(57)【要約】本発明は、導入遺伝子を哺乳動物細胞に送達するためのベクター、組成物及び方法に関する。本発明はまた、このような導入遺伝子を産生させるのに適した、遺伝子構築体及び組換え細胞に関する。本発明は更に詳細には、哺乳動物細胞への導入遺伝子送達に適したベクターに関するものであり、ここで該ベクターは、哺乳動物細胞内で機能性の少なくとも２個の相異なる転写後調節エレメントに作動可能に結合した導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を含むことを特徴とする。本発明は、実験、研究、治療、予防又は診断の分野において利用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞への導入遺伝子送達に適したベクターであって、該ベクターが、細胞内で機能性の少なくとも２個の相異なる転写後調節エレメントに作動可能に結合した導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を含む、ベクター。
【請求項２】
少なくとも１個の転写後調節エレメントが、ｍＲＮＡに安定性の増大を与える、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
少なくとも１個の転写後調節エレメントが、真核生物ｍＲＮＡのＵＴＲ領域の全部又は一部を含む、請求項１又は２記載のベクター。
【請求項４】
該ＵＴＲ領域が、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及び／又はＡＰＰ５′ＵＴＲあるいはその機能性部分から選択される、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
少なくとも１個の転写後調節エレメントが、ＷＰＲＥエレメントの全部又は機能性部分を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載のベクター。
【請求項６】
哺乳動物への導入遺伝子送達に適したベクターであって、該ベクターが、ＷＰＲＥエレメント及びＡＰＰ５′ＵＴＲ領域に作動可能に結合した導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を含む、ベクター。
【請求項７】
哺乳動物への導入遺伝子送達に適したベクターであって、該ベクターが、ＷＰＲＥエレメント、ＡＰＰ５′ＵＴＲ領域及びｔａｕ３′ＵＴＲ領域に作動可能に結合した導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を含む、ベクター。
【請求項８】
哺乳動物への導入遺伝子送達に適したベクターであって、該ベクターが、ＷＰＲＥエレメント、ＡＰＰ５′ＵＴＲ領域、ｔａｕ３′ＵＴＲ領域及びＴＨ３′ＵＴＲ領域に作動可能に結合した導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を含む、ベクター。
【請求項９】
ＷＰＲＥエレメントが、配列番号１の全部又は機能性断片を含む、請求項５〜８のいずれか１項記載のベクター。
【請求項１０】
ＡＰＰ５′ＵＴＲ領域が、配列番号２の全部又は機能性断片を含む、請求項４〜８のいずれか１項記載のベクター。
【請求項１１】
該ｔａｕ３′ＵＴＲ領域が、配列番号３の全部又は機能性断片を含む、請求項４、７又は８のいずれか１項記載のベクター。
【請求項１２】
該ＴＨ３′ＵＴＲ領域が、配列番号４の全部又は機能性断片を含む、請求項４又は８記載のベクター。
【請求項１３】
該ベクターが、該哺乳動物内で導入遺伝子の転写を制御するプロモーターを更に含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載のベクター。
【請求項１４】
該ベクターが、マーカー遺伝子を更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載のベクター。
【請求項１５】
該ベクターが、導入遺伝子に作動可能に結合したポリアデニル化シグナルを更に含む、請求項１〜１４のいずれか１項記載のベクター。
【請求項１６】
該ベクターが、プラスミド及び組換えウイルスから選択される、請求項１〜１５のいずれか１項記載のベクター。
【請求項１７】
該ベクターが、複製欠損アデノウイルス、複製欠損アデノ関連ウイルス又は複製欠損レトロウイルス（複製欠損レンチウイルスを含む）である、請求項１６記載のベクター。
【請求項１８】
導入遺伝子が、成長因子、神経栄養因子、サイトカイン、リガンド、受容体、イムノグロブリン及び酵素をコードする導入遺伝子から選択される、請求項１〜１７のいずれか１項記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項記載のキメラ遺伝子構築体又は請求項１〜１８記載のベクターを含む、組換え細胞。
【請求項２０】
疾患を処置するための医薬の製造のための、請求項１〜１８のいずれか１項記載のベクター又は請求項１９記載の組換え細胞の使用。
【請求項２１】
請求項１〜１８のいずれか１項記載のキメラ遺伝子構築体、請求項１〜１８のいずれか１項記載のベクター又は請求項１９記載の組換え細胞、及び薬学的に許容しうる賦形剤又は担体を含む、組成物。
【請求項２２】
ヒトの疾患を処置するための、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
該ヒトの疾患が、好ましくはパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン舞踏病及び網膜変性疾患から選択される、神経変性疾患である、請求項２０記載の使用又は請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
インビトロ又はエクスビボで哺乳動物細胞内で導入遺伝子を発現させる方法であって、
ａ．少なくとも２個の相異なる転写後調節エレメントに作動可能に結合した該導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を準備すること、及び
ｂ．該構築体を哺乳動物細胞に導入し、該導入が、該哺乳動物細胞内で該導入遺伝子の発現を引き起こすこと
を含む方法。
【請求項２５】
ａ．請求項１〜１８のいずれか１項記載のベクターを準備すること、及び
ｂ．該ベクターを哺乳動物細胞に導入し、該導入が、該哺乳動物細胞内で該導入遺伝子の発現を引き起こすこと
を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
該哺乳動物細胞が、好ましくはグリア細胞及び神経細胞から選択される、神経系細胞である、請求項２４又は２５記載の方法。
【請求項２７】
該哺乳動物細胞が、線維芽細胞である、請求項２４又は２５記載の方法。
【請求項２８】
該哺乳動物細胞が、ヒト細胞又は齧歯類細胞である、請求項２６又は２７記載の方法。
【請求項２９】
キメラ遺伝子構築体又はベクターが、ウイルス介在性感染により哺乳動物細胞に導入される、請求項２４〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
キメラ遺伝子構築体又はベクターが、プラスミド介在性トランスフェクションにより細胞に導入される、請求項２４〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
グリア細胞内で導入遺伝子を発現させる方法であって、
ａ．ＡＰＰ５′ＵＴＲ又はその一部と組合せたＷＰＲＥエレメントを含む転写後調節エレメントに作動可能に結合した該導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を準備すること、及び
ｂ．該構築体をグリア細胞に導入し、該導入が、該グリア細胞内で該導入遺伝子の発現を引き起こすこと
を含む方法。
【請求項３２】
線維芽細胞内で導入遺伝子を発現させる方法であって、
ａ．ＡＰＰ５′ＵＴＲ又はその一部と組合せたＷＰＲＥエレメントを含む転写後調節エレメントに作動可能に結合した該導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を準備すること、及び
ｂ．該構築体を線維芽細胞に導入し、該導入が、該線維芽細胞内で該導入遺伝子の発現を引き起こすこと
を含む方法。
【請求項３３】
神経細胞内で導入遺伝子を発現させる方法であって、
ａ．ＡＰＰ５′ＵＴＲ及びｔａｕ３′ＵＴＲ又はその一部と組合せたＷＰＲＥエレメントを含む転写後調節エレメントに作動可能に結合した該導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を準備すること、及び
ｂ．該構築体を神経細胞に導入し、該導入が、該神経細胞内で該導入遺伝子の発現を引き起こすこと
を含む方法。
【請求項３４】
神経細胞内で導入遺伝子を発現させる方法であって、
ａ．ＡＰＰ５′ＵＴＲ、ｔａｕ３′ＵＴＲ及びＴＨ３′ＵＴＲ又はその一部と組合せたＷＰＲＥエレメントを含む転写後調節エレメントに作動可能に結合した該導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を準備すること、及び
ｂ．該構築体を神経細胞に導入し、該導入が、該神経細胞内で該導入遺伝子の発現を引き起こすこと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、導入遺伝子を哺乳動物細胞に送達するためのベクター、組成物及び方法に関する。本発明はまた、このようなベクターを製造するのに適した遺伝子構築体及び組換え細胞に関する。本発明は更に詳細には、哺乳動物細胞への導入遺伝子送達に適したベクターに関するものであり、ここで該ベクターは、哺乳動物細胞内で機能性の少なくとも２個の相異なる転写後調節エレメントに作動可能に結合した導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を含むことを特徴とする。本発明は、実験、研究、治療又は予防の分野において利用することができる。
【０００２】
中枢神経系への外来遺伝子の送達のための技術の開発は、ヒトの疾患、特にヒトの神経変性疾患に対する種々の見込みある処置法の利用の可能性を開いている。遺伝子送達ベクターは、ヒトに使用できるようになる前に、有効性と安全性の幾つかの基準を満たす必要がある。臨床適用を成功させるには、ベクター関連毒性が最小化された効果的な導入遺伝子発現が必要とされる。ＣＮＳへの遺伝子運搬には、ウイルスベクターが最も広く使用される送達システムである。複製欠損組換えアデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びレンチウイルスは、非分裂ニューロン及びグリア細胞に高い効率で感染できるため、魅力あるベクターである（Le Gal La Salleら, 1993: Kaplittら, 1994; Naldiniら, 1996）。しかしこれらの使用は、ベクター関連毒性及び宿主の免疫応答により妨げられている。これらの現象は両方とも用量依存的であり、形質導入細胞の生存を脅かす（Thomasら, 2001）。よって導入遺伝子の存続を助けるため、ベクター負荷を、したがって毒性を最小化することは有利であろう。高レベルの発現を維持しながらウイルス用量を減少させる１つの方法は、ベクター１分子当たりの発現を改善することである。
【０００３】
導入遺伝子発現を増強するための以前の努力は、大部分が転写を高めることに向けられていた。しかし、組換えｍＲＮＡに関する転写後の事象を含めて、他の段階が導入遺伝子発現のレベルに影響する。ｍＲＮＡスプライシングは、種々のｍＲＮＡの効率的な産生に必要であり、転写後の増強を目指す以前の努力は、主として興味あるＲＮＡの５′又は３′末端でのイントロン配列の付加に関わっていた（Choiら, 1991）。ある場合には、発現は、イントロンの存在に完全に依存している（β−グロビン、BuchmanとBerg, 1988）。この作用の正確な機序は解明されていないが、イントロン、又はそれ自体のスプライシングのプロセスが、３′末端形成を促進して（Antoniouら, 1998；Nesicら, 1993；HuangとGorman, 1990）、核内のｍＲＮＡ安定性を増強するか、かつ／又は細胞質へのｍＲＮＡ核外移行を改善する（RyuとMertz, 1989）と考えられる。ウイルスＲＮＡの細胞質蓄積に必要とされるシス作用性ＲＮＡ配列である、Ｂ型肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）は、β−グロビン発現に及ぼすイントロンと同じ作用を有する（HuangとYen, 1995）。ＨＰＲＥと機能が類似している、別の調節エレメント（ＷＰＲＥ）は、ウッドチャック肝炎ウイルスで説明されている（Donelloら, 1998）。このエレメントは、導入遺伝子発現を増強するのに、最も不変かつ一般に最大の作用を持つ。ＷＰＲＥは、３′未翻訳領域に組み込まれると、トランスフェクト（Loebら, 1999）及び感染した培養細胞（Loebら, 1999；Zuffereyら, 1999；Schambachら, 2000；Ramezaniら, 2000）における導入遺伝子の発現を実質的に上昇させる。ＷＰＲＥ増強の機序は、充分には理解されていないが、転写後であると考えられている；ことによると、ＷＰＲＥは、ポリアデニル化及びＲＮＡ核外移行を含む、ＲＮＡプロセッシングの種々の段階を刺激することにより機能する（Huangら, 1999；Loebら, 2000）。
【０００４】
近年、真核生物ｍＲＮＡのフランキング領域の機能は、多くがｍＲＮＡ安定性又は翻訳の効率の一因となる幾つかのシグナルエレメントを含むため、益々精査されている。しかし、このようなエレメントは、プラスミド又はウイルスベクターでは未だ試験されていない。本発明の著者らの１つの仮説は、これらが、特定の標的細胞又は臓器における実質的な発現を得るために必要なベクター負荷を低下させることによって遺伝子運搬に有用であろうということであった。
【０００５】
発明の簡単な説明
本発明は今や、インビトロ、エクスビボ又はインビボでの哺乳動物細胞への遺伝子発現を改善できる、組成物及び構築体（例えば、キメラ遺伝子、ベクター、細胞など）を提供する。本発明は、哺乳動物細胞において、特に神経系細胞において、調節エレメントの適切な組合せを準備することにより、高度に上昇した遺伝子発現レベルを獲得できるという発見に由来する。詳細には、本発明は、キメラ遺伝子構築体又はベクター中の幾つかの転写後調節エレメントの組合せが、予期せぬことに哺乳動物細胞内の高レベルの遺伝子発現（対照実験に比較して最大２６倍の上昇）をもたらすことを明らかにする。更に、本出願は、このような特定の遺伝子構築体又はキメラ遺伝子が、ウイルスベクターを含む種々のバックボーンにおいて完全に活性であることを示しており、よって遺伝子送達と発現の効率に関して更なる利点を与えている。
【０００６】
本発明の第１の態様は、哺乳動物細胞（特に神経系細胞）への導入遺伝子送達に適したベクターに存在し、ここで該ベクターは、哺乳動物細胞内で機能性の少なくとも２個の相異なる転写後調節エレメントに作動可能に結合した導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を含むことを特徴とする。この転写後調節エレメントは、更に好ましくはＲＮＡを安定化するか、かつ／又はそのプロセッシングを増大させることができる。本発明の特定の構築体は、２個、３個又は４個の相異なる転写後調節エレメントを含むことを特徴とし、そしてこれらは、導入遺伝子発現を上昇させるために協力するように共に作動可能に結合している。好ましいベクターは、プラスミド又はウイルスベクターである。
【０００７】
本発明の別の態様は、哺乳動物細胞内で機能性の少なくとも２個の相異なる転写後調節エレメントに作動可能に結合した導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体に存在する。
【０００８】
本発明の更に別の態様は、上述のようなキメラ遺伝子構築体又はベクターを含む組換え細胞に関する。
【０００９】
本発明はまた、ヒトの疾患、特に神経変性疾患を処置するための医薬の製造のための、上に開示されたような遺伝子構築体、ベクター又は組換え細胞の使用に関する。
【００１０】
本発明の更に別の態様は、上に開示されたようなキメラ遺伝子構築体、ベクター又は組換え細胞、及び薬学的に許容しうる賦形剤又は担体を含む組成物に関する。
【００１１】
本発明はまた、インビトロ、エクスビボ又はインビボで哺乳動物細胞内で導入遺伝子を発現させる方法であって、
ａ）少なくとも２個の相異なる転写後調節エレメントに作動可能に結合した該導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を準備すること、及び
ｂ）該構築体を哺乳動物細胞に導入し、該導入が、該哺乳動物細胞内で該導入遺伝子の発現を引き起こすこと
を含む方法に関する。
【００１２】
本方法は、培養物中又は被験者中での、神経系細胞において、特にグリア細胞及び／又は神経細胞において、しかしまた線維芽細胞のような他の細胞型においても、導入遺伝子の発現に特に適している。本方法は、処置用生成物、酵素、神経伝達物質、毒素、増殖因子などのような、種々の導入遺伝子を発現するために使用することができる。
【００１３】
本発明に照らして得られる結果は、遺伝子治療用、更には遺伝子機能の研究用に最適な遺伝子運搬ベクターの開発に関する重要な情報を提供する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物細胞への、特に（典型的にはヒト起源の）神経系細胞への、効率的で改善された導入遺伝子送達及び発現に適した遺伝子構築体及びベクターに関する。上述のとおり、本発明は、とりわけヒト細胞への遺伝子発現を最適化できる、調節エレメントの特定の組合せの使用に基づく。よって本発明は、導入遺伝子と作動可能に組合せて結合すると、細胞内で高レベルの導入遺伝子を発現させられる、特に有利な転写後調節エレメントの使用を説明する。出願人らは実に、神経細胞（例えば、ＰＣ１２、ＮＧＦ処理ＰＣ１２、ＳＫＮＳＨ）、グリア細胞（例えば、Ｃ６、Ｕ−８７ＭＧ）及び線維芽細胞のような他の細胞型を含む、種々の表現型の細胞内での導入遺伝子発現が、適切な転写後調節エレメントの組合せにより実質的に増強されたことを見い出した。
【００１５】
よって本発明は、哺乳動物細胞への効率的で改善された導入遺伝子送達及び発現に適した、遺伝子構築体及びベクターに関するものであり、ここで該ベクターは、哺乳動物細胞内で機能性の少なくとも２個の相異なる転写後調節エレメントに作動可能に結合した導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を含む。
【００１６】
「キメラ遺伝子構築体」という表現は、本明細書において使用されるとき、組換えＤＮＡ技術（連結、クローニング、消化、ハイブリダイゼーションなど）を用いて人工的に創出された核酸構築体（例えば、種々の核酸の集成による）を意味する。キメラ遺伝子構築体は、典型的には、興味ある生物学的産物をコードする導入遺伝子を含むことを特徴とし、該導入遺伝子は、例えば、プロモーター、転写後調節エレメント、ポリＡ領域、標的部分などのような調節配列に作動可能に結合している。また、キメラ遺伝子構築体は、ｍｙｃタグ、ポリヒスチジンタグなどのような、精製又はモニタリングを容易にするためのタグを更に含んでいてもよい。キメラ遺伝子構築体は、１本鎖、又は更に好ましくは２本鎖であってよい。これは、ＤＮＡ又はＲＮＡの形であってよい。キメラ遺伝子構築体は、核酸合成法、ライブラリーからの増幅又は単離、化学修飾法などを含む、種々の技術により調製することができる。
【００１７】
「作動可能に結合」という表現は、本明細書において使用されるとき、機能的に協力するか又は相互作用するように、組み合わせ（combine）、融合又は結合（associate）していることを意味する。核酸は、直接相互に融合していても、又はキメラ遺伝子構築体の各要素の性質を変えないスペーサー領域により分離していてもよい。転写後調節エレメントは、導入遺伝子の上流又は下流に、同じ向きか又は逆向きに位置していてよい。更に、数コピーの転写後調節エレメントを使用することができる。「作動可能に結合」という用語は、一般にはプロモーターが、導入遺伝子の発現を調節すること、及び転写後調節エレメントが、導入遺伝子の形質導入発現に影響することを指している。このようなスペーサー領域は、クローニング部位、切断部位などを含む。
【００１８】
真核生物ｍＲＮＡのフランキング領域に由来する種々の転写後調節エレメントは、本発明のキメラ遺伝子構築体又はベクターの調製において、組合せて使用することができる。転写後調節エレメントは、ｍＲＮＡの安定性又は翻訳の効率の一因となる幾つかのシグナルエレメントを含む。本発明において使用されるとき、これらは、ｍＲＮＡの安定性を増大させ、そして哺乳動物細胞における、特に神経系細胞における高レベルの遺伝子発現をもたらす。
【００１９】
よって本発明の目的は、少なくとも１個の転写後調節エレメントが、真核生物ｍＲＮＡのＵＴＲ領域の全部又は一部を含むことを特徴とする、ベクターに関する。
【００２０】
本発明の発明者らは、哺乳動物細胞における導入遺伝子発現を増強しうる真核生物ｍＲＮＡからの種々のエレメント及び配列を試験した：ｉ）ＷＰＲＥ、ii）ラットｔａｕ  ｍＲＮＡの３′ＵＴＲの断片、iii）ラットのチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）ｍＲＮＡの３′ＵＴＲの断片、及びvi）ヒトのアルツハイマー病アミロイド前駆体（ＡＰＰ）ｍＲＮＡの５′ＵＴＲの断片。発明者らは、これらの転写後調節エレメントの組合せを試験して、予期せぬことに、これらが協力又は相乗して導入遺伝子発現に前向きの作用を及ぼしうることを見い出した。
【００２１】
試験した幾つかのエレメントの中で、ＷＰＲＥが最高レベルの発現を与えた。更なる増強は、ＷＰＲＥを、真核生物ｍＲＮＡの５′又は３′非翻訳領域（ＵＴＲ）に相当する配列（ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲ）と組合せると観測される。
【００２２】
上で説明されるように、ＷＰＲＥは、ＲＮＡの細胞質蓄積に必要とされるシス作用性ＲＮＡ配列である。本発明の著者らは、このエレメントがまた、哺乳動物の神経系細胞において導入遺伝子発現を増強するのに、最も不変かつ一般に最大の作用をも持つことを発見した。ＷＰＲＥは、３′未翻訳領域に組み込まれると、トランスフェクト及び感染した培養細胞における導入遺伝子の発現を実質的に上昇させる。ＷＰＲＥの機序は、転写後である。ＷＰＲＥは、ポリアデニル化及びＲＮＡ核外移行を含む、ＲＮＡプロセシングの種々の段階を刺激することにより機能することが証明されている。
【００２３】
よって本発明は、少なくとも１個の転写後調節エレメントが、ＷＰＲＥエレメントを含むことを特徴とする、上述のようなベクターを含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明の好ましい態様は、該ＷＰＲＥエレメントが、配列番号１の全部又は機能性断片を含むことを特徴とする、上述のようなベクターに関する。
【００２５】
配列番号１：
【００２６】
【表１】
2005523725.tif 000002
【００２７】
本発明はまた、少なくとも１個の転写後調節エレメントが、真核生物ｍＲＮＡのＵＴＲ領域の全部又は一部を含むことを特徴とする、上述のようなベクターを含む。ＵＴＲ領域は、ＷＰＲＥ、ヒトのアルツハイマー病アミロイド前駆体（ＡＰＰ）ｍＲＮＡの５′ＵＴＲ（ＡＰＰ５′ＵＴＲ）、ラットｔａｕ  ｍＲＮＡの３′ＵＴＲ（ｔａｕ３′ＵＴＲ）、ラットのチロシンヒドロキシラーゼｍＲＮＡの３′ＵＴＲ（ＴＨ３′ＵＴＲ）の断片、又はその機能性部分から選択することができる。
【００２８】
本発明の特定の目的は、少なくとも１個の転写後調節エレメントがＡＰＰ５′ＵＴＲ領域である、哺乳動物細胞への導入遺伝子送達に適した、上述のようなベクターに関する。更に別の好ましい態様において、ＡＰＰ５′ＵＴＲ領域は、ＳｍａＩ−ＮｒｕＩ  配列番号２（ヌクレオチド５０〜１４４）の全部又は機能性断片を含むことを特徴とする。
【００２９】
配列番号２：
【００３０】
【表２】
2005523725.tif 000003
【００３１】
本発明は、グリア細胞において、ＷＰＲＥ及びＡＰＰ５′ＵＴＲが、発現を約１０倍と相乗的に上昇させること、並びに線維芽細胞において、ＷＰＲＥ及びＡＰＰ５′ＵＴＲが、発現を約６倍と相乗的に上昇させることを示している。よって本発明の特定のベクターは、ＷＰＲＥエレメント及びＡＰＰ５′ＵＴＲ領域に作動可能に結合した導入遺伝子を含む、キメラ遺伝子構築体を含むことを特徴とする。
【００３２】
本発明はまた、少なくとも１個の転写後調節エレメントがｔａｕ３′ＵＴＲ領域である、哺乳動物細胞への導入遺伝子送達に適した、上述のようなベクターに関する。好ましい態様において、ｔａｕ３′ＵＴＲ領域は、配列番号３の全部又は機能性断片（ヌクレオチド２５１９〜２７６０）を含むことを特徴とする。
【００３３】
配列番号３：
【００３４】
【表３】
2005523725.tif 000004
【００３５】
本発明は、神経細胞株において、ＷＰＲＥ及びｔａｕ３′ＵＴＲとＡＰＰ５′ＵＴＲとの両方が発現に及ぼす相乗作用（基礎レベルの最大約２６倍）を有することを示している。よって本発明の別の特定の目的は、哺乳動物細胞（例えば、神経系細胞）への導入遺伝子送達に適したベクターに関するものであり、ここで該ベクターは、ＷＰＲＥエレメント、ＡＰＰ５′ＵＴＲ領域及びｔａｕ３′ＵＴＲ領域に作動可能に結合した導入遺伝子を含む、キメラ遺伝子構築体を含むことを特徴とする。
【００３６】
本発明はまた、少なくとも１個の転写後調節エレメントがＴＨ３′ＵＴＲ領域である、哺乳動物細胞への導入遺伝子送達に適した、上述のようなベクターに関する。好ましい態様において、ＴＨ３′ＵＴＲ領域は、配列番号４の全部又は機能性断片（ｐＴＨ５１の部分）を含むことを特徴とする。
【００３７】
配列番号４：
【００３８】
【表４】
2005523725.tif 000005
【００３９】
本発明は、ＷＰＲＥ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ及びｔａｕ３′ＵＴＲとＴＨ３′ＵＴＲとの両方が、発現に及ぼす相乗作用を有することを示している。次に本発明の更に別の特定の目的は、神経系細胞への導入遺伝子送達に適したベクターに関するものであり、ここで該ベクターは、ＷＰＲＥエレメント、ＡＰＰ５′ＵＴＲ領域、ｔａｕ３′ＵＴＲ領域及びＴＨ３′ＵＴＲ領域に作動可能に結合した導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を含むことを特徴とする。
【００４０】
哺乳動物細胞における発現の更なる増強は、イントロンのような、追加の調節エレメントを用いることにより可能であろう。よって本発明はまた、更にイントロンを含む、上述のようなベクターに関する。
【００４１】
本発明の好ましい実施態様において、上述のようなベクター又はキメラ遺伝子構築体は、該哺乳動物細胞における導入遺伝子の転写を制御するプロモーターを更に含むことを特徴とする。本発明に関して、色々な種類のプロモーターを使用することができる。これらは、強くとも弱くともよく、組織特異的であっても汎存してもよく、調節されていても構成的であってもよい。標的細胞集団において転写的に機能性である限り、一般には任意のプロモーターを使用することができる。よってこれは、ウイルスのプロモーター、細胞のプロモーター（例えば、ハウスキーピングプロモーター）、細菌のプロモーターなどであってよい。例えば、ウイルスのプロモーターは、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＬＴＲ、ＴＫなどから選択することができる。細胞のプロモーターは、β−アクチン、ＰＧＫ、アポリポプロテイン、アルブミン及びユビキチンＣ遺伝子のプロモーターから選ぶことができ、そして細菌のプロモーターは、ｐＬａｃ、ｐＴｒｐ、Ｔ７、ｐＴＡＣなどから選択することができる。最も好ましいプロモーターは、ウイルス又は細胞のプロモーター、更にはこれらの種々の組合せ又は合成プロモーターである。
【００４２】
本発明はまた、上述のようなベクターを含むが、ここで該ベクターは、マーカー遺伝子を更に含むことを特徴とする。「マーカー遺伝子」とは、本明細書で使用されるとき、その発現を、任意の公知の技術（栄養要求性、蛍光、ルミネセンス、耐性など）により、検出、観察又は測定することができる、任意の遺伝子又は核酸配列であってよい。よって本発明に関連して、例えば、ハイグロマイシン、ネオマイシン又はフレオマイシン耐性遺伝子、並びにルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を始めとする、種々の遺伝子をマーカー遺伝子として使用することができる。
【００４３】
本発明の更に別の目的は、上述のようなベクターに関するものであり、ここで該ベクターは、該導入遺伝子及び転写後調節エレメントに作動可能に結合したポリアデニル化シグナルを更に含むことを特徴とする。好ましいポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである。
【００４４】
本発明のベクターは、プラスミド、組換えウイルス、コスミド、人工染色体、エピソームなどのような、種々の型と起源のものであってよい。最も好ましいベクターは、プラスミド又はウイルスベクター、特にプラスミド及び組換えウイルスである。典型例は、市販のプラスミド（特にｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなど）から誘導されるプラスミドのようなものを含む。他の好ましいベクターは、複製欠損アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２）、複製欠損アデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）、若しくは複製欠損レンチウイルスを含む複製欠損レトロウイルス（例えば、ＭＬＶ、ＦＬＶ、ＨＩＶ、ＥＩＡＶなど）、バキュロウイルス又はワクシニアウイルスのようなウイルスから誘導される。組換えウイルスは、既知の技術（例えば、パッケージング細胞、一過性トランスフェクション、ヘルパープラスミド又はウイルスなど）を用いて調製することができる。ベクターの選択は、標的細胞、集団、組織又は臓器に応じて当業者により行われる。好ましいベクターは、哺乳動物細胞にインビトロ、エクスビボ又はインビボで感染又はトランスフェクトすることができる。
【００４５】
上述のように、本発明のベクターは、導入遺伝子を含むことを特徴とする。導入遺伝子は、生物学的産物（ＲＮＡ、ポリペプチドなど）をコードする任意の核酸であってよい。核酸は、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｇＤＮＡであってよく、好ましくはｃＤＮＡである。一般に、本発明は、関心ある任意のポリペプチド、例えば、生物学的性質又は免疫性を有する任意のポリペプチドを産生するために利用することができる。更に、本発明は、細胞中で相異なるポリペプチドをコードする幾つかの相異なるキメラ遺伝子構築体を同時に発現するか又は標的とするために、更には活性の範囲を拡大するため、又は複合分子を再構成ために利用することができる。コードされるポリペプチドは、任意のポリペプチドであってよく、そして好ましくはサイトカイン（ＩＬ−２、ＴＮＦ、ＩＦＮなど）、リガンド、受容体、イムノグロブリン、成長因子、神経栄養因子（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ、ＰＤＧＦ、ＳＣＦなど）、酵素又はその一部から選択される。これらのポリペプチドの核酸及びアミノ酸配列は、それ自体既知であり、そしてＤＮＡライブラリー、市販のプラスミドから、又は組換えＤＮＡ技術により得ることができる。
【００４６】
本発明の組成物及び方法は、驚くべきことに、哺乳動物細胞、特にＣＮＳの神経系細胞において治療用産物を産生させるベクター送達システムの能力を増強する。本出願の実験部分では、特に両方の表現型の神経系細胞（神経細胞及びグリア細胞）並びにまた線維芽細胞における導入遺伝子発現の増強を証明している。転写後調節エレメントの組合せは、相乗作用により発現を上昇させて、グリア細胞及び神経細胞株では、それぞれ最大１０倍及び２６倍の増強が生じ、ＷＰＲＥとＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せは、線維芽細胞における発現を６倍上昇させることができる。よって、これらのエレメントの組合せにより、実質的に少量のベクターで対象において治療効果を得ることができ、このためウイルス感染に伴う副作用と治療効果のために必要とされる１細胞当たりの導入遺伝子のコピー数との両方が減少する。
【００４７】
本発明は確かに、上述のようなキメラ遺伝子構築体を含む組換え細胞を含む。好ましい組換え宿主細胞は、哺乳動物細胞である。これらは、初代細胞であっても樹立細胞株であってもよい。実例としては、線維芽細胞、神経細胞及びグリア細胞並びにこれらの始原細胞又は前駆細胞を含む。
【００４８】
本発明はまた、ヒトの疾患、特に神経変性疾患の治療用医薬の製造のための、上述のようなキメラ遺伝子構築体、ベクター又は組換え細胞の使用を記述する。神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン舞踏病及び網膜変性疾患から選択することができる。
【００４９】
本発明の更に別の目的は、上述のようなキメラ遺伝子構築体、ベクター又は組換え細胞、及び薬学的に許容しうる賦形剤又は担体を含む組成物、並びに上述のようなヒトの疾患を治療するための該組成物の使用に関する。
【００５０】
本発明の特定の目的は、パーキンソン病を治療するための栄養因子であるＧＤＮＦのウイルス介在性送達に関する。ＧＤＮＦは実際に、黒質線状体変性の構造的及び機能的相関を逆転させるか、又は防止する。
【００５１】
本発明はまた、インビボ、インビトロ又はエクスビボで哺乳動物細胞内で導入遺伝子を発現させる方法であって、
ａ）少なくとも２個の相異なる転写後調節エレメントに作動可能に結合した該導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体、又は上述のようなベクターを準備すること、及び
ｂ）該構築体又は該ベクターを哺乳動物細胞に導入し、該導入が、該哺乳動物細胞内で該導入遺伝子の発現を引き起こすこと
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００５２】
上述の方法に関連して、哺乳動物細胞は、好ましくはグリア細胞（例えば、Ｃ６、Ｕ−８７ＭＧ）、神経細胞（例えば、ＰＣ１２、ＮＧＦ処理ＰＣ１２、ＳＫＮＳＨ）及び線維芽細胞のような他の細胞型から選択される。哺乳動物は、好ましくはヒト又は齧歯類（例えば、マウス又はラット）である。神経系細胞への遺伝子送達及び発現に特に適しているが、本発明はまた、他の組織、臓器又は細胞型（造血細胞、線維芽細胞、上皮細胞、筋肉細胞（平滑筋及び骨格筋）など）においても利用することができる。特定の臓器としては、ＣＮＳ、脳、網膜、肝臓、皮膚、筋肉などを含む。
【００５３】
上述のような方法において、遺伝子構築体（又はベクター）は、裸のＤＮＡ法、カチオン性脂質介在性トランスフェクション、ポリマー介在性トランスフェクション、ペプチド介在性トランスフェクション、ウイルス介在性感染、物理的又は化学的な物質又は処理などのような、任意の従来法により哺乳動物細胞に導入することができる。この点に関して、一過性トランスフェクションにより、当のキメラ遺伝子を充分に発現させられるため、安定な細胞株を創出したり、又はトランスフェクション条件を最適化する必要がないことに注目すべきである。キメラ遺伝子構築体又はベクターは、工程ｂ）の間に、好ましくはウイルス介在性感染、例えば、ＣＮＳ（線条体及び／又は黒質）への定位注入によるか、又はプラスミド介在性トランスフェクション、例えば、電気穿孔法により、哺乳動物細胞に導入することができる。
【００５４】
本発明によりグリア細胞内で導入遺伝子を発現させる特定の方法は、
ａ）ＡＰＰ５′ＵＴＲ又はその一部と組合せたＷＰＲＥエレメントを含む転写後調節エレメントに作動可能に結合した該導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を準備すること、及び
ｂ）該構築体をグリア細胞に導入し、該導入が、該グリア細胞内で該導入遺伝子の発現を引き起こすこと
を含むことを特徴とする方法である。
【００５５】
本発明により線維芽細胞内で導入遺伝子を発現させる別の特定の方法は、
ａ）ＡＰＰ５′ＵＴＲ又はその一部と組合せたＷＰＲＥエレメントを含む転写後調節エレメントに作動可能に結合した該導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を準備すること、及び
ｂ）該構築体を線維芽細胞に導入し、該導入が、該線維芽細胞内で該導入遺伝子の発現を引き起こすこと
を含むことを特徴とする方法である。
【００５６】
本発明により神経細胞内で導入遺伝子を発現させる更に別の特定の方法は、
ａ）ＡＰＰ５′ＵＴＲ及びｔａｕ３′ＵＴＲ又はその一部と組合せたＷＰＲＥエレメントを含む転写後調節エレメントに作動可能に結合した該導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を準備すること、及び
ｂ）該構築体を神経細胞に導入し、該導入が、該神経細胞内で該導入遺伝子の発現を引き起こすこと
を含むことを特徴とする方法である。
【００５７】
本発明により神経細胞内で導入遺伝子を発現させる別の方法は、
ａ）ＡＰＰ５′ＵＴＲ、ｔａｕ３′ＵＴＲ及びＴＨ３′ＵＴＲ又はその一部と組合せたＷＰＲＥエレメントを含む転写後調節エレメントに作動可能に結合した該導入遺伝子を含むキメラ遺伝子構築体を準備すること、及び
ｂ）該構築体を神経細胞に導入し、該導入が、該神経細胞内で該導入遺伝子の発現を引き起こすこと
を含むことを特徴とする方法である。
【００５８】
以下の実施例は、説明のために与えられるものであり、限定するためではない。
【００５９】
図面の説明
図１：神経細胞株及びグリア細胞株におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ及びＷＰＲＥの作用。
Ａ）ルシフェラーゼ遺伝子の３′又は５′末端に転写後調節エレメントを含む構築体の概要図。これらのエレメントは、ＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲである。
【００６０】
Ｂ）０．５８pmol（〜２μg）の構築体：ｐｌｕｃ、ｐｌｕｃ−ｔａｕ、ｐｌｕｃ−ＴＨ、ｐＡＰＰ−ｌｕｃ及びｐｌｕｃ−ＷＰＲＥを使用して、（ａ）神経細胞株：ＰＣ１２、ＮＧＦ処理ＰＣ１２、ＳＫＮＳＨ、及び（ｂ）グリア細胞株：Ｃ６、Ｕ−８７ＭＧをトランスフェクトした。各転写後調節エレメントで得られたルシフェラーゼ活性を、同じ抽出物で測定された、同時トランスフェクション内部対照プラスミドからのウミシイタケ活性に対して標準化した。標準化ルシフェラーゼ活性は、転写後調節エレメントを欠く構築体（ｐｌｕｃ）により得られた活性（これを任意に１．０に設定する）に対して表される。ヒストグラムは、少なくとも３回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。各実験において、三重反復のトランスフェクションが行われた。スチューデントのｔ検定を利用して、構築体とｐｌｕｃの間のルシフェラーゼ活性を比較した。*、有意差あり（ｐ＜０．０５）。
【００６１】
図２：神経細胞株及びグリア細胞株におけるｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ又はＡＰＰ５′ＵＴＲと組合せたＷＰＲＥの作用。
Ａ）ＷＰＲＥ及びそれぞれの真核生物配列を含むルシフェラーゼ構築体の概要図。
【００６２】
Ｂ）５８fmol（〜０．２μg）の構築体：ｐｌｕｃ−Ｗ、ｐｌｕｃ−ｔａｕ−Ｗ、ｐｌｕｃ−ＴＨ−Ｗ及びｐＡＰＰ−ｌｕｃ−Ｗを使用して、（ａ）神経細胞株：ＰＣ１２、ＮＧＦ処理ＰＣ１２、ＳＫＮＳＨ、及び（ｂ）グリア細胞株：Ｃ６、Ｕ−８７ＭＧをトランスフェクトした。各構築体で得られたルシフェラーゼ活性は、図１に記載されたように標準化して表した。*、ＷＰＲＥについて得られた値と有意差がある（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。
【００６３】
図３：神経細胞株におけるｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せの作用。
Ａ）真核生物配列の組合せを含むレポーター遺伝子構築体の概要図。
【００６４】
Ｂ）５８fmol（〜０．２μg）の構築体：ｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ｔａｕ、ｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＴＨ及びｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＴＨ−ｔａｕを使用して、神経細胞株：ＰＣ１２、ＮＧＦ処理ＰＣ１２及びＳＫＮＳＨをトランスフェクトした。各構築体で得られたルシフェラーゼ活性は、図１に記載されたように標準化して表した。*、ｐＡＰＰ−ｌｕｃについて得られた値と有意差がある；**、ｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ｔａｕ及びｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＴＨについて得られた値と有意差がある（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。ｎｓ、有意でない。
【００６５】
図４：神経細胞株における転写後調節エレメントの最適化組合せ。
Ａ）ＰＣ１２、ＮＧＦ処理ＰＣ１２細胞（ｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＷＰＲＥ−ＴＨ−ｔａｕ）又はＳＫＮＳＨ細胞（ｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＷＰＲＥ−ｔａｕ）における発現のための、ＷＰＲＥと真核生物エレメントとの最適化組合せを含むルシフェラーゼ構築体の概要図。
【００６６】
Ｂ）ＳＫＮＳＨは、５０fmol（〜０．２μg）のｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＷＰＲＥ−ＴＨでトランスフェクトした。ＰＣ１２及びＮＧＦ処理ＰＣ１２は、〜０．２μg（５８fmol）のｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＷＰＲＥ−ＴＨ及びｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＷＰＲＥ−ＴＨ−ｔａｕでトランスフェクトした。各構築体で得られたルシフェラーゼ活性は、図１に記載されたように標準化して表した。*、ｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＷＰＲＥについて得られた値と有意差がある（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。
【００６７】
図５：ルシフェラーゼ発現に及ぼすｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ及びＷＰＲＥの作用は、トランスフェクトするプラスミドの用量に依存する。
ＰＣ１２細胞は、種々の量のｐｌｕｃ−ｔａｕ、ｐｌｕｃ−ＴＨ、ｐＡＰＰ−ｌｕｃ及びｐｌｕｃ−ＷＰＲＥ（２〜１６μg／１．５×１０6細胞）でトランスフェクトした。各構築体で得られたルシフェラーゼ活性は、図１に記載されたように標準化して表した。線形回帰分析によって、トランスフェクトしたプラスミドの量とルシフェラーゼ発現に及ぼすｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＷＰＲＥの作用の間には相関が示されたが、このことは、線形の用量依存性（相関係数：ｔａｕ３′ＵＴＲではｒ＝０．９０；ＴＨ３′ＵＴＲではｒ＝０．９４；ＡＰＰ５′ＵＴＲではｒ＝０．８６；及びＷＰＲＥではｒ＝０．８９）を示している。
【００６８】
図６：神経細胞株及びグリア細胞株における、転写後調節エレメントの組合せによるＧＤＮＦ分泌の刺激。
Ａ）転写後調節エレメントを、単独又は組合せでｇｄｎｆ遺伝子の３′又は５′末端に含む、種々の構築体の略図。
【００６９】
Ｂ）ＰＣ１２、ＮＧＦ処理ＰＣ１２及びＳＫＮＳＨは、５８fmol（〜０．２μg）の構築体：ｐｇｄｎｆ、ｐｇｄｎｆ−ｔａｕ、ｐｇｄｎｆ−ＴＨ、ｐＡＰＰ−ｇｄｎｆ、ｐｇｄｎｆ−ＷＰＲＥ、ｐＡＰＰ−ｇｄｎｆ−ＷＰＲＥ及びｐＡＰＰ−ｇｄｎｆ−ＷＰＲＥ−ｔａｕでトランスフェクトした。Ｃ６、Ｕ−８７ＭＧは、５８fmol（〜０．２μg）のｐｇｄｎｆ、ｐＡＰＰ−ｇｄｎｆ、ｐｇｄｎｆ−ＷＰＲＥ及びｐＡＰＰ−ｇｄｎｆ−ＷＰＲＥでトランスフェクトした。細胞上清中のＧＤＮＦの濃度は、細胞溶解物で測定された、同時トランスフェクトした内部対照からのウミシイタケ活性に対して標準化した。標準化ルシフェラーゼ活性は、転写後調節エレメントを欠く構築体（ｐｇｄｎｆ）について得られた活性（これを任意に１．０に設定する）に対して表される。ヒストグラムは、少なくとも３回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。各実験において、三重反復のトランスフェクションが行われた。*、ｐｇｄｎｆの値よりも有意に高い（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。**、ｐｇｄｎｆ−ＷＰＲＥについて得られた値よりも有意に高い。***、ｐＡＰＰ−ｇｄｎｆ−ＷＰＲＥについて得られた値よりも有意に高い。
【００７０】
図７：ルシフェラーゼ発現に及ぼすＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲの相乗作用。（１９ページを参照のこと）
ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ及びＷＰＲＥを単独又は組合せで含む各構築体に関して得られた相対ルシフェラーゼ活性の値が与えられる（データは、組合せると、発現に及ぼす各エレメントの作用が累積される度合で図示される）。この比率は、エレメントの組合せで得られた相対ルシフェラーゼ活性を、各エレメントの作用の積で割ることにより計算した。これは、百分率として表される。１００％の比率は、エレメントが、組合せられたときに、ルシフェラーゼ転写物のＵＴＲに単独で存在したときと発現の増強に及ぼす作用は同じであることを示す。ｎｄ、測定せず。
【００７１】
図８：ＷＰＲＥとＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せはまた、ラット線維芽細胞株３Ｔ３においても有効であった。
３Ｔ３細胞は、５８fmol（〜０．２μg）のｐｌｕｃ−ＷＰＲＥｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＷＰＲＥ、ｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＷＰＲＥ−ＴＨ及びｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＷＰＲＥ−ＴＨ−ｔａｕでトランスフェクトした。各構築体で得られたルシフェラーゼ活性は、図１に記載されたように標準化して表した。
【００７２】
材料と方法
プラスミド構築
種々の転写後調節エレメントの調節制御下にホタルルシフェラーゼ遺伝子又はラットＧＤＮＦ  ｃＤＮＡを発現する一連のプラスミドベクターを構築した。ホタルルシフェラーゼプラスミドは、ｐＧＬ３−コントロール（プロメガ（Promega））から誘導した。ＧＤＮＦプラスミドはｐｇｄｎｆから誘導されるが、これは、ＣＭＶプロモーターから下流のｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン（Invitrogen））のＢａｍＨＩ部位への全ラットＧＤＮＦ  ｃＤＮＡ（Bilang-Bleuelら, 1997）の挿入により構築した。ラットｔａｕ３′ＵＴＲのヌクレオチド２５１９〜２７６０を含む２４１塩基対断片は、I. Ginzburg（ヴァイツマン科学研究所（Weizmann Institute of Science）、イスラエル；Aronovら, 1999）により提供された。ラットＴＨ３′ＵＴＲの最初の９０塩基対を含む断片は、ｐＴＨ５１（断片ＫｐｎＩ−ＡｐａＩ；Grimaら, 1985）から誘導した。６００塩基対ＷＰＲＥは、D. Trono博士（遺伝学及び微生物学部（Department of Genetics and Microbiology）、スイス）により提供された。これらのエレメント（ＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲ及びＴＨ３′ＵＴＲからの配列）とその組合せは、ルシフェラーゼ及びｇｄｎｆ遺伝子にｍＲＮＡの３′末端に相当する位置で、それぞれＸｂａＩ部位及びＡｐａＩ部位への平滑末端連結法により挿入した。ＫｐｎＩ制限部位が隣接するヒトＡＰＰ５′ＵＴＲのＳｍａＩ−ＮｒｕＩ配列（ヌクレオチド５０〜１４４；Rogersら, 1999）を含む２個の相補オリゴヌクレオチドをアニールした。生じた２本鎖オリゴヌクレオチドを、ＳＶ４０プロモーターから下流のｐＧＬ３−コントロールベクターのＨｉｎｄIII部位、及びＣＭＶプロモーターから下流のｐｇｄｎｆのＫｐｎＩ部位に挿入した。全てのプラスミドＤＮＡは、ジェットスター（Jetstar）プラスミド精製システム（ジェノメド（Genomed））を用いて調製した。本文の実験部分及びプラスミドの命名法を簡単にするために、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲからの配列は、それぞれ、本文ではｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲと称し、そしてプラスミド構築ではｔａｕ、ＴＨ及びＡＰＰと称する。
【００７３】
細胞培養
ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫）は、１０％ウマ血清（シグマ（Sigma））及び５％ウシ胎仔血清（シグマ）を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ）で増殖させ、５％  ＣＯ2中で３７℃で維持した。ＮＧＦ処理については、１．２５×１０5細胞をコラーゲン被覆１２ウェルプレートに蒔き、１％ウシ胎仔血清及び５０ng/mlのＮＧＦ（シグマ）を補足したＤＭＥＭ（シグマ）で増殖させた。ＮＧＦは、２日毎に６又は８日間加えた。ＳＫＮＳＨ（ヒト神経芽細胞腫）、Ｃ６（ラット星状細胞腫）及びＵ−８７ＭＧ（ヒト星状細胞腫）は、１０％ウシ胎仔血清及び２mMのＬ−グルタミンを補足したＤＭＥＭで増殖させた。
【００７４】
一過性トランスフェクション
１．５〜２．０×１０6細胞（ＰＣ１２、ＳＫＮＳＨ、Ｃ６及びＵ−８７ＭＧ）を、０．２mlの無血清培地に再懸濁して、５８０又は５８fmol（〜２又は０．２μg）のレポータープラスミドの１つ、及びトランスフェクション効率の差を補正するための内部対照としての０．０２μgのウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（ｐＲＬ−ＳＶ４０；プロメガ（Promega））で電気穿孔法によりトランスフェクトした。１９０Ｖ（ＰＣ１２）、１５０Ｖ（ＳＫＮＳＨ）及び２５０Ｖ（Ｃ６及びＵ−８７ＭＧ）で、９６０μFで５０msのバイオラッド（Biorad）遺伝子パルサーを電気穿孔法のために使用した。電気穿孔後、細胞を血清含有培地に入れた。ＮＧＦ処理ＰＣ１２のトランスフェクションは、リポフェクタミンプラス試薬（Lipofectamine Plus Reagent）（ギブコライフテクノロジーズ（Gibco Life Technologies））を使用して実施した。ＮＧＦ処理ＰＣ１２細胞は、３３０又は３３fmol（〜１．１又は０．１１μg）のレポータープラスミドの１つ、０．１１μgのｐＲＬ−ＳＶ４０、及び担体ＤＮＡ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ストラタジーン（Stratagene））の混合物でトランスフェクトすることにより、全部で０．５μgのＤＮＡ、及び５μlのプラス試薬とリポフェクタミンの両方が得られた。細胞は、トランスフェクションの４８時間後に回収した。ホタル及びウミシイタケのルシフェラーゼ活性は、デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Dual-Luciferase Reporter Assay System）（プロメガ）を用いて測定した。発光は、ルマット（Lumat）ＬＢ９５０１（バーソルド（Berthold））照度計で測定した。細胞上清中のＧＤＮＦタンパク質濃度は、ＥＬＩＳＡキット（プロメガ）を用いて測定した。ホタルルシフェラーゼ活性及びＧＤＮＦ濃度は、細胞抽出物中のウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。各株について、３〜５回の独立したトランスフェクション実験を実施した。
【００７５】
結果
１．ルシフェラーゼ発現に及ぼすＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲの作用
神経系細胞におけるルシフェラーゼ発現を増強する、ＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲの能力を試験した。レポータープラスミドにおいて、４個のエレメントのそれぞれは、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の３′又は５′末端のいずれかに配置した（図１Ａ）。全ての構築は、ｐＧＬ３−コントロールベクターにおいて行われ、そしてこのベクターは、対照プラスミドとして使用した。ＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲ及びＴＨ３′ＵＴＲは、ルシフェラーゼの終止コドンとＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの間に挿入した（ｐｌｕｃ−ＷＰＲＥ、ｐｌｕｃ−ｔａｕ及びｐｌｕｃ−ＴＨ）。ＡＰＰ５′ＵＴＲは、ＳＶ４０プロモーターとコザック（Kozak）配列の間に配置した（ｐＡＰＰ−ｌｕｃ）。各ベクターからのルシフェラーゼ発現は、神経細胞（ＳＫＮＳＨ及びＰＣ１２（神経分化を増強するためにＮＧＦで処理したものと処理しないものの両方））及びグリア細胞（Ｕ−８７Ｍ及びＣ６）表現型の細胞株の一過性トランスフェクションにより分析した。ラットは、ＣＮＳ遺伝子治療プロトコールを開発するために広く使用されているため、ヒトの細胞株（ＳＫＮＳＨ、Ｕ−８７ＭＧ）とラットの細胞株（ＰＣ１２、Ｃ６）の両方を使用した。ｐＧＬ３−コントロールベクターからのルシフェラーゼ発現を１．０として、他の全てのベクターの活性は、この値に対して表される。
【００７６】
神経細胞株とグリア細胞株の両方において、最高レベルのルシフェラーゼ発現は、ｐｌｕｃ−ＷＰＲＥで得られた（図１Ｂ、ａ及びｂ）。これは、ＮＧＦ処理ＰＣ１２で４倍、そしてＰＣ１２及びＳＫＮＳＨで７倍上昇した（図１Ｂ、ａ）。グリア細胞において、ＷＰＲＥによる刺激のレベルも有意であったが、神経細胞株で観測された値よりも低かった：ルシフェラーゼ発現は、Ｃ６では対照値の４．５倍であり、そしてＵ−８７ＭＧでは２．６倍であった（図１Ｂ、ｂ）。ＡＰＰ５′ＵＴＲもまた、神経細胞株とグリア細胞株の両方でルシフェラーゼ発現を上昇させた。ＡＰＰ５′ＵＴＲにより、神経細胞では１．９〜２．５倍高い発現が、そしてグリア細胞では１．６〜２．０倍高い発現が得られた。Ｃ６とＵ−８７ＭＧの両方のグリア細胞株において、ｔａｕ３′ＵＴＲ及びＴＨ３′ＵＴＲは、ルシフェラーゼ発現を有意に上昇させることはできなかった。ＮＧＦ処理ＰＣ１２及びＳＫＮＳＨでは、ｔａｕ３′ＵＴＲ及びＴＨ３′ＵＴＲは発現を倍加させた（ｔａｕ３′ＵＴＲでは１．８及び１．６、ＴＨ３′ＵＴＲでは２．０及び１．９）。ＰＣ１２において、ｔａｕ３′ＵＴＲ及びＴＨ３′ＵＴＲは、それぞれ発現を１．５倍及び１．４倍上昇させた。
【００７７】
よってルシフェラーゼ発現は、神経細胞株ではＷＰＲＥ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ、ｔａｕ３′ＵＴＲ及びＴＨ３′ＵＴＲによって、そしてグリア細胞株ではＷＰＲＥ又はＡＰＰ５′ＵＴＲによって有意に増強された。
【００７８】
２．ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ、又はＡＰＰ５′ＵＴＲのいずれかと組合せたＷＰＲＥの作用。
転写後調節エレメントの組合せを試験した。ＷＰＲＥは、神経細胞とグリア細胞の両方においてルシフェラーゼ発現を促進する最強の能力を有するため、該ＷＰＲＥを他のエレメント（ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲ）のそれぞれと共に試験した。対のエレメントを併せ持つ一連のベクターは、ｐｌｕｃ−ｔａｕ、ｐｌｕｃ−ＴＨ及びｐＡＰＰ−ｌｕｃにおいて、ＷＰＲＥをルシフェラーゼ遺伝子から下流に挿入することにより得た（図２Ａ）。
【００７９】
２個のエレメントの全ての組合せによって、神経細胞とグリア細胞の両方において、ＷＰＲＥでの発現レベルと同様なレベルが得られた（データは図示せず）。１／１０量のプラスミド（５８０fmolの代わりに５８fmol）を使用して細胞をトランスフェクトするとき、これらのエレメントの組合せは、ルシフェラーゼ発現を実質的に上昇させた（図２Ｂ、ａ）。ＰＣ１２では、ＷＰＲＥをｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ又はＡＰＰ５′ＵＴＲと一緒にしたとき、発現は、それぞれ１７、１３．５又は１４倍増強された。これらの組合せは、ＮＧＦ処理ＰＣ１２では５倍、６．５倍及び８倍の増強をもたらし、そしてＳＫＮＳＨでは１１、１１、１３倍の増強をもたらした。同様に、グリア細胞株では、ＷＰＲＥとＡＰＰ５′ＵＴＲとの組合せだけがルシフェラーゼ発現を上昇させた（図２Ｂ、ｂ）：Ｃ６及びＵ−８７ＭＧでは、それぞれ７及び４倍という率で発現が増強された。予想通りに、これらの細胞においてＷＰＲＥをｔａｕ３′ＵＴＲ又はＴＨ３′ＵＴＲと組合せたとき、更なる上昇は検出されなかった。構築体のｐｌｕｃ−ｔａｕ−ＷＰＲＥ及びｐｌｕｃ−ＴＨ−ＷＰＲＥでは、Ｃ６及びＵ−８７ＭＧの両方においてｐｌｕｃ−ＷＰＲＥよりも低いルシフェラーゼ発現となった。これらのデータにより、ルシフェラーゼ発現を促進するｔａｕ３′ＵＴＲ及びＴＨ３′ＵＴＲの能力は、神経細胞型に限定されているという著者らの観測を確認した。
【００８０】
図７は、個々のエレメントの作用に対しての、ＷＰＲＥとｔａｕ、ＷＰＲＥとＴＨ３′ＵＴＲ、ＷＰＲＥとＡＰＰ５′ＵＴＲの複合作用を示す（図７、１、２、３及び７行を８、９及び１０行と比較せよ）。例えば、ＰＣ１２では、ＷＰＲＥとＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せで観測された１４．５倍の増強は、ＷＰＲＥ単独及びＡＰＰ５′ＵＴＲ単独で記録された上昇（それぞれ６．９倍及び１．９倍）の積と同等である。よってＷＰＲＥは、神経細胞株及びグリア細胞株における発現に対して真核生物エレメントと相乗的に作用する。
【００８１】
３．神経細胞株における、ＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲの他の組合せの作用。
ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せを試験した。２個の真核生物エレメント（ｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ｔａｕ及びｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＴＨ）又は３個のエレメント（ｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＴＨ−ｔａｕ）を併せ持つ一連のベクターを、ｐＡＰＰ−ｌｕｃにおいて構築した（図３Ａ）。神経細胞株では、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せが、ＡＰＰ５′ＵＴＲ単独よりも高いルシフェラーゼ発現をもたらした（図３Ｂ）。ＰＣ１２では、ｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ｔａｕ、ｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＴＨ及びｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＴＨ−ｔａｕが、それぞれ２．７倍、２．４倍及び３．４倍発現を増強した。ＮＧＦ処理ＰＣ１２では、対応する結果は、３．６倍、２．９倍及び５．４倍の増強であった。ＳＫＮＳＨでは、増強は、３．５倍、３．７倍及び３．７倍であった。よって、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せは、ＰＣ１２及びＮＧＦ処理ＰＣ１２におけるルシフェラーゼ発現を相乗的に上昇させた（図７、１、２及び３行を４、５及び６行と比較せよ）。ＳＫＮＳＨでは、ｔａｕ３′ＵＴＲ又はＴＨ３′ＵＴＲと一緒になったＡＰＰ５′ＵＴＲが、ルシフェラーゼ発現を相乗的に上昇させたが、３個全てのエレメントの組合せでは、２個のエレメントだけでの発現レベルと同様であった。このことは、ｔａｕ３′ＵＴＲとＴＨ３′ＵＴＲが、ＳＫＮＳＨでは累積作用を持たないことを示唆している。
【００８２】
最後に、４個の転写後エレメントの組合せの有効性をＰＣ１２、ＮＧＦ処理ＰＣ１２において調査し、またＷＰＲＥとｔａｕ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲとの組合せの有効性をＳＫＮＳＨにおいて調査した。ＷＰＲＥを、ベクターｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＴＨ−ｔａｕ及びｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ｔａｕに３′ＵＴＲから上流に挿入することにより、それぞれｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＴＨ−ＷＰＲＥ−ｔａｕ及びｐＡＰＰ−ｌｕｃ−ＷＰＲＥ−ｔａｕを得た（図４Ａ）。これらの組合せは、ルシフェラーゼ発現における非常に実質的な上昇をもたらした：ＰＣ１２及びＮＧＦ処理ＰＣ１２では、４個全てのエレメントの存在下で、ルシフェラーゼ発現がそれぞれ基準線の２６及び２５倍以上であった（図４Ｂ）。ＳＫＮＳＨでは、ＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せが、１７倍の増強をもたらした（図４Ｂ）。ＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲの組合せで得られる増強のレベル（図７、１、２、３及び７行を、ＳＫＮＳＨでは１１行と、そしてＰＣ１２及びＮＧＦ処理ＰＣ１２では１２行と比較せよ）。
【００８３】
４．ＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲによる、発現の増強のベクター用量依存性。
これらのエレメントのどれがコピー数の影響を受けたかを決定するために、ＰＣ１２細胞を種々の量（２、４、６、８及び１６μg）のｐｌｕｃ−ＷＰＲＥ、ｐｌｕｃ−ｔａｕ、ｐｌｕｃ−ＴＨ及びｐＡＰＰ−ｌｕｃでトランスフェクトした。ルシフェラーゼ発現を測定して、各用量のプラスミドについてｐＧＬ３−コントロールで得られたもの（１．０と定義）と比較した。ルシフェラーゼ発現がプラスミドの用量に対して線形に上昇したという事実を初めて立証したことによって、試験範囲にわたり転写は制限的でないことが確認された（データは図示せず）。４個全てのエレメントは、トランスフェクトされたプラスミドの数に影響を受けた：プラスミドの量が上昇すると、発現に及ぼすｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ及びＷＰＲＥ  ｐｌｕｃ−ＷＰＲＥの作用は、用量依存的に低下した（図５）。
【００８４】
よってＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲによるルシフェラーゼ発現の調節は、トランスフェクションに使用されるプラスミド分子の数に影響された。
【００８５】
５．ＷＰＲＥとＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せ、及びＷＰＲＥとｔａｕ３′ＵＴＲとＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せは、ＧＤＮＦ遺伝子の発現を増強した。
治療目的の候補であるＧＤＮＦ遺伝子を伴う、ＷＰＲＥ及び真核生物エレメント並びにこれらの組合せの作用を試験した。ＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲが、ＧＤＮＦ遺伝子発現に影響を及ぼすかどうかを最初に確認した。次にｐｇｄｎｆ−ＷＰＲＥ、ｐｇｄｎｆ−ｔａｕ、ｐｇｄｎｆ−ＴＨ及びｐｇｄｎｆ−ＡＰＰ（図６Ａ）を構築した。これらの構築体でトランスフェクトした神経細胞株及びグリア細胞株から、培養上清中に分泌されたＧＤＮＦは、ＥＬＩＳＡにより定量して、ｐｇｄｎｆについて得られたものと比較した。ＧＤＮＦ発現は、ＰＣ１２及びＮＧＦ処理ＰＣ１２ではｔａｕ３′ＵＴＲ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ及びＷＰＲＥにより増強された。ＳＫＮＳＨ及びグリア細胞では、ＧＤＮＦ発現は、ＷＰＲＥ及びＡＰＰ５′ＵＴＲにより上昇した（図６Ｂ）。ＴＨ３′ＵＴＲは、ＧＤＮＦ分泌を有意に増強しなかったため、以降の構築には使用しなかった。結果は、ルシフェラーゼ遺伝子での結果と同様であったが、このことは、これらのエレメントの活性が、導入遺伝子に特異的でないことを示している。次にＳＫＮＳＨ、グリア細胞（Ｃ６、Ｕ−８７ＭＧ）ではＡＰＰ５′ＵＴＲと組合せたＷＰＲＥ、そして神経細胞（ＰＣ１２、ＮＧＦ処理ＰＣ１２）ではＡＰＰ５′ＵＴＲ及びｔａｕ３′ＵＴＲと組合せたＷＰＲＥを試験した。グリア細胞では、ＷＰＲＥとＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せが、Ｃ６ではｐｇｄｎｆ及びｐｇｄｎｆ−ＷＰＲＥからの発現より１０及び２倍高い発現をもたらし、そしてＵ−８７ＭＧではｐｇｄｎｆ及びｐｇｄｎｆ−ＷＰＲＥからの発現より５及び１．４倍高い発現をもたらした（図６Ｂ）。ＳＫＮＳＨでは、この組合せが、３．７及び１．４倍高い発現をもたらした。ＰＣ１２及びＮＧＦ処理ＰＣ１２では、ｐＡＰＰ−ｇｄｎｆ−ＷＰＲＥ−ｔａｕが、それぞれ、ｐｇｄｎｆより１５及び７倍高い発現をもたらし、そしてｐｇｄｎｆ−ＷＰＲＥよりも約３倍高い発現をもたらした（図６Ｂ）。神経細胞ではＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せで、そしてグリア細胞ではＷＰＲＥとＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せで得られた発現の増強は、ＧＤＮＦ発現に及ぼすこれらのエレメントの作用が相乗作用であることを示した。
【００８６】
考察
今や本発明により、ＣＮＳにおける高レベル遺伝子発現のために転写後調節エレメントが使用できる。神経系細胞特異的ＤＮＡ調節エレメントを用いる根拠は、標的ＣＮＳ細胞が、通常これらのエレメントと相互作用する神経系トランス作用因子を含むことである。神経細胞及び／又は星状細胞における転写後経路の段階の効率を上昇させると推測される無比のエレメントは、ＷＰＲＥ、並びにラットｔａｕ３′ＵＴＲ、ラットＴＨ３′ＵＴＲ及びヒトＡＰＰ５′ＵＴＲからの配列であった。これらのエレメントは、ラット神経細胞株（ＴＨ３′ＵＴＲ、PauldingとCzyzyk-Krzeska, 1999）における、又はヒトとラット両方の神経細胞株（ｔａｕ３′ＵＴＲ、Aronovら, 1999）における；インビボでニューロンにおける（ＷＰＲＥ、Kaplittら, 1994）、又はヒト神経細胞株及びヒトグリア細胞株の両方における（５′ＵＴＲ  ＡＰＰ、Rogersら, 1999）発現を上昇させる。このような以前の観測が確認され、そして本発明は今や更に、ＷＰＲＥが神経細胞並びにグリア細胞における遺伝子発現を改善し、そしてＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲが、ラットとヒトの両方からの細胞における発現を改善することを立証する。よって４個全ての配列は、ラットとヒトの細胞の両方において活性である。本発明はまた、これらのエレメントが、遺伝子発現に及ぼす相乗作用を有することを立証する。
【００８７】
試験した４個の転写後調節エレメントの中で、ＷＰＲＥは、ヒトとラット起源両方の神経系細胞株における導入遺伝子発現に及ぼす最大の作用を有する。これは、特に神経細胞における発現を実質的に増強する。このような高レベルの増強は、他のトランスフェクト及び感染した培養細胞型において観測されるものと同様である（Zuffereyら, 1999；Loebら, 1999）。遺伝子発現に及ぼすｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲの作用は、明白なものではない。ＡＰＰ５′ＵＴＲは、神経細胞とグリア細胞の両方において発現を倍加させるが、一方ｔａｕ３′ＵＴＲとＴＨ３′ＵＴＲもまた発現を倍加させるがこっちは神経細胞においてのみである。異なる機能を累積することによりウイルス遺伝子の高レベルの発現を保証することが判明したＷＰＲＥとは異なり、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲからの転写後調節エレメントは、特異的遺伝子の発現の調節に関わっている。これらの配列の作用は、穏やかであり、かつ細胞型に特異的である。ｔａｕ３′ＵＴＲからの配列は、ｔａｕ  ｍＲＮＡを安定化して、神経分化の間にこれが微小管の近くに局在することを保証する。このプロセスには、ニューロン特異的ＥＬＡＶ様ＨｕＤ  ＲＮＡ結合タンパク質が介在する（Aranda-Abreuら, 1999）。ニューロンのみにおけるこのタンパク質の発現は、ｔａｕ３′ＵＴＲ作用の神経特異性を説明する。このタンパク質のレベルは、ＮＧＦ誘導性分化中のＰＣ１２において上昇（Dobashiら, 1998）しており、これは神経分化において観測されるｔａｕ３′ＵＴＲによる発現増強の上昇とよく相関する。ＴＨ３′ＵＴＲは、ＴＨ  ｍＲＮＡの構造性及び低酸素調節性の両方の安定性に必要な安定化エレメントである、２８塩基配列を含む。この配列は、ポリ（Ｃ）結合タンパク質のＰＣＢＰにより認識される（HolcikとLiebhaber, 1997；PauldingとCzyzyk-Krzeska, 1999）。ＰＣＢＰは、汎存すると考えられ（Aasheimら, 1994；Leffersら, 1995）、そしてＴＨ３′ＵＴＲは、神経細胞においてのみ発現を刺激するため、ＴＨ３′ＵＴＲによる刺激の機序を理解するには、ＰＣＢＰがどのように調節されるかを決定することが更に重要であろう。
【００８８】
４個の転写後調節エレメントのｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ及びＷＰＲＥは、これらが組合せられるとき、発現に及ぼす相乗作用を有する。この相乗作用は、これらのエレメントの機能が重複していないことを示唆する。おそらく、ＷＰＲＥ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ、ｔａｕ３′ＵＴＲ及びＴＨ３′ＵＴＲは、転写後経路における異なる段階の効率を改善するか、又は同じ段階に作用するが異なる機序による。異なる段階がこれらの配列により影響を受けることは以前に証明されている。ＡＰＰ５′ＵＴＲは、ｍＲＮＡ翻訳を調節する（Rogersら, 1999）。ｔａｕ３′ＵＴＲ及びＴＨ３′ＵＴＲからの配列は、ｍＲＮＡ安定性に作用する（Aronovら, 1999；PauldingとCzyzyk-Krzeska, 1999）。ＷＰＲＥは、多段階に作用するがしかし、おそらくＲＮＡ転写物が転写機構から出現するとすぐに、その効率的プロセッシングを指示することにより、主としてＲＮＡ転写物の生物発生における非常に早期に作用する（Zuffereyら, 1999；Loeb, 2000）。ＰＣ１２細胞におけるｍＲＮＡ安定性に対して、ｔａｕ３′ＵＴＲとＴＨ３′ＵＴＲのような同じ段階に作用するエレメントの間の相乗作用を説明するために、これらの配列が遺伝子発現に作用する分子機序を同定する必要がある。これは、発現に及ぼすｔａｕ３′ＵＴＲとＴＨ３′ＵＴＲの間の相乗作用に必要な条件、ＮＧＦで処理したＰＣ１２細胞と未処理の同細胞の両方には存在するが、ＳＫＮＳＨには存在しない条件を明らかにするであろう。
【００８９】
転写後調節は、律速になりうる。本発明は、ＷＰＲＥ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ、ｔａｕ３′ＵＴＲ及びＴＨ３′ＵＴＲの作用が、導入遺伝子のコピー数に依存することを示す：発現に及ぼす４個のエレメントの作用は、トランスフェクトしたプラスミドの量が増加するにつれ低下した。これは、トランス作用因子のその標的配列による力価測定を示唆しており、そしてこれらのエレメントが介在する転写後プロセスが律速になるという事実を示唆している。これは、おそらく細胞内のトランス作用因子の低い存在量、又は強力なＳＶ４０プロモーターにより転写されるｍＲＮＡの高いコピー数のいずれか、あるいは両方のためである。一過性トランスフェクションでは、細胞の画分が、トランスフェクト分子の大部分を取り込んでいることに注目すると興味深い。
【００９０】
発明は、ＷＰＲＥとＡＰＰ５′ＵＴＲ、ｔａｕ３′ＵＴＲの間の組合せをベクターに含めると、ＣＮＳ遺伝子治療に役立つであろうことを示している。第１に、既に効率的に発現されている導入遺伝子の実質的な増強が、これらの組合せにより得られた。グリア細胞における最高レベルの発現は、ＡＰＰ５′ＵＴＲ＋ＷＰＲＥで得られ、そして神経細胞では、ｔａｕ３′ＵＴＲ＋ＡＰＰ５′ＵＴＲ＋ＷＰＲＥで得られた。これらの組合せにより、実質的に少ないベクターで治療目的を達成することができ、これによってウイルス注入伴う副作用と、１細胞当たりに必要とされる導入遺伝子のコピー数の両方が低下する。第２に、これらのエレメントは、ＣＮＳに影響する疾患の遺伝子治療のための２つの主要な標的細胞型：神経細胞及びグリア細胞における導入遺伝子発現を改善する。最後に、本発明は、これらの組合せが治療用遺伝子のＧＤＮＦでも活性であることを示している。ＧＤＮＦは、ＣＮＳのドーパミン含有ニューロンのための強力な栄養因子であり（Bilang-bleuelら, 1997；Kordowerら, 2000）そしてパーキンソン病の治療のための可能性ある候補である。
【００９１】
結論として、本発明は、シス作用エレメントのｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ及びＷＰＲＥでの転写後プロセスの改善が、既に充分発現されている導入遺伝子の発現を更に上昇させることができる（ただし、発現している細胞内のｍＲＮＡ濃度が高すぎないならば（高いとその調節された代謝を妨げる））ことを証明している。高レベル発現に最適な組合せは、グリア細胞ではＷＰＲＥとＡＰＰ５′ＵＴＲとの連合（association）、そして神経細胞ではＷＰＲＥとｔａｕ３′ＵＴＲとＡＰＰ５′ＵＴＲの連合である。本発明の著者らにより得られた結果は、遺伝子治療におけるだけでなく、同様に遺伝子機能の研究における、ベクターの構築に関する重要な情報を提供する。
【００９２】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１Ａ】図１Ａは、神経細胞株におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ及びＷＰＲＥの作用を示す概要図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、グリア細胞株におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ及びＷＰＲＥの作用を示す概要図である。
【図２Ａ】図２Ａは、神経細胞株におけるｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ又はＡＰＰ５′ＵＴＲと組合せたＷＰＲＥの作用を示す概要図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、グリア細胞株におけるｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ又はＡＰＰ５′ＵＴＲと組合せたＷＰＲＥの作用を示す概要図である。
【図３】図３は、神経細胞株におけるｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せの作用を示す概要図である。
【図４】図４は、神経細胞株における転写後調節エレメントの最適化組合せを示す概要図である。
【図５】図５は、ルシフェラーゼ発現に及ぼすｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ、ＡＰＰ５′ＵＴＲ及びＷＰＲＥの作用は、トランスフェクトするプラスミドの用量に依存することを示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、神経細胞株における、転写後調節エレメントの組合せによるＧＤＮＦ分泌の刺激を示す概要図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、グリア細胞株における、転写後調節エレメントの組合せによるＧＤＮＦ分泌の刺激を示す概要図である。
【図７】図７は、ルシフェラーゼ発現に及ぼすＷＰＲＥ、ｔａｕ３′ＵＴＲ、ＴＨ３′ＵＴＲ及びＡＰＰ５′ＵＴＲの相乗作用を示す表である。
【図８】図８は、ＷＰＲＥとＡＰＰ５′ＵＴＲの組合せはまた、ラット線維芽細胞株３Ｔ３においても有効であったことを示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2005523725.tif 000022
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