(57)【要約】  下記式（１）又は式（２）で示されるパンテチンリン酸エステルは、優れたチロシナーゼ活性阻害効果及びメラニン産生抑制効果を示す。2011030727.tif 000008
2011030727.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）又は式（２）で示されるパンテチンリン酸エステル又は医薬上許容され得る塩付加体を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害剤。
【化１】
2011030727.tif 000006
【請求項２】
下記式（１）又は式（２）で示されるパンテチンリン酸エステル又は医薬上許容され得る塩付加体を有効成分とするメラニン産生抑制剤。
【化２】
2011030727.tif 000007
【請求項３】
請求項１記載のチロシナーゼ活性阻害剤を含有する外用剤。
【請求項４】
請求項２記載のメラニン産生抑制剤を含有する外用剤。
【請求項５】
美白用皮膚外用剤である、請求項３又は４記載の外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パンテチンリン酸エステルを含む外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
パンテチンは、（１）パントテン酸欠乏症の予防及び治療、（２）消耗性疾患、甲状腺機能亢進症、妊産婦、授乳婦等のパントテン酸の需要が増大し、食事からの摂取が不十分である際の補給、（３）高脂血症、弛緩性便秘、ストレプトマイシン及びカナマイシンによる副作用の予防及び治療、急性湿疹、慢性湿疹、血液疾患の血小板数及び出血経口の改善のうち、パントテン酸の欠乏又は代謝障害が関与すると推定される場合等に用いられる有用な薬物である（非特許文献１）。その他にも、下痢の予防作用（特許文献１）、腸内でのビフィズス菌の増殖作用（特許文献２）等が知られている。【０００３】
また、パンテチンを外用剤として用いた場合、以下の作用が知られている。
（１）色素沈着改善作用、美白作用（特許文献３及び非特許文献２）
（２）色素増強疾患治療作用（特許文献４）
（３）保湿作用（非特許文献３）
（４）抗アクネ作用（特許文献５）
（５）皮膚刺激性低減作用（特許文献６）
（６）肌質改善作用（特許文献７）
（７）毛髪強度増加作用（特許文献８）【０００４】
パンテチンの美白活性については、他の美白作用のある物質と共に経口摂取した際にも作用することが知られている（特許文献９及び１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２８２５０７号公報
【特許文献２】特開昭５９−１３２８８４号公報
【特許文献３】特開昭５６−７３０１２号公報
【特許文献４】特開昭５８−１３４０２２号公報
【特許文献５】特開昭５８−１３４０２３号公報
【特許文献６】特開昭５７−３５５１１号公報
【特許文献７】特開昭５８−１２８３１０号公報
【特許文献８】特開昭６２−１８５００７号公報
【特許文献９】特開２００５−１９４２０３号公報
【特許文献１０】国際公開ＷＯ２００６／００３９６５号公報
【特許文献１１】特開昭６０−６４９２２号公報
【特許文献１２】国際公開ＷＯ２００４／０２８５２３号公報
【特許文献１３】特開２００７−２６９７８６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】財団法人日本医薬情報センター編、医療用医薬品集２００９年版、１９００〜１９０１頁（２００８）
【非特許文献２】Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｆｉｎｅ  Ｎｅｗｓ、Ｎｏ．７，１０頁（１９９１）
【非特許文献３】Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｆｉｎｅ  Ｎｅｗｓ、Ｎｏ．５，８頁（１９９０）
【非特許文献４】医薬部外品原料規格２００６、薬事日報社、１２４０〜１２４１頁
【非特許文献５】第十五改正  日本薬局方解説書  ２００６  Ｃ−３２０２〜Ｃ−３２０６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、パンテチンの美白活性作用のメカニズムの一つであるチロシナーゼ阻害活性は、パンテチン自体によるものではなく、ジスルフィド結合が還元されたパンテテインによることが報告されている（非特許文献２）。一方、美白活性を示すパンテテインは、ＳＨ基があるため安定性が悪く、強い臭気があるという問題があり、外用剤に添加することができなかった（特許文献１１）。さらに、本願発明者らは、パンテテインがｐＨ５以上の水溶液中で容易にパンテチンに酸化されてしまうことを確認している。【０００８】
パンテテイン−Ｓ−スルホン酸カルシウムは、パンテテインのＳＨ基をスルホン酸で保護し、パンテテインの悪臭を改善した化合物である。パンテテイン−Ｓ−スルホン酸カルシウム７０％を含有する水溶液が市販されているが（非特許文献４）、その粘度は高く、また、安定性も不十分であるため、取扱いに問題があることを本願発明者らは確認している。【０００９】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、上記のパンテチンよりも優れた美白活性作用を有する皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を達成するために本発明者らが鋭意検討を行った結果、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸及びパンテチン−４’−リン酸に優れたチロシナーゼ活性阻害作用及びメラニン生成抑制作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、下記式（１）又は式（２）で示されるパンテチンリン酸エステル又は医薬上許容され得る塩付加体を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害剤を提供する。また、下記式（１）又は式（２）で示されるパンテチンリン酸エステル又は医薬上許容され得る塩付加体を有効成分とするメラニン生成抑制剤を提供する。【００１２】
【化１】
2011030727.tif 000003
【００１３】
また、本発明は上記チロシナーゼ活性阻害剤を含有する外用剤を提供する。本発明は上記メラニン産生抑制剤を含有する外用剤を提供する。本発明の外用剤は、美白用皮膚外用剤であることが好ましい。【００１４】
本発明者らは、パンテチンの４’位水酸基、又は４’位と４’’位の２箇所の水酸基をリン酸エステル化することによりパンテチンよりも美白活性が高まることを見いだした。また、パンテチンの４’位と４’’位の２箇所の水酸基をリン酸エステル化することによりパンテチンよりも安定性が向上することを見いだした。【００１５】
パンテチンには、物性上の安定性に問題点がある。パンテチンは、常温で無水状態であれば無定形粉末であるが、吸湿性が高いために粉末状態を保つことができず、飴状となる。このため、パンテチンは粘性の液体として提供される。日本薬局方におけるパンテチンは、８０％のパンテチンを含む水溶液で、無色〜微黄色澄明の粘性の液である。しかしながら、この８０％パンテチン液は必ずしも保存安定性がよくなく、１０℃以下での保存が必要という問題点が知られていた（非特許文献５）。【００１６】
パンテチンの安定化の方法としては、下記の方法が知られている。
（１）賦形剤と混合する方法（特許文献１２）
（２）水溶液のｐＨを４〜６に調製する方法（特許文献１３）
しかしながら、外用剤として使用する場合、方法（１）には、溶液製品へ添加する際に溶解しにくい、方法（２）には、ｐＨ４以下又はｐＨ６以上の製品へ添加する際に安定性を保つことができないという問題がある。【００１７】
分解しやすい化合物にリン酸基やグリコシル基等の修飾基を附加し、安定性を高める方法は、ビタミンＣやビタミンＢ６で既に実用化されている（美間博之ら、ビタミン、４１、３８７−３９８（１９７０）、特開平３−１３９２８８号公報、国際公開ＷＯ２００５／０３３１２３号公報）。しかし、安定性を高めるための修飾位置や修飾基の種類については、化合物によって様々であって、類推できるものではない。また、その生理活性も、修飾位置や修飾基によって変化する場合がある。たとえば、ビタミンＣ誘導体のヒト繊維芽細胞におけるコラーゲン生成促進活性は、修飾位置、修飾基によって変化する（Ｉ．Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（１９９２），１２２，８７１−８７７）。【００１８】
パンテチンに関しては、分子内に４個（２’位、４’位、２’’位、４’’位）の水酸基を有しており、どの位置をどの修飾基で修飾すれば、その機能を損なうことなく安定化するかについての知見は全くなかった。発明者らは、安定化させるには２’位や２’’位ではなく４’位や４’’位の修飾が必要であり、４’位と４’’位の２箇所を共に修飾することで安定性が顕著に高まることを見出した。【００１９】
修飾基の種類に関しては、リン酸エステルと配糖体とでは安定性に大差なく、共に安定であることを発明者らは確認している。しかし、発明者らは、配糖体化によりパンテチンの美白活性は低下するが、リン酸エステル化によりパンテチンの美白活性が向上することを見出した。すなわち、ヒト皮膚３次元モデル試験において、パンテチン−４’，４’’−ジ−α−グルコシドやパンテチン−４’，４’’−ジ−β−ガラクトシドのメラニン生成阻害活性はパンテチンより低下したのに対し、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸のメラニン生成阻害活性はパンテチンより向上していた。その活性は、美白剤としてよく使われているアスコルビン酸−２−リン酸ナトリウムより高いことが判明した。【００２０】
また、マッシュルームチロシナーゼ阻害活性が、パンテチンでは観察されなかったのに対し、パンテチン−４’−リン酸やパンテチン−４’，４’’−ジリン酸には美白剤としてよく使われるβ−アルブチンと同程度の阻害活性があることを発明者は本願において明らかにした。【００２１】
パンテチン−４’，４’’−ジリン酸は、補酵素Ａの生合成の原料（特開昭５０−１２６８８４号公報）や補酵素Ａの誘導体の合成中間体（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ，４９，１１２２−１１２５（１９７６））としての用途は報告されている。また、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸が、ビフィズス菌の増殖因子であること（Ｚ．  Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｊａｐａｎ  Ａｃａｄ．，４８，１３８−１４３（１９７２））が報告されている。しかしながら、その他の用途は知られておらず、外用剤としての用途も知られていない。【００２２】
特開昭５４−１６０３１５号公報には、パンテチン脂肪酸エステル（２’位、４’位、２’’位、４’’位の４箇所を修飾）が記載されており、この物質に皮脂分泌促進効果があるとしているが、安定性が向上しているとの記述はない。特開昭５６−７３０１２号公報は、パンテチン及び／又はその誘導体を配合する美白化粧料を開示している。ここでいうパンテチン誘導体は、パンテチン脂肪酸エステル（２’位、４’位、２’’位、４’’位の４箇所の修飾位置と修飾数は特定せず）のことである。パンテチン脂肪酸エステルがマウス肝ホモジェネートとの共存下でマウスメラノーマのチロシナーゼを阻害するが、パンテチンと同等であることが記載されている。また、安定性についてパンテチン脂肪酸エステルが向上しているとの記述はない。【００２３】
米国特許４８３９１６４号公報には、パンテチンまたは化粧品上許容されるパンテチンエステルと、トレハロースを共に含む化粧品配合の特許が公開されているが、ここでいうパンテチンエステルとは、パンテチンパルミテートやパンテチンスルホネートであり、パンテチンリン酸エステルではない。また、同文献には、パンテチンに変えてパンテチンエステルを用いることによる作用向上や安定性向上を述べてはいない。また、同文献の外用剤は、トレハロースとの混合したものに限定しているが、本発明の外用剤はトレハロースの含有を必要とはしない。【００２４】
本発明によれば、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸、パンテチン−４’−リン酸、又は医薬上許容され得る塩付加体を有効成分とする優れたチロシナーゼ活性阻害剤及びメラニン産生抑制剤を提供することができる。本発明に係るパンテチン−４’，４’’−ジリン酸又はパンテチン−４’−リン酸は、パンテチンとは異なり、そのままでもチロシナーゼ阻害活性を示すことから、美白用皮膚外用剤として有効である。本発明に係るパンテチン−４’，４’’−ジリン酸又はパンテチン−４’−リン酸は、ヒト皮膚３次元モデルにおいて、パンテチンより美白活性が向上し、また、従来から広く使われている美白剤であるアスコルビン酸−２−リン酸ナトリウム塩より強い活性を示すことから、美白用皮膚外用剤として有効である。したがって、チロシナーゼ活性阻害剤及び／又はメラニン産生抑制剤としてパンテチン−４’，４’’−ジリン酸又はパンテチン−４’−リン酸を含有する外用剤は、美白を目的とする化粧品や医薬品等に有利に利用することができる。また、特にパンテチン−４’，４’’−ジリン酸は、水溶液中で広いｐＨ範囲において安定であることから、外用剤への利用の観点において有効である。【００２５】
本発明は、さらに、以下の［１］〜［６］を提供する。
［１］パンテチン−４’，４’’−ジリン酸、パンテチン−４’−リン酸、又は医薬上許容され得る塩付加体のチロシナーゼ活性阻害剤としての使用；
［２］パンテチン−４’，４’’−ジリン酸、パンテチン−４’−リン酸、又は医薬上許容され得る塩付加体のメラニン産生抑制剤としての使用；
［３］チロシナーゼ活性阻害剤を製造するためのパンテチン−４’，４’’−ジリン酸、パンテチン−４’−リン酸、又は医薬上許容され得る塩付加体の使用；
［４］メラニン産生抑制剤を製造するためのパンテチン−４’，４’’−ジリン酸、パンテチン−４’−リン酸、又は医薬上許容され得る塩付加体の使用；
［５］パンテチン−４’，４’’−ジリン酸、パンテチン−４’−リン酸、又は医薬上許容され得る塩付加体を対象に投与する、対象におけるチロシナーゼ活性を阻害する方法；及び
［６］パンテチン−４’，４’’−ジリン酸、パンテチン−４’−リン酸、又は医薬上許容され得る塩付加体を対象に投与する、対象におけるメラニン産生を抑制する方法。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】パンテチン−４’，４’’−ジリン酸、パンテチン−４’，４’’−ジ−α−グルコシド、パンテチン及びパンテテイン−Ｓ−スルホン酸カルシウムのｐＨ安定性比較を示すグラフ。
【図２】パンテチン−４’，４’’−ジリン酸、パンテチン−４’−リン酸及びパンテチンのｐＨ安定性比較を示すグラフ。
【図３】パンテチン、パンテチン−４’，４’’−ジ−α−グルコシド及びパンテチン−４’−α−グルコシドのｐＨ安定性比較を示すグラフ。
【図４】パンテテイン−４’−リン酸、パンテテイン及びパンテチンの安定性比較を示すグラフ。
【図５】ヒト皮膚３次元モデルにおけるメラニン生成阻害試験の結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明で使用されるパンテチン−４’，４’’−ジリン酸及びパンテチン−４’−リン酸は、それぞれ下記式（１）及び式（２）で示されるパンテチンリン酸エステルである。本発明では、これらのパンテチンリン酸エステルの医薬上許容され得る塩付加体を用いてもよい。
【００２８】
【化２】
2011030727.tif 000004
【００２９】
本発明で使用されるパンテチン−４’，４’’−ジリン酸及びパンテチン−４’−リン酸は公知化合物である。パンテチン−４’，４’’−ジリン酸の化学合成法としては、パンテテイン−４’−リン酸を合成後、酸化しジスルフィド結合を形成させることによって合成する方法（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，  １５，６４８―６５４（１９６７））、パンテトニトリル−４’−リン酸とシステアミンから２―［２―（４―ホストパントアミド）エチル］―２―チアゾリンを経てパンテチン−４’，４’’−ジリン酸を合成する方法（特公昭４２―２１３３３）、パンテチンをリン酸化試薬でリン酸エステル化した後に保護基を外す方法（英国特許ＧＢ７４９５１２及び特公昭４２―２４８８４）等がある。
【００３０】
また、パンテテイン−４’−リン酸は、酵素的にパンテテインをリン酸化することにより生成できる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２０７，７６１―７６５（１９５４））。また、補酵素Ａを酵素的に加水分解することにより、パンテテイン−４’−リン酸を得ることができる（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，  ２０６，５３３―５４５（１９５４））。また、パントテン酸より、４’−ホスホパントテン酸、４’−ホスホパントテノイルシステインを経てパンテテイン−４’−リン酸を生合成する補酵素Ａの生合成系の一部を利用してもよい。これらの方法で得たパンテテイン−４’−リン酸を酸化することで、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸を生成することができる。
【００３１】
また、パンテチン−４’−リン酸は、パンテテイン−４’−リン酸とパンテテインとを酸化し、ジスルフィド結合を形成させることで合成できる。また、パンテチンを化学的あるいは酵素的にリン酸エステル化を行い、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸を生成させる際、中間体として生成する。また、パンテテチン−４’，４’’−ジリン酸のリン酸エステル基をフォスファターゼなどで加水分解する際、中間体として生成する。
【００３２】
上記パンテチン−４’，４’’−ジリン酸及びパンテチン−４’−リン酸は、医薬上許容され得る塩基と塩付加体を形成することができるが、これらの化合物とこれらの塩付加体との間において効果に相違が生じるものではなく、むしろ使用する製剤の性質によって使い分けるべきものである。上記式（１）及び式（２）で示されるパンテチンリン酸エステルと塩付加体を形成する医薬上許容され得る塩としては、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、バリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩等の無機塩、あるいはモノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン類の有機塩とすることができる。特に好ましいのは、ナトリウム塩、カルシウム塩、バリウム塩、マグネシウム塩である。
【００３３】
パンテチン−４’，４’’−ジリン酸のバリウム塩は、粉末である（特公昭４２−２４８８４号公報）。また、発明者は、ナトリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩が粉末であることを確認している。したがって、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸の塩は、粘性の高い水溶液であるパンテチンやパンテテイン−Ｓ−スルホン酸カルシウムと比較し、取扱いが容易であり、外用剤の原料として優れている。
【００３４】
外用剤の例としては、特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、ローション、化粧水、美容液、パック、洗浄料、化粧下地等の基礎化粧料、ファンデーション、チークカラー、アイシャドウ、アイライナー、マニュキュア等のメーキャップ化粧料、分散液、軟膏、液剤、エアゾール、貼付剤、パップ剤、リニメント剤、シャンプー、トニック、コンディショナー等の頭髪化粧料、洗顔料、ボディ化粧料、入浴剤、石鹸、香水等、シェービングクリーム、アフターシェーブローション等の髭剃り関係化粧料、デオドラント、制汗剤等の、いずれの形態の化粧料であっても、外用医薬品等であってもよい。
【００３５】
本発明の外用剤は、上記必須成分の他に、薬学的に許容される担体又は化粧料的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体又は化粧料的に許容される担体としては、化粧料や医薬部外品、外用医薬品等に通常使用される各種の成分、即ち、水、低級アルコール、多価アルコール、油剤、界面活性剤、保湿剤、水溶性高分子化合物、増粘剤、皮膜剤、粉体、キレート剤、ｐＨ調整剤、動植物・微生物由来の抽出物、糖類、アミノ酸類、有機アミン類、合成樹脂エマルジョン、皮膚栄養剤、ビタミン類、酸化防止剤、酸化防止助剤、香料、各種薬効剤等が挙げられ、本発明の効果を損なわない範囲で適宜加えることができる。また、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸及びパンテチン−４’−リン酸を併用しても良い。パンテチン−４’，４’’−ジリン酸及び／又はパンテチン−４’−リン酸と、従来公知の美白剤、抗酸化剤、細胞賦活剤、抗炎症剤、紫外線防止剤等の薬効成分を併用して皮膚外用剤としたものは、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸及び／又はパンテチン−４’−リン酸の作用効果にこれら薬効剤の効果が加わり、本発明の効果を更に高めることができる。
【００３６】
外用剤中のパンテチン−４’，４’’−ジリン酸及び／又はパンテチン−４’−リン酸の含量は好ましくは０．０５〜２５重量％であり、より好ましくは０．１〜５重量％である。この範囲内であれば、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸及び／又はパンテチン−４’−リン酸を安定に配合することができ、チロシナーゼ活性阻害作用及びメラニン産生抑制作用に優れ、それらによる高い美白効果を発揮することができる。
【実施例】
【００３７】
試験化合物の調製
パンテチン−４’，４’’−ジリン酸バリウム塩をＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，  １５，６４８―６５４（１９６７）及び特公昭４２―２１３３３の記載に従い合成した。また、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸の遊離酸は、特公昭４２―２４８８４に従い、そのバリウム塩をイオン交換樹脂を用いて脱塩することで得た。また、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸ナトリウム塩はイオン交換樹脂を用いてパンテチン−４’，４’’−ジリン酸バリウム塩を塩交換することで得た。パンテチン−４’−リン酸は、パンテテイン−４’−リン酸とパンテテインを混合し、過酸化水素で酸化し、パンテチン−４’−リン酸とパンテチンとパンテチン−４’，４’’−ジリン酸の混合物を生成し、ＯＤＳカラムクロマトで精製することで得た。【００３８】
実施例１（パンテチン−４’，４’’−ジリン酸バリウム、パンテチン及びパンテテイン−Ｓ−スルホン酸カルシウムのｐＨ安定性比較）
パンテチン−４’，４’’−ジリン酸バリウムを０．１％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ各緩衝液（ｐＨ３〜９．５）を調製した。ｐＨ３、４、５及び６の緩衝液としてクエン酸ナトリウム緩衝液を用いた。ｐＨ６．５及び７の緩衝液としてリン酸ナトリウム緩衝液を用いた。ｐＨ８及び９．５の緩衝液としてトリス塩酸緩衝液を用いた。パンテチン−４’，４’’−ジリン酸バリウムを０．１％（ｗ／ｖ）含む各溶液０．４ｍＬを１ｍＬのガラスアンプルに封入し、４０℃で６ヶ月間加温した。加温の前後のサンプルをＨＰＬＣで分析し、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸含量を測定した。同濃度のパンテチン、パンテテイン−Ｓ−スルホン酸カルシウムについても同様の操作を行い、結果を比較した（図１）。【００３９】
その結果、ｐＨ５から６では、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸、パンテチン、パンテテイン−Ｓ−スルホン酸カルシウムの安定性に差はなく、いずれの化合物も安定であったが、ｐＨ４以下又はｐＨ６．５以上のいずれのｐＨ領域において、パンテチンやパンテテイン−Ｓ−スルホン酸カルシウムは明らかに分解していたが、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸は安定であった。【００４０】
実施例２（パンテチン−４’，４’’−ジリン酸、パンテチン−４’−リン酸及びパンテチンのｐＨ安定性比較）
パンテチン−４’，４’’−ジリン酸ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍＭ各緩衝液（ｐＨ３〜９．５）を調製した。ｐＨ３、４、５及び６の緩衝液としてクエン酸ナトリウム緩衝液を用いた。ｐＨ７の緩衝液としてリン酸ナトリウム緩衝液を用いた。ｐＨ８及び９．５の緩衝液としてトリス塩酸緩衝液を用いた。各溶液０．４ｍＬを１ｍＬのガラスアンプルに封入し、４０℃で３ヶ月加温した。加温前後のサンプルをＨＰＬＣで分析し、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸含量を測定した。同濃度のパンテチン、パンテチン−４’−リン酸についても同様の操作を行い、結果を比較した（図２）。【００４１】
その結果、ｐＨ５から６では、パンテチン、パンテチン−４’−リン酸、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸の安定性に差はなかった。しかし、ｐＨ４以下又はｐＨ７以上のｐＨ領域において、パンテチンは明らかに分解しており、パンテチン−４’−リン酸もパンテチンと同様のｐＨ安定性を示した。これに対して、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸は安定であった。【００４２】
実施例３（パンテチン−４’，４’’−ジ−α−グルコシド、パンテチン−４’−α−グルコシド及びパンテチンの安定性比較）
パンテチン−４’，４’’−ジ−α−グルコシドを０．１％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３〜９．５）を調製した。ｐＨ３、４、５及び６の緩衝液としてクエン酸ナトリウム緩衝液を用いた。ｐＨ７の緩衝液としてリン酸ナトリウム緩衝液を用いた。ｐＨ８及び９．５の緩衝液としてトリス塩酸緩衝液を用いた。各溶液０．４ｍＬを１ｍＬのガラスアンプルに封入し、４０℃で６ヶ月間加温した。加温の前後のサンプルをＨＰＬＣで分析し、パンテチン−４’，４’’−ジ−α−グルコシド含量を測定した。同濃度のパンテチン−４’−α−グルコシド、パンテチンについても同様の操作を行い、結果を比較した（図３）。【００４３】
ｐＨ５から６では、パンテチン−４’，４’’−ジ―α―グルコシド、パンテチン−４’−α−グルコシド、パンテチンの安定性に差はなかった。しかし、ｐＨ４以下又はｐＨ６．５以上のｐＨ領域において、パンテチンとパンテチン−４’−α−グルコシドは明らかに分解していた。それに対して、パンテチン−４’，４’’−ジ―α―グルコシドは安定であった。【００４４】
実施例４（パンテテイン−４’−リン酸、パンテテイン及びパンテチンの安定性比較）
パンテテイン−４’−リン酸を０．１％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３、４、５、６）、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８、９．５）を調製した。各溶液０．４ｍＬを１ｍＬのガラスアンプルに封入し、４０℃で１ヶ月間加温した。加温の前後のサンプルをＨＰＬＣで分析し、パンテテイン−４’−リン酸含量を測定した。同濃度のパンテテインについても同様の操作を行い、結果を比較した（図４）。【００４５】
ｐＨ３及び４において、パンテテイン−４’−リン酸の安定性は、パンテテインより向上していた。ｐＨ５以上でパンテテイン−４’−リン酸は酸化され、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸に変化した。パンテテインもｐＨ５以上で酸化され、パンテチンに変化した。ｐＨ７以上では、酸化が進み、パンテテイン−４’−リン酸とパンテテインは共に残存していなかった。【００４６】
パンテテインから生成したパンテチン量がｐＨ８とｐＨ９．５とで低下しているのは、生成したパンテチンが加温中に分解したためと考えられる。一方、パンテテイン−４’−リン酸から生成したパンテチン−４’，４’’−ジリン酸量はアルカリ性においても低下しなかった。【００４７】
実施例５（チロシナーゼ阻害試験）
マッシュルームチロシナーゼとしてＳＩＧＭＡ社製、商品番号：Ｔ−３８２４を用いた。基質Ｌ−ＤＯＰＡは、和光純薬製、商品番号：０４６−０６５６４のものを用いた。１２ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ（終濃度：３．３ｍＭ）と０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した各試料を混和し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で液量調整した溶液へ、５００  ｕｎｉｔｓ／ｍＬチロシナーゼ溶液を加えることにより（終濃度：２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）、反応を開始した。【００４８】
室温での反応１分後に、チロシナーゼによりＬ−ＤＯＰＡから生成したドーパキノンの増加をＵＶ吸収（４９２ｎｍ）により測定した。試料を添加してないときの、ドーパキノン生成量を基準とし、生成量を５０％減少させる試料濃度をＩＣ５０として、表１に示した。【００４９】
【表１】
2011030727.tif 000005
【００５０】
パンテチンは、３３５ｍＭでもチロシナーゼ阻害活性を示さなかったが、パンテチン−４’−リン酸やパンテチン−４’，４’’−ジリン酸は、阻害活性を示した（ＩＣ５０はそれぞれ２４ｍＭと１０９ｍＭ）。チロシナーゼ阻害活性があるといわれており、美白剤として広く使われているβ−アルブチンのＩＣ５０は９５ｍＭであり、パンテチン−４’−リン酸やパンテチン−４’，４’’−ジリン酸と同程度であった。【００５１】
実施例６（ヒト皮膚３次元モデルにおけるメラニン生成阻害試験）
メラノサイトを含むヒト皮膚３次元モデルであるＬａｂＣｙｔｅ  ＭＥＬＡＮＯ−ＭＯＤＥＬ（Ｊ−ＴＥＣ、商品番号：４０１２２５）の角層側に試料のＰＢＳ（−）溶液を５０μＬ適用し、付属の培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件でＣＯ２インキュベーター内で２週間培養した。培地及び適用した試料溶液は２又は３日おきに交換した。培養終了後はＭＴＴ（メチルチアゾ−ルテトラゾリウム）試験法により生細胞率を測定した。さらにメラニン量を測定した。
ＭＴＴ試験：皮膚細胞をＰＢＳで洗い、０．５ｍｇ／ｍＬに調整したＭＴＴ培地で３時間インキュベートした。イソプロパノールを用いてホルマザンを抽出し、５６２ｎｍの吸光度を測定した。ＰＢＳ（−）溶液のみを添加した試験をコントロールとしその測定値との比率から生細胞率を求めた。
メラニン量：ＭＴＴ試験終了後の皮膚細胞を、１％ＳＤＳ、０．０５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．２）を溶解した試薬に浸漬させた。５ｍｇ／ｍＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを３μＬ加えて４５℃の水浴で一晩温めて皮膚を溶解させた。３０％過酸化水素水と５００ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を加えてよく混合し、８０℃の水浴で３０分温め、クロロホルム：メタノール（２：１）で不純物を取り除いた。このときメラニン溶液を調製し同様の操作後、検量線を作成し、培養皮膚細胞中のメラニン量を求めた。【００５２】
コウジ酸０．１％（７ｍＭ）の場合のメラニン生成量は、ＰＢＳのみ添加した場合の３０％であった。このときの皮膚細胞を顕微鏡で観察するとメラノサイトがほとんど観察されず、メラニン生成量は最小限になっていると判断された。このときのメラニン生成阻害率を１００％とし、ＰＢＳのみ適用した場合のメラニン生成阻害率を０％とし各試料の適応濃度とメラニン生成阻害率を図５に示した。【００５３】
この図５のプロットよりメラニン生成阻害率が５０％になる濃度を求めると、パンテチン  ５．３ｍＭ、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸ナトリウム  ３．１ｍＭ、パンテチン−４’，４’’−ジ−α−グルコシド  １７７ｍＭ、パンテチン−４’，４’’−ジ−β−ガラクトシド  ７７ｍＭであった。すなわち、パンテチンをリン酸化すると美白活性が１．７倍に高まったが、配糖化すると美白活性が弱まった。一方、美白剤として定評のあるアスコルビン酸−２−リン酸ナトリウムのメラニン生成阻害５０％濃度は５４ｍＭであり、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸ナトリウムの美白活性はその１７倍であった。【００５４】
また、この試験での適応範囲では、いずれの試料を用いた場合においても、ＭＴＴ法で求めた生細胞率は８０％以上であり、細胞の生存に対する影響は小さいことが確認できた。【００５５】
以下の実施例７〜１０に示す通り、外用剤を配合した。【００５６】
実施例７（ローション）
セラミド配合物０．１ｇ、１，３−ブチレングリコール２．５ｇ、ジプロピレングリコール２．５ｇ、メチルパラベン０．０１ｇを８０℃にて加温し透明になるまで攪拌した。３５℃まで冷却後、攪拌しながらパンテチン−４’，４’’−ジリン酸ナトリウム１ｇ、ソルビトール発酵多糖１．０ｇ、精製水９０ｍＬを加えて溶解するまで攪拌し、１０％クエン酸水溶液にてｐＨ  ６．４とし、その後、精製水にて１００ｍＬに調整しローションとした。【００５７】
実施例８（乳液）
ポリオキシエチレン（１０ＥＯ）ソルビタンモノステアレート１ｇ、グリセリルモノステアレート１ｇ、ステアリン酸  ０．５ｇ、ベヘニルアルコール０．５ｇ、カルボキシビニルポリマー０．１ｇ、エチルアルコール５ｇ、精製水８０ｍＬを７０℃で加熱混合し、均一に乳化した。４０℃まで冷却し、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸ナトリウム１ｇを加え混合し、ｐＨを７に調整し、その後、精製水にて１００ｇに調整し、乳液とした。【００５８】
実施例９（シャンプー）
ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム１０．０ｇ、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム２０．０ｇ、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン１０．０ｇ、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド４．０ｇ、プロピレングリコール２．０ｇ、パラオキシ安息香酸メチル０．０１ｇを精製水４０ｍＬに加えて７０℃に加温し溶解した。３５℃以下まで冷却後、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸ナトリウム１ｇを加え混合し、１０％クエン酸水溶液にてｐＨ６．８とし、その後、精製水にて１００ｍＬに調整し、シャンプーとした。【００５９】
実施例１０（クリーム）
ステアリルアルコール６ｇ、ステアリン酸２ｇ、水素添加ラノリン４ｇ、スクワラン９ｇ、オクチルドデカノール１０ｇ、ポリオキシエチレン（２５ＥＯ）セチルアルコールエーテル３ｇ、グリセリンモノステアリン酸エステル２ｇ、１，３−ブチレンングリコール６ｇを精製水４０ｇに加え、７５℃に加温し、懸濁液にした。５０℃まで冷却し、パンテチン−４’，４’’−ジリン酸ナトリウム１ｇを加え混合し、６Ｎ苛性ソーダでｐＨを７に調整し、その後、精製水にて１００ｇに調整しクリームとした。【００６０】
実施例７〜１０で調製した外用剤は、いずれも肌に適用することによって、肌を白く滑らかにする優れた外用剤であった。また、これらの外用剤には、沈殿等が認められず、安定性も良好であった。
【図１】
2011030727.tif 000009
【図２】
2011030727.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
2011030727.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成24年3月2日(2012.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示されるパンテチン−４’，４’’−ジリン酸若しくは式（２）で示されるパンテチン−４’−リン酸又は医薬上許容され得る塩付加体を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害剤。
【化１】
2011030727.tif 000014
【請求項２】
下記式（１）で示されるパンテチン−４’，４’’−ジリン酸若しくは式（２）で示されるパンテチン−４’−リン酸又は医薬上許容され得る塩付加体を有効成分とするメラニン産生抑制剤。
【化２】
2011030727.tif 000015
【請求項３】
請求項１記載のチロシナーゼ活性阻害剤を含有する外用剤。
【請求項４】
請求項２記載のメラニン産生抑制剤を含有する外用剤。
【請求項５】
美白用皮膚外用剤である、請求項３又は４記載の外用剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
パンテチンは、（１）パントテン酸欠乏症の予防及び治療、（２）消耗性疾患、甲状腺機能亢進症、妊産婦、授乳婦等のパントテン酸の需要が増大し、食事からの摂取が不十分である際の補給、（３）高脂血症、弛緩性便秘、ストレプトマイシン及びカナマイシンによる副作用の予防及び治療、急性湿疹、慢性湿疹、血液疾患の血小板数及び出血傾向の改善のうち、パントテン酸の欠乏又は代謝障害が関与すると推定される場合等に用いられる有用な薬物である（非特許文献１）。その他にも、下痢の予防作用（特許文献１）、腸内でのビフィズス菌の増殖作用（特許文献２）等が知られている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
すなわち、本発明は、下記式（１）で示されるパンテチン−４’，４’’−ジリン酸若しくは式（２）で示されるパンテチン−４’−リン酸又は医薬上許容され得る塩付加体を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害剤を提供する。また、下記式（１）で示されるパンテチン−４’，４’’−ジリン酸若しくは式（２）で示されるパンテチン−４’−リン酸又は医薬上許容され得る塩付加体を有効成分とするメラニン生成抑制剤を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【化１】
2011030727.tif 000016
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
【化２】
2011030727.tif 000017
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明で使用されるパンテチン−４’，４’’−ジリン酸及びパンテチン−４’−リン酸は公知化合物である。パンテチン−４’，４’’−ジリン酸の化学合成法としては、パンテテイン−４’−リン酸を合成後、酸化しジスルフィド結合を形成させることによって合成する方法（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，  １５，６４８―６５４（１９６７））、パントテノニトリル−４’−リン酸とシステアミンから２―［２―（４―ホスホパントアミド）エチル］―２―チアゾリンを経てパンテチン−４’，４’’−ジリン酸を合成する方法（特公昭４２―２１３３３）、パンテチンをリン酸化試薬でリン酸エステル化した後に保護基を外す方法（英国特許ＧＢ７４９５１２及び特公昭４２―２４８８４）等がある。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
コウジ酸０．１％（７ｍＭ）の場合のメラニン生成量は、ＰＢＳのみ添加した場合の３０％であった。このときの皮膚細胞を顕微鏡で観察するとメラノサイトがほとんど観察されず、メラニン生成量は最小限になっていると判断された。このときのメラニン生成阻害率を１００％とし、ＰＢＳのみ適用した場合のメラニン生成阻害率を０％とし各試料の適用濃度とメラニン生成阻害率を図５に示した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
また、この試験での適用範囲では、いずれの試料を用いた場合においても、ＭＴＴ法で求めた生細胞率は８０％以上であり、細胞の生存に対する影響は小さいことが確認できた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2011030727.tif 000018
【国際調査報告】
2011030727.tif 000019
2011030727.tif 000020