(57)【要約】  本発明は、上皮誘導性癌、特に腎癌、例えば、腎臓細胞癌及び結腸直腸癌、例えば、結腸癌の診断への、さらにはこのような癌の治療方法へのポリペプチド（ＣＤ２７Ｌ）の使用に関するものである。
2005510734.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から得られた生体試料において、
（ｉ）ａ）図１に示されるアミノ酸配列（配列番号：２）を有する若しくはから構成される；
ｂ）ＣＤ２７結合能を保持する図１に示されるアミノ酸配列（配列番号：２）に対して一以上のアミノ酸が置換、修飾、欠失または挿入された誘導体である；または
ｃ）少なくとも１０アミノ酸長であり、断片の長さにわたって少なくとも７０％の相同性を有する、図１に示されるアミノ酸配列（配列番号：２）を有するポリペプチドの断片である、
ＣＤ２７Ｌポリペプチド；または
（ｉｉ）ｄ）図１に示されるＤＮＡ配列（配列番号：１）若しくはそのＲＮＡ等価物を有する若しくはから構成される；
ｅ）ｄ）の配列に相補的である配列を有する；
ｆ）上記ａ）〜ｃ）のいずれかで規定されるポリペプチドをコードする配列を有する；
ｇ）上記ｄ）、ｅ）及びｆ）のいずれかと実質的な同一性を示す配列を有する；または
ｈ）少なくとも３０ヌクレオチド長である、ｄ）、ｅ）、ｆ）若しくはｇ）の断片である、
ＣＤ２７Ｌ核酸分子
を検出するおよび／または定量する段階を有する、被検者において上皮誘導性癌をスクリーニングするおよび／または診断する、および／または上皮誘導性癌治療の有効性をモニターする方法。
【請求項２】
該ポリペプチドまたは該核酸のレベルを、予め決定された参考範囲またはコントロールと比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出する段階は、
（ａ）試料を、請求項１（ｉ）で規定されるポリペプチドに特異的である捕捉試薬と接触させ；さらに
（ｂ）試料中で捕捉試薬とポリペプチドとの間で結合が起こるかどうかを検出する
ことを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｂ）は、直接または間接的に標識された検出試薬を用いて捕捉されたポリペプチドを検出することを有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該捕捉試薬は、固相に固定化される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドは、請求項１（ｉ）で規定される一以上のＣＤ２７Ｌポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて検出されるおよび／または定量される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１（ｉ）で規定されるＣＤ２７Ｌポリペプチドに特異的な捕捉試薬、試薬及び使用説明書を有する診断キット。
【請求項８】
上皮誘導性癌の治療を目的とする組成物の製造における、
（ｉ）少なくとも一の請求項１（ｉ）で規定されるＣＤ２７Ｌポリペプチド；
（ｉｉ）請求項１（ｉｉ）で規定される核酸分子；または
（ｉｉｉ）ドミナントネガティブ変異体である図１に示されるアミノ酸配列（配列番号：１）に対して一以上のアミノ酸が置換、修飾、欠失または挿入された請求項１（ｉ）で規定されるポリペプチドの誘導体
の使用。
【請求項９】
上皮誘導性癌の治療を目的とする組成物の製造におけるＣＤ２７Ｌに特異的に結合する抗体の使用。
【請求項１０】
抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化若しくは二重特異性である、または治療部分、検出可能な標識、第二抗体若しくはその断片、細胞毒若しくはサイトカインに共役する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
組成物はワクチンである、請求項８（ｉ）または（ｉｉｉ）に記載の使用。
【請求項１２】
（ａ）ＣＤ２７Ｌポリペプチドを候補物質と接触させ；さらに
（ｂ）候補物質が該ポリペプチドと相互作用するかどうかを決定する
ことを有する、請求項１（ｉ）で規定されるＣＤ２７Ｌポリペプチドと相互作用する抗上皮誘導性癌剤に関するスクリーニング方法。
【請求項１３】
候補物質とＣＤ２７Ｌポリペプチドとの相互作用の決定は、候補物質及び該ポリペプチドの結合を定量的に検出することを有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）請求項１（ｉ）で規定されるＣＤ２７Ｌポリペプチドの発現若しくは活性、または
（ｂ）請求項１（ｉｉ）で規定されるＣＤ２７Ｌ核酸分子の発現
を調節する抗上皮誘導性癌剤に関するスクリーニング方法であって、
（ｉ）候補物質の存在下での、該ポリペプチドの発現若しくは活性、または該核酸分子の発現を、候補物質の不存在下での若しくはコントロール物質の存在下での、該ポリペプチドの発現若しくは活性、または該核酸分子の発現と比較し；さらに
（ｉｉ）候補物質が、該ポリペプチドの発現若しくは活性、または該核酸分子の発現を変えるかどうかを決定する
ことを有する方法。
【請求項１５】
該ポリペプチドの発現若しくは活性レベル、または該核酸分子の発現レベルを予め決定された参考範囲と比較する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらに試験する、または抗上皮誘導性癌剤として治療のために若しくは予防のために使用することを目的として該ポリペプチドの発現若しくは活性、または該核酸分子の発現を調節する物質を選択することをさらに有する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
該ポリペプチドの発現若しくは活性、または該核酸分子の発現を変える、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法によって同定される物質。
【請求項１８】
上皮誘導性癌の治療を目的とする組成物の製造における請求項１７に記載の物質の使用。
【請求項１９】
上皮誘導性癌は結腸直腸癌である、請求項１〜６及び１２〜１６のいずれか１項に記載の方法、または請求項８〜１１及び１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
上皮誘導性癌は腎癌である、請求項１〜６及び１２〜１６のいずれか１項に記載の方法、または請求項８〜１１及び１８のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、上皮関連癌(epithelial-related cancer)、特に腎癌、例えば、腎細胞癌および結腸直腸癌、例えば、結腸癌の診断を目的とするポリペプチド（ＣＤ２７Ｌ）の使用、さらにはこのような癌の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの癌のタイプの治療は、一般的に、外科手術、化学療法、放射線療法または生物学的療法によるものである。しかしながら、腫瘍によっては、癌細胞が化学療法剤に耐性を持つようになったりまたはホルモン感受性を失うというように、このような治療に対して抵抗性を示すものがあり、これらは治療不可能であることが多い再発性または転移性疾患を引き起こす。より近年では、腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を開始する及び標的とする手段として、癌のワクチン及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のような、免疫療法の開発に注意が集中してきた(Green et al. (2000) Cancer Treat. Rev. 26, 269-286; Davis (2000) Immunol. Cell Biol. 78, 179-195; Knuth et al. (2000) Cancer Chemother Pharmacol. 46, S46-51; Shiku et al. (2000) Cancer Chemother. Pharmacol. 46, S77-82; Saffran et al. (1999) Cancer Metastasis Rev. 18, 437-449)。１９９８年には、ＦＤＡが、転移性乳癌の治療として、erbB2/HER2-neuレセプタータンパク質を認識するｍＡｂである、ハーセプチン(Stebbing et al. (2000) Cancer Treat. Rev. 26, 287-290; Dillman (1999) Cancer Biother. Radiopharm. 14, 5-10 ; Miller et al. (1999) Invest. New Drugs 17, 417-427)を承認した。化学療法と組み合わせると、ハーセプチンは、化学療法単独を患者に施す場合に比べると、病気が進行する時間を延長することが示された(Baselga et al. (1998) Cancer Res. 58, 2825-2831)。他の癌、例えば、上皮誘導性癌(epithelial-derived cancer)の免疫療法に適する他のターゲットまたは抗原の同定がますます重要になってきた。
【０００３】
腎癌
腎癌には３つの主要なタイプ−血液を濾過する尿細管の内層で発達する腎細胞癌、５歳以下の小児で主に見つかる、ウィルムス腫瘍、及び膀胱、尿管または腎盂の内層で発達する、腎盂および／または尿管の移行細胞癌がある。それぞれ、腎癌の全症例の約８０％、５％及び７％を占める。
【０００４】
腎癌が成長するにつれて、肝臓、結腸、または膵臓等の、腎臓付近の器官を侵襲する。腎癌が広がると、癌細胞がリンパ節に見られることもある。このような理由により、腎臓付近のリンパ節が外科手術で除去される。腎癌は広がって、新たな癌を形成することもあり、最も多くは骨または肺である。
【０００５】
外科手術は腎癌の主な治療法である。外科手術の目的は、全てのまたは可能な限り多くの癌を除去し、さらなる治療の必要性を評価できるように正確に癌の「段階を判断する(stage)」ことである。根治的腎摘出では、癌を含む腎臓全体を取り除く。腎臓にくっついている、副腎もまた腎臓の周りの脂肪組織と共に取り除かれる。医師が癌がどの段階にあるのかを決定するのを助けられるように、近くのリンパ節もまた除去される。部分的な腎摘出では、癌を含む腎臓の部分のみが除かれるが、一般的にはあまり行われていない。場合によっては、二次転移の除去が痛み等の症状を和らげるために行なわれる。しかしながら、これは、一般的に予後という点では役には立たず、癌が取りやすく、重篤な副作用を引き起こすことなく外科手術を行なえる場合に試みられるのみであろう。動脈塞栓法は、癌を含む腎臓の動脈を遮断するために行われる方法である。この方法は、外科手術では除けない原発腫瘍を制御するためにまたは場合によっては外科手術をより容易にするために手術前に行なわれる。
【０００６】
放射線療法は、ときどき、病気が重すぎて大手術を受けられない患者に外科手術の代わりに使用される。場合によっては、再発または進行癌の結果生じる症状を和らげる(help with)のに使用される。しかしながら、腎細胞腎癌は、放射線療法に特に感受性がなく、また、研究により予後を改善しないことが示されたため、その使用は常用されない。
【０００７】
免疫療法による治療は、進行（転移性）腎癌の治療に、たいてい、サイトカイン、インターロイキン−２やインターフェロンαを使用する。
【０００８】
結腸直腸癌
皮膚癌を除いて、結腸直腸癌は、米国で男性及び女性で診断される癌のうち３番目に一般的な癌である。外科手術が結腸直腸癌の主要な治療法である。放射線療法は、しばしば、除ききれなかった付着物を殺すのに及び局所的な再発を予防するのに外科手術後に使用される。フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の薬剤を用いる、及び必要であればロイコボリンまたはレバミゾール、及びイリノテカン(Irinotecan)（ＣＰＴ−１１）を用いる、補助化学療法(adjuvant chemotherapy)もまた使用される。免疫療法はアジュバントのセッティングで外科手術による切除後に最も可能性があるという事実があるにもかかわらず、結腸直腸癌の治療に免疫療法剤は通常受け入れられない。しかしながら、Edrecolomab（モノクローナル抗体１７−１Ａ、またはPanorex）は、英国及び米国で臨床試験中であり、ドイツでは既に承認されている結腸直腸癌に対する付加療法剤(adjunctive therapy)である。したがって、結腸直腸癌の免疫療法に適する新たなターゲットまたは抗原の同定が非常に重要である。
【発明の開示】
【０００９】
発明の簡単な要約
本発明は、タンパク質、ＣＤ２７Ｌが、上皮誘導性癌(epithelial-derived cancer)、特に腎癌及び結腸直腸癌で発現の上昇を示すという知見に基づくものである。ＣＤ２７Ｌの発現の上昇は、診断上、さらには治療を目的とした処置のターゲットとして有用である。ＣＤ２７Ｌは、ヒトＴ及びＢリンパ球の表面上で発見されたサイトカインＣＤ２７レセプターに結合するリガンドである（米国特許第５，５７３，９２４号；米国特許第５，７１６，８０５号；ＷＯ  ９４／０５６９１号；Goodwin et al. (1993) Cell 73 (3): 447-456）。もともとは、ＣＤ７０として同定された、Hintzen et al Int Immunol, (1994), 6(3), pp477-80を参照。１９９１年に発表された研究では、ＣＤ７０／ＣＤ２７Ｌ等の様々な活性化抗原に対するモノクローナル抗体が使用され、ＣＤ７０／ＣＤ２７Ｌが活性化Ｂ及びＴ細胞で高い発現を有することが同定された(Paloczi K et al., (1991), Heamatologica, 24(2), pp83-90)。混乱を避けるために、このタンパク質を本明細書中ではＣＤ２７Ｌと称する。
【００１０】
本発明は、被検者から得られた生体試料において、
（ａ）図１に示されるアミノ酸配列（配列番号：２）を有する若しくはから構成される；
（ｂ）ＣＤ２７結合能を保持する図１に示されるアミノ酸配列（配列番号：２）に対して一以上のアミノ酸が置換、修飾、欠失または挿入された誘導体である；または
（ｃ）少なくとも１０アミノ酸長であり、断片の長さにわたって少なくとも７０％の相同性を有する、図１に示されるアミノ酸配列（配列番号：２）を有するポリペプチドの断片である、
ＣＤ２７Ｌポリペプチドを検出するおよび／または定量する段階を有する、被検者において、上皮誘導性癌(epithelial-derived cancer)をスクリーニングするおよび／または診断する方法を提供するものである。
【００１１】
さらなる実施態様においては、ＣＤ２７Ｌポリペプチドのレベルを参考範囲またはコントロールと比較する。
【００１２】
上記（ａ）〜（ｃ）で記載されるポリペプチドは、以降、「ＣＤ２７Ｌポリペプチド」と称される。「ポリペプチド」ということばは、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を包含する。これらは、特記しない限り、相互に使用される。
【００１３】
さらなる態様においては、本発明は、被検者から得られた生体試料において、
（ｄ）図１に示されるＤＮＡ配列（配列番号：１）若しくはそのＲＮＡ等価物を有する若しくはから構成される；
（ｅ）（ｄ）の配列に相補的である配列を有する；
（ｆ）上記（ａ）〜（ｃ）で規定されるポリペプチドをコードする配列を有する；
（ｇ）上記（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のいずれかと実質的な同一性を示す配列を有する；または
（ｈ）少なくとも８ヌクレオチド長である、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）若しくは（ｇ）の断片である、
ＣＤ２７Ｌ核酸分子を検出するおよび／または定量する段階を有する、被検者において、上皮誘導性癌をスクリーニングするおよび／または診断する方法を提供するものである。
【００１４】
上記（ｄ）〜（ｈ）に記載される核酸分子は、以降、「ＣＤ２７Ｌ核酸」と称される。
【００１５】
一実施態様においては、上皮誘導性癌は腎癌であり、特定の実施態様においては、腎癌は腎臓細胞癌である。他の実施態様においては、上皮誘導性癌は結腸直腸癌であり、特定の実施態様においては、結腸直腸癌は結腸癌である。本明細書中で使用される、「上皮誘導性癌(epithelial-derived cancer)」ということばは、腎癌、例えば、腎臓細胞癌及び結腸直腸癌、例えば、結腸癌双方を包含すると解される。被検者は哺乳動物であってもよく、好ましくはヒトである。
【００１６】
他の態様においては、本発明は、上皮誘導性癌の予防および／または治療の必要のある被検者に、治療上有効な量の少なくとも一のＣＤ２７Ｌポリペプチドを投与することを有する、被検者の上皮誘導性癌の予防および／または治療方法を提供する。
【００１７】
さらなる態様においては、本発明は、上皮誘導性癌の予防および／または治療の必要のある被検者に、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの発現若しくは活性を調節するまたはＣＤ２７Ｌ核酸の発現を調節する物質を治療上有効な量投与することを有する、被検者の上皮誘導性癌の予防および／または治療方法を提供する。
【００１８】
他の態様においては、本発明は、上皮誘導性癌の予防および／または治療に使用される、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの発現若しくは活性を調節するまたはＣＤ２７Ｌ核酸の発現を調節する物質を含む薬剤組成物を提供する。
【００１９】
さらなる態様においては、本発明は、上皮誘導性癌の予防および／または治療に使用される、少なくとも一のＣＤ２７Ｌポリペプチドを含む薬剤組成物を提供する。
【００２０】
上記態様において、ポリペプチドまたはその断片は、単離されたまたは組換体の形態であってもよく、他の部分に融合していてもよい。ポリペプチドまたはその断片は、実質的に純粋な形態で、即ち、他のタンパク質を実質的に含まない形態で提供されてもよい。ゆえに、ポリペプチドは、主成分として存在する（即ち、溶剤または担体を除いた重量／重量基準で測定される際に；少なくとも５０％；好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％のレベルで存在する）組成物中で提供されてもよい。
【００２１】
本発明のさらなる態様においては、本明細書において、これらすべてが十分に記載され、詳述されるように、ＣＤ２７Ｌポリペプチドをコード化する核酸、この誘導体及び断片、これに対する抗体、ならびにこれのアゴニスト及びアンタゴニストが、スクリーニングアッセイ等の診断アッセイの一部として、例えば、患者の上皮誘導性癌の存在または段階(instance)を同定するのに、さらにはこのような病気の処置に対する診断または治療の可能性のある物質として、同様の能力で機能する他の物質を同定するのに、使用されてもよい。本発明の方法は、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの発現または活性を調節できる物質、即ち、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの発現を増加させるまたは減少させる物質のスクリーニング方法を包含する。上皮誘導性癌の処置を受ける患者においてＣＤ２７Ｌの発現または活性を定量する段階を有する、患者の上皮誘導性癌の処置のモニター方法もまたさらに本発明に包含される。
【００２２】
したがって、本発明は、下記図面を参照しながら詳細な説明を考慮してより良く理解されるであろう。
【００２３】
図面の簡単な説明
図１：ＣＤ２７Ｌのヌクレオチド（配列番号：１）及びアミノ酸（配列番号：２）配列を示す。タンデムの質量スペクトルを、太字及び下線で示す。
【００２４】
図２：ＣＤ２７Ｌ  ｍＲＮＡの組織分布を示す。正常組織及び腎癌細胞系におけるｍＲＮＡのレベルは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量した。ｍＲＮＡレベルは、コピー数／ｎｇ  ｃＤＮＡとして表わす。
【００２５】
図３：正常及び腫瘍結腸組織におけるＣＤ２７Ｌの発現を示す。３人の患者からの同様の(matched)正常及び腫瘍組織におけるＣＤ２７Ｌ  ｍＲＮＡのレベルは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ｍＲＮＡレベルは、コピー数／ｎｇ  ｃＤＮＡとして表わす。
【００２６】
図４：２対の同様の正常及び腫瘍組織を含む、多くの腎腫瘍組織におけるＣＤ２７Ｌの発現を示す。ＣＤ２７Ｌ  ｍＲＮＡのレベルは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ｍＲＮＡレベルは、コピー数／ｎｇ  ｃＤＮＡとして表わす。
【００２７】
図５：ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２７Ｌ抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価されたＣＤ２７Ｌの相対的な発現を示す。
【００２８】
詳細な説明
本発明をより十分に理解するために、上記（ａ）〜（ｃ）の概念に含まれるポリペプチドをここでより詳細に説明する。
【００２９】
（ａ）の概念に含まれるポリペプチド：
（ａ）の概念に含まれるポリペプチドは、図１に示される特定のアミノ酸配列（配列番号：２）から構成されるまたは図１に示される配列（配列番号：２）にＮ末端が付加したおよび／またはＣ末端が付加したアミノ酸配列を有するものであってもよい。Ｎ末端またはＣ末端配列の付加は様々な理由によりなされる。このような配列を付加する技術は当該分野において既知である。配列の付加は特定のポリペプチドの特性を変えるためになされる。これは、発現を向上するまたは特定の発現系での発現を調節するのに有用でありうる。例えば、配列の付加により、タンパク質分解による切断に対する保護が得られる。これは、β−ガラクトシダーゼ酵素の一部にホルモンであるソマトスタチンをそのＮ末端で融合することによってソマトスタチンについてなされたことである(Itakwa et al. (1977) Science 198: 105-63)。
【００３０】
配列の付加はまた、同定または精製を補助するようにポリペプチドの性質を変更するのにも有用である。例えば、ポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィーによって単離されうる部分に連結される融合タンパク質が提供される。この部分は抗原またはエピトープであってもよく、また、アフィニティーカラムは当該抗原またはエピトープに（望ましくは高い特異性で）結合する固定化抗体または固定化抗体断片を有してもよい。融合タンパク質は、一般的に、適当な緩衝液の添加によってカラムから溶出できる。しかしながら、Ｎ末端またはＣ末端配列の付加は、本発明のポリペプチドを得るのに使用される特定の技術の結果として単に存在していてもよく、本発明のポリペプチドに特定の好ましい特性を付与する必要はない。このようなポリペプチドは本発明の範囲に含まれる。
【００３１】
Ｎ末端またはＣ末端配列の付加が存在するか否かにかかわらず、得られるポリペプチドは図１に示されるＣＤ２７Ｌポリペプチド（配列番号：２）の結合能を発揮することが好ましい。
【００３２】
（ｂ）の概念に含まれるポリペプチド：
上記（ｂ）で規定されるポリペプチドについては、これらのポリペプチドは、図１で示されるアミノ酸配列（配列番号：２）を有するポリペプチドの結合能を発揮する限り、上記ａ）で示されるポリペプチドの誘導体であることは当業者に理解されるであろう。タンパク質の機能には影響を与えないタンパク質のアミノ酸配列の変更が起こりうる。これらとしては、アミノ酸の欠失、修飾、付加及び置換があり、オルタネイティブスプライシングおよび／または複数の翻訳開始部位及び終了部位の存在から得られてもよい。多形性が翻訳過程のインフィデルティー(infidelity)の結果生じてもよい。ゆえに、タンパク質の機能に影響を与えないアミノ酸配列の変更は許容される。当業者は、活性の少なくとも一部を有し、好ましくは活性のかなりの割合を有する誘導体（場合によっては変異体(variant)または「ミューテイン(mutein)」として知られている）を製造するために、特定の活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列に様々な変更をしばしば行なえると考えるであろう。上記（ａ）で記載されるポリペプチドのこのような誘導体は、本発明で使用され、以下でより詳細に説明される。これらとしては、対立遺伝子及び非対立遺伝子誘導体がある。本発明の誘導体の一例としては、一以上のアミノ酸の一以上の他のアミノ酸への置換に加えて、上記（ａ）で規定されるポリペプチドがある。当業者は、様々なアミノ酸が似た性質を有することを知っている。ポリペプチドの一以上のこのようなアミノ酸は、しばしば、そのポリペプチドの所望の活性を失うことなく、一以上の他のこのようなアミノ酸に置換されうる。
【００３３】
一実施態様においては、アミノ酸の置換によって、ペプチドにドミナントネガティブ活性(dominant negative activity)を付与する。他の実施態様においては、アミノ酸の置換によって、ポリペプチドを構造上活性にする。
【００３４】
ゆえに、アミノ酸である、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは、しばしば相互に置換できる（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これらの可能性のある置換のうち、（側鎖が比較的短いので）グリシン及びアラニンを相互に置換するのに使用し、（疎水性であるより大きな脂肪族側鎖を有するため）バリン、ロイシン及びイソロイシンを相互に置換するのに使用することが好ましい。しばしば相互に置換できる他のアミノ酸としては、下記がある：
−フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
−リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパルテート及びグルタメート（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；および
−システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）。
【００３５】
このような性質を有する置換は、しばしば、「同類」または「半同類」アミノ酸置換と称される。
【００３６】
アミノ酸の欠失または付加もまた上記（ａ）で示されるアミノ酸配列に対してなされてもよい。ゆえに、例えば、ポリペプチドの活性に実質的に効果を及ぼさない、または少なくともこのような活性を失わせないアミノ酸を欠失させてもよい。ポリペプチドの全長及び分子量が活性は保持したまま小さくなるので、このような欠失は好ましい。これにより、特定の目的に必要なポリペプチドの量が減少でき、例えば、投与量を減らすことができる。
【００３７】
上記（ａ）で示される配列に対するアミノ酸の付加もまたなされてもよい。これは、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの性質を変更するためになされてもよい（例えば、融合タンパク質に関して上記で説明したように、同定、精製または発現を補助するため）。
【００３８】
上記（ａ）で示される配列に対するアミノ酸の変更は、適当な技術を用いて、例えば、特定部位の突然変異誘発(Hutchinson et al. (1978)  J. Biol. Chem. 253:6551)を用いることによってなされてもよい。
【００３９】
本発明の範囲に含まれるアミノ酸の置換または付加は、天然のまたは非天然のアミノ酸を用いてなされてもよいと考えるべきである。天然のあるいは合成のアミノ酸を使用するかどうかにかかわらず、Ｌ−アミノ酸のみが存在することが好ましい。どんなアミノ酸の変更（置換、付加または欠失による）がなされる場合でも、本発明の好ましいポリペプチドは、上記ａ）に規定されるポリペプチドと少なくとも５０％の配列の同一性を有しており、より好ましくは、配列の同一性の程度は少なくとも７５％である。少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の配列の同一性が最も好ましい。
【００４０】
「同一性」ということばは、２つのポリペプチド配列間の類似性を説明するのに使用できる。アミノ酸配列の同一性の程度は、「ｂｅｓｔｆｉｔ」等のプログラムを用いて算出でき(Smith and Waterman (1981) Advances in Applied Mathematics, 482-489)、任意の２配列間で最良の類似性を有するセグメントが見出せる。アライメントは、Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed pp 353-358によって記載されるものなど、アミノ酸の類似性のマトリックスを用いて達成されるスコアを最大にすることによる。
【００４１】
この方法を実施するのに当該分野において既知であるソフトウェアパッケージとしては、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムがある。これは、２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較して、適切になるようにいずれかの配列にスペースを挿入することによって最適なアライメントを見出す。最適なアライメントに関するアミノ酸の同一性または類似性（同一性＋アミノ酸タイプの保存）もまた、ＢＬＡＳＴｘ等のソフトウェアパッケージを用いて算出できる。このプログラムは、同様の配列を最長のストレッチで並べて、適合(fit)に対する値を割り当てる。一つのパターンの比較について、それぞれ異なるスコアを有する、類似する様々な領域を見つける。当業者は、異なる長さの２つのポリペプチドがより長い断片の全長にわたって比較されると考えるであろう。または、小さな領域を比較してもよい。一般的には、有用な比較をするために、同じ長さの配列を比べる。高度な配列の同一性が存在する場合には、アミノ酸配列にはほとんど相違はないであろう。ゆえに、これらの相違は、例えば、２０個未満、１０個未満、または５個未満の相違である。
【００４２】
（ｃ）の概念に含まれるポリペプチド：
上述したように、得られる長さの短いポリペプチドが依然として所望の活性を有しているあるいは有用な抗体を産生できる場合には、ポリペプチドの長さは短い方が好ましいことが多い。したがって、本発明の（ｃ）の態様は、上記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの断片を含むものである。当業者は、上記した技術を用いて特定の断片が活性を有するかどうかを決定できる。好ましい断片は、少なくとも１０アミノ酸長である。少なくとも２０、少なくとも５０または少なくとも１００アミノ酸長であってもよい。
【００４３】
以下に述べるように、ＣＤ２７Ｌポリペプチドは、上皮誘導性癌への免疫療法アプローチに用途があるであろう。当業者は、一以上のＣＤ２７Ｌポリペプチドの調製には、組換ＤＮＡ技術を用いたアプローチが好ましいと考えるであろう。
【００４４】
本発明をより十分に理解するために、上記（ｄ）〜（ｈ）の概念に含まれる核酸を、ここでより詳細に説明する。
【００４５】
ＣＤ２７Ｌポリペプチドは、暗号コードの既知の縮重を考慮して、広範な核酸分子によってコードされうる。これらの分子すべてが本発明で使用できる。これらは、ベクターに挿入され、クローニングされて、さらに研究するために大量のＤＮＡまたはＲＮＡが得られる。当業者に既知の技術を用いて、適当なベクターを宿主細胞に導入することによって、本発明のポリペプチドを発現させることができる。
【００４６】
ポリペプチドのクローニング、発現及び精製技術は当業者に既知である。ＤＮＡ構築物は、当該分野において既知の方法を用いて容易に得ることができる。これらの技術は、例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning 2ndEdition, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)に；Old & Primrose Principles of Gene Manipulation 5th Edition, Blackwell Scientific Publications (1994)に；およびStryer [Biochemistry 4th Edition, W H Freeman and Company (1995)]に開示される。次に、プロモーター、エンハンサー、シグナル配列、リーダー配列、翻訳開始及び終了シグナルならびにＤＮＡ安定性制御領域の付加などのＤＮＡ構築物及び発現タンパク質の修飾が行なわれてもよい。
【００４７】
一般的に、ＤＮＡ構築物をベクターに挿入するが、この際、ベクターはファージまたはプラスミド由来であってもよい。タンパク質の発現は、ベクターを真核または原核生物由来であってもよい宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクションすることによって達成される。このようなベクター及び適当な宿主細胞は、本発明の第三及び第四の概念を形成する。
【００４８】
核酸構造の知得は、抗体を生じるのにおよび遺伝子療法に使用できる。このための技術は、当業者には既知である。
【００４９】
適当な発現系を使用することによって、ＣＤ２７Ｌポリペプチドを配糖化あるいは非配糖化形態で発現してもよい。非配糖化形態は、大腸菌(E. coli)等の原核生物宿主での発現によって製造できる。
【００５０】
Ｎ末端メチオニンを有するポリペプチドは特定の発現系を用いて製造されるが、成熟ポリペプチドはこの残基を欠失しているであろう。
【００５１】
ＣＤ２７Ｌポリペプチドをクローニングし、発現させ、及び精製するための好ましい技術を、以下のように要約する。
【００５２】
ポリペプチドは、自然にまたは変性条件下で調製されてもよく、次に再生されて(refolded)もよい。バキュロウィルスの発現ベクターとしては、分泌プラスミド（Pharmingen製のｐＡＣＧＰ６７など）があるが、これは、検出を補助し、タンパク質を次で精製させるためにフレーム（例えば、ｍｙｃ、Ｖ５またはＨｉｓ）内にエピトープタグ配列がクローニングされていてもよい。哺乳動物の発現ベクターとしては、ｐＣＤＮＡ３及びｐＳｅｃＴａｇ（双方ともInvitrogen）、ならびにｐＲＥＰ９及びｐＣＥＰ４（Invitrogen）がある。大腸菌(E. coli)系としては、ｐＢａｄシリーズ（Ｈｉｓ標識−Invitrogen）またはｐＧｅｘシリーズ（Pharmacia）がある。
【００５３】
「同一性」ということばは、２つの個々のＤＮＡ配列間の類似性を説明するのに使用できる。「ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラム（Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)）は、２つの核酸配列間で最良の類似性を有するセグメントを見つけるのに使用されるコンピューターソフトウェアタイプの一例であり、ＧＡＰプログラムは、配列を全長にわたって並べることができ、適切になるようにいずれかの配列にスペースを挿入することによって最適なアライメントを見出す。上記（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のいずれかと実質的な同一性を示す配列が、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の配列の同一性を有すると、好ましい。
【００５４】
本明細書では「コーディング」核酸分子と称する、ＣＤ２７Ｌポリペプチドをコードする核酸分子に加えて、本発明はまた、これに相補的な核酸分子をも包含する。ゆえに、例えば、２本鎖の核酸分子の双方の鎖とも本発明で使用される（これらが相互に会合しているか否にかかわらず）。また、ｍＲＮＡ分子及び相補的なＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）もまた包含される。
【００５５】
上記した核酸分子のいずれかとハイブリッド形成できる核酸分子もまた本発明で使用されてもよい。このような核酸分子は、本明細書では「ハイブリッド形成」核酸分子と称する。ハイブリッド形成核酸分子は、例えば、プローブまたはプライマーとして使用できる。望ましくは、このようなハイブリッド形成分子は、少なくとも１０ヌクレオチド長であり、好ましくは少なくとも２５または少なくとも５０ヌクレオチド長である。ハイブリッド形成核酸分子は、好ましくは上記（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）の概念に含まれる核酸と特異的にハイブリッド形成する。望ましくは、ハイブリッド形成分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこのような分子とハイブリッド形成するであろう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例としては、所望のハイブリッド形成を、約０．９モルの塩溶液を用いて約３５℃〜約６５℃の温度で行なう。しかしながら、当業者は、プローブの長さ、塩基組成、存在するイオンのタイプなどの変数を考慮して適当であるような条件に変えることができるであろう。
【００５６】
タンパク質をコード化するＤＮＡの操作は、タンパク質を修飾するのにおよび精製目的で大量のタンパク質を得るのに特に強力な技術である。これには、所望の核酸配列を増幅するＰＣＲ技術の使用がある。ゆえに、本明細書で提供される配列データは、所望の配列を標的とし、さらに高度に増幅できるようにＰＣＲに使用されるプライマーを設計するのに使用できる。具体的には、プライマーは、少なくとも５ヌクレオチド長であり、通常、少なくとも１０ヌクレオチド長（例えば、１５〜２５ヌクレオチド長）であろう。場合によっては、少なくとも３０または少なくとも３５ヌクレオチド長のプライマーが使用されてもよい。
【００５７】
さらなる別法として、化学合成を使用してもよい。これは自動化されてもよい。比較的短い配列が化学的に合成され、一緒に連結されて、より長い配列を得る。プライマーおよび／またはプローブとして使用する以外に、本発明のハイブリッド形成核酸分子は、相補的な核酸分子に結合させることによってＣＤ２７Ｌポリペプチドの発現を変えるアンチセンス分子として使用できる。この技術は、アンチセンス療法に使用できる。本発明のハイブリッド形成核酸分子は、上記（ｄ）〜（ｈ）の概念に含まれる核酸分子とその全長にわたって高度の配列の同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の配列の同一性）を有してもよい。当業者には理解されるように、所定の１本鎖の核酸分子の他の核酸分子との配列の同一性が高いほど、適当な条件下で当該他の核酸分子と相補的である核酸分子にハイブリッド形成する可能性が高い。
【００５８】
上記で使用される際の「ＲＮＡ等価物」ということばは、ＲＮＡでの「Ｕ」は遺伝コードでは「Ｔ」に置換するという事実を考慮して、所定のＲＮＡ分子が所定のＤＮＡ分子の配列と相補的である配列を有することを示す。核酸分子は、単離された、組換体のあるいは化学的に合成された形態でもあってもよい。
【００５９】
前記説明を鑑みて、当業者は、非常に多数の核酸が本発明の範囲に含まれると考えるであろう。特記しない限り、本発明の核酸分子は、さらに以下の一以上の特性を有してもよい：
−核酸分子は、１本鎖または２本鎖であってもよい；
−核酸分子は、組換体の形態で提供されても、即ち、５’および／または３’フランキング配列に共有結合して、天然では生じない分子を提供してもよい；
−核酸分子は、一般的に天然で生じる５’および／または３’フランキング配列なしで提供されてもよい；および
−核酸分子は、実質的に純粋な形態で提供されてもよい。ゆえに、核酸分子は、混入タンパク質をおよび／または他の核酸を実質的に含まない形態で提供されてもよい。
【００６０】
本明細書中で記載される、ＣＤ２７Ｌは、上皮誘導性癌、特に腎癌および／または結腸直腸癌と関連があり、そのままで、検出および／または診断の手段を提供する。一実施態様においては、このような検出、定量、スクリーニング、診断、予防、または治療のための処置の簡便な手段は、抗体の使用を含むであろう。ゆえに、ＣＤ２７Ｌポリペプチドはまた、抗体を生じるのにも使用される。ゆえに、さらなる態様においては、本発明は、ＣＤ２７Ｌポリペプチドに結合する、抗体を用いる。好ましい抗体は、ＣＤ２７Ｌポリペプチドを精製するおよび／またはこのようなポリペプチドの活性を阻害するのに使用できるように、ＣＤ２７Ｌポリペプチドに特異的に結合する。
【００６１】
ゆえに、ＣＤ２７Ｌポリペプチドは、ＣＤ２７Ｌポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を生じるための免疫原として使用される。これらは、本明細書ではＣＤ２７Ｌ抗体と称する。ＣＤ２７Ｌ抗体としては、以下に制限されないが、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって製造される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびに上記したいずれかのエピトープ結合断片が挙げられる。本明細書で使用される「抗体」ということばは、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、即ち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれのクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）またはサブクラスであってもよい。
【００６２】
抗体を生産するにあたって、所望の抗体のスクリーニングは、当該分野において既知の技術、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素様免疫吸着法）によって達成されうる。例えば、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの特定のドメインを認識する抗体を選択するために、このようなドメインを含むポリペプチド断片に結合する産物について産生したハイブリドーマをアッセイしてもよい。第一のポリペプチド同族体には特異的に結合するが第二にポリペプチド同族体には特異的に結合しない（またはあまり強く結合しない）抗体を選択するためには、第一のポリペプチド同族体への陽性の結合および第二のポリペプチド同族体への結合の欠失（または結合の抑制）に基づいて選択できる。
【００６３】
モノクローナルＣＤ２７Ｌ抗体（ｍＡｂ）の調製のために、培養物中で連続細胞系により抗体分子を生産させる技術が使用される。例えば、Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495-497)によってもともと開発されたハイブリドーマ技術、さらにはトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72)、及びヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＤなどのいずれかの免疫グロブリンのクラスならびにこれのサブクラスであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、in vitroまたはin vivoで培養してもよい。本発明のさらなる実施態様においては、ｍＡｂは、既知の技術（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５）を用いて無菌動物で生産されてもよい。
【００６４】
ｍＡｂとしては、以下に制限されないが、ヒトｍＡｂ及びキメラｍＡｂ（例えば、ヒト−マウスキメラ）がある。キメラ抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域及びマウスｍＡｂ由来の可変領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種由来である分子である。（米国特許第４，８１６，５６７号；及び米国特許第４，８１６，３９７号を参照、これらは参考で全体を本明細書中に引用する。）ヒト化抗体は、非ヒト種由来の一以上の相補性決定領域(complementarity demteining region)（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する非ヒト種由来の抗体分子である。（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照、これらは参考で全体を本明細書中に引用する。）
キメラ及びヒト化ｍＡｂは、当該分野において既知の組換ＤＮＡ技術、例えば、ＷＯ  ８７／０２６７１；ＥＰ  １８４，１８７；ＥＰ  １７１，４９６；ＥＰ  １７３，４９４；ＷＯ  ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；ＥＰ  １２５，０２３；Better et al. (1988) Science 240:1041-1043；Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  84:3439-3443；Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526；Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  84:214-218；Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005；Wood et al. (1985) Nature 314:446-449；およびShaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559；Morrison (1985) Science 229:1202-1207；Oi et al. (1986,)Bio/Techniques 4:214；米国特許第５，２２５，５３９号；Jones et al. (1986) Nature 321:552-525；Verhoeyan et al. (1988) Science  239:1534；およびBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060に記載される方法を用いることによって、製造できる。
【００６５】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療のための処置に特に望ましい。このような抗体は、内因性の免疫グロブリンの重及び軽鎖遺伝子を発現することはできないが、ヒト重及び軽鎖遺伝子を発現することはできる形質転換マウスを用いて生産できる。形質転換マウスを、所定の抗原、例えば、ＣＤ２７Ｌポリペプチドのすべてまたは一部を用いて一般的な方法で免疫処置する。この抗原に対するｍＡｂは、公知のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。形質転換マウスから集められたヒト免疫グロブリントランスジーンは、Ｂ細胞分化中に再配列し、さらにクラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。ゆえに、このような技術を用いて、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するこの技術の大要については、Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)を参照。ヒト抗体及びヒトｍＡｂを産生するこの技術ならびにこのような抗体を産生するプロトコルの詳細な説明に関しては、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，０１６号；及び米国特許第５，５４５，８０６号を参照。
【００６６】
所定のエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド下選択(guided selection)」と称される技術を用いて得られる。このアプローチでは、所定の非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする。(Jespers et al. (1994) Bio/technology 12:899-903)。
【００６７】
ＣＤ２７Ｌ抗体はまた、当該分野において既知の様々なファージディスプレイ法(phage display method)を用いても得られる。ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインを、これらをコード化するポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上にディスプレイする。特に、このようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現する抗原結合ドメインをディスプレイするのに使用できる。有用な抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識抗原または固体表面若しくはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて、選択または同定できる。これらの方法に使用されるファージとしては、具体的には、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換により融合したＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現するｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージがある。本発明の抗体を作製するのに使用できるファージディスプレイ法としては、Brinkman et al (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50；Ames et al. (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleborough et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persic et al. (1997) Gene 187 9-18; Burton et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；ＷＯ  ９０／０２８０９；ＷＯ  ９１／１０７３７；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９３／１１２３６；ＷＯ  ９５／１５９８２；ＷＯ  ９５／２０４０１；及び米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号及び第５，９６９，１０８号に開示されるものがある；これらは参考で全体を本明細書中に引用する。
【００６８】
上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後は、例えば、以下に詳細に記載されるようにして、ファージ由来の抗体コーディング領域を、単離し、これを用いて、ヒト抗体等の完全な抗体、または他の所望の抗原結合断片を得、さらに哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌等の、所望の宿主で発現させてもよい。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を組換により産生する技術はまた、 ＷＯ  ９２／２２３２４；Mullinax et al. (1992) BioTechniques 12(6):864-869；及びSawai et al. (1995) AJRI 34:26-34及びBetter et al. (1988) Science 240:1041-1043（これらの参考文献は参考で全体を本明細書中に引用する）に開示されるものなど当該分野において既知の方法を用いて利用できる。
【００６９】
単鎖Ｆｖ及び抗体を産生するのに使用できる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２５８，４９８号；Huston et al. (1991) Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al. (1993) PNAS 90:7995-7999；及びSkerra et al. (1988) Science 240:1038-1040に記載されるものがある。
【００７０】
本発明はさらに、当該分野において既知の方法によって作製される、二重特異性抗体の使用を提供するものである。全長の二重特異性抗体の慣用的な生産は、２つの鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現によるものである(Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539)。免疫グロブリンの重及び軽鎖のランダムな組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クオドローマ(quadroma)）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生産し、これらの抗体分子のうち１つのみが正確な二重特異性構造を有する。正確な分子の精製は、一般的には、アフィニティークロマトグラフィー段階によって行なわれるが、むしろ扱いにくく、生成物の収率が低い。同様の方法が、ＷＯ  ９３／０８８２９に、及びTraunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659に開示される。
【００７１】
異なる及びより好ましいアプローチによると、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合させる。この融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を有する、免疫グロブリンの重鎖定常ドメインを用いる。軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が融合物の少なくとも一に存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および、必要であれば、免疫グロブリン軽鎖をコード化するＤＮＡを、別の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物体に同時にトランスフェクションする。これにより、構築に使用される異なる割合の３つのポリペプチド鎖から最適な収率が得られる実施態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合を調節するとかなりの柔軟性が得られる。しかしながら、等しい割合の少なくとも２のポリペプチド鎖の発現が高収率で起こる場合または割合に特に有意性がない場合には、３つのポリペプチド鎖のうちの２個またはすべてのコーディング配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００７２】
このアプローチの一実施態様においては、二重特異性抗体が、一つのアームに第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）から構成される。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することにより分離が容易であるので、この非対称構造により望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物を容易に分離できることが見出された。このアプローチは、ＷＯ  ９４／０４６９０に開示される。二重特異性抗体を得るための更なる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210を参照。
【００７３】
本発明はまた、ＣＤ２７Ｌ抗体の機能上活性のある断片、誘導体または類似体を用いるものである。機能上活性のあるとは、その断片、誘導体または類似体が、その断片、誘導体または類似体がそれ由来である抗体によって認識される同じ抗原を認識する抗−抗イディオタイプ抗体（即ち、三次抗体）を誘発できることを意味する。詳細には、好ましい実施態様においては、免疫グロブリン分子のイディオタイプの抗原性は、抗原を特異的に認識するＣＤＲ配列のＣ末端側のフレームワーク及びＣＤＲ配列の欠失によって促進される。どのＣＤＲ配列が抗原に結合するかを決定するために、ＣＤＲ配列を含む合成ペプチドが、当該分野において既知の結合アッセイ法によって抗原との結合アッセイに使用できる。
【００７４】
本発明は、以下に制限されないが、Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦａｂ断片などの抗体断片を使用するものである。特定のエピトープを認識する抗体断片は、既知の技術によって得られる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインから構成され、抗体分子のペプシン消化によって得られる。Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって得られる。本発明はまた、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖ダイマー、またはＦｖ若しくは単鎖抗体（ＳＣＡ）等のこれらの最小断片（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号；Bird (1988) Science 242:423-42；Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；及びWard et al. (1989) Nature 334:544-54に記載されるような)、または本発明の抗体と同じ特異性を有する他の分子を提供する。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重及び軽鎖断片を連結し、これにより１本鎖ポリペプチドを得ることによって形成される。大腸菌での機能性Ｆｖ断片のアセンブリに関する技術を使用してもよい(Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041)。
【００７５】
他の実施態様においては、本発明は、例えば、免疫グロブリンが、免疫グロブリンでない他のタンパク質（またはこれの一部、好ましくはタンパク質の少なくとも１０、２０または５０アミノ酸部分）のアミノ酸配列に対してＮ末端またはＣ末端のいずれかで、共有結合（例えば、ペプチド結合）を介して融合する、ＣＤ２７Ｌ抗体（またはこれの機能上活性のある断片）の融合タンパク質を使用するものである。好ましくは、ＣＤ２７Ｌ抗体、またはこの断片は、定常ドメインのＮ末端で他のタンパク質に共有結合する。上述したように、このような融合タンパク質は、精製が容易であり、in vivoでの半減期が上がり、さらに免疫系への上皮バリアを介した抗原のデリバリーを促進する。
【００７６】
使用されるＣＤ２７Ｌ抗体としては、修飾される、即ち、このような共有結合が免疫特異的結合を損なわない限りいずれのタイプの分子の共有結合による類似体及び誘導体がある。例えば、以下に制限されないが、ＣＤ２７Ｌ抗体の誘導体及び類似体としては、例えば、配糖化、アセチル化、ＰＥＧ化(pegylation)、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導化(derivatisation)、タンパク質分解による切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などにより、さらに修飾されるものがある。多数の化学的な修飾が、以下に制限されないが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化などの、既知の技術によってなされてもよい。加えて、類似体または誘導体は、一以上の非古典的アミノ酸を含んでいてもよい。
【００７７】
前記ＣＤ２７Ｌ抗体は、例えば、これらのタンパク質を撮像するまたは放射線撮像する(radioimaging)する、適当な生体試料におけるこのレベルを測定するために、診断方法などに、及び放射線療法のために、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの局在化及び活性に関連する当該分野において既知の方法に使用できる。
【００７８】
ＣＤ２７Ｌ抗体は、抗体の合成に関する当該分野において既知の方法によって、特に、化学合成によってまたは組換発現によって、製造でき、好ましくは、組換発現技術によって製造される。
【００７９】
ＣＤ２７Ｌ抗体の組換発現には、抗体をコード化する核酸の構築が必要である。抗体のヌクレオチド配列が知られている場合には、（例えば、Kutmeier et al. (1994) BioTechniques 17:242に記載されるようにして）その抗体をコード化する核酸を化学的に合成したオリゴヌクレオチドからアセンブリしてもよい。この方法は、簡単にいうと、抗体をコード化する配列の部分を含むオリゴヌクレオチドを重ねる合成を行い、これらのオリゴヌクレオチドをアニーリング及び連結し、さらにＰＣＲによって連結されたオリゴヌクレオチドを増幅することを含む。
【００８０】
または、抗体をコード化する核酸は、抗体をクローニングすることによって得てもよい。特定の抗体をコード化する核酸を含むクローンは市販されていないが、抗体分子の配列は知られている場合には、抗体をコード化する核酸は、配列の３’若しくは５’末端にハイブリッド形成可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によってまたは特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングすることによって適当な源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する組織若しくは細胞から得られたｃＤＮＡライブラリー）から得てもよい。
【００８１】
特定の抗原を特異的に認識する抗体分子（またはこのような抗体をコード化する核酸をクローニングするためのｃＤＮＡライブラリーの源）が市販されていない場合には、特定の抗原に特異的な抗体は、当該分野において既知の方法によって、例えば、ウサギ等の、動物を免疫処置して、ポリクローナル抗体を得ることによってまたは、より好ましくは、モノクローナル抗体を得ることによって、得られる。または、抗体の少なくともＦａｂ部分をコード化するクローンを、（例えば、Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281に記載されるのと同様にして）特定の抗原に結合するＦａｂ断片のクローンに関するＦａｂ発現ライブラリーをスクリーニングすることによってまたは抗体ライブラリーをスクリーニングする（例えば、Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937を参照）ことによって得てもよい。
【００８２】
抗体分子の少なくとも可変ドメインをコード化する核酸が得られたら、これを抗体分子の定常領域をコード化するヌクレオチド配列を含むベクターに導入する（例えば、ＷＯ  ８６／０５８０７；ＷＯ  ８９／０１０３６；及び米国特許第５，１２２，４６４号を参照）。核酸と同時発現させて完全な抗体分子を発現させるための完全な軽または重鎖を含むベクターを用いてもよい。次に、抗体をコード化する核酸は、鎖内ジスルフィド結合に関係する一以上の可変領域のシステイン残基をスルフヒドリル基を持たないアミノ酸残基に置換する（または欠失させる）のに必要なヌクレオチド置換（または欠失）を導入するのに使用されてもよい。このような修飾は、例えば、以下に制限されないが、化学突然変異誘発、in vitroでの特定部位の突然変異誘発(Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551)、ＰＣＲを用いる方法などの、ヌクレオチド配列に特定の変異または欠失を導入するための当該分野において既知の方法によって行なわれる。
【００８３】
加えて、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子を、適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによって「キメラ抗体」を生産することを目的として開発された技術(Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al. (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al. (1985) Nature 314:452-454)が使用できる。上述したように、キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変領域及びヒト抗体定常領域を有するもの、例えば、ヒト化抗体などの、異なる部分が異なる動物種由来である分子である。
【００８４】
ＣＤ２７Ｌ抗体をコード化する核酸が得られたら、抗体分子を生産するためのベクターを、当該分野において既知の技術を用いて組換ＤＮＡ技術によって生産してもよい。ゆえに、抗体分子配列を含む核酸を発現することによる本発明のタンパク質の調製方法が本明細書中に記載される。当業者に既知の方法が、抗体分子のコーディング配列ならびに適当な転写及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するのに使用できる。これらの方法としては、例えば、in vitroの組換ＤＮＡ技術、合成技術、及びin vivoの遺伝子組み換えがある。例えば、Sambrook et al. (1990), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 及び Ausubel et al. (eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY)に記載される技術を参照。
【００８５】
発現ベクターは、公知の技術によって宿主細胞に転移され、次に、トランスフェクトされた細胞を公知の技術によって培養して、本発明の抗体を生産する。
【００８６】
組換ＣＤ２７Ｌ抗体を発現するのに使用される宿主細胞は、大腸菌等の細菌細胞、または好ましくは、特に全組換抗体分子を発現するための、真核生物細胞のいずれであってもよい。特に、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間初期遺伝子プロモーター要素(major intermediate early gene promoter element)等のベクターと組み合わせた、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳動物細胞が、抗体の有効な発現系である(Foecking et al. (1998) Gene 45:101; Cockett et al. (1990) Bio/Technology 8:2)。
【００８７】
様々な宿主−発現ベクター系が、ＣＤ２７Ｌ抗体を発現するのに利用される。このような宿主−発現系は、これにより有益なコーディング配列が生産された後精製されるベヒクルを表わすが、適当なヌクレオチドのコーディング配列で形質転換またはトランスフェクションされると、in situで本発明の抗体分子を発現する細胞をも表わす。これらとしては、以下に制限されないが、抗体のコーディング配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis)）などの微生物；抗体のコーディング配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピチア属(Pichia)）；抗体のコーディング配列を含む組換えウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）で感染させた昆虫細胞系；抗体のコーディング配列を含む組換えウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染された若しくは抗体のコーディング配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム由来（例えば、メタロチオネインプロモーター）若しくは哺乳動物ウィルス（例えば、アデノウィルスレイトプロモーター(adenovirus late promoter)；ワクシニアウィルス  ７．５Ｋプロモーター）由来のプロモーターを含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ  ２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられる。
【００８８】
細菌系では、数多くの発現ベクターが発現される抗体分子に意図された用途によって好ましく選択される。例えば、抗体分子を含む薬剤組成物を得るために、大量のこのようなタンパク質を製造しようとする際には、容易に精製される融合タンパク質産物を高レベルで発現させるベクターが望ましい。このようなベクターとしては、以下に制限されないが、融合タンパク質が製造されるように、抗体のコーディング配列がｌａｃＺコーディング領域と同じフレームになるようにベクター中に個々に連結される、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８(Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791)；ｐＩＮベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509)などが挙げられる。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるのに使用される。通常、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズに吸着及び結合させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって溶解細胞から容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされたターゲット遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出されうるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【００８９】
昆虫系では、オートグラファ  カリフォルニア核多角体病ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)（ＡｃＮＰＶ）が外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。このウィルスはスポドプテラ  フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞中で成長する。抗体のコーディング配列を、ウィルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン(polyhedrin)遺伝子）中に個々にクローニングして、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリン(polyhedrin)プロモーター）の制御下においてもよい。哺乳動物の宿主細胞では、数多くのウィルスを用いた発現系（例えば、アデノウィルス発現系）が使用される。
【００９０】
上述したように、挿入された配列の発現を調節する、または望ましい特定の方法で遺伝子産物を修飾及び処理する宿主細胞株が選ばれる。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、配糖化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要である。
【００９１】
組換えＣＤ２７Ｌ抗体を長期間、高収率で生産するためには、安定した発現が好ましい。例えば、ＣＤ２７Ｌ抗体を安定して発現する細胞系は、抗体のヌクレオチド配列及び選択可能なヌクレオチド配列（例えば、ネオマイシンまたはハイグロマイシン）を有する発現ベクターで細胞をトランスフェクションして、選択マーカーの発現で選択することによって、製造できる。このように操作された細胞系は、抗体分子と直接または間接的に相互作用する物質のスクリーニング及び評価に特に有用である。
【００９２】
抗体分子の発現レベルは、ベクターの増幅によって増加できる（レビューとして、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)を参照）。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能である際には、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加によりマーカー遺伝子のコピー数が増加するであろう。増幅された領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体の生産もまた向上するであろう(Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257)。
【００９３】
宿主細胞は、２種の発現ベクターで同時にトランスフェクション(co-transfect)されてもよいが、この際、第１のベクターは重鎖由来のポリペプチドをコード化し、第２のベクターは軽鎖由来のポリペプチドをコード化する。この２種のベクターは、重及び軽鎖のポリペプチドを同等に発現できる同じ選択マーカーを含んでもよい。または、重及び軽鎖のポリペプチド双方をコード化する単一のベクターを用いてもよい。このような状況では、軽鎖は、過剰の毒性のある遊離重鎖を防止するために重鎖の前に置かれなければならない(Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197)。重及び軽鎖に関するコーディング配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んでもよい。
【００９４】
ＣＤ２７Ｌ抗体分子が組換えにより発現したら、この抗体分子は、抗体分子の精製に関する当該分野において既知の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたは特定の抗原を用いるなどのアフィニティクロマトグラフィー、及びサイズカラムクロマトグラフィー(sizing column chromatography)）、遠心、較差溶解度(differential solubility)によって、またはタンパク質の精製に関する他の標準的な技術によって、精製されてもよい。
【００９５】
または、融合タンパク質は、発現される融合タンパク質に特異的な抗体を用いることによって容易に精製される。例えば、Janknecht et al.によって記載されるシステムによって、ヒト細胞系で発現する非変性融合タンパク質が容易に精製できる(Janknecht et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897)。このシステムでは、有益な遺伝子を、遺伝子のオープンリーディングフレームが６個のヒスチジン残基から構成されるアミノ末端タグに翻訳により融合されるように、ワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングする。タグは、融合タンパク質のマトリックス結合ドメインとして作用する。組換えワクシニアウィルスで感染させた細胞からの抽出物を、Ｎｉ２＋ニトリル酢酸(nitriloacetic acid)−アガロースカラムにのせ、ヒスチジン標識タンパク質(histidine-tagged protein)をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出する。
【００９６】
好ましい実施態様において、ＣＤ２７Ｌ抗体またはこの断片は、診断または治療部分と共役する。このＣＤ２７Ｌ抗体は、診断にまたは所定の処置計画の有効性を決定するのに使用できる。検出は抗体を検出可能な物質にカップリングすることによって容易に行なえる。検出可能な物質としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子射出断層撮影に使用される）、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。一般的に、本発明による診断として使用される抗体に共役できる金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照。適当な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適当な補欠分子族としては、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが挙げられる；適当な蛍光材料としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン(dichlorotriazinylamine fluorescein)、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられる；適当な発光材料としては、ルミノールが挙げられる；適当な生物発光材料としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる；さらに、適当な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃが挙げられる。
【００９７】
ＣＤ２７Ｌ抗体を、治療剤または薬剤部分(drug moiety)に共役して所定の生物学的な応答を修飾してもよい。治療剤または薬剤部分は、典型的な化学治療剤に限定されると解されるものではない。例えば、薬剤部分は、所望の生物学的な活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌のエキソトキシン(pseudomonas exotoxin)、若しくはジフテリア毒素等の毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓剤または抗脈管形成剤(anti-angiogenic agent)、例えば、アンギオスタチン(angiostatin)若しくはエンドスタチン(endostatin)等のタンパク質；または、リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor)（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子(granulocyte colony stimulating factor)（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）若しくは他の成長因子等の生体応答調節剤が挙げられる。
【００９８】
このような治療部分の抗体への共役技術は既知であり、例えば、Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)を参照。
【００９９】
または、抗体を、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されるのと同様にして２次抗体に共役して抗体異種共役体(antibody heteroconjugate)を形成してもよい。
【０１００】
治療部分が共役されたまたは共役されない抗体を、単独でまたは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与される治療剤として使用してもよい。
【０１０１】
本発明による診断方法は、以下に制限されないが、免疫沈降、その後にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、２次元電気泳動、免疫細胞化学、免疫組織化学、イムノアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素様免疫吸着法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈殿反応、ゲル拡散沈降反応(gel diffusion precipitin reaction)、免疫拡散アッセイ(immunodiffusion assay)、凝集アッセイ(agglutination assay)、補体固定化アッセイ(complement-fixation assay)、免疫放射定量測定法(immunoradiometric assay)、蛍光イムノアッセイ(fluorescent immunoassay)およびプロテインＡイムノアッセイ(protein A immunoassays)などの、当業者に既知の数多くの方法を用いて行なわれる。
【０１０２】
本発明はまた、上記したＣＤ２７Ｌポリペプチドに対する捕捉試薬（例えば、抗体）を含む、診断キットを提供する。加えて、このようなキットは、必要であれば、一以上の下記を含んでいてもよい：
（１）診断、予想、治療のためのモニターまたはこれら用途の組み合わせのための捕捉試薬を用いるための説明書；
（２）捕捉試薬に対する標識結合パートナー(labeled binding partner)；
（３）捕捉試薬が固定化される固相（試薬ストリップなど）；および
（４）診断、予想若しくは治療用途またはこれらの組み合わせに関する規定承認を示すラベルまたはインサート。
【０１０３】
捕捉試薬に対する標識結合パーナーを提供しない場合には、抗ポリペプチド捕捉試薬自身が検出可能なマーカー、例えば、化学発光、酵素、蛍光、または放射性成分（上記参照）で標識されてもよい。
【０１０４】
さらなる実施態様においては、一以上の容器中に、適切な反応条件下で、ポリメラーゼ連鎖反応(例えばInnis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CAを参照)、リガーゼ連鎖反応（ＥＰ  ３２０，３０８号を参照）、Ｑβレプリカーゼの使用、サイクリックプローブリアクション（cyclic probe reaction）または当該分野において既知の他の方法などによって、ＣＤ２７Ｌ核酸分子の少なくとも一部分の増幅を開始できる一対のプライマーを有する診断キットが提供される。具体的には、プライマーは、少なくとも５ヌクレオチド長であり、好ましくは少なくとも１０〜２５ヌクレオチド長であり、より好ましくは１５〜２５ヌクレオチド長である。場合によっては、少なくとも３０または少なくとも３５ヌクレオチド長であるプライマーが使用されてもよい。
【０１０５】
生体試料は、血清サンプルまたは組織サンプル、例えば、腎臓または結腸組織など、いずれの源から得られてもよい。転移の証拠を探す際には、リンパ節、肝臓及び膵臓等、腎癌または結腸直腸癌の転移の主要な部位を見るであろう。
【０１０６】
さらなる実施態様においては、本発明は、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの発現若しくは活性またはＣＤ２７Ｌ核酸の発現を調節する抗上皮誘導性癌剤(anti-epithelial-derived cancer agent)に関するスクリーニング方法を提供する。これらの薬剤は上皮誘導性癌の処置に有用である。
【０１０７】
さらなる態様においては、本発明は、ＣＤ２７ＬポリペプチドまたはＣＤ２７Ｌ核酸と相互作用する抗上皮誘導性癌剤に関するスクリーニング方法を提供する。
【０１０８】
薬剤は、広範な候補物質から選択できる。候補物質の例としては、以下に制限されないが、核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）、抗体、炭水化物、脂質、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチドミメティックス(peptidomimetics)、小分子及び他の薬剤が挙げられる。物質は、生物学的なライブラリー(biological library)；空間的にアドレス可能な平行固相(spatially addressable parallel solid phase)または液相ライブラリー；逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー方法；「one-bead one-compound」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー方法などの、当該分野において既知のコンビナトリアルライブラリー(combinatorial library)方法において数多くのアプローチのいずれかを用いることにより得られる。生物学的なライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに適しているが、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用できる（Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145；米国特許第５，７３８，９９６号；及び米国特許第５，８０７，６８３号）。
【０１０９】
分子ライブラリーの合成方法に本明細書の記載に基づいて適当である方法の例は、当該分野において見出され、例えば、DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; 及び Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233に見出される。
【０１１０】
化合物のライブラリーは、提示されて(present)もよく、例えば、溶液中に（例えば、Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412-421）、またはビーズ(Lam, 1991, Nature 354:82-84)、チップ(Fodor, 1993, Nature 364:555-556)、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号；及び第５，２２３，４０９号）、プラスミド(Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)またはファージ(Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al,. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; 及び Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310)上に提示されてもよい。
【０１１１】
一実施態様において、ポリペプチドの発現を調節する物質は、細胞を用いるアッセイシステムで同定される。これによると、ＣＤ２７Ｌポリペプチドを発現する細胞を、候補物質またはコントロール物質と接触させて、候補物質がＣＤ２７Ｌポリペプチドの発現を変更できるかを決定する。さらなる実施態様においては、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの発現を参考範囲またはコントロールと比較してもよい。必要であれば、このアッセイは、複数（例えばライブラリー）の候補物質をスクリーニングするのに使用してもよい。例えば、細胞は、原核生物（例えば、大腸菌(E. coli)）由来であってもまたは真核生物（例えば、酵母または哺乳動物）由来であってもよい。さらに、細胞は、ＣＤ２７Ｌポリペプチドを内因的に発現してもまたはＣＤ２７Ｌポリペプチドを発現するように遺伝子操作されてもよい。候補物質がＣＤ２７Ｌポリペプチドの発現を変更できるかは、当業者に既知の方法によって、例えば、以下に制限されないが、フローサイトメトリー、放射線標識、シンチレーションアッセイ、免疫沈降またはウェスタンブロット分析によって決定できる。
【０１１２】
他の実施態様においては、細胞を用いるアッセイシステムを、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの活性を調節できる物質を同定するのに使用する。このようなアッセイでは、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの活性は、候補物質の存在下で、天然であるいは組換えによりＣＤ２７Ｌポリペプチドを発現する細胞の集団中で測定する。このようなアッセイでは、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの活性は、物質の存在下でおよび候補物質の不存在下で（例えば、コントロール物質の存在下で）、天然であるいは組換えによりＣＤ２７Ｌポリペプチドを発現する細胞の集団中で測定し、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの活性を比較する。次に、候補物質が、この比較に基づいてＣＤ２７Ｌポリペプチドの活性の刺激剤あるいは阻害剤として同定されうる。さらなる実施態様においては、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの活性は、候補物質の存在または不存在下で測定できる。好ましくは、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの活性を、参考範囲またはコントロールと比較する。
【０１１３】
他の実施態様においては、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの生産若しくは分解に応答できる、またはＣＤ２７Ｌポリペプチドの翻訳後修飾に応答できる、酵素等の物質、またはこの生物学的に活性のある部分が同定できる。１次スクリーニングでは、このような物質を同定するために、実質的に純粋な、天然の若しくは組換えにより発現するＣＤ２７Ｌポリペプチドまたは天然の若しくは組換えにより発現するＣＤ２７Ｌポリペプチドを含む細胞抽出物若しくは他のサンプルを、複数の候補物質、例えば、以下に制限されないが、ＣＤ２７Ｌポリペプチドのプロセシングに応答できるかもしれない、ライブラリーとして提示される複数の物質と接触させる。候補物質が、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの生産、分解または翻訳後修飾を調節できるかは、以下に制限されるものではないが、フローサイトメトリー、放射線標識、キナーゼアッセイ、ホスファターゼアッセイ、免疫沈降またはウェスタンブロット分析などの、当業者に既知の方法によって決定できる。
【０１１４】
さらなる他の実施態様においては、ＣＤ２７Ｌポリペプチドを発現する細胞を、複数の候補物質と接触させる。このような物質が、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの生産、分解または翻訳後修飾を調節できるかは、以下に制限されるものではないが、フローサイトメトリー、放射線標識、キナーゼアッセイ、ホスファターゼアッセイ、免疫沈降またはウェスタンブロット分析などの、当業者に既知の方法によって決定できる。
【０１１５】
一実施態様において、ポリペプチドの発現を調節する物質は、ＣＤ２７Ｌポリペプチドを発現する細胞（例えば、原核生物由来または真核生物由来の細胞）を、候補物質またはコントロール物質（例えば、リン酸緩衝生理食塩水；ＰＢＳ））と接触させて、ＣＤ２７ＬポリペプチドまたはＣＤ２７Ｌポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの発現を測定することによって同定される。候補物質の存在下でのＣＤ２７Ｌポリペプチドまたは当該ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの発現のレベルを、候補物質の不存在下での（例えば、コントロール物質の存在下での）ＣＤ２７Ｌポリペプチドまたは当該ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの発現のレベルと比較する。次に、候補物質が、この比較に基づいてＣＤ２７Ｌポリペプチドの発現の調節剤として同定できる。例えば、ＣＤ２７Ｌポリペプチド（またはそのｍＲＮＡ）の発現が候補物質の存在下での方が不存在下に比べて有意に大きい場合には、その候補物質はＣＤ２７Ｌポリペプチドの発現の刺激剤として同定される。または、ＣＤ２７Ｌポリペプチド（またはそのｍＲＮＡ）の発現が候補物質の存在下での方が不存在下に比べて有意に小さい場合には、その候補物質は当該ポリペプチドの発現の阻害剤として同定される。ＣＤ２７Ｌまたはこれをコード化するｍＲＮＡの発現のレベルは、当業者に既知の方法によって測定できる。例えば、ｍＲＮＡの発現は、ノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって評価でき、また、タンパク質のレベルは、以下に制限されないが、ウェスタンブロット分析によって評価できる。
【０１１６】
他の実施態様においては、ＣＤ２７Ｌポリペプチドの発現を調節する物質は、動物モデルで同定される。適当な動物の例としては、以下に制限されないが、マウス、ラット、ウサギ、サル、モルモット、イヌ及びネコが挙げられる。好ましくは、使用される動物は、上皮誘導性癌のモデルを表わす。この実施態様によると、候補物質またはコントロール物質は、適当な動物に（例えば、経口で、直腸にまたは腹腔内若しくは静脈内に等の非経口で）投与され、ＣＤ２７Ｌポリペプチド（またはそのｍＲＮＡ）の発現に関する効果を測定する。ポリペプチドの発現の変化は、上記で概説した方法によって評価できる。
【０１１７】
さらなる他の実施態様においては、ＣＤ２７Ｌポリペプチドは、ポリペプチドに結合するまたはこれと相互作用する他のタンパク質を同定するための２−ハイブリッドアッセイ(two-hybrid assay)または３ハイブリッドアッセイ(three hybrid assay)における「バイトタンパク質(bait protein)」として使用される（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号; Zervos et al., 1993, Cell 72:223-232; Madura et al. 1993, J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al., 1993, Bio/Techniques 14:920-924; Iwabuchi et al., 1993, Oncogene 8:1693-1696; 及びＷＯ  ９４／１０３００を参照）。当業者には理解されるように、このような結合タンパク質はまたＣＤ２７Ｌポリペプチドによるシグナルの伝達にかかわりがあると考えられ、例えば、これらは、ＣＤ２７Ｌポリペプチドを含むシグナル伝達経路の上流または下流要素であると考えられる。
【０１１８】
または、ＣＤ２７Ｌポリペプチドと相互作用できるポリペプチドが、ＣＤ２７Ｌポリペプチドを含むタンパク質複合体を単離し、マススペクトロメトリー等の当該分野において既知の方法を用いて会合したポリペプチドを同定することによって同定できる（例えば、Blackstock, W. & Weir, M. 1999, Trends in Biotechnology, 17: 121-127; Rigaut, G. 1999, Nature Biotechnology, 17: 1030-1032; Husi, H. 2000, Nature Neurosci. 3:661-669; Ho, Y. et al., 2002, Nature, 415:180-183; Gavin, A. et al., 2002, Nature, 415: 141-147を参照）。
【０１１９】
当業者はまた、ポリペプチドが、
１）ポリペプチドの３次元構造を決定し；
２）物質の反応性を有するまたは結合すると考えられる部位の３次元構造を推定し；
３）推定された反応性または結合部位に反応するまたは結合すると予想される候補物質を合成し；さらに
４）候補物質がポリペプチドの活性を調節できるかどうかを試験する
ことを有する、物質、特にポリペプチドの活性を調節する（例えば、刺激するまたは阻害する）ように作用する小分子の構造に基づく設計方法にも使用されるとも考えるであろう。
【０１２０】
上記方法は、反復工程であると考えられると思われる。
【０１２１】
本発明はさらに、上記スクリーニング方法によって同定される新規な物質および本明細書中に記載されるような治療を目的とするこれの使用を提供する。
【０１２２】
本明細書に記載されるように、本発明の物質は、上皮誘導性癌の治療に使用される。
【０１２３】
ゆえに、さらなる実施態様においては、本発明は、本発明の少なくとも一の物質、および必要であれば一以上の製薬上許容できる賦形剤、担体または希釈剤を含む薬剤組成物を提供する。一態様においては、薬剤組成物はワクチンとして使用され、このため、ワクチン用のさらなる成分が許容できるであろう。加えて、当業者は、一以上の適当なアジュバントがこのようなワクチン製剤に添加されてもよいと考えるであろう。
【０１２４】
本明細書で記載されるように、ＣＤ２７Ｌポリペプチド、ＣＤ２７Ｌ核酸及びＣＤ２７Ｌ抗体は、上皮誘導性癌の治療及び予防に使用できる。ゆえに、他の態様においては、本発明は、上皮誘導性癌の診断、治療および／または予防に使用される、少なくとも一のＣＤ２７Ｌポリペプチド、少なくとも一のＣＤ２７Ｌ核酸または少なくとも一のＣＤ２７Ｌ抗体、および必要であれば一以上の製薬上許容できる賦形剤、担体または希釈剤を含む薬剤組成物を提供する。一つの実施態様においては、ＣＤ２７Ｌポリペプチドは、ドミナントネガティブ変異体(dominant negative mutant)である。さらなる実施態様においては、ＣＤ２７Ｌポリペプチドは、構成上活性を有する(constitutively active)。好ましくは、薬剤組成物は、ワクチンとして使用され、このため、ワクチン用のさらなる成分が許容できるであろう。加えて、当業者は、一以上の適当なアジュバントがこのようなワクチン製剤に添加されてもよいと考えるであろう。
【０１２５】
一つの態様において、本発明は、被検者に、治療上有効な量の少なくとも一のＣＤ２７Ｌポリペプチド、ＣＤ２７Ｌ核酸またはＣＤ２７Ｌ抗体を投与することを有する、被検者の上皮誘導性癌の予防および／または治療方法を提供する。他の態様においては、本発明は、上皮誘導性癌の診断、予防および／または治療を目的とする組成物の調製における、少なくとも一のＣＤ２７Ｌポリペプチド、ＣＤ２７Ｌ核酸分子またはＣＤ２７Ｌ抗体の使用を提供する。
【０１２６】
組成物は、一般的に、通常、製薬上許容できる担体を含む滅菌されている薬剤組成物の一部として供給されるであろう。この薬剤組成物は、（患者への所望の投与方法によって）適当な形態を有するものであってもよい。これは、単位服用量形態(unit dosage form)で提供されてもよく、通常、密閉容器中で提供されるだろうし、また、キットの一部として提供されてもよい。このようなキットは、一般的に（必ずしもそうである必要はないが）、使用に関する使用説明書を含むであろう。また、複数の単位服用量形態を含むものであってもよい。
【０１２７】
薬剤組成物は、いずれかの適当な経路によって、例えば、経口（口腔内または舌下を含む）、直腸内、経鼻、局所（口腔内、舌下または経皮を含む）、経膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内または皮内を含む）経路による投与を目的として適用されてもよい。このような組成物は、薬学の分野において既知のいずれかの方法によって、例えば、滅菌条件下で活性成分を担体または賦形剤と混合することによって調製されてもよい。
【０１２８】
経口投与に使用される薬剤組成物は、カプセルまたは錠剤等の別個の単位として；粉末または顆粒として；溶液、シロップまたは懸濁液として（水性若しくは非水性液体における；または食用の発泡物若しくはホイップとして；またはエマルジョンとして）提示されてもよい。錠剤または硬質ゼラチンカプセルに適当な賦形剤としては、ラクトース、トウモロコシデンプンまたはこれの誘導体、ステアリン酸またはこれの塩が挙げられる。軟質ゼラチンカプセルに使用されるのに適当な賦形剤としては、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固体、または液状ポリオールなどが挙げられる。溶液及びシロップの調製を目的として、使用される賦形剤としては、例えば、水、ポリオール及び糖が挙げられる。懸濁液の調製を目的として、油（例えば、植物油）を用いて、水中油形または油中水形懸濁液を得てもよい。
【０１２９】
経皮投与に使用される薬剤組成物は、長期間、レシピエントの表皮とよく接触し続けるように意図された別個のパッチとして提示されてもよい。例えば、活性成分を、通常、Pharmaceutical Research (1986) 3(6):318に記載されるのと同様にして、イオン導入によってパッチからデリバリーしてもよい。
【０１３０】
局所投与に使用される薬剤組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルまたはオイルとして配合されてもよい。眼または他の外部組織、例えば、口及び皮膚の感染(infection)には、組成物は、好ましくは、局所軟膏またはクリームとして適用される。軟膏に配合される場合には、活性成分をパラフィン系または水混和性の軟膏基剤のいずれかと使用してもよい。または、活性成分を水中油形クリーム基剤または油中水形基剤とクリーム中で配合してもよい。眼への局所投与に使用される薬剤組成物としては、活性成分が適当な担体、特に水性溶剤に溶解または懸濁される点眼剤がある。口内への局所投与に使用される薬剤組成物としては、ロゼンジ、香錠及び口内洗剤が挙げられる。
【０１３１】
直腸内投与に使用される薬剤組成物は、坐剤または浣腸剤として提示されてもよい。
【０１３２】
担体が固体である経鼻投与に使用される薬剤組成物としては、吹入剤を摂取するように、即ち、鼻にまで接近して保持される粉末の容器から鼻腔を通じて迅速に吸入することによって投与される、例えば、２０〜５００ミクロンの粒度を有する粗い粉末がある。鼻噴霧剤としてまたは点鼻剤として投与される、担体が液体である適当な組成物としては、活性成分の水性または油性溶液が挙げられる。
【０１３３】
吸入による投与に使用される薬剤組成物としては、様々なタイプの一定量が投与される加圧式のエアロゾル(metered dose pressurised aerosol)、ネブライザーまたは注入器によって生じる微粒子ダストまたはミストが挙げられる。
【０１３４】
経膣投与に使用される薬剤組成物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤として提示されてもよい。
【０１３５】
非経口投与に使用される薬剤組成物としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及び製剤を意図されるレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含む水性及び非水性滅菌注射溶液；ならびに懸濁化剤及び増粘剤を含んでもよい水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。注射溶液に使用される賦形剤としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油が挙げられる。本組成物は、１回投与用の(unit-dose)または複数回投与用の(multi-dose)の容器、例えば、密閉アンプル及びバイアル瓶に提示されてもよく、また、使用される直前に、保持される滅菌液体、例えば、注射用の水の添加のみを必要とするフリーズドライ(freeze-dried)（凍結乾燥(lyophilised)）条件で貯蔵されてもよい。即時注射(extemporaneous injection)溶液及び懸濁液を、滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製してもよい。
【０１３６】
滅菌注射溶液は、上記した一の成分または成分の組み合わせを有する適当な溶剤に必要量の物質を入れ、必要であればさらに滅菌マイクロ濾過することによって調製されうる。
【０１３７】
特定の実施態様においては、本発明の物質は、in vivoで適当に分布できるように、例えば、リポソーム中で配合されてもよい。リポソームの製造方法に関しては、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５４８号；及び第５，３９９，３３１号を参照。リポソームは、特定の細胞または器官中に選択的に輸送される一以上の部分を含んでいてもよく、これにより標的とされたドラッグデリバリーが促進される（例えば、V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685を参照）。
【０１３８】
具体的なターゲッティング部分としては、葉酸塩またはビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号を参照）；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038)；抗体(P. G. Bloeman et al. (1995) FEBSLett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180)；これらの異なる種は本発明の配合物、さらには本発明の分子の成分を含んでいてもよい、界面活性プロテインＡレセプター(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134)；ｐｓｉ  ２０(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090)がある；また、K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBSLett. 346: 123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4 : 273を参照。本発明の一実施態様においては、本発明の物質は、リポソーム中に配合される；より好ましい実施態様では、リポソームは、ターゲッティング部分を含む。最も好ましい実施態様では、リポソーム中の物質は、腫瘍近くの部位に大量注射によってデリバリーされる。
【０１３９】
本組成物は、シリンジで簡単に注射できる(syringability)程度に流動性でなければならない。これは、製造及び貯蔵の条件下では安定でなければならず、また、細菌や真菌等の微生物のコンタミに対して保存がきかなければならない。
【０１４０】
本組成物は、滅菌され、かつ組成物がシリンジでデリバリー可能である程度に流動性でなければならない。水に加えて、担体は、等張緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコール等）、およびこれらの適当な混合物であってもよい。適当な流動性が、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合には所定の粒度の維持によっておよび界面活性剤の使用によって、維持できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトール等の多価アルコール、及び塩化ナトリウムを、組成物中に含ませることが好ましい。注射用組成物の長期間吸収は、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含ませることによって、達成できる。
【０１４１】
本薬剤組成物は、防腐剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、着香剤、塩（本発明の物質はそれ自体が製薬上許容できる塩の形態で提供されてもよい）、緩衝剤、被覆剤または抗酸化剤を含んでもよい。また、本薬剤組成物は、本発明の物質に加えて治療上活性のある物質を含んでもよい。
【０１４２】
本発明の物質の投与量は、処置される病気や疾患、治療される人の年齢や状態などによって、広い範囲で異なり、最終的には医師が適当な使用量を決定するであろう。この投与量は、適当な限りなるべく多く繰り返してもよい。副作用が生じたら、一般的な臨床の実施にしたがって、投与の量および／または頻度を下げてもよい。
【０１４３】
下記実施例は、本発明の好ましい実施態様をより十分詳述するために提示される。しかしながら、これらは、本発明の範囲を限定するものではないと解される。
【０１４４】
実施例
実施例１：ＣＤ２７Ｌの同定およびクローニング
タンパク質ＣＤ２７Ｌを、Ａ４９８細胞膜から単離した。Ａ４９８は、腎臓の上皮癌細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−７９０８）である。この細胞を、１０％ウシ胎児血清及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ培地中で生育させた。
【０１４５】
細胞の分画および細胞質膜の生成：
細胞の入った１０×１５ｃｍ２の皿を、ＰＢＳ−ＣＭで３回洗浄した（各々の皿には約２×１０８細胞が含まれた）。５ｍｌの冷ＰＢＳ−ＣＭを第一の皿に添加して、細胞をプラスチックのセルリフターを用いて剥がした。すべての皿から、この容積のＰＢＳ−ＣＭを捨てた。次に、細胞を、＋４℃で１０００×ｇで５分間、遠心した。上清を除いて、細胞を、１０ｍｌの均質化緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳにおける２５０ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  バナデート、０．０２％  アジド）中に再懸濁した。細胞を、＋４℃で１０００×ｇで５分間、遠心し、上清を除いた。次に、細胞ペレットを、均質化緩衝液にプロテアーゼインヒビター(Sigma)を加えたもので５×充填細胞容積で再懸濁した。ボールベアリングホモジナイザー(ball bearing homogeniser)（ＢＢＨ）（８．００２ｍｍ  ボール）を冷却し、均質化緩衝液で洗浄した。細胞懸濁液を２ｍｌシリンジにとり、これをＢＢＨの一方の側につけた。別のシリンジをＢＢＨの他方の側につけた。細胞混合物をチャンバーに５回まで供給した。細胞を顕微鏡を用いてモニターし、細胞が十分溶解したら、得られた混合物を＋４℃で１０００×ｇで５分間、遠心した。得られた上清（ＰＮＳ）を保持した。１ｍｌの均質化緩衝液を核ペレットに添加して、１０００×ｇで５分間、再遠心した。上記２画分をプールして、＋４℃で３０００×ｇで１０分間、遠心した。３０００×ｇの上清をＳＷ４０またはＳＷ６０管中で２ｍｌの６０％スクロースクッション上に積層して、ゆっくり加速及び減速しながら１００，０００×ｇで４５分間遠心した。未精製の細胞質膜が、スクロースクッションの頂上部上に別の層として現れた。上層を除いて（細胞質ゾル）、細胞質膜をパスツールピペットを用いて集めた。未精製の細胞質膜画分のスクロースのパーセント（％）を屈折計を用いて測定した。この膜調製物を、スクロース含量が１５％以下になるように、ＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈した。この未精製の細胞質調製物を、ＳＷ４０管中で予め形成した１５〜６０％スクロースグラジエント上に積層して、ゆっくり加速及び減速しながら１００，０００×ｇで１７時間遠心した。スクロースグラジエントをグラジエントアンローダー(gradient unloader)を用いて分画した（速度  ０．５、距離  ２．５、分画数  ３５）。画分のタンパク質含量を測定し、１０μｇのタンパク質を４〜２０％のアクリルアミド１Ｄゲル(Novex)で泳動し、トランスフェリンレセプター(Transferrin Receptor)、オキシドレダクターゼＩＩ(Oxidoreductase II)及びカルネキシン(Calnexin)に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにかけた。
【０１４６】
１Ｄゲル分析用の細胞質膜画分の調製：
トランスフェリンとの免疫反応性はあるがオキシドレダクターゼＩＩ及びカルネキシンとの免疫反応性はない細胞質膜画分を同定した。スクロース画分をプールし、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  バナデート、０．０２％アジドで少なくとも４倍希釈した。希釈したスクロース画分をＳＷ４０またはＳＷ６０管に加えて、ゆっくり加速及び減速しながら１００，０００×ｇで４５分間遠心した。上清を膜ペレットから除いて、ペレットをＰＢＳ−ＣＭで３回洗浄した。膜ペレットを、６３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ  ７．４）における２％  ＳＤＳで可溶化した。プロテインアッセイを行い、メルカプトエタノール（２％最終）、グリセリン（１０％）及びブロモフェノールブルー（０．００２５％最終）を添加した。１μｇ／μｌの最終タンパク質濃度を１Ｄゲルローディングに使用した。抽出したタンパク質サンプルを１Ｄ溶解緩衝液で可溶化して、タンパク質を１Ｄ  ＰＡＧＥ（８〜１６％濃度勾配）によって分離した。
【０１４７】
質量分析
１Ｄゲルから切り出したＣＤ２７Ｌタンパク質を、トリプシンで消化し、脱離用の３３７ｎｍ波長のレーザー及び分析のレフレクトロンモード(reflectron mode)を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ(Voyager STR, Applied Biosystems)によって分析した。ＣＤ２７Ｌの所定の質量（［Ｍ＋Ｈ］＝１２１７．６及び１６９５．８）の特徴を、装置中に直接溶出するナノ液体クロマトグラフィーシステムを備えたＱＴＯＦ−ＭＳを用いたタンデム質量分析によってさらに明らかにした。ＭＡＬＤＩ分析前に、サンプルを脱塩し、Ｃ１８  Ｚｉｐ  ＴｉｐｓＴＭ(Millipore)を用いて濃縮した。
【０１４８】
ＣＤ２７Ｌの部分的なアミノ酸配列決定および同定を目的として、トリプシン消化ペプチドの解釈されていないタンデムマススペクトル(uninterpreted tandem mass spectrum)を、ＳＥＱＵＥＳＴサーチプログラム(SEQUEST search program)(Eng et al., 1994, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 5:976-989)、version v.C.1.を用いて検索した。検索したデータベースは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/でアクセスできるNational Centre for Biotechnology Information (NCBI)に保持される冗長でないデータベース(non-redundant database)のタンパク質エントリーから構成されるデータベースであった。タンデムなアミノ酸配列を見つけて、タンパク質ＣＤ２７Ｌ（Swiss Institute of Bioinformatics(http://www.expasy.ch/)によって保持される、SwissProt databaseにおける受託番号Ｐ３２９７０で利用できる）とマッチさせた（図1）。タンパク質の予想質量は、２１．１ｋＤａであり、ゲルで測定される際の見かけの分子量は２３．７ｋＤａである。
【０１４９】
実施例２：ヒト組織におけるＣＤ２７Ｌ  ｍＲＮＡの発現
我々は、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ(real time quantitative RT-PCR)(Heid et al. (1996) Genome Res. 6, 986-994; Morrison et al. (1998) Biotechniques 24: 954-958)を用いて、正常ヒト組織、腎癌細胞系ならびに腎臓及び結腸癌臨床組織におけるＣＤ２７Ｌ  ｍＲＮＡの分布を分析した（図２〜４）。
【０１５０】
全ＲＮＡの調製及び第一の鎖ｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡを、製造社の指示に従って、Trizol試薬(Life Technologies)を用いて培養細胞及び均質化組織サンプルから調製し、１μｇ／μｌの濃度でＲＮａｓｅを含まない水中に再懸濁した。第一の鎖ｃＤＮＡを、製造社の指示に従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素(Superscript II reverse transcriptase)(Life Technologies)を用いて５μｇの全ＲＮＡから合成した。各ｃＤＮＡサンプルをＰＣＲ精製ミニカラム(Qiagen)を用いて精製し、２６０ｎｍでの分光測光によって定量し、１０ｎｇ／μｌに希釈した。
【０１５１】
ＲＴ−ＰＣＲによるＣＤ２７Ｌ  ｍＲＮＡの定量
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、正常ヒト組織ｍＲＮＡ(Clontech)、腎癌細胞系、ならびに腎臓及び結腸癌組織におけるＣＤ２７Ｌ発現を定量的に測定した。ＰＣＲに使用されたプライマーは以下のとおりであった：
センス：  ５’  ｇｃｔｇｃｔｔｔｇｇｔｃｃｃａｔｔｇｇｔｃｇ  ３’
（配列番号：３）
アンチセンス：  ５’  ｇａｇｇｔｃｃｔｇｔｇｔｇａｔｔｃａｇｃｔｇ  ３’
（配列番号：４）
上記したのと同様にして調製した、１０ｎｇ  ｃＤＮＡ、ＳＹＢＲグリーン配列検出試薬(SYBR green sequence detection reagent)(PE Biosystems)ならびにセンス及びアンチセンスプライマーを含む反応物を、ＡＢＩ７７００配列検出システム(ABI7700 sequence detection system)(PE Biosystems)でアッセイした。ＰＣＲ条件は、５０℃で２分を１サイクル、９５℃で１０分を１サイクル、及び９５℃で１５秒、６５℃で１分を４０サイクルであった。ＰＣＲ産物の集積は、ＳＹＢＲグリーン蛍光の増加としてリアルタイムで測定し、データをSequence Detector program v1.6.3 (PE Biosystems)を用いて分析した。蛍光及び増幅サイクル数に対する初期鋳型コピー数の標準曲線を、増幅したＰＣＲ産物を鋳型として用いて得、これを用いて各サンプルにおけるＣＤ２７Ｌコピー数を算出した。
【０１５２】
図２に示されるように、ＣＤ２７Ｌ  ｍＲＮＡの分布は正常組織では低かったが、この際、胸腺、扁桃及びリンパ節で発現が最も高いレベルであり（１４７〜２００コピー／ｎｇ  ｃＤＮＡ）、他の正常組織では低レベルのＣＤ２７Ｌ  メッセージのみが検出された。ＣＤ２７Ｌ  ｍＲＮＡは、ＨＥＫ  ２９３腎癌細胞系で検出され（１９０コピー／ｎｇ  ｃＤＮＡ）、ウィルムス腫瘍細胞系（小児の腎癌、上記参照）ではかなり過剰に発現した（９２００コピー／ｎｇ  ｃＤＮＡ  ）。
【０１５３】
図３は、正常な結腸における発現に加えて、３つの同様の(matched)正常／腫瘍結腸対におけるＣＤ２７Ｌの発現レベルを示す。発現のレベルは、すべてのサンプル対において、７〜３０倍、増加している。
【０１５４】
図４は、正常な腎臓組織におけるならびに腫瘍及び正常腎臓組織の２つの同様の対におけるのに加えて、７つの腎臓腫瘍におけるＣＤ２７Ｌの発現レベルを示す。発現レベルの上昇が大部分の腫瘍サンプル中で観察され、２つのサンプルにおけるレベルは３０００コピー／ｎｇ  ｃＤＮＡを超えている。
【０１５５】
実施例３−ＣＤ２７Ｌの相対的な発現を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２７Ｌ抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価した
直接共役した抗ＣＤ２７Ｌ抗体を、Ancell Corp(Bayport, USA)から得た。このＩｇＧ１抗体（ＢＵ６９と称する）を、マウスをＷＭ−１（ワルデンストレームマクログロブリン血症）細胞系で免疫処置することにより誘導した。結合エピトープは同定されなかったが、この抗体は樹状細胞によって誘導されるＴ細胞増殖を阻害することが示され、ゆえに「中和している」とみなすことができる、（Leukocyte Typing V, S.F. Schlossman, et al, eds. Oxford University Press, Oxford, (1995) p. 1137-1138を参照）。使用されたアイソトープコントロールは、Serotec Ltd (Kidlington, UK)から得られたＦＩＴＣ標識ＩｇＧｋ１抗体であった。下記Ｂ細胞系：ＢＬ１６、ＢＬ３２、ＢＬ５８、ＢＬ１１５、ＡＳ２８３及びＫＨＭ１０Ｂは、Prof. Martin Dyer (University of Leicester)によって提供され、また、ＭＵＴＵ−ＩＩＩ系は、Dr. Noemi Nagy (Karolinska Institute, Sweden)によって提供された。すべての他の系は、ＥＣＡＣＣまたはＡＴＣＣから購入した。
【０１５６】
付着細胞系を、標準非酵素解離溶液(standard non-enzymatic dissociation solution)(Sigma)を用いて集めた。懸濁細胞を、フラスコから適当量の培養液を除去することによって集めた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製；バフィーコート調製物は、協定０２１１／Ｔ４６４でnational blood service (NBS - John Radcliffe branch, Oxford, UK)から得た。純粋な細胞懸濁液をさらに、製造社の指示に従ってフィコールグラジエント(Ficoll gradient)(Sigma)による遠心によって精製した。次に、血小板を、４回低速で遠心することによってＰＢＭＣ細胞懸濁液から枯渇させた。さらに、すべての細胞系（付着、懸濁液及び一次ボランティア(primary volunteer)ＰＢＭＣ）をＤＰＢＳでさらに１回洗浄し、血球計を用いて計測し、５００万細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０１５７】
フローサイトメトリープロトコル
分析するすべての細胞について、１００μｌの細胞アリコート（５×１０５細胞）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。次に、細胞を２ｋｒｐｍで５分間遠心することによってペレット化し、各ペレットを０．５％ＢＳＡを補足したＤＰＢＳ  ４０μｌに再懸濁した。さらに、このプレートを４度で２０分間、インキュベートして、細胞表面上の疎水性結合部位を遮断した。インキュベーション後、予めＤＰＢＳを用いてもとのストックから１／１０に希釈した、抗ＣＤ２７Ｌ抗体を１０μｌ添加した［もとは各試験あたり１μｌ、ここでは各試験あたり１０μｌ使用］。すべての細胞について、平行して別のサンプルを調製し、この際、抗ＣＤ２７Ｌ抗体の代わりに、ＩｇＧ１ｋ  ＦＩＴＣアイソタイプコントロール抗体(Serotec Ltd.)の１０μｌアリコートを使用した。次に、抗体標識細胞を、断続的に混合しながら（１５分毎）、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を標準的なＤＰＢＳで３回洗浄し、ポリスチレンＦＡＣＳ管[Elkay Ltd.]に入れた。すべてのフローサイトメトリー収集を、ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーター(EPICS XL flow cytometer)[Coulter Corp]を用いて行なった。細胞の蛍光をＦＬ１で検出し、細胞凝集物をＦＳＣ／ＳＳＣゲーティング(gating)によって分析から除いた。データ分析では、アイソタイプコントロールサンプルの［ｌｏｇ］平均蛍光強度を、同じ細胞系の［ｌｏｇ］平均蛍光強度から引いた。さらに、「アイソタイプ修正蛍光(isotype corrected fluorescence)」と称される、この値を、各細胞系または末梢血サンプルについてプロットし、棒グラフの形態で表示した。＋／−１０％を超えない標準誤差はこれらの実験で許容されると見なされた。
【０１５８】
結果
試験されたすべての腎臓細胞系は、有意なレベルのＣＤ２７Ｌを発現することが分かった。２つの細胞系（Ａ４９８及び７８６−０）では、この蛍光が全体の細胞系パネルの中で最も高いものであった。試験されたＢ細胞系のうち、検出されたＣＤ２７Ｌのレベルにはかなりの変動があり、この際、細胞によっては全く発現しないものがあった。また、ヒト胚腎臓系であるＨＥＫ−２９３は、ネガティブコントロールとして含ませた、ＣＨＯ細胞系と同様、陰性であることが示された。Ｔ細胞から誘導される細胞系（ジャーカット(Jurkat)）、骨髄性白血病系（Ｋ５６２）及び２種の単球細胞系（Ｕ９３７及びＴＨＰ−１）もまた、ＣＤ２７Ｌに対して陰性であることが分かった。抹消血サブセットに関しては、４人のボランティアすべてについて、ＣＤ３＋［Ｔ細胞］及びＣＤ１９＋（Ｂ細胞）サブセット双方がＣＤ２７Ｌ陰性であることが見出された。
【０１５９】
したがって、腎臓細胞系は、末梢血Ｔ及びＢ細胞に比べてかなりＣＤ２７Ｌ発現が高い。ＣＤ２７Ｌの発現は、骨髄細胞系ではなくＢ細胞悪性を高い割合で検出できる。これらの知見から、循環にデリバリーされる治療の可能性のある抗体はＣＤ２７Ｌを発現するＢ／Ｔ細胞によって隔離され(sequestered)ないであろうことが示唆される。したがって、ＣＤ２７Ｌの発現は、リンパ組織、即ち、リンパ節、脾臓及び扁桃等内の活性化細胞にほとんど限定されると考えられる。
【０１６０】
実施例４−要約：腎臓腫瘍細胞系のパネルへの抗ＣＤ２７Ｌ抗体の結合
直接共役した抗ＣＤ２７Ｌ抗体を、上記したようにAncell Corp (Bayport, USA)から得た。
【０１６１】
細胞系を、トリプシン消化によって集め、チャンバースライド上に再播種した。２４時間インキュベーション後、チャンバーをＰＢＳで３回洗浄し、５％ホルムアルデヒド中に再懸濁して、固定した。５分間固定後、細胞をＤＰＢＳでさらに３回洗浄し、５％ＦＢＳを補足したＤＰＢＳで遮断した。細胞を６０分間遮断して、細胞への抗体の非特異的な結合を防止した。次に、一次ＦＩＴＣ共役抗体（抗ＣＤ２７ＬまたはＩｇＧ１アイソタイプコントロールのいずれか）を添加して（２００μｌの５％ＦＢＳ  ＤＰＢＳにおける１μｇ／ｍｌ）、チャンバースライドを４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＤＰＢＳ／５％で２回及びＤＰＢＳ単独で１回洗浄し、各洗浄段階の間は少なくとも５分間あけた。次に、スライドを水性取付媒質(aqueous mounting media)にのせ、ＤＭＲＩＥ２蛍光顕微鏡(DMRIE2 fluorescence microscope)(Leica AG)を用いて可視化した。
【０１６２】
試験した４つの腎臓腫瘍系すべてで、抗ＣＤ２７Ｌ  ＦＩＴＣ抗体との反応性があった。最も強力なＣＤ２７Ｌ染色はＡ４８９細胞で観察された。双方のコントロール系（ＣＨＯ及びＨＥＫ−２９３細胞）は、抗ＣＤ２７Ｌとインキュベートしても特異的な蛍光は示さなかった。すべての細胞系をＩｇＧ１ｋ−ＦＩＴＣコントロール抗体とインキュベートした後でも、ほとんどシグナルは観察されなかった。
【０１６３】
したがって、ＣＤ２７Ｌの発現は、試験した腎臓腫瘍系すべてで検出できるが、胚腎臓系であるＨＥＫ−２９３やコントロールＣＨＯ系では見いだされなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】ＣＤ２７Ｌのヌクレオチド（配列番号：１）及びアミノ酸（配列番号：２）配列を示す。タンデムの質量スペクトルを、太字及び下線で示す。
【図２】ＣＤ２７Ｌ  ｍＲＮＡの組織分布を示す。正常組織及び腎癌細胞系におけるｍＲＮＡのレベルは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量した。ｍＲＮＡレベルは、コピー数／ｎｇ  ｃＤＮＡとして表わす。
【図３】正常及び腫瘍結腸組織におけるＣＤ２７Ｌの発現を示す。３人の患者からの同様の(matched)正常及び腫瘍組織におけるＣＤ２７Ｌ  ｍＲＮＡのレベルは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ｍＲＮＡレベルは、コピー数／ｎｇ  ｃＤＮＡとして表わす。
【図４】２対の同様の正常及び腫瘍組織を含む、多くの腎腫瘍組織におけるＣＤ２７Ｌの発現を示す。ＣＤ２７Ｌ  ｍＲＮＡのレベルは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ｍＲＮＡレベルは、コピー数／ｎｇ  ｃＤＮＡとして表わす。
【図５】ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２７Ｌ抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価されたＣＤ２７Ｌの相対的な発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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