【手続補正書】
【提出日】令和2年1月10日(2020.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
Ｇａｓｔｒｏｄｉａｅ Ｒｈｉｚｏｍａ（Ｔｉａｎｍａ）は、ラン科の多年生寄生薬草であるオニノヤガラの根茎から得られる常用漢方であり、臨床分野では頭痛や眩暈、手足身体の痺れ、てんかん、破傷風による痙攣、神経衰弱、神経血管性頭痛等の治療に用いられる。オニノヤガラの臨床分野の医療用途に関しては、神経障害の予防について研究した文献が多くみられる。例えば、オニノヤガラの主成分であるガストロジンは、アレチネズミの海馬においてγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の代謝を変化させることが分かっている。更に、オニノヤガラのメタノール抽出物のジエチルエーテル分画層は、アレチネズミにおける虚血誘導障害やマウス海馬におけるカイニン酸誘導神経細胞死から神経細胞を保護する（Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）；Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００３））。また、オニノヤガラのメタノール抽出物のジエチルエーテル分画層は、β−アミロイド誘導神経細胞死を顕著に抑制することができる。Ｈｓｉｅｈらは同様に、ラットのカイニン酸誘導てんかん発作において、オニノヤガラ抽出物の投与が、発作回数を顕著に減少させるだけでなく、てんかんの発症時間を遅らせることを示している（Ｈｓｉｅｈ，ｅｔ  ａｌ（２００１））。このようなオニノヤガラの抗てんかん効果は、そのフリーラジカル除去活性の調節による（Ｈｓｉｅｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０００））。これ以外に、オニノヤガラのメタノール抽出物は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）活性の抑制を通じて、ＰＣ１２細胞の血清枯渇によるアポトーシスを抑制することができる（Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００４））。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【図１】本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−２）に対する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析の化学プロファイル。数字は、１：ガストロジン、２：ガストロジゲニン、３：パリシンＥ、４：ｐ−ヒドロキシベンジルアルデヒド、５：パリシンＢ、６：Ｔ１−１１、７：パリシンＣ、８：ビス（４−ヒドロキシベンジル）硫化物（Ｔ１−Ｃ）、９：パリシンＡを指す。
【図２】図２Ａは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ粗抽出物（ＴＭ１）による、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞老化マーカーβガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）活性への影響を示す図。データは、少なくとも４つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。コントロールと薬剤処理細胞との間の有意差は、コントロールとの比較で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で示される。図２Ｂは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ粗抽出物（ＴＭ１）による、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における細胞老化関連分子への影響を示す図。
【図３】図３Ａは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−１、ＴＭ１−２及びＮ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１））による、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のアンチエイジング活性への影響を示す図。データは、少なくとも４つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。コントロールと薬剤処理細胞との間の有意差は、コントロールとの比較で＊＊ｐ＜０．０１で示される。図３Ｂは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−１、ＴＭ１−２）による、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における細胞老化関連分子、リン酸化ＲＢ、ｐ１６、ｐ５３及びｐ２１への影響を示す図。
【図４】図４Ａは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−２）、Ｎ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）、ガストロジン（ＴＧ）及びその他オニノヤガラ成分（ビス（４−ヒドロキシベンジル）硫化物（Ｔ１−Ｃ））及びガストロジゲニン（４−ＨＢＡ）による、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞老化マーカーβガラクトシダーゼ活性への影響を示す図。データは、少なくとも４つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。コントロールと薬剤処理細胞との間の有意差は、コントロールとの比較で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で示される。図４Ｂは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のＮ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）、ガストロジン（ＴＧ）及びその他オニノヤガラ成分（ビス（４−ヒドロキシベンジル）硫化物（Ｔ１−Ｃ））及びガストロジゲニン（４−ＨＢＡ）による、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における細胞老化関連分子、リン酸化ＲＢ、ｐ１６、ｐ５３及びｐ２１への影響を示す図。
【図５】図５Ａは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−２）及びＮ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）による、巣造りへの影響を示す図。巣造りは、処理の後に行われた。１：対照グループ、２：Ｄ−ガラクトース（２００ｍｇ／ｋｇ）、３：Ｄ−ガラクトース（２００ｍｇ／ｋｇ）＋ビタミンＥ（１００ｍｇ／ｋｇ）（ポジティブコントロール）、４：Ｄ−ガラクトース（２００ｍｇ／ｋｇ）＋ＴＭ１−２（５ｍｇ／ｋｇ）、５：Ｄ−ガラクトース（２００ｍｇ／ｋｇ）＋ＴＭ１−２（２０ｍｇ／ｋｇ）、６：Ｄ−ガラクトース（２００ｍｇ／ｋｇ）＋ＴＭ１−２（５０ｍｇ／ｋｇ）、７：Ｄ−ガラクトース（２００ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ１−１１（１ｍｇ／ｋｇ）、８：Ｄ−ガラクトース（２００ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ１−１１（１０ｍｇ／ｋｇ）、９：Ｔ１−１１（１０ｍｇ／ｋｇ）。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）である。コントロールとＤ−ガラクトース誘導老化マウスとの間の有意差は、コントロールグループとの比較で＊＊ｐ＜０．０１で示される。Ｄ−ガラクトースだけで処理したマウスとＴＭ１−２またはＴ１−１１と組み合わせてＤ−ガラクトースで処理したマウスとの間の有意差は、Ｄ−ガラクトースグループとの比較で＊ｐ＜０．０５で示される。図５Ｂは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−２）及びＮ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）による、巣中に残った未破壊綿片の重量への影響を示す図。巣造りは、処理の後に行われた。グループ１−９は、それぞれ図５Ａに示したものである。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）である。コントロールとＤ−ガラクトース誘導老化マウスとの間の有意差は、コントロールグループとの比較で＊＊ｐ＜０．０１で示される。Ｄ−ガラクトースだけで処理したマウスとＴＭ１−２、ビタミンＥまたはＴ１−１１と組み合わせてＤ−ガラクトースで処理したマウスとの間の有意差は、Ｄ−ガラクトースグループとの比較で＃＃ｐ＜０．０１で示される。
【図６】本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−２）及びＮ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）による、Ｄ−ガラクトースにより老化を誘導されたマウスでの障害された穴掘り行動の改善を示す図。穴掘りは、処理の後に行われた。グループ１−９は、それぞれ図５Ａに示したものである。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）である。コントロールとＤ−ガラクトース誘導老化マウスとの間の有意差は、コントロールグループとの比較で＊＊ｐ＜０．０１で示される。Ｄ−ガラクトースだけで処理したマウスとビタミンＥ、ＴＭ１−２またはＴ１−１１と組み合わせてＤ−ガラクトースで処理したマウスとの間の有意差は、Ｄ−ガラクトースグループとの比較で＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１で示される。
【図７】図７Ａは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−２）及びＮ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）による、Ｄ−ガラクトースにより老化を誘導されたマウスでの空間学習及び記憶障害の改善への影響を示す図。グループ１−９は、それぞれ図５Ａに示したものである。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）である。コントロールとＤ−ガラクトース誘導老化マウスとの間の有意差は、コントロールグループとの比較で＊ｐ＜０．０５で示される。Ｄ−ガラクトースだけで処理したマウスとビタミンＥ、ＴＭ１−２またはＴ１−１１と組み合わせてＤ−ガラクトースで処理したマウスとの間の有意差は、Ｄ−ガラクトースグループとの比較で＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１で示される。図７Ｂは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−２）及びＮ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）による、Ｄ−ガラクトースにより老化を誘導されたマウスのプローブテストにおける以前のプラットフォーム位置を通り越した回数への影響を示す図。グループ１−９は、上記のものである。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）である。コントロールとＤ−ガラクトース誘導老化マウスとの間の有意差は、コントロールグループとの比較で＊ｐ＜０．０５で示される。Ｄ−ガラクトースだけで処理したマウスとビタミンＥ、ＴＭ１−２またはＴ１−１１と組み合わせてＤ−ガラクトースで処理したマウスとの間の有意差は、Ｄ−ガラクトースグループとの比較で＃ｐ＜０．０５で示される。
【図８】図８Ａは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−２）及びＮ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）による、Ｄ−ガラクトースにより老化を誘導されたマウスの血清、大脳皮質及び海馬におけるカタラーゼ（ＣＡＴ）活性への影響を示す図。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝６）である。コントロールとＤ−ガラクトース誘導老化マウスとの間の有意差は、コントロールグループとの比較で＊＊ｐ＜０．０１で示される。Ｄ−ガラクトースだけで処理したマウスとビタミンＥ、ＴＭ１−２またはＴ１−１１と組み合わせてＤ−ガラクトースで処理したマウスとの間の有意差は、Ｄ−ガラクトースグループとの比較で＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１で示される。図８Ｂは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−２）及びＮ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）による、Ｄ−ガラクトースにより老化を誘導されたマウスの血清、大脳皮質及び海馬におけるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性への影響を示す図。グループ１−９は、それぞれ図５Ａに示したものである。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝６）である。コントロールとＤ−ガラクトース誘導老化マウスとの間の有意差は、コントロールグループとの比較で＊＊ｐ＜０．０１で示される。Ｄ−ガラクトースだけで処理したマウスとビタミンＥ、ＴＭ１−２またはＴ１−１１と組み合わせてＤ−ガラクトースで処理したマウスとの間の有意差は、Ｄ−ガラクトースグループとの比較で＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１で示される。
【図９】本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−２）及びＮ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）による、Ｄ−ガラクトースにより老化を誘導されたマウスの血清、大脳皮質及び海馬における脂質過酸化（マロンジアルデヒド）への影響を示す図。グループ１−９は、それぞれ図５Ａに示したものである。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝６）である。コントロールとＤ−ガラクトース誘導老化マウスとの間の有意差は、コントロールグループとの比較で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で示される。Ｄ−ガラクトースだけで処理したマウスとビタミンＥ、ＴＭ１−２またはＴ１−１１と組み合わせてＤ−ガラクトースで処理したマウスとの間の有意差は、Ｄ−ガラクトースグループとの比較で＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１で示される。
【図１０】図１０Ａは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−２）及びＮ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）による、Ｄ−ガラクトースにより老化を誘導されたマウスの大脳皮質及び海馬におけるグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨ−Ｐｘ）活性への影響を示す図。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝６）である。コントロールとＤ−ガラクトース誘導老化マウスとの間の有意差は、コントロールグループとの比較で＊ｐ＜０．０５で示される。Ｄ−ガラクトースだけで処理したマウスとビタミンＥ、ＴＭ１−２またはＴ１−１１と組み合わせてＤ−ガラクトースで処理したマウスとの間の有意差は、Ｄ−ガラクトースグループとの比較で＃ｐ＜０．０５で示される。図１０Ｂは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−２）及びＮ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）による、Ｄ−ガラクトースにより老化を誘導されたマウスの大脳皮質及び海馬におけるグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）活性への影響を示す図。グループ１−９は、それぞれ図５Ａに示したものである。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝６）である。コントロールとＤ−ガラクトース誘導老化マウスとの間の有意差は、コントロールグループとの比較で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で示される。Ｄ−ガラクトースだけで処理したマウスとビタミンＥ、ＴＭ１−２またはＴ１−１１と組み合わせてＤ−ガラクトースで処理したマウスとの間の有意差は、Ｄ−ガラクトースグループとの比較で＃ｐ＜０．０５で示される。
【図１１】図１１Ａは、本発明における神経新生を促進する医薬組成物のオニノヤガラ抽出物（ＴＭ１−２）及びＮ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）により処理した後の歯状回における、神経新生マーカーである５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）及びダブルコルチン（ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ，ＤＣＸ）の免疫染色像を示す図。図１１Ｂは、図１１Ａにおける免疫染色像を定量化した図。１ｍｍ顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）当たりのＢｒｄＵ陽性細胞（ＢｒｄＵ＋）及びＤＣＸ陽性細胞（ＤＣＸ＋）の数をカウントした。コントロールとＤ−ガラクトース誘導老化マウスとの間の有意差は、コントロールグループとの比較で＊ｐ＜０．０５で示される。Ｄ−ガラクトースだけで処理したマウスとビタミンＥ、ＴＭ１−２またはＴ１−１１と組み合わせてＤ−ガラクトースで処理したマウスとの間の有意差は、Ｄ−ガラクトースグループとの比較で＃ｐ＜０．０５で示される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
（実施例４  オニノヤガラ粗抽出物ＴＭ１、部分的に精製したオニノヤガラ抽出物ＴＭ１−２及び純化合物Ｎ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）による細胞老化阻害の試験）
前述の実施例３における老化ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、オニノヤガラ粗抽出物ＴＭ１、オニノヤガラ抽出物ＴＭ１−２及び純化合物Ｎ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）により２４時間処理した後、４％ホルムアルデヒドで固定して、細胞老化の指標であるβガラクトシダーゼの染色を行った。その結果（図２Ａ参照）、オニノヤガラ粗抽出物ＴＭ１は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における細胞内βガラクトシダーゼの産生を抑制することができ、且つβガラクトシダーゼは、加えたＴＭ１の濃度上昇に伴い顕著に減少した。そして、オニノヤガラ抽出物ＴＭ１−２（図３Ａ参照）及び純化合物Ｎ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）（図３Ａ及び図４Ａ参照）も、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における細胞内βガラクトシダーゼの産生を顕著に減少させることができた。更に、細胞老化は、ｐ５３−ｐ２１経路及びｐ１６−Ｒｂ経路という２つの独立した経路により引き起こされることが分かっている。ｐ２１とｐ１６は、いずれもサイクリン依存性キナーゼ阻害因子（Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＣＤＫＩ）であり、Ｒｂのリン酸化を阻害してＲｂ活性化を抑制する。結果として、Ｅ２Ｆ転写因子の活性が阻害され、細胞周期の進行もブロックされる。ｐ５３、ｐ６３及びｐ７３は、いずれも直接にｐ２１タンパク質の活性化を誘導することで細胞周期の停滞や細胞老化を引き起こす。実験の結果、部分的に精製したオニノヤガラ抽出物ＴＭ１−２及び純化合物Ｎ６−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシン（Ｔ１−１１）によるｐ５３、ｐ１６、ｐ２１タンパク質発現の阻害は、効果的に細胞老化を緩和することができた（図２Ｂ、図３Ｂ、図４Ｂ参照）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
９組の動物に対して実験を行うにあたって、以下のようにグループ分けを行った。１：対照グループ、２：Ｄ−ガラクトース（０．２ｇ／ｋｇ）、３：Ｄ−ガラクトース（０．２ｇ／ｋｇ）＋ビタミンＥ（１００ｍｇ／ｋｇ）、４：Ｄ−ガラクトース（０．２ｇ／ｋｇ）＋ＴＭ１−２低剤量グループ（５ｍｇ／ｋｇ）、５：Ｄ−ガラクトース（０．２ｇ／ｋｇ）＋ＴＭ１−２中剤量グループ（２０ｍｇ／ｋｇ）、６：Ｄ−ガラクトース（０．２ｇ／ｋｇ）＋ＴＭ１−２高剤量グループ（５０ｍｇ／ｋｇ）、７：Ｄ−ガラクトース（０．２ｇ／ｋｇ）＋Ｔ１−１１低剤量グループ（１ｍｇ／ｋｇ）、８：Ｄ−ガラクトース（０．２ｇ／ｋｇ）＋Ｔ１−１１高剤量グループ（１０ｍｇ／ｋｇ）、９：Ｔ１−１１（１０ｍｇ／ｋｇ）。Ｄ−ガラクトースは頸背部皮下より注射し（０．２ｇ／ｋｇ体重）、オニノヤガラ抽出物ＴＭ１−２、Ｔ１−１１及びビタミンＥはいずれも経口投与（胃管を用いる方法による）とし、それぞれ１日１回、６週間連続して処理した。薬品処理を行うと同時に、前記対照グループを含む各グループには継続してＤ−ガラクトース０．２ｇ／ｋｇ体重を頸背部皮下より注射し、前記対照グループには生理食塩水を皮下より注射した。ビタミンＥグループは、ポジティブコントロールとした。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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