(57)【要約】  ニューロン活性を調節する化合物のスクリーニング方法  ニューロン（神経細胞）の活性・活動と可塑性の調節剤を特定化しかつ診断目的に有用な動物モデルおよびスクリーニング方法が提供されている。当該方法は、ニューロン活性のインディケーターとして、セリンプロテアーゼインヒビター、特にＰＮ−１の使用に基づいている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロンの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）動物の脳組織を候補化合物と接触させること；
ｂ）前記候補化合物が存在しない場合と比較して、ニューロン回路におけるプロテアーゼ  ネキシン−１（ＰＮ−１）の発現レベルの変化をアッセイすること；および
ｃ）前記の化合物が存在しない場合と比較して、ＰＮ−１の発現レベルを変化させる化合物をニューロン活性の調節剤として選択すること；
を含んでなる方法。
【請求項２】
ステップｃ）がＰＮ−１の発現レベルを減少させる化合物を選択することを含んでなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
ステップｃ）がＰＮ−１の発現レベルを増大させる化合物を選択することを含んでなる請求項１記載の方法。
【請求項４】
更に脳の特定の領域においてニューロン活性を誘発させることを含んでなる請求項１記載の方法。
【請求項５】
ニューロン活性が行動によって誘発される請求項４記載の方法。
【請求項６】
ニューロン活性が化学品によって誘発される請求項４記載の方法。
【請求項７】
化学品が６−ヒドロキシドーパミン、イボテン酸、または任意の神経毒物である請求項６記載の方法。
【請求項８】
ニューロン活性が増大し、そして化合物が、てんかん、薬物乱用、陽性の精神病症候群、または多動性シンドロームの潜在的調節剤である請求項１記載の方法。
【請求項９】
ニューロン活性が減少し、そして化合物が、神経変性疾患、アルツハイマー型または非アルツハイマー型痴呆、パーキンソン病、脳卒中、良性および悪性腫瘍または脳の皮質に影響を与える損傷の潜在的調節剤である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）におけるＰＮ−１発現レベルが、ＰＮ−１調節シーケンスのコントロールのもとで、発現されるタンパク質マーカーの存在を検知することを含んでなる請求項１記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質マーカーがレポーター遺伝子によってコードされ、前記レポーター遺伝子は、ＰＮ−１遺伝子またはその作動可能なフラグメントに作動可能なように結合している請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、クロラムフェニコール  アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、グルコロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、フォスファターゼ、オキシドリダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、リダクターゼ、デアミナーゼ、カタラーゼ、ウレアーゼおよび蛍光タンパク質からなる群より選択される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ステップｂ）におけるＰＮ−１発現レベルが、ペプチドまたはタンパク質タグの存在を検知することを含んでなり、前記タグは、ＰＮ−１またはそのフラグメントに作動可能なように結合している請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
タグがヘマグルチン（ＨＡ）、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒス６（Ｈｉｓ  ６）、またはｍｙｃである請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＰＮ−１が脳の幹細胞または前駆細胞で発現される請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ＰＮ−１を発現している幹細胞または前駆細胞を選択する方法であって、ＰＮ−１を蛍光タンパク質に連結させ、蛍光タンパク質を有する細胞を蛍光タンパク質が存在しない細胞から選別することを含んでなる方法。
【請求項１７】
ニューロン活性のインディケーターとしてのＰＮ−１の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、神経生物学、薬理学および医薬の分野に関する。更に詳しくは、本発明は、ニューロン回路（neuronal circuit）のアゴニストおよびアンタゴニストを特定するスクリーニング方法に関する。
【０００２】
このような化合物は、神経変性疾患の成り行きをモニターするのに有用であるのみならず、行動および学習障害の治療に有用である。本発明は、特定の行動規範（behaviour paradigms）に随伴するニューロン回路の活動をモニターする方法およびそのような回路を特異的に調節する化合物を特定化する方法を提供する。
【０００３】
プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）の活動により局在化されたタンパク質分解活性は、種々の重要な生物学的プロセスにおける重大な調節の役割を演じる。胎児の発達および神経システムにおけるセリンプロテアーゼおよびその阻害剤の機能に関する広い範囲の考え、概念が提案されてきた。プラスミノーゲンアクチベーターまたはトロンビンのようなセリンプロテアーゼは、発生と再生の過程におけるシナプス結合の再構築に関与していることが示唆されてきた。このようなプロセスは、発生・発達期における除去および成人における学習および記憶に関連しているシナプス可塑性を含んでいる。プロテアーゼとそれらのそれぞれの生物学的インヒビターのバランスは、これらの複雑な生物学的プロセスの調節を提供することが可能である。
【０００４】
最も研究されている内因性のセリンプロテアーゼインヒビターの一つは、プロテアーゼ  ネキシン−１（protease nexin-1）（ＰＮ−１）である。ＰＮ−１は、４３ｋＤａを有するセルピンスーパーファミリー（serpin superfamily）のセリンプロテアーゼインヒビターである（Ｓｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,  １９８７；２６（２０）：６４０７−１０）。セルピンスーパーファミリーには、プロテアーゼ  ネキシン−１（ＰＮ−１）のみならずニューロセルピン（neuroserpin）、組織プラスミノーゲンアクチベーターの脳関連阻害剤（brain-associated inhibitor of tissue-type plasminogen activator（ＢＡＩＴ）をも含む。たとえば、Ｏｓｔｅｒｗａｌｄｅｒ,  Ｔ．，  ｅｔ.  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９６；１５；２９４４−２９５３  または米国特許（ＵＳＰＮ）６，００８，０２０参照。
【０００５】
イン・ビトロにおいてＰＮ−１は、トロンビン、トリプシン、組織プラスミノーゲンアクチベーターおよびウロキナーゼープラスミノーゲンアクチベーターを含むいくつかのセリンプロテアーゼを阻害する（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９８５；４（８）：１９６３−６）。イン・ビボにおいてＰＮ−１は、胎児の発達段階において、軟骨、肺、皮膚、尿生殖器官および中枢・末梢神経系を含む種々の器官において発現され、そして発達中の中枢神経系においては、複雑な空間的、時間的な発現パターンを示して発現される（Ｍａｎｓｕｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９３；１１９（４）：１１１９−３４）。成熟した中枢神経系（ＣＮＳ）においては、ＰＮ−１は、臭球の臭神経層、皮質の錐体ニューロン層Ｖならびに上丘および下丘のような特定のニューロン集団において、構造的・恒常的に発現される（Ｒｅｉｎｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．，  １９９４；３７（２）：２５６−７０）。それにもかかわらず、ＰＮ−１の生体内でのパートナーおよび生理的な機能については、依然として、理解しにくい。
【０００６】
ＰＮ−１を過剰に発現するマウスおよびＰＮ−１  ノックアウトマウスは、痙攣の傾向があり、てんかん活性を発現することが示されてきた。海馬スライスのＣＡ１領域におけるシータ（ｔｈｅｔａ）波バースト刺激長期増強（ＬＴＰ）およびＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート）レセプターを介するシナプス伝達は、ＰＮ−１を過剰発現するマウスでは増大され、ＰＮ−１  ノックアウトマウスでは、減少される。ＰＮ−１過剰発現するマウスにおけるＧＡＢＡを介する阻害の変化は、脳ＰＮ−１レベルの変化があると興奮性と抑制性のシナプス伝達の間に不均衡をもたらす（Ｌｕｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７；１７（１２）：４６８８−９９）。
【０００７】
ＰＮ−１は、ラットの坐骨神経においては、軸索切断術の後は、一過性に昂進（アップレギュレート）され、ＰＮ−１を生産する細胞は、病変（損傷）部位の末端側に限局化されることが報告されてきた。ＰＮ−１のこのアップレギュレーションは、末端断端（distal stump）におけるプロトロンビンとトロンビンの同様なアップレギュレーションの２、３日後にも起きる（Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３４２（６２４９）：５４８−５０）。アルツハイマー病の患者の場合は、遊離のＰＮ−１タンパク質は、有意に減少しており、一方内因性のＰＮ−１−トロンビン複合体は脳において増加している（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １９８９；８６（２１）：８２８４−８）。パーキンソン病のモデルである６−ヒドロキシドーパミンによって誘発される黒質における細胞死の後では、被殻（putamen）においては、ＰＮ−１はアップレギュレートされる（Ｓｃｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．１９９４；３７（２）：１５５−６８）。ＰＮ−１は新生仔期マウスにおける脊髄の運動ニューロン死を救出することも報告されてきた（Ｈｏｕｅｎｏｕ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １９９５；９２（３）：８９５−９）。
【０００８】
最近の研究によれば、神経細胞（ニューロン）可塑性は、痛みの経路（Ａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１；４１（２−３）：６２９−４１；またはＭｉｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １９９５；１０７（１）：３４−３８）、不安回避の経路、社会的ストレスの経路（Ｋｏｌｌａｃｋ−Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７；１７（２２）：８８４２−５５）および毛（vibrissae）の経路（Ｂａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００；２０（１１）：４２０６−１６；またはＳｔａｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０００；９９（１）：７−１６）のような経路に関連していると示唆されている。
【０００９】
神経細胞回路の活性を特異的に変化させる化合物をスクリーニングする方法の必要性がある。特に、ニューロン活性を調節する、新規または既知の因子の生理学的機能を試験する必要性はもちろんであるが、ニューロン活性およびニューロン回路の可塑性があるかどうかを生体内のモデルで試験する必要性がまだ依然としてあるが、本発明は、その必要性を満足させるものである。加えて、生体内でのセリンプロテアーゼインヒビターの発現に影響を与え、それゆえセリンプロテアーゼ、特に神経系の調節に役割を演じる化合物を突きとめる必要性がある。というのは、このような調節を妨害することが、神経発生はもちろん、止血（haemostasis）、新脈管形成、腫瘍の転移、細胞間移動に関連している可能性があり、それゆえこのような障害を予防、軽減、または矯正する際に役割を演じることができる候補化合物を特定化し突きとめることおよび特徴づけることが要望されている。
【００１０】
本発明は、生体内で活性化されるニューロン回路を解剖学的に特定化し、モニタリングする方法を提供することにある。特に、この発明は、ニューロン活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、動物の脳組織を候補化合物と接触させること；候補化合物が存在しない場合と比較して、セリンプロテアーゼインヒビターの発現レベル、特にプロテアーゼ  ネキシン−１の発現レベル（protease nexin-1（ＰＮ−１）expression levels）の変化をアッセイすること、この場合、特定の脳領域においてＰＮ−１の発現は、疾患、障害および関連の病態を示す；そして該化合物が存在しない場合と比較して、セリンプロテアーゼインヒビターの発現レベル（expression level）、特にＰＮ−１の発現レベルを変化（modify）させる化合物をニューロン活性および／またはニューロン可塑性を変化させる調節剤として選択することを含んでなるスクリーニング方法を提供する。
【００１１】
候補化合物は、セリンプロテアーゼインヒビター、特にＰＮ−１の発現レベル（expression level）を減少させるかまたは増加させることが可能である。ニューロン活性を減少させる化合物は、てんかん、薬物乱用、陽性精神症候群（positive psychotic symptoms）または多動性シンドローム（hyperactivity syndromes）のようなニューロン活性が増強している状態の可能性の高い調節剤である。ニューロン活性を増加させる化合物は、神経変性疾患において、アルツハイマー型または非アルツハイマー型痴呆症、パーキンソン病、脳卒中、脳の皮質に影響を与える良性および悪性腫瘍または損傷のようなニューロン活性が減少している状態の可能性の高い調節剤である。
【００１２】
本発明の更なる態様は、脳の特定の領域において、たとえば、制限はされないが、行動に影響を与えること、または化学品（たとえば、６−ヒドロキシドーパミン、イボテン酸（ibotenic acid）または他の任意の神経毒物）を投与することによって、ニューロン活性を誘発することを含んでなるスクリーニング方法である。
【００１３】
本発明の好ましい態様においては、ＰＮ−１遺伝子調節シーケンス（ＰＮ−１プロモーターシーケンス）のコントロールのもとに発現されるタンパク質マーカー（protein marker）の存在を介してＰＮ−１発現レベルを検出するが、タンパク質マーカーは、好ましくはレポーター遺伝子によってコードされる。好ましいレポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ（β−galactosidase）、グルコシダーゼ（glucosidases）、クロラムフェニコール  アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、グルコロニダーゼ（glucoronidases）、ルシフェラーゼ（luciferases）、ペルオキシダーゼ（peroxidases）、フォスファターゼ（phosphatases）、オキシドリダクターゼ（oxidoreductases）、デヒドロゲナーゼ（dehydrogenases）、トランスフェラーゼ（transferases）、イソメラーゼ（isomerases）、キナーゼ（kinases）、リダクターゼ（reductases）、デアミナーゼ（deaminases）、カタラーゼ（catalases）、ウレアーゼ（urease）および蛍光タンパク質（fluorescent proteins）からなる群より選択される。
【００１４】
代替態様としては、ＰＮ−１発現レベルは、ヘマグルチン（hemagglutin（ＨＡ））、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase（ＧＳＴ））、ヒス６（Ｈｉｓ６）、またはｍｙｃのようなペプチドまたはタンパク質タグ（peptide or protein tag）の存在を介して検出される。
【００１５】
したがって、本発明は、セリンプロテアーゼインヒビター、好ましくはプロテアーゼ  ネキシン−１のようなタンパク質、より好ましくはＰＮ−１の発現を利用することにより、脳の特定の領域においてニューロン活性のインディケーターとして、ニューロン（神経細胞）の活性を調節するか、またはニューロン可塑性を変化させる可能性がある化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００１６】
本発明者らは、特に脳において、ＰＮ−１を発現する幹細胞および前駆細胞（progenitor cells）（これらも本発明に包含されている）を調製した。また、ＰＮ−１の発現が細胞の混合集団の中からＰＮ−１の発現が基底レベル（すなわち、ＰＮ−１のプロモーター活性）以上の活性を有することを特徴とする幹細胞または前駆細胞を選び出す方法であって、残存細胞（remaining cells）から蛍光によって検知できるタンパク質を有する細胞を選別し、該タンパク質を、ＰＮ−１プロモーターシーケンスのコントロールのもとで発現させることを含んでなる方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、ＰＮ−１の発現レベルに基づいて、ニューロン活性および／またはニューロン可塑性を検討するため；候補医薬化合物をスクリーニングまたは治療的インターベンション（therapeutic interventions）に可能性があるかの評価のため；そして、ＰＮ−１の調節シーケンスのコントロールのもとでタンパク質マーカー（すなわちレポーター遺伝子）を発現する体外培養された哺乳動物の細胞培養を製造のための非ヒト動物モデルを提供する。ＰＮ−１調節シーケンスは、好ましくは、ノック−イン（knock-in）動物の形で完全なＰＮ−１遺伝子として、本技術分野でよく知られているように、プロモーターおよびエンハンサーエレメントを含む完全なＰＮ−１遺伝子もしくはそのフラグメントとして存在し得る。また、ノック−イン動物、その子孫または同等物から抽出された細胞を提供するものであり、そしてニューロン活性および／またはニューロン可塑性の調節剤のイン・ビトロでのスクリーニングアッセイにおけるそれらの使用も提供する。
【００１８】
更に、本発明は、迅速かつ信頼性のある方法で化合物を特定化するイン・ビボにおけるスクリーニング方法を提供するものであって、どんな遺伝子がニューロン回路に関与しているかとは無関係に、イン・ビボにおける行動およびニューロン活性に関連するニューロン回路を解剖学的に特定化し、モニターするためにセリンプロテアーゼインヒビターが用いられる。本方法の利点は、たとえば候補化合物による調節後に、ニューロン活性の量を知ることができることである。本発明は、ニューロン活性に帰結する過程のインディケーターまたは解読（readout）を提供し、迅速かつ信頼できるイン・ビボでの行動アッセイに応用できる。てんかんのようなニューロン活性をモニタリングする（たとえばＴａｔｕｍ  ＷＯ  ＩＶ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．２００１；１８（５）:４４２−４５５）参照）最もよく知られた方法の一つである電気生理学と比較して、本発明は、行動、疾患のパラダイムまたは関連する他の病態によって誘発されるニューロン活性に実際に関連している脳の構造を定量的に特定する方法を提供する。本発明は、電気生理学と比較してより迅速であり、必要な場合は、電気生理学的方法と組み合わせて使用することができるスクリーニング方法を提供する。
【００１９】
本発明は、イン・ビボにおけるニューロン活性をモニタリングする方法およびイン・ビボの行動モデルにおいてセリンプロテアーゼインヒビターの発現がニューロン活性によって調節されることを示す方法を提供する。その結果として、セリンプロテアーゼインヒビターの発現のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる候補化合物を特定化するスクリーニング方法が提供される。本発明者らは、ＰＮ−１の発現は、ニューロン活性に基づいてアップレギュレートすることを動物において初めて示した。
【００２０】
加うるに、遺伝子転写の調節が経験依存的な神経可塑性にとって必要であるか否かについては、現在ほとんど知られていない。この質問の答えがだされて初めて、中枢・末梢神経系および循環系に関連した疾患を見つけるための診断方法および、そのような疾患の治療方法が容易となり得る。この質問に答え、疾患を診断し、治療するために使用される化合物を提供することを可能にし、新皮質の可塑性に関連する経路を研究するためには、可塑性の細胞ローカス（locus）を明瞭に特定化することが可能な信頼できるイン・ビボにおける系が必要である。
【００２１】
本発明は、ヒトを含む哺乳類の種々の神経系関連の疾患の診断に有効である。そのような疾患・疾患は、空間認知障害、臭覚・味覚嫌悪学習障害（impaired spatial, olfactory and taste-aversion learning）を含む学習・記憶障害、アルツハイマー病に伴う学習・記憶障害ならびにパーキンソン病およびそれと同種類のもののような他の神経変性疾患に伴う障害を含む学習および記憶過程の障害を含むものである。本発明は、セリンプロテアーゼインヒビター、特にＰＮ−１の発現を検出することにより、生体において活性化されたニューロン回路（ニューロナル回路）および障害・減損を受けている可能性のあるニューロン回路を解剖学的に特定化し、モニタリングする方法を提供するものである。したがって、ＰＮ−１発現の特定のパターンによって、所定の疾患、疾患または関連する病態と結びつけることが可能となり、そして同様のもの（疾患・疾患または関連する病態）の診断に用いることも可能となる。
【００２２】
動物の脳組織を候補化合物と接触させることと、セリンプロテアーゼ  ネキシン−１（ＰＮ−１）の発現レベルの変化がないかどうか、好ましくは、プロテアーゼ  ネキシン−１（ＰＮ−１）のようなタンパク質（たとえば、ニューロセルピン（neuroserpin）、ベイト（BAIT）またはセルピンスーパーファミリー（serpin superfamily）属の他のメンバー）の発現のレベル（発現量）の変化がないかどうか、最も好ましくは、候補化合物が存在しない場合と比較してプロテアーゼ  ネキシン−１（ＰＮ−１）の発現レベルの変化がないかどうかをアッセイすることと（そこで、特定の脳領域におけるセリンプロテアーゼインヒビターの発現が疾患、疾患またはその関連する病態を表示している）；および上記の化合物が存在しない場合と比較してセリンプロテアーゼインヒビターの発現レベルを変化させる化合物をニューロン活性および／または神経（ニューロン）可塑性の調節剤として選択することを含んでなるニューロン活性を調節する化合物をスクリーニングする方法をも提供する。
【００２３】
本発明における趣旨において、“調節（modulate）”とは、脳におけるセリンプロテアーゼインヒビターの発現、好ましくはＰＮ−１の発現のレベルを変化させること、たとえば、コントロールと比較してそのレベルを減少させるかまたは増加させることを意味するものである。
【００２４】
本発明における趣旨において、“ニューロン活性（neuronal activity）”とは、たとえば行動、痛み、学習、恐れ、ストレス、または薬物によって引き起こされるニューロン回路の活性を含み、そのような活性は、ニューロン回路の応答が感覚系の情報をほほひげのレベルから皮質のレベルまで移動させることに関係している毛の経路（vibrissae pathway）で例証されるように、一つの情報の入力（input）を回路内の他のニューロン構造に通過させ、入力を処理することに係わっている。
【００２５】
本発明における趣旨において、“神経可塑性（neuronal plasticity）”とは、行動、痛み、恐れ、病変、または神経変性疾患によって引き起こされるニューロン回路の効率の変化を意味する。それぞれの障害、疾患は、影響を受ける特異的な回路を持っているであろう。
【００２６】
本発明における趣旨において、“タンパク質分解活性（proteolytic activity）”とは、プロテアーゼによって活性化されるレセプターの活性化をもたらし、または細胞外マトリックスの成分を含む、細胞の微環境における異なったタンパク質の分解に至る酵素活性を含む。
【００２７】
本発明における趣旨において、“接触（contacting）”とは、候補化合物を、この分野における公知の方法であればいかなる方法でも投与することを含むが、たとえば、経口または静脈内（好ましくは、尻尾の静脈）筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内のそれぞれの注射および点滴である。候補化合物は、脳において所望の効果をもたらすが、典型的には、候補化合物は、脳または脳の特定の部位で直接的に作用する。それゆえ、候補化合物が、この分野でよく知られているように、血液脳関門（blood-brain barrier）を通過できるようにすることが考慮されなければならない。好ましくは、化合物は、血液脳関門を通過できることを条件として、経口で投与される。
【００２８】
本発明における趣旨において、“候補化合物（candidate compound）”とは、脳においてＰＮ−１のようなセリンプロテアーゼインヒビター発現レベルを変化させることができるいかなる化合物をも含むものであり、好ましくは、脳内の血液脳関門を通過できる化合物である。代替的には、ある態様においては血液脳関門を通過するかを見極めた後に、候補化合物を修飾することができる。候補化合物は、セリンプロテアーゼインヒビター発現にたいして、アンタゴニストとして作用することもできるし、またアゴニストとして作用することもできる。本発明において、可能性のあるアンタゴニストとしては、本発明のポリペプチドに結合する抗体を含み、小有機分子、ペプチド、ポリペプチドを含むが、それによって、活性を抑制し、消去する。しかしながら、投与の容易性から、小有機分子（small organic molecule）が好ましい。可能性のあるアゴニストも、小有機分子、ペプチド、およびポリペプチドを含む。
【００２９】
他の可能性のあるアンタゴニストは、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）分子である。アンチセンス技術は、アンチセンス  ＤＮＡ、またはＲＮＡを介して、または三重らせん形成（triple-helix formation）を介して遺伝子発現を抑制するために使用される。アンチセンス手法については、たとえばＯｋａｎｏ，  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，  １９９１；５６：５６０で検討されている。その方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡにポリヌクレオチドを結合させることに基づいている。たとえば、本発明の成熟したポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの５'コード部分（5'coding portion of a polynucleotide）が、長さ約１０から４０の塩基対を有するアンチセンス  ＲＮＡ  オリゴヌクレオチドを設計する（design）するために使用され得る。典型的には、ＤＮＡ  オリゴペプチドまたはｓｉＲＮＡは、転写にかかわっている遺伝子の領域と相補的になるように設計され、それによって転写およびＰＮ−１の生産が妨げられる。アンチセンスＲＮＡ  オリゴヌクレオチド生体内でｍＲＮＡとハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子が、ＰＮ−１ポリペプチドへの翻訳することを阻害する。上記に述べられているオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡが生体内でＰＮ−１の生産を阻害するように細胞に運ばれることができる。ＰＮ−１発現のアンタゴニスト（または他のセリンプロテアーゼインヒビターアンタゴニスト）は、生体内でＰＮ−１活性のレベルを低くする必要のある個体（すなわち、ＰＮ−１に影響されやすいプロテアーゼに対する阻害が弱い）を治療するために、そのような個体に治療的に効果のある量のＰＮ−１発現に対するアンタゴニストを含んでなる組成物を投与することを含むことからなる方法において使用することができる。
【００３０】
本発明における趣旨において、“動物（animal）”とは、ヒトを除くいかなる種類の哺乳類をも含む。本発明おいて動物モデルとして適切な動物種としては、限定はされないが、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、犬、猫、ヤギ、羊、豚およびサル、チンパンジーのようなヒトでない霊長類を含む。初期の研究のためには、トランスジェニックマウス、およびラットが特に好ましいが、それは、比較的維持が容易であること、および寿命がより短いことによる。ある研究のためには、形質転換されたイーストまたは無脊椎動物が、適切かつ好ましい。というのは、これらは、スクリーニングが迅速であることが見込まれ、そして扱いが容易であるからである。長期間の研究には、非ヒト霊長類が好ましい。
【００３１】
本発明は、ＰＮ−１の発現レベルに基づいてニューロン活性および／またはニューロン可塑性を研究するため；医薬しての候補化合物をスクリーニングすることまたは可能性のある治療的インターベンションの評価のため；およびＰＮ−１調節シーケンス（配列）（PN-1 regulatory sequences）のコントロールのもとでのタンパク質マーカー（たとえばレポータージーンプロダクト（reporter gene product））発現する移植された（explanted）哺乳類細胞培養の創製のための非ヒト動物モデルを提供する。ＰＮ−１調節シーケンスは、完全なＰＮ−１遺伝子または作動可能なそのフラグメント（operable fragment）として、好ましくは、完全なＰＮ−１遺伝子として、ノックイン動物の形で存在し得る。
【００３２】
本発明以前には、ＰＮ−１発現がニューロン活性に関連するいかなる動物モデルも利用可能ではなかった。ＰＮ−１トランスジェニックマウスは、報告されていた（不完全な３，７ｋｂプロモーター、たとえば、Ｋｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１９９７；１２４（６）：１２５１−６２；またはＭｉｈａｉｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ．  １９９９；８４（１−２）：５５−６７）けれども、ＰＮ−１発現は、主として胎児（embryonic）の中脳および後脳のジャンクション（junction）で視覚化されており、そしてニューロン活性またはニューロンの可塑性の変化のインディケーターとしてのＰＮ−１発現について示唆されていない。本発明者らはＰＮ−１発現がそのようなインディケーターとして、ＰＮ−１  ノックインマウスを発生させた後始めて実際に使用できることを、意外にも見出したものである。行動（たとえば、社会的ストレス、痛み、およびそれと同様なもの。下記参照）に応答してＰＮ−１発現が増加することが論証されている。動物は、好ましくは、ＰＮ−１調節シーケンスのコントロールのもとでマーカータンパク質（たとえば、レポーター遺伝子）を含む。
【００３３】
本明細書で使用されている“タンパク質マーカー（protein marker）”とは、セリンプロテアーゼインヒビター遺伝子のような遺伝子の発現ためのシグナルとしておよび好ましくはニューロン活性に基づいて脳の表現パターンを定量的に測定するために使用できる遺伝子産物である。そのようなタンパク質マーカーの例は、任意の検知可能なタンパク質（たとえば、発現しているタンパク質に特異的な抗体を用いること）であり得るが、たとえば、ＰＮ−１または、レポーター遺伝子により発現されるタンパク質であり、制限はされないが、β−ガラクトシダーゼ（β−galactosidase）、グルコシダーゼ（glucosidases）、クロラムフェニコール  アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、グルコロニダーゼ（glucoronidases）、ルシフェラーゼ（luciferase）、ペルオキシダーゼ（peroxidases）、フォスファターゼ（phosphatases）、オキシドリダクターゼ（oxidoreductases）、デヒドロゲナーゼ（dehydrogenases）、トランスフェラーゼ（transferases）、イソメラーゼ（isomerases）、キナーゼ（kinases）、リダクターゼ（reductases）、デアミナーゼ（deaminases）、カタラーゼ（catalases）、ウレアーゼ（urease）および緑色蛍光タンパク質（green fluorescent proteins）のような蛍光タンパク質である。本発明において、より好ましい態様においては、マーカータンパク質としてのβ−ガラクトシダーゼのような酵素マーカーが用いられる。
【００３４】
本発明の趣旨において、ＰＮ−１遺伝子の“作動可能なフラグメント（operable fragment）”とは、作動可能に結合しているシーケンスの発現を駆動できるＰＮ−１遺伝子の任意のフラグメントを意味する。
【００３５】
セリンプロテアーゼインヒビター、好ましくはプロテアーゼ  ネキシン−１（nexin-1）のようなタンパク質は、脳の特定の部位におけるニューロン活性のインディケーターとして使用されることができる。ここで提供されるスクリーニング方法により、生体内におけるセリンプロテアーゼインヒビターのアゴニストおよびアンタゴニストを特定化することが可能となり、また医学および医学でない目的のための化合物を特定化することが可能である。本発明における好ましい態様においては、セリンプロテアーゼインヒビターはＰＮ−１である。本発明は、セリンプロテアーゼインヒビターとして、ＰＮ−１を用いて例示としているが、他の任意のＰＮ−１様タンパク質を使用でき、それは、ＢＡＩＴまたはノイロセルピン（neuroserpin）を含むが、これらに限定されるわけではない。本アッセイにおいては、スタンダードと比較してレポーターにおいて増加していれば、その候補化合物はＰＮ−１の発現を高めていることを示し、スタンダードと比較してレポーターにおいて減少していれば、その化合物はＰＮ−１の発現に拮抗していることを示す。
【００３６】
ニューロン活性／可塑性のための動物を作成する方法はいくつかあるが、その一つが、下記の実施例１に例示されている。好ましい態様においては、ノックアウトマウスまたはラットが、セリンプロテアーゼインヒビターローカス（serine protease inhibitor locus）の３'末端にリボソーム内部認識部位（internal-ribosomal-entry-site）／レポーターコンストラクトを挿入して作成される。下記の実施例は、β−ガラクトシダーゼを用いて、本発明を説明しているが、内因性のＰＮ−１遺伝子シーケンスの存在下もしくは不存在下で、他のレポータータンパク質が使用できることは、明細書に照らして、本技術分野において通常の技能を有する者にとっては、明らかなことである。ロックス  ピー  サイト（ｌｏｘ  ｐ  ｓｉｔｅｓ）のような組換えエレメントを挿入することは、Ｃｒｅ組換え酵素（Cre recombinase）のような酵素で認められているように、有利に使用され得る。マウスを作成するには、所望の核酸をマウス生殖系（mouse germ line）に挿入することができるが、卵母細胞マイクロインジェクション、または胚性幹細胞における相同組換えを伴う胚性幹細胞遺伝子導入またはマイクロインジェクションのような標準的な方法を用いる。一般的には、トランスジェニック／ノックイン動物を作る手法は、広く受け入れられており実施されている。マウスの胚を取り扱う研究所マニュアルは、たとえば、トランスジェニックマウスを作成する標準的研究所手法として詳述されており（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６）、利用可能である。
【００３７】
本発明の更なる態様において、セリンプロテアーゼインヒビターのシナプス伝達および可塑性における役割およびニューロン活性のこれらのセリンプロテアーゼインヒビターの発現への影響が、ノックイン動物を使用して生体内で評価される。好ましくは、本方法はさらに試験薬をニューロン活性が引き起こされていないコントロール動物に投与することからなり、その結果、効果がコントロールを参酌して決定される。
【００３８】
一つの態様においては、本発明は生体内で活性化された神経細胞経路（ニューロン経路）（neuronal pathway）を解剖学的に特定化し、モニタリングするシステムを提供する。本発明における趣旨において、“神経細胞経路（Neuronal pathway）”とは、感覚に関する事象、たとえば、行動、痛み、不安、病変、疾患などによって引き起こされる回路を作るニューロンの集団を含む。ひげ（vibrissae）とバレル皮質の中のバレルの間の機能的かつ解剖学的相関関係から、バレル皮質（barrel cortex）を含むひげの経路が、本発明を例示するために選択された（下記の実施例参照）。このシステムの関係は、ひげ小胞（whisker follicle）におけるひげに感受性のある（whisker-sensitive）レセプター細胞から始まり、シグナルは、そこから三叉神経脳幹核複合体（trigeminal brainstem nuclear（ＴＢＮＣ） complex）に至る。いくつかの核が刺激される：すなわち三叉神経核主感覚核（trigeminal nucleus principalis）（ＰｒＶ）、および三つの三叉神経脊髄路核（spinal trigeminal nucleus）の亜核すなわち、上核（oralis）（ＳｐＶｏ）、中位核（interpolaris）（ＳｐＶｉ）、および下核（caudalis）（ＳｐＶｃ）である。ＴＢＮＣからの軸索は反対側の（contralateral）視床の一部に伸びており、そこから体性感覚皮質（somatosensory cortex）のＩＶ層のバレル（barrels）に向かっている。それゆえ、明瞭に感覚に関係しているひげの生えているところ（sensory whisker pad）を解剖学的に図解（Ｗｏｏlｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  １９７０；１７（２）：２０５−４２）しているものが、特定の遺伝子の発現における変化が特定のひげ（whisker）を介する経験の変化に特異的であるか否か、およびニューロン活性がそのような遺伝子の発現を調節しているか否かを示すために使用することができる。
【００３９】
ひげ（vibrissae）の経路によって、例示がなされているが、本発明は、いかなる他の関連するニューロン経路への適用、たとえば、パーキンソン病、行動、痛み、不安、病変、ストレス、薬物耽溺、疾患、または他の感覚系の事象・出来事などである。ニューロン回路の他の例は、Ｐａｘｉｎｏｓ，  Ｇ．（Ｅｄ．），  “Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ”，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  １９５５に詳細に述べられてきた。
【００４０】
本発明の更なる態様において、ニューロン活性は、脳の特定の領域でたとえば、行動によるもの、化学品による誘発（chemical induction）、物理的誘発（physical induction）または環境制限（environmental constraints）を通して誘発される。ここで使用されている“行動（Behaviour）”とは、学習、習慣、またはストレス、痛み、恐れ、不安もしくは薬物に対する反応を含む。ニューロン活性を増大または減少させる化学品の例としては、６−ヒドロキシドーパミン、イボテン酸（ibotenic acid）、Ａｂ  アミロイドペプチド（Ab amyloid peptid）、カイニン酸（kainic acid）、イソニアジド（isoniazid）、ニトロゼパン（nitrozepan）、ベンゾジアゼピン（benzodiazepine）、フェニレンテトラゾール（phenylenetetrazole）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（N-methyl-D-aspartate）、キズカレート（quisqualate）、ピクロトキシン（picrotoxin）、ビククリン（bicuculin）、または他の任意の神経毒物を含むが、特に制限をするものではない。
【００４１】
本発明は、また、活性成分が本発明化合物である医薬組成物に関する。それゆえ、本発明は、本発明方法で特定された化合物で疾患、障害またはそれに関係する状態を有する個体の治療方法を提供する。活性成分は、医薬上許容され、活性成分と適合し、ここに述べられた治療方法に使用するために適切な量の賦形剤と混合することができる。適切な賦形剤とは、たとえば、水、塩水、デキストローズ（dextrose）、グリセロール、エタノールまたは類似物およびこれらの組みあわせによる配合であり、また、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびベンジルアルコールを含み（注射、または液剤のため）；ペテロラタム、植物油、動物脂肪およびポリエチレングリコール（外用製剤のため）を含む。加うるに、所望により、組成物は湿潤剤または乳化剤、等張剤、溶解補助剤、安定剤、着色剤、防腐剤、無痛化剤および類似の添加剤（医薬製剤に用いる通常の補助添加剤として）、ｐＨ調整剤および活性成分の効果を高める類似のものを含む。
【００４２】
本発明の治療用組成物は、医薬上許容される成分の塩を含むことができる。医薬上許容される塩とは、たとえば、塩酸もしくは燐酸のような無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸で形成される酸付加塩（たとえば遊離のアミノ基（free amino groups）で形成される）を含む。遊離のカルボキシル基で形成される塩は、たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄（ferric hydroxides）のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミンエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基からも誘導されることができる。
【００４３】
本発明で組成物、担体、希釈剤および試薬（reagents）に言及するときに使用される用語“医薬上許容される（pharmaceutically acceptable）”、“生理上許容される（physiologically tolerable）”およびこれらの文法上の変形（variations）は、互換性をもって使用され、吐き気、めまい、胃の不調などの好ましくない生理的な影響を与えることなく、ある成分をたとえば、哺乳類など、対象へまたは、対象に投与できることを示す。
【００４４】
生理上許容される担体は、本技術分野でよく知られている。液体の担体の例を挙げれば、活性成分と水に加えて成分が何も入っていないか、または生理的なｐＨ値での燐酸ナトリウム、生理食塩水またはその両者を含むたとえば燐酸緩衝生理食塩水のような緩衝剤を含む滅菌された水溶性溶液である。そのうえ更には、水溶性担体は、ナトリウムまたはカリウムクロリド、ブドウ糖、ポリエチレングリコールおよび他の溶質のみならず一つ以上の緩衝液としての塩を包含することができる。液体組成物は、水に加えて液相を含むことができるし、水を加えずに液相を含むこともできる。このような付加する液相の例は、グリセリン、綿実油のような植物油および水−油乳化液である。
【００４５】
更に、本発明においては、有効な量のこのような化合物で脳におけるニューロン活性を特異的に増加する方法、およびこのような化合物で脳におけるニューロン活性を特異的に減少させる方法が包含される。このような方法は、医学および非医学の目的に用いることができる。たとえば、ニューロン活性が増加したことを示す疾患を、ニューロン活性を減少させる本発明の化合物の有効量の化合物で治療する方法が、本発明に包含される。このような疾患の例は、てんかん、薬物乱用、陽性精神症候群、多動性シンドロームである。加えるに、ニューロン活性が減少したことを示す疾患を、ニューロン活性を増加させる本発明の化合物の有効量の化合物で治療する方法が、本発明の一部である。ニューロン活性が減少したことを示す疾患は非常に多くあるが、たとえば、アルツハイマー型または非アルツハイマー型の痴呆症、パーキンソン病、脳卒中（vascular strokes）、良性または悪性腫瘍または脳皮質に影響を与える損傷がある。ヒトの脳に影響する疾患は、すべて本発明の意味において、ニューロン活性の調節に通じているということもできる。本発明に使用されている用語“ニューロン活性に左右される関連する病態”は、任意の障害、たとえば、限定されるわけではないが、学習障害、特定の行動障害など、薬剤もしくはアルコールの乱用、肥満、恐れ、ストレス、または望ましくはないが障害もしくは疾患とは必ずしも考えられない他の病態を包含している。
【００４６】
したがって、非医学目的のこのような化合物も、本発明によって意図されている。穏やかで、適度な行動に関連してニューロン活性を増加させ、一日を基準にして、すなわち、パフォーマンスの向上を得るために毎日のベースで消費され得るニューロン活性が、本発明の化合物が、その例である。本発明の目的に関する用語“パフォーマンス（performance）”は、たとえば、脳の学習および記憶の機能を包含している。
【００４７】
本発明者らは、ＰＮ−１を発現している幹細胞および前駆細胞を観察し、それゆえ、ＰＮ−１が脳の幹細胞または前駆細胞で発現される発明方法も本発明によって包含される。
【００４８】
さらに、本発明によって、ＰＮ−１の調節シーケンスのコントロールのもとで、遺伝子産物を蛍光発光により検出して、遺伝子産物（gene product）を発現する幹細胞または前駆細胞を他の細胞から選び出す方法も提供される。遺伝子産物自体が蛍光を発することもあり得るし（たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））または、遺伝子産物は、蛍光分子を放つ酵素反応によって検出できる。細胞は、ＰＮ−１発現が基準のレベル以上（すなわちＰＮ−１のプロモーター活性）であることを特徴とし、好ましくは、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いて細胞の混合集団から選択される。それゆえ、選択された細胞は、蛍光によって検知できるタンパク質を所有しており、それは、ＰＮ−１プロモーターシーケンスのコントロールのもとで所望よりＰＮ−１とともに発現される。一つの実施態様においては、β−ガラクトシダーゼによって例示されているようにレポーター遺伝子を発現する細胞は、レポーター遺伝子の蛍光基質をＦＡＣＳとともに利用する方法によって、精製される（たとえば、Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１９９６；１８０（２）：４６８−７２参照）。選別された細胞は、ニューロン活性または可塑性の調節剤を特定化するスクリーンのようなイン・ビトロにおけるスクリーンのためにとして有用である。
【００４９】
上記の説明は、イン・ビボにおけるニューロン活性を調節し、ニューロン可塑性が変化する薬剤を特定化するために本発明の動物モデルを使用することに言及しているが、本発明はそのように限定されない。本発明のもう一つの態様にしたがって、ＰＮ−１調節シーケンスのコントロールのもとで、ＰＮ−１またはタンパク質マーカー（たとえばレポーター遺伝子）を発現する体外移植された哺乳類の細胞培養は、ニューロン活性を調節するかまたはニューロン可塑性において変化する薬剤をスクリーニングするために使用されることができる。
【００５０】
したがって、本発明は、ニューロン活性を調節するかまたはニューロン可塑性において変化する薬剤を特定化する方法であって、試験薬剤をニューロン活性の特異的パターンを受け入れる本発明の対象のＰＮ−１ノック−イン動物に投与することよりなる方法を提供する。一つまたはそれ以上のニューロン細胞、グリア細胞、星状細胞、幹細胞、および前駆細胞、特にＰＮ−１を発現する細胞を動物から単離したあと、これらの細胞をイン・ビトロで培養し、そして、試験薬剤の細胞に対する少なくとも一つの効果を決定し、情報が更に得られるであろう。
【００５１】
本発明はまた、本発明のＰＮ−１ノックイン動物（またはその子孫あるいは同等物）から単離された一つまたはそれ以上のニューロン細胞、グリア細胞、星状細胞、幹細胞、および前駆細胞を、イン・ビトロにおいて試験薬剤と接触させ、試験薬剤の少なくとも一つの細胞に対する効果を決定することを含んでなるニューロン活性またはニューロン可塑性（の変化）を調節する薬剤を特定化する方法を提供する。“同等物（equivalents）”とは、イン・ビトロにおいてたとえばトランスフェクションによってノックイン動物から単離された細胞と同様の特性を有するように遺伝的に変換される細胞を意味する。好ましい実施態様においては、薬剤のセリンプロテアーゼインヒビターの発現、とりわけＰＮ−１発現に対する効果はイン・ビボまたはイン・ビトロにおけるニューロン活性の誘導のあとに決定される。
【００５２】
好ましくは、本発明方法は、さらに、試験化合物のコントロールに対する効果を試験することを含んでなり、ここでコントロール細胞または動物では、ニューロン活性が誘導されていないので、その結果、いかなる効果も、コントロールを参酌して決定される。
【００５３】
本発明について下記に実施例において更に述べるが、次の実施例は、単なる例示の目的のみである。
【００５４】
実施例１：ＰＮ−１発現の基底レベル
本実施例においては、通常の動物小屋の状態で維持されている動物において転写の基底レベルが、ＰＮ−１発現の変化がニューロン（神経細胞）活動中に起こるか否かを決定するために検討される。６０μｍ厚のミクロトーム切片がβ−ガラクトシダーゼ組織化学のために調製された。切片のβ−ガラクトシダーゼ組織化学が次の方法で行われた：２４時間または７２時間の隔離（deprivation）および／またはエンリッチ環境（実施例２および３参照）の後、実験動物をケタローム（Ketarom）で麻酔し、断頭した。脳を、氷冷した燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で切り裂き出して、すぐにＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ，  Ｅｕｒｏｐｅ）中で冷凍した。組織を、低温槽（cryostat）で薄片に切り６０μｍの厚さにし、しばらく空気で乾燥した。ついで組織を、２０分間４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、次に１５分、３回、溶液Ｂ（２ｍＭ  塩化マグネシウム、０．０２％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、０．０１％  デオキシコール酸ナトリウム（sodium deoxycholate））で洗浄し、３７℃、溶液Ｃ（溶液Ｂに５ｍＭ  フェリシアンカリウム、５ｍＭ  フェロシアンカリウムおよび０．６ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）（ベーリンガーマンハイム）を加えたもの）中で一晩インキュベートした。
【００５５】
脳のホールマウント染色（whole mount staining）のために、脳をすばやく切り開き、氷冷したＰＢＳ液に入れ、氷冷して２時間定着薬固定液（４％パラホルムアルデヒド、ＰＢＳ）に入れておく。ついで、組織はＰＢＳ中で、２回にわたり３０分間室温にて洗浄し、さらに溶液Ｂ中（ＰＢＳ、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．０２％ノニデットＰ４０（Nonidet P40）、０．０１％  デオキシコール酸ナトリウム）で１回３０分洗浄して、溶液Ｃ（溶液Ｂに加えて５ｍＭのフェリシアン化カリウム、５ｍＭのフェロシンカリウム、および０．６ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）（ベーリンガーマンハイム）中で３７℃にて一晩インキュベートする。
【００５６】
脳のホモジネート中の、β−ガラクシトシダーゼ活性がサプライアーのプロトコールにしたがって、化学発光レポーター遺伝子アッセイ系ガラクト−スター（Galacto−Star）（Ｔｒｏｐｉｘ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）（下記に説明される）で測定された。サンプルは、次のように調製された：動物は、ケタロームで腹腔内投与により麻酔し（Ｆｒａｎｋｓ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ，３６７：６０７−６１４）、氷冷したＰＢＳで灌流した（perfused）。脳全体を、すばやく切り裂き、アッセイ系サプライアーによって提供されるｌｙｓｉｓ溶液でホモジナイズした（１００ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）。
【００５７】
ホモジネートを、遠心分離機にかけ、上澄み液のタンパク質の量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｕｎｉｃｈ）を使用して定量した。タンパク質含量を標準化し、上澄み液は、連続した希釈でβ−ガラクトシダーゼ活性があるかどうかテストされた。β−ガラクトシダーゼ活性は、化学発光基質で評価され、ルミノメーターで測定された。
【００５８】
ＰＮ−１発現の基底ラインは、脳のいくつかの部分で検出された。いくつかの別個の領域で強いβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。臭覚神経層および中脳下丘のような構造では、特に顕著である。視覚野皮質および前視蓋前核のような視覚系部分では、非常に強い標識を示す。β−ガラクトシダーゼ活性はいくつかの視床核、線条体および三叉神経系脊髄路核、外側網様核および顔面神経核のような脳幹のいくつかの核で顕著である。β−ガラクトシダーゼ活性はまた大脳皮質の第Ｖ層錐体ニューロンおよび小脳プルキンエ細胞のような特定の細胞集団に特別に存在することが観察された。これらのデータは、感覚系構造がＰＮ−１を極めて強く発現することを示している。
【００５９】
本実験のために、ＰＮ−１ノックイン動物が、Ｌｕｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７に記載されたＰＮ−１ノックアウトマウスに準じて作成された。簡潔にいえば、ＰＮ−１ノックアウトマウス（Ｌｕｔｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７  Ｊｕｎ  １５；１７（１２）：４６８８−９９）は、胚性幹細胞で相同的組換えにより作成される。マウスは戻し交配され、Ｃ５７ＢＬ／６マウス系で維持された。可能性のある前歴の違いを排除するために、野生型動物でのＰＮ−１タンパク質の定量化アッセイおよびタンパク質分解アッセイ（proteolytic assays）は、すべて同年齢の標準Ｃ５７ＢＬ６でおこなわれた。ジェノタイピング（Genotyping）は、尾のバイオプシー（tail biopsies）からのＤＮＡでＰＣＲ法によってなされた。代表的な実験マウスは、３−６ヶ月齢であった。ノックアウトマウスを得るために、エキソンＩＩ（９９ｂｐ）の一部は、ＡＴＧ開始コドンとともに除かれた。一方、ノックインマウスにおいては、エキソンＩＩは、全体がノックインコンストラクトに置き換えられた。両方のケースにおいて、ターゲットコンストラクトは、胚性幹細胞に導入され、相同的組換えによってゲノム配列（genomic sequence）を置き換えた。
【００６０】
本実験におけるＰＮ−１ノックインコンストラクトは、ヘマグルチン（hemagglutin（HA））にタグのついた成熟ＰＮ−１シーケンス（ＰＮ−１  ｃＤＮＡ、たとえばＧｌｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．１９８８  Ｄｅｃ５；４７（５）：６６７−９３；またはＳｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  １９８７  Ｏｃｔ６；２６（２０）：６４０７−１０参照）の前に分泌シグナル（secretion signal）（５６ｂｐ，ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｘ７０２９６）を含んでいる。ＰＮ−１配列（シーケンス）は、リボソーム内認識部位（ＩＲＥＳ）（internal ribosome entry site）配列によってＮＬＳ−ＬａｃＺ−ｐＡ配列（その後にＴＫ  Ｎｅｏ  ｐＡ  カセットが続く）から、隔てられている。そのコンストラクトは、ＰＮ−１遺伝子のエキソンＩＩ中に、相同的組換えによって挿入された。
【００６１】
実施例２：片側のひげの除去とＰＮ−１発現
ＰＮ−１転写が感覚的経験の変化によって誘導されるか否かの問題に対処するために、鼻口部の片側のひげが、すべて一側性に除かれ、動物は、７２時間エンリッチ環境（enriched environment）におかれる。ＰＮ−１ノックインマウスが使用されているということと、ひげが刈り込まれた（trimmed）もので引き抜かれたものでないという違いはあるが、実質的には、Ｂａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００  Ｊｕｎ  １；２０（１１）：４２０６−１６に記載されている方法で、“片側のみのひげ”（single spared whisker）という除去パターンがおこなわれた。“片側だけ（unilateral）”の除去パターンは、片側のひげがすべて除かれているということ以外は同じようになされた。対照動物を、かごに入れる前に、簡便に麻酔したが、ひげは除去しなかった。
【００６２】
次いで、脳を、β−ガラクシトダーゼ組織化学のために、薄片にされ加工する（実質的に実施例１で述べられているように）。ＰＮ−１の片側のアップレギュレーションが、三叉神経脊髄路核中位核および三叉神経脊髄路核上核において、明瞭に認識できる。アップレギュレーションは、何もしない完全なひげの側と同側性で存在する。反対側は、β−ガラクシトダーゼ転写の基準のレベルを示す。片側だけのひげがバレル野におけるＰＮ−１転写への影響を示すために、マウスは２４時間の間、Ｄ１のひげ以外のすべてを片側だけ除去される。
【００６３】
次いで、全体の脳がβ−ガラクシトダーゼ組織化学のために処理される。Ｄ１バレル（D1 barrel）は、皮質の表面に青い点として肉眼でみえる。バレル野に投影される視床核がＰＮ−１発現を示すか否かを検討するために、視床腹後内側核（ventroposterior medial（VPm）nucleus）を含む前頭断切片（coronal sections）が研究される。これらにより、体性感覚経路内の制限された細胞集団が、可塑性を誘導する感覚状態のもとで、ＰＮ−１／ｌａｃ  Ｚの発現をアップレギュレートすることを示す。
【００６４】
実施例３：ＰＮ−１の転写とエンリッチ環境の後のタンパク質レベル
脳の薄片で得られたデータに基づいて、エンリッチ環境で飼育されている脳におけるＰＮ−１の転写のレベルおよびＰＮ−１のタンパク質レベルが定量化される。エンリッチ環境は、トンネル、格子、プラスチックの物、アルミニウム箔、紙のような異なる形や質感（textures）のものを備えた大きなかごからなる。水および食べ物に、自由に接近可能であった。動物が、２４時間以上エンリッチ環境に収容された場合、その環境にあるものは、毎日置き換えられるか、または並べ替えられる。コントロール動物は、標準的な小さなかごで、一匹で飼育された。実験前は、すべての動物を、少なくとも３週間標準的な小さなかごで、一匹で飼育した。
【００６５】
エンリッチ環境に６時間、７２時間、８日間収容されていた動物およびコントロールの動物からホモジネートされた脳全体のβ−ガラクシトダーゼ活性が測定される。その結果は、脳の薄片での所見から確認される。β−ガラクシトダーゼ活性のレベルは、コントロールマウスと比較して、エンリッチ環境に７２時間収容されていたマウスにおいて、顕著に高い。しかしながら、β−ガラクシトダーゼ活性のレベルは、エンリッチ環境の収容の８日以内に基底線に戻ってしまったように思われる。ＰＮ−１のタンパク質レベルは、ＰＮ−１の特定のマウスのモノクローナル抗体を使用して、ドット・ブロット（dot-blot）法にてその量が決められる。連続的に希釈して、ＰＮ−１のタンパク質量は、コントロールの動物は、エンリッチ環境の動物と比較してより低いことがわかる。同一の効果が、エンリッチ環境での収容後２４時間と７２時間後でも観察され得る。
【００６６】
実施例４：エンリッチ環境と脳におけるタンパク質分解活性
ＰＮ−１の転写および翻訳が高まることが、脳のタンパク質分解活性を変えるか否かについて検討するために、エンリッチ環境とコントロールの動物の脳のホモジネートが試験される。広範囲の発色物質であり、ｔ−ＰＡ、第ＩＸ因子およびいくつかのプラズマカリクレインに特異的であるＳ−２２８８が使用される。エンリッチ環境にあったマウスの脳におけるタンパク質分解活性は、コントロールの動物と比較して減少する。このようにタンパク質分解活性が低くなることは、ニューロン活性によってアップレギュレートされているセリンプロテアーゼインヒビターの存在を示している。この結果により、脳のセリンプロテアーゼとそのインヒビターのバランスは、ニューロン活性に大きく依存していることを示しており、そして、脳のタンパク質分解活性の主要な決定要素であることを示している。
【００６７】
実施例５：社会的ストレスと疼痛のアッセイ
この例は、セリンプロテアーゼインヒビターとニューロン活性のアップレギュレーションの間の相関関係は、社会的ストレスであることを説明している。社会的ストレスを受けた一群で収容されたノックイン雄性動物は、一匹用のハウスの動物と比較して、ストレスを受けた動物のなかで脳のいくつかの部分で強いＰＮ−１のアップレギュレーションを示す。同様に、恐れを誘導される刺激にあったマウスは、前脳部においてＰＮ−１のアップレギュレーションを示すものとおもわれる。
【００６８】
痛みを受けた、すなわち、少なくとも１５分間、ひげを引き抜かれたり、鼻毛を強くはさんだりした後の動物は、脳幹において、疼痛刺激に反応すると記載されてきた核（顔面核、外側網様体、たとえばＡｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１；４１（２−３）：６２９−４１；またはＭｉｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １９９５；１０７（１）：３４−３８参照）において、ＰＮ−１の片側だけのアップレギュレーションを示した。
【００６９】
本明細書で言及されたすべての文献および優先権出願であるＧＢ０１２８７９３．７を、それぞれが個別的に言及されているかの如く、出典明示により本明細書の一部とする。
【国際調査報告】
2005510250.tif 000002
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2005510250.tif 000004
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