(57)【要約】  本発明は、ブタノール生産可能なClostridium(クロストリジウム)属に属する微生物に、Clostridium属微生物が資化可能な糖質、並びに乳酸及び／又は酢酸を基質として含む環境(medium)で、ブタノールを生産させる工程を含む、ブタノールの生産方法を提供する。本発明の方法により、培地(溶液)中に生産されるブタノールの濃度を高めることができ、またブタノールの生産速度を高めることができる。本発明においては、乳酸発酵により得られる、D体とL体との混合物や、ヘテロ乳酸発酵により副産物である酢酸を含む発酵産物を利用することができる。乳酸発酵と本発明の方法とを組み合わせることにより、高価な酵素や遺伝子操作のような高度な技術を必要としない、実用的な非食用バイオマスからのブタノール生産システムを構築することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタノール生産可能なClostridium(クロストリジウム)属に属する微生物に、
Clostridium属微生物が資化可能な糖質、並びに
乳酸及び／又は酢酸
を基質として含む環境(medium)で、ブタノールを生産させる工程を含む、
ブタノールの生産方法。
【請求項２】
Clostridium属に属する微生物が増殖状態にあり、基質として含まれるのがグルコース及び乳酸である、請求項1に記載の生産方法。
【請求項３】
Clostridium属に属する微生物が静止状態にあり、基質として含まれるのがグルコース、乳酸及び酢酸である、請求項1に記載の生産方法。
【請求項４】
Clostridium属に属する微生物が、Clostridium saccharoperbutylacetonicum(クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の生産方法。
【請求項５】
乳酸が、Ｌ-乳酸とD-乳酸との混合物である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の生産方法。
【請求項６】
バイオマス原料から、ホモ型乳酸発酵可能であってL-乳酸とD-乳酸とを生産可能な乳酸菌、ヘテロ型乳酸発酵可能な乳酸菌、又は酢酸菌に、乳酸及び／又は酢酸を生産させる工程；
Clostridium属微生物が資化可能な糖質、並びに得られた乳酸及び／又は酢酸を基質として含む環境で、ブタノール生産可能なClostridium属に属する微生物にブタノールを生産させる工程
を含む、ブタノールの生産方法。
【請求項７】
バイオマス原料が、非食用バイオマスである、請求項6に記載の生産方法。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか1項に記載のブタノールの生産のための工程、及び
得られたブタノールをディーゼル燃料へ添加する工程を含む、ブタノール含有燃料の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Clostridium属微生物によるバイオブタノールの生産に関する。より詳細には、バイオブタノールの生産に際し、乳酸及び／又は酢酸を有効に利用する方法に関する。本発明においては、光学純度の低い乳酸、及び副産物として酢酸を含むヘテロ乳酸発酵産物、及び非食用バイオマスの利用にも有効である。
【背景技術】
【０００２】
Clostridium属微生物により生産されるバイオブタノールは，ポストバイオエタノールとして注目されている。Clostridium属微生物によるバイオブタノール生産は、同時にアセトン及び若干のエタノールも生成することから、アセトン・ブタノール・エタノール発酵(ABE発酵)とも呼ばれる。ブタノールは、エタノールと比較して、エネルギー密度や、低腐食性、低吸湿性であるという物性面での利点を有している。またブタノールは、イソプレン、イソブテン、ブテンなどのさまざまな化学合成物質の原材料となるだけでなく、ガソリン燃料のみならずディーゼル燃料へも添加することができ、用途も幅広い。【０００３】
一方でABE発酵は、菌の状態によって代謝物が大きく変化する複雑かつ特異な代謝経路を有している(非特許文献１)。またブタノールが、生産微生物の生育を阻害するために、発酵生産性がエタノールと比較して非常に低く、生産性向上のための技術的課題が多い。本発明者らは、バイオブタノール生産に関し、増殖菌体による酪酸を基質としたpH-stat流加培養による生産システム(非特許文献２)、及び静止菌体による高効率生産システム(非特許文献３)等について報告してきた。【０００４】
一方、微生物によるバイオ燃料やバイオマテリアル生産のために、トウモロコシやサトウキビ等の食用バイオマスを原料として用いると、食糧生産と競合して価格高騰を引き起こすことが問題となっている。これを解決するために、非食用バイオマスを原料とした物質生産が注目されてきた。アミロースを多く含んでおり発酵利用しやすい食用バイオマスに比較して、非食用バイオマスは一般にセルロース、ヘミセルロースを多く含む。そのため、非食用バイオマスを利用する研究は、主として、セルロースやヘミセルロースを糖化酵素等により、微生物が発酵基質とできるグルコースやキシロースに分解するアプローチと、セルロースやヘミセルロースを直接基質として利用できる微生物を得るアプローチとに拠る。【０００５】
しかしながら、バイオブタノール生産においては、これまで非食用バイオマスを直接の発酵原料とすることはできていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jones, D. T. and Woods, D. R.: Microbiol. Rev., 50, 484-524 (1986)
【非特許文献２】Tashiro, Y. et al.: J. Biosci. Bioeng., 98, 263-268 (2004)
【非特許文献３】Tashiro, Y. et al.: J. Biosci. Bioeng., 104, 238-240(2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、食品・医薬・環境保全のための微生物利用技術について研究してきており、ABE発酵のみならず、種々の特徴ある乳酸菌を用いる、生分解性・循環型プラスチックであるポリ乳酸の素材としての乳酸の発酵生産についても研究を重ねてきた。ポリ乳酸素材としてはホモ発酵による高光学活性乳酸が適するが、乳酸がD体とL体との混合物として得られる場合や、ヘテロ発酵により副産物である酢酸を含む場合には、別の利用法があり得る。また、乳酸発酵においては非食用バイオマスの利用技術が開発されつつあるので、乳酸発酵とABE発酵とを組み合わせることができれば、高価な酵素や遺伝子操作のような高度な技術を必要としない、実用的な非食用バイオマスからのブタノール生産システムを構築することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ブタノール生産微生物の代謝経路では、対数増殖期には有機酸(酢酸、酪酸)を生成し、定常期は有機酸を再同化してソルベント(アセトン、ブタノール、エタノール)を生成する。そこで本発明者らは、ブタノール生産に生物の有機酸を再同化する経路を利用して、乳酸、酢酸を用いた効率的はブタノール生産ができるのではないかと考え、鋭意研究した結果、本発明を完成した。【０００９】
本発明は、以下を提供する：
1) ブタノール生産可能なClostridium(クロストリジウム)属に属する微生物に、Clostridium属微生物が資化可能な糖質、並びに乳酸及び／又は酢酸を基質として含む環境(medium)で、ブタノールを生産させる工程を含む、ブタノールの生産方法。
2) Clostridium属に属する微生物が増殖状態にあり、基質として含まれるのがグルコース及び乳酸である、1)に記載の生産方法。
3) Clostridium属に属する微生物が静止状態にあり、基質として含まれるのがグルコース、乳酸及び酢酸である、1)に記載の生産方法。
4) Clostridium属に属する微生物が、Clostridium saccharoperbutylacetonicum(クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム)である、1)〜3)のいずれか一に記載の生産方法。
5) 乳酸が、Ｌ-乳酸とD-乳酸との混合物である、1)〜4)のいずれか一に記載の生産方法。
6) バイオマス原料から、ホモ型乳酸発酵可能であってL-乳酸とD-乳酸とを生産可能な乳酸菌、又はヘテロ型乳酸発酵可能な乳酸菌に、乳酸及び／又は酢酸を生産させる工程；Clostridium属微生物が資化可能な糖質、並びに得られた乳酸及び／又は酢酸を基質として含む環境で、ブタノール生産可能なClostridium属に属する微生物にブタノールを生産させる工程を含む、ブタノールの生産方法。
7) バイオマス原料が、非食用バイオマスである、6)に記載の生産方法。
8) 1)〜7)のいずれか一に記載のブタノールの生産のための工程、及び得られたブタノールをディーゼル燃料へ添加する工程を含む、ブタノール含有燃料の生産方法。【００１０】
本発明は、乳酸及び／又は酢酸を副原料としてブタノールを生産することに関する初めての報告である。本発明により、バイオブタノール生産において、最大ブタノール生産濃度を向上させることができ、またブタノール生産速度(単位時間当たりの培地中のブタノール濃度の差分として、g/l/hで表してもよい。)を上昇させることができる。【００１１】
本発明は、光学純度の低い乳酸、及び副産物として酢酸を含むヘテロ乳酸発酵産物、及び非食用バイオマスの利用にも資する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、増殖菌体による、乳酸及び／又は酢酸を添加したブタノール生産の結果を示したグラフである。
【図２】図2は、回分培養(A)と比較した、流加培養における乳酸再添加の効果(B)を示したグラフである。
【図３】図3は、グルコース及び13C3乳酸を基質とした培養液中のブタノールのマススペクトルである。矢印は、13C3乳酸と12Cグルコースに由来するブタノールのフラグメントのピークを示す。
【図４】図4は、静止菌体による、乳酸及び／又は酢酸を添加したブタノール生産の結果を示したグラフである。
【図５】図5は、静止菌体を用いた方法において、乳酸と酢酸との共添加がブタノール生産速度を促進することを示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［Clostridium微生物を用いたブタノール生産］
本発明で「ブタノール生産可能なクロストリジウム(Clostridium)属に属する微生物」というときは、特に記載した場合を除き、ABE発酵又はブタノール・イソプロパノール発酵可能な、Clostridium属に属する微生物をいう。「Clostridium属に属する微生物」は、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、クロストリジウム・ベージェリンキー(Clostridium beijerinckii)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・サッカロアセトブチリカム(Clostridium saccharoacetobutylicum)、クロストリジウム・オウランティブチリカム(Clostridium aurantibutyricum)、クロストリジウム・パスツーリアウム(Clostridium pasteurianum)、クロストリジウム・スポロゲンズ(Clostridium sporogenes)、クロストリジウム・カダベリス(Clostridium cadaveris)、クロストリジウム・テタノモルフュウム(Clostridium tetanomorphum)を含む。Clostridium acetobutylicumは、標準株であるClostridium acetobutylicum ATCC824株を含む。
【００１４】
本発明には、公知のClostridium属に属する微生物を利用することができる。本発明には、公知のClostridium saccharoperbutylacetonicum、Clostridium beijerinckii又はClostridium acetobutylicumに属する菌株、例えば、高ブタノール生産株であるClostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4株(ATCC 13564) や、全ゲノムが解読されているClostridium beijerinckii NCIMB8052株、及びClostridium acetobutylicum IFO13498株を好適に用いることができる。それぞれ市販されている。
【００１５】
本発明の「ブタノール生産可能なClostridium属に属する微生物」は、野生型のClostridium属に属する微生物を、遺伝子操作等により形質転換して得られた微生物も、ブタノールを生成可能であり、乳酸及び／又は酢酸を中間生産物とする代謝経路経路を有する限り、含む。例えば、アセトン-ブタノール-エタノール生産菌で複製可能なプラスミドに、変性したタンパク質を修復し、機能を回復させる分子シャペロンの遺伝子をクローニングした発現ベクターを構築し、シャペロン遺伝子を過剰発現させると、ブタノール生産量が増加することが報告されている(Tomas CA, Welker NE, Papoutsakis ET., Appl Environ Microbiol. 69(6):4951-4965(2003))。本発明の「ブタノール生産可能なClostridium属に属する微生物」はこのようなものも含む。
【００１６】
本発明の「ブタノール生産可能なClostridium属に属する微生物」はまた、Clostridium属に属する微生物由来の、アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、β-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、ブチリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、及びブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を、種々の宿主微生物に導入した形質転換体(特開2009-39031号公報)、並びに
a)アセチル-CoAからアセトアセチル-CoAへ、b)アセトアセチル-CoAから3-ヒドロキシブチリル-CoAへ、c)3-ヒドロキシブチリル-CoAからクロトニル-CoAへ、d)クロトニル-CoAからブチリル-CoAへ、e)ブチリル-CoAからブチルアルデヒドへ、及びf)ブチルアルデヒドから1-ブタノールへ、よりなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つのDNA分子を含む組み換え微生物宿主細胞であって、少なくとも1つのDNA分子が前記微生物宿主細胞に対して異種であり、前記微生物宿主細胞が1-ブタノールを生成する、上記組み換え微生物宿主細胞(WO2007／041269(特表2009-509541))も、含む。遺伝子操作には公知の方法を用いることができる。例えば種々の微生物のベクターや外来遺伝子の導入法及び発現法は、多くの実験書に記載されているので(Sambrook, J. & Russel, D. W. Molecular Cloning： A Laboratory Manual(3rd Edition)CSHL Press, 2001、又はAusubel, F. et al. Current protocols in molecular biology. Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987等)、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行なうことができる。
【００１７】
本発明で「ブタノール」というときは、特に記載した場合を除き、1-ブタノールを指す。本発明においては、ブタノールはアセトン及び／又はエタノールとともに生産されてもよい。
【００１８】
ABE発酵では、典型的には、細胞増殖期において酢酸及び酪酸が生成され、細胞増殖が停止した静止期(定常期ということもある。)に代謝系が大幅に変化して、アセトン及びブタノールが生成される。本発明においては、Clostridium属微生物の増殖菌体(growing cells)又は静止菌体(resting cells)を利用して効率的にブタノール生産を行うことができる。
【００１９】
Clostridium属微生物を増殖状態とするか静止状態とするかは、微生物を維持する環境中に増殖に必要な栄養素(窒素源及び/又はミネラル類)を包含させるかどうかによることができる。すなわち、静止状態としたければ、微生物を必要な栄養素、典型的には窒素源、を含まない環境に置けばよい。また、細胞内メッセンジャーであるグアノシン4リン酸(ppGpp)を誘導することにより細胞内ppGppを高いレベルに保つと、細胞の分裂が阻害され、アミノ酸発酵が促進するとの報告があるので(Imaizumi A, Kojima H, Matsui K., J. Biotechnol. 125(3):328-37, 2006)、このような手法を本発明においても利用することができる。
【００２０】
静止菌体のメリットとしては、菌体を再利用できる、操作安定性のすぐれた生産システムが構築できる、静止期にはブタノールが増殖非連動的に生産されるので、菌体増殖に伴う副産物の生産量が小さい、等が挙げられる。
【００２１】
本発明で「環境(medium, media)」というときは、特に記載した場合を除き、微生物を人工的に維持、発育又は増殖させるための、培地(culture medium)又は反応液(reaction medium)を意味する。
【００２２】
本発明のブタノール生産のための環境は、基質として、Clostridium属微生物が資化可能な糖質、並びに乳酸及び／又は酢酸を含む。
【００２３】
本明細書において、Clostridium属微生物のための環境に含まれる成分に関し、「基質として」というときは、特に記載した場合を除き、その微生物が栄養源として可能な量(濃度)で、その成分が含まれていることをいう。
【００２４】
本発明で「乳酸(lactic acid、IUPAC名は2-ヒドロキシプロパン酸。α-ヒドロキシプロパン酸ともいう。」というときは、特に記載した場合を除き、D-乳酸、L-乳酸、及びこれらの混合物からなる群から選択されるいずれかを指す。本発明で乳酸に関し、D体とL体との「混合物」というときは、特に記載した場合を除き、光学純度(鏡像体過剰率ともいう。多い方の物質量から少ない方の物質量を引き、全体の物質量で割った値)が99％未満である乳酸をいう。混合物には、D-乳酸及びL-乳酸の等量混合物であるラセミ体(光学純度0)が含まれる。
【００２５】
本発明でいう「Clostridium属微生物が資化可能な糖質」は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、トレハロース、マンニトール、ラクトース、マルトース、サリシン、セロビオース、マンノース、ラムノース、リボース、デンプン(可溶性デンプン、サゴデンプン、タピオカデンプン、コーンデンプン、ジャガイモデンプン、小麦デンプン)、デキストリン、キシラン等、様々な食用及び非食用の、六炭糖又は五炭糖を構成単位とする糖質(saccharides)を含む。
【００２６】
Clostridium属微生物が資化可能かどうかは、当業者であれば、資化性を判断するための定法により適宜判断できる。例えば炭素源としてその糖質を１重量％含む培地にClostridium属微生物を植菌して至適温度で1〜数日間維持し、660nmの吸光度の炭素源を含まないコントロールとの差が0.3以上のものを「資化可能」と判断することができる。
【００２７】
Clostridium属微生物が資化可能な糖質の典型的な例は、グルコースである。
【００２８】
本発明においては、Clostridium属微生物が増殖状態にある場合、基質として培地に含まれるのは、グルコース及び乳酸である。酢酸は添加しないほうが好ましい場合がある。Clostridium属微生物が静止状態にある場合、基質として反応液に含まれるのは、グルコース及び酢酸であり、グルコース、乳酸及び酢酸であることが好ましい。いずれの場合においても、添加される乳酸は、L体とD体との混合物であることが好ましい。
【００２９】
Clostridium属微生物のための環境は、グルコース、乳酸及び／又は酢酸以外に、他の各種栄養素を含んでもよい。Clostridium属微生物のための培地又は反応液としては、下記を使用することができる。
PG培地：細断したジャガイモ200gに、約1Lの蒸留水を加えて30分〜40分弱火で煮沸し、二重のガーゼでろ過する。ろ液にグルコースを20g/lとなるように加えた後、蒸留水で1Lとする。
TYA培地：グルコース4％、リン酸一カリウム0.05％、硫酸マグネシウム7水和物0.03％、硫酸鉄7水和物0.001％、酢酸アンモニウム0.3％、酵母エキス0.2％、トリプトン0.6％
TY培地：バクトトリプトン1%、バクトイーストエクストラクト1%、塩化ナトリウム0.5%、pH 7.0
無窒素メディウム(リン酸メディウム)：グルコース2％、リン酸一カリウム0.05％、硫酸鉄7水和物0.001％
【００３０】
本発明においては、初発環境(培養又は反応開始時の環境。微生物により成分のいずれも消費されていない。)中のグルコース濃度は、例えば2.5〜50g/lであり、好ましくは5〜40g/l、より好ましくは10〜30g/lである。初発培地の乳酸濃度は、例えば0.5〜30g/lであり、好ましくは1〜15g/l、より好ましくは2.5〜7.5g/lである。初発培地の酢酸濃度は、例えば0.3〜25g/lであり、好ましくは0.75〜12g/l、より好ましくは1.5〜6g/lである。
【００３１】
本発明においては、グルコースと乳酸とのモル比は、例えば2:0.1〜10であり、好ましくは2:0.3〜3であり、より好ましくは2:0.5〜2である。また、酢酸を使用する場合は、乳酸と酢酸とのモル比は、例えば1:0.1〜10であり、好ましくは1:0.3〜3であり、より好ましくは1:0.5〜2である。
【００３２】
なお、グルコース以外のClostridium属微生物が資化可能な糖質を用いる場合には、当業者であれば、グルコースの場合の好適な濃度及び他の成分との比を参考にして、その糖質の環境における適切な濃度及び他の成分との比を、適宜決定することができる。
【００３３】
本発明者らの検討によると、グルコースと乳酸とがモル比で2:1であるとき、酢酸を使用する場合は乳酸と酢酸とがモル比で1:1であるとき、ブタノール生産に特に適していた。乳酸と酢酸とのモル比が、1:1が適するということは、ヘテロ乳酸発酵の発酵産物をそのままバイオブタノールの原料に好適に利用できることを示している。
【００３４】
本発明の実施のための、上記の基質以外の条件に関しては、当業者であれば、従来のClostridium属微生物によるブタノール生産ための条件を応用して、適宜設定することができる。培養／反応温度は、Clostridium属微生物にとって通常最適な温度である、30℃〜37℃とすることができ、培養／反応時間は、数時間〜数日、例えば、1日〜3日とすることができる。また、培地／反応液の供給方式にも特に制限はなく、回分式(栄養分を最初に環境に加え、以後は補給しない。)によっても、流加式(回分式において、培地／反応液を抜き出すことなく、基質を含む培地／反応液を連続又は間欠的にフィードする。)によっても実施することができる(実施例1及び2)。
【００３５】
本発明者らの検討では、Clostridium属微生物を用いたブタノール生産において、13C安定同位体ですべての炭素を置換した乳酸を用いた場合、分子量が通常より2多い、すなわち13Cを2つ含む分子量76のブタノールの生産が確認された(実施例3)。ABE発酵の代謝に基づくと、13C3乳酸はピルビン酸を経てアセチルCoAに変換され、グルコース(12C)由来のアセチルCoAと共に、アセトアセチルCoAとなって、最終的には13Cを2つ含むブタノールに変換されると考察される(下図)。
【００３６】
【化１】
2011099165.tif 000002
【００３７】
乳酸及び／又は酢酸をブタノール生産の基質として添加する本発明は、連続発酵法において、gas-stripping法により連続的にブタノールを抽出する方法(Bioprocess and Biosystems Engineering, 27, 207-214.,2005)、Clostridium属細菌を固定化してブタノールを生産する方法(Pakistan Journal of Biological Sciences, 9, 1923-1928, 2006、及びApplied Biochemistry and Biotechnology, 113-116, 887-898, 2004)、連続発酵法においてClostridium属細菌の高濃度菌体を用い、菌体をリサイクルする技術(Journal of Biotechnol, 120, 197-206, 2005)にも適用することができる。
【００３８】
なお、Clostridium属微生物を用いたブタノール生産において、酪酸を添加する場合に比較した乳酸及び／又は酢酸添加のメリットは、1) 価格が安価であること、2) 発酵生産からは、酪酸より、乳酸・酢酸のほうがが高濃度で得られるため、バイオブタノールの原料として扱い易いことが挙げられる。特に、酪酸添加に比較した乳酸添加のメリットとしては、Clostridium属微生物が乳酸を代謝する場合に、ブタノール合成に必要な還元力も同時に供給できることが挙げられる。
【００３９】
［乳酸発酵等との組み合わせ］
本発明における乳酸及び／又は酢酸は、乳酸菌を用いた乳酸発酵産物及び／又は酢酸菌を用いた酢酸発酵産物であってもよい。
【００４０】
本発明で「乳酸菌」というときは、特に記載した場合を除き、多量に乳酸を生産(炭水化物を発酵し、生成する酸の50％以上)すると共に、炭水化物を含む培地によく繁殖し、グラム陽性で、運動性がなく、胞子をつくらない菌群をいう。本発明でいう乳酸菌は、ラクトバシラス(Lactobacillus) 属に属する微生物、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属に属する微生物、エンテロコッカス(Enterococcus) 属に属する微生物、ラクトコッカス (Lactococcus) 属に属する微生物、ペディオコッカス (Pediococcus)属に得する微生物、及びロイコノストック(Leuconostoc)属に属する微生物を含む。
【００４１】
乳酸菌には、グルコースに対してホモ発酵式に従って乳酸を生成するホモ乳酸発酵型とヘテロ発酵式に従って乳酸及び酢酸を生成するヘテロ乳酸発酵型とがあるが、本発明にはいずれも適用することができる。ホモ発酵型に関しては、D体及びL体の混合物である乳酸を発酵するものを、適用することが好ましい。
【００４２】
本発明の特に好ましい態様は、ホモ型乳酸発酵可能であってL乳酸とD乳酸とを生産可能な乳酸菌又はヘテロ型乳酸発酵可能な乳酸菌を用いて、乳酸及び／又は酢酸を生産する工程；グルコース、並びに得られた乳酸及び／又は酢酸を基質として含む培地で、Clostridium属に属する微生物を培養してブタノールが生産される。
【００４３】
本発明で「酢酸菌」というときは、アセトバクター(Acetobacter)属に属する微生物(例えば、アセトバクター・アセチ(Acetobacter aceti)、アセトバクター・オリエンタリス(Acetobacter orientalis)、アセトバクター・パスツリアナス(Acetobacter pasteurianus)、アセトバクター・キシリナム(Acetobacter xylinum))、アシディフィラム(Acidiphilium)属に属する微生物、アシディスファエラ(Acidisphaera)属に属する微生物、アシドセラ(Acidocella)属に属する微生物、アシドモナス(Acidomonas)属に属する微生物、アサイア(Asaia)に属する微生物、クラウロコッカス(Craurococcus)属に属する微生物、グルコナセトバクター(Gluconacetobacter)属に属する微生物、グルコノバクター(Gluconobacter)属に属する微生物、コザキア(Kozakia)属に属する微生物、ムリコッカス(Muricoccus)属に属する微生物、パラクラウロコッカス(Paracraurococcus)属に属する微生物、ロドピラ(Rhodopila)属に属する微生物、ロゼオコッカス(Roseococcus)属に属する微生物、ルブリテピダ(Rubritepida)属に属する微生物、ステラ(Stella)属に属する微生物、テイココッカス(Teichococcus)属に属する微生物、ザヴァルジニア(Zavarzinia)属に属する微生物を含む。
【００４４】
乳酸発酵及び酢酸発酵においては非食用バイオマスの利用技術が開発されつつあるので、乳酸発酵又は酢酸発酵と本発明のブタノール生産方法とを組み合わせることにより、実用的な非食用バイオマスからのブタノール生産システムを構築することができる。本発明者らは、セルロオリゴ糖から乳酸を生産する微生物、ヘミセルロースの主要成分であるキシラン、キシロオリゴ糖、キシロースから乳酸と酢酸を生産する微生物等を見いだしており、これらの微生物の乳酸発酵産物のブタノール生産への利用が期待できる。
【００４５】
本発明で「バイオマス(原料)」というときは、特に記載した場合を除き、再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたものをいう。本発明には、発生場所、現在の利用状況及び形態に制限されず、乳酸発酵のための原料として用いることができるあらゆるバイオマス原料を用いることができる。バイオマス原料の例は、さとうきび、米、とうもろこし、さつまいも、菜種、落花生、大豆、バカス、葉茎、稲わら、もみ殻、籾殻、麦わら、ゴルフ場などで大量に発生する刈芝、林地残材、間伐材、オイルパーム樹木、製材所の廃材(例えば、端材、おが屑、樹皮)、建設廃材(木屑)、古紙、畜糞尿、屠場残渣、水産加工残渣、廃棄物として発生するバイオマス有機汚泥、パルプ廃液、食品加工残渣、使用済み食用油、生ごみ、下水汚泥、魚貝類、昆布類、植物プランクトンが含まれる。
【００４６】
本発明で「食用バイオマス(食糧バイオマス、食料バイオマスということもある。)(原料)」というときは、特に記載した場合を除き、ヒト又は家畜食糧とすることもできるバイオマス原料をいう。食用バイオマスは、さとうきび、米、とうもろこし、さつまいもを含む。
【００４７】
本発明で「非食用バイオマス(原料)」というときは、特に記載した場合を除き、食用以外のバイオマス原料をいう。本発明には、非食用バイオマス原料を適用することが好ましい。
【００４８】
非バイオマス原料からの乳酸発酵に関しては、当業者は、本発明者らの下記の文献を参考にすることができる。
(1) キシロースからの乳酸発酵：K. Tanaka, A. Komiyama, K. Sonomoto, A. Ishizaki, S.J. Hall and P.F. Stanbury.: Two different pathways for D-xylose metabolism and the effect of xylose concentration on the yield coefficient of L-lactate in mixed-acid fermentation by the lactic acid bacterium Lactococcus lactis IO-1, Appl. Microbiol. Biotechnol., 60(1-2), 160-167 (2002.10)
(2) キシロオリゴ糖からの乳酸発酵：Hitomi Ohara, Michiko Owaki & Kenji Sonomoto.: Xylooligosaccharide fermentation with Leuconostoc lactis, J. Biosci. Bioeng., 101(5), 415-420 (2006.5.25)
(3) キシロースからの乳酸発酵：Hitomi Ohara, Michiko Owaki & Kenji Sonomoto.: Calculation of metabolites from xylose in Lactococcus lactis, J. Biosci. Bioeng., 103(1), 92-94 (2007.1.25)
(4) キシロースからの乳酸発酵：Mugihito Oshiro, Hideaki Shinto, Yukihiro Tashiro, Noriko Miwa, Tatsuya Sekiguchi, Masahiro Okamoto, Ayaaki Ishizaki & Kenji Sonomoto.: Kinetic modeling and sensitivity analysis of xylose metabolism in Lactococcus lactis IO-1, J. Biosci. Bioeng., 108(5), 376-384 (2009.11.25)
また、下記の文献も参照することができる。
(5) 同時糖化発酵によるセルロースからの乳酸生産：S. Abe and M. Takagi.: Simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to lactic acid, Biotechnol. Bioeng., 37, 93-96 (1991)
(6) 同時糖化発酵によるセルロースからの乳酸生産：K. V. Venkatesh.:  Simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to lactic acid,  Bioresour. Technol., 62, 91-98 (1997)
(7) キシランを直接資化する乳酸菌について：M. Ishikawa, K. Nakajima, Y. Itamiya, S. Furukawa, Y. Yamamoto and K. Yamasato.: Halolactibacillus halophilus gen. nov., sp. nov. and Halolactibacillus miurensis sp. nov., halophilic and alkaliphilic marine lactic acid bacteria constituting a phylogenetic lineage in Bacillus rRNA group 1., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 55, 2427-2439 (2005)
非バイオマス原料からの酢酸発酵に関しては、下記の文献を参考にすることができる。
(8) Cai S, Dong X.: Cellulosilyticum ruminicola gen. nov., sp. nov., isolated from yak rumen contents, and reclassification of Clostridium lentocellum as Cellulosilyticum lentocellum comb. nov. Int J Syst Evol Microbiol. 2009 in press. Aug 6. [Epub ahead of print]
(9) Yang SJ, Kataeva I, Hamilton-Brehm SD, Engle NL, Tschaplinski TJ, Doeppke C, Davis M, Westpheling J, Adams MW. : Efficient degradation of lignocellulosic plant biomass, without pretreatment, by the thermophilic anaerobe "Anaerocellum thermophilum" DSM 6725. Appl Environ Microbiol. Jul; 75(14):4762-9(2009).
【００４９】
［その他］
本発明により得られたブタノールは、ガソリン又はディーゼル燃料に添加して用いることができる。本発明で「ディーゼル燃料」というときは、特に記載した場合を除き、原油から精製される軽油の一種で、ディーゼルエンジンの燃料用途のものをいう。ディーゼル燃料は、単に「軽油」と表示されることもある。
【００５０】
本発明により得られたブタノールは、異性化して、iso-ブタノール、tert-ブタノールとすることができ、またイソプレン、イソブテン、ブテンなどのさまざまな化学合成物質の原材料とすることができる。
【実施例】
【００５１】
実施例で用いた培地／反応液組成を示す。
PG培地組成：ジャガイモ150 g/l、硫酸アンモニウム0.50 g/l、グルコース10g/l、炭酸カルシウム3.0 g/l
TYA培地組成：イーストエクストラクト2 g/l、トリプトン6.0 g/l、酢酸アンモニウム3.0 g/l、硫酸鉄7水和物 10 mg/l、リン酸二水素カリウム 0.50 g/l、硫酸マグネシウム7水和物 0.30 g/l
TY培地組成(前掲非特許文献2参照)：イーストエクストラクト2 g/l、トリプトン6.0 g/l、硫酸アンモニウム2.5 g/l、硫酸鉄7水和物 10 mg/l、リン酸二水素カリウム 0.50 g/l、硫酸マグネシウム7水和物 0.30 g/l
リン酸メディウム(前掲非特許文献3参照)：リン酸一カリウム0.50 g/l、硫酸鉄7水和物10 mg/l【００５２】
［実施例1：増殖菌体を用いた乳酸添加培養］
ABE生産菌として、Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 (ATCC 13564)を用い、下記の方法で培養を行った。
(1) PG培地にて24時間リフレッシュした(詳細には、PG培地に、胞子を含む砂3gを接種したものを1分間沸騰湯浴中で煮て、胞子を発芽させた。これを嫌気的条件下、30℃で、24時間培養した。以下の実施例において同じ。)。
(2) (1)の培養液をTYA培地に10%接種し、15時間前培養した。
(3) (2)の培養液をTYA培地に10%接種して19h本培養した後、集菌し、高密度菌体を得た。
(4) 大型試験管中の5ml TY培地に、3mlの基質(20g/lのグルコース；20g/lのグルコース及び5g/lの乳酸(DL-乳酸。以下の実施例において、特に記載した場合を除き、同じ。)；又は20g/lのグルコース、5g/lの乳酸及び3g/lの酢酸。いずれも最終濃度。)を添加したあと、2mlの高密度菌体を乾燥菌体重量で終濃度約5〜10g/lとなるように接種して、張り込み量10mlで48時間の回分試験管培養を行った。なお、温度30℃、嫌気的条件で培養を行い、初発pH5.5でpHコントロールは行わなかった(以下、実施例2〜6において同じ)。
(5) サンプリングは0, 48時間後に行った。
(6) HPLCにてグルコース及び乳酸濃度、GCにて酢酸、ブタノール濃度を分析した。【００５３】
結果を図1に示した。【００５４】
増殖菌体を用いた発酵法では、乳酸の添加がブタノール生産を促進した。すなわち、48時間後の回分発酵の結果、乳酸や酢酸のみを基質をすると発酵が進まず、ほとんどブタノールが生産できないのに対して、グルコースに乳酸、又はグルコースに乳酸及び酢酸を添加した混合基質を用いると、グルコースのみの場合と比較してブタノール濃度が高まった。特にグルコースと乳酸の混合基質を用いると、グルコースのみの場合と比較して38%、濃度が高まった。なお、グルコースに乳酸及び酢酸を添加した混合基質を用いた場合に、グルコースと乳酸の混合基質を用いた場合に比較して、ブタノール生産が減じたのは、酢酸による増殖阻害が一因だと考えられる。【００５５】
［実施例2：流加培養］
さらに高濃度のブタノールを得ることを目的に、実施例1と同様の菌体を用いて、下記の方法で、回分培養及び流加培養を行った。
(1) PG培地にて24時間リフレッシュした。
(2) (1)の培養液をTYA培地に10%接種し、15時間前培養した。
(3) (2)の培養液をTYA培地に10%接種して19h本培養した後、集菌し、高密度菌体を得た。
(4) 300ml容三角フラスコの50mlTY培地に、基質溶液(最終濃度で、20g/lのグルコース及び5g/lの乳酸)を30ml添加し、20mlの高密度菌体を乾燥菌体重量で終濃度約6g/lとなるように接種して、張り込み量100mlで培養試験を開始した。流加培養では、培養12h後に、10mlの基質溶液(グルコース200 g/l+乳酸50 g/l)を添加した。
(5) サンプリングは、回分培養の場合は0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 48時間後、流加培養の場合は0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 32, 40, 48時間後に行った。
(6) HPLCにてグルコース及び乳酸濃度、GCにてブタノール濃度を分析した。【００５６】
結果を図2に示した。回分培養では、48時間の培養により、ブタノール濃度は6.9 g/lとなった(図2A)。一方、基質を12時間後に再添加した流加培養では、48時間後にはグルコースと乳酸を完全に消費し、ブタノール濃度は13.5 g/lとなった(図2B)。流加培養は、回分培養の場合と比較して、濃度が95%高まった。【００５７】
以上の結果から、乳酸とグルコースとが消費されて、ブタノールが生産されたと考えられる。【００５８】
なお、ブタノール発酵の特性としてブタノール濃度が10数g/lとなった時点で、発酵が停止するので、流加培養において基質をさらに添加してもブタノール濃度は大きくは上がらなかった(データ示さず。)。【００５９】
［実施例3：13C3乳酸による確認］
実施例2において、乳酸からブタノールを生産されているかを調べるために、13C安定同位体ですべての炭素を置換した乳酸を用いて回分培養を行い、質量分析器を用いて13Cで置換されたブタノールが生産されているかを調べた。方法を下記に示した。
(1) PG培地にて24時間リフレッシュした。
(2) (1)の培養液をTYA培地に10%接種し、15時間前培養した。
(3) (2)の培養液をTYA培地に10%接種して19時間本培養した後、集菌し、高密度菌体を得た。
(4) 試験管中の1.5ml TY培地に、0.9mlの基質(終濃度で20g/lのグルコースと5g/lの13C L-乳酸)を添加したあと、0.6mlの高密度菌体を乾燥菌体重量で終濃度約10g/lとなるように接種して、張り込み量3mlで48時間の回分試験管培養を行った。なお、温度30℃、嫌気的条件で培養を行い、初発pH5.5でpHコントロールは行わなかった。
(5) 48時間後にサンプリングを行った。
(6) 質量分析器にて、13Cで置換されたブタノールが生産されたかを調べた。【００６０】
12Cブタノールのマススペクトルと、13C3乳酸を添加した培養から得られたブタノールのマススペクトルを図3に示した。【００６１】
一般に、一級アルコールでは水分子の脱水反応が起こりやすく、マススペクトルで分子イオンピークが観測されにくいことが知られている。今回の分析でも、12Cブタノール(分子量74)の分子イオンピークは観測されず、脱水が起きた56(74−18)のフラグメントピークが観測された。一方、培養から得られたブタノールのマススペクトルでは、13C3乳酸とグルコース由来と考えられる58(76−18)のピークが観測され、乳酸を基質としてブタノールが生産されていることが支持された。【００６２】
マススペクトルの結果より、4つのブタノール炭素のうちの2つが13C3乳酸由来であったといえる。ABE発酵の代謝経路から、13C3乳酸由来の13CアセチルCoAと、12Cグルコース由来の12CアセチルCoAから、13Cを2つと12Cを2つ含むアセトアセチルCoAが合成され、その結果分子量が2増えたブタノールが生産されたと考えられる。【００６３】
［実施例4：静止菌体を用いたブタノール生産］
下記の方法により、静止菌体を用いたブタノール生産を行った。
(1) PG培地にて24時間リフレッシュした。
(2) (1)の培養液をTYA培地に10%接種し、15時間前培養した。
(3) (2)の培養液をTYA培地に10%接種して19h本培養した後、集菌し、高密度菌体を得た。
(4) 大型試験管中の5mlリン酸メディウムに、3mlの基質(20g/lのグルコース；20g/lのグルコース及び5g/lの乳酸；20g/lのグルコース、5g/lの乳酸及び3g/lの酢酸；又は20g/lのグルコース及び3g/lの酢酸。いずれも最終濃度。)を添加したあと、2mlの高密度菌体を、乾燥菌体重量で終濃度約5〜10g/lとなるように添加して、張り込み量10mlで48時間の回分試験管反応を行った。
(5) サンプリングは0, 48時間後に行った。
(6) HPLCにてグルコース及び乳酸濃度、GCにて酢酸、ブタノール濃度を分析した。【００６４】
結果を図4に示した。乳酸を添加するとグルコースのみの場合と比較して、ブタノール濃度が低い結果となったが、さらに酢酸を添加することにより、グルコースのみの場合と比較して、ブタノール濃度が10%高まった。一方、乳酸を添加せず、酢酸を添加した系では、反応開始後48時間経過時のブタノール濃度は4.1g/lであったが、ブタノール対全基質収率(C-mol/C-mol)が0.54、ブタノール対糖収率(C-mol/C-mol)が0.58となり、グルコースのみの場合と比較して、収率が向上した。乳酸添加、酢酸添加の影響が、発酵プロセス(増殖菌体を用いた場合)とは異なることが示唆された。【００６５】
静止菌体を用いたプロセスでは、酢酸にブタノール生産促進効果があると考えられた。      【００６６】
［実施例5：ブタノール生産速度に関する検討]
実験方法
(1) PG培地にて24時間リフレッシュした。
(2) (1)の培養液をTYA培地に10%接種して、15時間前培養した。
(3) (2)の培養液をTYA培地に10%接種して、19h本培養した後集菌し高密度菌体を得た。
(4) 300ml容三角フラスコの50mlリン酸メディウムに、基質溶液(20g/lグルコース；又は20g/lのグルコース、5g/lの乳酸及び3 g/lの酢酸。いずれも最終濃度。)を30ml添加し、20mlの高密度菌体を乾燥菌体重量で終濃度約8g/lとなるように添加して、張り込み量100mlで反応試験を開始した。
(5) サンプリングは、0, 3, 6, 9, 12時間後に行った。
(6) HPLCにてグルコース濃度、GCにてブタノール濃度を分析した。【００６７】
結果を図5に示した。反応3時間までのブタノール生産速度((3時間目のブタノール濃度(g/l) - 0時間目のブタノール濃度(g/l))/3)は、グルコースのみを基質とする場合、0.620g/l/hであったが、乳酸と酢酸の共添加により、0.889 g/l/hとなり、43%向上した。また、この値は、グルコースのみを基質として最適化された条件で回分培養を行った場合のブタノール生産速度0.808g/l/hを上回っており、ブタノール生産速度の向上に、乳酸と酢酸の共添加が大変有効であることを示している。【００６８】
[実施例6：ブタノール収率に関する検討]
増殖菌体によるブタノール生産と、静止菌体によるブタノール生産との収率を、下記の方法で比較した。
(1) PG培地にて24時間リフレッシュした。
(2) (1)の培養液をTYA培地に10%接種して、15時間前培養した。
(3) (2)の培養液をTYA培地に10%接種して、19h本培養した後集菌し、高密度菌体を得た。
(4) 大型試験管中の5ml酸培地(増殖菌体の場合はTY培地、静止菌体の場合はリン酸メディウム)に、3mlの基質(20g/lのグルコース；20g/lのグルコース及び5g/lの乳酸；又は20g/lのグルコース、5g/lの乳酸及び3g/lの酢酸。いずれも最終濃度。)を添加したあと、2mlの高密度菌体を乾燥菌体重量で終濃度約5-10g/lとなるように接種(添加)して、張り込み量10mlで48時間の回分試験管培養(反応)を行った。
(5) サンプリングは0, 48時間後に行った。
(6) HPLCにてグルコース及び乳酸濃度、GCにて酢酸、ブタノール濃度を分析した。【００６９】
結果を下表に示した。
【表１】
2011099165.tif 000003
【００７０】
全基質に対するブタノール収率は、乳酸、酢酸を添加してもほぼ同じであったが、グルコースに対するブタノール収率は、増殖菌体の場合には0.47から0.56へ、静止菌体の場合には0.51から0.60へ、それぞれ約10%増加した。これは、乳酸や酢酸を添加することにより、同じグルコース量からC-mol換算で約10%多いブタノールが生産できることを意味している。乳酸及び／又は酢酸の添加が、ブタノールの収率向上に有効であると考えられた。【００７１】
［実施例7：他の微生物を用いた培養］
アセトン・ブタノール・エタノール(ABE)生産菌Clostridium beijerinckii NCIMB8052(NCIMB Ltd.)及びClostridium acetobutylicum IFO13498(財団法人発酵研究所)を用い、グルコース、乳酸をそれぞれ含む培地を用いて、実施例1と同様の培養条件で、ブタノール生産を行った。37℃、嫌気的条件下で48時間培養した後、培養上清液を用いて各生産物量を測定した。【００７２】
下表に培養48時間後におけるブタノール生産量、グルコース消費量、乳酸消費量を示した。
【表２】
2011099165.tif 000004
【００７３】
Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4の場合と同様、Clostridium beijerinckii NCIMB8052及びClostridium acetobutylicum IFO13498においても、グルコース及び乳酸の消費がみられ、乳酸を添加した場合のほうがより多くのブタノールが生産された。このことから、乳酸を基質としたブタノールの生産は、ABE発酵生産菌全般で可能であることが明らかになった。
【図１】
2011099165.tif 000005
【図２】
2011099165.tif 000006
【図３】
2011099165.tif 000007
【図４】
2011099165.tif 000008
【図５】
2011099165.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月16日(2010.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタノール生産可能なClostridium(クロストリジウム)属に属する微生物に、
Clostridium属微生物が資化可能な糖質、及び
0.5〜30g/lの乳酸
を基質として含む環境(medium)で、ブタノールを生産させる工程を含む、
ブタノールの生産方法。
【請求項２】
Clostridium属に属する微生物が増殖状態にあり、基質として含まれるのがグルコース及び乳酸である、請求項1に記載の生産方法。
【請求項３】
Clostridium属に属する微生物が静止状態にあり、基質として含まれるのがグルコース、乳酸及び酢酸である、請求項1に記載の生産方法。
【請求項４】
Clostridium属に属する微生物が、Clostridium saccharoperbutylacetonicum(クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム)、 Clostridium beijerinckii(クロストリジウム・ベージェリンキー)、又はClostridium acetobutylicum(クロストリジウム・アセトブチリカム)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の生産方法。
【請求項５】
乳酸が、Ｌ-乳酸とD-乳酸との混合物である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の生産方法。
【請求項６】
乳酸が、バイオマス原料から、ホモ型乳酸発酵可能であってL-乳酸とD-乳酸とを生産可能な乳酸菌、又はヘテロ型乳酸発酵可能な乳酸菌により生産されたものである、請求項1〜5のいずれか１項に記載のブタノールの生産方法。
【請求項７】
バイオマス原料が、非食用バイオマスである、請求項6に記載の生産方法。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか1項に記載のブタノールの生産のための工程、及び
得られたブタノールをディーゼル燃料へ添加する工程を含む、ブタノール含有燃料の生産方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
非食用バイオマス原料からの乳酸発酵に関しては、当業者は、本発明者らの下記の文献を参考にすることができる。
(1) キシロースからの乳酸発酵：K. Tanaka, A. Komiyama, K. Sonomoto, A. Ishizaki, S.J. Hall and P.F. Stanbury.: Two different pathways for D-xylose metabolism and the effect of xylose concentration on the yield coefficient of L-lactate in mixed-acid fermentation by the lactic acid bacterium Lactococcus lactis IO-1, Appl. Microbiol. Biotechnol., 60(1-2), 160-167 (2002.10)
(2) キシロオリゴ糖からの乳酸発酵：Hitomi Ohara, Michiko Owaki & Kenji Sonomoto.: Xylooligosaccharide fermentation with Leuconostoc lactis, J. Biosci. Bioeng., 101(5), 415-420 (2006.5.25)
(3) キシロースからの乳酸発酵：Hitomi Ohara, Michiko Owaki & Kenji Sonomoto.: Calculation of metabolites from xylose in Lactococcus lactis, J. Biosci. Bioeng., 103(1), 92-94 (2007.1.25)
(4) キシロースからの乳酸発酵：Mugihito Oshiro, Hideaki Shinto, Yukihiro Tashiro, Noriko Miwa, Tatsuya Sekiguchi, Masahiro Okamoto, Ayaaki Ishizaki & Kenji Sonomoto.: Kinetic modeling and sensitivity analysis of xylose metabolism in Lactococcus lactis IO-1, J. Biosci. Bioeng., 108(5), 376-384 (2009.11.25)
また、下記の文献も参照することができる。
(5) 同時糖化発酵によるセルロースからの乳酸生産：S. Abe and M. Takagi.: Simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to lactic acid, Biotechnol. Bioeng., 37, 93-96 (1991)
(6) 同時糖化発酵によるセルロースからの乳酸生産：K. V. Venkatesh.: Simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to lactic acid, Bioresour. Technol., 62, 91-98 (1997)
(7) キシランを直接資化する乳酸菌について：M. Ishikawa, K. Nakajima, Y. Itamiya, S. Furukawa, Y. Yamamoto and K. Yamasato.: Halolactibacillus halophilus gen. nov., sp. nov. and Halolactibacillus miurensis sp. nov., halophilic and alkaliphilic marine lactic acid bacteria constituting a phylogenetic lineage in Bacillus rRNA group 1., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 55, 2427-2439 (2005)
非食用バイオマス原料からの酢酸発酵に関しては、下記の文献を参考にすることができる。
(8) Cai S, Dong X.: Cellulosilyticum ruminicola gen. nov., sp. nov., isolated from yak rumen contents, and reclassification of Clostridium lentocellum as Cellulosilyticum lentocellum comb. nov. Int J Syst Evol Microbiol. 2009 in press. Aug 6. [Epub ahead of print]
(9) Yang SJ, Kataeva I, Hamilton-Brehm SD, Engle NL, Tschaplinski TJ, Doeppke C, Davis M, Westpheling J, Adams MW. : Efficient degradation of lignocellulosic plant biomass, without pretreatment, by the thermophilic anaerobe "Anaerocellum thermophilum" DSM 6725. Appl Environ Microbiol. Jul; 75(14):4762-9(2009).
【国際調査報告】
2011099165.tif 000010
2011099165.tif 000011