(57)【要約】移植対象にＣＲが明白な臨床的または組織学的出現として検出される前に移植生検試料組織に差次的に発現される遺伝子に基づいて、移植対象における慢性拒絶反応（ＣＲ）を早期に診断する方法；ＣＲを発症するおそれのある移植対象でＣＲを監視する方法；移植対象でＣＲを予防、阻止、軽減または処置する方法；またはＣＲを予防、阻止、軽減または処置するために使用する薬剤を確認する方法；の各々を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルをベースライン値とすること、但し、この遺伝子はＣＲを発症しないことが知られている移植対象の特異的同種移植組織生検試料に由来する；
ｂ）移植後１年以内の患者から採取したａ）と同じ組織型の同種移植組織生検試料内のａ）で確認された遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルを検出すること；および
ｃ）第一の値を第二の値と比較すること；
を含む移植対象における慢性拒絶反応（ＣＲ）を早期に診断する方法；
但し、ここに第二の値よりも低いか高い第一の値はその移植対象がＣＲを発症するおそれのあることを予測するものである。
【請求項２】
ベースライン値ａ）が移植の日にドナーから採取した同種組織生検試料内の遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルを検出することによって得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）ＣＲ阻止剤投与前に移植対象から投与前サンプルを採取すること；
ｂ）投与前サンプル中の遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルを検出すること；
ｃ）その移植患者から投与後サンプルを１個またはそれ以上採取すること；
ｄ）投与後サンプル１個またはそれ以上中の遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルを検出すること；
ｅ）投与前サンプル中の遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルと投与後サンプル１個またはそれ以上の中にある遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルとを比較すること；および
ｆ）その結果にしたがって薬剤を調整すること；
を含む、ＣＲを発症するおそれのある移植対象のＣＲを監視する方法。
【請求項４】
ＣＲの症状少なくとも一つを改善することを目的として請求項１または２に記載の遺伝子または遺伝子産物の１種またはそれ以上の合成、発現または活性を変調する化合物を対象に投与することを含む、処置が必要とする移植対象のＣＲを予防、阻止、軽減または処置する方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の遺伝子または遺伝子産物の１種またはそれ以上のｍＲＮＡ発現のレベルを監視することを含む、ＣＲの予防、阻止、軽減または処置に使用する薬剤を確認する方法。
【請求項６】
移植対象が腎移植対象である、請求項１、３または４に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子が表１および／または表２および／または表３に記載の遺伝子の群から選択される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子発現のレベルを遺伝子発現産物に対応するプロテインの存在を検出することによって評価する、請求項１、３、４または５に記載の方法。
【請求項９】
プロテインの存在をそのプロテインに特異的に結合する試薬を使用して検出する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子１種またはそれ以上のｍＲＮＡ発現のレベルをノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよび実時間定量的ＰＣＲから構成される群から選択される技術によって検出する、請求項１、３、４または５に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子セットのｍＲＮＡ発現のレベルを検出する、請求項１、３、４または５に記載の方法。
【請求項１２】
表１、表２または表３に記載の遺伝子またはその発現産物の、慢性移植片拒絶反応の早期バイオマーカーとしての使用。
【請求項１３】
エクソン４欠失ＦＡＳ遺伝子、網膜芽腫結合プロテイン７、プロヒビチンおよび結合組織成長因子を除く表１、表２または表３に記載された遺伝子またはその発現産物の、慢性移植片拒絶反応バイオマーカーとしての使用。
【請求項１４】
表１、表２または表３に記載する遺伝子またはその発現産物１種またはそれ以上の合成、発現または活性を変調する化合物の、移植対象におけるＣＲを予防または処置するための薬剤を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明はレシピエントに移植された組織または器官の状態を監視する方法に関する。特に本発明は慢性同種移植片拒絶反応の早期予測における遺伝子発現分析の使用に関する。
【０００２】
慢性同種移植片拒絶反応（ＣＲ）は移植片が長期に定着できない原因の主なものである。急性拒絶エピソードが処置可能なのとは対照的に、組織学的に検出された場合、慢性拒絶反応は今日まで如何なる処置によっても回復できず、如何なる免疫抑制処置による予防の可能性も証明がなく、その病理学は完全には理解されていないが免疫学的ならびに非免疫学的な因子を含むとされている。全ての固形器官移植片における慢性拒絶反応の特徴は血管リモデリングによる同心性動脈内膜肥厚である。慢性拒絶反応を示す腎臓同種移植片はさらに顕著な実質線維形成および糸球体硬化を示し：臨床的にはＣＲでは蛋白尿および高血圧を伴う腎機能の進行性低下が顕在化する。
【０００３】
移植研究におけるバイオマーカーを探求する試みは主に仮説主導型であって個々の遺伝子、多形、生化学的または組織病理学的特性の決定に到った。しかしこれらの研究は大部分が疾患の明白な兆候が証明された組織標本について行われたのでその疾患の将来の重症化との関連のみを明らかにした。
【０００４】
特に、臨床的または組織学的症状発現が顕示される前、たとえば移植後１年以内のＣＲの予後経過を早期予測し、追跡調査するために信頼できる手段を持つことが必要である；たとえば実施中の治療処置の最適化および新規ＣＲ阻害剤を含む臨床試験の設計のためにそのような手段は価値があろう。
【０００５】
本発明はＣＲ発症前の移植生検試料、たとえば腎生検で、生検試料採取後にＣＲを発症する患者とそうでない患者において差次的に（differentially）発現される遺伝子の確認に関する。こうして得られるこの遺伝子の部分集団が示す遺伝子発現パターンはＣＲの出現について統計学的に高度に有意な予測可能性を可能にする。たとえば、ＣＲが組織学的に顕示される前に移植後腎生検試料で確認された遺伝子を表１（上方制御された遺伝子）および表２（下方制御された遺伝子）に、および好適な遺伝子副集団を表３に示す。この明細書に開示する遺伝子６５個の完全配列は表１〜３に記載するGenBank受託番号を使用して入手できる。対応する各GenBank受託番号で示す配列は参考のために本明細書に引用するものである。
【０００６】
本研究で確認された各遺伝子は移植対象におけるＣＲの予後経過を予測するための有用なバイオマーカーである。これら遺伝子少なくとも１種の選択はＣＲの予後経過を早期に予告するバイオマーカー代替物（surrogate）として利用できる。殊に有用な態様ではこれら遺伝子の複数、たとえば腎生検試料の場合は表３に記載する遺伝子１０個を選択し、そのｍＲＮＡ発現を同時に監視して様々な側面における使用のために発現プロファイルを提供することができる。
【０００７】
したがって、本発明はたとえば明白な臨床的または組織学的発現などが現れる前、たとえば移植後１年以内などでのＣＲに対するバイオマーカーとして、慢性移植片拒絶反応の早期バイオマーカーとしての表１、表２または表３に示す遺伝子の発現産物（たとえばこの遺伝子がコードするプロテイン）の使用を提供する。
【０００８】
他の側面では、本発明は、エクソン４欠失ＦＡＳ遺伝子、網膜芽腫結合プロテイン７、プロヒビチンおよび結合組織増殖因子を除く表１、表２または表３に記載された遺伝子の慢性移植片拒絶反応のバイオマーカーとしての使用を提供する。
【０００９】
他の態様では、この遺伝子発現産物（プロテイン）のレベルを、これに限定するものではないが血液、血清、リンパ液、尿、糞便および胆汁を含む様々な体液または生検試料組織中で監視できる。この発現産物のレベルはＣＲを早期に診断するマーカーの代替として使用でき、また治療法に対する応答の指標をも提供できる。その一例はたとえば結合組織成長因子（GenBank受託番号Ｘ７８９４７）がコードするプロテインである。
【００１０】
したがって、本発明はまた表１、表２または表３に記載する遺伝子の発現産物（たとえばこの遺伝子がコードするプロテイン）の慢性移植片拒絶反応のための早期バイオマーカー、たとえば明白な臨床的または組織学的出現の前、たとえば移植後１年以内に用いるＣＲ用バイオマーカーとしての使用も提供する。
【００１１】
さらに別な側面では、本発明はエクソン４を欠失するＦＡＳ遺伝子、網膜芽腫結合プロテイン７、プロヒビチンおよび結合組織成長因子を除く表１、表２または表３に記載する遺伝子の発現産物（たとえばこの遺伝子がコードするプロテイン）の慢性移植片拒絶反応を表すバイオマーカーとしての使用も提供する。
【００１２】
本発明の方法は試験管内で実施してもよく、たとえばバイオマーカーのレベルは移植対象から抽出したまたは得られた組織中または体液中で分析してもよい。
【００１３】
ｍＲＮＡの発現レベルを検出する方法は当技術分野でよく知られており、これに限定するものではないが、逆転写ＰＣＲ、実時間定量的ＰＣＲ、ノーザンブロット法およびその他のハイブリッド形成法を含む。
【００１４】
開示する複数の遺伝子から得られるｍＲＮＡ転写のレベルを検出するために特に有用な方法には標識したｍＲＮＡの整備されたオリゴヌクレオチドアレイへのハイブリッド形成を含む。この方法でこれら複数の遺伝子の転写レベルを同時に決定して遺伝子発現プロファイルまたはパターンを作製することが可能になる。ＣＲを発症するおそれのある移植対象から採取した生検試料から誘導した遺伝子発現プロファイルとＣＲを発症しない移植対象から採取したサンプルから誘導した遺伝子発現プロファイルとを比較できる。
【００１５】
さらに別の態様では、この遺伝子単数または複数またはそれがコードするプロテインの発現プロファイルを測定することでＣＲの阻止、たとえばＣＲを予防または処置するための薬剤の効果を試験するために有用な分子的用具を提供できよう。移植患者が治療している間に発現プロファイルがベースラインプロファイルから変化する。したがって、この発明はまた対象がＣＲ療法に応答する蓋然性を決定するために移植対象をスクリーニングする方法；ＣＲのサインを示す移植対照を処置するために有用な薬剤を確認する方法；およびＣＲを処置するための薬剤の効果を監視する方法；を提供する。
【００１６】
一側面では、本発明は被験移植対象でのＣＲ発症前に所与の組織型の同種移植片において差次的に発現される遺伝子少なくとも１種を
ｉ）ＣＲを発症しないことが知られている対照移植対象の同一な組織型から得た遺伝子発現ベースラインプロファイル；または
ｉｉ）移植の日に被験移植対象から得た遺伝子発現ベースラインプロファイル；
と比較して確認する方法（たとえば試験管内法）を特徴とする。
【００１７】
用語「差次的に発現される」は所与の同種移植遺伝子の発現レベルを示し、対応するベースライン発現レベルの量より実質的に大きいかまたは小さい量として定義される。
【００１８】
他の側面では、本発明は所与の同種移植組織標本において差次的に発現される遺伝子を検出することによって被験移植対象におけるＣＲを早期に診断する方法（たとえば試験管内法）を提供する。たとえば、この方法は下記を含むこともある：
ａ）ＣＲを発症しないことが知られている対照移植対象の特定同種移植片組織生検試料に由来する遺伝子、たとえば表１および表２または表３に記載するような遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルをベースライン値として採用すること；
ｂ）移植後１年以内の被験移植対象から採取したａ）と同じ組織型の同種移植組織生検試料内のａ）で確認された遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルを検出すること；および
ｃ）第一の値と第二の値とを比較すること；
ここで、第二の値よりも低いかまたは高い第一の値はその被験移植対象がＣＲを発症するおそれのあることを予測するものである。
【００１９】
他の態様にしたがえば、本方法（たとえば試験管内法）は次を含むこともある：
ａ）移植の日にドナー、好ましくは生存ドナーから採取した同種移植片組織生検試料内のたとえば表１および表２または表３に記載のような遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルを検出すること；
ｂ）移植後１年以内の患者から採取した同種移植組織生検試料中のａ）で確認した遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルを検出すること；および
ｃ）第一の値と第二の値とを比較すること；
ここに第二の値よりも低いか高い第一の値はその移植対象がＣＲを発症するおそれのあることを予測する。
【００２０】
前記段階ｂ）ではｍＲＮＡまたはコードされるプロテインのレベルは好ましくは移植後４〜７ヶ月以内、さらに好ましくは移植後約６ヶ月目頃に検出する。
【００２１】
ＣＲ発症前またはＣＲの早期診断とは、ＣＲの明白な臨床的または組織学的出現の何れよりも前に移植対象でＣＲを検出することを意味する。
【００２２】
本発明によるＣＲの早期診断法は維持患者、すなわち１年またはそれ以上前に移植した患者に適用してもよい。したがって生検を行い、遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現のレベルを参考対照値におけるレベルと比較して、その後１、２ヶ月の間にＣＲを発症する患者を確認する。
【００２３】
別な側面では、本発明はＣＲ阻害剤（たとえば低分子、抗体またはその他の治療剤または候補薬剤）を用いてＣＲを発症するおそれのある移植対象におけるＣＲを監視、たとえば予防または阻止または軽減または処置する方法を提供する。本発明のマーカーの発現レベルについて薬剤（たとえば薬剤化合物）の影響を監視することは基本的薬剤検索に適用できるばかりでなく、臨床試験にも適用できる。たとえばマーカー発現に影響を与える薬剤の効果はＣＲ阻止についての処置を受けている移植対象の臨床試験において監視できる。
【００２４】
そのような方法は次の各項を含む：すなわち
ａ）薬剤投与前に移植対象から投与前標本を採取すること；
ｂ）投与前標本中の遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡの発現またはそれがコードするプロテインのレベルを検出すること；
ｃ）その移植患者から投与後標本を１個またはそれ以上採取すること；
ｄ）単数または複数の投与後標本における遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡの発現またはそれがコードするプロテインのレベルを検出すること；
ｅ）投与前標本内の遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルと投与後標本単数または複数内にある遺伝子少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルとを比較すること；および
f）それ相当に薬剤を調整すること。
【００２５】
たとえば、投与薬剤の増量または減量が少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを検出されたレベルよりも高くまたは低く変化させるために望ましいことがある。前記方法においてその薬剤は単独でまたは、好ましくは免疫抑制剤および／またはＣＲに有効な薬剤など他の薬剤との併用療法として投与できる。
【００２６】
したがってヒト生検試料、たとえばヒトの腎プロトコル生検試料から得た遺伝子発現プロファイルデータの取込みはＣＲに向けた進行の処置および予防を目的とする臨床的試験用患者選択の過程を改善するために役立つと思われる。
【００２７】
さらに別な側面では、本発明はさらに前記遺伝子少なくとも１種のｍＲＮＡ発現またはそれがコードするプロテインのレベルを監視することを含む、ＣＲの予防、阻止、低減または処置に使用する薬剤を確認する方法を提供する。
【００２８】
別な側面では、本発明はその処置を必要とする移植対象のＣＲを予防、阻止、軽減または処置するための方法であって、表１、表２または表３に記載する遺伝子または遺伝子産物１種またはそれ以上の合成、発現または活性を変調する化合物をＣＲの症状の少なくとも１つを改善するようにその対象に投与することを包含する方法を提供する。
【００２９】
別な側面では、本発明は前記遺伝子（たとえば表１、表２または表３に記載の遺伝子）または遺伝子産物１種またはそれ以上の合成、発現、活性を変調する化合物（たとえば低分子、抗体またはその他の治療剤または薬剤候補）を、たとえば移植対象におけるＣＲの予防または処置用の医薬として使用するために提供する。
【００３０】
別な側面では、本発明は前記遺伝子（たとえば表１、表２または表３に記載の遺伝子）または遺伝子産物１種またはそれ以上の合成、発現、活性を変調する化合物（たとえば低分子、抗体またはその他の治療剤または薬剤候補）の、たとえば移植対象におけるＣＲの予防または処置用医薬としての使用を提供する。
【００３１】
別な側面では、本発明は前記遺伝子（たとえば表１、表２または表３に記載の遺伝子）または遺伝子産物１種またはそれ以上の合成、発現、活性を変調する化合物（たとえば低分子、抗体または他の治療剤または薬剤候補）の移植対象におけるＣＲを予防または処置するための薬剤を製造するための使用を提供する。
【００３２】
移植対象とはドナー、好ましくは同種のドナーから組織または器官、たとえば腎臓、心臓、肺臓、心臓および肺臓の組合せ、肝臓、膵臓、胃腸（たとえば大腸、小腸、十二指腸）、ニューロン組織、四肢の提供を受けた対象を意味する。
【００３３】
本発明方法では好ましくは１種以上の遺伝子、たとえば遺伝子のセットを使用する。本発明の方法は腎移植には殊に好適である。
【００３４】
既述のように表１、表２または表３に記載した遺伝子少なくとも１種のいかなる選択も使用できる。好ましくは、表１の遺伝子少なくとも１種、たとえばＯＲＰ１５０（酸素制御プロテイン１５０）、チオレドキシン、ＯＳ−９、ＮＰＲＬ２、ＨＯＸＢ７、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＦＧＦなどおよび／または表２の遺伝子少なくとも１種、たとえばプロラクチン受容体、などの選択が使用される。表３の好適な遺伝子はたとえばＯＳ−９、ＮＰＲＬ２、ＨＯＸＢ７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＢＦＧＦである。本明細書に記載する遺伝子の大部分は腎臓同種移植拒絶反応に結び付けられていないが、様々な機能に関連がある。たとえば、ＯＳ−９はＡＰＲＩＬ（ロイシン豊富な酸性プロテイン）とも呼ばれ、酸性核燐蛋白質３２ファミリーの一員であり、推測上のＨＬＡクラスII関連プロテインであるＰＨＡＰＩとの配列相同性を有する。ＯＳ−９はまた骨髄性白血病に関連するプロトオンコジーンＤＥＫおよびＳＥＴプロテインとも配列類似性を有する。ＯＢＣＭＬ（オピエート結合プロテイン／細胞接着分子様）は小脳の領域に発現するとの報告のみがあるが、腎臓については記載がない。酵母窒素透過酵素制御遺伝子に配列類似性を持つ腫瘍抑制遺伝子ＮＰＲＬ２は、肺癌および乳癌の進行に関与する同じ領域内にある腫瘍抑制遺伝子２５個の一つとしてヒト染色体の領域３ｐ２１.３に存在することが証明されている。
【００３５】
遺伝子発現プロファイルはたとえばAffymetrixマイクロアレイ技術を使用して作製できる。マイクロアレイは当技術分野で知られており、配列が遺伝子産物（たとえばｍＲＮＡ、ポリペプチド、その断片など）に対応するプローブが所定の位置に特異的にハイブリッドを形成するか、または結合できる表面からなる。スキャナで検出されるハイブリッド形成強度のデータは自動的に取得され、GENECHIPRソフトウェアで処理される。原データは標的強度２００を使用して発現レベルに標準化する。
【００３６】
細胞の転写状態は当技術分野で知られている他の遺伝子発現技術で測定してもよい。そのような技術数種は電気泳動分析のために複雑性の限定された制限断片の集合を製造するが、たとえばフェージングプライマーを用いる二重制限酵素消化法（たとえばEPA10534858）、または一定のｍＲＮＡ末端に最接近する部位を持つ制限断片を選択する方法（たとえばPrashar et al, Proc. Nat. Acad. Sci., 93, 659 - 663, 1996）などのようなものである。他の方法は、たとえば各多重ｃＤＮＡ内の十分な塩基を（たとえば２０〜５０塩基）各ｃＤＮＡを確認するために配列決定することによって、または所定のｍＲＮＡ末端（たとえばVelculescu, Science, 270, 484 - 487, 1995）経路パターンに関する既知の位置で作製される短い（たとえば９〜１０塩基）タグを配列決定することによってｃＤＮＡプールを統計的に採取する。
【００３７】
本発明の他の態様では、マーカーに対応するプロテインを検出する。本発明のプロテインを検出する好適な薬剤はたとえばそのプロテインに結合できる抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体はポリクローナルであっても、または好ましくはモノクローナルであってもよい。未処理の抗体またはその断片（たとえばＦａｂまたはＦ（ab'）2）も使用できる。用語「標識」には検出可能な物質を抗体に結合することによって直接抗体を標識することならびに直接的に標識された他種試薬との間の反応性によって間接的に抗体を標識することを包含することが意図されている。あるサンプルに所与の抗体に結合するプロテインがあるかどうかを決定するには様々な形態を採用できる。そのような形態の例にはたとえば酵素免疫検定、放射免疫検定、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡが含まれる。
【００３８】
好適な態様では、前記方法の計算段階はコンピュータシステムにまたはコンピュータシステムのネットワーク１個またはそれ以上に組み込まれ、生物学系のモデルを形成し、試験するために強力で便利な装置が提供される。このコンピュータシステムは内部装置を含み、外部装置にリンクする単一のハードウェアプラットフォームであってもよい。このコンピュータシステムの内部装置は主メモリーに接続するプロセッサ素子を含む。外部装置は大量データ用ストレージも含む。この大容量データ用ストレージは単一またはそれ以上のハードディスクであることができる。他の外部装置にはモニターとキーボードであることのできるユーザーインターフェース装置をポインティング装置または他のグラフ入力装置とともに含む。典型的にはこのコンピュータシステムは他のローカルなコンピュータシステム、リモートコンピュータシステムまたは広域通信ネットワーク、たとえばインターネットにリンクする。このネットワークリンクはそのコンピュータシステムが他のコンピュータシステムとデータおよび処理タスクを共有することを可能にする。
【００３９】
このシステムの操作に当り当技術分野で標準的なソフトウェアと本発明に特定的なソフトウェア数種を記憶装置にロードする。これらのソフトウェアは集合的にコンピュータシステムをこの発明の方法にしたがって機能させる。これらソフトウェアは典型的には大容量ストレージに蓄積されるか、またはたとえばフロッピーディスクまたはＣＤ−ＲＯＭなど取外し可能な記憶装置に蓄積される。このソフトウェアはコンピュータシステムおよびそのネットワークの相互結合を処理するオペレーティングシステムを代表し、好ましくはこの発明の方法は数学的ソフトウェアパッケージの中にプログラムされ、等式のシンボル的エントリーおよび使用するアルゴリズムを含む高レベルな処理様式を可能にし、それによって必要とするユーザを個々の等式またはアルゴリズムの処理プログラム作成から開放する。
【００４０】
好適な態様では、分析用ソフトウェアは実際には相互に作用する個別なソフトウェアを含む。分析用ソフトウェアはこのシステムの操作に必要な全てのデータを含むデータベースを代表する。そのようなデータは一般的にはこれに限定するものではないが、以前の実験結果、ゲノムデータ、実験の操作および費用、その他の情報を含むが、これは当技術分野の熟練者には明らかである。分析用ソフトウェアは本発明の分析方法を行うプログラム１種またはそれ以上を包含するデータ圧縮および演算装置を含む。分析用ソフトウェアはコンピュータシステムのユーザにテストネットワークモデルの制御および入力と要すれば実験データの入力を提供する、ユーザーインターフェースも含んでいてもよい。このユーザーインターフェースはこのシステムに仮説を特定するためのドラッグアンドドロップインターフェースを含んでいてもよい。このユーザーインターフェースは実験データを大容量ストレージから、取外し可能なメディアから、または異なるコンピュータシステムからこのシステムにネットワークを経て通信してロードする手段を有していてもよい。
【００４１】
本発明はこの発明に記載のマーカー、たとえばｍＲＮＡを少なくとも１種を含むデータベースを作製する手順も提供する。たとえば、ポリヌクレオチド配列は標準化された遺伝子の表現のためのデータ操作システムがＣＲの予後経過を早期に確認できるようにデジタルストレージ媒体に蓄積される。このデータ処理システムは異なる時点、たとえば移植日および移植後に採取した組織サンプル２個の間の遺伝子発現を分析するために有用である。分離したポリヌクレオチドを配列決定する。標本から得た配列は相同性検索技術を使用してデータベースに存在する配列と比較してもよい。別のコンピュータシステムおよびこの発明の分析を実行する別の方法は当技術分野の熟練者には明白になるであろうし、添付する請求項の範囲内にあると理解することが意図されている。
【００４２】
ＣＲの予後経過を示すマーカーの確認
無作為、多施設、二重盲検、二重ダミー、平行グループ研究の一部として、移植時（ベースライン）、次に移植後６ヶ月および１２ヶ月に一連の腎プロトコル生検を行う。
【００４３】
これら生検試料からＲＮＡを抽出したが全ＲＮＡの合計収率は約１０ｎｇから約１.５μｇまでの範囲に過ぎない。殆どの標本は３０ｎｇ以下の全ＲＮＡを含み、この量は購入できるＲＮＡ標識キットとそれに続くマイクロアレイ実験の方法に必要な最低量１〜５μｇよりもはるかに低い。マイクロアレイ実験に十分な量のＲＮＡを得るために線状ＲＮＡ増幅を行う。要約するとこの方法は１回当り元の量を２０〜３０倍に増幅するｃＤＮＡおよびａＲＮＡ合成を複数回反復する。ＲＮＡ標本９０個を増幅し、標識する。ヒト遺伝子約１２０００個のオリゴヌクレオチドプローブを含むAffymetrix HG U95A v2チップにａＲＮＡをハイブリッド形成させ、分析する。
【００４４】
組織の均質化
液体窒素で瞬間凍結した生検サンプルは全て寒冷管中−８０℃で保管する。ホモジナイザー緩衝液（ABI lysis buffer／ＰＢＳ１：１）７００μＬを添加直後にPolytron rotor/stator homogenizer PT3100のロッドを緩衝液含有組織に潜らせて均質化工程を行い、ホモジェナイザーを最高速で３０秒間作動させる。作動時間後に残存する組織片が見えればこの操作を均質性が達成されるまで反復する。その後ホモジェネートをＲＮＡ抽出段階に使用するまで−８０℃で保管する。
【００４５】
ホモジェネートの前濾過およびＲＮＡの抽出
ホモジェネートの前濾過およびＲＮＡ抽出はABI 6700 Biorobot ワークステーション（Applied Biosystems, USA）で行う。組織のホモジェネートを９６深ウェルプレート（96 deep-well plate）のウェルに満たし、６７００ワークステーションの濾過液位置に設置する。組織前濾過トレーを精製カートリッジに入れ、この位置に固定する。装置の扉を閉じてワークステーションのソフトウェアを起動する。
【００４６】
ＲＮＡ抽出操作はサンプル移動段階、濾過段階、洗浄段階および溶離段階を含む。前濾過ホモジェネートを９６深ウェルプレートからＲＮＡ精製トレーに移動するサンプル移動段階は溶液５５０μＬの初期移動を含む。第二回の移動の前に均質化緩衝液（Applied Biosystems lysis buffer/ＰＢＳ １：１）１５０μＬを深ウェルプレートの各ウェルに加え、３回混合し，次にそこから１５０μＬを精製トレーに移す。濾過段階は８０％真空圧を１８０秒間適用して行う。洗浄段階は次のように行う：
段階１：４００μＬ  洗浄液１、８０％真空圧１８０秒間、２回；
段階２：５００μＬ  洗浄液２、８０％真空圧１８０秒間、１回；
段階３：３００μＬ  洗浄液２、６０％真空圧１２０秒間、２回。
【００４７】
９０％圧の溶離前真空を３００秒間適用する。その後の溶離段階では溶離液（Applied Biosystems）１２０μＬを加え、１００％真空圧を１２０秒間適用して行う。ＲＮＡ標本を９６ウェルプレート（Applied Biosystems）に集める。溶離物を等容の２部分に分割する。一方は−８０℃で保存し、他方はＲＮＡ増幅およびGeneChip分析に用いる。
【００４８】
ＲＮＡの増幅
ＲＮＡ増幅操作の前に、全ＲＮＡ溶離液をRNeasy kit chemistry（Qiagen）で処理して増幅の効果を妨害するかもしれない残存塩またはその他の物質からＲＮＡを浄化する。試料容積をＲＮａｓｅ不含水で１００μＬに調節する。緩衝ＲＬＴ３５０μＬを加え、よく混合する。エタノール（９６〜１００％）２５０μＬを加え、よく混合する。試料（７００μＬ）を２ｍＬ採集チューブ中のRNeasy mini columnに加える。１００００ｒｐｍ以上の遠心分離段階１５秒の後、通過液は廃棄する。RNeasy columnを新しい２ｍＬ採集チューブに移す。緩衝RPE５００μＬをカラム上にピペットで加え、チューブを閉じ１００００ｒｐｍ以上で１５秒間遠心分離してカラムを洗浄する。通過液を廃棄する。別な緩衝ＲＰＥ５００μＬをカラムに加え、チューブを１００００ｒｐｍ以上で２分間遠心分離してシリカゲル膜を乾燥する。溶離のために、RNeasy columnを新しい１.５ｍＬ採集チューブに移し、ＲＮａｓｅ不含水３０μＬを直接膜上に加える。１分間インキュベーションした後、チューブを１００００ｒｐｍ以上で１分間遠心分離して溶離する。この溶離段階を１回反復して溶離液の全容積を６０μＬとする。このＲＮＡをRibogreen法（Molecular Probes, Inc, USA）で定量する。各サンプルの全ＲＮＡ約１０ｎｇを使用してＲＮＡ増幅を３回行う。この増幅操作に使用する酵素および緩衝液は特に記載しないものは全てInvitrogen, Inc.（Carlsbad, CA, USA）から購入できる。合計１０ｍＬの全ＲＮＡを１０ピコモルのＴ７ポリｄＴプライマー［5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG（T）24］（Genset, Inc.）１１μＬ容と７０℃で１０分間、次に４２℃で５分間インキュベーションする。第一ストランドの反応は第一ストランド緩衝液、１０ｍＭ−ＤＴＴ、０.５ｍＭ−ｄＮＴＰ混合物、および１μＬＲＮａｓｅ阻害剤（Ambion, Inc.）の存在下にSuperScript IIを２００単位加え、２０μＬ容中４２℃で１時間インキュベーションして行う。第二ストランド合成は１×第二ストランド緩衝液、０.２ｍＭ−ｄＮＴＰ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ１０単位、および２単位のＲＮａｓｅＨ中で４０単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて１５０μＬ中で行う。１６℃で２時間インキュベーションした後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ８単位を加えて１６℃で１０分間処理して二重鎖ＤＮＡ末端を平滑にする。二重鎖ＤＮＡ産物をQIAquick PCR purification kit（Qiagen）で精製し、溶離緩衝液５０μＬで溶離する。１回目の増幅のみは真空下に溶離液を乾燥まで減容させ、ヌクレアーゼ不含水２２μＬに再懸濁し、次に下記のＲＮＡ標識反応に使用する。後続するラウンドの増幅では、溶離液を真空下に乾燥まで濃縮し、ヌクレアーゼ不含水８μＬ中に再懸濁し、反応容積２０μＬを製造者の指示書にしたがってAmbion MegAscript kitを用いるインビトロ転写反応に付す。３７℃で３時間インキュベーション後、ＲＮＡをRNeasy kit system（Qiagen）で精製する。ＲＮＡをＲＮａｓｅ不含水３０μＬで溶離し、真空下に乾燥まで濃縮し、ヌクレアーゼ不含水１１μＬに再懸濁する。
【００４９】
ＲＮＡ増幅の第二ラウンドは０.１ｍｇ/ｍＬランダム六量体プライマー１μＬを添加し、続いて７０℃で１０分間インキュベーションして開始する。この反応混合物を氷で冷却し、次に室温で１０分間インキュベーションし、ここで第一ストランド反応緩衝液の存在下にSuperScript II２００単位、ＲＮａｓｅ阻害剤２０単位、０.５ｍＭ−ｄＮＴＰおよび１０ｍＭ−ＤＴＴを加えると第一ストランドの合成が始まる。この混合物を３７℃で１時間インキュベーションする。３７℃で２０分間ＲＮａｓｅ Ｈ（２単位）処理をすると残留ＲＮＡが分解する。ＲＮａｓｅＨを９４℃で２分間熱不活化し、混合物を氷で冷却する。第二ストランド合成は１００ピコモル−Ｔ７−ポリｄＴプライマー（前記参照）を加え、７０℃で５分間、続いて４２℃で１０分間インキュベーションして開始させる。第二ストランド合成は前記の通りに行い、ｃＤＮＡをQIAquick PCR purification kit（Qiagen）で精製する。これが増幅の最終ラウンドの増幅であれば溶離液の容積を乾燥まで真空下に減容させ、ヌクレアーゼ不含水２２μＬに再懸濁し、続いてインビトロＲＮＡ標識操作を行う（下記参照）。
【００５０】
増幅の第３ラウンドは真空下に溶離液を乾燥まで減容させ、ヌクレアーゼ不含水８μＬに再懸濁して準備した後、増幅の第二ラウンドと同じ操作を施す。増幅の各ラウンドでａＲＮＡに１５〜３０倍の増加が観察され、３ラウンド後にはメッセンジャーＲＮＡが５×１０５〜１.９×１０６倍に増幅された（最初の全ＲＮＡプール内に３.３％ポリ（Ａ）＋ＲＮＡがあると仮定）。標識されたＲＮＡを一重（１×）、二重（２×）または三重（３×）増幅したＲＮＡについて、各々９４℃で３５、２５または２０分間分画する。２×ＲＮＡおよび３×ＲＮＡにはＲＮＡの完全な分解を避けるためにもっと短いインキュベーション時間が選択される。
【００５１】
ＲＮＡのビオチン化段階は製造者の指示書によるHigh-Yield RNA Labeling Kit （Enzo Diagnostics, NY, USA; P/N900182）の使用を含む。初期段階では次の成分を混合する：
２２μＬ  ａＲＮＡ
４μＬ  １０×ＨＹ反応緩衝液
４μＬ  １０×ビオチン標識リボヌクレオチド
４μＬ  １０×ＤＴＴ
４μＬ  ＲＮａｓｅ阻害剤混合物
２μＬ  ２０×Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ。
この混合物を３７℃で３〜４時間インキュベーションする。標識したａＲＮＡは製造者の指示書にしたがってRNeasy chemistry（Qiagen）を用いて精製する。溶離液の容積は６０μＬであり、その２μＬを用いて２６０ｎｍでの吸光度で分光学的にＲＮＡ濃度を決定する。
【００５２】
ＲＮＡの断片化
標識ａＲＮＡ１５μｇを２０μＬ容中で５×ＭＥＳ断片化緩衝液４μＬおよびＲＮａｓｅ不含水を添加して断片化する。この混合物を９４℃で２０分間インキュベーションする。
【００５３】
１２×ＭＥＳ断片化緩衝液（１０００ｍＬ用）：
７０.４ｇ  ＭＥＳ遊離酸（１.２２Ｍ−ＭＥＳ、０.８９Ｍ−［Ｎａ＋］（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（Sigma, P/N M5287）
１９３.３ｇ  ＭＥＳナトリウム塩（Sigma, P/N M3885）
８００ｍＬ  ＤＥＰＣ水
フィルター（０.２μｍ）で濾過する。ｐＨは未調整で６.５〜６.７の間にある。
【００５４】
マイクロアレイハイブリッド形成混合物
ハイブリッド形成は３００μＬ容中で行う。断片化したａＲＮＡを２×ＭＥＳハイブリッド形成緩衝液１５０μＬ、ニシン精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）３μＬ、ＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍＬ）３μＬ、９４８ｂ対照オリゴヌクレオチド（５ｎＭ）３μＬおよび２０×真核細胞ハイブリッド形成対照（Affymetrix）３μＬと混合する。ＤＥＰＣ水を最終容積３００μＬまで加える。
【００５５】
２×ＭＥＳハイブリッド形成緩衝液（５００ｍＬ用）：
２１７ｍＬ  ＤＥＰＣ水
２００ｍＬ  ５Ｍ−ＮａＣｌ
８２ｍＬ  １２×ＭＥＳ
フィルター（０.２μｍ）で濾過し、１０％トリトンＸ−１００を１.０ｍＬ添加する。室温で保存する。
【００５６】
マイクロアレイの前処理
マイクロアレイを４５℃で１５分間インキュベーションする。アレイチャンバーを新たに調製し、予め４５℃に加温しておいた前処理溶液で満たす。
【００５７】
前処理溶液（マイクロアレイ毎に３００μＬ）
２９４μＬ  １×ＭＥＳハイブリッド形成緩衝液
３μＬ  アセチル化ＢＳＡ（５０ｍｇ/ｍＬ）（Gibco BRL Life Technologies, P/N15561-020）
３μＬ  ニシン精子ＤＮＡ（１０ｍｇ/ｍＬ）（Promega / Fisher scientific, P/N D1811）
【００５８】
マイクロアレイハイブリッド形成
マイクロアレイを４５℃で前処理する一方で、ハイブリッド形成混合物を９９℃で５分間インキュベーションする。１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清液を新しいエッペンドルフチューブに移し、４５℃で５分間インキュベーションする。前処理溶液をマイクロアレイチャンバーから除き、発泡を避けながらハイブリッド形成混合物と交換する。プラスチック製カートリッジの隔壁をテープで覆い、カートリッジを４５℃のオーブンに入れ、ガラス製の前面を下ろす。ハイブリッド形成を１６〜１８時間継続する。
【００５９】
洗浄操作
ハイブリッド形成混合物をプローブアレイから取り除き、遠心分離管に取っておく。１×ＭＥＳハイブリッド形成緩衝液２８０μＬをチャンバーに加え、６×ＳＳＰＥ−Ｔ緩衝液を用いてGeneChip Fluidics Station 400上で液体洗浄を行う。
【００６０】
６×ＳＳＰＥ−Ｔ洗浄緩衝液（１０００ｍＬ）
３００ｍＬ  ２０×ＳＳＰＥ（BioWhittaker, P/N16-010Y）
６９９ｍＬ  水
フィルター（０.２μｍ）で濾過する。１０％トリトンＸ−１００を１ｍＬ加える。流体洗浄後、ＳＳＰＥ−Ｔ緩衝液をチャンバーから除き、泡を避けながらストリンジェント洗浄緩衝液で満たす。
【００６１】
ストリンジェント洗浄緩衝液（１０００ｍＬ）：
８３.３ｍＬ  １２×ＭＥＳ緩衝液
５.２ｍＬ  ５Ｍ−ＮａＣｌ
１ｍＬ  １０％トゥイーン２０
９１０.５ｍＬ  水
フィルター（０.２μｍ）で濾過する。１０％トリトンＸ−１００を１ｍＬ加える。マイクロアレイカートリッジを４５℃のインキュベーションオーブン内に表面を上向きにして３０分間置く。ストリンジェント緩衝液を除き、アレイを１×ＭＥＳハイブリッド形成緩衝液２００μＬで洗浄する。１×ＭＥＳハイブリッド形成緩衝液を完全に除き、アレイチャンバーをＳＡＰＥ染色液で満たし、３７℃で１５分間インキュベーションする。
【００６２】
ＳＡＰＥ染色液（６００μＬ）：
３００μＬ  ２×ＭＥＳハイブリッド形成緩衝液
２８８μＬ  水
６μＬ  ＢＡＳ（５０ｍｇ／ｍＬ）
６μＬ  ＳＡＰＥ（１ｍｇ／ｍＬ）（Molecular probes, P/N15230-147）
１５分後、ＳＡＰＥ染色液を除き、チャンバーを１×ＭＥＳハイブリッド形成緩衝液２００μＬで満たして流体洗浄を行う。ＳＳＰＥ−Ｔ溶液をマイクロアレイチャンバーから除いて、ＡＢ染色液３００μＬと交換する。
【００６３】
ＡＢ染色液（３００μＬ）：
１５０μＬ  ２×ＭＥＳハイブリッド形成緩衝液
１４６.２５μＬ  水
３μＬ  ＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍＬ）
０.７５μＬ  ビオチン化抗体（５００μｇ／ｍＬ）（Vector laboratories, P/N BA-0500）
カートリッジを３７℃で３０分間インキュベーションし、ＡＢ染色液を１×ＭＥＳハイブリッド形成緩衝液２００μＬと交換し、流体洗浄を行う。洗浄段階後、ＳＳＰＥ−Ｔ溶液を除去し、チャンバーをＳＡＰＥ染色液で満たし、３７℃で１５分間インキュベーションする。ＳＡＰＥ染色液を１×ＭＥＳハイブリッド形成緩衝液２００μＬと交換し、流体洗浄を行う。隔壁をテープで覆って緩衝液の漏れを防ぐ。
【００６４】
マイクロアレイをAffymetrix GeneArray（登録商標）スキャナで走査する。各チップのプローブセットの７５％変位値を標的強度２００に設定して原データセットを標準化する。
【００６５】
分離法
統計分析はS-Plus （Insightful, Inc. USA） およびGeneSpringR （Silicon Genetics, USA）を用いて行う。１０以下の差の平均は１０に四捨五入する。低発現レベル（１０と５０との間）を保持して可能性のあるパターンが失われないようにする。標準的なパラメータおよび非パラメータ統計学を援用する（スチューデントのｔ−検定、ウィルコクソン（Wilcoxon）のランクサム検定）。
【００６６】
さらに特定的には、アルゴリズムを開発してＣＲの特定遺伝子および対照群のデータを分離して対照群よりも低い発現値を持つＣＲ群と対照群よりも高い発現値を持つＣＲ群との間を区別する。別々の発現範囲を持つことに加えて、各群間の分離ギャップを最大化する。そこで特定変位値（Ｑ）データセット２組の間のギャップ（すなわち低発現レベルを持つ群の１−α変位値および高発現レベルを持つ群のα変位値）は０＜α＜０.５である。
【００６７】
各遺伝子が２群を分離する性能を判定する統計学は次の通り：
Ｓ＝ｍａｘ（ｑα, ｃｒ−ｑ１−α, 対照，ｑα, 対照−ｑ１−α, ｃｒ, ０）
［式中、ｑα, ｃｒはＣＲ群のα変位値が０＜α＜０.５（それ故１−α＞０.５）であることを示す。同様に、対照またはｃｒは対照群を示す］。
【００６８】
ｑα，ｃｒ−ｑ１−α，対照およびｑα，対照−ｑ１−α，ｃｒの両項は負になり得るのでＳの評価にこの０を加える。この場合、両群があまりにオーバーレイしているので、相違を測定することは意味がない。言い換えれば、１群の１−α変位値は他方の群のα変位値以下でなければならない。
【００６９】
次の設定をしたアルゴリズムを使用する：
−閾値（ノイズ用）Ｔ＝１０に設定。
−閾値（最小発現用）Ｔ２＝５０に設定。
−閾値Ｔ２を越えるシグナルの最小百分率を各群についてＰ＝４０％に設定する。
−閾値Ｔ２を越えるシグナルの最小百分率を結合する全群についてＰ＝５０％に設定する（一群における高百分率が他の群における低百分率をある程度補えるように）。
−Ｔ２に満たないシグナルの百分率を各遺伝子で各群について個々に決定する（ＣＲ、対照）。
−全最小百分率閾値を満たさない遺伝子は全て棄却する。
−各遺伝子について統計的Ｓを算出する。
−Ｓ＞０の遺伝子を戻し、Ｓでソートする。
【００７０】
最初のパスフィルターとして低シグナルの比率が大き過ぎる遺伝子を全て除外する。次の遺伝子はデータセットに含める：  両群、ＣＲ群および対照群が少なくとも閾値Ｔ２＝５０（少なくとも４／８および４／９サンプル）を超える４０％の値を含む。結合データセットが少なくとも閾値Ｔ＝１０（少なくとも９／１７サンプル）を超える５０％の値を含む。
【００７１】
第二のパスとして、１０以下の発現値を全てを１０に設定して無作為変動を低下させる（発現レベルを誘導するために使用するAffymetrixアルゴリズムは負の値をもたらすことがある）。低レベル（１０と５０との間）は存在するかも知れないパターンを失わないようにするには好適である。
【００７２】
GeneSpringTMでは、そのデータセットにある遺伝子の値の平均であるその遺伝子の正の合成対照を作製し、その遺伝子の全測定値をこの正の対照で割り算し、最低０.０１と仮定して各遺伝子をそれ自体にノーマライズする。
【００７３】
TaqMan プライマープローブの設計
TaqMan検定は対応するHG−U９５Av２マイクロアレイのプローブセットにハイブリッド形成する遺伝子の領域に対して設計する。この領域を標的配列と呼ぶ。NetaffxTMソフトウェア（Affymetrix, Inc）を使用して、プローブセットの標的配列を確認する。次にプログラムPrimer Express （Applied Biosystems） に標的配列をインポートし、次の条件を持つプログラムでプライマー／プローブ選択を行う：
【００７４】
プライマーのＴＭ（融点）は５８℃〜６０℃である。最適にはその値は５９℃であり、最大ＴＭ差は２℃である。
【００７５】
プライマーのＧＣ（ＧＴＰ、ＣＴＰ）含量は最小２０％と最大８０％との間であり、３'ＧＣクランプを避ける。
【００７６】
プライマーの最適な長さは約２０残基であるが、９〜４０残基の範囲でありうる。
【００７７】
アンプリコンの要件は最低ＴＭが０℃であり、最大ＴＭが９２℃である。アンプリコンは最小の長さ５０残基、最大の長さは１５０である。
【００７８】
TaqManプローブの要件はプローブＴＭがＰＣＲプライマーＴＭよりも少なくとも０℃大きいことであり、そのプローブがＧ（ＧＴＰ）残基で始まっていないことである。標的配列が前記判断基準を満足するTaqMan検定の一致を確認するには短すぎるなら、その配列を遺伝子の全配列に整列させ（たとえばGCG, Wisconsin Package, Accelrys, San Diego, CAのような標準的ソフトウェアを用いて）、標的配列を包含するもっと長いＤＮＡの伸長を選択する。正方向プライマー、逆方向プライマーおよびTaqManプローブの配列を表４に記載する。
【００７９】
慢性拒絶群と対照群とを最良に分離する遺伝子を確認するために標準的技術、たとえばｔ−およびWilcoxon統計値を適用するが、よく分離する基を見出すために新たに誘導した方法（相互の間に大きな分離ギャップを持つ）を含める。
【００８０】
この方法（Ｑ１５／８５およびＱ２０／８０）は良好な分離ギャップを見出すための分離の考え方に及ぶ。これはＣＲ群のα−変位値と対照群の（１−α）−変位値との距離およびその逆の測定に基づく。両群の（α、１−α）の範囲が重複しないならば、最大距離を採用するが、そうでなければ０とする。この方法を各遺伝子に個々に適用すればその２群を分離するための測定値が得られる。このＱ２０/８０法は遺伝子６５個を確認し、Ｑ１５／８５法は遺伝子１６個を確認し、各々（２０％、８０％）変位範囲および（１５％、８５％）変位範囲の完全分離が得られた。
【００８１】
ｔ−およびWilcoxon統計値で検出される遺伝子の比較はこの遺伝子の中で１０個は最尤なｔ−およびWilcoxon統計値を持つ１００個の中にランクされることを確認した。遺伝子識別子および注釈はたとえば表３に示す。
【００８２】
確認された遺伝子は殆ど全てが低閾値５０を超え、殆どがさらに高い発現レベルを示す。
【００８３】
２群のサンプルを分離する遺伝子セットの性能を評価する別の方法を適用して両方に共通な全部で６５個の遺伝子のクラスター分析でｔ−統計値リストおよびWilcoxonリスト作成を行う。クラスターは２段階で調製する。第一に、遺伝子クラスターは標準的な相関関係で調製し、次にPearson相関によってアレイクラスターを作製する。
【００８４】
ツリーを作製するためにGeneSpringは各遺伝子とセット中の他の各遺伝子との関連性を算出する。次に、最高の相関を取り、遺伝子２個を対にして発現プロファイルを平均する。次にGeneSpringはこの新複合遺伝子を他の非対遺伝子全てと比較する。これを遺伝子全てが対を形成するまで反復する。この点で最短距離と分離比率が登場する。これら双方はツリーの分枝性向に影響を与える。最短距離はツリーの分離した枝がどこまで記載されるかに関する。最短距離ボックスに記載される数字は遺伝子間に明らかに考えられる最低の分離を決定する。ツリーの基部における無意味な構造を減少させる。最小距離の減少はツリーの分枝度を増加させる。初期設定最低距離は０.００１である。殆どの遺伝子はそれよりも近く関連しないので、０.００１以下の値は殆ど効果がない。より高い数値は多数の遺伝子を一群に塊らせる傾向があり、その群の特異性が低下する。
【００８５】
この数字は０と１の間にある。分離比は離散群と考えられる群と互いに結合しない群のクラスター遺伝子群間にある相関の差を決定する。分離が増加するとツリーの分枝性が増加する。デフォルト分離比は０.５であるが、０.０〜１.０の範囲にある。分離比０では、全遺伝子の発現プロファイルが同一であると見なすことができる。
【００８６】
Pearson相関は標準的相関分析と酷似しているが、平均発現ベクターの周囲にある遺伝子ＡおよびＢの発現ベクターの角度を測定する（たとえば、遺伝子Ａと遺伝子Ｂとのプロファイルを構成する発現値の平均）。一般に発現値はｍＲＮＡの濃度に基づくものなので、発現ベクターの平均は正の値になる。Pearson相関を使用すると標準的相関分析よりもより負の相関が得られる。Pearson相関と標準的相関分析とは両方法を遺伝子の発現値の対数について行うと殆ど同じ結果を与えることは注目に値する。Pearson相関の算出法は次の通りである：ベクターaの全要素の平均値を計算する。この値をaの各要素から差引く。得られる値をベクターＡとする。ｂに同じ操作をしてベクターＢとする。Pearson 相関＝A.B /（ | A || B | ）
【００８７】
遺伝子クラスターは分離値０.５および最小距離値０.００１を用いて標準的相関分析を行って作製する。このマイクロアレイクラスターにPearson相関を分離比１.０および最小距離値０.００１で用いる。したがって、遺伝子６５個のセットは２群の患者を完全に識別する。両基間の距離はかなり短い。患者は全て生検試料採取の時点で臨床的および組織学的に健康であったのでこの点は予期されていた。
【００８８】
前記方法を適用して転写物約１２０００個の発現レベルを移植患者１７名から採取した一連の腎臓同種移植プロトコル生検によって監視した。この研究の全患者に関する人口学的特性および臨床的特性を表５に示す。患者の一群は生検試料を採取した時点から６ヶ月以内にＣＲを発症したが、他群では発症がなかった。生検試料のＲＮＡ発現プロファイルの詳細な統計的分析によって確認される開示した遺伝子セット、好ましくは表３に記載する遺伝子１０個のセットを使用して、これらの患者１７名の中で１５名（＞８８％）で慢性拒絶反応の出現／非出現が予測された。さらに、識別遺伝子のセットで１２ヶ月生検によって１８ヶ月までにＣＲを発症する患者を予測できた。
【００８９】
【表１】
2005536212.tif 000002
【表２】
2005536212.tif 000003
【００９０】
【表３】
2005536212.tif 000004
【表４】
2005536212.tif 000005
【００９１】
【表５】
2005536212.tif 000006
【００９２】
【表６】
2005536212.tif 000007
【００９３】
【表７】
2005536212.tif 000008
６ヶ月〜１２ヶ月の間にレシピエント患者Ａ〜I：ＣＲ発症、レシピエント患者Ｊ〜Ｑ：健康維持。ＡＲ：急性拒絶エピソード数。性：Ｆ＝女性；Ｍ＝男性。種族：Ｏｔ＝東洋人；Ｃａ＝コーカサス人；Ｂｌ＝黒人。最終段階腎疾患：ＧＮ／ＧＤ＝腎炎／糸球体疾患；ＰｙＮ／ＩＮ＝腎盂腎炎／間質性腎炎；ＰＣＫＤ＝腎嚢胞；Ｈｔｎ／Ｎｓｃ＝高血圧症／腎硬化症；Ｖｓｃ＝血管炎；ＤＭ＝糖尿病；ＯＤ／Ｒ＝閉塞性疾患／逆流；Ｕｎｋ＝原因不明。ＡＲ：急性拒絶エピソード数。１２ヶ月組織学的診断：１＝慢性拒絶反応陽性；０＝無拒絶。移植（ｔｘ）型：ＣａｄＨＢ＝死体・心拍；ＣａｄＮＨＢ＝死体・非心拍；ＬｉｖＲｅｌ＝生体・親族；ＬｉｖＵｎｒｅｌ＝生体・非親族。
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月3日(2005.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005536212000001.app
【国際調査報告】
2005536212.tif 000009
2005536212.tif 000010
2005536212.tif 000011
2005536212.tif 000012
2005536212.tif 000013
2005536212.tif 000014