(57)【要約】  ｃ−ｋｉｔ遺伝子の異なる多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別可能なプローブ（Ｐ１）〜（Ｐ４）を提供する。（Ｐ１）４〜５０塩基長、配列番号１の塩基番号１０５〜１０８を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１０５の塩基に相補的な塩基を３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド、（Ｐ２）７〜５０塩基長、配列番号１の塩基番号１０２〜１０８を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１０２の塩基を５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド、（Ｐ３）８〜５０塩基長、配列番号１の塩基番号１２７〜１３４を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１３４の塩基に相補的な塩基を５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド、（Ｐ４）５〜５０塩基長、配列番号１の塩基番号１２３〜１２７を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１２３の塩基を５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
2011077990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｐ１）〜（Ｐ４）および（Ｐ１’）〜（Ｐ４’）の少なくともいずれかのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型検出用プローブ。
（Ｐ１）塩基長が４〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０５〜１０８を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１０５の塩基に相補的な塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０２〜１０８を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１０２の塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ３）塩基長が８〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１２７〜１３４を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１３４の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ３’）前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ４）塩基長が５〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１２３〜１２７を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１２３の塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ４’）前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項２】
前記（Ｐ１）、（Ｐ１’）、（Ｐ２）および（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブが、配列番号１における塩基番号１０８の塩基の多型を検出するためのプローブである、請求項１記載の多型検出用プローブ。
【請求項３】
前記（Ｐ３）、（Ｐ３’）、（Ｐ４）および（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブが、配列番号１における塩基番号１２７の塩基の多型を検出するためのプローブである、請求項１記載の多型検出用プローブ。
【請求項４】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１０５の塩基に相補的な塩基を、３’末端から数えて１〜４番目の位置に有し、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１０２の塩基を、５’末端から数えて１〜４番目の位置に有し、
前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１３４の塩基に相補的な塩基を、５’末端から数えて１〜４番目の位置に有し、
前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１２３の塩基を、５’末端から数えて１〜４番目の位置に有する、請求項１記載の多型検出用プローブ。
【請求項５】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１０５の塩基に相補的な塩基を、３’末端の位置に有し、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１０２の塩基を、５’末端の位置に有し、
前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１３４の塩基に相補的な塩基を、５’末端の位置に有し、
前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１２３の塩基を、５’末端の位置に有する、請求項１記載の多型検出用プローブ。
【請求項６】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、配列番号２で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドが、配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドが、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の多型検出用プローブ。
5'-aatcattcttgatgwctc-3'        （配列番号２）
5'-ccagagwcatcaagaatg-3'        （配列番号３）
5'-ccacatahttagaatcattctt-3'    （配列番号４）
5'-ctaadtatgtggttaaaggaaa-3'    （配列番号５）
【請求項７】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドが、配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドが、配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドである、請求項６記載の多型検出用プローブ。
5'-aatcattcttgatgactc-3'        （配列番号６）
5'-ccagagtcatcaagaatg-3'        （配列番号７）
5'-ccacatacttagaatcattctt-3'    （配列番号８）
5'-ctaagtatgtggttaaaggaaa-3'    （配列番号９）
【請求項８】
前記プローブが、蛍光標識物質を有する標識プローブである、請求項１記載の多型検出用プローブ。
【請求項９】
前記多型検出用プローブが、Ｔｍ解析用のプローブである、請求項１記載の多型検出用プローブ。
【請求項１０】
請求項１記載の多型検出用プローブを用いて、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型検出方法。
【請求項１１】
下記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を含む、請求項１０記載の多型検出方法。
（Ａ）前記多型を検出する被検核酸と請求項１記載の多型検出用プローブとを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｂ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を検出する工程
【請求項１２】
前記反応系が、二種類以上の多型検出用プローブを含む、請求項１１記載の多型検出方法。
【請求項１３】
前記多型検出用プローブが、前記（Ｐ１）および（Ｐ２）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドからなるプローブ、および、前記（Ｐ３）および（Ｐ４）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドからなるプローブである、請求項１２記載の多型検出方法。
【請求項１４】
前記二種類以上の多型検出用プローブが、それぞれ、異なる蛍光標識物質を有する標識プローブである、請求項１２記載の多型検出方法。
【請求項１５】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸が、鋳型核酸からの増幅物である、請求項１１記載の多型検出方法。
【請求項１６】
さらに、下記（Ｘ）工程を含む、請求項１５記載の多型検出方法。
（Ｘ）  鋳型核酸から増幅物を生成する工程
【請求項１７】
前記（Ｘ）工程が、前記多型検出用プローブの存在下、前記反応系において、前記鋳型核酸から増幅物を生成する工程であり、
前記（Ａ）工程において、前記（Ｘ）工程における前記反応系の温度を変化させ、前記シグナル値の測定を行う、請求項１６記載の多型検出方法。
【請求項１８】
前記（Ｘ）工程が、配列番号１の塩基配列における塩基番号１０８および塩基番号１２７の少なくとも一方の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーを使用して、前記増幅物を生成する、請求項１６記載の多型検出方法。
【請求項１９】
前記プライマーが、下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーである、請求項１８記載の多型検出方法。
（Ｆ２）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８の塩基ｗを３’末端とするオリゴヌクレオチド
【請求項２０】
前記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドが、下記（Ｆ２−ｗｔ）および（Ｆ２−ｍｔ）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドである、請求項１９記載の多型検出方法。
（Ｆ２−ｗｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８の塩基ｗを３’末端とし、前記塩基ｗがアデニンであるオリゴヌクレオチド
（Ｆ２−ｍｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８の塩基ｗを３’末端とし、前記塩基ｗがチミンであるオリゴヌクレオチド
【請求項２１】
前記プライマーが、
配列番号１３および１４の少なくとも一方に示すオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、および、配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーである、請求項１８記載の多型検出方法。
5'-attttggtctagccagaga-3'      （配列番号１３）
5'-tgattttggtctagccagagt-3'    （配列番号１４）
5'-aaatcctttgcaggactgtc-3'      （配列番号１２）
【請求項２２】
前記プライマーが、下記（Ｆ３）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーである、請求項１８記載の多型検出方法。
（Ｆ３）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基ｄを３’末端とするオリゴヌクレオチド
【請求項２３】
前記（Ｆ３）のオリゴヌクレオチドが、下記（Ｆ３−ｗｔ）および（Ｆ３−ｍｔ）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドである、請求項２２記載の多型検出方法。
（Ｆ３−ｗｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基ｄを３’末端とし、前記塩基ｄがチミンであるオリゴヌクレオチド
（Ｆ３−ｍｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基ｄを３’末端とし、前記塩基ｄがグアニンまたはアデニンであるオリゴヌクレオチド
【請求項２４】
前記プライマーが、
配列番号１８および１９の少なくとも一方に示すオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、および、配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーである、請求項１８記載の多型検出方法。
5'-gatcgcagagacatcaagaatgattctaat-3'    （配列番号１８）
5'-tggcacagagacatcaagaatgattctaag-3'    （配列番号１９）
5'-aaatcctttgcaggactgtc-3'              （配列番号１２）
【請求項２５】
下記（Ｆ２）および下記（Ｆ３）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドからなるプライマーであることを特徴とする、ｃ-ｋｉｔ遺伝子の増幅用プライマー。
（Ｆ２）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８の塩基ｗを３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｆ３）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基ｄを３’末端とするオリゴヌクレオチド
【請求項２６】
前記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドが、下記（Ｆ２−ｗｔ）および（Ｆ２−ｍｔ）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドである、請求項２５記載のプライマー。
（Ｆ２−ｗｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８の塩基ｗを３’末端とし、前記塩基ｗがアデニンであるオリゴヌクレオチド
（Ｆ２−ｍｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８の塩基ｗを３’末端とし、前記塩基ｗがチミンであるオリゴヌクレオチド
【請求項２７】
前記（Ｆ２−ｗｔ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号１３に示すオリゴヌクレオチドであり、
前記（Ｆ２−ｍｔ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号１４に示すオリゴヌクレオチドである、請求項２６記載のプライマー。
5'-attttggtctagccagaga-3'      （配列番号１３）
5'-tgattttggtctagccagagt-3'    （配列番号１４）
【請求項２８】
前記（Ｆ３）のオリゴヌクレオチドが、下記（Ｆ３−ｗｔ）および（Ｆ３−ｍｔ）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドである、請求項２５記載のプライマー。
（Ｆ３−ｗｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基ｄを３’末端とし、前記塩基ｄがチミンであるオリゴヌクレオチド
（Ｆ３−ｍｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基ｄを３’末端とし、前記塩基ｄがグアニンまたはアデニンであるオリゴヌクレオチド
【請求項２９】
前記（Ｆ３−ｗｔ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号１８に示すオリゴヌクレオチドであり、
前記（Ｆ３−ｍｔ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号１９に示すオリゴヌクレオチドである、請求項２８記載のプライマー。
5'-gatcgcagagacatcaagaatgattctaat-3'    （配列番号１８）
5'-tggcacagagacatcaagaatgattctaag-3'    （配列番号１９）
【請求項３０】
請求項１記載のｃ-ｋｉｔ遺伝子の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、多型検出用試薬。
【請求項３１】
さらに、配列番号１の塩基配列における塩基番号１０８および塩基番号１２７の少なくとも一方の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項３０記載の多型検出用試薬。
【請求項３２】
前記プライマーが、請求項２５記載のプライマーである、請求項３１記載の多型検出用試薬。
【請求項３３】
前記プライマーが、
配列番号１３および１４の少なくとも一方に示すオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、および、配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーである、請求項３１記載の多型検出用試薬。
5'-attttggtctagccagaga-3'      （配列番号１３）
5'-tgattttggtctagccagagt-3'    （配列番号１４）
5'-aaatcctttgcaggactgtc-3'      （配列番号１２）
【請求項３４】
前記プライマーが、
配列番号１８および１９の少なくとも一方に示すオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、および、配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーである、請求項３１記載の多型検出用試薬。
5'-gatcgcagagacatcaagaatgattctaat-3'    （配列番号１８）
5'-tggcacagagacatcaagaatgattctaag-3'    （配列番号１９）
5'-aaatcctttgcaggactgtc-3'              （配列番号１２）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型を検出するためのプローブおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−ｋｉｔ受容体は、細胞表面の受容体型チロシンキナーゼであり、幹細胞因子と結合する。ｃ−ｋｉｔ受容体をコードするｃ−ｋｉｔ遺伝子は、ヒトの第４染色体に位置する。ｃ−ｋｉｔ遺伝子は、例えば、配列番号１に示すｃ−ｋｉｔ遺伝子の部分配列において、塩基番号１０８の塩基（ｗ）のアデニン（ａ）からチミン（ｔ）への変異、塩基番号１２７の塩基（ｄ）のチミン（ｔ）からグアニン（ｇ）またはアデニン（ａ）への変異等が知られている（非特許文献１等）。ｃ−ｋｉｔ受容体は、塩基番号１０８の塩基の変異により、８１６番目のアスパラギン酸（Ｄ）がバリン（Ｖ）に変異し、塩基番号１２７の塩基の変異により、８２２番目のアスパラギン（Ｎ）がリシン（Ｋ）に変異する。このような変異は、例えば、急性骨髄白血病、消化管間葉系腫瘍（ＧＩＳＴ）等の癌疾患との関連、前記癌疾患の予後不良との関連等が報告されている（非特許文献１等）。したがって、ｃ−ｋｉｔ遺伝子における、これらの変異の有無、すなわち、多型の検出は、例えば、前述の疾患の診断、より効果的な疾患の治療法の選択等に、極めて重要である。【０００３】
他方、遺伝子の多型を検出する方法は、様々な方法が報告されており、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法等があげられる。【０００４】
前記ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、試料の標的ＤＮＡについて、検出目的の領域をＰＣＲで増幅させ、その増幅物を制限酵素処理し、多型による制限断片長の変化を、サザンハイブリダイゼーションによりタイピングする方法である。遺伝子に目的の変異が存在すると、制限酵素の認識部位が消失するため、切断の有無、すなわち、制限断片長の変化によって、変異の有無を検出できる。【０００５】
しかしながら、前記ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、例えば、ＰＣＲの後、得られた増幅物を種々の制限酵素で処理し、解析する必要があり、手間がかかる。また、得られた増幅物の制限酵素処理は、一旦、増幅物を取り出して行う必要がある。このため、１回目の反応で得られた増幅物が飛散し、２回目の別の反応に混入するおそれがある。このような問題から、多型の検出を自動化し難い。【０００６】
このような問題から、近年、多型の検出方法として、Ｔｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）解析が注目されている。前記Ｔｍ解析は、融解曲線解析ともいう。これは、まず、検出目的の多型を含む領域に相補的なプローブを用いて、被検核酸と前記プローブとのハイブリッド（二本鎖核酸）を形成させる。そして、得られたハイブリッドに加熱処理を施して、温度上昇に伴うハイブリッドの一本鎖核酸への解離（融解）を、吸光度等のシグナル測定により検出する。この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって、多型を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッドにおける両一本鎖核酸の相補性が高い程高く、相補性が低い程低くなる。そこで、検出対象部位の多型がＸまたはＹの場合、目的の多型（例えば、Ｙ）を含む核酸とそれに１００％相補的なプローブとのハイブリッドについて、予めＴｍ値（評価基準値）を求めておく。続いて、前記被検核酸と前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定する。そして、この測定値が、前記評価基準値と同じであれば、前記被検核酸と前記プローブとはパーフェクトマッチである、すなわち、前記被検核酸の検出対象部位が目的の多型（Ｙ）であると判断できる。他方、前記測定値が前記評価基準値よりも低い場合、前記被検核酸と前記プローブとはミスマッチである、すなわち、前記被検核酸の検出対象部位が他方の多型（Ｘ）であると判断できる。このような方法であれば、例えば、前記プローブを添加したＰＣＲ反応液に温度処理を施し、シグナル測定を行うのみで、多型を検出できる。このため、検出装置の自動化も可能である。【０００７】
しかしながら、このようなＴｍ解析を利用した検出方法は、例えば、一塩基の違いをＴｍ値によって判断しなければならない。また、遺伝子が複数の多型を有する場合には、１つのサンプルを解析するにも多大な労力を伴う。このため、多数のサンプルを解析することは、実用的ではないという問題もある。このため、特に、野生型の多型と複数の変異型の多型とが混在している場合等であっても、変異の有無を正確に検出することが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ.、２００６年８月２０日、Ｖｏｌ．２４、Ｎｏ．２４、ｐ．３９０４−３９１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような理由から、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型の検出は、例えば、前記疾患の診断および治療法の選択において非常に重要である。そこで、本発明は、ｃ−ｋｉｔ遺伝子について、多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別可能な、多型検出用プローブおよびその用途の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明の多型検出用プローブは、下記（Ｐ１）〜（Ｐ４）および（Ｐ１’）〜（Ｐ４’）の少なくともいずれかのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型検出用プローブである。
（Ｐ１）塩基長が４〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０５〜１０８を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１０５の塩基に相補的な塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０２〜１０８を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１０２の塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ３）塩基長が８〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１２７〜１３４を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１３４の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ３’）前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ４）塩基長が５〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１２３〜１２７を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１２３の塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ４’）前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド【００１１】
本発明の多型検出方法は、本発明の多型検出用プローブを用いて、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型検出方法である。【００１２】
本発明の多型検出用試薬は、本発明の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、ｃ-ｋｉｔ遺伝子の多型を検出するための試薬である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の多型検出用プローブによれば、例えば、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型を、Ｔｍ解析によって、簡便且つ優れた信頼性で判別できる。具体的には、例えば、試料中に、目的の多型が野生型であるｃ−ｋｉｔ遺伝子と変異型であるｃ−ｋｉｔ遺伝子とが共存する場合でも、本発明の多型検出用プローブを用いたＴｍ解析を行うことで、多型の種類または変異の有無を、簡便且つ優れた信頼性で検出できる。このため、本発明は、例えば、野生型のｃ−ｋｉｔ遺伝子と変異型のｃ−ｋｉｔ遺伝子とを両方含む試料に対して、特に有用である。このように、本発明によれば、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別できることから、例えば、検出結果を、前述のような疾患の診断および治療法の選択等に反映できる。したがって、本発明は、医療分野等において極めて有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の実施例１における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例２における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例３における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、ｃ−ｋｉｔ遺伝子における検出目的の多型は、例えば、配列番号１に示すｃ−ｋｉｔ遺伝子の部分配列において、塩基番号１０８の塩基（ｗ）および塩基番号１２７の塩基（ｄ）の多型である。塩基番号１０８の塩基（ｗ）は、野生型がアデニン（ａ）であり、この場合、ｃ−ｋｉｔ受容体の８１６番目のアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）となる（Ｄ８１６）。変異型は、チミン（ｔ）であり、この場合、ｃ−ｋｉｔ受容体の８１６番目のアミノ酸は、バリン（Ｖ）となる（Ｄ８１６Ｖ）。塩基番号１２７の塩基（ｄ）は、野生型がチミン（ｔ）であり、この場合、ｃ−ｋｉｔ受容体の８２２番目のアミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）となる（Ｎ８２２）。変異型は、グアニン（ｇ）またはアデニン（ａ）であり、これらの場合、ｃ−ｋｉｔ受容体の８２２番目のアミノ酸は、リシン（Ｋ）となる（Ｎ８２２Ｋ）。ｃ−ｋｉｔ遺伝子において、前記２カ所の多型のうち少なくとも一方が前記変異型であれば、例えば、急性骨髄性白血病、消化管間葉系腫瘍（ＧＩＳＴ）等の癌疾患の可能性がある、または、前記疾患について、予後不良の可能性があると判断できる。
【００１６】
以下、ｃ−ｋｉｔ遺伝子において、前記８１６番目のアミノ酸に対するコドンにおける多型を、「８１６多型」という。具体的に、Ｄ８１６となる多型を、「Ｄ８１６野生型またはｇａｃ野生型」、Ｄ８１６Ｖとなる多型を、「Ｄ８１６Ｖ変異型またはｇｔｃ変異型」ともいう。以下、ｃ−ｋｉｔ遺伝子において、前記８２２番目のアミノ酸に対するコドンにおける多型を、「８２２多型」という。具体的に、Ｎ８２２となる多型を、「Ｎ８２２野生型またはａａｔ野生型」、Ｎ８２２Ｋとなる多型を、「Ｎ８２２Ｋ変異型、ａａｇ変異型またはａａａ変異型」ともいう。
【００１７】
ｃ−ｋｉｔ遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＧ＿００７４５６において、塩基番号４９３５〜８７７２１の配列として登録されている。配列番号１の塩基配列は、前記アクセッション番号の塩基配列におけるｃ−ｋｉｔ遺伝子の部分配列であり、前記アクセッション番号の塩基配列における塩基番号８００５４〜８０２９３の領域に相当する。
【００１８】
本発明において、以下、Ｄ８１６野生型であるｃ−ｋｉｔ遺伝子を「Ｄ８１６野生型遺伝子」といい、Ｄ８１６Ｖ変異型であるｃ−ｋｉｔ遺伝子を「Ｄ８１６Ｖ変異型遺伝子」ともいう。以下、Ｎ８２２野生型のｃ−ｋｉｔ遺伝子を「Ｎ８２２野生型遺伝子」、Ｎ８２２Ｋ変異型のｃ−ｋｉｔ遺伝子を「Ｎ８２２Ｋ変異型遺伝子」ともいう。
【００１９】
本発明において、前記多型が発生する部位、すなわち、配列番号１の塩基配列（センス鎖）において塩基番号１０８および塩基番号１２７の塩基、または、その相補配列（アンチセンス鎖）において前記センス鎖の塩基番号１０８および塩基番号１２７に対応する塩基を、「検出対象部位」という。配列番号１の配列（センス鎖）またはその相補配列（アンチセンス鎖）において、前記検出対象部位を含み、前記多型検出用プローブがハイブリダイズ可能な領域を、「ハイブリダイズ領域または検出対象配列」という。前記検出対象部位が野生型である前記検出対象配列を、「野生型検出対象配列」、前記検出対象部位が変異型である前記検出対象配列を、「変異型検出対象配列」ともいう。前記検出対象配列の中でも、前記多型検出用プローブとパーフェクトマッチする検出対象配列を「パーフェクトマッチ配列」、前記多型検出用プローブとミスマッチする検出対象配列を「ミスマッチ配列」という。本発明において、パーフェクトマッチは、前記検出対象部位の塩基が前記多型検出用プローブにおける対応塩基と相補的であることを意味し、好ましくは、前記検出対象配列と前記多型検出用プローブとが、完全に相補的であることを意味する。本発明において、ミスマッチは、前記検出対象部位の塩基が前記多型検出用プローブにおける対応塩基と非相補的であることを意味し、好ましくは、前記検出対象配列と前記多型検出用プローブとが、前記検出対象部位を除き、完全に相補的であることを意味する。
【００２０】
本発明において、前記８１６多型（ａ／ｔ）を検出するためのプローブを、「８１６用プローブ」、前記８２２多型（ｔ／ｇ、ｔ／ａ）を検出するためのプローブを、「８２２用プローブ」ともいう。前記検出対象配列において、野生型の検出対象部位にパーフェクトマッチするプローブを、「野生型プローブ」、前記変異型の検出対象部位にパーフェクトマッチするプローブを、「変異型プローブ」ともいう。
【００２１】
本発明において、ｃ−ｋｉｔ遺伝子を増幅させて、得られた増幅物と本発明の多型検出用プローブとをハイブリダイズさせる場合、ｃ−ｋｉｔ遺伝子における増幅領域を、以下、「増幅対象領域」という。前記増幅対象領域は、例えば、ｃ−ｋｉｔ遺伝子のセンス鎖における領域でもよいし、それに対応するアンチセンス鎖における領域でもよいし、両方でもよい。本発明において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、例えば、センス鎖の増幅物、アンチセンス鎖の増幅物の意味も含む。
【００２２】
本発明において、塩基配列の末端は、塩基配列の５’側および３’側の最も端の塩基を意味する。５’末端領域は、塩基配列の５’末端から数塩基の領域であり、３’末端領域は、塩基配列の３’末端から数塩基の領域である。前記数塩基は、例えば、末端から１塩基〜１０塩基、１〜４塩基、１〜３塩基、１〜２塩基である。本発明において、塩基配列の末端からＺ番目の塩基（Ｚは正の整数）は、末端の塩基を１番目とした順番であり、例えば、末端から１番目の塩基は、末端の塩基、末端から２番目の塩基は、末端の隣の塩基を意味する。
【００２３】
＜多型検出用プローブ＞
本発明の多型検出用プローブは、前述のように、下記（Ｐ１）〜（Ｐ４）および（Ｐ１’）〜（Ｐ４’）の少なくともいずれかのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型検出用プローブである。
（Ｐ１）塩基長が４〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０５〜１０８を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１０５の塩基に相補的な塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０２〜１０８を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１０２の塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ３）塩基長が８〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１２７〜１３４を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１３４の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ３’）前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ４）塩基長が５〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１２３〜１２７を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１２３の塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ４’）前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００２４】
前記（Ｐ１）および（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドの塩基長は、４〜５０塩基長であり、好ましくは、１０〜５０塩基長であり、より好ましくは、１３〜３０塩基長であり、さらに好ましくは、１５〜２０塩基長である。前記（Ｐ２）および（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドの塩基長は、７〜５０塩基長であり、好ましくは、１０〜５０塩基長であり、より好ましくは、１３〜３０塩基長であり、さらに好ましくは、１５〜２０塩基長である。前記（Ｐ３）および（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドの塩基長は、８〜５０塩基長であり、好ましくは、１０〜５０塩基長であり、より好ましくは、１３〜３０塩基長であり、さらに好ましくは、１５〜２０塩基長である。前記（Ｐ４）および（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドの塩基長は、５〜５０塩基長であり、好ましくは、１０〜５０塩基長であり、より好ましくは、１３〜３０塩基長であり、さらに好ましくは、１５〜２０塩基長である。
【００２５】
前記（Ｐ１）、（Ｐ１’）、（Ｐ２）および（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブは、前記８１６多型（ａ／ｔ）を検出するためのプローブ、すなわち、前記８１６用プローブである。配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８の塩基（ｗ）は、アデニン（ａ）またはチミン（ｔ）であり、塩基番号１２７の塩基（ｄ）は、チミン（ｔ）、グアニン（ｇ）またはアデニン（ａ）である（以下、同様）。
【００２６】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、例えば、ｃ−ｋｉｔ遺伝子のセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。
【００２７】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号１の塩基番号１０８の塩基（ｗ＝ａ、ｔ）に対応する相補的な塩基は、ｗで表され、前記ｗは、チミン（ｔ）またはアデニン（ａ）である。前記ｗがチミン（ｔ）である前記オリゴヌクレオチドは、Ｄ８１６野生型の検出対象部位を含む検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、Ｄ８１６野生型プローブといえる。前記ｗがアデニン（ａ）である前記オリゴヌクレオチドは、Ｄ８１６Ｖ変異型の検出対象部位を含む検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、Ｄ８１６Ｖ変異型プローブといえる。これらのオリゴヌクレオチドが、前記ｃ−ｋｉｔ遺伝子の検出対象配列とパーフェクトマッチか否かによって、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の８１６多型を検出できる。
【００２８】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号１０５の塩基に相補的な塩基を、３’末端領域に有し、好ましくは、３’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（３’末端）または２番目に有する。
【００２９】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２のオリゴヌクレオチドがあげられ、ｗは、チミンまたはアデニンである。前記オリゴヌクレオチドは、具体例として、例えば、配列番号６のオリゴヌクレオチドがあげられる。配列番号６の前記オリゴヌクレオチドを含むプローブは、例えば、Ｄ８１６Ｖ変異型プローブとして使用できる。
5'-aatcattcttgatgwctc-3'      （配列番号２）
5'-aatcattcttgatgactc-3'      （配列番号６）
【００３０】
前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、前述のように、前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的である。前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のようにいうこともできる。
（Ｐ１’）塩基長が４〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０５〜１０８を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１０５の塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
【００３１】
前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、ｃ−ｋｉｔ遺伝子のセンス鎖と相同的であり、アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、多型を確認できる。
【００３２】
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、例えば、ｃ−ｋｉｔ遺伝子のセンス鎖と相同的であり、アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。
【００３３】
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号１の塩基番号１０８の塩基（ｗ）は、前述のように、アデニン（ａ）およびチミン（ｔ）である。前記ｗがアデニン（ａ）である前記オリゴヌクレオチドは、Ｄ８１６野生型の検出対象部位を含む検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、Ｄ８１６野生型プローブといえる。前記ｗがチミン（ｔ）である前記オリゴヌクレオチドは、Ｄ８１６Ｖ変異型の検出対象部位を含む検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、Ｄ８１６Ｖ変異型プローブといえる。これらのオリゴヌクレオチドが、前記ｃ−ｋｉｔ遺伝子の検出対象配列とパーフェクトマッチか否かによって、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の８１６多型を検出できる。
【００３４】
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号１０２の塩基を、５’末端領域に有し、好ましくは、５’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（５’末端）または２番目に有する。
【００３５】
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号３のオリゴヌクレオチドがあげられ、ｗは、チミンまたはアデニンである。前記オリゴヌクレオチドは、具体例として、例えば、配列番号７のオリゴヌクレオチドがあげられる。配列番号７のオリゴヌクレオチドを含むプローブは、例えば、Ｄ８１６Ｖ変異型プローブとして使用できる。
5'-ccagagwcatcaagaatg-3'    （配列番号３）
5'-ccagagtcatcaagaatg-3'    （配列番号７）
【００３６】
前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、前述のように、前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的である。前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のようにいうこともできる。
（Ｐ２’）塩基長が７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０２〜１０８を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１０２に相補的な塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
【００３７】
前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、ｃ−ｋｉｔ遺伝子のセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、多型を確認できる。
【００３８】
前記（Ｐ３）、（Ｐ３’）、（Ｐ４）および（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブは、前記８２２多型（ｔ／ｇ、ｔ／ａ）を検出するためのプローブ、すなわち、前記８２２用プローブである。配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基（ｄ）は、チミン（ｔ）、グアニン（ｇ）およびアデニン（ａ）である（以下、同様）。
【００３９】
前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、例えば、ｃ−ｋｉｔ遺伝子のセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。
【００４０】
前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号１の塩基番号１２７の塩基（ｄ＝ｔ、ｇ、ａ）に対応する相補的な塩基は、ｈで表され、前記ｈは、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）およびチミン（ｔ）である。前記ｈがアデニン（ａ）である前記オリゴヌクレオチドは、Ｎ８２２野生型の検出対象部位を含む検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、Ｎ８２２野生型プローブといえる。前記ｈがシトシン（ｃ）である前記オリゴヌクレオチドは、Ｎ８２２Ｋ変異型の検出対象部位を含む検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、Ｎ８２２Ｋ変異型プローブといえる。前記ｈがチミン（ｔ）である前記オリゴヌクレオチドは、Ｎ８２２Ｋ変異型の検出対象部位を含む検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、Ｎ８２２Ｋ変異型プローブといえる。これらのオリゴヌクレオチドが、前記ｃ−ｋｉｔ遺伝子の検出対象配列とパーフェクトマッチか否かによって、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の８２２多型を検出できる。
【００４１】
前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号１３４の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有し、好ましくは、５’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（５’末端）または２番目に有する。
【００４２】
前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドがあげられ、ｈは、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）またはチミン（ｔ）である。前記オリゴヌクレオチドは、具体例として、例えば、配列番号８のオリゴヌクレオチドがあげられる。配列番号８のオリゴヌクレオチドを含むプローブは、例えば、Ｎ８２２Ｋ変異型プローブとして使用できる。
5'-ccacatahttagaatcattctt-3'    （配列番号４）
5'-ccacatacttagaatcattctt-3'    （配列番号８）
【００４３】
前記（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドは、前述のように、前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドに相補的である。前記（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のようにいうこともできる。
（Ｐ３’）塩基長が８〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１２７〜１３４を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１３４の塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
【００４４】
前記（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドは、ｃ−ｋｉｔ遺伝子のセンス鎖と相同的であり、アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、多型を確認できる。
【００４５】
前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドは、例えば、ｃ−ｋｉｔ遺伝子のセンス鎖と相同的であり、アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。
【００４６】
前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号１の塩基番号１２７の塩基（ｄ）は、前述のように、チミン（ｔ）、グアニン（ｇ）およびアデニン（ａ）である。前記ｄがチミン（ｔ）である前記オリゴヌクレオチドは、Ｎ８２２野生型の検出対象部位を含む検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、Ｎ８２２野生型プローブといえる。前記ｄがグアニン（ｇ）である前記オリゴヌクレオチドは、Ｎ８２２Ｋ変異型の検出対象部位を含む検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、Ｎ８２２Ｋ変異型プローブといえる。前記ｄがアデニン（ａ）である前記オリゴヌクレオチドは、Ｎ８２２Ｋ変異型の検出対象部位を含む検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、Ｎ８２２Ｋ変異型プローブといえる。これらのオリゴヌクレオチドが、前記ｃ−ｋｉｔ遺伝子の検出対象配列とパーフェクトマッチか否かによって、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の８２２多型を検出できる。
【００４７】
前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号１２３の塩基を、５’末端領域に有し、好ましくは、５’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（５’末端）または２番目に有する。
【００４８】
前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドがあげられ、この塩基配列において、ｄは、チミン（ｔ）、グアニン（ｇ）およびアデニン（ａ）である。前記オリゴヌクレオチドは、具体例として、例えば、配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。配列番号９のオリゴヌクレオチドを含むプローブは、例えば、Ｎ８２２Ｋ変異型プローブとして使用できる。
5'-ctaadtatgtggttaaaggaaa-3'    （配列番号５）
5'-ctaagtatgtggttaaaggaaa-3'    （配列番号９）
【００４９】
前記（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドは、前述のように、前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドに相補的である。前記（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のようにいうこともできる。
（Ｐ４’）塩基長が５〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１２３〜１２７を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１２３の塩基に相補的な塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
【００５０】
前記（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドは、ｃ−ｋｉｔ遺伝子のセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、多型を確認できる。
【００５１】
本発明の多型検出用プローブは、例えば、前記オリゴヌクレオチドを含むプローブでもよいし、前記オリゴヌクレオチドからなるプローブでもよい。
【００５２】
本発明の多型検出用プローブは、例えば、前記（Ｐ１）または（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドが、前記検出対象部位に対応する塩基部位、および、塩基番号１０５または１３４の塩基に相補的な塩基以外で、１個または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、前記検出対象配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドでもよい。また、例えば、前記（Ｐ１’）または（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドが、前記検出対象部位に対応する塩基部位、および、塩基番号１０５または１３４の塩基以外で、１個または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、前記検出対象配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドでもよい。例えば、前記（Ｐ２）または（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドが、前記検出対象部位に対応する塩基部位、および、塩基番号１０２または１２３の塩基以外で、１個または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、前記検出対象配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドでもよい。また、例えば、前記（Ｐ２’）または（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドが、前記検出対象部位に対応する塩基部位、および、塩基番号１０２または１２３の塩基に相補的な塩基以外で、１個または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、前記検出対象配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドでもよい。
【００５３】
これらのプローブは、例えば、いずれか１種類を使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。２種類以上を併用する場合、例えば、野生型プローブと、変異型プローブとを併用することが好ましい。これによって、野生型か変異型かを検出するだけでなく、さらに、変異型の特定も可能となる。
【００５４】
本発明の多型検出用プローブは、標識物質を有する標識プローブであることが好ましく、例えば、前述のオリゴヌクレオチドが、前記標識物質で標識化（修飾）されていることが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される部位は、特に制限されず、例えば、５’末端領域または３’末端領域であることが好ましく、より好ましくは５’末端または３’末端である。後述するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される塩基は、例えば、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）が好ましい。前記標識物質は、例えば、塩基を直接標識化してもよいし、前記塩基を間接的に標識化してもよい。後者の場合、例えば、前記塩基を含むヌクレオチド残基のいずれかの部位を標識することによって、前記塩基を間接的に標識化できる。前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、例えば、３’末端のシトシン（ｃ）が、前記標識物質で標識化されていることが好ましく、前記（Ｐ２）〜（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドは、例えば、５’末端のシトシン（ｃ）が、前記標識物質で標識化されていることが好ましい。前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、５’末端のグアニン（ｇ）が、前記標識物質で標識化されていることが好ましく、前記（Ｐ２’）〜（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、３’末端のグアニン（ｇ）が、前記標識物質で標識化されていることが好ましい。
【００５５】
前記（Ｐ１）、（Ｐ２’）、（Ｐ３’）および（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドは、３’末端領域に、前記標識物質を有することが好ましく、具体的には、例えば、３’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、３’末端から数えて１〜３番目の塩基、特に好ましくは、３’末端から数えて２番目または３’末端の塩基である。前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号１０２〜１０８のいずれかの塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号１０５の塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号９９〜１０５のいずれかの塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号１０２の塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。前記（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号１３１〜１３７のいずれかの塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号１３４の塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。前記（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号１２０〜１２６のいずれかの塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号１２３の塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。
【００５６】
前記（Ｐ１’）、（Ｐ２）、（Ｐ３）および（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドは、５’末端領域に、前記標識物質を有することが好ましく、具体的には、例えば、５’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、５’末端から数えて１〜３番目の塩基、特に好ましくは、５’末端から数えて２番目または５’末端の塩基である。前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号１０２〜１０８のいずれかの塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号１０５の塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号９９〜１０５のいずれかの塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号１０２の塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号１３１〜１３７のいずれかの塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号１３４の塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号１２０〜１２６のいずれかの塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号１２３の塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。
【００５７】
前記標識物質は、特に制限されず、例えば、前記標識プローブが単独であるか、ハイブリッドを形成しているかによって、シグナルを発するものが好ましい。前記シグナルの種類は、特に制限されず、例えば、蛍光、呈色、発色等があげられる。前記シグナルが蛍光の場合、シグナル値は、例えば、蛍光強度があげられる。前記シグナルが呈色または発色の場合、前記シグナル値は、例えば、反射率、吸光度、透過率等があげられる。前記シグナルは、例えば、前記標識物質から直接発せられてもよいし、間接的に発せられてもよい。
【００５８】
前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光団等の蛍光物質等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光物質は、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラープローブ社製）等があげられる。前記蛍光物質の検出条件は、特に制限されず、例えば、使用する蛍光物質の種類により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、例えば、シグナルとして蛍光を検出し、シグナル値として蛍光強度を測定することにより、蛍光強度の変動から、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。
【００５９】
前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブであることが好ましい。前記標識物質が蛍光物質の場合、前記標識プローブは、例えば、前記蛍光物質で標識化され、単独で蛍光を示し、且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象（Quenching  phenomenon）と呼ばれる。この現象を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記蛍光消光プローブは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が前記蛍光物質で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）であることが好ましい。前記末端の塩基がシトシン（ｃ）の場合、前記蛍光消光プローブは、例えば、被検核酸とハイブリッドを形成した際、前記被検核酸における、標識化された末端のシトシン（ｃ）と対をなす塩基または前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（ｇ）となるように、前記蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。前記対をなす塩基から一塩基離れた塩基は、前記対をなす塩基の隣の塩基を意味する。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが前記被検核酸にハイブリダイズすると、例えば、前記蛍光物質で標識化された末端のシトシン（ｃ）が、前記被検核酸におけるグアニン（ｇ）に近づくことによって、前記蛍光物質の蛍光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、蛍光強度の変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。同様に、前記末端の塩基がグアニン（ｇ）の場合、前記蛍光消光プローブは、例えば、前記被検核酸とハイブリッドを形成した際、前記被検核酸における、標識化された末端のグアニン（ｇ）と対をなす塩基または前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がシトシン（ｃ）となるように、前記蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。
【００６０】
本発明の多型検出用プローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、被検核酸は、例えば、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製でき、この際、本発明の多型検出用プローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、前記多型検出用プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、前記多型検出用プローブ自体が前記核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００６１】
本発明の多型検出用プローブを用いた多型の検出において、検出方法は何ら制限されず、前記検出対象配列とプローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。前記多型の検出方法として、以下に、本発明の多型検出方法を説明する。
【００６２】
＜多型検出方法＞
本発明の多型検出方法は、前述のように、本発明のｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型検出用プローブを用いて、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型検出方法である。
【００６３】
本発明の多型検出方法は、例えば、下記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を含むことが好ましい。
（Ａ）前記多型を検出する被検核酸と本発明の多型検出用プローブとを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｂ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を検出する工程
【００６４】
本発明の多型検出方法は、本発明の多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。本発明の多型検出用プローブは、前述のように標識プローブが好ましい。本発明において、前記反応系は、例えば、反応液である。
【００６５】
本発明において、前記本発明の多型検出用プローブは、例えば、いずれか一種類を使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。使用する前記多型検出用プローブの種類は、例えば、検出目的の多型に応じて適宜決定できる。
【００６６】
前記多型検出用プローブを使用する場合、少なくとも一種類が、本発明の多型検出用プローブであればよい。前記プローブの種類は、例えば、ｃ−ｋｉｔ遺伝子における検出目的の多型に応じて、適宜決定できる。本発明においては、例えば、８１６多型のみを検出してもよいし、８２２多型のみを検出してもよいし、両方の多型を、一つの反応系で検出することもできる。前記８１６多型および８２２多型の少なくとも一方と、その他の多型とを、一つの反応系で検出することも可能である。
【００６７】
前記８１６多型のみを検出する場合、前記本発明の多型検出用プローブの中でも、前記８１６用プローブを使用することが好ましい。前記８１６用プローブは、例えば、Ｄ８１６野生型プローブでもよいし、Ｄ８１６Ｖ変異型プローブでもよいし、両方を併用してもよい。前記８２２多型のみを検出する場合、前記本発明の多型検出用プローブの中でも、前記８２２用プローブを使用することが好ましい。前記８２２用プローブは、例えば、Ｎ８２２野生型プローブでもよいし、Ｎ８２２Ｋ変異型プローブでもよいし、両方を併用してもよい。
【００６８】
前記多型検出用プローブを二種類以上併用する場合、例えば、各プローブが、異なる標識物質を有する標識プローブであることが好ましい。前記異なる標識物質は、例えば、検出条件の異なる標識物質があげられる。
【００６９】
本発明において、前記被検核酸は、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前記被検核酸が前記二本鎖核酸の場合、例えば、後述するように、前記（Ａ）工程において、前記反応系を加熱して、二本鎖の前記被検核酸を解離させる工程を含むことが好ましい。前記二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、例えば、本発明の多型検出用プローブと前記一本鎖核酸とがハイブリダイズする。
【００７０】
本発明において、前記被検核酸は、例えば、試料中に元来含まれる核酸でもよいし、前記核酸の増幅物でもよい。後者は、例えば、検出精度を向上できることから好ましい。前記増幅物は、例えば、前記試料中の前記核酸を鋳型核酸として、核酸増幅法により増幅させることで調製できる。前記増幅物は、例えば、前記試料中のＤＮＡを鋳型とした増幅物でもよいし、前記試料中のＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型とした増幅物でもよい。前記試料中のＲＮＡは、例えば、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡがあげられ、前記ｃＤＮＡは、例えば、前記ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ）により合成できる。前記増幅物は、例えば、前記検出対象配列を含む領域の増幅物であることが好ましい。前記検出対象配列は、前記検出対象部位として、例えば、前記８１６多型の検出対象部位のみを含んでもよいし、前記８２２多型の検出対象部位のみを含んでもよいし、前記８１６多型と前記８２２多型の両方を含んでもよい。
【００７１】
本発明の多型検出方法は、例えば、前記被検核酸が前記増幅物の場合、例えば、さらに、下記（Ｘ）工程を含んでもよい。前記（Ｘ）工程は、例えば、前記（Ａ）工程に先立って行うことが好ましい。また、前記（Ｘ）工程は、例えば、前記多型検出用プローブの存在下、前記反応系において、前記鋳型核酸から前記増幅物を生成する工程でもよい。
（Ｘ）  鋳型核酸から前記増幅物を生成する工程
【００７２】
前記（Ａ）工程において、前記多型検出用プローブは、例えば、前記反応系に含まれていればよく、その添加のタイミングは、特に制限されない。前記被検核酸が前記増幅物の場合、前記（Ａ）工程における前記反応系は、例えば、前記（Ｘ）工程で得られた前記増幅物と前記多型検出用プローブとを用いて、新たに調製してもよいし、前記（Ｘ）工程における前記増幅反応の反応系でもよい。後者の場合、前記多型検出用プローブは、例えば、前記（Ｘ）工程の前または途中に、前記増幅反応の反応系に添加されてもよく、前記（Ｘ）工程の後、前記増幅反応の反応系に添加されてもよい。
【００７３】
前記核酸増幅法は、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられ、中でも、ＰＣＲ法が好ましい。前記核酸増幅法の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行える。
【００７４】
前記鋳型核酸からの前記増幅物の生成には、例えば、ｃ−ｋｉｔ遺伝子における検出目的の多型を含む領域を増幅するためのプライマーを使用することが好ましい。前記プライマーの配列は、特に制限されず、例えば、前記検出対象部位を含む検出対象配列を増幅できればよく、前記検出対象配列およびその周辺配列等に応じて、従来公知の方法により適宜設定できる。前記プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さに設定でき、例えば、１０〜５０塩基長があげられ、好ましくは、１０〜４０塩基長である。
【００７５】
前記プライマーによる増幅対象領域は、特に制限されず、検出目的の多型に応じて適宜設定できる。検出目的の多型が前記８１６多型の場合、前記増幅対象領域は、例えば、前記８１６多型の検出対象部位を含む領域、すなわち、配列番号１の塩基配列において塩基番号１０８の塩基を含む領域が好ましい。検出目的の多型が前記８２２多型の場合、前記増幅対象領域は、例えば、前記８２２多型の検出対象部位を含む領域、すなわち、配列番号１の塩基配列において塩基番号１２７の塩基を含む領域が好ましい。検出目的の多型が前記８１６多型および前記８２２多型の両方である場合、前記増幅対象領域は、例えば、前記８１６多型の検出対象部位を含む領域と前記８２２多型の検出対象部位を含む領域の二領域でもよいし、前記８１６多型と前記８２２多型の両方の検出対象部位を含む領域、すなわち、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８〜１２７の配列からなる領域または前記配列を含む領域でもよい。前記８１６多型と前記８２２多型の両方を検出する場合、例えば、使用するプライマー数を低減できることから、前述のように、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８〜１２７の配列を含む領域を、増幅対象領域とすることが好ましい。
【００７６】
前記プライマーは、例えば、遺伝子のセンス鎖を増幅するフォワードプライマー（以下、「Ｆプライマー」ともいう）およびアンチセンス鎖を増幅するリバースプライマー（以下、「Ｒプライマー」ともいう）のいずれか一方を使用できるが、両者を一対とするプライマーセットが好ましい。以下に、ＦプライマーおよびＲプライマーを例示するが、これらは一例であって、本発明を制限するものではない。
【００７７】
下記Ｆ１のオリゴヌクレオチドからなるＦプライマーと下記Ｒ１またはＲ２のオリゴヌクレオチドからなるＲプライマーによれば、例えば、８１６多型と８２２多型の両方を含む領域、すなわち、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０８〜１２７の配列を含む領域を、増幅できる。
【００７８】
（Ｆプライマー）
Ｆ１  （配列番号１０）
5'-tgtattcacagagacttggca-3'
（Ｒプライマー）
Ｒ１  （配列番号１１）
5'-gagaatgggtactcacgtttc-3'
Ｒ２  （配列番号１２）
5'-aaatcctttgcaggactgtc-3'
【００７９】
前記Ｆプライマーおよび前記Ｒプライマーは、例えば、前記検出対象部位を含む領域にアニーリング可能に設計されたプライマーでもよい。この場合、前記検出対象部位は、例えば、野生型および変異型のいずれに設定してもよい。野生型の検出対象部位を含む領域にアニーリング可能なプライマーは、例えば、野生型の検出対象配列を増幅可能であり、以下、野生型プライマーともいう。変異型の検出対象部位を含む領域にアニーリング可能なプライマーは、例えば、変異型の検出対象配列を増幅可能であり、以下、変異型プライマーともいう。前記プライマーにおいて、前記検出対象部位に対応する塩基の位置は、特に制限されず、例えば、３’末端が好ましい。
【００８０】
以下に、８１６多型の検出対象部位を含む領域にアニーリング可能であるＦプライマーを例示する。このようなプライマーを、以下、８１６用プライマーという。前記プライマーは、ｃ−ｋｉｔ遺伝子を増幅するためのプライマーであって、下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。下記オリゴヌクレオチドにおいて、ｗは、アデニン（ａ）またはチミン（ｔ）である。このプライマーによれば、例えば、８１６多型の検出対象部位と、８２２多型の検出対象部位とを含む領域を増幅することもできる。
（Ｆ２）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０８の塩基（ｗ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
【００８１】
前記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドは、例えば、下記（Ｆ２−ｗｔ）および（Ｆ２−ｍｔ）のオリゴヌクレオチドがあげられる。前記（Ｆ２−ｗｔ）のオリゴヌクレオチドは、３’末端が、Ｄ８１６野生型の検出対象部位にアニーリング可能である。前記（Ｆ２−ｍｔ）のオリゴヌクレオチドは、３’末端が、Ｄ８１６Ｖ変異型の検出対象部位にアニーリング可能である。
（Ｆ２−ｗｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８の塩基（ｗ）を３’末端とし、前記ｗがアデニン（ａ）であるオリゴヌクレオチド
（Ｆ２−ｍｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８の塩基（ｗ）を３’末端とし、前記ｗがチミン（ｔ）であるオリゴヌクレオチド
【００８２】
前記（Ｆ２−ｗｔ）の具体例として、下記（Ｆ２−ｗｔ１）を、前記（Ｆ２−ｍｔ）の具体例として、下記（Ｆ２−ｍｔ１）を、それぞれ以下に示す。下記配列において、大文字の塩基が検出対象部位にアニーリングする塩基である。
Ｆ２−ｗｔ１  （配列番号１３）
5'-attttggtctagccagagA-3'
Ｆ２−ｍｔ１  （配列番号１４）
5'-tgattttggtctagccagagT-3'
【００８３】
以下に、８２２多型の検出対象部位を含む領域にアニーリング可能であるＦプライマーを例示する。このようなプライマーを、以下、８２２用プライマーという。前記プライマーは、ｃ−ｋｉｔ遺伝子を増幅するためのプライマーであって、下記（Ｆ３）のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。下記オリゴヌクレオチドにおいて、ｄは、チミン（ｔ）、グアニン（ｇ）またはアデニン（ａ）である。
（Ｆ３）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基（ｄ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
【００８４】
前記（Ｆ３）のオリゴヌクレオチドは、例えば、下記（Ｆ３−ｗｔ）および（Ｆ３−ｍｔ）のオリゴヌクレオチドがあげられる。前記（Ｆ３−ｗｔ）のオリゴヌクレオチドは、３’末端が、Ｎ８２２野生型の検出対象部位にアニーリング可能である。前記（Ｆ３−ｍｔ）のオリゴヌクレオチドにおいて、ｄは、ｒ（グアニンまたはアデニン）であり、３’末端が、Ｎ８２２Ｋ変異型の検出対象部位にアニーリング可能である。
（Ｆ３−ｗｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基（ｄ）を３’末端とし、前記ｄがチミン（ｔ）であるオリゴヌクレオチド
（Ｆ３−ｍｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基（ｄ）を３’末端とし、前記ｄがｒであるオリゴヌクレオチド
【００８５】
前記（Ｆ３−ｗｔ）の具体例として、下記（Ｆ３−ｗｔ１）を、前記（Ｆ３−ｍｔ）の具体例として、下記（Ｆ３−ｍｔ１ｇ）および（Ｆ３−ｍｔ１ａ）を、それぞれ以下に示す。下記配列において、大文字の塩基が検出対象部位にアニーリングする塩基である。
Ｆ３−ｗｔ１    （配列番号１５）
5'-cagagacatcaagaatgattctaaT-3'
Ｆ３−ｍｔ１ｇ  （配列番号１６）
5'-cagagacatcaagaatgattctaaG-3'
Ｆ３−ｍｔ１ａ  （配列番号１７）
5'-cagagacatcaagaatgattctaaA-3'
【００８６】
前記Ｆプライマーおよび前記Ｒプライマーは、例えば、その５’末端に付加配列を有してもよい。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜１０塩基長であり、好ましくは２〜７塩基長である。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、ｇａｔｃｇ、ｔｇｇｃａ等の配列があげられる。以下に、前記付加配列を有し、８２２多型の検出対象部位を含む領域にアニーリング可能なＦプライマーを例示する。Ｆ３-ｗｔ２は、野生型の検出対象部位にアニーリング可能であり、Ｆ３−ｍｔ２ｇおよびＦ３−ｍｔ２ａは、変異型の検出対象部位にアニーリング可能である。下記配列において、下線部が前記付加配列であり、大文字の塩基が検出対象部位にアニーリングする塩基である。
Ｆ３−ｗｔ２    （配列番号１８）
5'-gatcgcagagacatcaagaatgattctaaT-3'
Ｆ３−ｍｔ２ｇ  （配列番号１９）
5'-tggcacagagacatcaagaatgattctaaG-3'
Ｆ３−ｍｔ２ａ  （配列番号２０）
5'-tggcacagagacatcaagaatgattctaaA-3'
【００８７】
本発明において、前記プライマーの組み合わせは、特に制限されず、例えば、ＦプライマーとＲプライマーとを一対のプライマーセットとして使用することが好ましい。さらに、ＦプライマーおよびＲプライマーの少なくとも一方について、前記野生型プライマーと、前記変異型プライマーとを併用することが好ましい。組み合わせの具体例は、例えば、野生型の検出対象領域を増幅するＦプライマー（野生型Ｆプライマー）と、変異型の検出対象領域を増幅するＦプライマー（変異型Ｆプライマー）と、Ｒプライマーとの組み合わせがあげられる。前記野生型プライマーと前記変異型プライマーとの併用によって、例えば、変異型ｃ−ｋｉｔ遺伝子が微量の場合にも、変異型ｃ−ｋｉｔ遺伝子を野生型ｃ-ｋｉｔ遺伝子よりも効率よく増幅できる。そして、結果的に、変異型の検出対象配列を、例えば、高精度、高感度に検出できる。
【００８８】
前記プライマーの組み合わせは、特に制限されず、例えば、以下の組み合わせがあげられる。
（１）Ｆ２−ｗｔ１と、Ｆ２−ｍｔ１との組み合わせ
（２）Ｆ３−ｗｔ１と、Ｆ３−ｍｔ１ｇまたはＦ３−ｍｔ１ａとの組み合わせ
（３）Ｆ３−ｗｔ２と、Ｆ３−ｍｔ２ｇまたはＦ３−ｍｔ２ａとの組み合わせ
（４）（１）〜（３）の少なくともいずれかと、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方との組み合わせ
（５）Ｆ１と、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方との組み合わせ
【００８９】
前記プライマーと前記多型検出用プローブとの組み合わせは、特に、制限されない。具体的には、例えば、例示した前記（１）〜（５）のプライマーの組み合わせに対して、下記プローブを使用することが好ましい。
【００９０】
前記プライマーの組み合わせ（１）および（４）に使用するプローブは、例えば、８１６用プローブおよび８２２用プローブの少なくとも一方であり、好ましくは、８１６用プローブであり、より好ましくは、変異型の８１６用プローブである。前記プライマーの組み合わせ（２）、（３）および（４）に使用するプローブは、例えば、８２２用プローブであり、好ましくは、変異型の８２２用プローブである。前記プライマーの組み合わせ（５）に使用するプローブは、例えば、８１６用プローブおよび８２２用プローブの少なくとも一方であり、好ましくは、８１６用プローブおよび８２２用プローブであり、より好ましくは、変異型の８１６用プローブおよび変異型の８２２用プローブである。
【００９１】
前記反応系において、前記プライマーの添加割合は、特に制限されず、例えば、一種類のプライマーについて、例えば、０．１〜２μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは、０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。ＦプライマーとＲプライマーとを使用する場合、前記Ｆプライマー（Ｆ）とＲプライマー（Ｒ）との添加割合（モル比Ｆ：Ｒ）は、特に制限されず、例えば、１：０．２５〜１：４が好ましく、より好ましくは、１：０．５〜１：２である。
【００９２】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸に対する本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、特に制限されず、検出シグナルを十分に確保できることから、１倍以下が好ましい。この際、前記被検核酸は、例えば、パーフェクトマッチ配列を有するパーフェクトマッチ核酸とミスマッチ配列を有するミスマッチ核酸との合計でもよいし、パーフェクトマッチ配列を含む増幅物とミスマッチ配列を含む増幅物との合計でもよい。なお、被検核酸におけるパーフェクトマッチ核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、パーフェクトマッチ核酸（パーフェクトマッチ配列を含む増幅物）に対して１０倍以下となることが好ましく、より好ましくは５倍以下、さらに好ましくは３倍以下である。その下限は特に制限されず、例えば、０．００１倍以上であり、好ましくは０．０１倍以上であり、より好ましくは０．１倍以上である。前記被検核酸に対する本発明の多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００９３】
前記反応系における本発明の多型検出用プローブの添加割合は、特に制限されず、例えば、一種類の前記多型検出用プローブにつき、１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。例えば、十分なシグナル値を確保できることから、前記反応系において、前記被検核酸に対する前記多型検出用プローブのモル比は、例えば、１倍以下が好ましい。前記被検核酸に対する前記多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００９４】
本発明の多型検出方法を適用する試料は、特に制限されず、生体試料があげられる。前記生体試料の具体例は、例えば、全血、白血球細胞等の血球、骨髄、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液等があげられる。本発明において、前記試料の採取方法、前記試料からの被検核酸の調製方法等は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００９５】
本発明の多型検出方法は、前述のような、いわゆるＴｍ解析（融解曲線解析ともいう）に利用できる。ここで、Ｔｍ解析におけるＴｍ値について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【００９６】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナルの測定は、前述した、２６０ｎｍにおける吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定でもよい。具体的には、前記多型検出用プローブとして、前述したように、前記標識物質で標識化された標識プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、前記増幅物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱により前記増幅物から前記プローブが解離するとシグナルを示す。後者のプローブであれば、前記増幅物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱により前記増幅物から前記プローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、前記標識物質のシグナルを検出することによって、前記２６０ｎｍにおける吸光度測定と同様に、ハイブリッドの融解の進行の検出ならびにＴｍ値の決定等を行える。前記標識物質のシグナル検出は、例えば、前記標識物質のシグナルに特有の条件で検出すればよく、前記条件は、例えば、励起波長、検出波長等があげられる。前記標識プローブならびに前記標識物質については、前述のとおりである。
【００９７】
前記（Ｂ）工程において、シグナル値の変動からの前記多型の検出は、従来の方法により行うことができる。具体例としては、例えば、前記シグナル値の変動を、前記多型検出用プローブと変異型の検出対象配列とのハイブリッドの変動および／または前記多型検出用プローブと野生型の検出対象配列とのハイブリッドの変動と比較し、多型が変異型か野生型かを判断できる。つまり、変異型と同様であれば変異型、野生型と同様であれば野生型と判断できる。また、例えば、前記シグナルの変動からＴｍ値を求め、Ｔｍ値の比較により、多型を判断できる。まず、前記シグナル値の変動から、Ｔｍ値を求める。つぎに、測定した前記Ｔｍ値を、予め求めた評価基準、すなわち、野生型の検出対象配列についてのＴｍｗｔ値および／または変異型の検出対象配列についてのＴｍｍｔ値と比較する。そして、測定したＴｍ値が、前記評価基準のＴｍ値ｗｔと同じまたは同程度であれば野生型、Ｔｍｗｔ値よりも低いならば変異型、前記評価基準のＴｍｍｔ値と同じまたは同程度であれば変異型、Ｔｍｍｔ値よりも低いならば野生型と判断できる。同程度とは、例えば、±３℃程度である。
【００９８】
次に、本発明の多型検出方法について、一例をあげて説明する。本例は、本発明の多型検出用プローブとして、蛍光物質で標識された標識プローブを使用し、前記多型検出用プローブの存在下、鋳型核酸からの増幅を行い、得られた増幅物を、前記被検核酸とする例である。本発明の多型検出方法は、本発明の多型検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【００９９】
まず、前記生体試料からゲノムＤＮＡを単離する。前記生体試料からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行える。具体的には、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名GFX  Genomic  Blood  DNA  Purification  kit；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【０１００】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に標識プローブを添加して、反応液を調製する。前記標識プローブは、例えば、前述のように、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）が好ましい。
【０１０１】
前記標識プローブは、例えば、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ用の反応液等の増幅用反応液等、従来公知のものがあげられる。
【０１０２】
前記標識プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、増幅反応の前、途中または後に添加できる。中でも、例えば、前記標識プローブの添加のために前記反応液を外部環境に露出する必要がなく、また、前記増幅反応とシグナル値の測定とを、連続的に行うことが可能であるため、前記増幅反応前に前記反応液に、前記標識プローブを添加することが好ましい。この場合、前記標識プローブは、前述のように、その３’末端が標識物質またはリン酸基で修飾されていることが好ましい。
【０１０３】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記標識プローブの存在下、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の多型が発生する検出対象部位を含む配列を増幅させる。以下、核酸増幅法としてＰＣＲを例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行える。
【０１０４】
具体的には、前記ゲノムＤＮＡ、前記標識プローブおよび前記プライマーを含む前記反応液を用いて、ＰＣＲを行う。この反応液の組成は、特に制限されず、当業者であれば適宜設定でき、例えば、前記ゲノムＤＮＡ、前記標識プローブおよび前記プライマーの他に、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、緩衝液、各種触媒等を含んでもよい。前記反応液における前記標識プローブおよび前記プライマーの添加割合は、特に制限されず、例えば、それぞれ前述の範囲があげられる。
【０１０５】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例は、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９２／９６８９）（Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ  ４５５  ４３０（商標Ｖｅｎｔ）：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の耐熱性ポリメラーゼが好ましい。
【０１０６】
前記反応液におけるＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されず、例えば、１〜１００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは、５〜５０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは、２０〜４０Ｕ／ｍＬである。ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＡＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノール、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＡＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＧＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＴＴＰ、１００μｍｏｌ／Ｌ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
【０１０７】
前記ヌクレオシド三リン酸は、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されず、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
【０１０８】
前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。
【０１０９】
前記反応液は、さらに、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。
【０１１０】
前記反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、サーマルサイクラー等の使用する機器等に応じて適宜設定でき、通常、１〜５００μＬであり、好ましくは１０〜１００μＬである。
【０１１１】
つぎに、ＰＣＲを行う。前記ＰＣＲのサイクル条件は、特に制限されず、例えば、（１）被検核酸である二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの解離、（２）前記一本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ポリメラーゼ反応による前記プライマーの伸長は、それぞれ下記表１の条件が例示できる。サイクル数も特に制限されず、下記（１）〜（３）の３ステップを１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。前記サイクル数の合計の上限は、特に制限されず、例えば、１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、より好ましくは、５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。
【０１１２】
【表１】
2011077990.tif 000003
【０１１３】
前記反応液における標識プローブの添加割合は、特に制限されず、例えば、前記標識プローブを１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。例えば、十分なシグナル値を確保できることから、前記反応液において、前記被検核酸に対する前記標識プローブのモル比は、例えば、１倍以下が好ましい。前記被検核酸に対する前記標識プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【０１１４】
次に、得られた増幅物（二本鎖ＤＮＡ）の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記標識プローブの存在下、前記反応液の温度を変化させることで行える。この場合、前述のように、予め前記標識プローブを添加した前記反応液について、増幅反応を行った後、前記反応液を温度変化させることが好ましい。
【０１１５】
前記解離工程における加熱温度は、二本鎖の前記増幅物を一本鎖に解離できる温度であれば特に制限されず、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されず、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【０１１６】
解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行える。温度条件は、例えば、４０〜５０℃である。前記温度での処理時間は、特に制限されず、例えば、１〜６００秒である。
【０１１７】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅物と前記標識プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリッド）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、グアニン消光プローブ、すなわち、末端のシトシン（ｃ）が標識化されたプローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【０１１８】
前記蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されない。開始温度は、例えば、室温〜８５℃であり、好ましくは、２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されず、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは、０．３〜５℃／秒である。
【０１１９】
次に、前記シグナル値の変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られた蛍光強度から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。単位時間当たりの蛍光強度変化量（ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）の最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。前記標識プローブとして、蛍光消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。また、例えば、前記標識プローブとして、検出波長の異なる標識物質を標識した複数のプローブを用いて、前記検出波長ごとに、前記シグナル値の変動を解析してもよい。
【０１２０】
前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）等により算出でき、最近接塩基対法（Nearest  Neighbor  Method）によって決定することもできる。
【０１２１】
そして、前記Ｔｍ値から、前記検出対象配列において、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型が、前記野生型であるか、前記変異型であるかを決定する。前記Ｔｍ解析において、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、一塩基または数塩基が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記標識プローブについて、検出対象部位とマッチするハイブリッド（例えば、完全に相補であるハイブリッド）のＴｍ値と、検出対象部位とミスマッチするハイブリッド（例えば、一塩基または数塩基が異なるハイブリッド）のＴｍ値とを、評価基準値として決定しておくことにより、前記検出対象配列の多型が、前記野生型であるか、前記変異型であるかを決定できる。前述のように、前記野生型プローブおよび変異型プローブを併用すれば、例えば、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値を示したのが、いずれのプローブであるかによって、前記多型の種類も決定できる。
【０１２２】
例えば、前記プローブとして、変異型プローブを使用した場合、完全に相補なマッチのハイブリッドのＴｍ値を示せば、多型は変異型、ミスマッチのハイブリッドのＴｍ値を示せば、多型は野性型と判断できる。一方、例えば、前記プローブとして、野生型プローブを使用した場合、完全に相補なマッチのハイブリッドのＴｍ値を示せば、多型は野生型、ミスマッチのハイブリッドのＴｍ値を示せば、多型は変異型と判断できる。
【０１２３】
本発明においては、前述のように、前記多型検出用プローブを含む反応系の温度を上昇させて（ハイブリッドを加熱して）、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記多型検出用プローブを含む反応系の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【０１２４】
具体例として、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、前記標識プローブは、一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブを使用した場合、前記標識プローブは、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【０１２５】
本発明は、前述のように、例えば、一つの反応系において、二種類以上の多型検出用プローブを使用できる。複数の多型検出用プローブを使用する場合、各プローブの添加のタイミングは、例えば、前述と同様であり、前記（Ａ）工程に先立って、同時に添加することが好ましく、増幅反応を行う場合、増幅反応前に、同時に添加することが好ましい。
【０１２６】
複数のプローブは、例えば、Ｄ８１６野生型プローブおよびＤ８１６Ｖ変異型プローブの組み合わせでもよいし、Ｎ８２２野生型プローブおよびＮ８２２Ｋ変異型プローブの組み合わせでもよい。前記複数のプローブは、例えば、８１６多型用プローブと８２２多型用プローブとの組み合わせでもよく、例えば、Ｄ８１６野生型プローブおよびＤ８１６Ｖ変異型プローブの少なくともいずれかと、Ｎ８２２野生型プローブおよびＮ８２２Ｋ変異型プローブの少なくともいずれかとの組み合わせでもよい。
【０１２７】
８１６多型および８２２多型の両方を、一反応系で検出する際、例えば、８１６用プローブと８２２用プローブとを併用できる。この際、前記８１６用プローブと８２２用プローブは、前述のように、それぞれ異なる標識物質を有することが好ましい。そして、前記反応液の温度を変化させ、各標識物質の測定条件に応じてシグナルを検出することによって、それぞれのＴｍ値を決定できる。
【０１２８】
前述のように、目的の多型について、前記野生型プローブおよび変異型プローブを併用することもできる。この場合、例えば、完全に相補（マッチ）のハイブリッドのＴｍ値を示したのが、いずれのプローブであるかによって、前記多型の種類も決定できる。例えば、異なる標識物質を有する変異型プローブと野性型プローブとを使用した場合、変異型プローブについて、完全に相補（マッチ）のハイブリッドのＴｍ値を示せば、多型は変異型と判断でき、野性型プローブについて、完全に相補（マッチ）のハイブリッドのＴｍ値を示せば、多型は野性型と判断できる。
【０１２９】
本発明の多型検出方法は、例えば、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型を検出するための本発明の多型検出用プローブと、他の遺伝子の多型を検出するためのプローブとを併用できる。本発明の多型検出用プローブと、その他の遺伝子を検出するためのプローブとの併用によって、同一の一つの反応系において、ｃ−ｋｉｔ遺伝子を含む二種類以上の遺伝子の多型を検出できる。
【０１３０】
＜プローブ試薬＞
本発明のプローブ試薬は、本発明の多型検出用プローブを含むことを特徴とする。本発明の多型検出用プローブは、前述の通りであり、いずれか一種類のプローブでもよいし、二種類以上のプローブを含んでもよい。前記プローブの組み合わせは、前述のとおりに例示できるが、これには制限されない。
【０１３１】
＜プライマーおよびプライマー試薬＞
本発明のプライマーは、下記（Ｆ２）および（Ｆ３）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の増幅用プライマーである。
（Ｆ２）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８の塩基ｗを３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｆ３）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基ｄを３’末端とするオリゴヌクレオチド
【０１３２】
前記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーは、前記８１６用プライマーであり、ｗは、アデニン（ａ）またはチミン（ｔ）である。前記（Ｆ３）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーは、前記８２２用プライマーであり、ｄは、チミン（ｔ）、グアニン（ｇ）またはアデニン（ａ）である。前記（Ｆ２）および（Ｆ３）のオリゴヌクレオチドは、前述の通りである。
【０１３３】
本発明のプライマー試薬は、ｃ−ｋｉｔ遺伝子を増幅するためのプライマーを含む試薬であり、前記本発明のプライマーを含むことを特徴とする。本発明のプライマー試薬は、前記本発明のプライマーを含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。本発明のプライマー試薬は、さらに、センス鎖を増幅するためのリバースプライマーを有してもよい。
【０１３４】
本発明のプライマー試薬において、前記本発明のプライマーは、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を含んでもよい。前記プライマーの種類は、例えば、目的の増幅対象領域に応じて適宜決定できる。前記８１６多型を含む検出対象配列を増幅する場合は、前記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましく、特に、前記（Ｆ２−ｗｔ）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｆ２−ｍｔ）のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。前記８２２多型を含む検出対象配列を増幅する場合は、前記（Ｆ３）のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましく、特に、前記（Ｆ３−ｗｔ）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｆ３−ｍｔ）のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。このように、検出対象部位にアニーリング可能なプライマーとして、野生型プライマーおよび変異型プライマーの両方を含むことで、例えば、微量な変異型検出対象配列を特異的に増幅できる。また、前記プライマーの組み合わせは、前述のとおりに例示できるが、これには制限されない。
【０１３５】
＜多型検出用試薬＞
本発明の多型検出用試薬は、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型を検出するための試薬であって、本発明の多型検出用プローブを含むことを特徴とする。本発明においては、前述の本発明の多型検出用プローブを含むことが特徴であって、その他の構成や条件は何ら制限されない。本発明の多型検出用試薬は、例えば、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型の検出に使用するプローブキットともいえる。
【０１３６】
前記多型検出用試薬は、例えば、前記多型検出用プローブを一種類含んでもよいし、二種類以上含んでもよく、検出目的の多型に応じて適宜決定できる。前記８１６多型のみを検出する場合は、例えば、前記８１６用プローブを含むことが好ましい。前記８１６用プローブは、例えば、Ｄ８１６野生型プローブでもよいし、Ｄ８１６Ｖ変異型プローブでもよいし、両方を含んでもよい。前記８２２多型のみを検出する場合は、例えば、前記８２２用プローブを含むことが好ましい。前記８２２用プローブは、例えば、Ｎ８２２野生型プローブでもよいし、Ｎ８２２Ｋ変異型プローブでもよいし、両方を含んでもよい。前記プローブの組み合わせは、前述のとおりに例示できるが、これには制限されない。
【０１３７】
本発明の多型検出用試薬は、さらに、ｃ−ｋｉｔ遺伝子における検出対象部位を含む領域を増幅するためのプライマーやプライマーセットを含んでもよい。プライマーは、例えば、前述のものがあげられ、本発明のプライマーを含むことが好ましい。前記プライマーの組み合わせは、前述のとおりに例示できるが、これには制限されない。
【０１３８】
本発明の多型検出用試薬は、この他にも、例えば、核酸増幅反応に必要な成分を含んでもよい。具体例は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、緩衝液、各種触媒等があげられる。本発明の多型検出用試薬は、検出試薬キットでもよく、さらに、使用説明書を含んでもよい。
【０１３９】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。％は、ＢＳＡとＮａＮ３に関してはｗ／ｖ％、グリセロールに関してはｖ／ｖ％、その他はｗ／ｗ％を示す。
【実施例】
【０１４０】
［実施例１］
本例では、野生型プラスミドと変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型を検出した。【０１４１】
ｃ−ｋｉｔ遺伝子の部分配列として、Ｄ８１６野生型およびＮ８２２野生型を有するオリゴヌクレオチド（配列番号２３）が挿入された野生型プラスミド（ＷＴ）、Ｄ８１６Ｖ変異型およびＮ８２２野性型を有するオリゴヌクレオチド（配列番号２４）が挿入されたＤ８１６Ｖ変異型プラスミド（Ｄ８１６Ｖ）、Ｄ８１６野生型およびＮ８２２Ｋ変異型を有するオリゴヌクレオチド（配列番号２５）が挿入されたＮ８２２Ｋ変異型プラスミド（Ｎ８２２Ｋ）を準備した。前記野生型プラスミド（ＷＴ）において、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号１０８の塩基（ｗ）は、アデニン（ａ）であり、塩基番号１２７の塩基（ｄ）は、チミン（ｔ）である。前記Ｄ８１６Ｖ変異型プラスミド（Ｄ８１６Ｖ）において、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号１０８の塩基（ｗ）は、チミン（ｔ）であり、塩基番号１２７の塩基（ｄ）は、チミン（ｔ）である。前記Ｎ８２２Ｋ変異型プラスミド（Ｎ８２２Ｋ）において、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号１０８の塩基（ｗ）は、アデニン（ａ）であり、塩基番号１２７の塩基（ｄ）は、グアニン（ｇ）である。下記配列番号２３〜配列番号２５において、下線部の大文字の塩基が、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号１０８および１２７の塩基に対応する。【０１４２】
ＷＴ（配列番号２３）
5’-cactatagtattaaaaagttagttttcactctttacaagttaaaatgaatttaaatggttttcttttctcctccaacctaatagtgtattcacagagacttggcagccagaaatatcctccttactcatggtcggatcacaaagatttgtgattttggtctagccagagAcatcaagaatgattctaaTtatgtggttaaaggaaacgtgagtacccattctctgcttgacagtcctgcaaaggatttttagtttcaactttcgataaaaattgtttcctgtgactttcataatgtaaat-3’
Ｄ８１６Ｖ（配列番号２４）
5’-cactatagtattaaaaagttagttttcactctttacaagttaaaatgaatttaaatggttttcttttctcctccaacctaatagtgtattcacagagacttggcagccagaaatatcctccttactcatggtcggatcacaaagatttgtgattttggtctagccagagTcatcaagaatgattctaaTtatgtggttaaaggaaacgtgagtacccattctctgcttgacagtcctgcaaaggatttttagtttcaactttcgataaaaattgtttcctgtgactttcataatgtaaat-3’
Ｎ８２２Ｋ（配列番号２５）
5’-cactatagtattaaaaagttagttttcactctttacaagttaaaatgaatttaaatggttttcttttctcctccaacctaatagtgtattcacagagacttggcagccagaaatatcctccttactcatggtcggatcacaaagatttgtgattttggtctagccagagAcatcaagaatgattctaaGtatgtggttaaaggaaacgtgagtacccattctctgcttgacagtcctgcaaaggatttttagtttcaactttcgataaaaattgtttcctgtgactttcataatgtaaat-3’【０１４３】
これらのプラスミドを、以下に示す所定の割合で混合し、三種類のプラスミド試料を調製した。プラスミド試料は、１μＬあたり、２×１０４コピー／μＬとした。【０１４４】
【表２】
2011077990.tif 000004
【０１４５】
下記表３のＰＣＲ反応液５０μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で６０秒の後、９５℃１秒および５８℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。そして、前記Ｔｍ解析は、前記反応液を、９５℃で１秒、および４０℃で６０秒処理した後、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から９５℃に加熱していき、検出波長４４５〜４８０ｎｍ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）および５２０〜５５５ｎｍ（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）における、経時的な蛍光強度の変化を測定することにより行った。【０１４６】
【表３】
2011077990.tif 000005
【０１４７】
前記ＦプライマーおよびＲプライマーの配列を以下に示す。
（Ｆプライマー）
Ｆ１  （配列番号１０）
5'-tgtattcacagagacttggca-3'
（Ｒプライマー）
Ｒ１  （配列番号１１）
5'-gagaatgggtactcacgtttc-3'【０１４８】
前記８１６用プローブおよび８２２用プローブとして、下記配列のプローブを使用した。下記Ｄ８１６Ｖ変異型プローブ１は、Ｄ８１６Ｖ変異型のｃ−ｋｉｔ遺伝子のセンス鎖における検出対象配列にパーフェクトマッチするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、Ｄ８１６Ｖ変異型に相補的な塩基である。前記Ｄ８１６Ｖ変異型プローブ１は、３’末端を、蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬで標識化した。下記Ｎ８２２Ｋ変異型プローブ１は、Ｎ８２２Ｋ変異型のｃ−ｋｉｔ遺伝子のセンス鎖における検出対象配列にパーフェクトマッチするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、Ｎ８２２Ｋ変異型に相補的な塩基である。前記Ｎ８２２Ｋ変異型プローブ１は、５’末端を、蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅで標識化し、３’末端を、リン酸化した。
（８１６用プローブ）
Ｄ８１６Ｖ変異型プローブ１  （配列番号６）
5'-aatcattcttgatgactc-(BODIPY  FL)-3
（８２２用プローブ）
Ｎ８２２Ｋ変異型プローブ１  （配列番号８）
5'-(Pacific  Blue)-ccacatacttagaatcattctt-P-3【０１４９】
これらの結果を図１に示す。図１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１において、（Ａ）はＷＴ  １００％、（Ｂ）はＤ８１６Ｖ  ２０％、（Ｃ）はＮ８２２Ｋ  ２０％の結果である。図１において、白丸（○）で示すプロットは、８２２用プローブに関する融解曲線であり、黒丸（●）で示すプロットは、８１６用プローブに関する融解曲線である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。前記Ｄ８１６Ｖ変異型プローブ１とのＴｍ値は、Ｄ８１６（ＷＴ）が４８℃付近、Ｄ８１６Ｖが５４℃付近であり、前記Ｎ８２２Ｋ変異型プローブ１とのＴｍ値は、Ｎ８２２（ＷＴ）が４６℃付近、Ｎ８２２Ｋが５５℃付近である。【０１５０】
図１において、（Ａ）に示すように、ＷＴ  １００％は、Ｄ８１６のＴｍ値と、Ｎ８２２のＴｍ値とでのみピークが確認された。一方、野生型プラスミドおよび変異型プラスミドを含む試料では、変異型プラスミドを混合した多型について、２つのＴｍ値でピークが確認された。すなわち、図１（Ｂ）に示すように、Ｄ８１６Ｖ  ２０％は、Ｄ８１６のＴｍ値およびＤ８１６ＶのＴｍ値の両方と、Ｎ８２２のＴｍ値とで、ピークが確認された。図１（Ｃ）に示すように、Ｎ８２２Ｋ  ２０％は、Ｄ８１６のＴｍ値と、Ｎ８２２のＴｍ値およびＮ８２２ＫのＴｍ値の両方とで、ピークが確認された。このように、本実施例の野生型Ｆプライマー、野性型Ｒプライマーおよび各多型の変異型プローブを用いれば、野性型と変異型の多型とが混在する場合であっても、野生型と変異型とを区別して、多型を検出可能であり、さらに、二種類の多型についても、同一反応系で検出可能であることがわかった。【０１５１】
［実施例２］
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の８１６多型を検出した。【０１５２】
前記実施例１の野生型プラスミド（ＷＴ）およびＤ８１６Ｖ変異型を有するオリゴヌクレオチドが挿入されたＤ８１６Ｖ変異型プラスミド（Ｄ８１６Ｖ）を、以下に示す所定の割合で混合し、三種類のプラスミド試料を調製した。プラスミド試料は、１μＬあたり、２×１０４コピー／μＬとした。【０１５３】
【表４】
2011077990.tif 000006
【０１５４】
下記表４のＰＣＲ反応液５０μＬを用い、下記ＰＣＲおよびＴｍ解析条件とした以外は、前記実施例１と同様にしてＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲおよびＴｍ解析条件は、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６１℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに、９５℃で１秒、および４０℃で６０秒処理し、続けて、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、検出波長を、５８５〜７００ｎｍ（ＴＡＭＲＡ）とした。【０１５５】
【表５】
2011077990.tif 000007
【０１５６】
前記野性型Ｆプライマー、変異型ＦプライマーおよびＲプライマーの配列を以下に示す。
（野性型Ｆプライマー）
Ｆ２−ｗｔ１  （配列番号１３）
5'-attttggtctagccagaga-3'
（変異型Ｆプライマー）
Ｆ２−ｍｔ１  （配列番号１４）
5'-tgattttggtctagccagagt-3'
（Ｒプライマー）
Ｒ２  （配列番号１２）
5'-aaatcctttgcaggactgtc-3'【０１５７】
前記プローブとして、以下のＤ８１６Ｖ変異型プローブ２を使用した。下記プローブは、Ｄ８１６Ｖ変異型のｃ−ｋｉｔ遺伝子のアンチセンス鎖における検出対象配列にパーフェクトマッチするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、Ｄ８１６Ｖ変異型に相補的な配列である。前記Ｄ８１６Ｖ変異型プローブ２は、５’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化し、３’末端を、リン酸化した。
5'-(TAMRA)-ccagagtcatcaagaatg-P-3'        （配列番号７）【０１５８】
これらの結果を図２に示す。図２は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図２において、（Ａ）はＷＴ  １００％、（Ｂ）はＤ８１６Ｖ  ０．３％、（Ｃ）はＤ８１６Ｖ  １％の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。前記Ｄ８１６Ｖ変異型プローブ２とのＴｍ値は、ＷＴが４８℃付近、Ｄ８１６Ｖが５６℃付近である。【０１５９】
図２において、（Ａ）に示すように、ＷＴ  １００％は、ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図２（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、野生型プラスミドおよび変異型プラスミドを含むＤ８１６Ｖ  ０．３％およびＤ８１６Ｖ  １％は、ＷＴのＴｍ値と、Ｄ８１６ＶのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。このように、本実施例の変異型プローブ、野生型Ｆプライマー、変異型Ｆプライマーおよび野生型Ｒプライマーを用いれば、野性型と微量の変異型の多型とが混在する場合であっても、野生型と変異型とを区別して、多型を検出可能であることがわかった。【０１６０】
［実施例３］
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の８２２多型を検出した。【０１６１】
前記実施例１の野生型プラスミド（ＷＴ）およびＮ８２２Ｋ変異型を有するオリゴヌクレオチドが挿入されたＮ８２２Ｋ変異型プラスミド（Ｎ８２２Ｋ）を、以下に示す所定の割合で混合し、三種類のプラスミド試料を調製した。プラスミド試料は、１μＬあたり、１×１０４コピー／μＬとした。【０１６２】
【表６】
2011077990.tif 000008
【０１６３】
前記プラスミド試料、ならびに下記に示すプライマーおよびプローブを用い、下記ＰＣＲ条件とした以外は、前記実施例２と同様にしてＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲ条件は、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６３℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに、９５℃で１秒、および４０℃で６０秒処理とした。【０１６４】
前記野性型Ｆプライマーおよび変異型Ｆプライマーの配列を以下に示す。前記Ｒプライマーは、前記実施例２と同じプライマーを使用した。
（野性型Ｆプライマー）
Ｆ３−ｗｔ２    （配列番号１８）
5'-gatcgcagagacatcaagaatgattctaat-3'
（変異型Ｆプライマー）
Ｆ３−ｍｔ２ｇ  （配列番号１９）
5'-tggcacagagacatcaagaatgattctaag-3'【０１６５】
前記プローブとして、以下のＮ８２２Ｋ変異型プローブ２を使用した。下記プローブは、Ｎ８２２Ｋ変異型のｃ−ｋｉｔ遺伝子のアンチセンス鎖における検出対象配列にパーフェクトマッチするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、Ｎ８２２Ｋ変異型に相補的な配列である。前記Ｎ８２２Ｋ変異型プローブ２は、５’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化し、３’末端を、リン酸化した。
5'-(TAMRA)-ctaagtatgtggttaaaggaaa-P-3'    （配列番号９）【０１６６】
これらの結果を図３に示す。図３は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図３において、（Ａ）はＷＴ  １００％、（Ｂ）はＮ８２２Ｋ  ０．３％、（Ｃ）はＮ８２２Ｋ  １０％の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。前記Ｎ８２２Ｋ変異型プローブ２とのＴｍ値は、ＷＴが５０℃付近、Ｎ８２２Ｋが５５℃付近である。【０１６７】
図３において、（Ａ）に示すように、ＷＴ  １００％は、ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図３（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、野生型プラスミドおよび変異型プラスミドを含むＮ８２２Ｋ  ０．３％およびＮ８２２Ｋ  １０％は、ＷＴのＴｍ値近傍と、Ｎ８２２ＫのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。このように、本実施例の変異型プローブ、野生型Ｆプライマー、変異型Ｆプライマーおよび野生型Ｒプライマーを用いれば、野性型と微量の変異型の多型とが混在する場合であっても、野生型と変異型とを区別して、多型を検出可能であることがわかった。【０１６８】
［比較例］
本例では、前記プローブとして、下記Ｄ８１６Ｖ変異型プローブ３および４を用いた以外は、前記実施例２と同様にして、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の８１６多型を検出した。【０１６９】
下記プローブ３は、Ｄ８１６Ｖ変異型のｃ−ｋｉｔ遺伝子のセンス鎖における検出対象配列にパーフェクトマッチするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、Ｄ８１６Ｖ変異型に相補的な配列である。下記プローブ４は、Ｄ８１６Ｖ変異型のｃ−ｋｉｔ遺伝子のアンチセンス鎖における検出対象配列にパーフェクトマッチするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、Ｄ８１６Ｖ変異型に相補的な配列である。前記プローブ３および４は、それぞれ、５’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化し、３’末端を、リン酸化した。
プローブ３  （配列番号２１）
5'-(TAMRA)-cttgatgactctggct-P-3'
プローブ４  （配列番号２２）
5'-(TAMRA)-ctagccagagtcatcaa-P-3'【０１７０】
本例において、ＷＴ  １００％は、ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認された。しかしながら、野生型プラスミドおよび変異型プラスミドを含むＤ８１６Ｖ  ０．３％およびＤ８１６Ｖ  １％は、Ｄ８１６ＶのＴｍ値およびＤ８１６のＴｍ値の両方で、ピークが確認されなかった。このように、本比較例の変異型プローブを用いた場合、８１６多型を検出できなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１７１】
以上のように、本発明の多型検出用プローブによれば、例えば、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型を、Ｔｍ解析によって、簡便且つ優れた信頼性で判別できる。具体的には、例えば、試料中に、目的の多型が野生型であるｃ−ｋｉｔ遺伝子と変異型であるｃ−ｋｉｔ遺伝子とが共存している場合でも、本発明の多型検出用プローブを用いたＴｍ解析を行うことで、多型の種類または変異の有無を、簡便且つ優れた信頼性で検出できる。このため、本発明は、野生型のｃ−ｋｉｔ遺伝子と変異型のｃ−ｋｉｔ遺伝子とを両方含む試料に対して、特に有用である。このように、本発明によれば、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別できることから、例えば、検出結果を、前述のような疾患の診断および治療法の選択等に反映できる。したがって、本発明は、医療分野等において極めて有用といえる。
【図１】
2011077990.tif 000009
【図２】
2011077990.tif 000010
【図３】
2011077990.tif 000011
【配列表】
2011077990000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年4月11日(2011.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｐ１）〜（Ｐ４）の少なくともいずれかのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型検出用プローブ。
（Ｐ１）塩基長が４〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０５〜１０８を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１０５の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されていると共に、前記塩基を３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０２〜１０８を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１０２の塩基が蛍光色素で標識されていると共に、前記塩基を５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ３）塩基長が８〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１２７〜１３４を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１３４の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されていると共に、前記塩基を５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ４）塩基長が５〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１２３〜１２７を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１２３の塩基が蛍光色素で標識されていると共に、前記塩基を５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１０５の塩基に相補的な塩基を、３’末端から数えて１〜４番目の位置に有し、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１０２の塩基を、５’末端から数えて１〜４番目の位置に有し、
前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１３４の塩基に相補的な塩基を、５’末端から数えて１〜４番目の位置に有し、
前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１２３の塩基を、５’末端から数えて１〜４番目の位置に有する、請求項１記載の多型検出用プローブ。
【請求項５】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１０５の塩基に相補的な塩基を、３’末端の位置に有し、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１０２の塩基を、５’末端の位置に有し、
前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１３４の塩基に相補的な塩基を、５’末端の位置に有し、
前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１２３の塩基を、５’末端の位置に有する、請求項１記載の多型検出用プローブ。
【請求項６】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、配列番号２で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドが、配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドが、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の多型検出用プローブ。
2011077990.tif 000012
【請求項７】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドが、配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドが、配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドである、請求項６記載の多型検出用プローブ。
2011077990.tif 000013
2011077990.tif 000014
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
前記多型検出用プローブが、Ｔｍ解析用のプローブである、請求項１記載の多型検出用プローブ。
【請求項１０】
請求項１記載の多型検出用プローブを用いて、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型検出方法。
【請求項１１】
下記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を含む、請求項１０記載の多型検出方法。
（Ａ）前記多型を検出する被検核酸と請求項１記載の多型検出用プローブとを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｂ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を検出する工程
【請求項１２】
前記反応系が、二種類以上の多型検出用プローブを含む、請求項１１記載の多型検出方法。
【請求項１３】
前記多型検出用プローブが、前記（Ｐ１）および（Ｐ２）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドからなるプローブ、および、前記（Ｐ３）および（Ｐ４）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドからなるプローブである、請求項１２記載の多型検出方法。
【請求項１４】
前記二種類以上の多型検出用プローブが、それぞれ、異なる蛍光標識物質を有する標識プローブである、請求項１２記載の多型検出方法。
【請求項１５】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸が、鋳型核酸からの増幅物である、請求項１１記載の多型検出方法。
【請求項１６】
さらに、下記（Ｘ）工程を含む、請求項１５記載の多型検出方法。
（Ｘ）  鋳型核酸から増幅物を生成する工程
【請求項１７】
前記（Ｘ）工程が、前記多型検出用プローブの存在下、前記反応系において、前記鋳型核酸から増幅物を生成する工程であり、
前記（Ａ）工程において、前記（Ｘ）工程における前記反応系の温度を変化させ、前記シグナル値の測定を行う、請求項１６記載の多型検出方法。
【請求項１８】
前記（Ｘ）工程が、配列番号１の塩基配列における塩基番号１０８および塩基番号１２７の少なくとも一方の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーを使用して、前記増幅物を生成する、請求項１６記載の多型検出方法。
【請求項１９】
前記プライマーが、下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーである、請求項１８記載の多型検出方法。
（Ｆ２）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８の塩基ｗを３’末端とするオリゴヌクレオチド
【請求項２０】
前記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドが、下記（Ｆ２−ｗｔ）および（Ｆ２−ｍｔ）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドである、請求項１９記載の多型検出方法。
（Ｆ２−ｗｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８の塩基ｗを３’末端とし、前記塩基ｗがアデニンであるオリゴヌクレオチド
（Ｆ２−ｍｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０８の塩基ｗを３’末端とし、前記塩基ｗがチミンであるオリゴヌクレオチド
【請求項２１】
前記プライマーが、
配列番号１３および１４の少なくとも一方に示すオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、および、配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーである、請求項１８記載の多型検出方法。
2011077990.tif 000015
【請求項２２】
前記プライマーが、下記（Ｆ３）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーである、請求項１８記載の多型検出方法。
（Ｆ３）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基ｄを３’末端とするオリゴヌクレオチド
【請求項２３】
前記（Ｆ３）のオリゴヌクレオチドが、下記（Ｆ３−ｗｔ）および（Ｆ３−ｍｔ）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドである、請求項２２記載の多型検出方法。
（Ｆ３−ｗｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基ｄを３’末端とし、前記塩基ｄがチミンであるオリゴヌクレオチド
（Ｆ３−ｍｔ）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１２７の塩基ｄを３’末端とし、前記塩基ｄがグアニンまたはアデニンであるオリゴヌクレオチド
【請求項２４】
前記プライマーが、
配列番号１８および１９の少なくとも一方に示すオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、および、配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーである、請求項１８記載の多型検出方法。
2011077990.tif 000016
【請求項２５】
（削除）
【請求項２６】
（削除）
【請求項２７】
（削除）
【請求項２８】
（削除）
【請求項２９】
（削除）
【請求項３０】
請求項１記載のｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、多型検出用試薬。
【請求項３１】
さらに、配列番号１の塩基配列における塩基番号１０８および塩基番号１２７の少なくとも一方の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項３０記載の多型検出用試薬。
【請求項３２】
（削除）
【請求項３３】
（削除）
【請求項３４】
（削除）
【国際調査報告】
2011077990.tif 000017
2011077990.tif 000018
2011077990.tif 000019
2011077990.tif 000020