(57)【要約】本発明は、外来界面活性剤を含まない、精製熱安定性酵素、特に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供する方法及び組成物に関する。本発明はまた、このように精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、１種以上の界面活性剤を添加することによって、アッセイに活性型で提供する方法を提供する。本発明はさらに、核酸の増幅及びシークエンシングを始めとする種々の適用で使用するための、精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物及びキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物であって、外来添加界面活性剤を含まない組成物。
【請求項２】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、サーマス、ピロコッカス、サーモコッカス、アキフェックス、スルフォロバス及びサーモトガからなる群から選択される属の生物から得たものであるか、又はそれに由来する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｎＴｂａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｂａ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑΔ２７１  Ｆ６６７Ｙ、ＴｔｈΔ２７３  Ｆ６６８Ｙ及びＴａｑΔ２７１  Ｆ６６７Ｙ  Ｅ６８１Ｗからなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを細胞から実質的に精製する方法であって、
（ａ）前記細胞を外来添加界面活性剤の非存在下で溶解して溶解物を得ること、及び
（ｂ）外来添加界面活性剤の非存在下で、１以上の精製ステップを実施して、溶解物から実質的精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを得ること
を含み、前記実質的精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが外来添加界面活性剤を含まない、方法。
【請求項５】
外来添加界面活性剤の非存在下で実施される前記精製ステップが、
前記溶解物を加熱して１種以上のタンパク質を変性させること、
前記溶解物を遠心分離し、上清の全て又は一部を除去して清澄化溶解物を得ること、及び
ブチル官能性を含むクロマトグラフィー媒体を用いて、清澄化溶解物を分画すること
を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、サーマス、ピロコッカス、サーモコッカス、テリオコッカス、アキフェックス、スルフォロバス及びサーモトガからなる群から選択される種を有する生物から得たものであるか、又はそれに由来する、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｎＴｂａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｂａ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑΔ２７１  Ｆ６６７Ｙ、ＴｔｈΔ２７３  Ｆ６６８Ｙ及びＴａｑΔ２７１  Ｆ６６７Ｙ  Ｅ６８１Ｗからなる群から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項８】
精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを活性型でアッセイに提供する方法であって、
外来添加界面活性剤を含まない精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ組成物に１種以上の界面活性剤を添加すること
を含む、方法。
【請求項９】
前記１種以上の界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｉｃｏｎｏｌ  ＮＰ−４０、  Ｍｅｇａ−８、Ｍｅｇａ−９、Ｍｅｇａ−１０、アルキルグリコシド類及びアルキル第三アミンＮ−オキシド類からなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記アルキルグリコシド類が、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド及びドデシル−β−Ｄ−マルトシドからなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
アルキル第三アミンＮ−オキシドが、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｎＴｂａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｂａ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑΔ２７１  Ｆ６６７Ｙ、ＴｔｈΔ２７３  Ｆ６６８Ｙ及びＴａｑΔ２７１  Ｆ６６７Ｙ  Ｅ６８１Ｗからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが活性型でシークエンシング反応に提供される、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
前記アッセイが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイ、一本鎖又は二本鎖エクソヌクレアーゼ活性アッセイ、或いは一本鎖又は二本鎖エンドヌクレアーゼ活性アッセイからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１５】
前記界面活性剤がＤＮＡポリメラーゼ活性を選択的に活性化させる、請求項８記載の方法。
【請求項１６】
実質的精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、並びにアルキル第三アミンＮ−オキシド類及びアルキルグリコシド類からなる群から独立に選択される１種以上の界面活性剤を含む組成物。
【請求項１７】
高分子非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
加水分解コラーゲン誘導体をさらに含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
前記長鎖アルキルグリコシドが、グルコース、ガラクトース、キシロース、マルトース又はラクトースからなる群から選択される親水性部分と、Ｃ7〜Ｃ16アルキル疎水性部分とを含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項２０】
前記長鎖アルキルグリコシドがドデシルマルトシド又はオクチルグルコシドである、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
前記長鎖アルキル第三アミンＮ−オキシドがＬＤＡＯである、請求項１６記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物及びキット、並びに熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを単離及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸からの、ＤＮＡの鋳型指示合成を触媒する酵素である。通常、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、微生物におけるＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩ；動物細胞におけるＤＮＡポリメラーゼα、β及びγ）は、ＤＮＡ鋳型からＤＮＡ鎖の合成を導くが、ＤＮＡポリメラーゼのなかには（一般に「逆転写酵素」と呼ばれる）、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡ鎖の合成を導くものもある。一般に、これらは生化学の学名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ合同委員会（ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｐａｃ／ｊｃｂｎ）に酵素委員会番号ＥＣ２．７．７．７及びＥＣ２．７．７．４９で認定されている。特にインビトロ反応で使用するための、細菌、酵母及びヒトを始めとする種々の生物由来のＤＮＡポリメラーゼの単離及び特性決定には広範囲な研究が実施されている。
【０００３】
特にインビトロ反応で使用するためのＤＮＡポリメラーゼを選択する場合は、当業者であれば幾つかの変数を考慮しなくてはならない。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、その天然の５’−３’又は３’−５’エクソヌクレアーゼ活性が欠失しているように（例えば、突然変異によって、又は酵素消化などの翻訳後修飾によって）、低いエラー率を示すように、高い前進性及び伸長率を示すように及び／又は有利な熱安定性を示すように選択することができる。好熱性微生物由来のＤＮＡポリメラーゼの同定及びＰＣＲなどの方法での熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用は、ＤＮＡを同定及び操作する能力に革命をもたらした。幾つかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、好熱性真正細菌、好熱古細菌などから単離されている。
【０００４】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの例としては、特に限定されないが、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、米国特許第４８８９８１８号参照）；サーマス ・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、米国特許第５１９２６７４号；同第５２４２８１８号；同第５４１３９２６号参照）；現在はサーマス・オスヒマイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ）と呼ばれている、サーマス種ｓｐｓ１７（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ１７）由来のＴｓｐ  ｓｐｓ１７  ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、米国特許第５４０５７７４号参照）；ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５９４８６６３号）；バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５７４７２９８号）；サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のＴｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５３２２７８５号）；ピロコッカス種ＫＯＤ１由来のＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第６０３３８５９号）；サーモコッカス・バロシイ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｉｉ）由来のｎＴｂａ及びＴｂａ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５６０２０１１号及び同第５８８２９０４号）；並びにＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びＡｍｐｌｉＴａｑ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔａｂｏｒ，  Ｓ．  ＆  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｃ．  Ｃ．  （１９９５）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスズ・オブ・ジ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ＵＳＡ  ９２、６３３９〜６３４３頁）などの市販のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【０００５】
界面活性剤は、膜を可溶化し、種々の化学物質の透過処理効率を高めるため、また、細菌細胞壁を崩壊させるために、当技術分野で広く用いられており、微生物由来のＤＮＡポリメラーゼなどの細胞内タンパク質の調製を容易にする。ゴールドステイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）らは、実質的に核酸を含まない熱安定性酵素の製造方法を開示している（米国特許第５８６１２９５号）。ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）らは、１以上の非イオン性高分子界面活性剤を含む緩衝液中で、精製した安定な熱安定性ポリメラーゼを含む安定な酵素組成物を開示している（米国特許第６１２７１５５号）。シンプソン（Ｓｉｍｐｓｏｎ）ら、バイオケミストリー・アンド・セル・バイオロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  ６８：１２９２〜６頁（１９９０）は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などの添加剤によって安定化されたＤＮＡポリメラーゼの精製を開示している。
【０００６】
界面活性剤は、得られる精製種から完全に除去するのが困難なことがある。さらに、ＤＮＡシーケンシング反応などの酵素反応では、界面活性剤の存在が結果に影響を及ぼすこともある。例えば、ルイズ−マルチネズ（Ｒｕｉｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ）ら、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）  ７０：１５１６〜１５２７頁、１９９８参照。さらに、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのなかには界面活性剤の非存在下では時間経過とともに実質的に活性の低下するものもある。例えば、米国特許第６１２７１５５号参照。
【特許文献１】米国特許第４８８９８１８号明細書
【特許文献２】米国特許第５１９２６７４号明細書
【特許文献３】米国特許第５２４２８１８号明細書
【特許文献４】米国特許第５４１３９２６号明細書
【特許文献５】米国特許第５４０５７７４号明細書
【特許文献６】米国特許第５９４８６６３号明細書
【特許文献７】米国特許第５７４７２９８号明細書
【特許文献８】米国特許第５３２２７８５号明細書
【特許文献９】米国特許第６０３３８５９号明細書
【特許文献１０】米国特許第５６０２０１１号明細書
【特許文献１１】米国特許第５８８２９０４号明細書
【特許文献１２】米国特許第５８６１２９５号明細書
【特許文献１３】米国特許第６１２７１５５号明細書
【特許文献１４】米国特許第６１２７１５５号明細書
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔａｂｏｒ，Ｓ．  ＆  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．  （１９９５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２，  ６３３９−６３４３
【非特許文献２】Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６８：  １２９２−６  （１９９０）
【非特許文献３】Ｒｕｉｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７０：  １５１６−１５２７，  １９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、熱安定性酵素、詳しくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを精製し使用する環境を当業者が制御することのできる組成物及び方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第一の態様では、本発明は、外部から界面活性剤を添加せずに熱安定性酵素を精製する方法を提供する。関連する態様では、本発明は、外来添加界面活性剤を含まない、精製熱安定性酵素を含む組成物を提供する。
【０００９】
熱安定性酵素は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましく、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、アキフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）、スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、サーモアネロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドサーマス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）及びサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）からなる群から選択される属の微生物から得たものであるか、又はそれに由来することが最も好ましい。
【００１０】
本発明の熱安定性酵素はどのような供給源から得たものであってもよく、天然又は組換えタンパク質であってよい。よって、本段中で用いられる語句「に由来する」とは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが組換えによって発現され、発現されたＤＮＡ配列が好熱性生物から得た野生型の配列であるか、又はその突然変異型であることを示す。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（配列及び／又はタンパク質）の供給源を提供するのに適した生物の例としては、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・ルベル（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・ステロサーモフィラス、サーマス・アクアティカス、サーマス・ラクテウス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ）、メイオテルムス・ルベル（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、サーマス・オスヒマイ、メタノサーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、スルフォロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、サーモプラズマ・アシッドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ）及びデスルフロコッカス・モビリス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）が挙げられる。
【００１１】
好ましいＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｎＴｂａ及び／又はＴｂａ  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ある実施形態では、本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑΔ２７１  Ｆ６６７Ｙ、ＴｔｈΔ２７３  Ｆ６６８Ｙ及びＴａｑΔ２７１  Ｆ６６７Ｙ  Ｅ６８１Ｗなどの野生型配列と比較して、１以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加によって改変されている。特に好ましいＤＮＡポリメラーゼは以下の表１に記載されている。
【００１２】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、天然にこの酵素を発現するか又はこの酵素を発現するよう設計された細胞（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどの外来ＤＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌）から精製することが好ましい。このような方法は、細胞を、外来界面活性剤が添加されていない環境に溶解すること、次いで、同様に外来添加界面活性剤の非存在下で、１以上の精製ステップによってＤＮＡポリメラーゼを精製することを含む。このような方法で得た実質的精製ＤＮＡポリメラーゼは外来界面活性剤を全く含まない。
【００１３】
種々の好ましい実施形態では、本発明の精製方法は、１以上の次のステップを含む：（ｉ）細胞溶解物を加熱して１種以上のタンパク質を変性させること、（ｉｉ）細胞溶解物を遠心分離し、上清の全て又は一部を除去して清澄化溶解物を得ること、及び（ｉｉｉ）クロマトグラフィー媒体、最も好ましくは、ブチル官能性を含むクロマトグラフィー媒体を用いて、清澄化溶解物を分画すること。
【００１４】
用語「熱安定性」とは、５０℃を超える温度で活性を保持する酵素をさす。よって熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、この高温でＤＮＡ鎖の合成を指示する能力を保持する。一酵素が２以上の酵素活性を有し得る。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、エンドヌクレアーゼ及び／又はエクソヌクレアーゼ活性を含み得る。このような酵素は、１つの活性に関して熱安定性を示すが、別のものはそうではないこともある。
【００１５】
好ましくは、熱安定性酵素は約５０℃〜８０℃の間、より好ましくは約５５℃〜７５℃の間、最も好ましくは約６０℃〜７０℃の間の温度で活性を保持する。さらに、このような高温の１つで示される活性が、同じ環境（例えば、同じ緩衝液組成物中）で、３７℃での同じ酵素の活性よりも優れていることが好ましい。よって、熱安定性酵素は約６０℃〜９５℃の間の温度、最も好ましくは約７０℃〜８０℃の間の温度で最大の触媒活性を示すことが特に好ましい。これに関連して、用語「約」とは、所与の温度の＋／−１０％をさす。
【００１６】
本明細書において、用語「活性な」とは、酵素の、化学反応を触媒する能力をさす。酵素には最大活性速度があり、それは飽和基質濃度という条件下で、温度、ｐＨ及び塩濃度を始めとする環境条件の選択されたセットで測定されることが好ましい。本明細書に記載したＤＮＡポリメラーゼには、活性を測定する好ましい条件は、２５ｍＭ  ＴＡＰＳ（トリス−ヒドロキシメチル−メチルアミノプロパンスルホン酸）緩衝液、ｐＨ９．３（２５℃で測定）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各０．２ｍＭ、０．２ｍＭ［α−33Ｐ］−ｄＡＴＰ（０．０５〜０．１  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び０．４ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。反応は７４℃で進行させる。このような条件下で酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する例示的な方法を以下に示す。
【００１７】
本明細書において、用語「不活性な」とは、酵素の最大活性速度の１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満である活性をさす。本明細書に記載したＤＮＡポリメラーゼには、活性を、前段に記載した活性を測定するための好ましい条件下で得た速度と比較することをさすことが好ましい。
【００１８】
本発明の熱安定性酵素は、外来添加界面活性剤を含まない、精製熱安定性酵素を含む組成物を得るのに必要な精製ステップに付される際に、不可逆的に不活化されていないことが最も好ましい。本明細書の目的上、「不可逆的な不活化」とは、酵素が曝されている条件を変えることでは回復できない酵素活性の損失をさす。よって、その酵素が、その環境を変えることによって（例えば、その後の界面活性剤への曝露によって、温度の上昇によってなど）、その後活性化できる限り、組成物は不活性の熱安定性酵素を含むことができる。
【００１９】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲなどのＤＮＡ増幅法で使用するのに必要な条件下で不可逆的に不活化されないことが好ましい。ＰＣＲの間、例えば、ポリメラーゼは、相補鎖ＤＮＡを融解及びアニーリングするために必要な、加熱及び冷却の反復サイクルに付され得る。このような条件は、例えば、緩衝液の塩濃度及び組成並びに増幅されるか又はプライマーとして用いられる核酸の長さ及びヌクレオチド組成によって左右されるが、通常、用いられる最高温度は、通常、約０．５〜４分間で約９０℃〜約１０５℃の範囲である。緩衝液の塩濃度及び／又は核酸のＧＣ組成が高まるにつれて高温が必要となり得る。酵素は最高９０℃の温度まで不可逆的に変性しないのが好ましく、９５℃までがより好ましく、９８℃までがさらにより好ましく、１００℃までが最も好ましい。高温に耐える能力はまた、所与の温度で、所与の量の酵素の酵素活性が当初の活性から半分に減少した時間をさす、「半減期」と表現されることも多い。酵素は、９０℃で３０分を越える半減期を有するのが好ましい。
【００２０】
本明細書において、用語「界面活性剤」とは、液体に加えると、界面活性剤が不在の同じ液体と比較して液体の表面張力が低下する、両親媒性の界面活性剤（「界面活性剤」）をさす。例えば、Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ：  Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ２００１参照、この全文は参照により本明細書に組み込む。
【００２１】
当業者であれば、生物に天然に存在する種々の成分が界面活性剤のような挙動を示すことがあることは理解されよう。よって、用語「外来添加界面活性剤」とは、特定の方法で処理されている生物内に、内在的には存在しない界面活性剤をさす。界面活性剤は、通常、細胞内タンパク質を抽出する目的で、膜タンパク質を可溶化するため、及び細胞の化学的崩壊を容易にするために外来供給源から添加される。
【００２２】
この目的のために用いられる一般的な界面活性剤としては、特に限定されないが、ｎ−ドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン界面活性剤；及びコール酸（コール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、グリココール酸（グリココール酸ナトリウム）などのジヒドロキシ又はトリヒドロキシ胆汁酸（及びその塩）；  セチルトリメチル−臭化アンモニウム（ＣＴＡＢ）などの陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンＮＰ−４０、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１１４、Ｃ12Ｅ8、Ｃ12Ｅ9、ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｘ−０８０、ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｘ−１００、ＬＵＢＲＯＬ（登録商標）ＰＸ、ＢＲＩＪ（登録商標）３５、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０及びＴＷＥＥＮ（登録商標）２０などの非イオン性界面活性剤；ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（「ドデシルマルトシド」）、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド  （「オクチルグルコシド」）、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド及びｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドなどのアルキルグリコシド；ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）などのアルキルアミンオキシド；並びにＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴＳ（登録商標）３−０８、３−１０、３−１２、３−１４及び３−１６などの両性イオン界面活性剤が挙げられる。本発明は、これらの例示的界面活性剤を全く含まない、精製及び実質的精製組成物に関する。
【００２３】
酵素に関して本明細書で用いられる、用語「精製」とは、完全に純粋であることをさすのではない。むしろ、「精製」とは、調製原料とした生物と比較して、対象とする酵素以外のタンパク質含有率が低減した組成物中の物質をいう。好ましくは、酵素は「実質的に純粋」である（酵素を含む組成物の質量を基準にして、酵素がタンパク質の５０％以上に相当することをいう。）。さらに好ましくは、実質的に純粋な酵素は、組成物の質量を基準にして７５％以上であり、最も好ましくは組成物の質量を基準にして９５％以上である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをアッセイに提供する方法を提供する。このような方法は、１種以上の界面活性剤を、外来添加界面活性剤を予め含んでいなかった、精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物へ添加することを含む。界面活性剤を、外来添加界面活性剤を予め含んでいなかった、精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼへ加えることが、不活性ＤＮＡポリメラーゼを活性型へ変換する、又はＤＮＡポリメラーゼの活性を高めることが最も好ましい。
【００２５】
種々の態様では、１種以上の界面活性剤を上記の組成物へ添加することができ、得られた組成物をアッセイで使用するために反応混合物へ添加することができる。或いは、精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを反応混合物へ添加することができ、その後、界面活性剤を添加することができる。及び／又は界面活性剤を反応混合物へ添加することができ、その後、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを添加することができる。どのような場合でも、結果は、外来添加界面活性剤を予め含まなかった、精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、今や界面活性剤を含む組成物中にあることになる。
【００２６】
本明細書において、用語「アッセイ」とは、精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがデオキシリボヌクレオシド三リン酸又はジデオキシリボヌクレオシド三リン酸などの類似体からの、ＤＮＡの鋳型指示合成を触媒する、どのような反応混合物もさす。好ましいアッセイとしては、ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイ、一本鎖又は二本鎖エクソヌクレアーゼ活性アッセイ、一本鎖又は二本鎖エンドヌクレアーゼ活性アッセイ、核酸増幅反応及び核酸シークエンシング反応が挙げられる。
【００２７】
このような方法での使用に適した界面活性剤としては、特に限定されないが、ｎ−ドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン界面活性剤；及びコール酸（コール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、グリココール酸（グリココール酸ナトリウム）などのジヒドロキシ又はトリヒドロキシ胆汁酸（及びその塩）；  セチルトリメチル−臭化アンモニウム（ＣＴＡＢ）などの陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンＮＰ−４０、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１１４、Ｃ12Ｅ8、Ｃ12Ｅ9、ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｘ−０８０、ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｘ−１００、ＬＵＢＲＯＬ（登録商標）ＰＸ、ＢＲＩＪ（登録商標）３５、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、及びＴＷＥＥＮ（登録商標）２０などの非イオン性界面活性剤；ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（「ドデシルマルトシド」）、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（「オクチルグルコシド」）、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、及びｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドなどのアルキルグリコシド；ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）などのアルキルアミンオキシド；並びにＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、及びＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴＳ（登録商標）３−０８、３−１０、３−１２、３−１４及び３−１６などの両性イオン界面活性剤が挙げられる。
【００２８】
また別の態様では、本発明はさらに、外来添加界面活性剤を含まない精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、精製ＤＮＡポリメラーゼへの添加に適した１種以上の界面活性剤とを含む組成物及びキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は、当業者が、熱安定性酵素、詳しくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを精製し使用する環境を制御できる組成物及び方法に関する。詳しくは、外来添加界面活性剤の非存在下で熱安定性酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を精製することによって、当業者はタイミング、同一性及び反応混合物中に存在する界面活性剤の量を制御できる。このようにして、特定の条件下で矛盾する又は望ましくない結果を生じる可能性のある界面活性剤の存在を回避しながら、活性酵素を提供できる。
熱安定性酵素の精製
従来、生物から細胞内タンパク質の調製を容易にするために、種々の方法が用いられてきた。最初のステップとして、通常、対象とする生物又は細胞の内容物を、例えば、細胞の溶解、破裂及び／又は透過処理によって遊離させる。この内容物の放出に続いて、多くは、一連のクロマトグラフィー、沈殿及び／又は選択的結合ステップによって、１種以上の所望のタンパク質を細胞抽出物から精製することができる。
【００３０】
幾つかのアプローチが、細胞内タンパク質を細胞から放出させるのに有用であると証明されている。これらには、化学的溶解又は透過処理、物理的破壊方法、或いは化学的及び物理的アプローチの組み合わせが含まれる。細菌の細胞壁の化学的破壊方法は、一般に、有機溶媒、カオトロープ、抗生物質、界面活性剤及び／又は酵素での細胞の処理を伴う。物理的方法としては、一般に、浸透圧ショック、乾燥、剪断力（例えば、ビーズミル又はブレンダーを用いる）、温度ショック、超音波処理、又は前記の何らかの組み合わせ（例えば、フレンチ・プレスは剪断力と爆発的な圧力低下の双方を生じる）が挙げられる。その他のアプローチは化学的破壊方法と物理的破壊方法の組み合わせであり、一般に、細胞破壊及びタンパク質放出を最大にするために、リゾチーム処理とそれに続く超音波処理又は圧力処理を伴う。
【００３１】
前記で論じたように、界面活性剤は、細胞内タンパク質の放出が最大となるように細胞を急速に破壊するために用いられることが多く、このようなアプローチは、大腸菌などの中温性生物、及び本明細書に記載のものなどの好熱性細菌及び古細菌から、天然又は組換えタンパク質を始めとする、種々の細菌のサイトゾル酵素を精製するための方法の最初のステップで使用されてきた。しかし、たとえ界面活性剤を分画の最初のステップで用いない場合でも、細胞抽出物の、種々の部分への分画を容易にするために、界面活性剤が後に添加されることが多い。
【００３２】
精製熱安定性酵素組成物を提供するために、本発明では、溶解と精製の両ステップが、外来添加界面活性剤の非存在下で実施されることが必要である。本発明の方法に従って調製及び使用できる熱安定性酵素は、市販の（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍｄ．より）種々の好熱性細菌から得ることができる。熱安定性酵素の供給源としての使用に適しているのは、好熱性細菌サーマス・フラバス、メイオテルムス・ルベル、サーマス・サーモフィルス、バシラス・ステアロサーモフィラス、サーマス・アクアティカス、サーマス・ラクテウス、サーマス・オスヒマイ、メタノサーマス・フェルビダス、スルフォロバス・ソルファタリカス、スルフォロバス・アシドカルダリウス、サーモプラズマ・アシッドフィラム、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム及びデスルフロコッカス・モビリス及びピロコッカス又はサーモトガ属のその他の種である。しかし、当業者であれば、どんな好熱性微生物も、本発明の方法に従って熱安定性酵素を調製するための供給源として使用できることは理解されよう。さらに、対象とする熱安定性酵素をコードするＤＮＡ配列を、当業者に周知の組換えＤＮＡ法を用いて、通常はそのような酵素を発現しない生物（例えば、大腸菌）に発現させることもできる。例えば、ルー（Ｌｕ）及びエリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）、プロテイン・エクスプレッション・アンド・プリフィケーション（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）１１：１７９〜８４頁（１９９７）；デサイ（Ｄｅｓａｉ）及びプファフル（Ｐｆａｆｆｌｅ）、バイオテクニークス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１９：７８０〜２頁、７８４（１９９５）参照。
【００３３】
特に好ましい熱安定性酵素としては、表１に記載のものとその機能的変異体が挙げられる。「機能的変異体」とは、１以上のアミノ酸が置換及び／又は付加及び／又は欠失しているが、親熱安定性酵素の示す１以上の酵素活性（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ活性）の１０％以上を依然として保持しているポリペプチドをさす。
【００３４】
表１
Taq DNA Polymerase (AmpliTaqO) (SEQ ID NO: 1)
1 mrgmlplfep kgrvllvdgh hlayrtfhal kglttsrgep vqavygfaks llkalkedgd
61 avivvfdaka psfrheaygg ykagraptpe dfprqlalik elvdllglar levpgyeadd
121 vlaslakkae kegyevrilt adkdlyqlls drihvlhpeg ylitpawlwe kyglrpdqwa
181 dyraltgdes dnlpgvkgig ektarkllee wgsleallkn ldrlkpaire kilahmddlk
241 lswdlakvrt dlplevdfak rrepdrerlr aflerlefgs llhefglles pkaleeapwp
301 ppegafvgfv lsrkepmwad llalaaargg rvhrapepyk alrdlkearg llakdlsvla
361 lreglglppg ddpmllayll dpsnttpegv arryggewte eageraalse rlfanlwgrl
421 egeerllwly reverplsav lahmeatgvr ldvaylrals levaeeiarl eaevfrlagh
481 pfnlnsrdql ervlfdelgl paigktektg krstsaavle alreahpive kilqyreltk
541 lkstyidplp dlihprtgrl htrfnqtata tgrlsssdpn lqnipvrtpl gqrirrafia
601 eegwllvald ysqielrvla hlsgdenlir vfqegrdiht etaswmfgvp reavdplmrr
661 aaktinfgvl ygmsahrlsq elaipyeeaq afieryfqsf pkvrawiekt leegrrrgyv
721 etlfgrrryv pdlearvksv reaaermafn mpvqgtaadl mklamvklfp rleemgarml
781 lqvhdelvle apkeraeava rlakevmegv yplavpleve vgigedwlsa ke
Tth DNA Polymerase (SEQ ID NO: 2)
1 meamlplfep kgrvllvdgh hlayrtffal kglttsrgep vqavygfaks llkalkedgy
61 kavfvvfdak apsfrheaye aykagraptp edfprqlali kelvdllgft rlevpgyead
121 dvlatlakka ekegyevril tadrdlyqlv sdrvavlhpe ghlitpewlw ekyglrpeqw
181 vdfralvgdp sdnlpgvkgi gektalkllk ewgslenllk nldrvkpenv rekikahled
241 lrlslelsrv rtdlplevdl aqgrepdreg lraflerlef gsllhefgll eapapleeap
301 wpppegafvg fvlsrpepmw aelkalaacr dgrvhraadp laglkdlkev rgllakdlav
361 lasregldlv pgddpmllay lldpsnttpe gvarryggew tedaahrall serlhrnllk
421 rlegeekllw lyhevekpls rvlahmeatg vrrdvaylqa lslelaeeir rleeevfrla
481 ghpfnlnsrd qlervlfdel rlpalgktqk tgkrstsaav lealreahpi vekilqhrel
541 tklkntyvdp lpslvhprtg rlhtrfnqta tatgrlsssd pnlqnipvrt plgqrirraf
601 vaeagwalva ldysqielrv lahlsgdenl irvfqegkdi htqtaswmfg vppeavdplm
661 rraaktvnfg vlygmsahrl sqelaipyee avafieryfq sfpkvrawie ktleegrkrg
721 yvetlfgrrr yvpdlnarvk svreaaerma fnmpvqgtaa dlmklamvkl fprlremgar
781 mllqvhdell leapqaraee vaalakeame kayplavple vevgmgedwl sakg
Thermus oshimai DNA Polymerase (Tsp sps17) (SEQ ID NO: 3)
1 mlplfepkgr vllvdghhla yrtffalkgl ttsrgepvqa vygfaksllk alkedgevai
61 vvfdakapsf rheayeayka graptpedfp rqlalikelv dllglvrlev pgfeaddvla
121 tlakkaereg yevrilsadr dlyqllsdri hllhpegevl tpgwlqeryg lsperwveyr
181 alvgdpsdnl pgvpgigekt alkllkewgs leailknldq vkpervreai rnnldklqms
241 lelsrlrtdl plevdfakrr epdweglkaf lerlefgsll hefglleapk eaeeapwppp
301 ggaflgflls rpepmwaell alagakegrv hraedpvgal kdlkeirgll akdlsvlalr
361 egreippgdd pmllaylldp gntnpegvar ryggewkeda aarallserl wqalyprvae
421 eerllwlyre verplaqvla hmeatgvrld vpylealsqe vafelerlea evhrlaghpf
481 nlnsrdqler vlfdelglpp igktektgkr stsaavlell reahpivgri leyrelmklk
541 styidplprl vhpktgrlht rfnqtatatg rlsssdpnlq nipvrtplgq rirkafiaee
601 ghllvaldys qielrvlahl sgdenlirvf regkdihtet aawmfgvppe gvdgamrraa
661 ktvnfgvlyg msahrlsqel sipyeeaaaf ieryfqsfpk vrawiaktle egrkkgyvet
721 lfgrrryvpd lnarvksvre aaermafnmp vqgtaadlmk lamvklfprl rplgvrillq
781 vhdelvleap karaeeaaql aketmegvyp lsvplevevg mgedwlsaka
Pfu DNA Polymerase (SEQ ID NO: 4)
1 mildvdyite egkpvirlfk kengkfkieh drtfrpyiya llrddskiee vkkitgerhg
61 kivrivdvek vekkflgkpi tvwklylehp qdvptirekv rehpavvdif eydipfakry
121 lidkglipme geeelkilaf dietlyhege efgkgpiimi syadeneakv itwknidlpy
181 vevvsserem ikrflriire kdpdiivtyn gdsfdfpyla kraeklgikl tigrdgsepk
241 mqrigdmtav evkgrihfdl yhvitrtinl ptytleavye aifgkpkekv yadeiakawe
301 sgenlervak ysmedakaty elgkeflpme iqlsrlvgqp lwdvsrsstg nlvewfllrk
361 ayernevapn kpseeeyqrr lresytggfv kepekglwen ivyldfraly psiiithnvs
421 pdtlnlegck nydiapqvgh kfckdipgfi psllghllee rqkiktkmke tqdpiekill
481 dyrqkaikll ansfygyygy akarwyckec aesvtawgrk yielvwkele ekfgfkvlyi
541 dtdglyatip ggeseeikkk alefvkyins klpglleley egfykrgffv tkkryavide
601 egkvitrgle ivrrdwseia ketqarvlet ilkhgdveea vrivkeviqk lanyeippek
661 laiyeqitrp lheykaigph vavakklaak gvkikpgmvi gyivlrgdgp isnrailaee
721 ydpkkhkyda eyyienqvlp avlrilegfg yrkedlryqk trqvgltswl nikks
Bst DNA Polymerase (SEQ ID NO: 5)
1 mknklvlidg nsvayraffa lpllhndkgi htnavygftm mlnkilaeeq pthilvafda
61 gkttfrhetf qdykggrqqt ppelseqfpl lrellkayri payeldhyea ddiigtmaar
121 aeregfavkv isgdrdltql aspqvtveit kkgitdiesy tpetvvekyg ltpeqivdlk
181 glmgdksdni pgvpgigekt avkllkqfgt venvlaside ikgeklkenl rqyrdlalls
241 kqlaaicrda pveltlddiv ykgedrekvv alfqelgfqs fldkmavqtd egekplagmd
301 faiadsvtde mladkaalvv evvgdnyhha pivgialane rgrfflrpet aladpkflaw
361 lgdetkkktm fdskraaval kwkgielrgv vfdlllaayl ldpaqaagdv aavakmhqye
421 avrsdeavyg kgakrtvpde ptlaehlvrk aaaiwaleep lmdelrrneq drllteleqp
481 lagilanmef tgvkvdtkrl eqmgaelteq lqaverriye lagqefnins pkqlgtvlfd
541 klqlpvlkkt ktgystsadv leklaphhei vehilhyrql gklqstyieg llkvvhpvtg
601 kvhtmfnqal tqtgrlssve pnlqnipirl eegrkirqaf vpsepdwlif aadysqielr
661 vlahiaeddn lieafrrgld ihtktamdif hvseedvtan mrrqakavnf givygisdyg
721 laqnlnitrk eaaefieryf asfpgvkqym dnivqeakqk gyvttllhrr rylpditsrn
781 fnvrsfaert amntpiqgsa adiikkamid lsvrlreerl qarlllqvhd elileapkee
841 ierlcrlvpe vmeqavtlrv plkvdyhygp twydak
Tli DNA Polymerase (SEQ ID NO: 6)
1 mildtdyitk dgkpiirifk kengefkiel dphfqpyiya llkddsaiee ikaikgerhg
61 ktvrvldavk vrkkflgrev evwklifehp qdvpamrgki rehpavvdiy eydipfakry
121 lidkglipme gdeelkllaf dietfyhegd efgkgeiimi syadeeearv itwknidlpy
181 vdvvsnerem ikrfvqvvke kdpdviityn gdnfdlpyli kraeklgvrl vlgrdkehpe
241 pkiqrmgdsf aveikgrihf dlfpvvrrti nlptytleav yeavlgktks klgaeeiaai
301 weteesmkkl aqysmedara tyelgkeffp meaelaklig qsvwdvsrss tgnlvewyll
361 rvayarnela pnkpdeeeyk rrlrttylgg yvkepekglw eniiyldfrs lypsiivthn
421 vspdtlekeg cknydvapiv gyrfckdfpg fipsilgdli amrqdikkkm kstidpiekk
481 mldyrqraik llansyygym gypkarwysk ecaesvtawg rhyiemtire ieekfgfkvl
541 yadtdgfyat ipgekpelik kkakeflnyi nsklpgllel eyegfylrgf fvtkkryavi
601 deegrittrg levvrrdwse iaketqakvl eailkegsve kavevvrdvv ekiakyrvpl
661 eklviheqit rdlkdykaig phvaiakrla argikvkpgt iisyivlkgs gkisdrvill
721 teydprkhky dpdyyienqv lpavlrilea fgyrkedlry qsskqtglda wlkr
KOD DNA Polymerase (SEQ ID NO: 7)
1 mildtdyite dgkpvirifk kengefkiey drtfepyfya llkddsaiee vkkitaerhg
61 tvvtvkrvek vqkkflgrpv evwklyfthp qdvpairdki rehpavidiy eydipfakry
121 lidkglvpme gdeelkmlaf dietlyhege efaegpilmi syadeegarv itwknvdlpy
181 vdvvsterem ikrflrvvke kdpdvlityn gdnfdfaylk krceklginf algrdgsepk
241 iqrmgdrfav evkgrihfdl ypvirrtinl ptytleavye avfgqpkekv yaeeittawe
301 tgenlervar ysmedakvty elgkeflpme aqlsrligqs lwdvsrsstg nlvewfllrk
361 ayernelapn kpdekelarr rqsyeggyvk eperglweni vyldfr
421
481
541
601
661
721                                                   slyp siiithnvsp
781 dtlnregcke ydvapqvghr fckdfpgfip sllgdlleer qkikkkmkat idpierklld
841 yrqraikila n
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381         sy ygyygyarar wyckecaesv tawgreyitm tikeieekyg fkviysdtdg
1441 ffatipgada etvkkkamef lkyinaklpg aleleyegfy krgffvtkkk yavideegki
1501 ttrgleivrr dwseiaketq arvleallkd gdvekavriv kevteklsky evppeklvih
1561 eqitrdlkdy katgphvava krlaargvki rpgtvisyiv lkgsgrigdr aipfdefdpt
1621 khkydaeyyi enqvlpaver ilrafgyrke dlryqktrqv glsawlkpkg t
【００３５】
注：明瞭化のため、上記の発現タンパク質アミノ酸番号は保存されているが、活性酵素では２つの介在（インテイン）が除去されている。Ｐｅｒｌｅｒ，  ＦＢ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００２  Ｊａｎ  １；３０（１）：３８３−４参照。
【００３６】
NTba DNA Polymerase (SEQ ID NO: 8)
1 mildvdyite dgkpvirvfk kdkgefkiey drefepyiya llrddsaiee iekitaerhg
61 kvvkvkraek vkkkflgrsv evwvlyfthp qdvpairpdk irkhpavidi yeydipfakr
121 ylidkglipm egdeelklms fdietlyheg eefgtgpilm isyadesear vitwkkidlp
181 yvdvvsteke mikrflkvvk ekdpdvlity dgdnfdfayl kkrceklgvs ftlgrdgsep
241 kiqrmgdrfa vevkgrihfd lypairrtin lptytleavy eavfgkpkek vyaeeiataw
301 etgeglegva rysmedarvt yelgreffpm eaqlsrligq glwdvsrsst gnlvewfllr
361 kayernelap nkpderelar rrggyaggyv keperglwdn ivyldfrsly psiiithnvs
421 pdtlnregck sydvapqvgh kfckdfpgfi psllgnllee rqkikrkmka tldplerkll
481 dyrqraikil ansfygyygy ararwyckec aesvtawgre yiemvirele ekfgfkdlya
541 dtdglhatip gadretvkkk dleflnyinp klpglleley egfysrgffv tkkkyavide
601 egkittrgle ivrrdwseia ketlarvlea ilrhgdveea vrivkeetek lskyevppek
661 lviteqitre lkdykatgph vaiakrlaar gikirpgtvi syivlkgsgr igdraipfde
721 fdptkhryda dyyienqvlp averilrafg ykkederyqk trqvglgawl gmggerlkl
Tba DNA Polymerase (SEQ ID NO: 9)
1 mildvdyite dgkpvirvfk kdkgefkiey drefepyiya llrddsaiee iekitaerhg
61 kvvkvkraek vkkkflgrsv evwvlyfthp qdvpairpdk irkhpavidi yeydipfakr
121 ylidkglipm egdeelklms fdietlyheg eefgtgpilm isyadesear vitwkkidlp
181 yvdvvsteke mikrflkvvk ekdpdvlity dgdnfdfayl kkrceklgvs ftlgrdgsep
241 kiqrmgdrfa vevkgrihfd lypairrtin lptytleavy eavfgkpkek vyaeeiataw
301 etgeglegva rysmedarvt yelgreffpm eaqlsrligq glwdvsrsst gnlvewfllr
361 kayernelap nkpderelar rrggyaggyv keperglwdn ivyldfrsly psiiithnvs
421 pdtlnregck sydvapqvgh kfckdfpgfi psllgnllee rqkikrkmka tldplerkll
481 dyrqraikil ansfygyygy ararwyckec aesvtawgre yiemvirele ekfgfkdlya
541 dtdglhatip gadretvkkk dleflnyinp klpglleley egfysrgffv tkkkyavide
601 egkittrgle ivrrdwseia ketlarvlea ilrhgdveea vrivkeetek lskyevppek
661 lviteqitre lkdykatgph vaiakrlaar gikirpgtvi syivlkgsgr igdraipfde
721 fdptkhryda dyyienqvlp averilrafg ykkederyqk trqvglgawl gmggerlkl
Taq D271 F667Y DNA Polymerase (Thermo Sequenase O) (SEQ ID NO: 10)
1
61
121
181
241                                   mlerlefgs llhefglles pkaleeapwp
301 ppegafvgfv lsrkepmwad llalaaargg rvhrapepyk alrdlkearg llakdlsvla
361 lreglglppg ddpmllayll dpsnttpegv arryggewte eageraalse rlfanlwgrl
421 egeerllwly reverplsav lahmeatgvr ldvaylrals levaeeiarl eaevfrlagh
481 pfnlnsrdql ervlfdelgl paigktektg krstsaavle alreahpive kilqyreltk
541 lkstyidplp dlihprtgrl htrfnqtata tgrlsssdpn lqnipvrtpl gqrirrafia
601 eegwllvald ysqielrvla hlsgdenlir vfqegrdiht etaswmfgvp reavdplmrr
661 aaktinygvl ygmsahrlsq elaipyeeaq afieryfqsf pkvrawiekt leegrrrgyv
721 etlfgrrryv pdlearvksv reaaermafn mpvqgtaadl mklamvklfp rleemgarml
781 lqvhdelvle apkeraeava rlakevmegv yplavpleve vgigedwlsa ke
Tth D273 F668Y DNA Polymerase (SEQ ID NO: 11)
1
61
121
181
241                                     mlerlef gsllhefgll eapapleeap
301 wpppegafvg fvlsrpepmw aelkalaacr dgrvhraadp laglkdlkev rgllakdlav
361 lasregldlv pgddpmllay lldpsnttpe gvarryggew tedaahrall serlhrnllk
421 rlegeekllw lyhevekpls rvlahmeatg vrrdvaylqa lslelaeeir rleeevfrla
481 ghpfnlnsrd qlervlfdel rlpalgktqk tgkrstsaav lealreahpi vekilqhrel
541 tklkntyvdp lpslvhprtg rlhtrfnqta tatgrlsssd pnlqnipvrt plgqrirraf
601 vaeagwalva ldysqielrv lahlsgdenl irvfqegkdi htqtaswmfg vppeavdplm
661 rraaktvnyg vlygmsahrl sqelaipyee avafieryfq sfpkvrawie ktleegrkrg
721 yvetlfgrrr yvpdlnarvk svreaaerma fnmpvqgtaa dlmklamvkl fprlremgar
781 mllqvhdell leapqaraee vaalakeame kayplavple vevgmgedwl sakg
Taq D271 F667Y E681W DNA Polymerase (SEQ ID NO: 12)
1
61
121
181
241                                   mlerlefgs llhefglles pkaleeapwp
301 ppegafvgfv lsrkepmwad llalaaargg rvhrapepyk alrdlkearg llakdlsvla
361 lreglglppg ddpmllayll dpsnttpegv arryggewte eageraalse rlfanlwgrl
421 egeerllwly reverplsav lahmeatgvr ldvaylrals levaeeiarl eaevfrlagh
481 pfnlnsrdql ervlfdelgl paigktektg krstsaavle alreahpive kilqyreltk
541 lkstyidplp dlihprtgrl htrfnqtata tgrlsssdpn lqnipvrtpl gqrirrafia
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【００３７】
本発明の種々の実施形態では、外来添加界面活性剤を用いずに酵素を精製する手順を設計でき、精製酵素の活性を、標準的な活性アッセイを用いて調べることができる。精製手順は一般に以下のステップを含む。
【００３８】
保存試薬及び精製緩衝液（界面活性剤を含まない）を調製し、例えば、フレンチ・プレス、窒素「爆弾」による破壊、又は剪断力を用いて細胞懸濁液又はペレットを破壊させて、対象とする酵素を含む溶解物を得る。次いで、この溶解物を１以上の精製手順に付す。
【００３９】
タンパク質精製手順は、当業者に周知である。例えば、ドーチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１８２巻、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」１９９０参照。溶解物から対象とする酵素を精製するためには、種々の沈殿、クロマトグラフィー及び／又は電気泳動法を用いることができる。これらとしては、種々の手段による沈殿（例えば、硫酸アンモニウム又はポリエチレンイミンなどのポリカチオンを用いて）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡＥ、第四アミン、セルロース、アガロース又は高分子ビーズ上のホスホリル及び／又はカルボキシル官能性を用いて）、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、アガロース又は高分子ビーズ上のヘパリンを用いて）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、アガロース又は高分子ビーズ上のブチル、オクチル、フェニル又はヘキシル官能性を用いて）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーその他が挙げられる。クロマトグラフィーは、低圧（例えば、重力による流れ）を用いて、又は高圧（例えば、ＦＰＬＣ又はＨＰＬＣなどのポンプを備えた機器を用いて）で実施することができる。
【００４０】
さらに、分離ステップとして熱処理を用いることにより対象とする酵素の熱安定性をうまく利用することができる。熱安定性でない多くのタンパク質は変性し、そのため沈殿するが、熱安定性酵素は熱による変性に対して感受性が低いことが多い。熱処理ステップは、好ましくは、約５０℃〜９５℃の間の温度で、より好ましくは、約６５℃〜８５℃の間で、最も好ましくは、約７０℃〜８０℃の間で、約５分〜約５時間の間で、より好ましくは、約１５分〜約２時間の間、最も好ましくは、約１時間以下で実施する。これに関連して、用語「約」とは、所与の測定値の＋／−１０％をさす。変性したタンパク質を、例えば、遠心分離によって除去し、残存する物質をさらなる処理に用いることができる。
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用
本発明の精製熱安定性酵素を得れば、それを当業者に周知の標準法に用いることができる。特にＤＮＡポリメラーゼ（例えば、先の「精製」の項に記載のもの）に関して、このような方法としては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼ活性反応、ＤＮＡシークエンシング反応、ＰＣＲなどの増幅反応、一本鎖エンドヌクレアーゼ反応、二本鎖エンドヌクレアーゼ反応、一本鎖エクソヌクレアーゼ反応及び二本鎖エクソヌクレアーゼ反応が挙げられる。例えば、ロイヤー（Ｌａｗｙｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）  １９８９年４月１５日；２６４（１１）：６４２７〜３７頁；コング（Ｋｏｎｇ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９９３年１月２５日；２６８（３）：１９６５〜７５頁；タボール（Ｔａｂｏｒ）及びリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９８９年４月１５；２６４（１１）：６４４７〜５８頁；及びリアミシェブ（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスズ・オブ・ジ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ＵＳＡ）１９９９年５月２５日；９６（１１）：６１４３〜８頁参照。ＤＮＡシークエンシング法が特に好ましく、ジデオキシ鎖終結シークエンシング法が最も好ましい。例えば、ロー、クラブトリー（Ｒｏｅ，  Ｃｒａｂｔｒｅｅ）及びカーン（Ｋｈａｎ）、「ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」（エッセンシャル・テクニークス・シリーズ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ））、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９６；Ｇｒａｈａｍ及びＨｉｌｌ編、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１参照。
【００４１】
特定の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載したように界面活性剤の非存在下で精製した場合、このようなアッセイにおいて、特に希釈溶液中ではうまく働かない。驚くべきことに、１種以上の界面活性剤を、外来界面活性剤を含まない精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ組成物へ付加することによって、このような酵素の活性を安定、回復、又は増強できることが多いことを測定した。したがって、種々の実施形態では、本発明は、このような組成物への、１種以上の界面活性剤、特に、ポリ（エチレンオキシド）類、アルキルグリコシド類及びアルキルアミンＮ−オキシド類をベースにした界面活性剤の添加について記載する。さらに、タンパク質加水分解物（例えば、Ｐｒｉｏｎｅｘ、加水分解修飾されたブタコラーゲン）も、単独で又は１種以上の界面活性剤と組み合わせて、このような酵素の活性を有利に回復又は増強することができる。
【００４２】
特に好ましいポリ（エチレンオキシド）界面活性剤は次式を有し、
【００４３】
【化１】
2005523016.tif 000002
【００４４】
ＮＰ−４０、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１１４、Ｃ12Ｅ8、Ｃ12Ｅ9、ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｘ−０８０、ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｘ−１００、ＬＵＢＲＯＬ（登録商標）ＰＸ、ＢＲＩＪ（登録商標）３５、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０及びＴＷＥＥＮ（登録商標）２０が挙げられる。
【００４５】
好ましいアルキルグリコシドは次式を有し、
Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2）x−ＣＨ3  Ｒ＝グルコース、マルトース、ラクトース、キシロース、ガラクトース、ｘ＝５〜１６；
Ｒ−Ｓ−（ＣＨ2）x−ＣＨ3  Ｒ＝グルコース、マルトース、ラクトース、  キシロース、ガラクトース、ｘ＝５〜１６、
ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（「ドデシルマルトシド」）、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（「オクチルグルコシド」）、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、  ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド及びオクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドが挙げられる。
【００４６】
好ましいアルキルアミンＮ−オキシドは次式を有し、
【００４７】
【化２】
2005523016.tif 000003
【００４８】
ラウリルジメチルアミンオキシドが挙げられる。
【００４９】
関連分野の当業者であれば、本明細書に記載した方法及び適用に対するその他の適した改変及び適合は自明であり、本発明又はその実施形態の範囲を逸脱することなくなされ得ることは容易に理解されよう。以下、本発明を詳しく説明したが、これは、単に例示目的で含めるものであり、本発明を限定するものではない、以下の実施例を参照することによってより明確に理解されるであろう。
【実施例１】
【００５０】
ＤＮＡポリメラーゼの精製
この実施例は、凍結細菌細胞ペーストから好熱性のＤＮＡポリメラーゼを精製する方法を記載する。
【００５１】
試薬及び緩衝液の調製
溶解緩衝液は、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、ＥＤＴＡ及び硫酸アンモニウムを混合することにより調製した。緩衝液溶液中のＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ＥＤＴＡ及び硫酸アンモニウムの最終濃度は、それぞれ５０ｍＭ、２ｍＭ及び１Ｍとした。この緩衝液溶液のｐＨを、室温で８．５０±０．１に調整した。緩衝液を４℃で最大１週間保存し、使用前に濾過した。
【００５２】
１００ｍＭ  ＰＭＳＦ：ＰＭＳＦ１ｇを適当な容器に入れたイソプロパノール６０ｍｌへ加え、ボルテックス処理をして完全に混合した（この物質は容易には溶けない）。この溶液を４℃で１ヶ月間保存した。穏やかに加熱して（＜５０℃）、使用前に、保存中に晶出していた物質を再び溶解する。
【００５３】
緩衝液Ａは、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、ＥＤＴＡ、硫酸アンモニウム及びＤＴＴを混合することにより調製した。Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、硫酸アンモニウム及びＤＴＴの最終濃度は、それぞれ５０ｍＭ、１ｍＭ、１Ｍ及び１ｍＭとした。緩衝液ＡのｐＨを、ＨＣｌ（６Ｎ）を用いて室温で８．５０±０．１に調整した。緩衝液Ａは、ブチルセファロースＦＦカラムの平衡化に用いた。
【００５４】
緩衝液Ｂは、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、ＥＤＴＡ及びＤＴＴを混合することにより調製した。Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ＥＤＴＡ及びＤＴＴの最終濃度は、それぞれ５０ｍＭ、１ｍＭ及び１ｍＭとした。緩衝液ＢのｐＨを、ＨＣｌ（６Ｎ）を用いて室温で８．５±０．１に調整した。緩衝液Ｂも、ブチルセファロースＦＦカラムに用いた。緩衝液ＡとＢの双方を滅菌濾過し、４℃で最大１週間保存した。
【００５５】
グリセロールを含む最終透析緩衝液：最終透析緩衝液は、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ＥＤＴＡ及びＫＣｌの溶液とグリセロール及びＨ2Ｏとを混合して調製した。Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ＥＤＴＡ及びＫＣｌの最終濃度は、それぞれ２０ｍＭ、０．１ｍＭ及び２５ｍＭとした。グリセロールの最終濃度は５０％（ｖ／ｖ）とした。緩衝液のｐＨを、６Ｎ  ＨＣｌを用いて室温で８．５±０．１に調整した。緩衝液は使用前にオートクレーブ処理しなくてはならず（濾過はしない）、次いで、緩衝液をオートクレーブ処理し、４℃まで冷却した後にＤＴＴ（最終濃度は１ｍＭ）を緩衝液へ加えた。
【００５６】
【表１】
2005523016.tif 000004
【００５７】
ブチルセファロース緩衝液Ａでのカラムの平衡化は、７５ｍｌ／分（３０ｃｍ／時、カラムの断面積は１５４ｃｍ2）、システム圧力が２．０バール以下（これは２．７バールの充填圧力のうちの７５％）にて、とした。インライン伝導率によってカラムの平衡化をモニタリングし、安定した読み取り値に到達するとカラムの平衡化が達成された。通常、２カラム容量（ＣＶ）が平衡化に適していると分かっているはずである。総ＣＶの１％の、緩衝液Ａ中１．５％アセトンを１５ｃｍ／時で注入して、カラムの性能をモニタリングした。非対称は０．８５〜１．６の間、ＨＥＴＰは２８００〜５５００Ｎ／ｍで０．０１８〜０．０３６ｃｍ。
【００５８】
細菌細胞の溶解：
組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを発現している大腸菌のペーストを、細菌細胞溶解の前日に−８０℃のフリーザーから４℃へ移した。予め冷却した溶解緩衝液をこの細胞（５ｍｌ／ｇ）へ加え、その後、直ちにＰＭＳＦ（１００ｍＭ）を加えて均質になるまで連続して混合した。サンプルのその他の部分を溶解され得るまで４℃で保存するならば、大容量のサンプルを、溶解ステップ用に分割することができる。
【００５９】
プレス器を４℃まで予め冷却し、２００〜５００ｍｌの４℃の溶解緩衝液を流した。細胞ペーストを均等に懸濁するとすぐに、１２〜１５０００  ＰＳＩＧで細胞をプレス器に通した。プレス器の排出ラインが曇って／乳状になった時点で、溶解物を回収した。溶解物は僅かに粘性があった。これをさらなるプライミングをせずに同じ条件下で２度目のプレス器に通した。２度目に通過した溶解物にはもう粘性はなかった。
【００６０】
熱沈降
溶解した細胞の容器を、変性させるため、予め加熱した８５±２℃の水浴中に入れた。溶解物の温度を、溶解物中に置いた温度計でモニタリングした。温度が７５±２℃に達するとすぐに、サンプルを４０分間インキュベートした。４０分後、サンプルを回収し、＜１０℃まで冷却するために、穏やかに旋回させながら直ちに氷上に置いた。冷却した細胞を１Ｌ瓶へ分配した。細胞抽出物のうち少量のサンプルを（＜２００μｌ）、後にサンプルの収率を評価するために残した。
【００６１】
細胞抽出物を、次に４℃で３０分間、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＬＡ  ８．１００ローターで、８０００ｒｐｍで遠心分離した（ｒｃｆ＝１６０００）。上清を清潔な容器に注ぎ入れ、冷蔵室で一晩保存した。細胞ペレットは廃棄した。次いで、一晩上清を４℃で３０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離した。清澄化した細胞抽出物の上清を、後で精製のためブチルセファロースＦＦカラムへ添加するために回収した。清澄化細胞抽出物のうち少量のサンプルを（＜２００μｌ）、後に精製サンプルの収率を評価するために残した。
【００６２】
ブチルセファロースＦＦカラム精製
清澄化細胞抽出物をブチルセファロースＦＦカラムへ添加する前に、カラムに緩衝液Ａを流した。ブチルセファロースカラムの流出液の伝導率及びｐＨを調べ、調整した。伝導率はブチルセファロース緩衝液Ａの±１０％で、ｐＨは±０．３ｐＨでなくてはならない。清澄化細胞抽出物の伝導率も測定した。それはブチルセファロース緩衝液Ａの１０％以内でなくてはならない。調整は不要であるはずである。
【００６３】
サンプルを７５ｍｌ／分でブチルセファロースＦＦカラムに添加した。非結合画分を、Ａ（２６０／２８０ｎｍ）が増加し始めるとすぐに回収した。カラムを１０ＣＶで洗浄し、以下の勾配で溶出した。１ＣＶ中０〜４０％、５ＣＶに対して又はＡ（２６０／２８０ｎｍ）がベースラインに戻るまで４０％で保持、３ＣＶ中４０〜７０％、５ＣＶに対して又はＡ（２６０／２８０ｎｍ）がベースラインに戻るまで７０％で保持、１ＣＶ中７０〜１００％、３ＣＶに対して１００％で保持。サンプルの回収は、Ａ２８０が増加したときに開始した。画分を４℃で一晩保存した。カラムと結合しないタンパク質、ピーク画分、一連の基準、カラムに添加した物質及び参照ＤＮＡポリメラーゼサンプルを８〜２５％  ＳＤＳゲルでランした。クロマトグラフ及び電気泳動結果を始めとするデータを記録する。
【００６４】
サンプル透析
次にサンプルを透析用に調製した。プールしていたブチル画分に沈殿物質があるならば、透析前に濾過する。ダイアフィルトレーションも用いてＤＮＡポリメラーゼを含む画分を濃縮した。サンプル容積が１Ｌ未満となると、サンプルを透析チューブに入れ、グリセロールを含む３Ｌの最終緩衝液に対して一晩透析した。緩衝液を、その日の終わりに交換し、翌日の朝に再び交換した。ＤＮＡポリメラーゼを透析から回収した。
【００６５】
本発明の一実施形態では、ＴａｑΔ２７１  Ｆ６６７Ｙ及びＴａｑΔ２７１  Ｆ６６７Ｙ  Ｅ６８１Ｗを、界面活性剤ＮＰ−４０及びＴｗｅｅｎ−２０を用いて又は用いずに精製した。界面活性剤を用いずに抽出したポリメラーゼのブチルセファロースクロマトグラフィーの溶出プロフィールは、Ｔｗｅｅｎ  ２０及びＮＰ−４０を用いて抽出したポリメラーゼのプロフィールと本質的に同一であった。界面活性剤を用いる又は用いない精製からの、これらの酵素の出発物質に対する収率を表３及び４に示す。界面活性剤を用いずに精製した酵素の収率は、界面活性剤を用いて精製した酵素の収率と有意差はない。
【００６６】
【表２】
2005523016.tif 000005
【００６７】
【表３】
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【実施例２】
【００６８】
酵素活性アッセイ
２５ｍＭ  ＴＡＰＳ（トリス−ヒドロキシメチル−メチルアミノプロパンスルホン酸）緩衝液、ｐＨ９．３（２５℃で測定）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各０．２ｍＭ、０．２ｍＭ［α−33Ｐ］−ｄＡＴＰ（０．０５〜０．１  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び０．４ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡを含む５０μＬの反応を実施して、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。反応混合物（４５μＬ）を７４℃まで予め加熱し、希釈したポリメラーゼ（５μＬ）を十分に混合しながら添加した。７４℃で、さらに１０分間インキュベーションした後、１０μＬの６０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して反応を停止させ、全混合物を０℃に置いた。アリコート（５０ｍＬ）の酸沈殿性放射活性を、０．０５  ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む１ｍｌの２ｍＭ  ＥＤＴＡで希釈し、１ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸、２％（ｗ／ｖ）ピロリン酸ナトリウム（Ｎａ4Ｐ2Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ）を添加し、氷上で１５分以上インキュベートすることによって測定した。沈殿したＤＮＡを、２．４ｃｍ  ＧＦＣフィルター・ディスク（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）を通して濾過することによって回収し、１Ｎ  ＨＣｌ、０．１Ｍ  ピロリン酸ナトリウム５ｍｌで７回洗浄した。フィルターを、３ｍｌのシンチレーション計数液に入れ、33Ｐ−特異的放射活性をシンチレーション計数によって求めた。
【００６９】
表５及び６に示したアッセイには、ポリメラーゼを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール及び指示された濃度の界面活性剤又はその他の添加剤を含む緩衝液で１０〜５０００倍に希釈した。可能な場合は、１０分で２０〜１００ｐｍｏｌのｄＡＭＰを取り込んだ反応だけを活性の算出に用いた。
【００７０】
【表４】
2005523016.tif 000007
【００７１】
界面活性剤ＮＰ−４０及びＴｗｅｅｎ−２０は、精製中に存在しなくとも、活性アッセイ中に存在すれば、所望の反応及びアッセイで、活性型のＴａｑΔ２７１  Ｆ６６７Ｙ（ポリメラーゼＡ）、ＴａｑΔ２７１  Ｆ６６７Ｙ  Ｅ６８１Ｗ（ポリメラーゼＢ）及びＴｔｈΔ２７３  Ｆ６６８Ｙ（ポリメラーゼＣ）活性を提供することが証明された。その他の界面活性剤及び化合物も、アッセイ反応混合物中でポリメラーゼ活性を希釈し、増加させるのに適していることが証明された。異なる界面活性剤は異なるポリメラーゼ活性を増加させることができることから、このような界面活性剤は、アッセイ中で異なるポリメラーゼの異なる活性を区別するのに有用であり得る。
【００７２】
【表５】
2005523016.tif 000008
【００７３】
【表６】
2005523016.tif 000009
【００７４】
本発明はこれで十分に説明したので、当業者であれば、これを、本発明又はその実施形態の範囲に影響を及ぼすことなく、広範で同等な範囲の条件、処方及びその他のパラメーター内で実行可能であることは理解されよう。本明細書中に引用した全ての出版物、特許及び特許出願は、本発明の属する技術分野の当業者の技術レベルを示し、これらはその全文を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【配列表】
2005523016000001.app
【国際調査報告】
2005523016.tif 000010
2005523016.tif 000011