(57)【要約】本発明は、ＳＥＴ領域タンパク質であるヒストンＨ３リジン・メチルトランスフェラーゼＤＩＭ−５で発見された新規ドラッガブル領域に関連する。本発明は、さらに、上記ドラッガブル領域を用いて、ＳＥＴドメイン・タンパク質の活性が関わる疾患の潜在的候補治療法をスクリーニングすることに関する。ＳＥＴドメインタンパク質ＤＩＭ−５およびその三重複合体を結晶化し、以下に詳細に述べるように、それらの構造を解明し、それによってそのポリペプチドならびにそれに含まれるドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）領域およびドメイン等の構造についての情報が得られた。それらのすべてを合理主義的薬剤設計の取り組み（ｒａｔｉｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ｅｆｆｏｒｔｓ）において使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＴドメイン・タンパク質の活性を修飾する方法であって、前記ＳＥＴドメイン・タンパク質のドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）領域の活性を修飾することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＳＥＴドメイン・タンパク質がヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼＳＥＴドメイン・タンパク質であり、前記ドラッガブル領域がプレＳＥＴドメイン、ポストＳＥＴドメイン、ＡｄｏＭｅｔ／ＡｄｏＨｃｙ補因子結合ポケット、ペプチド結合クレフト、標的リジン結合部位、およびＳＥＴドメイン活性部位からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記修飾が、化合物を前記ドラッガブル領域に接触することによって達成される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記接触が、前記化合物と前記ドラッガブル領域との結合をもたらす請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記接触が、前記ドラガッブル領域への、前記ドラガッブル領域の天然リガンドの結合能力を修飾する請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記修飾が、前記ドラガッブル領域への天然リガンドの結合を阻害することによって達成される請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記阻害が、前記天然リガンドの結合部位を遮断することによって達成される請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記阻害が、前記天然リガンドを試験化合物に結合させて、前記天然のリガンドが前記ドラガッブル領域に結合するのを防ぐことによって達成される請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、ドラガッブル領域への亜鉛原子の結合を修飾することを含む、ＳＥＴドメイン・タンパク質の触媒活性を阻害する方法である請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＥＴドメイン・タンパク質がヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼＳＥＴドメイン・タンパク質である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳＥＴドメイン・タンパク質が亜鉛依存型ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼＳＥＴドメイン・タンパク質であり、前記亜鉛原子が酵素活性に必要とされる請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記調節が、前記ドラガッブル領域への亜鉛原子の結合を化合物によって阻止することを含む請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記亜鉛原子の結合が、亜鉛をキレートする化合物によって阻止される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記亜鉛原子の結合が、前記ドラッガブル領域中の亜鉛結合部位を遮断することによって阻止される請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記亜鉛結合部位が、前記ＳＥＴドメイン・タンパク質のポストＳＥＴ領域中のシステインを含む請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記阻止が、前記ＳＥＴドメイン・タンパク質のポストＳＥＴ領域中のシステインへの亜鉛原子の結合である請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記ＳＥＴドメイン・タンパク質がヒストンＨ３リジン９メチルトランスフェラーゼ・タンパク質であり、前記修飾が、前記ＳＥＴドメイン・タンパク質のポストＳＥＴ領域中の亜鉛原子の結合を阻止することを含む請求項９記載の方法。
【請求項１８】
ＳＥＴドメイン・タンパク質を持つ生物によって引き起こされる疾患のための候補治療薬を同定するための方法であって、試験化合物の、前記ＳＥＴドメイン・タンパク質の少なくとも１つのドラッガブル領域の活性を修飾する能力をアッセイすることを含み、前記修飾する能力が候補治療薬を示す、方法。
【請求項１９】
前記生物が真菌であり、前記疾患が真菌感染症である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記生物がほ乳類であり、前記疾患が癌である請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記ＳＥＴドメイン・タンパク質がヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼである請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼが亜鉛依存型である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記試験化合物の、ドラッガブル領域への亜鉛原子の結合を阻止する能力がアッセイされ、前記亜鉛の結合を阻止する能力が候補治療薬を示す請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記試験化合物が化合物のライブラリーから選択される請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
前記ライブラリーが、コンビナトリアル合成法を用いて生成される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記修飾する能力が、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイを用いて測定される請求項１８記載の方法。
【請求項２７】
前記修飾する能力が、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）アッセイを用いて測定される請求項１８記載の方法。
【請求項２８】
ＳＥＴドメイン・タンパク質を持つ細胞または生物によって引き起こされる疾患のための候補治療薬を同定するための方法であって、前記ＳＥＴドメイン・タンパク質を試験化合物に接触することを含み、前記ＳＥＴドメイン・タンパク質への前記試験化合物の結合能力が候補治療薬を示す、方法。
【請求項２９】
ＳＥＴドメイン・タンパク質を持つ細胞または生物によって引き起こされる疾患のための候補治療薬を同定するための方法であって、前記ＳＥＴドメイン・タンパク質を試験化合物に接触することを含み、前記細胞または生物の生存率の低下が候補治療薬を示す、方法。
【請求項３０】
ポリペプチドの修飾因子をスクリーニングするための候補修飾因子を設計するための方法であって、
（ａ）（１）配列番号１を有するヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質を含むアミノ酸配列または（２）配列番号１に対する少なくとも約８５％同一性を持つアミノ酸配列を含むポリペチドのドラッガブル領域の立体構造を与えることと、
（ｂ）前記ポリペプチドのドラッガブル領域の立体構造にもとづいて、候補修飾因子を設計することと、
を含む、方法。
【請求項３１】
ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の活性の修飾因子を設計するための方法であって、
（ａ）（１）配列番号１を有するヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質を含むアミノ酸配列、（２）配列番号１に対する少なくとも約８５％同一性を持つアミノ酸配列、（３）配列番号１の少なくとも１つのドラッガブル領域を含むアミノ酸配列、または（４）配列番号１の少なくとも１つのドラッガブル領域に対する少なくとも約８５％同一性を持つ配列を含むアミノ酸配列を含み、かつヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の少なくとも１つの生物活性を持つ立体構造を与えることと、
（ｂ）前記立体構造を参照して、潜在的修飾因子を同定することと、
を含む、方法。
【請求項３２】
（ｃ）前記立体構造中の前記アミノ酸配列と少なくとも５０％同一である配列を含み、かつヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の少なくとも１つの生物活性を持つポリペプチドを前記潜在的修飾因子に接触させ、前記ポリペプチドが任意で前記立体構造中の前記ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質と同じものあってもよいことと、
（ｄ）前記潜在的修飾因子との接触の後に、（１）前記潜在的修飾因子の、前記ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質への結合能力をアッセイすること、（２）前記ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の活性をアッセイすること、あるいは（３）前記ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質を持つ細胞または生物の生存率を測定することとをさらに含み、
前記結合能力、前記ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の活性での変化、または前記細胞または生物の生存率が、前記潜在的修飾因子がヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質関連疾患または障害の予防または治療に有用であり得ることを示す請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質がＨ３リジン９メチルトランスフェラーゼであり、前記立体構造が図７の座標によって定義される請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチドがＤＩＭ−５である請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
データベースからヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドの潜在的修飾因子を同定するための方法であって、
（ａ）（１）配列番号１を有するヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質を含むアミノ酸配列、（２）配列番号１に対する少なくとも約８５％同一性を持つアミノ酸配列、（３）配列番号１の少なくとも１つのドラッガブル領域を含むアミノ酸配列、または（４）配列番号１の少なくとも１つのドラッガブル領域に対する少なくとも約８５％同一性を持つ配列を含むアミノ酸配列を含み、かつヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の少なくとも１つの生物活性を持つポリペプチドの複数のアミノ酸に対する立体的座標を与えることと、
（ｂ）前記ポリペプチドのドラッガブル領域を同定することと、
（ｃ）前記潜在的修飾因子が前記ドラッガブル領域に結合または干渉し得ることを示す立体的座標を含む少なくとも１つの潜在的修飾因子をデータベースから選択することと、
を含む、方法。
【請求項３６】
ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドの活性の修飾因子を同定するための方法のコンピュータ支援方法であって、
（ａ）ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドの上述のドラッガブル領域の任意のもの由来のアミノ酸残基の原子に対する、ＰＤＢ登録番号１ＭＬ９または図７に列記される構造座標のセットを、分子または複合体の一部分または全てを定義するようにコンピュータ・モデリング・アプリケーションに呈示することと、
（ｂ）化学物質の構造座標のセットを前記コンピュータ・モデリング・アプリケーションに提示することと、
（ｃ）前記化学物質が前記分子または複合体に結合または干渉することが期待されるかを決定することと、
を含む、方法。
【請求項３７】
前記化学物質が前記分子または複合体に結合または干渉することが期待されるかを決定することが、前記化学物質と前記分子または複合体のドラッガブル領域との間で適合操作をおこなった後、前記適合操作の結果をコンピュータで分析して、前記化学物質と前記ドラッガブル領域との結合を定量することを含む請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
潜在的修飾因子を呈示または合成した後、前記潜在的修飾因子をアッセイして、それがヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の活性を修飾するかを決定することをさらに含む請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
ポリペプチドに含まれるドラッガブル領域の潜在的修飾因子を調製するための方法であって、
（ａ）アミノ酸残基の骨格原子からの５．０Å以下のａ±ａ二乗平均平方根偏差を持つ、配列番号１のポリペプチド由来の少なくとも約６つのアミノ酸残基の骨格原子に対する原子座標を用いて、前記ポリペプチド由来のドラッガブル領域を含む分子の１つ以上の立体構造を生成することと、
（ｂ）前記分子の前記立体構造の１つ以上を用いて、前記ドラッガブル領域の潜在的修飾因子を設計または選択することと、
（ｃ）前記潜在的修飾因子を合成または入手することと、
を含む、方法。
【請求項４０】
ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドの活性の阻害剤を同定するためのコンピュータ支援方法であって、
（ａ）ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドの上述のドラッガブル領域の任意のもの由来のアミノ酸残基の原子に対する、ＰＤＢ登録番号１ＭＬ９または図７に列記される構造座標のセットを、分子または複合体の一部分または全てを定義するようにコンピュータ・モデリング・アプリケーションに呈示することと、
（ｂ）化学物質の構造座標のセットを前記コンピュータ・モデリング・アプリケーションに提示することと、
（ｃ）前記化学物質が前記分子または複合体に結合または干渉することが期待されるかを決定することと、
を含む、方法。
【請求項４１】
前記化学物質が前記分子または複合体に結合または干渉することが期待されるかを決定することが、前記化学物質と前記分子または複合体のドラッガブル領域との間で適合操作をおこなった後、前記適合操作の結果をコンピュータで分析して、前記化学物質と前記ドラッガブル領域との結合を定量することを含む請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
化学物質のライブラリーをスクリーニングすることをさらに含む請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼの活性の阻害剤を設計するためのコンピュータ支援方法であって、
（ａ）ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼの上述のドラッガブル領域の任意のもの由来のアミノ酸残基の原子に対する、ＰＤＢ登録番号１ＭＬ９または図７に列記される構造座標からの約１．５Å未満の二乗平均平方根偏差を持つ構造座標のセットを、分子または複合体の一部分または全てを定義するようにコンピュータ・モデリング・アプリケーションに呈示することと、
（ｂ）化学物質に対する構造座標のセットを、前記コンピュータ・モデリング・アプリケーションに呈示することと、
（ｃ）前記化学物質と前記分子または複合体との間の潜在的結合相互作用を評価することと、
（ｄ）前記化学物質を構造的に改変させて、改変された化学物質に対する構造座標のセットを生成することと、
（ｅ）前記改変された化学物質が、前記分子または複合体に結合または干渉すると期待される阻害剤であるかを決定することとを含み、
前記分子または分子複合体に結合または干渉することが、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼの活性の潜在的阻害を示す、方法。
【請求項４４】
前記改変された化学物質が、前記分子または複合体に結合または干渉すると期待される阻害剤であるかを決定することが、前記化学物質と前記分子または複合体との間で適合操作をおこなった後、前記適合操作の結果をコンピュータで分析して、前記化学物質と前記分子または複合体との結合を評価することを含む請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記化学物質に対する構造座標のセットが化学ライブラリーから得られる請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼの活性の阻害剤を新規に設計するためのコンピュータ支援方法であって、
（ａ）ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼの上述のドラッガブル領域の任意のもの由来のアミノ酸残基の原子に対する、ＰＤＢ登録番号１ＭＬ９または図７に列記される構造座標に由来する立体的座標のセットを、分子または複合体の一部分または全てを定義するようにコンピュータ・モデリング・アプリケーションに呈示することと、
（ｂ）構造座標のセットに表される化学物質をコンピュータで構築することと、
（ｃ）前記化学物質が、前記分子または複合体に結合または干渉することが期待される阻害剤であるかを決定することとを含み、
前記分子または複合体に結合または干渉することが、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼの活性の潜在的阻害を示す、方法。
【請求項４７】
前記化学物質が、前記分子または複合体に結合または干渉することが期待される阻害剤であるかを決定することが、前記化学物質と前記分子または複合体のドラッガブル領域との間で適合操作をおこなった後、前記適合操作の結果をコンピュータで分析して、前記化学物質と前記ドラッガブル領域との結合を定量することを含む請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
潜在的阻害剤を呈示または合成した後、前記潜在的阻害剤をアッセイして、それがヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼの活性を阻害するかを決定することをさらに含む請求項４０、請求項４３、または請求項４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質のドラッガブル領域を同定するための方法であって、
（ａ）（１）配列番号１を有するヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質を含むアミノ酸配列または（２）配列番号１に対する少なくとも約８５％同一性を持つアミノ酸配列を含み、かつヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の少なくとも１つの生物活性を持つポリペプチドの結晶を、結晶化ポリペプチドの立体構造が３．５Å以上の解像度まで決定され得るように得ることと、
（ｂ）Ｘ線回折を用いて、結晶化ポリペプチドの立体構造を決定することと、
（ｃ）前記結晶化ポリペプチドの立体構造にもとづいて、前記結晶化ポリペプチドのドラッガブル領域を同定することと、
を含む、方法。
【請求項５０】
Ｐ２１２１２１空間群を有する結晶を含む、結晶質ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ。
【請求項５１】
３６．７３×８１．５６×１０１．２７Åの細胞寸法と、非対称単位１当たりの１つの分子とをさらに有する請求項５０記載の結晶。
【請求項５２】
前記タンパク質がＤＩＭ−５である請求項５０記載の結晶。
【請求項５３】
結晶質ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ複合体。
【請求項５４】
Ｐ２１２１２１空間群を有する結晶を含む請求項５３記載の結晶質複合体。
【請求項５５】
６８．２６×９４．１７×１１４．６９Åの細胞寸法と、非対称単位１当たりの２つの分子とをさらに有する請求項５３記載の結晶。
【請求項５６】
前記複合体が金属依存型ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質および基質を含む請求項５３記載の結晶質複合体。
【請求項５７】
前記複合体が金属依存型ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の変異体および基質を含む請求項５３記載の結晶質複合体。
【請求項５８】
前記複合体が金属依存型ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の天然由来の変異体および基質を含む請求項５３記載の結晶質複合体。
【請求項５９】
前記複合体が金属依存型ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質および基質を含み、前記金属依存型ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質が天然由来の金属依存型ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質に対する９５％より大きい相同性を持つ請求項５３記載の結晶質複合体。
【請求項６０】
前記複合体が金属依存型ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質および基質を含み、前記金属依存型ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質のＳＥＴ領域が、天然由来の金属依存型ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質のＳＥＴ領域に対する９５％より大きい相同性を持つ請求項５３記載の結晶質複合体。
【請求項６１】
前記複合体が金属依存型ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質および基質を含み、前記トランスフェラーゼがヒストンＨ３中のリジン９に作用する請求項５３記載の結晶質複合体。
【請求項６２】
前記複合体がＤＩＭ−５を含む請求項５３記載の結晶質複合体。
【請求項６３】
前記複合体がペプチドを含む請求項５３記載の結晶質複合体。
【請求項６４】
前記複合体がＨ３ペプチドを含む請求項６３記載の結晶質複合体。
【請求項６５】
前記複合体がＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインを含む請求項５３記載の結晶質複合体。
【請求項６６】
前記結晶が、４．０Å未満の解像度までのヒストン・リジン・メチル・トランスフェラーゼ・タンパク質の原子座標の決定のためのＸ線を効果的に回析させる請求項５３記載の結晶質複合体。
【請求項６７】
前記解像度が３．０Å未満である請求項６６記載の結晶質複合体。
【請求項６８】
（１）配列番号１を有するヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質を含むアミノ酸配列、（２）配列番号１に対する少なくとも約８５％同一性を持つアミノ酸配列、（３）配列番号１の少なくとも１つのドラッガブル領域を含むアミノ酸配列、または（４）配列番号１の少なくとも１つのドラッガブル領域に対する少なくとも約８５％同一性を持つ配列を含むアミノ酸配列を含み、かつヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の少なくとも１つの生物活性を持ち、
結晶がｐ２１２１２１空間群を有する、結晶化ポリペプチド。
【請求項６９】
ＰＤＢ登録番号ＩＭＬ９または図７の原子座標の一部分によって定義されるポリペプチドの構造を含む、結晶化ポリペプチド。
【請求項７０】
ポリペプチドのホモログの結晶構造を決定するための方法であって、
（ａ）（１）配列番号１を有するヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質を含むアミノ酸配列、（２）配列番号１に対する少なくとも約８５％同一性を持つアミノ酸配列、（３）配列番号１の少なくとも１つのドラッガブル領域を含むアミノ酸配列、または（４）配列番号１の少なくとも１つのドラッガブル領域に対する少なくとも約８５％同一性を持つ配列を含むアミノ酸配列を含み、かつヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の少なくとも１つの生物活性を持つ第１の結晶化ポリペプチドの立体構造を与えることと、
（ｂ）前記配列番号１を含むアミノ酸配列に少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の少なくとも１つの生物活性を持つ第２のポリペプチドの結晶を、第２の結晶化ポリペプチドの立体構造が３．５Å以上の解像度まで決定され得るように得ることと、
（ｃ）ステップ（ａ）で与えられた前記立体構造の原子座標にもとづいて、Ｘ線結晶学によって前記第２の結晶化ポリペプチドの立体構造を決定することと、
を含む、方法。
【請求項７１】
未知の構造の分子または分子複合体に関する構造情報を得るための方法であって、
（ａ）前記分子または分子複合体を結晶化することと、
（ｂ）結晶化された前記分子または分子複合体から、ｘ線回析パターンを生成することと、
（ｃ）図７またはＰＤＢ登録番号ＩＭＬ９の構造座標の少なくとも一部分を前記ｘ線回析パターンに適用して、構造が未知である前記分子または分子複合体の少なくとも一部分の立体的電子密度マップを生成することと、
を含む、方法。
【請求項７２】
ポリペプチドおよび候補修飾因子を含む結晶化複合体を作製するための方法であって、
（ａ）（１）配列番号１を有するヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質を含むアミノ酸配列、（２）配列番号１に対する少なくとも約８５％同一性を持つアミノ酸配列、（３）配列番号１の少なくとも１つのドラッガブル領域を含むアミノ酸配列、または（４）配列番号１の少なくとも１つのドラッガブル領域に対する少なくとも約８５％同一性を持つ配列を含むアミノ酸配列を含み、かつヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の少なくとも１つの生物活性を持つポリペプチドを、結晶化ポリペプチドの結晶が５Å以上の解像度にｘ線を回析するように結晶化することと、
（ｂ）前記結晶を、潜在的修飾因子を含む溶液中に浸漬することと、
を含む、方法。
【請求項７３】
ポリペプチドの結晶中に潜在的修飾因子を組み込むための方法であって、空間群Ｐ２１２１２１を有するヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の結晶を、前記潜在的修飾因子を含む溶液中に入れることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＳＥＴドメインタンパク質の新規ドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）領域に関しており、特にヒストン  リジン  メチルトランスフェラーゼタンパク質、およびそれを使用する方法（例えば薬物送達）に関する。
【０００２】
（政府の支援）
対象とする発明は、ＮＩＨによる助成金ＧＭ６１３５５のもとで、政府の支援を一部受けてなされたものである。したがって、米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ヒストンは、主にヌクレオソームから突き出るＮ末端尾部で、アセチル化、リン酸化、およびメチル化を含む広範囲の翻訳後修飾を受ける。ここ数年間にわたって蓄積される証拠は、そのような修飾が、クロマチンに関する種々のプロセスに向ける「ヒストンコード（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｃｏｄｅ）」を構成することを示唆している。ヒストンメチル化は、最も最近認知されるヒストンコードの構成要素を表す。複数あるヒストンリジン（Ｋ）メチルトランスフェラーゼ（ＨＫＭＴ）は、種々の受容体リジンに対するそれらの基質特異性と、それらが移動させるメチル基の数（１、２、または３）についてのそれらの生成物特異性との両方において異なる。ＨＫＭＴに対する既知の標的として、ヒストンＨ３のＬｙｓ−４、９、２７、３６、および７９とヒストンＨ４のＬｙｓ−２０が挙げられる（Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ，２００３で概説）。しかし、これらの残基でのメチル化の範囲は、完全には定義されていない。酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＥＴ１タンパク質は、Ｈ３Ｌｙｓ−４のジメチル化およびトリメチル化を触媒し得、またＬｙｓ−４のトリメチル化は、活性遺伝子に排他的に存在すると思われる。さらに、アカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）のＤＩＭ−５は、主に、ＤＮＡメチル化のためのクロマチン領域をマークするトリメチル−Ｌｙｓ−９を生成する。一方、ヒトＳＥＴ７／９タンパク質は、排他的に、Ｈ３のモノメチルＬｙｓ−４を生成する。酵母と真菌タンパク質との間のそのような違いは、タンパク質の各々の型に関連した疾患または症状を処置するための治療法（例えば抗菌、抗ガン、または抗増殖性の治療法）の設計に用いられ得る。
【０００４】
約１３０アミノ酸の長さのＳＥＴドメインは、ある既知のＨＫＭＴ以外のすべてにおいて見いだされる。ＨＫＭＴは、ＳＥＴドメインを取り囲む配列の有無および該配列の性質に従って、分類され得る。主要なファミリーの代表例として、ＳＵＶ３９、ＳＥＴ１、ＳＥＴ２、ＥＺ、およびＲＩＺが挙げられる。ＳＥＴ７／９およびＳＥＴ８タンパク質は、これらのファミリーとはフィットしない（図１）。ＳＵＶファミリーは、最多数のＨＫＭＴを含む。最近、いくつかのＳＥＴドメインタンパク質について、結晶構造が示されている。これらの例として、２種類のＳＵＶ３９ファミリータンパク質（ＤＩＭ−５およびＣｌｒ４）、ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）ＭＴアーゼ、種々の形態の４種類のＳＥＴ７／９構造、ならびにＳＥＴドメインのみを含むウイルスタンパク質が挙げられる。これらの構造は、ＳＥＴドメインの高度に保存された残基（図１のマゼンタ）が、酵素の活性部位を構成するナット（ｋｎｏｔ）様構造を形成することを明らかにした。最近、ペプチドと複合体を形成したＳＥＴ７／９の構造がその基質結合部位を明らかにした。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
ＳＥＴドメインタンパク質ＤＩＭ−５およびその三重複合体を結晶化し、以下に詳細に述べるように、それらの構造を解明し、それによってそのポリペプチドならびにそれに含まれるドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）領域およびドメイン等の構造についての情報が得られた。それらのすべてを合理主義的薬剤設計の取り組み（ｒａｔｉｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ｅｆｆｏｒｔｓ）において使用され得る。ＤＩＭ−５は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのＤＮＡメチル化に不可欠であるアカパンカビ（Ｎ．  ｃｒａｓｓａ）由来のＳＵＶ３９型ヒストンＨ３Ｌｙｓ−９ＭＴアーゼである。
【０００６】
本発明は、種々の技術を使用して、構造的および機能的特性づけに適したヒストン・リシン・メチルトランスフェラーゼの精製化形態、可溶化形態、および結晶化形態も提供するもので、上記技術として、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、マススペクトル分析、磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）、およびＸ線結晶構造解析が挙げられる。本発明は、さらに、特徴づけを容易にするために、ヒストン  リシン  メチルトランスフェラーゼの修飾および／または変異型を提供するもので、該修飾または／変異型として、同位体原子または重原子で標識されるポリペプチドおよび融合タンパク質が挙げられる。
【０００７】
一般に、本発明のポリペプチドの生物学的活性度は、ＳＥＴドメインタンパク質の生物活性に対して実質的に類似した生物活性を持つものとして特徴づけられることが予想され、特定の実施形態においては、以下にさらに詳細に記載されるように、ヒストン  リジン  メチルトランスフェラーゼである。この課題は、ＤＩＭ−５およびＤＩＭ−５ペプチド補因子複合体のＸ線構造を解明することで、確認されている。          
【０００８】
ＳＥＴドメインタンパク質について本明細書で検討および説明する情報のすべてを使用して、それらの一種類以上の生物活性の修飾因子を設計し得る。特に、ＳＥＴドメインタンパク質ならびに（特定の実施形態において）ヒストン  リジン  メチルトランスフェラーゼ）について、治療用分子および診断用分子（例えば、タンパク質ドメイン、ドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）領域、および構造的情報等が挙げられる）の設計に対して極めて重要な情報は、それらならびにそれらのドメイン、フラグメント、変異体、および誘導体を、調製、精製、および特徴付けし得る結果として、現在、利用または達成可能である。
【０００９】
本発明の別の局面において、ＳＥＴドメインタンパク質ならびに（特定の実施形態において）ヒストン  リジン  メチルトランスフェラーゼについての構造的情報および機能的情報があり、そして得られる。そのような情報を、例えば、ＳＥＴドメインタンパク質および（特定の実施形態においては）ヒストン  リジン  メチルトランスフェラーゼならびに、別の微生物種由来の他のポリペプチド標的に関する情報を関する情報を含むデータベースに取り込み得る。そのようなデータベースによって、研究者は、ＳＥＴドメインタンパク質、ならびに（特定の実施形態において）ヒストン  リジン  メチルトランスフェラーゼを分析するための強力なツールが与えられ、治療用および診断用分子の迅速な発見および設計に役立つ。
【００１０】
別の局面において、ＳＥＴドメインタンパク質、および（特定の実施形態において）ヒストン  リジン  メチルトランスフェラーゼ、もしくはそれを含む生物学的複合体、またはそのオルソロガスに対する修飾因子、阻害剤、アゴニスト、またはアンタゴニストを使用して、患者（ヒトまたは動物を含む）の疾患または治療可能な症状（例えば、癌、他の増殖性疾患、ウオルフ−ハーシュホーン（Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ）またはプラダー−ウィリ（Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ）等の症候群、および真菌感染症が挙げられる）を処置し得る。
【００１１】
本発明は、さらに、種々のＳＥＴドメイン  タンパク質および（特定の実施形態において）ヒストン  リジン  メチルトランスフェラーゼを単離し、研究することによって、同一種由来のポリペプチドと複数種由来のポリペプチドとの間の関係を比較し得る。そのような比較研究（これは、必要に応じて多変量解析を含み得る）によって、複数種に影響を及ぼす薬物あるいは一種またはいくつかの種に影響を及ぼす薬物を同定し得る。このような方法で、いわゆる「広囲（ｗｉｄｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）」および「狭囲（ｎａｒｒｏｗ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）」抗感染薬を同定し得る。あるいは、１種類以上の哺乳動物（特にヒト）に対してではなく、１種類以上の細菌種または他の非哺乳動物種に対して選択される薬を、同定し得る（さらに逆も同じ）。別の実施形態において、哺乳動物種に選択的である薬物（例えば癌、他の増殖性疾患または症候群（例えばウオルフ−ハーシュホーン（Ｗｏｌｆ−ＩＩｉｒｓｃｈｈｏｒｎ）またはプラダー−ウィリ（Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ））を処置するための薬物）を同定し得る。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、対象とする核酸、ポリペプチド、結晶化ポリペプチド、抗体、および他の対象とする材料、さらに必要に応じてそれらの使用に関する指示書を含むキットを意図している。そのようなキットの用途として、例えば診断および治療への利用が挙げられる。
【００１３】
本発明の実施形態および実施、他の実施形態、ならびにそれらの特徴および特性は、明細書、図面、および特許請求の範囲から明らかであり、この結果、特許請求の範囲のすべてはこの要旨に援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
（Ａ．概要）
ポストＳＥＴドメインが、触媒活性に不可欠である亜鉛結合部位を形成し、金属キレータに対する感度を生じることが観察された。ポストＳＥＴドメインの役割を規定し、ヒストン  リジン  メチルトランスフェラーゼタンパク質、補因子、および基質間の相互作用を確立するために、Ｎ．ｃｒａｓｓａ由来ＤＩＭ−５（ヒストンＨ３リジン９ＭＴアーゼ）と、メチルドナー産物ＡｄｏＨｃｙと、ヒストンタンパク質との三重複合体の構造を決定した。さらに、この酵素の機能を明らかにするために、突然変異的および生化学的研究を実施した。
【００１５】
プレＳＥＴ領域の高度に保存された残基が三角形亜鉛クラスタ（Ｚｎ３Ｃｙｓ９）を形成し、ＳＥＴドメイン内のその残基が補因子結合およびメチル転移とって不可欠であるという知見が得られた。ＳＥＴ領域ドメインは、また、ヒストンＨ３のメチル化可能アミノ末端尾部に対する予想結合部位である間隙（クレフト）を有する。ポストＳＥＴ領域は、活性部位近傍のナット様構造にある保存されたシステインとともに別の亜鉛結合部位を形成することによって、補因子の結合および触媒作用に関与することも可能である。３つのＣｙｓドメインは、ＳＵＶ３９、ＳＥＴ１、およびＳＥＴ２ファミリーのメンバーを含むポストＳＥＴドメインを有しているかなりの数のＳＥＴタンパク質に関連するべきである。最後に、この研究は、共通の機能（ここではＡｄｏＭｅｔ依存型メチル転移）を実行するが、完全に関連していない構造的に異なるタンパク質の例を提供する。従って、これらの結果は、ＳＵＶ３９ファミリーヒストンＨ３リジン９ＭＴアーゼに関する共通の折り畳みおよび触媒機能、潜在的には一般にヒストン  リジン  メチルトランスフェラーゼに対する洞察を提供する。
【００１６】
また、特異的に改変されたＤＩＭ−５およびＳＥＴ７／９の変異体に対して操作を加えることで、産物特異性の構造的基礎を決定した。モノメチルリジン、ジメチルリジン、トリメチルリジンの産生が異なる変異体は、所定のリジンに対する異なるメチル化状態によって異なるようにして信号が出力される可能性を調べるためのリソースを提供する。例えば、ＤＩＭ−５のＦ２８１Ｙ突然変異を用いて、トリメチルＬｙｓ−９がＤＮＡメチル化の信号発生に必須であるかどうかが調べられる。主に正染色性のＨ３Ｌｙｓ−９ＭＴアーゼＧ９ａは、強力なジ−ＭＴアーゼおよびかなり弱いトリ−ＭＴアーゼである。Ｇ９ａをモノ−ＭＴアーゼまたはトリ−Ｍｔアーゼのいずれかに変換する効果を調べることは、興味深い。
【００１７】
（Ｂ．定義）
本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用する特定の用語をここに集めた。これらの定義は、当業者と同様に全ての開示を考慮して読まれ、かつ理解されるべきである。
【００１８】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の対象物の１つまたは１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）について言及するために、ここでは用いられる。例として、「成分（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの成分または複数の成分を意味する。
【００１９】
用語「アミノ酸」は、天然または合成であることにかかわらず、すべての分子を包含することを意図しており、アミノ官能基および酸性官能基を含み、かつ天然のアミノ酸からなるポリマーに含まれることができる。典型的なアミノ酸として、天然のアミノ酸；その類似体、誘導体、および同類；変異側鎖を持つアミノ酸類似体；および前述したものの任意のすべての立体異性体が挙げられる。
【００２０】
用語「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、安定な会合に言及するもので、２つの分子間、例えば生理学的条件下での静電結合、疎水結合、イオン結合、および／または水素結合相互作用または水素結合による、ＳＥＴドメインタンパク質と結合相手との間の安定な会合である。
【００２１】
ここで使用する用語「化学要素（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）」は、化学化合物、２つ以上の化学化合物からなる複合体、およびそのような化合物もしくは複合体の断片のことをいう。いくつかの例では、広範囲にわたる構造的および機能的多様性を示す化学物質、例えば異なる形状（例えば、平坦な芳香環、ひだ状の脂肪族環、単結合、二重結合、または三重結合を持つ直鎖および分岐状脂肪酸）および多様な官能基（例えば、カルボン酸、エステル、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン、および種々の複素環）を持つ化合物を用いることが望ましい。  
【００２２】
用語「複合体」は、互いに親和性を持つ少なくとも２つの構成成分（例えば、化学的または生化学的）間の会合をいう。複合体の例として、抗原／抗体、レクチン／炭水化物、標的ポリヌクレオチド／プローブオリゴヌクレオチド、抗体／抗抗体、レセプター／リガンド、酵素／リガンド、ポリペプチド／ポリペプチド、ポリペプチド／ポリヌクレオチド、ポリペプチド／補因子、ポリペプチド／基質、ポリペプチド／修飾因子、ポリペプチド／小分子等の間の関係が挙げられる。「複合体のメンバー」は、複合体の一構成成分をいう。例えば抗原またはリガンドである。「タンパク質複合体」または「ポリペプチド複合体」とは、少なくとも１つのポリペプチドを含む複合体をいう。
【００２３】
用語「化合物」は、ここでは任意の薬物、分子、複合体、または他の構成成分をいい、タンパク質と結合または相互作用し得るものでもよい。用語「試験化合物」は、ＨＫＭＴ等、ＳＥＴドメインタンパク質の推定修飾因子として、１種類以上のスクリーニング方法で試験される分子、または他の生物学的構成成分またはプロセスをいう。試験化合物は、重要な標的に結合することが一般に公知でない。用語「コントロール試験化合物」は、標的（例えば、既知のアゴニスト、アンタゴニスト、バーシャルアゴニスト、またはインバースアゴニスト）に結合することが公知である化合物をいう。用語「試験化合物」は、アッセイでシグナル特異性を決定するために標的の機能を変える制御条件として添加される化学物質を含むものではない。そのような制御化学物質または条件として、（１）非得的または実質的にタンパク質構造を崩壊させる化学物質（例えば、変性剤（例えば、尿素またはグアニジニウム）、カオトロピック剤、スルフヒドリル試薬（例えば、ジチオスレイトルおよびｂ−メルカプトエタノール）、ならびにプロテアーゼ）と、（２）通常、細胞代謝（例えば、ミトコンドリア脱共役剤）を阻害する化学物質と、（３）非特異的にタンパク質の静電気的または疎水性相互作用（例えば、高塩濃度、または非特異的に疎水相互作用を崩壊させるのに十分な濃度の界面活性剤を非特異的に崩壊させる化学物質）とが挙げられる。さらに、用語「試験化合物（ｔｅｓｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」はまた、対象の毒性にもとづく特定の兆候に対する治療上の使用に不適当であることが知られている化合物を含まない。特定の実施形態において、種々の所定濃度（例えば、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、および１０．０ｍＭ）の試験化合物がスクリーニングに用いられる。試験化合物の例として、限定されるものではないが、ペプチド、核酸、炭水化物、および小分子が挙げられる。用語「新規試験化合物」とは、この出願の出願日以降は存在していない試験化合物をいう。新規試験化合物を用いるいくつかのアッセイにおいて、新規試験化合物は、アッセイで用いられる試験化合物、または該アッセイの任意のトライアルで用いられる試験化合物の少なくとも約５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上を含む。
【００２４】
用語「保存された残基（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ）」とは、いくつかの共通する性質を持つアミノ酸群のメンバーであるアミノ酸をいう。用語「保存的アミノ酸置換」とは、１つのそのような群由来のアミノ酸をその同じ群由来の別のアミノ酸で置換すること（理論的またはその反対）をいう。個々のアミノ酸の間の共通の特性を規定する機能的な方法は、同種生物（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の対応タンパク質間のアミノ酸変化の正常化頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，  Ｇ．  Ｅ．  ａｎｄ  Ｒ．  Ｈ．  Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。そのような分析に従って、アミノ酸の群は、規定され得る。ここで、１つの群のアミノ酸は、お互いに優先的に交換し、それにより、全体的なタンパク質構造への影響という点でお互いに最も類似している（Ｓｃｈｕｌｚ，  Ｇ．  Ｅ．  ａｎｄ  Ｒ．  Ｈ．  Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このようにして定義された一組のアミノ酸の１つの例として、（ｉ）ＧｌｕおよびＡｓｐ、ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓからなる荷電した群、（ｉｉ）  Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓからなる正に荷電した群、（ｉｉｉ）  ＧｌｕおよびＡｓｐからなる負に荷電した群、（ｉｖ）  Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐからなる芳香族群、（ｖ）  ＨｉｓおよびＴｒｐからなる窒素環群、（ｖｉ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる大きい無極性脂肪族群、（ｖｉｉ）  ＭｅｔおよびＣｙｓからなるわずかに極性の群、および（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、およびＰｒｏからなる小さい残基の群、（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、およびＣｙｓからなる脂肪族群、ならびに（ｘ）ＳｅｒおよびＴｈｒからなる小さなヒドロキシルの群が挙げられる。
【００２５】
用語「ドメイン」とは、ポリペプチドに関して使用される場合、特定の構造を有するか、特定の機能を媒介するそのようなポリペプチド内での特定の領域をいう。代表的な場合において、ＳＥＴドメインタンパク質のドメイン、例えばＨＫＭＴタンパク質は、上記ポリペプチドのフラグメントである。特定の例において、例えば、質量分析によって、またはドメインのドラッガブル領域に対して修飾因子が結合し得るという事実によって、ドメインは構造的に安定なドメインである。  
【００２６】
用語「ドラッガブル領域」とは、ポリペプチド、核酸、複合体等に関して使用される場合、ＨＫＭＴタンパク質等のＳＥＴドメインタンパク質の一領域をいい、それはウイルス感染性を減少または阻害する薬剤を結合させるための標的または有望な標的である。ポリペプチドに関して、ドラッガブル領域とは、一般に、ポリペプチドのいくつかのアミノ酸が薬剤と相互作用し得る領域をいう。ポリペプチドまたはその複合体について、結合ポケットおよび部位を含む典型的なドラッガブル領域は、ポリペプチドまたは複合体のドメインの間で接合するか、または別の分子（例えば細胞膜）との相互作用に関与し得るポリペプチドまたは複合体の表面溝または輪郭もしくは表面の間で接合する。特に、対象ドラッガブル領域は、プレＳＥＴドメインの亜鉛結合部位である。
【００２７】
ドラッガブル領域を多くの方法で記載し得、特徴づけ得る。例えば、ドラッガブル領域は、該領域を形成するアミノ酸のいくつかもしくは全てによって、またはその主鎖原子、またはその側鎖原子（任意にＣａ原子を持っていようがいまいが）によって、特徴づけられる。あるいは、ドラッガブル領域を、同一または他の分子と比較することによって、特徴づけ得る。例えば、用語「親和性領域」は、いくつかの他の分子に存在する一分子（例えば、ＳＥＴドメインタンパク質（例えば、ＨＫＭＴタンパク質））上のドラッガブル領域をいい、多くの場合、この同一の親和性領域の構造は十分に同じであり、その結果、該親和性領域の構造は、同一または関連する構造類似体と結合すると予期される。親和性領域の例は、いくつかのプロテインキナーゼ（起源が同一であるかにかかわりなく）において見いだされるプロテインキナーゼのＡＴＰ結合部位である。用語「選択性領域（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎ）」とは、異なる選択性領域の構造が同一または関連の構造類似体と結合することになるように十分異なることから、他の分子では見つからないと思われる分子のドラッガブル領域をいう。典型的な選択性領域は、１つの基質に対して特異性を示すプロテインキナーゼの触媒ドメインである。特定の例において、一つの修飾因子は実質的に類似の生体機能がある多数のタンパク質全体で同じ親和性領域と結合し得る一方で、同じ修飾因子はそれらのタンパク質のうちの１つの選択性領域のみと結合し得る。
【００２８】
異なるドラッガブル領域の例示を続けると、用語「望ましくない領域（ｕｎｄｅｓｉｒｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）」とは、別の分子と相互作用して望ましくない影響が生ずる分子のドラッガブル領域をいう。例えば、上記相互作用分子（例えば、Ｐ−４５０活性）を酸化し、該酸化分子に対する毒性の増加をもたらす結合部位が、「望ましくない領域」であると考えられる。
【００２９】
潜在的に望ましくない領域として、薬物との相互作用に応じて、薬物の膜透過性の減少、薬物排出の増加、または薬物の血液脳輸送の増加をもたらす領域が挙げられる。いくつかの状況下では、望まない領域がもはや望まない領域とみなされる場合もある。なぜなら、上記領域の影響が有利となる。例えば、脳の症状を処置することを目的とした薬物は、血液脳輸送の増加をもたらす領域と相互作用して利益を受ける。その一方で、同じ領域が、脳へ送達されることを目的としなかった薬物にとっては望ましくないと考えることができた。
【００３０】
ドラッガブル領域に関連して用いた場合、ドラッガブル領域に対する修飾因子等の分子の「選択性」または「特異性」を用いて、該分子とドラッガブル領域との間の結合を説明することができる。例えば、ドラッガブル領域に関する修飾因子の選択性は、各々のＫｄ値（すなわち、各修飾因子−ドラッガブル涼気複合体の解離定数）を用いて、または生物学的効果がｋｄの下で観察されるケースでは、各々のＥＣ５０（すなわち、各ドラッガブル領域と相互作用する修飾因子に対する最大反応の５０％を生ずる濃度）を用いて、別の修飾因子と比較することによって発現させることができる。    
【００３１】
用語「遺伝子（ｇｅｎｅ）」とは、エクソン配列と任意にイントロン配列とを持つポリペプチドをコードしているオープン・リーディング・フレームを含む核酸をいう。用語「イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）」とは、タンパク質に翻訳されず、通常、エクソン間に見いだされる所定の遺伝子に存在するＤＮＡ配列をいう。
【００３２】
用語「実質的に類似の生物活性を持つ（ｈａｖｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｓｉｌｍｉｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」とは、２つのポリペプチドに関して用いる場合、第２のポリペプチドの生物活性の少なくとも１つに実質的に類似している第１のポリペプチドの活性をいう。実質的に類似の生物学的活性とは、ポリペプチドが類似の機能、例えば類似の酵素反応または類似の生理学的プロセス等を実行することを意味する。例えば、２つの相同タンパク質が類似の酵素反応に関与するならば、該相同タンパク質は実質的に類似の生物学的活性を持つと考えられる。例えば、相同タンパク質は、ともに基質ポリペプチドのリン酸化を触媒するキナーゼである。しかし、それらの相同タンパク質は、同一タンパク質基質上のリン酸化的（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙ）に異なる領域またはまったく異なる基質タンパク質であってもよい。あるいは、２つの相同タンパク質は、ともに類似の生理学的プロセス（例えば、転写）に関与する場合、実質的に類似の生物学的活性を持つものであってもよい。例えば、２つのタンパク質が転写因子でってもよい。しかし、該転写因子は、異なるＤＮＡ配列に結合または異なるポリペプチド・インタラクターに結合する可能性がある。実質的に、類似の生物活性もまた、類似の構造的役割を果たすタンパク質、例えば２つの膜タンパク質と関連したものであってもよい。
【００３３】
用語「ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｌｙｓｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｃｅ）」または「ＨＫＭＴ」は、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ活性を持つタンパク質に言及するものであり、少なくとも１つのＳＥＴドメインを有する。用語「ＳＥＴドメイン・タンパク質」は、したがってヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼを包含する。そのようなヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼは、より多くの特異的特性を有するものであってもよく、それによってさらに下位分類される（例えば、金属イオン型ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）。そのような下位分類および変異体のすべてがこの定義に包含される。アカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）由来のＤＩＭ−５配列の完全長アミノ酸配列（ヒストンＨ３リジン９ＭＴアーゼ）は、図７の配列番号１である。用語「ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ」は、配列番号１の部分、フラグメント、ホモログ、相同分子種、変異体、イソ型、および対立形質変異体を包含する。さらに、それは、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ活性と、ＤＩＭ−５配列（例えば、真核生物Ｈ３Ｌｙｓ−９ＭＴアーゼＧ９ａ）のＳＥＴドメイン、プレＳＥＴドメイン、および／またはポストＳＥＴドメイン、ならびにその部分またはフラグメント、ホモログ、相同分子種、変異体、イソ型、および対立形質変異体に対する少なくとも８０％同一性とを持つ他の配列も包含する。そのようなＨＫＭＴタンパク質およびタンパク質フラグメントは、公知の任意の方法によって作ることができ、該方法として自然源からの精製、組み換え法、およびペプチド合成が挙げられる。そのようなタンパク質は、可溶性の形態（例えば、細胞膜貫通領域の欠如）または適当な試薬（例えば、界面活性剤）を用いて可溶化してもよい。
【００３４】
用語「単離ポリペプチド（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、ポリペプチドをいい、特定の実施形態では、組み換え体ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または合成系、またはそれらのある組み合わせから調製され、該ポリペプチドは、（１）一般に自然に見いだされるタンパク質に関連せず、（２）該ポリペプチドが生ずる細胞から単離され、（３）同一細胞源由来の別のタンパク質なしで単離され、（４）異なる種由来の細胞で発現され、または（５）自然界では生じない。  
【００３５】
用語「単離核酸（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」とは、ゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、または合成系、またはそれらの組み合わせのポリペプチドをいい、該ポリペプチドは、（１）「単離核酸」が自然状態で見いだされる細胞に関連せず、または（２）自然状態では連結しないポリヌクレオチドに実施可能に連結している。
【００３６】
用語「ほ乳類（ｍａｍｍａｌ）」は公知であり、典型的なほ乳類とは、ヒト、霊長類、牛、ブタ、イヌ、猫、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。
【００３７】
用語「修飾（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」とは、機能的性質または生物学的活性またはプロセス（例えば、酵素活性もしくは受容体結合）に関して用いられる場合、上方制御（例えば、活性または刺激）、下方制御（例えば、阻害もしくは抑制）、あるいはさもなければそのような性質、活性、またはプロセスの品質を変える能力をいう。いくつかの例では、そのような制御は、特異的なイベント（例えばシグナル伝達経路の活性化）の発生を条件とすること、および／または特定の細胞種でのみで顕在化することが挙げられる。          
【００３８】
用語「修飾因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」とは、修飾を起こす能力があると思われるポリペプチド、核酸、高分子、複合体、分子、小分子、化合物、種、その他（天然由来または非天然由来）、あるいは生物学的材料（例えば、細菌、植物、菌類、または動物細胞もしくは組織）をいう。アッセイに包含することで、機能的性質、生物学的活性、あるいはプロセスの修飾因子または活性化因子（直接的または間接的）としての潜在的活性を評価するものであってもよい（例えば、アゴニスト、パーシャル・アンタゴニスト、パーシャル・アゴニスト、インバース・アゴニスト、アンタゴニスト、抗菌剤、菌感染症または増殖の修飾因子、その他）。そのようなアッセイでは、多くの修飾因子を一度にスクリーニングすることも可能である。収縮因子の活性化は公知、未知、または部分的に知られている。
【００３９】
用語「モチーフ（ｍｏｔｉｆ）」とは、特定の構造または機能のタンパク質で共通して見いだされるアミノ酸配列をいう。概して、コンセンサス配列は特定のモチーフを表すために定義される。コンセンサス配列は厳密に定義される必要はなく、変異性の位置、縮退、長さの変動性等を含むことができる。コンセンサス配列は、そのアミノ酸配列でモチーフの存在による類似の構造または機能を持つことが可能な他のタンパク質を同定するために、データベースを検索するのに用いることができる。例えば、オンライン・データベースを、特定のモチーフを含む他のタンパク質を同定するために、コンセンサス配列によって検索することができる。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＥＮＴＲＥＺ等の種々の検索アルゴリズムおよび／またはプログラムを用いることができる。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージの一部として入手可能である（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）。ＥＮＴＲＥＺは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ．を介して、入手可能である。
【００４０】
用語「天然リガンド（ｎａｔｕｒａｌ  ｌｉｇａｎｄ）」とは、ＳＥＴドメイン・タンパク質を結合する天然由来補因子、基質、または他の分子をいう。例えば、ＨＫＭＴ  ＳＥＴドメイン／タンパク質は、少なくとも天然のリガンドである亜鉛、ヒストン・ポリペプチド、およびＡｄｏＭｅｔを持つ。
【００４１】
目的物に適用されるように、用語「天然由来（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」とは、目的物が自然界で見いだされるという事実をいう。例えば、自然の源から単離される生物（細菌含む）に存在し、研究室でヒトによって故意に修飾されなかったポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が天然由来である。
【００４２】
用語「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」とは、ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）のポリマー形態、またはヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾された形態をいう。この用語は、等価物として、ヌクレオチド類似体から作られたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体、さらに、記載した実施形態に適用可能なものとして、一本鎖（例えば、センスまたはアンチセンス）および二重鎖のポリヌクレオチドが挙げられる。  
【００４３】
本明細書中で相互に取り替えて用いられる用語「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」および用語「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」もしくは「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、アミノ酸のポリマーをいう。典型的なポリペプチドとして、遺伝子産物、天延由来タンパク質、ホモログ、相同分子種、パラログ、フラグメント、ならびに前述の他の等価物、変異体、および類似体が挙げられる。
【００４４】
用語「ポリペプチド・プラグメント（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」または「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、参照ポリペプチドに関連して用いる場合、該参照ポリペプチドそれ自体と比較して、アミノ酸残基が欠失しているポリペプチドをいう。しかし、残りのアミノ酸配列が一般に参照ポリペプチドの対応位置と同一である。そのような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端、あるいはその両方で生じたものであってもよい。フラグメントは、一般に、少なくとも５、６、８、または１０アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０、３０、４０、または５０アミノ酸長、少なくとも７５アミノ酸長、または少なくとも１００、１５０、２００、３００、５００以上のアミノ酸長である。フラグメントは、上記参照ポリペプチドの生物活性を一種類以上保持することができる。いくつかの実施形態では、フラグメントはドラッガブル領域を有するものであってもよく、さらに任意に追加のアミノ酸をドラッガブル領域の一方の側または両側に含むものであってもよい。ここで、該アミノ酸が５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、または１００以上の残基数に達する。さらに、フラグメントは、特定の領域のサブフラグメントを含むことができ、該サブフラグメントは、それが由来する領域の機能を保持する。別の実施形態では、フラグメントが免疫源性を有するものであってもよい。
【００４５】
用語「精製（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、存在する優勢種である対象種（すなわち、モル・ベースで、組成物中の個々の他の種のいずれよりも豊富である）をいう。「精製分画（ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）」は、対象種が、存在するすべての種の少なくとも約５０パーセント（モル・ペース）を含む。溶液または文選状態で種の精製を測定をおこなう上で、該種が溶解または分散溶媒またはマトリックスは、通常、そのような測定に含まれない。そのかわり、溶解または分散した種（目的とするものの一つを含む）のみをが考慮される。一般に、精製組成物は、該組成物に存在するすべての種の約８０％を上回る１つの種を有し、存在する種の約８５％、９０％、９５％、９９％以上を有する。対象種は、組成物が本質的に単一の種からなる本質的均質性（従来の検出方法では組成物中に混在する不要な種が検出されない）に達するまで精製することができる。当業者は、本明細書中での教示を考慮してタンパク質精製の標準的技術を用いて、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）を精製することができる。また、ポリペプチドの純度は、例えば、アミノ末端アミノ酸配列分析、ゲル電気泳動、マススペクトル分析分析、および本明細書中の実施例に関するセクションで記述される方法を含む当業者に既知の方法のいくつかによって、測定することができる。
【００４６】
用語「組み換えタンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「組み換えポリペプチド（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、組換えＤＮＡ技術によって生産されられるポリペプチドをいう。そのような技術の一例として、発現タンパク質をコードしているＤＮＡをベクターに挿入して該ベクターが宿主細胞を形質転換して該ＤＮＡによってコードされたタンパク質またはポリペプチドを産生する例が挙げられる。
【００４７】
用語「ＳＥＴドメイン・タンパク質（ＳＥＴ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とは、約１３０残基の保存されたＳＥＴドメイン・モチーフ、任意にプレＳＥＴおよびポストＳＥＴドメイン・モチーフを有する任意のタンパク質（完全長またはフラグメント）をいう。
【００４８】
用語「小分子（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、分子量が約５ｋＤ未満、約２．５ｋＤ未満、約１．５ｋＤ未満、または約０．９ｋＤ未満の化合物をいう。小分子として、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ペプチド・ドミメティック、炭水化物、脂質、または他の有機（炭素含有）または無機分子が挙げられる。多くの製薬会社は、膨大な化学および／または生物学的混合物（しばしば真菌、最近、または藻類抽出物）のライブラリーを所有しており、本発明の任意のアッセイによってスクリーニングが可能である。用語「小有機分子（ｓｍａｌｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、しばしば有機化合物または医学化合物として同定される小分子をいうが、もっぱら核酸、ペプチド、またはポリペプチドである分子は含まない。用語「特異的にハイブリダイズ（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」とは、検出可能かつ特異的な核酸結合をいう。本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および核酸は、非特異的核酸に対して検出可能な結合のかなりの量を最小化するハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、核酸鎖に対して選択的にハイブリダイズする。当該技術分野で公知であり、かつ本明細書中で述べられているように、厳密な条件を用いて選択的ハイブリダイゼーション条件を達成することができる。通常、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および核酸と目的とする核酸との間の核酸配列相同性は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上である。いくつかの例では、ハイブリッダイゼーションおよび洗浄条件を、従来のハイブリダイゼーション方法および本明細書でさらに説明するようにして、厳密な条件下でおこなう。
【００４９】
用語「厳密な条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」または「厳密なハイブリダイゼーション条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」とは、二本鎖が形成されるように２つの相補的ポリヌクレオチド鎖間の特異的ハイブリダイザーションを促進する条件をいう。厳密な条件は、所定のイオン強度およびｐＨで所定のポリヌクレオチド二重鎖に対する熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。相補的ポリヌクレオチドの長さおよび該相補的ポリヌクレオチドのＧＣ含有量が二本鎖のＴｍを定めるので、ハイブリダイゼーションの書尾の特異性を得るのに必要なハイブリダイゼーション条件が定まる。Ｔｍは、ポリヌクレオチド配列の５０％が完全にマッチした相補的鎖にハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨ下で）である。いくつかの例では、特定の二重鎖のＴｍにおおよそ等しいハイブリダイゼーション条件の厳密さを高めることが望ましいと思われる。
【００５０】
Ｔｍを推定するための種々の技術が利用可能である。一般に、二本鎖のＧ−Ｃ塩基対がＴｍに対して約３℃貢献すると見積もられ、一方Ａ−Ｔ塩基対が約２℃、理論的最大値の約８０ないし１００℃まで貢献すると見積もられる。しかし、Ｔｍのより洗練されたモデルが利用でき、Ｇ−Ｃスタッキング相互作用、溶媒効果、所望のアッセイ温度等が考慮する。例えば、プローブは、以下の式を用いて、約６０℃の解離温度（Ｔｄ）を持つように設計される。
Ｔｄ  ＝  （（（（（３  ｘ  ＃ＧＣ）  ＋  （２  ｘ  ＃ＡＴ））  ｘ  ３７）  −  ５６２）／＃ｂｐ）  −５
式中、＃ＧＣ、＃ＡＴ、および＃ｂｐはグアニン−シトシン塩基対の数、アデニン−チミン塩基対の数、ならびに全塩基対の数であり、二本鎖の形成に関与する。
【００５１】
ハイブリダイゼーションは、少なくとも１時間、２時間、５時間、１２時間、または２４時間にわたって、５ｘＳＳＣ、４ｘＳＳＣ、３ｘＳＳＣ、２ｘＳＳＣ、１ｘＳＳＣ、または０．２ｘＳＳＣでおこなうことができる。ハイブリダイゼーションの温度は、反応の厳密さを調整するために、約２５℃（室温）から約４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、または６５℃まで、高めることが可能である。ハイブリダイゼーション反応はまた、厳密さに影響を及ぼす別の薬剤を含むことも可能である。例えば、５０％ホルムアルデヒドが存在下でハイブリダイゼーションをおこなうことで、所定の温度でのハイブリダイゼーションの厳密さが高まる。
【００５２】
ハイブリダイゼーション反応後に、塩分および温度を同じくして、あるいはそれらが異なるようにして、洗浄ステップを１回、または２回以上おこなってもよい。例えば、洗浄の温度を、約２５℃（室温）から約４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、またはそれ以上に上げて、厳密さの調整をおこなうことができる。洗浄ステップを、界面活性剤（例えば、０．１または０．２％ＳＤＳの存在下で実施することが可能である。例えば、ハイブリダイゼーションの後に６５℃での洗浄を２回おこなう。この際、各々の洗浄は、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで約２０分である。また、任意に、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで約２０分の６５℃での洗浄を２回増やすしてもよい。
【００５３】
典型的なハイブリダイゼーション条件として、溶液中、６５℃での一晩ハイブリダイゼーションが挙げられ、その溶液は、５０％ホルムアルデヒド、１０ｘＤｅｎｈａｒｄｔ（０．２％フィコール、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％牛血清アルブミン）、および２００μｇ／ｍｌの変性担体ＤＮＡ、例えば剪断サーモン精子、続いて６５℃で２回の洗浄ステップ（各々、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分）、および６５℃での２回の洗浄ステップ（各々、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分）、からなる。
【００５４】
ハイブリダイゼーションは、溶液中の２つの核酸または溶液中の１つの核酸を、固体支持体（例えば、フィルター）に付着した核酸とハイブリダイズさせることからなる。１つの核酸が固体支持体上にある場合、ハイブリダイゼーションに先立ってプレ・ハイブリダイゼーション・ステップをおこなってもよい。プレ・ハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション溶液（相補的ポリヌクレオチド鎖なし）と同一溶液および同一温度で、少なくとも約１時間、３時間、または１０時間にわたっておこなうことができる。
【００５５】
適当な厳密な条件は、当業者に知られており、または当業者が実験的に決定することができる。例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９），  ６．３．１−１２．３．６；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ；  Ｓ．  Ａｇｒａｗａｌ  （ｅｄ．）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌｕｍｅ  ２０；  Ｔｉｊｓｓｅｎ  （１９９３）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．．ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅｓ，  ｅ．ｇ．，  ｐａｒｔ  ＩＣｈａｐｔｅｒ  ２  ”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  ａｎｄ  Ｔｉｂａｎｙｅｎｄａ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３９：１９  （１９８４）  ａｎｄ  Ｅｂｅｌ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３１：１．２０８３  （１９９２）を参照されたい。
【００５６】
タンパク質に適用したように、用語「実質的同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、デフォルト・ギャップ・ウェイトを用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴ等によって２つのタンパク質配列が最適なかたちで整列される場合、少なくとも約７０パーセントの配列同一性、あるいは少なくとも約８０、８５、９０、９５、またはそれ以上の配列同一性が一般に共有されることを意味する。いくつかの例では、同一ではない残基位置は、上記した保守的アミノ酸置換によって異なる。        
【００５７】
用語「構造的モチーフ（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｔｉｆ）」は、ポリペプチドに関連して用いた場合、アミノ酸配列がたとえ異なったとしても類似の構造となるポリペプチドに言及するもので、構造によってとは、モチーフは、同一の三次構造を形成すること、またはモチーフ内にいくつかのアミノ酸残基が存在すること、またはそれらの骨格鎖もしくは側鎖（側鎖のＣα原子の有無を問わない）が該モチーフ内で相互に関連して配置されている。
【００５８】
用語「治療的有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、そのような処置を必要とする被験体に施す場合、処置を生じるのに十分である修飾因子、薬物、または他の分子の量についていう。治療的有効量は、治療している被験体および症状、該被験体の体重および年齢、症状の重症度、投与方法等に依存して変動するもので、当業者によって容易に決定することができる。
【００５９】
用語「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」とは、核酸の導入（例えば、発現ベクターをレシピエント細胞に導入）を意味し、いくつかの例では核酸媒介遺伝子導入を意味する。用語「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、細胞の遺伝子型が外因性核酸の細胞取り込みの結果として変化するプロセスをいう。例えば、形質転換細胞は、ＳＥＴドメイン・タンパク質、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼの組み換え体形態を発現であり、あるいはアンチセンス発現は伝達された遺伝子から生じて該遺伝子の自然形態の発現を妨げる。
【００６０】
用語「トランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、核酸配列を意味するもので、該核酸配列が部分的または全体的に、それが導入されるトランスジェニック動物または細胞に対して異種であるか、あるいはそれが導入されるトランスジェニック動物または細胞の内在性遺伝子に対して同種である。しかし、上記核酸配列が挿入される細胞のゲノムを変えるようにして動物ゲノムに挿入されるように消化、もしくは挿入されるものである（例えば、天然の遺伝子とは異なる位置に挿入され、またはその挿入物がノックアウトになる）。トランス遺伝子は、最適な発現に必要とされる１種類以上の調節配列および任意の他の核酸（例えば、イントロン）を含むものであってもよい。
【００６１】
「トランスジェニック動物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ）」とは、任意の動物、例えばマウス、ラットもしくはヒト以外の他の動物、鳥、あるいは両生類をいう。動物の１つ以上の細胞に、ヒトの介在、例えば公知の遺伝子導入技術によって導入された異種核酸が含まれる。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、慎重な遺伝子操作によって、例えばマイクロインジェクションまたは組み換えウイルスによって、直接または間接的におこなわれる。遺伝子操作という用語は、古典的な交雑または試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）受精を包含するものではなく、むしろ組み換えＤＮＡ分子の導入を目的としている。この分子を、染色体内に組み込んだり、染色体外でＤＮＡを複製したりすることが可能である。本明細書に記載した典型的なトランスジェニック動物では、トランス遺伝子は細胞に対してタンパク質の組み換え形態を発現させる。しかし、組み換え遺伝子がサイレント状態であるトランスジェニック導入もまた、意図したものである。
【００６２】
用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、それに連結された別の核酸を搬送することが可能な核酸をいう。本発明にもとづいて用いられるベクターの一種がエピソームである。すなわち、エピソームは、染色体外複製が可能な核酸である。他のベクターとして、それらが連結している核酸の自律複製および発現が可能なものが挙げられる。作用可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結した遺伝子の発現を導くことが可能なベクターは、本明細書では「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」と呼ばれている。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用性のある発現ベクターは、しばしば「プラスミド」の形態であり、該プラスミドとは環状二重鎖ＤＮＡ分子をいい、そのベクター形態とは染色体に結合していないことである。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は相互に置き換えることが可能なものとして用いられている。なぜなら、プラスミドはベクターの最も一般的に用いられている形態である。しかし、この発明は、同等の機能をする及びこの後に当業者に公知となる他の形態の発現ベクターを含むことを意図している。
【００６３】
特に明記しない限り、明細書および特許請求の範囲で使用される成分量、反応条件、その他を表す数字は、用語「約（ａｂｏｕｔ）」によってすべての例で変更されることが理解される。したがって、反対に示されない限り、この仕様と取付けられた請求で述べられる数のパラメータは本発明によって得られようとする望ましい性質によって変化する可能性がある近似値である。この明細書および特許請求の範囲で述べられる数のパラメータは、本発明によって得られようとする望ましい性質によって変化する可能性がある近似値である。
Ｃ．薬物発見
Ｃ．１  ドラッガブル領域
実施例に記載された構造的情報の一部にもとづいて、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ，  ａ  ＳＥＴドメイン・タンパク質に新規ドラッガブル領域を同定した。一態様では、本発明は、ＳＥＴドメイン・タンパク質のドラッガブル領域（いくつかの実施形態では、対象ドラッガブル領域に含まれるアミノ酸残基の大多数を含むヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質である。一実施形態では、この領域はプレＳＥＴドメインを含む。別の実施形態では、この領域はポストＳＥＴドメインを含む。別の実施形態では、この領域はＳＥＴドメイン活性部位を含む。別の実施形態では、ＳＥＴドメイン・タンパク質がヒストン・メチルトランスフェラーゼであり、この領域はＡｄｏＭｅｔ／ＡｄｏＨｃｙ補因子、結合ポケット、ペプチド結合クレフト、または標的リジン結合部位を含むものであってもよい。
Ｃ２．修飾因子、対象ドラッガブル領域を用いた修飾因子設計およびスクリーニング
一態様では、本発明は潜在的修飾因子に対する対象ドラッガブル領域のスクリーニング方法と、そのような修飾因子を設計するための方法とを提供する。本発明のポリペプチドに対する修飾因子および他の構造的に関連した分子に対する修飾因子、さらに同一物を含む複合体を以下に記載するように、さもなければ当業者に公知の技術および方法を用いて、同定し、かつ開発することが可能である。本発明の修飾因子は、例えば、ＳＥＴドメイン・タンパク質を持つ生物によって引き起こされる疾患、またはＳＥＴドメイン・タンパク質が関与する疾患の阻害および処置するために用いることができる。
【００６４】
ＳＥＴドメイン・タンパク質によるタンパク質リジン・メチル化は、種々の種でクロマチン構造、遺伝子抑制、転写性活性化、植物代謝、および他のプロセスを調整する。例えば、酵母（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＥＴ１タンパク質はＨ３Ｌｙｓ−４のジメチル化およびトリメチル化を触媒し、Ｌｙｓ−４のトリメチル化は活性遺伝子に排他的に存在すると思われる。さらに、アカパンカビ（Ｎ．  ｃｒａｓｓａ）のＤＩＭ−５は、主にトリメチルＬｙｓ−９を生成し、該トリメチルＬｙｓ−９はＤＮＡメチル化のためのクロマチン領域をマークする。ヒトＳＥＴ７／９タンパク質は、一方では、Ｈ３の排他的モノメチルＬｙｓ−４を生成する。ＳＥＴドメイン・タンパク質は植物にも見いだされる。植物、酵母、および真菌タンパク質間でのそのような違いは、タンパク質の各々の種類に関連した疾患または症状を処置する治療薬、例えば抗真菌治療薬または除草剤の設計で利用可能である。
【００６５】
さらに、ＳＥＴタンパク質は、ほ乳類動物でのクロマチン構造、遺伝子抑制、および転写活性化を調節することから、癌および他の増殖性疾患の多くの形態、Ｗｏｌｆ  Ｈｉｒｓｈｈｏｍ症候群、ならびにＰｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群等、クロマチン構造の障害、遺伝子抑制、転写活性化に関連した疾患または症状を処置するための治療薬の設計に用いられる。
【００６６】
別の態様では、本発明は、ＳＥＴドメイン・タンパク質に対する基質または補因子の結合部位に結合、該部位と相互作用、または該部位の機能もしくは活性を修飾するか、あるいはさもなければ該基質または補因子の結合を修飾する修飾因子に関する。対象ドラッガブル領域の残基の少なくとも１つの残基と結合または相互作用によって、そのような修飾因子は、基質または補因子の結合を減少または阻害すると思われる。同様に、そのような修飾因子は、対象ドラッガブル領域から構成される領域の少なくとも１つの移動または反応を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本発明はＳＥＴドメイン・タンパク質ドラッガブル領域の活性の修飾因子を目的としている。一実施形態では、修飾は、化合物を上記ドラッガブル領域に接触することによって達成される。接触は、化合物とその領域との結合をもたらし、さらに／あるいは上記領域の天然リガンドの結合活性を修飾する。例えば、化合物をドラッガブル領域に結合させ、その天然リガンドが該領域と結合または相互作用するのを防ぐ。別の実施形態では、化合物は天然のリガンドと結合または該リガンドをキレートするものであってもよい。一実施形態では、修飾因子は亜鉛原子とドラッガブル領域との結合に影響を及ぼす。修飾因子は、亜鉛原子へのアクセスまたは該亜鉛原子のキレート化によって、ドラッガブル領域への結合を妨げるものであってもよい。いくつかの実施形態では、亜鉛結合部位は、タンパク質のポストＳＥＴ領域内のシステインから構成される。
【００６７】
修飾因子を用いてＳＥＴドメイン・タンパク質活性を修飾するための種々の方法が本発明によって検討されている。例えば、典型的な方法では、ＳＥＴドメイン・タンパク質を持つ病原性生物を、そのような病原体に対して有効であると考えられている、または有効であることが示されている修飾因子と接触させることが含まれる。
【００６８】
例えば、一態様では、本発明では、癌、増殖性疾患、またはＷｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群もしくはＰｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群にかかった患者を処置する方法を検討するもので、該方法は患者に対して、ＳＥＴドメイン・タンパク質の発現および／または活性を修飾するのに有効な量の修飾因子を投与することが含まれる。いくつかの例では、動物はヒトまたは家畜（牛、豚、山羊、もしくはヒツジ）である。本発明は、さらに、微生物関連疾患または障害にかかった被験体を治療する方法を検討するもので、症状を持つ被験体に対して、本発明の方法の１つを用いて同定された分子を治療上有効量で投与することが含まれる。
【００６９】
別の実施形態では、ＳＥＴドメイン・タンパク質の修飾因子または該修飾因子を含む生物学的複合体を、例えば、患者（ヒトおよび動物を含む）の任意の疾患または他の治療可能な症状を処置する等、かなりの数の用途に対する薬剤の製造に用いることができる。
（ａ）  修飾因子設計  
多くの技術が、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ、構造的に相同な分子、および他の分子）と結合することができる化学成分のスクリーニング、同定、選択、および設計に用いられる。本明細書に記載された方法にもとづいて決定されたヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼおよびその三重複合体についての構造に関する知識によって、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の配座またはより詳しくはそのドラッガブル領域に対して相補的な形状を有する分子および／または他の修飾因子の設計および／または同定が可能になる。そのような技術と方法が、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）のための正確な構造座標と他の情報とに加えて、それについて上述の構造等価物（例えば、先に述べたようにドラッガブル領域に含まれるアミノ酸の構造座標に由来するそれらの構造座標を含む）を使用する可能性があると理解される。          
【００７０】
一態様では、薬物設計の方法は、一般に、選択された化合物が本発明の任意の分子または複合体（またはその一部）とが結合する可能性を計算的に評価することを含む。例えば、この方法は、（ａ）選択された化学物質と、上記分子または複合体のドラッガブル領域とのフィッティング操作を実行するため計算手段を用いるステップと、（ｂ）上記フィッティング操作の結果を分析して、化学物質とドラッガブル領域との結合を定量するステップとを含む。
【００７１】
化学物質は、目視観測、またはＧＲＡＭ、ＤＯＣＫ、もしくはＡＵＴＯＤＯＣＫ等のドッキング・プログラム（Ｄｕｎｂｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｏｌｄｉｎｇ  ＆  Ｄｅｓｉｇｎ，  ２：２７−４２  （１９９７））を用いたコンピュータ・モデリングを用いて調べることができる。この手順は各々の化学物質の形状と化学構造とがどれほど十分に、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、  ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の構造と補完または干渉するかを確かめるために、標的に対する化学成分のコンピュータ・フィッティングをおこなうことを含むことができる（Ｂｕｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，  Ｄｅｃ．：  ９２−９８  （１９９３）；  Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＴＩＰＳ，  １６：６７−７４  （１９９５））。コンピュータプログラムは、例えば、ドラッガブル領域に化学物質の引力、反発、および立体障害を推定するために使用してもよい。一般に、より密接であればあるほど化学物質がより強力になる（例えば、立体障害が低ければ低いほど、および／または引力が強ければ強いほど）。なぜなら、これらの性質がより厳格な結合定数と整合しているからである。  さらに、化学物質の設計がより特異的であればあるほど、化学物質は関連タンパク質と相互作用することなく、望ましくない相互作用による潜在的な副作用を最小限にすることが可能である。
【００７２】
ドラッガブル領域の立体的または電子的性質が化学成分の設計を導くために用いられる分子設計のための種々の計算方法が知られている（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ  Ｍｅｄ．  Ｃａｍ．  ３３：  ８８３−８９４；  Ｋｕｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６１：２６９−２８８；  ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ  （１９８８）  ＪＭｅｄｄ．  Ｃａｍ．  ３１：  ７２２−７２９；  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｓｐｅｃ．  Ｐｕｂｌ．，  Ｒｏｙ．  Ｓｏｃ．  Ｃｈｅｍ．  ７８：  １８２−１９６；  Ｇｏｏｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｊ  Ｍｅｄ．  Ｃａｍ．  ２８：  ８４９−８５７；  およびＤｅｓＪａｒｌａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  ＭｅｄＣａｍ．  ２９：  ２１４９−２１５３）。直接的な方法は、一般に２つのカテゴリーに分類される。すなわち、（１）既知の化学成分の３Ｄ構造（例えば、結晶学データベースから得たもの）をドラッガブル領域に、ドッキングさせて適合度（ｇｏｏｄｎｅｓｓ−ｏｆ−ｆｉｔ）を採点することによる設計と、（２）化学物質がドラッガブル領域で区分的（ｐｉｅｃｅ−ｗｉｓｅ）に構築されるデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）設計とである。化学物質を分子のライブラリーまたはデータベースの一部としてスクリーニングすることができる。用いることが可能なデータベースとして、ＡＣＤ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、  ＮＣＩ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＣＣＤＣ  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｄａｔａ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ＣＡＳＴ  （Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）、Ｄｅｒｗｅｎｔ  （Ｄｅｒｗｅｎｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、  Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  （Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ）、Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ），  ＤＯＣＫ  （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｉｎ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、およびＤｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  （Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ）が挙げられる。コンピュータ・プログラム、例えばＣＯＮＣＯＲＤ  （Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）  またはＤＢ−Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて、二次元で表されたデータ・セットを三次元で表されたものに変換することができる。
【００７３】
化学成分に対して、標的タンパク質のドラッガブル領域または他の部分で空間的にフィットするそれらの能力についての試験をおこなってもよい。本明細書で用いられるように、用語「空間的にフィットする（ｆｉｔｓ  ｓｐａｔｉａｌｌｙ）」は化学物質の三次元構造がドラッガブル領域によって幾何学的に収められることを意味する。化学物質の表面積が好適でない相互作用を形成することなくドラッガブル領域の表面領域に近接している場合、有利な幾何学的フィッティングが生ずる。化学物質が疎水性、芳香族、イオン性、二極性、または水素供与および授与の力によって相互作用する場合に、好ましい相補的相互作用が生ずる。好適でない相互作用は、化学物質の原子とドラッガブル領域の原子との間の立体障害である可能性がある。
【００７４】
もし、本発明のモデルがコンピュータ・モデルであるならば、上記化学成分を計算ドッキング（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｏｃｋｉｎｇ）を介してドラッガブル領域に配置する。もし、一方で、本発明のモデルが構造モデルであるならば、上記化学成分を、例えば手作業ドッキング（ｍａｎｕａｌ  ｄｏｃｋｉｎｇ）でドラッガブル領域に配置する。本明細書で用いられるように、「ドッキング（ｄｏｃｋｉｎｇ）」とは、化学物質をドラッガブル領域に近接させて配置するプロセス、または化学物質／ドラッガブル領域の複合体の低エネルギー配座を見つけるプロセスをいう。
【００７５】
例証した実施形態では、潜在的修飾因子の設計は、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）についての形状相補性の一般的見通しから開始し、標的ドラッガブル領域と幾何学的にフィットする化学成分に関する既知の三次構造の小分子のデータベースをスキャンすることができるサーチ・アルゴリズムが用いられる。このタイプの大部分のアルゴリズムは、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）のドラッガブル領域の形状に対する相補的である化学成分の幅広い組合わせを見いだす方法を提供する。特定のデータベース（例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  （ＣＣＤＢ）  （Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７３）  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｄｏｃ．  １３：  １１９））からの一組の化学成分の各々は、ドッキング・アルゴリズムを用いて幾何学的に許容される多数の配向で、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）のドラッガブル領域に、個々にドッキングされる。いくつかの実施形態では、ＤＯＣＫと呼ばれる一組のアルゴリズムを用いて、ドラッガブル領域の活性部位および認識表面を形成する陥入部および溝部の形状が特徴づけられる（Ｋｕｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．．Ｂｉｏｌ  １６１：  ２６９−２８８）。プログラムは、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の特定の結合部位に対して相補的である鋳型に関する小分子のデータベースを検索することもできる（Ｄｅｓｌａｒｌａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ３１：  ７２２−７２９）。
【００７６】
適合度（ｇｏｏｄｎｅｓｓ−ｏｆ−ｆｉｔ）について配向を評価し、ＡＭＢＥＲまたはＣＨＡＲＭＭ等の分子力学プログラムを用いてさらに検査するために最良のものをとっておく。そのようなアルゴリズムが、ドラッガブル領域に対して形状に相補性がある種々の化学成分を見いだす上で功を奏することが既にわかっている。
【００７７】
Ｇｏｏｄｆｏｒｄ  （１９８５，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２８：８４９−８５７）  およびＢｏｏｂｂｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ３２：１０８３−１０９４）  によって、コンピュータ／プログラム（ＧＲＩＤ）が作られている。このプログラムは、ドラッガブル領域の異なる化学基（プローブと呼ばれる）に対する高親和性を決定しようとする。したがって、ＧＲＩＤは、結合を高めると思われる既知の化学成分に対する修飾を提案するツールを提供する。高親和性の領域としてＧＲＩＤによって識別される部位のいくつかが、一連の既知のリガンドから推理して決定される「薬理作用的パターン（ｐｈａｒｍｃｏｐｈｏｒｉｃ  ｐａｔｔｅｒｎ）」に対応すると考えられる。本明細書で用いられるように、「薬理作用的パターン」は、結合に重要であると考えられる化学成分の特徴の幾何学的配列である。薬理作用的パターンを新規リガンドのための検索用スクリーニングとして用いる試みがなされている（Ｊａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｇｒａｐｈ  ５：４１−４８；  Ｂｒｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）ＪＧｒａｐｈ  ５：４９−５６；  Ｊａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）ＪＭｏｔ  Ｇｒａｐｈ  ４：１２−２０）。
【００７８】
本発明のさらに別の実施形態は、ＣＬＩＸのようなコンピュータ・アルゴリズムを利用するもので、該アルゴリズムは、化学成分のためのＣＣＤＢのようなデータベースを検索するもので、該化学成分は立体的に許容され、かつ化学物質と周囲のアミノ酸残基との間で好ましい化学的相互作用を達成する可能性が高くなる方向で、ドラッガブル領域とともに配向される。この方法は、異なる化学基のための良好な結合位置の母集団に関して領域を特徴づけ、該母集団のメンバーと個々の候補化学基との最大の空間的一致を引き起こす化学成分の配向を検索することにもとづいている。ＣＬＩＸのアルゴリズムの詳細は、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １２：３１−４１に記載されている。
【００７９】
このようにして、化学物質がドラッガブル領域と結合または相互作用する効率を、コンピュータによる評価によって試験および最適化することができる。例えば、ドラッガブル領域と好ましく結合するために、化学物質は好ましくは該化学物質の結合と微細状態（ｆｉｎｅ  ｓｔａｔｅｓ）との間のエネルギーの相対的に小さな違い（すなわち、結合の小変形エネルギー）を示さなければならない。したがって、ある種の、より求められる化学成分を約１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、より好ましくは７ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の結合変形エネルギーによって設計する。化学成分を、全体的な結合エネルギーに類似した複数の配座でドラッガブル領域と相互作用せることができる。これらの例では、それらの例では、結合の変形エネルギーは遊離の対象物（ｅｎｔｉｔｙ）のエネルギーと、化学物質が標的と結合する時に観察される配座の平均エネルギーとの差であるとみなされる。
【００８０】
このようにして、本発明は、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の活性の潜在的修飾因子を同定および設計するためのコンピュータ支援方法を提供するもので、該方法は、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）由来のドラッガブル領域の少なくとも一部分を含む分子または複合体の一組の構造座標をコンピュータ・モデリング・アプリケーションに供給するステップと、化学物質の一組の構造座標を該コンピュータ・モデリング・アプリケーションに供給するステップと、該化学物質が上記分子または複合体と結合すると思われるかどうかについて決定するステップとを有し、上記分子または複合体への結合は、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の活性の潜在的修飾を示す。
【００８１】
別の態様では、本発明は、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）に対する潜在的修飾因子を同定および設計するためのコンピュータ支援方法を提供するもので、該方法は、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）由来のドラッガブル領域の少なくとも一部分を含む分子または複合体の一組の構造座標をコンピュータ・モデリング・アプリケーションに供給するステップと、化学物質の一組の構造座標を該コンピュータ・モデリング・アプリケーションに供給するステップと、化学物質と分子または分子複合体との潜在的結合を評価するステップと、修飾化学物質についての一組の構造座標を生ずるために化学物質を構造的に修飾するステップと、該化学物質が上記分子または複合体と結合すると思われるかどうかについて決定するステップとを有し、上記分子または複合体への結合は、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の活性の潜在的修飾を示す。
【００８２】
一実施形態では、潜在的修飾因子は、ペプチドまたは他の化合物あるいは化学ライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９：３８６−３９０  （１９９０）；  Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８７：６３７８−６３８２  （１９９０）；  Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９：４０４−４０６  （１９９０））。このようにして選択された潜在的修飾因子を、１種類以上の有望な潜在的薬物が同定されるまで、コンピュータ・モデリング・プログラムによる系統的な修飾をおこなうことができる。そのような分析は、ＨＩＶプロテーゼ修飾因子の開発において効果的であることが示された（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：３８０−３８４  （１９９４）；  Ｗｌｏｄａｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ６２：５４３−５８５  （１９９３）；  Ａｐｐｅｌｔ，  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  １：２３−４８  （１９９３）；  Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  薬物  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  １：１．０９−１２８  （１９９３））。あるいは、潜在的修飾因子を、第三者（例えば、化学および製薬会社）から許可される化学製品等の化学製品からなるライブラリーから選択することが可能である。第３の選択肢は、潜在的修飾因子をｄｅ  ｎｏｖｏ合成することである。
【００８３】
例えば、いくつかの実施形態では、本発明はＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の潜在的修飾因子を作製する方法を提供する。この方法は、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の潜在的修飾因子を生ずるために、化学物質または該化学物質を含む分子を合成することを含み、該化学物質はコンピュータ支援方法の過程で同定され、該コンピュータ支援方法は、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）由来のドラッガブル領域の少なくとも一部分を含む分子または複合体の一組の構造座標をコンピュータ・モデリング・アプリケーションに供給するステップと、化学物質の一組の構造座標を該コンピュータ・モデリング・アプリケーションに供給するステップと、該化学物質が上記分子または複合体と結合すると思われるかどうかについて決定するステップとを有し、上記分子または複合体への結合は、潜在的修飾を示す。この方法は、さらに化学物質と分子または分子複合体との潜在的結合を評価するステップと、修飾化学物質についての一組の構造座標を生ずるために化学物質を構造的に修飾するステップとを有し、これらのステップを１回以上繰り返してもよい。
【００８４】
ひとたび潜在的修飾因子が同定されると、つぎに該修飾因子を、巨大分子について、もちろん該巨大分子に依存して、高スループット・アッセイ等の標準的な任意の分析法によって試験することができる。修飾因子の構造に対するさらなる改良は一般に必要である。それは、特定のスクリーニング分析（特に、例えば、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）に結合した修飾因子による１５Ｎ  ＮＭＲ緩和率測定またはＸ線結晶構造解析によるさらなる構造分析）によって提供されたステップの任意のものおよび／または該ステップのすべての連続した反復によって作られる。これらの研究は、生化学分析と同時に実施してよい。        
【００８５】
ひとたび同定されると、潜在的修飾因子をモデル構造として用いることが可能であり、化合物の類似体を得ることができる。次に、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）に対する結合能について、該類似体をスクリーニングする。先行の修飾因子よりも高い結合能で、潜在的修飾因子の類似体がＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）と結合した場合、それを修飾因子として選択することが可能である。
【００８６】
関連したアプローチでは、反復性の薬物設計は、標的タンパク質の修飾因子を同定するのに用いられる。反復性の薬物設計は、タンパク質／修飾因子複合体の連続した三次元構造の組を測定し、かつ評価することによって、タンパク質と修飾因子との間の結合を最適化する方法である。反復性の薬物設計において、一連のタンパク質／修飾因子複合体の結晶が得られ、各複合体の三次元構造が解明される。そのようなアプローチは、各々の複合体のタンパク質と修飾因子との結合に対する洞察を提供する。例えば、このアプローチは、修飾因子活性による修飾因子の選するステップと、この新規タンパク質／修飾因子複合体の結晶を得るステップと、該複合体の三次元構造を解明するステップと、新規タンパク質／修飾因子複合体と既に解明されたタンパク質／修飾因子複合体との結合を比較するステップとによって、達成可能である。修飾因子の変化がタンパク質／修飾因子結合にどのようにして影響を及ぼしたかを観察することによって、これらの結合を最適化することが可能である。      
【００８７】
ドラッガブル領域と結合する化学物質を設計および／または同定することに加えて、上記したように、同一の技術および方法を使用して、タンパク質標的の親和性領域、選択性領域、または望まない領域のいずれかに対して結合または非結合する化学成分を設計および／または同定することに用いることが可能である。そのような方法によって、一つまたはいくつかの標的に対する選択性、あるいは多数の標的に対する選択性が、同一種または多数の種から、達成することができる。
【００８８】
例えば、化学物質は、１つのドラッガブル領域（例えば、親和性領域または選択性領域）に対する結合エネルギーが他の領域（例えば、望ましくない領域）に対するものよりも約２０％、３０％、５０％ないし約６０％以上だけ、より好ましい。それは、違いが、（ａ）２を上回る数の領域間、（ｂ）同一標的からの異なる領域（選択性、親和性、または望ましくない領領域）間、（ｃ）異なる標的の領域間、（ｄ）異なる種由来のホモログの領域間、または（ｅ）他の組み合わせ間で観察される。あるいは、問題となっている２つ以上の領域を持つ上記化学物質のＫｄ（通常は、見かけのｋｄ）を参照することによって比較がなされる。
【００８９】
別の実施形態では、潜在的な修飾因子は、標的タンパク質上の近接する２つのドラッガブル領域に対する結合に関してスクリーニングされる。例えば、標的ポリペプチドの第１の領域と結合する修飾因子は、第２の近くの領域と結合しない。第２の領域に対する結合は、第１の領域に対する修飾因子（または潜在的修飾因子）の存在下で実施される元のスクリーニングまたは第２のスクリーニングでアミド化学シフトの異なる組みにおける変化をモニターすることによって、測定することができる。化学シフト変化の分析から、第２の領域に対する潜在的修飾因子のおおよその位置を同定する。上記領域に対する結合に関する第２の修飾因子の最適化を、構造的に関連した化合物（例えば、上記したような類似体）をスクリーニングすることによって実行することができる。第１の領域と第２の領域とに対する修飾因子が同定されると、三重複合体でのそれらの位置および配向を実験的に測定することができる。この構造的情報にもとづいて、連結した化合物（例えば、統合修飾因子（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ））が合成され、第１の領域の修飾因子と第２の領域の修飾因子とが連結される。いくつかの実施形態で、上記２つの修飾因子が共有結合して、統合修飾因子が形成される。この統合修飾因子を試験することで、上記２つの個々の修飾因子のいずれかよりも標的に対する結合親和性が高いかどうかが決定される。より大きな統合修飾因子は、類似した方法で構築される。例えば、標的上の近傍する３つの領域に結合する３つの修飾因子を連結することで、連結修飾因子よりも標的に対する親和性がさらに高い多数連結統合修飾因子を形成する。この例では、修飾因子をすべてのドラッガブル領域と結合させることが望ましいと考えられる。しかし、それはドラッグ領域への確かな結合が必要ではない場合と考えられ、同一の方法を用いて修飾因子および統合修飾因子を同定することができる。標的のすべてのドラッガブル領域のすべてではなく少なくとも１つへの結合に対する特異性が増加していることを示す修飾因子および統合修飾因子の同定に用いることが可能である。
【００９０】
本発明は、上記したように、薬物設計を使用するいくつかの方法を提供する。例えば、一つの態様では、本発明は、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の修飾因子をスクリーニングする候補化合物を設計する方法を意図している。この方法は、（ａ）結晶化したＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）またはそのフラグメントの三次元構造を決定するステップと、（ｂ）結晶化ポリペプチドまたはフラグメントの三次元構造にもとづいて候補修飾因子を設計するステップと、を有する。
【００９１】
別の態様では、本発明はＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の潜在的修飾因子を同定する方法を意図している。この方法は、（ａ）ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）またはそのフラグメントの三次元座標を提供するステップと、（ｂ）ポリペプチドまたはそのフラグメントのドラッガブル領域を同定するステップと、（ｃ）化合物がドラッグブル領域に結合可能であることを示す三次元座標を含む少なくとも一つの化合物をデータベースから選択するステップとを有し、（ｄ）上記選択された化合物はＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の潜在的修飾因子である。
【００９２】
別の態様では、本発明はドラッガブル領域を含む分子の潜在的修飾因子を同定する方法であって、該方法は、（ａ）ドラッガブル用域（例えば、プレＳＥＴドメイン、またはそのフラグメント）由来のアミノ酸残基の原子座標、１．５Å以下のアミノ酸の骨格原子からの±二乗平均平方根偏差を用いて、ドラッガブル領域（例えば、プレＳＥＴドメイン様領域）を含む分子の三次元構造を生成するステップと、（ｂ）潜在的修飾因子を設計または選択するために三次元構造を用いるステップと、（ｃ）修飾因子を合成するステップと、（ｄ）修飾因子と分子とを接触させて、該修飾因子がその分子と相互作用する能力を測定するステップとを有する。
【００９３】
別の態様では、本発明は化合物がＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の潜在的修飾因子であるかどうかを決定する装置を意図するもので、該装置は、（ａ）（ｉ）ドラッガブル部位（例えば、プレＳＥＴドメイン）を形成するＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の三次元構造および原子の同一性またはそれのフラグメントのアイデンティティと（ｉｉ）実行命令とから構成されるメモリーと、（ｂ）（ｉ）候補化合物に関する三次元構造的情報の受信、（ｉｉ）候補化合物がドラッガブル部位の内部の構造に対して相補的であるかどうかの決定、および（ｉｉｉ）上記決定の結果の出力に対する命令を実行する能力のあるプロセッサーとから構成される。
【００９４】
別の態様では、本発明はＳＥＴドメイン・タンパク質関連疾患または障害を予防または処置するための潜在的化合物を設計するための方法を意図するもので、該方法は、（ａ）結晶化ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）またはそのフラグメントの三次元構造を提供するステップと、（ｂ）結晶化ポリペプチドまたはフラグメントの三次元構造にもとづいたＳＥＴドメイン・タンパク質関連疾患または障害の予防または処置のための潜在的化合物を合成するステップと、（ｃ）ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）を潜在的化合物に接触させるステップと、（ｄ）ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の活性をアッセイするステップとを有し、上記ポリペプチドの活性の変化は、化合物がＳＥＴドメイン関連疾患または障害の予防またはｃに量に有用であることを示す。
【００９５】
（ｂ）修飾因子ライブラリー
組み合わせライブラリーの合成およびスクリーニングは、目的とする有機分子の同定および研究に対する確認された戦略である。本発明によれば、対象ドラッガブル領域と結合、相互作用、または該領域の活性／機能の修飾をおこなう分子を含むライブラリーの合成は、液相合成技術、固相合成技術、または液相と固相との組み合わせによる合成技術の確立された組み合わせ方法を用いて実行することが可能である。組み合わせライブラリーの合成は当業者に周知であり、概説されている（例えば、  ”Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ，  Ｆｅｂ．  ２４，  １９９７，  ｐ．  ４３；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  （１９９６）  ９６：５５５  を参照せよ）。多くのライブラリーが市販されている。当業者は、任意の特定の実施形態のための方法の選択が、発明のライブラリーの調整および分析のためのいかなる特定の実施形態のための方法の選択は、合成される分子の特定の数、特異的反応化学、および特定の機器（例えば、ロボット利用の機器）の有用性に依存することを、理解する。ある種の実施形態では、ライブラリーを生成するために実行される反応は、もし適用可能であれば、高収率で、かつ立体選択的および位置選択的な様式で進行する能力に関して選択される。
【００９６】
本発明の一態様では、本発明のライブラリーは液相技術を使用して生ずる。組み合わせライブリーを合成するための液相技術の伝統的な長所として、より広範な範囲の反応の利用性、製品が特徴づけられる相対的容易性、およびライブラリー・メンバーの素早い識別が挙げられる。例えば、いくつかの実施形態では、液相組み合わせライブラリーを生成するために、平行合成技術が利用され、すべての生成物が各々の反応容器で別々に集められる。特定の平行合成手順では、反応が起こる溶媒を数ミリリットル保持することが可能な小さな穴（ウエル）が横列にｎ個および縦列にｍ個あるマイクロタイター・プレートが用いられる。リガンド等の反応物Ａのｎ個の変異体と、第２のリガンド等の反応物Ｂのｍ個の変異体とを用いて、ｎｘｍウエルにｎｘｍ個の変異体を得ることが可能である。当業者は、より小さなライブラリーが求められる場合、この特定の手順が最も有用であり、特定のウエルが特定のウエルにあるライブラリー・メンバーを同定するための容易な手段を提供することを理解する。
【００９７】
本発明の別の実施形態では、固相合成技術が用いられる。固相技術は、反応が完了に追い込まれる。なぜなら、過剰な試薬が利用され、未反応の試薬が洗い流されるからである。固相合成は、平行合成技術に加えてＦｕｒｋａ他によって開発された「スプリット・アンド・プール（ｓｐｌｉｔ  ａｎｄ  ｐｏｏｌ）」と呼ばれる技術の使用を可能とする（例えば、Ｆｕｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｂｓｔｒ．  １４ｔｈ  Ｉｎｔ．  Ｃｏｎｇｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  （Ｐｒａｇｕｅ，  Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ）  （１９８８）  ５：４７  ；  Ｆｕｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  （１９９１）  ３７：４８７  ；  Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  （１９９３）  ３：４１３を参照せよ）。この技術では、関連分子の混合物を同一反応容器で調製することが可能であり、それによってかなり大きなライブラリー（例えば、１００万以上のライブラリー・メンバーを含むもの）を合成するのに必要な容器の数が実質的に減る。例えば、出発原料が付着した固体支持体をｎ個の容器に分けることができる。ここで、ｎはそのような出発原料と反応する試薬Ａの種類を表している。反応後、ｎ個の容器の中身を一緒にし、つづいてｍ個の容器に分ける。ここで、ｎは現在修飾した開始材料と反応する試薬Ｂの種の数を表す。この手順は、所望の数の試薬が開始材料と反応して本発明のライブラリーを生成するまで繰り返される。                
【００９８】
本発明での固相技術の使用もまた、特異的コード化技術の使用を含むことができる。特異的なコード化技術がＣｚａｒｎｉｋ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９７）  １：６０によって概説されている。当業者は、より小さい固相ライブラリーが特異的な反応ウエル（例えば、９６穴プレート）、またはプラスチック・ピン上で生ずる場合、これらのライブラリー・メンバーの反応歴が特定のプレートの空間座標によって同定され、さらに空間的にコード化されることがわかる。他の実施形態において、コード化技術は固体支持体に付着した特定の「同定試薬（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」の使用を伴うもので、その空間座標を参照することなく、特異的ライブラリーの構造の測定を可能にする。そのようなエンコード技術の例として、限定されるものではないが、空間的コード化技術、グラフィカル・コード化技術が挙げられ、「ティーバック（ｔｅａｃｈ  ｂａｇ）」方法、化学コード化方法、および分光光度学的コード化方法が挙げられる。当業者は、本発明で使用される特定のコード化方法が、所望のライブラリー・メンバーの数と使用される反応化学とにもとづいて選択されなければならないと理解する。
【００９９】
ある種の実施形態において、本発明の分子は、当該技術分野で知られている固体支持体化学を使用して合成することができる。例えば、最大で２０アミノ酸またはそれよりも多い数のアミノ酸を持つポリペプチドは、商商業的に入手可能な器材（例えばＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈのマルチプル有機合成装置）上で標準固相技術を使用して生成することが可能である。いくつかの実施形態では、出発原料または後の反応物が、連結ユニットを介して、または直接的に、固相に付着することが可能であり、さらに所望の分子の合成に用いることができる。連結の選択は、分子と固体支持体との反応性およびそれらの連結の安定性に依存する。リンカー分子を介した固体支持体への直接的付着は、該固体支持体からライブラリー・メンバーが分離しないことが要求される場合、有用であると思われる。例えば、生物学的活性の直接的なオン・ビード（ｏｎ−ｂｅａｄ）分析にとって、ライブラリー・メンバーと固体支持体との間のより強い相互作用が望まれる。あるいは連結試薬の使用は、固体支持体からの本発明のライブラリー・メンバーをより安易に切断する上で有用である。
【０１００】
現在対象となっている方法のオートメーションに関して、種々の機器類は、本発明の化学ライブラリーの安易で効率的な調製、さらにそのようなライブラリーのメンバーをアッセイする方法を可能とするために用いてもよい。一般に、対象化学ライブラリーの合成および調整に関連して用いられるように、オートメーションは、単一の分子のかわりにライブラリーを調製することから多数回にわたり繰り返されなければならない１つ以上の操作ステップを機器が完了させることを伴う。オートメーションの例として、限定されるものではないが、複数の試薬の添加、そえらの混合および反応、反応混合物のろ過、溶媒による固体の線上、溶媒の除去および添加、その他を機器に完了させる。オートメーションは、反応スキームの任意のステップに適用することができ、本発明の組成物で使用するための分子の調製、精製、およびアッセイが含まれる。
【０１０１】
可能なオートメーションの範囲がある。例えば、対象ライブラリーの合成は、完全に自動化される可能性があるか、部分的に自動化される可能性があるだけである。完全自動化される場合、試薬瓶を満たしたり、必要に応じて機器のモニタリングまたはプログラミング以外に、合成法を開始させた後にヒトの介入なしで機器によって対象ライブラリーを調製することができる。対象ライブラリーの合成が完全に自動化されるにもかからず、ライブラリー・メンバーの精製、同定、その他に関してヒトの介入が必要となる可能性がある。
【０１０２】
対照的に、対象ライブラリーの合成の部部的自動化は、ライブラリーを生ずる反応スキーマの物理的なステップ（混合、攪拌、ろ過、その他）によるなんらかのロボット支援を伴う。しかし、それでも試薬瓶を満たしたり、機器をモニタまたはプログラミングする意外に、なんらかのヒトの介在がいまだ必要である。この種のロボット・オートメーションが従来の有機合成および生物学的技術によって提供される支援とは区別される。なぜなら、部分的なオートメーションでも機器が、複数の分子からなる１つのライブラリーが調製されることから多数回完了させることが必要である任意のスキーマの１種類以上のステップが完了させるからである。
【０１０３】
ある種の実施形態では、対象ライブラリーを複数の反応容器（例えばマイクロタイター・プレート）で調製することができ、、またライブラリーの特定のメンバーの同一性を各容器の位置によって決定することができる。別の実施形態では、対象ライブラリーは溶液中で合成することが可能であり、またデコンボリューション技術を用いることによって、特定のメンバーの同一性を決定するこができる。
【０１０４】
発明の一態様では、対象スクリーニング方法は固定されたライブラリーを利用して実施することが可能である。いくつかの実施形態において、固定されたライブラリーには、先に述べたように微生物と結合する能力がある。適当な支持体の選択は、当業者にとってルーチンである。重要なクライテリアは、それを含む可能性がある支持体の反応性ライブラリーの調製に必要な反応に干渉する。不溶性高分子の支持体はポリスチレン、ポリスチレン／ジビニルベンゼン・コポリマー等にもとづいて官能性をもたせたポリマーを含み、第４．３節で記述されるいずれかの粒子が挙げられる。高分子支持体を固体支持体に被覆、移植、さもなければ結合させること可能であると理解される。
【０１０５】
別の実施形態では、高分子の支持体を、可逆的可溶性高分子によって提供することが可能である。そのような高分子の支持体は、ポリビニルアルコールまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にもとづいた官能化されたポリマーを含む。適当な不活性非溶媒を加えることで、可溶性支持体を不溶性にしてもよい（例えば、沈殿させてもよい）。可溶性高分子支持体を使用して実行される反応の１つの長所は、溶液の反応がより急速である可能性があって、より高く屈する可能性があって、不溶性高分子の支持体の上で実行される反応より完全である可能性があるということである。溶液の反応は、不溶性高分子支持体上で実行される反応と比べて、より急速、おり高い収率、およびより完全である。
【０１０６】
ひとたび所望の溶液相または固体支持体結合テンプレートのいずれかの合成が完了すると、つぎにテンプレートをさらなる反応に利用して、所望の溶液相または固体支持体結合構造を生じる。固体支持体結合テンプレートの使用は、より迅速な分割およびプール技術の活用法を可能にする。
【０１０７】
ライブラリー・メンバーの特徴付けを、標準的な分析技術（例えばマススペクトル分析、核磁気共鳴スペクトル分析、１９５ＰｔおよびＩＨ  ＮＭＲクロマトグラフィー（例えば、液体その他）ならびに赤外分光学）を使用して実行することができる。当業者は、特定の分析技術の選択が、本発明のライブラリー・メンバーが溶液相または固体相であるかどうかに依存することを理解する。そのような特徴付けに加えて、より手早い識別を可能にために、ライブラりー・メバーを別々に合成することができる。
【０１０８】
（ｃ）試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイ
ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の任意の形態、例えば標的ドラッガブル領域を含む完全長ポリペプチドまたはそのフラグメントは、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）分析で候補小分子および他の修飾因子の活性を評価するのに用いられる。そのような分析の１つの実施形態において、ドラッガブル領域、目的とするタンパク質相互作用、または対象ドラッガブル領域を含んでいるタンパク質複合体の形成の生物学的活性を調製する薬剤が同定されている。そのような分析の別の実施形態では、対象ドラッガブル用域に結合または相互作用する薬剤が同定されている。ある種の実施形態では、試験剤は小有機分子である。候補剤は、例えば、以下の種類の化合物から選択されるもおであってもよい。すなわち、界面活性剤、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、小分子、サイトカイン、またはホルモン類である。いくつかの実施形態において、候補治療薬は化合物ライブラリーに含まれるものであってもよい。これらのライブラリーは、上記した組み合わせ合成方法用いて生成することが可能である。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のいくつかの実施形態において、標的遺伝子または遺伝子産物を結合する候補治療薬の能力は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）分析によって評価される。いずれの実施形態（次のセクションで説明）においても、結合実験は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）であってもよい。
【０１０９】
本発明は、本発明のポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドの作用を修飾する化合物を同定するために、複数の化合物を速リーニングする方法も提供する。おのスクリーニングの方法は、高スループット技術をともなうものであってもよい。例えば、修飾因子をスクリーニングするために、合成反応混合物、細胞性成分（例えば、膜、細胞外皮、細胞壁）、もしくはそれらのいずれの標本、全細胞または組織、あるいはＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）を含む生物全体、さらにそのようなポリペプチドの標識基質またはリガンドを、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の修飾因子である候補分子の存在または非存在下で、インキュベートする。ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）を修飾する候補タンパク質の能力が、標識リガンドの結合の減少またはそのような基質由来の生成物の減少に反映される。生成物の生産率または生産水準の検出は、リポーター・システムを用いて、レポーター・システムを用いて、増強してもよい。この点に関して有用であると考えられるレポーター・システムは、限定されるものではないが、生成物に変わる比色標識基質、発明またはポリペプチド活性の核酸の変化に反応するリポーター遺伝子と当該技術分野で知られている結合実験とが包含される。
【０１１０】
ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の修飾因子を分析するための別の例は、競合アッセイである。この競合アッセイは、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）および潜在的修飾因子を、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）に結合する分子、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）に結合する組み換え分子、天然の基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド・ミメティックと、競合阻害アッセイにとって適当な条件下で、結合させる。本発明のポリペプチドを、結合分子に結合または生成物に変換したＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の分子数を正確に測定して、潜在的修飾因子の効果が評価できるように、放射能または比色化合物等によって標識することができる。
【０１１１】
ポリペプチドの活性を修飾する分子を同定する多数の方法が、当該技術分野で知られている。例えば、そのような方法の一つでは、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）に試験化合物を接触させ、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の活性を試験化合物の存在下で測定することであり、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の活性の変化は、試験化合物がＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の活性を修飾することを示す。
【０１１２】
別の実施例では、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）を調節する化合物は、（ａ）ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）を試験化合物を接触させ、（ｂ）試験化合物の存在下でポリペプチドの活性を測定することによって、同定され、ポリペプチドの活性の変化は、該試験化合物がタンパク質を修飾することを示す。
【０１１３】
いくつかの例では、試験化合物はＳＥＴドメイン・タンパク質上で直接作用するものでなく、その天然リガンド（例えば、補因子または基質）の一つに作用する。例えば、いくつかの試験化合物は、天然リガンド（例えば亜鉛）をキレート化する可能性または該天然リガンドと結合して、天然リガンドがＳＥＴドメイン・タンパク質に結合するのを妨げるものであってもよい。そのような試験化合物の評価は、天然リガンドへの結合を検定することで、または天然リガンドの結合に通常関連した活性を検定することでおこなうことができる。
【０１１４】
対象アッセイのある種のものでは、対象組成物を用いて結果を評価するために、既知の分子（例えば、標的に対する結合親和性が既知のもの）に対して比較をおこなってもよい。例えば、既知の分子と目的とする新規分子とをアッセイする。対象複合体に対するアッセイの結果は、既知の分子と比較可能な該対象複合体の種類および大きさに関するものである。既知の分子の応答と定量的に異なる対象複合体が分析で一種の反応を示す程度まで、アッセイでのそのような複合体に対する結果が陽性または陰性の結果とみなされる。いくつかの分析法では、応答の大きさは、既知の分子での結果によるパーセント応答として表され、例えばもしそれらが同一であるならば、既知の結果の１００％となる。
【０１１５】
当業者が理解するように、本発明の説明にもとづいて、結合アッセイを用いてポリペプチドに結合する薬剤の検出が行える。無細胞系のアッセイを用いて、ポリペプチドと相互作用することが可能な分子を同定することができる。好ましい実施形態では、そのような分子を同定する無細胞系のアッセイは、標的と試験分子または試験分子ライブラリーとを含む反応混合物から本質的に構成される。試験分子は、例えば、標的（例えば、生物学的に不活性なペプチドまたは小分子）の既知の結合パートナーの誘導体であってもよい。結合能について試験すべき薬剤の生産は、例えば細菌、酵母、または他の生物（例えば天然産物）によって、化学的に（例えば、小分子、ペプチド模倣体を含む）、あるいは遺伝子組み換えによって生産することができる。いくつかの実施形態では、試験分子は、脂質、炭水化物、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、小分子、天然産物、アプタマー、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。本発明の別の実施形態では、結合アッセイは無細胞系ではない。特定の実施形態では、標的に結合する分子を同定するためのそのようなアッセイは、標的微生物および試験分子もしくは試験分子ライブラリーを含む反応混合物から構成される。
【０１１６】
分子および天然の抽出物のライブラリーを試験する多くの候補スクリーニング・プログラムでは、所定の時間に調べる分子の数を最大限にするために、高いスループット・アッセイが求められる。無細胞系（例えば、精製または半精製タンパク質またはライセートにより誘導される可能性あるもの）で実施される本発明のアッセイは、多くの場合、該タンパク質が生成されて迅速な展開および相対的に容易な検出が標的と試験分子とのあいだで行えるという点で、「プライマリー」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験分子の細胞毒性および／または生物学的利用率は、一般にｉｎ  ｖｉｔｒｏ系では無視することができ、その代わりに、主に、標的に結合する分子の能力に対してアッセイの焦点が当てられている。したがって、潜在的結合分子は、細胞ライセート内で目的とする機能的相互作用の構成によって生ずる無細胞系で検出可能である。それに取って代わるフォーマットでは、アッセイは、後述するように、ライセートをベースとするアッセイで多くの利益を与える再構成タンパク質混合物として誘導される。
【０１１７】
一態様では、本発明はＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）（ドラッガブル領域に結合する分子のスクリーニング）に使われる可能性があるアッセイを提供する。典型的な結合アッセイでは、目的とする分子を、標的細胞表面ポリペプチドから生ずる混合物と接触させる。標的ポリペプチドに対する予想結合形態の検出および定量化は、標的との結合での分子効率を決定するための手段を提供する。分子効率の評価は、種々の濃度の試験分子を用いて得たデータから用量応答曲線を生成することで、おこなえる。さらに、対照用のアッセイも実施して比較のための基線を設けてもよい。対照アッセイでは、試験分子の非存在下、複合体の形成を定量化する。
【０１１８】
分子と標的ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）またはＳＥＴドメイン・タンパク質を含んでいる微生物との間での複合体形成、種々の技術によって検出することが可能であり、これらの多くは効率的に上述されている。例えば、複合体形成における修飾の定量化を、例えば検出可能に標識したタンパク質（例えば、放射線標識、蛍光標識、または酵素標識）を用いて、免疫アッセイによって、あるいはクロマトグラフィーによる検出によって、おこなうことが可能である。
【０１１９】
したがって、本発明の１つの典型的スクリーニング・アッセイは、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）またはその機能的フラグメントを試験分子または試験分子ライブラリーと接触させるステップと、複合体の形成を検出するステップとを含む。検出を目的として、例えば、上記分子を特異的マーカーで標識し、試験分子または試験分子のライブラリーを異なるマーカーで標識してもよい。試験分子とポリペプチドまたはそのフラグメントとの相互作用を、インキュベーション・ステップおよび洗浄ステップ後に、２種類の標識の濃度（レベル）を測定することによって、検出することが可能である。洗浄ステップ後の２種類のラベルの存在は、相互作用を表す。そのようなアッセイを、標的全体と作用するように修飾してもよい。
【０１２０】
ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）、標的、および分子の間の相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（光学現象）を検出するリアル・タイムＢＩＡ（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ）を用いて同定することも可能である。検出は、生物特異的インタフェースでの巨大分子の質量濃度の変化に依存するので、反応体のいかなる標識も必要としない。一実施形態では、試験分子のライブラリーをセンサー表面に固定化することができる（例えば、マイクロ・フロー・セルの一壁面を形成する）。つぎに、標的を含有する溶液が連続的にセンサーの表面上を流れる。シグナル記録で示されるように共鳴角度の変化は、相互作用が生じていることを示している。この技術は、さらに、ＰｈａｒａｍａｃｉａのＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されている。
【０１２１】
好ましい実施形態では、アッセイの自動化に対応するのと同様に、非複合体形態から複合体の分離を促進するために標的を固定化することが望ましい。試験分子へのポリペプチドの結合は、反応物を入れるのに適した任意の容器で達成することができる。例として、マイクロタイター・プレート、試験管、および遠心管が挙げられる。一実施形態では、融合タンパク質を与えることで、標的にマトリックスが結合するのを可能とするドメインが加わる。例えば、グルタチオン−Ｓ−転移酵素／ポリペプチド（ＧＳＴ／ポリペプチド）融合タンパクを、グルタチオン・セファロース・ビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）  またはグルタチオン誘導体化マイクロタイター・プレート上に吸着させて標識試験分子と結合せ（例えば、Ｓ３５標識、Ｐ３３標識等）、さらに複合体形に貢献する状況下（例えば、わずかに厳密さが高い条件であり、塩およびｐＨについて生理的条件）でインキュベートした混合物が求められる。インキュべーションに続いて、ビーズを洗浄して任意の非結合標識を除去し、複合体を引き離した後、固定化したマトリックスおよび直接的に、または上清内で、固定化し放射標識したマトリックス（例えば、シンチラントに置かれたビーズ）を測定する。あるいは、複合体をマトリックスから引き離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ビーズ分画に見いだされるポリペプチドまたは結合パートナーの濃度を、例えば付された実施例に記載されたような標準的な電気泳動技術を用いてゲルからビーズ分画を定量した。上記の技術もまた修飾することもでき、試験分子が固定され、標識分子を固定化試験分子とインキュベートする。本発明の一実施形態では、試験分子を、任意にリンカーを介して、本発明の粒子に固定化して、例えば最終組成物を生成する。    
【０１２２】
マトリックス上に標的または分子を固定化させる他の技術を対象のアッセイで用いることができる。例えば、標的または分子の固定化を、ビオチンおよびストレプトアビジンの接合を利用しておこなうことができる。例えば、ビオチン標識されたポリペプチド分子を、周知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ），を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ハイドロキシ・スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆９６穴プレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化した。あるいは、標的または分子と反応する抗体をプレートのウエル内に誘導体化し、標的または分子を抗体接合によってウエル内にトラップすることができる。上記したように、試験分子の試料をプレートのポリペプチド提示ウエルでインキュベートし、該ウエルにトラップされた複合体の量を定量化することができる。そのような複合体を検出するための典型的な方法は、ＧＤＳＴ免疫化複合体について記載されたものに加えて、複合体に反応する抗体または該複合体の一つに反応する抗体を用いた複合体の免疫検出が挙げられ、同様に、内因性または外因性の活性で標的または分子に関連した酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。後者の例では、酵素が化学的に結合または標的もしくは分子を持つ融合タンパク質として提供される。実例を示すために、標的ポリペプチドを西洋わさびペルオキシダーゼと遺伝的に融合または化学的に架橋形成させて、分子により複合体内にトラップされたポリペプチドの量を酵素の色素産生基質（例えば３，３’−ジアミノ−ベンザジン・テトラヒドロクロリドまたは４−クロロ−１−ナフトール）によって評価することが可能である。同様に、ポリペプチドとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとを含む融合タンパク質が提供され、さらに複合体形成が１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いたＧＳＴ活性の検出によって、定量化される（Ｈａｂｉｇ  ｅｔ  ａｌ  （１９７４）  ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４９．７１３０）。
【０１２３】
複合体にトラップされた成分の一つを定量化するための免疫検出法に依存したプロセスのために、成分に対する抗体（抗ポリペプチド抗体）を用いることができる。あるいは、複合体に検出される成分は、融合タンパク質の形態の「抗原決定基標識（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｔａｇｇｅｄ）であってもよい。この融合タンパク質は、ポリペプチド配列に加えて、抗体が容易に利用できる（例えば、商業的なソースから）第２のポリペプチドを含む。例えば、上記したＧＳＴ融合タンパク質もまたＧＳＴ部分に対する抗体を用いた結合の定量化として用いられる。他の有用なエピトープ・タグとして、ｍｙｃ−エピトープ（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：  ２１１５０−２１１５７を参照せよ）が挙げられる。このエピトープとして、ｃ−ｍｙｃ由来の１０残基配列と、ｐＦＬＡＧ系（（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）  またはｐＥＺＺ−タンパク質Ａ系  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  ＮＪ）とが挙げられる。
【０１２４】
本アッセイのいくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系実施形態では、標的を含む溶液は、少なくとも半精製タンパク質の再構成タンパク質を含む。半精製（ｓｅｍｉ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）によって、再構成された混合物で利用される構成要素が他の細胞またはウィルス・タンパク質からすでに切り離されていることを意味する。例えば、細胞ライセートと対照的に、標的タンパク質は混合物の他のすべてのタンパク質に対して相対的に少なくとも５０％の純度で存在し、より好ましくは９０〜９５％純度で存在する。対象方法のいくつかの実施形態では、再構成タンパク質混合物は、結合活性測定能に干渉またはそれを変えてしまう他のタンパク質（例えば細胞またはウイルス起源）を該再構成混合物が実質的に欠くようにして高度に精製されたタンパク質を、混合することによって、誘導される。一実施形態では、再構成タンパク質混合物の使用は、標的：分子相互作用条件をよりいっそう慎重に制御することを可能とする。
【０１２５】
本発明のさらに別の実施形態では、感染力アッセイの相違を利用して、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）を発現する酵母、真菌、または他の病原体が細胞に結合、融合、または感染するのを防ぐことが可能である。融合、結合、感染が予防されると、分子または組成物が治療薬として有効となる可能性がある。    
【０１２６】
スクリーニング法の全ては、種々のアッセイ・フォーマットを用いて達成することができる。本開示に鑑みて、本明細書中にははっきりと記載されていないにもかかわらず、当業者は知り、かつ理解する。タンパク質複合体またはタンパク質−核酸複合体のフォーマットのような状況と酵素活性に近いアッセイ・フォーマットとは、多くの異なる形態で生ずる可能性がある。当業者は、本発明の記載にもとづいて理解し、かつ限定されるものではないが、無細胞系に基づくアッセイを包含する（例えば、精製タンパク質または細胞ライセート、同様に無傷の細胞を利用する細胞をベースとしたアッセイ）。所定の標的から生じているアッセイ結合：分子相互作用は、反応物を含むのにふさわしい任意の血管でも堪能である可能性がある。例として、マイクロタイター・プレート、試験管、およびマイクロ遠心管が挙げられる。任意のアッセイをキット・フォーマットしたり、自動化することも可能である。以下に詳しく述べられたアッセイの多くは、一般の原理、例えば他の特定のアッセイにあてはまる可能性がある融合の妨害または防止に依存する。
【０１２７】
（ｄ）生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）アッセイ
候補の評価を、細胞をベースとする多数のアッセイ（疾患病理学の異なる機構の代表例）のいずれかによって、またさらなる動物実験によっておこなうことができる。そのような方法をこのセクションでは生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）系のものと言及する。なぜなら、それらの方法は、培養中の細胞全体または動物もしくは該動物から採取した試料の使用をともなうからである。これらの方法は、候補治療的なスクリーニング法の場合と同様に、標的の確認にも用いられる。例証となる実施形態において、被験体前駆細胞とその子孫を用いて、種々の化合物をスクリーニングすることができる。そのような細胞を、最小培地で一定期間維持することができる（例えば、７〜２１日間またはそれ以上）。また、そのような細胞を任意の化合物を接触させ、培地中での前駆細胞の細胞成長、増殖、または分化のいずれか１つについて、そのような化合物の効果を判断することができる。所定の化合物に応じたそれらの細胞の成長、増殖、または分化の検出および定量化によって、所定の管移植（ｄｕｃｔａｌ  ｅｘｐｌａｎｔ）での成長、増殖、または分化のいずれか１つを誘導する際の上記化合物の有効性を測定するための手段が得られる。細胞の増殖を測定する方法は周知であり、最も一般的には、細胞複製に特有のＤＮＡ合成を測定することが含まれる。しかし、タンパク質合成の測定も使用することが可能である。タンパク質合成を測定する方法が当該技術分野で数多くあり、それらのうちの任意のものが本発明にもとづいて使用される。本発明の実施形態では、タンパク質合成の測定を、放射性標識アミノ酸（例えば３Ｈ−ロイシン）または免疫蛍光による検出用の標識アミノ酸もしくはアミノ酸類似体を用いておこなった。化合物の有効性を、種々の濃度の化合物を使用して得られるデータから、用量応答曲線を作って評価することができる。対照アッセイもまた実施して比較のための基線を設けた。所定の試験化合物に反応して増幅される前駆細胞集団の同定を、先に述べたように、そのよう免疫表現型のタイピングによっておこなう。
【０１２８】
さらに、候補治療薬の有効性の試験を、候補治療薬を試験動物に投与し、標的ＳＥＴドメイン・タンパク質が関与した疾患（例えば、真菌感染、癌、増殖性疾患、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群）の進行または少なくともその１つの症状の阻害をモニタリングすることでおこなうことができる。
【０１２９】
ＳＥＴドメイン治療薬のための典型的な細胞系統および細胞培養（全細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ候補治療薬スクリーニングでも使用可能）として、酵母および真菌の細胞および細胞系統、同様に癌を持つ被験体由来の癌細胞系統が挙げられる。細胞系統および細胞培養を、周知の細胞培養技術を用いて培養することができる。培養のための適当な媒体として、化学的に定義された媒体と同様に組織抽出物および体液にもとづいた天然媒体が挙げられる。本発明の用途に適した媒体として、無血清媒体と同様に血清含有媒体が挙げられる。血清は任意の源（子牛、牛胎仔、ウマ、およびヒト血清）から得ることができる。どのような選択された媒体も１つ以上の以下ものを適当な組み合わせで含むことができる。すなわち、基本培地、水、緩衝液、フリーラジカル捕捉剤、界面活性剤、サーファクタント、ポリマー、セルロース、塩類、アミノ酸、ビタミン、炭素源、有機補助食品、ホルモン類、成長因子、抗生物質、栄養分および代謝産物、脂質、ミネラル、ならびに阻害剤である。媒体の選択または開発は、媒体の組成物から特定のｐＨ、炭酸ガス（ＣＯ２）分圧、酸素分圧、モル浸透圧濃度、粘性および／または表面張力が結果としれ得られるように、おこなわれる。上記の方法のインキュベーション・ステップは、温度および気圧が制御される環境で細胞培養を維持することによって達成される。培養条件は、細胞培養（最適培養条件は後述する）で細胞増殖と収縮活動を維持するために変えられる。
【０１３０】
特定の症状（例えば、癌または他の増殖性疾患）の動物モデルから採取した細胞、組織、または他の試料を上記方法で用いることができる。組織および試料を種々の公知の方法（例えば、外科的切除、血液または他の体液の採取、蓄尿、塗布、その他）を用いて動物から抽出してもよい。動物由来の細胞および／または組織および／または試料を評価する実験の例として、限定されるものではないが、細胞の形態学的検査、滑液組織の組織学的検査、ＤＮＡ複製および／または発現の評価、酵素活性評価アッセイ、ならびにプログラム化された細胞死もしくはアポトーシスを研究するアッセイが挙げられる。そのような実験を実行する方法は、標準的であり、かつ周知である。
【０１３１】
全動物を使用するスクリーニング・アッセイのために、候補薬剤または処置を、被験体動物に対して適用する。概して、動物群を陰性、無処置、またはプラセボ治療対照群として用い、また試験群を候補両方で処置する。一般に、複数のアッセイを異なる投薬量で実施することで、種々の投薬量に対する異なる応答が得られる。投薬量および投与経路は、検証される特異的な化合物または処置によって定められ、特異的な製剤、候補薬剤の安定性、動物の反応等に依存する。
【０１３２】
分析は、疾患誘導の防止での効果の測定を目的としものであってもよく、疾患の導入前、すなわち腫瘍細胞または病原の注入前に、処置剤の投与がおこなわれる。あるいは、分析は既存の病変の退行に対しておこなわれ、処置剤は疾患が最初に発症した後、または中等度から重度の疾患の確立後に投与される。しばしば、予防に効果的な処置は、疾患の退行に対しても効果的である。
【０１３３】
いずれの場合も、疾患の発症または退行に十分な時間後、該処置の効果を決定するのに適当な視覚的、組織学的、免疫組織学的、および他のアッセイ処置の衝撃について動物を評価した。結果の表現を、該結果の統計学的分析の基礎が提供されるように半定量的または定量的スケールで、おこなってもよい。
【０１３４】
（ｄ）有効性および選択性の研究
つぎに、化合物の有効性を付加的な生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイおよび生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）アッセイで試験することが可能である。試験化合物を細胞または組織に投与し、組織または細胞の少なくとも１つの特徴または挙動をモニターすることができる。例えば、特定の疾患、増殖状態、または分化状態に特有の１種類以上の標的遺伝子の発現もまた、組織または細胞への試験化合物の投与前後に測定してもよい。それらの標的遺伝子の１種類以上の発現の正規化は、動物の疾患を処置する化合物の有効性を示す。別の例では、組織または細胞への試験化合物の投与前後に、標的タンパク質の活性を測定してもよい。  
【０１３５】
化合物の有効性の評価を、種々の濃度の化合物を使用して得られるデータから、用量応答曲線を作ることで、おこなうことができる。対照アッセイもまた、比較のための基線を設けるために実行される。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトで用いる投薬量の範囲を明確に述べる際に使うことができる。いかなる補助食品の投薬量が、毒性がほとんどないＥＤ５０を示す循環濃度の範囲内に概ね入る。投薬は、使用される剤形と利用される投与経路とに応じて、その範囲の中で変動可能である。本発明の薬剤にとって、治療的かつ効果的な用量は、細胞培養アッセイからまず最初に推定してもよい。用量を、循環血漿中濃度範囲を成し遂げるために、動物モデルであたえてもよく、ＩＣ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む。そのような情報を使用してヒトによって有用な用量をより正確に測定するために用いることもできる。血漿中濃度を高性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０１３６】
本発明の別の実施形態では、薬物は合理的な薬物設計によって開発されるもので、すなわち、コンピュータで読み込み可能な形に保存され、かつアルゴリズムによって分析される情報にもとづいて、設計または同定がなされる。現在のところ、発現プロフィールのデータベースがますます確立され、その多数のものが好適に公的に利用できる。本発明は、発現プロフィールを、該プロフィールの生成方法と同様に、提供する（次のセクション参照）。疾患細胞に対応する正常細胞の遺伝子発現プロフィールに対する疾患細胞の遺伝子発現プロフィールにおける変化に類似するように、疾患に特有の遺伝子の少なくともいくつかの発現に影響を及ぼす薬物の記述に対するデータベースのスクリーニングによって、疾患細胞での遺伝子発現を正常化させる化合物が同定される。そのような化合物の誘導体および類似体は、化合物の活性を最適化することで、また上記したように試験および最適化をおこなうことで、合成することができる。
【０１３７】
候補治療薬の選択性は、標的に対する活性を他の遺伝子またはタンパク質に対する活性と比較することによっても評価することができる。例えば、標的遺伝子またはタンパク質に関する候補治療薬の選択性を、各々のＫｄ値（すなわち、各修飾因子−ドラッガブル領域複合体についての解離定数）を用いて、または生物学的効果がｋｄ、各々のＥＣ５０値の比（すなわち、各ドラッガブル領域と相互作用する修飾因子の最大反応の５０％を生ずる濃度）を下回って観察される例で、別の化合物との比較によって発現させることが可能である。
【０１３８】
ひとたび化合物が標的の阻害剤の活性として識別されると、最適化のためのプログラムが活性の強力さおよび／または選択性を改善する努力がおこなわれる。構造活性相互作用（ＳＡＲ）の分析は、化合物構造の選択的修飾の反復性および生化学的または生物学的活性に対するそれらの相関を一般に伴う。関連化合物のファミリーが設計され、全てが所望の活性をめざし、該ファミリーのいくつかのメンバーにより、すなわち適当な薬理学的プロフィールを持つもの、潜在的に治療用候補として定量化する。上記したように、標的に結合する化学物質を設計および／または同定することに加え、同一の技術および方法を使用し、タンパク質または遺伝子標的の親和性領域、選択性領域、または望まれない領域のいずれかと結合する、または結合できない化学成分を、設計および／または同定する。そのような方法によって、１つ以上用の選択、または代わりにマルチターゲット用の選択性は、同じ種からまたは複数の種から、達成可能である。
【０１３９】
例えば、化合物を設計および／または同定することで、約２０％、３０％、５０％ないし約６０％以上で、１つのドラッガブル領域（例えば、親和性領域または選択性領域）に対する結合エネルギーが別の領域（例えば、望まない領域）よりも好ましくなる。違いが観察される例は以下の通り：すなわち、ａ）２を上回る数の領域間、（ｂ）同一標的の異なる（選択性、親和性、または望ましくない）領域間、（ｃ）異なる標的の領域間、（ｄ）異なる種のホモログ領域の間、または（ｅ）他の組み合わせ間である。あるいは、比較は、問題の２つ以上領域で、化学物質のＫｄ（通常見かけ上のＫｄ）への言及によってなされる可能性がある。
【０１４０】
もう一つの側面において、潜在的化合物は標的タンパク質および遺伝子上で２つの近接ドラッガブル領域に対する結合について、スクリーニングされる。例えば、標的ポリペプチドの第１の領域に結合する化合物は、第２の近傍領域には結合しない。第２の領域に対する結合は、第１の領域に対して候補治療薬（または潜在的修飾因子）の存在下でオリジナル・スクリーンまたは第２のスクリーンのいずれかでの異なる組のアミノ酸化学シフトにおけるモニタリング変化によって、決定することができる。つぎに、領域に対する結合のための第２の修飾因子の最適化は、構造的に関連した化合物（例えば、上記したような類似体）をスクリーニングすることによって実行される。第１の領域および第２の領域のための修飾因子が同定されると、三重複合体内でのそれらの位置および配向が実験的に測定される。この構造的情報を基礎として、連結化合物（例えば連結の修飾因子）が合成され、第１領域用の修飾因子および第２領域用の修飾因子が連結される。いくつかの実施形態では、２つの修飾因子が共有結合して連結修飾因子を形成する。この連結修飾因子を試験して、２つの個々の修飾因子のいずれかよりも標的に対する結合親和性が高いことを判断する。連結修飾因子は、２つの個々の修飾因子のいずれかよりも標的に対する結合親和性が高い場合、修飾因子として選択される。より大きい連結修飾因子は、類似した方法で構築されることができる例えば、複数連結した連結修飾因子を形成するために目標に関して３つの近接領域に結合する３つの修飾因子を連結する。それは連結修飾因子よりも標的に対する親和性がよりいっそう高い。この例では、すべてのドラッガブル領域対して結合する修飾因子を持つように求められている考えられる。しかし、ドラッガブル領域のいくつかに対する結合は必要ではない例であると考えられ、同一の技術を用いて修飾因子を同定し、連結修飾因子は、の少なくとも１つ、しかしすべてではないドラッガブル領域への結合に基づいた特異性の増加を示す。しかし、ドラッガブル領域のいくつかに対する結合は必要ではない例であると考えられ、同一の技術を用いて修飾因子を同定し、連結修飾因子は、の少なくとも１つ、しかしすべてではないドラッガブル領域への結合に基づいた特異性の増加を示す。
【０１４１】
Ｄ．薬理学的組成物
この発明の医薬組成物は、本発明にもとづいて同定された任意の修飾因子、または薬学的に許容されるその塩、および薬学的に許容される担体（アジュバンド）またはベヒクルを有する。用語「薬学的に許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）は、組成物の他の成分と互換性を持つという意味において「許容される」もので、そのレシピエントに有害でない担体のことをいう。
【０１４２】
そのような薬学的組成物を作製かつ使用する方法として、例えば、癌、増殖性疾患、症候群、例えばＷｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｍ  または  Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ等の症候群、あるいは感染の処置等もまた、本発明に包含される。本発明の医薬組成物は、経口的、非経口的に、吸入スプレー、局所、直腸、経鼻、経膣、またはインプラント・レザーバーを介しておこなわれる。本明細書で用いられる用語「非経口」とは皮下、静脈内、筋肉内、骨関節内、骨液包内、胸骨内、くも膜下、病巣内、脳内注射、または注入技術が挙げられる。
【０１４３】
本明細書に記載した修飾因子の投薬量レベルは、約０．０１ないし約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは約０．５ないし約７５ｍｇ／ｋｇ／日であり、この修飾因子は疾患および症状の予防および処置に有用であり、本発明のポリプチドに対するオリジンの病原体種におって媒介された疾患および症状を含。単一の投与形態物を得るためにキャリヤー物質と組み合わせることのできる活性成分の量は、治療を受けるホストおよび投与方式の種類によって異なる。典型的標本は、約５％から約９５％まで活性体（ｗ／ｗ）を含む。あるいは、そのような標本は、約２０％から約８０％まで活性体を含む。
【０１４４】
Ｅ．キット
本発明は、ＳＥＴドメイン・タンパク質を有する生物体によって癌、増殖性疾患、Ｗｏｌｆ  Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群または感染症を処置するためのキットを提供する。例えば、キットは構成されている化合物がＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の修飾因子として本明細書中で同定した組成物から構成される可能性がある。組成物は、薬学的に許容される賦形剤から構成されている医薬品組成物である可能性がある。キットを含んでいる他の実施形態において、この発明は、本発明の組成物と任意にそれらの使用のための指示を含むキットを意図する。キット構成要素は、前述の方法の手動であるか部分的にまたは完全にオートメーション化した実施のためのパッケージである可能性がある。例えば、そのようなキットには、イメージング、診断、治療、および他のアプリケーションを含む種々の用途がある可能性がある。
Ｆ．ＳＥＴドメイン・タンパク質・ドラッガブル領域およびその複合体
Ｆ．１  Ｘ線結晶学によるタンパク質の分析
（ｉ）Ｘ線構造決定
分子または複合体の結晶形状の３次元構造を得る典型的な方法は、本明細書中に記載される。また、本明細書を鑑みて、これらの方法のバリエーションは当業者（Ｄｕｃｒｕｉｘ  ａｎｄ  Ｇｅｉｇｅ  １９９２，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ参照）にとって明らかである。
【０１４５】
Ｘ線結晶構造解析をともなう種々の方法は、本発明によって意図される。例えば、本発明は、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）またはそのフラグメントを生産することを意図するもので、該方法は、（ａ）ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）またはそのフラグメントをコードする核酸を含む発現ベクターを宿主細胞に導入するステップと、（ｂ）タンパク質またはフラグメントを発現するために細胞培養培地で宿主細胞を培養するステップと、（ｃ）細胞培養からタンパク質またはフラグメントを単離するステップと、（ｄ）タンパク質またはそのフラグトを結晶化するステップを含む。あるいは、本発明は、結晶化ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントの３次元構造を測定することを意図するもので、該方法は、（ａ）結晶が３．５Ａオアベターの解像度にＸ線を回折するようにして、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）またはそのフラグメントを結晶化させるステップと、（ｂ）結晶化ポリペプチドの３次元構造を決定するために上記ポリペプチドまたはフラグメントをＸ線回折で分析するステップと、を含む。
【０１４６】
Ｘ線結晶学技術は、タンパク質分子が結晶の形で利用できることを一般に必要とする。種々の従来方法によって、結晶はＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）またはそのフラグメント（例えば安定した領域）を含んでいる溶液から成長することができる。これらのプロセスは、例えば、バッチ、液体、ブリッジ、透析、蒸気拡散（例えば懸滴またはシッティング・ドロップ方法）を含む。（例えば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  １９８２  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  １９９０，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８９：  １−２３；  Ｗｅｂｂｅｒ．１９９１，  Ａｄｖ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．  ４１：１−３６  を参照せよ）．  
いくつかの実施形態において、本発明の天然の結晶を、沈澱剤をポリペプチドの濃縮溶液に加えることによって成長させることが可能である。沈澱剤は、タンパク質を沈殿させるのに必要な量よりもわずかに少ない濃度で添加される。水は沈殿状態を作り出すために、制御された蒸発によって除去してもよい。さらに、結晶成長が終わるまで維持される。
結晶の形成は、ｐＨ、温度、タンパク質濃度、溶媒の性質、および沈澱剤（添加イオンの存在またはタンパク質に対するリガンドと同様に）を含む多数の異なるパラメータに依存している。加えて、結晶化しているポリペプチドの配列は、結晶を成功裏に得る上で、重要な影響を及ぼす。多くのルーチンの結晶化実験は、全てのこれらのパラメータに対してＸ線回折分析に適した水晶を与えるかもしれない数組合せのスクリーニングを行うために必要と思われる（例えば、Ｊａｎｃａｒｉｋ，  Ｊ  ＆  Ｋｉｍ，  Ｓ．Ｈ．，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｃｒｙｓｔ．  １９９１２４：  ４０９−４１１を参照せよ）。
【０１４７】
結晶化ロボットは、再現的に結晶化実験をかなりの数準備する仕事を自動化して、かつその仕事をスピードアップする。ひとたび結晶を成長させるための条件のいくらかの適した組が見つかるならば、状態のバリエーションを条件の組が見いだされるように、系統的にスクリーニングをおこなう。このようにして、十分に大きな、よく順序づけられた結晶の成長を可能にする。いくつかの例において、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）はポリペプチドを安定させる化合物で、共同結晶する（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ＷＡ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２０００  Ｄｅｃ；  ２５（１２）：６３７−４３）．。情報収集が始まる前に、タンパク質結晶を放射線損傷から保護するために、凍る可能性がある。
【０１４８】
多数の異なる凍害防御物質は、結晶（例えばメチル辺他事オール（ＷＤ）、イソプロパノール、エチレングリコール、グリセロール、蟻酸塩、シトラート、鉱油または低分子のポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を凍らせる際の援助するに用いられる可能性がある。
本発明は、ＳＥＴドメイン・タンパク質から構成されている組成物を意図するより従来でないＬａｕｅ（ラウエ）回折検査のために、幅広い波長ウインドウをおおっている多染性Ｘ線も用いて、同時に多くの回折強度を観察することができる（Ｓｔｏｄｄａｒｄ，  Ｂ．  Ｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １９９８  Ｏｃｔ；  ８（５）：６１．２−８）。中性子が、タンパク質結晶構造を解決するために使われることもある（Ｇｕｔｂｅｒｌｅｔ  Ｔ，  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ  Ｕ  ＆  Ｓｔｅｉｎｅｒ  Ｍ．，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  ２００１；５７：  ３４９−５４）。
【０１４９】
情報収集が始まる前に、タンパク質クリスタルはそれを放射線損傷から保護するために凍る可能性がある。多数の異なる凍害防御物質は、結晶（例えばメチルペタジオール（ＷＤ）、イソプロパノール、エチレングリコール、グリセロール、蟻酸塩、シトラート、鉱油、または低分子のポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の凍結援助するのに用いられる可能性がある。本発明は、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）と凍害防御物質から構成されている組成物を意図する。結晶を凍らせることに代わるものとして、結晶が溶液の凝固点より上に温度で実行される回折実験のために使われる可能性もある。これらの例において、結晶は蒸気圧を維持するために含まれる結晶成長溶液の一部で適した材料（一般にガラスまたは水晶）の細い毛細管でそれを配置することによって乾燥することから保護される。
【０１５０】
Ｘ線回析の結果は、当業者に公知の多くの方法によって記録され得る。エリア電子検出器の例としては、電荷結合デバイス検出器、マルチワイヤエリア検出器およびホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）検出器が挙げられる。（Ａｍｅｍｉｙａ，  Ｙ，  １９９７．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ２７６．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ｐｐ．  ２３３−２４３；  Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｍ．，  Ｎａｄａｙ，  Ｉ．  １９９７．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ２７６．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ｐｐ．  ２４４−２６８；  １９９７．  Ｋａｈｎ，  Ｒ．  ＆  Ｆｏｕｒｍｅ，  Ｒ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ２７６．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ｐｐ．  ２６８−２８６）。検査値収集に適したシステムとして、銅回転陽極ソースおよびＣｏｎｆｏｒｃａｌ  Ｍａｘ−Ｆｌｕｘ（商標）光学部品、およびＳＭＡＲＴ６０００チャージ・カップル・デバイス検出器が備えられているＢｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｐｒｏｔｅｕｍ  Ｒシステムが考えられる。Ｘ回折パターンの収集が当業者によって、よく文書化されている（例えば、Ｄｕｃｒｕｉｘ  ａｎｄ  Ｇｅｉｇｅ，  １９９２，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄを参照せよ）。
【０１５１】
Ｘ線への暴露の結晶による回折の後の理論は、周知である。相情報が回折実験で直接測定されなくて、電子密度地図を再建するために必要であるので、この行方不明の情報を回復することができる方法は必要である。初めから構造を解く１つの方法は、リアル／逆格子空間循環技術である。適したリアル／逆格子空間循環検索プログラムはシェーク・アンド・べークが含まれる（Ｗｅｅｋｓ  ＣＭ，  ＤｅＴｉｔｔａ  ＧＴ，  Ｈａｕｐｔｍａｎ  ｝｛Ａ，  Ｔｈｕｍａｎ  Ｐ，  Ｍｉｌｌｅｒ  Ｒ  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ａ  １９９４；  Ｖ５０：  ２１０−２０）。  
【０１５２】
相を引き出す他の方法も、必要と思われる。これらの技術は、一般に以下のアイデアに依存する。すなわち、同一反射の二種類以上の測定がなされる場合、どこで、強くて、測定可能で、違いは単独で原子の小さいサブセットの特徴に起因している。つぎに、他の原子の貢献は、第一次近似に、無視されることができる。また、これらの原子の位置は、上記の技術のうちの１つによって、散乱の違いから測定されている可能性がある。それらの原子の位置および拡散特性を知ることで、観察された全体の散乱が違いを生産するためにどんな相に呈すことがなければならないかについて、相を計算する必要がある。
【０１５３】
この技術の１つのバージョンは同形置換テクニックである。これはは結晶に新しい、よく秩序ある、Ｘ線の散乱体の導入を必要とする。これらの追加は、通常重金属原子（それが回折パターンで有意差を作るように）である。すなわち、追加が分子のまたは結晶細胞の構造を変えない場合、結果として生じる結晶は同型でなければならない。同形置換実験は、通常、既存のタンパク質クリスタルのチャネルに異なるヘビーメタル金属を放散することによって実行される。重元素に浸漬されたタンパク質から結晶を発達させることも可能である（Ｐｅｔｓｋｏ，  Ｇ．Ａ．，  １９８５．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １１４．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｒｌａｎｄｏ，  ｐｐ．  １４７−１５６）．  あるいは、重元素は反応性を有し、共有結合でを露出したアミノ酸側鎖（例えばシステインの硫黄原子）にも付着した、または、それは非共有の相互作用を通して結合させることも可能である。しばしば、メタロ・タンパク質内の内因性の軽金属より重いもの、例えば水銀による亜鉛の置換、またはサマリウムによるカルシウムの置換が可能である（Ｐｅｔｓｋｏ，  Ｇ．Ａ．，  １９８５．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １１４．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｒｌａｎｄｏ，  ｐｐ．  １４７−１５６）。そのような重い化合物のための典型的なソースは、限定されるものではないが、臭化曹達、セレン酸ナトリウム、トリメチル酢酸鉛、昇汞、メチル酢酸水銀、プラチナ４シアン化物、プラチナ四塩化物、塩化ニッケルと塩化ユーロピウムを含む。
【０１５４】
散乱の違いを生じさせる第２の技術は、異常散乱の現象を含む。より高いシェルに内殻で電子の置換を生じるＸ線は、その後再散乱する。しかし、位相遅延として現れる時間のずれがある。この位相遅延は、異常散乱が存在しない場合、同一だろうフリーデル仲間として知られている反射の間で、強度の（一般に全く小さい）違いとして観察される。この現象に関連した第２の効果は、所定の原子の散乱の強度の違いが波長従属する方法で変化するということである。また、散発性の違いとして知られているものを生ずる。原則として、異常散乱は全ての原子で起こるが、効果は重元素で最も強くて、エネルギーがシェルの間でエネルギーの違いに耐えられる波長でＸ線を用いて最大になる可能性がある。したがって、同形置換のために必要とされているように、技術は非常に若干の重元素の編入を必要とする。異常拡散であっても、幅広い範囲の原子が適しており、おり軽い金属原子（銅、亜鉛、鉄）がメタロ・タンパク質に含まれる。異常散乱のためにタンパク質を準備する１つの方法は、セレノメチオニンを含んでいるセレニウムで全体または一部のメチオニン残基を置換することを含む。臭化物と他の非リアクタンス性のイオンのようなハロゲン塩による浸透は、効果的である可能性もある（Ｄａｕｔｅｒ  Ｚ，  Ｉｉ  Ｍ，  Ｗｌｏｄａｗｅｒ  Ａ．，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  ２００１；  ５７：  ２３９−４９）。
【０１５５】
もう一つのプロセスでは、複数の異常散乱またはＭＡＤとして知られて、適した波長の２ないし４のデータが収集される単一または複数の同型および異形散乱の種々の組み合わせによるフェージングも可能である。例えば、ＳＦＡＳ（異常散乱による一つの同形置換）は相を引き出すために、同型で変則的な違いを１つの誘導体のために利用する。より伝統的に、いくつかの異なる重元素は、異なる結晶に浸漬される。複数の同形置換（ＭＩＲ）として知られている技術で、異常散乱を無視している間、同型の違いから充分な相情報が得られる  （Ｐｅｔｓｋｏ，  Ｇ．Ａ．，  １９８５．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １１４．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｒｌａｎｄｏ，  ｐｐ．  １４７−１５６）。
【０１５６】
相に対するさらなる制約は、密度修飾技術に由来すると思われる。これらの技術は、相を改良するために、その特定の結晶について電子密度配布または既知の事実のいずれの一般に既知の特徴も働かせる。例えば、結晶のタンパク質地域が溶解力がある地方より強く点在するので、溶解力があるフラットニング（ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）／フリッピング（ｆｌｉｐｐｉｎｇ）は溶解力がある密度を均一の均一な値（Ｚｈａｎｇ，  Ｋ．  Ｙ．  Ｊ．，  Ｃｏｗｔａｎ，  Ｋ．Ｋ  ａｎｄ  Ｍａｉｎ，  Ｐ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２７７，  １９９７  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｒｌａｎｄｏ  ｐｐ  ５３−６４）とするために相を調整するのに用いられる。タンパク質の複数の分子が非対称の単位で存在する場合、異なる分子は実質的に同一でなければならないこの事実は、更に、非結晶学左右対称難平を使用しているフェーズ・エラーを減らすために利用される可能性がある（Ｖｉｌｌｉｅｕｘ，  Ｆ．Ｍ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ｒｅａｄ，  Ｒ．  １．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２７７，  １９９７  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｒｌａｎｄｏ  ｐｐｌ８−５２）。これらのプロセスを実行するために適したプログラムは、ＣＣＰ４セット（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，  Ｎｕｍｂｅｒ  ４．  １９９４．  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ｄ５０，７６０−７６３）のＤＭおよびＣＮＸと他のプログラムとを含む．。
【０１５７】
単位セル次元、左右対称、ベクトル振幅、および生じた相情報が、すなわち、実験的な電子密度地図を生成するために単位セルで電子密度を算出するために、フーリエ変換関数で使われる。これは、ＣＮＸまたはＣＣＰ４パッケージのプログラムを使用して達成可能である。分解能はオングストローム（Ａ）単位で測定される。分解能は２つの物体がそれが確実に区別されることができる前にどれくらいはるかに別々の必要があるかについて、密接に関連がある。小さければ小さいほど、より高い分解能が達成され、それによって、見られることができる詳細の量はよ好ましくは、発明の結晶は、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、１．０、０．５  Åについて、未満の解像度に、Ｘ線を回折する。
【０１５８】
本明細書中で使われるように、用語「モデリング（ｍｏｄｅｌｉｎｇ）」は原子構造的情報と相互作用モデルに基づく分子構造または機能の定量的で質的な分析を含む。用語「モデリング」は、従来の数のベースの分子動的なおよびエネルギー簡単化モデル、双方向コンピュータ・グラフィック・モデル、改質分子力学モデル、ディスタンスジオメトリー法、非重要構造に拠点を置く制約モデルを含む。モデル設定はＴＵＲＢＯ  ｏｒ  ０ようなコンピュータグラフィックス・プログラムのいずれかで堪能である可能性がある（Ｊｏｎｅｓ，  ＴＡ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ａ４７，  １００−１１９，１９９１）  。その他、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，  Ａ４７（１００−１１９，１９９１））または、適当な条件下で、完全自動化のモデル設定を用いておこなう。該プログラム、例えばｗＡＰＰ（Ａｎａｓｔａｓｓｉｓ  Ｐｅｒｒａｋｉｓ，  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｍｏｒｒｉｓ  ＆  Ｖｉｃｔｏｒ  Ｓ．  Ｌａｍｚｉｎ；  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｍａｙ  １９９９  Ｖｏｌｕｍｅ  ６  Ｎｕｍｂｅｒ  ５  ｐｐ  ４５８  −  ４６３）  ｏｒ  ＭＡＩＤ    （Ｌｅｖｉｔｔ，  Ｄ．  Ｇ．，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ  ２００１  Ｖ５７：  １０１３−９）。この構造は、モデルから派生した回折振幅と相を算出するのに用いられる可能性がある。モデルから派生して実験的な回折振幅が比較される。このことは、それらとの一致は増倍率として言及されるパラメータによって記載されることができる。正確な合意と０．５９が完全にランダムな構造を表していることを表している０．０で、振幅の高度な相互関係は、低いＲ因子値に対応する。Ｒ−因子がよりフリーなパラメータをモデルにもたらすことによって低下する可能性があるので、Ｒ−ｆｒｅｅとして知られているＲ因子の不偏の、クロス相関しているバージョンはモデル品質のより客観的な基準を与える。このパラメータの算出のために反射（一般に１０％周辺で）のサブセットが改良の始めにとっておかれて、改良目標の一部として使われないこと。これらの反射は、それからモデルのそばにそれらの予測されたと比較してある（Ｋｌｅｙｗｅｇｔ  ＧＪ，  Ｂｒｕｎｇｅｒ  ＡＴ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １９９６  Ａｕｇ  １５；４（８）：８９７−９０４）．
モデルは、同時にモデル・ジオメトリーを最適化する間、観測データが予測されたモデルから生産されられたという確率を最大にするコンピュータプログラムを使用して改良される。例えば、ＣＮＸプログラムが、モデル改良のために使われる可能性がある、ＸＰＬＯＲプログラムがそうすることができる（１９９２，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：４７２−４７５，  Ｇ．Ｎ．  Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，  Ａ．Ａ．Ｖａｇｉｎ  ａｎｄ  Ｅ．Ｊ．Ｄｏｄｓｏｎ，  （１９９７）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ｄ  ５３，  ２４０−２５５）。改良の収束半径を最大にするために、捻れ角力学を使用しているシミュレートアニーリング改良は、モデルの運動の自由度を減らすために使用される可能性がある（Ａｄａｍｓ  ＰＤ，  Ｐａｎｎｕ  ＮＳ，  Ｒｅａｄ  ＲＪ，  Ｂｒｕｎｇｅｒ  ＡＴ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９７  Ｍａｙ  １３；９４（１Ｏ）実験的な相情報が利用できる所で、（例えばＭＡＤデータが集められた所で）Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ−Ｌａｔｔｍａｎｎ相確率目標は使用される可能性がある。等方性であるか異方性の領域（群または個々の温度要因改良）は、その平均値から原子配置の相違をモデル化するのに用いられる可能性がある。タンパク質原子に起因していない電子密度の明確なピークは、通常、水分子としてモデル化される。水分子は、電子密度地図の手動点検によって、または自動的に水分を取る自動的なピッキングルーチンを選で水分がみつかる可能性がある。
【０１５９】
一般に、相当によく測定されたタンパク質構造について、Ｒ−フリー（Ｒ  ｆｒｅｅ）はまれに０．１５ほど低く、あるいは０．３５以上と同程度高い。残余の違いは、モデル（等方性ガウシアン球体として原子をモデル化して、一組の離散的な馴化動物、その他を持つよりはむしろ全ての分子が同一の場合溶媒の残余の構造の不十分なモデリング）の近似値とデータ（ｒａｔｔｍａｎ  ＥＥ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９９６；  ２５：  ｉ−ｉｉ）．ｉ〜ｉｉ）におけるエラーの結果である。高分解能の洗練された構造では、大きなエラーが通常個々の残基の方位にない、そして、原子配置ｓにおける推定されたエラーは通常、約０．１〜０．２、最大で３．０Åである。
【０１６０】
新しい結晶の３次元構造は、分子置換を使用してモデル化される可能性がある。用語「分子置換（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」は、分子の予備モデルを生成することを含む方法または構造座標ｓが知られていない複合体に、構造座標が未知の結晶の単位セルの中で知られている分子を正しい位置に置いて、配置することによって、それで、未知の結晶の観察された回折パターンを占めている最高のものとして言及する。つぎに、相がこのモデルから算出される可能性があって、座標ｓが知られていない構造の近似のフーリエ合成を与えるために、観察された振幅と結合される可能性がある。これが、次に、改良のいくつかの形の少しもあることができるので、それは未知の結晶の最終的な、精密な構造を提供する。  Ｌａｔｔｍａｎ，  Ｅ．，  ”Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ”，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １１５，  ｐｐ．  ５５−７７  （１９８５）；  Ｍ．  Ｇ．  Ｒｏｓｓｍａｎｎ，  ｅｄ．，  ”Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ”，  Ｉｎｔ．  Ｓｃｉ．  Ｒｅｖ．  Ｓｅｒ．，  Ｎｏ．  １３，  Ｇｏｒｄｏｎ  ＆  Ｂｒｅａｃｈ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９７２）。
【０１６１】
分子置換に用いられる共通のコンピュータ・ソフトウェア・パッケージは、ＣＮＸ、Ｘ−ＰＬＯＲ  （Ｂｒｕｎｇｅｒ  １９９２，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：  ４７２−４７５）、  ＡＭｏＲＥ  （Ｎａｖａｚａ，  １９９４，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  ＡＳ０：１５７−１６３）、ＣＣＰ４パッケージ、  ＭＥＲＬＯＴパッケージ  （Ｐ．Ｍ．Ｄ．  Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｃｒｙｓｔ．，  Ｖｏｌ．  ２１，  ｐｐ．  ２７３−２７８，  １９８８）  、および  ＸＴＡＬＶＩＥＷ  （ＭｅＣｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ  （１９９２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  １０：  ４４−４６）が挙げられる。モデルの品質は、プログラムを使用して分析することが可能性である。このプログラムとして、ＰＲＯＣＨＥＣＫ  または３Ｄ−Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  （Ｌａｓｋｏｗｓｌ  ｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９３  Ｊ，  Ａｐｐ！．  Ｃｒｙｓｔ．  ２６：２８３−２９１；  Ｌｕｔｈｙ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３  ５６：  ８３−８５，  １９９２；  ａｎｄ  Ｂｏｗｉｅ，  Ｊ．Ｕ．  ｅｔ  ａｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：  １６４−１７０，１９９１）が挙げられる。
【０１６２】
相同性モデリング（比較モデリングまたは知識ベース・モデリングとして知られている）方法もまた、三次元のモデルを既知のタンパク質の構造に基づくポリペプチド配列から開発することに用いられる。方法は、既知のタンパク質のコンピュータ・モデル、未知構造を持つポリペプチドのアミノ酸配列順序のコンピュータ表示、およびアミノ酸の構造の標準的コンピュータ表現を利用する。この方法は、当業者には周知である。（Ｇｒｅｅｒ，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８，  １０５５；  Ｂｕｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ  １９８８，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７２，  ５１３；  Ｋｎｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１３０−１３５，  ｂｔｔｐＪｌｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｔ．ｅｄｕ／ｃｏｕｒｓｅｓ／−ｍｏｄｅｌｉｎｇｌｈｏｍｏｌｏｇｙ．ｈｔｎ）。相同性モデリングに使用することができるコンピュータ・プログラムは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ，  ｏｒ  ＭＯＤＥＬＬＥＲ  （Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ｗｗｗ．ｉｕｃｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｉｎｒｉｓ−ｔｏｐ／ｌｏｇｉｃａｌ／ｐｒｇ−ｍｏｄｅｅｌｌｅｒ．ｈｔｍｌ）によって配布されたＩｎｓｉｇｈｔＩＩモデリングのＱＵＡＮＴＡおよびＨｏｍｏｌｏｇｙモデュールあるいはＭＯＤＥＬＬＥＲ  （Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ｗｗｗ．ｉｕｃｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｉｎｒｉｓ−ｔｏｐ／ｌｏｇｉｃａｌ／ｐｒｇ−ｍｏｄｅｅｌｌｅｒ．ｈｔｍｌ）．である。この分析を援助することができるコンピュータプログラムは、種々の試験を提供するＱＵＡＮＴＡのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｈｅａｌｔｈモジュールである。出力とともに構造解析を提供する他のプログラムは、ＰＲＯＣＨＥＣＫと３ＤＰｒｏｆｉｌｅｒを含む。モデルの品質は、プログラムを使用して分析可能である（Ｌｕｔｈｙ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：８３−８５，１９９２；  ａｎｄ  Ｂｏｗｉｅ，  Ｊ．Ｕ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：  １６４−１７０，１９９１）。いったん任意の不規則さが解決されると、全構造は更に洗練される可能性がある。
【０１６３】
一旦相同モデルが発生すると、その正当性を測定するための分析がなされる。この分析を援助することができるコンピュータプログラムは、種々の試験を提供するＱＵＡＮＴＡのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｈｅａｌｔｈモジュールである。出力とともに構造解析を提供する他のプログラムは、ＰＲＯＣＨＥＣＫと３ＤＰｒｏｆｉｌｅｒを含む。モデルの品質は、プログラムを使用して分析可能である。一旦相同モデルが発生するならば、その正当性を測定するための分析がなされる。
【０１６４】
他の分子モデリング技術もまた、本発明に従って使用され得る。例えば、Ｃｏｈｅｎ，  Ｎ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ３３，  ｐｐ．  ８８３−８９４  （１９９０）．  Ｓｅｅ  ａｌｓｏ，  Ｎａｖｉｘ，  Ｍ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｍ．  Ａ．  Ｍａｒｋｏ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２，  ｐｐ．  ２０２−２１０  （１９９２）を参照せよ。
【０１６５】
適当な状況下で、結晶構造を解決する全プロセスは、自動化した様式で、ほとんどユーザの介入なしにＥＬＶＥＳ（（ｈｔｔｐ：／／ｕｃｘｒａｙ．ｂｅｒｋｅｌｐｙ．ｅｄｕ／，ｊａｍｅｓｂ／ｅｌｖｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈ４ＡＩ）によって達成可能である。
（ｉｉ）Ｘ線構造  
本発明は、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）のアミノ酸またはそれの複合体のために構造座標ｓの一部または全てを測定するための方法を提供する。
もう一つの態様において、本発明は方法をＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）のドラッガブル領域を同定するための方法を提供する。
例えば、そのような方法は：
（ａ）結晶化するタンパク質の３次元構造が３．５Ａオアベターの分解能に測定されように、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）またはそのフラグメントの結晶を得るステップと；（ｂ）Ｘ線回折を用いて結晶化ポリペプチドまたはフラグメントの３次元構造を測定するステップと、（ｃ）ポリペプチドまたはフラグメントの３次元構造にもとづいて、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）のドラッガブル領域を同定するステップと、
を含む。
【０１６６】
分子または複合体の３次元構造は、最も、観察された回折データ（すなわち、最小Ｒ値を所有）を予測する原子の集合で記載することができる。ファイルは、その化学的同一性による各々の原子、三次元の空間座標、観察された平均位置からのルート平均値二乗偏差、および観察された位置の微小占有率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ）を定義する構造のために作成される可能性がある。
【０１６７】
当業者は、タンパク質（複合体またはそれの部分）のための一組の構造座標が三次元で形状を定義する点の相対的な集合であると理解する。このように、座標の完全に異なるセットが相似であるか同一の形状を定義することが可能である。さらに、個々の座標ｓにおけるわずかな変化は、全体の形状にほとんど影響を及ぼす可能性はほとんどない。座標におけるそのような変化を、構造座標の数学的操作によって引き起こすこともできる。例えば、構造座標は、構造座標の結晶学順列、構造座標のセットに対する構造座標ｓ、整数追加または減算の細分、構造座標の逆転または上記のいかなる組合せによる操作量となりうる。あるいは、アミノ酸の突然変異、追加、置換および／または欠如による結晶構造の修飾、または結晶を構成する任意の成分における他の変化もまた、構造座標における変化を生じえる。そのような個々の座標におけるわずかな変化は、全体の形状にほとんど影響を及ぼさない。そのような変異が原物の座標と比較すると許容される標準誤差の中である場合、結果として生じる三次元形状は構造的に等価であると考えられる。個人におけるわずかな変化がＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の座標を構築する点に留意する必要があり、または、それの複合体はそれのドラッガブル領域を一体にすることができた修飾因子の性質をかなり変えるとは考えられない。したがって、例えば、ＳＥＴドメイン・タンパク質（例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ）の活性部位と結合した修飾因子は、構造座標が許容エラーに入る形状を定義するもう一つの活性部位と結合または干渉するとも思われる。
【０１６８】
本発明の結晶構造を、ポリペプチド、複合体またはその一部の構造モデルまたはコンピュータ・モデルを作るために用いることが可能である。モデルは、ポリペプチド、複合体または部分の二次、三次、または四次構造を表すことができる。例えば、本発明によって構造座標に由来するスペースの点の構成はホログラフィック画像、ステレオ線図、モデルまたはコンピュータ表示画像として視覚化されることができる、そして、発明はこのようにそのような画像、線図またはモデルを含む。
【０１６９】
（ｉｉｉ）構造等価性
ある分子またはその活性部位部分が、その三次元構造に関して、例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼまたはその部分などのＳＥＴドメイン・タンパク質の構造の全体または一部に、構造的に等価であるかどうかを決定するために、様々なコンピュータ分析を用いることができる。
【０１７０】
本発明の目的においては、いかなる分子もしくは複合体、またはその部分も、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の基準構造座標によって記述される適切なバックボーン原子上に重畳されたとき、その保存性残基バックボーン原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ、Ｏ）の二乗平均平方根偏差が約１．７５Åより小さいなら、基準分子に「構造的に等価である」と考えられる。すなわち、その部分において、これら２つの分子の結晶構造は、許容される誤差の範囲にある、実質上相等しいものである。別法として、この二乗平均平方根偏差は、１．５０、１．４０、１．２５、１．０、０．７５、０．５、または０．３５Å未満であってもよい。
【０１７１】
「二乗平均平方根偏差」という用語は当技術分野で公知であり、偏差の二乗の算術平均の平方根を意味する。二乗平均平方根偏差は、傾向または対象からの偏差または変異を表現する一方法である。
【０１７２】
別の態様では、本発明は、例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の少なくとも一部の構造座標から派生し、かつ、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の構造座標からの二乗平均平方根偏差が、１．５０、１．４０、１．２５、１．０、０．７５、０．５または０．３５Å未満であるポイント、上記ポイントの少なくとも一部、および好ましくは上記ポイントすべての測定可能な立体配位を提供する。特定の実施形態では、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の部分は、このポリペプチド中に含有されるアミノ酸残基の２５％以上、３３％以上、５０％以上、６６％以上、７５％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上である。
【０１７３】
別の態様では、本発明は、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質のドラッガブル領域を含有する分子または複合体であって、上記ドラッガブル領域が、（ａ）例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質のドラッガブル領域に含有されるアミノ酸のバックボーン原子、（ｂ）そのようなドラッガブル領域に含有されるアミノ酸の側鎖原子（および、任意選択で、Ｃα原子）、または（ｃ）そのようなドラッガブル領域に含有されるアミノ酸の全原子を表すポイント群の構造座標からの二乗平均平方根偏差が１．７５Å未満である１セットのポイントによって定義される分子または複合体を提供する。特定の実施形態では、上記セットのポイントに含有されるアミノ酸は、ドラッガブル領域に含有されるアミノ酸の２５％以上、３３％以上、５０％以上、６６％以上、７５％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上など、ドラッガブル領域の一部分のみでもよい。特定の実施形態では、上記二乗平均平方根偏差は、１．５０、１．４０、１．２５、１．０、０．７５、０．５、または０．３５Å以下でもよい。さらに他の実施形態では、ドラッガブル領域ではなく、安定性を有する１つのドメイン、フラグメントまたは構造モチーフがドラッガブル領域に代わって用いられる。
【０１７４】
（ｉｖ）機械表示及び機械可読記憶媒体
本発明は、機械可読データでコードされたデータ保存物質を含む機械可読記憶媒体であって、上記データの使用に関するインストラクションでプログラムされた機械を用いた際、本発明のいかなる分子もしくは複合体、またはその部分の図式的立体表現も表示する機械可読記憶媒体を提供する。別の実施形態では、そのような分子、複合体、またはその部分の図式的立体表現は、二乗平均平方根偏差が０．８Å未満のバックボーン原子など、そのような分子における二乗平均平方根偏差が指定された量の特定の原子を含む。別の実施形態では、そのような分子、複合体、またはその部分の構造上の等価物を表示してもよい。別の実施形態では、上記部分は、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質のドラッガブル領域を含んでもよい。
【０１７５】
一実施形態によると、本発明は、分子または複合体から得られたＸ線回折データに対応する構造座標の少なくとも一部を決定するコンピュータであって、（ａ）例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の構造座標の少なくとも一部を有する機械可読データでコードされたデータ保存物質を含む機械可読データ記憶媒体と、（ｂ）上記分子または複合体からのＸ線回折データを有する機械可読データでコードされたデータ保存物質を含む機械可読データ記憶媒体と、（ｃ）（ａ）および（ｂ）における上記機械可読データをプロセシングするためのインストラクションを保存するためのワーキングメモリーと、（ｄ）（ａ）における機械可読データのフーリエ変換を行い、（ｂ）における上記機械可読データを構造座標にプロセシングするための上記ワーキングメモリー、ならびに、（ａ）および（ｂ）における上記機械可読データ保存媒体と連結された中央演算処理装置と、（ｅ）上記中央演算処理装置に連結された、上記分子または複合体の構造座標を表示するためのディスプレイとを備えたコンピュータを提供する。特定の実施形態では、表示される構造座標は、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の構造座標に構造上等価である。
【０１７６】
代替の一実施形態では、上記機械可読データ記憶媒体は、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼまたはその部分などのＳＥＴドメイン・タンパク質の構造座標のフーリエ変換を含み、かつ、上記データを用いるためのインストラクションでプログラムされた機械を用いた際、分子または複合体のＸ線回折パターンを含んだ第２のセットの機械可読データと併せて、第２のセットの機械可読データに対応する構造座標の少なくとも一部を決定することができる第１の機械可読データでコードされたデータ保存物質を含む。
【０１７７】
例えば、データ記憶媒体を読むシステムは、中央演算処理装置（「ＣＰＵ」）と、例えばＲＡＭ（ランダムアクセスメモリー）もしくは「コア」メモリーでもよいワーキングメモリーと、大容量記憶メモリー（１つまたは複数のディスクドライブまたはＣＤ−ＲＯＭドライブなど）と、１つまたは複数のディスプレイ装置（例えば、ブラウン管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ、発光ダイオード（「ＬＥＤ」）ディスプレイ、液晶ディスプレイ（「ＬＣＤ」）、エレクトロルミネセンスィスプレイ、真空蛍光ディスプレイ、電界放出ディスプレイ（「ＦＥＤ」）、プラズマディスプレイ、映写パネルなど）と、１つまたは複数のユーザ入力装置（例えば、キーボード、マイクロホン、マウス、タッチスクリーンなど）と、１つまたは複数の入力ラインと、１つまたは複数の出力ラインとを含み、これらすべてが従来の双方向性システムバスによって相互接続されているコンピュータを含むものでもよい。このシステムは、自立型コンピュータであってもよいし、または他のシステム（例えば、コンピュータ、ホスト、サーバーなど）にネットワークで接続されていてもよい（例えば、ローカル・エリア・ネットワーク、広域ネットワーク、イントラネット、エクストラネット、またはインターネットを通して）。また、このシステムは、家庭用電化製品および機器などの追加コンピュータ制御装置を含んでもよい。
【０１７８】
入力ハードウェアは、入力ラインによってコンピュータと結合されてもよく、また、様々な方法で実施されてもよい。本発明の機械可読データは、電話回線または専用データ線によって接続された１つまたは複数のモデムを使用して入力してもよい。入力ハードウェアは、代替または付加物として、ＣＤ−ＲＯＭドライブまたはディスクドライブを含んでもよい。ディスプレイ装置と組み合わせて、キーボードも入力装置として用いられてもよい。
【０１７９】
出力ハードウェアは、出力ラインによってコンピュータと結合されてもよく、また同様に、従来の装置によって実行されてもよい。例としては、この出力ハードウェアは、本発明の活性部位の図式表現を、本明細書に記載されているＱＵＡＮＴＡなどのプログラムを用いて表示するためのディスプレイ装置を含んでもよい。出力ハードウェアは、ハードコピー出力を生成できるように、プリンターを含んでもよく、または、後で使用するために、システム出力を記憶させるディスクドライブを含んでもよい。
【０１８０】
オペレーションにおいて、ＣＰＵは、様々な入出力装置の使用を調整し、大容量記憶装置からのデータ・アクセス、ワーキングメモリーへのデータ・アクセス、およびワーキングメモリーからのデータ・アクセスを調整し、さらにデータ・プロセシング・ステップの順序を決定する。本発明の機械可読データをプロセシングするのに、多数のプログラムが使用可能である。そのようなプログラムは、本明細書に記載した薬物発見のコンピュータ法に関連して論じられた。ハードウェア・システムの構成要素に関する言及は、データ記憶媒体に関する以下の記述中に適宜含まれている。
【０１８１】
本発明において有用な機械可読記憶装置には、磁気装置、電気装置、光機器、およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。そのようなデータ記憶装置の例には、ハードディスク装置、ＣＤ装置、デジタルビデオディスク装置、フロッピー（登録商標）ディスク装置、脱着可能ハードディスク装置、光磁気ディスク装置、磁気テープ装置、フラッシュメモリー装置、バブルメモリー装置、ホログラフィー記憶装置、および他のいかなる大容量記憶周辺装置も含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの記憶装置には、データ記憶を可能にするのに必要ないかなる媒体（例えば、ディスク、フラッシュカードなど）も含まれており、同様に、必要なハードウェア（例えば、ドライブ、コントローラー、電源など）も含まれていることを理解するべきである。
【０１８２】
一実施形態において、本発明は、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼまたはその部分などのＳＥＴドメイン・タンパク質のアイデンティティーおよび立体座標を含めた構造データを有するコンピュータ可読記憶媒体を想定する。別の態様において、本発明は、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼまたはその部分などのＳＥＴドメイン・タンパク質のアイデンティティーおよび立体座標を含むデータベースを想定する。別法として、本発明は、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼまたはその部分などのＳＥＴドメイン・タンパク質の原子座標の一部またはすべてを含むデータベースを想定する。
【０１８３】
（ｖ）構造類似分子および複合体
例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の構造座標は、別の分子または複合体の構造情報を取得する際の補助に用いることができる。本発明のこの方法によって、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の構造特徴に類似した１つまたは複数の構造特徴を含有する分子または分子複合体の立体構造の少なくとも一部が決定可能となる。類似した構造特徴には、例えば、アミノ酸同一性領域、保存活性部位または結合部位モチーフ、および二次構造要素（例えば、ヘリックスおよびシート）の同様な配列が含まれうる。例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の構造決定に関して前述した方法の多くは、この目的に用いることができる。
【０１８４】
本発明において、「構造相同体」とは、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の対象アミノ酸配列に関して、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または組換えを含有するが、未変性の立体配座にフォールドされた際、関連する対象アミノ酸配列によってコードされるポリペプチド、または、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなど、他のそのようなＳＥＴドメイン・タンパク質の三次（立体）構造の少なくとも一部を示すか、または示すことが合理的に予想されるポリペプチドである。例えば、構造上相同な分子は、ループおよびドメインなど、１つまたは複数の連続したアミノ酸、または非連続のアミノ酸の欠失または付加を含むことができる。構造上相同な分子には、１つまたは複数の構成アミノ酸が、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド生成、ならびに炭化水素部分、脂質部分、補因子、および同様のものの付着を含めた、側鎖改変、バックボーン改変、Ｎ末端およびＣ末端改変を含めた、化学的誘導体化または酵素的誘導体化によって改変されているポリペプチド分子も含まれる。
【０１８５】
例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の構造座標の全体または一部を利用して分子置換を用いることによって、構造が未知の、結晶化された分子または複合体の構造を、最初からそのような情報を決定しようと試みるより迅速かつ効率的に決定することができる。例えば、一実施形態において、本発明は、構造が未知の分子または複合体に関する構造情報を取得するために分子置換を利用する方法であって、（ａ）上記構造が未知の分子または複合体を結晶化させることと、（ｂ）上記記結晶化された分子または複合体からＸ線回折パターンを生成することと、（ｃ）例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の少なくとも一部の構造座標を上記Ｘ線回折パターン構造に適用して、上記構造が未知の分子または複合体の三次元電子密度マップを作成することとを含む方法を提供する。
【０１８６】
別の態様において、本発明は、構造座標が未知である分子または複合体の予備モデルを、上記構造が未知の分子または複合体の結晶単位格子中における、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の適切な部分の方向および位置を、上記構造が未知の分子または複合体の結晶で観測されたＸ線回折パターンを最も良く説明するように決定することによって構築する方法を提供する。
【０１８７】
例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の部分に構造上十分に類似した、いかなる結晶化された分子または複合体の部分に関する構造情報も、この方法によって決定されうる。例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質と１つまたは複数の構造特徴を共有する分子に加えて、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質と、同じ触媒活性、基質特異性、またはリガンド結合活性など、類似の生理活性を有する分子も、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の構造座標を利用して結晶構造を決定することが可能となるのに十分に、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質に構造上類似していることがある。
【０１８８】
別の態様において、上記分子置換の方法は、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質（または、そのドメイン、フラグメント、オーソログ、相同体など）と変調因子との複合体など、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質を含有する複合体に関する構造情報を得るために利用される。特定の場合では、上記複合体に、変調因子と共に複合体化された、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質（または、そのドメイン、フラグメント、オーソログ、相同体など）が含まれる。例えば、一実施形態において、本発明は、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質またはそのフラグメントと、化合物とを含む結晶化された複合体を調製する方法であって、（ａ）例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質を、その結晶が解像度３．５Åまたはそれより良い解像度でＸ線回折を引き起こすように結晶化させることと、（ｂ）上記結晶を上記化合物を含む溶液に浸漬し、これによって、上記ポリペプチドおよび上記化合物を含有する結晶化された複合体を調製することとを含む方法を想定する。他の実施形態では、例えば、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質は、少なくとも１つの基質または補因子と共に複合体化させてもよい。例えば、そのような複合体は、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼタンパク質と基質とを含んでもよい。特定の実施形態では、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼは、金属依存性であってもよい。上記ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼは、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質の自然発生変異体であっても、または計画的変異体であってもよい。そのような変異体は、特定の実施形態では、自然の配列に対して少なくとも約９５％の相同性を有し、また、特定の実施形態では、天然に存在するヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質のＳＥＴ領域に対して９５％より高い相同性を有する。複合体に含まれる基質は、例えば、ペプチドであってもよい。特定の実施形態では、ＨＫＭＴは、ヒストンＨ３のリシン９に作用する金属依存性ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質および基質であってもよい。一実施形態では、ＨＫＭＴがＤＩＭ−５であり、かつ基質がペプチドであってもよい。特定の実施形態では、上記ペプチドはＨ３ペプチドである。このような複合体は、亜鉛および／またはＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインなどの補因子も含んでもよい。
【０１８９】
相同性モデリングを用いれば、構造相同体または他のポリペプチドのコンピュータモデルを、分子を結晶化させずに構築または精密化することができる。例えば、別の一態様において、本発明は、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質の構造相同体のホモロジーモデリングを行うためのコンピュータを利用した方法であって、既知の構造相同体、または予測上の構造相同体のアミノ酸配列を、例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼなどのＳＥＴドメイン・タンパク質のアミノ酸配列と整列させ、上記構造相同体の配列を例えばヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ、上記構造相同体の予備モデルを得るための原子構造座標から派生したタンパク質などのＳＥＴドメイン・タンパク質のモデルに組み入れることと、上記予備モデルにエネルギー最小化操作を施し、エネルギー最小化モデルを構築することと、エネルギー最小化モデルの立体化学制限に違反する領域のリモデリングを行って、上記構造相同体の最終モデルを構築することとを含む方法を提供する。
【０１９０】
別の実施形態では、本発明は、対象のアミノ酸配列、またはその等価物によってコードされたポリペプチドの相同体の結晶構造を決定する方法であって、（ａ）対象アミノ酸配列またはそのフラグメントの結晶化されたポリペプチドの三次元構造を提供することと、（ｂ）結晶化された相同ポリペプチドの三次元構造が解像度３．５Åまたはそれより良い解像度で決定できるように、上記対象アミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む相同ポリペプチドの結晶を取得することと、（ｃ）ステップ（ａ）で提供された三次元構造の原子座標に基づいて、結晶化された相同ポリペプチドの三次元構造をＸ線結晶解析で決定することとを含む方法を想定する。前述の方法の特定の場合では、相同ポリペプチドの原子座標は、適切な対象アミノ酸配列またはそのフラグメントによってコードされるポリペプチドのバックボーン原子からの二乗平均平方根偏差が、そのようにコードされるポリペプチドまたはそのフラグメントと、上記相同ポリペプチドとに共有されるすべてのバックボーン原子に関して１．５Å以下である。
【０１９１】
（ｖｉ）Ｘ線構造データを用いた核磁気共鳴分析
別の態様において、構造の特徴付けがされていないか、または、不完全にしかされていないポリペプチドの三次元構造を決定するために、既知の結晶構造の構造座標を核磁気共鳴データに適用してもよい（例えば、Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，  １９８６，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  １７６−１９９；  Ｐｆｌｕｇｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８９：  ３８３−３８６；  Ｋｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １＝８９：３７７−３８２を参照）。ポリペプチドの２次構造はＮＭＲデータでしばしば決定されるかもしれないが、個々の２次構造部分相互の空間的な関係は、同じように容易には決定されない。Ｘ線結晶構造解析で決定されたポリペプチドの構造座標は、ＮＭＲ技術者が関連構造を有するポリペプチドの二次構造要素相互の空間相互作用を理解するガイドとして使用できる。二次構造要素相互の空間相互作用に関する情報は、二次元ＮＭＲ実験から得られるＮＯＥデータを大いに単純化することができる。さらに、ＮＭＲ法によって２次構造を決定した後に、このような構造座標を適用すると、このポリペプチド配列中の特定のアミノ酸に関するＮＯＥの帰属が単純化される。
【０１９２】
一実施形態において、本発明は、未知構造のポリペプチドの三次元構造を、本発明の結晶の構造座標を上記未知構造に関する核磁気共鳴データに適用することによって決定する方法に関する。この方法は、（ａ）ＮＭＲデータを用いて未知構造の２次構造を決定するステップと、（ｂ）アミノ酸の全空間相互作用の帰属を単純化するステップとを含む。「全空間相互作用」という用語は、三次元構造における二次構造要素の配向性と、アミノ酸配列の異なった部分からのアミノ酸相互の距離とを定義する。「帰属」という用語は、ＮＭＲデータを分析して、どのアミノ酸がＮＭＲスペクトルでシグナルをもたらすかを同定する方法を定義する。
【０１９３】
この節すべてにおけるＸ線結晶構造解析に関しては、Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ  ４：１８７−２１７；  Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （１９８１）  Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｌａｅｒｎ．  １０６：  ７６５；  Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６１：Ｃ３７６−３８６；  Ｌｙｂｒａｎｄ  （１９９１）  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｅｌｇ  ４６：４９−５４；  Ｆｒｏｉｍｏｗｉｔｚ  （１９９０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：６４０−６４４；  Ｂｕｒｂａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７：９９−１１１；  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  （１９８５）  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  ６１：１８５−１９０；  ａｎｄ  Ｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ  ９：４７５−４８８；  Ｒｙｃｋａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｐｈｙｓ  ２３：３２７；  Ｖａｎ  Ｇｕｎｓｔｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓ  ３４：１３  １１；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  （１９８３）  Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｐｈｙｓ  ５２：２４；  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４２−４５３，  １９７０；  Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ９１：  ５２４−５４５，  １９８３；  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：  １０９１５−１０９１９，  １９９２；  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３３：  ７１６−７３８，  １９９３；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２７６，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，  Ｐａｒｔ  Ａ，  ＩＳＢＮ  ０−１２−１８２１７７−３  ａｎｄ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２７７，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，  Ｐａｒｔ  Ｂ，  ＩＳＢＮ  ０−１２−１８２１７８−１，  Ｅｄｓ．  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｗ．  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｊｒ．  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍ．  Ｓｗｅｅｔ  （１９９７），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；  Ｐｆｕｅｔｚｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：  ４３０−４３４  （１９９７）も参照せよ。
【０１９４】
（例証）
以上説明してきた本発明は、下記実施例を参照するとより簡単に理解できる。下記実施例は、本発明のある側面および実施態様を例証することを目的として含まれているにすぎず、どのような方式であっても本発明を制限することを意図したものではない。
【実施例１】
【０１９５】
Ｋ９ヒストンＨ３メチルトランスフェラーゼ（ＭＴアーゼ）の一つである、未変性および変異体ＤＩＭ−５のアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）からの産生および解析
タンパク質の発現および精製
アカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ＤＩＭ−５タンパク質をＧＳＴ融合体として発現した。アミノ酸残基を１７ないし３１８有する前記野生型ＤＩＭ−５  ＯＲＦの一部を、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３／ＤＩＭ−５から増幅し、ｐＧＥＸ２Ｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｒｎ−Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ認識部位間をサブクローニングしてｐＸＣ３７９を得た。ｐＸＣ３７９を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系統  ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、３７℃で１０μＭ  ＺｎＳＯ下４を加えてＯＤ下６００＝０．５とし、２２℃にしてから２２℃で一晩０．４ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導したＬＢ培地上で培養した。前記タンパク質を、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＵｎｏＱ６  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  カラム  （Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製した。前記Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに結合する融合タンパク質にトロンビンを投与し、ＤＩＭ−５のアミノ酸残基１７前の付加的な５残基（ＧＳＨＭＧ）を残して、前記ＧＳＴタグを切断した。精製緩衝液は全て、１ｍＭ  ＤＴＴを含み、ＥＤＴＡを含まない。前記タンパク質を、２０ｍＭ  グリシン  （ｐＨ  ９．８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、および５％  グリセロールを含む前記Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム緩衝液中に保存した。（メチオニン５残基を含む）Ｓｅ含有ＤＩＭ−５を、Ｓｅ−メチオニン存在下で培養したメチオニン栄養要求系統（Ｂ８３４）中で発現し、前記タンパク質を未変性タンパク質と同様に精製した。
【０１９６】
メチル基転移活性アセイ  
ＤＩＭ−５活性を、５０ｍＭ  グリシン  （ｐＨ  ９．８）、１２ｍＭ  ＤＴＴ、４０−８０μＭ  非標識ＡｄｏＭｅｔ（Ｓｉｇｍａ）、０．５μＣｉ［メチル−３Ｈ］  ＡｄｏＭｅｔ  （７８  Ｃｉ／ｍｍｏｌ，  ＮＥＮ  ＮＥＴ１５５Ｈ）、０．２５ないし０．５μｇ  ＤＩＭ−５タンパク質、および２ないし５μｇ  ヒストン（子ウシ胸腺ヒストン  Ｓｉｇｍａ  Ｈ４５２４、Ｒｏｃｈｅ  ２２３５６５、または形質転換ニワトリ赤血球ヒストン、Ｄｒ．Ｖ．Ｒａｍａｋｒｉｓｂｎａｎからの寄贈）を含む２０μｌ反応液中でアセイした。前記反応液を室温で１０から１５分インキュベートし、メチル化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびフルオログラフィーにより、または２０％  ＴＣＡによる沈殿、濾過（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  ＧＦ／Ｆフィルター）、洗浄および液体シンチレーション計数により解析した。上記の条件で、ＤＩＭ−５活性を、直線的に反応時間および酵素量と関連づけ、ＡｄｏＭｅｔおよびヒストンを飽和させた。いくつかの理由により、  前記Ｒｏｃｈｅ  製剤または前記形質転換ヒストンよりも、一般に比較的未精製のＳｉｇｍａ  Ｈ４５２４ヒストン製剤は２から４倍多く取り込まれる。
【０１９７】
ＵＶ架橋によるＡｄｏＭｅｔ−結合アセイ
精製したＤＩＭ−５タンパク質  （２ないし５μｇ）  ２０μｌを、０．５μＣｉ  ［メチル−３Ｈ］  ＡｄｏＭｅｔ（７８  Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ  ＮＥＴＩ５５Ｈ）とともに４℃で一晩インキュベートした。試料を氷上で９６穴プレートに加え、インバーティッドＵＶトランスイルミネーター（ＶＷＲ、３０２ｎｍ）から８ｃｍの位置に１時間放置した。次に、前記タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシー染色してフルオログラフィーにかけた。
【０１９８】
亜鉛含量解析  
アセンズのジョージア大学Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて、Ｔｌｚｅｎｎｏ  Ｊａｒｒｅｌｌ−Ａｓｈ  Ｅｎｖｉｒｏ  ３６  ＩＣＡＰアナライザーにより、２０エレメンツ存在下で未処理の１試料およびＥＤＴＡ処理した２試料のＤＩＭ−５タンパク質  （２ｍｇ／ｍｌのそれぞれにつき約２ｍｌ）を解析した。タンパク質に対するＺｎのモル比を計算するため、エール大学Ｄｅｃｋ  Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓにおいて、アミノ酸解析（２回の独立した測定を平均化）を実行して前期未処理ＤＩＭ−５タンパク質の正確な濃度を決定した。ＥＤＴＡ処理した試料中のタンパク質濃度を推定するため、前記アミノ酸解析で得た吸光係数（２９，５５９  Ｍ−１ｃｍ−１）を用いた。
【０１９９】
変異導入
Ｒ１５５Ｈ、Ｗ１６１Ｆ、Ｙ２０４Ｆ、Ｒ２３８Ｈ、Ｎ２４１Ｑ、Ｈ２４２Ｋ、Ｄ２８２ＫおよびＹ２８３Ｆの変異を得るため、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異導入プロトコール（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従い、ｐＸＣ３７９およびプライマー対を用いてＣＡＣ、ＴＴＣ、ＴＴＣ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＡＡＡ、ＡＡＣおよびＴＴＣコドンをＡＧＧ、ＴＧＧ、ＴＡＣ、ＡＧＧ、ＡＡＣ、ＣＡＣ、ＧＡＣおよびＴＡＴコドンの各位置に生成し、ＤＩＭ−５アミノ酸を置換した。前記ポストＳＥＴ領域の不変システインが３つともすべてセリンに置換される、３Ｃから３Ｓの前記ＤＩＭ−５変異を、変異導入３’プライマーを用いたＰＣＲにより生成した。目的の変異が存在することと、付加的な変異が存在しないことを検証するため、すべての変異をシーケンスした。唯一の例外は、構造では観測されないＮ末端領域に付加的なＡｓｐ置換（Ａ２４Ｄ）を保有する、Ｙ２０４Ｆ変異である。野生型とともに、変異タンパク質を誘導培養液１００ないし２００ｍｌから精製した。Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を０．５ｍｌ含む、使い捨てカラムを各変異に用いた。前記変異タンパク質をオンカラム・トロンビン切断によりＧＳＴから分離し、次に酵素アセイ（子ウシ胸腺ヒストンＳｉｇｍａ  Ｈ４５２４を基質として使用）、架橋解析によるＡｄｏＭｅｔ結合、および未変性タンパク質のサイズ決定のためのアナリティカルゲル濾過クロマトグラフィーに用いた。全長ＳＥＴ７／９（３６６残基）および変異タンパク質を、前記ＤＩＭ−５タンパク質と同様の手順により発現、精製した。
【０２００】
ＤＩＭ−５の酵素化学的性質
前記ＤＩＭ−５タンパク質はｉｎ  ｖｉｔｒｏで非常に高い活性を有する。我々はＤＩＭ−５の際立った特性をいくつか見出した。
【０２０１】
（１）  我々の実験条件では、前記酵素は〜１０℃で最も高い活性を示し、３７℃ではほとんど活性がなかった。
【０２０２】
（２）  例えば１００ｍＭ  ＮａＣｌにより活性が９５％失われるなど、ＤＩＭ−５は塩に極めて感応的である。
【０２０３】
（３）  前記酵素は最適ｐＨが高い。
【０２０４】
ｐＨ８くらいで最も強いＡｄｏＭｅｔ架橋を示すにもかかわらず、ＤＩＭ−５は〜ｐＨ９．８で最も高い活性を示す。ｐＨ６．０未満では、ＨＫＭＴ活性もＡｄｏＭｅｔ結合も観測されなかった。
【実施例２】
【０２０５】
ＤＩＭ−５結晶構造、アカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）由来のＫ９ヒストンＨ３メチルトランスフェラーゼ（ＭＴアーゼ）、およびＤＩＭ−５三重複合体、メチル−ドナー産物  ＡｄｏＨｃｙ、ならびにヒストン・ペプチド
ＤＩＭ−５結晶解析
我々は、形質転換ＤＩＭ−５タンパク質（アクセッションＡＦ４２９２４８の残基１７ないし３１８）を結晶研究に用いた。実施例１で調製した精製ＤＩＭ−５タンパク質を、２０ｍＭ  グリシン（ｐＨ  ９．８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％  グリセロール、および６００μＭ  ＡｄｏＨｃｙで１０−１５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。１６℃で１．１−１．２  Ｍ  硫酸アンモニウムおよび１００ｍＭ  クエン酸ナトリウム  （ｐＨ  ５．４−５．６）を含む母液により、前記懸垂液滴法を用いて、結晶を得た。結晶は、３６．７３ｘ８１．５６ｘ１０１．２７Åの細胞容積を有する空間群Ｐ２１２１２１に属する。各非対称ユニットは１分子を含む。前記Ｚｎ−吸収端（表１）近くの未変性結晶およびＳｅ−およびＺｎ−吸収端（非表示）のＳｅＭｅｔを取り込んだ結晶から、完全なデータセットを収集した。ＨＫＬパッケージ（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉおよびＭｉｎｏｒ、１９９７）を用いて、前記データを処理した。
【０２０６】
３つの内因性亜鉛イオンによる多波長異常分散データを用いて、電子密度図を計算した。まずＳＯＬＶＥ（ＴｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒおよびＢｅｒｅｎｄｚｅｎ、１９９９）により３つの亜鉛原子の位置を解明し、次にＲＥＳＯＬＶＥ  （Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ、２０００）を用いて電子密度図を修正した。０を用いてＤＩＭ−５アミノ酸を認識可能な密度に設置することにより（ＪｏｎｅｓおよびＫｊｅｌｄｇａｒｄ、１９９７）、前記修正図は解像度２．９Åという高品質を有するようになった。それと平行して、ＳＯＬＶＥにより５つのセレン原子の位置を決定し、うち２つ（ＳｅＭｅｔ  ２３３および２４８）をＺｎ位相図により確定し、残り３つ（ＳｅＭｅｔ  ７５、８５、および３０３）をトレーシングの間、一次配列中のマーカーとして供した。
【０２０７】
ＤＩＭ−５のモデルを構築し、Ｘ−ＰＬＯＲプログラム・パッケージ  （Ｂｒｕｎｇｅｒ、１９９２）を用いて、結晶のＲ因子  ０．２０５およびＲｆｒｅｅ値  ０．２５８で解像度１．９８Åにリファインした。前記最終モデルは、理想値からのＲＭＳＤが長さおよび角度それぞれで０．００８Åおよび  １．５°で、１，９１３のタンパク質原子（平均Ｂ値  ２６．９  Å２）と、３つの亜鉛イオンと、１０３の水分子とを含む。ＤＩＭ−５の次に示す３つのセグメントは前記最終モデルには観測されない。
【０２０８】
・Ｎ末端８残基  （１７から２４）−  直後の残基にインフレーム・スプライシング部位が存在するため、これら残基は未変性ＤＩＭ−５タンパク質には存在しないことがある。
【０２０９】
・前記プレＳＥＴドメインの残基８９から９９  −  これら残基は前記ＳＴＪＶ３９タンパク質では除外されていることが多い。
【０２１０】
・Ｃ末端３４アミノ酸の大多数  −  Ｃ末端もまた、前記ポストＳＥＴ領域の３つのＣｙｓを除いて、ＳＥＴタンパク質間で長さおよび配列が変異に富んでいる。
前記非グリシンおよび非プロリン残基は、８６％が最も好ましく、１４％はラマチャンドラン・プロットの付加的許容領域に属す。
【０２１１】
前記構造の座標はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  （ＩＤコード  １ＭＬ９）に登録している。
【０２１２】
【表１】
2005536996.tif 000002
ＤＩＭ−５三重複合体の結晶解析
実施例１で述べているように、アカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ＤＩＭ−５タンパク質を発現、精製した。共結晶化のため、Ｈ３ペプチド（１ないし１５残基）を、精製ＤＩＭ−５タンパク質（１２  ｍｇ／ｍｌ  ２０ｍＭ  グリシン、ｐＨ  ９．８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、５％  グリセロール、および６００μＭ  ＡｄｏＨｃｙ）に最終濃度２ｍＭで付加した。０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．４−８．６、２０−２５％  ポリエチレングリコール２０００モノメチルエーテル、０．２  Ｍ  トリメチルアミン、および５ｍＭ  ＤＴＴを含む母液により、１６℃で前記懸垂液滴法を用いて結晶を得た。
【０２１３】
Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅにおいて、ビームラインＸ２５のＡＤＳＣ  Ｑ３１５  ＣＣＤ検出器により単一氷結結晶由来のＸ線データを収集した。検出器と試料の距離が４００ｍｍ、波長１．０  Åで、１°回転する間の露光時間は１２０秒である。ＨＫＬ２０００ソフトウェア・パッケージ（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉおよびＭｉｎｏｒ、１９９７）を用いて、合わせて１３５°回転分のデータ取得およびデータ処理を行った。結晶データの統計値を表２に示す。１０．０ないし４．０Åのデータを分子置換による構造決定に用いた。２．６Åの全データをリファインメントに用いた。
【０２１４】
【表２】
2005536996.tif 000003
ＡＭｏＲｅプログラム（Ｎａｖａｚａ、２００１）を用いて前記分子置換解を検索するため、上記の通り決定した前記基質フリーＤＪＭ−５座標（ＰＤＢ  １ＭＬ９）を使用した。検索モデルを参照したところ、２つの解がみつかった。２つの解とはすなわち、空間群Ｐ２下１２下１２下１における前記ＤＩＭ−５分子の方向であって、ａ、ｂ、およびｃ軸に沿ってトランスレートしたフラクショナル座標がそれぞれ（０．３８４、０．０５４７、０．０６３０）および（０．０９６６、０．６１７９、０．１５８１）である、（１０３．０７°、８０．８６°、０．１５°）および（９５．４８°、４５．６４°、１０９．３０°）のオイラー回転に相当する。前記解の相関係数０．４８８およびＲ因子０．４４という値は、各非対称ユニットが２つの複合体を含んでいることを示す。前記２つのＤＩＭ−５分子は、Ｎ末端残基３０ないし４５を介して接触する。
【０２１５】
Ｘ−ＰＬＯＲ  （Ｂｒｕｎｇｅｒ、１９９２）のリギッドボディー・リファインメントにより最適化した結果得た前期モデルは、総異方性Ｂ因子最適化（Ｂ１１＝２０．７、Ｂ２２＝１７．５、およびＢ３３＝１９．９）およびバルク溶媒相関（Ｘ−ＰＬＯＲ）により、Ｒ因子  ０．３３およびＲｆｒｅｅ  ０．３７の結果を得ることができるまで大幅に改善することができる初期位相を与える。次に、前記タンパク質モデルからの位相による差フーリエ図  （２Ｆｏｂｓ−Ｆｃａｌ、αｃａｌおよびＦｏｂｓ−Ｆｃａｌ、αｃａｌ）を、３．０、２．８および２．６  Åのそれぞれにつき計算し、グラフィック・プログラムＯ（ＪｏｎｅｓおよびＫｊｅｌｄｇａｒｄ、１９９７）を用いて検証した。２倍の非結晶対称平均化がない電子密度は、前記ＡｄｏＨｃｙ、ポストＳＥＴ  Ｃｙｓ残基により配意された前記亜鉛、および前記Ｈ３ペプチドの配意された部分に相当する分子をともにはっきりと見ることができる。前記電子密度にフィットさせるため、これらセグメントはマニュアルで位置を決定した。Ｘ−ＰＬＯＲを使った１サイクル（１００ステップ）の最小二乗法による位置リファインメントにより、Ｒ因子  ０．２６およびＲ下ｆｒｅｅ  ０．３３の結果を得た。Ｏを用いてマニュアルによりモデルを構築した後、最小二乗法による位置および個別Ｂ因子のリファインメントのサイクルを数回実行した。前記リファインメント（ＮＣＳウェイト３００）の間、前記非結晶対称制約を前記２複合体に適用した。マニュアルによるモデル・フィッティングをガイドするため、一連のシミュレーティッド・アニーリング・オミット図を用いた。
【０２１６】
リファインメントのこの段階では、前記ペプチドの残基１３から１５または１から６の前記ディスオーダード端は、ディスオーダード・タンパク質残基２８６から３０４の、開始位置または終了位置のゼネラルエリアそれぞれに共局在化することが観測される。断続的な密度は存在するが、明確に前記ペプチドおよびタンパク質の密度を判別することはできない。溶媒分子にこれら密度を割り当てると、Ｒ因子値およびＲｆｒｅｅ値の差が減少する。しかし、そのような溶媒分子は前記最終モデル（Ｒ因子  ０．２２およびＲｆｒｅｅ  ０．３２）には含まれない。
【０２１７】
前記ＳＥＴ領域およびポストＳＥＴ領域間の残基２８６から３０４に加え、前記最終構造には他にも２つのＤＩＭ−５セグメントがモデルに含まれない。すなわちそれら２つのセグメントとは、前記プレＳＥＴドメインのＮ末端残基１７から２５および残基９０から９６である。さらに、ディスオーダード側鎖および比較的高い結晶温度因子が、＞７５Å２  （前記タンパク質のその他の部分よりも２ないし３倍高い）であることが示すように、２、３の残基ストレッチ（プレＳＥＴの５２から６１、８５から８９および９７から９８、ＳＥＴの１９０から２０２および２１２から２２４）はフレキシブルである。その結果、前記フレキシブルストレッチの内部または近傍の残基の側鎖は、アラニンのみでモデル化されることが多い（プレＳＥＴ残基：  Ｋ５３、Ｎ５４、Ｑ６０、Ｖ６４、Ｓ７０、Ｅ７２、Ｅ７３、およびＤ８３。ＳＥＴ残基：  Ｅ１８１、５１８５、Ｅ１８６、Ｅ１９４、５１９５、Ｔ１９６、Ｒ１９９、Ｒ２００、Ｄ２１５、Ｓ２１６、Ｌ２１７、Ｌ２２１、およびＥ２２７）。前記フレキシブルストレッチは、折れたたみ構造内で同一クラスターに属する。例えば、ストランドβ３（Ｋ５３、Ｎ５４）の後のループにはストランドβ９  （Ｅ１８１）およびヘリックスαＦ  （Ｓ１８５およびＥ１８６）が続き、２つの３下１０へリックス、αＡ（Ｑ６０）およびαＩ（Ｌ２２１）が１つにまとまる。
【０２１８】
前記構造の座標はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  （ＩＤコード  １ＰＥＧ）に登録しており、図６にも記載している。
【０２１９】
活性部位、ドメイン、ならびに前記ＤＩＭ−５およびＤＩＭ−５三重複合体のドラッガブル（Ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）領域の構造
前記プレＳＥＴドメイン  
前記プレＳＥＴドメインは不変システイン残基を９残基含む。前記９残基の不変システイン残基は、種々の数のアミノ酸（ＤＩＭ−５では４６）により分離される、５および４のシステインの２セグメントに分けられる。イクオラテラル三角形クラスター（ｅｑｕａｌｌａｔｅｒａｌ  ｔｒｉａｎｇｕｌａｒ  ｃｌｕｓｔｅｒ）を形成するため、これら９残基のシステインは３つの亜鉛イオンを配意する（図１Ｃ）。各亜鉛イオンは、２つのユニークなシステイン群（合わせて６残基）により配意される。残り３システイン残基  （Ｃ６６、Ｃ７４、およびＣ１２８）はそれぞれ２つの亜鉛原子に共有される。つまり、前記金属原子の前記４面体配位を完成させるための橋の役割を果たす。亜鉛原子間の距離は〜３．９  Å、前記Ｚｎ−Ｓ間距離は〜２．３Åである。同様の金属−チオレートクラスターは、亜鉛代謝、亜鉛転移およびアポトーシスに必要なメタロチオネインでも見られる。メタロチオネインは２つの金属クラスターを有することが多い。２つの金属クラスターとは、すなわち、（Ｍｅ）下３Ｃｙｓ下９および（Ｍｅ）下４Ｃｙｓ下１２のことであり、ＭｅはＺｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｕ２＋またはその他の重金属であってよい。前記ＤＩＭ−５トリ亜鉛クラスターは、ラット・メタロチオネインの前記（Ｚｎ２Ｃｄ）Ｃｙｓ９クラスターに完全に重ね合わせることができる（非表示）。先に述べたように、前記プレＳＥＴドメインは、ディスオーダード領域  （残基９０から９６）により５および４システインの２セグメントに分離される、９不変システイン残基を含む。我々は、第１Ｃｙｓセグメント（残基５０から９９）は平均温度値７０Å２で、平均温度値が４０Å２の第２セグメント（残基１００から１５０）よりも動きやすいことを見出した。この観測結果は、メタロチオネインが２つの金属クラスターを含むように、プレＳＥＴ三角形クラスターから前記ポストＳＥＴドメインへと前記亜鉛が転移するという、興味深い可能性を示している。前記プレＳＥＴドメインの動的な特性を、Ａｓｇａｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅのビームライン１７−ＩＤで収集した、異なる結晶から得た２つ目のデータセットにより確認する。今回は、ＮＣＳに厳しい制約をつけて（ウェイト＝７００、前回のリファインメントで使用した３００ではなしに）構造をリファインした。ＮＣＳ制約を厳しくしたことにより、解像度の範囲１０ないし２．８Å（２８、７１３反射）でＲ因子（０．２６）およびＲｆｒｅｅ（０．３２）となり、Ｒ因子とＲｆｒｅｅの差が小さくなった（再度確認、水分子は含まれていない）。しかしながら、この結果得た構造、とくに活性部位付近の局所的領域の構造は、前回の構造とほとんど同じであった。
【０２２０】
前記プレＳＥＴドメインは、ドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）領域および亜鉛を転移する動作または活性を阻害する修飾因子を含んでいてもよく、本発明の範囲に含まれている。
【０２２１】
前記ＳＥＴドメインは前記活性部位を形成
前記ＳＥＴドメインは、頂上がヘリカルキャップ（αＦ、αＧ、αＨおよびαＩ）で側面が四角いβバレルに似ている。４つのβシート  −  （１↑  ５↑  ６↓）  （７↑  １６↓）  （４↓  １４↑  １５↓  ８↑）  ａｎｄ  （３↑９↑  １１↓１０↑）  −が前記バレルの側面を形成し、１つのシート  −  （２↓  １２↓）  −  が底を形成している（図２Ａ）。前記バレルの開いた側面の真ん中は、β１３およびβ１４ストランド間の短いループが作る開口部を、β１７−ループを通すことにより、クロスオーバー構造（マゼンタ）を形成している。これにより、前記ＳＥＴドメインの最も保存された２領域が合わさっている。２領域とは、αＪ−β１３ループ（Ｎ下２４１ＨＸＣＸＰＮ下２４７）およびβ１７−ループ（ＤＹ下２８３）（図１）のことである。強い相同性で保存されたこれら２セグメントの側鎖は、
（１）  疎水性の構造パッキング（αＪのＩ２４０ならびにβ１７のＬ２７９およびＦ２８１）と、
（２）  分子間の側鎖−主鎖相互作用（Ｐ２４６で急旋回した後、Ｎ２４７の前記側鎖は、Ｅ２７８の前記主鎖カルボニル酸素およびＴ２８０の前記主鎖アミド窒素と相互作用する）と、
（３）  ＡｄｏＭｅｔ結合部位および活性部位形成（αＪのＲ２３８およびＦ２３９、Ｎ２４１：Ｅ２７８ペア、Ｈ２４２：Ｄ２８２ペア、およびＹ２８３）と、に必要とされる。これら不変残基は同一クラスターに属し、Ｎ２４１とＥ２７８との間およびＨ２４２とＤ２８２との間の相互作用など、ペアワイズ相互作用を通じて、前記ＡｄｏＭｅｔ結合ポケットおよびペプチド結合クレフト（後述）のすぐ後に活性部位を形成する。前記ＳＥＴドメインのすべてまたは一部は、ドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）領域を含んでいてよい。
【０２２２】
ＡｄｏＭｅｔ／ＡｄｏＨｃｙ共同因子結合ポケット
知られているＨＫＭＴはすべて、メチルドナーとしてＡｄｏＭｅｔを用いる。最も一般的なＡｄｏＭｅｔの配座、またはその反応産物ＡｄｏＨｃｙは、いわゆる「コンセンサス」ＭＴアーゼでみつかっている。これらＭＴアーゼはミックスされた７ストランドβシートの周りに構築され、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または小分子基質中の炭素、酸素、または窒素原子に作用する、２０より多い構造既知ＭＴアーゼを含む。ＤＩＭ−５はこれらＡｄｏＭｅｔ依存タンパク質のいずれとも類似の部分構造を有さず、全く異なる手段でそれらの共同因子と相互作用することが明らかになっている。
【０２２３】
前記メチル−ドナー産物、ＡｄｏＨｃｙは、フォールディッド配座中の開いた凹面ポケット（図２Ｅ）に位置する。同様の共同因子配座は、ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）ＭＴアーゼおよびＳＥＴ７／９に見られる。前記ＡｄｏＨｃｙは、前記クラスＩＩＩ  ＭＴアーゼ  ＣｂｉＦ、プレコリン基質の環状炭素に作用するＭＴアーゼに結合するＡｄｏＨｃｙと同様によじれている。しかし、ＤＮＡ  ＭＴアーゼなどの広範なクラスＩ  ＭＴアーゼで最も見られる、伸長した配座とは有意に異なる。ＤＩＭ−５はファンデルワールス接触および水素結合を通じて、ＡｄｏＨｃｙの３つの骨格、アデニン塩基、リボース、およびホモシステインのすべてと相互作用する（図２Ａ）。
【０２２４】
この密集を囲む残基のいくつかにつき、我々は保存的置換を行った。いくつかの残基とは、すなわちＲ１５５Ｈ、Ｗ１６１Ｆ、Ｙ２０４ＦおよびＲ２３８Ｈである（実施例１を参照）。７５％低減（Ｗ１６１Ｆ）からほとんど不活性化（Ｒ２３８Ｈ）にいたるまで、すべての変異の酵素活性を低減した。架橋により測定される、これら変異のＡｄｏＭｅｔへの結合能もまた低減したが、なくなりはしなかった。低減したＡｄｏＭｅｔ結合だけで、Ｒ１５５Ｈ、Ｗ１６１Ｆ、およびＹ２０４Ｆ変異のＨＫＭＴ活性の低減を説明できることは明らかである。しかしながら、Ｒ２３８Ｈ変異はＡｄｏＭｅｔ結合よりもＨＫＭＴ活性の方が非常に低減した。このことは、Ｒ２３８が触媒として他の働きもしている可能性を示す。ＳＵＶ３９Ｈ１およびＳＵＶ３９Ｈ２に関して、ＤＩＭ−５はＲ２３８の位置にヒスチジンがある。このヒスチジンをアルギニンに変えると、ＳＵＶ３９Ｈ１活性が２０倍以上に増加する。この結果は、ＤＩＭ−５の逆Ｒ２３８Ｈ変異では活性が大幅に低減することと整合性がある。
【０２２５】
興味深いことに、前記凹面ポケットはＡｄｏＨｃｙを１つ収容するのに必要な程度よりはるかに大きい。特に、ＡｄｏＨｃｙ結合部位と隣接して、図２Ｅに示す方向に開けたスペースが存在する。このスペースは、相同性が強い残基  ８１５５、Ｗ１６１、Ｙ２０４、およびＲ２３８に囲まれた、乱雑に並んだ共同因子が、ＤＩＭ−５−ＡｄｏＨｃｙの２次構造で観測されるところである。このことは結合ＡｄｏＨｃｙがペプチド結合の活性部位方向に移動することを示し、Ｒ１５５Ｈ、Ｗ１６１Ｆ、Ｙ２０４ＦおよびＲ２３８１１変異のＡｄｏＭｅｔ結合能が低減されてもなくならないことを説明している。この移動経路により、ペプチド基質を放出することなく反応産物  ＡｄｏＨｃｙをＡｄｏＭｅｔと交換することを許容し、それゆえ、メチル基転移をプロセッシブに進められるようになる。実際、ＤＩＭ−５は、１および２つの中間物をほとんど蓄積することなくトリメチル−リシンを形成する。異なるメチル化産物は異なるシグナル特性を有することを考慮すれば、この明らかなプロセッシビティーの構造的な根拠を理解することが重要である。
【０２２６】
前記ＡｄｏＭｅｔ／ＡｄｏＨｃｙ結合ポケットのすべてまたは一部は、ドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）領域を含んでいてよい。
ペプチド結合クレフト
ヒストン尾部ペプチドは、表面溝部（図１Ｂ）に結合、２本のＤＩＭ−５鎖間にパラレル０鎖として挿入（図１Ｃ赤色）、０１０（緑色）、および１３１８（マゼンタ）、および６鎖ハイブリッド（３シート（３↑、９↑、１１↓、１０↑、Ｈ３↑、１８↑）で完了。メチル化ヒストンＨ３ペプチドを持つヘテロクロマチン・タンパク質ＨＰ１で見られる相互作用を暗示するβ鎖としての標的Ｈ３ペプチドの挿入。しかし、その例では、Ｈ３ペプチドは、２本のＨＰ１鎖間のアンチパラレル鎖として挿入される。ベータ鎖としてのＨ３ペプチドの結合もまた、アセチル化ペプチドがＨＫＭＴにとって貧弱基質。ヒストンＮ−末端のアセチル化によってそのヘリカル含有量が増加し、ヘリカルＨ３尾部がＥＫＭＴ結合溝部にフィットするとは期待できない。
【０２２７】
標的Ｌｙｓ−９は、ＤＩＭ−５と周囲Ｈ３配列との間の種々の相互作用を介して達成され、該相互作用は、主鎖−主鎖、主鎖−側鎖、および側鎖−側鎖を含む。すなわち、（ｉ）ＤＩＭ−５残基Ｌ２０５（Ｃ＝０）およびＡ２０７（ＡＮ−Ｈ）とＨ３Ｌｙｓ−９水素の主鎖（Ｎ−ＨおよびＣ＝Ｏ）との結合。（ｉｉ）主鎖Ｎ−ＨのＨ３Ｓｅｒ−１０水素がＹ２８３の主鎖カルボニルと結合する一方で、その側鎖のヒドロキシル酸素がＤＩＭ−５Ｄ２０９（図２Ｄ）の側鎖と結合する。この相互作用は、ペプチド認識にとってクリティカルなものとして現れる。Ｓｅｒ−１０おリン酸化は、ＤＩＭ−５による場合（未発表）と同様に、ＳＵＶ３９Ｈ１、Ｃｌｒ４、ＳＥＴＤＢ１によるＬｙｓ−９メチル化によるＨ３Ｌｙｓ−９メチル化を妨げる。Ｓｅｒ−１０の負に荷電したリン酸基がＤ２０９でその相互作用を崩壊させることは、驚くべきでない。高度に保存されたＤ２０９をＬｙ、Ｇｕ、またはＧｉｎによる置換もまた、ＡｄｏＭｅｔ架橋に影響を及ぼすことなくＤＩＭ−５活性を無効または減少させる。このことは、両側鎖長および電荷がＳｅｒ−１０との相互作用に重要であることを示唆している。（ｉｉｉ）Ｈ３Ｔｈｒ−１１水素の主鎖カルボニルがＱ２８５の側鎖と結合する一方で、その側鎖がＤ２０６の側鎖とＫ２１０疎水部分との間の空間にフィットする。Ｔｈｒ−１１は基質認識に対してクリティカルな情報を提供可能である。すなわち、Ｌｙ−９およびＬｙｓ−２７（ＱＡＲＫ９ＳＴまたはＡＡＲＫ２７ＳＡ）周囲の配列は、この位置で異なり、ＤＩＭ−５はＬｙｓ−２７をメチル化しない。
【０２２８】
Ｈ３（１−１５）ペプチドの末端、残基１３−１５および１−６（メチル化反応にとって重要）は、現在のモデルでは不調である。これらの残基を明白に同定することはできなかった。なぜなら、障害が生じたタンパク質残基２８６−３０４の開始端および末端の一般的老域に共に局在するからである（図１Ｃおよび１Ｄ）。ＨＫＭＴタンパク質間の長さおよび配列で高度に可変の領域に残基２８６−３０４が対応していることから、障害炉湯域は異なるＨＫＭＴの基質特異性に貢献するものと考えられる。
【０２２９】
さらなる生化学的および構造的な分析は、熱力学的理解に向けられており、そのような理解がＤＩＭ−５基質認識の興味深い態様を解決するのに必要であり、また酵素のこの部分とペプチド基質との相互作用の直接的な観察を可能にする。
【０２３０】
ペプチド結合部位のすべてまたはその一部は、ドラッガブル領域を含むものであってもよく、またＨＨ３ペプチドはこの領域に結合する修飾因子の設定のベースを提供するものであってもよい。
【０２３１】
標的リジン結合部位
標的Ｌｙｓ−９の側鎖は、ナロウチャネル（図２Ｂ）（ポストＳＥＴ領域が構築される場合にだけ、見られる）へ堆積している。Ｆ２０６、Ｆ２８１、Ｙ２８３とＣ末端残基Ｗ３１８の芳香族側鎖は、チャンネル壁を形成して、Ｌｙｓ−９側鎖（図２Ｃ）のメチレン基一部に、ファンデルワールス接点を作る。Ｙ２８３水酸基は、１２４０個の主鎖カルボニル酸素に水素が結合している。この相互作用はペプチド基質不在下で観察される。また、Ｔｙｒ基環がチャネルに標的リジンの側鎖を導く比較的一定の立場にあることを示唆する。チャネルの底で、基質リジン水素の末端アミノ基はＹ１７８ヒドロキシルを結合して、ＡｄｏＨｃｙ硫黄原子から〜４Åである。ここで、移動可能なメチル基はＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンに付着している。ＡｄｏＨｃｙ硫黄は、Ｙ２８３ヒドロキシル酸素から〜４Å離れてもいる。
【０２３２】
ＤＩＭ−５は異常に高い至適ｐＨ（−１０）を有し、塩に非常に影響される。ｐＨ  １０で、標的リジンのｃ−アミノ基とＹ１７８およびＹ２８３（それは、全て典型的なｐＫａ値＝〜１０を持つ）の水酸基が部分的に脱プロトンされなければならないこと。観察された相互作用は、脱プロトンされたＹ２８３（Ｏ〜）がＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン・メチル・スルホニウム基（ＣＨ３−Ｓ＋）の上で正電荷を安定させる間、脱プロトンされたＹ１７８（Ｏ〜）が標的Ｌｙｓの末端アミノ基と相互作用して、それによってその脱プロトン化を容易にすることを示唆する。これらの相互作用の結果として、標的リジンの脱プロトンされたアミノ基（ＮＨ２）は、いかなる一般的な塩基なしでも正に荷電するＡｄｏＭｅｔメチルスルホニウムを求核的に攻撃することが可能である。
【０２３３】
上述の相互作用によって、直ちにいくつかの実験的観察が説明される。すなわち、
（ｉ）３つの潜在的脱プロトン化イベント（標的リジン、Ｙ  １７８およびＹ２８３）の関係は、ＤＩＭ−５のｐＨプロフィールと整合している；  ここで、ｐＨに対する活性のログ・プロット中で、傾斜が約３ｐＨ単位（図２Ｄ）で妨害する点に注目。（ｉｉ）  Ａ  Ｙ２８３Ｆ突然変異はＡｄｏＭｅｔ架橋とＭＴアーゼ活性を無効にして、ＡｄｏＭｅｔを結合する際に影響を受けた水酸基のために重要な役割と整合させた。（ｉｉｉ）７８Ｖの突然変異が生じたＡ  Ｙ１は、ＡｄｏＭｅｔでＭＴアーゼ活性および還元型架橋の損失を完了する。同様に、Ｙ１７８Ｆ突然変異もＤＩＭ−５活性を激減させたが、ＡｄｏＭｅｔ橋かけにほとんど影響を及ぼさなかった。これは、標的窒素原子と直接接触し、触媒作用において必須役割を果たしているＹ１７８ヒドロキシルと整合している。
【０２３４】
ポストＳＥｔドメイン
結合ペプチドの他に、ペプチドの有無によるＤＩＭ−５構造間で最も顕著な違いは、ポストＳＥＴ構造である。ポストＳＥＴ領域は、基質のないＤＩＭ−５で構造化されていなかった。基質のないＤＩＭ−５構造では、Ｃ末端（ポストＳＥＴ領域を含む）の大部分が、２９９−３０８残基間のセグメントを除いて、結晶に障害があった。この１０−残基部分（セレノメチオニンを置換されたＤＩＭ−５タンパク質でＭ３０３を介して同定される）は、２つの結晶学的に関連した分子間の接点で安定した。われわれは、この部分（隣接した障害がある残基とともに）が基質に対する結合に異なる構造を採用すると仮定した。
【０２３５】
３つの保存システイン残基が、ＨＲＭＴ活性にとって不可欠であるこの地域にある。生化学的分析およびゲノム分析に基づいて、我々は活性部位（ＤＩＭ−５の署名モチーフＮ２４１ＨＸＣＸＰＮ２４７のＣ２４４）の近くで第４のシステインに連結するとき、これらの３つのシステインが金属結合部位を形成するように提案した。これは、実際、我々が現在の三元構築物（図２Ａ）で亜鉛イオンが四面体でＣ２４４、Ｃ３０６、Ｃ３０８、およびＣ３１３による座標ｄであることを観察したということである。面白いことに、非常に保存されたＨ２４２のイミダゾール環の位置は、そのＮε２原子が亜鉛原子（図２Ａ）に第５の配位を提供することができたことを示唆する。一方では、そのＮ５１原子水素はＹ２８３の骨格鎖ＮＨを結合して、更に活性部位と柱ＳＥＴ金属中心の間の相互作用を安定させる。  
【０２３６】
ポストＳＥＴ亜鉛結合部位は、活性部位（図２Ａ）の近傍にある。構造ポストＳＥＴ領域は、ＡｄｏＨｃｙとペプチド結合との両方に関与するＣ末端の残基をもたらす。（ｉ）Ｌ３０７水素の主鎖アミド窒素がＡｄｏＨｃｙアデニン塩基（図３Ａ）の環窒素Ｎ１で結合する。（ｉｉ）Ｌ３１７の側鎖がＡｄｏＨｃｙアデニン環に対してパックする。（ｉｉｉ）  Ｗ３１８は、標的Ｌｙｓを収めて、Ｈ３のＡｌａ−７に対して、およびＡｄｏＨｃｙリボースのヒドロキシルのうちの１つに対して、ファンデルワールス力による接触をもたらすチャネルの一部分を形成する。（ｉｖ）Ｒ３１４は、Ｄ２８２で塩橋を形成する。これらの相互作用は、セリンによる３つのポストＳＥＴシステインの同時置換がＤＩＭ−５  ＡｄｏＭｅｔ架橋とＭＴアーゼ活性とを無効にしたという観察と整合している。加えて、アラニンによる最後の２つのＣ末端残基（Ｌ３１７またはＷ３１８）のいずれかの置換は、有意に減少したが、ＡｄｏＭｅｔ架橋とＭＴアーゼ活性は消えなかった。多くのＳＥＴタンパク質（  ＳＵＶ３９、ＳＥＴ１、およびＳＥＴ２ファミリーを含む）のポストＳＥＴ領域の精検は、ポストＳＥＴドメインと活性部位との間のこれらの相互作用が高く保存されることを示唆する。すなわち、複数の疎水性残基はポストＳＥＴシステインの後で典型的に存在する、また、アスパラギン酸（ＤＩＭ−５のＤ２８２）が活性部位で存在するときはいつでも、正に荷電する残基（ＤＩＭ  ５の８３１４）が通常最後のポストＳＥＴシステインの後にある。
【０２３７】
われわれは、われわれがＤＩＭ−５で観察した金属中心がシステインの豊富なポストＳＥＴで全てのＳＥＴタンパク質の間で広く行われているように提案する。この金属中心が酵素活性のために絶対必要であることから、それは金属配位を崩壊させる阻害遺伝子を設計することを示し、マトリックスメタロプロテアーゼのような多数の金属酵素にとって良好であるＢｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）およびａｎｄ  Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２））に概説）。前述を考慮して、全てまたは一部のポストＳＥＴドメインは、ドラッガブル領域から構成される。
【０２３８】
他のＳＥＴタンパク質との比較
ＤＩＭ−５の構造測定は、われわれがヒトのＳＵＶ３９ファミリー・タンパク質、今までに報告  される全ての検査された活発なＨＫＭＴｓと３つの細菌ＳＥＴタンパク質とを含むＳＥＴタンパク質の構造誘導配列アラインメントを実行することができた。３１８−残基ＤＩＭ−５タンパク質は、ＳＵＶ３９ファミリーで最も小さいメンバーである。それは４つのセグメントを含有する。すなわち、（１）わずかに保存されたアミノ末端領域と、（２）９つの不変システインを含むプレＳＥＴドメインと、（３）ＮＨＣＸＰＮおよびｄＹの署名モチーフを含むＳＥＴ老域と、（４）３つの不変システインを含むポストＳＥＴ領域と、を含む。ポストＳＥＴ領域がＳＥＴ  １およびＳＥＴ２ファミリー（Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ、２００２）の多くのメンバーで、そして、Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ（図１）由来の１つの細菌ＳＥＴタンパク質でさえも存在する一方で、９−システイン・プレＳＥＴ領域はＳＵＶ３９ファミリーに特有である。２つの活性ヒトＨＫＭＴは、どちらもｐｒｅ−ポストＳＥＴ領域も含まない。ＳＥＴ７（また、ＳＥＴ９を呼ばれる）はヒストンＨ３のリジン４をメチル化し、ＳＥＴ８（また、ＰＲＳＥＴ７を呼ばれる）はＨ４のリジンをメチル化する。
【０２３９】
ＤＩＭ−５およびＳＥＴ７／９をＲｕｂｉｓｃｏ  ＭＴアーゼ（システインの豊富なポストＳＥＴドメインを持たない２つのＳＥＴタンパク質）との比較は、収束進化の著しい例を現す。特に、ＤＩＭ−５のように、これらの２つの酵素はリジン・チャンネルの編成のためにＳＥＴドメインの残基Ｃ末端に依存するが、活性部位上へｃｘ−螺旋（金属中心よりむしろ）がパックすることによってそうする。
【０２４０】
部分的に上述の構造的情報（一態様では）に基づいて、本発明はＳＥＴドメイン・タンパク質のドラッガブル領域を目的、いくつかの実施形態では、対象ドラッガブル領域に含まれるアミノ酸配列の主要部を含むヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質を目的する。もう一つの態様において、本発明は、ＳＥＴドメイン・タンパク質のドラッガブル領域と相互作用する修飾因子に向けられる。１つの実施形態において、この領域は、プレＳＥＴドメインから構成される。別の実施形態において、この領域は、ポストＳＥＴドメインから構成される。さらにもう一つの実施例において、この領域は、ＳＥＴドメイン活性部位から構成される。ＳＥＴドメイン・タンパク質がヒストン・メチルトランスフェラーゼであるさらに他の実施形態において、この領域は、ポケット、ペプチド結合クレフトまたは標的リジン結合部位を結合しているＡｄｏＭｅｔ／ＡｄｏＨｃｙ補因子から構成される可能性がある。もう一つの態様において、本発明はＳＥＴドメイン・タンパク質ドラッガブル領域の活性の修飾因子を目的とする。１つの実施形態において、ドラッガブル領域と化合物を接触させることによって修飾が達成される。接触させることは、領域に化合物を結合させることになり、さらに／あるいは該領域の天然リガンドの結合能の修飾をもたらす。例えば、接触させることは領域に化合物の結合をもたらし、および／または領域の天然リガンドの結合能力の変調をもたらす。例えば、化合物はドラッガブル領域と結合することが可能であり、天然リガンドが領域と結合するか、相互に作用するのを防止する可能性がある。他の実施形態において、化合物は天然リガンドと結合またはキレートすることが可能で、領域に対して結合を妨げる。１つの実施形態において、修飾因子はドラッガブル領域に亜鉛原子の結合に影響を及ぼす。修飾因子は、亜鉛をキレート化すること、またはブロッキング・アクセスによってドラッガブル領域に結合することで、亜鉛原子を妨げることができる。ある種の実施形態において、亜鉛結合部位は、システインをｐタンパク質のポストＳＥＴ領域に構成される。
【実施例３】
【０２４１】
ＤＩＭ−５タンパク質の生成物特性についての基礎
ＤＩＭ−５およびＳＥＴ／９は、異なる生成物を生成する。すなわでぃ、ＤＩＭ＝５はトリメチル−リジンを形成し、ＳＥＴ７／９はモノメチル−リジンのみを形成する。ＤＩＭ−５はトリメチルリジンを形成する、そして、ＳＥＴ７１９はモノメチル−リジンだけを形成する。それらの異なる生成物特異性に関してありそうな説明は、ＳＥＴ７／９のリジン結合チャネルの残基がメチル基で立体的に標的リジン側鎖を除外するということである。そのような残基を同定するために、我々はＡｄｏＨｅｙと複合体形成したＥＴ７／９複合体（図１３）のバイナリ構造における標的リジンを囲む残基で、ＤＩＭ−Ｓ三元構築物の標的リジンを囲んでいる残基を重畳し（図３）。プライマリー・シーケンス・アラインメント（図３Ｂ）からの期待されるものとして、Ｙ  １７８とＤＩＭ−ＳのＹ２８３は、ＳＥＴ７／９のＹ２４５とＹ３３５で井戸を重畳する。我々も、Ｆ２８１フェニル基の端がＳＥＴ７／９（標的リジン（図３Ｃ）のターミナルのアミノ基の近い付近の両方とも）のＹ３０５ヒドロキシルと同じ位置にＤＩＭ−５ポイントを到着時刻を記録するということを発見した。これらの２つの残基が一次配列レベルで整列させられないにもかかわらず、我々はＳＥＴ７／９のＹ３０５ヒドロキシルがメチル化を制限している立体障害のもとである可能性があると仮定した。
【０２４２】
この仮説を検証するために、我々はＤＩＭ−５（Ｆ２８  Ｉ  Ｙ）でＦ２８１をＴｙｒと取り替えて、ＳＥＴ７／９（Ｙ３０５Ｆ）で、Ｙ３０５をフェニルアラニンと取り替えた。我々は、Ｙ３０５Ｆ突然変異が既往歴（図３Ａ）でＳＥＴ７／９の活性の増加に帰着する間、Ｆ２８１Ｙ突然変異が既往歴でＤＩＭ−５の総活性に有意に影響を与えなかったことを発見した。我々は、それからＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル分析を基質として用いて、Ｈ３ペプチド（残基１−１５）で、生成物形成の反応速度論をモニターした。図５は、各々の酵素のために代表的なスペクトラムと時間経過を表す。未変性の基質の有意な量がまだ存在している（５分、酵素が進化性であるという考えと整合している間、野生型（ＷＴ）ＤＩＭ−５は支配的な生成物としてトリメチルリジンが生産される。面白いことに、ＤＩＭ−Ｓ  Ｆ２８１  Ｙはまず最初に、ＷＴ（５分）より急速に未変性の基質を変えた、しかし、反応はモノメチル段階（５分および３０分を比較する）で遅れて、それから、非常にゆっくり単一のをジ・メチルアルコールと混合した生成物（３０分および３時間を比較する）に変換した。トリメチル化生成物は、インキュベーション時間が延長された場合（３時間）、微量のトリメチル化産物が得られた。これらの結果は、鋭く、還元型全体の触媒活性（例えば１７８Ｆ  Ｙ、Ｒ２３８ＨおよびＷ３１８Ａ）で他のＤＩＭ−５異型で得られるそれらを対比する。これらの弱い酵素の一晩インキュベーションの後、未変性の基質の相当量は残る、しかし、トリメチル生成物はＦ２８１Ｙよりもかなり顕著ある。ｅがＦ２８１  Ｙ突然変異が全体の触媒活性に影響を及ぼすことなくＤＩＭ−５の生成物特異性を３ＭＴアーゼから単一のとジＭＴアーゼまで変えたと結論する。
【０２４３】
ＳＥＴ７／９の場合、ＷＴ酵素は、一晩のインキュベーションの後でモノメチル・リジン＋ジメチル・リジンの極微量だけを生産した。変異体Ｙ３０５Ｆでは、しかし、加速された率でジメチル・リジンが生産された、また、たとえ微量のトリメチル化生成物でもインキュベーション後で見られた。Ｙ３０５Ｆ変異体の特異的活性は、ＷＴのそれより高くて、おそらく、第２のメチル基を加えるその能力によるものと思われる。  
【０２４４】
ＳＥＴ７／９のＹ２４５Ａ置換が未変性の基質でほとんど活性を持たないことが、最近報告されている。しかし、そのような置換は、ＳＥＴ７／９を、それぞれ、ジ・メチルアルコールと混合したペプチドを形成する基質まされた生成物として１メチルアルコールと混合したペプチドまたはジ・メチルアルコールと混合したペプチドを利用させる。最近報告されていることは、ＳＥＴ７／９のＹ２４５Ａ置換が未修飾基質によるわずかな活性しかもたないことである。しかし、そのおうな置換は、ＳＥＴ７／９がモノメチル化ペプチドまたはジメチル化ペプチドを基質として用いてジメチル化ペプチドまたはトリメチル化プロダクトを、それぞれ生成することに利用される。ＤＩＭ−５（Ｙ  １７８１）の類似した突然変異は、ヒストリーと未変性ペプチド基質の両方での酵素活性を無効にした。対照的に、Ｙの残存活性は、１７８Ｆ変異体発生するトリメチルリジンである。ＤＩＭ−５（ＳＥＴ７／９のＹ２４５）のＹ  １７８がモノ、ジ、およびトリ特異性を持つ酵素全体（図３Ｂ）で非常に保存的であるという事実、この残基が主に生成物特異性よりむしろ一般の触媒作用に関係するという考えと整合している。逆に言えば、ＤＩＭ−５のＦ２８１およびＳＥＴ７／９のＹ３０５の突然変異は、顕著な影響を触媒可能性に与えることなく、特異性を変える。
【実施例４】
【０２４５】
メチル化の動力学的進行の質量分析
メチル化反応は、５０ｍＭグリシン（ｐＨ９．５）、４ｍＭＤＴＴ、２５０μＭ、ＡｄｏＭｅｔ、２０μＭペプチド、および０．０５ｍｇ／ｍｌ酵素（〜１．２μＭ）、ＤＩＭ−５に対して２３℃およびＳＥＴ７／９に対して３９℃で、実施した。反応は、ＴＦＡを０．５％添加することで停止させた。質量を測定するために、ＴＦＡ含む１μｌの反応混合物を５μｌのＣＨＣＡ（シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）マトリックスに直接加え、１μｌをステンレス・スチール試料プレートにスポッティングし、急激に空気乾燥した。較正用の酵素なしに反応混合物を用いて線形モードで操作したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ４２５８装置  （Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，  Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）  上のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって質量の測定をおこなった。各測定は、一位置あたり２００ショットで１０カ所の異なる位置で収集した１０個のスペクトラムの平均とした。
【０２４６】
われわれは、ヒストンＨ３  Ｎ末端残基に対応している３つの合成ペプチド（１−１５，  １−１３，  および５−１５）上で、ＤＩＭ−５の活性を試験した。トリメチル化リジンを、すべての３種類の基質の主生成物とした。それらのあいだで、Ｈ３  １−１５をあきらかに最良基質であり、他の２つのペプチドよりも１５ないし２０倍も速くトリメチル化生成物を合成した。Ｈ３  １−１５ペプチドおよびＡどＨｅｙにより複合体化したＤＩＭ−５の結晶を、上記酵素が活性を示すｐＨ８．５付近で得た。基質の不在下、ＤＩＭ−５の座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）を用いて分子置換することで、２．６Å分解能で、構造の分析をおこなった。差分フーリエ・マップ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｍａｐｓ）による分析は、明らかにＡｄｏＨｃｙ、ＤＩＭ−５のポストＳＥＴアミノ酸、およびＨ３ペプチドの構造化部分）（７ないし１２残基）の電子密度を示した。この構造を実施例２でより詳しく説明する。質量分析の結果は図４に示す。
【実施例５】
【０２４７】
ＤＩＭ−５亜鉛転移活性阻害剤
ＤＩＭ−５タンパク質とともに、金属キレート、フェナントロリン、またはＥＤＴＡをインキュベートすると、その活性が阻害され、ＡｄｏＭｅｔ結合が有意に減少する（図５Ｂ−Ｃ）。興味深いことに、ＥＤＴＡが完全にＤＩＭ−５活性を失活させる場合であっても、前記タンパク質は約３（２．９）の亜鉛イオンを保持し続けている（図５Ａ）。前記三角形亜鉛クラスターは非常に安定しているため、前記３つのポストＳＥＴシステインおよび活性部位近傍のＣ２４４により前記キレート亜鉛は配意されていることが想定できる。
【０２４８】
（等価）
本発明は、ＳＥＴドメイン・タンパク質の新規ドラッガブル領域、またいくつかの実施形態では、ヒストン・リジン・メチルトランスフェラーゼ・タンパク質をスクリーニングするための方法を部分的に提供して、タンパク質の修飾因子を開発する。対象発明の特定の実施形態について説明がおこなわれる一方で、上記明細書は例証のためのものであり、限定を加えるためのものではない。この明細書を検討することで、本発明の多くの変形例が当業者によって明らかになるだろう。添付した特許請求の範囲は、そのような実施形態および変形例すべての権利を主張することを意図しており、本発明の完全な範囲は、等価物および明細書の完全な範囲に沿って、さらにそのような変形例に沿って、特許請求の範囲を参照することによって定まる。以下のリストに挙げた項目が含まれる本明細書で言及したすべての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許が特異的に、かつ個別的に参照によって取り込まれるように、それらの全体を本明細書では援用する。
【０２４９】
あたかも個々の刊行または特許が参照によって組み込まれることを特異的に、そして、個々に示されるかのように、本明細書中で言及される全ての刊行物と特許は、下記のそれらの部材上場されたを含んで、全体として参照によってここに組み込まれる。矛盾する場合、本明細書のいかなる定義をも含む本出願が調整する。
【表Ｂ−１】
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【０２５０】
【表Ｂ−２】
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【０２５１】
【表Ｂ−３】
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【０２５２】
【表Ｂ−４】
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【図面の簡単な説明】
【０２５３】
【図１】図１Ａは、ＳＥＴＨＫＭＴファミリータンパク質のドメイン構造を示す。ＤＩＭ−５タンパク質（Ｓｕｖ３９ファミリーの最も小さい既知メンバー）は４種類のセグメントを含む。すなわち、弱く保存されたアミノ末端領域（明るい青色）、９つの不変システインを含むプレＳＥＴドメイン（黄色）、署名モチーフＮＨＸＣＸＰＮおよびＥＬＸＦＤＹ（マゼンタ）を含むＳＥＴ領域（緑色）、ならびに３つの不変システインを含むポストＳＥＴドメイン（灰色）である。図１Ｂは、ＤＩＭ−５三重複合体のＧＲＡＳＰ（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら，１９９１）表面電荷分布（青色は陽性、赤色は陰性、白色は中性）を示す。Ｈ３ペプチドおよびＡｄｏＨｃｙは、スティック・モデルとして示されている。図１Ｃは、図１Ａと同一のカラーリング・スキームを持つＤＩＭ−５三重複合体の図を示す。このプレＳＥＴ残基（黄色）は、Ｚｎ３Ｃｙｓ９三角形亜鉛クラスタを形成する。ＳＥＴ残基（緑色）およびＮ末端領域は、ナット様構造（マゼンタ）を包む６つのｂシートに折り畳まれる。ポストＳＥＴ残基（灰色）は、第４の亜鉛原子に結合し、基質Ｈ３ペプチド（赤色）およびＡｄｏＨｃｙ（青色）に隣接する。図１Ｄは、基質Ｈ３ペプチド（赤色）を示し、該基質Ｈ３ペプチド（赤色）は４．０ｓ（橙色）で輪郭が描かれたオミット電子密度上に重畳され、２本のＤＩＭ−５鎖であるｂ１０（緑色）とｂ１８（マゼンタ）との間に、平行なｂ鎖（図２Ｃでは赤色）として挿入される。Ｈ３Ａｒｇ−８の側鎖密度は、下部輪郭値（Ｆｏｂｓ−Ｆｃａｌでは２．５ｓおよび２Ｆｏｂｓ−Ｆｃａｌでは０．８ｓ）で完結する。
【図２】図２Ａは、ＤＩＭ−５メチル化機構の種々の態様を示す。図３Ａは、ポストＳＥＴ亜鉛イオンおよびＡｄｏＨｃｙ結合部位を図示したものである。亜鉛イオンは、赤い球体として表されており、４つのシステイン、Ｃ２４４（マゼンタ）およびＣ３０５ＸＣ３０８Ｘ４Ｃ３１３（灰色）によって配向されている。ＡｄｏＨｃｙは、４．０σ（橙色）で輪郭が描かれた差電子密度マップ上に重畳される。破線は、水素結合を示す。図２Ｂは、チャンネルに挿入されたＬｙｓ−９を有するＨ３ペプチド結合部位の拡大図である。図２Ｃは、標的Ｌｙｓ結合部位（立体）を示す。矢印は、ＡｄｏＭｅｔメチルスルホニウム基から標的アミノ基へ移るメチル基の動きを示す。図２Ｄは、ｐＨの関数としてのＤＩＭ−５活性（ＬｏｇＣＰＭ）のグラフを示す。図２Ｅは、大面積ポケットに結合したＡｄｏＨｃｙを示すもので、前進型メチル化を可能にする。緑色の楕円は、ペプチドのない構造にＡｄｏＨｃｙホモシステイン部分が結合する位置を示している（Ｚｈａｎｇら、２００２）。
【図３】図３は、組み換え型ＤＩＭ５およびＳＥＴ７／９変異体の酵素化学的性質の種々の態様を示す。図３Ａは、ヒストン基質（上部）を用いたＤＩＭ−５およびＳＥＴ７／９変異体の活性と、フルログラフ（中間部）およびクーマシー染色（下部）を示すＤＩＭ−５のＡｄｏＭｅｔ架橋実験を示す。図３Ｂは、ＤＩＭ−５およびＳＥＴ７／９の、構造に基づくシーケンス・アラインメントを示す。図示した二次構造は、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）に基づいている。縦方向のバーは、空間的に整列配置する残基を示す。２つの酵素間の同一残基（黒色背景）または類似残基（灰色背景）残基（ＤＩＭ−５のポストＳＥＴ領域と同様に）は、強調されている。番号が付された残基は、テキストに記述されている。ＤＩＭ−５のＣ末端疎水性残基は、下線が付されている。図３Ｃは、三元ＤＩＭ−５（着色）および二元ＳＥＴ７／９−ＡｄｏＨｃｙ（黒色）（ＰＤＢ１ＭＴ６（Ｊａｃｏｂ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２））を示す。ＤＩＭ−５の結合は、２つのＴｙｒおよび１つのＰｈｅ（ＤＩＭ−５）または３つのＴｙｒ（ＳＥＴ７／９）に囲まれた標的Ｌｙｓを有する固体電子密度（橙色）として表されている。
【図４Ａ】図４は、メチル化反応の速度論的進行（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）の質量分析による解析結果を示す。図４Ａ中、上側のパネルは、ＷＴＤＩＭ−５、そのＤ２８１Ｙ変異体、ＷＴＳＥＴ７／９、およびそのＹ３０５Ｆ変異体について種々の時間点での代表的なスペクトルである。未変性（Ｕｒｎ）基質、モノメチル化産物、ジメチル化産物、およびトリメチル化産物のピークが標識されている。非標識の軽度なピークは、主ピーク（＋２３Ｄａ）のナトリウム付加生成物に対応する。下側のパネルは完全時間経過を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、メチル化反応の速度論的進行の質量分析による解析結果を示す。図４Ｂは、正常な生成物特異性を持つが、触媒活性が大きく損なわれている３つのＤＩＭ−５変異体のスペクトルを示す。
【図５】図５Ａは、ＥＤＴＡ処理済みおよび未処理のＤＩＭ−５の亜鉛含有量の分析結果を示す。ＤＩＭ−５タンパク質を２０ｍＭＥＤＴＡで２日間インキュベートし、その時点でＨＫＭＴ活性はもはや検出不可能であった。ＥＤＴＡへの亜鉛の結合を除去するために、２０ｍＭグリシン（ｐＨ９．８）、５％グリセロール、０．５ｍＭＤＴＴ、および１ｍＭＥＤＴＡに対して、タンパク質を透析（実施例１）またはゲルろ過クロマトグラフィー（実施例２）のいずれかをおこなった。図５Ｂは、精製ＤＩＭ−５タンパク質（２０ｍＭグリシンｐＨ９．８，５％グリセロール中、１ｍｇ／ｍｌ）と種々の濃度の１．１０−フェナントロリンまたはＥＴＡとともに、４℃で指示時間にわたりインキュベートした結果を示す。酵素を８０倍に希釈し、ＤＴＴを含まない点を除いて標準的条件下で、ＨＫＭＴ活性を調べた。図５Ｂは、ＥＤＴＡ存在下でのＡｄｏＭｅｔ架橋のフルオログラフィーの結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、以下に詳細に説明するように、そのようなポリペプチドの結晶のＸ線回折に由来する本発明のポリペプチドの原子構造座標を一覧にしたものである。図６Ａに対して１、２、３等、多数のページがある。そのような図の情報は、一例として与えられた遺伝学的項目とともに以下の表のフォーマットで表示されている。
【表Ａ】
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表中、「記録ヘッダ」は、行の型（例えば、「ＡＴＯＭ」）を記述する。「Ｎｏ．」は、行番号を示す。第１の「原子種」の列は、座標が測定された原子を示し、該列中の最初の文字は、原子記号によって原子を同定し、その後の文字はアミノ酸残基または他の分子内でのその原子の位置を規定する。「残基」および「残基数」は、対象ポリペプチドの残基を同定する。「Ｘ、Ｙ、Ｚ」は、測定される原子の原子配置を結晶学的に規定する。「Ｏｃｃ」は、各々の原子が座礁によって特定される位置を占める分子の関数を意味する占拠率である。「１」の値は、各原子が、結晶中のすべての分子において同一の配座（すなわち、同一の位置）を有することを示している。「Ｂ］は、所定の原子座標のあたりに原子の位置で二乗平均平方根偏差に関する温度要因である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＤＩＭ−５のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図６Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月27日(2005.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005536996000001.app
【国際調査報告】
2005536996.tif 000076
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