｔを用いたデータベース検索を初めに実行した。その後、ＭＳスペクトル２２００中の＊＊の印が付いた高信頼度同定に対応する質量（重標識成分および軽標識成分両方が考慮される場合、４つの理論的に既知の質量）を再較正のために用いて、１０ｐｐｍ許容差の前駆体質量の減少させた質量許容差を用いた第２の検索を可能にする。図中の質量標識は、内部較正後の値に対応する。軽ＩＣＡＴ標識ＴＰＴＬＴＳＩＹＣＲ配列の理論上の質量は、１３８１．７１５Ｄａ（ＭＨ＋として）である。実験的に測定された質量は、１３８１．７１８（２ｐｐｍ誤差）である。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（ｖ０２．１３．２００３）は、１３８１．７１８Ｄａ付近の＋／−５ｐｐｍ質量ウィンドウ内で、ヒト・タンパク質由来の２０個のトリプシンペプチドを含み、そのうち４つ固有配列のみが単一のシステイン残基を含有する。前駆体質量の高質量正確度制約は、＋／−５ｐｐｍ許容差ウィンドウ内のペプチドの検索スペースを減少させ、Ｍａｓｃｏｔイオン・スコアの閾値を１３に低下させ、有意のヒット（ｐ＜０．０１）を生じた。
【０１５２】
図２３は、ペプチド配列ＹＬＡＴＣＡＤＤＲを持つトランスデューシン・ベータ様２タンパク質（Ｑ９Ｙ４Ｐ３）の検索結果依存的較正、定量化、および同定を説明する。ＭＳスペクトル２３００は、１つの強カチオン交換画分のＣ１８ＲＰ−ＬＣ勾配走行から回収された別の２０秒画分を表す。ＭＳスペクトル２３００のＭ／Ｚ値は、軽標識ペプチドに対してのみに表示される。実験では、中央ＩＣＡＴ比は、約０．５（重／軽として定義）である。タンパク質「トランスデューシン・ベータ様２（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ  ｂｅｔａｌｉｋｅ  ２）」は、ｍ／ｚ１２５４．５７９のペプチド２３１０によって同定され、平均値を有意に下回る０．２９２の重／軽比を有するため、このタンパク質の下方制御を表す。挿入は、ＭＳ／ＭＳスペクトル２３５０を示す。前駆体質量上で２００ｐｐｍ許容差が用いられる場合、２２のＭａｓｃｏｔスコアは、有意性閾値を下回る（イオン・スコア＞２４はｐ＜０．０５でのアイデンティティを示す）。高信頼度で同定される同じＭＳスペクトルの成分（＊＊によって示されるような）は、正確質量測定による他の同定の有意性を向上するのに役立つ。内部基準としての４つの質量（２つの対）を用いて、ｍ／ｚ１２５４．６の成分に対する実験上および理論上の質量は、１ｐｐｍ内の上記配列割り当てに整合する。ＭＳトレース中の質量標識は、内部較正後の値を反映する。ＭＳ／ＭＳスペクトルと適合する＋／−５ｐｐｍ許容差内のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（ｖ０２．１３．２００３）中のヒト・タンパク質由来の唯一のトリプシンペプチドは、システイン含有ペプチドに考慮を制限せず、かつ１つの見逃したトリプシン切断を考慮しないでも、ＹＬＡＴＣＡＤＤＲである。前駆体質量の高質量正確度制約は、＋／−５ｐｐｍ許容差ウィンドウ内のペプチドの検索スペースを減少させ、Ｍａｓｃｏｔイオン・スコアの閾値を１３に低下させ、有意なヒット（ｐ＜０．０１）を生じた。
【０１５３】
（実施例６  図表による概要）
図２４を参照すると、質量スペクトル、フラグメンテーション・スペクトル、および分析の様々な実施形態および説明のための例の概要が示される。この例で説明されるように、質量スペクトルのピーク２４１２に関連するｍ／ｚ範囲を更なる分析のために選択する。この選択されたピークのフラグメンテーション・スペクトルを得て（２４２０）、そのうちの一部分を、そこで同定された様々なピーク２４２２で拡張した。この例では、ＩＣＡＴ比も決定（２４３３）して、その後、ＣｙｓのＩＣＡＴ軽および重修飾２４４０を用いて、質量スペクトル２４２２に関連するペプチド２４４４を同定する。その後、複数の（２以上）のペプチド同定を用いて、関連タンパク質２４４２を決定する。
【０１５４】
別の態様では、上述の方法の１つ以上の機能を汎用コンピュータ上のコンピュータ可読命令として実行することが可能である。コンピュータは、質量分析系とは異なるか、質量分析系から取り外し可能であるか、質量分析系に組み込まれうる。多数の高水準言語（例えば、ＦＯＲＴＲＡＮ、ＰＡＳＣＡＬ、Ｃ、Ｃ＋＋、またはＢＡＳＩＣ等の）任意の１つにコンピュータ可読命令を書き込むことが可能である。さらに、コンピュータ可読命令をスクリプト、マクロ、あるいは市販のソフトウェア（ＥＸＣＥＬまたはＶＩＳＵＡＬ  ＢＡＳＩＣ等の）に組み込まれた機能に書き込むことが可能である。さらに、コンピュータ可読命令を、コンピュータに常駐のマイクロプロセッサに向けられるアセンブリ言語に実装することができる。例えば、コンピュータ可読命令を環境設定して、ＩＢＭ  ＰＣまたはＰＣクローン上で起動する場合、コンピュータ可読命令をＩｎｔｅｌ８０ｘ８６アセンブリ言語に実装することができる。一実施形態では、コンピュータ可読命令を製造物に組み込むことができ、該製造物としては、限定はされないが、例えば、フロッピー（登録商標）・ディスク、ハード・ディスク、光学ディスク、磁気テープ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、またはＣＤ−ＲＯＭ等のコンピュータ可読プログラム媒体が挙げられる。
【０１５５】
請求項は、その旨が記載されない限り、記載される順番または要素に限定されるように解釈されるべきではない。本発明を特定の説明的な実施形態を参照して特に図示および記載してきたが、形態および詳細の様々な変化が、添付の請求項によって定義されるような本発明の精神および範囲から逸脱せずになされうることが理解されるべきである。一例として、開示される特徴の任意のものを開示される他の特徴の任意のものと組み合わせて、生体分子を含有する試料を分析することが可能である。したがって、以下の請求項およびそれの等価物の範囲および精神内にある全ての実施形態が請求される。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、生体分子を含有する試料を分析するための方法の様々な実施形態を説明する流れ図である。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、発現依存的補正および選択の様々な実施形態を説明する図である。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、発現依存的補正および選択の様々な実施形態を説明する図である。
【図３】図３は、同位体コード・アフィニティー反応試薬標識試料の仮説的質量スペクトルの概略説明図である。
【図４】図４は、発現データ依存的ワークフローを利用する様々な実施形態を説明する流れ図である。
【図５】図５は、検索結果依存的ワークフローを利用する様々な実施形態を説明する流れ図である。
【図６】図６は、リレーショナル・データベースの様々な実施形態のブロック線図である。
【図７】図７は、図６のリレーショナル・データベースの様々な実施形態で用いられる関係の様々な実施形態を説明する。
【図８】図８は、ＴＯＦ質量分析装置の一実施形態の概略図である。
【図９】図９は、保持時間依存的前駆体選択の様々な実施形態の概略説明図である。
【図１０Ａ】図１０Ａないし図１０Ｆは、実施例１で得られる質量スペクトルの例である。
【図１０Ｂ】図１０Ａないし図１０Ｆは、実施例１で得られる質量スペクトルの例である。
【図１０Ｃ】図１０Ａないし図１０Ｆは、実施例１で得られる質量スペクトルの例である。
【図１０Ｄ】図１０Ａないし図１０Ｆは、実施例１で得られる質量スペクトルの例である。
【図１０Ｅ】図１０Ａないし図１０Ｆは、実施例１で得られる質量スペクトルの例である。
【図１０Ｆ】図１０Ａないし図１０Ｆは、実施例１で得られる質量スペクトルの例である。
【図１１Ａ】図１１Ａないし図１１Ｆは、実施例１での更なるＭＳ分析のためのピーク選択の例である。
【図１１Ｂ】図１１Ａないし図１１Ｆは、実施例１での更なるＭＳ分析のためのピーク選択の例である。
【図１１Ｃ】図１１Ａないし図１１Ｆは、実施例１での更なるＭＳ分析のためのピーク選択の例である。
【図１１Ｄ】図１１Ａないし図１１Ｆは、実施例１での更なるＭＳ分析のためのピーク選択の例である。
【図１１Ｅ】図１１Ａないし図１１Ｆは、実施例１での更なるＭＳ分析のためのピーク選択の例である。
【図１１Ｆ】図１１Ａないし図１１Ｆは、実施例１での更なるＭＳ分析のためのピーク選択の例である。
【図１２】図１２は、実施例２で得られる質量スペクトルの例である。
【図１３】図１３は、発現依存的前駆体選択の様々な実施形態の概略説明図である。
【図１４】図１４Ａないし図１４Ｆは、共溶出した非差次的発現対の質量スペクトルの例を説明する。
【図１５】図１５は、図１１で示される質量スペクトルに対する高質量クラスタおよび低質量クラスタの信号のプロットである。
【図１６】図１６は、推定発現値の補正の様々な実施形態を説明する。
【図１７】図１７は、実施例４の酵母研究に対する一ＳＣＸ画分当たりのＩＣＡＴ試薬対の数を示す図である。
【図１８】図１８は、実施例４の酵母研究に対するＨＬ比のヒストグラムを示す。
【図１９】図１９Ａおよび図１９Ｂは、それぞれ、実施例４の酵母研究で同定されるペプチドおよびタンパク質を説明する。
【図２０Ａ】図２０Ａおよび図２０Ｃは、実施例４の報告された酵母タンパク質および実験的に観察された酵母タンパク質のコドン・バイアス比較を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂおよび図２０Ｄは、実施例４の報告された酵母タンパク質および実験的に観察された酵母タンパク質の細胞下位置を説明する。
【図２０Ｃ】図２０Ａおよび図２０Ｃは、実施例４の報告された酵母タンパク質および実験的に観察された酵母タンパク質のコドン・バイアス比較を示す。
【図２０Ｄ】図２０Ｂおよび図２０Ｄは、実施例４の報告された酵母タンパク質および実験的に観察された酵母タンパク質の細胞下位置を説明する。
【図２１】図２１Ａは、アルギニン生合成酵素のＩＣＡＴ試薬およびｍＲＮＡ比を説明する。図２１Ｂは、アルギニン生合成酵素ペプチドのＩＣＡＴ試薬およびｍＲＮＡ比を説明する。
【図２２】図２２は、ペプチド配列ＴＰＴＬＴＳＩＹＣＲを持つ推定転写因子ＰＭＬ（Ｐ２９５９０）の検索結果依存的較正、定量化、および同定を説明する。
【図２３】図２３は、ペプチド配列ＹＬＡＴＣＡＤＤＲを持つトランスデューシン・ベータ様２タンパク質（Ｑ９Ｙ４Ｐ３）の検索結果依存的較正、定量化、および同定を説明する。
【図２４】図２４は、定量化および同定の例の概略説明図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005536728.tif 000010
【図６】
2005536728.tif 000011
【図７】
2005536728.tif 000012
【図８】
2005536728.tif 000013
【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
2005536728.tif 000018
【図１０Ｅ】
2005536728.tif 000019
【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
2005536728.tif 000021
【図１１Ｂ】
2005536728.tif 000022
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2005536728.tif 000034
【図２０Ａ】
2005536728.tif 000035
【図２０Ｂ】
2005536728.tif 000036
【図２０Ｃ】
2005536728.tif 000037
【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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