(57)【要約】細胞内で作用しそして多分化能細胞をｇｐ１３０の活性がないときに多分化能状態に維持する多分化能決定因子が記載され、これは、ヒト幹細胞の多分化能を維持または付与し、マウスＥＳ細胞の多分化能を維持または付与し、そしてマウスの非許容株由来の幹細胞の多分化能を維持または付与する。この因子およびこの因子をコードまたは活性化するベクターは、特に、ヒトを含む高等哺乳動物の多分化能細胞を維持および誘導するために使用される。
2005536183.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多分化能細胞集団を維持する方法であって、細胞内で作用しそしてｇｐ１３０の活性がないときに細胞に多分化能を維持または付与する因子を該集団に投与する工程を含み、該因子が、配列番号４に記載のポリペプチドと少なくとも５０％の配列同一性を有する、方法。
【請求項２】
細胞を多分化能状態で維持する方法であって、細胞内で作用しそしてｇｐ１３０の活性がないときに細胞に多分化能を維持または付与する因子をコードする遺伝子を該細胞において活性化する工程を含み、該因子が、配列番号４に記載のポリペプチドと少なくとも５０％の配列同一性を有する、方法。
【請求項３】
前記遺伝子が内因性遺伝子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子がエピソームプラスミド上に存在するかまたは安定に組込まれている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
細胞を多分化能状態で維持する方法であって、細胞内で作用しそしてｇｐ１３０の活性がないときに細胞に多分化能を維持または付与する因子をコードする遺伝子の発現を該細胞において維持または増加させる工程を含み、該因子が、配列番号４に記載のポリペプチドと少なくとも５０％の配列同一性を有する、方法。
【請求項６】
前記因子が、ヒト幹細胞の多分化能を維持または付与する、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
前記因子が、マウスＥＳ細胞に多分化能を維持または付与する、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項８】
前記因子が、マウスの非許容株由来の幹細胞に多分化能を維持または付与する、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項９】
前記因子が転写因子である、請求項１から８のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１０】
前記因子がホメオドメインを含む、請求項１から９のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１１】
前記因子が、マウス胚幹細胞および／またはマウス胚生殖細胞を多分化能状態で維持する、請求項１から１０のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１２】
前記因子が、ヒト胚幹細胞および／または他のヒト多分化能細胞を多分化能状態で維持する、請求項１から１１のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１３】
前記因子が、ＬＩＦ非応答性細胞を多分化能状態で維持する、請求項１から１２のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１４】
前記因子が、２００から４００アミノ酸を有するポリペプチドである、請求項１から１３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１５】
前記因子が、配列番号４に記載のポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１から１４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１６】
前記因子が、配列番号４に記載のポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１から１５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１７】
前記因子が、配列番号４に記載の配列を有する、請求項１から１６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１８】
前記因子が、細胞を多分化能状態で維持し、細胞内で作用し、そして配列番号４に記載のホメオドメインと５０％以上の配列同一性を有するホメオドメインを含む、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１９】
前記因子が、ＬＩＦ非応答性細胞を多分化能状態で維持する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記因子が、フィーダー細胞の不在下およびフィーダー細胞抽出物の不在下で、ヒトＥＳ細胞および／またはマウスの非許容株由来のＥＳ細胞を多分化能状態で維持する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記因子が、フィーダー細胞の不在下およびフィーダー細胞抽出物の不在下で、マウスの非許容株由来の細胞の多分化能状態での誘導および維持を支持する、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２２】
前記因子が、フィーダー細胞の不在下およびフィーダー細胞抽出物の不在下で、ヒトＥＳ細胞を多分化能状態で維持する、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２３】
前記因子が転写を調節する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記因子がホメオドメインを含む、請求項２１から２３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２５】
前記因子が、２００から４００アミノ酸を有するポリペプチドである、請求項２１から２４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２６】
前記因子が、ＬＩＦ非応答性細胞において活性である、請求項２１から２５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１、２、または５から２６のいずれかの項に記載の因子を、薬学的に受容可能なキャリアとともに含む、薬学的組成物。
【請求項２８】
請求項１、２、または５から２６のいずれかの項に記載の因子を含む、細胞培養培地。
【請求項２９】
ｇｐ１３０のアクチベーターをさらに含む、請求項２８に記載の細胞培養培地。
【請求項３０】
ＬＩＦレセプターリガンドを含む、請求項２９に記載の細胞培養培地。
【請求項３１】
ＩＬ−６および可溶性ＩＬ−６レセプターを含む、請求項２９に記載の細胞培養培地。
【請求項３２】
請求項１、２、または５から２６のいずれかの項に記載の因子の発現または活性が操作されている、細胞。
【請求項３３】
フィーダー細胞の不在下およびフィーダー細胞抽出物の不在下で、請求項１、２、または５から２６のいずれかの項に記載の因子によって多分化能状態で維持される、多分化能ヒト細胞。
【請求項３４】
請求項１、２、または５から２６のいずれかの項に記載の因子をコードする遺伝子を含む細胞であって、該遺伝子が活性化されている、細胞。
【請求項３５】
多分化能状態で細胞を維持するための、請求項１、２、または５から２６のいずれかの項に記載の因子の使用。
【請求項３６】
多分化能細胞を単離する方法であって、請求項１、２、または５から２６のいずれかの項に記載の因子をコードするヌクレオチドを、新たに単離された細胞集団中の細胞に導入する工程を含む、方法。
【請求項３７】
多分化能非ヒト細胞を単離する方法であって、
トランスジェニック動物を生成する工程であって、該トランスジェニック動物が、請求項１、２、または５から２６のいずれかの項に記載の因子をコードするヌクレオチドが調節されたプロモーターの制御下にある構築物を含む、工程、
該トランスジェニック動物からトランスジェニック胚を得る工程、
該トランスジェニック胚または動物から細胞を得る工程、および
該プロモーターを活性化して、該細胞において該因子を発現させる工程
を含む、方法。
【請求項３８】
トランスジェニック非ヒト動物を生成する方法であって、
請求項１、２、または５から２６のいずれかの項に記載の因子を細胞中に発現または提供し、それによって多分化能細胞の培養物を得る工程；
１以上の該細胞の遺伝子操作を行う工程；
該細胞において該因子の発現を実質的に消滅させる工程または該細胞から該因子を除去する工程；および
該細胞からトランスジェニック動物を得る工程
を含む、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法によって得られ得る、トランスジェニック動物。
【請求項４０】
調節可能なプロモーターの制御下に請求項１、２、または５から２６のいずれかの項に記載の因子をコードするヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック動物。
【請求項４１】
多分化能細胞を多分化能状態で維持する因子をスクリーニングする方法であって、
請求項１、２、または５から２６のいずれかの項に記載の因子を発現する多分化能細胞を提供する工程であって、該細胞が多分化能状態で安定に維持され、そして該因子の発現が制御され得る、工程；
該細胞の操作を行う工程；
該因子の発現を減少させる工程；および
多分化能状態で維持される細胞について選択する工程
を含む、方法。
【請求項４２】
前記操作が、
前記細胞の遺伝子操作であって、それによって前記スクリーニングが、請求項１、２、または５から２６のいずれかの項に記載の因子または多分化能状態で該細胞を維持するさらなる因子をコードする内因性遺伝子の発現を制御する因子を同定するために適切である操作；および
該細胞が培養される培養培地または培養条件の操作
から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記因子の発現が、該因子をコードするヌクレオチド配列と作動可能な組み合わせで調節可能なプロモーターを調節することによって制御される、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が培養される培地にリプレッサーを添加することによって前記因子の発現を減少させる工程を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１、２、または５から２６のいずれかの項に記載の因子をコードする内因性遺伝子の発現を調節する因子についてスクリーニングする方法であって、
（１）該内因性遺伝子に隣接するゲノムの領域を転写因子結合部位について分析する工程、および
（２）ＥＳ細胞からの抽出物を有する該領域のフラグメントをスクリーニングして、該フラグメントに結合する該抽出物の成分を同定する工程
を含む、方法。
【請求項４６】
前記内因性遺伝子に隣接しそして前記因子の多分化能細胞制限した発現を指示する前記ゲノムの領域を同定する工程をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記因子の発現を指示する領域がリポーター構築物のトランスフェクションによって同定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４１から４７のいずれかの項に記載の方法によって同定される、因子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多分化能決定因子およびその使用に関する。特に、本発明は、マウス、ヒト、および他の種の多分化能細胞の培養物を維持および誘導することに関する。
【背景技術】
【０００２】
マウスのある種の株から、ＬＩＦレセプター／ｇｐ１３０複合体によるシグナル伝達を活性化するサイトカインの供給によって、胚幹（ＥＳ）細胞は、培養物中で多分化能状態に誘導および維持され得る。しかし、このアプローチは、マウスに限定され、そしてヒト多分化能細胞の増殖には十分ではない。
【０００３】
細胞外活性ＥＳＲＦの発見（Daniら、1998）は、ＥＳ細胞の同一性を維持するためのＬＩＦレセプター／ｇｐ１３０非依存的経路の証拠を提供した。しかし、ＥＳＲＦは、完全には特徴づけられておらず、そしてｇｐ１３０サイトカイン以外の細胞外レギュレーターの分子性質は未知である。
【０００４】
さらに、多分化能の転写決定は十分に理解されていない。重要な役割は、ｇｐ１３０ターゲットＳＴＡＴ３およびＰＯＵ因子Ｏｃｔ−４について帰属されているが、これらはいずれも単独ではＥＳ細胞同一性を特定するには十分ではない。
【０００５】
ＷＯ02/097090は、ヌクレオチド配列データベースを調べることによるＥＣＡＴ（ＥＳ細胞関連転写物）遺伝子の同定、およびその後のマウスおよびヒトＥＣＡＴ遺伝子の発現パターンの分析を記載している。ＷＯ02/097090はまた、ＥＳ細胞を同定するためのプローブの使用およびＥＣＡＴ遺伝子を用いるＥＳ細胞の選択的単離を記載している。Ｏｃｔ−４は、ＥＣＡＴ遺伝子でありそして多分化能性細胞の特異的マーカーであるが、卵母細胞、分割胚、および卵筒期においても発現される。
【０００６】
ＷＯ01/66697は、動物血清を含まない培地中および線維芽細胞増殖因子の存在下でのＥＳ細胞の培養を記載している。好ましくは、ＥＳ細胞を、線維芽細胞フィーダー層の存在下で増殖する。
【０００７】
本出願人によるＷＯ97/30151は、ＥＳ細胞の分化を阻害し得るサイトカインであるＥＳＲＦを記載している。
【０００８】
ＷＯ96/22693は、自己再生造血幹細胞の維持に関する。特に、ＷＯ96/22693は、未分化状態において造血幹細胞を維持しそして未分化造血幹細胞の増殖を支持し得る「Ｆ因子」を記載している。
【０００９】
Berger C.N.およびSturm K.S.，Growth Factors 1997，14巻，145-159頁は、内因性ＬＩＦおよびフィーダー細胞の不在下でのＥＳ細胞の自己再生を記載している。しかし、BergerおよびSturmは、これらの条件下でＥＳ細胞の自己再生を促進し得るどのような因子の単離も記載していない。
【００１０】
Genbank登録番号AK010332，2001およびAK022643，2000は、ホメオボックスドメイン含有タンパク質についてのマウスおよびヒトｃＤＮＡの配列を提供する。これらの分子に機能は帰属されていない。
【００１１】
ヒト胚幹細胞および胚生殖細胞の多分化能が、異種細胞のフィーダー細胞層（Amitら，Dev. Biol. 2000）またはその抽出物（Xuら，Nat. Biotech 2001）との共培養によって持続されることが知られている。しかし、フィーダー細胞における依存性は、多くの問題を生じる。フィーダー細胞と多分化能細胞との共培養は、修正された培養条件を隠し得る。共培養は、多分化能培養物／それに由来する分化した生成物の夾雑の危険性がある。フィーダー細胞抽出物、これは細胞を用いることの代替物であり、これを生成するために、別々のフィーダー細胞集団が、維持および加工され、そして抽出物が保存されなければならない。抽出物は特徴づけられていないので、これは生成物の夾雑の他のソースとなり得る。多分化能細胞の分化の分析および操作は、フィーダー細胞または未同定抽出物の存在により修正を受ける。
【００１２】
多くの他の種に関して、特にブタ、ウシ、およびラットにおいて、培養物中で多分化能ＥＳ細胞を誘導しそして安定に維持することは未だ可能ではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の目的は、マウスおよびヒトの多分化能細胞の改良された培養物を提供することであり、そして本発明の特定の実施態様の目的は、多分化能細胞培養においてフィーダー細胞の依存性を除去することである。さらなる目的は、他の種に由来する多分化能細胞の誘導および維持を提供することである。
【００１４】
したがって、本発明は、哺乳動物の多分化能決定因子を提供し、第１の実施態様では哺乳動物細胞において多分化能を維持する因子によって例示される。
【００１５】
ＥＳ細胞の培養において、この因子は、これらの細胞の多分化能を付与するために十分であることが見出されている。本発明によれば、この因子は、自己再生する多分化能表現型の維持を生じるレベルで多分化能細胞中で維持され得る。この因子は、内因性であり得、この因子の細胞レベルは、内因性遺伝子の活性化によって維持され、または細胞の多分化能表現型の安定な維持を可能にするように細胞に導入される。
【００１６】
本発明の特定の因子は、細胞内で作用し、細胞を多分化能状態で維持し、そして細胞培養物中で構成的に活性である。この文脈において、細胞内作用とは、活性の部位が細胞内にあることを示す。
【００１７】
したがって、この因子は、例えば、ＬＩＦおよび他のサイトカインの場合のように細胞表面レセプターに対するリガンドではなく、そしてｇｐ１３０レセプターからのシグナルに非依存的に作用し得る。
【００１８】
本発明のさらなる多分化能決定因子は、ｇｐ１３０アクチベーターを含まないＥＳ細胞培地で培養される多分化能細胞を多分化能状態で維持する。したがって、この因子は、哺乳動物細胞をｇｐ１３０の活性がないときに多分化能状態で維持することができ、そしてｇｐ１３０レセプター複合体を活性化するサイトカインを含まない培養培地中で多分化能の維持を促進し得る。以下の実施例では、本発明者らは、本発明の好適な因子を発現する細胞が、ｇｐ１３０刺激の必要性から解放され、そしてレチノイン酸、３−メトキシベンズアミド、および凝集に応じて分化が減少またはなくなることを示し、したがってその分化がこれらの刺激に応じて抑制されることを証明した。さらに、特定の実施例の因子は、ｇｐ１３０の下流の転写ターゲットではない。本発明の因子は単離されており、そして動物の多分化能細胞、マウス、ヒト、霊長類、ヒツジ、ラット、ブタ、ウシ、および他の動物の細胞を含む動物細胞の維持に適切である。本発明の１つの因子は、ヒトＥＳ、ＥＣ、またはＥＧ細胞あるいは他のヒト多分化能細胞の多分化能を維持する。本発明の他の因子は、マウスＥＳ、ＥＣ、またはＥＧ細胞の多分化能を維持し、そして細胞内で作用し、そして構成的に活性である。本発明のさらなる因子は、マウスの非許容株由来の多分化能細胞の培養において連続増殖を可能にする。
【００１９】
本発明の利点は、培養中に多分化能細胞を安定に増殖する能力にある。本発明の因子は、ヒトおよび／またはマウス細胞を増殖的な多分化能状態で維持するために培養中に使用され得る。本発明はさらに、これまで可能ではなかったヒトおよびマウス以外の種に由来するＥＳ細胞を単離および維持する可能性を提供する。
【００２０】
特定の実施態様の因子は、転写因子である。これは、核内で作用し、その結果、ＥＳ細胞を自己再生する。以下の実施例に記載され使用される好適な因子は、ホメオドメインを含む。
【００２１】
本発明の１つの因子の使用において、因子は、フィーダー層またはフィーダー細胞抽出物の不在下およびｇｐ１３０サイトカインの不在下で、細胞を多分化能状態で維持する。したがって、因子の供給は、培養中に細胞の多分化能を維持するために十分である。この因子は、標準的なＥＳ細胞培養培地に添加され得るか、または、例えば、エレクトロポレーションもしくはマイクロインジェクションによって細胞中に直接導入され得るか、または本明細書に開示される種々の方法によって細胞中で生成され得る。以下により詳細に記載される本発明の特定の実施例では、この因子を発現するベクターは、細胞のエピソームトランスフェクションおよび細胞への染色体組込みの両方によってサイトカイン非依存的ＥＳ細胞の増殖を支持し；特に例示していないが、この因子をコードする内因性配列の発現についてのさらなる選択肢は、ＥＳ細胞が自己再生可能であるように誘導または増加させることである。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様では、この因子は、ＬＩＦ非応答性細胞を多分化能状態で維持する特性によって同定可能である。
【００２３】
この因子は、適切には、２００から４００アミノ酸を有するポリペプチドである。詳細には、本発明のマウス多分化能決定因子は配列番号２に、ヒト多分化能決定因子は配列番号４に、ラット多分化能決定因子は配列番号６に、そしてアカゲザル多分化能決定因子は配列番号８によって示される。
【００２４】
本発明の第２の局面は、細胞を多分化能状態で維持し、細胞内で作用し、そしてホメオドメイン、特に、配列番号２、４、６、または８のホメオドメインと少なくとも５０％の配列同一性を有するホメオドメイン、あるいは所定の種の細胞に対する因子に関して、同じ種の多分化能決定因子のホメオドメインと少なくとも５０％の配列同一性を有するホメオドメインを含む因子にある。一般的に、ホメオドメインは、約６０アミノ酸長であり、そして本発明の因子は、任意の２０アミノ酸フラグメントが配列番号２、４、６、または８のホメオドメインと少なくとも３５％の配列同一性を有するホメオドメインを含む。好ましくは、この因子は、ＬＩＦ非応答性細胞を多分化能状態で維持する。
【００２５】
さらなる実施態様の因子は、フィーダー細胞の不在下およびフィーダー細胞抽出物の不在下で、マウスの非許容株由来の培養した外胚葉細胞を多分化能状態で維持する因子である。このような第２の因子は、フィーダー細胞の不在下およびフィーダー細胞抽出物の不在下で、ヒト胚由来細胞（ＥＳおよびＥＧ細胞を含む）を多分化能状態で維持する因子である。
【００２６】
フィーダー細胞またはフィーダー細胞抽出物を回避することは、望ましくない細胞による培養物の夾雑を減少させるという利点がある。マウス細胞は、ヒト多分化能細胞培養物のためのフィーダー細胞として使用されており、そのため本発明は、非ヒト細胞によるヒト多分化能細胞集団の夾雑の危険性を著しく減少しそして排除し得る。ＥＳ細胞由来生成物が移植治療に使用される場合、非ヒト細胞の不在の保証は、おそらく、細胞の最初の単離およびその後の増殖の両方ともに必須である。
【００２７】
本発明はまた、因子と他の機能的ドメインとの結合体を提供する。このような第１の結合体は、第１および第２のドメインを含み、第１のドメインは本発明の因子を含み、そして第２のドメインはこの第１のドメインの細胞への取り込みを促進し、例えば、アンテナペディアのタンパク質形質導入ドメイン、HIV-1 TAT、またはHSV-1 VP22である（Schwarzeら、2000）。したがって、結合体は、培養培地成分として使用され得る。第２のドメインについてのさらなる選択肢は、細胞への取り込み後にこの因子の核への移動を補助する核局在化配列を含むことである。
【００２８】
使用したときに第２のドメインからの第１のドメインの放出を可能にするために、好ましい結合体の第１のドメインは、細胞内で第２のドメインから切断され得る。第１のドメインは、ジスルフィド架橋によって第２のドメインに連結され得、この架橋は、細胞の還元環境下で第１のドメインの放出を可能にする。第１のドメインは、第２のドメインに共有結合によって連結され得、これは、細胞に存在するプロテアーゼによって連結を切断される。第２のドメインについてのさらなる選択肢は、因子の活性の調節を可能にする配列を含み、これは、例えば、ステロイドホルモンレセプターである（Picard、2000）。
【００２９】
本発明のさらなる単離されたポリペプチドは、（ａ）配列番号２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子；（ｂ）（ａ）の天然に存在する改変体；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のオルソログ；および（ｄ）それらの生物学的に活性および診断または治療に有用なフラグメント、アナログ、および誘導体を含む。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
【００３１】
本発明のポリペプチドをいう場合、用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」とは、このようなポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を本質的に保持するポリペプチドを意味する。本発明のポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）と置換されそしてこのような置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによってコードされ得るまたはコードされ得ないもの、あるいは（ii）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（iii）成熟ポリペプチドが他の化合物、例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されるもの、あるいは（iv）追加のアミノ酸が、例えば、成熟ポリペプチドの精製を容易にするために、成熟ポリペプチドに融合されるものであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【００３２】
本発明のポリペプチドはまた、多分化能決定因子のエピトープ、ペプチド、またはポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するために使用され得る。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調製する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、HarlowおよびLane、Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999；およびHurrell, J.G.R.編, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1982を参照のこと。これらは参考として本明細書に援用される）。ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、およびラットなどの種々の動物から生成され得る。
【００３３】
多分化能決定因子ポリペプチドの免疫原性は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）あるいはフロイントの完全または不完全アジュバントのようなアジュバントの使用によって上昇され得る。免疫接種に有用なポリペプチドはまた、融合ポリペプチドを含み、例えば、多分化能決定因子またはその一部と、免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質との融合物である。ポリペプチド免疫原は、全長分子またはその一部であり得る。ポリペプチドの一部が「ハプテン様」であるならば、このような部分は、免疫接種のための巨大分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、または破傷風菌トキソイド）に有利に結合または連結され得る。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製したポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合フラグメント（例えば、F(ab')2およびFabタンパク質分解フラグメント）を含む。遺伝子操作した未処理の抗体またはフラグメント（例えば、キメラ抗体、Fvフラグメント、一本鎖抗体など）ならびに合成の抗原結合ペプチドおよびポリペプチドも含まれる。非ヒト抗体は、ヒトフレームワークおよび定常領域上に非ヒトＣＤＲのみをグラフトすることによって、または非ヒト可変ドメイン全体を組込むことによって（必要に応じて、露出した残基の置換によってヒト様表面で「覆い隠す」ことにより、結果として「化粧張り」抗体になる）ヒト化され得る。ある場合には、ヒト化抗体は、適切な結合特徴を増強するために、ヒト可変領域フレームワークドメイン内に非ヒト残基を保持し得る。抗体をヒト化することによって、生物学的半減期は増加し得、そしてヒトへの投与の際の有害な免疫反応の可能性が減少する。本発明に有用な抗体を生成または選択するための代わりの技法としては、多分化能決定因子タンパク質またはペプチドへのリンパ球のインビトロ曝露、および（例えば、固定または標識された多分化能決定因子タンパク質またはペプチドの使用による）ファージまたは類似のベクターにおける抗体提示ライブラリーの選択が挙げられる。
【００３５】
抗体は、１０６Ｍ−１以上、好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１以上、および最も好ましくは１０９Ｍ−１以上の結合親和性（Ｋａ）で多分化能決定因子ポリペプチドに結合するならば、特異的結合であると定義される。抗体の結合親和性は、公知の技法によって（例えば、Scatchard分析によって）容易に決定され得る。
【００３６】
当業者に公知の種々のアッセイが、多分化能決定因子タンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために利用され得る。アッセイの例は、Using Antibodies: A Laboratory Manual, HarlowおよびLane(編), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999に詳細に記載される。このようなアッセイの代表的な例としては、同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射免疫沈降、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットまたはウエスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイが挙げられる。さらに、抗体は、野生型対変異体の多分化能決定因子タンパク質またはペプチドへの結合についてスクリーニングされ得る。
【００３７】
本発明のポリペプチドは、さらに、配列番号２、４、６、および８のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）、ならびに配列番号２、４、６、または８のポリペプチドと少なくとも５０％の類似性（好ましくは少なくとも５０％の同一性）およびより好ましくは配列番号２、４、６、または８のポリペプチドと少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）およびさらにより好ましくは配列番号２、４、６、または８のポリペプチドと少なくとも９５％の類似性（さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そしてまた、このようなポリペプチドの一部を、一般的に少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含むポリペプチドのこのような一部とともに含む。２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換基を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。配列類似性および同一性の計算のための種々の異なるアプローチが公知である。一般的には、これらの計算を行うために適切な方法は、Smith-Waterman、BLAST、またはFASTAなどのプログラムを用いてデータベース検索を行い、そして１または好ましくは２またはさらに３つの類似性表を用いる。Blosum and PAM（Point Accepted Mutation）マトリクスは、データベース検索および配列アラインメントに適切なアミノ酸類似性マトリクスである。Smith-WatermanまたはFASTAが使用される場合、オープンギャップペナルティーが十分に大きいことを確実にすることが重要であり、そして最初のランが相同配列をカバーできないことがない場合、異なるアルゴリズムを試みることが適切であり得、これは、発見的アルゴリズムの１つであるBLASTまたはFASTAで開始する場合に特に当てはまる。
【００３８】
本発明のなおさらなる局面は、因子または結合体を含む組成物にあり、そして薬学的に受容可能なキャリアと共に上記の因子または結合体を含む薬学的組成物；ならびに、上記の因子または結合体を含む細胞培養培地を含む。
【００３９】
本発明の因子および／または結合体を含む細胞培養培地は、ＧＭＥＭ、血清、血清置換物、必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、ピルビン酸、およびグルタミンからなる群より選択される１以上の成分をさらに含み得る。
【００４０】
培養培地は、必要に応じて、ｇｐ１３０のアクチベーターをさらに含み、そして適切なアクチベーターとしては、ＬＩＦレセプターで作用するサイトカイン（例えば、ＬＩＦ）および可溶性ＩＬ−６レセプターと組み合わせたＩＬ−６が挙げられる。培養培地は、多分化能ＥＳ細胞（特にＥＳ、ＥＣ、およびＥＧ細胞）の維持に、ならびに多分化能細胞（特にＥＳ、ＥＣ、およびＥＧ細胞）の自己再生に使用され得る。培地は、さらに、体細胞（特に体性幹細胞）の維持に使用され得、そして本発明の特定の実施態様では、体細胞の自己再生の方法が提供され、この方法は、培地の存在下で細胞を培養する工程、および好ましくは培地中で細胞を増殖させる工程を含む。培養培地のなおさらなる使用は、多分化能細胞に由来する細胞の維持および／または増殖のためである。
【００４１】
本発明の他の適用は、細胞集団の拡張、例えば、体細胞の拡張にある。本発明を利用して行われ得るエクスビボ治療は、患者から細胞の集団を取り出す工程、細胞集団を拡張するように本発明の培養培地中で該細胞を培養する工程、およびその後該患者に細胞を移植または再導入する工程を含む。
【００４２】
本発明のさらなる培養方法は、本発明の因子とＯｃｔ−４の発現および／またはＯｃｔ−４の活性化との組み合わせを用いて細胞を維持および／または増殖する工程を含む。この因子は、因子自体としてまたは結合体によってまたは本明細書に記載のようなベクターを用いて導入され得る。Ｏｃｔ−４発現は、内因性Ｏｃｔ−４遺伝子の発現をアップレギュレートすることによって、またはＯｃｔ−４を含む発現ベクターを細胞に導入することによって行われ得る。本発明の因子とＯｃｔ−４との組み合わせは、細胞を維持および／または自己再生および／または増殖するために使用され得る。特に、この組み合わせは、増強された多分化能細胞の自己再生および／または多分化能の増強された維持を提供するために使用され得る。この組み合わせは、さらに、多分化能細胞集団の誘導に用いられ得る。本発明の特定の実施態様では、この因子とＯｃｔ−４との組み合わせにより、多分化能細胞の自己再生が改良され、そしてこの改良は、特にヒト細胞だけでなく他の動物（ラットおよびマウスのような齧歯類；サル、特にアカゲザルのような霊長類；ブタ；ヒツジ；およびウシ）の多分化能細胞の新しい多分化能細胞株の誘導に利用される。
【００４３】
多分化能細胞、特にＥＳ細胞は、播種前にあるいは播種時、例えば、フィーダー細胞が従来のように用いられる時点、または内部の細胞マスがプレート上に広げられる時点で、胚盤胞細胞をトランスフェクトすることによって適切に誘導される。トランスフェクションは、フィーダー層上の細胞またはフィーダー層上にはない細胞に行われ得るが、トランスフェクトされるべき細胞とフィーダー細胞との接触を避けるという利点がある。多分化能細胞の遺伝子導入は移植前胚についての段階を含むこの段階で達成可能であることが公知であり、したがって本発明の因子が発現されるようなトランスフェクションを用いて、安定な多分化能細胞集団を誘導する。
【００４４】
記載した技術の他の使用は、細胞および核を再プログラムすることにあり、したがって本発明は、体細胞の核を再プログラムする方法も提供し、この方法は、細胞を本発明の因子と接触させる工程、および細胞においてｇｐ１３０シグナリングを活性化する工程を含むか、あるいは、細胞を本発明の因子と接触させる工程、および細胞においてＯｃｔ−４を発現させる工程を含む。例えば、再プログラムすることは、本発明の因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクターで、およびＬＩＦレセプターリガンドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたはＯｃｔ−４をコードするヌクレオチド配列を含む第２のベクターで、細胞をトランスフェクトすることによって行われる。
【００４５】
本発明はさらに、本発明の因子をコードするポリヌクレオチドを提供する。因子の使用において、培養物中またはその他で細胞の多分化能を促進するような因子の発現の制御または指示のために提案された多くの異なる方法があり得る。したがって、必要に応じて、このポリヌクレオチド中に因子の発現を調節する配列を含む。この配列はプロモーターであり得、そしてまた活性が調節されるプロモーターであり得る。本発明のさらなるポリヌクレオチドは、上記の結合体をコードする。
【００４６】
所定の細胞における因子のレベルを制御するために、この因子をコードしそして細胞に存在する遺伝子が活性化され得る。内因性および異種の両方のプロモーターおよび他の調節エレメント、ならびにこれらの調節エレメントで作用する因子が使用され得る。１つのアプローチは、細胞のゲノム中に調節配列を挿入するためにポリヌクレオチドを使用することであり、挿入された場合に調節配列は、因子をコードする遺伝子の発現を調節する。このように、内因性遺伝子の発現が開始され得、またはその発現が維持される。調節配列は、因子をコードする内在遺伝子に相同組換えによって挿入され得る。調節配列は、調節されたプロモーターであり得、例えば、誘導性プロモーターは、培養培地がインデューサーを含む場合に因子を発現させるために用いられ得；インデューサーを除去することにより、因子の発現が減少しそして多分化能表現型がなくなる。プロモーターの除去または不活性化を可能にする配列も、因子の発現のさらなる制御を可能にするために含まれ得る。
【００４７】
細胞において因子のレベルを制御する他の方法は、例えば、ファージディスプレイを用いることによって、内因性ＰＤＦ遺伝子のプロモーター中の配列を認識する配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドドメインを設計または選択することである（IsalanおよびChoo, 2001 Methods in Enzymology 340 593-609頁）。このような配列特異的ＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化ドメインと融合されて内因性ＰＤＦ遺伝子の転写を活性化または維持するために使用され得る。あるいは、このような配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドドメインとサイレンサードメインとの融合は、ＰＤＦ発現を減少させるために使用され得る。さらに、これらの融合物は、融合タンパク質の細胞への取り込みを促進する他のドメインに連結され得る。このように、内因性ＰＤＦ遺伝子自体に作用する分子は、細胞に投与され得るかまたは細胞中で発現され得る。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得、このＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖であればコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、配列番号１、３、５、または７に示されるコード配列と同一であり得、そしてこれは、遺伝子コードの多重または縮重の結果として、コード配列がＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。
【００４９】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子；（ｂ）（ａ）の天然に存在する改変体；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のオルソログ；および（ｄ）それらの生物学的に活性および診断にまたは治療に有用なフラグメント、アナログ、および誘導体をコードし得る。
【００５０】
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、追加のコード配列および／またはイントロンのような非コード配列または成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’の非コード配列を含み得る。したがって、「ポリヌクレオチド」というときは、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに追加のコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドをいうことを含む。
【００５１】
本発明はさらに、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。
【００５２】
したがって、本発明は、同じ成熟ポリペプチドをコードする配列番号１、３、５、または７に示されるポリヌクレオチド、ならびに改変体がこの因子のフラグメント、誘導体、またはアナログをコードするこのようなポリヌクレオチドの改変体を含む。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加または挿入改変体を含む。
【００５３】
本明細書で上記のように、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、または７に示されるコード配列の天然に存在する改変体であるコード配列を有し得る。当該技術分野で公知であるように、ポリヌクレオチド配列の代わりの形態は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し、これはコードされたポリペプチドの機能を実質的に変更しない。
【００５４】
本発明はさらに、配列間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましくは少なくとも９５％の同一性がある場合に、本明細書で上記の１以上の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書で上記のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用する場合、用語「ストリンジェント条件」とは、配列間に少なくとも９５％および好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こることを意味する。好ましい実施態様では、本明細書で上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、または７のｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリヌクレオチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持するポリペプチドをコードする。
【００５５】
あるいは、ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そして上記のようにそれと同一性を有し、そして活性を保持しまたは保持し得ない、少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、およびより好ましくは少なくとも５０塩基を有し得る。例えば、このようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドの回収のための配列番号１、３、５、または７のポリヌクレオチドについてのプローブとして、または診断プローブとして、またはＰＣＲプライマーとして、用いられ得る。
【００５６】
本発明はさらに、本発明の因子の発現における使用のためのベクターを提供する。第１のベクターは、上記の本発明のポリヌクレオチドを含む。以下により詳細に記載する本発明の実施例に記載および使用されるベクターは、因子が細胞で発現されるように細胞のトランスフェクションについて設計され、そしてトランスフェクトされた細胞は多分化能状態で維持され得る。一般的に、このようなベクターは、以下の作動可能に連結されたエレメントを含む：転写プロモーター；本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡセグメント；およびポリアデニル化シグナル。ベクターについてのさらなる選択肢は、さらに選択可能マーカーをコードすることであり、選択は、ベクターを取り込みそして発現する細胞を同定するために用いられる。例として、ベクターは、抗生物質耐性をコードし得、培養液に抗生物質を添加して、うまくトランスフェクトされた細胞を同定する。細胞のトランスフェクション後、ベクターは、染色体組込みされるかまたは染色体外に維持され得、そしてコード配列はベクター上で発現され、そのため、因子のレベルは、多分化能状態で細胞を保持するために細胞中に十分に維持される。特定のベクターは、ポリオーマラージＴ抗原を発現または含む細胞のトランスフェクションのために設計される。このようなベクターは、ポリオーマ複製起点を有し得、そのため、ベクターはポリオーマラージＴ抗原が存在する場合、細胞中に安定に維持される。
【００５７】
活性が制御され得るベクターでプロモーターを用いることによって、さらなる制御および融通性がこのシステムに付与され得る。したがって、トランスフェクション後、プロモーターは非活性状態であり得、使用者がプロモーターを活性化する時期を選択することを可能にする。例えば、誘導性プロモーターを用いるときにはインデューサーが培養培地に添加され得る。代わりとして、プロモーターは最初に活性であり得るが、その活性は、培養培地へのサプレッサー物質の添加によって減少またはなくなり得る。これは、多分化能状態で細胞を維持する期間後に使用者がベクターからの多分化能決定因子の発現の停止を決定することを可能にし、細胞の分化を可能にし、そして残りの多分化能細胞の培養物を実質的に一掃する。分化した子孫の調製において、未分化細胞を除去することが必要であり、したがって本発明のこのエレメントはこの能力を提供する。適切なシステムは、ｔｅｔ調節システムである（BaronおよびBujard, 2000）。ベクターは、さらに、その後の除去または部位特異的組換えによる因子をコードする配列の除去を可能にするように構築され得る。
【００５８】
本発明のさらなる実施態様のベクターは、調節因子をコードするヌクレオチド配列を含み、この調節因子は、本発明の因子をコードする遺伝子を調節する。調節因子は、遺伝子を活性化または開始または発現を増加するために使用され得、これは、内因性遺伝子であり得または染色体外に位置し得る。この特定のベクターは、多くの用途を有する。多分化能決定因子をコードする遺伝子が実質的に停止される動物のトランスジェニック株が、調製され得る。次いで、トランスジェニック動物は、そこから外移植されそしてこのベクターでトランスフェクトされた胚および多分化能細胞を生成するために用いられ得、そのため、ベクターの調節因子は、多分化能決定因子の発現を開始し、多分化能細胞の培養物の維持を可能にする。あるいは、調節因子についてのベクターおよび多分化能決定因子についての調節可能遺伝子の両方を含むバイナリートランスジェニック動物が、生成され得る。後者は、次いで、幹細胞を動かすためにインビボで誘導され得る。
【００５９】
直接的にまたはこの因子をコードするヌクレオチド配列の発現によってのいずれにせよ、この因子の主な使用は、多分化能状態での細胞の維持である。ポリヌクレオチドは、細胞に内因性の配列であり得、例えば、天然の配列は活性化されて、多分化能の維持を達成し得、または細胞中に導入されたヌクレオチド配列が使用され得る。導入された配列はまた、プラスミド上にあり得る。この因子をコードするヌクレオチドはまた、安定に組込まれた導入遺伝子上にあり得る。
【００６０】
したがって、本発明は、多分化能細胞集団を維持する方法を提供し、この方法は、本発明の因子をこの集団に投与する工程を含む。さらなる培養方法は、本発明の因子をコードする遺伝子を細胞で活性化することによって、多分化能状態で細胞を維持することである。多分化能状態で細胞を維持するためのなおさらなる培養方法は、本発明の因子をコードする遺伝子の細胞での発現を維持または増加させる工程を含む。
【００６１】
本発明の多分化能決定因子はまた、体細胞または非多分化能細胞の効力を増加させるために使用され得る。したがって、本発明の方法は、細胞を多分化能決定因子に曝露することによって細胞の効力を増加させる工程を含み、この曝露は、必要に応じて、この因子を細胞に導入することによって、またはこの因子をコードするヌクレオチド配列を細胞で発現させることによって行われる。細胞の効力の増加は、例えば、細胞の核を再プログラムして体細胞または非多分化能細胞を多分化能幹細胞に変換させることであり得る。あるいは、本発明の因子の細胞に対する効果は、その効力を増加させるが、細胞を多分化能にするほどにはその効力を増加させないことであり得る。細胞がその効力を増加させると、その細胞は、異なる系統下で分化を受け得、したがって、本発明の因子は、所定の細胞の系統を再特定化することに有用であり得る。
【００６２】
この因子は、多分化能細胞を得るための多くの異なる方策を続けることを可能にする。このような１つの方策において、多分化能非ヒト細胞は、トランスジェニック動物を生成することによって単離され、この動物は、本発明の因子をコードするヌクレオチド配列が調節されたプロモーターの制御下にある構築物を含む。次いで、トランスジェニック胚は、トランスジェニック動物から得られ、そして細胞（例えば、外胚葉細胞または始原生殖細胞）は胚から得られる。プロモーターの活性化によって、この因子は細胞で発現され、続いて多分化能細胞が単離され得る。したがって、このアプローチにおいて、トランスジェニック動物は、最初の工程として生成され、そしてこのアプローチは、トランスジェニック動物の生成のための手順が存在する場合、特に適切である。例えば、トランスジェニック動物を生成することが可能ではないかまたは技術的により過酷である種において採用され得る他のアプローチでは、本発明の因子をコードするヌクレオチドは、新たに単離された細胞集団中の細胞に導入され、そしてその後、多分化能細胞が単離される。この後者のアプローチでは、新たに単離された細胞集団からの細胞は迅速にトランスフェクトされる。すなわち、少なくとも１つの細胞がトランスフェクトされる前に、細胞が分化を完了するに十分な時間にわたり細胞を培養液中に残すことなく、この因子はその細胞で発現される。上述のように、このアプローチは、トランスジェニック動物を生成することが可能ではない哺乳動物または他の動物から多分化能細胞を誘導および維持することに、特に有用性を有し得る。したがって、これらの方法によって得られ得るトランスジェニック動物、および調節可能なプロモーターの制御下に本発明の因子をコードするヌクレオチド配列を含むトランスジェニック動物も、本発明の範囲内である。
【００６３】
この因子および機能的アナログ、改変体、フラグメント、および誘導体が、多分化能の維持を促進するために使用される方法が、本明細書に記載される。本発明および多分化能決定因子の同定の他の利点は、発明者らがこれらの多分化能決定因子に対するアンタゴニストを案出する機会を有することであり、このアンタゴニストは、多分化能決定因子の活性を阻害するかまたはこのような因子に対するアンタゴニストとして作用するために使用され得る。この因子に対するアンタゴニストは、多分化能細胞の分化を促進するために使用され得、そしてこれは、例えば、培養物またはインビボのいずれかから多分化能細胞を排除することが所望される状況下で有用性を有する。本発明はまた、この因子に対してネガティブな優性形質である動物（例えば、この因子をコードする遺伝子の優性ネガティブ改変体または他の優性ネガティブ変異体を含む動物）の生成を可能にする。
【００６４】
したがって、本発明によれば、薬学的に受容可能なキャリアおよび本発明の因子のアンタゴニストを含む組成物も提供される。アンタゴニストは、細胞療法におけるような多分化能細胞由来の子孫細胞を患者に導入する前に、多分化能細胞を効果的に除去するために使用され得る。例えば、移植された材料の多分化能細胞による夾雑による奇形腫および／または他の腫瘍を避ける。これは、インビボまたはインビトロで適用され得る。アンタゴニストについての他の使用は、避妊薬としてである。本発明のアンタゴニストのさらなる使用は、一般的に、腫瘍、特に本発明の因子の不適切な発現に付随する腫瘍の治療についてである。
【００６５】
本発明によれば、本発明の因子の発現または活性が操作されている細胞が提供される。これらの細胞は、多分化能状態に維持され得る。本発明の第１の細胞は、２週間を超える期間にわたって本発明の因子を発現する。本発明のさらなる細胞は、（１）本発明のベクターを含む細胞、（２）フィーダー細胞の不在下およびフィーダー細胞抽出物の不在下で多分化能状態で維持される多分化能ヒト細胞、および（３）本発明の因子をコードする遺伝子を含む細胞であって、この遺伝子が活性化されている細胞である。
【００６６】
本発明の細胞はまた、本発明の因子の機能を妨害する分子についてのスクリーニングに使用され得る。このようなスクリーニングの１つは、本発明の因子の存在下で多分化能細胞を培養する工程であって、この因子が例えば、細胞培養培地中で提供されることによってまたは細胞中で発現させることによって存在している工程、テスト物質の存在下でこの細胞を培養する工程、およびこの細胞の多分化能表現型に変化があるかどうかを観察する工程を含む。このアッセイは、因子のアンタゴニストについてまたはその活性を妨害する他の分子について選択するために使用され得る。スクリーニングはまた、細胞の分化を誘導する機能を有するテスト物質を同定するために使用され得る。
【００６７】
本発明の細胞は、さらに、薬物の発見のためのアッセイに使用され得る。本発明の細胞はまた、細胞療法に使用され得、したがって、本発明の方法は、多分化能細胞を誘導および／または維持するために本発明の因子を使用する工程、そこから細胞療法のための細胞を誘導する工程、および細胞療法においてこれらの細胞を使用する工程を含む。
【００６８】
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための本発明のスクリーニング方法は、多分化能細胞においてこのスクリーニングを行う工程、および自己再生する表現型について選択する工程を含む。このスクリーニングは、サイトカイン非応答性である多分化能細胞を使用し得、そして外因性および内在性の両方の因子が同定され得る利点を有する。
【００６９】
本発明はさらに、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法を提供し、この方法は、多分化能細胞において相補性アッセイを行う工程を含む。この方法は、自己再生する表現型を付与するｃＤＮＡを同定するために用いられ得る。
【００７０】
本発明はなおさらに、多分化能細胞を多分化能状態で維持する因子についてのスクリーニング方法を提供し、この方法は、
本発明の多分化能決定因子を発現する多分化能細胞を提供する工程であって、該細胞が多分化能状態で安定に維持され、そして該因子の発現が制御され得る、工程；
該細胞の操作を行う工程；
該多分化能決定因子の発現を減少させる工程；および
多分化能状態で維持される細胞について選択する工程、を含む。
【００７１】
操作は、外因性因子、細胞表面レセプター、ｃＤＮＡ、または他の因子についてのスクリーニングとなるように設計され得、そして適切な操作は、細胞の遺伝子操作および細胞が培養される培養培地または培養条件の操作を含む。スクリーニングは、それによって、本発明の多分化能決定因子または細胞を多分化能状態で維持するさらなる因子をコードする内因性遺伝子の発現を制御する因子を同定するために適切になり得る。好ましくは、因子の発現は、因子をコードするヌクレオチド配列と作動可能に組み合わせた調節可能なプロモーターを調節することによって、あるいは細胞が培養される培地にリプレッサーを添加して、多分化能決定因子の活性を除去することあるいは因子の発現を低下させることを可能にすることによって、制御される。次いで、多分化能を保持する細胞は単離および特徴付けされて、多分化能決定因子と置換した因子の同一性を決定し得る。
【００７２】
本発明のさらなるスクリーニングは内因性遺伝子の調節を同定するためのスクリーニングであり、そして本発明はさらに、本発明の多分化能決定因子をコードする内因性遺伝子の発現を調節する因子についてのスクリーニング方法を提供し、この方法は、
（１）転写因子結合部位の存在について、内因性遺伝子に隣接するゲノムの領域を分析する工程、および
（２）ＥＳ細胞からの抽出物を有する該領域のフラグメントをスクリーニングして、該フラグメントに結合する抽出物の成分を同定する工程、を含む。
【００７３】
内因性遺伝子に隣接しそして因子の発現が制限された多分化能細胞を指示するゲノムの領域は、好ましくは、リポーター構築物のトランスフェクションによって適切に同定され、そのため、スクリーニングは、多分化能決定因子についての推定転写因子であるＥＳ細胞抽出物中の１以上の成分を同定し得る。スクリーニングの結果のさらなる分析は、細胞外物質によるような推定転写因子の制御が既に同定されているかどうかについての研究を含み得る。このような同定された制御因子は、多分化能哺乳動物細胞を誘導および／または維持するために使用され得る。
【００７４】
用語「オルソログ」とは、異なる種に由来するポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応物である１種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を示す。オルソログ中の配列の差異は、種分化の結果である。
【００７５】
用語「対立遺伝子改変体」とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の２以上の任意の代替形態を示す。対立遺伝子改変は、天然には変異によって生じ、そして集団内の表現型多様性を生じ得る。遺伝子変異は、サイレント（コードされたポリペプチドの変化がない）であり得、あるいは変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
【００７６】
用語「発現ベクター」とは、その転写を提供する追加のセグメントに作動可能に連結した目的のポリペプチドをコードするセグメントを含む、直鎖状または環状のＤＮＡ分子を示す。このような追加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含み得、そして必要に応じて、１以上の複製起点、１以上の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、一般的に、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来し、あるいは両方のエレメントを含み得る。
【００７７】
ポリヌクレオチド分子に適用する場合、用語「単離された」とは、ポリペプチドがその天然の遺伝的環境から取り出され、そのため他の無関係のまたは所望でないコード配列を含まないことを示し、そして遺伝子操作されたタンパク質産生システム内での使用に適切な形態である。このような単離された分子は、その天然環境から分離された分子であり、そしてｃＤＮＡおよびゲノムクローンを含む。本発明の単離されたＤＮＡ分子は、一般的に、通常は付随する他の遺伝子を含まないが、プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターのような調節エレメントを含む天然に存在する５’および３’フランキング領域を含み得る。付随の領域の同定は、当業者には明らかである（例えば、DynanおよびTijan，Nature 316:774-78，1985を参照のこと）。タンパク質に適用する場合、用語「単離された」とは、タンパク質が、血液および動物組織から離れるような、その天然の環境以外の条件下で見られることを示す。好ましい形態では、単離されたタンパク質は、他のタンパク質、特に動物起源の他のタンパク質を実質的に含まない。高度に精製された形態で、すなわち、９５％以上純粋、より好ましくは９９％以上純粋で、タンパク質を提供することが好ましい。
【００７８】
ＤＮＡセグメントについていう場合、用語「作動可能に連結した」とは、セグメントが意図された目的のための組み合わせで機能するように、例えば、転写物がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを介してポリアデニル化部位まで進むように、配列されることを示す。
【００７９】
用語「ポリヌクレオチド」とは、５’末端から３’末端まで読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを示す。ポリヌクレオチドとしてはＲＮＡおよびＤＮＡが挙げられ、そして天然のソースから単離されるか、インビトロで合成されるか、または天然および合成分子の組み合わせから調製され得る。
【００８０】
ポリヌクレオチド分子に関して、用語「相補体」とは、相補的塩基配列および参照配列と比較した場合に逆配向を有するポリヌクレオチド分子をいう。例えば、配列５’ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ３’は、５’ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ３’に相補的である。
【００８１】
用語「縮重ヌクレオチド配列」とは、（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子と比較した場合）１以上の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの種々のトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵおよびＧＡＣトリプレットは、それぞれＡｓｐをコードする）。
【００８２】
用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の一部をいう。プロモーター配列は、常ではないが、普通には、遺伝子の５’非コード領域で見られる。
【００８３】
本発明は、本明細書において、添付の図面によって説明される以下の特定の実施態様で説明される。
【実施例】
【００８４】
実施例１
多分化能決定因子
スクリーニングの設計
ｃＤＮＡライブラリーの機能的スクリーニングを、２つの基準に合致するように設計した。第１に、ｃＤＮＡが細胞に導入されそしてスクリーニングの期間中維持される頻度は、１０５〜１０６の独立したｃＤＮＡの複合ライブラリーをスクリーニングすることが実用的であるように十分に高くなければならなかった。これは、ポリオーマラージＴ抗原を発現するＬＲＫ１細胞（以下に記載）およびポリオーマ起点を含むベクターｐＰｙＣＡＧＩＰ（図１）の組み合わせの使用によって満たされる。発明者らがテストしたエピソームベクターのうち、このプラスミドが最高レベルのｃＤＮＡ発現を与える（データを示さず）。さらに、ブラスチシジンＳ、ハイグロマイシンＢ、およびゼオシンでの選択と比較して、ピューロマイシン選択は、トランスフェクトしていないＥＳ細胞の最も迅速な排除を可能にし、９５％のトランスフェクトしていない細胞は１日以内に死んだ（データを示さず）。したがって、生物学的活性を混同する可能性のあるソースは、培養物から速やかに除去される。第２に、スクリーニングしているものについての特性は、非常に高いバックグラウンドなしにスクリーニングを行うことが可能であるために十分に低レベルでトランスフェクトされている細胞株に存在すべきであった。理想的には、この特性は、宿主細胞株に存在しないが発現可能である。ＬＲＫ１細胞は、この重要な基準を満たす。インビトロでの分化中、ＬＩＦ遺伝子座からの発現は増加し（Rathjenら、1990）、そして多くのＥＳコロニーは、分化した細胞単層から出現することが見られ得る（Daniら、1998）。これらの再出現コロニーの多くは、ＬＩＦの作用のため出現する（Daniら、1998）。ＬＩＦに対する応答性を保持するＥ１４／Ｔ細胞は、分化後にこのバックグラウンド自己再生を示す。逆に、ＬＩＦＲを介して作用するサイトカインに対する応答性を失ったＬＲＫ１細胞は、ＩＬ６およびｓＩＬ６Ｒの撤去後に非常に少数のコロニーを産生する。バックグラウンド自己再生のこの減少は、ライブラリースクリーニングをこれらの細胞を用いて行わせるために十分である。
【００８５】
ＬＲＫ１細胞の調製
ポリオーマ起点含有ベクターで高頻度にスーパートランスフェクトされ得る細胞株は、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングを高効率で行うことを可能にするために必要であった。細胞株Ｅ１４／Ｔは、プラスミドｐＭＧＤ２０ｎｅｏ（Gassmannら、1995）でトランスフェクトされておりそしてスーパートランスフェクトするプラスミドの複製をサポートするＥ１４Ｔｇ２ａ細胞の派生物であり、この細胞株Ｅ１４／Ｔを、ＬＩＦの撤去の際に効率的に分化する能力を保持した株として選択した。この株を、ＬＩＦＲ遺伝子座を標的とする２ラウンドの遺伝子ターゲティングに供した。用いたターゲティングベクターは、既述（Li, Sendtner, およびSmith、1995）のような同じ相同アームを使用したが、選択可能マーカーカセットは、遺伝子ターゲティングの第１および第２ラウンドについて、それぞれＩＲＥＳＢＳＤｒｐＡおよびＩＲＥＳｈｐｈｐＡカセットに置き換えた。得られた細胞株（ＬＲＫ１）は、高いスーパートランスフェクション効率を保持し、そしてＬＩＦあるいはＬＩＦＲの刺激によるＥＳ細胞自己再生を指示し得る他のサイトカインに対してもはや応答しなかった。ＬＲＫ１細胞を、ＩＬ６およびｓＩＬ６Ｒの存在下でルーチンで維持し、ｇｐ１３０によってＥＳ細胞自己再生の刺激を行った（Yoshidaら、1994）。
【００８６】
ライブラリー構築
γ照射した初代マウス胚線維芽細胞およびＥＳ細胞の共培養物（ＺＨＴｃ６細胞；Niwaら、2000）を、サイトカインを含まない標準ＥＳ細胞培地中で培養を開始し維持した。共培養物中の細胞の数は、コンフルエント単層を形成したＭＥＦおよびＥＳ細胞が、増殖の３日後に過剰のＭＥＦであるように播種するような数であった。アルカリホスファターゼ（ＥＳ細胞のマーカー）についての代表的なプレートの染色により、細胞溶解時に存在するＥＳ細胞の数の推定が可能であった。これによれば、ＥＳ ＲＮＡ／ＭＥＦ ＲＮＡは１２：１の比であった。ＲＮＡを、２０ Ｆ１８０フラスコの細胞から調製し、そしてポリアデニル化ＲＮＡを調製した。ＲＮＡの質を、ＬＩＦＲ転写物についてのノーザンブロットを検査することによってモニターし；検出可能な分解物を含まないシャープな１１ｋｂバンドを生じるＲＮＡのみをさらに使用した。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ合成およびプラスミドクローニングのためのSuperscriptプラスミドシステム（Life Technologies）で供給される試薬を用いてオリゴd(T)プライミングによって、ポリアデニル化ＲＮＡから合成した。ｃＤＮＡをポリアクリルアミドゲルで分画し、そして電気溶出により１ｋｂを超えるｃＤＮＡを回収した後、ｃＤＮＡをXhoI/NotI切断したｐＰｙＣＡＧＩＰにライゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ株のエレクトロポレーション後、７．４×１０５の初代組換え体のライブラリーを生成した。各５×１０４〜１０５コロニーを播種した１５ｃｍ直径のペトリディッシュで一晩増殖した後、ＤＮＡを細菌から調製した。
【００８７】
ライブラリースクリーニング
ライブラリーまたは空のベクターのいずれかからのＤＮＡ（２５μｇ）を、エレクトロポレーションによってＬＲＫ１細胞（６×１０６）に導入し、そして細胞を１０６／９ｃｍディッシュまたは５×１０４／９ｃｍディッシュで播種し、そしてＩＬ６／ｓＩＬ６Ｒ中で培養した。２日後、培地を、ピューロマイシンを含むように交換し、そしてサイトカインを高密度プレートから撤去した。サイトカインを低密度プレートで維持して、トランスフェクション効率をモニターした。培地を、トランスフェクション後９日目まで、２日毎に交換した。このとき、偽トランスフェクトしたプレートには生存細胞はなく、そして空のベクターのみでトランスフェクトしたプレートは、分化した細胞のみを含んでいた。逆に、ライブラリーＤＮＡでトランスフェクトしたプレートのいくつかは、未分化細胞に形態学的に類似するコロニーを含んでいた。したがって、染色体外ＤＮＡを、これらのプレートの細胞から調製し、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ株にトランスフェクトした。ＤＮＡを、１０４細菌コロニーのプールから調製し、そしてこれを、ＬＲＫ１細胞に再導入し、そして上記の選択プロセスを繰り返した。スクリーニングした１０プールのうち、２つが陽性のようであり、そして染色体外ＤＮＡを、トランスフェクション後１４日目にこれらから調製した。これらのプールの１つからのＤＮＡを、さらに以下に詳述するように検査した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂへのトランスファーの後、約２５０コロニーのプールからのＤＮＡを調製し、ＬＲＫ１細胞に再導入し、そして選択プロセスを繰り返した。トランスフェクション後１４または１９日目に、ＤＮＡを細胞から調製した。これらをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂにトランスファーし、そしてＤＮＡから調製した１２のminiprep ＤＮＡをトランスフェクション後１４日目に採取し、そしてＤＮＡから調製した９つのminiprep ＤＮＡをトランスフェクション後１９日目に採取した。これらのＤＮＡを、５’クローニング部位の上流に位置するオリゴヌクレオチドを用いて配列決定した。
【００８８】
結果の確認
トランスフェクション後１９日目に調製した９つのＤＮＡの配列分析は、これらのプラスミドの１つが部分ｃＤＮＡを含み、１つが解釈不可能な配列を与え、そして２つがGenbankデータベースの全長配列と一致する同じ配列を与えることを示した。残りの５つのプラスミドのうちの４つは、ｃＤＮＡインサートがなく、そしてＩＲＥＳ内に互いに２塩基対以内までの欠失を含んでいた。最後のプラスミドは、ｃＤＮＡインサートがなく、そして、ＩＲＥＳからさらに２７５塩基対を除去した欠失を有していた。これらのプラスミドのいくつかが自己再生活性を付与することを確認するために、９つのすべてのプラスミドの等重量を含むプールを調製し、ＬＲＫ１細胞にトランスフェクトし、そして上記の選択プロセスに供した。空のベクターコントロールで並行してトランスフェクトした細胞はすべて分化しており、これとは逆に、９つのプラスミドＤＮＡのプールでトランスフェクトした細胞は、未分化の形態を示した。９つのプラスミドのどれが自己再生活性を付与したかを決定するために、個々のプラスミドをＬＲＫ１細胞にトランスフェクトし、そして上記の選択プロセスを繰り返した。部分ｃＤＮＡ、解釈不可能な配列、ならびにＩＲＥＳ内の欠失の２つのクラスのいずれかの代表を有するプラスミドは、自己再生活性を付与しなかった。逆に、Genbankデータベースの全長配列に一致する２つのプラスミドの両方とも、自己再生表現型を繰り返した。これは、形態学的に、およびマーカーであるアルカリホスファターゼの１０日間の持続発現の両方によって判断した。
【００８９】
トランスフェクション後１４日目に調製した１２のＤＮＡの配列分析は、これらのうちの４つが、上記の２つのプラスミドと同じ配列と一致することを示した。これらのうちの１つを、ＬＲＫ１細胞にトランスフェクトし、そして未分化コロニー形態、少なくとも１４日間のアルカリホスファターゼの持続発現、および少なくとも８日間のＯｃｔ４の持続発現によって判断した場合、サイトカイン非依存的自己再生を付与する能力を有していた。さらに、ＰＤＦ ｃＤＮＡと、ｃＤＮＡ配列がオープンリーディングフレームに制限される類似のプラスミドとのトランスフェクションの比較は、ＰＤＦ活性がＯＲＦ内にあることを示した。
【００９０】
実施例２
多分化能決定因子（ＰＤＦ）導入遺伝子の可逆的発現
ＥＳ細胞におけるＰＤＦの発現によって引き起こされるサイトカイン非依存的多分化能表現型の獲得が可逆的であることを証明するために、ＰＤＦをコードする転写ユニットが部位特異的組換えによって削除され得る導入遺伝子を作製した。
【００９１】
開始の時点で、最初のライブラリースクリーニングで同定されたＰＤＦをコードするプラスミドを、プロモーターとＰＤＦの翻訳開始コドンとの間に１つのｌｏｘＰ部位を、およびポリアデニル化シグナルの後に第２のｌｏｘＰ部位を配置することによって改変した。下流のｌｏｘＰ部位の次は、ＧＦＰ指標遺伝子のコード配列およびポリアデニル化シグナルであった。このように、ｌｏｘＰに隣接するＰＤＦ遺伝子が削除された細胞を、蛍光色の変化によって同定し得た（図２を参照のこと）。
【００９２】
ＰＤＦをコードするプラスミドを、ベクター骨格で線状化し、そして生殖細胞系コンピテントＥ１４Ｔｇ２ａ細胞にトランスフェクトした。細胞を、サイトカインを刺激するｇｐ１３０を含まない培地中での増殖について選択した。個々のクローンを、緑色蛍光についてチェックし、そして非蛍光クローンを、２週間サイトカインの不在下で拡張した。ジャクスタクリンＬＩＦファミリーメンバーの自己再生効果を排除するために、ＬＩＦアンタゴニストであるｈＬＩＦ−０５を、この期間中培地に添加した。その後、培養物を２つに分けた。これらの培養物の一方を、上記のように維持し、一方、他方をＬＩＦ中で維持しそしてＣｒｅをコードするプラスミド（ｐＣＡＧＧＣｒｅＧＳ）でトランスフェクトした。２日後、細胞を低密度でプレーティングし、そして個々のコロニーを顕微鏡検査した。緑色蛍光コロニーを拡張し、そしてそのゲノムＤＮＡを分析して、トランスジェニックＰＤＦ配列の削除を確認した。
【００９３】
ｆｌｏｘ化ＰＤＦ遺伝子または削除された導入遺伝子の両方を有する細胞を、次いで、胚盤胞に別々に注入し、そしてレシピエントの胚盤胞を養母にトランスファーした。その後の種々の時点で、胚を切り出して分析した。蛍光顕微鏡検査により、削除された導入遺伝子を有する細胞が、これらのすべての生殖層の胎児組織に寄与することを決定できた。いくつかのキメラを出産させ、その後、交配して、操作したＥＳ細胞からの生殖細胞系の伝達を証明した。
【００９４】
実施例３
多分化能細胞におけるＰＤＦ ｍＲＮＡの発現の分析
ノーザンブロッティング分析は、ＰＤＦ ｍＲＮＡがＥＣおよびＥＳ細胞で発現するがＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞およびＢ９骨髄細胞のような多分化能でない細胞株では発現しないことを証明する。さらに、ＰＤＦ発現は、ＥＳ細胞が培養物へのレチノイン酸の添加によって分化するように誘導される場合に減少する。インサイチュハイブリダイゼーション実験は、ＰＤＦ ｍＲＮＡが、発生の３．５日目に胚の内部細胞マスに存在するが、それ以降の胚盤胞や卵筒期胚には存在しないことを示す。したがって、発現は、それ自体が樹立した多分化能幹細胞株であるかまたは幹細胞が樹立され得る胚性多分化能細胞であるかのいずれかの細胞と相関する。
【００９５】
したがって、ノーザンブロッティングによる分析は、ＰＤＦ ｍＲＮＡが、ｃＤＮＡライブラリーが合成されるＥＳ細胞／ＭＥＦ共培養物中で発現されることを確認した（図４Ａ）。この分析はまた、ＰＤＦ ｃＤＮＡの小さいＢ２転写物へのハイブリダイゼーションを確認した。Ｂ２ハイブリダイゼーションは、ＰＤＦ ＯＲＦに制限されるプローブを使用する場合に排除された。したがって、続くノーザンおよびインサイチュ分析は、ＯＲＦプローブを利用した。発現は、ＭＥＦ単独においては検出されず、ＥＳ細胞と共培養した線維芽細胞ではＰＤＦ発現の誘導の何らの証拠もなかった（図４Ｂ）。これは、共培養物中のＥＳ細胞がＰＤＦ ｃＤＮＡのソースであることを示す。いくつかの細胞株の分析は、ＰＤＦ発現が、非常に制限されており、壁内胚葉、卵黄嚢、線維芽細胞、および造血細胞では検出不可能であることを示した（図４Ｃ）。発現は、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、およびＬＩＦ依存的（ＰＳＡ４）およびＬＩＦ非依存的の両方の胎生期癌細胞株で検出された。
【００９６】
ＰＤＦのヒトオルソログの検査は、対応するｍＲＮＡが胎生期癌細胞株で発現するが、リンパ様細胞株では発現しないことを示した（図４Ｅ）。いくつかの成熟マウス組織を、ＰＤＦ ｍＲＮＡについて測定したが、発現はトータルＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーションによって検出できなかった（図４Ｆ）。ＥＳ細胞分化中のＰＤＦ ｍＲＮＡの発現を、次に分析した。レチノイン酸または３−メトキシ−ベンズアミド処理による分化の誘導によるかどうかにかかわらず、ＰＤＦ ｍＲＮＡのレベルは迅速に低下した（図４Ｄ）。分化した細胞および未分化の細胞の混合物を用いるコロニーの形成を可能にするためにＬＩＦレベルを低下させたＥＳ細胞培養物のインサイチュハイブリダイゼーションによる検査は、ＰＤＦ発現が未分化細胞に制限されることを示した（図４Ｂ）。
【００９７】
Ｐｄｆ ｍＲＮＡは、多分化能ＥＳおよびＥＧ細胞で、およびマウスおよびヒトの両方のＥＣ細胞でも見出されるが、他のタイプの細胞株に存在しないようである（図４およびデータを示さず）。Ｐｄｆ発現は、ＥＳ細胞分化中の初期にダウンレギュレートされるが、これは多分化能幹細胞同一体との親密な関連と一致した。
【００９８】
実施例４
フィーダー／フィーダー抽出物の不在下での多分化能ヒト胚幹細胞の維持
ヒトＥＳ細胞を、100ユニット/mlのＬＩＦ、１mMのグルタミン、0.1mMの２-メルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸、４ng/mlの塩基性線維芽細胞増殖因子、および20％のKnockOut SR（無血清処方）（GIBCO-BRL）を補充した80％ＤＭＥＭ培地中、γ照射したマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層上で培養する。
【００９９】
図１に示すプラスミド（ならびに、マウスＰＤＦ配列がヒトＰＤＦ配列に置換される同様のプラスミド）を、ベクター骨格中で線状化し、そしてヒトＥＳ細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションは、プロトコルを１０７ヒトＥＳ細胞を使用するようにスケールアップしたこと以外は、Eigesらに記載のExGen 500方法を利用する。トランスフェクション後の当日に、細胞をトリプシン処理し、そして２つに分ける。一方の半分の細胞を、１０４／ｃｍ２の密度でピューロマイシン耐性ＭＥＦの層上にプレーティングし；他方の半分を、１０４／ｃｍ２の密度でピューロマイシン感受性ＭＥＦ上にプレーティングする。置き換えた２日後に、ピューロマイシン感受性ＭＥＦ上の細胞をトリプシン処理し、そしてゼラチンで覆ったプラスチックディッシュ上に１０４／ｃｍ２でプレーティングする。ピューロマイシンを、両方の培養物のセットに添加し、そして培地を３〜４日毎に交換する。約１４日後、フィーダー上で増殖しているピューロマイシン耐性ヒトＥＳ細胞コロニーのいくつかを、トリプシン処理およびゼラチンコートしたプレート上への直接プレーティングによってフィーダー層の不在下で増殖する能力についてテストする。
【０１００】
ピューロマイシン耐性ＥＳ細胞株を、６週の期間にわたって、フィーダー層の不在下で連続的に継代しそしてサブクローニングする能力について評価する。
【０１０１】
次いで、これらの細胞の分化の可能性を、記載のようにｆｌｏｘ化ＰＤＦ発現カセットの削除後にテストする（Eigesら、2001）。
【０１０２】
実施例５
ＰＤＦ ｃＤＮＡの特徴付け
ＳＭＡＲＴ（http://smart.embl-heidelberg.de（Letunicら、2002；Schultzら、1998））を用いるＰＤＦ配列中の認識可能ドメインについての検索により、アミノ酸残基９６と１５５との間のホメオドメインの存在が明らかになった。これは、これまでに特徴づけられたタンパク質とは他の明らかな関連はなかった。ＢＬＡＳＴによるさらなる分析により、ＰＤＦがＮＫ２ファミリーのいくつかのメンバーに最も密接に関連することが明らかになった。しかし、どの場合も、５０％以上の同一性はなかった（図３）。したがって、ＰＤＦは、新規なホメオドメインファミリーの基本メンバーであるかまたは独特な改変体のホメオドメインであるかのいずれかである（Shashikantら、1991）。
【０１０３】
ＰＤＦと最も密接に関連するヒト配列との比較は、６０％の全体の同一性を示した。配列保存は、２つの配列が８７％同一であるホメオドメイン上で最も明らかであった（図３Ｂ）。これは、ＰＤＦと他のマウスタンパク質のホメオドメインとの間で見られる同一性のレベルをはるかに超えており、これがＰＤＦのヒトオルソログであることを示している。８つの非同一アミノ酸のうちの６つは、ａ−ヘリックス１の周囲のＮ末端アームに位置し、ホメオドメインの領域がＤＮＡターゲットによりゆるやかに関連すると考えられた。ホメオドメイン以外に、連続長の４より多いアミノ酸残基が保存される４つの領域がある。これらの保存された領域のうち、セリンリッチなモチーフの１つのみが、ホメオドメインのＮ末端にあり、残りはホメオドメインのＣ末端にある。ヒト配列は、これらのＣ末端同一性モチーフの第１と第２と間に７つのアミノ酸の挿入を含む。マウス配列では、ホメオドメインとＣ末端保存配列との間に、５残基毎にトリプトファンがある４６アミノ酸長がある。さらに、この配列内の最初の３１アミノ酸は、配列ＷｎｓＱＴＷＴＮＰＴＷ（ｎ＝Ｇ、Ｓ、Ｎおよびｓ＝Ｓ、Ｎ）の簡単な繰り返しを示す。ヒトにおける配列の保存は、あまり顕著でなく、そしてマウス配列に対して短い欠失を含む。さらに、１６番目の残基以外は、５残基毎にトリプトファンが残る。
【０１０４】
ＰＤＦ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲには、ＰＤＦの反対の転写方向に配向したＢ２反復エレメントがある（図３Ｃ）。この配列がＲＮＡポリメラーゼIIIによって転写されるかどうかは明らかではないが、分断されたプロモーターの配列はそれがあり得ることを示唆する（Galliら、1981）。Ｂ２エレメントは胚細胞で高レベルで発現されるので（Ryskovら、1983）、ＰＤＦ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内のＢ２の存在が、直接的な転写妨害またはより間接的な手段のいずれかによってＰＤＦ遺伝子発現の調節に寄与し得る可能性がある。
【０１０５】
実施例６
マウスＥＳ細胞におけるｈＰＤＦ機能の分析
ヒトＰＤＦオルソログがマウスＰＤＦの活性を複製する能力を、ｐＰｙＣＡＧＩＰベクター中にヒトＯＲＦを配置しそしてマウスＥＳ細胞をトランスフェクトすることによってテストした。これは、ヒト配列がマウスＥＳ細胞のサイトカイン非依存的自己再生を指示し得ることを示す（図３）。この活性は、おそらくかなりの配列の分岐進化のため、マウスＰＤＦと比較して低下した。ＰＤＦの効果の特異性を、ＰＤＦに最も密接に関連するマウスホメオボックス遺伝子の１つのＯＲＦ（Ｎｋｘ２．５）をＥＳ細胞中で発現させる類似の実験によってテストした。この場合、サイトカイン非依存的自己再生は明らかではなかった；実際に、得られた細胞は、ＬＩＦの存在下でさえ、形態学的に分化しているようであった。これは、サイトカイン非依存性が、ＰＤＦによって特異的に付与され、そしてホメオドメインタンパク質に通常は寄与しないことを示す。
【０１０６】
実施例７
ｍＰＤＦのインビボ発現
発明者らは、インビボでＰＤＦ ｍＲＮＡの分布を検討した（図５）。早期卵割期中に発現は見られなかった。ＰＤＦ ｍＲＮＡ発現の最初の徴候は、固く締まった桑実胚である。ハイブリダイゼーションシグナルは、顕著に、将来の内部細胞マスである内部細胞に局在化される。Ｅ３．５胚盤胞では、発現は、内部細胞マスの細胞に限定され、そして栄養外胚葉にはない。後者の胚盤胞では、ＰＤＦ ｍＲＮＡは、外胚葉にさらに制限され、そして原始内胚葉から除外される。ＰＤＦ転写物は、後期桑実胚と中期胚盤胞との間の一時的な最大レベルの波のようである。移植しようとする胚盤胞では、ＰＤＦ ｍＲＮＡレベルは、可視化のレベル以下に低下している。しかし、顕著には、転写物は休眠中の胚盤胞の外胚葉で検出可能なままであった。発明者らはまた、これらが多分化能ＥＧ細胞に変換され得るので（Matsuiら、1992）、原始生殖細胞におけるＰＤＦ発現を検査した。発現は、Ｅ８．５で移動性生殖細胞において明らかではないが、ＰＤＦ ｍＲＮＡは、原始生殖細胞への局在化を示すパターンにおいてＥ１１．５胚の生殖隆起で容易に検出可能である(図５Ｂ)。
【０１０７】
実施例８
ＰＤＦと多分化能の他の公知のメディエーターとの相互関係
ＰＤＦのレベルを増加させるＥＳ細胞の用量応答を、ＬＲＫ１細胞におけるエピソームの発現によって評価した。これは、種々のレベルのｃＤＮＡ発現を指示するエピソームの構築物のトランスフェクションによって達成された（図８Ａ）。得られたコロニーのサイトカインの不在下で自己再生し得る割合は、ｇｆｐ発現レベルを測定する類似の研究に基づくエピソームから予測した発現レベルと相関した（データを示さず）。さらに、組込まれたＰＤＦ導入遺伝子を有する細胞について観察した場合、ＰＤＦエピソームを有する細胞の培養物へのＬＩＦの添加により、形成される自己再生コロニーの数およびコロニー形態の両方の点で評価した場合、自己再生が増加する。本質的に同一の結果を、ＣＣＥ由来ポリオーマラージＴ発現細胞株ＭＧ１．１９の同じＤＮＡのトランスフェクションによって得た（Gassmannら、1995）。
【０１０８】
発明者らは、ｇｐ１３０シグナルとＰＤＦ過剰発現との協調効果が、ＳＴＡＴ３の転写ターゲットであるＰＤＦ遺伝子によるものであるかどうかを研究した。ｇｐ１３０の細胞内部分がＧＣＳＦ−Ｒの細胞外部分に連結されているキメラレセプターを用いて、ＥＳ細胞においてＳＴＡＴ３ターゲットを研究することが可能である。すべてがＳＴＡＴターゲットの可能性がある８つの公知のＳＯＣＳファミリーメンバーの分析は、ＳＯＣＳ３のみがＬＩＦによってＥＳ細胞中で著しく刺激されることを示した（図８Ｂおよびデータを示さず）。この刺激は、レセプター中の４つのＳＴＡＴ結合部位が、チロシンからフェニルアラニンへの変異によってＳＴＡＴ３に結合することが抑制される場合には生じない（図８Ｂ）。逆に、ネガティブ調節チロシンが同様に変異誘発される場合にＳＯＣＳ３誘導が増強および持続され、持続したＳＴＡＴ３活性化と一致する結果がこれらの細胞で観察された（Burdonら、1999）。ＳＯＣＳ３での刺激とは逆に、ＰＤＦ発現の誘導は、ＬＩＦ刺激の場合もキメラレセプターを発現する細胞のＧ−ＣＳＦ刺激の場合も見られない（図８Ｂ）。
【０１０９】
実施例９
ＰＤＦとＯｃｔ４との相互関係
次いで、ＥＳ細胞の自己再生においてＰＤＦがＯｃｔ４に代わる能力を、ＺＨＢＴｃ４．１細胞を用いてテストした。これらの細胞は、Ｏｃｔ４についての２つのヌル対立遺伝子を有するが、その自己再生は、ドキシサイクリン応答性Ｏｃｔ４導入遺伝子の存在のため持続され得る（Niwaら、2000）。Ｏｃｔ４導入遺伝子の発現がドキシサイクリンの投与によって抑制される場合、細胞は分化する。ＺＨＢＴｃ４．１細胞を、インサートなしか、あるいはＯｃｔ４またはＰＤＦを有する線状化ｐＰｙＣＡＧＩＰ配列でトランスフェクトした。上述のように、このＯｃｔ４プラスミドは、ドキシサイクリンが誘導したＯｃｔ４導入遺伝子の抑制によって引き起こされる分化を抑制する（Niwaら、2002）。しかし、ＰＤＦ発現ベクターは、抑制し得なかった（図８Ｃ）。したがって、ＰＤＦは、ｇｐ１３０媒介ｇｐ１３０刺激の不在下でＥＳ細胞表現型を持続し得るが、Ｏｃｔ４の不在下では持続し得ない。
【０１１０】
実施例１０
ＥＳ細胞同一性はＰＤＦ発現によって正確に維持される
発明者らは、ポリオーマＬＴを含まないＥＳ細胞におけるＰＤＦトランスフェクションの結果を研究した。ＰＤＦ ｃＤＮＡがＣｒｅリコンビナーゼによって後に削除され得るようにｌｏｘＰを含む構築物を用いた。安定な成分の単離後、次いで、部位特異的組換えを用いて、ＰＤＦ ＯＲＦを除去し、同時にＣＡＧプロモーター制御下にＧＦＰを有するようにし得る（図６Ａ）。ＰＤＦ導入遺伝子の削除により、一時的な導入遺伝子発現によって引き起こされる細胞の遺伝的または後成的な変化の評価が可能である。これらの実験において、発明者らは、ＰＤＦを過剰発現する細胞が、ｇｐ１３０シグナリングの不在下でクローン増殖する能力をテストすることを目的とした。発明者らは、以下の２つの事項を検査するつもりであった；第１は、強化されたＰＤＦ発現が、ある範囲の環境中で分化を抑制するかどうかということ、および第２は、多分化能および胚コロニー形成能が、ｇｐ１３０シグナリングの不在下で持続され得るかどうかということ。
【０１１１】
クローントランスフェクタントを、ピューロマイシンでの選択によって単離し、そしてＰＤＦ導入遺伝子ｍＲＮＡの発現を、ノーザン分析によって確認した（図６Ｂ）。細胞を低密度で播種しそしてＬＩＦアンタゴニストであるｈＬＩＦ−０５（Vernallisら、1997）の存在下で２継代を通して少なくとも７日間拡張した。ｈＬＩＦ−０５は、すべての公知のＬＩＦ−ＲリガンドがＬＩＦ−Ｒ／ｇｐ１３０複合体を形成する能力をブロックする。並行して処理した親細胞は、拡張しない分化した細胞のみを生成した。逆に、ｆｌｏｘ化したＰＤＦ−ＩＲＥＳ−ｐａｃカセットを含む株は、未分化形態を維持し、そして増殖し続けた。続いて、ＬＩＦを添加し、そして細胞を一時的にＣｒｅでトランスフェクトした。ＰＤＦ発現カセットが除去されているコロニーを、ＧＦＰの発現およびピューロマイシン選択性の修復によって同定した。この手順を、２つの独立したＥＳ細胞株Ｅ１４Ｔｇ２ａおよびＺＩＮ４０を用いて行った。染色体伸長を、得られたクローンのいくつかについて検査し、そしてすべての場合に顕著に４０ＸＹであることがみられた。
【０１１２】
コロニー形成アッセイを、ＰＤＦトランスフェクタントの表現型およびそれらのＣｒｅ処理派生物の厳格な評価として行った。細胞を、ＬＩＦを含む、ＬＩＦを含まない、あるいはＬＩＦアンタゴニストのｈＬＩＦ−０５を含む培地中に、クローン密度でプレーティングした。６日間の培養後、プレートをアルカリホスファターゼ活性について染色し、そして未分化細胞のみからなるコロニーの割合を定量した（図６Ｃ）。親細胞もＧＦＰ発現細胞もいずれも、ＬＩＦの不在下またはＬＩＦアンタゴニストの存在下では、完全な未分化コロニーを形成しなかった。しかし、ＰＤＦトランスフェクタントは、かなりの数のこのような純粋な幹細胞コロニーを生成した。ＬＩＦの添加の際に、この割合はコロニーの８０％よりも高くまで上昇した。導入遺伝子のＣｒｅ媒介削除後に、このＬＩＦに対する増強された応答もまた消失した。
【０１１３】
ＬＩＦの存在下または不在下で完全な未分化コロニーを形成するＰＤＦ導入遺伝子を発現する細胞の割合の差は、コロニーの形態の変化に伴う（図６Ｄ）。両方の場合とも、コロニーは、不十分な細胞質および顕著な核小体を有する小さい未分化細胞から構成される。ＬＩＦなしでは、ＰＤＦ発現体は、単層として増殖し、そしてＬＩＦの存在下で培養した親またはＣｒｅ処理派生物のＥＳ細胞とは本質的に区別不可能である。しかし、ＬＩＦとＰＤＦとの発現の組み合わせにより、細胞が基層上で増殖するよりもむしろもう１つの細胞に付着する密に締った形態がコロニーに取り入れられる。これは、フィーダー層上で培養したＥＳ細胞の「古典的」出現に似ている。
【０１１４】
ＰＤＦの強化された発現は、親細胞が分化する培養条件のｇｐ１３０刺激の不在下で、ＥＳ細胞を自己再生させる。次に、発明者らは、ＰＤＦ発現体細胞が、通常には分化を引き起こす薬剤に曝露した場合に自己再生または分化するかどうかを測定した。３−メトキシベナミド（ＭＢＡ）またはオールトランスのレチノイン酸（ＲＡ）への曝露後４日間培養した場合、ＰＤＦ発現細胞は、未分化の外観を保持したが、ＧＦＰ派生物および親細胞の両方の培養物は、形態学的に分化していた（データを示さず）。これらの形態学的特徴は、Ｃｒｅ派生物における劇的なダウンレギュレーションと比較して、ＰＤＦ発現体によるＯｃｔ４の連続した発現を分子レベルで反映する（図６Ｅ）。これらのデータは、ＰＤＦトランスフェクタントが単層培養物において通常は分化を指示する合図を出すことが難しいが、導入遺伝子削除後に分化能力が修復されることを証明する。
【０１１５】
次いで、ＰＤＦ発現細胞が分化を誘導する細胞相互作用に応答する能力を、親ＥＳ細胞由来の多分化した胚様体の形成を導く条件の懸濁培養物中での凝集によって研究した（Doetschmanら、1985）。凝集培養の８日後、胚様体を４８ウェルディッシュに１つずつプレーティングし、そして続いて、心筋細胞分化の指標である自発収縮について毎日スコア付けした。図７Ａは、心臓発生の指標が、Ｃｒｅ派生物に対してＰＤＦ発現体では約５０％減少することを示す。さらに、ＰＤＦ発現体からの心臓細胞の出現は、Ｃｒｅ派生物に対して遅れている。ｆｌｏｘ化導入遺伝子を発現する細胞由来のウェルは、狭い鼓動領域のみを含むがＣｒｅ派生物細胞由来のウェルは、いくつかの場合では全体の成長をカバーしている広い鼓動領域を有するので、実際、図７のグラフが２つのクラス間の差を過小評価する。胚様体も、凝集培養の最後の４日間はレチノイン酸に曝露し、そして神経分化に好適な条件下でプレーティングした（Bainら、1995；Liら、1998）。Ｅ１４Ｔｇ２ａ細胞は、神経特異的III型ｂ−チューブリン（ＴｕＪ）を発現する神経形態の多数の細胞を形成した（図７Ｂ）。ＬＩＦの連続的な存在は、ＴｕＪ陽性細胞の分化を阻害した。ＴｕＪ陽性細胞の出現はまた、ｆｌｏｘ化導入遺伝子を発現するＥＳ細胞由来の培養物中でブロックされたが、Ｃｒｅ派生物において修復した。しかし、Ｅ１４Ｔｇ２ａ（＋ＬＩＦ）およびＥＦ４培養物からのウェルに残っている細胞の外観は同一ではなかった。前者はＥＳ細胞の形態を有する多くの細胞を含んでいたが、ＰＤＦ発現体は部分的に分化され得たことを示唆する、より分散した外観を有していた。これらの観察は、ＰＤＦを発現するＥＳ細胞が、多細胞凝集環境において分化を効率的に受けないが、ある程度の分化がなお誘導されることを示す。最も顕著には、Ｃｒｅ派生物細胞株は、検査したすべての条件下での正常なＥＳ細胞の分化についてかなりの可能性を有するので、増強されたＰＤＦ発現によって誘導されるクローン拡張の期間によって影響を受けないようである。
【０１１６】
最後に、発明者らは、ＰＤＦの強化された発現が、胚コロニー形成特性の維持におけるＬＩＦ−Ｒ／ｇｐ１３０媒介シグナリングの必要性をなくすかどうかを研究した。外因性ＰＤＦ配列がＣｒｅ媒介削除によって除去されているＰＤＦトランスフェクタント（ＬＩＦの不在下で単離し、次いでＬＩＦアンタゴニストの存在下で１週間にわたって培養した）を、マウス胚盤胞に注入した。これまで、発明者らは、ＰＤＦトランスフェクタントの１つに由来するＣｒｅ派生物株を評価した。懐胎中期に生じるキメラの検査は、ＧＦＰ発現によって示されるように、発達中の胚の組織へのこの細胞の広い寄与を示した（図７Ｄ）。同様に注入した胚を、その期間保持し、そして生きているキメラを生じさせた（表１）。
【０１１７】
これらの結果は、（ｉ）ＰＤＦ導入遺伝子を発現する細胞が、サイトカイン非依存的様式で自己再生すること；（ii）ＬＩＦが、増強された自己再生能力を付与するようにＰＤＦ導入遺伝子と共作動して作用すること；および（iii）ＰＤＦ導入遺伝子発現の効果が、導入遺伝子の削除後に完全に可逆的であることを証明する。
【０１１８】
【表１】
2005536183.tif 000003
【０１１９】
実施例１１
ヒト多分化能細胞株におけるＰＤＦ ｃＤＮＡの発現
本研究では、本発明者らは、ヒト多分化能ＥＣ細胞株における多分化能決定因子（ｈＰＤＦ）についてのヒトｃＤＮＡの発現後の多分化可能性の因子依存的維持を証明した。このクローン由来細胞株の生殖細胞腫瘍２７Ｘ−１（ＧＣＴ ２７Ｘ−１）（Monash Institute for Reproduction and Development (MIRD), Melbourne, AustraliaのMartin Pera助教授の好意により提供された）は、卵黄嚢、栄養芽細胞層、皮膚、軟骨、腺上皮、神経外胚葉、および外移植における３つの原始胚層の代表的な他の組織に生じることが既に示されている。同じ細胞株はまた、インビトロで体細胞タイプおよび胚体外細胞タイプへの自発分化を示す（Peraら、1998）。ＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞株は、有糸分裂が不活性化されたマウスＳＴＯフィーダー細胞の層上（図９Ａ）、あるいはヒト卵黄嚢癌由来細胞株のＧＣＴ ４４（MIRD, Melbourne, AustraliaのMartin Peraの好意により提供された）のフィーダー細胞を含まない培養物から分泌された特徴付けされていない因子を添加したフィーダー細胞不在下（図９Ｂ）のいずれかで、ルーチンで維持される。低密度およびクローン密度のＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞培養物からのこの条件培地の撤去により、完全な分化が生じる（図９Ｃ）。
【０１２０】
ｈＰＤＦ転写因子は、多分化能ＧＣＴ ２７Ｘ−１ ｈＥＣ細胞中で内因的に発現し（図１０）、したがって、このおよび他のヒト多分化能細胞株における自己再生の維持に役割を演じると仮定される。
【０１２１】
本明細書において、発明者らは、卵黄嚢癌細胞由来条件培地の撤去に応じたＧＣＴ ２７Ｘ−１フィーダーを含まない細胞培養物における多分化可能性の消失、ならびに外因性ｈＰＤＦが発現する場合の多分化可能性のクローンレベルでの維持を証明する。
【０１２２】
これらの所見は、ｈＰＤＦ転写因子が、ヒトＥＳ細胞についての強健な培養系の基礎を提供することを示す。
【０１２３】
実験方策
ｈＰＤＦ遺伝子のオープンリーディングフレームを含むヒトｃＤＮＡ配列を含む構築物を、リポフェクションおよびエレクトロポレーション技法の両方によってＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞にトランスフェクトした。安定なトランスフェクタントコロニーを、ｈＥＣ細胞増殖および維持するために必要なＧＣＴ ４４由来条件培地を添加しておよび添加せずに、フィーダー細胞の不在下で樹立した。安定なコロニーを、ピューロマイシン抗生物質の存在下で選択し、そして密なｈＥＣ表現型の維持を示すもの（形態によって判断した場合）を選択し、そして両方の条件から拡張した。続いて、これらのクローンのｈＰＤＦを発現する細胞株を、それらが条件培地の不在下で多分化能表現型を維持する能力について、ルーチンおよびクローン密度の両方でテストした。コントロールとして、野生型のＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞および類似の構築物でトランスフェクトされたがｈＰＤＦ配列を含まないＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞を用いた。
【０１２４】
ＰＤＦ発現細胞における最終的に未分化のｈＥＣ細胞表現型を、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーのメンバーであるマーカーCluster Designation 30（ＣＤ３０）についての間接免疫蛍光染色によって確認した。ＣＤ３０は、ヒトＥＣ細胞の特異的マーカーであり、インビトロ分化中にダウンレギュレートされる（Latzaら、1995；Peraら、1997）。マウスＥＣまたはマウスＥＳ細胞上にＣＤ３０が存在するという証拠はない。
【０１２５】
この実験方策を、フローチャート形態でまとめる（図１１）。
【０１２６】
材料および方法
ベクター構築物
ｆｌｏｘ化ｈＰＤＦと命名した８．８ｋｂ構築物（図１２Ａ）は、ヒトサイトメガロウイルス前初期エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）下で作動するｈＰＤＦ ｃＤＮＡ（約９００ｂｐ）についてのオープンリーディングフレーム、およびピューロマイシン耐性遺伝子のＩＲＥＳ媒介発現を提供するビシストロンリポーターカセットの上流にヒトアクチンプロモーターを含み、すべてがｌｏｘＰ組換え部位内に含まれる。さらに、このベクターは、ｌｏｘＰ部位の下流に増強されたＧＦＰリポーター遺伝子を含み、Ｃｒｅ媒介組換えが起こると蛍光による可視化が提供される。
【０１２７】
同様の非ｆｌｏｘ化構築物ｐＰｙＣＡＧｅｇｆｐＩＰ（「ＧＦＰコントロール」ベクター）（図１２Ｂ）は、Ｆｌｏｘ化ｈＰＤＦベクター中のｈＰＤＦ配列が、ＩＲＥＳ−ピューロマイシンリポーターカセットの上流の増強されたＧＦＰリポーター遺伝子に置き換えられており、これをコントロールとして用いて、各実験について「非ｈＰＤＦ」を発現するトランスフェクトされたｈＥＣ細胞を提供した。
【０１２８】
ｈＥＣ細胞培養物
ＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞を、２mMのＬ−グルタミン（Invitrogen）、2.7g/Lの炭酸水素ナトリウム（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）、および10％のＦＣＳ（Commonwealth Serum Laboratories, CSL, Melbourne, Australia）を補充した1:1v/vのαMEM/Ham's F-12培地（Invitrogen, Groningen, The Netherlands）中、有糸分裂が不活性化されたマウスＳＴＯ細胞のフィーダー層上でルーチンで培養し、そして37℃にて５％ＣＯ２で維持した。細胞を、上記培地中で調製した５mg/mlのディスパーゼ溶液（Sigma）で消化して、各７日ずつ継代し、そして採取物の10分の１以上の密度で再プレーティングした。
【０１２９】
トランスフェクション実験およびクローンアッセイについては、ＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞を、ＳＴＯフィーダー細胞を含まないがヒト卵巣嚢癌由来細胞株ＣＧＴ ４４（細胞は、MIRD, Melbourne, AustraliaのMartin Peraの好意により提供された）のフィーダーを含まない培養物から得た条件培地を添加して、上記の補充したαMEM/Ham's F-12培地中25％v/vで培養した。単一細胞懸濁液を、ＰＢＳ緩衝液で調製した0.025％トリプシン（Invitrogen）／１mM ＥＤＴＡ（Sigma）／１％ニワトリ血清（Invitrogen）溶液でのトリプシン消化によって調製した。クローン密度の細胞培養物を、２００〜３００細胞/cm2で播種し、そして低密度培養物を5000細胞/cm2で播種した。
【０１３０】
ＧＣＴ ４４細胞株を、２mMのＬ−グルタミン（Invitrogen）、3.7g/Lの炭酸水素ナトリウム（Sigma）、および10％のＦＣＳ（CSL）を補充した高グルコースＤＭＥＭ培地（Invtrogen）中で有糸分裂が不活性化されたマウスＳＴＯフィーダー細胞上でルーチンで維持し、そして37℃にて５％ＣＯ２で維持したが、ＰＢＳ緩衝液で調製した0.25％トリプシン（Invitrogen）／１mM ＥＤＴＡ（Sigma）溶液での消化によって継代した。条件培地を、フィーダーを含まない培養物から７、１０、および１４日目に回収し、濾過滅菌し、そして２カ月間４℃にて保存した。条件培地の各バッチを、上記のようにＧＣＴ ２７Ｘ−１ ｈＥＣ細胞のフィーダーなしのクローン培養物を維持する能力についてテストした（データを示さず）。
【０１３１】
マウスＳＴＯフィーダー細胞（MIRD, Melbourne, AustraliaのMartin Peraの好意により提供された）を、ＧＣＴ ４４培養物について、上記のように補充された高グルコースＤＭＥＭ培地（Invtrogen）中でルーチンで維持した。ルーチンのＳＴＯ培養物を、ＰＢＳ緩衝液で調製した0.25％トリプシン（Invitrogen）／１mM ＥＤＴＡ（Sigma）溶液での消化によって週２回継代した。ＳＴＯ細胞の有糸分裂不活性化を、（上記のように）補充したＤＭＥＭ培地で調製した16μg/mlのマイトマイシンＣ溶液（Sigma）中でのルーチン培養物の２〜３時間のインキュベーションによって行い、そしてＰＢＳで２回洗浄してトリプシン処理した。
【０１３２】
ｈＥＣ細胞のルーチンの形態学的検査については、培養物を固定し、そして既述のように（O'Brien、2001）Leishman'sで染色した。
【０１３３】
細胞培養物を、Leica DMIL（Leica Microscopy Systems, Wetzlar, Germany）またはNikon Diaphot 300（Nikon Inc., Melville, NY, USA）のいずれかの顕微鏡を用いて、位相差顕微鏡検査によってルーチンで検査した。蛍光を発するコントロールのＧＦＰ細胞培養物を、470/40nmのNikonフィルターを用いてNikon Diaphot 300顕微鏡で検査した。蛍光データを、Leica DFC300 Fイメージングシステムで捕捉した。すべての細胞培養を、Falcon（Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ, USA）またはNunc（Roskilde, Denmark）によって供給される組織培養グレードのプラスチック製品を用いて行った。
【０１３４】
ｈＥＣ細胞の安定な組込みトランスフェクション
ｆｌｏｘ化ｈＰＤＦおよびＧＦＰコントロールベクターを、標準的なPvuI制限酵素消化によってそれぞれ線状化し、そしてエレクトロポレーションおよびリポフェクションの両方の方法によってＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞にトランスフェクトした。
【０１３５】
エレクトロポレーション：２０〜３０×１０６のｈＥＣ細胞の単一細胞懸濁液を、トリプシン消化によって調製し、そして0.8kVの放電および0.1msの時定数（３μF電気容量）を送達するようにセットした、BTX ECM830矩形波エレクトロポレーター（BTX, San Diego, CA, USA）を用いて40μgの線状化ＤＮＡでトランスフェクトした。
【０１３６】
リポフェクション：２×１０６のｈＥＣ細胞を、トランスフェクションの１日前に78.5cm2の培養ディッシュに播種した。リポフェクションを、製造業者の指示書に従って、Lipofectamine 2000試薬（Invitrogen）とともに無血清培地中で６時間、60μｇ（１μg/μl溶液）および20μgの線状化ＤＮＡでの細胞のインキュベーションによって行った。細胞を、リポフェクション後48時間にトリプシン処理し、そしてエレクトロポレートした細胞と同じ密度でプレーティングした。
【０１３７】
トランスフェクトした細胞およびコントロールの非トランスフェクト細胞を、78.5cm2のディッシュに２×１０６細胞の密度（約25,500細胞/cm2）でプレーティングし、そして条件培地ありおよびなしの両方で、３〜４日毎に培地を新しくしながら15日間培養した。安定な組込み体の効果的な選択のために、ピューロマイシン選択を、トランスフェクションの２〜３日後に、最初は0.4μg/mlで、次いでトランスフェクションの10〜15日後からは1.0μg/mlで適用した。ピューロマイシン耐性ｈＥＣコロニーを、2.0cm2ウェル中に選び取り、そしてその後の凍結およびさらなる分析のために拡張した。自己再生するＧＦＰコントロールｈＥＣ細胞株の維持を確実にするために、条件培地プレートからのコロニーのみを選び取りそして拡張した。ｈＥＣ細胞の安定な組込みトランスフェクションを達成するためのすべての手順は、本質的にマウスＥＳ細胞についての既述のとおりであった（O'Brien、2001）。
【０１３８】
ＣＤ３０免疫染色
マウス抗ヒトＣＤ３０モノクローナル抗体（Dako, Glostrup, Denmark）での間接免疫蛍光染色用のｈＥＣ細胞培養物を、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、エタノール中で氷上で10分間固定し、そして−20℃にて保存することによって調製した。染色を、ＰＢＳ緩衝液中で調製した0.1％Triton X-100（Sigma）／２％ヤギ血清（Invitrogen）／13.3％v/vＢＳＡ（Invitrogen）染色希釈物中の1:20希釈の一次抗体を用いて行った。ＣｙTM３結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Westgrove, USA）を、上記希釈緩衝液中1:200希釈で用いた。ＣＤ３０陽性細胞を、535/50nmのNikonフィルターを用いて目視し、そして比較のHoechst（Sigma）染色をＵＶ330〜380nmのNikonフィルターで目視した。蛍光データを、Leica DFC300 Fイメージングシステムで捕捉した。免疫蛍光染色についてのすべての手順は、SCS Ltd実験室プロトコルに記載のとおりであった。
【０１３９】
ノーザンブロット分析
ポリＡ＋ ｍＲＮＡを、ＳＴＯフィーダー細胞上およびフィーダー細胞を含まないが上記の条件培地の存在下の両方で培養したＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞のサブコンフルエント培養物から調製した。さらに、その後のハイブリダイゼーションについてのコントロールとして、ポリＡ＋ ｍＲＮＡを、ＳＴＯ細胞およびＥ１４Ｔｇ２ａマウスＥＳ細胞のルーチンの培養物から調製した。ＲＮＡライセートを、細胞培養物から直接調製し、そしてポリＡ＋ ｍＲＮＡを既述（O'Brien、2001）のようにオリゴ(dT)セルロース（New England Biolabs, Beverly, MA, USA）でのアフィニティークロマトグラフィーによって単離した。
【０１４０】
抽出したｍＲＮＡ試料（３〜3.5μg）を、１％w/vアガロース／0.66Mホルムアルデヒド変性ゲルで電気泳動し、１×ＭＯＰＳ緩衝液で泳動した。ＲＮＡを、Hybond N+荷電メンブラン（Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Buckinghamshire, UK）に移し、そしてｐＰｙＣＡＧｈＰＤＦＩＰベクター（ベクターは、Ian Chambers, ISCR, Edinburgh, UKから好意により提供された）からEcoRI制限酵素消化によって単離した32Ｐ-標識（Amersham Pharmacia Biotech）960bp ｈＰＤＦ ｃＤＮＡフラグメントとハイブリダイズした。Gapdhコード配列の800bpのHindIII/EcoRIフラグメントを用いて、いくつかのメンブランを再ハイブリダイズして、ｍＲＮＡ試料（プラスミドＤＮＡは、Kate Loveland, MIRD, Melborne, Australiaから好意により提供された）についてのローディングコントロールを得た。メンブランを、増感紙間のBiomax MS（Kodak, Cedex, France）およびHyperfilm MP（Amersham Pharmacia Biotech）Ｘ線フィルムに、−70℃にて24時間までの間曝露した。ブロッティング、ハイブリダイゼーション、およびルーチンの分子手順は、Sambrookら（1989）に記載のように行った。
【０１４１】
結果
ＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞の自己再生および分化
ＧＣＴ ２７Ｘ−１ ｈＥＣ細胞のルーチン培養物を、方法の項に記載のように樹立した。ＳＴＯフィーダー細胞の層上で（図９Ａ）またはＳＴＯフィーダー細胞の不在下であるがＧＣＴ ４４由来条件培地の存在下で（図９Ｂ）、ルーチン（図９Ｂ）およびクローン密度（図１４ｇ）の両方で培養した場合の多分化能表現型の維持を、形態による判断によって示した。ｈＥＣ細胞のフィーダーなしの培養物からの条件培地の撤去は、細胞分化の開始、ならびに低密度およびクローン密度の培養物中の多分化能の完全な消失を示した（図９Ｃ）。フィーダーなしのｈＥＣ細胞の培養物は25％(v/v)よりも低い条件培地を含む培養物中で多分化能形態を維持できなかったが、ルーチン培養物の75％(v/v)より高い条件培地ヘの置換は、培養物の生存および増殖を全体的に支持できなかったことをさらに示した。（データを示さず）。
【０１４２】
ｈＥＣ細胞におけるｈＰＤＦの内因性発現
多分化能ＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞におけるｈＰＤＦ遺伝子の内因性発現を確認するために、ポリＡ＋ ｍＲＮＡノーザンブロットを調製し、そしてＦｌｏｘ化ｈＰＤＦベクターに含まれる約９００ｂｐのｈＰＤＦ ｃＤＡ配列に対応する放射標識したプローブとハイブリダイズした。図１０の結果は、ｈＰＤＦプローブが、フィーダー細胞上およびフィーダー細胞はないが条件培地の存在下の両方で増殖したＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞において、約2.4kbのハイブリダイゼーションバンドを強く検出することを示す。約5.6kbサイズの第２のより少ないハイブリダイズする転写物も、両方の培養物で検出され、そして異なるＲＮＡ調製物での繰り返し実験において確認した（データを示さず）。ルーチンのＳＴＯ細胞のみの培養物から調製したｍＲＮＡからは、ハイブリダイズするバンドは検出されなかった。約2.2kbの弱くハイブリダイズするバンドが、マウスＥ１４Ｔｇ２ａ ＥＳ細胞ｍＲＮＡにおいて検出され、そしてマウス多分化能細胞において発現した相同ＰＤＦ転写物を示している。種々のゲルのレーンにおけるポリＡ＋ ｍＲＮＡの相対量を、メンブランとハウスキーピング遺伝子Gapdhとの再ハイブリダイゼーションによって測定した。これは、マウスＰＤＦ転写物が、ｈＥＣ細胞で検出される転写物と比較して、非常に低いレベルで検出されることを示した（データを示さず）。
【０１４３】
ＧＣＴ ２７Ｘ−１ ｈＥＣ細胞ｍＲＮＡで検出された約2.4kbの転写物は、同じ親株に由来する無分化能ｈＥＣ細胞株ＧＣＴ ２７Ｃ４についてこれまでに観察されたものに一致する。
【０１４４】
ｈＰＤＦベクターおよびコントロールＧＦＰベクターのトランスフェクション
ＧＦＰコントロールベクターでの試行トランスフェクション実験において、エレクトロポレーションおよびリポフェクションの両方の方法とも、ＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞において匹敵する結果を得た（データを示さず）。ＧＣＴ ２７Ｘ−１ ｈＥＣ細胞のＦｌｏｘ化ｈＰＤＦベクターでのトランスフェクションを、エレクトロポレーションおよびリポフェクションの両方によって行い、比較のＧＦＰコントロールベクタートランスフェクションを、リポフェクション方法のみによって行った（表２）。
【０１４５】
Ｆｌｏｘ化ｈＰＤＦベクターを有する安定な組込みコロニーを、条件培地の存在下および不在下の両方でフィーダーなしの培養物として樹立した。ＧＦＰコントロールベクターを有する安定な組込みコロニーを、同数のプレーティングした細胞について、同じ条件下で樹立した。安定な中程度のサイズのコロニーを、この時点以後の増殖が本質的に明らかなトランスフェクトされていない細胞についてのピューロマイシンコントロールプレートを用いて、両ベクターについて10〜15日目に樹立した。
【０１４６】
表２の結果は、Ｆｌｏｘ化ｈＰＤＦベクターについてのエレクトロポレーションよりもリポフェクションによるＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞のトランスフェクションの方がわずかに高い効率を示すが、ＧＦＰコントロールトランスフェクタントと比較して、条件培地の存在下で樹立した安定なｈＰＤＦ組込みコロニーの数と条件培地なしの場合の数との差は見られないようである。しかし、条件培地なしでのトランスフェクトされた細胞の培養物は、コロニーが樹立される能力を隠さないようであるが、これらの形態は、以下の項で議論するように（表３を参照のこと）、Ｆｌｏｘ化ｈＰＤＦとＧＦＰコントロールトランスフェクタントとは異なる。
【０１４７】
密な多分化能ｈＥＣ表現型を提示しているすべての等しい数の初代コロニーを選び取り、そしてｈＰＤＦトランスフェクタントについての両条件から拡張した。ＧＦＰコントロールコロニーを、安定なコロニーにおける形態の観察について条件培地なしで樹立したが（表３を参照のこと）、これらは、同じ時間枠にわたるこれらのコロニーにおける分化の予測された開始のために選択されなかった。
【０１４８】
トランスフェクトしたｈＰＤＦ細胞が、条件培地の存在または不在下のいずれかでコロニーを樹立するために同じ時間量がかかるようであるが、選択した後、条件培地なしで増殖する細胞は、条件培地で培養したものよりも遅い速度で拡張することに留意する。これは、ＬＩＦを含むおよび含まない培養物中で樹立したＰＤＦを発現するマウスＥＳ細胞についての場合と同様の観察である（実施例８を参照のこと）。条件培地で拡張したＧＦＰコントロールコロニーが、ｈＰＤＦ対応物よりもわずかに速い増殖速度を提示したことも注目すべきである。
【０１４９】
ｈＰＤＦトランスフェクタントおよびＧＦＰコントロールトランスフェクタントについての形態学的観察
Ｆｌｏｘ化ｈＰＤＦベクターおよびＧＦＰコントロールベクターでのトランスフェクション後に樹立し、そして条件培地の存在および不在下で培養した安定なトランスフェクタントコロニーを、Leishman染色後に形態学的に比較した（表３）。コロニーを「密」、「中度」、または「疎」とスコアして、密な多分化能表現型を維持するピューロマイシン耐性コロニー、いくつかのｈＥＣ表現型を維持しながら分化を開始するコロニー、および完全に疎であり分化したコロニーを、それぞれ記載した（図１３Ａ〜Ｃ）。
【０１５０】
表３に示すように、初代トランスフェクタントについてのコロニー形態の検査は、ｈＰＤＦトランスフェクタントが、ＧＦＰコントロールトランスフェクタントと比較して条件培地中でより高程度の密なｈＥＣ形態を提示したが、ｈＰＤＦトランスフェクタントが、疎で分化している表現型の増加が観察されたＧＦＰコントロールコロニーと比較して、条件培地なしで多分化能表現型を保持する能力が上昇していたことを示す。
【０１５１】
各ベクターから生じるトランスフェクタントについての形態の変動は、ゲノムへのＤＮＡ組込み部位によって影響を受け得るが、ｆｌｏｘ化ｈＰＤＦトランスフェクションから生じる変動は、コロニーにおいて通常は分化および多分化能の消失を開始する条件下でさえも、多分化能表現型を樹立および維持する能力の上昇を提示するようである。
【０１５２】
一般的に、条件培地なしで培養したｈＰＤＦトランスフェクションプレートで観察されるコロニーは、多くが密な多分化能表現型を提示しているにもかかわらず、条件培地中で増殖するものよりもサイズが小さい。外因性ｈＰＤＦを発現するｈＥＣ細胞が条件培地の存在下で培養される場合に相乗効果が生じる可能性も残っている。
【０１５３】
ｈＰＤＦ発現トランスフェクタントにおける多分化能の維持
ｈＰＤＦを発現する安定なトランスフェクタント株が通常はＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞分化を開始する条件下で多分化能表現型を確実に維持する能力を、多分化能ｈＥＣ細胞に特異的であるが分化している細胞タイプで発現されないＣＤ３０マーカーでの間接免疫蛍光染色によって確認した。
【０１５４】
トランスフェクションの時から条件培地なしで樹立および培養したものを含む、６つのｈＰＤＦ発現細胞株を、条件培地の存在および不在下の両方でクローン密度で培養した。ＧＦＰコントロールｈＥＣトランスフェクタント細胞株（自己再生のための条件培地中で維持された）および非トランスフェクトＧＣＴ ２７Ｘ−１ ｈＥＣ細胞（これもまた、トランスフェクション実験の時以来フィーダー細胞を含まない条件培地中で維持された）の４つを、ｈＰＤＦ株と同じ条件下でクローン密度で並行して培養した。条件培地なしで培養したＧＦＰコントロールおよびＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞がコロニーの完全または著しい分化を証明する場合に、形態学的分析およびＣＤ３０間接免疫蛍光染色を行った。非トランスフェクトＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞が、ＧＦＰコントロールおよびｈＰＤＦ細胞株よりも速い速度で拡張したコロニーを樹立したこと留意した。
【０１５５】
ｈＰＤＦ ｃＤＮＡを発現する細胞株は、条件培地ありおよびなしで、クローン密度で多分化能表現型を維持することが示されたが、ＧＦＰコントロール細胞およびＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞は、条件培地が培養物中に存在する場合にのみ多分化能を維持し得た。
【０１５６】
図１４の結果は、条件培地の連続的存在（ｈＰＤＦクローンＤ７）または連続的不在（ｈＰＤＦクローンＥ７）下でトランスフェクションプレートから拡張し、そして条件培地ありおよびなしでクローン密度で培養した、２つのｈＰＤＦクローンの形態を示す（図１４ａ〜ｄ）。ｈＰＤＦ Ｄ７およびＥ７クローンの両方とも、両条件下で多分化能細胞表現型を提示するｈＥＣコロニーを樹立および維持する能力を証明する。ＧＦＰコントロールクローンＣ１５および非トランスフェクションＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞の並行クローン培養物は、これらの細胞が条件培地の連続存在下で多分化能ｈＥＣコロニーを樹立および維持するのみの能力を確認する。条件培地の不在下では、Ｃ１５およびＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞は、分化するように誘導され、疎に形成されたコロニー中にｈＥＣ細胞はほとんどまたは全く残っていない（図１４ｅ〜ｈ）。
【０１５７】
図１５の結果は、条件培地の存在および不在下で培養した、ｈＰＤＦ Ｄ７、ｈＰＤＦ Ｅ７、ＧＦＰ Ｃ１５、およびＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞株から樹立した個々のコロニーの比較ＣＤ３０およびHoechst免疫蛍光染色での上記の形態学的観察を確認する。すべての細胞株は、フィーダー細胞の不在下および条件培地の存在下で培養した場合に、自己再生するＣＤ３０陽性コロニーを維持する能力を提示した（図１５ａ〜ｈ）。ＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞は、トランスフェクトした細胞よりも迅速に大きな拡張したコロニーを樹立したので、これらの多くは、過剰増殖が予測されるその周囲で分化を開始した（図１５ｇ〜ｈ）。フィーダー細胞および条件培地の両方の不在下で、ｈＰＤＦ発現ｈＥＣ細胞のみがＣＤ３０陽性コロニーを維持できたが、ＧＦＰコントロールおよびＧＣＴ ２７Ｘ−１ ｈＥＣ細胞は自己再生コロニーを維持できなかった（図１５ｉ〜ｐ）。また、ＧＣＴ ２７Ｘ−１コロニーで観察される残りのＣＤ３０陽性細胞はいずれも、これらのコロニーのより迅速な拡張および過剰増殖に寄与し得た（図１５ｏ〜ｐ）。
【０１５８】
ｈＰＤＦ Ｅ７細胞株が、ｈＰＤＦ Ｄ７細胞と比較した場合、一般的により密なｈＥＣコロニー形態（図１４ａ〜ｄ；図１５ａ、ｃ、ｉ、ｋ）およびＣＤ３０マーカーのより強い検出（図１５ｂ、ｄ、ｊ、ｌ）を提示したことが観察され、そしてこれは各クローンにおいてゲノムへのランダムなＤＮＡ組込みの部位を反映し得る。ｈＰＤＦ Ｅ７細胞株は、トランスフェクション後にＳＴＯフィーダー細胞および条件培地の不在下で最初に樹立された。これらの培養条件下での連続拡張の８週以上の後、ｈＰＤＦ Ｅ７ ｈＥＣ細胞株は、自己再生するｈＥＣ細胞の表現型を提示し続ける（図１６）。
【０１５９】
これは、ヒト多分化能細胞株におけるヒトＰＤＦ ｃＤＮＡの外因性発現により、通常はこれらの細胞を分化しそして自己再生する能力を消失するように誘導する条件下で多分化能表現型を維持するようになることを証明する。
【０１６０】
参考文献
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【０１６１】
【表２】
2005536183.tif 000004
【０１６２】
表２は、ＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞のｈＰＤＦベクターでの安定な組込みトランスフェクションについての表である。多分化能ＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞を、エレクトロポレーションおよびリポフェクションの両方の方法によってＦｌｏｘ化ｈＰＤＦベクターでトランスフェクトし、そして安定なトランスフェクタントコロニーを、ピューロマイシン選択下にて、条件培地の存在および不在下（＋／−ＣＭ）でＳＴＯフィーダー細胞なしで樹立した。コントロール細胞株を提供するために、ＧＦＰコントロールベクターでのリポフェクションによってトランスフェクトしたＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞を、同じ条件下で樹立した。等しい数のコロニーを、ｈＥＣコロニーを維持する条件培地プレートからのみ選び取られるＧＦＰコントロールを除くすべての条件から選択しそして拡張した。
【０１６３】
【表３】
2005536183.tif 000005
【０１６４】
表３は、種々の培養条件における安定な組込みｈＰＤＦおよびコントロールＧＦＰトランスフェクタントＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞の形態についての表である。トランスフェクトした細胞を、約25,500細胞/cm2の密度で播種し、そして条件培地の存在および不在下（＋／−ＣＭ）で、10〜15日間のピューロマイシン選択下で、コロニーを樹立した。コロニーを、Leishman染色後、多分化能に対して密、中度、または疎の表現型についてスコア付けした。示したＦｌｏｘ化ｈＰＤＦコロニーのスコアは、エレクトロポレーショントランスフェクションプレートから取ったものである。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】プラスミドｐＰｙＣＡＧＩＰを示す。
【図２】ｌｏｘＰに隣接する多分化能決定因子導入遺伝子の組込みおよびそれに続く除去を示す。
【図３Ａ】ＰＤＦ ｃＤＮＡの配列分析を示し、ＰＤＦホメオドメインと、ホメオドメインタンパク質のいくつかの異なるクラスの最も密接に関連する代表物とのアラインメントを示す。アラインメントは、Clustal Wで生成し、そしてＰＤＦに関してMacBoxshadeを用いて濃淡をつけた：濃い灰色、すべての配列で同一；中間の灰色、ＰＤＦと同一；薄い灰色、ＰＤＦと類似。ＰＤＦホメオドメインに対するパーセント自体を、右に示す。
【図３Ｂ】マウス（Ｍｍ）ＰＤＦおよびヒト（Ｈｓ）オルソログ（仮定タンパク質FLJ12581）の対の比較を示す。同一の残基を四角で囲む。
【図３Ｃ】マウスＰＤＦ ｃＤＮＡの３’ＵＴＲがＢ２リピートを含むことを示す。番号付けは、ＰＤＦ ｃＤＮＡおよびＢ２配列登録番号Ｋ００１３２に従う。Ｂ２のスプリットＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターを四角で囲む。アステリスクは、本明細書に記載のＰＤＦ ｃＤＮＡとＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ＡＫ０１０３３２との間で異なる塩基を示す。
【図３Ｄ】マウスＥＳ細胞におけるＰＤＦのヒトオルソログの活性を示す。ＬＲＫ１細胞を、ｐＰｙＣＡＧＩＰ（インサートなし）またはｈＰＤＦ ＯＲＦインサートを有する誘導体でトランスフェクトした。周囲の分化した細胞がないアルカリホスファターゼ陽性コロニーの数を計数し、そしてＩＬ６／ｓＩＬ６Ｒの存在下で形成される数に対してサイトカインの不在下で形成されるパーセントとして表した。
【図４Ａ】インビトロでの発現が多分化能細胞に制限されることを示す。ライブラリー構築に使用されるＭＥＦ由来およびＭＥＦ／ＥＳ細胞共培養物由来のＲＮＡの比較ハイブリダイゼーションを示す。１レーンあたり１μｇのｐＡ＋ＲＮＡをロードし、そしてＰＤＦ ｃＤＮＡ（左）、ＧＡＰＤＨ（右）、およびＰＤＦ ＯＲＦ（中）についてのプローブをハイブリダイズした。示したサイズ（ｋｂ）のＲＮＡマーカーの移動位置を、左に示す。
【図４Ｂ】ＭＥＦ／ＥＳ細胞共培養物のインサイチュハイブリダイゼーションによって検出したＰＤＦ転写物（左）およびＥ１４Ｔｇ２ａ培養物中で分化した細胞によって取り囲まれた細胞の未分化コロニー（右）を示す。バーは５０μｍである。
【図４Ｃ】細胞株における発現が、ＥＳ、ＥＣ、およびＥＧ細胞に制限されることを示す。使用したＲＮＡは、ＰＳＭＢ、ＰＣ１３．５、Ｆ９、ＰＳＡ４、Ｐ１９はＥＣ細胞であり；ＣＧＲ８はＥＳ細胞であり；ＰＥは壁内胚葉であり；ＰＹＳは壁卵黄嚢であり；ＮＩＨ３Ｔ３は線維芽細胞であり；ＢＡＦＢ０３はプロＢ細胞であり；ＭＥＬは赤白血病細胞であり；Ｂ９は形質細胞腫であった。
【図４Ｄ】ＰＤＦ発現が、ＥＳ細胞分化の際に抑制されることを示す。ＲＮＡは、示した日数のＲＡまたはＭＢＡの適用によって分化するように誘導されたＥ１４Ｔｇ２ａ細胞に由来した。
【図４Ｅ】ヒトＰＤＦ ＲＮＡがＥＣ細胞で発現されることを示す。使用したＲＮＡは、胎生期癌（ＧＣＴ２７Ｃ４）細胞およびリンパ種（Ｊｕｒｋａｔ）細胞由来であった。ノーザンブロット分析を、ＰＤＦ、ＧＡＰＤＨおよびＯｃｔ４（Ｃ、Ｄ）、ＰＤＦおよびＧＡＰＤＨ（Ｅ）、ならびにｈＰＤＦおよびＧＡＰＤＨ（Ｆ）についてのプローブを用いて、連続ハイブリダイゼーションによって行った。
【図４Ｆ】成体組織においてＰＤＦの検出可能な発現がないことを示す。使用したＲＮＡは、１、精巣上体；２、精巣；３、ＣＧＲ８；４、脂肪；５、腎臓；６、肝臓；７、心臓；８、脾臓；９、脳；１０、骨髄；１１、舌；１２、眼；１３、卵管；１４、胸腺；１５、骨格筋；１６、皮膚；１７、卵巣；１８、精嚢；１９、肺であった。
【図５Ａ】インビボでのＰＤＦの発現を示す。ＰＤＦ ｍＲＮＡがＯＲＦプローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションによって可視化されており、着床前胚を示す。上列は、１、２、６、および８個の細胞の胚および後期桑実胚を示す。下列は、初期、拡張期、孵化期、および着床期の胚盤胞を示す。すべてのパネルを、同じ倍率で示す。
【図５Ｂ】雌（上）および雄（下）の胚からのＥ１１．５生殖隆起を示す。
【図６Ａ】ｇｐ１３０非依存的自己再生の可逆性を示し、構築物の図を提供する。ＣＡＧカセットは、ＰＤＦ−ＩＲＥＳ−ｐａｃｐＡ転写物の発現を指示する。これに続いて、転写ターミネーター配列（ＳＴＯＰ；ＳＰＡ Ｃ２ ＭＡＺ）およびｅｇｆｐｐＡカセットがある。ｌｏｘＰ部位は、ＣＡＧカセットの第２エクソンに、およびターミネーター配列とｅｇｆｐとの間に位置し、そのため、Ｃｒｅ媒介組換え後に、ＣＡＧはｅｇｆｐの発現を指示する。
【図６Ｂ】Ｃｒｅ削除の前（ＰＤＦ−ＩＲＥＳ−ｐａｃ、ｐａｃプローブ）および後（ｇｆｐ）の導入遺伝子転写物のノーザンブロット分析を示す。ブロットを、示したプローブで連続的にハイブリダイズした。Ｅ、Ｅ１４Ｔｇ２ａ；ＥＦ１、Ｆｌｏｘ化導入遺伝子を有するＥ１４Ｔｇ２ａサブクローン；ＥＦ１Ｃ１、Ｃｒｅ媒介した削除後のＥＦ１サブクローン。
【図６Ｃ】ＰＤＦ発現の反転が、ＬＩＦ依存的自己再生を回復させることを示す。ＥＳ細胞（ＺＩＮ４０）、Ｆｌｏｘ化ＰＤＦ導入遺伝子を発現するＥＳ細胞、およびそれらのＣｒｅ削除派生株を、示した培養条件下でクローン密度でプレーティングした後に分析した；０、添加なし；ＬＩＦ、１００μ/ml ＬＩＦ；ｈＬＩＦ−０５、１０ユニット/ml ＬＩＦをブロックするに十分なＬＩＦアンタゴニスト。培養６日後に、認識可能な分化した細胞を含まないアルカリホスファターゼ陽性コロニーのパーセントを定量した。
【図６Ｄ】サイトカイン不在下（０）、１００μ/ml ＬＩＦ（ＬＩＦ）、または１０ユニット/ml ＬＩＦをブロックするに十分なＬＩＦアンタゴニスト（ｈＬＩＦ−０５）の存在下での、ＰＤＦ発現細胞およびそれらのＣｒｅ削除派生株の形態を示す。細胞を、クローン密度でプレーティングし、そして培養の４日後に検査した。
【図６Ｅ】ＲＡまたはＭＢＡへの曝露の０、１、２、３、または４日後に調製しそしてＯｃｔ４に対してハイブリダイズしたｆｌｏｘ化導入遺伝子を発現するＥ１４Ｔｇ２ａ派生株（ＥＦ４）またはＣｒｅ削除サブクローン（ＥＦ４Ｃ３）の培養物からのＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。
【図７Ａ】ｇｐ１３０非依存的ＥＳ細胞同一性の可逆性を示す。凝集による分化を示す。ｆｌｏｘ化導入遺伝子を発現するＥ１４Ｔｇ２ａ派生株（ＥＦ４）またはＣｒｅ削除サブクローン（ＥＦ４Ｃ３）を、４８ウェルディッシュのウェル中に個々の胚様体を入れ、そして鼓動している細胞の存在について各ウェルを毎日スコアリングすることによって、心臓分化について評価した。
【図７Ｂ】レチノイン酸の存在下での凝集によって分化を示す。Ｅ１４Ｔｇ２ａおよびｆｌｏｘ化導入遺伝子を発現する派生株（ＥＦ４）またはＣｒｅ削除サブクローン（ＥＦ４Ｃ３）を、ＴｕＪ免疫組織化学によって神経発生について評価した。
【図７Ｃ】Ｃｒｅを欠失した細胞の懐胎中期胚ヘの寄与を示す。ＥＦ１Ｃ１細胞を、ＭＦ１胚盤胞に注入し、そして養母に移した後、緑色蛍光についてＥ９．５で検査した。
【図８Ａ】自己再生の他の公知のメディエーターへのＰＤＦの関係を示す。サイトカイン非依存的コロニーの割合が、エピソームのＰＤＦ発現のレベルと相関することを示す。ＬＲＫ１細胞を、ＰＤＦの発現のレベルの増加を指示するエピソームベクターでトランスフェクトした（ｐＰｙＰＰＧＫ＜ｐＰｙＰＣＡＧ＜ｐＰｙＣＡＧＩＰ）。選択の１２日後、サイトカインの不在下での自己再生コロニーの割合を、ＩＬ６／ｓＩＬ６Ｒの存在下での数に対して表す。データは、２つの独立した実験の平均である。
【図８Ｂ】ＰＤＦがＳＴＡＴ３ターゲットではないことを示す。４つのすべてのＳＴＡＴ３結合部位がチロシンコドンからフェニルアラニンへの変異（Ｙ１２６−２７５Ｆ）によって廃止されているかまたはネガティブ調節チロシンが同様に変異（Ｙ１１８Ｆ）されている、キメラＧＣＳＦＲ−ｇｐ１３０改変体分子を発現するＥＳ細胞を、ＲＮＡ調製前に、示した時間（分）の間ＬＩＦ（Ｌ）またはＧＣＳＦ（Ｇ）で刺激した。ノーザンブロット分析を、ＰＤＦ、ＧＡＰＤＨ、またはＳＴＡＴ３ターゲット遺伝子ＳＯＣＳ３に対するプローブとの連続ハイブリダイゼーションによって行った。
【図８Ｃ】ＰＤＦが、自己再生においてＯｃｔ４と置換できないことを示す。ドキシサイクリン応答性Ｏｃｔ４導入遺伝子が自己再生を持続するＥＳ細胞（ＺＨＢＴｃ４．１）を、インサートなし（ＭＴ）、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ）、またはＰＤＦ（ＰＤＦ）を有する線状化ｐＰｙＣＡＧＩＰ派生物でトランスフェクトし、そして導入遺伝子が発現したまま（０）であるかまたはスイッチオフである（Ｄｏｘ）条件下でＬＩＦの存在下で培養した。ピューロマイシン選択後、プレートを染色し、そして未分化コロニーのパーセントを測定した。
【図９Ａ】条件培地中での多分化能ＧＣＴ ２７Ｘ−１ ｈＥＣ細胞の維持を説明する。ＧＣＴ ２７Ｘ−１多分化能ｈＥＣ細胞株を示し、これは、有糸分裂で不活性化したＳＴＯ細胞のフィーダー層上にルーチンで維持される。位相差顕微鏡光学下で写真を撮影した（１０×）。
【図９Ｂ】ルーチンの密度で示される多分化能培養物を示し、そしてこれもまた、フィーダー細胞の不在下であるが、卵巣嚢癌細胞株ｈＥＣ ４４に由来する条件培地をルーチンの培養培地中で25％v/vまで添加して維持され得る。位相差顕微鏡光学下で写真を撮影した（１０×）。
【図９Ｃ】クローンの密度で示されるフィーダーを含まないＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞培養物からのこの条件培地の撤去により、細胞分化が開始しそして多分化能表現型がなくなることを示す。位相差顕微鏡光学下で写真を撮影した（４×）。
【図１０】ＧＣＴ ２７Ｘ−１ ｈＥＣ細胞における内因性ｈＰＤＦ発現のノーザンブロット分析を示し、ＳＴＯフィーダー細胞上で培養したＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞（２７Ｘ−１＋ＳＴＯ）およびフィーダー細胞は含まないが条件培地を添加して培養したＧＣＴ ２７Ｘ−１細胞（２７Ｘ−１−ＳＴＯ＋ＣＭ）から調製したポリＡ＋ｍＲＮＡ（３〜3.5μg）を、変性ゲル上で分離し、そして候補ヒトＰＤＦ配列に特異的なｃＤＮＡプローブ（約９００ｂｐ）とのノーザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。ＳＴＯ細胞培養物（ＳＴＯ）およびＥ１４Ｔｇ２ａマウスＥＳ細胞培養物（Ｅ１４Ｔｇ２ａ）から調製したポリＡ＋ｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション用のコントロールとして含んでいた。約２．４ｋｂのメジャーな転写物および約５．６ｋｂのより少ないハイブリダイズしている転写物を、両方のＧＣＴ ２７Ｘ−１培養物において検出し、多分化能ｈＥＣ細胞培養物中のｈＰＤＦ遺伝子の内因性発現を確認した。マウスＥＳ細胞株において検出された約２．２ｋｂの非常に弱いハイブリダイゼーションバンドは、マウス多分化能細胞における相同転写物を示す。予測したように、ＳＴＯ細胞ｍＲＮＡについてはハイブリダイゼーションシグナルを検出しなかった。増感紙を用いた−70℃にて８時間のオートラジオグラフ曝露を示した。
【図１１】ｈＰＤＦ ｃＤＮＡを発現するヒト多分化能細胞株における自己再生の維持を証明するための実験方法を説明するフローチャートを提供する。（ＣＭ＝条件培地）
【図１２Ａ】８．８ｋｂのＦｌｏｘ化ｈＰＤＦ構築物を示し、これは、ヒトサイトメガロウイルス前初期エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）下で作動するｈＰＤＦ ｃＤＮＡについてのオープンリーディングフレーム（約９００ｂｐ）およびピューロマイシン耐性遺伝子のＩＲＥＳ媒介発現を提供するビシストロンリポーターカセットの上流にヒトアクチンプロモーターを含む。増強されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ）リポーター遺伝子は、ｌｏｘＰ部位の下流にあり、Ｃｒｅ媒介組換えが生じる場合に蛍光による可視化を提供する。
【図１２Ｂ】ｐＰｙＣＡＧｅｇｆｐＩＰ（「ＧＦＰコントロール」）ベクターを示し、これは、（Ａ）のｈＰＤＦ配列がＩＲＥＳ−ピューロマイシンリポーターカセットの上流でｅＧＦＰ配列に置換されている類似の構築物であり、そしてコントロールの「非ｈＰＤＦ」発現トランスフェクタントを提供するために使用した。
【図１３Ａ】トランスフェクタントＧＣＴ ２７Ｘ−１コロニーの形態学的評価を示す。安定なトランスフェクタントのＦｌｏｘ化ｈＰＤＦコロニーおよびＧＦＰコントロールコロニーを、ＳＴＯフィーダー細胞を含まないピューロマイシン選択培養物中で、条件培地の存在および不在下で、１０〜１５日後に樹立した。Leishman染色後、コロニー形態を、（Ａ）を「密」とスコアした。このコロニーは、密な多分化能ｈＥＣ表現型を維持する。位相差顕微鏡光学下で写真を撮影した（４×）。
【図１３Ｂ】コロニー形態を、（Ｂ）を「中度」とスコアした。このコロニーは、いくつかのｈＥＣ表現型を維持しながら分化を開始する。位相差顕微鏡光学下で写真を撮影した（４×）。
【図１３Ｃ】コロニー形態を、（Ｃ）を「疎」とスコアした。このコロニーは、完全に離れておりそして分化していた。位相差顕微鏡光学下で写真を撮影した（４×）。
【図１４】クローンアッセイにおけるｈＰＤＦ発現ｈＥＣ細胞の形態を示す。ａ〜ｄは、トランスフェクションからの条件培地の存在（ｈＰＤＦ Ｄ７）および不在（ｈＰＤＦ Ｅ７）下で連続的に拡張したｈＰＤＦ発現ｈＥＣクローン株を示し、これらは条件培地あり（＋ＣＭ）およびなし（−ＣＭ）で１２〜１４日間クローン密度で培養した。ｅ〜ｈは、トランスフェクトしたＧＦＰコントロールクローン（ＧＦＰ Ｃ１５）および野生型ｈＥＣ細胞（２７Ｘ−１）を示し、これらも同じ条件で培養した。条件培地の不在下では、ｈＰＤＦ発現ｈＥＣ細胞のみが、多分化能ｈＥＣ表現型を維持することができるが、ＧＦＰコントロールおよび野生型ｈＥＣ細胞は、分化するように誘導される。位相差顕微鏡光学下で写真を撮影した（１０×）。
【図１５Ａ】クローンアッセイにおけるｈＰＤＦ発現ｈＥＣ細胞の自己再生を示す。ｈＰＤＦ発現ｈＥＣクローン株（ｈＰＤＦ Ｄ７およびＥ７）、トランスフェクトしたＧＦＰコントロールクローン（ＧＦＰ Ｃ１５）、および野生型ｈＥＣ細胞（２７Ｘ−１）を、条件培地の存在下（＋ＣＭ）で１２〜１４日間クローン密度で培養した。コロニー内の多分化能ｈＥＣ細胞を、ＣＤ３０マーカーについての間接免疫蛍光染色によって同定し（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）、同じコロニー内のすべての細胞についての比較Hoechst ＵＶ蛍光を示した（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）。コロニーを、５３５／５０ｎｍ（ＣＤ３０）およびＵＶ３３０〜３８０ｎｍ（Hoechst）フィルターを用いて、２０×の倍率で可視化した。
【図１５Ｂ】クローンアッセイにおけるｈＰＤＦ発現ｈＥＣ細胞の自己再生を示す。ｈＰＤＦ発現ｈＥＣクローン株（ｈＰＤＦ Ｄ７およびＥ７）、トランスフェクトしたＧＦＰコントロールクローン（ＧＦＰ Ｃ１５）、および野生型ｈＥＣ細胞（２７Ｘ−１）を、条件培地の不在下（−ＣＭ）で１２〜１４日間クローン密度で培養した。コロニー内の多分化能ｈＥＣ細胞を、ＣＤ３０マーカーについての間接免疫蛍光染色によって同定し（ｊ、ｌ、ｎ、ｐ）、同じコロニー内のすべての細胞についての比較Hoechst ＵＶ蛍光を示した（ｉ、ｋ、ｍ、ｏ）。条件培地の不在下では、ｈＰＤＦ発現ｈＥＣコロニーのみが多分化能表現型を維持できるが、コントロールのトランスフェクトしたおよび野生型のｈＥＣ細胞は、条件培地中で維持されなければ分化するように誘導される。条件培地の不在下では、ｈＰＤＦ Ｅ７コロニーは、ｈＰＤＦ Ｄ７細胞と比較した場合、ＣＤ３０マーカーの一般的により密な形態およびより強い検出を示した。コロニーを、５３５／５０ｎｍ（ＣＤ３０）およびＵＶ３３０〜３８０ｎｍ（Hoechst）フィルターを用いて、２０×の倍率で可視化した。
【図１６】ルーチン培養物中のｈＰＤＦ発現ｈＥＣ細胞の自己再生を示す。ｈＰＤＦ発現ｈＥＣ細胞株Ｅ７は、トランスフェクションの時以来、ＳＴＯフィーダー細胞および条件培地の両方の連続的不在下で拡張していた。ルーチンの継代後に示されるこのクローン細胞株は、これらの条件下で培養の８週以降にｈＥＣ細胞の自己再生を示し続ける。位相差顕微鏡光学下で写真を撮影した（１０×）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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