(57)【要約】以下の組成：（a）KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質とからなるADビークル；（b）カルボキシビニルポリマー；および（c）単独では、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせる量の粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量の抗原蛋白を含み、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせる量の抗原特異的粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることを特徴とする粘膜ワクチン。  本発明の粘膜ワクチンは、従来の粘膜ワクチンよりもさらに強い抗体産生能を有し、その結果として極めて少量の抗原で優れた効果を発揮することができる。
2011108521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の組成：
（a）KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質とからなるADビークル；
（b）カルボキシビニルポリマー；および
（c）単独では、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせる量の粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量の抗原蛋白
を含み、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせる量の抗原特異的粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることを特徴とする粘膜ワクチン。
【請求項２】
抗原蛋白（c）が、ADビークル（a）との組合せ、またはカルボキシビニルポリマー（b）との組合せによっても効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせる量の抗原特異的粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量である請求項１の粘膜ワクチン。
【請求項３】
合成ペプチドが、配列番号１または２のアミノ酸配列からなる請求項１の粘膜ワクチン。
【請求項４】
脂質が、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸の少なくとも１種である請求項１の粘膜ワクチン。
【請求項５】
脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロールおよびパルミチン酸の３種脂質混合物である請求項３の粘膜ワクチン。
【請求項６】
抗原蛋白が病原体に由来の不活化抗原、精製抗原、部分精製抗原、リコンビナント抗原又は無毒化毒素、アレルギーの原因となるアレルゲンである請求項１の粘膜ワクチン。
【請求項７】
以下の組成：
（a）KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質とからなるADビークル；
（b）カルボキシビニルポリマー；および
（c）単独では、効果的な免疫誘導を生じさせる量の粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量の抗原
を含み、効果的な免疫誘導を生じさせる量の抗原特異的粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることを特徴とする粘膜ワクチンの製造法であって、
（1）前記（a）および（c）を水に懸濁し、
（2）加温と攪拌とを１回以上反復し、
（3）凍結乾燥し、
（4）凍結乾燥体を生理食塩水に懸濁して所定濃度に調製し、
（5）前記（b）の溶液を加える、
ことを特徴とする製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、粘膜免疫IgAと血中免疫IgGを効果的に誘導する粘膜ワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１および２には、従来の不活化ワクチンやトキソイド等における欠点、粘膜ワクチンおよび免疫アジュバントの開発に関する現状等が詳細に記載されている。【０００３】
これら特許文献１、２に記載のとおり、皮下や筋肉内等へ接種する従来ワクチンから、ウイルスの自然感染ルートである粘膜においてIgA抗体の産生を誘導する粘膜ワクチンへの切り替えの必要性は、広くかつ深く認識されている。特に、２１世紀における次世代ワクチンとしては、IgA抗体の産生、局所免疫あるいは粘膜免疫を誘導する、いわゆる粘膜ワクチンの開発と実用化が全世界で待望されてはいるが、未だ達成されていない。【０００４】
本願発明者らはこのような課題に対して、肺サーファクタントプロテインＢおよび／または肺サーファクタントプロテインＣと、脂質との複合体である抗原薬物（ＡＤ）ビークルと、このADビークルと抗原とからなる粘膜ワクチンを発明し、特許出願している（特許文献１）。さらに本願発明者らは、ADビークル量（Ｖ）と抗原量（Ａ）との重量比Ｖ／Ａの調節によって、IgA抗体の選択的産生とIgA・IgG両抗体産生とが変換可能であることを見出し、これを作用機序とする粘膜ワクチンを特許出願している（特許文献２）。またこれらの特許文献１、２は、肺サーファクタントプロテインＢおよびＣの断片（ペプチド）の有効性についても開示している。【０００５】
さらに本願発明者らは、肺サーファクタントプロテイン断片の様々な変異体について抗体産生増強作用を検討した結果、特許文献１、２に開示された部分ペプチドよりもサイズの小さいペプチドであるにもかかわらず、抗体産生の強い誘導あるいは増強作用、特に、分泌型IgA抗体の単独産生、また、分泌型IgAと血中IgGの両抗体産生の優れて効果的な誘導作用を有する合成ペプチドKnLm（ただしnは4-8、mは11-20）を成分とするADビークルと、このADビークルと抗原とからなる粘膜ワクチンを発明し、特許出願している（特許文献３）。【０００６】
なお、粘膜ワクチンと同一の投与経路をとる点鼻薬には、その粘度を高め、花粉症やアレルギーへの効能を持続的に発揮させるためにカルボキシビニルポリマー（CVP）やヒドロキシプロピルセルロース（HPC）が広く使用されている他、その他アルギン酸ナトリウムを始めとする増粘ゲル化剤が使用されている。例えば、HPCを含有する粘膜ワクチン（特許文献４）や、CVPを含有する粘膜適用型ワクチン製剤（特許文献５）および鼻腔内噴霧投与用インフルエンザワクチン（特許文献６）なども知られている。また、特許文献７には、抗原、アジュバント［特にPoly(I.C.)］および増粘剤（アルギン酸ナトリウム等）からなる粘膜投与用のワクチンが開示されている。
【特許文献１】国際公開WO 2005/097182号公報
【特許文献２】国際公開WO 2007/018152号公報
【特許文献３】国際公開WO 2009/123119号公報
【特許文献４】特開2008-231343号公報
【特許文献５】国際公開WO 01/017556号公報
【特許文献６】特開平03-38529号公報
【特許文献７】特開2009-209086号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献３の粘膜ワクチンは強い抗体産生能を有するものであるが、粘膜ワクチンの共通の問題点として、経皮注射ワクチンよりも多量の抗原を必要とする問題点を有している。【０００８】
有効なワクチン治療のためには、その標的となる感染症の流行範囲に対して十分な量のワクチンが必要となるが、現状の抗原生産量の規模を鑑みた場合には、粘膜ワクチンの増産は困難である。従って、粘膜ワクチンにさらに強い抗体産生能を付与することが求められている。【０００９】
本願発明は、特許文献３に記載された粘膜ワクチンよりもさらに強い抗体産生能を有し、その結果として経皮注射ワクチンに匹敵するような少量の抗原で優れた効果を発揮することのできる改良型粘膜ワクチンを提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、特許文献３の粘膜ワクチンの抗体誘導をさらに増強する手段として、点鼻薬や粘膜適用型ワクチンに使用されているゲル化剤（CVP、HPC）の中から、ADビークルに働いて抗原提示細胞に運ばれる抗原量を増加させ、粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを誘導する効果を試験し、以下を確認した。
(1)特許文献３の粘膜ワクチン（抗原＋合成ペプチド＋脂質）、または特許文献５、６の粘膜ワクチン（抗原＋CVP）に比較して、「抗原＋合成ペプチド＋脂質＋CVP」からなる粘膜ワクチンは遙かに優れた抗体誘導能を有しており、その効果は、特許文献３（抗原＋合成ペプチド＋脂質）と特許文献５、６（抗原＋CVP）の単なる組合せから予測される範囲を大きく超えること。
(2)CVPと同様に点鼻薬や粘膜ワクチンのゲル化剤として広く報告されているHPC賦形剤は、抗原と併用、あるいは抗原とADビークルに併用した場合には全く抗体誘導能を持たず、粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを誘導する効果も期待できないこと。
(3)特許文献３の粘膜ワクチン（抗原＋合成ペプチド＋脂質）において必要な量の約１／５以下に抗原量を減じても、「抗原＋合成ペプチド＋脂質＋CVP」の粘膜ワクチンは遙かに強力な抗体誘導効果を有すること。【００１１】
本発明は、以上の新規な知見に基づき完成された。【００１２】
すなわち、本発明は、以下の組成：
（a）KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質とからなるADビークル；
（b）カルボキシビニルポリマー；および
（c）単独では、効果的な感染防御効果を生じさせる量の粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量の抗原蛋白
を含み、効果的な感染防御効果を生じさせる量の抗原特異的粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgGを産生させることを特徴とする粘膜ワクチンである。【００１３】
本発明の粘膜ワクチンにおいて抗原蛋白（c）は、さらに、ADビークル（a）との組合せ、またはカルボキシビニルポリマー（b）との組合せによっても効果的な感染防御効果を生じさせる量の抗原特異的粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量である。【００１４】
この粘膜ワクチンにおける一つの態様において、前記の合成ペプチドは配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドである。【００１５】
またこの粘膜ワクチンにおける別の態様において、脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸の少なくとも１種である。さらに具体的には、脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロールおよびパルミチン酸の３種脂質混合物である。【００１６】
この粘膜ワクチンにおけるさらに別の態様において、抗原は病原体に由来の不活化抗原、精製抗原、部分精製抗原、リコンビナント抗原又は無毒化毒素、アレルギーの原因となるアレルゲンを含む。【００１７】
さらに本発明は、以下の組成：
（a）KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質とからなるADビークル；
（b）カルボキシビニルポリマー；および
（c）単独では効果的な免疫誘導を生じさせる量の粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量の抗原蛋白
を含み、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせる量の抗原特異的粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgGを産生させることを特徴とする粘膜ワクチンの製造法であって、
（1）前記（a）および（c）を水に懸濁し、
（2）加温と攪拌とを１回以上反復し、
（3）凍結乾燥し、
（4）凍結乾燥体を生理食塩水に懸濁して所定濃度に調製し、
（5）前記（b）の溶液を加える、
ことを特徴とする製造方法である。【００１８】
本発明において、「効果的な免疫誘導を生じさせる量の粘膜免免疫IgAおよび血中免疫IgG」とは、例えば、血液のウイルス感染阻止効果HIの値が国際的評価基準以上であるような量のIgAおよびIgGである。【００１９】
なお、以下の説明において、合成ペプチドと脂質とからなる組成物を「ADビークル」と記載し、このADビークルと前記抗原とからなる組成物を「粘膜ワクチン」と記載することがある。これらの「ADビークル」および「粘膜ワクチン」は特許文献３に開示されたものと実施的に同一である。さらに、この粘膜ワクチンにCVPを添加した組成物を「CVP添加粘膜ワクチン」と記載することがある。また、本願発明は、前記の「脂質」に関しては特許文献１−３の開示内容、「合成ペプチド」および「ADビークル」に関しては特許文献３の開示内容を包含するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本願発明のCVP添加粘膜ワクチンは、ワクチン抗原特異的IgAおよびIgG抗体の極めて強い誘導効果と、誘導された抗体の国際基準をはるかに超える強いウイルス感染阻止効果（HI効果）を有している。これらの効果は、特許文献３に記載の粘膜ワクチン、あるいは「抗原＋CVPワクチン」（特許文献５、６）と比較しても極めて顕著であり、特許文献３の粘膜ワクチン効果と特許文献５、６のCVP効果とからは予期しえないほどの優れた効果である。【００２１】
このような強い抗体誘導能から、従来の粘膜ワクチンより少量の抗原を含有させることによって必要な感染防御効果が達成される。すなわち、本願発明のCVP添加粘膜ワクチンは、従来の粘膜ワクチン（抗原+合成ペプチド+脂質）に使用する抗原量を１／５以下にまで減じても、はるかに強力な抗体誘導効果を示す。例えば、試験例２に示したように、特許文献３の粘膜ワクチンは、抗原としてインフルエンザ抗原を使用した場合には、抗原量が0.2μgであっても血液のウイルス感染阻止効果HIはインフルエンザワクチンの国際的評価基準であるHI=40に満たないが、本発明のCVP添加粘膜ワクチンは抗原量が0.1μg、さらには抗原量が0.03μgであってもHI値が100以上という優れたウイルス感染阻止効果を示す。【００２２】
さらに、本願発明のCVP添加粘膜ワクチンの組成物（ADビークル、CVP）自身には、抗原認識細胞刺激効果は無く、そのため投与したワクチン抗原以外の抗原による予期しない副作用、例えば自己免疫疾患、ワクチン接種後のアレルギーの増悪等の起きる可能性は極めて低い。【００２３】
また、本発明の粘膜ワクチン製造法によれば、抗原特異的粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgGのさらに高い産生能を有する粘膜ワクチンを製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】試験１の結果であり、実施例１、比較例１−５の各ワクチン、HA抗原をそれぞれマウスに経鼻投与した場合の、鼻洗浄液IgA量（左）と血清IgG量（右）である。
【図２】試験１の結果であり、実施例１、比較例１、５の各ワクチン、HA抗原、比較対象としてHA+ADビークルをそれぞれマウスに経鼻投与した場合の、抗インフルエンザウイルスHA抗体が示すHI価である。
【図３】試験２において、抗原提示樹状細胞を、エンドトキシン（LPS）、poly(I.C.)、SF-10(CVP＋ADビークル)でそれぞれ刺激し、細胞膜の活性化表示分子（MHC II、CD40、CD80 (B7-1)およびCD86(B7-2)）の発現レベルを測定した結果である。左グラフは各膜分子の発現量が増加して陽性と判定される細胞（右のドット図でコントロールとして用いた生理食塩水処理から決められた中央近傍の陰性値上限表示バーの値を越えた細胞）の全細胞数における割合（％）で示し、右はフローサイトメトリーの測定結果で、細胞膜上の活性化表示分子の量を可視化定量した図である。
【図４】試験４の結果であり、感染させたインフルエンザウイルスPFU量と生存率の関係を示す。
【図５】試験４の結果であり、マウス（各群10匹）に実施例１、実施例５、比較例５、比較例６の各ワクチンを経鼻投与した後、50 PFUのインフルエンザウイルスを感染させた場合の生存率の変化を示す。
【図６】試験４の結果であり、マウス（各群10匹）に実施例１、実施例５、比較例５、比較例６の各ワクチンを経鼻投与した後、800 PFUのインフルエンザウイルスを感染させた場合の生存率の変化を示す。
【図７】試験6の結果を示す透過型電子顕微鏡写真増である。（A）は比較例１の粘膜ワクチン、（B）は実施例１のCVP添加粘膜ワクチンとその部分拡大像（右図）である。
【図８】試験７において、樹状細胞から検出される蛍光標識抗原量をフローサイトメトリーにより測定した結果である。HA抗原の単独投与時の樹状細胞で検出される抗原の蛍光標識量を１としたときに、それぞれの測定条件で蛍光標識量が何倍促進されたかを縦軸に “Fold versus HA” ＝[各サンプル測定時のMFI ]/[HA単独添加樹状細胞のMFI] として表示した。MFI: Mean Fluorescence Intensity **: p < 0.01 vs. HA (n = 3)。
【図９】試験８において、抗原提示樹状細胞を、poly(I.C.)、SF-10(CVP＋ADビークル)でそれぞれ刺激し、細胞膜の活性化表示分子（CD86）の発現レベルを測定した結果である。□はHA抗原蛋白なし、■はHA抗原蛋白ありの結果である。MFI: Mean Fluorescence Intensity、*: p < 0.05 vs.Adjuvant alone (n = 3)。
【図１０】試験９において、マウスにSF-10(CVP＋ADビークル)アジュバントを抗原の存在下と非存在下に経鼻投与し、鼻腔組織から調製した樹状細胞のCD86発現レベルを測定した結果である。MFI: Mean Fluorescence Intensity。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本願発明のCVP添加粘膜ワクチンは以下の組成からなる。
合成ペプチド
KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドでる。このKnLmはN末側のn個のK（Lys）残基とC末側のm個のL残基が連続している。このような合成ペプチドは、例えば以下のいずれかのペプチドである。なお、括弧内はペプチドの略号である。またアミノ酸残基は１文字記号で示している。
配列番号１（K6L16）:KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL
配列番号2（K6L11）:KKKKKKLLLLLLLLLLL
配列番号１（K6L16）は、N末側の6個のK（Lys）残基とC末側の16個のL残基とからなり、配列番号２（K6L11）は、N末側の6個のK（Lys）残基とC末側の11個のL残基とからなる。これらの合成ペプチドは、公知の化学合成法に従って調製された、純度95％以上のものを使用する。
脂質
リン脂質としては、肺サーファクタントが含有するリン脂質、例えばホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等の使用が望ましい。その他、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン等を用いることができる。また、脂肪酸としては、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸等を用いることができる。更に、肺の膨張が活発なクジラ、イルカ等の水棲動物に由来の脂質を用いることができる。
カルボキシビニルポリマー（CVP）
CVPはアクリル酸を主成分として重合して得られる親水性ポリマーであり、ハイビスワコー103、ハイビスワコー104、ハイビスワコー105、Sigma社製のpAA130（Sigma, St. Louis, MO, Cat No. 181293）、pAA450（Sigma, Cat No.181285）、pAA1250（Sigma, Cat No.306215）などの市販品を用いることができる。中でも化粧品や医薬品用ゲルの作成に汎用されているハイビスワコー104、Sigma社製のpAA130、pAA1250が好ましい。CVPを純水あるいは生理食塩水で超音波処理下に0.2-2.0重量%溶解液を作成した後、NaOH中和液でpH5.0-10.5の作成が可能であるが、ワクチン抗原の安定性に影響しないpHを選択することが好ましい。例えば、インフルエンザスプリットワクチン抗原の場合では、pH6.8-8.0、好ましくはpH7.0-7.2に調整する。
抗原
抗原は、ワクチン用に高度精製された純度が約90%以上の細菌由来抗原、ウイルス抗原、トキソイド等のタンパク質、糖タンパク質、アレルゲン、高分子の糖質や核酸等の抗原分子を含む。例えば、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群(SARS)ウイルス、ウエストナイルウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、HIVウイルス、C型肝炎ウイルス、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザb型菌、肺炎菌。コレラ菌、マラリア病原体、眠り病病原体などに対するワクチン用の抗原である。
【００２６】
これらの抗原は、それ単独、特にADビークル（a）との組合せまたはカルボキシビニルポリマー（CVP）との組合せによっても効果的な免疫誘導を生じさせる量の抗原特異的粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量を調製して使用する。
【００２７】
なお、インフルエンザ抗原蛋白の場合はHA抗原分子の他にM蛋白、ノイラミラーゼ、ヌクレオプロテイン等を含有する。以下の説明において、抗原蛋白量とはこれらの抗原分子を含む蛋白質総量を意味する。HA抗原分子それ自体の量は、使用したロットのインフルエンザワクチンでは、抗原総蛋白量の約50％であった。
【００２８】
次に、これらの材料からADビークルおよびCVP添加粘膜ワクチンを調製する方法を説明する。
ADビークルの調製
前記の脂質のうちの幾つかを任意の割合で混合し、脂質量として、例えば10mg/mLの濃度となるようにクロロホルム：メタノール（２：１(v/v)）混合液に懸濁し、脂質成分とする。また、合成ペプチドは、例えば5.0mg/mL濃度となるようにエタノールに溶解する。次いで、この脂質成分と合成ペプチドとを混合する。混合比は、合成ペプチドが約0.2〜約12.0乾燥重量%、脂質が約88〜約99.8乾燥重量%である。この混合物をロータリーエバポレーターを用いて約40℃で乾固し、任意の濃度で１０％エタノールに再懸濁し、約45℃の水浴中で15分間程度振盪混和し、均一分散液を調製し、凍結乾燥する。この乾燥物は約−30℃で保存し、使用時にその都度、純水または生理食塩水を加えて懸濁したのち、超音波、ホモジナイザー、ミキサー、振盪器等を用いて均一分散液とする。
CVP添加粘膜ワクチンの調製
前記のADビークル、CVPおよび抗原とを任意の割合で混合する。すなわち、インフルエンザワクチンの場合、ワクチン中の抗原蛋白量（A）に対するADビークル量（V）の乾燥重量比V/Aが所望の値になるよう、ワクチン原液にADビークル液を添加混合し調製する。マウス１匹当たりに投与する抗原蛋白の乾燥重量（A）は約0.01〜約10 μg/kg体重、好ましくは約0.03〜約5.0 μg/Kg体重である。この抗原量は、特許文献３の粘膜ワクチン（抗原＋ADビークル）における抗原量（約0.1〜50μg/kg体重、好ましくは約0.3〜30 μg/Kg体重）の1/5以下である。
【００２９】
このような抗原量において、IgA抗体産生を優先的かつ選択的に誘導するためのV/Aは、約0.1〜約1.0が望ましい。また、IgA及びIgG両抗体産生を誘導するためのV/Aは、約1.0〜約100、好ましくは約5〜約20の範囲を採用できる。以上のとおりのV/Aにおいて、抗原の約60%以上がADビークルに結合し、それによって得られた粘膜免疫ワクチンはIgA抗体産生及び／またはIgG抗体産生を効率的に誘導することができる。
【００３０】
またCVPを加えた最終経鼻投与ワクチン液中のCVP濃度は約0.1％〜1.0％、好ましくは0.3％〜0.8％の割合で添加する。尚、ADビークル、抗原、CVPを均一に混合するには、ホモジナイザー、ミキサー、振盪器、攪拌器等を用いることができる。
【００３１】
具体的には、下記実施例１に示したように、抗原蛋白とADビークルを混合した後、3分間超音波処理を行い、さらに室温で２時間回転混和した後、最後に1%CVP生理食塩水溶液を等量加えてCVP添加粘膜ワクチンを製造することができる。この方法は、CVPを添加することを除き、特許文献３に記載された方法と同一である。ただし、この方法は、超音波処理による発熱でウイルス抗原が失活する場合のあること、超音波処理の行程は、使用する機材の種類、発振器の大きさ、発振器の状態などから、一定の条件を保持することが困難な場合があることといった不都合がある。
【００３２】
そこで、実施例７に示したような以下の工程からなる製造方法が好ましい。
（1）ADビークルと抗原蛋白とを水（純水）に懸濁
（2）加温と攪拌とを１回以上反復
（3）凍結乾燥
（4）凍結乾燥体を生理食塩水に懸濁して所定濃度に調製
（5）生理食塩水に溶解したCVP溶液の添加
この方法は超音波処理による前記問題点を解決するだけでなく、後記試験５に示したように、さらに高い抗原特異的なIgAおよびIgGの産生を可能とする、優れた方法である。
【００３３】
調製したCVP添加粘膜ワクチンは、１回の投与で使用することもできるが、２回投与（初回免疫と２次免疫）または３回投与（初回免疫、２次免疫、３次免疫）として使用することが好ましい。このような複数回の免疫処置により、IgAおよびIgGの抗体価を著しく増加させることができる。なお、２回または３回のワクチン投与は、1週間から3週間、好ましくは約2週間の間隔で行うようにする。さらに、本願発明のCVP添加粘膜ワクチンの投与経路は、鼻腔のほか、口腔内や膣腔への投与も可能である（例えば、Lubrizol Pharmaceutical Bulletin, Polymers for Pharmaceutical Applications, Lubrizol Advanced Materials, Inc. 2008）。
【００３４】
以下、実施例を示して本願発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本願発明は以下の例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
[超音波処理を含む製造工程]
まず、以下のとおりにADビークルを調製した。
ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ホスファチジルグリセロール(PG)、パルミチン酸(PA)を75:25:10 (w/w/w) の割合で混合し、リン脂質量として10 mg/mlの濃度になるようにクロロホルム:メタノール (2:1 (v/v))混合液に懸濁し、脂質成分とした。また純度95%以上の合成ペプチドK6L16 (KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL)(GenScript社製)を5.0 mg/mLになるようにメタノールに溶解した。脂質成分（DPPC:PG:PA = 75:25:10, w/w/w）溶液とK6L16ペプチド溶液を重量比として、リン脂質成分：K6L16= 100: 2となるように混合し、ロータリーエバポレーターを用いて40℃で乾固した。これをリン脂質量として4 mg/mLとなるように、10%エタノールに再懸濁し、45℃の水浴中で15分間振盪混和し、均一分散液を調整した。これを凍結乾燥して、ADビークルとして-30℃で保存した。【００３６】
次に、前記のADビークルを用いてCVP添加粘膜ワクチンを以下のとおりに調製した。【００３７】
凍結乾燥したADビークルは要事に生理食塩水に懸濁して用いた。インフルエンザワクチン(HA)抗原は阪大微生物病研究会より供与されたA/NewCaledonia/20/99(H1N1)、1.94 mg蛋白質/mL（リン酸ナトリウム緩衝液、塩化ナトリウム、チメロサール溶液：1 mL中にリン酸水素ナトリウム水和物3.53 mg、リン酸二水素ナトリウム0.54 mg、塩化ナトリウム8.50 mg、チメロサール0.008 mg）を用いた。ワクチンとADビークの混合量は、抗原溶液の蛋白量（A）に対するADビークル溶液のリン脂質量（V）の量比V/A＝10となるように混合し、超音波処理 を30秒間隔でオンとオフを３回繰り返し、合計90秒のオンと90秒のオフの合計3分間の超音波処理 (model S-250D、Branson Ultrasonics Danbury)を行い、さらに室温で２時間回転混和した後、生理食塩水に溶解し、中性に調整した1% CVP（ハイビスワコー104）で最終濃度で0.5%になるように加えた。すなわち、マウス一匹当たり、片鼻2 μLを両鼻に投与する合計4 μLに含まれる組成は、インフルエンザワクチン(HA)抗原蛋白量/ADビークル溶液のリン脂質量/CVP重量＝0.2 μg/2.0 μg/20 μgとなる。
なお、このCVP添加粘膜ワクチンのpHは、HA抗原蛋白の抗原性を維持する範囲（7.0―7.2）とした。【００３８】
以下、このCVP添加粘膜ワクチンを「HA＋SF-10」と記載する。なお、SF-10量は、前記のとおりADビークル（2.0μg）＋CVP（20 μg）＝22 μgであるが、下記の説明ではアジュバントのビークル作用の基本骨格となるADビークルのリン脂質量で表記して、SF-10（2.0μg）と標記する。他の実施例におけるSF-10量もCVP量を除いた値で記載する。
【実施例２】
【００３９】
実施例１の方法に準じて、HA抗原蛋白量が0.1μgのCVP添加粘膜ワクチンを調製した。HA抗原蛋白、ADビークルおよびCVPの混合比は実施例１と同一とした（すなわち、抗原蛋白量の10倍のADビークルと、最終濃度0.5％のCVPを含む）。
【実施例３】
【００４０】
実施例１の方法に準じて、HA抗原蛋白量が0.03μgのCVP添加粘膜ワクチンを調製した。HA抗原蛋白、ADビークルおよびCVPの混合比は実施例１と同一とした（すなわち、抗原蛋白量の10倍のADビークルと、最終濃度0.5％のCVPを含む）。
[比較例１]【００４１】
特許文献３の粘膜ワクチン（HA+ADビークル）を調製した。HA抗原蛋白およびADビークルは実施例１と同一のものを使用し、ワクチンの調製は実施例１に準じた。HA抗原蛋白量は0.2μg、ADビークル量は2.0.μgである。
[比較例２]【００４２】
特許文献５、６に開示された粘膜ワクチン（HA＋CVP）を調製した。HA抗原蛋白およびCVPは実施例１と同一のものを使用し、ワクチンの調製は実施例１に準じた。HA抗原蛋白量は0.2μg、CVPは最終濃度0.5％である。
[比較例３]【００４３】
特許文献４に開示された粘膜ワクチン（HA＋HPC）を調製した。HA抗原蛋白は実施例１と同一のものを使用し、HPCは市販のHPC 6.0-10.0（和光純薬）を使用した。ワクチンの調製は実施例１に準じた。HA抗原蛋白量は0.2μg、HPC量は20 μgである。
[比較例４]【００４４】
特許文献３のHA＋ADビークルに、さらにHPCを添加した粘膜ワクチン（HA＋ADビークル＋HPC）を調製した。HA＋ADビークルは比較例１と同一のもの、HPCは比較例３と同一のものをそれぞれ使用し、ワクチンの調製は実施例１に準じた。HA抗原蛋白量は0.2 μg、ADビークル量は2.0 μg、HPC量は20 μgである。
[比較例５]【００４５】
樹状細胞のToll-Like Receptor (TLR)のリガンドであり、抗原提示細胞を強く刺激して抗体産生を促進するpoly (I.C.) (Alexis Corp.)を含む粘膜ワクチン（HA＋poly (I.C.)）を文献（(Asahi-Ozaki Y et al., Microbes Infect 2006; 8:2706-2714, Ichinohe T, et al., J Virol 2005; 79(5): 2910-2919)に記載の方法に準じて調製した。HA抗原蛋白量は0.2μg、poly (I.C.)量は2μgである。
[比較例６]【００４６】
HA抗原を生理食塩水で希釈して、ワクチンとして使用した。１匹当たりのHA抗原蛋白投与量は0.2 μgである。
[試験１]【００４７】
マウスを用いて、経鼻粘膜ワクチンの抗体産生増強作用を試験した。
１．粘膜ワクチン
・HA＋SF-10（実施例１）
・HA+ADビークル（比較例１）
・HA＋CVP（比較例２）
・HA＋HPC（比較例３）
・HA＋ADビークル＋HPC（比較例４）
・HA＋poly (I.C.)（比較例５）
・HA単独（比較例６）
２．動物
6-8週齢、メスBALB/c雌マウスを日本エスエルシー株式会社（日本・静岡）から購入して用いた。全ての動物実験は徳島大学医学部実験動物センターの感染動物舎（P2レベル）で行われ、徳島大学医学部動物実験委員会のガイドラインに従って行われた。
３．免疫法
ワクチンの経鼻投与においては、上記１の５種の粘膜ワクチンを、片鼻に2μLづつを両側に投与して、合計4μLをケタラール(62.6 mg/Kg)及びセラクタール(12.4 mg/Kg)で麻酔したマウスの両側鼻腔に点鼻投与した。対照には、ワクチン液と同量の生理食塩水投与群および比較例６（HA抗原蛋白単独投与群)を用いた。各群は9-10匹のマウスから成る。【００４８】
免疫は初回免疫後２週目に同様の組成からなる検体を、それぞれの群に２次免疫として同量経鼻投与した。２次免疫後２週目に同様な方法で３次免疫を行い、その後２週目に検体を採取した。なお、ワクチンの投与は合計３回おこなっているが、２次免疫で終了してもほぼ同様の結果が得られる。
４．マウス鼻腔・肺胞洗浄液および血清の調製
3次免疫後2週間目のマウスの、鼻腔・肺胞洗浄液および血清を調製して、ウイルスHA抗原特異的なIgA、IgGの測定を行った。文献（Mizuno D, Ide-Kurihara M, Ichinomiya T, Kubo I, Kido H. Modified pulmonary surfactant is a potent adjuvant that stimulates the mucosal IgA production in response to the influenza virus antigen. J Immunol. 2006;176 :1122-30）記載の方法に準じて、以下のとおりに行った。【００４９】
ワクチン投与マウスをペントバルビタール麻酔下で開腹開胸し、気管を切開しアトム静脈カテーテル節付3 Fr（アトムメディカル株式会社  日本・東京）を肺へ挿入後、生理食塩水1 mLを注入し、この液を回収した。これを3回繰り返して採取した液、計3 mLを肺胞洗浄液として用いた。肺洗浄液採取後、切開した気管から鼻腔方向へアトム静脈カテーテルを挿入し、1 mLの生理食塩水を注入し、鼻から出てきた液を採取した。この液を鼻洗浄液として用いた。さらに、心臓より採血を行い、5,000 rpm、10分間の遠心分離により血清を調製した。
５．抗インフルエンザ抗体の定量
鼻腔、肺胞洗浄液および血清中の抗インフルエンザIgA、IgG含有量を、前記文献（Mizuno D, et al. J Immunol. 2006;176 :1122-30）の記載に従い、ELISA assayにより定量した。【００５０】
ELISA assayはBETHYL LABORATORIES社（アメリカ・テキサス）のMouse ELISA quantitation kitの方法に従って行った。96ウェルNuncイムノプレート（Nalgen Nunc International アメリカ・ニューヨーク）各ウェルにワクチン1μg、ウシ血清アルブミン（BSA, SIGMA アメリカ・ミズーリ）1μg/mL PBS溶液100μLを加え、4℃で一晩固層化反応を行った。その後洗浄液（50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0）で3回すすぎワクチン液を除去した。各ウェルに0.15 M NaCl、1% BSAを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）200μLを加え、室温で1時間ブロッキング反応を行った。各ウェルを洗浄液で3回すすいだのち、サンプル結合緩衝液（50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween 20, pH 8.0）にて適量に希釈した鼻洗浄液・肺洗浄液あるいは血清を100μL加え、室温で2時間反応させた。Goat anti-mouse IgAまたはIgG-horse rADish peroxidase（HRP）（BETHYL LABORATORIES INC.）を二次抗体として用い、TMB Microwell Peroxidase Substrate System（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. アメリカ・メリーランド）を用いて発色反応を行った。各ウェルに100μL、2 M H2SO4（和光純薬株式会社）を添加することによって反応を停止し、450 nmの吸光度をSPECTRAmax PLUS 384で測定した。定量のためのスタンダードとして、上記肺洗浄液から精製した抗インフルエンザIgAおよびIgG 10 ngについて同様にして得られた吸光度を用いた。
６．結果
抗インフルエンザHA抗体の誘導結果を、鼻洗浄液中のIgA（左図１）、血液中のIgG（右図１）に示す。また、それぞれの測定値を表１に示す。また、図２および表２は各試験群のHI価を示す。
（1）HA抗原単独投与群（比較例６）のIgA量は24.77ng/mL、IgG量は0.54μg/mLに対して、HA＋SF-10（実施例１）投与群ではIgA量が3307.60ng/mL、IgG量は568.75μg/mLであり、鼻洗浄液中のIgAで132倍に、血清中のIgGで1137倍に増強した。本願発明のCVP添加粘膜ワクチン（HA＋SF-10）が極めて強い抗体誘導効果を有することが確認された（図１、表１）。
（2）HA＋SF-10（実施例１）投与群における抗体産生量は、HA＋ADビークル（比較例１）よりもIgAで15.6倍、IgGで150倍であり、HA＋CVP（比較例２）よりもIgAで10.7倍、IgGで115.4倍であった（図１、表１）。HA＋SF-10におけるこのような顕著に優れた抗体誘導効果は、特許文献３のおいて公知の粘膜ワクチン（HA＋ADビークル）と、特許文献５、６において公知のCVPとの単純な組合わせから予測される範囲を遙かに超えるものであった。
（3）HA＋HPC（比較例３）投与群の抗体産生量は、HA単独投与群（比較例６）と同様またはそれ以下であった。また、HA＋ADビークル＋HPC（比較例４）投与群の抗体産生量は、HA＋ADビークル（比較例１）よりも低かった（図１、表１）。以上の結果から、CVPと同様に点鼻薬や粘膜ワクチンにおいてゲル化剤として広く知られているHPCは、抗原との併用およびADビークルとの併用において免疫誘導増強効果を持たないことが確認された。このことから、ADビークルのアジュバント効果の増強には、単に増粘効果を持つ賦形剤ではなくADビークルの特性を基盤としたその増強効果であることが推定される。  
（4）HA＋SF-10（実施例１）投与群における抗体産生量は、HA＋poly(I.C.)（比較例５）よりも鼻洗浄液中のIgAで11.4倍、血清中のIgGで2.3倍であった（図１、表１）。この結果から、本願発明のCVP添加粘膜ワクチン（HA＋SF-10）は、抗原提示細胞を強く刺激して抗体産生を促進するpoly (I.C.)よりも強い免疫誘導効果を有することが確認された。【００５１】
【表１】
2011108521.tif 000003
【００５２】
（5）インフルエンザワクチンの国際的評価基準では、血液のウイルス感染阻止効果HI=40を超えたワクチンを有効と判定しているが、HA＋ADビークル（比較例１）ではHI=40を越えた検体が50％で、平均値でHI=39を示した。これに対して、HA＋SF-10（実施例１）では全例がHI=40を越え、平均値でHI=213.3と高値を示し、またHA＋poly (I.C.)（比較例５）のHI=137.0に比べて1.56倍の強いウイルス感染阻止効果を示した（図２、表２）。【００５３】
【表２】
2011108521.tif 000004
[試験２]【００５４】
調整した抗原提示樹状細胞（Mizuno D et al., J Immunol 2006;176:1122-1130）を、エンドトキシン（LPS: 100 ng/1×105 細胞）（Grauer O, et al., Histochem Cell Biol 2002; 117:351-362）、poly(I.C.)(10 μg/1×105 細胞)、SF-10(CVP添加ADビークル10 μg/1×105 細胞)でそれぞれ刺激し、細胞膜の活性化表示分子（MHC II、CD40、CD80(B7-1)およびCD86(B7-2)）の発現レベルを測定した。【００５５】
結果は図３に示したとおりである。LPSおよびpoly(I.C.)はCD40およびCD86の発現を著明に増加させ、抗原提示樹状細胞を活性化させたが、SF-10は抗原提示樹状細胞上のMHC II、CD40、CD80およびCD86の発現を増加させず、対照（無処理細胞）の発現量とほぼ同等のレベルであった。【００５６】
以上の結果から、SF-10は抗原提示樹状細胞を直接活性化することなしに、抗原提示能を増強して抗体産生量を増加させていること、すなわち、SF-10が効果的に抗原を抗原提示樹状細胞に運搬して抗体産生を誘導することが推定された
[試験３]【００５７】
実施例１（HA抗原蛋白量：0.2μg）、実施例２（HA抗原蛋白量：0.1μg）、実施例３（HA抗原蛋白量：0.03μg）の各CVP添加粘膜ワクチンを試験１と同様にマウス（各群10匹）に投与し、試験１と同様に鼻洗浄液中のIgA、血液中のIgGを測定した。【００５８】
結果は表３に示したとおりである。実施例１（HA抗原蛋白量：0.2μg）および実施例２（HA抗原蛋白量：0.1μg）はほぼ同等の抗体誘導効果を示した。さらに、実施例１よりも抗原蛋白量が１／６以下の実施例３（HA抗原蛋白量：0.03μg）も、試験例１（表1）の比較例２：HA＋ADビークル（HA抗原蛋白量：0.2μg）および比較例３：HA＋CVP（HA抗原蛋白量：0.2μg）に比べて遙かに強力な抗体誘導効果を示した。すなわち、実施例３投与群のIgA量は比較例２の11.7倍、比較例３の8.0倍であり、IgG量は比較例２の77.2倍、比較例３の60.1倍であった。【００５９】
以上の結果から、本願発明のCVP添加粘膜ワクチンは、特許文献３（HA＋ADビークル）や特許文献５、６（HA+CVP）の粘膜ワクチンよりも、遙かに少ない抗原量によって十分な抗体産生が可能であることが確認された。またウイルス感染阻止効果（HI効果）においても、CVP添加粘膜ワクチンではHA抗原蛋白量：0.03μgでもHI=198.0と十分な感染抑止効果を示した。【００６０】
【表３】
2011108521.tif 000005
【実施例４】
【００６１】
実施例１の方法に準じて、ADビークル量が0.3μg、HA抗原蛋白量が0.03μgのCVP添加粘膜ワクチンを調製した。HA抗原蛋白、ADビークルおよびCVPの混合比は実施例１と同一とした（すなわち、抗原蛋白量の10倍のADビークルと、最終濃度0.5％のCVPを含む）。
[試験４]【００６２】
マウス（各群10匹）に、実施例１（ADビークル：2.0μg、HA抗原蛋白量：0.2μg）および実施例４（ADビークル：0.3μg、HA抗原蛋白量：0.03μg）の各CVP添加粘膜ワクチンを試験例１と同様にしてそれぞれ投与し、２回目のブースターワクチン投与（合計３回免疫）から14日後に50 PFUおよび800 PFUのインフルエンザウイルス（A/PR8(N1H1)/μL）を感染させた。【００６３】
なお、図４に示したように、半数死亡率（LD50）が得られる感染ウイルス量はPFU＜5であり、ワクチン処置を行なわない場合、50 PFUは感染後9日、100 PFU以上では8日目以内に全マウスが死亡した。【００６４】
ワクチン接種の生存率への果は図５、図６に示したとおりである。コントロール（生理食塩水）および比較例６（HA抗原蛋白単独）の場合は共に、50 PFUのウイルス感染から7-9日で、800 PFUのウイルス感染では7日後に全例が死亡した。また比較例５（HA+poly（I.C.））の場合は、800 PFUのウイルス感染では10匹中9匹が9日後までに死亡した。【００６５】
これに対して、実施例１および実施例４のCVP粘膜ワクチンを投与したマウスは、50 PFUのウイルス感染では全例が15日間生存した。また、800 PFUのウイルス感染では、実施例１のワクチンでは死亡は10匹中1匹（8日以後）であり、実施例４のワクチンでは10匹中5匹（10日後）であった。【００６６】
以上の結果から、本発明のCVP添加粘膜ワクチンは優れた感染予防効果を有することが確認された。
【実施例５】
【００６７】
[超音波処理を含まない製造工程B]
実施例１と同様のHA抗原蛋白液に、凍結乾燥したADビークル粉末を純水に溶解して加え、次いでこの混合液に純水に溶解した1.0% CVPを等量混合して懸濁液を調整した。これを、超音波処理すること無くウォーターバスを用いて10分間42℃に加温処理し、加温処理中3分、7分時にミキサーで10秒間攪拌して液を均一化にした。加温処理後、懸濁液を-30℃〜-75℃で一晩凍結させ、凍結乾燥を行って乾燥粉末体を作成した。凍結乾燥粉末は-30℃で保存した。要事に凍結乾燥粉末を生理食塩水に懸濁して、CVP添加粘膜ワクチンとした。マウス１匹当たり片鼻2μLを両鼻に投与する合計4μLに含まれるワクチン液中のCVPは0.5%、HA抗原蛋白量は0.2 μg、ADビークルのリン脂質量は2.0 μgに調整した。以下、このCVP添加粘膜ワクチンをHA+SF-10-Bと記載する。
【実施例６】
【００６８】
[超音波処理を含まない製造工程C]
実施例と同様のHA抗原蛋白液に、凍結乾燥したADビークル粉末を純水に溶解して混合調整した。この懸濁液を、ウォーターバスを用いて10分間42℃に加温処理し、加温処理中3分、7分時にミキサーで10秒間攪拌して液を均一化にした。加温処理後、懸濁液を-30℃〜-75℃で一晩凍結させ、凍結乾燥を行って乾燥粉末体を作成した。凍結乾燥粉末は-30℃で保存した。要事に凍結乾燥粉末を、あらかじめ生理食塩水に溶解した0.5% CVP液で泡立たないように軽く攪拌、溶解してCVP添加粘膜ワクチンとした。マウス１匹当たり片鼻2μLを両鼻に投与する合計4μLに含まれるHA抗原蛋白量は0.2 μg、ADビークルのリン脂質量は2.0 μgである。以下、このCVP添加粘膜ワクチンをHA+SF-10-Cと記載する。
[試験５]【００６９】
実施例１（以下、「HA+SF-10-A」と記載する）、実施例５（HA+SF-10-B）、および実施例６（HA+SF-10-C）の各CVP添加粘膜ワクチンを、それぞれマウス（各群10匹）に試験例１と同様に接種（2週間間隔で３回）し、試験例１と同様に抗インフルエンザIgAおよびIgG抗体を測定した。【００７０】
結果は表４に示したとおりである。実施例６（HA+SF-10-C）は、実施例１（HA+SF-10-A）および実施例５（HA+SF-10-B）と比べてIgA量において約２−4倍、IgG量において約２倍の抗体誘導効果を示した。すなわち、実施例６の方法（工程C）は、超音波処理工程を含まないことと、CVP液の添加を最終工程で行なうことによって、その優れた抗体誘導効果をもたらすことが推定された。【００７１】
【表４】
2011108521.tif 000006
[試験６]【００７２】
本発明のCVP添加粘膜ワクチンの各組成（HA抗原蛋白、ADビークル、CVP）の状態を、透過型電子顕微鏡で観察した。図７に示したように、CVPは抗原とADビークルとの結合を大幅に増加させていることが確認された。【００７３】
CVPは、鼻腔内での有効成分の滞留性を改善する増粘剤ポリマーの一つとして、ヒドロキシポロピルセルロース（特許文献４）、アルギン酸ナトリウム（特許文献７）、その他の賦形剤と同様に、増粘剤として使用されてきた（特許文献５、６）。しかし、この試験６の結果が示すように、本発明におけるCVPがADビークルとの組合せにおいて、抗原とADビークルとの結合を増強させ、抗原提示細胞に取り込まれる抗原量を増加させ、ADビークル効果を増強していることが判明した。
[試験７]【００７４】
実施例１に記載したSF-10（ADビークル+CVP）(20μg)と、蛍光色素ATTO488でラベルした実施例１記載のHA抗原蛋白(2μg)とを混合して、マウス骨髄由来樹状細胞（2×105 cells）に添加し、1時間後に蛍光色素標識HA抗原蛋白によってラベルされた樹状細胞の蛍光標識量をフローサイトメトリーにより測定した。また、比較例５に記載のpoly (I:C)（10μg）と前記の蛍光標識HA抗原蛋白（2μg）とを混合し、同じく樹状細胞が示す蛍光標識抗原量を測定した。樹状細胞が示す蛍光は、蛍光色素標識HA抗原蛋白の細胞への結合と取り込み量を反映する。【００７５】
結果は図８に示したとおりである。Poly(I:C)には蛍光色素標識HA抗原蛋白の樹状細胞への結合と取り込み量を促進しなかったが、SF-10は有意な促進効果を示した。【００７６】
以上の結果から、本発明のSF-10粘膜ワクチンは、抗原提示細胞への抗原蛋白の結合及び取り込みを促進することによって、抗体産生量を増加させ、さらには優れた感染防御能を発揮していることが確認された。
[試験８]【００７７】
1 mLのcRPMI培地で培養したマウス骨髄由来樹状細胞（2 × 105 cells）に、以下を添加し、1時間後の樹状細胞の活性化を樹状細胞の活性化マーカーの一つであるCD86発現増加を指標にフローサイトメトリーにより測定した。なお、計測にはFACSCalibur cytometer （BD Biosciences、アメリカ、マサチューセッツ）を、データ処理にはCellQuest software （BD Bioscience、アメリカ、マサチューセッツ）を用いCD86の発現を測定した。
・生理食塩水
・生理食塩水＋HA抗原蛋白
・SF-10
・SF-10＋HA抗原蛋白
・Poly(I.C.)
・Poly(I.C.)＋HA抗原蛋白
なお、HA抗原蛋白（2μg）およびSF-10（20μg）は実施例１に記載のものであり、Poly(I.C.)（10μg）は比較例５と同一のものを使用した。【００７８】
結果は図9に示したとおりである。Poly(I:C)は、試験２と同様に単独でCD86の発現を増加（樹状細胞を活性化）するが、抗原を添加してもCD86の発現はさらに増加することはなかった。これに対して、SF-10はそれ単独で樹状細胞を活性化しないが、抗原の共存下でのCD86発現量は約2倍に増強された。【００７９】
以上の結果から、本発明のCVP添加粘膜アジュバントのSF-10は、抗原を抗原提示樹状細胞に運搬して樹状細胞を活性化し、抗体産生を促進していることが推定された。【００８０】
なお、同じく樹状細胞の活性化マーカーの一つであるCD40でも同様の結果が得られた。
[試験９]【００８１】
試験８において、in vitroで確認したSF-10の抗原運搬に依存した樹状細胞活性化をマウス個体（in vivo）で試験するため、試験８と同一の以下をマウス鼻腔内に投与した。
・生理食塩水
・生理食塩水＋HA抗原蛋白
・SF-10
・SF-10＋HA抗原蛋白
なお、動物実験は試験１に準じておこなった。HA抗原蛋白（0.2 μg）およびSF-10（2 μg）は実施例１に記載のものであり、Poly(I.C.)（2 μg）は比較例５と同一のものを使用した。【００８２】
経鼻接種後48時間にマウスから頭部を切断し、鼻腔内組織を採取し、コラゲナーゼ処理（1 mg/mL、37℃、30分振蕩）を行った。メッシュでろ過した後、遠心（4℃、10分、200×g）により回収した細胞から、Anti-CD11c (N-418)-conjugated magnetic beads（Miltenyl Biotech、ドイツ、ベルギッシュグラートバッハ）、LSカラムを用いたVarioMACS（Miltenyi Biotec、ドイツ、ベルギッシュグラートバッハ）法にて、説明書に記載された方法に従い樹状細胞を調整した。次いで試験８と同様な方法で、CD86の発現増加を測定した。【００８３】
結果は図10に示したとおりである。マウスの鼻腔においても、SF-10の抗原運搬に依存した樹状細胞活性化が確認された。
[試験１０]【００８４】
CVPの好ましい濃度を試験した。
CVPとしてSigma社製のpAA130を使用し、その濃度を0.1％、0.25％、0.5％、0.75％または1.0％とした以外は、実施例6と同様の方法によりCVP添加粘膜ワクチンを製造し、試験例１記載の方法によりマウスの鼻洗浄液IgAおよび血清IgGを測定した。【００８５】
結果は表５に示したとおりであり、IgA、IgGともにCVP pAA130濃度0.5%まではCVP量の増加に従った抗体誘導効果の上昇が認められた。CVP 0.5%をピークとしてこれよりも高い濃度のCVPを用いた際には逆に抗体誘導効果が減少する傾向が認められた。【００８６】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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