(57)【要約】本発明は、免疫応答を調節する新規なメカニズムに関する。更に詳細には、本発明は、5CD94/NKG2受容体をHLA-E＋結合ペプチドにより調節することに関し、これにより該受容体は阻害を受けるかまたは阻害を受けない。好ましい実施例では本発明はHLA-E結合性hsp(熱ショックタンパク質)60ペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HLA-E結合性ペプチドの医療における使用であって、該ペプチドがCD94/NKG2細胞受容体の効果を調節することを特徴とする方法。
【請求項２】
HLA-E結合性ペプチドが、ストレスにより誘起されるタンパク質のシグナル配列から誘導されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ストレスにより誘起されるタンパク質がhsp(熱ショックタンパク質)60由来ペプチドであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
ペプチドが組換え体、合成体および任意に誘導体、またはペプチド類似体であることを特徴とする請求項１〜３記載の方法。
【請求項５】
ペプチドが安定なペプチドであることを特徴とする請求項１〜４記載の方法。
【請求項６】
CD94/NKG2細胞受容体がNK細胞およびT細胞上のCD94/NKG2阻害性細胞受容体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
腫瘍治療のための請求項６記載の方法。
【請求項８】
hsp60ペプチドが九量体であることを特徴とする請求項３〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
VMAPVTVLL および QMRPRSRVLから選択されるペプチド
【請求項１０】
HLA-Eと錯結合している上記請求項のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１１】
請求項１０記載のいずれかのペプチドを医薬的に受容可能な担体中に含有する医薬組成物。
【請求項１２】
HLA-E結合性ペプチドまたは類似体の測定法であって、以下：
(a)  ペプチドライブラリーを得ること、
(b)  HLA-E/ペプチド複合体を形成すること、
(c)  NK細胞およびT細胞上のCD94/NKG2受容体を阻害または活性化することの可能な安定複合体を選択すること、および
(d)  該複合体から安定なペプチド/ペプチド類似体を単離すること、
の諸段階を含む測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物対象における免疫応答を調節する新規な組成物および方法に関する。更に詳細には、本発明は、HLA-E結合性ペプチドによってCD94/NKG2受容体機能を調整し、それによって該受容体を阻害または阻害不存在を招来することに関する。
関連出願の引用
本出願は米国仮出願番号60/308,598、出願日2002年7月31日、の優先権利益を主張しており、これを本明細書に編入して引用する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー(NK)細胞は、ある種の微生物および寄生生物の感染に対する先天的免疫応答に関連するリンパ球である。実験的な自己免疫モデルでのNK細胞の重要性を示唆している報告も最近あるが、ヒトの自己免疫疾患中でのNK細胞の機能については未だ判っていない。本書の本発明者らは、MHCクラスI分子に特異的なキラー細胞免疫グロブリン(Ig)様(KIR)受容体およびC型レクチン様（CD94・NKG2）受容体をNK細胞上、並びに  関節炎患者、主に慢性関節リウマチ(RA)患者の滑液(SF)および抹消血(PB)から誘導したabT細胞およびgdT細胞上に発現することを研究してきた。本発明者らは、関節炎患者のSFには、対応するPBに比較して含有NK細胞の集団が増大していることを知った。PB-NK細胞とは対照的に、SF-NK細胞の集団では、CD94・NKG2細胞表面受容体がほとんど一様に発現し、その集団に包含されるKIR＋NK細胞の集団は急激に減少した。機能分析の結果、患者由来のin vitroで培養したポリクロナールなSF-NK細胞もPB-NK細胞もある範囲の標的細胞を障害することができることが明らかとなった。しかし、SF-NK細胞の細胞傷害作用は、形質転換した標的細胞上にHLA-Eが存在すると阻害された。SF-NK細胞上のCD94を封鎖するか、または自家細胞上のHLAをマスクすると、SF-NK細胞は自からに指示した障害作用を実行することができた。したがって、HLA-Eは、炎症関節部位の主要なNK細胞集団を制御するのに重要な役割を果たしていると推測される。
【０００３】
MHCクラスI分子により、ナチュラルキラー(NK)細胞の機能、例えば標的細胞の溶解を仲介する能力は調節されている（Ljunggren ら、Immunol. Today 11: 237-244, 1990、本明細書に参考として編入）。 この調節は、NK細胞上に展開しているMHCクラスI特異的受容体の複雑な担当作業により制御される。すなわち、これらの受容体は、隣接細胞上でのMHCクラスIの発現をモニターしており、阻害シグナルを発送して、NK細胞が仲介する正常なMHCクラスI発現細胞の細胞傷害を抑止している（Lanier ら、Immunity 6:371-378, 1997、本明細書に参考として編入）。
【０００４】
HLA-Eは広く分布している、特異なMHCクラスI分子であり、βミクログロブリンに付随して細胞表面に発現される。HLA-Eは、b2ミクログロブリンおよび細胞上のペプチドに付随して広範囲に発現するが、ただしそのレベルは低い（Wei ら、Hum. Immunol. 29:131, 1990、本明細書に参考として編入）。HLA-Eがどのようなペプチドを負うかはTAPに依存すると考えられているが、TAPには依存しないペプチドであるとの報告がある。通常のMHCクラスI分子とは対照的に、HLA-Eが示す多形はむしろ限られており、HLA-Eとペプチドとの結合の境界は主としてある種のHLA-A、-B、-C、および-Gのシグナル配列に由来する九量体ペプチドが占拠している（Lazetic ら、 J. Immunol. 157:4741-4745, 1996、本明細書に参考として編入）。一般にこれらのペプチドは共通のモチーフ、すなわち２位にメチオニン、9位にロイシンまたはイソロイシンを共有している（Arnett ら、Arthritis Rheum. 31:315-324, 1988、本明細書に参考として編入）。HLA-Eの結晶構造を分析したところ、この分子は特定のペプチドを選択していることが明瞭になった（Soderstrom ら、 J. Immunol. 159:1072-1075, 1997、本明細書に参考として編入）。Qa-1bと命名されるHLA-Eのマウスの同族体も主としてマウスのあるMHCクラスI分子のシグナル配列に由来するペプチドを有し、このペプチドにも同様に2位および9位にアンカー残基が留保されている（Miller ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 70:190-194, 1973；Hendrichら、 Arthritis Rheum. 34:423-431, 1991、本明細書に参考として編入）。しかしながら、最近証明されていることであるが、HLA-EもQa-1bも共に無作為に抽出したペプチドライブラリーから誘導した種々の配列ペプチドと結合することができる（Fort ら、J. Immunol. 161: 3256-3261, 1998； Phillipsら、 Immunity 5:163-72, 1996、それぞれ本明細書に参考として編入）。また、Qa-1bは、マウスおよびバクテリアの熱ショックタンパク質60(hsp60)から誘導したペプチドを含有しており、それらの複合体をT細胞はその抗原特異的T細胞受容体(TCR)を介して認識することができると報告されている（Litwinら、 J. Exp. Med. 180:537-543, 1994、本明細書に参考として編入）。
【０００５】
MHCクラスI分子のシグナル配列内に留保されているアンカーモチーフは、HLA-Eペプチドとの結合境界にあるポケットに結合するのに重要であると考えられている。HLA-E分子にこれらHLA-EクラスIシグナルペプチドが付加すると、C型レクチン様受容体の二量体、すなわちCD94/NKG2A、-B、-C、-Eと呼ばれ、NK細胞上および小グループのT細胞上に発現する二量体に対し、それへの官能基リガンドを形成すると考えられている。
【０００６】
キラー細胞免疫グロブリン(Ig)様受容体(KIR)およびC型レクチン様受容体という少なくとも二つの独立した阻害受容体タイプがヒトでは記述されている。数個の独立したKIRがあり、細胞外Ig様領域が２個(2D)か3個(3D)か、細胞質性の尾部が短い(S)か長い(L）かによって特徴付けられている。構造に基づいてKIRはサブグループ化されており、Ig領域を３個有するある種のメンバー(KIR3DL)はHLA-B分子のグループを特異的に認識し、他方Ig領域を２個有する他のKIR(KIR2DL)はHLC-B分子のグループを認識する。更に二つのKIR3DL分子のホモ二量体HLA-A分子を認識すると報告されている（Longら、, 1999、本明細書に参考として編入）。C型レクチン様受容体は、CD94を含有しこれがNKG2ファミリー(NKG2A、-Bおよび-C)のメンバーに共有結合で付随している（Chang ら、 Eur. J. Immunol. 25:2433-2437, 1995；Lazeticら、 J. Immunol. 157:4741-4745, 1996、本明細書に参考として編入）ので、比較的に多形性のないHLA-E分子を特異的に認識する（Braudら、Nature 391:795-799, 1991、本明細書に参考として編入）。近傍の標的細胞上に発現した適当なペプチドを付加したHLA-Eを細胞が認識すると、CD94・NKG2A受容体はNK細胞に阻害シグナルを伝達すると考えられている。NK細胞は、正常な自家細胞に遭遇している間は、CD94・NKG2Aが伝達するこのシグナルによって活性化(例えば、細胞傷害性およびサイトカイン放出)を防止されると考えられている。NK細胞は、自己免疫寛容を制御するCD94・NKG2A受容体を有しているので、防護的なHLA-E分子の発現を喪失した細胞は殺害することができる。防護的なHLA-E分子には、ある他のMHCクラスI分子のシグナル配列から誘導されたペプチドが付加している。
【０００７】
HLA-B*5801の上にHLA-Gリーダー配列を接木したハイブリッド構造を721.221細胞に形質転換すると、この細胞株では防護的な内在HLA-Eのレベルが有意に増加すると以前は解釈されていた（Braud ら、 1991 前記）。これらの実験から、安定した成熟HLA-Eタンパク質が生成し細胞表面に移動してCD94・NKG2A阻害性受容体がこれを検知するためには、HLAクラスIリーダーが存在する必要があると示唆されていた。
【０００８】
CD94/NKG2受容体は、ヒトでもマウスでも大部分のNK細胞が発現し、特殊なMHCクラスI分子HLA-Eおよびそのマウスの同族体Qa-1bとそれぞれ相互作用する（Vance ら、 J. Exp. Med. 188:1841, 1998； Braud ら、 Nature 391:6669:795, 1998、それぞれ本明細書に参考として編入）。NKG2Aは細胞内免疫受容体チロシンをベースとする阻害モチーフ(ITIM)を含有し、このモチーフによって阻害シグナルが伝達される（Brooks ら、J. Exp. Med. 185:795, 1997、本明細書に参考として編入）のに対し、NKG2Cは免疫受容体チロシンをベースとする活性化モチーフ(ITAM)と結合し、このモチーフはアダプター分子DAP-12を有しているので、正のシグナルが伝達される（Lanier ら、Immunity 8:693, 1998、本明細書に参考として編入）。CD94・NKG2A/C受容体は、別のHLA-EとQa-1bとの間を識別すると報告されている（Kraft ら、J. Exp. Med. 192:613, 2000；Llanoら、Eur. J. Immunol. 28:2854, 1998；Vales-Gomez ら、Embo J. 18:4250, 1999；Brooksら、J. Immunol. 162: 305, 1999、それぞれ本明細書に参考として編入）。しかしこの選択性の生理学的な意味は明瞭ではない。
【０００９】
NK細胞が介入する自己免疫による攻撃を回避するためには、1個の自己MHCクラスI分子に対して少なくとも１個のMHCクラスIに特異的な阻害受容体を単一の各NK細胞に発現させるのが望ましいと提案されている（Lanierら、Immunity 6:371-378, 1997、本明細書に参考として編入）。一般に正常細胞は、大部分が十分なレベルのMHCクラスI分子を全部発現するので、NK細胞が介入する攻撃から防護される。しかし、ある種のウイルス感染および悪性の形質転換の間に通常起こることであるが、1種または数種のMHCクラスI分子が喪失または減少すると、細胞はNK細胞による破壊を受けやすくなる(同上)。また、自己免疫疾患、例えば関節リウマチ(RA)の患者由来のリンパ球は、MHCクラスIの発現を欠如している（Fu ら、J. Clin. Invest. 91:2301-2307, 1993、本明細書に参考として編入）。これがNK細胞トレランスに影響するのかどうかは判っていないし、また一般にRAにおけるNK細胞の役割も依然として不明のままである。
【００１０】
しかし、自己免疫疾患の各種実験モデルでの最近の研究が指摘するところによると、NK細胞の制御的な役割には病理学的な意味があるらしい。例えば、NK細胞は、パーフォリンに依存する方法でエフェクターT細胞の応答を制御することにより、TH1が介入する大腸炎の減少に重要な役割を果たしているらしい（Fortら、J. Immunol. 161:3256-3261, 1998、本明細書に参考として編入）。ヒトの多発性硬化症(MS)のモデルである実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)においては、NK細胞刺激性化合物リノマイドを投与すると、マウスを疾患進行から防止することができ、また同じモデルでNK細胞を抑制するとTH1サイトカインの産生が増大し疾患が増悪してしまった（Matsumoto ら、Eur. J. Immunol. 28:1681-1688, 1998； Zhangら、J. Exp. Med. 186:1677-1687, 1997、それぞれ本明細書に参考として編入）。これらの報告から、原型のTH1が介在する疾患に対してはNK細胞の存在は有益であることが示唆される。これに対し、マウスの喘息モデル、すなわち原型のTH2が介在する疾患では、NK細胞は病因的な役割が示唆され、したがってNK細胞を抑止するとマウスはアレルゲンが誘起する気道上皮の炎症の進行から防護された（Korsgren ら、J. Exp. Med. 189:553-562, 1999、本明細書に参考として編入）。
【００１１】
RAは関節の慢性的な炎症を特徴とする自己免疫疾患であり、軟骨および骨の進行性破壊に至る。RAが発症すると、滑膜部分には活性化T細胞ばかりでなく、グランザイム陽性のNK細胞が含まれる（Tak ら、Arthritis Rheum. 37:1735-1743, 1994、本明細書に参考として編入）。関節内では有力なNK細胞がサイトカイン、例えばIL-15を刺激しているのが見られるが（Thurkow ら、J. Pathol. 181:444-450, 1997、本明細書に参考として編入）、新たに単離した滑液のNK細胞は、抹消血液由来のNK細胞に比べれば、細胞傷害性は少なく、IFN-γを産生する傾向は少ない（Lipsky、Clin. Exp. Rheumatol. 4:303-305, 1986； Bergら、 Clin. Exp. Immunol. 1:174-182, 1999、それぞれ本明細書に参考として編入）。KIR-ならびにCD94/NKG2分子を介する信号伝達によってNK細胞が介入する細胞傷害およびサイトカインの産生は制御されることが判っているので、NK細胞に対する受容体を炎症部位で利用する研究は重要である。
【００１２】
熱ショックタンパク質(hsp)、例えばhsp60は、ヒトとバクテリアの間の進化の過程で高度に保存されている。Hsp60は生細胞微生物全てに存在する（Lindquist ら、Annu. Rev. Genet. 22:631, 1988； Bukauら、Cell 92:351, 1998、それぞれ本明細書に参考として編入）。それは真核細胞ではミトコンドリアのシャペロンとして、バクテリアでは多重タンパク質複合体の構築および分解に関与する細胞内タンパク質として生命機能に寄与している（Fink, Physiol. Rev. 79:425, 1999、本明細書に参考として編入）。多様なストレス刺激、例えば温度上昇、栄養不足、毒性化合物への接触、炎症性応答および移植拒否に応答して誘起されるhsp60のレベルは上昇する（Lindquist, 1988, 前記； Andertonら、Eur. J. Immunol. 23:33, 1993； Birk ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5159, 1999、それぞれ本明細書に参考として編入）。hsp60は、これら有害な刺激の結果から細胞を防護するのに重要な役割を果たしていると考えられる。同時にhsp60によって細胞はhsp60が指導する先天的で適応型の免疫応答の攻撃を一層受けやすくなると推測される。すなわちhsp60は高度に免疫原性である。例えば、バクテリアに感染中にバクテリアのhsp60に対して励起された免疫応答が自家のhsp60と交差反応する恐れがある。
【００１３】
hsp60は、哺乳動物の自己免疫において主要な自家抗原である。慢性的な炎症組織(例えば、リウマチ関節)では内因性hsp60の発現が高度に上昇するという事実は、自己免疫のメカニズムと疾患を研究するグループの間で大きな関心を呼んできた。細胞ストレス、例えば高熱の間にhsp60のレベルが上昇することもみられている。全身の高熱は癌治療として利用されている。
【００１４】
HLA-E/CD94/NKG2細胞受容体の相互作用を調節するための、あるいはHLA-E/CD94/NKG2細胞受容体の相互作用の変化および／または細胞ストレス因子および関連する疾患状態、例えば炎症および自己免疫に付随する異常な免疫応答を制御するための一般的な薬剤を使用することをこれらの報告に基づいて明瞭に教示または示唆しているものは当分野に見られない。同様に、HLA-E/CD94/NKG2細胞受容体の相互作用、および慢性的な炎症および自己免疫といった状態に付随する異常な免疫応答制御、を調節することに関連すると推測されるストレス誘起タンパク質およびペプチドの役割は未だ明瞭ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記にかんがみ、HLA-E/CD94/NKG2細胞受容体の相互作用を調節するための、および異常な免疫応答、特に細胞ストレス因子が介入したと思われるHLA-E/CD94/NKG2細胞受容体相互作用の変化に付随するものを制御するための新たな手段および方法が当分野において緊急に求められている。また、関連する疾患状態、例えば炎症、自己免疫、および癌の症状を緩和するための有効な組成物および方法が上記要請に関連して求められている。驚くべきことに、本発明によって、これらの目的は充足され、更に別の目的および利点まで充足されており、それらは以下の説明から明瞭となる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドを使用して、哺乳動物対象における免疫応答を調節する方法および組成物を提供する。一般的に、この結合性ペプチドは主要組織適合性複合体クラスI(MHCクラスI)分子、例えばHLA-E MHCクラスI分子と抗原提供細胞(APC)上で結合し、次にこの起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドとHLA-Eとの結合複合体がMHCクラスIに特異的な阻害性受容体と相互作用する。MHCクラスIに特異的な阻害性受容体は一般にCD94・NKG2細胞受容体となる。起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドとHLA-E結合性ペプチドとの間の相互作用により、結合ペプチド/HLA-E複合体と受容体との間の相互作用が調節され、それによって免疫応答の新規な調節が阻害受容体を発現する多数の細胞において得られる。
【００１７】
本発明の態様を更に詳細に言えば、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドとHLA-Eとの間の相互作用により、起炎症性応答または抗炎症性応答が、細胞群または他の対象、例えば自己免疫疾患、炎症の疾患または状態（例えば、慢性的炎症、または手術や精神的ショックに伴う炎症）、移植拒否反応、ウイルス感染、あるいは他の疾患または状態を有する哺乳動物対象において促進され、本発明の免疫応答調節による治療が容易になる。
【００１８】
本発明のある実施例では、抗炎症性の結合性ペプチドがHLA-E分子と細胞上で相互作用し、HLA-Eに結合したペプチドがその細胞から提供され、その得られたペプチドHLA-E複合体をMHCクラスIに特異的な阻害性受容体が認識している。この認識の結果は防護的な免疫応答に至るが、その応答の特徴は、CD94/NKG2細胞受容体を有する細胞が細胞傷害性を減少しおよび／または１以上の抗炎症性サイトカインの発現を誘起することにある。
【００１９】
本発明の別の態様では、本発明の起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドが、このペプチドに接触した細胞上ではHLA-E分子の発現を低下する活性をin vitroまたはin vivoで呈している可能性がある。
【００２０】
本発明の他の実施例では、起炎症性の結合性ペプチドがHLA-E分子と細胞上で相互作用し、HLA-Eに結合したペプチドがその細胞から提供され、その得られたペプチドHLA-E複合体がMHCクラスIに特異的な阻害性受容体の防護的な認識を妨害している。すなわちペプチドの結合により、CD94/NKG2細胞受容体が介入する防護的な免疫応答が阻害される。CD94/NKG2細胞受容体が介入する防護を阻害すると、起炎症性の結合性ペプチドと１以上の防護的(すなわち抗炎症性)ペプチドの間にHLA-Eへの結合をめぐって競合が招来し、防護的ペプチドは起炎症性の結合性ペプチドとの結合競合の結果無効化または弱体化する。これに関連して、起炎症性の結合性ペプチドはHLA-E結合境界を競合的に占拠するが、この起炎症性の結合性ペプチドとHLA-Eとの間の複合体をCD94/NKG2細胞受容体は認識しない。CD94/NKG2細胞受容体が介入する防護が阻害されると、それを反映して、CD94/NKG2細胞受容体を有する細胞(例えばNK細胞またはT細胞)が細胞傷害性を増大しおよび／または１以上の起炎症性サイトカインの発現を誘起する。
【００２１】
起炎症性の結合性ペプチドの場合に、このペプチドの生物活性は、MHCクラスI分子への結合をめぐって抗炎症性の結合性ペプチドと競合し、および／または細胞傷害性または起炎症性のサイトカインの誘起応答をCD94/NKG2細胞受容体を発現する細胞に刺激する場合に生ずる。
【００２２】
「抗原提供細胞」の語は、免疫系細胞に抗原を提供することができるクラスの細胞を言うが、ただしその免疫系細胞はその抗原が主要組織適合性複合体分子と結合した時点でその抗原を認識できなければならない。一般に抗原提供細胞が特定抗原への免疫応答に介入するために、この抗原提供細胞上の主要組織適合性複合体分子と結合可能な形態にその抗原を加工する。抗原提供細胞には、マクロファージ、T細胞および合成(人工)細胞といった広範な細胞型が挙げられる。
【００２３】
本発明の方法および組成物によって調節すべき免疫応答対象には、MHCクラスIに特異的な阻害性受容体における細胞傷害性応答および起炎症性および抗炎症性サイトカインの誘起が挙げられる。説明的な実施例において、これらの細胞はナチュラルキラー(NK)細胞および細胞傷害性Tリンパ球(CTL)から選択している。誘起した免疫応答はNK細胞またはT細胞の１以上の活性を抑制することも増強することもあり、例えば細胞傷害活性、サイトカイン産生、増殖、化学走性等の抑制または増強が挙げられる。
【００２４】
一般に本発明方法は、対象を本発明起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドの有効量に露出し、該ペプチドが該対象の表面上でHLA-E分子と結合し、そのペプチド/HLA-E複合体にCD94/NKG2細胞受容体が該表面上で結合するのを高揚または阻害することを特徴とする。該対象として、単離または結合状態のCD94/NKG2細胞受容体、該受容体を含有する膜または細胞調製物、該受容体を発現する細胞集団、組織または器官、あるいは哺乳動物患者は本発明方法の範囲内にある。更に詳細な実施例で言えば、該対象には、in vivoまたはex vivoの治療または診断処理のために選択された細胞集団、組織または器官が挙げられる。あるいはまた、該対象は、炎症性または自己免疫性の疾患または状態、ウイルス感染、移植拒否反応または癌に罹患している哺乳動物患者であってもよい。これらの場合において起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは、関連疾患の状態または症候を防止または阻止するのに効果的な予防的または治療的用量で投与してよい。
【００２５】
本発明の別の詳細な実施例で言うと、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドを１以上の生物学的活性を高揚または阻止するのに有効な用量で対象に投与し、その用量を、(a)CD94/NKG2受容体による細胞表面、HLA-E分子またはHLA-E/ペプチド複合体への結合、(ｂ)APC（例えばNK細胞またはCTL）の細胞傷害活性またはサイトカイン誘起活性、または（ｃ）炎症性または自己免疫性疾患、ウイルス感染、移植拒否反応または癌に付随する症候または状態、から選定する。
【００２６】
起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは、天然起源でも合成でもよい。時折、このペプチドは同族または模倣ペプチドであり、あるいは天然の起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドの配列に存在するアレル変異体である。ペプチド、同族ペプチド、または模倣ペプチドは、広範な手法、例えば該ペプチドの生物活性(例えばHLA-E結合性活性)を実質的に変化しない追加のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、化学試薬またはモイエチィーを添加、混合、または結合することによって修飾することができる。
【００２７】
他の態様として、本発明は、HLA-E結合性ペプチドまたは類似体の測定法であって、(a)ペプチドライブラリーを得ること、 (b)HLA-E/ペプチド複合体を形成すること、 (c)NK細胞およびT細胞上のCD94/NKG2受容体を阻害または活性化することの可能な安定複合体を選択すること、および(d)該複合体から安定なペプチド/ペプチド類似体を単離すること、の諸段階を含む測定法に関する。
【００２８】
他の態様として、本発明は、本発明ペプチドのいずれかを医薬的に受容可能な担体中に含有する医薬組成物に関する。本発明方法および組成物の範囲内において、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは、本明細書で以下に示す１以上の選択した疾患の状態または症候を防止または緩和するのに十分な量または投与形態にて、医薬的に受容可能な担体、希釈剤、賦形剤、免疫促進剤またの活性あるいは不活性な薬剤との各種組合わせで製剤化してよい。
【００２９】
本発明の更に別の態様では、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは、１以上の抗ウイルス、抗炎症、抗癌、抗移植拒否反応の治療用活性剤とのコンビナトリアルな製剤化または統合治療のプロトコールにて、前記方法により投与される。関連する方法および組成物の範囲内において、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは、１以上のこれら補助的治療薬剤と混合または併用(同時または連続して)投与され、それによって本明細書で以下に示す１以上の選択した疾患の状態または症候を防止または緩和する。
【００３０】
また本発明には、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドを含有するキット、パッケージおよび多重容器ユニットが含まれ、それには他の活性または不活性の成分、および／または、本明細書で以下に示す１以上の選択した疾患の状態または症候を診断、管理および／または予防および治療する際に使用する投与手段が任意に含有される。一般に、これらキットには、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドの診断用または医療用調製物が含まれており、それは通常は生物学的に適切な担体と共に製剤化され、また任意に調剤用の大きな容器またはユニットまたは多重ユニットの投与形態中に含有されている。任意の包装用材料には、本明細書に以下に説明する望ましいキット使用を指示するラベルまたは指導書が挙げられる。
【００３１】
本発明の別の態様には、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチド、ペプチド模倣体およびペプチド類似体をコードするポリヌクレオチド分子およびベクター構成物が挙げられる。
【００３２】
また、１以上の本発明起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドを標的とする抗体を産生する免疫応答を招来するためのワクチンおよび他の免疫原性組成物が提供され、これらは診断および／または治療の目的に有用であると思われ、以後に更に詳細に説明する。
【００３３】
また、各種の追加的な診断および治療の器具および試薬が本発明の範囲内で提供され、以下の説明にて詳細に記述される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、とりわけ炎症の疾患と状態、自己免疫疾患、ウイルス感染、移植拒否反応、および癌の診断および治療の新規な方法および組成物を提供することにより、前記要請を満足し、更なる目的および利点を充足する。これらの組成物および方法では起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドが使用され、対象、一般には疾患状態の哺乳動物対象の免疫応答を調節し、本発明方法および組成物による治療が可能になる。
【００３５】
本発明の範囲内で使用するペプチドは、主要組織適合性複合体クラスI(MHCクラスI)分子、例えばHLA-E MHCクラスI分子との特異的な結合相互作用を示す。一般に、これらMHCクラスI分子は抗原提供細胞(APC)上に存在する。この細胞がペプチドに露出されるとMHCクラスI分子の結合境界にそのペプチドが結合し、MHCクラスI分子とペプチドとの間の複合体が形成される。この結合した複合体はMHCクラスIに特異的な阻害性受容体、一般的にはCD94/NKG2細胞受容体（NKG2Aまたはそのスプライス変異体NKG2Bと対になったCD94からなる）と相互作用する。起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドとHLA-E結合性ペプチド(任意に別のペプチドを含んでよい)との間の相互作用により、結合性ペプチド/HLA-E複合体と受容体との間の相互作用が調整され、阻害性受容体を発現する多数の細胞において免疫応答の新たな制御が可能になる。
【００３６】
「主要組織適合性複合体分子」の語は、抗原提供細胞上の分子であって、その抗原と結合して抗原関連抗原提供細胞を形成することができるものを言う。CD94/NKG2細胞受容体が介入すると、NK細胞がこの抗原関連抗原提供細胞を認識する。
【００３７】
クラスI分子は、重鎖および非共有結合でリンクしたβ2ミクログロブリン分子から構成され、これには境界または溝があってそこに起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチを受理する。したがって該ペプチドは、その溝に入れる程度のサイズおよび寸法になる。溝のサイズおよび寸法は当業者には公知である（F. Latron Science 257:964-967, 1992、本明細書に参考として編入）。好ましくは、該ペプチドはその溝の中に実質的に合致するが、その抗原を認識できるNK細胞またはT細胞がクラスI分子と結合した場合にはその細胞にアクセスすることができる。一般に、該ペプチドの長さは約4〜24アミノ酸、時折約6〜15アミノ酸、更に通常は約8〜10アミノ酸からなる。典型的な例ではペプチドは九量体である。通常、該ペプチドのアミノ酸のうち2個は疎水性残基であり、これによってペプチドは溝に保持される。例えば、該ペプチドは、腫瘍、組織、ウイルスタンパク質またはバクテリアタンパク質から誘導してよい。
【００３８】
本発明の関連例では、NK細胞が正常および異常(例えば癌性またはウイルス感染性)細胞に遭遇している間に、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドによってNK細胞の活性（例えば細胞傷害性およびサイトカイン放出）が防止あるいは誘起される。CD94/NKG2受容体を有するNK細胞は、自己トレランスを制御するので、防護的HLA-E分子の発現を喪失した細胞を殺傷することができる。
【００３９】
本発明の更に詳細な態様では、起炎症性結合性ペプチドを別のMHCクラスI分子のシグナル配列から誘導する。抗炎症性結合性ペプチドは、典型的にはストレス誘起またはストレス関連タンパク質、あるいは熱ショックタンパク質(hsp)、例えばhsp60から誘導する。正統的なMHCクラスI分子とは対照的に、HLA-Eが見せる他形はむしろ限定されており、ペプチドが結合する境界は主にHLA-A、-B、-C、および-G分子のシグナル配列から誘導される九量体ペプチドが占拠している（Lazeticら、J. Immunol. 157:4741-4745, 1996、本明細書に参考として編入）。これらのペプチドは一般に共通のモチーフ、すなわち2位にメチオニン、9位にロイシンまたはイソロイシンを共有している（Arnett ら、Arthritis Rheum. 31:315-324, 1988、本明細書に参考として編入）。更にこれらペプチドには第三の共通モチーフ、すなわち4位にプロリン残基が見られる。このモチーフまたは同様な構造を共有するペプチドは、HLA-Eに結合しかつCD94/NKG2細胞受容体との相互作用を調節することにより免疫応答に介入することができる使用可能な起炎症性および抗炎症性結合性ペプチドを本発明の範囲内でスクリーニングして同定するための候補ペプチドとして有用である。
【００４０】
本発明のある実施例では、HLA-E結合性ペプチドをストレス誘起タンパク質のシグナル配列から誘導する。例えば、例示ペプチドをストレス誘起ペプチドhsp60から選択してよい。本発明の一実施例ではhsp60ペプチドは九量体である。好ましいペプチドの例は、（標準的な一文字コードで）VMAPVTVLLおよびQMRPRSRVLである。
【００４１】
ヒトhsp60から誘導したペプチドでHLA-E結合能を有するものを同定するためにhsp60の全長アミノ酸配列をスキャンニングして、HLA-Eの許容モチーフ（Ｃ末端側に2位にメチオニン、続いて9位にロイシンまたはイソロイシン）を発揮するペプチドを求めた。このように同定したペプチド(図１、表１)の中で、一つ(hsp60spと呼ばれるQMRPVSRVL)をhsp60のリーダー配列の範囲内の位置に基づいて最初に選択した。Hsp60spは、2位にメチオニンおよび9位にロイシンを有するばかりでなく、4位および8位においてHLA-Eに有効に結合することが判っているあるペプチド(表１)と共通のアミノ酸を有している。特にhsp60spの9個のアミノ酸の中の4個は、HLAクラスIリーダー配列に存在するあるペプチド(例えばHLA-A*0201および-A*3401、表１)と共有している。
【００４２】
【表１】
2005523236.tif 000002
【００４３】
本発明方法および組成物による治療および診断が可能な疾患および状態には、例えば関節リウマチ、若年性関節炎、クロン疾患、潰瘍性大腸炎、急性骨髄白血病、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、全身性エリテマトーデス、スウエーグレン症候群、バセドウ氏病、ハシモト病、自己免疫溶血性貧血、癌(例えば卵巣癌)、心筋症、初期心臓血管疾患、動脈硬化症、高血圧、ホジキンス氏病、および移植拒否反応が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のこの広範な適用を支持する代表的な報告によれば、パーフォリンに依存する方法でエフェクターT細胞の応答を制御してTH1介入大腸炎を低下する際にNK細胞が重要な役割を負っている（Fort ら、J. Immunol. 161:3256-3261, 1998、本明細書に参考として編入）。ヒトの多発性硬化症(MS)のモデルである実験的な自己免疫脳脊髄炎(EAE)において、NK細胞刺激性化合物リノマイドを投与すると、マウスは疾患の進展から防護され、また同じモデルでNK細胞を抑止するとTH1サイトカインの産生は増大し疾患は悪化する（Matsumotoら、Eur. J. Immunol. 28:1681-1688, 1998；Zhangら、J. Exp. Med. 186:1677-1687, 1997、それぞれ本明細書に参考として編入）。これらの報告から、TH1が介入する基本的な疾患の防止にはNK細胞の存在は有利であることが示唆される。反対に、TH2が介入する基本的な疾患である喘息のマウスモデルではNK細胞には病因的役割が示唆され、したがってNK細胞を抑止するとアレルゲンが誘起する気道炎症の進展からマウスは防御された。
【００４４】
熱ショックタンパク質(hsp)や他のタンパク質から誘導した別のペプチドを同定するために、上記hsp60で使用したと同様なデザインおよびスクリーニング方法を採用する。HLA-E結合能を有する候補を、本明細書に記載の構造的観点、および疾患状態の発生または悪化を促進するそれらの既知性能に基づいて同定してもよい。以下の表2および3に示されるように、hspの多くは深刻な疾患および状態に関与するが、それらは本発明方法および組成物により治療可能である。起炎症性および抗炎症性結合性ペプチド候補を、疾患に付随する悪化活性が判っている対象タンパク質から同定するために、そのタンパク質の全長アミノ酸配列をスキャンニングしてHLA-Eの許容モチーフ(例えばＣ末端側に2位にメチオニン、続いて9位にロイシンまたはイソロイシン)を呈するペプチドを求める。このようにして同定した候補ペプチドを本明細書に前記した方法により評価しスクリーニングする。
【００４５】
【表２】
2005523236.tif 000003
【００４６】
【表３】
2005523236.tif 000004
【００４７】
上で引用した参考文献
1. Albani Sら、Nat Med. May;1(5):448-52. 1995
2. de Graeff-Meeder, E.Rら、Clin Exp Rheumatol 11 Suppl 9, S25-28. 1993
3. Xu, Qら、Arterioscler Thromb 13:1763-1769. 1993
4. Yokota, Sら、Clin Immunol Immunopathol. 67: 163-170. 1993
5. Rambukkana, Aら、J Invest Dermatol 100, 87-92. 1993
6. Raz Iら、Lancet. Nov 24;358(9295):1749-53. 2001
7. Salvetti Mら、J Neuroimmunol. Apr;65(2):143-53. 1996
8. Jenkins SCら、Tissue Antigens. Jul;56(1):38-44. 2000
9. Hayem Gら、Ann Rheum Dis. May;58(5):291-6. 1999.
10. Blass Sら、Arthritis Rheum. Apr;44(4):761-71. 2001
11. Somersan Sら、J Immunol. Nov 1;167(9):4844-52. 2001
【００４８】
上の表３に同定された各ペプチド配列は、本発明の診断および治療方法の範囲内で使用するのに有用な起炎症性および抗炎症性結合性ペプチド候補である。
【００４９】
更に、種々の他のペプチドを分析し本発明の範囲内で使用する起炎症性および抗炎症性結合性ペプチド候補を決定してきた。その分析の一つとしてBLASTサーチを行い、ヒトhsp60リーダー配列とアミノ酸が85％同一のホモサピエンスベーターディフェンシン2(HBD2)遺伝子内の１連のヌクレオチドを同定した。リーディングフレームを逆にして位置HBD2：718から659へ読み上げるとhsp60リーダーペプチドと85％同じである。
【００５０】
BLAST search results:
gi|3818536|gb|AF071216.1|AF071216, complete cds
Score = 37.0 bits (84), Expect = 0.34
Identities = 17/20 (85%), Positives = 18/20 (90%)
Frame = -2
Query human hsp60sp: 1 MLRLPTVFRQMRPVSRVLAP 20
identities       ML LPTVF QMRPVSR+LAP
HBD2:718 MLPLPTVFHQMRPVSRLLAP 659
【００５１】
種々の対象タンパク質およびペプチド配列から、アミノ酸配列をスキャンニングし、HLA-E許容モチーフを示すペプチドを求める。このように同定したペプチド候補を本明細書に記載の方法により評価しスクリーニングする。表４に本発明で使用するHLA-E結合性ペプチド候補の大集団を示す。
【００５２】
【表４】
2005523236.tif 000005
2005523236.tif 000006
2005523236.tif 000007
2005523236.tif 000008
2005523236.tif 000009
【００５３】
参考文献
1.      Braud, V. M., D. S. Allan, C. A. O'Callaghan, K. Soderstrom, A. D'Andrea, G. S. Ogg, S. Lazetic, N. T. Young, J. I. Bell, I H. Phillips, L. L. Lanier, および A. I McMichael. 1998.「HLA-Eがナチュラルキラー細胞受容体 CD94/NKG2A、Bおよび Cへの結合 [コメント参照]」. Nature 391:795.
2.      Kleinau, S., K. Soderstrom., R. KiesslingおよびL. Klareskog. 1991.「ミコバクテリア65kDa熱ショックタンパク質(ML30)に対するモノクロナール抗体がラット健常および関節炎の関節細胞への結合」Scand J Immunol 33:195.
3.      Karlsson-Parra, A., K. Soderstrom, M. Ferm, I Ivanyi, R. Kiessling, およびL. Klareskog. 1990.「RA患者の炎症関節および皮下結節にヒト65kDa熱ショックタンパク質(hsp)の存在」[Scand J Immunol 1990 Mar;31(3)-.283-8に最初に刊行された論文の最初の頁で修正および再公表]. Scand.J.Immunol 31:283.
4.      Boog, C. J. P., E. R. de Graeff-Meeder, M. A. Lucassen, R. R. van der Zee, M. M. Voorhorst-Ogink, P. I S. van Kooten, H. J. Geutz, および W. van Eden. 1992. 「ヒトhsp60に対して作成した2個のモノクロナール抗体が若年性慢性関節炎患者の滑膜と反応性を示す」J Exp. Med 175:1805.
5.      Lo, W.-F.ら、「グラム陰性病原体感染後のN4HCクラスIb分子介入分子模倣」Nature Med 6, 215-218 (2000)
6.      Kraft, J.R.ら、「CD94/NKG2AのQa- I bペプチド結合特異性およびQa- Iペプチド複合体間識別能の分析」J Exp. Med 192, 613- 623(2000).
【００５４】
hsp60シグナルペプチドまたは他の起炎症性のHLA-E結合性ペプチド(例えばストレスタンパク質、熱ショックタンパク質または本明細書に開示の他のタンパク質由来)およびこれらの類似体であって、HLA-Eに強い結合能があり、HLA-E境界部で防護性MHCクラスIペプチドと潜在的に競合可能なものを使用すれば、新規の治療手段が開発され、NK細胞を活性化し、防護的なHLA-E発現に基づく免疫的検出を逃れた腫瘍細胞に対しCD94/NKG2発現性CTLを活性化する門戸を低めることができる。これらの組成物および方法は、患者の腫瘍細胞または癌性組織を起炎症性結合性ペプチドの治療的有効量に露出することに関し、このペプチドによって腫瘍細胞または癌性組織の増殖が防止または阻害される。
【００５５】
間連する方法は、ウイルス感染細胞の治療にも適用される。そのような感染細胞を起炎症性結合性ペプチドの治療的有効量に露出すると、このペプチドはHLA-Eの境界で防護性MHCクラスＩペプチドと競合し、NK細胞の活性化を誘起し、免疫的検出を逃れたウイルス感染細胞に対してCD94/NKG2A発現性CTLを活性化するための敷居を低くする。
【００５６】
ペプチド類似体および模倣体
本発明で使用する生物学的に活性なペプチドの定義には、天然または合成で、治療的または予防的に活性なペプチド（2以上の共有結合で結合したアミノ酸からなる）、ペプチド類似体、および活性ペプチドの化学修飾した誘導体または塩が包含される。時折、そのペプチドは、天然起源の、または天然（例えば野生型、天然起源変異体またはアレル変異体）のペプチド配列内でのアミノ酸の部分的な置換、付加または削除により簡単に得られる変異体である。更に天然ペプチドの生物学的な活性断片が包含される。このような変異誘導体および断片は天然ペプチドの所望する生物学的な活性を実質的に保持している。炭水化物鎖を有するペプチドの場合、これら炭水化物部分の変化がマークされた生物学的に活性な変異体も本発明の範囲に包含される。
【００５７】
別の実施例で、本発明で使用するペプチドは、合成重合体例えばポリエチレングリコール、天然重合体例えばヒアルロン酸、または任意の糖（例えばガラクトース、マンノース）、糖鎖、または非ペプチド化合物が追加または結合して修飾されてもよい。このような修飾によりペプチドに追加された物質が受容体または抗体への結合を特異化または促進してもよいし、さもなくば、該ペプチドの粘膜輸送、活性、半減期、細胞または組織の特異的標的化、その他の有利な特性を促進してもよい。例えば、そのような修飾、例えばフォスフォリピッドまたは脂肪酸の追加または結合によりペプチドが一層親油性となってもよい。本発明方法および組成物の範囲には、2以上のペプチド、タンパク質断片または機能領域（例えば細胞外、透過膜および細胞質の領域、リガンド結合性領域、活性部位領域、免疫抗原決定基、等）を結合（例えば化学結合）して製造したペプチド、例えば1個の被コード分子に複数の異なるペプチドの機能的要素を編入するために組替え技術により製造した融合ペプチドが包含される。
【００５８】
したがって、本発明方法および組成物で使用する生物学的に活性なペプチドには、例えば天然または「野生型」ペプチドおよびこれら分子の天然起源の変異体、例えば天然起源のアレル変異体および変異タンパク質が挙げられる。合成の、例えば化学的にまたは組替え技術的に作成したペプチド、ならびにペプチドおよびタンパク質の「類似体」、および天然起源ペプチドの化学的に修飾した誘導体、断片、結合体、および重合体も挙げられる。本明細書で使用する、ペプチド「類似体」の語には、選択したペプチドの天然のアミノ酸配列に比較して1以上のアミノ酸の置換、挿入、再配列または削除が編入された修飾ペプチドが包含される。このように修飾したペプチドおよびタンパク質の類似体が呈する実質的に留保された生物学的活性は対応する天然ペプチドのものに匹敵する、すなわち活性（例えば、HLA-E分子あるいはHLA-E発現細胞への結合、ペプチド/HLA-E複合体とCD94/NKG2細胞受容体の相互作用、等）レベルは対応する天然のタンパク質またはペプチドの活性レベルに比較して少なくとも50％、一般には少なくとも75％、時には85％−99％以上である。
【００５９】
起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドおよび他の同質または異質のペプチドとの間の融合ポリペプチドも提供さてる。多くの増殖因子およびサイトカインは同質の二量体であり、ペプチドの反復構造が結合して「クラスターペプチド」を形成すると、各種の利点、例えばタンパク質分解の恐れが少なくなる等が得られる。本発明ペプチドを含有する他の各種の多量体構成物も提供される。一例を示せば、米国特許番号6,018,026および5,843,725に記述されているように、本発明の1以上の起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドを異質の多量体化性ポリペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖定常領域または免疫グロブリン軽鎖定常領域と結合することにより各種のポリペプチド融合体が提供される。このように構成された生物学的に活性な多量体化ポリペプチドは、異質または同質の多量体、例えば同質二量体または異質二量体であって、それぞれ本発明の1以上の明確な起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドを含有する。他の異質ポリペプチドを該ペプチドと組合わせることによって、例えば異質の（例えばCD4）受容体への結合特異性を示すハイブリッドタンパク質を含有する融合体を得てもよい。同様に、誘導タンパク質の特性または活性の組合わせを呈する異質融合体を構成してもよい。他の典型的な例は、レポーターポリペプチド、例えばCATまたはルシフェラーゼと本発明ペプチドとの融合体であり、融合タンパク質の位置確認が容易になる（例えば、Dullら、米国特許番号4,859,609参照、本明細書に参考として編入）。これに関連して遺伝子/タンパク質融合体の他の有用なパートナーには、バクテリアβガラクトシダーゼ、trpE、タンパク質Ａ，βラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酵母α会合因子が挙げられる（例えば、Godowskiら、Science 241:812-816, 1988、本明細書に参考として編入）。
【００６０】
また、本発明は、化学成分との共有結合または凝集による結合によって修飾された起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドの使用を意図している。これらの誘導体は一般に三つのクラス、すなわち(1)塩、(2)側鎖および末端残基の共有結合による修飾、および(3)例えば細胞膜との吸着複合体、に分けられる。このような共有結合または凝集による誘導体は、各種の目的、例えば免疫原として、免疫測定法の試薬として、あるいは精製方法において、例えばリガンドまたは他の結合性リガンドのアフィニティー精製用に有用である。例えば、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドに特異的に結合する抗体を測定または精製するために、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドを固相担体、例えばシアノゲンブロマイド活性化セファローズに当分野で公知の方法により共有結合で結合して固定化し、あるいはポリオレフィン表面上にグルタールアルデヒドによる架橋を伴いまたは伴わずに吸着する。また起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは、検出可能な基で標識、例えばクロラミンＴ法で放射性ヨード化したり、希土類金属錯体に共有結合で結合したり、診断方法で使用するために他の蛍光成分に結合したりすることができる。
【００６１】
本発明のために言えば、生物学的に活性なペプチド「類似体」の語には、天然ペプチドの誘導体または合成変異体、例えばアミノおよび/またはカルボキシル末端の削除体および融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸による配列内の挿入体、置換体、または削除体が包含される。挿入アミノ酸配列変異体では、1以上のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位に導入される。無作為挿入も可能であり、得られた生成物を適切にスクリーニングする。削除変異体は、1以上のアミノ酸が配列から除去される点に特徴がある。置換アミノ酸変異体では、配列中の少なくとも１の残基が除去され別の残基がその位置に挿入される。
【００６２】
天然ペプチドをアミノ酸置換で修飾する場合には、一般的には前のアミノ酸に類似の、それとの関連を留保した化学特性、例えば疎水度、親水度、電気陰性度、側鎖の大小等を持った他のアミノ酸で置換する。天然ペプチドの配列に一致しない残りに位置は、類似の化学特性、例えば類似の電荷または極性を持ったアミノ酸で置換され、この場合にこの置換変化によってもそのペプチド類似体の特性は実質的な影響をうけない。このようなマイナーな変化では、修飾ペプチドの生物学的な特性、例えば生物学的活性（付着分子、他のリガンドまたは受容体への結合）、免疫同一性（天然ペプチドを認識する１以上のモノクロナール抗体による認識）、および対応する天然ペプチドの他の生物学特性は一般的には実質的に維持される。
【００６３】
本明細書で使用する「留保的なアミノ酸置換」の語は、類似の側鎖を持ったアミノ酸残基間の包括的な互換可能性を言う。例えば、脂肪族側鎖を持つアミノ酸の普通に互換可能なグループはアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンである。脂肪族ヒドロキシル側鎖を持つアミノ酸のグループはセリンおよびスレオニンである。アミド含有側鎖を持つアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンである。芳香族側鎖を持つアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンである。塩基性側鎖を持つアミノ酸のグループはリジン、アルギニンおよびヒスチジンである。硫黄含有側鎖を持つアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。留保的な置換の例には、非極性（疎水性）残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンを相互に置換することが挙げられる。同様に、本発明では、極性（親水性）残基、例えばアルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、スレオニンとセリンの間の置換が意図されている。更に、塩基性残基、例えばリジン、アルギニンまたはヒスチジンを相互に置換すること、あるいは酸性残基、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸を相互に置換することも意図されている。留保的なアミノ酸置換グループの例は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００６４】
生物学的活性ペプチドの語には、20個の通常のアミノ酸の立体異性体(例えば、D-アミノ酸)を含む天然ペプチドの修飾形、あるいは非天然アミノ酸、例えばα、α-ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸が更に包含される。これらの非通常的なアミノ酸も本発明で有用な天然ペプチドの中で置換または挿入されてよい。非通常的なアミノ酸の例には、4-ヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタメート、ε-Ｎ,Ｎ,Ｎ-トリメチルリジン、ε-Ｎ-アセチルリジン、Ｏ-フォスフォセリン、Ｎ-アセチルセリン、Ｎ-フォルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシイジン、ω-Ｎ-メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば4-ヒドロキシプロリン）が挙げられる。更に、生物学的活性ペプチド類似体には、対象ペプチドの構造成分として天然にまたは合成して生じたあるいはペプチドに結合または付随する炭水化物、脂肪および/またはタンパク質性の成分の一重または多重置換体、削除体および/または付加体が挙げられる。
【００６５】
ペプチドおよびタンパク質の類似体の本発明における製造と使用を容易にするために、分子発生的研究を参考にすることができる。これによれば、種、属、科あるいは他の分類学的グループの間でのタンパク質の構造的機能的要素における保存および拡散の特徴が明らかになる（例えば、ストレス誘起または熱ショックのタンパク質、関連メンバー、アレル変異体、および/または天然起源の変異体の間、例えばヒト、マウス、ラットおよび/またはウシ等異なる種に存在する同質タンパク質の間）。入手可能な研究資料から、微小分子レベルでの構造と機能の関係の詳細な解釈が得られるので、それによって本明細書に開示のペプチドの大半を修飾すればペプチドおよびタンパク質の類似体の製造と選択が容易になる。これらの研究資料には、例えば詳細な配列の比較があり、対象の起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドの多数の異形体または種またはアレル変異体の間での
構造要素の保存と拡散が同定される。これら保存され拡散した各構造要素によって、天然ペプチドを修飾し所望の構造的および／または機能的変化を得るのに有用な標的が指摘されれば、本発明の実施は容易になる。
【００６６】
これに関連して、既存の配列を分析し、通常の配列法を採用して解析のための比較、例えば問題のタンパク質について種内のタンパク質メンバーの間、および種による変異体の間におけるタンパク質の領域とアミノ酸位置の対応を同定してもよい。このような比較は問題の保存および拡散する構造要素を同定するのに有用であり、拡散する構造要素は生物学的活性ペプチドに編入してそれの機能的な類似体を得るのに有用である。典型的には、問題の拡散的な構造要素を別の参照用ペプチド配列中でマークしている1以上のアミノ酸残基を機能的なペプチド類似体に編入する。例えば、天然の起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドをコードするｃＤＮＡを１以上の対応するアミノ酸位置（すなわち、別の参考用ペプチド配列、例えば対象の起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドの異型体、種またはアレルの変異体、あるいは合成変異体中で問題の構造要素をマークしている残基に類似の配列要素を採用した配列方法に従って適合または挿入する位置）で組替え技術により修飾してアミノ酸の削除、置換、挿入をコードし、天然ペプチドの対応する残基を変更し、本発明で使用可能な−参照用ペプチドの同族的な構造および／または機能要素を有するペプチドを作成してよい。
【００６７】
生物学的活性ペプチド類似体を構成するためのこの合理的なデザイン方法においては、別の参考用ペプチド中で問題の構造要素に対応するアミノ酸位置の天然または野生型の残基を、参考用ペプチド中の対応するアミノ酸残基と同一または保存的に関連する残基に変更してもよい。しかし、対応する参考用タンパク質残基に関して非保存的に天然型アミノ酸残基を変更してしまう恐れが時折ある。特に拡散部位での非保存的なアミノ酸置換により多くの場合に、天然ペプチドの機能に比較して、効果が徐々に悪化または中性化したり、選択した生物学的活性が強化されたりする。
【００６８】
当分野に公知のコンピュータモデル化方法と組み合わせて、天然の生物学的活性ペプチドの結晶構造を解析（例えば、Loebermannら、J. Molec. Biol. 177:531-556, 1984； Huberら、Biochemistry 28:8951-8966, 1989； Steinら、Nature 347:99-102, 1990； Weiら、Structural Biology 1:251-255, 1994、それぞれ本明細書に参考として編入）すれば、配列を整列比較して有用なペプチドおよびタンパク質の類似体を予測する精度が向上する。これらの解析により構造と機能との間のマッピングが可能となり、ペプチドおよびタンパク質の類似体および模倣体に編入する所望の構造要素と修飾が同定され、本発明方法と組成物で使用する天然ペプチドにほぼ匹敵する活性が発揮される。
【００６９】
本発明生物学的活性ペプチド類似体には、対応するペプチド配列に配列の実質的同一性が見られる。「配列の実質的同一性」とは、二つの対象アミノ酸配列を最適に整列した場合、例えばデフォールトギャップペナルティーを使用するGAPまたはBESTFITプログラムによった場合に、少なくとも65％の配列同一性、通常は80〜85％配列同一性、時には少なくとも90〜95%以上の配列同一性が共有されていることを意味する。「アミノ酸同一性％」とは、二つのペプチドのアミノ酸配列を最適に整列して対比した場合に同一アミノ酸の％がほぼ表示の通りであることを言う。一般に配列対比は参照配列に対して少なくとも10残基の対比窓枠、多くの場合には少なくとも15〜20アミノ酸の窓枠越しに行われ、配列同一性％はこの窓枠で参照配列を第二の配列に対比して計算する。例えば、第二の配列がペプチド類似体であって1以上の削除、置換または付加がある場合に、それらの総計が対比窓枠越しで参照配列の20％、一般には5未満〜10％であるというように表わせばよい。参照配列はより大きな配列の小部分、例えばhsp60リーダー配列由来残基の小部分であればよい。対比窓枠を置くために最適な配列整列は、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482, 1981）に従って、NeedlemanおよびWunschの相同性整列アルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:443, 1970）によって、PearsonおよびLipmanの類似性方法の研究（Proc. Natl. Acad. Sci.USA 85:2444, 1988）によって、あるいはこれらアルゴリズムのコンピュータ化処理（GAP, BESTFIT, FASTA, および／または TFASTA, 例えばthe Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIに提供されている）によって行ってよい。
【００７０】
ペプチド類似体を対応する天然ペプチドと最適に配列し、適切な測定、例えば付着タンパク質または受容体結合性測定法を使用して選択すべき生物学的活性を決定することにより、本発明方法および組成物に使用する操作可能なペプチドおよびタンパク質の類似体が容易に同定される。操作可能なペプチドおよびタンパク質の類似体は、一般的には対応する天然ペプチドに対する抗体に特異的な免疫活性を有する。同様に、操作可能なペプチドおよびタンパク質の類似体をコードする核酸は、対応する天然ペプチドまたはその断片をコードする核酸に上記と同様の配列の実質的同一性を共有しており、対応する天然ペプチドをコードする部分または完全なる核酸配列に受容可能で緩徐または高度に厳密なハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズする（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001、本明細書に参考として編入）。「に選択的にハイブリダイズする」とは、特定標的DNAまたはRNA配列に優先的にハイブリダイズ、重なりあるいは結合する核酸プローブとの間の選択的相互作用を言い、例えばその標的配列が別異の調製物、例えば全細胞DNAまたはRNAに存在する場合を言う。一般に、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質類似体またはその断片をコードする核酸配列は、対応する天然ペプチドをコードする核酸配列に厳密な条件(例えば、所定のイオン強度とpHにおいて対象配列の熱的融点（Tm）より約5℃低い条件が選択される、ここでTmは所定のイオン強度とpHのもとで、相補または標的配列の50％が完全一致のプローブにハイブリダイズする温度を示す)の下でハイブリダイズする。核酸プローブのデザインとアニーリングの条件を考察するには、例えばSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001 または Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubelら編 Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1987、それぞれ本明細書に参考として編入を参照。一般に、厳格または選択的条件では、塩濃度はpH７で少なくとも約0.02モルであり、温度は少なくとも約60℃である。厳格な選択性の少ないハイブリダイゼーション条件を選択してもよい。他の要因、例えば特に相補鎖の塩基組成とサイズ、有機溶媒の存在、および塩基のミスマッチの程度が厳密なハイブリダイゼーションに有意に影響すると推測されるので、パラメータの組み合わせの方が特定の尺度よりも重要である。
【００７１】
本発明の別の態様では、選択した天然ペプチドの機能的領域(例えば、結合モチーフまたは活性部位)の三次構造および活性を模倣するペプチドまたは非ペプチド分子を含有するペプチド模倣体が提供される。これらのペプチド模倣体には、例えば、組み換え技術的にまたは化学的に修飾されたペプチド、ならびに非ペプチド剤、例えば以下に記述する小分子の薬物模倣体が挙げられる。
【００７２】
一つの態様として、本発明で有用なペプチド（ポリペプチドを含み）において、20個の遺伝子コードされたアミノ酸(またはDアミノ酸)からなる1以上の天然起源側鎖を他の側鎖で、例えばアルキル、低級アルキル、4-、5-、6-、7-員環アルキル、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ(低級アルキル)、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびこれの低級エステル誘導体で、および4-、5-、6-、7-員異項環で置換することによりペプチド模倣体を製造する。例えば、プロリン類似体は、プロリン残基の環サイズを5員から4、6、または7員に変更することにより作成することができる。環基を飽和化または不飽和化することができ、不飽和化した場合には芳香族または非芳香族とすることができる。異項環基には1以上の窒素、酸素、およびまたは硫黄のヘテロ元素を含有することができる。そのような基の例には、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、モルフォリニル(例えばモルフォリノ)、オキサゾリル、ピペラジニル(例えば1-ピペラジニル)、ピペリジル(例えば1-ピペリジル、ピペリジノ)、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル(例えば1-ピロリジニル)、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルフォリニル(例えばチオモルフォリノ)、およびトリアゾリルが挙げられる。これらの異項環基は置換または非置換が可能である。基を置換する場合は、置換基はアルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、または置換または非置換のフェニルが可能である。
【００７３】
ペプチド、ならびにペプチドおよびタンパク質の類似体および模倣体も共有結合により1以上の各種の非タンパク質性重合体、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルケンに結合させることができ、その方法は、米国特許番号4,640,835、 米国特許番号4,496,689、 米国特許番号4,301,144、 米国特許番号4,670,417、 米国特許番号4,791,192、または米国特許番号4,179,337に記載されており、全て、本明細書に参考として編入。
【００７４】
本発明の他のペプチドおよびタンパク質の類似体および模倣体には、グリコシル化変異体、他の化学的成分との共有結合または凝集による複合体が挙げられる。共有結合による誘導体は、アミノ酸側鎖またはNまたはC末端に存在する基に官能基を当分野に公知の手段により結合させて製造することができる。このような誘導体には、カルボキシル末端の、またはカルボキシル側鎖を含有する残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基のO-アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基、例えばリジンまたはアルギニンのN-アシル誘導体が挙げられる。アシル基は、アルキル成分、例えばC3〜C18直鎖アルキルの群から選択され、アルカノイルアロイル種が形成される。担体タンパク質、例えば免疫原成分に共有結合で結合させるのも採用してよい。
【００７５】
これらの修飾の外に、生物学的活性ペプチドのグリコシル化変異体は、例えばペプチドのグリコシル化パターンをその合成および加工の間に、あるいは別の加工段階で修飾することにより作成することができる。これを達成する特に好ましい手段は、普通にグリコシル化加工が行われている細胞から誘導したグリコシル化酵素、例えば哺乳動物のグリコシル化酵素にペプチドを露出することによる。脱グリコシル化酵素を使用した場合にも、本発明の有用な修飾ペプチドが首尾よく得られる。他のマイナーな修飾成分、例えばリン酸化アミノ酸残基、例えばフォスフォチロシン、フォスフォセリンあるいはフォスフォスレオニン、あるいは他の成分、例えばリボシル基または架橋試薬を有する天然の1次アミノ酸配列の改善体も包含される。
【００７６】
ペプチド模倣体には、フォスフォリル化、スルフォン化、ビオチニル化、あるいは他の成分、特にフォスフェート基に類似の分子形状を有するものの付加または除去によって化学的に修飾したアミノ酸残基があってよい。ある実施例では、修飾成分は有用な標識成分であり、あるいは精製用標的、例えばアフィニティーリガンドとして役立つ。
【００７７】
本発明ペプチド模倣体の主要なグループには、天然ペプチドまたはその断片と他のタンパク質またはペプチドとの共有結合による複合体が挙げられる。これらの誘導体は、組み換え培地で例えばNまたはC末端融合して、あるいは活性側基を介してタンパク質を架橋するのに有用であることが当分野で判っている薬剤を使用して合成することができる。架橋剤が標的とするペプチドおよびタンパク質の好ましい導入部位は、遊離アミノ基、炭水化物成分、およびシステイン残基にある。
【００７８】
生物学的活性ペプチドと他の同質または異質ペプチドとの間の融合ポリペプチドも提供されている。多くの増殖因子およびサイトカインは同質二量体であり、このような分子またはその活性断片の繰り返し構造によって、各種の利点、例えばタンパク質分解を受けにくくなるといったことが得られる。起炎症性または抗炎症性結合性ペプチドの繰り返しおよび他の融合構造により、本発明方法および組成物における同様な利点が得られる。したがって、本発明で有用なペプチドを含有する多様な多量体構造も提供されている。ある実施例では生物学的活性ポリペプチド融合体が提供されており、米国特許番号6,018,026、 5,843,725、 6,291,646、 6,300,099、および6,323,323（それぞれ本明細書に参考として編入）に記載されているように、例えば本発明の1以上の生物学的活性ペプチドを異質の多量体ポリペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖定常領域または免疫グロブリン軽鎖定常領域と結合させている。このように構成された生物学的活性多量化ポリペプチド融合体は、異質または同質多量体、例えば1以上の起炎症性または抗炎症性結合性ペプチド要素を含有する同質二量体または異質二量体が可能であり、それぞれ本発明で操作可能な1以上の異なる生物学的活性ペプチドを含有してよい。他の異質ポリペプチドを活性ペプチドと組み合わせることにより、誘導タンパク質の特性または活性の組み合わせを呈する融合体を得てもよい。他の典型的な例は、レポーターポリペプチド、例えばCATまたはルシフェラーゼと本明細書に記載のペプチドとの融合体であり、これにより融合ペプチドの位置確認が容易になる（Dullら、米国特許番号4,859,609、本明細書に参考として編入）。これに関連して有用な他の融合用パートナーには、バクテリアのβガカクトシダーゼ、trpE、タンパク質A、βラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および酵母α接合因子が挙げられる(例えば、Godowskiら、Science 241:812-816, 1988参照、本明細書に参考として編入)。
【００７９】
また本発明は、化学成分と共有結合または凝集による結合により修飾された生物学的活性ペプチドの使用を意図している。一般にこれらの誘導体は三つのクラスに分かれる。すなわち、(1)塩、(2)側鎖および末端残基の共有結合による修飾、および(3)付着複合体、例えば細胞膜との。このような共有結合または凝集による誘導体は、各種の目的、例えば免疫測定法あるいは精製法、例えばリガンドあるいは他の結合性リガンドのアフィニティー精製法における免疫原として、試薬としての1以上の起炎症性または抗炎症性結合性ペプチド間の同型または異型の結合を封止するのに有用である。例えば、活性ペプチドを共有結合により固体支持体、例えばシアノゲンブロマイド活性化セファローズに当分野に公知の方法で固定化させたり、ポリオレフィン表面にグルタールアルデヒド架橋によりあるいはよらずに付着化させたりして、該ペプチドに特異的に結合する抗体を測定または精製するのに使用することができる。また活性ペプチドは検出可能な基で標識、例えばクロラミンTにより放射性ヨード化したり、希土類錯体に共有結合で結合したり、あるいは他の蛍光成分に結合したりして、診断測定法、例えば標識ペプチドの経鼻投与を含む測定法において使用することができる。
【００８０】
対応する天然ペプチドと同等または類似の望ましい生物活性を有し、更に好ましい活性、例えば溶解性、安定性および／または加水分解またはタンパク質分解の受けやすさに関して向上した特性を有するペプチドおよびタンパク質の模倣体を構成するための各種技法が入手可能であることを当業者は承知している（MorganおよびGainor, Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252, 1989、本明細書に参考として編入）。ある種のペプチド模倣体化合物は、本発明で使用するために本明細書に記載のタンパク質およびペプチドのアミノ酸配列を基礎にしている。一般にペプチド模倣体化合物は、(模倣体化合物の少なくとも部分は)三次元構造を有する合成化合物であり、例えば選択ペプチド、またはそれの構造領域、活性部位、または結合領域（例えば同型または異型の結合部位、触媒活性部位または領域、レポータまたはリガンド結合の界面または領域）の一次、二次および／または三次構造および／または電気化学的特性を模倣している。ペプチド模倣体構造または部分的構造(ペプチド模倣体化合物のペプチド模倣「モチーフ」とも言う)は、望ましい生物学的活性、例えばHLA-E結合活性あるいは防護的HLA-E結合の結合封鎖あるいはCD94/NKG2受容体によるMHCリーダー配列ペプチド/HLA-E複合体の認識、を天然ペプチドと共に共有している。一般的には、模倣体化合物の生物学的活性は、模倣体がモデルになっている天然ペプチドの活性と比較して実質的に減少していないし、時には同等または以上である。更に、ペプチド模倣体化合物は、治療用途を高める他の望ましい特性、例えば細胞透過性の増加、アフィニティーおよび／またはアビディティーの増大、および生物学的半減期の延長といった特性を有することができる。本発明ペプチド模倣体の「骨格」は場合により部分または全部が非ペプチドであるが、ただし側鎖基は模倣体がモデルになっているペプチドのアミノ酸残基の側鎖と同一である。いくつかの型式の化学結合、例えばエステル、チオエステル、チオアミド、レトロアミド、還元されたカルボニル、ジメチレン、およびケトメチレンの結合は、一般に抗プロテアーゼペプチド模倣体を構築する際のペプチド結合に有用な置換体であることが当分野で判っている。
【００８１】
以下の記述は、ペプチドおよびタンパク質の模倣体を製造する方法であり、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基の位置で、およびまたは該ペプチド中の１以上のアミド結合を非アミド結合に変更する修飾がなされる。２以上のこのような修飾を１個のペプチド模倣体構造の中に重ねること(例えば、このペプチドにおいてＣ末端カルボキシル基で修飾および二つのアミノ酸の間に-CH2-カルバメート結合を挿入)ができる点が了解される。Ｎ末端修飾のためには、通常はペプチドを遊離酸としてごうせいするが、上記したようにアミドまたはエステルとして容易に製造することができる。また、ペプチド化合物のアミノおよび／またはカルボキシ末端を修飾し、本発明で有用な他の化合物に製造することができる。アミノ末端修飾には、メチル化(例えば-NHCH3または-NH(CH3)2)、アシル化、カルボベンゾイル基の付加、またはRCOO-で定義されるカルボキシレート官能基を含有する封鎖剤でアミノ基を封鎖、が挙げられる。ここでRはナフチル、アクリジニル、ステロイジルおよび類似の基からなる群から選択される。カルボキシ末端修飾には、遊離酸をカルバミド基で置換する、あるいはカルボキシ末端で環状ラクタムを形成して構造的に封入する、が挙げられる。アミノ末端修飾は上記のごとく例えば、アルキル化、アセチル化、カルボベンゾイル基付加、コハク酸イミド基形成、等が挙げられる。末端アミノ基を反応させて以下を形成することができる。
【００８２】
(a)     式RC(O)NH-のアミド基が形成される。ここでRは上記定義のごとく酸ハライド(例えばRC(O)Cl)または酸無水物との反応による。約等モルまたは過剰量(例えば約５等量)の酸ハライドを好ましくは過剰量（例えば約10等量）の3級アミン、例えばジイソプロピルエチルアミンを含有する不活性希釈液(例えばジクロロメタン)中でペプチドに接触させ、反応中に生成する酸を除去することにより反応を実行することができる。反応条件は通常通り(例えば室温30分間)である。末端アミノをアルキル化して低級アルキルN置換体を得、次に上記のごとく酸ハライドと反応させれば、式RC(O)NR-のNアルキルアミド基が得られる。
【００８３】
(b)     コハク酸無水物と反応させてコハク酸イミド基が形成される。前と同様に約等モル量または過剰量(例えば約５等量)の無水コハク酸を使用し、当分野で公知の方法、例えば適当な不活性溶媒(例えばジクロロメタン)中に過剰量（例えば約10等量）の3級アミン、例えばジイソプロピルエチルアミンを使用することによりアミノ基をコハク酸イミドに変化することができる(例えばWollenbergら、米国特許番号4,612,132参照、本明細書に参考として編入)。コハク酸基を、例えば常法で製造されるC2〜C6アルキル置換基または-SR置換基で置換することにより、ペプチドのＮ末端に置換されたコハク酸イミドが得られる。これらアルキル置換基は、Wollenbergらの記載方法（米国特許番号4,612,132）で低級オレフィン（C2〜C6）と無水マレイン酸との反応により製造される。-SR置換基は、RSHと無水マレイン酸との反応により製造され、Rは前記定義のごとくである。
【００８４】
(c)     約等モルまたは過剰量のCBZ-Cl(例えばベンジルオキシカルボニルクロライド)または置換されたCBZ-Clを好ましくは3級アミンを含有する適当な不活性希釈液(例えばジクロロメタン)中で反応させ、反応中に生成する酸を除去することにより、ベンジルオキシカルボニル-NH-または置換されたベンジルオキシカルボニル-NH-基が形成される。
【００８５】
(d)     等モルまたは過剰量(例えば約５等量)のR-S(O)2Clと適当な不活性希釈液(ジクロロメタン)中で反応させて末端アミンをスルフォナマイドに変換することにより、スルフォナマイド基が形成され、Rは前記定義のごとくである。好ましくは不活性希釈液は過剰量（例えば約10等量）の3級アミン、例えばジイソプロピルエチルアミンを含有し、反応中に生成する酸を除去する。反応条件は通常通り(例えば室温30分間)である。
【００８６】
(e)  等モルまたは過剰量(例えば約５等量)のR-OC(O)ClまたはR-OC(O)OC6H4-p-NO2と適当な不活性希釈液(例えばジクロロメタン)中で反応させて末端アミンをカルバメートに変換することにより、カルバメート基が形成され、Rは前記定義のごとくである。好ましくは不活性希釈液は過剰量（例えば約10等量）の3級アミン、例えばジイソプロピルエチルアミンを含有し、反応中に生成する酸を除去する。反応条件は通常通り(例えば室温30分間)である。
【００８７】
(f)  等モルまたは過剰量(例えば約５等量)のR-N=C=Oと適当な不活性希釈液(例えばジクロロメタン)中で反応させて末端アミンをウレア(例えばRNHC(O)NH-)基に変換することにより、ウレア基が形成され、Rは前記定義のごとくである。好ましくは不活性希釈液は過剰量（例えば約10等量）の3級アミン、例えばジイソプロピルエチルアミンを含有し、反応中に生成する酸を除去する。反応条件は通常通り(例えば室温30分間)である。
【００８８】
Ｃ末端カルボキシル基をエステル(例えば-C(O)OR、ここでRは前記定義のごとし)で置換したペプチド模倣体を製造する際には、ペプチド酸を製造するのに使用した樹脂を一般に使用し、側鎖を防護したペプチドを塩基および適当なアルコール、例えばメタノールで開裂する。次に側鎖を防護している基をフッ化水素で処理して通常通り除去し、所望のエステルを得る。
【００８９】
Ｃ末端カルボキシル基をアミド-C(O)NR3R4で置換したペプチド模倣体を製造する際には、ペプチド合成用の固相担体としてベンツヒドリルアミン樹脂を使用する。合成が完了したら、フッ化水素処理して担体からペプチドを放出すれば、遊離ペプチドアミドが直接得られる(例えばＣ末端は-C(O)NH2)。あるいは、ペプチド合成の間はクロロメチル化樹脂を使用し、次にアンモニアと反応させれば側鎖防護ペプチドが担体から分離して遊離のペプチドアミドが得られ、アルキルアミンまたはジアルキルアミンと反応させれば側鎖防護アルキルアミドまたはジアルキルアミド（例えばＣ末端は-C(O)NRR1、ここでRおよびR1は前記定義のごとし）が得られる。
【００９０】
本発明の他の実施例では、生物学的活性ペプチドのＣ末端カルボキシル基またはカルボキシルエステルを誘起し、そのカルボキシル基またはエステルのそれぞれ-OHまたはエステル(-OR)をＮ末端アミノ基で分子内置換して環状化することにより、環状ペプチドが形成される。例えば、合成し分離してペプチド酸が得られた後に、この遊離酸を適当なカルボキシル基アクチベータ、例えばジクロロヘキシルカルボジイミド(DCC)により溶液中で、例えばメチレンクロライド(CH2Cl2)ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）混液中で活性化エステルに変換する。次に、活性化エステルをＮ末端アミンで分子内置換することにより環状ペプチドを形成する。分子内環化は、重合化とは反対なので、非常に希薄な溶液を使用して促進される。このような方法は当分野に公知である。
【００９１】
本発明で使用する活性ペプチドを環化したり、あるいはペプチド末端に脱アミノ残基または脱カルボキシ残基を編入したりすることにより、末端アミノまたはカルボキシル基が存在しなくなり、したがってプロテアーゼ作用の受け易さが減少し、あるいはペプチドの変形が抑制されることが可能になる。本発明ペプチド類似体および模倣体の中のＣ末端官能基には、例えばアミド、アミド低級アルキル、アミドジ(低級アルキル)、低級アルコキシ、ヒドロキシ、およびカルボキシ、およびそれらの低級エステル誘導体、およびそれらの医薬的に受容可能な塩が挙げられる。
【００９２】
本発明方法および組成物で使用するペプチドおよびタンパク質の誘導体および模倣体を製造する他の方法は、Hrubyら（Biochem J. 268(2):249-262, 1990、本明細書に参考として編入）に記載されている。これらの方法によれば、生物学的活性ペプチドは、天然ペプチドと同様な生物学的活性を有する非ペプチド性模倣体化合物の構造モデルとして役立つ。リードペプチド化合物と同等または類似の望ましい生物活性を有するか、または望ましい特性、例えば溶解性、安定性および加水分解およびタンパク質分解の受けやすさに関してリード化合物よりも好ましい活性を有する化合物を構成するための各種技法が入手可能であることを当業者は承知している（MorganおよびGainor, Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252, 1989、本明細書に参考として編入）。これらの技法には、例えばペプチド骨格をフォスフォネート、アミデート、カルバメート、スルフォナマイド、２級アミンおよび／またはNメチルアミノ酸から構成される骨格で置換することが挙げられる。
【００９３】
1以上のペプチジル結合(-C(O)NH-)を-CH2-カルバメート結合、フォスフォネート結合、-CH2-スルフォナミド結合、ウレア結合、2級アミン(-CH2NH-)結合、およびアルキル化ペプチジル結合(-C(O)NR6-、ここでR6は低級アルキル)等の結合によって置換したペプチドおよびタンパク質の模倣体は、例えば、通常のペプチド合成の過程の適当な時点で適切に保護されたアミノ酸類似体をアミノ酸試薬に単に置換することにより製造される。適当な試薬には、例えばアミノ酸のカルボキシル基を上記結合の一つを形成するのに適切な成分で置換したアミノ酸類似体が挙げられる。例えばペプチドの-C(O)NR-結合を-CH2-カルバメート結合(-ＣＨ2OC(O)NR-)で置換したい場合には、適切に保護されたアミノ酸のカルボキシル(-COOH)基を先ず-CH2OH基に還元し、次にこれを常法により-OC(O)Cl官能基またはp-ニトロカルボネート-OC(O)O-C6H4-NONONONONOp-2官能基に変換する。これら官能基の一方を固相担体上に部分的に作成したペプチドの遊離アミンまたはアルキル化アミンと反応させると、-CＨ2OC(O)NR-結合が形成される。このような-CH2-カルバメート結合の形成についての更に詳細な記述は、例えばChoら（Science 261:1303-1305, 1993、本明細書に参考として編入）を参照。
【００９４】
活性ペプチドのアミド結合を-CH2-スルフォナミド結合で置換するには、適切に保護されたアミノ酸のカルボキシル(-COOH)基を-CH2OH基に還元することによって達成され、次にこのヒドロキシル基を適切な脱離基、例えばトシル基に常法により変換する。この誘導体を例えばチオ酢酸と反応させ、次に加水分解および酸化的塩素化を行うと、-CH2-S(O)2Cl官能基が得られるので、これによって適切に保護したアミノ酸のカルボキシル基を置換する。この適切に保護したアミノ酸類似体をペプチド合成において使用すると,-CH2S(O)2NR-結合が導入され、この結合によりペプチドのアミド結合が置換されてペプチド模倣体が得られる。アミノ酸のカルボキシル基をCH2-S(O)2Cl基に変換することについての更に完全な記載は、例えばWeinsteinおよびBoris（Chemistry & Biochemistry of Amino Acids, Peptides, Vol. 7, pp. 267-357, Marcel Dekker, Inc., New York, 1983、本明細書に参考として編入）を参照。活性ペプチドのアミド結合をウレア結合で置換するには、例えば米国特許出願シリアル番号08/147,805(本明細書に参考として編入)に記載の方法で達成することができる。
【００９５】
-CH2NH-結合によってペプチドのアミド結合を置換した2級アミン結合は、アミド結合のカルボニル結合を常法によりCH2基に還元し、適切に保護したジペプチド類似体を使用することにより製造することができる。例えば、ジグリシンの場合、アミドをアミンに還元すると、脱保護後にH2NCH2CH2NHCH2COOHが得られ、次にこれをN保護の形で次の結合反応において使用する。このような類似体をジペプチドのアミド結合のカルボニル基を還元することにより製造するのは、当分野で公知である。
【００９６】
本発明の生物学的活性ペプチドおよびタンパク質剤は単量体の形で存在してもよく、この場合にはシステイン残基のチオール基によって形成されるジスルフィッド結合は存在しない、ただし対象ペプチドではその結合は存在しているかもしれない。あるいは、２以上のペプチド上にシステインのチオール基があってそれらの間で分子間ジスルフィッドが形成されれば、多量体(例えば、二量体、四量体あるいはより高い少量体)化合物が得られる。そのようなペプチドのある種のものは、システインまたはホモシステイン残基の硫黄が脱離基に代わって置換することにより環化または二量体化することができる(例えば、Barkerら、J. Med. Chem. 35:2040-2048, 1992；および Orら、J. Org. Chem. 56:3146-3149, 1991、それぞれ本明細書に参考として編入)。したがって、1以上の天然システイン残基をホモシステインで置換してもよい。活性ペプチドの分子内または分子間ジスルフィッド誘導体から、それらの硫黄の一つを-CH2-または硫黄の他の等量体で置換した類似体が得られる。これら類似体は当分野に公知の方法により分子内または分子間置換を経由して製造することができる。
【００９７】
天然起源、組換え、および合成のペプチド、およびそのペプチドとタンパク質の類似体および模倣体であって、本発明で有用な薬剤であると同定されたものは全て、これらをスクリーニング(例えばキットおよび／またはスクリーニング測定法における)に使用した場合に、別の化合物、例えば他のペプチド、タンパク質、類似体および模倣体を本発明方法および組成物で機能するもの、例えば膜付着タンパク質間の同型および異型結合を阻害し、上皮の透過性を高めるものとして同定することができる。近年、いくつかの自己接合測定法が開発され、何万という化合物のスクリーニングが短時間で可能である（Fodorら、Science 251:767-773, 1991, および米国特許番号5,677,195; 5,885,837; 5,902,723; 6,027,880; 6,040,193;および6,124,102, Fodorらに特許、それぞれ本明細書に参考として編入）。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーがコード化された合成ライブラリー(ESL)によって構築することができ、このライブラリーは例えばWO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/35503, およびWO 95/30642（それぞれ本明細書に参考として編入）に記載されている。ペプチドライブラリーもファージのタンパク質展示法（Devlin, W0 91/18980、本明細書に参考として編入）により作成することができる。化学的多様性ライブラリーおよびスクリーニング方法を記述した他の多くの刊行物も当分野の状態を反映するものと考えられるので、本発明の態様に属し、本明細書に広く編入する。
【００９８】
本発明で使用する新しい生物学的活性剤(例えば小分子薬物ペプチド模倣体)のためのスクリーニング方法では、活性ペプチドを発現する組換え体DNA分子を安定に形質転換した真核または原核細胞が利用される。生存または固定の形態でのそれら細胞は標準的な測定法、例えばリガンド/受容体結合測定法に使用することができる（例えば、Parceら、Science 246:243-247, 1989；およびOwickiら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4007-4011, 1990、それぞれ本明細書に参考として編入）。特に有用な測定法は競合測定法であり、例えばペプチドリガンドへの結合親和性が判っている標識受容体または抗体ならびに結合親和性を測定すべきテスト化合物または試料に細胞を接触させインキュベートする。次に標識結合成分と標識遊離成分とを分離し、リガンド結合の程度を測定する。結合したテスト化合物の量は、既知ソースに結合している標識受容体の量に反比例する。多数の技法の中の任意の一つを使用すれば遊離リガンドから結合リガンドが分離され、リガンド結合の程度を測定することができる。この分離段階では通常の操作、例えば濾紙に付着させて洗浄する、プラスチックに付着させて洗浄する、あるいは細胞膜を遠心分離するといった操作を含めることができる。
【００９９】
本発明での薬物スクリーニングのための別の技法では、標的分子、例えばHLA-E分子、HLA-Eペプチド複合体、あるいはHLA-E/ペプチド/CD94/NKG2受容体複合体への結合親和性が適切な化合物を高処理スクリーニングするアプローチが関係しており、Geysenヨーロッパ特許出願84/03564, 公開日1984年9月13日(本明細書に参考として編入)に詳細に記述されている。最初に、多数の異なるテスト化合物、例えば小ペプチドを固相基質上、例えばプラスチックピンまたは何か他の適切な表面上に合成する（Fodorら、Science 251:767-773, 1991；および 米国特許番号5,677,195； 5,885,837； 5,902,723； 6,027,880； 6,040,193； および 6,124,102, Fodorらに特許.）。次に全てのピンを本発明の溶解したペプチド剤と反応させ、洗浄する。その次の段階では結合ペプチドを検出する。
【０１００】
合理的な薬物デザインを、生物学的活性ペプチドの分子型に関する構造的研究に基礎を置き、それを本発明方法で実施することに決定してもよい。ペプチドの構造的特徴を特性化し、マッピングし、翻訳し、再生産することにより新しいペプチド模倣体を製造し選択する指針とする各種の方法、例えばX線結晶法および二次元NMR法が入手可能であり、当分野で公知である。これらの方法により、分子接触領域から選別した特異性および活性に必要なペプチドにはどんなアミノ酸残基が存在するかを合理的に予測することが可能になる（例えばBlundellおよびJohnson, Protein Crystallography, Academic Press, N.Y., 1976、本明細書に参考として編入）。
【０１０１】
本明細書に開示した起炎症性または抗炎症性結合性ペプチドの使用可能な類似体および模倣体が保持する活性は、天然ペプチドに比較して、部分、完全またはより向上している。これに関し、本発明で使用する類似体および模倣体が保持する１以上の選択した活性は、選択した天然ペプチドまたは非修飾化合物について観察した同一の活性に比較して、少なくとも50％、時折75％、および95％以下〜100％以上のレベルである。変異したペプチド性または非ペプチド性模倣体の生物学的特性は本明細書に開示または編入した適当な測定法により決定することができる。
【０１０２】
本明細書の記述に従えば、本発明化合物は、起炎症性または抗炎症性結合性ペプチド、HLA-E分子、およびCD94/NKG2受容体の性質と機能を分析するための特異なツールとしてin vitroで有用であり、したがって粘膜上皮透過性を上昇し粘膜薬物運搬を容易にする別のペプチド性および非ペプチド性薬物(例えば小分子薬物)をデザインする各種プログラムのリードとしても役立つ。
【０１０３】
更に、本明細書に開示の起炎症性または抗炎症性結合性ペプチド、類似体および模倣体は、免疫原または免疫原成分として有用である。すなわちそれを使用して有用な抗体および関連薬剤を作成し、例えば起炎症性結合性ペプチドのHLA-E結合を封鎖して自己免疫または炎症の症状を緩和し、あるいは腫瘍細胞またはウイルス感染細胞に対するNKおよびCTLの応答を惹起する。後者に関して、例えば腫瘍関連抗原またはウイルス関連抗原に結合する抗体または抗体断片が腫瘍またはウイルスの標的因子に結合することにより、腫瘍またはウイルス感染の細胞または組織への該抗体の局在化が容易になる。
【０１０４】
したがって、本発明ペプチドは、免疫原として、典型的には複合体(例えば、多量体ペプチド、あるいはペプチド/担体またはペプチド/ハプテン複合体)の形態で投与されて抗体を作成する。その抗体は免疫性ペプチドまたは免疫性複合体に高度のアフィニティーまたはアビディティーをもって結合するが、関係のないペプチドを同様に認識することはない。
【０１０５】
これに関連してまた本発明は、起炎症性または抗炎症性結合性ペプチドに対向する診断用および治療用の抗体、例えばモノクロナール抗体を提供する。この抗体はペプチドと例えばHLA-E分子の間の相互作用に係わるペプチドの機能的部分を特異的に認識する。これら免疫治療剤には、例えばヒト化抗体が挙げられ、本明細書に開示した別の活性または不活性成分、例えば通常の医薬的に受容可能な担体または希釈剤、例えば免疫原アジュバント、および任意ではあるが付加的なまたはコンビナトリアルに活性な薬剤、例えば抗レトロウイルス剤と組み合わせて治療に使用することができる。機能的な抗体、例えばヒト化抗体、抗体断片、および他の関連薬剤を作成する方法は当分野で公知である（例えばHarlowおよびLane, Antibodies, A Laboratory Manual, CSHP, NY, 1988； Queenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989；および WO 90/07861参照、それぞれ本明細書に参考として編入）。
【０１０６】
ヒト化形マウス抗体は、組換えDNA技術によって非ヒト抗体のCDR領域をヒト定常領域に結合することにより作成することができる（例えばQueenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989 および WO 90/07861参照、それぞれ本明細書に参考として編入）。ヒト抗体はファージ展示法（例えばDowerら、WO 91/17271； McCafferty ら、WO 92/01047参照、それぞれ本明細書に参考として編入）を使用して得ることができる。これらの方法において、作成されているファージのライブラリーでは、メンバーがそれぞれの外表面にさまざまな抗体を展示している。抗体は通常FvまたはFab断片として展示されている。所望の特異性を持ったファージ展示抗体は、ヒトのシトクロームP450またはその断片に対する親和性の豊かさによって選択する。ヒト抗体は、競合的結合実験によるか、さもなければ特定のマウス抗体と同一の抗原決定基特異性を有するように選択する。
【０１０７】
本発明は更に上記の完全抗体の断片を提供する。一般にこれらの断片は、それらの由来元の完全抗体と競合してHLAに特異結合する。抗体断片には、例えば分離重鎖、軽鎖Fab、Fab’F(ab’)2、Fv、および単鎖抗体が挙げられる。断片は完全免疫グロブリンを酵素的または化学的に分離して製造することができる。例えば、F(ab’)2断片は、標準的な方法、例えば前記HarlowおよびLaneに記載の方法を使用し、pH3.0〜3.5にてペプシンでのタンパク質分解消化によりIgG分子から得ることができる。Fab断片は、F(ab’)2断片から限定還元により、あるいはホールの抗体から還元剤の存在下パパインでの消化により得てもよい。断片は組換えDNA技術によっても製造することができる。選択した断片をコードする核酸のセグメントも、全長をコードする配列を制限酵素で消化することにより、あるいはデノボ合成により製造することができる。時折、断片ハファージコート融合タンパク質の形態で発現される。この発現方法は抗体の親和性を鋭利にするのに有利である。
【０１０８】
本発明抗体を組換え技術により製造するために、任意に定常領域に結合させた軽鎖および重鎖の可変領域をコードする核酸を発現ベクターの中に挿入する。この軽鎖および重鎖は同一または別々の発現ベクターでクローン化することができる。抗体の鎖をコードするDNAセグメントを操作して、これを発現ベクター中の制御配列に結合し、抗体の鎖の発現を確実にする。このような制御配列には、例えばシグナル配列、プロモータ、エンハンサー、および転写終結配列が挙げられる。発現ベクターは一般に宿主微生物中でエピソームとしてまたは宿主の染色体の組込み部分として複製可能である。大腸菌は原核宿主の一つであり、本発明抗体を発現させるのに特に有用である。使用に適する他の細菌宿主には、バチリス属、例えば枯草菌、および他の腸内細菌、例えばサルモネラ、セラチアおよびシュードモナス種が挙げられる。これらの原核宿主で製造することができる発現ベクターには、一般にその宿主細胞に適した発現制御配列(例えば複製起点)および調節配列、例えばラクトースプロモータ系、トリプトファン(trp) プロモータ系、βラクタマーゼプロモータ系、あるいはファージラムダ由来のプロモータ系が含有されている。他の細菌、例えば酵母も発現に使用してよい。サッカロミセスは好ましい宿主であり、適切なベクターには発現制御配列、例えば3-フォスフォグリセレートキナーゼまたの解糖酵素を含むプロモータ、および複製起点、終結配列、等が存在する。
【０１０９】
哺乳動物の組織細胞培養を使用することによっても本発明抗体を発現し製造することができる(例えばWinnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., 1987参照、本明細書に参考として編入)。真核細胞は、完全抗体を分泌することができる多数の適切な宿主細胞株が開発されているので好ましい。本発明免疫グロブリンをコードする核酸を発現するのに好ましい適切な宿主細胞には、例えばSV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)で形質転換したモンキーキドニーCV1株、ヒトのエンブリオニックキドニー株(293)（Grahamら、J. Gen. Virol. 36:59, 1977、本明細書に参考として編入）、ベイビーハムスターキドニー細胞（BHK, ATCC CCL 10）、チャイニーズハムスターオバリー細胞-DHFR（CHO, Urlaubおよび Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980、本明細書に参考として編入）、マウスセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980、本明細書に参考として編入）、モンキーキドニー細胞（CV1 ATCC CCL 70）、アフリカグリーンモンキーキドニー細胞（VERO-76, ATCC CRL 1587）、ヒトの頚部癌細胞（HELA, ATCC CCL 2）、イヌのキドニー細胞（MDCK, ATCC CCL 34）、バッファローラットリバー細胞（BRL 3A, ATCC CRL 1442）、ヒトの肺細胞（W138, ATCC CCL 75）、ヒトの肝細胞（Hep G2, HB 8065）、マウス乳腺腫（MMT 060562, ATCC CCL51）、およびTRI細胞（Matherら、 Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-46, 1982、本明細書に参考として編入）、およびバキュロウイルス細胞、が挙げられる。
【０１１０】
問題のポリヌクレオチド配列(例えば重鎖および軽鎖をコードする配列および発現制御配列)を含有するベクターは、宿主細胞に移入することができる。原核細胞には塩化カルシウム形質転換が通常利用されるが、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理または電気穿孔が使用される (例えばSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989、本明細書に参考として編入)。重鎖および軽鎖を別々の発現ベクター上でクローン化する場合は、それらベクターを一緒に形質転換することにより、完全な免疫グロブリンが発現および組み立てられるようにする。組換え体DNAを導入後、免疫グロブリン体を発現する細胞株を選択する。安定した発現が可能な細胞株(例えば細胞株が50継代した後でも発現レベルが消滅していない)が好ましい。
【０１１１】
いったん発現したら、本発明のホールの抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、あるいは他の免疫グロブリンを当分野の標準的な操作、例えば硫酸アンモニウム沈降、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等に従って精製することができる（Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982、本明細書に参考として編入）。少なくとも約90〜95％の同質性を持った実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましい、98〜99%以上の同質性は最も好ましい。
【０１１２】
本発明起炎症性または抗炎症性結合性ペプチドは、前記のごとく薬物スクリーニングのための組成物および操作において使用することにより、HLA-E、HLA-E/ペプチド複合体、またはHLA-E/ペプチド/CD94/NKG2受容体複合体に結合親和性を有する別の化合物を同定し、および／またはHLA-Eが介入するCD94/NKG2受容体との防護的相互作用に対しアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し、したがって本明細書に記載の免疫調節剤として機能することができる。各種のスクリーニングの方法およびフォーマットが入手可能であり当分野で公知である。その後に生物学的測定法を利用すれば、選択した化合物が本発明に有用な結合活性または他の所望の活性を本来的に有するかどうかを決定することができる。その測定では、本発明化合物は修飾せずに使用できるし、あるいは多様に修飾して、例えば標識し、例えば共有結合または非共有結合により或る成分を加入して直接または間接に検出可能なシグナルを得る。直接標識が可能なものには、標識基、例えば放射ラベル、酵素、例えばパーオキシダーゼおよびアルカリフォスファターゼ(例えば米国特許番号3,645,090；および米国特許番号3,940,475参照、それぞれ本明細書に参考として編入)および蛍光ラベルが挙げられる。間接標識が可能なものには、例えば構成物の一つをビオチニル化し、次に上記の標識基の一つに結合させておいたアビジンにこれを結合するのが挙げられる。化合物を固相担体に接合させる場合には化合物にスペーサーあるいはリンカーを含有させてもよい。
【０１１３】
本発明起炎症性または抗炎症性結合性ペプチドは、HLA-EおよびCD94/NKG2細胞受容体複合体へのそれらの結合能に基づいて、生細胞、固定細胞上、生物学的液体中、組織ホモジネート中、精製した天然の生物学的物質中、等のHLA-E分子の検出および／または定量の試薬として使用することもできる。例えば、それらペプチドを標識すれば、HLA-E分子を表面上に有する細胞を同定および／または定量することができる。更に、起炎症性または抗炎症性結合性ペプチドは、それらの更に詳細な活性に基づいて使用すれば、他のHLA-E結合性ペプチドおよびCD94/NKG2細胞受容体の存在および活性を定量することができる。本発明ペプチドは、in situの染色、FACS(蛍光活性化細胞ソート)、ウエスタンブロット、ELISA等に使用することができる。更に、本発明ペプチドは、HLA-EおよびCD94/NKG2細胞受容体の精製、あるいはHLA-E発現細胞の精製に使用することができる。
【０１１４】
本発明起炎症性または抗炎症性結合性ペプチドは、各種の医療研究および診断用途のための市販試薬としても利用することができる。そのような用途には、例えば(1)HLA-E、他のHLA-E結合性ペプチド、およびまたはCD94/NKG2細胞受容体の存在または活性を定量するための検量標準としての用途、(2)共結晶化を経由してHLA-EおよびCD94/NKG2細胞受容体の構造解析をする用途、および(3)HLA-E/ペプチド/CD94/NKG2細胞の結合および活性化のメカニズムを研究する用途、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本発明の別の態様として、対象ペプチドは、NK、CTL、またはTヘルパー細胞の応答を誘起することができる少なくとも１の抗原決定基を含有する配列に結合することによって、その免疫調節活性を増大させることができる。例えば、これに関連する複合体によって、起炎症性結合性ペプチドおよび１以上の別個のまたは重なり合うCTL抗原決定基を特定してもよい。あるいは、このようなコンビナトリアルに活性なペプチド/抗原決定基を「カクテル」として組み合わせることにより、NKまたはCTLの応答を引き出す免疫原性を増大させることができる。ペプチドはまた、別のMHC制限要素を有するペプチドと組み合わせることができる。そのような組成物を使用すれば、本発明の治療、防疫、または診断の方法と組成物が提供する免疫的範囲が多くの人々の間に効果的に拡大することができる。
【０１１６】
本発明ペプチドは、結合を介する組み合わせにより重合体(多量体)を形成することができるし、あるいは結合させずに混合物として組成物中に配合することができる。同一のペプチドを相互に結合した場合には抗原決定基の複数の繰り返し単位を持ったホモ重合体が形成される。ホモまたはヘテロ重合体のための、あるいは担体に結合するための結合は、各種の方法で得ることができる。例えば、システイン残基はアミノ末端およびカルボキシ末端の両方で付加することができるので、この場合にはシステイン残基の酸化を制御しながらペプチドを共有結合で結合する。多数のヘテロ二官能基試薬、例えばN-サクシジミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP) も有用であり、これらは一方の官能基末端でジスルフィッド結合を形成し、他方の末端でペプチド結合を形成する。この試薬は、一方のタンパク質のシステイン残基との間でジスルフィッド結合を形成し、かつ別のタンパク質にあるリジン上のアミノ基または他の遊離アミノ基を介してアミド結合を形成する。各種のこのようなジスルフィッド/アミド形成剤は公知であり、例えば、Immun. Rev. 62:185 (1982)参照。他の二官能基性結合剤はジスルフィッド結合よりもむしろチオエーテル結合を形成する。これらのチオエーテル形成剤の多くは市販品として入手可能であり、例えば6-マレイミドカプロン酸、2-ブロモ酢酸、2-ヨード酢酸、4-(N-マレイミド-メチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸等の反応性エステルが挙げられる。カルボキシル基はコハク酸イミドまたは1-ヒドロキシ-2-ニトロ-4-スルフォン酸ナトリウム塩と組み合わせると活性化させることができる。特に好ましい結合剤は、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)等である。もちろん、結合によって結合した基の機能が実質的に妨害されてはならないことは了解される。
【０１１７】
好ましい実施例では、本発明起炎症性または抗炎症性結合性ペプチドはスペーサー分子によって他のペプチドに結合する。スペーサーは一般に比較的小さな中性分子、例えばアミノ酸またはアミノ酸模倣体であって、生理的な条件下で実質的に帯電せずまた直線状または分枝状の側鎖を有するものから構成されル。一般にスペーサーは、例えばAla、Gly、または非極性アミノ酸または中性の極性アミノ酸からなる他の中性スペーサーから選択される。本明細書のある好ましい実施例では中性スペーサーはAlaである。任意に存在する場合にはそのスペーサーは同一の残基だけから構成されている必要はないので、ヘテロオリゴマーであってもホモオリゴマーであってもよい。しかし好ましい例でのスペーサーはAlaのホモオリゴマーである。スペーサーとして存在する場合は一般的には少なくとも１または２残基であり、更に一般的には３〜６残基である。
【０１１８】
送達ビヒクルおよび方法
本発明のある態様では、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは、担体または基剤として機能する生体適合性ポリマーを含有する製剤で投与する。このようなポリマー担体には、ポリマー形態の中でもとりわけ、ポリマーの粉末、マトリックスまたは微粒子送達ビヒクルが挙げられる。当該ポリマーには、植物、動物または合成物由来が可能である。しばしば、当該ポリマーは架橋している。さらに、これらの送達システムでは、ペプチドに官能基を付けることによって、ポリマーに共有結合で結合することが可能となり、簡単な洗浄ではポリマーから分離しなくすることができる。他の実施態様では、ポリマーは、生物学的活性剤および/または送達増強剤を分解または不活性化すると思われる酵素または他の物質の阻害剤で化学修飾する。
【０１１９】
生分解性ポリマーを基礎とする薬物送達系は、多くの生物医学的用途において好ましい。理由は、この送達系は加水分解または酵素的反応によって非毒性分子に分解されるためである。分解速度は、生分解性ポリマーマトリックスの組成を操作することによって制御する。そのため、この種の送達系は、一定の設定条件で生物学的活性剤の長期放出に使用できる。ポリ(グリコール酸)（PGA）、ポリ-(乳酸)（PLA）およびポリ(D,L-乳酸-コグリコール酸)（PLGA）などの生分解性ポリマーが、可能な薬物送達担体としてかなり注目されており、その理由はこれらポリマーの分解生成物は低毒性であることが認められたからである。身体の代謝機能が正常である間は、これらのポリマーは、二酸化炭素と水に分解する（Mehta ら、J.Control.Rel. 29; 375-384, 1994）。これらのポリマーも、優れた生体適合性を呈する。
【０１２０】
起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドの生体活性を長期化するためには、それらをポリオルソエステル、酸無水物またはポリエステルなどのポリマーマトリックスに配合するのがよい。これによって活性剤の活性および放出が持続するが、これは例えばポリマーマトリックスの分解によって左右される（Heller, Formulation and Delivery of Proteins and Peptides, pp.292-305, Clelandら、編, ACSシンポジウムシリーズ  567, Washington DC, 1994； Tabata ら、 Pharm. Res. 10: 487-496、 1993； Cohenら、Pharm. Res. 8: 713-720, 1991, それぞれ本明細書に参考として編入）。生物学的治療分子を合成ポリマー内にカプセル化すれば、貯蔵および送達中でもそれらを安定にしておくことができるが、ポリマー系放出技術の最大の障害は、熱、超音波処理または有機溶媒が関与する配合工程中に治療分子がしばしば活性損失することである（Tabataら、 Pharm.Res.10: 487-496；Jones ら、 Drug Targeting and Delivery Series, New Delivery Systems for Recombinant Proteins-Practical Issues from Proof of Concept to Clinic, Vol.4, pp.57-67； Leeら、編, Harwood Academic Publishers, 1995）。
【０１２１】
本発明での使用に適したポリマーは、単独でも、選択した生物学的活性剤及び粘膜製剤の追加成分との併用でも安定でなければならず、約pH1〜pH10のpH条件範囲で安定なヒドロゲルを形成するのが望ましい。さらに典型的には、保護コーティングを追加しなくても、約3〜9の範囲のpH条件下で安定にポリマーを形成するのが望ましい。しかし、望ましい安定性は、標的送達部位（例、鼻粘膜または二次的送達部位、例えば全身循環）に特有の生理的パラメーターに適応させるのがよい。そのため、数種類の配合品で、特定pHと選択した化学的または生物学的環境において、安定性が高めであったり、低めであったりするのが、さらに望ましくなる。
【０１２２】
本発明の吸収促進ポリマーには、以下のビニルポリマーの各種配合によるホモおよびコポリマーの群からのポリマーが含有されてよい。すなわち、アクリルおよびメタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレートまたはメタクリレート、ビニルピロリドン、並びに、ポリビニルアルコールおよびそのコおよびターポリマー、ポリビニルアセテート、その、上記モノマーとのコポリマーおよびターポリマー、および2-アクリルアミド-2-メチル-プロパンスルフォン酸（AMPS（登録商標））。非常に有用なのは、コポリマー化可能な官能モノマーとの上記モノマーのコポリマーで、例えばアクリル、またはメタクリルアミドアクリレートまたは、エステル基を直鎖または枝分かれ鎖アルキル、炭素1〜6個のアルキル置換体を含有できる4個までの芳香環を持つアリールから誘導するメタクリルレートエステル; ステロイド、サルフェート、フォスフェートまたは陽イオンモノマー、例えばN,N-ジメチルアミノアルキル(メト)アクリルアミド、ジメチルアミノアルキル(メト)アクリレート、塩化（メト）アクリロキシアルキルトリメチルアンモニウム、塩化（メト）アクリロキシアルキルジメチルベンジルアンモニウムなどである。
【０１２３】
本発明で使用する別の吸収促進ポリマーは、デキストラン、デキストリンとして分類されるもの、また、天然ガムおよび樹脂として分類される材料クラスに由来するもの、あるいは、天然ポリマークラスに由来するもの、例えば加工コラーゲン、キチン、キトサン、プララン、ズーグラン、アルギネート、修飾アルギネート、例えば「ケルコロイド」(ポリエチレングリコール修飾アルギネート)など、「ケロコゲル」などのジェランガム、「ケルトロール」などのキサナタンガム、エラスチン、α-ヒドロキシブチレートおよびそのコポリマー、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリ乳酸およびグリコール酸などである。
【０１２４】
本発明で適用可能な、非常に有用なポリマークラスは、少なくとも1個の活性化炭素-炭素オレフィン二重結合、および少なくとも1個のカルボキシル基を含有するオレフィン不飽和カルボン酸、即ち、カルボキシル基に対してα-β位で、あるいは、末端メチレン基団の一部として、モノマー分子中に存在するために、重合の際に容易に機能するオレフィン二重結合を含む酸に容易に転化できる酸または官能基である。このクラスのオレフィン不飽和酸には、アクリル酸自体、α-シアノアクリル酸、βメチルアクリル酸（クロトン酸）、α-フェニルアクリル酸、β-アクリロキシプロピオン酸を代表とするアクリル酸、桂皮酸、ｐ-クロロ桂皮酸、1-カルボキシ-4-フェニルブタジエン-1,3、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、グルタコン酸、アコニット酸、マレイン酸、フマル酸およびトリカルボキシエチレンなどの材料がある。「カルボン酸」という用語は、本明細書で使用するごとく、ポリカルボン酸および、無水マレイン酸などのその酸無水物を含み、その場合、無水物（アンハイドライド）基は、同一カルボン酸分子上に位置する2個のカルボキシル基からの水分子1個の脱離によって形成される。
【０１２５】
本発明で吸収促進剤として有用な代表的アクリレートには、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸ブチル、アクリル酸イソブチル、メタクリル酸メチル、エタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、アクリル酸オクチル、アクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸2-エチルヘキシル、アクリル酸ノニル、アクリル酸ヘキシル、メタクリル酸n-ヘキシルなどがある。高級アルキルアクリル酸エステルは、アクリル酸デシル、メタクリル酸イソデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸ベヘニルおよびアクリル酸メリシルおよびそれらのメタクリレート版である。2個または3個以上の長鎖アクリル酸エステルの混合物は、カルボキシルモノマーの1種類との重合に成功することができる。その他のコモノマーには、α-オレフィンを含めたオレフィン、ビニルエステルおよびそれらの混合物がある。
【０１２６】
なおも別の有用な吸収促進剤は、2〜18個の炭素原子、好ましくは2〜8個の炭素原子を含有するα-オレフィン;4〜10個の炭素原子を含有するジエン;酢酸ビニルなどのビニルエステルおよびアリルエステル;スチレン、メチルスチレンおよびクロロスチレンなどのビニル芳香族化合物;ビニルメチルエーテルおよびメチルビニルケトンなどのビニルおよびアリルエーテルおよびケトン;クロロアクリレート;α-シアノメチルアクリレートおよびα-、β-およびγ-シアノプロピルアクリレートなどのシアノアルキルアクリレート;メトキシエチルアクリレートなどのアルコキシアクリレート;クロロエチルアクリレートなどのハロアクリレート;ビニルハライドおよび塩化ビニル、塩化ビニリデンなど; ジビニル、ジアクリレートおよび他の多官能モノマー、例えばジビニルエーテル、ジエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、メチレン-ビス-アクリルアミド、アリルペンタエリスリトールなど;およびビス(β-ハロアルキル)アルケニルフォスフォネート、例えばビス(β-クロロエチル)ビニルフォスフォネートなどが、当業者に公知である。カルボキシ含有モノマーが少量成分であり、他のビニリジンモノマーが主要成分として存在するコポリマーは、本明細書に開示する方法に従うと調製が容易である。
【０１２７】
さらなる関連態様では、多重リガンド共役ペプチド複合体が提供される。これに含有される起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは共有結合でトリグリセリド骨格成分および少なくとも1個の脂肪酸成分と結合しており、トリグリセリド骨格成分にはトリグリセリド骨格成分の炭素原子に結合したポリアルキレングリコールスペーサー基を介して結合し、そのトリグリセリド骨格成分の炭素原子には脂肪酸成分が直接に共有結合で結合するかまたは別のポリアルキグリコールスペーサー成分を介して共有結合で結合している（例えば米国特許No.5,681,811参照、本明細書に参考として編入）。前記の多重リガンド共役治療薬複合体では、トリグリセリド生体活性成分のα’およびβ炭素原子には、脂肪酸が共有結合で直接に結合するか、またはポリアルキレングリコールスペーサー成分を介して共有結合で間接に結合していればよい。別法として、脂肪酸成分をトリグリセリド骨格成分のαおよびα’炭素に直接またはポリアルキレングリコールスペーサー成分を介して共有結合で結合させ、同時に生体活性治療薬をそのトリグリセリド骨格成分のγ-炭素と共有結合で結合させ、この場合も共有結合で直接に結合させるか、またはポリアルキレンスペーサー成分を介して間接的に結合させればよい。トリグリセリド骨格成分を含むポリリガンド共役治療薬複合体には多様な構造、組成および配座の形態が本発明の範囲内で可能であると認められる。さらに留意されることとして、前記多重リガンド共役治療薬複合体では、生物学的活性剤は、本発明の範囲内でアルキルスペーサー基を介して、もしくは他の受容可能なスペーサー基を介してトリグリセリド修飾骨格成分と共有結合で結合させればよい点が有利である。ここで使用しているスペーサー基の受容可能とは、立体的、組成的、かつ最終用途を特定した受容可能性を指す。
【０１２８】
本発明の更に別の態様では、共役により安定化した複合体が提供される。これにはポリソルベート成分を含有するポリソルベート複合体が挙げられ、例えばトリグリセリド骨格のα、α’およびβ炭素原子に機能的な基、例えば (i)脂肪酸基;および(ii)ポリエチレングリコール基が共有結合で結合しており、そのポリエチレングリコール基に起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドが共有結合で結合しちる、例えばポリエチレングリコール基の適当な官能基に結合している（例えば、米国特許No. 5,681,811参照、本明細書に参考として編入）。ここでの共有結合は、例えばポリエチレングリコール基のヒドロキシ末端官能基に直接的であってもよいし、あるいはその共有結合は間接的であってもよく、例えば、ポリエチレングリコール基のヒドロキシ末端官能基をスペーサー基の末端カルボキシ官能基で反応的にキャッピングし、得られるキャッピングされたポリエチレングリコール基の末端カルボキシ基に起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドを共有結合で結合してもよい。
【０１２９】
リポソームおよびミセル送達ビヒクル
本発明の適切な投与法とコンビナトリアルな配合品では、任意ではあるが有効な脂質または脂肪酸系担体、加工用助剤または送達ビヒクルが編入され、それにより起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドの送達が改善される。例えば、粘膜送達には様々な配合品と方法が提供され、それに含まれる1以上の起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは、リポソーム、混合ミセル担体またはエマルジョンにより混合またはカプセル化され、あるいは、それらと共に適切に投与され、その結果、化学的および物理的安定性が増大し、粘膜送達時での生物学的活性剤半減期は（例えば、タンパク分解、化学的変異および/または変性に対する感受性が減少することによって）上昇する。
【０１３０】
本発明のいくつかの態様の中では、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチド用の特殊な送達系では、リポソームとして周知の脂質小胞が含まれる（例えば、Chonnら、Curr. Opin. Biotechnol. 6: 698-708, 1995； Lasic, Trends Biotechnol. 16: 307-321, 1998； Gregoriadis, Trends Biotechnol. 13: 527-537, 1995、本明細書に参考として編入）。これらは、天然、生分解性、非毒性および非免疫原性の脂質分子から調製するのが一般的であり、ペプチドやタンパク質を含めた薬物分子をその膜内または膜上に効率的に捕捉または結合することができる。本発明ペプチドおよびタンパク質送達系としてリポソームの魅力が増加するのは、カプセル化したタンパク質が、選択された水性環境にあってもその小胞内に留まっており、その間リポソーム膜は蛋白分解や他の不安定化因子からそれらを保護するという事実による。たとえペプチドおよびタンパク質のカプセル化が、その独特な物理的および化学的性状のために既知のリポソーム調製法全てにおいて実行可能でなくとも、数種類の方法によってこれらの高分子のカプセル化は実質的な失活を伴わずに可能である。（例えば、Weiner, Immunomethods 4: 201-209, 1994参照、本明細書に参考として編入）。
【０１３１】
本発明で使用するためのリポソームの調製には、様々な方法が利用できる（例えば、Szokaら、Ann.Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467, 1980；および米国特許No.4,235,871, 4,501,728および4,837,028, それぞれ本明細書に参考として編入）。生物学的活性剤は、リポソーム送達によって使用するには、リポソーム、即ち脂質小胞内に捕捉するか、当該小胞外部に結合するのが一般的である。リポソームに特定組織および特定細胞型を標的にさせることによってリポソーム介在送達の有効性を高めるためのいくつかの戦略が考え出されている。リポソーム配合品、例えば陽イオン脂質を含有するものは、ヒト患者において安全であり、良好に認容されることが判っている（Treat et al, J.Natl.Cancer Instit. 82: 1706-1710, 1990、本明細書に参考として編入）。
【０１３２】
リポソーム同様、不飽和長鎖脂肪酸は、粘膜吸収増強活性も有しており、二層様構造を持つ閉鎖小胞体を形成することができる（いわゆる「ウファソーム」）。これらは、本発明において、例えば、これらをオレイン酸を使って形成することにより、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質を鼻内のような粘膜送達用に捕捉することができる。
【０１３３】
本発明で使用する他の送達系は、ポリマーとリポソームを併用し、両小胞の有利な性状を合わせて活用する。この種のハイブリッド送達系の例を挙げると、モデルタンパク質西洋ワサビ過酸化酵素（HRP）を含有するリポソームが、天然ポリマーであるフィブリン内に効果的にカプセル化されている（Heschenら、 Blood Coagulation, pp.171-241、 Zwaal ら、Eds., Elsevier, Amsterdam, 1986、本明細書に参考として編入）。フィブリンは、その生体適合性と生分解性のために、これに関連して、薬物送達系に有用なポリマーマトリックスである（例えば、Senderoffら、J.Parenter.Sci.Technol. 45: 2-6, 1991; Jackson, Nat.Med. 2: 637-638, 1996、本明細書に参考として編入）。さらに、この送達系からの生物学的療法化合物の放出は、共有架橋結合の使用とフィブリンポリマーへの抗フィブリン溶解剤の添加によって制御可能である（Uchinoら、 Fibrinolysis 5: 93-98, 1991、本明細書に参考として編入）。
【０１３４】
本発明で使用するさらに簡略化した送達系では、送達ビヒクルまたは担体として陽イオン脂質が使用され、これらを有効に使用することによって、脂質担体および荷電した生物学的活性剤、例えばタンパク質およびポリ陰イオン核酸、の間の静電的相互作用が得られる（例えば、Hopeら、Molecular Membrane Biology 15: 1-14, 1998、本明細書に参考として編入）。これにより、薬物を粘膜投与および/またはその後の全身コンパートメントへの送達に適した形態に効果的にパッケージすることが可能になる。これらや関連系は、重合核酸、例えば遺伝子構成物、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム、の送達に特に十分に適している。これらの薬物は、大型の、通常負に荷電した分子であり、分子量は遺伝子の106からオリゴヌクレオチドの103までの規模である。これらの薬物の標的は、細胞内であるが、その物理的性状のために従来の薬物のような受動拡散による細胞膜通過ができない。さらに、未保護DNAは、正常血漿中に存在するヌクレアーゼによって数分の内に分解される。内在ヌクレアーゼによる不活性化を回避するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドとリボザイムは多様な周知の方法で化学修飾することにより酵素耐性にすることができるが、プラスミドDNAは、通常はウイルスまたは非ウイルス被膜中にカプセル化するか、あるいは、ポリ陽イオン、例えばタンパク質または陽イオン脂質小胞体による密充填微粒子体の中に凝縮化することによって保護しなければならない。ごく最近では、陽イオン脂質およびジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）から成る小単層小胞体（SUV）をプラスミドDNAなどのポリ核酸用小胞体として使用して成功しており、活性ポリヌクレオチドを広範囲スペクトル細胞の原形質膜を通過させ細胞質にまで運搬することができる粒子が形成されている。この過程（リポフェクションまたはサイトフェクションと称する）は、現在、一時的遺伝子発現の効果を検討するための、細胞にプラスミド構成物を導入する手段として汎用されている。本発明で使用するこの種の典型的な送達ビヒクルには、陽イオン脂質（例、N-(2,3-(ジオレイロキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA））、4級アンモニウム塩（例、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド（DODAC））、コレステロールの陽イオン誘導体（例、3□(N-(N’,N-ジメチルアミノエタン-カルバモイル-コレステロール(DC-chol))および多価ヘッドグループ（例、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（DOGS）、トランスフェクタム（登録商標）として市販）が挙げられる。
【０１３５】
本発明の中で使用するさらなる送達ビヒクルには、長鎖および中鎖脂肪酸、並びに、界面活性剤混合脂肪酸ミセルがある（例えば、Muranishi, Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst. 7: 1-33, 1990参照、本明細書に参考として編入）。天然起源のエステル形脂質の大部分は、自分だけで粘膜表面を通過する点で、重要な意味を持つ。遊離脂肪酸と極性基を持つそのモノグリセリドは、混合ミセル状となって腸のバリアーに通過増強剤として作用することが実証されている。遊離脂肪酸（鎖長が炭素原子12個から20個まで変動するカルボン酸）とその極性誘導体に対する、このバリアー改質機能の発見により、粘膜吸収増強剤としてこれらの物質を応用する研究が広範囲に刺激されている。
【０１３６】
長鎖脂肪酸、特に細胞融合誘導脂質（不飽和脂肪酸およびモノグリセリド、例えばオレイン酸、リノレン酸、モノオレイン酸など）は、本発明の方法の範囲内で使用する場合、有用な担体を提供し、ここに開示する起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチド、類似体および模擬体の送達を増強する。中鎖脂肪酸（C6〜C12）およびモノグリセリドも、薬物の腸内吸収の活性を増強することが認められており、本発明の送達配合品および方法の範囲内での使用に適応できる。さらに、中鎖および長鎖脂肪酸のナトリウム塩は、本発明の起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドにとって有効な送達ビヒクルであり、吸収増強剤である。従って、脂肪酸は、ナトリウム塩の可溶状態で、あるいは、非毒性界面活性剤、例えばポリオキシエチル化水添ヒマシ油、タウロコール酸ナトリウムなど、の添加によって使用できる。天然起源不飽和長鎖脂肪酸（オレイン酸またはリノレン酸）およびそのモノグリセリドの胆汁酸塩との混合ミセルは、腸粘膜に基本的に無害な吸収増強能を呈することが認められている（例えば、Moranishi, Pharm.Res.2: 108-118, 1985； Crit.Rev.Ther.drug Carrier Syst. 7: 1-33, 1990、それぞれ本明細書に参考として編入）。本発明の範囲内で有用な他の脂肪酸および混合ミセル調製物には、任意にグリココール酸塩やタウロコール酸塩などの胆汁酸塩と配合した、カプリル酸ナトリウム（C8）、カプリン酸ナトリウム（C10）、ラウリン酸ナトリウム（C12）またはオレイン酸ナトリウム（C1８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
PEG化
本発明で提供するさらなる方法と組成物は、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドをポリマー材料、例えばデキストラン、ポリビニルピロリドン、グリコペプチド、ポリエチレングリコールおよびポリアミノ酸の共有結合的な結合により化学修飾することに関する。得られる共役ペプチドは、臨床投与のための生物学的活性および溶解性を保持する。別の実施態様では、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドを、ポリアルキレンオキサイドポリマー、特にポリエチレングリコール（PEG）に共役させる（例えば、米国特許No.4,179,337参照、本明細書に参考として編入）。文献中の多数の報告には、PEG化したペプチドおよびタンパク質の潜在的な長所が記述されており、これらは、しばしば、タンパク分解への耐性増加、血漿半減期の増加、溶解性増加および抗原性および免疫原性の減少を呈する（Nucciら、 Advanced Drug Deliver Reviews 6: 133-155, 1991； Lu ら、Int.J.Peptide Protein Res. 43: 127-138, 1994、それぞれ本明細書に参考として編入）。L-アスパラギナーゼ、ストレプト-キナーゼ、インシュリン、インターロイキン-2、アデノシンデアミナーゼ、L-アスパラギナーゼ、インターフェロンα2ｂ、スーパーオキサイドジスムターゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、ウロキナーゼ、ウリカーゼ、ヘモグロビン、TGF-β、EGFおよび他の増殖因子を含めた多数のタンパク質がPEGに共役結合され、治療薬としての生物学的性状の変化について評価されている（例えば、Hoら、 Drug Metabolism and Disposition 14: 349-352, 1986； Abuchowskiら、 Prep.Biochem. 9: 205-211, 1979； Rajagopaianら、J.Clin.Invest. 75: 413-419, 1985； Nucciら、 Adv.Drug Delivery Rev. 4: 133-151, 1991、それぞれ本明細書に参考として編入）。PEG化タンパク質の試験管内in vitro生物学的活性は、低下する可能性があるが、この活性損失は、通常、血流中のin vivo半減期の増加によって相殺される（Nucciら、Advanced Drug Delivery Reviews 6: 133-155, 1991、本明細書に参考として編入）。従って、これらや他のポリマー結合ペプチドおよびタンパク質は、ここでの方法および配合品に従って粘膜内投与すると、半減期延長および免疫原性低下などの性状増強を呈する。
【０１３８】
タンパク質およびペプチドへのPEGの結合とその後の精製について、いくつかの手順が報告されている（Abuchowskiら、J.Biol.Chem.252: 3582-3586, 1977； Beauchampら、Anal.Biochem. 131: 25-33, 1983、それぞれ本明細書に参考として編入）。さらに、Luら、Int.J.Peptide Protein Res. 43: 127-138, 1994（本明細書に参考として編入）は、様々な技術的検討を記述し、PEG化手順をタンパク質とペプチドについて比較している（Katre ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 1487-1491, 1987； Beckerら、Makromol.Chem.Rapid Commun. 3: 217-223, 1982； Mutterら、Makromol. Chem.Rapid Commun. 13: 151-157, 1992； Merrifield, R.B., J.Am.Chem.Sco. 85: 2149-2154, 1993； Luら、Peptide Res. 6: 142-146, 1993； Leeら、Bioconjugate Chem. 10:973-981, 1999； Nucciら、 Adv.Drug Deliv.Rev. 6: 133-151, 1991； Francisら、J.Drug Targeting 3: 321-340, 1996； Zalipsky, S., Bioconjugate Chem. 6: 150-165； Clarkら、 J.Biol. Chem. 271: 21969-21977, 1996； Pettit ら、J.Biol.Chem. 272: 2312-2318, 1997； Delgadoら、Br.J.Cancer 73: 175-182, 1996； Benharら、 Bioconjugate Chem. 5: 321-326, 1994； Benharら、 J.Biol. Chem. 269: 13398-13404, 1994； Wang ら、Cancer Res. 53: 4588-4594, 1993； Kinstlerら、 Pharm.Res. 13: 996-1002, 1996； Filpulaら、 Exp.Opin. Ther.Patents 9: 231-245, 1999； Pelegrin ら、Hum.Gene Ther. 9: 2165-2175, 1998、それぞれ本明細書に参考として編入）。
【０１３９】
当分野の各種教示に従えば、ポリエチレングリコールポリマーとの起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドの共役結合は実施が容易であり、循環寿命が延長しおよび/または免疫原性が低下する一方でPEG化活性剤の活性レベルは容認可能な程度に維持されるという結果は予想通りである。本発明での使用のためのアミン反応性PEGポリマーには、分子質量2000、5000、10000、120000および20000 のSC-PEG; U-PEG-10000; NHS-PEG-3400-ビオチン; T-PEG-5000; T-PEG-12000;およびTPC-PEG-5000がある。これらのポリマーに対する化学共役結合の化学的方法は公開されている（例えばZalipsky, S., Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995； Greenwaldら、Bioconjugate Chem. 7:638-641, 1996； Martinezら、Macromol. Chem. Phys. 198:2489-2498, 1997； Hermanson, G. T. , Bioconjugate Techniques, pp. 605-618, 1996； Whitlowら、 Protein Eng. 6:989-995, 1993； Habeeb, A. F. S. A. , Anal. Biochem. 14:328-336, 1966； Zalipskyら、Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, pp. 318-341, 1997； Harlowら、Antibodies:  a Laboratory Manual, pp. 553-612, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY, 1988； Milenicら、Cancer Res. 51:6363-6371, 1991； Friguetら、J. Immunol. Methods 77:305-319, 1985、それぞれ本明細書に参考として編入）。これらのプロトコルでは、リン酸塩緩衝液が多用されているが、ホウ酸塩緩衝液を選択すると、PEG化反応速度および得られる生成物に好影響を与えることができる。
【０１４０】
生物学的活性ペプチドおよびタンパク質のPEG化は、カルボキシル部位の修飾によって達成できる（例えば、カルボキシル末端の他に、アスパラギン酸またはグルタミン酸基）。カルボジイミド活性化タンパク質のカルボキシル基を酸性条件下で選択的に修飾する際のPEG-ヒドラジドの有用性が記述されている。（Zalipsky, S., Bioconjugate Chem. 6: 150-165, 1995； Zalipskyら、 Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, pp.318-341, American Chemical Society, Washington, DC, 1997、本明細書に参考として編入）。別法として、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質の二官能基PEG修飾が使用できる。ある手順では、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸
を含めた荷電アミノ酸残基は、タンパク質表面に接近可能な媒体となる顕著な傾向がある。タンパク質のカルボン酸基への共役結合は、タンパクバイオコンジュゲートの製造用としてそれほど頻繁には探究されなかった方法である。しかし、Zalipskyらが述べたヒドラジド/EDCの化学的性状（Zalipsky, S., Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995； Zalipskyら、Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, pp. 318-341, American Chemical Society, Washington, DC, 1997、それぞれ本明細書に参考として編入）は、タンパクカルボキシル部位へPEGポリマーを結合する実用的な方法を提示している。例えば、この別種の共役結合化学は、生物学的活性を維持しながら、脳由来神経栄養性因子（BDNF）のPEG化にアミン結合よりも優れていることが認められている（Wuら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:254-259, 1999、本明細書に参考として編入）。Maedaらも、カルボキシル-標的PEG化がビリルビンオキシダーゼ共役結合の好ましい方法であることを認めている。（Maedaら、Poly(ethylene glycol) Chemistry.  Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Ed., pp. 153-169, Plenum Press, New York, 1992、本明細書に参考として編入）。
【０１４１】
しばしば、本発明で使用するペプチドPEG化は、ペプチドまたはタンパク質表面でリジン残基と反応する官能基でPEGを活性化することに関する。本発明のいくつかの別種態様では、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質を他の残基、例えばHis、Trp、Cys、Asp、Glu等でのPEG化により修飾するが、活性は実質的に損失しない。選択したペプチドまたはタンパク質のPEG修飾を完全終了まで進行させてしまうと、当該ペプチドまたはタンパク質の活性が減退する場合がしばしばある。そのため、一般にここでのPEG修飾操作をペプチドまたはタンパク質の部分PEG化に制限し、その結果活性損失は約50%未満、さらに多くの場合約25%未満とする一方で、半減期（例、スクラム半減期）は実質的に増加させ、PEG化活性剤の有効必要量は実質的に減少させる。
【０１４２】
活性剤の他の安定化修飾
起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは、PEG化の他に、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドを他の既知の保護化または安定化化合物への共役結合を介して遮蔽することによって、例えば、活性ペプチド、タンパク質、類似体または模倣体が1個以上の担体タンパク質、例えば1個以上のイムノグロブリン鎖に結合した融合タンパクを形成することによって修飾すれば、循環半減期を増強することができる。（例えば、米国特許番号 5,750,375、 5,843,725、 5,567,584 および6,018,026参照、それぞれ本明細書に参考として編入）。これらの修飾法によって、当該ペプチドの分解、分離またはクリアランスが減少し、生理的環境中での半減期が延長する結果となる（例、循環系または粘膜表面で）。そのため、本、各種安定化共役結合法によって修飾された活性剤は、発明の方法での効率性が上昇し有用となる。特に、そのように修飾された当該ペプチドは、未修飾の活性剤に比較して、送達部位でさらに長時間活性と作用を維持する。活性剤がそのように修飾された時でさえ、未修飾化合物の生物学的活性に比較して、実質的な生物学的活性を保持している。
【０１４３】
本発明の他の態様では、安定性増強のために、比較的低分子量の化合物、例えばアミノレシチン、脂肪酸、ビタミンB12およびグリコシドと起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドを共役結合させる（Igarishiら、Proc. Int. Symp. Control. Rel. Bioact. Materials, 17, 366, (1990)。本発明の組成物および方法で使用する別の典型的な修飾ペプチドは、以下の方法によってin vivoで修飾すると有利になる:
(a)活性ペプチドに哺乳動物シグナルペプチド（例えばLinら、J. Biol. Chem. 270:14255, 1995参照、本明細書に参考として編入） または細菌ペプチド (例えば、Joliotら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864, 1991参照、本明細書に参考として編入)を結合する化学的または組換えDNA法。これは、活性ペプチドまたはタンパク質に細胞質膜および小器官膜を通過させ、および/または、活性ペプチドまたはタンパク質を望みの細胞内コンパートメント（例、抗原提供細胞（APC）の小胞体（ER）、例えばCTL誘発を増強する樹状突起細胞）に運搬する働きをする;
(b)ビオチン残基の活性ペプチドへの付加。これは、細胞表面に存在する輸送体に特異的に結合する（即ち、約106, 107, 108, 109, または 1010 /M以上の結合親和性によって）能力があるために、活性共役体に細胞膜を通過させる働きをする（Chenら、Analytical Biochem. 227:168, 1995、本明細書に参考として編入）;
(c)in vivoにおける安定性を高めるための、活性ペプチドのアミノおよびカルボキシ末端の一方、あるいは、両方に遮断剤が付加。これは、活性ペプチドまたはタンパク質の末端が、細胞に取り込み前にあるいは細胞内を移動中にプロテアーゼによって分解される傾向がある状況では有用である。前記の遮断剤には、制限なしに、関連するまたは関連しない付加配列があり、これを投与する治療用ポリペプチドまたはペプチドのアミノおよび/またはカルボキシ末端残基に結合させることができる。これは、ペプチド合成中に化学的に、もしくは、組換えDNA技術によって実施できる。遮断剤、例えばピログルタミン酸および当業者に周知の他の分子もアミノおよび/またはカルボキシ末端残基に結合でき、あるいは、アミノ末端のアミノ基またはカルボキシ末端のカルボキシル基を各種成分で置換できる。
【０１４４】
プロドラッグ修飾
本発明で有用な別の処理および配合品戦略は、プロドラッグ修飾のそれである。小有機分子中のカルボキシル基、水酸基およびアミノ基などの基団を一時的に（即ち、生体可逆的に）誘導することによって、これらの分子の望ましくない物理化学的特徴（例、粘膜浸透を減退させる電荷、水素結合電位など）を、当該分子の薬理学的性状を永久に変化させずに、「マスク（遮蔽）」できる。治療用小分子薬物の生体可逆的プロドラッグ誘導体によって、多数の典型的治療薬、特に水酸基およびカルボン酸基を含有するものの物理化学的（例、溶解性、親油性）性状が改善されることが判っている。
【０１４５】
本発明のペプチドのようなアミン含有活性剤のプロドラッグを調製する一つの方法は、アミノ基のアシル化による。任意に、プロドラッグとして、アミンのアシロキシアルコキシカルバメート誘導体の使用が検討されている。エステラーゼ-、フォスファターゼ-およびデヒドロゲナーゼ-感受性の線状アミンプロドラッグの調製に、3-(2’-ヒドロキシ-4’,6’-ジメチルフェニル)-3,3-ジメチルプロピオン酸が使用されている（Amsberryら、Pharm. Res. 8:455-461, 1991； Wolfeら、J. Org. Chem. 57:6138, 1992、それぞれ本明細書に参考として編入）。これらの系は、2段階メカニズムで分解することが認められており、その第1段階は、緩徐な律速酵素触媒（エステラーゼ、フォスファターゼまたはデヒドロゲナーゼ）段階で、第2段階は迅速な（t1/2 =100 秒, pH 7.4, 37°C）化学的段階である（Amsberryら、J. Org. Chem. 55:5867-5877, 1990、本明細書に参考として編入）。興味深いことに、フォスファターゼ感受性系は、最近、in vivoで有意な抗腫瘍活性を示すTAXOLタキソールの高水溶性（10mg/ml以上）プロドラッグの調製に使用されている。各種プロドラッグ修飾系と得られる治療薬は本発明方法および組成物で有用である。
【０１４６】
本発明で有用なペプチドのプロドラッグを調製する目的で、米国特許番号.5,672,584（参考のためにここに編入する）は、生物学的活性ペプチドおよびペプチド核酸（PNA）の環状プロドラッグの調製と使用をさらに詳細に述べている。これらの環状プロドラッグを生成するには、リンカーを使って生物学的活性ペプチドまたはPNAのN-末端アミノ基とC-末端カルボキシル基を結合する、あるいは、当該ペプチドのC-末端カルボキシル基を側鎖アミノ基または側鎖水酸基にリンカーを使って結合する、あるいは、前記ペプチドのN-末端アミノ基を側鎖カルボキシル基にリンカーを使って結合する、あるいは、前記ペプチドの側鎖カルボキシル基を側鎖アミノ基または側鎖水酸記にリンカーを使って結合する。これに関する有用なリンカーには、3-(2'-ヒドロキシ-4',6'-ジメチルフェニル)-3,3-ジメチルプロピオン酸リンカーおよびその誘導体、およびアシロキシアルコキシ誘導体がある。編入した開示は、線状ペプチド、例えば、細胞膜透過性および代謝安定性の増強に有利な物理化学的特性（例、サイズ減少、分子内水素結合、両染性特徴）を呈するオピオイドペプチド、から合成した環状プロドラッグの生成と特徴付けに有用な方法を提供する。これらのペプチドプロドラッグ修飾法は、本発明方法および組成物の使用のために修飾ペプチド治療用誘導体を調製するのにも有用である。
【０１４７】
精製および調製
本発明のペプチドは、多様な方法で調製できる。当該ぺプチドは、そのサイズが比較的短いため、従来の技法に従って、溶液中または固体支持体上で合成できる。各種の自動合成装置が市販されており、周知のプロトコルに従って使用できる。例えば、Stewart とYoung, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co. (1984)； Tamら、J. Am. Chem. Soc. 105:6442 (1983)； Merrifield, Science 232:341-347 (1986); およびBarany とMerrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press, New York, pp. 1-284 (1979)を参照されたい。これらはそれぞれ本明細書に参考として編入する。
【０１４８】
別法として、組換えDNA技術を使用してもよく、問題の起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞内に形質転換または形質導入し、発現に適した条件下で培養する。これらの手順は、一般に当分野で公知であり、例えばSambrook ら、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982), およびAusubelら、(ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley およびSons, Inc., New York (1987), および米国特許番号. 4,237,224、 4,273,875、 4,431,739、 4,363,877 および4,428,941,に全般的に述べられており、これらの開示を本明細書に参考として編入する。それによって、1以上の本発明のペプチド配列を含む融合タンパクを使って、当該起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドを提示することができる。
【０１４９】
本明細書で意図している長さのペプチドをコードする配列は、化学的技法、例えばMatteucciら、 J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)のフォスフォトリエステル法によって合成できるので、天然ペプチド配列をコード化するものを適当な塩基で置換することによって修飾を簡単に実施できる。次に、このコード配列に適当なリンカーを付与し、当分野で一般に入手可能な発現ベクターに連結し、そのベクターを使用して適当な宿主を形質転換すれば、所望の融合タンパクを生成することができる。現在、多数の前記ベクターと適切な宿主系が入手できる。融合タンパクを発現させるには、開始および停止コドン、プロモーターおよびターミネーター領域および通常は複製系をそのコード配列に結合操作により付与することによって、所望の細胞宿主中で発現させる発現ベクターを得る。例えば、所望のコード配列を挿入するのに都合のよい制限部位を持ったプラスミド中に細菌宿主に適合したプロモーター配列が付与される。得られたた発現ベクターは、適切な細菌宿主中に形質転換される。当然、酵母または哺乳動物細胞宿主も、適切なベクターおよび制御配列を用いて使用してよい。
【０１５０】
本発明のペプチドおよびその医薬およびワクチン組成物は、哺乳動物、特にヒトに投与し、多様な疾患および病態を治療および/または防止するのに有用である。一般に、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは、対象に直接投与するに当たり実質的に精製された形態で提供される。ここで使用する「実質的に精製」という用語は、天然系タンパクおよび他の混入物質から全部または一部単離されたペプチド、タンパク質、核酸または他の化合物を指すことを意図しているが、当該ペプチド、タンパク質、核酸または他の活性化合物は、天然に産する状態に比較して、例えば細胞抽出液内の純度に比較して、測定可能な程度まで精製されていることを言う。
【０１５１】
特定の実施態様では、「実質的に精製」という用語は、細胞、細胞培養培地または他の粗調製物から単離され、分画して初回調製物の各種成分、例えばタンパク質、細胞残渣および他の成分を除去したペプチド組成物を指す。当然、前記精製調製物には、活性剤との共有結合での材料、例えばグリコシド残基または活性剤と混合または共役結合した材料が含有されていてもよく、それは当該活性剤の修飾誘導体または類似体が得られ、あるいは、コンビナトリアルな治療配合品、共役体、融合タンパクなどが生成するので望ましいといえる。従って、「精製」の用語には、ペプチドおよびタンパクの類似体または模擬体または他の生物学的活性化合物などの望ましい生成物が含まれており、その場合、別の化合物または成分、例えばポリエチレングリコール、ビオチンまたは他の成分が活性剤に結合され、他の化合物の結合が可能になり、治療処置または診断処置に有用な配合品が得られる。
【０１５２】
「実質的に精製」という用語は、ポリヌクレオチドに適用した場合、ポリヌクレオチドが、通常の付随物質を含まないが、コード配列の5’および/または3’末端に追加配列を含有してよいことを意味している。これは、例えば、DNAをcDNAライブラリーから誘導する時にメッセージの非コード部分が逆転写した結果である可能性があり、あるいはシグナル配列並びに成熟タンパクコード化配列の逆転写体が含まれた可能性がある。
【０１５３】
本発明のペプチド、タンパク質およびペプチド類似体（他のペプチドおよび/またはタンパク質とのペプチド融合体を含む）に関しては、「実質的に精製」という用語は一般的には、非精製状態、例えば自然の状態または環境においてはペプチド、タンパク質または類似体が結合している他の細胞成分を部分的ないし完全に含まない組成物を意味する。精製ペプチドおよびタンパク質は、一般に、乾燥状態か水溶液であることができるが、均質または均質に近い状態である。純度と均質性は、一般にポリアクリルアミドゲル電気泳動や高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使って決定する。
【０１５４】
一般に、本発明で使用する、実質的に精製されたペプチド、タンパク質および他の活性化合物の含量は、製剤用担体、賦形剤、緩衝液、吸収増強剤、安定化剤、防腐剤、アジュバントまたは治療目的の投与用完全医薬配合品中の他の共存成分とペプチド、タンパク質および他の活性化合物を混合または配合する前に、調製物中に存在する全巨大分子種の80%を越える。更に一般的には、ペプチドまたは他の活性物質を精製する結果、他の配合成分との混合前の精製調製物中に存在する全巨大分子種の90%を越え、しばしば95%を越える。他の場合には、活性物質の精製調製物が基本的に均質であり、他の巨大分子種は従来の技法では検出できなければよい。
【０１５５】
ペプチドおよびタンパク質の精製での使用に適した各種技法は、当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体などによる、あるいは熱変性による沈殿とそれに続く遠心分離;イオン交換などのクロマトグラフィー工程、ゲル濾過、逆相、ハイドロキシアパタイトおよび/またはアフィニティークロマトグラフィー;等電点電気泳動;ゲル電気泳動;および前記および他の技法の併用がある。特に有用な精製法には、硫酸アンモニウムなどの物質による選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫沈降法を含めたアフィニティー法、その他がある。（例えば、R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: New York, 1982参照、本明細書に参考として編入）。一般に、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質は、ペプチドを発現する組織および細胞培養物から抽出し、次に免疫沈降させることができ、その後、当該ペプチドおよびタンパク質を、標準的タンパク化学/クロマトグラフィー法によって、さらに精製できる。
【０１５６】
本発明の方法および組成物で使用するペプチドおよびタンパク質は、様々な手段によって入手できる。市販品から精製された形で多くのペプチドおよびタンパク質を容易に入手できる。小さなペプチド（アミノ酸の長さが100個未満）ほど、当業者に周知の標準的な化学的方法によって簡便に合成できる（例えば、Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., 1983参照）大きめのペプチド（アミノ酸100個以上）は、組換えDNA技術を含めた多数の方法によって生成できる（例えば、Sambrookら、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1989; およびAusubelら、 eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., N.Y, 1989に述べる技術参照、それぞれ本明細書に参考として編入）。別法として、タンパク質をコード化するRNAは、化学合成できる。例えば、Oligonucleotide Synthesis, Gait, M.J., ed., IRL Press, Oxford, 1984に述べる技術参照（本明細書に参考として編入）。
【０１５７】
本発明の特定の実施態様では、固相ペプチド合成（メリフィールド合成）などのペプチド合成技術を使って、あるいは、技術上周知の組換えDNA技術によって、生物学的活性ペプチドまたはタンパク質を構築する。前記の方法に従ってペプチドおよびタンパクの類似体および模擬体も生成できる。DNAの予定部位で置換変異を起こす技術には、例えばM13変異誘発がある。置換、挿入または欠失変異体を生成するDNA配列操作は、他で、例えばSambrookら、(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)に簡潔に記述されている。これらや関連の説明によれば、限定された突然変異を生物学的活性ペプチドまたはタンパク質に導入し、多様な従来の技術、例えば選択したペプチドの断片、ドメインまたはモチーフをコードする遺伝子の一部のｃDNAコピーの部位指向変異誘発によって当該類似体および模擬体を生成できる。これはBio-Rad Laboratories (Richmond, CA)のMUTAgen（登録商標）の使用などの一本鎖形の中間体、もしくは、Strategene(La Jolla, CA)のChameleon(登録商標)変異誘発キットなどの鋳型として二本鎖プラスミドを直接使用する方法、もしくは、当該突然変異体を含有するオリゴヌクレオチドプライマーか鋳型を用いたポリメラーゼ連鎖反応によって達成できる。次に、突然変異小断片を完全なペプチド類似体をコードするcDNAに組み入れることができる。多様な他の変異誘発技術が周知であり、本発明での使用のための当該生物学的活性ペプチドおよびたんぱく質の突然変異惹起への使用に常用できる。
【０１５８】
配合および投与
起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは、1種類以上の医薬的に受容可能な担体および、任意に、他の治療成分と併用するのが一般的である。担体は、配合品の他の成分に適合性があるという意味で「医薬的に受容可能」でなければならず、対象に対して受け入れ不能な有害作用を誘発してはならない。このような担体は、本明細書で上記しており、上記していなくても、薬学の当業者に周知である。望ましくは、配合品は、投与予する生物学的活性剤が適合しないことが判っている酵素や酸化剤などの物質を含んではならない。配合品は、薬剤学上周知のいずれの方法でも調製できる。
【０１５９】
本明細書に開示する起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは、予防および治療目的で、静脈内、皮下、腫瘍内、肺内、潅流などを含めた適切な投与経路で投与できる。治療目的では、本発明のペプチドは、弱毒ウイルスベクターや他の遺伝子治療送達構成物によっても発現できる。ワクシニアや鶏痘等の前記ベクターは、これらの公知手段の典型である。この方法は、本発明のペプチド（または共役結合体）をコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとして、例えばワクシニアウイルスの使用に関する。標的部位(例、腫瘍内部位、炎症部位、ウイルス感染部位)への導入時、組換えワクシニアウイルスは、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドを発現し、それによって、起炎症性または抗炎症性免疫応答を調節する。免疫化プロトコルで有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許番号 4,722,848（参考のためにここに編入する）に述べられている。別の有用なベクターはBCG（カルメットゲラン桿菌）である。BCGベクターは、Stover ら(Nature 351:456-460, 1991（本明細書に参考として編入）に記述されている。本発明のペプチドの治療用投与または免疫化に有用な多様な他のベクター、例えばチフス菌ベクターなどが、ここに示した説明から当業者に明らかになる。
【０１６０】
起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドは、単回全量送達、長時間に渡る、あるいは、反復投与プロトコル（1時間毎、毎日または毎週の反復投与プロトコル）での持続送達（経皮、粘膜または静脈内送達）により投与できる。これに関連して、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドの治療有効量は、長期予防または治療療法内の反復用量であり、これによって、標的疾患または病態に併発する1種類以上の症状または検知可能な状態を緩和する臨床的に有意な結果が上述のごとく得られる。これに関連する有効投与量の決定は、動物モデル試験に次ぐヒト臨床試験に基づくのが一般的であり、対象の標的疾患の症状または病態の発症または重症度を有意に軽減する有効投与量決定および投与プロトコルが指針となる。これに関する適切なモデルには、例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、ヒト以外の霊長類、並びに、当業者に周知の他の受容される動物モデル対象がある。別法として、有効投与量は、in vitroモデルを使って決定できる（例、免疫および組織病理検査）。前記のモデルを使うと、起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドの適切な濃度と投与量が決定され、治療有効量を投与するためには、通常の計算と調整が必要なだけである。別の実施態様では、生物学的活性剤の「有効量」または「有効投与量」は、治療または診断目的で、上述のような疾患または病態と相関する1種類以上の選択した生物学的活性を簡単に阻害または増強することができる。
【０１６１】
起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドの実際の投与量は、当然、適応症および対象の特殊な状態（例、対象の年令、大きさ、健康度、症状の範囲、感受性因子など）、投与時間および経路、併用する他の薬物または治療法、並びに、望みの活性または対象の生体応答の誘発に特異的な生物学的活性剤の薬理作用に応じて変動させる。最適な予防または治療応答を得るために、投与量の処方を調整することができる。治療有効量は、治療上の有益効果が起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドのいかなる毒性または有害副作用にも上回る量でもある。本発明方法および配合品における生物学的活性剤の治療有効量の非制限的な範囲は、0.01 μg/kg〜10 mg/kg、さらに一般的には約0.05〜5 mg/kg、またある実施態様では、約0.2〜2 mg/kgである。この範囲内の投与量は、単回または頻回投与、例えば1日当たり頻回投与、1日1回または週1回投与、によって達成できる。1回の投与で、平均的ヒト対象に少なくとも1mgの起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチド、さらに一般的には約10μg 〜5.0 mg、特定の実施態様では約100μg〜1.0または2.0 mgを投与するのが望ましい。更に留意すべきこととして、対象毎の特定投与レジメは、個人毎の要件および透過促進ペプチドおよび他の生物学的活性剤を投与しまたはその投与を監視する者の専門家としての判断に従って評価し、常時調整するのが望ましい。
【０１６２】
起炎症性または抗炎症性の結合性ペプチドの投与量は、標的部位で望みの濃度が維持されるように主治医が変更してよい。例えば、血流またはCNS（中枢神経系）中の生物学的活性剤の選択局所濃度は、対象の状態および予定または測定応答に応じて約1〜50ナノモル/L、時には約1.0ナノモル/L〜10、15または25ナノモル/Lであってよい。送達モード、例えば粘膜送達か静脈内または皮下送達かに基づいて高めあるいは低めの濃度を選択してよい。投与した配合品剤形、例えば鼻用スプレーか粉末か、持続放出経口剤か注射微粒子または経皮送達剤形か等の放出速度に基づいて投与量も調整するのが望ましい。同一血清濃度レベルを達成するには、例えば、（標準条件下で）放出速度5ナノモルの徐放性粒子は、放出速度10ナノモルの粒子の約2倍の投与量で投与することになる。
【０１６３】
本発明で使用する選択した生物学的活性剤の特定投与量に関する別の指針は、文献に広く散見できる。
【０１６４】
本発明を、以下の具体的実施例でさらに詳細に説明するが、これは、いずれにしても、本発明の範囲を制限することを意図していない。
【０１６５】
以下の実施例には、HLA-E分子も、典型的なストレス誘発タンパクであるヒト熱ショックタンパク60（hsp60）に由来するタンパク質と結合することができるという知見が立証されている。前述の開示に従って、HLA-Eに結合するhsp60候補ペプチドをhsp60タンパクのシグナル配列（ミトコンドリア標的配列に相当）において同定した。細胞にストレスが懸かっている間、このペプチドは新生HLA-E分子に接近するので、HLA-Eが細胞表面上に増加する。顕著な点として、HLA-E分子は、これらのhsp60に結合するともはや阻害性CD94/NKG2A受容体によって認識されない。
【０１６６】
従って、正常な細胞増殖中はHLA-EはMHCクラスIシグナル配列に由来するシグナルペプチドに結合するので、前記細胞はNK細胞介在攻撃から防御される。細胞ストレス中はHLA-E分子は主として他の内在タンパクに由来するペプチド、例えばhsp60シグナルペプチドに結合する。
【０１６７】
HLA-Eを、全長hsp60リーダー配列と共に、K562細胞（赤白血病細胞系K562はHLAクラスI細胞表面発現が乏しい）に形質転換した時、細胞表面HLA-E発現の若干の増加が認められた。対照的に、これらの細胞が、例えば高密度細胞増殖条件の形での細胞培養ストレスを受けると、大きな上昇が認められた。同一HLA-E構築物（および、hsp60リーダー配列の点突然変異した変異体）で形質転換したK562細胞では限界のある上昇のみが認められたという事実から、hsp60リーダー内に存在する必須ペプチド配列がHLA-Eに接近可能であることが示唆される。この観察から、細胞が危急である間にHLA-Eは新規ペプチドを提供する役割を果たすことが示唆される。
【０１６８】
HLA−Eの介在によりストレス誘発ペプチドが提示され、それによりNK細胞にCD94/NKG2Aは結合しないことから、NK細胞（およびCD94/NKG2A発現T細胞）は、例えば持続的な慢性炎症中はストレスを受けた自家細胞を検知し排除することができるという新規メカニズムが指摘される。
【０１６９】
本明細書に示す知見から、HLA-Eによってストレス誘発タンパク由来の典型的HLA-E結合ペプチドが提示されると、もはやCD94/NKG2A阻害性受容体の関与はなくなることが実証される。これはペプチド負荷HLA-Eで形質転換した細胞に対するNK細胞の細胞傷害性によっても、また四量体HLA-E/β2ミクログロブリン/hsp60ペプチド複合体を使用し、NK細胞上に内因的かつ機能的に発現されたもしくは細胞形質転換体によって発現されたCD94/NKG2Aに対するそれの結合性によっても測定される。これらの結果から、HLA-Eによって典型的hsp60ペプチドおよび他の関連ペプチドが提供されるとCD94/NKG2A阻害性受容体と結合しない複合体が形成され、結果的にはCD94/NKG2A受容体保持細胞は細胞活性化されることが示唆される。
【０１７０】
細胞培養
K562（ヒトHLA-クラスI陰性赤白血病）および721.221（ヒトHLA-クラスI低B-リンパ芽球様細胞）を、10%熱不活性化FCS、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリンおよび100□g/mlストレプトマイシンを補充したRPMI 1640（Life Technologies, Gaithersburg, MD）で維持した。  2種類のヒトCD94/NKG2A+（KIR-除く）細胞傷害性NK細胞株（NKL、Dr. M.Robertson, Indiana大学医学部, Indianapolis, INの好意的提供）およびNishi（Dr.H.Wakiguchi,
高知医科大学小児科よる提供）を7%貯留熱不活性化ヒトAB+血清、200 UIL-2/ml（PeproTech, Rocky Hill NJ）、2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリンおよび100□g/mlストレプトマイシン（Life Technologies）を補充したIMDM中で増殖させた。CD94とNKG2A、CD94、DAP-12とNKG2C-GFPまたはCD94とDAP-12を同時に形質転換したBa/F3細胞は、先に記述されている(Lanier et al., Immunity 6:371-378, 1997,参考のためにここに編入する)。HB-120（pan-HLAクラスI特異的ハイブリドーマ）を、American Type Culture Collection, Rockville, MDから入手し、10% FCS, 2mM L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、 HAT、100 U/ml ペニシリン、100 □g/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)を補充したDMEM中で培養した。
【０１７１】
ペプチド、HLA-E安定化および細胞培養ストレスアッセイ
Research Geneticsから購入した合成ペプチドをPBSに溶解した。使用したペプチドは、B7sp (VMAPRTVLL)、 hsp60sp (QMRPVSRVL)、 B7 R5V (VMAPVTVLL)、 hsp60 V5R (QMRPRSRVL)、 および P18I10 (RGPGRAFVTI) (すべてResearch Genetics, Huntsville, ALから入手)である。細胞とそのHLA-E形質転換誘導体を合成ペプチド（3〜300μM）と共に26°C で15〜20 時間、無血清AIM-V 培地(GibcoBRL, Paisley Scotland)中、細胞1〜3.106 個/mlの濃度で培養した。次に、細胞を採取し、PBSで洗浄、mAbsで染色し、フローサイトメトリーで分析した。増殖させる細胞密度を高めて、細胞にストレスを与えた。
【０１７２】
簡単に言えば、6日までの期間各時点で細胞濃度が0.2x106個/ml となるように細胞培養を設定した。終点時、細胞濃度および生存率をトリパンブルー排除試験で決定した。細胞表面HLA-EクラスI分子の発現を、フローサイトメトリーで評価した。生存率が90%を越えかつ3種類の密度での細胞培養物を細胞傷害性測定の標的として選択した。
【０１７３】
HLA-E四量体産生
既述のように（Michaelssonら、 Eur.J.Immunol. 30:300, 2000； Braudら、 Nature 391:795-799, 1991、それぞれ本明細書に参考として編入）、HLA-E四量体複合体を生成した。簡単に言えば、HLA-E および □2-ミクログロブリン (□2m) をE. coli BL21 pLysSに過剰発現させ、封入体から精製し、8M尿素溶液に溶解した後、合成ペプチド(B7sp, hsp60sp, B7 R5V or hsp60 V5R) (Research Genetics)でのin vitro希釈によりリフォールドした。HLA-E重鎖、□2mおよびペプチドの複合体をスーパーロース12カラム(Amersham-Pharmacia Biotech)上サイズ排除クロマトグラフィーで精製し、製造業者の説明書に従ってBirA酵素(Avidity, Denver CO)でビオチニル化した後、−80℃で急速に凍結保存した。ビオチニル化モノマーをストレプトアビジン-フィコエリスリン（分子プローブ、Leiden,  Netherlands）とモル比4：1で混合することにより四量体HLA-E複合体を作成した。別の四量体の同様の品質をゲルシフトアッセイ、並びに、pan-HLA特異的ハイブリドーマ（HB-120）の染色によって確認した。
【０１７４】
抗体およびフローサイトメトリー
使用したモノクロナール抗体は次の通りであった: DX22 (抗-CD94, DNAX, Palo Alto, CA), 抗-NKG2A (Z199, Dr. Lorenzo Moretta, Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Genova, Italyの提供), CD56 (B159, BD Pharmingen), 抗-MHC class I mabs (DX17, DNAX) および W6/32 (American Type Culture Collection)。  3H5 (抗-MICA) および 3D12 (抗-HLA-E) mAbs は、それぞれDr. T. Spies およびDr. D. Geraghtyの提供を受けた(Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, USA)。 抗-hsp60 (ML30)は Dr. J. Ivanyi (University of London, England)の提供を受けた。抗-MICB (7C5) は、N末端CD8リーダーペプチド、次にFLAGエピトープおよび細胞外膜貫通細胞質性MICBcDNAを含有するpCDNA3発現ベクターで安定に形質転換したP815細胞でマウスを免疫することにより当研究室で作成した。ハイブリドーマ7C5 (抗-MICB)を選択し、MICB*002 cDNA発現ベクターで形質転換した721.221およびP815細胞と結合することを確認したが、非形質転換または対照形質転換細胞、並びに、 MICA*005 形質転換細胞は陰性であった。第2段階の試薬は、FITC- およびPE-共役ヤギ抗-マウスIgGであった (共にDakopatts, Glostrup Denmarkより入手)。トリプルカラー(Dakopatts)用陰性対照mAbsとしてDAK-GO1を使用した。細胞をFACScan（登録商標） (Becton Dickinson, San Jose, CA)で分析した。標準プロトコルに従って免疫蛍光染色法を実施した。簡単に言うと、野生型（wt）または変異体全長hsp60シグナルペプチド-GFPで形質転換したK562 細胞を、核染色剤Hoechst33342により37°Cで30分間、およびミトコンドリア染料テトラメチルローダミンエチルエステル（TMRE）により37℃で15分間染色した後、3段階の洗浄を行なった。細胞は、浜松C4742-98デジタルカメラに連結したニコンEclipse E400万能顕微鏡を使って分析した。標識細胞の免疫蛍光分析用の適当なフィルターを使用し、Jasc Paint Shop Pro 6.0を使って画像を入手し、Adobe Photoshop（登録商標）に取り込んだ。
【０１７５】
発現ベクターおよび形質転換細胞の作成
5’Eco RI/3’ BamHI部位(5’CGGAATTCATGCTTCGGTTACCCACAGT CTTTCGCCAGATGAGACCGGTGTCCAGGGTACTGGCTCCTCATCTCACTCGGGCTTATGGATCCGC3’).が隣接する全長hsp60シグナルペプチドをコードする合成のセンスおよび抗センスDNAをInteractiva (Ulm, 独)から購入した。アニール化し、消化した生成物をpEGFP-N3 発現ベクター(Clontech, Palo Alto, USA)に連結した。次のオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、かつ製造業者の推奨による部位指向突然変異誘発キット（QuikChangeTM, Stratagene, La Jolla, CA）を使って、hsp60シグナルペプチド中11位のMet残基用3文字コードをgly残基用3文字コードに変異させ、配列決定により確認した： 5'CAGTCTTTCGCCAGGGGAGACCGGTGTCCAG-3’ 。HLA-E*0101 およびHLA-E*01033 cDNA コード化プラスミド(pCDNA3)は、Dr. M. Ullbrecht およびDr. E. Weiss (Institut fuer Anthropologie und Humangenetik, Munich,独)から提供された。721.221 および K562細胞は、標準プロトコルに従って電気穿孔法(Gene pulser, BioRad, Hercules CA)で形質転換した。HLA-EおよびキメラGFPコード化プラスミドによる一時的な共形質転換実験には、10：1の比率（HLA-E：GFP）を使用した。形質転換細胞は、1mg/ml G418（BioRad）を補充した完全培地中で選択した。緑色蛍光の性質に基づいて、フローサイトメトリー（FACScan（登録商標））によって安定な形質転換細胞を単離した。
【０１７６】
NK細胞介在細胞傷害性アッセイ
2時間標準51Cr放射性同位体放出アッセイを使ってNK細胞介在細胞傷害性を測定した。簡単に言うと、標的細胞を、1〜300μMの範囲の濃度の各種ペプチドと共に、26℃で15〜20時間培養した後、51Crで標識した。若干の実験を除いて、アッセイ開始前にペプチドを洗浄した。それらの実験では、防御B7spと共に培養した標的に比較して高めのHLA-E発現レベルを確保するように非防御hsp60sp、B7 R5V および hsp60 V5Rを維持した。mAb封鎖実験では、Fc-受容体を封鎖するために、マウス血清または非関連同位体対応抗体と共に細胞を前培養した。標的またはエフェクター細胞のmAbによる封鎖を4℃で実施し、抗体もアッセイに含めた。
【０１７７】
実施例Ｉ
hsp60spによるHLA-E細胞表面発現の安定化
HLA-Eへの結合能を有するヒトhsp60から誘導したペプチドを同定するため、HLA-E増殖の許容モチーフを発揮するペプチド（Ｃ末端の２位のメチオニンに続いて９位のロイシンまたはイソロイシンのいずれか）を求めて、hsp60のアミノ酸配列の全長をスキャンニングした。同定されたかかる４つのペプチド（図１；表３）のうち、１つ（QMRPVSRVL、hsp60spを示す）を、hsp60のリーダー配列内のその位置に基づいて最初に選択した。更に、hsp60spは２位にメチオニンおよび９位にロイシンを有するだけでなく、４位とおよび８位のアミノ酸はHLA-Eに有効に結合することが判っている幾つかのペプチドと共通している（表１）。特に、hsp60spにおける９個のアミノ酸のうちの４つは、HLAクラスＩリーダー配列に存在する幾つかのペプチドと共通している（例えば、HLA-A*0201および−A*3401、表１）。
【０１７８】
ペプチドとHLA-Eの相互作用に関する研究で示されているように、形質転換されたcDNA発現プラスミド中に産生するか、あるいは合成ペプチドを外部から追加するかしてHLA-E結合性ペプチドが存在すれば、HLA-E細胞表面での発現は、フローサイトメトリーによって検出可能なレベルにまで安定化し、増加させるのに十分である（Braud ら、Nature 391: 795-799, 1991； Leeら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 5199, 1998； Borregoら、 J. Exp. Med. 187: 813, 1998、それぞれ本明細書に参考として編入）。Hsp60由来ペプチドがHLA-Eと結合することができるかどうかを試験するために、安定化されたHLA-Eの細胞表面発現を、様々な合成ペプチドを用いて、２６℃で一夜インキュベートすることによって安定化した。この目的のために、HLA-E*01033で形質転換したK562細胞（K562-E*01033）やHLA-E*0101はもとより、MHCクラスＩ欠損細胞株（HLA-A、-B、-Cおよび-Gを欠損しているが、細胞内にHLA-Eおよび-Fを発現する）、例えば721.221も用いられた。721.221細胞、およびHLA-Eで形質転換し、全て形質転換したK562細胞では、通常の細胞生育の間に細胞表面に低レベルながらHLA-Eが発現する。このような基底レベルのHLA-Eが発現することから、産生直後のHLA-E分子を安定化させるのに十分な、極めて少量のペプチドが細胞内に存在すると示唆される。
【０１７９】
図２に示すように、hsp60spを用いた場合、HLA-E*01033で形質転換したK562細胞およびHLA-E*0101で形質転換したK562細胞のいずれにおいても、HLA-E発現の実質的な増加が観察された。Hsp60spで負荷後のHLA-Eの発現レベルは、HLA-B*0701のリーダー配列（B7sp、VMAPRTVLL）由来のペプチドで負荷した細胞でのレベルに匹敵した（図２）。しかしながら、３７℃において、HLA-E/hsp60sp複合体は、HLA-E/B7spよりも速く解離し、その後ほぼ基底レベルに達した。Hsp60spに加えて、hsp60.4ペプチド（GMKFDRGYI）もまた、721.221細胞上だけでなく、形質転換したK562細胞上でHLA-E分子を安定化させることができた。このペプチドは以前、マウスＱａ−１b分子に結合することも示されている（Lo ら、Nature Med. 6:215, 2000、本明細書に参考として編入）。HLA-Eの安定化は、他の２つのhsp60由来ペプチドでは、おそらくアッセイ溶媒に難溶性であることが原因で観察されなかった（hsp60.2およびhsp60.3；表１）。
【０１８０】
実施例II
hsp60シグナルペプチドによるHLA-Eへの細胞内アクセス、および細胞ストレス下でのHLA-E/hsp60spレベルの増加
hsp60はミトコンドリアマトリックスタンパク質であり、ゲノムDNA内にコードされる（Bukauら、Cell 923:351, 1998；Itohら、J. Biol. Chem. 270:13429, 1995、それぞれ本明細書に参考として編入）。それは、26個のアミノ酸からなるＮ末端ミトコンドリア標的配列を有する前駆体タンパク質として合成される（hsp60L、図１参照）。生物学的研究により、hsp60Lの開裂は前駆体タンパク質のミトコンドリアマトリックスへの取り込みを必要とし、この開裂は細胞質ゾルにおいて起こりそうにない、ということが明らかになった。その理由は、hsp60Lの非存在下ではミトコンドリアのhsp60の取り込みは観察されないからである。（Singhら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 1692:391, 1990、本明細書に参考として編入）。その開裂後のhsp60Lの最終的な行き先は知られていない。ストレス下において、hsp60は、その細胞内レベルおよび分布に影響を及ぼす転写後の事象によってだけでなく増加した転写によって調節される（Bellesら、Infect. Immun. 67:4191, 1999； Samaliら、 Embo J. 18:2040, 1999； Fengら、Blood 97:3505, 2001； Soltysら、 Exp. Cell. Res. 222: 16, 1996、それぞれ本明細書に参考として編入）。
【０１８１】
Hsp60Lの局在化に続いて、特にhsp60spがHLA-E分子へアクセスすることができるかどうか判断するために、野生型hsp60Lまたは11位のメチオニンをグリシンで置換した変異型バリアントのいずれかを含むキメラ構造で形質転換したK562細胞に基づくモデルシステムを開発した。上記メチオニン残基は、hsp60sp九量体における２位に該当し、HLA-Eへの安定な結合のために必要とされる。野生型および変異型hsp60Lを緑色蛍光タンパク質（GFP）のＮ末端上のフレームに移植することにより、形質転換の際に、緑色蛍光細胞はそれぞれのhsp60リーダー配列を確実に翻訳した。形質転換に続いて、GFPはhsp60L-GFPで形質転換した２つの細胞株のミトコンドリアの内側に局在化しており、これは11位のメチオニンの置換はミトコンドリアへの輸送を変化させないことを示唆した。GFP遺伝子を単独で形質転換した場合には、GFPは明らかな細胞内局在化を示さなかった。
【０１８２】
以前、マウスQa-1b分子の細胞表面レベルは、細胞ストレスの間に実質的に増加することが報告されている（Imaniら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10475, 1991、本明細書に参考として編入）。Qa-1bとHLA-Eの間の相同性（いずれも配列、生体機能およびペプチド結合特異性に関して）を考慮して、特に細胞ストレス条件下において、hsp60のミトコンドリア標的細胞の内側に存在する九量体ペプチドが最終的にHLA-Eへアクセスできるかどうかを試験するように実験を計画した。このために、野生型hsp60L-GFP構造体またはその変異型バリアントのいずれかと共に、K562細胞をHLA-E*01033コードプラスミドと共形質転換した。その後、培養物に増加細胞密度で増殖させるストレスを加えながら、これらの形質転換体のHLA-E細胞表面発現をモニタリングした。
【０１８３】
野生型hsp60L-GFP構造体で形質転換した細胞は、変異構造体を用いて共形質転換した細胞よりも高レベルのＨＬＡ−Ｅを一貫して発現した（図３ａ）。この差は増殖条件によって異なる；１日目における野生型および変異型hsp60spを発現する細胞の間のHLA-E細胞表面レベルの差は中程度であった一方、５日目における差は多大であったことに注意すべきである。通常の条件に対してストレス下で増殖した場合は、変異型hsp60L-GFP構造体で形質転換された細胞でもHLA-Eレベルの若干の増加があった（図３ａ、１日目対５日目）。これは、HLA-Eに結合する変異型ペプチドの残存能力によるかまたは内在由来hsp60ペプチドのHLA-Eへのアクセスによるかのいずれかであると思われた。後者の可能性と一致して、HLA-E遺伝子のみで形質転換しておいたK562細胞においても、培養誘導性ストレスの結果としてHLA-Eレベルは増加したが（図３ｂ、下パネル）、非形質転換K562細胞はHLA-E陰性のままであった（図３ｂ、上パネル）。ストレスを受けた細胞における転写後（だがペプチド非依存）のHLA-Eの調節も同様に、他のHLA-E結合性ペプチドによる影響の可能性が残る。なお、K562-E*01033細胞株および図４ａに示す共形質転換された細胞株は、別々に生成および選択されたが、これが１日目に観察された高いHLA-Eバックグラウンドレベルの原因であり得る。したがって、HLA-Eの絶対レベルは図３ａと図３ｂの間で必ずしも直接比較できない。
【０１８４】
上記の形質転換体研究により、ストレス応答により細胞内でミトコンドリアhsp60spのHLA-Eへのアクセス性が増加する結果となり、結局、HLA-E/hsp60sp細胞表面レベルの増加を引き起こすことが示唆された。これは、用いられたhsp60L-GFPおよびHLA-E構造体の両者が同一のCMVプロモーターの制御下にあったため、少なくとも一部はストレス応答の間のhsp60spの転写後の制御によるものであるとみられ、GFP発現レベルは細胞密度が増加しても変化しなかった（図３ａ）。最終的に、K562は活性NKG2D配位子MIC-AおよびMIC-Bを構成的に発現するものの、これらの分析の間にストレス誘導性MHCクラスＩ様分子の細胞表面のさらなる増加は観察されなかった。しかしながら、他の活性ストレス誘導性配位子（例えばUL16結合タンパク質（ULBP））の増加を無視することはできない。
【０１８５】
実施例III
HLA-Eが介在してhsp60spが提供された結果CD94/NKG2AおよびCD94/NKG2C受容体の認識が破棄
阻害性レクチン様受容体ヘテロ二量体CD94/NKG2Aは、ヒトおよびマウス両者の末梢血における全NK細胞のうちの約50％に存在する。このHLA-E特異的受容体は、様々な防御HLA-EクラスＩシグナルペプチドを提示するHLA-Eに結合する際に負のシグナルを仲介し、これによりNK細胞のエフェクター機能が非活性化される。同様に、許容性ＭＨＣクラスＩリーダーペプチドを有する複合体におけるQa-1bを、マウスのCD94/NKG2A受容体は効率良く認識しており、これはヒトおよびマウスの受容体および配位子のレベルが共に進化において保存されていることを示唆している。MHCクラスＩシグナルペプチドを有する複合体におけるHLA-Eと相互作用する可能なNK細胞受容体の特徴を明らかにするために、形質転換体およびＮＫ細胞に発現したCD94/NKG2受容体にMHC四量体複合体が結合することができるかどうか確定するように研究を計画した。組換え体可溶性HLA-E分子は、ヒトβ2ミクログロブリンおよびB7sp(VMAPRTVLL)またはhsp60sp(QMRPVSRVL)の存在下、in vitroでリフォールドされた。このリフォールドされたMHC複合体を用いて四量体HLA-E分子を生成し、これはHLA-E結合性受容体の分析を可能にする。両ペプチドは、in vitroでHLA-Eを効率良くリフォールドすることを可能にし、ゲルシフトアッセイで分析された場合に効率良くビオチン化された。これらの研究により、HLA-E/B7sp四量体は、CD94およびNKG2A、またはCD94、NKG2CおよびDAP12で共形質転換されたマウスBa/F3 pro-B細胞に効率良く結合することが示された（図４、パネルａおよびｂ）。この結果は、阻害性受容体CD94/NKG2Aを発現するNK細胞株（図４、パネルｃ）、または新規に単離された、CD94/NKG2A受容体を主に発現するNK細胞を染色することによって確認された。一方、HLA-E/hsp60sp四量体は、CD94/NKG2AまたはCD94/NKG2C/DAP12のいずれかで共形質転換されたBa/F3 pro-B細胞、および試験した全ＮＫ細胞を結合することができなかった。（図５、パネルａ〜ｃ）。しかしながら、HLA-E/B7spおよびHLA-E/hsp60spのいずれも、HLAクラスＩ分子に特異的な対照Ｂ細胞ハイブリドーマと同程度に結合した（図５、パネルｄ）。したがって、hsp60spは生理的にHLA-Eへ効率良くアクセスすることができるものの、この複合体はもはやCD94/NKG2AおよびCD94/NKG2C受容体によって認識されず、これは、それらがペプチド選択的であることを示している。
【０１８６】
実施例IV
細胞傷害性アッセイにおいてHLA-E/hsp60spがCD94/NKG2A+NK細胞を阻害不可；ペプチドにおける５位の重要な役割
増加したHLA-E/hsp60sp細胞表面レベルの機能的な意義に取り組むため、これらのMHC複合体を発現する細胞がCD94/NKG2A+NK細胞による死滅から防御されるかどうか確定するように研究を計画した。Hsp60spまたはB7spペプチドのいずれかと共に26℃で一夜インキュベートしたK562-E*01033細胞を、CD94/NKG2A+NK細胞株NishiおよびNKLをエフェクターとして用いた２時間のクロム放出アッセイにおける標的として試験した。他の場合なら感受性であるK562-E*01033細胞をB7spと共にインキュベートした場合、明らかな死滅からの防御が観察されたが、hsp60spと共にインキュベーションした場合は、有意な防御は見られなかった（図５、パネルａ）。上記のように、hsp60spおよびB7spはHLA-Eとは解離速度が異なり、これが標的の感受性の差の原因であり得る。したがって、HLA-Eの表面発現を傷害性アッセイの前後でモニタリングすることにより、アッセイの間での標的上のHLA-Eレベルは確実に比較可能であった。
【０１８７】
CD94/NKG2AによるHLA-E認識の喪失原因である残基を特定するため、標的変異をB7spおよびhsp60spに導入した。Qa-1b結合性ペプチドQdmにおけるp5Rの変化によって、マウスにおけるCD94/NKG2Aによる認識が破棄されることは以前に示されている（Kraftら、J. Exp. Med. 192:613, 2000、本明細書に参考として編入）。両ペプチドにおける５位の機能の保存程度を試験するため、実験的ペプチドB7 R5V(VMAPVTVLL)およびhsp60 V5R(QMRPRSRVL)を      作成した。これらのペプチドがK562-E*01033細胞を防御する能力を、上記のように細胞傷害性アッセイで試験した。B7 R5Vと共に26℃でインキュベートしたK562-E*01033細胞は、高レベルのHLA-Eを発現した（図６、パネルｃ）が、それらはCD94/NKG2A+NK細胞に効率良く死滅させられた（図５、パネルｂ）。したがって、この変異はB7spの防御能力を破棄するのに十分である。しかしながら、hsp60に導入されたV5R変異は、同一のエフェクター細胞を用いて死滅から防御するのを復活させるには不十分である（図５、パネルｂ）。
【０１８８】
Hsp60.4ペプチド（GMKFDRGYI）はQa-1bに結合することができたが、CD94/NKG2A+NK細胞からの防御を誘導しなかったことが最近報告されている（Gaysら、J. Immunol. 166:1601-1610, 2001、本明細書に参考として編入）。しかしながら、このペプチドは、100,000倍過剰で1nMのQdm(同上.)と混合した場合でさえ、Qa-1bに結合するために防御Qdmペプチドと競合することができなかった。一方、本開示は、hsp60spがMHCクラスＩシグナルペプチドと競合することによってHLA-E仲介防御と相互作用し得ることを示している。
【０１８９】
すなわち、K562-E*01033細胞を、0.1□ＭのB7spと増加濃度の競合ペプチドと共にインキュベートし、細胞障害性アッセイで試験した。0.1□□ＭのB7spおよび対照ペプチドとインキュベートした細胞は、試験した全濃度において死滅から防御されたままであった一方、0.1□□ＭのB7spおよびhsp60spと共にインキュベートした細胞は、増加濃度のhsp60spによる死滅に対してより感受的になった（図６ｄ）。B7 R5Vペプチドは、hsp60spよりも強いコンペチターでさえあった（図６ｄ）。Gayら(36)が報告したような、Qa-1bペプチド結合の競合に関する結果と一致して、hsp60.4はHLA-Eと結合するためにB7spと競合できなかった（図５ｄ）。
【０１９０】
更に追加的研究が行われ、K562-E*01033細胞において観察されたストレス誘導性HLA-Eの細胞表面増加により、NK細胞仲介溶解から防御するかどうか確定した。様々な密度で増殖させたK562-E*01033細胞を、NKLおよびNishiをエフェクター細胞として用いた２時間のクロム放出アッセイにおける標的として試験した。増加したHLA-Eレベルを示したにもかかわらず、死滅は減少せずにむしろ増加し、これは、これらの細胞に誘導されたHLA-E分子が防御的でないことを示唆する。アネキシンV染色およびトリパンブルーにより測定すると、全標的細胞は９０％を超える生存率を有していた（データは含まれず）。更に、また重要なことに、B7spペプチドを添加することにより、高密度に増殖させた細胞を死滅から救うことができた（図６、パネルｂ）。このことは、増加した死滅は細胞培養条件により最終的に決定されず、適切なペプチドが存在すれば、HLA-Eレベルは防御に十分であったことを示す。このデータはまた、ストレスにより誘導されたHLA-E発現が、NK細胞仲介死滅から防御するのに不十分であることを示唆する。なお、活性受容体NKG2Dに対するMIC-AおよびMIC-B配位子をK562が構成的に発現するものの、これらのアッセイにおいて受ける細胞ストレスによってこれらは更に増加しない。したがって、本明細書における実験の幾つかにおいて観察された細胞ストレス後に増加した死滅は、MIC-AまたはMIC-Bの増加した発現によるものでありそうにない。また、他の活性配位子（例えばULBP）の増加も、死滅の増加を引き起こし得る。
【０１９１】
上記実施例を要約すると、HLA-Eはhsp60のシグナル配列由来の新規なストレス関連ペプチドと結合することが示された。阻害的CD94/NKG2A受容体は、得られた複合体を効率良く認識することができない。このことは、CD94/NKG2A発現細胞へのHLA-E/hsp60sp四量体の結合の不足により、およびかかるHLA-E/ペプチド複合体を発現する細胞のＮＫ細胞仲介死滅により示された。更に、形質転換された細胞に基づく研究により、in vivoで、特に細胞ストレスという条件においてhsp60spはHLA-E分子へアクセスできることが示唆された。したがって、このペプチドを有する複合体におけるHLA-Eの比率はストレス下において増加し、結局HLA-Eペプチドの範囲はＮＫ細胞防御複合体体から非防御複合体に徐々にシフトした。
【０１９２】
このモデルによると、ペプチド選択的な方法でHLA-E/ペプチド複合体を調査することによって、ＮＫ細胞は感染および炎症応答の間にストレスを受けた細胞を検出することができる。これは、CD94/NKG2Aを主な阻害性受容体として均一に発現するNK細胞のサブセットにとって、またこの受容体を発現する活性Ｔ細胞のサブセットにとっても、特に重要であり得る。
【０１９３】
自己認識を喪失するのはペプチドに特異的な認識に基因するかどうかが検討された。その意味は、ＭＨＣクラスＩと結合している通常の自己ペプチドは阻害的受容体の結合を許容するが、ウィルスペプチドおよび他の非自己のペプチドはその結合を許容しないからである。幾つかの受容体は、結合したペプチドに強く影響される、という十分な証拠がある。これは、CD94/NKG2Aを含むＣ型レクチン様受容体のみならず免疫グロブリン様受容体にも当てはまる。しかしながら防御能力は、ペプチド源、すなわちそれが自己か非自己か、または健康か疾患かと相関関係はない。しかしながら、様々なHLA-E複合体間には相互の均衡がとれている状態は、ペプチドのMHC競合に依存した表示をもって細胞は「正常」か「異常」かのシグナルを発していることの現れである。したがって、HLA-E仲介防御は、十分な許容性シグナルペプチド（主に各種MHCクラスＩ分子からの）が産生されたかどうかだけでなく、どのようにしてこれらが非許容性ストレス誘導性ペプチドによってバランスをとられるかにも依存する。
【０１９４】
MHCクラスＩのKIR認識は結合したペプチドによって影響され得るものの、ストレスを受けた細胞のペプチド選択監視に基づくメカニズムは、主にCD94/NKG2受容体に関連する。この理由は、これら受容体は限定された一組の防御ペプチドと結合している形態変化の少ないHLA-E分子を認識するように特別に設計されているためである。一方、主にKIRは、多型のHLA-A、-Bおよび-C分子の高度に多様化した全範囲を認識するように進化してきた。ストレスを受けた細胞に関する類似の監視メカニズムには、KIRを介して機能するならば、各HLAクラスＩ対立遺伝子に負荷することが可能なストレス誘導性ペプチドは莫大な数の存在を必要とする。
【０１９５】
ストレス誘導性ペプチドが阻害的認識を妨害（SPI）することに関する本明細書での研究の第一の焦点は、様々なHLA-E/ペプチド複合体の構造的様相に関連する。HLA-E/B7spの結晶構造により、５つのペプチド残基がよく定義されたHLA-E分子のポケット内にあることが明らかにされ（O’Callaghanら、Mol. Cell. 1:531, 1998、本明細書に参考として編入）、これは結合溝の至る所にあるペプチドの構造を抑制する。Hsp60sp配列とMHCクラスＩシグナルペプチド配列との比較（表１）により、５つの位置（p1、p3、p5、p6およびp7）における差がわかる。中でもp3、p6およびp7は、それぞれポケットD、ポケットＣおよびポケットＥに埋没されている一方、p1およびp5は表面に露出している。
【０１９６】
HLA-E/B7sp構造に基づき、O’Callaghanらは、B7spにおけるp5RがHLA-E結合受容体に対するHLA-E接触残基として作用することを提案した。実際に、B7spの５位におけるアルギニンからバリンへ（hsp60spにおける該当する残基）の変化は、CD94/NKG2A発現NK細胞による死滅からのHLA-E仲介防御を完全に破棄するのに十分であった。しかしながら、hsp60spにおける逆の変化（p5におけるバリンからアルギニンへ）は、防御を獲得するのに不十分であり、これは、このペプチドにおいて付加されたアミノ酸が重要であることを示唆している。ここにおいて特に注目すべきは３位と７位におけるアルギニンであり、これらは浅く、疎水性のＤおよびＥポケットに合わせるのは困難であると考えられる。これらの側鎖の位置を変えることにより直接的または間接的に受容体結合を干渉すると予想され、したがって本発明のある態様において有用であろう。
【０１９７】
本発明における更なる発展に対する別の重要な焦点は、HLA-E/hsp60sp複合体の生物学的関与性に関する。上記の証拠は、ストレス下で観察されたHLA-Eレベルの増加が、hsp60由来ペプチドのHLA-E提示経路への流入に起因することを示す。これを慎重に調査するため、K562細胞をHLA-E*01033で共形質転換し、hsp60シグナル配列の全長をGFPと結合させた（hsp60L-GFP）。これにより、GFPがミトコンドリアで発現するという結果となった一方、HLA-Eは細胞内に高レベルで発現したが、細胞表面においては低レベルでしかなかった。HLA-E*01033で形質転換された対照と、重要なHLA-Eアンカー残基が置換された変異型hsp60L-GFP構造体とを比較すると、かかる細胞を培養誘導性ストレスに付した場合、細胞表面のHLA-Eレベルはこの細胞において増加した。更に、HLA-Eの増加もまた、ストレス下における内生hsp60spのレベルの高さや分布の変化の結果として推定される。また、これと一致して、HLA-E*01033のみで形質転換したK562細胞は、ストレス時に細胞表面のHLA-Eのレベルが増加したことも示した。更に、ストレスの結果として、細胞表面におけるHLA-Eの増加は、これらの実験のいずれにおいてもNK細胞仲介死滅から防御しなかった。
【０１９８】
しかしながら、防御ペプチド（例えばB7spペプチド）を添加することにより、HLA-E仲介防御を取り戻すことができる。実際に、ストレスを受けた細胞は、アッセイにおいて防御B7spペプチドを添加することにより簡単に防御された。これは、内生hsp60spは、ストレス下においてHLA-Eによって提供されることが可能であることを示唆する。したがって、HLA-Eは、感染、自己免疫および炎症中のNK細胞およびＴ細胞に対するストレス誘導性ペプチドの提供者として重要であると考えられている。通常の条件下で生育する細胞および様々なストレス刺激にさらされた細胞の単離されたHLA-E分子からのペプチドの溶出および配列決定は、実際にhsp60spがこれらのおよび他の疾病状況および状態においてストレスを受けた細胞によって主に提供されるかどうか判断するように評価されることになる。
【０１９９】
上記の結果は、ストレス誘導により増加したhsp60spのHLA-Eへのアクセス性の少なくとも一部は転写後の因子によるものであるに違いない、ということを更に示唆した。かかる因子は、プロテアーゼ活性の変化、ミトコンドリアからERへのより効率の良いペプチド輸送、hsp60の分布の変化、またはミトコンドリア膜の浸透性の変化、を伴い得る。大部分(80〜90%)のhsp60プールは、健常細胞のミトコンドリアマトリックスにおいて局在化する（Soltysら、Exp. Cell. Res. 222:16, 1996、本明細書に参考として編入）。しかしながら、細胞ストレスおよび前アポトーシス事象後（Feng ら、 Blood 97: 3505, 2001; Samali ら、Embo J. 18:2040, 1999、それぞれ本明細書に参考として編入）のみならず、細菌感染後（Bellesら、Infect. Immun. 67: 4191, 1999、本明細書に参考として編入）の余分なミトコンドリアhsp60のレベルの増加に関する報告がある。これらの観察は、成熟hsp60を用いて行われたが、少なくともミトコンドリア浸透性への影響は、開裂したシグナルペプチドにも当てはまると考えられる。
【０２００】
変化したペプチド負荷のメカニズムや増加したhsp60spの発現に加えて、HLA-Eを結合することが可能な他のペプチドは、ストレス下で増加し得る。報告によれば、Ｌ細胞の簡単な熱処理によりQa-1bの細胞表面レベルは増加する（Imaniら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10475, 1991、本明細書に参考として編入）。最近、hsp60由来ペプチド（サルモネラのGMQFDRGYLおよびマウスのGMKFDRGYI）がQa-1bと結合することが報告された（Lo ら、Nature Med. 6:215, 2000、本明細書に参考として編入）。更に、ここで行われた研究により、このペプチドGMKFDRGYI（表１中のhsp60.4）もHLA-Eに結合できることが確認される。Hsp60spと対照的に、このペプチドはHLA-Eに結合するためにB7spと競合することができず（図５、パネルｄ）、また報告によれば、このペプチドはQa-1bと結合するために競合することができない（Gaysら、. J. Immunol. 166:1601-1610, 2001、本明細書に参考として編入）。Hsp60.4を提示するQa-1bがＮＫ細胞仲介溶解（同上）から細胞を防御することができないことも報告されている。したがって、これらの配位子は、CD94/NKG2A受容体を結合することができないと考えられるが、代わりにマウスにおけるサルモネラ感染の間にクロノティピックＴ細胞受容体によって検出されることができる（Lo ら、2000, 前記）。したがって、他のストレス誘導性および熱ショックタンパク質由来のペプチド（追加的hsp60由来ペプチドを含む）は、細胞内感染により引き起こされた細胞ストレスの間に、HLA-Eへアクセス可能となり得ると思われる。これらのペプチドにより、CD94/NKG2受容体に対する配位子としてのHLA-E分子の機能的役割を、感染の間に抗原特異的TCRを介してＴ細胞に認識されることが可能な複合体に転じることが提案される。
【０２０１】
なお、Ｔ細胞はCD94/NKG2A阻害性受容体も発現することができ、したがって、hsp60spを有するHLA-E分子とMHCクラスＩシグナルペプチドとの間のバランスも、炎症応答におけるＴ細胞を調節することが提案される。これに関連して、本知見は、ウィルス抗原を対象にしたエフェクター細胞傷害性Ｔリンパ球がCD94/NKG2Aの発現によって抑制されるようになり得る、という最近発表された報告により支持される（Moser, J. M.ら、Nature Immunol. 3:189-196, 2002、本明細書に参考として編入）。この受容体を介してのQa-1bの認識により、ポリオーマウィルスによる腫瘍形成だけでなく急性感染への劇的な影響により、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を阻害した。著者らは、Qa-1bのペプチド負荷が、阻害されたＴ細胞との相互作用に影響を与えると考えられる病理的条件下において影響され得ると推測した。
【０２０２】
本開示は、ストレスを受けた細胞において誘導されるだけでなく、通常はHLA-Eに授与されるCD94/NKG2A+NK細胞に対する防御と相互作用も行うペプチドによるHLA-Eの負荷を表す。これらの知見は、Ｔ細胞の応答制御の間のCD94/NKG2A発現の役割を明らかにする。この受容体の共発現は、健常細胞と罹患細胞の区別において、MHCクラスＩ分子の産生の減少を感知することによるだけでなく、ストレス誘導性ペプチドのHLA-Eへのアクセス性の増加も感知することによって、TCR経路を補完し得る。これらのメカニズムを更に明らかにするために、研究は、CD94/NKG2発現ヒトＴ細胞が標的細胞におけるストレス誘導性変化によって影響され得るかどうか確定するように意図される。この内容において、健常供血者からの末梢血の分析は、CD94/NKG2A+Ｔ細胞のサブセットもHLA-E/B7sp四量体に結合することを明らかにする。更に、本明細書において示された追加の研究により、HLA-E/hsp60sp四量体がCD94/NKG2A+Ｔ細胞またはCD94/NKG2A-Ｔ細胞のいずれにも結合しないことを検出できたことが明らかにされ、これは、Ｔ細胞がNK細胞と同様に様々なHLA-E複合体を区別し、HLA-E/hsp60spに特異的なTCRを発現するＴ細胞は健常者において十分でないことを示唆している。
【０２０３】
HLA-E分子は、CD94/NKG2A阻害性でCD94/NKG2C活性化性の複合体に認識される。活性型の役割はまだはっきりと特定されていない。HLA-E/hsp60sp複合体がCD94/NKG2Cまたは別の未知の活性ＮＫ受容体に認識される可能性が注意を引く。これにより、増加したHLA-Eレベルにも関わらず、なぜストレスを受けたK562-E*01033細胞がＮＫ細胞によってより効率良く死滅されられたかを説明できる。しかしながら、NKL細胞株は活性NKG2C受容体を発現せず、またHLA-E/hsp60sp四量体はCD94/NKG2C形質転換体にも試験したいかなるＮＫ細胞にも結合しない。したがって、NK細胞活性受容体を誘発する他の配位子が関与し得る。NKG2Dに対する配位子であるMIC-AもMIC-Bも、培養ストレスを受けたK562またはK563-E*01033細胞において増加しなかった。しかしながら、NKG2Dに対する追加的配位子または他の活性受容体は、K562またはK563-E*01033細胞の感度に影響を及ぼし得る。更に、活性ＮＫ細胞受容体を特異的に阻害する試薬を用いた実験は、培養ストレス時に増加したＮＫ細胞感度のメカニズムを明らかにする手助けをし得る。
【０２０４】
CD56細胞表面発現のレベルに基づいて、ＮＫ細胞を２つの主なサブセットに分類することができる（CD56dimおよびCD56bright）（Sedlmayerら、Int. Arch. Allergy. Immunol. 110:308, 1996、本明細書に参考として編入）。少数のCD56brightサブセットに属する細胞は、全て高レベルのCD94/NKG2Aを発現し、ほんの少数のみがKIRを発現する。一方、ほとんどのCD56dimNK細胞はKIRを発現し、CD94/NKG2Aの低い細胞表面レベルを発揮する（Jacobs ら、Eur. J. Immunol. 31: 3121, 2001、本明細書に参考として編入）。CD56dimおよびCD56brightＮＫ細胞の表現型分割は、様々なエフェクター機能と関連する（Cooperら、Blood 97:3146, 2001、本明細書に参考として編入）。刺激された場合、CD56brightNK細胞は、ほとんど細胞傷害性ではなく、よりサイトカイン産生をしやすく、したがって免疫調節的であると提案されてきた（Chenら、J. Immunol. 162:3312, 1999、本明細書に参考として編入）。これらの細胞は、潜在的に炎症促進シグナルに対する感度が良く（ケモカイン受容体および接着分子の発現特徴に基づく）、また炎症部位において大部分は過剰提示される（下記参照）。更に、マクロファージは、このＮＫ細胞サブセットの重要な活性剤であるIL-12およびIL-15(Id.)の産生が増加したヒトhsp60に応答することが報告されている。ここで提示された知見に基づき、また炎症中にhsp60が増加するという事実に基づき、HLA-Eによるhsp60spの結合は、ほとんどの場合は、CD94/NKG2A+、CD56brightNK細胞によるサイトカインの産生をもたらす。
【０２０５】
下記実施例において、機能性HLA-E特異的阻害性受容体を発現するCD56-brightナチュラルキラー細胞は、関節炎の関節において選択的に蓄積されることを示すことを含む、追加的な知見を提示する。上記のように、ナチュラルキラー（NK）細胞は、ある微生物および寄生虫感染に対する生得免疫応答に関連するリンパ球である。最近の報告により、実験的な自己免疫モデルにおいてＮＫ細胞の更なる重要な役割が示唆されたが、ヒトにおける自己免疫疾病の間のＮＫ細胞の機能についてはまだほとんど知られていない。以下の実施例において、関節炎（主にリウマチ関節炎（RA））を罹患した患者の滑液（SF）および末梢血（PB）由来の□□Ｔ細胞および□□Ｔ細胞に関してだけでなく、ＮＫ細胞に関して、MHCクラスＩ分子に特異的なキラー細胞免疫グロブリン（Ig）様およびＣ型レクチン様（CD94/NKG2）受容体の発現を分析する。
【０２０６】
これらの研究から、関節炎患者のSFは、一対のPBと比較して増加した比率のＮＫ細胞を含むと判断される。PB-NK細胞とは対照に、SF-NK細胞集団はほとんど均一にCD94/NKG2A細胞表面受容体を発現し、大幅に減少した比率のKIR+ＮＫ細胞を含んだ。機能的分析により、in vitroで培養された患者からのポリクローナルSF-NK細胞およびPB-NK細胞が、各種標的細胞を死滅させることが十分に可能であることが明らかになった。しかしながら、SF-NK細胞溶解は、形質転換された標的細胞におけるHLA-Eの存在により阻害された。SF-NK細胞においてCD94を封鎖する場合、または自家細胞においてHLAをマスクすることにより、SF-NK細胞は自己指定の溶解を行うことができた。したがって、HLA-Eは、炎症を起こしている関節においてほとんどのＮＫ細胞集団の調節に基本的な役割を果たすと考えられる。
【０２０７】
患者、対照および細胞分離
全１７人の患者はひざの関節炎を罹患しており、分析の際にSFの治療的吸引を受けた。RA患者は、RA用のAmerican College of Rheumatology分類基準を満たしていた（Arnett, Arthritis Rheum. 31:315-324, 1988、本明細書に参考として編入）。初期のオリゴ関節炎と診断された一人の４４歳の女性患者以外の全患者は、疾病を緩和する抗リウマチ薬を服用した。RA患者の中の関節外の兆候としては、糖尿病（１名）、レイノー現象（２名）、および二次性シューグレン症候群（１名）が挙げられる。患者からのSFとPBとを組み合わせたサンプル、および８人の健常女性対照（平均年齢52.7歳、49〜61歳の範囲）からのPBを、防腐剤無添加ヘパリンへ収集し、FICOLL-HYPAQUE（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）密度勾配遠心分離によって、標準プロトコルに従い、単核細胞を単離した。
【０２０８】
ＮＫ細胞培養
PB-NK細胞株およびSF-NK細胞株の成育は、抗CD3mAb（OKT3、American Type Culture Collection, Rockville, MD）および製造者に推奨されるような（Dynal AS, Oslo, Norway）pan抗マウスIgコートダイナビーズ（ビーズ対細胞の比は４：１）を用いたCD3+細胞の除去によって行った。本質的に以前に述べたような方法（Soderstromら、J. Immunol. 159: 1072-1075, 1997、本明細書に参考として編入）を少し改良し、残存するＮＫ細胞濃縮集団を保持した。すなわち、２％のプールされたヒトAB+血清、10％のＦＣＳ、2ｍＭのＬ−グルタミン、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび100U/mlのヒト組換えIL-2を添加したIMDM（Life Technologies, Gaitherburg, MD）中に、1×106細胞/mlの濃度のCD3-細胞を24ウェル培養プレート（Costar, Cambridge, MA）に播種した。培養開始2〜3週間後に、CD56+CD3-PB-およびSF-NK細胞株を機能アッセイで試験した。
【０２０９】
mAbsおよびフローサイトメトリー
抗ＫIR mAbs DX9（抗KIR3DL1）、DX27（抗KIR2DL2、KIR2DL3およびKIR2DS2）、DX31（抗KIR3DL2）およびDX22（抗CD94/NKG2A、-Bおよび-C）は、Lewis L. LanierおよびJoseph H. Phillips博士（それぞれ、UCSF, San FranciscoおよびDNAX, Palo Alto, CA）により供与された。他の抗体は、対NKG2A（Z199、Lorenzo Moretta博士（Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Genova, Italy）より供与）、CD3（UCHT1、BD Pharmingen, San Diego, CA）、CD56（B159、BD Pharmingen）、CD16（Leu-11c、Becton & Dickinson, San Jose, CA）、TCRαβ（WT31、Becton & Dickinson）およびTCRγδ（Immu510、Coulter-Immunotech, Miami, FL）、MHCクラスＩ（w6/32、American Type Culture Collection）であった。第２段階の試薬は、FITCおよびPE結合ウサギ抗マウスIg（いずれもDakopatts, Glostrup, Denmark製）および三色用陰性対照（DAK-GO1、Dakopatts）であった。免疫蛍光染色は、標準プロトコルを用いて行った。細胞はFACScan（商標）で分析した。
【０２１０】
細胞
K562（ヒトHLA-クラスＩ赤白血病）、Daudi（ヒト□2m-バーキットリンパ腫）、P815（マウス肥満細胞腫）、721.221（ヒトHLA-EクラスＩ-B−リンパ芽球様細胞）を、10％の熱非働化FCS、2mMのＬ−グルタミン、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを添加したRPMI1640（Life Technologies）からなる完全培地に保持した。HLA-B*5801で形質転換した721.221細胞およびHLA-B*5801と融合したHLA-Gリーダーから構成されるキメラ遺伝子で形質転換した721.221細胞をDNAX（Palo Alto, USA）で産生した。すなわち、HLA-Gのリーダーセグメントを含むキメラcDNA、およびHLA-B*5801の細胞外、膜内外および細胞質ドメインは、野生型HLA-GおよびHLA-B*5801cDNAを鋳型として用いたPCRにより産生された（詳細およびプライマー配列は、Braudら、 Nature 391: 795-799, 1991参照、本明細書に参考として編入）。産生物をpBJ-neo発現ベクターに挿入し、配列を明らかにした。721.221細胞をエレクトロポレーションにより形質転換し、1mg/mlのG418を添加した完全培地で選択した。高レベルの細胞表面HLAクラスＩを発現する形質転換された細胞をフローサイトメトリーで単離した。EBVで形質転換したＢリンパ芽球様細胞（B-LCL）を、in vivoで患者のＢ細胞をB95-8EBV株で感染させることにより構築した。すなわち、患者のPBからの106個の単核細胞をB95-8EBV産生細胞株（Millerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:190-194, 1973, inch）の上清と共に、37℃で１時間、5％CO2中でインキュベートした。その後、感染したＢ細胞をシクロスポリンA（Sigma, St Louis, MO）を5μg/ml添加した完全培地中で約２週間培養した。In vivoで構築したEBV形質転換Ｂ細胞に典型的な細胞凝集および増殖により形質転換の成功を確認した。
【０２１１】
ＮＫ細胞仲介細胞傷害性アッセイ
ＮＫ細胞仲介細胞傷害性は、４時間の51Cr同位元素、または以前に述べた（Soderstromら、J. Immunol. 159: 1072-1075, 1997、本明細書に参考として編入）、18時間のアラマーブルー生存率アッセイ（Alamar Biosciences, Sacramento, CA）を用いて測定された。幾つかの実験において、最終濃度1μg/mlでのmAbの阻害が追加され、このアッセイの間存在した。
【０２１２】
HLA-E四量体産生
四量体産生用HLA-E発現ベクターは、Veronique Braud博士（Oxford, UK）より供与された。四量体HLA-E複合体は、本質的に以前に述べられた（Braudら、 Nature 391:795-799, 1991、本明細書に参考として編入）ように生成した。すなわち、Ｃ末端でBirA基質ペプチド（bsp）と融合したHLA-E重鎖と、ヒトβ２ミクログロブリン（β2m）を大腸菌BL21 pLysSにおいて過剰発現させ、封入体から精製し、DTTを含む8Mの尿素溶液に可溶化した。HLA-E-bsp、ヒトβ2mおよび合成ペプチド（VMAPRTVLL、HLA-B*0701リーダー配列由来、Research Genetics, Huntsville, AL）の複合体は、HLA-E-bsp、ヒトβ２およびペプチドをin vitroでリフォールドすることにより産生された。リフォールドされた複合体は、Superose12カラム（Amersham Pharmacia Biotech）によるサイズ排除クロマトグラフィーにより精製され、次いで、製造者の使用説明書に従ってBirA酵素（Avidity, Denver, CO）を用いてビオチン化した。遊離のビオチンは、NAP-5脱塩カラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて除去された。ビオチン化の程度は、ゲルシフトアッセイにより調べたところ、約90％であった。ビオチン化されたHLA-E/β2m/ペプチドモノマーを、ストレプトアビジン-PE（Sigma）と４：１のモル比で混合することにより、四量体を生成した。
【０２１３】
統計
陽性細胞の割合は平均値±標準偏差で示してある。SFとPBの比較には対応のあるスチューデントＴ検定を用いた。
【０２１４】
実施例V
関節炎患者由来NK細胞上のKIRおよびCD94/NKG2分子の発現
関節炎を罹患している患者由来の新規に単離されたNK細胞表現型およびサブセット分布を確定するために、一覧のmAbを用いて三色染色を行い、次いでフローサイトメトリー分析を行った。図７に示すように、患者のPBと比べて、SFにおいてわずかに増加した比率のNK細胞（CD3-CD56+）が観察された。更に、患者および健常者両者のほとんどのPB-NK細胞は、NK細胞マーカーCD16（FC□RIII）を発現した一方、減少頻度のCD16+NK細胞がSFにおいて観察され、これは他の報告（Hendrichら、Arthritis Rheum. 34: 423-431, 1991、本明細書に参考として編入）を裏付ける。更に、患者および健常な対照のSFおよびPB両者において、少ない比率のＴ細胞はCD56およびCD3に対してダブルポジティブであったが、患者と対照のSFおよびPBの間には有意な差は観察されなかった。
【０２１５】
特に、全ての患者は、対となるPBサンプルと比較して、SFにおいて極めて少量のKIR3DL1+、KIR2DL2/KIR2DL3+およびKIR3DL2+NK細胞を有していた（表６）。患者のPB-NK細胞におけるこれらのKIR分子の発現は外生であり、明らかに健常な対照のPB-NK細胞と異なっていなかった。SFにおける、ある古典的なHLA-A、-Bおよび-C分子に特異的なKIR分子を発現するNK細胞の比率の劇的な減少は、SF-NK細胞がKIR型の分子とは別の他のMHCクラスＩ特異的阻害性受容体に依存し、エフェクター機能を制御し得ることを示唆した。これらの結果を考慮して、NKG2A（またはそのスプライスバリアントであるNKG2B）と対となるCD94鎖が非古典的HLA-E分子に特異的に結合する阻害性ユニットを形成する、レクチン様MHCクラスＩ特異的受容体（すなわち、CD94/NKG2受容体複合体）の分析を行った（Braud ら、 Nature 391: 795-799, 1991、本明細書に参考として編入）。
【０２１６】
【表５】
2005523236.tif 000010
【０２１７】
ａ）患者および健常被験者（対照PB）のSFおよびPB由来の新規に単離された細胞は、様々なMHCクラスＩ特異的受容体（KIR3DL1、KIR2DL2/L3およびKIR3DL2）に対するmAbを用いて、第２段階としてFITC結合ヤギ抗マウス抗体を用いて、その後CD3（Cychrome）およびCD56（PE）に対するmAbと結合させて、三色染色を行った。結果は、それぞれの患者に対する組み合わせデータとして示された。RA患者７および９に対して提示されたSF値は、右／左ひざに対応している。CD56+CD3-ゲートリンパ球集団内に細胞を発現する、KIRの割合を示す（NK細胞ゲート内に5000〜10000事象を獲得）。対となるPBサンプルと比較した場合、患者のサンプルは、SFにおけるKIRを発現するNK細胞を劇的に低い割合で含んだ（KIR3DL1ではｐ＜0.001、KIR2DL2/L3ではｐ＜0.001、KIR3DL2ではｐ＜0.001; 対応のあるスチューデントＴ検定）。患者のPB-NK細胞におけるKIR発現は、健常対照のPB-NK細胞と異なっていなかった。
【０２１８】
明らかな一貫した知見は、ほとんどのSF-NK細胞は単一のヒストグラムピークとしてCD94に対する抗体で明るく染色され、一方PB-NK細胞における抗CD94染色パターンは二相性であることであり、これによりこの集団がCD94dimおよびCD94brightサブセットに分類される。図８Ａは代表的な患者のヒストグラム分布を示し、図８Ｂは研究した全患者から得られたデータを要約する。興味深いことに、ほとんどのSF-NK細胞もNKG2A分子を明るく発現したのに対し、一部のPB-NK細胞のみがNKG2A+であった（図８Ａおよび８Ｂ）。表６に示した結果と合わせて、これらの知見により、大多数のSF-NK細胞が阻害性CD94/NKG2A受容体複合体を発現し、劇的に減少した割合のKIR発現サブセットを含むことが示された。CD56の発現レベルによっても、大多数のSF-NK細胞がCD56brightサブセットに属する（57.7±5.3％、n=16）一方、少数の割合のPB-NK細胞のみがbrightCD56レベルを発現した（24.1±5.0％、n=14、ｐ＜0.001、対となるSF-NK細胞と比較）が、これは健常被験者由来のPB-NK細胞の中で見られた割合と近い（17.5±3.2％、n=8）ことが示された。
【０２１９】
更に、これらの分析により、患者のPB-NK細胞におけるKIR発現は常にCD56dimに限られた一方、ほとんどのCD56brightPB-NK細胞は、CD94brightおよびNKG2A+でなかった。したがって、CD56、KIR、CD94およびNKG2A染色分布に基づき、主なSF-NK細胞サブセットは健常者のみならず患者のPBに存在するCD56brightNK細胞の少数のサブセットと類似しており（図８Ｃ）、これはCD56、CD94およびNKG2A分子を高レベルで発現するSF-NK細胞と類似しているが、少なくともKIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1およびKIR3DL2分子をほぼ完全に欠いているようである。総括すると、炎症を起こしたSFは、患者および健常対照のPBと比較して、MHCクラスＩ特異的受容体がより限られた範囲を有するNK細胞サブセットに関して高められるようである。
【０２２０】
実施例VI
慢性関節炎患者のＴリンパ球サブセット上のKIRおよびCD94/NKG2の発現
KIRおよびCD94/NKG2分子の発現は、患者および健常被験者のαβ−およびγδ−Ｔ細胞で測定された。細胞をSFから得たか、PBから得たかに関わらず、KIRおよびCD94/NKG2A、BおよびC発現細胞の割合は、γδＴ細胞と比較すると、αβＴ細胞において低かった（それぞれ表６および表７）。しかしながら、これらの受容体がαβＴ細胞よりもγδＴ細胞においてより多く発生するということは文献でよく述べられているため、これは驚くべきことではない。興味深いことに、これらの分子の幾つかを発現しているαβＴ細胞およびγδＴ細胞の割合は、数人の患者のPBおよびSFサンプル対の間で顕著に異なっており（それぞれ表６および表７）、これは、特定のMHCクラスＩ特異的受容体を発現するＴ細胞の優先的な蓄積がある患者において起こり得ることを示唆する。このSFとPBの差はγδＴ細胞に関してさらに顕著であったが、数人の患者が、対となるPBと比較してSFにおいて実質的に低い割合（＞５倍）のあるKIR+サブセットを有していたものの（例えば患者RA1、RA4、RA5、A8およびポリ.A参照）、逆のパターンも観察された。したがって、この結果により、増加または減少した割合の、あるKIRおよび／またはCD94/NKG2発現αβ−またはγδ−Ｔ細胞がRA患者のPBまたはSFのいずれかに関与することを示唆する明らかな傾向は示されなかった。
【０２２１】
【表６】
2005523236.tif 000011
【０２２２】
ａ）関節炎患者および健常被験者（対照PB）のSFおよびPB由来の新規に単離された細胞は、様々なMHCクラスＩ特異的受容体（KIR3DL1、KIR2DL2/L3、KIR3DL2およびCD94/NKG2A、B、C）に対するmAbを用いて、第２段階としてFITC結合ヤギ抗マウス抗体を用いて、その後CD3（Cychrome）およびTCRαβ（PE）に対するmAbと結合させて、三色染色を行った。結果は、それぞれの患者に対して組み合わせデータとして示された。患者RA7に対して提示された結果は、右／左ひざに対応している。CD3+TCRαβ+ゲートリンパ球集団内に細胞を発現するKIRおよびCD94/NKG2の割合を示す（ゲート内に5000〜10000事象を獲得）。
【０２２３】
【表７】
2005523236.tif 000012
ＲＡ患者由来ＮＫ細胞株の機能分析
In vitroでIL-2の存在下で培養することにより、対となるポリクローナルCD3-CD56+SF-NKおよびPB-NK細胞株を構築した。1〜2週間後、これらのNK細胞株の細胞傷害性能を、各種標的細胞に対して試験した（721.221、K562、DaudiおよびP815）。表５に示すように、ポリクローナルSF-およびPB-NK細胞株の両者は、これらの様々な標的細胞溶解が可能であった。表８で試験されたようなこれらのＮＫ細胞株は、同じレベルの炎症促進サイトカインIFNγ、TNFαおよびIL-6も産生し、またほぼ同量のIL-2およびIL-10（ELISAアッセイを用いて並行して測定）も分泌し、細胞内IFNγに対してPMAでの刺激後、90％以上のSF-NK細胞およびPB-NK細胞が染色（フローサイトメトリーで測定）された。したがって、in vitroで確立されたSF-NK細胞およびPB-NK細胞株の間で、細胞障害性能およびサイトカイン産生に関する明らかな違いは観察されなかった。
【０２２４】
【表８】
2005523236.tif 000013
【０２２５】
a) 標的細胞の溶解は４時間の51Cr放出アッセイを用いて検出し、データを、in vitroで  培養された同一の患者由来のポリクローナルSF-NK細胞（SF-左の値）およびPB-NK細  胞（PB-右の値）を用いて、３つのE/T比で示す。短期のPB-NK細胞株の表現型は、KI  RおよびCD94/NKG2A発現に関しては外生であったが、SF-NK細胞株はCD94/NKG2Aを均質  に発現し、本質的にKIRの発現を欠いていた。
【０２２６】
実施例VII
自家細胞をＮＫ細胞の攻撃から防御する主要配位子として提示されたHLA-Eを滑液NK細胞株が機能的に認識
HLA-Eの表面発現は、他のHLA-A、-B、-Cおよび-G分子のシグナル配列に由来する九量体ペプチドへの結合に依存する。したがって、CD94/NKG2AとHLA-Eとの相互作用は、特定の多形および非多形のHLAクラスＩ分子の発現を間接的にモニタリングする特定のＮＫ細胞の戦略であると考えられる。形質転換システムでは、幾つかのHLA分子（例えば、許容性HLA-E結合シグナル配列を有するHLA-G）は過剰発現するので、NK細胞に発現するCD94/NKG2Aと相互作用するために十分な量のHLA-Eは収集することができる（Braudら、Nature 391: 795-799, 1991、本明細書に参考として編入）。
【０２２７】
SF-NK細胞がCD94/NKG2A受容体を介してHLA-Eを認識するかを機能的に試験するために、721.221細胞を用いて細胞傷害性アッセイを行った。721.221細胞は、HLA-B*5801(GL-B*5801）の細胞外ドメインに移植されたHLA-Gリーダー配列を含むキメラ遺伝子により安定に形質転換されている。対照としては、HLA-B*5801分子（CD94/NKG2A受容体による認識に関与しないＨＬＡ分子、Phillipsら、 Immunity 5:163-172, 1996を参照、本明細書に参考として編入）の全長を発現している721.211形質転換体を用いた。これら形質転換体の両者は、HLA-Bw4型対立遺伝子に特有の受容体であることを前に示したKIR3DL1+（およびCD94/NKG2A-）NK細胞クローンにより同様に良好に認識されるHLA-B*5801を細胞表面に発現する（Litwinら、J. Exp. Med. 180:537-543, 1994； D'Andrea ら、 J. Immunol. 155:2306-2310, 1995、それぞれ本明細書に参考として編入）。HLA-B*5801のほかに、GL-B*5801で形質転換した細胞も、CK94/NKG2A+NK細胞クローンにより機能的に検出可能なHLA-Eを表面発現する。図９Ａに示すように、ポリクローナルSF-NK細胞株は、形質転換されていない721.221細胞および野生型HLA-B*5801で形質転換した721.221細胞を効率良く死滅させる。しかしながら、NK細胞仲介溶解による防御はキメラGL-B*5801分子の発現により与えられた。CD94またはHCLクラスＩいずれかに対する抗体の存在下で防御は逆転するため、ポリクローナルSF-NK細胞は一様に、阻害性CD94/NKG2A受容体を介してHLA-Eを認識可能であることが明確に表された（図９Ｂ）。更に、患者のHLA-E四量体分子を有するPBおよびSF（HLA-B*0701九量体リーダーペプチド配列の存在下、リフォールドされる）から新規に単離したNK細胞を染色する場合、SF-NK細胞の大部分はHLA-E四量体により効率良く染色され、一方新しいPB-NK細胞は（CD56brightPB-NK細胞のほとんどを含む幾つかはHLA-E四量体陽性であったにも関わらず）十分に染色されなかった（図９Ｃは代表的な患者を示す）。PB中の多くのNK細胞がHLA-E四量体により染色されない理由は、おそらくCD94dimサブセットのCD94/NKG2分子が低レベルであることに起因する。
【０２２８】
CD94/NKG2AとHLA-Eとの相互作用により、SF-NK細胞が自家細胞を死滅させるのが防止され得るかを試験するため、RA患者１人からのB-LCLを標的としてNK細胞仲介細胞傷害性試験に用いた。図１０に示すように、PB-NK細胞およびSF-NK細胞の両者は自家B-LCLを溶解できなかった。しかしながら、エフェクターとしてポリクローナルPB-NK細胞およびSF-NK細胞の両者を用いることで、自家細胞における細胞溶解は、抗HLAクラスＩmAbまたは抗CD94mAbにより増加した。SF-NK細胞をエフェクターとして用いることで、抗CD94mAbによる溶解は抗HLA−クラスＩmAbで観察される場合とほぼ同レベルにまで回復した。これは、自己HLA防御メカニズムの大部分がCD94/NKG2AとHLA-Eとの相互作用を伴うことを示す。一方、ポリクローナルPB-NK細胞株も、他の受容体と配位子間の相互作用により調節されている。これは、抗CD94の添加が溶解を部分的にしか増加させない一方、抗HLAクラスＩは自己標的細胞をほぼ完全に溶解させるからである。以上の知見は、ポリクローナルPB-NK細胞の一部分のみがCD94/NKG2A+であり、ほぼ全てのSF-NK細胞がCD94/NKG2A+であったという事実に対応している。更に、図１０に示すこの患者の結果は、CD94/NKG2AがSF-NK細胞に存在する主な自己特異的受容体であることを示す。
【０２２９】
追加的研究により、RAおよび他の炎症性および自己免疫疾患、例えば有害な移植拒否反応に関連するHLA-E/CD94/NKG2細胞受容体相互作用および関連免疫応答を調節する本発明の重要な用途が更に明確になった。上述したように、ヒト関節の慢性炎症が永続化するのは、炎症性サイトカインが滑膜および滑液で次々と産生されるからである。ＮＫ細胞は有力なサイトカイン産生者であり、これら炎症部位に存在するが、慢性ヒト関節炎におけるその役割はこれまで概して知られていなかった。ＮＫ細胞の機能は、細胞表面の阻害的および活性化的な受容体が隣接細胞上の分子と相互作用することにより調節される。本開示では、キラー免疫グロブリン様受容体（KIR）およびＣ型レクチン様受容体CD94/NKG2Aによる滑液(SF)NK細胞発現について詳しく検討した。NK細胞における、起炎症性サイトカインIFN-γおよびTNF-αの産生能力についても詳しく検討した。ＮＫ細胞のサイトカイン産生（IFN-γおよびTNF-α）を阻害性HLA-E＋ペプチド複合体を発現する標的細胞の存在下で新規に調節することを報告する。
【０２３０】
上述の実施例の補足として、図１１は、SF-NK細胞が、例示としてのVMAPRTVLLペプチドと結合しているHLA-Eと結合することを表す。図１２は、SF-NK細胞が、VMAPRTVLL(B7sp)と結合しているHLA-Eとは結合するが、QMRPVRSVL(hsp60sp)ペプチドと結合しているHLA-Eとは結合しないことを示す。図１３は、SF-NK細胞が、RA患者または健常者のいずれかのPB-NK細胞と比較して、リポ多糖（LPS）に暴露するとIFN-γおよびTNF-αを産生するよう刺激されることを表す。図１４は、SF-NK細胞が、PB-NK細胞と比較して、IL-2への暴露後にIFN-γを産生するよう刺激されることを示す。図１５は、これらモデル研究において、B7シグナルペプチド（VMAPRTVLL）を提示するHLA-Eが、ＮＫ細胞のIFN-γおよびTNF-αサイトカイン産生を阻害するのに十分であることを表す。
【０２３１】
上述した補足結果は、慢性炎症性関節炎患者の関節液中のヒトＮＫ細胞が、前述のCD56-bright末梢血管のＮＫ細胞サブセットに類似した、表現型でも機能的にも独特なＮＫ細胞サブセットに属することを示す。関節炎の関節内のＮＫ細胞は、他のサイトカインが関節で産生されるに応答してIFN-γおよびTNF-αを強力に産生することにより炎症促進カスケードに加担し得る。また、これらＮＫ細胞のサイトカイン応答は、防御ペプチド、すなわちCD94-NKG2A阻害性受容体が認識する複合体と共にＨＬＡ−Ｅを発現する細胞に細胞接触すると著しく縮小される。HLA-Eが非防御ペプチドと結合しても、CD94/NKG2A阻害性受容体がこれを認識しないので、ＮＫ細胞のサイトカイン産生を阻害することができない。
【０２３２】
上述の実施例を要約すると、関節炎患者のSFからのNK細胞は、主にKIR分子を有さず、阻害性CD94/NKG2Aヘテロ二量体を均質に発現する独特なＮＫ細胞サブセットに表現型が属することが明らかとなった。本開示は、全てのヒト自己免疫疾患におけるＮＫ細胞サブセットの疾患に関連する特異な蓄積についての初めての記載であると考えられる。
【０２３３】
先の研究により、正常PB-NK細胞上のKIR発現は、個人毎にクローン化が拡がり変動的に発現されることが立証されている（Lanierら、Immunity 6:371-378, 1997、本明細書に参考として編入）。そのうえ、KIRの表面レベルおよびPB中の少なくとも幾つかのKIR+NK細胞サブセットの頻度はいずれも長期にわたり安定で、個人のHLAクラスＩハプロタイプと無関係であると考えられる（Gumperzら、J. Exp. Med. 183:1817-1827, 1997、本明細書に参考として編入）。したがって、特定のKIRアイソフォームを発現するＮＫ細胞が、適切な自己HLAクラスＩ分子を欠く個人には存在し、分子を有する個人には存在しない場合がある（同上）。したがって、特定の個人は、阻害性KIRまたはCD94/NKG2AのいずれかをMHCクラスＩの自己認識に用いるＮＫ細胞を有すると考えられる（Valianteら、 Immunity 7:739-751, 1997、本明細書に参考として編入）。若干の個人はさらに「広く」反応性のCD94/NKG2A系に依存するが、PK-NK細胞上のKIR発現の明確な減少はない。したがって、RA患者のPB-NK細胞上ではKIR3DL1、KIR2DL2、/KIR2DL3およびKIR3DL2分子が外見上正常なパターンで発現されるが、大部分のSF-NK細胞上ではこれらの分子は発現されず、その代わりCD94/NKG2A受容体が主に発現されるという特異な蓄積であることから、炎症関節によって与えられる環境は特定のＮＫ細胞サブセットのみであることが示唆される。
【０２３４】
CD56brightPB-NK細胞の少量のサブセットと大部分のSF-NK細胞サブセットとの間の表現型上の類似点は、この少量のPBサブセットが、局所的に生じるマクロファージ炎症性タンパク質１α（MIP-1α）、MIP-1βまたはRANTES等、炎症関節に存在すると知られている化学走化性因子に応答して選択的に炎症関節へと移動される（Hosakaら、Clin. Exp. Immunol. 97:451-457, 1994、本明細書に参考として編入）ことを示唆し、この予測されたメカニズムは本明細書の教示をいっそう確実にするものと評価される。CD56brightPB-NK細胞サブセットが、血管壁を転がる白血球に重要なより高レベルの分子（例えばCD62L）および炎症部位への白血球の癒着および溢出に必要な分子（例えば、CD2、CD11c、CD44、CD49e、CD54）(26)も発現するとの研究に基づくならば、CD56brightCD94/NKG2A+KIR-NK細胞サブセットが炎症関節に選択的に補充されている可能性がある。更に、関節に存在するサイトカイン（例えばIL-15）は選択的な増殖を促進し、および／またはこの特定サブセットをアポトーシスから救済することに関与し得る。
【０２３５】
上述した知見に加えて、本明細書の実施例は、SF-NK細胞が機能的にもHLA-Eを認識できることを表す。この認識が、SF-NK細胞を自家細胞攻撃から防護する主機能的な受容体と配位子との相互作用であることが立証された。
【０２３６】
CD94/NKG2A受容体自身が許容性リーダーペプチドを含有するHLAクラスＩ分子の大部分の存在を間接的に認識するため、均一に発現された広く反応性な系の存在は炎症関節内のＮＫ細胞において重要であり得る（Braud ら、Nature 391: 795-799, 1991、本明細書に参考として編入）。しかしながら、この受容体と配位子との相互作用に主に依存しているとこの系は攻撃されやすくなる。理由は、SF-NK細胞による自己寛容はHLA-E発現によってのみ維持されているからである。したがって、関節内細胞上で高レベルのHLA-E発現を維持することがSF-NK仲介細胞傷害性を防止するために必要になる。古典的MHCクラスＩ分子が正常レベルで産生されている限り、十分な量の防御的リーダーペプチドが作成されるはずであるから、HLA-E分子が細胞内に負荷され次に細胞表面に局在化し、その結果SF-NK細胞の応答が阻害されるものと推定される。しかしながら、RAを含む様々な自己免疫疾患の患者のリンパ球細胞表面上のMHCクラスＩ発現は外見上低レベルであると報告されている（Fu ら、J. Clin. Invest. 91:2301-2307, 1993、本明細書に参考として編入）。そこで、SF-NK細胞を適切に刺激してこれらHLA-Eのレベルを低くすれば、特定のリンパ球との相互作用後にＮＫ細胞の応答が誘起され滑液部位で重要な調節機能を担うことになるとの提案がされている。なお、抗原処理運搬体（TAP）を遺伝的に欠損し、その結果MHCクラスＩ細胞表面分子の発現量が全ての細胞上で皆無または少量である患者においては、機能的なCD94/NKG2A受容体がＮＫ細胞上に過剰発現されることは興味深く、このことは、MHCクラスＩのレベルが低いことへの対応がこの受容体の発現に関連していることを示唆する（例えば、Zimmer ら、J. Exp. Med. 187:117-122, 1998を参照、本明細書に参考として編入）。さらに、これら患者由来のin vitroで活性化されたＮＫ細胞は自家LCL細胞および繊維芽細胞を効果的に溶解したことから、このサブセットの寛容状態は崩壊し、その結果これらＭＨＣクラスＩ発現の低い細胞に対するＮＫ細胞の自己免疫反応が可能になったことが示唆される（同上）。
【０２３７】
RA患者から新規に単離したＮＫ細胞が示す溶解活性は通常低下しており（Lipsky, Clin. Exp. Rheumatol. 4:303-305, 1982で概説されており、本明細書に参考として編入）、刺激してもIFNγ産生との対応に乏しい（Bergら、Clin. Exp. Immunol. 1:174-182, 1999、本明細書に参考として編入）との報告は多数あるが、SF単核細胞培地からin vitroでＮＫ細胞を除去すると特定のIgアイソタイプの産生が促進されるとの報告もある（Tovarら、Arthritis Rheum. 29:1435-1439, 1986、本明細書に参考として編入）。このことから、SF-NK細胞は抗体産生の調節に関与しており、おそらくその原因は特定のＢ細胞を直接に細胞溶解するか、または間接的にサイトカインを産生し（例えばTGFβ）、それによって次に抑制的なＴ細胞反応が誘起されるからであると示唆される（Horowitzら、Immunol. Today 18:538-542, 1997、本明細書に参考として編入）。
【０２３８】
上述した結果で証明されるように、自己免疫関節症患者のSFでは、含有されるNK細胞の画分が有意に増大し、その絶対多数はCD94/NKG2A受容体を発現し、ごく少数だけがKIR3DL1、KIR3DL2/3およびKIR3DL2分子を発現する。SF-NK細胞はHLA-Eと結合可能であり、形質転換された細胞上のHLA-Eを機能的に認識するという証拠も提供されている。さらに、ポリクローナルSF-NK細胞株上に発現されたCD94/NKG2A受容体は、自家LCL細胞を用いた阻害実験で示すように、自己ＭＨＣクラスＩ反応性の調節に関与する主要受容体であると考えられる。
【０２３９】
実施例VIII
CD94-NKG2受容体ペアを結合するための「オン／オフスイッチ」能を有する合成HLA-E結合性ペプチドのスクリーニング
Hsp60リーダーペプチドと結合したHLA-Eは若干不安定であり、ペプチドを負荷した細胞をＮＫ細胞傷害性アッセイ中に37℃に昇温すると解離する傾向がある。ペプチド変異体は結合相互作用の安定性を向上あるいは低減する可能性があるが、それを同定することにより、本発明方法および組成物の使用、例えばin vivoでの治療使用のための別の活性剤が得られる。本発明の態様を向上するために、hsp60骨格の僅かな変性を特徴としたペプチド変異体を用いて、合成ペプチドまたはペプチド類似体の大規模スクリーニングを行うことができる。このスクリーニングを採用すれば、安定なHLA-E結合性ペプチドであって、活性化性CD94/NKG2受容体ペアとの機能的相互作用が向上したものを単離することできる。このようなペプチド類似体の単離には、幅広い腫瘍に対する治療への将来的関心がある。以下は、本発明で有用なペプチド変異体を同定する大規模スクリーニングプログラムの一例の概要である。
【０２４０】
材料：
−HLA-E*0101またはHLA-E*01033で形質転換したK562細胞
コメント：大規模ペプチドスクリーニング法を高速度化するために、GFPをコードするプラズミド（下記参照）と共にこれら細胞株を共形質転換してもよい。
−RPMI 1640培地
−九量体ペプチドライブラリー、hsp60リーダーペプチド骨格に基づく変性ペプチド、HLA-Eペプチド結合溝に結合する他の潜在的な合成または天然類似体。
−26℃インキュベーター
−37℃インキュベーター
−96ウェルプレートホルダー付き細胞遠心分離器
−96ウェル丸底プレート
【０２４１】
HLA-E安定化のための初期スクリーニング
ペプチドとHLA-Eの相互作用の研究から、培養培地に合成九量体ペプチドを添加して得られたHLA-E結合性ペプチドの存在により、フローサイトメトリーで測定されるHLA-Eの細胞表面発現レベルが十分に安定化され増加されることが判った。合成ペプチド／ペプチド類似体がHLA-Eと結合するかどうか試験するため、HLAE*01033またはHLAE*0101で形質転換したK562細胞を用いて、26℃で一夜、HLA-Eの細胞表面レベルを安定化させる。
【０２４２】
HLA-E*0101およびHLA-E*0133結合ペプチド／ペプチド類似体をスクリーニングする手順
HLA-Eで形質転換したK562細胞を、FCS非含有RPMI培地で２回洗浄し、200μlの300μＭペプチドを含むRPMI培地に、2×10e５細胞／ウェルで、96ウェル丸底プレートに設置する。プレートを26℃で一夜インキュベートし、その後FCS非含有RPMI1640培地で２回洗浄する。アリコートを抗クラスＩmAbで染色し、フローサイトメトリーによってHLAクラスＩ発現レベルに関して分析する。残存する細胞を37℃に戻し、１時間、２時間、３時間および４時間染色して、その後HLA-E／ペプチド複合体の安定性の評価を行う。このアプローチにより、かなり安定な複合体を形成する各種HLA-E結合性ペプチドをスクリーニングすることができる。
【０２４３】
CD94/NKG2A（阻害性）またはCD94/NKG2C（活性化性）受容体ペアのいずれかとの結合能によるHLA-E／ペプチド複合体の潜在的機能を評価する手順
【０２４４】
スクリーニングに用いるエフェクターＮＫ細胞
NKLおよびNishiNK細胞株（いずれも阻害性CD94/NKG2A受容体ペアを有する）を、RT-PCRにより、またはNKG2C特異的mAbおよび細胞表面染色とそれに続くフローサイトメトリーを用いて、NKG2C cDNA転写産物の存在に関して最初に分析する。これらの細胞株が活性化性NKG2C受容体鎖を欠いている場合は、リウマチ関節から確立した不均質なポリクローナルＮＫ細胞集団であって、主に機能性CD94/NKG2A受容体ペアを発現するものを、活性NKG2C受容体鎖の存在に関して分析する。
【０２４５】
手順
HLA-Eで形質転換したK562細胞であって、GFPと安定に共形質転換したものに、本発明者らの選択した各種HLA-E安定化ペプチドを９６ウェルプレート中で上記のように負荷する。洗浄後、これらの標的細胞プレートをエフェクターＮＫ細胞と共に37℃で２〜４時間インキュベートし、ＮＫ細胞仲介細胞障害性を前洗浄せずにフローサイトメトリーによって直接分析する。このアッセイ手順の正確な詳細および動的要件を、典型的なHLA-B*0701シグナルペプチド（VMAPRTVLL）およびhsp60シグナルペプチド（QMRPVRSVL）を負荷したHLA-E*0101およびHLA-E*01033で形質転換したGFP陽性K562細胞を用いて、実験的に最初に確定する。アッセイは、HLA-Eで形質転換した標的細胞の中で、ＮＫ細胞仲介溶解から防御されたものはGFP陽性（緑色蛍光）のまま生存可能ゲート内に留まり、溶解されたものは緑色蛍光を失い、結局生存可能ゲートの外側で終息することに基づく。このアッセイの有利な点は、かなり大きなペプチドライブラリーのスクリーニングを、一度に素早く行うことができることである。潜在的に不利な点は、対照ペプチドとして処置する細胞に比較して、標的細胞の溶解比率が有意に高いかどうか確定する閾値レベルを見極めることが困難かもしれないことである。したがって、この方法を使用する場合には溶解から良好に防御されるペプチドまたはペプチド類似体を最初に選択するのが望ましい。次に、残りの選択したペプチドの効果を、従来の方法によって試験する（すなわち、５１−Ｃｒ放射性同位元素ラベル標的細胞を用いたＮＫ細胞中仲介細胞傷害性）。この実験的アプローチにより、CD94/NKG2A阻害性受容体用の「オフスイッチ」として、および潜在的にCD94/NKG2活性化性受容体用の「オンスイッチ」として作用する、新規なペプチドおよびペプチド類似体をスクリーニングすることが可能となる。最終的には、この実験的アプローチにより、安定な防御HLA-E複合体（すなわち、CD94/NKG2A阻害性受容体用の「オンスイッチ」）を形成する新規なペプチドおよびペプチド類似体をスクリーニングすることが可能となる。
【０２４６】
実施例IX
Qa-1b(HLA-Eのマウス同族体）が腫瘍エスケープ（escape）に関連すること、およびCD94-NKG2A非結合性ペプチドの投与によりQa-1b発現腫瘍の拒絶の強化が達成されることの証明
HLA-E/hsp60複合体は、細胞疲労中に増加する。この複合体は、阻害性CD94-NKG2A受容体に認識されない。CD94-NKG2AはＮＫ細胞においてだけでなく、γ／δＴ細胞およびCD8＋細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）のサブセットにおいても発現する。古典的MHCクラスＩ分子の減少は、おそらく免疫検出からの逃避メカニズムとして、多くの腫瘍において起こる。したがって、例えば、古典的ＭＨＣクラスＩは減少しているがHLA-Eの発現は維持されている黒色腫細胞は、おそらく免疫系にとっては挑発的な標的であり、CTLおよびNK活性を阻害してきた。強いHLA-E結合能を有し、HLA-Eの結合溝で防御ＭＨＣクラスＩペプチドと潜在的に競合することができるhsp60シグナルペプチドまたは他の起炎症性HLA-E結合性ペプチド（例えば、ストレスタンパク質、熱ショックタンパク質、または本明細書に開示した他の例示的タンパク質由来）およびその類似体を用いることにより、新規な治療手段を開発し、ＮＫ細胞の活性化を誘起し、防御HLAE発現維持に基づいて免疫検出を回避してきた腫瘍細胞に対してCD94-NKG2A発現CTLを活性化するための閾値を低下することができる。
【０２４７】
最初に、Qa1-b発現腫瘍細胞に、選択したペプチドまたはペプチドの類似体を、およびhsp60ペプチド（GMKFDRGYI−既知のQa1-b結合性、CD94/NKG2A非結合性ペプチド（Lo ら、Nature Med. 6:215-218, 2000参照、本明細書に参考として編入））ならびにAMAPRTLLL（Qa1-b結合性、CD94/NKG2A結合性ペプチド（Kraft, J. Exp. Med. 192:613-623, 2000、本明細書に参考として編入）を負荷した。ＮＫ細胞除去（抗NK1．Ｉ処置）および非除去マウスにおいて分析を行い、CD94-NKG2A非結合ペプチドを使用して観察した場合にＮＫ細胞依存性の腫瘍拒絶が強化されるかどうか、また同様に、CD94-NKG2A結合性ペプチドを使用して観察した場合に腫瘍の構築が強化されるかどうかを確定する。
【０２４８】
実施例XIII
実験的に誘起した関節炎におけるマウスＮＫ細胞の研究
このモデルにおいて、コラーゲン誘起性関節炎（CIA）の発症および持続におけるＮＫ細胞の潜在的役割を確定する。疾病の誘起前および疾病が確立されている間にＮＫ細胞除去性抗体（NK1.1）を用いることによって、疾病の発生原因におけるＮＫ細胞の存在および非存在の役割が更に明らかにされる。ＮＫ細胞除去および非除去マウスにおける様々な組織（例えば脾臓、リンパ節、血液、関節組織）を収集し、ＮＫ細胞の存在および様々な細胞表面マーカーの発現に関して分析した。これらの分析の主な目的は、マウスCIAにおける炎症組織が、ヒトリウマチ関節炎（RA）の滑液と同様に、マウスにおけるHLA-E同族体に特異的なQa-1bと称するCD94-NKG2A受容体ペアを主に発現するＮＫ細胞の特異なサブセットを蓄積するかどうかを評価することである。これらの研究は、非古典的HLA-E/Qa-1bが炎症部位においてＮＫ細胞を調節する際に果たす役割を更に明らかにする。
【０２４９】
コラーゲンII型で免疫化すると、コラーゲン誘起性関節炎がC57B1/6マウスに起こり、関節にヒトRAに類似の組織病理学的変化を伴うことが示されている（Cambellら、Eur. J. Immunol. 30:1568-1575, 2000）。重要なことに、C57B1/6マウスは、qdmと称されるQa-1b結合性防御九量体シグナルペプチド（AMAPRTLLL）を担持するH-2bハプロタイプを所持しており、また抗NK1.1抗体で検出可能なＮＫ細胞を有している。このCIAモデルにより、Qa1b＋ペプチドの役割、およびNK細胞およびNK1.1陽性Ｔ細胞上に発現したマウスCD94/NKG2受容体との相互作用の更なる解明が可能である。
【０２５０】
マウス
C57BL/6(H-2b）マウスは、実験開始時に６〜８週齢であった。全ての実験をKariolinska Instituteの倫理ガイドラインの範囲内で行った。
【０２５１】
コラーゲン誘起性関節炎の誘起
100mgの熱死滅M. tuberculosis  H37Ra（Difco, Detroit, MI）を20mlの不完全フロイントアジュバント(IFA)(Difco)へ混合することにより完全フロイントアジュバント（CFA）を調製した。ニワトリCII（Sigma, St. Louis, MO）を10mMの酢酸（Sigma）中で４℃一夜インキュベートすることにより、2mg/mlの濃度に可溶化した。その後、ニワトリCIIをCFA中に1：1で乳化した。100μlのエマルジョンを、マウスの尾の付け根から皮内注射した。
【０２５２】
関節炎誘起時のＮＫ細胞の除去
CFA中のCIIで免疫する１日前に、マウス抗NK1.1(PK136、BD Biosciences）除去性mAb（PBS中200μg/マウス）をマウスに腹腔内注射した。除去効率を、pan-NK細胞抗体（DX5、BD Biosciences）で染色した血液のFACS分析によってNK1.1注射の２日後にモニタリングし、除去効率を確認した。除去の第２ラウンドは最初の除去の１０日後に行われた（すなわち、CIIによる免疫の９日後）。対照として、NK1.1と並行して、200μｇ／マウスのマウスIgG（Sigma）または同量（200μl）のPBSを動物に腹腔内注射した。
【０２５３】
関節炎の臨床的評価
臨床的評価をビジュアルスケールを用いて行った。１は１つの関節（通常つま先）における赤みと腫れ、評価２は２つ以上の関節における赤みと腫れ、評価３は足全体が罹患している場合を表す。各動物に、最大評価である１２を与えることができる。
【０２５４】
CIAの罹患率
図１６は、抗NK1.1抗体（NK1.1）、IgG対照（IgG1）およびPBSのみ（CII/CFA）で処置されたマウスにおける疾病の罹患率を示す。コラーゲンII注射による追加免疫は行わなかったため、対照群（すなわちCII/CFA）の数匹のマウスしかCIAを構築しなかった（10匹のマウスのうち１匹が28日目にCIAに罹患し42日目に緩解した）。一方、抗NK1.1抗体を注射した10匹のマウスのうち８匹が42日目にCIAを構築したが、IgG対照処置マウスの中の10匹のマウスのうち５匹のみが42日目に疾病の兆候を示した。
【０２５５】
全疾病評価
図１７は、抗NK1.1抗体（NK1.1）、IgG対照（IgGI）およびPBSのみ（CII/CFA）で処置された動物の全関節炎評価を示す。IgG処置およびPBS処置対照マウスとは対照的に、抗NK1.1抗体で処置されたマウスは重篤なCIAを示した。
【０２５６】
上記の結果は、NK1.1マーカーを発現する細胞の存在がCIAの誘導を防御するのに必要であることを示す。
【０２５７】
関節炎を調節するペプチド処理
Qa1b結合性防御qdmペプチド（AMAPRTLLL）、マウスhsp60（アクセッション番号：P19226）由来九量体（10〜18位；QMRPVSRAL）hsp60シグナルペプチド、および合成qdmR5Vペプチド（AMAPVTLLL）を、コラーゲンII型を注射する前後にマウスに投与する。これらの実験により、このモデルのコラーゲン誘起性関節炎の調節における、Qab1およびCD94/NKG2A相互作用のポテンシャルを調節する役割が明らかになる。
【０２５８】
Qa-1b結合性ペプチドを用いた実験的治療アプローチ
HLA-Eのように、Qa-1bは、大部分はMHCクラスＩシグナルペプチド由来の九量体ペプチドと結合する。このQa-1b／ペプチド複合体は、CD94-NKG2A阻害性受容体に対する機能的配位子を形成する。HLA-Eが、細胞疲労の間に熱ショックタンパク質60（hsp60）シグナルペプチド由来の九量体ペプチドを提供するという証拠がある。この提供は、抗原提供１および２（TAP1/2）と関連する輸送体と無関係なように思われるが、MHCクラスＩシグナルペプチドを新生HLA-E/Qa-1b分子に負荷するのに必要である。特に、HLA-E/hsp60シグナルペプチド複合体は、適切なMHCクラスＩシグナルペプチドと複合体を形成したHLA-Eを認識するCD94-NKG2A阻害性受容体のペアによって認識されない（Braudら、Nature 391: 795-799, 1991、本明細書に参考として編入）。Hsp60は、ヒトおよび実験的関節炎モデル両者の関節炎組織において高度に発現することが知られている（Kleinauら、Scand. J. immunol. 33:195, 1991； Karlsson-Parra ら、Scand. J. Immunol. 31:283, 1991； Boogら、J. Exp. Med. 175:1805, 1992、それぞれ本明細書に参考として編入）。潜在的に、関節炎の病巣は、主に局所的ＮＫ細胞の重要な誘発因子の一つであり得るHLA-E/hsp60シグナルペプチド複合体を含む。実験的関節炎（すなわちCIA）のモデルにおける第一段階として、阻害性CD94-NKG2A受容体ペアが認識可能な比較的安定なQa-1b/ペプチド複合体を形成することが知られているQa-1b結合性MHCクラスＩシグナルペプチド（すなわちAMAPRTLLL）の投与による潜在的治療効果を評価する。他のマウスには無関係の対照ペプチドを投与し、更に別の群には九量体hsp60ペプチドを投与する。CIAを構築する間にこれらのペプチドを最初に投与し、治療の可能性を評価する。かかるペプチドもコラーゲンIIの注射の前に投与する。関節炎の臨床的および組織学的評価を続ける。関節炎の実験的モデルにおけるペプチド療法の結果に基づき、これらの知見をヒトの臨床試験に置き換えて、特にHLA-EとおよびヒトCD94-NKG2受容体ペアに対する機能的配位子を形成するその能力とを標的とする新規の治療戦略を開発する。
【０２５９】
CD94/NKG2A受容体によって認識された適切な防御ペプチドを有するHLA-E分子を再生させることは、持続的な慢性免疫応答の治療的調節において有用である。主にCD94/NKG2A受容体を有するＮＫ細胞が関節炎患者の炎症を起こしている滑液に蓄積されるという知見を考慮すれば、本発明の方法に従って適切なHLA-E結合性ペプチドを治療的に投与することによって、炎症関節において十分なCD94/NKG2A仲介応答を再生することができる。更に、CD94/NKG2Aと結合していないHLA-E結合性ペプチドの局所投与は、NK細胞（およびＴ細胞）仲介抗腫瘍応答を増強する癌治療において、治療的価値があると考えられる。したがって、広く発現したHLA-E配位子のＮＫ細胞仲介認識をオンまたはオフのいずれかへ切り替えるスイッチを構成するHLA-E結合性ペプチドが提供される。
【０２６０】
上記発明は明確に理解させる目的で詳細に説明されたが、ある一定の変更および修正が本開示に包含されており、それらは格別の実験を必要とせずに添付の請求の範囲内で実施され、非制限的な実例によって提示されているものであることは当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
【図１】図１は、ヒトのhsp60のタンパク質配列を示す。ミトコンドリア標的シグナルは灰色で示してある。四角の箱に囲った四つの配列は、メチオニンとそれにＣ末端側に続くロイシンまたはイソロイシンまでの７個のアミノ酸を示しており、この二つの残基はHLA-Eポケットに結合するために重要である。Hsp60spは、この配列の残基番号10〜18に対応する。
【図２】図２は、HLA-E*0101またはHLA-E*01033で形質転換したK562細胞上でHLA-Eがhsp60spおよびB7spにより安定化されるのを図示する。300mMのhsp60sp（左側パネルの太線）またはB7sp（右側パネルの太線）と共に 26℃で一夜インキュベートした後のHLA-E*0101(上段パネル)またはHLA-E*01033(下段パネル)の細胞表面での発現。点線は300mMのコントロールペプチド（P18I10）と共にインキュベートした後のHLA-E発現を表す。細胞を抗MHCクラスIモノクロナール抗体DX17、次にRPEを結合したヒツジ抗マウスIgGで染色した。HLA-E発現を抗HLA-Eモノクロナール抗体3D12で染色することにより確認した。アイソタイプに対向するコントロール抗体での染色は影付きの灰色で示してある。10個を越える実験からの代表的な１例を示す。
【図３】図３は、細胞ストレスにより、全長のhsp60シグナルペプチドが過剰発現してHLA-Eの増加が促進されることを示す。高密度で増殖する細胞上でHLA-Eの表面発現をモニターした。（ヒストグラムの頂上に示す）1日目と５日目の間で細胞を集めHLA-Eの発現を分析した。各ヒストグラム内の上方右隅の数字は、分析時点での細胞密度（細胞数/ml）と生存率をそれぞれ示す。(a)欄の各ヒストグラム内の下方右隅の数字は、HLA-E発現のMFI(上段、黒色)およびGFPのMFI（下段、灰色）を示す。(b)欄の各ヒストグラム内の下方右隅の数字は、HLA-E発現のMFIを示す。細胞は全てHLAに特異的な抗体(DX17、点線)またはコントロールIg(灰色ヒストグラム)で、次にRPEを結合したヒツジ抗マウスIgGで染色した。(a) HLA-E*01033および全長(残基番号１〜26)野生型hsp60シグナルペプチドのGFP構造(野生型hsp60L、上段パネル)または変異体hsp60シグナルペプチドのGFP（変異hsp60L、下段パネル）で共形質転換し、高密度で培養したK562細胞。GFP陽性細胞上に開閉ゲートを設定し、このゲート内に10000個を獲得した。(b)高密度で培養したK562細胞（上段パネル）およびHLA-E*01033で形質転換したK562（K562 E*01033、下段パネル）。留意事項として、(b)のK562 E*01033細胞株および図(a)に示す共形質転換細胞株は独立に作成し選択したので、１日目で観察したHLA-Eの背景レベルは高めになっている可能性がある。したがって、HLA-Eの絶対レベルを図3aおよび図3bの間で直接に比較するのは望ましくない。
【図４】図４は、可溶性HLA-E四量体分子のCD94/NKG2受容体への結合を示す。(a) CD94およびNKG2Aで形質転換したBa/F3細胞をHLA-E/B7sp四量体（太線）、HLA-E/hsp60sp四量体(細線)、またはコントロールH-2Db/gp33四量体（点線）と共にインキュベートした。(b) CD94、NKG2CおよびDAP-12で形質転換したBa/F3細胞をHLA-E/B7sp四量体（太線）、HLA-E/hsp60sp四量体(細線)、またはコントロールH-2Db/gp33四量体（点線）と共にインキュベートした。(c) NK細胞株NKLをHLA-E/B7sp四量体（太線）、HLA-E/hsp60sp四量体(細線)、またはコントロールH-2Db/gp33四量体（点線）と共にインキュベートした。(d) HB-120B細胞ハイブリドーマ(抗MHCクラスI) をHLA-E/B7sp四量体（太線）、HLA-E/hsp60sp四量体(細線)、またはコントロールH-2Db/gp33四量体（点線）と共にインキュベートした。インキュベートは全て4℃で45分間1％PCSを補充したPBS中で行った。HLA-E/hsp60sp四量体は、HLA-E/hsp60sp四量体の濃度範囲にわたって、CD94/NKG2A陽性細胞およびCD94/NKG2C陽性細胞の両方に結合しなかった。以上は５個を越える実験の代表的な１例である。
【図５】図５は、hsp60spはK562 E*01033細胞をNK細胞による傷害から防護しないことを示す。K562 E*01033細胞を各種ペプチドと共に26℃で15~20時間インキュベートし、2h51Cr放出測定法でテストした。防護能はHLA-Eレベル単独ではなく、HLA-Eレベルと防護性ペプチドにより得られることを確実にするために、測定の間は、非防護性ペプチドを維持し、B7spを除外した。(a) 300mM P18I10コントロールペプチド、300mM hsp60sp、または300mM B7spと共にインキュベートした後にNKL(左)またはNishi(右)によるK562 E*01033細胞の殺傷。測定の間は、50mM P18I10コントロールペプチドおよびhsp60spが含有された。E：T比が30：1でのデータを示してある。図は少なくとも3個の実験の平均値を示す。誤差線は平均値からの標準偏差を示す。(b) 30mM B7sp、300mM P18I10(pCtrl)、300mM B7R5V、300mM hsp60sp、または300mM hsp60V5Rと共に一夜インキュベートしたNKL(左パネル)またはNishi(右パネル)によるK562 E*01033細胞の殺傷。測定の間は、B7spを除く全てのペプチドの50mMが含有された。図5cによりペプチド濃度を選定した。図は少なくとも3個の実験の平均値を示す。誤差線は平均値からの標準偏差を示す。(c)  測定後K562 E*01033細胞によるHLA-E細胞表面での発現。(a)および(b)におけると同様にして平行してコールドの標的調製物を作成し、DX17モノクロナール抗体(抗HLA-EクラスI)、次にRPEを結合したヒツジ抗マウスIgGで染色した。5個を越える実験からの代表的な一例を示す。留意すべきは、(a)および(b)におけると同様に、測定中はB7spを除く全てのペプチド50mMが存在した。すなわち、hsp60sp、hsp60V5RおよびB7R5Vに比較してB7spでのHLA-E発現は低かった。  (d) 0.1mM B7spと共に室温30分間のインキュベーション後にNashiによるK562 E*01033細胞の殺傷、および競合ペプチド（hsp60sp、hsp60.4、B7R5VおよびP18I10）量の増加。測定中は全てのペプチドを維持した。
【図６】図６は、細胞ストレス後K562 E*01033細胞上でHLA-Eの細胞表面レベルが増加してもNK細胞が介入する殺傷が防止されないことを示す。(a) 2h51Cr放出測定でのNKLによるK562 E*01033細胞（図3bにおけると同様に高細胞密度で増殖）の殺傷。(b) 100mM B7spの存在下上記と同じ実験設定。黒塗り丸印は高密度、白抜き四角は中密度、黒塗り三角は低密度。(c) 高細胞密度での培養後K562 E*01033細胞上でのHLA-Eの発現。
【図７】図７は、リウマチ関節炎(RA)患者の滑液（SF）に存在するNK細胞の比率の増加を示す。RA患者のSFおよびPB由来および健常コントロールのPB由来の新たに単離した単核細胞をCD56（PE結合)およびCD3（Cychrome結合）に対するモノクロナール抗体で染色した。リンパ球集団に開閉ゲートを設置し、約10,000個を獲得しフローサイトメトリーで分析した。結果は、リンパ球ゲート内のCD56+CD3+細胞パーセントの平均値±標準偏差で示す。リンパ球中のCD56+CD3+NK細胞の比率は細胞患者PB（9.4±1.3％、p<0.05）に比較してSF（14.1±2.2％）中で増加した。
【図８】図8A〜8Cは、SF-NK細胞がCD94ブライトおよびNKG2A+であり、CD56ブライトPB-NK細胞のマイナー集団に表現型が似ていることを示す。図8A：代表的なRA患者の右膝および左膝(それぞれ中段および下段ヒストグラム列)から採ったPB(上段ヒストグラム)およびSF由来の新たに単離した単核細胞を、CD94（DX22；太線、中央ヒストグラム欄）、NKG2A(Z199；太線、右側ヒストグラム欄)またはcIg(点線)に対する抗体、次にFITC結合ヒツジ抗マウスIgGおよび抗CD3（Cychrome結合）および抗CD56(PE結合；太線、左側ヒストグラム欄)で三重染色した。リンパ球ゲート内のCD56+CD3-NK細胞集団にゲートを設定した。留意すべきは、CD94はPB-NK細胞の中で明瞭に二相であり(CD94ディム集団とCD94ブライト集団に分裂)、大部分のPB-NK細胞はCD94ブライトNKG2A+集団に属し、一部分のPB-NK細胞のみがNKG2A+である。図8B：CD56+CD3-ゲートリンパ球集団内でCD94ディム、CD94ブライトおよびNKG2Aを発現する細胞の比率を計算した（このNK細胞ゲート内に5000〜10000個）。ほとんどがCD94ディム（69.2±4.9％、n=15）であるPB-NK細胞(黒棒)に比較すると、CD94ブライト小集団に属するSF-NK細胞の部分(白棒)はかなり増大している（78.5±3.0％、n=17、ｐ<0.001）。CD94ブライトSF-NK細胞の部分が増大すると、NKG2A+細胞が増加する(93.6％、n=6、p<0.001)。  図8C：CD56ブライトPB-NK細胞の小集団はメジャーなSF-NK細胞集団に表現型が似ている。7人の健常血液供給者から採った新たに単離したPB単核細胞をプールし直ちに以下の抗体で三重染色した。すなわち、コントロールIg(Y軸、上段左)、抗KIRモノクロナール抗体(Y軸上のDX9、DX27およびDX31、上段右)、抗CD94(Y軸上DX22、下段左)および抗NKG2A(Y軸上Z199、下段右)のカクテル、次にPE結合したヒツジ抗マウス抗体および抗CD3（Cychrome結合）および抗CD56(FITC結合、X軸)。リンパ球ゲート内の約105個が得られ、CD56ブライト細胞集団の中に少なくとも103個が得られ、分析ゲートをCD3-細胞上に設定した。留意すべきは、KIR発現はCD56ディムNK細胞集団に制限されている。他方、CD56ブライトNK細胞集団はKIR-であり、CD94およびNKG2Aを高レベルに発現する。
【図９】図９A〜９Cは、SF-NK細胞がHLA-Eを機能的に認識することを示す。図９A：二人の患者由来のin vitro培養ポリクロナールＳＦ−ンＫ細胞株をAlamar-blue細胞傷害測定法において  非形質転換721.221細胞(HLAクラスI、黒塗りバー)、GL-B*5801形質転換細胞（キメラタンパク質を発現する721.221細胞、ここでHLA-GリーダーペプチドをHLA-B*5801タンパク質の上に移植済み、斜線入りバー）および野生型HLA-B*5801形質転換721.221細胞(白色バー)に対するイフェクターとして使用した。E/T比率は1：1であった。図９B：図８Aで使用したのと同一の二つのポリクロナールSF-NKをAlamar-blue細胞傷害測定法(E/T比は1：1であった)において  非形質転換721.221細胞(HLAクラスI、白色バー)およびGL-B*5801形質転換細胞(黒色バー) に対するイフェクターとしてテストした。特定モノクロナール抗体でMHCクラスIまたはCD94を封鎖するとGL-B*5801形質転換細胞上のHLA-E発現による防護が逆転する。抗CD94(DX22)、抗HLAクラスI(w6/32)またはcIgは細胞傷害測定の間１μg/mlの濃度で存在した。図９C：四量体HLA-E分子は大部分のSF-NK細胞を明るく染色する。代表的なRA患者のPB(左側)およびSF(右側)由来の新たに単離した細胞をコントロール四量体（ストレプタビジン-PEに結合したマウスH2-Kb分子、上段等高線プロット上のY軸）およびHLA-E四量体分子(これらはY軸上のストレプタビジン-PEに結合したHLA-B*0701九量体の存在下に復元した、下段等高線プロット)およびCD56-FITC（X軸）で染色した。ゲートをCD3-Cychrome-リンパ球上に設定した。
【図１０】図10は、自己HLAクラスIのCD94/NKG2A結合は受容体/リガンドの主要な相互反応であり、これによって自家細胞がSF-NK細胞により溶解されるのが防止されることを示す。図9Aおよび9Bで分析したポリクロナールSF-NKおよびPB-NK細胞株（２患者）を４時間51Cr放出細胞殺傷測定法においてEBV形質転換自家細胞に対しE/T比率4：1で使用した。MHCクラスI(斜線入りバー)またはCD94/NKG2A（黒塗りバー）を特定モノクロナール抗体で封鎖すると自家細胞の殺傷が誘起されたが、cIg（白色バー）は効果をしめさなかった。SF-NK細胞株をイフェクターとして使用すると同様なレベルの殺傷が抗MHCクラスIまたは抗CD94モノクロナール抗体の存在下に観察された。このことから、自己防衛が起こる大部分の原因は自家細胞上でのCD94/NKG2AとHLA-AクラスIとの相互作用であると示唆される。抗CD94(DX22)または抗HLAクラスI(w6/32)またはcIgは、細胞傷害測定の間１μg/mlの濃度で存在した。
【図１１】図11は、SF-NK細胞が一例としてのVMAPRTVLLペプチドと錯結合してHLA-Eに結合するのを示す。四量体HLA-E/B7sp分子は大部分のSF-NK細胞を明るく染色する。代表的なRA患者のPB(左側)およびSF(右側)由来の新たに単離した細胞をコントロール四量体（ストレプタビジン-PEに結合したマウスH2-Kb分子、上段等高線プロット上のY軸）およびY軸上のストレプタビジン-PEに結合したHLA-E四量体分子(これらはVMAPRTVLLの存在下に復元した)およびCD56-FITC（X軸）で染色した。ゲートをCD3-Cychrome陰性リンパ球上に設定した。
【図１２】図12は、SF-NK細胞がVMAPRTVLL(B7sp)ペプチドとの錯結合でHLA-Eに結合するが、QMRPVRSVL(hsp60sp)との錯結合ではHLA-Eに結合しないことを示す。四量体HLA-E/B7sp分子は大部分のSF-NK細胞(上列、中央等高線プロット)およびSF-T細胞画分(下列、中央等高線プロット)を明るく染色する。HLA-E/hsp60spでのSF-NK細胞またはSF-T細胞の染色は観察されない（それぞれ上列、右側等高線プロットおよび下列、右側等高線プロット）。コントロール四量体（ストレプタビジン-PEに結合したマウスH2-Kb分子）染色は左側に示す。
【図１３】図13は、RA患者または健常固体のSF-NK細胞はPB-NK細胞に比較してLPSで刺激されるとIFN-γおよびTNF-αを産生する傾向が大きいことを示す。PBおよびSFの単核細胞(MC)を、LSP（10mg/ml）で終夜、またはK562(1：1細胞比)で4時間GolgStop(商標)の存在下で刺激した。細胞をCD3およびCD56について表面染色し、その後IFN-γまたはTNF-αについて細胞内染色した。分析をフローサイトメトリーで行った。
【図１４】図14は、SF-NK細胞はPB-NK細胞に比較してIL-2で刺激されるとIFN-γを産生する傾向が大きいことを示す。PBおよびSFの単核細胞(MC)を、IL-2（200U/ml）で終夜刺激した。細胞をCD3およびCD56について表面染色し、その後IFN-γまたはTNF-αについて細胞内染色した。分析をフローサイトメトリーで行った。
【図１５】図15は、HLA-Eが提供するB7シグナルペプチド（VMAPRTVLL）だけで十分にIFN-γおよびTNF-αのサイトカイン産生を阻害することを示す。HLA-E*01033で形質転換したK562上でのHLA-Eの発現は、各用量のHLA-B7シグナル配列誘導ペプチド（VMAPRTVLL）と共にインキュベートすることにより安定化された。次に、RA患者のPBおよびSF単核細胞(MC)を、ペプチド安定化K562細胞と共に(1：1細胞比)4時間 GolgStop(商標)の存在下でインキュベートした。細胞をCD3およびCD56について表面染色し、その後IFN-γまたはTNF-αについて細胞内染色した。分析をフローサイトメトリーで行った。
【図１６】図１６は、抗NK1.1抗体（NK1.1）、IgG対照（IgG1）およびPBSのみ（CII/CFA）で処置されたマウスにおける疾病の罹患率を示す。コラーゲンII注射による追加免疫は行わなかったため、対照群（すなわちCII/CFA）の数匹のマウスしかCIAを構築しなかった（10匹のマウスのうち１匹が28日目にCIAに罹患し42日目に緩解した）。一方、抗NK1.1抗体を注射した10匹のマウスのうち８匹が42日目にCIAを構築したが、IgG対照処置マウスの中の10匹のマウスのうち５匹のみが42日目に疾病の兆候を示した。
【図１７】図１７は、抗NK1.1抗体（NK1.1）、IgG対照（IgGI）およびPBSのみ（CII/CFA）で処置された動物の全関節炎評価を示す。IgG処置およびPBS処置対照マウスとは対照的に、抗NK1.1抗体で処置されたマウスは重篤なCIAを示した。
【図１】
2005523236.tif 000014
【図２】
2005523236.tif 000015
【図３】
2005523236.tif 000016
【図４】
2005523236.tif 000017
【図５】
2005523236.tif 000018
【図６】
2005523236.tif 000019
【図７】
2005523236.tif 000020
【図８Ａ】
2005523236.tif 000021
【図８Ｂ】
2005523236.tif 000022
【図Ｃ】
2005523236.tif 000023
【図９Ａ】
2005523236.tif 000024
【図９Ｂ】
2005523236.tif 000025
【図９Ｃ】
2005523236.tif 000026
【図１０】
2005523236.tif 000027
【図１１】
2005523236.tif 000028
【図１２】
2005523236.tif 000029
【図１３】
2005523236.tif 000030
【図１４】
2005523236.tif 000031
【図１５】
2005523236.tif 000032
【図１６】
2005523236.tif 000033
【図１７】
2005523236.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月8日(2004.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005523236000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月11日(2005.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病気治療に供する薬剤組成物であって、第２位にメチオニンを有し、第４位にプロリンを有し、第９位にロイシンまたはイソロイシンを有したペプチドを含んでおり、該ペプチドはヒト白血球アンチゲンＥ（ＨＬＡ-Ｅ）に結合してペプチド/ＨＬＡ-Ｅ複合体を形成する能力を有していることを特徴とする薬剤組成物。
【請求項２】
ペプチドはヒートショックプロテインからのペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも６５％のアミノ酸配列一致性を有していることを特徴とする請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項３】
ヒートショックプロテインからのペプチドはヒートショックプロテインからのシグナル配列であることを特徴とする請求項２記載の薬剤組成物。
【請求項４】
ペプチドはヒト白血球アンチゲンＡ、Ｂ、ＣまたはＧのシグナル配列からのペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６５％のアミノ酸配列一致性を有していることを特徴とする請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項５】
ペプチドは９のアミノ酸残基を有しており、第１位はバリン、アラニン、ロイシンまたはイソロイシンであり、第３位はアラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、第５位はアルギニンであり、第６位はセリンまたはスレオニンであり、第７位と第８位はそれぞれ独立的にアラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンまたはメチオニンであることを特徴とする請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項６】
ペプチドは９のアミノ酸残基を有しており、第１位、第５位及び第７位はそれぞれ独立的にアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンまたはバリンであり、第３位はバリン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニンから選択され、第６位はセリンまたはスレオニンであり、第８位はＬまたはＩであることを特徴とする請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項７】
ペプチドは９のアミノ酸残基を有しており、第１位はグルタミンまたはアスパラギンであり、第３位、第５位及び第７位はそれぞれ独立的にリジン、ヒスチジンまたはアルギニンであり、第６位はセリンまたはスレオニンであり、第８位はアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンまたはバリンであることを特徴とする請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項８】
免疫応答を調節することで治療される疾病に利用されることを特徴とする請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項９】
疾病は自己免疫症であることを特徴とする請求項８記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
自己免疫症は多硬化症またはリューマチ性関節炎であることを特徴とする請求項９記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
疾病はクローン病、潰瘍性大腸炎、移植拒絶反応、全身性エリテマトーデス、急性脊髄性白血病、卵巣癌、アテローム性動脈硬化症、及びインスリン依存真性糖尿病であることを特徴とする請求項８記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
疾病はウィルス疾患であることを特徴とする請求項８記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
ペプチドはリポゾーム内に捕獲されていることを特徴とする請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を有したベクターをさらに含んでいることを特徴とする請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
複合体はＣＦ９４/ＮＫＧ２受容体と相互作用するものであることを特徴とする請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
ＣＤ９４/ＮＫＧ２細胞受容体はＣＤ９４/ＮＫＧ２Ａ細胞受容体であることを特徴とする請求項１５記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
複合体はＣＤ９４/ＮＫＧ２受容体と相互作用するものであることを特徴とする請求項１５記載の薬剤組成物。
【請求項１８】
保護免疫応答を阻害するように複合体はＣＤ９４/ＮＫＧ２では認知されないものであることを特徴とする請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
保護免疫応答の阻害には天然キラー細胞またはＴ型細胞の細胞毒性活性またはサイトカイン放出の増加が含まれることを特徴とする請求項１８記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
第２の治療剤がさらに含まれていることを特徴とする請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項２１】
第２の治療剤は抗ウィルス剤、抗炎剤、抗癌剤または免疫抑制剤であることを特徴とする請求項２０記載の薬剤組成物。
【請求項２２】
生体適合性ポリマーキャリアがさらに含まれていることを特徴とする請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項２３】
キャリアは生物分解性ポリマーであることを特徴とする請求項２２記載の薬剤組成物。
【請求項２４】
ポリマーは吸収促進性ポリマーであることを特徴とする請求項２２記載の薬剤組成物。
【請求項２５】
アミノ酸配列に直接的に対抗する単クローン抗体の投与で使用する薬剤組成物であって、該アミノ酸配列は第２位にメチオニンを有し、第４位にプロリンを有し、第９位にロイシンまたはイソロイシンを有しており、前記アミノ酸配列はヒト白血球アンチゲンＥ（ＨＬＡ-Ｅ）に結合してペプチド/ＨＬＡ-Ｅ複合体を形成する能力を有していることを特徴とする薬剤組成物。
【請求項２６】
ヒト白血球アンチゲンＡ、Ｂ、ＣまたはＧのシグナル配列からのペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６５％のアミノ酸配列一致性を有しているペプチドに直接対抗する単クローン抗体をさらに含んでいることを特徴とする請求項２５記載の薬剤組成物。
【請求項２７】
免疫応答を調節することで治療される疾病に利用されることを特徴とする請求項２５記載の薬剤組成物。
【請求項２８】
疾病はウイルス疾患または癌であることを特徴とする請求項２７記載の薬剤組成物。
【請求項２９】
癌は急性脊髄性白血病であることを特徴とする請求項２８記載の薬剤組成物。
【請求項３０】
複合体は天然キラー細胞またはＴ型細胞上に存在するＣＤ９４/ＮＫＧ２受容体と相互作用することを特徴とする請求項２５記載の薬剤組成物。
【請求項３１】
ＣＤ９４/ＮＫＧ２細胞受容体はＣＤ９４/ＮＫＧ２Ａ細胞受容体であることを特徴とする請求項３０記載の薬剤組成物。
【請求項３２】
単クローン抗体はペプチドに結合するものであり、ＣＤ９４/ＮＫＧ２細胞受容体によるＨＬＡ-Ｅと該ペプチドの認知を妨害することを特徴とする請求項２５記載の薬剤組成物。
【請求項３３】
ペプチドは阻害性ペプチドであり、単クローン抗体に保護免疫応答を阻害させることを特徴とする請求項２５記載の薬剤組成物。
【請求項３４】
保護免疫応答の阻害は天然キラー細胞または細胞毒性Ｔ型リンパ球の細胞毒性活性またはサイトカイン放出の増加を含んでいることを特徴とする請求項３３記載の薬剤組成物。
【請求項３５】
免疫系調節組成物であって、
(a)第１位、第５位及び第７位はアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン及びバリンから独立的に選択され、第２位はメチオニンであり、第３位はバリン、ロイシン、イソロイシン及びアラニンから選択され、第４位はプロリンであり、第６位はセリンまたはスレオニンであり、第８位はロイシンまたはイソロイシンであり、第９位はロイシンまたはイソロイシンである第１ペプチドと、
(b)第１位はグルタミンまたはアスパラギンであり、第２位はメチオニンであり、第３位、第５位及び第７位はリジ、ヒスチジン及びアルギニから独立的に選択され、第４位はプロリンであり、第６位はセリンまたはスレオニンであり、第８位はアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンまたはバリンであり、第９位はイソロイシンまたはロイシンである第２ペプチドと、
を含んで成り、前記第１ペプチドと前記第２ペプチドはヒト白血球アンチゲンＥ（ＨＬＡ-Ｅ）と結合でき、ペプチド/ＨＬＡ-Ｅ複合体を形成することを特徴とする組成物。
【請求項３６】
ペプチドはリポゾーム内に捕獲されていることを特徴とする請求項３５記載の組成物。
【請求項３７】
生体適合性ポリマーキャリアをさらに含んでいることを特徴とする請求項３５記載の組成物。
【請求項３８】
キャリアは生物分解性ポリマーであることを特徴とする請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
ポリマーは吸収促進製ポリマーであることを特徴とする請求項３８記載の組成物。
【請求項４０】
第１ペプチドまたは第２ペプチドをエンコードした第１ヌクレオチド配列を含んだベクターであって、これらペプチドは哺乳類の免疫系の調整に有効であり、
(a)前記第１ペプチドは、第１位、第５位及び第７位がアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン及びバリンから独立的に選択され、第２位がメチオニンであり、第３位がバリン、ロイシン、イソロイシン及びアラニンから選択され、第４位がプロリンであり、第６位がセリンまたはスレオニンであり、第８位がロイシンまたはイソロイシンであり、第９位がロイシンまたはイソロイシンであるアミノ酸残基を有しており、
(b)前記第２ペプチドは、第１位がグルタミンまたはアスパラギンであり、第２位がメチオニンであり、第３位、第５位及び第７位がリジン、ヒスチジン及びアルギニンから独立的に選択され、第４位がプロリンであり、第６位がセリンまたはスレオニンであり、第８位がアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンまたはバリンであり、第９位がイソロイシンまたはロイシンであるアミノ酸残基を有しており、
該ペプチドは白血球アンチゲンＥ（ＨＬＡ-Ｅ）と結合でき、ペプチド/ＨＬＡ-Ｅ複合物を形成することを特徴とするベクター。
【請求項４１】
表面にヒト白血球アンチゲン-Ｅを有する細胞を有した哺乳類の免疫系の調節に使用する薬剤組成物であって、該ヒト白血球アンチゲン-Ｅは細胞上でＨＬＡ-Ｅ結合ペプチドで占領された結合切片を有して第１複合体を形成し、該第１複合体は天然キラー（ＮＫ）細胞またはＴ型細胞上の阻害性ＣＤ９４/ＮＫＧ２細胞受容体に対して露出され、該ＮＫ細胞またはＴ型細胞に対して第１調節効果を発揮するものであり、本薬剤組成物は、
第２位にメチオニンを有し、第４位にプロリンを有し、第９位にロイシンまたはイソロイシンを有したペプチドを含んでおり、該ペプチドはヒト白血球アンチゲンＥ（ＨＬＡ-Ｅ）に結合してペプチド/ＨＬＡ-Ｅ複合体を形成する能力を有しており、該ペプチドは該ＨＬＡ-Ｅ結合ペプチドとの競合において効果的であり、前記結合切片に結合して第２複合体を形成し、該第２複合体は前記ＣＤ９４/ＮＧＫ２細胞受容体に対して露出され、前記第１複合体の前記第１調節効果とは反対の第２調節効果を有していることを特徴とする薬剤組成物。
【請求項４２】
ペプチドは、ヒト白血球アンチゲンＡ、Ｂ、ＣまたはＧのシグナル配列からのペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６５％のアミノ酸配列一致性を有しており、第１調節効果はＮＫ細胞またはＴ型細胞を活性化させ、免疫系の活性化を阻害することを特徴とする請求項４１記載の薬剤組成物。
【請求項４３】
ペプチドは、ヒートショックプロテインからのペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６５％のアミノ酸配列一致性を有しており、第１調節効果はＮＫ細胞またはＴ型細胞の活性化を阻害し、免疫系を活性化させることを特徴とする請求項４１記載の薬剤組成物。
【請求項４４】
ペプチドは９のアミノ酸残基を有しており、第１位はバリン、アラニン、ロイシンまたはイソロイシンであり、第３位はアラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、第５位はアルギニンであり、第６位はセリンまたはスレオニンであり、第７位はアラニン、イソロイシン、ロイシンまたはメチオニンであり、第８位はアラニン、イソロイシン、ロイシンまたはメチオニンであることを特徴とする請求項４１記載の薬剤組成物。
【請求項４５】
ペプチドは９のアミノ酸残基を有しており、第１位、第５位及び第７位はそれぞれ独立的にアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンまたはバリンであり、第３位はバリン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニンから選択され、第６位はセリンまたはスレオニンであり、第８位はロイシン、イソロイシンまたはフェニルアラニンであることを特徴とする請求項４１記載の薬剤組成物。
【請求項４６】
ペプチドは９のアミノ酸残基を有しており、第１位はグルタミンまたはアスパラギンであり、第３位、第５位及び第７位はそれぞれ独立的にリジン、ヒスチジンまたはアルギニンであり、第６位はセリンまたはスレオニンであり、第８位はアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンまたはバリンであることを特徴とする請求項４１記載の薬剤組成物。
【請求項４７】
表面上にヒト白血球アンチゲン-Ｅを発現させることが可能な細胞を有した哺乳類の免疫系の調節に使用される薬剤組成物であって、該ヒト白血球アンチゲンＥは細胞阻害性ヒト白血球アンチゲンＥ-結合ペプチドを結合させる結合切片を有して、天然キラー細胞またはＴ型細胞上でＣＤ９４/ＮＫＧ２細胞受容体に露出される複合体を形成し、該天然キラー細胞またはＴ型細胞に対して阻害効果を発揮するものであり、本薬剤組成物は、前記ペプチドに効果的的に結合し、前記複合体と前記ＣＤ９４/ＮＫＧ２細胞受容体との間の相互作用を阻害する単クローン抗体を含んでおり、前記阻害効果の発生を抑えることを特徴とする薬剤組成物。
【請求項４８】
ペプチドは第２位にメチオニンを有し、第４位にプロリンを有し、第９位にロイシンまたはイソロイシンを有し、該ペプチドはヒト白血球アンチゲンＥ（ＨＬＡ-Ｅ）と結合してペプチド/ＨＬＡ-Ｅ複合体を形成することを特徴とする請求項４７記載の薬剤組成物。
【請求項４９】
ＣＤ９４/ＮＫＧ２細胞受容体はＣＤ９４/ＮＫＧ２Ａ細胞受容体であることを特徴とする請求項４７記載の薬剤組成物。
【請求項５０】
ペプチドは９のアミノ酸残基を有しており、第１位はバリン、アラニン、ロイシンまたはイソロイシンであり、第３位はアラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、第５位はアルギニンであり、第６位はアラニンまたはスレオニンであり、第７位はアラニン、イソロイシン、ロイシンまたはメチオニンであり、第８位はアラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンまたはメチオニンであることを特徴とする請求項４７記載の薬剤組成物。
【請求項５１】
第２位にメチオニンを有し、第４位にプロリンを有し、第９位にロイシンまたはイソロイシンを有したペプチドに直接的に対抗するたんクローン抗体であって、該ペプチドはヒト白血球アンチゲンＥ（ＨＬＡ-Ｅ）と結合してペプチド/ＨＬＡ-Ｅ複合体を形成できることを特徴とする単クローン抗体。
【請求項５２】
ペプチドはヒートショックプロテインからのペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６５％のアミノ酸配列同一性を有していることを特徴とする請求項５１記載の抗体。
【請求項５３】
ヒートショックプロテインからのペプチドはヒートショックプロテインからのシグナル配列であることを特徴とする請求項５２記載の抗体。
【請求項５４】
ペプチドはヒト白血球アンチゲンＡ、Ｂ、ＣまたはＧのシグナル配列からのペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６５％のアミノ酸配列同一性を有していることを特徴とする請求項５１記載の抗体。
【請求項５５】
ペプチドは９のアミノ酸残基を有しており、第１位はバリン、アラニン、ロイシンまたはイソロイシンであり、第３位はアラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、第５位はアルギニンであり、第６位はセリンまたはスレオニンであり、第７位と第８位は独立的にアラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンまたはメチオニンであることを特徴とする請求項５１記載の抗体。
【請求項５６】
ペプチドは９のアミノ酸残基を有しており、第１位、第５位及び第７位は独立的にアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンまたはバリンであり、第３位はバリン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニンであり、第６位はセリンまたはスレオニンであり、第７位と第８位はロイシンまたはイソロイシンであることを特徴とする請求項５１記載の抗体。
【請求項５７】
ペプチドは９のアミノ酸残基を有しており、第１位はグルタミンまたはアスパラギンであり、第３位、第５位及び第７位は独立的にリジン、ヒスチジンまたはアルギニンであり、第６位はセリンまたはスレオニンであり、第８位はアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンまたはバリンであることを特徴とする請求項５１記載の抗体。
【国際調査報告】
2005523236.tif 000035
2005523236.tif 000036
2005523236.tif 000037