(57)【要約】  単独で、またはコア／シェル粒子のような粒子を含む複合体として用いることができるフィブロイン溶液および懸濁液を用い、生物活性材料が作成される。該材料は、身体の骨および他の組織の構築、修復、再生または増加をサポートするように設計される。溶液および懸濁液には、リン酸カルシウム前駆体の外側コーティングを持つ生分解性を持つポリマーでコートされた無機コア材料を含むコア／シェルタイプの粒子を含まれることができる。フィブロイン溶液、懸濁液および複合体を注射して、キャビティを充填する、または失われた組織を置き換えることができる。注射の後、該材料は、分解しつつ、組織再生を促進することができる骨格を生じさせることができる。存在する場合、粒子の分解は、骨格内にさらなる多孔度を生じさせ、制御された様式で他の化合物を放出して、組織修復に必要な細胞の増殖および活性化を増強することができる。フィブロイン溶液、懸濁液および複合体を注射する能力は、骨および他の組織を置き換えまたは修復するのに用いられる多くのタイプの外科的治療の必要性を低下させることができる。
2005510268.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロイン懸濁液および、所望により、孔隙形成性粒状材料を含む組成物。
【請求項２】
フィブロイン懸濁液が、オクルージョン（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、ゲル、クリームまたはペーストの形態である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該フィブロインがモリカイコのフィブロインを含む請求項１記載の組成物。
【請求項４】
該フィブロインが蛋白質分解フィブロインである請求項１記載の組成物。
【請求項５】
該孔隙形成性粒状材料がヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、セラミック、サンゴ、キトサン、または前記材料の１以上を含む組合せである請求項１記載の組成物
【請求項６】
該孔隙形成性粒状材料が任意のカルシウム化合物、任意のリン酸塩源、おほび任意の反応性層を含むコア／シェル粒子を含む請求項１記載の組成物。
【請求項７】
該シュルが生分解性ポリマーを含む請求項１記載の組成物。
【請求項８】
該コアがヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム系ミネラル、再吸着可能なガラス充填剤、または前記材料の１以上を含む組合せを含み、ここに、該シュルが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリトリメチル炭酸塩、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、ポリフォスファジン、ポリアセタール、ポリエステル、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリアルファーヒロドキシ酸、ポリアミド、ポリアミノ酸、または前記生分解性ポリマーの１以上を含む組合せを含む請求項６記載の組成物。
【請求項９】
該フィブロイン懸濁液がさらに生理活性剤を含む請求項１の組成物。
【請求項１０】
該生理活性剤が抗生物質、骨形成蛋白質、組織成長を促進する化合物、骨再生を促進する化合物、創傷修復を促進する化合物、細胞、または前記剤の１以上を含む組合せを含む請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
熱、酸、アルコール、蛋白質分解酵素、生体適合性ポリマー、または前記剤の１以上を含む組合せを含む剤でフィブロイン溶液を処理して、フィブロイン懸濁液を形成することを特徴とするフィブロイン懸濁液の形成方法
【請求項１２】
該フィブロイン懸濁液がオクルージョン（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、ゲル、クリームまたはペーストの形態である請求項１１の記載の方法。
【請求項１３】
熱での処理が、約−２０℃から約５０℃の温度まで加熱することを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
アルコールがグリセロールを含み、該酸がクエン酸、アスコルビン酸、乳酸、または前記酸の１以上を含む組合せを含み、ここに、該生体適合性ポリマーがポリエチレングリコール、ポリエチレン酸化物、ポリビニルピロリドン、または前記生体適合性ポリマーの１以上を含む組合せを含み、ここに、該蛋白質分解酵素がストレプトマイセス・グリセウス由来のプロテアーゼ、パパイン、キモトリプシン、または前記蛋白質分解酵素の１以上を含む組合せを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
さらに、孔隙形成性粒状材料、生理活性剤、または前記剤の１以上を含む組合せ、および材料をフィブロイン懸濁液に添加することを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
組織形成を促進するのに有効な量のフィブロイン溶液または懸濁液を組織構築の部位に投与することを含み、ここに、該フィブロイン溶液または懸濁液が、所望により孔隙形成性粒状材料、生理活性剤、または前記剤の１以上を含む組合せおよびフィブロリン材料に対する材料を含むことを特徴とするフィブロイン溶液または懸濁液で哺乳動物を処置する方法。
【請求項１７】
該フィブロイン懸濁液がオクルージョン（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、ゲル、クリーム、またはペーストの形態である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
細胞増殖を誘導するのに有効な量のフィブロイン溶液または懸濁液と細胞とを接触させることを特徴とするフィブロイン溶液または懸濁液で細胞を処置する方法。
【請求項１９】
該フィブロイン懸濁液がオクルージョン（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、クリーム、またはペーストの形態である請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、骨および組織修復の分野、特に骨および組織修復のための材料、材料の製法、および材料の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
怪我の後の骨および他の組織の置き換えおよび修復は、しばしば、外科的治療の使用を必要とする。３００，０００を超える人工股関節が米国および欧州において毎年埋め込まれている。加えて、人口の１０％が歯周病に罹り、３０％が彼／彼女の人生の間で歯のインプラントを必要とする。他の外科的治療は軟骨修復および軟組織の形成外科手的処置を含む。従って、組織の修復または復元用の骨格材料、特に多くの侵襲的治療の必要性を排除することができる注入可能な材料を作り出すのが望ましい。そのような材料は生体適合性、すなわち、細胞障害性ではないか、または身体中で有害な反応を引き起こさず、かつ、好ましくは、生物活性であり、すなわち、組織形成に必要な細胞活性の代謝に必要な発育シグナルを供するべきである。それらは、さらには、好ましくは、再吸着可能で、修復の間に毎日の活動によって課される応力に耐えることができる。
【０００３】
組織修復のための骨格に対するいくつかの異なるアプローチが提案されている。脱塩化骨、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、および他の無機材料のような硬組織修復用の現在入手可能な材料は生物学的に誘導される生物活性骨格ほどは効果的でない。ヒアルロン酸は、米国特許５，９３９，３２３号に開示されている骨格材料として用いられてきた。もう１つのアプローチば、米国特許第４，４９０，９８４号および米国特許第５，４８０，６４４号に開示されているようなコラーゲン−ベースの材料を用いることであった。しかしながら、これらの材料は、貧弱な物理的特性、予測できない分解速度および、コラーゲンでは免疫原性反応および潜在的な汚染に関連する危険性のため、潜在的使用および適用のその範囲は制限されているようである。
【０００４】
カイコの絹の蛋白質成分であるフィブロインを含む膜、フィルムおよびファブリックは、動物組織および器官の成長用の基材材料として提案されてきた。特に、ＰＣＴ出願ＷＯ  ０１／２５４０３は水溶液からのフィブロイン膜型の形成を記載している。該膜は、その中に、成長媒体および種々の細胞型が添加された容器内に成形され、フィブロイン膜は骨芽細胞、上皮細胞および肝細胞のような細胞の増殖をサポートした。フィブロインの膜およびフィルムはＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：ＰａｒｔＢ：Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ３２：９６１−９６８，１９９４においてＴｓｕｋａｂａらによって；および「Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｆｒｏｍｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＰｏｌｙｍｅｒｓＩｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｆｒｏｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｓｈｉｇｈａ  Ｊａｐａｎ，１９９９年５月においてＭｏｔｔａらによっても開示されている。ＰＣＴ出願ＷＯ０２／２９１４１は、ギ酸でフィブロイン繭を処理することによって作成されたフィブロイン不織布の形成を記載している。フィブロイン不職布を用いて角質細胞および繊維芽細胞のような細胞を培養することができる。インビボ組織修復のための骨格としてそのようなフィブロインの膜、フィルムまたは不職布を用いる欠点は、材料を回復すべき部位に位置させるために侵襲的外科的治療を必要とすることであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、インビトロおよびインビボ双方で用いられる生物活性骨格材料、特に、生体適合性で、生物活性であって、再吸着可能である材料に対する要望が依然として存在する。さらに、好ましくは、侵襲的外科的治療を用いることなく、回復すべき部位に容易に適用される生物活性骨格材料に対する要望が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
先行技術の上記のおよび他の欠点および欠陥は、フィブロイン溶液または懸濁液を含む組成物によって克服されるか、または軽減される。フィブロイン溶液および懸濁液は生体適合性であり、生物活性であって、再吸着可能である。特に有利な特徴において、フィブロイン溶液または懸濁液は注射によって所望の部位に適用することができ、これは、侵襲的外科治療の使用を最小化する。
【０００７】
また、約−２０℃から約５０℃まででフィブロイン溶液を加熱して、フィブロイン懸濁液を形成することを含む、フィブロイン懸濁液の形成方法が開示される。フィブロイン懸濁液を形成するためのもう一つの方法は、フィブロイン溶液を、フィブロイン懸濁液を形成するのに有効な剤で処理することを含む。効果的な剤は酸、アルコール、蛋白質分解酵素、生体適合性ポリマー、または前記剤の少なくとも１以上を含む組合せを含む。
【０００８】
さらに、細胞増殖、好ましくは組織増殖を促進するのに有効な量のフィブロイン溶液または懸濁液を構築すべき部位に投与することを含む組織構築の方法が開示される。投与は好ましくは注射による。前記および他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および図面から当業者に認識され、理解されるであろう。
【０００９】
さて、例示的図面を参照し、そこでは、同様のエレメントにはいつくかの図面中で同様に番号付けする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
フィブロインは、当該ポリペプチド鎖のほぼ９０％を占めるグリシン、アラニン、セリンおよびチロシンを含む１８の異なるアミノ酸の組合せを含む公知のポリペプチドである。フィブロインは、ジスルフィド結合によって結合し、ほぼ３５０，０００ダルトン（Ｈ鎖）および２５，０００ダルトン（Ｌ鎖）の分子量を有する２つの主鎖よりなることが一般的に認識されている。フィブロインの利用できる研究は、フィブロインに由来する製造された産物の構造および形態は、それを形成するのに用いられる加工条件に大いに依存していることを示す。有利には、ここでは、新規なフィブロイン懸濁液は種々の技術を用いてフィブロイン溶液から生産することができ、そしてこのように生産されたフィブロイン懸濁液は、身体中の正常な部位（すなわち、負傷のない部位）および、例えば、負傷または老化による修復および／または復元の必要性のある部位における組織の形成を含めた、組織構築において利用性を有することを発見した。本明細書中で用いられる場合には、「フィブロイン溶液」とは、実質的に１つの相を有する組成物、すなわち、フィブロインが実質的に溶解した溶媒を含む組成物をいう。フィブロインは、当該フィブロインの９５重量％を超えて、好ましくは９８重量％を超えて、最も好ましくは９９重量％を超えて溶液中にある場合に実質的に溶解している。さらに本明細書中で用いられる場合には、「フィブロイン懸濁液」とは、２以上の相を有する組成物（すなわち、多相物質）をいい、少なくとも１つの相は溶媒および少なくとも１つのフィブロインを含む相を含む。理論に拘束されるつもりはないが、フィブロイン懸濁液は、種々の形態で、例えば、コロイド、エマルジョンの形態で、ミセル、ゾルまたはゲルとして存在することができる。
【００１１】
本明細書中でフィブロイン懸濁液を記載する目的では、外観および相対的粘度のような容易に観察できる物理的特長によって特徴付けできる「フィブロインオクルージョン（ｆｉｂｒｏｉｎ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）」、「フィブロインゲル」、「フィブロインクリーム」、「フィブロインペースト」に言及する。「フィブロインオクルージョン（ｆｉｂｒｏｉｎ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）」とは、水平表面上を流れることができるフィブロイン懸濁液をいう。オクルージョン（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）はしばしば曇っており、すなわち、ある程度の不透明性を呈する。水平表面上を流動できるとは、懸濁液の１立法センチメートルの試料が、水平表面に沈積された場合に実質的に直ちに変形することを意味する。理論に拘束されるつもりはないが、フィブロインオクルージョン（ｆｉｂｒｏｉｎ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）は、溶媒の連続相中の１０−９から１０−６メートルの寸法を有する固体粒子の分散液を含むコロイド、特にゾルの形態であり得る。
【００１２】
本明細書中で用いる「フィブロインゲル」とは、ゲルのような物質的特長、例えば、可塑性、弾性、またはある程度の剛性を有するフィブロイン懸濁液をいう。ゲルは、ゲルを形成するのに用いる方法に依存して不透明または半透明であり得る。オクルージョン（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）とは対照的に、水平表面に置かれた場合に、ゲルは容易には流動しない。しかしながら、熱または圧力のような物理的応力が加えられた場合、すなわち、ゲルが可逆的である場合、ゲルは流動し、または変形することができる。理論に拘束されるつもりはないが、フィブロインゲルは溶媒に分散させられたフィブロインの三次元網目構造を含むことができる。
【００１３】
本明細書中で用いる「フィブロインクリーム」とは、フィブロインオクルージョン（ｆｉｂｒｏｉｎ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）よりも粘性の高いフィブロイン懸濁液をいう。それは、しばしば白色であって、それは水平表面では実質的に非流動性である。水平表面で実質的に非流動性とは、フィブロインクリームの１立方センチメートルの試料が、水平表面に沈積されて、１分以内に認識可能に変形しないことを意味する。フィブロインゲルと同様に、フィブロインクリームは、熱または物理的応力を当該材料に加えられた場合に変形することができる。
【００１４】
本明細書中で用いる「フィブロインペースト」とは、水平表面に置いた場合に、高度に粘性であって、非流動性であるフィブロイン懸濁液をいう。水平表面で非流動性とは、フィブロインペーストの１立方センチメートルの試料が、水平表面に沈積させて１時間以内に認識可能に変形しないことを意味する。しかしながら、該ペーストは、物理的圧力下では変形可能である。
【００１５】
あるいは、種々のタイプのフィブロイン懸濁液は、特定サイズの開口を通じての懸濁液の（すなわち、針の）注射可能性に基づいて記載することができる。フィブロインオクルージョン（ｆｉｂｒｏｉｎ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）またはゲルは、約５８４マイクロメートルの直径を有する２０ゲージ注射針のような小さな開口針を介して手で容易に注射できる。フィブロインクリームはより粘性が高く、従って、より大きな穴の注射針、すなわち、約８３８マイクロメートルの直径を有する１８ゲージ針を介して手で容易に注射することができる。ペーストは、非常に大きな穴の注射針、すなわち、約２ミリメートルよりも大きな直径を有するものを介する以外は手で容易に注射することができない。オクルージョン（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、ゲル、クリームまたはペーストのようなフィブロイン懸濁液の分類は、フィブロイン懸濁液の使用を記載することにおける便宜のためにすぎない。
【００１６】
フィブロイン懸濁液はインビトロまたはインビボで形成することができる。フィブロイン懸濁液のインビボ形成には、熱、蛋白質分解酵素、酸、アルコールまたは生体適合性ポリマーのような、懸濁液を形成するのに有効な剤でフィブロイン溶液を処理することを含むことができる。あるいは、フィブロイン懸濁液は、フィブロイン溶液を動物に注射、または別の方法で投与することによってインビボで形成することができる。理論に拘束されるつもりはないが、動物の身体における部位への投与の後、フィブロイン溶液は迅速に過剰の水を消費し、それにより、例えば、ゲルの形態の懸濁液を生じることができる。また、フィブロイン懸濁液はインビボで形態変化を受けることができる。例えば、フィブロインオクルージョン（ｆｉｂｒｏｉｎ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）は、動物の身体における部位へのインビボ投与の後に、フィブロインゲルを形成するように転移を受けることができる。
【００１７】
フィブロインの便宜な源は、フィブロインおよびセリシン蛋白質を共に含むモリカイコからの繭である。絹は、クモ、および種々の昆虫から生産される繊維状蛋白質である。その最も知られているものはカイコ（特に、モリカイコ）である。絹繊維は縫合糸として用いられてきたが、編んだ絹縫合糸はしばしば非免疫学的異物反応を生じ、外科的処置後に毎年肉芽腫を起こすことが判明している（黒崎ら，日本医科大学雑誌６６：４１−４４，１９９９）。しかしながら、観察された非免疫学的異物反応は、天然の絹中のセリシンの存在によって引き起こされ、純粋なフィブロインは免疫学的応答を惹起しないことが確認されている。
【００１８】
好ましくは、フィブロインを精製して、身体中で有害な反応を引き起こし得るセリシンのような毒素または他の物質を除去する。セリシンの多くは、例えば、精錬によって、すなわち、９８℃のドデシル硫酸ナトリウムと共に、またはそれなくして炭酸ナトリウム中で洗浄することによって除去することができる。
【００１９】
次いで、単位容量当たりほぼ１０重量％のフィブロインを含有する臭化リチウムの水溶液のような溶媒に精製されたフィブロインを溶解させることができる。フィブロイン溶液は、所望により、フィブロインの構造または安定性に有意には悪影響しない緩衝液および他の添加剤のような他の成分を含有することができる。フィブロインは、さらに、好ましくは約９０重量％を超えて、より好ましくは約９５重量％を超えて、最も好ましくは約９９重量％を超えるように精製することができる。臭化リチウムは蒸留水に対する透析によって除去され他の不純物はろ過によって除去することができる。一旦精製されれば、フィブロインは凍結乾燥して粉末とし、貯蔵することができる。次いで、溶液を熱、蛋白質分解酵素、酸、アルコールまたは生体適合性ポリマーで処理することによって、フィブロイン懸濁液を純粋なフィブロイン溶液から形成することができる。
【００２０】
一つの実施形態においては、フィブロイン懸濁液はフィブロイン溶液の熱処理によって生じさせることができる。例えば、ゲルを生じさせるためには、フィブロイン溶液を約−２０℃に約２から２４時間維持し、次いで、約４℃から約５０℃までの温度に加熱することができる。熱処理条件の変更の結果、上記のような種々の属性の懸濁液が得られ、これは特定の適用に基づいて当業者によって選択され得る。
【００２１】
別の実施形態においては、フィブロイン懸濁液は、特定のアミノ酸の間の切断に特異的な蛋白質分解酵素でフィブロイン溶液を処理することによって生じさせることができる。そのような蛋白質分解酵素は、限定されるものではないが、ストレプトマイセス・グリセウス由来のプロテアーゼ、パパイン、キモトリプシン等を含む。理論に拘束されるつもりはないが、蛋白質分解酵素処理は、フィブロインポリマーの平均分子量を低下させることによって懸濁液を生じさせることができると仮定される。限定されたアミノ酸配列を選択して、所望の分子量およびアミノ酸配列を有する断片を生じさせることができる。断片のサイズを調整して、フィブロイン材料の生物活性および分解速度のような特定の適用の具体的要求を満たすことができる。特定の平均分子量の選択は、最終的な用途、所望の粘度、他の成分の添加、分子量分布、担体のタイプ等を含めた多数の因子に依存するであろう。蛋白質分解処理の後のフィブロインの平均分子量は約２００から約０．１キロダルトン（Ｋｄ）、好ましくは約５０から約０．２Ｋｄ、より好ましくは約２０から約０．５Ｋｄである。
【００２２】
別の実施形態においては、フィブロイン懸濁液は、フィブロイン溶液を酸で処理することによって形成することができる。理論に拘束されるつもりはないが、そのフィブロイン溶液のｐＨをその等電点以下にまで低下させることによってフィブロインの溶媒への混和性が低下し、それにより懸濁液の形成を促進すると考えられる。酸は、フィブロインのｐＨ点をｐＨ３．８のその等電点以下（すなわち、約ｐＨ３．７未満またはそれと等しい
）まで低下させることができる酸である。好ましい酸はクエン酸、アスコルビン酸、乳酸、上記の酸の組合せ等である。添加する酸の量は、溶液のｐＨを所望のｐＨまで低下させるのに十分な量であり、それは当業者によって容易に決定される。
【００２３】
フィブロイン懸濁液は、あるいは、フィブロイン溶液をアルコールで処理することによって形成することができる。理論に拘束されるつもりはないが、アルコールはフィブロイン蛋白質の構造を改変し、それにより懸濁液の形成を促進することができると考えられる。アルコールは好ましくは溶媒と混和性であり、例えば、グリセロール、エチレングリコール、エタノール、イソプロパノール、および上記アルコールの１以上を含む混合物などであり得る。好ましいアルコールはグリセロールである。フィブロイン溶液に添加する場合、アルコールは、全容量の約１０容量％から約５０容量％の量で添加する。
【００２４】
さらに別の実施形態においては、より粘性の高いフィブロイン溶液は、フィブロイン溶液を、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレン酸化物、ポリビニルピロリドン等のような１以上の生体適合性ポリマーと混合することによって形成することができる。生体適合性ポリマーは、約２から約２０重量％の量でフィブロイン溶液と混和性であるべきである。
【００２５】
種々の添加剤、例えば、診断的活性または治療的活性のような生理活性を有する生理活性剤を用いて、フィブロイン溶液および懸濁液の有効性を改良することができる。従って、活性剤は、インビボにて放出された剤の位置を同定するのに有用な検出可能な標識（例えば、放射製標識）を含むことができる。また、活性剤は、疾患又は症状を治療するのに有用な治療薬を含む。生理活性剤は、例えば、感染を阻害する抗生物質または他の化合物；骨粗鬆症を治療するための治療薬、骨および骨格に作用する他の因子、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）および組織成長、骨再生または創傷治癒を促進する他のサイトカインなどを含む。生理活性剤は細胞、例えば、患者の部位から採取し、フィブロイン懸濁液で培養した細胞でもあり得る。
【００２６】
例示的な抗生物質はテトラサイクリン、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、スルホンアミド薬物、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、エリスロマイシン、バンコマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、ナイスタチン、アムホテリシンＢ、アマンチジン、イドクスウリジン、ｐ−アミノシクル酸、イソニアジド、リファンピン、アンチノマイシンＤ、ミトラマイシン、ダウノマイシン、クロレキシジン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、イミダゾールカルボキサミド等を含む。
【００２７】
骨粗鬆症を治療するための例示的な治療薬および骨および骨格に作用する他の因子はカルシウム、アレンドロネート、骨ＧＬａペプチド、副甲状腺ホルモンおよびその活性断片、ヒストンＨ４−関連骨形成および増殖ペプチド、ならびにそれらの突然変異体、誘導体および類似体を含む。
【００２８】
例示的なサイトカインはトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、骨形成因子、およびそのような成長因子の生物活性な類似体、断片および誘導体を含む。多機能調節蛋白質であるトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーのメンバーが特に好ましい。ＴＧＦスーパー遺伝子ファミリーのメンバーはベータトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３）；骨形成蛋白質（例えばＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）；ヘパリン結合成長因子（例えば、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））；インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）；成長分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）；およびアクティビン（例えば、アクティビンＡ、アクティビンＢ、アクティビンＡＢ）を含む。成長因子は哺乳類細胞からのように、天然または自然源から単離することができるか、あるいは例えば、組換えＤＮＡ技術によって、または種々の化学的プロセスによって、合成により調製することができる。加えて、これらの因子の類似体、断片または誘導体を用いることができ、但し、それらは天然分子の生物学的活性の少なくとも幾らかは呈するものとする。例えば、類似体は、部位特異的突然変異誘発または他の遺伝子工学技術によって改変された遺伝子の発現によって調製することができる。
【００２９】
生理活性剤は分化した細胞または分化していない細胞でもあり得る。間葉幹細胞は、例えば、それが送達される組織と同一タイプの細胞を生じさせるために送達することができる。間葉幹細胞は分化されておらず、従って、分化して、活性剤、または局所的組織環境の効果（化学的、物理的等）の存在により種々のタイプの新しい細胞を形成することができる。分化した間葉幹細胞の例は骨芽細胞、軟骨細胞および繊維芽細胞を含む。例えば、骨芽細胞は骨欠陥の部位に送達して新しい骨を生じさせることができ；軟骨細胞は軟骨欠陥の部位に送達して新しい軟骨を生じさせることができ；繊維芽細胞は送達して新しい結合組織が必要とされるいずれの場所においてもコラーゲンを生じさせることができる。細胞または遺伝子は同種または異種由来のいずれであってもよい。例えば、細胞は、遺伝的に変更されている宿主動物種以外の種からのものであり得る。
【００３０】
生理活性剤は、単にフィブロイン溶液および懸濁液に添加することができるか、あるいは別の成分に共有結合させることができる。あるいは、生理活性剤は放出制御剤で添加することができる。一つの放出制御処方物は、米国特許第４，６７５，１８９号においてＫｅｎｔによって記載されているように、コポリ（乳酸／グリコール酸）のようなゆっくりと分解する非毒性の非抗原性ポリマー中に分散させるか、またはカプセルかした活性剤を含む。さらなる放出制御処方物は当業者に明らかであろう。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８およびＲ．Ｗ．Ｂａｋｅｒ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７参照。
【００３１】
別の実施形態においては、フィブロイン溶液および懸濁液は、多孔度および生分解のような因子に影響する作成されたサイズおよび化学組成の有機物、無機物、および／または蛋白質含有物を含むことができる。好ましい実施形態においては、フィブロイン溶液および／または懸濁液は、さらに、ゲルにおいてさらなる多孔度を生じ、それにより、注射後に骨格を形成するコア／シェル粒子のような粒子を含むことができる。
【００３２】
骨成長および形成を助けることができる例示的な有機または無機粒子は、例えば、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、サンゴおよびキトサンのような海洋動物由来粒子などを含む。
【００３３】
好ましい孔隙形成性粒子は、生分解性有機シェルによって無機コアが囲まれたコア／シェル粒子である。そのような粒子は、骨格を形成するための、一時的なサポート構造および内部基材双方として働くことができる。シェルの制御された生分解は、フィブロイン骨格に更なる多孔度を供することができる。コア／シェル粒子を以下に詳細に記載する。
【００３４】
好ましいコアは無機コアである。無機コアの組成、サイズおよび形状は種々の適用の要望に合致させるように変化させることができる。例えば、コアは、骨成長を助けるためのヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、またはサンゴおよびキトサンのような海洋動物由来粒子であり得る。コアはその最大直径で約１ナノメートルから約５００マイクロメートルの直径を有することができ、球形、プレート、繊維などの形態とすることができる。
【００３５】
任意の反応性層をコア上に設けて、コアのポリマーシェルへの接着を促進することができる。適切な反応性層はコアおよびシェルの組成に依存し、それは当該分野で公知である。特に有用な種類の化合物は反応性チタン酸塩、ジルコン酸塩およびシラン、例えば、ガンマ−グリシドキシプロピルトリエトキシシランを含む。
【００３６】
シェルは少なくとも一つの生分解性ポリマーを含むことができる。ポリマーまたは複数ポリマーの組成および分子量は、後に記載するように生分解の適切な速度を得るように選択することができる。シェル用の適切な生分解性ポリマー組成物はポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリトリメチル炭酸塩、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、ポリホスファジン、ポリアセタール、ポリエステル、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリアルファ−ヒドロキシ酸、ポリアミド、ポリアミノ酸、および適切な生分解速度を持ち、生体適合性である他の生分解性ポリマーまたはコポリマーのうちの１以上を含む。
【００３７】
生分解性ポリマーは予め形成されたポリマーであるかあるいは、コア上への沈積の時点で重合することができる。生分解性ポリマー層は、当該分野で公知の方法によって、例えば、反応性モノマーまたはポリマーの希薄有機溶液中のコア粒子のスラリーを作成することによって、反応性層またはコアそれ自体に連結することができる。一つの実施形態において、シェルのモノマーまたはポリマーを化学的に修飾して、身体内の細胞と相互作用するペプチドのような末端基、例えば、組織修復または骨再生を促進することにおいて活性な末端基を含ませる。そのような末端基は、例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を含むペプチド、シグナル分子、および、例えば、骨形成蛋白質のような先に記載した生理活性剤の多くを含むことができる。
【００３８】
生分解性シェルは、骨格の一時的な物理的安定性およびさらなる内部多孔度の発生の間のバランスを供するように選択することができる。コア／シェル成分の容量比は、約９５／５から５／９５まで広く変化させることができ、好ましいコア／シェルは２０／８０である。
【００３９】
コアへのポリマーの吸着の後、懸濁させた固体用の安定化剤を所望により添加することもできる。コア／シェルスラリーは、少量の、例えば、約０．５重量％から約３重量％の高分子量ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールを含有する希薄な水溶液と混合することができる。
【００４０】
コア／シェル粒子をスラリーとして形成する場合、スラリーをカルシウム源、および所望によりリン酸塩源と混合して、形成された粒子のポリマーシェルの外部にコーティングを形成することができる。カルシウムおよび任意のリン酸塩源を供するための例示的な前駆体はカルシウム塩（例えば酢酸カルシウム塩）、カルシウム塩およびリン酸エステルまたは処方された血漿液の緩衝化水−アルコール溶液である。このカルシウムイオンを塗った外側コーティングは、生物活性フィブロインマトリックスとの界面として働くことができる。
【００４１】
得られたコア／シェル粒子は水相中の比較的安定な懸濁液中にある。乾燥、例えば、凍結乾燥の後、粒子を軽く粉砕してコア／シェル粉末を形成することができる。一旦形成されれば、次いで、コア／シェル粉末をフィブロイン溶液または懸濁液と混合することができる。混合物の含水量は流動性を維持するように調整することができる。粒子およびフィブロイン溶液または懸濁液の相対量は、特定の適用に応じて変化させることができる。典型的には、溶液または懸濁液は約１０容量％から約５０容量％（容量％）、好ましくは約３０容量％から約５０容量％の粒状相を含むことができる。
【００４２】
一旦形成されれば、フィブロイン溶液および／または懸濁液を組織構築のための骨格としてインビボで用いることができるか、あるいは組織構築のために動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒト等のような哺乳類に投与することができる。本明細書中で用いる場合には、「組織構築」とは、例えば、形成外科において、または負傷の部位における修復または復元においてで、負傷の部位においてではなく、硬いまたは柔軟な組織の形成を含むことを意図する。
【００４３】
もしフィブロイン懸濁液がオクルージョン（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）またはゲルの形態である場合、フィブロイン懸濁液は好ましくは注射によって組織構築部位に投与する。注射用のフィブロインゲルは可逆的なゲル、すなわち、例えば、熱または物理的応力の適用下で粘性の低い状態に戻ることができるゲルである。物理的応力は注射プロセスの間にゲルに加えられる応力を含むことができる。あるいは、もしフィブロイン懸濁液がクリームまたはペーストの形態であるならば、フィブロイン懸濁液は、外科的置き換えのような手段によって、または広げることによって（すなわち、局所投与）、組織構築部位（すなわち、組織修復が必要な部位）に置くことによって適用することができる。理論に拘束されるつもりはないが、投与の態様とは無関係に、一旦適用されれば、フィブロイン懸濁液は、組織構築で用いられる細胞の侵潤および成長を可能とすることができるマトリックスまたは骨格を形成することができる。
【００４４】
フィブロイン溶液および懸濁液は、注射または他の形態の投与の準備ができている実行者に供することができる。粒子と混合した場合、フィブロイン溶液および懸濁液の特徴は、１−または２−シリンジ技術を用いる注射の時点で選択することができる。１−シリンジ技術においては、粒子およびフィブロイン溶液または懸濁液の相対量は、適用に応じて実行者によって供され、次いで、混合され、針を備えた伝統的な単一シリンジに入れ、注射される。あるいは、粒子およびフィブロイン溶液または懸濁液は別々のカートリッジにて供することができ、置き換えに先立って混合チャンバー中で混合することができる。置き換えの間に可変混合を可能とするデバイスの使用により、骨格の組成を変化させて、与えられた部位（例えば、骨または柔軟組織）において特性の変動に良好にマッチさせる能力が実行者に供される。２つの成分の含水量は、迅速な混合および注射を可能とするように選択する。
【００４５】
使用において、フィブロイン溶液および懸濁液は、例えば、キャビティーを充填し、失われた組織を置き換える種々の目的で、または柔軟組織または関節の修復のためにヒトまたは動物に投与される。フィブロイン溶液または懸濁液は、例えば、注射または局所適用によって投与することができる（すなわち、クリームとして皮膚に適用される）。理論に拘束されるつもりはないが、溶液の場合には、注射された物質および周囲の体液の間に準平衡が確立され、それにより、インビボで骨格を形成することができる懸濁液を生じるまで、溶液は迅速に過剰の水を体に消費することができると考えられる。オクルージョン（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）の場合には、体中での置き換えに際して、オクルージョン（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）はゾル−ゲル転移のような転移を受けることができ、それにより、骨格の形態であり得るゲルを生じさせると考えられる。全ての場合において、一旦注入されれば、物質は多孔性であることが好ましい。
【００４６】
理論に拘束されるつもりはないが、注射されたフィブロイン溶液または懸濁液がコア／シェル粒子を含む場合、経時的なポリマーシェルの分解はゲルの形態で、懸濁液内にさらなる多孔度を生じさせ、組織修復に必要な細胞の浸潤および成長を増強する骨格を形成すると考えられる。一旦注射されれば、例えば、フィブロインは、コア／シェル粒子の分散液をカプセル化するゲルの形態の三次元のクモの巣状体（またはハチの巣状体）を含むことができる。図１は、組織修復のプロセスにおける仮想の三次元のクモの巣状体の模式図を示す。フィブロイン１は細胞に浸潤し、コア／シェル粒子２は少なくとも部分的な分解を受ける。コア／シェル粒子の寸法および凝集の状態は、骨格のさらなる多孔度を制御する。新しく形成された組織３は、孔隙において組織化を受けることができる。フィブロインマトリックスの組成および形態は、生物活性を制御する主な要因である。
【００４７】
多孔性フィブロイン骨格は、治癒プロセスの間にゆっくりと分解しつつ、細胞接着、増殖および活性化を促進することができる。さらに、フィブロインの分解は約２０キロダルトン以下の範囲の分子量を持つペプチドを生じさせることができ、これは、周囲の生物学的流体に放出されることができ、それにより周囲の細胞の代謝活性を増強することができる。理論に拘束されるつもりはないが、さらに、熱的または蛋白質分解酵素処理は、成長因子、薬理学的分子、および細胞接着の媒介に特異的なペプチドとの最後の相互作用のために特異的活性部位を露出させることによって、フィブロインの生分解速度を増加させることができると仮定される。
【００４８】
上記のフィブロイン溶液および懸濁液は、例えば、骨および組織のための種々の修復手法で用いることができる。例示的な手法は、限定されるものではないが、整形外科、顎顔面、歯科、ならびに腫瘍切除および形成外科処置のような一般的な外科手法を含む。例えば、フィブロイン溶液および懸濁液は、患部骨を修復することによって、骨粗鬆症および骨関節炎に関係する骨の接着結合および修復を介して骨折の修復に用いることができる。そのような材料は（例えば、人工器官の）骨セメントとして用いて、歯および関節インプラント用の安定化剤として、歯周ポケットにおいて、組織を充填しまたは増加させ、組織のサイズまたは形状を修復し、また臀部、膝、および他の人工器官と骨の間で生じるギャップ用の充填剤として用いて、人工器官固定化を達成し、骨再生を促進することができる。また、フィブロイン溶液および懸濁液を用いて、例えば、歯周病患者の歯の周りに形成されたポケットを充填し、それいより部分的な骨再成長を可能とし、恐らくは、細菌感染を低下させ；骨、および例えば臀部または膝インプラントのようなインプラントの間のギャップを充填することができる。このようなギャップの充填は、潜在的に、補てつ物の安定化を導くことができ、補てつ物の耐用年数を増加させることができる。また、フィブロイン溶液および懸濁液を用いて、骨腫瘍外科処置および再構成外科処置によって引き起こされるもののような組織欠陥を充填し、骨および組織修復を増強させ、例えば、新たに形成される骨組織の形成と共に、カルシウム沈殿、または骨芽細胞増殖および活性を誘導することができる。
【００４９】
コア／シェル粒子を含むフィブロイン溶液および懸濁液は、骨修復に特に有用である。理論に拘束されるつもりはないが、この場合には、骨修復プロセスは以下の通りに起こり得る考えられる。分解される第１の成分は、生分解性シェルとカプセル化フィブロインウェブとの間の界面ゾーンとして働く、コア／シェル粒子のカルシウムイオンを塗ったシェルであり得、これによりカルシウムイオンを多く含む水層に体液が拡散するのを可能とする。フィブロインマトリックスの多孔度およびシェル分解によって生じたさらなる多孔度は多孔性骨格への骨芽細胞の浸潤を可能とし、これは、骨格の生物活性クモの巣状体と相互作用し、新しい組織および骨の成長を開始させる。次の段階は、もし存在すれば、例えば、ミネラルコアへ生分解性シェルを結合させ、これにより再吸着可能なミネラルコアを残存するヒドロゲルの流体に導入する−ＳｉＯ−結合の水和による反応性層の生分解である。修復プロセスには、新しい骨が生じるとともに、フィブロインの生分解が伴う。複合骨格は、少なくとも骨再生の最初の段階の間、三次元で物理的に安定な表面積の大きなクモの巣状体の物理的安定性を維持することができる。
【００５０】
フィブロイン溶液および懸濁液の特に有利な特徴は、材料の形態および物理的特性が、特定の適用の要件を満たすように、生物活性マトリックスおよびコア／シェル生分解性粒子の変更によって容易に変えられる。フィブロイン以外の生物活性の生分解性ゲルおよびポリマーは、本明細書中に記載したコア／シェル分子と組み合わせて用いて、骨格を形成することができると考えられる。
【００５１】
フィブロイン溶液、懸濁液および複合体は、骨芽細胞、角質細胞、繊維芽細胞、周皮細胞、内皮細胞のような細胞型において増殖を誘導することができる。フィブロイン溶液および懸濁液は多くの細胞型の増殖を増強させることができるので、それらは、例えば、形成外科処置、人工皮膚移植、軟骨修復等の後のような柔軟組織復元のために、骨組織以外の組織を含む適用で用いることもできる。
【００５２】
以下の非限定的実施例によって本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００５３】
絹フィブロインの精製
当該分野で公知の技術を用い、モリカイコの繭をまず精錬した。膠様セリシン蛋白質を、以下のように、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）の水溶液中での反復洗浄によって抽出した。繭を、まず、９８℃の１．１ｇ／ｌ（１リットル当たりのグラム）のＮａ２ＣＯ３の水溶液中で１時間洗浄し、次いで、９８℃にて０．４ｇ／ｌのＮａ２ＣＯ３を含有する水溶液中で１時間すすいだ。次いで、繭を９８℃から室温に低下させる温度にて蒸留水中で反復洗浄し、セリシンを含まないフィブロインを得た。水中の生のフィブロインの量は１０ｇ／ｌであった。次いで、精錬したフィブロインを、６５℃で、１００ｇフィブロイン／ｌ溶液の初期組成にて、臭化リチウム（ＬｉＢｒ）の９．３モル水溶液に３時間で溶解させた。溶解が完了すると、水溶液を蒸留水の添加によって５％重量／容量フィブロインまで希釈した。残存している不純物および未溶解繊維を、孔隙サイズｎ．１を持つフィルターを用いる濾過によって除去した。次いで、３，５００の分子量カットオフの再生したセルロース膜を用い、７２時間の蒸留水に対する透析によって塩をフィブロイン混合物から除去した。透析したフィブロインの最終濃度は１から２％純度の絹フィブロインであった。
【実施例２】
【００５４】
フィブロインの水溶液の熱処理による懸濁液の形成
フィブロイン水溶液（２０ｍｌ（ミリリットル））を、−２０℃から５０℃の温度で２から２４時間インキュベートしたポリスチレンカプセルに注いだ。−２０℃でインキュベートした溶液を加熱し、ゲル化が起こるまで室温に維持した。４℃から５０℃の一定温度に保持された他のフィブロイン溶液は、ゲル化が起こるのに２から２４時間のインキュベーションが必要であった。熱重力分析によって測定したゲルの含水量は９５から９８重量％までで変化した。懸濁液の粘度は、それをインキュベートする時間および温度に依存した。従って、フィブロインのレオロジー特性は熱処理によって変化することが証明された。
【実施例３】
【００５５】
絹フィブロインの酵素処理
水性フィブロイン混合物を、特定のアミノ酸の結合部位との反応に特異的な種々の蛋白質分解酵素で処理した。目標は平均分子量を低下させ、生分解速度を増加させ、および細胞接着因子、成長因子および薬理学的分子との媒介に特異的なペプチドとの最終的な相互作用のための特異的活性部位を露出させることであった。以下の酵素を調べた：
【００５６】
プロテアーゼ（Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来）：この酵素は、グルタミン酸のカルボキシル部位においてペプチド結合を加水分解する。グルタミン酸の末端基を有するフィブロインのペプチド鎖は絹フィブロインの規則正しいベータ構造の形成を邪魔することが示されている。５０μｌ／ｍｌ（マイクロリットル／ミリリットル）の酵素−基質濃度で酵素反応を行い、３７℃における１時間後、溶液は色が白色となり、より粘りけがでる。形成されるゾルは、ゲルを形成することができる注射可能な物質である。１５分間の５０℃までの加熱により、酵素が脱活性化された。フィブロイン蛋白質鎖内のグルタミンアミノ酸含有量は、電気泳動分析によって測定して、ほぼ１％であることが判明した。処理前のフィブロイン混合物に存在したよりも低い分子量を持つペプチドの顕著な存在があった。
【００５７】
パパイン：この酵素はロイシン（フィブロインの０．５％）およびグリシン（フィブロインの４４％）の化学結合との反応に特異的である。処理の条件および酵素−基質濃度比を変化させて、得られたフィブロインゾルまたは溶液の粘度の種々のレベルを生じさせることができる。この場合、生成物は、電気泳動分析による測定で２０Ｋｄから２Ｋｄの範囲の分子量を持つペプチドを含む。
【００５８】
キモトリプシン：この酵素での処理は、Ｃｐ（重）画分（原理的にはグリシン−アラニン−セリンで構成される）および純粋なフィブロイン物質中に存在する他のアミノ酸を含むＣｓ画分（軽：短いペプチド鎖の混合物）を連結させるジスルフィド結合の加水分解を引き起こす。緩衝化酵素溶液を４０℃にてフィブロイン−水溶液に添加した。加水分解の程度は反応時間によって制御した。異なる処理時間は、異なる量の加水分解を生じる。反応の完了時点では、得られた水性媒体は溶液中のＣｓまたは軽い画分およびＣｐまたは重い画分のゼラチン状沈殿を含んだ。
【実施例４】
【００５９】
フィブロイン溶液への酸またはアルコールの添加による懸濁液の形成
クエン酸またはグリセロールをフィブロイン溶液に添加することによって、ゲル化を誘導した。
【００６０】
ｐＨが３．７（等電点は３．８に等しい）に到達するまで、クエン酸を１０ｍｌのフィブロイン溶液に一滴づつ添加した。ゲル化は約６時間後に起こり、白色の不透明多孔質ゲルが生じ、これは約９５重量％の水を含んでいた。図２は、形成された物質の環境走査型電子顕微鏡写真を示す。
【００６１】
３ｍｌのグリセロールを７ｍｌのフィブロイン溶液に添加すると、ゲル化が約２０時間以内におこり、約９０重量％の水を含む白色半透明ゲルが生じた。図３は、形成された物質の環境走査型電子顕微鏡写真を示す。
【実施例５】
【００６２】
注射用フィブロインゲル／ヒドロキシアパタイト／ポリ（ラクチド）複合骨格のインビトロ調製
ポリマーでコーティングしたヒドロキシアパタイト粒子のコア／シェル粒子の粉末を作成した。ほぼ６，０００の分子量を持つ（ポリ）ラクチド（ＰＬＡ）を、生分解性ポリマーのシェルとして用いた。２グラムのシラン処理ヒドロキシアパタイトを５０ｍｌのブタノール中の６グラムのポリラクチドに添加した。溶液を２時間で７０℃まで加熱し、室温まで冷却し、５０ｍｌのポリエチレングリコールの２％重量／容量水溶液と混合した。コーティングした粒子の沈降速度は、コーティングプロセスの相対的均一性を維持するのに十分なほどに遅かった。コア／シェル混合物を攪拌し、ガラスペトリ皿に注ぎ、５０℃にて乾燥し、軽く粉砕して粉末とした。得られた物質はむしろ広いサイズ分布の球状ポリマーコーティング凝集体であった。
【００６３】
２グラムのコア／シェル粉末を１０ｍｌのフィブロインゲルと混合した。粉末はゲル中に容易に分散して、ペーストを形成した。コア／シェル粒子を含むペーストを２つの方法で乾燥させ、すなわち、凍結乾燥また室温でゆっくりと乾燥させた。図４から７は得られた骨格の光学顕微鏡写真である。室温でゆっくりと乾燥させると、明らかな構造一体性を持つ粒子充填フィブロイン物質が形成される。凍結乾燥させた試料は、予測される形態的構造、すなわち、フィブロインコーティングの広い分布を呈する。
【実施例６】
【００６４】
フィブロイン懸濁液のインビトロテスト
グリセロールをフィブロイン水溶液に添加し、４℃にてフィブロイン水溶液を処理することによって作成したフィブロインゲル上で、ヒト骨芽細胞様細胞（ＭＧ６３）を７２時間培養した。テストした物質上で、および対照として用いた空のポリスチレンウェルで増殖させたＭＧ６３の生化学的および免疫酵素パラメータを評価して、細胞増殖および活性を測定した。
【００６５】
熱処理によって調製した純粋なフィブロインゲル上での細胞増殖は、対照と比較すると、有意に低かったが、同時に、各々、増強されたＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）活性（１６．７１＋／−１．８１−対−対照１０．１０＋／−１．６１）およびＴＧＦβ１（トランスフォーミング成長因子β１）レベル（４８７＋／−２９−対−対照４３２＋／−４２）によって示されるように、ゲルは骨芽細胞の活性および分化に好都合であった。グリセロールを添加することによって調製したゲル上での細胞増殖は、対照と比較した場合、ほとんど差を示さなかった。
【００６６】
ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）レベル（純粋なフィブロインゲル、１４．６７＋／−２．０４；グリセロールを含むゲル、１８．０３＋／−０．２３；対照、１４．６３＋／−２．１９）によって明らかにされるように、いずれのゲルも細胞傷害性を誘導しなかった。
【実施例７】
【００６７】
フィブロイン懸濁液のインビボテスト
クエン酸由来のフィブロインゲルを、ウサギの大腿顆にドリルで開けたキャビティー（６ｍｍ直径、１０ｍｍ深さ）に移植した。インプラントを含まないキャビティーを対照として用いた。移植から１ヶ月後にウサギを犠牲とし、インプラント部位の組織学的結果をインプラントを含まない部位のそれと比較した。
【００６８】
移植の一ヶ月後に、フィブロインゲルを充填した１つのキャビティ中の穴は、新たに形成された骨によって完全に充填された（図８Ａ）。一部フィブロイン４が残っているほとんど完全な骨治癒が観察された。フィブロインを添加しなかったキャビティーは骨再生を呈しなかった（図８Ｂ参照）。元の骨５および空の欠損部６が観察された。フィブロインゲルで充填されたキャビティーの４つにおいて、キャビティーは新たに形成された骨７でほとんど充填され、小さな残りのキャビティー８は依然として存在していた（図９Ａ）。図９Ａにおいて、キャビティーは１．０８ミリメートルの幅および１．７ミリメートルの長さを有する。図１０は、元の骨５と新たに成長した骨７の間の界面を示す。新しい骨はよく組織化された小柱を形成し、これは、新しく形成されたのと元の骨との間で全く隙間を生じることなく、元の骨の小柱から増殖したものである。ミネラル化９を受けつつある結合組織として、残存するキャビティー８が観察された。軽度の炎症が観察され、肉芽腫および明らかに有害な免疫学的応答のいずれも存在しなかった。元のフィブロインゲルの断片のみが依然として目に見え、組織再生の速度と適合する速度で分解するゲルの能力が確認され、これによりフィブロイン懸濁液が提案された適用に有用であるとういう証拠を供する。
【００６９】
新規のフィブロイン懸濁液および複合体を開示した。そのようなフィブロイン懸濁液は、熱、タンパク質分解酵素、酸、アルコールまたは生体適合性ポリマーを用いて精製されたフィブロインの溶液から作成することができる。フィブロイン懸濁液はオクルージョン（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、ゲル、クリームまたはペーストの形態とすることができる。フィブロイン懸濁液および複合体ならびに溶液は、骨および組織の構築、修復および再生で用いられる特定の用途を有する。フィブロイン溶液、懸濁液および複合体は注射することができるので、多くの侵襲的外科手法、特に整形外科手法に対する必要性を低下させ、それにより感染の可能性を最小化し、必要な回復期間を減少させ、医療手法の全体的なのコストを低下させる。
【００７０】
好ましい実施形態を参照して本発明を記載してきたが、当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変形をなすことができ、そのエレメントを同等物で置き換えることができるのを理解するであろう。加えて、多くの変更を行って、その必須の範囲を逸脱することなく、本発明の教示に対して特定の状況および材料を適応させることができる。従って、本発明は発明を実施するために考えられる最良の形態として開示された特定の実施形態に限定されず、本発明は添付の請求の範囲内にある全ての実施形態を含むように意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、組織修復のプロセスにおける多成分骨格の模式図である。
【図２】図２は、クエン酸の水溶液をフィブロイン−水溶液に添加することによって作成されたフィブロイン懸濁液の環境走査型電子顕微鏡写真である。
【図３】図３は、グリセロールをフィブロイン−水溶液に添加することによって作成されたフィブロイン懸濁液の環境走査型電子顕微鏡写真である。
【図４】図４は、複合体を室温で乾燥した後に、フィブロインマトリックスに埋められたヒドロキシアパタイト／（ポリ）ラクチドコア／シェル粒子を含むフィブロイン複合体懸濁液の光学顕微鏡写真である。
【図５】図５は、複合体を室温で乾燥した後にフィブロインマトリックスに埋められたヒドロキシアパタイト／（ポリ）ラクチドコア／シェル粒子を含むフィブロイン複合体懸濁液の、より高い倍率の光学顕微鏡写真である。
【図６】図６は、複合体を凍結乾燥した後にフィブロインマトリックスに埋められたヒドロキシアパタイト／（ポリ）ラクチドコア／シェル粒子を含むフィブロイン複合体懸濁液の光学顕微鏡写真である。
【図７】図７は複合体を乾燥結合した後に、フィブロインマトリックスに埋められたヒドロキシアパタイト／（ポリ）ラクチドコア／シェル粒子を含むフィブロイン複合体懸濁液の、より高い倍率の光学顕微鏡写真である。
【図８】図８は、ウサギの大腿にドリルで開け、注射用フィブロイン懸濁液を充填したキャビティにおける移植の１ヶ月後の組織（Ａ）を、対照として用いた空のキャビティのそれ（Ｂ）と比較する。
【図９】図９は、第２のウサギの大腿に開けられた、注射用フィブロイン懸濁液で充填したキャビティにおける移植から１ヶ月後の組織（Ａ）を、対照として用いた空のキャビティのそれ（Ｂ）と比較する。
【図１０】図１０は、古い骨、および図９に示したインプラントのフィブロイン懸濁液充填キャビティで形成された新しい骨の間の界面を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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