(57)【要約】ペプチド混合物中のペプチドを定量するための、方法および装置（コンピュータープログラム製品を含む）である。複数のペプチドを含むペプチド混合物が得られる。１つ以上のペプチドが、一定期間にわたってペプチド混合物より分離される。特定の時間に分離された１つ以上のペプチドが、質量対電荷分析に供され、そして質量分析された１つ以上のペプチドの存在量が計算される。質量分析された１つ以上のペプチドについての相対量は、そのペプチドの計算された存在量を、第１ペプチド混合物から外部にある参照サンプル中の１つ以上のペプチドの存在量と比較することによって、計算される。この技術は、差次的な質量標識化の使用の必要なしに、任意のペプチドについて適用され得、そして他の生物学的分子（例えば、核酸および低分子）に対して適用され得る。
2005522713.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド混合物中の１つ以上のペプチドを定量するための方法であって、
複数のペプチドを含む第１ペプチド混合物を得る工程；
一定期間にわたって該第１ペプチド混合物の該複数のペプチドのうちの１つ以上を分離する工程；
該一定期間における特定の時間に、該第１ペプチド混合物の該分離された１つ以上のペプチドを、質量対電荷分析する工程；
該第１ペプチド混合物のうちの該質量分析された１つ以上のペプチドの存在量を計算する工程；
該第１ペプチド混合物のうちの該質量分析された１つ以上のペプチドの計算された存在量を、参照サンプル中の１つ以上のペプチドの存在量と比較することによって、該第１ペプチド混合物のうちの該質量分析された１つ以上のペプチドについて、相対量を計算する工程であって、該参照サンプルが該第１ペプチド混合物に対して外部にある、工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
複数のペプチドを含む第１ペプチド混合物を得る工程が、第１ポリペプチドサンプルを消化して該第１ペプチド混合物を作製する工程
を包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
第２ポリペプチドサンプルを消化することによって前記参照サンプルを調製する工程；
該消化された該第２ポリペプチドサンプルから、１つ以上のペプチドを分離する工程；
該消化された第２ポリペプチドサンプルからの該分離されたペプチドを質量分析する工程；および
該第２ポリペプチドサンプルからの該質量分析されたペプチドのうちの１つ以上の存在量を計算する工程、
をさらに包含し、
ここで、前記第１ペプチド混合物のうちの前記質量分析された１つ以上のペプチドについての相対量を計算する工程が、該第１ペプチド混合物のうちの質量分析された１つ以上のペプチドの計算された存在量を、該第２ポリペプチドサンプルからの１つ以上の対応する質量分析されたペプチドの計算された存在量と比較する工程を包含する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
１つ以上のペプチドを分離する工程が、液体クロマトグラフィーによって該１つ以上のペプチドを分離する工程を包含する、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
１つ以上のペプチドを分離する工程が、前記特定の時間にて液体クロマトグラフィー溶出物を単離する工程を包含し；そして
前記第１ペプチド混合物のうちの前記分離された１つ以上のペプチドを質量分析する工程が、該単離された溶出物中の１つ以上のペプチドを質量分析する工程を包含する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記第１ペプチド混合物のうちの１つ以上のペプチドを同定する工程
をさらに包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
前記第１ペプチド混合物のうちの１つ以上のペプチドを同定する工程が、質量分析情報に基づき、前記分離された１つ以上のペプチドを同定する工程を包含する、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
前記分離された１つ以上のペプチドを質量分析する工程が、該分離された１つ以上のペプチドのうちのペプチドに由来するイオンをフラグメント化する工程、および該イオンのフラグメントを質量分析する工程を包含し；そして
前記第１サンプル中の１つ以上のペプチドを同定する工程が、該フラグメントについての質量分析情報に基づき、配列データベースを検索する工程を包含する、方法。
【請求項９】
請求項４に記載の方法であって、
前記質量分析された１つ以上のペプチドの存在量を計算する工程が、ペプチドについてのクロマトグラムピークを、該ペプチドについての質量分析情報に基づいて再構築する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
ペプチドについての存在量を計算する工程が、ペプチドについての存在量を、該ペプチドについて再構築されたクロマトグラムピーク面積に基づいて計算する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
ペプチドについての存在量を計算する工程が、前記特定時間での再構築されたクロマトグラムにおいて閾値間隔内に位置するクロマトグラムピークのみを使用して、ペプチドについての存在量を計算する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、
前記質量分析された１つ以上のペプチドについての相対量を計算する工程が、前記第１ペプチド混合物のうちのペプチドについてクロマトグラムピーク面積を再構築することによって計算される存在量を、前記参照サンプル中のペプチドについてのクロマトグラムピーク面積を再構築することによって計算される存在量と比較する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項２に記載の方法であって、
前記第１ペプチド混合物のうちの前記質量分析された１つ以上のペプチドの計算された存在量を正規化する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
前記計算された存在量を正規化する工程が、前記第１ポリペプチドサンプルに添加された１つ以上のペプチドを含む内部標準に基づき、前記計算された存在量を正規化する工程を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、
前記計算された存在量を正規化する工程が、１つ以上のペプチドを含む外部標準に基づき、前記計算された存在量を正規化する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項２に記載の方法であって、
前記質量分析する工程に基づき、前記第１ペプチド混合物のうちの複数のペプチドを同定する工程
をさらに包含し；
ここで、前記質量分析された１つ以上のペプチドについての相対量を計算する工程が、該同定されたペプチドの各々についての相対量を計算する工程を包含する、工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
前記第１ペプチド混合物中の１組のペプチドについて再構築されたクロマトグラムピーク面積に基づき、補正係数を計算することによって前記同定されたペプチドの各々について計算された存在量を正規化する工程であって、該１組のペプチドにおける各々のペプチドは、複数の実験にわたって一定のクロマトグラムピーク面積を有する工程、および
該同定されたペプチドの各々についての計算された存在量に対して補正係数を適用する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
前記質量分析する工程および計算する工程が、１回の自動化された実験において、前記第１ペプチド混合物中の全てのペプチドについての相対量を、同定および計算するために実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
質量対電荷分析する工程および計算する工程に供される、前記分離された１つ以上のペプチドが、天然に存在するペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記参照サンプル中の１つ以上のペプチドが、天然に存在するペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、
前記分離された１つ以上のペプチドを質量対電荷分析する工程、および前記質量分析された１つ以上のペプチドの存在量を計算する工程が、前記第１ペプチド混合物のうちの１つ以上の任意のペプチドを質量対電荷分析する工程、および該ペプチドについての存在量を計算する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記分離する工程、前記質量対電荷分析する工程、および前記計算する工程が、対象ペプチドの特定のアミノ酸組成に制約されない、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
混合物中の１つ以上のペプチドを定量化する方法であって、該方法は：
タンパク質サンプルを消化してペプチドの混合物を作製する工程；
液体クロマトグラフィーを使用して、該ペプチドの混合物のうちの１つ以上のペプチドを分離する工程；
該分離された１つ以上のペプチドを質量分析する工程；
該ペプチドについての質量スペクトルに基づき、該質量分析された１つ以上のペプチドを同定する工程、
該同定されたペプチドについてのクロマトグラムピーク面積を計算する工程；
該同定されたペプチドに対応する１つ以上のタンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を、該対応するペプチドについて計算されたクロマトグラムピーク面積に基づき計算する工程；
内部標準についてのクロマトグラムピーク面積に基づき、該タンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を正規化する工程；および、
該１つ以上のタンパク質のうちのタンパク質について、該タンパク質について正規化されたクロマトグラムピーク面積を参照サンプル中の対応タンパク質についてのクロマトグラムピーク面積に対して比較することによって、相対量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
ペプチド混合物中の１つ以上のペプチドを定量化するための装置であって、該装置は；
複数のペプチドを含む第１ペプチド混合物を得るための手段；
一定期間にわたって、該第１ペプチド混合物の複数のペプチドのうちの１つ以上を分離するための手段；
該一定期間における特定の時間にて、該第１ペプチド混合物の該分離された１つ以上のペプチドを質量分析するための手段；
該第１ペプチド混合物の該質量分析された１つ以上のペプチドの存在量を計算するための手段；
該第１ペプチド混合物の該質量分析された１つ以上のペプチドの計算された存在量を、該第１ペプチド混合物に対して外部にある参照サンプル中の１つ以上のペプチドの存在量と比較することによって、該第１ペプチド混合物の該質量分析された１つ以上のペプチドについて相対量を計算するための手段；
を備える、装置。
【請求項２５】
前記存在量を計算するための手段および前記相対量を計算するための手段が同一である、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
請求項２４に記載の装置であって、
前記質量分析のための手段が、イオントラップ質量分析計、三連四重極質量分析計、四重極飛行時間型質量分析計、トラップ飛行時間型質量分析計、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、ポストソース分解飛行時間型質量分析計、飛行時間−飛行時間型質量分析計、またはオービトラップ質量分析計である、装置。
【請求項２７】
前記分離するための手段が、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、電気泳動およびキャピラリー電気泳動のうちの少なくとも１つを包含する、請求項２４に記載の装置。
【請求項２８】
前記分離するための手段が少なくとも２次元の分離を包含する、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
前記計算するための手段がコンピューターシステムを包含する、請求項２４に記載の装置。
【請求項３０】
少なくとも１つのさらなるペプチド混合物を得るための手段をさらに備える、請求項２４に記載の装置。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのさらなるペプチド混合物が参照サンプルを含む、請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
前記存在量を計算するための手段がさらに参照情報を含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項３３】
前記質量対電荷分析するための手段および前記計算するための手段が、天然に存在するペプチドを質量対電荷分析しそして該ペプチドについての存在量を計算するよう構成される、請求項２４に記載の装置。
【請求項３４】
前記計算するための手段が、前記質量分析された１つ以上のペプチドの計算された存在量を、参照サンプル中の天然に存在する１つ以上のペプチドの存在量と比較するよう構成される、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
前記質量対電荷分析するための手段および前記計算するための手段が、前記第１ペプチド混合物のうちの任意の１つ以上のペプチドを質量対電荷分析し、そして該ペプチドについての存在量を計算するよう構成される、請求項２４に記載の装置。
【請求項３６】
分離するための手段、質量対電荷分析するための手段および計算するための手段が、対象ペプチドの特定のアミノ酸組成とは無関係に、１つ以上のペプチドを分離し、質量対電荷分析し、そして該ペプチドについての存在量を計算するように構成される、請求項２４に記載の装置。
【請求項３７】
第１ペプチド混合物中の１つ以上のペプチドを定量するための、コンピューター読み取り可能な媒体上のコンピュータープログラム製品であって、該製品は、プログラム可能なプロセッサに、
一定期間にわたり、第１ペプチド混合物からの複数のペプチドのうちの１つ以上の分離を表す、分離情報を受け取ること；
該一定期間における特定の時間にて、該第１ペプチド混合物の該分離された１つ以上のペプチドについての、質量対電荷分析情報を受け取ること；
該第１ペプチド混合物の該質量分析された１つ以上のペプチドの存在量を計算すること；および
該第１ペプチド混合物のうちの該質量分析された１つ以上のペプチドの計算された存在量を、参照サンプル中の１つ以上のペプチドの存在量と比較することによって、該第１ペプチド混合物の該質量分析された１つ以上のペプチドについての相対量を計算することであって、該参照サンプルは該第１ペプチド混合物に対して外部にあること、
をさせるために操作可能な命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項３８】
第１ペプチド混合物中の１つ以上のペプチドを定量するための、コンピューター読み取り可能な媒体上のコンピュータープログラム製品であって、該製品は、プログラム可能なプロセッサに、
一定期間にわたり、第１ペプチド混合物の複数のペプチドのうちの１つ以上の分離を表す、分離情報を受け取ること；
該一定期間における特定の時間にて、該第１ペプチド混合物の該分離された１つ以上のペプチドについての、質量対電荷分析情報を受け取ること；
該ペプチドについての質量対電荷分析情報に基づき、該質量分析された該１つ以上のペプチドを同定すること；
該同定されたペプチドについてのクロマトグラムピーク面積を計算すること；
該同定されたペプチドに対応する１つ以上のタンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を、該対応するペプチドについて計算されたピーク面積に基づいて計算すること；
内部標準についてのクロマトグラムピーク面積に基づき、該タンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を正規化すること；および
該１つ以上のタンパク質のうちのタンパク質についての相対量を、該タンパク質について正規化されたクロマトグラムピーク面積を参照サンプル中の対応するタンパク質についてのクロマトグラムピーク面積に対して比較することによって、決定すること、
をさせるために操作可能な命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項３９】
第１ペプチド混合物中の１つ以上のペプチドを定量するための装置であって、該装置は、以下の動作：
一定期間にわたり、第１ペプチド混合物の複数のペプチドのうちの１つ以上の分離を表す、分離情報を受け取る動作；
該一定期間における特定の時間にて、該第１ペプチド混合物のうちの該分離された１つ以上のペプチドについての質量対電荷分析情報を受け取る動作；
該第１ペプチド混合物のうちの質量分析された該１つ以上のペプチドの存在量を計算する動作；および
該第１ペプチド混合物のうちの該質量分析された１つ以上のペプチドの計算された存在量を、参照サンプル中の１つ以上のペプチドの存在量と比較することによって、該第１ペプチド混合物のうちの該質量分析された１つ以上のペプチドについての相対量を計算する動作であって、該参照サンプルは該第１ペプチド混合物に対して外部にある、動作、
を実施するよう構成されたデジタル回路を備える、装置。
【請求項４０】
請求項３１に記載の装置であって、該装置は、プログラム可能なプロセッサを備え、そして該装置は、該プロセッサによる実行のためにメモリ内に記録された命令によって構成される、装置。
【請求項４１】
第１ペプチド混合物中の１つ以上のペプチドを定量するための装置であって、該装置は、以下の動作：
一定期間にわたり、第１ペプチド混合物の複数のペプチドのうちの１つ以上の分離を表す、分離情報を受け取る動作；
該一定期間における特定の時間にて、該第１ペプチド混合物の該分離された１つ以上のペプチドについての、質量対電荷分析情報を受け取る動作；
該ペプチドについての質量対電荷分析情報に基づき、該質量分析された１つ以上のペプチドを同定する動作；
該同定されたペプチドについてのクロマトグラムピーク面積を計算する動作；
該同定されたペプチドに対応する１つ以上にタンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を、該対応するペプチドについて計算されたピーク面積に基づき、計算する動作；
内部標準についてのクロマトグラムピーク面積に基づき、該タンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を正規化する動作；および
該１つ以上のタンパク質のうちのタンパク質についての相対量を、該正規化された該タンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を参照サンプル中の対応するタンパク質についてのクロマトグラムピーク面積に対して比較することによって、決定する動作、
を実施するよう構成されたデジタル回路を備える、装置。
【請求項４２】
請求項４１に記載の装置であって、該装置は、プログラム可能なプロセッサを備え、そして該装置は、該プロセッサによる実行のためにメモリ内に記録された命令によって構成される、装置。
【請求項４３】
生物学的サンプル中の１つ以上の化合物を定量するための方法であって、
複数の化合物を含む生物学的サンプルを得る工程；
一定期間にわたって、該生物学的サンプルの該複数の化合物のうちの１つ以上を分離する工程；
該一定期間における特定の時間にて、該生物学的サンプルのうちの該分離された１つ以上の化合物を質量対電荷分析する工程；
該生物学的サンプルのうちの該質量分析された１つ以上の化合物の存在量を計算する工程；および
該生物学的サンプルのうちの該質量分析された１つ以上の化合物の計算された存在量を、参照サンプル中の１つ以上の化合物の存在量と比較することによって、該生物学的サンプルのうちの該質量分析された１つ以上のペプチドについての相対量を計算する工程であって、該参照サンプルは、該生物学的サンプルに対して外部にある、工程
を包含する、方法。
【請求項４４】
生物学的サンプル中の１つ以上の化合物を定量するための装置であって、該装置は、以下の動作：
複数の化合物を含む生物学的サンプルを得る動作；
一定期間にわたって、該生物学的サンプルの複数の化合物のうちの１つ以上を分離する動作；
該一定期間における特定の時間にて、該生物学的サンプルのうちの該分離された１つ以上の化合物を質量対電荷分析する動作；
該生物学的サンプルのうちの該質量分析された１つ以上の化合物の存在量を計算する動作；および
該生物学的サンプルのうちの該質量分析された１つ以上の化合物の計算された存在量を、参照サンプル中の１つ以上の化合物の存在量と比較することによって、該生物学的サンプルのうちの該質量分析された１つ以上の化合物についての相対量を計算する動作であって、該参照サンプルは、該生物学的サンプルに対して外部にある、動作
を実施するよう構成されたデジタル回路を備える、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００２年４月１５日に出願された、米国仮特許出願第６０／３７３，００７号の利益を主張する。この米国仮特許出願第６０／３７３，００７号は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ポリペプチドの同定および定量のための分析技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
多くの年月の間、二次元ゲル電気泳動（２D  ＧＥ）は、タンパク質混合物の分離および定量のための標準的方法であった。タンパク質に異なる色素（例えば、クーマシーブルー）を結合させること（染色）、または放射性標識（例えば、３２Ｐ）を使用することは、ゲル上のタンパク質のスポットを視認化させることを可能にする。このゲルをスキャンした後、濃度計が、そのスポットの「濃さ」を測定しそして定量的情報を得るために、使用された。１９９０年代に、質量分析法（ＭＳ）が、ゲル内消化後のタンパク質の同定のための一般的な道具となった。広範に使用されているにもかかわらず、２Ｄ  ＧＥ−ＭＳは、非常に大きなタンパク質または非常に小さなタンパク質、ｐＩ尺度の極値にあるタンパク質、膜タンパク質および微量タンパク質を扱う場合に、制限を有する。結合した色素の量は、濃度に対して直線的には比例せず、従って、この定量の信頼性は依然として疑わしい。さらに、単独の２Ｄゲルを泳動するのに２日以上掛かり得、そして質量分析法前の染色および脱染は、さらなる時間が掛かる。ラジオグラフィーもまた、非常に時間の掛かる方法である。最終的に、ゲルのスポットを切り出す工程、タンパク質を消化する工程、タンパク質分解産物を抽出する工程、および質量分析法によって個々のスポットを分析する工程はまた、非常に時間が掛かり、かつ非常に労力の掛かる工程である。
【０００４】
質量分析法によるペプチド混合物およびタンパク質混合物の定量は、同時に溶出する（ｃｏｅｌｕｔｉｎｇ）種の間でのイオン化抑制に大部分起因する、分析上の問題に挑戦している。これらの挑戦に取り組むために、安定同位体で標識されたペプチドが、質量分析法のための内部標準として使用されている。これらの化合物は、魅力ある標準である。何故なら、これらは質量が異なる一方、これらの化学的特性および物理的特性（例えば、クロマトグラフィーの保持時間およびイオン化効率）は、非標識化対応物のそれら特性と同等であるからである。これらの技術は、２Ｄ  ＧＥおよび濃度計の必要性を避けるが、完全に異なる組の挑戦が生じる。標準タンパク質混合物を作製するために、希少安定同位体（例えば、１８Ｏ）での天然の同位体（例えば、１６Ｏ）の完全な置換を達成すること（このことは、意図される原子のうちのほんの一部分のみが置換された非常に多くのタンパク質分子を生じる）が難しくあり得る。希少同位体標識化試薬はまた高額であり、そしてこのような試薬を用いた作業は、さらなる安全性基準および技能を要する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本発明は、生物学的混合物において分子を相対的に定量するための技術を提供する。一般的に、１つの局面において、本発明は、ペプチド混合物においてペプチドを定量するための技術を実行する、方法および装置（コンピュータープログラム製品を含む）を提供する。この技術は、以下の工程を包含する：複数のペプチドを含む第一ペプチド混合物を得る工程、第一ペプチド混合物から、複数のペプチドのうちの１つ以上を一定期間にわたって分離する工程、その一定期間中での特定の時点において、第一ペプチド混合物のうちの１つ以上の分離されたペプチドを質量対電荷分析（ｍａｓｓ−ｔｏ−ｃｈａｒｇｅ  ａｎａｌｙｚｅ）する工程、第一ペプチド混合物のうちの質量分析された１つ以上のペプチドの存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を計算する工程、および第一ペプチド混合物のうちの質量分析された１つ以上のペプチドの計算された存在量を、参照サンプルにおける１つ以上のペプチドの存在量と比較することによって、第一ペプチド混合物のうちの質量分析された１つ以上のペプチドについて相対量を計算する工程。この参照サンプルは、第一ペプチド混合物に対して外部にある。
【０００６】
特定の実施形態は、以下の特徴のうち１つ以上を含み得る。複数のペプチドを含む第一ペプチド混合物を得る工程は、第一ポリペプチドサンプルを消化して第一ペプチド混合物を作製する工程を包含し得る。この技術は、以下の工程を含み得る：第二ポリペプチドサンプルを消化することによって参照サンプルを調製する工程、消化された第二ポリペプチドサンプルから１つ以上のペプチドを分離する工程、消化された第二ポリペプチドサンプルからの分離されたペプチドを質量分析する工程、および第二ポリペプチドサンプルからの質量分析された１つ以上のペプチドの存在量を計算する工程。第一ペプチド混合物のうちの質量分析された１つ以上のペプチドについて相対量を計算する工程は、第一ペプチド混合物のうちの質量分析された１つ以上のペプチドの計算された存在量を、第二ペプチドサンプルからの、質量分析された１つ以上の対応ペプチドの計算された存在量と比較する工程を、包含し得る。１つ以上のペプチドを分離する工程は、液体クロマトグラフィーによって１つ以上のペプチドを分離する工程を包含し得る。
【０００７】
１つ以上のペプチドを分離する工程は、特定の時間で液体クロマトグラフィー溶出物を単離する工程を包含し得、そして第一ペプチド混合物のうちの分離された１つ以上のペプチドを質量分析する工程は、単離された溶出物中の１つ以上のペプチドを質量分析する工程を包含し得る。
【０００８】
本技術は、第一ペプチド混合物のうちの１つ以上のペプチドを同定する工程を包含し得る。第一ペプチド混合物のうちの１つ以上のペプチドを同定する工程は、質量分析の情報に基づき、分離された１つ以上のペプチドを同定する工程を包含し得る。分離された１つ以上のペプチドを質量分析する工程は、分離された１つ以上のペプチドのうちのペプチドに由来するイオンをフラグメント化する工程、およびそのイオンのフラグメントを質量分析する工程を包含し得る。第一サンプル中の１つ以上のペプチドを同定する工程は、そのフラグメントの質量分析情報に基づき配列データベースを検索する工程を包含し得る。
【０００９】
１つ以上の質量分析されたペプチドの存在量を計算する工程は、ペプチドについてのクロマトグラムのピークを、そのペプチドについての質量分析情報に基づき、再構築する工程を包含し得る。ペプチドについての存在量を計算する工程は、ペプチドについての存在量を、そのペプチドについての再構築されたクロマトグラムピーク面積に基づいて計算する工程を包含し得る。ペプチドについての存在量を計算する工程は、特定の時間の再構築されたクロマトグラムにおいて、閾値間隔内に位置するクロマトグラムピークのみを使用して、ペプチドについての存在量を計算する工程を包含し得る。
【００１０】
１つ以上の質量分析されたペプチドについての相対量を計算する工程は、第一ペプチド混合物のうちのペプチドについてのクロマトグラムピーク面積を再構築することによって計算された存在量を、参照サンプル中のペプチドについてのクロマトグラムピーク面積を再構築することによって計算された存在量と比較する工程を、包含し得る。
【００１１】
本技術は、第一ペプチド混合物のうちの１つ以上の質量分析されたペプチドの計算された存在量を、正規化する工程を包含し得る。計算された存在量を正規化する工程は、第一ポリペプチドサンプルに添加された１つ以上のペプチドを含む内部標準に基づき、その計算された存在量を正規化する工程を包含し得る。計算された存在量を正規化する工程は、１つ以上のペプチドを含む外部標準に基づき、その計算された存在量を正規化する工程を包含し得る。
【００１２】
本技術は、質量分析工程に基づき、第一ペプチド混合物のうちの複数のペプチドを同定する工程を包含し得、ここで、１つ以上の質量分析されたペプチドについての相対量を計算する工程は、同定されたペプチドの各々についての相対量を計算する工程を包含する。同定されたペプチドの各々について計算された存在量は、第一ペプチド混合物中の１組のペプチドについて再構築されたクロマトグラムピーク面積に基づき、補正係数（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）を計算すること（ここで、その組のペプチド中の各々のペプチドは、複数の実験にわたり一定のクロマトグラムピーク面積を有する）、およびその同定されたペプチドの各々について計算された存在量に対して、補正係数を適用することによって、正規化され得る。
【００１３】
質量分析工程および計算工程は、自動化された１回の実験において、第一ペプチド混合物中の全てのペプチドについての相対量を同定および計算するために、実施され得る。
【００１４】
質量対電荷分析工程および計算工程に供される１つ以上の分離されたペプチドは、天然に存在するペプチドであり得る。参照サンプル中の１つ以上のペプチドは、天然に存在するペプチドであり得る。分離された１つ以上のペプチドを質量対電荷分析する工程、および１つ以上の質量分析されたペプチドの存在量を計算する工程は、第一ペプチド混合物のうちの１つ以上の任意のペプチドを質量対電荷分析する工程およびそれについての存在量を計算する工程を、包含し得る。本技術は、分離工程、質量対電荷分析工程および計算工程が、対象ペプチドの特定のアミノ酸組成に制約されることのないように、実施され得る。
【００１５】
一般的に、別の局面において、本発明は、混合物において１つ以上のペプチドを定量するための技術を実施する、方法および装置（コンピュータープログラム製品を含む）を提供する。本技術は、以下の工程を包含する：タンパク質サンプルを消化してペプチドの混合物を作製する工程、液体クロマトグラフィーを用いてペプチド混合物のうちの１つ以上のペプチドを分離する工程、分離された１つ以上のペプチドを質量分析する工程、ペプチドについての質量スペクトルに基づき、質量分析された１つ以上のペプチドを同定する工程、同定されたペプチドについてのクロマトグラムピーク面積を計算する工程、同定されたペプチドに対応する１つ以上のタンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を、その対応するペプチドについての計算されたピーク面積に基づいて計算する工程、内部標準についてのクロマトグラムピーク面積に基づき、そのタンパク質に対するクロマトグラムピーク面積を正規化する工程、およびそのタンパク質についての正規化されたクロマトグラムピーク面積を、参照サンプル中の対応するタンパク質についてのクロマトグラムピーク面積と比較することによって、１つ以上のタンパク質のうちのタンパク質についての相対量を決定する工程。
【００１６】
一般的に、なお別の局面において、本発明は、生物学的サンプルにおいて１つ以上の化合物を定量するための技術を実施する、方法および装置（コンピュータープログラム製品を含む）を特徴とする。本技術は、以下の工程を包含する：複数の化合物を含む生物学的サンプルを得る工程、生物学的サンプルの複数の化合物のうちの１つ以上を一定期間にわたって分離する工程、一定期間中の特定の時間にて、生物学的サンプルのうちの分離された１つ以上の化合物を質量対電荷分析する工程、生物学的サンプルのうちの質量分析された１つ以上の化合物の存在量を計算する工程、および生物学的サンプルのうちの質量分析された１つ以上の化合物の計算された存在量を、参照サンプル（この参照サンプルは、生物学的サンプルに対して外部にある）中の１つ以上の化合物の存在量と比較することによって、生物学的サンプルのうちの質量分析された１つ以上の化合物についての相対量を計算する工程。
【００１７】
本発明は、以下の利点のうちの１つ以上を達成するために、実施され得る。開示された技術を使用して、例えば、薬物、栄養素、毒素などによって処理された細胞群における、タンパク質の相対存在量が、コントロールの細胞群由来のタンパク質と比較されて、その試薬の影響の下で過剰発現されるかまたは発現不足にされるタンパク質が発見され得る。本技術は、疾患マーカーもしくは薬物標的を探索および定量するため、そして／または強力な薬物をスクリーニングするために、実施され得る。記載された技術は、分子量およびｐＩ尺度の極値にあるタンパク質にアクセスすることにおいて、従来のゲル電気泳動において存在する制限を避けるために、実施され得る。本技術は、サンプルの内容にも、ポリペプチド、特定のアミノ酸などの性質によっても制限されず、そして天然に存在するタンパク質およびペプチドについて実施され得る。分析の前に、非常に労力が掛かりかつ時間を浪費するサンプルの標識化工程は、必要とされない。同様に、同位体コード化アフィニティータグ（ＩＣＡＴ）法または類似の方法におけるような、外部標準を作製するための高価な試薬は必要とされない。本技術は、特定のアミノ酸（例えば、システイン）を含むタンパク質に制限されない。無限に多くのサンプルが比較され得る。各々のサンプルは別々の実験において分析され、そして各々は、所望の場合、同じ参照サンプルに対して、参照され得る。サンプルの実験および参照サンプルの実験は、別個の実験である。タンデム質量分析法と組み合わせた二次元液体クロマトグラフィー技術を使用することは、未知の修飾を組み込んでいるタンパク質を同定および定量すること、ならびに同じ質量を有する異なるタンパク質を同定および定量することを、可能にする。ペプチドの完全な分離は必要とされない；むしろ、ペプチドの部分的分離でさえ、本明細書中に記載される技術を使用した定量のためには、十分である。本技術は、自動化された１工程において、混合物中の全てのタンパク質を同定するために、実施され得る。
【００１８】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の記載において記される。他に規定されない場合、本明細書中で使用される全ての技術用語および専門用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味を有する。本明細書中に記される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が支配する。本発明の他の特徴および利点は、明細書、図面および特許請求の範囲より明確となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（詳細な説明）
本発明は、ペプチドおよびタンパク質を定量するための、方法および装置（コンピュータープログラム製品を含む）を提供する。図１を参照すると、本発明の１つの局面に従う、ペプチド混合物中のペプチドを定量する方法１００は、タンパク質サンプルに由来するペプチド集団の分離（工程１１０）で、開始する。分離されたサンプルは、質量分析（工程１２０）に供される。この分離情報および質量分析情報を使用して、上記混合物中の１つ以上のペプチドの各々についての存在量を計算する（工程１３０）。所定のペプチドの相対量は、そのペプチドについて計算された存在量を、参照サンプルについて計算された存在量と比較することによって、計算される（工程１４０）。参照サンプルの存在量は、以下に詳細に記載されるように、参照サンプルを用いて工程１１０から工程１３０を実施することによって計算され得る。方法１００は、多数のサンプルを用いて反復され得、その結果、任意の数（すなわち、潜在的に無限の数）のサンプルが、互いと、および参照サンプルと、比較され得る。各々のサンプルは、別々の実験において分析され、そして各々は、所望の場合、同じ参照サンプルに対して参照され得る。上記サンプルの実験および参照サンプルの実験は別個の実験である。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、ペプチドまたはポリペプチドは、ペプチド（アミド）結合によって結合された２つ以上のアミノ酸を含むポリマー性分子である。本明細書中で使用される場合、ペプチドは、代表的に、親のタンパク質またはポリペプチドの１サブユニット（例えば、酵素を使用したタンパク質分解性切断または化学的手段もしくは物理的手段によって生じた、フラグメント）を示す。ペプチドおよびポリペプチドは、天然に存在するもの（例えば、タンパク質またはそのフラグメント）であっても、または合成性質のものであってもよい。ポリペプチドはまた、天然に存在するアミノ酸と天然に存在しないアミノ酸との組み合わせからなり得る。ペプチドおよびポリペプチドは、任意の供給源（例えば、動物（例えば、ヒト）、植物、真菌、細菌および／またはウイルス）に由来し得、そして細胞サンプル、組織サンプル、器官、体液、または環境サンプル（例えば、土壌サンプル、水サンプルおよび大気サンプル）より入手され得る。ポリペプチドは、膜会合型（すなわち、脂質二分子相にまたがるかまたは脂質二分子相の表面に吸着される）であり得る。膜会合型ポリペプチドは、例えば、形質膜、細胞膜、オルガネラの膜、およびウイルスのキャプシドと会合し得る。ポリペプチドは、細胞質性またはオルガネラ性であり得る。ポリペプチドは、間質にかまたは体液（例えば、血漿および髄液）中に見出される、細胞外性であり得る。ポリペプチドは、生物学的触媒、種々の分子のためのトランスポーターまたはキャリア、細胞内シグナル伝達のためのレセプターおよび細胞間シグナル伝達のためのレセプター、ホルモン、ならびに細胞、組織および器官の構成成分であり得る。いくつかのポリペプチドは腫瘍マーカーである。本明細書中で使用される場合、タンパク質はポリペプチドである。
【００２１】
質量分析法の分野において、イオンの「質量」という言葉で略書された様式で述べることが通常であるが、イオンの質量対電荷比を述べることがより正確であり、これが実際に測定されるものであることに、注意されたい。便宜上、本明細書は、通常の慣習を採用し、そして質量対電荷比、または質量対電荷比を記す量より数学的に導かれた量を意味するために、用語「質量」を頻繁に使用する。
【００２２】
図２は、本発明の１つの局面に従う、ペプチド混合物中のペプチドを定量するためのシステム２００の１つの実施を示す。システム２００は、慣用的構成の、一般的目的のプログラム可能なデジタルコンピューターシステム２１０を含み、この構成は、メモリ、および分析プログラム２２０を実行する１つ以上のプロセッサを備え得る。コンピューターシステム２１０は、質量スペクトルデータの供給源２３０へのアクセスを有し、この供給源は、質量分析計（例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析計）であり得る。あるいは、またはさらに、質量スペクトルデータは、コンピューターシステム２１０にアクセス可能であるデータベースから検索され得る。コンピューターシステム２１０はまた、配列情報の供給源２４０（例えば、アミノ酸配列情報またはヌクレオチド配列情報の公的データベース）と繋がれる。システム２００はまた、入力デバイス（例えば、キーボードおよび／またはマウス）および出力デバイス（例えば、ディスプレイモニター）、ならびにコンピューターシステム２１０を他のコンピューターシステム（または質量分析計２３０および／またはデータベース２４０）と、例えばネットワークを介して接続し得る、慣用的通信ハードウェアおよびソフトウェアを、備え得る。
【００２３】
図３は、本発明の１つの局面に従う方法３００の１つの実施を、より詳細に示す。参照サンプルに対して定量されるべき１つ以上のタンパク質の実験サンプルを消化して、ペプチド混合物を作製する（工程３１０）。サンプルは、例えばゲル電気泳動のスポットにおいて含まれる、１つまたは２つのみしかタンパク質を含まない簡単な混合物であり得る；あるいは、サンプルは、より複雑なタンパク質混合物（例えば、ヒト血漿中に含まれるタンパク質のサンプル）であり得る。サンプルは、任意の供給源（例えば、動物（例えば、ヒト）、植物、真菌、細菌および／またはウイルス）に由来し得、そして細胞サンプル、組織サンプル、体液、または環境サンプル（例えば、土壌サンプル、水サンプルおよび大気サンプル）より入手され得る。実験サンプル中の１つ以上のタンパク質の量およびしばしば正体は、代表的に未知である。サンプル（添加した任意の外部標準を含む）は、公知の技術を使用して種々のタンパク質分解酵素のいずれかを使用して酵素的に消化され得るか、または公知の化学的手段もしくは物理的手段を使用して、消化され得る。
【００２４】
ペプチド混合物は、分離される（工程３２０）。混合物は、種々の公知の分離方法（液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、電気泳動、およびキャピラリー電気泳動を含むが、これらに限定されない）を、単独でかまたは組み合わせて、分離され得る。分離のための特定の条件（例えば、媒質およびカラムの型、溶媒、ならびに流速を含む）は、特定の実験および所望される分離に基づき選択され得る。１つの実施形態において、ペプチド混合物は、逆相キャピラリーカラムを使用する一次元液体クロマトグラフィーを使用して、分離される。より複雑な分離が所望される場合、さらなる次元の液体クロマトグラフィー（例えば、強力なカチオン交換カラムでの最初の分離、その後の連続した逆相キャピラリーカラム分離を含む、二次元液体クロマトグラフィー）が、利用され得る。いくつかの場合において、分離は、ペプチド混合物から１つ以上の別個のペプチドを分離するために実施され得るが、このことは必要ではない。しかし、ペプチドの部分的分離でさえ、本明細書に記載される技術を使用する定量のためには十分であり得る。何故なら、分離の間の２つ以上のペプチドの同時溶出は、その後続く定量を妨げないからである。このことは、他の技術（例えば、ＵＶ検出を用いたクロマトグラフィー分離、ここでは、完全なピークの分離が定量のために必要とされる）と比較して、重要な利点であり得る。一般的に、より良好な分離は、より良好な最終結果（すなわち、より良好な相対定量情報）を生じる。
【００２５】
分離されたペプチドは、質量分析に供される（工程３３０）。分離されたペプチドは、ＭＳ能力および／またはＭＳ／ＭＳ能力のいずれかを有する任意の質量分析計（これは、ＭＳデータおよびＭＳ／ＭＳデータを記録するために液体クロマトグラフィーと組み合わせて操作し得る）を使用して、質量分析され得る。特定の実施において、質量分析計は、イオントラップ（ｉｏｎ  ｔｒａｐ）分光計、三連四重極分光計、ｑ−ＴＯＦ分光計、トラップ（ｔｒａｐ）−ＴＯＦ分光計、ＦＴ−ＩＣＲ分光計、ＰＳＤ  ＴＯＦ分光計、ＴＯＦ−ＴＯＦ分光計またはオービトラップ（ｏｒｂｉｔｒａｐ）分光計であり得る。工程３２０において分離された各々のペプチドまたはペプチドの組み合わせについて（例えば、液体クロマトグラムにおける各々のピークについて）、完全スキャン質量スペクトルが得られる。次いで、完全スキャン質量スペクトル中に示される１つ以上のイオンの各々について、ＭＳ／ＭＳスペクトルが得られる。
【００２６】
分離された１つ以上のペプチド、およびそれらの対応タンパク質は、ペプチドについて生じたタンデム質量スペクトルに基づき同定される（工程３４０）。ペプチドおよびそれらの対応タンパク質は、実験のタンデム質量スペクトルを、データベース（例えば、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の公的に利用可能なデータベース）からの配列情報より由来する理論上のフラグメントパターンと相関させることによって、同定され得る。例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）より入手可能な、ＴｕｒｂｏＳＥＱＵＥＳＴ（登録商標）タンパク質同定ソフトウェアのような、市販のデータベース検索エンジンソフトウェアを使用して、ペプチドおよびタンパク質は、そのペプチドについて得られたタンデム質量スペクトルを、配列情報のデータベース（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベース、ＧｅｎＢａｎｋ／ＧｅｎＰｅｐｔデータベース、ＰＩＲデータベース、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースおよびＰＤＢデータベース）において示されるタンパク質（およびそのフラグメント）について決定された理論上の質量スペクトルと比較することによって、同定され得る。他のデータベース検索エンジン（例えば、Ｍａｓｃｏｔ、ＰｒｏＦｏｕｎｄ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｉｌｌ、ＲＡＤＡＲＳ、Ｓｏｎａｒソフトウェアなど）もまた、使用され得る。ペプチドおよびタンパク質は、検索エンジンによって、適合の近さ（ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ−ｏｆ−ｆｉｔ）または相関スコア出力を使用して、同定され得る。
【００２７】
本発明の１つの局面において、分離された１つ以上のペプチドおよびそれらの対応タンパク質は、フーリエ変換技術および質量フィンガープリンティング技術を利用する、完全質量スペクトルより同定される。次いで、１つ以上の同定された質量は、公的に利用可能なデータベース中のデータと合わされる。
【００２８】
あるいは、ペプチドおよびタンパク質は、新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）配列決定技術を使用して、分離されたペプチド中のペプチドの部分配列決定または完全配列決定、その後の、公的に利用可能なデータベースにおける、得られた配列の位置特定（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）によって、同定され得る。
【００２９】
次いで、工程３３０において得られた質量スペクトルを使用して、同定されたペプチドイオンの存在量を計算する（工程３５０）。イオン存在量は、対応する同定されたペプチドイオンについてのクロマトグラムを、そのペプチドについての質量スペクトルにおいて測定されたイオン強度に基づき再構築することによって、各々の同定されたペプチドについてのピーク面積として計算され得る。ピーク面積は、完全質量スペクトルまたはタンデム質量スペクトルより決定され得る。必要に応じて、再構築されたクロマトグラムおよび／または計算されたピークは、ユーザーに画像表示され得る。
【００３０】
１つの実施において、所定のペプチドイオンについての存在量は、特定のタンパク質のタンパク質分解性産物でないが同等のｍ／ｚ値を有する種によって生成される偽のピークを避けるために、同定時間から近接位にあるクロマトグラフィーのピークのみに基づいて計算される。従って、例えば、同定時間から、予め決定された閾値の距離（すなわち、時間）以内にあるピークのみが、使用され得る。この閾値は、クロマトグラムの特定の領域において、例えば、流速、分離技術、利用されるカラムおよび分離媒体に依存し、そして２〜３秒間から数分間までの範囲にわたり得る、ペプチドの代表的な溶出時間に従って規定され得る。偽のピークの除去は、ピーク面積測定の精度を有意に向上させ得る。１つの実施において、同定されたペプチドイオンについてのピーク面積は、市販のソフトウェア（例えば、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）より入手可能））を使用して計算され得る。あるいは、イオンの存在量は、ピーク面積の代わりにピークの高さに基づいて計算され得る。
【００３１】
所定のタンパク質からの全ての同定されたペプチドのピーク面積は、そのタンパク質についての再構築されたピーク面積を規定するために、一緒に加算される（工程３６０）。あるいは、各々の同定されたペプチドまたはポリペプチドについてのピーク面積は、参照サンプルと直接比較され得る。
【００３２】
実験サンプル中の所定のタンパク質の相対量は、実験サンプルおよび参照サンプルの中のペプチドまたはタンパク質についてのピーク面積比を計算することによって決定される（工程３７０）。参照サンプルは、１つのタンパク質またはタンパク質混合物に由来するペプチド混合物であり得る。いくつかの実施において、参照サンプルは、量的情報が所望されるタンパク質を含むことが期待される。例えば、参照サンプルは、既知の供給源（例えば、健常被験体）より採取されたタンパク質混合物（例えば、細胞サンプル、組織サンプル、体液など）であり得、一方、実験サンプルは、未知の供給源（例えば、羅患した被験体）より採取された同等のサンプルであり得る。１つに実施形態において、実験サンプルおよび参照サンプルは、実質的に同等であり（例えば、健常な生存被験体からの血漿サンプルおよび羅患した被験体からの血漿サンプル）、そして少数のタンパク質のみ異なることが期待される。参照サンプルについてのピーク面積は、参照サンプルのペプチドおよびタンパク質についてのピーク面積を決定するために、図３に示されそして上に記載される順序（すなわち、参照サンプルの消化、タンパク質消化物の分離、質量分析、ペプチド同定およびクロマトグラムの再構築）と同様の順序から、導かれ得る。
【００３３】
方法３００は、複数のサンプルについての相対量を提供するために複数（Ｎ）回、Ｎ個未満の参照を利用して繰り返され得る。従って、例えば、種々の条件下で採取されたタンパク質混合物は、それらの条件下でのタンパク質相対量を決定するために、本明細書中に記載される技術に供され得る。
【００３４】
同一サンプル中のペプチドについて得られたピーク面積は、１つの実施と別の実施とで異なり得る。これらの差異は、種々の実験依存性パラメータ（例えば、サンプル調製における差異（ピペッティングの誤差、不完全な消化）または不正確なサンプル注入）により起こり得る。これらの実験依存性パラメータは、任意の所定の実験において未知であるが、同一方法での１回の実施からの全てのタンパク質に影響を与えることが予想される。従って、混合物中の各々のタンパク質について計算されたピーク面積は、これらの系統的誤差について補正するために正規化され得る。
【００３５】
いくつかの実施において、全てのピーク面積は、既知タンパク質のピーク面積に対して正規化され得る。サンプルは、内部標準を含み得る。内部標準は、そのサンプル中に天然には存在せず、そして正規化のための参照として作用するようにサンプルに添加される、１つ以上のタンパク質（例えば、サンプルに既知量で添加される、ネイティブでないタンパク質）であり得る。あるいは、内部標準は、ハウスキーピングタンパク質（すなわち、そのサンプルが由来する媒体中に比較的一定量で代表的に存在するタンパク質）を含み得る。このような場合において、各々のタンパク質についてのピーク面積は、内部標準についてのピーク面積に対して正規化され得る。あるいは、各々タンパク質についてのピーク面積は、混合物中に同定された全てのタンパク質の総ピーク面積に対して正規化され得る。２〜３個のタンパク質の濃度のみしか異ならない同等のサンプル（例えば、異なる薬物で処理された細胞培養物）を比較するために、ピーク面積または比は、明白な傾向に対して正規化され得る。例えば、特定の実験において、タンパク質についての予想ピーク面積と計算されたピーク面積との間の差異がサンプル調製における差異に起因する可能性があり、かつその差異が同一方法での１回の実施に由来する全てのタンパク質に影響することが予想される場合、ピーク面積は、２回以上の実験にわたって（または、実験サンプルと参照サンプルとの間で）一定である全てのタンパク質の平均ピーク面積比に基づいて、正規化され得る。異なる実験において異なる量で存在するタンパク質（例えば、相対量的情報が所望されるタンパク質）は、ピーク面積比の標準偏差（中央標準偏差）を計算し、その比が中央標準偏差以内に存在しない全てのタンパク質を除外し、そして残るタンパク質についての比の平均（中央値）を再計算することによって、排除され得る。１つの実施において、ピーク面積比の対数値の標準偏差が、計算される。別の実施において、比の中央値が使用される。なぜなら、これは傾向に対する除外に対してより影響を受けにくく、かつ広範な領域の適用に対して最も良好なアプローチであることが期待されるからである。ピーク面積を正規化するための他の公知の方法もまた使用され得る。この方法全体は、相対的定量測定の精度を増加させるために、１回以上繰り返され得る。
【００３６】
本発明の別の局面において、実験サンプル中のペプチドの相対量は、実質的に、絶対的な差異の情報を提供し得る。何故なら、ペプチドのピーク面積とその濃度との間に直線的な相関が存在するからである。このことは、実施例３、表４および図１１においてより詳細に記載される。
【００３７】
本発明の局面は、デジタル電子回路においてか、またはコンピューターハードウェア、ファームウェア、ソフトウェアもしくはこれらの組み合わせにおいて、実施され得る。本発明のいくつかの局面またはすべての局面は、データ処理装置（例えば、プログラム可能なプロセッサ、１台のコンピューターまたは複数のコンピューター）による実行のため、またはこの装置の操作を制御するために、コンピュータープログラム製品（すなわち、情報運搬体（例えば、機械読み取り可能な記憶デバイスもしくは伝搬されたシグナル）において明白的に統合されたコンピュータープログラム）として実施され得る。コンピュータープログラムは、任意の形態のプログラム言語（コンパイル言語またはインタプリタ言語を含む）で記され得、そしてこのプログラムは任意の形態（独立型のプログラムとしての形態、またはコンピューター処理環境における使用に適した、モジュール、コンポーネント、サブルーチンもしくは他のユニットとしての形態を含む）で配備され得る。コンピュータープログラムは、１台のコンピューターで実行されるように配備され得るか、または複数のコンピューターで１つの場所（ｓｉｔｅ）で実行されるか、もしくは複数の場所にわたって分散されそして通信ネットワークによって連絡された複数のコンピューターで実行されるように配備され得る。
【００３８】
本発明のいくつかの方法工程または全ての方法工程は、コンピュータープログラムを実行する１つ以上のプログラム可能なプロセッサによって実施されて、入力データを処理しそして出力を形成することによって、本発明の機能を実施し得る。方法工程はまた、特別な目的の論理回路構成（例えば、ＦＰＧＡ（フィールドプログラム可能なゲートアレイ（ｆｉｅｌｄ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｇａｔｅ  ａｒｒａｙ））またはＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路））によって実施され、そして本発明の装置は特別な目的の論理回路構成（例えば、ＦＰＧＡ（フィールドプログラム可能なゲートアレイ（ｆｉｅｌｄ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｇａｔｅ  ａｒｒａｙ））またはＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路））として実行され得る。本発明の方法は、コンピューター制御の下で自動で実施される工程、および人的ユーザー（例えば、科学者）によって手動で実施される工程の組み合わせとして、実行され得る。
【００３９】
コンピュータープログラムの実行に適したプロセッサとしては、例として、汎用マイクロプロセッサおよび特別目的のマイクロプロセッサの両方、ならびに任意の種類のデジタルコンピューターの任意の１つ以上のプロセッサが、挙げられる。一般的に、プロセッサは、リードオンリーメモリもしくはランダムアクセスメモリまたはその両方から、命令およびデータを受け取る。コンピューターの必須要素は、命令を実行するためのプロセッサ、ならびに命令およびデータを保管するための１つ以上の記憶デバイスである。一般的に、コンピューターはまた、データを保管するための１つ以上の大容量記憶デバイス（例えば、磁気ディスク、光磁気ディスク、または光ディスク）を備え得るか、またはこの大容量記憶デバイスからデータを受け取ったりデータを転送したりするように作動可能に接続される。コンピュータープログラムの命令およびデータを組み込むのに適した情報運搬体としては、全ての形態の不揮発性メモリ（例として、半導体記憶デバイス（例えば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ）およびフラッシュメモリデバイス；磁気ディスク（例えば、内蔵ハードディスクまたはリムーバブルディスク）；光磁気ディスク；ならびにＣＤ−ＲＯＭディスクおよびＤＶＤ−ＲＯＭディスクを含む）が挙げられる。プロセッサおよびメモリは、特別な目的の論理回路構成によって補われ得るか、またはその論理回路構成に組み込まれ得る。
【００４０】
ユーザーとの対話を提供するために、本発明は、ユーザーに情報を表示するための表示デバイス（例えば、ＣＲＴ（陰極線管）モニターまたはＬＣＤ（液晶ディスプレイ）モニター）、およびキーボードおよびポインティングデバイス（例えば、マウスまたはトラックボール）を備えるコンピューター上で実行され得、これらによってユーザーはコンピューターに入力を提供し得る。他の種類のデバイスもまた、ユーザーとの対話を提供するために使用され得る。
【００４１】
本発明は、さらに、以下の実施例において記載される。これら実施例は、単なる例示であって、そして特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限するようには意図されない。
【実施例】
【００４２】
（実施例１）
この開示される方法を、５つの標準タンパク質（ウシアルブミン、ウマヘモグロビン、ウマフェリチン、ウマシトクロムおよびウマミオグロビン）の混合物に対して適用した。４つのタンパク質を一定濃度（２００ｆｍｏｌ）で維持し、一方、５番目のタンパク質（ミオグロビン）の濃度を、広範な範囲にわたって変動させた。タンパク質消化物のピーク面積を、アルブミン消化物のピーク面積に対して正規化した。この手順全体を３回繰り返した。３回の測定後、２０％  ＲＳＤを用いて、４つの一定濃度のタンパク質消化物について計算されたピーク面積は、一定であった。５番目のタンパク質（ミオグロビン）の相対ピーク面積は、１０ｆｍｏｌから１０００ｆｍｏｌまで濃度を増加させるにつれて、直線的な増加を示した。
【００４３】
（サンプルの調製）
５つのタンパク質を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より凍結乾燥粉末として購入した：ウシアルブミン（Ａ−７６３８）；ウマヘモグロビン（Ｈ−４６３２）；ウマフェリチン（Ａ−３６４１）；ウマミオグロビン（Ｍ−０６３０）；ウマシトクロムＣ（Ｃ−７７５２）。溶媒および試薬を、以下のような種々の業者から購入した：アセトニトリル（カタログ＃０１５−１，Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍｕｓｋｅｇｏｎ，ＭＩ）；水（カタログ＃４２１８−０２，ＪＴ  Ｂａｃｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）；ギ酸（カタログ＃１１６７０，ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）；炭酸水素アンモニウム（カタログ＃Ａ−６１４１，Ｓｉｇｍａ）；シーケンシンググレード修飾トリプシン（カタログ＃Ｖ５１１３，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；ヨード酢酸（カタログ＃３５６０３）およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）（カタログ＃２０２９０，両者ともＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬより）。
【００４４】
タンパク質消化物のストック溶液を、以下のように調製した。各々のタンパク質を１００ｍＭの炭酸水素アンモニウム緩衝液に溶解し、そしてＤＴＴを添加することにより還元した。トリプシンを用いた消化の前に、システイン残基を、ヨード酢酸を用いてカルボキシメチル化した。このアルキル化工程は、システイン残基の質量を５８Ｄａ増加させた。５つのタンパク質消化物のストック溶液をさらに希釈しそして一緒に混合して、ミオグロビンについての希釈系列（８つの混合物を含む）を調製した。これらの混合物の４μｌの注入アリコートは、１ｆｍｏｌ、５ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、５０ｆｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、２００ｆｍｏｌ、５００ｆｍｏｌおよび１０００ｆｍｏｌのミオグロビンを含んだ。アルブミン、ヘモグロビン、フェリチンおよびシトクロムＣは、全ての注入混合物において２００ｆｍｏｌで存在した。５つのタンパク質の同一ストック溶液を使用して、シトクロムＣについての希釈系列（これもまた８つの混合物を含む）を調製した。この系列において、シトクロムＣの注入量は各々の混合物で異なっており、そしてこの注入量は１ｆｍｏｌ、５ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、５０ｆｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、２００ｆｍｏｌ、５００ｆｍｏｌおよび１０００ｆｍｏｌに等しかった。この系列において、アルブミン濃度、ヘモグロビン濃度、フェリチン濃度およびミオグロビン濃度は一定であり、そしてこれらのタンパク質の各々の注入量は、２００ｆｍｏｌであった。
【００４５】
（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）
Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）は、オートサンプラーおよび高圧ポンプを備えた。ミオグロビン希釈系列の８つの４μｌアリコートおよびシトクロムＣ希釈系列の８つの４μｌアリコートを、ポリエステルシーリングテープ（カタログ＃  ２３６３６６、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｃ）で覆った円錐形底面を有する９６ウェルプレート（カタログ＃２９９４６，Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌ，ＩＬ）のウェルに配置し、そしてこれらを４℃に維持したオートサンプラーに入れた。１６個のサンプル全てを以下の方法に従って１日以内に分析した。同一の順序を、続く３日間に繰り返し、このようにして各々の希釈系列からの全てのタンパク質混合物を３回分析した。サンプルの４μｌアリコートをウェルの底からオートサンプラーのニードル内に吸引し、そして２０μｌのサンプルループ内に注入した。ループの残りを０．１％ギ酸水溶液（「溶媒Ａ」）で満たした。オートサンプラーのニードル中およびサンプルループ中に、サンプルの４μｌアリコートを１μｌの気泡２つの間に挟んだ。このいわゆる「無駄のない注入」ルーチンは、少量のサンプルの完全な注入を可能にした。注入後、オートサンプラーの弁のスイッチを入れ、そしてループからのサンプルを、ＢｉｏＢａｓｉｃ  Ｃ１８固定相、５μｍ粒子、３００Ａ口径を充填されたエレクトロスプレーチップを有する７５μｍ  ＩＤ×１０ｃｍのキャピラリーＨＰＬＣカラム（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に直接装填した。このキャピラリーカラムに、溶媒Ａを２μｌ／分のイソクラティック流で装填した。勾配溶出のために、ポンプからの５０μｌ／分の流れを、カラムを通る０．１μｌ／分の流れに分けた。アセトニトリル中０．１％ギ酸溶液（「溶媒Ｂ」）の０〜６０％の直線勾配を用いて、ペプチドをカラムから溶出させた。溶出したペプチドを、ナノエレクトロスプレーイオン供給源を取り付けたＬＣＱ  ＤＥＣＡイオントラップ質量分析計（両方ともＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって、分析した。この質量分析計はデータ依存的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳモード（ここでは、前駆イオンが以前の完全スキャン質量スペクトルより選択される）で稼動した。選択されたイオンに対して衝突誘起解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を実施し、そしてそのｍ／ｚ値をさらなるフラグメント化から１分間動的に排除した。この自動化分析の特徴は、複雑な混合物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の間に溶出する（そしてしばしば同時に溶出する）非常に多くのペプチドに対する査定（ａｓｓｅｓｓ）を提供した。
【００４６】
タンデム質量スペクトルを、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｄａｔａｂａｓｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブページよりダウンロードされるウマタンパク質およびウシタンパク質の４４００個の配列を含むデータベースを用いて、ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して、相関付けられる。相関分析からの出力ファイルをさらに、同定されるペプチドおよび対応するタンパク質の一覧を作製するためにＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔアルゴリズムによって形成される３つの相関係数の統一スコア（スコア＝（１０００×ＤｅｌＣｎ２＋Ｓｐ）×Ｘｃｏｒｒ）を使用して、さらに要約した。
【００４７】
５つのタンパク質消化物混合物の代表的なイオンクロマトグラム４００を、図４に示す。この混合物において、全てのタンパク質は、２００ｆｍｏｌのレベルで存在した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の間、溶出ペプチドの完全スキャン質量スペクトルの後に、クロマトグラム上の一連の突出（ｓｐｉｋｅ）を形成するタンデム質量スペクトルが続き、ここで、完全スキャン質量スペクトルは、その最も高い突出に寄与した。単独の前駆ピークを単離しそしてＭＳ／ＭＳを取得した場合にいつも、イオン電流が減少して２つの突出間に谷間を形成した。定量的ピーク面積測定のために、完全スキャン質量スペクトルからの前駆イオンの強度を使用した。すなわち、イオンクロマトグラム上のピークを、図４に示されるように、最も高い突出を通って引かれた直線によって平滑化した。全ての同定された消化産物は、７分間隔で溶出した。約３００個の質量スペクトル（その半分はＭＳであり、そして残りの半分はＭＳ／ＭＳである）を、この期間（すなわち、１スペクトルにつき１．４秒）の間に取得した。また、３３．５０分で溶出した消化産物の完全スキャンＭＳ４１０、ならびにｍ／ｚ  ５８５．１を有する前駆イオンのＭＳ／ＭＳスペクトル４２０を、図４に示す。後者の質量スペクトルは、ｂ型およびｙ型のフラグメントによって支配され、このスペクトルは、イオントラップにおける衝突誘導性解離についての代表的なパターンである。ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して、ｍ／ｚ  ５８５．１でのピークを、シトクロムＣペプチドＴＧＰＮＬＨＧＬＦＧＲ（配列番号２５）の２＋イオンとして同定した。ｍ／ｚ  １１６８．６でのピークを、次のＭＳ／ＭＳスキャンの間のフラグメント化のために選択し、そしてこのピークを同じペプチドの単一に荷電したイオンとして同定して、この同定を確実にした。
【００４８】
代表的なフラグメント化質量スペクトルおよびその解釈（これは、ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して自動的になされる）の例を、図５Ａに示す。このソフトウェアは、実験の分解質量スペクトルを、タンパク質データベースからの全てのタンパク質の理論上の分解パターンと相関付け、そしてスキャン回数；荷電状態；（Ｍ＋Ｈ）値；ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔによって形成される３つの主要な相関係数（すなわち、Ｘｃｏｒｒ、ＤｅｌｔａＣｎ、Ｓｐ）、タンパク質名、同定された配列ならびにいくつかの他のパラメータを報告する（図５Ｂ）。これらのパラメータを使用して、偽の同定から真の同定をより分ける（ｆｉｌｔｅｒ）。
【００４９】
図４での等モル濃度の混合物を含む、希釈系列全体のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を、３回繰り返した。５つのタンパク質混合物についての消化産物として、全部で３４個のペプチド（アルブミン由来の１６個のペプチド、ヘモグロビン由来の７個のペプチド、フェリチン由来の１個のペプチド、シトクロムＣ由来の３個のペプチドおよび５個のミオグロビンペプチドを含む）を同定した。これらのペプチドの多くは、２つ以上の荷電形態によって示された。取得された全てのタンデム質量スペクトルを、１重荷電の前駆イオン、２重荷電の前駆イオンまたは３重荷電の前駆イオンより生じ得るという仮定の下で、データベースと３回相関付けた。シトクロムＣペプチドＴＧＰＮＬＨＧＬＦＧＲ（配列番号２５）の２つの荷電形態を、このペプチドの溶出時間の間の衝突誘導性解離に供し、ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔによる同定のさらなる確実性を追加した。５つのタンパク質混合物についての消化産物として総計６１個のイオンを同定し、またはそれぞれのペプチドについて２つのイオン形態を同定した。表１は、同定されたペプチドの配列、それらの荷電状態およびｍ／ｚ値、各々の実験のＭＳ／ＭＳスペクトルとデータベースより導かれた理論上のフラグメント化パターンとの間の相互相関係数、ならびに同定されたペプチドの名前を、ＮＣＢＩデータベースにおけるそれらのｇｉ番号と共に、列挙する。全ての５つのタンパク質を、異なる３日において、明白に同定した。１回以上同定されたそれらのペプチドが、表１に含まれた。
【００５０】
（表１）
【００５１】
【表１−１】
2005522713.tif 000003
【００５２】
【表１−２】
2005522713.tif 000004
。
【００５３】
各々の同定されたイオンのクロマトグラムピーク面積を、対応する完全スキャン質量スペクトルからのイオン強度を使用するＸｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）ソフトウェアを使用して、再構築した。図６は、シトクロムＣペプチドＴＧＰＮＬＨＧＬＦＧＲ（配列番号２５）の２＋イオンについての、このような再構築されたイオンクロマトグラムの例である。ｍ／ｚ  ５８５．１±０．５を有する質量スペクトルピークの強度のみを使用して、この再構築されたイオンクロマトグラムをプロットした。自動計算されたピーク面積値（ＡＡ値）を、図６に示す。ここで、ピーク面積は、（任意の単位のイオン強度）×（秒間）で報告される。
【００５４】
真のシトクロムＣペプチドは３３．５０分で０．２分間の幅のピークとして溶出したが、このクロマトグラムはまた、３１．６６分における別の未同定のピークを特徴とする。この偽のピークは、再構築されたイオンクロマトグラム上に現れる。なぜなら、そのｍ／ｚ値５８５．４は、シトクロムＣの同定されたイオンのｍ／ｚ値に近接していたからである（±０．５Ｄａ以内）。この偽のピークを、以下のように考慮から除外した。３０分間で０〜６０％Ｂの本発明者らの勾配について、クロマトグラムピークは、平均して、基部で０．２分間の幅だった（図６）。従って、ピーク同定時間から再構築されたイオンクロマトグラム上で±０．２分間以内に位置するピークのみを、考慮した。このことは、同定されたトリプシン消化産物ではないが類似のｍ／ｚ値を有する種によって形成された、偽のピークの取り除きを可能にする。同じ規則を他の同定されたイオンについて、適用した。このことは、ピーク面積測定の精度の有意な向上をもたらした。
【００５５】
図７は、ｍ／ｚ  ７４８．６（１＋）を有するミオグロビンペプチドＡＬＥＬＦＲ（配列番号３１）のイオン（表１の番号３１）、ならびにｍ／ｚ  ４７４．７（３＋）、７１１．０（２＋）および１４２０．５（１＋）を有するアルブミンペプチドＳＬＨＴＬＦＧＤＥＬＣＫ（配列番号１５）のイオン（表１の番号１５）についての、８個の再構築されたクロマトグラムを示す。両方のピークが溶出する場合、溶出時間３４分付近で、小さな１分間のみのセクションのクロマトグラムを再構築した。８つ全てのクロマトグラムにおいてアルブミン濃度は２００ｆｍｏｌであり、一方、ミオグロビン濃度は、示されるように、１ｆｍｏｌ〜１００ｆｍｏｌまで変動した。ミオグロビンペプチドの再構築されたクロマトグラムのピーク面積が、ミオグロビン濃度の増加につれて、一定濃度のアルブミン濃度に対して、直線的に増加することを観察した。再構築されたクロマトグラムを図７に示すが、再構築されたクロマトグラムおよびまたは計算されたピーク面積の実際の表示は、必要とされない。
【００５６】
図８は、一定量（２００ｆｍｏｌ）のアルブミン、ヘモグロビン、フェリチンおよびシトクロムＣと混合したミオグロビン消化物（１ｆｍｏｌ、５ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、５０ｆｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、２００ｆｍｏｌ、５００ｆｍｏｌおよび１０００ｆｍｏｌの量）についての較正曲線を、示す。各々のＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータファイルにおいてアルブミンのピーク面積に対して正規化され、３つの異なる日における３つの測定について平均した、各々のタンパク質についてのタンパク質消化物のピーク面積を、ｙ軸上にプロットする。エラーバーは、異なる３日における測定の標準偏差（１シグマ）を示す。１ｆｍｏｌおよび５ｆｍｏｌでのミオグロビンについての相対標準偏差（ＲＳＤ）値は６０％を超えており、このことはこれらの測定がノイズレベルにあることを示す。１０ｆｍｏｌについてのＲＳＤは３６％であり、そしてそれから希釈系列におけるより高い濃度について１５％未満に下がった。その結果、プロット上の大部分のデータ点についてのＲＳＤ値は２０％未満である。ミオグロビンの一次傾向直線に対するＲ２＝０．９８９５の値（示さず）は、ミオグロビン消化物の相対ピーク面積が１０ｆｍｏｌ量から１０００ｆｍｏｌ量まで増加するにつれて、直線増加することを、示す。また、一定レベルで混合物中に存在するタンパク質消化物について、各々の日のうちに８回の注入について再現性を測定し、そしてその再現性は２０％ＲＳＤよりも良好であった。
【００５７】
シトクロムＣの量を１ｆｍｏｌ、５ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、５０ｆｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、２００ｆｍｏｌ、５００ｆｍｏｌおよび１０００ｆｍｏｌの量で変動させ、そしてアルブミン消化物、ヘモグロビン消化物、フェリチン消化物およびミオグロビン消化物を２００ｆｍｏｌで一定に保ちながら、これら５つのタンパク質混合物について同じ組み合わせの２４回のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析および計算を繰り返した。１連の８回のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を、異なる日で３回繰り返した。図９は、シトクロムＣについての較正曲線を提示する。図９において、各々のデータ点は３回の測定の平均である。ミオグロビンの系列の場合、１ｆｍｏｌおよび５ｆｍｏｌでのシトクロムＣのデータ点についてのＲＳＤは非常に高かった。このことは、これらの濃度が再現的に測定され得ないことを示す。１０ｆｍｏｌでのデータ点は３３％ＲＳＤを有しており、すると再現性は２０％ＲＳＤ未満に改善する。シトクロムＣ（示さず）較正曲線についての一次傾向直線についてのパラメータ値は、Ｒ２＝０．９９４であった。
【００５８】
（実施例２）
凍結乾燥したタンパク質サンプル（１ｍｇのヒト血清および１ｍｇのウマミオグロビン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を、１ｍｌの炭酸水素アンモニウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）および３μｌ  ＤＴＴ（１Ｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）において、再構成した。この混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。タンパク質をアルカリ化するため、７μｌのヨード酢酸（１Ｍ  ＫＯＨ中に１Ｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加し、そしてこの混合物を暗所において室温でさらに３０分間インキュベートした。１３μｌのＤＴＴ（１Ｍ）を添加してヨード酢酸をクエンチした。還元されかつアルキル化されたタンパク質を、２０μｌのトリプシン（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を添加することによって消化した。この混合物を３７℃で６時間インキュベートし、次いで、さらなる２０μｌのトリプシン（２５ｍｇ／ｍｌ）を添加して、３７℃で１６時間続けた。
【００５９】
サンプル消化物のアリコート（本文中で示される通り）を、９６ウェルプレートのウェル中に配置した。このプレートをプラスチックフィルムで密閉して蒸発を最小限にし、そしてＳｕｒｖｅｙｏｒオートサンプラーに置いた。ここで、分析を待つ間、これを４℃に維持した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒオートサンプラーに無廃液（ｎｏ−ｗａｓｔｅ）注入能力（これは、１μＬほどの低さの注入量を可能にする）を装着した。最初に、毎分１０μＬの比較的高い流量で３分間、微細逆相ペプチドトラップポリマー（ｓｍａｌｌ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｐ  ｐｏｌｙ）（スチレン−ジビニルベンゼン；Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）に、注入されたペプチドをロードした。次いで、ペプチドをトラップから溶出させ、続いて、分離後、毎分０．１μＬの流量で、０．１％ギ酸水溶液中の０％〜６０％アセトニトリルの３０分の直線勾配で、逆相キャピラリーカラム（ＰｉｃｏＦｒｉｔ；５μｍ  ＢｉｏＢａｓｉｃ  Ｃ１８，３００Å口径；７５μｍ×１０ｃｍ；先端１５μｍ、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）で分離した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＨＰＬＣシステムは、ナノＬＣエレクトロスプレーイオン化源を取り付けた、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ｄｅｃａ  ＸＰイオントラップ質量分析計に、直接的に接続した。スプレー電圧は２．０ｋＶであり、キャピラリー温度は１５０℃であり、そしてイオントラップ衝突分解スペクトルを、３５単位の衝突エネルギーによって取得した。各々の完全質量スペクトルの後、最も強い３つのピークについて３つのＭＳ／ＭＳスペクトルを続けた。動的除外（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を可能にした。各々のサンプルの後、１０μＬの０．１％ギ酸水溶液の注入を分析して、系の正しい平衡化を確実にした。
【００６０】
ペプチドおよびタンパク質を、コンピュータープログラムＳｅｑｕｅｓｔ（これは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）配列データベースより得られるアミノ酸配列からの理論上のタンデム質量スペクトルに対して、実験のタンデム質量スペクトルを相関付ける）によって自動的に同定した。さらに、Ｓｅｑｕｅｓｔにより形成される３つの相関係数全てを組み合わせて統一されたスコアを使用して、ペプチド同定を評価した。このスコアを、以下の公式に従って計算した：スコア＝（１００００×ＤｅｌＣｎ２＋Ｓｐ）×Ｘｃｏｒｒ。タンパク質に対して、各々のペプチドのスコアを加え、そして正規化されたスコアを計算して、ペプチド数で除算した全スコアとした。２０００より大きいスコアを有するペプチドのみを受け入れた。ＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェアでのＧｅｎｅｓｉｓアルゴリズムを、ピークの検出およびピーク面積の計算に使用した。
【００６１】
複雑な混合物のタンパク質プロファイリングのための定量化方法をさらに評価するため、ヒト血清（約１μｇ全タンパク質）を異なる量のウマミオグロビン（２５０ｆｍｏｌおよび５００ｆｍｏｌ）と混合し、そしてこれら２つの混合物を分析した。トリプシン消化されたペプチドを、３０分間に０％〜６０％のアセトニトリル勾配で、Ｃ−１８カラムで分離した。クロマトグラムを図１０に示す。ＭＳ／ＭＳスペクトルからのフラグメント化情報および自動化検索プログラムＳｅｑｕｅｓｔを、ペプチドおよびタンパク質の同定のために使用した。同定された全てのタンパク質の要約を表２に示す。２０個の異なるタンパク質に対応する総計５６個のペプチドを、両サンプルにおいて同定し得た。ペプチドの適用範囲において微細な差異のみしか有さない同一のタンパク質を、両サンプル中に同定した（データは、示さず）。注入されたタンパク質の量およびペプチドの分離のために使用された勾配を考慮すると、この研究において同定されたのが極少数のペプチド（従って、極少数のタンパク質）であることは、驚くべきことではない。この研究の焦点は、サンプル中の最大数のペプチドを同定することではなく、僅かな期間で全てのペプチドの溶出を確実にすることである。８時間までのより長期の勾配を使用し、そしてより多くの物質を使用する同様の実験において、３００個を超えるタンパク質を同定し得た。
【００６２】
定量分析のため、ヒト血清由来の５つのタンパク質（血清アルブミン、セロトランスフェリン、α−１−アンチトリプシン、Ｉｇγ−４  Ｃ鎖領域およびアポリポタンパク質Ａ−１）およびウマミオグロビンを含む６つの異なるタンパク質由来の総計１６個のペプチドを、選択した。１つより多くの同定されたペプチドを有するタンパク質全てを、定量分析に含めた。これらのペプチドのピーク面積を、上記のように計算し、そして２つのサンプルを比較した。これら２つのサンプルにおける唯一の差異は、ウマミオグロビンの濃度であった。理論上、ヒトタンパク質のピーク面積は一定であるはずであり、そしてウマミオグロビンのピーク面積のみが変化するはずである。
【００６３】
この実験の結果を、表３に要約する。サンプル１（２５０ｆｍｏｌミオグロビン）とサンプル２（５００ｆｍｏｌミオグロビン）との比較は、サンプル２のヒトペプチドのピーク面積が、全て、ほぼ同じであるかまたはより小さい（１．０４〜０．６９までの比であり、一方、ミオグロビンペプチドのピーク面積は全て、より高い（１．２７〜２．２９までの比）ことを、示す。ピーク面積比は、実験依存的な補正係数に対して正規化された。中央値（０．９２）±標準偏差（０．４２）以内に存在しない全ての比を除外することによって、この補正係数を計算した。この残った比の平均を計算すると０．８７であり、そしてこの率に対して全てのピーク面積比を正規化した。ヒトタンパク質の濃度は一定であり、従って、ピーク面積は比１を有するはずである。血清アルブミンを計算すると比０．９１を有しており、セロトランスフェリンを計算すると１．０５であり、アンチトリプシンを計算すると０．８４であり、Ｉｇγ−４  Ｃ鎖領域を計算すると０．９５であり、そしてアポリポタンパク質Ａ−１を計算すると１．１０であった。２つ目のサンプル中のミオグロビン濃度は、１つ目のサンプル中のミオグロビン濃度の２倍であり、従って、ピーク面積比は２であるはずである。そしてウマミオグロビンについての実際のピーク面積比を計算すると、１．９１であった。ピーク面積比の実測値およびピーク面積比の予測値は、計算されたタンパク質について、１６％以内であった。これらの結果は、ペプチド由来のピーク面積が複雑な混合物中のタンパク質の定量的プロファイリングのために使用され得ることを、確実にする。この方法を使用して、１つのサンプルから他のサンプル対しての、タンパク質濃度における小さな変化を検出し得、そしてこの方法は、その変化が生じている比についての情報を与える。
【００６４】
【表２−１】
2005522713.tif 000005
【００６５】
【表２−２】
2005522713.tif 000006
【００６６】
【表３】
2005522713.tif 000007
。
【００６７】
（実施例３）
１０ｆｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌまでの範囲で異なる量のミオグロビン消化物を含む１１個のアリコートを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析し、そして選択された５つのペプチドのピーク面積を計算した。この実験を３回繰り返して、再現性を確認した。このピーク面積は、注入されたペプチド濃度の増加につれて増加する。この実験において、ピークの検出についての下限は、１０ｆｍｏｌであった。上限は、１００ｐｍｏｌであった。５つのミオグロビンペプチド全てのピーク面積を合わせ、そしてミオグロビン量に対してプロットした。このピーク面積は、１０ｆｍｏｌから１００ｐｍｏｌまでのミオグロビン濃度に対して直線相関した（ｒ２＝０．９９１）。そしてこの結果は反復可能である。これらの結果の要約を、表４および図１１に示す。値０を有するピーク面積（表４を参照のこと）が対数スケールでは示されないが、一次回帰において含まれることに注目するべきである。
【００６８】
（表４．ウマミオグロビンのトリプシン消化からのミオグロビンタンパク質分解フラグメントのＥＳＩ−ＭＳ分析）
【００６９】
【表４】
2005522713.tif 000008
。
【００７０】
本発明は、特定の実施形態について記載されている。添付の特許請求の範囲の範囲内に他の実施形態が存在する。例えば、本発明の工程は異なる順序で実施および／または組み合され得、そして依然として所望の結果を達成し得る。
【００７１】
さらに、本発明は、天然に存在するにせよ、合成的であるにせよ、それ以外の方法で作製されるにせよ、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に関する実施形態について記載されてる。本明細書中に記載される技術がまた、他の物質（例えば、脂肪酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジゴヌクレオチド、有機分子、または無機分子など）に対して適用され得ることは、明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
種々の図面における同じ参照番号および同様の指示は、同様の成分を示す。
【図１】図１は、本発明の１つの局面に従う、ペプチドの混合物中のペプチドを定量するための方法の１つの実施を示す、フロー図である。
【図２】図２は、本発明の１つの局面に従う、ペプチドの混合物中のペプチドを定量するために作動可能な系を示す、スキーム図である。
【図３】図３は、本発明の１つの局面に従う、ペプチドの混合物中のペプチドを定量するための方法の１つの実施を示す、より詳細なフロー図である。
【図４】図４は、本発明の１つの局面の１つの実施によって提供される、５つのタンパク質を含む混合物の代表的なイオンクロマトグラムを示す（配列「ＴＧＰＮＬＨＧＬＦＧＲ」は、配列番号２５である）。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、本発明の１つの局面の１つの実施によって提供される、代表的なフラグメント化質量スペクトルおよびその解読を示す（配列「ＴＧＰＮＬＨＧＬＦＧＲ」は、配列番号２５である）。
【図６】図６は、本発明の１つの局面の１つの実施に従って再構築された、クロマトグラフィーのピーク面積の例である（配列「ＴＧＰＮＬＨＧＬＦＧＲ」は、配列番号２５である）。
【図７】図７は、本発明の１つの局面に従う、ミオグロビンペプチドおよびアルブミンペプチドのイオンについての、再構築された８つのクロマトグラムを示す。
【図８】図８は、本発明の１つの局面に従う、ミオグロビン消化物についての較正曲線を示す。
【図９】図９は、本発明の１つの局面に従う、シトクロムＣについての較正曲線を示す。
【図１０】図１０（ａ）および（ｂ）は、本発明の１つの局面に従う、それぞれ２５０ｆｍｏｌおよび５００ｆｍｏｌのミオグロビンを添加した、ヒト血漿消化物の基礎ピークイオンクロマトグラムを示す。図１０（ｃ）および（ｄ）は、本発明の１つの局面に従う、それぞれ２５０ｆｍｏｌおよび５００ｆｍｏｌのミオグロビンを添加したヒト血漿における、同定されたミオグロビンペプチドの再構築されたイオンクロマトグラムを示す。
【図１１】図１１は、本発明の１つの局面に従う、注入された異なる量のミオグロビンについての、合わせたクロマトグラフィーのピーク面積の変化を示す。
【配列表】
2005522713.tif 000009
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2005522713.tif 000011
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005522713.tif 000023
【図８】
2005522713.tif 000024
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2005522713.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月15日(2004.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド混合物中の１つ以上のペプチドを定量するための方法であって、
複数のペプチドを含む第１ペプチド混合物を得る工程；
一定期間にわたって該第１ペプチド混合物の該複数のペプチドのうちの１つ以上を分離する工程；
該一定期間における特定の時間に、該第１ペプチド混合物の１つ以上の該分離されたペプチドを、質量対電荷分析する工程；
該第１ペプチド混合物のうちの１つ以上の該質量分析されたペプチドの存在量を計算する工程；
該第１ペプチド混合物のうちの該１つ以上の質量分析されたペプチドの計算された存在量を、参照サンプル中の１つ以上のペプチドの存在量と比較することによって、該第１ペプチド混合物のうちの該１つ以上の質量分析されたペプチドについて、相対量を計算する工程であって、該参照サンプルが該第１ペプチド混合物に対して外部にある、工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
複数のペプチドを含む第１ペプチド混合物を得る工程が、第１ポリペプチドサンプルを消化して該第１ペプチド混合物を作製する工程を包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
第２ポリペプチドサンプルを消化することによって前記参照サンプルを調製する工程；
該消化された第２ポリペプチドサンプルから、１つ以上のペプチドを分離する工程；
該消化された第２ポリペプチドサンプルからの該分離されたペプチドを質量分析する工程；および
該第２ポリペプチドサンプルからの１つ以上の該質量分析されたペプチドの存在量を計算する工程、
をさらに包含し、
ここで、前記第１ペプチド混合物のうちの前記１つ以上の質量分析されたペプチドについての相対量を計算する工程が、該第１ペプチド混合物のうちの該１つ以上の質量分析されたペプチドの計算された存在量を、該第２ポリペプチドサンプルからの１つ以上の対応する質量分析されたペプチドの計算された存在量と比較する工程を包含する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記１つ以上のペプチドを分離する工程が、液体クロマトグラフィーによって該１つ以上のペプチドを分離する工程を包含する、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記１つ以上のペプチドを分離する工程が、前記特定の時間にて液体クロマトグラフィー溶出物を単離する工程を包含し；そして
前記第１ペプチド混合物のうちの１つ以上の前記分離されたペプチドを質量分析する工程が、該単離された溶出物中の１つ以上のペプチドを質量分析する工程を包含する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記第１ペプチド混合物のうちの１つ以上のペプチドを同定する工程
をさらに包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
前記第１ペプチド混合物のうちの１つ以上のペプチドを同定する工程が、質量分析情報に基づき、１つ以上の前記分離されたペプチドを同定する工程を包含する、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
前記１つ以上の前記分離されたペプチドを質量分析する工程が、該１つ以上の分離されたペプチドのうちのペプチドに由来するイオンをフラグメント化する工程、および該イオンのフラグメントを質量分析する工程を包含し；そして
前記第１サンプル中の１つ以上のペプチドを同定する工程が、該フラグメントについての質量分析情報に基づき、配列データベースを検索する工程を包含する、方法。
【請求項９】
請求項４に記載の方法であって、
前記１つ以上の前記質量分析されたペプチドの存在量を計算する工程が、ペプチドについてのクロマトグラムピークを、該ペプチドについての質量分析情報に基づいて再構築する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
前記ペプチドについての存在量を計算する工程が、ペプチドについての存在量を、該ペプチドについて再構築されたクロマトグラムピーク面積に基づいて計算する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
前記ペプチドについての存在量を計算する工程が、前記特定時間での再構築されたクロマトグラムにおいて閾値間隔内に位置するクロマトグラムピークのみを使用して、ペプチドについての存在量を計算する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、
前記１つ以上の質量分析されたペプチドについての相対量を計算する工程が、前記第１ペプチド混合物のうちのペプチドについてクロマトグラムピーク面積を再構築することによって計算される存在量を、前記参照サンプル中のペプチドについてのクロマトグラムピーク面積を再構築することによって計算される存在量と比較する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項２に記載の方法であって、
前記第１ペプチド混合物のうちの前記１つ以上の質量分析されたペプチドの計算された存在量を正規化する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
前記計算された存在量を正規化する工程が、前記第１ポリペプチドサンプルに添加された１つ以上のペプチドを含む内部標準に基づき、前記計算された存在量を正規化する工程を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、
前記計算された存在量を正規化する工程が、１つ以上のペプチドを含む外部標準に基づき、前記計算された存在量を正規化する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項２に記載の方法であって、
前記質量分析する工程に基づき、前記第１ペプチド混合物のうちの複数のペプチドを同定する工程
をさらに包含し；
ここで、前記１つ以上の質量分析されたペプチドについての相対量を計算する工程が、該同定されたペプチドの各々についての相対量を計算する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
前記第１ペプチド混合物中の１組のペプチドについて再構築されたクロマトグラムピーク面積に基づき、補正係数を計算することによって前記同定されたペプチドの各々について計算された存在量を正規化する工程であって、該１組のペプチドにおける各々のペプチドは、複数の実験にわたって一定のクロマトグラムピーク面積を有する工程、および
該同定されたペプチドの各々についての計算された存在量に対して該補正係数を適用する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、
前記１つ以上の前記分離されたペプチドを質量対電荷分析する工程、および前記１つ以上の前記質量分析されたペプチドの存在量を計算する工程が、前記第１ペプチド混合物のうちの１つ以上の任意のペプチドを質量対電荷分析する工程、および該ペプチドについての存在量を計算する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
混合物中の１つ以上のペプチドを定量化する方法であって、該方法は：
タンパク質サンプルを消化してペプチドの混合物を作製する工程；
液体クロマトグラフィーを使用して、該ペプチドの混合物のうちの１つ以上のペプチドを分離する工程；
１つ以上の該分離されたペプチドを質量分析する工程；
該ペプチドについての質量スペクトルに基づき、１つ以上の該質量分析されたペプチドを同定する工程、
該同定されたペプチドについてのクロマトグラムピーク面積を計算する工程；
該同定されたペプチドに対応する１つ以上のタンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を、該対応するペプチドについて計算されたクロマトグラムピーク面積に基づき計算する工程；
内部標準についてのクロマトグラムピーク面積に基づき、該タンパク質についての該クロマトグラムピーク面積を正規化する工程；および、
該１つ以上の該タンパク質のうちのタンパク質について、該タンパク質についての該正規化されたクロマトグラムピーク面積を参照サンプル中の対応タンパク質についてのクロマトグラムピーク面積に対して比較することによって、相対量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
ペプチド混合物中の１つ以上のペプチドを定量化するための装置であって、該装置は；
複数のペプチドを含む第１ペプチド混合物を得るための手段；
一定期間にわたって、該第１ペプチド混合物の該複数のペプチドのうちの１つ以上を分離するための手段；
該一定期間における特定の時間にて、該第１ペプチド混合物の１つ以上の該分離されたペプチドを質量分析するための手段；
該第１ペプチド混合物の１つ以上の該質量分析されたペプチドの存在量を計算するための手段；
該第１ペプチド混合物の該１つ以上の質量分析されたペプチドの計算された存在量を、該第１ペプチド混合物に対して外部にある参照サンプル中の１つ以上のペプチドの存在量と比較することによって、該第１ペプチド混合物の該１つ以上の質量分析されたペプチドについて相対量を計算するための手段；
を備える、装置。
【請求項２１】
少なくとも１つのさらなるペプチド混合物を得るための手段をさらに備える、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのさらなるペプチド混合物が参照サンプルを含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記存在量を計算するための手段がさらに参照情報を含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項２４】
前記質量対電荷分析するための手段および前記計算するための手段が、前記第１ペプチド混合物のうちの１つ以上の任意のペプチドを質量対電荷分析し、そして該ペプチドについての存在量を計算するよう構成される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２５】
分離するための手段、質量対電荷分析するための手段および計算するための手段が、対象ペプチドの特定のアミノ酸組成とは無関係に、１つ以上のペプチドを分離し、質量対電荷分析し、そして該ペプチドについての存在量を計算するように構成される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２６】
第１ペプチド混合物中の１つ以上のペプチドを定量するための、コンピューター読み取り可能な媒体上のコンピュータープログラム製品であって、該製品は、プログラム可能なプロセッサに、
一定期間にわたり、第１ペプチド混合物からの複数のペプチドのうちの１つ以上の分離を表す、分離情報を受け取ること；
該一定期間における特定の時間にて、該第１ペプチド混合物の１つ以上の該分離されたペプチドについての、質量対電荷分析情報を受け取ること；
該第１ペプチド混合物の１つ以上の該質量分析されたペプチドの存在量を計算すること；および
該第１ペプチド混合物のうちの該１つ以上の質量分析されたペプチドの計算された存在量を、参照サンプル中の１つ以上のペプチドの存在量と比較することによって、該第１ペプチド混合物の該１つ以上の質量分析されたペプチドについての相対量を計算することであって、該参照サンプルは該第１ペプチド混合物に対して外部にあること、
をさせるために操作可能な命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２７】
第１ペプチド混合物中の１つ以上のペプチドを定量するための、コンピューター読み取り可能な媒体上のコンピュータープログラム製品であって、該製品は、プログラム可能なプロセッサに、
一定期間にわたり、第１ペプチド混合物の複数のペプチドのうちの１つ以上の分離を表す、分離情報を受け取ること；
該一定期間における特定の時間にて、該第１ペプチド混合物の１つ以上の該分離されたペプチドについての、質量対電荷分析情報を受け取ること；
該ペプチドについての質量対電荷分析情報に基づき、１つ以上の該質量分析されたペプチドを同定すること；
該同定されたペプチドについてのクロマトグラムピーク面積を計算すること；
該同定されたペプチドに対応する１つ以上のタンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を、該対応するペプチドについて計算されたピーク面積に基づいて計算すること；
内部標準についてのクロマトグラムピーク面積に基づき、該タンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を正規化すること；および
該１つ以上の該タンパク質のうちのタンパク質についての相対量を、該タンパク質について正規化されたクロマトグラムピーク面積を参照サンプル中の対応するタンパク質についてのクロマトグラムピーク面積に対して比較することによって、決定すること、
をさせるために操作可能な命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２８】
第１ペプチド混合物中の１つ以上のペプチドを定量するための装置であって、該装置は、以下の動作：
一定期間にわたり、第１ペプチド混合物の複数のペプチドのうちの１つ以上の分離を表す、分離情報を受け取る動作；
該一定期間における特定の時間にて、該第１ペプチド混合物のうちの１つ以上の該分離されたペプチドについての質量対電荷分析情報を受け取る動作；
該第１ペプチド混合物のうちの１つ以上の該質量分析されたペプチドの存在量を計算する動作；および
該第１ペプチド混合物のうちの該１つ以上の質量分析されたペプチドの計算された存在量を、参照サンプル中の１つ以上のペプチドの存在量と比較することによって、該第１ペプチド混合物のうちの該１つ以上の質量分析されたペプチドについての相対量を計算する動作であって、該参照サンプルは該第１ペプチド混合物に対して外部にある、動作、
を実施するよう構成されたデジタル回路を備える、装置。
【請求項２９】
第１ペプチド混合物中の１つ以上のペプチドを定量するための装置であって、該装置は、以下の動作：
一定期間にわたり、第１ペプチド混合物の複数のペプチドのうちの１つ以上の分離を表す、分離情報を受け取る動作；
該一定期間における特定の時間にて、該第１ペプチド混合物の１つ以上の該分離されたペプチドについての、質量対電荷分析情報を受け取る動作；
該ペプチドについての質量対電荷分析情報に基づき、１つ以上の該質量分析されたペプチドを同定する動作；
該同定されたペプチドについてのクロマトグラムピーク面積を計算する動作；
該同定されたペプチドに対応する１つ以上のタンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を、該対応するペプチドについて計算されたピーク面積に基づき、計算する動作；
内部標準についてのクロマトグラムピーク面積に基づき、該タンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を正規化する動作；および
該１つ以上の該タンパク質のうちのタンパク質についての相対量を、該正規化された該タンパク質についてのクロマトグラムピーク面積を参照サンプル中の対応するタンパク質についてのクロマトグラムピーク面積に対して比較することによって、決定する動作、
を実施するよう構成されたデジタル回路を備える、装置。
【請求項３０】
生物学的サンプル中の１つ以上の化合物を定量するための方法であって、
複数の化合物を含む生物学的サンプルを得る工程；
一定期間にわたって、該生物学的サンプルの該複数の化合物のうちの１つ以上を分離する工程；
該一定期間における特定の時間にて、該生物学的サンプルのうちの１つ以上の該分離された化合物を質量対電荷分析する工程；
該生物学的サンプルのうちの１つ以上の該質量分析された化合物の存在量を計算する工程；および
該生物学的サンプルのうちの該１つ以上の質量分析された化合物の計算された存在量を、参照サンプル中の１つ以上の化合物の存在量と比較することによって、該生物学的サンプルのうちの該１つ以上の質量分析されたペプチドについての相対量を計算する工程であって、該参照サンプルは、該生物学的サンプルに対して外部にある、工程
を包含する、方法。
【請求項３１】
生物学的サンプル中の１つ以上の化合物を定量するための装置であって、該装置は、以下の動作：
複数の化合物を含む生物学的サンプルを得る動作；
一定期間にわたって、該生物学的サンプルの該複数の化合物のうちの１つ以上を分離する動作；
該一定期間における特定の時間にて、該生物学的サンプルのうちの１つ以上の該分離された化合物を質量対電荷分析する動作；
該生物学的サンプルのうちの該質量分析された１つ以上の化合物の存在量を計算する動作；および
該生物学的サンプルのうちの該１つ以上の質量分析された化合物の計算された存在量を、参照サンプル中の１つ以上の化合物の存在量と比較することによって、該生物学的サンプルのうちの該１つ以上の質量分析された化合物についての相対量を計算する動作であって、該参照サンプルは、該生物学的サンプルに対して外部にある、動作、
を実施するよう構成されたデジタル回路を備える、装置。
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月30日(2005.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005522713000001.app
【国際調査報告】
2005522713.tif 000028
2005522713.tif 000029
2005522713.tif 000030
2005522713.tif 000031
2005522713.tif 000032