(57)【要約】本発明は、サンプル中の少量のポリヌクレオチドを選択的に富化する方法に関する。これらの方法は、酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーを用いて、選択的に多量な種に対するポリメラーゼ活性を選択的にブロックし、それによって、サンプル中にさほど多量には存在しない種の富化を生じる。結果として得られる富化されたポリヌクレオチドのプールは、種々の使用（遺伝子発現の分析、およびｃＤＮＡライブラリーの作製）において、有用性を見出す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の多量のポリヌクレオチドに対する少量のポリヌクレオチドを富化するための方法であって、ここで、多量のポリヌクレオチドと少量のポリヌクレオチドとの比が、少なくとも約１０：１であり、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを、該多量のポリヌクレオチド内の配列に相補的なヌクレオベース配列を有する少なくとも１つの第１の酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーに対して、塩基対形成が生じる条件下で、曝露する工程；
（ｂ）該サンプルを、該少量のポリヌクレオチド内の配列に対して相補的なヌクレオベース配列を有するプライマーに対して、塩基対形成が生じる条件下で、暴露する工程；および
（ｃ）該サンプルを、ポリメラーゼ伸長のための条件に供して、その結果、該少量のポリヌクレオチドが、該プライマーの伸長によって増幅され、そして該多量のポリヌクレオチドが増幅されない、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、該多量のポリヌクレオチドと該少量のポリヌクレオチドとの比が、少なくとも１００：１である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記サンプルは、第１および第２の多量のポリヌクレオチドを含有し、そして、工程（ａ）において、該サンプルを、少なくとも２つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーに対して、曝露し、ここで、１つのヌクレオベースオリゴマーは、該第１の多量のポリヌクレオチド内の配列に対して相補的なヌクレオベース配列を含み、そして、該第２のヌクレオベースオリゴマーは、該第２の多量のポリヌクレオチド内の配列に対して相補的であるヌクレオベース配列を含有する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記少量のポリヌクレオチドおよび多量のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＲＮＡおよびｔＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記少量のポリヌクレオチドおよび多量のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ分子である、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーは、リボース含有オリゴマー構造を有さない、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、ここで、前記酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーである、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーは、改変されたヌクレオチドオリゴマーまたはヌクレオチド間アナログオリゴマーである、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、ここで、前記改変されたヌクレオチドオリゴマーは、２’−改変ヌクレオチドオリゴマー、および３’−改変ヌクレオチドオリゴマーからなる群から選択される、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記２’−改変ヌクレオチドオリゴマー、および３’−改変ヌクレオチドオリゴマーが、２’−Ｏ−アルキル改変ヌクレオチドオリゴマー、および３’−アルキル改変ヌクレオチドオリゴマーからなる群から選択される、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記２’−Ｏ−アルキル改変ヌクレオチドオリゴマーが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドオリゴマーである、方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の方法であって、ここで、前記改変ヌクレオチドオリゴマーまたはヌクレオチド間アナログオリゴマーが、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート（ＮＰ）オリゴマー、副溝結合物連結オリゴヌクレオチド（ＭＧＢ−連結オリゴヌクレオチド）、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴマー、Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネートオリゴマー、ホスホロアミデート、β−ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、およびα−ホスホジエステルオリゴヌクレオチドから選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネートオリゴマーが、メチルホスホネート（ＭＰ）オリゴマーである、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記酵素的に伸長不可能な第１のヌクレオベースオリゴマーがキメラである、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、１つより多い、多量のポリヌクレオチドを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ポリヌクレオチドのサンプルが、ＲＮＡおよびＤＮＡからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ポリヌクレオチドのサンプルがＲＮＡを含み、そして、ポリメラーゼの伸長が、逆転写により、第１鎖ｃＤＮＡを生じる、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記方法がさらに、第２鎖ｃＤＮＡ合成を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、第１鎖ｃＤＮＡ合成の間に、少なくとも１つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーに曝露される、方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、第２鎖ｃＤＮＡ合成の間に、少なくとも１つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーに曝露される、方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、第１鎖ｃＤＮＡ合成および第２鎖ｃＤＮＡ合成の両方の間に、少なくとも１つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーに曝露される、方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記方法がさらに、増幅工程を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応による、方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記増幅工程が、インビトロ転写による、方法。
【請求項２５】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記ＲＮＡがｍＲＮＡまたはｃＲＮＡまたは総細胞ＲＮＡである、方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ポリヌクレオチドのサンプルが、ＤＮＡを含み、そして、ポリメラーゼ伸長が、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる、方法。
【請求項２７】
さらに、前記増幅されたポリヌクレオチドを標識する工程を包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、前記標識が、増幅と同時である、方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、前記標識が、増幅後である、方法。
【請求項３０】
複数のポリヌクレオチドであって、ここで、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドの相対的な存在量が、非標的ポリヌクレオチドに対して減少され、そして、ここで、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドが、図１４に示される遺伝子のリストから選択される、ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項３０に記載の複数のポリヌクレオチドであって、ここで、前記少なくとも１つの非標的ポリヌクレオチドの相対的な存在量が、標的ポリヌクレオチドに対して増加している、ポリヌクレオチド。
【請求項３２】
請求項３０に記載の複数のポリヌクレオチドであって、ここで、前記複数のポリヌクレオチドがＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である、ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項３２に記載の複数のポリヌクレオチドであって、ここで、前記ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子である、ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項３２に記載の複数のポリヌクレオチドであって、ここで、前記ＲＮＡ分子がｃＲＮＡ分子である、ポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項３０に記載の複数のポリヌクレオチドであって、ここで、前記ポリヌクレオチドが、標識されている、ポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項３３に記載の複数のポリヌクレオチドであって、ここで、前記ｃＤＮＡ分子がベクター中にクローニングされている、ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
ポリヌクレオチドのサンプル中の少なくとも１つの少量のポリヌクレオチドを富化するためのキットであって、ここで、該サンプルが、少なくとも１つの多量のポリヌクレオチド、および少なくとも１つの少量のポリヌクレオチドを含み、ここで、該キットは、該少なくとも１つの多量の標的ポリヌクレオチドに対して相補的なヌクレオベース配列を有する少なくとも１つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーを含む、キット。
【請求項３８】
請求項３７に記載のキットであって、ここで、前記サンプルは、少なくとも５つの多量のポリヌクレオチドを含み、そして、該キットは、少なくとも５つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーを含み、ここで、該酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーの各々は、該５つの多量の標的ポリヌクレオチドの１つに対して相補的なヌクレオベース配列を有する、キット。
【請求項３９】
さらに、少なくとも１つの少量のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーを含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
請求項３９に記載のキットであって、ここで、前記プライマーがランダムプライマーである、キット。
【請求項４１】
請求項３７に記載のキットであって、ここで、前記多量の標的ポリヌクレオチドが図１４に記載される遺伝子から選択される、キット。
【請求項４２】
請求項３７に記載のキットであって、ここで、前記酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー、２’−Ｏ−アルキル改変ヌクレオチドオリゴマー、３’−アルキル改変ヌクレオチドオリゴマー、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート（ＮＰ）オリゴマー、副溝結合物連結オリゴヌクレオチド（ＭＧＢ−連結オリゴヌクレオチド）、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴマー、Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネートオリゴマー、ホスホロアミデート、β−ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、およびα−ホスホジエステルオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、キット。
【請求項４３】
請求項３７に記載のキットであって、ここで、該キットは、さらに、ＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴｄＴポリメラーゼプライマー、さらにＲＮＡポリメラーゼの開始のためのヌクレオチド配列を含むオリゴｄＴポリメラーゼプライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、リボヌクレオチド三リン酸、ｃＤＮＡ第２鎖合成に適切なＤＮＡポリメラーゼプライマー、およびポリヌクレオチド標識のための手段からなる群から選択される１つ以上の成分を含む、キット。
【請求項４４】
少なくとも１つの多量のポリヌクレオチドを有するサンプル中の遺伝子発現を分析するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを、該多量のポリヌクレオチド内の配列に相補的なヌクレオベース配列を有する少なくとも１つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーに対して、塩基対形成が生じる条件下で、曝露する工程；
（ｂ）該サンプルを、ポリメラーゼ伸長が生じる条件に供して、富化されたポリヌクレオチドサンプルを生成する工程；
（ｃ）該富化されたポリヌクレオチドサンプル中の該ポリヌクレオチドを標識する工程；
（ｄ）該標識されたポリヌクレオチドサンプルを、ハイブリダイゼーション手段を用いてプローブと接触させて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する、工程；および
（ｅ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程であって、ここで、該ハイブリダイゼーション複合体の検出は、遺伝子発現の指標である、工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
少なくとも１つの少量のポリヌクレオチドについて富化されたｃＤＮＡライブラリーを合成するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ｍＲＮＡのサンプルを提供する工程であって、ここで、該ｍＲＮＡは、少なくとも１つの多量の転写物、および少なくとも１つの少量の転写物を有する、工程；
（ｂ）該サンプルを、該多量のｍＲＮＡ内の配列に相補的なヌクレオベース配列を有する少なくとも１つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーに対して、塩基対形成が生じる条件下で、曝露する工程；
（ｃ）該サンプルを、逆転写および第１鎖ｃＤＮＡ合成のための条件に供する、工程；
（ｄ）該サンプルを、第２鎖ｃＤＮＡ合成の条件に供して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を形成する、工程；ならびに
（ｅ）該二本鎖ｃＤＮＡ分子を、ベクターにクローニングして、富化されたｃＤＮＡライブラリーを生成する、工程；
を、包含する、方法。
【請求項４６】
１つ以上の少量のポリヌクレオチドについて、サンプルを富化する方法であって、該方法は、以下：
少なくとも１つの多量のポリヌクレオチドの増幅をブロックしながら、ポリメラーゼ伸長を用いて、少量のポリヌクレオチドを増幅する工程、
を、包含し、
ここで、該多量のポリヌクレオチドの増幅のブロックは、増幅前に、該多量のポリヌクレオチドを、塩基対形成が生じる条件下において、酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーと接触させることを包含し、ここで、該酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーは、該多量のポリヌクレオチド内の配列に対して相補的な配列を含み、
ここで、該多量のポリヌクレオチドと少量のポリヌクレオチドとの比は、少なくとも１０：１である、方法。
【請求項４７】
請求項４５に記載の方法であって、ここで、前記サンプルは、少なくとも１０種の少量のポリヌクレオチドについて富化される、方法。
【請求項４８】
請求項４５に記載の方法であって、ここで、前記サンプルは、少なくとも１００種の少量のポリヌクレオチドについて富化される、方法。
【請求項４９】
請求項４５に記載の方法であって、ここで、少なくとも２種の多量のポリペプチドの増幅がブロックされる、方法。
【請求項５０】
請求項４５に記載の方法であって、ここで、少なくとも１０種の多量のポリペプチドの増幅がブロックされる、方法。
【請求項５１】
請求項４５に記載の方法であって、ここで、少なくとも５０種の多量のポリペプチドの増幅がブロックされる、方法。
【請求項５２】
請求項４５に記載の方法であって、ここで、前記サンプルは、少なくとも１０種の少量のポリヌクレオチドについて富化され、そして、少なくとも２種の多量のポリペプチドの増幅がブロックされる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、試料における少量のポリヌクレオチドを選択的に濃縮するための組成物および方法に関連する。これらの方法は、酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーを使用して、多量種に対するポリメラーゼ活性を選択的に阻害し、それによって試料におけるより少量の種の濃縮を引き起こす。生じた濃縮ポリペプチドのプールは、遺伝子発現の分析およびｃＤＮＡライブラリーの作製を含む、様々な使用法を見出す。
【背景技術】
【０００２】
序文
遺伝子発現の全体的な分析は、いくつかの理由のために手強い挑戦である。遺伝子発現を分析する１つの障害は、単一の細胞または組織における異なる遺伝子間の、広い範囲の発現レベルである。単一の細胞型または組織において、２つの遺伝子は発現レベルにおいて４次を超える大きさで異なり得ることが公知である。対照的に、ほとんどのマイクロアレイに基づく遺伝子発現アッセイは、多くても２次または３次の大きさの動的な範囲しか有さない。
【０００３】
細胞に存在するｍＲＮＡのプールにおいて、不釣合いに少数の遺伝子が、発現された細胞ｍＲＮＡの大部分を占める。高度に発現された遺伝子由来のこれらの転写物（すなわち、高いコピー数を有する遺伝子）は、典型的には全ての細胞型に存在する「ハウスキーピング」遺伝子である。代謝経路遺伝子を大部分の他の遺伝子の大部分は、典型的には中程度から低レベルで発現される（すなわち、低コピー数を有する）。
【０００４】
対照的に、まだ他の遺伝子は、非常に低いレベルで発現される傾向がある（すなわち、非常に低いコピー数を有する）。このカテゴリーの遺伝子は、例えばキナーゼを含むシグナル伝達構成成分、転写因子、および細胞周期調節タンパク質をコードする遺伝子を含む。これらの非常に低いコピー数の転写物は、多くの場合検出および／または単離するのが困難である。皮肉なことに、細胞生理学およびヒト疾患の分子的基礎の研究において最も多くの場合関心のあるのは、これらの非常に低いコピー数の転写物である。これらの低コピー数遺伝子のいくつかは、疾患を治療する治療薬の開発において有望であることが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、低コピー数遺伝子（すなわち、低コピー数の遺伝子転写物またはｃＤＮＡ分子）を同定、分析および／または単離するための組成物および方法を開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の概要
本発明は、試料における少量のポリヌクレオチドを選択的に濃縮するための組成物および方法に関連する。これらの方法は、酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーを使用して、多量種に対するポリメラーゼ活性を選択的に阻害し、それによって試料におけるより少量の種の濃縮を引き起こす。少量種の濃縮のためのこれらの方法は、増幅工程を必要としない；しかし、いくつかの実施形態において、増幅工程を任意で使用し得る。生じる濃縮ポリヌクレオチドのプールは、遺伝子発現の分析およびｃＤＮＡライブラリーの作製を含む、様々な使用法を見出す。
【０００７】
その最も広い局面において、本発明は、少なくとも１つの少量のポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの多量のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの試料において、少量のポリヌクレオチドを濃縮する方法を提供し、ここでその方法は、一般的に試料を、多量のポリヌクレオチド中の配列に相補的なヌクレオベース配列を有する少なくとも１つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーに、塩基対形成が起こるような条件下に曝露する工程、次いで試料をポリメラーゼ伸長のための条件に供する工程を含む。
【０００８】
広く様々な酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーが、本発明の方法で有用であり、そして本発明は使用されるオリゴマーの型に制限されることを意図しない。１つの局面において、酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーは、リボースを含むオリゴマー構造を有さない。そのような構造の例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーである。
【０００９】
他の実施形態において、酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーとしは、改変ヌクレオチドオリゴマーまたは改変ヌクレオチド間アナログオリゴマーである。そのような構造の例は、２’改変ヌクレオチドオリゴマーおよび３’改変ヌクレオチドオリゴマーが挙げられる。より具体的には、これらの構造としては、２’−Ｏ−アルキル改変ヌクレオチドオリゴマーおよび３’−アルキル改変ヌクレオチドオリゴマーが挙げられ得る。さらにより具体的には、２’−Ｏ−アルキル改変ヌクレオチドオリゴマーは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドオリゴマーであり得る。
【００１０】
他の実施形態において、改変ヌクレオチドオリゴマーまたは改変ヌクレオチド間アナログオリゴマーは、ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミダイト（ＮＰ）オリゴマー、副溝結合物連結オリゴヌクレオチド（ＭＧＢ−連結オリゴヌクレオチド）、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴマー、Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネートオリゴマー、ホスホロアミダイト、β−ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、およびα−ホスホジエステルオリゴヌクレオチドであり得る。より具体的には、Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネートオリゴマーは、メチルホスホネート（ＭＰ）オリゴマーであり得る。
【００１１】
さらに他の実施形態において、本発明の方法において使用される酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーは、キメラである。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの少量のポリヌクレオチドおよび１種より多く多量のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの試料において、少量のポリヌクレオチドを濃縮する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、少なくとも１つの少量のポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの多量のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの試料において、少量のポリヌクレオチドを濃縮する方法を提供し、ここでそのポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかである。ポリヌクレオチドがＲＮＡであるいくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長は、逆転写により、そして第１鎖ｃＤＮＡを産生する。他の実施形態において、これらの方法はさらに第２鎖ｃＤＮＡの合成を伴う。いくつかの実施形態において、第１鎖ｃＤＮＡ合成の間に、試料を少なくとも１つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーに曝露する。あるいは、第２鎖ｃＤＮＡ合成の間に、試料を少なくとも１つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーに曝露する。これらの方法のさらに他の実施形態において、第１鎖ｃＤＮＡ合成および第２鎖ｃＤＮＡ合成両方の間に、試料を少なくとも１つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーに曝露する。
【００１４】
他の実施形態において、二本鎖ｃＤＮＡを産生する本発明の方法はさらに、任意で増幅工程を含み得る。いくつかの実施形態において、その増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応による。他の実施形態において、その増幅工程はインビトロ転写による。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの少量のポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの多量のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの試料において、少量のポリヌクレオチドを濃縮するための方法を提供し、ここでそのポリヌクレオチドはＲＮＡであり、そしてそのＲＮＡは、ｍＲＮＡであっても、ｃＲＮＡであっても、または全細胞ＲＮＡであってもよい。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの少量のポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの多量のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの試料において、少量のポリヌクレオチドを濃縮するための方法を提供し、そのポリヌクレオチドはＤＮＡを含み、そしてポリメラーゼ伸長はポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる。
【００１７】
別の実施形態において、少なくとも１つの少量のポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの多量のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの試料において、少量のポリヌクレオチドを濃縮するための本発明の方法はさらに、当該増幅ポリヌクレオチドの標識工程を含む。いくつかの実施形態において、その標識化は増幅と同時に生ずる。いくつかの実施形態において、その標識化は増幅に続く。
【００１８】
他の局面において、本発明は、少量のポリヌクレオチドが濃縮されたポリヌクレオチドのプールを提供する。１つの実施形態において、本発明は、複数のポリヌクレオチドを提供し、ここで少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドの相対的な量が、非標的ポリヌクレオチドと比較して減少されており、そしてここで少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドは、図１４に列挙した遺伝子のリストから選択される。関連する実施形態において、本発明は、複数のポリヌクレオチドを提供し、ここで少なくとも１つの非標的ポリヌクレオチドの相対的な量が、標的ポリヌクレオチドと比較して増加されている。１つの実施形態において、複数のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のいずれかである。より具体的には、ＤＮＡ分子はｃＤＮＡ分子であり得、そしてＲＮＡ分子はｃＲＮＡ分子であり得る。他の実施形態において、複数のポリヌクレオチドが標識される。さらに他の実施形態において、本発明によって提供される複数のポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングされる。
【００１９】
他の実施形態において、本発明は、本発明によって提供される方法の使用を促進するキットを提供する。１つの実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドの試料において少なくとも１つの少量のポリヌクレオチドを濃縮するためのキットを提供し、ここでその試料は、少なくとも１つの多量のポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの少量のポリヌクレオチドを含み、ここでそのキットは、少なくとも１つの多量の標的ポリヌクレオチドに相補的なヌクレオベース配列を有する、少なくとも１つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーを含む。これらキットのいくつかの実施形態において、伸長不可能なオリゴマーは、図１４において列挙された遺伝子または複数の遺伝子を標的とする。
【００２０】
他の実施形態において、そのキットにおいて提供される伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー、２’−Ｏ−アルキル改変ヌクレオチドオリゴマー、３’−アルキル改変ヌクレオチドオリゴマー、ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミダイト（ＮＰ）オリゴマー、副溝結合剤連結オリゴヌクレオチド（ＭＧＢ−連結オリゴヌクレオチド）、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴマー、Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネートオリゴマー、ホスホロアミダイト、β−ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、およびα−ホスホジエステルオリゴヌクレオチドから選択される。
【００２１】
さらに他の実施形態において、そのキットは任意で、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴ−ｄＴポリメラーゼプライマー、さらにＲＮＡポリメラーゼ開始のためのヌクレオチド配列を含むオリゴ−ｄＴポリメラーゼプライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、リボヌクレオチド三リン酸、ｃＤＮＡ第２鎖合成に適当なＤＮＡポリメラーゼプライマー、およびポリヌクレオチド標識手段のような、様々な構成成分を含み得る。
【００２２】
他の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの多量のポリヌクレオチドを有する試料において、遺伝子発現を分析する方法を提供し、ここでその方法は一般的に、（ａ）試料を、多量のポリヌクレオチド中の配列に相補的なヌクレオベース配列を有する少なくとも１つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーに、塩基対形成が起こる条件下で曝露する工程、（ｂ）試料をポリメラーゼ伸長の条件において濃縮ポリヌクレオチド試料を産生する工程、（ｃ）濃縮ポリヌクレオチド試料中のポリヌクレオチドを標識する工程、（ｄ）ハイブリダイゼーションの手段を用いて標識化ポリヌクレオチド試料をプローブと接触させ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程、および（ｅ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含み、ここでそのハイブリダイゼーション複合体の検出は、遺伝子発現を示す。
【００２３】
他の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの少量のポリヌクレオチドが濃縮されたｃＤＮＡライブラリーを合成する方法を提供し、それは一般的に（ａ）ｍＲＮＡの試料を提供する工程であって、ここでそのｍＲＮＡは少なくとも１つの多量の転写物および少なくとも１つの少量の転写物を有する、工程、（ｂ）試料を、多量のｍＲＮＡ中の配列に相補的なヌクレオベース配列を有する少なくとも１つの酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーに、塩基対形成が起こる条件下で曝露する工程、（ｃ）試料を、逆転写および第１鎖ｃＤＮＡ合成のための条件に供する工程、（ｄ）試料を、第２鎖ｃＤＮＡ合成のための条件に供して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を形成する工程、および（ｅ）二本鎖ｃＤＮＡ分子をベクターにクローニングして、濃縮ｃＤＮＡライブラリーを産生する工程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の詳細な説明
定義
他に定義されなければ、本明細書中で使用される技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。当業者は、本明細書中で記載されたものと同様または等価な多くの方法および材料を認識し、それらを本発明の実施において使用し得る。実際、本発明は、記載された方法および材料に決して制限されない。本発明の目的のために、以下の用語を下記で定義する。
【００２５】
「ヌクレオベース」は、相補的なヌクレオベースまたはヌクレオベースアナログ（すなわちヌクレオベースの誘導体）と対を形成してワトソン−クリック水素結合を形成し得る、あらゆる窒素含有複素環式部分を意味する。「複素環式」は、１つまたはそれ以上の環原子がヘテロ原子（例えば窒素、酸素、または硫黄である（すなわち炭素でない））環系を有する分子を指す。多数のヌクレオベース、ヌクレオベースアナログ、およびヌクレオベース誘導体が公知である。ヌクレオベースの例としては、プリンおよびピリミジン、および改変形式（例えば７−デアザプリン）が挙げられる。典型的なヌクレオベースは、天然に存在するヌクレオベース、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、および天然に存在するヌクレオベースのアナログ（Ｓｅｅｌａ、米国特許第５，４４６，１３９号）（例えば７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１７：１２０１−１２０９［１９９５］）、ニトロインドール、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン（Ｓｅｅｌａ、米国特許第６，１４７，１９９号）、７−デアザグアニン（Ｓｅｅｌａ、米国特許第５，９９０，３０３号）、２−アザプリン（Ｓｅｅｌａ、ＷＯ０１／１６１４９）、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、Ｏ６−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｏ４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチルインドール、ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン、「ＰＰＧ」（Ｍｅｙｅｒ、米国特許第６，１４３，８７７号および同第６，１２７，１２１号；Ｇａｌｌ、ＷＯ０１／３８５８４）、およびエテノアデニン（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３８５−３９４頁、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦｌにおけるＦａｓｍａｎ（１９８９）））である。
【００２６】
本明細書中で使用される「ヌクレオベースオリゴマー」または「オリゴマー」という用語は、ヌクレオベースの多量体構成を指す。オリゴマーは、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよく、そして遺伝子配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖に相補的であり得る。ヌクレオベースオリゴマーは、標的ポリヌクレオチドの相補的部分とハイブリダイズして二本鎖を形成し得、それはホモ二本鎖であってもまたはヘテロ二本鎖であってもよい。ヌクレオベースオリゴマーは短く、典型的には１００ヌクレオベースより少ない長さであるが、必ずしもそうではない。ヌクレオベース間の結合は、ヌクレオチド間型ホスホジエステル結合、またはあらゆる他の型の結合であり得る。ヌクレオベースオリゴマーは、酵素的に伸長可能であっても、または酵素的に伸長不可能であってもよい。
【００２７】
「ヌクレオシド」は、天然のβアノマー配置またはαアノマー配置において、リボース、アラビノース、キシロース、およびピラノースのような糖のＣ−１’炭素に結合したヌクレオベースからなる化合物を指す。その糖は、置換であっても未置換であってもよい。置換リボース糖としては、炭素原子のうちの１つまたはそれ以上（例えば２’炭素原子）が、１つまたはそれ以上の同じまたは異なるＣｌ、Ｆ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲ２またはハロゲン基で置換されたリボースが挙げられるがこれらに限定されず、ここで各Ｒは独立にＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ５−Ｃ１４アリールである。リボースの例としては、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、および２’−アルキルリボース、例えば２’−Ｏ−メチル，４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド（Ａｓｓｅｌｉｎｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４０６７−７４［１９９１］）、２’−４’結合および３’−４’結合および他の「ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）」または「ＬＮＡ」、二環式糖改変形（ＷＯ９８／２２４８９；ＷＯ９８／３９３５２；ＷＯ９９／１４２２６）が挙げられる。ポリヌクレオチド中の例示的なＬＮＡ糖アナログとしては、以下の構造が挙げられる：
【００２８】
【化１】
2005536193.tif 000002
【００２９】
【化２】
2005536193.tif 000003
ここでＢはあらゆるヌクレオベースである。
【００３０】
糖は、２’−または３’−位置において、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモのような改変を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、天然のＤ配置アイソマー（Ｄ型）、およびＬ配置アイソマー（Ｌ型）を含む（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ、米国特許第６，２５１，６６６号；Ｃｈｕ、米国特許第５，７５３，７８９号；Ｓｈｕｄｏ、ＥＰ０５４０７４２；Ｇａｒｂｅｓｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：４１５９−４１６５（１９９３）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３５（１９９０）；Ｕｒａｔａ（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９−７０）。ヌクレオベースがプリン、例えばＡまたはＧである場合、リボース糖は、ヌクレオベースのＮ９−位置に結合する。ヌクレオベースがピリミジン、例えばＣ、ＴまたはＵである場合、五炭糖はヌクレオベースのＮ１−位置に結合する（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ（１９９２）ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）。
【００３１】
「ヌクレオチド」は、モノマー単位として、またはポリヌクレオチド中で、ヌクレオシドのリン酸エステルを指す。「ヌクレオチド５’−三リン酸」は、５’位置に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドを指し、そしてリボース糖の構造的特徴を特に指摘するために、「ＮＴＰ」または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」と呼ばれることもある。三リン酸エステル基は、様々な酸素の硫黄置換、例えばα−チオ−ヌクレオチド５’−三リン酸を含み得る。ポリヌクレオチドおよび核酸化学の概説のために、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．およびＢｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、ＶＣＨ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４を参照のこと。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、そしてヌクレオチド間ホスホジエステル結合、例えば３’−５’逆方向結合および２’−５’逆方向結合、例えば３’−３’分岐構造および５’−５’分岐構造またはヌクレオチド間アナログによって結合した、２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含むヌクレオチドモノマーの一本鎖ポリマーおよび二本鎖ポリマーを意味する。「ポリヌクレオチド配列」は、ポリマーに沿ったヌクレオチドモノマーの配列を指す。
【００３３】
「ＲＮＡ」という用語は広く使用され、そして例えばおよび制限なしに、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡを含む。
【００３４】
３’−５’ホスホジエステル結合によって形成されたポリヌクレオチドは、５’末端および３’末端を有すると言われる。なぜなら、ポリヌクレオチドを作るように反応するモノヌクレオチドは、１つのモノヌクレオチド五炭糖環の５’リン酸が、その隣りの３’酸素（すなわち水酸基）に１つの方向においてホスホジエステル結合によって結合する方式で結合しているからである。従って、ポリヌクレオチド分子の５’末端は、ヌクレオチドの五炭糖環の５’位に遊離のリン酸基または水酸基を有し、一方ポリヌクレオチド分子の３’末端は、五炭糖環の３’位に遊離のリン酸または水酸基を有する。ポリヌクレオチド分子中で、別の位置または配列に対して５’の方向にある位置または配列は、「上流」に位置すると言われ、一方別の位置に対して３’側にある位置は、「下流」であると言われる。この用語は、ポリメラーゼが、鋳型鎖にそって５’から３’への様式で進行してポリヌクレオチド鎖を伸長するという事実を反映する。
【００３５】
ポリヌクレオチドは、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋等のような、会合対イオンを有する。ポリヌクレオチドは、全体がデオキシリボヌクレオチドから構成されても、全体がリボヌクレオチドから構成されても、またはそのキメラ混合物から構成されてもよい。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド間、ヌクレオベース、および糖アナログから構成され得る。他に示されなければ、ポリヌクレオチド配列が表示される場合はいつでも、他に示されなければ、ヌクレオチドは左から右へ５’から３’の方向であり、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」という用語はあらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形式を含むので、「ポリヌクレオチド」は、いかなる特定の長さのヌクレオチド配列にも制限されない。大きさが約５モノマー単位〜約４０モノマー単位の範囲であるポリヌクレオチドは、典型的には当該分野においてオリゴヌクレオチドと呼ばれる。長さが数千モノマーヌクレオチド単位以上であるポリヌクレオチドは、典型的には核酸と呼ばれる。ポリヌクレオチドは、直鎖状分子、分岐型直鎖状分子、または環状分子であり得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「相補的」または「相補性」という用語は、ワトソン／クリック型塩基対形成の法則およびフーグスティーン型塩基対形成の法則によって関連しているヌクレオベースの逆平行の鎖（すなわちヌクレオベースの配列）を指して使用される。例えば、配列５’−ＡＧＴＴＣ−３’は、配列５’−ＧＡＡＣＴ−３’に対して相補的である。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「アンチセンス」という用語は、別のヌクレオベースオリゴマーに対して逆平行でありかつ相補的な、あらゆるポリヌクレオチドまたは他のヌクレオベースオリゴマーを指す。「相補的」という用語は、「アンチセンス」と交換可能に使用されることもある。本発明は、あらゆる方法によって産生されるアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはあらゆる他のアンチセンスヌクレオベースオリゴマーを含む。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「Ｔｍ」という用語は、「融解温度」を指して使用される。融解温度は、ホモ二本鎖またはヘテロ二本鎖の、二本鎖ポリヌクレオチド分子またはヌクレオベースオリゴマーの集団が、半分解離して一本鎖になる温度である。２つの分子間のＴｍを計算する方程式は、塩基配列および構造的特徴および配列特徴およびオリゴマー結合の性質を含む他の因子を考慮に入れる。Ｔｍを決定する方法は、当該分野で公知である。
【００４０】
「ヌクレオチド間アナログ」は、ポリヌクレオチドのリン酸エステルアナログまたは非リン酸アナログを意味する。リン酸エステルアナログは：（ｉ）Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネート、例えばメチルホスホネート；（ｉｉ）ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）；（ｉｉｉ）Ｃ１−Ｃ６アルキル−ホスホトリエステル；（ｉｖ）ホスホロチオエート；および（ｖ）ホスホロジチオエートを含む。
【００４１】
非リン酸ヌクレオチド間アナログは、通常ＰＮＡと呼ばれる、ペプチド核酸のファミリーを含み、ここでＤＮＡまたはＲＮＡの糖／リン酸バックボーンは、非環式、アキラル、および中性ポリアミド結合によって置換されている（米国特許第５，５３９，０８２号；ＷＯ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００［１９９１］；Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６−５６８［１９９３］）。ヌクレオベースがアミド結合によって結合に連結した２−アミノエチルグリシンポリアミド結合は、ＰＮＡの１つの実施態様としてよく研究され、そして例外的なハイブリダイゼーション特異性および親和性を有することが示された。この分子の部分的な構造を、カルボキシル末端アミドと共に下記に示し、そしてここでＢはあらゆるヌクレオベースである：
【００４２】
【化３】
2005536193.tif 000004
その名前にもかかわらず、ＰＮＡは真のペプチド、核酸、または酸性ではない。ＰＮＡは、天然に存在しない分子であり、そしてあらゆるポリメラーゼ酵素、ペプチダーゼ、またはヌクレアーゼの基質であることは知られていない。ＰＮＡはポリアミドであるので、それはＣ−末端（カルボキシル末端）およびＮ−末端（アミノ末端）を有する。標的配列に対する逆平行結合（すなわちハイブリダイゼーション）に適当なＰＮＡオリゴマーを設計する目的のために、ＰＮＡオリゴマーのヌクレオベース配列のＮ−末端は、等価なＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシル末端と等価である。本明細書中で使用される場合、「ＰＮＡ」という用語はまた、当該分野で公知の関連する構造、特に他のペプチドに基づく核酸模倣物を含むことが意図される（例えばＷＯ９６／０４０００を参照のこと）。
【００４３】
ＰＮＡの合成方法は、当該分野で公知である（例えば、ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１）：５−２３（１９９６）；ＷＯ９２／２０７０２；ＷＯ９２／２０７０３および米国特許第５，５３９，０８２号を参照のこと）。ＰＮＡオリゴマーの化学的組み立ては、固相ペプチド合成と同様であり、ここで組み立ての各サイクルにおいて、オリゴマーは成長するオリゴマーに加わる次のモノマー単位と縮合する反応性アルキルアミノ末端を有する。標準的なペプチド化学を利用するので、天然および非天然アミノ酸をＰＮＡオリゴマーに組み込み得、そしてｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ固相合成を用いて合成し得る。ＰＮＡオリゴマーの支持体結合自動化化学合成の化学的試薬および装置は、市販で入手可能であり、そして注文のヌクレオベース配列を有するＰＮＡオリゴマーが、商業主（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から容易に注文される。
【００４４】
本明細書中で使用される「置換された」は、１つまたはそれ以上の水素原子が、１つまたはそれ以上の非水素原子、官能基または部分で置換された分子を指す。例えば、未置換窒素は−ＮＨ２であり、一方置換窒素は−ＮＨＣＨ３である。典型的な置換基は、ハロ、例えばフッ素および塩素、Ｃ１−Ｃ８アルキル、硫酸、スルホン酸、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、ニトロ、アルコキシ（−ＯＲ、ここでＲはＣ１−Ｃ１２アルキルである）、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族、ヘテロ環、水溶性基、および結合部分を含むがこれに限らない。
【００４５】
「アルキル」は、親アルカン、アルケン、またはアルキンの単一の炭素原子から１つの水素原子を除去することによって得られた、飽和または不飽和、直鎖、分岐、環状または置換炭化水素ラジカルを意味する。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、シアノエチル、イソプロピル、ブチル等を含むがこれに限らない、１−１２の飽和および／または不飽和炭素からなる。
【００４６】
「アルキルジイル」は、親アルカン、アルケン、またはアルキンの同じまたは２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去することによって得られた、１−１２炭素原子および２つの一価のラジカル中心を有する、飽和または不飽和、分岐、直鎖、環状、または置換炭化水素ラジカルを意味する。典型的なアルキルジイルラジカルは、１，２−エチルジイル（−ＣＨ２ＣＨ２−）、１，３−プロピルジイル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１，４−ブチルジイル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）等を含むがこれに限らない。「アルコキシジイル」は、酸素から水素を除去することによって、および炭素原子から水素原子を除去することによって得られた２番目のラジカルによって得られた、２つの一価のラジカル中心を有するアルコキシル基を意味する。典型的なアルコキシジイルラジカルは、メトキシジイル（−ＯＣＨ２−）および１，２−エトキシジイルまたはエチレンオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）を含むがこれに限らない。「アルキルアミノジイル」は、窒素から水素原子を除去することによって、そして炭素原子から水素原子を除去することによって得られた２番目のラジカルによって得られた、２つの一価のラジカル中心を有するアルキルアミノ基を意味する。典型的なアルキルアミノジイルラジカルは、−ＮＨＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−および−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を含むがこれに限らない。「アルキルアミドジイル」は、窒素から水素原子を除去することによって、そして炭素原子から水素原子を除去することによって得られた２番目のラジカルによって得られた、２つの一価のラジカル中心を有するアルキルアミド基を意味する。典型的なアルキルアミドジイルラジカルは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、および−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を含むがこれに限らない。
【００４７】
「アリール」は、親芳香族環系の単一の炭素原子から１つの水素原子を除去することによって得られる、５−１４炭素原子の一価芳香族炭化水素ラジカルを意味する。典型的なアリール基は、置換アリール基を含んで、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル等から得られたラジカルを含むがこれに限らない。
【００４８】
「アリールジイル」は、置換アリールジイル基を含んで、親アリール化合物の２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去することによって得られる、結合した共鳴電子系および少なくとも２つの一価のラジカル中心を有する、５−１４炭素原子の不飽和環状または多環式炭化水素ラジカルを意味する。
【００４９】
「置換アルキル」、「置換アルキルジイル」、「置換アリール」および「置換アリールジイル」はそれぞれ、１つまたはそれ以上の水素原子が、それぞれ独立に別の置換基で置換されたアルキル、アルキルジイル、アリールおよびアリールジイルを意味する。典型的な置換基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ、ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、−＋ＮＲ３、−Ｎ＝ＮＲ２、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、−Ｎ２＋、−Ｎ３、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＣＯ２−、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−Ｃ（ＮＲ）ＮＲ２を含むがこれに限らず、ここで各Ｒは独立にーＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ５−Ｃ１４アリール、ヘテロ環、または結合基である。置換基はまた、二価、ジアゾ（−Ｎ＝Ｎ−）のような架橋官能基、エステル、エーテル、ケトン、リン酸、アルキルジイル、およびアリールジイル基を含む。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、ヌクレオベースオリゴマーに適用される「酵素的に伸長可能」は、ポリメラーゼ酵素による、ポリヌクレオチド鋳型に相補的なヌクレオチドの組み込み（すなわち伸長）の酵素基質として作用し得るヌクレオベースオリゴマーを指す。酵素的に伸長可能なヌクレオベースオリゴマーは、ポリメラーゼ「プライマー」として作用し、そしてプライマーの伸長を支持し得る。酵素的に伸長可能なヌクレオベースオリゴマーの例は、２−デオキシリボースポリヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボースポリヌクレオチド（ＲＮＡ）を含むオリゴマーを含み、ここでそのオリゴマーは、フリーのリボース糖３’水酸基を有する。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、ヌクレオベースオリゴマーに適用される「酵素的に伸長不可能」は、ポリメラーゼ酵素による、ポリヌクレオチド鋳型に相補的なヌクレオチドの組み込み（すなわち伸長）の酵素基質として作用できないヌクレオベースオリゴマーを指す。酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーは、ポリメラーゼ「プライマー」として作用できず、そしてプライマーの伸長を開始できない。酵素的に伸長不可能なヌクレオベースオリゴマー構造の多くの例が、当該分野で公知である。これらの構造は、例えば：（ｉ）３’末端ヌクレオチドにおけるリボース糖の３’位置に水酸基を欠く、（ｉｉ）３’末端ヌクレオチドまたはその付近において糖、ヌクレオベース、またはヌクレオチド間結合にポリメラーゼ活性を阻害する修飾、例えば２’−Ｏ−メチルを有するあらゆるポリヌクレオチド、または（ｉｉｉ）そのオリゴマー構造においてリボース糖ホスホジエステルバックボーンを利用しないヌクレオベースオリゴマーを含む。後者の例は、ＰＮＡと呼ばれるペプチド核酸を含むがこれに限らない。本明細書中で使用される場合、「伸長不可能なオリゴマ−」および「ブロッキングオリゴマー」という用語は、交換可能に使用される。
【００５２】
伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーを、「ターミネーターヌクレオチド」を用いることによって形成し得る。ターミネーターヌクレオチドは、ポリメラーゼ酵素の作用によってポリヌクレオチドの３’末端に酵素的に組み込まれ得るが、それ以上伸長できないヌクレオチドである。従って、ターミネーターヌクレオチドは、酵素的に組み込み可能であるが、酵素的に伸長可能ではない。ターミネーターヌクレオチドの例は、２，３−ジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）、２’−デオキシ，３’−フルオロヌクレオチド５’−３リン酸およびその標識化形式を含む。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「標的」、「標的ポリヌクレオチド」および「標的配列」等は、相補的なポリヌクレオチド、例えばブロッキングオリゴマー、またはｃＤＮＡ第１鎖合成プライマーとハイブリダイズする対象である特定のポリヌクレオチド配列を指す。標的配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、そのアナログ、またはその組み合せから成り得る。その標的は、一本鎖または二本鎖であり得る。プライマー伸長過程において、プライマーとハイブリダイゼーション二本鎖を形成する標的ポリヌクレオチドは、「鋳型」とも呼ばれ得る。鋳型は、相補的ポリヌクレオチドを合成するための型として作用する（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）ＣＰＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗｂｕｒｙ、ＵＫ）。本発明で使用するための標的配列を、原核生物、真核生物、植物、動物、およびウイルスを含むあらゆる生きた、またはかつて生きていた生物、および合成および／または組換え標的配列から得ることができるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「プローブ」という用語は、標的ポリヌクレオチドの配列と相補的塩基対形成によって二本鎖構造を形成し得るポリヌクレオチドを指す。続いて、そのように形成された二本鎖を検出、視覚化、測定、および／または定量する。いくつかの実施態様において、プローブは、チップアレイ形式におけるように、固体支持体に固定される。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「プライマー」という用語は、標的配列の相補的なプライマー特異的部分とハイブリダイズするよう設計され、そしてプライマー伸長を受ける、規定された配列のオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、ヌクレオチドの酵素的ポリマー化の開始点として機能し得、それをプライマー伸長と呼び得る（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）ＣＰＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗｂｕｒｙ、ＵＫ）。
【００５６】
「二本鎖」という用語は、ワトソン−クリック、フーグスティーン、またはヌクレオベースの他の配列特異的相互作用によって塩基対形成する、１つまたはそれ以上のヌクレオベースオリゴマーの分子間または分子内二本鎖部分を意味する。１つの実施態様において、二本鎖はプライマーおよび鋳型鎖から成り得る。別の実施態様において、二本鎖は伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーおよび標的鎖から成り得る。「ハイブリッド」は、塩基特異的相互作用、すなわちワトソン−クリックまたはフーグスティーン型相互作用によって相互作用する、ヌクレオベースオリゴマーの二本鎖、三本鎖、または他の塩基対形成複合体を意味する。
【００５７】
「プライマー伸長」という用語は、鋳型依存性ポリメラーゼを用いた、５’から３’の方向における、標的にアニーリングした伸長可能なプライマーの伸長過程を意味する。伸長反応は、適当な緩衝液、塩、ｐＨ、温度、およびそのアナログおよび誘導体を含むヌクレオチド３リン酸、および鋳型依存性ポリメラーゼを使用する。プライマー伸長反応のために適当な条件は、当該分野で周知である。鋳型依存性ポリメラーゼは、鋳型鎖に相補的なヌクレオチドを、アニーリングしたプライマーの３’末端から始めて組み込み、相補鎖を産生する。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドに関する「標識」という用語は、ポリヌクレオチドに結合し得、そして：（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）２番目の標識と相互作用して、２番目の標識によって提供される検出可能なシグナルを修飾する、例えばＦＲＥＴ；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション、すなわち二本鎖形成を安定化する；（ｉｖ）捕捉機能を与える、すなわち疎水性アフィニティー、抗体／抗原、イオン性複合体形成、または（ｖ）電気泳動移動度、疎水性、親水性、可溶性、またはクロマトグラフィー挙動のような物理的性質を変化させる、あらゆる部分を指す。標識化を、公知の標識、結合、結合グループ、試薬、反応条件、および分析および精製方法を採用する、多くの公知の技術のいずれか１つを用いて達成し得る。標識は、検出可能な蛍光、化学発光、または生物発光シグナルを産生または消光する、発光または吸光化合物を含む（Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、３−２８頁におけるＫｒｉｃｋａ，Ｌ．）。生物分子を標識するのに有用な蛍光リポーター色素は、フルオレセイン（米国特許第５，１８８，９３４；６，００８，３７９；６，０２０，４８１号）、ローダミン（米国特許第５，３６６，８６０；５，８４７，１６２；５，９３６，０８７；６，０５１，７１９；６，１９１，２７８号）、ベンゾフェノキサジン（米国特許第６，１４０，５００号）、ドナーおよびアクセプターのエネルギー転移色素対（米国特許第５，８６３，７２７；５，８００，９９６；５，９４５，５２６号）、およびシアニン（Ｋｕｂｉｓｔａ、ＷＯ９７／４５５３９）、および検出可能なシグナルを産生し得るあらゆる他の蛍光標識を含む。フルオレセイン色素の例は、６−カルボキシフルオレセイン；２’、４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（Ｍｅｎｃｈｅｎ、米国特許第５，１１８，９３４号）を含む。
【００５９】
別の種類の標識は、二本鎖のハイブリダイゼーションを増強、安定化、または影響をあたえるように作用する、ハイブリダイゼーション安定化部分、例えばインターカレーター、副溝結合剤、および架橋官能基である（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１５−８１頁におけるＢｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．およびＧａｉｔ，Ｍ．編、「ＤＮＡおよびＲＮＡ構造」）。さらに別の種類の標識は、特異的または非特異的捕捉、例えばビオチン、ジゴキシゲニン、および他のハプテンによって分子の分離または固定化を引き起こす（ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、３９−５４頁におけるＡｎｄｒｕｓ，Ａ．「ＰＣＲプローブおよびプライマーの５’非アイソトープ標識の化学的方法」（１９９５））。非放射活性標識方法、技術、および試薬は、Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．（１９９７）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏにおいて概説される。
【００６０】
「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」という用語は、交換可能に使用され、そして二本鎖または他の高次構造の形成を引き起こす、１つのポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドとの塩基対形成相互作用を意味する。主な相互作用は、ワトソン／クリックおよびフーグスティーン型水素結合によって、塩基特異的、すなわちＡ／ＴおよびＧ／Ｃである。
【００６１】
「固体支持体」という用語は、オリゴヌクレオチドが合成、結合、または固定化される、あらゆる固相物質を指す。固体支持体は、「樹脂」、「固相」および「支持体」のような用語を含む。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドのような有機ポリマー、およびそのコポリマーおよびグラフト（ｇｒａｆｔｓ）から成り得る。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、多孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、または逆相シリカのような無機であり得る。固体支持体の形態は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、または表面の形式であり得る。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または無孔性であり得、そして膨張または非膨張性特長を有し得る。固体支持体は、ウェル、くぼみ、または他の容器、管、造り、または位置の形式に配置し得る。複数の固体支持体を、試薬のロボットによる伝達、またはレーザー照明および共焦点または偏向集光によるスキャニングを含む検出手段によってアドレス可能な、様々な位置におけるアレイに配置し得る。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「アレイ」または「マイクロアレイ」は、固体支持体および／または容器の配置に存在するハイブリダイズ可能なエレメント（例えばポリヌクレオチド）の、前もって決定した空間的配置を意味する。あるアレイ形式は、「チップ」または「バイオチップ」と呼ばれる（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｂｏｏｋｓ、Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ［２０００］）。アレイは、低密度の数のアドレス可能な位置、例えば２から約１２、中程度の密度、例えば約１００またはそれ以上の位置、または高密度の数、例えば１０００またはそれ以上を含み得る。典型的には、アレイ形式は幾何学的に規則的な形であり、それは組み立て、取り扱い、配置、積み重ね、試薬の導入、検出および保存の促進を可能にする。アレイを、各位置の間に規則的な間隔を有する、横列および縦列の形式に配置し得る。あるいは、均等な処理またはサンプリングのために、位置をまとめる、混合する、または均一に混合し得る。アレイは、各位置がハイスループットの取り扱い、ロボットによる試薬の伝達、マスキング、またはサンプリングのために空間的にアドレス可能であるように配置された、複数のアドレス可能な位置を含み得る。アレイをまた、レーザー照明、共焦点または偏向集光、および化学的発光によるスキャニングを含むがこれに限らない、あらゆる特定の手段による検出または定量を促進するために配置し得る。その最も広い意味において、本明細書中で列挙される「アレイ」形式は、アレイ（すなわち、多数のチップのアレイ）、マイクロチップ、マイクロアレイ、単一のチップに集めたマイクロアレイ、またはあらゆる他の同様の形式を含むがこれに限らない。
【００６３】
「遺伝子」という用語は、部分からなるポリヌクレオチド配列を指し、それは天然または組換え方式で操作可能に組み合わさった場合、ある産物または機能を提供する。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡおよびゲノム形式を含む。全てではないがいくつかの実施態様において、遺伝子は、ポリペプチドの産生に必要なコード配列を含む。ポリヌクレオチドのコード領域に加えて、「遺伝子」という用語はまた、コード領域の５’および３’末端に隣接する全長ｍＲＮＡの転写ヌクレオチド配列を含み、それは様々な大きさであり、そして典型的にはコード領域の５’および３’末端両方に伸びる。コード領域の５’および３’に位置し、そしてｍＲＮＡに含まれる配列は、５’および３’非翻訳配列（それぞれ５’ＵＴおよび３’ＵＴ）と呼ばれる。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「調節エレメント」という用語は、ポリヌクレオチド配列発現のある局面を調節する遺伝的エレメントを指す。例えば、プロモーターは、操作可能に連結したコード領域の転写開始を可能にする調節エレメントである。他の調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、停止シグナル等である。いくつかの実施態様において、プロモーター配列は「内因性」であり、ここでそのプロモーターはゲノムにおいて所与の遺伝子に天然に連結しているものである。他の実施態様において、プロモーターは「外来性」または「異種由来」であり、ここで遺伝子の転写が連結したプロモーターによって調節されるように、非天然プロモーターが遺伝的操作（すなわち、クローニングおよび組換えのような分子生物学的技術）によって遺伝子と近位に置かれる。
【００６５】
核酸に関して本明細書中で使用される「操作可能な組み合せ」、「操作可能な順序」、「操作可能に連結した」、「操作可能に結合した」という用語および同様の語句は、お互いに機能的な関係におかれたポリヌクレオチドを指す。例えば、その組み合せが遺伝子の正確な転写を引き起こし、ＲＮＡ分子を産生する場合、プロモーターポリヌクレオチド配列および遺伝子オープンリーディングフレームは操作可能に連結されている。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子発現」という用語は、染色体におけるゲノムヌクレオチド配列にコードされた遺伝情報を、遺伝子の「転写」によって（すなわちＲＮＡポリメラーゼの酵素的作用によって）ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｓｎＲＮＡ）に変換する過程を指す。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、「ベクター」という用語は、ＤＮＡ部分を１つの細胞から別の細胞へ伝達し、そして適当な細胞型内で複製し得るポリヌクレオチド分子を指して使用される。「ビヒクル」という用語が、「ベクター」と交換可能に使用されることもある。ベクターは、その維持を媒介する、およびその意図された使用を可能にする部分を含む（例えば、複製に必要な配列、薬剤または抗生物質耐性を与える遺伝子、複数のクローニング部位、およびクローニングされた遺伝子の発現を可能にする、操作可能に連結されたプロモーター／エンハンサーエレメント）。ベクターは多くの場合プラスミド、バクテリオファージ、または植物または動物ウイルスから得られる。「クローニングベクター」または「シャトルベクター」または「サブクローニングベクター」は、サブクローニング工程を促進する、操作可能に連結された部分を含む（例えば、複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む複数のクローニング部位）。
【００６８】
本明細書中で使用される「発現ベクター」という用語は、特定の宿主生物において操作可能に連結されたコード配列の発現に必要な、操作可能に連結されたポリヌクレオチド配列を含むベクターを指す（例えば、細菌発現ベクター、酵母発現ベクター、または哺乳類発現ベクター）。原核生物において発現に必要なポリヌクレオチド配列は、多くの場合他の配列と共に、典型的にはプロモーター、オペレーター（任意）、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、エンハンサー、および停止およびポリアデニル化シグナル、および一般的に原核生物によって使用されるものとは異なる他の配列を利用する。
【００６９】
本明細書中で使用される「試料（サンプル）」という用語は、その最も広い意味で使用される。本明細書中で使用される「試料」という用語は、典型的には生物学的由来のものであり、ここで「試料」は動物または植物から得られたあらゆる型の物質（例えばあらゆる液体または組織）、培養細胞または組織、微生物の培養（原核生物または真核生物）、および生きた（またはかつて生きていた）培養または細胞から産生されるあらゆる画分または産物を指す。試料は、未精製または精製し得る。精製試料は、主に１つの成分、例えば全細胞ＲＮＡ、全細胞ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを含み得る。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、「インビトロ」という用語は、人工的な環境および人工的な環境内で起こる過程または反応を指す。「インビボ」という用語は、天然の環境（例えば動物内において、または細胞内において）および天然の環境内で起こる過程または反応を指す。インビトロ転写（ＩＶＴ）反応は、主に精製された成分、例えば精製ＤＮＡ鋳型および精製ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、細胞を含まない環境で起こる転写反応である。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、相補的および逆平行ＤＮＡ鎖を合成するために、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を鋳型として使用するＤＮＡポリメラーゼを指す。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」という用語は、ＲＮＡ鎖合成のために、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を鋳型として使用するＲＮＡポリメラーゼを指す。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって媒介される過程は、通常「転写」と呼ばれる。二本鎖ＤＮＡ分子のいずれかの鎖をＲＮＡ合成の鋳型として使用し得、そしてＤＮＡ分子に操作可能に連結したＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列および方向に依存する。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、相補的および逆平行ＤＮＡ鎖を合成するために、リボ核酸（ＲＮＡ）を鋳型として使用するＤＮＡポリメラーゼを指す。ＲＮＡ分子のＤＮＡコピーを産生する過程は、通常「逆転写」と呼ばれ、そしてそれを達成する酵素は「逆転写酵素」である。いくつかの場合において、逆転写酵素活性を示す酵素はまた、ヌクレアーゼ活性（例えばＲＮアーゼＨリボヌクレアーゼ活性）およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性のような、しかしそれに限らないさらなる活性を示す。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「増幅」という用語は、一般的に分子の量の増加を引き起こすあらゆる過程を指す。ポリヌクレオチド分子に適用される場合、増幅は、ポリヌクレオチド分子、またはポリヌクレオチド分子の部分の、１つまたは少数のコピーまたは少量の開始材料からの、複数コピーの産生を意味する。ポリヌクレオチドの増幅は、様々な化学的および酵素的過程を含む。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中の、１つまたは少数のコピーの鋳型ＤＮＡ分子からの、複数のＤＮＡコピーの産生は、増幅の１つの形式である。他の増幅過程は、鎖置換増幅（ＳＤＡ；Ｂｅｃｋｔｏｎ，Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、およびＮａｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、転写による増幅（ＴＭＡ；Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標），Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；Ｏｒｇａｎｏｎ−Ｔｅｋｎｉｋａ）を含む。増幅は、開始分子の厳格な複製に限らない。例えば、転写過程（例えば、インビトロ転写）の間の、単一のＤＮＡ分子からの複数のＲＮＡ分子の産生は、増幅の１つの形式である。
【００７５】
いくつかの実施態様において、増幅は、増幅反応の後にいかなる続く工程も必要としない。他の実施態様において、増幅の後にさらなる工程、例えば標識化、シークエンシング、精製、単離、ハイブリダイゼーション、発現、検出および／またはクローニングが続くがこれに限らない。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）という用語は、試料における標的ポリヌクレオチドの部分の濃度を増加させる、当該分野で周知の増幅方法を指し、ここで試料は単一のポリヌクレオチド種、または複数のポリヌクレオチドであり得る。一般的に、ＰＣＲ過程は、モル過剰の２つまたはそれ以上の伸長可能なオリゴヌクレオチドプライマーを、望ましい標的配列を含む反応混合物に導入することから成り、ここでそのプライマーは二本鎖標的配列の反対の鎖に相補的である。反応混合物をＤＮＡポリメラーゼの存在下で正確な温度サイクルのプログラムにかけ、ＤＮＡプライマーに隣接する望ましい標的配列の増幅を引き起こす。逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＲＮＡ鋳型および逆転写酵素を使用して、ＤＮＡ依存性ＤＡＮポリメラーゼプライマー伸長の複数サイクルの前に、一本鎖ＤＮＡ分子を最初に産生するＰＣＲ反応である。マルチプレックスＰＣＲは、典型的には単一の反応に２つより多いプライマーを含むことによって、単一の反応において１つより多い増幅産物を産生するＰＣＲ反応を指す。広く様々なＰＣＲ適用の方法が、当該分野で広く公知であり、そして多くの情報源、例えばＡｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５節、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）において記載されている。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、「富化」という用語は、複数の種のプールにおいて、少なくとも１つの種の相対的割合（すなわちパーセンテージ）における変化を指し、ここで１つまたはそれ以上の種の割合が、別の種と比較して増加する。本明細書中で使用される場合、増幅は、富化を達成するために必要ではない。さらに、富化が増幅を引き起こすことも必要ではない。本発明のいくつかの実施態様において、富化の後に任意で増幅工程が続く。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、「ポリメラーゼ伸長」という用語は、あらゆるポリメラーゼ酵素による、ポリヌクレオチドのあらゆる鋳型依存性ポリマー化を指す。そのポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち逆転写酵素、例えばモロニーマウス白血病ウイルス［ＭＭＬＶ］逆転写酵素）、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）、またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ）であり得る。ポリメラーゼ伸長は、ポリマー化を開始するためにプライマーを必要とするポリメラーゼ活性に限らない。例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼの開始および伸長にプライマーの存在を必要としない。
【００７９】
（詳細な説明）
遺伝子発現の定量的および定性的研究、およびある遺伝子の単離に関する困難の１つは、単一の細胞または組織における異なる遺伝子間の広範囲な発現レベルである。すなわち、当該トランスクリプトームで発現する遺伝子は、同等でない分配を示し、ここでいくつかの遺伝子は他の遺伝子より有意に高レベルで発現する。この遺伝子発現レベルの範囲を、表１に示す仮定的例において説明する。
【００８０】
【表１】
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表１は、低、中程度、または高レベルの転写物と考え得るものの１つの例を提供する。表１において見られるように、細胞あたりの遺伝子転写物の数（すなわち、転写物のコピー数）は、４オーダー以上の程度で異なり得る。
【００８１】
さらに、非常に高レベルで発現する比較的少数の遺伝子と比較して、低および中程度クラスの遺伝子発現によって示される不釣合いに多数の遺伝子が存在する。この不均衡が、ｍＲＮＡ集団の約１０−２０％の原因となる比較的少数の高コピー数遺伝子転写物を生ずる。対照的に、より多数の中程度の量の遺伝子が、ｍＲＮＡ集団の４０−４５％のみの原意であり、一方、遺伝子の最も大きなパーセンテージである、少量の遺伝子は、ｍＲＮＡ集団の４０−４５％を占める。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、「低」または「高」という用語は、いかなる局面においても厳格に規定されることを意図しない。１つの局面において、「高度に転写される」または「多量の」（すなわち、細胞において高コピー数を有する）と考えられる遺伝子またはポリヌクレオチドは、試料中のポリヌクレオチドの少なくとも０．１％の量を有する。例えば、そして制限無しに、多量の遺伝子は、３００，０００ｍＲＮＡ転写物ごとに５００ｍＲＮＡ転写物を有し得（ここで３００，０００転写物は、ある所定の時間における、ある所定の細胞におけるｍＲＮＡ分子の数の近似値である）、そして従って、所定の細胞、細胞集団、または組織におけるポリＡ  ｍＲＮＡの少なくとも０．１６７％の原因である。特定の実施態様において、「多量の」ポリヌクレオチドは、試料におけるポリヌクレオチドの少なくとも約０．２％を占める。別の実施態様において、多量のポリヌクレオチドは、試料におけるポリヌクレオチドの少なくとも約０．５％を占める。さらなる実施態様において、多量のポリヌクレオチドは、試料におけるポリヌクレオチドの少なくとも約１％を占める。またさらなる実施態様において、多量のポリヌクレオチドは、試料におけるポリヌクレオチドの少なくとも約５％を占める。
【００８３】
別の局面において、もしそれが試料におけるポリヌクレオチドの約０．１％より少ない量ならば、その遺伝子またはポリヌクレオチドは、「少量」であると考えられる。従って、中程度のレベルで発現する遺伝子は、「少量」であると考えられ得る。１つの実施態様において、「少量の」ポリヌクレオチドは、試料におけるポリヌクレオチドの約０．０５％より少ない量を占める。別の実施態様において、それらは試料におけるポリヌクレオチドの約０．０１％より少ない量を占める。さらなる実施態様において、それらは試料におけるポリヌクレオチドの約０．００５％より少ない量を占める。またさらなる実施態様において、少量のポリヌクレオチドは、試料におけるポリヌクレオチドの約０．００１％より少ない量を占める。例えば、そして制限無しに、低レベルの転写を有する（すなわち、細胞において低コピー数を有する）遺伝子は、各３００，０００ｍＲＮＡ転写物ごとに１５転写物より多くない量を有し得、そして従って、所定の細胞、細胞集団、または組織におけるｍＲＮＡの０．００５％より多くない量の原因である。
【００８４】
試料における少量のヌクレオチドに対する多量のポリヌクレオチドの関係を、比として与え得る。１つの実施態様において、多量のポリヌクレオチド（または遺伝子）は、少量のポリヌクレオチドの発現レベルの、少なくとも約２倍のレベルで発現するものである。従って、少量のポリヌクレオチドに対する多量のポリヌクレオチドの比は、少なくとも約２：１である。別の実施態様において、多量のポリヌクレオチドは、少量のポリヌクレオチドの発現レベルの、少なくとも約５倍の発現レベルを有する（１０：１）。さらなる実施態様において、多量のポリヌクレオチドは、少量のポリヌクレオチドの発現レベルの、少なくとも約１０倍の発現レベルを有する（１００：１）。またさらなる実施態様において、多量のポリヌクレオチドは、少量のポリヌクレオチドの発現レベルの、少なくとも約５０倍の発現レベルを有する（５００：１）。またさらなる実施態様において、多量のポリヌクレオチドは、少量のポリヌクレオチドの発現レベルの、少なくとも約１００倍の発現レベルを有する（１，０００：１）。他の実施態様において、少量のポリヌクレオチドに対する多量のポリヌクレオチドの比は、少なくとも約５，０００：１、１０，０００：１またはそれ以上であり得る。
【００８５】
表１における情報は、様々な技術を用いて実験的に示され、そして当該分野においてよく記録されている。例えば、トランスクリプトームにおける相対的転写物量の不均一な分布は、リアルタイム定量的ＰＣＲ分析を用いて示された。リアルタイムＰＣＲ分析は、蓄積するＰＣＲ産物の定期的なモニタリングを指す（蛍光発生的５’ヌクレアーゼアッセイ、すなわちＴａｑＭａｎ（登録商標）分析としても知られる；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０［１９９１］；およびＨｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４［１９９６］を参照のこと）。
【００８６】
生きた細胞における転写物分布の不均一な分布はまた、遺伝子発現の連続分析（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＳＡＧＥ）分析を用いて示された。公共で入手可能なＳＡＧＥ分析の結果を、図１に示す。ＳＡＧＥは、ハイスループットシークエンシング技術を利用して、分析する各転写物に対する個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要無しに、細胞遺伝子発現の定量的分析を提供する方法である。
【００８７】
本質的に、ＳＡＧＥ技術は、遺伝子の発現レベルを測定するのではなく、遺伝子の転写産物を示す「タグ」を定量する。ＳＡＧＥの目的のためのタグは、典型的には約９−１４塩基対の長さの、特定の制限酵素の最も３’の制限部位の直接３’にある、規定された長さのヌクレオチド配列である。酵素ＮｌａＩＩＩが、依然として最も広く使用される制限酵素であるが、他の制限酵素も使用し得る。多くの転写物がお互いに連結して長い連続的な分子を形成し、それを迅速にシークエンシングし得、このことは、同時に複数のタグのアイデンティティーを明らかにする。このアプローチをＳＡＧＥタグカウントセットで使用し、ここで、全部で約２５０，０００のタグをシークエンシングした。
【００８８】
転写物のあらゆる集団（すなわちトランスクリプトーム）の発現パターンを、（ｉ）所定のトランスクリプトームにおける個々のタグの量を決定する、および（ｉｉ）各タグに対応する遺伝子を同定することによって、定量的に評価し得る。ＳＡＧＥ技術のデータ産物は、対応するカウント値を有するタグのリストであり、そして従って細胞遺伝子発現のデジタル表示である。ＳＡＧＥ分析の方法論および使用法は、当該分野で公知であり、そして様々な情報源において記載されている。例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４−４８７（１９９５）；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ  ８８：２４３−２５１（１９９７）；およびＺｈａｎｇら、Ｓｃｉｎｅｃｅ  ２７６：１２６８−１２７２（１９９７）を参照のこと。
【００８９】
図１の分析に示すように、Ｘ軸はＳＡＧＥタグＩＤ（１０マーのオリゴヌクレオチド）をプロットし、そしてＹ軸は特定のタグの出現頻度をプロットする。このグラフに示したデータセットは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈによって維持される、公共で利用可能なデータベースから抽出される。この分析は、ｃＤＮＡライブラリーから６２，４８６配列タグをサンプリングした。
【００９０】
図１で見られるように、非常に少数のＳＡＧＥタグが、トランスクリプトームにおいて、不均一に高レベルで占める。大多数のＳＡＧＥタグは、ライブラリーにおいて中程度または低い表示を示す。実際、サンプリングした６２，４８６個のタグのうち、それらの多くは単一のヒットとしてのみ出現した（すなわち、試料において１回のみ表示された）。逆に、比較的少数の、頻繁に出現するタグが、試料におけるタグヒットの大部分の原因である。
【００９１】
現在の技術の限界を説明する、ｍＲＮＡ定量および濃度の仮定的計算を、図２に示す。図２において、標準的な２５０μＬのハイブリダイゼーション反応（典型的な「チップ」形式）における７つの異なる遺伝子のｍＲＮＡ濃度を、８つの異なる量の未増幅標識ｍＲＮＡ投入量（０．１−５００μｇ）に関して決定する。図２に示す遺伝子は、発現レベルにおいて１００，０００倍の範囲を示す。ハイブリダイゼーション反応における各遺伝子転写物の予測される濃度を、ｐＭで提供する。アレイ形式におけるｍＲＮＡ検出の下限は、約１ｐＭである。従って、１ｐＭより低い濃度を有する、図３の表におけるあらゆる転写物は、検出不可能である。例えば、もしハイブリダイゼーション反応において５μｇのｍＲＮＡを使用したら、１０またはそれより多いコピー数を有する転写物のみが検出可能である。
【００９２】
遺伝子発現分析における限界を示す同様の例を、図３で示す。図３は、異なる量のｍＲＮＡ開始材料が与えられた場合の、ｍＲＮＡ定量の仮定的計算を示す。１０４から１０８ＨｅＬａ細胞からの仮定的ＲＮＡ収量を、μｇ、ｐｍｏｌ、および転写物の数において計算する。この分析は、平均転写物の長さを１．９キロベース（ｋｂ）と仮定し、そして少量、中程度、および多量の種類のｍＲＮＡ転写物に関してこれらの計算を行なう。この分析はまた、２５０μＬのハイブリダイゼーション反応における、予測されるｍＲＮＡモル濃度も決定する。所定のｍＲＮＡに関する約１ｐＭの検出下限を考慮して（百万個の細胞において細胞あたり約１転写物の遺伝子発現の検出下限に相当する）、この検出限界より上の遺伝子転写物を、囲んで示す。従って、１０６（百万）個の細胞から始めると、中程度および多量のｍＲＮＡ転写物のみを検出し得る。
【００９３】
図４はまた、少量の転写物を分析する困難さを示す。図２および３と同様に、図４はハイブリダイゼーション反応におけるポリヌクレオチド（ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ）濃度の仮定的計算を提供し、ここで発現レベルにおいて１０，０００倍の違いを有する６つの異なる遺伝子（遺伝子Ａ〜Ｆ）を、３つの異なる量の開始材料を用いて分析する。再び、これらの計算は、最も少量の転写物は、少量の開始材料のみを分析し得る現在公知の方法を用いて検出不可能であることを示す。
【００９４】
ハイブリダイゼーション分析において、ポリヌクレオチド開始材料（未増幅ｍＲＮＡまたは全ＲＮＡ、増幅ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ、あるいはセンスまたはアンチセンスＩＶＴ産物のいずれか）の量を増加させることは、低レベルの遺伝子発現の問題を補正し得る。しかし、ハイブリダイゼーション反応において使用し得るポリヌクレオチドの量に実際上の限界が存在する。標準的な実験室の条件を用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）標識反応によって産生し得る増幅ＲＮＡの量に、実際上の上限が存在する（約１００μｇ）。それに加えて。高度に発現される遺伝子または転写物が、大部分のＩＶＴ試薬を消費し、そして従って、発現量の低い、標的遺伝子の収量を減少する。ｍＲＮＡは、全細胞ＲＮＡの１−５％のみの原因であるので、分析のために産生および標識し得るｍＲＮＡ（すなわちポリＡ  ＲＮＡ）の量にも実際上の限界が存在する。別の懸念は、非常に高濃度の最も多量の転写物によって引き起こされるプローブ交差ハイブリダイゼーションの可能性である。
【００９５】
図２−４における計算から、現在の技術は、マイクロアレイハイブリダイゼーション形式を用いた少量のポリヌクレオチド（例えば、一次ｍＲＮＡ転写物、ｃＤＮＡ分子またはｃＲＮＡ）の低い検出および分析によって妨げられていることが明らかである。従って、少量のポリヌクレオチドの改善された検出および分析のための組成物および方法に関する必要性が、当該分野に存在する。さらに、ポリヌクレオチドまたは遺伝子発現の分析に関して当該分野で現在公知のあらゆる種類の技術を用いて、低コピー数の転写物を検出および／または分析し得るように、少量の転写物を特異的に富化または選択的に増幅する組成物および方法に関する必要性が、当該分野に存在する。
【００９６】
試料において、標的ポリヌクレオチドを選択的に除去する、現在使用されている方法は、技術的限界を有する。これらの方法のいくつかは、サブトラクティブハイブリダイゼーション（すなわち、ハイブリダイゼーションに基づく引き抜き）を使用して、標的配列を捕捉および除去する。他の方法は、特異的な酵素的分解（例えば、ＲＮアーゼＨ消化）を用いて、規定されたオリゴヌクレオチドと二本鎖を形成した転写物を除去する。これらの方法は、低い収量、大量の開始材料の必要性、および望ましい少量のポリヌクレオチドの非特異的な損失／分解のために、次善のものである。これらのアプローチは多くの場合、ポリヌクレオチドの試料において少量の種を同定できない。
【００９７】
（Ａ．少量のポリヌクレオチドの富化）
少量のポリヌクレオチド（すなわちｍＲＮＡ転写物）を分析するために使用する開始材料の全量を増加させる必要性を回避する１つの方法は、少量の種に関してポリヌクレオチド試料を富化することである。このアプローチは、ハイブリダイゼーション反応に使用される分析材料の量を単に増加させることに対して利点を提供する。まず、このアプローチは、偽陽性の結果を引き起こす、ハイブリダイゼーションプローブに対する、多量のメッセージの非特異的交差ハイブリダイゼーションの可能性を除去する。２番目に、それは中程度および少量のメッセージの相対的量の増加を引き起こす。これは、ハイブリダイゼーション反応または他の適用において使用される材料の所定の量に関して、残る配列のそれぞれが、より多量に存在し、そして従ってより容易に検出、定量および／または単離されることを意味する。
【００９８】
試料における少量の種の富化を、試料において最も多量の種の選択的抑制によって達成し得る。この原理を、図４および５において提供する単純な仮定的シナリオにおいて示し、６つの異なる遺伝子（遺伝子Ａ−Ｆ）の増幅時に、相対的な転写物濃度に何が起こるか説明する。図４は、遺伝子発現の仮定的分析を示し、ここで発現レベルにおいて１０，０００倍の範囲を有する６つの異なる遺伝子（遺伝子Ａ−Ｆ）を、増幅（ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ分子のいずれかとして）およびハイブリダイゼーション法において分析する。３つのシナリオが提供され、ここで１、１０または１００μｇの標識材料（すなわちｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ）をハイブリダイゼーション反応において使用する。ハイブリダイゼーション反応において各遺伝子転写物の予測される濃度を、ｐＭで提供する。これらの計算において見られるように、１μｇの開始材料を使用する場合、少量の転写物（すなわち遺伝子ＥおよびＦ）は、１ｐＭより低い濃度を有するので、検出不可能である。この場合、最も低く発現される転写物（すなわち遺伝子Ｆ）を検出するために、１０μｇの標識材料をハイブリダイズしなければならない。ヒトｍＲＮＡのより複雑な場合において、さらにより低い発現レベルを有する転写物を検出するために必要な材料の量は、より多いことが予測される。
【００９９】
図５においてなされた計算は、最も多量の転写物（すなわち遺伝子Ａ）のレベルが９９％抑制された以外は、図４でなされたものと類似している。図５において見られ得るように、遺伝子Ａのレベルが減少した場合、他の転写物の分数量が、検出可能なレベルまで増加する。従って、ある種の増幅を選択的にブロッキングすることによって、他の種の相対的富化が観察され、そしてこのアプローチは、図４において示されるような、非選択的増幅単独による限界を克服し得る。
【０１００】
（Ｂ．少量のポリヌクレオチドを富化するための新規組成物および方法）
本発明は、試料における少量のポリヌクレオチドを富化するための組成物および方法を提供する。これらの方法は、試料におけるポリヌクレオチドを酵素的ポリマー化の条件にさらし、そして同時に試料における少なくとも１つの多量の種のポリマー化を抑制することによって、試料を少量の種に関して富化する。少なくとも１つの多量のポリヌクレオチド種のポリマー化の阻害は、試料における他のより少量の種の相対的富化を引き起こす（図４および５の仮定的な例で示したように）。
【０１０１】
これらの新規方法は、単一の反応において、望ましい種（すなわち少量または中程度の量の種）のポリマー化、および望ましくない種（すなわち少なくとも１つの多量の種）のポリマー化の抑制を組み合せて、そして従って富化過程を単純にする。これらの２つの工程を単一の工程に組み合せることによって、試料、特に試料中の少量のまたは希少な種の損失および／または分解は、最小限となる。本発明の方法は、大量の開始材料（例えば、特にｍＲＮＡ）を必要とせず、そして従って、開始材料の量が限られる場合の試料の分析において特に有用である。本発明の組成物および方法は、下記で詳述するように、様々な適用において有用である。
【０１０２】
さらに、富化後に、ポリヌクレオチド試料を任意で、当該分野で公知の様々な増幅工程のいずれかにおいて使用し得る。これらの増幅メカニズムは、ＰＣＲ、インビトロ転写、またはプラスミド／ファージミド増殖によるサブクローニングを含む。
【０１０３】
本発明の方法は、開始ポリヌクレオチドプールと比較して、少量のポリヌクレオチド種が富化されたポリヌクレオチドプールを産生し、そして従って少量種（例えばｍＲＮＡまたはｃＲＮＡ転写物、またはｃＤＮＡ分子）の検出および／または単離を促進する。これらの新規方法は、分子のプールにおいて、多量の標的分子のポリマー化を優先的に阻害する、配列特異的伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーを利用し、そして従って少量の転写物の相対的割合を増加させる。これらのブロッキングオリゴマーを、ポリメラーゼ増幅反応を開始する前に試料に加える。ブロッキングオリゴマーは、その標的配列にアニーリングし、そしてポリメラーゼ酵素の進行または開始、すなわちプライマー伸長を阻害することによって、ポリヌクレオチドのプールにおいて標的ポリヌクレオチドの増幅を選択的に抑制する二本鎖を形成する。従って、本発明の方法は、いかなる特殊な装置または他の器具類も必要としない。
【０１０４】
１つまたは複数の少量のポリヌクレオチドを、ポリマー化過程で増幅し得る。増幅される少量のポリヌクレオチドそれぞれの配列に特異的なプライマーを使用することによって、それらを個々に増幅し得る。あるいは、阻害されるポリヌクレオチド以外の、試料中の全てのポリヌクレオチドを、ランダムプライマーの使用によるような、当該分野で周知の方法によって増幅し得る（例えばＦｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．１９８３．Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６−１３；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．１９８４．Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：２６６−２６７を参照のこと）。ランダムプライマーは、所定のｎマーの、全ての可能性のある置換の混合物を含み、ここでｎは、例えば６、７、８、９または１０である。典型的には、ランダムヘキサマー（ｎ＝６）またはオクタマー（ｎ＝８）を採用する。しかし、所定のｎマーの、全ての可能性のある置換のサブセットを用いて、阻害される多量のポリヌクレオチド以外の、試料中の全てのポリヌクレオチドを増幅することが可能であり得る。従って、１つの実施態様において、ランダムプライマーは、１００個の別々のｎマー（すなわち、それぞれ別々の配列を有する１００個のヘキサマー）を含む。別の実施態様において、ランダムプライマーは、２００個の別々のｎマーを含む。またさらなる実施態様において、ランダムプライマーは、４００、８００、１０００または５０００個の異なるｎマーを含み得る。ランダムプライマーを市販で購入し得るか、またはオリゴヌクレオチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて調製し得る。
【０１０５】
本発明の方法を、少量のポリヌクレオチドがポリヌクレオチドの試料中にあり、より多量のポリヌクレオチドが少量種の検出または単離を防止するまたは妨げるあらゆる状況に適用し得る。この多量種の配列特異的抑制および結果として生ずる少量種の富化が、富化前には検出または単離されるために濃度が低すぎた少量のポリヌクレオチドの検出、単離および／または分析を可能にする。いくつかの実施態様において、本発明は、少量の転写物が富化されたポリヌクレオチドのプールを標識化する方法を提供し、ここでポリヌクレオチドの標識化プールは、例えば遺伝子発現の分析または遺伝子クローニングの方法において有用である。他の実施態様において、本発明は、本方法を促進するキットを提供し、ここでそのキットは本方法で使用する様々な試薬を提供する。
【０１０６】
本発明の方法は、酵素的に伸長不可能なブロッキングヌクレオベースオリゴマーを利用する。オリゴマーが配列特異的な方式で相補的な標的にハイブリダイズする能力を保持する場所を除いて、伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーの化学的構造を特に制限することを意図しない。様々な伸長不可能なヌクレオベース構造が、当該分野で公知であり、それらは全て本発明で有用である。そのオリゴマーを、試料中の多量の（すなわち高度に転写される）標的配列に相補的であるように設計し、そして標的にハイブリダイズさせる。
【０１０７】
いくつかの実施態様において、ポリメラーゼ反応において１つより多いブロッキングオリゴマーを使用し、そして従って、１つより多い多量のポリヌクレオチドのポリマー化を同時に阻害する。
【０１０８】
ブロッキングオリゴマーおよび標的分子間の二本鎖形成部位を特に制限することを意図しない。いくつかの実施態様において、ポリメラーゼ開始部位により近い二本鎖形成部位が、ポリメラーゼ開始部位からより遠い二本鎖形成部位より好ましい。別の実施態様において、二本鎖形成部位は、ポリメラーゼ開始部位と重なる、または含む。
【０１０９】
（Ｃ．少量のｍＲＮＡ分子の富化方法）
いくつかの実施態様において、本発明は、試料における少なくとも１つの多量のｍＲＮＡのＤＮＡポリマー化を抑制する新規方法を提供し、ここでそのｍＲＮＡを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性（すなわち逆転写酵素；ＲＴ）によって相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子の第１鎖に変換する。ＲＴ反応に新規ブロッキングオリゴマーを含むことによってこれを達成し、ここでそのオリゴマーは試料における１つまたはそれ以上の多量のｍＲＮＡ転写物に相補的である。これらのブロッキングオリゴマーは二本鎖を形成し、それはオリゴｄＴプライマーからの第１鎖ｃＤＮＡ産物の開始または伸長を阻害し、そして従って逆転写酵素が第１鎖ｃＤＮＡ合成を開始できなくする、すなわち、全長のｃＤＮＡ第１鎖の産生を阻害する。
【０１１０】
他の実施態様において、ブロッキングオリゴマーは、ｃＤＮＡ第２鎖合成反応中に存在し、ここでそのブロッキングオリゴマーは、第１鎖合成中の阻害を免れ得た、新規に合成されたＤＮＡの第１鎖に相補的である。この実施態様において使用されるブロッキングオリゴマーは、第１鎖合成反応において標的化された反対の鎖にハイブリダイズする。第２鎖に特異的なこれらのブロッキングオリゴマーは、ｃＤＮＡ第１鎖の産生を阻害するために使用したヌクレオベースオリゴマー配列とは別のヌクレオベース配列を有する。第１鎖ｃＤＮＡにおいてブロッキングオリゴマーとの二本鎖形成のために標的化された領域は、第２鎖ｃＤＮＡにおいてブロッキングオリゴマーとの二本鎖形成のために標的化された領域とは、異なっても、異ならなくてもよい。
【０１１１】
ブロッキングオリゴマーを、ｃＤＮＡ第１鎖合成の間、ｃＤＮＡ第２鎖合成の間、または第１鎖および第２鎖合成反応の両方のいずれかにおいて使用し得ることが企図される。ブロッキングオリゴマーを第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成の両方において使用する場合（介在する精製工程無しで）、２つの酵素的工程において使用されるブロッキングオリゴマーは、非生産的なオリゴマー／オリゴマー二本鎖の形成を防ぐために、標的遺伝子の異なる領域にハイブリダイズするよう設計される。
【０１１２】
本発明のいくつかの実施態様において、ｃＤＮＡ第２鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によって合成し、そしてランダムＤＮＡオリゴマーによって開始する。しかし、第２鎖ｃＤＮＡ合成の代替プロトコールが当業者に公知であり、そしてそれは本発明で有用であるので、本発明を第２鎖合成のこの１つの方法に制限することを意図しない。
【０１１３】
この修飾ＲＴ反応は、ブロッキングオリゴマーを使用せずに産生したＲＴ反応産物のプールと比較して、少量の転写物から得られたｃＤＮＡが富化された、二本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のプールを産生する。本発明の新規方法によって産生された、この偏ったｃＤＮＡプールは、マイクロチップアレイハイブリダイゼーション（すなわち遺伝子発現分析）、ｃＲＮＡ産物を産生するためのインビトロ転写（ＩＶＴ）反応における使用、ｃＤＮＡライブラリー合成およびスクリーニング、ＳＡＧＥ分析、および他の適用を含むがこれに限らない、様々な使用法を有する。
【０１１４】
（Ｄ．ＰＣＲを用いたポリヌクレオチド配列の富化）
他の実施態様において、ブロッキングヌクレオベースオリゴマーを、ＰＣＲ反応に直接組み込み得る。この場合、ブロッキングオリゴマーは二本鎖ＤＮＡ鋳型分子（例えば二本鎖ｃＤＮＡ）の１つまたは両方の鎖いずれかを標的化し得る。この方法の１つの実施態様において、ブロッキングオリゴマーのＴｍは、好ましくはＰＣＲ反応において使用するプライマーのＴｍより高い。
【０１１５】
二本鎖ＤＮＡ鋳型の両方の鎖に特異的なブロッキングオリゴマーを同時に使用する場合、その２つのブロッキングオリゴマーは、お互いに別々のヌクレオベース配列を有し、そしてさらに、その使用されるブロッキングオリゴマーは、相補的な塩基対形成による、非生産的なオリゴマー／オリゴマー二本鎖の形成を防ぐために、二本鎖標的の異なる領域にハイブリダイズするように設計される。
【０１１６】
ＰＣＲ反応にブロッキングオリゴマーを含むことは、標的配列を含むＰＣＲアンプリコンを産生できなくするか、またはその能力の抑制を引き起こす。例えば、この適用は、ｃＤＮＡライブラリーが、ライブラリー全体のＰＣＲ増幅のためのユニバーサルプライマーを使用することを可能にするベクターにクローニングされた場合のように、ｃＤＮＡライブラリーの増幅の間に公知の多量の配列のＰＣＲ増幅を阻害することにおいて有用である。
【０１１７】
（Ｅ．インビトロ転写による少量種が富化されたＲＮＡを産生する方法）
上記で記載したように、本発明は、少なくとも１つの多量種のポリマー化を抑制する結果として、少量種が富化されたｃＤＮＡ分子の集団を産生する新規方法を提供する。いくつかの実施態様において、そのように形成されたｃＤＮＡ分子を、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）を用いた、転写、すなわちインビトロ転写（ＩＶＴ）の開始に適当なヌクレオチド配列と操作可能に連結し得る。従って、そのｃＤＮＡプールをＩＶＴ反応における鋳型材料として使用して、少量種が富化されたＲＮＡのプールを産生し得る。
【０１１８】
ＩＶＴ反応は、最小限の開始量のＤＮＡ鋳型から大量のＲＮＡを産生するので、一般的には、増幅反応である。ＩＶＴ反応において、ＤＮＡ鋳型を、１０００倍まで増幅し得る。ＩＶＴ反応は、操作可能に連結したプロモーター開始配列を有するＤＮＡ鋳型（例えばｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子のプール）、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７、ＳＰ６、またはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ）および遊離のリボヌクレオチド３リン酸（ｒＮＴＰ）を利用して、開始ＤＮＡ鋳型の１つの鎖に相補的なＲＮＡ分子を酵素的に産生する。
【０１１９】
二本鎖ｃＤＮＡ  ＩＶＴ鋳型は、一般的には直線状分子である。ｃＤＮＡ分子は、主に転写プロモーターと操作可能に連結したｃＤＮＡ配列から成り得る、またはあるいは、そのｃＤＮＡを適当なベクター（例えばバクテリオファージλに基づくベクター、例えばλ−ｇｔ１１またはλ−ｇｔ１２、または環状発現ベクター）にサブクローニングし得る。いくつかの実施態様において、ｃＤＮＡを含む環状ベクターを、ＩＶＴ反応の前に直線状にする。
【０１２０】
これらの方法において、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、アンチセンス転写物（すなわち、相補的、またはｃＲＮＡ）または「センス」ＲＮＡ転写物のいずれかを産生し得る。センスＲＮＡ転写物は、対応する内因性転写物と同じ方向で産生される転写物である。すなわち、センス転写物は、主なｍＲＮＡ転写物と同じ方向、および、同じか、または実質的に同じヌクレオチド配列を有する。対照的に、ｃＲＮＡは、対応するｍＲＮＡ産物と相補的な配列を有する。センスまたはアンチセンス産物のどちらが形成されるかは、転写の方向に依存する。
【０１２１】
ＩＶＴを行なうための、広く様々な試薬および反応条件が、当該分野で公知であり、そしてそれは本発明で有用である。これらの条件は性質においてただ例示的なものであるので、本発明を、特に本明細書中で列挙されたＩＶＴ反応条件および試薬に制限することを意図しない。ＩＶＴの方法および試薬は、当該分野で広く知られており、そして様々な製造会社から入手可能であり、そして多くの情報源、例えばＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１−４巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９）において記載されている。
【０１２２】
ＩＶＴ反応によって産生されたＲＮＡ産物は、遺伝子発現分析におけるマイクロチップアレイハイブリダイゼーション、および他の適用を含むがこれに限らない、様々な適用において有用である。１つの実施態様において、ＩＶＴ  ＲＮＡ産物を、ハイブリダイゼーション分析において使用するために、その合成の間に標識する（実施例３を参照のこと）。
【０１２３】
（Ｆ．本発明の様々な実施態様の実証）
本発明の様々な性質および利点を、図１１−１３に示す一連の実験において示した。これらの実験において、伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーを、ｍＲＮＡ標的配列に結合して二本鎖を形成し、それが、逆転写酵素が標的配列を転写し、そして相補的ＤＮＡ配列の第１鎖を産生する（すなわちｃＤＮＡ第１鎖合成）のを阻害するよう設計した。この１つの場合において、伸長不可能なペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーを、ブロッキングオリゴマーとして使用した。ＰＮＡオリゴマーの合成およびＰＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーション性質は、当該分野で公知である（Ｂｕｃｈａｒｄｔら、ＷＯ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００［１９９１］；Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６−５６８［１９９３］）。
【０１２４】
本明細書中で使用されるＰＮＡオリゴマーは、本発明の様々な性質を説明する目的のための例示であると意図される。本発明を、本明細書中で使用されたヌクレオベース配列に制限することも、ＰＮＡ構造を有する分子の使用に制限することも意図しない。他で議論されるように、様々なさらなるブロッキングオリゴマー配列および構造が、本発明で有用であり、そして本発明の最も広い局面は、そのような代替試薬を含むことが意図される。さらに、当業者は、等価の条件も本発明で有用であることを認識するので、本発明を、本明細書中で特に列挙された逆転写酵素試薬および反応条件に制限することを意図しない。
【０１２５】
ＰＮＡオリゴマーを、２つの異なる遺伝子転写物（Ｈ＋輸送ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ、サブユニットＢ、アイソフォーム１遺伝子のサブユニットＢのヒト移入前駆体（ＡＴＰ５Ｆ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１６８８）、およびコレステロールエステル輸送タンパク質遺伝子（ＣＥＴＰ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００７８）に相補的に設計した。ＡＴＰ５Ｆ１およびＣＥＰＴ遺伝子配列を、本明細書において、本発明の種々の特徴を説明するための、例示的様式において、使用した。本発明を、これらの標的遺伝子に対して特異的なブロッキングオリゴマーの使用に限定することを意図しない。本明細書の別の部分において考察されるように、種々のさらなる標的遺伝子に対して特異的なヌクレオベース配列もまた、本発明における使用が見出され、そして本発明の広範な局面に包含される。さらなる高レベルに発現する遺伝子のリストは、図１４に示されるブロッキング標的としての使用を見出す。
【０１２６】
ＡＴＰ５Ｆ１およびＣＥＴＰ遺伝子の短縮型形態の合成転写物を、これらのポリメラーゼ反応において使用した。ＰＮＡオリゴマー（重複する、ポリＡの最初の３つのＡ、ポリＡテイルから３塩基上流、および遺伝子内の他の部位を含む）を、各転写物のいくつかの異なる領域に結合するように、設計して、合成した。ＡＴＰ５Ｆ１およびＣＥＴＰ遺伝子に特異的なオリゴマーのＰＮＡヌクレオベース配列を、図８および９に、それぞれ提供し、配列番号３−２０、および２１−３９において、それぞれ提供する。図８および９において使用される場合、ＰＮＡ配列中の文字「Ｏ」は、リンカー／スペーサー部分を示し、ＧＥＮ０６３０３２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と呼ばれ、当該分野で当業者に公知のように（ＷＯ９９／３７６７０；およびＧｉｌｄｅａ  ｅｔら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３９：７２５５−７２５８［１９９８］を参照のこと）、ＰＮＡオリゴマーの溶解度を改善するために、取り込まれる。このリンカー／スペーサーの構造を、図１０Ａ−１０Ｃに示す。図１０Ａは、リンカーが、オリゴマーの内部位置にある場合の、この構造を示す。図１０Ｂは、リンカーがアミノ末端位置にある場合の、リンカーの構造を示す。図１０Ｃは、リンカーが、カルボキシル末端位置にある場合のリンカーの構造を示す。
【０１２７】
長さおよび二本鎖融点（Ｔｍ）において多様なオリゴマーを、ポリメラーゼ活性をブロックするのに最適なＰＮＡオリゴマーを同定し得るか決定するために試験した。図８および９において示すように、ＰＮＡオリゴマーおよび類似のＤＮＡオリゴマーの計算したＴｍを、比較のために示す。ＰＮＡオリゴマーのＴｍは、一様に、対応するＤＮＡオリゴマーよりも高い。このことは、ＰＮＡ含有ヘテロ二本鎖は、類似のＤＮＡ二本鎖よりも安定であり、そしてエネルギー的に有利であることを示す。
【０１２８】
組換えＭＭＬＶ逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ（登録商標）  ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩＴＭ  逆転写酵素）、人工ＡＴＰ５Ｆ１転写物、オリゴ−ｄＴ２１ＲＴプライマー、およびいくつかの異なるＰＮＡオリゴマーを用いる逆転写反応を用いて、ＰＮＡオリゴマーが、標的特異的様式において、逆転写反応を阻害することを実証した。
【０１２９】
この分析の結果を、図１１に示す。ＲＴ反応の一本鎖ｃＤＮＡ産物を、アガロースゲルにおいて分解し、エチジウムブロミド染色を用いて検出した。レーン１２は、６０ｎｇのサイズ比較のための６２６リボヌクレオチドを示す、レーン１０は、ＰＮＡオリゴマーを全く含まない逆転写した一本鎖５７３デオキシリボヌクレオチド産物を示す。このことは、鋳型とほぼ同一のサイズの一本鎖の優勢な産物を明らかにする。レーン１１は、オリゴ−ｄＴプライマーを除いたコントロール反応である。種々のＰＮＡオリゴマーの阻害効果が、明確に観察され得る。ＰＮＡ番号８５９および８６４は、同一長であり、そして同一の推定Ｔｍを有するが、ポリＡテイルの最初の３塩基に結合する８６４は、より強力なブロッキング効果を有する。２３５および３４５ヌクレオチドにそれぞれ結合するＰＮＡ番号８６９および８７３を用いるポリＡテイルからの反応は、ほぼこれらのサイズの少量のｃＤＮＡを産生するようである。レーン８および９は、２つのＰＮＡ配列または３つのＰＮＡ配列を使用することが一致して一つのＲＴ反応において、さらに、ＲＴブロッキング効率を改善すること（これらの反応において、ｃＤＮＡ産物が検出可能ではなかった）を、実証する。
【０１３０】
図１１において提供される結果は、試験したＡＴＰ５Ｆ１転写物に特異的なすべてのＰＮＡオリゴマー（番号８５９、８６４、８６９、および８７３−８７５）が、逆転写およびｃＤＮＡ産物の産生を抑制するいくつかの能力を示し、そのため、本発明での使用を全て見出すことを示す。
【０１３１】
この阻害効果がＰＮＡオリゴマーによるＲＴブロッキングに起因することを実証するために、ＡＴＰ５Ｆ１転写鋳型を用いる種々のコントロール実験を行った。これらの実験の結果を、図１２に示す。図１２において、レーン１０は、リボヌクレオチド鋳型を示し、レーン７は、ＰＮＡオリゴマー非存在下における一本鎖ＤＮＡ産物の逆転写を示し、そして、レーン９は、オリゴ−ｄＴプライマーを除いたコントロール反応である。レーン１および１１は、ＤＮＡサイズマーカーを示す。ＰＮＡ（１％  Ｎ−メチルピロリドン［ＮＭＰ］）自体を可溶化するために使用した溶媒が、ＲＴ反応を阻害し得るか否かを試験した。図１２のレーン８において見られ得るように、ＲＴ反応における０．０５％ＮＭＰは、ＲＴ活性、および一本鎖ｃＤＮＡ産生に対して影響を有さなかった。
【０１３２】
観察されたＲＴ阻害がＰＮＡオリゴマーの用量に依存するか否かをまた、決定した。図１２のレーン２−７は、ＲＴ反応産物における、ＰＮＡ濃度の範囲の効果を示す。ＰＮＡオリゴヌクレオチド番号８６４を、２倍希釈において使用した。これらの反応において、ＡＴＰ５Ｆ１転写鋳型のモル濃度は、０．４μＭであった。ＰＮＡ濃度が、約０．４μＭを超える場合、阻害が観察され、このことは、ＰＮＡの標的に対するＰＮＡの結合が１対１の化学量論であることを示唆する。
【０１３３】
ブロッキング活性の配列特異性を実証するために、同一のＡＴＰ５Ｆ１  ＰＮＡオリゴマーの一連の希釈を、非相同の鋳型（ＣＥＴＰ遺伝子）を用いる一連のＲＴ反応において使用した。この実験の結果を、図１３に示す。これらの反応において、ＣＥＴＰ転写物鋳型の最終濃度は、０．３μＭであった。ＡＴＰ５Ｆ１特異的ＰＮＡオリゴマーの最も高い濃度（２．５μＭ）であっても、ＣＥＴＰ  ＲＴ反応の阻害はなく、このことは、ブロッキングは、高度に配列特異的であり、非特異的な干渉に起因しないことを示す。
【０１３４】
ヒト肝臓組織から単離されたＲＮＡを用いた別の実験において、伸長不可能なオリゴマーが、ヒト細胞から単離された総細胞ＲＮＡおよびｍＲＮＡのサンプル中の標的化された転写物の逆転写をブロックする能力を、実証した。これらの実験において、インビトロ転写反応から産生された標識されていないｃＲＮＡ産物（実施例３に記載されるように）を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲプロトコール（実施例４に記載されるように）を用いて、当該分野で一般に使用されるように、定量した。ブロッキングオリゴマーが逆転写工程においてＲＮＡサンプル中の種々の転写物に対応するｃＤＮＡ分子の生成をブロックする効果を、評価した。この分析の結果を、図１５−１６に示す。
【０１３５】
リアルタイム定量ＰＣＲ分析（発蛍光性５’ヌクレアーゼアッセイ、すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析として公知；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０［１９９１］；およびＨｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４［１９９６］を参照のこと）とは、定期的に蓄積したＰＣＲ産物をモニターすることをいう。
【０１３６】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲプロトコールにおいて、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを生成する。第３のオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計する。プローブは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長不可能な構造を有し、そしてレポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識される。レポーター色素からのレーザーによって誘導される発光は、２つの色素がプローブ上にある場合、ともに密接に位置する場合に、クエンチング色素によってクエンチされる。
【０１３７】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ反応は、５’−３’ヌクレアーゼ活性を保持する、熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）を使用する。ＰＣＲ増幅反応の間、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、アンプリコンに鋳型依存性の様式においてハイブリダイズする標識されたプローブを切断する。結果として生じるプローブフラグメントは、溶液中に解離し、そして放出されたレポーター色素が第２の発蛍光団からのクエンチング効果を受けない。レポーター色素の１分子は、新たに合成された各分子から遊離し、そして、クエンチングされていないレポーター色素の検出によって、データの定量的解釈の基礎が提供され、その結果、放出された蛍光レポーター色素の量が、直接、開始アンプリコン鋳型の量に比例する。
【０１３８】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲを、市販の装置（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｍｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて実施することができる。好ましい実施形態において、５’ヌクレアーゼ手順は、リアルタイム定量ＰＣＲ装置（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）における実行である。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、カメラ、およびコンピュータからなる。このシステムは、９６ウェル形式においてサーモサイクラー上のサンプルを増幅する。増幅の間、レーザーによって誘導された蛍光シグナルが、リアルタイムにおいて、９６ウェルの全てについて、光学繊維ケーブルを通して、収集され、ＣＣＤにて検出される。このシステムは、データの解析のための装置を実行するためのソフトウェアを備える。
【０１３９】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイデータは、閾値サイクル（ＣＴ）として表される。上記にて考察したとおり、蛍光値は、各ＰＣＲサイクルの間に記録され、そして、増幅反応におけるその時点までに増幅された産物の量を示す。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録される時のＰＣＲサイクルが、閾値サイクル（ＣＴ）である。
【０１４０】
誤差、および、サンプル間の変動を最小限にするために、ＲＴ−ＰＣＲは、通常、内部標準を用いて、実施される。理想的な内部標準は、異なる組織において一定レベルで発現され、そして実験の処理によって影響を受けない。最も頻繁に遺伝子発現パターンの標準化に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンについてのｍＲＮＡである。
【０１４１】
より最近のＲＴ−ＰＣＲ技術の変法は、リアルタイム定量ＰＣＲであり、この方法は、ＰＣＲ産物の蓄積を二重に標識した発蛍光性プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を通して測定する。リアルタイムＰＣＲは、定量性競合性ＰＣＲ（各標的配列に対する内部競合物を標準化のために使用する）および定量性比較ＰＣＲ（サンプル中に含まれる標準化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する）の両方に適合する。さらなる詳細については、例えば、Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４（１９９６）を参照のこと。
【０１４２】
本件の場合では、ＲＴ後のＩＶＴ増幅によって生成されたｃＲＮＡ（実施例３を参照のこと）を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プロトコールを用いるリアルタイムＰＣＲ定量アッセイにおいて使用した。２つの標的遺伝子（ＡＴＰ５Ｆ１およびＣＥＴＰ（実施例２に記載されるように））からのｃＲＮＡ産物を定量した。さらに４つの非標的化遺伝子からのｃＲＮＡ産物もまた、アッセイした。これらの非標的化遺伝子は、ＡＴＰ５Ｂ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体、βポリペプチド；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１６８６）、ＣＯＸ６Ｂ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｂ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１８６３）、ＲＰＳ４Ｘ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｘ染色体連鎖リボソームタンパク質Ｓ４；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１００７）、およびＰＥＸ７（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ペルオキシソーム生合成因子７；  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００２８８）であった。定量は、ｃＲＮＡを鋳型として用い、ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析と共役したＲＴ−ＰＣＲによって行った（実施例４を参照のこと）。
【０１４３】
このＴａｑＭａｎ分析の結果を、図１５に示す。結果を、ＣＴすなわち閾値サイクル（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブによる検出可能なシグナルが統計的に有意であるとして最初に記録されたＰＣＲサイクルの数として定義される）で表す。ＣＴ値は、標準化曲線（データ示さず）に対する較正によって、実際の濃度に変換する。この分析は、ＰＮＡオリゴマーが特定の標的遺伝子（ＡＴＰ５Ｆ１およびＣＥＴＰ）の転写を、ｍＲＮＡまたは総細胞ＲＮＡ開始物質を鋳型として用いるＲＴの間に、それぞれ９９．１％および９９．６％まで、効果的にブロックし得ることを明らかにした。さらに、これらのデータはまた、ＡＴＰ５Ｆ１およびＣＥＴＰの逆転写反応を阻害するために使用したこれらの同一のブロッキングＰＮＡオリゴマーが、非標的化遺伝子（すなわち、ＡＴＰ５Ｂ、ＣＯＸ６Ｂ、ＲＰＳ４ＸおよびＰＥＸ７）の逆転写を阻害しないことを実証する。このデータを、図１５に示し、そしてグラフとして図１６に示す。
【０１４４】
（Ｇ．高コピー数遺伝子転写物）
任意の所定の細胞のトランスクリプトームは、全ての発現された遺伝子について、等しく分割されているのではないことが、広範に認識されている。その反対に、比較的少数の遺伝子が、任意の所定の細胞において見出されるｍＲＮＡ転写物の主要なほとんどの原因であることが、認識されている。そのような遺伝子は、これらの遺伝子の転写物が細胞性のｍＲＮＡプールの中において不均衡に大量であるため、「高コピー数」遺伝子として、公知である。
【０１４５】
そのような高コピー数遺伝子転写物を、本発明の方法においてブロッキングオリゴマーによって標的化して、その重合化および増幅をブロックし得ることが予想される。例えば、豊富な遺伝子転写物に相補的な伸長不可能なヌクレオベースオリゴマーを、第１鎖ｃＤＮＡ合成の間に使用して（すなわち、逆転写反応）、ｍＲＮＡサンプルからの豊富な転写物のｃＤＮＡへのＤＮＡ重合を抑制し得る。いくつかの実施形態において、１つの多量のポリヌクレオチドを、ブロッキングオリゴマーを用いて標的化する。別の実施形態において、１つより多い高度に豊富な種を、ブロッキングオリゴマーを用いて同時に標的化する。さらに、異なる細胞型が、異なる発現遺伝子のパターンを提示する場合、異なるブロッキングオリゴマーまたはオリゴマーの組み合わせを、種々のサンプルから少量のポリヌクレオチドの富化において、必要に応じて使用することが、意図される。
【０１４６】
本発明のブロッキングオリゴマーは、ＡＴＰ５Ｆ１遺伝子またはＣＥＴＰ遺伝子の標的化オリゴマーに限定されないことが意図される。それとは反対に、大多数の多量（すなわち、高コピー数）遺伝子が公知である。多量の遺伝子の例が、図１４の網羅的ではないリストにおいて、遺伝子ｃＤＮＡ配列についての対応するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号とともに、提供される。この図において列挙される遺伝子は、例示のみであり、さらなる多量の遺伝子（すなわち、ｍＲＮＡ）が、当該分野で広範に公知である。さらに、豊富なリボソームＲＮＡ（例えば、１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡ種）もまた、本発明の方法において使用する場合、ブロッキングオリゴマーの標的として適切である。
【０１４７】
さらに、１つより多い多量のポリヌクレオチドの増幅を、例えば、適切な数の特異的ブロッキングオリゴマーの使用によって、同時にブロックし得る。１つの実施形態において、少なくとも２つの多量のポリヌクレオチドが、ブロックされる。別の実施形態において、少なくとも５つの多量のポリヌクレオチドがブロックされる。さらなる実施形態において、少なくとも１０つの多量のポリヌクレオチドがブロックされる。なおさらなる実施形態において、少なくとも５０から少なくとも１００の多量のポリヌクレオチドが、ブロックされる。他の実施形態において、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００またはそれより多い多量のポリヌクレオチドがブロックされる。
【０１４８】
同様に、１つより少量のポリヌクレオチドが、同時に増幅され得る。例えば、１つの実施形態において、増幅プロセスによって、ブロックされないポリペプチドの全てが増幅される。別の実施形態において、少なくとも２つの小量のポリヌクレオチドが、増幅される。なお別の実施形態において、少なくとも５つの小量のポリヌクレオチドが増幅される。さらに別の実施形態において、少なくとも１０つの小量のポリヌクレオチドが増幅される。他の実施形態において、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００またはそれより多い小量のポリヌクレオチドが増幅される。
【０１４９】
別の局面において、１つ以上の多量のポリヌクレオチドがブロックされ、その間に、１つ以上の少量のポリヌクレオチドが増幅される。１つの実施形態において、少なくとも２つの多量のポリヌクレオチドがブロックされ、その間に、少なくとも２つの少量のポリヌクレオチドが増幅される。別の実施形態において、少なくとも５つの多量のポリヌクレオチドが増幅され、その間に、少なくとも１０の少量のポリヌクレオチドが増幅される。別の実施形態において、少なくとも２０の多量のポリヌクレオチドがブロックされ、その間に、少なくとも２０の少量のポリヌクレオチドが増幅される。さらなる実施形態において、少なくとも２０つの小量のポリヌクレオチドがブロックされ、その間に、少なくとも４０の少量のポリヌクレオチドが増幅される。他の実施形態において、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００またはそれより多い小量のポリヌクレオチドが増幅され、その間に、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００またはそれより多い多量のポリヌクレオチドがブロックされる。
【０１５０】
（Ｈ．逆転写反応における使用のためのＲＮＡの供給源および単離）
ｃＤＮＡ産物を産生するために逆転写反応において使用されるＲＮＡ鋳型の供給源は、任意の特定の供給源に限定することを、意図しない。ＲＮＡ供給源の非限定的な例としては、組織（全血または培養細胞）が挙げられ、そして、さらに任意の器官から得られ得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、ヒト組織、ヒト血液、または培養ヒト細胞由来である。ＲＮＡは、本発明において、総細胞ＲＮＡ、または、ポリＡ  ＲＮＡ（すなわち、ＲＮＡサンプルが、主に、３’−ポリアデニル化を有するｍＲＮＡである）のプールとして使用され得る。市販のＲＮＡもまた、本発明において使用される。
【０１５１】
本発明において使用されるＲＮＡの単離方法は、任意の特定の方法に限定されない。総ＲＮＡおよびポリＡ  ＲＮＡ単離の方法は、当該分野で一般的であり、種々の供給源において記載される（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ４，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９９４］；およびＳａｍｂｒｏｏｋら（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｆｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，［１９８９］を参照のこと）。本発明において使用されるＲＮＡ単離法の非限定的な例としては、塩化セシウム勾配沈殿および示差沈殿を用いるグアニジンイソチオシアネート溶解が挙げられる。さらに、市販の手順を用いるＲＮＡ単離法は、当該分野で一般的であり、例えば、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＲＮＡ単離キット、およびＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）ポリＡ  ＲＮＡ単離キットが挙げられる。
【０１５２】
（Ｉ．逆転写反応）
本発明は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）酵素の存在下において、ＲＮＡが逆転写されてｃＤＮＡ分子の第１鎖を形成する（逆転写）方法を提供する。広範な逆転写酵素反応条件および試薬が、当該分野で周知であり、本発明は、本出願において引用される特定のＲＴ反応条件または試薬に限定することを意図しない。種々の等価なＲＴ反応条件が、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １〜４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９９４］；およびＳａｍｂｒｏｏｋら（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ  １〜３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，［１９８９］のような供給源において見出され得る。
【０１５３】
本発明において使用される逆転写酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性を有する必要はない。従って、ＲＮａｓｅＨ活性を有する逆転写酵素も、有さない逆転写酵素も、本発明において使用され得る。任意の生物またはウイルス由来の逆転写酵素（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶまたはＭｏＭｕＬＶ）逆転写酵素およびトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の組換え形態が挙げられるが、これらに限定されない）が、本発明において使用され得る。逆転写酵素は、市販の供給源（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ（登録商標），ＱＩＡＧＥＮ（登録商標），  ＲｏｃｈｅＴＭＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓおよびＳｉｇｍａ（登録商標）／Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）が挙げられる）から容易に入手可能である。
【０１５４】
本発明が第１鎖ｃＤＮＡ合成に使用される任意の特定の逆転写プライマーに限定されることは、意図されない。本明細書において記載されるように、第１鎖ｃＤＮＡ合成のプライマーは、オリゴ−ｄＴベースのプライマーであり得る。ＲＴプライマーの他のタイプ（例えば、鋳型特異的プライマーまたはランダムヘキサマープライマー）もまた、本発明において使用され得る。
【０１５５】
本発明のｃＤＮＡの第２鎖合成方法は、任意の特定の方法に限定することは、意図されない。本明細書において記載されるように、ｃＤＮＡ第２鎖合成は、ランダムプライマーを用いて開始され得る。しかし、当該分野に精通する者は、他の等価の方法を知っており、そのような方法が、本発明に包含される。例えば、ｃＤＮＡ第２鎖合成は、（ｉ）逆転写酵素の内在性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によって、または（ｉｉ）ＲＮａｓｅＨを添加して、ＲＮＡ鋳型にニックを入れて、適切なＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の開始に適切な５’−ＲＮＡ末端の生成、によって達成され得る。
【０１５６】
さらに、ポリメラーゼのプライマーは、さらなる有利なヌクレオチド配列を含むように操作され得る。例えば、上記のように、プライマー配列は、バクテリオファージＴ７  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター認識配列を含み得る。この最小のＴ７プロモーター認識配列は、５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’（配列番号４０）である。同様に、バクテリオファージＳＰ６およびＴ３プロモーター配列もまた、本発明において使用され得る。なぜなら、これらのプロモーター配列はそれぞれ、ＳＰ６およびＴ３  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写を同様に促進し得るからである。これらの配列は、当該分野で公知である。
【０１５７】
また、ＲＴプライマーは、ＰＣＲプライマーのための標的配列としての使用に適切な、その後のＰＣＲ増幅を促進する、なお別の配列（すなわち、ユニバーサルＰＣＲプライマー配列）を含み得る。所望される場合、制限酵素認識配列もまた、逆転写プライマー中に操作され、その結果、有用な制限部位（ｃＤＮＡのサブクローニングを促進する）が二本鎖ｃＤＮＡ産物中に出現し得る。
【０１５８】
ＤＮＡ制限酵素、サブクローニング技術、および他の分子遺伝学技術は、当該分野で一般的であり、そして、多数の供給源において記載される。同様に、そのようなプロトコールにおける使用のための試薬は、多数の市販業者から、容易に入手可能である。
【０１５９】
（Ｊ．伸長不可能なブロッキングヌクレオベースオリゴマー）
種々の改変ヌクレオチド塩基、ヌクレオチドアナログまたは改変鎖骨格を含む特定のヌクレオベースオリゴマーは、ＤＮＡ依存性またはＲＮＡ依存性のポリメラーゼによる酵素的なＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成の開始において、プライマーとして機能し得ない（すなわち、酵素的に伸長不可能である）。大多数のこれらの構造が、当該分野で公知であり、種々の供給源において記載される（例えば、ＷＯ９５／０８５５６およびＷＯ９９／３４０１４を参照のこと）。本明細書において使用する場合、本発明の伸長不可能なオリゴマーとは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかに結合するか、またはより典型的には、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に結合し得るオリゴマーをいう。すなわち、本発明の伸長不可能なオリゴマーは、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ポリメラーゼの両方についてブロッキング活性を有する。ヌクレオベースオリゴマー配列は、配列特異的様式において相補的ポリヌクレオチド分子に結合し得るが、ヌクレオベースオリゴマーの伸長不可能な化学的構造に起因して、酵素的なＤＮＡ合成もＲＮＡ合成（すなわち、開始も伸長も）も生じない。例えば、いくつかのオリゴマーは、ヌクレオチドの付加に必要とされる３’ヒドロキシル基をリボース糖に有さないため、酵素的な伸長をなし得ない。
【０１６０】
大多数の伸長不可能な改変ヌクレオチドおよび他のヌクレオベース構造が、本発明において使用され得、そして本発明の方法は、任意の特定の伸長不可能なヌクレオベース構造の使用に限定することは意図されない。しかし、ヌクレオベースオリゴマーの種々の特性は、いくつかの種を、他の種よりも好ましくする。これらの好ましい特徴は、１）規定された塩基配列のオリゴマーは、容易に合成され得、そして水溶液中での多少の溶解度を有する、２）オリゴマーは、配列特異的様式において相補的なポリヌクレオチド配列に結合し得、そして安定なヘテロ二本鎖を形成する、３）ヘテロ二本鎖を、ヌクレアーゼ消化に供さず、そして４）ブロッキングオリゴマーは、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼにとって、伸長不可能なプライマー基質である（すなわち、ヌクレオチド鎖の伸長を開始し得ない）。他の実施形態において、ブロッキングオリゴマーのＴｍは、同一の鋳型からの核酸合成の開始のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーのＴｍよりも高いことが好ましい。
【０１６１】
当該分野で公知であり、本発明において使用され得る、伸長不可能なヌクレオベースオリゴマー構造の非限定的な例が以下に考察される。
【０１６２】
ペプチド（または、ポリアミド）核酸（ＰＮＡとしてもまた、公知）は、ブロッキングオリゴマーとして、本発明において使用され得る。ＰＮＡは、ポリヌクレオチドのホスホジエステルリボース骨格がアキラルな非環式の荷電されていないシュードペプチド骨格で置換され、繰り返しのポリアミド構造単位から構成される、ヌクレオベースオリゴマー分子である。ＰＮＡ骨格は、共有結合したヌクレオベースの足場を形成して、規定された塩基配列を有するオリゴマー構造を形成する。ＰＮＡ骨格は、反復するＮ（２−アミノエチル）グリシン単位から構成され、そして本発明において使用される；しかし、本発明のＰＮＡ構造が、この構造に限定されることを意図しない。代替的なＰＮＡ構造およびＰＮＡオリゴマーの合成方法は、当該分野で公知である（ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４（１）：５−２３（１９９６）；ＷＯ９２／２０７０２ならびにＷＯ  ９２／２０７０３）。ＰＮＡオリゴマーを、ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ固相合成を用いて、合成し得、そしてあつらえのオリゴマー配列を、市販業者から容易に注文し得る（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
【０１６３】
これらのＰＮＡ分子は、ヌクレオチドオリゴマーといくつかの特性を共有するが、顕著な差異も有する。第１に、ＰＮＡオリゴマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズして、安定なヘテロ二本鎖を形成し得、そしてこれらのヘテロ二本鎖は、同一の塩基配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの二本鎖よりも高いＴｍを有する。第２に、ＰＮＡオリゴマーは、逆転写酵素または任意の他のＤＮＡポリメラーゼ酵素またはＲＮＡポリメラーゼ酵素のための酵素的な鎖伸長を開始するプライマーとして作用し得ない、さらに、ＰＮＡオリゴマーは、ポリヌクレオチド鋳型中の下流にハイブリダイズした場合、ヌクレオチド鎖伸長をブロックする能力を有する。第３に、ＰＮＡ含有二本鎖は、ＲＮａｓｅＨ切断、または、ポリメラーゼ酵素によってコードされる他のヌクレアーゼ活性による切断についての基質ではない。また、図１１に示されるように、ＰＮＡオリゴマーの長さまたはハイブリダイゼーションの位置は、ポリメラーゼブロッキング活性を示すために、特に限定的ではないようである。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、ＰＮＡオリゴマーは、さらに、そして、必要に応じて、当該分野で公知のように、ＰＮＡオリゴマーの溶解度を改善するために取り込まれるリンカー／スペーサー部分（ＧＥＮ０６３０３２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と称する）を含む（ＷＯ９９／３７６７０；およびＧｉｌｄｅａ  ｅｔら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ３９：７２５５−７２５８［１９９８］を参照のこと）。このリンカー／スペーサーは、内部に、アミノ末端に、または、カルボキシ末端の位置に取り込まれ得、そして１つ以上のリンカー／スペーサーが、オリゴマーに取り込まれ得る。これらの多様な位置での、このリンカー／スペーサーの構造が、図１０Ａ−１０Ｃに示される。
【０１６５】
他の実施形態において、本発明において使用されるＰＮＡ分子は、キラル分子、すなわち、エナンチオマー形態を有する。キラル構造を有するペプチド核酸は、当該分野で公知である（Ｄ’Ｃｏｓｔａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３：８８３−８８６［２００２］）。
【０１６６】
代替的な実施形態において、他のオリゴマーヌクレオベース構造が、本発明において使用され得る。これら構造の合成および特性は、当該分野で記載されている。これらの構造
としては、ロックされた核酸（ＬＮＡ；ＷＯ９８／２２４８９；ＷＯ９８／３９３５２；  およびＷＯ９９／１４２２６を参照のこと）、２’−Ｏ−アルキルオリゴヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル改変オリゴヌクレオチドオリゴ；Ｍａｊｌｅｓｓｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６（９）：２２２４−２２２９［１９９８］を参照のこと）、３’改変オリゴデオキシリボヌクレオチド、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート（ＮＰ）オリゴマー、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド（副溝結合物連結オリゴヌクレオチド）、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴマー、Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネートオリゴマー（例えば、メチルホスホネート（ＭＰ）オリゴマー）、ホスホロアミデート、β−ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、およびα−ホスホジエステルオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１６７】
本発明のブロッキングオリゴマーは構造においてキメラであり得、オリゴマーが化学構造の２つ以上の異なる部分を含むことがさらに意図される（例えば、米国特許第６，３１６，２３０号を参照のこと）。均一なオリゴマー構造を用いるので（例えば、ＰＮＡオリゴマー）、本発明のキメラオリゴマーは、酵素的に伸長不可能であり、それが特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの転写の開始および伸長をブロックする。
【０１６８】
（Ｋ．二本鎖ｃＤＮＡ産物のサブクローニングおよびｃＤＮＡライブラリー構築）
本発明の他の実施形態において、少量の種において富化されたｃＤＮＡ産物がベクター中にサブクローニングされて、他の適用を可能にする。サブクローニングされた産物のプールは、ｃＤＮＡ「ライブラリー」を形成する。サブクローニングされたｃＤＮＡプールは、ｃＤＮＡを生成する逆転写反応を再生する必要なしに、これらｃＤＮＡ分子の増幅を可能にする。このことは、非常に限られた量のｍＲＮＡ開始物質が利用可能である場合、および、ｃＤＮＡ産物が種々の適用において使用される場合において顕著である。
【０１６９】
例えば、少量の転写物について富化されたｃＤＮＡライブラリーの作製は、特に、遺伝子ｍＲＮＡの低コピー数および希少性に起因して、クローニングが扱いにくいいくつかの遺伝子を考慮すると、本発明の有用な実施形態である。また、ｃＤＮＡプールを、正方向の転写または逆転写を許容するベクター中にサブクローニングし得、ここで、正方向の転写は、翻訳および発現スクリーニングに適切なセンス転写物を産生する。
【０１７０】
組換えＤＮＡ分子の操作方法、クローニング技術および適切なベクター（プラスミドベクターおよびウイルス（例えば、ファージ）ベクターを含む）は、当該分野で一般的であり、多くの供給源において記載される（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１〜４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９９４］；およびＳａｍｂｒｏｏｋら（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｆｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１〜３
，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，［１９８９］）。
【０１７１】
（Ｌ．適用）
本発明は、種々のプロトコールにおいて用いることができる。例えば、本発明の方法および組成物は、遺伝子発現の分析、ｃＤＮＡライブラリー構築において使用することができる。しかし、本発明は、これらの適用のみにおいて使用されることを意図しない。実際に、当該分野に精通する者は、直ちに、サンプル中の少量のポリヌクレオチドについて富化する方法についての種々の使用を認識する。同様に、新規の方法を用いて作製された富化されたポリヌクレオチドのプールには、種々の用途がある。本発明において引用される用途は、例示として意図され、そのような例は、包括的ではない。
【０１７２】
（１）遺伝子発現の分析）
本発明において提供されたｃＤＮＡおよびｃＲＮＡ産物は、遺伝子発現の分析のハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。この実施形態において、少量のポリヌクレオチドについて富化されたポリヌクレオチドサンプルをハイブリダイゼーション反応において使用して、遺伝子発現、特に、低コピー数の遺伝子の検出をする。本発明において提供されるように、少量の種について富化し、そして増幅されたポリヌクレオチドのプールは、低コピー数の種の検出を可能にする（以前は、低コピー数の種は、当該分野で現在使用されている方法によっては、検出不可能である）。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション反応は、当該分野で公知のように、高スループット形式において行われる。本発明は、任意の特定のハイブリダイゼーション形式またはプロトコールに限定されることを意図しない。なぜなら、当該分野に精通する者は、種々のハイブリダイゼーションプロトコールに精通しており、そして、多くの高スループットスクリーニング形式に適用する場合に、本発明の利点を十分に認識するからである。
【０１７４】
一般に、高スループットハイブリダイゼーション形式は、固相支持体に固定化されたプローブを使用する。固相支持体は、任意の組成および構成であり、有機支持体および無機支持体を含み、そして、ビーズ、球体、粒子、顆粒、平坦な表面または平坦でない表面、および／あるいは、ウェル、ディッシュ、プレート、スライド、ウェハー、または任意の他の支持体の形式を含み得る。いくつかの実施形態において、固相支持体の構造および構成は、ロボット自動化技術を促進するように設計される。検出、測定、および／または定量の工程もまた、自動化技術を使用してなされ得る。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション形式は、当該分野で広く公知なように、「アレイ」、「マイクロアレイ」、「チップ」、「バイオチップ」である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２２、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｒｒａｙｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９９４］；およびＭ．Ｓｃｈｅｎａ，（編集）、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｂｏｏｋｓ、Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ［２０００］を参照のこと）。一般に、アレイ形式は、大多数のサンプルの自動化分析を促進するか、および／または大多数のアドレス可能な位置を有し、その結果、大多数の遺伝子の遺伝子発現のパターンを、非常に迅速に研究し得る。大多数のアレイ形式を、本発明において使用することが意図され、そして本発明は特定のアレイ形式に限定されることを意図しない。
【０１７６】
少量の種について富化されたポリヌクレオチドのプールの、ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用は、典型的には、ハイブリダイゼーション前にポリヌクレオチドプールを標識することを必要とする。種々の標識技術が、当該分野で公知であり、そして本発明は、任意の特定のポリヌクレオチド標識法に限定されることを、意図しない。本明細書において使用する場合、「標識」とは、検出または可視化を可能とする任意の部分をいうが、それ自身は、検出可能であっても、なくてもよい（例えば、それぞれ、蛍光またはビオチン）。それ自身が検出可能でない標識は、それが第２の分子と相互作用することによって、検出可能となる（例えば、蛍光色素と共役したストレプトアビジン）。標識したポリヌクレオチドは、固相支持体（例えば、マイクロアレイにおいて）に固定したプローブとともに二本鎖である種の検出を可能にする。固定化したプローブとの二本鎖における標識したポリヌクレオチドは、種々の適切な方法（比色決定、蛍光、化学発光および生物発光）を用いて、検出され得る。
【０１７７】
本発明の１つの実施形態において、ポリヌクレオチドプール（ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子のいずれかを含む）の標識は、合成時に適切な標識を合成初期のポリヌクレオチド分子中に取り込むことによって達成される。例えば、本明細書において記載されるように、色素と結合したＵＴＰを、合成初期のＲＮＡ鎖中に取り込むことができる（実施例３を参照のこと）。
【０１７８】
代替的な実施形態において、ポリヌクレオチドプールの標識は、ポリヌクレオチドプールが合成された後に達成される。これらの実施形態において、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、鎖合成の後にポリヌクレオチドに結合される適切な標識を使用して、標識される（すなわち、結合体化されるか、またはそうでなければ、共有結合する）。
【０１７９】
なお別の実施形態において、本発明によって産生される、少量の種について富化されたポリヌクレオチドの標識されていないプールを、標識工程を必要としない方法を用いて、ハイブリダイゼーションまたは遺伝子発現分析において、直接使用し得る。例えば、固定されたプローブとの二本鎖形成を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて検出し得る。例えば、ＳｐｒｅｅｔａＴＭ  ＳＰＲ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）、およびＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標），Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を参照のこと。共鳴光散乱法もまた、そうでなければ標識されていないプローブを用いるハイブリダイゼーション分析における二本鎖形成を検出するために使用し得る（Ｌｕら、Ｓｅｎｓｏｒｓ  １：１４８−１６０［２００１］）。
【０１８０】
本発明は、任意の特定の標識法に限定されることを意図しない。当業者は、広範な種々の代替的な標識プロトコールおよび試薬について精通しており、これらプロトコールおよび試薬の全てが、本発明において使用され得る。
【０１８１】
（２）ｃＤＮＡライブラリー合成およびスクリーニング）
本発明によって提供される方法を使用して、少量の転写物について富化されたｃＤＮＡのプールを生成し得る。１つの実施形態において、これらのｃＤＮＡプールを使用して、少量のメッセージについて富化したｃＤＮＡライブラリーを生成し得る（これらのライブラリーは、低コピー数のｍＲＮＡ分子によって示される遺伝子の同定および単離において使用し得る）。別の実施形態において、少量の種について富化されたこれらｃＤＮＡのプールをまた使用して、まれな種の配列を、直接ｃＤＮＡプールから配列決定し得る（ｃＤＮＡライブラリーの構築前または後に）。
【０１８２】
ｃＤＮＡ分子の生成後のｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、当該分野で公知である。同様に、ｃＤＮＡライブラリースクリーニング法もまた、広範に公知であり、例えば、ホモロジースクリーニングおよびＤＮＡ／タンパク質相互作用スクリーニング、および種々の発現スクリーニングの形態（例えば、抗体ベースの免疫スクリーニング）、タンパク質間相互作用スクリーニング、および機能的アッセイに基づくスクリーニングが挙げられる。ライブラリー構築およびスクリーニングのための方法および試薬は、種々の供給源において利用可能であり、Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１−４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、（編集），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
（３）交差ハイブリダイゼーション（すなわち、非特異的ハイブリダイゼーション）試験）
本発明において提供される組成物および方法は、特定のプローブの配列特異性を決定するためのアッセイにおいて使用され得る。例えば、多くのポリヌクレオチド配列の混合サンプル（例えば、総細胞ＲＮＡ中、または、ｍＲＮＡ中）中に含まれる特定のヌクレオチド配列についてのプローブの特異性を決定することが、頻繁に望まれる。すなわち、プローブが標的配列にのみハイブリダイズするか否か、またはプローブがサンプル中に含まれる意図された標的に加えて他の配列にもハイブリダイズするか（すなわち、プローブが非特異的交差ハイブリダイゼーションを示すか）否かを知ることが有利である。このことは、２つの異なるポリヌクレオチドサンプル（１つのサンプルは、全ての種を含む「野生型」サンプルであり、第２のサンプルは、標的配列を含まない「試験」サンプルである）を用いて達成されるハイブリダイゼーションシグナルを比較することによって、達成される。
【０１８４】
以前に、このタイプの情報は、遺伝子欠損（例えば、ノックアウト）変異がある場合（例えば、実験的生物において調製され得る）にのみ利用可能であった。このタイプの実験は、ヒトの系においては、なされ得ないので、ヒトに適用する場合には、このタイプの情報は、以前には、利用可能ではなかった。しかし、本発明の組成物および方法は、ポリヌクレオチドの単一の種について特異的に枯渇したポリヌクレオチドのプールを提供する。従って、これらのプールを、ヒトサンプル中または任意の他の生物のサンプル中の特異的標的に対してハイブリダイズするプローブの特異性を決定するためのハイブリダイゼーションシグナル試験において使用し得る。
【０１８５】
（Ｍ．製造のための製品）
本発明は、製造のための製品を提供する。より顕著なことには、本発明は、少量の種について富化されたポリヌクレオチドのプールを提供する。これらの富化されたポリヌクレオチドサンプルは、ｃＤＮＡ分子の形態、または、より典型的には、ｃＤＮＡライブラリーの形態（ｃＤＮＡ分子が、プラスミド、ファージミド、またはいくつかの他の適切なベクター中にクローニングされている）であり得る。これらのｃＤＮＡライブラリーは、必要に応じて、発現ライブラリーの形態（ｃＤＮＡが、クローニングされた配列の転写および翻訳を可能にする適切なベクター中にクローニングされている）であり得る。富化されたｃＤＮＡライブラリーを、任意の種、組織または細胞株から調製し得る。ｃＤＮＡライブラリーを、輸送および／または保存の間に、冷蔵または冷凍し得る、適切な容器（例えば、チューブまたはアンプル）に包装し得る。
【０１８６】
本発明は、本発明の方法（すなわち、ブロッキングヌクレオベースオリゴマーの使用によって、少量の種について富化されたポリヌクレオチドのプールの生成方法）を促進するためのキットをもまた、提供する。これらの方法を実施するための材料および試薬は、本発明の実施を促進するキットにおいて、提供される。
【０１８７】
本発明において使用される場合、用語「キット」は、サンプルの処理、方法、アッセイ、分析、または操作を促進する製品の組み合わせを参照して、用いられる。キットは、本方法のために必要な化学試薬または酵素、ならびに他の成分を含み得る。いくつかの実施形態において、本発明は、細胞性ｍＲＮＡの逆転写のためのキットを提供する。これらのキットは、例えば、限定的ではないが、細胞または組織の採取および／または収集のための試薬、ｍＲＮＡの収集および精製のための試薬、逆転写酵素、逆転写の開始および第１鎖ｃＤＮＡ合成に適切なプライマー、少なくとも１つの適切なブロッキングヌクレオベースオリゴマー、第２鎖ｃＤＮＡ合成に適切なプライマー、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、遊離のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、および反応によって産生されたｃＤＮＡ分子の単離／精製に適切な試薬を含む。
【０１８８】
別の実施形態において、本発明は、ｃＤＮＡ分子のインビトロ転写およびｃＲＮＡの産生のためのキットを提供する。例えば、これらのキットは、限定されることはないが、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つの適切なブロッキングヌクレオベースオリゴマー、遊離のリボヌクレオチド三リン酸、および反応によって産生されたｃＲＮＡ分子の単離／精製ために適切な試薬を含む。
【０１８９】
本発明のキットを提供する１つの実施形態において、単一の高コピー数の遺伝子に特異的なブロッキングヌクレオベースオリゴマーが、提供される。別の実施形態において、複数の標的遺伝子に対して特異的なブロッキングヌクレオベースオリゴマーが提供される。１つの実施形態において、少なくとも２つの多量のポリヌクレオチドのブロッキングオリゴマーが提供される。別の実施形態において、少なくとも５つの多量のポリヌクレオチドのブロッキングオリゴマーが提供される。さらに別の実施形態において、少なくとも１０の多量のポリヌクレオチドのブロッキングオリゴマーが提供される。なおさらに別の実施形態において、少なくとも５０〜１００の多量のポリヌクレオチドのブロッキングオリゴマーが提供される。別の実施形態において、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００またはそれより多い多量のポリヌクレオチドのブロッキングオリゴマーが提供される。
【０１９０】
キットにおいて提供される複数のブロッキングオリゴマーは、単一のポリメラーゼ反応において同時に使用されても、されなくてもよい。さらに、本発明のキットにおいて提供されるブロッキングヌクレオベースオリゴマーを、種々の細胞型における使用のために最適化し得る（ブロッキングオリゴマーは、研究対象の特定の細胞型中で、高度に発現することが公知である配列に特異的である）。例えば、上皮細胞の遺伝子発現の研究において、豊富ではない転写物の検出および単離を容易にするために、高度に発現するケラチン遺伝子の増幅をブロックすることが有利である。
【０１９１】
キットは、１つ以上の少量のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーを含み得る。例えば、キットは、上記のように、全てのポリヌクレオチドの特異的増幅のために、１つ以上のランダムプライマーを含み得る。キットはまた、特定の少量のポリヌクレオチドの増幅のために特に設計された、１つ以上のプライマーを含み得る。例えば、１つの実施形態において、キットは、少なくとも２つの少量のポリヌクレオチドの少量の増幅のためのプライマーを含む。なお別の実施形態において、キットは、少なくとも５つの少量のポリヌクレオチドの特異的増幅のためのプライマーを含む。さらなる実施形態において、キットは、少なくとも１０の少量のポリヌクレオチドの特異的増幅のためのプライマーを含む。別の実施形態において、キットは、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００またはそれより多い、少量のポリヌクレオチドの増幅のためのプライマーを含む。
【０１９２】
キットは、多量の遺伝子の増幅をブロックするための１つ以上のブロッキングオリゴマーならびに、少量のポリヌクレオチドの増幅のための１つ以上のプライマーを含有し得る。１つの実施形態において、ブロッキングオリゴマーは、少なくとも２つの多量のポリヌクレオチドをブロッキングするために提供され、そして、プライマーは、少なくとも２つの少量のポリヌクレオチドを増幅するために提供される。別の実施形態において、ブロッキングオリゴマーは、少なくとも５つの多量のポリヌクレオチドをブロッキングするために提供され、そして、プライマーは、少なくとも１０の少量のポリヌクレオチドを増幅するために提供される。なお別の実施形態において、ブロッキングオリゴマーは、少なくとも２０の多量のポリヌクレオチドをブロッキングするために提供され、そして、プライマーは、少なくとも２０の少量のポリヌクレオチドを増幅するために提供される。さらなる実施形態において、ブロッキングオリゴマーは、少なくとも２０の多量のポリヌクレオチドをブロッキングするために提供され、そして、プライマーは、少なくとも４０の少量のポリヌクレオチドを増幅するために提供される。なおさらなる実施形態において、ブロッキングオリゴマーは、１〜５０の多量のポリヌクレオチドをブロッキングするために提供され、そして、ランダムプライマーは、全ての少量のポリヌクレオチドを含む全ての他のポリヌクレオチドを増幅するために提供される。別の実施形態において、プライマーは、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００またはそれより多い少量のポリヌクレオチドを増幅するために提供され、そして、ブロッキングオリゴマーは、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００またはそれより多い多量のポリヌクレオチドをブロックするために提供される。
【０１９３】
別の実施形態において、本発明は、少量の種について富化されたポリヌクレオチドサンプルを標識するためのキットを提供する。これらのキットは、上記に列挙される成分を提供し得、さらに、ｃＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子を標識するための手段を提供する。
【０１９４】
なお別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される方法によって、産生されたポリヌクレオチドのプールを用いる遺伝子発現分析のためのキットを提供する。これらのキットは、上記に列挙される成分を含み得、そしてさらに、標識手段および適切なアレイまたはチップに固定化された適切なハイブリダイゼーションプローブ、ならびにハイブリダイズした複合体の検出／可視化のために必要な試薬を提供する。
【０１９５】
別の実施形態において、本発明は、交差ハイブリダイゼーションアッセイキットを提供し、このキットは、目的のポリヌクレオチド標的配列について特異的に枯渇したサンプル中に存在するプローブ交差ハイブリダイゼーションの量を決定することによる、プローブの特異性の分析のために有用である。この情報は、任意の供給源からのサンプル（ヒトサンプルを含む）から解明され得る。
【０１９６】
さらに、本発明のキットはまた、限定されることはないが、例えば、サンプルの収集および／または精製のための装置および試薬、産物の収集および／または精製のための装置および試薬、サンプルチューブ、ホルダー、トレイ、ラック、ディッシュ、プレート、キットのユーザのための指示書、溶液、緩衝液または他の化学試薬、標準化、規準化、および／またはコントロールサンプルのために使用される適切なサンプルもまた、含み得る。本発明のキットはまた、便利な貯蔵および輸送のために、例えば、蓋を有する箱の中にパッケージングされ得る。
【０１９７】
本発明のいくつかの局面が、図１７に示される。その図面に示されるように、ブロッキングオリゴマーを、種々のポリメラーゼ反応（逆転写反応（例えば、ｃＤＮＡ第１鎖合成）、第２鎖合成、ＰＣＲ反応が挙げられるが、これらに限定されない）において、利用され得る。本発明の選択された適用がまた、図１７に示される。これらとしては、限定されることはないが、ハイブリダイゼーション／遺伝子発現分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ｃＤＮＡライブラリー構築、ｃＤＮＡライブラリースクリーニング、およびインビトロ転写が挙げられる。図１７に示されない、本発明の他の適用および使用は、そして本明細書の他の箇所において記載される。さらに、本発明に具体的に記載されていないが、本発明の記載を読んだ当業者が認識する本発明の使用もまた、本発明の範囲内であることが意図される。
【０１９８】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態および局面をさらに説明するために提供される。これらの実施例が、いかなる局面においても、本発明の範囲を限定するべきではない。特定の反応条件および試薬が記載されるが、当業者が、代替的な条件または等価な条件を、本発明において使用し得ることを理解し、その代替的な条件または等価な条件も、本発明の範囲内であることは、明らかである。
【実施例】
【０１９９】
（実施例１）
（ブロッキングＰＮＡオリゴマー存在下における人工遺伝子転写物の逆転写および第１鎖ｃＤＮＡ合成）
本実施例において、伸長不可能なＰＮＡオリゴマーの逆転写酵素の第１鎖合成をブロックする能力を、インビトロにおいて生成された、ＡＴＰ５Ｆ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１６８８；Ｈ＋輸送ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ、サブユニットＢ、アイソフォーム１遺伝子のサブユニットＢのヒト移入前駆体）に対応する人工転写物を用いて、試験した。種々の長さおよび配列のＡＴＰ５Ｆ１遺伝子に対して特異的なブロッキングオリゴマーを、このアッセイにおいて試験した。
【０２００】
人工的に短縮したＡＴＰ５Ｆ１遺伝子の転写物（６３６リボヌクレオチド長）を、インビトロ転写によって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、鋳型としてのＰＣＲアンプリコンから、生成した。ＡＴＰ５Ｆ１  ＰＣＲアンプリコンの完全な配列を、図６および配列番号１に提供する、人工転写物として使用するＡＴＰ５Ｆ１遺伝子配列は、ヌクレオチド３３−６５８であり、図６に下線を引いて示される。種々のＰＮＡオリゴマーを、人工ＡＴＰ５Ｆ１転写物のいくつかの異なる領域に相補的であるように、設計して、合成した（重複するポリＡテイルの最初の３つのＡ、ポリＡテイルの３塩基上流、および遺伝子内部の他の部位を含む）。ＰＮＡオリゴマーを、市販の固相合成サービスを用いて、合成し（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、そして水中の１％  １−メチル２−ピロリドン（Ｎ−メチルピロリドン；ＮＭＰ）中に５０μＭ濃度（Ａｂｓ２６０で測定）で溶解した。合成したＡＴＰ５Ｆ１  ＰＮＡオリゴマーを図８および配列番号３−２０に示す。
【０２０１】
逆転写反応を、最初に、２．０μｇのＡＴＰ５Ｆ１転写物鋳型および５０ｐｍｏｌ  ＰＮＡオリゴマーを、最終容量１０．５μＬで組み合わせて、行った。混合物を、９５℃にまで５分間、加熱し、次に、４℃にまで冷却した。この混合物に対して、５０ｐｍｏｌのオリゴｄＴ２１デオキシリボヌクレオチドＲＴプライマーまたは水を、最終容量１１．５μＬにまで、添加した。このプライマーは、配列：５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号４１）を有する。
【０２０２】
混合物を７０℃にまで５分間加熱し、次に４℃にまで冷却した。このアニーリングした混合物を用いて、ＲＴ反応を、０．４μＭのＡＴＰ５Ｆ１  ＲＮＡ鋳型、２．５μＭのＰＮＡオリゴマー、２．５μＭのオリゴｄＴ２１プライマー、１ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ、１×Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（登録商標）ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩＴＭ緩衝液、ならびに５単位／μＬのＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ（登録商標）ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩＴＭ逆転写酵素を含む２０μＬの反応容量において、行う。
【０２０３】
反応を、４２℃において１時間行い、その後、７０℃で１５分間、熱によって不活性化した。ＲＮＡ鋳型を、２μＬの２．５Ｍ  ＮａＯＨの添加、および３７℃  １５分間のインキュベーションによって加水分解した。反応混合物を、２０μＬ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０の添加によって中和した。サンプル中の一本鎖ｃＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ  ＤＮＡ精製スピンカラムを、製造業者の指示に従って、精製した。
【０２０４】
ＲＴ反応からの精製したＤＮＡ産物の８分の１を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして、図１１に示すように、エチジウムブロミド染色を用いて検出した。レーン１２は、一本鎖ＡＴＰ５Ｆ１  ＲＮＡ鋳型（ほぼ６００リボヌクレオチド長）を示す。レーン１０は、全くＰＮＡオリゴヌクレオチドを含まない逆転写の一本鎖デオキシリボヌクレオチド産物を示し、これは、単一の優勢な約６００ヌクレオチド長の産物を明らかにする。種々のＰＮＡオリゴマーの阻害効果が、明らかに観察され得る。試験した全てのＰＮＡオリゴマー（エチジウムゲルに示されない他のオリゴマーを含む）は、ｃＤＮＡ第１鎖合成をブロックする、いくらかの能力を示した。ＰＮＡ８５９番および８６４番は、同一の長さを有し、そして同一の推定Ｔｍを有するが、８６４番は、ポリＡテイルの最初の３塩基に結合し、わずかに強いブロッキング効果を有するようである。ポリＡテイルから、それぞれ２３５ヌクレオチドおよび３４５ヌクレオチドに結合する、ＰＮＡ８６９番および８７３番を用いる反応は、ほぼこれらのサイズの少量の短縮型一本鎖ｃＤＮＡを産生するようである。１つより多いＰＮＡブロッカーを用いて、ＲＴ産生の阻害の程度を増加し得る。レーン８および９は、２つまたは３つのＰＮＡ配列を共に、単一のＲＴ反応において使用することが、さらにブロッキング効率を改善し、ｃＤＮＡ産物がこれらの反応において全く検出可能ではないことを実証する。レーン１１は、１ｋｂのラダーＤＮＡサイズマーカー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ／Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１０７８７−０１８）を含む。
【０２０５】
この阻害効果が、ＰＮＡオリゴマーによる逆転写のブロッキングに起因することを実証するために、ＡＴＰ５Ｆ１転写物鋳型を用いるコントロール実験を行った。結果を図１２に示す。第１に、ＰＮＡを溶解するために使用した１％  ＮＭＰ溶媒が、ＲＴ反応を阻害し得るか否かを試験した。図１２のレーン８は、ＲＴ反応中の最終濃度０．０５％のＮＭＰが、ＲＴ活性およびｃＤＮＡ産物の生成になんら影響しないことを示す。
【０２０６】
観察されたＲＴ阻害が、ＰＮＡオリゴマーの用量に依存するか否かについても、試験した。図１２のレーン２−７は、ＲＴ反応産物におけるＰＮＡ濃度の範囲の影響を示す。ＰＮＡオリゴマー８６４番を、２倍の連続希釈において使用した。これらの反応の各々において、ＡＴＰ５Ｆ１転写物鋳型のモル濃度は、０．４μＭであった。ＰＮＡオリゴヌクレオチド濃度が０．５μＭを超える場合、阻害が観察され、このことは、ＰＮＡの標的に対するＰＮＡの結合の化学量論が１対１であることを示唆する。図１２のレーン１は、１ｋｂラダーＤＮＡサイズマーカー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ／Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１０７８７−０１８）を含み、そしてレーン１１は、ＲＮＡラダーマーカー（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１５６２０−０１６）を含む。
【０２０７】
ブロッキング活性の配列特異性を実証するために、一連の同一のＡＴＰ５Ｆ１  ＰＮＡオリゴヌクレオチド希釈を、ＣＥＴＰ遺伝子から生成された異種ＲＮＡ鋳型を用いるＲＴ反応において、使用した。ＣＥＴＰ遺伝子（９５９リボヌクレオチド長）の人工の短縮型転写物を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、鋳型としてのＰＣＲアンプリコンからインビトロ転写によって生成した。ＣＥＰＴアンプリコンについての完全な配列が、図７および配列番号２において提供される。人工転写物として使用したＣＥＴＰアンプリコンの部分は、ヌクレオチド３３−９９１であった（図７に下線を引いて示す）。
【０２０８】
異種転写物を使用するこの実験の結果を、図１３に示す。これら反応の各々において、ＣＥＴＰ転写物鋳型の最終濃度は、０．３μＭであった。ＡＴＰ５Ｆ１特異的ＰＮＡオリゴヌクレオチドの最も高い濃度（２．５μＭ）においてでさえも、ＣＥＴＰ  ＲＴ反応の阻害はない。このことは、ブロッキングは、配列特異的であり、非特異的干渉に起因しないことを示す。図１３において、レーン１は、１ｋｂラダーＤＮＡサイズマーカー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ／Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１０７８７−０１８）を含み、そしてレーン１１は、ＲＮＡラダーマーカー（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１５６２０−０１６）を含む。
【０２０９】
（実施例２）
（ブロッキングＰＮＡオリゴマーの存在下における、逆転写および二本鎖ｃＤＮＡ合成）
本実施例は、総ＲＮＡおよびポリＡ  ＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ）の開始サンプルからの二本鎖ｃＤＮＡの生成を記載し、ここで、ＲＮＡサンプル中の２つの標的転写物の増幅を、ブロッキングＰＮＡオリゴマーを用いて、同時にブロックした。
【０２１０】
これらのＲＴ反応において、ヒト肝臓組織から単離された、総量０．０５〜１．０μｇのｍＲＮＡまたは２〜１０μｇの総ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；ポリＡ  ＲＮＡカタログ番号７９６１、総ＲＮＡカタログ番号７９６０）を、１×ＲＴ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ，製品番号４３２２１７１）中で、２０μＬの反応容量中で、使用した。ＲＴ反応の各々は、ｍＲＮＡ中のポリＡ配列にハイブリダイズし、そしてＴ７プロモーターコンセンサス配列を含む配列を含む、５μＭのオリゴｄＴプライマーを含んだ。このプライマー（Ｔ７−ｄＴ２４）は、配列：５’−ＣＧＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号４２）を有する。
【０２１１】
さらに、反応の別のセットもまた、上記の条件と類似するが、４つの異なるＰＮＡブロッキングオリゴマーを添加（これらの２つは、内在性のＡＴＰ５Ｆ１転写物にハイブリダイズし、そして、これらの２つは、内在性のＣＥＴＰ転写物にハイブリダイズすることが予測される）して、行った。この実験において使用したＡＴＰ５Ｆ１特異的ＰＮＡオリゴマーは、それぞれ８５９番および８７５番である（図８ならびに配列番号４および２０を参照のこと）。この実験において使用したＣＥＴＰ特異的ＰＮＡオリゴマーは、それぞれ８４９番および８５４番（図９ならびに配列番号３１および３６を参照のこと）であった。ＰＮＡブロッカーの各々を、各最終濃度２．５μＭにて、ＲＴ反応に添加した。
【０２１２】
ＲＴ反応混合物を、７０℃にて５分間で変性した。第１鎖ｃＤＮＡ合成を、１００−２００Ｕの逆転写酵素（組換えＭｏＭｕＬＶ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅＴＭ逆転写酵素、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、１ｍＭ  ｄＮＴＰｓおよび３０ＵのＲＮａｓｅインヒビター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号Ｎ８０８−０１１９）の添加、および、４２℃  ２時間のインキュベーションによって実行した。ＲＴ反応を、６５℃で１５分間加熱することによって、終結した。過剰なＲＴプライマーを、ＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）−１００フィルトレーションカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて、反応物中から、除去した。
【０２１３】
第２鎖ｃＤＮＡを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびランダムＤＮＡプライマーを用いて、合成した。反応液は、１０００μＭの各ｄＮＴＰ、２０μＭの５’−リン酸化ランダム８−９マー、０．１−１Ｕ／μＬのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、および１６Ｕ／μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼを、３７℃で２時間含んだ。結果としての二本鎖ｃＤＮＡを、１０−２０ＵのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによって、１５分間３７℃で平滑末端化した。平滑末端二本鎖ｃＤＮＡを、フィルトレーションカラム（ＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）−１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはアフィニティー捕捉カラム（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ  精製キット）によって、精製した。
【０２１４】
（実施例３）
（ｃＤＮＡからのｃＲＮＡのインビトロ転写および生成）
本実施例において、実施例２において記載されるように生成された二本鎖ｃＤＮＡを、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応において使用して、ｃＲＮＡ産物を生成する。２つの異なる反応を、本実施例に記載する。１つの反応において、ＩＶＴ反応は、その後のリアルタイムＰＣＲ定量（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析；実施例４を参照のこと）に適切な、非標識ｃＲＮＡ産物を産生する。第２の反応において、標識されたｃＲＮＡ産物は、蛍光標識されたリボヌクレオチドを、生成中のｃＲＮＡ鎖に取り込むことによって、産生され、高スループットハイブリダイゼーションスクリーニングにおける使用に適切な標識産物を生成する（すなわち、プローブによって検出するアレイ形式；実施例５を参照のこと）。
【０２１５】
ＩＶＴ反応の両方を、鋳型としてのＴ７プロモーター含有二本鎖ｃＤＮＡ、およびｃＤＮＡの３’末端にあるＴ７プロモーター配列からの転写を開始するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、行った。反応を、２０μＬの容量において行い、そして１０−４０Ｕ／μＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＤＴＴ、および２ｍＭのスペルミジンを含んだ。ＩＶＴ反応は、７．５ｍＭの各ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰを用いて、非標識のｃＲＮＡを生成した。別個のＩＶＴ反応のセットは、７．５ｍＭの各ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ、ならびに減少した量のＵＴＰを含み、そして、それに加えて、０．５−２．５ｍＭの色素−リンカーＵＴＰを含んだ。ＩＶＴ反応を、３７℃で６−９時間行った。増幅されたｃＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）総ＲＮＡ精製カラムを用いて精製して、取り込まれなかったリボヌクレオチドを除去した。
【０２１６】
（実施例４）
（ｃＲＮＡ産物のリアルタイム定量ＰＣＲモニタリング）
本実施例は、実施例３に記載のように生成された非標識ｃＲＮＡプール中の特異的ｃＲＮＡ産物の定量を記載する。本実施例は、当該分野において一般的に使用されるように、ＴａｑＭａｎＴＭ  ＲＮＡ定量プロトコールを使用した。ＰＮＡオリゴマーが、逆転写工程において、配列特異的様式において、種々の標的転写物の増幅をブロックするＰＮＡオリゴマーの効力を、評価した。この分析の結果を、図１５−１６に示す。
【０２１７】
蛍光色素結合ＵＴＰを取り込まないＲＴ−ＩＶＴ増幅後に生成されたｃＲＮＡ（実施例３を参照のこと）を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プロトコールを用いるリアルタイムＰＣＲ定量アッセイにおいて使用した。合計４つの非標的化遺伝子（ＡＴＰ５Ｂ、ＣＯＸ６Ｂ、ＲＰＳ４Ｘ、ＰＥＸ７）、および２つの標的化遺伝子（ＡＴＰ５Ｆ１およびＣＥＴＰ）（実施例２に記載されるように）からのｃＲＮＡ産物を定量した。定量は、ｃＲＮＡを鋳型として用いる、ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析と共役した、ＲＴ−ＰＣＲによるものであった。
【０２１８】
ＰＣＲプライマーおよび二重色素標識ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを、Ｐｒｉｍｅｒ  ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ（バージョン１．０、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、設計した。ＰＣＲプライマーのＴｍは、５８℃〜６０℃の範囲であり、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのＴｍは、６８℃〜７０℃の範囲である。
【０２１９】
ＰＣＲ増幅反応物（５０μＬ）は、実施例３に記載されるようにＩＶＴによって生成された１０，０００×希釈したｃＲＮＡサンプル、２×マスターミックス（２５μＬ）（ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰｓ、およびＭｇＣｌ２を含む）、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、遺伝子特異的正方向プライマーおよび逆方向プライマー（各々２００〜９００ｎＭ）、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（２００〜２５０ｎＭ）を含んだ。これらの反応において使用したＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ配列を、表２に示す。
【０２２０】
【表２】
2005536193.tif 000006
ＲＴ−ＰＣＲ反応条件は、５０℃にて４５分間、次に９５℃にて１０分間を含んだ。ＲＴ−ＰＣＲサーマルサイクリングは、９５℃にて１５秒間および６０℃にて１分間の４０サイクルにて進んだ。全ての反応を、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）において、行った。データ収集および分析のためのソフトウェアは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の製品である。
【０２２１】
このＴａｑＭａｎ（登録商標）分析の結果を、図１５に示す。結果を、ＣＴ（すなわち、閾値サイクル）として表す。蛍光の値を、全てのサイクルの間に記録し、そして、増幅反応におけるその時点までに増幅された産物の量を表す、蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録された時点が、閾値サイクル（ＣＴ）である。分析および標準化した値（データを示さず）に対するＣＴ較正の後に、これらのデータが、鋳型としてのｍＲＮＡまたは総細胞性ＲＮＡ開始物質のいずれかを用いるＲＴおよびＩＶＴ増幅の間に、特定の標的遺伝子（ＡＴＰ５Ｆ１およびＣＥＴＰ）の転写を、それぞれ、９９．１％および９９．６％まで効果的にＰＮＡオリゴマーがブロックし得ることを実証することが、決定された。さらに、これたのデータはまた、ＡＴＰ５Ｆ１およびＣＥＴＰの逆転写反応を阻害するために使用された、これら同一のブロッキングＰＮＡオリゴマーが、非標的化されていない遺伝子（例えば、ＡＴＰ５Ｂ、ＣＯＸ６Ｂ、ＲＰＳ４ＸおよびＰＥＸ７）の逆転写を阻害しないこともまた、実証する。図１５に示されるデータはまた、図１６においてグラフとして示される。
【０２２２】
（実施例５）
（２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドブロッキングオリゴマーを使用する、サンプル中の少量の転写物の富化）
本実施例は、ヒト肝臓ポリＡ  ＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ）の開始サンプルからの二本鎖ｃＤＮＡの生成を記載する。ここで、結果としてのｃＤＮＡプールは、特異的な２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドブロッキングオリゴマーを使用する多量のアクチン転写物の増幅をブロックすることによって、少量の転写物を富化する。
【０２２３】
本方法において、ヒト肝臓組織から単離された総量で１．０μｇのポリＡ  ｍＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；カタログ番号７９６１）を、２０μＬの逆転写反応において使用する。このＲＴ反応は、１×ＲＴ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ，製品番号４３２２１７１）、および５μＭのオリゴ−ｄＴプライマー（Ｔ７−ｄＴ２４（配列番号４２）と称する）を使用する。
【０２２４】
さらに、反応液はまた、β−アクチンｍＲＮＡ転写物（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１０１）とハイブリダイズし得るヌクレオベース配列を含む少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドブロッキングオリゴマーを含む。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドオリゴマーを、２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイト（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）（種々の市販の供給源（例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  ＶＡ）から入手可能であり、標準的なポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、精製される）を使用する標準的なホスホロアミダイト化学を使用して、合成される。
【０２２５】
β−アクチン特異的２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドブロッキングオリゴマーの例としては、限定されることはないが、以下が包含される：
【０２２６】
【化４】
2005536193.tif 000007
これらの任意のブロッキングオリゴマーを、ＲＴ反応において使用し得るか、または、代替的に、このオリゴマーの任意の組み合わせを使用し得る（同一反応中で、このオリゴマーの全てを同時に使用することを含む）。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドブロッキングオリゴマーの各々を、最終濃度が、それぞれ２．５μＭまで、ＲＴ反応液に添加する。
【０２２７】
ＲＴ反応混合物を、７０℃で５分間、変性する。第１鎖ｃＤＮＡ合成を、１００〜２００Ｕの逆転写酵素（例えば、組換えＭｏＭｕＬＶ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅＴＭ逆転写酵素、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、１ｍＭ  ｄＮＴＰｓおよび３０ＵのＲＮａｓｅインヒビター（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号Ｎ８０８−０１１９）の添加、および、４２℃  ２時間のインキュベーションによって、行う。ＲＴ反応を、６５℃で１５分間加熱することによって、終結した。過剰なＲＴプライマーを、ＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）−１００フィルトレーションカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて、反応物中から、除去する。
【０２２８】
第２鎖ｃＤＮＡを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびランダムＤＮＡプライマーを用いて、合成した。反応液は、１０００μＭの各ｄＮＴＰ、２０μＭの５’−リン酸化ランダム８−９マー、０．１−１Ｕ／μＬのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、および１６Ｕ／μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼを、３７℃で２時間含んだ。結果としての二本鎖ｃＤＮＡを、１０−２０ＵのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによって、１５分間３７℃で平滑末端化した。平滑末端二本鎖ｃＤＮＡを、フィルトレーションカラム（ＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）−１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはアフィニティー捕捉カラム（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ  精製キット）によって、精製した。
【０２２９】
上記明細書中で言及された、全ての刊行物、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列の提出、特許および公開された特許出願が、本明細書において、その全体を、参考として援用する。本発明の記載された組成物および方法の種々の改変および変更は、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、種々の特定の実施形態を用いて記載してきたが、請求項に記載される本発明は、そのような特定の実施形態に、不当に制限されるべきではないことが、理解される。実際に、遺伝子発現分析および核酸の酵素学および生化学、または関連する分野の当業者にとって明らかである、本発明を実施するために記載された様式の種々の改変は、添付の請求の範囲内であることが、意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
【図１】図１は、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）の結果を示すグラフである。Ｘ軸は、ＳＡＧＥタグＩＤ（１０マーのオリゴヌクレオチド）をプロットし、そしてＹ軸は特定のタグの出現頻度をプロットする。
【図２】図２は、遺伝子発現およびハイブリダイゼーションの仮定的分析を示し、ここで発現において１００，０００倍の範囲を有する７つの異なる遺伝子転写物を分析する。その計算は、２５０μＬのハイブリダイゼーション反応において、０．１〜５００μｇの範囲の未増幅細胞ｍＲＮＡを利用する。ハイブリダイゼーション反応における、各遺伝子転写物の予測される濃度を、ｐＭで提供する。
【図３】図３は、２５０μＬのアレイハイブリダイゼーションにおいて、１０４から１０８個のＨｅＬａ細胞の範囲の、異なる量の開始材料を考慮して、ｍＲＮＡの定量および濃度の仮定的計算を提供する表を示す。平均転写物長を１．９キロベース（ｋｂ）と仮定して、その表は仮定的なＲＮＡ収量（μｇ、ｐｍｏｌ、および分子数）、およびハイブリダイゼーション反応における推定ｍＲＮＡモル濃度を提供する。これらの計算は、少量、中程度、および多量の種類のｍＲＮＡ転写物に関して示される。表において、１ｐＭの検出下限より多いｍＲＮＡ種を囲んで示す。
【図４】図４は、遺伝子発現およびハイブリダイゼーションの仮定的分析を示し、ここで発現レベルにおいて１０，０００倍の範囲を有する６つの異なる遺伝子（遺伝子Ａ−Ｆ）を、増幅し、ハイブリダイゼーション法において分析する。３つのシナリオが提供され、ここで標識されたｃＤＮＡまたはｃＲＮＡいずれかの１μｇ、１０μｇまたは１００μｇを、ハイブリダイゼーション反応で使用する。ハイブリダイゼーション反応において、各遺伝子転写物の推定濃度を、ｐＭで提供する。
【図５】図５は、最も多量の転写物（遺伝子Ａ）のレベルが９９％減少された以外は、図４と同様の仮定的遺伝子発現分析を示す。
【図６】図６は、Ｈ＋輸送ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ、サブユニットＢ、アイソフォーム１（ＡＴＰ５Ｆ１）遺伝子のサブユニットＢのヒト移入前駆体のＰＣＲアンプリコンヌクレオチド配列を示す。合成ＲＮＡ鋳型として使用されるＰＣＲアンプリコンの領域を、下線で示す。
【図７】図７は、ヒトコレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）遺伝子のＰＣＲアンプリコンヌクレオチド配列を示す。合成ＲＮＡ鋳型として使用されるＰＣＲアンプリコンの領域を、下線で示す。
【図８】図８は、ヒトＡＴＰ５Ｆ１遺伝子転写物に対して特異的および配列が相補的な１８の異なる合成ＰＮＡオリゴマー（番号８５８〜８７５）を記載する表を示す。ＰＮＡオリゴマーの配列および位置が提供される。ＰＮＡ：ＲＮＡ二本鎖の推定Ｔｍ（℃）、およびＰＮＡオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有する類似するオリゴデオキシリボヌクレオチドの推定Ｔｍも示される。配列中の「Ｏ」位置はリンカー／スペーサーを示し、その構造を図１０で示す。
【図９】図９は、ヒトＣＥＴＰ遺伝子転写物に対して特異的でありかつ配列が相補的な１９の異なる合成ＰＮＡオリゴマー（番号８３９〜８５７）を記載する表を示す。ＰＮＡオリゴマーの配列および位置が提供される。ＰＮＡ：ＲＮＡ二本鎖の推定Ｔｍ（℃）、およびＰＮＡオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有する類似するオリゴデオキシリボヌクレオチドの推定Ｔｍも示される。配列中の「Ｏ」位置はリンカー／スペーサーを示し、その構造を図１０で示す。
【図１０】図１０Ａから１０Ｃは、ＧＥＮ０６３０３２リンカー／スペーサーの構造を示す。図１０Ａは、それがＰＮＡオリゴマーにおいて内部位置にある場合の、この分子の構造を示す。図１０Ｂは、それがＰＮＡオリゴマー分子中でアミノ末端位置にある場合の、その分子の構造を示す。図１０Ｃは、それがＰＮＡオリゴマー分子中でカルボキシル末端位置にある場合の、その分子の構造を示す。
【図１１】図１１は、様々な逆転写反応（すなわち、ＲＴ第１鎖合成；レーン２−１０）の一本鎖産物を含む、エチジウムブロミド染色アガロースゲルの画像を示す。これらのＲＴ反応は、ＡＴＰ５Ｆ１合成ＲＮＡ鋳型、オリゴｄＴ合成プライマー、および様々なＡＴＰ５Ｆ１特異的ＰＮＡ阻害オリゴマーを使用した。鋳型ＲＮＡのみを含むコントロール反応（レーン１２）、プライマーなしのＲＴ反応（レーン１１）、および１ＫｂのＤＮＡラダー（レーン１）もゲル上にある。
【図１２】図１２は、様々な逆転写反応（すなわち、ＲＴ第１鎖合成；レーン２−７）の一本鎖産物を含む、エチジウムブロミド染色アガロースゲルの画像を示す。これらのＲＴ反応は、ＡＴＰ５Ｆ１合成ＲＮＡ鋳型、オリゴｄＴ合成プライマー、およびＡＴＰ５Ｆ１特異的ＰＮＡ阻害オリゴヌクレオチド番号８６４の濃度滴定を使用した。鋳型ＲＮＡのみを含むコントロール反応（レーン１０）、プライマーなしのＲＴ反応（レーン９）、ＮＭＰ緩衝液コントロール（レーン８）、１ＫｂのＤＮＡラダー（レーン１）、およびＲＮＡサイズラダー（レーン１１）もゲル上にある。
【図１３】図１３は、様々な逆転写反応（すなわち、ＲＴ第１鎖合成；レーン２−７）の一本鎖産物を含む、エチジウムブロミド染色アガロースゲルの画像を示す。これらのＲＴ反応は、ＣＥＴＰ合成ＲＮＡ鋳型、オリゴｄＴ合成プライマー、およびＡＴＰ５Ｆ１特異的ＰＮＡ阻害オリゴヌクレオチド番号８６４の濃度滴定を使用した。鋳型ＲＮＡのみを含むコントロール反応（レーン１０）、プライマーなしのＲＴ反応（レーン９）、ＮＭＰ緩衝液コントロール（レーン８）、１ＫｂのＤＮＡラダー（レーン１）、およびＲＮＡサイズラダー（レーン１１）もゲル上にある。
【図１４】図１４は、公知の高度に発現される遺伝子の表を、それらの遺伝子の発現ｃＤＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号と共に提供する。
【図１５】図１５は、ヒト肝臓から単離された全細胞ＲＮＡまたはｍＲＡＮいずれかから得られたｃＤＮＡ分子のインビトロ転写によって産生された６つのｃＲＮＡ産物の、ＴａｑＭａｎＲ定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。そのｃＤＮＡプールを産生した逆転写反応を、ＡＴＰ５Ｆ１遺伝子およびＣＥＴＰ遺伝子に特異的な阻害ＰＮＡオリゴマーの存在下または非存在下のいずれかで行なった。表に示した値は、閾値サイクル（ＣＴ）である。ｃＲＮＡの定量を、標的化遺伝子および非標的化遺伝子の両方について決定した。
【図１６】図１６は、図１５で示した閾値サイクル（ＣＴ）ＴａｑＭａｎＲ分析データのグラフ表示を示す。白いバーは、あらゆる阻害ＰＮＡオリゴマーの非存在下でｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡから合成されたｃＲＮＡを用いて産生されたＣＴ値を示し、斑のバーは、阻害ＰＮＡオリゴマーの存在下でｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡから合成されたｃＲＮＡを用いて産生されたＣＴ値を示し、斜線のバーは、あらゆる阻害ＰＮＡオリゴマーの非存在下で全ＲＮＡ由来のｃＤＮＡから合成されたｃＲＮＡを用いて産生されたＣＴ値を示し、そして黒いバーは、阻害ＰＮＡオリゴマーの存在下で全ＲＮＡ由来のｃＤＮＡから合成されたｃＲＮＡを用いて産生されたＣＴ値を示す。
【図１７】図１７は、本発明のｃＤＮＡ合成および他の局面のフローチャートを示す。これらの様々な反応における阻害オリゴマーの使用を、大きな矢印で示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月6日(2005.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005536193000001.app
【国際調査報告】
2005536193.tif 000044
2005536193.tif 000045
2005536193.tif 000046