(57)【要約】本発明の課題は、ヒト及び／又は動物に投与することにより、造血効果が７日以上持続する、エリスロポエチンを有効成分として含有する医薬組成物を提供することである。本発明は、水溶性長鎖分子が２分子以上付加されたエリスロポエチンを全エリスロポエチン中に５０％以上含有する医薬組成物を提供する。また、本発明は、水溶性長鎖分子が付加されたエリスロポエチンを含有し前記水溶性長鎖分子の分子量が３０ｋＤａ以上である医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、水溶性長鎖分子が付加されたエリスロポエチンを含有し前記水溶性長鎖分子が分岐鎖を有する医薬組成物を提供する。
2011034105.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性長鎖分子が２分子以上付加されたエリスロポエチンを、全エリスロポエチン中に５０％以上含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
水溶性長鎖分子が付加されたエリスロポエチンを含有し、前記水溶性長鎖分子の分子量が３０ｋＤａ以上であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３】
水溶性長鎖分子が付加されたエリスロポエチンを含有し、前記水溶性長鎖分子が分岐鎖を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
水溶性長鎖分子がポリエチレングリコール、ポリアミノ酸、及びポリプロピレングリコールからなる群から選ばれる１以上の化合物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ヒト及び／又は動物における造血効果が７日以上持続することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
動物がネコ科及び／又はイヌ科の動物であることを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
溶液又はゲルであり、前記溶液又はゲルのｐＨが４以上８以下である請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
溶液組成が哺乳動物の体液浸透圧およびｐＨと実質的に同等であって、投与時に痛みがないことを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
エリスロポエチンが、ヒト、ネコ、又はイヌに由来するアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
エリスロポエチンが、以下の（ａ）〜（ｃ）；
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞による細胞増殖アッセイでエリスロポエチン活性を有するポリペプチド、又は
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び／又は付加したポリペプチドであって、ＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞による細胞増殖アッセイでエリスロポエチン活性を有するポリペプチド
であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ポリエチレングリコールの付加部位の少なくとも１箇所が、リジン７８残基であることを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
反復投与してもエリスロポエチンに対する抗体が産生しないことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む貧血治療薬。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む造血薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性長鎖分子が付加されたエリスロポエチンを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
貧血改善のため、造血を亢進するホルモンであるエリスロポエチン（ＥＰＯと記載する事がある）が遺伝子組換え法で生産され、医薬品として貧血症の治療に実績を上げている。ヒト由来ＥＰＯに水溶性長鎖分子であるポリエチレングリコール（ＰＥＧと記載する事がある）を付加すると、ＥＰＯの肝臓での代謝が阻害され血中寿命が延びることが確認されている（特許文献１）。この血中滞留期間延長効果により、薬効持続時間が延長され投与頻度が少なくて済むとの利点から、ＥＰＯに限らずＰＥＧ修飾したタンパク製剤が次世代の医薬品として注目されており、一部は既に実用化されている。【０００３】
タンパク質にＰＥＧ修飾を行う場合、付加するＰＥＧの分子量が高いほど、また付加数が多いほど、タンパク質は代謝されにくくなる傾向がある。従って分子量の大きいＰＥＧ分子が多数付加したタンパク質は、体内に投与されたときに血中寿命が長くなることが予想される（非特許文献１）。その一方、受容体と結合することによって生理活性を発現するＥＰＯなどのタンパク質の場合、付加する水溶性長鎖分子の分子量が大きく、付加数が多くなるほどインビトロでの生理活性が低下する。【０００４】
先に述べたヒト由来配列を持つＥＰＯ（ヒトＥＰＯと記載することがある）をＰＥＧで修飾した場合、５２位のリジンにＰＥＧが１分子付加したＰＥＧ修飾ＥＰＯ（モノＰＥＧ体と記載することがある）が、ラット尾静脈単回投与における造血活性（網状赤血球の増加を指標）の持続効果に優れているとの報告がある（特許文献１）。【０００５】
一方、現在使用されているヒトＥＰＯ製剤は、静脈、皮下、筋肉内等の経路に投与される。また経口、経鼻吸収製剤等の工夫もなされている（特許文献２）。ヒトＥＰＯ製剤を血管内投与することは汎用性に欠き、より簡便な投与方法で、注射後の痛み等患者の負担が少なく、しかも薬効が持続するＥＰＯ製剤が望まれている。【０００６】
ヒトで報告のある慢性腎不全又は化学療法剤又は外科手術等によって引き起こされる貧血症状は、愛玩動物であるイヌやネコにも見られ、これら動物の死亡原因の多くを占めている。例えばネコ（国内）では、１９９６年からの１０年間で慢性腎不全は、０．６４％から３．９５％と大幅に増加し、疾病順位も２８位から４位へ増加している（非特許文献２）。動物の貧血治療においてもヒトＥＰＯ製剤が治療に用いられている。しかし、ＥＰＯのような生理活性タンパク質は種固有のアミノ酸配列をもつので、ヒト以外の動物にヒト由来のＥＰＯ製剤を投与すると抗ＥＰＯ抗体の発現を招く恐れがある。この事から、近年ネコやイヌの治療用に各々の固有のアミノ酸配列をもつＥＰＯ製剤の実用化が検討されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０２／３２９５７
【特許文献２】特開昭６２−８９６２７
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Polyethylene glycol-conjugated pharmaceutical proteins;PSTT Vol.1, No.8, 1998, 352-356
【非特許文献２】多摩獣医臨床研究会調査報告（２００６年度）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ヒト及び／又は動物に投与することにより、造血効果が７日以上持続することを特徴とし、ＥＰＯを有効成分として含有する、高い生理活性を有しながら生体内での安定性も高い医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＥＰＯのＰＥＧによる化学修飾を詳細に検討した結果、ＰＥＧの付加数、分子量または構造によって、造血効果が７日以上持続することを見出し、本発明に至った。【００１１】
すなわち、本発明は、水溶性長鎖分子が２分子以上付加されたエリスロポエチンを、全エリスロポエチン中に５０％以上含有することを特徴とする医薬組成物に関する。【００１２】
また、本発明は、水溶性長鎖分子が付加されたエリスロポエチンを含有し、前記水溶性長鎖分子の分子量が３０ｋＤａ以上であることを特徴とする医薬組成物に関する。【００１３】
また、本発明は、水溶性長鎖分子が付加されたエリスロポエチンを含有し、前記水溶性長鎖分子が分岐鎖を有することを特徴とする医薬組成物に関する。【００１４】
水溶性長鎖分子は、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸、及びポリプロピレングリコールからなる群から選ばれる１以上の化合物であることが好ましい。【００１５】
ヒト及び／又は動物における造血効果が７日以上持続することが好ましく、前記動物がネコ科及び／又はイヌ科の動物であることが好ましい。【００１６】
溶液又はゲルであり、前記溶液又はゲルのｐＨが４以上８以下であることが好ましい。【００１７】
溶液組成が哺乳動物の体液浸透圧及びｐＨと実質的に同等であって、投与時に痛みがないことが好ましい。【００１８】
エリスロポエチンが、ヒト、ネコ、又はイヌに由来するアミノ酸配列からなることが好ましい。【００１９】
エリスロポエチンが、以下の（ａ）〜（ｃ）；
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞による細胞増殖アッセイでエリスロポエチン活性を有するポリペプチド、又は
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び／又は付加したポリペプチドであって、ＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞による細胞増殖アッセイでエリスロポエチン活性を有するポリペプチド
であることが好ましい。【００２０】
ポリエチレングリコールの付加部位の少なくとも１箇所は、リジン７８残基であることが好ましい。【００２１】
反復投与してもエリスロポエチンに対する抗体が産生しないことが好ましい。【００２２】
また、本発明は、前記医薬組成物を含む貧血治療薬、及び造血薬に関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の医薬組成物をヒト又は動物に投与することにより、造血効果が７日以上持続することが可能である。本発明の医薬組成物は、製剤を投与する際に、注射後の痛みなどの患者の負担が少なく、しかも薬効が持続する効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】分子量２０，０００の直鎖型ＰＥＧを様々な分子数付加したＰＥＧ修飾ネコＥＰＯをラットに投与した場合の造血効果の比較。
【図２】分子量５，０００の直鎖型ＰＥＧを様々な分子数付加したＰＥＧ修飾ネコＥＰＯをラットに投与した場合の造血効果の比較（対照：分子量２０，０００の直鎖型ＰＥＧを１分子付加したモノＰＥＧ化ネコＥＰＯ）。
【図３】分子量４０，０００の直鎖型ＰＥＧを１および２分子付加したＰＥＧ修飾ネコＥＰＯをラットに投与した場合の造血効果の比較（対照：分子量２０，０００の直鎖型ＰＥＧを１分子付加したモノＰＥＧ化ネコＥＰＯ）。
【図４】分子量２０，０００の分岐型ＰＥＧを１および２分子付加したＰＥＧ修飾ネコＥＰＯをラットに投与した場合の造血効果の比較（対照：分子量２０，０００の直鎖型ＰＥＧを１分子付加したモノＰＥＧ化ネコＥＰＯ）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
１．本発明は３つの医薬組成物に関する。
第一の本発明は、水溶性長鎖分子が２分子以上付加されたエリスロポエチン（ＥＰＯと記載することがある）を、全エリスロポエチン中に５０％以上含有する医薬組成物に関する。
【００２６】
第一の本発明において、ＥＰＯに付加される水溶性長鎖分子の数は、２分子以上であり、２分子であることが好ましい。水溶性長鎖分子が１分子付加されたＥＰＯをさらに含有してもよいが、造血効果の持続性の観点から、水溶性長鎖分子が２分子以上付加されたＥＰＯの、全ＥＰＯ中の含有量は、主成分であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましい。
ここで、水溶性長鎖分子が２分子以上付加されたＥＰＯの、全ＥＰＯ中の含有量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画後、蛍光染色によって得られるバンドの蛍光強度を測定することにより算出される。
【００２７】
水溶性長鎖分子が２分子以上付加されたＥＰＯが全ＥＰＯ中の主成分であるとは、水溶性長鎖分子が２分子以上付加されたＥＰＯがＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて最も濃いバンドを示すことをいう。ここで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて最も濃いバンドを示すとは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動した試料に含まれるタンパク質を例えば、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ等を利用した蛍光染色法で検出した時に、水溶性長鎖分子が２分子以上付加されたＥＰＯに由来するシグナル強度が、他のシグナル強度よりも高いことをいう。
水溶性長鎖分子が２分子以上付加されたＥＰＯが全ＥＰＯ中の主成分であることは、ＨＰＬＣによって確かめることも可能である。例えば、ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｄｉｏｌ−２００（株式会社ワイエムシィ製）等のカラムを通過する試料を、吸光度測定により検出し、水溶性長鎖分子が２分子以上付加されたＥＰＯに由来するシグナル強度が、他のシグナル強度よりも高いことにより確かめられる。
【００２８】
造血効果の持続性の観点から、水溶性長鎖分子の分子量は、１０ｋＤａ以上であることが好ましく、２０ｋＤａ以上であることがより好ましい。５ｋＤａ未満では造血効果が持続しなくなる傾向がある。
【００２９】
また、第二の本発明は、水溶性長鎖分子が付加されたＥＰＯを含有し、前記水溶性長鎖分子の分子量が３０ｋＤａ以上である医薬組成物に関する。
【００３０】
第二の本発明において、ＥＰＯに付加される水溶性長鎖分子の数は特に限定されず、１分子であってもよく、２分子以上でもよい。
【００３１】
造血効果の持続性の観点から、水溶性長鎖分子の分子量は、３０ｋＤａ以上であることが好ましく、４０ｋＤａ以上であることがより好ましい。２０ｋＤａ未満では造血効果が持続しなくなる傾向がある。
【００３２】
また、第三の本発明は、水溶性長鎖分子が付加されたＥＰＯを含有し、前記水溶性長鎖分子が分岐鎖を有する医薬組成物に関する。水溶性長鎖分子が分岐鎖を有するとは、分岐の枝の数が２以上であり、分岐点の数が１以上であることをいう。
【００３３】
水溶性長鎖分子が分岐鎖である場合には、ＥＰＯに付加される水溶性長鎖分子の分子数は特に限定されない。付加される水溶性長鎖分子の分子数が１分子であっても、医薬組成物を投与した時の造血効果が７日間以上持続するという効果を奏する。なお、分岐鎖をもつＰＥＧの付加方法は特表平９−５０４２９９号公報に記載されている。
【００３４】
以下に、前記医薬組成物における水溶性長鎖分子、投与方法及び効果、容器ならびにエリスロポエチンについて説明する。
【００３５】
２．水溶性長鎖分子
水溶性長鎖分子は、代謝を阻害し、血中動態を延長する目的でＥＰＯに付加する。水溶性長鎖分子としては特に限定されないが、例えば、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ポリアミノ酸、ポリプロピレングリコール等が使用できる。これらは反応前駆体を作製し、合成反応によりタンパク質に付加することができる。遺伝子組換え法でこれらの分子が結合したタンパク質を生産することもできる。このうち、ＰＥＧは抗原性がなく無毒であるため、修飾タンパク質の抗原性を低下させ、副作用としての抗ＥＰＯ抗体の発現を抑える点からも有効である。
【００３６】
一般に、ＰＥＧをタンパク質に共有結合させる方法としては、タンパク質、又は糖鎖の酸化活性可能な官能基であるポリオール、ラクトール、アミン、カルボン酸又はカルボン酸誘導体との化学反応がある。またスルホネートエステル活性化ポリマー、例えばスルホネートエステル活性化ＰＥＧを用いる方法などがある。ＥＰＯに付加する場合にもこれらの方法で付加することができる。
【００３７】
ＰＥＧ化反応前駆体としては、長鎖分子の片末端をメトキシ化したものが使用できる。さらにメトキシ化されていない末端をスクシンイミジル脂肪酸エステル化したＰＥＧが開発されており、なかでも脂肪酸がプロピオン酸もしくは酪酸であるものが反応性の点から好ましい。メトキシＰＥＧのスクシンイミジルプロピオン酸エステル（ＳＰＡ−ＰＥＧと称する）をヒトＥＰＯと反応させると、リジン残基に選択的に付加することが知られている。ＥＰＯには複数のリジン残基が存在するため、反応が進むにつれＰＥＧの付加数は増え、付加数の異なる異性体混合物となる。
【００３８】
ヒトＥＰＯをラット尾静脈に単回投与した結果では、リジン５２に単一のＰＥＧ（２０ｋＤａ）が付加したモノＰＥＧ体が最も良好な造血持続効果があることが報告されているが、ＥＰＯの由来する動物種、投与経路により最適な異性体、もしくはその混合比は異なる。ＰＥＧの付加数が１のＰＥＧ修飾ＥＰＯ、ＰＥＧの付加数が２以上のＰＥＧ修飾ＥＰＯは、各々単独で投与することもできるが、混合物として投与することもできる。
【００３９】
またＰＥＧをＥＰＯタンパクに付加する部位としては、ＥＰＯの由来する種や反応形式により異なることが考えられるが、複数個のＰＥＧが付加する場合であっても、少なくとも１箇所が、ヒトＥＰＯのリジン５２に対応するリジン残基であることが好ましい。例えば、配列番号１からなるネコＥＰＯにおいては、リジン７８であることが好ましい。
【００４０】
３．投与方法及び効果
本願発明のＥＰＯを含有する医薬組成物は、結果として、ヒト及び／又は動物における造血効果が７日以上持続する。
【００４１】
造血効果は、本発明の医薬組成物を投与したときの造血活性として、赤血球前駆体である網状赤血球の赤血球に占める割合を定量することで指標とすることができる。網状赤血球数は色素染色による塗沫試験、あるいは自動血球計数機で測定できる。
【００４２】
医薬組成物の投与対象は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の動物にも投与可能である。ヒト以外の動物としては、特に限定されないが、ネコ科及び／又はイヌ科の動物であることが好ましい。後述のように、ネコ由来のＥＰＯを使用する場合、ネコ科及びイヌ科の動物においてはＥＰＯが抗原となる可能性が低く、副作用の発生を回避できる。
【００４３】
医薬組成物の投与方法としては、特に限定されないが、静脈内投与、皮下投与、経口投与、筋肉内投与、経皮投与、経鼻投与などが挙げられる。
【００４４】
本発明のＰＥＧ修飾されたＥＰＯは、薬理学的に許容される賦形剤、崩壊剤、結合剤から選ばれる剤を使用できる。
【００４５】
賦形剤とは、澱粉、寒天、白糖、乳糖、ブドウ糖、デキストリン、ソルビトール、アラビアガム、コーンスターチ、マンニトール、結晶セルロース、レシチン、リン酸カルシウム、硫酸カルシウムを例示することができ、これら以外にも製薬的に許容される賦形剤であれば使用できる。
【００４６】
崩壊剤とは、澱粉、寒天、クエン酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、トラガントであり、これら以外にも製薬的に許容される崩壊剤であれば使用できる。
【００４７】
結合剤とは、でんぷん及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、糖類、エタノール、ポリビニルアルコールを例示することができ、これら以外にも製薬的に許容される結合剤であれば使用できる。
【００４８】
本発明におけるＰＥＧ修飾されたＥＰＯは、安定化剤、ｐＨ調節剤及び浸透圧調節剤、界面活性剤から選ばれる剤を使用できる。
【００４９】
安定化剤としてアミノ酸を例示することができる。ここで、安定化剤として用いるアミノ酸は、結晶でもアモルファスでもよく、またこれらのアミノ酸を高率に含有する植物、動物成分など不純物を含むものを用いても良い。結晶としては、Ｌ体、Ｄ体もしくはＤＬ混合体が使用できる。
【００５０】
ｐＨ調節剤としては、緩衝系には、例えば、酢酸／酢酸塩、リンゴ酸／リンゴ酸塩、クエン酸／クエン酸塩、酒石酸／酒石酸塩、乳酸／乳酸塩、リン酸／リン酸塩、グリシン／グリシネート、トリス、グルタミン酸／グルタミン酸塩、及び炭酸ナトリウムからなる群から選択された系が含まれる。ＥＰＯを含有するゲル又は溶液のｐＨの下限は４が好ましく、より好ましくは４．５であり、さらに好ましくは５である。ｐＨの上限は８が好ましく、より好ましくは７.５であり、さらに好ましくは７である。
【００５１】
浸透圧調節剤としては、塩類、糖類、アルコール類、及びアミノ酸類を包含するが、これらに限らない。特に塩化ナトリウム、多価アルコール類、一価アルコール類、単糖類、二糖類、オリゴ糖及びアミノ酸類又はそれらの誘導体などを好適に用いることができる。
【００５２】
前記の多価アルコール類としては、例えば、グリセリン等の三価アルコール類、アラビトール，キシリトール，アドニトール等の五価アルコール類、マンニトール，ソルビトール，ズルシトール等の六価アルコール類などが用いられる。なかでも、六価アルコール類が好ましく、特にマンニトールが好適である。
【００５３】
前記の一価アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどが挙げられ、このうちエタノールが好ましい。
【００５４】
前記の単糖類としては、例えば、アラビノース，キシロース，リボース，２−デオキシリボース等の五炭糖類、ブドウ糖，果糖，ガラクトース，マンノース，ソルボース，ラムノース，フコース等の六炭糖類が用いられ、このうち六炭糖類が好ましい。
【００５５】
前記のオリゴ糖としては、例えば、マルトトリオース，ラフィノース糖等の三糖類、スタキオース等の四糖類などが用いられ、このうち三糖類が好ましい。
【００５６】
前記の単糖類、二糖類及びオリゴ糖の誘導体としては、例えば、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、ガラクツロン酸などが用いられる。
【００５７】
本発明のＰＥＧ修飾ＥＰＯは、さらに界面活性剤を含んでもよい。界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、両性界面活性剤及び陽イオン界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。陰イオン界面活性剤としては、例えば脂肪酸系陰イオン界面活性剤、直鎖アルキルベンゼン系陰イオン界面活性剤、高級アルコール系陰イオン界面活性剤、アルファオレフィン系陰イオン界面活性剤及びノルマルパラフィン系陰イオン界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。非イオン界面活性剤としては、例えば脂肪酸系非イオン界面活性剤、高級アルコール系非イオン界面活性剤、アルキルフェノール系非イオン界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また非イオン界面活性剤の例としては、例えばポリソルベート及び／又はポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。両性界面活性剤としては、例えばアミノ酸系、ベタイン系及びアミンオキシド系が挙げられるが、これらに限定されるものではない。陽イオン界面活性剤としては、例えば第４級アンモニウム塩系が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
上記の賦形剤、崩壊剤、結合剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、浸透圧調節剤及び界面活性剤は任意に組み合わせることができる。さらに、賦形剤、崩壊剤、結合剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、浸透圧調節剤及び界面活性剤以外の製薬的に許容される添加剤を添加することができる。例えば、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、健康食品素材、栄養補助食品素材、ビタミン、香料、甘味剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤などが挙げられる。
【００５９】
製剤としては、溶液、ゲル、又は、粉末として加工した後、溶液製剤、凍結乾燥製剤、プレフィルドシリンジ、皮下埋め込み型除放製剤、ミセル製剤、ゲル化製剤、リポソーム製剤などにすることができる。
【００６０】
ＥＰＯを含有する医薬組成物を溶液で用いる場合、溶液組成が哺乳動物の体液（浸透圧：２８０ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏ、ｐＨ:７．４）の浸透圧、ｐＨと実質的に同等であって、皮下投与時に痛みがないことが重要である。ＥＰＯを含有する医薬組成物を溶液で用いる場合の浸透圧は４００ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏ以下のものを本発明に好適に用いることができる。また、２００ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏ以上のものを好適に用いることができる。
【００６１】
４．容器
ＥＰＯは微量の投与でも生体内で効果があるため、製剤の容器壁への吸着によるロスが生体投与時の実効活性に大きな影響を与える。そのため本剤の容器にはタンパク質の吸着が少ない樹脂製品が好ましい。よって容器へのＥＰＯ吸着量が、容器中ＥＰＯ総量の１％以下になるような素材を選択することが望ましい。好ましくは０．７％以下、より好ましくは０．５％以下になるような素材を選択する事が好ましい。
【００６２】
タンパク質吸着が少ない事が知られている樹脂材料としては特に限定されないが、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリエチルメタクリレートなどの医用容器材料が含まれる。タンパク質吸着が少ない事が知られている樹脂材料として好ましいのは、例えばノルボルネンもしくはテトラシクロドデセン又はそれらの誘導体などのシクロオレフィン類開環重合体及びその水素添加物、ノルボルネンもしくはテトラシクロドデセン又はその誘導体などのシクロオレフィンと、エチレン又はプロピレンとの重合により分子鎖にシクロペンチル残基や置換シクロペンチル残基が挿入された共重合体である樹脂である。さらにテトラシクロドデセンとエチレン等のオレフィンを原料とした共重合体であるシクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）は吸着が少ない点でより好ましく、またノルボルネンを開環重合し、水素添加した重合物であるシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）も同様に好ましい（特開平５−３００９３９号あるいは特開平５−３１７４１１号を参照）。
【００６３】
５．ＥＰＯのアミノ酸配列
ＥＰＯのアミノ酸配列はいかなる生物に由来する配列であってもよい。ＥＰＯのｃＤＮＡクローニングは、ヒト以外にもマウス、ラット、イヌ、ネコなどで行われており（ヴェンら：Blood, 82, 1507 (1993)）、それぞれがコードするアミノ酸配列が解明されている。本発明には、ヒトＥＰＯだけでなく、ヒト以外の種固有のアミノ酸配列をもつＥＰＯを使用することができる。
【００６４】
本発明におけるＥＰＯのアミノ酸配列は、ヒトや食肉目に由来するアミノ酸配列であることが好ましい。食肉目としては、ネコ科やイヌ科であることが好ましく、ネコ科であることがより好ましい。
【００６５】
ネコＥＰＯはヒトＥＰＯと配列同一性が８３．４％である事が知られている。また、ＣＨＯ細胞で発現させたネコＥＰＯはネコに対して造血活性がある（Am. J. Vet. Res. 64, 1465-71 (2003））。
【００６６】
貧血の原因には、大量の出血、ビタミン不足、自己免疫疾患、悪性腫瘍、慢性炎症、慢性腎不全、溶血および造血異常などが知られている。これらを原因とする貧血はヒトのみならず、愛玩動物であるイヌ、ネコ、あるいは家畜であるウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、あるいは生態研究用に動物園などで飼育・展示公開されるライオン、トラ、カンガルー、ゾウ、キリン、シマウマ、コアラ、パンダ等でも発症するが、本発明のＥＰＯによってこれらの貧血を治療することができる。ネコＥＰＯは、ネコ、ライオン、及びトラ等のネコ科動物（Ｆｅｌｉｄａｅ）の貧血の治療に使用可能である。また、ネコＥＰＯは、イヌＥＰＯに対する配列同一性も高く、分類学上ネコ目（食肉目）であるイヌ及びイヌ科動物（Ｃａｎｉｄａｅ）にも有効である。
【００６７】
上記の動物はヒトと異なり、輸血用血液のバンクシステムを持たないため、事故、手術時等の失血に対して輸血措置を施すことは困難である。しかし、本発明の造血効果が長期間持続するＥＰＯ製剤は、上記動物に対し、輸血代替あるいは点滴時にも使用できる。投与時に動物が疼痛を感じると投与に支障が生じ、また大型動物の場合に獣医師に危険が及ぶ可能性があるが、投与対象動物の体液組成に近い浸透圧、ｐＨに調製することで疼痛を最小にすることができる。
【００６８】
ネコ科に由来するＥＰＯのアミノ酸配列としては、配列番号１に示したアミノ酸配列であることが好ましい。
【００６９】
また、配列番号１に示したＥＰＯを構成するアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも、本発明のＥＰＯに含まれる。
【００７０】
ＥＰＯポリペプチドの、配列番号１に示したアミノ酸配列との配列同一性は、７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、８５％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらにより好ましく、９５％以上であることが最も好ましい。
【００７１】
また、ＥＰＯは、造血活性を損なわないように１個又は複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び／又は付加したポリペプチドでもよい。導入する変異等の数は５０を超えないことが好ましく、４０を超えないことがより好ましく、３０を超えないことがさらに好ましく、２０を超えないことがさらにより好ましく、１０を超えないことが最も好ましい。
【００７２】
ＥＰＯの製造方法としては、一般的に入手可能な動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）、原核生物、酵母を宿主として製造される組換え品のほか、天然物から取得されたもの、組換え動物で製造されたもの等が利用できるが、これらに限定されるものではない。ＥＰＯを製造する組み換え動物として、遺伝子組み換え鳥類を利用することも可能である。また精製品であっても未精製状態でも良いが、品質管理の点からは精製品が好ましい。
【００７３】
ＥＰＯの精製のためには、一般的なタンパク質の回収手段として、塩析法、吸着カラムクロマトグラフ法、イオン交換カラムクロマトグラフ法、ゲルろ過カラムクロマトグラフ法、抗体カラム法を単独、もしくは組み合わせて精製することができるが、これらのみに限定されるものではない。吸着カラムクロマトグラフ法としては、ブルーセファロースクロマトグラフ、ヘパリンクロマトグラフ等があり、イオン交換カラムクロマトグラフ法としては、陽イオン交換クロマトグラフや陰イオン交換クロマトグラフ法等がある。
【実施例】
【００７４】
以下実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。商品名を記載している場合は特に記述のない限り添付の説明書の指示に従った。
ネコ由来エリスロポエチンの合成は、特開２００７−８９５７８に記載の方法により行ったが、その工程を改めて以下に記載する。【００７５】
（製造例１）ニワトリ胚へのレトロウイルスベクターのマイクロインジェクションと人工孵化
ネコ由来エリスロポエチン発現用レトロウイルスベクターを、ニワトリ胚へマイクロインジェクションし、ネコ由来エリスロポエチンを発現するトランスジェニックニワトリを作製した。マイクロインジェクションと人工孵化は無菌条件下でおこなう。ニワトリ受精卵（城山種鶏場製）の外側を消毒液（株式会社昭和フランキ製）及びエタノールで除菌する。孵卵機Ｐ−００８（Ｂ）型（株式会社昭和フランキ製）を３８℃、湿度５０〜６０％の環境になるようセットし、電源を入れた時刻を孵卵開始時刻（０時間）とし、以後１５分毎に９０°転卵しながら孵卵を行った。【００７６】
孵卵開始から約５５時間経過後、孵卵機から卵を取り出し、その鋭端部を直径３．５ｃｍの円形にダイヤモンド刃（刃先径２０ｍｍ、シャフト径２．３５ｍｍ）を付けたミニルーター（プロクソン製）で切り取った。ニワトリ二黄卵（城山種鶏場製）の鋭端部を直径４．５ｃｍに切り取り、中身を捨てた卵殻に受精卵の中身を移し、注射器の内筒で胚を上方へ移動させた。実体顕微鏡システムＳＺＸ１２（オリンパス株式会社製）下で、フェムトチップＩＩ（エッペンドルフ株式会社製）にウイルス液を注入し、フェムトジェット（エッペンドルフ株式会社製）を用い、特開２００７−８９５７８に記載のネコ由来エリスロポエチン発現用レトロウイルスベクターを含む溶液約２μｌをマイクロインジェクションした。【００７７】
卵白を糊として約８×８ｃｍ２に切ったサランラップ（旭化成株式会社製）でこの穴を塞ぎ、孵卵機に戻し孵卵を続けた。孵卵機の転卵を３０分毎に３０°転卵に変更した。孵卵開始から２０日目にサランラップに２０Ｇの注射針で２０個程度穴を開け、孵卵機に６０ｃｃ／ｍｉｎで酸素を供給し孵卵を行った。雛がハシ打ちを始めたら卵殻を割って孵化させた。誕生した雛を飼育して成長させた。飼料として、幼雛ＳＸセーフティー及びネオセーフティー１７（豊橋飼料株式会社製）を用いた。トランスジェニックニワトリにおけるネコ由来エリスロポエチンの血中および卵中の発現を、後述のＢａＦ／ＥＰＯＲによる細胞増殖アッセイにより確認した。【００７８】
（製造例２）卵白からのネコ由来エリスロポエチンの精製
卵白中にネコ由来エリスロポエチン活性が確認されたニワトリ個体の卵を回収し、卵白よりネコ由来エリスロポエチンを後述のカラムを使用して回収・精製した。【００７９】
カラムにアプライするサンプルは全て、使用直前に孔径０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＨＶ（日本ミリポア株式会社製）にてシリンジろ過を行った。ろ過困難な場合には、孔径２μｍのプラディスク２５（ワットマン製）により予めろ過した後、Ｍｉｌｌｅｘによるろ過を行った。【００８０】
精製過程でのネコ由来エリスロポエチン含有量の測定は、Ｂｉｃｏｒｅ３０００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社・ＢＩＡＣＯＲＥ製）にて行った。Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５ ｒｅｓｅｒｃｈ ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社・ＢＩＡＣＯＲＥ製）に抗ヒトエリスロポエチンモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）をアミンカップリングキット（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社・ＢＩＡＣＯＲＥ製）でＮＨＳ固定化して測定用チップとし、エポジンを標準物質として、装置の定量用プログラムを用いて濃度を測定した。【００８１】
卵白をカラムにアプライするために、粘性を低下させる前処理を行った。冷蔵保存しておいた卵を室温に戻して割卵し、卵の殻等を用いて卵黄と卵白を分離した後、卵白のみを回収して重量を測定した。卵白をスターラーで攪拌して濃厚卵白を解きほぐし、５倍量の超純水を加え更に攪拌した。この時点で卵白液のｐＨは９．０〜９．３程度であった。これに１Ｎ ＨＣｌを適宜加えてｐＨ５．０に調整し、１５分間以上攪拌した後、９，５００Ｇ×３０分間、４℃で遠心分離した。上清に１Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨ７．０に調整し、１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．０を終濃度５０ｍＭとなるよう加えた。このステップにおけるネコ由来エリスロポエチン回収率は最大９５％であった。【００８２】
次いで、ブルーセファロースクロマトグラフィーを行った。前処理後の卵白液５００ｍｌ（卵白２〜３個分）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で平衡化した５０ｍｌのＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社・アマシャム製）にアプライした。カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で十分洗浄した後、２００ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で溶出した。溶出画分を、４℃の低温室で２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．２で常法にて一晩透析し、バッファー交換を行った。このステップにおけるネコ由来エリスロポエチン回収率は最大９８％であった。【００８３】
次いで、ヘパリンクロマトグラフィーを行った。２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．２で平衡化したＨｉＰｒｅｐ １６／１０ Ｈｅｐａｒｉｎ ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社・アマシャム製）に、ブルーセファロース溶出画分（透析後）を２回に分けてアプライし、それぞれ２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．２でカラムを十分に洗浄した後、ＮａＣｌ濃度を８０ｍＭまで上昇させるグラジエント溶出を行った。カラムは毎回１Ｍ ＮａＣｌおよび０．１Ｍ ＮａＯＨで再生した。Ｂｉａｃｏｒｅにてネコ由来エリスロポエチンの存在が確認された画分を回収した。このステップでのネコ由来エリスロポエチンの回収率は最大８０％であった。【００８４】
次いで、脱塩カラムによるバッファー交換を行った。ヘパリンセファロース溶出画分を分画分子量５，０００のビバスピン２０（ザルトリウス・メカトロニクス・ジャパン株式会社製）により総量３０〜４０ｍｌ程度に濃縮し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で平衡化したＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社・アマシャム製）に１０ｍｌずつアプライし、同バッファーで溶出し、タンパク質を含む画分を回収した。１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ９．０に調整し、さらに１Ｍ ＮａＣｌで電気伝導度が３．０〜３．２ｍＳ／ｃｍとなるよう調整した。このステップにおけるネコ由来エリスロポエチン回収率は最大９５％であった。【００８５】
次いで、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。バッファー交換後のサンプルを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、電気伝導度３．０〜３．２ｍＳ／ｃｍで平衡化した５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社・アマシャム製）に２回に分けてアプライし、それぞれ素通り画分を回収した。カラムは毎回１Ｍ ＮａＣｌで再生した。分画分子量５，０００のビバスピン２０により、総量２〜３ｍｌ程度まで濃縮した。このステップでのネコ由来エリスロポエチン回収率は、最大９２％であった。【００８６】
ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。濃縮後のサンプルを、５０ｍＭ ホウ酸バッファー、ｐＨ９．０もしくは他の適当なバッファーで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社・アマシャム製）にアプライして同バッファーで溶出した。Ｂｉａｃｏｒｅにてネコ由来エリスロポエチンの存在が確認された画分を回収し、分画分子量５，０００のビバスピン６にて総量１〜２ｍｌ程度にまで濃縮した。このステップでのネコ由来エリスロポエチン回収率は最大９３％であった。【００８７】
精製各ステップでの回収画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。サンプルはｅ・パジェル１２．５％を用いて、変性条件で泳動し、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｓｔａｉｎ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製）で検出した。【００８８】
卵白から精製したネコ由来エリスロポエチンについて、後述の方法により、Ｂａｆ／ＥＰＯＲ細胞増殖アッセイを行った。その結果比活性は１６０，０００〜２９０，０００ＩＵ／ｍｇであった。【００８９】
ネコ由来エリスロポエチンへのＰＥＧ付加は、以下のように行った。
（実施例１）ＰＥＧを付加したネコ由来エリスロポエチン（ＰＥＧ化ネコＥＰＯ）の合成反応
精製したネコＥＰＯ溶液（２０ｍＭリン酸緩衝液  ｐＨ＝７．０）を用いて、以下のＰＥＧ試薬を添加した。
分子量５，０００直鎖ＰＥＧ（日油株式会社製：ＭＥ−０５０ＨＳ）
分子量２０，０００直鎖ＰＥＧ（日油株式会社製：ＭＥ−２００ＨＳ）
分子量４０，０００直鎖ＰＥＧ（日油株式会社製：ＭＥ−４００ＨＳ）
分子量２，００００分岐ＰＥＧ、分岐数１（日油株式会社製：ＧＬ２−２００ＧＳ２）
ネコＥＰＯとＰＥＧ試薬とをモル比で１：５の割合で混合後、４℃で混和しながら反応させた。ＰＥＧの付加により、まずモノＰＥＧ体が生成し、次にジＰＥＧ体が生成し、その後オリゴＰＥＧ体が生成するため、ＨＰＬＣ（株式会社島津製作所製）により各ＰＥＧ体の生成状態をモニタリングして十分量得られた段階で反応を停止させた。なお、カラムには、ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｄｉｏｌ−２００（順相系、株式会社ワイエムシィ製）を用いた。【００９０】
各ＰＥＧ体が充分量生成したところで、反応停止剤として、１００ｍＭグリシン溶液を１／１０量加え、４℃で１時間混和しながら反応を停止させ、反応液を透析（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ＝４．５）した。【００９１】
（実施例２）ＰＥＧ反応液の精製によるＰＥＧ化ネコＥＰＯの分離精製
ＰＥＧ反応により生成した、モノＰＥＧ体、ジＰＥＧ体、オリゴＰＥＧ体および未反応ＰＥＧ、未反応ＥＰＯを分離回収するため、陽イオン交換カラムにより分離精製を行った。【００９２】
反応液を陽イオン交換カラム（ＭａｃｒｏＣａｐＳＰ：ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）により分離精製した（結合：５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．５）、溶出：１Ｍ  ＮａＣｌグラジエント）。オリゴＰＥＧ体、ジＰＥＧ体、モノＰＥＧ体の順に塩濃度により単離溶出されるピークを分取し、それぞれを透析（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）した。分散剤として、ポリソルベート８０（和光純薬工業株式会社製）を０．０５％（Ｖ／Ｖ）添加し、投与サンプルとした。【００９３】
（評価１）ネコＥＰＯ及びＰＥＧ付加ネコＥＰＯの活性測定
実施例２で合成した各種ＰＥＧ化ネコＥＰＯのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性測定を行った。
ネコＥＰＯの活性は、ＥＰＯ依存性細胞株であるＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞（（財）化学及血清療法研究所）による細胞増殖アッセイ（特開平１０−９４３９３）により行った。細胞増殖アッセイはエポジン（中外製薬株式会社製）を標準エリスロポエチンとして、増殖の検量線を描きそれを元に未知サンプルのＥＰＯ活性を測った。ＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞用培地として５％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、及びストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０リキッド培地（日水製薬株式会社製）を用いた。通常のＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞の培養の際には終濃度１Ｕ／ｍｌとなるようにエポジンを加えた。細胞増殖アッセイには対数増殖期にある細胞を用いた。【００９４】
ＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞で細胞増殖アッセイを行うため、まず培地中のエポジンを除去した。培養したＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を取り除き、沈殿にエポジンを含まない培地を１０ｍｌ加え懸濁した。同様の操作を３度行い培地中のエポジンを除去した。細胞を計数し、エポジンを含まない培地で５５５５５Ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように希釈した。９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに９０μＬずつ播種した。これに、培地で２５、１６、１０、６．４、４．０、２．５、１．６、１．０Ｕ／ｍＬとなるよう希釈したエポジンを１０μＬずつ加え、一様になるよう懸濁した（ＥＰＯの終濃度はそれぞれ２．５、１．６、１．０、０．６４、０．４、０．２５、０．１６、０．１Ｕ／ｍＬとなる）。【００９５】
アッセイに用いるサンプルは培地で２〜４倍程度ずつ段階希釈し、検量線の測定範囲内に入るようにし、播種した細胞中に１０μＬずつ加え、一様になるよう懸濁した。標準サンプル、未知サンプル共に同じものを３点測った。２日間培養し、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社同仁化学研究所製）溶液を各ウェルに１０μＬずつ添加した。１〜４時間呈色反応を行った後、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を１０μＬ加え反応を停止し、マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準サンプルの測定結果を対数近似し、近似式を求めた。求めた近似式よりサンプルの活性を換算した。
測定結果を表１に示した。【００９６】
【表１】
2011034105.tif 000003
【００９７】
（評価２）ラットへの皮下投与試験
実施例２で調製されたサンプルをラットに皮下投与した。
雄性ラット（日本チャールス・リバー株式会社製、ＳＰＦ、７週齢）に３０３μｇ／ｋｇとなるようにサンプル溶液を単回皮下投与した。実験の群および投与サンプルを表２に示した。【００９８】
【表２】
2011034105.tif 000004
【００９９】
（評価３）ラット網状赤血球数の測定
皮下投与前をＤａｙ０とし、皮下投与後、４、７、１０、１４日に経時的に頚静脈より採血した。採血した全血を用いて、末梢血における網状赤血球数を測定した（メチレンブルー染色法：株式会社ランス）。網状赤血球数の変化を図１〜図４に示した。【０１００】
（評価４）水溶性長鎖分子が付加されたエリスロポエチンの含量の測定方法
水溶性長鎖分子が付加されたエリスロポエチン溶液は、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）により透析を行う。分光光度計（Ｇｅｎｅ  Ｑｕａｎｔ  ｐｒｏ：ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社・アマシャム製  ｃｏｄｅ  ８０−２１１４−９８）およびＵＶセルを用いて２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）をブランクとして、２８０ｎｍの波長での吸光度が０．１となるようにリン酸緩衝液を用いて調製する。【０１０１】
この溶液に等量のＬａｅｍｍｌｉ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製  ｃｏｄｅ  １６１−０７３７に終濃度３５０ｍＭとなるようＤＴＴを加える）を添加し、９５℃  ５分熱変性を行った後、氷上で急冷したものをサンプルとし、２μｌを電気泳動する。電気泳動は、ゲルとしてｅ−ＰＡＧＥＬ（アトー株式会社製  Ｅ−Ｒ１２．５Ｌ）を用い、泳動装置としては、ＰＡＧＥＲＵＮ（アトー株式会社製  Ｍｏｄｅｌ  ＡＥ−６５３１）を用いて、ゲル１枚あたり２０ｍＡに設定のあと、８０分間電気泳動する。電気泳動が終了したら、ゲル板からゲルをはがし、超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ：日本ミリポア株式会社製  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＺＭＱＳ７Ｖ０Ｔ１）に３０分浸漬する。超純水を除き、固定化溶液に３０分浸漬し、ゲルを固定化処理する。固定化溶液を除き、染色液を加えて３時間以上６時間未満の時間浸漬する。染色液を除き、固定化溶液に浸漬し、ゆるやかに振とうしながら６０分洗浄し、洗浄に用いた固定化溶液を除く。新しい固定化溶液を加え、ゆるやかに振とうしながら６０分洗浄を行う。【０１０２】
２回の洗浄のあと、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製）により、紫外線照射を行いながらゲルのイメージを取り込む。ソフトウェアとしてはＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  ｖｅｒ．４．６（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製）を用いて、イメージ中のバンドの蛍光強度を測定する。Ｆｒａｍｅ  Ｌａｎｅによりレーン指定を行った後、Ｌａｎｅ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄで表示されるＩｎｔｅｎｓｉｔｙのエリア比率により含有量を算出する。複数のバンドが確認される場合、目的とする分子量のバンドの蛍光強度の全バンドの蛍光強度に占める割合を含有率と規定する。【０１０３】
なお、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）、固定化溶液、染色液はそれぞれ以下のものを用いた。
（ｉ）２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）
１Ｌの超純水に対し、以下の試薬を溶解させたものとする。
リン酸二水素ナトリウム２水和物（和光純薬工業株式会社製  １９２−０８２５）０．５９ｇ
リン酸水素二ナトリウム１２水和物（和光純薬工業株式会社製  １９６−０２８３５）５．８ｇ
塩化ナトリウム（ナカライテスク株式会社製  ３１３２０−０５）８．７６ｇ
（ｉｉ）固定化溶液
超純水を用いて以下の割合となるように調製された水溶液とする。
１０％メタノール（ナカライテスク株式会社製  ２１９１５−９３）
７％酢酸（ナカライテスク株式会社製  ００２１２−８５）
（ｉｉｉ）染色液
ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｌｏｎｚａ  ｃａｔ．５０５６４）
【図１】
2011034105.tif 000005
【図２】
2011034105.tif 000006
【図３】
2011034105.tif 000007
【図４】
2011034105.tif 000008
【配列表】
2011034105000001.app
【国際調査報告】
2011034105.tif 000009
2011034105.tif 000010
2011034105.tif 000011
2011034105.tif 000012