(57)【要約】  本発明は、破壊されたプロスタグランジンＥ合成酵素２遺伝子を含有する、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物及び動物細胞を特色とし、加えて、プロスタグランジンＥ合成酵素２を阻害する薬剤の投与を含む、炎症を介した障害を治療する方法を特色とする。
2005510220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変により破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を生じる、遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記哺乳動物がマウスである、請求項１の哺乳動物。
【請求項３】
前記哺乳動物がさらに破壊されたＡｐｏＥ遺伝子を含む、請求項１の哺乳動物。
【請求項４】
改変が破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を含む、遺伝子改変動物細胞。
【請求項５】
前記細胞が胚幹（ＥＳ）細胞またはＥＳ様細胞である、請求項４の動物細胞。
【請求項６】
前記細胞がＥＳ細胞由来マクロファージである、請求項４の動物細胞。
【請求項７】
前記細胞が、破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を生じる改変を含有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物から単離される、請求項４の動物細胞。
【請求項８】
前記細胞がＰＧＥ２を添加した培地において利用される、請求項４の動物細胞。
【請求項９】
炎症を介する障害を治療する方法であって、該方法はプロスタグランジンＥ合成酵素２を阻害する薬剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項１０】
薬剤を、関節炎を低減し、白血球浸潤を低減し、関節の関節面でのプロテオグリカン減少を低減し、かつ／または炎症性疼痛の検出を低減するのに十分な量で前記薬剤を投与する、請求項９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、破壊されたプロスタグランジンＥ合成酵素２遺伝子を含有する、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物及び動物細胞を特色とし、加えて、プロスタグランジンＥ合成酵素２を阻害する薬剤の投与を伴う、炎症を介した障害を治療する方法を特色とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、プロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）の分解またはプロスタグランジンＥ合成酵素（ＰＧＥＳ）によって触媒される反応のいずれかによりＰＧＨ２から誘導される主要なプロスタノイドである（Ｊａｋｏｂｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７２２０−２５，１９９９）。ＰＧＨ２は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−１またはＣＯＸ−２のいずれかにより触媒される反応において形成され、プロスタグランジン類、プロスタサイクリン、トロンボキサン類を含む、形成されるすべてのプロスタノイド生成物の前駆体となる（Ｓｍｉｔｈ及びＭａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８３：１−１７，１９９１；  Ｖａｎｅ及びＢｏｔｔｉｎｇ，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．  ４４：１−１０，１９９５；  Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２９９：１２５−４０，１９９６）。
【０００３】
ＰＧＥ２に特異的なモノクローナル抗体を用いた研究では、ＰＧＥ２が炎症に寄与する主要なプロスタノイドであることが示されている（Ｐｏｒｔａｎｏｖａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １８４：８８３−９１，１９９６）。ＰＧＥ２の注入は、血漿の血管外遊走を伴う血管拡張及び侵害受容器の感作を介した炎症を誘発する（Ｖａｎｅ及びＢｏｔｔｉｎｇ，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．  ４７（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ７８，１９９７）。さらに、ＰＧＥ２はマトリックスメタロプロテイナーゼの産生を刺激し（Ｍｅｈｉｎｄａｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：３５７０，１９９５）、血管新生を刺激し（Ｂｅｎ−Ａｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３７２：８３，１９９５）、そしてＴリンパ球のアポトーシスを阻害する（Ｇｏｅｔｚｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４：１０４１，１９９５）。
【０００４】
ＰＧＥＳのある型（ＰＧＥＳ１またはｃＰＧＥＳ）は、種々の哺乳動物細胞株の細胞質ゾル中に恒常的に発現しており、そして細菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を用いた刺激により通常変わらない（Ｔａｎｉｏｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ４２：３２７７５，２０００）。誘導型ＰＧＥＳ（ＰＧＥＳ２、ｉＰＧＥＳ、またはｍＰＧＥＳ−１）はミクロソーム区画に局在する。ｍＰＧＥＳ−１がＰＧＥＳ２の好ましい名称となったことは有名である。ＰＧＥＳ２酵素は、エイコサノイド及びグルタチオン代謝に関与する膜結合タンパク質のメンバーとして同定されており、そしてインターロイキン（ＩＬ）−１βにより誘導される（Ｊａｋｏｂｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７２２０，１９９９；  Ｔｈｏｒｅｎ及びＪａｋｏｂｓｅｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６７：６４２８，２０００）。この酵素は、もとはミクロソームグルタチオンＳトランスフェラーゼ１様１と呼ばれていた（Ｊａｋｏｂｓｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ８：６８９，１９９９）。
【０００５】
種々の研究により、ＣＯＸ−２及びＰＧＥＳ２が協調的な様式で調節されていることが示され、そして、炎症、発熱効果及び細胞増殖の調節に関連するＣＯＸ−２を介する反応において、ＰＧＥＳ２はＰＧＥ２の形成に関与する重要な酵素であることが示唆される（Ｙａｍａｇａｔａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２１：２６６９−７７，２００１；  Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７５：３２７８３−９２，２０００）。したがって、ＰＧＥＳ２を阻害する薬剤は、ＣＯＸ−２阻害剤に替わるものとして、またはＣＯＸ−２阻害剤に加えて、治療学を提供することが示唆される（Ｓｔｉｃｈｔｅｎｏｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７：４６９−７４，２００１）。しかしながら、ＰＧＥＳ２阻害の完全な効果はまだ解明されないままである。このように、炎症反応におけるＰＧＥＳ２の役割及びＰＧＥＳ２活性の調節に関連する治療学的な意味あいをさらに明確にするため、ＰＧＥＳ２ノックアウトマウス及びＰＧＥＳ２ノックアウトＥＳ細胞を含むさらなる研究ツールが必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子についてホモ接合体またはヘテロ接合体である、遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞を特色とする。
【０００７】
第一の側面では、本発明は、改変によりＰＧＥＳ２遺伝子が破壊される、遺伝子改変非ヒト哺乳動物を特色とする。好ましくは、哺乳動物はげっ歯類、さらに好ましくはマウスであり、かつ／または哺乳動物は実験的に誘導された炎症モデルに対して減弱した反応、例えば関節炎の低減、白血球浸潤の低減、関節の関節面におけるプロテオグリカン減少の低減、及び／または炎症性疼痛検出の低減を示す。別の好ましい態様において、哺乳動物は破壊されたＡｐｏＥ遺伝子をさらに含む。
【０００８】
本発明の第二の側面は、改変がＰＧＥＳ２遺伝子破壊を含む、遺伝子改変動物細胞を特色とする。好ましい態様において、細胞は胚幹（ＥＳ）細胞、ＥＳ様細胞、またはＥＳ細胞由来マクロファージであり、ＰＧＥ２を添加した培地中で細胞は培養され、かつ／または、細胞はネズミまたはヒトのものである。別の好ましい態様において、炎症条件下で細胞はＰＧＥ２産生の低減を示す。別の好ましい態様において、細胞は、破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を生じる改変を含有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物から単離される。
【０００９】
第三の側面では、本発明が、動物細胞におけるＰＧＥＳ２活性が改変された結果として改変された発現を示す遺伝子を同定する方法、すなわち、ＰＧＥＳ２遺伝子を破壊する遺伝子改変についてホモ接合性である遺伝子改変動物細胞の発現プロファイルを野生型細胞と比較することを含む前記方法を特色とする。
【００１０】
本発明の第四の側面は、プロスタグランジンＥ合成酵素２を阻害する薬剤の投与を含む、炎症を介する障害を治療する方法を特色とする。こういった炎症には、慢性炎症（例として、関節リウマチ、及び多発性硬化症といったＴｈ１を介する障害）及び急性炎症性疼痛（例として、傷害を介する疼痛）が含まれる。好ましくは、薬剤は、関節炎、白血球浸潤、関節の関節面におけるプロテオグリカン減少及び／または炎症性疼痛の検出を低減するのに十分な量で投与される。
【００１１】
当業者は、本明細書における記載及び付随する請求項において、本発明を記載するのに使用される用語を十分に理解するであろう。それでもなお、本明細書において特別の定めのない限り、以下の用語については直下に記載されるとおりである。
【００１２】
「遺伝子改変」非ヒト哺乳動物または動物細胞は、非ヒト哺乳動物または動物細胞、あるいは非ヒト哺乳動物または動物細胞の前駆体に遺伝子操作によって導入される改変について、ヘテロ接合性またはホモ接合性である。改変を導入するのに利用可能な遺伝子操作の標準的な方法には、相同的組換え、ウイルスベクター遺伝子トラップ、放射線照射、化学的突然変異誘発、及びアンチセンスＲＮＡを単独でまたは触媒性リボザイムとともにコードするヌクレオチド配列の遺伝子導入発現が含まれる。遺伝子を破壊する遺伝子改変の好ましい方法は、例えば、相同組換えまたはウイルスベクター遺伝子トラップによって、「外来核酸配列」を遺伝子座に挿入することにより内在性遺伝子を改変する方法である。「外来核酸配列」は、遺伝子において天然には生じない外因性の配列である。この外来ＤＮＡの挿入は、例えば、エンハンサー、プロモーター、レギュレーター領域、非コード領域、コード領域、イントロンまたはエキソンといった、ＰＧＥＳ２遺伝子のいかなる領域内でも起こり得る。遺伝子を破壊するのに最も好ましい遺伝子操作方法は相同組換えであり、外来核酸配列を単独でまたは内在性遺伝子配列の一部欠失と組み合わせて、ターゲティング方法にて挿入する方法である。
【００１３】
「破壊」されているＰＧＥＳ２遺伝子とは、破壊された遺伝子によりコードされるＰＧＥＳ２ポリペプチドの細胞内活性が、野生型バージョンのＰＧＥＳ２遺伝子を正常に発現する細胞において減少または消失するように遺伝子改変されるＰＧＥＳ２遺伝子を意味する。遺伝子改変により細胞中のＰＧＥＳ２遺伝子のすべての野生型コピーが効果的に消失する場合（例えば、遺伝子改変非ヒト哺乳動物または動物細胞がＰＧＥＳ２遺伝子破壊についてホモ接合性であるか、または元々存在したＰＧＥＳ２遺伝子の野生型コピーのみが破壊される場合）、遺伝子改変により、野生型ＰＧＥＳ２遺伝子を発現する対照細胞と比べてＰＧＥＳ２ポリペプチド活性の低減を生じる。このＰＧＥＳ２ポリペプチド活性の低減は、ＰＧＥＳ２遺伝子発現の低減（すなわち、ＰＧＥＳ２のｍＲＮＡレベルが効果的に低減し、その結果としてＰＧＥＳ２ポリペプチドのレベルの低減を生じる）に起因し、かつ／または、破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子が、例えば、野生型ＰＧＥＳ２ポリペプチドと比較して変化した、例えば低減した、機能または安定性を有する変異ポリペプチドをコードすることに起因する。好ましくは、遺伝子改変非ヒト哺乳動物または動物細胞におけるＰＧＥＳ２ポリペプチド活性は、野生型レベルの５０％以下、より好ましくは２５％以下、そしてより一層好ましくは野生型レベルの１０％以下に低減する。最も好ましくは、公知の方法論によって評価されるように、ＰＧＥＳ２遺伝子の破壊によりＰＧＥＳ２活性が検出されなくなる。
【００１４】
破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を含有する「遺伝子改変非ヒト哺乳動物」とは、例えば、所望の遺伝子改変を保有する胚盤胞または胚を作製し、次いで代理母にこの胚盤胞または胚を子宮内で発生させるために移植することにより、元来産生される非ヒト哺乳動物を意味する。マウスの場合、遺伝子改変胚幹（ＥＳ）細胞をマウス胚盤胞に移植することにより、またはＥＳ細胞を四倍体胚と凝集させることにより、遺伝子改変された胚盤胞または胚を作製することが可能である。別の方法において、ＥＳ細胞及び桑実期（８細胞）胚（二倍体）を用いて凝集させることにより、キメラ動物を作製してもよい。あるいは、様々な種の遺伝子改変胚を核移植によって得ることが可能である。核移植の場合、ドナー細胞は体細胞または多能性幹細胞であり、そしてＰＧＥＳ２遺伝子を破壊する所望の遺伝子改変を含有するよう操作される。次いで、この細胞の核を、受精または単為発生させた除核卵母細胞に移植し；結果として生じる胚は胚盤胞へと再構成または発生させる。次いで、上記方法のいずれかにより作製された遺伝子改変胚盤胞を、当業者に周知の標準的な方法にしたがって代理母に移植する。「遺伝子改変非ヒト哺乳動物」は、子孫がＰＧＥＳ２遺伝子を破壊する遺伝子改変の少なくとも一つのコピーを受け継ぐという条件で、上述の方法により作製される、非ヒト哺乳動物のすべての子孫を含む。遺伝子改変非ヒト哺乳動物のすべての体細胞及び生殖系列細胞は、改変を含有することが好ましい。破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を含有するように遺伝子改変される好ましい非ヒト哺乳動物は、マウス及びラットといったげっ歯類、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ及びフェレットである。
【００１５】
破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を含有する「遺伝子改変動物細胞」とは、破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を含有するよう遺伝子操作により作製されたヒト細胞を含む動物細胞、及び破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を受け継ぐ娘細胞を意味する。これらの細胞は、当該技術分野において公知のいずれかの標準的な方法に従って、培養物中で遺伝子改変してもよい。培養物中で細胞を遺伝子改変するのに代わるものとして、ＰＧＥＳ２遺伝子破壊を含有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物から非ヒト哺乳動物細胞を単離してもよい。本発明の動物細胞は、初代細胞または組織標本、あるいは培養用細胞株、腫瘍細胞株または形質転換細胞株から得てもよい。これらの細胞及び細胞株は、例えば、内皮細胞、上皮細胞、島、神経及び他の神経組織由来の細胞、中皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、主要な腺または器官の細胞（例えば、精巣、肝臓、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓及び皮膚）、筋細胞（骨格筋、平滑筋及び心筋由来の細胞を含む）、外分泌または内分泌細胞、線維芽細胞、並びに胚幹細胞及び他の全能性または多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞、ＥＳ様細胞及び胚性生殖系列（ＥＧ）細胞、並びに前駆細胞及び組織由来幹細胞といった他の幹細胞）に由来する。好ましい遺伝子改変細胞はＥＳ細胞であり、さらに好ましくはマウスまたはラットＥＳ細胞、そして、最も好ましくはヒトＥＳ細胞である。
【００１６】
「ＥＳ細胞」または「ＥＳ様細胞」は、無制限の自己複製及び３つの胚性胚葉（embryonic germ layers）三胚葉すべてを表す細胞種類への分化が可能な胚由来、始原生殖細胞由来または奇形癌腫由来の多能性幹細胞を意味する。
【００１７】
「改変されたＰＧＥＳ２活性」とは、細胞内の機能的ＰＧＥＳ２酵素レベルを変動させるＰＧＥＳ２遺伝子の遺伝子操作の結果として、あるいはＰＧＥＳ２活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする薬剤を投与する結果として、ＰＧＥＳ２酵素活性が変化することを意味する。
【００１８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び請求項から明らかであろう。本発明を特定の実施態様に関連して記載するが、実行可能な他の変更及び修正もまた本発明の一部であり、そして付随する請求項の範囲内であると理解されるであろう。本出願は、当該技術分野での公知または慣例の実践の範囲内にある本開示からの逸脱を含む、概して本発明の原理に追随するものであって、そして必要以上の実験をすることなく解明が可能な、本発明の同等物、変形物、使用、または改作のいかなるものも対象とすることを意図している。核酸及びポリペプチドの作製及び使用に関するさらなる手引きは、分子生物学、タンパク質科学及び免疫学の標準的な教科書に見つけられる（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，エルセビア・サイエンス・パブリッシング，インク、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９８６年；  Ｈａｍｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＬプレス社、１９８５年；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編集、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら編集、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編集、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社；  及び、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編集、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社を参照されたい。）。本明細書に記載のすべての出版物は、すべて参照によってそのすべてを援用する。
【００１９】
発明の詳細な説明
破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を含有する、遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞
１．遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞
本発明の、遺伝子改変非ヒト哺乳動物及びヒト細胞を含む遺伝子改変動物細胞は、ＰＧＥＳ２遺伝子を破壊する改変についてヘテロ接合性またはホモ接合性である。細胞は、遺伝子操作した培養細胞から得てもよく、あるいは、非ヒト哺乳動物細胞の場合、細胞は遺伝子改変非ヒト哺乳動物から単離してもよい。
【００２０】
ＰＧＥＳ２遺伝子座は、化学的突然変異誘発（Ｒｉｎｃｈｉｋ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１５−２１，１９９１，  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ２３（Ｓｕｐｐｌ．２４）：２３−２９，１９９４）、放射線照射（Ｒｕｓｓｅｌｌ，同上）、単独もしくは触媒性ＲＮＡリボザイム配列と組み合わせたＰＧＥＳ２遺伝子アンチセンスＲＮＡの遺伝子導入発現（Ｌｕｙｃｋｘら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９６：１２１７４−７９，１９９９；  Ｓｏｋｏｌら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：３６３−７１，１９９６；  Ｅｆｒａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２０５１−５５，１９９４；  Ｌａｒｓｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：２２４２−４８，１９９４）、及び、以下にさらに論じるように、ＰＧＥＳ２遺伝子座に外来核酸配列を挿入することによるＰＧＥＳ２遺伝子の破壊を含む、当該技術分野において公知のいくつかの遺伝子改変技術のうちの一つにより破壊される 。好ましくは、外来配列は、相同組換えにより、またはウイルスベクターの挿入により挿入される。最も好ましくは、ＰＧＥＳ２遺伝子破壊の方法は相同組換えであり、そして内在性ＰＧＥＳ２遺伝子配列の一部欠失を含む。
【００２１】
以下のメカニズムのうち一つ以上を介して；ＰＧＥＳ２遺伝子の転写または翻訳過程を妨げることにより（例えば、プロモーター認識を妨げることにより、または転写終結点もしくは転写終止コドンをＰＧＥＳ２遺伝子に導入することにより）；またはＰＧＥＳ２遺伝子コード配列を、正常な機能ではもはやＰＧＥＳ２ポリペプチドをコードしないよう歪めることにより（例えば、外来コード配列をＰＧＥＳ２遺伝子コード配列に挿入することによりフレームシフト変異もしくはアミノ酸置換を導入することにより、または、二重乗換え現象の場合、機能的ＰＧＥＳ２タンパク質の発現に必要とされるＰＧＥＳ２遺伝子コード配列の一部を欠失させることにより）；外来配列の組込みはＰＧＥＳ２遺伝子を破壊する。
【００２２】
本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞を本記載に基づき作製するために外来配列を細胞ゲノム中のＰＧＥＳ２遺伝子座に挿入するのに、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈澱法、レトロウイルス感染、マイクロインジェクション、遺伝子銃、リポソームによるトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、またはトランスフェリンフェクションといった当該技術分野において公知の標準的な方法（例えば、Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １：８４１−８４５，１９８２；  Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：７１６１−６５，１９８４；  Ｃｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：１３１１−２６，１９８７；  Ｔｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−１２，１９８７；  Ｂａｕｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：１０５８−６２，１９９４；  Ｂｉｅｗｅｎｇａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７１：６７−７５，１９９７；  Ｚｈａｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−７２，１９９３；  Ｒａｙ及びＧａｇｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：５９８−６０３，１９９２；  Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ３：１８０３−１４，１９８３；  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １０：９３−１０１，１９９８；  Ｌｉｎｎｅｙら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（オーランド）  ２１３：２０７−１６，１９９９；  Ｚｉｍｍｅｒ及びＧｒｕｓｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：１５０−１５３，１９８９；  及び、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：４４５−４８，１９８６を参照されたい）に従い、外来ＤＮＡ配列を細胞内に導入する。好ましい外来ＤＮＡの細胞内への導入方法は、電気穿孔法である。
【００２３】
２．相同組換え
相同組換えの方法は、ＰＧＥＳ２遺伝子を含有する細胞にＰＧＥＳ２遺伝子ターゲティングベクターを導入することによって破壊する目的で、ＰＧＥＳ２遺伝子を標的とする。破壊を目的としてＰＧＥＳ２遺伝子を標的とするベクターの性能は、ＰＧＥＳ２遺伝子に相同的な、すなわち関連する、ベクター中のヌクレオチド配列の使用に由来する。この相同領域は、ベクターとＰＧＥＳ２遺伝子内在性配列との間のハイブリッド形成を促進する。ハイブリッド形成下では、ターゲティングベクターとゲノム配列の間の乗換え現象の確率は非常に上昇する。この乗換え現象により、ＰＧＥＳ２遺伝子座へのベクター配列の組込み及びＰＧＥＳ２遺伝子の機能的な破壊が生じる。
【００２４】
ターゲティングに使用するベクターの作製に関する一般原則はＢｒａｄｌｅｙらにより概説されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：５３４，１９９２）。相同組換えによりＤＮＡを挿入するには、二つの異なるタイプのベクター：挿入ベクターまたは置換ベクターを使用することが可能である。挿入ベクターは、二重鎖が切断されたＰＧＥＳ２遺伝子相同領域を含有する環状ＤＮＡである。相同領域と内在性ＰＧＥＳ２遺伝子の間でハイブリッド形成後、二重鎖切断部位での単一の乗換え現象により、全ベクター配列が乗換え部位において内在性遺伝子に挿入される。
【００２５】
本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞を相同組換えにより作製するのに、より好ましいベクターは置換ベクターであり、該ベクターは環状よりもむしろ共直線性である。置換ベクターのＰＧＥＳ２遺伝子への組込みには、二重乗換え現象、すなわち、ターゲティングベクターとＰＧＥＳ２遺伝子の間の二箇所のハイブリッド形成部位における乗換えが必要とされる。この二重乗換え現象の結果として、二箇所の乗換え部位の間に挟まれるベクター配列がＰＧＥＳ２遺伝子へ組込まれ、そして元来二箇所の乗換え部位の間に股がっていた対応する内在性ＰＧＥＳ２遺伝子配列が欠失する（例えば、Ｔｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉら、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−１２，１９８７；  Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−５２，１９８８；  Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：７６８８−７６９２，１９９０；  及びＭａｎｓｏｕｒ，ＧＡＴＡ  ７：２１９−２２７，１９９０を参照されたい）。
【００２６】
本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞を作製するためのターゲティングベクターにおける相同領域は、概して少なくとも１００ヌクレオチド長である。最も好ましくは、相同領域は少なくとも１〜５キロベース（ｋｂ）長である。相同領域に必要とされる最短の長さまたは最小の関連性の度合いに実証されたものはないが、相同組換えのターゲティング効率は、概して長さ及びターゲティングベクターとＰＧＥＳ２遺伝子座の間の関連性の度合いに合致する。置換ベクターを使用し、そして内在性ＰＧＥＳ２遺伝子の一部を相同組換えにより欠失させる場合、さらに考慮すべきなのは、内在性ＰＧＥＳ２遺伝子の欠失部分の大きさである。内在性ＰＧＥＳ２遺伝子の該部分が１ｋｂよりも長い場合、１ｋｂより長い相同領域を有するターゲティングカセットが、組換え効率を増強するのに推奨される。本記載に基づく、相同組換えに効果的な配列の選択及び使用に関するさらなる手引きは、文献に記載されている（例えば、Ｄｅｎｇ及びＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １２：３３６５−３３７１，１９９２；  Ｂｏｌｌａｇら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．  ２３：１９９−２２５，１９８９；  及び、Ｗａｌｄｍａｎ及びＬｉｓｋａｙ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ８：５３５０−５３５７，１９８８を参照されたい）。
【００２７】
当業者は認識するであろうが、本発明のＰＧＥＳ２遺伝子ターゲティングベクターの構築に際して、多様なクローニングベクターがベクターバックボーンとして使用してもよく、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ関連プラスミド（例えば、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋１１）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｈｉＸ１７４、ｐＢＫ  Ｐｈａｇｅｍｉｄ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ｚ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５  ＰＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン社）、ｐＳＶＫ３、ＰＢＰＶ、ＰＭＳＧ、及びｐＳＶＬ、ｐＢＲ３２２並びにｐＢＲ３２２ベースのベクター、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８、ｐＨＣ７９、ファージ  Ｃｈａｒｏｎ  ２８、ｐＫＢ１１、ｐＫＳＶ−１０、ｐＫ１９関連プラスミド、ｐＵＣプラスミド、及びｐＧＥＭシリーズのプラスミドを含む。これらのベクターは種々の商業的供給源から入手可能である（例えば、ベーリンガー・マイハイム・バイオケミカル社、インディアナポリス、イリノイ州；  キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州；  ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州；  プロメガ社、マディソン、ウイスコンシン州；  及び、ニューイングランド・バイオラボ社、ビバリー、マサチューセッツ州）。しかしながら、例えばプラスミド、ウイルスまたはその一部分といった他のいかなるベクターも、所望の宿主において複製可能でありそして生存可能である限り使用してもよい。ベクターはまた、ゲノムを改変しようとする宿主において複製を可能とする配列を含んでもよい。こういったベクターの使用により、組換えが起こりうる相互作用期間の拡張が可能であり、ターゲティング効率が上昇する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、９．１６章、図９．１６．１を参照されたい）。
【００２８】
本発明のターゲティングベクターを増殖させるのに使用する宿主に、特に決定的なものはない。例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  Ｋ１２  ＲＲ１（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ  ２：９５，１９７７）、大腸菌  Ｋ１２  ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）、大腸菌  ＭＭ２１（ＡＴＣＣ番号３３６７８０）、大腸菌  ＤＨ１（ＡＴＣＣ番号３３８４９）、大腸菌  ＤＨ５α株及び大腸菌  ＳＴＢＬ２を含む。あるいは、酵母（Ｃ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が使用可能である。上述の宿主は商業的に入手可能である（例えば、ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州；  及び、ライフテクノロジーズ社、ロックビル、メリーランド州）。
【００２９】
ターゲティングベクターを作製するには、ＰＧＥＳ２遺伝子のターゲティングコンストラクトを上記のベクターバックボーンに追加する。本発明のＰＧＥＳ２遺伝子ターゲティングコンストラクトは、少なくとも一つのＰＧＥＳ２遺伝子相同領域を有する。ＰＧＥＳ２遺伝子相同領域を作製するには、ＰＧＥＳ２ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを作製するための土台として使用する。これらのプライマーは、忠実度の高いＰＣＲ（high fidelity PCR）増幅によりＰＧＥＳ２配列の所望の領域を増幅させるのに用いられる（Ｍａｔｔｉｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：４９６７，１９９１；  Ｅｃｋｅｒｔ及びＫｕｎｋｅｌ  １：１７，１９９１；  及び、米国特許第４，６８３，２０２号）。ゲノム配列は、ゲノムクローンライブラリまたはゲノムＤＮＡ調製物より得られ、好ましくはＰＧＥＳ２遺伝子破壊の標的となる動物種より得られる。マウスＰＧＥＳ２のｃＤＮＡ配列を、ＰＧＥＳ２ターゲティングベクター（ジェンバンク  ＮＭ  ０２２４１５及びＡＢ０４１９９７）の作製に用いることが可能である。
【００３０】
好ましくは、本発明のターゲティングコンストラクトにはまた、陽性マーカータンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列が含まれる。ベクター組込み後の安定した陽性マーカー発現により、理想的には細胞の生存性を損なうことなく、識別可能な特性が細胞に与えられる。したがって、置換ベクターの場合、マーカー遺伝子が組込み後の発現のために配置されるような様式で、二重乗換え現象後にＰＧＥＳ２遺伝子に組込まれるよう、マーカー遺伝子は二つのフランキング相同領域の間に配置する。
【００３１】
陽性マーカータンパク質は選別可能なタンパク質であることが好ましい；このようなタンパク質の細胞内における安定した発現により、選択可能な表現型の特性が与えられる、すなわち、この特性は、そうでなければ致死的となる条件下において細胞の生存性を増強する。このように、選択可能な条件を課すことにより、陽性選択マーカーをコードするベクター配列を安定に発現する細胞を、ベクター配列を組込むことに成功しなかった他の細胞から、生存性に基づき単離することができる。陽性選択マーカータンパク質（及びその選択用薬剤）の例として、ｎｅｏ（Ｇ４１８またはカノマイシン）、ｈｙｇ（ハイグロマイシン）、ｈｉｓＤ（ヒスチジノール）、ｇｐｔ（キサンチン）、ｂｌｅ（ブレオマイシン）、及びｈｐｒｔ（ヒポキサンチン）が含まれる（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ及びＴｈｏｍａｓ、米国特許第５，４６４，７６４号、及び、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−９２，１９８９を参照されたい）。選択マーカーに代わるものとして使用してもよい他の陽性マーカーとしては、β−ガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラーゼまたはＧＦＰといったレポータータンパク質が含まれる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、９．５章、及び、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９．６章、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、２０００年を参照されたい）。
【００３２】
上記の陽性選択の段階では、ＰＧＥＳ２遺伝子座において標的とする相同組換えによりベクターを組込んだ細胞と、染色体の任意の位置にベクター配列をランダムで非相同的に組込んだ細胞とが区別されない。したがって、置換ベクターを相同組換えに用いる際に、陰性選択マーカータンパク質または適切な代替物をコードするヌクレオチド配列が含まれることが好ましい。陰性選択マーカーの例は、特定の薬剤に曝露すると、マーカー発現細胞に生存性の喪失をもたらす（すなわち、特定の選択的条件下において、マーカータンパク質は細胞に対して致死的となる）。陰性選択マーカーの例（及びその致死用薬剤）には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ガンシクロビルまたは１，２−デオキシ−２−フルオロ−α−ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨードウラシル）、Ｈｐｒｔ（６−チオグアニンまたは６−チオキサンチン）、及びジフテリア毒素、リシン毒素、及びシトシンデアミナーゼ（５−フルオロシトシン）が含まれる。
【００３３】
陰性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、置換ベクターの二つの相同領域の外側に配置する。この配置を与えられるときのみ、組込みがランダムな非相同組換えにより起こる場合は、細胞は陰性選択マーカーを組込みそして安定に発現させるであろうし；ＰＧＥＳ２遺伝子とターゲティングコンストラクト中の二つの相同領域との間の相同組換えにより、陰性選択マーカーをコード化する配列は組込まれない。このように、陰性条件を課すことにより、ランダムな非相同組換えによりターゲティングベクターを組込んだ細胞は生存性を失う。
【００３４】
相同組換えによりベクター組込みを行い、そしてその結果、破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を潜在的に含有する細胞のみを、より効率的に選択するように一連の陽性及び陰性選択段階を設計することが可能であるとの理由から、上記のように陽性及び陰性選択マーカーを組み合わせることが好ましい。陽性−陰性選択のスキーム、選択マーカー及びターゲティングコンストラクトのさらなる例については、例えば、米国特許第５，４６４，７６４号、ＷＯ  ９４／０６９０８、及びＶａｌａｎｃｉｕｓ及びＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １１：１４０２，１９９１に記載されている。
【００３５】
ベクター組込みによりマーカータンパク質を安定に発現させるために、ベクター組込みにおいてマーカーをコードする配列が内在性ＰＧＥＳ２遺伝子プロモーターに機能可能に連結されるように、ターゲティングベクターを設計してもよい。その結果、ＰＧＥＳ２遺伝子を正常に発現する細胞において、マーカーの発現はＰＧＥＳ２遺伝子プロモーターにより推進される。あるいは、ベクターのターゲティングコンストラクト中の各マーカーは、ＰＧＥＳ２遺伝子プロモーターより独立して発現を推進する、マーカー自身のプロモーターを含有してもよい。この後者のスキームは、典型的にＰＧＥＳ２遺伝子を発現しない細胞においてマーカーの発現を可能にするという利点を有している（Ｓｍｉｔｈ及びＢｅｒｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．  ４９：１７１，１９８４；  Ｓｅｄｉｖｙ及びＳｈａｒｐ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  ８６：２２７，１９８９；  Ｔｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３，１９８７）。
【００３６】
マーカー遺伝子発現を推進するのに用いることが可能な外因性プロモーターには、細胞特異的または時期特異的プロモーター、構成的プロモーター、及び誘導または制御プロモーターが含まれる。これらのプロモーターの限定されない例には、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０プロモーター類、ＰＧＫプロモーター、ＰＭＣ１−ｎｅｏ、メタロチオネインプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、トリベータグロビンプロモーター、ヒストンプロモーター類（例えば、マウスヒストンＨ３−６１４）、ベータアクチンプロモーター、神経特異的エノラーゼ、筋アクチンプロモーター、及びカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｉ〜ＩＩＩ巻、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、１９８９年、及び、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、２０００年を参照されたい）；ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州、が含まれる。
【００３７】
細胞が、標的とするＰＧＥＳ２遺伝子座にベクター配列を組込んだかどうかを確認するには、所望のベクター組込み現象に特異的なプライマーまたはゲノムプローブを、ＰＣＲまたはサザンブロット解析と組み合わせて、所望のベクターのＰＧＥＳ２遺伝子座への組込みの存在を同定するのに用いることが可能である（Ｅｒｌｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６４３−５１，１９９１；  Ｚｉｍｍｅｒ及びＧｒｕｓｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：１５０，１９８９；  Ｍｏｕｅｌｌｉｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  ８７：４７１２，１９９０；  及び、Ｓｈｅｓｅｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  ８８：４２９４，１９９１）。
【００３８】
３．遺伝子トラップ
本記載に基づいて、ＰＧＥＳ２遺伝子を破壊するために外来核酸配列をＰＧＥＳ２遺伝子座に挿入するのに利用可能な別の方法は、遺伝子トラップである。この方法は、遺伝子トラップベクターのコード配列をランダムに遺伝子に挿入するために、エキソンをｍＲＮＡにスプライスするというすべての哺乳動物細胞に存在する細胞の機構を利用する。ひとたび挿入されると、遺伝子トラップベクターは、トラップされたＰＧＥＳ２遺伝子を破壊することが可能な変異を引き起こす。相同組換えとは対照的に、この変異原性システムは非常にランダムな変異を引き起こす。このように、破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を含む遺伝子改変細胞を得るには、種々の遺伝子中にランダムな変異を含有する細胞のプールより、この特定の変異を含有する細胞を同定しそして選択しなければならない。
【００３９】
遺伝子トラップシステム及びベクターについては、遺伝子改変マウス細胞及び他の細胞種類における使用に関して記載されている（例として、Ａｌｌｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３３：８５２−５５，１９８８；  Ｂｅｌｌｅｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ３：１２８８−１３００，１９８９；  Ｂｉｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ３：１２７３−１２８７，１９８９；  Ｂｏｎｎｅｒｏｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６６：４９８２−９１，１９９２；  Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５５１７−２１，１９８９；  Ｃｈａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：７３７−４７，１９９３；  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ及びＳｏｒｉａｎｏ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２２５：６８１−７０１，１９９３；  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ及びＳｏｒｉａｎｏ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ５：１５１３−２３，１９９１；  Ｇｏｆｆ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５２：４６９−８１，１９８７；  Ｇｏｓｓｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４６３−６５，１９８９；  Ｈｏｐｅ，Ｄｅｖｅｌｏｐ．  １１３：３９９−４０８，１９９１；  Ｋｅｒｒら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．  ２：７６７−７７６，１９８９；  Ｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６５：１５０７−１５１５，１９９１；  Ｒｅｄｄｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９：６７２１−２５，１９９２；  Ｓｋａｒｎｅｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ６：９０３−９１８，１９９２；  ｖｏｎ  Ｍｅｌｃｈｎｅｒ及びＲｕｌｅｙ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６３：３２２７−３２３３，１９８９；  及び、Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｔｒａｎｓｇｅｎ．Ｒｅｓ．  ４：２７７−８７，１９９５を参照されたい）。
【００４０】
プロモータートラップベクターまたは５’ベクターは、５’から３’への順に、スプライシングアクセプター配列に続いて、典型的には翻訳開始コドン及びオープンリーディングフレーム並びに／または配列内リボソーム侵入部位により特徴づけられるエキソンを含有する。概して、これらのプロモータートラップベクターは、プロモーターまたは機能可能に連結されたスプライシングドナー配列を含有しない。その結果として、プロモータートラップベクター配列は、宿主細胞の細胞ゲノムへ組込まれた後、上流遺伝子の正常なスプライシングを妨害し、そして終末エキソンとしての機能を果たす。ベクターコード配列の発現は、破壊された遺伝子のイントロンにベクターが適切な読み枠において組込まれることに依存する。こういった場合、細胞のスプライシング機構により、ベクターコード配列上流においてトラップされた遺伝子からエキソンがスプライシングされる（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら、ＷＯ  ９９／５０４２６、米国特許第６，０８０，５７６号）。
【００４１】
上記のプロモータートラップベクターに似た効果を作出するもう一つの方法は、プロモータートラップベクターのスプライシングアクセプターと翻訳開始コドンまたはポリアデニル化配列との間の領域に存在するか、もしくは設計された、終止コドンの入れ子構造のセットを組込むベクターである。コード配列はまた、独立したリボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有するように設計されることが可能であり、その結果として、コード配列は、宿主細胞のゲノム内の組込み部位から大きく独立した様式で発現されるであろう。典型的には、しかし必須ではないが、ＩＲＥＳは終止コドンの入れ子構造のセットと連動させて用いられる。
【００４２】
別のタイプの遺伝子トラップのスキームは、３’遺伝子トラップベクターを用いる。このタイプのベクターは、隣接するコード配列の発現を媒介するプロモーター領域、コード配列、及びコード配列のエキソンの３’末端を決めるスプライシングドナー配列を、有効な組み合わせで含有する。宿主細胞ゲノムに組込まれた後、ベクターのプロモーターによって発現された転写物は、組込まれた遺伝子トラップベクター配列の下流に位置するトラップされた遺伝子の、スプライシングアクセプター配列までスプライシングされる。このように、ベクターの組込みによって、３’遺伝子トラップカセットのコード配列、並びに終末エキソン及びそのポリアデニル化シグナルを含む下流の任意の細胞エキソンを含む融合転写物が発現する。このようなベクターを遺伝子に組込むとき、細胞のスプライシング機構により、トラップされた遺伝子の３’エキソンの上流のベクターコード配列がスプライシングされる。このようなベクターの一つの利点は、３’遺伝子トラップベクターの発現が、遺伝子トラップカセット内のプロモーターによって推進され、宿主細胞で正常に発現している遺伝子への組込みを必要としないことである（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら、ＷＯ  ９９／５０４２６）。３’遺伝子トラップベクターに組み込んでもよい転写プロモーター及びエンハンサーの例には、ターゲティングベクターに関して先に論じたものが含まれる。
【００４３】
プロモーターまたは３’遺伝子トラップベクターの構造成分として用いられるウイルスベクターバックボーンは、標的細胞のゲノムへの挿入が可能な広範なベクターから選択してもよい。適切なバックボーンベクターには、限定されるわけではないが、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、仮性狂犬病ウイルス、アルファヘルペスウイルスベクターなどが含まれる。ウイルスベクター、特に複製中ではない細胞を改変するのに適したウイルスベクター、及び外因性ポリヌクレオチド配列の発現と併せてこれらのベクターを使用する方法についての詳細な総説は、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃａｐｌｉｔｔ及びＬｏｅｗｙ編集、アカデミックプレス社、サンディエゴ、１９９５年、に見られる。
【００４４】
好ましくは、レトロウイルスベクターが遺伝子トラップに用いられる。これらのベクターは、米国特許第５，４４９，６１４号に記載されたものなどの、レトロウイルス・パッケージング細胞株と併せて、使用することが可能である。非マウス哺乳動物細胞を遺伝子改変の標的細胞として用いる場合、広宿主性または汎宿主性パッケージング細胞株を、適切なベクターをパッケージするのに用いることが可能である（Ｏｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１１４００−１１４０６，１９９６）。ここに記載の３’遺伝子トラップベクターを作製するのに適用可能な代表的なレトロウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，５２１，０７６号に記載されている。
【００４５】
遺伝子トラップベクターは、相同組換えに使用されるターゲティングベクターに関して先に論じた、１またはそれより多くの陽性マーカー遺伝子を含有することが可能である。ターゲティングベクターにおけるそれらの使用と同様、これらの陽性マーカーは、遺伝子トラップベクターにおいてベクターを細胞ゲノムに組込んだ細胞を同定しそして選択するのに用いられる。マーカー遺伝子は、独立したリボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有するように設計してもよく、その結果として、マーカーは、ベクターが標的細胞ゲノムに組込まれた部位とは概して無関係な様式で発現するであろう。
【００４６】
遺伝子トラップベクターが、感染した宿主細胞のゲノムに極めてランダムな様式で組込まれる場合、破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を持つ遺伝子改変細胞を、ランダムなベクター組込みを行った細胞のポピュレーションから同定する必要がある。好ましくは、細胞ゲノム中に見つけられる基本的にすべての遺伝子において、ポピュレーションが変異を示すように、細胞のポピュレーションにおける遺伝子改変は十分にランダム及び頻繁であり、破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を持つ細胞がポピュレーションから同定される可能を高める（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら；  ＷＯ  ９９／５０４２６；  Ｓａｎｄｓら、ＷＯ  ９８／１４６１４；  米国特許第６，０８０，５７６号を参照されたい）。
【００４７】
例えば、ＰＧＥＳ２遺伝子配列における変異を同定するのに、逆転写及びＰＣＲを用いて、破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を含有する個々の変異細胞株を、変異細胞のポピュレーション中で同定する。この過程は、クローンをプールすることにより能率化することが可能である。例えば、破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を含有する個々のクローンを見つけるには、遺伝子トラップベクター内にアンカーされた一方のプライマー及びＰＧＥＳ２遺伝子配列内に位置する他方のプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行う。ＲＴ−ＰＣＲの陽性結果は、ベクター配列がＰＧＥＳ２遺伝子転写物中にコードされていることを示しており、ＰＧＥＳ２遺伝子が遺伝子トラップ組込み現象により破壊されたことが示唆される（例えば、Ｓａｎｄｓら、ＷＯ  ９８／１４６１４、米国特許第６，０８０，５７６号を参照されたい）。
【００４８】
４．時間的、空間的及び誘導性のＰＧＥＳ２遺伝子破壊
本発明のある実施態様において、内在性ＰＧＥＳ２遺伝子の機能的な破壊は、特定の発生または細胞周期の段階で（時間的な破壊）、あるいは特定の細胞種類に（空間的な破壊）生じる。他の実施態様では、ＰＧＥＳ２遺伝子の破壊は、ある条件が存在する場合に誘導される。特定の組織または細胞種類において、あるいは特定の環境条件下で、Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステムといったリコンビナーゼによる切除システムを、特定の発生段階においてＰＧＥＳ２遺伝子を活性化または不活化するのに用いてもよい。概して、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ技術を利用する方法は、例えば、Ｔｏｒｒｅｓ及びＫｕｈｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、オックスフォード大学出版局、１９９７年、に記載されるように行われる。ＦＬＰ−ＦＲＴシステムを利用して、Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステムについて記載されたのと同様な方法論を用いることも可能である。 相同組換えまたはウイルス挿入により条件的に遺伝子を破壊する、リコンビナーゼによる切除システムの使用に関するさらなるガイダンスは、例えば、米国特許第５，６２６，１５９号、米国特許第５，５２７，６９５号、米国特許第５，４３４，０６６号，  ＷＯ  ９８／２９５３３、Ｏｒｂａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６８６１−６５，１９９２；  Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−５５，１９９１；  Ｓａｕｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：１４７−６１，１９８９；  Ｂａｒｉｎａｇａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：２６−２８，１９９４；  及び、Ａｋａｇｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：１７６６−７３，１９９７において提供される。当業者は認識するであろうが、一つより多くのリコンビナーゼシステムを、非ヒト哺乳動物または動物細胞を遺伝子改変するのに用いることが可能である。
【００４９】
Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステムといったリコンビナーゼシステムを用いて、時間的、空間的または誘導性の方法でＰＧＥＳ２遺伝子を破壊するのに相同組換えを用いる場合、ＰＧＥＳ２遺伝子コード領域の一部は、ｌｏｘＰ部位が隣接したＰＧＥＳ２遺伝子コード領域を含むターゲティングコンストラクトに置換される。この遺伝子改変を保有する非ヒト哺乳動物及び動物細胞は、機能的な、ｌｏｘＰが隣接したＰＧＥＳ２遺伝子を含有する。ＰＧＥＳ２遺伝子破壊の時間的、空間的または誘導性の側面は、追加の導入遺伝子であるＣｒｅリコンビナーゼ導入遺伝子の発現パターンに起因し、該導入遺伝子は、所望の空間的制御された、時間的制御された、または誘導性の各々のプロモーターの制御下で、非ヒト哺乳動物または動物細胞に発現する。組換えに際して、ＣｒｅリコンビナーゼはｌｏｘＰ部位を標的とする。したがって、Ｃｒｅ発現が活性化されるとき、ＬｏｘＰ部位は、挟まれたＰＧＥＳ２遺伝子コード配列を切除するように組換えを行い、その結果、ＰＧＥＳ２遺伝子の機能的な破壊が生じる（Ｒａｊｅｗｓｋｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ９８：６００−０３，１９９６；  Ｓｔ．−Ｏｎｇｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４：３８７５−７７，１９９６；  Ａｇａｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  １００：１６９−７９，１９９７；  Ｂｒｏｃａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１４５５９−６３，１９９７；  Ｆｅｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０８８７−９０，１９９６；  及び、Ｋｕｈｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１４２７−２９，１９９５）。
【００５０】
Ｃｒｅリコンビナーゼ導入遺伝子及びｌｏｘＰが隣接したＰＧＥＳ２遺伝子の双方を含有する細胞は、標準的な遺伝子導入技術を介して、または、遺伝子改変非ヒト哺乳動物の場合、片方の親がｌｏｘＰが隣接したＰＧＥＳ２遺伝子を含有し、もう片方の親が所望のプロモーターの制御下にあるＣｒｅリコンビナーゼ導入遺伝子を含有する、改変非ヒト哺乳動物を交配させることにより、作出することが可能である。ＰＧＥＳ２遺伝子を時間的、空間的または条件的に破壊するためのリコンビナーゼシステム及び特定のプロモーターの使用に関するさらなるガイダンスは、例えば、Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．  ２２５：８９０−９００，１９９３，  Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０３−０６，１９９４，  Ａｒａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １２２：９７７−８２，１９９７，  Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ９３：６１９１−９６，１９９６，  及び、Ｍｅｙｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８：１３６−４１，１９９８に見いだされる。
【００５１】
ＰＧＥＳ２遺伝子の誘導性の破壊はまた、テトラサイクリン応答性バイナリーシステムを用いることによっても達成できる（Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５１，１９９２）。このシステムは、細胞を遺伝的に改変して、Ｔｅｔプロモーターを内在性ＰＧＥＳ２遺伝子調節エレメントに導入し、そしてテトラサイクリン制御可能リプレッサー（ＴｅｔＲ）を発現する導入遺伝子を導入することを含む。このような細胞においては、テトラサイクリンの投与によりＴｅｔＲが活性化され、これが次にＰＧＥＳ２遺伝子発現を阻害し、そしてそれゆえにＰＧＥＳ２遺伝子が破壊される（Ｓｔ．−Ｏｎｇｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４：３８７５−７７，１９９６，  米国特許第５，９２２，９２７号）。
【００５２】
時間的、空間的及び誘導性のＰＧＥＳ２遺伝子破壊のための上述のシステムはまた、例えば、ＷＯ  ９８／２９５３３及び米国特許第６，２８８，６３９号に記載されるように、遺伝子改変の方法として遺伝子トラップを用いる場合にも採用可能である。
【００５３】
５．遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞の作製
上述の遺伝子改変の方法は、実質的に動物由来のいかなる種類の体細胞または幹細胞においても、ＰＧＥＳ２遺伝子を破壊するのに用いることが可能である。本発明の遺伝子改変動物細胞には、限定されるわけではないが、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞及びトリ細胞が含まれる。これらの細胞は、培養適応細胞株、腫瘍原性細胞株または形質転換細胞株といった、いかなる動物細胞株を遺伝子操作することによって得てもよく、あるいは、所望のＰＧＥＳ２遺伝子改変を保有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物から単離してもよい。
【００５４】
細胞は、破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性であってよい。ＰＧＥＳ２遺伝子破壊についてホモ接合性である細胞（ＰＧＥＳ２−／−）を得るために、双方の対立遺伝子に直接的で連続的なターゲティングを行うことが可能である。この過程は、陽性選択マーカーを再利用することにより促進される。このスキームに従い、陽性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、一方の対立遺伝子を破壊後に、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ  Ｐシステムを用いて除去される。このように、第二のＰＧＥＳ２遺伝子の対立遺伝子を破壊するための続く回のターゲティングにおいて、同じベクターを用いることが可能である（Ａｂｕｉｎ及びＢｒａｄｌｅｙ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １６：１８５１−５６，１９９６；  Ｓｅｄｉｖｙら、Ｔ．Ｉ．Ｇ．  １５：８８−９０，１９９９；  Ｃｒｕｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  ８８：７１７０−７４，１９９１；  Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  ８８：７０３６−４０，１９９１；  Ｒｉｅｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）  ３４８：６４９−６５１，１９９０）。
【００５５】
ＰＧＥＳ２−／−であるＥＳ細胞を得るためのもう一つのストラテジーは、ＰＧＥＳ２遺伝子破壊についてヘテロ接合性である細胞（ＰＧＥＳ２  ＋／−）のポピュレーションからの、細胞のホモジェのタイゼーション（homogenotization）である。この方法は、選択的な薬剤耐性マーカーを発現するＰＧＥＳ２＋／−標的クローンを、非常に高い薬剤濃度に対して選択するというスキームを用いる；この選択は、薬剤耐性マーカーをコード化する配列の二つのコピーを発現する細胞、つまり、ＰＧＥＳ２遺伝子破壊についてホモ接合性である細胞に対して有利に働く（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １２：２３９１−９５，１９９２）。加えて、以下でさらに論じるように、遺伝子改変動物細胞は、生殖系列細胞においてＰＧＥＳ２＋／−である非ヒト哺乳動物を交配させることにより作製される遺伝子改変ＰＧＥＳ２−／−非ヒト哺乳動物から得ることが可能である。
【００５６】
所望の細胞または細胞株を遺伝子改変した後、標準ＰＣＲ法によるＰＣＲ解析または当該技術分野において公知のサザンブロット法によって、ＰＧＥＳ２遺伝子座を改変部位として確認することが可能である（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；  及び、Ｅｒｌｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６４３，１９９１を参照されたい）。ＰＧＥＳ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベル及び／またはＰＧＥＳ２のポリペプチドレベルが、ＰＧＥＳ２遺伝子を正常に発現する細胞において低減する場合、ＰＧＥＳ２遺伝子の機能的な破壊をさらに検証してもよい。ＰＧＥＳ２遺伝子のｍＲＮＡレベルの測定は、逆転写酵素を介したポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット解析またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成を用いることによって得られる。細胞により産生されるＰＧＥＳ２遺伝子ポリペプチドレベルは、例えば、当該技術分野において公知の標準イムノアッセイ法により、定量することが可能である。こういったイムノアッセイには、限定されるわけではないが、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射性測定法、ゲル内拡散沈降反応（gel diffusion precipitin reactions）、免疫拡散法、（例えば、金コロイド、酵素または放射性同位体による標識を用いた）ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ、ウエスタンブロット、二次元ゲル解析、沈降反応、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動法といった技術を用いる競合的及び非競合的アッセイ系が含まれる。
【００５７】
好ましい遺伝子改変動物細胞は、胚幹（ＥＳ）細胞及びＥＳ様細胞である。これらの細胞は、マウス（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  １２９：１５４−１５６，１９８１；  Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：７６３４−７６３８，１９８１）、ブタ及びヒツジ（Ｎｏｔａｎｉａｎｎｉら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｓｕｐｐｌ．，４３：２５５−２６０，１９９１；  Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４−６８，１９９６）、及びヒトを含む霊長類（Ｔｈｏｍｓｏｎら、米国特許第５，８４３，７８０号，  Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７，１９９５；  及び、Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４−７８４８，１９９５）といった、様々な種の着床前胚及び胚盤胞に由来する。
【００５８】
これらの種類のＥＳ細胞は多能性である。すなわち、適切な条件下で、これらは、３つの胚性胚葉：外胚葉、中胚葉及び内胚葉のすべてに由来する多様な細胞種類に分化する。培養条件次第で、ＥＳ細胞試料は、幹細胞として無制限に培養可能であり、単一試料の中から多様な異なる細胞種類に分化することが可能であり、あるいは、マクロファージ様細胞、神経細胞、心筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、ケラチン生成細胞、及び、好酸球、肥満細胞、赤血球前駆細胞または巨核球といった造血細胞のような特定の細胞種類への分化へ向けることが可能である。定方向分化は、例えば、Ｋｅｌｌｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７：８６２−６９，１９９５，  Ｌｉら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．  ８：９７１，１９９８，  Ｋｌｕｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ９８：２１６−２４，１９９６，  Ｌｉｅｓｃｈｋｅら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２３：３２８−３４，１９９５，  Ｙａｍａｎｅら、Ｂｌｏｏｄ  ９０：３５１６−２３，１９９７，  及び、Ｈｉｒａｓｈｉｍａら、Ｂｌｏｏｄ  ９３：１２５３−６３，１９９９においてさらに記載されるように、培養条件に特定の成長因子またはマトリックス成分が含まれることによって、成し遂げられる。
【００５９】
遺伝子改変に用いられる胚幹細胞株には、特段に決まったものはない；典型的なマウスＥＳ細胞株には、ＡＢ−１（ＭｃＭａｈｏｎ及びＢｒａｄｌｅｙ、Ｃｅｌｌ  ６２：１０７３−８５，１９９０）、Ｅ１４（Ｈｏｏｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：２９２−９５，１９８７）、Ｄ３（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．  ８７：２７−４５，１９８５）、ＣＣＥ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：４４５−４８，１９８６）、ＲＷ４（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，セントルイス、ミズーリ州）、及びＤＢＡ／１ｌａｃＪ（Ｒｏａｃｈら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２２１：５２０−２５，１９９５）が含まれる。公開された手順（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，１９８７，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編集、オックスフォード：ＩＲＬプレス、７１−１１２頁，１９８７；  Ｚｊｉｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８，１９８９；  及び、Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：７９９−８０３，１９８９）にしたがって、遺伝子改変マウスＥＳ細胞株を、遺伝子改変マウスを作出するのに用いてもよい。
【００６０】
ＥＳ細胞が所望のＰＧＥＳ遺伝子の機能的破壊を含有することを確認後、次いで、これらのＥＳ細胞を、当該技術分野において公知の方法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ５：７０，１９８９）にしたがい、キメラマウスの作出に適した胚盤胞宿主に注入する。本発明に使用されるマウス胚盤胞には、特段に決まったものはない。このような胚盤胞の例には、Ｃ５７ＢＬ６マウス、Ｃ５７ＢＬ６アルビノマウス、スイス・ウェブスター非近交系マウス、ＣＦＬＰマウス及びＭＦＩマウス由来の胚盤胞が含まれる。スイス・ウェブスターマウスは商業的に入手可能であり、すなわちチャールズ・リバー研究所のＣＤ−１マウスである。あるいは、凝集ウェル中で四倍体胚間にＥＳ細胞を挟んでもよい（Ｎａｇｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８４２４−８４２８，１９９３）。
【００６１】
次いで、遺伝子改変ＥＳ細胞を含有する胚盤胞または胚を、偽妊娠した雌マウスに移植し、子宮内での発生を可能にする（Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、１９８８年；  及び、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編集、ＩＲＬプレス、ワシントンＤ．Ｃ．、１９８７年）。代理母より誕生した子（offspring）を、ＰＧＥＳ２遺伝子破壊についてキメラの子を同定するために、スクリーニングすることが可能である。概して、このような子は、遺伝子改変ドナーＥＳ細胞由来のいくつかの細胞、ならびに、元の胚盤胞由来の他の細胞を含有する。このような環境において、子は初めにモザイク模様の毛色によりスクリーニングされてよく、この毛色による選択ストラテジーは、ドナーＥＳ細胞由来の細胞を胚盤胞の他の細胞と区別するのに使用されている。あるいは、子の尾部組織由来のＤＮＡを、遺伝子改変細胞を含有するマウスを同定するのに用いることが可能である。
【００６２】
生殖系列細胞にＰＧＥＳ２遺伝子破壊を含有するキメラマウスを交配すると、すべての生殖系列細胞及び体細胞にＰＧＥＳ２遺伝子破壊を含有する子孫が作出される。次いで、ＰＧＥＳ２遺伝子破壊についてヘテロ接合性であるマウスを、ホモ接合体を作出するため交配させることが可能である（例えば、米国特許第５，５５７，０３２号及び米国特許第５，５３２，１５８号を参照されたい）。
【００６３】
細胞から動物一個体へと遺伝子改変を移行させる、上記のＥＳ細胞の技術に代わる方法は、核移植を使用することである。この方法は、マウス以外の遺伝子改変非ヒト哺乳動物、例えば、ヒツジ（ＭｃＣｒｅａｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９：１０６６−６９，２０００；  Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：  ６４−６６，１９９６；  及び、Ｓｃｈｎｉｅｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：２１３０−３３，１９９７）及び子ウシ（Ｃｉｂｅｌｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１２５６−５８，１９９８）を作製するのに使用可能である。簡潔に言えば、体細胞（例として、線維芽細胞）または多能性幹細胞（例として、ＥＳ様細胞）を核ドナーとして選択し、ＰＧＥＳ２遺伝子の機能的破壊を含有するよう遺伝子改変する。ＰＧＥＳ２遺伝子を変異させるためにＤＮＡベクターを体細胞に挿入する際には、ＰＧＥＳ２遺伝子へのベクターの組み込みによりＰＧＥＳ２遺伝子プロモーターの制御下でマーカーが発現するように、ベクターにはプロモーターを持たないマーカーを用いることが好ましい（Ｓｅｄｉｖｙ及びＤｕｔｒｉａｕｘ，Ｔ．Ｉ．Ｇ．  １５：８８−９０，１９９９；  ＭｃＣｒｅａｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９：１０６６−６９，２０００）。次いで、適切なＰＧＥＳ２遺伝子破壊を有するドナー細胞からの核を、受精または単為発生させた除核卵母細胞に移植する（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４，１９９６；  Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０，１９９７）。胚は、再構築されて、培養されて桑実胚／胚盤胞期へ発生し、そして全期を子宮内で発生させるために代理母へ移植される。
【００６４】
本発明はまた、遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び遺伝子改変動物細胞の子孫をも包含する。子孫がＰＧＥＳ２遺伝子を破壊する遺伝子改変についてヘテロ接合性またはホモ接合性であっても、子孫は、ＰＧＥＳ２遺伝子の元の遺伝子破壊以外の、後に続く世代に起こり得る変異または環境的な影響により、親の非ヒト哺乳動物及び動物細胞と遺伝的に同一でなくてもよい。
【００６５】
非ヒト遺伝子改変動物由来の細胞は、当業者に公知の技術を用いて、組織または器官より単離することが可能である。ある実施態様において、本発明の遺伝子改変細胞は不死化される。この実施態様によれば、テロメラーゼ遺伝子、例としてｍｏｓまたはｖ−ｓｒｃといった癌遺伝子、あるいは例としてｂｃｌ−２といったアポトーシス阻害遺伝子を細胞中に遺伝子操作することにより、細胞を不死化することが可能である。あるいは、当該技術分野において公知の技術を利用して、ハイブリッド形成のパートナーと融合させることにより細胞を不死化することが可能である。
【００６６】
６．「ヒト化」非ヒト哺乳動物及び動物細胞
破壊された内在性ＰＧＥＳ２遺伝子を含有する、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び非ヒト動物細胞は、ヒトＰＧＥＳ２配列（本明細書では「ヒト化」と呼ぶこととする。）を発現するようにさらに改変することが可能である。細胞をヒト化するのに好ましい方法は、内在性ＰＧＥＳ２遺伝子配列を、相同組換えにより、ヒトＰＧＥＳ２配列をコードする核酸配列に置き換えることを含む（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７２２０−２５，１９９９）。ベクターは、従来よりターゲティングベクターとして用いられているベクターと、５’及び３’側相同性アーム及び陽性／陰性選択スキームに関して類似している。ただし、ベクターはまた、組換え後に、ヒトＰＧＥＳ２コード配列を内在性配列と置換する配列か、あるいは、ヒトＰＧＥＳ２をコードするように内在性配列を改変する塩基対変換、エキソン置換またはコドン置換を達成する配列を含む。ひとたび、相同組換え体が同定されれば、ＣｒｅまたはＦｌｐを介する部位特異的な相同組換えを用いることにより、選択に基づくいずれの配列（例として、ｎｅｏ）をも切除することが可能である（Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ９３：６１９１−９６，１９９６）。
【００６７】
ヒトＰＧＥＳ２配列を内在性配列と置き換える場合、これらの変化が内在性の翻訳開始部位のすぐ下流に導入されることが望ましい。この配置により、ＰＧＥＳ２遺伝子の時間的及び空間的な内在性の発現パターンが保たれる。ヒト配列は、適切なプロセシングのために３’末端に結合したポリＡテールを持つ完全長ヒトｃＤＮＡ、またはゲノム全配列であり得る（Ｓｈｉａｏら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  ８：２９５−３０２，１９９９）。内在性遺伝子の発現をヒトの対応物に置換するために、細胞及び非ヒト哺乳動物を遺伝子改変するこれらの方法に関するさらなるガイダンスは、例えば、Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７２：１７９７２−８０，１９９７，  Ｒｅａｕｍｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７１：２３３８０−８８，１９９６，  及び、Ｓｃｏｔｔら、米国特許第５，７７７，１９４号に見いだされる。
【００６８】
このような「ヒト化」生物体を作製する別の方法は、内在性遺伝子の破壊に続いて、ノックアウト胚への前核のマイクロインジェクションによるヒト配列をコードする導入遺伝子の導入を含む、二段階の過程である。
【００６９】
７．遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞の使用
ＰＧＥＳ２の機能及び治療上の関連性については、ＰＧＥＳ２遺伝子の破壊についてホモ接合性（−／−）及びヘテロ接合性（＋／−）である、本発明の非ヒト哺乳動物及び動物細胞の表現型を調べることにより明らかにすることが可能である。例えば、遺伝子改変されたＰＧＥＳ２−／−非ヒト哺乳動物及び動物細胞を、例えば関節炎または癌などの特定の病態モデルにおいて現れる徴候または表現型を引き起こすか、低減するかまたは予防するのに、ＰＧＥＳ２が役割を担うかどうかを決定するのに用いることが可能である。徴候または表現型が、ＰＧＥＳ２−／−非ヒト哺乳動物または動物細胞において、野生型（ＰＧＥＳ２＋／＋）またはＰＧＥＳ２＋／−非ヒト哺乳動物または動物細胞と比べて異なる場合、ＰＧＥＳ２ポリペプチドは、徴候または表現型に関連する機能を制御する役割を担っている。ＰＧＥＳ２の機能を評価するのに用いることが可能な動物モデルの例には、慢性及び急性炎症反応並びに侵害受容機能を検討するモデル（例として、コラーゲン誘導関節炎、白血球走化性に対する空気嚢モデル、カラゲニン誘導浮腫及び酢酸誘導ライジング）、心腎機能を評価するモデル（例として、ナトリウム取り込み機能としての尿中プロスタグランジン排泄の測定）、及び血栓症を評価するモデル（例として、出血時間及び血小板凝集の測定）が含まれる。
【００７０】
加えて、薬剤がＰＧＥＳ２アゴニストまたはアンタゴニストとして同定されている（例えば、ＰＧＥＳ２＋／＋またはＰＧＥＳ２＋／−非ヒト哺乳動物または動物細胞に薬剤を投与すると、薬剤が一つ以上のＰＧＥＳ２ポリペプチド活性を有意に変化させる）状況下において、本発明の遺伝子改変されたＰＧＥＳ２−／−動物細胞は、ＰＧＥＳ２のアゴナイズ作用（アンタゴナイズ作用）に起因することが知られている影響のほかにも、その薬剤に起因する他のいかなる影響をも特徴づけるのに有用である（すなわち、非ヒト哺乳動物及び動物細胞を陰性対照として使用することが可能である）。例えば、ＰＧＥＳ２ポリペプチド活性と関連することが知られていない薬剤の投与が、ＰＧＥＳ２＋／＋非ヒト哺乳動物または動物細胞において影響をもたらす場合は、薬剤が単独でこの影響を及ぼすのか、あるいは、ＰＧＥＳ２の調節をまず介してこの影響を及ぼすのかを、対応するＰＧＥＳ２−／−非ヒト哺乳動物または動物細胞に薬剤を投与することにより決定することが可能である。ＰＧＥＳ２−／−非ヒト哺乳動物または動物細胞において、この影響がないまたは有意に低減する場合は、この影響はＰＧＥＳ２により、少なくとも部分的に、媒介されている。しかしながら、ＰＧＥＳ２−／−非ヒト哺乳動物または動物細胞が、ＰＧＥＳ２＋／＋またはＰＧＥＳ２＋／−非ヒト哺乳動物または動物細胞と同程度の影響を示す場合は、この影響はＰＧＥＳ２シグナル伝達を伴わない経路によって媒介される。
【００７１】
さらに、薬剤が、ＰＧＥＳ２経路を通じて影響を与える可能性が疑われる場合、この仮説を検証するには、ＰＧＥＳ２−／−非ヒト哺乳動物が陰性対照として有用である。薬剤が本当にＰＧＥＳ２を通じて作用する場合、ＰＧＥＳ２−／−非ヒト動物は薬剤を投与された際に、ＰＧＥＳ２＋／＋非ヒト哺乳動物に見られるのと同様な効果を示さないはずである。
【００７２】
本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び動物細胞はまた、ＰＧＥＳ２＋／−またはＰＧＥＳ２−／−非ヒト哺乳動物または動物細胞において、発現がこれらの各野生型対照と比較して亢進している遺伝子を同定するのに用いることが可能である。このような遺伝子を本記載に基づいて同定するのに、当業者に公知の技術を用いることが可能である。例えば、ＰＧＥＳ２発現の欠如を補うために、ＰＧＥＳ２＋／−またはＰＧＥＳ２−／−マウスにおいて発現が亢進している遺伝子を同定するのに、ＤＮＡアッセイを用いることが可能である。ＤＮＡアレイは、当業者に公知であり、例えばアフィメトリックス社より、商業的に調達してもよい（例えば、米国特許第５，９６５，３５２号；  Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０，１９９５；  ＤｅＲｉｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４５７−４６０，１９９６；  Ｓｈａｌｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ６：６３９−６４５，１９９６；  及び、Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  ９３：１０５３９−１１２８６，１９９５を参照されたい）。
【実施例】
【００７３】
（実施例）
Ａ．  ライブラリのハイブリッド形成
３３５ヌクレオチドの部分ｃＤＮＡ断片（ジェンバンクＡＢ０４１９９７のネズミＰＧＥＳ２  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド３５〜３６９）を、ＤＢＡ／１ｌａｃＪゲノムラムダファージライブラリ（ストラタジーン社）をハイブリッド形成するのに用いた。３つのオーバーラップしたＰＧＥＳ２ゲノムクローンを単離し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（ストラタジーン社）のＮｏｔ  Ｉ部位にサブクローニングした。これらのクローンを、制限酵素地図で表し、３つのエキソンすべてを含む、ＰＧＥＳ２ゲノム座の２４ｋｂを含有すると判断された。
Ｂ．  ターゲティングベクターの作製
１．０ｋｂ  Ｎｈｅ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩ断片をＰＧＥＳ２ゲノムクローン＃２４．２−８から単離し、Ｌｉｔｍｕｓ  ２８ベクター（ニューイングランド・バイオラボ社、ビバリー、マサチューセッツ州）のＸｂａ  Ｉ／ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。この１．０ｋｂ断片を、Ｋｐｎ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩを用いて消化することでＬｉｔｍｕｓベクターから再単離し、５’相同性アームとして機能するようにｐＪＮＳ２−Ｆｒｔターゲティングベクターバックボーン（Ｄｏｍｂｒｏｗｉｃｚら、Ｃｅｌｌ  ７５：９６９−７６，１９９３）のＫｐｎ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ部位にクローニングした。この中間クローンを、ＰＧＥＳ２  ５’−ＪＮＳ２Ｆｒｔクローン＃１０と命名した。３’相同性アームもまた、ゲノムクローン＃２４．２−８から８．８ｋｂ  Ｎｏｔ  Ｉ／Ｓｐｈ  Ｉ制限酵素断片として単離した。この８．８ｋｂ断片を、クローニングベクターＬｉｔｍｕｓ  ３９（ニューイングランド・バイオラボ社）のＥａｇ  Ｉ／Ｓｐｈ  Ｉ部位にサブクローニングし、そしてＬｉｔｍｕｓ  ３９ベクターから８．８ｋｂ  Ｓａｌ  Ｉ断片として再単離した。このＳａｌ  Ｉ断片を、ＰＧＥＳ２  ５’−ＪＮＳ２Ｆｒｔクローン＃１０のＸｈｏ部位にクローニングした。ＰＧＥＳ２−ＫＯクローン＃５と命名された、双方の相同性アームを含有する最終的なターゲティングベクタークローンは、ＰＧＥＳ２ゲノム座の３．０ｋｂをＰＧＫ−ネオマイシンカセットに置換するように設計された。３．０ｋｂの除去された断片は、ジェンバンクＡＢ０４１９９７のｃＤＮＡ配列のヌクレオチド３５〜２５６をコードするエキソン１の一部及びエキソン２の全体を含有した（図１）。
Ｃ．  ＥＳ細胞のスクリーニング
ＰＧＥＳ２−ＫＯクローン＃５ターゲティングベクターを、Ｎｏｔ  Ｉで直線化し、そしてＤＢＡ／１ＬａｃＪ  ＥＳ細胞中へ電気穿孔した（Ｒｏａｃｈら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．  ２２１：５２０−２５，１９９５）。１５％ＥＳ細胞用ウシ胎児血清（ＩＬＴＩ、＃１０４３９−０２４）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（シグマ・ケミカル社、＃Ｍ−７５２２）、０．２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＩＬＴＩ、＃２５０３０−０８１）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＩＬＴＩ、＃１１１４０−０５０）、１０００単位／ｍｌ  リコンビナントネズミ白血球阻害因子（ケミコン・インターナショナル・インク、テメキュラ、カリフォルニア州、＃ＥＳＧ−１１０７）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ＩＬＴＩ、＃１５１４０−１２２）を添加した、ノックアウトＤＭＥＭ（インビトロジェン・ライフテクノロジーズ，インク（ＩＬＴＩ）、カールスバッド、カリフォルニア州、＃１０８２９−０１８）からなる幹細胞用培地（ＳＣＭＬ）中の、マイトマイシンＣ（シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）処理初代胚線維芽細胞（ＰＥＦ）フィーダー層上で多能性ＥＳ細胞を培養維持した。
【００７４】
ＳＣＭＬ中の１ｘ１０７個の細胞及び２５μｇの直線化したターゲティングベクターの電気穿孔を、ＢＴＸエレクトロ・セル・マニピュレーター  ６００（ＢＴＸ，インク、サンディエゴ、カリフォルニア州）を電圧２４０Ｖ、電気容量５０μＦ及び抵抗３６０Ｏｈｍｓにて用いて行った。電気穿孔した２４時間後に、２００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ＩＬＴＩ、＃１１８１１−０３１）及び２μＭガンシクロビル（シンテックス社、パロ・アルト、カリフォルニア州）を含有するＳＣＭＬ中で陽性／陰性選択を開始した。選択の８〜１２日後に、耐性コロニーをマイクロピペットで拾った。耐性ＥＳ細胞コロニーの増殖及びスクリーニングを、Ｍｏｈｎ及びＫｏｌｌｅｒ（Ｍｏｈｎ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ４（Ｈａｍｅｓ編集）、１４３−１８４，オックスフォード大学出版局、ニューヨーク、１９９５）に記載されるように行った。
【００７５】
Ｇ４１８及びガンシクロビル選択より生き残った７９個のＥＳ細胞クローンからＤＮＡを単離し、Ｎｈｅ  Ｉ及びＥｃｏ  ＲＶ制限酵素を用いて消化した。消化物を、０．７％アガロースゲル（バイオウィッタカー・モレキュラー・アプリケーションズ社、ロックランド、メーン州）上で電気泳動し、そしてサザン分析用のＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社、バッキンガムシャー、英国）ナイロン膜に転写した。８．８ｋｂの３’相同性アームの３’である、１．１ｋｂのＫｐｎ  Ｉ／Ｎｈｅ  Ｉゲノム断片を、３’側における相同組み換えをスクリーニングするためのプローブとして用いた。１．１ｋｂプローブは、１２．５ｋｂの内在性Ｎｈｅ  Ｉ断片及び標的とする対立遺伝子の１１．０ｋｂ断片を、ネオマイシンカセットとともに導入されたＥｃｏ  ＲＶ部位のために認識する。７９個のスクリーニングされたクローンから、１．１ｋｂ  ３’プローブを用いて、４個の標的クローンを同定した（クローン＃２２、＃７０、＃７８、＃８４）。これらの４個のクローンについて、５’側における組換えを、１．０ｋｂの５’相同性アームの５’である４００ｂｐのＮｏｔ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩ断片を用いて確認した。この４００ｂｐプローブは、１２．０ｋｂの内在性Ｓｐｅ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＶ断片及び標的とする対立遺伝子の３．５ｋｂ断片を、ネオマイシンカセットとともに導入された新たなＥｃｏ  ＲＶ部位のために認識する。
【００７６】
Ｄ．  ノックアウトマウスの作製及び遺伝子型同定
標的クローン＃２２及び＃７０由来のＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌（ジャクソン研究所、バルハーバー、メーン州）から単離した胚盤胞期の胚にマイクロインジェクションした。
【００７７】
両方のクローンに対する雄のキメラを同定し、そして生殖系列がＰＧＥＳ２ヘテロ接合性（＋／−）の子（offspring)を作出するため、ＤＢＡ／１ｌａｃＪ雌（ジャクソン研究所）と戻し交配した。ヘテロ接合性動物について、Ｎｅｏ−８３３Ｆ（５’  ｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃ  ３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＮｅｏ−１０２３Ｒ（５’  ｇａｔｇｃｔｃｔｔｃｇｔｃｃａｇａｔｃａｔｃｃ  ３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のプライマーセットを用いて、ネオマイシン遺伝子の存在に関してＰＣＲ法により遺伝子型の同定を行った。このプライマーセットは、ＰＧＥＳ２標的対立遺伝子由来の１９０ｂｐ断片を増幅した。
【００７８】
ホモ接合性ＰＧＥＳ２ノックアウトマウス（ＰＧＥＳ２  ＫＯ）は、ヘテロ接合体の交配（ヘテロ接合体  Ｘ  ヘテロ接合体）から、通常みられるメンデル比で作出された。ヘテロ接合体の交配由来の動物について、２つのオリゴセット、すなわち、標的対立遺伝子に特異的な一方のセット（Ｎｅｏ  ＰＣＲ）及びＰＧＥＳ２対立遺伝子に特異的なもう一方のセット（ノックアウト領域内）を用いて、ＰＣＲ法により遺伝子型の同定を行った。Ｎｅｏ  ＰＣＲには、ヘテロ接合体のスクリーニングに用いたのと同じプライマーセットを使用した。ＰＧＥＳ２  ＰＣＲ用のオリゴは、ＰＧＥＳ２ＫＯ−４０９Ｆ（５’  ｔｃｃｃａｇｇｔｇｔｔｇｇｇａｔｔｔａｇａｃｇ  ３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）及びＰＧＥＳ２ＫＯ−８２１Ｒ（５’  ｔａｇｇｔｇｇｃｔｇｔａｃｔｇｔｔｔｇｔｔｇｃ  ３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）であった。これらのオリゴは４１２ｂｐ断片を増幅し、そして３．０ｋｂノックアウト領域内に含有された。
【００７９】
このように、遺伝子型を決定するとき、野生型動物はＰＧＥＳ２  ＰＣＲに対して陽性となり、そしてＮｅｏ  ＰＣＲに対して陰性となるであろう。ＰＧＥＳ２ヘテロ接合性動物は、両方のＰＣＲ反応に対して陽性となるであろうし、ＰＧＥＳ２  ＫＯ動物は、ＰＧＥＳ２  ＰＣＲに対して陰性となり（両方の対立遺伝子上で領域が欠失するため）、そしてＮｅｏ  ＰＣＲに対して陽性となるであろう（図２）。
【００８０】
雌雄の野生型及びＰＧＥＳ２  ＫＯ（各性及び遺伝子型につきｎ＝１）の初回病理組織検査により、検出可能な違いは示されなかった。ＰＧＥＳ２  ＫＯマウスと野生型マウス間の生殖能力にも、検出可能な違いはなかった。
【００８１】
Ｅ．  ＰＧＥＳ２／ＡｐｏＥダブルＫＯマウス
ＰＧＥＳ２／ＡｐｏＥダブルＫＯマウスを、ＰＧＥＳ２  ＫＯマウスをＡｐｏＥノックアウトマウス（Ｃ５７／Ｂｌ６バックグラウンド、チャールズ・リバー研究所）と交配させることにより作出した。ＰＧＥＳ２＋／−／ＡｐｏＥ−／−及びＰＧＥＳ２−／−／ＡｐｏＥ−／−マウスが作出された。
【００８２】
Ｆ．  ＰＧＥＳ２  ＫＯ  ＥＳ細胞
ＤＢＡ／１  ＬａｃＪ細胞株由来のＤＢＡ−２５２ネズミＥＳ細胞株（Ｒｏａｃｈら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２２１：５２０−５２５，１９９５）を用いた。１５％ＥＳ細胞用ウシ胎児血清（ＩＬＴＩ、＃１０４３９−０２４）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（シグマ・ケミカル社、＃Ｍ−７５２２）、０．２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＩＬＴＩ、＃２５０３０−０８１）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＩＬＴＩ、＃１１１４０−０５０）、１０００単位／ｍｌリコンビナントネズミ白血球阻害因子及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＬＴＩ、＃１５７１０−０６４）を添加した、基本培地ノックアウトＤ−ＭＥＭ（ＩＬＴＩ、＃１０８２９−０１８）を含有する幹細胞用培地（ＳＣＭＬ）中の、マイトマイシンＣ処理初代胚線維芽細胞（ＰＥＦ）フィーダー層上で、多能性ＥＳ細胞を培養維持した。
【００８３】
実施例Ｂにおいて論じたように、４００μＬ  ＳＣＭＬ中の１Ｘ１０７個のＤＢＡ−２５２  ＥＳ細胞の、２５μｇの直線化したＰＧＥＳ２  ＫＯターゲティングベクターでの電気穿孔を、ＢＴＸエレクトロ・セル・マニピュレーター  ６００（ＢＴＸ，インク）を電圧２６０Ｖ、電気容量５０μＦ及び抵抗３６０  Ｏｈｍｓにて用いて行った。電気穿孔後、４つの１００ｍｍ組織培養皿中のＳＣＭＬ中で、マイトマイシンＣ処理ＰＥＦ上に細胞を蒔いた。電気穿孔した２４時間後に、１７５μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８及び２μＭガンシクロビルをＳＣＭＬに加えることによって、陽性／陰性選択を開始した。ターゲティングベクターのＥＳ細胞ゲノムへの相同組換えにより、マウスＰＧＥＳ２遺伝子が除去され、そしてネオマイシン耐性遺伝子が挿入された。Ｇ４１８選択の７〜９日後、毛細管ピペットを用いてＧ４１８耐性コロニーを拾って２４ウェル組織培養皿の各ウェルへ移し、そしてクローンＥＳ細胞株へと発展させた。相同組換えによる標的遺伝子組換えを示した、形質転換されたＥＳ細胞株は、サザン分析により同定された。
【００８４】
ＰＧＥＳ２標的（＋／−）ＥＳ細胞クローン＃２２及び＃７０を、ＰＧＥＳ  ＫＯ（−／−）ＥＳ細胞の作製に用いた。クローンを解凍して、そしてＳＣＭＬ中で１７５μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８においてＰＥＦ上に２日間維持し、次いでＧ４１８濃度を２μｇ／ｍｌに上昇させた（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １２：２３９１−９５，１９９２）。高濃度Ｇ４１８による選択の７〜１０日後に、生き残ったＥＳ細胞コロニーを分離して、そして２〜５ｘ１０５細胞／ｍｌを、ＳＣＭＬ中で２ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８において新たなＰＥＦ上に蒔いた。さらに４〜７日間高濃度Ｇ４１８による選択を行った後、毛細管ピペットを用いて耐性コロニーを拾って、ＳＣＭＬ中で２ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８において、ＰＥＦを含まない２４ウェル組織培養皿の各ウェルへ移し、クローンＥＳ細胞株へと発展させた。野生型対立遺伝子の欠失を示したＰＧＥＳ２  ＫＯ（−／−）ＥＳ細胞株は、サザン解析により同定された。
【００８５】
Ｇ．  ＰＧＥＳ２  ＫＯ  ＥＳ細胞由来マクロファージ
ＤＢＡ−２５２  ＷＴ（＋／＋）及びＰＧＥＳ  ＫＯ（−／−）ＥＳ細胞クローン＃２２Ｄ、＃２２Ｆ及び＃７０Ｖを、ＥＳ細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化型（ＩＶＤ）マクロファージへと発生させるのに用いた。ＷＴ及びＫＯ  ＰＧＥＳ２  ＥＳ細胞クローンをＳＣＭＬ中でＰＥＦフィーダーなしで維持した。胚様体（ＥＢ）形成の２日前に、すべてのＥＳ細胞株を、１５％ＥＳ細胞用ウシ胎児血清、０．２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０００単位／ｍｌリコンビナントマウス白血球阻害因子、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（シグマ社、＃Ｍ−７５２２）を添加した、イスコフＭＤＭ（ＩＬＴＩ、＃３１９８０−０３０）の基本培地を含有するＩ−ＳＣＭＬ培地へ移し替えた。
【００８６】
胚様体期：  ＷＴ及びＫＯ  ＥＳ細胞クローンを分離して、そして、細菌学用１００ｍｍ皿で、１５％ＥＳ細胞用ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、３００μｇトランスフェリン（ＩＬＴＩ、＃１３００８−０１６）、５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−アスコルビン酸（シグマ・ケミカル社、＃Ａ−４４０３）、５％ＰＦＨＭ−ＩＩ（ＩＬＴＩ、＃１２０４０−０９３）、４Ｘ１０−４Ｍモノチオグリセロール（ＭＴＧ）及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したイスコフＭＤＭ基本培地を含有するＭａｃＥＢ培地中で、懸濁培養増殖させた。ＥＳ細胞は懸濁液中で６日間増殖させ、ＥＢ細胞塊を形成した。
【００８７】
マクロファージ前駆体期：  ＥＢを第６日に分離して、そして、１０％ＦＢＳ（ＩＬＴＩ、＃１０４３９−０２４）、５％  ＰＦＨＭ−ＩＩ（ＩＬＴＩ、＃１２０４０−０９３）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、３ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ（シグマ社、＃Ｍ−９１７０）、１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３（ペプロ・テク，インク、ロッキーヒル、ニュージャージー州、＃２１３−１３）及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したイスコフＭＤＭ基本培地を含有するＭａｃ  Ｉ培地中で、組織培養皿に蒔いた。この細胞のポピュレーションが集密的になったとき、マクロファージ前駆体は非付着性クラスターとして発生し、そして第１４日から第３０日にかけて一日おきに回収することが可能であった。
【００８８】
ＥＳ細胞由来マクロファージ：  マクロファージ前駆体の非付着性クラスターを、遠心分離により培地から回収した。１０％ＦＢＳ、５％ＰＦＨＭ−ＩＩ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、３ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したイスコフＭＤＭ基本培地を含有するＭａｃ  ＩＩ培地中に、細胞ペレットを再懸濁した。細胞を、組織培養皿またはマルチウェルプレートに蒔き、そして評価に先だって１〜５日間培養した。
【００８９】
ＰＧＥＳ２  ＫＯ  ＥＳ細胞由来マクロファージにおける野生型表現型の回復：  ＰＧＥＳ２  ＫＯ  ＥＳ細胞クローン＃２２Ｆ由来のＥＳ細胞ＩＶＤマクロファージが、ＤＢＡ−２５２  ＷＴ及びＰＧＥＳ２＋／−クローン＃２２  ＥＳ細胞由来マクロファージと比較して、生存性及び増殖の特徴において、減少を示すことが認められた。この表現型が、ＰＧＥＳ２産生が欠失した結果であるかどうかを判断するため、ＰＧＥ２（ケイマン・ケミカルズ社、＃１４０１０）を０．１、１．０または１０μＭのいずれかの用量で、分化過程のすべての期の培地に加えた。
【００９０】
ＰＧＥ２なしで培養したＰＧＥＳ２  ＫＯクローン＃２２Ｆ由来マクロファージは、野生型のおよそ半分の密度であった。０．１または１．０μＭ  ＰＧＥ２中で培養されたＰＧＥＳ２  ＫＯクローン＃２２Ｆ由来マクロファージは、野生型と同等の密度であり、そして、１０．０μＭ  ＰＧＥ２中で培養されたＰＧＥＳ２  ＫＯクローン２２Ｆ由来マクロファージは、野生型のおよそ７５％の密度であった。
【００９１】
Ｈ．  ＰＧＥＳ２  ＫＯ  ＥＳ細胞由来マクロファージの特徴付け
ＰＧＥＳ２  ＫＯ、ＰＧＥＳ２ヘテロ接合性及び野生型ＥＳ細胞由来のＥＳ細胞ＩＶＤマクロファージ（ＥＳＭ）を、分化第１４〜２１日に、５Ｘ１０５細胞／ウェル（９６ウェルプレート）でＭａｃ  ＩＩ（実施例Ｇを参照されたい。）培地中に蒔いた。細胞を３７℃（５％二酸化炭素、９５％湿度）で一晩増殖させ、それから様々な条件下で刺激した：  １）ＥＳＭを、指示された濃度のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）存在下で２４時間インキュベートした（図３）（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１ｍｇ／ｍｌ  ＬＰＳ原液（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ０１１１：Ｂ４、シグマ・ケミカル社）を細胞培地中に希釈し、０．００１〜１００μｇ／ｍｌの範囲の所望の最終濃度に到達させた。）；  ２）ＥＳＭを、１００μＭアラキドン酸（ＡＡ）（ケイマン・ケミカル・カンパニー、アン・アーバー、ミシガン州）とともに１０分間インキュベートした。（１００％エタノール中の１０ｍＭ  ＡＡの原液を細胞培地中に希釈し、最終濃度に到達させた。）（図４）；  ３）ＥＳＭを、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（カルバイオケム社、サンディエゴ、カリフォルニア州）（１００％  ＤＭＳＯ中、１０μＭ）とともに１０分間インキュベートした（図５）；  及び、４）ＥＳＭを、１０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ存在下において細胞培地中で２４時間インキュベートし、続いて、１００μＭ  ＡＡとともに細胞培地中で１０分間インキュベートした（図６）。
【００９２】
各インキュベーション期間の終了時に、細胞上清を単離し、そしてＰＧＥ２についてアッセイするまで−２０℃で保管した。ＰＧＥ２の測定を、ＥＬＩＳＡ検出キット（ケイマン・ケミカル社）を用いて行った。すべての試料を、標準曲線のダイナミックレンジにシグナルを得られるように希釈した。図３〜６のそれぞれに示されたデータは、３つの独立した実験を表しており、それぞれの実験は２回行われた。
【００９３】
図３に示されるように、ＰＧＥＳ２が、炎症条件下（例えば、ＬＰＳ刺激による）における細胞外ＰＧＥ２の放出の原因である中心的なＰＧＥ２合成酵素であることが、結果より示される。しかしながら、図４、５及び６に示されるように、より急性の刺激条件下において（例として、アラキドン酸またはカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）刺激で）、このＰＧＥＳ２遺伝子の破壊により、ＥＳＭのＰＧＥ２放出は阻害されないとの結果も示される。これらの結果により、ＰＧＥＳ２が、炎症中にＰＧＥ２を産生するのに重要な遺伝子であることが示される。
【００９４】
Ｉ．炎症モデルにおけるＰＧＥＳ２  ＫＯの特徴づけ
ＰＧＥＳ２  ＫＯマウスを、コラーゲン誘導関節炎（慢性炎症モデル）及び酢酸誘導ライジング（writhing）（急性炎症／疼痛モデル）の２つの炎症実験モデルにおいて解析した。ＤＢＡ１／ｌａｃＪ遺伝的背景にて繁殖させた、週齢／性別の一致した動物を用いて、すべての実験を行った。この遺伝的背景はコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）に最適である。このＣＩＡにおける表現型を、抗体産生及び遅延型過敏反応を評価することによりＰＧＥＳ２  ＫＯ及び野生型動物の免疫応答を特徴づけることによって、さらに解析した。要約すると、ＣＩＡ及び酢酸誘導ライジングモデルの結果により、ＰＧＥ２を介する慢性炎症、急性炎症、及び神経因性疼痛の検出とは対照的な急性炎症性疼痛の検出においてＰＧＥＳ２の果たす役割が示される。
【００９５】
コラーゲン誘導関節炎
コラーゲン溶液、並びに、以下の試薬：（氷）酢酸（シグマ・ケミカル社、＃３３，８８２−６）、ニワトリＩＩ型コラーゲン（コンドレックス社、レッドモンド、ワシントン州、＃２０００１−１）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）  Ｈ３７ＲＡ（ベクトン・ディッキンソン社、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、＃２３１，１４１）及びフロイント不完全アジュバント（シグマ・ケミカル社、＃Ｆ−５５０６）を用いて調製された完全フロイントアジュバントを用いて、マウスを第０日に免疫した。０．１Ｍ酢酸を、溶液がシャーベット状（slushy）になるまで、−８０℃のフリーザーに１０分間置いた。次いで、この酢酸溶液のアリコット（５ｍｌ）を１０ｍｇニワトリコラーゲンバイアル（２ｍｇ／ｍｌ）に加え、次にこのバイアルをホイルで覆って一晩振とうさせながら４℃に置いた。続いて、フロイント不完全アジュバント２０ｍｌをガラス製組織グラインダー（５０ｍｌ）中に置いて、そして結核菌（２ｍｇ／ｍｌ）４０ｍｇを加えて、そして均一な懸濁が観察されるまで撹拌した（すなわち、完全フロイントアジュバント）。各溶液の等量を、撹拌しにくくなるまで約１５分間撹拌した。次いで、すべてのマウスの尾の付け根を剃毛した。第０日及び第２０日に、各動物の尾の付け根に０．１ｍｌを皮下注射した。
【００９６】
二度目の免疫を第２０日に行った。第２５日までに、マウスは関節炎の最初の徴候（発赤腫脹した関節）を現し始めた。第５０日までに、平均関節炎スコアは最大に達した。図７〜１０に示されるように、関節炎の発生率及び重症度は、ＰＧＥＳ２  ＫＯマウスにおいて減弱した。ＰＧＥＳ２  ＫＯ動物では第５６日にほんの１．１±０．４の関節炎スコアに達したのに比べて、野生型対照では関節炎スコア５．５±０．７の最大重症度に達した（図７及び９）。発生率はまたＰＧＥＳ  ＫＯ群において有意に減弱した（図８及び１０）。加えて、野生型に比べて、コラーゲン処理ＰＧＥＳ２  ＫＯの関節の関節面においてプロテオグリカン欠失がみられないことが、組織学的検査により明らかとなった。
【００９７】
関節炎における違いがＰＧＥＳ２  ＫＯ動物において抗体産生が不十分であったためかどうかを判断するため、ＩＩ型コラーゲン（抗原）に対する抗体レベルを、マウスＩｇＧ抗ＩＩ型コラーゲン抗体用ＥＬＩＳＡキット（コンドレックス社、レッドモンド、ワシントン州、＃２０３１）、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（サザン・バイオテク社、バーミングハム、アラバマ州、＃１０３１−０５）、ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰ（サザン・バイオテク社、＃１０７０−０５）、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ（サザン・バイオテク社、＃１０８０−０５）及びヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ−ＨＲＰ（サザン・バイオテク社、＃１０９０−０５）を用いて、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【００９８】
キットとともに提供された使用説明書に、第二段階を除きしたがった。凍結乾燥抗ＩｇＧ抗体を用いるかわりに、第二の希釈用緩衝液（コンドレックス・キットの溶液Ｃ）で希釈したＨＲＰ結合アイソタイプ特異的抗体を使用した。
【００９９】
野生型及びＰＧＥＳ２  ＫＯ動物はともに、ＩＩ型コラーゲンに対するＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及び総ＩｇＧ抗体を有意なレベルで産生した。二つの遺伝子型由来のマウスの間に抗体産生における検出可能な違いはなく、関節炎における違いは、ＰＧＥＳ２  ＫＯ動物がこの特定の抗原に対して免疫応答を起こす能力がないためではないことが示唆された。
【０１００】
関節炎の重症度及び発生率における野生型とＰＧＥＳ２  ＫＯマウスの間の違いの根底にあるメカニズムを判断するために、同様なコラーゲン免疫プロトコールを受けた動物に遅延型過敏（ＤＴＨ）反応を誘発した。第０日にマウスの尾の付け根に注射した。第１７日に、コラーゲン１０μｇ（１５μＬ）を右足の背側に注射した。各動物の左足を対照として用い、そして同じ位置に生理食塩水１５μＬを投与した。第１８日に、体積測定器を用いて、足の厚みを測定した。野生型マウスでは、生理食塩水処理した対側の足に比して、コラーゲン処理した足で有意に腫脹を発現した。浮腫は、組織病理学的解析により判断されたように、白血球浸潤に関連していた。ＰＧＥＳ２  ＫＯマウスのコラーゲン処理した足における浮腫形成は、野生型またはＰＧＥＳ２  ＫＯ動物の生理食塩水処理した足における浮腫形成と同様であった（図１１）。この欠損には、投与部位に浸潤する白血球数の有意な低減を伴ったが、このことは炎症におけるＰＧＥＳ２の役割と一致する。
【０１０１】
加えて、ＰＧＥＳ２  ＫＯ及び野生型マウスから単離した血液を、好中球、リンパ球、単球、好塩基球及び好酸球数について分析した。健康な動物と病気の動物との間に検出可能な違いは認められず、全体的な免疫学的欠損は、ＣＩＡモデルにおいて観察されたＰＧＥＳ２  ＫＯ表現型を引き起こさないことが示された。
【０１０２】
酢酸誘導ライジング（writhing）
マウスを無作為化し、そしてビヒクル（０．５％（ｗ／ｗ）メチルセルロース、シグマ・ケミカル社、＃Ｍ０５１２）または１０ｍｇ／ｋｇピロキシカム（シグマ・ケミカル社、＃Ｐ５６５４）のいずれかを経口投与した。一時間後に、０．７％酢酸を１６μＬ／ｇ体重で腹腔内投与した。マウスを５つに仕切られた箱に置き、そして、酢酸注射後２０分間、伸びの数（number of stretches）をカウントした。
【０１０３】
ＰＧＥＳ２  ＫＯマウスは、野生型マウスに比して低減した疼痛反応を示した（図１２）。ピロキシカム処理により、野生型マウスにおける反応は低減したが、ＰＧＥＳ２  ＫＯマウスに影響はなかった。
【０１０４】
炎症性プロスタグランジン類の６−ケトＰＧＦ１α（ＰＧＩ２の安定な代謝物）及びＰＧＥ２のｉｎ  ｖｉｖｏレベルについても、特徴づけた。酢酸溶液の注射により、両プロスタグランジンの、ベースラインレベルより上への有意な上昇が引き起こされた。６−ケトＰＧＦ１αレベルにおける検出可能な違いは、処理に関係なくいずれの遺伝子型においても記録されなかった。対照的に、ＰＧＥ２レベルは、ＰＧＥＳ２  ＫＯ群において野生型動物に比して５２％低減したが、このことはＰＧＥＳ２  ＫＯ動物においてライジング反応の減弱が認められたことと一致した。
【０１０５】
脊髄及び脊髄上位レベルでの疼痛応答といった疼痛応答を調節する、ＰＧＥＳ２の阻害／破壊の性能をさらに特徴づけるため、ホットプレート試験法にて、引っ込める時間（withdrawal latencies）をＰＧＥＳ２  ＫＯ及び野生型動物において測定した。５２．５、５５．５または５８．５℃では、反応における違いは測定されなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、ＰＧＥＳ２遺伝子ターゲティングベクター、内在性ネズミＰＧＥＳ２遺伝子におけるベクターの相同組換え部位、及び遺伝子ターゲティングを確認するのに用いるプライマーの位置についての実施態様を表した概略図である。
【図２】図２は、破壊されたＰＧＥＳ２対立遺伝子について、野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）及びノックアウト（−／−）マウスのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく遺伝子型同定の結果を示す。
【図３】図３は、アラキドン酸（ＡＡ）を用いた１０分間の刺激が、ＰＧＥＳ２ノックアウト（−／−）、ＰＧＥＳ２ヘテロ接合体（＋／−）及び野生型（＋／＋）ＥＳ細胞由来のＥＳ細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ由来マクロファージ（ＥＳＭ）におけるＰＧＥ２産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図４】図４は、種々の濃度のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を用いた刺激が、ＰＧＥＳ２−／−、ＰＧＥＳ２＋／−及び＋／＋  ＥＳ細胞由来のＥＳＭにおけるＰＧＥ２産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】図５は、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７を用いた１０分間（１０’）の刺激が、ＰＧＥＳ２−／−、ＰＧＥＳ２＋／−及び＋／＋  ＥＳ細胞由来のＥＳＭにおけるＰＧＥ２産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】図６は、１０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳによる２４時間の刺激の後のアラキドン酸（ＡＡ）を用いた１０分間の刺激が、ＰＧＥＳ２ノックアウト（−／−）、ＰＧＥＳ２ヘテロ接合体（＋／−）及び野生型（＋／＋）ＥＳ細胞由来のＥＳ細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ由来マクロファージ（ＥＳＭ）におけるＰＧＥ２産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図７】図７は、ＰＧＥＳ２−／− 及びＰＧＥＳ２＋／＋コラーゲン免疫雌雄マウスにおける経時的な関節炎スコアを示す。
【図８】図８は、ＰＧＥＳ２−／− 及びＰＧＥＳ２＋／＋コラーゲン免疫雌雄マウスにおける経時的な関節炎発生百分率を示す。
【図９】図９は、雌雄混合のＰＧＥＳ２−／− 及びＰＧＥＳ２＋／＋コラーゲン免疫マウスにおける経時的な関節炎スコアを示す。
【図１０】図１０は、雌雄混合のＰＧＥＳ２−／− 及びＰＧＥＳ２＋／＋コラーゲン免疫マウスにおける経時的な関節炎発生百分率を示す。
【図１１】図１１は、同様な免疫プロトコールを受けた動物における、遅延型過敏症反応後のＰＧＥＳ２＋／＋及びＰＧＥＳ２−／− の足体積の変化を示す。
【図１２】図１２は、ピロキシカム対ビヒクル処理したＰＧＥＳ２＋／＋及びＰＧＥＳ２−／− マウスの時間間隔内における伸びの数を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年7月20日(2004.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変により破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を生じる、遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記哺乳動物がマウスである、請求項１の哺乳動物。
【請求項３】
前記哺乳動物がさらに破壊されたＡｐｏＥ遺伝子を含む、請求項１または２に記載の哺乳動物。
【請求項４】
改変が破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を含む、遺伝子改変動物細胞。
【請求項５】
前記細胞が胚幹（ＥＳ）細胞またはＥＳ様細胞である、請求項４の動物細胞。
【請求項６】
前記細胞がＥＳ細胞由来マクロファージである、請求項４の動物細胞。
【請求項７】
前記細胞が、破壊されたＰＧＥＳ２遺伝子を生じる改変を含有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物から単離される、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の動物細胞。
【請求項８】
前記細胞がＰＧＥ２を添加した培地において利用される、請求項４ないし７のいずれか１項に記載の動物細胞。
【請求項９】
炎症を介する傷害を治療する方法であって、該方法はプロスタグランジンＥ合成酵素２を阻害する薬剤を非ヒト動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１０】
薬剤を、関節炎を低減し、白血球浸潤を低減し、関節の関節面でのプロテオグリカン減少を低減し、かつ／または炎症性疼痛の検出を低減するのに充分な量で投与する、請求項９の方法。
【請求項１１】
炎症を介する障害を治療するための、プロスタグランジンＥ合成酵素２を阻害する薬剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
関節炎を低減し、白血球浸潤を低減し、関節の関節面でのプロテオグリカン減少を低減し、かつ／または炎症性疼痛の検出を低減するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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