(57)【要約】  核酸分子のフットプリントを得る方法およびシステム。試料は、毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生じる強度をもったＸ線ビームで１，０００ミリ秒よりも短い時間の間照射された場合、・ＯＨラジカルを発生するような環境の中にある核酸分子から成っている。次いで毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生じる強度をもったＸ線ビームで１，０００ミリ秒よりも短い時間の間試料を照射して該環境の中で・ＯＨラジカルを発生させる。次に核酸分子のフラグメント化を検出する。
2005510740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生じる強度をもったＸ線ビームを発生し得るＸ線発生器、および
（ｂ）該Ｘ線ビームによって試料が照射される開いた状態と、該Ｘ線ビームによって試料が照射されない閉じた状態との間を交互にとることができるシャッターであって、１，０００ミリ秒より少ない時間の間開いた状態にあるように設計されているシャッターを具備していることを特徴とする試料照射システム。
【請求項２】
該Ｘ線発生器が回転アノードＸ線発生器であることを特徴とする請求項１記載のシステム。
【請求項３】
該回転アノードＸ線発生器がＣｕの回転アノードＸ線発生器であることを特徴とする請求項２記載のシステム。
【請求項４】
該シャッターが１００〜３００ミリ秒の時間の間開いた状態にあるように設計されていることを特徴とする上記請求項のいずれか一つに記載されたシステム。
【請求項５】
試料保持器をさらに具備していることを特徴とする上記請求項のいずれか一つに記載されたシステム。
【請求項６】
該Ｘ線ビームによって試料が照射される開いた状態と、該Ｘ線ビームによって試料が照射されない閉じた状態との間を交互にとることができるシャッターであって、該シャッターは１秒より長い時間の間開いた状態にあるように設計された第２のシャッターをさらに具備していることを特徴とする上記請求項のいずれか一つに記載されたシステム。
【請求項７】
毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生じる強度をもったＸ線ビームを用い、１，０００ミリ秒よりも短い時間の間試料を照射することを特徴とする試料照射方法。
【請求項８】
Ｘ線で照射した場合、試料は・ＯＨラジカルを生成することを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
該Ｘ線ビームが回転アノードＸ線発生器で発生させられることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該回転アノードＸ線発生器はＣｕの回転アノードＸ線発生器であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該シャッターが１００〜３００ミリ秒の時間の間開いた状態にあるように設計されていることを特徴とする請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生じる強度をもったＸ線ビームで１，０００ミリ秒よりも短い時間の間照射された場合、・ＯＨラジカルを発生するような環境の中に核酸の分子を置き、
（ｂ）毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生じる強度をもったＸ線ビームで１，０００ミリ秒よりも短い時間の間該環境を照射して該環境の中において・ＯＨラジカルを発生させ、
（ｃ）核酸分子のフラグメント化を検出する
ことを特徴とする核酸分子のフットプリント方法。
【請求項１３】
該Ｘ線発生器が回転アノードＸ線発生器であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該回転アノードＸ線発生器がＣｕの回転アノードＸ線発生器であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該シャッターが１００〜３００ミリ秒の時間の間開いた状態にあるように設計されていることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物物理的方法、より具体的には試料、特に生物分子を含む試料を照射する生物物理的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜先行技術＞
下記の非特許文献１〜３４は本発明の分野において当該技術の状態を説明する上で関連があると考えられるものである。これらの文献の参照は本明細書の説明において括弧の中に示された番号によって行われるものとする。
【非特許文献１】Ｔｕｌｌｉｕｓ，Ｔ．Ｄ．（１９８９）、フットプリント法による蛋白質−ＤＮＡ複合体の物理的研究、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ，１８，２１３〜３７．
【非特許文献２】Ｂｒｅｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓｅｎｅａｒ，Ｄ．Ｆ．，Ｓｈｅａ，Ｍ．Ａ．およびＡｃｋｅｒｓ，Ｇ．Ｋ．（１９８６）、定量的なＤＮアーゼ・フットプリント滴定：蛋白質−ＤＮＡ相互作用を研究する一方法、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１３０，１３２〜８１．
【非特許文献３】Ｇａｌａｓ，Ｄ．Ｊ．およびＳｃｈｍｉｔｚ，Ａ．（１９７８）、ＤＮアーゼ・フットプリント法：蛋白質−ＤＮＡの結合の特異性を検出する簡単な方法、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，５（９），３１５７〜７０．
【非特許文献４】Ｔｕｌｌｉｕｓ，Ｔ．Ｄ．およびＤｏｍｂｒｏｓｋｉ，Ｂ．Ａ．  （１９８６）ヒドロキシルラジカルによる「フットプリント法」：ＤＮＡ−蛋白質の接触に関する高分解能情報、およびλ−抑制因子およびＣｒｏ蛋白質に対する適用性、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８３（１５），５４６９〜７３．
【非特許文献５】Ｔｕｌｌｉｕｓ，Ｔ．Ｄ．，Ｄｏｍｂｒｏｓｋｉ，Ｂ．Ａ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ｍ．Ｅ．およびＫａｍ，Ｌ．（１９８７）、ヒドロキシルラジカルによるフットプリント法：蛋白質−ＤＮＡの接触をマッピングする高分解能的方法、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５５，５３７〜５８．
【非特許文献６】Ｓｔｒａｈｓ  Ｄ．およびＢｒｅｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．（１９９４）、バクテリオファージλのｃＩ−抑制因子のＯＲに対する協力的な結合に伴うＤＮＡの立体配座の変化、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２４４（５），４９４〜５１０．
【非特許文献７】Ｋｉｎｇ，Ｐ．Ａ．，Ｊａｍｉｓｏｎ，Ｅ．，Ｓｔｒａｈｓ，  Ｄ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｖ．Ｅ．およびＢｒｅｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．（１９９３）、ペルオキソ亜硝酸を用いるＤＮＡ上の蛋白質の「フットプリント」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２１（１０），２４７３〜８．
【非特許文献８】Ｂｕｒｋｈｏｆｆ，Ａ．Ｍ．およびＴｕｌｌｉｕｓ，Ｔ．Ｄ．（１９８７）キネトプラストＤＮＡにおけるアデニン索によってとられる異常な立体配座、Ｃｅｌｌ，４８（６），９３５〜４３．
【非特許文献９】Ｌａｔｈａｍ，Ｊ．Ａ．およびＣｅｃｈ，Ｔ．Ｒ．（１９８９）、触媒となるＲＮＡ分子のインサイドおよびアウトサイドの定義、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５（４９１５），２７６〜８２．
【非特許文献１０】Ｃｅｌａｎｄｅｒ，Ｄ．Ｗ．およびＣｅｃｈ，Ｔ．Ｒ．（１９９０）、鉄（ＩＩ）−エチレンジアミン四酢酸を触媒としたＲＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドの切断：一本鎖および二本鎖の形に対する同様な反応性、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９（６），１３５５〜６１．
【非特許文献１１】Ｆｒａｎｃｈｅｔ−Ｂｅｕｚｉｔ，Ｊ．，Ｓｐｏｔｈｅｉｍ−Ｍａｕｒｉｚｏｔ，Ｍ．，Ｓａｂａｔｔｉｅｒ，Ｒ．，Ｂｌａｚｙ−Ｂａｕｄｒａｓ，Ｂ．およびＣｈａｒｌｉｅｒ，Ｍ．（１９９３）、放射線分解によるフットプリント法、β線、γ光子、および高速中性子をプローブにしたＤＮＡ−蛋白質の相互作用、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２（８），２１０４〜１０．
【非特許文献１２】Ｉｓａｂｅｌｌｅ，Ｖ．，Ｆｒａｎｃｈｅｔ−Ｂｅｕｚｉｔ，Ｊ．，Ｓａｂａｔｔｉｅｒ，Ｒ．，Ｓｐｏｔｈｅｈｎ−Ｍａｕｒｉｚｏｔ，Ｍ．および  Ｃｈａｒｌｉｅｒ，  Ｍ．（１９９４）、高速中性子を照射したＤＮＡにおける鎖の切断部位、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７６（２），１８７〜９１．
【非特許文献１３】Ｓｃｌａｖｉ，Ｂ．，Ｗｏｏｄｓｏｎ，Ｓ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．，Ｃｈａｎｃｅ，Ｍ．Ｒ．およびＢｒｅｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．（１９９７）、時間分解シンクロトロンＸ線による「フットプリント法」、核酸の構造と機能の研究に対する新しい手法、蛋白質−ＤＮＡの相互作用およびＲＮＡの折り畳みに対する応用、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２６６（１），１４４〜５９．
【非特許文献１４】Ｋｌａｓｓｅｎ，Ｎ．Ｖ．（１９８７）、放射線化学の原理と応用、ＶＣＨ，Ｔａｘｅｓ，ｐｐ．２９〜６１．
【非特許文献１５】ｖｏｎ  Ｓｏｎｎｔａｇ，Ｃ．（１９９１）、フリーラジカルによるＤＮＡの損傷、Ｂａｓｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，５８，２８７〜３１７；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ３１７−２１．
【非特許文献１６】Ｈａｙｅｓ，Ｊ．Ｊ，Ｋａｍ，Ｌ．およびＴｕｌｌｉｕｓ，Ｔ．  Ｄ．（１９９０）、γ線を用いる蛋白質−ＤＮＡ複合体のフットプリント、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１８６，５４５〜９．
【非特許文献１７】Ｓｃｌａｖｉ，Ｂ．，Ｗｏｏｄｓｏｎ，Ｓ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．，Ｃｈａｎｃｅ，Ｍ．およびＢｒｅｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．（１９９８）、時間分解シンクロトロンＸ線フットプリント法によるＲＮＡの折り畳みの追跡、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２９５，３７９〜４０２．
【非特許文献１８】Ｈａｍｐｅｌ，Ｋ．Ｊ．およびＢｕｒｋｅ，Ｊ．Ｍ．（２００１）Ｆｅ（ＩＩ）−ＥＤＴＡを使用したＲＮＡのヒドロキシルラジカルによる時間分解フットプリント、Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３（３），２３３〜２３９．
【非特許文献１９】Ｒａｌｓｔｏｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｈｅ，Ｑ，，Ｂｒｅｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．およびＣｈａｎｃｅ，Ｍ．Ｒ．（２０００）、化学変性で明らかになったＲＮＡの個別的な第３の接触の安定性および共同性、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ，７（５），３７１〜４．
【非特許文献２０】Ｐｅｔｒｉ，Ｖ．およびＢｒｅｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．（１９９７）  核酸の定量的なフットプリント：熱力学的および速度論的方法、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，８（１），３６〜４４．
【非特許文献２１】Ｔｕｌｌｉｕｓ，Ｔ．Ｄ．およびＤｏｍｂｒｏｓｋｉ，Ｂ．Ａ．（１９８５）、任意のＤＮＡ分子に沿った螺旋的な捩れの測定に使用するための鉄（ＩＩ）ＥＤＴＡ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０（４７２６），６７９〜８１．
【非特許文献２２】Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｗ．およびＮａｓｈ，Ｈ．Ａ．（１９９４）、ＤＮＡ−蛋白質複合体の特異的な光架橋性：組み込みホスト因子とその標的ＤＮＡとの間の接触点の同定、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９ｌ（２５），１２１８３〜７．
【非特許文献２３】Ｎｅｌｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｈｉｒａｙａｍａ，Ｈ．およびＲｏｇｅｒｓ，Ｄ．Ｗ．Ｏ．（１９８５）、ｐｐ．２６５．
【非特許文献２４】Ｎａｍｉｔｏ，Ｙ，Ｂａｎ，Ｓ．およびＨｉｒａｙａｍａ，Ｈ．（１９９５）、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．，５１，３０３６〜３０４３．
【非特許文献２５】Ｎａｍｉｔｏ，Ｙ，Ｂａｎ，Ｓ．およびＨｉｒａｙａｍａ，Ｈ．（１９９３）、ＥＧＳ４コード中への線形偏光した光子の散乱の実装、Ｎｕｃｌ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ，３３２，２７７〜２８３．
【非特許文献２６】Ｄｉｘｏｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｈａｙｅｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｌｅｖｉｎ，Ｊ．Ｒ，Ｗｅｉｄｎｅｒ，Ｍ  Ｆ．，Ｄｏｍｂｒｏｓｋｉ，Ｂ．Ａ．およびＴｕｌｌｉｕｓ，Ｔ．Ｄ．（１９９１）、ヒドロキシルラジカルによるフットプリント、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０８，３８０〜４１３．
【非特許文献２７】Ｔｕｌｌｉｕｓ，Ｔ．Ｄ．（１９９１）、ヒドロキシルラジカルを用いるフットプリント法、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１２〜１３  Ｐｔ  ２，５２１〜９．
【非特許文献２８】Ｐａｓｔｏｒ，Ｎ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｈ．，Ｊａｍｉｓｏｎ，Ｅ，およびＢｒｅｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．（２０００）、ＴＢＰ−ＤＮＡ複合体のＯＨラジカルによるフットプリントの詳細な解釈は塩基配列に特異的な結合の機構における働力学的役割を明示する、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３０４（１），５５〜６８．
【非特許文献２９】Ｒａｌｓｔｏｎ，Ｃ．Ｙ，Ｓｃｌａｖｉ，Ｂ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．，Ｄｅｒａｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｗｏｏｄｓｏｎ，Ｓ．Ａ．，Ｃｈａｎｃｅ，Ｍ．Ｒ．およびＢｒｅｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．（２０００）、時間分解シンクロトロンＸ線フットプリント法、およびＲＮＡの折り畳みへのその応用、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｔｎｏｌ，３１７，３５３〜６８．
【非特許文献３０】Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ａ．，Ｙａｎｇ，Ｓ．，Ｍｉｚｕｕｃｈｉ，Ｋ．およびＮａｓｈ，Ｈ．Ａ．（１９９６）、ＩＨＦ−ＤＮＡ複合体の結晶構造；蛋白質で誘起されるＲＮＡのＵ−ターン、Ｃｅｌｌ，８７（７），１２９５〜３０６．
【非特許文献３１】Ｄｈａｖａｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｃｒｏｔｈｅｒｓ，Ｄ．Ｍ．，Ｃｈａｎｃｅ，Ｍ．Ｒ．およびＢｒｅｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．（２００１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ組み込みホスト因子によるＤＮＡの協奏的な結合および湾曲、投稿中．
【非特許文献３２】Ｈｕｂｅｌｌ，Ｊ．Ｈ．，Ｖｅｉｇｅｌｅ，Ｗ．Ｊ．，Ｂｒｉｇｇｓ，Ｅ．Ａ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｒ  Ｔ．，Ｃｒｏｍｅｒ，Ｄ．Ｔ．およびＨｏｗｅｒｔｏｎ，Ｒ．Ｊ．（１９７５）、原子形因子、非干渉性散乱関数および光散乱断面積、Ｊ．  Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｆ．Ｄａｔａ，４，４７１．
【非特許文献３３】Ｗｕ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｏｚａｒｉｃｈ，Ｊ．Ｗ．およびＳｔｕｂｂｅ，Ｊ．（１９８３）、ブレオマイシンによるＤＮＡからの遊離塩基の生成機構；ポリ（ｄＡ．ｄＵ）からの部位に特異的なトリチウムの放出に基づく一提案、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２５８（８），４６９４〜７．
【非特許文献３４】Ｈｅｙｄｕｋ，Ｔ．，Ｂａｉｃｈｏｏ，Ｎ．およびＨｅｙｄｕｋ，Ｅ．（２００１）、金属イオン錯体を使用する蛋白質のヒドロキシルラジカルを用いるフットプリント法、Ｍｅｔ  Ｉｏｎｓ  Ｂｉｏｌ  Ｓｙｓｔ，３８，２５５〜８７．
【０００３】
＜発明の背景＞
蛋白質と核酸との間の相互作用、および核酸の立体配座は通常「フットプリント」方法よって調べられる。これらの方法では、分子のホスホジエステル主鎖の中にニックを生じる試薬を作用させることにより核酸分子をフラグメントしている。次にニックをもたない分子の領域を探す。このようなニックをもたない領域は該試薬の作用から保護された領域である。このような保護は、例えば或るリガンドを核酸の中の特定の塩基配列に結合させるか、或いは分子の立体配座に結合させることによって行うことができる（非特許文献１，２）。このような試験法の前提条件は高品位の核酸のフラグメント化をもたらし、そして検出できることである。核酸のフラグメント化は多種多様な酵素および化学試薬を用いることによって達成することができる（非特許文献３）。「ヒドロキシルラジカルを用いる化学的なフットプリント法」と呼ばれる核酸をフラグメント化する他の方法では、フェントン（Ｆｅｎｔｏｎ）試薬（非特許文献４〜６）およびペルオキソ亜硝酸（非特許文献７）が使用される。この方法では、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）は塩基配列に対し非特異的な配列様式でホスホジエステル主鎖を切断する。酵素を用いるフットプリント法に比べヒドロキシルラジカルによるフットプリント法を使用する方が有利である。何故ならその場合塩基配列に依存した湾曲（非特許文献８）およびＤＮＡの折り畳み（非特許文献９）のような核酸の構造に対して大きな感度が得られるからである。
【０００４】
ヒドロキシルラジカルによる核酸のフラグメント化は主としてホスホジエステル主鎖に対する溶媒の到達し易さに依存している。またそれは塩基配列に比較的鈍感であり、核酸が１本鎖であるか２本鎖であるかは重要ではない（非特許文献１０）。・ＯＨはＦｅ−ＥＤＴＡ触媒により、或いはγ線、β粒子、高速中性子、Ｘ線の照射によってつくることができる（非特許文献１１〜１３）。エネルギーが１００ｅＶないしＭｅＶ範囲のＸ線による放射線分解により下記反応式（１）に示される全体的な反応によって自由電子と・ＯＨが生じる（非特許文献１４）。
【０００５】
【数１】
2005510740.tif 000003
【０００６】
この反応によって生じた・ＯＨはＤＮＡおよびＲＮＡのリボース糖のＣ’４炭素から１個の水素を引き抜き、核酸ポリマーのホスホジエステル主鎖を切断する（非特許文献１５）。蛋白質−核酸複合体を制御された方法でＸ線に露出する方法は、このような複合体の内部における特異的な相互作用を検出するのに使用されてきた（非特許文献１１、１６）。Ｘ線を用いるフットプリント法は時間分解フットプリント法の研究に対する魅力的な方法であることが示されている。何故ならば、これによって塩基対の分解を伴うミリ秒の時間尺度において核酸の主鎖をフラグメント化する・ＯＨを高い密度束で得ることができるからである。シンクロトロン時間分解Ｘ線フットプリント法の最近の発展により、この方法をＲＮＡ折り畳み構造の動的変化の研究に使用できることが実証された（非特許文献１７）。
【０００７】
シンクロトロンのような高エネルギー源は１／１０ミリ秒以内で核酸を切断するのに十分な濃度で・ＯＨラジカルを生成するほど十分に高い光子束を生成することができる（非特許文献１３）。しかし、比較的入手し難いことおよび操作のコストが高いことのために、フットプリント法にシンクロトロン放射線源を使用することには限界がある。
【発明の開示】
【０００８】
＜本発明の概要＞
本発明においてはその第１の態様において試料を照射するシステムが提供される。本発明のこの態様に従えば、該システムは、毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生しる強度をもったＸ線ビームを発生するＸ線発生器を具備している。例えばこのシステムに回転アノードを使用することができる。またこのシステムは、開いた状態と閉じた状態の間を交互にとり得るシャッターを具備し、このシャッターは１，０００ミリ秒より短い予め定められた時間の間開いた状態にあることができる。本発明の第２の態様においては試料を照射する方法が提供される。本発明のこの態様においては、毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生じる強度をもったＸ線ビームで試料を照射する。試料は１，０００ミリ秒よりも短い時間の間放射線に露出される。
【０００９】
例えば本発明は、核酸分子を含む試料を照射して試料の中に・ＯＨラジカルを発生させ分子をフラグメント化するのに使用することができる。これによって、ＲＮＡの折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）の構造的な動的変化（非特許文献１９）および蛋白質−核酸の相互作用（非特許文献２０）を研究するのに適した時間尺度において・ＯＨラジカルによるＤＮＡのフットプリントを行うことができる。
【００１０】
本発明によれば、
（ａ）毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生じる強度をもったＸ線ビームを発生することができるＸ線発生器；および
（ｂ）試料をＸ線ビームで照射する開いた状態と試料をＸ線ビームで照射しない閉じた状態との間を交互にとることができるシャッターであって、開いた状態における時間が１，０００ミリ秒より短くなるように設計されたシャッターを具備した試料照射システムが提供される。
【００１１】
さらに本発明においては、
（ａ）毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生じる強度をもったＸ線ビームで１，０００ミリ秒よりも短い時間の間照射した場合・ＯＨラジカルを発生するような環境の中に核酸分子を置き、
（ｂ）毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生じる強度をもったＸ線ビームで１，０００ミリ秒よりも短い時間の間該環境を照射して該環境の中で・ＯＨラジカルを発生させ、
（ｃ）核酸分子のフラグメント化を検出することを特徴とする核酸分子のフットプリントを行う方法が提供される。
【００１２】
本発明を理解し、それを如何にして実施するかを示すために、添付図面を参照し本発明の非限定的実施例を用いて下記に好適具体化例の説明を行う。
【００１３】
本発明の特定の具体化例の詳細な説明
図１は、本発明の一具体化例に従った一般的に番号１００で示される試料照射システムの模式図である。このシステムは、日本のＲｉｇａｋｕ製ＲＴＦ  ５００型回転アノード管１１０を具備している。この回転アノード管１１０は試料１２０を照射するＸ線ビーム１１５を発生する。図１の具体化例においては，下記に説明するように，試料１２０はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管１２２の底の所かまたはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管１２４のカバーの上にある。次にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管１２２または１２４を試料保持器１２５の中にいれ、次にこの保持器をアダプター１２８の中に挿入して試料をＸ線ビーム１１５の中に位置させる。
【００１４】
本発明に従えば、システム１００は米国、ニューヨーク州、ＲｏｃｈｅｓｔｅｒのＶｉｎｃｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ製の電子シャッター１３０を具備している。この電子シャッター１３０は露出時間を最高１，０００ミリ秒に設定するために使用される。電子シャッター１３０は、Ｘ線がアノード管１１０から放出されるまで真空中に保持することが好ましい。アノード管１１０と試料との間の空気中をＸ線ビームが通過する距離をさらに短くするためには、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管１２４のキャップの中に試料を入れることが好適である。電子シャッター１３０は、米国、ニューヨーク州、ＲｏｃｈｅｓｔｅｒのＶｉｎｃｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ製の遠隔制御ボックス１４５から出ているケーブル１４０によってコントロールされる。この電子シャッターはＸ線に対する抵抗性が厳密に試験されたものである。
【００１５】
システム１００は１秒を越える露出時間を設定するために使用することができる手動の機械的シャッターを場合により備えていることができる。手動のシャッター１５０を使用する場合には、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管１２２の底に試料を置く。次にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管をアダプター１２５に入れ、試料をＸ線ビーム１１５の中に位置させる。図１の具体化例においては、Ｘ線ビームは手動のシャッター１５０からＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管１２２の底までの空気中を３．６ｃｍ通過する。
【００１６】
挿入される装置はすべて真鍮からつくられることが好ましい。これによって発散を起こすことなくＸ線ビームで直接試料を照射することができる。
【００１７】
下記の実施例に記載するように、図１のシステムを用いてＤＮＡ分子のフットプリントを行った。
【００１８】
材料および方法
ＤＮＡのクロニングおよびプラスミドの精製  −  大腸菌から分離された染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて切断して得られる不規則な断片を、同じ酵素を用いて予備消化したｐＴＺ１８Ｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の中にクロニングした。大腸菌のＸＬ−１  Ｂｌｕｅ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の形質転換を行った後、協奏（ｃｏｎｃｅｒｔ）核酸精製システム・キット（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いてプラスミドを増幅し精製した。酵素制限反応によりＤＮＡ断片を切断し、１４０ｂｐの断片をつくった。これをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ−ＤＮＡ精製キットで１％のアガロースのゲルから精製した。
【００１９】
ＤＮＡ分子の調製および末端標識  −  標準的な手順を使用し、α−［３２Ｐ］−ＡＴＰを用いＫｌｅｎｏｗ断片（Ｒｏｃｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で末端の所においてＤＮＡに標識を付けた。標識されたＤＮＡを８％のＰＡＧＥ／トリス・ボーレイト（Ｔｒｉｓ  Ｂｏｒａｔｅ）ＥＤＴＡ  （ＴＢＥ）×１．０の未加工のゲルの中に混入し、ゲルからＤＮＡ断片を切り取った。
【００２０】
Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆    Ｓｃｈｕｅｌｌ  ＢＩＯＴＲＡＰシステムを用い、電気泳動溶出法によってゲルからＤＮＡを抽出した。ＤＮＡを沈澱させ、ｐＨ  ７．５、１０ｍＭのカコジル（Ｃａｃｏｄｙｌｉｃ、Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ）緩衝液の中に再懸濁させた。
【００２１】
化学的フットプリント  −  ＴｕｌｌｉｕｓおよびＤｏｍｂｒｏｓｋｉ（非特許文献２１）の方法によりＦｅ（ＩＩ）−ＥＤＴＡによる切断反応を行った。切断反応の成分、即ち１μｌの０．２％Ｈ２Ｏ２、１μｌの６０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、および１μｌのＦｅ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ（６０  ｍＭのＦｅ（ＮＨ４）２−（ＳＯ４）２および５０ｍＭのＮａ２−ＥＤＴＡを化学反応を行う前にｐＨ８で混合したもの）を順次Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管の内壁に加えた。次にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管を表面の上で軽く叩いて迅速な撹拌を行った。２秒間反応を進行させ、次いで９０μｌの１００％エタノールを用いて反応を停止させ、ｐＨ５．２の０．３ＭのＮａＡＣｃで−２０℃において０．４μｇのｔＲＮＡを沈澱させ、添加緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）の中に再懸濁させた。
【００２２】
Ｘ線によるフットプリント  −  シリコーン処理したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管の中で比活性６０，０００ｃｐｍの酵素を用いＤＮＡのフットプリントを行った。１０μｌの標識したＤＮＡ（比活性６０，０００ｃｐｍ）の試料を氷の上で定温に保った後Ｘ線に露出した。本発明の装置を用い、その中に各試料を入れてＸ線に露出させた。指示された時間の間Ｘ線シャッターを開いた。Ｘ線に露出した直後、試料を氷の上に載せ、同容積の添加緩衝液、即ち９０％のホルムアミド、０．５×ＴＢＥ緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０５（ｗ／ｗ）のキシレンシアノールと一緒にした。さらに他の分析を行うために試料を−８０℃に保った。
【００２３】
蛋白質−ＤＮＡのフットプリント  −  大腸菌から得られた精製した組み込みホスト因子（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒ（ＩＨＦ））蛋白質およびＤＮＡ基質はＭｉｃｈａｅｌ  Ｂｒｅｎｏｗｉｔｚ博士およびＧｕｒｉｅ  Ｄｈａｖａｎ氏から提供された。ＩＨＦはｐＨ７．５のトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび５％グリセリンの中に貯蔵した。ＩＨＦの標的ＤＮＡ基質（図５）はＩＨＦの共通配列を有するプラスミドのＰＣＲ増幅によってつくった（非特許文献２２）。得られた１６４ｂｐのＰＣＲ生成物をそのプライマーの一つの中でＰＣＲ反応を行う前の冷ＡＴＰを用い予備ホスホリル化した。３２Ｐ−γ−ＡＴＰを用いてＰＣＲ増幅を行った後、標準的なＴ４ポリヌルレオチド・キナーゼ（ＮＥＢ）を使用して第２のホスホリル化を行った。上記のようにしてＤＮＡの電気泳動溶出を行った。フットプリント反応はｐＨ７．５の２０ｍＭのカコジル（ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ）緩衝液、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２の中で室温において１０分間行った。エタノールで沈澱させることにより反応を停止させ、添加緩衝液の中で再懸濁させ、ゲル電気泳動法で分析した。
【００２４】
ゲル電気泳動法  −  予め温めた１０％の変性されたポリアクリルアミド配列決定ゲルに試料を被覆した。１．０×ＴＢＥの緩衝液を用い５０℃において電気泳動を行った。実験終了後、ゲルを１０％の酢酸および１０％のメタノールで２０分間固定し、その後ゲルを１０％のグリセリンの中で２０分間インキュベートした。乾燥したゲルのオートラジオグラフをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（ＭＤ）のＰｈｏｓｐｈｏｌｍａｇｅｒ  Ｓｔｏｒｍ  ８２０を用いてデンシトメトリーにより解析した。
【００２５】
フットプリントの実験のデータ解析  −  データはＩｍａｇｅＱｕａｎｔＮＴソフトウエア（ＭＤ）で解析した。切断されずに残ったフラクションの定量は次の式に従って計算した：
Ｆ＝ＯＤｎ，ｃｕｔ／ＯＤｕｎｃｕｔ
ここでＦは切断されなかったフラクションに等しく、ＯＤｎ，ｃｕｔはｎ番目のバンドの測定強度であり、ＯＤｕｎｃｕｔは露出されなかった試料の測定強度である。データを１次の指数関数的な減衰に対する片対数のプロットの式：Ｙ＝ｙ０＋Ａｅ−ｘ／ｔに当てはめた。それぞれのデータ点は二つの独立に行った実験の平均である。
【００２６】
光子の吸収に対するモンテカルロ法によるシミュレーション  −  低エネルギーの散乱および分極に対するＥＧＳ４コード・システム（非特許文献２３）の最も最近の発展により、このコード・システムはシンクロトロンをベースにしたＸ線のシミュレーションに対する最良の手段の一つとして確立された。ＫＥＫ  ＥＧＳグループ（非特許文献２４、２５）によって開発された低散乱光子輸送ルーティンのモジュラー構造により、Ｈ２Ｏ、空気、ＤＮＡ（Ｃ５Ｏ５Ｈ７−Ｐの重合体として）およびポリプロピレンのような形状因子および散乱関数をもつ化合物の断面積をつくることができる。ＥＧＳ４システムを用いて異なった光子源に対するフットプリント試料のデポシット・エネルギー（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ  ｅｎｅｒｇｙ）のシミュレーションを行った。第１のユーザー・コードはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＮＳＬＳ）のビーム・ラインＸ９−を含ませるように開発された。スペクトルの形はウエッブに見出だされた情報により計算した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｃｘｒｏ．ｌｂｌ．ｇｏｖ／ｏｐｔｉｃａｌ＿ｃｏｎｓｔａｎｔｓ／ｅｎｄ２．ｈｔｍｌ）。計算に使用した条件は、線形偏光比が９２％であり、ＤＮＡ試料をポリプロピレンのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管（１．５ｍｌ）の円錐形の端の内側に導入し、同じ材料からつくられた１ｍｍのカバーで密封するという条件であった。カバーおよび試料の中への入射フラウンス（ｆｌｏｕｎｃｅ）当たりの吸収されたエネルギーを計算し、フットプリントに対するＮＳＬＳ光子源の効率を見出だした。
【００２７】
他のグループのユーザー・コードはＸ線発生器のフットプリント照射システムに対して書かれたものであるが、これはフィルターかけ（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（Ｂｅおよび空気）、アノード材料による発生源エネルギー、および開いたポリプロピレンのシリンダー（図２に示すような）内部の試料を含んでいる。Ｘ線発生器のシミュレーションにおいてもそれぞれに対し１０７個の履歴を用いＮＳＬＳのシミュレーションの場合と同じ出力を適用した。
【００２８】
結果
核酸分子のフラグメント化は水の放射線分解から発生するフリーラジカルの有効濃度に依存することが示されている（非特許文献２６）。Ｘ線によるフットプリントの場合には、Ｘ線に対してＤＮＡ／ＲＮＡ試料が受ける露出量（「照射量」）を監視することによって溶液中のフリーラジカルの濃度をコントロールする。実験的に決定された照射量−応答曲線により、各ＤＮＡ／ＲＮＡ分子が１回だけ切断されるのに必要なＸ線の露出時間が与えられる。１０〜３０％の核酸を切断するようなＸ線露出時間がこの必要条件を満たしている。これらの実験に用いられた試料の調製法および緩衝システムは、異なった反応条件に対して照射量−応答曲線をつくる実験を行うことによって最適化されたものである。
【００２９】
試料の調製法  −  溶液中のフリーラジカル濃度の有効濃度を増加させるために、・ＯＨラジカルを消滅させる原因となる因子を最低限度に抑制した。標識されたＤＮＡの精製は通常ポリアクリルアミド・マトリックスから抽出することによって行われる。この方法では抽出されたＤＮＡ／ＲＮＡにポリアクリルアミドが汚染物質として導入される。従ってゲル・マトリックスから得られたＤＮＡを電気泳動溶出法によって精製した。この方法を用いれば１０〜３０％の核酸の切断を達成するために必要なＸ線ビームに対する核酸試料の露出時間が著しく低下する。これに加えて、次の３種の緩衝システムを試験した（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）：トリス−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ−Ｎａ、およびカコジル−Ｎａ。カコジル緩衝システムを用いた場合最良の結果が得られた。この緩衝システムはＸ線フットプリント法にしばしば用いられる（非特許文献１３、１８）。全体的に見てこれらの結果は、回転アノード装置によって発生するＸ線を用いたフットプリント試験法においては試料の組成および精製が主要な役割を演じていることを示している。
【００３０】
回転アノードのパラメータ  −  回転アノードをもつＸ線源の光子束強度およびエネルギーを最適化して核酸のフラグメトント化収率が最大になるようにした。これは理論的および実験的な両方の研究を用いて行われた。或る与えられた操作パワーおよびターゲット材料に対し、Ｘ線ビームによって生じる光子束を計算することができる。通常の診断用Ｘ線発生器に対する光子のスペクトル束は、種々のアノード材料および管球の電圧に対して計算されてカタログにまとめられている（Ｂｉｒｃｈ等、１９７９）。１Ａｍｐ当たりの参照光子束の値に回転アノード電流の値を乗じて光源から出る光子束を計算した。モリブデン（Ｍｏ）のターゲットに対して管球の電圧が５０ｋＶの場合、フィルターをかけない参照値としてカタログから１．９１×１０６ｐｈ  ｍＡ−１ｓ−１ｍｍ−２が１Ａｍｐ当たりの光子束の値として選ばれている。何故なら、ＥＧＳ４モンテ・カルロ・ユーザー・コードのシミュレーションの中にはフィルターをかけることが含まれていたからである。従って、Ｍｏの回転アノード（３００ｍＡ）に対する光源光子束は１７．４８ｋｅＶにおいて５．７×１０８ｐｈ  ｍＡ−１ｓ−１ｍｍ−２である。Ｚ数が低い他のターゲット材料（例えば銅（Ｃｕ）、クロム（Ｃｒ）、ニッケル（Ｎｉ）、鉄（Ｆｅ）の材料）のＫα放出線における光子束はＭｏの蛍光収率比によって比較することができる。これらの結果は、２００ｍＡのリング電流で毎秒５×１０９個の光子をを発生するシンクロトロンによるフットプリントの実験（非特許文献１７）に使用される光子束に比べ、回転アノードから発生する光子束が１桁低いことを示している。
【００３１】
効果的な核酸のフットプリントを行うのに必要な最小の時間尺度でのビームの比エネルギーを計算するために、３種の異なったターゲット材料用の元素をアノードとして試験した。照射量−応答実験を行うことにより或る与えられた時間におけるＤＮＡの切断の量に対するＸ線エネルギー源の効果を検討した。この実験においては、銀（Ａｇ）、ＭｏおよびＣｕのターゲットを使用した。これは比較的広いエネルギー範囲を表している：（Ａｇ，λ＝０．５６Å（２５．５ＫｅＶ）；Ｍｏ，λ＝０．７１Å（１９．９ＫｅＶ）；Ｃｕ，λ＝１．５４Å（８．９７ＫｅＶ））。
【００３２】
これらの実験の結果、並びに各アノードから発生する光子束および試料に吸収されたエネルギーの割合（％）を図８の表にまとめる。それぞれの結果は二つの独立の試料の平均である。上記の材料および方法の項で説明したようにしてモンテ・カルロ法による理論的計算を行った。
【００３３】
図８は、与えられたＸ線発生器の設定においてＣｕアノードが最も効率の良いＤＮＡのフラグメント化を達成したことを示している。何故ならば、発生したエネルギーの大部分が試料に当たっているからである。さらにこの結果によれば、ＤＮＡの効率的な切断が起こる主要な因子は試料に吸収されたエネルギーの量であり、これは線源の比エネルギーに関連していることが示される（図８）。ＤＮＡのフラグメント化に対するビームの効果をさらに調べるために、モンテ・カルロ法による計算を行った。異なったアノード用の金属を用いたＸ線発生器の場合、モンテ・カルロ法によるシミュレーションから得られる吸収されたエネルギーを導入して試料の放射線吸収量が最大になるように最適の回転アノードを選択した。各材料の蛍光収率に光子束の値を乗じ、試料の絶対吸収値を比較した（また表１参照）。図２はアノード材料のＺ数に対して試料の吸収効率を与えるシミュレーションの結果を示す。これらの結果によれば、ＫｅＶ単位で７〜９．５の範囲のエネルギーが水溶液中におけるＤＮＡの切断に最も寄与することが示されている。このエネルギー範囲はＣｕの回転アノードのエネルギー（９ＫｅＶ）と一致する。従ってＣｕの回転アノードはＸ線発生器によるフットプリント法に対し最も適切な材料であることが示された。
【００３４】
Ｘ線ビームの強度  −  ビームの強度のパラメータとそのＤＮＡ切断率（％）との間の関係を調べた。約５０，０００ｃｐｍのＤＮＡ試料を異なったビーム強度においてＣｕをターゲットにした線源を用いＸ線ビームに３秒間露出した（Ｋｗ＝ＫｅＶ・ｍＡ）。ＵＲＥＡ／ＰＡＧＥ電気泳動法によりＤＮＡ試料を解析した。上記の材料および方法の項に記載した方法で、全長をもった核酸分子を表すゲル上の一番上のバンドを定量した。これらのデータの組は二つの独立した決定値を表している。ＤＮＡの切断はＸ線発生器の強度に対し直線的な関係を示す。データに対して当てはめを行った直線を高い強度の所まで外挿し、ＤＮＡの切断に対するビーム束（強度）の影響を示した。（Ｒ２＝０．９８）。図３はＸ線ビームの強度とＸ線に露出された後も切断されなかったＤＮＡの割合との間の関係を示す。これらの結果によれば、Ｘ線ビームの強度はフラグメント化されたＤＮＡの量の対数と直線関係を示すことが分かる。この直線を理論的に外挿すれば、ビームの強度がさらに高くなると、より短い時間でＤＮＡのフラグメント化の割合が増加することが示される。従ってＸ線発生器で得ることができる最高の強度を適切な線源エネルギーと組み合わせると、最低の時間尺度でＤＮＡのフラグメント化の収率を最大にすることができる。
【００３５】
塩基対レベルのの分解能におけるＤＮＡの分割（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）  −  塩基対レベルのの分解能において核酸のフラグメント化を追跡するには、切断の選択性において矛盾を示さない核酸のフラグメント化法が必要である。これに加えて、核酸のフラグメントは長いＤＮＡ／ＲＮＡ分子を高い分解能をもったバンドの分離幅で分割できなければならない。ヒドロキシルラジカルは化学的な生成源およびＸ線による生成源の両方からこのような分解パターンを生じることが示されている（非特許文献１３、２７）。
【００３６】
図４ａは回転アノードＸ線ビームに１〜４秒露出した後の１４０ｂｐのＤＮＡフラグメントの写真を示す。このディジタル画像は、１４０ｂｐのＤＮＡの３２Ｐで標識した制限断片をＸ線ビームに１〜４秒間露出して得られた反応生成物に対し、１２％のＵＲＥＡ／ＰＡＧＥの楔形の切り込みが配置されたゲルについて燐光記憶イメージング法（ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）を行うことによって得られた。ＦｅＥＤＴＡの記号を付けたレーンは同じＤＮＡ調合物に対してＦｅｎｔｏｎ反応で処理したものであるが、上記と同じ条件を用いて別のゲル上で分析した。挿入部分は指示した領域の拡大図である。この結果は、ＦｅＥＤＴＡ手順（非特許文献１８）によって得られたＤＮＡ切断パターンと同等であった。図４におけるＸ線回転アノードによるフットプリントは極めて均一で再現可能な切断パターンを示す（挿入拡大図参照）。積分バンド強度解析法（図４ｂ）によれば、分離されたゲルのバンドの長い領域に亙って極めて均一なパターンが得られる（非特許文献２８）。電気泳動の間にＤＮＡフラグメントをより良く分割するために楔形のゲル・スペーサーを使用した。これによって核酸の分離の長さ並びにバンドの均一性が増加する。この配置を用い、ＤＮＡ分子の最大１２０個の塩基対を定量的なフットプリント分析を行うのに十分な品質で分割することができる。Ｘ線ビームが空気中を通過する距離を最低限度に抑制するために、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管のカバー・キャップを用いてＸ線の出口に面した真空ラインの端に試料をできるだけ近づけて保持した。この改善された配置を用いると、或る与えられたＤＮＡ断片の１０〜３０％のＤＮＡを切断するのに必要な時間はミリ秒の時間領域まで低下した。
【００３７】
図５ａは１４０ｂｐのＤＮＡ断片の照射量−応答の結果を示す。切断しなかった部分の定量は上記の材料および方法の項に記載した方法で計算した。この結果は二つの独立した決定値の平均である。ＤＮＡの切断の割合（％）はミリ秒の時間尺度でＸ線源に露出した後に測定した。照射量−応答のデンシトメトリーを解析すれば、２００ミリ秒で１０％の切断が起こることが示される（Ｃｕ、６０ＫｅＶ、３００ｍＡ）。個別的なバンド強度の信号対雑音比を精密に検査すれば、１００ミリ秒のような短い時間尺度においてフットプリント・データの定量的な解析を行うことができる（非特許文献１３）。図５ｂはＸ線ビームに対する種々の露出時間で１４０ｂｐのＤＮＡ断片について行ったデンシトメトリーの走査の図を示す。一番上の右側の挿入部分は、異なった露出時間の後で得られたゲルの中央領域における１０個の塩基の領域に亙る種々のデンシトメトリーの走査を示す。一番下から一番上への走査は０（バックグラウンド）、１００、３００、５００、７００および１０００ミリ秒の露出後の走査である。１００ミリ秒の所での積分バド強度はバックグラウンドの走査に対して３倍増加し、１秒の所では強度の１０倍の増加を示す。
【００３８】
蛋白質−ＤＮＡのフットプリント  −  本発明の装置を使用し、標的ＤＮＡ塩基配列に結合したＩＨＦ蛋白質に対して蛋白質−ＤＮＡのフットプリントの実験を行った。この複合体は生化学的および構造的な研究によって特性が示されている（非特許文献２２、３０）。ＩＨＦは３４ｂｐ領域に沿って３個の部位にしっかりと結合している（図６ａ参照）。これらの部位はＤＮＡの目標の上に３個の保護領域をつくっている。３４ｂｐから成る標的ＤＮＡ領域の上におけるこの３個のＩＨＦの結合部位はブラックボックスＡＩ、ＡＩＩおよびＡＩＩＩの中に囲まれている。ＩＨＦがその基質ＤＮＡと相互作用すると３個の保護領域がつくられる。星印が付けられた５’端は３２Ｐで標識した位置を示している。図６ｂはＦｅＥＤＴＡおよびＸ線の両方の方法によるＩＨＦ−ＤＮＡのフットプリントを示す。５０ｎＭのＩＨＦをその目標ＤＮＡと共に１０μｌの反応容積で室温において１０分間保持する。試料をＦｅＥＤＴＡ切断剤（レーン１）またはＸ線ビームに１秒間（レーン４）に露出した。レーン２は対照のＤＮＡであり、レーン３はＸ線に露出した遊離のＤＮＡである。ＩＨＦと３４ｂｐのＤＮＡ領域とのしっかりとした結合から得られる３個の結合部位はＡＩ、ＡＩＩおよびＡＩＩＩの標識が付けられている。３個のすべての部位はレーン１およびレーン２において同定される。標的のＤＮＡ上における蛋白質の結合部位は対応する塩基配列に従ってＡＩ、ＡＩＩおよびＡＩＩＩとして示されている。これらの結合部位をＦｅＥＤＴＡ法および本発明方法に従って分析した。ＦｅＥＤＴＡ反応は２秒間進行させた。Ｘ線の実験は５００ミリ秒の間１回だけ試料を照射することによって行った。図６ｂのレーン１および４は、ＦｅＥＤＴＡ法および本発明の方法によって３個の上記のＩＨＦ結合部位が明かに同定できることを示している。さらに、これらの結果は、シンクロトロンＸ線フットプリント法を用いて同じＩＨＦ−ＤＮＡ複合体のフットプリント・パターンを報告したＤｈａｖａｎ等による最近の研究（非特許文献３１）と良く一致している。図６ｃは図６ｂのデンシトメトリーの図を示し、レーン３および４（それぞれ黒および青）はＩＨＦがＤＮＡに結合した場合ピーク強度が減少することを示している（図６ｂ、レーン４）。
【００３９】
シンクロトロン・ビームおよびＸ線アノードに対する光源のスペクトルと核酸試料上におけるデポシット・スペクトルとの比較を図７に示す。図７ではＸ−９  ＮＳＬＳビーク・ラインの所における正規化された光子束スペクトルが水溶液中の核酸試料上における正規化された吸収エネルギーの分布と対比して示されている。核酸試料上におけるピークエネルギーは１１〜１２ＫｅＶの範囲に入り、これは非特許文献２７に示された結果と一致している。誤差範囲を示す縦棒はシミュレーションの結果の標準偏差を表している。Ｃｕのアノード線源をもったＸ線発生器からデポジット・エネルギーのピーク（点線）はＸ−９  ＮＳＬＳからのデポジット・エネルギーのピークの極めて近くに存在している。これらの結果は、Ｃｕ回転アノードのエネルギーがシンクロトロン線源の中に入れた試料によって吸収されるピーク・エネルギーと極めて良く一致していることを示している。しかし、シンクロトロンＸ線ビームによって試料にかけられるエネルギーが広い範囲に亙っていることとは対照的に、Ｃｕのアノードのスペクトルは単一のあるいは非常に狭いエネルギー範囲を与える。全体的に見てこれらの結果によれば、光子束の或る与えられた値より高い場合、吸収された光子のエネルギーは希薄溶液中においてＸ線によりＤＮＡが効果的に切断されることに対する制限因子と考えることができる。従って、短い時間尺度において効果的に核酸を切断するためには、回転アノードをもつ発生器におけるターゲットの材料は注意深く選ばなければならない。それにも拘わらず、Ｃｕのアノードよって与えられるエネルギーの最高８１％はＤＮＡ溶液の中で吸収され（表１）、このことにより・ＯＨのフリーラジカルによってＤＮＡが切断される確率が改善される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の一具体化例に従った試料照射システム。
【図２】異なった回転アノードのターゲット用元素によりＤＮＡ試料中に吸収されたエネルギーのモンテ・カルロ法によるシミュレーション。
【図３】ビームの強度対切断しなかったＤＮＡの割合の照射量−応答曲線。
【図４】塩基対レベルの分解能における回転Ｘ線アノードによるＤＮＡの分割。（ａ）Ｘ線ビームに露出した後の１４０ｂｐのＤＮＡ断片の塩基対分割写真。（ｂ）ＤＮＡの切断パターンから得られたバンド強度のピークの当てはめ直線の例。データの解析はＰａｓｔｅｒ等記載の方法（非特許文献２８）で行った。上側のグラフはプログラムＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ５．０（ＭＤ）から得られた生のデータを表し、下側のグラフはピークの当てはめを行った後のデータを表す。
【図５】切断されなかったＤＮＡの量を、ミリ秒シャッターで制御されたＸ線源に試料を露出した時間と関係付ける照射量−応答曲線。
【図６】ＩＨＦ−ＤＮＡ複合体のフットプリント。（ａ）ＩＨＦに結合するＤＮＡの塩基配列。（ｂ）ＩＨＦ結合配列の３４ｂｐ領域を含む３２Ｐで標識された１６５ｂｐのＤＮＡの１０％塩基配列決定用のゲル。
【図７】水溶液中の核酸試料上での正規化された吸収エネルギーの分布と対比したＸ−９  ＮＳＬＳビーム・ラインでの正規化された光子束スペクトル。
【図１】
2005510740.tif 000004
【図２】
2005510740.tif 000005
【図３】
2005510740.tif 000006
【図４Ａ−４Ｂ】
2005510740.tif 000007
【図５Ａ−５Ｂ】
2005510740.tif 000008
【図６Ａ−６Ｃ】
2005510740.tif 000009
【図７】
2005510740.tif 000010
【図８】
2005510740.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月11日(2004.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む試料を照射する方法において、毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生じる強度において１，０００ミリ秒よりも短い時間の間試料をＸ線で照射することを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｘ線で照射した場合、試料が・ＯＨラジカルを生成することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該Ｘ線ビームが回転アノードＸ線発生器で発生させられることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
該回転アノードＸ線発生器がＣｕの回転アノードＸ線発生器であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
該予め定められた時間が１００〜３００ミリ秒の時間であることを特徴とする請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
（ａ）毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生じる強度においてＸ線ビームで１，０００ミリ秒よりも短い時間の間照射された場合、・ＯＨラジカルを発生するような環境の中に核酸の分子を置き、
（ｂ）毎秒１ｍｍ２当たり１０９個より少ない量の光子を生じる強度においてＸ線ビームで１，０００ミリ秒よりも短い時間の間該環境を照射して該環境の中において・ＯＨラジカルを発生させ、
（ｃ）核酸分子のフラグメント化を検出することを特徴とする核酸分子のフットプリント方法。
【請求項７】
該Ｘ線発生器が回転アノードＸ線発生器であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
該回転アノードＸ線発生器がＣｕの回転アノードＸ線発生器であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
該予め定められた時間が１００〜３００ミリ秒の時間であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか一つに記載の方法。
【国際調査報告】
2005510740.tif 000012
2005510740.tif 000013
2005510740.tif 000014