(57)【要約】ヒトCD45RBアイソフォームを特異的に認識する抗体を提供する。これらの抗体を使用して、移植拒絶および慢性関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病などの自己免疫疾患を有する患者における望ましくない免疫反応をブロックすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD45RBに結合する単離モノクローナル抗体であって、配列番号55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135および139からなるグループから選択されたH鎖アミノ酸配列またはこれらのフラグメントを含むモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137および141からなるグループから選択されたL鎖アミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項３】
キメラ抗体である、請求項1に記載の抗体。
【請求項４】
完全ヒト抗体である、請求項1に記載の抗体。
【請求項５】
薬剤として許容される担体または希釈薬と結合している、請求項1に記載の抗体。
【請求項６】
治療薬に結合している、請求項1に記載の抗体。
【請求項７】
前記治療薬が毒素である、請求項6に記載の抗体。
【請求項８】
前記治療薬が放射性同位体である、請求項6に記載の抗体。
【請求項９】
CD45RBの発現に関連した細胞増殖を抑制する方法であって、CD45RBを発現する細胞を、有効量の請求項1に記載の抗体で処理することを含む方法。
【請求項１０】
in vivoで実施される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物に対して実施される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記有効量が0.001〜50mg/kgである、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物が、哺乳動物の細胞、組織または器官の拒絶を含む疾患に罹患している、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物が自己免疫疾患に罹患している、請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135および139からなるグループから選択されたH鎖アミノ酸配列またはこれらのフラグメントを含む単離ヒト抗CD45RB抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項１７】
前記抗CD45RB抗体が、配列番号57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137および141からなるグループから選択されたアミノ酸配列をコードするL鎖核酸を含む、請求項16に記載の単離核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CD45のRBアイソフォーム(isoform)を特異的に認識する新規の完全ヒト抗体(fully human antibody)に関する。本発明はさらに、このような抗体を使用して自己免疫疾患を治療し移植拒絶を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、組織または器官移植の拒絶の予防および自己免疫疾患の治療にはそれぞれ、免疫寛容の誘導、または免疫寛容の回復が必要である。胸腺では免疫寛容が、成熟中の自己反応性Tリンパ球の欠損によって確立される。末梢においては免疫寛容が、自己反応性T細胞の欠損、T細胞アネルギーの誘導、T細胞インディファレンス(T cell indifference)として知られる抗原に対する応答の欠如を含む、いくつかの機構によって維持される。T細胞インディファレンスの場合には、自己抗原が存在し、T細胞はそれに応答することができるが、同時に、応答するための適当な共刺激シグナルを欠いている。結局のところ、自己免疫疾患に関連した免疫寛容の破壊および移植拒絶に関連した同種移植に対する免疫寛容の欠如は主に、T細胞が媒介する免疫反応であると考えられる。
【０００３】
CD45は、主に造血系起源の細胞に発現する膜貫通タンパク質チロシンホスファターゼであり、T細胞活性化の調節に重要な役割を果たすと考えられている。CD45は、A、BおよびCとも呼ばれるエキソン4〜6の交互スプライシングによって単一の転写一次産物から生成される異なるいくつかのアイソフォームとして存在している。CD45RO、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RBC、CD45RACおよびCD45RABCを含む合計8個のアイソフォームが記述されている。これらのアイソフォームは細胞外ドメインは異なるが、タンパク質チロシンホスファターゼドメインを含む同一の細胞質ドメインを有している。ヒトでは、ナイーブヘルパーT細胞および記憶T細胞がそれぞれ、CD45RAおよびCD45ROを主に発現する。CD45RBの発現は、ナイーブヘルパーT細胞でより高いようであり、細胞が活性化されるにつれてダウンレギュレートされるようである。
【０００４】
文献は、移植拒絶における抗CD45RB抗体の防御的役割を支持している(Zhang et al.、Transplant Proc. 27:389 (1995)、Lazarovits et al.、Nature、380:717 (1996))。Lazarovits et al.は、ラット抗マウスCD45RB抗体MB23G2が、マウスの腎同種移植の拒絶を予防する能力を持つことを証明した。この文献はさらに、別のラット抗マウスCD45RB抗体MB4B4が、腎同種移植の拒絶を予防する効果を持たないことを証明し、全ての抗CD45RB抗体が治療効力を示すわけではないことを示した。MB23G2抗体は、ランゲルハンス島細胞同種移植の長期生存の増進にも効能を示した (Basadonna et al.、PNAS 95:3821 (1998))。抗CD45RB抗体の寛容誘導の具体的な機構は現在知られていない。抗CD45RB抗体による寛容誘導はチロシンホスファターゼ活性の増大と相関していた(Lazarovits et al.、Kidney Int. 55:1303 (1999))。寛容は、アロリアクティブ(alloreactive)末梢血単核細胞の特異的な欠損、またはT調節細胞の誘導によっても生じることがある。
【０００５】
PoppemaとLazarovitsは以前に、ヒトCD45RBに対して誘導されたマウスIgG1抗体を分離し、特徴を記述し、6G3抗体として識別した(米国特許第6024957号(Lazarovits, et al.))。しかしこれはマウス抗体であり、そのため、ヒトにおいては高い免疫原性を示す可能性がある。6G3およびCD45RBに対して特異的な他の抗体は、それぞれカニクイザル(cynomolgous monkey)およびマウスで、腎同種移植またはランゲルハンス島細胞同種移植の生存を引き伸ばすことが示されている。機能上、6G3、およびCD45RBに対して特異的な他の抗体は、末梢血単核細胞上のCD45RBおよびL-セレクチンの発現をダウンレギュレートする。興味深いことに、MB23G2は、末梢血単核細胞上のCD45RBの発現をダウンレギュレートするが、MB4B4はせず、このことは、CD45RBのダウンレギュレーションを、移植保護が可能な他の抗CD45RB抗体を識別する代用マーカとすることができるとする見解を支持している(Basadonna et al.、PNAS 95:3821 (1998))。
【０００６】
米国特許第6106834号(Lazarovits, et al.)は、CD45RB、CD45ROに対して特異的なリガンド(抗体)を、免疫親和性カラムを使用して(すなわちMT3または6G3抗体を用いて)識別する方法を確認した。免疫親和性カラムを使用して、抗原を含有する結合相手を識別する。次いで、この結合相手を使用して交差反応性リガンドを選抜する。しかし、CD45RBアイソタイプを認識する特異的抗体は識別されなかった。
【０００７】
米国特許第6024957号(Lazarovits, et al.)は、免疫系によって異物と認識されにくいと考えられる以前に識別されたMT3または6G3抗体をヒト化する方法を記載している。しかし、これらの抗体は依然として完全ヒト抗体ではなく、ヒト免疫系に導入されたときに反応を誘発する可能性がある。
【非特許文献１】Zhang et al.、Transplant Proc. 27:389 (1995)
【非特許文献２】Lazarovits et al.、Nature、380:717 (1996)
【非特許文献３】Basadonna et al.、PNAS 95:3821 (1998)
【非特許文献４】Lazarovits et al.、Kidney Int. 55:1303 (1999)
【特許文献１】米国特許第6024957号(Lazarovits, et al.)
【特許文献２】米国特許第6106834号(Lazarovits, et al.)
【非特許文献５】E. Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988
【非特許文献６】Green et al. Nature Genetics 7:13-21(1994)
【非特許文献７】Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156(1997)
【特許文献３】米国特許出願番号08/759620(1996年12月3日出願)
【特許文献４】米国特許出願番号07/466008(1990年1月12日出願)
【特許文献５】米国特許出願番号07/610515(1990年11月8日出願)
【特許文献６】米国特許出願番号07/919297(1992年7月24日出願)
【特許文献７】米国特許出願番号07/922649(1992年7月30日出願)
【特許文献８】米国特許出願番号08/031801(1993年3月15日出願)
【特許文献９】米国特許出願番号08/112848(1993年8月27日出願)
【特許文献１０】米国特許出願番号08/234145(1994年4月28日出願)
【特許文献１１】米国特許出願番号08/376279(1995年1月20日出願)
【特許文献１２】米国特許出願番号08/430938(1995年4月27日出願)
【特許文献１３】米国特許出願番号08/464584(1995年6月5日出願)
【特許文献１４】米国特許出願番号08/464582(1995年6月5日出願)
【特許文献１５】米国特許出願番号08/463191(1995年6月5日出願)
【特許文献１６】米国特許出願番号08/462837(1995年6月5日出願)
【特許文献１７】米国特許出願番号08/486853(1995年6月5日出願)
【特許文献１８】米国特許出願番号08/486857(1995年6月5日出願)
【特許文献１９】米国特許出願番号08/486859(1995年6月5日出願)
【特許文献２０】米国特許出願番号08/462513(1995年6月5日出願)
【特許文献２１】米国特許出願番号08/724752(1996年10月2日出願)
【特許文献２２】米国特許出願番号08/759620(1996年12月3日出願)
【特許文献２３】米国特許第6162963号
【特許文献２４】米国特許第6150584号
【特許文献２５】米国特許第6114598号
【特許文献２６】米国特許第6075181号
【特許文献２７】米国特許第5939598号
【特許文献２８】日本国特許3068180B2
【特許文献２９】日本国特許3068506B2
【特許文献３０】日本国特許3068507B2
【非特許文献８】Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998)
【特許文献３１】欧州特許EP0463151B1(1996年6月12日)
【特許文献３２】国際特許出願WO94/02602(1994年2月3日)
【特許文献３３】国際特許出願WO96/34096(1996年10月31日)
【特許文献３４】国際特許出願WO98/24893(1998年6月11日)
【特許文献３５】国際特許出願WO00/76310(2000年12月21日)
【特許文献３６】米国特許第5545807号(Surani et al.)
【特許文献３７】米国特許第5545806号(Lonberg and Kay)
【特許文献３８】米国特許第5625825号(Lonberg and Kay)
【特許文献３９】米国特許第5625126号(Lonberg and Kay)
【特許文献４０】米国特許第5633425号(Lonberg and Kay)
【特許文献４１】米国特許第5661016号(Lonberg and Kay)
【特許文献４２】米国特許第5770429号(Lonberg and Kay)
【特許文献４３】米国特許第5789650号(Lonberg and Kay)
【特許文献４４】米国特許第5814318号(Lonberg and Kay)
【特許文献４５】米国特許第5877397号(Lonberg and Kay)
【特許文献４６】米国特許第5874299号(Lonberg and Kay)
【特許文献４７】米国特許第6255458号(Lonberg and Kay)
【特許文献４８】米国特許第5591669号(Krimpenfort and Berns)
【特許文献４９】米国特許第6023010号(Krimpenfort and Berns)
【特許文献５０】米国特許第5612205号(Berns et al.)
【特許文献５１】米国特許第5721367号(Berns et al.)
【特許文献５２】米国特許第5789215号(Berns et al.)
【特許文献５３】米国特許第5643763号(Choi and Dunn)
【特許文献５４】米国特許出願番号07/574748(GenPharm International、1990年8月29日出願)
【特許文献５５】米国特許出願番号07/575962(GenPharm International、1990年8月31日出願)
【特許文献５６】米国特許出願番号07/810279(GenPharm International、1991年12月17日出願)
【特許文献５７】米国特許出願番号07/853408(GenPharm International、1992年3月18日出願)
【特許文献５８】米国特許出願番号07/904068(GenPharm International、1992年6月23日出願)
【特許文献５９】米国特許出願番号07/990860(GenPharm International、1992年12月16日出願)
【特許文献６０】米国特許出願番号08/053131(GenPharm International、1993年4月26日出願)
【特許文献６１】米国特許出願番号08/096762(GenPharm International、1993年7月22日出願)
【特許文献６２】米国特許出願番号08/155301(GenPharm International、1993年11月18日出願)
【特許文献６３】米国特許出願番号08/161739号(GenPharm International、1993年12月3日出願)
【特許文献６４】米国特許出願番号08/165699号(GenPharm International、1993年12月10日出願)
【特許文献６５】米国特許出願番号08/209741号(GenPharm International、1994年3月9日出願)
【特許文献６６】欧州特許0546073B1
【特許文献６７】国際特許出願番号WO92/03918
【特許文献６８】国際特許出願番号WO92/22645
【特許文献６９】国際特許出願番号WO92/22647
【特許文献７０】国際特許出願番号WO92/22670
【特許文献７１】国際特許出願番号WO93/12227
【特許文献７２】国際特許出願番号WO94/00569
【特許文献７３】国際特許出願番号WO94/25585
【特許文献７４】国際特許出願番号WO96/14436
【特許文献７５】国際特許出願番号WO97/13852
【特許文献７６】国際特許出願番号WO98/24884
【特許文献７７】米国特許第5981175号
【非特許文献９】Taylor et al., 1992
【非特許文献１０】Chen et al., 1993
【非特許文献１１】Tuaillon et al., 1993
【非特許文献１２】Choi et al., 1993
【非特許文献１３】Lonberg et al., (1994)
【非特許文献１４】Taylor et al., (1994)
【非特許文献１５】Tuaillon et al., (1995)
【非特許文献１６】Fishwild et al., (1996)
【特許文献７８】欧州特許出願番号773288
【特許文献７９】欧州特許出願番号843961
【特許文献８０】米国特許第5260203号(Ladner et al.、1993年11月9日発行)
【特許文献８１】米国特許第5869620号(Whitlow et al.、1999年2月9日発行)
【特許文献８２】PCT/EP97/05897(1997年10月24日出願)
【非特許文献１７】Terskikh et al., Biochemistry 94:1663-1668 (1997)
【非特許文献１８】Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、CD45RBのさまざまな抗原決定基に対して特異的であり、かつCD45抗原の他のアイソフォームを認識しない抗CD45RB特異的抗体が求められている。ヒトに対して有用であるために、これらの抗体は完全ヒト抗体でなければならず、6G3と同様の機能特性を示さなければならない。さらに、この抗体の大規模濃縮物は、最小限の労力で生産できなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
CD45のRBアイソフォームを認識する完全ヒト抗体を生産した。これらの抗体を使用して、移植拒絶および/または自己免疫疾患を有する患者における望ましくない反応をブロックすることができる。
【００１０】
本発明の一実施形態は、CD45のRBアイソフォームを認識する抗体である。これらの抗体は完全ヒト抗体であり、これを使用して、移植拒絶および/または自己免疫疾患を有する患者における望ましくない反応をブロックできることが好ましい。
【００１１】
本発明の他の実施形態は、CD45のRBアイソフォームを認識する抗体であって、さらに図1および2に示した配列を含むCDRを有する抗体である。この抗体は、配列番号55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135および139からなるグループから選択されたH鎖アミノ酸配列、および/または配列番号57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137および141からなるグループから選択されたL鎖アミノ酸配列を含むことができる。
【００１２】
図1および2に示した相補性決定領域(CDR)からなるグループから選択された少なくとも1つのCDRを有する精製された完全ヒト抗体。
【００１３】
他の実施形態は、哺乳動物の細胞、組織または器官移植の拒絶を処置しまたは予防する方法であって、図1および2に示したCDRからなるグループから選択される少なくとも1つのCDRを含む少なくとも1つの完全ヒト抗体を前記哺乳動物に投与することを含む方法である。
【００１４】
他の実施形態は、哺乳動物の自己免疫疾患を治療する方法であって、図1および2に示したCDRからなるグループから選択される少なくとも1つのCDRを有する少なくとも1つの完全ヒト抗体を前記哺乳動物に投与することを含む方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の一実施形態は、CD45のRBアイソフォームを認識する抗体である。これらの抗体は完全ヒト抗体であり、これを使用して、移植拒絶および/または自己免疫疾患を有する患者における望ましくない反応をブロックできることが好ましい。
【００１６】
これらの抗体は、IgG2定常領域を有するヒト抗体を産生するXenoMouse(登録商標)マウス(XMG2)(Abgenix, Inc.、米カリフォルニア州Fremont)を、CD45RBを発現するT細胞系、CD45RBを発現するトランスフェクション細胞系、およびさまざまなペプチドを含むさまざまなCD45RB抗原で免疫することによって生産した。いくつかのケースでは、抗原の組合せを免疫に使用した。リンパ節および脾臓を取り出し、記憶B細胞を分離し、組織培養で増殖させた。記憶B細胞を増殖させ、形質細胞に分化させた。これらのB形質細胞が産生した抗体を、CD45RBに対する特異性に関してスクリーニングした。特異的抗体が識別された場合には、その抗体を発現したB細胞を分離し、H鎖およびL鎖可変領域の配列を決定した。これらの抗体を、ヒトT細胞への結合ならびにヒトT細胞上のCD45RBおよびL-セレクチンのダウンレギュレーションに関してさらに分析した。
【００１７】
CD45のRBアイソフォームと特異的に結合する合計22個の抗体が識別された。これらの抗体は、ヒトおよびマカク(macaque)のナイーブまたは活性化T細胞に対する異なる結合特異性、ならびにCD45RBおよびL-セレクチンの発現をダウンレギュレートする異なる能力を示した。これらの特性は、それぞれの抗体を、特定の病気または病期に対して有用なものにする。
【００１８】
さらに、マカクにおいてヒトCD45RB 46量体と相同の配列を識別した。このヌクレオチド配列がコードするタンパク質を使用して、マカクT細胞にも結合する抗体に関してスクリーニングした。この試薬は、サルでの臨床前確認に直接に使用できる抗体を識別するのに有用だろう。
【００１９】
したがって、一実施形態は、配列番号55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135または139のアミノ酸配列を有する少なくとも1つのH鎖またはそのフラグメント、および/あるいは配列番号57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、1113、117、121、125、129、133、137または141のアミノ酸配列を有する少なくとも1つのL鎖またはそのフラグメントを含む抗体である。
【００２０】
他の実施形態は、シグナル配列を除いた図1に示す配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、24、25または26のH鎖アミノ酸配列、および/あるいはシグナル配列を除いた図2に示す配列番号28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、1、42、43、44、45、47、49、50、51または53のL鎖アミノ酸配列を含む抗体である。
【００２１】
他の実施形態は、図1および2に示すH鎖またはL鎖抗体の1つまたは複数のCDR領域を含む抗体である。
【００２２】
抗体およびフラグメントは、標準法を使用して生産することができる(例えば、E. Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988を参照されたい)。ただし、抗体の分離、識別および分子構造は、選択肢がほぼ無尽蔵である程度まで明らかにされている。したがって、抗体部分および複合体の例は、使用可能なものの一部を表すに過ぎないことを理解されたい。
【００２３】
一実施形態では、抗体が単鎖Fv領域である。抗体分子は、一般に認められた2つの領域をH鎖およびL鎖にそれぞれ有する。これらの領域は、問題の特異的抗原への結合を担ういわゆる「可変」領域と、補体結合、好中球およびマクロファージへの結合などの生体エフェクタ応答を担ういわゆる「定常」領域である。定常領域は抗原の結合にとって必要のないものである。定常領域は抗体分子から分離され、可変結合領域が得られている。したがって、抗体分子が治療用複合体のリガンド部分として作用しているとき、定常領域は、抗体分子の結合作用にとって明らかに必要ではない。
【００２４】
抗体の可変領域はL鎖およびH鎖からなる。L鎖およびH鎖可変領域を異種宿主中でクローン化し、それらの結合能力を維持したまま発現させた。したがって、多重鎖凝集体(抗体)から単鎖構造を、多重鎖凝集体の3次元アーキテクチャを単鎖構造が保持するように生成することができる。
【００２５】
この目標に向かう1つのアプローチは、マウス抗体産生能を欠き、ヒトIg遺伝子座の大きなフラグメントを有するマウス系統を遺伝子操作する方法である。このアプローチでは、このようなマウスが、マウス抗体を産生せずにヒト抗体の大きなレパートリーを産生するのを見越している。大きなヒトIgフラグメントは、大きな可変遺伝子多様性ならびに抗体産生および発現の適当な調節を保存していると考えられる。抗体の多様化および選抜に対するこのマウス機構およびヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如を利用することによって、これらのマウス系統で再生されるヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む関心の抗原に対して高い親和性を有する抗体を与えるはずである。ハイブリドーマ技術を使用して、望ましい特異性を有する抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を容易に生産し選抜することができる。
【００２６】
この全体戦略は、1994年に発表された最初のXenoMouse(商標)系統の生成に関して証明された。Green et al. Nature Genetics 7:13-21(1994)を参照されたい。それぞれコア可変および定常領域配列を含むヒトH鎖遺伝子座およびκL鎖遺伝子座の245kbおよび190kb生殖細胞系構成フラグメントを含む酵母人工染色体(YAC)を用いてXenoMouse(商標)系統を遺伝子操作した。ヒトIgを含むYACは、抗体の再配置および発現に対してマウス系と両立することが判明し、不活化されたマウスIg遺伝子に取って代わることができた。このことは、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを生み出し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を産生するB細胞発生を誘導するそれらの能力によって証明された。これらの結果はさらに、より多くのV遺伝子、追加の調節要素およびヒトIg定常領域を含むヒトIg遺伝子座のより大きな部分の導入によって、完全なレパートリーが実質的に反復される可能性があることを示唆した。これは、感染および免疫に対するヒトの体液性応答の特徴である。Green et al.の研究は最近、XenoMouse(商標)マウスを生み出すそれぞれヒトのH鎖遺伝子座およびκL鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖細胞系構成YACフラグメントの導入によって、約80%を超えるヒト抗体レパートリーの導入にまで拡張された。Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156(1997)および1996年12月3日出願の米国特許出願番号08/759620を参照されたい。
【００２７】
このようなアプローチはさらに、1990年1月12日出願の米国特許出願番号07/466008、1990年11月8日出願の番号07/610515、1992年7月24日出願の番号07/919297、1992年7月30日出願の番号07/922649、1993年3月15日出願の番号08/031801、1993年8月27日出願の番号08/112848、1994年4月28日出願の番号08/234145、1995年1月20日出願の番号08/376279、1995年4月27日出願の番号08/430938、1995年6月5日出願の番号08/464584、1995年6月5日出願の番号08/464582、1995年6月5日出願の番号08/463191、1995年6月5日出願の番号08/462837、1995年6月5日出願の番号08/486853、1995年6月5日出願の番号08/486857、1995年6月5日出願の番号08/486859、1995年6月5日出願の番号08/462513、1996年10月2日出願の番号08/724752および1996年12月3日出願の番号08/759620、米国特許第6162963号、6150584号、6114598号、6075181号および5939598号、日本国特許3068180B2、3068506B2および3068507B2で論じられ、記述されている。Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)およびGreen and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998) も参照されたい。さらに、1996年6月12日発行の欧州特許EP0463151B1、1994年2月3日公告の国際特許出願WO94/02602、1996年10月31日公告の国際特許出願WO96/34096、1998年6月11日公告のWO98/24893、2000年12月21日公告WO00/76310も参照されたい。上記それぞれの特許、特許出願の開示。
【００２８】
代替のアプローチにおいて、GenPharm International, Inc.社を含む他社は、「ミニローカス(minilocus)」アプローチを利用した。ミニローカスアプローチでは、Ig遺伝子座からの片(個々の遺伝子)の包含によって外因性Ig遺伝子座を模倣する。したがって、1つまたは複数のVH遺伝子、1つまたは複数のDH遺伝子、1つまたは複数のJH遺伝子、μ定常領域および第2の定常領域(好ましくはγ定常領域)が、動物への挿入のための構成に形成される。このアプローチは、Surani et al.の米国特許第5545807号、Lonberg and Kayの米国特許第5545806号、5625825号、5625126号、5633425号、5661016号、5770429号、5789650号、5814318号、5877397号、5874299号および6255458号、Krimpenfort and Bernsの米国特許第5591669号および6023010号、Berns et al.の米国特許第5612205号、5721367号および5789215号、Choi and Dunnの米国特許第5643763号、GenPharm Internationalの1990年8月29日出願の米国特許出願番号07/574748、1990年8月31日出願の番号07/575962、1991年12月17日出願の番号07/810279、1992年3月18日出願の番号07/853408、1992年6月23日出願の番号07/904068、1992年12月16日出願の番号07/990860、1993年4月26日出願の番号08/053131、1993年7月22日出願の番号08/096762、1993年11月18日出願の番号08/155301、1993年12月3日出願の番号08/161739号、1993年12月10日出願の番号08/165699号、1994年3月9日出願の番号08/209741号に記載されている。欧州特許0546073B1、国際特許出願番号WO92/03918、WO92/22645、WO92/22647、WO92/22670、WO93/12227、WO94/00569、WO94/25585、WO96/14436、WO97/13852およびWO98/24884、ならびに米国特許第5981175号も参照されたい。さらに、Taylor et al., 1992、Chen et al., 1993、Tuaillon et al., 1993、Choi et al., 1993、Lonberg et al., (1994)、Taylor et al., (1994)、Tuaillon et al., (1995)およびFishwild et al., (1996)も参照されたい。
【００２９】
Medical Research Counsel(「MRC」)に譲渡された前掲のSurani et al.の発明者らは、このミニローカスアプローチを使用して、Ig遺伝子座を持つトランスジェニックマウスを生み出した。前掲のGenPharm International社の発明の発明者Lonberg and Kayは、本発明の発明者の先導に従って、Surani et al.の研究の実質的な複製と結合させた内因性マウスIg遺伝子座の不活化を提案した。
【００３０】
ミニローカスアプローチの利点は、Ig遺伝子座の部分を含む構造を迅速に生成し動物に導入できることである。ミニローカスアプローチの重大な欠点は、理論上、少数のV、DおよびJ遺伝子の包含によって不十分な多様性が導入されることである。実際に、発表された文献はこの懸念を支持しているように見える。ミニローカスアプローチの使用によって生み出された動物のB細胞発生および抗体産生は妨げられているように見える。したがって、より大きな多様性を達成し、動物の免疫レパートリーを再構成するため、本発明の周囲の研究は、Ig遺伝子座の大きな部分の導入に向かって一貫して導かれた。Kirinはさらに、ミクロセル融合によって大きな染色体片または染色体全体を導入したマウスからのヒト抗体の産生を証明した。欧州特許出願番号773288および843961を参照されたい。
【００３１】
抗体分子の多重鎖可変領域の特性結合能力を有する単鎖ポリペプチド鎖結合タンパク質であるFvフラグメントを本発明のリガンドに使用することができる。これらのリガンドは例えば、コンピュータベースのシステムおよび方法を使用して化学構造を決定する1993年11月9日発行のLadner et al.の米国特許第5260203号の方法に従って生み出される。これらの化学構造体は、天然では凝集し化学的に単離抗体可変領域からの2本のLおよびHポリペプチド鎖を、2本のポリペプチド鎖の元々の構造に非常によく似た3次元構造に折り重なる単鎖ポリペプチド鎖に変換するのに使用される。アミノ酸配列を架橋として使用して、この2つの領域を連結することができる。
【００３２】
次いで、この方法から得られた単鎖ポリペプチド鎖を使用して、このポリペプチド鎖をコードしている遺伝子配列を生成することができる。次いで、適当な宿主の中でこの遺伝子配列を複製し、さらに制御領域に結合させ、この配列を発現させることができる発現宿主に形質転換することができる。結果として得られる単鎖ポリペプチド鎖結合タンパク質は、リフォールディング後に、抗体の可変領域の元の2本の(HおよびL)ポリペプチド鎖の凝集体の結合特性を有する。
【００３３】
他の実施形態では、抗体が、単鎖抗原結合タンパク質の多価形態をとる。単鎖抗原結合タンパク質の多価形態は、一価単鎖抗原結合タンパク質をしのぐ重大な有用性を有する。多価抗原結合タンパク質は2つ以上の抗原結合部位を有し、その結果、増強された結合親和性を有する。多価抗体は、1999年2月9日発行のWhitlow et al.,の米国特許第5869620号に開示されている方法を使用して生産することができる。この方法は、少なくとも2つの単鎖分子を結合させることによって多価抗原結合タンパク質を生み出すことを含む。それぞれの単鎖分子は、単鎖タンパク質に結合した抗体H鎖またはL鎖の可変領域の2つの結合部分を有する。このようにして抗体は、抗原の異なる部分に対する結合部位を有することができ、または、複数の抗原に対する結合部位を有することができる。
【００３４】
一実施形態では抗体がオリゴマーである。このオリゴマーは、1997年10月24日に出願のPCT/EP97/05897に記載されているように、まず最初にファージディスプレイドライブラリ(phage-displayed library)から特定のリガンドを分離することによって生成する。オリゴマーは、低親和性リガンドをオリゴマー化して高親和性オリゴマーを生み出すことによって、これらのライブラリからの低親和性リガンドの分離の問題を克服する。オリゴマーは、軟骨オリゴマー基質タンパク質(Cartilage Oligomeric Matrix Protein:COMP)から半剛体ヒンジおよび高次コイルドメインに融合させたリガンドを有する融合タンパク質を生み出すことによって構築される。この融合タンパク質を宿主細胞で発現させると、オリゴマーに自己集合する。
【００３５】
オリゴマーは、ペプタボディ(peptabody)(Terskikh et al., Biochemistry 94:1663-1668 (1997))であることが好ましい。ペプタボディは、それぞれの結合部位が低親和性結合を有し、複合体として高い親和性で結合することができる五量体であるIgM抗体として例示することができる。ペプタボディは、ファージディスプレイドランダムペプチドライブラリ(phage-displayed random peptide library)を使用して作られる。このライブラリからの短いペプチドリガンドを、半剛体ヒンジを介して、COMP(軟骨オリゴマー基質タンパク質) 五量体化ドメインのN末端に融合させる。融合タンパク質は細菌の中で発現され、そこで、その標的に対して高い親和性を示す五量体抗体に集合する。リガンドの親和性に応じて、非常に高い親和性を有する抗体を産生することができる。
【００３６】
モノクローナル抗体を組換えDNA技術の諸技法にかけて、元々のモノクローナル抗体の特異性を保持した他の誘導体抗体またはキメラ分子を生み出すことができることを当業者は理解されたい。このような技法は例えば、免疫グロブリンの可変領域またはモノクローナル抗体の相補性決定領域(CDR)をコードしているDNAを、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域+フレームワーク領域をコードしているDNAと結合させることを含む。例えば、米国特許第4816567号は、キメラ抗体を生み出す1つの方法を開示している。ただし、使用可能な多種多様な方法およびベクターがあることを理解されたい。
【００３７】
抗体は、薬剤組成物の形態で使用することができる。この薬剤組成物は、CD45RBアイソフォームを認識する少なくとも1つの抗体を含むことができる。薬剤組成物は例えば、CD45RB抗原上の1つの抗原決定基を認識する抗体と別の抗原決定基を認識するもう1つの抗体の2つの抗体を含むことができる。薬剤組成物はあるいは、2つ以上の抗体を含むことができる。
【００３８】
薬剤組成物はさらに、抗炎症薬、免疫調整剤および自己免疫疾患の治療に使用される他の薬剤を含む、その病気に対する他の治療薬を含むことができる。薬剤組成物はあるいは、移植された細胞、器官または組織に対する免疫系の作用を低減させるために使用される薬剤を含むことができる。薬剤組成物は、治療中に患者をより快適にし、副作用を減らし、または取込みを増強する物質を含むことができる。
【００３９】
薬剤組成物は、添加剤、賦形剤、またはより効果的な投与を可能にする他の物質を含むことができる。
【００４０】
抗体または薬剤組成物は、自己免疫疾患、移植拒絶および感染を含む、T細胞が関与する疾患の治療に使用することができる。自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ、自己免疫性糖尿病、強皮症、多発性硬化症、狼瘡、線維筋痛症および結合組織炎、ならびに強直性脊椎炎が含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。
【００４１】
製剤は、局所または全身投与することができる。例えば自己免疫性皮膚疾患の治療に対しては、製剤を局所投与することができる。あるいは、鼻腔内投与、吸入、経口摂取または注射によって製剤を投与することができる。最良の投与方法は、製剤を投与する対象の疾患によって決まる。
【００４２】
用量は、投与方法、疾患、患者および重症度によって異なる。一般に、体重1kgあたり約0.01mgから約25mgの抗体または抗体混合物を、1日1回から週に1度または月に1度静脈内投与する。他の好ましい用量は体重1kgあたり0.2mgから10mgである。他の好ましい用量は体重1kgあたり0.02mgから5mgである。あるいは、疾患の再発時に投与することもできる。あるいは、細胞、組織または器官の移植時に投与することもできる。
【００４３】
自己免疫成分を有する感染には、リウマチ熱、梅毒およびライム病が含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。
【００４４】
したがって、一実施形態は、組織または器官移植の拒絶を処置または予防するため、および自己免疫疾患を治療するための方法であって、CD45RBアイソフォームのCD45RBエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体の投与を含む方法である。この方法では、配列番号55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135、139、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、図1A〜1Bに示した配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、24、25、26、図2A〜2Bに示した配列番号28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、49、50、51および/または53の配列を含む任意の抗体を使用することができる。ただし、ある種の抗体の特性は、その抗体を、特定の疾患または病期の治療で使用するのに特に適したものにする。
【００４５】
抗体および方法の選択された実施形態を以下の実施例で示す。
【実施例】
【００４６】
抗CD45RB特異的抗体を産生させるため、XenoMouseマウスを抗原で免疫した(実施例1参照)。これらのマウスの血清学的分析を実施して、抗CD45RB高度免疫マウスを識別し、採集物(harvest)のための適当なマウスを選抜した。Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996)の記載に従って、採取した脾臓およびリンパ節から分離したB細胞を培養し、CD45RB特異的抗体を分泌している形質細胞を分離した。次いで、培養したB細胞を形質細胞に分化させた。約1週間後、得られた形質細胞を冷凍し、上澄みを使用して実施例2の記載のとおりにCD45RB特異的抗体を識別した。採集物ごとに、抗CD45RB特異的抗体を含むウェルをELISAまたはFMAT技術によって識別した(実施例6から13を参照されたい)。溶血プラーク検定を使用してこれらのウェルを分析して、CD45RB 46量体特異的形質細胞を識別した(実施例3参照)。これらの単抗原特異的形質細胞を顕微操作によって分離し、それらの特異性を単一細胞RT-PCRを使用して捕捉して、H鎖およびL鎖可変領域をコードしているcDNAを分離し分析した(実施例5参照)。次いで、これらの可変領域を発現構造中へクローン化し、これらを使用して組換えモノクローナル抗体を生成した(実施例4参照)。組換え抗体の抗原結合を確認し、大量の抗体を生産して、自己免疫疾患の治療および移植拒絶の処置において有用であろう抗体をさらに特徴づける。
【００４７】
実施例6および13では、免疫、血清学応答、スクリーニングデータ、および固有の抗CD45RB特異的抗体を生じたそれぞれの採集物(採集物2、4、6〜11)で生成された組換え抗体について詳細に述べる。実施例14では、さまざまなCD45RBペプチド、CHO細胞中の一過的に発現されたCD45RB、あるいはヒトまたはマカクT細胞中の内因的に発現されたCD45RBに対する22個の固有抗CD45RB抗体の結合特異性をまとめた。実施例15では、ナイーブおよび活性化ヒトおよびマカクT細胞に結合する抗CD45RB抗体のFAC分析について詳細に述べる。
【００４８】
実施例16、17では抗CD45RB抗体の生体活性を評価する。実施例16では、CD45RBおよびL-セレクチンの発現をダウンレギュレートする抗CD45RB抗体の能力を詳述する。実施例17では、抗CD3抗体によるCD3架橋に応答したヒト末梢血単核細胞(PBMNC)の増殖およびサイトカイン産生に対する抗CD45RB抗体の効果をまとめる。
【００４９】
(実施例1)
XenoMouseマウスの免疫
XenoMouseマウス(XenoMouse(登録商標) XG2、Abgenix, Inc.、米カリフォルニア州Fremont)をさまざまなCD45RB抗原(表2参照)で順次に免疫することによって、CD45RBに対するモノクローナル抗体を得た。いくつかのケースでは、XenoMouseマウスを、表3に詳細に記載した5つのヒトCD45RBペプチドで免疫した。他のケースでは、XenoMouseマウスを、これらのペプチドとCEM細胞との混合物で免疫した。CEM細胞は、CD45RBを自然に発現するT細胞系である。あるいは、完全長CD45RBを発現するプラスミドをトランスフェクションしたHEK-293細胞を使用した。さらに、抗原独立のT細胞ヘルプをB細胞に提供するTCEを加えた。TCEは、抗原に接合したときに抗原特異的B細胞にMHCクラスII制限T細胞ヘルプを提供するT細胞エピトープである。T細胞ヘルプは、クローン展開、クラススイッチング、体細胞ハイパー突然変異および形質細胞への分化に必要なシグナルを抗原特異的B細胞に提供する。
【００５０】
表2に概要を示した抗CD45RB特異的抗体を産生した採集物の免疫スケジュールは実施例6から13に示されている。一般に、抗原は、少なくとも3カ月、最長7カ月の期間にわたってIPまたはB/IPで投与した。リンパ節および脾臓は一般に、約3カ月から約7カ月の間で採取した。
【００５１】
【表１】
2005536180.tif 000002
【００５２】
このように、表2では、マウスK522-3を、CEM細胞とCD45RB発現ベクターで一過的にトランスフェクションしたHEK-293細胞との混合物で免疫した。リンパ節および脾臓を採取し、50個のプレートに接種した。同様に、マウスL576-6は、5つのヒトペプチド(表3のヒト46量体、ヒト18量体、ヒト20.3、ヒト20.1およびヒト20.2)ならびにTCEエピトープで免疫した。リンパ節および脾臓を採取し、50個のプレートに接種した。他のマウスも表2に示すように免疫した。
【００５３】
【表２】
2005536180.tif 000003
【００５４】
マカクCD45RBのRBエキソン(マカク46量体)をコードするヌクレオチド配列は、ヒトCD45特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用した逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によって識別した。このcDNAを配列決定し、翻訳して、マカクCD45RBのRBエキソンのアミノ酸配列を決定した(表3)。マカクRBエキソンをコードするDNAを使用して、完全長ヒトCD45RB発現構造中のRBエキソンを置換して、キメラ発現構造を得た。この新しい発現構造および完全長ヒトCD45RB発現構造は、CHO細胞中でのヒトおよびマカクCD45RBの一時的トランスフェクションを可能にした。マカクCD45RBのRBエキソンのヌクレオチド配列の分離は、マカク46量体ペプチドの合成を可能にした。このペプチドを、ヒト46量体ペプチドとともに使用して、マカクCD45RBとの交差反応性についてヒトCD45RB特異的抗体をスクリーニングした。
【００５５】
(実施例2)
ヒトCD45RBを特異的に認識した抗体のスクリーニング
2種類のスクリーニングを使用して、CD45RBを特異的に認識したプール上澄み中の抗体を識別した。
【００５６】
最初のスクリーニングはネイティブ結合検定(Native Binding Assay)であり、CHO細胞に結合した抗体がCD45RBまたはCD45ROを発現したかどうかを識別することを含む。ネイティブ結合検定は、完全長CD45RBを一過的に発現しているCHO細胞に対して実施した。上澄みは定性的に評価し、以下に示すように、目で見て、またはFMAT技術(図3参照)を使用して相対的な結合をランク付けした。
【００５７】
4.84 一過的にトランスフェクションしたCHO細胞でのネイティブ結合検定
1.1 完全長CD45RBまたはCD45ROでCHO細胞を一過的にリポフェクションした。
1.2 48時間後、細胞をトリプシン処理し、テラサキ皿(Terasaki dish)に接種した(5000細胞/ウェル)。細胞を37℃で一晩培養した。
1.3 培地を除去し、B細胞培養上澄み10μLを用いて氷上で2時間、細胞を染色した。
1.4 モノクローナル6G3またはPC2を陽性対照として含めた。250ng/mLから1:2で滴定した。この検定には無関係なXG2組換え対照も含めた。
1.5 一次抗体インキュベーションの後、培地を除去し、細胞を1%パラホルムアルデヒドで固定した(10μL、20分)。
1.6 細胞をPBS 20μLで2回洗浄した。
1.7 二次抗体(ヤギ抗ヒトIgG Fc Alexa 488、2μg/mL)を氷上で1時間インキュベートした。
1.8 細胞をPBS 20μLで2回洗浄した。
1.9 蛍光顕微鏡法によって細胞を調べた。
【００５８】
図3では、緑色の染色が細胞膜に結合した抗体を表している。したがって図3では、抗体39E11(sc324)、16C9(sc009)および1G10(sc026)が、CD45RB発現CHO細胞に特異的な結合を示した。これらの抗体がRBアイソタイプを特異的に認識することを確認するために、CD45RO細胞を使用した同じ検定を実施した。両方の細胞に対して結合がポジティブの場合、抗体はRBに対して特異的ではない。しかし、CD45RBを発現しているCHO細胞に対してだけ結合がポジティブな場合には、抗体はRBに対して特異的である。B細胞培養上澄みからのヒトおよびマカク交差反応性抗体または組換え抗体のスクリーニングのために、この検定を、マカクCD45RBのRBエキソンをコードしている発現構造とともに使用することもできる。
【００５９】
代替として、またはこれに加えて、ペプチド検定または抗原被覆ELISA(antigen coated ELISA)を実施した。抗原被覆ELISAは、CD45RBのRBエキソンからの合成ペプチドを使用して以下のように実施した。
【００６０】
抗原特異的ELISAプロトコル:
1)Corning Costar Universal結合プレート(製品番号2503)を以下の濃度のCD45RBペプチドでコーティングする: 46量体2μg/ml、20量体0.87μg/mlおよび18量体0.78μg/ml。
2)数回はたいてコーティング溶液をプレートから除去し、一部の液体をウェルに残す。
3)36OnmのUVをプレートに4分照射する。
4)プレートをdH2Oで5回洗浄する。
5)プレートを2%Milk/PBS 250μ1でブロックし、室温で30分保持する。
6)プレートをdH2Oで5回洗浄する。
7)プレートに2%Milk/PBS 40μ1を追加し、次いでB細胞上澄み10μlをそれぞれのウェルに加え、室温で1時間保持する。
8)プレートをdH2Oで5回洗浄する。
9)それぞれのウェルに、Gt抗ヒト(Fc)-HRP(1μg/ml)を50μl加え、室温で1時間保持する。
10)プレートをdH2Oで5回洗浄する。
11)それぞれのウェルにTMB基質50μlを加える。
【００６１】
関心の抗体はCD45RBペプチドに結合した抗体である。
【００６２】
最初の6つの採集物は目視によって分析した。採集物7〜11は、FMAT蛍光プレートリーダーを使用して分析した。
【００６３】
関心の特異的B細胞は実施例3に示すように識別し分離した。
【００６４】
(実施例3)
CD45RB特異的形質細胞の識別および分離
関心のウェルを識別した後、溶血プラーク検定を使用して特異的B細胞を識別し分離した。検定は、ビオチン化したペプチド抗原でコーティングしたヒツジ赤血球(SRBC)を使用して実施した。関心のウェルからのB細胞を解凍し培養した。次いで、ペプチドで被覆したSRBCを形質細胞と混合した。補体、ならびにヒト抗体を認識する抗血清を加えた。関心の細胞は、抗原特異的抗体を発現し分泌している形質細胞の周囲のSRBCが溶解した溶解ゾーンを示した。
【００６５】
CD45RB特異的溶血プラーク検定
4.84 ヒツジ赤血球(SRBC)のビオチン化
1.1 RPMI培地中で保存した25%SRBCストックを、管を数回振り混ぜることによって完全に再懸濁させる。
1.2 15mlファルコンチューブに25%ストック1.0mlを分取する。細胞を遠心機にかけ、上澄みを除去し、次いでSRBCを追加しまたは除去して、250μ1の圧縮細胞ペレットを得る。pH8.6のPBS 4.75mlに再懸濁させる。
1.3 別の50ml管にpH8.6のPBS 20mlを入れ、これにスルホNHSビオチン1.25mgを加える。ビオチンを完全に溶解させた後、SRBC 5mlを加え、室温で1時間回転させる。
1.3.1 ペプチドプラーク検定に関して、SRBCのビオチン化は1.3に記載したとおりだが、組換え体CD45RB-hisを使用したプラーク検定では、SRBC上のビオチンを2倍にした。したがって、ステップ1.3ではスルホNHSビオチンを5.0mg使用した。
1.4 SRBCを3000gで5分間遠心処理し、上澄みを除去する。pH 7.4のPBS 25m1を加えて洗浄する。
1.5 洗浄を3回繰り返し、ビオチン化SRBC(B-SRBC)ペレット250μlに免疫細胞培地4.75mlを加え、B-SRBCを静かに再懸濁させ(5%B-SRBCストック)、4℃で保存する。
【００６６】
B-SRBCのストレプトアビジン(SA)コーティング
2.1 新しいエッペンドルフ管(eppendorf tube)に5%B-SRBCストック1mlを分取する。
2.2 8000rpm (6800rcf)のパルススピンで微量遠心管中のB-SRBCをペレット化し、上澄みを除去し、このペレットをpH 7.4のPBS 1.0mlに再懸濁させ、遠心処理を繰り返す。
2.3 洗浄を2回繰り返し、次いでB-SRBCペレットをpH 7.4のPBS 1.0mlに再懸濁させ、最終濃度を5%(v/v)とする。
2.4 10mg/mlストレプトアビジンストック10μlを加え、混合し、室温で20分間回転させる。
2.4.1 ペプチドプラーク検定に関して、使用するストレプトアビジンの量は2.4に記載のとおりだが、組換えCD45RB-hisを使用したプラーク検定では、ビオチン化したSRBCに10倍のストレプトアビジンをロードした。したがってステップ2.4では10mg/mlスルホNHSビオチンを100μl使用した。
2.5 洗浄ステップ2.0および3.0を繰り返し、pH7.4のPBS 1mlにSA-SRBCを再懸濁させる(5%(v/v))。
【００６７】
3.0 SA-SRBCのCD45RB-Hisコーティング
3.1 ペプチドプラーク検定では、ビオチン化したペプチドをSRBC上に以下の濃度でコーティングした。
3.2 組換えCD45RB-hisプラーク検定に関しては、計量していないビオチン化CD45RB-HisでSA-SRBCをコーティングした。コーティングは、赤血球凝集のないポイントにB-CD45RB-hisを最大限にコーティングすることによって決定した。
3.3 混合し、室温で20分間回転させる。
3.4 SRBCのストレプトアビジンコーティングのステップ2.0および3.0と同様にSRBCを洗浄する。
3.5 CD45RB被覆SRBCをRPMI(+l0%FCS)に再懸濁させ、最終濃度を5%(v/v)とする。
【００６８】
蛍光抗体法(IF)によるCD45RB-SRBCの品質の決定
4.1 PBS 40μlを含む新しい1.5mlエッペンドルフ管に5%SA-SRBC10μlを加える。
4.2 それぞれのSRBC試料に45μg/mlのMu抗CD45RB抗体(m6G3)を加える。
4.3 室温で25分間回転させる。
4.4 PBS 100μlで細胞を3回洗浄する。
4.5 PBS 50μlに細胞を再懸濁させ、Alexa 488に接合させたGt抗ヒトIgG Fc抗体に加える。
4.6 室温で25分間回転させる。
4.7 PBS 100μlで細胞を1回洗浄し、PBS 10μlに再懸濁させる。
4.8 清潔なガラス顕微鏡スライドに、染色された細胞10μlを滴下し、それぞれの試料にカバーガラスを被せ、蛍光の下で観察し、0〜4の任意のスケールで採点する。
【００６９】
5.0 形質細胞の調製
5.1 さまざまな検定によって、関心の免疫グロブリンを分泌しているB細胞クローンを含むと以前に識別された単一のミクロ培養ウェルの内容物を採取する。
5.2 100〜1000μlのピペットマン(pipetman)を使用し、37C RPMI(+10%FCS)を加えることによって、ウェルの内容物を回収する。ピペットの内容物を2〜3回上下させて細胞を再懸濁させ、次いで新しい1.5mlエッペンドルフ管に移す(最終体積は約500〜700μ1)。
5.3 微量遠心管に入れて1500rpm(240rcf)で2分間、室温で遠心処理し、次いで管を180度回転させ、1500rpmで2分間再び遠心処理する。凝固した培地を取り出す。
5.4 10〜100μlのピペットマンを使用して内容物を静かに数回上下させることによって、免疫細胞をRPMI(10%FCS)100μlに再懸濁させる。
5.5 ステップ3.0と同様に遠心処理し、洗浄培地を捨て、無傷の細胞ペレットを残す。
5.6 ステップ5.4および5.3を繰り返す。
5.7 RPMI(FCS)60μlに細胞を再懸濁させ、洗浄した免疫細胞を使用するまで氷上で保存する。
【００７０】
6.0 補体および増強血清の4倍ストックの調製
6.1 一定量の凍結モルモット血清(補体の給源)(-70℃)を氷上で解凍する。RPMI(FCS)中で4倍ストックを作製する。
6.2 RPMI(FCS)中で増強血清(enhancing sera)の4倍ストック(1:900)を調製する。濃度は、それぞれのロットに対して経験的に決定しなければならない。
【００７１】
プラーク検定
7.1 前もってガラススライドを用意する。2インチ×3インチのガラススライドにシリコーンのエッジを適用し、室温で一晩硬化させる。使用前に、SigmaCoat約5μlを用いてスライドのガラス面を均一に拭き、乾燥させ、次いで強く拭く。
7.2 細胞試料60μlに、CD45RB-His被覆SRBC(5%v/vストック)、4倍補体ストックおよび4倍増強血清ストックをそれぞれ60μl加える。混合物の総体積は240μlである。
7.3 ガラススライド上にこの混合物を滴下する。それぞれのスポットは約3〜5μlである。気泡が入らないようにする。
7.4 希釈していないパラフィン油をスポットの上に広げる。スポットが表面を突破しないよう十分な油があるようにする。
7.5 スライドを37℃で少なくとも45分間インキュベートする。プラークが見られない場合、さらに15分間インキュベートして再び調べる。
7.6 これらの単一細胞をできるだけ早く顕微操作する。
【００７２】
(実施例4)
抗体の発現および精製
単形質細胞の分離の後、mRNAを抽出し、逆転写酵素PCR法を実施して、cDNAを得た。可変H鎖およびL鎖をコードしているcDNAをポリメラーゼ連鎖反応を使用して特異的に増幅した。可変H鎖領域をIgG2発現ベクター中にクローン化した。このベクターは、pcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen、カナダ、オンタリオ州Burlington)のマルチクローニングサイトにヒトIgG2の定常ドメインをクローン化することによって生成した。可変L鎖領域をIgK発現ベクター中にクローン化した。このベクターは、pcDNA3.1+/Neo(Invitrogen、カナダ、オンタリオ州Burlington)のマルチクローニングサイトにヒトIgKの定常ドメインをクローン化することによって生成した。H鎖およびL鎖発現ベクターを次いで、70%融合性ヒト胚性腎臓293細胞の60mm皿に共リポフェクションし、トランスフェクション細胞に、元の形質細胞と全く同じ特異的を有する組換え抗体を24時間分泌させた。HEK293細胞から上澄み(3mL)を採取し、ヒトIgGを特異的に検出するサンドイッチELISAを用いて無傷の抗体の分泌を証明した。組換え抗体の特異性は、実施例2で説明した溶血プラーク検定の間に形質細胞を分離するのに使用する抗原へのELISAでの組換え抗体の結合によって評価した。
【００７３】
ヒトIgGを検出するELISA法:分泌ELISAテストを以下のように実施した。プレートを2mg/mLヤギ抗ヒトIgG H+L O/Nでコーティングした。これらのプレートをdH2Oで5回洗浄した。リポフェクションした細胞からの無希釈上澄みから7つのウェルに組換え抗体を1:2で滴定した。プレートをdH2Oで5回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的HRP接合抗体を最終濃度が1μg/mLとなるように加え、分泌ELISAのため室温で1時間保持した。プレートをdH2Oで5回洗浄した。TMBを追加してプレートを30分現像した。1Mリン酸の追加によってELISAを停止させた。それぞれのELISAプレートを分析して、それぞれのウェルの光学密度を450nmで判定した。
【００７４】
抗CD45RB抗体の精製:抗CD45RB抗体のより大規模な生産のため、H鎖およびL鎖発現ベクター(それぞれの鎖ごとに2.5μg/皿)を、HEK293細胞と70%融合した10枚の100mm皿にリポフェクションした。トランスフェクション細胞を37℃で4日間インキュベートし、上澄み(6mL)を採取し、新しい培地6mlで置換した。7日目に、上澄みを取り出し、最初の採集物と一緒にプールした(10枚のプレートから合計120mL)。プロテインAセファロース(Amersham Biosciences、米ニュージャージー州Piscataway)アフィニティクロマトグラフィーを使用して上澄みから組換え抗体を精製した(1mL)。pH2.5の0.1Mグリシン500mLを用いてプロテインAカラムから抗体を溶離した。溶離液をpH7.4のPBSで透析し、次いでろ過滅菌した。非還元SDS-PAGEによって抗体を分析して純度および収率を評価した。
【００７５】
(実施例5)
H鎖およびL鎖可変領域の配列決定
関心の抗体を発現しているB細胞クローンを識別、分離した(実施例4)後、シグナルペプチドを含むL鎖およびH鎖可変領域をPCR法を使用して増幅し、次いでその配列を決定した。
【００７６】
識別された22個のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のアミノ酸配列は、AB-CD45RB-XG2-009ではそれぞれ配列番号55および57に、AB-CD45RB-XG2-026ではそれぞれ配列番号59および61に、AB-CD45RB-XG2-275ではそれぞれ配列番号63および65に、AB-CD45RB-XG2-324ではそれぞれ配列番号67および69に、AB-CD45RB-XG2-413ではそれぞれ配列番号71および73に、AB-CD45RB-XG2-416ではそれぞれ配列番号75および77に、AB-CD45RB-XG2-439ではそれぞれ配列番号79および81に、AB-CD45RB-XG2-446ではそれぞれ配列番号83および85に、AB-CD45RB-XG2-475ではそれぞれ配列番号87および89に、AB-CD45RB-XG2-487ではそれぞれ配列番号91および93に、AB-CD45RB-XG2-493ではそれぞれ配列番号95および97に、AB-CD45RB-XG2-502ではそれぞれ配列番号99および101に、AB-CD45RB-XG2-525ではそれぞれ配列番号103および105に、AB-CD45RB-XG2-539ではそれぞれ配列番号107および109に、AB-CD45RB-XG2-556ではそれぞれ配列番号111および113に、AB-CD45RB-XG2-569ではそれぞれ配列番号115および117に、AB-CD45RB-XG2-593ではそれぞれ配列番号119および121に、AB-CD45RB-XG2-606ではそれぞれ配列番号123および125に、AB-CD45RB-XG2-636ではそれぞれ配列番号127および129に、AB-CD45RB-XG2-648ではそれぞれ配列番号131および133に、AB-CD45RB-XG2-662ではそれぞれ配列番号135および137に、AB-CD45RB-XG2-662ではそれぞれ配列番号139および141にそれぞれ対応する。
【００７７】
シグナルペプチドを除いたこれらの抗体の可変H鎖のアミノ酸配列は図1に示されており、これらは、AB-CD45RB-XG2-009、AB-CD45RB-XG2-026、AB-CD45RB-XG2-446、AB-CD45RB-XG2-606、AB-CD45RB-XG2-713、AB-CD45RB-XG2-275、AB-CD45RB-XG2-324、AB-CD45RB-XG2-413、AB-CD45RB-XG2-416、AB-CD45RB-XG2-439、AB-CD45RB-XG2-487、AB-CD45RB-XG2-493、AB-CD45RB-XG2-502、AB-CD45RB-XG2-525、AB-CD45RB-XG2-593、AB-CD45RB-XG2-475、AB-CD45RB-XG2-539、AB-CD45RB-XG2-556、AB-CD45RB-XG2-569、AB-CD45RB-XG2-662、AB-CD45RB-XG2-648およびAB-CD45RB-XG2-636についてそれぞれ配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、24、25および26によって表されている。
【００７８】
シグナルペプチドを除いたこれらの抗体の可変L鎖のアミノ酸配列は図2に示されており、これらは、AB-CD45RB-XG2-009、AB-CD45RB-XG2-026、AB-CD45RB-XG2-446、AB-CD45RB-XG2-606、AB-CD45RB-XG2-713、AB-CD45RB-XG2-275、AB-CD45RB-XG2-324、AB-CD45RB-XG2-413、AB-CD45RB-XG2-416、AB-CD45RB-XG2-439、AB-CD45RB-XG2-487、AB-CD45RB-XG2-493、AB-CD45RB-XG2-502、AB-CD45RB-XG2-525、AB-CD45RB-XG2-593、AB-CD45RB-XG2-475、AB-CD45RB-XG2-539、AB-CD45RB-XG2-556、AB-CD45RB-XG2-569、AB-CD45RB-XG2-662、AB-CD45RB-XG2-648およびAB-CD45RB-XG2-636についてそれぞれ配列番号28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、49、50、51および53によって表されている。
【００７９】
これらの抗体は、「AB-CD45RB-XG2」の後に識別番号を付けて識別される。例えば、「AB-CD45RB-XG2-009」として識別される抗体は、図1および2で単一細胞(sc)009として識別される配列と関連する。抗体のそれぞれの領域は、フレームワーク領域(FR)または相補性決定領域(CDR)として別々に識別される。可変H鎖(γ)および可変L鎖(κ)はそれぞれ3つのCDRを含む。H鎖では、FR1+CDR1+FR2+CDR2+FR3+CDR3+FR4として識別される図1のセクションをシグナル配列と組み合わせて、配列番号55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135および139の配列を生み出すことができる。L鎖でも同様に、FR1+CDR1+FR2+CDR2+FR3+CDR3+FR4として識別される図2のセクションとして識別される図1のセクションをシグナル配列と組み合わせて、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137および141の配列を生み出すことができる。
【００８０】
AB-CD45RB-XG2-009(sc009)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号54は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号55は、配列番号54のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号56は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号57は、配列番号56のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００８１】
AB-CD45RB-XG2-026(sc026)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号58は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号59は、配列番号58のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号60は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号61は、配列番号61のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００８２】
AB-CD45RB-XG2-275(sc275)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号62は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号63は、配列番号62のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号64は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号65は、配列番号64のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００８３】
AB-CD45RB-XG2-324(sc324)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号66は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号67は、配列番号66のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号68は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号69は、配列番号68のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００８４】
AB-CD45RB-XG2-413(sc413)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号70は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号71は、配列番号70のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号72は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号73は、配列番号72のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００８５】
AB-CD45RB-XG2-416(sc416)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号74は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号75は、配列番号74のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号76は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号77は、配列番号76のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００８６】
AB-CD45RB-XG2-439(sc439)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号78は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号79は、配列番号78のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号80は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号81は、配列番号80のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００８７】
AB-CD45RB-XG2-446(sc446)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号82は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号83は、配列番号82のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号84は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号85は、配列番号84のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００８８】
AB-CD45RB-XG2-475(sc475)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号86は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号87は、配列番号86のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号88は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号89は、配列番号88のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００８９】
AB-CD45RB-XG2-487(sc487)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号90は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号91は、配列番号90のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号92は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号93は、配列番号92のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００９０】
AB-CD45RB-XG2-493(sc493)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号94は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号95は、配列番号94のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号96は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号97は、配列番号96のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００９１】
AB-CD45RB-XG2-502(sc502)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号98は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号99は、配列番号98のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号100は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号101は、配列番号100のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００９２】
AB-CD45RB-XG2-525(sc525)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号102は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号103は、配列番号102のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号104は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号105は、配列番号104のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００９３】
AB-CD45RB-XG2-539(sc539)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号106は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号107は、配列番号106のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号108は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号109は、配列番号108のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００９４】
AB-CD45RB-XG2-556(sc556)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号110は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号111は、配列番号110のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号112は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号113は、配列番号112のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００９５】
AB-CD45RB-XG2-569(sc569)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号114は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号115は、配列番号114のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号116は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号117は、配列番号116のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００９６】
AB-CD45RB-XG2-593(sc593)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号118は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号119は、配列番号118のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号120は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号121は、配列番号120のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００９７】
AB-CD45RB-XG2-606(sc606)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号122は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号123は、配列番号122のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号124は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号125は、配列番号124のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００９８】
AB-CD45RB-XG2-636(sc636)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号126は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号127は、配列番号126のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号128は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号129は、配列番号128のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【００９９】
AB-CD45RB-XG2-648(sc648)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号130は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号131は、配列番号130のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号132は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号133は、配列番号132のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【０１００】
AB-CD45RB-XG2-662(sc662)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号134は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号135は、配列番号134のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号136は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号137は、配列番号136のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【０１０１】
AB-CD45RB-XG2-713(sc713)で示す本発明のヒト抗CD45RB抗体のH鎖およびL鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号によって表される:配列番号138は、H鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号139は、配列番号138のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表し、配列番号140は、L鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を表し、配列番号141は、配列番号140のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列を表す。
【０１０２】
(実施例6)
採集物2
この実施例では、XenoMouse K522-2の採集物について述べる。XemoMouse系統IgG2のこのマウス(XMG2)をアジュバントを用いずに以下の抗原で腹膜内(IP)またはBIPで免疫した:CEM T細胞、完全長CD45RBで一過的にトランスフェクションしたHEK-293細胞、または完全長CD45RBで一過的にトランスフェクションしたTSA細胞。免疫スケジュールは以下のとおりである。
1)CEM細胞、B/IP、18日
2)CD45RBを一過的に発現しているTSA、B/IP、1日
3)CD45RBを一過的に発現しているTSA、B/IP、14日
4)CD45RBを一過的に発現している293細胞、IP、56日
5)CD45RBを一過的に発現している293細胞、IP、102日
【０１０３】
この動物からの血清を分析して、CEM T細胞、トランスフェクションしていないチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、CD45ROまたはCD45RBを一過的に発現しているCHO細胞に対する力価を求めた。ヒト46量体ペプチド、および6G3を使用してCEM T細胞から親和性精製したCD45RBタンパク質に対する力価も分析した。このマウスの血清学的応答を表4に示す。
【０１０４】
【表３】
2005536180.tif 000004
【０１０５】
107日目にリンパ節および脾臓を採取し、得られた細胞を35〜96ウェルプレートで培養した。B細胞を形質細胞に分化させ、それらの上澄みを分析して、ヒトCD45RB 46量体特異的抗体の存在の有無を調べた。抗原特異的溶血プラーク検定、続いて単一抗原特異的形質細胞の顕微操作を使用して、このスクリーニングから合計4つの抗CD45RB特異的抗体が識別され、CD45RBに対する抗体を産生する形質細胞が識別された。このプラーク検定の結果を表5に詳細に示す。
【０１０６】
【表４】
2005536180.tif 000005
【０１０７】
抗体AB-CD45RB-XG2-009(図1)をウェル16C9から分離した。このウェルから生成されたこの抗体はCD45のRBエキソンに特異的に結合することが分かった。このAB-CD45RB-XG2-009抗体を組換え抗体としてさらに分析した。
【０１０８】
(実施例7)
採集物4
この実施例では、XenoMouse K522-1の採集物について述べる。このXMG2マウスを、抗原であるCEM T細胞、完全長CD45RBで一過的にトランスフェクションしたHEK-293細胞、または完全長CD45RBで一過的にトランスフェクションしたTSA細胞で、BIPまたはIPによって免役した。アジュバントTiterMax classic(CytRx Corporation、米ジョージア州Norcross)を使用した。免疫スケジュールは以下のとおりである。
1)CEM細胞、B/IP、18日
2)CD45RBを一過的に発現しているTSA、B/IP、1日
3)CD45RBを一過的に発現しているTSA、B/IP、14日
4)TiterMax Classic中で乳化した親和性精製したCEM溶解産物、IP、45日
5)CD45RBを一過的に発現している293細胞、IP、56日
6)CD45RBを一過的に発現している293細胞、IP、114日
7)CD45RBを一過的に発現している293細胞、IP、135日
【０１０９】
このマウスの血清学的応答は表4に示されている。
【０１１０】
排出側リンパ節(draining lymph node)を139日目に採取し、合計35プレートを、500 CD19+B細胞/ウェルで培養した。ELISAによって、この採集物から、CD45RB 46量体特異的抗体を有する11個のウェルが識別された。これらのウェルを、CHO細胞中で一過的に過剰発現したヒトCD45RBに結合する能力に関してさらに分析した。CD45RB 46量体特異的形質細胞を識別するため、これらのウェルを、溶血プラーク検定を使用して分析した。そのデータを表6に示す。
【０１１１】
【表５】
2005536180.tif 000006
【０１１２】
抗体AB-CD45RB-XG2-026(図2)をウェル1G10から分離した。この抗体はCD45のRBエキソンに特異的に結合することが分かった。したがってこの抗体を組換え抗体としてさらに分析した。さらに3H1、6A6、7C5、30E11および38E2から他の組換え抗体が産生したが、これらの抗体はAB-CD45RB-XG2-026と全く同じだった。
【０１１３】
(実施例8)
採集物6
この実施例では、XenoMouse L576-6の採集物について述べる。このXMG2マウスを、ヒトCD45RB特異的ペプチド、すなわち18量体、20.1、20.2、20.3および46量体で、BIPによって免疫した。完全フロイントアジュバント(CFA、Sigma、カナダ、オンタリオ州Oakville)および不完全フロイントアジュバント(IFA、Sigma、カナダ、オンタリオ州Oakville)を使用した。免疫スケジュールは以下のとおりである。
1)5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、CFA、1日
2)5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、14日
3)5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、29日
4)5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、43日
5)5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、57日
【０１１４】
このマウスの血清学的応答を表7に示す。
【０１１５】
【表６】
2005536180.tif 000007
【０１１６】
脾臓および排出側リンパ節を83日目に採取した。L576-6の脾臓およびリンパ節から形質細胞を直接に分離した。溶血プラーク検定において異なるペプチド抗原を表8に示すように使用してこれらの細胞をプラークした。
【０１１７】
【表７】
2005536180.tif 000008
【０１１８】
XenoMouse動物L576-6のリンパ節から合計50プレートを、500 CD19+ B細胞/ウェルで培養した。脾臓Bリンパ球から5プレート、鼠蹊リンパ節から11プレート、大動脈周囲リンパ節から13プレート、残りのプールリンパ節(膝窩、腸間膜、腋窩、肩甲骨および頸部)から12プレート用意した。ELISAによって、この採集物から、CD45RBペプチド特異的抗体を有する18個のウェルが識別された(表9)。これらのウェルをデコンボルート(de-conbolute)して、それぞれのウェルが結合したペプチドを特異的に識別した。これらのウェルを、CHO細胞中で一過的に過剰発現したヒトCD45RBに結合する能力に関してさらに分析した。CD45RB 46量体特異的形質細胞を識別するため、これらのウェルを、溶血プラーク検定を使用して分析した。
【０１１９】
【表８】
2005536180.tif 000009
【０１２０】
【表９】
2005536180.tif 000010
【０１２１】
AB-CD45RB-XG2-275抗体(図3)およびAB-CD45RB-XG2-324抗体(図4)を、培養したB細胞から分離し、AB-CD45RB-XG2-413抗体(図5)およびAB-CD45RB-XG2-416抗体(図6)を脾臓形質細胞から直接に分離した。これらの抗体は全て、CD45のRBエキソンに特異的に結合することが分かった。したがってこれらの抗体を組換え抗体としてさらに分析した。
【０１２２】
(実施例9)
採集物7
この実施例では、XenoMouseマウスL577-2およびL577-14の採集物について述べる。これらのXMG2マウスを、CD45RB特異的ペプチド、すなわち18量体、20.1、20.2、20.3および46量体、ならびにCEM T細胞で、BIPによって免疫した。完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)を使用した。免疫スケジュールは以下のとおりである。
1)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、CFA、1日
2)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、14日
3)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、27日
4)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、41日
5)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、56日
6)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、117日
7)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、131日
8)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、145日
9)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、158日
10)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、173日
採取日:177日
【０１２３】
これらのマウスの血清学的応答を表11に示す。
【０１２４】
【表１０】
2005536180.tif 000011
【０１２５】
排出側リンパ節を177日目に採取し、XenoMouseマウスL577-2およびL577-14のリンパ節から合計50プレートを、500 CD19+ B細胞/ウェルで培養した。培養したB細胞の上澄みを採取し、まず最初に、FMAT技術を使用してCD45RBまたはCD45RO特異性に関してスクリーニングした。これらのスクリーニングは、CD45RBに特異的な39個のB細胞ウェルを識別した。次いで、これらのウェルの上澄みを、ヒトまたはマカク末梢血単核細胞および異なるCD45RBペプチドに対する結合能力に関して分析した。スクリーニングデータを下表12に示す。これらのウェルのうち2つのウェルを、抗原特異的溶血プラーク検定を使用してさらに分析して、抗原特異的形質細胞を分離した。次いで、これらの形質細胞を単一細胞RT-PCRを使用して処理して、H鎖およびL鎖可変領域を分離した。
【０１２６】
AB-CD45RB-XG2-439抗体(図7)およびAB-CD45RB-XG2-446抗体(図8)をそれぞれ、ウェル75H9および87E3から分離した。これらのウェルから産生した抗体はCD45のRBエキソンに特異的に結合することが分かった。これらの抗体を組換え抗体としてさらに分析した。
【０１２７】
【表１１】
2005536180.tif 000012
【０１２８】
(実施例10)
採集物8
この実施例では、XenoMouseマウスL577-6およびL577-8の採集物について述べる。これらのXMG2マウスを、CD45RB特異的ペプチド、すなわち18量体、20.1、20.2、20.3および46量体、ならびにCEM T細胞で、BIPによって免疫した。完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)を使用した。免疫スケジュールは以下のとおりである。
1)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、CFA、1日
2)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、14日
3)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、29日
4)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、43日
5)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、57日
6)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、108日
7)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、122日
8)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、136日
9)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、149日
10)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、202日
【０１２９】
これらのマウスの血清学的応答は表11に示されている。
【０１３０】
排出側リンパ節を206日目に採取し、XenoMouseマウスL577-6およびL577-8のリンパ節から合計105プレートを、500 CD19+ B細胞/ウェルで培養した。培養したB細胞の上澄みを採取し、まず最初に、FMAT技術を使用してCD45RBまたはCD45RO特異性に関してスクリーニングした。次いで、これらのウェルの上澄みを、ヒトまたはマカク末梢血単核細胞および異なるCD45RBペプチドに対する結合能力に関して分析した。これらのスクリーニングは、CD45RBに特異的な関心の7つのB細胞ウェルを識別した。スクリーニングデータを下表13に示す。これらのウェルを、抗原特異的溶血プラーク検定を使用してさらに分析して、抗原特異的形質細胞を分離した。次いで、これらの形質細胞を単一細胞RT-PCRを使用して処理して、H鎖およびL鎖可変領域を分離した。
【０１３１】
【表１２】
2005536180.tif 000013
【０１３２】
AB-CD45RB-XG2-475抗体(図9)、AB-CD45RB-XG2-487抗体(図10)、AB-CD45RB-XG2-493抗体(図11)、AB-CD45RB-XG2-502抗体(図12)、AB-CD45RB-XG2-525抗体(図13)およびAB-CD45RB-XG2-593抗体(図17)を採集物8から分離した。これらのウェルから産生した抗体はCD45のRBエキソンに特異的に結合することが分かった。これらの抗体を組換え抗体としてさらに分析した。
【０１３３】
(実施例11)
採集物9
この実施例では、XenoMouseマウスL577-3およびL577-5の採集物について述べる。これらのXMG2マウスを、CD45RB特異的ペプチド、すなわち18量体、20.1、20.2、20.3および46量体、ならびにCEM T細胞で、BIPによって免疫した。完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)を使用した。以下の免疫スケジュールを使用した。
1)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、CFA、1日
2)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、14日
3)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、27日
4)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、41日
5)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、55日
6)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、106日
7)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、120日
8)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、134日
9)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、147日
10)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、204日
【０１３４】
これらのマウスの血清学的応答は表11に示されている。
【０１３５】
排出側リンパ節を208日目に採取し、XenoMouseマウスL577-3およびL577-5のリンパ節から合計80プレートを、500 CD19+ B細胞/ウェルで培養した。培養したB細胞の上澄みを採取し、まず最初に、FMAT技術を使用してCD45RBまたはCD45RO特異性に関してスクリーニングした。次いで、これらのウェルの上澄みを、ヒトまたはマカク末梢血単核細胞および異なるCD45RBペプチドに対する結合能力に関して分析した。これらのスクリーニングは、CD45RBに特異的な関心の7つのB細胞ウェルを識別した。スクリーニングデータを下表14に示す。これらのウェルを、抗原特異的溶血プラーク検定を使用してさらに分析して、抗原特異的形質細胞を分離した。次いで、これらの形質細胞を単一細胞RT-PCRを使用して処理して、H鎖およびL鎖可変領域を分離した。
【０１３６】
【表１３】
2005536180.tif 000014
【０１３７】
AB-CD45RB-XG2-636抗体(図19)、AB-CD45RB-XG2-648抗体(図20)、AB-CD45RB-XG2-662抗体(図21)およびAB-CD45RB-XG2-713抗体(図22)を採集物9から分離した。これらのウェルから産生した抗体はCD45のRBエキソンに特異的に結合することが分かった。これらの抗体を組換え抗体としてさらに分析した。
【０１３８】
(実施例12)
採集物10
この実施例では、XenoMouseマウスL577-11およびL577-15の採集物について述べる。これらのXMG2マウスを、CD45RB特異的ペプチド、すなわち18量体、20.1、20.2、20.3および46量体、ならびにCEM T細胞で、BIPによって免疫した。完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)を使用した。以下の免疫スケジュールを使用した。
1)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、CFA、1日
2)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、14日
3)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、27日
4)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、41日
5)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、55日
6)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、106日
7)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、120日
8)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、134日
9)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、147日
10)CEM T細胞(107細胞)および5ペプチド(各2μg)+T細胞エピトープ、IFA、218日
【０１３９】
これらのマウスの血清学的応答は表11に示されている。
【０１４０】
排出側リンパ節を222日目に採取し、XenoMouseマウスL577-11およびL577-15のリンパ節から合計80プレートを、500 CD19+ B細胞/ウェルで培養した。培養したB細胞の上澄みを採取し、まず最初に、FMAT技術を使用してCD45RBまたはCD45RO特異性に関してスクリーニングした。次いで、これらのウェルの上澄みを、ヒトまたはマカク末梢血単核細胞および異なるCD45RBペプチドに対する結合能力に関して分析した。これらのスクリーニングは、CD45RBに特異的な関心の7つのB細胞ウェルを識別した。スクリーニングデータを下表15に示す。これらのウェルを、抗原特異的溶血プラーク検定を使用してさらに分析して、抗原特異的形質細胞を分離した。次いで、これらの形質細胞を単一細胞RT-PCRを使用して処理して、H鎖およびL鎖可変領域を分離した。
【０１４１】
【表１４】
2005536180.tif 000015
【０１４２】
AB-CD45RB-XG2-539抗体(図14)、AB-CD45RB-XG2-556抗体(図15)、AB-CD45RB-XG2-569抗体(図16)およびAB-CD45RB-XG2-713抗体(図22)を採集物10から分離した。これらのウェルから産生した抗体はCD45のRBエキソンに特異的に結合することが分かった。これらの抗体を組換え抗体としてさらに分析した。
【０１４３】
(実施例13)
採集物11
この実施例では、XenoMouseマウスL574-1およびL574-14の採集物について述べる。これらのXMG2マウスを、CEM T細胞でBIPによって免疫した。完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)を使用した。以下の免疫スケジュールを使用した。
1)CEM T細胞(107細胞)+T細胞エピトープ、CFA、1日
2)CEM T細胞(107細胞)+T細胞エピトープ、IFA、14日
3)CEM T細胞(107細胞)+T細胞エピトープ、IFA、28日
4)CEM T細胞(107細胞)+T細胞エピトープ、IFA、42日
5)CEM T細胞(107細胞)+T細胞エピトープ、IFA、56日
6)CEM T細胞(107細胞)+T細胞エピトープ、PBS、206日
採取日:210日
【０１４４】
これらのマウスの血清学的応答を表16に示す。
【０１４５】
【表１５】
2005536180.tif 000016
【０１４６】
排出側リンパ節を210日目に採取し、XenoMouseマウスL574-1およびL574-14のリンパ節から合計100プレートを、500 CD19+ B細胞/ウェルで培養した。培養したB細胞の上澄みを採取し、まず最初に、FMAT技術を使用してCD45RBまたはCD45RO特異性に関してスクリーニングした。次いで、これらのウェルの上澄みを、ヒトまたはマカクCD45RB 46量体ペプチドに対する結合能力に関して分析した。これらのスクリーニングは、CD45RBに特異的な関心の5つのB細胞ウェルを識別した。スクリーニングデータを下表17に示す。これらのウェルを、抗原特異的溶血プラーク検定を使用してさらに分析して、抗原特異的形質細胞を分離した。次いで、これらの形質細胞を単一細胞RT-PCRを使用して処理して、H鎖およびL鎖可変領域を分離した。
【０１４７】
【表１６】
2005536180.tif 000017
【０１４８】
AB-CD45RB-XG2-606抗体(図18)を採集物11から分離した。この抗体はCD45のRBエキソンに特異的に結合することが分かった。この抗体を組換え抗体としてさらに分析した。
【０１４９】
(実施例14)
組換え抗体の特性評価
実施例1から13に記載したとおりに識別し生産した組換え抗CD45RB抗体を再分析して、それらの結合特異性を確認した。組換え抗体の特異性を表18にまとめた。マウスモノクローナル抗CD45RB抗体6G3の結合特異性も表18にまとめた。
【０１５０】
【表１７】
2005536180.tif 000018
【０１５１】
これらの組換え抗体を、(i)ナイーブおよび活性化ヒトおよびマカクT細胞に対する組換え抗体の結合(FAC分析を使用)(実施例15)、(ii)ヒトT細胞でのCD45RBの発現をダウンレギュレートする組換え抗体の能力(実施例16)、(iii)ヒトT細胞でのL-セレクチンの発現をダウンレギュレートする組換え抗体の能力(実施例16)、(iv)ヒトT細胞の抗CD3誘導増殖を抑制する組換え抗体の能力(実施例17)、および(v)抗CD3刺激T細胞によるサイトカイン産生を抑制する組換え抗体の能力(実施例18)を含む、いくつかの検定でさらに分析した。
【０１５２】
(実施例15)
T細胞に対する抗CD45RB抗体の結合のFACS分析
以前に、これらの抗体が、CD45RBペプチド、およびヒトCD45RBを一過的に発現している細胞に特異的に結合することを示した。しかし、どちらの場合も、CD45RB抗原は、構造ならびにグリコシル化において違いを示すかもしれない。したがって、ナイーブおよび活性化正常ヒトT細胞に対する抗体の結合を分析することは興味深い。さらに、ナイーブおよび活性化マカクT細胞に対する結合を分析することも興味深い。したがって、以下のように、ナイーブおよび活性化正常ヒトおよびマカクT細胞に抗体を結合させた。
【０１５３】
ヒトおよびマカクT細胞のFACS分析プロトコル
1.0 フィコール勾配遠心法(400×g、30分)を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)または活性化PBMCをRBCから分離した。
2.0 200,000個のPBMCを、96ウェルプレート中の特定の濃度の一次抗体100μlで7分間染色した。
3.0 次いで、プレートを400gで3分間遠心処理し、上澄みを除去した。
4.0 細胞ペレットを、二次抗体(5μg/ml)100μlで7分間再懸濁させた。
5.0 プレートを再び遠心処理し、上澄みを除去し、細胞を、FACS緩衝液(PBS、2%FCS)400μlの入ったFACS管に移した。
6.0 BD FACSCalibur上で試料を分析した。
【０１５４】
6G3は、ヒトT細胞とマカクT細胞の両方を特異的に認識するマウス抗体である。したがって、図4Aおよび4Bは、マウス抗体6G3がヒトおよびマカクT細胞に結合することを示している。図4Aは、ナイーブおよび活性化ヒトT細胞への結合を示している。図4Bは、ナイーブおよび活性化マカクT細胞への結合を示している。2番目のピークの右側への移動は特異的な結合を指示している。移動が大きいほど結合は良好である。ピークのサイズは、抗体に特異的に結合している細胞の数を指示している。
【０１５５】
図5〜11を含む「ビン1」の抗体群は、ナイーブおよび活性化ヒトCD45RBに対する特異的な結合によって特徴づけられる。これらの抗体は全て、ヒト46量体ペプチドに結合することが可能であった。興味深いことに、これらの抗体はいずれも、ナイーブおよび活性化マカクCD45RBには結合することができなかった。これらの抗体にはsc026、sc439、sc446、sc487、sc502、sc606およびsc713が含まれた。
【０１５６】
図12および13を含む「ビン2」の抗体群は、RBペプチドへの結合を示さなかった抗体のサブセットである。したがって、これらは、特異的なヒトグリコシル化または細胞外ドメイン全体によって提供される特異的な立体配座を必要としたかもしれない。FACS分析を実施すると、これらの抗体はヒトT細胞と特異的に結合し、マカク細胞には結合しなかった。これらの抗体にはsc636およびsc648が含まれた。
【０１５７】
図14〜16を含む「ビン3」の抗体群は、活性化ヒトT細胞ならびにナイーブおよび活性化マカクT細胞に対する結合を示した。これらの抗体にはsc324、sc325、sc475およびsc569が含まれた。sc324とsc325は同じB細胞培養ウェルから単離ものであることに留意されたい。これは、これらが全く同じでなければならないことを意味している。しかし、これらの2つの抗体ではアミノ酸が1つ異なっており、これはおそらくPCR突然変異によるものと考えられる。
【０１５８】
いくつかの抗体がT細胞の活性化後により良好な結合を示したことも興味深い。これを、病因または病気の生物学に対してどのように解釈すべきかについては明白ではない。しかし、活性化T細胞が自己免疫疾患の病因においてより大きな役割を果たす場合、活性化T細胞上のCD45RBを認識する抗体の使用は、疾患のより効率的な治療を可能にするだろう。これらの抗体の例はsc324、sc325、sc475およびsc569である。
【０１５９】
(実施例16)
ヒト末梢血単核細胞上のCD45RBおよびL-セレクチンのダウンレギュレーション
免疫細胞に結合したときに抗体が生物学的効果を示すかどうかを判定するため、CD45RBおよびL-セレクチンをダウンレギュレートする能力を以下のように分析した。
1.0 末梢血単核細胞(PBMC)を培養した。96ウェルU底マイクロ培養プレート1ウェルあたり0.2mLの培地(10%FBS、RPMI、2mMグルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン)の中に0.3×106個の細胞を入れて培養した。
2.0 ダウンレギュレーションに対しては、検定の開始時に、培養物を、抗CD45RB抗体(1mg/mL)またはアイソタイプ対応対照で処理した。
3.0 5%CO2空気混合物を含む加湿されたインキュベータの中で培養物を37℃で24時間インキュベートした。
4.0 24時間後、細胞を洗浄し、抗CD45RB抗体(1mg/mL)とともに4℃で20分インキュベートし、フルオロクロムで標識したヤギ抗ヒトIgGを細胞ペレットに加え、4℃でさらに20分インキュベートし、またはPE標識した抗ヒトCD62L 20μlとともにインキュベートした。
5.0 染色された細胞を洗浄し、0.5%パラホルムアルデヒド中で固定してから回収した。
6.0 FACS VantageまたはFACSCalibur上でデータを取得し、分析データをCell Questソフトウェアで処理した。
【０１６０】
図17の結果は、陽性対照であるマウス抗体6G3が、CD45RBをダウンレギュレートすることができ、抗体1G10 (026)および502がダウンレギュレートする働きは弱く、抗体487が、CD45RBを強くダウンレギュレートしたことを示している。マカク特異的抗体である抗体324および413は、ナイーブヒト末梢血単核細胞に対して働かなかった。
【０１６１】
L-セレクチンは、T細胞を含む白血球を炎症部位に誘導する際に関与する接着分子である。図18の結果は、陽性対照である抗体6G3がL-セレクチンをダウンレギュレートすることができ、抗体1G10(026)および502がダウンレギュレーションする働きは弱く、抗体487が、L-セレクチンを強くダウンレギュレーションしたことを示している。マカク特異的抗体である抗体413は働かず、抗体324も働かなかった。このデータは、抗体487がT細胞の活性化をダウンレギュレートすることができることを示唆している。
【０１６２】
したがって、これらの2つの検定に基づくと、これらの5つのヒト抗体のなかでは抗体487が、治療薬として使用することに関して最も興味深いといえる。
【０１６３】
(実施例17)
ヒト末梢血単核細胞の抗CD3抗体誘導増殖およびサイトカイン放出に対する抗CD45RB抗体の効果
抗CD45RB抗体はさらに、T細胞増殖およびサイトカイン産生に対するそれらの効果を決定すると特徴づけられた。それらの生物学的効果を判定するため、これらの抗体を、PBMNC上の抗CD3抗体とともに、以下で説明するとおりにインキュベートした。
【０１６４】
方法:ヒトPBMNC(0.2×106細胞)を、抗CD3抗体10ng/mLとともに、抗体の存在下で、37℃の5%CO2雰囲気中で、T細胞増殖のために72時間、IL-2およびIL-10の産生のために22時間、IFNγの産生のために10時間インキュベートした。T細胞増殖は、トリチウムチミジンの細胞取込みを測定することによって評価した。サイトカイン産生は、ELISAによって培養上澄み中のサイトカイン濃度を測定することによって評価した。データは、n=3〜5のPBMNC製剤(すなわちドナー)の平均および変動である。
【０１６５】
図19の結果は、抗体キメラ6G3(CH6G3)、sc487、sc606、sc636およびsc713の増殖が用量に依存して抑制されることを示している。アイソタイプ対応対照抗体では増殖の抑制が見られないので、この知見は、CD45RBに対する特異性にも依存していた。
【０１６６】
これらの抗CD45RB特異的抗体は、用量に依存したIL2(図20)およびIFNγ(図21)の産生の抑制をも示した。対照的に、これらの抗体は、sc636を除いてIL10(図22)の産生には失敗した。増殖検定で見られたとおり、アイソタイプ対応対照抗体は、IL2、IFNγまたはIL10の産生に効果を有さなかった。このことは、抗CD45RB抗体で見られる効果は特異的だったことを指示している。
【０１６７】
これらのin vitro検定において抗体487、606、sc636およびsc713は、キメラヒト6G3と同様に働いた。6G3は、カニクイザルの腎同種移植またはランゲルハンス島細胞同種移植の生存を引き伸ばすのにあるin vivo効能を示した。これらの完全ヒト抗CD45RB抗体は、6G3と同様の生体活性を示すので治療上興味深い。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１Ａ】本発明に従って生成された抗CD45RBモノクローナル抗体の可変γ鎖の配列および遺伝子ファミリーを示す図である。これらのアミノ酸配列は、リーダーのないVγ配列およびそれらのそれぞれの生殖細胞系配列である。生殖細胞系配列との一致は「-」によって指示されており、体細胞ハイパー突然変異は新しいアミノ酸によって、挿入は「#」で、欠失は「x」でそれぞれ示されている。
【図１Ｂ】本発明に従って生成された抗CD45RBモノクローナル抗体の可変γ鎖の配列および遺伝子ファミリーを示す図である。これらのアミノ酸配列は、リーダーのないVγ配列およびそれらのそれぞれの生殖細胞系配列である。生殖細胞系配列との一致は「-」によって指示されており、体細胞ハイパー突然変異は新しいアミノ酸によって、挿入は「#」で、欠失は「x」でそれぞれ示されている。
【図２Ａ】本発明に従って生成された抗CD45RBモノクローナル抗体の可変κ鎖の配列および遺伝子ファミリーを示す図である。これらのアミノ酸配列は、リーダーのないVκ配列およびそれらのそれぞれの生殖細胞系配列である。生殖細胞系配列との一致は「-」によって指示されており、体細胞ハイパー突然変異は新しいアミノ酸によって、挿入は「#」で、欠失は「x」でそれぞれ示されている。
【図２Ｂ】本発明に従って生成された抗CD45RBモノクローナル抗体の可変κ鎖の配列および遺伝子ファミリーを示す図である。これらのアミノ酸配列は、リーダーのないVκ配列およびそれらのそれぞれの生殖細胞系配列である。生殖細胞系配列との一致は「-」によって指示されており、体細胞ハイパー突然変異は新しいアミノ酸によって、挿入は「#」で、欠失は「x」でそれぞれ示されている。
【図３】CD45RBで一過的にトランスフェクションしたCHO細胞に対する39E11(sc324)、16C9(sc009)および1G10(sc026)抗体のネイティブ結合を示す図である。
【図４】ナイーブおよび活性化ヒトT細胞(図4A)およびナイーブおよび活性化マカクT細胞(図4B)に対するマウスモノクローナル抗体6G3の結合のFACS分析を示す図である。
【図５】ナイーブおよび活性化ヒトT細胞(図5A)およびナイーブおよび活性化マカクT細胞(図5B)に対するヒト抗体sc026の結合のFACS分析を示す図である。
【図６】ナイーブおよび活性化ヒトT細胞(図6A)およびナイーブおよび活性化マカクT細胞(図6B)に対するヒト抗体sc439の結合のFACS分析を示す図である。
【図７】ナイーブおよび活性化ヒトT細胞(図7A)およびナイーブおよび活性化マカクT細胞(図7B)に対するヒト抗体sc446の結合のFACS分析を示す図である。
【図８】ナイーブおよび活性化ヒトT細胞(図8A)およびナイーブおよび活性化マカクT細胞(図8B)に対するヒト抗体sc487の結合のFACS分析を示す図である。
【図９】ナイーブおよび活性化ヒトT細胞(図9A)およびナイーブおよび活性化マカクT細胞(図9B)に対するヒト抗体sc502の結合のFACS分析を示す図である。
【図１０】ナイーブおよび活性化ヒトT細胞(図10A)およびナイーブおよび活性化マカクT細胞(図10B)に対するヒト抗体sc606の結合のFACS分析を示す図である。
【図１１】ナイーブおよび活性化ヒトT細胞(図11A)およびナイーブおよび活性化マカクT細胞(図11B)に対するヒト抗体sc713の結合のFACS分析を示す図である。
【図１２】ナイーブおよび活性化ヒトT細胞(図12A)およびナイーブおよび活性化マカクT細胞(図12B)に対するヒト抗体sc636の結合のFACS分析を示す図である。
【図１３】ナイーブおよび活性化ヒトT細胞(図13A)およびナイーブおよび活性化マカクT細胞(図13B)に対するヒト抗体sc648の結合のFACS分析を示す図である。
【図１４】ナイーブおよび活性化ヒトT細胞(図14A)およびナイーブおよび活性化マカクT細胞(図14B)に対するヒト抗体sc324の結合のFACS分析を示す図である。
【図１５】ナイーブおよび活性化ヒトT細胞(図15A)およびナイーブおよび活性化マカクT細胞(図15B)に対するヒト抗体sc475の結合のFACS分析を示す図である。
【図１６】ナイーブおよび活性化ヒトT細胞(図16A)およびナイーブおよび活性化マカクT細胞(図16B)に対するヒト抗体sc569の結合のFACS分析を示す図である。
【図１７】マウスモノクローナル抗体6G3ならびにヒトモノクローナル抗体1G10(sc026)、325、413、487および502による末梢血単核細胞(PBMC)上のCD45RBのダウンレギュレーションを示す図である。
【図１８】マウスモノクローナル抗体6G3ならびにヒト抗体1G10(sc026)、325、413、487および502による末梢血単核細胞(PBMC)上のL-セレクチンのダウンレギュレーションを示す図である。
【図１９】キメラヒト6G3、ヒト抗体sc487、sc606、sc636、sc713およびアイソタイプ対応対照抗体の存在下での抗CD3活性化ヒト末梢血単核細胞の細胞増殖を示す図である。
【図２０】抗CD3活性化リンパ球によるIL2産生に対するキメラヒト6G3、ヒト抗体sc487、sc606、sc636、sc713およびアイソタイプ対応対照抗体の効果を示す図である。
【図２１】抗CD3活性化リンパ球によるIFNγ産生に対するキメラヒト6G3、ヒト抗体sc487、sc606、sc636、sc713およびアイソタイプ対応対照抗体の効果を示す図である。
【図２２】抗CD3活性化リンパ球によるIL-10産生に対するキメラヒト6G3、ヒト抗体sc487、sc606、sc636、sc713およびアイソタイプ対応対照抗体の効果を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2005536180.tif 000031
【図１２】
2005536180.tif 000032
【図１３】
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【図１４】
2005536180.tif 000034
【図１５】
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【図１６】
2005536180.tif 000036
【図１７】
2005536180.tif 000037
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2005536180.tif 000042
【配列表】
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【国際調査報告】
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