(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの異なる部位を有する二本鎖ポリヌクレオチド配列を提供することと、異なる部位の配列位置の決定の必要なしにポリヌクレオチドを異なる部位、又は異なる部位付近において選択的にランダム化することとを含む、特定部位におけるポリヌクレオチドの選択的組合せランダム化（SCR）の方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列関連決定の必要なしにポリヌクレオチドを特定部位においてランダム化する方法であって、
少なくとも1つの異なる部位を有する少なくとも1つのポリヌクレオチドを提供することと、少なくとも1つの異なる部位、又はその付近においてポリヌクレオチドを選択的にランダム化することとを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、二本鎖であり、かつ、少なくとも1つの開始一本鎖ポリヌクレオチドに由来するものであるか又は少なくとも1つの部位において相互に異なる少なくとも2つのポリヌクレオチドから生成されたヘテロ二重鎖である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチド又はその対応する翻訳産生物が、その遺伝子型及び／又は表現型の特徴に関して事前選択されたものである、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
(a) 1つ以上の部位で相互に異なるポリヌクレオチドを提供して、それによりこれらの異なる部位がランダム化の開始点を定義するステップ；
(b) これらのポリヌクレオチドからヘテロ二重鎖を生成するステップ；
(c) 得られたミスマッチ部位を認識するステップ；
(d) これらのミスマッチ部位、又はその付近においてポリヌクレオチドを選択的にランダム化するステップ；
を含む、請求項1〜3に記載の方法。
【請求項５】
ステップ(a)〜(d)、ステップ(a)〜(b)及び／又はステップ(c)〜(d)が、次のステップに入る前に複数サイクル実施される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドの異なる部位が1つ以上の変異から成り、好ましくは当該変異が、
(i) 1つ以上のヌクレオチド置換、
(ii) 1つ以上のヌクレオチド挿入、
(iii) 1つ以上のヌクレオチド欠失、又は
(iv) (i)〜(iii)の組合せ
を含む、請求項1〜5に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも1つの選択的にランダム化されたポリヌクレオチド又はその対応する翻訳産生物を、所望の特性について選択又はスクリーニングすることをさらに含む、請求項1〜6に記載の方法。
【請求項８】
周期的に実施される、請求項1〜7に記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドを特定部位でランダム化する方法であって、
次のステップ：
(a) 1つ以上の部位で相互に異なるポリヌクレオチドを提供して、それによりこれらの1つ以上の異なる部位が、ランダム化される部位を特定するステップ；
(b) 1つ以上の部位でミスマッチを生じさせる、ステップ(a)で提供されたポリヌクレオチドからヘテロ二重鎖を生成するステップ；
(c) ミスマッチ部位を特異的に認識できる薬剤によって、ステップ(b)で生成された1つ以上のミスマッチにおいて少なくとも1つの核酸塩基を除去して、それにより1つ以上のミスマッチにおいて脱塩基部位を生成するステップ；
(d) ヘテロ二重鎖を相互に分離するステップ；及び
(e) テンプレートとして生成された一本鎖を用いて対向鎖を合成し、それによりステップ(c)で脱塩基部位が生成された部位でポリヌクレオチドを特異的にランダム化するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドを特定部位でランダム化する方法であって、
次のステップ：
(a) 1つ以上の部位で相互に異なるポリヌクレオチドを提供して、それによりこれらの1つ以上の異なる部位が、ランダム化される部位を特定するステップ；
(b) 1つ以上の部位でミスマッチを生じさせる、ステップ(a)で提供されたポリヌクレオチドからヘテロ二重鎖を生成するステップ；
(c) ミスマッチ部位を特異的に認識できる薬剤によって、ステップ(b)で生成された1つ以上のミスマッチにおいて一本鎖ニックを導入するステップ；
(d) ステップ(c)で生成された一本鎖ニックにおいて開始するポリヌクレオチドヘテロ二重鎖から1つ以上のヌクレオチドを除去するステップ；
(e) 1つ以上のミスマッチヌクレオチドの取り込みを引き起こす条件下で、ステップ(d)で産生された1つ以上のギャップを充填し、それによりポリヌクレオチドを特定部位でランダム化するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドを特定部位でランダム化する方法であって、
次のステップ：
(a) 1つ以上の部位で相互に異なるポリヌクレオチドを提供して、それによりこれらの1つ以上の異なる部位が、ランダム化される部位を特定するステップ；
(b) 1つ以上の部位でミスマッチを生じさせる、ステップ(a)で提供されたポリヌクレオチドからヘテロ二重鎖を生成するステップ；
(c) ミスマッチ部位を特異的に認識できる薬剤によって、ステップ(b)で生成された1つ以上のミスマッチにおいて一本鎖ニックを導入するステップ；
(d) ステップ(c)で生成された一本鎖ニックにおいて開始するポリヌクレオチドヘテロ二重鎖から1つ以上のヌクレオチドを除去するステップ；
(e) ステップ(d)で産生された1つ以上のギャップを、少なくとも一部においてユニバーサルモノマーを用いて充填し、それによりユニバーサルモノマーが、4つの天然の核酸塩基の2つ以上を交互に用いて塩基対を形成することができるものとして特徴付けられるステップ；
(f) ヘテロ二重鎖を相互に分離するステップ；及び
(g) ステップ(f)でテンプレートとして生成された一本鎖を用いて対向鎖を合成し、それによりステップ(e)でユニバーサルモノマーが導入された部位でポリヌクレオチドを特異的にランダム化するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項１２】
(i) ステップ(c)におけるニックの導入が、ホスホジエステル主鎖におけるミスマッチ部位の3'又は5'側での単一の一本鎖切断の導入、あるいはミスマッチヌクレオチド全体の除去、あるいはミスマッチ部位又はその周囲での複数のヌクレオチドの除去を含み；及び／又は
(ii) ステップ(d)によるヌクレオチドの除去が、ミスマッチ部位の近くに一本鎖領域を生成するために複数のヌクレオチドに制限されるか、ミスマッチ位置からポリヌクレオチド末端までのギャップを生成するために制限されないかのいずれかであり；及び／又は
(iii) ステップ(d)による1つ以上のヌクレオチドの除去及びステップ(e)によるギャップの充填が、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有する標準ポリメラーゼによって並行して行われ；及び／又は
(iv) ステップ(e)によるギャップの充填が、少なくとも一部でオリゴヌクレオチド及びリガーゼ酵素の使用によって実施される；
請求項10又は11に記載の方法。
【請求項１３】
前記ステップ(e)によるギャップの充填が、ポリメラーゼ及び
(i) 4つの標準ヌクレオチド（dATP、dTTP、dGTP、dCTG）のうちの3つの混合物によって、又は
(ii) 3つのヌクレオチド（dATP、dTTP、dGTP、dCTG）の混合物の異なる組成物によって独立して、又は
(iii) 各反応で提供される4つの標準ヌクレオチド（dATP、dTTP、dGTP、dCTG）の1つによって独立して、
行われ、好ましくはステップ(e)により独立して充填されたギャップが後でプールされる、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップ(e)によるギャップの充填が、高い突然変異誘発性の条件下でポリメラーゼを用いて、又は高いエラー率を持つ低忠実度ポリメラーゼを用いて行われる、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ステップ(e)によるギャップの充填が、dATP、dTTP、dGTP、dCTG、又はdITPとdATP、dTTP、dGTP、dCTGとの混合物の代わりに、同じ又は異なる濃度で、ポリメラーゼ及びdITPを用いて行われる、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも1つの異なる部位を有するポリヌクレオチド配列の変異体を提供することと、ポリヌクレオチド配列を当該異なる部位又はその付近で選択的にランダム化することとを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
配列関連決定の必要なしにポリヌクレオチド配列を最適化する方法であって、
このポリヌクレオチド配列から変異体を提供することと；
これらの変異体が相互に異なるこれらの部位で、ポリヌクレオチド配列を特異的にランダム化することと；
ランダム化されたポリヌクレオチドのプールを所望の特性について選択又はスクリーニングすることと；
を含む方法。
【請求項１８】
配列関連決定の必要なしにポリヌクレオチドをその翻訳産生物の所望の特性について最適化する方法であって、
(a) 確率論的ランダム変異をポリヌクレオチド内に導入するステップと；
(b) ステップ(a)で生成されたポリヌクレオチドの集合を選択又はスクリーニングするステップと；
(c) 改良特性を備えた遺伝子産生物をコードするポリヌクレオチドを単離するステップと；
(d) ステップ(c)で単離されたポリヌクレオチドが相互に異なる部位又はその付近で、ポリヌクレオチドを選択的にランダム化するステップと；
(e) ステップ(d)で生成されたポリヌクレオチドの集合を選択又はスクリーニングするステップと；
(f) さらなる改良特性を備えた遺伝子産生物をコードするポリヌクレオチドを単離するステップと；
を含み、上記方法において、好ましくはステップ(a)〜(c)、及び／又はステップ(d)〜(f)、及び／又はステップ(a)〜(f)が反復して繰り返される、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定部位におけるポリヌクレオチドの選択的組合せランダム化（SCR）の方法であって、少なくとも１つの異なる部位を有する二本鎖ポリヌクレオチド配列を提供することと、異なる部位の配列位置の決定の必要なしにポリヌクレオチドを異なる部位又はその付近において選択的にランダム化することとを含む、方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学の基本概念は、現存する興味のある遺伝子の同定、それに続く、この遺伝子の産生生物への移行、及び醗酵による対応遺伝子産生物、例えば酵素、抗体又は二次代謝産物の産生である。異種遺伝子発現は、莫大な価値の遺伝子産生物が天然源からの抽出によっては達成できない量で入手可能であるという簡単な理由で画期的なステップとなった。しかしながら自然では確かに、生物医薬品として、工業用酵素として、又は化学プロセス用の生体触媒として作用する分子を進化させなかった。従って、定量的改良が定性的改良によって増幅できることは、非常に早く明らかとなった。定性的改良は、その技術的又は医療的応用性を改善する目的で、興味のある１つ又は複数の遺伝子産生物の特性又は組成を変更することを意味する。遺伝子産生物がタンパク質、例えば酵素又は抗体である場合、この定性的改良は、タンパク質工学と呼ばれている。他の用途も同じように呼ばれている。例えば代謝産物を扱う場合、プロセスは代謝工学と呼ばれている。細菌株の改良は、菌株工学などと呼ばれている。今日、そのような工学技術に関する需要は高まりつつあり、遺伝子産生物を、栄養物又は消費者製品中の新たな機能性成分、化学工業の新たな触媒、又は未だ治療されていないか十分に治療されていない疾患を標的とする新たな薬物とするために、遺伝子工学で作り変えることができる。
【０００３】
興味のある遺伝子産生物の性質とは無関係に、この遺伝子産生物の質を改良するための工学は、それをコードする遺伝子配列又はポリヌクレオチドの修飾に依存している。遺伝子配列の修飾のための広範にわたる技法が周知である。一般に、既存の配列部分の新たな組合せの生成方法と、突然変異誘発による新しい配列の生成方法を区別する必要がある。両技法は、決定論的技法とランダム技法にさらに分類できる。決定論的方法は、特異的配列を備えた１つ又は２、３個のポリヌクレオチドを生成する目的を有するが、他方、ランダム技法は、少なくとも部分的にランダムな配列を有するポリヌクレオチドを生成する目的を有する。遺伝子配列の修飾の技法に関する一般的概要については、表１が参照される。
【表１】
2005536213.tif 000002
【０００４】
配列部分の新たな組合せの決定論的生成の技法は、特異的配列を別の配列の特定部位に挿入するか、さらに一般的には２つ以上の特異的配列を特定の順序で結合させる。挿入又は結合は、従来より、配列を特定部位で制限酵素によって切断し、得られた断片をリガーゼ酵素によって共に連結することによって行われる。あるいは近年開発された技法は、リコンビナーゼ酵素を同じ目的に使用する。これらの技法は一般に、組換えＤＮＡ技術として既知である。他方、ランダム組換え技法は、配列部分を多かれ少なかれランダムに選択された位置で組合せる、すなわち原則として、提供される配列の考えられるすべての組合せを生成する。これは相同的に、すなわち異なるソース配列による類似配列部分を連結することによって、又は非相同的に、すなわち異なるソース配列による非類似配列部分を連結することによってのどちらかで行うことができる。従来技術で既知のランダム組換え法は、例示的にはＤＮＡシャッフリング（Stemmer, Nature 379:389,1994）、ＲＣＲ（国際公開第０１／３４８３５号で開示された組換え法）、Ｓｔｅｐ（付着伸長プロセス、Staggered extension process, Zhao et al., Nat. Biotechnol. 16 (3):258, 1998）、Ｉｔｃｈｙ（ハイブリッド酵素作製のためのインクリメンタル・トランケーション、Incremental Truncation for creation of Hybrid Enzymes, Lutz et al., PNAS. 98 (20): 1248,2001）である。国際公開第０２／４６３９６号は、ヘテロ二重鎖におけるヌクレオチドのミスマッチを補正するミスマッチ修復酵素を利用することによるさらなる組換え手法を開示している。
【０００５】
新たな配列の決定論的生成のための技法は、異なるヌクレオチドのポリヌクレオチドの特定部位において１つ以上のヌクレオチドを変更する。得られたポリヌクレオチド配列に関して特異的であるが、、交換部位に関してだけでなく、これらの方法は伝統的に、部位特異的突然変異誘発法と呼ばれる。ポリヌクレオチド中で選択される、特異的ヌクレオチドの定義された交換を可能にする周知の技法は、Ｋｕｎｋｅｌ（PNAS, 82 (2): 488,1985）によるプロトコルである。また、新たな配列のランダム生成の技法は、決定されない配列を備えたポリヌクレオチドのプールをもたらす。ヌクレオチドのこのランダム化は位置に関して、遺伝子配列全体に渡って、例えば改良ＰＣＲプロトコルによって、又は定義された位置又は領域において、例えば配列部分をそのランダム化された相対物と交換することによってのどちらかで再度ランダムに行うことができる。
【０００６】
一般に決定論的技法は、１個又は２、３個の所望の配列を生成する目的を有する。これらの遺伝子配列は既知であるか、又は改良遺伝子産生物をもたらすことが期待されているかのどちらかである。従って決定論的技法は、遺伝子配列の遺伝子型と表現型との関係の、知識又は理論的モデル化のどちらかに依存する。ランダム技法は、遺伝子配列の遺伝子型と表現型との関係の知識を必要としないが、代わりに、生成されたランダム配列のプールからの、所望の表現型についての、遺伝子配列の効率的な同定のための方法に依存する。
【０００７】
遺伝子配列の修飾の程度と遺伝子産生物の意図された改良因子との間に、簡単な関係が存在する：意図された改良因子が高くなればなるほど、通例、さらに多くの遺伝子配列の修飾が必要である。これらの技法は新たな配列を生成しないが、既存の配列を組換えるのみなので、ランダム組換え技法はこの点で制限される。これらの技法のみが、新たな変異体の導入、それによりまだ天然に存在していない新たな配列の生成を可能とするので、それゆえ、新たな配列のランダム生成のための技法、すなわちランダム突然変異誘発技法は非常に重要である。
【０００８】
ランダム突然変異誘発技法は、標的配列全体に渡ってランダム変異を均一に導入するか、又は興味のあるポリヌクレオチドの離散した位置又は領域へのランダム化の局在を可能にするかのどちらかである。
【０００９】
標的配列全体の均一ランダム化の方法の大半は、ポリヌクレオチド増幅中の誤取り込みの頻度を増加させることによって作用する。
【００１０】
Ｌｅｈｔｏｖａａｒａ及び共同研究者（Lehtovaara, P. M. et al., Protein Eng. 2(1): 63,1988）は、あらゆる種類の塩基置換変異を核酸中にランダムに導入するための方法について述べている。当該方法は、テンプレートからコピーされ、特定のヌクレオチドの考えられるすべての位置で終止する分子の集合を生成するための、各ヌクレオチドに付き１つの、４つの独立した反応において変位誘発される核酸にハイブリダイズされるプライマーの伸長；以前に生成された３’末端におけるヌクレオチドの誤取り込み；ならびに増幅及びクローニングできる形への分子の完成を含む。
【００１１】
Ｃａｄｗｅｌｌ及びＪｏｙｃｅ（PCR Methods Appl. 2(1) : 28,1992 ;PCR Methods Appl. 3(6):136,1994）は、突然変異誘発性ＰＣＲと呼ばれるランダム突然変異誘発技法について述べている。改良されたポリメラーゼ連鎖反応は、ＤＮＡ合成の間のヌクレオチド取り込みの忠実度を低下させる条件下で、４つのｄＮＴＰの不同の濃度を使用して、、マグネシウムイオンの代わりにマンガンを添加することによって実施する。
【００１２】
Ｖｉｒｎｅｋａｓら（Nucleic Acids Res. 22 (25): 5600,1994）は、トリヌクレオチドホスホルアミダイトを使用するランダム突然変異誘発技法について述べている。これらのトリヌクレオチドは、２０個のアミノ酸すべてのコドンを表現し、変異誘発オリゴヌクレオチドの化学合成用の試薬として使用される。
【００１３】
核酸の均質ランダム突然変異誘発のためのこれらの技法以外に、ポリヌクレオチド配列の特定部位の選択的ランダム化に関して公表された複数の方法がある。
【００１４】
Ｗｅｌｌｓら（Gene 34 (2-3): 315,1985）は、特定部位又は領域での興味のある配列のランダム化のための方法について述べている。当該方法は、ランダムヌクレオチド置換を生成するために、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドカセットを使用する。ＤＮＡカセットの導入は、複数の変異による標的アミノ酸コドンの飽和を可能にする。興味のあるアミノ酸配列の完全ランダム化及びカセットとしての遺伝子内への再導入のこの手順は、Ｌｏｅｂら（Genome 31(1) : 112,1989）及びＯｌｉｐｈａｎｔら（Gene 44 (2-3): 177, 1986）によっても述べられている。アミノ酸の特定のセットを標的とした領域特異性ランダム突然変異誘発としての、オリゴヌクレオチド−カセット突然変異誘発の手法は、文献（Kuchner and Arnold, TIBTECH 15: 523, 1997）において既知である。
【００１５】
米国特許第５，７２３，３２３号（1985）は、合成ポリヌクレオチドカップリングの使用による、配列内の特定部位における飽和突然変異誘発の方法を開示している。得られた、確率論的に生成されたポリヌクレオチド配列が続いて、興味のある遺伝子を含有するベクターに導入される。このプロセスを実施する特定の方式において、確率論的遺伝子は、最初に直線化された発現ベクターの２つの末端からの４種類のデオキシホスホヌクレオチド、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴの確率論的共重合によって、続いて３’末端が相補性である２つの確率論的配列を所有する発現ベクターの分子によって構成されるＤＮＡの確率論的第一鎖を形成するような方法での付着末端の形成によって、続いて確率論的ＤＮＡの第二鎖の合成によって産生される。
【００１６】
Ｈｅｒｍｅｓら（Gene 84(1) : 143,1989 ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (2): 696, 1990）は、いわゆる「スパイクされた」オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーの使用による、遺伝子のより大きい部分をランダム化する方法について述べている。トリオースリン酸イソメラーゼについて、遺伝子のランダム突然変異誘発のための方法が開発された。各位置にあるパーセンテージのミスマッチ塩基を含有するオリゴヌクレオチドを提供することによって、プライマー結合部位によって定義されるこれらの配列部分に制限された変異を備える、ミュータントのライブラリが産生される。
【００１７】
Ｌａｎｉｏ及びＪｅｌｔｓｃｈ（Biotechniques 25 (6):958,1998）は、遺伝子の選択した部分をランダム化するための、突然変異誘発性プライマーオリゴヌクレオチドを用いた別の手法について述べており、野生種は形質転換体から除外される。変異誘発部位をクローニング部位として使用すると、修飾クローンは突然変異誘発ステップ後に効率的に単離することができる。
【００１８】
Ｒｅｅｔｚら（Tetrahedron 58: 6595,2002）は、エナンチオ選択性酵素の技術に関する手法について述べており、第一のステップは、酵素の全長に渡るランダム突然変異誘発、改良された変異体のスクリーニング及び続いての配列決定及びそれによるいわゆる「ホットスポット」又は「ホット領域」の、改良されたエナンチオ選択性に潜在的に関与する酵素内の位置としての同定を含む。第二に、そのような「ホットスポット」又は「ホット領域」において、飽和突然変異誘発又はカセット突然変異誘発が特に利用される。当該方法は、変異の導入前に、配列決定及び変異誘発される位置の同定を必要とする。
【００１９】
要約すると、上述のすべてのランダム突然変異誘発方法は、配列情報に対する要求によって分類できる。当該方法の第一のセットは、遺伝子全体、ゲノム又は遺伝子の一部を含み、従って基礎を成す配列情報を必要としない、ポリヌクレオチドのランダム化に関する。しかしながら、これらの方法は、ポリヌクレオチドによってコードされた遺伝子産生物の機能又は表現型に関連するか、又は必須である、あるいは実験者によって任意に選択された部位に限定される変異を導入する可能性を教示しない。他方、当該方法の第二のセットは、ポリヌクレオチド配列における特定の部位のランダム化に関する。これらの方法は、単一の特定位置のランダム化から、全領域のランダム化までを範囲とする。しかしながらこれらのすべての方法は、変異誘発される部位での配列情報の知識を必要とする。次にこの配列情報を使用して例えば、これらの部位で結合する突然変異誘発性プライマーを合成するか、又はこれらの部位で、又はこれらの部位の隣で特異的に切断する制限酵素の使用により、これらの部位で挿入される、定義可能な程度の変異を有するオリゴヌクレオチドカセットを合成する。また、ポリヌクレオチド配列中で相互に分離された複数の部位が同時にランダム化される場合、ランダム化される部位が固定されないが、一連の工学実験の間に変化する場合、又は標的ポリヌクレオチドの配列を決定する及びその中で明示的に関連する又は必須の部位を同定する可能性がない場合、これらの方法は有用でない。
【００２０】
従って、標的ポリヌクレオチドに関する配列情報の必要なしに、部位の効率的なランダム化を可能にするランダム突然変異誘発方法を有することが好都合であろう。これらの部位の従来の明示的な同定の必要なしに、標的ポリヌクレオチド内の関連する又は必須の部位の効率的なランダム化を可能にするランダム突然変異誘発方法を有することが特に好都合である。ポリヌクレオチド内の関連する又は必須の部位は、２つ以上のポリヌクレオチドの比較及びこれらの２つ以上のポリヌクレオチドが異なる部位の選択によって、容易かつ効率的に同定される。従って、異なる部位の配列位置の決定の必要なしに、２つ以上のポリヌクレオチド配列が相互に異なるこれらの位置又はその位置付近において部位のランダム化を可能にするランダム突然変異誘発方法を有することは特に好都合である。上述の特性を備えた方法は、今まで利用され得なかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の基礎を成す技術的問題は、標的ポリヌクレオチドに関する配列情報の必要なしに、部位の効率的なランダム化を可能にする方法を提供することである。本発明の基礎を成す技術的問題の詳細な態様は、これらの部位の明示的な知識を必要としない、ポリヌクレオチドの関連する又は必須の部位での選択的ランダム化のための方法を提供することである。この技術的問題は、本発明の実施例によって解決されている。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
従って本発明は、ポリヌクレオチドの関連する又は必須の部位におけるランダム化の方法に関する。これらの部位は、２つ以上のポリヌクレオチドが相互に異なる位置によって定義される。ランダム化は、多様な表現型をコードするポリヌクレオチド集合を提供し、それにより多様性は、関連する又は必須の部位に、あるいは関連する又は必須の部位の近くに限定される。当該方法は、１つ以上の部位が相互に異なるポリヌクレオチドを提供し、それによりこれらの異なる部位がランダム化される部位を定義するステップと；これらのポリヌクレオチドからヘテロ二重鎖を生成するステップと；得られた異なる部位を認識するステップと；ポリヌクレオチドをこれらの異なる部位で、又はその付近で選択的にランダム化するステップと；を含む。当該方法は、配列解析、すなわちランダム化前の、ランダム化される部位の配列位置の決定を必要としない。
【００２３】
その上、本発明は、上述のステップ（ｉ）〜（ｉｖ）によるポリヌクレオチドのランダム化とこれらのポリヌクレオチド又は対応する遺伝子産生物の選択又はスクリーニングとの組合せによる、ポリヌクレオチド特性を変化させる方法に関する。本発明は上述のステップ（ｉ）〜（ｉｖ）によるポリヌクレオチドのランダム化と他のランダム突然変異誘発技法、例えば突然変異誘発性ＰＣＲ又はカセット突然変異誘発との、及び／又はインビトロ組換え技法、例えば国際公開第０１／３４８３５号に開示されている方法との、及び／又はこれらのポリヌクレオチド又は対応する遺伝子産生物の選択又はスクリーニングとの組合せによる、ポリヌクレオチド特性を変化させる方法にも関する。
【００２４】
本発明の第一の態様における方法は、元のポリヌクレオチド配列内の変異によって特徴付けられる位置でのポリヌクレオチドの飽和突然変異誘発に関し、それによりこれらの変異は、元のポリヌクレオチドに均一ランダム突然変異誘発方法を受けさせることと、所望の特性を有するこれらのポリヌクレオチド変異体を選択又はスクリーニングすることとを含む、先行プロセスで生成される。均一ランダム突然変異誘発技法は通例、考えられるすべての変異のサブセットに偏りを有する。従って、均一ランダム突然変異誘発技法と選択又はスクリーニングステップとの組合せは、遺伝子産生物にとって部分的にのみ最適である変異の選択を引き起こすことができる。第一の態様による本発明を利用するとき、これらの事前選択位置は、完全にランダム化することができ、すなわち天然型ヌクレオチドのいずれかをこれらの位置に導入して、それにより得られた集束ライブラリから、最適な変異を有する変異体を高い効率で選択することができる。
【００２５】
本発明の第二の態様における方法は、元のポリヌクレオチド配列内のこれらの領域での変異によって特徴付けられる領域における、ポリヌクレオチドのランダム化に関し、それにより変異は、元のポリヌクレオチドに均一ランダム突然変異誘発方法を受けさせることと、所望の特性を有するこれらのポリヌクレオチド変異体を選択又はスクリーニングすることとを含む、先行プロセスで生成される。ランダム突然変異誘発技法によってポリペプチドを作ることを目的とする場合、これらの突然変異誘発技法が単一のヌクレオチドのみを交換するという問題がよくあるが、１個のアミノ酸の他の任意のアミノ酸へのある程度までの突然変異誘発は、特定のコドン内の２個又は３個ものヌクレオチドの交換を必要とする。しかしながら均一ランダム突然変異誘発技法によって特定のコドン内の２個又は３個ものヌクレオチドを交換する確率は、比較的低い。第二の態様による本発明を利用するとき、事前選択によるこれらの領域における少なくとも部分的な改良変異の同定により、関連性があると認められる領域は、特異的にランダム化され、それにより得られた集束ライブラリから、最適な変異を有する変異体を高い効率で選択することができる。これらの領域は、コドンのサイズ、すなわち３個のヌクレオチドを持つことができるか、又はより大きく、最大３０個以上のヌクレオチドであり得る。
【００２６】
本発明の第三の態様における方法は、特定のアミノ酸をコードするコドンの交換に耐性であることについてスクリーニングされたポリペプチド内のコドンと一致する部位での、ポリヌクレオチドのランダム化に関する。ランダム突然変異誘発技法によってポリペプチドを作ることを目的とする場合、例えば特定のアミノ酸残基が構造に、又はポリペプチドの折畳み機構に必要であるため、ランダム化されたポリヌクレオチドのかなりの割合が全く機能を持たないという問題がよくある。第三の態様による本発明を利用するとき、交換可能であると認められるコドンは、選択的にランダム化できる。例えば、ポリヌクレオチド内の各コドンがアラニンをコードするヌクレオチドに交換された後、機能性ポリペプチドをなおコードするすべての変異体が、上述の本発明の方法のステップ（ｉ）における開始ポリペプチドとして使用される。これは、スクリーニングされる複雑度を著しく減少させ、それによりランダム突然変異誘発によってポリペプチドを作製する効率を大幅に向上させる。
【００２７】
本発明の第四の態様における方法は、天然型ポリヌクレオチドが相互に異なる部位での、ポリヌクレオチドのランダム化に関する。同じ又は異なる種からの類似又は関連遺伝子はしばしば高度に相同性を有し、場合によりヌクレオチドレベルで９０％を超える相同性を有する。第四の態様による本発明を利用するとき、これらの天然型の、相同性遺伝子の配列の決定なしに、突然変異誘発がそのような相同性遺伝子が異なるこれらの部位に限定される場合、ポリヌクレオチド集合を効率的に生成できる。
【００２８】
本発明の第五の態様における方法は、複数の事前定義された部位での同時の、効率的なポリヌクレオチドのランダム化に関する。大きな配列、例えばポリペプチドをコードする遺伝子、代謝経路をコードするオペロン、又はゲノム全体に分布した複数の領域又は位置でランダム化される、ポリヌクレオチドの集合を生成することは、重大な問題であった。第五の態様による本発明を利用するとき、関連性があることが既知である領域は、上述のステップ（ｉ）で、配列がこれらの特定の部位で相互に異なる２つ以上のポリヌクレオチドを提供することによって、効率的にランダム化できる。例えば、同じ配列を有し、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（CDR）でのみ異なる、２つ以上の免疫グロブリンコード化ポリヌクレオチドが提供され、ＣＤＲにおいて特異的にランダム化されるポリヌクレオチドの集合がもたらされる。
以下の詳細な説明は、本発明の好ましい機能、利点及び有用性について述べる。後述する図面は、詳細な説明を補足して本発明をさらに説明するために提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の枠組みにおいて、以下の用語及び定義を使用する。「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ分子を含む、任意の長さ及び任意の配列の遺伝物質に相当し、調節要素、構造遺伝子、遺伝子の群、プラスミド、ゲノム全体、又はその断片を含む。ポリヌクレオチド内の「部位」という用語は、ポリヌクレオチド配列内のある位置又は領域を指す。ポリヌクレオチド内の「位置」という用語は、ポリヌクレオチド配列内の特定の単一の塩基を指す。ポリヌクレオチド内の「領域」という用語は、ポリヌクレオチド配列内の複数の塩基のストレッチを指す。「異なる部位」という用語は、Ａ／Ｔ又はＧ／Ｃ  Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成しない少なくとも１個のヌクレオチドとして定義される。「ポリペプチド」という用語は、タンパク質、例えば酵素、抗体など、中程度の長さのポリペプチド、例えばペプチドインヒビター、サイトカインなどはもちろんのこと、アミノ酸配列長が１０以下の短いペプチド、例えばペプチド性レセプターリガンド、ペプチドホルモンなども含む。「遺伝子産生物」という用語は、これに限定されるわけではないが、ポリヌクレオチドによってコードされ、スクリーニング又は選択技法の任意の手段によって選択できる特定の表現型を有するポリペプチドを含む、任意の産生物に相当する。
【００３０】
「関連する又は必須の部位」あるいは「事前定義部位」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチドが相互に異なる位置を指すが、これらの位置は、任意の種類の配列解析によって必ずしも同定されない。
【００３１】
本発明による「配列関連決定の必要なしで」という表現は、ランダム化前に、異なる部位の配列位置の決定が必要ないことを意味する。
【００３２】
「事前選択ステップ」という用語は、本発明の方法に先行する任意のステップを説明しており、それにより、均一ランダム化突然変異誘発方法から得たポリヌクレオチド変異体は、任意の所望の特性に関して変異体の選択又はスクリーニングを受ける。従って「事前選択位置」という用語は、上述のステップによって得た「関連する又は必須の部位」を説明する。
【００３３】
「ランダム突然変異誘発」又は「ランダム化」という用語は、本明細書で使用されるように、元のヌクレオチドの予測できない確率論的置換による、ポリヌクレオチドのある位置での、他の任意のヌクレオチドを用いた操作を示す。あるいはその用語は、元のアミノ酸残基の予測できない確率論的置換による、ポリペプチド配列のある位置での、他の任意のアミノ酸残基による操作も示すことができる。ランダム化又はランダム突然変異誘発方法は通常、関連しているが、１つ以上の位置で相互に異なるポリヌクレオチド又はポリペプチドの集合をもたらす。「ヘテロ二重鎖」は、１つ以上の位置で相互に異なる一本鎖より成る、二本鎖ポリヌクレオチド分子を指す。１つ以上の位置で異なる２個の一本鎖ポリヌクレオチドをアニーリングする場合、得られた二本鎖へテロ二重鎖は、塩基対合及び非塩基対合領域を含む。ＤＮＡにおいて、アデニン（Ａ）は通常、チミジン（Ｔ）と対合し、グアニン（Ｇ）は通常、シトシン（Ｃ）と対合する。他のすべての組合せは通常、塩基対を形成せず、従って「ミスマッチ」と呼ばれる。「ニック」は、二本鎖ポリヌクレオチドのどちらかの鎖の一方の主鎖における切込みである。これらの一本鎖の切断は、二本鎖ポリヌクレオチドにニックを導入することができる薬剤によって生成することができる。「核酸塩基」又は「塩基」は、表２に示すように省略される。
【表２】
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【００３４】
「ユニバーサル塩基」という用語は、１つを超える天然型塩基と対合できる塩基性類似物質を指す。同様に、「ユニバーサルヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチド中に取り込むことが可能であり、取り込み後に１つを超える天然型ヌクレオチドと対合できるヌクレオチド類似物質を指す。
【００３５】
本発明の原理を、図１に図式的及び例示的に示す。本発明の方法は、関連する又は必須の部位でのポリヌクレオチドのランダム化に関する。これらの部位は、２つ以上のポリヌクレオチドが相互に異なる位置によって定義される。ランダム化は、多様な表現型をコードするポリヌクレオチド集合を提供し、それにより多様性は、関連する又は必須の部位あるいはこれらの部位の付近に限定される。当該方法は、１つ以上の部位で相互に異なるポリヌクレオチドの提供（１０１、「Ｘ」によって示される変異）、これらのポリヌクレオチドからのヘテロ二重鎖の生成（１０２）、及び単一のミスマッチヌクレオチド（１０４）に、あるいは３個のヌクレオチドのコドン（１０５）に、あるいは周囲のヌクレオチドの領域又はより大きなストレッチ（１０６）のいずれかに集束される、得られたミスマッチの認識及び選択的ランダム化（１０３、「Ｎ」によって示されるランダム化位置）を含む。
【００３６】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、以下のステップを含む。
１つ以上の部位で相互に異なるポリヌクレオチドを提供して、それによりこれらの１つ以上の異なる部位がランダム化される部位を定義するステップ；
１つ以上の部位でミスマッチを引き起こす、ステップ（ａ）で提供されたポリヌクレオチドからヘテロ二重を生成するステップ；
ミスマッチ部位を特異的に認識できる薬剤によって、ステップ（ｂ）で生成された１つ以上のミスマッチに一本鎖ニックを導入するステップ；
ステップ（ｃ）で生成された一本鎖ニックにおいて開始するポリヌクレオチドヘテロ二重鎖から、１つ以上のヌクレオチドを除去するステップ；
１つ以上のミスマッチヌクレオチドの取り込みを引き起こす条件下で、ステップ（ｄ）で産生された１つ以上のギャップを充填し、それによりポリヌクレオチドを関連する又は必須の部位で特異的にランダム化するステップ。
【００３７】
特に好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）及び（ｄ）は同時に実施され、すなわちミスマッチヌクレオチドは１つのステップで直接除去される。あるいは、ミスマッチヌクレオチドの核酸塩基は、一本鎖切断の導入と同時に除去され、それにより脱プリン(apurinic)／脱ピリミジン(apyrimidinic)（ＡＰ）部位（脱塩基部位）が生成され、それが後で修飾されて伸長可能な３’−ＯＨ末端が生成される。別の特に好ましい実施形態において、この単一のヌクレオチドギャップは、さらに５’−３’、３’−５’又は両方の方向に同時に伸長される。別の特に好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）によるギャップの充填は、ヌクレオチドの重合ストレッチの末端にニックを生じさせ、それが次に、場合によりポリヌクレオチドキナーゼと組合されたリガーゼ酵素によって、共有結合的に閉止される。別の特に好ましい実施形態において、ギャップは形成されないが、代わりにステップ（ｄ）及び（ｅ）が同時に実施され、すなわちステップ（ｃ）で導入されたニックに隣接するヌクレオチドが、１つ以上のミスマッチヌクレオチドの取り込みと同時に除去される。残りのニックは好ましくは、リガーゼ酵素によって共有結合的に閉止される。代案として、１つ以上のミスマッチヌクレオチドの取り込み後に、重合条件が非突然変異誘発性条件に切り換えられ、ミスマッチヌクレオチドの取り込みなしに鎖が合成される。
【００３８】
本発明の方法の開始物質は、１つ以上の部位で相互に異なる、２つ以上のポリヌクレオチドである。これらの相違は、ランダム化が実施される部位をマークする。これらのポリヌクレオチドは好ましくは、一本鎖又は二本鎖形のどちらかで、直鎖ＰＣＲ産生物として提供される。あるいは他の直鎖ポリヌクレオチド、例えば直鎖化プラスミド又は遺伝子の部分を同様に使用することができる。２つのポリヌクレオチドによって開始する場合、これらのポリヌクレオチドは好ましくは、１本はプラス鎖、１本はマイナス鎖として一本鎖形で提供され、それによりヘテロ二重鎖の選択的生成が可能になる。２つを超えるポリヌクレオチドで開始する場合、これらのポリヌクレオチドは好ましくは考えられる各ヘテロ二重鎖対を形成させるために、二本鎖形で提供される。提供された二本鎖ポリヌクレオチドの数が増加すると、定義によりさらなるランダム突然変異誘発プロセスに寄与しないホモ二重鎖の割合は減少する。例えば２つのポリヌクレオチドが同じ濃度で提供されると、ホモ二重鎖の割合は平均で５０％であるのに対して、２０個のポリヌクレオチドが同じ濃度で提供されると、ホモ二重鎖の割合は平均５％である。
【００３９】
ステップ（ａ）で提供されるポリヌクレオチドは、異なる供給源から得ることができる。それらは、改良特性を備えた遺伝子産生物をコードするこれらのポリヌクレオチドを選択する１つ以上の選択又はスクリーニングステップと組合せた、元のポリヌクレオチドの先行ランダム化から得ることができる。好ましくは先行ランダム化は、均一に実施され、ポリヌクレオチド全体に渡る変異を引き起こす。その上、開始ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド交換及び／又はコード化ポリペプチドにおけるアミノ酸交換に耐性である単一の位置又はより長い領域を含む部位についての、元のポリヌクレオチドの走査から生じることが可能である。あるいは、開始ポリヌクレオチドは、最低限度の相同性を示す、同じ又は異なる種から単離された類似又は関連遺伝子又はその部分である。さらなる代案として、ポリヌクレオチドが異なる位置は、その位置で選択的かつ効率的にランダム化されるマーク付きポリヌクレオチドを供給するために、任意に導入できる。ポリヌクレオチドは、２、３個のヌクレオチドから数キロ塩基までの範囲の長さを持ちうる。好ましくはポリヌクレオチドは、１０〜１００，０００ヌクレオチド長、さらに好ましくは１００〜１０，０００ヌクレオチド長、及び最も好ましくは５００〜５，０００ヌクレオチド長である。
【００４０】
ステップ（ｂ）において、ヘテロ二重鎖は、ステップ（ａ）で提供されたポリヌクレオチドから生成される。開始物質が二本鎖ポリヌクレオチドである場合、ポリヌクレオチドは混合され、続いて二本鎖の融解を引き起こす条件を受けて一本鎖分子が産生され、これらの一本鎖のアニーリングが続く（Current Protocols in Molecular Biology, 1987-1988,Wiley Interscience）。開始物質が一本鎖ポリヌクレオチドである場合、これらは混合され、ランダムにアニーリングされて二本鎖ポリヌクレオチドを形成する。得られたヘテロ二重鎖分子は、化学的、生化学的及び／又は酵素手段によって選択的に標的化できるミスマッチを含む。
【００４１】
ステップ（ｃ）において、ニックは、特異的にヘテロ二重鎖内のミスマッチ部位において、又はそれに隣接して導入される。そのようなニックは、ミスマッチ部位の５’又は３’側におけるホスホジエステル主鎖中での単一の一本鎖切断であるか、又はミスマッチヌクレオチド全体の除去、又は特定のミスマッチ部位における、又はその周囲での複数のヌクレオチドの除去のいずれかである。ニックの導入は通常、ニックが行われるヘテロ二重鎖内の特定の鎖に関してランダムである。しかしながら詳細な実施形態において、２つの鎖のうち一方に選択的にニックすることができ、それにより得られた集合でのポリヌクレオチド当たりのランダム化部位の起こりうる頻度が上昇する。
【００４２】
ミスマッチ位置での一本鎖切断は、複数の酵素的及び非酵素的方法により産生できる。E.coliによるＶｓｒエンドヌクレアーゼが特に有用である。酵素は、二本鎖ＤＮＡをＴ：Ｇ塩基対ミスマッチにおいて開裂させ、遊離３’−ＯＨと不正に対合した一本鎖切断５’及び５’−ホスフェート残基をこのニックにおいて産生する。酵素は、特定の配列状況内でＴ：Ｇミスマッチへの優先を示す。コンセンサス配列は、Ｎ1ＴA／TＧＮ2である。Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣを表し、下線付きＴには、ｄＧ塩基が対向する（Glaner, W.et al., J. Mol. Biol. 245(1) :1, 1995; Lieb, M. and Rehmat,S., J. Bacteriol. 177 (3): 660,1995）。別の有用な酵素は、E.coliエンドヌクレアーゼＩＶである。この酵素は、３’−修復ホスホジエステラーゼ活性を有するクラスＩＩ  ＡＰエンドヌクレアーゼであり、脱プリン／脱ピリミジン（AP）部位の５’側のホスホジエステル主鎖を開裂させて、５’−末端２−デオキシリボース５−ホスフェート残基（ｄＲＰ、ｄＲＰａｓｅ活性により除去可能）及び遊離３’−ＯＨ残基を残す。酵素は、３’ブロッキング断片、例えばホスホグリコアルデヒド、デオキシリボース−５−ホスフェート、４−ヒドロキシ−２−ペンテナール、及びホスフェート基を、ＡＰリアーゼ活性によって残されたＤＮＡの３’末端から除去する（Friedberg, E. C. et al., DNA Repair and Mutagenesis, ASM Press, Washington: 157-158, 1995; Levin, J. D. etal., J.Biol. Chem. 266 (34): 22893,1991）。E.coliエンドヌクレアーゼＶ（デオキシイノシン３’−エンドヌクレアーゼ）は、別の有用な酵素である。それは二重鎖ＤＮＡ内のミスマッチを認識し、ミスマッチに対する第二及び第三のホスホジエステル結合３’をそれぞれ９５％及び５％の頻度で開裂させる。酵素は、５’末端に最も近いミスマッチを有する鎖内の３’−ヒドロキシル及び５’−ホスホリル基によってニックを産生する。グリコシラーゼクラスの酵素の構成要素とは異なり、エンドヌクレアーゼＶは、ＤＮＡから遊離塩基を解放するようには見えない。別の特に有用な酵素はエンドヌクレアーゼＶであり、ＡＰ部位、尿素残基、ヘアピン又は不対合ループ、フラップ、及び偽Ｙ構造を含有するＤＮＡ二重鎖を開裂させる（Yao, M. et al., J. Biol. Chem. , 269 (23): 16260,1994）。酵素の作用方式は、反応条件、すなわちｐＨ、ＭｎＣｌ2又はＭｇＣｌ2の存在に依存する。各種のミスマッチに対する広範な特異性を有する、ヘテロ二重鎖における２本のＤＮＡ鎖の一方でのミスマッチ部位の３’側への切込みを実施するさらなる酵素は、セロリから単離されたＣＥＬ  Ｉ様ヌクレアーゼ（"CEL-1"）である（Oleykowski et al., Nucleic Acids Res. 26 (20): 4597,1998）である。
【００４３】
この状況において、さらに特に有用な酵素は、ＭｕｔＹである。酵素は、二官能性グリコシラーゼである。それは二重鎖ＤＮＡにおけるＡ／Ｇ及びＡ／８−オキソ−ｄＧミスマッチを認識し、Ａを含有する鎖を開裂させる。反対側の鎖は開裂されない。ＭｕｔＹは、関連するＡＰリアーゼ活性を有する（Lu, A. L. and Hsu, I.C., Genomics 14(2) : 249,1992 ; Friedberg, E. C. et al., DNA Repair and Mutagenesis, ASM Press, Washington: 157-158,1995）。E.coliからのＭＵＧは、さらに有用な酵素である。ＭＵＧは、Ｕ／Ｇ及びＴ／Ｇミスマッチからピリミジンウラシル（シトシンの脱アミノ化）及びチミン（５−メチルシトシンの脱アミノ化）を除去する（Barrett, T. E. etal., Cell 92(1) : 117,1998 ; Barrett, T. Eet al., EMBO.J. 18 (23): 6599,1999）。ＴＤＧ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍからのチミンミスマッチＤＮＡグリコシラーゼ）は、別の特に有用な酵素である。ＴＤＧは、ｄｓＤＮＡ内のＴ／Ｇ（U／Ｇ、Ｇ／Ｇ、Ｔ／Ｔ、T／C）ミスマッチ（５’−メチルシトシンからチミンへの脱アミノ化）を認識する。ＴＤＧは、単官能性グリコシラーゼである。本酵素は、Ｎ−グリコシド結合の加水分解によって、グアニンと誤対合したチミン及びウラシル塩基を特異的に除去し、それによりＤＮＡ内に脱塩基部位を生成する。さらに有用な酵素は、ヒトエンドヌクレアーゼＩＶ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ＡＰＥ／ＨＡＰ１である。本酵素は、ＤＮＡをＤＮＡ内にニックを形成するＡＰ部位で開裂させる（Yacoub, A. et al., Cancer Res. 57 (24): 5457,1997 ; Duguid, J. R. et al., Cancer Res. 55 (24): 6097,1995）。エンドヌクレアーゼＩＶとは対照的に、ＡＰＥ１は、ＤＮＡ鎖切断に位置するデオキシリボース断片に対して弱い３’−修復ジエステラーゼ活性のみを示す（Demple, B and Harrison,L., Annu. Rev. Biochem. 63: 915,1994 ; Xu,Y.J. et al., J. Biol. Chem. 273 (44): 28837,1998）。さらに有用な酵素は、E.coliエキソヌクレアーゼＩＩＩである。この酵素は、３’−ｔｏ−５’−エキソヌクレアーゼ活性以外に、クラスＩＩＩ  ＡＰエンドヌクレアーゼ活性を有する。それは３’−ＯＨ、３’−ホスフェート、及び３’−ホスホグリコレート基に作用する（Friedberg, E. C. et al, DNA Repair and Mutagenesis, ASM Press, Washington: 157-158,1995）。
【００４４】
酵素プロセスの代案として、ミスマッチ位置での一本鎖切断は、化学開裂（ＣＭＣ−化学ミスマッチ開裂）によっても産生できる。ミスマッチ塩基対の検出のための「ミュータントプロファイリング」でのその応用で既知である四酸化オスミウム及びヒドロキシルアミン（Wurst, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 9909,1991）は、適切な化学薬品の例である。四酸化オスミウム、過マンガン酸カリウムは、一連のミスマッチ塩基（Ｔ／Ｃ、Ｔ／Ｇ、Ｔ／Ｔ及びＣ／Ｔ、Ｃ／Ａ、Ｃ／Ｃミスマッチ）を認識及び修飾することが既知である。過マンガン酸カリウム／テトラエチルアンモニウムクロライド及びヒドロキシルアミンは、他のさらなる代案に並ぶものである（Roberts, E. et al., Nucleic. Acids. Res. 25 (16): 3377,1997）。
【００４５】
さらなる実施形態において、、ステップ（ｃ）での一本鎖ニックの導入の代案として、ミスマッチヌクレオチドの核酸塩基のみが除去され、それによりミスマッチ位置で脱塩基部位が生成されるが、鎖の切込みはなしである。ミスマッチ位置での核酸塩基の除去に有用な薬剤の例は、ＡＰリアーゼ機能を持たないＤＮＡグリコシラーゼ、例えばＵＤＧ（E.coliからの）である。この実施形態により、ステップ（ｄ）、すなわちギャップを生成するための、切込まれた鎖におけるヌクレオチドの除去を避けることができる。ステップ（ｅ）で述べたランダム化は、脱塩基部位含有鎖をテンプレートとして用いて重合により行われ、それにより元のポリヌクレオチド内のミスマッチ位置におけるヌクレオチド、又はそれに隣接するヌクレオチド以外のヌクレオチドの取り込みが引き起こされる。従ってミスマッチ位置での脱塩基部位の生成は、ミスマッチ位置への一本鎖ニックの導入後の、ユニバーサルヌクレオチドの取り込みに類似している。
【００４６】
ステップ（ｄ）による一本鎖の除去は、二本鎖ポリヌクレオチド内のミスマッチ位置に近接した一本鎖領域を生成するために、複数のヌクレオチドに制限することができる。あるいは、ステップ（ｄ）による一本鎖の除去は限定されなくてもよく、それによりギャップをミスマッチ位置からポリヌクレオチドの末端まで伸長できる。エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼは、この目的に好都合に使用できる。有用なエキソヌクレアーゼの例は、ラムダ−エキソヌクレアーゼ（５’→３’エキソヌクレアーゼ）（Little, Gene Amplification & Analysis 2,135-145, 1981）；Ｔ７エキソヌクレアーゼ（５’→３’エキソヌクレアーゼ）、Ｔ５  Ｄ１５エキソヌクレアーゼ（５’→３’エキソヌクレアーゼ、Sayers et al., J. Biol. Chem. 265: 18311-18317, 1990）、バクテリオファージＮ４からの５’−３’エキソヌクレアーゼ（Guinta et ai., J. Biol. Chem. 261: 10736-10743,1986）、Saccharomyces cerevisiaeの核抽出物からの５’−３’−エキソヌクレアーゼ（Exol）（Huang and Symington, Mol. Cell. Biol., 3125-3134,1993）、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（５’→３’エキソヌクレアーゼ）、エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’エキソヌクレアーゼ）（Brody et al., J. Biol. Chem. 261: 7136-7143,1986; Brody and Doherty, Biochemistry 24: 2072-2076, 1985）、Saccharomyces cerevisiaeからのＹＮＴ２０（３’−５’エキソヌクレアーゼ）（Hanekamp and Thorsness, Current Genetics 34: 438-448,1999）、E.coliのＤＮＡポリメラーゼ−ｌｉｌ−サブユニット−イプシロン（３’→５’エキソヌクレアーゼ）（Krutyakov, Mol. Biol. 32: 197-199, 1998）である。有用なポリメラーゼの例は、ＤＮＡポリメラーゼ（５’→３’ポリメラーゼ、３’→５’及び５’→３’エキソヌクレアーゼ）（Rigby etal.,J. Mol. Biol. 113: 237-251,1997）、Ｔａｑ（Ｔｔｈ）ポリメラーゼ（５’→３’ポリメラーゼ、３’→５’及び５’→３’エキソヌクレアーゼ）（Longley M. J. etal., Nucleic Acids Res. 18 (24): 7317-22, 1990）、Ｋｌｅｎｏｗ断片（５’→３’ポリメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ）（Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467,1977）、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（５’→３’ポリメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ）（Young et al., Biochemistry 31 (37): 8675,1992）、Pwo, Pfu, Pfx, Tub, Vent, Tma, UITmaポリメラーゼ（５’→３’ポリメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ、Newton and Graham, in: PCR, Spektrum Akad. Verlag Heidelberg, 1,1994）である。
【００４７】
ステップ（ｅ）によるギャップの充填は、ヌクレオチドの重合によって実施される。好ましくは充填は、標準ポリメラーゼによって、誤取り込みの頻度増加を引き起こす条件下で行うことができる（例えばCadwell, R. C and Joyce, G. F. , PCR MethodsAppl. 2(1) : 28,1992 ; PCR MethodsAppl. 3 (6): 136,1994によって述べられているような、突然変異誘発性ＰＣＲの条件）。さらに好ましくはギャップの充填は、ポリメラーゼ及びユニバーサルヌクレオチドによって実施できる。ユニバーサルヌクレオチドは、選択すべき４つの標準核酸塩基の２つ以上を用いて塩基対を形成できるとして特徴付けられる；従ってユニバーサルヌクレオシドは、これに限定されるわけではないがｄＩ（２’−デオキシ−イノシン）、ｄＰ（６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オンのＰコード化、「ｐ」はピリミジン（Ｃ又はＴ）類似物質として作用する、Lin and Brown, Nucleic Acids Res. 17(24):10373-83,1989）、ｄＫ（N６−メトキシ−２，６−ジアミノプリンのＫコード化、「Ｋ」はプリン（Ｇ又はＡ）類似物質として作用する、Lin and Brown, Nucleic Acids Res. 20 (19): 5149-52,1992）である。さらにユニバーサル塩基として、３−ニトロピロール（Nichols et al., Nature 369: 492,1994 ; Bergstrom etal., J. Am. Chem. Soc.117 : 1201, 1995）又は４−、５−、及び６−ニトロインドール（Loakes et al, Nucleic Acids Res. 22 (20): 4039-43,1994）を使用できる。
【００４８】
あるいはステップ（ｅ）によるギャップの充填は、ポリメラーゼ及び４つの標準ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の不均等混合物によって実施できる。さらなる代案として、ギャップの充填は、ポリメラーゼによって４つの独立した反応において実施可能であり、それにより各反応において、４つの標準ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の１つが欠失している。その上、ギャップの充填は、ポリメラーゼならびに標準（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）及びユニバーサルヌクレオチド、例えばｄＩＴＰの混合物によって実施できる。ヌクレオチドのそれぞれの取り込み率によって、各ヌクレオチドの不均等濃度の混合物が提供される。例えば、他と比較してより低い取り込み効率のヌクレオチドの組み込みを実施するために、このヌクレオチドは、より高い濃度で提供される。
【００４９】
さらなる代案において、「分割−混合」手法の変異体が実施される。そこでギャップの充填は独立した反応において実施され、それにより各反応において、４つの標準ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の１つのみ又はユニバーサルヌクレオチドの群のうちの１つの薬剤、例えばｄＩＴＰが提供される。好ましい実施形態において、ギャップの充填は、各反応で提供される４つの標準ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）のうちの１つのみによって、４つの独立した反応において行われる。例えばステップ（ｄ）で生成されたギャップが、１つのヌクレオチドの長さを有する場合、ポリヌクレオチド分子内の１つ１つのヌクレオチドギャップは、テンプレートヌクレオチドとは無関係に、ポリヌクレオチドが第一の反応に存在する場合にはＡによって、第二の反応ではＣによって、第三の反応ではＧによって、、第四の反応ではＴによって充填される。それによりポリヌクレオチドは、ステップ（ｄ）で生成されたギャップでランダム化される。平均で１個を超えるギャップがポリヌクレオチド内に存在する場合、得られたポリヌクレオチドは重合ステップの後に混合されて、次に異なる反応へ分割されて、さらなる重合ステップを受ける。好ましくはこれは、複数の分割及び混合サイクルに渡って行われる。さらに好ましくは、２つのサイクル間で、新たに生成されたポリヌクレオチドは、ミスマッチ認識、一本鎖開裂及びギャップ生成ステップ（ステップ（ａ）〜（ｄ）で行われるように）を受け、それにより１つのステップにおいてミスマッチヌクレオチドとして導入された、元のではないヌクレオチドを次のステップで使用する。別の代案として、ギャップの充填は、ポリメラーゼ及びランダムヌクレオチドトリマーの混合物によって、遺伝子の元のプールから生成されたが、変異を有する特異性オリゴヌクレオチドによって、完全にランダムなオリゴヌクレオチドによって、あるいはこれらの組合せによって実施することができる。
【００５０】
さらに、ステップ（ｅ）によるギャップの充填は、リガーゼ及び特異性及び／又はランダムオリゴヌクレオチド又はその混合物によって実施することができる。重合中の条件を変更する代わりに、ポリメラーゼは、高いエラー率を有するように選択することもできる（Suzuki, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (17): 11228,1997）。
【００５１】
ステップ（ｅ）で生成されたポリヌクレオチドは、増幅手順を受けさせることができる。インビトロＰＣＲ増幅は、標準ヌクレオチドｄＮＴＰのいずれかを提供する条件下で実施される。増幅中にユニバーサルヌクレオチドに対向して組込まれたヌクレオチドに対する偏りを補正するために、増幅は好ましくは、４つの標準ヌクレオチドの不均等混合物によって実施される。ステップ（ｅ）で得られたポリヌクレオチドは、インビボでも増幅できる。
【００５２】
本発明の方法の第一の実施形態においては、ステップ（ｄ）によるニック鎖の分解は、不対合ヌクレオチドを特定の特異性ミスマッチ位置にのみ生成するために、１つのヌクレオチドに制限される。
【００５３】
この実施形態の特に好ましい変形を、図２に示す。この変形により、ミスマッチ核酸塩基は、ミスマッチを特異的に認識することができ、ＤＮＡグリコシラーゼ及びＡＰリアーゼ活性を有する薬剤によって最初に除去される。得られたニック脱塩基デオキシリボース部分は好ましくは、ＡＰエンドヌクレアーゼ活性を有する薬剤、例えばE.coliからのエンドヌクレアーゼＩＶ（Friedberg, E. C. et al., DNA Repair and Mutagenesis, ASM Press, Washington: 157-158,1995 ; Levin, J. D.et al., J. Biol. Chem. 266 (34): 22893,1991）、ヒトエンドヌクレアーゼＩＶ（Yacoub, A. et al., Cancer Res. 57 (24): 5457,1997 ; Duguid,J. R. et al., Cancer Res. , 55 (24): 6097,1995）、E.coliからのエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Friedberg, E.C. et al., DNA Repair and Mutagenesis, ASM Press, Washington: 157-158,1995）によって除去され、最終的に伸長可能な3'-OHを前のミスマッチの位置に有する単一のヌクレオチドギャップを生じさせる。この実施形態には、ポリメラーゼによる単一のユニバーサルヌクレオチド、例えばｄＩＴＰの導入、及び場合によりポリヌクレオチドキナーゼと組合されたリガーゼ酵素による、得られたニックの連結を続けることができる。
【００５４】
この修飾ポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅、又はベクターへの挿入及び細胞内への形質転換による増幅は最終的に、ミスマッチ位置に特異的にランダム変異を含むポリヌクレオチド分子の集合を生じさせる。
【００５５】
本発明の第二の実施形態において、（ｄ）によるニック鎖からのヌクレオチドの除去は、ミスマッチ位置の３’側におけるランダム化位置に対する５’−３’外ヌクレオチド鎖分解性活性又は鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、ステップ（ｅ）による新たなヌクレオチドの取り込みと同時に行われる。
【００５６】
この第二の実施形態の特に好ましい変形を、図３に示す。この変形により、ミスマッチ核酸塩基は、ミスマッチを認識し、ＡＰ部位で生じた対応する核酸塩基を切除できる薬剤により最初に除去される。好ましくは、ＤＮＡグリコシラーゼ機能を備えた酵素、例えばＴＤＧ（Tymine mismatch DNA glycosylase from M.thermoautotrophicum, Neddermann, P. etal., J. Biol. Chem. 271 (22): 12767, 1996）又はＭＵＧ（Mismatch Uracil DNA glycosylase from E.coli, Barrett, T. E et al., Cell 92(1) : 117,1998 ; Barrett, T. E et al.,EMBO. J. 18 (23): 6599,1999）をこのステップに使用する。ＡＰ部位のホスホジエステル結合５’は次に、第二の薬剤によって加水分解されて、伸長可能な３’ＯＨ末端を生じる。好ましくはＡＰエンドヌクレアーゼ機能を有する酵素、例えばE.coliエンドヌクレアーゼＩＶ（Friedberg, E. C. et al., ＤＮＡ Repair and Mutagenesis, ASM Press, Washington: 157-158,1995 ; Levin, J. D. et al., J. Biol. Chem. 266 (34): 22893, 1991）又はヒトエンドヌクレアーゼＩＶ（Yacoub, A. et al., Cancer Res. 57 (24): 5457, 1997; Duguid,J. R. etal., Cancer Res. 55 (24): 6097,1995）をこのステップで使用する。得られた ３’ＯＨ末端は次に、残りの脱塩基デオキシリボースホスフェート部分を除去するために、場合によりｄＲＰａｓｅ（デオキシリボースホスファターゼ）機能を有するポリメラーゼ、例えばヒトＤＮＡポリメラーゼβ（Matsumoto et al., Science 269 (5224): 699,1995）、ショウジョウバエリボソームタンパク質Ｓ３（Sandigursky et al., J.Biol. Chem. 272 (28): 17480,1997）によって伸長される。新たなヌクレオチドの取り込み中のヌクレオチド除去のための、５’−３’−外ヌクレオチド鎖分解性活性を備えた特に有用なポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Rigby et al., J. Mol. Biol. 113:237-251, 1977）又はThermus aquaticusからのＴａｑポリメラーゼである。新たなヌクレオチドの取り込み中のヌクレオチド除去のための、鎖置換活性を備えた特に有用なポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼδ、B.stearothermophilusからのｒＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの大型断片、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（Giesler et al., Amersham Pharma Biotech）である。鎖置換活性を備えたポリメラーゼを使用すると、置換された一本鎖は、ＤＮａｓｅ  ＩＶ又は哺乳類ＦＥＮ−１又はSaccharomyces cerevisiaeからのＲａｄ２７によって開裂させる必要がある（Negritto et al., Molecular and Cellular Biology 21 (7): 2349,2001）。取り込まれたヌクレオチドは、誤取り込み率の上昇を引き起こす条件下で、ユニバーサル塩基（ｄＩＴＰ、ｄＰＴＰ、ｄＫＴＰなど）又は標準ヌクレオチドのどちらかである。場合によりポリヌクレオチドキナーゼと組合せたリガーゼ酵素による、得られたニックの結合後、ポリヌクレオチドはＰＣＲ増幅されるか、ベクターへの挿入及び細胞内への形質転換によって増幅されて、ミスマッチ位置から３’下流にランダム変異を特異的に含むポリヌクレオチド分子の集合を最終的に生じさせる。この好ましい実施形態の別の変異体において、ランダム化は、高い頻度の誤取り込みを引き起こす条件下での第一の重合ステップ及び低い頻度の誤取り込みを引き起こす条件下での第二の重合ステップによって行える。特に、第一の重合ステップは、５’−３’外ヌクレオチド鎖分解性活性を有し、ユニバーサルヌクレオチドを使用するポリメラーゼによって実施される。次に第二の重合ステップは、５’−３’外ヌクレオチド鎖分解性活性を有し、標準ヌクレオチドを使用するポリメラーゼによって実施される。上述の変異体の代案として、ＤＲＰａｓｅを持つが、５’−３’外ヌクレオチド鎖分解性活性及び鎖置換活性のないポリメラーゼを使用できる。次に１個のヌクレオチドのみが取り込まれ、第一の実施形態と同じ結果を引き起こす。
【００５７】
本発明の第三の実施形態において、ステップ（ｄ）によりニック鎖からのヌクレオチドの除去は、エキソヌクレアーゼによって行われ、それによりミスマッチ部位を３’側、５’側、あるいは３’及び５’側の両方のいずれかまで伸長する領域をランダム化することができる。この領域のサイズは好ましくは、外ヌクレオチド鎖分解性消化を制御することにより制限される。
【００５８】
この第三の実施形態の特に好ましい変形を、図４に示す。この変形により、ミスマッチ核酸塩基は、ミスマッチを特に認識することができ、ＤＮＡグリコシラーゼ及びＡＰリアーゼ活性を有する薬剤によって最初に除去される。得られたニック脱塩基デオキシリボース部分は場合により、ＡＰエンドヌクレアーゼ活性を有する薬剤、例えばE.coliエンドヌクレアーゼＩＶ（Friedberg et al., 1995）、ヒトエンドヌクレアーゼＩＶ（Yacoub et al., 1997）によって除去することができる。次に、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により、ニックをあるサイズのギャップまで伸長させる。特に好ましい実施形態において、ギャップは、一本鎖３’−５’外ヌクレオチド鎖分解性活性を特異的に有するエキソヌクレアーゼ、例えばE.coliからのエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Friedberg et al., 1995）又はE.coliエキソヌクレアーゼＩ（Brody et al., J. Biol. Chem. 261: 7136,1986）によって３’方向に伸長される。別の特に好ましい実施形態において、ギャップは、一本鎖５’−３’外ヌクレオチド鎖分解性活性を特異的に有するエキソヌクレアーゼ、例えばＸ−エキソヌクレアーゼ又はバクテリオファージＴ７からのＴ７−５’エキソヌクレアーゼによって５’方向に伸長される。さらなる特に好ましい実施形態において、ギャップは、一本鎖３’−５’及び５’−３’外ヌクレオチド鎖分解性活性を有するエキソヌクレアーゼ、例えばAlteromonas espejianaからのＢａｌ  ３１（Gray et al., Nucleic Acid Res. 2: 1459-1492, 1975）によって、又は一本鎖３’−５’外ヌクレオチド鎖分解性及び５’−３’外ヌクレオチド鎖分解性活性を有する酵素のブレンドによって両方向に伸長される。次に得られた３’ＯＨ末端は、５’−３’外ヌクレオチド鎖分解性及び鎖置換活性が欠如したポリメラーゼによって伸長される。この目的に特に有用なポリメラーゼは、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼである。取り込まれたヌクレオチドは、誤取り込み率の上昇を引き起こす条件下で、ユニバーサル塩基、例えばｄＩＴＰ又は標準ヌクレオチドのどちらかである。
【００５９】
この好ましい実施形態の別の変形において、異なる長さのランダム化オリゴヌクレオチドは、上で概説したようにｓｓＤＮＡのギャップにハイブリダイズされている。場合により、これらのオリゴヌクレオチドは、異なる程度のユニバーサル塩基を含有できる。
【００６０】
場合によりポリヌクレオチドキナーゼと組合わされたリガーゼ酵素による、得られたニックの連結後、ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅されるか、あるいはベクター内への挿入及び細胞内への形質転換によって増幅されて、ミスマッチ位置から３’下流又は５’上流又は両方の方向で、ランダム変異を特異的に含むポリヌクレオチド分子の集合を生じさせる。
【００６１】
上述の実施形態の複数の組合せを定義して、本発明の方法の特に有用な変異体を生成させることができる。本明細書で述べた実施形態は、例示目的のみであることと、それに照らした各種の修飾又は変更が当業者に提示され、本出願の目的及び範囲に含まれ、添付した請求項の範囲内とみなされることが理解される。本明細書で引用したすべての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のためその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
実施例：
【実施例１】
【００６２】
ＤＮＡ−ヘテロ二重鎖の生成
以下のポリヌクレオチドを使用して、相同性及び異種領域を備えた二本鎖ポリヌクレオチドを生成した。
ポリヌクレオチド１（配列番号：１）：
2005536213.tif 000004
ポリヌクレオチド２（配列番号：２）：
2005536213.tif 000005
ポリヌクレオチド３（配列番号：３）：
2005536213.tif 000006
ポリヌクレオチド４（配列番号：４）：
2005536213.tif 000007
【００６３】
ポリヌクレオチド１の（＋）鎖及びポリヌクレオチド２の（−）鎖はもちろんのこと、ポリヌクレオチド３の（＋）鎖及びポリヌクレオチド４の（−）鎖を当モル量で混合して、水２０μｌ中のＤＮＡ  １μｇの溶液を得た。アニーリングは、ＰＣＲサイクルにおいて、溶液の９４℃までの加熱、及び続いての０．０４℃／秒の速度による５０℃までの冷却によって実施した。ポリヌクレオチド１の（＋）鎖及びポリヌクレオチド２の（−）鎖は、位置５１にミスマッチを持つ二本鎖ポリヌクレオチドを作製する（ヘテロ二重鎖１）。ポリヌクレオチド３の（＋）鎖及びポリヌクレオチド４の（−）鎖は、８つの考えられるミスマッチの種類のうち３つを含む、位置５１、１７２、２０２、２２１、２５９、３４８、３４９それぞれに各種のミスマッチ、例えばＴ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、Ａ／Ａ、Ｇ／Ｔ、Ｃ／Ａ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ａを備えた、二本鎖ポリヌクレオチドを作製する（ヘテロ二重鎖２）。
【実施例２】
【００６４】
ミスマッチにおける一本鎖ニックの導入
ヘテロ二重鎖内のミスマッチは、ＤＮＡグリコシラーゼによって認識される。この例において、以下のＤＮＡグリコシラーゼ：ＴＤＧ（チミン−ＤＮＡグリコシラーゼ、酵素は標準条件下で、好ましくはＴ／Ｇ＞＞Ｔ／Ｃ＞Ｔ／Ｔの順序のミスマッチを認識し、Ｔで一本鎖を特異的に開裂する）；ＭｕｔＹ（ＭｕｔＹ−ＤＮＡグリコシラーゼ、酵素は標準条件下で、好ましくはＡ／Ｇ及びＡ／Ｃミスマッチを認識し、Ａで一本鎖を特異的に開裂する）を使用する。非標準条件では、どちらの酵素も他の優先度を示す。
【００６５】
開裂反応の解析は、蛍光標識ヘテロ二重鎖によって実施し、各鎖をその５’末端において標識した。蛍光標識一本鎖ポリヌクレオチドは、５’末端標識プライマー及び標準ＰＣＲプロトコルによって標識した。各ＰＣＲ産生物を標準ＰＣＲ条件（９４℃→４０℃、０．０４℃／秒）下で変性及び再アニーリングし、精製した（QIAgen  ＰＣＲ精製キット）。これらの蛍光標識ヘテロ二重鎖に酵素反応を受けさせた。得られたＤＮＡ断片は、蛍光検出を用いてポリアクリルアミドキャピラリー電気泳動によって解析した。
【００６６】
ＴＤＧ（２Ｕ／μｌ、R＆D Systems）１μｌ及び１０×ＴＤＧ緩衝液（R＆D Systems）２μｌの、ヘテロ二重鎖２  ２０μｌ（１μｇ／２０μｌ）への添加、及び６５℃での１時間のインキュベーションは、これらの条件下でＴ／Ｇ及びＴ／Ｔミスマッチの好ましい開裂を示した。
【００６７】
ＭｕｔＹ（２Ｕ／μｌ、R＆D Systems）１μｌの、ＲＥＣ緩衝液（R＆D Systems）５０μｌ中のヘテロ二重鎖２  ０．５μｇへの添加及び続いての３７℃での２時間のインキュベーションは、これらの条件下でＡ／Ｇミスマッチに関して、ＭｕｔＹでの好ましい開裂を示した。
【実施例３】
【００６８】
ＡＰ部位での一本鎖ニックの導入
ヘテロ二重鎖内のミスマッチは、２つのミスマッチ塩基対の一方におけるヌクレオシド残基の開裂によって認識及び修飾できる。脱プリン部位（AP部位）を備えた二本鎖ポリヌクレオチドは、E.coliエンドヌクレアーゼＩＶによって、以下の条件下で開裂できる：脱プリン部位を備えた二本鎖ポリヌクレオチド基質は、オリゴヌクレオチド１
（5'-GAATATGCACAGAGTG[Sp-d]TCCTTATGGC；配列番号：５；“Sp-d”＝脱塩基部位）
及びオリゴヌクレオチド２
（5'-GCCATAAGGAGCACTCTGTGCATATTC；配列番号：６）
をアニーリング（９４℃→４０℃、０．０４℃／秒）することにより生成させた。合計１μｇのアニーリング産生物を、ＴＤＧ緩衝液（R＆D Systems）２０μｌ中でエンドヌクレアーゼＩＶ（E.coli、MBI Fermentas）４Ｕによって各種の期間でインキュベートした。反応は、６×負荷緩衝液（MBI Fermentas）５μｌを添加して、９５℃で１０分間煮沸することにより停止させた。反応産生物は、１５％ポリアクリルアミドゲル及びエチジウムブロマイド染色を用いて解析した。インキュベーションの延長とともに、予想された開裂産生物の強度の上昇があった。
【実施例４】
【００６９】
ポリメラーゼ反応のための３’末端のトリミング
ミスマッチを示すヘテロ二重鎖ＤＮＡは、グリコシラーゼ活性の後で３’部位でβ脱離を介してさらに切込む二官能性ＤＮＡグリコシラーゼによってニックされ、それにより閉塞性３’末端が産生される。これらの３’封鎖基はE.coliエンドヌクレアーゼＩＶによって除去可能であり、伸長反応に適したプライマーを生成する。閉塞性３’末端を有する、ＴＤＧ作用（実施例２）によって生成された断片は、標準手順を利用して変性ＰＡＧＥゲルから単離した。以下では実施例３に概説した条件を使用して、封鎖断片をエンドヌクレアーゼＩＶによってインキュベートした。トリミングしたオリゴヌクレオチドの官能性は、標準条件下でのプライマー伸長によって証明された。反応産生物は実施例２で概説したように解析され、エンドヌクレアーゼＩＶ処理オリゴヌクレオチドの伸長性を示した。
【実施例５】
【００７０】
ＣＥＬ  １、ＴＤＧ、ＭｕｔＹ、及びエンドヌクレアーゼＩＶの混合物によるミスマッチ位置の認識
ポリヌクレオチド４（配列番号：４）の（＋）鎖及びポリヌクレオチド３（配列番号：３）の（−）鎖からなる、蛍光標識４１９ｂｐ−ヘテロ二重鎖１  ＤＮＡ  ３μｇ、ならびにポリヌクレオチド３（配列番号：３）の（＋）鎖及びポリヌクレオチド４（配列番号：４）の（−）鎖より成る、蛍光標識４１９ｂｐヘテロ二重鎖２  ＤＮＡ  ３μｇを含む２つの独立したサンプルを、ＣＥＬ１（Transgenomic, Omaha, NE, USA）２５Ｕを用いて、反応体積１００μｌ中の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４；１０ｍＭ  ＫＣｌ；３ｍＭ  ＭｇＣｌ2で３７℃で２分間処理した。反応は、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することによって終了させた。さらに、１００μｌ中の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１０Ｕ  E.coli MutY DNAグリコシラーゼ（Trevigen, Gaithersburg, MD, USA）を添加した。３７℃での１時間のインキュベーション後、ヒトＴＤＧ  ＤＮＡグリコシラーゼ（Trevigen, Gaithersburg, MD, USA）１０Ｕを添加し、反応混合物を６５℃でさらに１時間インキュベートした。
【００７１】
サンプルは、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Qiagen, Hilden）を用いて精製した。ニック脱塩基部位で３’末端からデオキシリボース−５−ホスフェートを除去するために、溶出されたｄｓＤＮＡを、８０μｌ中の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％で、エンドヌクレアーゼＩＶ（MBI Fermentas）１０Ｕを用いてインキュベートした。ポリアクリルアミドキャピラリー電気泳動によって解析し、結果を図５に示す。そこでピークの注釈は、ポリヌクレオチドの全長（４１９ｂｐ）に対する断片サイズの相違によって得られたポリヌクレオチド内での認識された変異の位置を指す。ヌクレオチド６０個以下のサイズでは、機器の制限により検出は不可能であった。
【００７２】
図５Ａ及び図５Ｂは、ヘテロ二重鎖１の蛍光標識（＋）鎖及び蛍光標識（−）鎖から産生された断片をそれぞれ示している。
図５Ｃは、ヘテロ二重鎖２の蛍光標識（＋）鎖からの断片を示す。ヘテロ二重鎖２の（−）鎖は、機器の制限により、この実験では標識されなかった。
【００７３】
ヘテロ二重鎖分子におけるすべてのミスマッチは、異なる効率によってだが、予想通りに認識された。ヘテロ二重鎖１の（−）鎖の位置２０２及び３４９におけるミスマッチｔ／ｔはそれぞれ（（＋）鎖の位置２１７及び７０にそれぞれ相当する）は、低い効率によってのみ検出できる。
【実施例６】
【００７４】
ｄＩＴＰの取り込み
ポリヌクレオチドは、蛍光標識９０９ｂｐポリヌクレオチド３をＮａｅＩで消化することによって生成させた。Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼによる伸長前に、３３８ｂｐ断片を精製（QIAgen Minelute  ＰＣＲ産生物精製キット）、溶融及び未標識ポリヌクレオチド３を用いて、アニーリングした（９４℃→４０℃、０．０４℃／秒）。伸長反応は、緩衝液（７５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８；２００ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4；２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）１０μｌの添加により、１００μｌ中の０．０５Ｕ／μｌ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（MBI Fermentas）を用いて実施し、続いてｄＮＴＰの非存在下であるが、２ｍＭ  ｄＩＴＰの存在下で７２℃で２０分間インキュベーションした。伸長産生物は、標準及び突然変異誘発性条件下で実施例２で述べたＤＮＡ断片解析によって検出し、ｄＩＭＰの取り込みが示された。図６は、ｄＩＴＰによる３３８ｂｐ断片の伸長を示す。ｄＩＴＰの取り込みから得られた伸長産生物が示されている。実験条件下で、当該産生物の大部分は２個のデオキシイノシン残基によって伸長され、伸長は少なくとも２１個のデオキシイノシン残基まで続く。
【実施例７】
【００７５】
分割−混合プロトコルによる４つの独立した反応におけるｄＮＴＰの取り込みによるランダム化
４つの独立した反応においてヒトＤＮＡポリメラーゼを用いて、ヌクレオチドギャップの充填を実施し各反応において、４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）のうち、１つのみが存在した。
【００７６】
単一ヌクレオチドギャップにおけるミスマッチｄＮＴＰの取り込みを研究するために、単一のヌクレオチドギャップをそれぞれ有する二本鎖ＤＮＡ分子を、０．５ｐｍｏｌのプライマー２３
（5'-フルオロホル-CGAGCGTTGCATATGTGGAAGAAGATCATAT；配列番号：７）、
２ｐｍｏｌのプライマー１１
（5'-[P]-GCACATGAATATGCACAGAGTGTTCCTTATGGC；配列番号：８）
及び１ｐｍｏｌのテンプレート３１
（5'-GCCATAAGGAACACTCTGTGCATATTCATGTGCXATATGATCTTCTTCCACATATGCAACGCTCG (ここでＸはA、T、C又はGを表す)；配列番号：９）
をＥＢ緩衝液  １０μｌ中で９５℃で５分間インキュベートして、４０℃までゆっくり冷却することにより、生成させた。ｄＮＴＰの取り込みは、２０μｌ中の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１．０ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロール中のヒトＤＮＡポリメラーゼ（Trevigen）５Ｕを用いて、４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の１つの５ｍＭによって実施した。３７℃での２分間のインキュベーションの後、フェノール／クロロホルムを用いた抽出により酵素を除去し、エタノールでｄｓＤＮＡを沈殿させた。
【００７７】
ギャップ閉鎖反応は、１×リガーゼ緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＡＴＰ）２０μｌ中でE.coli  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ  １０Ｕを用いて実施した。上で示したプライマーでは、１２個の生じ得る単一ヌクレオチドミスマッチすべてを示すヘテロ二重鎖を形成及び解析した。結合産生物の形成は、ポリアクリルアミドキャピラリー電気泳動によって観測した。ｄＮＴＰ取り込み及び結合の効率は図３に示す。
【表３】
2005536213.tif 000008
【実施例８】
【００７８】
３’末端にｄＩＭＰを含有するポリヌクレオチドの結合
３’末端にｄＩＭＰを有する蛍光標識オリゴヌクレオチド３
（5'-フルオロホル-CGAGCGTTGCATATGTGGAAGAAGATCATATI；配列番号：１０）
を、オリゴヌクレオチド４
（5'[P]-GCACATGAATATGCACAGAGTGTTCCTTATGGC；配列番号：１１）
及び未標識オリゴヌクレオチド３と混合した。変性及びアニーリング（９４℃→５０℃、０．０４℃／秒）の後、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（MBI Fermentas）２５Ｕを用いて、１６℃、標準条件下で一晩、オリゴヌクレオチドを結合させた。６５ｎｔ一本鎖オリゴヌクレオチドの結合産生物は、実施例２で述べたＤＮＡ断片解析を用いて検出した。
【実施例９】
【００７９】
ｄＩＭＰストレッチを含有するテンプレートの増幅
標準ＰＣＲは、１００ｐｍｏｌのプライマー１
（5'-GATCATATTGCACTGCATATGCACAG-3'；配列番号：１２）
及び１００ｐｍｏｌのプライマー２
（5'-フルオロホル-CAAGGCTCATGTTGATAACATC-3'；配列番号：１３）
を用いて、１０μｌ中の７５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８；２００ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4；０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、１０ｆｍｏｌ  スブチリシンｗｔ遺伝子を持つテンプレートベクター、２００μＭ  ｄＮＴＰ、５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（MBI Fermentas）、及び蒸留水１００μｌの中で実施した。次のサイクラープロトコルを使用した：１’９４℃；１’ ９４℃、１’ ５５℃、１．５’ ７２℃を２５サイクル；６’ ７２℃を１サイクル。図７の４００ｂｐにおける主ピークは、増幅産生物の９０％超が全長であることを示す。１０％未満では、長さ３８５ｂｐのより短い断片が生成された。
【実施例１０】
【００８０】
スブチリシン遺伝子の特定位置でのランダム化
ポリヌクレオチド１４（配列番号：１４）
2005536213.tif 000009
ポリヌクレオチド１５（配列番号：１５）
2005536213.tif 000010
【００８１】
スブチリシンＥの野生種遺伝子（配列番号：１４；B.subtilisからのapre遺伝子）及びその変異体（配列番号：１５；ランダム突然変異誘発及び続いての改良活性のスクリーニングによって同定された変異体）を利用して、これらの２つの配列間で異なるこれらの位置でランダム化された、スブチリシン遺伝子の変異体を生成した。
【００８２】
直鎖ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅によって生成した。２つの遺伝子の一方をそれぞれ含有する２つのプラスミドを、テンプレートとして使用した。プライマーＬ
（5'-CGTTGCATATGTGGAAGAAGATC-3'；配列番号：１６）
及びプライマーＲ
（5'-GAAGCAGGTATGGAGGAAC-3'；配列番号：１７）
をプライマーとして使用した。反応条件：１０μｌ中の２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８；１００ｍＭ  ＫＣｌ；１００ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4；２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4；１％（ｖ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００；１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｆｍｏｌ  プラスミド、１００ｐｍｏｌ  プライマーＬ、１００ｐｍｏｌ  プライマーＲ、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５Ｕ  ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）、及び蒸留水１００μｌ。次のサイクラープロトコルを使用した：１’９４℃；１’ ９４℃、１’ ５５℃、１．５’ ７２℃を２５サイクル；６’ ７２℃を１サイクル。９０９ｂｐ  ＰＣＲ産生物は、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットを製造者の説明に従って使用して精製した（Qiagen, Hilden）。
【００８３】
ヘテロ二重鎖形成のために、各ＰＣＲ産生物２μｇ（３．３ｐｍｏｌ）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ４０μｌ、ｐＨ８．５に混合して、９４℃で５分間加熱し、徐々に冷却して（０．０４℃／秒）、６５℃で１時間インキュベートし、次に４２℃まで再度ゆっくり冷却し（０．０４℃／秒）、この温度でさらに１時間インキュベートして、鎖を再アニーリングして、それによってヘテロ二重鎖を産生した（０．０４℃／秒で９４℃  ５’→６５℃  １時間、及び、０．０４℃／秒で６５℃→４２℃  １時間）。生成されたヘテロ二重鎖分子は、それぞれ８個のミスマッチを含有していた（合計１６個）。
【００８４】
一本鎖切断を生成するために、酵素ＭｕｔＹ及びＴＤＧを利用して、ミスマッチ部位で核酸塩基を特異的に除去し、一本鎖切断を触媒し、デオキシリボース−５−ホスフェート残基を残した。従ってヘテロ二重鎖ＤＮＡを４０μｌ中の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡで、８ＵのE.coli MutY及びＴＤＧ  ＤＮＡグリコシラーゼ（Trevigen, Gaithersburg, MD）を用いて、３７℃（ＭｕｔＹ）及び６５℃（ＴＤＧ）の各温度で１時間インキュベートした。ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットを用いてサンプルを精製した。
【００８５】
ニック脱塩基部位において３’末端からデオキシリボース−５−ホスフェートを除去するために、ＤＮＡは、０．０５Ｕ／μｌ  E.coliエンドヌクレアーゼＩＶ（MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany）を用いて５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート、ｐＨ７．５；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００でインキュベートした。３７℃での２時間のインキュベーションの後、タンパク質はフェノール／クロロホルムを用いた抽出によって除去し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。
【００８６】
ミスマッチ位置でランダム化するために、単一のヌクレオチドギャップをｄＩＴＰで充填した。従って沈殿ＤＮＡを５０μｌ中の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．８；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１００ｍＭ  ＫＣｌ；１．０ｍＭ  ＤＴＴ；１０％グリセロールに溶解させ、１００μＭ  ｄＩＴＰ及び８Ｕ  ＤＮＡポリメラーゼベータを用いて３７℃で１時間インキュベートした。次に反応混合物を、０．１Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、４０μＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＡＴＰで１６℃で１２時間インキュベートした。ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットを用いてサンプルを精製した。次に、ポリヌクレオチドを含有するデオキシイノシンをポリメラーゼ伸長反応でのテンプレートとして使用した。従って、1００μｌ中の７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2；０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、０．８ｐｍｏｌ  テンプレート、１００ｐｍｏｌ  プライマーＬ、１００ｐｍｏｌ  プライマーＲ、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、４Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及び１Ｕ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（MBI Fermentas）を混合することによって、ＰＣＲを実施した。次のサイクラープロトコルを使用した：１’ ９４℃；１’ ９４℃、１’ ５５℃、２’ ７２℃を２０サイクル；６’ ７２℃を１サイクル。得られたＤＮＡ断片は、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲを製造者の説明に従って使用して精製した。ＰＣＲ断片をＤｒａＩＩＩを用いて消化し、ＤｒａＩＩＩによって直鎖化されたプラスミド内に結合して、E.coli  ＸＬ−１ブルー内に形質転換させた。形質転換体は、予想された長さのインサートを持っているか点検した。１０個の考えられる形質転換体のＰＣＲ産生物は、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、配列決定によって解析した。ランダムに選択した配列１０個のうち、１個が変異体配列（配列番号：６）を持ち、他の９個が１つ以上の変異位置を持ち、大多数（９個中８個）が、（遺伝子あたり８個の考えられる位置から）１個の変異位置を持っていた。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明の方法を図式的及び例示的に表す。
【図２】単一位置がランダム化された、本発明の第一の実施形態を示す。
【図３】複数のヌクレオチドが３’方向で除去された、本発明の第二の実施形態を示す。
【図４】領域が異なる部位に対する両方の方向で、又はその付近でランダム化された、本発明の第三の実施形態を示す。
【図５Ａ】ＣＥＬ  Ｉ、ＭｕｔＹ、ＴＤＧ及びエンドヌクレアーゼＩＶによる処置を受けた、ポリヌクレオチドの電気泳動図を示す。
【図５Ｂ】ＣＥＬ  Ｉ、ＭｕｔＹ、ＴＤＧ及びエンドヌクレアーゼＩＶによる処置を受けた、ポリヌクレオチドの電気泳動図を示す。
【図５Ｃ】ＣＥＬ  Ｉ、ＭｕｔＹ、ＴＤＧ及びエンドヌクレアーゼＩＶによる処置を受けた、ポリヌクレオチドの電気泳動図を示す。
【図６】ｄＩＴＰ取り込みの結果を示す。
【図７】ＩＭＰ含有テンプレートの増幅の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
配列番号1：ポリヌクレオチド
配列番号2：ポリヌクレオチド
配列番号3：ポリヌクレオチド
配列番号4：ポリヌクレオチド
配列番号5：オリゴヌクレオチド
配列番号6：オリゴヌクレオチド
配列番号7：プライマー
配列番号8：プライマー
配列番号9：テンプレート
配列番号10：オリゴヌクレオチド
配列番号11：オリゴヌクレオチド
配列番号12：プライマー
配列番号13：プライマー
配列番号14：ポリヌクレオチド
配列番号15：ポリヌクレオチド
配列番号16：プライマー
配列番号17：プライマー
【配列表】
2005536213.tif 000011
2005536213.tif 000012
2005536213.tif 000013
2005536213.tif 000014
2005536213.tif 000015
2005536213.tif 000016
2005536213.tif 000017
【図１】
2005536213.tif 000018
【図２】
2005536213.tif 000019
【図３】
2005536213.tif 000020
【図４】
2005536213.tif 000021
【図５Ａ】
2005536213.tif 000022
【図５Ｂ】
2005536213.tif 000023
【図５Ｃ】
2005536213.tif 000024
【図６】
2005536213.tif 000025
【図７】
2005536213.tif 000026
【国際調査報告】
2005536213.tif 000027
2005536213.tif 000028
2005536213.tif 000029