(57)【要約】本発明は、精神分裂病及び／又は双極性感情障害を患っていると診断された患者において破壊されている遺伝子の同定、並びに該遺伝子によってコードされるタンパク質及び該遺伝子に対する抗体、並びに精神分裂病及び／又は感情精神病の治療用薬物としての該産物の使用に関する。本発明は、精神分裂病及び／又は感情精神病を患っている又はそのような病気にかかりやすい患者の診断方法、並びに精神分裂病及び／又は感情精神病の新規な治療レジメを開発するためのスクリーニングにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の精神分裂病及び／又は感情精神病の治療用薬物製造のための、SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子或いはその断片、誘導体又は相同体を含むポリヌクレオチド断片の使用。
【請求項２】
SEMCAP3ヌクレオチド断片が、アクセッション番号AF127084〜AF127088、KIAA1095、AB029018、XM_041363若しくはBC014432で公共のデータベース内で見られる配列又は図３に示される配列を含む、請求項１記載の使用。
【請求項３】
N33ポリヌクレオチド断片が、アクセッション番号U42349若しくはBAC RP11-23；14で公共のデータベース内で見られる配列又は図６若しくは７に示される配列を含む、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
GRIK4ポリヌクレオチド断片が、アクセッション番号NM_014619で公共のデータベース内で見られる配列又は図１０若しくは１６に示される配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
NPAS3ポリヌクレオチド断片が、アクセッション番号AB054575若しくはAF164438で公共のデータベース内で見られる配列又は図１８若しくは２０に示される配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
PDE4Bが、図２５、２７又は２９に示される配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
CDH8ポリヌクレオチドが、アクセッション番号L34060、AB035305、NM_001796、AB010436、AB010437、BAC CTC-420A11若しくはAC040161で公共のデータベース内で見られるか、又は図３５に示される配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
患者の精神分裂病及び／又は感情精神病の治療用薬物製造のための、SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子或いはその断片、誘導体又は相同体を含むポリペプチド断片の使用。
【請求項９】
SEMCAP3ポリペプチド断片が、アクセッション番号AAF22131、AAF22132若しくはXP_041363で公共のデータベース内で見られるか、又は図４に示される配列を含む、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
N33ポリペプチド断片が、アクセッション番号Q13454で公共のデータベース内で見られるか、又は図６若しくは７に示される配列を含む、請求項８又は９記載の使用。
【請求項１１】
GRIK4ポリペプチド断片が、アクセッション番号NM_014619で公共のデータベース内で見られるか、又は図１１若しくは１７に示される配列を含む、請求項８〜１０のいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
PDE4Bポリペプチド断片が、図２６、２８又は３０に示される配列を含む、請求項８〜１１のいずれか１項記載の使用。
【請求項１３】
CDH8ポリペプチド断片が、アクセッション番号NP_001787で公共のデータベース内で見られるか、又は図３６に示される配列を含む、請求項８〜１２のいずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
ポリヌクレオチド断片又はポリペプチド断片が、本質的に、同定された配列から成る、請求項１〜１３のいずれか１項記載の使用。
【請求項１５】
個体の精神分裂病及び／又は感情精神病或いは精神分裂病及び／又は感情精神病に対する感受性を診断する方法であって、個体内のSEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子が変異又は染色体再構成によって破壊されているかを決定する工程を含む方法。
【請求項１６】
SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子によって発現されるmRNAの相対的レベルを検出することによっていずれかの破壊を決定する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子産物のレベルを免疫学的技術で検出する、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子に特異的な抗体を用いて前記遺伝子産物を検出する請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
精神分裂病及び／又は感情精神病の診断のための、SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8に特異的な抗体の使用。
【請求項２０】
精神分裂病及び／又は感情精神病の治療用薬物製造のための、SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8に特異的な抗体の使用。
【請求項２１】
SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子の発現を特異的に破壊することによって生成される精神障害の動物モデル。
【請求項２２】
SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8の発現を特異的に上方制御することによって生成される精神障害の動物モデル。
【請求項２３】
以下の工程を含む、SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子産物のリガンドを同定する方法：
(ａ)本発明のポリヌクレオチド断片を適切な宿主細胞中に導入する工程；
(ｂ)前記ポリヌクレオチド断片の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程；
(ｃ)場合により、前記発現産物を単離する工程；
(ｄ)前記発現産物（又は工程(ｂ)の前記宿主細胞）を、工程(ａ)の前記ポリヌクレオチド断片によってコードされるタンパク質に結合する可能性のあるリガンドと接触させる工程；
(ｅ)発現タンパク質にリガンドが結合したかどうかを確証する工程；及び
(ｆ)場合により、前記リガンドを単離および同定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精神分裂病（統合失調症）(schizophrenia)及び／又は双極性感情障害を患っていると診断された患者で破壊されている遺伝子の同定、該遺伝子によってコードされるタンパク質及びそれに対する抗体、並びに精神分裂病及び／又は感情精神病の治療用薬物としての該産物の使用に関する。本発明は、精神分裂病及び／又は感情精神病を患っている又はそのような病気にかかりやすい患者の診断方法、並びに精神分裂病及び／又は感情精神病の新規な治療レジメを開発するためのスクリーニングにも関する。
【背景技術】
【０００２】
精神分裂病及び双極性感情障害は、一般的かつ消耗性の精神障害である。この病気の疫学、神経解剖学及び薬理学に関する豊富な情報にかかわらず、どの分子経路が関与し、またそれらの障害がどのように脳の発達及び神経機能に作用するかはっきりしていない。60〜80％という推定遺伝率にもかかわらず、これらの精神病に関与する遺伝子の数又は実体についてほとんど知られていない。リンケージおよび集団研究において、特にゲノム-ワイドスキャンから最近進展が見られたが、これら研究は、まだ感受性遺伝子座又は候補遺伝子の同定から病原遺伝子の完全な特徴づけまで進展していない(Berrettini, 2000)。
【０００３】
染色体異常（転座、逆位など）のある患者のブレークポイントのクローニングが、多くの病気の遺伝子（例えば、デュシェーヌ筋ジストロフィー、網膜芽腫、ウィルムス腫瘍、家族性大腸ポリポーシス、脆弱Ｘ染色体症候群、多発性嚢胞腎、多くの白血病及びごく最近では、候補スピーチ及び言語障害遺伝子(Laiら, 2001)）の同定で役立つと分かった。このような研究は、染色体のブレークポイントが、直接的に遺伝子配列を破壊するか、又は遺伝子発現を撹乱させることによって臨床的徴候を引き起こすと仮定する。遺伝子トラップ変異導入が破壊したマウス遺伝子を同定するために使用できるのと同様な方法で(Brennan & Skarnes, 1999)、細胞遺伝子的ブレークポイントによって生じた物理的“フラッグ”が病気遺伝子座の地理的ポインターを与える。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の目的は、精神分裂病及び／又は感情精神病に伴う発症及び／又は症状に関与すると推定される遺伝子及び／又はタンパク質を提供することである。
以下に示されるように、本発明は、精神分裂病及び／又は感情精神病を患っていると診断された被験者の染色体破壊の分子特徴づけに基づく。高処理能力蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を基礎とするアプローチを採用してこれら患者における染色体ブレークポイントのマッピングを行った。ブレークポイント遺伝子座の配列データの参照は、コーディング領域のターゲティングによって為される効率的なFISHプローブ選択を可能にするのみならず、プローブの正確な位置を候補遺伝子のゲノム構造に関連づけることによって遺伝子破壊の完全に証明することが出来る。
【０００５】
４人の患者について研究し、彼らの染色体破壊を特徴づけた。以後、これらの患者を患者１〜４と特定する。
以下に示すように、一実施形態では、本発明は、分裂情動性障害を患っていると診断された被験者（患者１）においてt(3;8)(p13;p22)と示される染色体再構成の分子特徴づけに基づいている（図１参照）。高処理能力蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を基礎とするアプローチを採用してこれら患者の染色体ブレークポイントのマッピングを行った。ブレークポイント遺伝子座の配列データの参照は、コーディング領域のターゲティングによって為される効率的なFISHプローブ選択を可能にするのみならず、プローブの正確な位置を候補遺伝子のゲノム構造に関連づけることによって完全に遺伝子破壊の証拠を全体的に推測することができる。
【０００６】
この被験者の１つのブレークポイント（染色体8p22上に位置する）は、Ｎ-結合グリコシル化経路に関与する遺伝子、N33の近傍にある。
この経路は３段階から成る。第１に、小胞体管腔膜における供与体オリゴ糖の構築。第２に、この分子のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（OST）複合体によって触媒される新しく翻訳された分泌性かつ膜貫通タンパク質上への移動。第３に、引き続き糖タンパク質上のオリゴ糖の修飾がある。N33は、酵母相同体から推測すれば、経路の第２段階に関与すると考えられるタンパク質をコードする。理論に拘泥する意図はないが、この被験者のブレークポイントは、位置効果サイレンシング又は遺伝子プロモーターからの調節要素の分離によって間接的にN33の発現を撹乱すると仮定される（両効果は、ブレークポイントが標的遺伝子から１Mbになる場合でさえ生じることが分かっている(Kleinjanら 1999)）。
【０００７】
N33遺伝子は、精神分裂病リンケージ研究で繰返し陽性と見られる染色体領域内に位置するので、本発明者らは、連関研究によってこの遺伝子をさらに追跡した。
正常集団と比べて精神分裂病患者とその家族で過剰提示される特定のミクロサテライトリピートハプロタイプがN33遺伝子座で同定されている。原因となる変異を同定するため、ハプロタイプ保有個体のN33遺伝子のシークエンシングがその後進行中である。
【０００８】
この患者の他のブレークポイント（3p13）も今や完全に特徴づけされており、遺伝子、SEMCAP3（KIAA1095としても知られる）を破壊することが実証されている。従って、本発明は、精神分裂病及び／又は感情精神病の病因学におけるこの遺伝子（正常及び変異型）の提唱される役割にも基づく。
さらなる実施形態では、本発明は、GRIK4遺伝子に基づき、この遺伝子及び／又はタンパク質の精神分裂病及び／又は感情精神病との関与についての本発明の発明者らの観察にも基づく。
GRIK4遺伝子は、KA1及びEAA1としても知られるが、本明細書では簡単のためGRIK4と呼ぶ。しかし、限定するものと解釈すべきでない。
【０００９】
被験者（患者２）は、日常的なＧ-バンド核型分析を用いてスクリーニングされた、精神分裂病と軽い学習障害（米国の専門用語：“精神遅滞”）が共存する一連の約100名の患者の１人である。この患者は、以下のような標準的命名法で示すことができる複雑な染色体再配列を所有する；(46, XX, ins(8;11) (q13;q23.3q24.2)inv(2)(p12q32.1)t(2;11)(q21.3;q24.2)der(2)(2qter->2q32.1::2p12->2q21.3::11q24.2->11qter)der(11)(11pter->11q23.3::2q21.3->2q32.1::2p12->2pter)der(8)(8pter->8q13::11q23.2->11q24.2::8q13->8qter))。精神分裂病は、軽い学習障害を有する個体において通常の集団よりも頻繁に起こることが繰返し観察されており、最近の研究によれば、この共存症状態の高い遺伝率が明らかにされている。
【００１０】
本明細書で述べるように、FISHの結果により、この被験者が脳発現遺伝子に破壊があること；すなわち、シナプス伝達の強度調節に関わる分子メカニズムに関与することが分かっているGRIK4に破壊があることが明らかにされる。
さらなる実施形態では、本発明は、精神分裂病の母親（患者３）及び精神分裂病と軽い学習障害が共存しているその娘における染色体９と14との間の平衡相互転座、t(9;14)(q34;q13)の特徴づけに基づく。脳の転写因子遺伝子、NPAS3は、14p31における転座によって破壊されることが分かっている。理論に拘泥する意図はないが、本発明者らは、この遺伝子の破壊が母親と娘によって示される精神病の症状の原因であると仮説を立てる。
【００１１】
以下に示されるように、本発明は、t(1;16)(p31.2;q21)と示される染色体再配列の分子特徴づけにも基づく（患者４）。
発端者は、明確な精神分裂病のICD-10及びDSM-IV判定基準を満たした。転座は可変性臨床的発現のある家族の他の分家(branch)内で遺伝していた。しかし、発明者らがアクセスした被験者の数人の重要な転座キャリヤーは、臨床的に特徴づけされたときには危険のある年齢を通過していなかった。
【００１２】
患者４の１つのブレークポイント（染色体1p31.2上に位置する）は、cAMP二次メッセンジャーシグナリングの減衰に関与する遺伝子、PDE4Bの選択的にスプライシングされる型内にある。
この患者の残りのブレークポイント（16q21）も今や完全に特徴づけされており、遺伝子、CADHERIN8（CDH8）を破壊することが実証された。従って、本発明は、部分的に、精神分裂病及び／又は感情精神病の病因学でこの遺伝子の推定される役割にも基づく。
【００１３】
第１局面では、本発明は、患者の精神分裂病及び／又は感情精神病の治療用薬物を製造するための、SEMCAP3、N33、NPAS3、GRIK4、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子或いはその断片、誘導体又は相同体を含むポリヌクレオチド断片の使用を提供する。
別の局面では、本発明は、患者の精神分裂病及び／又は感情精神病の治療用薬物を製造するための、SEMCAP3、N33、NPAS3、GRIK4、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子或いはその断片、誘導体又は相同体によってコードされるポリペプチド断片の使用を提供する。
【００１４】
本明細書で使用する場合、精神分裂病及び／又は感情精神病は、精神分裂病、及び“精神及び行動障害のICD-10分類(The ICD-10 Classification of Mental and Behavioural Disorders)”世界保健機構, ジュネーブ 1992に掲載されているもののような他の感情精神病に関する。F20とF29を含むカテゴリーF20〜F29は、精神分裂病、分裂病型及び妄想性障害を包含する。F30とF39を含むカテゴリーF30〜F39は、双極性感情障害及び抑うつ障害を含む気分（感情）障害である。精神遅滞は、F70とF79を含むカテゴリーF70〜F79に分類される。精神障害の診断及び統計マニュアル、The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 第４版（DSM-IV）。アメリカ精神医学協会(American Psychiatric Association), ワシントンDC. 1994。295.xx（精神分裂病及び他の精神障害）及び296.xx（主要な抑うつ障害及び双極性障害）に分類される全疾病を含む。精神遅滞は、315、317、318及び319に分類される。
【００１５】
SEMCAP3は、これまでに２つの選択的スプライシング型（Semcap3Aと3B）としてマウス内にてクローン化され、配列決定されており、その配列は、1999年にWang & Strittmatterによって直接提出されているように、公共のデータベース（核酸配列；それぞれAF127084/AF127085；タンパク質配列、それぞれAAF22131/AAF22132）内にある。この遺伝子のヒト型は、配列KIAA1095(核酸配列、AB029018又はXM_041363、及びより小さい型、BC014432；タンパク質配列、XP_041363)によって定義される。この遺伝子に対応するゲノム配列も公共のデータベース内にある(例えばBAC RP11-252o10, AC024102)。それにもかかわらず、先行技術は、SEMCAP3と精神分裂病及び／又は感情精神病との間の連関について何も示唆していない。
従って、本明細書でSEMCAP3遺伝子を参照する場合は、公共のデータベース内にあり、かつ図３で同定されている配列に関するものと、またSEMCAP3タンパク質配列を参照する場合は、公共のデータベース内にあり、かつ図４で同定されている配列に関するものと解釈する。
【００１６】
N33は、これまでにクローン化かつ配列決定されており、その配列は公共のデータベース内にあり（核酸配列；U42349、タンパク質配列；Q13454）、MacGroganら, 1996に記載されている。この遺伝子に対応するゲノム配列も公共のデータベース（例えば、BAC RP11-23j14）内にあるが、いくつかのSNP多型性又はシークエンシングエラーがある（例えば、余分の“Ｃ”がエクソン1b内に存在し、以後−cctgcccCaccggg−ここで提示される配列に対する差異となる）。それにもかかわらず、先行技術はN33と精神分裂病及び感情精神病との間の連関について何も示唆していない。
【００１７】
これまでに同定された配列に加え、本発明者らは、新しい開始エクソン（1a、図６及び７参照）を同定し、該遺伝子の３'端におけるエクソンスプライシングの複雑さを観察した（図６及び７参照）。
従って、本明細書でN33遺伝子を参照する場合、公共のデータベース内にあり、かつ図６及び７で同定されている配列に関するものと、またN33タンパク質配列を参照する場合、公共のデータベース内にあり、かつ図６及び７で同定されている配列に関するものと解釈する。
【００１８】
GRIK4遺伝子は、１１番染色体上、細胞遺伝学的位置11q22.3にある。この遺伝子はカイニン酸受容体サブユニットをコードし、以前にKambojら, 1994によって記載されている。cDNAヌクレオチド配列とペプチド配列がKambojら, 1994によって開示されており、かつアクセッション番号NM_014619でGenBank/EMBLデータベースに提出されている。この遺伝子のコード配列は、2871ヌクレオチド長として同定され、957個のアミノ酸のタンパク質をコードする。ヌクレオチド及びタンパク質配列は、それぞれ図10及び図11に示される。本発明者らは、この遺伝子の別の開始部位を同定しており（図15〜17参照）、これは956に対して933個のアミノ酸という、より短い遺伝子／タンパク質を生じさせる。この選択的にコードされる遺伝子／タンパク質の完全なヌクレオチド配列及びタンパク質配列は、図16及び図17に示される。
従って、本明細書でGRIK4遺伝子を参照する場合、図10と図16で同定されている配列に関するものと、またGRIK4タンパク質配列を参照する場合、図11と図17で同定されている配列に関するものと解釈する。
【００１９】
NPAS3のヒト型は、以前に同定されており、かつ選択的スプライシングによる相違を有する、アクセッション番号AB054575及びAF164438として公共のデータベース内にあり、すべての型が本発明に包含される。
従って、本明細書でNPAS3遺伝子を参照する場合、図18（A,B）と図20で同定されている配列に関するものと、またNPAS3タンパク質配列を参照する場合、図19と図21で同定されている配列に関するものと解釈する。
【００２０】
PDE4B遺伝子は、１番染色体上細胞遺伝子学的位置1p31.2にある。この遺伝子は、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のDunce学習及び記憶遺伝子産物に相同性を示すホスホジエステラーゼをコードする（Bolgerら, 1993）。２つの長い（PDE4B1とPDE4B3）スプライス型と１つの短い（PDE4B2）スプライス型が記載される。３つの全型が共有している525個のアミノ酸残基のコアタンパク質配列がある。PDE4B2の場合、これに39個のＮ末端アミノ酸残基が付加している。長い型は両方とも更に中心に長さ118個のアミノ酸残基を共有しているが、タンパク質のＮ末端で異なっており；PDE4B1は93個の特有の残基を有し、PDE4B3は78個の特有の残基を有する。PDE4B1スプライス型（脳発現される）だけが患者と家族で観察される染色体異常によって破壊されると予想される。
従って、本明細書でPDE4B遺伝子を参照する場合、図25（Ａ、Ｂ）、27及び29（Ａ、Ｂ）で同定されている配列に関するものと、またPDE4Bタンパク質配列を参照する場合、図26、28及び30で同定されている配列に関するものと解釈する。
【００２１】
CADHERIN8（CDH8）は、以前にクローン化かつ配列決定されており、配列は公共のデータベース内にあり（核酸配列；L34060/AB035305/NM_001796、タンパク質配列；NP_001787）、かつSuzukiら, 1991、Taniharaら, 1994、及びShimoyamaら, 2000によって記載されている。ラットにおいて選択的転写物が記載されており、第５カドヘリン(cadherin)ドメイン内に短縮(truncation)がある(Kidoら, 1998及び図４参照)。ラットのCDH8の正常及び短縮型のアクセッション番号は、それぞれAB010436及びAB010437である。対応するヒトの短縮転写物は公共のデータベース内にないので、まだ確認されていない。CDH8に対応するゲノム配列も公共のデータベース内にある(例えば、BAC CTC-420A11；AC040161)。それにもかかわらず、先行技術はCDH8と精神分裂病及び／又は感情精神病との間の関係をについて何も示唆していない。
従って、本明細書でCDH8遺伝子を参照する場合、公共のデータベース内の配列及び図35で同定されている配列に関するものと、またCDH8タンパク質配列を参照する場合、公共のデータベース内の配列及び図36で同定されている配列に関するものと解釈する。
【００２２】
特定の管轄区域では、治療法に対する請求項が許されるので、熟練読者は、前記SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子、或いはその断片、誘導体又は相同体；或いはSEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8タンパク質、或いはその機能的に活性な断片、誘導体、又は相同体を、精神分裂病及び／又は感情精神病の個体の治療法として個体に投与しうることを認めるだろう。
【００２３】
本明細書で使用する場合、“ポリヌクレオチド断片”は、デオキシリボース核酸（DNA）のようなヌクレオチド及びRNAのようなその転写産物の鎖を指す。もちろん、熟練読者は、天然に存在するヒトゲノム全体はポリヌクレオチド断片の定義に含まれないことを認めるだろう。
ポリヌクレオチド断片は、実質的に、ゲノム全体が通常はin vivoで会合している生体物質がないという意味でそれを単離することができる。単離ポリヌクレオチド断片をクローン化して、該ポリヌクレオチド断片を含む組換え分子を与えることができる。従って、“ポリヌクレオチド断片”には、二本鎖及び一本鎖DNA、RNA及びそれらから誘導されるポリヌクレオチド配列、例えば、前記断片の部分配列でいずれかの所望長さの配列が包含される。核酸が一本鎖の場合、与えられたストランドと配列の両方又はそれらに対する逆相補性のストランドと配列が本発明の範囲内である。
【００２４】
一般に、用語“発現産物”又は“遺伝子産物”は、前記ポリヌクレオチド断片の転写及び翻訳産物の両者を指す。発現又は遺伝子産物が“ポリペプチド” （すなわち、該タンパク質の生物学的活性に対して実質的に同様の生物学的活性（例えば、98％、95％、90％、80％、75％活性）を示すアミノ酸の鎖又は配列）である場合、それは、特定の長さの産物を意味しない。従って、熟練読者は、“ポリペプチド”が、とりわけペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を包含することを認めるだろう。必要ならば、in vivo及びin vitroでタンパク質を、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化及び／又は翻訳後切断によって修飾することができる。
【００２５】
さらに、本発明は、精神分裂病及び／又は感情精神病の治療で治療薬として使用するための試薬の製造用組換え又は合成ポリペプチドを提供する。特に、本発明は、組換え又は合成ポリペプチドと共に、その薬学的に許容しうるキャリヤーとを含んでなる医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、関連ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズしうる別の種由来の単離ポリヌクレオチド断片を提供する。このように、本発明は、exo vivo及び／又はin situ検出及び発現研究用のプローブ及び／又はプライマーを提供する。典型的な検出研究としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)研究、ハイブリダイゼーション研究、又はシークエンシング研究が挙げられる。原則として、同定された配列由来のいずれの特異的ポリヌクレオチド配列断片も検出及び／又は発現研究で使用しうる。熟練読者は、特異的断片は、本明細書で定義されるような高ストリンジェンシー条件下で該配列に特異的に結合するのに十分な長さ（一般には10、12、14、16又は20ヌクレオチド長より長い）であり、かつ無関係な配列、すなわちその配列の対立遺伝子型以外のその生物のゲノム中のどこかにある配列または他の生物由来の非相同な配列、には結合しない断片であることを理解する。
【００２６】
“特異的にハイブリダイズしうる”とは、好ましくは、前記ポリヌクレオチド断片が、無関係又は非類似のポリヌクレオチド配列に優先して関連又は類似のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを意味する。
本発明は、本明細書に記載したような関連ポリヌクレオチド配列又はその断片に対して特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含み、それらは前記関連ポリヌクレオチド配列またはその断片に必ずしも完全に相補性又は逆相補性である必要はない。例えば、少なくとも50％、又は少なくとも75％、少なくとも90％、又は少なくとも95％の相補性であってよい。当然に、完全な逆相補性（100％逆相補性）又はそれに近い逆相補性（例えば、10未満、典型的には５未満のミスマッチがあってよい）の場合もあり得る。従って、本発明は、アンチセンス又は開示されるポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズしうる相補性ヌクレオチド配列も提供する。特異的ポリヌクレオチドをPCR及び／又はシークエンシング研究でプライマーとして使用する場合、該ポリヌクレオチドは関連核酸にハイブリダイズすることができ、該ポリヌクレオチドの３'末端から鎖伸長を開始できなければならないが、無関係な配列から鎖伸長を正確に開始できない。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチド配列をハイブリダイゼーション研究で用いて別の生物由来の関連配列を得る、又は同定する場合、該ポリヌクレオチド配列は、好ましくはストリンジェントな条件下で試料ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたままでなければならない。所望により、試験又は試料ポリヌクレオチドのどちらかを固定化してもよい。一般的に、試験ポリヌクレオチド配列は、少なくとも10、14、20又は少なくとも50塩基長さである。技術的に既知の適切な方法で標識することができる。好ましくは、試験ポリヌクレオチド配列は、少なくとも200塩基長さであり、数キロ塩基長であってもよい。従って、変性試料又は試験配列のどちらを最初に支持体に結合してもよい。ハイブリダイゼーションは、50〜70℃の温度で、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含有する二倍強度SSC（2xNaCl 17.5g/l及びクエン酸ナトリウム(SC) 8.8g/l）緩衝生理食塩水中で行うことができる。この後、同一温度であるがSSC濃度を低下させた緩衝液で支持体を洗い流すことができる。必要とするストリンジェンシーの程度、従って該配列の同一性の程度に依存して、このような低減濃度緩衝液は、典型的に、0.1％SDSを含有する単強度SSC、0.1％SDSを含有する1/2強度SSC及び0.1％SDSを含有する1/10強度SSCである。最高程度の同一性を有する配列は、低減濃度の緩衝液内で洗浄することでほとんど影響を受けない。試料と本発明の配列とのハイブリダイゼーションが、0.1％SDSを含有する標準的なクエン酸ナトリウム（0.1xSSC）緩衝液内での洗浄又はインキュベーションによって実質的に影響を受けないくらい、試料と本発明の配列が非常に似ていることが最も望ましい。
【００２８】
オリゴヌクレオチドを、N33、SEMCAP3、NPAS3、GRIK4、PDE4B及び／又はCDH8核酸に特異的にハイブリダイズするように設計することができる。それらは、既知の方法で合成することができ、かつPCR又はシークエンシング反応のプライマーとして、或いは試料中の変異した又は正常のN33、SEMCAP3、NPAS3、GRIK4、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子の存在を検出するように設計したハイブリダイゼーションのプローブとして使用することができる。放射性標識、化学発光標識又は蛍光標識などのような技術的に既知の適切な標識でオリゴヌクレオチドを標識化することもできる。
【００２９】
用語“オリゴヌクレオチド”は、いずれかの特定の長さの配列を示すことを意味するのではなく、好ましくは少なくとも10ｂ（例えば、10ｂ〜１kb）長さ、さらに好ましくは12ｂ〜500ｂ長さ、最も好ましくは15ｂ〜100ｂ長さのヌクレオチドを包含する。
オリゴヌクレオチドは本明細書で述べるいずれの配列についても設計することができ、既知の方法で製造することができる。それらは、本明細書中で示されるストランドの１つ若しくはRNA等価物、又は該ストランドの一部分と実質的な配列同一性（例えば、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも90％又は少なくとも95％の配列同一性）を有しうる。好ましくは、このような部分は、少なくとも10、少なくとも30、少なくとも50又は少なくとも200塩基長さである。それはオープンリーディングフレーム(ORF)又はその一部でありうる。
【００３０】
通常30塩基長より大きいオリゴヌクレオチドは、好ましくは上述した１種以上のストリンジェントな条件下で試料ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたままでなければならない。通常30塩基長さ未満のオリゴヌクレオチドも、好ましくは試料ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたままであるべきだが、これは高ストリンジェンシーの種々の条件とは異なる条件で維持される。典型的に、30塩基未満のオリゴヌクレオチドの融解温度は、以下の式によって計算することができ；Ａ又はＴごとに２℃、プラスＧ又はＣごとに４℃、マイナス５℃である。ハイブリダイゼーションは、６ｘSSC及び１％SDS中、いずれの特定のオリゴヌクレオチドについても計算した融解温度又はその近傍で起こりうる。ストリンジェントな洗浄によって、例えば、同一温度で３ｘSSC及び0.1％SDS中で洗浄することによって、非特異的にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを除去することができる。実質的に類似のマッチング配列、すなわち前記オリゴヌクレオチドおよび対応する試験核酸だけがハイブリダイズしたままである。
【００３１】
通常30塩基長さ未満のオリゴヌクレオチドをシークエンシング及び／又はPCR研究で使用する場合、上述したのと同様の方法で融解温度を計算することができる。そのオリゴヌクレオチドの計算した融解温度近傍の温度でオリゴヌクレオチドをアニール又はハイブリダイズさせうる。PCR研究の場合、アニーリング温度は、その２つのプライミング(priming)オリゴヌクレオチドについて計算した融解温度より低くなければならない。条件及び融解温度の計算は例示のためだけに提供されており、かつ限定することを意図していないことを理解すべきである。実験者の経験を通じてハイブリダイゼーションの条件を変えることができ、従って、計算した融解温度より高い温度でオリゴヌクレオチドをアニール／ハイブリダイズすることができる。実際、これはいわゆる非特異的なハイブリダイゼーションが起こるのを妨げるために望ましいことがある。
【００３２】
PCR研究を行うとき、本明細書で述べる配列のどこにハイブリダイズするであろうかということに基づき、２種以上のオリゴヌクレオチドの適切な組合せを用いて得られるPCR産物の期待される大きさを予測することができる。DNAの試料についてこのようなPCRを行って予測したサイズの断片が得られた場合、該DNAが試験生物由来の相同配列をコードすると予測される。
本明細書で述べる全用途のタンパク質は、該遺伝子を、例えば選択した例えば昆虫細胞培養、酵母菌、動物細胞、大腸菌のような細菌の系内で高い発現を可能にするプラスミドベクター中にクローン化することで産生させることができる。タンパク質の効率的な精製を可能にするため、合成時該タンパク質にエピトープタグ（又はHis6のような他の“接着性”伸長部分）を取り込ませるベクターを使用することができる。多くのこのようなベクター及び精製系が商業的に入手可能である。
標準的な方法を用いて、ポリヌクレオチド断片を原核生物又は真核生物発現ベクター中に分子的にクローン化し、宿主に投与することができる。発現ベクターは、細胞によって取り込まれ、問題のポリヌクレオチド断片が発現され、タンパク質を産生する。
【００３３】
本明細書に包含される特定のポリヌクレオチドについて、多型性によって生じるような天然の変異種が個体間又は家族員間で存在しうることが分かるだろう。これら変異種は、配列全体中のアミノ酸の相異、その配列内のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位又は付加によって示される。認識される活性を示すこのような誘導体の全ては本発明の範囲内に包含される。例えば、本発明の目的では、以下のグループのアミノ酸間の保存的置換を行うことができる：
（Ｉ）アラニン、セリン、スレオニン；
（II）グルタミン酸及びアスパラギン酸；
（III）アルギニン及びロイシン；
（IV）アスパラギン及びグルタミン；
（Ｖ）イソロイシン、ロイシン及びバリン；
（VI）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン
【００３４】
さらに、組換えDNA技術を用いて、上で概要を述べた種々の誘導体をコードする核酸配列を調製することができる。
技術的に周知なように、遺伝コードの縮重がコドン内における塩基の置換を許し、同一のアミノ酸をコードできる異なるコドンを生じる。例えばアミノ酸、グルタミン酸のコドンはＧＡＴ及びＧＡＡの両方である。結果として、本明細書で述べるヌクレオチド配列又はその断片由来のポリペプチド発現のために、図に示される核酸配列と異なるこのような別のコドン組成を有する誘導核酸配列を利用できる。
本発明のポリヌクレオチド断片は、好ましくは調整制御配列に結合している。このような制御配列は、プロモーター、オペレーター、インデューサー、エンハンサー、サイレンサー、リボソーム結合部位、ターミネーター等を含みうる。当業者は、特定の宿主に好適な制御配列を選択することができる。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチド断片を種々の発現制御配列に連結させていわゆる組換え核酸分子にすることができる。従って、本発明は、発現しうる核酸分子を含有する発現ベクターをも包含する。組換え核酸分子は、適切な宿主の形質転換のために使用できる。
本発明の核酸配列をクローン化するために使用可能な特有のベクターは、技術的に公知である（例えば、Rodriguez, R.L.及びDenhadt, D.T., Edit., ベクター：分子クローニングベクターの調査とその用途(Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses), Butterworths, 1988, 又はJonesら, ベクター：クローニング適用：基本技術(Vectors: Cloning Applications: Essential Techniques)(基本技術シリーズ), John Wiley & Son. 1998）。
本発明の組換え核酸分子の構築のために用いられる方法は当業者には周知であり、かつとりわけSambrookらに述べられている(Molecular Cloning：実験室マニュアル Cold Spring Harbour Laboratory, 1989)。
【００３６】
本発明は、発現しうる形態のポリヌクレオチド断片を含有する形質転換細胞にも関する。本明細書で使用する場合、“形質転換”は、宿主細胞中への異種ポリヌクレオチド断片の導入を意味する。用いる方法は技術的に公知のいずれの方法でも、例えば直接摂取、形質移入、形質導入又はエレクトロポレーションでよい(Current Protocols in Molecular Biology, 1995. John Wiley and Sons Inc.)。異種ポリヌクレオチド断片は、自己複製によって維持されることもあり、あるいは、宿主ゲノム中に組み込まれることもある。組換え核酸分子は、好ましくは挿入されたポリヌクレオチド断片の発現を調節できる指定された宿主と適合性の適切な制御配列、例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、SV-40プロモーター等を備える。
組換え核酸分子の発現に好適な宿主は、その起源が原核生物性又は真核生物性でもよい。組換え核酸分子の発現に好適な宿主は、細菌、酵母菌、昆虫細胞及び哺乳動物細胞から選択することができる。
別の局面では、本発明は、個体の精神分裂病及び／又は感情精神病或いは精神分裂病及び／又は感情精神病に対する感受性の診断方法であって、個体内のSEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子が変異又は染色体再配列によって破壊されているかを決定する工程を含む前記診断方法にも関する。
【００３７】
このような変異又は染色体再配列の解明に使用可能な方法は、当業者には周知であり、例えば、本発明者らによって同定され、かつ本明細書で述べられるブレークポイントのような、前記N33、SEMCAP3、NPAS3、GRIK4、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子に近接している特定の変異部位又は染色体ブレークポイントに及ぶように設計された適切なプローブを用いるPCRによって或いはハイブリダイゼーション研究で検出することができる。
【００３８】
一旦、特定の多型性又は変異が同定されれば、特定の治療過程を決定することができる。例えば、治療のいくつかの形態がある患者達に対して機能することは知られているが、すべてがそうではない。実際に、これは、前記N33、SEMCAP3、NPAS3、GRIK4、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子又は周囲の配列内の変異に起因し、従って、患者の遺伝子型に基づいて、現行の療法を用いて治療戦略を決定することができる。
【００３９】
遺伝子配列又は遺伝子の制御要素、例えばプロモーター及び／又はエンハンサーの変異は、mRNAスプライシング／安定性／活性及び／又は遺伝子発現レベルの制御に及ぼすようなわずかな効果を有しており、これらも決定できることが分かるだろう。また、SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子が破壊されているかを決定するために、例えばハイブリダイゼーション又は定量的PCRを手段として用いてRNAの相対的レベルを決定することができる。
【００４０】
さらに、前記SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子産物自体の存在及び／又はレベルは、該遺伝子産物に対して産生される特異的抗体を用いるラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット法及びELISAのような免疫法によって検定することができる。従って、本発明は、SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子産物に特異的な抗体と、その診断及び／又は治療での使用にも関する。
【００４１】
従って、本発明のさらなる局面は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体又はそのエピトープを提供する。ある抗原に特異的な抗体の生産と精製は、通常のスキルの問題であり、使用すべき方法は当業者には明らかである。用語抗体は、限定するものではないが、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体(mAbs)、ヒト化若しくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、Fab発現ライブラリーによって産生された断片、抗-イディオタイプ（抗-Id）抗体、及び上記いずれかのエピトープ結合断片を包含する。このような抗体は、特定のポリペプチドの発現又は活性の調節、或いは前記ポリペプチドをin vivo又はin vitroで検出するのに使用しうる。
【００４２】
本明細書で開示される配列を用い、本発明のヌクレオチド配列及びタンパク質が誤って機能していることと関連した精神障害に関する動物モデルを提供することを意図して、哺乳動物のような他の動物における関連配列を同定することができる。一旦同定されれば、本発明のヌクレオチド配列とタンパク質に相同なそれらのヌクレオチド配列とタンパク質の機能性を変えるために、当業者にとっては一般的ないくつかの方法でそれらの相同な配列を操作することができる。例えば、“ノックアウト”動物、すなわち、本発明のヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現を低下させ、或いは実質的に除去して、これらの遺伝子の発現を低下または実質的に除去した効果を決定できる動物を作製することができる。あるいは、本発明のヌクレオチド配列とタンパク質に相同なヌクレオチド配列とタンパク質の発現が上方制御された、すなわち、本発明のヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現を増大させ、これらの遺伝子の発現を増大させた効果を決定できる動物を作製することができる。これら操作に加え、本発明のタンパク質に相同なタンパク質をコードするヌクレオチド配列に置換、欠失及び付加を生じさせ、該タンパク質の活性に変化を生じさせて該タンパク質内のドメイン、アミノ酸などの機能の解明を助けることができる。さらに、本発明の配列を用いて上記様式に動物を形質転換させることもできる。上述した操作を用いて、本発明のヌクレオチド配列及び／又はタンパク質が不適切に機能することに関連する精神分裂病及び／又は感情精神病の動物モデルを作製し、精神分裂病及び／又は感情精神病のような精神障害に対して有効に戦いうる可能性のある薬剤を評価することもできる。
【００４３】
従って、本発明は、SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子及び／又はその遺伝子産物の発現の破壊又は変化に関連する精神分裂病及び／又は感情精神病の予防及び／又は治療に好適な薬剤を同定するためのスクリーニングをも提供する。このようなスクリーニングは、合成、天然又は組合せ化合物ライブラリーのような化合物のライブラリーの高処理能力スクリーニング用に簡単に適合させることができる。
【００４４】
従って、本発明の前記SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子産物は、新規リガンド又はその類似体のインビボ又はインビトロ同定のために使用できる。この目的では、結合性研究を、本発明のヌクレオチド断片、又は本発明のポリヌクレオチド断片を含む発現ベクターで形質転換させた細胞、本発明の前記SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子産物を発現する前記細胞で行うことができる。
【００４５】
あるいは、前記SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子産物の機能性リガンド又は類似体の同定用アッセイにおいて、本発明の前記SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子産物、並びにそのリガンド-結合ドメインを使用することができる。
発現される遺伝子産物に対する結合性を決定するための方法、並びに遺伝子産物の生物学的活性を決定するためのインビトロ及びインビボアッセイは周知である。一般に、発現した遺伝子産物を試験すべき化合物と接触させて、結合性、機能的反応の刺激又は阻害を測定する。
【００４６】
従って、本発明は、SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子産物用リガンドの同定方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
(ａ)本発明のポリヌクレオチド断片を適切な宿主細胞中に導入する工程；
(ｂ)前記ポリヌクレオチド断片の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程；
(ｃ)場合により、前記発現産物を単離する工程；
(ｄ)前記発現産物（又は工程(ｂ)の前記宿主細胞）を、工程(ａ)の前記ポリヌクレオチド断片によってコードされるタンパク質に結合する可能性のあるリガンドと接触させる工程；
(ｅ)発現タンパク質にリガンドが結合したかどうか確証する工程；及び
(ｆ)場合により、前記リガンドを単離かつ同定する工程。
発現タンパク質に対するリガンドの結合性を検出する好ましい方法として、シグナル伝達能力を測定してもよい。
本発明のポリペプチドを活性化又は阻害するための治療措置において、SEMCAP3、N33、GRIK4、NPAS3、PDE4B及び／又はCDH8遺伝子産物の機能を活性化又は阻害する化合物を使用することができる。
【００４７】
以下、実施例によって、かつ図面を参照しながら本発明をさらに説明する。
図１は、患者１の染色体再配列（相互転座）の記号図を示す。２つのブレークポイントが位置する近くの染色体位置に２つのブレークポイントの印がつけられている。さらに、スケールには従っていないが、病気を引き起こす２つの候補遺伝子、N33とSEMCAP3が正確な方向で、かつブレークポイントに関して配置されている。
【００４８】
図２は、SEMCAP3遺伝子のゲノム構造を表す：そのスプライスされたエクソンが約250kbのゲノム範囲にわたって広がっている。
この遺伝子の上に、SEMCAP3タンパク質への各エクソンのコーディング寄与が、細い線と細かい波線で示されている。図の上部に、SEMCAP3タンパク質のドメイン構造が示されている。‘RING’は、RING-フィンガードメインを表し、‘ZF-T.’は、TRAF型亜鉛フィンガーを表し（シナ(sina)ドメインとも呼ばれる）、‘PDZ’は、PSD-95、Dlg、及びZO-1/2内に存在するPDZドメインを表す。図の下部には、ブレークポイント位置を同定するために使用するBACクローンが、これらクローンを用いたFISH結果から推測されるブレークポイントの方向（矢印）と共に示される。太い波線は、遺伝子エクソン及びタンパク質のドメイン構造に関してブレークポイントの位置を示す。
【００４９】
図３は、ヒトSEMCAP3の核酸配列を示す（明瞭にするため、CpGアイランド/５'UTR/cDNA配列の推定プロモーター上流を含むゲノムDNA配列も含まれる）。明瞭にするために以下の特徴に印がつけられている。
ａ）位置709にあるATG開始部位（下線）
ｂ）エクソン３と４の接合部のGG塩基（下線）（すなわち、ブレークポイントがある間）
ｃ）位置3907にあるUAA終止コドン（下線）。
【００５０】
図４は、注目の下線領域を有するヒトSEMCAP3のアミノ酸配列を示す。
ａ）残基18〜55 Ringフィンガードメイン
ｂ）残基101〜158 SINA/ZF-TRAFドメイン
ｃ）残基246〜339 PDZドメイン #1
ｄ）残基418〜504 PDZドメイン #2
【００５１】
図５は、N33遺伝子：本発明で同定されたエクソンスプライシング及び染色体ブレークポイントの概略図を示す。
図６は、N33の種々のエクソンのヌクレオチド配列を示す。
図７は、N33の種々の転写オプション及び転写物の関連アミノ酸配列を示す。
図８は、他の相同体と共に配列されたN33タンパク質を示す。
図９は、種々のN33スプライス型のＣ末端の効果を示す。遺伝子の3'末端におけるスプライシング型の多様性はこのタンパク質のC-末端と関連する。N33が細胞のゴルジ／ER区画（タンパク質が別のオルガネラに輸送されるまたは繋留されることに関してＣ−末端がしばしば関与する場）に存在しそうであると考えた場合に特にこれは重要である。明るい灰色の陰は推定される膜貫通ドメインを示す。従って、エクソン1a/1b、2-6、７、８、９、10、11または1a/1b、2-6、７、８、９、11を含むスプライシング型のみが機能性タンパク質をコードする可能性が高く、これらはC-末端残基のみが異なっている。
図10は、GRIK4の公表されているヌクレオチド配列を示す。
図11は、GRIK4の公表されているアミノ酸配列を示す。
【００５２】
図12は、被験者（患者２）で同定されたブレークポイントを示す。ブレークポイントに及んでいるCEPHライブラリーYACs（Chumakovら, 1992）が表に示される。ブレークポイント上に及ぶまたは隣接する（ダッシュで示される）RPCI-11 BACライブラリー（Osoegawaら, 2001）からのBACクローンも詳細に示される。この研究では、8q13のブレークポイントは特徴づけされなかった。
【００５３】
図13は、被験者（患者２）の複雑な染色体再構成図を示す。挟動原体染色体２の逆位が染色体11への転座と連結している。11q23.3及び11q24.3ブレークポイント間の染色体11領域が染色体8q13上に挿入されている。
【００５４】
図14は、被験者の破壊されたGRIK4遺伝子のゲノム配列を示す。選択的開始部位を有する２つの可能性のあるGRIK4転写物が示される。1a/1a'エクソンは、EST BE388730から導かれる。1bエクソンを含有する転写物は、公表されているGRIK4配列（acc. S67803）に対応している。おそらくエクソン“４”は、遺伝子のこの部分に関するゲノム配列の公表後にのみ再分割しうる複数の未定義エクソンに相当するであろう。それゆえに、GRIK4転写物エクソンの実際の数は、14を超えると考えられる。BAC（グレーの囲み）、コスミド（白色の囲み）及び長距離PCR産物（黒線）誘導FISHプローブは、ブレークポイントの位置づけを可能にした（矢印は、２つの誘導染色体上の信号の存在／非存在から導かれるブレークポイントの相対的な方向を示す）。BAC RPCI-11 89P5及びコスミドLA11197-C5、LA1163-H6、LA11236-G3及びLA1192-C6からのプローブは、ブレークポイントがエクソン２と３の近くに位置することを示した。これら２つのエクソン間のイントロン配列に対応する長距離PCR産物から合成したFISHプローブは、エクソン２と３との間のイントロンの上流にブレークポイントがあることを示した。
【００５５】
図15は、GRIK4遺伝子の５'配列を示す。選択的開始部位に由来する２つの可能なＮ末端ペプチドを示してある。エクソンの組合せ1a-1a'-2は、EST配列（acc. BE388730）から導かれる。エクソンの組合せ1b-2は、公表されているcDNA配列（例えば、acc. S67803）に基づく。より保存的なKozak配列（Kozak, 1986）を含有する下流メチオニン開始の可能性があるので（MPRV…の代わりにMVAC…）、実際のアミノ酸配列は公表されているアミノ酸配列と異なるかもしれない。エクソン２の上流ブレークポイントはプロモーターからコーディング配列の大部分を分離し、その結果推定上のヌル(null)対立遺伝子になることが分かる。エクソンDNA配列は大文字で示され、イントロン配列又は上流配列は小文字で示されている。保存されているスプライシング接合部配列（EXON/GT…AG/EXON）には下線が引かれている。一文字のアミノ酸コードが、適切なDNAコドンの下に示される。機能的なＣ/Ｇ：Leu/Val単一ヌクレオチド多型性（下線）がエクソン２内に見られる。
【００５６】
図16は、本発明者らによって同定された完全な選択的核酸配列を示す。
図17は、本発明者らによって同定された完全な選択的アミノ酸配列を示す。
図18は、NPAS3スプライス型１の核酸配列を示す。
図19は、NPAS3スプライス型１のタンパク質配列を示す。
図20は、NPAS3スプライス型２の核酸配列を示す。
図21は、NPAS3スプライス型２のタンパク質配列を示す。
図22は、この発明に係る患者３の平衡転座の記号の説明図を示す。
図23は、観察されたブレークポイントの位置を含むNPAS3遺伝子のゲノム配列を示す。
図24は、NPAS3遺伝子に対する破壊の潜在的な機能的因果関係：ドミナント-ネガティブ活性を示す。
図25は、PDE4B1核酸配列を示す。
図26は、PDE4B1タンパク質配列を示す。
図27は、PDE4B3核酸配列を示す。
図28は、PDE4B3タンパク質配列を示す。
図29は、PDE4B2核酸配列を示す。
図30は、PDE4B2タンパク質配列を示す。
図31ａ）は、患者４の染色体１及び16間の平衡転座の記号の説明図を示す。
図32は、被験者（患者４）の破壊されたPDE4B遺伝子のゲノム配列を示す。PDE4B遺伝子の２つの長い転写物が示される。FISHは、ブレークポイントがBACs RPCI-11 433N2とRPCI-11 442I1との間のゲノム配列内のギャップ内であることを示した。これは、該遺伝子のPDE4B1型（acc. L20966）の第１及び第２エクソン間にブレークポイントを位置づけた。PDE4B1の1aエクソンを包含するゲノム領域に対応する長距離PCR産物FISHプローブは、該遺伝子がエクソン対1aとエクソン２との間で破壊されることを確証した（すなわち、PDE4B1転写物だけが、染色体異常によって直接破壊される）。
【００５７】
図33は、患者４の染色体再構成（相互転座）の記号説明図を示す。２つのブレークポイントが位置する近接染色体位置に印がつけらている。さらに、縮尺には従っていないが、病気を引き起こす２つの候補遺伝子、PDE4BとCDH8が正確な方向で、かつブレークポイントに関して配置されている。相互転座の結果の誘導染色体１と16上の融合遺伝子も示され、融合転写物／タンパク質合成の潜在的能力を示している。
【００５８】
図34は、CDH8遺伝子のゲノム構造を表す：そのスプライシングされたエクソンが約400kbのゲノム範囲にわたって広がっている。
遺伝子の上に、CDH8タンパク質への各エクソンのコーディング寄与が細い線と細かい波線で示されている。図の上部に、CDH8タンパク質のドメイン構造が示されている。‘Ｎ’と‘Ｃ’は、タンパク質のＮ末端とＣ末端を表す。Ｎ末端の波線は、シグナルペプチドとプロタンパク質ドメインの存在を示し、両方とも成熟タンパク質では切断される。‘CD’卵円は、５つの細胞外カドヘリン(cadherin)ドメイン(domains)の位置を示す。黒色の囲みは、膜-スパニング(spanning)ドメインとして作用する、アミノ酸の疎水性範囲の位置を意味する。図の下部には、ブレークポイント位置を同定するために使用したBACクローンが、これらクローンを用いたFISH結果から推測されるブレークポイントの方向（矢印）と共に示される。太い波線は、遺伝子エクソン及びタンパク質のドメイン構造に関してブレークポイントの位置を示す。
【００５９】
図35は、ヒトCDH8の核酸配列を示す。明瞭にするために以下の特徴に印がつけられている。
ａ）位置253にあるATG開始部位（下線）
ｂ）エクソン１と２の接合部のGG塩基（下線）（すなわち、ブレークポイントがある間）
ｃ）位置2650にあるUGA終止コドン（下線）。
【００６０】
図36は、注目の下線領域を有するヒトCDH8のアミノ酸配列を示す。
ａ）残基1〜29 シグナルペプチドドメイン（イタリック体）
ｂ）残基30〜61 成熟タンパク質において切断されるプロペプチド断片
ｃ）残基76〜158 カドヘリンドメイン #1（下線）
ｄ）残基172〜248 カドヘリンドメイン #2（下線）
ｅ）残基281〜383 カドヘリンドメイン #3（下線）
ｆ）残基396〜487 カドヘリンドメイン #4（下線）
ｇ）残基500〜597 カドヘリンドメイン #5（下線）
ｈ）位置153の強調表示した‘Ｖ’は、選択的スプライス型由来の推定される短くなったラットのタンパク質産物と共有する最後の残基である。
ｉ）残基622〜645 膜貫通ドメイン #1（下線）。
【００６１】
図37ａ）は、PDE4Bエクソン２及びそれを超えてスプライスされる、CDH8プロモーター/エクソン１から生じる融合タンパク質産物を示す（der(16)上で転写された）。下線を付した残基‘RV’は、２つの遺伝子間の融合部位を表す。
ｂ）は、CDH8エクソン２及びそれを超えてスプライスされるPDE4Bプロモーター（長型）/エクソン1aから生じる融合タンパク質産物を示す（der(1)上で転写された）。詳細は本文を参照せよ：CDH8タンパク質のＮ末端が短縮された型を生成するリーディングフレームだけが示されている。位置68の下線を付した残基‘gc’は、２つの遺伝子間の融合部位を表す。可能性のある３つのメチオニン翻訳開始部位が示されており（強調表示）、このうちの２番目が標準的なKozak配列に最も似ている核酸配列（下線）を有する。この開始部位を使用すると、シグナルペプチド、プロタンパク質断片、カドヘリンドメイン１及びカドヘリンドメイン２の大部分を欠いた、短くなったCDH8を生じさせるだろう。
【００６２】
材料及び方法
（リンパ球抽出及び中期染色体調製）
密度勾配分離(Histopaque-1077, Sigma)によって、７mlの患者血液からリンパ球を抽出した（EBV-形質転換細胞系の貯蔵及び生成用）。細胞遺伝学分析用の中期-静止染色体を生成するため、0.8mlの患者血液を71時間フィトヘマグルチニン含有培地(Peripheral Blood Medium, Sigma)中で培養した。短期間培養物をコルセミドで１時間処理後、通常の固定手順で処理した。固定した染色体をスライドガラス上に滴下し、FISH実験で使用する前１週間貯蔵した。
【００６３】
（FISHプローブ合成用YACクローンの選択）
YACクローンは、ブレークポイントが位置すると判定された細胞遺伝学間隔中、関連染色体のWhitehead/MIT地図から選択した。YACは、HGMP Resource Centre, Babraham Bioincubator, Babraham, Cambridge, UK (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/)から得た。標準的な方法でクローンDNAを調製し、原型Aluリピート（Breenら, 1992）内のコンセンサス配列要素に対して設計されたプライマーを用いてPCR増幅した。この“Alu-PCR”は、YACの全長にわたって非反復配列の代表的な広がりを与え、天然のYAC DNAよりも良いFISHプローブを生成する。Alu-PCRは、Expand Long Template PCRキット(Roche)を用いて行った。サイクル条件：94℃−45秒、55℃−30秒、68℃−８分：35サイクル。68℃−10分最終伸長。
【００６４】
（蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)プロトコロル）
プローブ鋳型DNA(プールしたAlu-PCR産物、BACクローンDNA、コスミドクローンDNA又は長範囲PCR産物)をニックトランスレーションで標識し、標準的なFISH法を用いて患者の中期染色体スプレッディングにハイブリダイズさせた。スライドガラスをVectashield抗-消失溶液(Vector laboratories)中のDAPIで対比染色した。クロマ番号81000又は830000の多スペクトルフィルターセットを備えたZeiss Axioskop蛍光顕微鏡を用いて染色体ハイブリダイゼーションを観察した。IP Labスペクトル内でVysis SmartCapture伸長運転により、又はデジタルScientific SmartCapture画像処理ソフトウェアを用いて画像を得た。誘導染色体上で観察されるFISHシグナルにより、ブレークポイントに向けて“ウォーキング”するために必要なさらなるクローンを選択した。ブレークポイント-スパニングFISHプローブは、正常な染色体上と、両方の誘導染色体上にシグナルを有する。
【００６５】
（ブレークポイント位置の解明）
以下を参考にして陽性YAC領域に対応するBACクローンをコンティグ中に整列させた：Washington University FPC(http://www.genome.wustl.edu/gsc/human/Mapping/index.shtml)、UCSC GoldenPath Draft Human Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/hgTracks.html)及びEnsembl(http://www.ensembl.org/)データベース。BACクローンは、BACPAC Resources, Oakland, California, USA(http://www.chori.org/bacpac/)から供給された。クローンの選択は、遺伝子含有BACに偏らせた。一旦ブレークポイント-スパニングBACが同定されると、候補遺伝子エクソンに対するブレークポイントの位置は、染色体-特異的ライブラリーコスミド(HGMP Resourceセンター)又は正確に位置づけされた反復要素のない長距離PCR産物(拡張長距離PCRキット, Roche；プライマー配列については以下参照)から生成したFISHプローブで決定した。サイクル条件：94℃−45秒、52℃−30秒、68℃−11分：35サイクル。68℃−15分最終伸長。同位体標識したエクソン特異的PCR産物で適切な染色体特異的ライブラリーフィルター(HGMP-RC)を探索することによってコスミドを単離した。
【００６６】
（実施例）
実施例１：患者１由来の染色体破壊の分子特徴づけと破壊遺伝子の同定
染色体3p13に関するFISH実験により、ブレークポイントの位置を大きい遺伝子SEMCAP3(約250kbゲノム範囲)を含む領域にまで狭めた。ヒトゲノム地図(2002年6月公表の'BAC End Pairs'トロラック,UCSC Genome Browser上；http://genome.cse.ucsc.edu/index.html?org=Human)骨格上に置かれたBACクローンのタイル(tiling)図から２つのBACクローンを選択した。これらはRPCI-11 606p16とRPCI-11 94j25だった。FISHによれば、これらBACクローンはブレークポイントに隣接していた(前者は８番誘導染色体に転座し、後者は３番誘導染色体上に残った)。この２つのBACクローンの位置は、ブレークポイントがSEMCAP3遺伝子のエクソン３と４の間の大きい(200kb)イントロン内にあることを示した(図２参照)。そこで、発明者らは、この結果からSEMCAP3遺伝子は3p13転座事象によって直接破壊され、従って、患者が示す精神障害の候補遺伝子であると推定した。
【００６７】
Semcap3(セマフォリン細胞質ドメイン関連タンパク質(semaphorin cytoplasmic domain-associated protein))は、最初M-semF/Sema4cと相互作用するタンパク質をコードする遺伝子としてマウスで同定された。２つの型、3Aと3Bが公共の核酸配列データベースに提出されたが(Wang & Strittmatter, 1999)、まだ公表されていない。3bは配列中に欠失を示すので人為的結果の配列のようである。Sema3aは、予測したヒト遺伝子、KIAA1095と構造が同一なので、発明者らは、この配列をヒトSEMCAP3と称する。Sema3a/bを単離した酵母菌２-ハイブリッドスクリーニングによって、SEMA4Cタンパク質の細胞質尾部と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子としてSema1とSema2も同定された(Wangら, 1999)。
【００６８】
これらスクリーニング実験の目的は、膜貫通受容体、SEMA4Cとの細胞質相互作用物質を解明することだった。このタンパク質は、‘セマフォリン(semaphorins)’と示されるシグナリングタンパク質の大きなグループに属する。脳内では、これらタンパク質が、その軸索誘導及び成長円錐安定性に及ぼす作用を通じて脳の発達に重要な役割を果たすと考えられる。Inagakiら, (1995)は、Sema4Cが発生中のマウスの脳で発現されることを示した。精神障害（本明細書で述べる患者が示す障害を含む）の原因の一つの可能な説明は、脳、特に脳の小領域間の結合、投射及び神経回路網の不正確な発達である。このことを考慮すると、セマフォリン、及びそれらと相互作用するタンパク質(SEMCAPsのような)は、精神障害の魅力的な候補遺伝子になる。
【００６９】
SEMCAP3タンパク質のPDZドメインは、他のタンパク質におけるのと同様に、タンパク質-タンパク質相互作用(SEMA4C相互作用のような)に関与すると推測される(図２参照)。SEMCAP3のRING-フィンガードメインは、それがユビキチンリガーゼとして知られるタンパク質のクラスに属すことを認める。ユビキチンリガーゼは、タンパク質を特異的にユビキチン化および続くプロテアソーム経路におけるタンパク質破壊の標的とする。従って、SEMCAP3は、タンパク質(例えば、セマフォリン経路の成分)を破壊の標的とすることによってそれらの活性を制御するように作用するかもしれない。ZF-TRAF/SINAドメインは、RING-フィンガードメインの最もありうる拡張である。
【００７０】
図２は、ブレークポイントが、誘導染色体上の第３エクソンの後ろでSEMCAP3転写を終結させることを示す(まだ各核内には１つの正常な染色体３とSEMCAP3遺伝子が残存)。 誘導３番染色体上で転写が起こると、結果の翻訳されたタンパク質産物は短縮され；第１PDZドメインの一部と、Ｃ末端方向に引き続くすべてのアミノ酸を欠くだろう。この患者の精神障害が、１つの対立遺伝子上のN33のかく乱、１つの対立遺伝子上のSEMCAP3の破壊、１つの対立遺伝子由来の異常機能性の短縮されたSEMCAP3の生成又はこれらの組合せの結果であるかは調査しなければならない。
Pulverら(1995)は、精神分裂病の染色体3p(SEMCAP3に対してテロメリックであるが)に対する関係について詳述した。しかし、２つのさらなる研究は、異なる集団でこの知見を再現することに失敗している(Maziadeら, 2001 & Hovattaら, 1998)。
【００７１】
実施例２：染色体破壊のさらなる分子特徴づけ及び破壊遺伝子の同定
本実施例では、N33 3'UTR配列とSTS、SHGC-12093(Acc. No. G17275)に対応するプライマーを設計した(プライマー配列については下記参照)。これらPCR産物を用いて８番染色体特異的コスミドライブラリー(LA08)をスクリーニングした。その中で、陽性コスミドLA0854-H5(3' UTR)とLA08145-E3(STS)を単離し、引き続きFISH実験で用いた(結果については下記参照)。
3'UTRプライマー
プライマー A: TGCCACGTGTTAGCAGAAAG
プライマー B: TGCCTTTAACCAGATGAGGC
SHGC-12093プライマーs
プライマー A: TCTTGTGGGTCACAATTAGGC
プライマー B: TAAAAAGGTGCAGTTTCTTCAGC'。
【００７２】
被験者は、分裂情動性障害を有し、３番染色体と８番染色体の間に平衡相互転座を有する。8p22ブレークポイント-交差YAC, 931_a_1が明らかにされた。これによって8p22ブレークポイント-交差BAC RPCI-11 23j14(アクセッション番号AC019292)を見つけることができた。これは、N33遺伝子の3'末端を含むことが示された(図６)。引き続き、LANL８番染色体特異的ライブラリー(HGMP Resource Centre, Babraham, Cambridge, UK)由来のコスミドLA0854-H5及びLA08145-E3を用いたFISHは、ブレークポイントをフランキングし、このブレークポイントをN33のエクソン11から約100Kbに位置づけた。N33は、多くの遺伝子、ヒトIAG2、Drosophila CG7830、C. エレガンス(elegans) g304348及び２つの酵母タンパク質、OST3とOST6に関連している(タンパク質のアラインメントについては図８参照)。N33と酵母タンパク質との間の相同性はかなり弱いが、それらは保存されたシステイン残基を共有し、かつ疎水性プロットによって予測される４つの膜貫通ドメインについては同じ位置を有する。Ost3とOst6は、選択したタンパク質へのオリゴ糖の付加に寄与するオリゴサッカリルトランスフェラーゼ複合体の成分である。このことは、最近のレポート（Fetrowら, 2001）に詳述されているタンパク質構造予測プログラムによって支持されている。
【００７３】
本発明者らは、公共のデータベース内の開始エクソン（本明細書ではエクソン1bと特定）に対して別の開始エクソン（本明細書ではエクソン1aと特定）を同定した(図５及び６参照)。さらに、本発明者らは、それぞれ図５、６及び37に示される、これらのエクソンを含むスプライシングの複雑なバリエーション及び転写物の予想される配列を特定した。複雑なスプライシングバリエーションを考慮すると、種々のN33スプライス型のＣ末端配列が変動することが予測され、これは図９に示される。 
N33は、精神分裂病のリンケージホットスポット内に位置するので(Gurlingら, 2001, Brzustowiczら, 1999, Blouinら, 1998, Kaufmannら, 1998, Kendlerら, 1996, Pulverら, 1995)、本発明者らは、この遺伝子について集団研究(associatio study)を行うことを決定した。３種のミクロサテライトマーカー(D8S549, N33ミクロサテライト及びD8S1992
関連研究で用いたミクロサテライト
D8S549
プライマー A: AAATGAATCTCTGATTAGCCAAC
プライマー B: TGAGAGCCAACCTATTTCTACC
N33 ミクロサテライト
プライマー A: AGGCTGAGTGCCAAAAAGTA
プライマー B: CTTTAAGCTTGCTATTTGAAGGC
D8S1992
プライマー A: TTCATCGTCTGAACCTGG
プライマー B: ACACATTTCCTCTATGTTGC)を選択し、25の母-父-精神分裂病発端者の三人組と、64の精神分裂病例と、64の正常な対照の分類に使用した。三人組の研究から導かれたハプロタイプは、精神分裂病例と参照サンプルの頻度バイアスのために調査した。現在のところ、対照に比べて精神分裂病例遺伝子型で特定のハプロタイプが過剰提示されている。現在、ハプロタイプを有する適切な個体を変異についてスクリーニングしている。
【００７４】
実施例３：患者２由来の染色体破壊の分子特徴づけと破壊遺伝子の同定
（精神医学的評価）
被験者(女性)に交渉し、精神分裂病と精神遅滞が共存している人の大きなコホート(cohort)の１人としてこの研究の書面による完全なインフォームド・コンセントを得た。調査前、彼女に何らかの核型異常があることは全く知られていなかった。彼女は、慢性精神分裂病と軽度の精神遅滞を患っていた(IQ 65〜70)。慢性精神分裂病という診断は、一般的な精神医学と精神遅滞の精神医学の両方で経験のある精神科医(WM)により、SADS-L構造インタビューを用いてDSM-IV及びICD-10判断基準を生成することによって確認した。SADSは、軽い精神遅滞の患者に信頼性高く使用することができる。２人の精神科医（WMとDB）によるレビューに基づいて一致した診断がなされた。IQスコアはWAIS-Rから作成し、その安定性は、彼女の人生を通して異なる時間における心理調査によって検出されるレベルが同様であることによって示される。被験者に異形特徴はなかった。しかし、被験者は子供時代以来（乳様突起炎の外科手術の結果）両耳難聴を患っていた。確認できる精神的病気及び精神遅滞の家族的な歴史はなかった。家族の他のメンバーは、この研究に関与することを辞退した。
【００７５】
この患者の初期Ｇ-バンド核型は、染色体異常が複雑であることを示し(46, XX,ins(8;11)(q13;q23.3q24.2)inv(2)(p12q32.1) t(2;11)(q21.3;q24.2)der(2)(2qter->2q32.1::2p12->2q21.3::11q24.2->11qter) der(11)(11pter->11q23.3::2q21.3->2q32.1::2p12->2pter)der(8)(8pter->8q13::11q23.3->11q24.2::8q13->8qter))、染色体２番、８番及び11番と関連した再構成と共役している、２番染色体の挟動原体逆位を含む(図13)。図12は、２及び11上にブレークポイントを交差又はひとまとめにする(bracketing)YAC及びBAC FISHプローブを詳細に示す。ブレークポイントの位置内の配列を遺伝子含量について評価した。
【００７６】
（PCRプライマー）
FISH用長距離PCRプローブ鋳型：
Int2-3 GRIK4a; CAGGAGGTCCTGTGAAGCTC,
Int2-3 GRIK4b; ACAGGGAAAGAAGCAAAGCA.
GRIK4エクソン領域特異的PCR：染色体11コスミドライブラリーのスクリーニング：
Ex1a/a' a; AAAGCTAAGCGCAGGTGTGT, 
Ex1a/a' b; TTTCTGGGAGGCAACCATAG,
Ex1b    a; GCAGAGTTATGTCATGCCCA,
Ex1b    b; CCTGTGCAGCACTCTGATGT,
Ex2/3   a; TTGAACCCAAGAGAACAGGG,
Ex2/3   b; TCCCCTTCTCCTTCCAGTTT
サイクル条件：94℃−２分初期変性。94℃−１分、52℃−１分、72℃−75秒：33サイクル。72℃−15分最終伸長。
【００７７】
11q23.3ブレークポイントは、カイニン酸型のイオンチャネル型グルタミン酸受容体を含有する遺伝子座に位置する(GRIK4, acc. S67803 & NM_014619 (11)、以前の命名法では KA1/EAA1)。個々のエクソンに対するコスミドFISHおよびイントロン特異的長距離PCR産物FISH(図15)によりブレークポイントをGRIK4遺伝子配列内に位置づけした；最も有望なのはエクソン２のすぐ上流(我々の命名法、図15)。これは、エクソン２と３の間のイントロンに対応する長距離PCR産物FISHプローブを用いて確認した(図15)。我々は、別の同族Ｎ末端ペプチド配列をもたらす別の開始部位を生成する、GenBank EST(acc. BE388730, IMAGEクローン ID:3613199)も同定した(図16及び17)。エクソン1a/a'/1bとエクソン３との間のいかなる位置のブレークポイントも、誘導染色体11番上に何も受容体機能がコードされ得ないようにすべての推定される型の転写物を短縮するだろう。それゆえに、患者は１つだけ無傷のGRIK4対立遺伝子を持っていた。
【００７８】
（考察）
本発明者らは、機能性疾患候補でもある染色体転座事象によって脳-発現遺伝子が破壊されている、精神分裂病と軽い学習障害の共存被験者を同定した。理論に拘泥する意図はないが、GRIK4遺伝子の染色体ブレークポイントによる破壊(及びその結果の遺伝子量の減少)がこの患者の精神病の主要な根元的原因であると仮説を立てる。
この患者で破壊されている遺伝子は、脳内で発現され、かつCNS内における重要な生理学的プロセスに関与する。特に、該遺伝子は、長期増強(LTP)として知られるシナプス/神経伝達の強度の変化に関与しうる。LTPは、学習や記憶のような認知機能の根底にあると推定されている。さらに、認知試験により、これらの機能が精神分裂病の患者で頻繁に影響を受けることが以前に確証されている。
【００７９】
（GRIK4）
３つのクラスのイオンチャネル型グルタミン酸受容体がその薬理学的プロフィルと配列相同性に基づいて同定されている；NMDA受容体、AMPA受容体及びカイニン酸(Kainate)受容体。機能性カイニン酸受容体はin vivoで低いカイニン酸アゴニスト親和性(GLUR5、GLUR6及びGLUR7)と高親和性サブユニット(GRIK4及びGRIK5)の組合せから成るヘテロマーでありうる(Chittajalluら, 1999；Lermaら, 2001及びWernerら, 1991)。精神分裂病と軽い学習障害の共存被験者は、複雑な染色体再構成を有する。この患者で研究したすべてのブレークポイントのうち、GRIK4遺伝子だけが直接破壊されている。これは、サブユニット化学量論を変えることによってカイニン酸受容体のチャネル特性を変更すると予想される。
グルタミン酸受容体は、シナプスLTPの重要なイニシエーターである(Miller及びMayford, 1999)。NMDA受容体は、LTPの主要な媒介物質であるが、最近シナプス前カイニン酸受容体-依存性可塑性変化が海馬中の苔状線維で観察された(Contractorら, 2001及びLauriら, 2001)。興味深いことに、精神分裂病の病態生理学でグルタミン酸神経伝達物質系の関与が想定されている。“グルタミン酸仮説”は、フェンシクリジン(PCP; "Angel Dust")及びケタミン(Goff及びNine, 1997)のようなイオンチャネル型グルタミン酸受容体アンタゴニストの投与後に起こる精神病の徴候の説明を試みる。いくつかの研究は、精神分裂病患者の脳内におけるグルタミン酸受容体サブユニット発現(カイニン酸受容体を含む)の変化、主として減少も指摘する(Ibrahimら, 及びMeador-Woodruff, 2001)。同様に、Mohnら, 1999は、NMDAR1(別のグルタミン酸受容体)発現レベルが減少した変異マウスが精神分裂病様挙動を示すことを報告している。
【００８０】
成人の異所性神経伝達作用と同様に、神経発生的欠損が精神分裂病に寄与しうることが示唆されている。神経解剖学的研究は、精神分裂病及び共存症患者の統計的に有意な脳領域、特に海馬の減量を指摘している(Sandersonら, 1999及びPearlson, 1999)。GRIK4は、扁桃体、海馬体(CA3錐体細胞及び歯状顆粒細胞)及び嗅内皮質内で発現される。グルタミン酸受容体は、ニューロン連絡の活性依存性微調整を通じて脳の発達を媒介するだろう。
【００８１】
本被験者は、臨床的に軽い学習障害と共に精神分裂病を有すると診断された。これは共存症患者における原因となる遺伝子変異が精神分裂病のみの患者における遺伝子変異よりも重大な表現型をもたらす、或いは重大な下流効果を有する事例かもしれない(すなわち、共存症状態は精神分裂病の最も重症な形態を意味する(Doodyら, 1998))。第２の可能性は、遺伝子変異が脳の発達と独立な効果を通じて該病気の学習障害要素を生じさせることである。変異した遺伝子型が(機能又は発生メカニズムによって)観察される表現型を生じさせる様式は、分子神経生物学、特にマウスの“ノックアウト”変異体の特徴づけにおいて重要な問題である(Mayfordら, 1995)。
【００８２】
多くの文献が精神病感受性遺伝子座を同定するために行った家族及び集団を基礎としたリンケージ研究について詳述している。結果は確証的ではなく、おそらく集団の階層化、不完全な浸透度、遺伝的不均一性及び不確定な遺伝様式のような交絡因子(confounding factor)の存在を示しているのだろう。それにもかかわらず、GRIK4は、最近の文献で記載されている精神分裂病関連領域端に位置する(Gurlingら, 2001)。この論文では精神分裂病に対して関連を示す最も動原体側のマーカー、D11S925はGRIK4の3'末端のイントロン内に位置する。
【００８３】
実施例４：患者３由来の染色体破壊の分子特徴づけと破壊遺伝子の同定
（コスミドクローンによるブレークポイントの詳細なFISHマッピング）
標準的なPCR条件下、以下のプライマーを用いて、hNPAS3エクソン４、５及び６内又はその近傍の領域に対応するPCR産物を得た(エクソン4-i ACAACCATTCTGGGAACAGC, エクソン4-ii GTGTAGGGAAAGCCATCCAA, エクソン5-i TCTTTTTCCTGCAGTCCCTG, エクソン5-ii CTCCAAATGACTCCTGCCAT, エクソン6-i GCCTCTGCCATAGATTTTGC, エクソン6-ii TTCCTTCCCACCCTTTCTCT)。PCR産物の放射性dCTPによるランダム−プライミング標識化によってプローブを作製し；これらを用い、Church and Gilbert(1986)で述べられたハイブリダイゼーション条件でLANL14番染色体-特異的コスミドライブラリー(LA14NC01,UK HGMP Resource Centre, Hinxton, Cambridgeから得た)をスクリーニングした。標準的なアルカリ溶解手順で陽性クローン(エクソン; LA1431-G5, エクソン5: LA14123 - C4及びエクソン6; LA1487 - D9)を調製し、上述したようなFISH分析で調べた。
【００８４】
結果
連続的に小さくなるDNAプローブを用いた蛍光in situハイブリッド(FISH)でEBV-形質転換細胞系由来の中期染色体スプレッディングを分析した。FISHスクリーニング(RPCI-11 BAC 1078i14, acc. no. AL161851)によって、ブレークポイントに及ぶBACクローンを得た。ブレークポイントに隣接するゲノムDNA内でEST配列を調査し、その位置における可能性のある転写物を同定した。多数の遺伝子内に存在する保存“PAS”ドメインに対する相同性配列を含有すると注釈をつけられている(Guら, 2000)多数のESTsが同定された。このような遺伝子の調査は、最も密接に関連する遺伝子がマウス脳-発現転写物、ニューロンパス(pas)ドメインタンパク質３(NPAS3(MOP6)，アクセッション番号AF137871；以後mNPAS3と称する)をコードすることを明かにした。14q13におけるヒトゲノムDNA BACクローン配列中におけるmNPAS3 cDNAに対するBLASTアルゴリズムを用いたヌクレオチド相同性により、約800〜900kbのゲノム領域にわたって分布している（これによりヒトゲノム中最大の遺伝子座の１つとなっている）mNPAS3のヒトオルソログ(hNPAS3)に対応する１２のエクソンを同定した(図23)。引き続き、２つの他のグループによって、GenBank/EMBLに全長hNPAS3 cDNA配列が提出されアクセッション番号AB054575及びAF164438が与えられているが、これらは5'エクソン内でマウススプライス型に対する違いがある。これはヒト及びマウス遺伝子の両方で利用される２つの選択的転写開始部位の存在のためである。このことは、対応するIMAGEクローンのさらなるシークエンシングと組み合わせて公表されているcDNA及びEST配列を解析することによって確認することができる。これらスプライシング変異体は、図18、30及び23で強調表示されている。
【００８５】
ブレークポイント-スパニングBACプローブ、1078i14由来の誘導染色体９番及び14番上の蛍光シグナルの比は、ブレークポイントがBACの動原体末端に位置することを示した。これは該遺伝子のエクソン５の位置である。エクソン4-、5-及び6-含有コスミドを単離し、FISHプローブとして用いて、ブレークポイントの位置の完全な証拠と、全長転写物（ひいてはタンパク質）が14番誘導染色体上では合成され得ないという確証を得た。エクソン5-含有コスミド（図23参照）はブレークポイントに及んでいる。続いて、エクソン５に対応する長距離PCR産物-誘導FISHプローブにより、ブレークポイントがエクソン５の上流に位置することが示された。
長距離PCRプライマー-NPAS3エクソン5
a)  ccagcttgtatgtggtgtgg
b)  ttactcccagtgcccattgt。
【００８６】
考察
FISH-ベースアプローチにより、それぞれ精神分裂病と学習障害を同時に患っている母親と娘に存在する染色体再構成によって遺伝子、NPAS3が破壊されることが示された。NPAS3は、AHR及びARNTのようなメンバーを含む塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスPASドメインクラスの脳発現転写因子である。
【００８７】
ニューロンpas3(NPAS3)は、初めその他のPASドメインタンパク質との配列相同性に基づいてマウスでクローン化された(Brunskillら, 1999)。その発現は、発生中のマウス胚において特徴づけされており、神経管、神経上皮内、後に新外套皮層内で高いレベルが見られる。心臓、肢及び腎臓内で非神経発現も観察された。マウスでは、深錐体皮質細胞、海馬及び扁桃体内でNPAS1(ヒト染色体位置, 19q13)が発現される(Zhouら, 1997)。NPAS2(ヒト染色体位置, 2q13)は、皮質、海馬及び視床内で発現される。脊髄、腸及び子宮内でも低レベルで見られた。最近、相同的組換えによってマウスのNPAS2を欠失させたが(Garciaら, 2000)、これは記憶の手がかりや前後関係の欠損をもたらした。さらに、NPAS2は細胞エネルギー状態のモニタリングや概日リズム経路を有するようである(Reickら, 2001及びRutterら, 2001)。本明細書で述べる転座事象がエクソン４と５の間の遺伝子を破壊する。この破壊された遺伝子座で転写が起こると、短縮されたタンパク質はbHLHドメインだけを含有することになるだろう。このタンパク質が、非機能性ダイマーの生成を通じて野生型NPAS3タンパク質(又は他のヘテロダイマータンパク質パートナー)にドミナントネガティブ効果を及ぼすと考えられる(説明図については図24参照)。これが、通常の点変異よりも潜在的により重篤な又は印象的表現型をもたらすのだろう。bHLH-PASタンパク質がＣ末端PASドメインの欠損によって変化している２つの例（一方は実験的、他方は染色体転座のある患者）は、ドミナントネガティブと思われる作用を生じさせた(Maemuraら, 1999, Holder jr.ら, 2000)。
核型的に正常な個体内におけるこの遺伝子の変異は、２人のt(9;14)患者で観察されるほど重篤又は印象的効果を及ぼすとは予想されない。
【００８８】
hNPAS3とNPASサブファミリーの他のメンバーとの間で配列を比較すると、相同性は、ほとんどタンパク質のＮ末端；塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス及びPASドメインに限定されることが分かる。最大の相同性は、NPAS1、次いでNPAS2及び他のPASドメイン-含有タンパク質である(データ示さず)。同族のヒト(概念的にはエクソン1〜12を含有するスプライス型から翻訳される)及びマウスNPAS3タンパク質のアラインメントにより、該タンパク質はＮ末端半分にわたってほぼ同一であるが、Ｃ末端部では多様性が増えることが明らかになる。特に、ヒトオルソログにおいてそれぞれ５及び７アミノ酸が増加している２つの伸長の場合である(図21)。これらは、エクソン12(それぞれ11及び20残基の)内に存在する２つのポリ-グリシン区域に相当する。このような区域は、トリヌクレオチドリピートが異所的に伸長又は欠失した、スリップド鎖誤対合を示すものであり得る。それらがコーディング配列内で起こると、トリヌクレオチドリピート数の増加がタンパク質機能に病理学的効果を及ぼしうる（例えば、ハンチントン舞踏病及び脊髄小脳失調症）。このようなリピートの別の特徴は、世代間におけるそれらの不安定な性質であり：世代を過ぎる毎に病気発生の年齢が低化する（予期(anticipation)）のは、リピート単位数の増加に直接関係することが多い。
【００８９】
極端に高密度のCpGジヌクレオチドのためエクソン12(タンパク質のＣ末端をコードする)も注意すべきである(ヒト及びマウスで)；隣接イントロン/3'配列を有する接合部で突然終止するという特徴。この“CpGアイランド”は、転写され、かつ遺伝子の5'末端ではなく3'末端に位置するので異常である。メチル化による潜在的な転写制御又は変異に対する感受性という点では、この意義は未だに未知である。しかし、高レベルのＧ及びＣ塩基はアミノ酸組成に偏りを生じさせ、アラニン、グリシン、ヒスチジン及びプロリンが過剰提示される。これがNpas3内のポリ-グリシン区域の存在と拡大を説明しうる。14q13は、ファミリーの解析から決定されるようにファール症候群(特発性脳幹神経節石灰化(idiopathic basal ganglia calcification)；IBGC)に関係する部位でもある(Geschwindら, 1999)。ファール症候群の症状は、精神分裂病のような精神病を伴うことが多い。従って、NPAS3がファール症候群の原因遺伝子である場合もある。
【００９０】
実施例５：患者４由来の染色体破壊の分子的特徴づけと破壊遺伝子の同定
（精神医学評価）
被験者(男性)は、t(1;16)平衡相互転座を分離する家族の発端者である。この被験者からこの研究に対して完全なインフォームド・コンセントを得た。慢性精神分裂病というこの人の診断は、SADS-構造インタビューで確認し、２人の精神科医（WMとDB）によって一致を達成した。この被験者には精神遅滞はない。彼の近い家族の他のメンバーもこの研究の関与に同意し、だれも現在は精神病はない（数人は、精神病の危険のある年齢未満である）。転座保因者であることが分かっている拡張家族のメンバーには精神病（主要な抑うつ障害）の履歴もあったが、本研究に際しては確認のためにアプローチできなかった。学習障害がなくDSM-IV慢性精神分裂病の無関係な個体（今は死去）も同一のブレークポイントのあるt(1;16)平衡転座を持っていた。
【００９１】
（PCRプライマー）
FISH用長距離PCRプローブ鋳型：
PDE4B3a; GTCAGACAAATCCAAATGGAGAG, PDE4B3b; CTTTCTCCTGTCACTTTCCTTCA.
サイクル条件：94℃−２分初期変性。94℃−１分、52℃−１分、72℃−75秒：33サイクル。72℃−15分最終伸長。
この家族における平衡転座、t(1;16)(p31.2;q21)は２つのブレークポイントをもたらす(図33)。16q21のゲノム配列は完全でない。このブレークポイント領域の近傍の唯一の既知遺伝子はカドヘリン8である(CDH8, acc. AB035305)。 
【００９２】
対照的に、染色体1p31.2については、FISHは、この患者のブレークポイントのどちらかの側に残存する２つの非-オーバーラップBACクローン(RP11-433N2, acc. AL513493及びRP11-442I1, acc. AL391359)を同定した。これら２つのBACクローン間のブレークポイント含有ゲノム領域は、まだ配列決定されていない(図32参照)。この２つのBACクローンのデータベースアノテーションと共にゲノム配列上へのエクソンのBLASTマッピングにより、この遺伝子座がcAMPホスホジエステラーゼ遺伝子、PDE4Bを含有することが示された。この遺伝子のより長い転写型に対応する２つのcDNAs(それぞれPDE4B1, acc. L20966及びPDE4B3, acc. U85048と示される)は、以前に特徴づけされている(Bolgerら, 1994；Hustonら, 1997)。長距離PCR産物FISH(図32)は、PDE4B1転写物が直接ブレークポイントによって破壊されることを明らかにした(さらなるPDE4B3発現の位置-効果撹乱を除外できないが)。Hustonら(1997)は、以前にPDE4B1転写物が別のＮ末端ペプチド配列をコードすることを示している。さらに、彼らは、その型だけが脳内で発現されることを明らかにした。従って、この患者には脳における機能性PDE4Bの減少が予想される。
【００９３】
（考察）
本発明者らは、機能性疾患の候補でもある、染色体転座事象が脳-発現遺伝子を破壊しているDSMIV慢性精神分裂病の被験者を同定した。理論に拘泥する意図はないが、染色体ブレークポイント（及びその結果の遺伝子量の減少）によるPDE4B遺伝子の破壊が、この患者の精神分裂病の根本的な原因であると仮定される。
この患者で破壊された遺伝子は、脳内で発現され、かつCNS内の重要な生理学的プロセスに関与する。特に、該遺伝子は、長期増強(LTP)として知られる現象であるシナプス/神経伝達の強度の変化に関与しうる。LTPは、学習や記憶のような認知機能の基礎になると仮定される。さらに、認知試験により、これら機能が精神分裂病の患者内で頻繁に影響を受けることが既に明らかにされている。
【００９４】
（PDE4B）
Ｇタンパク質共役受容体／ヘテロトリマーＧタンパク質経路の刺激の結果、アデニルシクラーゼ酵素ファミリーのメンバーにより、２次メッセンジャー、cAMPが合成される。この２次メッセンジャーは、主としてcAMP-依存性タンパク質キナーゼA(PKA)と cAMP-応答性転写因子、CREB（両方ともLTPの分子経路に関係している(Abel & Latal, 2001)）によって媒介される、よく特徴づけされているシグナル伝達カスケードを誘発する。cAMPシグナル伝達は、ホスホジエステラーゼ酵素ファミリーのメンバーによる分解によって減衰される。現在までにcAMPホスホジエステラーゼのPDE4サブ-ファミリーの４つのメンバーが同定されている(PDE4A-PDE4D)。これら４つの遺伝子はショウジョウバエ学習及び記憶変異遺伝子、Dunceのヒト相同体である。PDE4Bタンパク質の長型、PDE4B1は、脳発現のある唯一のスプライス型であり、本発明者らは、それが被験者では破壊されていることを示した。抗-PDE4B抗体により、下オリーブ、視床下部、腹側線状体、小脳分子層、淡蒼球、側坐核及び黒質における発現が明らかになった(Cherry & Davis, 1999)。この発現研究の著者らは、PDE4B発現は、哺乳動物における報酬と情動(reward and affect)の基礎となる脳領域と強く関係することを示唆した。さらに、PDE4Bタンパク質は、抗うつ効果のある薬物であるロリプラム(Rolipram)の分子標的として認識されている。PDE4活性のロリプラム阻害は、マウスの長期海馬LTPと空間記憶を向上させることが分かっている(Baradら, 1998及びBachら, 1991)。ここで述べるPDE4B1に対する(ヘテロ接合)破壊は、脳内のタンパク質産物の50％減少に等しいであろう。この結果、より長いcAMP半減期を生じさせ、同時に下流cAMP標的の活性化の上昇となるだろう。
さらに、すべての転座保因者に精神病があるわけではないので（しかし精神病の拡張家族の全員が転座核型を持つ；データ示さず）、PDE4Bに対する破壊は浸透度が低下していることを示している。
【００９５】
実施例６：患者４由来の染色体破壊の分子特徴づけと破壊遺伝子の同定
染色体16q21についてのFISH実験により、ブレークポイントの位置を大きい遺伝子CDH8(約400kbのゲノム範囲)を含む領域にまで狭めた。ヒトゲノム地図骨格上に置かれたBACクローンのタイル(tiling)図から３つのBACクローンを選択した(2002年6月公表の'BAC End Pairs'トロラック,UCSC Genome Browser上；http://genome.cse.ucsc.edu/index.html?org=Human)。これらはRPCI-11 599c11、RPCI-11 875e12及びRPCI-11 685m21だった。FISHによれば、これらBACクローンはブレークポイントに隣接していた(最初の２つは誘導染色体１に転座し、３番目は誘導染色体16上に残った)。この３つのBACクローンの位置により、ブレークポイントがCDH8遺伝子のエクソン１と２の間の大きい(100kb)イントロン内にあることが示された(図２参照)。そこで、発明者らは、この結果からCDH8遺伝子は16q21転座事象によって直接破壊され、従って、患者が示す精神障害の候補遺伝子であると推定した。１番染色体上のPDE4B遺伝子の同様の破壊と、２つの染色体上のその相対的な方向により、誘導染色体(転座：der(1)とder(16)の結果生じる２つの染色体)は融合／ハイブリッド遺伝子を転写できるという可能性が提起された。これは、転座が癌に対する羅病性を上昇させる事例で頻繁に見られる。要するに、発端者における転座は、２つの遺伝子のプロモーターと第１エクソン配列の交換を生じさせた。der(1)については、CDH8遺伝子のプロモーターと第１エクソンがPDE4B遺伝子のエクソン２および下流に並列する(図33参照)。しかし、これら２つの遺伝子セグメントの読み枠は同一ではなく、結果として、シグナルペプチドと、プロタンパク質断片と、中に含まれるカドヘリンドメインの小部分だけを有する、早発的に短縮されたペプチドとなった(図37a参照)。これは、正常なCDH8遺伝子と同じ細胞型／組織内で発現されるだろうが、この小さいペプチドの機能的／病理学的意義は、現時点では明らかでない。der(16)については、PDE4Bプロモーターとエクソン1aがCDH8遺伝子のエクソン２及び下流と並列する(図33参照)。PDE4Bのエクソン1aは翻訳開始部位を含まないので、推定される融合転写物の読み枠適合性は問題でない。しかし、CDH8遺伝子のエクソン２と下流は、翻訳機構に利用されてペプチド配列を生成しうるいくつかのATG開始部位を含む。これらの読み枠のうち２つについては、いずれの生成ペプチドも小さく、おそらく重要でないだろう。第３の読み枠(正常なCDH8読み枠、図5b参照)は、最初の方に３つのATG開始部位を含み、これらの２番目は、大部分の翻訳開始部位で見られる正統なKozak配列に非常に良く整合する(CCAxxATGG)。これが使用されると、生じるペプチドは正常なCDH8タンパク質と同一であるが、シグナルペプチド、プロタンパク質断片、第１カドヘリンドメイン及び第２カドヘリンドメインの大部分をコードするＮ末端部分を欠いている。ペプチド配列の大半は正常なCDH8タンパク質であるが、Ｎ末端配列の欠如のため、タンパク質がゴルジ/ER細胞下画分に入る、すなわち細胞膜への正確な挿入／輸送を必要とするプロセスが妨げられる。この短縮形態のCDH8タンパク質が、PDE4B遺伝子の長型が発現される組織の細胞質内に存在することの機能的／病理学的結果は、現時点では不明である。
【００９６】
要約すると、発端者、及び家族の他のメンバーに見られる精神病は、以下の事情（又は組合せ）の１つの結果でありうる：PDE4Bの１つの対立遺伝子の欠損(破壊による)、CDH8の１つの対立遺伝子の欠損(破壊による)又は潜在的に病原性の融合ポリペプチドの生成。
カドヘリン-8は、最初ヒトでクローン化され(Taniharaら, 1994)、後にマウス(Munroら, 1996)及びラット(Kidoら, 1998)でクローン化された。配列解析により、この遺伝子産物は隣接細胞間のカルシウム依存性同種親和性相互作用を媒介すると考えられる細胞外カドヘリンドメインを有する膜-スパニングタンパク質の大ファミリー内に即座に置かれた。従って、カドヘリンは、細胞接着タンパク質という機能的に定義されたグループのメンバーである。
【００９７】
CDH8は、おそらくＩ型カドヘリンの結合特異性に関与する細胞外トリペプチドモチーフ、HAVの欠如によって定義される、II型、又は非定型カドヘリンである。図２は、カドヘリンドメインの５コピーと、膜スパニングドメインと、Ｃ末端細胞質尾部を含有する細胞外ドメインを含むCDH8タンパク質の構造を示す。細胞質尾部は、β-カテニン、α-カテニン及び最終的には、細胞骨格タンパク質、アクチンやα-アクチンのようなタンパク質との相互作用を通じて受容体のクラスター形成を媒介することによって、細胞内画分に相互作用の存在の信号を送ると考えられる。このようにして、隣接細胞に対する接着が細胞の細胞構造に影響を及ぼし、かつ細胞運動にさえ役割を果たしうる。
【００９８】
ニューロンカドヘリンの２つの主要な役割は、脳内の特定の発生経路の媒介と、シナプス機能の調節であると考えられている。カドヘリン相互作用の同種親和的性質（すなわち、CDH8タンパク質は、優先的に他のCDH8タンパク質に結合する）は、カドヘリンが器官内における同様な細胞の集合又は相互結合の原因であるという仮説を促した。これは、CDH8発現が特定の小領域に限定され、ニューロン斑(neuronal patch)にまで限定されることが分かっている脳における場合であることが示されている(Redies, Bishop, Rubenstein, Korematsu X 2)。
【００９９】
脳内の主なカドヘリン、N-カドヘリン(CDH2によってコードされる)は、シナプスの長期増強(LTP)：脳について学習と記憶の根底にあると考えられるメカニズムに関係があるとされている(例えば、Huntleyら, 2002 & Bozdagiら, 2000,)。他のカドヘリンもこのプロセスで一部の役割を果たしうる(Uemura, 1998 & Tangら, 1998)。要するに、カドヘリンは、シナプスの効力及び／又は脊髄形態を修正しうるシナプス間隙を横切って物理的な橋を形成するようだ(LTPの誘導後変化することが実証されたニューロンの２つの特徴)。
【０１００】
興味深いことに、精神病の原因を説明するために使用する仮説のうちの２つは、第１に異常な脳の発達の発生であり、第２に、特定の認知／記憶作業における乏しい能力として顕在化される、細胞経路における欠損の存在である。ニューロンカドヘリンの２つの役割は、これら２つの仮説をよく反映しているようであり、CDH8が精神病の良い機能的候補であることを示唆している。
【０１０１】
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【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】患者１の染色体再配列（相互転座）の記号図を示す。
【図２】SEMCAP3遺伝子のゲノム構造の説明図を示す。
【図３】ヒトSEMCAP3の核酸配列を示す。
【図４】問題の下線領域を有するヒトSEMCAP3のアミノ酸配列を示す。
【図５】N33遺伝子：本発明で同定されるエクソンスプライシング及び染色体ブレークポイントの概略図を示す。
【図６Ａ】N33の種々のエクソンのヌクレオチド配列を示す。
【図６Ｂ】N33の種々のエクソンのヌクレオチド配列を示す。図６Ａ続き。
【図７Ａ】N33の種々の転写オプション及び転写物の関連アミノ酸配列を示す。
【図７Ｂ】N33の種々の転写オプション及び転写物の関連アミノ酸配列を示す。図7Ａ続き。
【図７Ｃ】N33の種々の転写オプション及び転写物の関連アミノ酸配列を示す。図７Ｂ続き。
【図７Ｄ】N33の種々の転写オプション及び転写物の関連アミノ酸配列を示す。図７Ｃ続き。
【図７Ｅ】N33の種々の転写オプション及び転写物の関連アミノ酸配列を示す。図７Ｅ続き。
【図７Ｆ】N33の種々の転写オプション及び転写物の関連アミノ酸配列を示す。図７Ｆ続き。
【図８】他の相同体と共に配列されたN33タンパク質を示す。
【図９】種々のN33スプライス型のＣ末端の効果を示す。
【図１０】GRIK4の公表されているヌクレオチド配列を示す。
【図１１】GRIK4の公表されているアミノ酸配列を示す。
【図１２】被験者（患者２）で同定されたブレークポイントを示す。
【図１３】被験者（患者２）の複雑な染色体再配列の説明図を示す。
【図１４】被験者内で破壊されたGRIK4遺伝子のゲノム配列を示す。
【図１５】選択的開始部位から誘導される２つの可能なＮ末端ペプチドを示すGRIK4遺伝子の５'配列を示す。
【図１６】本発明者らによって同定されたとおりの完全な選択的核酸配列を示す。
【図１７】本発明者らによって同定されたとおりの完全な選択的アミノ酸配列を示す。
【図１８Ａ】NPAS3スプライス型１の核酸配列を示す。
【図１８Ｂ】NPAS3スプライス型１の核酸配列を示す。図１８Ａ続き。
【図１９】NPAS3スプライス型１のタンパク質配列を示す。
【図２０】NPAS3スプライス型２の核酸配列を示す。
【図２１】NPAS3スプライス型２のタンパク質配列を示す。
【図２２】この発明に係る患者３の平衡転座の記号の説明図を示す。
【図２３】観察されたブレークポイントの位置を含むNPAS3遺伝子のゲノム配列を示す。
【図２４Ａ】NPAS3遺伝子に対する破壊の潜在的な機能的因果関係：ドミナント-ネガティブ活性を示す。
【図２４Ｂ】NPAS3遺伝子に対する破壊の潜在的な機能的因果関係：ドミナント-ネガティブ活性を示す。
【図２５Ａ】PDE4B1核酸配列を示す。
【図２５Ｂ】PDE4B1核酸配列を示す。図２５Ａ続き
【図２６】PDE4B1タンパク質配列を示す。
【図２７】PDE4B3核酸配列を示す。
【図２８】PDE4B3タンパク質配列を示す。
【図２９Ａ】PDE4B2核酸配列を示す。
【図２９Ｂ】PDE4B2核酸配列を示す。図２９Ａ続き。
【図３０】PDE4B2タンパク質配列を示す。
【図３１】ａ）患者４の染色体１及び16間の平衡転座の記号の説明図を示す。
【図３２】被験者（患者４）の破壊されたPDE4B遺伝子のゲノム配列を示す。
【図３３】患者４の染色体再配列（相互転座）の記号説明図を示す。
【図３４】CDH8遺伝子のゲノム構造の説明図を示す。
【図３５】ヒトCDH8の核酸配列を示す。
【図３６】問題の下線領域を有するヒトCDH8のアミノ酸配列を示す。
【図３７】ａ）は、PDE4Bエクソン２及びそれを超えてスプライスされるCDH8プロモーター/エクソン１から生じる融合タンパク質産物を示す。ｂ）は、CDH8エクソン２及びそれを超えてスプライスされるPDE4Bプロモーター（長型）/エクソン1aから生じる融合タンパク質産物を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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