(57)【要約】本発明は、高温で安定な末端リン酸ブロックヌクレオシドポリリン酸、並びに核酸増幅及び解析におけるその使用を記載する。本発明はさらに、改善された取込みのための荷電修飾末端リン酸ブロックヌクレオシドポリリン酸及び分離媒体への核酸シークエンシング反応の直接ローディングを記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型核酸、プライマー、核酸ポリメラーゼ及び１種以上のヌクレオシドポリリン酸のポリメラーゼ反応を含む核酸の改良解析法であって、ポリメラーゼ反応を１種以上の末端ブロックヌクレオシドポリリン酸の存在下で実施することを改良点とする方法。
【請求項２】
前記核酸解析がＤＮＡ配列決定である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記末端ブロックヌクレオシドポリリン酸が標識ターミネーターである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記核酸解析が核酸増幅である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記増幅が、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）又はＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）で実施される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記１種以上の末端ブロックヌクレオシドポリリン酸が追加の負電荷を有する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記１種以上の末端ブロックヌクレオシドポリリン酸が正味の正電荷を有する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記１種以上の末端ブロックヌクレオシドポリリン酸が熱安定性である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記末端ブロックヌクレオシドポリリン酸が次の式で表される、請求項１記載の方法。
Ｚ−Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ｌ
式中、Ｚは線状又は枝分れ環式又は非環式アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族、複素環式又は検出可能な標識を含む有機部分からなる末端ブロックであり、
Ｘは３個以上のリン酸又は修飾リン酸基を有するポリリン酸であり、
Ｓは天然又は修飾糖、炭素環式又は非環式リンカーであり、
Ｂは天然又は修飾複素環式塩基であり、
ＬはＨ、或いは置換もしくは非置換、線状もしくは枝分れ環式もしくは非環式アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族又は複素環式からなる群から選択されるリンカー部分である。
【請求項１０】
Ｌ、Ｂ、Ｓ、Ｘ又はＺの少なくとも１つが検出可能な部分で置換されている、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Ｌ、Ｂ、Ｓ、Ｘ又はＺの少なくとも１つが負電荷部分で置換されている、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
Ｌ、Ｂ、Ｓ、Ｘ又はＺの少なくとも１つが正味の正電荷を与える部分で置換されている、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
Ｚが、追加の負電荷又は１以上の正電荷をもつように修飾されている、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
Ｌが、放射性同位体、電気化学的タグ、蛍光タグ、エネルギー移動（ＥＴ）標識、質量分析タグ、ラマンタグ、ハプテン、化学発光基、酵素、発色団及びこれらの組合せからなる群から選択される検出可能な部分で標識されている、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
Ｂがウラシル、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン及び２，６−ジアミノプリン又はその誘導体からなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
Ｘが３、４又は５個のリン酸基からなるポリリン酸鎖である、請求項９記載の方法。
【請求項１７】
Ｓが、２′−デオキシリボシル、３′−デオキシリボシル、２′，３′−ジデオキシリボシル、２′，３′−ジデオキシ−２′，３′−ジデヒドロリボシル、３′−アルコキシリボシル、３′−アジドリボシル、３′−アミノリボシル、３′−フルオロリボシル、３′−メルカプトリボキシル、３′−アルキルチオリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アジドリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−メルカプトリボシル、２′−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式及び他の修飾糖からなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１８】
Ｓが、２′−デオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アジドリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−メルカプトリボシル、２′−アルキルチオリボシルからなる群から選択される、核酸増幅のための請求項９記載の方法。
【請求項１９】
前記末端ブロックヌクレオシドポリリン酸が次の式で表される、請求項９記載の方法。
【化１】
2005536999.tif 000008
式中、ｎは１、２又は３であり、
ブロックは有機部分又はＸがＣＨ２のときはＨであり、
ＸはＣＨ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、
ＲはＨ又はＯＨであり、
塩基は天然又は修飾ヌクレオシド塩基であり、
リンカーはＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、アルケニル、アルキニル、芳香族又は複素環式であって、適宜荷電していてもよく、
Ｚは、蛍光色素、エネルギー移動色素、化学発光化合物、着色化合物、質量タグであるか又は標識が全くない。
【請求項２０】
（ａ）１種以上の末端リン酸ブロックヌクレオシドポリリン酸と、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ
を含むＤＮＡ配列決定又は核酸増幅用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温で安定な末端リン酸ブロックヌクレオシドポリリン酸、並びに核酸増幅及び解析におけるその使用に関する。本発明は、さらに、改善された取込み用の荷電修飾末端リン酸ブロックヌクレオシドポリリン酸及び核酸シークエンシング反応物の分離媒体への直接ローディングについて記載する。
【背景技術】
【０００２】
多くの増幅法ではＤＮＡ増幅は高温で実施される。例えばＰＣＲでは、９５℃での変性、約６０℃でのアニーリング及び約７０℃での伸長の繰返しサイクルによって、ｄＮＴＰのかなりの分解が起こる。そのため、後期サイクルでの産物の収率に大きな影響を与えかねない。ＲＣＡやＮＡＳＢＡのような他の増幅法は等温的ではあるが、高温で実施される。ＮＡＳＢＡの場合、４１℃で実施され、ヌクレオチドの安定性はさほど重要でないかもしれない。しかし、ＲＣＡは、用いるポリメラーゼ及び増幅すべき配列の複雑さに応じて高温で実施されることがある。こうした条件下ではヌクレオチドの安定性が問題となる。そのため、こうした繰返し温度サイクル又は定温ではあるが高温での長期加熱に耐えるヌクレオチドであって、増幅の後期サイクルでも高い収率を与え続け、所望の増幅率の達成に要するサイクル数／時間を低減できるものが望まれる。
【０００３】
ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列は様々な方法で決定できる。チェーンターミネーション法では、一般に、鋳型鎖の一部にハイブリダイズし得るプライマーをＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させ、配列決定すべき鋳型鎖に相補的なＤＮＡを合成する。合成反応では、ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）のような鎖終結剤が取込まれるまでデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）が取込まれてＤＮＡフラグメントが形成される。ｄｄＮＴＰの取込みによってそれ以上のＤＮＡ合成が阻害される（チェーンターミネーションと呼ばれるプロセス）。この方法で合成された各ＤＮＡフラグメントのサイズをゲル電気泳動で決定し、その情報を用いて元の鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列を求める。例えば、Ｔａｂｏｒ及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎの米国特許第４７９５６９９号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。）には、二段階配列決定法が記載されており、標識段階で未標識プライマーを標識し、次いでチェーンターミネーション段階で過剰のｄＮＴＰ及びｄｄＮＴＰの存在下で伸長させる。標識段階では、低濃度のｄＮＴＰ（標識されたもの）が得られ、少量のプライマー伸長が可能になる。
【０００４】
ジデオキシ配列決定法では、ポリヌクレオチドキナーゼを用いたプロセスによってプライマーを例えば３２Ｐで標識してもよい。かかる標識によって、ゲル電気泳動後の伸長プライマーのゲルのオートラジオグラフィーによる検出が可能となる。別法として、標識ｄＮＴＰを、ＤＮＡ合成プロセスに取込んでもよく、かかる標識ｄＮＴＰの存在はオートラジオグラフィーその他の手段で検出し得る。こうした目的のため、ｄＮＴＰを３２Ｐ又は３５Ｓのいずれかで放射性標識してもよい。別の方法では、蛍光による検出のためプライマーを１以上の蛍光部分で標識することもできる。さらに別の方法では、ｄｄＮＴＰを例えば蛍光マーカーで標識してもよい。
【０００５】
シークエンシング反応では、標識ｄＮＴＰ又はｄｄＮＴＰが部分的に分解して（多分サーマルサイクリング条件に起因する）標識副生成物を生じ、かかる標識副生生物が分離媒体を移動して、正しいシークエンシングフラグメントの解釈が妨げられる。例えば、標識ｄＮＴＰ又はｄｄＮＴＰの分解産物及び未反応ターミネーターが、シークエンシングゲル又は電気泳動図にピーク又は斑点として現れることがある（図１、レーン３及び４、従来のターミネーターを含むシークエンシング生成物を電気泳動ゲルに直接ロードしたときに得られた斑点）。現在、この問題は、シークエンシング生成物の沈殿、例えばローディング前のエタノール沈殿などによって対処されている（図１、レーン１及び２）。これによって汚染は幾分低減するが、この方法は時間がかかり、ハイスループットシークエンシング用途の障害となる。
【０００６】
そこで、シークエンシングデータの明確さを改善するプロセスが必要とされている。理想的には、かかるプロセスは、サンプル調製時間を短縮して、シークエンシングスループットを向上させることが望ましい。さらに、かかる方法は経済的に使用できることが望ましい。上記その他の課題について以下で詳細に取り組む。
【０００７】
最近、シークエンシングゲルでの分離の際に、シークエンシングフラグメントよりも先に移動するように高度に負に荷電しているか、或いはシークエンシングフラグメントとは逆方向に移動するように高度に正に荷電した荷電修飾ヌクレオシド三リン酸が記載されている（国際公開第０１／１９８４１号）。これらのヌクレオチドでは、一連の負電荷又は正電荷部分が塩基に結合している。これらのヌクレオチドが組込まれると、塩基に一連の電荷が存在しているため、シークエンシングフラグメントの移動度にかなりの影響が生じる。高度に負に荷電又は正味の正に荷電した修飾ヌクレオシド三リン酸で、取込み後は天然ヌクレオチドと同じ荷電を有するものが望ましい。そうすると、シークエンシング生成物の移動度は影響されない。移動度が問題とならない場合でも、分解生成物による問題が起こらないように、安定性の向上したヌクレオシド三リン酸があれば望ましい。
【特許文献１】米国特許第４７９５６９９号明細書
【特許文献２】国際公開第０１／１９８４１号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は一つの態様では、増幅産物の収率を高めるためＰＣＲのような高温増幅法における末端リン酸ブロックヌクレオシドポリリン酸（構造１）の使用に関する。別の態様は、末端リン酸基にブロック基を有する標識ヌクレオシドポリリン酸、並びに高温又は温度サイクリングを要する配列決定及び他の遺伝子型解析法における使用について開示する。
【０００９】
本発明には、核酸増幅及び／又は検出キットも包含されるが、当該キットは次式の１種以上の熱安定性末端リン酸ブロックヌクレオシドを備える。
【００１０】
Ｚ−Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ｌ（構造１）
式中、Ｚは有機部分からなる末端ブロックである。末端ブロックは、線状又は枝分れ環式又は非環式アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族、複素環式部分或いはリンカーを有する又は有さない検出可能な標識であり、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ及びハロゲンのような原子を含んでいてもよい。Ｚは適宜追加の負電荷又は正電荷部分を含むように修飾されていてもよい。後者の場合、添加される正電荷の量は分子上の他の正電荷と併せて全体として正味の正電荷を与えるのに十分である。Ｘは３個以上のリン酸又は修飾リン酸基を有するポリリン酸鎖であるが、このヌクレオシドポリリン酸のＤＮＡ又はＲＮＡポリマーへの取込みをかかる修飾が妨げないことを条件とする。
Ｓは天然又は修飾糖、炭素環式又は非環式リンカーである。
Ｂは天然又は修飾複素環式である。適当な塩基アナログとしては、特に限定されないが、国際公開第９９／０６４２２号及び同第９７／２８１７７号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。）に開示されているものが挙げられ。
ＬはＨ又はリンカー部分である。リンカーはＨ、線状もしくは枝分れ環式もしくは非環式アルキル、アルケニル又はアルキニル、芳香族、複素環式とすることができ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びハロゲンのような原子を含んでいてもよい。
Ｌ、Ｂ、Ｓ、Ｘ又はＺは、生理的又は核酸配列決定条件下で構造１に追加の負電荷又は正味の正電荷を与える部分で置換されてもよい。
【００１１】
リンカーは、標識（「レポーター又はシグナル部分」とも呼ばれる。）で適宜置換されていてもよい。標識は、蛍光タグ、エネルギー移動（ＥＴ）標識、放射性同位体、電気化学的タグ、質量分析タグ、ラマンタグ、ハプテン、化学発光基、酵素、発色団及び２種以上の標識のような部分であってもよい。標識は荷電していてもよく、例えばＣｙ３．５、Ｃｙ５．５、カルボキシフルオレセインでもよいし、或いは荷電部分に結合した色素、例えば、システイン酸に結合したカルボキシフルオレセインその他同様の荷電種であってもよい。上記その他同様の化合物の製造方法は当技術分野で公知であり、Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖａ，ＬＡ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９８，  ２６，  ７７８−７８６、Ａｒｚｕｍａｎｏｖ，ＡＡ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９６，  ２７１，  ２４３８９−２４３９４、米国特許出願番号９０／０１８６９５号及びＰＣＴ／ＧＢ９８／００９７８に開示されており、それらの開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００１２】
この分子は、生理的条件又は核酸シークエンシングもしくは増幅条件下で構造１に追加の負電荷又は正味の正電荷を与える部分で置換されていてもよい。この部分は、構造の電気泳動移動度を変える荷電種、例えば、α−スルホ−β−アラニン、システイン酸、スルホン酸、カルボキシレート、リン酸、ホスホジエステル、ホスホン酸、アミン、四級アミン及びホスホニウム部分であってもよい。この部分（「移動度調節基」という。）は、リンカーと標識の間、塩基とリンカーの間に結合していてもよいし、糖だけ又はリンカーだけに結合していてもよい。また、末端リン酸との間に結合していてもよく、実際に末端ブロックであってもよい。また、標識と末端ブロックの間に結合していても、末端ブロックだけ又は末端ブロックの標識だけに結合していてもよい。分子は互いに間隔をおいて複数のリンカー又は部分を含んでいてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
「ヌクレオシド」という用語は、本明細書では、プリン、デアザプリン又はピリミジン塩基が糖又は炭素環式もしくは非環式リンカーのような糖置換体に１′位又は等価な部位で結合した化合物であり、２′−デオキシ及び２′−ヒドロキシ、２′，３′−ジデオキシ型その他の置換体を包含する。
【００１４】
「ヌクレオチド」という用語は、本明細書では、ヌクレオシドのリン酸エステルをいい、エステル化部位は典型的には五炭糖のＣ５位についた水酸基に相当する。
【００１５】
「オリゴヌクレオチド」という用語には、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを始めとするヌクレオチド又はその誘導体の線状オリゴマーが包含される。本明細書全体を通して、オリゴヌクレオチドを文字の配列で示すときは、特記しない限り、ヌクレオチドは左から右に５′→３′方向の順序で示し、Ａはデオキシアデノシン、Ｃはデオキシシチジン、Ｇはデオキシグアノシン、Ｔはチミジンを表す。
【００１６】
「プライマー」という用語は、ユニークな鋳型核酸配列に特異的にアニールしてそのユニーク配列の増幅を可能にする線状オリゴヌクレオチドをいう。
【００１７】
本発明の方法に有用な炭素環式部分は、Ｆｅｒｒａｒｏ，Ｍ．及びＧｏｔｏｒ，Ｖ．，  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．  ２０００，  ｖｏｌ．１００，  ４３１９−４８に記載されている。適当な糖部分は、Ｊｏｅｎｇ，Ｌ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １９９３，  ｖｏｌ．３５６，  ２６２７−３８、Ｋｉｍ，Ｈ．Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １９３，  ｖｏｌ．３６，  ３０−７並びにＥｓｃｈｅｎｍｏｓｓｅｒ，Ａ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９，  ｖｏｌ．２８４，２１１８−２１２４に記載されている。また、有用な非環式部分は、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｃ．Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９９，  ｖｏｌ．２７，  １２７１−１２７４、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｃ．Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９７，  ｖｏｌ．７，  ３０１３−３０１６並びにＴｒａｉｎｅｒ，Ｇ．Ｌ．の米国特許第５５５８９１号に記載されている。これらの部分の構造を、以下に示すが、すべての部分についてＲはＨ、ＯＨ、ＮＨＲ、低級アルキル及びアリールであり、糖部分についてはＸ及びＹは独立にＯ、Ｓ又はＮＨであり、非環式部分についてはＸ＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲである。
【００１８】
【化１】
2005536999.tif 000002
【００１９】
ある実施形態では、糖部分は、リボシル、２′−デオキシリボシル、３′−デオキシリボシル、２′，３′−ジデオキシリボシル、２′，３′−ジデヒドロジデオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アジドリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−メルカプトリボキシル、２′−アルキルチオリボシル、３′−アルコキシリボシル、３′−アジドリボシル、３′−アミノリボシル、３′−フルオロリボシル、３′−メルカプトリボキシル、３′−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式及び他の修飾糖から選択し得る。他の実施形態では、３′位は鎖伸長に必要な水酸基を有する。
【００２０】
また、上記の構造１において、塩基としては、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン又はそのアナログが挙げられる。
【００２１】
本発明は、ブロックされていない対応核酸ポリリン酸よりも高温での安定性が向上した末端リン酸ブロック核酸ポリリン酸の使用に関する。これには、末端位がブロックされたデオキシヌクレオシドポリリン酸及びリボヌクレオシドポリリン酸が挙げられる。また、シークエンシング反応の際に顕著な分解を起こさず、シークエンシング反応産物とは異なる速度で分離媒体を移動する末端リン酸ブロックジデオキシヌクレオシドポリリン酸又はヌクレオシドターミネーターが挙げられる。その結果、配列データが改善される。かかる核酸ターミネーターは、分離媒体への核酸シークエンシング反応の直接ローディングを可能にする。この目的を達成するため、ターミネーターリン酸部分を修飾してターミネーター分子を安定化する。未反応ターミネーターは移動度が速い（負電荷）。さらに、修飾によってターミネーターに追加の負電荷を加えるか或いは構造に多数の正電荷を加えてターミネーターを全体として正に荷電させることによって、移動度を変えることができる。後者も望ましい。正に荷電したヌクレオシド三リン酸は、親化合物よりもポリメラーゼの基質として優れていることが判明しているからである（Ｆｉｎｎ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００３）３１，  ４７６９−４７７８）。
【００２２】
本発明において有用な末端リン酸ブロックヌクレオシドポリリン酸の一実施形態は、以下の構造２で表される。
【００２３】
【化２】
2005536999.tif 000003
【００２４】
上記構造において、ｎは１以上であり、Ｒ１及びＲ２は独立にＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＯＲ又はＯＨであり、「塩基」は天然又は修飾ヌクレオシド塩基であり、ＸはＣＨ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、ＹはＯ、Ｓ又はＢＨ３であり、「ブロック」は１個以上の炭素原子を含む有機部分であり、ヘテロ原子及び検出可能な部分を含んでいてもよい。「ブロック」はＸがＣＨ２のときはＨであってもよい。リンカーはＨ、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族又は複素環式であり、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ及びハロゲンのような原子を含んでいてもよい。ＺはＨ又は検出可能な部分、例えば放射性同位体、電気化学的タグ、蛍光タグ、エネルギー移動（ＥＴ）標識、質量分析タグ、ラマンタグ、ハプテン、化学発光基、酵素、発色団及び２以上の標識であってもよい。標識は荷電していてもよく、例えばＣｙ３．５、Ｃｙ５．５、カルボキシフルオレセインであってもよいし、又は荷電部分に結合した色素、例えばシステイン酸に結合したカルボキシフルオレセインもしくは同様の荷電種であってもよい。
【００２５】
ｎが２以上の場合、ヌクレオチドは、ｎが１のときよりもポリメラーゼの基質として格段に優れていることが判明した。従って、本発明の好ましい実施形態では、ｎは２、３又は４である。本発明のさらに好ましい実施形態では、Ｘ及びＹはＯであり、Ｒ１及びＲ２は独立にＨ又はＯＨであり、ＺはＨ又は蛍光標識のいずれかである。
【００２６】
この分子は、生理的条件又は核酸シークエンシング条件下で構造２に追加の負電荷又は正味の正電荷を与える部分で修飾されていてもよい。この部分は、構造の電気泳動移動度を変える荷電種、例えばα−スルホ−β−アラニン、システイン酸、スルホン酸、カルボキシレート、リン酸、ホスホジエステル、ホスホン酸、アミン、四級アミン及びホスホニウム部分であってもよい。この部分（「移動度調節基」という。）は、リンカーとＺの間、塩基とリンカーの間に結合していてもよいし、糖だけ又はリンカーだけに結合していてもよい。また、末端リン酸とブロックの間に結合していてもよく、実際に末端ブロックであってもよい。また、末端ブロックを標識する場合、末端ブロックに結合していてもよく、標識と末端ブロックの間に結合していても、末端ブロックの標識だけに結合していてもよい。分子は互いに間隔をおいて複数のリンカー及び部分を含んでいてもよい。
【００２７】
末端リン酸ブロック核酸ポリリン酸がターミネーターのときは、分離媒体上をシークエンシング反応産物とは異なる速度で移動して、改善された配列データが得られ（すなわち、真のデータを不明瞭にする斑点がない）、分離媒体での核酸シークエンシング反応の直接ローディングが可能となる。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、高温でのＤＮＡ又はＲＮＡ増幅法における末端リン酸ブロックヌクレオシドポリリン酸の使用である。かかる方法の例としては、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及びＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。例えば、標的分子がＤＮＡのような核酸ポリマーである場合、末端リン酸基がブロックされたヌクレオチド塩基（アデニン、チミン、シトシン、グアニンその他の窒素複素環式塩基など）のＰＣＲ方法によるＤＮＡへの取込みによって増幅し得る。ＰＣＲ法は、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２３９，  ｐ．４８７，  １９８８、Ｍｕｌｌｉｓ他の米国特許第４６８３１９５号、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８０）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ（１９９９）並びにＷｕ，Ｒ．（Ｅｄ．），  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ＩＩ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ，  （１９９５）に記載されている。ＰＣＲを用いて、検出すべきＤＮＡのような標的核酸を、ＰＣＲ試薬と適当なプライマーを含んだ反応容器に直接入れて増幅する。通例、標的核酸の少なくとも一部に相補的な配列のプライマーが選択される。
【００２９】
核酸の増幅に適した核酸ポリメラーゼ反応としては、核酸配列を増幅するための各種ＲＣＡ法が挙げられる。例えば、Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐａｕｌ  Ｍの米国特許第５８５４０３３号に開示されているものが有用であり、その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。ポリメラーゼ反応としては、ＮＡＳＢＡも挙げられるが、系は、ＤＮＡではなくＲＮＡを増幅し、増幅は等温的であって、単一の温度（４１℃）で起こる。ＮＡＳＢＡによる標的ＲＮＡの増幅は、標的ＲＮＡ試料に対するオリゴヌクレオチドプライマーと共に、逆転写酵素とｒＲｎａｓｅ  ＨとＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの３種類の酵素の協調した活性が関与する。これらの酵素は、伸長、分解、ＤＮＡ合成及び環状ＲＮＡ増幅の４段階で標的一本鎖ＲＮＡの指数関数的な増幅を触媒する。
【００３０】
増幅用のＤＮＡ配列としては、細胞から単離したＤＮＡ、化学的処理を施したＤＮＡ、例えば亜硫酸水素処理したメチル化ＤＮＡ、又は当技術分野で公知の方法で化学合成もしは酵素合成したＤＮＡが挙げられる。かかる方法としては、ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ，  Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．及びＤａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．（Ｅｄｓ．），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２１１，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載された方法があり、その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。ＤＮＡ配列としては、染色体ＤＮＡ及び天然又は合成オリゴヌクレオチドも挙げられる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。
【００３１】
本発明で有用な熱安定性末端リン酸ブロックヌクレオシドポリリン酸の別の実施形態は構造３で表される。
【００３２】
【化３】
2005536999.tif 000004
【００３３】
上記構造において、ｎは１以上であり、ＲはＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＯＲ又はＯＨであり、「塩基」は、天然又は修飾ヌクレオシド塩基であり、ＸはＣＨ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、Ｙは、Ｏ、Ｓ又はＢＨ３であり、「ブロック」は１個以上の炭素原子を含む有機部分であり、ヘテロ原子及び検出可能な部分を含んでいてもよい。「ブロック」はＸがＣＨ２である場合にはＨであってもよい。リンカーはＨ、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族又は複素環式であり、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ及びハロゲンのような原子を含んでいてもよい。ＺはＨ又は検出可能な部分、例えば放射性同位体、電気化学的タグ、蛍光タグ、エネルギー移動（ＥＴ）標識、質量分析タグ、ラマンタグ、ハプテン、化学発光基、酵素、発色団及び２以上の標識であってもよい。標識は荷電していてもよく、例えば、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、カルボキシフルオレセインであってもよいし、或いは荷電部分に結合した色素、例えばシステイン酸に結合したカルボキシフルオレセインもしくは同様の荷電種であってもよい。
【００３４】
ｎが２以上の場合、ヌクレオチドは、ｎが１のときよりもポリメラーゼの基質として格段に優れていることが判明した。従って、本発明の好ましい実施形態では、ｎは２、３又は４である。本発明のさらに好ましい実施形態では、Ｘ及びＹはＯであり、ＲはＨ又はＯＨであり、ＺはＨ又は蛍光標識のいずれかである。
【００３５】
本発明で有用な構造３の末端リン酸ブロックヌクレオチドの別の好ましい実施形態では、ｎは２、３又は４であり、Ｘ及びＹはＯであり、ブロックは低分子Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリールであって置換基を有していても有していなくてもよく、塩基は天然に存在する塩基であり、リンカーはＨであって、それに結合した標識を有しておらず、ＲはＨ又はＯＨである。
【００３６】
この分子は、生理的条件又は核酸シークエンシング条件下で構造３に追加の負電荷又は正味の正電荷を与える部分で修飾されていてもよい。この部分は、構造の電気泳動移動度を変える荷電種、例えばα−スルホ−β−アラニン、システイン酸、スルホン酸、カルボキシレート、リン酸、ホスホジエステル、ホスホン酸、アミン、四級アミン及びホスホニウム部分であってもよい。この部分（「移動度調節基」という。）は、リンカーとＺの間、塩基とリンカーの間に結合していてもよく、糖だけ又はリンカーだけに結合していてもよい。また、末端リン酸とブロックの間に結合していてもよく、実際には末端ブロックであってもよい。また、末端ブロックを標識する場合、末端ブロックに結合していてもよいし、標識と末端ブロックの間又は末端ブロックの標識だけに結合していてもよい。分子は互いに間隔をおいて複数のリンカー及び部分を含んでいてもよい。
【００３７】
以上説明してきた本発明の方法は、１種以上のＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼの存在下でポリメラーゼ反応を行なうことを含んでいてもよい。ポリメラーゼ反応の基質として添加される適当なヌクレオチドには、ヌクレオシドポリリン酸、デオキシヌクレオシドポリリン酸及びジデオキシヌクレオシドポリリン酸、炭素環式ヌクレオシドポリリン酸及び非環式ヌクレオシドポリリン酸及びそのアナログが挙げられる。特に望ましいのは、末端リン酸がブロックされ、ポリリン酸鎖に３、４又は５個のホスホリル基を含むヌクレオチドである。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例で幾つかの好ましい実施形態を例示するが、あらゆる実施形態を例示するものではない。
【００３９】
実施例１
メチル−ブロック，色素標識−２′，３′−ジデオキシヌクレオシド−５′−四リン酸の合成：フルオレセイン−１８−ｄｄＡ４Ｐ−メチルの合成
【００４０】
【化４】
2005536999.tif 000005
【００４１】
Ａ．ＦＡＭ−１８−ｄｄＡＴＰの調製
【００４２】
【化５】
2005536999.tif 000006
【００４３】
１８−ｄｄＡＴＰの溶液（６０μｍｏｌ、５ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ８．５）中）を氷／水浴で冷却した。この溶液に、ＤＭＦ（５ｍｌ）中の５−カルボキシ−フルオレセイン−ＮＨＳエステル（３５ｍｇ、１当量）を添加した。反応フラスコを冷却浴から取り出し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。生成物を陰イオン交換クロマトグラフィー及びＨＰＬＣで精製した。生成物含有画分を濃縮し、凍結乾燥して黄色固体を得た。
【００４４】
Ｂ．メチル−ホスホイミダゾリデートの調製
メチル一リン酸（５０μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２×２ｍｌ）及びトリブチルアミン（５０μｍｏｌ）と共蒸発させた。これを無水ＤＭＦ（０．５ｍｌ）に再溶解し、カルボニルジイミダゾール（２００μｍｏｌ、５当量）で一晩処理した。メタノール（５０μｌ）の添加によって反応混合物を奪活した。１時間後、混合物を減圧下で蒸発乾固し、無水ＤＭＦ（５００μｌ）に再溶解した。
【００４５】
Ｃ．フルオレセイン−１８−ｄｄＡ４Ｐ−メチルの合成
ＦＡＭ−１８−ｄｄＡＴＰ（３μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ及びトリブチルアミンと共蒸発し、無水ＤＭＦ（４００μｌ）に再溶解した。この溶液に、１００μｌのメチルホスホイミダゾリデートを添加して、反応混合物を一晩撹拌した。そのマススペクトル分析で、三リン酸から所要のメチル四リン酸に完全に変換したことを確認した。反応混合物を濃縮して、最初に陰イオン交換カラム、次いでＸ−ｔｅｒｒａ  Ｃ１８  ＲＰ  ＨＰＬＣカラムで精製した。所要画分を回収して、減圧下で濃縮し、水に再溶解した。収量は、分光法でモニターして２．５μｍｏｌであった。ＵＶ最大は５０１ｎｍ、ＥＳＭＳ：１２０４（Ｍ−１）。
【００４６】
実施例２
エネルギー移動色素をベースにしたブロック−ジデオキシヌクレオシド−５′−四リン酸：ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ−ｄｄＡ４Ｐ−メチルの合成
【００４７】
【化６】
2005536999.tif 000007
【００４８】
ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ−１８−ｄｄＡ４Ｐを、上記のＦＡＭ−１８−ｄｄＡ４Ｐ−メチルの合成について記載した方法と基本的に同じ方法でメチル四リン酸に変換した。出発物質１０μｍｏｌからの収量は８．５μｍｏｌであった。ＵＶ４９５及び５５６ｎｍ。ＥＳＭＳ：１６４４（Ｍ−１）。
【００４９】
実施例３
通常及びメチルブロックエネルギー移動ターミネーターの安定性
２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ８．０、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＳＯ４、２００マイクロモル  ｄＮＴＰ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２０単位のＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｉ、０．８ミリ単位ピロホスファターゼ、１００ｎｇ  Ｍ１３ｍｐ１８、５ｐｍｏｌユニバーサル−４０プライマー及び３．５マイクロモル  ＦＡＭ−ＴＡＭ−１８ｄｄＡＴＰを含む配列反応を、９５℃１５秒から６０℃２分まで２５回繰返す。次いで反応物をエタノール沈殿し、ＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００シークエンシング装置で電気泳動した（図２、パネル１）。エタノール沈殿しなかったときは、分解生成物は電気泳動図の斑点として現われ、５０〜１００ヌクレオチド長のフラグメントに干渉する。
【００５０】
同じＭｅｇａＢＡＣＥの泳動で、１０マイクロモルのＦＡＭ−ＴＡＭ−１８−ｄｄＡＴＰ又は１０マイクロモルのＦＡＭ−ＴＡＭ−１８−ｄｄＡ４Ｐ−メチルを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ８．０，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＳＯ４、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を、９５℃２０分間の加熱の有無とともに直接（沈殿を行わずに）電気泳動した（パネル２〜５）。図２のパネル２及び３から、通常のターミネーターは加熱時に分解するが、同じターミネーターの末端リン酸をメチルブロックすると大半はインタクトなまま残ることが分かる（パネル４及び５）。
【００５１】
実施例４
通常及び末端リン酸ブロックターミネーターを用いたＤＮＡ配列決定
配列反応は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ８．０、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＳＯ４、２００マイクロモル  ｄＮＴＰ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２０単位のＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｉ、０．８ミリ単位  ピロホスファターゼ、１００ｎｇ  Ｍ１３  ｍｐ１８、５ｐｍｏｌ  ユニバーサル−４０プライマー、及び３．５マイクロモルのＦＡＭ−ＴＡＭ−１８ｄｄＡＴＰ又は５０マイクロモルのＦＡＭ−ＴＡＭ−１８−ｄｄＡ４Ｐ−メチルのいずれかを含んでいた。反応を、９５℃１５秒から６０℃２分まで２５回繰返す。次いで反応物をエタノール沈殿して、ＡＢＩ３７７  ＤＮＡシークエンシング装置で電気泳動した。図３から、メチルブロックターミネーターが、通常のターミネーターと対比して同様の配列ラダーを与えることが分かる。
【００５２】
実施例５
γブロックヌクレオシド三リン酸の安定性
ｄＡＴＰ及びγ−メチル−ｄＡＴＰを別々に、１００μｌの緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ及び１０％グリセロール）に５０μＭ濃度に溶解して、９５℃で２時間加熱した。反応混合物を、分解生成物については逆相ＨＰＬＣで、生成物の同定についてはＬＣＭＳで分析した。ＨＰＬＣ及びＬＣＭＳいずれもγ−メチル−ｄＡＴＰの分解はみられなかったが、ｄＡＴＰは約７５％が分解されてｄＡＤＰ（６９％）及びｄＡＭＰ（５．７％）となった（図４）。
【００５３】
実施例６
γ−ＤＤＡＯ−ｄｄＴＴＰの安定性
Ｔｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ及び１０％グリセロール）にγ−ＤＤＡＯ−ｄｄＴＴＰを５０μＭ濃度に溶解して３組の２サンプル（各１００μｌ）を調製した。各組を３７℃、６０℃又は９５℃で１０分間加熱した。各組の１サンプルに、１単位のウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）を添加して、混合物を３７℃で５分間インキュベートした。１単位のＣＩＡＰは、毎分１μｍｏｌのｐ−ニトロフェニル−リン酸を加水分解する。ＣＩＡＰなしのサンプルも３７℃で５分間インキュベートした。次いで、全サンプルをＨＰＬＣで解析した。温度もＣＩＡＰもγ−ＤＤＡＯ−ｄｄＴＴＰの安定性には有意の影響がなかった。非ＣＩＡＰ処理サンプルに比べて、ＣＩＡＰ存在下での遊離色素形成のわずかな増大はおそらく出発物質中の不純物の分解に起因する（図５）。
【００５４】
以上、本発明の特定の望ましい実施形態について記載してきたが、本発明の技術的範囲から逸脱せずに変更を加えることができる。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】シークエンシングゲルにエタノール沈殿後（レーン１及び２）又は直接ローディング（レーン３及び４）したＥＴターミネーターＤＮＡシークエンシング反応のゲル画像である。
【図２】９５℃で２０分間加熱したときの通常のターミネーター及び末端リン酸ブロックターミネーターの安定性を示す。
【図３】通常のエネルギー移動ターミネーター又は末端リン酸ブロックターミネーターのいずれかを用いて得られたシークエンシングラダーを示す。
【図４】９５℃で２時間加熱したときの通常のヌクレオシド三リン酸及びγブロックヌクレオシド三リン酸の安定性を示す。
【図５】γ−ＤＤＡＯ−ｄｄＴＴＰの安定性を示す。
【図１】
2005536999.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2005536999.tif 000015