(57)【要約】本発明は、高い親和性と高い感度とを組み合わせて、固相上の核酸を検出するための方法に関する。より具体的には、本発明は、固相ベースの核酸アッセイにおいて、高親和性ハイブリダイゼーションを高度に特異的な酵素的識別と組み合わせた方法に関する。本発明はさらに、開示されたアッセイを実行するために必要な試薬を含有するキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸分子を含むサンプル中で、一塩基多型を含むアリルを識別することができる、固相ベースの核酸アッセイであって、
a）以下のi）およびii）を使用して、固相支持体に対して標的核酸分子を固定化すること、
i）固相支持体に固定化され、標的分子にハイブリダイズし、そしてブロック化されている末端ヌクレオチドおよび／またはリン酸化されていない末端ヌクレオチドを有する、1またはそれ以上の捕捉オリゴヌクレオチド、および
ii）固相支持体に固定化され、標的分子にハイブリダイズする識別オリゴヌクレオチドであって、識別オリゴヌクレオチドの末端のヌクレオチドが、一塩基多型位置に相補的であり、そしてブロック化されていないものおよび／またはリン酸化されているもの；
b）相補的ヌクレオチドにハイブリダイズされたいずれかのブロック化されていない末端ヌクレオチドおよび／またはリン酸化されている末端ヌクレオチド上で、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない末端ヌクレオチドおよび／またはリン酸化されている末端ヌクレオチドに対して特異的な反応を行うこと；そして
c）いずれかの反応が生じるかどうかを調べることであって、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない末端ヌクレオチドおよび／またはリン酸化されている末端ヌクレオチドの反応を検出することが、一塩基多型位置にて標的核酸分子に対して完全にハイブリダイズする識別オリゴヌクレオチドであることを意味すること；
を含む、前記固相ベースの核酸アッセイ。
【請求項２】
a）ハイブリダイズ条件下において、標的ヌクレオチド分子、1またはそれ以上の標的捕捉エキステンダー、識別エキステンダーおよび1またはそれ以上の標的捕捉プローブを含みそして直接的またはスペーサーを使用して固相支持体に対して3'末端で固定化された捕捉プローブを含む固相支持体、を接触させること：ここで、
i）識別エキステンダーは、固相支持体に対して識別エキステンダーを固定化するために十分な、捕捉プローブの配列に対して相補的な配列を含み、そして一塩基多型位置に対して相補的なヌクレオチドが識別エキステンダーのブロック化されていない3'末端ヌクレオチドであるような一塩基多型を含むアリルに対して相補的な配列を含む標的核酸分子の配列に対して相補的な配列を含み、
ii）捕捉プローブは、固相支持体に対して識別エキステンダーを固定化するために十分な識別エキステンダーの配列に対して相補的な配列を含み、
iii）1またはそれ以上の標的捕捉プローブは、固相支持体に対して標的捕捉エキステンダーを固定化するためにそれぞれが十分な1またはそれ以上の標的捕捉エキステンダーの配列に対して相補的な配列を含み、ここでそれぞれの標的捕捉エキステンダーはさらに、標的捕捉エキステンダーに対して標的核酸分子をハイブリダイズさせるためにそれぞれが十分な標的核酸分子の配列に対して相補的な配列を含み、それぞれの標的捕捉エキステンダーはブロック化されている3'末端ヌクレオチドを有し；そして
iv）1またはそれ以上の標的捕捉エキステンダーは、固相支持体上の1またはそれ以上の標的捕捉プローブに対してハイブリダイズしそして標的核酸分子に対してハイブリダイズし、そして識別エキステンダーは、固相支持体上の捕捉プローブに対してそして標的核酸分子に対してハイブリダイズし；
b）相補的ヌクレオチドに対してハイブリダイズさせたいずれかのブロック化されていない3'末端ヌクレオチド上で反応を行うことであって、この反応は相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドに特異的であり；そして
c）いずれかの反応が生じるかどうかを調べることであって、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドの反応を検出することは、3'末端ヌクレオチドにて標的核酸分子に対して完全にハイブリダイズする識別エキステンダーであることを意味し、そして標的核酸分子中に存在するアリルが識別エキステンダーの3'末端に対して相補的な一塩基多型を有するアリルであることを意味する；
を含む、請求項1に記載の固相ベースの核酸アッセイ。
【請求項３】
a）ハイブリダイズ条件下において、標的ヌクレオチド分子、1またはそれ以上の標的捕捉エキステンダー、識別エキステンダー、および5'末端にて固相支持体に対して直接的またはスペーサーを使用して固定化された1またはそれ以上の標的捕捉プローブおよび捕捉プローブを含む固相支持体を接触させること：ここで、
i）識別エキステンダーが、固相支持体に対して識別エキステンダーを固定化するために十分な捕捉プローブの配列に対して相補的な配列および一塩基多型位置に対して相補的なヌクレオチドが識別エキステンダーのリン酸化されている5'末端ヌクレオチドであるような一塩基多型を含むアリルに対して相補的な配列を含む標的核酸分子の配列に対して相補的な配列を含み、
ii）捕捉プローブが、固相支持体に対して識別エキステンダーを固定化するために十分な識別エキステンダーの配列に対して相補的な配列を含み、
iii）1またはそれ以上の標的捕捉プローブが、固相支持体に対して標的捕捉エキステンダーを固定化するためのそれぞれ十分な1またはそれ以上の標的捕捉エキステンダーの配列に対して相補的な配列を含み、それぞれの標的捕捉エキステンダーはさらに、標的捕捉エキステンダーに対して標的核酸分子をハイブリダイズさせるためにそれぞれ十分な標的核酸分子の配列に対して相補的な配列を含み、それぞれの標的捕捉エキステンダーはリン酸化されていない5'末端ヌクレオチドを有し；そして
iv）1またはそれ以上の標的捕捉エキステンダーが、固相支持体上の1またはそれ以上の標的捕捉プローブに対してハイブリダイズしそして標的核酸分子に対してハイブリダイズし、そして識別エキステンダーが固相支持体上の捕捉プローブに対してハイブリダイズしそして標的核酸分子に対してハイブリダイズし；
b）相補的ヌクレオチドに対してハイブリダイズするいずれかのリン酸化されている5'末端ヌクレオチド上で、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするリン酸化されている5'末端ヌクレオチドに対して特異的である反応を行うこと；そして
c）いずれかの反応が生じるかどうかを調べることであって、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドの反応を検出することが、リン酸化されている5'ヌクレオチドにて標的核酸分子に対して完全にハイブリダイズする識別エキステンダーを意味しており、そして標的核酸分子中に存在するアリルが識別エキステンダーの5'末端に対して相補的な一塩基多型を有するアリルであることを意味する；
を含む、請求項1の固相ベースの核酸アッセイ。
【請求項４】
a）ハイブリダイズ条件下において、標的ヌクレオチド分子、1またはそれ以上の標的捕捉エキステンダー、識別エキステンダー、および3'末端にて固相支持体に直接的またはスペーサーを使用して固定化された1またはそれ以上の標的捕捉プローブおよび捕捉プローブ、および5'末端にて固相支持体に対して直接的またはスペーサーを使用して固定化された1またはそれ以上の標的捕捉プローブを含む固相支持体、を接触させること：ここで、
i）識別エキステンダーは、固相支持体に対して識別エキステンダーを固定化するために十分な捕捉プローブの配列に対して相補的な配列、および一塩基多型位置に対して相補的なヌクレオチドが識別エキステンダーのブロック化されていない3'末端ヌクレオチドであるような一塩基多型を含むアリルに対して相補的な配列を含む標的核酸分子の配列に対して相補的な配列を含み、
ii）捕捉プローブは、固相支持体に対して識別エキステンダーを固定化させるために十分な識別エキステンダーの配列に対して相補的な配列を含み、
iii）1またはそれ以上の標的捕捉プローブは、固相支持体に対して標的捕捉エキステンダーを固定化するためにそれぞれ十分な1またはそれ以上の標的捕捉エキステンダーの配列に対して相補的な配列を含み、それぞれの標的捕捉エキステンダーはさらに、標的捕捉エキステンダーに対して標的核酸分子をハイブリダイズさせるのにそれぞれ十分な標的核酸分子の配列に対して相補的な配列を含み、それぞれの標的捕捉エキステンダーおよびそれぞれの標的捕捉プローブは、ブロック化されている3'末端ヌクレオチドを有し；そして
iv）1またはそれ以上の標的捕捉エキステンダーは、固相支持体上の1またはそれ以上の標的捕捉プローブに対してハイブリダイズしそして標的核酸分子に対してハイブリダイズし、そして識別エキステンダーは、固相支持体上の捕捉プローブに対してハイブリダイズしそして標的核酸分子に対してハイブリダイズし；
c）相補的ヌクレオチドに対してハイブリダイズさせたいずれかのブロック化されていない3'末端ヌクレオチド上で、相補的ヌクレオチドに完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドに特異的である反応を行うこと；そして
d）いずれかの反応が生じるかどうかを調べることであって、ここで、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドの反応を検出することは、3'末端ヌクレオチドにて標的核酸分子に対して完全にハイブリダイズする識別エキステンダーを意味しており、そして標的核酸分子中に存在するアリルが、識別エキステンダーの3'末端に対して相補的な一塩基多型を有するアリルであることを意味する、
を含む、請求項1に記載の固相ベースの核酸アッセイ。
【請求項５】
a）ハイブリダイズ条件下において、標的核酸分子、および固相支持体に対して5'末端にて直接的またはスペーサーを使用して結合させた1またはそれ以上の標的捕捉プローブおよび識別プローブを含む固相支持体を接触させること；
i）識別プローブは、一塩基多型位置に対して相補的なヌクレオチドが識別プローブのブロック化されていない3'末端ヌクレオチドであるような一塩基多型を含むアリルに対して相補的な配列を含む標的核酸分子の配列に対して相補的な配列を含み、
ii）1またはそれ以上の標的捕捉プローブは、捕捉プローブに対して標的核酸分子をハイブリダイズさせるためにそれぞれ十分な標的核酸分子の1またはそれ以上の配列に対して相補的な配列を含み、それぞれの捕捉プローブは、ブロック化されている3'末端ヌクレオチドを有し；
b）相補的ヌクレオチドに対してハイブリダイズしたいずれかのブロック化されていない3'末端ヌクレオチド上で、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドに特異的である反応を行うこと；そして
d）いずれかの反応が生じるかどうかを調べることであって、ここで、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドの反応を検出することは、3'末端ヌクレオチドにて標的核酸分子に対して完全にハイブリダイズする識別プローブを意味し、そして標的核酸分子中に存在するアリルが識別プローブの3'末端に対して相補的な一塩基多型を有するアリルであることを意味する；
を含む、請求項1に記載の固相ベースの核酸アッセイ。
【請求項６】
a）ハイブリダイズ条件下において、標的核酸分子、および3'末端にて直接的またはスペーサーを使用して固相支持体に対して結合する1またはそれ以上の標的捕捉プローブおよび識別プローブを含む固相支持体を接触させ；ここで
i）識別プローブは、一塩基多型位置に対して相補的なヌクレオチドが識別プローブのリン酸化されている5'末端ヌクレオチドであるような一塩基多型を含むアリルに対して相補的な配列を含む標的核酸分子の配列に対して相補的な配列を含み、
ii）1またはそれ以上の標的捕捉プローブは、捕捉プローブに対して標的核酸分子をハイブリダイズさせるためにそれぞれ十分な標的核酸分子の1またはそれ以上の配列に対して相補的な配列を含み、それぞれの捕捉プローブは、リン酸化されていない5'末端ヌクレオチドを有し；
b）相補的ヌクレオチドに対してハイブリダイズしたいずれかのリン酸化されている5'末端ヌクレオチド上で、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするリン酸化されている5'末端ヌクレオチドに特異的である反応を行うこと；そして
d）いずれかの反応が生じるかどうかを調べることであって、ここで、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするリン酸化されている5'末端ヌクレオチドの反応を検出することが、5'末端ヌクレオチドにて標的核酸分子に対して完全にハイブリダイズする識別プローブであることを意味し、そして標的核酸分子中に存在するアリルが識別プローブの5'末端に対して相補的な一塩基多型を有するアリルであることを意味する；
を含む、請求項1に記載の固相ベースの核酸アッセイ。
【請求項７】
相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドに特異的な反応、または相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするリン酸化されている5'末端ヌクレオチドに特異的な反応を含み、ここで、相補的なヌクレオチドに完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドに特異的な反応または相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするリン酸化されている5'末端ヌクレオチドに特異的な反応は、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドを有する識別プローブまたは識別エキステンダーに対して、標識化ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを酵素的にライゲーションする反応、または相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするリン酸化されている5'末端ヌクレオチドに特異的な反応である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアッセイ。
【請求項８】
相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドに特異的な反応または相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするリン酸化されている5'末端ヌクレオチドに特異的な反応を含み、ここで、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドに特異的な反応または相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするリン酸化されている5'末端ヌクレオチドに特異的な反応が、標識されたヌクレオチドの取り込みを含むポリメラーゼ触媒化プライマー伸長反応である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアッセイ。
【請求項９】
相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドに特異的な反応を含み、ここで、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドに特異的な反応が、標識されたヌクレオチドの取り込みを含むポリメラーゼ触媒化プライマー伸長反応である、請求項1、2、4または5のいずれか1項に記載のアッセイ。
【請求項１０】
相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドに特異的な反応を含み、ここで、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドに特異的な反応が、標識されたヌクレオチドの取り込みを含むポリメラーゼ触媒化一塩基伸長反応である、請求項1、2、4または5のいずれか1項に記載のアッセイ。
【請求項１１】
相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドに特異的な反応または相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするリン酸化されている5'末端ヌクレオチドに特異的な反応を含み、ここで、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドに特異的な反応または相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするリン酸化されている5'末端ヌクレオチドに特異的な反応が、相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするブロック化されていない3'末端ヌクレオチドを有する識別プローブまたは識別エキステンダーに対して標識化部分を化学的にライゲーションする反応または相補的ヌクレオチドに対して完全にハイブリダイズするリン酸化されている5'末端ヌクレオチドに特異的な反応である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のアッセイ。
【請求項１２】
標識化部分が、標識されたオリゴヌクレオチドである、請求項11に記載のアッセイ。
【請求項１３】
標識されたヌクレオチドが、ビオチン、蛍光物質、ナノ粒子または酵素により標識化される、請求項7〜12のいずれか1項に記載のアッセイ。
【請求項１４】
固相支持体が、ビーズ、平面表面、金属粒子、またはゲルマトリクスである、請求項1〜13のいずれか1項に記載のアッセイ。
【請求項１５】
反応が生じるかどうかを決定する際に、光学的方法、電気的方法、機械的方法、または磁性的方法を使用する、請求項1〜14のいずれか1項に記載のアッセイ。
【請求項１６】
アッセイが、一塩基多型を含むアリルを有する複数の遺伝子の存在を同定するための多重アッセイであり、一塩基多型を含むアリルを有する一遺伝子にそれぞれ特異的な複数の識別プローブを含むアッセイを含み、そして識別プローブおよび標的捕捉プローブは固相支持体上の特異的なスポット上で空間的に分離されており、ここでアッセイは一塩基多型を含むアリルを有する一遺伝子にそれぞれ特異的な複数の識別プローブを含み、そして識別プローブおよび標的捕捉プローブは固相支持体上の特異的なスポット上で空間的に分離されているか、またはアッセイは一塩基多型を含むアリルを有する一遺伝子にそれぞれ特異的な複数の識別エキステンダーを含み、そして捕捉プローブおよび標的捕捉プローブは固相支持体に対して固定化されている固相支持体上の特異的なスポット上で空間的に分離されている、請求項1〜15のいずれか1項に記載のアッセイ。
【請求項１７】
識別エキステンダーを固相支持体に固定化させた捕捉プローブに対してハイブリダイズさせ、その後標的核酸分子と接触させる、請求項2〜4のいずれか1項に記載のアッセイ。
【請求項１８】
標的捕捉エキステンダーを標的核酸分子と混合し、その後固相支持体上に固定化した標的捕捉プローブと接触させる、請求項17に記載のアッセイ。
【請求項１９】
標的捕捉エキステンダーを固相支持体上に固定化した標的捕捉プローブと混合し、その後標的核酸分子と接触させる、請求項17に記載のアッセイ。
【請求項２０】
以下のものを含む固相支持体からなる群から選択される固相支持体を含むキットであって：
a）3'末端にて直接的またはスペーサーを使用して固相支持体に対して結合されている捕捉プローブおよび1またはそれ以上の標的捕捉プローブ、ブロック化されている3'末端を有しそして標的捕捉プローブおよび標的核酸分子上の配列に対して相補的な配列を有する1またはそれ以上の標的捕捉エキステンダー、およびブロック化されていない3'末端を有しそして捕捉プローブおよび標的核酸分子上の配列に対して相補的な配列を有する識別エキステンダー、ここで、識別エキステンダーの3'末端のヌクレオチドは、アリルの一塩基多型位置に対して相補的であり；
b）5'末端にて直接的またはスペーサーを使用して固相支持に対して結合している捕捉プローブおよび1またはそれ以上の標的捕捉プローブ、リン酸化されていない5'末端を有しそして標的捕捉プローブおよび標的核酸分子上の配列に対して相補的な配列を有する1またはそれ以上の標的捕捉エキステンダー、およびリン酸化されている5'末端を有しそして捕捉プローブおよび標的核酸分子上の配列に対して相補的な配列を有する識別エキステンダー、ここで、識別エキステンダーの5'末端のヌクレオチドは、アリルの一塩基多型位置に相補的であり；
c）3'末端にて直接的またはスペーサーを使用して固相支持体に対して結合する捕捉プローブ、ブロック化されている3'末端を有しそして5'末端にて直接的またはスペーサーを使用して固相支持体に結合される1またはそれ以上の標的捕捉プローブ、ブロック化されている3'末端を有しそして標的捕捉プローブおよび標的核酸分子上の配列に対して相補的な配列を有する1またはそれ以上の標的捕捉エキステンダー、およびブロック化されていない3'末端を有しそして捕捉プローブおよび標的核酸分子上の配列に対して相補的な配列を有する識別エキステンダー；およびこれらの組み合わせであって、ここで識別エキステンダーの3'末端のヌクレオチドは、アリルの一塩基多型位置に対して相補的である；
前記キット。
【請求項２１】
固相支持体は異なる識別エキステンダーにハイブリダイズする1つより多い異なる捕捉プローブを含み、それぞれの異なる捕捉プローブは同定可能な位置で空間的に分離されており、そして異なる識別エキステンダーは異なる遺伝子のアリルの一塩基多型位置に対して相補的な末端を有する、請求項20に記載のキット。
【請求項２２】
a）5'末端にて直接的またはスペーサーを使用して固相支持体に対して結合する識別プローブ、ブロック化されている3'末端を有しそして5'末端にて直接的またはスペーサーを使用して固相支持体に対して結合する1またはそれ以上の標的捕捉プローブを含む固相支持体であって、標的プローブの配列が、標的核酸分子上の配列に対して相補的であり、そして識別プローブ上の配列が標的核酸分子上の配列に対して相補的であり、識別プローブの3'末端のヌクレオチドはブロック化されておらずそしてアリルの一塩基多型位置に対して相補的であり；
b）3'末端にて直接的またはスペーサーを使用して固相支持体に対して結合する識別プローブ、リン酸化されていない5'末端を有しそして3'末端にて直接的またはスペーサーを使用して固相支持体に対して結合する1またはそれ以上の標的捕捉プローブを含む固相支持体であって、標的プローブの配列は標的核酸分子上の配列に対して相補的であり、そして識別プローブ上の配列は標的核酸分子上の配列に対して相補的であり、識別プローブの5'末端のヌクレオチドはリン酸化されそしてアリルの一塩基多型位置に対して相補的であり；そしてこれらの組み合わせ；
からなる群から選択される、固相支持体。
【請求項２３】
固相支持体は1つより多い異なる識別プローブを含み、それぞれの異なる識別プローブは同定可能な位置で空間的に分離されており、そして異なる識別エキステンダーは異なる遺伝子のアリルの一塩基多型位置に対して相補的な末端を有する、請求項22に記載の固相支持体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
［0001］本発明は、固相上の核酸を高親和性および高特異性で検出するための方法に関する。より具体的には、本発明は、固相ベースの核酸アッセイにおいて、高親和性ハイブリダイゼーションを高度に特異的な酵素的識別と組み合わせる方法に関する。本発明はさらに、開示されたアッセイを実行するために必要な試薬を含有するキットに関する。デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）の検出は、ヒトの診断または獣医学的な診断、食品管理、環境的解析、穀物保護、生化学的／薬理学的研究、または法医学において重要である。
【０００２】
発明の背景
［0002］典型的な固相ベースの核酸アッセイにおいては、捕捉オリゴヌクレオチドは、固相支持体上に固定化される。標識された核酸標的または標識されていない核酸標的は、捕捉プローブに対して特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの後そして必要であれば標識化の後、ハイブリダイゼーション現象を、たとえば、光学的方法、電気的方法、機械的方法、磁性的方法、またはその他の読み出し方法を用いて、検出することができる。一般的には、核酸鎖間の塩基対合相互作用の高特異性をこれらの方法において使用して、異なる標的どうしを区別する。固相を使用することにより、異なる配列を有する異なる捕捉オリゴヌクレオチドを空間的に分離することにより、核酸ハイブリダイゼーションアッセイの多重化が容易に可能になる。さらに、固相により、結合種および非結合種の分離が、単純な洗浄工程により可能になる。非常に多数の異なる支持体、たとえば、平面表面（“チップ”）、ビーズまたはゲルマトリクスを固相として使用することができる。DNAオリゴヌクレオチドアレイを調製する方法は、たとえば、S. L. Beaucage（Curr. Med. Chem. 2001, 8, 1213-1244）またはM. C. Pirrung（Angew. Chem. 2002, 114, 1326-1341）中にまとめられている。固相ベースの核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、たとえば、一塩基多型（SNPs）の解析、発現プロファイリングまたはウィルス検出などのために幅広く使用されている（まとめたものとしては、たとえば、J. Wang, Nucl. Acids Res. 2000, 28, 3011-3016を参照）。
【０００３】
［0003］核酸の特異的検出のための代替的なアプローチは、固相上のまたは溶液中の異なるプローブ-標的複合体の識別のための酵素の特異性を使用する。たとえば、酵素的SNPアッセイにおいて、固定化捕捉プローブを、アリル-特異的プライマー伸長反応のためのプライマーとして、またはアリル-特異的オリゴヌクレオチドライゲーション反応の1つの構成要素として、使用することができる。ライゲーションアッセイは、たとえば、US 5,800,994およびWO 9631622中に記載されている；プライマー伸長反応は、たとえば、WO A200058516/US 2001046673/EP 1061135A2中に記載されている。また、酵素的核酸アッセイの多重化は、表面上でのオリゴヌクレオチドプローブの空間的な分類により実現することができる。
【０００４】
［0004］化学的オリゴヌクレオチドライゲーション反応は、上述した酵素的な方法と類似して、異なる配列間の識別のために使用することができる。たとえば、WO 9424143は、α-ハロアセチル誘導体化オリゴヌクレオチドを、第二のホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドに対して化学的ライゲーションを行い、自発的にそして選択的に共有結合を形成することを記載している。
【０００５】
［0005］一塩基多型を遺伝子型決定する方法は、たとえば、P.-Y. Kwok（Annu. Rev. Genomics Hum. Gen. 2001, 2, 235-258）中に記載されている。SNPsの検出のための現在の一般的な方法の一つは、3工程の手順：生物学的材料からのゲノムDNAの精製、たとえば、PCRによる所望の遺伝子フラグメントの増幅、およびそれに引き続いて、たとえば、アリル特異的ハイブリダイゼーション、酵素的反応などにより行う検出；に依存している。高感度の核酸検出方法が現在は存在しないため、増幅工程はさけて通ることができないものである。しかしながら、この工程は、非常に手間がかかり、時間がかかり、費用がかかり、そして多重化が困難なものである。したがって、たとえば、SNPsを含有する核酸を高感度、高選択的に、ゲノムDNAから直接的に、事前に増幅することなく検出することができるアッセイが必要とされている。
【０００６】
［0006］本発明は、事前に増幅することなく、生物学的供給源由来の核酸を固相表面上で解析することができるようにするための、高特異性と高感度とを組み合わせる方法に関する。
【０００７】
［0007］ハイブリダイゼーション反応を調節するために電流を使用する固相ベースの核酸検出方法は、WO 9512808中に開示されている。電流を使用して、核酸は、電極により誘導されて、溶液から表面上の特異的位置に能動的に輸送される。この方法を使用して、核酸ハイブリダイゼーション反応の特異性および感度を調節しそして高めることができる。この技術の一つの重大な傷害は、電子を方向付けるプロセスに伴って生じる電気分解である。このように、特定のバッファシステムへの限定が存在し、サンプル調製工程の必要性が強制される。さらに、それぞれのハイブリダイゼーション現象は、個々に方向付けられなければならない。したがって、表面の電極構造の複雑性は、検出すべき分析物の数が増加するとともに高まる。
【０００８】
［0008］親和性と特異性とを組み合わせるために複数のハイブリダイゼーション反応を使用する核酸アッセイの例は、WO 95/16055に開示される。このアプローチにおいて、捕捉プローブが表面に対して結合される。1またはそれ以上の捕捉エキステンダー分子が使用され、それぞれは、表面結合捕捉プローブにハイブリダイズすることができる標的特異的結合配列および支持体結合配列を含有する。捕捉エキステンダー配列を使用して、標的を支持体に対して、高親和性で結合させる。検出のためには、たとえば、シグナルを増幅するため、増幅マルチマー（multimer）を標的に対してハイブリダイズさせる。異なる配列を、異なる標的領域に対する配列特異性を含有する捕捉エキステンダーの特異的ハイブリダイゼーションにより、識別することができる。わずか1塩基だけ配列が相違する標的（たとえば、SNPs）の場合、このアプローチは、1つより多い捕捉エキステンダーのためには機能しない。というのも、熱力学的安定性の相違、およびその結果としての溶融温度の相違が、効果的な識別のためには非常に小さいからである。
【０００９】
［0009］親和性と特異性とを組み合わせる核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、Wanda L. B. Whiteら（Poster: “SNP determination by dual hybridization with DNA and PNA probes”, Cambridge Healthtech Institute Conference on Nucleic Acid Based Technologies, Washington D. C., 2002）により記載されている。固定化された40merのDNAを使用して、高親和性で標的を捕捉するが、一方短いPNAプローブをアリル-特異的ハイブリダイゼーションのために使用する。このアッセイの原理の障害は、（1）長い捕捉配列は、多重化アッセイのために十分に特異的ではなく、そして（2）SNPsの解析のため、固相支持体に加えて、第二の多重化の原理（たとえば、異なる発色標識）をアリル間を識別するために導入しなければならない。
【００１０】
［0010］まとめると、固相上に固定化された捕捉プローブに対する標的プローブのハイブリダイゼーション反応を利用する多数の核酸アッセイフォーマットは、感度および選択性のいずれかの問題を抱える。したがって、たとえば、事前に標的増幅をすることなくサンプル中の一塩基多型を検出しなければならない場合に、問題が生じる。もし捕捉プローブが最高の親和性を得るように、したがって最高のアッセイ感度を得るように設計されれば、捕捉反応は、選択性という問題を抱える。もし捕捉プローブが最高の選択性を得るように設計されれば、ハイブリダイゼーション反応は中程度の親和性を示すに過ぎない。
【００１１】
発明の概要
［0011］高い感度でそして高い特異性で固相支持体上にて核酸を検出するための方法およびキットが提供される。一般的には、この方法は、1またはそれ以上の標的特異的オリゴヌクレオチドを用いる高親和性の捕捉と、高度に特異的な酵素的識別方法とを組み合わせる。好ましい方法には、標的を高い親和性で捕捉するための1またはそれ以上の捕捉エキステンダー分子を、ライゲーションまたはプライマー伸長などの酵素的反応のために使用され、それにより特異的に標識を取り込む、“識別エキステンダー”を組み合わせて使用することが含まれる。
【００１２】
発明の詳細な説明
［0019］本発明は、高親和性オリゴヌクレオチド捕捉と固相支持体上での高度に特異的な酵素的識別とを、好ましくはゲノムDNAの増幅を事前に行うことなく多重アッセイにおいて一塩基多型を検出するために、組み合わせる。本発明は、ポリメラーゼ媒介性プライマー伸長またはリガーゼ媒介性オリゴヌクレオチドライゲーションなどの酵素的反応が、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの活性化5 5'-末端リン酸基に対して遊離の3'-末端ヒドロキシル基が求核性に攻撃することを介して進行し、それにより3'-5'-ホスホジエステル結合を形成する、という事実を利用する。したがって、3'-末端ヒドロキシル基は、ブロッキングすることにより、ポリメラーゼ伸長またはリガーゼ伸長が容易に起こらない様にすることができる。開示されたアッセイフォーマットにおいて、酵素的識別のために使用される識別エキステンダー以外のすべてのオリゴヌクレオチドは、その3'-末端をブロック化される。その3'-ヒドロキシル末端を介して、結局のところは3'-末端と固定化のために使用される基との間にスペーサー基を用いることにより、固定化することにより、捕捉プローブを、酵素的反応に対してブロック化することができる。たとえば、3'-デオキシヌクレオチド、2',3'-ジデオキシヌクレオチド、3'-ホスフェート、3'-アミノアルキルホスフェート、3'-アルキルホスフェート、3'-カルボキシアルキルホスフェート、3'-末端ビオチン修飾、3'-末端逆位ヌクレオチドなどを使用することにより、その他の3'-末端を、酵素的プロセッシングに対してブロック化することができる。上述したすべての修飾およびその他の可能性のあるブロッキング修飾を、標準的なオリゴヌクレオチド合成方法を用いて取り込むことができる。
【００１３】
［0020］開示されるアッセイにおいて使用される識別反応は、酵素的に触媒されるプライマー伸長反応またはオリゴヌクレオチドライゲーション反応であってもよい。あるいは、非酵素的、化学的伸長反応を用いて、標識化部分のアリル-特異的取り込みを実現することができる。オリゴヌクレオチドライゲーションに関するいくつかの化学的反応の信頼性は、酵素的方法と比較することができる（たとえば、K. D. James, A. D. Ellington, Chem. Biol. 1997, 4, 595-605を参照）。酵素的識別は、1つのアリル配列の完全な相補体であるプライマーに依存する。SNPの位置は、プライマーの3'-末端ヌクレオチドに位置することが好ましい。ライゲーション反応の場合には、識別エキステンダーは、SNP位置に対して相補的な3'-末端ヌクレオチドを有するブロック化されていない3'-末端をディスプレイすることができる。SNPに隣接する標的領域に対して相補的な第二の5'-リン酸化されている標識されたオリゴヌクレオチドは、リガーゼ媒介性反応においてライゲーションされ、それにより標識化部分を導入する。あるいは、リガーゼ媒介性識別のために使用される識別エキステンダーは、SNP位置に対して相補的な5'-末端ヌクレオチドを有するリン酸化されている5'-末端をディスプレイすることができる。SNPに隣接する標的領域に対して相補的な第二の3'-末端をブロック化されていない標識されたオリゴヌクレオチドは、リガーゼ媒介性反応においてライゲーションされ、それにより標識化部分を導入する。
【００１４】
［0021］酵素的識別反応を使用して、多数の異なる標識化部分または標識化反応を可能にする部分を、特異的に取り込むことができる。SNP解析が行われる場合、アッセイの多重化は識別エキステンダーの空間的分離により実現されるため、開示されるアッセイのためには1タイプの標識のみが必要である。標識または標識化反応を可能にする基は、たとえば、蛍光体、ナノ粒子、酸化還元活性成分、抗体、抗体フラグメント、ビオチン、アプタマー、ペプチド、タンパク質、単糖類または多糖類、核酸、核酸類似体、化合物、シクロデキストリン、クラウンエーテル、アンチカリン、受容体などであってもよい。
【００１５】
［0022］酵素的反応または化学的反応のあいだに導入された標識のタイプに依存して、異なる読み出し方法を使用して、アッセイの結果を評価することができる。読み出し方法のための例には、光学的検出、電気的検出、機械的検出、または磁性的検出が含まれる。より具体的には、蛍光体は、たとえば、US 5959292およびWO 99/47705に開示される様な平面光学的ウェーブガイド、DE 196 28 002において開示されるようなインターフェース上での全反射、またはUS 4815843において開示されるような光ファイバを使用して、検出することができる。ナノ粒子標識は、たとえば、光学的方法を介して、またはたとえば、US特許US 4794089、US 5137827およびUS 5284748に開示されるような自動金属平版増感後の直接的電気的検出により、検出することができる。
【００１６】
［0023］本発明の第一の側面において、1またはそれ以上の捕捉エキステンダー分子が使用され、そのそれぞれが特異的部位において標的分子に対して結合しなければならないアッセイが提供される（図1）。これらの捕捉エキステンダーの3'-末端は、酵素的伸長またはライゲーションを防止するため、ブロック化される。さらなる識別エキステンダーを使用し、そのそれぞれは、標的の一つのアリルに対して相補的である。SNPは、酵素的識別のために使用されるこれらの識別エキステンダーの3'-末端ヌクレオチドに位置する。すべての捕捉プローブは、それらの3'-末端を介して固相支持体上に固定化される。空間的な場所指定（addressing）を実現するため、アリル識別のために使用される識別エキステンダーを、支持体に対してハイブリダイズさせ、その後標的のハイブリダイゼーションを行わなければならない。捕捉エキステンダーを溶液中の標的と混合し、その後ハイブリダイゼーションを行うことができる。あるいは、すべての捕捉エキステンダーを固定化捕捉プローブとハイブリダイズさせ、その後標的のハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００１７】
［0024］本発明の第二の側面において、1またはそれ以上の捕捉エキステンダー分子が使用され、そのそれぞれが特異的部位で標的分子に結合しなければならないアッセイが提供される（図2）。さらなる識別エキステンダーを使用し、そのそれぞれは標的の一つのアリルに対して相補的であり、そして5'-末端がリン酸化されているヒドロキシル基を有する。SNPは、酵素的識別のために使用されるこれらの識別エキステンダーの5'-末端ヌクレオチドに位置する。すべての捕捉プローブは、それらの5'-末端を介して固相支持体上に固定化される。空間的な場所指定を実現するため、アリル識別のために使用される識別エキステンダーを、支持体に対してハイブリダイズさせ、その後標的のハイブリダイゼーションを行わなければならない。捕捉エキステンダーを溶液中の標的と混合し、その後ハイブリダイゼーションを行うことができる。あるいは、すべての捕捉エキステンダーを固定化捕捉プローブとハイブリダイズさせ、その後標的のハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００１８】
［0025］本発明の第三の側面において、1またはそれ以上の捕捉エキステンダー分子が使用され、そのそれぞれが特異的部位での標的分子に結合しなければならないアッセイが提供される（図3）。これらの捕捉エキステンダーの3'-末端ならびに固定化捕捉プローブの3'-末端が、酵素的伸長またはライゲーションを阻害するためにブロック化される。さらなる識別エキステンダーを使用し、そのそれぞれは標的の一つのアリルに対して相補的である。SNPは、酵素的識別のために使用されるこれらの識別エキステンダーの3'-末端ヌクレオチドに位置する。捕捉エキステンダーに対して相補的な捕捉プローブは、それらの5'-末端を介して固相支持体上に固定化される。識別エキステンダーに対して相補的な捕捉プローブは、それらの3'-末端を介して固相支持体に対して固定化される。空間的な場所指定を実現するため、アリル識別のために使用される識別エキステンダーを、支持体に対してハイブリダイズさせ、その後標的のハイブリダイゼーションを行わなければならない。捕捉エキステンダーを溶液中の標的と混合し、その後ハイブリダイゼーションを行うことができる。あるいは、すべての捕捉エキステンダーを固定化捕捉プローブとハイブリダイズさせ、その後標的のハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００１９】
［0026］本発明の第四の側面において、1またはそれ以上の捕捉プローブ分子が使用され、そのそれぞれが特異的部位で標的分子に結合しなければならないアッセイが提供される（図4）。捕捉プローブは、それらの5'-末端を介して固定化され、それらの3'-末端は酵素的伸長またはライゲーションを阻害するためブロック化される。さらに、識別プローブは表面に結合され、そのそれぞれは標的の一つのアリルに対して相補的である。
【００２０】
［0027］本発明の第五の側面において、1またはそれ以上の捕捉プローブ分子が使用され、そのそれぞれが特異的部位で標的分子に結合しなければならないアッセイが提供される（図5）。捕捉プローブは、それらの3'-末端を介して固定化される。さらに、識別プローブは表面に対して結合しており、そのそれぞれは標的のアリルの一つに対して相補的である。これらのアリル特異的識別プローブは、リン酸化されている5'-末端を有しており、それにより標識化オリゴヌクレオチドの酵素的ライゲーションが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】［0012］図1は、好ましい態様のアッセイの概要である。3'-末端をブロック化された捕捉エキステンダーは、標的を捕捉し、ブロック化されていない識別エキステンダーは、特異的識別のために使用される。すべての捕捉プローブは、その3'-末端を介して固定化される。
【図２】［0013］図2は、識別のために酵素的ライゲーションを使用する、別の好ましい態様におけるアッセイの概要である。捕捉エキステンダーは、標的を捕捉し、5'-リン酸化されている識別エキステンダーは、特異的識別のために使用される。すべての捕捉プローブは、その5'-末端を介して固定化される。
【図３】［0014］図3は、別の好ましい態様におけるアッセイの概要である。酵素的識別（識別エキステンダー）のために使用される3'-末端以外のすべての3'末端は、ブロック化されているかまたは固定化されている。
【図４】［0015］図4は、別の好ましい態様におけるアッセイの概要である。3'末端をブロック化された捕捉プローブは、標的を捕捉するために使用される。追加のブロック化されていない識別プローブは、酵素的識別のために使用される。
【図５】［0016］図5は、別の好ましい態様におけるアッセイの概要である。5'-末端を固定化された捕捉プローブを、標的を捕捉するために使用する。5'-リン酸化されている識別プローブを、酵素的識別のために使用する。
【図６】［0017］図6は、平面表面上でのアッセイの多重化についての一事例である。捕捉プローブは、分離したスポットに固定化される。アリル-特異的識別エキステンダーは、それぞれのスポットに対してハイブリダイズされ、その後、標的のハイブリダイゼーションに供される。
【図７】［0018］図7は、平面表面上でのアッセイの多重化についての別の事例である。捕捉プローブは、分離したスポット中に固定化される。捕捉エキステンダーおよびアリル-特異的識別エキステンダーは、それぞれのスポットに対してハイブリダイズされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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