【手続補正書】
【提出日】令和2年6月1日(2020.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシルアミノ酸を合成する少なくとも１つの操作されたペプチドシンテターゼを発現するように操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞であって、前記操作されたペプチドシンテターゼは、前記合成されたアシルアミノ酸を前記操作されたペプチドシンテターゼから放出し、前記操作されたペプチドシンテターゼは、（ｉ）アデニル化（Ａ）ドメイン、チオール化（Ｔ）ドメインおよび縮合（Ｃ）ドメインを含む単一のペプチドシンテターゼドメインであるかまたはこれを含み、かつ、（ｉｉ）チオエステラーゼドメインおよびレダクターゼドメインを欠く、操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【請求項２】
前記操作されたペプチドシンテターゼが、リポペプチドを合成するペプチドシンテターゼ中で見出されるような脂肪酸をアミノ酸に連結する単一のペプチドシンテターゼドメインであるかまたはこれを含む、請求項１に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【請求項３】
アシルアミノ酸組成物が、顕著な成分としてアシルアミノ酸を含み、そのアミノ酸部分がグリシンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸由来であり、かつそのアシル部分が、ミリスチン酸およびラウリン酸からなる群から選択される脂肪酸由来である、請求項１または２に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【請求項４】
前記単一のペプチドシンテターゼドメインが、サーファクチン（ｓｒｆ）シンテターゼのモジュール１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【請求項５】
前記ｓｒｆシンテターゼがｓｒｆＡＡである、請求項４に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【請求項６】
前記単一のペプチドシンテターゼドメインが、マイコスブチリンシンテターゼのモジュール１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【請求項７】
前記マイコスブチリンシンテターゼが、ＭｙｃＡであるかまたはこれを含む、請求項６に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【請求項８】
前記単一のペプチドシンテターゼドメインが、ダプトマイシンシンテターゼのモジュール１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【請求項９】
前記ダプトマイシンシンテターゼが、ｄｐｔＡ１であるかまたはこれを含む、請求項８に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【請求項１０】
前記操作されたペプチドシンテターゼが、２，４−ジアミノ酪酸、（２Ｓ）−２，３−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、オルニチンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸をアシル化する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、内因性のα−ケト酸デヒドロゲナーゼの活性を欠く、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、前記α−ケト酸デヒドロゲナーゼの少なくとも１つ以上の機能的サブユニットを欠くように操作される、請求項１１に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、前記α−ケト酸デヒドロゲナーゼのＥ１サブユニットおよびＥ１βサブユニットをそれぞれコードするｂｋｄＡＡ遺伝子およびｂｋｄＡＢ遺伝子を欠失するように操作される、請求項１２に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【請求項１４】
アシルアミノ酸組成物を作製する方法であって、アシルアミノ酸組成物が作製されるために十分な条件下および時間の間、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項１５】
前記アシルアミノ酸組成物を特定のアシルアミノ酸について富化するステップと；
前記富化されたアシルアミノ酸組成物を、少なくとも１つの他の成分と組み合わせて、ある生成物を生成するステップと
をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
アシルアミノ酸組成物を作製する方法であって、アシルアミノ酸組成物が作製されるために十分な条件下および時間の間、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項１７】
前記培養するステップが、アシルアミノ酸を合成し、かつ、内因性のα−ケト酸デヒドロゲナーゼの活性を保持するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞によって生成されるアシルアミノ酸組成物と比較して、Ｃ１４の分岐脂肪酸テールの長さを有するアシルアミノ酸が富化されたアシルアミノ酸組成物を生成させるために、イソ酪酸の存在下で前記操作された細胞を培養することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養するステップが、アシルアミノ酸を合成し、かつ、内因性のα−ケト酸デヒドロゲナーゼの活性を保持するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞によって生成されるアシルアミノ酸組成物と比較して、奇数のアンテイソ型分岐脂肪酸テールを有するアシルアミノ酸が富化されたアシルアミノ酸組成物を生成するのに十分な濃度の２−メチル酪酸の存在下で前記操作された細胞を培養することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養するステップが、アシルアミノ酸を合成し、かつ、内因性のα−ケト酸デヒドロゲナーゼの活性を保持するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞によって生成されるアシルアミノ酸組成物と比較して、偶数の非分岐脂肪酸テールを有するアシルアミノ酸が富化されたアシルアミノ酸組成物を生成するのに十分な濃度の２−メチル酪酸の存在下で前記操作された細胞を培養することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養するステップが、アシルアミノ酸を合成し、かつ、内因性のα−ケト酸デヒドロゲナーゼの活性を保持するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞によって生成されるアシルアミノ酸組成物と比較して、奇数のイソ型分岐脂肪酸テールを有するアシルアミノ酸が富化されたアシルアミノ酸組成物を生成するのに十分な濃度のイソ吉草酸の存在下で前記操作された細胞を培養することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記培養するステップが、アシルアミノ酸を合成し、かつ、内因性のα−ケト酸デヒドロゲナーゼの活性を保持するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞によって生成されるアシルアミノ酸組成物と比較して、偶数の非分岐脂肪酸テールを有するアシルアミノ酸が富化されたアシルアミノ酸組成物を生成するのに十分な濃度のイソ吉草酸の存在下で前記操作された細胞を培養することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記アシルアミノ酸組成物内のアシルアミノ酸を切断して、遊離脂肪酸およびアミノ酸を生成するステップをさらに含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記切断するステップが、前記アシルアミノ酸組成物をアシラーゼと接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞を、
前記ペプチドシンテターゼポリペプチドのアミノ酸基質；および
前記ペプチドシンテターゼポリペプチドのアシル部分基質
と接触させるステップを含む方法であって、
前記接触させるステップが、アシルアミノ酸が生成されるように、前記操作されたペプチドシンテターゼポリペプチドが、前記アシル部分基質からのアシル部分を前記アミノ酸に共有結合的に連結するのに十分な条件下および時間の間、実施され、生成された前記アシルアミノ酸が、前記操作されたペプチドシンテターゼポリペプチドから放出される、方法。
【請求項２５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞によって生成されるアシルアミノ酸組成物であって、アシルアミノ酸と、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の操作されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞とを含む、組成物。
【請求項２６】
前記組成物中のアシルアミノ酸の実質的に全てが同じアミノ酸成分を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物中のアシルアミノ酸が異なるアシル部分を含む、請求項２５または２６に記載の組成物。