(57)【要約】部位特異的リステリア組込みベクターおよびその使用方法を提供する。本発明のベクターは、バクテリオファージインテグラーゼ遺伝子およびバクテリオファージ結合部位を含み、多数の態様において、これらの要素源であるバクテリオファージはリステリオファージである。ある態様において、本発明のベクターは、マルチクローニングサイトをさらに含み、マルチクローニングサイトは、例えば異種抗原のためのポリペプチドコード配列をさらに含んでもよい。本発明のベクターおよび方法は、リステリア種の研究およびリステリアワクチンの製造を含む種々の異なる応用に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的リステリアゲノム組込みを可能にする組込みベクター。
【請求項２】
プラスミドである、請求項1記載の組込みベクター。
【請求項３】
バクテリオファージインテグラーゼ遺伝子およびバクテリオファージ結合部位を含む、請求項2記載の組込みベクター。
【請求項４】
バクテリオファージがリステリオファージである、請求項3記載の組込みベクター。
【請求項５】
結合部位が、comK組込み部位およびtRNAArg組込み部位からなる群より選択される組込み部位における組込みを提供する、請求項3記載の組込みベクター。
【請求項６】
マルチクローニングサイトをさらに含む、請求項1記載の組込みベクター。
【請求項７】
コード配列をさらに含む、請求項6記載の組込みベクター。
【請求項８】
コード配列がポリペプチドをコードする、請求項7記載の組込みベクター。
【請求項９】
ポリペプチドが抗原である、請求項8記載の組込みベクター。
【請求項１０】
pPL1である、請求項1記載の組込みベクター。
【請求項１１】
pPL2である、請求項1記載の組込みベクター。
【請求項１２】
リステリアを形質転換する方法であって、
組込みベクターがリステリアのゲノムに組込まれるのに十分な条件下においてリステリアに請求項1記載の組込みベクターを接触させる段階
を含む方法。
【請求項１３】
請求項1記載のベクターで形質転換したリステリア。
【請求項１４】
被験者において抗原に対する細胞性免疫応答を誘発または追加免疫投与する方法であって、
請求項13記載のリステリア細胞の有効量を被験者に投与する段階
を含む方法。
【請求項１５】
リステリア細胞が弱毒化されている、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
リステリア細胞が異種抗原を発現する、請求項13記載のリステリア細胞株を含むワクチン。
【請求項１７】
リステリア細胞が弱毒化されている、請求項16記載のワクチン。
【請求項１８】
請求項13記載のリステリア細胞の組換え培養物。
【請求項１９】
リステリア細胞が弱毒化されている、請求項18記載の組換え培養物。
【請求項２０】
請求項1記載のベクターと、
マルチクローニングサイトでベクターを切断する少なくとも1つのヌクレアーゼと
を含む、請求項7記載のベクターを作製する際に使用するためのキット。
【請求項２１】
宿主細胞をさらに含む、請求項20記載のキット。
【請求項２２】
請求項1記載のベクターと、
マルチクローニングサイトでベクターを切断する少なくとも1つのヌクレアーゼと、
リステリア細胞と
を含む、請求項13記載の細胞を作製する際に使用するためのキット。
【請求項２３】
請求項1記載のベクターと、
マルチクローニングサイトでベクターを切断する少なくとも1つのヌクレアーゼと、
異種抗原のコード配列と、
リステリア細胞と
を含む、請求項16記載のワクチンを作製するためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の謝辞
本発明は、米国立衛生研究所の助成金番号第1 R37 AI29619号および同第1 R01 AI27655号による政府支援によってなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、2002年4月30日提出の出願番号第10/136,860号の一部継続出願であり、その開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【０００３】
序文
発明の分野
本発明の分野は、リステリア種、例えばリステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、特にリステリア種の組換え株、ならびにそれらを製造および使用する方法である。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)は、免疫無防備個体および妊婦の重篤な感染症の原因となる、グラム陽性で食品媒介性のヒトおよび動物の病原菌である。ヒトにおける重症のL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)感染症は、髄膜炎、髄膜脳炎、敗血症および胎児の死亡によって特徴付けられる。L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)は自然界に広く存在しており、また多種多様な温血動物から単離することができる。
【０００５】
リステリア種を組換えにより操作するプロトコールは、研究および治療的用途において興味深い。例えば、リステリア種形質転換プロトコールは、これらの種類の細菌の増殖および病原性の機序を解明する際に有用である。またこのようなプロトコールは、リステリア生ワクチンを製造する際にも有用であり、ワクチンは種々の異なる医学的用途に有用である。
【０００６】
これまで、リステリア種を形質転換するために種々の異なるプロトコールが使用されており、このようなプロトコールには、相同組換え、トランスポゾンに基づいた組換え等が挙げられる。リステリア種を操作するために異なるプロトコールが現在利用可能であるが、このような方法は完全に満足できるものではない。1つ以上の利用可能なプロトコールが現在遭遇している欠点には以下が挙げられる：(1)形質転換種における発現カセットの不安定性、(2)形質転換種の病原性に対する影響のばらつき、(3)形質転換種に配置することができる発現カセットのサイズ制限等。
【０００７】
このように、利用可能な異なる形質転換プロトコールの多様性にもかかわらず、利用可能な遺伝学的ツールのレパートリーを増やすことができるさらに別の形質転換プロトコールを同定することには関心が尽きない。特に興味深いのは、現在利用可能なプロトコールの1つ以上の上記欠点に見舞われることがない、多種多様の異なるリステリア種に使用するのに適した、効率的な部位特異的組込みベクターの開発であろう。
【０００８】
関連文献
関心対象の特許文献および公開されている特許出願には、米国特許第5,830,702号および公開されているPCT出願国際公開公報第99/25376号および国際公開公報第00/09733号が挙げられる。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
部位特異的リステリア組込みベクターおよびその使用方法を提供する。本発明のベクターは、バクテリオファージインテグラーゼ遺伝子およびバクテリオファージ結合部位を含み、多くの態様において、これらの要素源であるバクテリオファージはリステリオファージである。ある態様において、本発明のベクターは、マルチクローニングサイトをさらに含み、マルチクローニングサイトは、例えば異種ポリペプチドのコード配列等をさらに含んでもよい。本発明のベクターおよび方法は、リステリア種の研究およびリステリア種ワクチンの製造を含む種々の異なる応用に有用である。
【００１０】
具体的な態様の説明
部位特異的リステリア組込みベクターおよびその使用方法を提供する。本発明のベクターは、バクテリオファージインテグラーゼ遺伝子およびバクテリオファージ結合部位を含み、多数の態様において、これらの要素源であるバクテリオファージはリステリオファージである。ある態様において、本発明のベクターは、マルチクローニングサイトをさらに含み、マルチクローニングサイトは、例えば異種ポリペプチド等のコード配列をさらに含んでもよい。本発明のベクターおよび方法は、リステリア種の研究、およびリステリアワクチンの製造を含む種々の異なる応用に有用である。
【００１１】
本発明をさらに記載する前に、特定の態様は変更を加えることができ、添付の特許請求の範囲の意図内に含まれるので、本発明は以下に記載する特定の態様に限定されないことが理解されるべきである。使用する用語は特定の態様を記載する目的のためであって、限定する意図のものではないことも理解されるべきである。その代わり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定される。
【００１２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ある1つのもの（a, an）」および「その1つのもの（the）」は、内容がそうでないことを明らかに示さない限り、複数の言及を含む。特に規定しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に普通に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１３】
値の範囲が提供される場合には、その範囲の上限と下限の間の、内容がそうでないことを明らかに示さない限り、下限の単位の10分の1までの介在する各値、および任意の他の記載値またはその記載範囲内の介在値が本発明に含まれることが理解される。これらの狭い範囲の上限および下限は独立に狭い範囲に含まれてもよく、同様に本発明に含まれ、記載されている範囲の具体的に排除される任意の限界に従う。記載されている範囲が一方または両方の限界を含む場合には、含まれる限界のどちらかまたは両方を排除した範囲も本発明に含まれる。
【００１４】
特に規定しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に普通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または等価な任意の方法、装置および材料を、本発明を実施または試験する際に使用することができるが、代表的な方法、装置および材料をここに記載する。
【００１５】
本明細書に記載する全ての文献は、本願に記載されている本発明に関連して使用してもよい、文献に記載されている種々の発明の要素を記載する目的のために参照として本明細書に組み入れられる。
【００１６】
本発明をさらに記載する際には、本発明のベクターを最初に詳細に説明し、次に本発明のベクターを使用する方法、ならびに本発明のベクターおよび方法が有用となる代表的な用途を説明する。
【００１７】
ベクター
上記に要約したように、本発明は、リステリア部位特異的組込みベクター、すなわち、部位特異的にリステリアゲノムに組込まれるベクターを提供する。本発明のベクターは、ランダムでなく、部位特異的にリステリア種のゲノムに安定に組込まれることを特徴とする。本発明のベクターは標的ゲノムに部位特異的に組込まれるので、本発明のベクターは典型的には、リコンビナーゼ、具体的にはインテグラーゼによって媒介される機序によって標的ゲノムの特異的な位置または配列(すなわち、ドメイン、位置)に挿入される。インテグラーゼは基質として2つの別個の認識部位を使用するものであり、その1つは標的ゲノムの組込み部位に位置し(核酸が組込まれる予定の部位)、他方は組込み部位に導入される予定の関心対象の核酸に隣接している(すなわち、「バクテリオファージ結合部位」と本明細書において呼ばれる本発明のベクター上の部位)。例えば、ファージインテグラーゼの認識部位は、細菌ゲノム(核酸が挿入される予定の)に存在するattB、およびattP(「バクテリオファージ結合部位」と本明細書において呼ばれる、細菌ゲノムに挿入するための核酸に隣接するファージ核酸に存在する)と総称的に呼ばれる。認識部位は天然であっても(標的ゲノムに内因性)、天然の配列に対して改変されてもよい。インテグラーゼが認識配列を「認識する」という文脈における「認識する」という用語の使用は、インテグラーゼが認識部位と相互作用して部位特異的組換えを容易にする能力をさす。
【００１８】
本発明のベクターは、多種多様の異なるリステリア種のゲノムに組込むことができる。組込みは、ベクターDNAが標的生物のゲノムDNAに組込まれたかどうかを同定することができる当業者に既知のものを含む任意の都合の良いアッセイを使用して容易に判定される。例えば、ベクターDNAは、例えば接合によって標的生物に導入することができ、次いで標的部位に隣接するプライマーを使用する組込み配列のPCR増幅によって組込みを判定することができる。この場合、増幅産物のサイズが、組込みが生じたかどうかの指標である。このようなアッセイの一例は以下の実験の部に提供されている。本発明のベクターの多数の態様のさらなる特徴は、それらは非リステリア宿主細胞、例えば大腸菌(E. coli)において自己複製し、このような非リステリア宿主細胞において安定で無害であるということである。
【００１９】
本発明の組込みベクターは、典型的には2本鎖プラスミドベクターであり、この場合ベクターは、一般に少なくとも約3kbであり、しばしば少なくとも約5kbであり、15kb、20kb、25kb、30kb以上ほど大きくてもよく、この場合ベクターは約3〜6から約20kbの範囲の場合もある。ベクターは、ベクターに上記の機能的な特徴を与える数多くの構造的特徴を含む。
【００２０】
本発明のベクターの1つの構造的な特徴は、ベクターがそのために設計されているリステリア細胞において遺伝子(コード配列)が発現されるように、リステリア特異的プロモーターに機能的に結合しているバクテリオファージインテグラーゼ遺伝子、すなわちバクテリオファージインテグラーゼの配列をコードする核酸である。多数の態様において、バクテリオファージインテグラーゼ遺伝子はリステリオファージから得られるものであり、すなわちそれはリステリオファージインテグラーゼ遺伝子である。種々の異なるリステリオファージが当技術分野において既知であり、任意の便利なリステリオファージを、インテグラーゼ遺伝子、すなわちインテグラーゼをコードする核酸の供給源とすることができる。関心対象の具体的なインテグラーゼには、U153インテグラーゼ、PSAインテグラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
上記のように、インテグラーゼ遺伝子は、ベクターがそのために設計されていてベクターの組込みが望まれるリステリア細胞内にベクターが存在する場合にインテグラーゼ遺伝子の発現を誘導するプロモーター(さらに必要であれば、調節および／またはシグナル配列)に機能的に結合している。任意の便利なプロモーターを使用することができ、ある態様において、プロモーターはリステリア特異的プロモーターである。関心対象の代表的なプロモーターには、リステリアp60プロモーター、リステリアactAプロモーター、リステリアplcAプロモーター、リステリアmplプロモーター、リステリアplcBプロモーター、リステリアinlAプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターには、リステリア株が同族のバクテリオファージRNAポリメラーゼも発現する場合には、T7、Qβ、SP6等のプロモーターなどのある種のバクテリオファージプロモーターを含んでもよい。上記のインテグラーゼ遺伝子／プロモーター要素以外に、本発明のベクターはまた、ファージ結合部位、すなわちリステリアゲノムによる部位特異的組込みを提供するヌクレオチド配列またはドメインも含む。任意の便利なファージ結合部位を使用することができ、ファージ結合部位の選択は、少なくとも一部にはベクターの所望の組込み位置に依存する。関心対象の代表的なファージ結合部位には、comK組込み部位(以下の実験の部にさらに詳細に記載されている)、tRNAArg組込み部位(以下の実験の部にさらに詳細に記載されている)等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
また、本発明のベクターは、非リステリア宿主細胞、例えば大腸菌(E. coli)においてベクターの複製を提供する複製起点を含んでもよい。この複製起点は任意の便利な複製起点またはori部位であってよく、数多くのori部位が当技術分野において既知であり、関心対象の特定の部位には、p15A、pSC101、ColEI、pUC、PMB9等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
また本発明のベクターは、都合がよければ、例えば以下にさらに詳細に記載するように接合プロトコールを使用してベクターを標的リステリア細胞に導入する場合には、導入起点部位または要素を含んでもよい。任意の便利な導入起点(oriT)を使用することができ、関心対象の代表的な導入起点には、RP4 oriT、RSF1010 oriT等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
また本発明のベクターは、典型的には、異種遺伝子／発現カセットの挿入を受けやすいベクター上の位置にある、少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位、すなわち制限部位を含む。種々の制限部位が当技術分野において既知であり、ベクター上に存在させることができる。このような部位には、以下の制限酵素によって認識されるものが挙げられる：HindIII、PstI、SalI、AccI、HincII、XbaI、BamHI、SmaI、XmaI、KpnI、SacI、EcoRI、BstXI、EagI、NotI、SpeI等。多数の態様において、ベクターはポリリンカーまたはマルチクローニングサイト、すなわち上記に掲載するものなどの複数の異なる制限酵素によって認識される部位の密接に配列されたシリーズまたはアレイの部位を含む。
【００２５】
ある態様において、本発明のベクターは、少なくとも1つのコード配列、例えば既知の組換え技術プロトコールにより、マルチクローニングサイトに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を使用してコード配列をベクターに挿入する結果として、例えばマルチクローニングサイトに存在する異種ポリペプチド／タンパク質コード配列のコード配列を含む。「異種」とは、コード配列が、通常ではリステリアにおいて発現されない、例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、または他の高分子のような産物をコードすることを意味する。多数の態様において、このコード配列は、ベクターがそのために設計されているリステリア細胞においてコード配列の発現を提供する発現カセットの一部である。本明細書において使用する「発現カセット」という用語は、特定の宿主生物、すなわちベクターがそのために設計されているリステリア細胞において、少なくとも1つの所望のコード配列、および上記に特定されているプロモーター／調節／シグナル配列などの、機能的に結合しているコード配列の発現に必要な適当な核酸配列を含有する組換えDNA分子から作製されている発現モジュールまたは発現構築物をいい、発現カセットは適宜、2つ以上の異なるポリペプチドのコード配列または同じコード配列の多数のコピーを含んでもよい。コード配列および／またはこれを含む発現カセットのサイズは異なってもよいが、典型的には約25〜30から約6000 bpの範囲内であり、通常約50〜約2000 bpの範囲内である。このように、コードされる産物のサイズは大きく異なってもよく、多種多様の異なる産物が、この態様のベクターに存在する発現カセットによってコードされうる。
【００２６】
発現カセットのコード配列および他の要素の性質は、例えば、リステリア種を研究するため、リステリア種ワクチンを製造するため、高分子の細胞質内送達のためなど、ベクターの特定の用途に応じて異なってもよい。例えばベクターがリステリアワクチンの製造に使用される場合には、コード配列は異種抗原をコードすることができ、関心対象の代表的な異種抗原には、(a)ウィルス抗原、例えば、インフルエンザnpタンパク質、HIV gagタンパク質、HIV envタンパク質、またはgp120およびgp41のようなそれらの一部、HIV nefタンパク質、HIV polタンパク質、HIV逆転写酵素、HIVプロテアーゼ、ヘルペスウィルスタンパク質等、(b)マラリア抗原、(c)真菌抗原、(d)細菌抗原、(e)腫瘍および腫瘍関連抗原等が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターシステムの柔軟性により、実質的に任意の関心対象のコード配列を挿入することができる。発現カセットによってコードされる産物の分泌が望ましい場合には、発現カセットは、選択した外来抗原と分泌を誘導するタンパク質との融合タンパク質のコード配列、例えばリステリオリシンOまたはPI-PLC、溶血素シグナル配列などのシグナル配列等を含んでもよい。例えば、PCT国際公開公報第00/09733号(この優先権出願が参照として本明細書に組み入れられる)およびDietrichら、Nature Biotechnology(1998) 16: 181-185に記載されているように、本発明のベクターをリステリア送達担体の作成に使用する場合には、異種ポリペプチドコード配列は、細胞溶解素、例えば、ホスホリパーゼ、孔形成毒素、リステリオリシンO、ストレプトリシンO、パーフリンゴリシンO、酸活性化型細胞溶解素、ファージ溶解素等であってもよい。関心対象の他のコード配列には、サイトカイン、同時刺激分子等が挙げられるが、これらに限定されない。上記に示すように、ベクターは少なくとも1つのコード配列を含んでもよく、ある態様において、ベクターは2つ以上のコード配列を含み、コード配列は、同時に作用して所望の結果を提供する産物をコードすることができる。
【００２７】
一般に、コード配列は数多くの異なる産物のいずれかをコードすることができ、種々の異なるサイズであってもよく、上記の議論は単に関心対象の代表的なコード配列を提供するにすぎない。
【００２８】
本発明のベクターを作製する方法
本発明のベクターは、標準的な制限酵素切断、ライゲーション、および分子クローニング方法を含む任意の便利なプロトコールを使用して作製することができる。本発明のベクターを構築する1つのプロトコールは、以下の段階を含む。最初に、所望の成分のヌクレオチド配列およびその他の配列を含有する精製された核酸断片を制限エンドヌクレアーゼで最初の材料から切断する。次いで、従来の分離方法、例えばアガロースゲル電気泳動を使用して、所望のヌクレオチド配列を含有する断片を、異なるサイズの望ましくない断片から分離する。所望の断片をゲルから切り出し、所望の配列、例えば上記のような本ベクターの種々の要素に対応する配列を含有する環状の核酸またはプラスミドが作製されるように、適当な構成でライゲーションする。望ましい場合には、このように構築した環状分子を宿主、例えば大腸菌(E. coli)内で増幅する。これらの段階に関与する切断、プラスミド構築、細胞形質転換、およびプラスミド作製の手法は当業者に既知であり、制限およびライゲーションに必要な酵素は市販品を購入できる(例えば、R. Wu編、Methods in Enzymology、68巻、Academic Press, N. Y. (1979)、T. Maniatis, E. F. FritschおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)、Catalog 1982-83、New England Biolabs, Inc.、Catalog 1982-83、Bethesda Research Laboratories, Inc.を参照されたい)。本発明のベクターを構築する方法の一例は以下の実験の部に提供されている。
【００２９】
方法
上記リステリア部位特異的組込みベクターを使用して、異種核酸をリステリアゲノムに組込む方法もまた、本発明によって提供される。本発明の方法を実施する際には、本発明のベクターは、ベクターの標的細胞ゲノムへの組込みを生じさせるのに十分な条件下において、標的リステリア細胞に導入される。ベクターを標的細胞に導入するための任意の便利なプロトコールを使用することができる。
【００３０】
好適なプロトコールには、リン酸カルシウム媒介性のトランスフェクション、ベクターの量が増幅されているプロトプラストに標的細胞を融合させるプロトプラスト融合、高電圧の短時間のパルスを標的細胞に適用して標的細胞の細胞膜をベクターに対して透過性にする電気穿孔、ベクターを細胞に直接注射するマイクロインジェクション（Capechhiら、Cell(1980) 22: 479）等が挙げられる。上記のインビトロプロトコールは当技術分野において既知であり、Sambrook、Fritsch & Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989) 16.30〜16.55ページにさらに詳細に説明されている。
【００３１】
ある態様において、例えば標的リステリア細胞への直接導入が最適の結果を提供しない場合に使用することができる1つの代表的な方法は、(a)ベクターを非リステリア宿主細胞、例えば大腸菌(E. coli)に導入する段階と、次に(b)ベクターを非リステリア宿主細胞からリステリア宿主細胞へ、例えば接合によって導入する段階とを含む接合方法である。非リステリア宿主細胞への導入は、上記のプロトコールのいずれかを使用して実施することができる。接合段階については、任意の便利なプロトコールを使用することができ、好適なプロトコールは典型的には、ドナーおよびアクセプター細胞を好適な培地において合わせる段階と、接合およびベクター導入を生じさせるのに好適な条件下において維持する段階とを含む。具体的な代表的条件は以下の実験の部に提供されている。
【００３２】
上記の方法により、ベクターおよびそれに含まれる任意の発現カセット、例えば異種タンパク質／外来抗原をコードするものは、標的リステリア細胞ゲノムに部位特異的に安定して組込まれる。本発明の方法は、多種多様の異なるリステリア種に有用である。
【００３３】
有用性
上記のベクターおよびその使用方法は、種々の異なる用途に有用であり、代表的な応用には、(a)研究用途、(b)ワクチン製造用途、(c)リステリア送達担体作製用途等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明のベクターおよび使用方法を利用することができる1つの種類の用途は、リステリア種の研究におけるものである。例えば、本発明のベクターおよび方法は簡単且つ効率的な株の構築を可能にし、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の細胞内ライフサイクルを検討するために使用される種々の株において広範に有用である。さらに、本発明のベクターおよび方法は、安定な部分二倍体株を作製するために使用して、精密なコピー数検討、および多量体化によるタンパク質内相互作用の検討、および同じ細菌株における遺伝子の異なる対立遺伝子の優性または劣性の試験を可能にすることができる。
【００３５】
本発明のベクターおよび方法はまた、ワクチン製造用途にも有用である。例えば、本発明のベクターは、異種抗原、すなわちリステリアワクチンを発現することができるリステリア培養物の作製に有用であり、使用するリステリア細胞は弱毒化することができる。使用する弱毒化株は宿主細胞の通常の侵入が可能であるが、細胞への伝播または細胞間の伝播における通常の生存または増殖を不可能とすることができ、あるいはそれらは通常の病原性が排除された他の改変体を有することができる。
【００３６】
本発明のベクターを使用して作製するワクチンは、遺伝子操作したリステリアワクチンの致死量以下の用量を脊椎動物に接触させることによって、脊椎動物に投与され、接触は典型的には、ワクチンを宿主に投与する段階を含む。従って、本発明は、組込みベクターを用いて遺伝子操作し、薬学的に許容されうる製剤の形態で提供されるワクチンを提供する。投与は経口、非経口、鼻腔内、筋肉内、血管内、リンパ節の直接ワクチン接種、カテーテルによる投与または種々の既知の投与経路の任意の1つ以上であってもよい。農場の動物では、例えば飼料または液体(水など)にワクチンを混ぜて経口投与することができる。それは凍結乾燥粉末として、凍結製剤として、またはカプセルもしくはワクチンの抗原性を保持する任意の他の便利な薬学的に許容されうる製剤の成分として供給することができる。薬学的に許容されうる数多くの既知の希釈剤または賦形剤の任意の1つを本発明のワクチンに使用することができる。好適な希釈剤には、例えば、滅菌蒸留水、生理食塩液、リン酸緩衝液等が挙げられる。希釈剤の量は、当業者が認識しているように、大きく異なりうる。好適な賦形剤も当業者に既知であり、例えば、A. WadeおよびP. J. Weller編、Handbook of Pharmaceutical Excipients(1994) The Pharmaceutical Press: Londonから選択することができる。投与量は、患者の年齢、健康状態および体重、患者の種類、ならびにもしあれば併用治療の存在に依存しうる。ワクチンは、経口投与用のカプセル、溶液、懸濁液もしくはエリキシル、または非経口、鼻腔内、筋肉内もしくは血管内用途用の溶液もしくは懸濁液などの滅菌製剤液などの剤形で使用することができる。本発明によると、ワクチンは、選択された生物もしくはウィルスによる感染または腫瘍等に対して患者を免疫化する際に有用なワクチン組成物として、薬学的に許容されうる希釈剤と併用して使用することができる。患者の免疫化は、選択された病原菌、癌細胞等に対する少なくともある程度の治療的または予防的免疫を患者に提供することを意味する。
【００３７】
本発明のベクターを用いて作製する本発明のワクチンは、脊椎動物において、選択された因子、例えば、病原生物、腫瘍等に対するヘルパーT細胞または細胞傷害性T細胞応答を誘発または追加免疫する方法に有用であり、このような方法は、有効量のリステリアワクチンを投与する段階を含む。本発明のベクターを用いて作製する本発明のワクチンは、抗原特異的な免疫応答を増大する自然免疫応答を脊椎動物において誘発する方法に有用である。さらに、本発明のワクチンは、接触後(post-exposure)または診断後(post diagnosis)治療に使用することができる。一般に、接触後治療用ワクチンの使用は、例えば狂犬病および破傷風の治療において当業者に認識されていると考えられる。本発明の同ワクチンは、例えば免疫化および接触後の追加免疫投与のために使用することができる。または、本発明の別のワクチンは、例えば接触の後期において発現される抗原に特異的であるものなどの接触後治療に使用することができる。このように、本発明のベクターを用いて作製する本発明のワクチンは、種々の疾患状態に関連する抗原に特異的な免疫応答を誘導するための予防的および治療的ワクチンとして有用である。
【００３８】
患者は、選択した生物による感染を受けやすい任意のヒトおよびヒト以外の動物であってもよい。本発明のワクチンは、人間などの脊椎動物および家畜に特に有用である。家畜には、家禽、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、Leporidate(ウサギなど)、または飼育することができる他の動物が挙げられる。
【００３９】
全体として、本発明のベクターおよび方法は、開示内容が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,830,702号、および優先権出願の開示内容が参照として本明細書に組み入れられるPCT国際公開公報第99/25376号に記載されているワクチンの製造に有用である。
【００４０】
本発明のベクターはまた、例えば、PCT国際公開公報第00/09733号(優先権出願が参照として本明細書に組み入れられる)およびDietrichら、Nature Biotechnology (1998) 16: 181-185に記載されているように、標的細胞に高分子を送達するためのリステリア送達担体の製造に有用である。これらの文献に記載されているように、核酸、ポリペプチド／タンパク質等を含むがこれらに限定されない種々の異なる種類の高分子を送達することができる。
【００４１】
キットおよびシステム
上記のような本発明のベクターの作製ならびに／または本発明のベクターおよび方法を使用する組換えリステリア細胞の製造に有用であるキットおよびシステムも提供される。例えば、本発明のベクターを作製するためのキットおよびシステムは、以下の1つ以上を含みうる：マルチクローニングサイトを有する最初のベクター、マルチクローニングサイトの部位を切断するための制限エンドヌクレアーゼ、マルチクローニングサイトに挿入する予定の関心対象の発現カセットを含むベクター等。キットおよびシステムが組換えリステリア細胞の作製に設計されている場合には、これらキットおよびシステムは、ベクター、または上記のようなこれを作製するための要素、リステリア標的細胞、非リステリア宿主細胞等を含んでもよい。本発明のキットは、本発明の方法に有用な他の要素、例えば、反応緩衝液、増殖培地等をさらに含んでもよい。
【００４２】
本キットの種々の試薬要素は、別個の容器で提供されても、または全てを事前に合わせて鋳型DNAと組み合わせるための試薬混合物としてもよい。
【００４３】
上記の要素以外に、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための取扱説明書をさらに含む。これらの取扱説明書は、種々の形態で本発明のキットに提供されてよく、その1つ以上を本キットに提供することができる。これらの取扱説明書を提供することができる1つの形態は、好適な媒体または基板に印刷された情報、例えば情報が印刷されている紙として、キットの包装、添付文書等に存在する。さらに別の手段は、情報が記録されているコンピュータで読取可能な媒体、例えば、ディスク、CD等であってもよい。提供することができるさらに別の手段は、インターネットにより、移動したサイトの情報にアクセスするために使用することができるウェブサイトアドレスである。都合の良いいずれかの手段を本キットに提供しうる。
【００４４】
以下の実施例は例示のために提供されており、限定のためではない。
【００４５】
実験
I.  材料と方法
A.  pPL1組込みベクターの構築
標準的な分子的技法を、6101 bp組込みベクターpPL1(図1A)の構築に使用した。pPL1ベクターの完全な配列を配列番号：25として提供する。pPL1は大腸菌(E. coli)内で自己複製し、部位特異的にL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)に組込まれる低コピープラスミドであり、以下のように6つの別個のDNA源から集成した。構築に使用するPCRプライマーの制限部位に下線をつけてある。クローニング段階に使用した全てのPCR反応はVent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を使用した。
【００４６】
pBluescript KS-(Alting-Mees, M. A.およびJ. M. Short. 1989. pBluescript II: gene mapping vectors. Nucleic Acids Res. 17: 9494)(bp 1〜171)のマルチクローニングサイト(MCS)を、プライマー
2005523716.tif 000002
を用いたPCRの後にクローニングした。低コピーグラム陰性複製開始部およびpACYC184のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子(Chang, A.C.およびS.N. Cohen. 1978. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J. Bacteriol. 134: 1141-1156.)(bp 172-2253)を、プライマー
2005523716.tif 000003
を用いたPCRの後にクローニングした。大腸菌(E. coli)からL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)への直接接合は、RP4導入開始部(oriT)(Pansegrau, W.、E. Lanka、P. T. Barth、D. H. Figurski、D. G. Guiney、D. Haas、D. R. Helinski、H. Schwab、V. A. StanisichおよびC. M. Thomas. 1994. Complete nucleotide sequence of Birmingham IncP alpha plasmids. Compilation and comparative analysis. J. Mol. Biol. 239: 623-663)(bp 2254-2624)を、プライマー
2005523716.tif 000004
を用いたPCRの後に、プラスミドpCTC3(Williams, D. R.、D. I. YoungおよびM. Young. 1990. Conjugative plasmid transfer from Escherichia coli to Clostridium acetobutylicum. J. Gen. Microbiol. 136: 819-826)からクローニングした。プラスミドの部位特異的組込みを誘導するリステリオファージU153インテグラーゼ遺伝子および結合部位(attPP')(A. Nolte、P. LauerおよびR. Calendar、未公開、bp 2629〜4127)(配列番号：25はこれらの部位の配列を含む)は、プライマー
2005523716.tif 000005
を用いたPCRの後にクローニングした。U153インテグラーゼ遺伝子の発現は、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)p60プロモーター(Lauer, P.、J. A. Theriot、J. Skoble、M.D. WelchおよびD. A. Portnoy. 2001. Systematic mutational analysis of the amino-terminal domain of the Listeria monocytogenes ActA protein reveals novel functions in actin-based motility. Mol. Microbiol. 42: 1163-1177)を、プライマー
2005523716.tif 000006
を用いてPCR増幅し、インテグラーゼ遺伝子の上流にクローニングした。塩基対4570〜6101は、pUC18-Cat(Nancy Freitag氏からの供与)からサブクローニングしたHindIII-AatII制限断片であり、pC194由来の誘導性グラム陽性CAT遺伝子(Horinouchi, S.およびB. Weisblum. 1982. Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J. Bacteriol. 150: 815-825)(bp 4788-5850))を含有する。
【００４７】
B.  hlyおよびactA遺伝子のpPL1へのクローニング
hly遺伝子は、BamHIおよびXbaIを用いて制限消化し、2.9kb断片をゲル精製し、BamHIおよびSpeIで切断したpPL1にライゲーションすることによって、プラスミドpDP-906(Jones, S.およびD. A. Portnoy. 1994. Characterization of Listeria monocytogenes pathogenesis in a strain expressing perfringolysin O in place of listeriolysin O. Infect. Immun. 62(12): 5608-5613)からサブクローニングした。得られたプラスミドはpPL24と名づけた(図1A)。actA遺伝子は、プライマー
2005523716.tif 000007
を用いて10403SゲノムDNAからPCR増幅した。2220 bpのPCR産物をゲル精製し、BamHIおよびXbaIで切断し、BamHIおよびSpeIで切断したpPL1にクローニングした。得られたプラスミドはpPL25と名づけた(図1A)。
【００４８】
C.  ファージキュアリング、接合およびプラスミド組込みの分子的立証
ファージキュアリングは、従来の方法(Cohen, D. 1959. A variant of Phage P2 Originating in Escherichia coli, strain B. Virology 7: 112-126; Six, E. 1960. Prophage substitution and curing in lysogenic cells superinfected with hetero-immune phage. J. Bacteriol. 80: 728-729)を適合させることによって実施した。comK-attBB'にプロファージを保有するL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)10403S誘導株(記載されているように(Loessner, M. J、R. B. Inman、P. LauerおよびR. Calendar. 2000. Complete nucleotide sequence, molecular analysis and genome structure of bacteriophage A118 of Listeria monocytogenes: implications for phage evolution. Mol. Microbiol. 35:(2): 324-340)、comK ORFに組込まれている)をBHI中で37℃において108CFU/mlまで増殖させ、5 mM CaCl2の存在下において感染多重度20:1でリステリオファージU153(Hodgson, D. A. 2000. Generalized transduction of serotype 1/2 and serotype 4b strains of Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 35(2): 312-323.)を感染させた。培養物は、37℃において75分間振盪することによってインキュベーションし、感染培養物のOD600を未感染対照培養物と比較することによって増殖阻害をモニターした。感染培養物はBHIで10-2および10-4希釈し、10-2希釈液の光学密度が100倍増加するまで、両希釈液を37℃において増殖させた。次いで10-4倍希釈液を10-2希釈し、3μlをBHIにプレーティングした。まずコロニーを0.25 mlのLBブロスに取り、プラークを特に形成しやすいL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の非溶原性ラフ株、Mack-4R(DP-L862)壌地上で30℃においてレプリカ培養することによって、50コロニーをファージ放出について試験した。次いで、10μlの培養物をMack-4Rの壌地にスポットしてプラーク形成を検出することによって、プラークを形成しなかった候補を試験した。この2番目の試験が陰性であった場合には、親10403S株のファージによるプラーク形成を支持することができるかどうかについて候補を試験した(Φ10403、Hodgson, D. A. 2000. Generalized transduction of serotype 1/2 and serotype 4b strains of Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 35(2): 312-323.))。キュアリングは、comK-attBB'特異的プライマー対PL60/PL61(配列は以下に示す)を用いたPCRによって、comK-attBB'にファージが存在しないことについて分子的に確認した。この手法を使用して約10%のコロニーがキュアリングされた。
【００４９】
L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)のレシピエント株(SLCC-5764、DP-L1169およびDP-L1172)は、200μg/mlの抗生物質を添加したBHI上でのプレート選択(plate selection)によって接合実験において対抗選択するためにストレプトマイシン耐性にした。
【００５０】
pPL1プラスミド構築物は、標準的な技法 (Sambrook, J.、T. Maniatis,およびE. F. Fritsch. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N. Y.)を使用して、大腸菌(E. coli)株SM10(Simon, R.、U. PrieferおよびA. Puhler. 1983. A broad host range mobilization system for in vitro genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria. Bio/Technology 1: 784-791.)に電気穿孔した。細菌株は、30℃において振盪しながら中期対数増殖期(OD600約0.55)まで増殖させた。大腸菌(E. coli)ドナー株は、25μg/mlクロラムフェニコールを含有するLBで増殖させ、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)レシピエント株はBHIで増殖させた。2.5 mlのドナー培養物に1.5 mlのレシピエント培養物を混合し、事前に洗浄しておいた47 mm 0.45μm HA型フィルター(Millipore)でろ過した。フィルターは10 mlのBHIで1回洗浄し、抗生物質を含まないBHIプレートに移し、30℃において2時間インキュベーションした。細菌細胞を2.5 mlのBHIにていねいに再懸濁し、25μlおよび50μlの分量を、7.5μg/mlのクロラムフェニコールおよび200μg/mlのストレプトマイシンを添加したBHIプレート上の3mlのLBトップアガーにプレーティングした。プレートは30℃において終夜インキュベーションし、37℃に温度を上げて2〜3日間インキュベーションした。個々のコロニーを取り、プライマー
2005523716.tif 000008
を使用して、ファージ結合部位への組込みについてPCRによってスクリーニングした。PCR反応は、滅菌したP200ピペットチップでBHIプレートから20μlのPCR反応液に直接採取した個々の細菌コロニーの少量について実施した。プライマー対PL14/PL61はPCR反応においてattBP'を特異的に増幅し、組換え株(プロファージおよびpPL1誘導株)で743 bp産物を産生した。プライマー対PL60/PL61はPCR反応においてcomK-attBB'を特異的に増幅し、非溶原性株(すなわち、DP-L4056)においてのみ417 bp産物が産生された。PCRアッセイは、Hybaid Omn-Eサーモサイクラーにおいて、アニーリング温度55℃で30サイクル実施した。組換え体は、ドナー細胞あたり約2×10-4の頻度で生じた。
【００５１】
D.  血液プレートにおける溶血および溶血活性アッセイ
血液プレートにおける溶血は、5%脱線維素(defimbrinated)ヒツジ血液(HemoStat、Davis CA)を添加したトリプシンダイズ寒天プレート（tryptic soy agar plate）で判定した。溶血アッセイは本質的に、記載されているように実施した(Portnoy, D. A.、P. S. JacksおよびD. J. Hinrichs. 1988. Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 167(4): 1459-1471.)。溶血活性は、ヒツジ赤血球の50%を溶血するのに必要な培養上清の希釈の逆数として表す。
【００５２】
E.  L2細胞におけるプラーク形成
プラークサイズは、以前に記載されているように求めた(Lauer, P.、J. A. Theriot、J. Skoble、M.D. WelchおよびD. A. Portnoy. 2001. Systematic mutational analysis of the amino-terminal domain of the Listeria monocytogenes ActA protein reveals novel functions in actin-based motility. Mol. Microbiol. 42(5): 1163-1177)。各株は6〜8個の独立した実験においてプラーク形成させ、各実験において10403Sと比較した。
【００５３】
F.  表面発現型ActAのSDS-PAGE
表面発現型ActAタンパク質は、等量をSDS-PAGE緩衝液に再懸濁し、5分間煮沸することによって、LBブロスにおいて増殖した後期対数増殖期の細菌培養物(OD600約0.7)から調製した。この手法は表面発現型タンパク質を抽出するが、細胞壁を損傷しない。等量を7% SDS-PAGEにロードし、クーマシーブルーで可視化した。
【００５４】
G.  アフリカツメガエル(Xenopus laevis)細胞抽出物の移動性アッセイ
アフリカツメガエル(X. laevis)の卵の細胞質抽出物を記載されているように調製し(Theriot, J. A.、J. Rosenblatt、D. A. Portnoy、P. J. Goldschmidt-ClermontおよびT. J. Mitchison. 1994. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell 76(3): 505-517)、テトラメチルローダミンヨードアセトアミドで標識したアクチンを添加した(Theriot, J. A.およびD. C. Fung. 1998. Listeria monocytogenes-based assays for actin assembly factors. Methods Enzymol. 298: 114-122)。SLCC-5764由来株は静止期まで終夜増殖させ、1回洗浄し、細胞抽出物に添加し、45分間インキュベーションしてから顕微鏡で観察した。
【００５５】
H.  LD50測定
限界LD50は、記載されているように(Portnoy, D. A.、P. S. JacksおよびD. J. Hinrichs. 1988. Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 167(4): 1459-1471.)、BALB/cマウスにおいて実施した。動物実験は、実験室（the laboratory of Archie Bouwer at Oregon Health Sciences Center、Portland、OR）で実施した。
【００５６】
I.  PSA結合部位の同定およびpPL2の構築
PSA結合部位(tRNAArg-attBB')DNA配列は、インバースPCRとゲノムウォーキングの組み合わせにより得た。インバースPCRは、PSA int遺伝子内でアニーリングする多岐プライマー(divergent primers)
2005523716.tif 000009
を使用して、Sau3AI消化したDP-L4061 DNA(PSAに対してはWSLC 1042溶原性)(配列番号：26はWSLC 1042 tRNAArg-attBB'周囲の2,072 bpの配列である)で実施した。得られたDNA配列はさらに別のオリゴヌクレオチドを設計するために使用し、製造業者の推奨によりこれらをGenome Walkerキット(Clontech)と共に使用した。DNA配列およびtRNA分析は、MacVector(Accelrys)、DNAsis(Hitachi)、BLASTアルゴリズム(2)およびtRNAscan-SE(Lowe, T. M.およびS. R. Eddy. 1997. tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25(5): 955-964)を使用して実施した。
【００５７】
pPL1は、プラスミドのU153インテグラーゼ遺伝子および結合部位を置換することによって、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)染色体の異なる結合部位を使用するように改変した。PSA intおよびattPP'は、プライマー
2005523716.tif 000010
ならびにVent DNAポリメラーゼを用いてPSAゲノムDNAからPCR増幅し、BglIIおよびSphIで消化し、同じ酵素で消化されているpPL1にライゲーションした。得られたプラスミドはpPL2と名づけた(図1B)。pPL2の配列は配列番号：28として提供されている。
【００５８】
血清型1/2 L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株のPSA tRNAArg-attBB'のDNA配列は、プラスミドトラップ法によって得た。DP-L4211(pPL2が10403Sに組込まれている)ゲノムDNAを、ベクター内では切断しないNsiIおよびNheIで消化し、分子内ライゲーションを促進するための希釈条件下においてライゲーションした。ライゲーション体をXL1-blueに形質転換し、クロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。得られたプラスミドは、PSAゲノムDNA配列のattPP'に隣接する、それぞれattPB'およびattBP'の収斂（convergent）プライマー
2005523716.tif 000011
およびPL95(配列は上記)を用いて配列決定した。さらに、血清型間のtRNAArg遺伝子の下流の配列間の相違のために、tRNAArg-attBB'の血清型1/2特異的PCRアッセイを10403S DNA配列から開発し、種々のL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株のプロファージ状態を判定するために使用した。プライマー
2005523716.tif 000012
は、非溶原性血清型1/2株の533 bpのPCR産物を特異的に増幅する。プライマー対NC16
2005523716.tif 000013
およびPL95は、溶原性であるかまたはtRNAArg-attBB'に組込みベクターを含有する株の499 bp PCR産物を特異的に増幅する。(配列番号：27は10403S tRNAArg-attBB'の周囲の643 bpを提供する。)
【００５９】
II.  結果と考察
A.  pPL1は種々のL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株において安定なシングルコピー組込み体を形成する。
pPL1は、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)における株構築を促進するために本発明者らが構築した最初の組込み型シャトルベクターである。pPL1ベクターを試験するために、本発明者らは、comK細菌結合部位にファージを持たないL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株を必要とした。本発明者らは、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株のプロファージをキュアリングするための従来の方法を適合させ、内因性10403Sプロファージと同じ結合部位を有するファージU153による重感染後に、プロファージフリー株を単離することができることを見出した(「材料と方法」を参照されたい)。プロファージをキュアリングした10403S株はDP-L4056と名づけ、以降の実験に使用した。
【００６０】
多くのリステリアspp.は形質転換効率が悪いので、ベクターを標的細胞に導入する方法として接合を選択した。大腸菌(E. coli)のpPL1のL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)への接合は成功であった。薬剤耐性トランス接合は、ドナー大腸菌(E. coli)細胞あたり約2×10-4の再現頻度で生じ、自己複製プラスミドの接合と比較して約3倍低く、接合によりプラスミドを受容する株の組込み効率は約30%であることが示された。クロラムフェニコール耐性コロニーの全てがプライマーPL14およびPL61を使用したPCRアッセイで陽性であり、pPL1のattPP'のPCRアッセイでは陰性であり(PL14はRP4 oriTにおいてプライマーと対形成する)、それらが真の組込み体であること、そしてプラスミドpPL1の全ての遺伝子相補鎖がリステリア染色体に組込まれたことを示している。またこの実験により、pPL1はエピソームプラスミドとして維持されないこと、ベクターはコンカテマー（concatamer）として組込まれないことが示された。
【００６１】
本発明者らは、非選択増殖条件下において組込み体の安定性を試験した。3つの組込み株、DP-L4074ならびに部分二倍体株DP-L4076およびDP-L4078(以下のセクションに記載されている)を液体BHI培地で継代培養して100世代とし、プレーティングして個別のコロニーとした。次いで96個のコロニーを0.1μg/mlのクロラムフェニコールに接触させて(CAT遺伝子発現を誘導するため)、7.5μg/mlの抗生物質を含有するプレートに貼り付けた。全てのコロニーは薬剤耐性を保持した。各非選択増殖実験のコロニー30個をPL14/PL61 PCRアッセイでアッセイすると、全てのPCR反応が743 bpの産物を生じ、全てのトランス接合体は組込まれたプラスミドを保持したことが示された。
【００６２】
本発明者らは、組込みベクターが全体的に、利用可能な結合部位を有する任意のL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株に有用であるかどうかにさらに取り組んだ。単離したリステリオファージは320を超え、多くは宿主範囲に制限があった。U153感染を支持しない宿主株に、U153インテグラーゼ遺伝子機能の生物学的障壁があるかどうかは不明であった。従って本発明者らは、comK結合部位にプロファージを持たない3つの株、2つの血清型4b臨床単離株、および既知の病原性因子を非調節的に構成的に発現し、インビトロにおいてこれらの病原性因子を検討するために有用である1つの血清型1/2a株、SLCC-5764を選択した。最初に、これらの株の各々を接合実験において対抗選択するためにストレプトマイシン耐性にした(「材料と方法」に記載)。生存度に関連する実験の複雑さを回避するために、親株と同じ増殖速度を有するかどうかに基づいてストレプトマイシン耐性誘導株を選択した。得られた株、DP-L4088、DP-L4089およびDP-L4082は全て、DP-L4056と同じ頻度でpPL1組込みに好適なレシピエントであることが証明された。
【００６３】
最後に本発明者らは、comK-attBB'(プライマーPL60/PL61)およびハイブリッドattPB'(プライマーPL14/PL61)のPCRアッセイを使用して、comK結合部位にプロファージを持たない好適な株を同定するためにL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)単離株の調査を実施した。これらの実験の結果(表2)により、10403S、L028およびEGDeを含むL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の生物学および病原性を検討するために通常使用される株の多数はcomKにプロファージを有することが示された。
【００６４】
（表２）種々の株のプロファージ状態
2005523716.tif 000014
a(-)：カラムの上部に記載されているプライマー対で陰性のPCR結果を生じた。b(+)：カラムの上部に記載されているプライマー対で陽性のPCR結果を生じた。PL60/PL61プライマー対は、非溶原性株において417 bp PCR産物を特異的に増幅し、溶原性株ではPCR産物を生じない。PL14/PL61プライマー対は、溶原性株において743 bp PCR産物を特異的に増幅し、非溶原性株においてPCR産物を生じない。
【００６５】
B.  comKの状態はL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の病原性に影響を与えなかった。
本発明者らは次に、comKにプロファージが存在すること、プロファージが存在しないこと、または組込みベクターが病原性の表現型を変更するかどうかを判定するために、標準的な病原性アッセイにおいてDP-L4056およびDP-L4074を野生型10403Sと比較した。これらの3つの株を、LLO活性、単層のL2細胞においてプラークを形成する能力、およびマウスLD50アッセイにおける病原性についてアッセイした(表3)。全て互いに識別不可能であり、comK ORFの完全性およびpPL1の存在は病原性に測定可能な影響を与えないことを強く示唆した。
【００６６】
（表３）actAおよびhlyの相補性
2005523716.tif 000015
a示してある溶血単位データは1つの代表的な実験のものである。nd：測定されず。bプラークサイズは8〜10の独立した実験の平均であり、野生型(100%と規定する)に対する割合として示されている。標準偏差を括弧内に示す。na：適用不能。c10403SおよびΔhly(DP-L2161)のLD50は(37)で測定し、ΔactA株(DP-L1942、細菌表面においてアクチンの核形成を支持しない、actA ORF内のわずかな欠損)のLD50は(4)で測定した。
【００６７】
C.  ファージ結合部位におけるhlyの完全な相補性
hlyの遺伝子産物であるリステリオリシン-O(LLO)は、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)が最初に宿主細胞に侵入した際に、膜結合液胞からの回避を担当する分泌型の孔形成細胞溶解素である。LLOは、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の細胞内ライフサイクルおよび病原性に欠くことができない。LLO活性は、赤血球細胞に対する溶血活性によって測定することができる。Hly突然変異体は単層のL2細胞においてプラークを形成せず、マウスLD50アッセイにおいて病原性が5log低い。
【００６８】
本発明者らは、hly構造遺伝子をpPL1にクローニングし、このプラスミドを大腸菌(E. coli)から、ファージキュアリングした野生型およびΔhly L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)誘導株に接合し、DP-L4076(hly部分二倍体)およびDP-L4075(ファージcomK-att部位にのみhly)を得た。これらの株を、血液プレートに対する溶血性活性、分泌された溶血性単位の相対量、単層のL2細胞においてプラークを形成する能力、およびマウスLD50アッセイにおける病原性について試験した(表3)。欠損株バックグラウンドにおけるhlyの量的な相補性および部分二倍体株において産生された溶血性単位が2倍であることは2つのことを示している。第一には、遺伝子発現はcomK染色体位置における異所的な発現によって事実上影響されない。第二に、hlyプロモーターは分子内に含有されている。さらに、LLO量の2倍の増加は、少なくともプラーク形成で測定したとき、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の病原性および細胞内ライフサイクルに有害でない。
【００６９】
D.  ファージ結合部位におけるactAの相補性は野生型発現に匹敵する。
第2の主要なL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)病原性因子であるActAは、細菌細胞内の運動に使用される宿主細胞アクチン-細胞骨格因子を奪い取る原因である。actAの突然変異体は細胞間の伝播だけでなく、細胞単層においてプラーク形成もできず、野生型と比較して病原性が3log低いので、ActAも細菌の病原性に欠くことができない。さらに、ActA発現はLLOより複雑と考えられ、actA発現を誘導するプロモーターは2つある。1つはactA ORFのすぐ上流にあり、2つめはactAの上流のmpl遺伝子の前にある。
【００７０】
本発明者らは、ファージ結合部位におけるactAの相補性を評価するために数種の株を構築した。第1のグループは、10403Sをバックグラウンドとして、第2の部位を相補性にしたもの(DP-L4077)および部分二倍体(DP-L4078)株を含んだ。これらを、L2単層においてプラーク形成についてアッセイした(表3)。組込み型ActAはこのアッセイにおいて十分には相補せず(プラークサイズ86%)、部分二倍体株はいっそう小さなプラークを形成した(野生型の72%)。本発明者らは、これらの結果を、最適なactA発現にはmpl遺伝子の上流の第2のプロモーターがわずかに寄与している可能性があることを示すと解釈している。さらに、おそらく最適な運動性のために細菌表面にActAが多すぎると、actAの2つのコピー(発現を誘導する3つのプロモーターを有する)は、細胞間に伝播する能力をさらに低下するので、細胞内の細菌表面には臨界濃度のActAが存在すると思われる。
【００７１】
本発明者らは、病原性遺伝子を過剰発現する株SLCC-5764のActA相補性をさらに試験した。ActAは、この株のcomK-attBB'部位から効果的に発現される(図3A、レーン9)。10403S相補actA株のプラーク形成データを考慮すると、部分二倍体株DP-L4085は親株よりも多いActAを産生することが示唆されているのかもしれない。しかしこれは観察されておらず、親株、相補株および部分二倍体株は全て同様のレベルのActAを発現した(図3A、レーン5、8および9)。この観察は、SLCC-5764における調節の完全な欠損およびActAの高いレベルの構成的発現による可能性が高い。さらに、DP-L4087は細菌表面におけるアクチン核形成、アクチン尾部形成および細胞抽出物における細菌の運動性を支持した(図3B)。これらの細胞抽出物実験の結果は、相補のための組込みベクターシステムが、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)運動性のインビトロ研究、望ましいアッセイ系における研究のために、株の構築を容易にし、異なる宿主株に種々の分子構築物を配置することに有用であることを示している。特に、通常ではない運動性表現型を有するactAの数種の対立遺伝子を、pPL1を使用してSLCC-5764ΔactA株に導入し、現在細胞抽出物において評価中である。簡略化した細胞抽出物システムにおけるこれらの突然変異体の検討は、ActAタンパク質のあまり理解されていない領域の活性の洞察を与えるはずである。
【００７２】
上記に言及した株を以下の表1に提供する。
【００７３】
（表１）
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【００７４】
E.  ファージPSAのtRNAArg遺伝子への組込みおよびpPL2構築
comK結合部位にプロファージを有するL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株へのpPL1組込みは、最初に宿主株からプロファージをキュアリングしなければならない過程によって妨害される。ファージキュアリング段階の必要性を軽減するために、pPL1組込みの特異性をPSAプロファージのそれに変更した。PSA((Phage from ScottA)は、ヒトリステリア症の流行中に単離された血清型4b株であるL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株ScottAのプロファージである。本発明者らは、PSAゲノムDNA配列を使用して、attPP'配列を含有すると本発明者らが予測した近接する非コード配列を有するインテグラーゼ様ORFを同定した。次いで、PSAインテグラーゼ配列を使用して、PSA溶原性株DP-L4061からPSA-attBB'のDNA配列を得た(「材料と方法」を参照されたい)。PSAは、枯草菌(B. subtilis)のtRNAArg遺伝子(trnSL-ARG2)と88%同一であるtRNAArg遺伝子に組込むことが見出された。tRNAArg遺伝子のアンチコドンは5'UCUであり、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)において最も普通に使用されるアルギニンアンチコドンである。PSAおよび細菌結合部位は17 bpのDNA同一性を有し、tRNAArg-attBB'は、PSAの組込みによって中断されるtRNAArg配列を完成させる短いヌクレオチド配列を有する(図4)。結合部位tRNAArg遺伝子はL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株EGDeのゲノムに1箇所だけ存在し、おそらく血清型4bに1箇所だけ存在する。これは、PSA組込み部位が1つしかないことだけではなく、組込み(または切断)の結果遺伝子の正確な再構成が細胞の生存に必要である可能性が高いことを示している。
【００７５】
pPL2は、U153リステリオファージインテグラーゼ遺伝子およびpPL1の結合部位をPSAリステリオファージインテグラーゼ遺伝子および結合部位と交換することによって構築した。pPL2をSM10に形質転換し、得られた株を10403S、EGDe(ストレプトマイシン耐性変異を有する)および血清型4b株DP-L4088に接合した。クロラムフェニコール耐性トランス接合体が、pPL1組込みと同じ割合である、ドナー細胞あたり約2×10-4の頻度でこれらの交雑株の各々から生じた。各交雑株の2つの組換え株を薬剤選択条件下で面線接種し、プライマーNC16およびPL95を使用してPSA-attBP'の存在についてPCRで試験した。予測された499 bpのPCR産物は試験したコロニーの各々において得られ、両方の血清型1/2および4b株のtRNAArg-attBB'にpPL2が組込まれることを示した。本発明者らは、pPL1について記載したものと同じ非選択100世代実験を用いて、EGDeおよびDP-L4088株に組込んだpPL2の安定性を試験した。増殖した培養物の各々の49個のコロニーをクロラムフェニコール耐性について試験した。EGDe誘導株は100%薬剤耐性コロニーを保持し、組込み体の完全な安定性を示した。DP-L4088組込み体の場合には、49コロニーのうち2つがクロラムフェニコール感受性であり、低レベルの切断がこの血清型4b株に生じる可能性があることを示している。正確な切断が生じたかどうかを試験するために、本発明者らはtRNAArg-attBB'をPCR増幅し、PCR産物を配列決定した。野生型DNA配列が得られ、正確な切断事象を示している。
【００７６】
本発明者らのPCR実験の経過中に、本発明者らは、血清型4bおよび血清型1/2のL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)のtRNAArg-attPB'部位間の相違に注目した。この相違の性質を判定するために、本発明者らは、10403SからtRNAArg-attBB'部位を単離して配列決定した(「材料と方法」に記載)。10403SのattPB'の配列(tRNAArg遺伝子の3')は血清型4b株WSLC 1042のそれと関連がないことを本発明者らは見出した。これと対照的に、10403SのattBP'の配列(tRNAArg遺伝子の5')は、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)血清型4b株WSLC 1042の対応する領域と96〜97%同一であり、血清型4b株はTIGRで配列決定され、血清型1/2a株EGDeは欧州リステリア協会(European Listeria Consortium)によって配列決定された。従って、PSAインテグラーゼによって認識される細菌attBB'配列は、attB' DNA配列より多量のattB DNA配列を含む可能性が高い。さらに、本発明者らは、プライマーPL102およびPL103を使用したPCRアッセイを用いてL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の共通の実験株においてtRNAArg-attBB'の利用率を試験した。本発明者らは、tRNAArg結合部位が株10403S、EGEeおよびL028において利用可能であることを見出し、pPL2は、最初に内因性プロファージをキュアリングすることなく、株構築、相補性および遺伝学研究のこのようなバックグラウンドに容易に利用することができることを示している。
【００７７】
F.  オワンクラゲ(Aquoria victoria)GFPの発現
米国特許第5,777,079号(開示内容が参照として本明細書に組み入れられる)に記載されているGFPコード配列をプラスミドpPL1にクローニングし、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)のゲノムに組み込む。GFPコード配列をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅し、PCR断片をpPL1のマルチクローニングサイトにクローニングする。L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)においてGFPを発現するために適当な転写要素および翻訳リーダー配列を含有する好適なプロモーターを、GFPタンパク質の発現を誘導するように、GFPコード配列の5'末端にクローニングする。改変したpPL1プラスミド構築物を標準的な技法を使用して大腸菌(E. coli)株SM10に電気穿孔し、上記のように、改変したpPL1プラスミド構築物をL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)に接合する。7.5μg/mlクロラムフェニコールおよび200μg/mlストレプトマイシンを添加したBHIプレートで組換えL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)を選択する。個々のコロニーを取り、プライマー
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を使用して、ファージ結合部位への組込みについてPCRでスクリーニングする。組換えL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の培養物を増殖、調製し、GFPについてスクリーニングする。
【００７８】
III.  pPL1およびpPL2の有用性
L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)に使用するための最初の一段階部位特異的組込みベクターの構築および特徴づけは、この病原菌の研究に利用可能な遺伝子ツールを推進する。これらのベクターは、従来の方法と比較して手軽な株構築を可能にし、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の細胞内ライフサイクルを研究するために使用される種々の株において広範囲に有用である。さらに、安定な部分二倍体株を構築して、精密なコピー数検討、および多量体化によるタンパク質内相互作用の検討、および同じ細菌株における遺伝子の異なる対立遺伝子の優性または劣性の試験を可能にすることができる。
【００７９】
pPL1およびpPL2はまた、例えば標的細胞、例えば外来病原菌等に対する免疫応答を誘発および追加免疫することを含む、少なくとも増強するためのワクチンの開発にも有用である。いくつかの組換えL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)システムがマウスにおいて細胞性免疫応答を誘発するために使用されている(Frankel, F. R.、S. Hegde、J. LiebermanおよびY. Paterson. 1995. Induction of cell-mediated immune responses to human immunodeficiency virus type 1 Gag ptotein by using Listeria monocytogenes as a live vaccine vector. J. Immunol. 155(10): 4775-4782、Goossens, P. L.、G. Milon、P. CossartおよびM. F. Saron. 1995. Attenuated Listeria monocytogenes as a live vector for induction of CD8+ T cells in vivo: a study with the nucleoprotein of the lymphocytic choriomeningitis virus. Int. Immunol. 7(5): 797-805、Ikonomidis, G.、Y. Paterson、F. J. KosおよびD. A. Portnoy. 1994. Delivery of a viral antigen to the class I processing and presentation pathway by Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 180(6): 2209-2218、Shen, H.、M. K. Slifka、M. Matloubian、E. R. Jensen、R. AhmedおよびJ. F. Miller. 1995. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(9): 3987-3991)。L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)における組換えタンパク質のプラスミドに基づいた発現の1つの限界は、選択をしないインビボ(すなわち、宿主動物内における)プラスミドの安定性である。さらに、外来抗原を発現する株の染色体構築は時間がかかる。pPL1およびpPL2はこれらの懸念を共に軽減する。
【００８０】
本発明が数多くの利点を提供することは上記の結果と考察から明らかである。本明細書に記載する、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)に使用するための最初の一段階部位特異的組込みベクターの構築および特徴づけは、この病原菌の研究に利用可能な遺伝子ツールを推進する。例えば、本発明のベクターおよび方法は、従来の方法と比較して手軽な株構築を可能にし、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の細胞内ライフサイクルを研究するために使用される種々の株において広範囲に有用である。さらに本発明は、ワクチン製剤を製造するための重要な新規ツールを提供する。L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)における組換えタンパク質のプラスミドに基づいた発現の1つの限界は、選択をしないインビボでの(すなわち、宿主動物内における)プラスミドの安定性である。さらに、外来抗原を発現する株の染色体構築は時間がかかる。本発明のベクターおよび使用方法はこれらの懸念を共に軽減する。このように、本発明は当技術分野に大いに貢献する。
【００８１】
本願に引用されている全ての文献および特許出願は、個々の文献または特許出願の各々が具体的且つ個別に参照として本明細書に組み入れられることが示されるものとして、参照として本明細書に組み入れられる。任意の文献の引用は、提出日以前の開示のためであり、本発明が先行発明によってこのような文献より先行する資格がないと認めるものと考慮されるべきではない。
【００８２】
上記発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によって幾分詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、ある一定の変更および改良を加えることができることが、本発明の教示内容を考慮すると当業者には容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】(A)pPL1組込みベクターのプラスミドマップである。配列番号：24はpPL1の配列を提供する。クロラムフェニコール耐性遺伝子および大腸菌(E. coli)の複製起点を灰色で示し、RP4導入起点を白で示し、インテグラーゼ遺伝子およびL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)p60プロモーターを黒で示す。マルチクローニングサイトをプラスミドの底部に示し、独自の制限部位をMCSの下に四角に入れて記載した。pPL24およびpPL25挿入断片はMCSの下に模式図で示し、「材料と方法」に記載されているようにクローニングした。クローニングに使用したプラスミド構築物の最終サイズおよび制限部位を、挿入断片の各々に並記した。(B)組込みベクターpPL2のプラスミドマップである。配列番号：28はpPL2の配列を提供する。PSAインテグラーゼおよびPSAattPP部位が記載されていることを除いて、色のスキームおよび遺伝子は図1Aと同じである。13の独自の制限部位を有するマルチクローニングサイトをプラスミドの底部に示す。
【図２】comK遺伝子(AおよびB)およびtRNAArg遺伝子(CおよびD)の結合部位のゲノム組成である。(A)無傷のcomK遺伝子を有する非溶原性L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株である。プライマーPL60およびPL61は、細菌の結合部位comK-attBB'を増幅する。(B)溶原性L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株(約40kbのファージDNAがcomK遺伝子に挿入されている)または組込み後の株(pPL1構築物がcomK遺伝子に挿入されている)である。プライマーPL14およびPL61はハイブリッド結合部位comK-attPB'を増幅する。(C) tRNAArg-attBB'において非溶原性のL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)血清型4b株である。プライマーNC16およびNC17は、血清型4b株の細菌の結合部位tRNAArg-attBB'を増幅する。星印は、血清型1/2株において細菌結合部位tRNAArg-attBB'を増幅するために、プライマーNC16およびNC17がPL102およびPL103と置換されていることを示す。(D)溶原性L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株(約40kbのファージDNAまたは6kb pPL2ベクターDNAがtRNAArg遺伝子の3'末端に挿入されている)である。プライマーNC16およびPL95は、血清型4b株および1/2株両方のハイブリッド結合部位tRNAArg-attBP'を増幅する。
【図３】SLCC-5764におけるActAの発現および機能的相補性を示す。(A)クーマシーブルーは対数増殖期後期まで増殖したSLCC-5764由来株のSDS-PAGEを染色した。ActAは矢印で示す。レーン1：分子量マーカー、レーン2：DP-L3780、レーン3：DP-L4083、レーン4：DP-L4086、レーン5：SLCC-5764、レーン6：DP-L4082、レーン7：DP-L4084、レーン8：DP-L4085、レーン9：DP-L4087。株は表1に記載する。(B)ゼノパス(Xenopus)細胞抽出物におけるアクチン尾部形成およびDP-L4087の運動である。上のパネルは位相像で、下のパネルは同じ視野の蛍光像である。
【図４】(A)PSA結合部位として使用されるtRNAArgのクローバーの葉の形のダイアグラムである。アルギニンアンチコドンは円で囲まれている。tRNA遺伝子とPSA attPP'の配列同一性領域を示す。tRNAArg遺伝子とCoveスコア(82.37)の境界はtRNAscan-SEで予測した(31)。(B)L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)WSLC 1042(上のライン)のtRNAArg -attBB'領域のアラインメントおよびインテグラーゼ遺伝子下流のPSAのattPP'領域である。L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の74 nt tRNAArg遺伝子は四角で囲み、配列同一性の17 bp重複領域(コア組込み部位)にはグレーで影をつけてある。tRNAArg遺伝子アンチコドンは太字で示し、下線をつけてある。同一のヌクレオチド残基は(:)で示してある。左の数はWSLC 1042結合部位(AJ314913)およびPSAゲノム(AJ312240)のDNA配列におけるヌクレオチド位置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月26日(2005.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
上記のように、インテグラーゼ遺伝子は、ベクターがそのために設計されていてベクターの組込みが望まれるリステリア細胞内にベクターが存在する場合にインテグラーゼ遺伝子の発現を誘導するプロモーター(さらに必要であれば、調節および／またはシグナル配列)に機能的に結合している。任意の便利なプロモーターを使用することができ、ある態様において、プロモーターはリステリア特異的プロモーターである。関心対象の代表的なプロモーターには、リステリアp60プロモーター、リステリアactAプロモーター、リステリアplcAプロモーター、リステリアmplプロモーター、リステリアplcBプロモーター、リステリアinlAプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターには、リステリア株が同族のバクテリオファージRNAポリメラーゼも発現する場合には、T7、Qβ、SP6等のプロモーターなどのある種のバクテリオファージプロモーターを含んでもよい。上記のインテグラーゼ遺伝子／プロモーター要素以外に、本発明のベクターはまた、ファージ結合部位、すなわちリステリアゲノムによる部位特異的組込みを提供するヌクレオチド配列またはドメインも含む。任意の便利なファージ結合部位を使用することができ、ファージ結合部位の選択は、少なくとも一部にはベクターの所望の組込み位置に依存する。関心対象の代表的なファージ結合部位には、U153 attPP'結合部位(以下の実験の部にさらに詳細に記載されている)、PSA attPP'結合部位(以下の実験の部にさらに詳細に記載されている)等が挙げられるが、これらに限定されない。


【国際調査報告】
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