(57)【要約】脊椎動物におけるプロ炎症性サイトカイン放出または炎症を阻害する方法が提供される。本方法は、脊椎動物の脳マスカリン製レセプターを活性化するか、または脊椎動物の脳の迷走神経経路を直接刺激することを含む。感覚刺激を受けた際に脊椎動物においてプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するか、または脊椎動物において炎症を低減するようにせきつい動物を条件付ける方法もまた提供される。本方法は、（ａ）ムスカリン性脳レセプターを活性化するか、または迷走神経経路を直接刺激し、感覚刺激と脳ムスカリン性レセプターの活性化との間に関連性が作られるのに十分な期間、脊椎動物に感覚刺激を提供すること；および（ｂ）感覚刺激のみにより炎症が低減されるように十分に関連性を増強するのに十分な間隔および期間、工程（ａ）を繰り返すことを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化させることを含む、炎症性サイトカインカスケードにより媒介される疾患の危険性にあるか、または該疾患を有する脊椎動物においてプロ炎症性サイトカインの放出を阻害する方法。
【請求項２】
プロ炎症性サイトカインが、腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン（IL）-1α、IL-1β、IL-6、IL-18、HMG-B1、MIP-1α、MIP-1β、MIF、インターフェロンγ、およびPAFからなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
プロ炎症性サイトカインがTNFである請求項１記載の方法。
【請求項４】
脊椎動物がヒトである請求項１記載の方法。
【請求項５】
疾患が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、炎症性腸疾患、憩室炎、喉頭蓋炎、噴門痙攣、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、腸炎、ウイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、器官虚血、再灌流傷害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺限外顕微鏡的間質性肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染、疱疹感染、HIV感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、腹腔疾患、うっ血性心不全、成人呼吸促進症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギヤン-バレー症候群、神経炎、神経痛、脊椎損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶、移植片対宿主病、I型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ライター症候群、およびホジキン病からなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項６】
炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎、虚血性大腸炎、およびクローン病からなる群より選ばれる請求項５記載の方法。
【請求項７】
関節炎がリウマチ様関節炎である請求項５記載の方法。
【請求項８】
疾患が、同種移植拒絶、関節炎、喘息、狼瘡、成人呼吸促進症候群、膵炎、腹膜炎、火傷、ベーチェット病、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、器官虚血、再灌流傷害、心筋虚血、および悪液質からなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項９】
疾患がショック、慢性閉塞性肺疾患、または乾癬である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
疾患がセプシスである請求項１記載の方法。
【請求項１１】
脳ムスカリン性レセプターがM1、M2、およびM4レセプターからなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項１２】
脳ムスカリン性レセプターが、脊椎動物にムスカリン性アゴニストを投与することにより活性化される請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ムスカリン性アゴニストが脊椎動物の脳に直接投与される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ムスカリン性アゴニストが脊椎動物の血液脳関門を通過することができ、該アゴニストが経腸的もしくは非経口的に投与されるか、または脊椎動物の血流に注射される請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ムスカリン性アゴニストがムスカリン、McN-A-343、およびMT-3からなる群より選ばれる請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
脊椎動物の脳における迷走神経経路を直接刺激することを含む、炎症サイトカインカスケードにより媒介される疾患の危険性があるか、または該疾患を有する脊椎動物においてプロ炎症性サイトカインの放出を阻害する方法。
【請求項１７】
迷走神経経路が電気的に刺激される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
プロ炎症性サイトカインの放出を阻害するのに十分なレベルで脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化することを含む、脊椎動物において炎症性疾患を処置する方法。
【請求項１９】
脊椎動物がヒトである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
炎症性疾患が、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
炎症性疾患が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、炎症性腸疾患、憩室炎、喉頭蓋炎、噴門痙攣、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、腸炎、ウイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、器官虚血、再灌流傷害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺限外顕微鏡的間質性肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染、疱疹感染、HIV感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、腹腔疾患、うっ血性心不全、成人呼吸促進症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギヤン-バレー症候群、神経炎、神経痛、脊椎損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶、移植片対宿主病、I型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ライター症候群、およびホジキン病からなる群より選ばれる請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎、虚血性大腸炎およびクローン病からなる群より選ばれる請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
関節炎がリウマチ様関節炎である請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
炎症性疾患が、同種移植拒絶、関節炎、喘息、ループス、成人呼吸促進症候群、膵炎、腹膜炎、火傷、ベーチェット病、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、器官虚血、再灌流傷害、心筋虚血、および悪液質からなる群より選ばれる請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
炎症性疾患がショック、慢性閉塞性肺疾患、または乾癬である請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
疾患がセプシスである請求項１８記載の方法。
【請求項２７】
脳ムスカリン性レセプターがM1、M2、およびM4レセプターからなる群より選ばれる請求項１８記載の方法。
【請求項２８】
脳ムスカリン性レセプターが、脊椎動物にムスカリン性アゴニストを投与することにより活性化される請求項１８記載の方法。
【請求項２９】
ムスカリン性アゴニストが脊椎動物の脳に直接投与される請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ムスカリン性アゴニストが脊椎動物の血液脳関門を通過することができ、該アゴニストが経腸的もしくは非経口的に投与されるか、または脊椎動物の血流に注射される請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
ムスカリン性アゴニストがムスカリン、McN-A-343、およびMT-3からなる群より選ばれる請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
脊椎動物のプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するのに十分な量で脊椎動物の脳における迷走神経経路を直接刺激することを含む、脊椎動物において炎症性疾患を処置する方法。
【請求項３３】
迷走神経経路が電気的に刺激される請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化することを含む、心筋細胞アポトーシスの危険性がある脊椎動物において心筋細胞のアポトーシスを阻害する方法。
【請求項３５】
脊椎動物の脳における迷走神経経路を直接刺激することを含む、心筋細胞アポトーシスの危険性がある脊椎動物において心筋細胞のアポトーシスを阻害する方法。
【請求項３６】
（ａ）感覚刺激と脳ムスカリン性レセプターの活性化との間に関連性が作られるのに十分な期間、脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化し、かつ脊椎動物に感覚刺激を提供すること；および
（ｂ）プロ炎症性サイトカイン放出が感覚刺激のみにより阻害されるように関連性を十分に増強するのに十分な間隔および期間、工程（ａ）を繰り返すこと、
を含む、感覚刺激を受ける際にプロ炎症性サイトカインの放出が阻害されるように脊椎動物を条件付ける方法。
【請求項３７】
（ａ）感覚刺激と迷走神経経路の刺激との間に関連性が作られるのに十分な期間、脊椎動物の脳内の迷走神経経路を直接刺激し、かつ脊椎動物に感覚刺激を提供すること；および
（ｂ）プロ炎症サイトカイン放出が感覚刺激のみにより阻害されるように関連性を十分に増強するのに十分な間隔および期間、工程（ａ）を繰り返すこと、
を含む、感覚刺激を受ける際にプロ炎症性サイトカインの放出が阻害されるように脊椎動物を条件付ける方法。
【請求項３８】
（ａ）感覚刺激と脳ムスカリン性レセプターの活性化との間に関連性が作られるのに十分な期間、脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化し、かつ脊椎動物に感覚刺激を提供すること；および
（ｂ）炎症が感覚刺激のみにより低減されるように関連性を十分に増強するのに十分な間隔および期間、工程（ａ）を繰り返すこと、
を含む、感覚刺激を受ける際に脊椎動物において炎症が低減されるように脊椎動物を条件付ける方法。
【請求項３９】
（ａ）感覚刺激と脳ムスカリン性レセプターの活性化との間に関連性が作られるのに十分な期間、脊椎動物の脳における迷走神経経路を直接刺激し、かつ脊椎動物に感覚刺激を提供すること；および
（ｂ）炎症が感覚刺激のみにより低減されるのに十分に関連性を増強するのに十分な間隔および期間、工程（ａ）を繰り返すこと、
を含む、感覚刺激を受ける際に脊椎動物において炎症が低減されるように脊椎動物を条件付ける方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、2002年２月26日に出願された米国仮出願第60/360,082号の利益を主張する。上記出願の全体の教示が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般に炎症を低減する方法に関する。より詳細には、本発明は、プロ炎症性サイトカインまたは炎症性サイトカインカスケードにより引き起こされる炎症を低減する方法に関する。
【０００３】
脊椎動物は、プロ炎症性および抗炎症性経路の活性を釣り合わせることにより、感染または損傷の間に内部ホメオスタシスを達成する。しかし、多くの疾患状態では、この内部ホメオスタシスは不均衡になる。例えば、全てのグラム陰性菌により産生される内毒素（リポポリサッカリド、LPS）はマクロファージを活性化し、宿主に対して潜在的に致命的であるサイトカインを放出する（Traceyら、1986; Dinarello, 1994; Wang Hら、1999; Nathan, 1987）。
【０００４】
炎症および他の有害な状態（内毒素曝露により引き起こされる肺血性ショック等）は、腫瘍壊死因子（TNF; TNFαまたはカケクチンとしても知られる）、インターロイキン（IL）０-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、インターフェロン-γ、血小板活性化因子（PAF）、マクロファージ遊走阻害因子（MIF）、および他の化合物（Thompson, 1998）等のプロ炎症性サイトカインによりしばしば誘導される。所定の他の化合物、例えば、高移動群タンパク質１（HMG-B1）は、敗血症等の種々の疾患の間に誘導され、プロ炎症性サイトカインとしても働きうる（WO 00/47104）。これらのプロ炎症性サイトカインは、いくらかの異なる細胞型、最も重要には免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、および好中球）ならびに線維芽細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、およびニューロン等の非免疫細胞によっても産生される（ZhangおよびTracey, 1998）。プロ炎症性サイトカインは、炎症性サイトカインカスケードの間のそれらの放出を通じて、種々の障害、主として敗血症に寄与する。
【０００５】
炎症性サイトカインカスケードは、多数の障害の有害な特徴に寄与する。これらの有害な特徴としては、炎症およびアポトーシスが挙げられる（Pulkki,1997）。炎症性サイトカインカスケードが少なくとも部分的に関連する障害としては、胃腸管および関連する組織に関する疾患（虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎および虚血性大腸炎、炎症性腸疾患、憩室炎、喉頭蓋炎、噴門痙攣、胆管炎、腹腔疾患、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、およびホイップル病等）；全身性または局所性炎症疾患および状態（喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、器官虚血、再灌流傷害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、およびサルコイドーシス等）；泌尿生殖器系および関連する組織に関する疾患（敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、および尿道炎）；呼吸器系および関連する組織に関する疾患（気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、成人呼吸促進症候群、肺炎、肺限外顕微鏡的間質性肺炎（pneumoultramicroscopic silicovolcanoconiosis）、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、および副鼻腔炎等）；種々のウイルス（インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、HIV、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、および疱疹等）、細菌（播種性菌血症、デング熱等）、菌類（カンジダ症等）および原生生物および多細胞寄生生物（マラリア、フィラリア症、アメーバ症、および包虫等）による感染から生じる疾患；皮膚病および皮膚の状態（火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、じんま疹、いぼ、および膨疹等）；循環系および関連する組織に関する疾患（血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血管静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、うっ血性心不全、結節性動脈周囲炎、およびリウマチ熱等）；中枢神経または末梢神経系および関連する組織に関する疾患（アルツハイマー病、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギヤン-バレー(Guillame-Barre)症候群、神経炎、神経痛、脊椎損傷、麻痺、ブドウ膜炎等）；骨、関節、筋肉、および結合組織の疾患（種々の関節炎および関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎、および滑膜炎等）；他の自己免疫性および炎症性障害（重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主疾患、Ｉ型糖尿病、バージャー病、およびライター(Retier)症候群等）；ならびに種々の癌、腫瘍および増殖性障害（ホジキン病等）；および、任意の場合、任意の原発性疾患に対する炎症または免疫宿主応答（例えば、Gattornoら、2000; YehおよびSchuster, 1999; McGuinnessら、2000; Hsuら、1999; JanderおよびStoll, 2001; Kanaiら、2001; PrystowskyおよびRege, 1997; Kimmingsら、2000; Hirano, T., 1999; Leeら、1995;Wasermanら、2000; Watanabeら、1997; Katagiri,ら、1997; Bumgardner, およびOrosz, 1999; Dibbsら、1999; BlackwellおよびChristman, 1996; BlumおよびMiller, 1998; Carteron, 2000; Fox, 2000; Hommesおよびvan Deventer, 2000; Gracieら、1999; Raynerら、2000参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００６】
腫瘍壊死因子は、種々の急性および慢性炎症性疾患（例えば、グラム陰性細菌性敗血症、多臓器不全(MSOF)、循環虚脱および死亡）の主要なプロ炎症性サイトカインメディエータであることが知られている。敗血症チャレンジ後の循環TNFの主要な供給源は肝臓である。従って、2/3肝切除に供したラットは、偽対照と比べて内毒素後のTNFの産生が64％低い（Kuminsら、1996）。
【０００７】
心筋によるTNFの直接産生はまた、敗血性心筋抑制（septic myocardial depression）にいて主要な役割を果たすようである。筋細胞は、TNFの直接的な産生によって、およびTNFレセプターを増大することによってストレスに応答する（Irwinら、1999）。心臓で局所的に産生されるか、または他の供給源に由来するTNFは、筋細胞アポトーシスおよび血栓症を引き起こす（Songら、2000）。TNFは、敗血性心筋症、両室機能障害、および肺水腫に続く心不全を含む種々の心臓障害に関連付けられている。TNFはまた、心機能に対する直接的な陰性変力効果を有しうる。
【０００８】
脊椎動物は、迷走神経活性化により、および末梢抗炎症サイトカイン産生（例えば、IL-10産生）により、中枢神経系の体液性機構を介して炎症性サイトカインカスケードによって部分的に引き起こされる炎症に応答する（視床下部-下垂体副腎[HPA]軸の活性化）。この応答は、内毒素に対する炎症応答の間の全身性体液応答機構に関して詳細に特徴付けられた（Besedovskyら、1986; Woiciechowskyら、1998; Huら、1991; LiptonおよびCatania, 1997）。
【０００９】
迷走神経は、全身ホメオスタシス(とりわけ、求心性および遠心性シグナル伝達の両方による炎症調節を含む)の調節において重要な脳神経である。迷走神経線維は、気管/気管支、腹腔血管、腎臓、小腸および大腸、副腎、肝臓、ならびに心臓等の多くの臓器に達する。動物の足はまた、血管に沿って進む神経線維、および汗腺中の神経線維等により迷走神経支配を受けていることが示された。
【００１０】
一連の応答において、求心性迷走神経線維は、内毒素またはサイトカインによって活性化され、糖コルチコイドホルモン放出による体液性抗炎症応答の放出を刺激する（WatkinsおよびMaier, 1999; Sternberg,1997; Scheinmanら、1995）。サイトカインまたは内毒素は、求心性迷走神経を刺激し得、次に多数の重要な脳核にシグナル伝達し、HPA抗炎症応答の活性化および内毒血症およびサイトカイン血症(cytokinemia)のダウンレギュレーションを導く（Gaykemaら、1995; Fleshnerら、1998; Watkinsら、1995; Romanovskyら、1997）。類似して、ラットにおける直接的な遠心性迷走神経刺激（VNS）は、肝臓におけるTNF合成を低減させることにより、誘導される内毒素チャレンジに続くショックを防止する（米国特許出願第09/855,446号参照。この教示は参考として本明細書中に援用される）。遠心性迷走神経はまた、薬理学的手段によって免疫抑制を達成するように刺激されうる。例えば、抗炎症薬剤CNI-1493は、末梢に投与された場合、血液脳関門を通過する能力、および活動の中枢機構を介して遠心性迷走神経を活性化する能力を有し、抗炎症効果により、末梢免疫抑制を媒介する（Borovikovaら、2000）。CNI-1493の脳室内投与はまた、有効な抗炎症処置である（前出）。
【００１１】
炎症に対する脳コリン作用性アゴニストの直接的な刺激の効果は、Bhattacharya ら、(1991)において評価された。これらの研究では、高用量のムスカリン性アゴニストの直接投与は、カラゲナン誘導性足浮腫の増強を引き起こした。低用量のムスカリン性アゴニストカルバコールは足浮腫の軽減を引き起こしたが、著者らは、全体を通して、脳のムスカリン性アゴニスト処置は、足浮腫の増強を引き起こすと結論づけた。また、この論文では、ムスカリン性アゴニストが炎症を低減するのに有用でありうることの示唆はなかった。
【００１２】
免疫系の条件付け
条件付けは、認知できる中性刺激が、一時的に生理的刺激に関連し、その結果動物が、それが生理的刺激であるかのように中性刺激に最終的に応答することによる動物の訓練法である。例えば、Pavlovは、ベルが鳴る刺激と同時に所定の食物刺激（唾液分泌に関連する）を犬に与えた先の実験後に、ベルが鳴ることに対して唾液分泌で応答するように犬を訓練した。
【００１３】
Elmer Green (1969)は、知覚が精神的および感情的応答を導き、生理的変化を誘導する辺縁系、視床下部、および下垂体の応答を生じることを提案した。AderおよびCohen (1982)はさらに、条件付けの範囲を免疫系に拡大した。彼らは、中性刺激であるサッカリンを繰り返し与え、同時に免疫抑制剤であるシクロフォスファミドに供した後に、ラットが、免疫応答の低減を伴って中性刺激であるサッカリンに応答するように条件付けられうることを示した。観察された効果は、体液性免疫（すなわち、抗体産生）および細胞性免疫（すなわち、移植片対宿主応答）の両方に拡大した（AderおよびCohen、1975; Cohenら、1979; AderおよびCohen, 1982; AderおよびCohen, 1992）。
【００１４】
ヒト研究はまた、免疫調節不全と心理学的疾患とを関連づけた（Cohenら、2001）。さらに催眠法（Wyler-Harperら、1994; Foxら、1999）およびバイオフィードバック（Peaveyら、1985）が免疫応答を調節することにおいて有効であることが見出された。
【００１５】
発明の要旨
したがって、本発明者らは、脊椎動物におけるプロ炎症性サイトカイン放出、および関連する炎症応答が、脳ムスカリン性レセプターを活性化することにより阻害されうることを首尾よく発見した。さらに、本発明者らは、この抗炎症応答が、感覚刺激と脳ムスカリン性レセプターの活性化との繰り返し関連付け(association)によって条件付けられうることを発見した。これらの発見は、プロ炎症性サイトカイン放出および炎症の新規阻害方法を可能にする。
【００１６】
したがって、ある局面では、本発明は、脊椎動物においてプロ炎症性サイトカインの放出を阻害する方法に関する。本方法は、脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化することを含む。
【００１７】
本発明はまた、脊椎動物においてプロ炎症性サイトカインの放出を阻害する方法に関する。本方法は脊椎動物の脳の迷走神経経路を直接刺激することを含む。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、脊椎動物において炎症性疾患を処置する方法に関する。本方法は脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化することを含む。
【００１９】
本発明はさらに、脊椎動物において炎症性疾患を処置する方法に関する。本方法は脊椎動物の脳の迷走神経経路を直接刺激することを含む。
【００２０】
別の局面では、本発明は、心筋細胞アポトーシスの危険性にある脊椎動物において心筋細胞のアポトーシスを阻害する方法に関する。本方法は、脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化させることを含む。
【００２１】
本発明はまた、心筋細胞アポトーシスの危険性にある脊椎動物における心筋細胞のアポトーシスを阻害する方法に関する。本方法は、脊椎動物の脳の迷走神経経路を直接刺激することを含む。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、感覚刺激を受ける際にプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するように脊椎動物を条件付ける方法に関する。本方法は、以下の工程：
（ａ）感覚刺激と脳ムスカリン性レセプターの活性化との間に関連性(association)が作られるのに十分な期間、脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化し、かつ脊椎動物に感覚刺激を提供すること；および
（ｂ）プロ炎症性サイトカイン放出が感覚刺激のみにより阻害されるように関連性を十分に増強するのに十分な間隔および期間、工程（ａ）を繰り返すこと、
を含む。
【００２３】
本発明はまた、感覚刺激を受ける際にプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するように脊椎動物を条件付ける方法に関する。上記方法は、以下の工程：
（ａ）感覚刺激と迷走神経経路の刺激との間に関連性が作られるのに十分な期間、脊椎動物の脳内の迷走神経経路を直接刺激し、かつ脊椎動物に感覚刺激を提供すること；および
（ｂ）プロ炎症サイトカイン放出が感覚刺激のみにより阻害されるように関連性を十分に増強するのに十分な間隔および期間、工程（ａ）を繰り返すこと、
を含む。
【００２４】
本発明はさらに、感覚刺激を受ける際に脊椎動物において炎症を低減するように脊椎動物を条件付ける方法に関する。上記方法は以下の工程：
（ａ）感覚刺激と脳ムスカリン性レセプターの活性化との間に関連性が作られるのに十分な期間、脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化し、かつ脊椎動物に感覚刺激を提供すること；および
（ｂ）炎症が感覚刺激のみにより低減されるように関連性を十分に増強するのに十分な間隔および期間、工程（ａ）を繰り返すこと、
を含む。
【００２５】
さらに、本発明は、感覚刺激を受ける際に脊椎動物において炎症を低減するように脊椎動物を条件づける方法に関する。上記方法は以下の工程：
（ａ）感覚刺激と脳ムスカリン性レセプターの活性化との間に関連性が作られるのに十分な期間、脊椎動物の脳における迷走神経経路を直接刺激し、かつ脊椎動物に感覚刺激を提供すること；および
（ｂ）炎症が感覚刺激のみにより低減されるのに十分に関連性を増強するのに十分な間隔および期間、工程（ａ）を繰り返すこと、
を含む。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターの活性化が末梢において様々なプロ炎症性サイトカインの放出の阻害を引き起こし、次いで末梢の炎症の軽減を引き起こすという発見に基づく。この末梢の炎症の軽減は、ムスカリン性アゴニスト処置によって、または外部感覚刺激とムスカリン性アゴニスト処置との前もっての反復関連付けによるPavlovの条件付け後の外部感覚刺激への暴露によって達成され得る。プロ炎症性サイトカイン放出の阻害および末梢の炎症の軽減は迷走神経依存性であり、脳における迷走神経の直接刺激により軽減され得る。これらの発見は、新規方法での様々な炎症状態の処置を可能とする。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、サイトカインは、脊椎動物細胞により天然に産生され、インビボでマイクロモル濃度からピコモル濃度での体液性調節因子として作用する、可溶性のタンパク質またはペプチドである。サイトカインは、正常条件下または病的条件下のいずれかで個々の細胞および組織の機能活性を調節する。プロ炎症性サイトカインは、炎症に関連する以下の任意の生理学的反応：血管拡張、充血、水腫に関連した管の透過性の増加、顆粒球および単核食細胞の蓄積、またはフィブリンの沈着を引き起こすことのできるサイトカインである。いくつかの場合において、プロ炎症性サイトカインはまた、TNFが心筋細胞アポトーシスを刺激することが示されている (Pulkki, 1997; Tsutsuiら, 2000) 慢性心不全などにおいて、アポトーシスを引き起こし得る。プロ炎症性サイトカインの非限定的な例は、腫瘍壊死因子 (TNF)、インターロイキン (IL)-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、インターフェロン-γ、HMG-B1、血小板活性化因子 (PAF)、およびマクロファージ移動阻害因子 (MIF) である。本発明の好ましい態様において、コリン作用性アゴニスト処置により阻害されるプロ炎症性サイトカインは、TNF、IL-1、IL-6、またはIL-18である。これらのサイトカインはマクロファージにより産生され、多数の重大な障害 (例えば、内毒素性ショック、喘息、慢性関節リウマチ、炎症性胆汁疾患、心不全、および同種移植拒絶) に関する有害な状態を媒介するからである。最も好ましい態様において、プロ炎症性サイトカインはTNFである。
【００２８】
プロ炎症性サイトカインは、炎症を阻害する傾向のある、IL-4、IL-10、およびIL-13などの抗炎症性サイトカインと区別される。好ましい態様において、抗炎症性サイトカインの放出はコリン作用性アゴニストによっては阻害されない。
【００２９】
多くの場合、プロ炎症性サイトカインは、本明細書中では脊椎動物における少なくとも１つのプロ炎症性サイトカインのインビボ放出として規定され、該サイトカイン放出が脊椎動物の生理学的状態に影響を与える、炎症性サイトカインカスケードにおいて産生される。従って、プロ炎症性サイトカイン放出が有害な生理学的状態を引き起こす本発明の態様において、炎症性サイトカインカスケードは阻害される。
【００３０】
プロ炎症性サイトカイン放出により少なくとも部分的に媒介される有害な生理学的状態の存在を特徴とする疾患の非限定的な例は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍または十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎または虚血性大腸炎、炎症性腸疾患、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、器官虚血、再灌流障害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺限外顕微鏡的間質性肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、RSウイルス、ヘルペス、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、じんま疹、いぼ、膨疹、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム硬化症、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎 (periarteritis nodosa) 、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸促進症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギヤン−バレー症候群 (Guillame-Barre syndrome)、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周疾患、慢性関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶、対宿主性移植片病、I型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ライター症候群 (Retier's syndrome)、およびホジキン病である。プロ炎症性サイトカイン放出により媒介される状態の更なる例としては、ショック (例えば出血性ショック)、慢性閉塞性肺疾患 (COPD) および乾癬が挙げられる。
【００３１】
プロ炎症性サイトカインを産生する任意の脊椎動物細胞は、本発明の実施に有用である。非限定的な例は、単球、マクロファージ、プロ炎症性サイトカインを産生し、輸送し、または濃縮する、クップファー細胞および胆管内皮細胞を含む肝臓に内在する任意の細胞、好中球、上皮細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、肝細胞、平滑筋細胞および心筋細胞を含む筋細胞、ならびにニューロンである。好ましい態様において、該細胞はマクロファージ、クップファー細胞、単球、胆管内皮細胞、肝細胞、または心筋細胞である。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、コリン作用性アゴニストは細胞上のコリン作用性レセプターに結合する化合物である。当業者は数種の周知方法のうち任意の方法により、任意の特定化合物がコリン作用性アゴニストであるかどうかを決定し得る。
【００３３】
プロ炎症性サイトカインの放出もしくは炎症性サイトカインカスケードにおけるコリン作用性アゴニストの効果、または炎症性サイトカインカスケードにおける迷走神経刺激の効果を言う場合、「阻害する」または「減少する」という用語の使用は、プロ炎症性サイトカイン放出における少なくとも小さいが測定可能な減少を包含する。好ましい態様において、プロ炎症性サイトカインの放出は非処置対照を超えて、少なくとも20％阻害される；より好ましい態様において、阻害は少なくとも50％である；更により好ましい態様において、阻害は少なくとも70％であり、最も好ましい態様においては、阻害は少なくとも80%である。プロ炎症性サイトカイン放出におけるかかる減少は、炎症性サイトカインカスケードの有害な影響を減らすことが可能である。
【００３４】
従って、いくつかの態様において、本発明は脊椎動物におけるプロ炎症性サイトカインの放出の阻害方法に関する。該方法は、脊椎動物において脳ムスカリン性レセプターを活性化させることを含む。好ましい態様において、プロ炎症性サイトカインは腫瘍壊死因子 (TNF)、インターロイキン (IL)-1β、IL-6、IL-18、HMG-B1、MIP-1α、MIP-1β、MIF、インターフェロンγ、またはPAFである。より好ましい態様において、プロ炎症性サイトカインは腫瘍壊死因子 (TNF)、インターロイキン (IL)-1β、IL-6、IL-18、およびHMG-B1からなる群より選択される。最も好ましい態様において、プロ炎症性サイトカインはTNFである。
【００３５】
これらの方法は、任意の脊椎動物においてプロ炎症性サイトカインの放出を妨げるために有用である。好ましい態様において、脊椎動物は哺乳動物である。特に好ましい態様において、脊椎動物はヒトである。脊椎動物は好ましくは炎症性サイトカインカスケードに媒介される状態を患っている、またはそのような状態の危険性のある患者である。本明細書中で使用される場合、患者は、迷走神経を有する種からの任意の脊椎動物個体であり得る。好ましくは、状態は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎または虚血性大腸炎、炎症性腸疾患、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、器官虚血、再灌流障害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺限外顕微鏡的間質性肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、RSウイルス感染、ヘルペス感染、HIV感染、B型肝炎ウイルス感染、C型肝炎ウイルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメ−バ症、包虫、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム硬化症、血栓性動脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸促進症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギヤン−バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周疾患、慢性関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶、対宿主性移植片病、I型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ライター症候群、およびホジキン病である。より好ましくは、状態は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎および虚血性大腸炎、炎症性腸疾患、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、器官虚血、再灌流障害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、熱傷、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸促進症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄損傷、多発性硬化症、麻痺、同種移植拒絶および対宿主性移植片病である。最も好ましい態様において、状態は内毒素性ショックである。
【００３６】
これらの方法は、脳、または迷走神経が供給される任意の末梢器官において、プロ炎症性サイトカインの放出を妨げるために使用され得る。好ましい例としては、内毒素性ショックなどの全身性炎症カスケードに関与するプロ炎症性サイトカインを作製する、肝臓が挙げられる。心筋細胞は筋細胞アポトーシスおよび血栓症に関わるプロ炎症性サイトカインを放出することが知られていることから、別の好ましい末梢器官は心臓である。
【００３７】
これらの方法で活性化される好ましい脳ムスカリン性レセプターはM1、M2、およびM4レセプターである。これらのレセプターがプロ炎症性サイトカインの放出の阻害において最も強い効果を引き起こすためである。実施例２を参照のこと。従って、ムスカリン性レセプターを活性化するためにムスカリン性アゴニストを利用する態様において、M1、M2、および／またはM4レセプターを活性化させるアゴニストが特に好ましい。これらの方法のために有用な好ましいムスカリン性アゴニストの非限定的な例としては、ムスカリン、McN-A-343、およびMT-3が挙げられる。１つの態様において、ムスカリン性アゴニストはN,N'-ビス(3,5-ジアセチルフェニル)デカンジアンミンテトラキス(アミジノヒドラゾン)テトラヒドロクロリド (CNI-1493) ではない。別の態様において、ムスカリン性アゴニストはCNI-1493化合物ではない。本明細書中で使用される場合、「CNI-1493化合物」とは、芳香族グアニルヒドラゾン (「Ghy」、より適切な用語はアミジノヒドラゾン、すなわち、以下の構造式：
【化１】
2005522457.tif 000002
(式中、X2 はGhyCH-、GhyCCH3- またはH- であり; X1、X'1およびX'2 は独立してGhyCH- またはGhyCCH3- であり; Zは非置換、モノ- またはジ- Cメチル置換、またはそのモノ- もしくはジ- 非飽和誘導体である、-NH(CO)NH-、-(C6H4)-、-(C5NH3)- または -A-(CH2)n-A- (nは2〜10)であり；Aは独立して -NH(CO)-、-NH(CO)NH-、-NH- または -O- である) を有するNH2(CNH(-NH=) 化合物 およびその塩を意味する。GhyCH- はNH2(CNH)-NH-N=CH-であり、GhyCCH3- は NH2(CNH)-NH-N=CCH3- である。好ましい態様は、Aが単一官能性である化合物を含む。X1およびX2がHであり; X'1およびX'2 が独立してGhyCH- またはGhyCCH3-であり; Zが -A-(CH2)n-A- (nは3〜8)であり; Aが -NH(CO)- または -NH(CO)NH-である、同じ構造式を有する化合物およびその塩もまた含まれる。X1およびX2 がHであり; X'1 およびX'2 が独立してGhyCH- またはGhyCCH3- であり、Zが -O-(CH2)2-O- である化合物もまた含まれる。
【００３８】
CNI-1493化合物の更なる例としては、上記構造式の化合物 (式中、X2はGhyCH-、GhyCCH3- またはH-であり；X1、X'1 およびX'2は GhyCH- または GhyCCH3-であり；Z は -O-(CH2)n -O- (n=2〜10) である) およびその塩；ならびに関連化合物 (式中、X2 が H以外の場合は X2 は X1に対してメタまたはパラであり、式中、X'2はX'1 に対してメタまたはパラである) が挙げられる。上記構造式を有する化合物 (式中、X2 は GhyCH, GhyCCH3 またはHであり；X1、X'1 およびX'2, は GhyCH- または GhyCCH3-であり；Z は -NH- (C=O)-NH- である) およびその塩；ならびに関連属 (式中、X2が H以外の場合はX2 はX1 に対してメタまたはパラであり、式中、X'2 はX'1に対してメタまたはパラである) 。
【００３９】
「CNI-1493化合物」はまた、以下の構造式：
【化２】
2005522457.tif 000003
(式中、X1、X2およびX3は独立してGhyCH- またはGhyCCH3- であり；X'1、X2おおよびX'3は独立してH、GhyCH- またはGhyCCH3- であり、m1、m2、m3が0 の場合はZ=Nであり、m1、m2、m3が独立して2〜6の場合はZ=(C6H3)であり；Aは -NH(CO)-、-NH(CO)NH-、-NH- または -O- である) を有する芳香族グアニルヒドラゾン化合物およびその塩を意味する。更なるCNI-1493の例としては、X'1、X2および X'3 のうち任意のものがH以外の場合、X1、X2 およびX3からなる群の対応する置換物がX'1、X2 および X'3 に対してそれぞれメタまたはパラである属；m1、m2、m3が0 で、Aが -NH(CO)- である属；ならびにm1、m2、m3が2〜6で、Aが -NH(CO)NH- である属が挙げられる。CNI-1493の例およびかかる化合物の作製法は、米国特許第5,854,289号 (この教示は参照により本明細書中に援用される) に記載されている。好ましい態様において、CNI-1493化合物は、N,N'-ビス(3,5-ジアセチルフェニル)デカンジアミン (0.65 g)、アミノグアニジンヒドロクロリド (0.691 g)、およびアミノグアニジンデヒドロクロリド (0.01 g) を結合させ、91% エタノール (5.5 mL) 中で18時間加熱し, 続いて冷却および濾過することにより作製し得る、N,N'-ビス(3,5-ジアセチルフェニル)デカンジアミンテトラキス(アミジノヒドラゾン)テトラヒドロクロリド(CNI-1493としても知られる) である。この合成は323℃〜324℃の融解点を有する化合物を生じる。この組成物は、薬学的に許容され得る担体中で製剤化され得る。
【００４０】
従って、脳ムスカリン性レセプターの活性化は、ムスカリン性アゴニストでの処置により達成され得る。本明細書で使用される場合、ムスカリン性アゴニストはムスカリンレセプターに結合し得るアゴニストである。１つの態様において、ムスカリン性アゴニストは、ムスカリンレセプターに加えて他のレセプター型 (例えば、別のコリン作用性レセプター) にも結合し得る。かかるムスカリン性アゴニストの例はアセチルコリンである。別の態様において、ムスカリン性アゴニストは他のコリン作用性レセプター (例えば、ニコチン様レセプター) よりも高い親和性で (例えば、少なくとも10％高い親和性、20％高い親和性、50％高い親和性、75％高い親和性、90％高い親和性、または95％高い親和性で) ムスカリンレセプターを結合する。１つの態様において、ムスカリン性アゴニストはM1、M2、またはM4レセプターに対して選択的である。本明細書中で使用される場合、M1、M2、またはM4レセプターに対して「選択的」であるアゴニストとは、それが１つ、２つ、またはより多くの他のレセプター (例えば、１つ以上の他のムスカリン性レセプター (例えばM3もしくはM5ムスカリン性レセプター)、または１つ以上のコリン作用性レセプター) に結合するよりも高い親和性で、M1、M2、および／またはM4レセプターに結合するアゴニストである。１つの態様において、アゴニストは、M1、M2、および／またはM4レセプター以外のレセプターに結合するよりも、少なくとも10％高い親和性、20％高い親和性、50％高い親和性、75％高い親和性、90％高い親和性または95％高い親和性で結合する。結合親和性は本明細書中に記載のとおりに、または当業者に公知である他のレセプター結合アッセイを使用して決定し得る。１つの態様において、脳ムスカリン性レセプターは充分な量のムスカリン性アゴニストで、または脊椎動物細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するために充分なレベルで活性化される。
【００４１】
ムスカリン性アゴニストは、脳室内注射によって、脳ムスカリン性レセプターに投与され得る。あるいは、ムスカリン性アゴニストは、ムスカリン性アゴニストが血液脳関門を通過することができれば、経口的に、非経口的に、鼻腔内に、膣に、直腸に、舌に、舌下に、頬に (bucally)、頬内に、または経皮的に、患者に投与され得る。
【００４２】
ムスカリン性アゴニストの投与経路は、処置対象の状態に依存し得る。例えば、静脈内注射は敗血性ショックなどの全身性障害の処置に好ましく、経口投与は胃潰瘍などの胃腸障害を処置するために好ましいであろう。投与されるコリン作用性アゴニストの投与経路および投薬量は、過度の実験を要することなく、標準の用量応答研究を用いて当業者によって決定され得る。これらの決定を下す際に考慮すべき関連する環境は、処置対象の状態、投与する組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、および応答、ならびに患者の症状の重篤度を含む。
【００４３】
本発明に有用なムスカリン性アゴニスト組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、鞘内、または皮下注射などにより、非経口的に投与され得る。非経口投与は、本発明のムスカリン性アゴニスト組成物を水溶液または懸濁液に混合することにより達成され得る。かかる水溶液または懸濁液はまた、注射用の水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈液を含み得る。非経口製剤はまた、例えば、ベンジルアルコール、またはメチルパラベン、酸化防止剤 (例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど)、およびキレート剤 (EDTAなど) などの抗菌薬剤を含む。また、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および張性調節のための薬剤 (塩化ナトリウムもしくはデキストロースなど) などの緩衝液も添加され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の多用量バイアルに封入され得る。
【００４４】
直腸投与は、直腸または大腸に医薬組成物を投与することを含む。これは、坐薬または浣腸剤を使用して達成され得る。坐薬製剤は当該分野で公知の方法により作製され得る。例えば坐薬製剤は、約120℃でグリセリンを加熱し、グリセリン中にコリン作用性アゴニストを溶解させ、加熱されたグリセリンを混合した後精製水を添加し得、坐薬の鋳型に熱い混合物を注入することにより調製され得る。
【００４５】
経皮投与は、皮膚を通してのコリン作用性アゴニストの経皮吸収を含む。経皮製剤としては、パッチ、軟膏 (ointment)、クリーム、ゲル、軟膏 (salve)などが挙げられる。
【００４６】
本発明は、治療有効量のムスカリン性アゴニストを脊椎動物に鼻内投与することを含む。本明細書中で使用される場合、鼻内投与はコリン作用性アゴニストを患者の鼻道または鼻腔粘膜に投与することを含む。本明細書中で使用される場合、コリン作用性アゴニストの鼻内投与のための医薬組成物は、例えば、鼻内スプレー、鼻内ドロップ、懸濁液、ゲル、軟膏、クリーム、または粉末などとして周知の方法により調製された治療有効量の投与用アゴニストを含む。コリン作用性アゴニストの投与はまた、鼻内タンポン、または鼻腔内スポンジを使用して行った。
【００４７】
従って、口、舌、舌下、頬および頬内への投与用に設計されたムスカリン性アゴニスト組成物は、過度の実験を要することなく、例えば不活性な賦形剤と共にまたは可食担体と共に、当業者に公知の方法によって作製され得る。組成物はゼラチンカプセルに封入されるか、または錠剤内に圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、本発明の医薬組成物は賦形剤と混合され、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、オブラート剤、チューイングガムなどの形状で使用される。
【００４８】
錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などはまた、結合剤、受容剤 (recipient)、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、および香料添加剤を含み得る。結合剤のいくつかの例としては、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンが挙げられる。賦形剤の例としては、デンプンまたはラクトースが挙げられる。崩壊剤のいくつかの例としては、アルギン酸、コーンスターチなどが挙げられる。潤滑剤の例としては、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カリウムが挙げられる。流動促進剤(glidant)の例は、コロイド状二酸化ケイ素である。甘味剤のいくつかの例としては、スクロース、サッカリンなどが挙げられる。香料添加剤の例としては、ペパーミント、メチル・サリチル酸、オレンジ香料などが挙げられる。これら様々な組成物の調製に使用される物質は薬学的に純粋であり、使用される量で無毒であるべきである。
【００４９】
先に論議されている通り、末梢でのプロ炎症性サイトカインの放出の阻害における脳ムスカリン性レセプターの活性化の効果は、完全な迷走神経に依存すると本明細書中で立証された。どの特定のメカニズムにも限定されること無しに、本発明者らは、脳ムスカリン性レセプターの活性化が、迷走神経経路を刺激し、この刺激がプロ炎症性サイトカイン放出の阻害を引き起こすと考える。この脳迷走神経経路の刺激は、以前に確立されたプロ炎症性サイトカイン放出における末梢迷走神経の刺激の効果 (Borovikovaら、2000a；米国特許出願第09/855,446号もまた参照のこと) よりも、迷走神経経路において「上流」である。完全な迷走経路が脳ムスカリン性アゴニスト活性化の影響によるプロ炎症性サイトカインの阻害に必要とされるという決定に基づいて、本明細書中で確立された通り、プロ炎症性サイトカインは脳における迷走神経経路を直接刺激することにより阻害され得ることが明らかである。１つの態様において、迷走神経経路は、脊椎動物細胞由来のプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するために充分なレベルで刺激される。
【００５０】
従って、本発明のいくつかの態様は、脊椎動物におけるプロ炎症性サイトカインの放出の阻害方法に関する。本方法は、脊椎動物の脳における迷走神経経路を直接刺激することを含む。これらの方法において、迷走神経経路は任意の公知方法により刺激され得る。非限定的な例としては、針、超音波、または振動などの機械的手段；薬理的または化学的刺激、赤外線、可視光、紫外線などの任意の電磁放射線；熱、または他の任意のエネルギー源が挙げられる。好ましい態様において、迷走神経は、例えば近年パーキンソン病の処置のために使用されるMedtronic SOLETRAデバイスなどの市販の脳深部電気刺激装置などを用いて、電気的に刺激される。好ましい態様において、迷走神経経路は電気的に刺激される。
【００５１】
これらの方法はプロ炎症性サイトカインの産生の阻害において、先に記載された脳ムスカリン性レセプターを活性化する方法と同様の効果を有する、すなわち、同じプロ炎症性サイトカインを阻害し、同じ炎症状態を有する患者において炎症を低減し、脳または迷走神経経路が提供される任意の末梢器官もしくは細胞 (例えば、肝臓または心筋細胞) からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害する。
【００５２】
これまでに述べたように、脳ムスカリン性レセプターの活性化によって、プロ炎症性サイトカインの放出が阻害される。プロ炎症性サイトカインカスケードに媒介される炎症によって特徴付けられる疾患において、プロ炎症性サイトカインの放出を阻害することで、炎症を抑えることができる。
【００５３】
したがって、本発明は、脊椎動物における炎症性疾患を処置する方法に関する。この方法は、脊椎動物における脳ムスカリン性レセプターの活性化を含む。この方法は、ヒトを含む任意の脊椎動物における、少なくとも部分的にプロ炎症性サイトカインカスケードに媒介される、全身性の炎症性疾患を含む任意の病気を処置するのに有用である。かかる病気の例は、これまでに挙げられてきた。迷走神経は、全身性の病気におけるプロ炎症性サイトカインの主要な源である肝臓を神経支配するので、たとえプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するシグナルが迷走神経によって運搬されているように見えるとしても、これらの方法は全身性の炎症性疾患を処置するのに効果的である。
【００５４】
これまでに述べたように、脳内の迷走神経経路を直接刺激することによっても、ムスカリン性レセプターを活性化することによって得られるのと同じ効果が得られる。したがって、本発明はまた、脊椎動物における炎症性疾患を処置する方法に関し、このような方法は、脊椎動物の脳内の迷走神経経路を直接刺激することを含む。これまでに述べたように、迷走神経経路は当該分野で公知の任意の手段によって刺激され得、任意の脊椎動物（ヒトを含む）における、少なくとも部分的に炎症性サイトカインカスケードによって媒介される任意の炎症性疾患を治療するのに有用である。
【００５５】
迷走神経は心臓に働き、サイトカイン放出はいくつかの炎症性疾患において少なくとも部分的に筋細胞アポトーシスの原因となるので、心筋細胞のアポトーシスは、脊椎動物における脳ムスカリン性レセプターの活性化を含む方法によって、心筋細胞のアポトーシスの危険がある、ヒトを含む脊椎動物において阻害され得るとも考えられる。好ましいムスカリン性レセプターはM1、M2およびM4レセプターである。これらの方法によって処置され得る炎症性疾患としては、脈管炎、血管炎、心内膜炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周辺炎、リウマチ熱、うっ血性心不全、成人呼吸促進症候群、筋膜炎または対宿主性移植片病が挙げられる。これまでに述べられてきた方法と同様に、脳ムスカリン性レセプターは、脊椎動物にムスカリン性アゴニストを、脊椎動物の脳に直接、または腸にもしくは非経口的に投与されることによって活性化され得る。好ましいムスカリン性アゴニストは、ムスカリン、McN-A-343およびMT-3である。
【００５６】
同様に、心筋細胞におけるアポトーシスは、脊椎動物の脳内の直接迷走神経経路を直接、例えば電気的に刺激することによって阻害され得る。
【００５７】
脳ムスカリン性レセプターの活性化と感覚刺激とを関連付けることで脊椎動物はプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するように条件付けられ得ることも発見されている。したがって、いくつかの態様においては、本発明は、感覚刺激を受けた際にプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するように脊椎動物を条件付ける方法に関する。これらの方法には、以下の工程が含まれる：
(a)刺激と脳ムスカリン性レセプターとの間に関連性が作られるのに十分な期間、脊椎動物における脳ムスカリン性レセプターを活性化し、かつ脊椎動物に感覚刺激を提供すること；および
(b)感覚刺激のみによってプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するのに十分なほど関連性を強めるのに十分な間隔および期間、工程(a)を繰り返すこと。
【００５８】
これらの方法は、関節炎の状態のような慢性の炎症状態の処置に特に有用であり、このような方法によって患者の抗炎症の投薬の必要を低下させられる。したがって、胃腸、腎臓、心臓または肝臓への作用のような、抗炎症の投薬による潜在的な副作用が低下し得る。
【００５９】
これらの方法は、腫瘍壊死因子(TNF)、インターリューキン（IL）-1β、IL-6、IL-18、HMG-B1、MIP-1α、MIP-1β、MIF、インターフェロン-γおよびPAFを含むこれまでに述べられてきた方法と同様に、任意のプロ炎症性サイトカインの放出を減少させるのに用いられ得る。特に、プロ炎症性サイトカインの放出は、肝臓および心筋細胞を含む、迷走神経の刺激によって影響を受ける任意の器官、組織または細胞によって阻害される。これらは、全ての哺乳類を含む、迷走神経を有する任意の脊椎動物に有用である。これらは、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される状態に苦しんでいる、またはそのような状態になる危険のある脊椎動物（ヒトを含む）に特に有用である。かかる状態の例は、これまでに考察されている。
【００６０】
これらの方法の条件付け工程において（工程(a)）、脳ムスカリン性レセプターは、これまでに考察されている任意の方法によって活性化され得る。刺激と脳ムスカリン性レセプター活性化との関連性は、刺激と活性化が一時的に、好ましくは1分のうちに、可能な限り近づいた場合に最も効果的に作られると考えられている。好ましい時間間隔は毎日2回である。条件付けの期間はまた、関連付けの最適な増強を提供するのに十分であるべきである。好ましい持続期間は、少なくとも1週間である。最適な時間間隔および持続期間は、当該分野で公知の標準的な方法による過度の実験を要することなく当業者によって決定され得る。
【００６１】
感覚刺激は、五感のうちのいずれでもあり得る。適切な感覚刺激の非制限的な例としては、ベルやブザーおよび音楽の一節のような音；ピン、羽毛の触感および電気ショック；甘味、酸味、塩味およびサッカリンのような、味覚、特定の化学物質の摂食；写真、トランプの札または短いビデオ講演のような視覚映像が挙げられる。
【００６２】
これまでに述べた方法と同様に、プロ炎症性サイトカインの放出を阻害する、感覚刺激を用いた条件づけに、脊椎動物脳において、脳ムスカリン性レセプターを活性化するよりも迷走神経経路の刺激を利用し得る。
【００６３】
さらに、上で述べたように、プロ炎症性サイトカインの放出阻害はまた、炎症の低減に影響するので、上述の条件付け方法は、処置される脊椎動物において炎症を低減させるのに有用である。したがって本発明は、感覚刺激を受けた際、炎症を低減させるように脊椎動物を条件付けする方法に関する。このような方法には、以下の工程が含まれる：
(a)感覚刺激と脳ムスカリン性レセプターとの間に関連性が作られるのに十分な期間、脊椎動物の脳内の迷走神経経路を直接刺激し、かつ脊椎動物に感覚刺激を提供すること；および
(b)感覚刺激のみによって炎症を低減するのに十分なほど関連性を強めるのに十分な間隔および期間、工程（ａ）を繰り返すこと。
【００６４】
以下の実施例で、本発明の好ましい態様を述べる。
【００６５】
実施例１
この実施例は、CNI-1493が脳ムスカリン性レセプターに結合すること、CNIの脳室内(i.c.v.)注射がカラゲナン誘導性後足水腫（carrageenan-induced hindpaw）および血中へのTNFの放出を抑制すること、これらの効果はアトロピンによって逆転することならびにニコチンおよびプロザックのi.c.v.注射のいずれもTNF生成を阻害しないことを証明する実験を説明している。
【００６６】
方法
CNI-1493レセプター結合の測定方法
NovaScreen Biosciences Corporation (Hanover, MD)によって、CNI-1493を、レセプター結合アッセイのパネル中で単一の濃度（10 μM）で検査した。値は特異的な結合の阻害の割合（percent inhibition）として表され、複製チューブ（duplicate tube）の平均を表した。
【００６７】
定位固定脳室内注射の方法
ラットの脳に薬剤を直接送達できるように、脳室内(i.c.v.)注射のラットモデルを確立した。これは、中央対末梢機構（central versus peripheral mechanism）を通して起こった末梢の炎症への薬剤の効果を分離させるために必要であった。Lewisラットを、ウレタン（1 g/kg、i.p.）およびキシラジン（xylazine）（15 mg/ラット、i.m.（筋肉内））で麻酔した。次いでラットを定位固定頭部枠（Stoelting、Wood Dale、IL、USA）内に配置した。ラムダおよびブレグマによって特定される面がベースプレートと平行になるまで切歯（incisor）バーを調節した。i.c.v.注射のために、ハミルトンシリンジ（25μl）の針を側脳室上方（ブレグマよりも0.2 mmおよび1.5 mm後方、硬膜（dura）より3.2 mm下方）に定位固定的に配置した。検査される薬物の溶液は、特定の濃度で無菌の無エンドトクシン水中に調製され、10μl注射／ラットでカラゲナン注射またはLPSのいずれかに1時間先立って、2分かけて投与された。
【００６８】
カラゲナンおよび／またはLPS実験のいずれかにおいて試験された薬物は：生理食塩水コントロール；塩酸フルオキセチン、（プロザックとしても知られる）（0.01 mg/100 g）；ムスカリン（50μg/ラット、5μg/ラット、0.05μg/ラット、0.005μg/ラット）；4-(N-[3-クロロフェニル]カルバモイロキシ)-2-ブチニルトリメチルアンモニウムクロライド（McN-A-343としても知られる）（5μg/ラット）；Dendroaspis angusticepsヘビ毒由来のムスカリントキシン-3（MT-3としても知られる）（1μg/kg、50μg/ラット）；アトロピン（1μg/kg、5μg/ラット）；アトロピン添加CNI-1493（各薬物を1μg/kg；それぞれ5μg/ラット、50μg/ラット）、ナロキソン添加CNI-1493（それぞれ50μg/ラット＋5μg/ラット）；およびモルヒネ（20μg/ラット）であった。
【００６９】
カラゲナン誘導性後足水腫の方法
左後足の足裏表面へ1-カラゲナンの1％溶液を注射（100μl）することによって、麻酔したラットで足水腫を誘導した。右後足に、同じ体積の生理食塩水のみを注射した（コントロールとして）。カラゲナン投与後3時間目にキャリパーを用いてカラゲナン処理後足および生理食塩水処理後足の厚さを測定し、後足の厚さの差を炎症の指標として計算した（後足腫脹）。
【００７０】
LPS注射およびTNF測定の方法
薬物注射の1時間後に、尾の血管にLPS（15 mg/kg、i.v.）を注射した。LPS注射の2時間後に、パラオービタル出血（paraorbital bleeding）によって血液を得た。L929生物活性アッセイによって血清TNF濃度を測定した。
【００７１】
L929生物活性アッセイによるTNF評価の方法
L929細胞を、ウシ胎児血清（10％；Hyclone）およびペニシリン／ストレプトマイシン（0.5％；Sigma Chemical Co.）添加Dulbecco's minimal Eagle's medium（DMEM；GibcoBRL）に懸濁し、96-ウェル平底マイクロタイタープレートの1ウェルごとに2×104細胞をプレーティングした。24時間後、培地をレスピレータで除去してシクロヘキシミド（10μg/ml；Sigma Chemical Co.）および評価対象のサンプルを含む培地で置換した／TNF標準。プレートをオーバーナイトで培養し、この間、MTTアッセイによって、TNF濃度の関数として、細胞の生存性を評価した。ラットTNFの標準曲線との比較によって、吸収値をミリリットルごとの単位に変換した。
【００７２】
結果
レセプター結合アッセイのインビトロパネルを用いて検査した場合、CNI-1493は、10μMで7つの異なるレセプターに対して50％を超えるレセプター結合を阻害した（アルファ1アドレナリン性（89.7％）、ムスカリン性（60.6％）、セロトニン（75.6％）、N型カルシウムチャネル（84.2％）、電圧無反応性カリウムチャネル（voltage-insensitive potassium channel）（60.2％）、電圧反応性ナトリウムチャネル（73.0％）および血管活性腸管ペプチド（58.5％））。
【００７３】
CNI-1493は、10μMで、以下のレセプターにおいて50％未満のレセプター結合を阻害した（NovaScreenによって最低限または無活性を示すと見なされる）：ベータアドレナリン性、ドーパミン、グルタミン酸塩（NMDAアゴニスト部位）、H1ヒスタミン、L型カルシウムチャネル、塩化物チャネル、部位1ナトリウム、部位2ナトリウム、NK1ニューロキニン、バソプレシン1、ロイコトリエンD4およびLTD4、トロンボキサンA2、および上皮成長因子。
【００７４】
上述の研究により、他の薬物による代替的な薬理学的活性化が末梢の免疫抑制活性を別々に引き起こすのか、およびこの活性は別の迷走神経にさらに依存するのかを判断するために検査されるレセプターのリストが提供された。この目的を達成するために、種々の薬物の効果が脳内への定位固定的な脳室内送達によって検査される、後足水腫の動物モデルおよび内毒素性ショックの動物モデルを確立した。
【００７５】
ある一連の実験において、生理食塩水（n=1）、CNI-1493（5μg/ラット、n=3）、アトロピン添加CNI-1493（各5μg/ラット）またはアトロピン（5μg/ラット）をi.c.v.法によってラットに注射した。1時間後にLPSを投与した（15mg/kg、i.v.）。LPS投与後2時間目に血液を採集した。L929アッセイによって血清TNFを測定した。
【００７６】
これらの実験の結果を図１に要約する。脳室内に投与されたCNI-1493は、LPS誘導性血清TNFレベルを、80％を超えて阻害した。アトロピンは、アトロピンのみのTNFレベルまでCNI-1493の阻害作用を逆転させた。
【００７７】
これらの結果から、i.c.v.CNI-1493は末梢の炎症を抑制し得ること、およびこの作用はi.c.v.アトロピンを同時に投与することによって逆転することが示唆される。アトロピンはムスカリン性レセプターのアンタゴニストなので、これらの結果から、CNI-1493の免疫抑制作用は脳内のムスカリン性レセプターによって媒介されることが示唆される。
【００７８】
二つ目の一連の実験において、生理食塩水（n=4）、ニコチン（10μg/ラット、n=3）、またはプロザック（0.01 mg/100 g、n=3）のいずれかをi.c.v.法によってラットに注射した。1時間後にLPSを投与した（15 mg/kg、i.v.）。LPS投与後2時間目に血液を採集した。L929アッセイによって血清TNFを測定した。
【００７９】
結果を図２に要約する。ニコチンおよびプロザックのいずれも、LPS誘導性血清TNFレベルを低下させる作用が全くなかった。これらの結果から、ニコチンおよびプロザックのいずれも末梢の免疫抑制における中心的な作用を示さないことが示唆される。
【００８０】
三つ目の一連の実験において、生理食塩水（n=4）、CNI-1493（5μg/ラット、n=3）、アトロピン添加CNI-1493（各5μg/ラット）またはアトロピン（5μg/ラット）のいずれかをi.c.v.法によってラットに注射した。1時間後に動物にカラゲナンを投与し、カラゲナン投与後3時間目に後足水腫を測定した。
【００８１】
これらの実験の結果を図３に要約する。LPS誘導性血清TNFレベルと同様に、CNI-1493の脳室内投与によってカラゲナン誘導性後足水腫が有意に阻害され、アトロピン（ATR）によってその作用が逆転する。
【００８２】
これらの結果は、異なる方法によってもi.c.v.CNI-1493が末梢の炎症を抑制すること、およびこの作用がi.c.v.アトロピンを同時に投与することによって逆転することを示唆する。アトロピンはムスカリン性レセプターのアンタゴニストなので、これらの結果から、CNI-1493の免疫抑制作用は脳内のムスカリン性レセプターによって媒介されることが示唆される。
【００８３】
別の一連の実験において、生理食塩水またはムスカリン（棒グラフの左から右へ5μg/ラット、0.5μg/ラット、0.05μg/ラット、0.005μg/ラット、n=4動物／群）をi.c.v.法によってラットに注射した。1時間後に動物にカラゲナンを投与し、カラゲナン投与後3時間目に後足水腫を測定した。
【００８４】
これらの実験の結果を図４に要約する。ムスカリンの脳室内への投与によって、投与量依存的にカラゲナン誘導性後足水腫が有意に阻害される。これらの結果から、i.c.v.ムスカリンによって末端での炎症の抑制が行なわれることが立証される。
【００８５】
他の実験において、ラットを、両側性頸部迷走神経切断術（bilateral cervical vagotomy）（VGX）あるいはまた両側性迷走神経単離（bilateral vagus nerve isolation）に供した。次いで生理食塩水（SAL、n=2動物／群）またはムスカリン（MUS、0.5μg/ラット、n=4動物/群）のいずれかの4つの群のそれぞれについて脳室内注射を行なった（26-66分後）。i.c.v.薬物注射の1時間後に動物にカラゲナンを投与し、カラゲナン投与後3時間目に後足水腫を測定した。P=0.015 SAL対MUS。P=0.039 MUS対MUS-VGX。
【００８６】
これらの実験の結果を図５に要約する。迷走神経切断術によって、カラゲナン誘導性後足水腫へのムスカリンの脳室内（i.c.v.）投与の阻害作用が明らかに排除される。したがって、中枢に投与されたムスカリンによる末梢の免疫抑制作用は、迷走神経切断術によって排除され、脳内のムスカリン性レセプターの活性化が末梢の免疫抑制シグナルを迷走神経へ運搬することを立証している。
【００８７】
実施例２
この実施例は、本発明に有用な好ましいムスカリン性レセプターサブタイプの確立の実験結果を提供する。
【００８８】
方法
ムスカリン性レセプターサブタイプの決定方法
NovaScreen Biosciences Corporation（Hanover、MD）によるムスカリン性レセプター結合アッセイのパネル中で、CNI-1493を単一の濃度（10μM）で検査した。値は、特異的な結合の阻害の割合として表され、複製チューブの平均を表した。
【００８９】
他の方法は実施例１の記述と同様である。
【００９０】
結果
示されているように、CNI-1493の、ムスカリン性レセプターのパネルに対する結合阻害の検査の結果を表１に要約する。
【００９１】
表１
レセプター 阻害の割合
ムスカリン性、M1                                83％
ムスカリン性、M1（ヒト組換え）                  72％
ムスカリン性、M2                                85％
ムスカリン性、M2（ヒト組換え）                  58％
ムスカリン性、M3                                9％
ムスカリン性、M3（ヒト組換え）                  40％
ムスカリン性、M4（ヒト組換え）                  57％
ムスカリン性、M5（ヒト組換え）                  43％
50％未満の値は、NovaScreenによって、最低限または無活性を示すと見なされる。
【００９２】
この結果から、M1、M2およびM4はCNI-1493に結合する一次ムスカリン性レセプターであると示唆される。
【００９３】
別の一連の実験において、生理食塩水、M1アゴニストMcN-A-343（5μg/ラット、n=5）またはM4アゴニストMT-3（0.37μg/ラット、n=4）のいずれかを、実施例１に記載されるようなi.c.v.によって、動物に注射した。実施例１に記載されているように、1時間後に動物にカラゲナンを投与し、カラゲナン投与後3時間目に後足水腫を測定した。
【００９４】
これらの実験の結果を図６中に提供する。M1アゴニストMcN-A-343またはM4アゴニストMT-3の脳室内投与によって、カラゲナン誘導性後足水腫が有意に阻害される。これらの結果から、末梢の免疫プロセスの抑制にM1レセプターおよびM4レセプターの中枢での活性化が働いていることがさらに立証される。
【００９５】
他の実験において、生理食塩水またはM1アゴニストMcN-A-343のいずれかを5μg/ラット（n=5）で動物にi.c.v.注射した。あるいは、McN-A-343をより高い濃度で末梢に投与した（5 mg/kg、i.p.、n=2）。i.c.v.またはi.p.薬物投与の1時間後に、動物にカラゲナンを投与し、カラゲナン投与後3時間目に後足水腫を測定した。
【００９６】
これらの実験の結果を図７に要約する。M1アゴニストMcN-A-343の脳室内（i.c.v.）投与は、腹腔内への（i.p.）高投与量の投与に匹敵する、カラゲナン誘導性後足水腫の阻害に対する効果を有する。これらの結果から、末梢の免疫抑制を達成するのに必要なM1アゴニストの有意により高いi.p.濃度が、この成分の、少量での血液脳関門浸透に起因することが示唆される。したがって、中枢に浸透した少量の物質が、観察された薬物の免疫抑制作用の原因でありそうである。
【００９７】
実施例３
この実施例は、脳ムスカリン性レセプターの活性化と関連付けられた感覚刺激を通して哺乳類が抗炎症応答を始めるように条件付けし得ることを示唆する実験結果を提供する。
【００９８】
方法
マウスを４つの群にグループ化した（n=4動物／群）。群２〜４に対する条件付けトレーニング（conditioning training）は、朝の回および午後の回から構成された。群２のマウスは一緒に部屋に運ばれ、そこで各マウスにCNI-1493を注射した（2.5 mg/kg、i.p.）。注射と同時に、各マウスを45秒ベル音に供した。群４のマウスを、群２のマウスと同様に、CNI-1493の代わりに生理食塩水をマウスに注射するコントロール条件に供した。群３のマウスに、群２のマウスと同様に生理食塩水を注射したが、ベル音には供さなかった。このプロトコールは、10日間かけて1〜4日目および8〜10日目に実施された。11日目に、群１のマウスにCNI-1493を注射した（2.5 mg/kg、i.p.）。また、11日目に、群１のマウスの注射の実施30分後に、全ての群の動物にLPSを注射した（5 mg/kg、i.p.）。2時間後に、CO2吸入によってマウスを安楽死させ、血液を回収した。L929アッセイによって血清TNFを測定した。
【００９９】
結果
この実験の結果を図８に要約する。反復腹腔内CNI-1493投与とベル音との関連付けによって条件付けされた動物において、平均LPS誘導性TNF放出はベル音および腹腔内生理食塩水注射にさらされた動物に対して約60％減少した（群２対群４；p=0.22）。
【０１００】
これらの実験に基づくと、遠心性迷走神経の刺激による免疫抑制は、当たり障りのない刺激および脳ムスカリン性レセプターを活性化すると知られている薬物（ここではCNI-1493）を用いた条件付けトレーニングに続く当たり障りのない刺激（すなわちベル）への条件付けられた曝露によってなされると予測し得る。
【０１０１】
実施例４
この実験は、ラットへのムスカリンの脳室内投与によって血清、脾臓および心臓TNF濃度が投与量依存的に減少することを示唆する実験結果を提供する。
【０１０２】
方法
ラットへのムスカリンの定位固定的脳室内投与およびLPS注射の方法は、実施例１の記述と同様であった。製品の使用説明書にしたがって（R&D Systems (Minneapolis、Minnesota)）、酵素免疫測定法（ELISA）を用いて血清中および組織中のTNFレベルを測定した。
【０１０３】
結果
生理食塩水（コントロール）またはムスカリン（0.005μg/kg体重、0.5μg/kg体重、5.0μg/kg体重または50μg/kg体重）のいずれかを、i.c.v.法によってラットに注射した。1時間後にLPSを投与した。LPS投与の2時間後にラットを安楽死させ、ラットから血液、心臓組織および脾臓組織を分離した。これらの実験の結果を図９Ａ〜９Ｃに要約する。図９Ａ〜９Ｃに示されるように、ムスカリンのi.c.v.投与によってLPS誘導性の血清、心臓および脾臓（末梢性）TNFレベルが阻害された。これらの結果から、末梢TNF生成は中枢でのムスカリン性レセプターの活性化によって阻害され得ることが実証される。
【０１０４】
実施例５
この実施例は、ラットへのムスカリンの静脈内投与がラット脾臓、肝臓および心臓のTNF濃度に全く作用しないことを示唆する実験結果を提供する。
【０１０５】
方法
LPS注射の方法は、実施例１の記述と同様であった。血清および組織TNFレベルの測定は、実施例４の記述と同様であった。ムスカリン（またはコントロール生理食塩水）を、0.05μg/kg体重、0.5μg/kg体重または5.0μg/kg体重の濃度でラットに静脈内注射した。
【０１０６】
結果
生理食塩水（コントロール）またはムスカリン（0.05μg/kg体重、0.5μg/kg体重または5.0μg/kg体重）のいずれかをi.v.法によってラットに注射した。1時間後にLPSを投与した。LPS投与の2時間後にラットを安楽死させてラットから血液、肝臓組織、心臓組織および脾臓組織を分離し、TNF濃度について分析した。これらの実験の結果を図10Ａ〜10Ｄに要約する。図10Ａ〜10Ｄに示されるように、ムスカリンの静脈内投与はLPS誘導性の血清、肝臓、心臓および脾臓TNFレベルに全く作用しなかった。
【０１０７】
ムスカリンは四級塩であり、それ自体では血液脳関門を容易には通過しない。上の結果から、末梢のムスカリン性レセプターの活性化はLPS誘導性TNF生成に全く作用しないことが実証される。
【０１０８】
上のことを考慮すると、本発明のいくつかの利点が得られ、他の利点が達成されることが理解されよう。
【０１０９】
本発明の範囲から逸脱することなく、上の方法および組成に様々な変更がなされ得るので、上の記述に含まれる全ての事項および添付の図面に示される全ての事項は例であり、制限を意味するのではないと解釈される。
【０１１０】
本明細書中で引用される全ての参考文献は、参照として本明細書中に援用される。本明細書中の参考文献の考察は、著者らによってなされた主張を要約することを目的とするだけであり、いずれの参考文献も先行技術を構成すると承認していない。出願人は、引用文献の正確性および妥当性に意義を唱える権利を留保する。
【０１１１】
本発明の好ましい態様について、参考文献を用いて本発明を具体的に示し、記述してきたが、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細において様々な変更がなされ得ることは、当業者に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、CNI-1493の脳室内投与がTNFのLPS誘導性放出を有意に阻害し、アトロピン（ATR）がその効果を逆転することを示す実験の結果を要約するグラフである。
【図２】図２は、ニコチンまたはプロザックの脳室内投与がTNFのLPS誘導性放出に対して効果がないことを示す実験の結果を要約するグラフである。
【図３】図３は、CNI-1493の脳室内投与がカラゲナン誘導性足浮腫を有意に阻害し、アトロピン（ATR）がその効果を逆転することを示す実験の結果を要約するグラフである。
【図４】図４は、ムスカリンの脳室内投与が用量依存性様式でカラゲナン誘導性足浮腫を有意に阻害することを示す実験の結果を要約するグラフである。
【図５】図５は、迷走神経切離術がカラゲナン誘導性足浮腫に対するムスカリンの脳室内（i.c.v.）投与の阻害効果を排除することを示す実験の結果を要約するグラフである。
【図６】図６は、M1アゴニストMcN-A-343またはM4アゴニストMT-3の脳室内投与がカラゲナン誘導性足浮腫を有意に阻害することを示す実験の結果を要約するグラフである。
【図７】図７は、M1アゴニストMcN-A-343の脳室内（i.c.v.）投与が、腹膜内（i.p.）投与と比べてカラゲナン誘導性足浮腫を阻害することにおいて有意により強力であることを示す実験の結果を要約するグラフである。
【図８】図８は、腹膜内CNI-1493投与とベルを鳴らすこととを関連付けることによる動物の条件付けが、CNI-1493を投与することなくベルを鳴らすことによりLPS誘導性TNF放出の阻害を可能にしたことを示す実験の結果を要約するグラフである。
【図９】図９Ａは、ラットの血清におけるLPS誘導性TNF産生（TNF濃度(pg/mlタンパク質)）に対するムスカリンなし（対照）、または0.005μg/kg体重、0.5μg/kg体重、5.0μg/kg体重、もしくは50μg/kg体重のムスカリンの脳室内（i.c.v.）投与の効果の結果を要約するグラフである。Rは試験条件あたりのラットの数を示す。  図９Ｂは、ラットの心臓組織におけるLPS誘導性TNF産生（TNF濃度(ng/gタンパク質)）に対するムスカリンなし（対照）、または0.005μg/kg体重、0.5μg/kg体重、5.0μg/kg体重、もしくは50μg/kg体重のムスカリンの脳室内（i.c.v.）投与の効果の結果を要約するグラフである。Rは試験条件あたりのラットの数を示す。  図９Ｃは、ラットの脾臓におけるLPS誘導性TNF産生（TNF濃度(ng/gタンパク質)）に対するムスカリンなし（対照）、または0.005μg/kg体重、0.5μg/kg体重、5.0μg/kg体重、もしくは50μg/kg体重のムスカリンの脳室内（i.c.v.）投与の効果の結果を要約するグラフである。Rは試験条件あたりのラットの数を示す。
【図１０】図１０Ａは、ラットの血清におけるLPS誘導性TNF産生（TNF濃度(pg/ml)）に対するムスカリンなし（対照）、または0.05μg/kg体重、0.5μg/kg体重、もしくは5.0μg/kg体重のムスカリンの静脈内（i.v.）投与の効果の結果を要約するグラフである。Rは試験条件あたりのラットの数を示す。  図１０Ｂは、ラットの肝臓におけるLPS誘導性TNF産生（TNF濃度(ng/gタンパク質)）に対するムスカリンなし（対照）、または0.05μg/kg体重、0.5μg/kg体重、もしくは5.0μg/kg体重のムスカリンの静脈内（i.v.）投与の効果の結果を要約するグラフである。Rは試験条件あたりのラットの数を示す。  図１０Ｃは、ラットの脾臓におけるLPS誘導性TNF産生（TNF濃度(ng/gタンパク質)）に対するムスカリンなし（対照）、または0.05μg/kg体重、0.5μg/kg体重、もしくは5.0μg/kg体重のムスカリンの静脈内（i.v.）投与の効果の結果を要約するグラフである。Rは試験条件あたりのラットの数を示す。  図１０Ｄは、ラットの心臓組織におけるLPS誘導性TNF産生（TNF濃度(ng/gタンパク質)）に対するムスカリンなし（対照）、または0.05μg/kg体重、0.5μg/kg体重、もしくは5.0μg/kg体重のムスカリンの静脈内（i.v.）投与の効果の結果を要約するグラフである。Rは試験条件あたりのラットの数を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年4月12日(2004.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化させることを含む、炎症性サイトカインカスケードにより媒介される疾患の危険性にあるか、または該疾患を有する脊椎動物においてプロ炎症性サイトカインの放出を阻害する方法。
【請求項２】
プロ炎症性サイトカインが、腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン（IL）-1α、IL-1β、IL-6、IL-18、HMG-B1、MIP-1α、MIP-1β、MIF、インターフェロンγ、およびPAFからなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
プロ炎症性サイトカインがTNFである請求項１記載の方法。
【請求項４】
脊椎動物がヒトである請求項１記載の方法。
【請求項５】
疾患が、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、炎症性腸疾患、憩室炎、喉頭蓋炎、噴門痙攣、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、腸炎、ウイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、器官虚血、再灌流傷害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺限外顕微鏡的間質性肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染、疱疹感染、HIV感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、腹腔疾患、うっ血性心不全、成人呼吸促進症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギヤン-バレー症候群、神経炎、神経痛、脊椎損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶、移植片対宿主病、I型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ライター症候群、およびホジキン病からなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項６】
炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎、虚血性大腸炎、およびクローン病からなる群より選ばれる請求項５記載の方法。
【請求項７】
関節炎がリウマチ様関節炎である請求項５記載の方法。
【請求項８】
疾患が、同種移植拒絶、関節炎、喘息、狼瘡、成人呼吸促進症候群、膵炎、腹膜炎、火傷、ベーチェット病、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、器官虚血、再灌流傷害、心筋虚血、および悪液質からなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項９】
疾患がショック、慢性閉塞性肺疾患、または乾癬である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
疾患がセプシスである請求項１記載の方法。
【請求項１１】
脳ムスカリン性レセプターがM1、M2、およびM4レセプターからなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項１２】
脳ムスカリン性レセプターが、脊椎動物にムスカリン性アゴニストを投与することにより活性化される請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ムスカリン性アゴニストが脊椎動物の脳に直接投与される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ムスカリン性アゴニストが脊椎動物の血液脳関門を通過することができ、該アゴニストが経腸的もしくは非経口的に投与されるか、または脊椎動物の血流に注射される請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ムスカリン性アゴニストがムスカリン、McN-A-343、およびMT-3からなる群より選ばれる請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
脊椎動物の脳の迷走神経経路を直接刺激することを含む、炎症サイトカインカスケードにより媒介される疾患の危険性があるか、または該疾患を有する脊椎動物においてプロ炎症性サイトカインの放出を阻害する方法。
【請求項１７】
迷走神経経路が電気的に刺激される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化することを含む、心筋細胞アポトーシスの危険性がある脊椎動物において心筋細胞のアポトーシスを阻害する方法。
【請求項１９】
脊椎動物の脳の迷走神経経路を直接刺激することを含む、心筋細胞アポトーシスの危険性がある脊椎動物において心筋細胞のアポトーシスを阻害する方法。
【請求項２０】
（ａ）感覚刺激と脳ムスカリン性レセプターの活性化との間に関連性が作られるのに十分な期間、脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化し、かつ脊椎動物に感覚刺激を提供すること；および
（ｂ）プロ炎症性サイトカイン放出が感覚刺激のみにより阻害されるように関連性を十分に増強するのに十分な間隔および期間、工程（ａ）を繰り返すこと、
を含む、感覚刺激を受ける際にプロ炎症性サイトカインの放出が阻害されるように脊椎動物を条件付ける方法。
【請求項２１】
（ａ）感覚刺激と迷走神経経路の刺激との間に関連性が作られるのに十分な期間、脊椎動物の脳内の迷走神経経路を直接刺激し、かつ脊椎動物に感覚刺激を提供すること；および
（ｂ）プロ炎症サイトカイン放出が感覚刺激のみにより阻害されるように関連性を十分に増強するのに十分な間隔および期間、工程（ａ）を繰り返すこと、
を含む、感覚刺激を受ける際にプロ炎症性サイトカインの放出が阻害されるように脊椎動物を条件付ける方法。
【国際調査報告】
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