(57)【要約】本発明は、哺乳類細胞を培養する方法であって、前記細胞への生体異物材料の移行を減少させる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞の培養のための方法において：
i)細胞培養容器を提供する工程であって、前記容器は、
a)哺乳類細胞と；
b)酸モノマーのポリマーとそれに付着した線維芽細胞フィーダー細胞とを含む細胞培養表面を備える基体を含む細胞培養支持体と；
c)前記哺乳類細胞の生育を支持するのに十分な、血清を含まない細胞培養液と
を含む工程と、
iii)前記哺乳類細胞の増殖を促進する細胞培養液および条件を提供する工程と
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記哺乳類細胞がヒトである請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳類細胞が未分化な状態で培養中に維持される請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法であって、前記哺乳類細胞が、表皮性ケラチン生成細胞；真皮性線維芽細胞；成体皮膚幹細胞；胚性幹細胞；メラニン形成細胞、角膜線維芽細胞、角膜上皮性細胞、角膜幹細胞；腸管粘膜線維芽細胞、腸管粘膜ケラチン生成細胞、口内粘膜線維芽細胞、口内粘膜ケラチン生成細胞、尿道線維芽細胞および上皮細胞、膀胱線維芽細胞および上皮細胞、ニューロングリア細胞および神経細胞、肝星細胞および上皮細胞からなる群から選択される方法。
【請求項５】
前記哺乳類細胞が自家ケラチン生成細胞である請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳類細胞と前記線維芽細胞の数が、約1：1〜5：1の間の比率である請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記比率が約5：1である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳類細胞が約0.75×104細胞／mm2で播種される請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳類細胞がケラチン生成細胞である請求項6ないし8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記基体が非多孔性ポリマーを含む請求項1ないし9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記基体が固相基体である請求項1ないし9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記基体が多孔性材料である請求項1ないし9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記材料が織布材料である請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記材料が不織布材料である請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞培養表面が少なくとも2％の酸含量を含むポリマーを備える請求項1ないし14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記表面が約2〜20％の間の酸含量を含むポリマーを備える請求項1ないし15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記表面が20％を超える酸含量を含むポリマーを備える請求項1ないし14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマーが少なくとも2％の酸含量でアクリル酸モノマーを含む請求項15または16に記載の方法。
【請求項１９】
前記酸含量が2％〜10％の間にある請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記酸含量が約4〜5％である請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリマーが酸コポリマーを含む請求項1ないし20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記線維芽細胞フィーダー細胞が非増殖性である請求項1ないし21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記線維芽細胞フィーダー細胞が、増殖培地のカルシウム濃度を低下させることによって非増殖性を与えられる請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記フィーダー細胞がヒト線維芽細胞である請求項1ないし23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
前記線維芽細胞が真皮性または口内線維芽細胞である請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記線維芽細胞が自家由来である請求項24または25に記載の方法。
【請求項２７】
細胞培養容器であって、酸モノマーのポリマーとそれに付着した線維芽細胞フィーダー細胞とを含む細胞培養表面を備える基体を含む細胞培養支持体を含んでなる細胞培養容器。
【請求項２８】
請求項27に記載の容器であって、前記容器がさらに哺乳類細胞と血清を含まない細胞培養液とを含む容器。
【請求項２９】
請求項28に記載の容器であって、前記哺乳類細胞が、表皮性ケラチン生成細胞；真皮性線維芽細胞；成体皮膚幹細胞；胚性幹細胞；メラニン形成細胞、角膜線維芽細胞、角膜上皮性細胞、角膜幹細胞；腸管粘膜線維芽細胞、腸管粘膜ケラチン生成細胞、口内粘膜線維芽細胞、口内粘膜ケラチン生成細胞、尿道線維芽細胞および上皮細胞、膀胱線維芽細胞および上皮細胞、ニューロングリア細胞および神経細胞、肝星細胞および上皮細胞からなる群から選択される容器。
【請求項３０】
請求項29に記載の容器であって、前記哺乳類細胞がケラチン生成細胞、好ましくは自家ケラチン生成細胞である容器。
【請求項３１】
細胞培養容器を処理する方法であって：
i)供給ガス中に少なくとも1つの酸モノマー供給源を提供する工程と；
ii)前記酸モノマーのプラズマを発生させる工程と；
iii)酸ポリマーを含む細胞培養容器を提供するように、細胞培養容器を前記プラズマポリマーと接触させるようにする工程と
を含んでなる方法。
【請求項３２】
前記酸モノマー供給源が30〜99％の酸モノマーを含む請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記酸モノマー供給源が100％の酸モノマー供給源からなる請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
前記酸モノマー供給源が100％のアクリル酸からなる請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
細胞培養容器を処理する方法であって：
(i)供給ガス中において選択された比率の酸含有モノマーと炭化水素とを提供する工程と；
(ii)前記混合物のプラズマを発生させる工程と；
(iii)酸コポリマーを含む細胞培養表面を与えるように、細胞培養容器を前記プラズマ混合物と接触させるようにする工程と
を含んでなる方法。
【請求項３６】
銅コイルまたはバンドで連結された電力入力手段によって前記プラズマを発生させる請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
治療学的担体上で哺乳類細胞を培養する方法において：
i)製剤を提供する工程であって、前記製剤は、
a)哺乳類細胞と；
b)酸モノマーのポリマーとそれに付着した線維芽細胞フィーダー細胞とを含む表面を備える基体を含む治療学的担体と；
c)前記哺乳類細胞の生育を支持するのに十分な、血清を含まない細胞培養液と
を含む工程と、
ii)前記治療学的担体上での前記哺乳類細胞の増殖を促進する細胞培養条件を提供する工程と
を含んでなる方法。
【請求項３８】
前記哺乳類細胞がヒトである請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
請求項37または38に記載の方法であって、前記哺乳類細胞が、表皮性ケラチン生成細胞；真皮性線維芽細胞；成体皮膚幹細胞；胚性幹細胞；メラニン形成細胞、角膜線維芽細胞、角膜上皮性細胞、角膜幹細胞；腸管粘膜線維芽細胞、腸管粘膜ケラチン生成細胞、口内粘膜線維芽細胞、口内粘膜ケラチン生成細胞、尿道線維芽細胞および上皮細胞、膀胱線維芽細胞および上皮細胞、ニューロングリア細胞および神経細胞、肝星細胞および上皮細胞からなる群から選択される方法。
【請求項４０】
前記哺乳類細胞が自家由来である請求項37ないし39のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４１】
前記哺乳類細胞がケラチン生成細胞である請求項39または40に記載の方法。
【請求項４２】
前記線維芽細胞フィーダー細胞がケラチン生成細胞である請求項37ないし41のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４３】
前記線維芽細胞フィーダー細胞が真皮性線維芽細胞またはヒト口内線維芽細胞である請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
前記フィーダー細胞が自家由来である請求項42または43に記載の方法。
【請求項４５】
前記哺乳類細胞の数と前記線維芽細胞の数が、約1：1〜5：1の間の比率である請求項37ないし44のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４６】
前記比率が約5：1である請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記哺乳類細胞がケラチン生成細胞であり、前記線維芽細胞との比率が約5：1である請求項45または46に記載の方法。
【請求項４８】
前記哺乳類細胞が約0.75×104細胞/mm2で播種される請求項37ないし47のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４９】
請求項45ないし48のいずれか1項に記載の方法であって、前記治療学的担体がポリマー材料で構成された基体を含み、哺乳類細胞と線維芽細胞の比率が約5：1である方法。
【請求項５０】
前記基体がビニルポリマーで構成される請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
前記ビニルポリマーが塩化ポリビニル、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコールからなる群から選択される請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
請求項37ないし51のいずれか1項に記載の方法によって得られ得る治療学的担体。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、哺乳類の細胞を培養する方法；酸モノマーのプラズマポリマーおよび線維芽細胞フィーダー細胞を含む細胞培養表面を備える細胞培養基体；ならびに前記基体を含む培養容器および治療学的担体に関する。
【０００２】
真核細胞、例えば哺乳類細胞の培養は日常的作業となり、細胞を増殖させることができる細胞培養条件は十分に定まっている。典型的には、哺乳類細胞の細胞培養は、無菌容器(通常はプラスチックから製造されたもの）、所定の増殖培地、ならびに(ある例では)線維芽細胞フィーダー細胞および血清(典型的には子牛血清)を必要とする。フィーダー細胞は、細胞増殖を刺激し、および／または細胞を未分化な状態に維持する分裂促進シグナルを提供するように機能する。フィーダー細胞は典型的には線維芽細胞であって、増殖することができないように処理された（例えばマイトマイシンまたは照射処理）細胞である。典型的には、フィーダー線維芽細胞はマウス由来である(Rheinwald and Green, 1975)。生体異物材料、例えばウシ血清またはマウス細胞の追加を必要としない細胞培養条件が確立され得る場合は有利になるだろう。なぜなら、それらを使用することは、培養中に増殖する哺乳類細胞に感染する感染性病原体（例えば、特にウシ産物についてのウイルスおよびプリオン、ならびにマウスフィーダー細胞についてのマウスウイルス)の感染の可能性を増加させるからである。また、フィーダー細胞に関して、自家の線維芽細胞がフィーダー層として使用され得、これらがマイトマイシンCの使用または照射処理なしで増殖抑制され得る場合は有利になるだろう。
【０００３】
組織工学は、臨床および美容手術の多くの領域に関して密接な関係をもつ新興の科学である。特に、組織工学は、組織および／または器官を機能的状態に回復させるための、被損傷および／または疾患組織の交換および／または復元および／または修復に関する。例えば（限定するものではないが）、組織工学は、挫傷もしくは火傷、または静脈性もしくは糖尿病性潰瘍を原因とする回復すべき組織不全の結果として生じる傷を修復するための、皮膚移植片の供給に有用である。組織工学は、修復すべき損傷部に組織を外科的に適用する前に、代替組織のインビトロ培養を必要とする。インビトロで生成された組織が感染性病原体を含まない可能性を増加させるために、血清中に存在するおそれがある生体異物病原体または生体異物細胞への組織の曝露を減少または回避することが望ましいであろう。
【０００４】
我々は、哺乳類細胞の培養のための細胞培養容器を作製するために、「プラズマ重合」を利用した。
【０００５】
プラズマ重合は、極薄(例えば約200nm)の架橋ポリマーフィルムを複雑な幾何学形状の基体上に堆積させ、制御可能な化学的官能性をもたせることができる技術である。結果として、材料の表面化学を、そのように処理された基体の本体特性に影響を与えることなく、改変することができる。プラズマまたはイオン化されたガスは一般に電場によって励起される。それらは、イオン、電子、中性種(ラジカル、準安定種、基底および励起状態の種）および電磁放射線を含む高反応性の化学的環境である。減圧下では、電子の温度がイオンおよび中性種の温度と実質的に異なる環境が達成され得る。このようなプラズマは、「低温」または「非平衡」プラズマと呼ばれている。このよう環境において、多くの揮発性有機化合物（例えば、揮発性アルコール含有化合物、揮発性酸含有化合物、揮発性アミン含有化合物、または揮発性炭化水素）が、ニートでまたは他のガス（例えばAr）とともに重合することが示され(H.K. Yasuda, Plasma Polymerisation, Academic Press, London 1985)、これらはプラズマと接触する表面またはその放出下流と接触する表面の両者を被覆する。ここでの有機化合物はしばしば「モノマー」と呼ばれる。堆積物はしばしば「プラズマポリマー」と呼ばれる。このような重合方法の利点には、極薄のピンホールフリーのフィルム状堆積物；即ち、プラズマポリマーが基体の広範囲に堆積され得ること；プロセスが溶剤フリーであり、プラズマポリマーが汚染とは無縁であることが潜在的に含まれる。低電力の条件下では、元のモノマーの化学的性質を十分な程度に保持するプラズマポリマーフィルムを調製することができる。例えば、アクリル酸のプラズマ重合フィルムは、カルボキシル基を含む。低電力環境は、連続的な電力を下げることによって、あるいは電力を断続的にパルシングすることによって達成され得る。
【０００６】
官能基をもつ１以上の化合物と炭化水素との共重合は、合成されたプラズマコポリマー(PCP)の表面官能基に対する或る程度のコントロールを可能にする。好ましくは、モノマーはエチレン的に不飽和である。従って、官能基化合物は、例えば不飽和のカルボン酸、アルコールまたはアミンであってもよく、一方、炭化水素は好ましくはアルケンである。
【０００７】
プラズマ重合によって、エチレンオキサイド型の分子(例えばテトラエチレングリコールモノアリルエーテル)を堆積させて、「汚れの無い」表面を形成することができる。また、パーフルオロ化合物(すなわちパーフルオロヘキサン、ヘキサフルオロプロピレン酸化物)を堆積させて、疎水性／超疎水性の表面を形成することができる。この技術は、表面が特有の化学的および物理的特性をもつので有利である。さらに、基体の表面湿潤性、接着性および摩擦性／磨耗性の特性を、制御可能かつ予測可能なやり方で改変することができる。
【０００８】
WO00/78928において、我々は、プラズマ重合の方法によって得られ得る高度の酸官能性をもつ表面を含む治療学的担体を開示している（高度の酸官能性とは、プラズマ重合のモノマーから達成される高度のカルボキシル(酸)の保有をいい；表面中の酸の量ではない）。この方法において処理された担体は、細胞の付着性および増殖性、ならびに重要なことには、傷ついた層に進入して該層を修復するための細胞の剥離性を支持し得る構造を提供する。WO03/035850において、我々は、修復の必要な傷に細胞を送達する実用性をもった、プラズマ重合により得られる高度な酸官能性表面を備えたポリマー基体を開示している。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、プラズマ重合によって処理され、かつ血清の無い培養液中で細胞を維持するために必要とされる細胞培養条件に関して驚くほど興味深い特性をもった、細胞培養容器に関する。本発明はまた、治療学的担体上で細胞を培養する方法に関し、これはその後、損傷を受けた組織の修復に後に使用される。
【００１０】
本発明の一態様によれば、
哺乳類細胞の培養のための方法において：
i)細胞培養容器を提供する工程であって、前記容器は、
a)哺乳類細胞と；
b)酸モノマーのポリマーとそれに付着した線維芽細胞フィーダー細胞とを含む細胞培養表面を備える基体を含む細胞培養支持体と；
c)前記哺乳類細胞の生育を支持するのに十分な、血清を含まない細胞培養液と
を含む工程と、
ii)前記哺乳類細胞の増殖を促進する細胞培養条件を提供する工程と
を含んでなる方法が提供される。
【００１１】
本発明の好ましい方法において、前記哺乳類細胞はヒトである。
【００１２】
本発明のさらなる好ましい方法において、前記哺乳類細胞は未分化な状態に培養液中で維持される。好ましくは前記細胞は未分化なケラチン生成細胞、例えばケラチン生成細胞の幹細胞である。
【００１３】
有利には、本発明による方法は、ある細胞品種、例えばケラチン生成細胞を長期間の培養にわたって未分化な状態に維持することができるので、継続的な細胞増殖および臨床用途、例えば傷の修復に使用され得る細胞材料の十分な量の産生を可能にする。
【００１４】
本発明のさらに好ましい方法において、前記哺乳類細胞は、表皮性ケラチン生成細胞；真皮性線維芽細胞；成体皮膚幹細胞；胚性幹細胞；メラニン形成細胞、角膜線維芽細胞、角膜上皮性細胞、角膜幹細胞；腸管粘膜線維芽細胞、腸管粘膜ケラチン生成細胞、口内粘膜線維芽細胞、口内粘膜ケラチン生成細胞、尿道線維芽細胞および上皮細胞、膀胱線維芽細胞および上皮細胞、ニューロングリア細胞および神経細胞、肝星細胞(hepatocyte stellate cells)および上皮細胞からなる群から選択される。
【００１５】
本発明は、インビボにおいて、より特殊化された分化した細胞への栄養シグナルを供給する支持細胞として機能する他の細胞の組み合わせを含む。このさらなる例は、患者の診断または治療のために必要とされる、癌細胞の生存と増殖を支持するフィーダー層として機能する自家細胞、例えば線維芽細胞または上皮細胞であろう。例えば、細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)を患者に再導入するときに、宿主免疫応答を誘導するように設計された条件下で、腫瘍細胞を免疫系の細胞とともに培養する場合である。
【００１６】
本発明の好ましい方法において、前記哺乳類細胞はケラチン生成細胞、好ましくは自家ケラチン生成細胞である。
【００１７】
典型的には、哺乳類細胞、あるいは後述の実施例において示されるようなケラチン生成細胞は、約0.75×104細胞/mm2の細胞密度で播種される。このことは、良好に機能しかつ良好な表面被覆を提供することが示されている（表３を参照）。
【００１８】
本発明の好ましい方法において、共培養中の前記哺乳類細胞の数と前記線維芽細胞の数は、約1：1〜5：1(哺乳類細胞：線維芽細胞）の比率である。好ましくは前記比率は、約5：1である。
【００１９】
好ましくは、前記哺乳類細胞はケラチン生成細胞であり、前記線維芽細胞との比率は約5：1である。
【００２０】
哺乳類細胞、例えばケラチン生成細胞と線維芽細胞フィーダー細胞との比率が約1：5である場合、線維芽細胞は致死的に照射される必要はなく、増殖状態で使用され得る。
【００２１】
本発明のさらなる好ましい方法において、前記容器は、ペトリ皿；細胞培養ボトルまたはフラスコ；複数ウェルプレートからなる群から選択される。「容器」とは、哺乳類細胞培養液を含むための任意の適切な手段として解釈される。
【００２２】
本発明の好ましい方法において、前記基体は非多孔性のポリマーを含む。好ましくは固相基体、例えばプラスチック、ガラス、コンタクトレンズである。
【００２３】
多孔性および線維性材料、織布および不織布材料のプラズマ被覆もまた、本発明の範囲内にある(例えば、包帯、ガーゼ、ギブス包帯）。
【００２４】
細胞培養容器製品の製造に使用されるプラスチックは、ポリエチレンテレフタラート、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレンまたはポリスチレンを含む。
【００２５】
本発明の好ましい方法において、前記細胞培養表面は少なくとも2％の酸含量を含むポリマーを含む。好ましくは前記酸含量は2〜20％である。あるいは前記酸含量は20％よりも大きい。％とはこの種の環境にある炭素原子のパーセントをいう。例えば20％の酸とは、プラズマポリマー中の100炭素当り20の炭素が、酸型の環境にあることを意味する。細胞培養表面の酸含量は、本明細書中に開示され当該技術において知られた方法によって決定される。例えば、酸の割合は、Ｘ線光電子分光法によって測定されるだろう。
【００２６】
本発明のプラクティスにおいて使用され得る重合可能なモノマーは、好ましくは不飽和有機化合物、例えばハロゲン化オレフィン、オレフィンカルボン酸およびカルボキシレート、オレフィンニトリル化合物、オレフィンアミン、酸化添加オレフィンおよびオレフィン炭化水素を含む。このようなオレフィンにはビニル型およびアリル型が含まれる。モノマーはオレフィン型である必要はないが、重合可能である必要がある。環状化合物、例えばシクロヘキサン、シクロペンタンおよびシクロプロパンは、一般にグロー放電方法によってガスプラズマ中で重合可能になる。これらの環状化合物の誘導体、例えば1,2-ジアミノシクロヘキサンもまた、一般にガスプラズマ中で重合可能になる。特に好ましいものは、ヒドロキシル基、アミノ基またはカルボン酸基を含む重合可能なモノマーである。これらのうち、アリルアミンまたはアクリル酸の使用を通して特別の利益ある結果が得られている。重合可能なモノマーの混合物を使用してもよい。さらに、重合可能なモノマーを、それ自体重合可能であると一般に考えられない他のガス、例えばアルゴン、窒素および水素とブレンドしてもよい。重合可能なモノマーは、好ましくは蒸気の形態で真空チャンバーに導入される。蒸気圧が1.3×10-2mbar未満である重合可能なモノマーは、本発明のプラクティスの使用に一般に適していない。
【００２７】
周囲室温で少なくとも6.6×l02mbarの蒸気圧をもつ重合可能なモノマーが好ましい。プラズマ重合堆積物に対してモノマーがグラフトされる場合は、周囲条件で少なくとも1.3mbarの蒸気圧をもつ重合可能なモノマーが特に好ましい。
【００２８】
特にモノマーはプラズマ重合操作で消費されるので、所望の圧力レベルを維持するために、プラズマ領域でのモノマー蒸気の連続的流入が通常行われる。重合不可能なガスがモノマー蒸気とブレンドされるとき、余分なガスの連続的除去は、真空ポートを通して真空源へと同時にポンピングすることによって達成される。いくつかの重合不可能なガスが、しばしばグロー放電ガスプラズマから放出されるので、本発明のプロセスにおいて、基体上へのプラズマ重合堆積の際に、同時に行われる真空化ポンピングを通して少なくとも部分的にガスプラズマ圧力を制御することが有利である。
【００２９】
他の例は、20炭素原子までの完全飽和および不飽和カルボン酸化合物を含む。より典型には2〜8炭素である。アクリル酸、メタクリル酸を含むエチレン的に不飽和な化合物(特に、α,β不飽和カルボン酸)が含まれる。エタン酸およびプロパン酸を含む飽和化合物が含まれる。容易に加水分解してカルボン酸官能基を与えるプラズマ重合可能な化合物、例えば有機酸無水物(例えば無水マレイン酸)、アシル塩化物を含む。
【００３０】
本発明のさらに好ましい方法において、前記ポリマーは少なくとも2％の酸含量をもつアクリル酸モノマーを含む。好ましくは、前記酸含量は2％〜10％間にある。好ましくは、前記酸含量は約4％〜5％(例えば4.5％)である。
【００３１】
本発明のさらに好ましい方法において、前記ポリマーは酸コポリマーを含む。コポリマーは、有機カルボン酸(もしくは無水物)と、飽和(アルカン)または不飽和(アルケン、ジエンもしくはアルキン)炭化水素とのプラズマ重合によって調製される。炭化水素は、20炭素以下(但し、より一般には4〜8)のものであろう。アルカンの例は、ブタン、ペンタンおよびヘキサンである。アルケンの例は、ブテンおよびペンテンである。ジエンの例は1〜7オクタジエンである。また、共重合用モノマーは芳香族を含有するものであってよく、例えばスチレンでもよい。
【００３２】
プラズマ共重合は、酸：炭化水素の任意の比率を使用して行ってもよいが、典型的には100(酸)：0(炭化水素)〜20(酸)：80(炭化水素)を限度とし、この限度の間のいずれかの比率を使用するだろう。
【００３３】
また、プラズマ重合アミンも本発明の範囲内にあり、例えば、完全飽和の一級、二級または三級アミン(例えば、ブチルアミン、プロピルアミン、ヘプチルアミン)、または不飽和のアミン、例えばアリルアミン(少なくとも20炭素であるがより典型的には4〜8炭素である)がある。アミンは上記のような炭化水素と共重合化され得る。
【００３４】
プラズマ重合アルコールもまた本発明の範囲内にあり、例えば、アリルアルコールまたはエタノールがある。アルコールは上記のように共重合化され得るであろう。
【００３５】
真空チャンバー中のガスまたはガスのブレンドを通したグロー放電は、真空チャンバーの領域に（もしくはを通して）伝達された可聴周波数、マイクロ波周波数または高周波数の電場によって開始されてもよい。特に好ましいものは、高周波数(RF)放電の使用であって、RFシグナル発生装置に接続された電極によって、真空チャンバーの空間的領域を通して伝達される。50 kHz程度の低さで開始するいくぶん広い範囲のRFシグナル周波数が、モノマー蒸気を通してグロー放電を引き起こしかつ維持するのに使用されてもよい。RFプラズマ重合の商業的スケールの使用においては、後述する実施例にあるような潜在的なラジオ波干渉の問題を避けるために、13.56 MHzの割当てられた周波数を使用することがより好ましいであろう。
【００３６】
グロー放電は連続的である必要はなく、プラズマ重合物の堆積の際に事実上断続的であってもよい。あるいは、連続的なグロー放電を使用してもよいが、ガスプラズマに対する基体表面の曝露は、全体の重合物堆積プロセスの際に断続的であってもよい。あるいは、所望の全体の堆積時間にわたって、連続的なグロー放電と、発生したガスプラズマへの基体表面の連続的な曝露との両方が使用されてもよい。一般に基体上に堆積するプラズマ重合物は、流入する重合可能な単一のモノマー(または複数のモノマー)と同じ元素組成をもたないであろう。プラズマ重合の際に、特定の元素または基本的な基のいくつかの断片化および欠損が自然と起こる。すなわち、アリルアミンのプラズマ重合においては、プラズマ重合物の窒素含量は、典型的には純粋なポリアリルアミンに相当する量よりも少ない。同様に、アクリル酸のプラズマ重合において、プラズマ重合物のカルボキシル含量は、典型的には純粋なポリアクリル酸に相当する量よりも少ない。グロー放電への断続的な曝露による場合のように、ガスプラズマの不存在下においてこれらの未反応モノマーのいずれかに対してある時間曝露を行えば、該モノマーのプラズマ重合物へのグラフティングが可能になるので、最終堆積物中の官能基(アミンまたはカルボン酸)のレベルをある程度増加させることができる。プラズマ曝露とグラフティング曝露との間の時間間隔は、秒間隔から数分まで変化させることができる。
【００３７】
プラズマ重合条件は、当業者によって大気プラズマ(すなわち、真空プラズマ反応器の使用のない)に適合され得る。
【００３８】
本発明のさらに好ましい方法において、前記線維芽細胞フィーダー細胞は非増殖性である。
【００３９】
本発明のさらに好ましい方法において、フィーダー細胞は、培養液のカルシウム濃度を下げることにより、マイトマイシンCまたは照射の使用を回避する方法によって、非増殖性を与えられる。例えば、共培養において哺乳類細胞の増殖を可能にするが、フィーダー細胞の増殖を阻害または防止するようなカルシウムの濃度水準が提供され得る。典型的には、カルシウムの濃度水準は、生理学的な濃度水準の約10分の1まで減少され得る。
【００４０】
本発明のさらに好ましい方法において、前記フィーダー細胞はヒト線維芽細胞、好ましくはヒト真皮性線維芽細胞である。さらなるフィーダー細胞の供給源は、口内線維芽細胞である。
【００４１】
本発明のさらなる態様によれば、細胞培養容器であって：酸モノマーのポリマーとそれに付着した線維芽細胞フィーダー細胞とを含む細胞培養表面を備える基体を含んだ細胞培養支持体を含んでなる細胞培養容器が提供される。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態において、前記線維芽細胞フィーダー細胞は非増殖性である。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態において、前記容器は哺乳類細胞と、血清を含まない細胞培養液とを更に含む。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、前記哺乳類細胞は、ケラチン生成細胞；線維芽細胞；成体皮膚幹細胞；胚性幹細胞；メラニン形成細胞からなる群から選択される。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態において、前記哺乳類細胞は、ケラチン生成細胞、好ましくは自家ケラチン生成細胞である。
【００４６】
本発明のさらなる態様によれば、細胞培養容器を処理する方法であって：
i)少なくとも1つの酸モノマー供給源を供給ガス中に提供する工程と；
ii)前記酸モノマーのプラズマを発生させる工程と；
iii)酸ポリマーを含む細胞培養容器を提供するように、細胞培養容器と前記プラズマモノマーとを接触に至らせる工程と
を含んでなる方法が提供される。
【００４７】
本発明の好ましい方法において、前記酸モノマー供給源は、30〜99％の酸モノマーを含む。好ましくは前記酸モノマー供給源は、100％の酸モノマー供給源からなる。好ましくは前記方法は100％のアクリル酸供給源からなる。
【００４８】
本発明のさらなる態様によれば、細胞培養容器を処理する方法であって：
i)選択された比率の酸含有モノマーと炭化水素とを供給ガス中に提供する工程と；
ii)前記混合物のプラズマを発生させる工程と；
iii)酸コポリマーを含む細胞培養表面を提供するように、細胞培養容器と前記プラズマ混合物とを接触に至らせる工程と
を含んでなる方法が提供される。
【００４９】
本発明の好ましい方法において、前記プラズマは、銅製コイルまたはバンドによって連結された電力入力(ラジオ周波数 13.56 MHz)によって作り出される。
【００５０】
反応容器の容積は2〜10Lの範囲にあり、該反応容器は、二重ステージの回転ポンプによって10-4mbar付近の基礎圧力までポンピングされた。回転ポンプをターボモレキュラーポンプに置き換える場合は、より良い基礎圧力が達成され得る。モノマーの圧力は、10-1mbar〜10-3mbarの範囲にあり、かつモノマーの流速は1〜10cm3／分である。電力は、典型的には0.5〜50W連続波であろう。当業者は、マイクロ秒またはミリ秒の時間スケールでのパルシングによってプラズマ状態を生み出すために、あるいはより小さいまたはより大きい容積の反応容器を使用することによってプラズマ状態を生み出すために、これらのパラメーターを調整してもよい。
【００５１】
本発明のさらなる態様によれば、治療学的担体上に哺乳類細胞を培養する方法において：
i)製剤を提供する工程であって、前記製剤が、
a)哺乳類細胞と；
b)酸モノマーのポリマーとそれに付着した線維芽細胞フィーダー細胞とを含む表面を備える基体を含む治療学的担体と；
c)前記哺乳類細胞の生育を支持するのに十分な、血清を含まない細胞培養液と
を含む製剤を提供する工程と、
ii)前記治療学的担体上で前記哺乳類細胞の増殖を促進する細胞培養条件を提供する工程とを含んでなる方法が提供される。
【００５２】
本発明の好ましい方法において、前記哺乳類細胞はヒトである。
【００５３】
本発明のさらなる好ましい方法において、前記哺乳類細胞は、表皮性ケラチン生成細胞；真皮性線維芽細胞；成体皮膚幹細胞；胚性幹細胞；メラニン形成細胞、角膜線維芽細胞、角膜上皮細胞、角膜幹細胞；腸管粘膜線維芽細胞、腸管粘膜ケラチン生成細胞、口内粘膜線維芽細胞、口内粘膜ケラチン生成細胞、尿道線維芽細胞および上皮細胞、膀胱線維芽細胞および上皮細胞、ニューロングリア細胞および神経細胞、肝星細胞および上皮細胞からなる群から選択される。
【００５４】
好ましくは前記哺乳類細胞は自家細胞、好ましくは自家ケラチン生成細胞である。
【００５５】
本発明のさらなる好ましい方法において、前記線維芽細胞フィーダー細胞はヒトである。
【００５６】
本発明のさらなる好ましい方法において、前記線維芽細胞フィーダー細胞はヒト真皮性線維芽細胞またはヒト口内線維芽細胞である。好ましくは前記フィーダー細胞は自家細胞である。
【００５７】
本発明の好ましい方法において、前記担体で共培養中の前記哺乳類細胞の数と線維芽細胞の数は、約1：１〜5：1(哺乳類細胞：線維芽細胞)の比率である。好ましくは前記比率は約5：1である。
【００５８】
好ましくは前記哺乳類細胞はケラチン生成細胞であり、前記線維芽細胞との比率は約5：1である。
【００５９】
本発明の好ましい方法において、前記哺乳類細胞、例えばケラチン生成細胞は、例えば約0.75×104細胞/mm2の細胞密度で播種される。
【００６０】
本発明のさらなる好ましい方法において、前記治療学的担体は、プロセシス(prothesis);インプラント；マトリックス；ステント；生分解性マトリックス；またはポリマーフィルムからなる群から選択される。
【００６１】
本発明のさらなる好ましい方法において、前記治療学的担体は、ポリマー材料、好ましくはビニルポリマーで構成された基体を含む。
【００６２】
好ましくは前記ビニルポリマーは、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコールからなる群から選択される。
【００６３】
代わりのポリマー材料が利用可能であり、これには以下の例が含まれる。
【００６４】
基体の例には、ポリエチレン[PE]非常に低密度、鎖状低密度、塩素化(＜20％)および脂肪族ポリオレフィン(ポリエチレン以外)を含むオレフィン、例えばポリプロピレン(PP)  ポリブト-1-エン(アタクチック)、ポリイソブチレンおよびジエンゴム例えば、天然ゴム、スチレンブタジエンゴム(その外にラテックス)  ブチルゴム、ニトリルゴム、ポリブタジエン、ポリイソプレン  エチレンプロピレンゴムおよびポリクロルプレン(polychlorprene)が含まれる。PEおよび他の脂肪族オレフィンは、添加剤、例えば酸化防止剤、抗オゾン処理剤、軟化剤、処理助剤、発泡剤、色素、および賦形剤(filer)を含んでもよい。
【００６５】
さらなる例には、エチレンコポリマー、例えばエチレンビニルアセテートおよびエチレンエチルアクリレート；ビニル塩化物重合体、例えばポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコールであって、安定剤、可塑剤、潤滑剤、賦形剤およびその他の添加剤を含むことができるもの；アクリル物質、例えばアクリルゴムおよびアクリルポリマーをブレンドしたもの；スチレンに基づいたプラスチック、例えばスチレンイソプレンおよびスチレン熱可塑性エラストマー；ポリアミド、例えばポリアミド12およびポリアミドコポリマー；シリコーンポリマー(その例はポリジメチルシロキサン)、およびシリコーンゴム；ポリウレタン；ポリウレタンゴム；およびポリスルフィドが含まれる。
【００６６】
さらなる基体には、ポリエチレン(非常に低密度、鎖状低密度、塩素化(＜20％))、および脂肪族ポリオレフィン(ポリエチレン以外)、例えばポリプロピレン(PP)ポリブタ-1-エン(アタクチック)およびポリイソブチレンを含むオレフィンからなる群から選択されるポリマーが含まれる。
【００６７】
さらなる基体には、ジエンゴム、例えば天然ゴム、スチレンブタジエンゴム(ラテックスを含む)  ブチルゴム、ニトリルゴム、ポリブタジエン、ポリイソプレン  エチレンプロピレンゴム、ポリクロルプレンからなる群から選択されるポリマーが含まれる。
【００６８】
エチレンコポリマー、例えばエチレンビニルアセテートおよびエチレンエチルアクリレートからなる群から選択されるポリマーを含む基体は、本発明の範囲内にある。
【００６９】
さらなる例には、アクリル物質、例えばアクリルゴムおよびアクリルポリマーをブレンドしたもの；スチレンベースのプラスチック、例えばスチレンイソプレンおよびスチレン熱可塑性エラストマー；ポリアミド、例えばポリアミド12およびポリアミドコポリマー；シリコーンポリマー(その例はポリジメチルシロキサン)、およびシリコーンゴム；ポリウレタン；ポリウレタンゴム；およびポリスルフィド；ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、シリコーンおよびポリヒドロキシブチレートからなる群から選択されたポリマーを含んでなる基体を含む。例は、PVC(PL 1240, Baxter)、PVC(PL 146, Baxter）、PVC(410CU, Pall Medical）、PVC(5550 Seta, Solmed)、PVC(3226 Seta, Solmed）、ポリプロピレン(7210, Solmed）、ポリヒドロキシブチレート(Goodfellow)およびシリコーン-ポリジメチルシロキサン(Baxter)が含まれる。また、イソシアネートと反応したポリオール形状の熱可塑性ポリウレタン処方のポリマーとポリオールまたはポリアミン鎖の増量剤とを含んでなる基体も含まれる。同様に、トリルジイソシアネートまたはメチルジイソシアネートを含むイソシアネートまたはジイソシアネート分子で架橋されたポリオール／ポリアミン形状の熱硬化性ポリウレタン処方のポリマーが含まれる。
【００７０】
ヒドロゲルもまた本発明の範囲内に含まれる。ヒドロゲルは、アモルファスゲルまたはシートドレッシング(sheet dressing)であって、架橋されたもの、典型的には様々な比率のポリマー、湿潤剤および水からなるものである。ヒドロゲルは当該技術において知られ、かつ商業的に利用可能である。ヒドロゲル／シートは、湿った創傷環境を維持するように機能し、かつ創傷への損傷を伴わずに除去され得る。商業的に利用可能なヒドロゲルの例はTegageltm, Nu-GeltmまたはFlexiGeltmである。
【００７１】
本発明の好ましい方法において、前記治療学的担体はヒドロゲルである。
【００７２】
本明細書中で開示された条件下における治療学的担体上での哺乳類細胞の直接的な培養は、組織工学において明らかに有益である。なぜなら、前記担体表面の調製が、細胞の培養、および修復されるべき傷への細胞の移植および移動の全てを容易にするからである。細胞培養容器の処理のための本明細書中に開示されたプラズマ重合条件は、治療学的担体の表面処理に対して等しく適用可能である。
【００７３】
ここで、本発明の実施形態を、単なる実施例として、表および図を参照しながら説明する。
【実施例】
【００７４】
材料および方法
プラズマ共重合
アクリル酸(＞99％）、オクタ-1,7-ジエン(＞99％)およびアリルアミン(＞99％)を、アルドリッチ化学社(英国)から得た。それらを、数回の凍結ポンプ／解凍サイクル後に受領したままで使用した。真空および液体窒素ポンプと連結された円柱状の反応容器中で重合を行った。インピーダンス整合装置と外部に巻回された銅コイルによって誘導的に結合されたラジオ周波数シグナル発生装置(13.56 MHz)および増幅器によってプラズマを持続させた。2Wまたは10Wのプラズマ電力で2.0cm3(stp)min-1の全流速でモノマーを重合または共重合させた。整合ネットワークは電力損失が最小であることを保証し、供給電力を最大に保持し、かつ反射電力をできる限り最低水準まで下げた。理想気体のふるまいを想定するYasudaによって説明された方法［12］を使用して、プラズマ反応容器中で測定された圧力変化を換算することによってモノマーの流速を算出した。反応容器中の圧力は、典型的には重合中3×10-2barであった。プラズマポリマーを、ＸＰＳ分析のための清潔なアルミニウムホイルで被覆されたガラスカバー小片上に；接触角測定のための清潔なガラススライド上に、および細胞培養研究用の組織培養用ウェルプレート(ＴＣＰＳ)上に堆積させた。反応容器でプラズマ堆積の任意のばらつきを避けるために各実験用の反応容器中で理想の位置に基体を配置させた。20分の堆積時間は、XPSスペクトルからあらゆる基体シグナルを遮断するのに十分な厚みをもつプラズマコーティングを堆積させるのに十分であった。さらに、プラズマを遮断した後、さらに15分間にわたってモノマー混合物を流しておいた。これは、大気に曝露された被覆物による大気酸素の取り込みを最小化するために役立った［9］。さらに、リークがプラズマ重合の間に発生じなかったことを確認するために、実験の最後に流速を調べた。
【００７５】
Ｘ線光電子分光法(XPS)分析
プラズマ重合の30日後にアルミニウム箔上に堆積された被覆物をＸ線光電子分光法(XPS)を使用して分析し、サンプル(特に、アリルアミンおよびオクタジエンプラズマで被覆された基体)のエイジングを記録することを可能にした[13]。100Wの電力で作動するMg Kα X線源をもつVG CLAM 2分光計を使用してXPSを行った。84.00eVでのAu 4f 7/2ピーク位置および397.2eVで測定されたPTFEサンプルのC 1sとF 1sピーク位置の間の間隔を使用して分光計を較正し、Beamson and Briggsによって報告された397.19eVの値と十分に比較した[14]。サンプル表面に対して30°の固定されたテークオフ角度を使用し、スペクトル6.0ソフトウェア(R. Unwin Software, Cheshire, UK)を使用してスペクトルを獲得した。各サンプルの広範な走査(0〜1100eV)と狭小な走査を獲得した。広範な走査を使用して表面酸素／炭素(O/C)比を得、狭小な走査を使用して炭素、酸素および窒素の結合環境についての情報を得た。広範および狭小走査についてのスペクトルの収集のために、使用された分析器通過エネルギー(analyser pass energies)はそれぞれ50および20eVとした。
【００７６】
ESCA300 (Scienta Software)を使用してC1sコアレベルスペクトルのピーク適合化(peak fits)を得た。Gaussian-Lorenzian(G/L)混合ピーク0.8-0.9を、良好な確立された化学シフトを使用してC 1sコアレベルスペクトルに適合させた［15］。ピーク適合化において、ピークの半値幅(the full width half maximums)(FWHM)を同等に維持し1.38〜1.67の範囲に維持した。炭化水素ピークを285eVに設定して任意のサンプル電荷を矯正した。サンプル電荷は4〜5eVの範囲とした。
【００７７】
接触角の測定
また、プラズマポリマーフィルムをガラスカバー小片上に堆積させ、接触角の測定値を使用して表面の湿潤性およびその溶解に対する安定性を調べた。接触角の測定値を連続的に使用して最も外側の0.5〜l.0mmの表面での極性基および無極性基の濃度の変化をモニターする。Burge Equipment, UKからのRame-Hart角度計(モデル100-00(220))を使用した。全ての接触角の記録は、あらかじめこのラボラトリー［16］によって詳細に記載されているように、そしてAndradeによって提示された基準［17］に従って行われた。接触角の測定値は、20μl以下の蒸留水の4μl増分を添加および除去することによる前進および後退モードの両方で読み取られた。前進角度は表面の低エネルギー部分を表わし、後退角度は高エネルギー部分のよりよい特徴である。少なくとも3つの測定値が各サンプル表面について読み取られた。
【００７８】
細胞培養
通常の手術手順（乳房減少および腹部整形）の後、被検体から採取された中間層皮膚移植片をトリプシン処理して皮膚の真皮層からヒト真皮性線維芽細胞を得た。事前に、PBSで洗浄しメスで細かく切り刻み0.5％のコラゲナーゼ中に静置しておいた。コラゲナーゼ消化および上澄みの除去のための遠心分離後に、T25フラスコ中の10ml線維芽細胞培養液(FCM)中で細胞を再懸濁した。フラスコを37℃で5％CO2雰囲気で維持した。
【００７９】
500 mlのFCMは、438.75 mlsのダルベッコ改質イーグル培地(DMEM)、50 mlsのウシ胎仔血清(FCS)、5 mlsの1-グルタイミン、5 mlsのペニシリン／ストレプトマイシン(それぞれ10,000 U/mlおよび10,000 μg/ml)、1.25mlsのフンギソンからなる。FCS無しのFCMは、補うために追加の50mlsのDMEMを含む。線維芽細胞は、90〜100％コンフルエントになったときに播種され、継代数5〜9で使用した。FCS有りおよび無しの2W〜10Wのプラズマポリマーに対する線維芽細胞の付着と比較する際、同一のフラスコおよび継代数の細胞を使用した。線維芽細胞の継代はT25フラスコ当り0.1％トリプシンと0.02％ EDTAの1:1の混合物1.5mlを使用して行った。2Wラウンドの実験の開始時に、0.9mlのDMEMと0.1mlのDMSO(凍結防止剤)とを含む1ml溶液を含む極低温バイアル中に10Wの実験に必要とされる細胞を-80℃で凍結した。
【００８０】
ヒト真皮性ケラチン生成細胞(乳房減少および腹部整形から得られた)を、真皮性／表皮性接合から新たに分離した。グリーンの培養液コレラ毒素(0.1 nM)、ヒドロコルチゾン(0.4μgm-1)、EGF(lOngm-1)、アデニン(1.8×104M)、トリ-ヨード-L-チロシン(2×10-7M)、フンギソン(0.625μg ml-1)、ペニシリン(1000 IU ml-1)、ストレプトマイシン(1000μg ml-1)および(任意的に)10％ウシ胎仔血清を含む中で細胞を培養した。細胞は37℃で5％CO2雰囲気で培養した。コラーゲンコートされたTCPSウェルプレートを、0.1M酢酸(200μg ml-1)中のコラーゲンI(32μg cm-2)の溶液を層流キャビネット内で終夜にわたって空気乾燥することによって調製した。
【００８１】
細胞付着性、生存能力および増殖性の評価
ヒト真皮性線維芽細胞の付着性および生存能力の調査のために、細胞を24の別々のウェルプレート(1.6cmの直径)中に7.0×103細胞ml-1の密度で播種した。ヒト表皮性ケラチン生成細胞を、3.8×105細胞/mlの密度で播種した。共培養の実験は、照射(セシウム137シール源を使用して4780秒間照射)された2×104細胞/mlの真皮性線維芽細胞で、1.5×105細胞/mlのケラチン生成細胞の播種密度を採用した。ポジティブコントロールのTCPSを除いて、プレートをプラズマ重合した。3および7日目での線維芽細胞の付着性および生存能力を、MTT-ESTAアッセイを使用して評価した。MTT基体を着色されたホルマザン生成物に変換させる細胞デヒドロゲナーゼ活性が、一般に細胞数と関係をもつという点で、このアッセイは生存可能な細胞を表示し、かつ細胞数の間接的な反映を提供する。細胞を1mlのPBS溶液で洗浄し、その後、0.5mg ml-1のMTTとともにPBS中40分間インキュベートした。その後、300μlの酸性化イソプロパノールを使用して染色を溶出させた。150μlを96ウェルプレートに移した。光学密度を540nmの波長に設定されたプレート読取り機を使用して630nmのタンパク質参照(protein reference)を差し引いて読み取った。さらに、細胞の外観を評価し3および6または7日目に記録をとった。
【００８２】
細胞のDNA含量(細胞数を反映するが、必ずしも生存能力があるとは限らない)を、ヘキスト蛍光染色液(33258 Sigma Chemicals)を使用して同時期に計算した。細胞を、1mlの消化緩衝液中で1時間インキュベートした。この緩衝液は、100mlのクエン酸ナトリウム溶液(SSC)当り、細胞を破壊する48gの尿素と、DNAaseから細胞を保護する0.04gのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)とから成る。消化後、SSC緩衝液中1μg/mlでヘキスト蛍光染色を使用して細胞を染色した。蛍光計を使用し、355および460nmそれぞれの励起および発光波長を使用して蛍光を測定した。既知のDNA濃度の標準曲線を使用してDNA含量を計算した。表わされた全ての実験データに関して、6日または7日間にわたって単独でまたは共培養中で培養された細胞は3日目に新しい培地の交換を受けた。
【００８３】
統計
血清有りおよび無しのケラチン生成細胞の増殖を向上させる照射された線維芽細胞フィーダー層の重要性を、p＜0.05の値が統計学的に意義があるとみなされる統計学的two-tailed Student t試験を使用して分析した。
【００８４】
分化の評価
血清有りおよび無しの細胞培養および共培養におけるケラチン生成細胞の分化を、商業的に利用可能な抗体を使用して固定化および染色化することによる、被覆発現によって評価した。血清の存在／欠損中における被膜発現は、水酸化ナトリウム消化剤で蛍光を抽出することによる、可視的調査および量的測定によって決定された(18)。蛍光は、それを並行培養のDNA含量と関係づけることによって定量化された。
【００８５】
移動実験
血清欠損中、線維芽細胞とともに上記のように共培養されたケラチン生成細胞の培養表面（PVCポリマーフィルム‐Solmed上に堆積されたプラズマ重合アクリル酸)からの移動を、脱表皮化真皮(DED)を含むインビトロの傷ついた層モデルを使用して評価した。実験および使用した材料の完全な詳細は参照文献10に与えられる。
【００８６】
致死の照射無しの線維芽細胞の共培養
血清の欠損中において、10Wのアクリル酸プラズマ重合表面上でケラチン生成細胞培養物を支持するために、未照射の線維芽細胞を使用した。ケラチン生成細胞の増殖を、ケラチン生成細胞有効培地(グリーンの培地)中で行った1ウェル[24ウェル組織培養プレート(ウェル面積＝133mm2)]当り1×105のケラチン生成細胞と5×104の線維芽細胞という、ケラチン生成細胞と線維芽細胞の最小播種密度を採用した。また、未照射の線維芽細胞を使用して、ケラチン生成細胞培養物を支持するために、1ウェル当り5×104の線維芽細胞で5×105のケラチン生成細胞という、ケラチン生成細胞播種密度を採用した。
【００８７】
例１
プラズマコポリマーの特性
4つのプラズマコポリマー表面は、アクリル酸とオクタ-1,7-ジエンとアリルアミン由来のものとから、2Wおよび10W電力両方で調製された。プラズマポリマーは、モノマー流の％アクリル酸で定義される(そして、特に明記しない限り、我々は例においてこの慣行を続ける）。炭化水素消化剤であるオクタ-1,7-ジエンは、アクリル酸モノマーの架橋を促進させることによって生じる官能基濃度の調節を可能にした。アルミニウム箔上に堆積されたアクリル酸とオクタ-1,7-ジエン由来の全てのプラズマポリマー表面のXPS分析は、炭素と酸素だけで明らかにした。予期されたように、モノマーからアクリル酸のモル分率が増加したときに、O/C比は増加した。オクタ-1,7-ジエンを含むプラズマポリマーは、XPS分析前に空気へ曝露してフィルム中に酸素を必然的に組み込んだ。プラズマ重合されたアリルアミン表面のXPSの広範な走査は、堆積物中の炭素、窒素および酸素を明らかにした。空気からの酸素の組み込みがプラズマからの酸素とともに起こった可能性があることを想定することは合理的である。さらに、水は、反応容器内の容器の壁の内層から脱着すると考えられる[9]。
【００８８】
C1sスペクトルは、酸素含有官能基の範囲を使用してピーク適合された[14]。アクリル酸重合化のために、アルコール/エーテル(C-OH/R)基を、炭化水素ピーク(C-C/H)と比較して+1.5 eVに、カルボニル(C=0)を+3.0eVに、カルボキシル/カルボキシレート(COOH/R)を+4.0eVに、そして最後にβ-シフト化炭素を炭化水素と比較して+0.7eVに適合させた。オクタジエンでは、COOH/Rおよびβ-シフトは適合しなかった。ピーク適合化において、2つの炭素原子は1つのシェアされた酸素原子によってもたらされるものと同じシフトを生じるので、エーテル官能基は2倍にカウントされる。XPSはエステルとカルボン酸基との間を区別することができないのでAlexander and Ducはトリ-フルオロエタノール(TFE)を使用してプラズマ重合アクリル酸の酸をラベルし、本研究中で使用されたものと同様の電力／流速で、カルボキシレートピークの約30％が酸に割り当てられ得ることを明らかにした[19]。O'Toole et alはグレージング角度IR分光器を使用して10Wで調製されたアクリル酸サンプルが酸基よりも大きな割合のエステルを含むことを結論づけた。逆に、低電力(＜5W)では、全てのCOOH/Rは、カルボン酸官能基に割り当てられ得る[19b]。これらの研究に基づいて、我々はCOOH/R基の全てが酸であるわけでないことを認める。モノマー供給のアクリル酸の割合とプラズマポリマーのカルボキシレート基のもたらされた濃度との間の相互関係を、10W表面に関して表1に示した。10Wで調製された純粋なアクリル酸プラズマポリマーに関する狭小な走査スペクトルを図1に示した。2Wの重合化に関するデータは提供していない。
【００８９】
アリルアミンについてのC１sコアレベル適合化は、刊行物[14,20]から報告された化学シフト値を使用して窒素含有官能基にピーク適合された。XPSデータを数量化し表2に示した。適合化された官能基は、イミン(C=N)が0.9eV、アミン(C-NR2)が1.7eV、およびアミド(CNO)が0.3eVであった。しかしながら、天然のアミン(第1級、2級、または3級)は知られていない。表面元素濃度を決定するのに使用されるピーク適合から生じる誤差およびピーク領域の測定の誤差は、一般に+/-5％であると考えられる[14]。ピーク適合からのO/CおよびN/C比の両方の計算において、酸素または窒素のいずれかに対して結合した炭素の総数を100炭素原子で割り、それぞれO/CおよびN/C比を得た。
【００９０】
例２
表面の安定性
37℃、5％CO2雰囲気中、0、1、および24時間にわたる水中への浸漬後に、前進および後退接触角の測定を2WおよびlOWプラズマ重合ガラススライド上で記録した。各フィルムの相対的な疎水性/親水性の性質を、蒸留水の4μl増分の追加および除去で記録した。2Wのプラズマ重合表面では、接触角測定のかなりの変化がある‐表面はしばしば水中への浸漬後にガラスカバー小片からはっきりと剥がれてしまうので、細胞培養目的には不適切であった(データは示していない)。対照的に、10W表面は、図2に図示したように、24時間にわたる水中への浸漬に対して非常に安定であった。最大の疎水性lOW表面は純粋な炭化水素オクタジエンであり(89°)、最大の親水性は純粋なアクリル酸表面である(46°)。図2は、24時間にわたる溶解に対して安定な純粋アクリル酸のlOW表面の例を示す。その他のlOW表面は、溶解に対して同様の安定性を共有した。これらの結果から、2W表面よりもlOWで機能を継続させるという結論が得られた。
【００９１】
例３
プラズマコポリマー上での線維芽細胞の培養
10Wプラズマ表面上でのヒト真皮性線維芽細胞の付着性および増殖性を、ウシ胎仔血清(FCS）有りおよび無しでこの細胞を培養し、3日目および7日目にMTTおよびDNAアッセイを使用して調査を行った(図3を参照)。また、細胞の形態を記録するために写真を撮影した(図4)。細胞生存能力についての細胞のふるまい(cell behaviour)は、DNAアッセイによって評価されてもMTTアッセイによって評価されても同様の結果が得られた。3日目および7日目において、100％オクタジエン表面上での細胞の機能性は不十分であったが、その他の全ての表面上では、組織培養プラスチックであっても、表面が30, 60または100％のアクリル酸またはアリルアミンを含むガスフローで調製されていても良好に機能した。細胞は、血清の存在中でその欠損中よりもはっきりとより良く機能した。これは7日目でより顕著に明らかになった(かなりの細胞増殖が7日目までに行われているが、少なくとも3日目にはほとんど行われていない)。これはまた、図4に示された線維芽細胞の外観においても明らかである。ここで、100％アクリル酸上で3日目の細胞は、血清存在中において良好に組織化され、数がより多かったが(図4A)、血清欠損中では、細胞は血清存在中の線維芽細胞と比較して明らかにその数が少なく、相対的に異常な細胞骨格配置を示した(図4B)。
【００９２】
例４
プラズマコポリマー上でのケラチン生成細胞の培養
これら表面上でのケラチン生成細胞の機能性を評価することにおいて、ケラチン生成細胞が容易に付着する組織培養プラスチック(TCPS)およびI型コラーゲンの2つの内部対照を使用した。新たに単離されたケラチン生成細胞を、24ウェルプレートの全表面上に3.8×105細胞/mlで播種した。ケラチン生成細胞を、標準的なグリーンの培地中でウシ胎仔血清の存在中および欠損中で培養した。培地中FCS無しで培養されたケラチン生成細胞は、24時間後にウェルに付着したが(図5A, B）、6日目までに明らかになったように血清欠損中で増殖能力が少なかった(図5C, D)。全ての表面上でかなり均等に付着性および増殖性を示した線維芽細胞と対照的に、モノマー供給中のアクリル酸の百分率が、ケラチン生成細胞の付着性の度合について著しい影響を与える。これは、MTTアッセイによって評価しようとDNAアッセイによって評価しようと同様である。一方、MTT-ESTAアッセイによって6日目まで見積られたときの細胞付着性および増殖性の度合は、概ねDNAアッセイについて示されたものと酷似していた(図5)。9.2％のCOOH/Rを含む純粋なアクリル酸表面上では、血清含有培地中のケラチン生成細胞増殖の度合は最大であり、I型コラーゲン上で測定されたものに匹敵した(図5C, D）。全ての実験を通して、100％のオクタジエン表面上では細胞の機能性が不十分であった。
【００９３】
例５
10Wで調製された100％のアクリル酸表面上でのヒト真皮性線維芽細胞と表皮性ケラチン生成細胞との共培養
両細胞の共培養のために選択された表面は、アクリル酸表面(100％アクリル酸から調製されたもの)であった。なぜなら、これがケラチン生成細胞の付着性および増殖性について最高の表面性を提供するからであり、さらにまた、線維芽細胞もこの表面上で良好な機能性を示すからである(但し、線維芽細胞はモノマー流中のアクリル酸のより低百分率を使用して調製された表面上でも良好な機能性を示す)。次に、この10W表面が選択され、ウシ胎仔血清の存在中および欠損中でケラチン生成細胞の培養を調査してこれらの2つの細胞種のための共培養条件を調査した。ウシ胎仔血清の代わりとして、照射された線維芽細胞を使用した。照射された線維芽細胞を、最初に2×104細胞/mlで24時間にわたって血清存在DMEM中に播種した。その後、あらゆる共培養調査のために、培地を取り除いて、血清有りまたは無しの1.5×lO5細胞/mlで播種されたケラチン生成細胞と交換した。また、ケラチン生成細胞(血清有りおよび無しの培地)と照射された線維芽細胞を、比較の目的のためにそれら単独で培養した。I型コラーゲンのポジィティブコントロールが全体にわたって使用された。3日目まで、ケラチン生成細胞は、血清有りおよび無しのグリーンの培地で、照射された真皮性フィーダー層の存在中で良好にコロニーを形成した(図6）。しかしながら、7日目までには、血清なしの条件下で、照射された線維芽細胞無しで培養されたケラチン生成細胞は、表面から剥離し始めた(図7A）。対照的に、照射された線維芽細胞の存在する血清無しの培地中の細胞は(図7B)、ケラチン生成細胞の集密の健全なシートを形成し、多層を形成し始めた。
【００９４】
血清無しの条件下での線維芽細胞フィーダー層の貢献についての定量的なデータを、図8および9において要約された実験で示した。図8のMTT-ESTAおよびDNAデータは、照射された線維芽細胞フィーダー層の存在中・血清無しの共培養条件下・7日目の共培養の後における、付着性と増殖性の両方の観点からケラチン生成細胞の向上した機能性を示す。また、ケラチン生成細胞の増殖を最適化するように設計されている、商業的に利用可能な所定の培地(Gibco規定の培地）中における細胞の共培養を調べた。図に示すように、MTTおよびDNA値の両方は、血清の欠損中において、照射された線維芽細胞(それ自体は少量DNAを与える)とケラチン生成細胞(それ自体は血清欠損中で生育状態が悪い)との間でかなりの相乗作用があるということをはっきりと示す。また、Gibco培地(血清無し)中における細胞の共培養は、100％酸表面の条件を含む血清中の細胞またはI型コラーゲン上の細胞と比較して非常に良好な結果となった。
【００９５】
血清無しの培地中で線維芽細胞を照射し、その後これをケラチン生成細胞とともに実験の全体にわたって血清無しの状態で維持することによって線維芽細胞培養物から血清汚染を排除する、更なる工程が行われた。血清無しの100％アクリル酸表面上で両細胞を一緒にしたとき、血清の存在中で観察されるものと同等のDNA値が4日目および6日目に達成された(図9A, B)。血清の存在中の100％アクリル酸またはI型コラーゲン上でケラチン生成細胞を培養したとき、線維芽細胞フィーダー細胞を追加してもほとんど差異は表われなかった；が、対照的に、血清の欠損中、100％アクリル酸上のケラチン生成細胞の機能性がかなり低い場合において、線維芽細胞フィーダー層を追加すると、劇的にケラチン生成細胞の増殖が向上した(図7A, Bにおいても示されているように)。4日目の結果と6日目の結果とを比較すると(図9A, B)、培養物が増殖し続けていることがはっきりと解る。細胞を、血清無しのグリーンの培地中で培養しても血清無しのGibco培地中で培養しても同様の結果が得られた。
【００９６】
照射された線維芽細胞の存在下にあって、血清の欠損中におけるプラズマ重合表面上で培養されたケラチン生成細胞は、細胞のDNA含量に関する被膜発現を測定することによって評価されたときに、血清の存在中におけるプラズマ重合表面上またはI型コラーゲン上で培養されたものと比較して分化の程度が低かった。被膜は、ケラチン生成細胞が分化し始めるときにケラチン生成細胞によって生成された修飾された膜(envelope)の成分として測定された。
【００９７】
実験は、あらかじめ記載されている手順を使用して行われ、その後、培養物は、商業的に利用可能な抗体を使用して被膜について固定化および染色化が行われ、この段階で細胞を撮影した。血清の欠損中で培養されたケラチン生成細胞は、血清有りで培養されたものと比較して培養物当りの被膜発現量が少なかった。水酸化ナトリウム消化剤で蛍光を溶出させ(Little et al, 18中にあるような完全な方法)、それを並行培養のDNA含量に関係付けることによって蛍光量を定量化し、この結果を定量的に確認した。
【００９８】
グリーンの培地中でケラチン生成細胞を培養することによって得られた上記の結果に加えて、ケラチン生成細胞の所定の培地(生理的カルシウムが1/lOである）を使用すると、ケラチン生成細胞の被膜が低発現化する。なぜなら、生理的カルシウムがケラチン生成細胞の分化のために必要とされるからである。また、プラズマ重合表面上でケラチン生成細胞の所定の培地中に培養されたケラチン生成細胞は、照射された線維芽細胞有りおよび無しの両方で非常に低発現の被膜を示した。従って、グリーンの培地中のケラチン生成細胞とケラチン生成細胞の所定の培地中のケラチン生成細胞は、増殖性と分化の程度が低いという点において、この表面上で良好な結果を示した。
【００９９】
本研究の目的は、ケラチン生成細胞の培養と移動に適した表面であって、該表面が臨床的に使用され得、かつケラチン生成細胞を患者の傷害部に送達する他の手法を上回る利点をもつであろう表面を開発することであった。現在において利用可能な方法論のうち、マウス線維芽細胞の致死的に照射された層上でのケラチン生成細胞の増殖と、トリプシンを使用してこれらの細胞を細胞の統合シートとして剥離することとは、現時点で「最高の標準的方法」である(Rheinwald and Green[1])。この方法は、1980年代初頭から使用されており、欧州および米国において、火傷による過度の皮膚の喪失をもつ患者の治療に使用されてきた。不幸なことに、これらの培養された皮膚移植片の臨床的な「定着」は、一般に全体の50％未満である[2,3]。これは、患者の損傷層の状態を含む複数の要因の組み合わせが原因であろう。しかしながら、この不十分な定着を導く疑いのない細胞培養の2つの問題がある。1つ目は、細胞が酵素的に剥離され、これがケラチン生成細胞が傷害層に付着するのに必要である細胞表面受容体(インテグリン)に対する損傷を引き起こし得ることによる。2つ目の問題は、付着に適した細胞の統合シートを形成するために、細胞の分化が十分に進んでしまう前までに細胞を培養していかなければならないということである。分化が進行した細胞は傷害層上で良好に機能する可能性が低い。トリプシンを使用して細胞を剥離する必要性を回避しかつ細胞が集密シートを形成する必要がない、ケラチン生成細胞の培養と傷害層への細胞の移動とに適したプラズマ重合表面を開発したことは、このような背景に対してのものであった。
【０１００】
現在の研究は、線維芽細胞フィーダー細胞を導入することによって、この表面上でのケラチン生成細胞の増殖を助け、増殖性の表現型のケラチン生成細胞を維持することを助けるさらなるこの仕組みを開発することであり、そしてこの仕組みの一部として、血清無しでなし得る培養系を開発する可能性を探索することである。
【０１０１】
本研究の主用な発見は、線維芽細胞のフィーダー層が存在する場合において、血清無しの条件下で9.2％のCOOH/R基を含む10Wのプラズマポリマー表面上でのケラチン生成細胞の増殖を、現在の「最高の標準的な」方法（ウシ胎仔血清の存在下において照射されたマウス線維芽細胞上で細胞を培養するという方法）によって得られ得るのと同じくらい急速に行わせることを可能にすることである。細胞はI型コラーゲンでコートされた表面上でうまく培養され得、実際に臨床目的で使用されてきたが、I型コラーゲンの供給源は通常はウシのコラーゲンである[4]。現在の欧州全土の心配事は、BSEが何れのインビトロ試験によっても検出することができないことであり、従って、ウシ材料がBSEに決して感染していない群れに由来するものでない限り、ウシの材料がBSEフリーであることを確信することは不可能である。これは米国では主用な心配事として見られていないけれども、欧州行政当局は、病気の伝染の危険性を減らすために、臨床使用のために培養された細胞は、ウシ、および実際には他の動物由来の製品の使用を避けることを要求する。従って、臨床使用のための細胞培養の「究極の目的」は、完全に定められた培養系を開発することである。この研究で示された仕組みは、この終着点へと向かう重要な一歩である。
【０１０２】
我々は、まず最初にその表面の性質を議論し、次にその表面上での細胞のふるまいについて議論する。アクリル酸とオクタ-1,7-ジエンとのプラズマ重合は、カルボキシル／カルボキシレート基(COOH/R)の濃度を変えることによって広範なプラズマポリマーを生み出した。XPSデータは、O/C比とモノマー供給中のアクリル酸の割合との間に比例した関係を示した。接触角の測定の結果は、2Wプラズマポリマーフィルムの不安定な性質と、蒸留水の浸漬後にガラススライドから剥離するというそれらの感受性を示した。この硫酸グループのこれまでの研究は、低電力フィルムでこの問題を示し、アクリル酸との架橋を提供して表面の安定性を向上させるオクタ-1,7-ジエンのモノマー供給への組み込みによってこの問題を克服する[16]。また、電力を10Wまで増加させることによって、図2によって図示されたように表面の安定性を向上させることが可能になった。このオプションは、これらの研究のために選択された。より高い電力を使用する弱点は、より広範な範囲の酸素-炭素の官能基で生じるモノマーの断片化を増加させることであり、存在する酸基の正確な百分率を得ることをより難しくした。
【０１０３】
ヒト真皮性線維芽細胞は、FCSを含む培地中において、アクリル酸とアリルアミンに基づいたプラズマポリマー表面上で最初はうまく培養された。血清無しでは線維芽細胞は増殖することができず、これは72時間後の培養物が明らかにした。実験全体を通して、100％のオクタジエン表面はネガティブコントロールとして機能し、ヒト真皮性線維芽細胞について付着性を提供するアクリル酸とアリルアミンの両方で構成された表面の表面化学の重要性を示す。Greisser et alは、生理的pH7.4でプロトン化されたアミン基(アミド基)によって提供される正電荷に対する、負に帯電したタンパク質の親和性を示した[21]。アクリル酸に基づいたプラズマポリマー表面上でのヒト真皮性線維芽細胞の培養についての仕組みは報告されていないけれども、多くの研究は、線維芽細胞がより高い表面エネルギーをもつ表面の広範な範囲に広がったことに言及している[22, 23]。10W表面上でのヒト真皮性線維芽細胞の培養についてのMTTおよびDNAの結果は、これらの状態の両方を支持する。良好な細胞付着性は、9.2％COOH/R基を含む、10Wでの100％のアクリル酸表面上で示されたが、良好な付着性はまた、9.2％未満のCOOH/R基と純粋なアリルアミン表面とを含むより低い百分率のアクリル酸表面上でも同じように観察された。溶解に対するこの表面の安定性をモニタリングする前進および後退接触角の測定結果が、細胞培養用途についてのこれらの10Wプラズマポリマーの適合性をさらに強調した。
【０１０４】
プラズマポリマー表面に対するヒト真皮性ケラチン生成細胞の付着性は、10Wで調製された100％アクリル酸表面上で明らかに最高であった。プラズマポリマー中のアクリル酸の量の増加は、ケラチン生成細胞の増殖の増大を誘導した。この表面に対する細胞の付着性は、ケラチン生成細胞を培養するためのより確立された基層材料であるI型コラーゲンに対する細胞付着性に匹敵するものであった。血清フリーでのケラチン生成細胞の機能性は、線維芽細胞よりも良好であったが、7×103 細胞/mlの線維芽細胞の細胞密度と比較して、より高い初期細胞密度（3.8×105細胞/ml）をこの実験で採用したことは、注目すべき重要なことである。これは、既に分化したケラチン生成細胞の高パーセンテージでの占有とその補償を可能にした（分化は、ケラチン生成細胞が表皮性／真皮性の接合から新たに分離するとその後に起こる）。プラズマ重合表面に対する細胞付着性を調査する既存の研究は、2.3％カルボン酸基を含む2Wでの純アクリル酸表面上での最適なケラチン生成細胞の付着性について記している。10Wのプラズマ中におけるモノマーはより大きな度合いで断片化するために、COOH/Rピークに対する酸の相対的寄与は解らないが確実に100％未満であり、＜50％のCOOH/Rがカルボキシル(例えば≦4.6％）であると想定するのは非合理的ではない[19b]。
【０１０５】
ケラチン生成細胞と線維芽細胞との共培養は、血清欠損中においてケラチン生成細胞の機能性を強化する、照射されたヒト真皮性線維芽細胞層の利益をはっきりと示した。照射された線維芽細胞とケラチン生成細胞とが血清中で共培養されたとき、ケラチン生成細胞の増殖に対する線維芽細胞の貢献は、血清無しのデータのそれらの貢献と比較してわずかなものであった。フィーダー層は、血清無しのケラチン生成細胞の増殖を支持するのに十分な全ての必要な成長因子と細胞外マトリックスタンパク質とを提供するようである。これは、血清含有条件下で3T3セルラインを使用する、Rheinwald and Greenによって最初に報告された観察を支持し広げる[1]。
【０１０６】
血清の使用を避ける主要な利益は、現在ではBSE検出と関連した問題を避けることにある。この理由のために、我々は本研究中においてマウス線維芽細胞よりもむしろヒトのものを使用した（この研究において、ヒト線維芽細胞は最初に血清含有の培地中で増殖させ、その後に血清無しの条件下で培養した。臨床的使用としては、組換え型の有糸分裂促進因子を含む血清無しの所定の培地を使用して疾患初期の生検材料からの線維芽細胞を増殖させる必要性があるだろう）。細胞が表面にどのように付着するかを考えるにあたって、線維芽細胞とケラチン生成細胞の両方が、（血清欠損中においていずれも良好に増殖しなかったにも関わらず）血清無しの条件下において10Wのプラズマポリマー表面ではうまく付着したということは注目すべき興味深いことであった。細胞の付着は、表面に直接的に、あるいは表面に付着したタンパク質の層を通して起こり得る[9]。血清が存在するとき、表面を被覆するタンパク質は血清によって誘導され；血清の欠損中では、細胞それ自体がタンパク質を分泌するだろう。典型的な例は、培養中で大量のフィブロネクチンを分泌する線維芽細胞である(Ralston et al[7]中において概説されるように）。対照的に、血清は付着性(フィブロネクチンおよびビトロネクチン)と非付着性(例えば、非常に大量のアルブミン)の両方のタンパク質を含む。血清はまた、ある範囲の血清誘導の有糸分裂促進因子、例えば血清誘導成長因子(PDGF)、表皮性成長因子(EGF)および形質転換成長因子(TGF-β)を含む（これらは全て細胞増殖を刺激する）[25]。血清が細胞培養において広く使用されるのは、これらの有糸分裂促進因子のためである。所定の培地を生成することにおいて、組換え型の有糸分裂促進因子が使用される。
【０１０７】
この研究の目的は、哺乳類細胞、例においてはケラチン生成細胞を、臨床的傷害部の治療のために増殖および移動させるための向上した方法論を開発することであった。我々は、細胞の傷害層への送達に適した表面上に細胞を培養し、同時にケラチン生成細胞の増殖の速度を向上させ、生体異物材料の使用を必要としない培養系を開発しようとした。我々が採用した手法は、ケラチン生成細胞増殖のための有糸分裂促進因子の供給源として生育が抑止されたヒト真皮性線維芽細胞を導入し、プラズマ重合コポリマー上でケラチン生成細胞を培養することであった。アクリル酸／オクタ-1,7-ジエンとアリルアミンとのプラズマコポリマーが調製され、X線光電子分光法(XPS)を使用して特性を決定した。ポリマーは2Wおよび10Wで調製された。10W表面は2W表面よりもより安定であることが分かった。線維芽細胞は、モノマーフロー中で30〜100％アクリル酸で調製された全ての表面上で良好に付着および増殖した(ウシ胎仔血清の存在中)。対照的に、ケラチン生成細胞はより選択的であることがわかり、100％アクリル酸(プラズマ堆積物において9.2％カルボキシル／カルボキシレートを与える)から生成された表面上でのみ付着性および増殖性を示し、オクタジエンをモノマー流に加えると、I型コラーゲンに対する付着性と比較して相対的に付着性が低下した。線維芽細胞とケラチン生成細胞との付着性に関しては、血清除去によって大きな影響はなかったが、増殖性に関しては両細胞ともに血清が必要であった。しかしながら、純粋なアクリル酸表面と、10Wの電力での調製と、ヒト真皮性線維芽細胞の非増殖性線維芽細胞フィーダー層とを使用して、ヒトケラチン生成細胞の急速な増殖性を完全な血清無しの条件において達成した。得られた結果は、血清存在中で組織培養用プラスチックまたはI型コラーゲンの基体上でケラチン生成細胞と生育が抑止された線維芽細胞とを培養することによって得られた結果と同じくらい良好であった。従って、化学的に処理された表面と生育抑止の線維芽細胞とを組み合わせることによって、ケラチン生成細胞の増殖性は血清無しの条件のもとでも達成され得る。この培養系は、臨床使用のケラチン生成細胞の培養について魅力的な手法を提示する。
【０１０８】
プラズマポリマー上でのケラチン生成細胞の血清無しの共培養の可能性は、刺激的である。動物ベースの産物無しで、傷害部への細胞送達担体として機能することができる合成表面としてプラズマポリマーを使用する機会がある。臨床用途のために血清フリー共培養系を開発する次の段階は、インビトロ傷害層モデルに移動する線維芽細胞の欠損中および存在中でケラチン生成製細胞の機能性を調査することであろう(最近我々の研究室から行われたように)[10]。
【０１０９】
要約すれば、本研究は、9.2％のCOOH/R基を含むlOWプラズマポリマー表面上でのヒト表皮性ケラチン生成細胞の培養物に対して照射されたヒト線維芽細胞を加えると、血清無しの条件下でもケラチン生成細胞の増殖性が加速することを示す。
【０１１０】
例６：プラズマポリマー表面からDEDへのケラチン生成細胞の移動
血清欠損下において、アクリル酸プラズマポリマー表面上で線維芽細胞とともに共培養されたケラチン生成細胞は、DED表面にうまく移動した。
【０１１１】
例７：線維芽細胞を致死的に照射しないで行う共培養
9.2％COOH-R基を含むlOWアクリル酸プラズマポリマー表面上でのヒト表皮性ケラチン生成細胞の培養における、未照射のヒト線維芽細胞（致死的に照射された線維芽細胞と反対に）の使用は、血清無しの条件下でのケラチン生成細胞の増殖を可能にする。これらの結果を表３に示す。
【０１１２】
ケラチン生成細胞密度      線維芽細胞密度      90％コンフルエント
(細胞/ウェル)            （細胞/ウェル）
5×105                      1×105              3〜4日
5×105                      5×104              3〜5日
5×105                      1×104              9日
1×105                      1×105              7日
1×105                      5×104              8日
1×105                      1×104              達成されなかった
5×104                      1×105−1×104      達成されなかった
表3：ケラチン生成細胞が、ヒト線維芽細胞と混合されて血清フリーのグリーンの培地中で共播種された後、90％の表面領域を達成するまでにかかった時間。得られた結果は、３回試験の平均値である。
【０１１３】
これらの結果は、ケラチン生成細胞の増殖をうまく行わせるためには、ケラチン生成細胞有効培地（例えばグリーンの培地）と、ケラチン生成細胞の最小播種密度−ケラチン生成細胞の最小播種密度は1×105ケラチン生成細胞／ウェル(ウェルの底面積＝133mm2)とした−とを使用する必要があることを示している。1×105ケラチン生成細胞／ウェルの播種密度では、8日目にケラチン生成細胞によって90％占有をの表面を達成するためには5×104の線維芽細胞／ウェルを必要とした。わずか1×104の線維芽細胞を使用した場合、ケラチン生成細胞は有意な表面域を達成しなかった。しかしながら、5×105のケラチン生成細胞と5×104の線維芽細胞で実験を開始した場合、4日以内に90％を越えるウェル表面がケラチン生成細胞によって占有された。ケラチン生成細胞の増殖を達成させるための、ケラチン生成細胞と線維芽細胞との比率を調べる実験によって、1ウェル当りのケラチン生成細胞の最小播種密度があることがわかった(1×105/ウェル)。ケラチン生成細胞を支持する培地を使用する必要があった（線維芽細胞を支持する培地を使用した場合、うまくいかなかった）。理想の線維芽細胞とケラチン生成細胞の比率は１：１であり（1x105のケラチン生成細胞／ウェル（133mm2）のとき）、約５：１よりは大きくならない必要がある。同様に、他の1x105細胞／ウェルよりも大きいケラチン生成細胞播種密度についても比率を決定することができる。
【０１１４】
参照文献
1. Rheinwald J, Green H, Serial cultivation of strains of human epidermal 
keratinocytes :theformation of coloniesfrom single cells, Cell, 1975, Vol 6, pp 331- 
344. 
2. Boyce S, Designprinciples for composition and performance of cultured skin substitutes, Burns, 2001, Vol 27, pp534-544. 
3. Balasubrammi M etal, Skin substitutes: a review, Burns, 2001, Vol 27, pp523- 533. 
4. Grant Iet al, Demonstration of epidermal transferfi om a polymer membraneusing genetically faarkedporcifze keratinocytes, Burns, 2001,27, pp 1-8. 
5. Boyce S, Ham RG, Calcium-regulated differentiation of normal epidermalkeratinocytes in chemically defined cloiial culture and serum-free serial culture, J Invest Dermatology, 1983, Vol81, pp 33-40. 
6. Wang HJ etal, Human keratinocyte culture using porcijze pituitary extract inseru77Z-free medium, Burns, 1995,Vol 21, No 7, pp 503-506. 
7. Ralston D etal, keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production in a skin composite, British Journal of Plastic Surgery, 1997, Vol 50, pp408-415. 
8.Ghakrabarty K et al, Development of autologous human dermal-epidermal compositesbased on sterilised human allodermis for clinical use, British Journal of Dermatology,1999, Vol 41,pp811-823. 
9. France R etal,Attachment of human keratinocytes to plasma co-polymers of acrylicacid/octadiene and allyl amine/octadiene. Journal of Materials Chemistry,1998. 8(1) : pp 37-42. 
10. Haddow DB et al, Plasma polymerised surfaces for culture of humankeratinocytes and transfer of cells to an in vitro wound bed model, Journal of Biomedical Materials Research, 2003,64,80-87. 
11. Haddow D B et al, Comparison of Proliferation and Growth of Human Keratinocytes on Plasma Co-polymers of AcrylicAcid/1, 7 Octadiene and Self Assemble Monolayers, Journal of Biomedical Materials Research, 1999,47 (5),pp379-387. 
12. Yasuda H (1985) Plasma Polymerisation, Academic Press: New York, 1985, Chapter 3. 
13. Whittle, J, R. Short, Differences in the ageing of Allyl Alcohol, Acrylic Acid, Allylamine and octa-l, 7-diene plasma polymers by XPS. Chem Mater, 2000. 12: p. 2664- 2671. 
14. Beamson, G. and G. Briggs, High resolution XPSoforganic polymers : TheScienta ESCA300 Handbook. 1992: John Wiley and sons. 
15. Hynes,A., Macromolecules, 1996.29 : p. 4220 
16. Daw, R., PlasmaCo-polyzer Surfaces of acrylic acidll, 7 octadieneafad Met7zylVinyl Ketone/Octa-l, 7-diene : Surface, characterisation and behaviour of osteoblastlike cells, in EngineeringMaterials. 1998, University of Sheffield : Sheffield. 
17. Andrade J,Contact Angle and interface Energetics. Surface and Interfacial aspects of biomedical polymers. Vol. 2. 1985 : New York and London. 249292. 
18. Little M. C. et al,The Participation ofProliferative Keratinocytes in the Pre-Immue Resporzse to SensitizingAgents, British Journal of Dermatol., 1997,138, 45-56 
19. Alexander M, Duc, T, Thechemistry of deposits formedfrom ac7ylic acid plasmas, J. Mater. Chem, 1998,8 (4), pp 937-943. 
19b. O'Toole L, Beck, Short R, Characterisation of Plasma Polymers of Acrylic acid and Propanoic acid, Macromolecules, 1996,29,pp5172-5177. 
20. Fally F, Quantification of the functional groups present at the surface of plasma polymers deposited from propylamine,allylamine, and propargylamine, J 
Appl.Polym. Sci, 1995, Vol 56, p597-614. 
21. Greisser H etal., Growth of human cells on plasma polymers : Putative role of amine and amide groups. J. Biomater. Sci. Polymer Edition, 1994.5 (6): p. 531-55412. 
22. Altankov G etal,Studies on the biocompatibility of materials : Fibroblast organisationof substratum-bound f bronectin on surfaces varying in wettability. Journal of Biomaterials Research, 1996.30 : pp385-391. 
23. Ruardy T et al,Sdhesion and spreading of human skin fibroblasts onphysiochemically characterised gradient surfaces. Journal of Biomedical Materials Research, 1995.29 : pp 1415-1423. 
24. Kelly J,Osteoblast Response to Oxygen Fufzctionalised Plasma Polymer Surfaces, PhD thesis, 2001, University of Sheffield. 
25. Freshney, RI, Culture of animal cells, Chapter 7"The culture environment". Wiley-Liss Inc. 1994, p74-p77.
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、10Wで調製されたプラズマ重合アクリル酸のピーク適合されたC 1sコアレベルを示す。A= C-C/C-H. B= COOH/R(β-シフト). C= C-OH/R. D=C=O. E= COOH/R(カルボキシレート基）。
【図２】図２は、0, 1および24時間にわたる浸漬後の、10Wで調製された純粋なアクリル酸表面上での前進および後退接触角の測定値を示す。
【図３】図３は、培養の3日後および7日後のプラズマポリマー表面上でのヒト真皮性線維芽細胞の増殖を示す。示された結果は、３回試験の細胞の平均+/-標準偏差である。
【図４】図４は、100％アクリル酸プラズマ重合表面上で3日間にわたって培養された線維芽細胞の外観を示す（Ａ）は血清(10％ウシ胎仔血清(FCS))有り、（Ｂ）は血清無し。
【図５】図５は、MTT-ESTAアッセイ（Ａ, Ｃ）およびDNAアッセイ（Ｂ, Ｄ）によって示されたときの、24時間後（Ａ, Ｂ）および６日後（Ｃ, Ｄ）のケラチン生成細胞の表面に対する付着性を示す。示された結果は、３回試験の細胞のウェル当りの平均+/-標準偏差である。
【図６】図６は、10Ｗでの純粋アクリル酸表面上の線維芽細胞フィーダー層上でのケラチン生成細胞の共培養上の血清の効果を示す（写真Aは血清有り、写真Bは血清無し）。
【図７】図７は、血清の欠損中の10Wアクリル酸表面上のケラチン生成細胞培養上の線維芽細胞フィーダー層の影響を示す。血清無しの状態下において、線維芽細胞フィーダー層の欠損中(Ａ)または存在中(Ｂ)において７日間にわたって細胞を培養する。矢印Ｘは典型的な分化した細胞を示し、Ｙはゴールデン剥離細胞(golden unattached cells)の領域を指す。Ｂでは、フィーダー層の存在中において細胞の健康的な集密シートが明確な境界線Ｚで形成される。
【図８】図８は、10Wでの純粋アクリル酸上でのケラチン生成細胞の増殖性について、血清および照射された線維芽細胞の効果を示す。単独および共培養で7日間にわたって細胞を培養した。（Ａ）は、MTT-ESTA値を示し、（Ｂ）はDNA値を示す。示された値はn=3の3回試験のウェル当りの平均+/-標準偏差である。相互にはっきりと異なる値を、* p＜0.05、** p＜0.01および*** p＜0.005によって示した。
【図９】図９は、ケラチン生成細胞と照射された線維芽細胞の両方の、単独および共培養における増殖性についての血清の効果を示すDNAアッセイである（グラフＡは4日目、グラフＢは6日目)。示された値は、n=3の3回試験のウェル当りの平均+/-標準偏差である。相互にはっきりと異なる値を、* p＜0.05、** p＜0.01および*** p＜0.005によって示した。
【図１０】図１０は、共培養の6日目にケラチン生成細胞によって発現された被膜の量についての定量的データを示す。血清無しでケラチン生成細胞はこの時点であまり被膜を発現しなかったということを示した。
【図１１】図１１は、血清無しの共培養下で6日目のケラチン生成細胞によって発現された被膜の量の免疫蛍光を示す。
【図１２】図１２は、血清存在の共培養下で6日目のケラチン生成細胞によって発現された被膜のより大きな量の免疫蛍光を示す。
【図１３】表１は、10Wでアクリル酸とオクタジエンから調製されたプラズマポリマーについてのXPS結果の概要を示す。
【図１４】表２は、10Wでアリルアミンから調製されたプラズマポリマーについてのXPS結果の概要を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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