(57)【要約】  本発明は、アンチセンス化合物を含むユニジーンアンチセンスライブラリーを用いた、機能的ゲノミクスのための高スループットシステムを提供する。前記アンチセンス化合物は、標的ｍＲＮＡの除去に対して特異的および効果的であった。よって、本発明のシステムは、疾患に重要な遺伝子の機能を発現させるための一時的なノックダウンシステムとして有効に用いられうる。本発明のシステムは、機能的ゲノミクスのためだけではなく、種々の悪性腫瘍、感染症、および他の疾患に関与する特定の遺伝子を阻害することにより、前記疾患に対するアンチセンスまたは他の分子による治療のための標的を効果的に確認するためにも適用されうる。
2005510206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれが水性媒体中に少なくとも１つの特有の一方向性アンチセンス核酸インサートを含む組換えバクテリオファージまたは組換えファージミドベクター由来の、１以上の一本鎖ＬＣ−アンチセンス化合物を有する、複数のコンパートメントを含み、
ここで前記ＬＣ−アンチセンス化合物は、宿主細胞中に導入されることができ、そして、前記特有のアンチセンス核酸インサートと実質的に相補的な、前記宿主細胞中の核酸に特異的に結合しうる、
複数の特有一本鎖核酸のライブラリー。
【請求項２】
前記特有のアンチセンス核酸インサートの標的遺伝子に対する特異性は、ライブラリーの初回作製時に既知である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
前記宿主細胞の表現型の発現を調節する標的宿主細胞核酸の特異性は、ライブラリーの初回作製時に未知である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項４】
前記宿主細胞は、真核細胞である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項５】
前記コンパートメントは、それぞれ前記ＬＣ−アンチセンス化合物を水性媒体１ｍｌあたり約０．１μＭ〜約１μＭ含有する、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項６】
前記バクテリオファージまたはファージミドベクターは、繊維状バクテリオファージ由来である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項７】
前記バクテリオファージまたはファージミドベクターは、前記特有のアンチセンス核酸インサート配列が挿入された、バクテリオファージまたはファージミドゲノム配列を有する、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項８】
前記バクテリオファージまたはファージミドベクターは、１超の特有のアンチセンス核酸インサート配列を含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項９】
前記複数のコンパートメントは、少なくとも６ウェルのマルチウェルフォーマットを含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１０】
実質的に自動化された工程において作製され、用いられるように設定されている、請求項９に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記複数のコンパートメントは、少なくとも９６ウェルのマルチウェルフォーマットを含む、請求項９に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記宿主細胞は異常であり、前記宿主細胞を正常な状態に戻すのに遺伝子発現の調節が有用である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記異常は、癌、ウイルス感染、免疫障害または代謝疾患である、請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記癌は、肝癌、肺癌、胃癌、結腸癌、白血病、子宮頸癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、卵巣癌、腎臓癌または乳癌である、請求項１３に記載のライブラリー。
【請求項１５】
前記ウイルス感染は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＨＩＶ、天然痘、単球増加症（エプスタイン−バーウイルス）、肝炎または呼吸器系合胞ウイルス（ＲＳＶ）により生じる、請求項１３に記載のライブラリー。
【請求項１６】
前記代謝疾患は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、原発性甲状腺機能低下症、ガラクトース血症、異常ヘモグロビン、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病または肥満である、請求項１３に記載のライブラリー。
【請求項１７】
前記免疫障害は、シェーグレン症候群、抗リン脂質抗体症候群、免疫複合体疾患、紫斑病、シェーンライン−ヘノッホ、免疫不全症候群、全身性エリテマトーデス、免疫不全、リウマチ、腎または肝硬化である、請求項１３に記載のライブラリー。
【請求項１８】
核酸断片をバクテリオファージまたはファージミドベクター中に一方向にクローニングすることにより、前記ベクター中に核酸断片を一方向に挿入すること：を含む、
少なくとも１つの特有の一方向性アンチセンス核酸インサートを含む、組換えバクテリオファージまたは組換えファージミドベクター由来の１以上の一本鎖ＬＣ−アンチセンス化合物を有する、複数の特有の一本鎖核酸を含むライブラリーの製造方法。
【請求項１９】
細菌形質転換体を作製するために、インサートを有するベクターをコンピテント細菌細胞中に導入することにより、細菌形質転換体を調製し；そして次いで、一本鎖核酸ライブラリーを製造するために、前記細菌形質転換体にヘルパーファージを感染させる：ことをさらに含む、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
多発性筋炎／強皮症自己抗原、ＥＳＴ（Ｎ２１９７２）、核マトリックスタンパク質ｐ８４、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ａ受容体ベータ３、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス９、ＥＳＴ（Ｈ１３１１２）、ＥＳＴ（ＡＷ２９４１３３）、プライマーゼ，ポリペプチド１（４９ｋＤ）、ヒトＥＶ１２タンパク質遺伝子、上皮成長因子受容体経路基質８またはタンパク質チロシンホスファターゼ，非受容体タイプ２に対して標的化された大環状アンチセンス化合物を、肝癌細胞に対して投与することを含む、肝癌細胞の増殖を特異的に阻害する方法。
【請求項２１】
ＴＧＦ−β刺激性タンパク質，ＴＳＣ−２２、基礎転写因子ＩＩＨ、チトクロムＰ４５０，サブファミリーＩＩＩＡ，ポリペプチド７、ＫＩＡＡ００９４タンパク質（Ｄ４２０８４）、ＭＡＸ二量化タンパク質、セリン／スレオニンキナーゼ１３（ａｕｒｏｒａ／Ｌ  １−ｋｉｋｅ）、ＥＳＴ（ＡＩ０５７０９４）、Ｒａｓ−関連ＧＴＰ−結合タンパク質、ＭＨＣクラスＩ領域ＯＲＦまたは腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー，メンバー７に対して標的化された大環状アンチセンス化合物を、肺癌細胞に対して投与することを含む、肺癌細胞の増殖を特異的に阻害する方法。
【請求項２２】
以下の段階を含む、ユニジーン一方向性アンチセンスライブラリーを用いて機能的ゲノミクス分析を行うための、高スループットシステム：
（ｉ）前記ユニジーン一方向性アンチセンスライブラリーを有する、大環状アンチセンス分子−キャリアー複合体を形成すること；
（ｉｉ）内生的に発現している、実質的に相補的な転写産物を除去するために、前記複合体を宿主細胞にトランスフェクションすること；
（ｉｉｉ）前記宿主細胞の表現型の変化をスクリーニングすること；および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）において表現型の変化を引き起こした遺伝子を同定すること。
【請求項２３】
さらなる機能的試験を必要とする、請求項２２に記載の高スループットシステム。
【請求項２４】
相同の遺伝子または完全な遺伝子配列を決定するために、前記段階（ｉｖ）において得られた遺伝子配列を、以前に確認されたクローン情報と比較することを含む、請求項２２に記載の高スループットシステム。
【請求項２５】
前記キャリアーは、リポソーム、カチオン性高分子、ＨＶＪ−リポソーム複合体、ペプチドまたはウイルスである、請求項２２に記載の高スループットシステム。
【請求項２６】
前記大環状アンチセンス分子および前記キャリアーは、約１：３（ｗ／ｗ）または約１：４（ｗ／ｗ）を含む比で混合される、請求項２５に記載の高スループットシステム。
【請求項２７】
分析される表現型は、細胞の形態、細胞の増殖、細胞のアポトーシス、または基質に対する細胞の応答である、請求項２２に記載の高スループットシステム。
【請求項２８】
前記分析は、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット分析、イムノアッセイ、ＭＴＴ還元分析、［３Ｈ］−チミジン取込み（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）分析、コロニー形成分析、ＤＮＡ合成およびクロマチン活性化、細胞の形態変化の検査によるアポトーシスの分析、染色体の凝集または断片化、ＤＮＡの断片化、アポトーシスの定量分析、アポトーシスのシグナル機構、細胞サイクル調節因子の活性化、細胞サイクル調節因子間での複合体形成、または、インビトロおよびインビボにおける、代謝の、形態の、生理的な、および生化学的な表現型の変化の分析である、請求項２７に記載の高スループットシステム。
【請求項２９】
１）大量のユニジーンに対するＬＣ−アンチセンス化合物を大規模に並行して製造することによりアンチセンスライブラリーを作製し；
２）宿主細胞群をマルチウェルプレート中で培養し；
３）前記１）のアンチセンスライブラリーを用いて、ＬＣ−アンチセンス化合物−キャリアー複合体を形成し；
４）前記３）の複合体を宿主細胞群にトランスフェクションすることにより、遺伝子の一次の機能的分析を行い；および
５）前記４）においてスクリーニングされた遺伝子のさらなる機能的分析を行う：ことを含む、
ユニジーン一方向性アンチセンスライブラリーを特定の疾患の細胞株に適用することにより行われる、大規模な機能的ゲノミクス分析を行うための高スループットシステム。
【請求項３０】
前記ユニジーンＬＣ−アンチセンス化合物は、
１）標的遺伝子のｃＤＮＡ断片を調製し；
２）前記１）のｃＤＮＡ断片を、ＬＣ−アンチセンス化合物を製造しうるファージまたはファージミドベクターに挿入することにより、組換えファージまたは組換えファージミドを調製し；および
３）前記２）の組換えファージまたは組換えファージミドベクターにより作られる一本鎖環状ゲノムの一部として、前記ユニジーンのアンチセンス配列を含有するＬＣ−アンチセンス化合物を製造する：段階により調製される、請求項２９に記載の、機能的ゲノミクスのための高スループットシステム。
【請求項３１】
１）ユニジーンＬＣ−アンチセンス化合物を選抜することによりアンチセンスアレイを作製し；
２）宿主細胞群をマルチウェルプレート中で培養し；
３）前記１）のアンチセンスアレイ上でＬＣ−アンチセンス化合物−キャリアー複合体を形成し；
４）前記３）の複合体を前記細胞群にトランスフェクションすることにより、遺伝子の一次の機能的分析を行い；および
５）前記４）においてスクリーニングされた遺伝子のさらなる機能的分析を行う：ことを含む、
マクロアレイまたはマイクロアレイアセンブリを疾患細胞に適用することにより行われる、大規模な機能的ゲノミクスのための高スループットシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野：
本発明は、アンチセンステクノロジーの分野に関する。本発明はまた、アンチセンステクノロジーの、治療における利用、および遺伝子機能同定システムにおける利用に関する。本発明は、ユニジーンアンチセンスライブラリーを用いた機能的ゲノミクスのための高スループットシステムに関する。そして特に、本発明は遺伝子の機能の大規模なスクリーニングのためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
２．背景の説明：
ヒトゲノム中の遺伝情報のほとんどが解読されるにつれて、遺伝子をスクリーニングし、その機能を分析するためのたくさんの新規な方法が、世界中の様々な施設において研究され、開発されている。これらの方法により、細胞の生存力および疾患の原因の生化学的なおよび生理学的な機構を理解するための新たな情報が提供されている。多くの不治の病の分子的な基盤はさらに解明され、それに付随してより効果的な治療薬も開発されるだろう。
【０００３】
ヒトの疾患のほとんどは、異常な遺伝子発現が原因である。疾患の遺伝的な原因は、直接のＤＮＡ損傷による遺伝子発現の停止、並びに異常な転写および／または翻訳のような、種々の方法により証明される。癌原遺伝子の異常な発現により、癌が生じうる（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７（２），  ５３８−５４２  （１９９０）；  Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８０（７），  １９８２−１９８６  （１９８３）；およびＳｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ５（１２），  １７６１−１７６７  （１９９０））。免疫疾患の発生および進行は、サイトカインの生産過剰（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）または生産不足（ｕｎｄｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）に密接に関連しているということが報告されている（Ｗａｓｚｃｚｙｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ．，  ８（２），  ９３−１００  （１９９９）；Ｐｕｌｓａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，  ２６（９），  １９９２−２００１  （１９９９））。種々の型の癌や免疫疾患のような慢性のまたは不治の疾患は、異常な遺伝子発現が原因である。したがって、遺伝子発現の修飾により、これらの疾患が調節されうるということが考えられる。
【０００４】
特定のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入することにより、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを標的のｍＲＮＡに結合させ、それによって標的のｍＲＮＡを除去することが、遺伝子発現を調節するための１つの方法であるということは、本技術分野において公知である。
【０００５】
アンチセンス分子は、ワトソン−クリック塩基対合を介してｍＲＮＡの相補的な塩基配列に結合する。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−オリゴ）は、塩基配列特異的な方法で遺伝子発現を減少させることから、遺伝子の機能的研究において有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１４，  ３６３−  ３６６  （１９８５）；  Ｍｅｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５１，  ２８９７−２９０１  （１９９１）；  Ａｎｆｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６，  ３３７９−３３８３  （１９８９））。腫瘍の発生（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）および発達（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）に関与する遺伝子の異常な発現を除去するアンチセンス抗癌剤を開発するためにもまた、懸命な努力が払われている（Ｋａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｅｕｋ．  Ｒｅｓ．，  １４，  ８３１−８３９  （１９９０）；  Ｍｅｌｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ，  ８７，  ２２２１−２２３４  （１９９６）；  Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，  １，  ５４３−５４８  （１９９０）；  Ｒａｔａｊｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ，  ７９，  １９５６−１９６１  （１９９２）；  Ｋａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ，  ７４，  １５１７−１５２４  （１９８９）；  Ｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９３，  １３５２−  １３５６  （１９９６）；  Ｗａｇｎｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７２，  ３３３−３３５  （１９９４））。合成のＡＳ−オリゴは、デザインおよび合成が容易であり、標的遺伝子に対する潜在的な特異性を有するために広く利用されている。遺伝子発現のアンチセンス阻害は、アンチセンスＤＮＡ−ｍＲＮＡ二量体の形成に伴うリボヌクレアーゼＨ活性を介して、またはリボソーム複合体に結合するためのｍＲＮＡの移動に対する立体障害を介して、発現していると考えられている（Ｄｏｌｎｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９，  １８５−１９４  （１９９１））。ゲノムＤＮＡのプロモーター領域を照準として、三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害するための努力もなされている。さらに、ゲノムＤＮＡのプロモーター領域と競合する二重オリゴヌクレオチドデコイもまた作製されている（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８，  １００２３−１００２６  （１９９１））。ＡＳ−オリゴの効率は、動物モデルおよび種々の最近の臨床研究において確認されている（Ｏｆｆｅｎｓｐｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １２，  １２５７−  １２６２  （１９９３）；  Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２５  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，  ２６，  １３１−１３６  （１９９５）；  Ｎｅｓｔｅｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  １，  ５２８−５３３  （１９９５）；  Ｒｏｕｓｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７６，  １１９２−１１９３  （１９９７））。加えて、アメリカ合衆国およびヨーロッパにおいて、最初のアンチセンス医薬がＣＭＶ網膜炎に対して承認された。
【０００６】
しかしながら、成果がいつも明瞭であるとは限らないために、ＡＳ−オリゴに対する期待は時として失望に終わることもあった。ＡＳ−オリゴを用いる際の問題としては、標的部位に到達しにくいこと（Ｆｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ；  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １７２，  ２１３−２２５  （１９９７）；  Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ，  ７，  １０９５−１１０６  （１９９６））、ヌクレアーゼに対して不安定であること（Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，  ４９，  １７９３−１８０１  （１９９１）；  Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６０，  １５１０−１５１３  （１９９３）；  Ｇｒｙａｚｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２４，  １５０８−１５１４  （１９９６））、塩基配列特異性を失うこと、およびインビボにおける種々の好ましくない副作用などがあった。ＡＳ−オリゴの安定性は、いわゆる第２世代ＡＳ−オリゴ（ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＡＳ−ｏｌｉｇｏｓ）である、化学的に修飾されたオリゴを用いることにより、ある程度改善された（Ｈｅｌｅｎｅ  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２７（１１），１４６６−７１  （１９９１）；Ｂａｙｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．  ３（４），  ３８３−９０  （１９９３）；  Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １４８９，  ３−１８  （１９９９））。ホスホロチオエート（ＰＳ）−およびメチルホスホネート（ＭＰ）−オリゴは、徹底的に研究され、主にヌクレアーゼに対する安定性を増大させるために利用されている。しかしながら、修飾された各ＡＳ−オリゴは、塩基配列特異性の喪失およびリボヌクレアーゼＨに対する不安定性の双方を示す。さらに、加水分解された修飾ヌクレオチドをリサイクルすることによって、ＤＮＡ複製または修復の際に、偶然に突然変異が導入されることも懸念されている。
【０００７】
１）ステム−ループ構造、２）ＣＭＡＳ（環状複合アンチセンス（Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ−ｃｌｏｓｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ））構造、および３）ＲｉＡＳ（リボンアンチセンス）構造を有する安定性の向上した一連の異なるアンチセンス分子、いわゆる「第３世代ＡＳ−オリゴ」が開示されている（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，  ３４６，  ２９５−３０３  （２０００）；  Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ，  Ｉ  ７，  １０９５−１１０６  （１９９６）；  Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  ２７５（７），  ４６４７−５３  （２０００））。ＣＭＡＳおよびＲｉＡＳ−オリゴヌクレオチドは、いずれも体液中のエキソヌクレアーゼおよびヌクレアーゼに対する安定性が向上している。これらのアンチセンス分子は、標的のｍＲＮＡを特異的に減少させるのにも有効である。しかしながら、本技術分野においては、さらに簡便で結合効率の向上したアンチセンス分子の開発が望まれている。
【０００８】
Ｍ１３バクテリオファージのようなある種のバクテリオファージは、一本鎖環状ゲノムを有しており、ＤＮＡ塩基配列分析および突然変異誘発研究に利用されている。Ｍ１３ファージミドは、組換えバクテリオファージの構築に用いられるプラスミドであり、特定の遺伝子に対するアンチセンス配列を有する大量の環状一本鎖ゲノムＤＮＡを作製するために用いられうる。アンチセンスＤＮＡを作製するためのこのアプローチは、環状構造に関係するエキソヌクレアーゼに対し安定であること、塩基配列が高度に忠実であること、困難である標的部位の探索を必要としないこと、およびアンチセンスライブラリーの構築が容易であるという利点を有している。
【０００９】
合成のＡＳ−オリゴは、約１５から２５塩基の長さであり、単一の標的部位にのみ結合して、基質ｍＲＮＡを除去する。しかしながら、慢性のおよび末期のヒト疾患のほとんどは、複数の遺伝的障害を示す。よって、このような疾患の治療においては、複数の遺伝子を標的としうるアンチセンス分子がより効果的であると思われる。このような要求を満足するために、複数の標的化能を有するアンチセンス分子システムを案出することは魅力的である。しかし、このような分子を化学的に合成するのは困難であり、これらを合成することは実用的ではないだろう。
【００１０】
ＡＳ−オリゴは、機能的ゲノミクスにおける使用に対して、根本的な固有の欠点を抱えている。第一に、化学的に修飾されたＡＳ−オリゴにより、無関係のｍＲＮＡに対する非特異的な結合が生じ、その結果、効率は低下して、時として細胞に対して毒性を示し、当然、偽陽性の結果を生じる。第二に、合成のＡＳ−オリゴは、自身サイズ（通常、１５から２５塩基）が短いために、その標的に対する結合における有効性が均一ではない可能性がある。なぜなら、ＡＳ−オリゴは、その標的のｍＲＮＡに対して有効に結合する前に標的の探索を必要とするからである。第三に、ＡＳ−オリゴの合成における誤りによって、その結合の特異性が低下する可能性がある。第四に、ＡＳ−オリゴの製造コストは高い。そして最後に、ＡＳ−オリゴが機能的ゲノミクスに用いられる際、これらのＡＳ−オリゴは、時に標的のｍＲＮＡに対し不完全なアンチセンス活性を示し、これによって信頼性に劣るあいまいなデータが生まれる。
【００１１】
ＤＮＡチップテクノロジーやプロテオミクスなどを用いる現在の機能的ゲノミクスシステムは、遺伝子発現プロファイルを提供するにとどまっている。しかしながら、決定的な遺伝子の機能的分析を行うためには、特定の遺伝子の不活性化の下流においてさらなる分析を行うことが必要である。
【００１２】
よって、本技術分野においては、未だ特性の決定されていない遺伝子の機能を直接決定するための遺伝子機能化システム（ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）が望まれている。
【発明の開示】
【００１３】
発明の要約
特許請求の範囲に係る発明は、上記の問題を解決し、アンチセンス分子、アンチセンス分子の組成物、アンチセンス分子の製造方法、並びに、ある標的遺伝子の発現を阻害しまたは有意に修飾する効果を示す前記分子および前記組成物の使用方法を提供する。これらの標的遺伝子の発現が癌の原因となっている場合には、本発明のアンチセンス分子を細胞に投与すると、標的ＲＮＡが除去される。これによって、前記細胞の増殖が阻害され、そしてその結果治癒し、または少なくとも癌に関係する生存率が改善されるだろう。
【００１４】
本出願人は、一本鎖環状ゲノムを有するファージミドベクターを用いた、少なくとも１つの標的特異的アンチセンス領域を有する大環状核酸分子を開発した。この大環状核酸分子は、ＬＣ−アンチセンス化合物とも称される。本発明の特定の実施態様において、本出願人は、配列が確認され、個別に分離してクローニングされたｃＤＮＡを有するファージゲノムアンチセンスライブラリーを構築した。このアンチセンスライブラリーによれば、遺伝子の機能を迅速かつ正確にスクリーニングおよび分析することが可能となる。これによって、高スループットでかつ大規模な機能的ゲノミクスシステムが提供される。さらに、本発明は、慢性のまたは不治の疾患に対する治療用アンチセンス化合物を確認するためにも用いられうる。
【００１５】
一態様においては、本発明はＬＣ−アンチセンス化合物を用いた大規模な機能的ゲノミクスを指向している。ＬＣ−アンチセンス化合物は、未知の機能を有する多数の遺伝子、および、既知であるがさらなる未知の機能を有する多数の遺伝子の機能化のための有効な場を提供する。さらに、本発明は、アンチセンス分子療法の直接の開発のためにも用いられうる。
【００１６】
ＬＣ−アンチセンス化合物は、従来のＡＳ−オリゴと比較して、少量でも優れた敏感なアンチセンス活性を示す。一般的に、ＬＣ−アンチセンス化合物はファージミドベクターにクローニングされたｃＤＮＡから得られ、そして標的特異的アンチセンス領域を有する大きな一本鎖ＤＮＡが生じる。よって、分子のサイズが大きいために、ＬＣ−アンチセンス化合物は標的部位の探索を必要とせずに有効なアンチセンス活性およびヌクレアーゼによる分解に対する安定性を示す。さらに、アンチセンスライブラリーは、数万の様々な遺伝子または遺伝子断片をファージミドベクターに全て一度に導入することにより、比較的容易に構築されうる。細菌を用いて製造を行うことで、低コストで容易にＬＣ−アンチセンス化合物を大規模に製造しうる。最後に、バクテリオファージゲノムアンチセンス化合物を、大規模な機能的ゲノミクスの領域に適用することにより、迅速性、低コスト化、および分析精度が向上する。
【００１７】
ＬＣ−アンチセンス化合物が治療において用いられる際、本発明が癌の治療に制限されないこともまた理解されるだろう。本発明のアンチセンス化合物の原理は、任意の標的ＲＮＡを効率よく除去するために適用されうる。癌の治療、ウイルス感染の副作用の除去、代謝疾患や免疫障害の治療などの形でのこの化学的な活性の表現型の発現は、いずれもアンチセンス分子療法の結果として生じうる。
【００１８】
巨大なアンチセンスライブラリーから選択されたＬＣ−アンチセンス化合物は、マクロアレイまたはマイクロアレイのようなアンチセンスアレイシステムを形成するために適用されうる。前記アンチセンスアレイシステムは、アンチセンス化合物で処理された種々の型の細胞間における前記アンチセンス化合物の機能的な比較のために、有効に利用されうる。本発明のアンチセンスアレイアセンブリシステムを用いることによって、比較による機能的診断、および疾患の基礎となる分子的機構の解明が行われうる。
【００１９】
前記アンチセンスアレイアセンブリにおいて用いられる一群のアンチセンス化合物は、アンチセンスライブラリーを用いた一次の機能分析、または、ＤＮＡチップ、ＳＡＧＥ、Ｔｏｇａおよびプロテオミクスのような従来の発現プロファイリングシステムもしくは発現トラッキングシステムから得られた結果に基づいて選択されうる。
【００２０】
本発明はさらに、製薬上許容できるキャリアーを有する、特許請求の範囲に係るアンチセンス分子の組成物を含む。
【００２１】
本発明は複数の特有の一本鎖核酸のライブラリーを指向しており、前記ライブラリーは：
少なくとも１つの特有の一方向性アンチセンス核酸インサートを水性媒体中に含む、組換えバクテリオファージまたは組換えファージミドベクター由来の１以上の一本鎖ＬＣ−アンチセンス化合物を有する、複数のコンパートメントを含み、
ここで前記ＬＣ−アンチセンス化合物は、宿主細胞中に導入されることができ、さらに、前記特有のアンチセンス核酸インサートと実質的に相補的な、前記宿主細胞中の核酸に特異的に結合しうる。
【００２２】
上記で説明したライブラリーにおいて、前記特有のアンチセンス核酸インサートの標的遺伝子に対する特異性は、前記ライブラリーの初回作製時に既知であっても未知であってもよい。さらに、前記ライブラリーにおいて、前記宿主細胞の表現型の発現を調節する標的宿主細胞核酸の特異性は、前記ライブラリーの初回作製時に既知であっても未知であってもよい。そして、前記宿主細胞は、原核細胞であってもよく、または真核細胞であってもよい。好ましくは、前記細胞は真核細胞である。さらに、前記ライブラリーは、水性媒体１ｍｌあたり約０．１μＭから約１μＭの前記ＬＣ−アンチセンス化合物を含有するコンパートメントとして配列されてもよい。さらに、前記バクテリオファージまたはファージミドベクターは、繊維状バクテリオファージ由来であってもよい。そして、前記繊維状バクテリオファージは、Ｍ１３バクテリオファージであってもよい。さらに、前記バクテリオファージまたはファージミドベクターは、前記特有のアンチセンス核酸インサート配列が挿入されたバクテリオファージまたはファージミドゲノム配列を有してもよい。
【００２３】
前記ライブラリーにおいて、前記バクテリオファージまたはファージミドベクターは、２種以上の特有のアンチセンス核酸インサート配列を有してもよい。そして前記複数のコンパートメントは、少なくとも６ウェルの、好ましくは少なくとも９６ウェルの、マルチウェルフォーマットを有してもよい。さらに、前記ライブラリーは、実質的に自動化された工程において作製され、用いられるように設定されていてもよい。そして前記宿主細胞は異常であってもよく、前記宿主細胞を正常な状態に戻すのに遺伝子発現の調節が有用であってもよい。
【００２４】
前記ライブラリーにおいて、前記宿主細胞の異常は、これに制限されないが、癌、ウイルス感染、免疫障害または代謝疾患のような種々の作用因子により生じるものであってもよい。癌は、特に制限されないが、肝癌、肺癌、胃癌、結腸癌、白血病、子宮頸癌、前立腺癌、直腸癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、卵巣癌、腎臓癌または乳癌を含んでもよい。ウイルス感染は、特に制限されないが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＨＩＶ、天然痘、単球増加症（エプスタイン−バーウイルス）、肝炎または呼吸器系合胞ウイルス（ＲＳＶ）により生じるものであってもよい。代謝障害は、特に制限されないが、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、原発性甲状腺機能低下症、ガラクトース血症、異常ヘモグロビン、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病または肥満を含んでもよい。免疫障害は、特に制限されないが、シェーグレン症候群、抗リン脂質抗体症候群、免疫複合体疾患、紫斑病、シェーンライン−ヘノッホ、免疫不全症候群、全身性エリテマトーデス、免疫不全、リウマチ、腎または肝硬化であってもよい。
【００２５】
本発明はまた、
核酸断片をバクテリオファージまたはファージミドベクター中に一方向にクローニングすることにより、前記ベクター中に核酸断片を一方向に挿入すること；を含む、
少なくとも１つの特有の一方向性アンチセンス核酸インサートを含む１以上の一本鎖の組換えバクテリオファージまたは組換えファージミドベクター由来のＬＣ−アンチセンス化合物を有する、複数の特有の一本鎖核酸を含むライブラリーの製造方法を指向している。
【００２６】
前記方法は、細菌形質転換体を作製するために、インサートを有するベクターをコンピテント細菌細胞中に導入することにより、細菌形質転換体を調製すること；および、次いで前記一本鎖核酸ライブラリーを製造するために、前記細菌形質転換体にヘルパーファージを感染させることをさらに含んでもよい。
【００２７】
本発明の他の実施態様において、本発明は、多発性筋炎／強皮症自己抗原、ＥＳＴ（Ｎ２１９７２）、核マトリックスタンパク質ｐ８４、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ａ受容体ベータ３、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス９、ＥＳＴ（Ｈ１３１１２）、ＥＳＴ（ＡＷ２９４１３３）、プライマーゼ，ポリペプチド１（４９ｋＤ）、ヒトＥＶ１２タンパク質遺伝子、上皮成長因子受容体経路基質８またはタンパク質チロシンホスファターゼ，非受容体タイプ２に対して標的化された大環状アンチセンス化合物を肝癌細胞に対して投与することを含む、肝癌細胞の増殖を特異的に阻害する方法を指向している。
【００２８】
さらに他の実施態様において、本発明は、ＴＧＦ−β刺激性タンパク質，ＴＳＣ−２２、基礎転写因子ＩＩＨ、チトクロムＰ４５０，サブファミリーＩＩＩＡ，ポリペプチド７、ＫＩＡＡ００９４タンパク質（Ｄ４２０８４）、ＭＡＸ二量化タンパク質、セリン／スレオニンキナーゼ１３（ａｕｒｏｒａ／Ｌ  １−ｋｉｋｅ）、ＥＳＴ（ＡＩ０５７０９４）、Ｒａｓ−関連ＧＴＰ−結合タンパク質、ＭＨＣクラスＩ領域ＯＲＦまたは腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー，メンバー７に対して標的化された大環状アンチセンス化合物を、肺癌細胞に対して投与することを含む、肺癌細胞の増殖を特異的に阻害する方法を指向している。
【００２９】
本発明のさらに他の実施態様において、本発明は、
（ｉ）前記ユニジーン一方向性アンチセンスライブラリーを有する、大環状アンチセンス分子−キャリアー複合体を形成すること；
（ｉｉ）内生的に発現している実質的に相補的な転写産物を除去するために、宿主細胞に前記複合体をトランスフェクションすること；
（ｉｉｉ）前記宿主細胞の表現型の変化をスクリーニングすること；
（ｉｖ）（ｉｉｉ）における表現型の変化を引き起こした遺伝子を同定すること。
を含む、ユニジーン一方向性アンチセンスライブラリーを用いて、機能的ゲノミクス分析を行うための、高スループットシステムを指向している。
【００３０】
前記高スループットシステムは、さらなる機能的試験を必要としてもよい。そして前記高スループットシステムは、相同の遺伝子または完全な遺伝子配列を決定するために、前記段階（ｉｖ）において得られた遺伝子配列を、以前に確認されたクローン情報と比較することをさらに含んでもよい。
【００３１】
前記高スループットシステムにおいて、用いられるキャリアーは、特に制限されないが、リポソーム、カチオン性高分子、ＨＶＪ−リポソーム複合体、ペプチドまたはウイルスを含みうる。そして前記大環状アンチセンス分子および前記キャリアーは、通常の実験により決定でき、通常は約１：３（ｗ／ｗ）または約１：４（ｗ／ｗ）を含む、所望の最適な比で混合されてもよい。
【００３２】
分析される表現型は、所望の任意のものでよく、特に制限されずに細胞の形態、細胞の増殖、細胞のアポトーシス、または基質に対する細胞の応答の表現型を含みうる。
【００３３】
用いられうる分析としては、特に制限されず、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット分析、イムノアッセイ、ＭＴＴ還元分析、［３Ｈ］−チミジン取込み（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）分析、コロニー形成分析、ＤＮＡ合成およびクロマチン活性化、細胞の形態変化、染色体の凝集もしくは断片化の検査によるアポトーシスの分析、ＤＮＡの断片化、アポトーシスの定量分析、アポトーシスのシグナル伝達機構、細胞サイクル調節因子の活性化、細胞サイクル調節因子間での複合体形成、または、インビトロまたはインビボにおける、代謝の、形態の、生理的な、および生化学的な表現型の変化の分析を含みうる。
【００３４】
本発明はまた、
１）多数のユニジーンに対するＬＣ−アンチセンス化合物を大規模に並行して製造することによりアンチセンスライブラリーを作製し；
２）宿主細胞群をマルチウェルプレート中で培養し；
３）前記１）のアンチセンスライブラリーを用いて、ＬＣ−アンチセンス化合物−キャリアー複合体を形成し；
４）前記３）の複合体を宿主細胞群にトランスフェクションすることにより、遺伝子の一次の機能的分析を行い；および
５）前記４）においてスクリーニングされた遺伝子のさらなる機能的分析を行う：ことを含む、
ユニジーン一方向性アンチセンスライブラリーを特定の疾患の細胞株に適用することにより行われる、大規模な機能的ゲノミクス分析を行うための高スループットシステムを指向している。
【００３５】
前記高スループットシステムにおいて、前記ユニジーンＬＣ−アンチセンス化合物は、
１）標的遺伝子のｃＤＮＡ断片を調製し；
２）前記１）のｃＤＮＡ断片を、ＬＣ−アンチセンス化合物を製造しうるファージまたはファージミドベクターに挿入することにより、組換えファージまたは組換えファージミドを調製し；および
３）前記２）の組換えファージまたは組換えファージミドベクターにより作られる一本鎖環状ゲノムの一部として、前記ユニジーンのアンチセンス配列を含有するＬＣ−アンチセンス化合物を製造する：段階により調製されてもよい。
【００３６】
本発明のさらに他の実施態様において、本発明は、
１）ユニジーンＬＣ−アンチセンス化合物を選抜することによりアンチセンスアレイを作製し；
２）宿主細胞群をマルチウェルプレート中で培養し；
３）前記１）のアンチセンスアレイ上でＬＣ−アンチセンス化合物−キャリアー複合体を形成し；
４）前記３）の複合体を前記細胞群にトランスフェクションすることにより、遺伝子の一次の機能的分析を行い；および
５）前記４）においてスクリーニングされた遺伝子のさらなる機能的分析を行う：ことを含む、
マクロアレイまたはマイクロアレイアセンブリを種々の疾患細胞に適用することにより行われる、大規模な機能的ゲノミクスのための高スループットシステムを指向している。
【００３７】
これらのおよび他の本発明の目的は、以下の本発明の説明、参照される添付の図面および添付の特許請求の範囲により、より完全に理解されるであろう。
【００３８】
図面の簡単な説明
ここで、以下に記される詳細な説明、および例示のみの目的で添付され、よって本発明を制限するものではない図面により、本発明はより完全に理解されるようになるであろう。そしてここで；
図１は、ラットＴＮＦα−Ｍ１３アンチセンス分子（ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ）の作製のための概略図を示す。
【００３９】
図２は、ＴＮＦ−αインサートのアンチセンス特性を確認するための、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの塩基配列分析を示す。
【００４０】
図３Ａは、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳを種々の酵素を用いて処理した結果を示す。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは一本鎖であることが確認された。レーン１：ＴＮＦα−ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡ（ＴＮＦα−プラスミド）；レーン２：ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ；レーン３：ＸｈｏＩで消化されたＴＮＦα−プラスミド；レーン４：ＸｈｏＩで消化されたＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ；レーン５：Ｓ１ヌクレアーゼで消化されたＴＮＦα−プラスミド；レーン６：Ｓ１ヌクレアーゼで消化されたＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ；レーン７：ＸｈｏＩおよびエキソヌクレアーゼＩＩＩで消化されたＴＮＦα−プラスミド；並びにレーン８：ＸｈｏＩおよびエキソヌクレアーゼＩＩＩで消化されたＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ。
【００４１】
図３Ｂは、ヌクレアーゼに対するＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの安定性を示す。レーン１：ＴＮＦα−プラスミド；レーン２：ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ；レーン３：ＴＮＦα−プラスミド＋ＦＢＳ；レーン４：ＸｈｏＩで消化されたＴＮＦα−プラスミド＋ＦＢＳ；レーン５：ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ＋ＦＢＳ；レーン６：ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳおよびリポソーム複合体＋ＦＢＳ；レーン７：ＴＮＦα−プラスミド＋子牛血清；レーン８：ＸｈｏＩで消化されたＴＮＦα−プラスミド＋ＦＢＳ；レーン９：ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ＋子牛血清；レーン１０：ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳおよびリポソーム複合体＋子牛血清。
【００４２】
図４Ａは、ＴＮＦα−特異的プライマーペアおよびβ−アクチン特異的プライマーペアを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ラットＴＮＦ−αの発現は、本発明のＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳを用いて特異的に阻害された。レーン１：リポソーム；レーン２：ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ；レーン３：ＴＮＦα−Ｍ１３センス；およびレーン４：ラットＴＮＦ−αｃＤＮＡを持たない一本鎖ファージゲノムＤＮＡ。
【００４３】
図４Ｂは、ＩＬ−１βおよびＧＡＰＤＨの転写産物をＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳがラットＴＮＦ−αの発現を特異的に阻害していることを確認した結果を示す。レーン１：リポソーム；レーン２：ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ；レーン３：ＴＮＦα−Ｍ１３センス；およびレーン４：ラットＴＮＦ−αｃＤＮＡを持たない一本鎖ファージゲノムＤＮＡ。
【００４４】
図４Ｃは、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳがラットＴＮＦ−αの発現を特異的に阻害していることを確認した、ラットＴＮＦ−α特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いたサザンブロットのデータを示す。レーン１：リポソーム；レーン２：ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ；レーン３：ＴＮＦα−Ｍ１３センス；およびレーン４：ラットＴＮＦα−ｃＤＮＡを持たない一本鎖ファージゲノムＤＮＡ。
【００４５】
図５は、細胞から分泌されたラットＴＮＦ−αタンパク質の量を測定するＥＬＩＳＡ分析のデータを示す。このデータは、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの投与に応答して、ラットＴＮＦ−αタンパク質の発現が減少したことを示している。レーン１：リポソーム；レーン２：ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ；およびレーン３：ＴＮＦα−Ｍ１３ＳＳ。
【００４６】
図６Ａは、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳの投与に応答して、内生のＮＦ−κＢの発現が減少したことを確認したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【００４７】
図６Ｂは、ＮＦ−κＢ特異的プローブを用いたサザンブロットの結果を示す。このデータから、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳの投与に応答して、ヒトＮＦ−κＢの発現が減少したことが確認された。
【００４８】
図７は、ユニジーンアンチセンスライブラリーを特定の疾患の細胞に適用する、機能的ゲノミクスのための高スループットシステムの概略図を示す。
【００４９】
図８は、ユニジーンアンチセンスライブラリーから選択された大環状アンチセンス化合物（ＬＣ−アンチセンス化合物）を有するマクロアレイアセンブリを、種々の細胞タイプに適用する、機能的ゲノミクスのための高スループットシステムの概略図を示す。
【００５０】
図９は、ユニジーンアンチセンスライブラリーを用いた遺伝子の機能化の概略図を示す。
【００５１】
図１０は、アンピシリンを含有する選択培地上で増殖した形質転換体を示す。ＬＣ−アンチセンス化合物を製造する前に、ユニジーンｃＤＮＡインサートを有する組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）ファージミドを、塩化カルシウム法によりコンピテント細菌細胞中に導入した。
【００５２】
図１１は、細菌形質転換体からの組換えファージミドの大規模精製の例を示す。
【００５３】
図１２は、インサートの長さの確認を示す。ユニジーンｃＤＮＡのサブクローニングに用いられた制限酵素を用いて、精製された組換えファージミドを消化し、１％アガロースゲル上で電気泳動した。
【００５４】
図１３は、ＬＣ−アンチセンス化合物を有するユニジーンアンチセンスライブラリーの迅速な構築を示す。
【００５５】
図１４Ａおよび１４Ｂは、ユニジーンアンチセンスライブラリーを用いた大規模な遺伝子の機能化を示す。９６ウェルプレート中で、ＬＣ−アンチセンス化合物−キャリアー複合体を肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）にトランスフェクションさせた。細胞増殖における変化を確認するために、ＭＴＴ還元分析を行った。図１４Ａは、ＭＴＴ試薬を含有する９６ウェルプレートを示す。図１４Ｂは、ＬＣ−アンチセンス化合物で処理された細胞の増殖阻害の百分率を算出することによる、肝癌に関連する遺伝子のスクリーニングの結果を示す。
【００５６】
図１５Ａおよび１５Ｂは、ユニジーンアンチセンスライブラリーを用いた大規模な遺伝子の機能化を示す。９６ウェルプレート中で、ＬＣ−アンチセンス化合物−キャリアー複合体を肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１２９９）にトランスフェクションさせた。細胞増殖における変化を確認するために、ＭＴＴ還元分析を行った。図１４Ａは、ＭＴＴ試薬を含有する９６ウェルプレートを示す。図１４Ｂは、ＬＣ−アンチセンス化合物で処理された細胞の増殖阻害の百分率を算出することによる、肝癌に関連する遺伝子のスクリーニングの結果を示す。
【００５７】
図１６Ａ−１６Ｄは、ユニジーンアンチセンスライブラリーからのクローンを用いて、ＨｅｐＧ２細胞株上で行われた遺伝子の機能化の例を示す。ＨｅｐＧ２の細胞増殖の測定は、光学顕微鏡検査（図１６Ａおよび１６Ｄ）、ＭＴＴ分析（図１６Ｂ）および［３Ｈ］−チミジン取込み分析（図１６Ｄ）により行われた。
【００５８】
図１７Ａ−１７Ｄは、ユニジーンアンチセンスライブラリーからのクローンを用いて、ＨｅｐＧ２細胞株上で行われた遺伝子の機能化の例を示す。ＨｅｐＧ２の細胞増殖の測定は、光学顕微鏡検査（図１７Ａおよび１７Ｄ）、ＭＴＴ分析（図１７Ｂ）および［３Ｈ］−チミジン取込み分析（図１７Ｄ）により行われた。
【００５９】
図１８Ａ−１８Ｄは、ユニジーンアンチセンスライブラリーからのクローンを用いて、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞株上で行われた遺伝子の機能化の例を示す。ＮＣＩ−Ｈ１２９９の細胞増殖の測定は、光学顕微鏡検査（図１８Ａおよび１８Ｄ）、ＭＴＴ分析（図１８Ｂ）および［３Ｈ］−チミジン取込み分析（図１８Ｄ）により行われた。
【００６０】
図１９Ａ−１９Ｄは、ユニジーンアンチセンスライブラリーからのクローンを用いて、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞株上で行われた遺伝子の機能化の例を示す。ＮＣＩ−Ｈ１２９９の細胞増殖の測定は、光学顕微鏡検査（図１９Ａおよび１９Ｄ）、ＭＴＴ分析（図１９Ｂ）および［３Ｈ］−チミジン取込み分析（図１９Ｄ）により行われた。
【００６１】
図２０は、種々の癌細胞に対するＬＣ−アンチセンス化合物のアンチセンス活性プロファイルの例を示す。前記ＬＣ−アンチセンス化合物を、異なる癌細胞株、Ｈｅｐ３Ｂ（肝癌）、ＮＣＩ−Ｈ１２９９（非肺小細胞癌）、ＡＧＳ（胃癌）およびＨＴ−２９（結腸癌）にトランスフェクションさせた。マクロアレイアセンブリ上でのＭＴＴ分析により細胞増殖を測定し、データを比較した。
【００６２】
発明の詳細な説明
本発明は、標的特異的アンチセンス領域を有する大環状ファージゲノム分子は遺伝子発現の有効な除去剤として有用であり、標的遺伝子の機能を決定するために用いられうるという発見に基づいている。本発明のシステムは、細胞の種々の生理的過程に関与している遺伝子を同定するための高スループット式の大規模な機能的ゲノミクスプロトコルにおいて用いられうる。
【００６３】
本願はある特定のヒト疾患状態に関連する機能的ゲノミクス分析のためのユニジーンライブラリーの利用について説明するが、前記ユニジーンライブラリーは、特定の表現型を調節する遺伝子を発見することを目的とする限り、任意の生物より得られ、そして任意の生物において利用されうるということは理解される。このような生物には細菌の細胞、菌類の細胞、植物の細胞または動物の細胞が含まれ、そして分析が望まれる表現型は、既知のまたは未知の表現型であってもよい。
【００６４】
特に、本発明は、組換えバクテリオファージゲノム由来のＬＣ−アンチセンス化合物、およびその製造方法を提供する。本発明はまた、バクテリオファージゲノムアンチセンスベクターを用いて構築されうる、ユニジーンアンチセンスライブラリーを提供する。さらに、本発明は、前記アンチセンスライブラリーを用いた機能的ゲノミクスのための高スループットシステムを提供する。
【００６５】
本願において、「ａ」および「ａｎ」は、単数および複数の物の双方を表すために用いられる。
【００６６】
ここで用いられるように、「アンチセンス」の語は、アンチセンス核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）およびその類似体を意味し、標的配列のヌクレオチド塩基との水素結合相互作用を介して、ポリヌクレオチド標的配列または配列部分を認識する、ある範囲のヌクレオチド塩基配列を有する、ある範囲の化学種をいう。前記標的配列は、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、または一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡのいずれであってもよい。
【００６７】
このようなＲＮＡまたはＤＮＡ類似体は、２’−Ｏ−アルキル糖修飾、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホルムアセタール、３’−チオホルムアセタール、スルホン、スルファメート、およびニトロキシド骨格修飾、アミド、並びに塩基部分が修飾された類似体を含むがこれに制限されない。さらに、分子の類似体は、糖部分が他の適切な部分により修飾または置換された高分子であってもよく、かかる高分子は結果として、モルフォリノ類似体およびペプチド核酸（ＰＮＡ）類似体を含むがこれに制限されない。このような類似体は、リボヌクレアーゼを介する標的ＲＮＡの除去、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性およびまたは標的特異性を改善するための、結合基および／または糖または塩基の構造的修飾を伴う上記の修飾の種々の組み合わせを含む。
【００６８】
ここで用いられているように、「アンチセンス療法」は総称であり、インビトロまたはインビボにおいて好ましくない標的ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基配列と相互作用するための、標的遺伝子に対するアンチセンスセグメントを有する大環状アンチセンス分子の特異的結合を含む。
【００６９】
ここで用いられているように、「細胞増殖（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」とは、細胞の分裂をいう。ここで用いられる「増殖（ｇｒｏｗｔｈ）」の語は、細胞分裂の加速、およびアポトーシス、すなわち細胞死の速度の低下による細胞数の増加の双方を含む。制御されない細胞増殖は、癌性のまたは異常な細胞型に対するマーカーとなる。正常な、非癌性の細胞は、個々の細胞型に特徴的な頻度で規則的に分裂する。ある細胞が癌性の状態に転換すると、細胞は抑えきれずに分裂し増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｓ）する。増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）または増殖（ｇｒｏｗｔｈ）を阻害することにより、細胞の制御不能な分裂が調節される。
【００７０】
ここで用いられるように、「キメラ性大環状アンチセンス分子」とは、多数の標的遺伝子と実質的に相補的な多数のアンチセンスヌクレオチドセグメントを有する大環状核酸分子をいう。前記アンチセンスヌクレオチドセグメントは、直接的に、または各セグメント間にスペーサーを用いることにより間接的に、相互に連結または結合していてもよい。
【００７１】
ここで用いられるように、「コンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）」または「コンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ）」とは、ＬＣ−アンチセンス分子ライブラリーの各メンバークローンの物理的な描写（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ）をいう。物理的な描写は、マルチウェルプレート中のようなウェルの形状であってもよい。一般的には、９６ウェルプレートまたは９６ディープウェルプレートが用いられる。平らなシートまたは膜上への個々のスポッティングのように、他の物理的なバリアは空気であってもよい。コンパートメント化によれば、各クローンメンバーは互いに分離されることになると理解される。他のバリアとしては、個々のクローンを膜状の金属中に封入することによるものなどでもよい。
【００７２】
ここで用いられるように、「繊維状ファージ」は、本発明の大環状アンチセンス分子を製造するための媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）である。ファージまたはファージミドが用いられうる。この例においては、所望の塩基配列が前記媒体中に挿入またはクローニングされ、ファージまたはファージミドにより一本鎖が生成すると、大環状アンチセンス分子が生成する。この目的には、ＤＮＡまたはＲＮＡバクテリオファージが用いられうる。特に、繊維状バクテリオファージが用いられうる。Ｍ１３、ｆｄおよびｆ１のような繊維状ファージは、環状の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子を含む繊維状カプシドを有する。前記繊維状ファージのライフサイクルは、カプシド化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）の前に一本鎖ＤＮＡに変換された細胞内での二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中間体の複製型に関係する。この変換により、ｓｓＤＮＡを調製する手段が提供される。バクテリオファージＭ１３が、クローニングベクターとしての使用のために適用されている。
【００７３】
ファージミドベクターはまた、繊維状ファージｆ１Ｏｒｉ領域を有する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）、ｐＧＥＭ−ｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）、Ｍｌ３ｍｐ、ｐＣＲ２．１、ｐＧＬ２、ｐβｇａｌおよびｐＳＰＯＲＴベクター並びにこれらの誘導体が用いられうる。優先的には、Ｍ１３バクテリオファージ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）またはＫＳ（−）のファージミドベクターが用いられうる。Ｍ１３バクテリオファージに基づく組換えウイルスベクターを用いる利点は、前記ベクターは多様なサイズのアンチセンスインサートを収容しうるという点である。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）ファージミドベクターは、ｆ１（−）起源（ｏｒｉｇｉｎ）を有しているため、標的ヌクレオチド配列のアンチセンス型、並びにベクター由来の遺伝子、例えば、アンピシリン耐性遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子、を含む全ヌクレオチド配列が一本鎖の形状で発現する。
【００７４】
一本鎖環状ゲノムを有し、二十面体の形状を有する別のバクテリオファージとしては、ΦＸ１７４がある。しかしながら、このクローニングベクターはインサートサイズの点で限界がある。
【００７５】
ここで用いられるように、「機能的ゲノミクス」または「大規模機能的ゲノミクス」とは、遺伝子の機能を実験的に決定し同定する、遺伝子工学における科学の研究分野および有用性をいう。この過程が迅速に、平行して、そして大量に実施されれば、その過程は「高スループット（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）」または「大規模（ｍａｓｓｉｖｅ）」機能的ゲノミクスと称されうる。
【００７６】
ここで用いられるように、「遺伝子」とは、遺伝子の完全なヌクレオチド配列または遺伝子の配列の一部をいう。
【００７７】
ここで用いられるように、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」および「減少させる（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」の語は、遺伝子発現もしくは細胞増殖または他の表現型の特性を低下させることを示すために、ほぼ同じ意味で用いられうる。
【００７８】
ここで用いられるように、「ファージゲノムアンチセンス分子」、または時に「大環状核酸分子」とも称される「大環状アンチセンス分子（ＬＣ−アンチセンス分子）」は、一本鎖分子であり、標的遺伝子またはＲＮＡ配列と実質的に相補的で、前記配列に結合する少なくとも１つのアンチセンス領域を含み、前記領域は、前記遺伝子の、また時にはそのアイソフォームの発現を阻害しまたは減少させる。前記環状一本鎖核酸分子は、標的遺伝子の配列がアンチセンス型である限り、１つのまたはいくつかの遺伝子に対するセンス配列またはアンチセンス配列を含有してもよい。
【００７９】
大環状核酸分子は、化学的な方法により合成されてもよい。一般的には、前記大環状核酸分子は繊維状ファージシステムにより製造され、前記システム由来のＭ１３およびファージミドを含む。前記大環状核酸分子がファージから生成する場合には、「ファージゲノムアンチセンス化合物」とも称される。
【００８０】
ある意味では、前記大環状核酸分子は、約２０から３０ヌクレオチド長の典型的なオリゴヌクレオチド配列よりも長い。逆に、前記大環状核酸分子は少なくとも３，０００のヌクレオチド長であってもよい。通常は、その範囲は約３，０００から約８，０００のヌクレオチド長でもよい。本発明においては約３，０００から約７，０００の長さが有用であるが、好ましい長さの範囲は、約３，３００から約６，０００塩基でもよい。
【００８１】
あるいは、前記大環状核酸分子の長さについて絶対的な上限または下限を設ける必要がないということは理解される。前記大環状核酸分子を製造するためにファージが用いられる場合に特に当てはまり、この際には、ファージのサイズ、および標的遺伝子の少なくとも一部をコードするインサートのサイズにより、製造される一本鎖核酸の長さが調節されうる。よって、一実施態様においては、前記核酸分子は繊維状ファージのようなファージが収容しうる程度の長さであってもよい。
【００８２】
前記大環状核酸分子は、特異的アンチセンス配列に加えて、外来の配列を含有してもよい。外来の配列としては、種々の他の遺伝子のセンス型またはアンチセンス型を含む。あるいは、前記核酸分子を製造するためにファージが用いられる場合には、前記外来の配列はベクター配列であってもよい。前記大環状核酸分子の標的特異的アンチセンス領域の長さは、特に制限されず、約５０ヌクレオチドよりわずかに短い長さから、約５，０００塩基を超える長さまででありうる。通常は、この範囲は約２００から約３，０００ヌクレオチドでありうる。特には、前記範囲は、約４００から約２，０００でありうる。前記特異的アンチセンス領域はまた、遺伝子全体と相補的であってもよい。
【００８３】
他の実施態様において、前記アンチセンス分子は、バクテリオファージの自然のライフサイクルの一部として、前記バクテリオファージのゲノムから製造されてもよい。
【００８４】
ここで用いられるように、「マクロアレイ」または「マイクロアレイ」とは、ＬＣ−アンチセンス化合物の選択された１セットをいい、異なる型の細胞または細胞株におけるアンチセンス分子の機能プロファイルを調べるために用いられうる。
【００８５】
ここで用いられるように、「遺伝子」とは、遺伝子の完全なヌクレオチド配列、または遺伝子の配列の一部をいう。
【００８６】
ここで用いられるように、「実質的に相補的である」とは、標的ＲＮＡに対して相補的で特異的に結合するアンチセンス化合物と少なくとも約７０％、または好ましくは、約８０％の相同性を有するアンチセンス配列を意味する。一般的な問題として、完全な相同性は必要とはされない。標的核酸と安定な二量体または三量体を形成するのに充分な相同性を有するアンチセンス分子であれば、適切であると考えられる。安定な二量体の形成は、ハイブリダイズするアンチセンス分子の配列および長さ、並びにアンチセンス分子と標的配列との間の相同性の程度に依存する。
【００８７】
ここで用いられるように、「標的」または「ターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」とは、アンチセンス分子がその遺伝子に対して作製された、特定の個々の遺伝子をいう。本発明のある実施態様においては、前記アンチセンス分子は、ＬＣ−アンチセンス化合物中のインサートから作製される。ある文脈においては、「ターゲティング」は、標的遺伝子の発現を抑えるために、内生的に発現している転写産物にアンチセンス分子を結合させること、または内生的に発現している転写産物をアンチセンス分子に結合させることを意味する。標的ヌクレオチド配列は、免疫疾患、感染症、代謝疾患および遺伝的疾患、または遺伝子の異常発現により生じる他の疾患のような種々の疾患の発生および進行に関与する遺伝子を含む、種々の悪性疾患（ｍａｒｉｇｎａｎｃｉｅｓ）に関与する遺伝子から選択されうる。
【００８８】
ここで用いられるように、「ユニジーン」アンチセンスライブラリーとは、必要であればアンチセンス核酸生成ベクター中に挿入された、配列の確認された核酸断片の集合をいう。
【００８９】
大環状（ＬＣ）アンチセンス化合物
本発明は、ヌクレアーゼに対する安定性および特異性の向上したＬＣ−アンチセンス化合物を提供する。本発明はまた、一本鎖環状ゲノムを有する組換えバクテリオファージを用いることによる、前記ＬＣ−アンチセンス化合物の製造方法を指向している。さらに、本発明のある実施形態においては、本発明のファージゲノムアンチセンス法を用いることにより、大規模な機能的ゲノミクスに用いられる場合には、従来のＡＳ−オリゴ法と比較してシステムの効率が数百倍優れている。さらに、ＤＮＡチップ、遺伝子発現の経時分析（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＳＡＧＥ）、およびＴＩＧＲ定向進化遺伝子アラインメント（ＴＩＧＲ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（ＴＯＧＡ）データベースプロテオミクスのような他の間接的なシステムを用いるのではなく、本発明のファージゲノムアンチセンスシステムを用いる大規模な機能的ゲノミクスは、直接的な遺伝子の機能化システムを利用する。
【００９０】
本発明のＬＣ−アンチセンス化合物は、１）標的ヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡ断片を調製すること；２）前記ｃＤＮＡ断片を、ＬＣ−アンチセンス化合物を製造しうるファージミドベクターにクローニングすることにより組換えファージを調製すること；および３）標的アンチセンス配列を有する一本鎖環状ファージゲノムを大量に製造すること、により作製されうる。
【００９１】
前記ＬＣ−アンチセンス化合物は、標的配列または全遺伝子配列の断片を含んでもよいということは理解される。また、複数の異なる遺伝子に対するいくつかの標的アンチセンス配列が１つの一本鎖ファージゲノム中に挿入されてもよいということも考えられる。
【００９２】
ＬＣ−アンチセンス化合物は、細菌細胞中のＤＮＡポリメラーゼにより複製されるため、高度の複製忠実度を有する。ＤＮＡポリメラーゼは校正能を有していることから、ＬＣ−アンチセンス化合物の忠実度は化学的に合成されたＡＳ−オリゴよりも高い。さらに、本発明のＬＣ−アンチセンス化合物は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドよりも安価に作製される。高品質のＡＳ−オリゴの合成には高いコストが必要であることが、前臨床および臨床試験における障害であると考えられている。
【００９３】
ＬＣ−アンチセンス化合物は、ヌクレアーゼによる分解に対して安定であり、そして標的特異的である。一方、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドが細胞中に導入されると、血液凝固の遅延または補体の活性化反応に加えて、突然変異が誘発される。さらに、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドが最終的に分解すると、ＤＮＡの複製機構または修復機構を介して、それぞれのヌクレオチドがゲノムＤＮＡ中にリサイクルされる。化学的に修飾されたヌクレオチドがゲノムＤＮＡ中に取り込まれると、突然変異が発生しやすくなる。
【００９４】
ＬＣ−アンチセンス化合物がなぜこれらの有利な特性を有するかについては、特定の理論にとらわれることはなく、本発明のＬＣ−アンチセンス化合物のような大きな標的特異的なアンチセンス配列が用いられると、標的ｍＲＮＡに沿っての開放部位（ｏｐｅｎ  ｓｉｔｅ）の探索が容易に行われると考えられる。
【００９５】
本発明の実施例においては、ＴＮＦ−αおよびＮＦ−κＢに対するＬＣ−アンチセンス化合物が調製された。これらのＬＣ−アンチセンス化合物はそれぞれ、約３．７ｋｂのサイズを有し、ヌクレアーゼによる分解に対して安定であった。ＴＮＦ−α特異的インサートは７０８ｂｐであり、ＴＮＦ−α遺伝子の発現を除去するのに有効であった。ＮＦ−κＢ特異的インサートは７００ｂｐであり、これもまたＮＦ−κＢ遺伝子の発現を除去するのに有効であった。これにより、有効な標的部位を決定するために慎重でかつ困難な過程を必要とする、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを用いることに対して著しく有利であることが示される。よって、前記ＬＣ−アンチセンス化合物は使用が容易であり、これにより、有効な標的部位を探索するのにかかる時間および労力が削減される。
【００９６】
さらに、ＬＣ−アンチセンス化合物は充分に長い配列を有していることから、リポソームを介したＬＣ−アンチセンス化合物の送達効率はプラスミドの送達効率に近く、これが優れたアンチセンス活性に貢献している。ＬＣ−アンチセンス化合物リポソーム複合体の細胞への取り込み速度は、オリゴヌクレオチドの取り込み速度よりも優れていた。
【００９７】
ＬＣ−アンチセンス化合物は、一般的に、アンチセンス配列、並びに、アンチセンス型またはセンス型の、アンピシリン耐性遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）のような、ベクターにコードされる遺伝子のヌクレオチド配列を有している。しかしながら、ＬＣ−アンチセンス化合物は、重大な程度の遺伝子発現の非特異的な阻害を引き起こすことはない。一方、化学的に修飾された合成オリゴヌクレオチドは、非特異的阻害に関連する重大な問題を引き起こす。
【００９８】
アンチセンス分子のサイズに関しては、アンチセンス研究の分野における従来の知見によれば、長いアンチセンス分子を用いることは否定されてきた。なぜなら、より長いＡＳ−オリゴはより特異性が劣り、合成がより困難で、細胞取込みの効率が低下すると考えられていたためである。実際、ホスホロチオエート修飾オリゴのような化学的に修飾された第２世代のＡＳ−オリゴでは、ＡＳ−オリゴの長さが伸長するにつれて配列特異性を失う。さらに、オリゴヌクレオチドがより長い配列に伸長するにつれて、線状ＡＳ−オリゴの合成は徐々に困難になり、ＡＳ−オリゴの長さが増加するにつれて、配列の忠実度も著しく低下する。しかしながら、この知見に反して、アンチセンス活性はアンチセンス配列の長さに依存することを本出願人は見出した。仮にアンチセンス配列の長さが減少すると、アンチセンス活性も低下する。よって、ＬＣ−アンチセンス化合物は、配列特異性、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性を示し、毒性を示さない。
【００９９】
ファージゲノムアンチセンス分子に関連するさらなる利点は、配列の多様性に対して広く寛容であることである。本発明のゲノムアンチセンス分子は、連続する約１５超のヌクレオチドを有する相同配列の断片が異なる遺伝子変異体間で保存されている限り、有効でありうる。この特性は、変異型に対して同一のアンチセンス分子が用いられうる、ＨＩＶおよびＨＢＶのような病原体ウイルスの多型性株のターゲティングにおいて、特に有用である。さらに、ヒトのような１つの種から生成したこのタイプのファージゲノムアンチセンス分子は、源の動物と標的の動物との間の配列の相違がコード領域中にまで広がっていない限り、齧歯動物のような他の種における遺伝子の機能を調べるために用いられうる。
【０１００】
ＬＣ−アンチセンス化合物の非常に有利な特徴のいくつかは、以下の通りである：
１．ＬＣ−アンチセンス化合物は、アンチセンス活性が改善されている。一般に、本発明の実施例としてのみ表されている特定の量に制限されることはなく、約１×１０５個の細胞に０．１μｇのアンチセンス化合物を投与すれば、標的転写産物は完全に除去される。さらに、前記アンチセンス配列は、前記転写産物の全体の長さの５分の１未満の長さであってもよい。ＬＣ−アンチセンス分子はまた、投与されるアンチセンス化合物の量に対して高いアンチセンス活性をも有する。
【０１０１】
２．ＬＣ−アンチセンス化合物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌形質転換体から、迅速に、性格に、そして低コストで大規模に製造されうる。
【０１０２】
３．アンチセンス化合物−キャリアー複合体は、細胞に容易に吸収される。
【０１０３】
４．ＬＣ−アンチセンス化合物は、血清中のヌクレアーゼに対して安定であり、リポソームと安定な複合体を形成しうる。
【０１０４】
５．ＬＣ−アンチセンス化合物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞中のＤＮＡポリメラーゼにより複製される。
【０１０５】
６．複数の標的ｍＲＮＡの除去が可能である。キメラ性ＬＣ−アンチセンス化合物は、単一のベクター中に複数の標的特異的アンチセンス配列を含有しうる。各アンチセンス配列の長さは、通常は化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドよりもずっと長くてもよい。いくつかの異なるアンチセンス配列が直列に配置されてもよい。したがって、いくつかの異なる遺伝子の複数のタイプの転写産物を標的とすることも可能である。この特性は、複数の遺伝子が異常に発現している進行型の癌のような、不治の疾患の複数の遺伝子の発現を抑えるのに有用である。
【０１０６】
７．ＬＣ−アンチセンス化合物が示す毒性は低い。ＬＣ−アンチセンス化合物は天然に存在するのと同一の塩基組成からなるため、化学的に修飾されたＡＳ−オリゴと比較して、非特異性および好ましくない毒性効果が減少している。
【０１０７】
８．ランダム遺伝子またはユニジーン一方向性アンチセンスライブラリーは構築される。複数の異なるクローンを有するアンチセンスライブラリーの構築は、容易にかつ迅速に行われうる。特定の疾患に対して特異的なランダム遺伝子一方向性アンチセンスライブラリーは、罹患した細胞または組織を用いることにより容易に構築されうる。ランダム遺伝子アンチセンスライブラリーは、ＤＮＡ配列が個別には確認されていない疾患特異的遺伝子に対するアンチセンスを含むことができ、よって部分的に余分な場合がある。すなわち、ライブラリー中に重複した化合物が存在しうる。一方、前記ユニジーン一方向性アンチセンスライブラリーは、任意の生物に属する、配列の確認された多数の遺伝子を含みうる。前記ユニジーン一方向性ライブラリーは、そのメンバーアンチセンス化合物を余らせることなく構築されうる。前記ユニジーンライブラリーの各メンバーは、アンチセンス化合物生成ベクター中に個別にクローニングされうる。これらのアンチセンスライブラリーは、特定の細胞タイプにおける遺伝子発現のノックダウンにより、大規模な遺伝子の機能化を効率よく行うために用いられうる、数千万のクローニングされた遺伝子を含みうる。
【０１０８】
ユニジーン一方向性アンチセンスライブラリー
本発明は、ファージゲノムを用いて、ユニジーン一方向性アンチセンスライブラリーを構築するための方法を提供する。前記アンチセンスライブラリーを構築するためには、配列の確認された「ユニジーン」ｃＤＮＡが用いられうる。
【０１０９】
前記ユニジーンライブラリー用のｃＤＮＡは、まず遺伝子をＲＴ−ＰＣＲ法を用いてクローニングすることにより得られうる。ある場合には、前記ｃＤＮＡは商業的に入手しうる。前記ユニジーンの標的ヌクレオチド配列は、遺伝子の異常な発現により生じる、種々の悪性腫瘍（ｍａｒｉｇｎａｎｃｉｅｓ）、免疫疾患の開始および進行、感染症、代謝疾患および遺伝病に関与する遺伝子から選択されうる。例えば、ＴＮＦ−α、ＮＦ−κＢ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｋ−ｒａｓ、ｒａｆ、ＣＤ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリンＥ、ＴＧＦ−β、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓのｃＤＮＡが、これらの候補遺伝子のいくつかである。
【０１１０】
ある実施態様においては、特定のファージシステムを用いることに制限されず、ＬＣ−アンチセンス化合物が組換えバクテリオファージを含む細菌培養により大規模に製造される。この目的のために、本発明者はｃＤＮＡ断片をＭ１３ファージミドのマルチクローニングサイトにクローニングした。次いでコンピテント細菌細胞にヘルパーファージを感染させ、ＬＣ−アンチセンス化合物をレスキューした。
【０１１１】
ユニジーンアンチセンスライブラリーを構築するための代表的な方法は以下の通りであるが、特定の実施態様および例示によっては本発明はどのようにも限定されないということは理解されるべきである。
【０１１２】
（１）関心のある細胞、特に疾患に関連する細胞株または組織からＲＮＡを調製する；
（２）テンプレートとしてＲＮＡを用い、逆転写により第一の鎖および第二の鎖のｃＤＮＡを合成する。第二の鎖のｃＤＮＡは、第一の鎖のｃＤＮＡから合成される。第一の鎖のｃＤＮＡは、制限酵素部位（ＸｈｏＩ）を有するオリゴ−ｄＴプライマーを用いて、精製されたポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡから逆転写される；
（３）ｃＤＮＡ断片をファージミドベクターにクローニングすることにより、組換えＭ１３バクテリオファージを調製する。制限酵素部位（ＥｃｏＲＩ）を導入するために、合成されたｃＤＮＡの末端領域にＥｃｏＲＩアダプターを連結する。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いて消化することにより、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片を作製する。ｃＤＮＡ断片を脱リン酸化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）ベクターにクローニングすることにより、組換えファージを調製する。実験上の必要に応じて、繊維状ファージのＦ１複製起源を有するファージミドベクターをｃＤＮＡクローニングのために用いる。かかるベクターとしては、ｐＵＣ、Ｍ１３ｍｐ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＣＲ２．１、ｐＧＥＭ−ｆ、ｐＧＬ−２、ｐβｇａｌ、ｐＳＰＯＲＴ、およびこれらの誘導体が挙げられる；
（４）前記組換えＭ１３ファージミドをコンピテント細菌細胞に導入することにより、細菌形質転換体を調製する。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、およびＸｌ−１０ＧＯＬＤ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような細菌細胞が用いられうる。コンピテント細胞は、塩化カルシウムを用いた処理により作製されうる。
【０１１３】
（５）前記形質転換体にヘルパーファージを重感染させることにより、ランダム遺伝子一方向性アンチセンスライブラリーを構築し、それによりＬＣ−アンチセンス化合物を大規模に製造する（図９）。Ｆ１（＋）またはＦ１（−）起源を有する全てのファージミドベクターがアンチセンス化合物を製造しうる。本発明において用いられるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）ファージミドは、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩにより切断されるクローニング部位にｃＤＮＡ断片を一方向にクローニングすることにより、ＬＣ−アンチセンス化合物を製造しうる。
【０１１４】
大規模な機能的ゲノミクス
本発明はまた、上記で説明したユニジーンアンチセンスライブラリーを用いた機能的ゲノミクスのための高スループットシステムを提供する。本発明の機能的ゲノミクスシステムは、遺伝子の機能を迅速にかつ大規模に探索するために用いられうる。よって、前記アンチセンスライブラリーは、遺伝子の機能を分析するために用いられうるだけでなく、標的の確認するためや、異なる遺伝子産物間での相互作用を決定するためにも用いられうる。
【０１１５】
機能的ゲノミクスのためにファージゲノムライブラリーを用いる利点の一つは、予め発現のプロファイリングを行う必要がないということである。特定の疾患に重要な遺伝子を同定するためには、前記ユニジーンアンチセンスライブラリーが直接用いられうる。このことは、少なくとも一時的に、関連遺伝子の発現を標的特異的にノックダウンすることによって、特定の細胞タイプの表現型の変化の原因となる遺伝子を大規模にかつ並行して決定するために、一群のＬＣ−アンチセンス化合物が用いられうるということを意味している。
【０１１６】
前記ＬＣ−アンチセンスライブラリーは、機能的分析のために単一の細胞タイプに対して適用されうる。特定の数のＬＣ−アンチセンス分子がトランスフェクションにより選択される場合には、一群の異なるタイプの細胞が、比較による機能的プロファイリングのためのアンチセンス効果を検出するために用いられうる。
【０１１７】
大規模な機能的ゲノミクスの代表的なプロトコールは以下の通りであるが、特定の実施態様および例示によって本発明はどのようにも限定されず、段階は必ずしも記載された順序ではないということは理解されるべきである。
【０１１８】
（１）ファージゲノムアンチセンス化合物の大きな群（アンチセンスライブラリー）を調製し、前記アンチセンスライブラリーを用いてアンチセンスマクロアレイを形成する；
（２）マルチウェルプレートの各セットについて、あるタイプの所望の疾患細胞または細胞株を分割し、培養する；
（３）ファージゲノムアンチセンスライブラリーからＬＣ−アンチセンス化合物−キャリアー複合体を形成する；
（４）前記ＬＣ−アンチセンス化合物−キャリアー複合体を、マルチウェルプレート中の細胞にトランスフェクションし、一次の機能的分析を行う；および
（５）得られた結果に基づいて選択された遺伝子のさらなる機能的分析を行う。
【０１１９】
前記アンチセンスライブラリーのトランスフェクション用の細胞は、特に制限されないが、肝癌、肺癌、胃癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、膀胱癌、直腸癌、前立腺癌、皮膚癌のような種々のタイプの癌の細胞、並びに、肥満、禿頭症の毛嚢、自己免疫疾患および代謝障害の細胞を含む、所望の細胞から選択されうる。細胞は、その細胞の型および評価される特性に応じて、懸濁液または粘着性組成物としてウェルに播種される。
【０１２０】
前記ＬＣ−アンチセンス化合物を所望の細胞中に送達するためには、前記アンチセンス化合物をキャリアーを用いて複合体化してもよい。キャリアーに対する前記アンチセンス化合物の比は、用いられる細胞のタイプおよびアンチセンス化合物のタイプに応じて変化しうる。
【０１２１】
前記キャリアーは、これに制限されないが、リポソーム、カチオン性高分子、カチオン性高分子とウイルスベクターとで形成された複合体、ＨＶＪ−リポソーム、リポフェクトアミン類似体、プロナーゼ複合体、ペプチド、およびウイルスベクターでありうる。前記アンチセンス化合物は、単独でまたはキャリアー組成物との複合体として細胞中に送達されうる。前記ＬＣ−アンチセンス化合物−キャリアー複合体は、マルチウェルプレート中で細胞と混合され、ここで各ウェル中の前記ＬＣ−アンチセンス化合物は配列がそれぞれ異なる。よって、所望の特定の遺伝子が標的化される。
【０１２２】
上記で説明した機能的ゲノミクス法では、多くのタイプの疾患細胞または特に所望の細胞に適用される、選択されたＬＣ−アンチセンス化合物の所定のセットが用いられる。よって、前記アンチセンスマクロアレイアセンブリは、比較による決定的な機能的研究向けである（図８および２０）。有効な遺伝子療法のための遺伝子を発見する目的で、および、同一もしくは類似の細胞における、または異なる系統の細胞からの遺伝子の機能を比較することにより疾患細胞における遺伝子間の関係を調べる目的で、前記マクロアレイアセンブリは機能的な診断にも用いられうる。
【０１２３】
異なる遺伝子の機能化分析が行われうる。本発明の方法を行う際に、遺伝子の機能化分析のために従来の方法が用いられうる（図９）。その例として、一次の分析のパラメータをスコア付けする目的で、細胞の形態的観察、増殖パターン（増殖の促進または阻害）および細胞死が用いられる。
【０１２４】
さらに、本発明は、ファージゲノムアンチセンスライブラリーから選抜された限られた数のアンチセンス化合物を有するアンチセンスマクロアレイで処理された種々のタイプの細胞を用いて、大規模なスケールで遺伝子を特徴づけ、機能化するためのシステムを提供する。
【０１２５】
９６ウェルまたは３８４ウェルのプレートに所望の細胞を播種し、ＣＯ２インキュベーター中で１日間インキュベートして、ＬＣ−アンチセンス化合物−キャリアー複合体による処理の準備をする。トランスフェクションプロトコルにおいて９６ウェルプレートを用いる場合には、複合体を形成するための、リポソームに対するＬＣ−アンチセンス化合物の比は、１：３（ｗ／ｗ）、１：４（ｗ／ｗ）またはその他の、用いられる細胞またはリポソームに応じた、実験的に決定されうる適切な比であってもよい。本発明については、効率的なトランスフェクションのために、通常、前記の比は１：３（ｗ／ｗ）を採用した。
【０１２６】
トランスフェクションされた細胞におけるアンチセンス活性を調べるために、免疫学的分析用に細胞培養抽出液を便宜的に用いてもよい。また、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロッティング用のテンプレートとして用いられうるＲＮＡを調製するために、トランスフェクションされた細胞を用いてもよい。一次の機能的研究のその他の対象としては、細胞の形態、細胞死、増殖パターン、および基質応答性などの特性が挙げられる。これらの一次の機能的研究では、顕微鏡による観察を用いるのが一般的である。図９を参照のこと。
【０１２７】
一次の遺伝子機能化分析の結果に基づいて、一次の機能を確認するために、分子生物学、細胞生物学、免疫学、生化学、動物実験などの分野における技術を用いたさらなる分析を行う。これらの結果から、これらの遺伝子間における相互関係がより正確に理解されうる。
【０１２８】
特定の遺伝子につき、異なる分析法を用いた機能的ゲノミクス分析が行われうる。特に制限されないが、以下のアプローチが好ましく用いられうる：
（１）遺伝子発現に対するアンチセンス活性を、（ａ）ｍＲＮＡレベルを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ、（ｂ）タンパク質レベルを検出するためのウエスタンブロッティング、および（ｃ）酵素的反応または免疫学的反応についての他の分析法により測定する；
（２）細胞の増殖および分化を、ＭＴＴ分析、チミジンの取込み、および軟らかいアガロース上でのコロニー形成を用いて測定する。この測定は、ＤＮＡ複製またはクロマチンの活性化に関連する因子（例えば、ヒストンアセチラーゼ）の測定を含む；
（３）形態の変化、核の凝縮、ＤＮＡの断片化、アポトーシスの定量分析、アポトーシスに関する細胞間のシグナリングなどにより遺伝子の機能でスコア付けしうる、アポトーシス性細胞死を測定する；
（４）フローサイトメトリー分析、細胞サイクルの進行または停止に関与する因子の活性、および細胞サイクルに関与する因子間での複合体の形成によりスコア付けしうる、細胞サイクルの調節を測定する；
上記の方法の他にも、アンチセンス阻害技術を用いた機能的ゲノミクス分析のための方法としては、インビトロまたはインビボにおける、分子生物学的な、生化学的な、および生理学的な変化を用いた分析法が含まれる。
【０１２９】
ファージベクターにより、アンチセンス配列を高度な配列忠実度で有する長い一本鎖配列が容易に製造されうる。新規なアンチセンス分子は、従来知られていないくらい長くとも、標的ｍＲＮＡの発現を除去する際の配列特異性に優れている。アンチセンス核酸の挙動については、特定の理論または機構にとらわれることはなく、アンチセンス配列のごく一部がその相補的な配列に一旦結合すると、相補的な標的配列の全長にわたって二本鎖が形成される（ｚｉｐｓ）。そして、アンチセンスＤＮＡとセンスＲＮＡとの間に形成された長い二量体は、リボヌクレアーゼ活性の基質としてきわめて安定に維持される。
【０１３０】
本発明のアンチセンス分子による結合が有利である別の理由としては、構造的に露出している標的部位に長いアンチセンス分子が結合する機会が増加しうるということがあるかもしれない。メッセンジャーＲＮＡは、自己の配列中で、および細胞質中のＲＮＡ結合タンパク質とともに、強固な二次構造および三次構造を形成しやすい。アンチセンス活性を向上させるには、アンチセンス分子に対して開放された標的部位を発見することが重要である。ファージゲノムアンチセンス分子は、長さが長いために、露出された相補的な配列に接近しうる配列をいくつか有さざるをえず、これにより、標的ｍＲＮＡを除去する機会が向上する。
【０１３１】
アンチセンス分子療法
本発明のＬＣ−アンチセンス分子は、種々のタイプの癌、ウイルス感染、免疫障害、代謝障害、および疾患の開始および進行を阻害するために遺伝子発現の調節が有効でありうる他のヒト疾患に対する有効な治療剤である。
【０１３２】
本発明のアンチセンス分子の原理は、任意の所望の標的遺伝子に適用されうる。本発明のアンチセンス分子の例としてはＴＮＦ−αおよびＮＦ−κＢ特異的ＬＣ−アンチセンス化合物が開示されているが、本発明のアンチセンス分子は任意の所望の遺伝子に対して作製されうる。実際、本発明のＬＣ−アンチセンス化合物はヌクレアーゼに対して非常に安定であり、標的の除去に有効であった。例示されたＴＮＦ−αおよびＮＦ−κＢ標的遺伝子の配列特異的な減少により、アンチセンス分子療法の広範な利用性が確認される。よって、本発明のアンチセンス分子は、任意の源由来の内生的に発現しているどのような標的転写産物に対して結合させるためにも用いられうる。
【０１３３】
また、標的ｍＲＮＡの除去およびタンパク質の除去の双方の相関を確認するために、アンチセンス活性をタンパク質レベルにおいても調べた。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの投与により、細胞培養の培地中へのラットＴＮＦ−αの分泌の有意な減少がみられ、有効なアンチセンス活性が確認された。一方、コントロールファージゲノム化合物（アンチセンスインサートを有さない一本鎖環状分子）では、ＴＮＦ−α分泌において穏やかな減少を示すのみであった。コントロールアンチセンス分子の添加によるＴＮＦ−α分泌のわずかな減少は、エンドソーム内に蓄積された遊離のカチオン性リポソームの毒性により、部分的には説明されうる。カチオン性リポソームが単独で処理された細胞は、リポソーム−アンチセンス分子複合体で処理された細胞と比較して、生存能力が低かった。
【０１３４】
治療上の応用において、前記大環状核酸分子は、経口投与、局所投与または限局性投与を含む種々の投与方法用に調製されうる。技術や製剤は通常、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．の最新の版にみられうる。アンチセンス分子である活性成分は、通常、投与および剤形の性質および方法に応じて、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、錠剤分解剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）、界面活性剤、侵食性の高分子（ｅｒｏｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、または潤滑剤を含みうる添加剤の希釈剤のようなキャリアーと結合されうる。一般的な剤形としては、錠剤、懸濁剤、乳剤および液剤を含む液状製剤、細粒およびカプセルを含む。
【０１３５】
本発明の大環状核酸化合物の中には、従来の薬物送達条件下で約４時間まで、徐放性の形式で送達された場合には約１２時間までの間、薬剤が胃内の酸性条件にさらされる必要のある経口投与に特に適応しうるものもある。ある条件での治療には、これらのアンチセンス化合物を徐放型の形式で調製するのが有利な場合がある。
【０１３６】
大環状核酸分子の全身投与は、経粘膜的な手段もしくは経皮的な手段により、または、前記化合物を経口的に投与することにより達成されうる。経粘膜的な投与または経皮的な投与のためには、透過するバリアに適当な浸透剤が製剤中に用いられる。かかる浸透剤は、本技術分野においては公知であり、例えば、経粘膜的な投与のためには、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに、透過を促進させるために界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）が用いられうる。経粘膜的な投与は、例えば、鼻内スプレーや、吸入剤による投与に適当な製剤、または座薬を用いることにより行われうる。
【０１３７】
本発明の大環状核酸分子はまた、患者への投与のために製薬上許容しうるキャリアーと結合されうる。適当な製薬上許容しうるキャリアーとしては、これに特に制限されないがＮ−（１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、種々のカチオン性脂質がある。リポソームもまた、本発明のアンチセンス分子の適切なキャリアーである。別の適切なキャリアーとしては、特許請求の範囲に係るアンチセンス分子を含有する徐放性ゲルまたは高分子がある。
【０１３８】
前記大環状核酸分子は、静脈内注射、筋肉内注射、クモ膜下注射、鼻腔内注射、腹腔内注射、腫瘍内注射、皮下注射、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）注射および経口投与を含む任意の効果的な経路で患者に投与されうる。特許請求の範囲に係るアンチセンス分子およびその誘導体が消化管に沿って分解するのを保護するために、経口投与では腸溶コーティングが必要な場合がある。大環状核酸分子は、食塩水または他の適切な液体のような、ある量の生理学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤と混合されてもよい。また、前記核酸分子もしくはその誘導体がその標的に到達するまでに分解するのを保護するために、および／または前記アンチセンス分子もしくはその誘導体の組織のバリアを横切る移動を促進するために、前記アンチセンス分子を他のキャリアー手段と結合させてもよい。
【０１３９】
ある実施態様において、前記大環状核酸分子は、癌細胞または新生細胞の増殖を阻害するために有効な量が投与される。他の実施態様においては、前記アンチセンス分子は、これに制限されないが、疱疹、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＨＩＶ、天然痘、単球増加症（エプスタイン−バーウイルス）、肝炎、呼吸器系合胞ウイルス（ＲＳＶ）などのようなウイルス感染を治療するために用いられうる。さらに、これに制限されないが、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、原発性甲状腺機能低下症、ガラクトース血症、異常ヘモグロビン、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、肥満などのような代謝障害もまた標的である。本発明のアンチセンス分子は、これに制限されないが、シェーグレン症候群、抗リン脂質抗体症候群、免疫複合体疾患、紫斑病、シェーンライン−ヘノッホ、免疫不全症候群、全身性エリテマトーデス、免疫不全、リウマチなどのような疾患を含む免疫疾患のような、他の疾患を治療するために用いられうる。
【０１４０】
投与される特定の大環状核酸分子の実際の投与量は、疾患または感染の型および段階、体内の他の細胞に対するアンチセンス分子の毒性、細胞によるアンチセンス分子の取り込み速度、並びに核酸分子が投与される個体の体重および年齢のような因子に依存するだろう。患者についての有効量は、アンチセンス分子の用量を細胞増殖を阻害するのに有効でない量から有効量まで漸増させるような従来の方法によって確認されうる。疾患細胞にもたらされる濃度は約１０ｎＭから約３０μＭの範囲であり、遺伝子発現を阻害し、分析可能な表現型を示すには効果があるだろうと予想される。癌または他の兆候を治療するためのアンチセンス分子の化学療法への適用において、製剤学的／薬物動態学的パラメータを測定するための方法は、本技術分野において公知である。
【０１４１】
前記大環状核酸分子は、患者に対し、少なくとも所望の効果を示すのに充分な回数にわたって投与される。有効なレベルを維持するためには、前記アンチセンス核酸分子を一日に数回、毎日またはより広い間隔で投与することが必要な場合がある。癌細胞については、アンチセンス分子は、もはや癌細胞が検出されなくなるまで、もしくはさらなる治療により細胞数の有意な減少が見られないほど細胞数が減少するまで、または外科手術もしくは他の治療により処理しうる数まで癌細胞数が減少するまで投与される。前記アンチセンス分子が投与される時間の長さは、癌細胞による特定の分子の取り込み速度および細胞が前記分子に応答するのに必要な時間といった因子に依存するだろう。
【０１４２】
以下の実施例は本発明を例示する目的で提示されており、限定する目的ではない。
【実施例】
【０１４３】
実施例１−Ｍ１３バクテリオファージを用いたＬＣ−アンチセンス化合物の構築
Ｍ１３バクテリオファージ（ファージ）の環状ファージゲノムがアンチセンス配列をそのゲノムの一部として収容しうるかどうか、およびこれらの新規なアンチセンス分子が合成された型のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関連する問題を克服しうるかどうかを調べるために、実験を行った。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）ファージミド（Ｊｕｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  ２３，  ５３５−５３６  （１９９５））を用いてすでに形質転換している細菌細胞に、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させることによって、組換えＭ１３ファージを製造した。標的遺伝子に対するアンチセンス配列またはセンス配列を含有する一本鎖環状ファージゲノムを作製するためには、Ｆ１起源を利用した。ラットＴＮＦ−αをコードする遺伝子の場合には、アンチセンス配列を作成するために前記遺伝子の全ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）ベクターに挿入した（図１）。
【０１４４】
一本鎖ゲノムＤＮＡ中の前記アンチセンス配列は、Ｔ７配列決定プライマーを用いてＤＮＡの塩基配列を決定することにより確認した（図２）。ＴＮＦ−αアンチセンスインサートの５’および３’の双方のフランキング配列は、ファージミドベクターのフランキング配列であることが示された。前記インサート配列はＴＮＦ−αｍＲＮＡの配列と一致し、アンチセンス配列が存在することが確認された。ＴＮＦ−αおよびＮＦ−κＢに対するアンチセンス配列を含有する環状ファージゲノムは、それぞれＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳおよびＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳと名づけられた。
【０１４５】
１．ｍＲＮＡの誘導、並びにラットＴＮＦ−αおよびヒトＮＦ−κＢをコードする遺伝子のクローニング
ＷＲＴ７／Ｐ２細胞において、リポポリサッカライド（ＬＰＳ、３０ｇ／ｍｌ）を用いてラットＴＮＦ−αの発現を誘導した。４８−ウェルプレートの各ウェルに１×１０６細胞／ウェルの細胞を播種し、ＬＰＳを用いて４から２４時間処理した。所望の時点で細胞を回収し、ｍＲＮＡの量を調べた。さらなる実験のために、ＴＮＦ−α発現が最も高レベルに誘導されるＬＰＳインキュベーション時間を選択した。ラットＴＮＦ−α発現のレベルが最も高いのは、ＬＰＳ処理後６時間であると決定された。
【０１４６】
増幅された上記のｃＤＮＡ断片から、ラットＴＮＦ−αｃＤＮＡを得た。全コード領域を有するＴＮＦ−αのＲＴ−ＰＣＲ断片（７０８ｂｐ）を、ＰＣＲプライマーのペア：５’−ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＣＡＴＧＡＴＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および５−ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＡＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を用いて増幅した。ラットＴＮＦ−αｃＤＮＡ断片を、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）ベクターのマルチクローニングサイトにｌａｃＺ遺伝子と同一の向きにクローニングした（図１）。
【０１４７】
同様に、前記ＮＦ−κＢ遺伝子のｃＤＮＡ断片をＰＣＲプライマーのペアを用いて増幅し、ｐＢＳ−ＫＳ（＋）ベクターのＥｃｏＲＶ部位に末端を平滑化した後にクローニングした。増幅されたｃＤＮＡ断片は、常に制限酵素による消化およびＤＮＡ塩基配列決定の双方を用いて確認された。
【０１４８】
詳細には、ＤＮＡのリポソームに対する比が約１：４（ｗ／ｗ）でリポソームと複合体化されたＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳ、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＳＥまたはＭ１３ＳＳを用いてトランスフェクションされた、白血球性単球由来のＴＨＰ１細胞を培養した。リポフェクション１日後、ＰＭＡ（１６０ｎＭ）を用いて６時間、細胞を刺激した。全ＲＮＡを単離し、プライマーのペア：５’−ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＧＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および５’−ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を用いてＲＴ−ＰＣＲに供した。ＰＣＲ産物は、５’−ＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の２５−マーオリゴヌクレオチドプローブを用いたサザンブロット分析に用いられた。
【０１４９】
２．ファージミドベクターおよびＭ１３Ｋ０７ヘルパーバクテリオファージを用いた大環状核酸分子の構築
（１）センス配列またはアンチセンス配列を有する一本鎖バクテリオファージゲノムの構築
標的遺伝子に特異的なアンチセンス領域を有する大環状核酸分子を、標準的なクローニング法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  １９８９）に従って構築した。適切なｃＤＮＡを含むｐＢＳ−ＫＳ（＋）または（−）ファージミドを有するコンピテント細菌細胞（ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）に、ヘルパーバクテリオファージＭ１３Ｋ０７（ＮＥＢ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  ＵＳＡ）を感染させた。クローニングされたｃＤＮＡのファージミドベクター中の向きにより、センス配列またはアンチセンス配列のいずれが作製されるかが決定される。２×ＹＴ中におけるヘルパーファージ感染細胞の一晩の培養の上清に、２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）を添加した。バクテリオファージの沈殿をＴＥ（ｐＨ８．０）中に再懸濁させ、フェノール抽出およびエタノール沈殿によりファージゲノムＤＮＡを単離した。
【０１５０】
（２）ファージゲノムアンチセンス分子の精製
小規模な精製には０．８％低融点（ＬＭＰ）アガロースゲルを用いて、大規模な精製にはゲル濾過カラムクロマトグラフィ（１．０×５０ｃｍ）を用いて、ヘルパーバクテリオファージおよび宿主細菌細胞の残りのゲノムＤＮＡからのファージゲノムアンチセンス分子の精製を行った。ゲル濾過用のカラム樹脂は特級の（ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＴＭＳ−１０００（分子カットオフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｕｔｏｆｆ）：２０，０００ｂｐ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，  Ｓｗｅｄｅｎ）であり、充填させ、０．２ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）を用いて平衡化させた。開始時のアンチセンス分子の体積は、ゲル空隙体積の５％に調節し、樹脂の平衡化に用いたのと同じ緩衝液を用いてＤＮＡの溶出を行った（流速：０．３ｍｌ／分）。二元（ｄｕａｌ）ＵＶ検出システムを用いてサンプルを２６０／２８０ｎｍでＵＶスキャンし、溶出中５分毎にサンプルを回収した。サンプルフラクションを洗浄し、７０％冷エタノールを用いて沈殿させ、続きの実験用として、蒸留超純水中およびＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中に再懸濁させた。精製されたアンチセンス分子について、１％アガロースゲルを用いてその量および純度を試験した。ｌａｃＺ遺伝子とは逆の向きで、ｐＢＳ−ＫＳ（＋）中にクローニングされたＴＮＦ−αｃＤＮＡ断片を用いて、コントロールセンス分子を構築した。センスまたはアンチセンスの一本鎖分子については、塩基配列決定用のＴ７プライマーを用いて、塩基配列の完全性を確認した。ＤＮＡの塩基配列決定は、自動ＤＮＡシーケンサーを用いて行った（図２）。
【０１５１】
実施例２−ファージゲノム環状アンチセンス分子の構造分析および安定性試験
１．一本鎖環状ＴＮＦ−αアンチセンス分子
前記アンチセンス分子は一本鎖であり、環状であり、安定であることを、以下の方法により確認した。ＴＮＦ−αをコードする遺伝子に対し標的化されたアンチセンス領域を含有するＬＣ−アンチセンス分子の１μｇを、ＸｈｏＩ（１０Ｕ／μｇＤＮＡ）、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（１６０Ｕ／μｇＤＮＡ）、またはＳ１ヌクレアーゼ（１０Ｕ／μｇＤＮＡ）を用いて３７℃で３時間処理し、その安定性および消化パターンを調べるために、フェノール抽出、エタノール沈殿、および１％アガロースゲルを用いた電気泳動に供した。
【０１５２】
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳについて、その環状構造およびヌクレアーゼに対する安定性を試験した。前記ＬＣ−アンチセンス分子は、その閉環構造により、エキソヌクレアーゼに対して安定であると予想された。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳをエンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびエキソヌクレアーゼＩＩＩとともにインキュベートした場合には、これらのヌクレアーゼとともに３時間インキュベーションした後であっても、前記アンチセンス分子はほぼ完全であった（図３Ａ）。一方、組換えＭ１３ファージＤＮＡの二本鎖複製型にＸｈｏＩを添加した場合には、予想されたように、前記ＤＮＡは制限酵素およびエキソヌクレアーゼの組み合わせにより完全に消化された。一本鎖ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳはまた、一本鎖ＤＮＡに特異的なヌクレアーゼであるＳ１ヌクレアーゼにより、完全に消化された。よって、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは一本鎖環状分子の形状であることが確認された。
【０１５３】
２．ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの安定性試験
安定性試験のために、アンチセンス分子の１μｇを、単独で、または、約１：３（ｗ／ｗ）のＤＮＡ：リポソーム比でリポソームと複合体を形成した後に、添加した。熱により不活性化していない３０％ＦＢＳ溶液を、アンチセンス−リポソーム複合体に添加し、４８時間までの異なる時間にわたり、３７℃でインキュベートした。ＦＢＳおよびヌクレアーゼとともにインキュベートした後、アンチセンスＤＮＡをクロロホルムを用いて抽出し、エタノールを用いて沈殿させ、１％アガロースゲルを用いて電気泳動した。
【０１５４】
ファージゲノムアンチセンス分子はまた、血清とともにインキュベート後も、その構造の完全性がほぼ保存され、安定であることがわかった。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳがカチオン性リポソームと結合すると、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）中でのさらなるインキュベーション後も、アンチセンス分子のほとんどのフラクションは完全なままであった。実際、３０％ＦＢＳを用いた２４時間のインキュベーション後にも、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは完全なままであった（図３Ｂ）。この結果から、リポソームと複合体を形成することによって、前記ファージゲノムアンチセンス分子は、インビボの適用の際により安定化されうるということが示唆される。
【０１５５】
実施例３−ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳによるラットＴＮＦ−α発現の効率的かつ特異的な除去
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのアンチセンス活性を試験した。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、非特異敵アンチセンスファージミドベクター配列およびラットＴＮＦαｍＲＮＡに特異的なアンチセンス領域を含む長いアンチセンス配列を有する。前記ファージゲノムアンチセンス分子が大量の非特異的配列を有することから、アンチセンス活性の標的特異性を完全に分析することが必要となる。ファージゲノムアンチセンス分子が標的遺伝子の発現を抑えるために特異的に作用するかどうかを決定する目的で、ｍＲＮＡ除去のレベルを比較するために複数のコントロール遺伝子を用いた。
【０１５６】
１．細胞培養
単球性マウス細胞株ＷＲＴ７／Ｐ２およびヒト細胞株ＴＨＰ−１を、１０％熱不活性化ＦＢＳ（ＪＢＩ，Ｋｏｒｅａ）、１００μｇ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０またはＥＭＥＭ（ＪＢＩ，ｋｏｒｅａ）中で維持した。ＣＯ２（５％）インキュベーター中、３７℃で細胞を培養し、過剰な増殖を避けるために注意して維持した。リポフェクションの前日に（１６時間）細胞培地を新鮮な培地と交換し、実験日に、０．４％トリパンブルー染色により細胞の生存力を試験した。
【０１５７】
２．リポソームと複合体化されたＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのトランスフェクション
リポフェクトアミンＴＭ、リポフェクトアミン２０００ＴＭ、またはリポフェクトアミンプラスＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＵＳＡ）のようなカチオン性リポソームを、アンチセンス分子またはセンスコントロール分子と混合させた。これらのリポソーム−ＤＮＡ複合体をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＵＳＡ）と混合し、次いで業者により提供されたプロトコールに従って、細胞に添加した。
【０１５８】
リポフェクションの詳細は以下の通りである。１０％ＦＢＳの添加されたＲＰＭＩ１６４０またはＥＭＥＭ中で細胞を培養し、リポフェクションの３０分前にＯＰＴＩ−ＭＥＭを用いて２回洗浄した。培地２００μｌずつで、４８−ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に細胞を播種した。約１：３（ｗ／ｗ）の比でアンチセンス分子をカチオン性リポソームと混合し、トランスフェクションするために細胞に添加した。無血清培地中、３７℃で６時間、細胞をインキュベートした。リポフェクションの後、２×ＦＢＳおよび抗生物質を培地に添加して、さらに３７℃で１８時間インキュベートした。ＬＰＳ（３０ｇ／ｍｌ）を用いてラットＴＮＦ−αの発現を誘導した。細胞をＲＮＡの調製に用い、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、培養の上清についてＩＬ−１０の存在を試験した。
【０１５９】
３．ＲＴ−ＰＣＲを用いた転写の検出
Ｔｒｉ  ｒｅａｇｅｎｔＴＭ（ＭＲＣ，ＵＳＡ）を用い、業者により推奨されるプロトコールに従って、ＲＮＡの調製を行った。ＲＮＡ精製のために、各ウェルから回収された細胞を、１ｍｌのＴｒｉ  Ｒｅａｇｅｎｔおよび２００μｌのクロロホルムと混合させた。ＡｃｃｅｓｓＴＭＲＴ−ＰＣＲキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用い、５０μｌの反応容積で、精製されたＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに供した。ＰＣＲチューブには、精製ＲＮＡ、プライマーのペア：５’−ＣＡＴＣＴＣＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＧＧＡＣＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）および５’−ＣＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣＧＣＣＡＧＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＡＭＶ逆転写酵素（５Ｕ／μｌ）、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ、１μｌ）およびＭｇＳＯ４（２５ｍＭ、２．５μｌ）を添加した。サーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）（Ｈｙｂａｉｄ，ＵＫ）中で、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応を順に行った。ｃＤＮＡの第一の鎖の合成は４８℃で４５分間行い、続くＤＮＡの増幅は９４℃で３０秒間（変性）、５９℃で１分間（アニーリング）、および６８℃で２分間（重合）のサイクルの３０回の繰り返しにより行った。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲル上で確認し、増幅ＤＮＡの定量分析は、ゲルドキュメンテーション（ｇｅｌ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）装置である、アルファイメージャー（ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ）１２２０（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏ−Ｔｅｃｈ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１６０】
４．サザンブロティング
ＥＣＬ（強化化学ルミネセンス（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ））オリゴ−ラベリングおよび検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ＵＫ）を用いて、サザンハイブリダイゼーション用のプローブを調製した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにかけ、０．４Ｍ  ＮａＯＨ溶液中のナイロン膜状に移した。ＴＮＦ−α用のオリゴヌクレオチドプローブは２２マー：５’−ＧＡＴＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＣＡＴＴＴＧＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）であり、ＮＦ−κＢ用のオリゴヌクレオチドプローブは２５マー：５’−ＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）であった。
【０１６１】
１００ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプローブをフルオレセイン−１１−ｄＵＴＰ、カコジル酸塩緩衝液およびターミナルトランスフェラーゼを混合させ、ＥＣＬラベリングのために３７℃で７０分間インキュベートした。移ったＤＮＡを有するナイロン膜へのプローブのハイブリダイゼーションは、６ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、０．０２％ＳＤＳ、リキッドブロック（ｌｉｑｕｉｄ  ｂｌｏｃｋ））中で、４２℃で１４時間行った。前記ナイロン膜を、０．１％ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中で２回、０．１％ＳＤＳを含有する１×ＳＳＣ中で１回、４５℃で各１５分間洗浄した。前記膜を、ＨＲＰ抗−フルオレセインに共役した抗体とともに３０分間インキュベートし、続いて、Ｘ線フィルムにさらす前に、ＥＣＬ検出試薬とともに約５分間インキュベートした。
【０１６２】
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの特異的活性を試験するため、０．５μｇ（１．４ｎＭ）のアンチセンス分子を１．５μｇのカチオン性リポソームと複合体化させ、１×１０５細胞の単球性細胞株、ＷＲＴ７／Ｐ２に添加した。次いで、ＬＰＳ処理により、前記細胞においてＴＮＦ−αの発現を誘導した。前記細胞をＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳを用いて処理すると、ＴＮＦ−αｍＲＮＡの誘導レベルが有意に減少した。一方、細胞をＴＮＦα−Ｍ１３ＳＥ（ＴＮＦ−αのセンス鎖）またはＭ１３ＳＳ（アンチセンスインサートを有さない一本鎖ファージゲノム）で処理すると、ＴＮＦ−αｍＲＮＡはそれほど減少しない（図４Ａおよび４Ｃ）。ＴＮＦ−αのＲＴ−ＰＣＲバンドは、増幅ＤＮＡ断片の中央に結合するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
【０１６３】
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、ラットＴＮＦ−αアンチセンス配列を、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子およびβ−ラクタマーゼ（Ａｍｐ）遺伝子のアンチセンス配列とともに有し、全部で３．７ｋｂの一本鎖環状ゲノムを形成している。ＴＮＦ−α特異的アンチセンス部位は、約７０８塩基の長さである。よって、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ中のＴＮＦ−α特異的アンチセンス配列は、約２０または３０ヌクレオチドの従来の合成アンチセンス分子と比較すると、それ自体がとても長い。本技術分野においては、アンチセンス分子が長くなると、その配列特異性は低下すると一般的に考えられていたため、このことは重要である。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのアンチセンス活性が本当に配列特異的であることを示すため、さらなる確認試験を行った。
【０１６４】
配列特異的なアンチセンス活性を示すために、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのリポフェクション後に、３つの異なる遺伝子のｍＲＮＡレベルを調べた。これらの遺伝子は、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、およびＩＬ−１β（インターロイキン−１β）であった。これらの遺伝子の発現は、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのリポフェクションによっては影響を受けなかった（図４Ａ−４Ｃ）。
【０１６５】
アンチセンス活性におけるＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの用量応答（ｄｏｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）もまた調べた。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳを０．０１μｇ（０．０３ｎＭ）の濃度で用いた場合には、ＴＮＦ−αの発現はわずかに減少したのみであった。０．０５μｇ（０．１４ｎＭ）の濃度では、ＴＮＦ−αの発現は部分的に減少した。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの量が０．１μｇ（０．２８ｎＭ）まで増加すると、ＴＮＦ−αｍＲＮＡは完全に除去されることがわかった。これらの結果より、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、従来用いられていたアンチセンス分子よりもずっと少ない量を用いても、標的ｍＲＮＡの除去に有効であることが示される。
【０１６６】
実施例４−ラットＴＮＦアルファタンパク質の発現パターン
アンチセンス処理後の標的タンパク質の定量を、ＥＬＩＳＡ法またはウエスタンブロッティング法を用いて行った。ＥＬＩＳＡ分析のために、細胞培養の上清を５０倍に希釈し、ＴＮＦ−αに対する抗体で被覆されたＥＬＩＳＡプレートに添加した。抗ＴＮＦ−αに対するビオチン化二次抗体をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、室温で９０分間インキュベートした。３回洗浄後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を添加し、４５分間インキュベートした。結合していないストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを除去するために前記プレートを４回洗浄し、クロモゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）を添加した。発色のために２０分間インキュベートした後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１６７】
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳを用いてＷＲＴ７／Ｐ２細胞にリポフェクションし、トランスフェクションされた細胞から分泌されたＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ分析を用いて測定した。内生的なＴＮＦ−αｍＲＮＡの減少レベルと同様に、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ投与後には細胞培養の上清中のＴＮＦ−αタンパク質もまた９０％超が減少した（図５）。しかし、コントロールアンチセンス分子である、ＴＮＦα−Ｍ１３ＳＥ（ＴＮＦ−α遺伝子のセンス鎖を有する）またはＭ１３ＳＳのいずれによっても、ＷＲＴ７／Ｐ２トランスフェクション細胞中のＴＮＦ−α発現は減少しなかった。これらの結果より、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、トランスフェクションされた細胞からの、ＴＮＦ−αｍＲＮＡの除去、およびそれに続くＴＮＦ−αの消失に有効であったことが示される。
【０１６８】
実施例５−ヒトＮＦカッパＢ転写に対するＮＦカッパＢ−Ｍ１３ＡＳの効果
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの有効性を観察した後、他の遺伝子に特異的に指向化されたファージゲノムアンチセンス化合物が、ＮＦ−κＢのような別の遺伝子の発現を阻害するかどうかを決定するために実験を行った。ＮＦ−κＢ（ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳ）に対するアンチセンス化合物を作製し、ＴＨＰ−１細胞においてアンチセンス活性の有効性を試験した。ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳについてもリポソームと複合体化させ、増量させながら細胞に添加した。０．０５μｇ（０．１４ｎＭ）のＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳをＴＨＰ−１に添加すると、ＮＦ−κＢｍＲＮＡが約７０％減少した。ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳの量が０．１μｇ（０．２８ｎＭ）および０．２μｇ（０．５６ｎＭ）まで増加すると、ＮＦ−κＢｍＲＮＡの９０％超が除去された。一方、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＳＥ（ＮＦ−κＢのセンス配列を有するファージゲノムＤＮＡ）またはＭ１３ＳＳで処理された細胞においては、ＮＦ−κＢの発現はほとんど影響を受けなかった（図６Ａ−６Ｂ）。
【０１６９】
実施例６−ユニジーンアンチセンスライブラリーの構築
１．ユニジーンｃＤＮＡライブラリーの構築
例としてユニジーンアンチセンスライブラリーを構築するために、数万のユニジーンクローン中の６８７の特有のｃＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）ＳＫ（−）ベクターのマルチクローニングサイト中にＬａｃＺ遺伝子と同じ向きにクローニングした。組換えファージミドを、塩化カルシウム法により、エピキュリアンコリ（登録商標）ＸＬ−１０ゴールドウルトラコンピテント細胞（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ（登録商標）  ＸＬ−１０  Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）に形質転換させた（図１０）。
【０１７０】
アルカリ−ＳＤＳ法により、形質転換体から組換えファージミドを高スループット式に精製し（図１１）、サブクローニング工程において用いたのと同一の制限酵素により消化して、アガロースゲル電気泳動を行った（図１２）。
【０１７１】
２．ユニジーンＬＣ−アンチセンス化合物の作製
ユニジーンアンチセンスライブラリーを作製するための、細菌培養段階および精製段階を、以下のように行った。ｃＤＮＡインサートを有するｐＢＳ  ＳＫ（−）ファージミドを含むコンピテント細菌細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ寒天プレート上に塗布し、３７℃で１６時間インキュベートした。９６−ディープウェルプレートの各ウェル中に播種され、単離された単一コロニーを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ液体培地（１０００ｍｌあたりトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ）１．５ｍｌを用いて等分し、強く振とうしながら３７℃で７時間前培養した。各ファージミドからＬＣ−アンチセンス化合物を製造するために、アンピシリンを含まないがヘルパーバクテリオファージＭ１３Ｋ０７（ＮＥＢ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  ＵＳＡ）９μｌを含む２×ＹＴ液体培地１．４ｍｌが予め充填されたウェルに、前培養液の２０μｌをマルチチャンネルピペットを用いて移した。
【０１７２】
１時間インキュベートした後、５０μｇ／ｍｌカナマイシンの４．２μｌを添加し、上記と同様の条件下で１２時間培養した。単一の精製段階におけるアンチセンス分子の収率を最大化するために、感染は各クローンにつき３回行った。
【０１７３】
一本鎖ＬＣ−アンチセンス分子を高スループットで大規模に製造するために、ＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  Ｍ１３キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎ）を用いて、２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）を一晩培養した培養液の上清に添加した。精製段階は、業者の指示書に従って、ＱＩＡＶＡＣ  Ｖａｃｕｍｎ  Ｍａｎｉｆｏｌｄ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎ）を用いて行った。
【０１７４】
精製されたＬＣ−アンチセンス分子は、ｃＤＮＡインサートを有さないｐＢＳ  ＳＫ（−）ファージミド由来のコントロール分子とともに１％アガロースゲルにかけ、アンチセンス分子の量および純度を調べた（図１３）。
【０１７５】
精製されたアンチセンス化合物が完全であることをゲル電気泳動により確認した後、６８７種のＬＣ−アンチセンス化合物のユニジーンアンチセンスライブラリーを、８の９６−ウェルプレートに配列させた。
【０１７６】
実施例７−ユニジーンアンチセンスライブラリーの肺癌細胞および肝癌細胞に対するリポフェクション
これは、特定の細胞株の疾患の過程に関与している遺伝子を決定するための、アンチセンスライブラリーの応用の例である。相補的なｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスライブラリー分子の結合により標的遺伝子の発現が阻害されうるという原理より、本発明者はまず、ユニジーンアンチセンスライブラリーの肝癌細胞株および肺癌細胞株に対するリポフェクションにより、肝癌細胞および肺癌細胞の増殖に影響を与えるアンチセンス化合物をスクリーニングした。
【０１７７】
韓国細胞バンク（Ｋｏｒｅａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｂａｎｋ）（ＫＣＬＢ，Ｋｏｒｅａ）より、癌細胞株である、ＨｅｐＧ２およびＮＣＩ−Ｈ１２９９を入手した。前記細胞株は、１０％の熱不活性化ＦＢＳ（ＪＢＩ，Ｋｏｒｅａ）、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地（ＪＢＩ，Ｋｏｒｅａ）中で維持した。
【０１７８】
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を用いて細胞を２回洗浄後、１３の９６−ウェルプレートの各ウェル中で、１０％ＦＢＳの添加された１００μｌの最適な培地中に７×１０３細胞のＨｅｐＧ２および５×１０３細胞のＮＣＩ−Ｈ１２９９を播種した。前記細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１２〜１８時間インキュベートした。１３の９６−ウェルプレート中に添加される予定の各ＬＣ−アンチセンス化合物０．１μｇを、カチオン性リポソーム０．３μｇと複合体化させ、そしてＬＣ−アンチセンス化合物−キャリアー複合体を培養細胞に添加した。トランスフェクションの２４時間後に細胞の培地を新鮮な培地と交換し、さらに３から４日間インキュベートした。
【０１７９】
ＬＣ−アンチセンス化合物の細胞増殖に対する効果を比較するため、キャリアー単独およびコントロールＤＮＡ−キャリアー複合体の等量を、異なる９６−ウェルプレート中の細胞に添加し、同時に分析した。コントロールＤＮＡは、ｃＤＮＡインサートを有さない大環状ファージゲノムＤＮＡであった。次いで、ＨｅｐＧ２およびＮＣＩ−Ｈ１２９９をそれぞれ３日間および４日間インキュベートした。
【０１８０】
実施例８−肝癌細胞および肺癌細胞の増殖に重要な遺伝子のスクリーニング
肝癌細胞および肺癌細胞の増殖に関与する遺伝子をスクリーニングするため、光学顕微鏡検査、ＭＴＴ還元分析および［３Ｈ］−チミジン取込み分析を行った。ＬＣ−アンチセンス化合物を用いることによる肝癌細胞および肺癌細胞の増殖の阻害は、光学顕微鏡検査（初期倍率、×２００）によってまず確認した（図１６−１９）。
【０１８１】
ＭＴＴ還元分析については、ＬＣ−アンチセンス化合物のトランスフェクションの３日後または４日後に、細胞培養の培地を５０μｌの新鮮な培地で置換した。５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−  ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ，リン酸緩衝食塩水中，ＳＩＧＭＡ，ＵＳＡ）の２５μｌを、９６−ウェルプレートの各ウェルにマルチチャンネルピペットを用いて添加し、次いで３７℃で４時間インキュベートした。０．１Ｎ  ＨＣｌを含有するイソプロパノール１５０μｌを細胞に添加し、室温で１時間インキュベートした。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ１９０ＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を用いて５７０ｎｍの吸光度を測定し、生き残った細胞の量を算出した。
【０１８２】
以下の式を用いて、増殖阻害の百分率を算出した：
増殖阻害の百分率＝１−（実験ウェルの吸光度／コントロールウェルの吸光度）×１００。
【０１８３】
ＬＣ−アンチセンス化合物−キャリアー複合体で処理がされた実験ウェル、並びに、キャリアー単独またはコントロールＤＮＡ−キャリアー複合体により偽の処理がされたコントロールウェルにおける増殖阻害の百分率は、互いに比較される、光学密度および記録された吸光度の値により全て測定された（図１４および１５）。細菌の培養から精製された、インサートを有さない一本鎖ＤＮＡをコントロールＤＮＡとして用いた。
【０１８４】
高スループット分析において用いられた６８７のＬＣ−アンチセンス化合物から、ＨｅｐＧ２（表１）では８０のアンチセンス化合物（〜１２％）が、そしてＮＣＩ−Ｈ１２９９（表２）では１２９のアンチセンス化合物（〜１９％）が、種々の程度の増殖阻害効果を示した。さらに、ＨｅｐＧ２細胞株では８０遺伝子のうちの２２が、そしてＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞株では１２９遺伝子のうちの４８が、既知の機能を全く有していないことがわかった。さらに、機能が不明であった遺伝子も発見された。しかしこの結果より、同定されたこれらの遺伝子が、肝癌細胞および肺癌細胞の増殖の促進に重要な役割を果たしていることは明らかである。
【０１８５】
ＬＣ−アンチセンス化合物により阻害された癌細胞の増殖は、上記のＭＴＴ還元分析によりまず測定され、形成されたＬＣ−アンチセンス化合物マクロアレイアセンブリ上で行われた［３Ｈ］−チミジン取込み分析により確認された（図１６−１９）。［３Ｈ］−チミジン取込み分析については、トランスフェクションの２４時間後に０．５μＣｉの［３Ｈ］−チミジン（２．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を細胞に添加し、前記細胞をＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。４日後、前記細胞をトリプシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）で処理し、ガラスマクロファイバーフィルター（ＧＦ／Ｃ  Ｗｈａｔｍａｎ、Ｍａｄｉｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）を用いて回収した。前記フィルターを冷リン酸緩衝食塩水で洗浄し、次いで１０％トリクロロ酢酸および無水アルコールで引き続き処理した。［３Ｈ］−チミジン取込みは、トルエン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２，５−ジフェニルオキサゾールおよび１，４−ビス［２−（フェニルオキサゾリ）］ベンゼン（１，４−ｂｉｓ［２−（５−ｐｈｅｎｙｌｏｘａｚｏｌｙ）］ｂｅｎｚｅｎ）を含有する混合液中で、液体シンチレーションカウンターにより測定した。
【０１８６】
以下の式を用いて、増殖阻害の百分率を算出した：
増殖阻害の百分率＝１−（実験ウェルのｃｐｍ／コントロールウェルのｃｐｍ）×１００。
【０１８７】
実施例９−疾患細胞に対するアンチセンス化合物のマクロアレイの形成における機能的プロファイリング
同定された遺伝子のアンチセンス活性プロファイルを得るために、Ｈｅｐ３Ｂ（肝癌）、ＮＣＩ−Ｈ１２９９（非肺小細胞癌）、ＡＧＳ（胃癌）、ＨＴ−２９（大腸癌）およびＨｅｐＧ２（肝癌）の培養された細胞を、選択されたＬＣ−アンチセンス化合物のセットからなるマクロアレイアセンブリに同時に移した。
【０１８８】
前記ＬＣ−アンチセンス化合物を、ペプチド、ＤＯＴＡＰ、およびカチオン性リポソームのような種々のキャリアーと種々の比（ｗ／ｗ）で混合させた。この混合物を種々の量の細胞にその増殖特性に応じて添加した。ＬＣ−アンチセンス化合物−キャリアー複合体で処理された実験細胞およびキャリアー単独で処理されたコントロール細胞を、さらに３から５日間インキュベートし、ＭＴＴ還元分析に２回供した。活性プロファイルを調べるため、増殖阻害の量を算出し、データを異なるタイプの癌細胞株の間で比較した（図１９）。驚くべきことに、７つのＬＣ−アンチセンス化合物が、ＨｅｐＧ２細胞の増殖を特異的に、強く、他と区別して（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）阻害するということがわかった（図２０）。
【０１８９】
これらの結果により、機能的ゲノミクスのための本発明の高スループットシステムを用いると、直接の遺伝子の機能化だけではなく、特定の疾患に対する分子療法のための標的遺伝子の確認も同時に行われうるということが示される。
【０１９０】
ここに引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０１９１】
当業者であれば、ここに特に記載された本発明の特定の実施態様についての均等物の多くを認識し、通常の実験のみを用いることにより確認することができるであろう。このような均等物は、特許請求の範囲に含まれるものと意図されている。
【０１９２】
【表１】
2005510206.tif 000003
【０１９３】
【表２】
2005510206.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】図１は、ラットＴＮＦα−Ｍ１３アンチセンス分子（ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ）の作製のための概略図を示す。
【図２】図２は、ＴＮＦ−αインサートのアンチセンス特性を確認するための、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの塩基配列分析を示す。
【図３】図３ａは、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳを種々の酵素を用いて処理した結果を示す。図３ｂは、ヌクレアーゼに対するＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの安定性を示す。
【図４】図４ａは、ＴＮＦα−特異的プライマーペアおよびβ−アクチン特異的プライマーペアを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図４ｂは、ＩＬ−１βおよびＧＡＰＤＨの転写産物をＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳがラットＴＮＦ−αの発現を特異的に阻害していることを確認した結果を示す。図４ｃは、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳがラットＴＮＦ−αの発現を特異的に阻害していることを確認した、ラットＴＮＦ−α特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いたサザンブロットのデータを示す。
【図５】図５は、細胞から分泌されたラットＴＮＦ−αタンパク質の量を測定するＥＬＩＳＡ分析のデータを示す。
【図６】図６ａは、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳの投与に応答して、内生のＮＦ−κＢの発現が減少したことを確認したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図６ｂは、ＮＦ−κＢ特異的プローブを用いたサザンブロットの結果を示す。
【図７】図７は、ユニジーンアンチセンスライブラリーを特定の疾患の細胞に適用する、機能的ゲノミクスのための高スループットシステムの概略図を示す。
【図８】図８は、ユニジーンアンチセンスライブラリーから選択された大環状アンチセンス化合物（ＬＣ−アンチセンス化合物）を有するマクロアレイアセンブリを、種々の細胞タイプに適用する、機能的ゲノミクスのための高スループットシステムの概略図を示す。
【図９】図９は、ユニジーンアンチセンスライブラリーを用いた遺伝子の機能化の概略図を示す。
【図１０】図１０は、アンピシリンを含有する選択培地上で増殖した形質転換体を示す。
【図１１】図１１は、細菌形質転換体からの組換えファージミドの大規模精製の例を示す。
【図１２】図１２は、インサートの長さの確認を示す。
【図１３】図１３は、ＬＣ−アンチセンス化合物を有するユニジーンアンチセンスライブラリーの迅速な構築を示す。
【図１４】図１４ａおよび１４ｂは、ユニジーンアンチセンスライブラリーを用いた大規模な遺伝子の機能化を示す。図１４ａは、ＭＴＴ試薬を含有する９６ウェルプレートを示す。図１４ｂは、ＬＣ−アンチセンス化合物で処理された細胞の増殖阻害の百分率を算出することによる、肝癌に関連する遺伝子のスクリーニングの結果を示す。
【図１５】図１５ａおよび１５ｂは、ユニジーンアンチセンスライブラリーを用いた大規模な遺伝子の機能化を示す。
【図１６】図１６ａ−１６ｄは、ユニジーンアンチセンスライブラリーからのクローンを用いて、ＨｅｐＧ２細胞株上で行われた遺伝子の機能化の例を示す。
【図１７】図１７ａ−１７ｄは、ユニジーンアンチセンスライブラリーからのクローンを用いて、ＨｅｐＧ２細胞株上で行われた遺伝子の機能化の例を示す。
【図１８】図１８ａ−１８ｄは、ユニジーンアンチセンスライブラリーからのクローンを用いて、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞株上で行われた遺伝子の機能化の例を示す。
【図１９】図１９ａ−１９ｄは、ユニジーンアンチセンスライブラリーからのクローンを用いて、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞株上で行われた遺伝子の機能化の例を示す。
【図２０】図２０は、種々の癌細胞に対するＬＣ−アンチセンス化合物のアンチセンス活性プロファイルの例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
2005510206000001.app
【国際調査報告】
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2005510206.tif 000026