(57)【要約】本発明は式（Ｉ）の化合物およびそれらの医薬適合性の塩または水和物を包含する。これらの化合物はグランザイムＢの阻害剤であり、自己免疫および慢性炎症性疾患の治療に有用である。医薬組成物および使用方法も含まれる。
2005522430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉで表される化合物またはそれらの医薬適合性の塩もしくは水和物。
【化１】
2005522430.tif 000030
（ここで；
ｎは０、１、または２であり；
Ｒ１およびＲ２は、各々独立に、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、アリール、ＨＥＴおよび−Ｎ（Ｒ１０）２からなる群より選択され、ここで：
（ａ）該Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシおよびＣ３−６シクロアルキルは、ハロおよびヒドロキシからなる群より独立に選択される１−３の置換基で場合により置換され；並びに
（ｂ）該アリールおよびＨＥＴは、ハロ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択される１−３の置換基で場合により置換され；
または、Ｒ１およびＲ２はそれらが結合する炭素原子と共に結合して、Ｓ、ＯおよびＮ（Ｒ１０）からなる群より選択される１−３のヘテロ原子を任意に含む、５または６員単環式環を形成することができ、ここで、該環は１−３のＲ１０基で場合により置換され、
ただし、Ｒ１およびＲ２は両者とも水素ではなく；
Ｒ３およびＲ７の各々は、水素、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択され；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ８の各々は、水素、ハロ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択され；
Ｒ９は、ハロ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択される１−３の置換基で場合により置換される、ＨＥＴであり；
Ｒ１０は水素、Ｃ１−４アルキルおよび−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−４アルキルからなる群より選択され、該−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−４アルキルは、Ｎ（Ｒ１１）２、ＨＥＴおよびアリールで場合により置換され、該アリールは１−３のハロ基で場合により置換され；
Ｒ１１は水素、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルから選択され；
ＨＥＴは、Ｏ、ＳおよびＮ（Ｒ１２）から選択される１−４のヘテロ原子を含み、かつ１−２のオキソ基で場合により置換される、５から１０員芳香族、部分芳香族または非芳香族単環式または二環式環であり；並びに
Ｒ１２は水素、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より選択される。）
【請求項２】
ｎが０である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｎが１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ｎが２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８の各々が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
ＨＥＴが、各々ハロ、オキソ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択される１−２の置換基で場合により置換される、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾキサゾリル、シノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンズイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニルからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ９が、各々ハロ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択される１−３の置換基で場合により置換される、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソキサゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、およびテトラゾリルからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１およびＲ２が、各々、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、フェニル、ピリジル、２−オキソピロリジンおよび−Ｎ（Ｒ１０）２からなる群より独立に選択され、ここで：
（ａ）該Ｃ１−６アルキルおよびＣ３−６シクロアルキルは、ハロおよびヒドロキシからなる群より独立に選択される１−３の基で場合により置換され；および
（ｂ）該フェニル、ピリジルおよび２−オキソピロリジンは、ハロ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択される１−３の基で場合により置換され；並びに
Ｒ１０は水素、Ｃ１−４アルキル、および−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−４アルキルからなる群より選択され、該−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−４アルキルはＮ（Ｒ１１）２、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ベンゾチオフェンおよびフェニルで場合により置換され、該フェニルは１−３のハロ基で場合により置換される、
請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
ｎが１である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８の各々が水素である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ９が、各々ハロ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択される１−３の置換基で場合により置換される、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソキサゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、およびテトラゾリルからなる群より選択される、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
下記式ＩＩ
【化２】
2005522430.tif 000031
2005522430.tif 000032
（ここで：
Ｒ９はベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾキサゾリル、シノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンズイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニルからなる群より選択される）、
下記式ＩＩの、請求項１に記載の化合物またはそれらの医薬適合性の塩もしくは水和物。
【請求項１３】
Ｒ９がピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソキサゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、およびテトラゾリルからなる群より選択される、請求項１２による化合物。
【請求項１４】
以下のものからなる群より選択される化合物。
【表１】
2005522430.tif 000033
2005522430.tif 000034
2005522430.tif 000035
2005522430.tif 000036
【請求項１５】
請求項１に記載の化合物を医薬適合性の担体との組み合わせで含有する医薬組成物。
【請求項１６】
免疫調節異常の治療を、そのような治療を必要とする哺乳動物患者において行う方法であって、該免疫調節異常の治療に有効な量の、請求項１に記載の化合物を該患者に投与することを含む方法。
【請求項１７】
免疫調節異常が全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、胆管硬変、ブドウ膜炎、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、水疱性類天疱瘡、サルコイドーシス、乾癬、自己免疫性筋炎、ウェグナー肉芽腫症、魚鱗癬、グレーブス眼症、喘息、シュレロダーマおよびシェーグレン症候群からなる群より選択される自己免疫または慢性炎症性疾患である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
免疫調節異常が骨髄もしくは臓器移植拒絶または移植片対宿主病である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
免疫調節異常が臓器もしくは組織の移植、移植によって生じる移植片対宿主病、関節リウマチを含む自己免疫症候群、全身性エリテマトーデス、ハシモト甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、ブドウ膜炎、後ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、リウマチ熱および感染後糸球体腎炎を含む感染後自己免疫疾患、炎症性および過剰増殖性皮膚疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、苔癬、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、表皮水疱症、蕁麻疹、血管性浮腫、血管炎、紅斑、皮膚好酸球増加症、エリテマトーデス、座瘡、円形脱毛症、角結膜炎、春季結膜炎、ベーチェット病に伴うブドウ膜炎、角膜炎、疱疹性角膜炎、円錐角膜、ジストロフィア・エピセリアリス・コルニエ、コルニアル・ロイコーマ、眼天疱瘡、モーレン潰瘍、強膜炎、グレーブス眼症、フォークト・小柳・原田症候群、サルコイドーシス、花粉アレルギー、可逆性閉塞性気道疾患、気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息、粉塵喘息、慢性もしくは難治性喘息、遅発性喘息および気道反応性亢進、気管支炎、胃潰瘍、虚血性疾患および血栓症によって生じる血管損傷、虚血性腸疾患、炎症性腸疾患、壊死性全腸炎、熱傷に伴う腸管傷害、セリアック病、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、潰瘍性大腸炎、片頭痛、鼻炎、湿疹、間質性腎炎、グッドパスチャー症候群、溶血性尿毒症候群、糖尿病性腎障害、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、メニエール病、多発性神経炎（ｐｏｌｙｎｅｕｒｉｔｉｓ）、多発性神経炎（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎｅｕｒｉｔｉｓ）、単発神経炎、神経根障害、甲状腺機能亢進症、バセドウ病、真正赤血球形成不全、再生不良性貧血（ａｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ）、再生不良性貧血（ｈｙｐｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ）、突発性血小板減少性紫斑、自己免疫溶血性貧血、無顆粒球症、悪性貧血、巨赤芽級性貧血、赤血球形成不全、骨粗鬆症、サルコイドーシス、繊維化肺、突発性間質性肺炎、皮膚筋炎、尋常性白斑、尋常性魚鱗癬、光アレルギー感受性、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、大動脈炎症候群、結節性多発動脈炎、心筋症、強皮症、ウェグナー肉芽腫、シェーグレン症候群、脂肪過多、好酸球性筋膜炎、歯肉、歯根膜、歯槽骨、歯のセメント質の病変、糸球体腎炎、脱毛の阻止もしくは発毛の供与および／または毛髪産生および毛髪成長の促進による男性型脱毛症もしくは老人性脱毛症、筋ジストロフィー、膿皮症およびセザリー症候群、アジソン病、保存、移植もしくは虚血性疾患で生じる臓器の虚血・再灌流傷害、内毒素ショック、偽膜性大腸炎、薬物もしくは放射線による大腸炎、虚血性急性腎不全、慢性腎不全、肺・酸素もしくは薬物によって生じる中毒、肺癌、肺気腫、白内障、鉄沈着症、網膜色素変性症、老人性黄斑変性症、硝子体散乱、角膜のアルカリによる火傷、多発性紅斑皮膚炎、線状ＩｇＡ水疱性皮膚炎およびセメント皮膚炎、歯肉炎、歯周炎、敗血症、膵炎、環境汚染、加齢、発癌、カルチノーマの転移および高山病によって生じる疾患、ヒスタミンもしくはロイコトリエン−Ｃ４放出によって生じる疾患、ベーチェット病、自己免疫性肝炎、原発性胆管硬変、硬化性胆管炎、部分的肝臓切除、急性肝臓壊死、毒素、ウイルス性肝炎、ショック、もしくは酸素欠乏症によって生じる壊死、Ｂウイルス肝炎、非Ａ／非Ｂ肝炎、肝硬変、アルコール性肝硬変、肝不全、劇症肝不全、遅発性肝不全、「ａｃｕｔｅ−ｏｎ−ｃｈｒｏｎｉｃ」肝不全、化学療法効果の増強、サイトメガロウイルス感染、ＨＣＭＶ感染、ＡＩＤＳ、癌、老人性痴呆、心的外傷、慢性細菌感染、リンパ腫起源の悪性腫瘍並びに急性および慢性リンパ性白血病およびリンパ腫からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
免疫抑制を必要とする哺乳動物患者において免疫系を抑制する方法であって、免疫抑制有効量の請求項１の化合物を該患者に投与することを含む方法。
【請求項２１】
グランザイムＢを阻害し、かついかなるカスパーゼプロテアーゼをも実質的に阻害しない化合物を医薬適合性の担体との組合せで含有する医薬組成物。
【請求項２２】
グランザイムＢの阻害について５００ｎＭ以下のＫｉを有し、かつカスパーゼ−１からカスパーゼ−１３の各々の阻害について１０，０００ｎＭ以上のＫｉを有する化合物を医薬適合性の担体との組合せで含有する医薬組成物。
【請求項２３】
免疫調節異常の治療を、そのような治療を必要とする哺乳動物患者において行う方法であって、該免疫調節異常の治療に有効である量の、グランザイムＢを阻害し、かついかなるカスパーゼプロテアーゼをも実質的に阻害しない化合物を該患者に投与することを含む方法。
【請求項２４】
免疫調節異常の治療を、そのような治療を必要とする哺乳動物患者において行う方法であって、該免疫調節異常の治療に有効である量の、グランザイムＢの阻害について５００ｎＭ以下のＫｉを有し、かつカスパーゼ−１からカスパーゼ−１３の各々の阻害について１０，０００ｎＭ以上のＫｉを有する化合物を該患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
自己免疫疾患は自己分子に対する特異的免疫応答が生じる疾患であり、しばしば、組織および器官の損傷および機能不全につながる。これらの疾患は器官特異的（例えば、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎、重症筋無力症、原発性胆汁性肝硬変）または本質的に全身性（例えば、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性筋炎、皮膚筋炎、Ｓｊｏｇｒｅｎｆｓ症候群、強皮症、および移植片対宿主病）であり得る。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、広範囲の生理学的および病理学的状況の間に多くの異なる細胞型において生じる細胞死の形態学的および生化学的に異なる形態である（（Ｊａｃｏｂｓｏｎら，１９９７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９５；Ｗｈｉｔｅ，１９９６）において再考されている）。研究は、システインプロテアーゼの新規ファミリーによって触媒される特定のタンパク分解がアポトーシスの媒介において非常に重要なものであることを報告する（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ａｎｄ  Ｄｉｘｉｔ，１９９６ａ；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，１９９５；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｉｎｅａｕｘ，１９９５）。これらのプロテアーゼ（カスパーゼと呼ばれる）はアスパラギン酸で終止するコンセンサステトラペプチド配列の後で下流基質を開裂する。これらのカスパーゼは、活性化のためにアスパラギン酸残基の後での特異的タンパク分解性開裂を必要とする、不活性前駆体として合成される。
【０００３】
グランザイムＢは、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞質顆粒中に見出されるセリンプロテアーゼであり、基質Ｐ１位置におけるアスパラギン酸に対する、カスパーゼと同様の必要条件を有する（Ｏｄａｋｅら，１９９１；Ｐｏｅら，１９９１）。研究は、グランザイムＢが、顆粒開口放出誘導細胞毒性の間の標的細胞におけるアポトーシス性核変化の誘発において重要な役割を果たすことを報告している（Ｄａｒｍｏｎら，１９９６；Ｈｅｕｓｅｌら，１９９４；Ｓａｒｉｎら，１９９７；Ｓｈｒｅｓｔａら，１９９５；Ｔａｌａｎｉａｎら，１９９７）。
【０００４】
グランザイムＢは幾つかのカスパーゼの開裂および活性化を触媒するものとして説明される（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら，１９９６ｂ；Ｄａｒｍｏｎら，１９９５；Ｄｕａｎら，１９９６；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉら，１９９６；Ｇｕら，１９９６；Ｍａｒｔｉｎら，１９９６；Ｍｕｚｉｏら，１９９６；Ｑｕａｎら，１９９６；Ｓａｒｉｎら，１９９７；Ｓｏｎｇら，１９９６ａ；Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａら，１９９６；Ｔａｌａｎｉａｎら，１９９７；Ｗａｎｇら，１９９６）。グランザイムＢは標的細胞の死に寄与するカスパーゼ非依存経路も開始させる。しかしながら、これらの追加経路の幾つかの候補が存在するものの、それらはほとんど不確定のままである（Ｓａｒｉｎら，１９９７；Ｔａｌａｎｉａｎら，１９９７）。
【０００５】
候補経路の１つはグランザイムＢによる死基質の直接タンパク分解であるが、このプロテアーゼの効率的な非カスパーゼ細胞基質は未だに特定されていない。初期研究は、グランザイムＢ誘導細胞死の間に観察されるＰＡＲＰ、Ｕ１−７０ｋＤａおよびラミンＢの開裂が直接グランザイムＢによってではなくカスパーゼによって触媒されることを示しているが（Ｄａｒｍｏｎら，１９９５；Ｍａｒｔｉｎら，１９９６；Ｔａｌａｎｉａｎら，１９９７）、イン・ビトロでの、および顆粒誘導細胞毒性の間での他のカスパーゼ基質に対するグランザイムＢの効果は徹底的に研究されてはいない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、カスパーゼを阻害することのないグランザイムＢの阻害剤である化合物を包含する。したがって、これらの化合物は、ＣＴＬ誘導細胞毒性に特異的であり得る自己免疫および慢性炎症性疾患の治療に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要約）
本発明は式Ｉの化合物
【０００８】
【化１】
2005522430.tif 000003
およびそれらの医薬適合性の塩または水和物を包含する。これらの化合物はグランザイムＢの阻害剤であり、自己免疫および慢性炎症性疾患の治療に有用である。医薬組成物および使用方法も含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、式Ｉ：
【００１０】
【化２】
2005522430.tif 000004
で表される化合物またはそれらの医薬適合性の塩もしくは水和物を包含し、ここで；
ｎは０、１、または２であり；
Ｒ１およびＲ２は、各々独立に、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、アリール、ＨＥＴおよび−Ｎ（Ｒ１０）２からなる群より選択され、ここで：
（ａ）該Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシおよびＣ３−６シクロアルキルはハロおよびヒドロキシからなる群より独立に選択される１−３の置換基で場合により置換され；並びに
（ｂ）該アリールおよびＨＥＴは、ハロ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択される１−３の置換基で場合により置換され；
または、Ｒ１およびＲ２はそれらが結合する炭素原子と共に結合して、Ｓ、ＯおよびＮ（Ｒ１０）からなる群より選択される１−３のヘテロ原子を任意に含む、５または６員単環式環を形成することができ、ここで、該環は１−３のＲ１０基で場合により置換され、
ただし、Ｒ１およびＲ２は両者とも水素ではなく；
Ｒ３およびＲ７の各々は、水素、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択され；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ８の各々は、水素、ハロ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択され；
Ｒ９は、ハロ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択される１−３の置換基で場合により置換される、ＨＥＴであり；
Ｒ１０は水素、Ｃ１−４アルキルおよび−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−４アルキルからなる群より選択され、該−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−４アルキルはＮ（Ｒ１１）２、ＨＥＴおよびアリールで場合により置換され、該アリールは１−３のハロ基で場合により置換され；
Ｒ１１は水素、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルから選択され；
ＨＥＴは、Ｏ、ＳおよびＮ（Ｒ１２）から選択される１−４のヘテロ原子を含み、かつ１−２のオキソ基で場合により置換される、５から１０員芳香族、部分芳香族または非芳香族単環式または二環式環であり；並びに
Ｒ１２は水素、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より選択される。
【００１１】
本発明の一実施態様は、ｎが０である式Ｉの化合物を包含する。
【００１２】
本発明の一実施態様は、ｎが１である式Ｉの化合物を包含する。
【００１３】
本発明の一実施態様は、ｎが２である式Ｉの化合物を包含する。
【００１４】
本発明の一実施態様は、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８の各々が水素である式Ｉの化合物を包含する。
【００１５】
本発明の一実施態様は、ＨＥＴが、各々ハロ、オキソ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択される１−２の置換基で場合により置換される、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾキサゾリル、シノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンズイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニルからなる群より選択される式Ｉの化合物を包含する。
【００１６】
本発明の一実施態様は、Ｒ９が、各々ハロ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択される１−３の置換基で場合により置換される、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソキサゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、およびテトラゾリルからなる群より選択される式Ｉの化合物を包含する。
【００１７】
本発明の一実施態様は、Ｒ１およびＲ２が、各々、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、フェニル、ピリジル、２−オキソピロリジンおよび−Ｎ（Ｒ１０）２からなる群より独立に選択され、ここで：
（ａ）該Ｃ１−６アルキルおよびＣ３−６シクロアルキルは、ハロおよびヒドロキシからなる群より独立に選択される１−３の基で場合により置換され；および
（ｂ）該フェニル、ピリジルおよび２−オキソピロリジンは、ハロ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択される１−３の基で場合により置換され；並びに
Ｒ１０が水素、Ｃ１−４アルキル、および−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−４アルキルからなる群より選択され、該−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−４アルキルはＮ（Ｒ１１）２、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ベンゾチオフェンおよびフェニルで場合により置換され、該フェニルは１−３のハロ基で場合により置換される、
式Ｉの化合物を包含する。
【００１８】
ｎが１である式Ｉの化合物が本発明のこの実施態様の範囲内に包含される。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８の各々が水素である式Ｉの化合物もこの実施態様の範囲内に包含される。Ｒ９が、各々ハロ、ヒドロキシ、および１−３のハロ基で場合により置換されるＣ１−４アルキルからなる群より独立に選択される１−３の置換基で場合により置換される、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソキサゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、およびテトラゾリルからなる群より選択される式Ｉの化合物もこの実施態様の範囲内に包含される。
【００１９】
本発明の別の実施態様は式ＩＩの化合物：
【００２０】
【化３】
2005522430.tif 000005
またはそれらの医薬適合性の塩もしくは水和物を包含し、ここで：
Ｒ９はベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾキサゾリル、シノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンズイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニルからなる群より選択される。
【００２１】
Ｒ９がピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソキサゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、およびテトラゾリルからなる群より選択される式Ｉの化合物がこの実施態様の範囲内に包含される。
【００２２】
本発明の別の実施態様は、式Ｉの化合物を医薬適合性の担体と組み合わせて含有する医薬組成物を包含する。
【００２３】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常の治療を、そのような治療を必要とする哺乳動物患者において行う方法であって、該免疫調節異常の治療に有効な量の請求項１に記載の化合物を該患者に投与することを含む方法を包含する。
【００２４】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常が全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、胆管硬変、ブドウ膜炎、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、水疱性類天疱瘡、サルコイドーシス、乾癬、自己免疫性筋炎、ウェグナー肉芽腫症、魚鱗癬、グレーブス眼症、喘息、シュレロダーマ（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）およびシェーグレン症候群からなる群より選択される自己免疫または慢性炎症性疾患である上記方法を包含する。
【００２５】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常が骨髄もしくは臓器移植拒絶または移植片対宿主病である上記方法を包含する。
【００２６】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常が臓器もしくは組織の移植、移植によって生じる移植片対宿主病、関節リウマチを含む自己免疫症候群、全身性エリテマトーデス、ハシモト甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、ブドウ膜炎、後ブドウ膜炎（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｕｖｅｉｔｉｓ）、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、リウマチ熱および感染後糸球体腎炎を含む感染後自己免疫疾患、炎症性および過剰増殖性皮膚疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、苔癬、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、表皮水疱症、蕁麻疹、血管性浮腫、血管炎、紅斑、皮膚好酸球増加症、エリテマトーデス、座瘡、円形脱毛症、角結膜炎、春季結膜炎、ベーチェット病に伴うブドウ膜炎、角膜炎、疱疹性角膜炎、円錐角膜、ジストロフィア・エピセリアリス・コルニエ（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉａ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｓ  ｃｏｒｎｅａｅ）、コルニアル・ロイコーマ（ｃｏｒｎｅａｌ  ｌｅｕｋｏｍａ）、眼天疱瘡、モーレン潰瘍、強膜炎、グレーブス眼症、フォークト・小柳・原田症候群、サルコイドーシス、花粉アレルギー、可逆性閉塞性気道疾患、気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息、粉塵喘息、慢性もしくは難治性喘息、遅発性喘息および気道反応性亢進、気管支炎、胃潰瘍、虚血性疾患および血栓症によって生じる血管損傷、虚血性腸疾患、炎症性腸疾患、壊死性全腸炎、熱傷に伴う腸管傷害、セリアック病、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、潰瘍性大腸炎、片頭痛、鼻炎、湿疹、間質性腎炎、グッドパスチャー症候群、溶血性尿毒症候群、糖尿病性腎障害、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、メニエール病、多発性神経炎（ｐｏｌｙｎｅｕｒｉｔｉｓ）、多発性神経炎（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎｅｕｒｉｔｉｓ）、単発神経炎、神経根障害、甲状腺機能亢進症、バセドウ病、真正赤血球形成不全、再生不良性貧血（ａｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ）、再生不良性貧血（ｈｙｐｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ）、突発性血小板減少性紫斑、自己免疫溶血性貧血、無顆粒球症、悪性貧血、巨赤芽級性貧血、赤血球形成不全、骨粗鬆症、サルコイドーシス、繊維化肺、突発性間質性肺炎、皮膚筋炎、尋常性白斑、尋常性魚鱗癬、光アレルギー感受性、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、大動脈炎症候群、結節性多発動脈炎、心筋症、強皮症、ウェグナー肉芽腫、シェーグレン症候群、脂肪過多、好酸球性筋膜炎、歯肉、歯根膜、歯槽骨、歯のセメント質の病変、糸球体腎炎、脱毛の阻止もしくは発毛の供与および／または毛髪産生および毛髪成長の促進による男性型脱毛症もしくは老人性脱毛症、筋ジストロフィー、膿皮症およびセザリー症候群、アジソン病、保存、移植もしくは虚血性疾患で生じる臓器の虚血・再灌流傷害、内毒素ショック、偽膜性大腸炎、薬物もしくは放射線による大腸炎、虚血性急性腎不全、慢性腎不全、肺・酸素もしくは薬物によって生じる中毒、肺癌、肺気腫、白内障、鉄沈着症、網膜色素変性症、老人性黄斑変性症、硝子体散乱（ｖｉｔｒｅａｌ  ｓｃａｒｒｉｎｇ）、角膜のアルカリによる火傷、多発性紅斑皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、線状Ｉｇ���水疱性皮膚炎およびセメント皮膚炎、歯肉炎、歯周炎、敗血症、膵炎、環境汚染、加齢、発癌、カルチノーマの転移および高山病によって生じる疾患、ヒスタミンもしくはロイコトリエン−Ｃ４放出によって生じる疾患、ベーチェット病、自己免疫性肝炎、原発性胆管硬変、硬化性胆管炎、部分的肝臓切除、急性肝臓壊死、毒素、ウイルス性肝炎、ショック、もしくは酸素欠乏症によって生じる壊死、Ｂウイルス肝炎、非Ａ／非Ｂ肝炎、肝硬変、アルコール性肝硬変、肝不全、劇症肝不全、遅発性肝不全、「ａｃｕｔｅ−ｏｎ−ｃｈｒｏｎｉｃ」肝不全、化学療法効果の増強、サイトメガロウイルス感染、ＨＣＭＶ感染、ＡＩＤＳ、癌、老人性痴呆、心的外傷、慢性細菌感染、リンパ腫起源の悪性腫瘍並びに急性および慢性リンパ性白血病およびリンパ腫からなる群より選択される上記方法を包含する。
【００２７】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常が多発性硬化症である上記方法を包含する。
【００２８】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常が関節リウマチである上記方法を包含する。
【００２９】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常が全身性エリテマトーデスである上記方法を包含する。
【００３０】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常が乾癬である上記方法を包含する。
【００３１】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常が移植された臓器または組織の拒絶である上記方法を包含する。
【００３２】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常が炎症性腸疾患である上記方法を包含する。
【００３３】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常がリンパ腫起源の悪性腫瘍である上記方法を包含する。
【００３４】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常が急性および慢性リンパ性白血病およびリンパ腫である上記方法を包含する。
【００３５】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常が強皮症、自己免疫性筋炎、シェーグレン症候群およびＩ型糖尿病から選択される上記方法を包含する。
【００３６】
本発明の別の実施態様は、免疫抑制を必要とする哺乳動物患者において免疫系を抑制する方法であって、免疫抑制有効量の式Ｉの化合物を該患者に投与することを含む方法を包含する。
【００３７】
本発明の別の実施態様は、グランザイムＢを阻害し、かついかなるカスパーゼプロテアーゼをも実質的に阻害しない化合物を医薬適合性の担体との組合せで含有する医薬組成物を包含する。
【００３８】
本発明の別の実施態様は、グランザイムＢの阻害について５００ｎＭ以下のＫｉを有し、かつカスパーゼ−１からカスパーゼ−１３の各々の阻害について１０，０００ｎＭ以上のＫｉを有する化合物を医薬適合性の担体との組合せで含有する医薬組成物を包含する。
【００３９】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常の治療を、そのような治療を必要とする哺乳動物患者において行う方法であって、該免疫調節異常の治療に有効である量の、グランザイムＢを阻害し、かついかなるカスパーゼプロテアーゼをも実質的に阻害しない化合物を該患者に投与することを含む方法を包含する。
【００４０】
本発明の別の実施態様は、免疫調節異常の治療を、そのような治療を必要とする哺乳動物患者において行う方法であって、該免疫調節異常の治療に有効である量の、グランザイムＢの阻害について５００ｎＭ以下のＫｉを有し、かつカスパーゼ−１からカスパーゼ−１３の各々の阻害について１０，０００ｎＭ以上のＫｉを有する化合物を該患者に投与することを含む方法を包含する。
【００４１】
この明細書の目的のため、化合物の活性に対する参照はここに開示されるアッセイにおいて測定されるものである。
【００４２】
本発明を例示するものは以下の表の化合物である：
【００４３】
【表１】
2005522430.tif 000006
2005522430.tif 000007
2005522430.tif 000008
【００４４】
他に指示されない限り、以下の定義を用いて本発明を説明する。
【００４５】
「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩを含む。
【００４６】
「アルキル」という用語は、指示された数の炭素原子を有する、直鎖または分岐鎖構造およびそれらの組合せを意味する。したがって、例えば、Ｃ１−６アルキルには、メチル、エチル、プロピル、２−プロピル、ｓ−およびｔ−ブチル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、１，１−ジメチルエチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが含まれる。
【００４７】
「アルコキシ」という用語は、指示された数の炭素原子を有する、直鎖、分岐鎖または環状配置のアルコキシ基を意味する。例えば、Ｃ１−６アルコキシには、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ等が含まれる。
【００４８】
「アルキルチオ」という用語は、直鎖、分岐鎖または環状配置の、指示された数の炭素原子を有するアルキルチオ基を意味する。例えば、Ｃ１−６アルキルチオには、メチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ等が含まれる。
【００４９】
「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、指示された数の炭素原子の直鎖または分岐鎖構造およびそれらの組合せを意味し、ここで、水素がさらなる炭素−炭素二重結合によって置換されていてもよい。例えば、Ｃ２−６アルケニルには、エテニル、プロペニル、１−メチルエテニル、ブテニル等が含まれる。
【００５０】
「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する、指示された数の炭素原子の直鎖または分岐鎖構造およびそれらの組合せを意味する。例えば、Ｃ３−６アルキニルには、プロペニル、１−メチルエテニル、ブテニル等が含まれる。
【００５１】
「シクロアルキル」という用語は、直鎖または分岐鎖構造と任意に組み合わされている、指示された数の炭素原子の単環式、二環式または三環式構造を意味する。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘプチル、アダマンチル、シクロドデシルメチル、２−エチル−１−ビシクロ［４．４．０］デシル等が含まれる。
【００５２】
「アリール」という用語は単環式または二環式芳香族環系と定義され、これには、例えば、フェニル、ナフチル等が含まれる。
【００５３】
「アラルキル」という用語は、アルキル水素原子のうちの１つの代わりに用いられる上に定義されるアリール基を伴う、１から６個の炭素原子を有する上に定義されるアルキル基、例えば、ベンジル等を意味する。
【００５４】
「アリールオキシ」という用語は、酸素原子によって分子に結合する、上に定義されるアリール基（アリール−Ｏ）を意味し、これには、例えば、フェノキシ、ナフトキシ等が含まれる。
【００５５】
「アラルコキシ」という用語は、酸素原子によって分子に結合する、上に定義されるアラルキル基（アラルキル−Ｏ）を意味し、これには、例えば、ベンジルオキシ等が含まれる。
【００５６】
「アリールチオ」という用語は、イオウ原子によって分子に結合する、上に定義されるアリール基（アリール−Ｓ）と定義され、これには、例えば、チオフェノキシ、チオナフトキシ等が含まれる。
【００５７】
「アロイル」という用語は、カルボニル基によって分子に結合する、上に定義されるアリール基（アリール−Ｃ（Ｏ）−）を意味し、これには、例えば、ベンゾイル、ナフトイル等が含まれる。
【００５８】
「アロイルオキシ」という用語は、酸素原子によって分子に結合する、上に定義されるアロイル基（アロイル−Ｏ）を意味し、これには、例えば、ベンゾイルオキシもしくはベンゾキシ、ナフトイルオキシ等が含まれる。
【００５９】
「ＨＥＴ」という用語は、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１−４のヘテロ原子を含み、かつ１−２のオキソ基で場合により置換される、５から１０員芳香族、部分的芳香族または非芳香族単環式または二環式環と定義される。好ましくは、「ＨＥＴ」は、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１−５のヘテロ原子を含む５もしくは６員芳香族もしくは非芳香族単環式環、例えば、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソキサゾール等であり、または複素環はＯ、Ｓ、およびＮから選択される１−５のヘテロ原子を含む９もしくは１０員芳香族もしくは部分的芳香族二環式環、例えば、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インドール、ピラノピロール、ベンゾピラン、キノリン、ベンゾシクロヘキシル、ナフチリジン等である。「ＨＥＴ」には以下のものも含まれる：ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリル、アゼチジニル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンズイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニル。
【００６０】
「治療する」という用語は、疾患または状態の徴候および症状を有する患者を救済するために患者を治療するだけではなく、疾患または状態の発症または進行を阻止するために無症候患者を予防的に治療することも包含する。「治療に有効な量」という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床医が求める組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘導する薬物または薬剤の量を意味することが意図される。この用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床医が組織、系、動物またはヒトにおいて阻止しようと求める生物学的または医学的現象の発生の危険性を阻止または減少させる薬剤の量も包含する。
【００６１】
この明細書の目的のため、以下の略語は指示された意味を有する：
ＡｃＯＨ  ＝  酢酸
Ａｌｌｏｃ  ＝  アリルオキシカルボニル
ＡＰＣＩ  ＝  大気圧化学イオン化
ＢＯＣ  ＝  ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＣＢＺ  ＝  カルボベンゾキシ
ＤＣＣ  ＝  １，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＩＢＡＬ  ＝  水素化アルミニウムジイソブチル
ＤＩＥＡ  ＝  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ  ＝  ４−（ジメチルアミノ）ピリジン
ＤＭＦ  ＝  ジメチルホルムアミド
ＤＴＴ  ＝  ジチオトレイトール
ＥＤＣＩ  ＝  １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
ＥＤＴＡ  ＝  エチレンジアミン四酢酸、四ナトリウム塩水和物
ＥＳＩ  ＝  エレクトロスプレーイオン化
ＦＡＢ  ＝  高速原子衝撃
ＦＭＯＣ  ＝  ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＭＰＡ  ＝  ヘキサメチルホスホラミド
ＨＡＴＵ  ＝  Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾル−１−イル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢＴ  ＝  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＲＭＳ  ＝  高分解能質量分析
ＩＣＩ  ＝  一塩化ヨウ素
ＩＢＣＰ  ＝  イソブチルクロロホルメート
ＫＨＭＤＳ  ＝  カリウムヘキサメチルジシラザン
ＬＤＡ  ＝  リチウムジイソプロピルアミド
ＭＣＰＢＡ  ＝  メタクロロ過安息香酸
Ｍｓ  ＝  メタンスルホニル  ＝  メシル
ＭｓＯ  ＝  メタンスルホネート  ＝  メシレート
ＮＢＳ  ＝  Ｎ−ブロモスクシンイミド
ＮＭＭ  ＝  ４−メチルモルホリン
ＰＣＣ  ＝  ピリジニウムクロロクロメート
ＰＤＣ  ＝  ピリジニウムジクロメート
Ｐｈ  ＝  フェニル
ＰＰＴＳ  ＝  ピリジニウムｐ−トルエンスルホネート
ｐＴＳＡ  ＝  ｐ−トルエンスルホン酸
ｒ．ｔ．  ＝  室温
ｒａｃ．  ＝  ラセミの
ＴＦＡ  ＝  トリフルオロアセテート
ＴｆＯ  ＝  トリフルオロメタンスルホネート  ＝  トリフレート
ＴＬＣ  ＝  薄層クロマトグラフィー
アルキル基略語：
Ｍｅ  ＝  メチル
Ｅｔ  ＝  エチル
ｎ−Ｐｒ  ＝  ノーマルプロピル
ｉ−Ｐｒ  ＝  イソプロピル
ｎ−Ｂｕ  ＝  ノーマルブチル
ｉ−Ｂｕ  ＝  イソブチル
ｓ−Ｂｕ  ＝   二級ブチル
ｔ−Ｂｕ  ＝  三級ブチル
ここで説明される化合物は、塩、鏡像異性体、エステルおよび水和物を純粋形態で、およびそれらの混合物として含むことが意図されている。窒素原子が見えるとき、その窒素原子の原子価を満たすのに十分な水素原子が存在することも理解される。
【００６２】
示されるもの以外の鏡像異性体を合成スキームで代用することにより、または鏡像異性体の混合物をスキームで代用することにより、キラル構造が以下に示されるが、異なる異性体またはラセミ混合物を達成することができる。したがって、そのような異性体および混合物の全てが本発明に含まれる。
【００６３】
説明される化合物は典型的には非対称中心を含み、したがって、ジアステレオマーおよび光学異性体を生じ得る。本発明は、そのような考え得るジアステレオマーの他に、それらのラセミ体および分解された鏡像異性的に純粋な形態並びにそれらの医薬適合性の塩を包含しようとするものである。
【００６４】
ここで説明される化合物の幾つかはオレフィン性二重結合を含み、他に指定されない限り、ＥおよびＺ幾何異性体の両者を含もうとするものである。
【００６５】
本発明の医薬組成物は、活性成分としての式Ｉの化合物またはそれらの医薬適合性の塩を医薬適合性の担体、および任意に、他の治療薬成分との組合せで含有する。「医薬適合性の塩」という用語は、無機塩基および有機塩基を含む医薬適合性の塩基から調製される塩を指す。無機塩基から誘導される代表的な塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン酸塩、マンガン、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛等が含まれる。特に好ましいものは、カルシウム、マグネシウム、カリウム、およびナトリウム塩である。医薬適合性の有機塩基から誘導される代表的な塩には、一級、二級および三級アミン、天然置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン等の塩が含まれる。
【００６６】
本発明の化合物が塩基性であるとき、無機および有機酸を含む医薬適合性の非毒性酸から塩を調製することができる。そのような酸の例には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ショウノウスルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が含まれる。特に好ましいものは、クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸および酒石酸である。
【００６７】
以下の治療方法の考察において、式Ｉの化合物に対する参照は医薬適合性の塩も含もうとするものである。
【００６８】
それらのグランザイムＢ阻害活性により、本発明の化合物は自己免疫または慢性炎症性疾患の治療または予防に有用である。本発明の化合物は、例えば、全身エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、胆管硬変、ブドウ膜炎、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、水疱性類天疱瘡、サルコイドーシス、乾癬、自己免疫性筋炎、ウェグナー肉芽腫症、魚鱗癬、グレーブス眼症、喘息、強皮症およびシェーグレン症候群を含む、骨髄、臓器または移植拒絶、自己免疫並びに慢性炎症性疾患のために免疫抑制が存在する場合における免疫系の抑制に有用である。
【００６９】
特には、本発明の化合物は、臓器もしくは組織の移植、移植によって生じる移植片対宿主病、関節リウマチを含む自己免疫症候群、全身性エリテマトーデス、ハシモト甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、ブドウ膜炎、後ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、リウマチ熱および感染後糸球体腎炎を含む感染後自己免疫疾患、炎症性および過剰増殖性皮膚疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、苔癬、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、表皮水疱症、蕁麻疹、血管性浮腫、血管炎、紅斑、皮膚好酸球増加症、エリテマトーデス、座瘡、円形脱毛症、角結膜炎、春季結膜炎、ベーチェット病に伴うブドウ膜炎、角膜炎、疱疹性角膜炎、円錐角膜、ジストロフィア・エピセリアリス・コルニエ、コルニアル・ロイコーマ、眼天疱瘡、モーレン潰瘍、強膜炎、グレーブス眼症、フォークト・小柳・原田症候群、サルコイドーシス、花粉アレルギー、可逆性閉塞性気道疾患、気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息、粉塵喘息、慢性もしくは難治性喘息、遅発性喘息および気道反応性亢進、気管支炎、胃潰瘍、虚血性疾患および血栓症によって生じる血管損傷、虚血性腸疾患、炎症性腸疾患、壊死性全腸炎、熱傷に伴う腸管傷害、セリアック病、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、潰瘍性大腸炎、片頭痛、鼻炎、湿疹、間質性腎炎、グッドパスチャー症候群、溶血性尿毒症候群、糖尿病性腎障害、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、メニエール病、多発性神経炎（ｐｏｌｙｎｅｕｒｉｔｉｓ）、多発性神経炎（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎｅｕｒｉｔｉｓ）、単発神経炎、神経根障害、甲状腺機能亢進症、バセドウ病、真正赤血球形成不全、再生不良性貧血（ａｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ）、再生不良性貧血（ｈｙｐｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ）、突発性血小板減少性紫斑、自己免疫溶血性貧血、無顆粒球症、悪性貧血、巨赤芽級性貧血、赤血球形成不全、骨粗鬆症、サルコイドーシス、繊維化肺、突発性間質性肺炎、皮膚筋炎、尋常性白斑、尋常性魚鱗癬、光アレルギー感受性、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、大動脈炎症候群、結節性多発動脈炎、心筋症、強皮症、ウェグナー肉芽腫、シェーグレン症候群、脂肪過多、好酸球性筋膜炎、歯肉、歯根膜、歯槽骨、歯のセメント質の病変、糸球体腎炎、脱毛の阻止もしくは発毛の供与および／または毛髪産生および毛髪成長の促進による男性型脱毛症もしくは老人性脱毛症、筋ジストロフィー、膿皮症およびセザリー症候群、アジソン病、保存、移植もしくは虚血性疾患で生じる臓器の虚血・再灌流傷害、内毒素ショック、偽膜性大腸炎、薬物もしくは放射線による大腸炎、虚血性急性腎不全、慢性腎不全、肺・酸素もしくは薬物によって生じる中毒、肺癌、肺気腫、白内障、鉄沈着症、網膜色素変性症、老人性黄斑変性症、硝子体散乱、角膜のアルカリによる火傷、多発性紅斑皮膚炎、線状ＩｇＡ水疱性皮膚炎およびセメント皮膚炎、歯肉炎、歯周炎、敗血症、膵炎、環境汚染、加齢、発癌、カルチノーマの転移および高山病によって生じる疾患、ヒスタミンもしくはロイコトリエン−Ｃ４放出によって生じる疾患、ベーチェット病、自己免疫性肝炎、原発性胆管硬変、硬化性胆管炎、部分的肝臓切除、急性肝臓壊死、毒素、ウイルス性肝炎、ショック、もしくは酸素欠乏症によって生じる壊死、Ｂウイルス肝炎、非Ａ／非Ｂ肝炎、肝硬変、アルコール性肝硬変、肝不全、劇症肝不全、遅発性肝不全、「ａｃｕｔｅ−ｏｎ−ｃｈｒｏｎｉｃ」肝不全、化学療法効果の増強、サイトメガロウイルス感染、ＨＣＭＶ感染、ＡＩＤＳ、癌、老人性痴呆、心的外傷、慢性細菌感染からなる群より選択される疾患または障害の治療または予防に有用である。
【００７０】
式Ｉの化合物の治療用量の大きさは、もちろん、治療しようとする状態の重篤性の性質並びに式Ｉの化合物およびその投与経路に従って変化し、かつ臨床医の判断で変化する。また、個々の患者の年齢、体重および応答によっても変化する。したがって、活性化合物の有効投与量は臨床医が全ての基準を考慮した後に決定することができ、患者の利益に対する最良の判断が用いられる。代表的な用量は０．００１ｍｐｋ／ｄから約１００ｍｐｋ／ｄの範囲である。
【００７１】
許容し得る眼用処方中に式Ｉの化合物の０．００１重量％から１重量％溶液または懸濁液を含有する眼内投与用の眼用調製品を用いることができる。
【００７２】
本発明の化合物の有効投与量を提供するのにあらゆる適切な投与経路を用いることができる。例えば、経口、非経口および局所を用いることができる。投与形態には、錠剤、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、カプセル、クリーム、軟膏、エアロゾル等が含まれる。
【００７３】
これらの組成物には経口、非経口および目（眼）に適する組成物が含まれる。これらは単位投与形態で都合よく存在することができ、薬学の技術分野において公知の方法のいずれによっても調製することができる。
【００７４】
実際の使用においては、式Ｉの化合物を、通常の医薬配合技術に従い、活性成分として接触混合で医薬担体と組み合わせることができる。担体は、投与に望ましい調製品の形態に依存して、広く様々な形態をとることができる。経口投与形態のための組成物の調製においては、通常の医薬媒体のいずれをも用いることができ、例えば、経口液体調製品、例えば、懸濁液、エリキシルおよび溶液の場合には水、アルコール、油、香味料、保存剤、着色料等を用いることができ；または経口固体調製品、例えば、粉末、カプセルおよび錠剤の場合には担体、例えば、デンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合剤、分散剤等を用いることができ、固体経口調製品が液体調製品よりも好ましい。それらの投与のし易さのため、錠剤およびカプセルが最も有利な経口投与単位形態を代表し、その場合には固体医薬担体が明らかに用いられる。所望であれば、標準水性または非水性技術によって錠剤をコートすることができる。
【００７５】
経口投与に適する本発明の医薬組成物は、各々所定の量の活性成分を含有する個別の単位、例えば、カプセル、カシューまたは錠剤として、粉末もしくは顆粒として、または水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、水中油エマルジョンもしくは油中水エマルジョンとして存在し得る。そのような組成物は薬学の方法のいずれによっても調製することができるが、全ての方法は活性成分を１種類以上の必要成分を構成する担体と合わせる工程を含む。一般には、組成物は、活性成分を液体担体もしくは微粉砕固体担体またはその両者と均一かつ緊密に混合し、次いで、必要であれば、生成物を望ましい形状に成形することによって調製する。例えば、錠剤は、任意に１種類以上の補助成分と共に、圧縮または成型することによって調製することができる。圧縮錠は、適切な機械において、自由流動形態、例えば、粉末または顆粒状の、任意に結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、表面活性剤または分散剤と混合された、活性成分を圧縮することによって調製することができる。成型錠は、適切な機械において、不活性希釈剤で加湿した粉末化化合物の混合物を成型することによって作製することができる。例えば、各投与単位は約０．０１ｍｇから約１．０ｇの活性成分を含有することができる。
【００７６】
合成方法
本発明の化合物は以下に説明される一般手順を用いて調製する。
【００７７】
【化４】
2005522430.tif 000009
【００７８】
商業的に入手可能な（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボン酸を、適切な塩基、例えば、Ｎ．Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン等中で臭化ベンジルと反応させることにより、ベンジルエステルに変換することができる。ＦＭＯＣ保護基の除去はジエチルアミンを用いて行うことができ、その遊離アミンを、次に、標準ペプチドカップリング条件を用いてカルボン酸とカップリングさせることができる。ベンジル保護基の除去は、パラジウムを用いる触媒水素化によって、またはその代わりに、適切な塩基、例えば、水酸化リチウムを用いる加水分解によって行うことができる。必要なアミンとのカップリングを標準的なペプチドカップリング条件を用いて、例えば、ＥＤＣ／ＨＯＢｔを用いて達成し、所望の化合物を得ることができる。
【００７９】
本発明の化合物の調製方法を以下に例においてさらに説明する。代替経路はこの分野における熟練者には容易に識別可能である。
【００８０】
（実施例１）
【００８１】
【化５】
2005522430.tif 000010
（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−テトラゾル−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド
【００８２】
工程Ａ：ベンジル（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキシレート
（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボン酸（１．５グラム、３．２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．７３ｍＬ、４．２ｍｍｏｌ）および臭化ベンジル（０．４６ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）の溶液を４ｍＬ  ＤＭＦ中で１２時間攪拌した。その混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、水（３×）および飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（３／１  ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により１．６グラム（９０％）の生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ，７．８１（ｄ，２Ｈ），７．６５（ｄ，２Ｈ），７．３１−７．４４（６Ｈ），７．１２−７．２１（３Ｈ），６．２８（ｄ，１Ｈ），５．３９（ｄ，１Ｈ），５．２１（ｄｄ，２Ｈ），４．４２（ｍ，２Ｈ），４．３７（ｍ，１Ｈ），４．２８（ｍ，１Ｈ），３．５３（ｍ，２Ｈ），３．３８（ｍ，１Ｈ），３．１７（ｍ，２Ｈ），２，４１（ｍ，１Ｈ），２．１８（ｍ，１Ｈ）。
【００８３】
工程Ｂ：ベンジル（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキシレート
２０ｍＬの１／１  ジエチルアミン／ジクロロメタン中のベンジル（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキシレート（１．６グラム、２．８ｍｍｏｌ、実施例１工程Ａから）の溶液を２時間攪拌した。この混合物を真空下で乾燥するまで蒸発させた後、１５ｍＬジクロロメタンに再溶解した。アセチルイソロイシン（７４４ｍｇ、４．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（６６０ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（７７５ｍｇ、５．７ｍｍｏｌ）を添加し、その混合物を１０時間攪拌した。混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ、飽和重炭酸ナトリウム（２×）および飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機層を乾燥させて濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１／１  ジクロロメタン／エーテル）により１．２グラム（８５％）の生成物を得た。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）計算値（Ｍ＋Ｈ）４９２．２、実測値４９２．３。
【００８４】
工程Ｃ：（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボン酸
４０ｍＬメタノール中のベンジル（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキシレート（１．２グラム、２．４ｍｍｏｌ、実施例１工程Ｂから）の溶液を、パラジウム付着炭素（２６０ｍｇ、１０％ｗｔ．、０．２４ｍｍｏｌ）上、水素雰囲気下で２時間攪拌した。その混合物を濾過して濃縮し、０．９３グラム（９５％）の生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ，８．２１（ｄ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ），７．１５（ｄ，１Ｈ），７．０８（ｄ，１Ｈ），６．９５（ｄｄ，１Ｈ），５．０５（ｄ，１Ｈ），４．３５（ｍ，１Ｈ），４．２５（ｔ，１Ｈ），３．５（ｄｄ，１Ｈ），３．２−３．４（ｂｓ，１Ｈ），３２．９７−３．２（ｍ，３Ｈ），１．９７−２．１７（ｍ，２Ｈ），１．８８（ｓ，３Ｈ），１．７−１．８（ｍ，１Ｈ），１．４−１．４８（ｍ，１Ｈ），１．０８−１．１７（ｍ，１Ｈ），０．９（ｄ，３Ｈ），０．８２（ｔ，３Ｈ）
【００８５】
工程Ｄ：（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−Ｎ−（シアノメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド
（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，ｌ−ｈｉ］インドール−２−カルボン酸（１００ｍｇ．０．２５ｍｍｏｌ、実施例１工程Ｃから）、アミノアセトニトリル（１７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（７２ｍｇ、０．３５７ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（６８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の混合物を１ｍＬ  ＤＭＳＯ中で一緒に攪拌した。１時間後、その混合物を半調製用ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ  Ｐｒｏ−ｐａｃｋ  Ｃ１８  ５μ、２０×１００ｍｍ、勾配：２０％→８０％  アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ含有水、２０ｍＬ／分）によって精製し、８６ｍｇ（７８％）の生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ，８．６８（ｄ，１Ｈ），８．２５（ｄ，１Ｈ），７．９３（ｄ，２Ｈ），７．１１（ｄ，１Ｈ），７．０５（ｄ，１Ｈ），６．９８（ｄｄ，１Ｈ），５．０２（ｄ，１Ｈ），４．３７（ｍ，１Ｈ），４．２３（ｔ，１Ｈ），４．１２（ｍ，２Ｈ），３．４４（ｄｄ，１Ｈ），３．１（ｍ，２Ｈ），２．８９（ｄ，１Ｈ），２．０２−２．１４（ｍ，２Ｈ），１．８４（ｓ，３Ｈ），１．７３（ｍ，１Ｈ），１．４３（ｍ，１Ｈ），１．１３（ｍ，１Ｈ），０．９（ｄ，３Ｈ），０．８３（ｔ，３Ｈ）。
【００８６】
工程Ｅ：（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−テトラゾル−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド
１ｍＬ  ＤＭＦ中の（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−Ｎ−（シアノメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド（２７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、実施例１工程Ｄから）、ナトリウムアジド（２０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）および塩酸トリエチルアミン（５１ｍｇ、０．３７ｍｍｍｉ）の混合物を１１５℃に６時間加熱した。その生成物を半調製用ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ  Ｐｒｏ−ｐａｃｋ  Ｃ１８  ５μ、２０×１００ｍｍ、勾配：１０％→７０％  アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ含有水、２０ｍＬ／分）によって単離した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ，８．７４（ｍ，１Ｈ），８．２１（ｄ，１Ｈ），７．９２（ｄ，１Ｈ），７．０８（ｄ，１Ｈ），７．０４（ｄ，１Ｈ），６．９５（ｄｄ，１Ｈ），５．０４（ｄ，１Ｈ），４．５２（ＡＢＸ，２Ｈ），４．３２（ｍ，１Ｈ），４．２０（ｔ，１Ｈ），３．４２（ｄｄ，１Ｈ），３．０５（ｍ，２Ｈ），２．９８（ｄ，１Ｈ），２．０３（ｍ，２Ｈ），１．８４（ｓ，３Ｈ），１．７３（ｍ，１Ｈ），１．４２（ｍ，１Ｈ），１．１１（ｍ，１Ｈ），０．８６（ｄ，３Ｈ），０．８１（ｔ，３Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）計算値（Ｍ＋Ｈ）４８３．２，実測値４８３．３。
【００８７】
（実施例２）
【００８８】
【化６】
2005522430.tif 000011
（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド
【００８９】
工程Ａ：１−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−４−イル）メチルアミン
ナトリウムアジド（１１．５グラム、１７６ｍｍｏｌ）、および臭化プロパルギル（２７．７グラム、トルエン中の８０％ｗｔ溶液、１８６ｍｍｏｌ）を２００ｍＬジオキサンおよび１５０ｍＬ水の混合液中で１０時間攪拌した。水層を分離し、有機層を加圧反応器に移した。濃水酸化アンモニウム（２００ｍＬ）を添加し、その混合物を６５℃に加熱した。１５時間後、混合物を冷却して濃縮した。ジオキサン／水からの結晶化により５．２グラム（３０％）の純粋生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ，７．６２（ｓ，１Ｈ），５．１−５．５（ｂｓ，３Ｈ），３．７９（ｓ，２Ｈ）。
【００９０】
工程Ｂ：（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド
この化合物は、実施例１工程Ｄの手順に従い、（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボン酸（１００ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、実施例１工程Ｃから）および１−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−４−イル）メチルアミン（５０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、実施例２工程Ａから）から調製した。生成物を半調製用ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ  Ｐｒｏ−ｐａｃｋ  Ｃ１８  ５μ、２０×１００ｍｍ、勾配：２０％→４０％  アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ含有水、２０ｍＬ／分）によって精製し、６３ｍｇ（５２％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ，８．４７（ｍ，１Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ），７．９１（ｄ，１Ｈ），７．６（ｂｓ，１Ｈ），７．０８（ｄ，１Ｈ），７．０４（ｄ，１Ｈ），６．９５（ｄｄ，１Ｈ），５．０１（ｄ，１Ｈ），４．３２（ｍ，３Ｈ），４．２１（ｔ，１Ｈ），３．４２（ｄｄ，１Ｈ），３．０７（ｍ，２Ｈ），２．９５（ｄ，１Ｈ），２．０３（ｍ，２Ｈ），１．８４（ｓ，３Ｈ），１．７２（ｍ，１Ｈ），１．４２（ｍ，１Ｈ），１．１１（ｍ，１Ｈ），０．８７（ｄ，３Ｈ），０．８１（ｔ，３Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）計算値（Ｍ＋Ｈ）４８２．２，実測値４８２．３。
【００９１】
（実施例３）
【００９２】
【化７】
2005522430.tif 000012
（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（２Ｒ）−３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノイル］アミノ｝−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド
【００９３】
工程Ａ：ベンジルピリジン−２−イルアセテート
２−ピリジル酢酸塩酸塩（８グラム、４６ｍｍｏｌ）、ベンジルアルコール（１９ｍＬ、１８４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１３グラム、６９ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８ｍＬ、４６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（５６０ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ）を１５０ｍＬジクロロメタン中で合わせ、その混合物を一晩攪拌した。混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、２Ｍ  ＨＣｌ（２×）で抽出した。合わせた水層を固体重炭酸ナトリウムで中和し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機部分を硫酸ナトリウムで乾燥させて濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（２／１  ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により８．６グラム（８６％）の生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ，８．５９（ｄ，１Ｈ），７．６６（ｄｄ，１Ｈ），７．３−７．４（ｍ，６Ｈ），７．２（ｍ，１Ｈ），５．１９（ｓ，２Ｈ），３．９６（ｓ，２Ｈ）。
【００９４】
工程Ｂ：ベンジル３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノエート
リチウムヘキサメチルジシラジドの溶液（５．５ｍＬ、ＴＨＦ中１．０Ｍ、５．５ｍｍｏｌ）および追加の１５ｍＬ  ＴＨＦを窒素雰囲気下で−７８℃に冷却した。ベンジルピリジン−２−イルアセテート（１．１ｇ、５ｍｍｏｌ、実施例３工程Ａから）を添加し、生じる混合物を３０分間攪拌した。２−ヨードプロパン（０．５５ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）を添加し、その混合物を室温に暖めた後、１２時間攪拌した。その反応混合物を飽和塩化アンモニウムに注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機部分を硫酸ナトリウムで乾燥させて濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（５／１  ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により０．９グラム（６７％）の生成物を得た。
【００９５】
工程Ｃ：３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタン酸
１５ｍＬエタノール中のベンジル３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノエート（０．９グラム、３．３ｍｍｏｌ、実施例３工程Ｂから）の溶液をパラジウム付着炭素（３５０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、１０％ｗｔ．）と共に１気圧の水素の下で攪拌した。１．５時間後、その混合物をセライトを通して濾過し、濃縮して５５０ｍｇ（９３％）の生成物を得た。その生成物は、自発的にＣＯ２を失うため、直ちに用いなければならない。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ，８．４８（ｄ，１Ｈ），７．８２（ｄｄ，１Ｈ），７．５５（ｄ，１Ｈ），７．３４（ｍ，１Ｈ），３．４２（ｄ，１Ｈ），２．４２（ｍ，１Ｈ），１．１（ｄ，３Ｈ），０．７３（ｄ，３Ｈ）。
【００９６】
工程Ｄ：ベンジル（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（２Ｒ）−３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノイル］アミノ｝−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキシレート
表題の化合物を３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタン酸（１．５グラム、８．５ｍｍｏｌ、実施例３工程Ｃから）およびベンジル（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキシレート（３．０５グラム、５．５ｍｍｏｌ、実施例１工程Ａから）から調製した。フラッシュクロマトグラフィー（５／１  ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により１．７グラム（６７％）の生成物を得た。所望のジアステレオマー（より速く溶出する異性体）をキラル半調製用ＨＰＬＣ（イソプロパノールで溶出する３５０グラムのｃｈｉｒａｌ−ｐａｋ  ＡＤ静止相）によって単離した。
【００９７】
工程Ｅ：（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（２Ｒ）−３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノイル］アミノ｝−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボン酸
ベンジル（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（２Ｒ）−３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノイル］アミノ｝−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキシレート（５５０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、実施例３工程Ｄから）を実施例１工程Ｃにおいて説明される手順を用いて水素化し、４１０ｍｇ（９２％）の生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ，８．６７（ｄ，１Ｈ），８．５４（ｄ，１Ｈ），７．７２（ｄｄ，１Ｈ），７．４３（ｄ，１Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），７．１（ｄ，１Ｈ），７．０３（ｄ，１Ｈ），６．９６（ｍ，１Ｈ），５．０３（ｄ，１Ｈ），４．３７（ｔ，１Ｈ），３．４８（ｍ，１Ｈ），２．４（ｄ，１Ｈ），２．９８−３．１５（ｍ，３Ｈ），２．３８（ｍ，１Ｈ），１．９５（ｍ，２Ｈ），１．０５（ｄ，３Ｈ），０．６５（ｄ，３Ｈ）。
【００９８】
工程Ｆ：（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（２Ｒ）−３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノイル］アミノ｝−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド
表題の化合物を、（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（２Ｒ）−３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノイル］アミノ｝−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボン酸（３１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、実施例３工程Ｅから）および１−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−４−イル）メチルアミン（１５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、実施例２工程Ａから）から、実施例２工程Ｂにおいて説明される手順を用いて調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ，８．６４（ｄ，１Ｈ），８．４７−８．５１（ｍ，２Ｈ），７．７０（ｄｄ，１Ｈ），７．４１（ｄ，１Ｈ），７．２３（ｍ，１Ｈ），７．０６（ｄ，１Ｈ），７．００（ｄ，１Ｈ），６．９３（ｄｄ，１Ｈ），５．０（ｄ，１Ｈ），４．２３−４．３５（ｈ，３Ｈ），３．３５−３．５５（ｍ，２Ｈ），３．２９（ｍ，４Ｈ），２．９８−３．０５（ｍ，２Ｈ），２．８９（ｄ，Ｈ），２．３４（ｍ，１Ｈ），１．９４−２．０４（ｍ，２Ｈ），１．０２（ｄ，３Ｈ），０．６２（ｄ，２Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）計算値（Ｍ＋Ｈ）４８７．２，実測値４８７．３。
【００９９】
（実施例４）
【０１００】
【化８】
2005522430.tif 000013
（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド
【０１０１】
工程Ａ：Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシン
イソロイシンベンジルエステルｐ−トルエンスルホネート（３．９グラム、１０ｍｍｏｌ）、フェニル酢酸（１．４グラム、１０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．３グラム、１２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２．０グラム、１５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．９ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）の溶液を５０ｍＬジクロロメタン中で合わせ、その混合物を３時間攪拌した。その反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム（３×）、水および飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（３／１  ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により３．４グラムの生成物を得た。そのエステルを５０ｍＬメタノールに溶解し、パラジウム付着炭素（１．０グラム、１ｍｍｏｌ、１０％ｗｔ．）上、水素雰囲気下で攪拌した。２時間後、その混合物をセライトを通して濾過し、濃縮して１．９グラム（７５％）の所望の酸を得た。
【０１０２】
工程Ｂ：（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボン酸
表題の化合物を、Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシン（１００ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ、実施例４工程Ａから）およびベンジル（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキシレート（１５０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、実施例１工程Ａから）から、実施例１工程ＢおよびＣにおいて説明される手順を用いて調製した。
【０１０３】
工程Ｃ：（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２、１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド
表題の化合物を、（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボン酸（３６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、実施例４工程Ｂから）および１−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−４−イル）メチルアミン（１５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、実施例２工程Ａから）から、実施例２工程Ｂにおいて説明される手順を用いて調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ，８．４７（ｔ，１Ｈ），８．２８（ｄ，１Ｈ），８．１１（ｄ，１Ｈ），７．２５（ｍ，４Ｈ），７．１９（ｍ，１Ｈ），７．０７（ｄ，１Ｈ），７．０３（ｄ，１Ｈ），６．９５（ｄｄ，１Ｈ），５．０１（ｄ，１Ｈ），４．２０−４．３６（ｍ，４Ｈ），３．４８（ＡＢ，２Ｈ），３．４３（ｍ，１Ｈ），３．０５（ｍ，２Ｈ），２．８９（ｄ，２Ｈ），２．０３（ｍ，２Ｈ），１．７５（ｍ，１Ｈ），１．４２（ｍ，１Ｈ），１．０８（ｍ，１Ｈ），０．８４（ｄ，３Ｈ），０．７８（ｔ，３Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）計算値（Ｍ＋Ｈ）５５８．２，実測値５５８．３。
【０１０４】
（実施例５から３３）
表２に示される実施例５から３３を実施例１から４におけるものに類似する手順を用いて調製した。
【０１０５】
【表２】
2005522430.tif 000014
2005522430.tif 000015
2005522430.tif 000016
【０１０６】
生物学的活性を決定するためのアッセイ
本発明の化合物のグランザイムＢ阻害活性は以下の手順を用いて評価することができる：
グランザイムＢ産生
プラスミドｐＭｅＩＢａｃおよびＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｐＣＲ２．１）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ）から購入した。Ｂａｃ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系および全ての細胞培養物供給はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）からであった。ヒトグランザイムＢプロテアーゼは特定されており、この技術分野において公知である。例えば、Ｐｏｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，９８−１０３を参照。Ｂａｃ−Ｂａｃ系におけるタンパク質発現のスクリーニングのためベクターを産生させた。ハチミツメリチン分泌シグナルを、ｐＭｅＩＢａｃから、プライマー５’−ＧＴＧＴ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  Ｇ−３’および５’−ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＡＡＧ−３’を用いるＰＣＲによって増幅した。増幅産生物はメリチン分泌シグナルの上流にＢｇｌＩＩ部位を含み、ベクターのマルチクローニングサイトをスパン（ｓｐａｎｎｅｄ）していた。その断片をＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ消化ｐＦａｓｔＢａｃにサブクローン化した。生じるベクターをｐＳｅｃＢａｃと命名した。活性化可能なタグ付加グランザイムＢをこのｐＳｅｃＢａｃに２つの連続する工程でクローン化した。まず、成熟グランザイムＢを、プライマー５’−ＧＧＡＴＣＣ  ＡＴＣ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＧＧＡＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＣＣ−３’および５’−ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＴＡ  ＧＴＡ  ＧＣＧ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＴ  ＣＣ−３’を用いるＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ２．１にクローン化した。センスプライマーにおいて、Ｘａ因子認識部位、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、をコードするボールド体の配列を、成熟グランザイムＢの第１アミノ酸であるイソロイシン２１（伝統的にチモーゲン、キモトリプシノーゲンに基づくこのファミリーのセリンプロテアーゼのナンバリング体系を用いるこの書類においてはＩＬＥ１６と呼ばれる）の上流に挿入した。次に、ヘキサヒスチジンタグ付加活性化可能グランザイムＢを、グランザイムＢ／ｐＣＲ２．１クローンから、プライマー５’−ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＡＴＣ−３’および５’−ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＧＴＡ  ＧＣＧ  ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＴ  ＣＣ−３’を用いるＰＣＲによって増幅した。増幅産生物はヘキサヒスチジンタグの上流にＢａｌｉ部位を含み、かつＸａ因子認識配列を含んでいた。この断片をＢａｌｉおよびＥＣＯＲで消化し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ消化ｐＳｅｃＢａｃにサブクローン化した。完成したベクターは組換えバキュロウイルスをＧｉｂｃｏ  ＢＲＬのＢａｃ−Ｂａｃ系において産生し、これは６−ヒスチジンタグ付加グランザイムＢを分泌した。タンパク質発現のため、１０％ウシ胎児血清およびペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（Ｃａｔ．１０３７８−０２４）を補足したＧｒａｃｅ培地（Ｃａｔ．１１６０５−０９４）においてｓｆ９細胞を１．５×１０６細胞ｍｌ−１の密度まで成長さ��た。ウイルスの添加に先立ち、細胞を１０００×ｇで１５分間遠心し、組換えウイルスストックおよびＳＰセファロースビーズ（培養物のリットル当たり４ｍｌの樹脂）を含有する新鮮な成長培地中に同じ密度まで再懸濁させた。２７℃で７２時間のインキュベーションの後、樹脂を５０ミクロンナイロンメッシュ（ＰＧＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ）に集め、５０ｍＭ  Ｍｅｓ  ＮａＯＨ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．６で徹底的に洗浄し、カラムに注ぎ入れた。ＮａＣｌの直線勾配（０．３から１．０Ｍ）を用いてタンパク質を溶離した。グランザイムＢ活性を含む画分を特定し、合わせて濃縮した後、２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０で希釈した。この試料を最終ｐＨ８．０に再調整してＣａＣｌ２（最終濃度３ｍＭ）およびＸａ因子（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、タンパク質のｍｇ当たり１０単位）を添加し、室温で１８時間インキュベートして活性グランザイムＢを産生させた。これらの条件の下で、完全な開裂が達成された。この組換えグランザイムＢを、１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて開裂混合物から精製した。収量は、培養物のリットル当たり４ｍｇから５ｍｇもの精製グランザイムＢになり得る。質量スペクトル分析により、２７，４６６Ｄａの１つの主要ピークが特定される（２７，３２０Ｄａおよび２６，６３０Ｄａの他の成分も一貫して観察された）。配列分析によって定義される２２７アミノ酸の合計質量は２５，５１１．５８Ｄａを説明するだけであるため、本発明者らは、この方法で精製される組換えグランザイムＢの調製品がＮＫ細胞顆粒から精製される未変性グランザイムＢの調製品よりもより同質であり、かつグリコシル化が少ないものと結論付けた。それにもかかわらず、生じる酵素は、Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＣＨＯおよび他の阻害剤による阻害の速度パラメータに関して未変性酵素と区別することができない。
【０１０７】
グランザイムＢの蛍光発生アッセイ
グランザイムＢの活性を、基質Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＡＭＣを用いる連続蛍光定量アッセイを用いて測定した。簡潔に述べると、基質（１０μＭ）を含有する反応混合物に酵素の適切な希釈を添加し、様々な濃度の関心阻害剤を１００μｌの最終反応容積で添加した。ＡＭＣの遊離を、Ｔｅｃａｎ  Ｆｌｕｏｓｔａｒ  ９６ウェルプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ製のブラックプレート）を用い、３８０ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの放射波長を用いて室温で連続的に監視した。他に指示されない限り、全ての実験は、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１０％スクロース、０．１％ＣＨＡＰＳおよび１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ＝７．５、２５℃と定義される標準反応条件の下、室温で行った。
【０１０８】
データ分析
全ての速度定数は、非線形最小二乗分析コンピュータプログラム（ＮＬＩＮ）を用いてデータを適切な式に当てはめることによって算出した。反応速度を非線形回帰によって競合阻害のためのＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ式に当てはめ、解離定数Ｋｊの値を得た。阻害が時間依存性の場合、代わりに定常状態の速度から、またはゆっくりと緊密に結合する阻害剤の分析のためにＭｏｒｒｉｓｏｎによって開発された式（２１）による酵素−阻害剤複合体の会合（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）の速度定数からＫｊを算出した。速度および解離定数の再現における誤差は１０％を上回ることはなかった。
【０１０９】
生物学的データ
下記の表は選択された例の活性を示す。全ての化合物がカスパーゼ酵素に対して不活性であった。
【０１１０】
【表３】
2005522430.tif 000017
2005522430.tif 000018
【０１１１】
蛍光発生基質の開裂によるカスパーゼ活性の測定
カスパーゼの活性を測定するためのアッセイはこの技術分野において公知である。例えば、以下の手順に従ってカスパーゼ−３の活性を決定することができる。
【０１１２】
カスパーゼ−３によって認識され、かつＰＡＲＰ開裂部位のＰ１からＰ４アミノ酸に相当するテトラペプチドの蛍光発生誘導体、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（ＡＭＣ、アミノ−４−メチルクマリン）を以下のように調製した：ｉ）Ｎ−Ａｃ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−Ｇｌｕ（ＯＢｎ）−Ｖａｌ−ＣＯ２Ｈの合成、ｉｉ）Ａｓｐ（ＯＢｎ）−７−アミノ−４−メチルクマリンとのカップリング、ｉｉｉ）ベンジル基の除去。
【０１１３】
【化９】
2005522430.tif 000019
【０１１４】
標準反応混合物（最終容積３００μＬ）はＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣおよび精製もしくは粗製カスパーゼ−３酵素を５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭジチオトレイトール中に含んでおり、それを２５℃でインキュベートした。反応を分光蛍光光度計において励起波長３８０ｎｍおよび放射波長４６０ｎｍで連続的に監視した。
【０１１５】
他のカスパーゼの活性を決定するためのアッセイは当業者が識別可能である。
【０１１６】
データ分析は上述のように行うことができる。
【０１１７】
参考文献
以下の参考文献は参照することによりそれらの全体がここに組み込まれる：
【０１１８】
【表４】
2005522430.tif 000020
2005522430.tif 000021
2005522430.tif 000022
2005522430.tif 000023
2005522430.tif 000024
2005522430.tif 000025
2005522430.tif 000026
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2005522430.tif 000028
2005522430.tif 000029
【国際調査報告】
2005522430.tif 000037