(57)【要約】本発明は、細胞における目的配列の増幅及び／又は発現の方法であって、トランススプライシングが可能であるように設計されたＲＮＡ配列と標的ＲＮＡとの間のトランススプライシングによって少なくとも１種類のアンプリコンを前記細胞内で産生させ、前記アンプリコンは、前記植物細胞において増幅し、目的配列を発現することが可能である方法を提供する。
2005522182.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランススプライシングが可能なように設計されたＲＮＡ配列と標的ＲＮＡとの間のトランススプライシングによって少なくとも１種類のアンプリコンを細胞内で産生させ、それによって、前記アンプリコンが、前記細胞において増幅することができ、目的配列を発現することができる、細胞における目的配列の増幅及び／又は発現の方法。
【請求項２】
前記細胞に前記ＲＮＡを提供することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞に前記ＲＮＡ配列を前記提供することは、前記細胞に、前記細胞において転写されて前記ＲＮＡ配列を産生することが可能なＤＮＡ配列を提供することを含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記に前記ＲＮＡ配列を前記提供することは、ウイルストランスフェクション、アグロバクテリウム媒介送達、非生物学的送達を含み、又は核ＤＮＡ中に予め組み込まれ若しくは核内に保持されて、標的ＲＮＡとのトランススプライシングが可能なように設計されたＲＮＡ配列を自律的に生成する前駆体ＤＮＡの変換による請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡ配列は、目的配列をさらに含む請求項１から４までの一項に記載の方法。
【請求項６】
前記目的配列は、二本鎖ＲＮＡ構造を形成するための自己相補性を有する部分を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記二本鎖ＲＮＡ構造は、宿主細胞の遺伝子に対して配列同一性を有する部分があり、前記細胞において前記遺伝子の発現を阻害するのに十分な長さである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡ配列及び／又は前記標的ＲＮＡは、前記アンプリコンが複製起点を含むように設計される請求項１から７までの一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞には、前記アンプリコンの増幅を可能にするＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが提供される請求項１から８までの一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的ＲＮＡは、前記細胞の内因性ＲＮＡ、特にメッセンジャーＲＮＡである請求項１から９までの一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞には、ウイルストランスフェクション、アグロバクテリウム媒介送達、非生物学的送達により、又は核ＤＮＡ中に予め組み込まれ若しくは核内に保持されて、標的ＲＮＡとのトランススプライシングが可能なように設計されたＲＮＡ配列を自律的に生成する前駆体ＤＮＡの変換によって、前記標的ＲＮＡが提供される請求項１から１０までの一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アンプリコンは、ＲＮＡウイルス起源である請求項１から１１までの一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンプリコンは、ＤＮＡウイルス起源である請求項１から１１までの一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンプリコンは、レトロウイルス又はレトロトランスポゾン起源である請求項１から１１までの一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記トランススプライシングは、１種類又は複数のＲＮＡアンプリコンをもたらす請求項１から１４までの一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記トランススプライシングの後に逆転写を行ってＤＮＡを産生させる請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡは、前記細胞のゲノムに組み込まれている請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞には、トランススプライシングが可能なように設計された１種類又は複数のＲＮＡ配列が提供される請求項１から１７までの一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記トランススプライシングは、２種類以上のアンプリコンを産生する請求項１から１８までの一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記トランススプライシングの後にＲＮＡｃｉｓ−スプライシングを行う請求項１から１９までの一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アンプリコンのうち一つは、前記細胞における増幅が可能であり、他の非自律性アンプリコンの複製に必要な機能をｉｎ  ｔｒａｎｓで提供する十分に機能性の自律性アンプリコンである請求項１から２０までの一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アンプリコンのうち一つは、本質的に、他のアンプリコンの複製に必要な１種類又は複数の機能をｉｎ  ｔｒａｎｓで提供する野性型ウイルス又は弱毒化野性型ウイルスである請求項１から２１までの一項に記載の方法。
【請求項２３】
１種類又は複数の前記アンプリコンは、感染力、ウイルス粒子を構築する能力、細胞間移動、逆転写、宿主染色体への組込み又は全身性移動などの他のウイルス又はレトロトランスポゾン機能を保持している請求項１から２２までの一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞は、植物細胞である請求項１から２３までの一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞は、動物細胞である請求項１から２３までの一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞は、野性型である請求項１から２５までの一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞をさらに遺伝子操作し、又は一過性に改変して、増幅、感染力、ウイルス粒子構築、遺伝子サイレンシングの抑制、細胞の代謝プロフィールの変更、逆転写、宿主染色体への組込み、得られた前記アンプリコンの細胞間又は遠距離移動に必要な１種類又は複数の機能をｉｎ  ｔｒａｎｓで提供する請求項１から２５までの一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞又は前記細胞を含む生物体の前記遺伝子操作又は前記一過性組の改変に厳格に依存することによって、前記方法の制御の改善及び／又は前記方法の安全性の改善を提供する請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アンプリコンの増幅は、一時的であり、前記増幅に必要な１種類又は複数の機能が一過性に提供される時間内に起こる請求項２７又は２８のうち一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記トランススプライシングが目的ＲＮＡ配列又は転写ユニットを構築することによって、前記ＲＮＡ配列及び前記標的ＲＮＡが各々、前記目的配列又は前記転写ユニットの一部を提供する請求項１から２９までの一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記トランススプライシングが、転写ユニットにおいて、以下の群、すなわち転写及び翻訳シグナル若しくはエレメント；イントロン、エキソン、インテイン又はエクステイン；シグナル、輸送、ターゲティング又は接着モチーフ；精製及び可視化タグ；触媒的、認識、親和性又は他の機能性のドメイン若しくはそれらの部分から選択される遺伝子エレメントを構築し、
それによって、前記遺伝子エレメントが、１個又は複数の遺伝子から誘導されるか、人為的に提供される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
遺伝子又は遺伝子制御エレメントの管理下での発生（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）のために使用される請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
多量体タンパク質産生に必要なポリペプチド（複数）の同時産生にとって必要な２種類以上の目的配列の増幅及び／又は発現をもたらす請求項１から３２までの一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記多量体タンパク質は、ヒト又は動物モノクローナル抗体などの免疫応答タンパク質である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
機能ゲノム科学、遺伝子同定、遺伝子機能の決定、生化学的経路解析又は選択的スクリーニングを目的とする目的配列の増幅及び／又は発現をもたらす請求項１から３４までの一項に記載の方法。
【請求項３６】
生化学的産生又は治療の目的で、核酸配列の特異的増幅及び／又は発現をもたらす請求項１から３５までの一項に記載の方法。
【請求項３７】
トランススプライシングが可能であるように設計された前記ＲＮＡ配列は、以下の群、すなわちグループＩイントロン、グループＩＩイントロン、遺伝的に改変した若しくは人工のイントロン、又は宿主細胞によりプロセシングされると特異的トランススプライシングが可能であるリボザイムを産生するプロイントロンから選択される請求項１から３６までの一項に記載の方法。
【請求項３８】
目的とする生化学的プロセス又は生化学的カスケードは、前記トランススプライシング及び／又は前記増幅によってスイッチオンされる請求項１から３７までの一項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１から３７までの一項に記載の方法を行うことによって得られる、又は得ることが可能な細胞、組織、生物体又はそれらの材料。
【請求項４０】
請求項１から３９までの一項に記載の方法を行うためのベクター又はプロベクターであって、標的ＲＮＡとのトランススプライシングが可能であるＲＮＡ配列を有するか又はコードするベクター又はプロベクター。
【請求項４１】
（ｉ）植物細胞、植物の種子若しくは植物、又は動物細胞若しくは動物、及び（ｉｉ）請求項４０に記載のベクターを含む複数の構成部材からなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、特に植物細胞において目的配列を発現させる方法に関する。さらに、本発明は、トランススプライシングの効率を高める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランススプライシング現象の初期応用例の一つは、Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ及びＣｅｃｈ（Ｎａｔｕｒｅ、３７１巻、６１９〜６２２ページ、１９９４年）によって提案されており、彼らは、リボザイム媒介トランススプライシングを用い、再構築したテトラヒメナグループＩイントロンを使用することによってＲＮＡの欠陥部分を機能的構造と入れ替え、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において翻訳可能なｌａｃＺ転写物を作製する実験について記載している。彼らは、多くの遺伝性疾患を治療する目的で特定の宿主転写物の配列を変化させる一般的手段としてトランススプライシングを提案した。トランススプライシングの別の用途は、Ａｙｒｅ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６巻、３５０７〜３５１２ページ、１９９９年）によって提案されており、彼らは、リボザイム媒介トランススプライシングを利用し、極めて特異的に細胞毒を細胞に向ける技術を開発した。彼らは、グループＩイントロンを用い、ジフテリア毒素ＡのｍＲＮＡをウイルスｍＲＮＡと共にスプライシングしてウイルスｍＲＮＡを発現する細胞を不活性化することにより、感染した酵母細胞を選択的に不活性化した。
【０００３】
さらに別の重要な応用例は、Ｍｉｋｈｅｅｖａ及びＪａｒｒｅｌｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、７４８６〜７４９０ページ、１９９６年）によって開発されており、彼らは、キメラ遺伝子の構築を触媒するために操作されたグループＩＩイントロンを用いている。この研究では、組織のプラスミノーゲン活性化因子のｍＲＮＡをシャッフルできるようにリボザイムが改変され、得られたキメラＲＮＡは、ＤＮＡに逆転写された。このアプローチは、新規な機能を有するキメラタンパク質をコードする遺伝子のライブラリーを一方向性に作製することを可能にする。
【０００４】
上述のアプローチすべてにおいて遭遇する共通の問題点は、切断型リボザイムが、選ばれた標的ＲＮＡの生細胞を使い果たせないことである。さらに、トランススプライシングの効率は極めて低く、細胞中にもたらされるトランススプライシングされたＲＮＡは極めて少量である。多くの細胞では、トランススプライシングされたＲＮＡ産物は全く得られない。標的ＲＮＡに対する相補性を広げたリボザイムを用い、基質認識に必要なガイド配列の正確な変化を設計する試みが行われている（Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８５巻、１９３５〜１９５０ページ、１９９９年）。それでもなお、トランススプライシングは非効率的であるため、ｉｎ  ｖｉｖｏのリボザイム媒介トランススプライシングの応用例は、現在、極めて豊富な標的ＲＮＡ（ウイルスのコートタンパク質の）と共にトランススプライシングされた強力な毒素を用いる細胞の特異的不活性化、宿主細胞においてスプライシングされていない標的ｍＲＮＡの存在下でも効果的に機能することができる方法に限定されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の一目的は、細胞における目的配列の増幅又は発現の効率的方法を提供することである。
【０００６】
本発明の一目的は、細胞における目的配列の増幅又は発現の生物学的に安全な方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、細胞において前駆体ＲＮＡ分子から、目的ＲＮＡ、特に目的ｍＲＮＡを構築する効率的方法を提供することである。
【０００８】
他の目的は、細胞において居住型（ｒｅｓｉｄｅｎｔｉａｌ）ＲＮＡ及び外部から提供されたＲＮＡからｍＲＮＡを構築する方法（残ったいずれの居住型ＲＮＡの影響も、構築されたＲＮＡに比べて無視しうる）を提供することである。
【０００９】
他の目的は、細胞において選択されたｍＲＮＡを増幅又はダウンレギュレートする方法を提供することである。
【００１０】
他の目的は、トランススプライシングの効率を高める方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的は、細胞内で少なくとも１種類のアンプリコンを作製することによる、細胞における目的配列の増幅及び／又は発現の方法であって、前記アンプリコンは、トランススプライシングが可能であるように設計されたＲＮＡ配列と標的ＲＮＡ間のトランススプライシングによって作製され、前記アンプリコンは、前記細胞において増幅することができる方法によって達成される。さらに、前記アンプリコンは、前記目的配列を発現することが可能であることが好ましい。
【００１２】
驚いたことに、発明者他は、上記の方法が、従来のトランススプライシング法の多くの欠点を解決し、トランススプライシングを生物工学における極めて用途が広いツールにすることを見いだした。最も重要なことだが、本発明の方法は、これまで知られている方法に比べて環境的により安全である。本明細書において、トランススプライシングは、前記細胞において増幅することが可能であるアンプリコンを作製することにより、トランススプライシング事象及び前記アンプリコン上に存在する任意の目的配列の産物を増幅する。前記目的配列は、前記アンプリコンから発現させることができる。
【００１３】
トランススプライシングによって少なくとも１種類のアンプリコンを前記細胞内で作製することを提供することは、トランススプライシングが可能であるように設計された前記ＲＮＡ配列（例えば、リボザイム）を有する前記細胞を提供することを含む。前記細胞には、知られている任意の方法によって前記ＲＮＡ配列を提供することができる。前記ＲＮＡ配列は、前記細胞において転写されて前記ＲＮＡ配列を産生することが可能であるＤＮＡ配列を直接提供することにより、前記細胞へ間接的に提供することができる。
【００１４】
トランススプライシングが可能であるように設計された前記ＲＮＡ配列は、トランススプライシングが可能であるイントロンを含むことが好ましい。トランススプライシングが可能であるイントロンは、自己スプライシングイントロン、例えば、グループＩ又はグループＩＩイントロンであってもよい。或いは、前記イントロンは、スプライセオソーム媒介スプライシングのための核ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）のイントロンであってもよい。さらに、前記イントロンは、遺伝子改変イントロン、又は宿主細胞によるプロセシングで（例えば、ｃｉｓ−スプライシングにより）トランススプライシングが可能であるイントロン又はリボザイムを産生する人工イントロン若しくはプロイントロン（ｐｒｏ−ｉｎｔｒｏｎ）であってもよい。自己スプライシングイントロンが好ましく、グループＩイントロンが最も好ましい。さらに、前記ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡと相補的な少なくとも１種類、好ましくは少なくとも２種類の配列を含む。そのようなＲＮＡ配列及びリボザイムの詳細については以下を参照されたい。
【００１５】
前記トランススプライシングは、構築される前記アンプリコンの５’と３’部分を連結することによって前記アンプリコンを構築する。構築される前記アンプリコンの５’部分は、前記ＲＮＡ配列又は前記標的ＲＮＡによって提供することができる。構築される前記アンプリコンの３’部分は、前記標的ＲＮＡ又は前記ＲＮＡ配列によって提供することができる。アンプリコンの５’部分は前記標的ＲＮＡによって提供され、アンプリコンの３’部分は前記ＲＮＡ配列によって提供されることが好ましく、かつ技術的にもより容易である。
【００１６】
前記ＲＮＡ配列は、目的配列のような他の配列をさらに含むことが好ましい。前記目的配列は、発現される配列又は発現される配列の一部であってもよい。発現される配列は、ポリペプチドをコードすることが好ましい。この場合、目的配列は、翻訳を可能にするための制御配列をさらに含むことが好ましい。
【００１７】
前記目的配列は、翻訳を意図しないＲＮＡ配列をさらに含み、又はコードすることができる。前記目的配列は、例えば、ＲＮＡレベルで二本鎖構造を形成するための自己相補性を有する配列部分を含むことができる。二本鎖ＲＮＡ構造は、宿主細胞の遺伝子に対して一部の配列同一性を有することができ、前記細胞において前記遺伝子の発現を阻害するのに十分な長さであってもよい。この方法は、宿主細胞の選択された遺伝子のダウンレギュレーション又はサイレンシングに、及び機能ゲノム科学研究に使用することができる。二本鎖ＲＮＡによる遺伝子抑制の方法は、ＷＯ９９／３２６１９に一般的に記載されている。小さな干渉ＲＮＡを用いて任意の目的とする標的遺伝子をダウンレギュレートする効率的方法は、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６巻、５５０〜５５３ページ、２００２年）に記載されている。
【００１８】
前記アンプリコンは、前記アンプリコンの増幅を可能にする複製起点を含む。前記複製起点は、前記ＲＮＡ配列により提供することができる。また、前記複製起点は、前記標的ＲＮＡによっても提供することができる。或いは、前記ＲＮＡ配列及び前記標的ＲＮＡは各々、複製起点の一部を提供することができる。その場合、機能性複製起点を、前記トランススプライシング反応において構築することができる。
【００１９】
前記トランススプライシングは、トランススプライシングが可能であるように設計された前記ＲＮＡ配列と標的ＲＮＡの間で起きる。第一の一般的実施形態では、前記標的ＲＮＡは、宿主細胞に特有のＲＮＡ（居住型ＲＮＡ）である。前記標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡであることが好ましい。このことは、例えば、居住型ＲＮＡを増幅又はサイレンシングするため、又は前記居住型ＲＮＡ及び／又は前記ＲＮＡ配列上の目的配列によってコードされるタンパク質を発現させるため、前記ＲＮＡ配列上（例えば、前記リボザイム上）に存在する目的配列に前記居住型ＲＮＡを連結することを可能にする。前記標的ＲＮＡが前記宿主細胞に特有のＲＮＡである場合、複製起点は、前記ＲＮＡ配列によって提供されることが好ましい。前記の特有又は居住型ＲＮＡは、前記宿主細胞の前駆体細胞中に人為的に導入される導入遺伝子から誘導できることは言うまでもない。
【００２０】
第二の一般的実施形態では、前記標的ＲＮＡは、外部から前記細胞中に導入される。この実施形態では、トランススプライシングによって構築される前記アンプリコンの両部分は共に、前記細胞とは異種であってよい。前記アンプリコンの両部分は、要望どおり遺伝子改変されていてもよく、そのことがこの実施形態を特に柔軟にしている。前記標的ＲＮＡは、前記ＲＮＡ配列の場合に用いたのと同一又は異なる形質転換又はトランスフェクション方法によって細胞内に導入することができる。特に、前記標的ＲＮＡ及び前記ＲＮＡ配列は、例えば、Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ中に１つは前記標的ＲＮＡを運び、１つは前記ＲＮＡ配列を運ぶアグロバクテリウム菌株の混合物を前記細胞に感染させることによって同時に導入することができる。別の好ましい方法は、先ずアグロバクテリウムを介して前記標的ＲＮＡを導入し、ウイルス感染によりしばらく後の望ましい時点で前記ＲＮＡ配列を提供するものである。しかしながら、この一般的実施形態のステップを特定の場合の要求に適合させるためのさらに多くの可能性が存在する。
【００２１】
前記第二の一般的実施形態では、前記標的ＲＮＡは、前記ＲＮＡ配列に含まれていてもよい前記目的配列と類似した目的配列を含むことができる。重要な実施形態では、トランススプライシングによる前記アンプリコンの構築を用い、それらの部分から目的配列を構築することができる（前記標的ＲＮＡ及び前記ＲＮＡ配列は各々、前記の目的配列の一部を提供する）。前記標的ＲＮＡ或いは前記ＲＮＡ配列によって前記目的配列の第二の部分を提供することは、機能的形態で前記目的配列（例えば、遺伝子）を構築するためのスイッチとして機能し、前記の構築された目的配列によって前記細胞に付与される機能又は形質をスイッチオンする。目的配列は、発現された場合に各部分が目的配列の機能を発揮できないように前記ＲＮＡ配列及び前記標的ＲＮＡ上に分裂かつ分割されていることが好ましい。前記目的配列は、抗生物質抵抗性遺伝子又は有用な形質を付与するその他の遺伝子であってもよい。この実施形態の重要な利点は、機能性導入遺伝子の一部のみを含むトランスジェニック植物は、機能性導入遺伝子を交雑子孫（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｇｅｎｙ）又は他の生物体に伝達できないことであり、このことが、この技法を従来技術の方法に比べ環境的により安全にしている。
【００２２】
さらに、本発明の方法、特に前記トランススプライシング及び／又は前記増幅を用い、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０２／０２０９１に記載の目的生化学的プロセス又は生化学的カスケードをスイッチオンすることができる。
【００２３】
前記標的ＲＮＡが外部から前記細胞に提供される場合、これは、ウイルストランスフェクション、アグロバクテリウム媒介送達、非生物学的送達により、又は核ＤＮＡ中に予め組み込まれた、又は核内に保持されて自律的に本発明の標的ＲＮＡを生成する前駆体ＤＮＡの変換によって行うことができる。
【００２４】
本発明の方法は、植物細胞又は動物細胞で行うことができる。植物細胞が好ましい。前記方法は、細胞培養液中の細胞について行うことができる。前記細胞は、植物又は動物生物体に属することが好ましい。前記方法は、植物について行うことが最も好ましい。前記細胞は、野性型細胞であっても、又は遺伝子操作された細胞であってもよい。前記細胞は、核又は細胞小器官ゲノム中に望ましい配列を導入したことによって安定に遺伝子操作されていてもよい。さらに、前記細胞は、一過性に改変されていてもよい。前記遺伝子操作は、トランススプライシングによってアンプリコンを産生するのに必要な機能を有する前記細胞を提供することができる。さらに、前記遺伝子操作は、前記アンプリコンを増幅するのに必要な機能、例えば、ＲＮＲ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＲ／ＲＮＲポリメラーゼ）、逆転写酵素又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する前記細胞を提供することができる。さらに、前記遺伝子操作は、前記標的ＲＮＡを有する前記細胞を提供することができる。
【００２５】
前記細胞をさらに遺伝子操作し、又は一過性に改変して、増幅、感染力、ウイルス粒子構築、遺伝子サイレンシングの抑制、細胞の代謝プロフィールの変更、逆転写、宿主染色体への組込み、得られた前記アンプリコンの細胞間又は遠距離移動に必要な１種類又は複数の機能、又はトランススプライシングによって前記アンプリコンを産生するために必要な機能をｉｎ  ｔｒａｎｓで提供することができる。
【００２６】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法、特に前記トランススプライシング又は前記アンプリコンの増幅は、前記細胞の、又は前記細胞を含む生物体の前記遺伝子操作又は前記一過性遺伝子操作に厳格に依存するため、前記方法を上回る制御の改善及び／又は前記方法の環境安全性の改善を提供する。さらに、前記増幅は、一時的であることがあり、前記増幅に必要な１種類又は複数の機能が一過性に提供される時間内にもっぱら起きることがある。このことは、例えば、ＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼを一過性に提供することによって達成することができる。選択圧の除去は、前記ポリメラーゼをコードするベクターの喪失をもたらすことがある。例えば、前記の一時的増幅は、アグロバクテリウムを介して一過性に提供される因子によって制御することができる。
【００２７】
前記トランススプライシングの直接産物はＲＮＡ分子である。重要な実施形態では、トランススプライシングの前記直接産物は、本発明の前記アンプリコンである。或いは、本発明のアンプリコンは、ＤＮＡアンプリコンであってもよい。この場合、前記トランススプライシングによって直接産生されるＲＮＡ分子は、逆転写されて前記ＤＮＡアンプリコンを産生しなければならない。前記細胞がすでに、例えば、レトロトランスポゾンからのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の遺伝子を含んでいない限り、前記細胞には、このような逆転写酵素が提供されなければならない。ＤＮＡアンプリコンは、ＤＮＡウイルスに関連しているか、又はＤＮＡウイルス起源であってもよい。しかしながら、トランススプライシングによって産生される前記ＲＮＡ分子は、アンプリコン、すなわちＲＮＡアンプリコンであることが好ましい。
【００２８】
さらに、前記アンプリコンは、レトロウイルス若しくはレトロトランスポゾン起源であってもよく、又はレトロウイルス若しくはレトロトランスポゾンの選択された特性を有していてもよい。前記レトロウイルス又はレトロトランスポゾン起源の特性は、例えば、宿主細胞の核ゲノム中に目的配列を組み込むことを可能にする。
【００２９】
前記アンプリコンがＲＮＡアンプリコンである場合、ＲＮＡアンプリコンは、ＲＮＡウイルスに関連しているか、又はＲＮＡウイルス起源であってもよい。このことは、例えば、前記複製起点は、前記ＲＮＡウイルスの複製起点であることが好ましいことを意味する。ＲＮＡアンプリコンは、アンプリコンの複製起点を認識することができる前記ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードすることができる。本発明の方法は植物細胞上で行うことが好ましいことから、前記ＲＮＡウイルスは、植物ウイルスであることが好ましい。好ましい植物ウイルスは、トバモウイルス属に属するウイルス、例えば、タバコモザイクウイルスである。
【００３０】
前記細胞には、ウイルストランスフェクション、アグロバクテリウム媒介送達、非生物学的送達により、又は核ＤＮＡ中に予め組み込まれている、又は核内に保持され標的ＲＮＡとのトランススプライシングが可能であるように設計されたＲＮＡ配列を自律的に産生する前駆体ＤＮＡの変換によって前記ＲＮＡ配列を提供することができる。非生物学的送達には、パーティクルボンバードメント、植物プロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換、及びエレクトロポレーションが含まれる。アグロバクテリウム及び非生物学的送達の場合、前記細胞において転写され前記ＲＮＡ配列を産生することが可能なＤＮＡを細胞に提供することが好ましい。ウイルストランスフェクションは、ＲＮＡ又はＤＮＡを用いて行うことができる。
【００３１】
前記細胞には、同一又は異なる方法によって２種類以上のＲＮＡ配列を提供することができる。前記２種類以上のＲＮＡ配列は、同時に（一段階法で）又は連続的に（二段階法で）提供することができる。それにより、前記トランススプライシングは、２種類以上のタイプのアンプリコンを産生することができる。
【００３２】
前記アンプリコンのうち一つは、前記細胞における増幅が可能であり、他の非自律性アンプリコンの複製に必要な機能をｉｎ  ｔｒａｎｓで提供する完全に機能性の自律性アンプリコンであってもよい。さらに、前記アンプリコンのうち一つは、基本的に他のアンプリコンの複製に必要な１種類又は複数の機能をｉｎ  ｔｒａｎｓで提供する野性型ウイルス又は弱毒化野性型ウイルスであってもよい。さらに、１個又は複数の前記アンプリコンは、感染力、ウイルス粒子を構築する能力、細胞間移動、逆転写、宿主染色体への組込み又は全身性移動などの他のウイルス又はレトロトランスポゾン機能を保持することができる。
【００３３】
本発明の方法は、多細胞の植物又は動物生物体について行う。多細胞植物が好ましい。動物のうちでは、哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、並びにブタ及びウシ動物のようなヒトの栄養のために使用される動物）が好ましい。ヒトは除外する。植物のうちでは、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、コムギ、トウモロコシ、イネ、アワ、ジャガイモ、採油用ナタネ、キャノーラ及びタバコを含む作物が好ましい。
【００３４】
本発明の方法は、多種多様な応用例に使用することができる。本発明の方法は、例えば、目的配列を発現させるために使用することができる。さらに、本発明の方法は、２種類以上の目的配列、例えば、多量体タンパク質産生に必要なポリペプチドの同時産生にとって必要な目的配列を増幅又は発現させるために使用することができる。前記タンパク質多量体の好ましい例は、ヒト又は動物モノクローナル抗体などの免疫応答タンパク質である。さらに、前記方法は、生化学的経路又はカスケードの少なくとも２種類の遺伝子の増幅及び／又は発現をもたらし、それによって全生化学的経路を細胞又は生物体に導入することができる。
【００３５】
さらに、本発明の方法は、機能ゲノム科学、遺伝子同定、遺伝子機能の決定、生化学的経路解析を目的とする、及び／又は選択的スクリーニングのための目的配列の増幅及び／又は発現をもたらすことができる。さらに、前記トランススプライシングは、目的ＲＮＡ配列又は転写ユニットを構築することができる（前記ＲＮＡ配列及び前記標的ＲＮＡは各々、前記の目的配列又は前記転写ユニットの一部を提供する）。前記転写ユニットでは、以下の群、すなわち転写及び翻訳シグナル又はエレメント；イントロン、エキソン、インテイン又はエクステイン；シグナル、輸送、ターゲティング又は接着モチーフ；精製及び可視化タグ；触媒的、認識、親和性又は他の機能性ドメイン若しくはそれらの部分から選択される遺伝子エレメントを構築することができる（前記遺伝子エレメントは、１個又は複数の遺伝子から誘導されるか、人為的に操作される）。
【００３６】
さらに、本発明の方法は、生化学的産生又は治療の目的で、核酸配列の特異的増幅及び／又は発現のために使用することができる。
【００３７】
また、本発明は、例えばシグナルペプチド、結合ドメイン、保留シグナル、区画化シグナル、活性化ドメイン、酵素活性を持つドメイン、アフィニティタグ、及び制御配列のモジュールにより、タンパク質をコードする配列を構築することを可能にする。このようなモジュール式アプローチは、特定の目的のために最適な発現カセットを見いだすこと、又は細胞において特定の遺伝子が過剰発現及び蓄積されるための最適な分泌若しくは輸送ペプチド又はそれらの特定の区画を見いだすことを可能にする。このようなアプローチは、機能ゲノム科学及びプロテオミクス研究にとって価値ある道具となり得る。例えば、植物のライブラリーを作製することができる（ライブラリーの各メンバーは、例えば、前記標的ＲＮＡのような、上記モジュールクラスのうち一つの特定モジュール（例えば、特定のシグナルペプチド）を含む）。その場合、前記ＲＮＡ配列は、例えば、シグナルペプチドと連結される目的タンパク質をコードすることができる。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態は以下の通りである。
【００３９】
細胞における目的配列の増幅及び／又は発現の方法であって、標的ＲＮＡとのトランススプライシングが可能であるように設計されたＲＮＡ配列を前記細胞に提供し、前記ＲＮＡ配列によって特異的に認識される前記標的ＲＮＡを前記細胞に提供して前記ＲＮＡ配列と前記標的ＲＮＡとの間の前記トランススプライシングによりもたらされる少なくとも１種類のアンプリコンを前記細胞内で産生させることによる方法（前記アンプリコンは、前記細胞において増幅し、目的配列を発現することが可能である）。
【００４０】
植物細胞における目的配列の増幅及び／又は発現の方法であって、トランススプライシングが可能であるように設計されたＲＮＡ配列と標的ＲＮＡとの間のトランススプライシングによって少なくとも１種類のアンプリコンを前記植物細胞内で産生させることによる方法（前記アンプリコンは、前記植物細胞において増幅し、目的配列を発現することが可能であり、前記植物細胞には、前記細胞において転写され前記ＲＮＡ配列を産生することが可能なＤＮＡ配列を前記細胞に提供することによって前記ＲＮＡ配列を提供し、前記標的ＲＮＡは、前記植物細胞に特有の遺伝子のＲＮＡ転写物である）。
【００４１】
植物細胞における目的配列の増幅及び／又は発現の方法であって、トランススプライシングが可能であるように設計されたＲＮＡ配列と標的ＲＮＡとの間のトランススプライシングによって少なくとも１種類のアンプリコンを前記植物細胞内で生成させることによる方法（前記アンプリコンは、前記細胞において増幅し、目的配列を発現することが可能であり、前記植物細胞には、前記細胞において転写され前記ＲＮＡ配列を産生することが可能なＤＮＡ配列を前記植物細胞に提供することによって前記ＲＮＡ配列を提供し、前記標的ＲＮＡは、形質転換又はトランスフェクションによって前記植物細胞に提供する）。
【００４２】
上記の好ましい実施形態では、前記アンプリコンの５’末端は前記標的ＲＮＡによって提供されることが好ましく、前記アンプリコンの３’末端は前記ＲＮＡ配列によって提供される。
【００４３】
さらに、本発明は、本発明の方法を行うことによって得られる、又は得ることが可能な細胞、組織、生物体又はそれらの材料を提供する。さらに、本発明の方法を行うために、ベクター又はプロベクター（ｐｒｏ−ｖｅｃｔｏｒ）を提供する。前記ベクターは、標的ＲＮＡとのトランススプライシングが可能なＲＮＡ配列を有する、又はコードすることが好ましい。さらに、前記ベクターの前記ＲＮＡ配列は、複製起点として機能する配列を含むことが好ましく、ＲＮＡレベル（例えば、植物ＲＮＡウイルス複製起点）であることが最も好ましい。さらに、複数の構成部材からなるキット（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）は、（ｉ）植物細胞、植物の種子、植物又は動物細胞若しくは動物及び（ｉｉ）前記ベクター又はそれらの前駆体を含む。前記ベクターはアグロバクテリアに入れることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
ＲＮＡトランススプライシングに基づく技術の非効率を回避するため、我々は、トランススプライシングが、増幅が可能である分子を生成し、その方法の最終結果が、目的核酸、並びにそれらの発現の産物の双方を増幅することを可能にする一つのアンプリコン又は多くのアンプリコンであるシステムを開発した。我々の知る限り、このような解決策について記載する従来技術は存在しない。本発明の方法を用いることにより、宿主細胞におけるスプライスされたｍＲＮＡとスプライスされていないｍＲＮＡの比は、スプライスされた産物寄りへ劇的に変化させることができる。このアプローチは、その過程が特異的トランススプライシングの結果として引き起こされるアンプリコンの構築に必要なすべての前駆体成分が宿主細胞に同時に存在する必要がある。アンプリコン要素又はプロアンプリコン（ｐｒｏａｍｐｌｉｃｏｎ）からのアンプリコンの生成をもたらすそのようなトランススプライシングの一般的スキームを図１に示す。２個のプロアンプリコンＲＮＡ分子間の相互作用は、操作されたリボザイムによって引き起こされ、増幅が可能である機能性ＲＮＡ分子を構築する。
【００４５】
トランススプライシング反応は、グループＩイントロン及びそれらの誘導体の使用法に限定されるものではない。それらの内部組織化及びスプライシングの機序に従って分類される様々なグループ／クラスのイントロンが存在する。核イントロンは、一般的に５’及び３’末端にＧＴ−ＡＧジヌクレオチドを有し、それらのスプライシングには通常スプライセオソーム生成を必要とする。グループＩ及びグループＩＩイントロンは、様々な真菌ミトコンドリア遺伝子にイントロンが見いだされた後に命名された。それらは、内部組織化に従って分類されるが、一般的には自身のスプライシングを自己触媒する能力を有する。
【００４６】
核イントロンは、ｓｎＲＮＰ媒介（スプライセオソーム媒介）機序を介してスプライスされる。様々な真核生物体における核遺伝子の選択的スプライシングを含むｃｉｓ−スプライシングの機序について記載している多くの文献が存在する（総説としては、Ａｄａｍｓ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、８巻、３３１〜３３９ページ、１９９６年；Ｈａｓｔｉｎｇｓ及びＫｒａｉｎｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３巻、３０２〜３０９ページ、２００１年を参照）。ｓｎＲＮＰ媒介機序が関与する天然に存在するトランススプライシングは、トリパノソーマ（Ａｇａｂｉａｎ、Ｎ．、Ｃｅｌｌ、６１巻、１１５７〜１１６０ページ、１９９０年；Ｌｕｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、３１９４７〜３１９５４ページ、１９９９年）及び線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｈｉｒｓｈ及びＨｕａｎｇ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、１４巻、１１５ページ、１９９０年）におけるｍＲＮＡの５’末端へのＳＬ（スプライストリーダー（ｓｐｌｉｃｅｄ  ｌｅａｄｅｒ））ＲＮＡの接着について記載されている。これらの小さな「スプライストリーダー」ＲＮＡは、哺乳類のｓｎＲＮＰスプライシング抽出物においてＵ１  ｓｎＲＮＡと機能的に置き換わることができる配列に融合されている５’エキソンからなる。ＳＬ  ＲＮＡの同様なトランススプライシングは、脊椎動物においても示された。ホヤ類の原索動物カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）では、少なくとも７種類の遺伝子のｍＲＮＡが、ＳＬＲＮＡとのトランススプライシングを受ける（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１５巻、２９４〜３０３ページ、２００１年）。また、ｍＲＮＡのトランススプライシングは、哺乳類の細胞（Ｅｕｌ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１４巻、３２２６〜３２３５ページ、１９９５年；Ｌｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、１１０６０〜１１０７１ページ、１９９９年；Ｃａｕｄｅｖｉｌｌａ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、５０７巻、２６９〜２７９ページ、２００１年）及びショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（Ｄｏｒｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻、９７２４〜９７２９ページ、２００１年）について立証されている。トランススプライシングが植物の核ＲＮＡ成熟において機能するという初期の徴候は、イネからのカルシウム依存性種子特異的プロテインキナーゼ（ＳＰＫ）をコードするｍＲＮＡの分析によりもたらされた（Ｋａｗａｓａｋｉ他、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１８巻、６２５〜６３２ページ、１９９９年）。ＳＰＫのｃＤＮＡクローンのマッピングは、全ｃＤＮＡが、異なるイネ染色体上に位置する２つの異なる領域、ＳＰＫ−Ａ及びＳＰＫ−Ｂに分けられることを示した。トランススプライシングは、スプライセオソーム媒介機序を用いることによって操作できることを明確に立証する様々なグループによる報告が存在する（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７巻、２４６〜２５２ページ、１９９９年；Ｌｉｕ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０巻、４７〜５２ページ、２００１年）。
【００４７】
グループＩ及びＩＩイントロンは、ｍＲＮＡ前駆体からそれら自身をスプライシングする能力を有する。この反応は、ＲＮＡ単独でｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。このような触媒活性を持つＲＮＡは、一般的にリボザイムと呼ばれる。本発明では、用語リボザイムは、別々のＲＮＡ分子間でトランススプライシング反応を行うことができる触媒的ＲＮＡをいうのに使用する。グループＩイントロンとグループＩＩイントロンは共に、人為的システムにおけるトランススプライシングが可能である（Ｂｅｅｎ他、Ｃｅｌｌ、４７巻、２０７〜２１６ページ、１９８６年；Ｊａｃｑｕｉｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３４巻、１０９９〜１１９４ページ、１９８６年；Ｊａｒｒｅｌｌ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、８巻、２３６１〜２３６６ページ、１９８８年）。また、トランススプライシングは、葉緑体の分断化された遺伝子におけるグループＩＩイントロン（Ｋｏｈｃｈｉ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻、１００２５〜１００３６ページ、１９８８年）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において人為的に分断化された遺伝子におけるグループＩイントロン（Ｇａｌｌｏｗａｙ−Ｓａｌｖｏ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１１巻、５３７〜５４９ページ、１９９０年）についても見いだされた。グループＩイントロンは、テトラヒメナサーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）のｒＲＮＡにおいて初めて発見された（Ｃｅｃｈ、Ｔ．Ｒ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９巻、５４３〜５６８ページ、１９９０年）。それらのイントロンは、切断部位の５’に接する標的配列中にＵを必要とし、切断部位の５’側で４〜６個のヌクレオチドと結合する。現在まで、７５種類以上のこのグループのメンバーが存在する。また、それらは、真菌及び植物のミトコンドリア（Ｒｉｃｈａｒｄ及びＤｕｊｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、３２巻、１７５〜１８１ページ、１９９７年；Ｃｈｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、１４２４４〜１４２４９ページ、１９９８年）、葉緑体（Ｔｕｒｍｅｌ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３２巻、４４６〜４６ページ、１９９３年）、ファージＴ４（Ｇａｌｌｏｗａｙ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１１巻、５３７〜５４９ページ、１９９０年）、藍藻類、及び他の生物体で見いだされた。
【００４８】
本発明を実施するために用いることができるいくつかの先進的アプローチ及び操作されたリボザイムが存在する（上記で引用された参考文献）。それらは、真核細胞におけるトランススプライシング事象を操作するための知られているすべてのタイプのイントロンの使用法を包含している。本発明における使用に加えて、グループＩテトラヒメナイントロンに基づいて操作されたリボザイム（ＵＳ６，０１５，７９４；Ａｙｒｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６巻、３５０７〜３５１２ページ、１９９８年）、スプライセオソーム媒介（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７巻、２４６〜２５２ページ、１９９９年；Ｌｉｕ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０巻、４７〜５２ページ、２００１年）又はグループＩＩイントロン媒介トランススプライシング（Ｍｉｋｈｅｅｖａ及びＪａｒｒｅｌｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、７４８６〜７４９０ページ、１９９６年；ＵＳ５，４９８，５３１）も適用可能である。
【００４９】
我々の発明において企図されているトランススプライシングの応用例の一つは、前駆体又はアンプリコン要素からのトランススプライシングによるＲＮＡウイルスに基づくアンプリコンの生成である。実施例１及び２において、我々は、植物においてＧＦＰを発現するＴＭＶに基づくベクターのリボザイム媒介生成について記載する。第一の実施例では、リボザイム媒介アンプリコン構築は、ＧＦＰ遺伝子をサブゲノム（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）プロモーターの制御下に置く。第二の実施例では、同一の戦略を用い、２個の遺伝子断片から機能性ＧＦＰ遺伝子を構築する。これらの戦略を用い、その構成成分から任意の目的遺伝子を構築し、発現させることができる。これは、新しい特徴を有するタンパク質の操作、例えば、ドメインスワップ実験にも有用なアプローチとなり得る。前記実施例において、我々は、植物細胞におけるアグロバクテリウム媒介一過性発現を使用した。或いは、プロアンプリコンの一部分を、核ゲノム中に安定に組み込まれた導入遺伝子から植物細胞に提供し、他の部分を一過性に送達することができる（アグロバクテリウム媒介送達、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、マイクロインジェクションなど）。植物細胞中にプロアンプリコンベクターを送達するには、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、エレクトロポレーション又はプロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換による細胞中への前記ベクターの直接導入などの様々な方法を使用することができる。アグロバクテリウム媒介植物形質転換も、ベクター送達の効率的方法である。このように、アグロバクテリウムによって運ばれるＴｉプラスミドベクター（ＵＳ５，５９１，６１６；ＵＳ４，９４０，８３８；ＵＳ５，４６４，７６３）、パーティクル又はマイクロプロジェクタイルボンバードメント（ＵＳ０５１００７９２；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１）によるなどの様々な適切な技術により、植物細胞中にＤＮＡを形質転換することができる。原則として、例えば、マイクロインジェクション（ＷＯ０９２０９６９６；ＷＯ０９４００５８３Ａ１；ＥＰ１７５９６６Ｂ１）、エレクトロポレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１；ＷＯ０８７０６６１４Ａ１）などの他の植物形質転換法も使用することができる。形質転換法の選択は、形質転換される植物種によって異なる。例えば、マイクロインジェクタイルボンバードメントは、単子葉植物の形質転換には好ましいが、双子葉植物については、アグロバクテリウム媒介形質転換が一般的により良好な結果をもたらす。また、前記プロアンプリコンの両部分は、同一又は異なる植物の核ＤＮＡ中に安定に組み込むことができる。前記トランスジェニック植物を交雑させることは、プロアンプリコンの相互作用部分を一つにまとめる可能性がある。場合により、プロアンプリコンの一部分又は両部分の発現を誘導プロモーターの制御下におくことができる。そのような場合、誘導プロモーターから転写をスイッチオンする非生物的又は生物的因子への曝露は、トランススプライシング事象を引き起こすことができる。
【００５０】
植物における遺伝子発現を制御するための既存技術は通常、組織特異的プロモーター及び誘導プロモーターに基づいており、それらのプロモーターはほぼすべて、誘導されていない場合であっても基礎的発現活性を受けている、すなわち、「漏出性」である。組織特異的プロモーター（ＵＳ０５９５５３６１；ＷＯ０９８２８４３１）は強力な道具であるが、それらの使用法は、応用例の極めて特異的な領域、例えば無菌植物の生産（ＷＯ９８３９４６２）又は種子における目的遺伝子の発現（ＷＯ０００６８３８８；ＵＳ０５６０８１５２）に限定されている。誘導プロモーターは、それらの誘導条件に従い、非生物学的因子（温度、光、化学物質）によって誘導されるプロモーター、及び生物学的因子、例えば、病原体又は害虫の攻撃によって誘導され得るプロモーターという２つのカテゴリーに分けることができる。第一のカテゴリーの例は、熱誘導（ＵＳ０５１８７２８７）及び寒冷誘導（ＵＳ０５８４７１０２）プロモーター、銅誘導システム（Ｍｅｔｔ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０巻、４５６７〜４５７１ページ、１９９３年）、ステロイド誘導システム（Ａｏｙａｍａ及びＣｈｕａ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１１巻、６０５〜６１２ページ、１９９７年；ＭｃＮｅｉｌｌｉｓ他、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１４巻、２４７〜２５７ページ、１９９８年；ＵＳ０６０６３９８５）、エタノール誘導システム（Ｃａｄｄｉｃｋ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６巻、１７７〜１８０ページ、１９９７年；ＷＯ０９３２１３３４）、及びテトラサイクリン誘導システム（Ｗｅｉｎｍａｎｎ他、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、５巻、５５９〜５６９ページ、１９９４年）である。植物に関する化学的誘導システムの領域における最新の展開の一つは、糖質コルチコイドのデキサメタゾンによってスイッチオンし、テトラサイクリンによってスイッチオフすることができるキメラプロモーターである（Ｂｏｈｎｅｒ他、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１９巻、８７〜９５ページ、１９９９年）。化学的誘導システムに関する総説については、Ｚｕｏ及びＣｈｕａ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１巻、１４６〜１５１ページ、２０００年）を参照されたい。誘導プロモーターの他の例は、植物において病原性関連（ＰＲ）遺伝子の発現を制御するプロモーターである。これらのプロモーターは、病原体の攻撃に反応する植物シグナル伝達経路の重要な成分であるサリチル酸、又はＰＲ遺伝子発現を引き起こすことが可能である他の化合物（ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール又はイソニコチン酸）による植物の処理によって誘導することができる（ＵＳ０５９４２６６２）。或いは、翻訳ベクターアプローチ（ＤＥ１００６１１５０．８）は、様々な組織における、又は植物発育の様々な段階における前駆体部分からのアンプリコンの生成を達成することを可能にするかもしれない。
【００５１】
ウイルス感染によって提供されるウイルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼを用いる制御可能な導入遺伝子発現システムについての報告が存在する（例えば、ＵＳ６０９３５５４；ＵＳ５９１９７０５を参照）。これらのシステムでは、組換え植物ＤＮＡ配列には、ウイルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるウイルスゲノムからのヌクレオチド配列が含まれる。本発明のためのアプローチの一つは、トランススプライシング媒介レプリコン構築の厳格かつ信頼できる制御のための組換えウイルススイッチアプローチ（ＤＥ１０１０９３５４．３）の使用法である。前記アプローチが、本発明の不可欠の部分であるのは、組換えウイルススイッチは、リボザイム媒介アンプリコン構築のプロベクター／前駆体としての機能を果たすことができるためである。しかしながら、構築されたアンプリコンは、ウイルススイッチを上回る選択可能な利点を有していなければならず、例えば、元のウイルススイッチよりも効率的に増幅及び／又は伝播しなければならない。例えば、前記スイッチは、その機能（例えば、細胞間移動）を制限する一部のウイルス遺伝子又はそれらの部分（例えば、ＭＰ−移行タンパク質）を失うかもしれないが、トランスジェニック植物において操作されたリボザイムの転写を引き起こす異種転写因子を運ぶことができる。前記リボザイムは、前記ウイルススイッチ（組換えウイルスＲＮＡ）と相互作用し、トランススプライシングを介して、細胞間移動を獲得した新しいより効率的なアンプリコンを生成するはずである。
【００５２】
通常、操作されたリボザイムによって媒介されるトランススプライシングは、比較的正確なプロセスであり、所定の位置においてスプライシングされている機能性ｍＲＮＡの生成をもたらす。しかしながら、トランススプライシングした分子の増幅によって生じる我々のアプローチの感度を考慮すると、どのミススプライシング事象も結果の質及びシステムの効率に著しい影響を与える可能性がある。また、トランススプライシングの精度は、様々な構築物間で著しく異なる可能性がある。トランススプライシングに続くｃｉｓ−スプライシングの導入は、トランススプライシングによって生じるどのような誤りをも訂正するのに役立つことができ、我々の発明にはそのようなステップも企図されている（実施例２を参照）。その場合、トランススプライシングによって産生されるＲＮＡ分子は、ＧＦＰをコードする配列内にイントロンを含むことができる。そのようなイントロンは、標準的核ＲＮＡｃｉｓ−スプライシングのプロセスにおいて容易にかつ正確に除去することができる。スプライシングの前記追加ステップ（ｃｉｓ−スプライシング）は、アンプリコン構築のプロセスに導入され、トランススプライシングに関与する操作された要素のプロセスに対して顕著な自由度及び柔軟性を追加することができる。
【００５３】
また、トランススプライシングと、それに続く増幅は、任意の目的遺伝子を特定の細胞内区画の標的とするために使用することができる。そのような実験の一般的スキームを図２に示す。多くの異なる細胞内／細胞外区画（プラスチド、アポプラスト、ミトコンドリア、空胞、核）、若しくは同じ区画内の多くの遺伝子、又は双方において同一の遺伝子を送達するのに必要な速度及び効率が得られる。同一植物細胞において２種類の異なる遺伝子を発現する方法を実施例３に記載する。
【００５４】
また、本明細書に記載の発明を用い、アンプリコン特性を有する分子中に任意の目的ｍＲＮＡが具体的に含まれる２つの独立したトランススプライシング事象を用いることにより、植物細胞に存在する任意のｍＲＮＡを増幅及び発現させることができる。したがって、一実施形態は、そのｍＲＮＡの選択的増幅及び発現による任意の特定居住型目的遺伝子の迅速な表現型決定を可能にする。
【００５５】
リボザイム媒介トランススプライシングと、続く構築されたＲＮＡの増幅は、植物細胞に限定されるものではなく、動物及び真菌細胞を含む任意の細胞培養／細胞システムにおいても使用することができる。酵母及び動物ＲＮＡウイルス及びレトロウイルスに基づく多くのベクターが記載されている（Ａｇａｐｏｖ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、１２９８９〜１２９９４ページ、１９９８年；Ｐａｌｅｓｅ、Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、１２７５０〜１２７５２ページ、１９９８年；Ｌｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７４巻、６５６４〜６５６９ページ、２０００年）。さらに、クロスキングダムバリア（ｃｒｏｓｓ−ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂａｒｒｉｅｒ）を容易に克服するような方法で多くのＲＮＡウイルスを操作することができる。例えば、動物ウイルスＦＨＶ（フロックハウスウイルス）は、ＦＨＶゲノムＲＮＡをトランスフェクションされた酵母、酵母細胞においてウイルスＲＮＡの複製、転写、及び感染性ビリオンの構築を誘導し（Ｐｒｉｃｅ、Ｒｕｅｃｋｅｒｔ及びＡｌｑｕｉｓｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、９４６５〜９４７０ページ、１９９６年）、タバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）へ全身的に伝播し、植物ウイルスの移行タンパク質を受けることができる（Ｄａｇｓｕｐｔａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻、４９１０〜４９１５ページ、２００１年）。また、多くの既存植物ウイルスＲＮＡベクターは、動物又は酵母細胞において増幅することができる可能性が高い。さらに、土壌中の植物病原体であるアグロバクテリウムツメファシエンスは、ＨｅＬａ細胞を形質転換できることが分かった（Ｋｕｎｉｋ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻、１８７１〜１８７６ページ、２００１年）。このことは、アグロバクテリウム媒介Ｔ−ＤＮＡ送達が、トランススプライシングのためのプロベクターを含む植物又は動物ウイルスプロベクターを動物細胞に導入するための便利な方法として使用できることを示唆している。
【００５６】
興味深い応用例は、レトロウイルス及びレトロトランスポゾンの使用法から生じることがある。宿主ゲノムに安定に組み込めるが、遺伝子転移のＲＮＡ媒介機序によって追加のコピーを作製することができる。レトロウイルスとレトロトランスポゾンの唯一の差は、レトロトランスポゾンは、外膜タンパク質を有しておらず、結果として、感染性のウイルス粒子を生成できず、細胞間移動を行えないことである（Ｂｏｅｋｅ及びＣｏｒｃｅｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４５巻、４０３〜４３４ページ、１９８９年）。レトロウイルス及びレトロトランスポゾン複製のＲＮＡ期の利用能を考慮すると、リボザイム媒介トランススプライシングを用い、組換えレトロウイルス及びレトロトランスポゾンに基づくベクターを生成することができる。ＲＮＡウイルスベクターと異なり、機能性レトロウイルス又はレトロトランスポゾンの構築は、遺伝子操作されたレトロポゾンの事象の宿主ゲノムへの組み込みをもたらすことができる。このようなベクターは、宿主種のゲノムＤＮＡ中に安定に組み込むことができる。このような組み込み事象を獲得した細胞は、組換えレトロエレメント組み込みを介して送達される選択マーカーを用いて選択することができる。このことは、トランススプライシング事象に関する増幅媒介選択（組み込み媒介選択）に対する追加物／代替案になり得る。前記アプローチが他の実施形態の高レベルな生物学的安定性を欠くのは、トランススプライシング産物を子孫へ安定に引き継ぐことができるためであるが、ある場合には、それが、問題の有用な解決策を提供する可能性があり、例えば、真核細胞を形質転換する別の方法としてある種の興味を与える可能性がある。レトロウイルス（ＵＳ５，５２７，０５８；ＵＳ６，２９１，７４０；ＵＳ６，３１６，２５５）及びレトロトランスポゾン（ＵＳ５，３５４，６７４；ＵＳ６，２８７，８６３；ＵＳ６，２２８，６４７）は、酵母及び動物細胞の形質転換に日常的に使用される。しかしながら、レトロトランスポゾンが植物を含む真核生物の間に広く分布しているにもかかわらず、植物細胞中への導入遺伝子送達のためのレトロトランスポゾンの使用法について記載しているデータは見いだされない（Ｌａｎｇｄｏｎ他、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５６巻、３１３〜３２５ページ、２０００年）。タバコのＴｎｔ１（Ｇｒａｎｄｂａｓｔｉｅｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３７巻、３７６〜３８０ページ、１９８９年；Ｆｅｕｅｒｂａｃｈ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７１巻、４００５〜４０１５ページ、１９９７年）及びＴｔｏ１（Ｈｉｒｏｓｈｉｋａ及びＯｔｓｕｋｉ、Ｇｅｎｅ、１６５巻、２２９〜２３２ページ、１９９５年；Ｔａｋｅｄａ他、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、２８巻、３０７〜３１７ページ、２００１年）はよく研究されており、トランススプライシングに基づく操作技術に使用することができる。レトロトランスポゾンは、プロトプラスト単離、組織培養（Ｈｉｒｏｓｈｉｋａ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３巻、２５２１〜２５２８ページ、１９９３年）、創傷、病原体感染、サリチル酸処理を含むストレス条件（Ｇｒａｎｄｂａｓｔｉｅｎ他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、３巻、１８１〜１８７ページ、１９９８年；Ｔａｋｅｄ���他、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、２８巻、３０７〜３１７ページ、２００１年）の間に活性化される。以上を参照すると、内因性レトロトランスポゾンは、リボザイム媒介トランススプライシングの標的の役割を果たすことができることが明らかになる。このように改変され、レトロトランスポゾンを宿主ゲノム中に組み込むことによって目的導入遺伝子を安定に導入することができる。さらに、このような組み込まれたＤＮＡは、組み込みの安定性及び導入遺伝子発現パターンに影響することがある望ましからぬレトロポゾン配列を除去するために部位特異的組換えによるさらなる変化を受けることができる（ＵＳ６，２００，８００）。
【００５７】
本発明者らの知る限り、これまで類似のアプローチは記載されていない。我々のアプローチが既存の技術を上回る利点を有しているのは、トランススプライシングの結果が増幅され、さらに逆転写したトランススプライシング産物の組み込みによって標的細胞の子孫に固定することができるためであることは明らかである。
【００５８】
本発明を用い、複数の産物又は長めの転写物を産生することができるのは、挿入サイズに制限がないためである。
【００５９】
我々の発明に記載のトランススプライシングシステムは、ｉｎ  ｔｒａｎｓで提供することができる２種類以上の構成成分を含む。このことは、我々のシステムが、より良く制御され、より安全であることを意味し、例えば、非誘導状態ではゼロ発現レベルを有する。
【００６０】
本発明を用い、センス又はアンチセンスオリエンテーションで発現することができる目的遺伝子、又はそれらの断片には、デンプン修飾酵素（デンプン合成酵素、デンプンリン酸化酵素、脱分枝酵素、デンプン枝作り酵素、デンプン枝作り酵素ＩＩ、デンプン粒結合型デンプン合成酵素）、スクロースリン酸合成酵素、スクロースホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフラクタンスクラーゼ、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、フラクトシルトランスフェラーゼ、グリコーゲン合成酵素、ペクチンエステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌ｇｌｇＡタンパク質、ＭＡＰＫ４及びオルソログ、窒素同化／代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼｐｈｉＣ３１、又はそれらの変異体の活性断片）、イソペンテニルトランスフェラーゼ、ＳｃａＭ５（ダイズカルモジュリン）、鞘翅類タイプの毒素又は殺虫性活性断片、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合タンパク質、脂質、アミノ酸、糖、核酸及び多糖を代謝する酵素、スーパーオキシドジスムターゼ、不活性プロ酵素型プロテアーゼ、植物タンパク質毒素、繊維生産性植物において繊維を変質させる形質、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からの鞘翅類活性毒素（Ｂｔ２毒素、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙｌＣ毒素、デルタ内毒素、ポリオペプチド（ｐｏｌｙｏｐｅｐｔｉｄｅ）毒素、プロトキシンなど）、昆虫特異的毒素ＡａＩＴ、セルロース分解酵素、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓからのＥ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シンナモイルアルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース−６−リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニアハービコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）リコピン合成酵素、ＡＣＣオキシダーゼ、ｐＴＯＭ３６によってコードされたタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ（ｋｅｔｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタノエート）合成酵素、アシルキャリアタンパク質、ナピン、ＥＡ９、非高等植物フィトエン合成酵素、ｐＴＯＭ５によってコードされたタンパク質、ＥＴＲ（エチレン受容体）、プラスチドピルビン酸リン酸ジキナーゼ、線虫誘導（ｎｅｍａｔｏｄｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）膜貫通型細孔タンパク質、植物細胞の光合成又はプラスチド機能を強化する形質、スチルベン合成酵素、フェノールをヒドロキシル化することができる酵素、カテコールジオキシゲナーゼ、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ、クロロムコン酸シクロイソメラーゼ（ｃｈｌｏｒｏｍｕｃｏｎａｔｅ  ｃｙｃｌｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、アントラニル酸合成酵素、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース１，６−ビホスファターゼ（ＦＢＰａｓｅ）、ＡＭＶ  ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレ��リカーゼ、ポティウイルスコートタンパク質、ＣＭＶコートタンパク質、ＴＭＶコートタンパク質、ルテオウイルスレプリカーゼ、ＭＤＭＶメッセンジャーＲＮＡ、突然変異したジェミニウイルスレプリカーゼ、ウンベルラリアカリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）Ｃ１２：０嗜好性（ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、植物Ｃ１０又はＣ１２：０嗜好性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０嗜好性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物合成酵素Ａ因子、植物合成酵素Ｂ因子、６−不飽和化酵素、植物細胞における脂肪酸のペルオキシソーム酸化において酵素活性を有するタンパク質、アシルＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰ）、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣデアミナーゼ、リボザイム、翻訳後切断部位を有するタンパク質、Ｇａｌ４転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインからなるタンパク質融合物、脂質相中への融合タンパク質を標的とすることが可能な目的タンパク質とのオレオシンタンパク質の翻訳融合物、スルホンアミド耐性を与えるＤＨＰＳ遺伝子、細菌ニトリラーゼ、２，４−Ｄモノオキシゲナーゼ、アセト酢酸合成酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、細菌ニトリラーゼ、プラスチドの内包膜（ｉｎｎｅｒ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に存在する成熟リン酸輸送体タンパク質のアミノ末端疎水性領域の、前記膜中への標的とされる目的タンパク質との融合物などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
トランススプライシングシステムと、続く増幅を用い、任意のヒト又は動物タンパク質を発現させることができる。そのような目的タンパク質の例には、とりわけ、免疫応答タンパク質（モノクローナル抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体など）、抗原、コロニー刺激因子、リラキシン、ポリペプチドホルモン、サイトカイン及びそれらの受容体、インターフェロン、成長因子及び凝固因子、酵素的に活性なリソソーム酵素、線維素溶解性ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシノーゲン、１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、並びに上記タンパク質の融合物、変異体及び合成誘導体のような機能保存的タンパク質が含まれる。
【００６２】
本発明の方法は、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）サプレッサータンパク質又は前記トランスジェニックコーディング配列のＰＴＧＳを抑制するための植物中へのそれらの機能保存的変異体若しくは断片をコードする遺伝子を発現することをさらに含む。前記ＰＴＧＳサプレッサータンパク質遺伝子又はその機能保存的変異体若しくは断片は、前記トランスジェニックコーディング配列を運ぶ同一ベクター又は特別のベクター上で植物に提供することができる。前記ＰＴＧＳサプレッサータンパク質は、ウイルス又は植物起源であることが好ましい。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質の例は、ジャガイモウイルスＸ  ｐ２５タンパク質、アフリカのキャッサバモザイクウイルスＡＣ２タンパク質、イネ黄斑ウイルスＰ１タンパク質、トマトブッシースタント（ｂｕｓｈｙ  ｓｔｕｎｔ）ウイルス１９Ｋタンパク質、ｒｇｓＣＡＭ又はこれらのタンパク質のうち一つの機能保存的変異体又は断片である。前記機能保存的変異体又は断片は、上記タンパク質のうち一つに対して７５％の配列同一性を有することが好ましい。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質及びそれらの使用法の詳細は、ＷＯ０１３８５１２に見いだすことができる。
【００６３】
また、我々の発明は、選択可能／スコアラブル（ｓｃｏｒａｂｌｅ）マーカー遺伝子及びそれらの様々な目的遺伝子との融合物に適用可能であり、最良の組換えタンパク質産生株の直接選択を可能にする。そのような選択可能／スコアラブルマーカーの例には、とりわけ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド６’−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ）、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＦＲ１）、６’ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ（６’ＧＡＴ）、アセトアセテート合成酵素（ＡＬＳ）、リン酸マンノース異性化酵素（ＰＭＩ）、グリフォセートオキシドレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）、２−デオキシグルコース−６−リン酸ホスファターゼ（２−ＤＯＧ−６−Ｐ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、並びに選択可能でスクリーニング可能なマーカー遺伝子融合物の遺伝子又は断片が含まれる。
【００６４】
さらに、トランススプライシング技術のさらなる発展を条件として、本発明は、特定の宿主メッセンジャーＲＮＡの差次的増幅にも有用である。
【実施例１】
【００６５】
サブゲノムプロモーターの制御下におけるトランススプライシング媒介遺伝子配置
ＴＭＶアンプリコンの５’及び３’末端を運ぶ２種類の構築物は、標準的分子生物学技法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ、分子クローニング：実験用マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、第２版）を用いて設計した。第一の構築物（図３、上部）は、ＲｄＲｐ（ＲＮＲ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）遺伝子、ＭＰ（移行タンパク質）遺伝子及びＣＰ（コートタンパク質）サブゲノムプロモーター（ＳＧＰｒ）と、続いて人工リボザイムの可変部分と相補的な配列を含むＴＭＶアンプリコンの５’末端を運ぶ（図３及び７を参照）。第二の構築物は、完全長ｓＧＦＰ遺伝子及びＴＭＶの３’ＮＴＲ（非翻訳領域）をさらに含む。構築物並びにそれらのトランススプライシングの産物の略図を図３（一般的スキーム）及び７（詳細に）に示す。
【００６６】
トランススプライシングシステムの５’末端のクローニング
標的配列として、ＨＰＴ遺伝子の一部（３００ヌクレオチド、配列を以下に示す）を選んだ。ＨＰＴは細菌遺伝子であり、植物遺伝子のいずれとも関係しない。Ｇ／Ｃ含量は約６０％であるため、ウイルスベクターの５’部分と３’部分間の塩基対形成は極めて効率的でなければならない。
2005522182.tif 000003
【００６７】
ＨＰＴ標的配列の増幅のために以下のプライマーを発注した（制限部位は、ボールド体文字で書き、下線を引く）
Ｔａｒｇｈｐｔ１：
５’−ａｔｇｃｃｔｃｇａｇｔｔａｃｔａｇａａｔｔｇｃｔｇａｔｃｃｃｃａｔｇｔｇｔａｔｃａｃ−３’
ＸｈｏＩ
Ｔａｒｇｈｐｔ２：
５’−ｔｃａｇｇｇａｔｃｃａｔｇｃｃｔｃｃｇｃｔｃｇａａｇｔａｇｃｇｃｇｔ−３’
ＢａｍＨＩ
Ｔａｒｇｈｐｔ４：
５’−ｔｇａｃｔｃｔａｇａａｔｔｇｃｔｇａｔｃｃｃｃａｔｇｔｇｔａｔｃａｃ−３’
ＸｂａＩ
Ｔａｒｇｈｐｔ５：
５’−ｔｃａｇａｇａｔｃｔａｔｇｃｃｔｃｃｇｃｔｃｇａａｇｔａｇｃｇｃｇｔ−３’
ＢｇＩＩＩ
【００６８】
構築物ｐＩＣＨ１６００をテンプレートとして見なし、これらのオリゴヌクレオチドを標的配列のＰＣＲ増幅に使用した。ＰＣＲ産物１（プライマーｔａｒｇｈｐｔ１及びｔａｒｇｈｐｔ５により得られる）及び２（プライマーｔａｒｇｈｐｔ４及びｔａｒｇｈｐｔ５）をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングし、それぞれプラスミドｐＩＣＨ７６６８及びｐＩＣＨ７６８５を得た。また、ＰＣＲ産物１をＸｈｏＩ及びＢｇＩＩＩにより消化し、ＸｈｏＩとＢｇｌＩＩ部位間のｐＩＣＨ６５４９中にクローニングし、中間構築物ｐＩＣＨ７７８４（ｎｏｓターミネーターに融合されたＨＰＴ標的）を得た。
【００６９】
トランススプライシングシステムの５’部分のために別の中間プラスミドをクローニングした。最適な塩基対形成及びスプライシングのためにはＭＰ終止コドンの前後関係を最適化する必要があった（図７を参照）。その目的で、テンプレートｐＩＣＨ３４６１のＰＣＲ増幅では、２種類の他のプライマーを使用した。
Ｔａｒｇｍｏｄ１（ｐ）：
５’−ｔｇｔｇｇｔｔｇａｃｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｔｔｃｇｇｔｔｇｃａｇｃａ−３’
ＥｃｏＲＩ
Ｔａｒｇｍｏｄ２（ｍ）：
５’−ａｇｔｃｃｔｃｇａｇｔｇａｃａａｔｔａｔｔｃｇｇｇｔｔｔｇｔａａｔｇｔｔｇｔａａ−３’
ＸｈｏＩ
【００７０】
次いで、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ（ｐＩＣＨ７６７１）中にクローニングし、切り離して、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ制限部位との間のｐＩＣＨ３４６１中に挿入した（ｐＩＣＨ７７６５）。最終構築物ｐＩＣＨ７８１４（Ａｃｔ２プロモーター−ＲｄＲｐ−ＭＰ−ＨＰＴ／標的（センス）−ｎｏｓターミネーター、補足図５を参照）は、ｐＩＣＨ７７６５（ベクター、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ部位）及びｐＩＣＨ７６６８（挿入、ＸｈｏＩ／ＢｇＩＩＩ）から得た。
【００７１】
トランススプライシングシステムの５’部分のＴＭＶ−Ｕ１に基づく版（ｐＩＣＨ７９４２、補足図７を参照）は、ＣＰ−３’ＮＴＲ−ｎｏｓターミネーターの代わりにＸｈｏＩとＰｓｔＩ制限部位との間にＨＰＴ／標的（センス）−ｎｏｓターミネーターを配置することにより、ｐＩＣＨ７９３７（Ａｃｔ２プロモーター−ＲｄＲｐ（Ｕ１）−ＭＰ（Ｕ１）−ＣＰサブゲノムプロモーターの完全版−ＸｈｏＩ−ＣＰ−３’ＮＴＲ−ｎｏｓターミネーター）及びｐＩＣＨ７７８４から構築した。
【００７２】
ｐＩＣＨ７８１４とｐＩＣＨ７９４２は共に、（それぞれ、７７５２及び７９５０と一緒に（下記参照））タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉のパーティクルボンバードメントによってテストした。アグロインフィルトレーション（Ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）実験については、ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（ｐＩＣＨ７８１４）或いはＫｐｎ／ＳａＩＩ（ｐＩＣＨ７９４２）制限部位間のｐＢｉｎ１９中にクローニングした。
【００７３】
トランススプライシングシステムの３’末端のクローニング
グループＩイントロンに基づく合成リボザイムの配列は、テトラヒメナテルモフィラ前駆体２６Ｓ  ｒＲＮＡ（Ｋｏｅｈｌｅｒ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８５巻、１９３５〜１９５０ページ、１９９９年；Ａｙｒｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６巻、３５０７〜３５１２ページ、１９９９年）から採取した。
2005522182.tif 000004
【００７４】
このリボザイム配列は、ＡＴＧ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ（Ｐ０２０２００１）に発注し、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ制限部位との間のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）中に挿入し（プラスミドｐＩＣＨ０８０）、さらなるクローニングステップに用いた。次いで、ｐＩＣ０８０（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ）からのリボザイムを、ＨＰＴ−標的のアンチセンス版（ｐＩＣＨ７６８４、ＸｂａＩ／ＢｇＩＩＩ）と融合させ、一次プラスミドｐＩＣＨ７７０１（ベクターとしてｐＵＣ１９、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ；補足図３）を得た。中間構築物ｐＩＣＨ７６９２（ＲＢ−３５Ｓプロモーター−ＩＲＥＳｍｐ７５（ｃｒ）（翻訳エンハンサーとして）−ｓＧＦＰ−３’ＮＴＲ−ｎｏｓ−ＬＢ；補足図２）は、バイナリーベクターｐＩＣＢＶ（ＣｌａＩ／ＸｂａＩにより消化）並びに２種類の挿入断片、ｐＩＣＨ１７３１（ＣｌａＩ／ＢｓｒＧＩ）及びｐＩＣＨ５３３２（ＢｓｒＧＩ／ＸｂａＩ）からの２断片クローニングで得た。クローニング最終ステップ中に、ｐＩＣＨ７７０１とｐＩＣＨ７６９２の双方を用い、トランススプライシングベクターｐＩＣＨ７７５２の最終３’部分（ＲＢ−３５Ｓプロモーター−ＨＰＴ／標的（アンチセンス；補足図４）−リボザイム−ＩＲＥＳｍｐ７５（ｃｒ）（翻訳エンハンサーとして）−ｓＧＦＰ−３’ＮＴＲ−ｎｏｓ−ＬＢ）を得た。
【００７５】
トランススプライシングシステムの３’部分のＴＭＶ−Ｕ１に基づく版（ｐＩＣＨ７９５５；補足図６）を得るため、プラスミドｐＩＣＨ７７５２をＮｃｏＩ／ＡｐａＩにより消化し、ｐＩＣＨ６６７１からのＮｃｏＩ／ＡｐａＩ断片（ｓＧＦＰ−３’ＮＴＲ（Ｕ１））をライゲーションした。
【００７６】
構築物ｐＩＣＨ７７５２及びｐＩＣＨ７９５５は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のパーティクルボンバードメント（下記参照）又はアグロインフィルトレーション（Ｖａｑｕｅｒｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６巻、１１１２８〜１１１３３ページ、１９９９年）によってテストし、ＧＦＰ蛍光は、ＵＶランプ（３８５ｎｍ）で検出した。
【００７７】
マイクロプロジェクタイルボンバードメント
マイクロプロジェクタイルボンバードメントは、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を利用して行った。別々のタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉に、マクロキャリア（ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）発射点からストッピングスクリーンまでの距離１５ｍｍ、ストッピングスクリーンから標的組織までの距離６０ｍｍとし、１１００ｐｓｉで打ち込んだ。ラプチャーディスクとマクロキャリア発射点の距離は１２ｍｍとした。
【００７８】
ＤＮＡ金コーティング手順（ＰＥＧ／Ｍｇ）は、以下の通り行った。金懸濁液（５０％グリセロール中６０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを、シリコン処理したエッペンドルフ管中でプラスミドＤＮＡ（１μｇ／μｌまで）５〜１０μｌと混ぜ、続いて１．０Ｍ  ＭｇＣｌ２中の４０％ＰＥＧ１５μｌを添加した。混合物を２分間ボルテックスし、次いで、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離（２０００ｒｐｍ、１分間）後、ペレットを、無水アルコール３０μｌに最終的に分散させた。エタノール中のＤＮＡ−金懸濁液のアリコート（６μｌ）を、マクロキャリアディスク上に装着し、５〜１０分間乾燥させた。
【実施例２】
【００７９】
完全長コーディング配列のトランススプライシング媒介構築
実施例１に記載のアプローチを用い、２種類の構築物を設計した。構築物並びにトランススプライシングの産物の略図を図４に示す。実施例１との相違は、プロアンプリコンの５’末端は、サブゲノムプロモーターの他に、ＧＦＰ（ｓＧＦ）の５’末端（場合により、シロイヌナズナアクチン２イントロン１の５’末端と共に）と、続いて合成リボザイム及び転写終結シグナルによって認識できる配列を含むことである。プロアンプリコンの３’末端は、リボザイムの３’末端がＧＦＰの３’末端（場合により、ＡＤＨ１イントロンの３’末端が先行する）と、続いてＴＭＶ３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ）及び真核生物の転写終結領域からなることを除いては、Ａｙｒｅ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６巻、３５０７〜３５１２ページ、１９９９年）によって記載されているように設計された合成リボザイムからなる。両構築物をシロイヌナズナアクチン２プロモーターの制御下に置き、ｐＩＣＢＶファミリーのバイナリーベクター中に再クローニングした（補足図１を参照）。実験は、タバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉における両構築物のアグロバクテリウム媒介一過性発現（Ｖａｑｕｅｒｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６巻、１１１２８〜１１１３３ページ、１９９９年）を用いて行った。これらの構築物からの転写物のリボザイム媒介トランススプライシングは、ＧＦＰタンパク質を発現する機能性ＴＭＶアンプリコンの生成をもたらした。ｓＧＦＰの存在は、タバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉の浸潤領域において紫外光の下で容易に検出可能であった。
【実施例３】
【００８０】
同一植物細胞における２種類以上の遺伝子の発現のためのトランススプライシングの使用法
実施例２に記載の構築物に類似しているが、ＧＵＳ遺伝子の２つの部分（図５においてＧＵ及びＳで示す）を運ぶ２種類の追加構築物をｐＩＣＨ７９４２及び７９５５から取得し、バイナリーベクター中に置いた（ｐＩＣＢＶファミリー又はｐＢｉｎ１９、実施例１及び２を参照）。ＧＵＳの２つの部分を有するプロアンプリコンを運ぶアグロバクテリウム菌株を、ＧＦＰプロアンプリコンの２つの部分を運ぶアグロバクテリウム菌株と混ぜ、成長中のタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉｎａｎａ）植物の葉に接種した。接種から１週間後に、紫外ランプを用いてＧＦＰの発現について植物をモニターした。ＧＦＰを発現する葉は、ｘ−ｇｌｕｃによる染色によってＧＵＳ活性の検出に使用した（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、Ｋａｖａｎａｇｈ及びＢｅｖａｎ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６巻、３９０１〜３９０７ページ、１９８７年）。ＧＵＳ活性の青色に染色されたセクターは、接種した大部分の葉組織においてＧＦＰ活性のセクターと共存した。この実験の略図を図５に示す。
【実施例４】
【００８１】
トランススプライシングを介する機能性ウイルス遺伝子の構築は、増幅及び細胞間移動が可能なアンプリコンをもたらす
実施例１に記載の基本的プラスミドから、より大きな構築物を設計した。これらの構築物略図を、トランススプライシングの産物と一緒に図６に示す。トランススプライシングシステムの５’末端（ｐＩＣＨ７９６３から改変した）は、シロイヌナズナアクチン２プロモーター、ＴＭＶ−Ｕ１レプリカーゼ遺伝子のＮ末端部分（図６においてＲｄと示されているＲｄＲｐのＮ末端部分）の開始コドンからシロイヌナズナアクチン２イントロン１の５’末端とＢａｍＨＩ部位までと、続くセンスオリエンテーションのＨＰＴ−標的（実施例１を参照）及びｎｏｓ終止／ｐｏｌｙＡ追加シグナルを含む。システムの３’末端は、一次構築物ｐＩＣＨ６５４９及びｐＩＣＨ７６５２から得られ、３５Ｓプロモーター、合成リボザイム（ｐＩＣＨ７７５２から採取、上記参照）に融合しているＨＰＴ−標的（アンチセンスオリエンテーション）、ＡＤＨ１イントロンの３’末端、ＲｄＲｐ遺伝子のＣ末端部分（図６においてＲｐと示される）と、続いてＭＰ遺伝子、ＣＰサブゲノムプロモーターの制御下にあるｓＧＦＰ遺伝子、ＴＭＶ３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ）及びｎｏｓ終止／ｐｏｌｙＡ追加シグナルからなる。
【００８２】
実験は、パーティクルボンバードメントを用いて行った（実施例１を参照）。実施例１及び２におけると同様、ＧＦＰは、タバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉において発現されたが、この場合、目的リポーター遺伝子（ＧＦＰ又はＧＵＳ）の代わりに、機能性ウイルス遺伝子（ＲｄＲｐ）が回復し、効率的複製及び細胞間移動をもたらした。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】アンプリコン生成をもたらすトランススプライシングの一般的スキームを示す図である。
【図２】トランススプライシングが、シグナルペプチドを様々な目的遺伝子と融合させ、同一の細胞下区画を標的とする複数の機能性アンプリコンを生成する一般的スキームを示す図である。
【図３】トランススプライシングが、サブゲノムプロモーターの制御下に目的遺伝子（ＧＦＰ）をトバモウイルスアンプリコン内に入れるスキームを示す図である。ＳＧＰｒは、サブゲノムプロモーターを表す。
【図４】トランススプライシング及びｃｉｓ−スプライシングが、トバモウイルスに基づくアンプリコン内で機能性目的遺伝子（ＧＦＰ）の構築をもたらすスキームを示す図である。ｓＧＦは、合成ＧＦＰのＮ末端部分を表す。Ｐは、前記ＧＦＰのＣ末端部分を表す。ＭＰは、移行タンパク質を表す。
【図５】トランススプライシングが、異なる導入遺伝子を有する２種類のアンプリコンの生成をもたらすスキームを示す図である。ＧＵは、ＧＵＳのＮ末端部分を表す。Ｓは、ＧＵＳのＣ末端部分を表す。ＲｄＲｐは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを表す。
【図６】トランススプライシングが、トバモウイルスに基づくアンプリコンにおいて機能性ウイルス遺伝子（ＲｄＲｐ）の構築をもたらすスキームを示す図である。Ｒｄ及びＲｐは、それぞれＲｄＲｐのＮ及びＣ末端部分を表す。
【図７】アンプリコン生成をもたらすトランススプライシングの詳細な機序を示す図である。
【図８】補足図１は、プラスミドｐＩＣＢＶ１０（ｃａｒｂ）を示す。
【図９】補足図２は、プラスミドｐＩＣＨ７９６２を示す。
【図１０】補足図３は、プラスミドｐＩＣＨ７７０１を示す。
【図１１】補足図４は、プラスミドｐＩＣＨ７７５２を示す。
【図１２】補足図５は、プラスミドｐＩＣＨ７８１４を示す。
【図１３】補足図６は、プラスミドｐＩＣＨ７９５５を示す。
【図１４】補足図７は、プラスミドｐＩＣＨ７９４２を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月17日(2004.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランススプライシングが可能なように設計されたＲＮＡ配列と標的ＲＮＡとの間のトランススプライシングによって少なくとも１種類のＲＮＡアンプリコンを細胞内で産生させ、それによって、前記アンプリコンが、前記細胞において増幅することができ、目的配列を発現することができる、細胞における目的配列の増幅及び／又は発現の方法。
【請求項２】
前記細胞に前記ＲＮＡを提供することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞に前記ＲＮＡ配列を前記提供することは、前記細胞に、前記細胞において転写されて前記ＲＮＡ配列を産生することが可能なＤＮＡ配列を提供することを含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞に前記ＲＮＡ配列を前記提供することは、ウイルストランスフェクション、アグロバクテリウム媒介送達、非生物学的送達を含み、又は核ＤＮＡ中に予め組み込まれ若しくは核内に保持されて、標的ＲＮＡとのトランススプライシングが可能なように設計されたＲＮＡ配列を自律的に生成する前駆体ＤＮＡの変換による請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡ配列は、目的配列をさらに含む請求項１から４までの一項に記載の方法。
【請求項６】
前記目的配列は、二本鎖ＲＮＡ構造を形成するための自己相補性を有する部分を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記二本鎖ＲＮＡ構造は、宿主細胞の遺伝子に対して配列同一性を有する部分があり、前記細胞において前記遺伝子の発現を阻害するのに十分な長さである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡ配列及び／又は前記標的ＲＮＡは、前記アンプリコンが複製起点を含むように設計される請求項１から７までの一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞には、前記アンプリコンの増幅を可能にするＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが提供される請求項１から８までの一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的ＲＮＡは、前記細胞の内因性ＲＮＡ、特にメッセンジャーＲＮＡである請求項１から９までの一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞には、ウイルストランスフェクション、アグロバクテリウム媒介送達、非生物学的送達により、又は核ＤＮＡ中に予め組み込まれ若しくは核内に保持されて、標的ＲＮＡとのトランススプライシングが可能なように設計されたＲＮＡ配列を自律的に生成する前駆体ＤＮＡの変換によって、前記標的ＲＮＡが提供される請求項１から１０までの一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アンプリコンは、ＲＮＡウイルス起源である請求項１から１１までの一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンプリコンは、ＤＮＡウイルス起源である請求項１から１１までの一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンプリコンは、レトロウイルス又はレトロトランスポゾン起源である請求項１から１１までの一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記トランススプライシングは、１種類を超えるＲＮＡアンプリコンをもたらす請求項１から１４までの一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記トランススプライシングの後に逆転写を行ってＤＮＡを産生させる請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡは、前記細胞のゲノムに組み込まれている請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞には、トランススプライシングが可能なように設計された１種類又は複数のＲＮＡ配列が提供される請求項１から１７までの一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記トランススプライシングは、２種類以上のアンプリコンを産生する請求項１から１８までの一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記トランススプライシングの後にＲＮＡｃｉｓ−スプライシングを行う請求項１から１９までの一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アンプリコンのうち一つは、前記細胞における増幅が可能であり、他の非自律性アンプリコンの複製に必要な機能をｉｎ  ｔｒａｎｓで提供する十分に機能性の自律性アンプリコンである請求項１から２０までの一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アンプリコンのうち一つは、本質的に、他のアンプリコンの複製に必要な１種類又は複数の機能をｉｎ  ｔｒａｎｓで提供する野性型ウイルス又は弱毒化野性型ウイルスである請求項１から２１までの一項に記載の方法。
【請求項２３】
１種類又は複数の前記アンプリコンは、感染力、ウイルス粒子を構築する能力、細胞間移動、逆転写、宿主染色体への組込み又は全身性移動などの他のウイルス又はレトロトランスポゾン機能を保持している請求項１から２２までの一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞は、植物細胞である請求項１から２３までの一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞は、動物細胞である請求項１から２３までの一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞は、野性型である請求項１から２５までの一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞をさらに遺伝子操作し、又は一過性に改変して、増幅、感染力、ウイルス粒子構築、遺伝子サイレンシングの抑制、細胞の代謝プロフィールの変更、逆転写、宿主染色体への組込み、得られた前記アンプリコンの細胞間又は遠距離移動に必要な１種類又は複数の機能をｉｎ  ｔｒａｎｓで提供する請求項１から２５までの一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞又は前記細胞を含む生物体の前記遺伝子操作又は前記一過性組の改変に厳格に依存することによって、前記方法の制御の改善及び／又は前記方法の安全性の改善を提供する請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アンプリコンの増幅は、一時的であり、前記増幅に必要な１種類又は複数の機能が一過性に提供される時間内に起こる請求項２７又は２８のうち一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記トランススプライシングが目的ＲＮＡ配列又は転写ユニットを構築することによって、前記ＲＮＡ配列及び前記標的ＲＮＡが各々、前記目的配列又は前記転写ユニットの一部を提供する請求項１から２９までの一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記トランススプライシングが、転写ユニットにおいて、以下の群、すなわち転写及び翻訳シグナル若しくはエレメント；イントロン、エキソン、インテイン又はエクステイン；シグナル、輸送、ターゲティング又は接着モチーフ；精製及び可視化タグ；触媒的、認識、親和性又は他の機能性のドメイン若しくはそれらの部分から選択される遺伝子エレメントを構築し、
それによって、前記遺伝子エレメントが、１個又は複数の遺伝子から誘導されるか、人為的に提供される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
遺伝子又は遺伝子制御エレメントの管理下での発生（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）のために使用される請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
多量体タンパク質産生に必要なポリペプチド（複数）の同時産生にとって必要な２種類以上の目的配列の増幅及び／又は発現をもたらす請求項１から３２までの一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記多量体タンパク質は、ヒト又は動物モノクローナル抗体などの免疫応答タンパク質である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
機能ゲノム科学、遺伝子同定、遺伝子機能の決定、生化学的経路解析又は選択的スクリーニングを目的とする目的配列の増幅及び／又は発現をもたらす請求項１から３４までの一項に記載の方法。
【請求項３６】
生化学的産生又は治療の目的で、核酸配列の特異的増幅及び／又は発現をもたらす請求項１から３５までの一項に記載の方法。
【請求項３７】
トランススプライシングが可能であるように設計された前記ＲＮＡ配列は、以下の群、すなわちグループＩイントロン、グループＩＩイントロン、遺伝的に改変した若しくは人工のイントロン、又は宿主細胞によりプロセシングされると特異的トランススプライシングが可能であるリボザイムを産生するプロイントロンから選択される請求項１から３６までの一項に記載の方法。
【請求項３８】
目的とする生化学的プロセス又は生化学的カスケードは、前記トランススプライシング及び／又は前記増幅によってスイッチオンされる請求項１から３７までの一項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１から３８までの一項に記載の方法を行うことによって得られる、又は得ることが可能な、ヒトを除く細胞、組織、生物体又はそれらの材料。
【請求項４０】
請求項１から３８までの一項に記載の方法を行うためのベクター又はプロベクターであって、標的ＲＮＡとのトランススプライシングが可能であるＲＮＡ配列を有するか又はコードするベクター又はプロベクター。
【請求項４１】
（ｉ）植物細胞、植物の種子若しくは植物、又はヒトを除く動物細胞若しくは動物、及び（ｉｉ）請求項４０に記載のベクターを含む複数の構成部材からなるキット。
【国際調査報告】
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