(57)【要約】  本発明は、重鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲにおける少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、グラフト化抗体またはその機能的フラグメントを提供し、ここで、これらのグラフト化抗体またはその機能的フラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープに対する特異的結合活性を有する。本発明はまた、隠れたコラーゲンエピトープに対する特異的結合活性を有する抗体を使用する方法を提供し、これらの方法は、新脈管形成、腫瘍成長、および転移を阻害する方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラフト化抗体、またはその機能的フラグメントであって、配列番号２６、２８、および３０からなる群より選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号２０、２２および２４からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該グラフト化抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、グラフト化抗体。
【請求項２】
抗体またはその機能的フラグメントであって、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、および配列番号１６２として参照されるＣＤＲからなる群より選択される１つ以上のＣＤＲを含み、該抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項３】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号２８として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号２０として参照される軽鎖ＣＤＲ１；；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項４】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号２８として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号７２として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項５】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４８として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号２０として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項６】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４５として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５４として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５７として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項７】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５８として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項８】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５９として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項９】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４８として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６０として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項１０】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４５として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号７２として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項１１】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５７として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項１２】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４５として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６０として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項１３】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６０として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項１４】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４５として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１６２として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５８として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項１５】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４５として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５６として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５７として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項１６】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５４として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５７として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項１７】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４５として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５７として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項１８】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５４として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６１として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項１９】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５６として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６１として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項２０】
請求項２に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号２８として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号２０として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項２１】
抗体またはその機能的フラグメントであって、１つ以上の重鎖ＣＤＲにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含む重鎖ポリペプチドを含み、該重鎖ＣＤＲが、配列番号２６、４３、４４、４５、４６、および４７として参照されるＣＤＲからなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号２８、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および５５として参照されるＣＤＲからなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号３０、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３および６４として参照されるＣＤＲからなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３からなる群より選択され、該抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項２２】
抗体またはその機能的フラグメントであって、１つ以上の軽鎖ＣＤＲにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖ポリペプチドを含み、該軽鎖ＣＤＲが、配列番号２０、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５および７６として参照されるＣＤＲからなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号２４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６として参照されるＣＤＲからなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３からなる群より選択され、該抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項２３】
グラフト化抗体またはその機能的フラグメントであって、配列番号３８、４０および４２からなる群から選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）または配列番号３２、３４および３６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該グラフト化抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、グラフト化抗体。
【請求項２４】
抗体またはその機能的フラグメントであって、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、および配列番号１５３として参照されるＣＤＲからなる群より選択される１つ以上のＣＤＲを含み、該抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項２５】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号３８として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４０として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号３２として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項２６】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号３８として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９２として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号３２として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項２７】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号１４７として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９２として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１４９として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項２８】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号１４７として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９２として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５０として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項２９】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号１４７として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１４９として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項３０】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号１４７として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１４４として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１４９として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項３１】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号１４７として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５１として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項３２】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号１４７として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９２として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５１として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項３３】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号１４７として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５２として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１４５として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項３４】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号１４８として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５０として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項３５】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号１４７として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１１５として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項３６】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号１４７として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４０として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５３として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項３７】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号１４７として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９２として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１１６として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項３８】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号１４７として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１１６として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項３９】
請求項２４に記載の抗体であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号３８として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号３２として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項４０】
抗体またはその機能的フラグメントであって、１つ以上の重鎖ＣＤＲにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含む重鎖ポリペプチドを含み、該重鎖ＣＤＲが、配列番号３８、８７、８８、８９、９０、９１、１４７、および１４８として参照されるＣＤＲからなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４０、９２、９３、９４、９５および１４４として参照されるＣＤＲからなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号４２、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８および１０９として参照されるＣＤＲからなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３からなる群より選択され、該抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項４１】
抗体またはその機能的フラグメントであって、１つ以上の軽鎖ＣＤＲにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖ポリペプチドを含み、該軽鎖ＣＤＲが、配列番号３２，１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１４６、１４９、１５０、１５１、１５２および１５３として参照されるＣＤＲからなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および１２５として参照される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号３６、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、および１４５として参照されるＣＤＲからなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３からなる群より選択され、該抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載のグラフト化抗体であって、前記機能性フラグメントが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２およびｓｃＦｖからなる群から選択される、グラフト化抗体。
【請求項４３】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体をコードする、核酸。
【請求項４４】
脈管形成脈管構造を標的化する方法であって、抗体、またはその機能的フラグメントを投与する工程を包含し、該抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号２６、２８、および３０からなる群より選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号２０、２２および２４からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、および配列番号１６２として参照されるＣＤＲからなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、方法。
【請求項４６】
請求項４４に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、治療部分をさらに含む、方法。
【請求項４７】
請求項４４に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、検出可能な部分をさらに含む、方法。
【請求項４８】
脈管形成を阻害する方法であって、抗体またはその機能的フラグメントを投与する工程を包含し、該抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号２６、２８、および３０からなる群より選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号２０、２２および２４からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、および配列番号１６２として参照されるＣＤＲからなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、方法。
【請求項５０】
請求項４８に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、治療部分をさらに含む、方法。
【請求項５１】
腫瘍を標的化する方法であって、抗体またはその機能的フラグメントを投与する工程を包含し、該抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号２６、２８、および３０からなる群より選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号２０、２２および２４からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、前記抗体または機能的フラグメントが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、および配列番号１６２として参照されるＣＤＲからなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、方法。
【請求項５３】
請求項５１に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、治療部分をさらに含む、方法。
【請求項５４】
請求項５１に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、検出可能な部分をさらに含む、方法。
【請求項５５】
腫瘍増殖を阻害する方法であって、抗体またはその機能的フラグメントを投与する工程を包含し、該抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号２６、２８、および３０からなる群より選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号２０、２２および２４からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、および配列番号１６２として参照されるＣＤＲからなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、方法。
【請求項５７】
請求項５５に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、治療部分をさらに含む、方法。
【請求項５８】
脈管形成脈管構造を検出する方法であって、脈管形成脈管構造を抗体またはその機能的フラグメントと接触させる工程を包含し、該抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号２６、２８、および３０からなる群より選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号２０、２２および２４からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法であって、前記抗体または機能的フラグメントが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、および配列番号１６２として参照されるＣＤＲからなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、方法。
【請求項６０】
請求項５８に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、検出可能な部分をさらに含む、方法。
【請求項６１】
転移を阻害する方法であって、抗体またはその機能的フラグメントを投与する工程を包含し、該抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号２６、２８、および３０からなる群より選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号２０、２２および２４からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、および配列番号１６２として参照されるＣＤＲからなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、方法。
【請求項６３】
請求項６１に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、治療部分をさらに含む、方法。
【請求項６４】
脈管形成脈管構造を標的化する方法であって、抗体、またはその機能的フラグメントを投与する工程を包含し、該抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号３８、４０、および４２からなる群より選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号３２、３４および３６からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該グラフト化抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、方法。
【請求項６５】
請求項６４に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、および配列番号１５３として参照されるＣＤＲからなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、方法。
【請求項６６】
請求項６４に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、治療部分をさらに含む、方法。
【請求項６７】
請求項６４に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、検出可能な部分をさらに含む、方法。
【請求項６８】
脈管形成を阻害する方法であって、抗体、またはその機能的フラグメントを投与する工程を包含し、該抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号３８、４０、および４２からなる群より選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号３２、３４および３６からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該グラフト化抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、方法。
【請求項６９】
請求項６８に記載の方法であって、前記抗体または機能的フラグメントが、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、および配列番号１５３として参照されるＣＤＲからなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、方法。
【請求項７０】
請求項６８に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、治療部分をさらに含む、方法。
【請求項７１】
腫瘍を標的化する方法であって、抗体、またはその機能的フラグメントを投与する工程を包含し、該抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号３８、４０、および４２からなる群より選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号３２、３４および３６からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該グラフト化抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、方法。
【請求項７２】
請求項７１に記載の方法であって、前記抗体または機能的フラグメントが、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、および配列番号１５３として参照されるＣＤＲからなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、方法。
【請求項７３】
請求項７１に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、治療部分をさらに含む、方法。
【請求項７４】
請求項７１に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、検出可能部分をさらに含む、方法。
【請求項７５】
腫瘍の増殖を阻害する方法であって、抗体、またはその機能的フラグメントを投与する工程を包含し、該抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号３８、４０、および４２からなる群より選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号３２、３４および３６からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該グラフト化抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、方法。
【請求項７６】
請求項７５に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、および配列番号１５３として参照されるＣＤＲからなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、方法。
【請求項７７】
請求項７５に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、治療部分をさらに含む、方法。
【請求項７８】
脈管形成脈管構造を検出する方法であって、脈管形成脈管構造を抗体、またはその機能的フラグメントと接触させる工程を包含し、該抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号３８、４０、および４２からなる群より選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号３２、３４および３６からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該グラフト化抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、方法。
【請求項７９】
請求項７８に記載の方法であって、前記抗体または機能的フラグメントが、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、および配列番号１５３として参照されるＣＤＲからなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、方法。
【請求項８０】
請求項７８に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、検出可能部分をさらに含む、方法。
【請求項８１】
腫瘍増殖を阻害する方法であって、抗体、またはその機能的フラグメントを投与する工程を包含し、該抗体またはその機能的フラグメントが、配列番号３８、４０、および４２からなる群より選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号３２、３４および３６からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを含み、該グラフト化抗体またはその機能的フラグメントが、隠れたコラーゲンエピトープに対して特異的結合活性を有する、方法。
【請求項８２】
請求項８１に記載の方法であって、前記抗体または機能的フラグメントが、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、および配列番号１５３として参照されるＣＤＲからなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、方法。
【請求項８３】
請求項８１に記載の方法であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが、治療部分をさらに含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般に、免疫学に関し、そしてより具体的には、ヒト化抗体およびそれらの使用に関する。
【０００２】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、正常プロセスおよび病的プロセスの調節に必須の役割を果たす。ＥＣＭ中に見出される最も大量に発現される成分は、コラーゲンである。３重らせん状コラーゲン（ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）は、タンパク質分解性の切断に対して、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の酵素ファミリーのメンバーによる切断を除いて、高度に耐性であることが公知である。
【０００３】
新脈管形成および腫瘍増殖は、細胞外マトリックスとの細胞の相互作用に依存する。新脈管形成および腫瘍侵襲の間、内皮細胞および腫瘍細胞は両方とも、これらの細胞の細胞外微環境を、タンパク質分解的に再構築する。次いで、これらの侵襲性細胞は、この新規に再構築された細胞外マトリックスと相互作用し、続いて移動および侵襲が起こる。このために、血管周囲の基底膜の主要成分は、コラーゲン−ＩＶである。さらに、コラーゲン−Ｉは、この間質マトリックス（ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｔｉａｌ  ｍａｔｒｉｘ）の主要成分である。
【０００４】
癌の進行の主な有害影響の１つは、原発腫瘍の部位を越える転移である。このような転移は、より攻撃的な治療をしばしば必要とし、そして一旦転移が起こると、癌患者の生存に関する予後は劇的に減少する。
【０００５】
全ての固形腫瘍の成長は、腫瘍（特に最小サイズを超える腫瘍）の連続した拡大のために、新しい血管の成長を必要とする。新脈管形成が腫瘍の成長に必要であるので、新脈管形成を阻害することは、腫瘍の成長の阻害への１つのアプローチである。従って、脈管形成の脈管構造を標的とし得る分子の同定が所望される。脈管形成の脈管構造の標的化についての特に魅力的な分子は、脈管形成の脈管構造に特異的に結合し得る抗体である。しかし、大抵の抗体は非ヒト動物（例えば、マウス）において開発されるので、これらの抗体は、しばしば所望でない免疫原性活性を有し、ヒトの治療に対するこれらの抗体の有効性を制限する。
【０００６】
非ヒト抗体の有害な特性を克服するための１つのアプローチは、結合特異性を与える結合ドメインとともにスプライスされたヒト抗体フレームワーク領域配列を用いることによって、これらの抗体をヒト化することである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、これらの結合ドメイン（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）のヒトフレームワークへのグラフトは、しばしば結合親和性の欠如を生じた。
【０００８】
従って、脈管形成の脈管構造に特異的な抗体を同定する必要性ならびに治療プロセスのためにこれらの抗体をヒト化および最適化する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
以下の発明は、この必要性を満たし、そして、関連の利点をも提供する。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、重鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲにおける少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、グラフト化抗体またはその機能的フラグメントを提供し、ここで、これらのグラフト化抗体またはその機能的フラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープ（ｃｒｙｐｔｉｃ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）に対する特異的結合活性を有する。本発明はまた、隠れたコラーゲンエピトープに対する特異的結合活性を有する抗体を使用する方法を提供し、これらの方法は、新脈管形成、腫瘍成長、および転移を阻害する方法を包含する。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、隠れたコラーゲン部位に特異的な抗体を提供し、これらの抗体は、新脈管形成および腫瘍細胞侵襲の間、膠原性組織の至るところに曝露され、従って脈管形成の脈管構造を標的化し得る抗体としての役割を果たす。これらの抗体は、隠れたコラーゲン部位への結合活性について最適化される。これらの抗体は、診断目的または治療目的のための脈管形成の脈管構造を標的化するために使用され得る。これらの抗体はまた、腫瘍の成長を阻害するために使用され得る。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内で見出される非連続な抗原結合部位を意味することが意図される。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９〜６６１６（１９７７））；Ｋａｂａｔら（米国保健社会福祉省、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９９１））；Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７））；およびＭａｃＣａｌｌｕｍら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５（１９９６））によって記載されており、これらの定義は、相互に比較される場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それでもなお、抗体もしくはグラフト化抗体またはその改変体のＣＤＲを言うためのいずれかの定義の適用は、本明細書中で定義および使用される用語の範囲内であることを意図する。上記で引用した参考文献の各々によって定義されるように、ＣＤＲを含むアミノ酸残基は、比較として以下の表１に示される。
【００１３】
【表１】
2005510246.tif 000002
１  残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら（前出）の命名法に従う。
２  残基の番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａら（前出）の命名法に従う。
３  残基の番号付けは、ＭａｃＣａｌｌｕｍら（前出）の命名法に従う。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「フレームワーク」は、抗体可変領域に関して使用される場合、抗体の可変領域内のＣＤＲ領域の外側の全てのアミノ酸残基を意味することが意図される。可変領域フレームワークは、一般に約１００〜１２０アミノ酸長の間であるが、ＣＤＲの外側のアミノ酸のみを参照することが意図される。本明細書中で使用される場合、用語「フレームワーク領域」は、これらのＣＤＲによって隔てられるフレームワークの各ドメインを意味することが意図される。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「ドナー」は、部分が由来するか、別の抗体分子もしくはそのフラグメントに与えられるかまたは寄与して、親分子の構造的特性または機能的特性のいずれかを受け入れ分子（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に与える、親抗体分子（ｐａｒｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）またはそのフラグメントを意味することが意図される。ＣＤＲグラフトの特定の例として、グラフト化ＣＤＲが誘導される親分子は、ドナー分子である。これらのドナーＣＤＲは、受け入れ分子に親分子の結合親和性を与える。ドナー分子は、受け入れ分子と異種または同種であり得る。ドナー分子および受け入れ分子が同種である場合、このドナー分子は、受け入れ分子と別の異なった分子で十分であることが理解される。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「アクセプター」は、親抗体分子もしくはドナー抗体分子またはそれらのフラグメントから供与される部分を受け入れる、抗体分子またはそのフラグメントを意味することが意図される。従って、アクセプター抗体分子またはそのフラグメントは、親分子から供与される部分の構造的特性または機能的特性を分与される。ＣＤＲグラフトの特定の例として、フレームワークおよび／または他の抗体フラグメントを含むアクセプター分子は、ＣＤＲがグラフトされる受け入れ分子である。アクセプター抗体分子またはフラグメントは、ドナーＣＤＲまたは親分子の結合親和性が与えられる。ドナー分子と同様に、アクセプター分子もまた、ドナーと同種または異種であり得ることが理解される。
【００１７】
「可変領域」は、抗体またはその重鎖もしくは軽鎖を参照して用いられる場合、抗原結合を分子に付与し、かつ定常領域ではない、抗体のアミノ末端部分を意味することを意図する。この用語は、可変領域全体の結合機能の全てのうちのいくつかを維持するその機能的フラグメントを包含することを意図する。それゆえ、用語「ヘテロマー可変領域結合フラグメント」は、ヘテロマー複合体にアセンブリした、少なくとも１つの重鎖可変領域および少なくとも１つの軽鎖可変領域またはそれらの機能的フラグメントを意味することを意図する。ヘテロマー可変領域結合フラグメントとしては、例えば、機能的フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などが挙げられる。このような機能的フラグメントは、当業者に周知である。従って、ヘテロマー可変領域の機能的フラグメントを記載する際のこれらの用語の使用は、当業者に周知の定義に対応することが意図される。このような用語は、例えば、以下に記載される：ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ａ．（編），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．）；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２２：１８９−２２４（１９９３）；ＰｌｕｃｋｔｈｕｎおよびＳｋｅｒｒａ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７８：４９７−５１５（１９８９）；ならびにＤａｙ，Ｅ．Ｄ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９０）。
【００１８】
本明細書中で用いられる場合、用語「集団」は、２以上の異なる分子の群を言及することが意図される。集団は、使用者が現在入手可能であるかまたは当業者によって作製され得る個々の分子の数ほど大きくてもよい。集団は、２〜４分子程度に小さくてもよく、または１０１３分子程度に大きくてもよい。一般に、集団は、２以上、３以上、５以上、９以上、１０以上、１２以上、１５以上、または２０以上の異なる分子を含む。集団はまた、数十もしくは数百の異なる分子、またはさらには数千の異なる分子を含み得る。例えば、集団は、約２０〜約１００，０００以上の異なる分子（例えば、約２５以上、３０以上、４０以上、５０以上、７５以上、１００以上、１５０以上、２００以上、３００以上、５００以上、または１０００以上の異なる分子）を含み得、そして１０，０００以上、１００，０００以上、さらには１×１０６以上の異なる分子を含み得る。当業者は、どのサイズおよび密度の集団が、特定の適用に適切であるかがわかる。
【００１９】
本明細書中で用いられる場合、用語「変更された」は、抗体可変領域を参照して用いられる場合、親アミノ酸配列と同じ位置で比較したときの１以上のアミノ酸の変化をフレームワーク領域、ＣＤＲまたはその両方に含む、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を意味することが意図される。変更された可変領域が、ドナー領域およびアクセプター領域に由来するかまたはこれらから構成される場合、変更された種内の変化したアミノ酸残基は、親ドナー領域および親アクセプター領域内のそれらのそれぞれのアミノ酸位置に対して比較されるべきである。
【００２０】
本明細書中で用いられる場合、用語「核酸」は、１本鎖または２本鎖のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を意味することが意図される。本発明の核酸分子は、直鎖、環状または分枝鎖の立体構造であり得、そして核酸分子のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖またはその両方のいずれかを表し得る。この用語はまた、合成および天然起源の両方の核酸分子を包含することを意図する。天然起源の核酸分子は、任意の動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、または両生類）または下等真核生物（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、酵母など）に由来し得る。合成核酸としては、例えば、化学合成および酵素合成が挙げられる。用語「核酸」は、同様に、参照核酸と類似の機能的特性を有し、そして天然に存在するヌクレオチドおよびヌクレオシドと類似の様式で利用され得る、天然ヌクレオチドのアナログを包含することが意図される。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにそのような抗体の抗原結合フラグメントを包含するように、その最も広義の意味で用いられる。本発明において有用な抗体またはそのような抗体の抗原結合フラグメントは、ポリペプチドまたはそのペプチド部分についての、少なくとも約１×１０５Ｍ−１の特異的結合活性を有することによって特徴付けられる。従って、ポリペプチドについての特異的結合活性を保持する、抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントなどは、抗体の定義に含まれる。ポリペプチドについての抗体の特異的結合活性は、当業者により、例えば、特定のポリペプチドへの抗体結合活性を、その特定のポリペプチドではないコントロールポリペプチドへの抗体結合活性に対して比較することにより、容易に決定され得る。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を調製する方法は、当業者に周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照のこと）。
【００２２】
さらに、用語「抗体」は、本明細書中で用いられる場合、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能性抗体およびヒト化抗体、ならびにそれらの抗原結合フラグメントを含め、天然に存在する抗体ならびに天然に存在しない抗体を包含する。このような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築され得るか、組換え産生され得るか、または例えば、Ｈｕｓｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９））によって記載されるような可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって入手され得る。機能的抗体を作製するこれらの方法および他の方法は、当業者に周知である（ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：２４３−２４６（１９９３）；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，前出，１９８８）；Ｈｉｌｙａｒｄら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５））。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、特異的結合とは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、コントロール分子（これは一般に、結合活性を有さない類似の構造の分子（例えば、別のエピトープまたは抗原を結合する抗体）である）の結合に対して比較した分子の結合を決定することによって測定され得る。結合の特異性はまた、例えば、コントロール分子との競合（例えば、過剰の同じ分子を用いた競合）によって決定され得る。この場合、分子の結合がそれ自体によって競合的に阻害される場合、特異的結合が示される。従って、抗体と抗原との間の特異的結合は、非特異的相互作用とは測定可能に異なり、そしてその抗体の抗原結合部位を介して生じる。
【００２４】
本明細書中で用いられる場合、選択的結合とは、特異的であって、かつ分子（例えば、単一の分子に結合する抗体または密接に関連する分子）の間を識別する、結合相互作用をいう。例えば、抗体は、エピトープが分子に独特であれば、抗原について特異的かつ選択的の両方である、抗原特異性を示し得る。従って、選択的結合を有する分子は、１つの分子または密接に関連した分子に対して独特のエピトープについての特異性を有する抗体によって例示されるように、分子の間を識別し得る。あるいは、抗体は、多くの分子に共通であるエピトープ（例えば、多数の分子上に発現される糖質）についての特異性を有し得る。このような抗体は、特異的結合を有するが、１つの分子または密接に関連した分子について選択的ではない。
【００２５】
本明細書中で用いられる場合、用語「結合親和性」は、結合相互作用の強度を意味することが意図され、そして実際の結合親和性ならびに見かけの結合親和性の両方を包含する。実際の結合親和性は、会合速度の、解離速度に対する比である。それゆえ、結合親和性を付与または最適化することは、これらの成分のいずれかまたは両方を変更して、所望のレベルの結合親和性を達成することを包含する。見かけの親和性は、例えば、相互作用のアビディティを包含し得る。例えば、二価ヘテロマー可変領域結合フラグメントは、その価数に起因して、変更された結合親和性または最適化された結合親和性を示し得る。
【００２６】
本明細書中で用いられる場合、用語「実質的に同じ」は、結合親和性を参照して用いられる場合、１つの分子が、親和性測定値の実験的変動性内で、別の分子と類似した結合親和性を有する、類似または同一の結合親和性を意味することが意図される。結合親和性測定値の実験的変動性は、用いられる特定のアッセイに依存し、そして当業者に公知である。
【００２７】
本明細書中で用いられる場合、用語「最適化する」とは、可変領域またはその機能的フラグメントを参照して用いられる場合、その可変領域の機能的活性が、親可変領域またはドナー可変領域の活性と比較して改変されており、活性における所望の変化がもたらされていることを意味することが意図される。最適化された活性を示す、可変領域またはその機能的フラグメントは、例えば、変更されていない可変領域と比較して、より高い親和性もしくはより低い親和性の結合、または増大もしくは低下した会合速度もしくは解離速度を示し得る。最適化された活性を示す、可変領域またはその機能的フラグメントはまた、特定の生物において、増大した安定性（例えば、増大した半減期）を示し得る。例えば、抗体活性は、タンパク質分解に対する感受性を低下させることによって安定性を増すように最適化され得る。最適化された活性を示す抗体はまた、所望の場合、低下した会合速度または増大した解離速度を含め、より低い親和性の結合を示し得る。より低い親和性の結合を示す、最適化された可変領域は、例えば、固形腫瘍に浸透するに有用である。その高い親和性に起因して、腫瘍の末梢領域に結合するが、腫瘍の内部領域に浸透することができない、より高い親和性の可変領域とは対照的に、より低い親和性の可変領域は、腫瘍の内部領域に浸透するために有利である。上記の結合親和性の最適化についてと同様に、触媒性可変領域の最適化は、例えば、増大または低下した触媒速度、解離定数または会合定数であり得る。
【００２８】
本明細書中で用いられる場合、「隠れたコラーゲン部位（ｃｒｙｐｔｉｃ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｉｔｅ）」または「隠れたコラーゲンエピトープ」とは、変性したコラーゲンにおけるよりも、ネイティブなコラーゲンにおいて抗体またはその機能的フラグメントの結合にアクセスしにくい（ｌｅｓｓ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）コラーゲン分子エピトープをいう。隠れたコラーゲンエピトープについての結合活性を有する抗体は、ネイティブなコラーゲンよりも、変性したコラーゲンを優先的に認識する。すなわち、変性したコラーゲンに対して、ネイティブなコラーゲンよりも高い結合親和性を有する。例えば、このような抗体は、変性したコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅ）に対して、ネイティブなコラーゲンよりも少なくとも約２倍以上の優先度、すなわち、少なくとも約２倍高い結合活性を有し得、そして変性したコラーゲンに対して、ネイティブなコラーゲンよりも、約３倍以上の優先度、約５倍以上の優先度、約１０倍以上の優先度、約１５倍以上の優先度、約２０倍以上の優先度、約２５倍以上の優先度、約５０倍以上の優先度、約１００倍以上の優先度、またはなおより高い優先度を示し得る。
【００２９】
ネイティブなコラーゲンとは、本明細書中で、３つのα鎖が三重らせん分子に組織化されている分子をいう。ネイティブなコラーゲンは、翻訳後プロセシングの種々の段階のコラーゲン（例えば、プロコラーゲンおよび成熟組織形態のコラーゲンの生成における任意の中間体、またはコラーゲンの三重らせん構造が破壊されない条件下での組織の制限されたタンパク質分解によって単離されたコラーゲン分子）であり得る。従って、ネイティブなコラーゲンは、インタクトなコラーゲン分子であってもよく、または三重らせんが破壊されない限り、三重らせん領域に隣接する非三重らせん配列を含み得る。本明細書中では、変性したコラーゲンとは、隠れたエピトープが利用可能になるように、三重らせんが完全または部分的に破壊されたコラーゲンをいう。コラーゲンの変性は、三重らせん領域内のコラーゲンを切断して、三重らせんの得られるフラグメントを不安定にする、プロテイナーゼ（例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ）の作用によってインサイチュで生じ得る。コラーゲンの変性は、ネイティブなコラーゲンの熱変性または化学的変性によって、インビトロで誘導され得る。変性したコラーゲンはまた、三重らせんの得られるフラグメントが熱に不安定な温度における、三重らせん領域を切断し得るプロテイナーゼ（これは通常、コラーゲン分解酵素といわれる）でのネイティブなコラーゲンの処理によって、インビトロで調製され得る。変性したコラーゲンは、翻訳後プロセシングの種々の段階のネイティブなコラーゲンの変性、または制限されたタンパク質分解によって組織から単離されたネイティブなコラーゲンの変性によって入手され得る。当業者は、ネイティブなコラーゲンを単離するための種々の方法および隠れたコラーゲンエピトープを含む三重らせんを変性させる種々の方法がわかる。
【００３０】
本発明の抗体は、それぞれの親マウス抗体と同じである隠れたコラーゲンエピトープについての結合活性を有し得る。例えば、ＨＵＩＶ２６由来のＣＤＲを有する本発明の抗体は、Ｘｕら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９：３７５−３８５（２０００）；Ｘｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５４：１０６９−１０７９（２００１）；およびＷＯ００／４０５９７（これらの各々は、参考として本明細書中に援用されている）により記載のマウスＨＵＩＶ２６抗体と本質的に同じ結合特異性を有し得る。同様に、ＨＵＩ７７由来のＣＤＲを有する本発明の抗体は、Ｘｕら、前出，２０００；Ｘｕら、前出，２００１；およびＷＯ００／４０５９７によって記載のマウスＨＵＩ７７抗体と本質的に同じ結合特異性を有し得る。このような結合特異性は、本明細書中に開示された方法（例えば、本発明の抗体の活性を、対応する親マウス抗体の活性と比較することにより）によって試験され得る。例えば、ＨＵＩＶ２６に由来する本発明の抗体は、図２Ｃ（配列番号２および４）中に示される可変領域アミノ酸配列を有する対応するマウス抗体に対して比較され得る。同様に、ＨＵＩ７７由来の本発明の抗体は、図３Ｃ（配列番号１０および１２）中に示される可変領域アミノ酸配列を有する対応するマウス抗体に対して比較され得る。同様の結合特異性は、例えば、対応する親抗体との競合結合によって決定され得る。本発明の抗体は、対応する親抗体と本質的に同じ特異性を有し得るか、またはその抗体が隠れたコラーゲンエピトープについての結合活性を有する限り、変化した特異性を有し得ることが理解される。
【００３１】
本発明は、隠れたコラーゲンエピトープについての特異的結合活性を有する抗体を提供する。これら抗体は、抗体ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７のＣＤＲにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＣＤＲを含み、ここでこれら抗体は、隠れたコラーゲン部位に結合する抗体である。本発明はまた、これらの抗体をコードする核酸を提供する。本発明はさらに、これら抗体を使用する方法を提供する。
【００３２】
ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７と称される、ヒトコラーゲンの隠れたドメインを認識する、高度に特異性のモノクローナル抗体が、開発されている（Ｘｕら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９：３７５−３８５（２０００）；Ｘｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５４：１０６９−１０７９（２００１）；ＷＯ００／４０５９７（これらの各々は、参考として本明細書中に援用されている）を参照のこと）。モノクローナル抗体ＨＵＩＶ２６は、ヒトコラーゲン−ＩＶの隠れたドメインを認識し、そしてＨＵＩ７７は、ヒトコラーゲン−ＩおよびＩＶの隠れたドメイン（これはまた、コラーゲンＩＩ、ＩＩＩおよびＶにも共通である）を認識する。この隠れたドメインは、ほとんどの正常な生理的条件下ではやや利用しにくいが、インビボにおけるコラーゲン三重螺旋のタンパク質分解性再構築の後に、利用可能になる。従って、隠れたコラーゲンエピトープは、侵襲性の細胞プロセスの間に、より利用可能になり得る。重要なことに、これらの抗体によって定義される隠れたドメインは、ヒト腫瘍（胸部腫瘍、膀胱腫瘍、および黒色腫を含む）から腫瘍関連脈管形成性血管の基底膜内に露出されることが示された。しかし、この隠れたドメインは、試験された血管または正常組織内では、ほとんど露出されなかった。従って、抗体ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７は、脈管形成性血管の重要な特異的マーカーを表す。これらの隠れたドメインは、脈管形成および腫瘍増殖の調節において重要な役割を果たす。なぜなら、モノクローナル抗体ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７は、全身投与後のニワトリ胚、ラットおよびマウスモデルにおいて脈管形成およびヒト腫瘍増殖を強力に阻害するからである（Ｘｕら、前出、２００１）。従って、これらのモノクローナル抗体、およびこれらの隠れたコラーゲン部位について特異的結合活性を有する本発明の抗体は、異常な新生血管形成によって特徴付けられる疾患についての処置のための高度に強力であり、かつ有効な新規な治療試薬を表す。
【００３３】
本発明の核酸配列は、具体的に記載された配列番号と同じであるか、または実質的に同じである配列を含み得る。同様に、本発明のアミノ酸配列は、具体的に記載された配列番号と同じであるか、または実質的に同じである配列を含み得る。本明細書中で使用されるように、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関して用いられる場合、用語「実質的に」または「実質的に同じ」とは、そのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、参照配列（例えば、親抗体の配列）と比較される場合、かなりの割合、量、または程度の配列同一性を示すことを意味することが意図される。このような配列同一性のかなりの割合、量、または程度は、有意である、および意味がある、とさらに考えられ、従って、決定的に認識可能であるかまたは決定的に知られている特徴を呈示する。従って、本発明の抗体の重鎖または軽鎖（それらのフラグメントを含む）と実質的に同じヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列は、親抗体配列としてそのアミノ酸配列をコードするか、またはそのアミノ酸配列であると決定的に知られているか、または認識可能である特徴を呈示する配列をいう。それらの微小な改変は、それらが親抗体配列として認識可能である限り、含まれる。同様に、本発明の抗体の重鎖または軽鎖、またはそれらの機能的フラグメントと実質的に同じアミノ酸配列であるアミノ酸配列が、親抗体のアミノ酸配列およびそれらの微小改変を表すとして決定的に知られている、または認識可能である特徴を呈示する配列をいう。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列が親抗体と実質的に同じであるか否かを決定する場合、機能が維持されるか、例えば、隠れたコラーゲン部位への結合の機能が、本発明の抗体について維持されるかと共に、親抗体に対する変更の数に対して検討が与えられる。
【００３４】
これらのヌクレオチド配列および／またはアミノ酸の微小な改変は、重鎖および軽鎖をコードする核酸およびそれらの機能的フラグメントとして含まれることが意図される。このような微小な改変としては、例えば、遺伝暗号の縮重に起因して、コードされたアミノ酸配列を変更しない改変、ならびに、コードされたアミノ酸配列の保存的置換を単に生じる改変が挙げられる。コードされたアミノ酸の保存的置換としては、例えば、以下の群内に属するアミノ酸が挙げられる：（１）非極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ）；（２）極性中性アミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ）；（３）極性酸性アミノ酸（ＡｓｐおよびＧｌｕ）；（４）極性塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓ）；ならびに（５）芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＨｉｓ）。他の微小な改変は、その核酸またはコードされたポリペプチドが、本明細書中に記載されるようなそれらの機能のいくらかまたは全体を保持する限り、本発明の重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードする核酸内に含まれる。
【００３５】
隠れたコラーゲンエピトープについて特異的結合活性を有する本発明の抗体を生成するために、抗体ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７の重鎖および軽鎖可変領域がクローニングされ、そして配列決定された（実施例Ｉ、ならびに図２および３を参照のこと）。重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲが同定された。例示の重鎖および軽鎖のＣＤＲ（Ｋａｂａｔの番号付けによって決定した）を、図２Ｃおよび３Ｃ中に示す（下線）。ＨＵＩＶ２６の例示の重鎖および軽鎖ＣＤＲとしては、例えば、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号２０）；ＶＬ  ＣＤＲ２、ＧＡＳＴＲＥＳ（配列番号２２）；ＶＬ  ＣＤＲ３、ＱＮＤＨＳＹＰＹＴ（配列番号２４）；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＧＦＤＦＳＲＹＷＭＳ（配列番号２６）；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤ（配列番号２８）；およびＶＨ  ＣＤＲ３、ＰＶＤＧＹＹＤＡＭＤＹ（配列番号３０）が挙げられる。ＨＵＩ７７の例示の重鎖および軽鎖ＣＤＲとしては、例えば、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号３２）；ＶＬ  ＣＤＲ２、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号３４）；ＶＬ  ＣＤＲ３、ＦＱＧＳＨＶＰＷＴ（配列番号３６）；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号３８）；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＤＩＷＷＤＤＮＫＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４０）；およびＶＨ  ＣＤＲ３、ＲＡＮＹＧＮＰＹＹＡＭＤＹ（配列番号４２）が挙げられる。
【００３６】
単一アミノ酸置換を含むＣＤＲ改変体のライブラリーが生成された（実施例ＩＩ）。ライブラリーは、隠れたコラーゲン部位への結合についてスクリーニングされ、有益な活性を有する単一アミノ酸変異が同定された。コンビナトリアル変異体、ここでは、親ＨＵＩＶ２６またはＨＵＩ７７  ＣＤＲに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む２つ以上の改変体ＣＤＲｓが組み合わされ、そして活性についてスクリーニングされた（実施例ＩＩＩ）。隠れたコラーゲン部位への結合について最適化された活性を有する多数のコンビナトリアル変異体が、同定された。
【００３７】
隠れたコラーゲンエピトープについての結合活性を有する本発明の抗体。本明細書中に開示されるように、コラーゲンは、ネイティブコラーゲン中ではやや利用しにくかった抗原決定基が露出される限り、種々の方法のいずれによっても変性され得る。このような方法としては、例えば、蛋白質分解消化、加熱または熱的変性、化学変性などが挙げられる。当業者は、隠れたコラーゲン部位またはエピトープを解明するためにコラーゲン分子を変性するのに適切な種々の方法を認知する。さらに、変性方法は、２つ以上の変性方法の組み合わせ（例えば、タンパク質分解消化と、化学変性および／または熱的変性との組み合わせ）であり得る。例えば、タンパク質分解消化は、コラーゲンを切断するために使用され得、熱的変性または化学変性により感受性であるコラーゲン分子を生じる。コラーゲンを変性するために使用され得る例示のプロテアーゼは、マトリクスメタロプロテイナーゼであり、これは、インビトロで使用され得、そして哺乳動物における体温で三重螺旋領域内でコラーゲンを切断するようにインビボで機能し得る。
【００３８】
本発明は、ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７抗体のグラフト化抗体を提供する。１つの実施形態では、本発明は、ＨＵＩＶ２６のグラフト化抗体を提供する。グラフト化抗体またはそれらの機能的フラグメントは、配列番号２６、２８および３０からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ、または配列番号２０、２２および２４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上の相補的決定領域（ＣＤＲ）を含み、このグラフト化抗体またはそれらの機能的フラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープについての特異的結合活性を有する。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、ＨＵＩ７７のグラフト化抗体を提供する。グラフト化抗体またはそれらの機能的フラグメントは、配列番号３８、４０および４２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ、または配列番号３２、３４および３６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲの１つ以上のＣＤＲにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つ以上の相補的決定領域（ＣＤＲ）を含み、このグラフト化抗体またはそれらの機能的フラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープについての特異的結合活性を有する。
【００４０】
本発明は、さらに、具体的に記載されたＣＤＲを含む、抗体またはそれらの機能的フラグメントを提供し、ここで、この抗体またはそれらのフラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープについての特異的結合活性を有する。このような抗体としては、少なくとも単一アミノ酸置換を有し、そして隠れたコラーゲンエピトープについての結合活性を保持する抗体が挙げられる。このようなＣＤＲ改変体間には、図４および５中に記載の改変体が含まれる。
【００４１】
ＨＵＩＶ２６のＣＤＲにおいて単一アミノ酸置換を有する本発明の例示のＣＤＲとしては、例えば、以下に記載のものが挙げられ、ここで、Ｋａｂａｔの番号付けにおけるアミノ酸変異の位置は、野生型から変異体（野生型→変異体）へのアミノ酸置換と共に示される。このような例示のＣＤＲとしては、以下が挙げられる：ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ１  ３１Ｒ→Ｈ（配列番号４３）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ１  ３４Ｍ→Ｉ（配列番号４４）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ１  ３５Ｓ→Ｔ（配列番号４５）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ１  ３５Ｓ→Ａ（配列番号４６）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ１  ３５Ｓ→Ｇ（配列番号４７）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ２  ５７Ｉ→Ａ（配列番号４８）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ２  ５７Ｉ→Ｓ（配列番号４９）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ２  ６２Ｓ→Ｙ（配列番号５０）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ２  ６２Ｓ→Ａ（配列番号５１）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ２  ６２Ｓ→Ｈ（配列番号５２）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ２  ６２Ｓ→Ｇ（配列番号５３）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ２  ６４Ｋ→Ｑ（配列番号５４）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ２  ６５Ｄ→Ｓ（配列番号５５）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ３  ９７Ｄ→Ｐ（配列番号５６）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ３  ９７Ｄ→Ｇ（配列番号５７）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ３  ９７Ｄ→Ｔ（配列番号５８）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ３  ９７Ｄ→Ａ（配列番号５９）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ３  ９８Ｇ→Ｐ（配列番号６０）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ３  ９８Ｇ→Ａ（配列番号６１）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ３  ９８Ｇ→Ｈ（配列番号６２）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ３  １０２Ｙ→Ｐ（配列番号６３）；ＨｕＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ３  １０２Ｙ→Ｎ（配列番号６４）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７Ｑ→Ｒ（配列番号６５）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７Ｑ→Ｓ（配列番号６６）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｄＮ→Ｓ（配列番号６７）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｅＳ→Ｙ（配列番号６８）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｅＳ→Ｗ（配列番号６９）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｅＳ→Ｈ（配列番号７０）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｅＳ→Ｒ（配列番号７１）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｆＧ→Ｙ（配列番号７２）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｆＧ→Ｒ（配列番号７３）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｆＧ→Ｈ（配列番号７４）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｆＧ→Ｉ（配列番号７５）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２９Ｑ→Ｋ（配列番号７６）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９３Ｓ→Ｑ（配列番号７７）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９３Ｓ→Ｇ（配列番号７８）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９３Ｓ→Ｌ（配列番号７９）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９３Ｓ→Ａ（配列番号８０）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９３Ｓ→Ｔ（配列番号８１）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９３Ｓ→Ｖ（配列番号８２）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９４Ｙ→Ｎ（配列番号８３）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９４Ｙ→Ｓ（配列番号８４）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９４Ｙ→Ｐ（配列番号８５）；ＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９４Ｙ→Ｍ（配列番号８６）；およびＨｕＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ２  ５７Ｉ→Ｖ（配列番号１６２）。
【００４２】
ＨＵＩ７７のＣＤＲにおいて単一アミノ酸置換を有する本発明の例示のＣＤＲとしては、例えば、以下に記載のものが挙げられ、ここで、Ｋａｂａｔの番号付けにおけるアミノ酸変異の位置は、野生型から変異体（野生型→変異体）へのアミノ酸置換と共に示される。このような例示のＣＤＲとしては、以下が挙げられる：ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ１  ３２Ｓ→Ｐ（配列番号８７）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ１  ３２Ｓ→Ｗ（配列番号８８）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ１  ３５ｂＧ→Ｗ（配列番号８９）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ１  ３５ｂＧ→Ｌ（配列番号９０）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ１  ３５ｂＧ→Ａ（配列番号９１）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ２  ５９Ｙ→Ｓ（配列番号９２）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ２  ５９Ｙ→Ａ（配列番号９３）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ２  ５９Ｙ→Ｐ（配列番号９４）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ２  ６４Ｋ→Ｐ（配列番号９５）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ３  ９５Ｒ→Ｐ（配列番号９６）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ３  ９５Ｒ→Ｑ（配列番号９７）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ３  ９５Ｒ→Ｌ（配列番号９８）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ３  ９５Ｒ→Ｔ（配列番号９９）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ３  ９５Ｒ→Ｖ（配列番号１００）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ３  １００Ｎ→Ｖ（配列番号１０１）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ３  １００Ｎ→Ｗ（配列番号１０２）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ３  １００ｅＭ→Ｑ（配列番号１０３）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ３  １００ｅＭ→Ｎ（配列番号１０４）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ３  １００ｅＭ→Ｔ（配列番号１０５）；ＨＵＩ７７ＶＨ  ＣＤＲ３  １０２Ｙ→Ｋ（配列番号１０６）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ３  １０２Ｙ→Ｔ（配列番号１０７）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ３  １０２Ｙ→Ｍ（配列番号１０８）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ３  １０２Ｙ→Ｈ（配列番号１０９）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｃＶ→Ｐ（配列番号１１０）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｃＶ→Ｗ（配列番号１１１）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｄＨ→Ｌ（配列番号１１２）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｄＨ→Ｓ（配列番号１１３）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｅＳ→Ｗ（配列番号１１４）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２８Ｎ→Ｙ（配列番号１１５）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２８Ｎ→Ｗ（配列番号１１６）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ３０Ｎ→Ｙ（配列番号１１７）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ３３Ｌ→Ｆ（配列番号１１８）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ３３Ｌ→Ｖ（配列番号１１９）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ２  ５０Ｋ→Ｓ（配列番号１２０）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ２  ５１Ｖ→Ａ（配列番号１２１）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ２  ５３Ｎ→Ｓ（配列番号１２２）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ２  ５４Ｒ→Ｌ（配列番号１２３）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ２  ５６Ｓ→Ｗ（配列番号１２４）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ２  ５６Ｓ→Ｆ（配列番号１２５）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ８９Ｆ→Ｖ（配列番号１２６）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ８９Ｆ→Ｈ（配列番号１２７）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９０Ｑ→Ｒ（配列番号１２８）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９０Ｑ→Ｗ（配列番号１２９）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  Ｃ���Ｒ３  ９１Ｇ→Ｓ（配列番号１３０）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９２Ｓ→Ｗ（配列番号１３１）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９２Ｓ→Ｅ（配列番号１３２）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９３Ｈ→Ｌ（配列番号１３３）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９３Ｈ→Ｔ（配列番号１３４）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９３Ｈ→Ｓ（配列番号１３５）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９３Ｈ→Ａ（配列番号１３６）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９３Ｈ→Ｑ（配列番号１３７）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９４Ｖ→Ｔ（配列番号１３８）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９７Ｔ→Ａ（配列番号１３９）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９７Ｔ→Ｒ（配列番号１４０）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９７Ｔ→Ｈ（配列番号１４１）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９７Ｔ→Ｋ（配列番号１４２）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９７Ｔ→Ｉ（配列番号１４３）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ２  ５９Ｙ→Ｔ（配列番号１４４）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ９４Ｖ→Ｆ（配列番号１４５）；およびＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２８Ｎ→Ｑ（配列番号１４６）。
【００４３】
単一のアミノ酸置換を有するＣＤＲに加え、本発明はさらに２つ以上のアミノ酸置換を有するＨＵＩＶ２６  ＣＤＲおよびＨＵＩ７７  ＣＤＲを提供する。ＨＵＩＶ２６において、２つ以上のアミノ酸置換を有する例示的なＣＤＲとしては、例えば、ＨＵＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ２  ５７Ｉ→Ａ／６２Ｓ→Ａ（配列番号１５４）；ＨＵＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ２  ５７Ｉ→Ａ／６２Ｓ→Ｙ（配列番号１５５）；ＨＵＩＶ２６  ＶＨ  ＣＤＲ２  ５７Ｉ→Ａ／６２Ｓ→Ｈ（配列番号１５６）；ＨＵＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｅＳ→Ｗ／２７ｆＧ→Ｙ（配列番号１５７）；ＨＵＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｅＳ→Ｙ／２７ｆＧ→Ｙ（配列番号１５８）；ＨＵＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｅＳ→Ｙ／２７ｆＧ→Ｈ（配列番号１５９）；ＨＵＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｅＳ→Ｒ／２７ｆＧ→Ｙ（配列番号１６０）；およびＨＵＩＶ２６  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｅＳ→Ｗ／２７ｆＧ→Ｈ（配列番号１６１）が挙げられる（図６を参照のこと）。ＨＵＩ７７において、２つ以上のアミノ酸置換を有する例示的なＣＤＲとしては、例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１  ３２Ｓ→Ｐ／３５ｂＧ→Ｗ（配列番号１４７）；ＨＵＩ７７  ＶＨ  ＣＤＲ１  ３２Ｓ→Ｐ／３５ｂＧ→Ａ（配列番号１４８）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｄＨ→Ｓ／２８Ｎ→Ｗ（配列番号１４９）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｄＨ→Ｓ／２８Ｎ→Ｙ（配列番号１５０）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７ｄＨ→Ｓ／２８Ｎ→Ｑ（配列番号１５１）；ＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２８Ｎ→Ｑ／３３Ｌ→Ｆ（配列番号１５２）；およびＨＵＩ７７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ２７Ｈ→Ｓ／２８Ｎ→Ｗ／３３Ｌ→Ｆ（配列番号１５３）が挙げられる（図７を参照のこと）。
【００４４】
本発明は、少なくとも１つの上記の改変体ＣＤＲ配列を有する抗体を提供する。ＨＵＩＶ２６  ＣＤＲの任意の組み合わせは、隠れたコラーゲン部位に対する結合活性が維持される限り、変異ＣＤＲおよび／または野生型ＣＤＲと組み合わされ、ＨＵＩＶ２６グラフト化抗体を生成し得ることが理解される。同様に、ＨＵＩ７７  ＣＤＲの任意の組み合わせは、隠れたコラーゲン部位に対する結合活性が維持される限り、変異ＣＤＲおよび／または野生型ＣＤＲと組み合わされ、ＨＵＩ７７グラフト化抗体を生成し得ることが理解される。従って、単一のアミノ酸置換の任意の組み合わせは、他のＣＤＲ変異体と組み合わされ得、少なくとも２つの改変体ＣＤＲを有する抗体を生成する。さらに、同じＣＤＲ内の異なる位置での任意の単一の変異が組み合わされ、２つ以上の位置で、２つ以上のアミノ酸置換を有するＣＤＲを生成し得る。隠れたコラーゲン部位に対する結合活性が維持される限り、任意の単一の変異、または任意の複数の変異が組み合わされ得る。
【００４５】
従って、本発明は、以下として参照されるＣＤＲからなる群から選択される、１つ以上のＣＤＲを含む、抗体、またはその機能的フラグメントを提供する；配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、および配列番号１６２。この抗体またはその機能的フラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープに特異的な結合活性を有する。
【００４６】
本発明はさらに、以下として参照されるＣＤＲからなる群から選択される１つ以上のＣＤＲを含む、抗体、またはその機能的フラグメントを提供する；配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、および配列番号１５３。この抗体またはそれらの機能的フラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープに特異的な結合活性を有する。
【００４７】
本発明はさらに、１つ以上の重鎖ＣＤＲ中に、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、１つ以上のＣＤＲを含む重鎖ポリペプチドを含む抗体、またはその機能的フラグメントを提供し、ここで重鎖ＣＤＲは、以下からなる群より選択される；配列番号２６、４３、４４、４５、４６、および４７として参照されるＣＤＲからなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号：２８、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、および５５として参照されるＣＤＲからなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２；および配列番号３０、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、および６４として参照されるＣＤＲからなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３。この抗体またはその機能的フラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープに特異的な結合活性を有する。
【００４８】
本発明はまた、１つ以上の軽鎖ＣＤＲ中に、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖ポリペプチドを含む抗体、またはその機能的フラグメントを提供し、ここで軽鎖ＣＤＲは、以下からなる群より選択される；配列番号２０、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、および７６として参照されるＣＤＲからなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号２４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、および８６として参照されるＣＤＲからなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３。この抗体またはその機能的フラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープに特異的な結合活性を有する。
【００４９】
本発明はさらに、１つ以上の重鎖ＣＤＲ中に、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、１つ以上のＣＤＲを含む重鎖ポリペプチドを含む抗体、またはその機能的フラグメントを提供し、ここで重鎖ＣＤＲは、以下からなる群より選択される；配列番号３８、８７、８８、８９、９０、９１、１４７および１４８として参照されるＣＤＲからなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号：４０、９２、９３、９４、９５および１４４として参照されるＣＤＲからなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２；および配列番号４２、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８および１０９として参照されるＣＤＲからなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３。この抗体またはその機能的フラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープに特異的な結合活性を有する。
【００５０】
さらに、１つ以上の軽鎖ＣＤＲ中に、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖ポリペプチドを含む抗体、またはその機能的フラグメントが提供され、ここで軽鎖ＣＤＲは、以下からなる群より選択される；配列番号３２、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１４６、１４９、１５０、１５１、１５２および１５３として参照されるＣＤＲからなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号：３４、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および１２５として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３および１４５として参照されるＣＤＲからなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３。この抗体またはその機能的フラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープに特異的な結合活性を有する。
【００５１】
上記のように、本発明の抗体は、隠れたコラーゲン部位に対する結合活性が維持される限り、変異ＣＤＲおよび／または野生型ＣＤＲの任意の組み合わせから生成され得る。本明細書中に開示される場合、少なくとも単一のアミノ酸置換を有する、複数のＣＤＲを含む様々なコンビナトリアル抗体は、隠れたコラーゲン部位に対する結合活性を有することが同定された。本明細書中に開示されたそれぞれのＣＤＲの任意の組み合わせを含む抗体に加え、以下のＣＤＲの特定の組み合わせがまた、本発明によって提供される。
【００５２】
例示的なＨＵＩＶ２６改変体としては、例えば、以下の抗体が挙げられる：配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号２８として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号２０として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（４．１−２Ｄ４）。配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号２８として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号７２として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（Ｌ１ｂ−Ｆ１１）。配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４８として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号２０として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（Ｈ２ａ−Ｇ８）。配列番号４５として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５４として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５７として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（ＤｃｏｍＡ２）。配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５８として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（ＤｃｏｍＡ４）。配列番号４６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５９として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（ＤｃｏｍＢ１）。
【００５３】
配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４８として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６０として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（ＤｃｏｍＤ２）。配列番号４５として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号７２として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（ＤｃｏｍＤ３）。配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５７として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（ＤｃｏｍＤ６）。
【００５４】
配列番号４５として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６０として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（ＤｃｏｍＥ３）。配列番号４６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６０として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（ＤｃｏｍＧ２）。配列番号４５として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１６２として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５８として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（ＤｃｏｍＡ７）。
【００５５】
配列番号４５として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５６として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５７として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（ＤｃｏｍＢ１０）。配列番号２６として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５４として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５７として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（ＤｃｏｍＣ８）。配列番号４５として参照される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５５として参照される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として参照される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５７として参照される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として参照される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として参照される軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（ＤｃｏｍＤ７）。
【００５６】
配列番号４６として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５４として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６１として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（ＤｃｏｍＤ１１）。
配列番号４６として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５６として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６１として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（ＤｃｏｍＥ１１）。
配列番号４６として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号２８として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号６３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号２０として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７７として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（２Ｄ４Ｈ１−Ｃ３）。
【００５７】
例示的なＨＵＩ７７改変体としては、例えば、以下の抗体が挙げられる：
配列番号３８として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４０として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号３２として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（１２Ｆ１０Ｑ）。
配列番号３８として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９２として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号３２として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（ＱＨ２ｂ−Ａ３）。
配列番号１４７として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９２として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１４９として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（Ｑｃｏｍ１Ｂ６）。
【００５８】
配列番号１４７として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９２として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５０として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（Ｑｃｏｍ１Ｂ８）。
配列番号１４７として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１４９として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（Ｑｃｏｍ１Ｃ３）。
配列番号１４７として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１４４として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１４９として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（Ｑｃｏｍ１Ｄ３）。
【００５９】
配列番号１４７として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５１として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（Ｑｃｏｍ１Ｅ３）。
配列番号１４７として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９２として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５１として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（Ｑｃｏｍ１Ｈ６）。
配列番号１４７として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５２として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１４５として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（Ｑｃｏｍ１Ｈ７）。
【００６０】
配列番号１４８として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５０として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（Ｑｃｏｍ２Ａ４）。
配列番号１４７として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１１５として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（Ｑｃｏｍ２Ｂ１１）。
配列番号１４７として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４０として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１５３として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（Ｑｃｏｍ２Ｃ１）。
【００６１】
配列番号１４７として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９２として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１１６として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（Ｑｃｏｍ２Ｄ９）。
配列番号１４７として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１１６として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（Ｑｃｏｍ２Ｅ３）。
配列番号３８として表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９３として表される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１０３として表される重鎖ＣＤＲ３；配列番号３２として表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４として表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３６として表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む抗体（Ｑｈ２ｂ−Ｂ７）。
【００６２】
本発明はまた、それぞれＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７由来のＣＤＲを含む、グラフト化抗体を提供する。このようなグラフト化ＣＤＲとしては、ヒト化抗体が挙げられ、ここで、ＨＵＩＶ２６またはＨＵＩ７７由来のＣＤＲは、グラフト化されているか、または１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＤＲがグラフト化される。ＣＤＲは、本明細書中に開示されるように、ヒトフレームワークに直接グラフト化され得る。所望であれば、フレームシフト変化もまた、フレームワークライブラリーを作製することによって、組み込まれ得る。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク配列の最適化は、独立し、そして連続的に組み合わされて実施され得るか、あるいは以下により詳細に記載されるように、同時に実施され得る。
【００６３】
従って、本発明は、ＨＵＩＶ２６  ＣＤＲ（配列番号２０、２２、２４、２６、２８および３０）がヒトフレームワーク配列にグラフト化された、グラフト化抗体をさらに提供する。ＨＵＩ７７  ＣＤＲ（配列番号３２、３４、３６、３８、４０および４２）がヒトフレームワークにグラフト化された、グラフト化抗体もまた提供される。
【００６４】
グラフト化抗体を作製するために、コラーゲン特異的抗体のドナーＣＤＲが、抗体アクセプター可変領域フレームワークにグラフト化される。抗体をグラフト化するため、およびＣＤＲ改変体を生成して、活性を最適化するための方法は、以前に記載されている（ＷＯ  ９８／３３９１９；ＷＯ  ００／７８８１５；ＷＯ  ０１／２７１６０）。この手順を実施して、ドナーＣＤＲのグラフト化および親和性の再獲得を、同時のプロセスで達成し得る。この方法は、同様に、単独でかまたはＣＤＲグラフト化と組み合わせてかのいずれかで、可変領域の結合親和性を改変または最適化するために使用され得る。ドナーＣＤＲの、アクセプター可変領域に対する結合親和性を与えるための方法は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との両方に適用可能であり、従って、抗体可変領域をグラフト化し、同時に抗体可変領域の結合親和性を最適化するために、使用され得る。
【００６５】
ドナーＣＤＲは、複数の異なるアミノ酸残基変化を、ドナーＣＤＲ内の全ての位置または選択された位置において含むように、変更され得る。例えば、２０の天然に存在するアミノ酸残基、または予め選択されたサブセットの、ランダムな組み込みまたは偏った組み込みが、ドナーＣＤＲに導入されて、ＣＤＲ種の様々な集団を産生し得る。ＣＤＲ改変体種を、可変領域の様々な集団に含めることにより、予め決定された抗原に対して最適化された結合親和性を示す改変体種の産生が可能になる。
【００６６】
可能な変化の範囲が、ドナーＣＤＲ位置において作製され得る。変化のために選択され得る可能な変化のうちのいくつかまたは全ては、グラフト化されるドナーＣＤＲの集団に導入され得る。ＣＤＲにおける単一の位置が、変化の導入のために選択され得るか、または変更されたアミノ酸を有する種々の位置が組み合わせられ得、そして活性についてスクリーニングされ得る。
【００６７】
１つのアプローチは、例えば、ＣＤＲに沿った全てのアミノ酸位置を、各位置での、２０種全ての天然に存在するアミノ酸での置き換えによって変化させることである。各位置の置き換えは、他のドナーＣＤＲアミノ酸位置の観点で起こり得、その結果、ＣＤＲのかなりの部分が、基準のドナーＣＤＲ配列を維持し、従って、ドナーＣＤＲの結合親和性を維持する。例えば、アクセプター可変領域フレームワーク（天然または変更されたフレームワークのいずれか）が、単一の位置の置き換えをＣＤＲ内の各位置において含むＣＤＲの集団をグラフト化され得る。同様に、アクセプター可変領域フレームワークは、２０種全てのアミノ酸残基、またはアミノ酸のサブセットを組み込むように変化された、１つより多くの位置を含むＣＤＲの集団をグラフト化されるために、標的化され得る。ＣＤＲにおける、またはグラフト化されるべきＣＤＲの群における、１つ以上のアミノ酸位置が変更され得、そしてアクセプター可変領域フレームワークにグラフト化されて、グラフト化抗体の集団を産生し得る。１つ以上の変更された位置を有するＣＤＲは、所望であれば、１つ以上の変更された位置を有する１つ以上の他のＣＤＲと組み合わせられ得ることが、理解される。
【００６８】
１つ以上の変更された位置を有するＣＤＲ改変体種の集団は、可変領域の結合ポケットを構成するＣＤＲのいずれかまたは全てと組み合わせられ得る。従って、アクセプター可変領域フレームワークは、重鎖または軽鎖における１つ、２つ、または３つ全てのレシピエントＣＤＲ位置における、ドナーＣＤＲ改変体集団の同時の組み込みのために、標的化され得る。アミノ酸位置変化で標的化するためのＣＤＲまたはＣＤＲの数の選択は、例えば、アクセプターへの十分なＣＤＲグラフト化が望ましいか否か、または結合親和性の最適化のためにこの方法が実施されるか否かに依存する。
【００６９】
ドナーＣＤＲ結合親和性を抗体アクセプター可変領域フレームワークに与えるための、変化のためのドナーＣＤＲアミノ酸を選択するための別のアプローチは、高度に可変性の、既知または容易に同定可能なＣＤＲ位置を選択することである。例えば、可変領域ＣＤＲ３は、一般に、非常に可変性である。従って、この領域は、グラフト化手順の間にアミノ酸位置変化のために選択的に標的化されて、本明細書中に記載されるように、単独でかまたは関連するアクセプター可変フレームワーク変化と一緒にかのいずれかで、結合親和性の再獲得または増強を確実にし得る。
【００７０】
所望であれば、１つ以上の変更されたアミノ酸位置を有するＣＤＲ改変体集団は、１つ以上の変更されたアミノ酸位置を有するフレームワーク改変体集団と有利に組み合わせられ得る。このような組み合わせは、変化の有利な組み合わせを生じ得、これらは、最適化された活性についてスクリーニングすることによって、同定される。
【００７１】
従って、ＣＤＲをグラフト化された可変領域の得られる集団は、基準の親アミノ酸残基に対応する種を各位置において含み、そして基準の親アミノ酸残基の可能な組み合わせおよび並べ替えに対応する様々な数の異なる種を、改変体残基と一緒に、選択されたＣＤＲ位置の各々において含む。ＣＤＲをグラフト化された可変領域のこのような様々な集団は、ドナーのＣＤＲ結合活性を維持するか、または最適化された結合活性を有する、変更された可変領域種についてスクリーニングされる。
【００７２】
アクセプターは、ドナーＣＤＲを保有する可変領域アミノ酸配列に非常に類似するように選択され得る。さらに、ドナー抗体にさほど関連していない種々のアクセプターが使用され得る。あるいは、アクセプターフレームワークにおける全ての可能な変化または関連する変化のライブラリーが作製され得、次いで、これらのドナー分子と比較して増加した結合親和性を維持するかまたは示す可変領域、またはそのヘテロマー結合フラグメントについてスクリーニングされ得る。ドナーＣＤＲは、種々の天然に存在するアクセプターフレームワークに、または１つ以上の変化を有する変更されたフレームワークに、または１つ以上の位置において変化を含むライブラリーに、グラフト化され得る。従って、適用可能性は、ドナーと類似のアクセプターフレームワーク可変領域に対する利用可能性または検索によって、予め条件付けされない。
【００７３】
ドナーＣＤＲ結合親和性を可変領域に与えるための方法は、ＣＤＲコンホメーションに影響を与えることが既知であるかまたは予測される、あるいは結合に関与するＣＤＲ内のアミノ酸側鎖の空間的局面に影響を与えることが既知であるかまたは予測される、アクセプターフレームワークにおける関連するアミノ酸位置を同定する工程、次いで、複数の異なるアミノ酸残基をそれらの位置に組み込む、変更された可変領域種の集団を産生する工程を包含し得る。例えば、これらの位置における異なるアミノ酸残基は、ランダムにか、または予め決定された偏りで組み込まれ得、そして２０種の天然に存在するアミノ酸残基の全てを、関連する位置の各々において含み得る。サブセット（天然に存在するアミノ酸の全て未満を含む）が、さらに、関連するフレームワーク位置における組み込みのために選択され得る。複数の異なるアミノ酸残基を、関連するフレームワーク位置の各々において含むことにより、アクセプターフレームワーク可変領域に関して、ＣＤＲがそのドナー結合親和性を再獲得することを可能にするフレームワーク変化を有する少なくとも１つの種が、集団において存在することが確実になる。
【００７４】
抗体をヒト化することに関して、種々のヒトフレームワークのいずれかが、ＣＤＲグラフト化のために選択され得る。例えば、ＨＵＩＶ２６またはＨＵＩ７７のＣＤＲは、種々のヒトフレームワーク配列中にクローニングされ得る。このフレームワークは、ＣＤＲのグラフト化のためのヒトフレームワーク配列を得るために、重鎖可変領域および軽鎖可変領域ならびにＪ領域をコードするヒト生殖系列遺伝子を用いて作製され得る。例示的なヒトフレームワークヌクレオチド配列としては、例えば、ＤＰＫ２４（ＶＫＩＶ）（配列番号５）、ＤＰ−５４（ＶＨＩＩＩ）（配列番号７）、ＤＰＫ１３（ＶＫＩＩ）（配列番号１３）、ＤＰ−２８（ＶＨＩＩ）（配列番号１５）のフレームワーク配列、ならびにＪ領域ＪＫ１（配列番号２１７）、ＪＫ２（配列番号２１８）およびＪＨ６（配列番号２１９）が挙げられる。任意の利用可能な生殖系列配列由来のフレームワーク領域は、所望の場合、ＣＤＲのグラフト化のためのヒトフレームワークを生成するために、任意の利用可能なＪ配列と組み合わされ得ることが理解される。例えば、ＨＵＩＶ２６のマウス可変領域と例示的なヒトフレームワークとのアライメント、およびＨＵＩ７７のマウス可変領域と例示的なヒトフレームワークとのアライメントは、それぞれ、図２Ｃおよび図３Ｃに示される。ＶＫＩＶ／ＪＫ２軽鎖可変領域とＶＨＩＩＩ／ＪＨ６重鎖可変領域との融合体は、ＨＵＩＶ２６とアライメントされる（図２Ｃ）。ＶＫＩＩ／ＪＫ１軽鎖可変領域とＶＨＩＩＩ／ＪＨ６重鎖可変領域との融合体は、ＨＵＩ７７とアライメントされる（図３Ｃ）。生殖系列とＪ領域との例示的な融合体を、図３Ｄに示す。これは、ＨＵＩ７７軽鎖とアライメントされる。任意の入手可能なヒトフレームワークが、ＣＤＲグラフト化のために選択され得、そして所望の場合、本明細書中に開示される方法によって最適化され得ることが理解される。本明細書中に開示されたように、有益な変異を有するＣＤＲは、種々のフレームワーク中にグラフト化され得、そして保持または改善された活性を有し得る（実施例ＩＩＩを参照のこと）。
【００７５】
変化させるに適切なフレームワークのアミノ酸の位置の選択は、当業者に周知の種々の基準に依存する。変化させるに適切なフレームワークアミノ酸を選択するための１つの基準は、ドナー分子とアクセプター分子との間でのアミノ酸フレームワーク残基の相対的相違であり得る。このアプローチを用いて改変するに適切なフレームワーク位置の選択は、単純であり、そして残基の決定におけるあらゆる主観的偏りまたは残基によるＣＤＲ結合親和性寄与におけるあらゆる偏りを回避するという利点を有する。
【００７６】
変更するための適切なアミノ酸位置を決定するために使用され得る別の基準は、例えば、ＣＤＲのコンフォメーションに重要であるかまたはＣＤＲのコンフォメーションに寄与することが公知のフレームワーク残基の選択であり得る。例えば、正統な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）フレームワーク残基は、ＣＤＲのコンフォメーションまたは構造に重要である。変化するための適切な位置としての正統なフレームワーク残基の標的化は、その関連するドナーＣＤＲ配列の文脈で、より適合性のアミノ酸残基を同定し得る。
【００７７】
特定のフレームワーク位置におけるアミノ酸残基の頻度は、変化するための適切なフレームワークアミノ酸位置を選択するために使用され得る別の基準である。例えば、選択されたフレームワークとそのサブファミリー内における他のフレームワーク配列との比較は、特定の位置または複数の位置に少ない頻度で生じる残基を明らかにし得る。あまり豊富でない残基を有するこのような位置は、同様に、アクセプター可変領域フレームワークにおいて変化するための位置としての選択に適用可能である。
【００７８】
変化するための適切なアミノ酸位置はまた、例えば、ＣＤＲに対する近接性に基づいて選択され得る。特定の文脈において、このような残基は、ＣＤＲのコンフォメーションまたは抗原結合に関与し得る。さらに、この基準は、同様に、本明細書中に記載される他の基準によって選択される適切な位置に優先順位を付けるために使用され得る。従って、１つ以上のＣＤＲに対して近位な残基と遠位な残基との間の区別は、変化するための適切な位置の数を減少させる有効な方法である。
【００７９】
変化するための適切なアミノ酸フレームワーク位置を選択するための他の基準としては、例えば、抗原−ＣＤＲ界面近くの３次元空間に存在することが公知であるかまたは予測されるか、あるいはＣＤＲ活性を調節することが予測される残基が挙げられる。同様に、重鎖（ＶＨ）可変領域と軽鎖（ＶＬ）可変領域との間の界面の接触を形成することが公知または予測されるフレームワーク残基が選択され得る。このようなフレームワーク位置は、ＣＤＲ結合ポケット、抗原相互作用またはＶＨおよびＶＬの相互作用を調節することによって、ＣＤＲのコンフォメーションまたは親和性に影響し得る。従って、結合活性をスクリーニングするための多様な集団を構築するための、これらのアミノ酸位置の選択は、ＣＤＲコンフォメーションに対する有害な効果を有する残基を置換するか、またはフレームワークの他のところに存在する残基の有害な効果を補償する、フレームワークの変化を同定するために使用され得る。
【００８０】
変更のために選択され得る他のフレームワーク残基としては、溶媒にアクセス不可能であるアミノ酸位置が挙げられる。このような残基は、一般的に、可変領域において埋め込まれ、従って、ＣＤＲのコンフォメーションまたはＶＨおよびＶＬの相互作用に影響し得る。溶媒のアクセス可能性は、例えば、ポリペプチドのアミノ酸側鎖によってまたは既知の３次元構造データによって作り出される環境の相対的な疎水性から予測され得る。
【００８１】
ドナーＣＤＲの適切なアミノ酸位置、および変化することが望ましいフレームワーク領域の任意の適切なアミノ酸位置の選択に続いて、選択された位置のいくつかまたは全てにおけるアミノ酸の変化は、アクセプター可変領域フレームワークおよびドナーＣＤＲについてのコード核酸に組み込まれ得る。変化したフレームワークまたはＣＤＲ配列は、所望であれば、個々に作製および試験され得るか、または同時に組み合わせて試験され得る。
【００８２】
任意のまたは全ての変化した位置における可変性は、少しから複数の異なるアミノ酸残基の範囲であり得、これには、２０種全ての天然に存在するアミノ酸またはその機能的等価物およびアナログが挙げられる。
【００８３】
変化するためのアミノ酸位置の数および位置の選択は、柔軟であり、そして意図される使用およびドナー可変領域と比較して実質的に同じかまたはより大きな結合親和性のような所望の活性を有する変化した可変領域の同定のための所望の効率に依存し得る。これに関して、変化した可変領域集団に組み込まれる変化の数が多くなるにつれて、所望の活性（例えば、ドナーと実質的に同じまたはより大きな結合親和性）を示す少なくとも１つの種を同定することがより効率的になる。あるいは、ユーザーが、特定のアミノ酸残基または位置が結合親和性に不均衡に寄与する影響に対する経験的データまたは実際のデータを有する場合、同定された残基または位置の中または周りの変化に焦点を当てる、変化した可変領域の制限された集団を作製することが望ましくあり得る。
【００８４】
例えば、ＣＤＲグラフト化可変領域が望ましい場合、大きな多様な集団の変更された可変領域が、ドナーフレームワークとアクセプターフレームワークとの間の全ての非同一なフレームワーク領域位置および全ての単一のＣＤＲアミノ酸位置の変化を含み得る。あるいは、中程度の多様性のある集団が、例えば、全ての単一のＣＤＲアミノ酸位置の変化とともに組み込まれるべき近位の非同一フレームワーク位置のみのサブセットを含み得る。上記集団の多様性は、例えば、さらに全ての対のＣＤＲアミノ酸位置変化を含むことによってさらに増加され得る。対照的に、１つのフレームワークおよび／または１つのＣＤＲアミノ酸位置ほどに少ない改変体残基を組み込む所定の残基または位置に焦点を当てる集団は、同様に、本発明の変更された抗体可変領域のスクリーニングおよび同定のために構築され得る。上記集団とともに、このように焦点を当てられた集団の多様性は、さらに、フレームワークおよびＣＤＲ領域のいずれかまたは両方における他の適切な位置を含むように変化を選択された位置をさらに増大させることによって増加され得る。さらに使用され得るフレームワーク領域およびＣＤＲのいずれかまたはその両方における少しの変化から多くの変化の範囲の多くの他の組合せが存在し、これらの全てが、所望の活性（例えば、隠れたコラーゲン部位に対する結合活性）を有する少なくとも１つのＣＤＲグラフト化変更可変領域の同定のためにスクリーニングされ得る変更された可変領域の集団を生じる。当業者は、フレームワークまたはドナーＣＤＲあるいはそのサブセットの残基のどの選択された残基位置が変更されて、本明細書中に提供される教示およびガイダンスを考慮して、本発明の変更された抗体のスクリーニングおよび同定のための集団を生成し得るかを知っているかまたは決定し得る。
【００８５】
ＣＤＲコード核酸の全ておよび選択されたアミノ酸位置の変化の全ての同時の組み込みが、当業者に公知の種々の方法によって達成され得、これには、例えば、組換え合成および化学合成が挙げられる。例えば、同時の組み込みは、例えば、ドナーＣＤＲコード核酸と一緒に融合されたアクセプター可変領域のためのヌクレオチド配列を化学合成すること、および選択された位置において、可変アミノ酸残基を有するために、複数の対応するアミノ酸コドンを組み込むことによって達成され得る。
【００８６】
１つの既知のアミノ酸配列に多数の変更を迅速かつ効率的に作製するため、または可変性またはランダムな配列の多様な集団を作製するための当該分野において周知の１つのこのような方法は、コドンベースの合成または変位誘発として公知である。この方法は、米国特許第５，２６４，５６３号および同第５，５２３，３８８号の主題であり、そしてまた、Ｇｌａｓｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９：３９０３（１９９２）に記載される。簡単に述べると、例えば、遺伝子コードのアミノ酸を特定する２０種全てのコドンのランダム化のためのカップリング反応は、別の反応容器において実施され、そして特定のコドン位置に対するランダム化は、反応容器の各々の産物を混合することによって生じる。混合に続いて、２０種全てのアミノ酸の当量混合物をコードするコドンに対応するランダム化反応産物は、次いで、次の位置に各々ランダム化されたコドンの合成のための別々の反応容器に分割される。２０種全てのアミノ酸の等しい頻度の合成のために、２個までのコドンが、各反応容器において合成され得る。
【００８７】
これらの合成方法に対するバリエーションもまた存在し、これには、例えば、所望の位置における所定のコドンの合成、および１つ以上のコドン位置における所定の配列の偏った（ｂｉａｓｅｄ）合成が、挙げられる。偏った合成は、２つの反応容器の使用を包含し、ここで、所定のまたは親のコドンが１つの容器で合成され、そしてランダムなコドン配列が、第２の容器で合成される。第２の容器は、複数の反応容器（例えば、全体的にランダムなアミノ酸を特定の位置に特定するコドンの合成について上に記載されたもの）に分割され得る。あるいは、縮重したコドンの集団は、例えば、ＮＮＧ／Ｔヌクレオチドのカップリングによって第２の反応容器において合成され得、ここで、Ｎは、４つ全てのヌクレオチドの混合物である。所定のコドンおよびランダムコドンの合成に続いて、２つの反応容器の各々における反応産物が混合され、次いで、次のコドン位置における合成のためにさらに２つの容器に再分割される。
【００８８】
多様な数の改変体配列を作製するための上記コドンベースの合成に対する改変は、同様に、本明細書中に記載される改変体集団の作製のために使用され得る。この改変は、上記２容器方法に基づき、この方法は、親配列に向けて合成を偏らせ、そして使用者が、改変体を、ランダムなコドン変化を有する特定の数のコドン位置を含む集団に分離することを可能にする。
【００８９】
簡単に述べると、この合成は、各コドン位置合成の後に反応容器を２つの新たな容器に分割し続けることによって実施される。分割の後、各々連続した対の反応容器からの反応産物（第２の容器で開始する）を混合する。この混合は、ランダムな変化と同じ数のコドン位置を有する反応産物を一緒にする。合成は、次いで、第１の容器および最後の容器の産物、ならびに反応容器の各々連続した対からの新たに混合した産物を分割し、そして２つの新たな容器に再分割することによって進行する。新たな容器の１つにおいて、親コドンが合成され、そして第２の容器において、ランダムなコドンが合成される。例えば、第１のコドン位置における合成は、１つの反応容器における親コドンの合成および第２の反応容器におけるランダムなコドンの合成を伴う。第２のコドン位置における合成のために、第１の２つの反応容器の各々が、２つの反応容器に分割され、２対の容器を生じる。各対について、親コドンは、容器の１つにおいて合成され、そしてランダムコドンは、第２の容器において合成される。直線に配列される場合、第２の容器および第３の容器における反応産物は、１つのコドン位置においてランダムなコドンを有する産物を一緒にするように混合される。この混合はまた、産物の集団を３つに減少し、これらは、次の回の合成のための開始集団である。同様に、第３、第４、および各々の残りの位置のために、先行する位置のための各反応産物集団は、分割され、親コドンおよびランダムコドンが合成される。
【００９０】
コドンベースの合成の上記改変後、１つ、２つ、３つまたは４つの位置にランダムコドン変化を含む集団ならびに他の集団が、個々の必要性に基づいて、簡便に分離され得、そして使用され得る。さらに、親配列合成のみを含む容器が、ランダムコドン合成から同様に分離されるので、この合成スキームはまた、親配列を超えて、ランダム化配列についての集団の富化を可能にする。
【００９１】
既知のアミノ酸配列における多数の変更を生成するため、または可変配列もしくはランダム配列の多様な集団を生成するための、当該分野で周知な他の方法としては、例えば、変性オリゴヌクレオチド合成または部分的変性オリゴヌクレオチド合成が挙げられる。４つ全てのヌクレオチドモノマーの等量混合物を特定するコドン（ＮＮＮで示される）は、変性合成を生じる。部分的変性合成は、例えば、以前に記載されたＮＮＧ／Ｔコドンを使用して達成され得る。あるいは、統計的に予め決定されたかまたは変化（ｖａｒｉｇａｔｅ）されたコドン合成の使用（これは、米国特許第５，２２３，４０９号および同第５，４０３，４８４号の目的である）のような、当該分野で周知の他の方法が使用され得る。
【００９２】
一旦、変更された可変領域コード核酸の集団が上記のように構築されると、これらは発現されて、結合親和性についてスクリーニングされ得る変更された可変領域ポリペプチドの集団を生成し得る。例えば、変更された可変領域コード核酸は、増殖、操作および発現のために適切なベクター中にクローニングされ得る。このようなベクターは、公知であるか、または当業者によって構築され得、そして転写、翻訳、調節、そして所望の場合には、変更された可変領域ポリペプチドの分類および分泌のために十分な全ての発現エレメントを含むべきである。これらのベクターは、それぞれの宿主系において発現エレメントおよび調節エレメントが機能する限り、原核生物または真核生物の宿主系のいずれかにおける発現のために適切であり得る。発現ベクターは、さらに、誘導性または細胞型特異的発現のための調節エレメントを含み得る。当業者は、どの宿主系が特定のベクターと適合性であるか、そしてどの調節エレメントまたは機能的エレメントが、可溶性形態、分泌形態または細胞表面形態のポリペプチドの発現を達成するのに十分であるかを知っている。
【００９３】
適切な宿主細胞としては、例えば、細菌および対応するバクテリオファージ発現系、酵母、鳥類、昆虫ならびに哺乳動物細胞が挙げられる。種々の宿主系におけるこのような集団内における、変更された可変領域または変更された可変領域ポリペプチドの集団の、組換え発現、スクリーニングおよび精製のための方法は、当該分野で周知であり、そして例えば、以下に記載される：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（補遺５４），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）。変更された可変領域の発現およびスクリーニングのための特定のベクターおよび宿主系の選択は、当業者に公知であり、そして使用者の好みに依存する。さらに、糸状バクテリオファージベクター／宿主系を使用した、可溶性形態または細胞表面形態のいずれかでの異種レセプターの多様な集団の発現は、当該分野で周知であり、そして米国特許第５，８７１，９７４号の目的である。
【００９４】
変更された可変領域ポリペプチドの発現された集団は、最適化された結合活性（例えば、ドナーＣＤＲ可変領域と実質的に同じかまたはそれより大きい結合親和性）を示す１つ以上の変更された可変領域種の同定のために、スクリーニングされ得る。スクリーニングは、ポリペプチドまたは化合物の結合親和性を決定するための、当該分野で周知の種々の方法を使用して達成され得る。さらに、変更された可変領域ポリペプチドとドナーＣＤＲ可変領域との間の結合量の比較による、それらのパートナーに対する結合分子の相対的親和性の決定に基づく方法は、ドナーＣＤＲ可変領域と実質的に同じかまたはそれより大きい結合親和性を示す種の同定のために、同様に使用され得る。全てのこのような方法は、例えば、溶液中または固相において、実施され得る。さらに、結合アッセイの種々の形式が、当該分野で周知であり、そして例えば、フィルタ（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）への固定化；２次元アレイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、パニングおよびプラズモン共鳴が挙げられる。このような方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前出）１９８８において記載され、見出され得る。
【００９５】
ポリペプチド集団（例えば、本発明の方法によって生成された変更された可変領域集団）のスクリーニングについて、フィルタまたは他の固体基材への、変更された可変領域集団の固定化は、有利であり得る。なぜなら、多数の異なる種が、抗原結合について効果的にスクリーニングされ得るからである。このようなフィルタの助力は、ドナーＣＤＲ可変領域と比較して、実質的に同じかまたはより大きい結合親和性を示す変更された可変領域の同定を可能にする。あるいは、変更された可変領域の集団が細胞またはバクテリオファージの表面上に発現される場合、固定化抗原に対するパニングは、抗原結合活性を有する改変体について効果的にスクリーニングするため、または集団内の種の相対的結合親和性を決定するために、使用され得る。
【００９６】
変更された可変領域ポリペプチドの集団をスクリーニングするための別の親和性方法は、リガンドに対する選択的親和性を有する結合分子を同定するために有用な捕捉リフト（ｃａｐｔｕｒｅ  ｌｉｆｔ）アッセイである（Ｗａｔｋｉｎｓら、（１９９７）；ＷＯ  ９９／０６８３４）。この方法は、固体支持体への変更された可変領域の選択的固定化を使用し、次いで、同族抗原または結合パートナーに対する選択的結合相互作用について、選択的に固定化された変更された可変領域のスクリーニングを使用する。選択的固定化は、測定される結合相互作用の選択性を増大させるように機能する。なぜなら、固体支持体への、変更された可変領域の集団の最初の固定化は、反応系中に存在し得る無関係の分子または混入物との非特異的結合相互作用を低減させるからである。
【００９７】
集団をスクリーニングするため、または個々の変更された可変領域ポリペプチドの親和性を測定するための別の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による。この方法は、表面プラズモン波が金属／液体界面で励起される場合に生じる現象に基づく。光が、サンプルと接触していない表面の側に指向され、そしてそこから反射され、そしてＳＰＲは、角度および波長の特定の組み合わせで反射された光の強度の減少を引き起こす。生体分子結合事象は、表面層において屈折率を変化させ、これが、ＳＰＲ信号の変化として検出される。結合事象は、レセプター−リガンド対の間の結合の会合または解離のいずれかであり得る。屈折率の変化は、本質的に瞬間的に測定され得、従って、親和性定数の個々の成分の決定を可能にする。より具体的には、この方法は、会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）の正確な測定を可能にする。
【００９８】
ｋｏｎ値およびｋｏｆｆ値の測定は、治療的により有効な、変更された可変領域または最適化された可変領域を同定するために使用され得る。例えば、変更された可変領域またはそのヘテロマー結合フラグメントは、例えば、類似の結合親和性を示す可変領域およびヘテロマー結合フラグメントと比較して、より高いｋｏｎ値を有するので、より有効であり得る。より高いｋｏｎ値を有する分子は、より速い速度でその標的と特異的に結合し得、かつその標的を阻害し得るので、増大した効力が付与される。同様に、本発明の分子は、類似の結合親和性を有する分子と比較して、より低いｋｏｆｆ値を示すので、より有効であり得る。一旦結合すると、これらの分子は、その標的からの解離がより遅いので、より低いｋｏｆｆ速度を有する分子を用いて観察される効力の増大が、観察され得る。本発明の変更された可変領域および最適化された可変領域に関して記載されているが、会合速度および解離速度の測定について上記されている方法は、治療目的または診断目的のためにより有効な結合因子を同定するために、本質的に任意の抗体またはそのフラグメントに適用可能である。
【００９９】
表面プラズモン共鳴を使用して親和性（会合速度および解離速度を含む）を測定するための方法は、当該分野で周知であり、そして例えば、以下に記載され、見出され得る：ＪｏｎｓｓｏｎおよびＭａｌｍｑｕｉｓｔ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，２：２９１−３３６（１９９２）ならびにＷｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６０３７−６０４２（１９９８）。さらに、結合相互作用を測定するための当該分野で周知の１つの装置は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００機器であり、これは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって市販される。
【０１００】
上記スクリーニング方法、ならびに当該分野で周知の他の方法のいずれかを使用して、最適化された結合親和性（例えば、ドナーＣＤＲ可変領域と実質的に同じかまたはそれより大きい結合親和性）を有する、変更された可変領域は、その集団内の少なくとも１つの変更された可変領域の、その抗原または同族リガンドへの結合を検出することによって、同定される。抗原結合活性についての最適化に加えて、触媒活性もまた、本発明の抗体中に含まれ得、そして結合親和性最適化のために本明細書中に開示された方法を使用して最適化され得る。従って、上記の方法は、最適化された触媒活性についてスクリーニングするために、基質および反応物の添加を含むように、改変され得る。ドナー可変領域との、同じスクリーニングにおいて独立してかまたは同時のいずれかの比較は、ドナーと実質的に同じかまたはそれより大きい結合親和性を有する結合因子を同定する。当業者は、非特異的結合を超えた選択的相互作用を同定するために十分な結合条件を知っているか、またはドナー可変領域を使用して決定し得る。
【０１０１】
変更された可変領域の集団内の結合種の同定のための検出方法は、直接的または間接的であり得、そして例えば、光放射、放射性同位体、比色色素および蛍光色素の測定が挙げられ得る。直接的検出方法としては、中間体も二次測定手順も伴わずに、結合した抗原またはリガンドの量を評価するように機能する方法が挙げられる。このような方法は、一般に、検出可能な部分（例えば、放射性部分、光放射部分、蛍光部分、比色部分または酵素部分）でそれ自体が標識化されたリガンドを使用する。対照的に、間接的検出としては、中間体または二次測定手順を介して機能する方法が挙げられる。これらの方法は、一般に、抗原またはリガンドと特異的に反応し、そしてそれ自体、検出可能な部分で直接標識され得るか、または二次試薬によって検出され得る分子を、使用する。例えば、リガンドに特異的な抗体は、リガンドに特異的な一次抗体と相互作用し得る二次抗体を使用し、再度直接的検出のための上記検出方法を使用して、検出され得る。さらに、触媒的抗体についてのスクリーニングの特定の例について、基質の消失または産物の出現が、結合親和性または触媒活性の間接的測定として使用され得る。
【０１０２】
単離された可変領域は、そのそれぞれのＶＨサブユニットまたはＶＬサブユニットとのヘテロマー構造への構築の非存在下で、単鎖として結合親和性を示す。このように、ＶＨおよびＶＬの変更された可変領域ポリペプチドの集団は、単独で発現され得、そして結合活性（例えば、ＣＤＲドナーのＶＨ可変領域またはＶＬ可変領域と比較して、実質的に同じかまたはそれより高い結合親和性を有する、最適化された活性）についてスクリーニングされ得る。あるいは、ＶＨおよびＶＬの変更された可変領域ポリペプチドの集団は、ヘテロマーの変更された可変領域結合フラグメントへと自己会合するように、同時発現され得る。ヘテロマー結合フラグメント集団は、次いで、ＣＤＲドナーの可変領域結合フラグメントと実質的に同じかまたはそれより高い結合親和性を示す種について、スクリーニングされ得る。
【０１０３】
同時グラフト化および最適化のための方法、または最適化のための方法を使用して、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約８倍または約１０倍よりも高い親和性の増加を有する、ヘテロマーの可変領域結合フラグメントを生成することが可能である。特に、ドナー分子または親分子と比較して、１２倍、１５倍、２０倍および２５倍より高い親和性の増加、ならびに５０倍、１００倍、２００倍、５００倍または１０００倍より高い親和性の増加を有する、ヘテロマー可変領域結合フラグメントが生成され得る。
【０１０４】
さらに、本明細書中に記載される最適化のための方法はまた、触媒性ヘテロマー可変領域フラグメントを生成するため、またはその触媒活性を最適化するために、適用可能である。触媒活性は、例えば、基質結合のオン速度またはオフ速度、基質結合親和性、転移状態の結合親和性、ターンオーバー速度（ｋｃａｔ）またはＫｍを変化させることによって、最適化され得る。これらの特徴を測定するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓｅｇｅｌ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５）を参照のこと）。このような方法は、ヘテロマー可変領域結合フラグメントの触媒活性を最適化するために使用される場合、上記の方法のスクリーニング工程において使用され得る。
【０１０５】
さらに、抗体アクセプター可変領域フレームワークへのドナーのＣＤＲ結合親和性を比較するための方法は、Ｋａｂａｔら（前出）、Ｃｈｏｔｈｉａら（前出）、またはＭａｃＣａｌｌｕｍら（前出）に記載されるように、ＣＤＲのグラフト化に適用可能である。これらの方法は、同様に、Ｋａｂａｔら（前出）、Ｃｈｏｔｈｉａら（前出）、またはＭａｃＣａｌｌｕｍら（前出）に記載されるように、ＣＤＲのアクセプターフレームワーク重複領域または組み合せへのグラフト化に使用され得る。一般に、ＣＤＲの可変領域は、当該分野で公知であり、本明細書中に示されるＣＤＲの定義の１つにより記載される境界を同定することにより、グラフト化される。しかし、これらの方法は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方で関連するアミノ酸部分の変化を組み入れ得、このようなバリエーションは、例えば、可変領域のどこかでアミノ酸の変化を補償または増強し得る、グラフト化されたＣＤＲの、変更された可変領域の集団を構築し、スクリーニングすることに関するので、特定のＣＤＲの正確な境界またはＣＤＲの可変領域のセットは変化し得る。したがって、グラフト化するための正確なＣＤＲ領域（Ｋａｂａｔら、Ｃｈｏｔｈｉａら、またはＭａｃＣａｌｌｕｍらに記載される領域であろうと、またはその任意の組み合せであろうと）は、使用者の存在に本質的に依存する。
【０１０６】
同様に、抗体の結合親和性を最適化するための以前に記載された方法もまた、コード核酸が入手可能であるかまたは入手可能にし得る、本質的に任意の可変領域での使用のために適用され得る。ドナーのＣＤＲ結合親和性を与えるための方法を使用する場合、結合親和性を最適化するための方法の多くの適用は、ヒトフレームワークを有するグラフト化されたＣＤＲの可変領域の結合親和性を改変するためである。再び、このような分子は、ヒト患者において抗原性が有意に低く、したがって、ヒト疾患の処置において治療的に有益であり得る。しかし、可変領域の結合親和性を最適化するための本発明の方法は、全ての種の可変領域に適用可能である。したがって、本発明は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギおよびトリまたは他の任意の所望の種に由来する可変領域の結合親和性を最適化する工程を含む。
【０１０７】
本発明の方法は、可変領域およびヘテロマー可変領域結合フラグメントを参照して、記載されている。当業者は、このような方法が全て、全抗体およびその機能フラグメントに、そして所望される場合、抗体の抗原結合可変領域以外の領域および機能ドメインに適用可能であることを理解する。
【０１０８】
会合速度は、任意の非平衡混合物（例えば、結合ポリペプチドとリガンドを迅速に接触させることによってか、または温度を迅速に変化させることによって形成されるものが挙げられる）中で決定され得る。非平衡混合物は、前平衡混合物であり得る。前平衡混合物は、例えば、可溶性結合ポリペプチドと可溶性リガンドを、検出チャンバー中の総リガンドおよび総結合ポリペプチドの量が一定である条件下で接触させることによって形成され得る。前平衡混合物の会合速度の測定は、結合ポリペプチドとリガンドとの迅速な混合および結合ポリペプチドまたはリガンドの、ミリ秒またはそれより早い時間尺度での特性の変化の迅速な検出を提供する様式でなされ得る。以下に記載されるような停止流体機器および迅速クエンチ流体機器は、非平衡動力学を測定するための簡便な手段を提供する。会合速度はまた、非平衡混合物（例えば、結合ポリペプチド、リガンドもしくはリガンドに結合する結合ポリペプチドの不溶性種を含む溶液、または種々の濃度の総リガンドもしくは総結合ポリペプチドを含む溶液）において測定され得る。非平衡混合物の会合速度の測定は、リガンドの表面への結合、表面を覆う結合ポリペプチドを含有する溶液の連続的な流れ（逆もまた同様）を提供する様式と、結合ポリペプチド、リガンドまたは表面の変化する特性の迅速検出と組み合せてなされ得、その結果、測定は、ミリ秒より早い時間尺度でなされる。会合速度の非平衡測定を提供する様式の例としては、表面プラズモン共鳴機器およびエバネッセント波機器が挙げられる。
【０１０９】
会合速度の測定は、結合状態と未結合状態の間に存在する結合ポリペプチドもしくはリガンドの特性の変化を検出することによってか、または結合ポリペプチドとリガンドが会合する場合の周囲の環境の変化を検出することによってなされ得る。会合により変化し得、そして会合速度を測定するのに使用され得る結合ポリペプチドまたはリガンドの特性としては、例えば、熱の吸収および放出、電磁放射線の吸収および放出、レセプターへの親和性、分子量、密度、質量、電荷、導電率、核の磁気モーメント、電子のスピン状態、極性、分子形態、または分子サイズが挙げられる。結合ポリペプチドがリガンドと会合する場合に変化し得る周囲の環境の特性としては、例えば、温度および周囲の溶媒の屈折率が挙げられる。
【０１１０】
前平衡混合物の会合速度を測定するための様式としては、例えば、停止流体動力学機器および迅速クエンチ流体機器が挙げられる。停止流体動力学機器は、結合ポリペプチドおよびリガンドを含む溶液を、検出セルへ流す直前に別々のレザバから混合チャンバーに押し出すのに使用され得る。次いで、この機器は、１以上の上記の特性の変化を検出し、結合事象の進行をモニタリングし得る。迅速クエンチ流体機器は、結合ポリペプチドを含む溶液とリガンドを含む溶液を迅速に混合し、限られた時間の後、結合反応をクエンチするのに使用され得る。次いで、１以上の上記の特性の変化が、混合後の異なる時間にクエンチすることにより生じたクエンチされた混合物で検出され得る。クエンチは、クエンチ工程が結合速度の測定に依存する検出を阻害しなければ、例えば、凍結または化学クエンチ剤の添加により実施され得る。従って、迅速クエンチ機器は、例えば、分光学的検出が簡便でない状況において有用であり得る。種々の機器が、ＫｉｎＴｅｋ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）およびＨｉ−Ｔｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、ＵＫ）のような製造業者から市販されている。
【０１１１】
非平衡混合物の会合速度を測定するための様式としては、例えば、表面プラズモン共鳴機器およびエバネッセント波機器が挙げられる。表面プラズモン共鳴およびエバネッセント波技術は、バイオセンサ表面に結合されたリガンドまたは結合ポリペプチド、およびバイオセンサ表面を覆って通過する結合ポリペプチドまたはリガンドのいずれかを含む溶液を利用する。結合ポリペプチドがリガンドと会合する場合にチップ表面で起こる溶液の屈折率の変化は、時間依存性の様式で測定され得る。例えば、表面プラズモン共鳴は、表面プラズモン波が金属／液体界面で励起される場合に生じる現象に依存する。光は、サンプルと接触しない表面の側面に向けられて、その面から反射され、そしてＳＰＲは、角度と波長の特定の組み合せで反射光の強度を減少する。生体分子結合事象は、表面層での屈折率の変化を生じ、これはＳＰＲ信号の変化として検出される。結合事象は、レセプター−リガンド対の間の結合の会合または脱会合のいずれかであり得る。屈折率の変化は、本質的に瞬間的に測定され得、従って、個々の成分の親和性定数の決定を可能にする。より具体的には、この方法は、会合速度（ｋｏｎ）および脱会合速度（ｋｏｆｆ）の正確な測定を可能にする。表面プラズモン共鳴機器は、当該分野において入手可能であり、これらとしては、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器、ＩＢＩＳシステム、ＳＰＲ  ＣＥＬＬＩＡシステム、ＳｐｒｅｅｔａおよびＰｌａｓｍｏｎ  ＳＰＲが挙げられ、ならびに、エバネッセント波技術は、例えば、ＲｉｃｈおよびＭｙｓｚｋａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：５４〜６１（２０００）に記載されるようなＩａｓｙｓシステムにおいて入手可能である。
【０１１２】
結合親和性を測定するための別の方法としては、競合ＥＬＩＳＡがあげられる。本明細書中に開示されるように、最大結合の半分のシフトに基づく親和性の変化の近似が、野生型に対するｋｏｎ値およびｋｏｆｆ値を同定するのに使用された（実施例ＩＩＩ）。このような方法は、多数の変異体をスクリーニングするのに特に有用であるのに対して、上記の方法が、結合活性の詳細の分析のために使用され得る。
【０１１３】
会合速度は、結合事象の間に、１以上の慎重な時間間隔で、例えば、上記の方法を使用してリガンドまたは結合ポリペプチドの特性の変化を測定することにより決定され得る。結合事象の間に慎重な時間間隔で決定される測定は、会合速度の定量的基準または会合速度の相対的基準を決定するのに使用され得る。会合速度の定量的速度としては、例えば、会合速度値またはｋｏｎ値が挙げられ得る。会合速度値またはｋｏｎ値の定量的値は、時間依存性の測定の数学的分析または図式的分析により決定され得る。このような分析は当該分野で周知であり、これらとしては、指数関数的な項もしくは線形項の和にデータをフィットさせるためのアルゴリズム、または例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：８７〜８９（１９９８）（これは本明細書中に参考として援用される）に記載される結合モデルにデータをフィットさせるコンピュータシミュレーションのためのアルゴリズムが挙げられる。
【０１１４】
会合速度は、質量輸送の効果が反応において説明される場合、不溶性種または種々の濃度の総リガンドもしくは総結合ポリペプチドを含む混合物から、上記のような数学的分析および図式的分析を使用して決定され得る。当業者は、同様の制限を有する条件下で会合速度を大量輸送に関して比較することによってかまたは、当該分野で利用可能なモデル（例えば、Ｍｙｓｚｋａら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７５：５８３〜５９４（１９９８）（これは本明細書中に参考として援用される）に記載されるものが挙げられる）に従って計算された会合速度を調節することによって、質量輸送を説明し得る。
【０１１５】
会合速度またはｋｏｎのいずれかの高い値は、一般に、改善された治療的効力を示す。従って、定量的な決定は、結合ポリペプチドの会合速度と、使用される方法が、一貫した結果を生じることが当業者に理解される限り、異なる方法によって決定される治療コントロールとの間での比較を可能にすることにより利点を提供する。
【０１１６】
会合速度の相対的な測定としては、例えば、同様の条件下でリガンドに結合する２つ以上の結合ポリペプチドの会合速度の比較、または所定の速度でリガンドに結合する結合ポリペプチドの会合速度の比較が挙げられ得る。２つ以上の結合ポリペプチドの会合速度の比較としては、既知の会合速度の標準または既知の治療効果の分子が挙げられ得る。比較に使用される所定の速度は、例えば、以前に測定された速度（例えば、科学文献またはデータベースにおいて利用可能なものが挙げられる）に対してその測定値を較正することによって決定され得る。所定の速度との比較の例は、時間精密選択デバイスを用いることにより所定の速度で規定される慎重な時間間隔でリガンドに結合する結合ポリペプチドの種の選択である。
【０１１７】
比較の目的のために、結合ポリペプチドとリガンドとの会合速度は、治療コントロールと同じリガンドとの会合速度に対して決定され得る。比較はまた、治療コントロールとリガンドの定量的会合速度と比較して結合ポリペプチドとリガンドの定量的会合速度に従ってなされ得る。相対的または定量的な会合速度は、上述の方法によって決定され得る。リガンドに会合する結合ポリペプチドの会合速度の決定は、結合ポリペプチドおよび治療コントロールと同時にかまたは別々に実施され得る。但し、条件は各アッセイにおいて十分に同じであり、妥当な比較を可能にする。従って、結合ポリペプチドについて決定した会合速度は、治療コントロールの前もって測定された会合速度と比較され得る。
【０１１８】
改善された治療効力を有する結合ポリペプチドは、リガンドに対する増加したＫａを有するが、改善された治療効力を有さない結合ポリペプチドから区別され得る。Ｋａに基づく治療的結合ポリペプチドを同定するための方法は、平衡測定に依存し、これは、非平衡条件下でなされる時間依存性測定を欠くことで増加した会合速度を有し、従って、改善された治療効力を有する結合ポリペプチドを同定するのに不正確である。Ｋａ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆの関係に従って、結合ポリペプチドとリガンドの会合についての増加したＫａは、ｋｏｎまたはｋｏｆｆの変化に起因し得る。例えば、改善された治療効力を有する結合ポリペプチドは、ｋｏｎの増加を補正するｋｏｆｆにおける減少が生じる場合、減少したＫａを有し得る。従って、Ｋａの変化は、ｋｏｆｆの変化によって影響されるので、治療効力の変化に明らかに相関しない。なぜならば、改善された治療効力を有する結合ポリペプチドは、減少したかまたは増加したかのいずれかのＫａを示し得るからである。
【０１１９】
本発明の抗体の結合活性の最適化のために、会合速度の倍増加は、ｋｏｎの増加によって示され得る。従って、本明細書中に記載される方法を使用して、ｋｏｎは、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍または約１０倍以上であり得る。ｋｏｎは、少なくとも、約１×１０２Ｍ−１Ｓ−１、約２×１０２Ｍ−１Ｓ−１、約５×１０２Ｍ−１Ｓ−１、約１×１０３Ｍ−１Ｓ−１、約２×１０３Ｍ−１Ｓ−１、約５×１０３Ｍ−１Ｓ−１、約１×１０４Ｍ−１Ｓ−１、約２×１０４Ｍ−１Ｓ−１、約５×１０４Ｍ−１Ｓ−１、約１×１０５Ｍ−１Ｓ−１、約２×１０５Ｍ−１Ｓ−１、または約３×１０５Ｍ−１Ｓ−１であり得る。ｋｏｎはまた、少なくとも約約５×１０５Ｍ−１Ｓ−１、約７×１０５Ｍ−１Ｓ−１、約９×１０５Ｍ−１Ｓ−１、約１×１０６Ｍ−１Ｓ−１、約３×１０６Ｍ−１Ｓ−１、約５×１０６Ｍ−１Ｓ−１、約７×１０６Ｍ−１Ｓ−１、約９×１０６Ｍ−１Ｓ−１または約１×１０７Ｍ−１Ｓ−１以上まで増加し得る。さらに、改善された治療効力をもたらすｋｏｎの増加は、結合ポリペプチドに対するＫａの変化の効果に無関係であり得る。ｋｏｎの増加を有する結合ポリペプチドは、その親ポリペプチドのＫａ値と同じＫａ値、またはその親ポリペプチドのＫａよりも低いＫａ値を有し得る。
【０１２０】
本発明はまた、本発明の抗体および本発明のＣＤＲをコードする核酸を提供する。本発明はさらに、マウス抗体ＨＵＩＶ２６（配列番号１および３）およびＨＵＩ７７（配列番号５および７）をコードする核酸を提供する（図２および３を参照のこと）。ＨＵＩＶ２６  ＣＤＲ（配列番号２０、２２、２４、２６、２８および３０）をコードする核酸およびＨＵＩ７７  ＣＤＲ（配列番号３２、３４、３６、３８、４０および４２）をコードする核酸をさらに提供する。このような核酸は、そのＣＤＲにおけるアミノ酸のいずれかまたは全てをコードする縮重コドンを有する核酸を含む。例えば、本発明は、ＨＵＩＶ２６  ＣＤＲ：ＶＬ  ＣＤＲ１（配列番号１９）；ＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号２１）；ＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号２３）；ＶＨ  ＣＤＲ１（配列番号２５）；ＶＨ  ＣＤＲ２（配列番号２７）；およびＶＨ  ＣＤＲ３（配列番号２９）をコードする核酸を提供する。本発明はまた、ＨＵＩ７７  ＣＤＲ：ＶＬ  ＣＤＲ１（配列番号３１）；ＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号３３）；ＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号３５）；ＶＨ  ＣＤＲ１（配列番号３７）；ＶＨ  ＣＤＲ２（配列番号３９）；およびＶＨ  ＣＤＲ３（配列番号４１）をコードする核酸を提供する。このような核酸の縮重バージョンもまた提供され、その結果、それらは、ＨＵＩＶ２６について配列番号２０、２２、２４、２６、２８および３０として、ならびにＨＵＩ７７について配列番号３２、３４、３６、３８、４０および４２として言及されるアミノ酸配列をコードする。
【０１２１】
さらに、１つ以上のアミノ酸置換（ｓｕｂｓｉｔｕｔｉｏｎ）を含むＨＵＩＶ２６またはＨＵＩ７７のＣＤＲをコードする核酸を提供する。例えば、本発明は、本明細書中に開示されるように、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する、ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７のＣＤＲをコードする核酸を提供する。１つ以上のアミノ酸置換を有するＣＤＲをコードする核酸が、例えば、ＨＵＩＶ２６について配列番号１９、２１、２３、２５、２７もしくは２９、またはＨＵＩ７７について配列番号３１、３３、３５、３７、３９または４１のうちの１つに由来する場合、そのアミノ酸置換は、そのアミノ酸についての対応する縮重コドンのうちのいずれかによってコードされ得る。このようなＣＤＲ改変体をコードする核酸はまた、野生型アミノ酸位置のうちのいずれかまたは全てにおいて縮重コドンを含み得る。
【０１２２】
本願全体を通して、天然に存在するヌクレオチドであるＡ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵに加えて、種々の核酸およびオリゴヌクレオチドプライマーは、標準的な略語：Ｒ＝ＧもしくはＡ；Ｙ＝Ｔ／ＵもしくはＣ；Ｍ＝ＡもしくはＣ；Ｋ＝ＧもしくはＴ／Ｕ；Ｓ＝ＧもしくはＣ；Ｗ＝ＡもしくはＴ／Ｕ；Ｂ＝Ｇ、ＣもしくはＴ／Ｕ；Ｄ＝Ａ、ＧもしくはＴ／Ｕ；Ｈ＝Ａ、ＣもしくはＴ／Ｕ；Ｖ＝Ａ、ＧもしくはＣ；Ｎ＝任意のヌクレオチドを言及する。
【０１２３】
本発明の抗体は、隠れたコラーゲンエピトープに対する結合活性を有する。ＨＵＩＶ２６抗体およびＨＵＩ７７抗体は、脈管形成脈管構造（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）に標的化することが示された（Ｘｕら，前出，２００１；ＷＯ００／４０５９７を参照のこと）。従って、本発明のグラフト化ＨＵＩＶ２６抗体およびグラフト化ＨＵＩ７７抗体（これらは、隠れたコラーゲンエピトープに特異的に結合する）は、同様に、脈管形成脈管構造に標的化し得る。そのモノクローナル抗体ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７、ならびに本明細書中に開示されるそのグラフト化形態の最も重大かつ重要な局面のうちの１つは、それらの特異性の局面である。本発明の抗体の全身投与は、あるとしても、最小限の毒性副作用を有することが予測される。なぜなら、ＨＵＩＶ２６抗体およびＨＵＩ７７抗体によって認識される隠れたエピトープは、成熟したネイティブ三本鎖らせんコラーゲンにおいて露出されていないが、変性（例えば、熱変性またはタンパク質分解変性）の際にのみ露出されるからである。従って、あるとしても、通常の生理学的条件下での結合は、わずかしか予測されない。
【０１２４】
さらに、ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７が結合する隠れたコラーゲンドメインは、多くの新血管形成疾患（腫瘍増殖および転移、を含む）、糖尿病性網膜症ならびに他の関連する眼の疾患（例えば、黄斑変性）、乾癬、および慢性関節リウマチの処置のための新規な治療的標的を示す。脈管形成と関連する他の例示的疾患としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：炎症性障害（例えば、免疫炎症および非免疫炎症、慢性関節リウマチならびに乾癬）、不適切なまたは都合の悪い脈管浸潤と関連する障害（例えば、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、再狭窄、アテローム硬化症の斑における毛細管増殖および骨粗鬆症）、ならびに癌関連障害（例えば、固形腫瘍、固形腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後線維増殖症、血管腫、カポージ肉腫および腫瘍増殖を支持するために新血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を要する類似の癌）。他の例示的腫瘍としては、黒色腫、癌腫、肉腫、線維肉腫、神経膠腫および星状細胞腫などが挙げられる。
【０１２５】
従って、本発明の方法は、脈管形成と関連する疾患（上記の疾患を含む）を有する個体を処置するために使用され得る。この方法は、疾患と関連する徴候または症状を改善するために使用され得る。例えば、癌の処置の場合に、この方法は、腫瘍増殖を阻害するために使用され得る。当業者は、本発明の抗体を使用する治療的適用の有効性を決定するために適した疾患と関連する適切な徴候もしくは症状を知っているかまたは容易に決定し得る。
【０１２６】
本発明の抗体はまた、侵襲性腫瘍増殖および転移と関連した、異常な新血管新生の早期検出のために重要な診断試薬および画像化試薬として使用され得る。本発明の抗体はまた、腫瘍の病期分類（ｓｔａｇｉｎｇ）および段階分け（ｇｒａｄｉｎｇ）において使用され得る。なぜなら、侵襲性腫瘍は、良性病変とは対照的に、周辺の基底膜の変性と関連する可能性があるからである。
【０１２７】
従って、本発明は、脈管形成脈管構造を標的化する方法を提供し、この方法は、抗体またはその機能的フラグメントを投与する工程を包含し、この抗体またはその機能的フラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープに対する特異的結合活性を有し、ここでこの抗体または機能的フラグメントは、本発明の抗体である。例えば、この抗体は、１以上のＣＤＲ（本明細書中に開示されるＨＵＩＶ２６抗体およびＨＵＩ７７抗体の野生型ＣＤＲまたはその改変体を含む）を含み得る。脈管形成脈管構造を標的化する方法は、治療目的および／または診断目的で使用され得る。
【０１２８】
治療目的に関しては、その抗体またはその機能的フラグメントは、治療剤自体として投与され得るか、または治療的部分をさらに含み得る。治療的部分の場合、この部分は、薬物（例えば、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、毒素、または抗脈管形成薬剤）であり得、これらは、脈管形成を低下または阻害する分子をいう。例えば、細胞傷害性薬剤は、放射性核種または化合物であり得る。治療剤として有用な例示的な放射性核種としては、例えば、Ｘ線またはγ線放射体が挙げられる。さらに、部分は、薬物送達ビヒクル（例えば、チャンバのあるマイクロデバイス（ｃｈａｍｂｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅ）、細胞、リポソームまたはウイルスであり得る。これは、薬剤（例えば、薬物または核酸）を含み得る。
【０１２９】
例示的治療剤としては、例えば、アントラサイクリン、ドキソルビシンが挙げられ、これらは、抗体に連結され、その抗体／ドキソルビシン結合体は、腫瘍の処置において、治療的に有効であった（Ｓｉｖａｍら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：２３５２−２３５６（１９９５）；Ｌａｕら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：１２９９−１３０４（１９９５）；Ｓｈｉｈら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３８：９２−９８（１９９４））。同様に、他のアントラサイクリン（イダルビシンおよびダウノルビシンを含む）は、抗体に化学的に結合体化され、この抗体は、有効用量の薬剤を腫瘍に送達した（Ｒｏｗｌａｎｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：１９５−２０２（１９９３）；Ａｂｏｕｄ−Ｐｉｒａｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３８：６４１−６４８（１９８９））。
【０１３０】
アントラサイクリンに加えて、アルキル化剤（例えば、メルファランおよびクロラムブシル）は、抗体に連結されて、治療的に有効な結合体が生成された（Ｒｏｗｌａｎｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：１９５−２０２（１９９３）；Ｓｍｙｔｈら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６５：３１５−３２１（１９８７））。ビンカアルカロイドもまた同様であった（例えば、ビンデシンおよびビンブラスチン（Ａｂｏｕｄ−Ｐｉｒａｋら，前出，１９８９；Ｓｔａｒｌｉｎｇら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．３：３１５−３２２（１９９２））。同様に、抗体と代謝拮抗物質（例えば、５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジンおよびそれらの誘導体）との結合体は、腫瘍を処置するに有効であった（Ｋｒａｕｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１３２−１３７（１９９２）；Ｈｅｎｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１５７０−１５７９（１９９３））。他の化学療法剤（シスプラチン（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４８：１６７−１７２（１９９１）、メトトレキセート（Ｓｈａｗｌｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄ．７：６０８−６１８（１９８８）；ＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋおよびＧａｒｎｅｔｔ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１０：１１−２４（１９９５））およびマイトマイシン−Ｃ（Ｄｉｌｌｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｈｅｒ．１：２５０−２５５（１９８９）を含む）はまた、種々の異なる抗体との結合体として投与される場合に治療的に有効である。治療剤はまた、リシンなどの毒素であり得る。
【０１３１】
治療剤はまた、物理的、化学的、または生物学的な物質（例えば、リポソーム、マイクロカプセル、マイクロポンプ、または他のチャンバのあるマイクロデバイス）であり得、これらは、例えば、薬物送達系として使用され得る。一般に、このようなマイクロデバイスは、非毒性であるべきであり、所望であれば、生分解性であるべきである。薬剤を含み得る種々の部分（マイクロカプセルを含む）、および部分（チャンバのあるマイクロデバイスを含む）を本発明の抗体に連結するための方法は、当該分野で周知であり、市販されている（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９０）、第８９〜９１章；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８）を参照のこと）。
【０１３２】
診断目的に関しては、その抗体またはその機能的フラグメントは、検出可能な部分をさらに含み得る。検出可能な部分は、例えば、放射性核種部分、蛍光部分、磁性部分、比色部分などであり得る。インビボ診断目的に関しては、γ線を放射する放射性核種（例えば、インジウム−１１１またはテクネチウム−９９）のような部分が、本発明の抗体に連結され得、被験体への投与後に、固体シンチレーション検出器を使用して検出され得る。同様に、ポジトロン放出放射性核種（例えば、炭素−１１）または常磁性スピン標識（例えば、炭素−１３）は、その分子に連結され得、被験体への投与後に、その部分の位置が、それぞれ、ポジトロン放出軸並進（ｔｒａｎｓａｘｉａｌ）トモグラフィーまたは核磁気共鳴画像法を使用して検出され得る。このような方法は、原発性腫瘍および転移病変を同定し得る。
【０１３３】
診断目的に関しては、本発明の抗体は、組織中または体液中の変性コラーゲンのレベルを決定するために使用され得る。変性コラーゲンのレベルは、例えば、組織生検によって、被験体から得られた組織サンプル中で決定され得る。例示的な体液としては、血清、血漿、尿、髄液などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
本発明はまた、抗体またはその機能的フラグメントを投与することによって、脈管形成を阻害する方法を提供する。ここでこの抗体またはその機能的フラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープに対する特異的結合活性を有する。ここでこの抗体は、本発明の１以上のＣＤＲを含む。例えば、本発明の抗体は、脈管形成が、個体の組織において阻害されるように投与され得る。本発明はさらに、本発明の抗体を投与することによって、腫瘍を標的化する方法を提供する。本発明はまた、本発明の抗体またはその機能的フラグメントを投与することによって腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。
【０１３５】
本発明の抗体はまた、インビボまたはインビトロの診断適用のために使用され得る。従って、本発明は、脈管形成脈管構造と、本発明の抗体またはその機能的フラグメントと接触させることによって脈管形成脈管構造を検出する方法を提供する。脈管形成脈管構造は、本発明の抗体を、単独、または検出可能な部分に結合してかのいずれかで、個体に投与することによって、インビボで画像化され得る。その脈管形成脈管構造は、従って、インビボで検出され得る。あるいは、その抗体は、個体から得られた組織（例えば、組織生検）に投与され得る。その結果、本発明の抗体は、脈管形成脈管構造を検出する診断目的で、インビトロで使用され得る。
【０１３６】
治療部分または検出可能な部分は、部分を連結または結合体化するための多くの周知の方法のいずれかによって、本発明の抗体またはその機能的フラグメントに連結され得る。このような連結方法は、治療部分または検出可能な部分を、抗体の結合活性（すなわち、隠れたコラーゲン部位に結合する能力）を妨害も阻害もすることなく、結合を可能にすることが理解される。本発明の抗体またはその機能的フラグメントに、部分を結合体化するための方法は、当業者に周知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９６）を参照のこと）。
【０１３７】
被験体に投与される場合、本発明の抗体は、例えば、その抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物として投与される。本明細書中で開示されるように、その抗体は、治療的部分および検出可能な部分に連結され得る。薬学的に受容可能なキャリアは、当該分野で周知であり、例えば、水溶液（例えば、水または生理学的に緩衝化された生理食塩水）または他の溶媒もしくはビヒクル（例えば、グリコール、グリセロール）、油（例えば、オリーブ油または注射可能な有機エステル）が挙げられる。
【０１３８】
薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、結合体の吸収を安定化するかまたは増加するように作用する、生理学的に受容可能な化合物を含み得る。このような生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、スクロースまたはデキストラン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定化剤もしくは賦形剤が挙げられる。当業者は、薬学的に受容可能なキャリア（生理学的に受容可能な化合物を含む）の選択が、例えば、組成物の投与の経路に依存することを知る。薬学的組成物はまた、癌治療剤のような薬剤を含み得る。
【０１３９】
当業者は、本発明の抗体を含む薬学的組成物が、種々の経路（例えば、経口的または非経口的（例えば、静脈内的））によって被験体に投与され得ることを知る。組成物は、注射または挿管によって投与され得る。薬学的組成物（例えば、薬物（例えば、化学療法剤））はまた、その中に取り込まれ得るリポソームまたは他のポリマーマトリクスに連結された抗体であり得る（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻，第２版（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ（１９９３）（これは、参考として本明細書中に援用される））。例えば、リン脂質または他の脂質からなるリポソームは、非毒性で生理学的に受容可能なキャリアおよび代謝性キャリアであり、これは、作製および投与が比較的単純である。
【０１４０】
本明細書中に開示される診断法または治療法について、有効量の抗体および治療部分が、被験体に投与される。本明細書中で使用される場合、用語「有効量」は、所望の効果を生じる薬学的組成物の量を意味する。有効量は、しばしば、抗体そのものが投与されるかどうかまたは抗体が部分に連結されるかどうか、および部分の型に依存する。従って、治療目的のために投与される放射性薬物／抗体結合体の量と比較した場合、より少ない量の放射性標識分子が、画像化のために必要とされ得る。特定の目的のための特定の抗体／部分の有効量は、当業者に周知の方法を使用して決定され得る。当業者は、治療目的または診断目的のために有効な量について、本発明の抗体の適切な用量を容易に決定し得る。
【０１４１】
治療目的またはインビボ診断目的について、種々の投与方法のいずれかが、その投与が所望の目的に有効である限り、使用され得ることが理解される。このような投与方法としては、例えば、静脈的、経皮的、滑液包内的、筋内的、腫瘍内的、眼内的、鼻内的、髄腔内的、局所的、経口的などが挙げられる。当業者は、所望の治療効果または所望の診断目的に依存して、適切な投与様式を容易に決定し得る。
【０１４２】
さらに、治療適用または診断適用について、本発明の抗体が一般的に、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与されることが理解される。本発明の抗体の家畜または農業目的に対する適用としては、他の哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラバ、ロバ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラットなど）が挙げられる。
【０１４３】
本明細書中に開示される本発明の抗体を使用する治療法のいずれかが、他の治療法と組み合わせて使用されることが理解される。例えば、本発明の抗体（抗体そのものまたは治療剤に結合された抗体のいずれか）は、他の治療処置レジメンと同時にかまたは連続的に投与され得る。例えば、本発明の抗体は、単独でか、または別の治療処置と組み合わせて投与され得、この処置としては、特定の疾患を治療するための、本明細書中に開示される治療薬および当業者に周知の他の薬物のいずれかが挙げられる。例えば、癌を処置する場合において、本発明の抗体は、別の化学療法剤（例えば、薬物または放射性核種）と同時にかまたは連続的に投与され得る。同様に、本発明の抗体は、外科手術の前、外科手術の間、または外科手術の後、抗体を投与することによって、他の処置レジメン（例えば、外科手術）と合わされ得る。当業者は、所望の場合、本発明の抗体を組み合わせて使用されるべき、所望の治療処置であることを知るか、または容易に決定し得る。従って、本発明の抗体は、他の治療レジメン（化学療法、放射線療法、外科手術などが挙げられるがこれらに限定されない）と組み合わせて投与され得る。
【０１４４】
本発明は、本発明の抗体を使用して転移を阻害する方法を提供する。本方法は、抗体またはその機能性フラグメントを投与する工程を包含し得、この抗体またはその機能性フラグメントは、隠れたコラーゲンエピトープに対して結合活性を有する。抗体は、例えば、抗体ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７の重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲの１つ以上に、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。１つ以上のＣＤＲを含む。本明細書中で使用される場合、転移を阻害することは、原発性腫瘍部位から離れた転移部位の数および／またはサイズの減少をいう。転移を阻害する方法は、腫瘍細胞の隠れたコラーゲンエピトープへの結合をブロックする本発明の抗体を使用する工程を包含し、この隠れたコラーゲンエピトープは、腫瘍細胞によって分泌されるコラーゲン分解酵素の作用による組織のリモデリングの後、曝露される。
【０１４５】
本明細書中に開示されるように、１つ以上のＣＤＲにおいて１つ以上のアミノ酸置換を有するＨＵＩ７７の改変体は、インビトロで黒色腫細胞の増殖を阻害した（実施例ＶＩを参照のこと）。本発明の抗体は、腫瘍細胞まで送達される生存シグナルまたは増殖シグナルへの接近をブロックし得るか、またはそれへの結合を阻害し得る。このように、本発明はまた、隠れたコラーゲンエピトープに対して結合活性を有する本発明の抗体の投与によって、腫瘍細胞を標的化する方法を提供し、この抗体は、隠れたコラーゲン部位によって腫瘍細胞に送達される生存シグナルまたは増殖シグナルに接近することをブロックする。
【０１４６】
新脈管形成を阻害する方法について、脈管形成構造は、腫瘍に関連し得る。本発明の方法はまた、腫瘍増殖を直接阻害するために、単独でかまたは腫瘍の脈管形成構造を抑制することと組み合わせて、使用され得る。本発明の方法は、転移を阻害するために、単独でまたは腫瘍脈管形成構造および／もしくは腫瘍増殖を阻害することと組み合わせてさらに使用され得る。例示的な腫瘍としては、本明細書中に開示される腫瘍（黒色腫、癌腫、肉腫、線維肉腫（ｆｉｂｒｏｓａｃｒｏｍａ）、神経膠腫、星状細胞腫など）が挙げられるがこれらに限定されない。新脈管形成の阻害または腫瘍増殖の阻害のためのＨＵＩＶ２６またはＨＵＩ７７の効果を試験するための方法は、以前に記載されるように、ラット角膜微小ポケット（ｍｉｃｒｏｐｏｃｋｅｔ）新脈管形成アッセイ、ニワトリ胎仔腫瘍増殖アッセイ、またはＳＣＩＤマウス腫瘍増殖アッセイのようなアッセイ（Ｘｕら、２００１、上述に記載されるような）あるいは新脈管形成の抑制、腫瘍増殖の阻害、または転移の阻害を測定するための任意の他の周知のアッセイを使用して実施され得る。
【０１４７】
本発明の方法はまた、非腫瘍新脈管形成構造の阻害に適用され得る。このような非腫瘍新脈管形成構造に対する適用は、炎症組織および新脈管形成が生じる組織を含み得る。本発明の抗体を用いる処置に適切な新脈管形成構造と関連する例示的な非腫瘍疾患としては、本明細書中に開示されるもの（関節炎、眼疾患、網膜疾患、血管腫などが挙げられる）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗体はまた、乾癬、黄斑変性、再狭窄など、または本発明の抗体が結合活性を有する隠れたコラーゲンエピトープの接近可能性の増加に関連する任意の腫瘍疾患もしくは非腫瘍疾患を抑制するために使用され得る。
【０１４８】
本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響しない改変がまた、本明細書中に提供される本発明の定義内に提供されることは、理解される。従って、以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、限定することを意図しない。
【実施例】
【０１４９】
（実施例Ｉ）
（ＨＵＩＶ２６抗体およびＨＵＩ７７抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のクローニング）
この実施例は、ＨＵＩＶ２６抗体可変領域およびＨＵＩ７７抗体可変領域のクローニングを記載する。
【０１５０】
ＨＵＩＶ２６抗体およびＨＵＩ７７抗体の可変領域は、これらのマウスモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマからクローン化され、配列決定される。簡単には、総ｍＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）を使用して、それぞれのマウスハイブリドーマ細胞から単離した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を使用してｍＲＮＡから合成した。抗体可変領域配列を、ＶＬ配列に対するマウスκ鎖定常領域またはＶＨ配列に対するＩｇＭ  ＣＨ１領域に対する単一の３’プライマーと対合するための、マウス軽鎖配列または重鎖配列のシグナル配列に対して設計された５’プライマーのセットを使用するＰＣＲによって増幅した。マウス抗体重鎖および軽鎖のシグナルペプチドに対する５’プライマーの配列ならびに定常領域プライマーの配列を、図１に示す。マウスκ軽鎖定常領域に対する３’プライマー（プライマー２６５０；配列番号２１２）は、アミノ酸１１５〜１２３に対応する。マウスＩｇＭ  ＣＨ１領域に対する３’プライマー（プライマー２６５６；配列番号２１３）は、アミノ酸１２１〜１１４に対応する。マウスＩｇＭ  ＣＨ１領域に対する３’プライマー（プライマー２７０６；配列番号２１４）は、アミノ酸１３１〜１２４に対応する。
【０１５１】
ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ反応から単離し、それは、約４００ｂｐ長の主要生成物を有した。ＤＮＡフラグメントを、ｐＣＲ２．１ベクターにクローン化した。挿入されたＤＮＡフラグメントを、順方向Ｍ１３プライマーおよび逆方向Ｍ１３プライマーの両方を使用して配列決定した。ＤＮＡ配列を、抗体配列データベースと比較した。ＨＵＩＶ２６抗体およびＨＵＩ７７抗体のＮ−末端アミノ酸配列を決定し、ＤＮＡフラグメントの配列をまた、対応する抗体のＮ−末端アミノ酸に対して比較した。
【０１５２】
ＨＵＩＶ２６ＶＬコード核酸を、５’プライマーｍＫ２（プライマー２６６４；配列番号１８５）および３’プライマー２６５０（配列番号２１２）を用いてクローン化した。ＨＵＩＶ２５ＶＬの部分配列は、
【０１５３】
【化１】
2005510246.tif 000003
（配列番号２１５）であり、ＭＫ２プライマーは、下線を付され、マウスシグナルペプチドをコードする部分配列は、イタリックである。ＨＵＩＶ２６ＶＨコード核酸を、５’プライマーＭＨ１２（プライマー２７３１；配列番号２０３）および３’プライマー２７０６（配列番号２１４）を用いてクローン化した。
【０１５４】
ＨＵＩ７７ＶＬコード核酸を、５’プライマーｍＫ１（プライマー２６６３；配列番号１８４）および３’プライマー２６５０（配列番号２１２）を用いてクローン化した。ＨＵＩ７７ＶＬの部分配列は、
【０１５５】
【化２】
2005510246.tif 000004
（配列番号２１６）であり、ｍＫ１プライマーは、下線を付され、マウスシグナルペプチドをコードする部分配列は、イタリックである。ＨＵＩ７７ＶＨコード核酸を、５’プライマーＭＨ１５（プライマー２７３４；配列番号２０６）および３’プライマー２６５６（配列番号２１３）を用いてクローン化した。
【０１５６】
ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７に対する重鎖ヌクレオチドおよび軽鎖ヌクレオチド配列ならびにアミノ酸配列を、それぞれ、図２および３に示す。Ｋａｂａｔ（上述）の番号付けシステムを使用して、重鎖のＣＤＲおよび軽鎖のＣＤＲを、ＨＵＩＶ２６抗体およびＨＵＩ７７抗体の各々について同定した（図２Ｃおよび３Ｃに下線を付す）。
【０１５７】
ＨＵＩ７７ＶＬヌクレオチド配列（配列番号９）のヒトフレームワーク融合ＤＰＫ１３／ＪＫ１のヌクレオチド配列（配列番号１７）とのアライメントを、図３Ｄに示す。対応する軽鎖アミノ酸配列を、ＨＵＩ７７およびＤＰＫ１３／ＪＫ１について、それぞれ、配列番号１０および配列番号１８として参照事項をつける。
【０１５８】
この実施例は、マウス抗体ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７のクローニングおよび配列を記載する。
【０１５９】
（実施例ＩＩ）
（ＨＵＩＶ２６抗体およびＨＵＩ７７抗体のＣＤＲ改変体ライブラリーの作成）
この実施例は、ＣＤＲ最適化のための、ＨＵＩＶ２６抗体およびＨＵＩ７７抗体のＣＤＲ改変体ライブラリーの作成を記載する。
【０１６０】
抗体ＨＵＩＶ２６および抗体ＨＵＩ７７のＣＤＲ３領域を、ＣＤＲ改変体のライブラリーを作成することによって最適化した。軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３に対するプライマーを、使用して、ＣＤＲ３改変体のライブラリーを作成し、ここで、プライマーを、ＣＤＲ３中の１つ以上の位置で１つを超えるアミノ酸をコードするように合成した。ＣＤＲ３改変体をコードするプライマーの合成の後、改変体ＣＤＲ３領域を、軽鎖（ＶＬ）領域および重鎖（ＶＨ）領域にアセンブルした。
【０１６１】
手短に言うと、ＨＵＩ７７抗体およびＨＵＩＶ２６抗体のヒト化ＶＬ遺伝子およびＶＨ遺伝子を、ＰＣＲまたはプライマー伸張連結反応（ｌｉｇａｎａｔｉｏｎ）を用いて、それぞれ、図４Ａおよび図５Ａに示されるプライマーと一緒に構築した。ＣＤＲ３変異体を含む可変領域の遺伝子を、野生型ＣＤＲ３プライマー（ＩＶ２６−１７、ＩＶ２６−ｈ７、Ｉ７７−１７またはＩ７７−ｈ７）をＣＤＲに対応する変異体プライマーの群で置き換えることにより、構築した。次いで、構築された可変領域を、プライマーＢ−ｐｅｌＢおよびＶＬに対する２２４ならびにＢ−ｐｈＡおよびＨＶ遺伝子に対する１２００ａを用いてＰＣＲにより増幅し、プラス鎖に非対称的にビオチン化した。ヒト化ＶＬおよびＶＨ配列の増幅およびマイナス鎖ＤＮＡの単離のためのプライマーは：Ｂ−ｐｅｌＢ、ビオチン−ＴＴＡ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ（配列番号２２０）；２２４、ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＡＧＴ（配列番号２２１）；Ｂ−ｐｈｏＡ、ビオチン−ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＣＴ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＧＣＣ（配列番号２２２）；および１２００ａ、ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＧＧＴ（配列番号２２３）であった。
【０１６２】
構築されたＶＬおよびＶＨ領域を、変異誘発によりＦａｂ発現ベクターに導入した。手短に言うと、非ビオチン化マイナス鎖を、ＰＣＲ産物のＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ結合磁性ビーズに結合した後単離し、ハイブリダイゼーション変異誘発によりＦａｂ発現ベクターＩＸ−１０４ＣＳＡに導入した（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９５，３９−４３頁，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  （１９９５）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｗｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２９４：１５１−１６２（１９９９））。
【０１６３】
３つのヒト化ＣＤＲ３変異ライブラリを、ＨＵＩ７７およびＨＵＩＶ２６抗体の各々について構築した。３つのライブラリを、ランダムな変異に導入したが、ＣＤＲ３変異においては異なる。１つのライブラリが、ＬＣＤＲ３においてのみ変異を有し、第２のライブラリが、ＨＣＤＲ３においてのみ変異を持ち、そして第３のライブラリが、ＬＣＤＲ３およびＨＣＤＲ３の両方において変異を有した。
【０１６４】
ＣＤＲ３変異誘発に対する上記のような方法と本質的に同じ方法をまた、ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７抗体のＣＤＲ１およびＣＤＲ２上で実施した。Ｆａｂ発現ベクターに構築した後、Ｆａｂ含有ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７改変体ＣＤＲを、細菌中で発現し、変性コラーゲンへの結合を試験した。変異ライブラリを、フィルタリフトスクリーニングおよびＥＬＩＳＡでスクリーニングした。これらのアッセイを、以前に記載されたのと実質的に同じように実施した（Ｈｕｓｅら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３９１４−３９２０（１９９２）；Ｗａｔｋｉｎｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：３７−４５（１９９７））。簡潔に言うと、ニトロセルロース膜を、熱変性ヒトコラーゲンＩまたはＩＶで予めコーティングして、ファージプレートからＥ．ｃｏｌｉ発現改変体ＦＡＢをリフトするために用いた。次いで、これらの膜を、抗体（抗ヒトκ鎖またはアルカリ性ホスファターゼに結合した抗ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ）でインキュベートし、結合した改変体Ｆａｂを検出した。ポジティブクローンを、一点ＥＬＩＳＡ（Ｗａｔｋｉｎｓら、前述、１９９７）により対応させ、変性ビオチン化ヒトコラーゲンＩおよびＩＶへの結合のために、再びスクリーニングした。利益のある改変体を、天然およびＥＬＩＳＡにより熱変性した形態における両方のコラーゲンに結合するために特徴付けする。利益のある変異体を、ＥＬＩＳＡにより実証されるように対応する野生型Ｆａｂと比べて変性したコラーゲンへのより高い結合親和性を有するものとして、決定した。
【０１６５】
ＨＵＩＶ２６抗体およびＨＵＩ７７抗体における利益のあるＣＤＲ変異体の要約を、図４Ｂおよび図５Ｂに示す。図４Ｂは、ＨＵＩＶ２６の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ３における利益のある単一のアミノ酸変異体を要約する。単一のアミノ酸置換基を有する例示的なＨＵＩＶ２６改変体は、１２Ｆ１０Ｑ改変体であり、これは、ＥＬＩＳＡ滴定から得られる半最大結合におけるシフトに基づく倍数（ｆｏｌｄ）改善により概算されるように０．０５５のｋｏｎおよび０．０４９のｋｏｆｆを示した。
【０１６６】
図５Ｂは、ＨＵＩ７７の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３における利益のある単一のアミノ酸変異を要約する。見られ得るように、種々のＣＤＲ中の数多くの単一のアミノ酸変異が、隠れたコラーゲン部位への結合を保つまたは増強するために見出された。
【０１６７】
この実施例は、利益のある変異を有するＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７のＣＤＲ改変体を記載する。
【０１６８】
（実施例ＩＩＩ）
（増強された活性を有するＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７の組み合わせ改変体の同定）
本実施例は、ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７における種々の利益のあるＣＤＲ変異体を組み込む組み合わせ改変体の生成および同定を記載する。
【０１６９】
ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７抗体ＣＤＲ改変体をさらに最適化するために、１つ以上の変異を含む少なくとも２つのＣＤＲを組み込む組み合わせ改変体を、生成し、隠れたコラーゲン部位への結合のについて試験した。組み合わせ改変体を実施例ＩＩに記載されるような改変体アミノ酸をコードする１つ以上の位置でプライマーを用いて合成した。これらのプライマーを、図６および図７に示す。
【０１７０】
ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７抗体それぞれの利益のある組み合わせ改変体の要約を、図６および図７に示す。図６および図７（「ＳＰＥＫｏｎ」および「ＳＰＥｋｏｆｆ」）に示されるｋｏｎおよびｋｏｆｆ値を、ＥＬＩＳＡ滴定から得られる半最大結合におけるシフトに基づく改変体の倍数改善として概算した。同じ利益のあるＣＤＲ変異体を有するが、異なるフレームワーク配列を有するいくつかの改変体をまた示す。これらの結果が、利益のあるＣＤＲ変異体が、種々のフレームワークにグラフト化され得、かつ改善された結合活性を保ち得、または有し得ることを示す。
【０１７１】
本実施例は、ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７の組み合わせＣＤＲ改変体の生成を示す。数多くの改変体が、それぞれの抗体の野生型形態に比較して増加した親和性を有することが同定された。
【０１７２】
（実施例ＩＶ）
（ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７改変体の結合活性および特異性）
本実施例は、天然コラーゲンおよび変成コラーゲンでのＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７の結合活性および特異性を記載する。
【０１７３】
野生型および選択された例示的なＨＵＩＶ２６改変体およびＨＵＩ７７改変体の活性および特異性を、決定した。図８に示されるように、ＩＸ−ＩＶ２６の活性および特異性、Ｆａｂ含有野生型ＨＵＩＶ２６ＣＤＲ、およびＨＵＩＶ改変体２Ｄ４Ｈ１−Ｃ３およびＤｈｕＧ５を、決定した。これらの抗体を、変性したコラーゲンＩＶ（図８Ａ）、変性したコラーゲンＩ（図８Ｂ）、天然のコラーゲンＩＶ（図８Ｃ）への結合について試験した。天然のコラーゲンＩＶに対して重要な結合活性を有する抗体はない（図８Ｃ）。全ての３つの抗体が、変性したコラーゲンＩＶに対して結合活性を示した（図８Ａ）。しかし、２Ｄ４Ｈ１−Ｃ３およびＤｈｕＧ５改変体が、ＩＸ−ＩＶ２６に対して有意に増加する結合活性を示した（図８Ａ）。ＩＸ−ＩＶ２６は、変性したコラーゲンＩに対して有意に結合活性を示さず、そして２Ｄ４Ｈ１−Ｃ３およびＤｈｕＧ５は、抗体の最大測定濃度にて低い結合活性を示した（図８Ｂ）。これらの結果は、ＨＵＩＶ２６改変体が、野生型ＨＵＩＶ２６のものと、類似の結合活性および特異性を有し、隠れたコラーゲンエピトープに対する活性および特異性を保つことを示す。これらの結果は、変異されたＣＤＲを有する改変体が、野生型と比べて保たれた、または増加した結合親和性を有し得ることをさらに示す。
【０１７４】
図９に示されるように、ＩＸＩ７７、Ｆａｂ含有野生型ＨＵ１７７ＣＤＲ、ならびにＨＵ１７７改変体Ｑｈ２ｂ−Ｂ７およびＱｈｕＤ９の活性および特異性を、決定した。抗体を、変性したコラーゲンＩ（図９Ａ）変性したコラーゲンＩＶ（図９Ｂ）および天然のコラーゲンＩ（図９Ｃ）への結合について試験し、そしてその結果が、これらの改変体が野生型と類似の結合特異性を示したことを示す。改変体ＱｈｕＤ９が、抗体のより高い濃度にて天然のコラーゲンへの穏やかな結合活性を示したが、ＩＸＩ７７またはＱｈｕ２ｂ−Ｂ７のいずれもが、天然のコラーゲンＩに対して有意な結合活性を示さなかった。これらの抗体全てが、変性したコラーゲンＩ（図９Ａ）および変性したコラーゲンＩＶ（図９Ｂ）に対して結合活性を示した。しかし、Ｑｈｕ２ｂ−Ｂ７およびＱｈｕＤ９改変体が、変成したコラーゲンＩおよびＩＶの両方においてＩＸＩ７７と比較して有意に増加した結合活性を示した。これらの結果は、変異したＣＤＲを有する改変体が、野生型と比較して保たれたまたは増加した結合親和性を有し得ることを示す。
【０１７５】
結合活性におけるＣＤＲ変異体の効果をさらに検証するために、ＨＵＩＶ２６改変体ＤｈｕＨ８を、Ｆａｂおよび免疫グロブリン（ＩｇＧ）のように２つの形態で選択し、発現した。これらの２つの形態の結合活性を、天然のヒトコラーゲンＩＶ（ｎ−ＩＶ）および変性したヒトコラーゲンＩＶ（ｄ−ＩＶ）に対して決定した。図１０に示すように、Ｄｈｕ８改変体のＦａｂまたはＩｇＧ形態のいずれもが、天然のコラーゲンＩＶへの有意な結合を示さなかった。Ｆａｂ形態が、変性したコラーゲンＩＶに対する結合活性を示し、そして結合親和性が、ＩｇＧ形態に対して有意に増加した。これらの結果が、野生型に対する１つ以上のＣＤＲアミノ酸置換を有するＨＵＩＶ２６改変体が、隠れたコラーゲンエピトープへの結合を示し得ること、そして結合親和性が、抗体改変体のＦａｂ形態と比較してＩｇＧにおいて有意に増加し得ることを示す。
【０１７６】
これらの結果が、１つ以上のＣＤＲアミノ酸置換を有するＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７が、類似の結合特異性および野生型と比較して増加した結合親和性を示し得ることを示す。
【０１７７】
（実施例Ｖ）
（最適化されたＣＤＲを有するグラフト化されたＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７の生成）
本実施例は、利益のあるＣＤＲ変異体を組込むヒト化ＨＵＩＶ２６抗体およびＨＵＩ７７抗体の生成を記載する。
【０１７８】
ＣＤＲ改変体は、利益のある変異を有し、実施例ＩＩおよびＩＩＩに記載されるように同定される。一旦利益のあるＣＤＲ改変体が同定されると、ＣＤＲ改変体は、ヒトフレームワーク配列中にグラフト化される。利益のある変異を有するＣＤＲ改変体に加えて、他のＣＤＲが、それぞれの抗体または１つ以上の改変体ＣＤＲの野生型配列であり得る。少なくとも１つのＣＤＲが、利益のある変異を含む改変体である。例えば、グラフト化した抗体が、重鎖および軽鎖を含む場合、対応する野生型ＣＤＲと比較して、重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つが、少なくとも１つのアミノ酸変異を有する。
【０１７９】
ヒトフレームワーク配列が、グラフト化のためのレシピエントとして選択される。ヒトフレームワークは、ドナー抗体フレームワーク配列に密接に関連し得るか、または親のドナー抗体から比較的多岐にわたり得る。一旦ヒトフレームワークが、グラフト化のために選択されると、少なくとも１つの利益のある変異体を含む少なくとも１つの改変体ＣＤＲを含む、選択されるヒトフレームワークおよび適切なドナーＣＤＲをコードする重複オリゴヌクレオチドを、合成する。重複オリゴヌクレオチドを用いて、選択されるヒトフレームワーク、ＣＤＲ改変体、および適切な他のＣＤＲを含み、隠れたコラーゲン部位についての結合活性を有する抗体またはフラグメントを生成する可変領域をコードする核酸を構築する。
【０１８０】
構築される可変領域を発現ベクター（例えば、実施例ＩＩに記載されるようなＦａｂ発現ベクター）にクローニングし、そして変性したコラーゲンへの結合活性が、実施例ＩＩおよびＩＩＩに記載されるように試験される。
【０１８１】
本実施例は、ＨＵＩＶ２６およびＨＵＩ７７抗体の利益のあるＣＤＲ変異を含むヒト化抗体の生成を記載する。
【０１８２】
（実施例ＶＩ）
（改変体ＨＵＩ７７抗体によるＢ１６黒色腫細胞増殖の阻害）
本実施例は、Ｂ１６黒色腫細胞増殖におけるＨＵＩ７７改変体ＱＨ２ｂの効果を記載する。
【０１８３】
ＨＵ１７７抗体のＱＨ２ｂ−Ｂ７改変体である、ＱＨ２ｂを示したヒト化Ｆａｂが、全長ＩｇＧ１抗体へと処理される（ＱＨ２ｂ−ＩｇＧ１）。ＱＨ２ｂ−ＩｇＧ１抗体を、ＮＳＯ細胞中で哺乳動物細胞培養物において発現し、精製した。
【０１８４】
精製したＱＨ２ｂ−ＩｇＧ１抗体をインビトロの細胞増殖アッセイ中で使用した。Ｂ１６黒色腫細胞を、変性したヒトＩ型コラーゲン上にプレートした。ＱＨ２ｂ−ＩｇＧ１（１００μｇ／ｍｌ／日）を、１セットの培養皿に加え、そして細胞数を指示された回数で決定した（図１１）。コントロールとして、細胞を、抗体で処理しなかった。
【０１８５】
図１１に示すように、Ｂ１６黒色腫細胞が、３日にわたって細胞数における増加により示されるように、変性したコラーゲンＩ型上で増殖した。ＱＨ２ｂ−ＩｇＧ１で処置されるＢ１６黒色腫細胞培養物が、３日間にわたり基本的な細胞増殖を示さず、これは、黒色腫細胞が、ＨＵＩ７７改変体ＱＨ２ｂ−ＩｇＧ１の存在下増殖しなかったことを示した。
【０１８６】
これらの結果は、１つ以上のＣＤＲアミノ酸置換を有するＨＵＩ７７改変体が、Ｂ１６黒色腫細胞の細胞増殖を阻害し得ることを示す。
【０１８７】
本願の全体にわたって種々の刊行物が参照された。発明が関連する技術の状態をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示が、本願の参考としてその全体において本明細書中で援用される。本発明は、上で提供されるような実施例に対して参考で記載されるが、種々の改変が、本発明の精神から逸脱することなく行われ得ることが、理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１は、ＨＵＩＶ２６抗体およびＨＵＩ７７抗体をコードする核酸をクローン化するために使用するプライマーの配列を示す。図１Ａは、マウス抗体軽鎖のシグナルペプチドについての５’プライマーのセット（配列番号１８４〜１９２）を示す。図１Ｂは、マウス抗体重鎖のシグナルペプチドについての５’プライマーのセット（配列番号１９３〜２１１）を示す。図１Ｃは、マウス重鎖および軽鎖の定常領域についてのプライマーのセットを示す。プライマー２６５０（配列番号２１２）は、マウスκ軽鎖定常領域（アミノ酸１２３〜１１５）についての３’プライマーである。プライマー２６５６（配列番号２１３）は、マウスＩｇＭ  ＣＨ１領域（アミノ酸１２１〜１１４）についての３’プライマーである。プライマー２７０６（配列番号２１４）は、マウスＩｇＭ  ＣＨ１領域（アミノ酸１３１〜１２４）についての３’プライマーである。
【図２Ａ】図２は、抗隠れたコラーゲン部位抗体ＨＵＩＶ２６の可変領域の配列を示す。図２Ａは、ＨＵＩＶ２６可変領域軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２Ｂ】図２は、抗隠れたコラーゲン部位抗体ＨＵＩＶ２６の可変領域の配列を示す。図２Ｂは、ＨＵＩＶ２６可変領域重鎖のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図２Ｃ】図２は、抗隠れたコラーゲン部位抗体ＨＵＩＶ２６の可変領域の配列を示す。図２Ｃは、ＨＵＩＶ２６のＨＵＩＶ２６軽鎖（ＶＫ）ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）と、ヒト可変領域融合体ＶＫＩＶ／ＪＫ２のアミノ酸配列（配列番号６）とのアラインメント、およびＨＵＩＶ２６重鎖（ＶＨ）ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）と、ヒト可変領域融合体ＶＨＩＩＩ／ＪＨ６のアミノ酸配列（配列番号８）とのアラインメントを、ＣＤＲに下線を引いて示す。これらのアラインメントした配列間で異なるフレームワーク領域中のアミノ酸を、線によって示す。
【図３Ａ】図３は、抗隠れたコラーゲン部位抗体ＨＵＩ７７の可変領域の配列を示す。図３Ａは、ＨＵＩ７７可変領域軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図３Ｂ】図３は、抗隠れたコラーゲン部位抗体ＨＵＩ７７の可変領域の配列を示す。図３Ｂは、ＨＵＩ７７可変領域重鎖のヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図３Ｃ】図３は、抗隠れたコラーゲン部位抗体ＨＵＩ７７の可変領域の配列を示す。図３Ｃは、ＨＵＩ７７のＨＵＩ７７軽鎖（ＶＫ）ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０）と、ヒト可変領域融合体ＶＫＩＩ／ＪＫ１のアミノ酸配列（配列番号１４）とのアラインメント、およびＨＵＩ７７重鎖（ＶＨ）ドメインのアミノ酸配列（配列番号１２）と、ヒト可変領域融合体ＶＨＩＩＩ／ＪＨ６のアミノ酸配列（配列番号１６）とのアラインメントを、ＣＤＲに下線を引いて示す。これらのアラインメントした配列間で異なるフレームワーク領域中のアミノ酸を、線によって示す。
【図３Ｄ】図３は、抗隠れたコラーゲン部位抗体ＨＵＩ７７の可変領域の配列を示す。図３Ｄは、ＨＵＩ７７可変領域のヌクレオチド配列とＤＰＫ１３およびＪＫ１のヒトフレームワーク融合体の配列（配列番号１７）とのアラインメントを示す。
【図４Ａ】図４は、抗隠れたコラーゲン部位抗体ＨＵＩＶ２６についての有利なＣＤＲ変異を示す。図４Ａは、ＨＵＩＶ２６のＬＣＤＲ３およびＨＣＤＲ３におけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセット（ＨＵＩＶ２６  ＬＣＤＲ３プライマー、配列番号２２４〜２３２；ＨＵＩＶ２６  ＨＣＤＲ３プライマー、配列番号２３３〜２４３）を示す。
【図４Ｂ】図４は、抗隠れたコラーゲン部位抗体ＨＵＩＶ２６についての有利なＣＤＲ変異を示す。図４Ｂは、ＨＵＩＶ２６のＬＣＤＲ１ａにおけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセット（配列番号２６６〜２７３）、ＨＵＩＶ２６のＬＣＤＲ１ｂにおけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセット（配列番号２７４〜２８２）、ＨＵＩＶ２６のＬＣＤＲ２におけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセット（配列番号２８３〜２８９）、ＨＵＩＶ２６のＨＣＤＲ１におけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセット（配列番号２９０〜２９４）、ＨＵＩＶ２６のＨＣＤＲ２ａにおけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセット（配列番号２９５〜３０３）およびＨＵＩＶ２６のＨＣＤＲ２ｂにおけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセット（配列番号３０４〜３１１）を示す。
【図４Ｃ】図４は、抗隠れたコラーゲン部位抗体ＨＵＩＶ２６についての有利なＣＤＲ変異を示す。図４Ｃは、ＨＵＩＶ２６抗体の有利なＣＤＲ変異を示す。
【図５Ａ】図５は、抗隠れたコラーゲン部位抗体ＨＵＩ７７についての有利なＣＤＲ変異を示す。図５Ａは、ＨＵＩ７７のＬＣＤＲ３およびＨＵＩ７７のＨＣＤＲ３におけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセットを示す。
【図５Ｂ】図５は、抗隠れたコラーゲン部位抗体ＨＵＩ７７についての有利なＣＤＲ変異を示す。図５Ｂは、ＨＵＩ７７のＬＣＤＲ１ａにおけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセット（配列番号３１２〜３１９）、ＨＵＩ７７のＬＣＤＲ１ｂにおけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセット（配列番号３２０〜３２７）、ＨＵＩ７７のＬＣＤＲ２におけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセット（配列番号３２８〜３３４）、ＨＵＩ７７のＨＣＤＲ１におけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセット（配列番号３３５〜３４１）、ＨＵＩ７７のＨＣＤＲ２ａにおけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセット（配列番号３４２〜３４９）およびＨＵＩ７７のＨＣＤＲ２ｂにおけるランダム変異の生成に使用されるプライマーのセット（配列番号３５０〜３５７）を示す。
【図５Ｃ】図５は、抗隠れたコラーゲン部位抗体ＨＵＩ７７についての有利なＣＤＲ変異を示す。図５Ｃは、ＨＵＩ７７抗体の有利なＣＤＲ変異を示す。
【図６】図６は、ＨＵＩＶ２６抗体の無作為配列改変体における変異を示す。アミノ酸の位置を示し、野生型と異なる変異を太字で示す。無作為配列改変体の相対活性を、「ＳＰＥＫｏｎ」および「ＳＰＥＫｏｆｆ」として示す（最終列）。無作為配列ライブラリーの作製に使用されるプライマー（配列番号１６３〜１７３）もまた示す。
【図７】図７は、ＨＵＩ７７抗体の無作為配列改変体における変異を示す。アミノ酸の位置を示し、野生型と異なる変異を太字で示す。無作為配列改変体の相対活性を、「ＳＰＥＫｏｎ」および「ＳＰＥＫｏｆｆ」として示す（最終列）。無作為配列ライブラリーの作製に使用されるプライマーもまた示す（配列番号１７４〜１８３）。
【図８】図８は、ＨＵＩＶ２６改変体の活性および特異性を示す。ＩＸ−ＩＶ２６の精製Ｆａｂ（野生型ＨＵＩＶ２６  ＣＤＲを含む）、ならびにＨＵＩＶ２６改変体２Ｄ４Ｈ１−Ｃ３の精製ＦａｂおよびＨＵＩＶ２６改変体ＤｈｕＧ５の精製Ｆａｂの、変性コラーゲンＩＶ（図８Ａ）、変性コラーゲンＩ（図８Ｂ）および天然コラーゲンＩＶ（図８Ｃ）に対する結合を示す。
【図９】図９は、ＨＵＩ７７改変体の活性および特異性を示す。ＩＸ−Ｉ７７の精製Ｆａｂ（野生型ＨＵＩ７７  ＣＤＲを含む）、ならびにＨＵＩ７７改変体Ｑｈ２ｂ−Ｂ７の精製ＦａｂおよびＨＵＩ７７改変体ＱｈｕＤ９の精製Ｆａｂの、変性コラーゲンＩ（図９Ａ）、変性コラーゲンＩＶ（図９Ｂ）および天然コラーゲンＩ（図９Ｃ）に対する結合を示す。
【図１０】図１０は、ＨＵＩＶ２６改変体ＤｈｕＨ８の結合活性を示す。変性（ｄ−ＩＶ）ヒトコラーゲンＩＶおよび天然（ｎ−ＩＶ）ヒトコラーゲンＩＶに対する、これらの抗体のＦａｂ形態およびＩｇＧ形態の結合活性を示す。
【図１１】図１１は、Ｂ１６黒色腫細胞の増殖に対するＨＵＩ７７改変体ＱＨ２ｂの影響を示す。培養して増殖させたＢ１６黒色腫細胞を、処理しなかった（コントロール；四角）かまたはＱＨ２ｂ改変体のＩｇＧ形態で処理（丸）した。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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