(57)【要約】  植物におけるカドミウムの蓄積に関与する遺伝子を同定し、その遺伝子の利用方法を提供する。本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを植物に発現可能に導入する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物の生産方法であって、
下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、植物に発現可能に導入することを特徴とする、形質転換植物の生産方法：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
上記植物はイネ科植物であることを特徴とする請求項１に記載の形質転換植物の生産方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の形質転換植物の生産方法によって生産されたことを特徴とする形質転換植物。
【請求項４】
カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を作製するためのキットであって、
下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするキット：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物におけるカドミウムの蓄積に関与する遺伝子の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
カドミウムはイタイイタイ病の原因物質として知られ、毒性の強い重金属である。カドミウムは、鉱物中や土壌中等に天然に存在する重金属で、銀・銅・亜鉛等の金属とともに存在することから、これらの金属を採掘、精錬する際の副産物として環境中へ排出され土壌に蓄積される。【０００３】
カドミウムに汚染された土壌で栽培された野菜、穀類等の様々な農作物を経由してカドミウムは人体内に取り込まれ、我々の健康に悪影響を与える。このため、我が国では農作物からのカドミウム摂取量を制限するため、食品衛生法によって、農作物に含まれるカドミウム濃度の基準値が定められている。例えば、玄米中におけるカドミウムの濃度が０．４ｐｐｍ以上１．０ｐｐｍ未満のコメは食用としての販売禁止され、カドミウムの濃度が１ｐｐｍ以上のコメは、販売や加工等が禁止され、実態として焼却処分されている。【０００４】
コメ等の農作物に含まれるカドミウム濃度を基準値以下とし、食の安全を確保するために、従来、土壌洗浄、埋め立て、客土等の手法によってカドミウムに汚染された土壌を浄化する試みがなされている（例えば、特許文献１および非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００４／０３７４５３号パンフレット（２００４年５月６日公開）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Calmano W, Mangold S, Stichnothe H, Thoming J: Clean-up and assessment of metal contaminated soils; in Treatment of Contaminated soil, ed. R. Stegmann, G. Brunner, W. Calmano and G. Matz, p.471-490, Springer, Berlin(2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述のような土壌洗浄、埋め立て、および客土といった従来の方法は、コストが高い、埋め立てや客土に用いる未汚染土壌の確保が困難である等の問題を有している。また、化学的または物理的に土壌を処理するため生態系が乱れる可能性がある。このため、カドミウムによって汚染された農業用地は利用されずに放棄されている。【０００８】
カドミウムによって汚染された農業用地を有効に利用するという観点から、土壌に含有されているカドミウムを蓄積し難い植物を実現することができれば非常に有用であると考えられる。しかし、どのような遺伝子が、植物におけるカドミウムの蓄積に関与するのかは不明であった。【０００９】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物におけるカドミウムの蓄積に関与する遺伝子を同定し、その遺伝子の利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、イネの７番染色体に座乗するＯｓＨＭＡ３遺伝子が、植物におけるカドミウムの輸送に関与することを本発明者が初めて発見し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。【００１１】
本発明に係る形質転換植物の生産方法は、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物の生産方法であって、下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、植物に発現可能に導入することを特徴としている：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【００１２】
本発明に係る形質転換植物は、本発明に係る形質転換植物の生産方法によって生産されたことを特徴としている。【００１３】
本発明に係るキットは、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を作製するためのキットであって、下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【００１４】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る形質転換植物の生産方法によれば、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を生産することができるという優れた効果を奏する。具体的には、野生型の植物と比較して、カドミウムの蓄積の局在性を根に変化させた、またはカドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させた形質転換植物を生産することができる。【００１６】
カドミウムの蓄積の局在性を根に変化させた形質転換植物は、根を除く植物体にカドミウムが蓄積され難いため、カドミウムを含有する土壌においても栽培することができる。また、カドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させた形質転換植物は、カドミウムを含有する土壌において栽培することによって、土壌中のカドミウムを低コスト、且つ容易に除去する土壌浄化用の植物として好適に利用することができる。【００１７】
また、本発明に係るキットを用いれば、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を容易に作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】カドミウムによって汚染されていない圃場において栽培した１３１系統のイネの穀粒におけるカドミウム濃度を示すグラフである。
【図２】カドミウムによって汚染されていない圃場において栽培したアンジャナ・ダーンと日本晴とについて、地上部および玄米におけるカドミウム濃度を表すグラフである。
【図３】カドミウム汚染土壌において栽培したアンジャナ・ダーンと日本晴とについて、地上部および玄米におけるカドミウム濃度を表すグラフである。
【図４】アンジャナ・ダーンの地上部に含まれるカドミウム濃度を１００とした場合のＦ２集団の地上部に含まれるカドミウム濃度の相対値を表すグラフである。図４中のＡ、Ｈ、およびＢは、それぞれ量的遺伝子座が検出された近傍のマーカーの遺伝子型を示しており、「Ａ」はアンジャナ・ダーン型、「Ｈ」はヘテロ型、「Ｂ」は日本晴型を表している。
【図５】穀粒中のカドミウム濃度が高い７系統のイネについてＰＣＲを行った結果を表す図である。１レーン目：Ｊａｒｊａｎ、２レーン目：アンジャナ・ダーン（Ａｎｊａｎａ  Ｄｈａｎ）、３レーン目：ＩＲ  ５８、４レーン目：Ｂｌｅｉｙｏ、５レーン目：ＩＲ３６、６レーン目：ＰＩ３１２７７７である。
【図６】日本晴とアンジャナ・ダーンとにおいて、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質およびＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。図６において、ＴＭ１〜ＴＭ８は、膜貫通ドメインを示している。
【図７】定量的ＰＣＲの結果を表すグラフである。
【図８】酵母を用いたＯｓＨＭＡ３遺伝子の機能解析の結果を表す図である。
【図９】アンジャナ・ダーンおよび日本晴について、導管液、地上部、および根に含まれるカドミウム濃度を経時的に測定した結果を表すグラフである。図９の（ａ）は導管液、（ｂ）は地上部、（ｃ）は根における測定結果を表している。
【図１０】アンジャナ・ダーンおよび日本晴の根のカドミウム吸収能を表すグラフである。
【図１１】アンジャナ・ダーンおよび日本晴の導管液に含まれるカドミウムの濃度を測定した結果を表すグラフである。
【図１２】相補性検定の結果を表す図であり、（ａ）はアンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎを導入した３種類の形質転換株および空ベクターを導入したコントロール株の地上部におけるカドミウム濃度を示し、（ｂ）は根におけるカドミウム濃度を示している。
【図１３】アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した３種類の形質転換株および空ベクターを導入したコントロール株における微量栄養素の濃度を示す図である。
【図１４】アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した３種類の形質転換株および空ベクターを導入したコントロール株における多量栄養素の濃度を示す図である。
【図１５】日本晴においてＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによってノックダウンしたＲＮＡｉ株および空ベクターを導入したコントロール株におけるカドミウムの蓄積量を測定した結果を示す図であり、（ａ）は日本晴における３種類のＲＮＡｉ株およびコントロール株の地上部におけるカドミウム濃度を示し、（ｂ）は根におけるカドミウム濃度を示している。
【図１６】日本晴においてＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによってノックダウンしたＲＮＡｉ株および空ベクターを導入したコントロール株における微量栄養素の濃度を示す図であり、（ａ）は日本晴における３種類のＲＮＡｉ株およびコントロール株におけるＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現レベルを示し、（ｂ）はＲＮＡｉ株およびコントロール株の地上部および根における微量栄養素の濃度を示している。
【図１７】ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現パターンを示す図であり、（ａ）は、日本晴およびアンジャナ・ダーンの根および地上部におけるＯｓＨＭＡ３遺伝子の２つの対立遺伝子の発現を示し、（ｂ）は日本晴およびアンジャナ・ダーンの根の異なる部分における２つの対立遺伝子の発現を示している。
【図１８】イネの根におけるＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在を示す図であり、（ａ）はアンジャナ・ダーンの根における免疫染色の結果を示し、（ｂ）は日本晴の根における免疫染色の結果を示している。
【図１９】ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質の細胞内の局在を示す図であり、（ａ）は、ＧＦＰ−ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質を発現しているタマネギの表皮細胞におけるＧＦＰの蛍光を示し、（ｂ）はＧＦＰタンパク質のみを発現しているタマネギの表皮細胞におけるＧＦＰの蛍光を示している。
【図２０】ウエスタンブロット解析の結果を示す図であり、（ａ）は、抗ＯｓＨＭＡ３ｎ抗体の特異性を示し、（ｂ）はショ糖密度勾配解析の結果を示している。
【図２１】カドミウムに関する酵母における機能解析の結果を示す図であり、（ａ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、ＡｔＨＭＡ３遺伝子または２種類のキメラ遺伝子のいずれかを形質導入した野生型の酵母細胞（ＢＹ４７４１株）の、グルコース存在下における成長を示し、（ｂ）は、ガラクトースの存在下における成長を示している。
【図２２】ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質とＯｓＨＭＡ３ａタンパク質とのキメラタンパク質の概略を示す図である。
【図２３】カドミウムに関する酵母における機能解析の結果を示す図であり、（ａ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、またはＡｔＨＭＡ３遺伝子のいずれかを形質導入したΔｙｃｆ１酵母細胞の、グルコースの存在下における成長を示し、（ｂ）は、ガラクトースの存在下における成長を示している。
【図２４】金属に関する酵母における機能解析の結果を示す図であり、（ａ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、またはポジティブコントロールとしてＡｔＨＭＡ３遺伝子のいずれかを形質導入したΔｚｒｃ１酵母株の、ガラクトースおよび４ｍＭ ＺｎＳＯ４の存在下における成長を示し、（ｂ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、またはポジティブコントロールとしてＡｔＨＭＡ３遺伝子のいずれかを形質導入したΔｃｏｔ１酵母株の、ガラクトースおよび２．５ｍＭ ＣｏＣｌ２の存在下における成長を示し、（ｃ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａＨ８０Ｒ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａＶ６３８Ａ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａＨ８０Ｒ／Ｖ６３８Ａ遺伝子、またはＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子のいずれかを形質導入した野生型酵母細胞の、ガラクトースおよび２０μＭ ＣｄＳＯ４の存在下における成長を示している。
【図２５】カドミウムの蓄積および他の金属の蓄積に関するＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子の過剰発現の作用を示す図であり、（ａ）は、玄米におけるカドミウムの濃度を示し、（ｂ）は玄米における亜鉛の濃度を示し、（ｃ）は玄米における鉄の濃度を示している。
【図２６】過剰発現株およびベクターコントロール株におけるＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子の発現レベルを示す図である。
【図２７】カドミウムの蓄積および他の金属の蓄積に関するＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子の過剰発現の作用を示す図であり、（ａ）は、地上部におけるカドミウムの濃度を示し、（ｂ）は地上部における亜鉛の濃度を示し、（ｃ）は地上部における鉄の濃度を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。尚、本明細書において特記しない限り、数値範囲を示す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」であることを示す。
【００２０】
〔１．形質転換植物の生産方法〕
本発明に係る形質転換植物の生産方法は、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物の生産方法であって、下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、植物に発現可能に導入する工程を含んでいる：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２１】
本発明者は、細胞内へのカドミウムの輸送に関与する遺伝子（ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子およびＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子）を、イネから新たに同定した。上記の配列番号１および２に示すポリペプチドは、それぞれＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子およびＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子の翻訳産物である。すなわち、配列番号１および２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、本発明者によってイネから新たに同定された、細胞内へのカドミウムの輸送に関与するタンパク質である。つまり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、カドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有しているといえる。尚、本明細書では、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子およびＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子を、単に「ＯｓＨＭＡ３遺伝子」と称し、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質およびＯｓＨＭＡ３ａタンパク質を、単に「ＯｓＨＭＡ３タンパク質」と称することがある。
【００２２】
上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３に示された塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。また、上記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号４に示された塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２３】
ここで、本明細書において、上記「カドミウムの蓄積の局在性を変化させた」とは、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドが導入されていない野生型の植物と比較して、形質転換植物におけるカドミウムの蓄積の局在性を根に変化させた、または形質転換植物におけるカドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させたことを意図している。また、上記「根を除く植物体」とは、例えば、茎、葉、穀粒等を含む、植物体の根以外の部分を意図している。尚、本明細書においては、上記「根を除く植物体」を「地上部」と称する場合がある。
【００２４】
カドミウムの蓄積の局在性が変化したことは、野生型の植物と形質転換植物とを同じ条件で栽培し、栽培後の野生型の植物と形質転換植物とについて、根または根を除く植物体におけるカドミウムの蓄積量を比較することによって確認することができる。カドミウムの蓄積量は、例えば、後述する実施例に示す方法によって測定することができる。
【００２５】
上記「カドミウム」は、イオン化されているものでも、塩を形成しているものであってもよい。また、上記「カドミウム」は、カドミウムおよびカドミウムを含む化合物を示すものとする。
【００２６】
また、上記「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」とも換言できる。上記「１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、または付加ができる程度の数（例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００２７】
また、上記「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体が意図されている。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言でき、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列からなるポリヌクレオチドを示している。
【００２８】
上記ポリヌクレオチドを取得する方法は、特に限定されるものではないが、公知の技術によって取得することができる。例えば、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法によって取得することができる。具体的には、上記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドについて５’側および３’側の配列（またはその相補配列）に対応するプライマーをそれぞれ作製し、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することによって、上記のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
【００２９】
また、公知の日本晴の配列情報に基づいて、ＯｓＨＭＡ３遺伝子領域を増幅できるようなプライマーを設計し、そのプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）またはＲＴ−ＰＣＲ産物を鋳型にして、ＯｓＨＭＡ３遺伝子領域を増幅することによっても上記ポリヌクレオチドを取得することができる。
【００３０】
また、上記ポリヌクレオチドまたはその一部の配列を含むオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法によってもポリヌクレオチドを取得することができる。例えば、上記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものも用いることができる。
【００３１】
上記ポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、配列番号１および配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＯｓＨＭＡ３タンパク質）は、イネである日本晴に由来することから、イネ科植物（イネ、トウモロコシ等）を用いることが好ましい。
【００３２】
植物に導入される上記「ポリヌクレオチド」の形態としては、植物に発現可能に導入することができる限り特に限定されず、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）であってもよい。
【００３３】
上記ポリヌクレオチドが導入される上記「植物」としては、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、イネ科植物、ナス科植物、マメ科植物等を挙げることができる。上記「イネ科植物」としては、例えば、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、ソルガム等を挙げることができる。上記「ナス科植物」としては、例えば、ナス等を挙げることができる。上記「マメ科植物」としては、例えば、ダイズ等を挙げることができる。
【００３４】
本発明に係るカドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物の生産方法は、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入されており、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドを発現させるものであれば、特に限定されるものではない。尚、本明細書において、上記「カドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性」とは、「上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドが導入されていない野生型の植物と比較して、形質転換植物のカドミウムの蓄積の局在性を根に変化させる活性、または形質転換植物のカドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させる活性」を意図している。
【００３５】
上記「組換え発現ベクター」は、（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むものであれば、その種類は特に限定されない。例えば、配列番号３または４に示すｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターを挙げることができる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、コスミド等を用いることができるが、本発明はこれらに限定されない。
【００３６】
また、上記「組換え発現ベクター」は、植物の細胞（以下、「ホスト細胞」とも言う）において挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば、特に限定されるものではない。例えば、アグロバクテリウムを用いる方法（アグロバクテリウム感染法）によって植物に組換え発現ベクターを導入する場合には、組換え発現ベクターとして、ｐＢＩ系等のバイナリーベクターを用いることが好ましい。バイナリーベクターとしては、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【００３７】
また、上記「組換え発現ベクター」は、導入対象となる植物（導入対象植物）の細胞内において遺伝子を発現させることが可能なプロモーターを有するベクターであることが好ましい。プロモーターとしては公知のプロモーターを好適に用いることができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、ユビキチンプロモーターやアクチンプロモーター等を挙げることができる。これらのプロモーター配列と上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとをプラスミド等に組み込んだ組換え発現ベクターとして用いることによって、導入したポリヌクレオチドを植物の細胞内において好適に発現させることができる。中でも、ＯｓＨＭＡ３タンパク質を高発現させる観点から、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを用いることが好ましい。例えば、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質を高発現させることにより、カドミウムが地上部により蓄積され難い形質転換植物を生産することができる。また、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質を高発現させることにより、カドミウムが地上部により蓄積され易い形質転換植物を生産することができる。
【００３８】
また、ＯｓＨＭＡ３タンパク質は主に植物の根に発現することが発明者によって明らかにされた。そこで、形質転換植物においてＯｓＨＭＡ３タンパク質を好適に機能させる観点から、上記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、上記植物の根において特異的に発現可能に導入することが好ましい。
【００３９】
例えば、根において特異的に発現する遺伝子を制御することが知られているプロモーターの制御下に上記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを導入することによって、上記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、上記植物の根において特異的に発現させることができる。このようなプロモーターとしては、例えば、ＯｓＨＭＡ３プロモーターを用いることができる。
【００４０】
上記ポリヌクレオチド、または上記組換え発現ベクターを植物に導入する方法、すなわち形質転換方法としては特に限定されるものではない。例えば、上記ポリヌクレオチド、または上記組換え発現ベクターを染色体に組み込ませてもよいし、相同組換えによって上記ポリヌクレオチドが染色体の特定の部位に組み込ませてもよい。また、上記ポリヌクレオチド、または上記組換え発現ベクターを植物内で一過的に発現させてもよい。
【００４１】
上記形質転換方法としては、従来公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）を用いることができる。例えば、アグロバクテリウム感染法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、およびパーティクルガン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。例えば、上記「アグロバクテリウム感染法」としては、Plant, J. 6: 271-282 (1994)に記載された方法を用いることができる。
【００４２】
また、上記ポリヌクレオチド、または上記組換え発現ベクターがホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞内で確実に発現しているか否かについては、各種マーカーを用いて確認することができる。例えば、ハイグロマイシンのような抗生物質に抵抗性を与える薬剤耐性遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する方法を挙げることができる。この方法を用いれば、薬剤選択によって、導入された遺伝子がホスト細胞内で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【００４３】
本発明に係る形質転換植物の生産方法によって生産された形質転換植物は、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチド、または上記の組換え発現ベクターが導入されており、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドを発現しているものである。すなわち、本発明に係る形質転換植物の生産方法によって生産された形質転換植物は、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチド（ＯｓＨＭＡ３遺伝子）が導入されていない野生型の植物と比較して、カドミウムの蓄積の局在性が変化している。
【００４４】
具体的に説明すると、上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドは、日本晴に由来するＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子に対応している。このため、上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドが導入された形質転換植物では、これらのポリヌクレオチドが導入されていない野生型の植物と比較して、根におけるカドミウムの蓄積性が向上し、且つ根を除く植物体（例えば、穀粒等）におけるカドミウムの蓄積性が低下すると考えられる。
【００４５】
一方、上記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドは、アンジャナ・ダーンに由来するＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子に対応している。このため、上記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドが導入された形質転換植物では、これらのポリヌクレオチドが導入されていない野生型の植物と比較して、根におけるカドミウムの蓄積性が低下し、且つ根を除く植物体（例えば、穀粒等）におけるカドミウムの蓄積性が向上すると考えられる。
【００４６】
従って、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドが導入された形質転換植物では、これらのポリヌクレオチドが導入されていない野生型の植物と比較して、カドミウムの蓄積の局在性が変化しているといえる。
【００４７】
本発明に係る形質転換植物の生産方法によれば、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を容易に作製することができる。
【００４８】
本発明に係る形質転換植物の生産方法では、上記植物はイネ科植物であることが好ましい。
【００４９】
〔２．形質転換植物〕
本発明に係る形質転換植物は、本発明に係る形質転換植物の生産方法によって生産されたことを特徴としている。
【００５０】
上記「本発明に係る形質転換植物の生産方法」については、上記「１．形質転換植物の生産方法」の項において説明した通りであるので、ここでは省略する。
【００５１】
本発明に係る形質転換植物の範疇には、植物体のみならず、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス等も含まれる。また、本発明に係る形質転換植物の生産方法によって、植物の染色体に上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドが組み込まれた形質転換植物がいったん得られれば、当該植物から得られる種子にも上記ポリヌクレオチドが導入されている。従って、本発明には、形質転換植物から得られた種子も含まれる。
【００５２】
本発明に係る形質転換植物は、カドミウムの蓄積の局在性が変化しているため、様々な用途に用いることができる。例えば、カドミウムの蓄積の局在性を根に変化させた形質転換植物は、根を除く植物体にカドミウムが蓄積され難いため、カドミウムを含有する土壌においても栽培することができる。
【００５３】
また、カドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させた形質転換植物を、カドミウムを含有する土壌で栽培すれば、土壌中のカドミウムを形質転換植物内に効率よく蓄積させることができる。このため、かかる性質が付与された形質転換植物は、カドミウムを含有する土壌からカドミウムを除去するために用いることができる。例えば、カドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させた形質転換植物を、カドミウムを含有する土壌で栽培し、栽培した形質転換植物を収穫し、焼却等によって処分する工程を繰り返すことによって、土壌に含まれるカドミウムを効率よく除去することができる。
【００５４】
〔３．キット〕
本発明に係るキットは、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を作製するためのキットであって、下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００５５】
上記「ポリヌクレオチド」については、上記「１．形質転換植物の生産方法」の項において説明した通りであるので、ここでは省略する。
【００５６】
本発明に係るキットは、上述したポリヌクレオチド以外の成分を含んでいてもよい。例えば、上記ポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを作製するためのプラスミド、当該組換え発現ベクターを作製するために必要な試薬、バッファー、植物の形質転換を行うために必要な試薬等が含まれていてもよい。
【００５７】
本発明に係るキットを用いれば、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を容易に作製することができる。
【００５８】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。【００６０】
（カドミウム濃度の測定方法）
本発明の実施例では、イネの根、地上部、および穀粒（玄米）におけるカドミウム濃度は、植物試料を全て濃硝酸（６０％）で分解し、原子吸光光度計を用いて吸光度を測定した。【００６１】
（１．地上部へのカドミウムの蓄積に関与する遺伝子の同定）
まず、世界各国の様々な品種のイネ（計１３１系統）を用いて、各品種のイネについて穀粒におけるカドミウムの蓄積量を調べた。具体的には、カドミウムによって汚染されていない圃場（土壌中のカドミウム濃度１ｐｐｍ未満）においてイネを栽培し、得られた穀粒におけるカドミウム濃度を測定した。【００６２】
図１は、カドミウムによって汚染されていない圃場において栽培した１３１系統のイネの穀粒におけるカドミウム濃度を示すグラフである。図１に示すように、穀粒に含まれるカドミウムの濃度は系統間で大きく異なることが明らかになった。中でも、インディカ米（Indica）の系統の一つであるアンジャナ・ダーン（Anjana Dhan）は、日本米（Japonica）の系統の一つである日本晴（Nipponbare）と比較して、穀粒に含まれるカドミウム濃度が４０倍以上高いことが明らかになった。【００６３】
そこで、カドミウム高蓄積品種としてアンジャナ・ダーンを、カドミウム低蓄積品種として日本晴を選び、アンジャナ・ダーンと日本晴について、カドミウムの蓄積量についてさらに詳しく解析を行った。図２は、カドミウムによって汚染されていない圃場において栽培したアンジャナ・ダーンと日本晴とについて、地上部および玄米におけるカドミウム濃度を表すグラフである。尚、本実施例においては、上記「地上部」は、地上に出ている部分、つまりイネの茎、葉を含む部分を指し、穀粒は地上部には含まない。図２に示すように、日本晴と比較して、アンジャナ・ダーンの地上部に含まれるカドミウム濃度は２８倍、玄米に含まれるカドミウム濃度は１５倍高いことが明らかになった。【００６４】
次いで、人工のカドミウム汚染土壌において、１／５０００アールのワグネルポットを用いて１７９日間栽培した場合の、アンジャナ・ダーンおよび日本晴におけるカドミウム蓄積量を解析した。用いた人工カドミウム汚染土壌は、０．１Ｎ塩酸抽出画分において、カドミウム濃度７．６ｐｐｍであった。図３は、カドミウム汚染土壌において栽培したアンジャナ・ダーンと日本晴とについて、地上部および玄米におけるカドミウム濃度を表すグラフである。図３に示すように、日本晴と比較して、アンジャナ・ダーンの地上部に含まれるカドミウム濃度は６倍、玄米に含まれるカドミウム濃度は８倍高いことが明らかになった。【００６５】
次いで、アンジャナ・ダーンと日本晴との交配を行い、得られたＦ２集団を用いて、カドミウムの蓄積に関与する量的形質を調べた。具体的には、５０ｎＭのカドミウムを含んだ１／２木村Ｂ溶液を用いて得られたＦ２集団を１０日間栽培し、地上部におけるカドミウム濃度を測定した。尚、１／２木村Ｂ溶液は、多量栄養素（ｍＭ）：ＭｇＳＯ４（０．２８），（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．１８），Ｃａ（ＮＯ３）２（０．１８），ＫＮＯ３（０．０９），ＫＨ２ＰＯ４（０．０９）、および微量栄養素（ｍＭ）：Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４（１０），Ｈ３ＢＯ３（３），ＭｎＣｌ２（０．５），ＣｕＳＯ４（０．２），ＺｎＳＯ４（０．４），（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４（１）を含む培養培地である。１／２木村Ｂ溶液は、１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ５．４に調整したものを用いた。【００６６】
図４は、アンジャナ・ダーンの地上部に含まれるカドミウム濃度を１００とした場合のＦ２集団の地上部に含まれるカドミウム濃度の相対値を表すグラフである。図４中のＡ、Ｈ、およびＢは、それぞれ量的遺伝子座（ＱＴＬ）が検出された近傍のマーカーの遺伝子型を示しており、「Ａ」はアンジャナ・ダーン型、「Ｈ」はヘテロ型、「Ｂ」は日本晴型を表している。図４に示すように、Ｆ２集団における地上部のカドミウム濃度は３：１に分離した。この結果から、アンジャナ・ダーンと日本晴とにおいて、地上部に含まれるカドミウム濃度に差があるのは、一つの遺伝子の違いによって生じていることが明らかになった。【００６７】
そこで、上記Ｆ２集団の地上部へのカドミウムの蓄積量を規定する遺伝子座を検出するために、ＱＴＬ解析を行った。ＱＴＬ解析は、qtl cartographer version 2.5（ノースカロライナ州立大学のバイオインフォマティクスリサーチセンターから提供、http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm）を用いて行った。その結果、地上部へのカドミウムの蓄積に関与するＱＴＬは、座乗していることが明らかになった。このＱＴＬのＬＯＤ値は５３．１であり、寄与率は７２．５％であった。【００６８】
さらに、１０００株以上のＦ２集団を用いて、原因遺伝子のマッピングを行ったところ、地上部へのカドミウムの蓄積に関与するＱＴＬが座乗している候補領域を、マーカーＲＭ２１２５１とＲＭ２１２７５とに挟まれた５００ｋｂの範囲内に絞り込むことができた。この領域に存在する遺伝子を、イネゲノムの注釈情報を収録・公開するデータベースであるＲＡＰ-ＤＢ（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）を用いて検索した。その結果、マーカーＲＭ２１２５１とＲＭ２１２７５との間には、３２個の予測遺伝子が存在することが明らかになった。その内、アンジャナ・ダーンと日本晴との間に塩基配列の差が認められたＯｓＨＭＡ３が、カドミウムの輸送に関与する遺伝子と考えられた。【００６９】
ついで、表１に示した、穀粒に含まれるカドミウム濃度が高い６系統と、日本晴とからｃＤＮＡを作製し、かかるｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。【００７０】
【表１】
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具体的には、ＯｓＨＭＡ３のＣ末端側、つまり日本晴におけるＰＣＲ増幅産物が８４８ｂｐとなる領域においてプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Ｅｘ  Ｔａｑ（製品名、ＴａＫａＲａ製）を用いてＰＣＲ反応液を作製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（製品名、エッペンドルフ社製）を用いて増幅を行った。ＰＣＲの反応条件は、初期変性９４℃  ２０秒、変性９８℃  １０秒、アニーリング６２℃  ３０秒、伸長７２℃  ６０秒、変性から伸長の行程を３５回反復した。【００７１】
図５は、穀粒中のカドミウム濃度が高い７系統のイネについてＰＣＲを行った結果を表す図である。１レーン目：Ｊａｒｊａｎ、２レーン目：アンジャナ・ダーン（Ａｎｊａｎａ  Ｄｈａｎ）、３レーン目：ＩＲ  ５８、４レーン目：Ｂｌｅｉｙｏ、５レーン目：ＩＲ３６、６レーン目：ＰＩ３１２７７７である。図５に示すように、穀粒に含まれるカドミウム濃度が高い上位２品種であるＪａｒｊａｎとアンジャナ・ダーンでは、ＰＣＲ増幅産物の長さが短いことが明らかになった。【００７２】
（２．ＯｓＨＭＡ３遺伝子の単離）
ＯｓＨＭＡ３遺伝子は、以下の方法によってアンジャナ・ダーンおよび日本晴のそれぞれから単離した。具体的には、日本晴由来のＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子のＯＲＦは、データベース（ＲＡＰ-ＤＢ）の情報を基に、Ｎ末端とＣ末端とについてプライマーを設計し、ＰＣＲによって遺伝子を増幅した。アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子は、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（製品名、クロンテック社製）を用いて５’-ＲＡＣＥ、および３’-ＲＡＣＥを行い、ＯＲＦを単離した。【００７３】
日本晴由来のＯｓＨＭＡ３タンパク質（ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質）のアミノ酸配列を配列番号１に、日本晴由来のＯｓＨＭＡ３遺伝子（ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子）の塩基配列を配列番号３に示した。また、アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３タンパク質（ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質）のアミノ酸配列を配列番号２に、アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３遺伝子（ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子）の塩基配列を配列番号４に示した。【００７４】
図６は、日本晴とアンジャナ・ダーンとにおいて、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質およびＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。図６において、ＴＭ１〜ＴＭ８は、膜貫通ドメインを示している。図６に示すように、アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３ａタンパク質には、日本晴由来のＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質と比較して、Ｃ末端側の領域に５３アミノ酸の欠失が認められた。以上のから、アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３ａタンパク質が正常に機能していない可能性が考えられた。尚、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質とＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質との相同性は、９１．４％であった。【００７５】
（３．ＯｓＨＭＡ３遺伝子の機能解析）
まず、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現に対するカドミウム添加の影響について解析した。具体的には、蒔種後１１日目の幼植物を５０ｎＭのカドミウムを含む１／２木村Ｂ溶液を用いて２４時間培養した。陰性対照として、カドミウムを含有しない１／２木村Ｂ溶液を用いて培養を行った。培養後、地上部および根からＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型として定量的ＰＣＲを行った。【００７６】
尚、キアゲンのＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（製品名、キアゲン社製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、インビトロジェンのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII逆転写酵素（製品名、インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。定量的ＰＣＲは、Ｔｈｕｎｄｅｒｂｒｉｄ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（製品名、東洋紡製）を用いてＰＣＲ反応液を作製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｅｐ  ＲｅａｌｐｒｅｘリアルタイムＰＣＲ（製品名、エッペンドルフ社製）を用いて増幅を行った。ＰＣＲの反応条件は、初期変性９５℃  ３０秒、変性９５℃  ３０秒、アニーリング６２℃  ２０秒、伸長７２℃  ３５秒、変性から伸長の行程を４０回反復した。【００７７】
図７は、定量的ＰＣＲの結果を表すグラフである。図７に示すように、ＯｓＨＭＡ３遺伝子は、主に根で発現していることが明らかになった。カドミウムの添加は、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量に影響を及ぼさなかった。また、アンジャナ・ダーンと日本晴との間においても、カドミウムの有無に関わらず、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量に有意な差は認められなかった。この結果から、アンジャナ・ダーンと日本晴との地上部に含まれるカドミウム濃度の差をもたらす要因は、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量の差によるものではなく、ＯｓＨＭＡ３タンパク質の機能の違いによるものであることが明らかになった。【００７８】
次いで、アンジャナ・ダーンおよび日本晴のそれぞれから単離したＯｓＨＭＡ３遺伝子を、酵母に発現させ、ＯｓＨＭＡ３タンパク質のカドミウムの輸送活性を解析した。具体的には、酵母（ＢＹ４７４１株、Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ社から購入）に発現ベクターｐＹＥＳ２（インビトロジェン社製）を用いて日本晴およびアンジャナ・ダーンのそれぞれに由来するＯｓＨＭＡ３を、従来公知の酢酸リチウム法によって導入した。陰性対照としてｐＹＥＳ２ベクターのみを導入した。【００７９】
得られた形質転換酵母を、０μＭ、１０μＭ、または２０μＭのカドミウムを含有する寒天培地に播種し、３０℃で４２時間培養した。具体的には、まず、形質転換酵母を２％グルコースを含み、且つウラシルを含まない液体ＳＣ培地を用いて、対数増殖期（ＯＤ０．５〜１．０）になるまで培養した。測定したＯＤを基に、各株の密度を一定にし、形質転換酵母を滅菌水で３回洗浄してから１０倍毎、５段階の希釈系列を作り、形質転換酵母を寒天培地に５μＬずつスポットした。上記寒天培地にはウラシルを除いたＳＣ培地を用いた。尚、ＧＡＬ１プロモーターによってＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現を誘導するために、炭素元としてガラクトースを用いた。【００８０】
ＯｓＨＭＡ３タンパク質は排出型の輸送体であり、ＯｓＨＭＡ３タンパク質を発現する酵母では、細胞質内のカドミウムが特定のオルガネラに集中するため、カドミウムの毒性によって増殖が抑制されると考え、酵母の増殖を指標として、カドミウムの輸送活性の有無を判断した。【００８１】
図８は、酵母を用いたＯｓＨＭＡ３タンパク質の機能解析の結果を表す図である。図８に示すように、日本晴由来のＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質を発現させた酵母は、陰性対照としてｐＹＥＳ２ベクターを導入した酵母と比較して、カドミウムを含有する培地において増殖が抑制された。この結果から、日本晴由来のＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質はカドミウムの輸送活性を有することが明らかになった。一方、アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３ａタンパク質を発現させた酵母の増殖は、陰性対照としてｐＹＥＳ２ベクターを導入した酵母と同じであった。この結果から、アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３ａタンパク質は、カドミウムの輸送活性を有さないことが明らかになった。【００８２】
さらに、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質についての生理学的な解析を行った。具体的には、蒔種後２８日目のアンジャナ・ダーンおよび日本晴の幼植物を１μＭのカドミウムを含む１／２木村Ｂ溶液を用いて栽培し、経時的に導管液、地上部、および根を採取し、それぞれの部位に含まれるカドミウムの濃度を測定した。尚、導管液は、地上部と根の境目から上部３〜４ｃｍの葉鞘をカミソリを用いて水平に切断し、切断面から滲出してくる液をマイクロピペットを用いて採取した。尚、切断後最初の１〜２マイクロリットルは細胞質液のが混入する可能性があるため、導管液として採取しなかった。【００８３】
図９は、アンジャナ・ダーンおよび日本晴について、導管液、地上部、および根に含まれるカドミウム濃度を経時的に測定した結果を表すグラフである。図９の（ａ）は導管液、（ｂ）は地上部、（ｃ）は根における測定結果を表している。図９に示すように、培養５日目におけるアンジャナ・ダーンの導管液および地上部におけるカドミウム濃度は、日本晴における各部位のカドミウム濃度と比較して、導管液中では６倍、地上部では３倍高いことが明らかになった。【００８４】
一方、根においては、日本晴の方が、アンジャナ・ダーンよりもカドミウム濃度が２倍高いことが明らかになった。この結果は、日本晴と比較して、アンジャナ・ダーンでは、吸収したカドミウムを根に留めておく能力が低いことを示している。【００８５】
そこで、日本晴およびアンジャナ・ダーンの根におけるカドミウムの吸収能について解析した。具体的には、０μＭ〜５μＭのカドミウムを含んだ１／２木村Ｂ溶液に、蒔種後２１日目のアンジャナ・ダーンおよび日本晴の幼植物の根を暴露し、暴露後３０分後に根に吸収されたカドミウムの濃度を測定した。【００８６】
図１０は、アンジャナ・ダーンおよび日本晴の根のカドミウム吸収能を表すグラフである。いずれのカドミウム濃度の培養液に暴露した場合も、カドミウム低蓄積性の日本晴の方が、高蓄積性のアンジャナ・ダーンよりも根のカドミウム吸収能が高かった。この結果は、アンジャナ・ダーンの地上部および穀粒におけるカドミウム高蓄積の要因は、外部からカドミウムを吸収する能力が高いためではないことを示している。【００８７】
そこで、日本晴およびアンジャナ・ダーンの導管液におけるカドミウムの濃度について解析した。具体的には、０μＭ〜５μＭのカドミウムを含んだ１／２木村Ｂ溶液において、蒔種後３３日目のアンジャナ・ダーンおよび日本晴の幼植物の根を３日間培養し、培養後の導管液中のカドミウム濃度を測定した。【００８８】
図１１は、アンジャナ・ダーンおよび日本晴の導管液に含まれるカドミウムの濃度を測定した結果を表すグラフである。日本晴およびアンジャナ・ダーンのどちらの品種においても、培養液に含まれるカドミウム濃度が０．５μＭのときに、導管液に含まれるカドミウムの濃度が飽和した。しかし、アンジャナ・ダーンの導管液には、日本晴と比較して、８．５倍高い濃度のカドミウムが含まれていた。【００８９】
以上の生理学的解析結果は、アンジャナ・ダーンのカドミウム高蓄積性は、カドミウムを根に留めておくことができなくなったことにより導管へ排出されるカドミウムの量が高くなったことに起因していることを示している。すなわち、アンジャナ・ダーンは、日本晴に比べて、根からカドミウムを吸収する活性と根から地上部へカドミウムを輸送する活性とが高いため、アンジャナ・ダーンの地上部および穀粒にカドミウムが高蓄積すると考えられた。【００９０】
（４．形質転換株の機能解析）
アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した形質転換株におけるカドミウムの蓄積を調べた。【００９１】
鋳型として日本晴のゲノムＤＮＡを用い、２．１ｋｂのプロモーターと全長ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子とを有する６．８ｋｂのＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅した。２つのＤＮＡ断片を増幅するために用いたプライマーペアは、それぞれ、5’-atctagaAGCATAAAAGAATAGAGCCGTGGAC-3’（配列番号５）および5’-GGATGCGTCAATCAGTTTACCA-3’（配列番号６）；5’-GGCACAATGAACTTTGACGGT-3’（配列番号７）および5’-CTCTTCTGGACAAGCTTCCTTAATC-3’（配列番号８）である。【００９２】
まず、２つのＤＮＡ断片を、ｐＴＡ２ベクターにクローニングし、その後、制限酵素サイトＡｆｌＩＩを用いて連結した。融合した６．８ｋｂのＤＮＡは、その後、バイナリーベクターであるｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃに挿入した。【００９３】
作製したコンストラクトは、Agrobacterium tumefaciens（ＥＨＡ１０１株）を用いた方法によってアンジャナ・ダーン由来のカルスに形質転換した。【００９４】
プラスミドを導入した後、形質転換植物を、およそ１００日間ゲル上で前培養した。形質転換した幼植物体を、栄養溶液中で１〜３週間栽培し、その後、カドミウム処理に供した。カドミウム処理は、５０ｎＭ ＣｄＳＯ４を含有している栄養溶液に、幼植物体を１０日間曝露した。処理溶液は、２日毎に交換した。【００９５】
図１２は、相補性検定の結果を表す図である。図１２の（ａ）はアンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎを導入した３種類の形質転換株および空ベクターを導入したコントロール株の地上部（Shoot）におけるカドミウム濃度を示し、（ｂ）は根（Root）におけるカドミウム濃度を示している。それぞれのデータは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定（Dunnett’s t-test）を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊」は、危険率５％未満において、コントロール株と形質転換株との間に有意差があることを表し、「＊＊」は、危険率１％未満において、コントロール株と形質転換株との間に有意差があることを表す。【００９６】
図１２の（ａ）に示すように、アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した形質転換株は、地上部におけるカドミウムの蓄積が有意に減少した（ｐ＜０．０１）。これに対して、図１２の（ｂ）に示すように、アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した形質転換株は、根におけるカドミウムの蓄積が有意に増加した（ｐ＜０．０１）。【００９７】
図１３は、アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した３種類の形質転換株および空ベクターを導入したコントロール株における微量栄養素（micronutrient）の濃度を示す図である。形質転換株およびコントロール株を５０ｎＭカドミウムに１０日間にわたって曝露した。それぞれのデータは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝４）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊」は、危険率５％未満において、コントロール株と形質転換株との間に有意差があることを表す。【００９８】
図１４は、アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した３種類の形質転換株および空ベクターを導入したコントロール株における多量栄養素（macronutrient）の濃度を示す図である。形質転換株およびコントロール株を５０ｎＭカドミウムに１０日間にわたって曝露した。それぞれのデータは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝４）。【００９９】
図１３および図１４に示すように、根および地上部における他の微量栄養素や多量栄養素の濃度については、コントロールと形質転換株との間に差異がなかった。【０１００】
これらの結果から、ＯｓＨＭＡ３遺伝子が、アンジャナ・ダーンおよび日本晴の品種間におけるカドミウム蓄積の違いに関与する遺伝子であることが確認できた。【０１０１】
（４．ＲＮＡｉ株の機能解析）
日本晴においてＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによってノックダウンしたＲＮＡｉ株におけるカドミウムの蓄積を調べた。【０１０２】
ヘアピンＲＮＡｉコンストラクトを作製するために、逆方向反復（inverted repeat）として、ＯｓＨＭＡ３ｎ  ｃＤＮＡの５１１ｂｐ断片（転写開始点から８９３ｂｐ〜１４０７ｂｐ）を、トウモロコシ（maize）のユビキチンプロモーターの制御下において、ｐＡＮＤＡベクターにクローニングした。ユビキチンプロモーターを有するコンストラクトを作製するために、プライマーセット5'-AGGATCCATGGCCGGAAAGGATGAGG-3'（配列番号９）および5'-TGGATCCGCAACATCATCCTTTCACTTCACC-3'（配列番号１０）を用いて、ＰＣＲ法によってＯｓＨＭＡ３ｎ  ｃＤＮＡからＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子およびＮＯＳターミネーターを増幅した。増幅した断片は、ｐＡＮＤＡベクターにクローニングし、その後、トウモロコシのユビキチンプロモーターと一緒に切り取り、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃバイナリーベクターにサブクローニングした。【０１０３】
作製したコンストラクトは、アグロバクテリウム法によって、日本晴由来のイネのカルスに導入した。【０１０４】
図１５は、日本晴においてＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによってノックダウンしたＲＮＡｉ株および空ベクターを導入したコントロール株におけるカドミウムの蓄積量を測定した結果を示す図である。図１５の（ａ）は日本晴における３種類のＲＮＡｉ株およびコントロール株の地上部におけるカドミウム濃度を示し、（ｂ）は根におけるカドミウム濃度を示している。ＲＮＡｉ株およびコントロール株を５０ｎＭカドミウムに１０日間にわたって曝露した。それぞれのデータは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊」は、危険率５％未満において、コントロール株とＲＮＡｉ株との間に有意差があることを表し、「＊＊」は、危険率１％未満において、コントロール株とＲＮＡｉ株との間に有意差があることを表す。【０１０５】
図１５の（ａ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによってノックダウンすると、コントロール株と比較して、ＲＮＡｉ株の地上部におけるカドミウムの濃度が、２．１〜２．５倍に有意に上昇した（ｐ＜０．０５）。これに対して、ＲＮＡｉ株の根におけるカドミウム濃度は、コントロール株と比較して、７４〜６０％まで有意に低下した（ｐ＜０．０５）。【０１０６】
図１６は、日本晴においてＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによってノックダウンしたＲＮＡｉ株および空ベクターを導入したコントロール株における微量栄養素の濃度を示す図である。図１６の（ａ）は日本晴における３種類のＲＮＡｉ株およびコントロール株におけるＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現レベルを示し、（ｂ）はＲＮＡｉ株およびコントロール株の地上部および根における微量栄養素の濃度を示している。【０１０７】
ＲＮＡｉ株およびコントロール株を５０ｎＭカドミウムに１０日間にわたって曝露した。図１６の（ａ）は、コントロール株におけるＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量に対するＲＮＡｉ株におけるＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量を示している。【０１０８】
それぞれのデータは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊」は、危険率５％未満において、コントロール株とＲＮＡｉ株との間に有意差があることを表し、「＊＊」は、危険率１％未満において、コントロール株とＲＮＡｉ株との間に有意差があることを表す。【０１０９】
図１６の（ａ）に示すように、コントロール株と比較して、ＲＮＡｉ株では、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量が有意に減少していた。また、図１６の（ｂ）に示すように、根および地上部における亜鉛、銅、マンガンおよび鉄を含む他の微小栄養素の濃度については、ＲＮＡｉ株とコントロール株との間に差異はなかった。【０１１０】
これらの結果から、ＯｓＨＭＡ３遺伝子が、日本晴およびアンジャナ・ダーンの２種の品種間におけるカドミウムの蓄積の違いに関与する遺伝子であることがさらに確認できた。【０１１１】
（５．ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現パターン解析）
２つの品種の異なる組織における２つの対立遺伝子の発現レベルを、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＴ法を用いて解析した。【０１１２】
発現レベルは、以下のプライマーペアを用い、ThunderbirdTM qPCR Mix（Toyobo製）を用いて分析した：
ＯｓＨＭＡ３解析用として、5'-TCCATCCAACCAAACCCGGAAA-3'（配列番号１１）および5'- TGCCAATGTCCTTCTGTTCCCA-3'（配列番号１２）；内部標準としてのヒストンＨ３解析用として、5'-GGTCAACTTGTTGATTCCCCTCT-3'（配列番号１３）および5'-AACCGCAAAATCCAAAGAACG-3'（配列番号１４）。【０１１３】
データは、7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems製)に従って収集した。増幅産物の相対量を見積もるために、ΔＣｔ法を用いた。リアルタイムＰＣＲ法の増幅効率は、希釈したプラスミドＤＮＡを鋳型として用いた標準曲線によって確認した。ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子およびＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子の増幅効率は、共に１．９６であった。【０１１４】
図１７は、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現パターンを示す図である。図１７の（ａ）は、日本晴およびアンジャナ・ダーンの根および地上部におけるＯｓＨＭＡ３遺伝子の２つの対立遺伝子の発現を示し、（ｂ）は日本晴およびアンジャナ・ダーンの根の異なる部分における２つの対立遺伝子の発現を示している。【０１１５】
ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現パターンを調べるために、日本晴およびアンジャナ・ダーン（それぞれ１２日齢）の地上部および根からＲＮＡを抽出した。また、日本晴およびアンジャナ・ダーンの苗を、０μＭ ＣｄＳＯ４または１μＭ ＣｄＳＯ４に２４時間曝露し、その後、根を０〜１ｃｍ、１〜２ｃｍ、および２〜３ｃｍの部分で切断し、ＲＮＡを抽出した。発現レベルは、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＴ法によって決定した。内部標準としてヒストンＨ３を用いた。発現は、ヒストンＨ３の発現レベルに対する発現量を示した。データは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊」は、危険率５％未満において、コントロール株とＲＮＡｉ株との間に有意差があることを表す。【０１１６】
図１７の（ａ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３遺伝子は、カドミウムの蓄積に関して対照的な２つの品種において、主として根において、同じレベルで発現していた。また、図１７の（ｂ）に示すように、根の異なる部分間ではＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現に差異がないことが空間的解析によって示された。さらに、カドミウムに対する曝露によってＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現が影響を受けないことが明らかになった。この結果は、２つの品種においてＯｓＨＭＡ３遺伝子が恒常的に発現していることを示すものである。【０１１７】
（６．ＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在解析）
免疫染色およびプロモーター−ＧＦＰ形質転換イネを用いて、ＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在を確認した。【０１１８】
ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の第９９３位〜第１００４位合成ペプチドを用いてウサギを免疫し、ＯｓＨＭＡ３タンパク質に対する抗体を取得した。使用する前に、取得した抗血清を、ペプチドアフィニティーカラムを通して精製した。日本晴およびアンジャナ・ダーン（それぞれ１０日齢）の根を用いて、ＯｓＨＭＡ３タンパク質の免疫染色を行った。二次抗体（Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG; Molecular Probes）の蛍光は、共焦点レーザー顕微鏡（LSM700；Carl Zeiss製）によって観察した。【０１１９】
トランスレーショナルなｐＯｓＨＭＡ３−ＧＦＰ融合遺伝子を作製するために、プライマーセット5'-ATCTAGAAGCATAAAAGAATAGAGCCGTGGAC-3'（配列番号１５）および5'-ATCTAGAATGCAAGTGGGGATCAAGGA-3'（配列番号１６）を用いて、ＰＣＲ法によって、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の２ｋｂ上流領域（翻訳開始コドンより−３４ｂｐ〜−２０９４ｂｐ）を、日本晴のゲノムＤＮＡから増幅した。ｐＵＣ１８ベクター（Ｔａｋａｒａ）において、ＧＦＰおよびＮＯＳターミネーターのＸｂａＩサイトに、プロモーターをクローニングした。ｐＯｓＨＭＡ３ｎ−ＧＦＰおよびＮＯＳターミネーターを有しているコンストラクトは、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃバイナリーベクターにサブクローニングした。【０１２０】
作製したコンストラクトは、アグロバクテリウム法によって、日本晴由来のイネのカルスに導入した。ＧＦＰシグナルは、共焦点レーザー顕微鏡（LSM700；Carl Zeiss製）によって観察した。【０１２１】
図１８は、イネの根におけるＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在を示す図である。図１８の（ａ）はアンジャナ・ダーンの根における免疫染色の結果を示し、（ｂ）は日本晴の根における免疫染色の結果を示している。図中のスケールバーは、１００μｍに相当する。【０１２２】
図１８の（ａ）および（ｂ）に示すように、抗ＯｓＨＭＡ３ポリクローナル抗体を用いた免疫染色によって、ＯｓＨＭＡ３タンパク質が根の全ての細胞に局在していることが確認された。また、アンジャナ・ダーンと日本晴ではＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在に差異がないことが確認された。【０１２３】
図１８の（ｃ）はｐＯｓＨＭＡ３ｎ−ＧＦＰを形質転換した日本晴の根におけるＧＦＰタンパク質の蛍光を示し、（ｄ）は野生型日本晴の根におけるＧＦＰタンパク質の蛍光を示している。図中のスケールバーは、１００μｍに相当する。【０１２４】
図１８の（ｃ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３ｎプロモーターの制御下にＧＦＰをつないだｐＯｓＨＭＡ３ｎ−ＧＦＰを形質転換した日本晴は、根の全ての細胞においてＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質が発現していた。これに対して、図１８の（ｄ）に示すように、野生型の日本晴では、ＧＦＰシグナルは観察されなかった。【０１２５】
図示しないが、抗ＯｓＨＭＡ３抗体を用いた過剰発現株の免疫染色では、ＯｓＨＭＡ３タンパク質のシグナルは非常に亢進していた。これに対して、抗ＯｓＨＭＡ３抗体を用いたＲＮＡｉ株の免疫染色では、ＯｓＨＭＡ３タンパク質のシグナルは、非常に低下していた。これらの結果から、免疫染色に用いた抗ＯｓＨＭＡ３抗体の特異性が確認された。【０１２６】
図示しないが、ＯｓＨＭＡ３タンパク質のシグナルは、核の外側で観察された。このことから、ＯｓＨＭＡ３タンパク質は液胞膜に局在していることが明らかになった。【０１２７】
ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子のＯＲＦおよびＯｓＨＭＡ３ａ  ｃＤＮＡ断片は、プライマーセット5'-ATCCGGAATGGCCGGAAAGGATGAGGC-3'（配列番号１７）および5'-TTCCGGATCCTTTCACTTCACCGGAG-3'（配列番号１８）を用いて増幅した。ＯｓＨＭＡ３断片を、リンカー配列（ＳＧＧＧＧＧＧ）を有しているＧＦＰの３’末端に連結し、ｐＵＣ１８（Ｔａｋａｒａ）において、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下に配置した。得られたプラスミド（ｐＧＦＰ−ＯｓＨＭＡ３）またはＧＦＰのみを、１１００プシープレッシャーディスクを用いた粒子衝突（PDS-1000/He particle delivery system, Bio-Rad, http
://www.bio-rad.com/）によってタマネギの表皮細胞に導入した。ＧＦＰシグナルは、共焦点レーザー顕微鏡（LSM700；Carl Zeiss製）によって観察した。【０１２８】
図１９は、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質の細胞内の局在を示す図である。図１９の（ａ）は、ＧＦＰ−ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質を発現しているタマネギの表皮細胞におけるＧＦＰの蛍光を示し、（ｂ）はＧＦＰタンパク質のみを発現しているタマネギの表皮細胞におけるＧＦＰの蛍光を示している。図中のスケールバーは、１００μｍに相当する。【０１２９】
図１９の（ａ）に示すように、タマネギの表皮細胞におけるＯｓＨＭＡ３ｎ−ＧＦＰ融合タンパク質の一過性の発現を観察することによって、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質が液胞膜に局在することが明らかになった。図示しないが、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質についても同様の結果が得られた。さらに、ＧＦＰ−ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質またはＧＦＰ−ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質と小胞体マーカーであるＤｓＲｅｄ−ＨＤＥＬとの共発現の結果から、ＯｓＨＭＡ３タンパク質は、小胞体ではなく、液胞膜に局在していることがさらに確認された（図示しない）。【０１３０】
図２０は、ウエスタンブロット解析の結果を示す図である。日本晴（１３７日齢）から作出した、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質の過剰発現株の根の全てからミクロソームを抽出し、抗ＯｓＨＭＡ３ｎ抗体を用いたウエスタンブロット解析に供した。ミクロソーム画分は、ショ糖密度勾配によって分画した。一次抗体として、抗ＯｓＨＭＡ３ポリクローナル抗体（１００倍希釈）、抗γ−ＴＩＰポリクローナル抗体（液胞膜マーカー、１０００倍希釈）および抗Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅポリクローナル抗体（細胞膜マーカー）を用いた。二次抗体として、ＥＣＬペルオキシダーゼ標識抗−ウサギ抗体（１００００倍希釈、GE Healthcare製）を用い、ECL Plus western blotting detection system（GE Healthcare製）を用いて、シグナルを検出した。【０１３１】
図２０の（ａ）は、抗ＯｓＨＭＡ３ｎ抗体の特異性を示し、（ｂ）はショ糖密度勾配解析の結果を示している。【０１３２】
図２０の（ａ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３タンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロット解析によって、予測されたサイズに単一のバンドが確認されたことから、この抗体の特異性が確認された。また、図２０の（ｂ）に示すように、ショ糖密度勾配解析によって、ＯｓＨＭＡ３タンパク質が、液胞膜マーカーであるγ−ＴＩＰと同じ分画に存在することが明らかになった。これらの結果から、イネの根の細胞において、ＯｓＨＭＡ３タンパク質は、液胞膜に局在していることが明らかになった。【０１３３】
（６．酵母における輸送活性の解析）
アンジャナ・ダーンと日本晴との間のカドミウム蓄積における大きな違いを解析するために、酵母においてそれぞれの遺伝子を発現させた。【０１３４】
サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＢＹ４７４１株（Mat a; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0）、並びに変異株であるΔｚｒｃ１株（Mat a; his3Δ1; leu2Δ0;met15Δ0; ura3Δ0; YMR243c::kanMX4）およびΔｃｏｔ１（Mat a; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0;ura3Δ0; YOR316c::kanMX4）は、Euroscarf（http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html）から購入した。【０１３５】
ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子およびＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子は、ＰＣＲ法によって増幅した。ＯＲＦを含む断片を、酵母発現ベクターであるｐＹＥＳ２に挿入した。【０１３６】
図２１は、カドミウムに関する酵母における機能解析の結果を示す図である。図２１の（ａ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、ＡｔＨＭＡ３遺伝子または２種類のキメラ遺伝子のいずれかを形質導入した野生型の酵母細胞（ＢＹ４７４１株）の、グルコース存在下における成長を示し、（ｂ）は、ガラクトースの存在下における成長を示している。酵母は、２０μＭ ＣｄＳＯ４の存在下において培養した。【０１３７】
なお、Ｎ−ＯｓＨＭＡ３ｎ−Ｃ−ＯｓＨＭＡ３ａ（ＯｓＨＭＡ３ｎａ）およびＮ−ＯｓＨＭＡ３ａ−Ｃ−ＯｓＨＭＡ３ｎ（ＯｓＨＭＡ３ａｎ）は、ＯｓＨＭＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１または配列番号２）の第５０１位において、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質とＯｓＨＭＡ３ａタンパク質とを融合したキメラタンパク質（図２２を参照）を発現している形質転換株である。【０１３８】
図２３は、カドミウムに関する酵母における機能解析の結果を示す図である。図２３の（ａ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、またはＡｔＨＭＡ３遺伝子のいずれかを形質導入したΔｙｃｆ１酵母細胞の、グルコースの存在下における成長を示し、（ｂ）は、ガラクトースの存在下における成長を示している。酵母は、２μＭカドミウムを含む培地において、３日間にわたって培養した。【０１３９】
ｐＹＥＳ２ベクターにおいて、ＧＡＬ１プロモーターからの遺伝子の発現は、ガラクトースの存在下において誘導され、グルコースの存在下において抑制されることが知られている。このため、形質導入した遺伝子の発現を抑制するためにグルコースを培地に添加し、形質導入した遺伝子の発現を誘導するためにガラクトースを培地に添加した。【０１４０】
図２１の（ａ）に示すように、グルコースの存在下において、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を含んでいるプラスミドを有する酵母、およびＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子を含んでいるプラスミドを有する酵母において、カドミウムに対する感受性に差異はなかった。しかし、図２１の（ｂ）に示すように、ガラクトースの存在下において、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を発現している酵母は、カドミウムに対する感受性が強くなっていた。一方、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子を発現している酵母は、コントロールと同様の成長を示した。【０１４１】
また、図２３の（ａ）および（ｂ）に示すように、カドミウム感受性変異体であるΔｙｃｆ１酵母においてＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子およびＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を発現させると、図２１と同じ結果を示した。これらの結果から、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子は、酵母においてカドミウム輸送体として機能し、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子は、カドミウム輸送体として機能しないと考えられた。【０１４２】
図２４は、金属に関する酵母における機能解析の結果を示す図である。図２４の（ａ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、またはポジティブコントロールとしてＡｔＨＭＡ３遺伝子のいずれかを形質導入したΔｚｒｃ１酵母株の、ガラクトースおよび４ｍＭ ＺｎＳＯ４の存在下における成長を示し、（ｂ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、またはポジティブコントロールとしてＡｔＨＭＡ３遺伝子のいずれかを形質導入したΔｃｏｔ１酵母株の、ガラクトースおよび２．５ｍＭ ＣｏＣｌ２の存在下における成長を示し、（ｃ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａＨ８０Ｒ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａＶ６３８Ａ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａＨ８０Ｒ／Ｖ６３８Ａ遺伝子、またはＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子のいずれかを形質導入した野生型酵母細胞の、ガラクトースおよび２０μＭ ＣｄＳＯ４の存在下における成長を示している。全ての酵母株は、３０℃で３日間培養した。【０１４３】
なお、ＯｓＨＭＡ３ａＨ８０Ｒ、ＯｓＨＭＡ３ａＶ６３８ＡおよびＯｓＨＭＡ３ａＨ８０Ｒ／Ｖ６３８Ａは、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子（配列番号４）の塩基配列の第８０位および／または第６３８位における部位特異的突然変異体である。【０１４４】
図２４の（ａ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を形質導入したΔｚｒｃ１酵母株と、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子を形質導入したΔｚｒｃ１酵母株とでは、亜鉛に対する感受性に差異がなかった。また、図２４の（ｂ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を形質導入したΔｃｏｔ１酵母株と、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子を形質導入したΔｃｏｔ１酵母株とでは、コバルトに対する感受性に差異がなかった。これに対して、ポジティブコントロールとしてＡｔＨＭＡ３遺伝子を形質導入したΔｃｏｔ１酵母株では、コバルトに対する感受性が強くなっていた。【０１４５】
ＯｓＨＭＡ３タンパク質は、イネの根の液胞膜に局在している（図１９の（ａ）および（ｂ））。酵母においてもＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在が同じであれば、機能的なＯｓＨＭＡ３タンパク質の発現は、カドミウムに対する耐性を強くすると考えられた。しかし、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を発現する酵母は、カドミウムに対する感受性が強くなっていた（図２１の（ｂ））。この矛盾は、酵母におけるＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在ミスに起因すると考えられた。具体的には、ＯｓＨＭＡ３タンパク質は、酵母では小胞体に局在していると考えられた（図示しない）。それゆえ、機能的なＯｓＨＭＡ３タンパク質は、カドミウムを小胞体へ輸送し、その結果、カドミウム感受性が強くなったと考えられた（図２１の（ｂ））。【０１４６】
ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子における機能の欠失の基礎となる機構を分析するために、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質およびＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のキメラタンパク質を２種類作製した。ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質とＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質との間で最も異なる部分はＣ末端側にあり、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質では、推定された金属結合ドメインの繰り返し内で、５３個のアミノ酸残基が欠失している（ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質は９個の繰り返しを有し、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質は６個の繰り返しを有している）（図６を参照）。【０１４７】
ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の第５０１位において、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質のＮ末端型を、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のＣ末端型と融合させたキメラタンパク質、またはＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）の第５０１位において、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のＮ末端型を、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質のＣ末端型と融合させたキメラタンパク質（図２２を参照）を用いて、輸送活性における金属結合ドメインの繰り返しの役割を解析した。【０１４８】
ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質において観察されたように、Ｎ−ＯｓＨＭＡ３ｎ−Ｃ−ＯｓＨＭＡ３ａキメラタンパク質において、カドミウム感受性が強くなっていた（図２１の（ｂ））。しかし、Ｎ−ＯｓＨＭＡ３ａ−Ｃ−ＯｓＨＭＡ３ｎキメラタンパク質では、カドミウム感受性に変化が無かった（図２１の（ｂ））。これらの結果は、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質のＣ末端における５３残基の欠失ではなく、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質におけるＮ末端領域が、カドミウム輸送機能に重要であることを示している。【０１４９】
２つの対立遺伝子のＮ末端部をさらに比較した。膜貫通ドメイン予測プログラム（SOSUI; http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/）を用いて、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の第８０位および第６３８位におけるアミノ酸の変異が、予測された膜貫通ドメインの数の違いをもたらしていることを見出した。これらの変異がＯｓＨＭＡ３ａタンパク質の機能の欠失に関与することを調べるために、酵母発現系を用いて部位特異的突然変異解析を行った。【０１５０】
図２４の（ｃ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の第８０位におけるヒスチジン（Ｈｉｓ）をアルギニン（Ａｒｇ）に置換したタンパク質（Ｈ８０Ｒ）では、カドミウムに対する感受性が強くなっていた。しかし、第６３８位のバリン（Ｖａｌ）をアラニン（Ａｌａ）に置換したタンパク質（Ｖ６３８Ａ）では、カドミウム感受性は変化しなかった。この結果は、キメラタンパク質の実験結果（図２３の８ｂ））と一致していた。また、第８０位および第６３８位でのアミノ酸置換体（Ｈ８０Ｒ／Ｖ６３８Ａ）も、カドミウムに対する感受性が増加していた（図２４の（ｃ））。これらの結果から、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）の第８０位におけるアミノ酸が、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質の機能にとって重要である可能性が示唆された。【０１５１】
（７．形質転換株の機能解析２）
穀粒におけるカドミウムの蓄積が、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現レベルの操作によって低下する可能性を調べるために、カドミウム低蓄積性の品種である日本晴において、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を、トウモロコシユビキチンプロモーターの制御下において過剰発現させた。【０１５２】
図２６は、過剰発現株およびベクターコントロール株におけるＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子の発現レベルを示す図である。発現レベルは、ベクターコントロール株に対する値として示した。データは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊＊」は、危険率１％未満において、ベクターコントロール株と過剰発現株との間に有意差があることを表す。【０１５３】
図２６に示すように、過剰発現株では、ベクターコントロール株と比較して、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現が有意に増加していることが確認された。【０１５４】
これらの過剰発現株、ベクターコントロール株および形質転換していない日本晴（非形質転換株）を、中程度にカドミウム汚染された土壌（1.5 mg Cd kg-1）において湛水することなく５ヶ月間栽培した。処理後、フレーム原子吸光分析（Ｚ−２０００；日立製作所製）によってカドミウムおよび他の金属を測定するために、葉身（leaf blade）および葉鞘を含む地上部、根、並びに玄米に分けて収穫した。【０１５５】
結果を図２５に示す。図２５は、カドミウムの蓄積および他の金属の蓄積に関するＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子の過剰発現の作用を示す図であり、（ａ）は、玄米におけるカドミウムの濃度を示し、（ｂ）は玄米における亜鉛の濃度を示し、（ｃ）は玄米における鉄の濃度を示している。なお、データは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊＊」は、危険率１％未満において、ベクターコントロール株と過剰発現株との間に有意差があることを表す。【０１５６】
図２５の（ａ）に示すように、カドミウム汚染土壌において栽培すると、ベクターコントロール株および非形質転換株と比較して、過剰発現株では、玄米におけるカドミウム濃度が有意に低下していた（ｐ＜０．０１）。また、図２５の（ｂ）および（ｃ）に示すように、玄米における亜鉛および鉄の濃度は、ベクターコントロール株および過剰発現株の間で差異がなかった。【０１５７】
図２７は、カドミウムの蓄積および他の金属の蓄積に関するＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子の過剰発現の作用を示す図であり、（ａ）は、地上部におけるカドミウムの濃度を示し、（ｂ）は地上部における亜鉛の濃度を示し、（ｃ）は地上部における鉄の濃度を示している。なお、データは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊＊」は、危険率１％未満において、ベクターコントロール株と過剰発現株との間に有意差があることを表す。【０１５８】
図２７の（ａ）〜（ｃ）に示すように、地上部においても、玄米と同じ傾向が観察された。
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
本発明によれば、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を生産することができる。かかる形質転換植物は、様々な用途に利用することができる。例えば、カドミウムの蓄積の局在性を根に変化させた形質転換植物は、カドミウムを含む土壌においても栽培できる。また、カドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させた形質転換植物は、カドミウムを含有する土壌を浄化するために用いることができる。それゆえ、本発明は、農業において好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図５】
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【図８】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年4月18日(2011.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
根を除く植物体におけるカドミウムの蓄積性を低下または向上させる方法であって、
根を除く植物体におけるカドミウムの蓄積性を低下させる場合は、下記の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを、植物に発現可能に導入し、
根を除く植物体におけるカドミウムの蓄積性を向上させる場合は、下記の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドを、植物に発現可能に導入し、
当該方法は、植物において、カドミウム以外の金属、多量栄養素および微量栄養素の輸送には影響を与えることなく、根を除く植物体におけるカドミウムの蓄積性のみを特異的に低下または向上させることを特徴とする方法：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウム以外の金属、多量栄養素および微量栄養素の輸送には影響を与えることなく根を除く植物体におけるカドミウムの蓄積性のみを特異的に低下させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウム以外の金属、多量栄養素および微量栄養素の輸送には影響を与えることなく根を除く植物体におけるカドミウムの蓄積性のみを特異的に向上させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
上記植物はイネ科植物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法によってカドミウム以外の金属、多量栄養素および微量栄養素の輸送には影響を与えることなく、根を除く植物体におけるカドミウムの蓄積性のみを特異的に低下または向上させたことを特徴とする形質転換植物。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法を実施するためのキットであって、
下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするキット：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペブチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウム以外の金属、多量栄養素および微量栄養素の輸送には影響を与えることなく根を除く植物体におけるカドミウムの蓄積性のみを特異的に低下させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペブチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウム以外の金属、多量栄養素および微量栄養素の輸送には影響を与えることなく根を除く植物体におけるカドミウムの蓄積性のみを特異的に向上させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【国際調査報告】
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