(57)【要約】活性薬剤の制御された放出のための方法および組成物を提供する。該組成物はオリゴヌクレオチド足場および実質的に相補的なオリゴヌクレオチド因子を含む。活性薬剤はオリゴヌクレオチド因子に結合させられる。足場の分解が因子の分解よりも早く起こるように２つのオリゴヌクレオチドは異なったふうに分解されうる。足場が分解されるにつれ、因子が放出される。活性薬剤は治療薬であってもよく、あるいは診断薬であってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性薬剤の制御放出のための組成物であって、下記のもの：
（ａ）オリゴヌクレオチド足場；
（ｂ）オリゴヌクレオチド因子、該足場および因子オリゴヌクレオチドは実質的に相補的なものであり；
（ｃ）オリゴヌクレオチド因子に結合された活性薬剤；
を含み、足場の分解速度が因子の分解速度よりも速いものである組成物。
【請求項２】
該足場および因子オリゴヌクレオチドがそれぞれ５ないし１００個の核酸塩基を含むものである請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該足場および因子オリゴヌクレオチドがそれぞれ１０ないし４０個の核酸塩基を含むものである請求項１記載の組成物。
【請求項４】
該活性薬剤が該オリゴヌクレオチド因子に共有結合されている請求項１記載の組成物。
【請求項５】
ヌクレアーゼと接触した場合の足場の分解速度が、そのヌクレアーゼと接触した場合の因子の分解速度よりも速いものである請求項１記載の組成物。
【請求項６】
該活性薬剤が治療薬または診断薬である請求項１記載の組成物。
【請求項７】
該活性薬剤が、抗細菌剤、抗ウイルス剤、および抗増殖剤、抗真菌剤、および免疫抑制剤、および鎮痛剤からなる群より選択されるものである請求項１記載の組成物。
【請求項８】
エンドヌクレアーゼと接触した場合の足場の分解速度が、そのエンドヌクレアーゼと接触した場合の因子の分解速度よりも速いものである請求項１記載の組成物。
【請求項９】
エキソヌクレアーゼと接触した場合の足場の分解速度が、そのエキソヌクレアーゼと接触した場合の因子の分解速度よりも速いものである請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
該足場および因子オリゴヌクレオチドが少なくとも８０％相補的である請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
該足場および因子オリゴヌクレオチドが少なくとも９０％相補的である請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
該足場および因子オリゴヌクレオチドが１００％相補的である請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
同じであってもよくあるいは異なっていてもよい複数のオリゴヌクレオチド因子を含む請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
該オリゴヌクレオチド因子が同じものである請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
該オリゴヌクレオチド因子が異なったものである請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
該複数のオリゴヌクレオチド因子に結合した複数の活性薬剤を含み、活性薬剤が同じであってもよくあるいは異なっていてもよい、請求項１３記載の組成物。
【請求項１７】
（ａ）該活性薬剤が該オリゴヌクレオチド因子に共有結合されており、
（ｂ）該足場および因子オリゴヌクレオチドがそれぞれ５ないし１００個の塩基を含み、少なくとも９０％相補的であり、そして
（ｃ）エンドヌクレアーゼと接触した場合の足場の分解速度が、そのエンドヌクレアーゼと接触した場合の因子の分解速度よりも速いものである
請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
（ａ）該活性薬剤が該オリゴヌクレオチド因子に共有結合されており、そして
（ｂ）該足場および因子オリゴヌクレオチドがそれぞれ５ないし１００個の塩基を含み、少なくとも９０％相補的であり、そして
（ｃ）エキソヌクレアーゼと接触した場合の足場の分解速度が、そのエキソヌクレアーゼと接触した場合の因子の分解速度よりも速いものである
請求項１記載の組成物。
【請求項１９】
該オリゴヌクレオチド因子が、結合した標的化部分を有するものである請求項１記載の組成物。
【請求項２０】
該標的化部分が細胞表面受容体に対する特異性を有する抗体またはペプチドである請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
該オリゴヌクレオチド足場が結合した標的化部分を有するものである請求項１記載の組成物。
【請求項２２】
該標的化部分が細胞表面受容体に対する特異性を有する抗体またはペプチドである請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
（ａ）該標的化部分が細胞表面受容体に対する特異性を有する抗体またはペプチドであり、
（ｂ）該活性薬剤が該オリゴヌクレオチド因子に共有結合しており、
（ｃ）該足場および因子オリゴヌクレオチドがそれぞれ５ないし１００個の塩基を含み、少なくとも９０％相補的であり、そして
（ｄ）エンドヌクレアーゼと接触した場合の足場の分解速度が、そのエンドヌクレアーゼと接触した場合の因子の分解速度よりも速いものである
請求項１９記載の組成物。
【請求項２４】
（ａ）該標的化部分が細胞表面受容体に対する特異性を有する抗体またはペプチドであり、
（ｂ）該治療薬が該オリゴヌクレオチド因子に共有結合しており、
（ｃ）該足場および因子オリゴヌクレオチドがそれぞれ５ないし１００個の塩基を含み、少なくとも９０％相補的であり、そして
（ｄ）エキソヌクレアーゼと接触した場合の足場の分解速度が、そのエキソヌクレアーゼと接触した場合の因子の分解速度よりも速いものである
請求項１９記載の組成物。
【請求項２５】
（ａ）該標的化部分が細胞表面受容体に対する特異性を有する抗体またはペプチドであり、
（ｂ）該活性薬剤が該オリゴヌクレオチド因子に共有結合しており、
（ｃ）該足場および因子オリゴヌクレオチドがそれぞれ５ないし１００個の塩基を含み、少なくとも９０％相補的であり、そして
（ｄ）エンドヌクレアーゼと接触した場合の足場の分解速度が、そのエンドヌクレアーゼと接触した場合の因子の分解速度よりも速いものである
請求項２１記載の組成物。
【請求項２６】
（ａ）該標的化部分が細胞表面受容体に対する特異性を有する抗体またはペプチドであり、
（ｂ）該治療薬が該オリゴヌクレオチド因子に共有結合しており、
（ｃ）該足場および因子オリゴヌクレオチドがそれぞれ５ないし１００個の塩基を含み、少なくとも９０％相補的であり、そして
（ｄ）エキソヌクレアーゼと接触した場合の足場の分解速度が、そのエキソヌクレアーゼと接触した場合の因子の分解速度よりも速いものである
請求項２１記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１の組成物を対象に投与することを特徴とする、対象において活性薬剤を制御放出させる方法。
【請求項２８】
請求項１７の組成物を対象に投与することを特徴とする、対象において活性薬剤を制御放出させる方法。
【請求項２９】
請求項１８の組成物を対象に投与することを特徴とする、対象において活性薬剤を制御放出させる方法。
【請求項３０】
活性薬剤を対象にデリバリーする方法であって、該対象を固体支持体に結合した制御放出組成物と接触させることを特徴とし、該組成物が：
（ａ）該固体支持体に結合したオリゴヌクレオチド足場；
（ｂ）オリゴヌクレオチド因子、該足場および因子は実質的に相補的なものであり；および
（ｃ）該オリゴヌクレオチド因子に結合した活性薬剤；
を含むものであり、
足場の分解速度が因子の分解速度よりも速いものである方法。
【請求項３１】
該固体支持体が、ゲル、埋め込み型バイオセンサー、および塞栓形成コイル、整形外科的補てつ、埋め込み型三次元マトリックス、およびステントからなる群より選択されるものである請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
制御放出活性薬剤組成物を調製するためのキットであって、下記のもの：
（ａ）オリゴヌクレオチド足場を入れた第１の容器；および
（ｂ）結合した活性薬剤を有するオリゴヌクレオチド因子を入れた第２の容器
を含み、
ヌクレアーゼと接触した場合の足場の分解速度が、そのエキソヌクレアーゼと接触した場合の因子の分解速度よりも速いものであるキット。
【請求項３３】
細胞中の複数の遺伝子の機能を同時に調べる方法であって、下記工程：
（ａ）複数の既知位置を有する支持体上に細胞培養物を置き
ここに、
（ｉ）各既知位置は、異なるオリゴヌクレオチド足場および異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド因子を含む組成物と結合されており、
（ｉｉ）足場および因子は実質的に相補的であり、
（ｉｉｉ）各因子は既知遺伝子の発現を抑制するような形であり、そして
（ｉｖ）ヌクレアーゼと接触した場合の足場の分解速度が、そのヌクレアーゼと接触した場合の因子の分解速度よりも速いものであり；
（ｂ）培養物をヌクレアーゼと接触させ；
（ｃ）アンチセンス因子を足場から放出させて、細胞と反応させ；
（ｄ）蛋白発現に関して細胞を免疫染色し；次いで
（ｅ）各既知位置の近傍の細胞を分析して、細胞の生理に対するアンチセンス因子の影響を調べる
を含む方法。
【請求項３４】
試験試料中のヌクレアーゼ活性の存在を調べる方法であって、下記工程：
（ａ）試験試料を複合体と接触させ、
ここに、
（ｉ）複合体はオリゴヌクレオチド足場およびオリゴヌクレオチド因子を含み、
（ｉｉ）足場および因子は実質的に相補的であり、
（ｉｉｉ）因子は標識に結合されており、そして
（ｉｖ）ヌクレアーゼと接触した場合の足場の分解速度が、そのヌクレアーゼと接触した場合の因子の分解速度よりも速いものであり；
（ｂ）試験試料を複合体と反応させ；
（ｃ）標識された因子が足場から放出されるかどうかを調べ、かくして試験試料中のヌクレアーゼ活性の存在が示される
を含む方法。
【請求項３５】
足場の分解速度が因子の分解速度の少なくとも２倍である請求項１記載の組成物。
【請求項３６】
足場の分解速度が因子の分解速度の少なくとも１０倍である請求項１記載の組成物。
【請求項３７】
オリゴヌクレオチド足場がゲル形成性ＤＮＡである請求項１記載の組成物。
【請求項３８】
生物学的に活性のあるオリゴヌクレオチド因子の制御放出用組成物であって、下記のもの：
（ａ）オリゴヌクレオチド足場；および
（ｂ）オリゴヌクレオチド因子、該足場および因子オリゴヌクレオチドは実質的に相補的である
を含み、
足場の分解速度が因子の分解速度よりも速く、オリゴヌクレオチド因子は該オリゴヌクレオチド足場から放出された場合に生物学的に活性を有するものである組成物。
【請求項３９】
該オリゴヌクレオチド因子がアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項３８記載の組成物。
【請求項４０】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドがＣ型肝炎ウイルス蛋白の発現を阻害するものである請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
該オリゴヌクレオチド因子が遺伝子治療薬である請求項３８記載の組成物。
【請求項４２】
該オリゴヌクレオチド因子がリボザイムである請求項３８記載の組成物。
【請求項４３】
生物学的に活性のあるオリゴヌクレオチドを細胞中に輸送し放出させる方法であって、該細胞を請求項３８の組成物と接触させることを特徴とする方法。
【請求項４４】
該オリゴヌクレオチド因子がアンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子治療薬およびリボザイムからなる群より選択されるものである請求項４３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００１年１０月１８日出願の仮出願第６０／３３６３４４号についての利益を主張するものであり、参照により該仮出願の内容を本明細書に一体化させる。
【０００２】
発明の背景
分子生物学の分野が発展するにつれ、オリゴヌクレオチドの使用はインビトロ状態におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用、ゲノムマイクロアレイ、バイオセンサーおよび分子コンピューティング、ならびにインビボ状態でのアンチセンスおよびリボザイム治療のごとき遺伝子標的化治療を包含するようになってきた。これらの適用は、オリゴヌクレオチドの化学的性質の特徴づけならびにオリゴヌクレオチドの修飾を目的としたかなりの量の研究を促進してきた。例えば、ゲノムマイクロアレイまたは「遺伝子チップ」の出現は、固体表面上に容易に結合およびパターン化されうる官能基でキャップされたオリゴヌクレオチドの開発を導いた。インビボにおけるオリゴヌクレオチドに基づくアンチセンスおよびリボイザイム治療を検討することは、血清または他のヌクレアーゼ含有体液中でのオリゴヌクレオチドの半減期を延長させうる、ホスホロチオエート骨格のごとき異なるＤＮＡ骨格修飾物についての研究を導いた。
【０００３】
最近、オリゴヌクレオチドの化学的性質を改変することのみならずそれらを所望位置にて放出するための改良された方法を見出すことに注意が注がれている。
【０００４】
治療目的のオリゴヌクレオチドの制御された放出のための方法および組成物を開発することに大きな興味が持たれている。アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボでの半減期を改善する場合、例えば、ＤＮＡに結合し保護し、次いで、それをインビボで除々に放出することのできる合成ポリマーを用いる制御放出方法が有望と思われる。これらの方法において、ＤＮＡの制御放出には、ＤＮＡとイオン結合を形成する合成ポリマー足場、アニオン性ＤＮＡに結合するカチオン性ポリマーが用いられる。かかる化学物質はポリリジン（Leonetti et al., "Antiviral activity of conjugates between poly(L-Lysine) and synthetic oligodeoxyribonucleotides," Gene, 72(1-2):323-32, 1998, および Sakharov et al., "Polylysine as a vehicle for extracellular matrix-targeted local drug deliovery, providing high accumulation and long-term retention within the vascular wall," Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21(6):943-8, 2001 参照）およびポリアルギニン（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９８／５２６１４参照）を包含する。ポリマー−ＤＮＡ複合体が溶液中に置かれ、ポリマー足場中の結合の加水分解がポリマーの分解を引き起こす場合にＤＮＡの持続的放出が起こる。イオン結合したＤＮＡはゆっくりと溶液中に放出され、次いで、それが意図された効果を発揮しうる。かかるシステムに伴う問題は、主として使用されるポリマーの性質から生じる。特に、加水分解による分解産物は、しばしば、その近傍において大きな化学変化を引き起こす。多くの場合望ましくないことであるが、これらの結果はｐＨレベルの変動、細胞に対する毒性効果の発揮、インビボにおける免疫応答の誘発等を引き起こしうる。
【０００５】
治療的適用のほかに、診断およびアッセイ目的のオリゴヌクレオチドの制御放出のための方法および組成物の開発に大きな興味が持たれている。
【０００６】
上記の観点からすると、制御されたオリゴヌクレオチドの放出のためのよりエレガントな基盤に対する必要性が当該分野において存在する。理想的には、オリゴヌクレオチドの制御放出の基礎とされる足場または担体の材料はいくつかの特徴を有するべきである。第１に、所望の放出時間または状態の前に、足場はオリゴヌクレオチドを不安定化させないあるいは分解しないように結合しうるものであるべきである。好ましくは、足場は実際にオリゴヌクレオチドを保護し安定化させることに役立つものであるべきである。第２に、所望の放出時間または状態において、足場は、数分ないし数日のごとき使用可能な期間にわたり予想可能な速度で持続的放出を起こすものであるべきである。第３に、足場自体は放出の前後において、意図された適用を害する可能性のあるシステム中の大きな変動を引き起こすものであってはならない。例えば、大幅なｐＨ変化、細胞に対する毒性等を回避することが望ましい。インビボでの適用の場合、足場材料およびその分解産物の生体適合性が最も重要である。最後に、コスト、製造、集合（すなわち、足場へのオリゴヌクレオチドの結合）、ならびに適合性の問題を考慮しなければならない。
【０００７】
驚くべきことに、本発明は、オリゴヌクレオチドの制御された放出のためのかかる組成物および方法を提供するものである。
【０００８】
発明の概要
本発明は、オリゴヌクレオチドの制御された放出のための組成物、方法およびキットを包含する。詳細には、本発明は、オリゴヌクレオチド自体がオリゴヌクレオチドの放出のための便利で効率的な基盤を提供することを見出したことに基づく。
【０００９】
第１の態様において、本発明は、活性薬剤の制御された放出のための方法および組成物を提供する。該組成物はオリゴヌクレオチド足場および実質的に相補的なオリゴヌクレオチド因子を含む。活性薬剤はオリゴヌクレオチド因子に結合させられる。足場の分解が因子の分解よりも早く起こるように２個のオリゴヌクレオチドは異なったふうに分解されうるものである。足場が分解するにつれ、因子が放出される。活性薬剤は治療薬であってもよく、あるいは診断薬であってもよい。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、活性薬剤の制御された放出のための方法および組成物を提供する。該組成物はオリゴヌクレオチド足場および実質的に相補的なオリゴヌクレオチド因子を含む。足場の分解が因子の分解よりも早く起こるように２つのオリゴヌクレオチドは異なったふうに分解されうるものである。足場が分解するにつれ、因子が放出される。ここで、活性薬剤はオリゴヌクレオチド因子自体である。
【００１１】
第３の態様において、本発明は、固体または半固体支持体からの活性薬剤の制御された放出のための方法および組成物を提供する。該組成物はオリゴヌクレオチド足場および実質的に相補的なオリゴヌクレオチド因子を含む。足場は固体支持体に結合させられる。活性薬剤はオリゴヌクレオチド因子に結合させられる。足場の分解が因子の分解よりも早く起こるように２つのオリゴヌクレオチドは異なったふうに分解されうるものである。足場が分解するにつれ、因子が支持体から放出される。
【００１２】
第４の態様において、本発明は、制御された放出の組成物の製造のためのキットを提供する。該キットは、オリゴヌクレオチド足場を入れた第１の容器、および実質的に相補的なオリゴヌクレオチド因子を入れた第２の容器を含む。活性薬剤はオリゴヌクレオチド因子に結合させられる。足場の分解が因子の分解よりも早く起こるように２つのオリゴヌクレオチドは異なったふうに分解されうるものである。使用に際し、足場が分解するにつれ、因子が放出される。
【００１３】
このアプローチの利点は数倍である。足場およびそのヌクレオチド分解産物は低い毒性および高い生体適合性を示す。足場は、ヌクレアーゼのごとき予想可能かつ生物学的に適切な放出機構を提供する。足場−因子複合体は自己集合に適合したものである。該複合体は、放出前に相補的足場とハイブリダイゼーションすることによりオリゴヌクレオチド因子の安定化を提供する。オリゴヌクレオチド足場は柔軟性および十分に研究された化学的特性を提供する。そのうえ、これらの方法および組成物は、インビトロ適用およびインビボ適用の両方に適したものであり、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ機構の両方による放出に適したものである。
【００１４】
他の目的および利点は、図面と組み合わせて以下の説明から明らかであろう。
【００１５】
発明の詳細な説明
特記しないかぎり、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書記載のものと類似の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができ、好ましい方法および材料につき説明する。本明細書で述べるすべての刊行物を参照により本明細書に一体化させる。
【００１６】
一般
本発明は、オリゴヌクレオチドの制御された放出のための方法および組成物を提供し、ハイブリダイゼーションした複合体の使用を包含する。該複合体はオリゴヌクレオチド足場およびオリゴヌクレオチド因子を含む。足場および因子オリゴヌクレオチドは異なったふうに分解されて、オリゴヌクレオチド因子の制御された放出を提供する。
【００１７】
例えば、ヌクレアーゼ存在下において異なった挙動を示すように２つのオリゴヌクレオチドを設計してもよい。オリゴヌクレオチド因子はヌクレアーゼに対してより耐性があり、オリゴヌクレオチド足場はより耐性がない。かくして、足場は因子よりも早い速度で分解する。典型的には、活性薬剤はオリゴヌクレオチド因子に結合させられる。例えば、活性薬剤は治療薬であってもよく、あるいは診断薬であってもよい。
【００１８】
関連した実施例において、本発明は、ヌクレアーゼ存在下においてその相補鎖（鎖Ｂ）に対する制御放出足場としての１本鎖ＤＮＡ分子（鎖Ａ）を提供する。鎖Ａは鎖Ｂよりもヌクレアーゼ感受性である。放出の前に、鎖Ａおよび鎖Ｂは自己集合して２本鎖足場−因子複合体を形成する。ヌクレアーゼ存在下のごとき放出条件下において、鎖Ａは鎖Ｂよりも早い速度で分解する。適切な時期に、鎖Ｂが複合体から解離する。ヌクレアーゼ分解は確率により駆動されるイベントなので、鎖Ａのすべての分子が正確に同じ速度で分解されるとは限らず、かくして、混合物中の鎖Ｂの解離が持続し、持続性の放出が起こる。鎖Ａの分解産物はモノマーヌクレオチドであり、無毒で生体適合性である。後でさらに説明するように、これらの短鎖１本鎖ＤＮＡ分子が分子生物学において多くの重要な用途を有するのと同様、鎖Ｂは摂取されてオリゴヌクレオチドとなる。
【００１９】
オリゴヌクレオチドを用いる場合、合成ポリマーのかわりに、本発明者らの分解可能足場として、古い分子（例えば、ＤＮＡ）は制御放出の新たなトリックを効果的に教示した。一般的に核酸に基づく分子は薬剤または作用剤のデリバリー用の材料として有望視されていなかった。足場材料としてのオリゴヌクレオチドの新しい用途と同様に、放出機構もまた以前説明されていなかった。本明細書に記載された足場は、ヌクレアーゼ活性が存在する場合にのみ分解可能オリゴヌクレオチド（鎖Ａ）を分解させる。放出されるべきオリゴヌクレオチド（鎖Ｂ）がより耐性であるかぎり、ヌクレアーゼは、ＤＮＡを鎖の末端から分解するエキソヌクレアーゼ、鎖内部でＤＮＡを分解するエンドヌクレアーゼ、あるいはエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性の両方を有するヌクレアーゼであってよい。このことは容易に達成されうる。
【００２０】
ヌクレアーゼにより引き金を引かれる放出の利点はいくつかある。インビトロ適用の場合、引き金を引くことによる放出は、分解および放出の開始を容易に制御することを可能にする。ヌクレアーゼが溶液に添加されるまで放出は開始しない。ヌクレアーゼ添加の前には、オリゴヌクレオチド足場はポリマー足場とは異なり溶液中で安定なままである。インビボでの使用の場合、血清を包含する大部分の体液は本質的にエキソヌクレアーゼを含有しており、それゆえ本来的に放出プロセスの引き金を引くので、ヌクレアーゼにより引き金を引かれる放出は特に都合がよい。
【００２１】
さらに、炎症および細胞死のごとき多くの異常なインビボでの状態は、鎖の末端ではなく中ほどからＤＮＡ鎖を分解するエンドヌクレアーゼによる放出を引き起こす。かかる酵素の存在により、かかる異常な環境に特異的なエンドヌクレアーゼ機構を介してオリゴヌクレオチド因子の制御された放出が可能となる。ＤＮＡ足場の修飾等によりエンドブクレアーゼに対してより耐性とするようにオリゴヌクレオチド因子を設計することにより、エンドヌクレアーゼ機構の放出は容易に達成されうる。結果として、該因子はその実質的に相補的なオリゴヌクレオチド足場よりも遅く分解する。
【００２２】
オリゴヌクレオチドのための制御放出足場としてのＤＮＡの使用はさらに多くの利点を提供する。第１に、合成ポリマーとは異なり、ＤＮＡは、天然のＤＮＡの構成ブロックであるモノマー分子にまで分解する。結果的に、生体適合性および毒性の問題は生じない。第２に、２本鎖ＤＮＡ足場−オリゴヌクレオチド複合体は本来的に１本鎖よりもずっと安定である。よって、分解可能なＤＮＡ鎖（鎖Ａ）は、放出前には、結合しているオリゴヌクレオチド（鎖Ｂ）の安定化および保護に実際に役立つ。第３に、２本のＤＮＡ鎖が相補的なので、適切な熱力学的条件下において互いにハイブリダイゼーションすることにより足場−オリゴヌクレオチド複合体が自己集合し、そのことは、製造を大いに簡略化させる。さらに、集合相互作用は、合成ポリマー足場に存在するイオン性相互作用よりも水素結合に負うところが大きい。このタイプの相互作用および化学的性質はよく研究されており、足場または放出される因子に種々の修飾を施すことができ、特定の機能に関して複合体を最適化することができる。よって、制御された放出のための足場としてＤＮＡを用いることにより、本明細書記載の組成物は、個々の用途のための設計に関して非常に柔軟性を有する。
【００２３】
例えば、ＤＮＡを遺伝子チップの表面に結合させるのと同じ化学修飾を行なうことにより、足場ＤＮＡ鎖（鎖Ａ）に、固体表面からの実質的に相補的なオリゴヌクレオチドの放出を媒介させることができる。このことは、バイオセンサーテクノロジーまたはアンチセンスおよび他の治療薬のデリバリー、移植されたデバイス、冠状動脈ステント、あるいは移植片に関連する。もう１つの有用な修飾は、鎖Ａの末端の一方に抗体またはペプチドを結合させて細胞タイプ特異性を付与することを包含し、そうすることにより足場−オリゴヌクレオチド複合体は特定細胞の表面に結合できる。そのことによりオリゴヌクレオチド因子が放出後にこれらの細胞により優先的に取り込まれる。かくして、ＤＮＡにより媒介される制御放出のユニークな特徴は、オリゴヌクレオチドに関して現在使用されているポリマー基盤に優る有意な利点を明確に提供する。
【００２４】
図１から図４までは本発明の一般的概念の説明を提供する図１において、足場および因子オリゴヌクレオチド鎖が実質的に相補的である足場−因子複合体が説明される（分解プロセス前）。図２は、足場オリゴヌクレオチドは分解されるが因子オリゴヌクレオチドは分解に耐性である分解プロセスを示す。分解産物が特定のサイズとなるように設計されうる開裂部位を示す。因子オリゴヌクレオチドに結合した治療薬も示す。結合は非共有結合（例えば、イオン結合）または共有結合（示さず）を介するものであってよい。図３は、足場オリゴヌクレオチドが結合された標的化部位をその３’−末端に有し、因子オリゴヌクレオチドが結合された治療薬をその３’−末端に有する本発明のもう１つの例を示す。最後に図４は、支持体に結合された足場オリゴヌクレオチドの分解後の、支持体からの因子オリゴヌクレオチドの放出を示す。
【００２５】
具体例の説明
制御放出組成物
好ましい具体例において、本発明は、活性薬剤の制御された放出のための組成物を提供する。該組成物はオリゴヌクレオチド足場および実質的に相補的なオリゴヌクレオチド因子を含む。活性薬剤はオリゴヌクレオチド因子に結合させられる。足場の分解が因子の分解よりも早い速度で起こるように２つのオリゴヌクレオチドは異なったふうに分解されうる。足場が分解するにつれ、因子が放出される。活性薬剤は治療薬であってもよく、あるいは診断薬であってもよい。
【００２６】
オリゴヌクレオチド
本明細書の用語「オリゴヌクレオチド」は、１またはそれ以上のタイプの化学結合により、通常には相補塩基対により、通常には水素結合形成により、相補的配列の標的核酸に結合しうる核酸をいう。オリゴヌクレオチド足場は因子配列に結合できるが、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによっては足場に対して完全な相補性を欠くものであることを、当業者は理解するであろう。
【００２７】
好ましい具体例において、オリゴヌクレオチドはアデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルのごとき天然の塩基を含んでいてもよい。所望により、オリゴヌクレオチドは７−デアザグアノシン、イノシン、４−アセチルシチジン、ジヒドロウリジン、ケルノシン、ウィブトシン等のごとき修飾塩基を含んでいてもよい。
【００２８】
好ましい具体例において、オリゴヌクレオチドの塩基はホスホジエステル結合により結合されている。もう１つの好ましい具体例において、ハイブリダイゼーションを妨害しない限り、オリゴヌクレオチド中の塩基はホスホジエステル結合以外の結合により互いに結合されていてもよい。よって、例えば、オリゴヌクレオチドは、構成塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合により結合されているペプチド核酸（ＰＮＡｓ）であってもよい。処置またはアッセイの必要性に応じて種々のレベルのｐＨ感受性、あるいは加水分解感受性を示すように結合を選択してもよい。
【００２９】
さらにもう１つの好ましい具体例において、いずれか一方のオリゴヌクレオチドは、合成の、天然に存在する、天然に存在しない、リファレンス核酸と類似の結合特性を有する、そしてリファレンス核酸と類似の様式で代謝される、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであるヌクレオチド、ならびに既知のヌクレオチドアナログまたは修飾足場残基もしくは結合を含むことができる。かかるアナログの例は、ホスホロチオエート、ホスホラミダイト、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチドおよびペプチド−核酸（ＰＮＡｓ）を包含するが、これらに限定されない。特に好ましい具体例において、足場オリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドから製造された、ヌクレアーゼ分解に対して感受性になったものである。
【００３０】
特に好ましい具体例において、オリゴヌクレオチド足場は５ないし１００個の核酸塩基、より好ましくは１０ないし４０個の核酸塩基を有する。同様に、オリゴヌクレオチド因子はオリゴヌクレオチド足場に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチドであり、好ましくは、５ないし１００個の核酸塩基、より好ましくは１０ないし４０個の核酸塩基を有する。
【００３１】
当業者は、本発明のオリゴヌクレオチド構築物が、塩基および結合の異なる組み合わせに基づいて、種々の形式で存在しうることを理解するであろう。
【００３２】
ハイブリダイゼーション
好ましい具体例において、オリゴヌクレオチド足場およびオリゴヌクレオチド因子は、それらのそれぞれの配列の有意な部分に関して互いに、完全でないにしても、実質的な相補性を有する。このオリゴヌクレオチド配列の「有意な部分」は、典型的には、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端上のオーバーハングのごとき、相補的でないように特別に設計された配列の部分を除外するものとする。一般的には、これらの部分は、後で説明するような診断および治療部分の結合のような、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび放出以外の機能のために含められている。
【００３３】
本発明において、２つのオリゴヌクレオチド配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれら２つの配列が互いにハイブリダイゼーションする場合には、実質的に相補的である。語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」とは、典型的には核酸の複合体混合物中において、１のオリゴヌクレオチドがその標的配列または第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションするが、標的配列に対して十分な相補性または類似性を欠く他の配列にはハイブリダイゼーションしない条件をいう。
【００３４】
当業者は、ストリンジェントな条件が配列に依存するものであり、異なる環境においては異なるものであることを理解するであろう。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイゼーションする。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる指針はTijssen, Techniques in Biotechnology and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)中に見出される。一般的には、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低いように選択される。Ｔｍは、平衡状態（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、オリゴヌクレオチドの５０％が平衡に用いられる）において標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドの５０％が標的配列にハイブリダイゼーション（一定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度において）する温度である。
【００３５】
当業者は、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０ないし８．３において、塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオン濃度未満、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（あるいは他の塩）であり、温度が、短いオリゴヌクレオチド（例えば、１０ないし５０ヌクレオチド）の場合には少なくとも約３０℃、長いオリゴヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドよりも長い）の場合には少なくとも約６０℃である条件であることを理解するであろう。
【００３６】
ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのごとき不安定化剤の添加で達成されうることも当該分野において知られている。選択的あるいは特異的ハイブリダイゼーションのためには、ポジティブシグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２倍、最適にはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも１０倍である。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は下記のものであってもよい：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、および１％ ＳＤＳ、４２℃でインキュベーション、あるいは５ｘＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、６５℃でインキュベーション、０．２ｘＳＳＣ、および０．１％ ＳＤＳ中６５℃で洗浄。かかる洗浄を５、１５、３０、６０、１２０分またはそれ以上行なうことができる。
【００３７】
好ましくは、オリゴヌクレオチド足場およびオリゴヌクレオチド因子は、標的配列に対して少なくとも５０％相同、より好ましくは少なくとも７０％相同、最も好ましくは少なくとも９０％相同である。さらに、通常には、この場合、いずれか一方のオリゴヌクレオチドの末端におけるオーバーハングのような、ハイブリダイゼーションしないように慎重に設計されたいずれか一方のオリゴヌクレオチドの部分を除外する。
【００３８】
分解可能性
好ましい具体例において、本質的にはオリゴヌクレオチド足場は、同じまたは類似の条件下でオリゴヌクレオチド因子が分解する速度よりも早い速度で分解するいずれのオリゴヌクレオチドであってもよい。換言すれば、オリゴヌクレオチドは異なったふうに分解されるものである。
【００３９】
もう１つの好ましい具体例において、オリゴヌクレオチド足場はエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼのいずれかにより分解される。確立された方法（例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, NY, 1989参照）により、あるいは本発明のアッセイ（アッセイのセクション参照）によりヌクレアーゼ分解の評価を行うことができる。
【００４０】
好ましい具体例において、本発明の足場-因子複合体は、異なったふうに分解可能なオリゴヌクレオチドの最適な組み合わせを示す。一般的なヌクレアーゼ活性のアッセイにおいて評価される場合、好ましくは、足場の分解速度は因子の分解速度の１．５倍である。好ましい具体例において、足場の分解速度は因子の分解速度の２倍である。もう１つの好ましい具体例において、足場の分解速度は因子の分解速度の１０倍である。
【００４１】
当業者は、一定条件下でより早い分解速度で分解する、あるいは一定条件下でより遅い速度で分解するオリゴヌクレオチド配列を選択することが望ましいかもしれないことを認識するであろう。確立された方法、あるいは本発明のアッセイ（アッセイのセクション参照）によりオリゴヌクレオチド分解可能性の検出および評価を行うことができる。
【００４２】
当業者は、広範な分解特性を示すようにオリゴヌクレオチドを設計できることを理解するであろう。好ましい具体例において、オリゴヌクレオチドは一方の末端において、エキソヌクレアーゼ耐性を付与することが知られている３’−３’チミジンのごとき修飾塩基を含んでいてもよい。
【００４３】
好ましい具体例において、オリゴヌクレオチドは、ある程度の分解可能性をオリゴヌクレオチドに付与するホスフェート結合を含むものである。関連した具体例において、オリゴヌクレオチドは、別の程度の分解可能性を付与するホスホロチオエート結合を含むものである。もう１つの具体例において、オリゴヌクレオチドは、さら別の分解可能性をオリゴヌクレオチドに付与するメチルホスホネート結合を含むものである。さらにもう１つの具体例において、オリゴヌクレオチドはペプチド結合を含むものである。
【００４４】
ある種のタイプの結合はオリゴヌクレオチドの分解感受性を高め、あるいは低くすることが知られている。エンドヌクレアーゼ感受性を付与するいくつかのタイプの結合が知られており、また、エキソヌクレアーゼ感受性を付与するいくつかのタイプの結合も知られている。当業者は、種々のタイプの結合を種々のタイプの塩基と組み合わせることにより、多様な分解可能性プロファイルを示すオリゴヌクレオチドを得ることが可能であることを理解するであろう。
【００４５】
当業者は、異なる分解可能性プロファイルが特定の放出機構の反応動力学を付与し、治療またはアッセイの要求に応じてこれらのパラメーターを最適化できることを認識するであろう。
【００４６】
さらに別の具体例において、鎖のオーバーハングを介してハイブリダイゼーションする鎖を「重ねる」ことによりオリゴヌクレオチドを集合させて、放出が開始されるまで３個または４個の別個の鎖をすべて集合させておくこともできる。
【００４７】
もう１つの好ましい具体例において、オリゴヌクレオチド足場は例えば紫外光のごとき電磁波照射により分解される。
【００４８】
治療活性薬剤
具体例の１のグループにおいて、オリゴヌクレオチド因子は結合された治療薬を有する。本発明のこの態様において、本質的に治療薬剤は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに結合している結合基への共有結合または非共有結合を形成しうるいずれの薬剤であってもよい。いくつかの具体例において、結合基への、あるいはより直接的にオリゴヌクレオチド因子への結合ポイントとして役立ちうる非妨害性の官能基を提供するように治療薬が修飾される。
【００４９】
好ましい具体例において、治療薬は、小型有機分子、金属（しばしばそれらのイオン形態の錯体として存在する）、ペプチド、核酸、および特に既知の治療薬（例えばGoodman & Gliman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Ed. Hardman, et al., eds. McGraw-Hill, (1996)参照）を包含する群から選択されてもよい。
【００５０】
関連する具体例において、治療薬はそのイオン形態の錯体として存在する金属であり、ＤＮＡを細胞中に輸送することを助けるものである。
【００５１】
本発明に用いる好ましい治療薬は抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗増殖剤、抗真菌剤、免疫抑制剤、鎮痛剤等から選択される。
【００５２】
適当な抗細菌剤は、セフォタキシム、セフトリアキソン、リファンピン、ミノマイシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、エリスロマイシン、バンコマイシン、アモキサシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、アンピシリン、およびそれらの関連誘導体を包含するが、これらに限らない。
【００５３】
本発明において有用な抗ウイルス剤は、イドキシウリジン、ソリブジン、トリフルリジン、バラシクロビル、シドフォビル、アシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、ファスカルネト、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジン、リバビリンおよびリマンタチンから選択されうる。
【００５４】
同様に、適当な抗微生物剤（いくつかは抗細菌剤としても知られている）は、例えば、スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルフアセトアミド、スルフィソキサゾール、スルファジアジン、ペニシリン類（例えば、ペニシリンＧおよびＶ、メチシリン、オキサシリン、ナフィシリン、アンピシリン、アモキサシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリンおよびピペラシリン）、セファロスポリン類（例えば、セファロチン、セファキソリン、セファレキシン、セファドロキシル、セファマンドール、セフォキシチン、セファクロール、セフロキシン、ロラカルベフ、セフォニシド、セフォテタン、セフォラニド、セフォタキシム、セフポドキシム プロキセチル、セフチゾキシム、セフォペラゾン、セフタジジム、およびセフェピム）、アミノグリコシド類（例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルミシン、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン等）、テトラサイクリン類（例えば、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリンおよびミノマイシン）、ならびにマクロライド類（例えば、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン）から選択されうる。
【００５５】
特に好ましい具体例において、治療薬は抗癌剤である。本発明の適当な抗癌剤はカリケアミシンのごとき細胞毒性抗腫瘍抗生物質である。別の具体例において、治療薬はパクリタクセル（タクソール）である。当業者は、本発明の組成物および方法が広範な化学治療剤および細胞毒性剤を用いることに十分に適したものであることを理解するであろう。
【００５６】
もう１つの好ましい具体例において、本発明の治療薬は免疫活性剤である。種々の免疫活性剤を本発明に用いることができ、例えば、インターロイキン類（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３およびＩＬ−１４）、ＴＮＦ−αおよびγ−インターフェロンが包含される。
【００５７】
別の好ましい具体例において、本発明の治療薬はペプチドまたは蛋白である。好ましい具体例において、本発明のペプチドはジンクフィンガー蛋白である。のう１つの具体例において、本発明の蛋白は血管内皮成長因子である。
【００５８】
もう１つの好ましい具体例において、本発明の治療薬は核酸である。特に好ましい具体例において、本発明は、疾病を有する個体の欠損した遺伝物質を置換または増加させる目的で、核酸を制御放出させることを提供する。例えば、本発明の方法および組成物を用いて、のう胞性線維症患者において欠損している核酸の正しいコピーをデリバリーするための新規ビヒクルを提供してもよい。
【００５９】
関連した具体例において、治療薬はグリコール酸のごときコスモシューティカル（cosmoceutical）である。
【００６０】
関連した具体例において、治療薬はグルコサミンまたはコンドロイチン硫酸のごときニュートラシューティカル（nutraceutical）である。
【００６１】
好ましい具体例において、治療薬は抗体またはそのフラグメントである。特に好ましい具体例において、抗体は、アルツハイマー病に関与するベータアミロイドペプチドに指向されたものである。もう１つの具体例において、抗体は、クローン病および多発性硬化症を包含する広範な炎症性および非炎症性疾患に関与しているアルファ−４−ベータ（ＶＬＡ−４）またはアルファ−４−ベータ−７として知られる細胞表面受容体に指向されたものである。
【００６２】
好ましい具体例において、治療薬はワクチンである。関連する具体例において、治療薬は、はしか、おたふくかぜ、ポリオ、水痘、ジフテリア、Ａ型肝炎、百日咳、破傷風またはhaemophilus influenzae bに関するワクチンである。
【００６３】
別のグループの具体例において、オリゴヌクレオチド因子自体が治療薬である。特に好ましい具体例において、オリゴヌクレオチド因子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンス分子がウイルス複製に必要なある種のウイルス蛋白の発現抑制に関して臨床的に有効性を示すことが当該分野において知られている。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドがウイルスの複製に必要なＣ型肝炎ウイルス蛋白の発現を抑制することが示されている。
【００６４】
好ましい具体例において、オリゴヌクレオチド因子は遺伝子治療剤である。遺伝子治療により治療が承認された最初の疾病は稀な遺伝病であるアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症であった。この症状の患者は正常なＡＤＡ遺伝子を有しておらず、その欠損遺伝子は機能的なＡＤＡ酵素を作らない。結果は重症の免疫不全である。本発明の組成物および方法を用いる場合、オリゴヌクレオチド因子は例えば正常なＡＤＡのコピーを包含してもよく、それによりＡＤＡ患者および遺伝病に苦しむ他の患者の治療に用いることができる。
【００６５】
別の好ましい具体例において、オリゴヌクレオチド因子はリボザイムである。特に好ましい具体例において、オリゴヌクレオチド因子は、疾病を引き起こすｍＲＮＡ配列を認識し、結合し、消化しうるリボザイムである。１の具体例において、リボザイムは血管内皮成長因子の形成を阻害することにより抗腫瘍活性を付与する。もう１つの具体例において、リボザイムはウイルス複製を妨害することにより抗ウイルス活性を付与する。
【００６６】
活性薬剤の結合
活性薬剤をオリゴヌクレオチドに結合させる方法は当該分野においてよく知られており、結合部位として活性薬剤中に用いられる官能基の性質ならびにオリゴヌクレオチド上の結合部位に応じたものである。結合基は、複合体のオリゴヌクレオチド部分を治療薬に共有結合させる部分であり、好ましくは多くとも３０原子、より好ましくは多くとも約１５原子の鎖を介して結合させるものである。さらに、オリゴヌクレオチド上の結合部位は、好ましくはオリゴヌクレオチドの３’または５’末端のいずれかである。しかしながら、他の具体例において、オリゴヌクレオチドへの結合は中間部または内部位置のヌクレオチドへの結合、特に中間部の位置のヌクレオチドの複素環塩基への結合であってよい。
【００６７】
目下好ましい具体例において、結合基は二機能性分子に由来するものであり、その結果、アミン官能基のごとき１の官能基が例えばオリゴヌクレオチドの５’末端に結合し、カルボニル基（ＣＯ）のごとき他の官能基が治療薬のアミノ基またはヒドロキシ基に結合する。ヘテロ二機能性結合基は多くの商業的ソース、例えば、Pierce Chemical Co. (1999/2000年版カタログの173-209ページ（架橋剤のところ）参照) および Biosearch Technologiesから利用可能である。
【００６８】
関連する具体例において、結合基はアミノアルコール由来のものであってもよく、その結果、アルコール官能基が例えばオリゴヌクレオチドの３’ホスフェート末端に結合し、アミノ官能基が治療薬のカルボニル基に結合する。さらにもう１つの結合基は、アミノカルボン酸に結合したアミノアルコール（エステル結合で３’−ホスフェートに結合）を包含し、アミノカルボン酸は治療剤に結合する。好ましい具体例において、結合基を下式で表すことができる：
-NH(CH2)mCO-; -0(CH2)mCO-; -0(CH2)mNH-; および
-O(CH2)mCH(OH)(CH2)nNHCO(CH2)pNH-;
式中、小文字のｍ、ｎおよびｐは独立して１ないし約２０の整数であり、ただしリンカーの全長が長くとも３０原子、好ましくは多くとも約１５原子である。これらの結合基の好ましい具体例は下記のものである：
-NH(CH2)5CO-; -O(CH2)mCO-; -O(CH2)6NH-; および
-OCH2CH(OH)CH2NHCO(CH2)2NH-
【００６９】
いくつかの具体例において、結合基はインビボで開裂されて治療薬を放出するものであろう。したがって、結合基は、例えばグルタチオン、エステラーゼまたはプロテアーゼにより開裂されてオリゴヌクレオチドから治療薬を放出しうる内部官能基（例えば、−ＳＳ−、−ＣＯＯ−または−ＣＯＮＨ−）を有していてもよい。関連した技術が例えばＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１（ＷＯ９８／５２６１４）に記載されている。
【００７０】
本発明の１の特に好ましい具体例において、治療薬は因子オリゴヌクレオチドに共有結合させられ、足場および因子オリゴヌクレオチドはそれぞれ５ないし５０塩基を含み、少なくとも９０％の相補性を有し、同じまたは類似の条件下でエンドヌクレアーゼに接触させられた場合、足場オリゴヌクレオチドは因子オリゴヌクレオチドよりも早い分解速度を有するものである。
【００７１】
本発明の１の特に好ましい具体例において、治療薬は因子オリゴヌクレオチドに共有結合させられ、足場および因子オリゴヌクレオチドはそれぞれ５ないし５０塩基を含み、少なくとも９０％の相補性を有し、同じまたは類似の条件下でエキソヌクレアーゼに接触させられた場合、足場オリゴヌクレオチドは因子オリゴヌクレオチドよりも早い分解速度を有するものである。
【００７２】
別のオリゴヌクレオチド構築物
１のグループの具体例において、足場−因子複合体はＤＮＡゲルの形態である。適当なゲルを形成するための粘性剤としてのより長いＤＮＡの使用はＰＣＴ出願公開ＷＯ０１／２４７７５に記載されている。したがって、このグループの具体例において、ゲル形成ＤＮＡは足場オリゴヌクレオチドとしても役立つことができ、ヌクレアーゼ分解により、結合した治療剤を有していてもよいオリゴヌクレオチド因子を放出する。あるいはまた、ＤＮＡゲルの分解により、それ自身治療薬であるオリゴヌクレオチド因子が放出されてもよい。さらに他の具体例において、ＤＮＡゲル（足場）は、オリゴヌクレオチド因子には結合していないが、結合した治療薬を有するオリゴヌクレオチド因子とともに所望部位で放出された場合に治療上有益でありうるさらなる治療薬を含む。
【００７３】
もう１つの好ましい具体例において、オリゴヌクレオチド因子は、直鎖状に共有結合した、あるいは別個のオリゴヌクレオチド因子としての一連のオリゴヌクレオチドサブセグメントを含む。この具体例において、各オリゴヌクレオチドサブセグメントは活性薬剤に結合させることができる。このアプローチは、組成物により放出される活性薬剤の量が変更されうる、あるいは制御されうる別の機構を提供する。例えば、オリゴヌクレオチド因子上の活性薬剤の数を増加させることにより、あるいは単一のオリゴヌクレオチド足場に沿って複数のオリゴヌクレオチド因子を提供することにより、高濃度の活性薬剤あるいは「定時」の活性薬剤を所望位置に放出させることができる。「定時」のアプローチの場合、オリゴヌクレオチド足場は、好ましい具体例において、エキソヌクレアーゼ感受性であるように選択されるであろう。すなわち、オリゴヌクレオチド足場はとの末端から分解され、そのことにより一定速度でオリゴヌクレオチド因子（治療薬剤が結合している、あるいはしていない）が放出されるであろう。
【００７４】
関連した具体例において、本発明は、足場−因子複合体からの治療薬剤の制御された放出のための方法を提供し、該方法において、足場−因子複合体は適当なエキソヌクレアーゼと組み合わせて投与される。特に好ましい具体例の１のグループにおいて、足場−因子複合体のオリゴヌクレオチド足場部分が固体支持体の１の末端に結合され、エキソヌクレアーゼ感受性であるように設計される。好ましくは、複合体は複数のオリゴヌクレオチド因子／治療薬剤部分を含む。より好ましくは、各オリゴヌクレオチド足場つき結合した２ないし１００個のオリゴヌクレオチド因子／活性薬剤部分が存在する。
【００７５】
標的化部分
本発明の組成物の標的化デリバリーを容易化するために、組成物は共有結合または非共有結合により結合した標的化部分を有していてもよい。種々の標的化部分が本明細書記載の組成物に有用であり、それらは足場−因子複合体を特定部位に指向し輸送することを可能にするいずれの基であってもよく、例えば、特定組織または癌細胞、肝細胞、造血細胞等のごとき特定タイプの細胞に複合体を指向させることができるものである。かかる標的化部分は、複合体を特定の細胞コンパートメントまたは成分、例えばミトコンドリア、核等に指向させる細胞内標的化剤であってもよい。
【００７６】
好ましい具体例において、標的化部分をオリゴヌクレオチド足場またはオリゴヌクレオチド因子のいずれに結合させてもよい。
【００７７】
本発明の標的化部分は、ヌクレアーゼにより引き金を引かれる分解により因子が放出されうる位置に、足場−因子複合体を指向させるように選択してもよい。もう１つの具体例において、標的化部分はオリゴヌクレオチド因子自体に結合されて、放出後のオリゴヌクレオチドのより特異的な摂取が可能となる。
【００７８】
目下好ましい具体例において、標的化部分（複数も可）は、所望により結合基を介して、足場−因子複合体に共有結合される。標的化部分ならびに他の生物学的作用剤の核酸への結合方法は当業者によく知られており、例えば、ヘテロ二機能性結合基を用いる方法がある。具体例の１のグループにおいて、標的化部分は細胞のトランスフェクションを促進するための融合性ペプチドであり、いわば膜を横切る足場−因子複合体の通過に好ましいものであるか、あるいはエンドソームからの排出を助けるためのものであるか、あるいは核膜を横切るためのものである。関連した具体例において、標的化部分はカチオン性ペプチドである。
【００７９】
もう１つの具体例において、標的化部分は、例えば、糖、トランスフェリン、インスリンまたはアシアロ−オロソムコイド蛋白のごとき細胞タイプの表面に存在する受容体に対する細胞受容体リガンドであってもよい。かかるリガンドは、転移したＤＮＡの核中への蓄積を促進する核ロケーションシグナル（ｎｌｓ）配列のごとき細胞内タイプの１つであってもよい。
【００８０】
本発明において有用な他の標的化部分は、糖、ペプチド、ホルモン、ビタミン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、脂質またはこれらのエレメント由来の配列もしくはフラクションを包含し、それらは対応受容体との特異的結合を可能にするものである。好ましくは、標的化部分は抗体または抗体フラグメント、細胞受容体リガンドまたはそのフラグメント、受容体または受容体フラグメント等のごとき糖および／またはペプチドである。より好ましくは、標的化部分は、成長因子の、サイトカイン受容体の、または細胞レクチン受容体もしくは接着蛋白受容体のリガンドである。
【００８１】
さらにもう１つの具体例において、標的化部分は糖であってもよく、それはアシアロ糖蛋白のごときレクチンを標的化することを可能にする糖、あるいは免疫グロブリンのＦｃフラグメント受容体を標的化することを可能にする抗体Ｆａｂフラグメントであってもよい。本明細書の用語「抗体」は、免疫グロブリンを意味し、天然のものあるいは部分的または完全に合成されたものであってもよい、特異的結合能を維持しているすべての誘導体も該用語に包含される。該用語は、免疫グロブリン結合ドメインと相同的な、あるいはほとんど相同的な結合ドメインを有する蛋白を包含する。これらの蛋白は天然ソースに由来するものであってもよく、あるいは部分的または完全に合成されたものであってもよい。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。抗体は多くの免疫グロブリンクラスのメンバーであってよく、下記のヒトのクラスを包含する：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ。しかしながら、ＩｇＧクラスの誘導体が本発明において好ましい。さらに、用語「抗体フラグメント」は、完全長よりも短い抗体誘導体をいう。好ましくは、抗体フラグメントは完全長抗体の特異的結合能の少なくとも重要な部分を保持するものである。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディーおよびＦｄフラグメントを包含するが、これらに限らない。抗体フラグメントはいずれの手段によっても作成可能である。例えば、インタクトな抗体をフラグメント化させることにより、抗体フラグメントを酵素的にあるいは化学的に得てもよく、あるいは部分抗体配列をコードする遺伝子から組み換え法によりそれを得てもよい。あるいはまた、抗体フラグメントは完全にまたは部分的に合成により得られるものであってもよい。抗体フラグメントは１本鎖抗体フラグメントであってもよい。あるいはまた、フラグメントは、例えばジスルフィド結合により結合された複数の鎖を含むものであってもよい。フラグメントは複数分子の複合体であってもよい。典型的には、機能的な抗体フラグメントは少なくとも約５０個のアミノ酸、より典型的には少なくとも約２００個のアミノ酸を含む。
【００８２】
特に好ましい具体例の１のグループにおいて、標的化部分は細胞表面受容体に対する特異性を有する抗体または抗体フラグメントである。治療薬剤と同様に、抗体または抗体フラグメントは結合基により組成物中のいずれかのオリゴヌクレオチドのいずれかの末端に結合されうる。好ましくは、標的化薬剤はオリゴヌクレオチド足場に結合され、オリゴヌクレオチド足場が分解されるにつれ組成物から放出される。より好ましくは、標的化部分はオリゴヌクレオチド足場中の部位に結合され、オリゴヌクレオチド足場は結合している治療薬剤から空間的に除去されて、その結果、標的化部分がその結合パートナーと相互作用しなくなる。関連した具体例において、結合パートナーは細胞表面抗原である。
【００８３】
例えば、治療薬剤がオリゴヌクレオチド因子の５’−末端に結合される具体例において、好ましくは、標的化部分はオリゴヌクレオチド足場の５’−末端に結合されるであろう。別法として、治療薬剤がオリゴヌクレオチド因子の３’−末端に結合される具体例において、好ましくは、標的化部分はオリゴヌクレオチド足場の３’−末端に結合されるであろう。
【００８４】
特別な実施例において、標的化部分は、ＣＤ３３抗原や、白血病性幼若細胞上およびミエロ単球系統の未成熟正常細胞上に見られるが正常造血幹細胞上には見られないシアル酸依存性接着蛋白のごとき細胞表面受容体に指向される。
【００８５】
診断上の活性を有する薬剤
好ましい具体例において、本発明の方法および組成物はさらに「標識」または「検出可能部分」を含んでいてもよい。これらの基は分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出されうる成分を含む。例えば、有用な標識は３２Ｐ、蛍光色素、電子濃密試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに通常使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンおよび蛋白を包含し、例えば、それらは放射性標識をペプチド中に組み入れることにより検出可能となり、あるいはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために用いられる。
【００８６】
「標識された」オリゴヌクレオチドは、共有結合により、リンカーにより、あるいは化学結合により、あるいは非共有結合により、イオン結合により、ファンデルワールス力により、静電気により、あるいは水素結合より、標識に結合させられたものであり、その結果、そのオリゴヌクレオチドの存在がそのオリゴヌクレオチドに結合した標識の存在を検出することにより検出されうるものである。
【００８７】
結合は共有結合または非共有結合であってよいが、結合方法は本発明にとり重要でない。標識は、標識されたオリゴヌクレオチドが検出可能なシグナルを発するのを可能にする。オリゴヌクレオチドに直接結合するか、あるいは補助的な結合メンバー手段によりオリゴヌクレオチドに間接的に結合する標識を選択する。標識は、本発明のフォーマットに応じてオリゴヌクレオチド足場またはオリゴヌクレオチド因子のいずれかの中、あるいは両方の中に含ませることができる。
【００８８】
好ましい具体例において、診断用薬剤をオリゴヌクレオチド足場、オリゴヌクレオチド因子、あるいは両方に結合させてもよい。
【００８９】
目下好ましい具体例において、標識は、肉眼または装置手段により検出可能なシグナルを発することのできる物質をいう。本発明における使用に適した種々の標識は、化学的手段または物理的手段のいずれかによるシグナルを発するものを包含する。かかる標識は酵素および基質、クロモゲン、触媒、ナノ粒子、ナノ結晶、量子ドット、蛍光化合物および蛋白、化学発光化合物、ならびに放射性標識を包含しうる。他の適当な標識は、金のごときコロイド状金属粒子、セレンまたはテルルのごときコロイド状非金属粒子、色素処理されたプラスチックまたは染色された微生物のごとき色素処理された粒子または着色粒子、有機ポリマーラテックス粒子およびリポソーム、着色ビーズ、ポリマーマイクロカプセル、嚢、赤血球、赤血球ゴースト、または直接見ることのできる物質を含む他の小胞等を包含する。
【００９０】
好ましい具体例において、視覚的に検出可能な標識を用い、そのことにより、さらなるシグナル発生化合物を必要とせずに試験試料中のオリゴヌクレオチドの存在または量を直接視覚的にあるいは装置により読むことができる。
【００９１】
個々の標識の選択は本発明には重要でないが、標識はそれ自体で検出可能なシグナルを発しうるものであるか、あるいは装置により読むことのできるものであるか、あるいは酵素／基質シグナル発生システムのごとき１またはそれ以上のさらなるシグナル発生成分と組み合わせることにより検出可能なものである。選択には検出されるオリゴヌクレオチドおよび所望検出手段を考慮されることが当業者に理解されるであろう。アッセイの対照系に標識を含ませてもよい。
【００９２】
好ましい具体例において、１またはそれ以上のシグナル発生成分が標識と反応して検出可能なシグナルを生じる。標識が酵素である場合、酵素を１またはそれ以上の基質またはさらなる酵素および基質と反応させて検出可能な生成物を得ることにより検出可能なシグナルの増幅が得られる。
【００９３】
関連した具体例において、標識は蛍光化合物であり、検出可能なシグナルを得るために酵素処理は非地用ない。フルオレセイン、フィコビリ蛋白、ローダミンおよびそれらの誘導体およびアナログのごとき蛍光分子はそのような具体例における標識として適している。
【００９４】
蛋白、炭水化物、核酸および生物全体のごとき出発生物学的材料に対する色素の使用は文献に記載されており、本発明の組成物および方法により包含される。色素およびリガンドの適合する化学的性質に基づいてある種の色素は特定の物質を優先的に染色することが知られている。例えば、蛋白にはクーマシーブルーおよびメチレンブルー、炭水化物には過ヨウ素酸−シフ試薬、細胞全体の染色にはクリスタルバイオレット、サフラニンＯおよびトリパンブルー、核酸染色には臭化エチジウムおよびアクリジンオレンジ、そして蛍光顕微鏡により検出にはローダミンおよびカルコフラワーホワイトのごとき蛍光物質である。標識のさらなる例は少なくとも米国特許第４６９５５５４号、第１８６３８７５号、第４３７３９３２号および４３６６２４１号に記載されており、参照によりすべてを本明細書に記載されているものとする。
【００９５】
さらに別の具体例において、放出されたオリゴヌクレオチド因子自体が蛍光蛋白あるいは検出可能な蛋白（例えば、緑色蛍光蛋白）をコードしてもいてもよい。
【００９６】
当業者は、種々の診断イメージング剤および造影剤を本発明の活性薬剤として用いてもよいことを理解するであろう。さらに、侵襲的または非侵襲的手段により診断試薬をインビボで検出できることも理解されるであろう。好ましい具体例において、診断試薬は蛍光または放射性分子、あるいは手術中に映像化または可視化されうるガドリニウム造影剤である。
【００９７】
医薬処方
別の態様において、本発明は、対象において活性薬剤を制御放出するための組成物および方法を提供し、組成物は対象または患者に投与されるものである。典型的には、組成物は医薬上許容される担体および上で詳述した足場−因子複合体を含む。簡単に説明すると、この足場−因子複合体はオリゴヌクレオチド足場および実質的に相補的なオリゴヌクレオチド因子を含む。オリゴヌクレオチド因子は結合された活性薬剤を有し、あるいは活性薬剤自体である。あるいは、足場を活性薬剤に結合させてもよい。足場の分解が因子の分解よりも早い速度で起こるように２つのオリゴヌクレオチドは異なったふうに分解されうるものである。足場が分解するにつれ、因子が放出される。
【００９８】
上記のごとく、組成物は医薬上許容される担体または賦形剤をさらに含む。賦形剤の性質は主に投与方法に依存する。
【００９９】
本発明の組成物を得て、経口、局所および非経口剤形のような種々の剤形として投与することができる。よって、本発明の組成物を注射により、すなわち、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、十二指腸内または腹腔内投与することができる。さらに、吸入、例えば、鼻腔内吸入により本明細書記載の組成物を投与することができる。また、本発明の組成物を経皮的に投与することもできる。
【０１００】
上記の足場−因子複合体から医薬組成物を調製するには、医薬上許容される担体は固体または液体であってよい。固体調合物は粉末、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、坐薬および分散可能な顆粒を包含する。固体担体は、希釈剤、香料、結合剤、保存料、錠剤崩壊剤または封入剤として作用しうる１またはそれ以上の物質あってもよい。
【０１０１】
粉末において、担体は細かく粉砕された有効成分と混合された細かく粉砕された固体である。錠剤において、有効成分は、必要な結合特性を有する担体と適当な割合で混合され、所望形態およびサイズに打錠される。
【０１０２】
一群の具体例において、好ましくは、粉末および錠剤は５％または１０％ないし７０％の活性複合体を含有する。適当な担体は炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ロウ、カカオ脂等である。用語「調合物」は、カプセルを提供する担体としての封入物質を伴った活性複合体の処方を包含し、カプセル中において、有効成分は担体に囲まれて会合しているが、他の担体と共存していてもよく、あるいは共存していなくてもよい。錠剤、粉末、カプセル、ピル、カシェ剤およびロゼンジを、経口投与に適した固体剤形として用いることができる。
【０１０３】
坐薬を調製するためには、脂肪酸グルセリドまたはカカオ脂のごとき低融点ロウをまず融解させ、次いで、有効成分を撹拌によりその中に均一に分散させる。次いで、融解した均一な混合物を都合のよいサイズの鋳型中に注ぎ、放冷し、そのことにより固化させる。
【０１０４】
液体調合物は溶液、懸濁液およびエマルジョン、例えば、水または水／プロピレングリコール溶液を包含する。非経口注射には、水性ポリエチレングリコール溶液中の溶液として液体調合物を処方することができる。
【０１０５】
活性複合体を水に溶解させ、所望により適当な着色料、香料、安定化剤および増粘剤を添加することにより経口用途に適した水溶液を調製することができる。細かく粉砕された活性複合体を、天然または合成ガム類、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび他のよく知られた懸濁剤のごとき粘性物質を含む水に分散させることにより経口用途に適した水性懸濁液を作成することができる。
【０１０６】
使用する少し前に経口投与用液体処方に変換される固体調合物も包含される。かかる液体処方は溶液、懸濁液およびエマルジョンを包含する。これらの調合物は、活性複合体のほかに、着色料、香料、安定化剤、バッファー、人工および天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤を含んでいてもよい。
【０１０７】
好ましくは、医薬処方は単位投与形態である。かかる形態において、調合物は適当量の活性複合体を含む単位用量に細分される。単位投与形態は包装された調合物、パックされた錠剤、カプセル、ならびにバイアルまたはアンプル中の粉末のごとき個別量の調合物を含むパッケージであってもよい。さらに、単位投与形態はカプセル、錠剤、カシェ剤またはロゼンジそれ自体であてもよく、あるいは適当数のこれらの包装された剤形のいずれかであってもよい。
【０１０８】
単位投与調合物中の活性複合体の量は、有効成分の個々の適用法および効力にもよるが、伝統的な医薬作用剤については０．１ｍｇないし１０００ｍｇ、好ましくは１．０ｍｇないし１００ｍｇの間で変更または調節されうる。所望ならば、組成物は他の適合する活性薬剤をさらに含む。いくつかの具体例において、単位投与調合物中の活性複合体の量は、治療薬剤の性質およびその所望効能にもよるが、０．１ピコグラム程度から約１００ナノグラムまでであってよい。
【０１０９】
細菌感染の処置のための治療的用途において、本発明の薬学的方法に用いられる化合物は１日に約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇの初期用量で投与される。しかしながら、患者の要求、処置すべき症状の重さおよび使用化合物に応じて用量を変化させてもよい。個々の状況に対する正しい用量の決定は当業者が行うところである。一般的には、化合物の最適用量より少ない用量で処置を開始する。その後、最適効果が得られるまで、少しずつ用量を増加させる。都合よくは、所望により１日の全用量を分割し、１日に少しずつ投与してもよい。
【０１１０】
固体支持体からの活性薬剤の放出
好ましい具体例において、本発明は、固体または半固体支持体から活性薬剤を制御放出する方法および組成物を提供する。組成物はオリゴヌクレオチド足場および実質的に相補的なオリゴヌクレオチド因子を含む。足場は固体支持体に結合される。活性薬剤はオリゴヌクレオチド因子に結合される。足場の分解が因子の分解よりも速い速度で起こるように２つのオリゴヌクレオチドは異なったふうに分解されうるものである。足場が分解するにつれ、因子が支持体から放出される。
【０１１１】
当業者は、広範な機構により足場が支持体に共有結合または非共有結合により結合されてよいことを理解するであろう。支持体をベースにしたオリゴヌクレオチド因子の放出に関して多くの治療的および診断的適用がある。
【０１１２】
種々の固体または半固体支持体は本発明において有用である。１のグループの具体例において、支持体はゲルまたはヒドロゲル組成物のごとき半固体支持体である。例えば、２０００年９月２９日出願の共有の同時係属出願第０９／６７５５６６号（発明の名称：ゲル形成組成物）参照。これには治療薬剤またはオリゴヌクレオチド組成物の制御放出に有用な一群の半固体支持体が記載されている。他の支持体は米国特許第５８７９７１３号、５８５８７４６号、５９１９４８４号および５５１４３７９号に記載されている。
【０１１３】
別のグループの具体例において、支持体は埋め込み型バイオセンサー、ステントまたは診断アッセイデバイスのごとき固体支持体である。適当な支持体は、例えば、Von Recum's Handbook of Biomaterials Evaluation : Scientific, Tec7inical, and Clinical Testing of Implant Materials, Hemisphere Publishing,2nd Ed. Nov. 1998に記載されている。関連した具体例において、支持体はステントであり、オリゴヌクレオチド因子は平滑筋細胞増殖を抑制するような形のアンチセンス分子である。
【０１１４】
他の具体例において、支持体は塞栓形成コイル、整形外科的補てつまたは薬剤デリバリーのための埋め込み型デバイスのごとき医学的デバイスである。特に好ましい具体例において、足場は活性薬剤をデリバリーするために用いられる生分解性ゲルのポリマー骨格に結合される。所望により、支持体は、本発明の組成物または方法により前処理される合成または天然の組織移植片であってもよく、そのことにより感染または疾病が減少し、あるいは移植片−宿主免疫応答がモジュレートされる。関連した具体例において、支持体は組織処理加工のための三次元足場である。
【０１１５】
当業者は、多くの材料が足場との結合に適していることを理解するであろう。とりわけ、ガラス、金、ＰＴＦＥのごときデバイスグレードのポリマー、ステンレス鋼等が挙げられる。
【０１１６】
制御放出組成物のキット
さらなる好ましい具体例において、本発明は、制御放出組成物を調製するためのキットを提供する。該キットはオリゴヌクレオチド足場を入れた第１の容器、および実質的に相補的なオリゴヌクレオチド因子を入れた第２の容器を含む。活性薬剤はオリゴヌクレオチド因子に結合される。足場の分解が因子の分解よりも速い速度で起こるように２つのオリゴヌクレオチドは異なったふうに分解されうるものである。使用に際して、足場が分解するにつれ、因子が放出される。
【０１１７】
アッセイ
機能ゲノム学
好ましい具体例において、本発明の組成物および方法は機能ゲノム学アッセイのための形である。特に好ましい具体例において、オリゴヌクレオチド因子はアンチセンス分子である。もう１つの特に好ましい具体例において、オリゴヌクレオチド因子はリボイザイム分子である。これらのオリゴヌクレオチドをベースにした分子は、遺伝子のＤＮＡ配列以上のことを知らなくても、遺伝子の発現を特異的に阻害するので、それらは異なる細胞タイプにおける遺伝子の機能を決定する助けとなるので非常に有用である。機能ゲノム学の証明であるのは、このようなゲノム情報の機能情報への翻訳である。機能ゲノム学アプローチは、ヒトゲノム中に存在する膨大な遺伝子のなかから薬剤標的に対する特別な遺伝子候補を同定するためによく適用されている。
【０１１８】
目下好ましい具体例において、リボザイムオリゴヌクレオチド因子が細胞培養プレートから放出され、該因子はプレート上で増殖した細胞における遺伝子発現を抑制するような形である。
【０１１９】
さらにもう１つの具体例において、支持体上に繋がれた足場−因子複合体が提供される。各複合体は既知の位置に分属され、各複合体は既知配列を有するオリゴヌクレオチド因子を含む。無数の異なる配列がオリゴヌクレオチド因子により表されうる。次いで、細胞培養物を支持体上に沈着または増殖させる。ヌクレアーゼが培養物に添加されると、足場鎖が分解され、因子鎖が放出される。その後、それぞれの位置において放出されたアンチセンスまたはリボザイムは、その近傍で増殖している細胞においてのみ特定の遺伝子を特異的に阻害する。多くの異なるオリゴヌクレオチド因子が支持体上の多くの異なる位置から放出されるので、細胞に関して多くの遺伝子の機能を同時に研究することが可能である。次いで、アンチセンスで処理された細胞の特性を、研究される遺伝子に対応した支持体上の既知の位置のそれらの近傍の細胞と並行して、例えば蛋白発現に関する免疫染色により、詳細に分析することができる。
【０１２０】
当業者は、位置を非常に小さくすることができ、それゆえ一度に研究される遺伝子数を最大化するのに必要な細胞がより少なくなるので、機能的ゲノム学に対するこのアプローチが高処理量アッセイに十分に適したものであることを理解するであろう。
【０１２１】
もう１つの好ましい具体例において、インビボでのアッセイのためにリボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド因子をマウスまたはラットのごとき哺乳動物モデルに導入する。この具体例において、因子はモデルの特定の細胞において遺伝子発現を抑制する形である。当業者は、足場−因子複合体をモデルに直接導入してもよく、あるいは複合体を固体または半固体支持体に結合させて導入してもよいことを理解するであろう。
【０１２２】
さらにもう１つの好ましい具体例において、本発明の方法および組成物は細胞選択性アッセイに適用される。この具体例において、足場鎖は細胞タイプ特異的抗体標的化部分を含み、因子鎖は蛍光マーカーを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。その後、この足場−因子複合体を、抗体特異性を有する第１の細胞タイプおよび抗体特異性を欠く第２の細胞タイプを含む混合細胞培養物に接触させる。足場−因子複合体が適当な細胞に結合できると、ｅｘｏＩＩＩのごときヌクレアーゼを添加して足場鎖の分解を開始させる。次いで、標識されたアンチセンス因子が足場から放出され、細胞中に取り込まれ、そのアンチセンス効果を発揮する。その後、すべての細胞を染色して、抗体で被覆された細胞、蛍光を示す細胞、そしてアンチセンスにより影響された遺伝子のモジュレートされたｍＲＮＡまたは蛋白発現を有する細胞を調べて、すべて同じ細胞タイプかどうかを決定する。
【０１２３】
分解アッセイ
好ましい具体例において、本発明の組成物および方法を、分解性の薬剤の存在の検出、あるいは分解性の薬剤の活性の測定に使用してもよい。分解性の薬剤の存在下においてオリゴヌクレオチド因子が足場から放出されるにつて、放出されたオリゴヌクレオチド因子の検出または測定は分解性の薬剤のアッセイとして役立ちうる。特別な具体例において、分解性の薬剤はヌクレアーゼである。関連した具体例において、分解性の薬剤は電磁波照射である。
【０１２４】
特に好ましい具体例において、本発明の組成物および方法を、ヌクレアーゼの存在を検出するためのアッセイに使用してもよい。適当なヌクレアーゼの存在下で足場からオリゴヌクレオチド因子が放出されるので、放出されたオリゴヌクレオチド因子の検出は、それ自体そのオリゴヌクレオチドの存在に関する検出機構として役立ちうる。関連した具体例において、試料が実質的にヌクレアーゼ不含であること、あるいは試料がヌクレアーゼを含むことが肯定されることを確認するためにこのアッセイを用いる。
【０１２５】
関連した具体例において、試験試料中のヌクレアーゼ活性を測定するためのアッセイが提供される。関連した具体例において、試験試料は既知または疑わしいヌクレアーゼ活性を有する化合物を含んでいてもよい。
【０１２６】
当業者は、多くの異なるタイプの体液が種々のレベルのヌクレアーゼ活性を含んでおり、これらのヌクレアーゼのレベルを検出または定量することは興味深いということを認識するであろう。特に好ましい具体例において、本発明のアッセイを用いて体液のヌクレアーゼ活性を調べる。関連した具体例において、体液は血清、関節液、脳脊髄液、汗、唾液、肋膜浸出液、腹水、細胞外液（ＥＣＦ）または種々の腫瘍、虚血性および壊死性組織のＥＣＦ、あるいは急性および慢性の炎症組織のＥＣＦであってよい。同様に、液体は、細胞質液またはリソソーム液を包含する、正常、異常、壊死性、またはアポトーシス性の状態にあるいずれの細胞タイプの細胞内液体であってもよい。
【０１２７】
当業者は、本発明のアッセイがエキソヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を特徴づけるのに十分適したものであることを認識するであろう。
【０１２８】
オリゴヌクレオチドアッセイ
好ましい具体例において、本発明の組成物および方法は、特定の足場配列の分解可能性をアッセイするための形である。当業者は、多くの場合において、試験オリゴヌクレオチド配列の分解可能性を検出または測定することが望ましいということを理解するであろう。試験配列をオリゴヌクレオチド足場として用い、種々の分解プロトコルで処理することができる。検出可能なオリゴヌクレオチド因子を用いて、足場が分解可能であるかどうか、あるいは足場がどの程度まで分解可能であるのかを決定する助けとすることができる。このアッセイアプローチを用いて、特定のオリゴヌクレオチド配列および構築物の分解可能性プロファイルを特徴づけることができる。好ましい具体例において、これらのアッセイを用いて、ある種の結合、塩基、キャッピングまたはブロッキング基、ならびに他の結合した活性薬剤がオリゴヌクレオチドの分解可能性に及ぼす影響を調べる。
【０１２９】
他のアッセイ
さらにもう１つの具体例において、本発明はインビトロ診断アッセイを提供し、そこでは放出されたオリゴヌクレオチド因子を用いて、複数のオリゴヌクレオチド鎖を含有する未知試料中の特定のオリゴヌクレオチド配列を検出または除去することができる。
【０１３０】
本発明は、添付図面および実施例に示す試験デバイスに特に適したものである。図面および実施例は説明のために提供され、本発明の範囲を限定する意味はないことが理解されよう。
【０１３１】
実施例
好ましい具体例の典型である下記実施例により本発明はより良く理解されうるが、下記実施例は本発明の範囲を限定するものと介してはならない。
【０１３２】
実施例１
この実施例はＤＮＡにより媒介されるＤＮＡの制御放出を説明する。
【０１３３】
それぞれ５’末端においてフルオレセイン（蛍光マーカー）で標識された２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドをSigma Genosysから得た。足場鎖Ａは２７ｂｐの長さであり、未修飾３’末端を有し、それゆえこの末端においてエキソヌクレアーゼに感受性を有していた。因子鎖Ｂは１８ｂｐの長さであり、３’末端において３’−３’チミジン塩基にてキャップされてこの末端においてエキソヌクレアーゼ耐性が付与されていた。鎖Ｂは鎖Ａ上の塩基１０から２７までに対して相補的であり、それゆえ、アニーリング条件下において両方の鎖が溶液中にある場合にはＢ鎖はＡ鎖と完全にハイブリダイゼーションするものであった。エキソヌクレアーゼの存在下および不存在下においてＡ：Ｂ２本鎖を試験した。
【０１３４】
図５は、ヌクレアーゼが不存在の場合、Ａ：Ｂ複合体は時間が経過してもサイズおよび量において安定なままであったことを示すポリアクリルアミドゲルである（レーン１〜３）。より大きな足場−因子複合体に対応するバンドのほかに、第２のバンドが見られ、過剰な未結合足場鎖Ａに対応していた。
【０１３５】
エキソヌクレアーゼ存在下において、Ａ：Ｂ複合体はより小型化し、はじめはサイズが様々であり、複合体中の鎖Ａが徐々に分解されたことを意味するものであった。過剰な鎖Ａの分解も明確に観察できた。時間がたつと、試料中に出現する鎖Ｂ自身に対応する１８ｂｐのバンドの量が増加し、放出されたオリゴヌクレオチドを意味するものであった（レーン４〜９）。結局、複合体の鎖Ｂのみが残り、放出の完了が意味された（レーン１０）。レーン１１および１２はそれぞれ鎖Ｂおよび鎖Ａの対照試料である。この結果は、ヌクレアーゼ活性が、ヌクレアーゼ感受性の足場ＤＮＡからヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドを制御放出様式で徐々に放出させるための引き金を引くことができることを示すものである。
【０１３６】
【表１】
2005523890.tif 000002
【０１３７】
実施例２
この実施例は固体支持体からの活性薬剤の制御放出を説明する。
【０１３８】
材料
未修飾の２７量体オリゴヌクレオチド配列5'-AAAAAAAAATTTGAGGCACGCCTGATC-3'（０．１μｇ／μＬ）をSigma Genosys (Woodlands, Texas, USA)から得た。１８量体オリゴヌクレオチド5'-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3'（０．１μｇ／μＬ）をSigma Genosysから得て、末端をブロックして（実施例１に記載のごとく）エキソヌクレアーゼ耐性とし、蛍光標識としてＦＩＴＣを５’末端に付して可視化させた。エキソヌクレアーゼＩＩＩ（２００ユニット／μＬ）およびエキソヌクレアーゼＩＩＩ １０Ｘ反応バッファー（Ｅ５７７Ａ）をPromega (Madison, Wisconsin, USA)から得た。ウシ胎児血清をPierce (Rockford, Illinois, USA)から得た。９９％メチルイミダゾールアッセイグレードの試薬をResearch Chemicals Ltd (Heysham, GBR)から得た。ＥＤＣをPierce (Rockford, Illinois, USA)から得た。Dnase Rnase不含蒸留水およびＴＥ（Tris EDTA）バッファー ｐＨ８．０（滅菌済み）をGibco BRLから得た。
【０１３９】
手順
ステンレス鋼表面の誘導体化
ステンレス鋼は、血液（したがって血清）と接触する血管ステントを包含する多くの医学的デバイス用の材料として役立っている。ステントからのオリゴヌクレオチドの放出についていくぶん興味があるので、このモデルは本明細書記載の方法の実行可能性を示すための医学的に適切なものである。このことを念頭に置いて、図６に示すように３１６番のステンレス鋼のシート（McMaster-Carr Supply company, Atlanta, GA）をプラズマチャンバー内でアリルアミンで処理して反応性アミン基を導入した。図６に示すように、アリルアミン−ステンレス鋼表面の１ｃｍの片に、９８０μＬの蒸留水（rnaseおよびdnase不含）、１０μＬのメチルイミダゾールおよび１０ｍｇのＥＤＣを添加して、ＤＮＡの末端ホスフェートとの反応用に活性化させた。混合物を１０秒間激しく振盪した。
【０１４０】
結合用２７量体オリゴＤＮＡの調製
１８μＬ（０．１８μｇ）の２７量体オリゴヌクレオチドＤＮＡを１．５ｍＬの微量遠心チューブに入れ、rnaseおよびdnase不含蒸留水で合計４０μＬとし、１５秒間激しく撹拌した。次いで、ＤＮＡ溶液をヒーティングブロックに置き、１００℃で５分間加熱して鎖を分離させた。加熱後、溶液を約１０秒間ボルテックス処理して均一溶液を得た。
【０１４１】
１本鎖２７量体オリゴのワッシャーへの結合
全部で１０μＬ（０．４５μｇ）の１本鎖２７量体オリゴヌクレオチドを、上記活性化ステンレス鋼混合物を入れた各微量遠心チューブに添加した。次いで、微量遠心チューブを２回倒置し、アルミニウムブロックに置き、６０℃で一晩加熱した。その後、活性化ステンレス鋼片をＴＥバッファーですすぎ、ＴＥバッファーの入った微量遠心チューブ中に貯え、冷蔵した。
【０１４２】
活性化ステンレス鋼片上の２７量体オリゴへの１８量体オリゴのアニーリング
１．０ｍＬのＴＥ中の２７量体オリゴヌクレオチドにより処理されたステンレス鋼片を７２℃（１８量体オリゴの融解温度よりも約５℃高い）に加熱した。次いで、４．４マイクロリットル（０．４４マイクログラム）の１８量体オリゴを、２７量体オリゴにより活性化されたステンレス鋼片の入った各微量遠心チューブに添加した。混合物を約３０秒ボルテックス処理し、次いで、加熱ブロックにて７２℃で５分間加熱した。その後、微量遠心チューブをフォイルで包んで不活性化を防止し、３７℃のウォーターバス中に約３０分間置いた。１８量体オリゴはアンカーされた２７量体に相補的であり、これらの条件下でアニールするものである。さらに、１８量体をキャップしてエキソヌクレアーゼ耐性を付与した（２７量体とは異なる処理）。最後に、１８量体を蛍光標識であるＦＩＴＣに結合させて可視化（蛍光または吸光度による）を可能にし、ＤＮＡ鎖への無関係な治療薬剤のアンカーリングの可能性が示された。かくして、この実験は、治療ＤＮＡ鎖またはＤＮＡに結合した治療薬剤のいずれかの放出のためのＤＮＡ結合を特に示すものであった。チューブを４℃で保存した。
【０１４３】
活性化ステンレス鋼片上のＤＮＡの分析
処理されたステンレス鋼片をボルテックス処理し、それぞれを、リン酸バッファーセイラインを満たした５０ｍＬの遠心チューブに入れた。次いで、ステンレス片の入った５０ｍＬのチューブを３０秒ボルテックス処理し、次いで、表面をコンタミネーションさせないように鉗子で取り出した。その後ステンレス片の水分を吸い取って乾燥させ、ＵＶランプの下に置き、処理されたステンレス鋼片の各面の映像を得た。次いで、映像を「時間０」とラベルし、ＮＩＨイメージ（バージョン１．６２，NIH，Bethesda, MD）ソフトウェアを用いて表面蛍光密度を分析し、Ststview（Abacus Concepts, Berkeley, CA）を用いて平均値と標準偏差を決定し、ポスト−ｈｏｃ検定を用いるワンウェイＡＮＯＶＡ繰り返し測定を用いて有意さを決定した。結果を図７（エキソヌクレアーゼＩＩＩ実験）および図８（血清実験）に示す。
【０１４４】
シングルパスアッテネーテッドトータルレフレクタンスフーリエ変換赤外スペクトル法（Thermo Nicolet, Madison, WI）を用いてステンレス鋼片表面上のＤＮＡ量を決定した。１３５０〜１７００の曲線下の面積を平均値と標準偏差とともに測定し、結果を図９（エキソヌクレアーゼＩＩＩ実験）および図１０（血清実験）にまとめた。
【０１４５】
エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびウシ胎児血清の調製
ワッシャー表面からのキャップされた１８量体オリゴの放出の一般的可能性を、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いることにより分析した。１８量体オリゴは３’キャップを含むので、２７量体オリゴのみが分解される。次いで、２７量体オリゴの分解は、ワッシャー表面からの１８量体オリゴの定時の放出を可能にする。１００μＬのエキソヌクレアーゼＩＩＩ、５００μＬのエキソヌクレアーゼＩＩＩバッファーを添加し、ｒｎａｓｅおよびｄｎａｓｅ不含蒸留水で５ｍＬとすることによりエキソヌクレアーゼＩＩＩ溶液の１：５０希釈物を１５ｍＬの遠心チューブ中に調製した。３本の微量遠心チューブを適宜「６０分」、「１２０分」および「２４時間」とラベルした。次いで、エキソヌクレアーゼ溶液１ｍＬを、ラベルした各微量遠心チューブに分注し、一晩冷蔵保存した。
【０１４６】
高レベルの外因性エキソヌクレアーゼではなく血清（エキソヌクレアーゼを含有）の存在下におけるキャップされたオリゴの放出により生物学的に適切な放出を評価した。この実験のために、１セットの微量遠心チューブを「ＦＢＳ−６０分」、「ＦＢＳ−１２０分」および「ＦＢＳ−２４時間」とラベルした。ウシ胎児血清１ｍＬを各微量遠心チューブに分注した。次いで、微量遠心チューブを一晩冷蔵した。
【０１４７】
ワッシャー表面からの１８量体オリゴの放出
表面上で２７量体オリゴにアニールした１８量体オリゴで処理されたワッシャーを、エキソヌクレアーゼＩＩＩを伴う「６０分」とラベルされたチューブおよび「ＦＢＳ−６０分」とラベルされたチューブのそれぞれに入れた。次いで、チューブをフォイルで包んで蛍光標識の不活性化を防止し、３７℃のウォーターバス中に６０分間置いた。６０分後、チューブからワッシャーを取り出し、リン酸バッファーセイラインの入った５０ｍＬの遠心チューブに入れた。次いで、６０分の溶液を含む微量遠心チューブをフォイルで包んで蛍光標識の不活性化を防止し、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計による分析のために４℃に置いた。次いで、遠心チューブを３０秒ボルテックス処理した。ワッシャーの水分を吸い取って乾燥させた。ＵＶランプ下でのワッシャーの両面の映像を得て、蛍光密度を分析した。ワッシャー表面のＦＴＩＲ分析も行い、波長１３５０〜１７００の曲線下の面積を測定した。その後、エキソヌクレアーゼＩＩＩ溶液からのワッシャーを、「１２０分」とラベルされた微量遠心チューブに入れ、３７℃のウォーターバスに１時間置いた。ＦＢＳ溶液からのワッシャーについても同じ操作を行った。１時間後、ワッシャーを、リン酸バッファーセイラインの入った５０ｍＬの遠心チューブに別々に入れ、３０秒間ボルテックス処理した。次いで、６０分のときと同様にしてワッシャーを分析し、「１２０分」とラベルした微量遠心チューブをフォイルで包んで、ＵＶ／Ｖｉｓ分析のために４℃で保存した。次いで、ワッシャーを、「２４時間」とラベルした微量遠心チューブに入れ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ処理されたワッシャーを、エキソヌクレアーゼＩＩＩの入ったチューブに入れ、ＦＢＳ処理されたワッシャーを、ＦＢＳの入った微量遠心チューブに入れた。次いで、チューブを３７℃のウォーターバスに２２時間置いた。その後、ワッシャーをすすぎ、６０分および１２０分のときと同様にして分析し、「２４時間」とラベルされた微量遠心チューブをＵＶ／Ｖｉｓ分析のために４℃で保存した。実験結果を図７（表面蛍光によるエキソヌクレアーゼＩＩＩ）、図８（ＦＩＴＲによるエキソヌクレアーゼＩＩＩ）、図９（表面蛍光による血清）および図１０（ＦＩＴＲによる血清）にまとめる。
【０１４８】
図７に関し、時間ゼロにおける表面蛍光は、６０分、１２０分および２４時間エキソヌクレアーゼに暴露したものよりも統計学的に有意に高く、６０分の表面蛍光は１２０分のものに対して有意であった。しかしながら、説明したようなエキソヌクレアーゼＩＩＩでの処理後の表面蛍光について１２０分と２４時間との間には統計学的に有意な相違はなかった。よって、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて、誘導体化された表面からの分解不可能鎖の迅速かつ特異的な放出を得ることができる。
【０１４９】
図８に関し、時間ゼロにおける表面蛍光は、６０分、１２０分および２４時間血清に暴露したものよりも統計学的に有意に高く、６０分の表面蛍光は１２０分および２４時間のものに対して有意であった。さらに、説明したような血清での処理後の表面蛍光について１２０分と２４時間との間には有意さが認められる統計学的傾向があった（０．０８＞Ｐ＞０．０５として定義）。よって、血清を用いて、誘導体化された表面からの分解不可能鎖の定時の放出を得ることができる。この実施例は、血液に接触しているデバイスからの治療薬剤のヌクレオチドに基づく制御された放出が直ちに達成可能であることを示唆するものである。
【０１５０】
図９に関し、時間ゼロにおける表面ＦＴＩＲは、６０分、１２０分および２４時間エキソヌクレアーゼＩＩＩに暴露したものよりも統計学的に有意に高かった。しかしながら、説明したようにエキソヌクレアーゼＩＩＩで処理した後の表面蛍光は６０分以降有意差がなかった。よって、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて、誘導体化表面からの分解不可能鎖の迅速かつ特異的な放出が可能である。
【０１５１】
図１０に関し、時間ゼロにおける表面ＦＴＩＲは、６０分、１２０分および２４時間血清に暴露したものよりも統計学的に有意に高く、６０分の表面蛍光は、１２０分および２４時間のものに対して有意であり、１２０分のものは２４時間のものに対して有意であった。よって、血清を用いて、誘導体化された表面からの分解不可能鎖のより遅い持続的かつ特異的放出を得ることが可能である。
【０１５２】
上記実験からの上清をPerkin-Elmer DU 640での走査ＵＶ／Ｖｉｓ分析に供して、ＤＮＡ（ＯＤ ２６０）および標識（ＯＤ ４９５）の存在を確認した。ＩＲを行って、ＤＮＡが無傷であること（すなわち、標識の付いた分解不可能鎖が分解されずに放出されたこと）を確認した。
【０１５３】
結局、この実験は、制御された様式で（外因性エキソヌクレアーゼ）、あるいは生物学的に適切な様式で（血清）、相補的ヌクレオチドセグメントの開裂でもって特定のヌクレオチドの放出を達成できることを示す。
【０１５４】
本明細書に記載された実施例および具体例は説明のみを目的とするものであり、それらに照らして種々の修飾または変更が当業者に示唆され、該修飾または変更は本明細書およびクレームの精神および範囲内に包含されることが理解される。本明細書で引用されたすべての刊行物、特許および特許出願を、参照によりすべての目的のために本明細書に記載されているものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は本発明の足場−因子複合体を示す。
【図２】図２は部分的に分解された本発明の足場−因子複合体を示す。
【図３】図３は標的化部分および治療薬を含む、本発明の足場−因子複合体を示す。
【図４】図４は表面に結合された本発明の足場−因子複合体を示す。
【図５】図５はゲル電気泳動実験の結果を示す。
【図６】図６は合成スキームを示す。ステンレス鋼表面をアリルアミンで誘導体化して金属表面に共有結合した遊離アミンを得る（左）。次いで、遊離アミンを活性化させ、１本鎖（分解可能）オリゴヌクレオチド上のホスフェートと反応させて、金属表面に結合した分解可能なＤＮＡ鎖を得る（右）。
【図７】図７はエキソヌクレアーゼＩＩＩ処理後の表面蛍光を示す。
【図８】図８は血清処理後の表面蛍光を示す。
【図９】図９はエキソヌクレアーゼＩＩＩ処理後の表面上のＦＴＩＲ吸収を示す。
【図１０】血清処理後の表面上のＦＴＩＲ吸収を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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