(57)【要約】本発明は、ハイブリダイゼーションによりターゲットヌクレオチド配列を分析するためのオリゴヌクレオチド及びその用途に関する。前記オリゴヌクレオチドは、次の一般構造：5′-Xp-Yq-Zr-3′または5′-Zr-Yq-Xp-3′を有する。式中、Xpは、特定のハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する第１のハイブリダイゼーション部分を示し、前記特定のヌクレオチド配列は、ハイブリダイズされる試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列に実質的に相補的であり；Yqは、少なくとも２個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を示し；Zrは、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を有する第２のハイブリダイゼーション部分を示し；p、q及びrは、ヌクレオチドの数であり；そしてX、Y及びZは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。
2005522190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイゼーションにより試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列を分析するためのオリゴヌクレオチドであって、次の一般構造を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
5′-Xp-Yq-Zr-3′または5′-Zr-Yq-Xp-3′
[式中、Xpは、特定のハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する第１のハイブリダイゼーション部分を示し、前記特定のヌクレオチド配列は、ハイブリダイズされる試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列に実質的に相補的であり；Yqは、少なくとも２個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を示し；Zrは、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を有する第２のハイブリダイゼーション部分を示し；p、q及びrは、ヌクレオチドの数であり；X、Y及びZは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。]
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドは、第１及び第２のハイブリダイゼーションとしての２つの別個のハイブリダイゼーションに関与し、前記第１のハイブリダイゼーション部分は、第１のハイブリダイゼーションで特異的にハイブリダイズする部位として作用し、前記第２のハイブリダイゼーション部分は、第２のハイブリダイゼーションで普遍的にハイブリダイズする部位として作用することを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記調節部分は、前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部分を調節することができることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体は、天然のDNA/RNA塩基を識別することなく、天然のDNA/RNA塩基の各々と塩基対を形成することができることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体は、デオキシイノシン、イノシン、7-デアザ-2′-デオキシイノシン、2-アザ-2′-デオキシイノシン、2′-OMe イノシン、2′-F イノシン、デオキシ 3-ニトロピロール、3-ニトロピロール、2′-OMe 3-ニトロピロール、2′-F 3-ニトロピロール、1-(2′-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロール、デオキシ 5-ニトロインドール、5-ニトロインドール、2′-OMe 5-ニトロインドール、2′-F 5-ニトロインドール、デオキシ 4-ニトロベンズイミダゾール、4-ニトロベンズイミダゾール、デオキシ 4-アミノベンズイミダゾール、4-アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、2′-F ネブラリン、2′-F 4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-5-イントロインドール、PNA-ネブラリン、PNA-イノシン、PNA-4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-3-ニトロピロール、モルフォリノ-5-ニトロインドール、モルフォリノ-ネブラリン、モルフォリノ-イノシン、モルフォリノ-4-ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ-3-ニトロピロール、ホスホルアミデート-5-ニトロインドール、ホスホルアミデート-ネブラリン、ホスホルアミデート-イノシン、ホスホルアミデート-4-ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート-3-ニトロピロール、2′-0-メトキシエチルイノシン、2′-0-メトキシエチルネブラリン、2′-0-メトキシエチル 5-ニトロインドール、2′-0-メトキシエチル 4-ニトロ-ベンズイミダゾール、2′-0-メトキシエチル3-ニトロピロール及びこれらの組合せからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体は、デオキシイノシン、イノシン、1-(2′-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロールまたは5-ニトロインドールであることを特徴とする、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記調節部分は、連続したユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含んでなることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記デオキシリボヌクレオチドは、天然のdNMP、修飾ヌクレオチド及び非天然ヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記pは、6〜100の整数であることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記qは、少なくとも3であることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記qは、少なくとも4であることを特徴とする、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記qは、2〜15の整数であることを特徴とする、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記rは、15〜100の整数であることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記第２のハイブリダイゼーション部分は、前記試料核酸のいかなる部位に対しても実質的に相補的ではない予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドは、不溶性担体に固定化されていることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、ハイブリダイゼーションを実施するためのキット。
【請求項１７】
ハイブリダイゼーションにより試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列の存在を検出する方法であって、次のステップ：
(a)請求項１〜１５のいずれか１項に記載の第１のオリゴヌクレオチドを使用して、第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分が前記ターゲットヌクレオチド配列にハイブリダイズされる条件下で第１のハイブリダイゼーションを実施するステップ、ただし、前記第１のオリゴヌクレオチドは、その第１のハイブリダイゼーション部分に、ハイブリダイズされる前記ターゲットヌクレオチド配列に実質的に相補的な特定のヌクレオチド配列を有するものであること；及び
(b)前記ターゲットヌクレオチド配列と前記第１のハイブリダイゼーション部分とのハイブリダイゼーションを表すシグナルにより、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分に実質的に相補的な、前記試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列の存在または不存在を検出するステップ；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
(c)ステップ(a)で使用した前記第１のオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分にハイブリダイズされる実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する第２のオリゴヌクレオチドを使用して、前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第１のオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分にハイブリダイズされる条件下で第２のハイブリダイゼーションを実施するステップ；及び
(d)前記第１のオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分と前記第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを表すシグナルを検出し、それにより、ステップ(b)の前記シグナルの存在及び不存在が、前記ターゲットヌクレオチド配列と前記第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分とのハイブリダイゼーションにのみ起因することを確認するステップ；
をさらに含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列のヌクレオチド変異を同定する方法であって、次のステップ：
(a)請求項１〜１５のいずれか１項に記載の第１のオリゴヌクレオチドを使用して、第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分が試料核酸のターゲットヌクレオチド配列にハイブリダイズされる条件下で第１のハイブリダイゼーションを実施するステップ、ただし、前記第１のオリゴヌクレオチドは、その第１のハイブリダイゼーション部分に、ハイブリダイズされる試料核酸の前記ターゲットヌクレオチド配列に実質的に相補的な特定のヌクレオチド配列を有するものであり、第１のオリゴヌクレオチド及びターゲットヌクレオチド配列の各々は、前記ヌクレオチド変異に対応する疑問位置を含み、それにより、前記疑問位置がターゲットヌクレオチド配列のその対応ヌクレオチドに相補的な第１のオリゴヌクレオチドの相補ヌクレオチドにより占められる場合には、前記ヌクレオチド変異を含む第１のオリゴヌクレオチドがターゲットヌクレオチド配列にハイブリダイズされること；及び
(b)前記ターゲットヌクレオチド配列と前記第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分とのハイブリダイゼーションを表すシグナルを検出して、前記試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列の前記ヌクレオチド変異を同定するステップ；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
(c)ステップ(a)で使用した前記第１のオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分にハイブリダイズされる実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する第２のオリゴヌクレオチドを使用して、前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第１のオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分にハイブリダイズされる条件下で第２のハイブリダイゼーションを実施するステップ；及び
(d)前記第１のオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分と前記第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを表すシグナルを検出し、それにより、ステップ(b)の前記シグナルの存在及び不存在が、前記ターゲットヌクレオチド配列と前記第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分とのハイブリダイゼーションにのみ起因することを確認するステップ；
をさらに含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のオリゴヌクレオチドの調節部分は、前記ターゲットヌクレオチド配列とハイブリダイズされる前記第１のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部分を、前記第１のハイブリダイゼーション部分に制限することを特徴とする、請求項１７または１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のオリゴヌクレオチドの調節部分は、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーション特異性を増加させることを特徴とする、請求項１７または１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料核酸は、ヌクレオチド変異を含む短いヌクレオチドセグメントであり、前記短いヌクレオチドセグメントの対応するヌクレオチド配列を増幅して調製されたものであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料核酸は、ヌクレオチド変異を含む２以上の短いターゲットヌクレオチドセグメントであり、前記短いヌクレオチドセグメントの各々の対応するヌクレオチド配列を増幅して調製されたものであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヌクレオチド変異は、一塩基多型または点突然変異であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヌクレオチド変異は、ヒト核酸に含まれることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヌクレオチド変異は、感染性疾患を誘発する生物の核酸に含まれることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ(a)で使用した前記第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分は、ヌクレオチド変異に対応するヌクレオチドに相補的なヌクレオチドにより占められた疑問位置を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ(a)で使用した前記第１のオリゴヌクレオチドの疑問位置は、その第１のハイブリダイゼーション部分の中央に位置することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ(a)で使用した前記第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分は、長さが8〜30ヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ(a)で使用した前記第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分は、長さが10〜15ヌクレオチドであることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ(a)で使用した前記第１のオリゴヌクレオチドの疑問位置は、前記第１のオリゴヌクレオチドの3′末端ヌクレオチドから約10塩基以内にあることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ(a)で使用した前記第１のオリゴヌクレオチドの疑問位置は、前記第１のオリゴヌクレオチドの3′末端ヌクレオチドから約6塩基以内にあることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ(a)で使用した前記第１のオリゴヌクレオチドの疑問位置は、前記第１のオリゴヌクレオチドの3′末端ヌクレオチドから4〜6塩基以内にあることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ(a)で使用した前記第１のオリゴヌクレオチドは、その第１のハイブリダイゼーション部分に、少なくとも１つの人為的なミスマッチヌクレオチドを有し、前記ミスマッチヌクレオチドは、前記第１のオリゴヌクレオチドの疑問位置に実質的に隣接していて、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
請求項19〜37のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットを含むことを特徴とする、試料核酸中のターゲット核酸のヌクレオチド変異を同定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料核酸の選択されたヌクレオチド配列を分析するための核酸ハイブリダイゼーションの分野に関するものである。より詳細には、本発明は、特異的ハイブリダイゼーションを成す機能とハイブリダイゼーション結果を検証する機能との二重機能を有する新規な構造のハイブリダイゼーション部分調節オリゴヌクレオチド及びその応用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一本のDNA鎖が相補的な他の鎖に結合して二重鎖構造を形成するDNAハイブリダイゼーションは、分子生物学では基本的なプロセスである。二重鎖の形成は、イオン強度、塩基組成、断片の長さ、ミスマッチの程度及び変性剤の存在により影響を受ける。原則的に、どのような核酸二本鎖DNA、一本鎖DNA、オリゴヌクレオチド、mRNA及びRNAも、プローブとして作用することができ、その選択は実験の目的により決定される。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは、ターゲット配列との完全にマッチした二重鎖を形成するために使用される。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション分析法は、次の一般スキームに基づく。すなわち、プローブまたはターゲットを標識して(例えば、放射性同位元素、蛍光染料または反応性化合物を利用)、核酸をハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせ、ハイブリダズされなかった標識物質を除去し、残存する標識を定量する。
【０００３】
完全にマッチした二重鎖と１個以上のミスマッチ塩基対を有する二重鎖との識別を高める方法は、特定の核酸配列の決定において非常に有用な手段であり、臨床診断、遺伝子関連研究及び法医学的分析においても価値があることは明らかである。例えば、Wallance及び共同研究者らは、単一塩基の変化のような微細な配列の違いが短いオリゴマー(例えば、14-mer)を識別するのに十分であることを提示して、β-グロビン遺伝子における点突然変異の分子的分析に対する有用性を実証した(Wallace et al., 1981; Conner et al., 1983)。
【０００４】
相補鎖を正確に同定するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの強力な力にも拘わらず、それには限界がある。オリゴヌクレオチドを含むハイブリッドは、長い核酸のハイブリッドに比べかなり不安定である。これは、低い融解温度に反映される。ハイブリッドの不安定性は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを設計するときに考慮される最も重要な要素の一つである。完全にマッチした鋳型と、１個の塩基のみがミスマッチの鋳型との安定性の差は、非常に小さくて、Tms(二重鎖の融解温度)において0.5℃程度の差である(Tibanyenda et al., 1984; Werntges et al., 1986)。オリゴマーが短ければ短いほど(より複雑な混合物中の相補鎖の同定を可能にする)、全体的な二重鎖の安定性に及ぼす単一塩基ミスマッチの影響はさらに大きくなる。しかし、このような短いオリゴヌクレオチドを用いることの短所は、これらが完全に相補的な配列に対しても弱くハイブリダイズするということである。それゆえ、それらは低いストリンジェンシーの条件下で使用しなければならない。従って、短いオリゴヌクレオチドを修飾して高度のストリンジェンシー条件下でさえも安定であるようにすることにより、短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの特異性を高度のストリンジェンシー条件下でも向上させて、単一ヌクレオチドのミスマッチを識別できるようにする方法が依然必要とされている。
【０００５】
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの特異性を改善するために、たくさんの研究が成されてきた。高感度ハイブリダイゼーションのためにDNA塩基を化学的に修飾する方法(Azhikina et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11460-11462 (1993))、及びハイブリダイゼーション後の洗浄を低温で長時間実施してミスマッチを識別する能力を高める方法 (Drmanac et al., DNA and Cell Biology, 9:527-534 (1990))が提案された。最近、人為的なミスマッチによりDNAハイブリダイゼーションで一塩基多型(SNPs)の識別を高めるための他の方法が紹介されている(Guo et al., Nature Biotechnology, 15:331-5(1997))。また、米国特許第6,077,668号、第6,329,144号、第6,140,054号、第6,350,580号、第6,309,824号、第6,342,355号及び第6,268,128号を含む多数の米国特許は、ハイブリダイゼーションのためのプローブ及びその応用を開示している。各方法に対する改良法が次々と紹介されているが、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを含むあらゆる方法及び技術は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの非特異性に起因する制限及び問題から完全に免れることはできないだろう。
【０００６】
しかも、支持体上へのオリゴヌクレオチドのスポッティング(spotting)及び固定化の失敗、そして最適ハイブリダイゼーション条件の樹立の失敗などのような人為的な要因は、ハイブリダイゼーションのネガティブデータに影響を与える可能性がある；特に、間違った結果の影響は、ハイスループットスクリーニング法により得られた結果において大きい。スポッティングとハイブリダイゼーションにもともと備わっているこのような人為的要因は、オリゴヌクレオチドに基づくDNAマイクロアレイにおいて、実際上の大きな欠点となる。従って、ハイブリダイゼーションの結果を検証する機能を有するオリゴヌクレオチドを使用することができれば、オリゴヌクレオチドに基づいたDNAマイクロアレイにおいて有利であろう。
【０００７】
本明細書全体を通して多数の特許文献及び論文が掲載されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、本発明及び本発明が属する分野の技術水準をより詳しく説明するために、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のプローブ及びハイブリダイゼーション方法に存在する問題を解決するために鋭意研究した結果、本発明者は、高度の特異性を有するハイブリダイゼーションを可能にする新規なオリゴヌクレオチド、及びハイブリダイゼーションを基礎にする技術分野でのその応用技術を開発した。
【０００９】
従って、本発明の目的は、ハイブリダイゼーションにより試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列を分析するためのオリゴヌクレオチドを提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、ハイブリダイゼーションにより試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列の存在を検出するための方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列のヌクレオチド変異を同定するための方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、ハイブリダイゼーションを実施するためのキットを提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列のヌクレオチド変異を同定するためのキットを提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的及び利点は、下記の詳細な説明、添付の特許請求の範囲及び図面によりさらに明確になるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、特異的ハイブリダイゼーションを成す機能と、ハイブリダイゼーション結果を定量的に検証する機能との二重機能を有するオリゴヌクレオチドに関するものである。本発明のオリゴヌクレオチド、即ち、ハイブリダイゼーション部分調節オリゴヌクレオチド(以下、「HPCオリゴヌクレオチド」という)は、ターゲットヌクレオチド配列に対して非常に特異的なハイブリダイゼーション反応を保証するため、ハイブリダイゼーションを利用する多様な分析を高い信頼性でもって実施することができるようになる。
【００１６】
HPCオリゴヌクレオチドの原理は、その新規な構造に基づいており、その構造は、(i)ターゲットヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する第1のハイブリダイゼーション部分、(ii)予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を有する第2のハイブリダイゼーション部分、及び(iii)第1のハイブリダイゼーション部分と第2のハイブリダイゼーション部分との間に位置し、少なくとも２個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を有する。
【００１７】
本発明のHPCオリゴヌクレオチドは、第1及び第2のハイブリダイゼーション部分が各々第1のハイブリダイゼーション及び第2のハイブリダイゼーションの２つの独立したハイブリダイゼーションに関与できるようにする。HPCオリゴヌクレオチド中のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体の存在は、第1のハイブリダイゼーション部分のみが第1のハイブリダイゼーションにおいて目的のターゲットヌクレオチド配列とハイブリダイズできるようにする。さらに、第2のハイブリダイゼーション部分は、第2のハイブリダイゼーションにおいてハイブリダイズする普遍的部位として作用し、第1のハイブリダイゼーション反応の結果を定量的に検証する。従って、この二重機能HPCオリゴヌクレオチドを使用するだけで、ターゲットヌクレオチド配列との特異的ハイブリダイゼーション及び第1のハイブリダイゼーションの結果の定量的な検証を達成することができる。
【００１８】
それゆえ、本発明のHPCオリゴヌクレオチドは、特定のストリンジェンシー条件下でオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの特異性を改善することと、ハイブリダイゼーション結果を定量的に検証することから、従来のオリゴヌクレオチドとは根本的に相違する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のHPCオリゴヌクレオチドは、非常に効果的で、核酸ハイブリダイゼーションに基づいた用途に幅広く適用できる。また、従来のオリゴヌクレオチドにおけるハイブリダイゼーション特異性に係わる様々な問題点を、本発明のHPCオリゴヌクレオチドにより根本的に解決することができる。本発明のHPCオリゴヌクレオチドの特徴及び利点は、以下のとおりである：
(a)本発明のオリゴヌクレオチドの調節部分は、少なくとも２個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含み、塩基対形成での弱い水素結合相互作用により本発明のオリゴヌクレオチドの他の部位より低いTmを有するため、HPCオリゴヌクレオチドの第1のハイブリダイゼーション部分がターゲット核酸とハイブリダイズされる条件下では、ターゲット核酸とのハイブリダイゼーションにおいて有利でない。従って、第1及び第2のハイブリダイゼーション部分間のユニバーサル塩基残基群の存在は、これらの部分間に境界を形成し、これは、第1のハイブリダイゼーション部分がターゲットヌクレオチド配列とハイブリダイズする条件下で、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部分を第1のハイブリダイゼーション部分に限定し、その結果、第２のハイブリダイゼーション部分が第1のハイブリダイゼーション部分とターゲットヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション反応から完全に除外される。即ち、調節部分は、第１のハイブリダイゼーション部分がターゲットヌクレオチド配列とハイブリダイズするとき、第２のハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーションを妨害することができ、それゆえ、第１のハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーション特異性を強化する。従って、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は正確に調節することができ、これは、所望の数のハイブリダイゼーション配列を有するオリゴヌクレオチドの設計を可能にする。こうしたことは、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部分を制限する必要がある場合(例えば、一塩基多型(SNP)遺伝子型決定、DNAマイクロアレイスクリーニング、及び異なって発現された遺伝子の検出)に特に有用である。
(b)本発明のHPCオリゴヌクレオチドを支持体（例えば、ナイロン膜またはガラス）に結合させる場合、ターゲットヌクレオチド配列に相補的ではない第２のハイブリダイゼーション部分は、第１のハイブリダイゼーション部分を、そのターゲットヌクレオチド配列にハイブリダイズされるように遊離の状態にしておき、これにより第１のハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーション強度(効率)を増加させる。
(c)第１のハイブリダイゼーション部分の増加されたハイブリダイゼーション強度(効率)は、高温のハイブリダイゼーション及び洗浄温度を含む高ストリンジェンシー条件下でもハイブリダイゼーション反応を実施できるようにして、第１のハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーション特異性を増加させる。
(d)本発明のHPCオリゴヌクレオチドの上述した特徴は、ハイブリダイゼーション特異性を劇的に増加させ、結果的に、ハイブリダイズされた二重鎖の全体を通してただ一つのミスマッチでさえも完全なマッチから識別することができる。従って、本発明のHPCオリゴヌクレオチドは、ターゲット核酸のヌクレオチド変異、例えば、一塩基多型及び点突然変異を同定するのに非常に有用であり、プローブ設計のための「サーチパラメーター」(例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、ハイブリダイゼーション温度、GC含量)に対する高い寛容性(tolerance)を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
(e)さらに、第２のハイブリダイゼーション部分は、第１のハイブリダイゼーションの結果を検証するため、支持体上へのオリゴヌクレオチドの固定化の失敗及び最適なハイブリダイゼーション条件の樹立の失敗といった人為的な影響に起因する誤った結果からの第１のハイブリダイゼーションデータを排除することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のHPCオリゴヌクレオチドの原理
本発明の一態様によると、本発明は、ハイブリダイゼーションにより試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列を分析するためのHPCオリゴヌクレオチドを提供する。HPCオリゴヌクレオチドは、次の一般構造を有する：
5′-Xp-Yq-Zr-3′または5′-Zr-Yq-Xp-3′
式中、Xpは、特定のハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する第１のハイブリダイゼーション部分を示し、前記特定のヌクレオチド配列は、ハイブリダイズされる試料核酸中の前記ターゲットヌクレオチド配列に実質的に相補的であり；Yqは、少なくとも２個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を示し；Zrは、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を有する第２のハイブリダイゼーション部分を示し；p、q及びrは、ヌクレオチドの数であり；X、Y及びZは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。
【００２１】
HPCオリゴヌクレオチドの原理は、少なくとも２個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分により分離された第１のハイブリダイゼーション部分及び第２のハイブリダイゼーション部分を有するその新規な構造と、第１のハイブリダイゼーション部分及び第２のハイブリダイゼーション部分に及ぼす調節部分の影響に基づいている。第１のハイブリダイゼーション部分と第２のハイブリダイゼーション部分の間に少なくとも２個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を導入することは、ハイブリダイゼーション特異性の向上に貢献する主因となる。
【００２２】
核酸と関連する用語「試料」は、目的の核酸(ターゲットヌクレオチド配列)を含むまたは含むと推測される任意の物質を意味するか、または目的のターゲットヌクレオチド配列を含むまたは含むと推測される核酸それ自体である任意の物質を意味する。従って、用語「試料」は、核酸(ゲノムDNA、cDNA及びRNA)、細胞、生物、組織、液体、または物質の試料を含み、これらには、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、糞便；皮膚、気道、腸管及び泌尿生殖器の外分泌物；唾液、血液細胞、腫瘍、器官、組織、in vitro細胞培養構成物の試料、自然界からの分離物(例えば、飲料水、海水及び固形物質)及び微生物試料が含まれるが、これらに限定されるものではない。用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体(特に断らないかぎり、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む)である。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、二本鎖または好ましくは一本鎖のgDNA、cDNAまたはmRNAを試料核酸として利用するハイブリダイゼーションに使用しうる。用語「核酸」と「ヌクレオチド」の間には意図した区別はなく、互換的に使用される。
【００２３】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、天然もしくは修飾モノマーの線状オリゴマーまたは連鎖物(linkages)を意味し、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなどを含み、ターゲットヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズすることができる、天然に存在するかまたは人為的に合成されたものである。オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションの最大効率のために、好ましくは一本鎖である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。本発明のHPCオリゴヌクレオチドは、天然に存在するdNMP(即ち、dAMP、dGMP、dCMP及びdTMP)、ヌクレオチド類似体または誘導体を含むことができる。また、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドも含むことができる。例えば、本発明のHPCオリゴヌクレオチドは、バックボーンが修飾されたヌクレオチド、例えば、ペプチド核酸(PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993))、ホスホロチオエートDNA、ホスホロジチオエートDNA、ホスホルアミデートDNA、アミド連結されたDNA、MMI連結されたDNA、2′-O-メチルRNA、アルファ-DNA及びメチルホスホネートDNA、糖が修飾されたヌクレオチド、例えば、2′-O-メチルRNA、2′-フルオロRNA、2′-アミノRNA、2′-O-アルキルDNA、2′-O-アリルDNA、2′-O-アルキニルDNA、ヘキソースDNA、ピラノシルRNA及びアンヒドロヘキシトールDNA、及び塩基の修飾を有するヌクレオチド、例えば、C5置換ピリミジン(置換基は、フルオロ-、ブロモ-、クロロ-、ヨード-、メチル-、エチル-、ビニル-、ホルミル-、エチニル-、プロピニル-、アルキニル-、チアゾリル-、イミダゾリル-、ピリジル-を含む)、C7置換基を有する7-デアザプリン(置換基は、フルオロ-、ブロモ-、クロロ-、ヨード-、メチル-、エチル-、ビニル-、ホルミル-、アルキニル-、アルケニル-、チアゾリル-、イミダゾリル-、ピリジル-を含む)、イノシン及びジアミノプリンを含むことができる。
【００２４】
本発明のHPCオリゴヌクレオチドに関連して本明細書で使用される用語「部分」は、調節部分により分離されたヌクレオチド配列を意味する。本発明のHPCオリゴヌクレオチドに関連する用語「第１のハイブリダイゼーション部分」は、ハイブリダイズされる試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列に実質的に相補的な特定のヌクレオチド配列を有する部分を意味する。第１のハイブリダイゼーション部分は、HPCオリゴヌクレオチドの3′または5′末端部分に位置させることができる。本発明のHPCオリゴヌクレオチドに関連する用語「第２のハイブリダイゼーション部分」は、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を有する部分を意味する。また、第２のハイブリダイゼーション部分は、本発明のHPCオリゴヌクレオチドの3′または5′末端部分に位置させることができる。用語「アービトラリ」(arbitrary)ヌクレオチド配列は、ハイブリダイズされるターゲット核酸の配列に関する情報がない状態で選択されるヌクレオチド配列を意味する。
【００２５】
HPCオリゴヌクレオチドに関連する用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸配列とHPCオリゴヌクレオチドの部分間の塩基対形成により二本鎖核酸が形成されることを意味する。本明細書で使用される用語「プローブ」は、ターゲットヌクレオチド配列に実質的に相補的な１以上の部分を含む一本鎖核酸分子を意味する。
【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分は、試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する。オリゴヌクレオチドに関連する用語「実質的に相補的な」は、本明細書では、オリゴヌクレオチドが指定されたハイブリダイゼーション条件下でターゲットヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするのに十分相補的であることを意味するために使用される。従って、この用語は、「完全に相補的な」またはその関連用語とは違った意味を有する。HPCオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分は、所望のハイブリダイゼーション特異性が達成される範囲内でターゲットヌクレオチド配列に対し１以上のミスマッチを有することができる。ハイブリダイゼーションと関連する用語「特異性」は、完全にまたは十分に相補的な塩基間に形成されたハイブリダイゼーションの忠実度を意味する。最も好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分は、試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列に完全に相補的な、即ち、ミスマッチのないヌクレオチド配列を有する。
【００２７】
本発明のHPCオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分は、その用途及びターゲットヌクレオチド配列に応じて、多様なヌクレオチド配列を有する。例えば、HPCオリゴヌクレオチドが試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列のヌクレオチド変異を同定する方法に適用される場合、その第１のハイブリダイゼーション部分は、ヌクレオチド変異の対応ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。さらに、本発明のHPCオリゴヌクレオチドをディファレンシャルディスプレー(differential display)に使用する場合は、mRNAから形成されたcDNAの一部位に実質的に相補的な任意の配列が、本発明のHPCオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分を構成する；保存されたホモロジーセグメントの同定では、本発明のHPCオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分が、遺伝子ファミリーのコンセンサス配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列、または予め決定されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの複数の組合せから選択される縮重配列を有する。
【００２８】
少なくとも２個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分は、本発明のHPCオリゴヌクレオチドの比較的高いハイブリダイゼーション特異性に関与する。本明細書で用いる「ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体」という用語は、天然のDNA/RNA塩基をほとんど識別することなく、それらの塩基の各々と塩基対を形成することができるものを意味する。
【００２９】
縮重オリゴヌクレオチドの設計上の問題点を解決するため、縮重オリゴヌクレオチドのあいまいな位置にあるヌクレオチドが、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体、例えば、デオキシイノシン(Ohtsuka, E. et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608(1985); Sakanari, J.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:4863-4867(1989))、1-(2′-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロール(Nichols, R. et al., Nature 369:492-493(1994))及び5-ニトロインドール(Loakes, D. and Brown, D.M. Nucleic Acids Res. 22:4039-4043(1994))で置換されることは公知である。その理由は、このようなユニバーサル塩基が4種すべての塩基と非特異的に塩基対を形成することができるからである。しかし、デオキシイノシン、1-(2′-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロール及び5-ニトロインドールのようなユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体が、オリゴヌクレオチド中のハイブリダイゼーション部分を調節することができる調節部分として使用できるということは、これまで何も報告されていない。HPCオリゴヌクレオチドのユニークな部分としての調節部分は、前記２つの部分を機能的にまたは構造的に分離する。
【００３０】
HPCオリゴヌクレオチドにデオキシイノシン、1-(2′-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロール及び5-ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を存在させると、塩基対形成の際の弱い水素結合相互作用のため、融解温度が比較的低くなる。このような理論を拡張して、本発明者は、HPCオリゴヌクレオチドの第１及び第２のハイブリダイゼーション部分間にユニバーサル塩基を導入すると、より低い融解温度を有する領域が形成され、HPCオリゴヌクレオチドの第１及び第２のハイブリダイゼーション部分の各々に対する境界が形成され、そして各部分のハイブリダイゼーションが影響されるであろうと推論した。このような理論は、本発明のHPCオリゴヌクレオチドの基礎を提供する。
【００３１】
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、第１のハイブリダイゼーション部分と第２のハイブリダイゼーション部分の配列間に少なくとも3個、より好ましくは、少なくとも4個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む。好ましくは、第1及び第２のハイブリダイゼーション部分の配列間のユニバーサル塩基は、最大15残基の長さである。本発明の一実施形態によると、本発明のHPCオリゴヌクレオチドは、2〜15個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む。最も好ましくは、第1及び第２のハイブリダイゼーション部分の配列間のユニバーサル塩基は、約5残基の長さである。
【００３２】
ユニバーサル塩基の最適数、即ち、5残基に関連して、特定のハイブリダイゼーション条件下でのターゲットヌクレオチド配列への第２のハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーションを妨害するためには、本発明のHPCオリゴヌクレオチドの第1及び第２のハイブリダイゼーション部分間のユニバーサル塩基を最少数とすることが好ましい。ユニバーサル塩基の長さ(8〜10個の塩基)は、本発明のHPCオリゴヌクレオチドでのそれ自体の機能に大きな影響を及ぼさない可能性が高い。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態によると、HPCオリゴヌクレオチドの調節部分のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体には、デオキシイノシン、イノシン、7-デアザ-2′-デオキシイノシン、2-アザ-2′-デオキシイノシン、2′-OMe イノシン、2′-F イノシン、デオキシ 3-ニトロピロール、3-ニトロピロール、2′-OMe 3-ニトロピロール、2′-F 3-ニトロピロール、1-(2′-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロール、デオキシ 5-ニトロインドール、5-ニトロインドール、2′-OMe 5-ニトロインドール、2′-F 5-ニトロインドール、デオキシ 4-ニトロベンズイミダゾール、4-ニトロベンズイミダゾール、デオキシ 4-アミノベンズイミダゾール、4-アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、2′-F ネブラリン、2′-F 4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-5-イントロインドール、PNA-ネブラリン、PNA-イノシン、PNA-4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-3-ニトロピロール、モルフォリノ-5-ニトロインドール、モルフォリノ-ネブラリン、モルフォリノ-イノシン、モルフォリノ-4-ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ-3-ニトロピロール、ホスホルアミデート-5-ニトロインドール、ホスホルアミデート-ネブラリン、ホスホルアミデート-イノシン、ホスホルアミデート-4-ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート-3-ニトロピロール、2′-0-メトキシエチルイノシン、2′-0-メトキシエチルネブラリン、2′-0-メトキシエチル 5-ニトロインドール、2′-0-メトキシエチル 4-ニトロ-ベンズイミダゾール、2′-0-メトキシエチル3-ニトロピロール、及びこれらの組合せが含まれるが、それらに限定されるものではない。より好ましくは、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体は、デオキシイノシン、1-(2′-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロールまたは5-ニトロインドールであり、最も好ましくは、デオキシイノシンである。
【００３４】
好ましくは、HPCオリゴヌクレオチドの全長は、所望のハイブリダイゼーション特異性及びターゲット核酸にハイブリダイズさせるのに必要なヌクレオチドの数により決定される。
【００３５】
本発明のHPCオリゴヌクレオチドの各部分の長さは、一部には、本発明のHPCオリゴヌクレオチドを利用する各用途での目的により変化する。好ましい実施形態では、HPCオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分の長さは、少なくとも6ヌクレオチドであり、この長さは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに必要とされる最小の長さであると考えられる。より好ましくは、第１のハイブリダイゼーション部分の配列の長さは、10〜50ヌクレオチドで、最大100ヌクレオチドまでである。
【００３６】
上述したように、HPCオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分は、第１のハイブリダイゼーション部分とターゲットヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションから完全に除外されるため、そのヌクレオチド配列の選択は制限されない。即ち、第２のハイブリダイゼーション部分のヌクレオチド配列が試料核酸のある部位(例えば、第１のハイブリダイゼーション部分のターゲットヌクレオチド配列に隣接した部位)に多かれ少なかれ相補的である場合でも、ターゲットヌクレオチド配列に対する第１のハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーション特異性は、実際上低下しない。これがHPCオリゴヌクレオチドの利点の一つである。好ましくは、HPCオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分は、試料核酸のいかなる部位に対しても実質的に相補的でない予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
本発明のHPCオリゴヌクレオチドが支持体（例えば、ナイロン膜またはガラス）に結合される場合、第２のハイブリダイゼーション部分は、第１のハイブリダイゼーション部分を、そのターゲットヌクレオチド配列にハイブリダイズされるように遊離の状態にしておき、これにより第１のハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーション強度(効率)を増加させる。これはSaiki及び共同研究者により提案されたスペーサー効果(spacer effect)とも一致する(Randall K. Saiki, et al., PNAS USA, 86:6230-6234(1989))。彼らは、オリゴヌクレオチドに付加されたホモポリマーテイルは、ナイロン膜とテイル付加オリゴヌクレオチドプローブとの距離を増加させることによりハイブリダイゼーション効率を向上させることを示した。従って、第１のハイブリダイゼーション部分の増加したハイブリダイゼーション強度(効率)は、より高いハイブリダイゼーション及び洗浄温度を含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーション反応を実施できるようにし、その結果、第１のハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーション特異性が大いに高まる。さらに、第２のハイブリダイゼーション部分は、第１のハイブリダイゼーション部分とターゲットヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーション結果の検証を可能にする。このような検証により、第１のハイブリダイゼーション部分とそのターゲットヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションのみから信頼性のある結果を得ることができる。
【００３８】
好ましい実施形態において、HPCオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分の長さは、少なくとも15ヌクレオチドであり、この長さは、ハイブリダイゼーションのための長さの最小必要条件であると考えられる。好ましくは、第２のハイブリダイゼーション部分の配列長さは、最大100ヌクレオチドまでである。より好ましくは、第２のハイブリダイゼーション部分の配列長さは、20〜30ヌクレオチドである。第２のハイブリダイゼーション部分は、第１のハイブリダイゼーション部分より長いほうが好ましい。
【００３９】
第２のハイブリダイゼーション部分の予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列は、天然または修飾ヌクレオチドの特定配列を含む、規定されたまたは予め選択されたデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは混合デオキシリボヌクレオチド配列でありうる。
【００４０】
本発明の一実施形態によると、HPCオリゴヌクレオチドの利点、即ち、ハイブリダイゼーション特異性の向上が損なわれない範囲内で、本発明のHPCオリゴヌクレオチドを修飾することができる。これら修飾、即ち標識は、ハイブリダイゼーションを表示する検出可能なシグナルを提供することができ、これはHPCオリゴヌクレオチドに結合させることができる。適する標識としては、蛍光団、発色団、化学発光団、磁性粒子、放射性同位元素、質量標識、電子密度粒子、酵素、補因子、酵素に対する基質、並びに抗体、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン及びキレーティング基のような特異的結合パートナーを有するハプテンが含まれるが、これらに限定されるものではない。標識は、蛍光、放射能、発色測定、重量測定、X線回折または吸収、磁気、酵素活性、質量分析、結合親和性、ハイブリダイゼーション高周波、ナノ結晶などにより検出できるシグナルを提供する。本発明のHPCオリゴヌクレオチドは、5′末端、3′末端または内部に標識される。標識は、直接標識、即ち染料、または間接標識、即ちビオチン、ジゴキシン、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどであってよい。
【００４１】
本発明の一実施形態によると、本発明のHPCオリゴヌクレオチドは、不溶性担体に固定化することができる。不溶性担体の例としては、ニトロセルロースまたはナイロンフィルター、ガラス板、シリコン及びフルオロカーボン支持体が含まれる。HPCオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の多数の方法で固定化することができ、例えば、ヌクレオシドホスホルアミダイトまたはヌクレオシド水素ホスホレートのような試薬を利用するリン酸基を介したレーザー活性化光脱保護(photodeprotection)結合法がある。
【００４２】
固定化されたHPCオリゴヌクレオチドは、特定の用途のための１以上のアレイへと構成することができる。疎水性仕切壁を使用してHPCオリゴヌクレオチドまたはHPCオリゴヌクレオチドのアレイを分離することができる。アレイは、多様な用途 (例えば、マッピング、部分配列決定、診断目的のための標的領域の配列決定、mRNA配列決定及びラージスケール配列決定) に対し設計することができる。ガラス板のような不溶性担体上の異なる配列を有する多様なHPCオリゴヌクレオチドの組合せ及び配置を選択することにより特定のマイクロアレイを設計して、特定の用途に使用することができる。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態によると、HPCオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションによりターゲットヌクレオチド配列の存在を検出する方法に適用しうる(即ち、ターゲットヌクレオチド配列に特異的なプローブとして使用しうる)。より好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、高度のハイブリダイゼーション特異性を必要とするターゲットヌクレオチド配列の存在(１個のヌクレオチドの存在さえも)を検出する方法において非常に強力なツールとして使用できる。
【００４４】
HPCオリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーション反応は、２つの別個のハイブリダイゼーション、即ち、第1及び第２のハイブリダイゼーションにより実施することができる。HPCオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分は、ターゲット核酸との第１のハイブリダイゼーションに関与し、第２のハイブリダイゼーション部分は、第１のハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーションからの結果を検証する第２のハイブリダイゼーションに関与する。
【００４５】
本発明の他の態様によると、本発明は、本発明によるHPCオリゴヌクレオチドまたはHPCオリゴヌクレオチドのセットを含むハイブリダイゼーション実施用のキットを提供する。本発明の一実施形態によると、本発明のキットは、HPCオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを追加的に含む。また、本発明のキットは、調節部分はないが本発明のオリゴヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを追加的に含む。本発明のキットは、場合により、ハイブリダイゼーション反応に必要な緩衝液のような試薬を含んでいてもよい。所定の反応に用いられる試薬の最適量は、本明細書の内容を把握した当業者が容易に決定しうる。典型的には、本発明のキットは、分離されたパッケージまたはコンパートメントに上述した成分を含むように適合される。
【００４６】
本発明のHPCオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションに基づく多様な技術に応用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドの効果を立証する代表的な例は：(i)ターゲットヌクレオチド配列の検出；(ii)ターゲットヌクレオチド配列中のヌクレオチド変異の同定；(iii)ハイブリダイゼーションによる配列決定(Genomics, 13:1378(1992))；(iv)２つ以上の核酸試料間の核酸レベル差の同定(米国特許第5,143,854号参照)；(v) in situハイブリダイゼーション(Young, W.S., In Situ Hybridization: A Practical Approach. New York: Oxford University Press; 33-44(1992))；(vi)感染性疾患及び遺伝性疾患の診断；及び(vii)巨大ゲノムDNAのマッピングがある。
【００４７】
一般的なハイブリダイゼーションへの応用
本発明の他の一態様によると、本発明は、ハイブリダイゼーションにより試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列の存在を検出する方法を提供し、この方法は、次のステップ：(a)上述の第１のHPCオリゴヌクレオチドを使用して、第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分が前記ターゲットヌクレオチド配列にハイブリダイズされる条件下で第１のハイブリダイゼーションを実施するステップ、ただし、前記第１のオリゴヌクレオチドは、その第１のハイブリダイゼーション部分に、ハイブリダイズされる前記ターゲットヌクレオチド配列に実質的に相補的な特定のヌクレオチド配列を有するものであること；及び(b)前記ターゲットヌクレオチド配列と前記第１のハイブリダイゼーション部分とのハイブリダイゼーションを表すシグナルにより、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分に実質的に相補的な、前記試料核酸中の前記ターゲットヌクレオチド配列の存在または不存在を検出するステップ；を含むことを特徴とする。
【００４８】
本発明の方法はHPCオリゴヌクレオチドを使用するので、過度の多様性をもたらす本明細書の複雑化を避けるために、共通する内容はその記載を省略する。
【００４９】
本発明の方法によると、ステップ(a)及び(b)は、ターゲットヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションのプロセスを構成し、本明細書では「第１のハイブリダイゼーション」と称される。従って、試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列の存在または不存在は、ターゲットヌクレオチド配列と第１のオリゴヌクレオチドの特定部分間のハイブリダイゼーションを表すシグナルにより検出することができる。本明細書で用いる「第１のオリゴヌクレオチド」という用語は、第１のハイブリダイゼーションで使用されるオリゴヌクレオチドを意味し、上述のHPCオリゴヌクレオチドと同じ構造を有する。ターゲットヌクレオチド配列よりは第１のオリゴヌクレオチドを上述の不溶性担体(支持体)に固定化することが好ましい。好ましくは、ステップ(a)でのハイブリダイゼーションは、通常使用される条件よりも高いストリンジェンシー条件下で実施されるが、これはハイブリダイゼーションの特異性を向上させる。
【００５０】
使用する第１のオリゴヌクレオチドの調節部分は、ターゲットヌクレオチド配列に対する第１のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部分を、第１のハイブリダイゼーション部分に制限することができる。従って、第１のオリゴヌクレオチドの調節部分は、第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーション特異性を向上させるうえで重要な役割を果たす。
【００５１】
好ましい実施形態によると、本発明の方法は、次のステップ：(c)ステップ(a)で使用した第１のオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分にハイブリダイズされる実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する第２のオリゴヌクレオチドを使用して、前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第１のオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分にハイブリダイズされる条件下で第２のハイブリダイゼーションを実施するステップ；及び(d)前記第１のオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分と前記第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを表すシグナルを検出し、それにより、ステップ(b)の前記シグナルの存在及び不存在が、前記ターゲットヌクレオチド配列と前記第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分とのハイブリダイゼーションにのみ起因することを確認するステップ；をさらに含む。
【００５２】
好ましい実施形態によると、ステップ(c)及び(d)は、第１のハイブリダイゼーションからの結果を検証するプロセスを構成し、本明細書では「第２のハイブリダイゼーション」と称される。本明細書で用いる「第２のオリゴヌクレオチド」という用語は、第２のハイブリダイゼーションで使用されるオリゴヌクレオチドを意味し、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分に実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する。
【００５３】
本発明の方法では、適切なハイブリダイゼーション条件を最適化法によってルーチンに決定しうる。このような方法は、研究室で使用するためのプロトコルを樹立するために当業者が日常的に行っていることである。例えば、温度、成分濃度、ハイブリダイゼーション及び洗浄時間、緩衝液成分とそのpH及びイオン強度などの条件は、オリゴヌクレオチド及びターゲットヌクレオチド配列の長さ、GC含量といった多様な要因により変化しうる。例えば、比較的短いオリゴヌクレオチドを使用する場合には、低いストリンジェンシー条件を採用することが好ましい。ハイブリダイゼーションのための詳細な条件は、Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); and M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)から確認できる。
【００５４】
ヌクレオチド変異の同定への応用
本発明のまた他の態様によると、本発明は、試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列のヌクレオチド変異を同定する方法を提供し、この方法は、次のステップ：(a)上述の第１のHPCオリゴヌクレオチドを使用して、第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分が前記試料核酸のターゲットヌクレオチド配列にハイブリダイズされる条件下で第１のハイブリダイゼーションを実施するステップ、ただし、前記第１のオリゴヌクレオチドは、その第１のハイブリダイゼーション部分に、ハイブリダイズされる前記試料核酸のターゲットヌクレオチド配列に実質的に相補的な特定のヌクレオチド配列を有するものであり、第１のオリゴヌクレオチド及びターゲットヌクレオチド配列の各々は、前記ヌクレオチド変異に対応する疑問位置を含み、それにより、前記疑問位置がターゲットヌクレオチド配列のその対応ヌクレオチドに相補的な第１のオリゴヌクレオチドの相補ヌクレオチドで占められる場合には、前記ヌクレオチド変異を含む第１のオリゴヌクレオチドがターゲットヌクレオチド配列にハイブリダイズされること；及び(b)前記ターゲットヌクレオチド配列と前記第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分とのハイブリダイゼーションを表すシグナルを検出して、前記試料核酸中のターゲットヌクレオチド配列の前記ヌクレオチド変異を同定するステップ；を含むことを特徴とする。
【００５５】
本発明のHPCオリゴヌクレオチドを使用する前記適用例は、ターゲットヌクレオチド配列の存在を検出する本発明の方法により実施されるため、過度の多様性をもたらす本明細書の複雑化を避けるために、共通する内容はその記載を省略する。
【００５６】
好ましい実施形態によると、前記方法は、次のステップ：(c)ステップ(a)で使用した前記第１のオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分にハイブリダイズされる実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する第２のオリゴヌクレオチドを使用して、前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第１のオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分にハイブリダイズされる条件下で第２のハイブリダイゼーションを実施するステップ；及び(d)前記第１のオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分と前記第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを表すシグナルを検出し、それにより、ステップ(b)の前記シグナルの存在及び不存在が、前記ターゲットヌクレオチド配列と前記第１のオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分とのハイブリダイゼーションにのみ起因することを確認するステップ；をさらに含む。
【００５７】
使用する試料核酸は、ヌクレオチド変異を含む短いヌクレオチドセグメントとすることができ、これは短いヌクレオチドセグメントの対応ヌクレオチド配列を増幅することにより調製される。また、試料核酸は、それぞれがヌクレオチド変異を含む２つ以上の短いターゲットヌクレオチドセグメントであってもよく、これらは２以上の短いターゲットヌクレオチドセグメントの各々の対応ヌクレオチド配列を増幅することにより調製される。
【００５８】
好ましい実施形態において、検出できるヌクレオチド変異は、一塩基多型または点突然変異である。ヌクレオチド変異は、ヒト核酸に含まれるものであっても、感染性疾患の原因となる生物の核酸に含まれるものであってもよい。
【００５９】
ステップ(a)で使用した第１のオリゴヌクレオチドは、対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション部分内に、ターゲット核酸のヌクレオチド変異に対応するヌクレオチドに相補的なヌクレオチドで占められた疑問位置を含む。好ましくは、第１のオリゴヌクレオチドの疑問位置は、その第１のハイブリダイゼーション部分の中央に位置する。より好ましい実施形態では、対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドの疑問位置は、3′末端ヌクレオチドから約10塩基以内にある。より好ましくは、対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドの疑問位置は、対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドの3′末端ヌクレオチドから約6塩基以内にある。他の好ましい実施形態では、対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドの疑問位置は、3′末端ヌクレオチドから4〜6塩基以内にある。より好ましくは、対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドの疑問位置は、3′末端ヌクレオチドから5塩基の位置にある。
【００６０】
好ましい実施形態によると、ステップ(a)で使用した第１のオリゴヌクレオチドは、その第１のハイブリダイゼーション部分に、少なくとも１つの人為的なミスマッチヌクレオチドを有し、前記ミスマッチヌクレオチドは、前記第１のオリゴヌクレオチドの疑問位置に実質的に隣接しており、前記ミスマッチヌクレオチドはユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む。
【００６１】
ステップ(a)で使用したHPCオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分の長さは、少なくとも6ヌクレオチドであることが好ましく、この長さは、ハイブリダイゼーションのための長さの最小必要条件であると考えられる。より好ましくは、第１のハイブリダイゼーション部分の配列長さは、約8〜30ヌクレオチドである。最も好ましくは、第１のハイブリダイゼーション部分の配列長さは、約10〜15ヌクレオチドである
【００６２】
本明細書で使用される「疑問位置」(interrogation position)という用語は、ターゲット核酸中にある特定のヌクレオチド塩基の位置を意味する。例えば、SNPの分析において、ターゲット核酸中の「疑問位置」は、野生型と異なる位置にある。また、疑問位置には、ターゲット核酸の疑問位置に相補的な、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の位置が含まれる。ターゲット核酸の疑問位置は、オリゴヌクレオチドがターゲット核酸にハイブリダイズされるとき、オリゴヌクレオチドの疑問位置の反対側にある。
【００６３】
本発明のまた他の態様によると、本発明は、ターゲット核酸のヌクレオチド変異を同定するためのキットを提供し、このキットは、上述のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセット(第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含む)を含む。本発明のキットは、場合により、ハイブリダイゼーション反応に必要な緩衝液のような試薬を含んでいてもよい。所定の反応で使用する試薬の最適量は、本明細書の内容を把握した当業者により容易に決定され得る。典型的には、本発明のキットは、分離されたパッケージまたはコンパートメント中に上述した成分を含む。
【実施例】
【００６４】
下記の具体的な実施例は、本発明を例示するためのものであって、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を制限するものではない。
【００６５】
以下の実施例では、次の略語が使用される：M (モル)、mM (ミリモル)、μM (マイクロモル)、g (グラム)、μg (マイクログラム)、ng (ナノグラム)、l (リッター)、ml (ミリリッター)、μl (マイクロリッター)、℃ (摂氏度)、Promega (Promega Co., 米国マジソン)、Roche (Roche Diagnostics, ドイツ国マンハイム)、QIAGEN (QIAGEN GmbH, ドイツ国ヒルデン)、Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, 米国ハーキュレス)、Applied Biosystems (米国カリフォルニア州フォスターシティー)、Amersham (Amersham Phamacia Biotech, 米国ピスカタウェー)、及びStratagene (Stratagene, 米国ラ・ホヤ)。
【００６６】
実施例で使用したオリゴヌクレオチドの配列は表１に示してある。
【００６７】
実施例１：  HPCオリゴヌクレオチド中のユニバーサル塩基残基がハイブリダイゼーション特異性に及ぼす効果
HPCオリゴヌクレオチドの3′末端部分と5′末端部分の間に位置するデオキシイノシンのようなユニバーサル塩基残基の効果を、SNP遺伝子型決定(genotyping)分析により評価した。このために、対立遺伝子特異的10-merを有する３つの異なるタイプのオリゴヌクレオチド（従来の短いオリゴヌクレオチドと長いオリゴヌクレオチド及びHPCオリゴヌクレオチドを含む）を使用した。
【００６８】
A.  オリゴヌクレオチドの合成
表１に示す配列を有する実施例１で用いるオリゴヌクレオチドは、DNA合成機((Expedite 8900 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems (ABI))を用いて標準プロトコルに従って合成した。HPCオリゴヌクレオチドにおいては、デオキシイノシンCEホスホルアミダイト(ABI)を用いてデオキシイノシンを組み込んだ。このオリゴヌクレオチドをOPCカートリッジ(ABI)により精製して、その濃度を260nmでUV分光光度計により測定した。下記HPCオリゴヌクレオチドで「I」はデオキシイノシンを示す。
【００６９】
TP53遺伝子のエキソン4中のSNPを検出するための対立遺伝子特異的な従来の短いオリゴヌクレオチドは、次のとおりである：
2005522190.tif 000003
【００７０】
TP53遺伝子のエキソン4中のSNPを検出するための対立遺伝子特異的な従来の長いオリゴヌクレオチドは、次のとおりである：
2005522190.tif 000004
【００７１】
TP53遺伝子のエキソン4中のSNPを検出するための対立遺伝子特異的なHPCオリゴヌクレオチドは、次のとおりである：
2005522190.tif 000005
【００７２】
多型塩基には下線が引かれており、多型塩基の位置を疑問位置とみなす。疑問位置は対立遺伝子特異的ヌクレオチド配列の中央に置かれる。
【００７３】
対立遺伝子特異的な従来の長いオリゴヌクレオチド及びHPCオリゴヌクレオチドの5′末端部分は、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含む第２のハイブリダイゼーション部分であり、第２のハイブリダイゼーションのための普遍的プロービング部位として作用する。第２のハイブリダイゼーション部分の配列は、
JYC7    5′- GTCTACCAGGCATTCGCTTTGC -3′(配列番号７)
である。対立遺伝子特異的な従来の長いオリゴヌクレオチド及びHPCオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分の配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、
JYC7R    5′- GCAAAGCGAATGCCTGGTAGAC -3′(配列番号８)
である。
【００７４】
B.  オリゴヌクレオチドの固定化
従来の短いオリゴヌクレオチド、長いオリゴヌクレオチド及びHPCオリゴヌクレオチドのそれぞれを、次の方法によりナイロン膜に固定化した。オリゴヌクレオチド((100μMを6μl)をHybond-N+膜(Amersham Pharmacia Biotech)上にドットブロッティング装置(Bio-Rad)またはピペッティングを用いてスポットした。膜を乾燥させ、最適化UV架橋方法により固定した。
【００７５】
C.  DNA試料の調製
ヒトp53(TP53)遺伝子の一塩基多型(SNP)を含む領域(Matlashewski et al., 1987; Lamb and Crawford, 1986)を、従来のプライマー系またはアニーリング調節プライマー系を用いて増幅した。アニーリング調節プライマーは、本発明者により開発されたもので、PCT/KR02/01781に開示されている。DNA鋳型を、TP53遺伝子のエキソン4中にSNPを有するヒト血液試料から取得した(Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001))。この多型は、アミノ酸位置72でのArg→Pro置換として表され、これはGがCで置き換えられたことによる。突然変異型ホモ接合体の鋳型からTP53遺伝子のヌクレオチド11991と12339の間の349ヌクレオチド配列を、次のプライマーセットを用いて増幅した：
P53N-ACP  5′-TATGAATGCTGTGACGCCGAIIIIICCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3′(配列番号９)、及び
P53C-ACP  5′-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3′(配列番号10)。
【００７６】
TP53遺伝子のエキソン4中にSNPを含む50ngのゲノムDNA、5μlの10×PCR反応緩衝液(Promega)、5μlの25mM MgCl2、5μlのdNTP (各々2 mMのdATP, dCTP, dGTP及びdTTP)、1μlのP53N-ACPプライマー(10μM)及び1μlのP53C-ACPプライマー(10μM)を含む最終容量49.5μlの増幅反応混合物を94℃に予熱して、この反応混合物を含むチューブを94℃に維持しながら、0.5μlのTaqポリメラーゼ(5単位/μl, Promega)を前記混合物に添加し、その後PCR反応を次のように実施した：94℃で40秒、65℃で40秒、72℃で40秒を30サイクル；その後、72℃で5分の最終伸長。SNPの隣接領域を含む増幅産物をQiagen(Chatsworth, CA)PCR精製キットを利用して精製した。
【００７７】
D.  試料DNAまたはオリゴヌクレオチドの標識化
増幅されたターゲットゲノムDNAセグメントを、当業界で知られているようにRandom Prime DNA標識化キット(Roche)を使用して[α-32P]dCTP (3,000 Ci/mmol, Amersham Phamacia Biotech)で標識化した(Multiprime DNA labeling systems booklet, “Amersham”, 1989)。従来の長いオリゴヌクレオチド及びHPCオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分の配列に相補的なオリゴヌクレオチドJYC7Rは、当業界で知られているように[γ-32P]ATP (3,000 Ci/mmol, Amersham Phamacia Biotech)及びT4ポリヌクレオチドを利用して末端標識化した(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499-560(1986))。
【００７８】
E.  ハイブリダイゼーション反応
(a)  第１のハイブリダイゼーション
第１のハイブリダイゼーションを、従来のオリゴヌクレオチド及びHPCオリゴヌクレオチドを固定化させた上述の膜フィルター及び放射能標識されたゲノムDNAセグメントを使用して、10mlのクイックハイブリダイゼーション溶液(Stratagene)中で40〜50℃にて1〜4時間実施した。ハイブリダイゼーションの完了後、ハイブリッドを2×SSC及び0.1％ SDSの緩衝液を使用して3〜5回、室温で1〜10分間洗浄し、自然乾燥させた。前記膜をKodak X-Omat XK-1フィルムにFuji増感スクリーンを利用して-80℃で感光させた。その後、各ドットの放射線量をオートラジオグラフィーにより測定してハイブリダイゼーションの強度を分析した(図１Ｂ)。
【００７９】
(b)  第２のハイブリダイゼーション
第１のハイブリダイゼーションで使用した膜は、第２のハイブリダイゼーションにおいて再使用したが、第１のハイブリダイゼーションで用いた第１のプローブを除去するためのストリッピングは行わなかった。第２のハイブリダイゼーションは、第１のハイブリダイズされたフィルターと放射能標識オリゴヌクレオチドJYC7R（従来のオリゴヌクレオチド及びHPCオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む）を使用して、10mlのクイックハイブリダイゼーション溶液(Stratagene)中で50〜65℃にて1〜4時間実施した。ハイブリダイゼーションの完了後、ハイブリッドを2×SSC及び0.1％ SDSの緩衝液を使用して3回、50〜65℃で10分〜1時間洗浄して、自然乾燥させた。前記膜をKodak X-Omat XK-1フィルムにFuji増感スクリーンを利用して-80℃で感光させた。その後、各ドットの放射線量をオートラジオグラフィーにより測定してハイブリダイゼーションの強度を分析した(図１Ｃ)。
【００８０】
図１Ａは、従来のオリゴヌクレオチド及びHPCオリゴヌクレオチドをそれぞれの膜に等しくスポットしたものを示す。レーン1及びレーン２は、野生型[P53NA(配列番号１)、P53NA-JYC7 (配列番号３)及びP53NA-HPC (配列番号５)]、及び、突然変異型[P53NB (配列番号２)、P53NB-JYC7 (配列番号４)及びP53NB-HPC (配列番号６)]に対する対立遺伝子特異的な従来のオリゴヌクレオチドまたはHPCオリゴヌクレオチドを各々示す。
【００８１】
図１Ｂは、ステップCから得られた突然変異型ゲノムDNA断片に対する第１のハイブリダイゼーションの結果を示す。第１のハイブリダイゼーション条件下で、従来の短いオリゴヌクレオチドに対しては、シグナルが検出されなかった。突然変異型の遺伝子型を含む突然変異型ゲノムDNA断片は、野生型(レーン１)と突然変異型(レーン２)の両方の対立遺伝子特異的な従来の長いオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。これとは対照的に、突然変異型の遺伝子型を含む突然変異型ゲノムDNA断片は、突然変異型対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチド(レーン２)にハイブリダイズしたが、野生型対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチド(レーン１)にはハイブリダイズしなかった。
【００８２】
この結果から明らかなように、従来の短いオリゴヌクレオチドは、このような高いストリンジェンシー条件下ではハイブリッドを形成することさえできなかったが、従来の長いオリゴヌクレオチド及びHPCオリゴヌクレオチドは、それと同じ条件下でハイブリッドを形成した。このことは、第２のハイブリダイゼーション部分の配列のような追加的な配列が第１のハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーション強度(効率)を増加させることを意味する。しかし、従来の長いオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション部分は、一塩基のヌクレオチドミスマッチを識別できるほどには感度が高くない。これは、第２のハイブリダイゼーション部分の配列が部分的に第１のハイブリダイゼーションに関与するからであろう。一方、第１及び第２のハイブリダイゼーション部分間の境界を形成するユニバーサル塩基残基群の存在は、ハイブリダイゼーション部分を、比較的高いストリンジェンシー条件である第１のハイブリダイゼーションの条件下で第１のハイブリダイゼーション部分に制限し、その結果、第２のハイブリダイゼーション部分はハイブリダイゼーション反応から完全に除外されて第１のハイブリダイゼーション部分がターゲットヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズすることが明らかである。
【００８３】
図1Ｃは、HPCオリゴヌクレオチド及び従来の長いオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む放射能標識オリゴヌクレオチドJYC7Rを使用した第２のハイブリダイゼーションの結果を示す。
【００８４】
前記結果から、各スポットは、ほとんど等しい放射能を有することが分かった。同等な放射能は、どのような人為的な要因（例えば、スポッティングの失敗、固定化の失敗及び最適なハイブリダイゼーション条件の樹立の失敗）も第１のハイブリダイゼーションに影響を及ぼさなかったこと、また、対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドが各々の実験で第１のハイブリダイゼーションのためのプローブとしての役目を好適に果たしたことを示しており、これにより、第２のハイブリダイゼーションは、第１のハイブリダイゼーションの結果が正しいことを証明した。
【００８５】
実施例２：  HPCオリゴヌクレオチドを利用したSNP遺伝子型決定
HPCオリゴヌクレオチドの一塩基多型遺伝子型決定への適用可能性を実証するために、HPCオリゴヌクレオチドをヒトp53(TP53)遺伝子の一塩基多型(SNP)に適用した。
【００８６】
TP53遺伝子のエキソン4中のSNPを検出するための対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドは、次のとおりである：
2005522190.tif 000006
【００８７】
前記HPCオリゴヌクレオチドにおいて、「I」はデオキシイノシンを示す。多型塩基は、各々の対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドの第１のハイブリダイゼーション(3′末端)部分に下線が引かれており、多型塩基の位置は疑問位置と考えられる。疑問位置は、対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドの3′末端から幾つかの異なる位置に置かれたが、それは、SNPを検出するためのハイブリダイゼーション特異性の最も決定的な位置を決定するためである。
【００８８】
対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドの5′末端部分は、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含む第２のハイブリダイゼーション部分であって、第２のハイブリダイゼーションに対する普遍的プロービング部位として作用する。第２のハイブリダイゼーション部分の配列は、
JYC4    5′- GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT -3′JYC2 (配列番号21)
である。
【００８９】
対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分の配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、
JYC4R    5′- ATGAAGCGAATGCCTGGTAGTC -3′ (配列番号22)
である。
【００９０】
対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドは、実施例１に記載のようにナイロン膜に固定化した。ヒトp53(TP53)遺伝子のエキソン4にSNPを含む領域(Matlashewski et al., 1987; Lamb and Crawford, 1986)を、実施例１のステップCで使用したのと同じプライマーを使用して実施例１と同様に増幅した。
【００９１】
増幅されたターゲットゲノムDNA断片を、[α-32P]dCTP (3,000 Ci/mmol, Amersham Phamacia Biotech)を用いて実施例１と同様に標識化した。対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分の配列に相補的なオリゴヌクレオチドJYC4Rを、[γ-32P]ATP (3,000 Ci/mmol, Amersham Phamacia Biotech)及びT4ポリヌクレオチドを用いて実施例１と同様に末端標識化した。第1及び第２のハイブリダイゼーションを実施例１と同様に実施した。各ドットの放射線量をオートラジオグラフィーにより測定してハイブリダイゼーションの強度を分析した(図２〜４)。
【００９２】
図２Ｂは、野生型ゲノムDNA断片に対する第１のハイブリダイゼーションの結果を示している。野生型遺伝子型を含む野生型ゲノムDNA断片は、野生型対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチド(レーン１)にハイブリダイズしたが、突然変異型対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチド(レーン２)及び陰性対照HPCオリゴヌクレオチド(レーン3)にはハイブリダイズしなかった。また、図２Ｃは、放射能標識されたオリゴヌクレオチドJYC4Rを使用した第２のハイブリダイゼーションの結果を示しており、前記オリゴヌクレオチドは、対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドの第２のハイブリダイゼーション部分の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。前記結果から、各スポットは、ほとんど等しい放射能を有することが分かった。同等な放射能は、どのような人為的な要因（例えば、スポッティングの失敗、固定化の失敗及び最適なハイブリダイゼーション条件の樹立の失敗）も第１のハイブリダイゼーションに影響を及ぼさなかったこと、また、対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドが各々の実験で第１のハイブリダイゼーションのためのプローブとしての役目を好適に果たしたことを示しており、これにより、第２のハイブリダイゼーションは、第１のハイブリダイゼーションの結果が正しいことを証明した。従って、これらの結果から、対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドは、一塩基のミスマッチでさえも検出するのに十分高い感受性を有することが分かる。
【００９３】
図３Ｂは、突然変異型ゲノムDNA断片に対する第１のハイブリダイゼーションの結果を示す。図２Ｂとは対照的に、突然変異型遺伝子型を含む突然変異型ゲノムDNA断片は、突然変異型対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチド(レーン２)にハイブリダイズしたが、野生型対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチド(レーン１)にはハイブリダイズしなかった。
【００９４】
図４Ｂは、ヘテロ接合型のゲノムDNA断片に対する第１のハイブリダイゼーションの結果を示す。ヘテロ接合遺伝子型を含むヘテロ接合型ゲノムDNA断片は、野生型(レーン１)と突然変異型(レーン２)の両方の対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。
【００９５】
図３Ｃ及び図４Ｃは、突然変異型及びヘテロ接合型遺伝子型に対する第１のハイブリダイゼーションの結果を検証するための第２のハイブリダイゼーションの結果を各々示している。これらの結果は図２Ｃの結果と同様である。
【００９６】
さらに、対立遺伝子特異的HPCオリゴヌクレオチドが第１のハイブリダイゼーション部分の配列の中央に疑問位置を有する場合は、ハイブリダイゼーション特異性が最も成功裏に達成されることが見出された。
【００９７】
これらの結果から分かるように、本発明のHPCオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブの長さ、位置及び鎖特異性を調整することなく、また、膜に適用する量を変えることなく、１個のヌクレオチドしか違わないターゲット配列同士を識別することを可能にし、その結果、HPCオリゴヌクレオチドを使用するSNP遺伝子型決定分析は、信頼できるやり方で、容易かつ経済的に実施することができた。さらに、HPCオリゴヌクレオチドを使用して多重SNP遺伝子型決定を達成する場合は、迅速性と効率性が大いに改善されると期待できる。
【００９８】
【表１】
2005522190.tif 000007
【００９９】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】本発明のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特異性を評価するオートラジオグラフである。全てのパネルにおいて、野生型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(レーン１)及び突然変異型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(レーン２)をナイロン膜に固定化する。パネルAは、実験で使用するオリゴヌクレオチドが膜に同等にスポットされることを示す。パネルBには、突然変異型ゲノムDNA断片に対する第１のハイブリダイゼーションの結果を示す。パネルCは、第１のハイブリダイゼーションからの結果を検証するための第２のハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図２】本発明のオリゴヌクレオチドを使用した野生型ゲノムDNA断片に対するハイブリダイゼーション反応の結果を示すオートラジオグラフである。野生型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(レーン１)、突然変異型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(レーン２)及び陰性対照オリゴヌクレオチド(レーン３)をナイロン膜に固定化する。パネルBには、野生型ゲノムDNA断片に対する第１のハイブリダイゼーションの結果を示す。パネルCは、第１のハイブリダイゼーションの結果を検証するための第２のハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図３】本発明のオリゴヌクレオチドを使用した突然変異型ゲノムDNA断片に対するハイブリダイゼーション反応の結果を示すオートラジオグラフである。レーン及びパネルの説明は、図２と同じである。
【図４】本発明のオリゴヌクレオチドを使用したヘテロ接合型ゲノムDNA断片に対するハイブリダイゼーション反応の結果を示すオートラジオグラフである。レーン及びパネルの説明は、図２と同じである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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