(57)【要約】パラ−ヒドロキシ桂皮酸（ＰＨＣＡ）の産生のために、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）およびフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）を、コード化する遺伝子を宿主生物体に導入した。これらの遺伝子の導入により、宿主において炭素流の再指令が生じ、グルコースからＰＨＣＡへの炭素流が最適化される。中間体、チロシンおよび桂皮酸も産生される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）
ｉ）チロシンアンモニアリアーゼ活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子と、
ｉｉ）フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子と、
を含む組換え生物体を提供する工程、および
ｂ）発酵可能な炭素基質の存在下で前記組換え生物体を増殖させ、それによってパラ−ヒドロキシ桂皮酸が産生される工程、
を含んで成る、パラ−ヒドロキシ桂皮酸の産生方法。
【請求項２】
ａ）フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子を含む組み換え生物体を提供する工程と、
ｂ）発酵可能な炭素基質の存在下で前記組換え生物体を増殖させ、それによってチロシンが産生される工程と、
を含んで成る、チロシンの産生方法。
【請求項３】
前記発酵可能な炭素基質が、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルメート、および炭素含有アミン類から成る群より選択される、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記発酵可能な炭素基質がグルコースである、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
チロシンアンモニアリアーゼ活性をコード化する前記遺伝子が、配列番号４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２から成る群より選択されるポリペプチドをコード化する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する前記遺伝子がプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）から単離される、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子が配列番号２に記載のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素をコード化する、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記組換え生物体が、細菌、酵母、糸状菌類および藻類から成る群より選択される、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記組換え生物体が、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびアースロボトリス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）から成る群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｉ）チロシンアンモニアリアーゼ活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子と、
ｉｉ）フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子と、
を含んで成る、組換え宿主。
【請求項１１】
遺伝子が、配列番号４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２から成る群より選択されるチロシンアンモニアリアーゼ酵素をコード化する、請求項１０に記載の組換え宿主。
【請求項１２】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する遺伝子がプロトバクテリアから単離される、請求項１０に記載の組換え宿主。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００１年５月４日に出願された米国仮出願第６０／２２８，７０１号明細書の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、分子生物学および微生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼを介するフェニルアラニンからチロシンへの変換およびそれに続くチロシンアンモニアリアーゼを介するチロシンからパラ−ヒドロキシ桂皮酸への変換による、組換え生物体におけるチロシンおよびパラ−ヒドロキシ桂皮酸の産生に関する。
【背景技術】
【０００３】
微生物由来からの化学物質の産生は、バイオテクノロジーの重要な応用例である。典型的に、そのようなバイオ産生の方法を開発する工程には、１）適切な微生物宿主の選択、２）副産物を生じる代謝経路の排除、３）酵素活性レベルおよび転写レベルの両方におけるそのような経路の脱調節、ならびに４）所望する経路における適切な酵素の過剰発現が含まれ得る。本発明は、パラ−ヒドロキシ桂皮酸の所望する生合成に必要な前駆体およびエネルギーを供給するフェニルアラニンヒドロキシラーゼを介するフェニルアラニンからチロシンへの炭素の流れを再指令するための、上記の工程の組み合わせを用いている。
【０００４】
パラ−ヒドロキシ桂皮酸（ＰＨＣＡ）は、液晶ポリマー（ＬＣＰ）の製造に有用なモノマーである。ＬＣＰは、電子接続具およびテレコミュニケーションならびに航空宇宙の適用において使用することができる。ＬＣＰは滅菌放射線に耐性であるため、それらの材料を医療機器ならびに化学、および食品包装の応用において使用することも可能である。
【０００５】
パラ−ヒドロキシ桂皮酸（ＰＨＣＡ）またはｐ−クマリン酸は、植物のリグニン生合成経路における既知の中間体である（非特許文献１）。ＰＨＣＡの単離および精製方法は公知である（（非特許文献２）および（特許文献１））。これらの方法は時間を浪費し、かつ煩雑であり、このモノマーの大規模合成のためのより平易な産生方法が必要とされている。発酵経路は１つの可能な解決方法を与える。
【０００６】
ＰＨＣＡへの発酵経路には、ＰＨＣＡ合成に関与するいくらかの重要な酵素の適切な宿主への操作が必要である。ＰＨＣＡはリグニン生合成経路における天然の中間体であり、合成のための重要な酵素は、さまざまな植物から得ることができる。リグニンの生合成は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）の作用を介するフェニルアラニンの桂皮酸への変換によって開始される。経路の第２の酵素は、桂皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、ケイヒ酸のＰＨＣＡ（ｐ−クマリン酸とも呼ばれる）への変換を担うチトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０）である。
【０００７】
従って、ＰＨＣＡへの１つの可能な経路は、フェニルアラニンからフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）を介することが明白である。しかし、この経路はまた、第２の酵素である桂皮酸４−ヒドロキシラーゼ（ほとんどの微生物において稀である酵素）の存在を必要とする。
【０００８】
利用可能な情報によると、いくつかの植物および微生物由来のＰＡＬは、フェニルアラニンを桂皮酸に変換する能力に加えて、基質としてチロシンを受容することができることが示されている。そのような反応における酵素活性はチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）と呼ばれる。ＴＡＬによるチロシンの変換により、桂皮酸の媒介を伴わずにチロシンからＰＨＣＡが直接的形成される。しかし、すべての天然のＰＡＬ／ＴＡＬ酵素は、それらの基質としてチロシンを使用するよりもむしろフェニルアラニンを使用することを選好する。ＴＡＬ活性のレベルは常にＰＡＬ活性よりも低いが、この差の大きさは広範に変動する。例えば、パセリの酵素は、フェニルアラニンに対して１５〜２５μＭおよびチロシンに対して２．０〜８．０ｍＭのＫＭを有し、代謝回転数はそれぞれ２２／秒および０．３／秒である（非特許文献３）。対照的に、トウモロコシの酵素は、フェニルアラニンに対してチロシンよりも僅か１５倍高いＫＭ、および約１０倍高い代謝回転数を有する（非特許文献４）。この規則の例外は酵母のロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）であり、ＰＡＬ触媒活性に対するＴＡＬ触媒活性の比は約０．５８である（非特許文献５）。従って、チロシンの豊富な供給源が存在するのであれば、ＰＨＣＡに対する代替的経路はＴＡＬを介するチロシンのＰＨＣＡへの直接変換に関与し得る。しかし、ほとんどの微生物においてチロシンは一般に供給が低く、フェニルアラニンの方が豊富である。フェニルアラニンをチロシンに変換する方法により、ＴＡＬを介するＰＡＬへの経路が可能となる。
【０００９】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）系は、原核生物において稀にしか認められないようである。フェニルアラニンヒドロキシラーゼは、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）綱のα部門（非特許文献６）に属する少数の種およびγ部門の緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）において報告されている。これらのうち、緑膿菌は分子遺伝子レベルで最も良好に特徴付けされている（（非特許文献７）および（非特許文献６））。緑膿菌は、哺乳動物のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ、トリプトファンヒドロキシラーゼ、およびチロシンヒドロキシラーゼに相同なフェニルアラニンヒドロキシラーゼを含む多重遺伝子オペロンを有する（非特許文献６）。緑膿菌およびクロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）由来の細菌性フェニルアラニンヒドロキシラーゼはクローニングされ、発現され、精製され、そして十分に特徴付けされている（非特許文献８）。さらに、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）におけるＰＡＨの存在が実証されている（非特許文献９）。
【００１０】
フェニルアラニンのチロシンへの酵素変換は真核生物において公知である。ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼは肝臓において特異的に発現され、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−チロシンに変換する（非特許文献１０）。ＰＡＨ酵素が欠損すると、一般的遺伝子疾患である古典的フェニルケトン尿症が発症する。
【００１１】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼを介するフェニルアラニンからチロシンへの炭素流を再指令し、細胞内のチロシン濃度を最大にしてグルコースのＰＨＣＡへのＴＡＬ経路の使用を可能にすることによって、グルコースをパラ−ヒドロキシ桂皮酸へ変換することに関する文献はあまり知られていない。
【００１２】
ここで解決しようとする課題は、遺伝子組み換え微生物を使用して、産業上適切なチロシンおよびパラ−ヒドロキシ桂皮酸の産生方法を開発することである。
【００１３】
出願人らは、発酵可能な炭素基質からのチロシンおよびパラ−ヒドロキシ桂皮酸の産生のためのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子ならびにフェニルアラニンおよびチロシンアンモニアリアーゼ活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子を含んで成るいくらかの組換え微生物を操作することによって上記の課題を解決した。
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ  ９７２１３４号明細書
【非特許文献１】Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（植物生化学）、Ｐ．Ｍ．デイ（Ｐ．Ｍ．Ｄｅｙ）編、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９７年
【非特許文献２】Ｒ．ベンリーフ（Ｒ．Ｂｅｎｒｉｅｆ）ら著、「Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（植物光学）」第４７巻、１９９８年、ｐ．８２５−８３２
【非特許文献３】アッペルト（Ａｐｐｅｒｔ）ら著、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（ヨーロッパ生化学雑誌）」第２２５巻、ｐ．４９１、１９９４年
【非特許文献４】ハビル（Ｈａｖｉｒ）ら著、「Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（植物生理学）」４８：１３０、１９７１年
【非特許文献５】ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）およびハビル（Ｈａｖｉｒ）著、「Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ（植物の生化学）」、第７巻、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ニューヨーク市（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８１年、ｐ．５７７−６２５
【非特許文献６】ジャオ（Ｚｈａｏ）ら著、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（全米科学アカデミー会報）」９１：１３６６、１９９４年
【非特許文献７】ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、「Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」第２２巻、１９９６年、ｐ．４９７−５０７
【非特許文献８】アブ−オマー（Ａｂｕ−Ｏｍａｒ）ら著、「２１９ＡＣＳ全国集会要旨集（Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，２１９  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）」、カリフォルニア州サンフランシスコ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、２０００年３月２６〜３０日ＩＮＯＲ−０６８  発行者：米国化学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）
【非特許文献９】マラドカル・ヒンド（Ｍａｌａｄｋａｒ，Ｈｉｎｄ．）著、「Ａｎｔｉｂｉｏｔ．Ｂｕｌｌ．」第２８巻、１９８６年、ｐ．１−４、ｐ．３０−６
【非特許文献１０】ワン（Ｗａｎｇ）ら著、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（生物学雑誌）」第２６９（１２）巻、１９９４年、ｐ．９１３７−４６
【発明の開示】
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、ａ）
ｉ）チロシンアンモニアリアーゼ活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子と、
ｉｉ）フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子と、
を含む組換え生物体を提供する工程、および
ｂ）発酵可能な炭素基質の存在下で前記組換え生物体を増殖させ、それによってパラ−ヒドロキシ桂皮酸が産生される工程、
を含んで成る、パラ−ヒドロキシ桂皮酸の産生方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、
ａ）フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子を含む組み換え生物体を提供する工程と、
ｂ）発酵可能な炭素基質の存在下で前記組換え生物体を増殖させ、それによってチロシンが産生される工程と、
を含んで成る、チロシンの産生方法を提供する。
【００１７】
もう１つの実施態様において、本発明は、
ｉ）チロシンアンモニアリアーゼ活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子と、
ｉｉ）フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する少なくとも１つの遺伝子と、
を含んで成る、組換え宿主を提供する。
【００１８】
配列の説明および生物学的寄託の簡単な説明
本発明は、本出願の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列の説明からさらに完全に理解することができる。
【００１９】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用した記号および形式は、米国特許法施行規則第１．８２２に記載の規則に従う。
【００２０】
配列番号１は、Ｃ．ビオラセウム（Ｃ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素をコード化するヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号２は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列によってコードされるＣ．ビオラセウムフェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素の推定されたアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号３は、野生型Ｒ．グルチニス（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＰＡＬ酵素をコード化するヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号４は、野生型Ｒ．グルチニスＰＡＬ酵素をコード化するヌクレオチド配列によってコードされる推定されたアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号５および配列番号６は、クロモバクテリウム・ビオラセウムのＰＡＨ遺伝子の単離に使用されるプライマーである。
【００２５】
配列番号７〜１６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主においてＰＡＨオペロンおよびその相補体を増幅するために設計および使用されるプライマーである。
【００２６】
配列番号１７〜２２は、野生型Ｒ．グルチニスＰＡＬ／ＴＡＬアミノ酸内のアミノ酸置換を有する変異ＴＡＬタンパク質である。
【００２７】
配列番号２３は、増強されたＴＡＬ活性を有する変異または改変されたＲ．グルチニスＰＡＬ酵素をコード化するヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号２４は、増強されたＴＡＬ活性を有する変異Ｒ．グルチニスＰＡＬ酵素をコード化するヌクレオチド配列によってコードされる推定されたアミノ酸配列である。
【００２９】
出願人らは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、以下の生物学的寄託を行った。
【００３０】
【表１】
2005522180.tif 000002
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、チロシン、およびＰＨＣＡの産生のための生物学的方法について記載している。さらに、本発明は、遺伝子的に改変されて、ＰＨＣＡ産生への炭素流を増加する微生物に関する。具体的には、本発明は、最初にフェニルアラニンをチロシンに変換するためにラクトバチルスまたはバチルスのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子を使用してフェニルアラニン産生微生物においてチロシンおよびＰＨＣＡを産生させる方法を提供する。
【００３２】
本開示では、多数の用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
【００３３】
「フェニルアラニンアンモニアリアーゼ」はＰＡＬと略称される。
【００３４】
「チロシンアンモニアリアーゼ」はＴＡＬと略称される。
【００３５】
「パラ−ヒドロキシ桂皮酸」はＰＨＣＡと略称される。
【００３６】
「桂皮酸４−ヒドロキシラーゼ」はＣ４Ｈと略称される。
【００３７】
「フェニルアラニンヒドロキシラーゼ」はＰＡＨと略称される。
【００３８】
「フェニルアラニン４−モノオキゲナーゼ」はｐｈｈＡと略称される。
【００３９】
「４−αカルビノールアミンデヒドラターゼ」はｐｈｈＢと略称される。
【００４０】
「芳香族アミノ酸トランスフェラーゼ」はｐｈｈＣと略称される。
【００４１】
「４−α−カルビノールアミンデヒドラターゼおよび芳香族アミノ酸トランスフェラーゼ」はｐｈｈＢＣと略称される。
【００４２】
「フェニルアラニン４−モノオキシゲナーゼおよび４α−カルビノールアミンデヒドラターゼ」はｐｈｈＡＢと略称される。
【００４３】
フェニルアラニン４−モノオキシゲナーゼおよび芳香族アミノトランスフェラーゼはｐｈｈＡＣと略称される。
【００４４】
用語「全オペロン」は、ｐｈｈＡ、ｐｈｈＢおよびｐｈｈＣ遺伝子を含んで成るＤＮＡフラグメントを指す。
【００４５】
用語「ＴＡＬ活性」または「ＴＡＬ酵素」は、タンパク質がチロシンのパラ−ヒドロキシ桂皮酸（ＰＨＣＡ）への直接変換を触媒する能力を指す。
【００４６】
用語「ＰＡＬ活性」または「ＰＡＬ酵素」は、タンパク質がフェニルアラニンの桂皮酸への変換を触媒する能力を指す。
【００４７】
用語「ＰＡＬ／ＴＡＬ活性」または「ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素」は、ＰＡＬおよびＴＡＬ活性の両方を含有するタンパク質を指す。そのようなタンパク質は、酵素基質としてのチロシンおよびフェニルアラニンの両方に対する少なくともいくつかの特異性を有する。
【００４８】
用語「改変されたＰＡＬ／ＴＡＬ」または「変異ＰＡＬ／ＴＡＬ」は、ＰＡＬ活性よりも大きなＴＡＬ活性を有する野生型ＰＡＬ酵素から誘導されるタンパク質を指す。例えば、改変されたＰＡＬ／ＴＡＬタンパク質は、フェニルアラニンよりもチロシンに対して大きな基質特異性を有する。
【００４９】
用語「ＰＡＨ活性」または「ＰＡＨ酵素」は、フェニルアラニンのチロシンへの変換を触媒するタンパク質を指す。
【００５０】
本明細書において使用される用語「桂皮酸（ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）」および「シンナメート（ｃｉｎｎａｍａｔｅ）」は交換可能に使用される。
【００５１】
用語「発酵可能な炭素基質」は、本発明の宿主生物体により代謝されることができる炭素源を指し、また特に、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および単炭素基質またはこれらの混合物から成る群より選択される炭素源である。
【００５２】
用語「相補的」は、相互にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、そしてシトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明はまた、付随する配列表で報告されるような完全な配列、ならびにそれらの本質的に類似の核酸配列に相補的である単離された核酸フラグメントを含む。
【００５３】
「遺伝子」は、コーディング配列の前（５’非コーディング配列）および後（３’非コーディング配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」または「野生型遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコーディング配列を含んで成る、生来の遺伝子ではないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ起源から由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコーディング配列を含んでいてもよい。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。
【００５４】
「コーディング配列」は特定のアミノ配列をコーディングするＤＮＡ配列を指す。
【００５５】
「適切な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内、または下流（３’非コーディング配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定、または関連するコーディング配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含んでもよい。
【００５６】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コーディング配列はプロモーター配列に対し３’側に配置される。プロモーターは生来の遺伝子に完全に由来してよいか、または、天然に見出される多様なプロモーター由来の異なるエレメントから構成されてよいか、または合成ＤＮＡセグメントさえ含むことができる。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型において、または発生の異なる段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることが、当業者に理解される。大部分の時間で大部分の細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは普遍的に「構成プロモーター」と称される。大部分の場合で調節配列の正確な境界が完全に規定されていないため、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有することができることがさらに認識される。
【００５７】
用語「操作可能に連結される」は、一方の機能が他方により影響を受ける単一核酸フラグメント上の核酸配列の対合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指す。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を影響することができる（すなわちコーディング配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に操作可能に連結されている。コーディング配列はセンスまたはアンチセンスの配向で調節配列に操作可能に連結されることができる。
【００５８】
本明細書において使用される用語「発現」は、本発明の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能なアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」は、正常または非形質転換生物体内での産生のレベルを超えるトランスジェニック生物体内の遺伝子産物の産生を指す。「共抑制」は、同一または本質的に類似する外来または内因性遺伝子の発現を抑制することが可能なセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００５９】
「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物のゲノムへの伝達を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物体と呼ぶ。
【００６０】
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのようなエレメントは、任意の起源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組換えられている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、かつ該外来遺伝子に加えて特定の宿細胞の形質転換を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、かつ該外来遺伝子に加えて外来宿主の遺伝子の発現の増強を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。
【００６１】
用語「アミノ酸」は、タンパク質またはポリペプチドの基本的化学構造単位を指す。以下の略記号は、本明細書において特定のアミノ酸を同定するために使用する：
【００６２】
【表２】
2005522180.tif 000003
【００６３】
用語「化学的に等価なアミノ酸」は、所定のタンパク質の化学的または機能的性質を変更することなく、該タンパク質において別のアミノ酸に置換することが可能なアミノ酸を指す。例えば、所定の部位で化学的に等価なアミノ酸の産生を生じるが、コード化されるタンパク質の機能的特性に影響を及ぼさない遺伝子の変更が一般的であることは、当該分野において周知である。本発明の目的として、置換とは、以下の５つの群のうちの１つの中での交換であると規定される。
１．小さな脂肪族の非極性または僅かに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．極性の負に荷電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性の正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．大きな脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；および
５．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
【００６４】
従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンを、別の疎水性のより小さな残基（例えば、グリシン）、またはより疎水性の大きな残基（例えば、バリン、ロイシンもしくはイソロイシン）により置換してよい。同様に、１個の負に荷電した残基の別のもの（例えば、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸）、または１個の正に荷電した残基の別のもの（例えば、アルギニンの代わりにリジン）への置換をもたらす変化もまた、機能的に等価な産物を生じさせるものと期待することができる。さらに、多くの場合、タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の変更もまた、該ポリペプチドの活性を変更しないことが期待される。
【００６５】
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野において周知であり、サンブルックＪ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル）」第２版（コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、１９８９年（以後「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」））、ならびにシルハビーＴ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンナンＭ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）、およびエンクイストＬ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）著、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ（遺伝子融合の実験）」（コールド・スプリング・ハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、１９８４年）、ならびにアウスベルＦ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら著、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学最新プロトコル）」（グリーン・パブリッシング・アソシエーション・エンド・ワイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）より出版、１９８７年）により記載されている。
【００６６】
本発明は、フェニルアラニンを産生する組換え微生物におけるチロシンならびにｐ−ヒドロキシ桂皮酸の産生方法について記載している。チロシン産生のため、組換え微生物はフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）活性をコード化する異種遺伝子を含有する。ｐ−ヒドロキシ桂皮酸の産生のため、組換え微生物はチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）活性をコード化する遺伝子をさらに含有する。関連経路を以下に例示する：
【００６７】
【化１】
2005522180.tif 000004
【００６８】
本発明は、組換え宿主におけるフェニルアラニンの供給源に依存する。フェニルアラニンは、外因的に供給されてもよく、または細胞により内因的に産生されてもいずれでもよい。
【００６９】
本発明は、液晶ポリマー（ＬＣＰ）の製造のためのモノマーとして使用することができるＰＨＣＡの生物学的産生に有用である。ＬＣＰは、電子接続具およびテレコミュニケーションならびに航空宇宙アプリケーションにおいて使用することができる。ＬＣＰは滅菌放射線に耐性であるため、それらの材料を医療デバイスならびに化学、および食品包装アプリケーションに使用することも可能である。
【００７０】
さらに、本発明は、産業微生物学および製薬合成方法において広範に使用されるアミノ酸であるチロシンの新規産生方法を提供する。
【００７１】
遺伝子
本発明において使用される重要な酵素は、当該分野において公知の多くの遺伝子によってコードされる。主要酵素はフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）およびチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）である。
【００７２】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）およびチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）
本発明は、フェニルアラニンのチロシンへの変換に有用なＰＡＨ活性を有する組換え生物体を提供する。この酵素は当該分野において公知であり、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）において報告されている（ジャオ（Ｚｈａｏ）ら著、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（全米科学アカデミー会報）」第９１巻、ｐ．１３６６（１９９４年））。例えば、緑膿菌は、哺乳動物のフェニルアラニンヒドロキシラーゼに相同なフェニルアラニンヒドロキシラーゼ、トリプトファンヒドロキシラーゼ、およびチロシンヒドロキシラーゼを含む多遺伝子オペロンを有する（ジャオ（Ｚｈａｏ）ら著、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（全米科学アカデミー会報）」第９１巻、ｐ．１３６６（１９９４年））。
【００７３】
フェニルアラニンのチロシンへの酵素変換は真核生物において公知である。ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼは肝臓において特異的に発現され、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−チロシンに変換する（ワン（Ｗａｎｇ）ら著、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（生物学雑誌）」第２６９（１２）巻、ｐ．９１３７−４６（１９９４年））。
【００７４】
ＰＡＨ活性をコード化するいかなる遺伝子も有用であり、プロテオバクテリアから単離される遺伝子は特に適切であるが、本発明において、ＰＡＨをコード化する配列番号１に記載の遺伝子はクロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）から単離されることが好ましい。
【００７５】
天然では、フェニルアラニンアンモニアリアーゼをコード化する遺伝子は、フェニルアラニンを桂皮酸に変換することが公知であり、次いで桂皮酸は、ｐ−４５０／ｐ−４５０レダクターゼ酵素系を介してパラ−ヒドロキシ桂皮酸に変換され得る。多くの場合、フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、二基質特異性を有し、原則としてフェニルアラニンに作用するが、チロシンにもいくらかの親和性を有する。例えば、パセリ（アッペルト（Ａｐｐｅｒｔ）ら著、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（ヨーロッパ生化学雑誌）」第２２５巻、ｐ．４９１（１９９４年））およびトウモロコシ（ハビル（Ｈａｖｉｒ）ら著、「Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（植物生理学）」第４８巻、ｐ．１３０（１９７１年））から単離されるＰＡＬ酵素は両方とも基質としてチロシンを使用する能力を実証している。同様に、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）から単離されるＰＡＬ酵素（ホドギンスＤＳ（Ｈｏｄｇｉｎｓ  ＤＳ）著、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（生物化学雑誌）」第２４６巻、ｐ．２９７７（１９７１年））も基質としてチロシンを使用することができる。そのような酵素を、本明細書ではＰＡＬ／ＴＡＬ酵素または活性と呼ぶ。ＰＡＬ／ＴＡＬ活性をコード化する野生型の遺伝子を発現する組換え生物体を作製することを所望する場合、トウモロコシ、コムギ、パセリ、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、ロドスポリジウム、スポロボロマイセス・パラロセウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）およびロドスポリジウムから単離される遺伝子は、ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）およびハビル（Ｈａｖｉｒ）著、「Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ（植物の生化学）」第７巻（アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ニューヨーク市（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８１年、ｐ．５７７−６２５）において考察されている通りに使用することができ、ここで、ロドスポリジウムが好ましく、配列番号３に記載の遺伝子が最も好ましい。
【００７６】
場合によって、様々な形態の変異誘発およびタンパク質工学を介するＰＡＬ／ＴＡＬ酵素の基質特異性を増加することが可能である。ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素の変異誘発のために、様々な取り組み方を使用することができる。変異誘発に適切な取り組み方には、誤りがちなＰＣＲ（ロイング（Ｌｅｕｎｇ）ら著、「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（テクノロジーズ）」第１巻、ｐ．１１−１５（１９８９年）およびジョウ（Ｚｈｏｕ）ら著、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（核酸残基）」第１９巻、ｐ．６０５２−６０５２（１９９１年）およびスピー（Ｓｐｅｅ）ら著、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（核酸残基）」第２１巻、ｐ．７７７−７７８（１９９３年））およびインビボ変異誘発が含まれる。タンパク質工学は、「遺伝子シャッフリング」（米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、および同第５，８３７，４５８号明細書）として一般に公知である方法、または３次元構造および古典的なタンパク質化学に基づく合理的設計によって達成することができる。出願人らは、古典的なロドスポリジウムＰＡＬ／ＴＡＬ酵素（配列番号４）内のどのようなアミノ酸の変更がチロシンに対する基質特異性の増強を与えるかを決定するためのこれらの様々な方法を使用してきた。これらの変異、変更されたアミノ酸残基、およびＴＡＬ／ＰＡＬ活性を以下に示す。
【００７７】
【表３】
2005522180.tif 000005
【００７８】
本発明は、上記の特異的変異だけではなく、化学的に等価なアミノ酸の置換を可能にする方法をも包含することが理解されよう。従って、例えば、脂肪族比極性アミノ酸であるアラニンでアミノ酸を置換する場合、同じ部位を化学的に等価なアミノ酸であるセリンで置換してもよいことが予想される。従って、本発明は、野生型のＰＡＬ／ＴＡＬアミノ酸配列（配列番号４）内の以下のアミノ酸置換を有する変異ＴＡＬタンパク質を提供する。
【００７９】
【表４】
2005522180.tif 000006
【００８０】
上記の合理的改変に加えて、無作為に変異を作製することができる。今回、野生型Ｒ．グルチニスＰＡＬから、増強されたＴＡＬ活性を有する改変されたＰＡＬ酵素を作製した。この変異は、誤りがちなＰＣＲによって作製したが、配列番号２３に記載されており、配列番号２４に記載のタンパク質をコード化する。
【００８１】
本発明は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼまたはチロシンアンモニアリアーゼ活性のいずれかをコード化するいかなる特定の配列にも制限されず、当該分野において公知である類似の活性を有し、日常的な配列依存性プロトコルによって入手可能な遺伝子によって補足することができる。配列依存性プロトコルの例としては、核酸ハイブリダイゼーションの方法、ならびに核酸増幅技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））の多様な使用によって例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８２】
例えば、上記の活性（ＴＡＬ、またはＰＡＨ）のいずれか１つの相同物をコード化する遺伝子は、既知の配列のすべてまた一部を、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用し、当業者に周知の方法論を使用して任意の所望される植物、菌類、酵母、または細菌からライブラリーをスクリーニングすることによって、直接単離し得る。本文献の核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブは、当該分野において既知の方法（マニアティス、上掲）により設計および合成することができる。さらに、配列全体は、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、もしくは末端標識技術のような当業者に既知の方法によりＤＮＡプローブを、または利用可能なインビトロ転写系を使用してＲＮＡプローブを合成するのに直接使用することができる。加えて、本配列の一部または完全長を増幅するための特異的プライマーを設計かつ使用することができる。生じる増幅産物は増幅反応中に直接標識することができるか、または増幅反応後に標識することができ、そして適切なストリンジェンシーの条件下で、完全長のｃＤＮＡまたはゲノムフラグメントを単離するためのプローブとして使用することができる。これらおよび他のプロトコルによって、チロシンアンモニアリアーゼおよびフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する様々な遺伝子を単離することができる。
【００８３】
微生物宿主
本発明の産生生物体には、ＰＨＣＡまたはチロシンの産生に必要な遺伝子を発現することが可能な任意の生物体が含まれる。典型的に、産生生物体は微生物に限定される。
【００８４】
ＰＨＣＡおよびチロシンの産生のための本発明において有用な微生物としては、例えば、腸内細菌（例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ））ならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ）などの細菌、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ）およびシネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）などのシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）などの酵母、ならびにアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびアースロボトリス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）などの糸状菌、ならびに藻類が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＰＡＬ／ＴＡＬおよびＰＡＨ遺伝子は、これらおよび他の微生物宿主において産生され、商業的に有用な大量のＰＨＣＡおよびチロシンを調製する。
【００８５】
外来タンパク質の高レベル発現を指令する調節配列を含有する微生物発現系および発現ベクターは当業者に周知である。これらのいずれをも使用して、ＰＨＣＡの産生のためのキメラ遺伝子を構築することができる。次いで、これらのキメラ遺伝子を、形質転換によって適切な微生物に導入し、高レベルの酵素発現を可能にすることができる。
【００８６】
適切な微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当該分野において周知である。典型的に、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指令する配列、選択マーカー、および自己複製もしくは染色体組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始の制御を有する遺伝子の５’側領域および転写の終了を制御するＤＮＡフラグメントの３’側領域を含む。両方の制御領域が形質転換された宿主細胞に相同な遺伝子に由来することが最も好ましいが、そのような制御領域は、産生宿主として選択される特定種に生来である遺伝子に由来する必要はないことを理解すべきである。
【００８７】
所望の宿主細胞において、関連遺伝子の発現を推進するのに有用である、開始制御領域またはプロモーターは多数あり、かつ当業者に馴染みである。事実上、これらの遺伝子を駆動することができるいかなるプロモーターも本発明に適し、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロマイセスでの発現に有用）；ＡＯＸ１（ピヒアでの発現に有用）；ならびにｌａｃ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌での発現に有用）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
終了制御領域もまた、好適な宿主に生来の様々な遺伝子から誘導することができる。必要に応じて、終了部位は必要ではないが、含まれている場合が最も好ましい。
【００８９】
ＰＨＣＡまたはチロシンの商業的産生を所望する場合、様々な発酵方法論を適用することができる。例えば、バッチまたは連続発酵の両方によって、大規模産生を行うことができる。
【００９０】
古典的なバッチ培養方法は閉鎖系であり、ここで、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵中に人工的に変更されることはない。従って、発酵の開始時に、培地に所望の微生物または複数の微生物を接種し、発酵を可能にして、系には何も添加しない。しかし、典型的に、「バッチ」発酵における炭素源の濃度は制限され、しばしばｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御することが試みられる。バッチ系では、系の代謝物およびバイオマス組成は、発酵が終了する時点まで一定に変化する。バッチ培養物内では、細胞は静的対数期を穏やかに通過して高対数増殖期に達し、最終的に、増殖速度が減少または停止する定常期に達する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、一般的に、最終産物または中間体の大量産生を担う。
【００９１】
標準的なバッチ系の１つのバリエーションは流加培養系である。流加発酵プロセスも本発明に適切であり、発酵の進行に伴って基質を徐々に増量しながら添加することを除いて、典型的なバッチ系を構成する。異化産物の出現によって細胞の代謝が阻害される傾向がある場合、および培地中の基質量を制限することを所望する場合は、流加培養系が有用である。流加培養系における実際の基質濃度の測定は困難であるため、ｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２などの排気体分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて見積もられる。バッチおよび流加培養発酵は当該分野において一般的かつ周知であり、その例はブロックＴ．Ｄ．（Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（バイオテクノロジー）：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第２版（シナウエル・アソシエート（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｅｓ）、１９８９年）、またはデスパンデＭ．Ｖ．（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍ．Ｖ．）著、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（応用生化学バイオテクノロジー）第３６巻ｐ．２２７、（１９９２年）（本明細書において参考として援用される）に見出すことができる。
【００９２】
ＰＨＣＡまたはチロシンの商業的産生は、連続培養によっても達成することができる。連続培養は開放系であり、規定された発酵培地を連続的にバイオリアクターに添加し、同時に等量の順化培地を処理のために取り出す。一般に、連続発酵は、培養物を一定の高密度で維持し、ここで、細胞は主に対数増殖期にある。
【００９３】
連続発酵によって、細胞増殖または最終産物の濃度に影響を及ぼすいくつかの因子を変調することが可能である。例えば、１つの方法は、炭素源などの制限されている栄養物または窒素レベルを一定速度で維持し、他のすべてのパラメータを中位にすることが可能である。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多くの因子は連続的に変更することができる。連続系は定常状態の増殖条件を維持しようとし、従って、培地を取り出すことによって失われる細胞は発酵中の細胞増殖速度に対して均衡を保たなければならない。連続発酵プロセスの栄養および増殖因子を変調するための方法ならびに生成物の形成速度を最大にするための技術は、産業微生物学の分野において周知であり、様々な方法がブロック（Ｂｒｏｃｋ）、上掲によって詳述されている。
【００９４】
ＰＨＣＡまたはチロシンの産生には、適切な炭素基質が必要である。適当な基質としては、グルコース、ラフィノースおよびフルクトースなどの単糖類、ラクトースまたはスクロースなどのオリゴ糖類、デンプンまたはセルロースなどの多糖類、またはこれらの混合物、ならびにチーズ乳漿浸透液（ｃｈｅｅｓｅ  ｗｈｅｙ  ｐｅｒｍｅａｔｅ）、コーンステープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、テンサイモラス、およびオオムギモルトなどの再生可能な原料からの未精製混合物が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、炭素基質は、重要な生化学中間体への代謝返還が実証されている二酸化炭素、ホルムアルデヒド、ホルメート（ｆｏｒｍａｔｅ）またはメタノールなどの単炭素基質であってもよい。
【００９５】
好適な実施例の説明
クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）（配列番号１）のＰＡＨ遺伝子をクローニングし、緑膿菌およびＤＨ５α大腸菌の両方において発現させた。クロモバクテリウム・ビオラセウム（配列番号１）のＰＡＨ遺伝子を含有する緑膿菌株によるチロシン、桂皮酸、およびＰＨＣＡの産生を実証した。緑膿菌は、桂皮酸をパラ−ヒドロキシ桂皮酸に変換するのに必要なｐ−４５０／ｐ−４５０レダクターゼ酵素系を欠くことが実証されたため、これらの実験系において産生されるすべてのパラ−ヒドロキシ桂皮酸はフェニルアラニンからチロシン、次いでパラ−ヒドロキシ桂皮酸への炭素流の再指令から生じた。桂皮酸の産生は、ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素によって保持されるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の副産物である可能性がある。
【００９６】
本発明の方法の特定のアプリケーションにおいて、改変されたＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子（配列番号２３）によるフェニルアラニンのチロシンへの変換のためのＰＡＨオペロンを含有する緑膿菌の形質転換体はチロシンへの炭素流を増加し、産生されるＰＨＣＡの量を増加させることを見出した。
【００９７】
好適な実施態様では、Ｃ．ビオラセウムＰＡＨ遺伝子を内因性緑膿菌ＰＡＨオペロンおよび改変されたＰＡＬ／ＴＡＬの発現と組み合わせて組み入れることにより、チロシンおよびＰＨＣＡの産生量を増加させた。
【００９８】
もう１つの実施態様では、緑膿菌ＰＡＨをクローニングし、フェニルアラニン過剰発現大腸菌および大腸菌の栄養要求性突然変異体において発現させた。
【実施例】
【００９９】
以下の実施例において本発明をさらに規定する。これらの実施例は本発明の好適な実施態様を示すと同時に例示のみの方法によって与えられることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的特徴を確かめることができ、そして本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更および改変を加えて、さまざまな用途および条件に適応することができる。
【０１００】
一般的方法
実施例で使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野において周知であり、サンブルックＪ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル）」（コールド・スプリング・ハーバー実験室出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９年）（マニアティス））、ならびにＴ．Ｊ．シルハビー（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）著、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ（遺伝子融合の実験）」（コールド・スプリング・ハーバー実験室（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年））、ならびにアウスベルＦ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら著、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学最新プロトコル）」（グリーン・パブリッシング・アソシエーション・エンド・ワイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）より出版）（１９８７年））により記載されている。
【０１０１】
細菌培養の維持または増殖に適切な材料および方法は当該分野において周知である。以下の実施例での使用に適切な技術は、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（マニュアル・オブ・メソッズ・フォー・ジェネラル・バクテリオロジー）」（フィリップ・ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．ミュレイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスチロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）（１９９４年））、またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（バイオテクノロジー）：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第２版（シナウエル・アソシエーツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）（１９８９年））に記載の通りに見ることができる。すべての試薬、制限酵素ならびに細菌細胞の増殖および維持のために使用した材料は、特に特定しない限りアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、ギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）（メリーランド州ガイセルブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））より入手した。
【０１０２】
略語の意味は次のようである：「ｓｅｃ」は秒（単数および複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数および複数）を意味し、「ｈ」は時間（単数および複数）を意味し、「ｐｓｉ」は平方インチあたりのポンドを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日（単数および複数）を意味し、「μＬ」はマイクロリットル（単数および複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットル（単数および複数）を意味し、「Ｌ」はリットル（単数および複数）を意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」は「ミリモルの」を意味し、「Ｍ」は「モルの」を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（単数および複数）を意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｍＵ」はミリ単位を意味し、「Ｕｍｇ−１」はｍｇあたりの単位を意味する。
【０１０３】
株の説明
全体を通して、緑膿菌ＡＴＣＣ１５６９１をコントロールとして使用した。ＡＴＣＣ１５６９１株は、生来のＰＡＨオペロンを含有するが、ＰＡＬまたはＴＡＬのいずれの酵素機能をも欠き、桂皮酸をパラ−ヒドロキシ桂皮酸に変換するのに必要なｐ−４５０／ｐ−４５０レダクターゼ酵素系を欠く。また、緑膿菌ＡＴＣＣ１５６９１をＲ．グルチニス由来の生来のＰＡＬ／ＴＡＬで形質転換し、フェニルアラニンを桂皮酸に変換する能力を与えた。さらに、緑膿菌ＡＴＣＣ１５６９１を、チロシンに対して増強された基質特異性を有する変異ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素［配列番号２３］（Ｒ．グルチニスの野生型配列（配列番号４）に基づく）で形質転換した。さらに、Ｃ．ビオラセウム由来のＰＡＨをコード化する遺伝子（配列番号１）およびＲ．グルチニス（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）由来の野生型ＰＡＬをコード化する遺伝子（配列番号３）を含有する緑膿菌ＡＴＣＣ１５６９１形質転換体を作製した。同様の様式で、緑膿菌ＡＴＣＣ１５６９１を、増強されたＴＡＬ活性を有するＲ．グルチニス由来の変異ＰＡＬ／ＴＡＬをコード化する遺伝子［配列番号２３］およびＣ．ビオラセウム由来のＰＡＨをコード化する遺伝子（配列番号１）で形質転換した。緑膿菌ＡＴＣＣ１５６９１に加えて、大腸菌のフェニルアラニン過剰産生菌を、変異および野生型ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子、ならびにＣ．ビオラセウム由来のＰＡＨ遺伝子で形質転換した。
【０１０４】
本発明の株は、以下の実施例において以下のように標識される：
コントロール＝緑膿菌（ＡＴＣＣ１５６９１）
ＴＡＬ＝Ｒ．グルチニス由来の改変されたＰＡＬ／ＴＡＬ（配列番号２３）を含有する緑膿菌（ＡＴＣＣ１５６９１）
ＰＡＨ／ＴＡＬ＝Ｒ．グルチニス由来の改変されたＰＡＬ／ＴＡＬ（配列番号２３）およびＣ．ビオラセウム由来のＰＡＨ（配列番号１１）を含有する緑膿菌（ＡＴＣＣ１５６９１）
【０１０５】
緑膿菌（ＡＴＣＣ１５６９１）のエレクトロポレーション：
緑膿菌のグリセロールストックのサンプルを、抗生物質を含まない寒天プレート上に拡げ、３７℃で１晩インキュベートすると、コロニーは直径が少なくとも１．０ｍｍであり稠密であった。細胞（約１．０〜３．０ｍｇ）をプレートから回収し、滅菌接種ループを使用してチューブに移した。必要なサンプルを得るには、通常、１枚のプレートから大きく３回スワイプすれば十分であった。次いで、回収した細胞を再懸濁し、滅菌水で１回洗浄し、水（５００μｌ）中に再懸濁した。プラスミドＤＮＡ（約５０ｎｇ、下記のプラスミド）を、細胞を含有するチューブに添加した。次いで、ＤＮＡ／細胞懸濁液を、予め冷却したエレクトロポレーションキュベット（０．１ｃｍ、バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））に移し、キュベットを氷上に保持した。各サンプルに、ジーンパルサー（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）（バイオ−ラド）（２５μＦ、２００ｏｍ）中、１８ｋＶ／ｃｍで電気パルスを印加した。パルス印加直後、ＳＯＣ培地（１．０ｍｌ）を各キュベットに添加した。次いで、細胞混合物をチューブに移し、振盪器に置いた（３７℃、２２０ｒｐｍで１．０時間）。次いで、各形質転換反応のサンプル（１００μｌ）を個別のＬＢプレート上にピペッティングし、３７℃で１晩インキュベートした。
【０１０６】
酵素活性アッセイ
アベル（Ａｂｅｌｌ）ら著、「酵母ロドトルラ・グルチニス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  Ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）」（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（メソッズ・エンザイモール）社、第１４２巻、ｐ．２４２−２４８（１９８７年））に従い、分光光度計を使用して、精製された酵素のＰＡＬまたはＴＡＬ活性を測定した。ＰＡＬの決定に関する分光光度アッセイは、１．０ｍＭのＬ−フェニルアラニンおよび５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を含有する溶液に酵素を添加することによって開始した。次いで、９０００ｃｍ−１のモル吸光係数を使用して、産物である桂皮酸の吸収をモニターすることによって、反応を追跡した。アッセイは、０．００７５〜０．０１８／分の範囲の吸収の変化を生じる酵素の量を使用して、５分間行った。１単位の活性は、１分間当たりの１．０μｍｏｌフェニルアラニンの桂皮酸への脱アミノ化を示した。同様に、反応溶液中のチロシンを使用して、ＴＡＬ活性を測定した。産生するパラ−ヒドロキシ桂皮酸の吸収を３１５ｎｍで追跡し、ＰＨＣＡに対する１０，０００ｃｍ−１の吸光係数を使用して活性を決定した。１単位の活性は、１分間当たりの１．０μｍｏｌチロシンのパラ−ヒドロキシ桂皮酸への脱アミノ化を示した。
【０１０７】
ＳＤＳゲル電気泳動
８〜２５％ネイティブファストゲルズ（ＰｈａｓｔＧｅｌｓ）を、レーンあたり４．０μｇのタンパク質で行った。ファルマシア高分子量（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｈｉｇｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ）（ＨＭＷ）マーカーおよびシグマ（Ｓｉｇｍａ）製１級ＰＡＬを標準として使用した。
【０１０８】
ＨＰＬＣ分析用サンプルの調製
全細胞により形成される桂皮酸およびＰＨＣＡのレベルを測定するために、ＨＰＬＣアッセイを開発した。典型的なアッセイでは、選択した培地中で増殖した培養物の遠心分離後、２０〜１０００μＬの上清をリン酸で酸性化し、０．２または０．４５ミクロンフィルターでろ過し、ＨＰＬＣで分析し、増殖培地中のＰＨＣＡおよび桂皮酸の濃度を決定した。あるいは、遠心分離後、細胞を、１．０ｍＭチロシンまたは１．０ｍＭフェニルアラニンを含有する１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中に再懸濁し、室温で１．０〜１６時間インキュベートした。次いで、この懸濁液のろ過したアリコート（２０〜１０００ｍＬ）を分析した。
【０１０９】
ＨＰＬＣ方法：
オートサンプラーおよびダイオードアレイＵＶ／可視検出器を具備したヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）１０９０Ｍ  ＨＰＬＣシステムを、ＭＡＣ−ＭＯＤアナリティカル（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）社製逆相ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）ＳＢ−Ｃ８カラム（４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ）と共に使用した。４０℃のカラム温度で、１分間あたり１．０ｍＬの流速を行った。ＵＶ検出器を設定して、２５０、２３０、２７０、２９０および３１０ｎｍの波長で溶出物をモニターした。
【０１１０】
【表５】
2005522180.tif 000007
【０１１１】
上記のＨＰＬＣシステムを使用する関連代謝物の保持時間（ＲＴ）を以下にまとめる。
【０１１２】
【表６】
2005522180.tif 000008
【０１１３】
モノ（ＭＯＮＯ）Ｑ緩衝液：
これらの分析に使用した緩衝液は、開始緩衝液としての５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０、続いて、モノ（Ｍｏｎｏ）Ｑカラムに対する溶出液としての４００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２であった。
【０１１４】
実施例１
微生物におけるクロモバクテリウム・ビオラセウムフェニルアラニンヒドロキシラーゼのクローニングおよび発現
クロモバクテリウム・ビオラセウムＤＮＡの増幅およびクローニングに対するフェニルアラニンヒドロキシラーゼ：
これらの研究では、クロモバクテリウム・ビオラセウムのＰＡＨ遺伝子（配列番号１）を緑膿菌（ＡＴＣＣ１５６９１）およびＤＨ５α大腸菌の両方にクローニングした。先に記載のＣ．ビオラセウムフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子のコーディング領域に隣接するデオキシヌクレオチド配列（Ａ．オオニシ（Ａ．Ｏｎｉｓｈｉ）、Ｌ．Ｊ．リオッタ（Ｌ．Ｊ．Ｌｉｏｔｔａ）、Ｓ．Ｊ．ベンコビック（Ｓ．Ｊ．Ｂｅｎｋｏｖｉｃ）著、「大腸菌におけるクロモバクテリウム・ビオラセウムフェニルアラニンヒドロキシラーゼのクローニングおよび発現ならびに哺乳動物芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼとのアミノ酸配列の比較（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｙｌａｓｅ）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（生物化学雑誌）第２６６巻、ｐ．１８４５４−１８４５９（１９９１年））に基づいて、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＴＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＡＴＣＧＣＧＣＣＧＡ−３’［配列番号５］（ＣＶＰＨ１６８と称する）および５’−ＧＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＡＴ−３’[配列番号６]（ＣＶＰＨ１１７０と称する）を合成した。各プライマーの５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位（ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ、上記のプライマーの下線を付した配列）を設計し、クローニングを容易にした。キアゲン・キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｋｉｔ）でＣ．ビオラセウムゲノムＤＮＡを単離および精製し、ＤＮＡの複製を行った。増幅反応混合液（１００μｌ）は、１．０ｍｇのゲノムＤＮＡテンプレート、１００ｐｍｏｌの２種の各プライマー、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）中２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、０．２ｍＭの４種の各ｄＮＴＰ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．０１％ウシ血清アルブミンを含有した。３０回のＰＣＲサイクル（９４℃、０．５分間；５５℃、０．５分間および７２℃、２．０分間）を実施した。正確に増幅されたＤＮＡフラグメント（フラグメントのサイズに基づく）をＴＡベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））にクローニングし、配列分析に供した。このようにして、遺伝子を含有するいくらかのクローンを得た。
【０１１５】
遺伝子発現およびタンパク質の精製：
クローニングされたフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子を発現するために、ジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）ＩＩキット（バイオ１０１社（Ｂｉｏ１０１）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））を使用して増幅された目的のＤＮＡフラグメントを精製し、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））で消化し、ｐＥＴ２４ａ（ノボゲン（Ｎｏｖｏｇｅｎ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、ｐＱＥ３０（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））およびｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））などのプラスミドベクターのＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。調製したベクターに対し、次の名称：ｐＥＴＤＷ（Ｃ．ビオラセウム由来のＰＡＨ遺伝子（配列番号１）を含有するＰＥＴ２４ａベクター）、ＰＱＳＷ−ＰＡＨ１１７０（同じ遺伝子を含有するｐＱＥ３０ベクター）およびｐＴｒｃ−ＰＡＨ（ＰＡＨ遺伝子を含有するｐＴｒｃ９９ａ）を使用した。エレクトロポレーションにより発現ベクターを形質転換したシュードモナスおよび大腸菌株を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の非存在または存在下で、ｖｐＥＳＷ−ＰＡＨ１１７０については２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンもしくはｐＱＳＥ−ＰＡＨ１１７０およびｐＴｒｃ−ＰＡＨの両方については１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンのいずれかを含有するＬＢ培地中、３７℃で増殖させた。組換え体のフェニルアラニンヒドロキシラーゼの発現を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。均質化までのフェニルアラニンヒドロキシラーゼの精製は、１μｇ／ｍｌのロイペプチンおよびペプスタチンＡを含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０中の細胞懸濁液を１８，０００ｐｓｉでフレンチプレッシャー（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ）セルに通過させる（×２）ことによって達成した。次いで、プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦを抽出物に添加し、最終濃度を０．５ｍＭとした。３８，０００×ｇで２０分間の遠心分離により、細胞破砕物および封入体を除去した。次いで、上清を、細胞を含まない抽出物として使用した。
【０１１６】
２０ｍｍ×１６５ｍｍ、５０μｍＨＱカラム上、３０ｍｌ／分の流量で陰イオン交換を行った。開始緩衝液（緩衝液Ａ）は、２０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６．０であり、溶出緩衝液（緩衝液Ｂ）は、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６．０である。カラムを平衡化し、サンプル注入後、緩衝液Ａで洗浄した。勾配は緩衝液Ａの１００％から緩衝液Ｂの１００％へ１０カラム容量で行った。カラムを緩衝液Ｂで洗浄し、次いで、緩衝液Ａで再平衡化した。２８０ｎｍでタンパク質をモニターし、２カラム容量の勾配後に１０ｍｌ画分を回収した。カラムに対し１回の操作ですべての粗抽出物を使用した。ＰＡＨ活性を含有する画分を集め、セントリコン１０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｍ−１０）限外ろ過により濃縮した。液体窒素中で凍結後、精製した酵素を−７０℃で保存した。サンプルの電気泳動後、クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）で染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルを調べることにより、フェニルアラニンヒドロキシラーゼの純度を判定した。
【０１１７】
【表７】
2005522180.tif 000009
【０１１８】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素活性およびタンパク質濃度の決定：
分光光度計でチロシンの産生をモニターすることにより、フェニルアラニン依存性ＤＭＰＨ４脱水素活性を測定した。Ｌ−フェニルアラニン（１．０ｍＭ、１０ｍｌの１００ｍＭ溶液）；ジチオトレイトール（ＤＴＴ、６．０ｍＭ、６．０ｍｌの１．０Ｍ溶液）；Ｆｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２（１０ｍＭ、１０ｍｌの１００ｍＭ溶液）、６，７−ジメチルテトラヒドロプテリン（ＤＭＰＨ４）（１２０ｍＭ、１０ｍｌの１２ｍＭ溶液）およびＨＥＰＥＳ緩衝液（９６０ｍｌの１００ｍＭ、ｐＨ７．４）を含有する１．０ｍｌの溶液に酵素溶液（１．０〜１０ｍｌ）を添加することによって、アッセイを実施した。フェニルアラニンを上記の混合物に添加することによって反応を開始し、生成物であるチロシンの形成による２７５ｎｍでの上昇をモニターすることによって、追跡した。約０．０１／分で吸収の変化が生じる様な酵素量を使用して、アッセイを数分間行った。１７００ｃｍ−１のモル吸光係数を使用して、活性を決定した。１単位の酵素活性は１分間あたり１．０μｍｏｌのチロシンを生じる。ＢＣＡタンパク質アッセイ（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））によって、溶液中の酵素濃度を日常的に決定した。
【０１１９】
チロシンのインビボ産生：
ＨＰＬＣ方法により、インビボでのチロシン産生のアッセイを行った。フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子を含有する微生物を、補因子ＤＭＰＨ４および／またはＦｅＳＯ４の存在あるいは非存在下で、対応する抗生物質を有するＬＢ培地に接種した。細胞を３７℃で１晩、振盪器に置いた。次いで、培養物を、２％グルコースを含有するＭ９倍値で洗浄（×３）し、同培地に再懸濁した。サンプル（１．０ｍｌ）を特定の時間間隔で採取し、調製し、ＨＰＬＣで分析した。
【０１２０】
実施例２
クロモバクテリウム・ビオラセウムのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子を含有する緑膿菌株によるチロシン、桂皮酸およびＰＨＣＡの産生
本実施例では、緑膿菌におけるＣ．ビオラセウム由来のフェニルアラニンヒドロキシラーゼの発現について説明する。
【０１２１】
緑膿菌（ＡＴＣＣ１５６９１）において産生されるパラ−ヒドロキシ桂皮酸の供給源を確認するためには、緑膿菌（ＡＴＣＣ１５６９１）が桂皮酸からパラ−ヒドロキシ桂皮酸を産生する酵素機構を有さないことを確認することがまず必要であった。このことを確認するために、以下の研究を行った。
【０１２２】
１個のコロニーをＬＢ寒天プレートから拾い出し、４．０ｍｌのＬＢ培地に接種した。培養液を１晩、振盪器（３０℃、２２５ｒｐｍ）に置いた。次いで、２００μｌの培養液を１５０．０ｍｌの新鮮ＬＢ培地に移し、培養液を１晩、振盪器（３０℃、２２５ｒｐｍ）に置いた。次いで、細胞を遠心分離し、２％グルコースを含有するＭ９培地で２回洗浄した。次いで、細胞ペレットを、Ｍ９培地、２％グルコースを含有するＭ９培地、ＬＢ培地、２％グルコースを含有するＬＢ培地のいずれかに再懸濁し、６００ｎｍでのＯＤを０．２に調整した。ｐＨＣＡまたは桂皮酸（１．０ｍＭ）のいずれかを培養液に添加し、次いで、振盪器に置いた（３０℃）。ＰＨＣＡまたは桂皮酸のいずれも添加されていない培養液をコントロールとして使用した。２４時間および４８時間目に培養液から、ＨＰＬＣ分析用にサンプル（１．０ｍｌ）を採取した。分析結果を以下にまとめる（表２）が、これは、緑膿菌は、桂皮酸からＰＨＣＡを産生することができず、実質的量で消費されなかったことを示す。
【０１２３】
【表８】
2005522180.tif 000010
【０１２４】
この研究で使用される組換え株は、緑膿菌を発現ベクターｐＥ−ＰＡＬ（アンピシリン選択マーカーを有するロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）由来の生来のＰＡＬ／ＴＡＬを含有する）およびｐＪ−ＰＡＨ（カナマイシン選択マーカーを有するクロモバクテリウム・ビオラセウム由来のＰＡＨ（配列番号１）を含有する）でエレクトロポレーションすることによって調製した。二重選択プレートは、ＬＢ培地＋カルベニシリン（１７５μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（１５０μｇ／ｍｌ）を含有した。単一のコロニーを選択プレートから拾い出し、抗生物質を有するＬＢ培地（１０ｍｌ）を含有するチューブに接種した。培養液を１晩、振盪器に置いた（３７℃、２２５ｒｐｍ）。次いで、それらを遠心分離し、ＬＢ培地で１回洗浄し、１０ｍｌの同培地に再懸濁した。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ、１０μｌの１．０Ｍストック溶液）を培養液に添加し（最終濃度１．０ｍＭ）、振盪器に置いた（３７℃、２２５ｒｐｍ、２４時間）。ＩＰＴＧ接種の２４時間後、サンプル（１．０ｍｌ）を採取し、ＨＰＬＣ分析用に調製して、サンプル中のチロシン、桂皮酸およびＰＨＣＡの濃度を決定した。ＨＰＬＣ分析の結果を表３にまとめる。コントロール細胞（シュードモナスＰＡＨオペロンを含有する生来の緑膿菌）、ならびにＰＡＬおよびＴＡＬ形質転換体は、ＬＢ培地上での増殖後、何らチロシンを産生しなかった。しかし、（生来のＰＡＨに加えて）Ｃ．ビオラセウム由来のＰＡＨ［配列番号１］を含有するシュードモナス形質転換体およびＰＡＨ／ＰＡＬまたはＰＡＨ／ＴＡＬのいずれかを含有するそれらの形質転換体は、これらの実験条件下でそれぞれ２３３．５、１３．６および２３．５Ｍのチロシンを産生した。様々な株による桂皮酸産生の分析により、生来の緑膿菌株およびＣ．ビオラセウム由来のＰＡＨ［配列番号１］を含有する細胞の両方による極めて低いレベルの産生（１．４５および１２．２Ｍ）が示された。しかし、ＰＡＬまたはＴＡＬのいずれか一方を含有する細胞は、極めて高いレベルの桂皮酸の産生（それぞれ３２２．３および２２０．８Ｍ）を示した。ＰＡＬまたはＴＡＬのいずれか一方に加えて、Ｃ．ビオラセウムＰＡＨを含む細胞は、ＰＡＬまたはＴＡＬのみを含有する細胞と比較して、より低い量の桂皮酸（それぞれ２０４．８および１０９．５ｍ）を形成することを示した。同様に、コントロールおよびＰＡＨ含有細胞によって極少量のＰＨＣＡ（それぞれ０．４６および０．３７Ｍ）が形成されたが、ＰＡＬおよびＴＡＬ（それぞれ１８８．９および２８５．１）またはＰＡＨ／ＰＡＬおよびＰＡＨ／ＴＡＬの組み合わせ（それぞれ１５５．６および２０７．５ｍ）を含有する細胞によりより高いレベルのＰＨＣＡが観察された。これらの結果は、生来のＰＡＨオペロンに加えてＣ．ビオラセウム遺伝子を含有するシュードモナス形質転換体においてチロシンが認められることによって証明されるように、フェニルアラニンからチロシンへの炭素流を転換する際のＰＡＨ酵素の効果を明瞭に表す。ＰＡＨおよびＰＡＬの両方またはＴＡＬを含有する形質転換体によって形成されるＰＨＣＡのレベルは若干低いという事実は、こ��らの細胞におけるＰＡＨの律速的役割に反映し得る。
【０１２５】
【表９】
2005522180.tif 000011
【０１２６】
実施例３
Ｍ９＋グルコースにおける増殖後の組換え緑膿菌株によるチロシン、桂皮酸およびＰＨＣＡの産生
組換え体緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株によるチロシン、桂皮酸およびＰＨＣＡの産生：
本研究で使用した組換え株は、実施例に１に記載のものである。実験手順は、本実施例において、限定Ｍ９培地で細胞を増殖させ、次いで、唯一の炭素減としてグルコースを添加し、２４時間ではなく６時間後に分析のためにサンプルを採取することを除いて、実施例１の手順と同様であった。増殖培地をＬＢ（実施例２）から限定Ｍ９＋グルコース（実施例３）に変更することにより、産生される細胞塊が有意に減少し、従って、産生されるチロシン、桂皮酸およびＰＨＣＡの濃度について得られる値は、実施例１で得られる値よりも有意に低い。
【０１２７】
得られた結果は、コントロール細胞（それらは常に生来のＰＡＨオペロンを含有したが）グルコースからチロシンを産生することはできないことを示した。これらの細胞を改変されたＰＡＬ／ＴＡＬ（配列番号２３）で形質転換する場合、６時間のサンプルにおいてチロシン（９５．５４Ｍ）が認められた。しかし、これらの細胞は何ら桂皮酸および／またはＰＨＣＡを産生しなかった。ＴＡＬをシュードモナス細胞に組み入れた場合、極僅かな量のチロシン（３．４４Ｍ）しか検出されなかった。これらの培養物では桂皮酸およびＰＨＣＡ（それぞれ１８．４９Ｍおよび１３．５９Ｍ）が検出された。ＰＡＨおよびＴＡＬの両方を含有する形質転換体は、最も高いレベルのチロシン、桂皮酸およびＰＨＣＡ（それぞれ９７．２４Ｍ、２３．４４Ｍ、および１９．１９Ｍ）を産生した。ＴＡＬおよび／またはＰＡＨ／ＴＡＬを含有する細胞が桂皮酸を産生することによって、実施例１において考察されたように、培地におけるチロシン産生を可能にするためにはシュードモナスにおけるＰＡＨの過剰発現が必要であること、およびＴＡＬはなおいくらかのＰＡＬ活性を含有するという結果が確認される。
【０１２８】
【表１０】
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【０１２９】
実施例４
フェニルアラニンの添加を伴うまたは伴わない緑膿菌ＴＡＬ形質転換体によるチロシンおよびＰＨＣＡ産生
緑膿菌は、フェニルアラニンのチロシンへの変換のためのＰＡＨオペロンを含有する。チロシンへの炭素流を増加すること、従って産生されるＰＨＣＡの量を増加することに対する緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＨオペロンの効果について研究するために、改変されたＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子（配列番号２３）によりこの株の形質転換体を調製した。形質転換体をＬＢ培地中で増殖させ、次いで、２つのグループに分けた。一方のグループには、フェニルアラニン（０．１ｍＭ）を添加し、他方のグループには何らさらなるフェニルアラニンを添加しなかった。サンプルを６時間後に採取したが、これは表５に見ることができる。培地において検出されたチロシンのレベルは、コントロールの誘導されなかった細胞での約２３Ｍからさらなるフェニルアラニンを伴うことなくＩＰＴＧで誘導された形質転換体による約６６Ｍ、さらなるフェニルアラニンを添加された誘導された形質転換体による約３５０Ｍにまで増加した。コントロール細胞は、ＰＨＣＡを何ら産生しなかったが、フェニルアラニンの添加を伴わないおよび伴う培養物では、それぞれ約１０および１３．０ＭのＰＨＣＡが検出された。
【０１３０】
【表１１】
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【０１３１】
実施例５
フェニルアラニンの添加を伴うまたは伴わない緑膿菌ＰＡＨ形質転換体によるチロシンおよびＰＨＣＡ産生
Ｃ．ビオラセウムＰＡＨ（配列番号１）で形質転換された緑膿菌を使用して、実験を実施し、それらがチロシンを産生する能力について調べた（表６）。細胞をＬＢ培地中で増殖させ、次いで、２つのグループに分けた。一方のグループには、フェニルアラニン（０．１ｍＭ）を添加し、他方のグループには何らさらなるフェニルアラニンを添加しなかった。サンプルを６時間後に採取したが、これは表６に見ることができる。培地において検出されたチロシンのレベルは、コントロールの誘導されなかった細胞での約６９．０Ｍからさらなるフェニルアラニンを伴うことなくＩＰＴＧで誘導された形質転換体による約１７４Ｍ、さらなるフェニルアラニンを添加された誘導された形質転換体による約４２４Ｍにまで増加した。ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子が存在しないため、本研究では、研究過程でＰＨＣＡを産生した細胞は認められなかった（表６）。
【０１３２】
【表１２】
2005522180.tif 000014
【０１３３】
実施例６
フェニルアラニンの添加を伴うまたは伴わない緑膿菌ＰＡＨ／ＴＡＬ形質転換体によるチロシンおよびＰＨＣＡ産生
形成されるチロシンおよびＰＨＣＡのレベルに対する内因性緑膿菌ＰＡＨオペロン、および改変されたＰＡＬ／ＴＡＬ（配列番号２３）に加えて、Ｃ．ビオラセウムＰＡＨを組み入れることの組み合わされた効果について研究するために、以下の実験を実施した。緑膿菌をＣ．ビオラセウムＰＡＨ遺伝子（配列番号１）および改変されたＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子（配列番号２３）の両方で形質転換した。さらなるフェニルアラニンの存在および非存在下でＬＢ培地において細胞を増殖させた。表７は得られた結果をまとめている。ＰＨＣＡおよびチロシンの両方のレベルとも、さらなるフェニルアラニンを添加された誘導された細胞において増加した。チロシンとＰＨＣＡのレベルを比較すると、ＴＡＬ経路を介するフェニルアラニンのＰＨＣＡへの完全な変換における律速段階は、ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素であることは明らかであった。
【０１３４】
【表１３】
2005522180.tif 000015
【０１３５】
実施例７
フェニルアラニンの添加を伴うまたは伴わない緑膿菌ＰＡＨ形質転換体によるチロシンおよびＰＨＣＡ産生
Ｍｇ＋２を補充したＭ９およびグルコース培地中で増殖する実施例５の形質転換体の挙動について調べるため、Ｃ．ビオラセウムＰＡＨを含有する緑膿菌細胞を上記の培地中で増殖させ、チロシンおよびＰＨＣＡのレベルを測定した。表８に得られた結果をまとめている。コントロール（誘導なし）細胞は何らチロシンまたはＰＨＣＡを産生しなかった。さらなるフェニルアラニンの存在下で、誘導された細胞は約３３５Ｍのチロシンを産生したが、ＰＨＣＡを産生しなかった。０．１ｍＭのフェニルアラニンを添加すると、６１２Ｍのチロシンが産生された。しかし、ＰＨＣＡは検出されなかった。
【０１３６】
【表１４】
2005522180.tif 000016
【０１３７】
実施例８
フェニルアラニンの添加を伴うまたは伴わない緑膿菌ＴＡＬ形質転換体による桂皮酸およびＰＨＣＡ産生
改変されたＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子（配列番号２３）を含有する実施例５において使用した緑膿菌細胞をＭ９＋グルコース＋Ｍｇ＋２中で増殖させ、形成される桂皮酸およびＰＨＣＡのレベルを測定した。試験したすべての細胞において、桂皮酸のレベルは、ＰＨＣＡについて観察されたレベルよりも高く、改変された酵素においてＴＡＬ活性よりも高いＰＡＬが存在することが証明された（表９）。
【０１３８】
【表１５】
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【０１３９】
実施例９
Ｃ．ビオラセウムＰＡＨ（配列番号１）および改変されたＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子（配列番号２３）の両方を含有する実施例６において使用された緑膿菌細胞を本実験で使用した。それらをＭ９＋グルコースおよびＭｇ＋２中で増殖させ、２４時間後の桂皮酸およびＰＨＣＡのレベルを測定した。すべての場合において、ＰＨＣＡと比較した場合よりも高いレベルの桂皮酸が産生された（表１０）。
【０１４０】
【表１６】
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【０１４１】
実施例１０
フェニルアラニン過剰産生大腸菌における緑膿菌フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）オペロンのクローニングおよび発現
緑膿菌のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）：ＤＮＡ増幅およびクローニング：
緑膿菌からフェニルアラニン過剰産生大腸菌株（ＡＴＣＣ３１８８４）および大腸菌チロシン栄養要求性突然変異体株（ＡＴ２７４１）へのＰＡＨオペロンの組み入れに使用するために、表１１に列挙したプライマーを設計した。大腸菌宿主におけるＰＡＨオペロンおよびその相補体を増幅するために、緑膿菌オペロンの以下のプライマーを設計し、使用した。
【０１４２】
【表１７】
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【０１４３】
上に記載の緑膿菌フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子オペロン（ジャオ（Ｚｈａｏ）Ｇ、シャーＴ（Ｘｉａ  Ｔ）、ソンＪ（Ｓｏｎｇ  Ｊ）およびジェンセンＲＡ（Ｊｅｎｓｅｎ  ＲＡ）（１９９４年）著、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（全米科学アカデミー会報）」第９１巻、ｐ．１３６６−１３７０）のコーディング領域に隣接するデオキシヌクレオチド配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプライマー（表１１）を合成した。制限エンドヌクレアーゼ部位（実施例１の上記のプライマーの下線を付した配列、配列番号５および６）を各プライマーの５’末端で設計し、クローニングを容易にした。キアゲン・キットで緑膿菌ゲノムＤＮＡを単離および精製し、ＤＮＡの複製を行った。増幅反応混合液（１００μｌ）は、１．０ｍｇのゲノムＤＮＡテンプレート、１００ｐｍｏｌの２種の各プライマー、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）中２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン）、０．２ｍＭの４種の各ｄＮＴＰ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．０１％ウシ血清アルブミンを含有した。３０回のＰＣＲサイクル（９４℃、０．５分間；５５℃、０．５分間および７２℃、２．０分間）を実施した。正確に増幅されたＤＮＡフラグメント（フラグメントのサイズに基づく）をＴＡベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））にクローニングし、配列分析に供した。このようにして、遺伝子を含有するいくらかのクローンを得た。
【０１４４】
遺伝子発現およびタンパク質の精製
クローニングされたフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子のオペロンを発現するために、ジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）ＩＩキット（バイオ１０１社、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））を使用して増幅された目的のＤＮＡフラグメントを精製し、エンドヌクレアーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））で消化し、表１２に見られるように、ｐＤ１００（ＡＴＣＣ８７２２２）、ｐＫＳＭ７１５（ＡＴＣＣ８７１６１）およびｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））などのプラスミドベクターの制限ヌクレアーゼ部位にクローニングした。
【０１４５】
【表１８】
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【０１４６】
エレクトロポレーションにより発現ベクターを形質転換した大腸菌株を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の非存在または存在下で、ｐＤ１００発現ベクターについては２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールもしくはｐＫＫ２２３−３およびｐＴｒｃ１９Ａについては１００μｇ／ｍｌのアンピシリンのいずれかを含有するＬＢ培地中、３７℃で増殖させた。
【０１４７】
実施例１１
Ｃ．ビオラセウムＰＡＨおよび緑膿菌ＰＡＨオペロンの様々な成分による形質転換後の大腸菌ＡＴ２７１Ｔｙｒ−栄養要求性突然変異体株の増殖
Ｍ９培地＋グルコースを含有する寒天プレートを調製した。チロシン栄養要求性突然変異体ＡＴ２７１株は、チロシン非存在下では、このプレート上で増殖することができない（コントロール−１を参照のこと）。１．０ｍＭのチロシンを含有するフィルターディスクをプレートに添加する場合、ディスクの周囲に増殖が観察され、生物体のチロシン存在への依存性を示す（コントロール−２を参照のこと）。本研究で使用したＡＴ２７１組換え株には、ＰｈｈＡ、ＰｈｈＢ、ＰｈｈＣ、ＰｈｈＢＣ、ＰｈｈＡＢＣ、ＰＡＨおよびＰＡＨ／ＰｈｈＢ／ＰｈｈＣを含有する株が含まれる。３種の組換え体に対し、それぞれのプレートの中央にトリプシンディスクを配置した。ＰｈｈＡ、ＰｈｈＢ、ＰｈｈＣ、およびＰｈｈＢＣを含有する株については、チロシンディスクの周辺にのみ増殖が認められ、これらの株がトリプシンを合成することができず、増殖のためにこの化合物の外部からの供給になお依存することを示す。しかし、ＰｈｈＡＢＣ、ＰＡＨおよびＰＡＨ／ＰｈｈＢ／ＰｈｈＣを含有する組換え体については、プレート全体に増殖が認められ、増殖のために要求されるチロシンを合成する生物体の能力および外部のチロシンを含有するディスクの必要がないことが証明された。
【０１４８】
実施例１２
ＰＡＨ遺伝子を含有するフェニルアラニン過剰産生大腸菌の形質転換体による増殖およびチロシン産生に対する鉄の影響
ＰＡＨの活性に対する鉄の影響、従ってチロシンの産生を調べるために、Ｃ．ビオラセウムのＰＡＨ遺伝子（ＰＡＨ）［配列番号１］およびシュードモナスＰＡＨオペロンのＰｈｈＡ成分を含有する大腸菌株を、ＦｅＳＯ４またはＦｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２（最終濃度１．０Ｍ）の添加を伴うおよび伴わないグルコースを有するＭ９培地中で増殖させた。２．０、６．０、１６．０、および２２時間目にサンプルを採取した。結果を表１３に示す。得られた結果に基づいて、２つの鉄供給源のいずれの添加も、産生されるチロシンのレベルに有意なポジティブな影響を何ら有さないと結論された。
【０１４９】
【表１９】
2005522180.tif 000021
【０１５０】
実施例１３
様々なフェニルアラニン過剰産生大腸菌株によって産生されるフェニルアラニンのレベルの決定
フェニルアラニン、またはチロシンによるＤＡＨＰシンターゼの阻害が除去され、フェニルアラニンによる酵素コリスミ酸ムターゼＰ−プレフェン酸デヒドラターゼの阻害が除去され、そして酵素ＤＡＨＰシンターゼ、コリスミ酸ムターゼＰ−プレフェン酸デヒドラターゼおよびシキミ酸キナーゼのレベルの増強が達成されるフェニルアラニン過剰産生大腸菌株（ＡＴＣＣ３１８８２、３１８８３、３１８８４）（トライブＤ．Ｅ．（Ｔｒｉｂｅ，Ｄ．Ｅ．）「新規微生物および方法（Ｎｏｖｅｌ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ）」、米国特許第４６８１８５２号明細書、１９８７年）を、グルコースを含有するＭ９培地中に増殖させた場合のフェニルアラニン産生能について試験した。表１４に見られるように、株ＡＴＣＣ３１８８４は最も高いレベルのフェニルアラニン（８７０．５４Ｍ）を産生した。
【０１５１】
【表２０】
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【０１５２】
実施例１４
フェニルアラニン過剰産生大腸菌株（ＡＴＣＣ３１８８４）による桂皮酸およびパラ−ヒドロキシ桂皮酸の産生
桂皮酸およびＰＨＣＡを産生させるためにロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）由来の生来のＰＡＬ／ＴＡＬ酵素で形質転換されたＡＴＣＣ３１８８４株の能力を試験するために、実験を実施した。大腸菌株（ＤＨ５α）をコントロールおよびまたＰＡＬ／ＴＡＬ酵素組み入れ後の試験株として使用した。第３の株は、生来のＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を有するフェニルアラニン過剰産生菌の大腸菌ＡＴＣＣ３１８８４であった。すべての株をＭ９＋グルコース培地中で増殖させ、サンプルを採取（１８時間後）し、前記のようにＨＰＬＣ分析用に調製した。結果を表１５に示す。生来のＰＡＬ／ＴＡＬを含有するＤＨ５α株によって産生されるＰＨＣＡおよび桂皮酸のレベル間に有意さが認めらなかったことに留意したことは興味深かった。しかし、ＰＨＣＡ（１７５Ｍ）に比べて、桂皮酸は、非常に高いレベル（約７５０Ｍ）でフェニルアラニン過剰産生ＡＴＣＣ３１８８４株＋ＰＡＬ／ＴＡＬによって産生された。これらの結果は、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）の生来のＰＡＬ／ＴＡＬ酵素におけるＴＡＬ活性と比較して、高いレベルのＰＡＬ活性が認められることのさらにもう１つの証拠を提供する。
【０１５３】
【表２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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