(57)【要約】  本発明は、一つもしくはそれ以上の未反応の二重結合を含むマクロ孔質ポリマー性支持体の後修飾のための方法であって、その方法が支持体をグラフト化化合物を含む液相と接触させること；および得られた混合物においてフリーラジカル反応を開始すること、の工程を含み、そこではグラフト化化合物が直線状もしくは環状の炭素鎖に結合される反応性基としての二重結合から成る、方法に関する。グラフト化化合物は、ビニルエーテルおよび／もしくはスチレンならびにスチレン誘導体によって例示され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つもしくはそれ以上の未反応の二重結合を含むマクロ孔質ポリマー性支持体の後修飾のための方法であって、その方法は、
(ａ)ポリマー性支持体を、一つもしくはそれ以上のグラフト化化合物を含む液相と接触させること；
(ｂ)工程(ａ)から得られた混合物において当該ポリマー性支持体上の一つもしくはそれ以上の二重結合およびグラフト化化合物上の一つもしくはそれ以上の反応性基の間で、フリーラジカル反応を開始すること、ならびに任意に
(ｃ)ポリマー性支持体を洗浄して、過剰のグラフト化化合物を除去すること；
の工程を含み、
そこではグラフト化化合物(複数を含む)が、一般式(Ｉ)：
【化１】
2005510609.tif 000004
[式中、
Ｒ＝一つもしくはそれ以上のヒドロキシル、アミン、カルボニル、エーテル；もしくは酸素で任意に置換されている、Ｃ０〜Ｃ３０のアルキル鎖；
Ｒ'＝ＨもしくはＣＨ３；
Ｒ''＝Ｃ０〜Ｃ３０の脂肪族もしくは芳香族基；または酸素；そして
Ｘ＝Ｏｎ、｛式中、もしＲ''が酸素もしくは芳香族基であるならば、そのときはｎは０であって、そしてもしＲ''がアルキル鎖であるならば、そのときはｎは１であるという条件で、ｎは０〜１の整数である｝]
によって説明される、方法。
【請求項２】
当該マクロ孔質ポリマー性支持体が、モノマーとしてのメタクリレートおよび／またはスチレン誘導体から作成されるクロマトグラフィー支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
当該マクロ孔質ポリマー性支持体がジビニルベンゼンを含む、請求項１もしくは２に記載の方法。
【請求項４】
支持体が一つもしくはそれ以上の粒子から成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程(ｂ)が、加えたグラフト化化合物をポリマー性支持体に重合させるに十分な量にてフリーラジカル開始剤を添加することにより実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
式(Ｉ)において、ＲがＣ１〜Ｃ１０のアルキル鎖であり、Ｒ'はＨであり、Ｒ''はＯでありそしてｎは０である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＲがＣ１７アルキル鎖である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＲがＣ１〜Ｃ１０アルキル鎖であり、Ｒ'はＨであり、Ｒ''はＣＨ２でありそしてｎは１である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
グラフト化化合物が少なくとも一つの親水基を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、その方法が さらに当該親水基(複数を含む)の誘導体化の工程を含む方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、グラフト化化合物が反応性二重結合に加えて少なくとも一つの官能基を含み、その官能基がそのように修飾された支持体の表面上のリガンドとして利用可能である、方法。
【請求項１１】
Ｒ''が芳香族基でありそしてグラフト化化合物がスチレンもしくはその誘導体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
逆相クロマトグラフィー(ＲＰＣ)樹脂の作成に適する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
そのようにして得られた後修飾されたポリマー性支持体を逆相クロマトグラフィー(ＲＰＣ)において用いる工程(ｄ)を含む、請求項１１もしくは１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項において定義された方法により後修飾されている、マクロ孔質ポリマー性支持体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の後修飾されたマクロ孔質ポリマー性支持体のクロマトグラフィーにおける使用。
【請求項１６】
請求項１４に記載の後修飾されたマクロ孔質ポリマー性支持体を含むクロマトグラフィーカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にクロマトグラフィーで使用するための、マクロ孔質ポリマー性支持体の分野に関する。より特異的には、本発明は、クロマトグラフィーのような分離の応用において用いられるとき、大いに改良された性質を持つ支持体をもたらす、そのような支持体の後修飾の新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーで普遍的に使用可能である、分離物質を開発するために、クロマトグラフィー支持体をグラフトすることは、ＥＰ  ０  ３３７  １４４(Merck Patent Gesellschaft mit beschraenkter Haftung)から、公知である。グラフト化は、通例のレドックス重合の過程で実施される。支持体粒子の細孔表面上にラジカル部位を形成するためには、セリウム(ＩＶ)イオンが重合触媒として利用される。かくして、ＥＰ  ０  ３３７  １４４の一つの目的は、公知物質と比較して溶解能力を改善することであって、それは、その支持体が共有結合的に結合されたポリマーでコーティングされているところの、ヒドロキシ基を含有する支持体に基づく親水性分離の使用により得られる。より特異的には、ポリマーは、ヒドロキシ基のα‐Ｃ原子において発生されたラジカルを介して支持体に結合されて、それ故にこの種類のグラフト化は、“からのグラフト化”原理を代表する、例えば、P F Rempp, P J Lutz: Comprehensive Polymer Science vol. 6, pp 403-421, Eds. G. Allen et al, Oxford 1989、を参照されたい。この技法は、支持体表面上における、限定された数のラジカルによる重合の開始に基づいて、したがって例えば酸素による終結に対し感受性である。好ましいモノマーは、高い増殖速度を持つモノマーであって、それは典型的には、アクリルアミド、アクリル酸エステルもしくはメタクリル酸エステルのモノマーを意味する。これらのモノマーのポリマーは、特にアルカリ性条件下で、加水分解に一般的に感受性である。実際的には、これは、ＥＰ  ０  ３３７  １４４のグラフト化された生成物が、特異的な応用に対して不利であり得るところの性質である、加水分解を受け易いということを意味する。
【０００３】
ＵＳ  ５,９２９,２１４(Peters et al)は、細孔がグラフト化される温度‐応答性ポリマーおよびコポリマーを含有する、多孔性合成ポリマーモノリスを開示する。これらのモノリスは、熱性ゲートもしくは熱性バルブとしての用途に特に適する。このようなモノリス中の細孔は、直径が約６００ｎｍより大であって、それ故にポリマーは、そのようなマクロ細孔を閉塞するに十分なサイズのものである必要がある。細孔の支持体上にグラフトされる熱的応答性ポリマーを形成するための適当なモノマーは、公知であって、窒素原子上で弱い疎水性基で置換されたアクリルアミドおよびメタアクリルアミド、ビニルカプロラクタム、メチルビニルエーテル、３‐ヒドロキシプロピルアクリル酸エステル、酢酸ビニル、２‐(Ｃ置換２〜Ｃ置換６)‐アルキル‐１‐ビニルオキサゾリン、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ならびに、ここで生じたポリマーの熱的応答性を妨害しないところの共重合可能なコモノマーとのそれらのコポリマー、が含まれる。適当なコモノマー、例えば、Ｎ‐アルキルアクリルアミドとのメチレンビスアクリルアミド、を用いて、交差結合および制御可能な膨潤性もしくは他の望ましい性質を付与し得る。５,９２９,２１４にしたがって生産されるポリマーは、それらの低臨界溶液温度(ＬＣＳＴ)以下における第一の構造から、それらのＬＣＳＴ以上における第二の構造へと、迅速かつ可逆的な相転移を受けて、それ故に“熱‐収縮”ポリマーと呼ばれる。
【０００４】
Dhal等(Dhal, Pradeep K.; Vidyasankar, S.; Arnold, Frances H. Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, Pasadena, CA, USA. Chem. Mater. (1995), 7(1), 154-62)は、マクロ孔質ポリ(トリメチロールプロパントリメタクリル酸エステル)への機能性ポリマーの表面グラフト化を開示している。機能性モノマーのタイプは、元来のマトリックスの物理的性質を保持するために、選択される。
【０００５】
さらに、不飽和基および親水性ドメインを含む疎水性ドメインを含むところの、親水性‐コーティング化支持体を形成することが、ＵＳ  ５,５０３,９３３から公知である。親水性コーティング剤は、ジビニルベンゼンで交差結合されたポリスチレンのような疎水性ポリマーに、例えば、共有結合的に付着され得る。説明されたコーティングの目的は、疎水性支持体をマスクし、そして高低の極端なｐＨにおいて化学的に安定であるところのポリマーを提供することである。
【０００６】
多孔性のクロマトグラフィー粒子中に存在するミクロ細孔は、それらは立体障害効果を引き起こし得るので、望ましくないことがまた公知である。そのような立体効果は、より遅速な拡散をもたらして、ひいては低分離能を起こさせるであろう。クロマトグラフィー樹脂中のミクロ細孔の問題は議論されており、例えば、逆相クロマトグラフィー(ＲＰＣ)におけるミクロ細孔の負の効果が説明されている、F Nevejans, M Verzele: J Chrom 406, 325-342 (1987)、を参照されたい。ミクロ細孔を除去するための一つの方式は、当該細孔を閉塞するためにエポキシ樹脂での処理であった。しかしながら、これは複雑な方法であり、そしてこの分野内には、メソ多孔性およびマクロ孔質のクロマトグラフィー樹脂中のミクロ細孔を除外するための単純化された方法の必要性がある。
【０００７】
最後に、ＵＳ  ５,８６５,９９４(Dionex Corporation)は、陽イオンとの複合体の形成を許容するところのクラウンエーテル官能基および陽イオンとの電荷相互作用の能力のあるところの非‐クラウンエーテル陽イオン‐交換官能基より成る、二官能性陽イオン‐交換組成物を開示する。好ましい非‐クラウンエーテル官能性基は、スルホン酸エステル、カルボン酸エステルおよびホスホン酸エステル基である。ＵＳ  ５,８６５,９９４では、カルボン酸エステル‐官能基およびリンカーがマクロ孔質ポリマー性樹脂上にグラフトされている、標準的陽イオン‐交換樹脂の比較例が、提供されている。より特異的には、カルボン酸エステル基は無水マレイン酸によって提供されて、一方ではリンカーはエチルビニルエーテルである。この文脈では、ビニルエーテルは一般には、単独モノマーとして極めて重合し難いことが、周知である。表３‐１においてビニルエーテルのファミリーは、ラジカル重合に対して−(マイナス)と評価されている、例えば“重合の原理”第三版、page 200, Author: George Ordian, and publisher: John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい。しかしながら、上で議論されかつＵＳ  ５,８６５,９９４中で提供されている比較例では、エチルビニルエーテルが電子供与体として働く一方で、無水マレイン酸が電子受容体として働くので、重合が可能である。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明の一つの目的は、先行の使用方法と比較して、時間的必要性および複雑性に関して単純化されるところの、ポリマー性マクロ孔質支持体の後修飾の方法を提供することである。これは、請求項１および従属の請求項において説明されるように、支持体上に存在する未反応の二重結合を介して比較的短いポリマー鎖をグラフト化することにより達成される。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、その頑健性が先行技術の方法と比較して改良されているところの、ポリマー性マクロ孔質支持体の後修飾のための方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、立体障害効果が減少される、クロマトグラフィーのマトリックスとして有用なポリマー性マクロ孔質支持体を提供することである。これは、用いられるグラフト化化合物が、より大きな細孔を拡散移動に対して開放されたままに放置しながら、ミクロ細孔を本質的に遮断するのに適当な長さの鎖を提供する、上のようなポリマー性マクロ孔質支持体の後修飾により達成される。
【００１１】
本発明のなおもう一つの目的は、先行技術の支持体と比較して、改良された分解能を示すところの、クロマトグラフィーのマトリックスとして有用なポリマー性マクロ孔質支持体を提供することである。そのような支持体は、その方法がカラム効率および選択性の両方を改良し得るところの、上で説明された後修飾の使用により提供される。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、その方法が当該支持体において得られる疎水性および親水性の程度に関して増強された柔軟性を許容するところの、マクロ孔質ポリマー性支持体の後修飾の方法を提供することである。例えば、グラフト化化合物として親水性ビニルエーテルのような、親水性モノマーを用いることによって、支持体は親水性にされる。そのような親水性支持体は、ひいては望ましくない、非特異的疎水相互作用が本質的に無いであろうところの、イオン交換体、親和性クロマトグラフィー樹脂等の製造に使用され得る。これに代えて、もし例えば疎水性のビニルエーテル、またはスチレンもしくはスチレン誘導体がグラフト化化合物として用いられるならば、性質が本質的に疎水性であるところの支持体が得られるであろう。かくして、後修飾の新規な方法において用いられるグラフト化化合物を適当に選択することによって、そのように修飾された支持体の疎水性の程度が容易に制御される。
【００１３】
かくして、本発明のさらなる目的は、逆相クロマトグラフィー(ＲＰＣ)で用いられるとき、改良された効率と選択性を持つクロマトグラフィーにおける使用のためのマクロ孔質ポリマー性支持体を提供することである。これは、グラフト化化合物がスチレン、その誘導体もしくはビニルエーテルである、請求項１に記載の従来のクロマトグラフィー支持体の後修飾によって達成される。そのようなグラフト化された支持体は、それらが改良された分解能を提供するので、ＲＰＣでは有利に用いられるであろう。
【００１４】
本発明のなおもう一つの目的は、アルカリ性条件による分解を受け易いところの、ＲＰＣで従来用いられる先行技術のシリカマトリックスよりも加水分解を受け難いところのマクロ孔質ポリマー性クロマトグラフィー支持体を提供することである。かくして、本発明は、例えば、水酸化ナトリウムを用いる従来のクリーニング手順において安定であるところの、支持体を提供する。これは、上の後修飾の方法によって達成される。
【００１５】
図面の簡単な説明
図１は、未反応のビニル基を持つジビニルベンゼン(ＤＶＢ)樹脂(SOURCE[登録商標]、Amersham Biosciences AB、スウェーデン)および実施例１で説明されるようなオクタデシルビニルエーテルによる後修飾の後の対応するＤＶＢ樹脂を示す、ＩＲスペクトルである。
図２は、未修飾の樹脂(下)および上で説明された後修飾された樹脂(上)を用いるＲＰＣによる、四つのペプチドの分離を示す。
図３は、未反応のビニル基を持つＤＶＢ樹脂(SOURCE[登録商標])および実施例２で説明されるようなヒドロキシブチルビニルエーテルによる後修飾の後の対応するＤＶＢ樹脂を示す、ＩＲスペクトルである。
図４は、未反応のビニル基を持つＤＶＢ樹脂(SOURCE[登録商標])(下)および実施例３で説明されるようなスチレンによる後修飾の後の対応するＤＶＢ樹脂を用いる、ＲＰＣによる四つのペプチドの分離を示す、クロマトグラムである。
【００１６】
定義
本明細書中では、特異的に説明されない用語は、当業者が本文脈の読み取りから理解するであろうところの従来の意味で用いられる。
用語“マクロ孔質”(macroporous)とは、定義された孔径の物質を指す：ＩＵＰＡＣ定義にしたがうと、ミクロ細孔は直径＜２ｎｍを有し、メソ細孔は２〜５０ｎｍの間隔以内の直径を有し、マクロ細孔は、＞５０ｎｍの直径を有する。ミクロ細孔は、支持体の外表面中に存在し得るが、しかしまた上に定義されるようなメソ細孔もしくはマクロ細孔内にも存在し得る。かくして、物質がその最大細孔にしたがって分類されることが、理解されるべきである。その結果、本明細書で使用される際には、用語“マクロ孔質”とは、メソ細孔および／もしくはミクロ細孔をよくまた含有し得るところの、物質を指す。
【００１７】
用語“グラフト化”は、本明細書で使用される際には、第一の重合の後に未反応で残されているところの二重結合のような基が今回反応させられる、第二の重合について用いられる。(グラフト化の異なる原理の総説としては、例えば、P F Rempp, P J Lutz: Comprehensive Polymer Science vol. 6, pp 403-421, Eds. G Allen et al, Oxford 1989、を参照。)
【００１８】
本発明の詳細な説明
より特異的には、本発明は、一つもしくはそれ以上の未反応の二重結合を含むマクロ孔質ポリマー性支持体の後修飾のための方法であって、その方法は、
(ａ)ポリマー性支持体を、一つもしくはそれ以上のグラフト化化合物を含む液相と接触させること；
(ｂ)工程(ａ)から得られた混合物において、当該ポリマー性支持体上の一つもしくはそれ以上の二重結合およびグラフト化化合物上の一つもしくはそれ以上の反応性基の間で、フリーラジカル反応を開始すること、ならびに任意に
(ｃ)ポリマー性支持体を洗浄して、もしあれば過剰のグラフト化化合物も除去すること；
の工程を含み、
そこではグラフト化化合物(複数を含む)が、任意に一つもしくはそれ以上のヘテロ原子を含むところの、直線状もしくは環状の炭素鎖に結合される反応性基としての二重結合から成る、方法に関する。未反応の二重結合は、支持体の製造から残存し得るしそして／もしくは意図的に導入されてい得る。未反応の二重結合は、本明細書中で説明されるように、反応に利用され得るとまた理解される。
【００１９】
上述のように、後修飾の本方法は、イオン交換法において将来の使用ための一つもしくはそれ以上の官能基を導入するために改善された可能性を含む、柔軟な方法である。本発明にしたがうグラフト化の方法は、マクロ細孔内ならびに支持体の外部表面上において有益な重合をもたらし、そしてクロマトグラフィーでの改善された結果は、恐らくは改善された物質移動に因って、示されている。
【００２０】
本後修飾の予期しない効果は、マクロ孔質ポリマー性支持体中に存在する多数のミクロ細孔を除去するかもしくは少なくとも本質的な減少を提供すると示されていることである。上で議論されたように、ミクロ細孔は、或る場合にはクロマトグラフィー支持体中では望ましくなくあり得て、そのようなミクロ細孔を除去するための先行の試みは、複雑かつ時間を浪費する手順であった。したがって、本発明にしたがう後修飾は、クロマトグラフィーで用いられるときに、減少された数の立体相互作用を示すところのグラフト化されたポリマー性支持体をもたらす。かくして、本発明にしたがう後修飾支持体の、例えばイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーによる分離においての使用は、従来の支持体の使用と比較して、より高い分解能のような、改善された結果を提供し得る。
【００２１】
本発明にしたがう後修飾は、未反応の二重結合、即ち、ポリマー性支持体上に存在する未反応基への、適当な化合物のグラフト化である。そのような二重結合を用いる代わりに、上で議論したＥＰ  ０  ３３７  １４４(Merck)は、当該支持体上に存在するヒドロキシル基のα‐Ｃ原子を介してグラフトすることを提案している。したがって、本発明とＥＰ  ０  ３３７  １４４との間の一つの相違は、本発明によって提供される後修飾が、出発物質の適切な選択により、加水分解に本質的に安定であるところの支持体をもたらし、一方で、当該ＥＰ  ０  ３３７  １４４にしたがってグラフトされる支持体は、例えばアルカリによる、加水分解をより受け易いと証明するであろう、ということである。その結果、先行技術と比較した本発明の利点は、本発明にしたがって後修飾された支持体は、アルカリを用いる従来のクリーニング手順に対して、ＲＰＣマトリックスのいかなる分解も起こること無しにさらに耐性であるであろうということである。
【００２２】
上で議論されたＵＳ  ５,９２９,２１４によって解決される問題は、熱的ゲートとして機能し得るところのモノリスを提供することである。これは、特定の条件下でマクロ細孔を閉塞するために十分な重合によって達成される。そのような閉塞を可能にするためには、ＵＳ  ５,９２９,２１４にしたがう重合は、比較的長いポリマー鎖を与える程度にまで、実施される必要があろう。実際に、ＵＳ  ５,９２９,２１４は、分子サイズを増大させて、細孔のそのような閉塞を容易にするためには、特定の量の交差結合モノマーを含むことさえ教示している。ビニルエーテルのラジカル重合は、恐らくは必要とされるポリマー鎖長をその方式では得ることが可能ではないであろうので、ＵＳ  ５,９２９,２１４では特異的には示唆されていない。ＵＳ  ５,９２９,２１４にしたがってグラフトされたポリマーは、実際には対流的および拡散的流動の両方を減少するかもしくは停止さえするに十分なほど大きく、それは、明白にこれらの物質をクロマトグラフィーでの使用に不適当とする。反対に、本発明にしたがう新規な後修飾は、フリーラジカル重合によって提供され、そしてマクロ細孔がその後のクロマトグラフィー手順に対してなお利用可能である、マクロ孔質ポリマー性支持体をもたらす。
【００２３】
交差結合したポリマーのマクロ孔質ビーズポリマーは、例えば、従来の懸濁重合(例えば、J. R. Benson and D. J. Woo, J. Chromatographic Sci., 1984, 22, 386、を参照)によって作成され得る。最初に、モノマー性物質、交差リンカーおよび細孔原の希釈剤(porogenic diluent)が、水中油乳濁液中に、乳化剤の助けで液滴として懸濁される。開始剤の添加とともに、重合は液滴中で進行して、ポリマー性マトリックス内に閉じ込められた細孔原の希釈溶媒を含有するゲルビーズを形成する。閉じ込められた細孔原は、エタノール、アセトン、トルエン、等のような第二の溶媒による抽出で除去されて、第二のより揮発性な溶媒の蒸発後に、ポリマーマトリックス中に溶媒の無いマクロ細孔を残す。一方において、交差結合されたポリマー相は、マトリックス中にミクロ細孔を形成する。望ましい官能基は、その誘導体化によりポリマーの表面上に提供される。マクロ孔性ビーズはまた、例えば、Dynal Particles A/S、ノルウェーから、市販されている。
【００２４】
本方法の一つの実施態様において、工程(ｂ)は、加えたグラフト化化合物をポリマー性支持体に重合させるに十分な量にてフリーラジカル開始剤を添加することにより実施される。フリーラジカルは、例えば、過酸化ジアセチル、過酸化ジベンゾイル、過酸化ジラウロイル、ペルオキシピバロン酸ｔ‐ブチル、過オクタン酸ｔ‐ブチル、ペルオキシピバロン酸ｔ‐アミル、ペルオキシ‐２‐エチルへキサン酸ｔ‐ブチル、ペルオキシジ炭酸ジ‐(４‐ｔ‐ブチルシクロヘキシル)、２,２'‐アゾビス(イソブチロニトリル)、２,２'‐アゾ‐ビス(２,４‐ジメチルバレロニトリル)、もしくは１,１'‐アゾ‐ビス(シアノシクロヘキサン)、およびそれらの混合物に基づいた、任意の適当な市販されている開始剤であり得る。特異的な例は、製品Ｖ６５(＝２,２'‐アゾ‐ビス(２,４‐ジメチルバレロニトリル、和光純薬工業)もしくはＡＩＢＮ(＝２,２'‐アゾ‐ビス(イソブチロニトリル)、また和光純薬工業から)である。フリーラジカル開始剤の選択は、以下により詳細に議論されるであろうところの、用いられるグラフト化化合物を考慮して、当業者により容易になされる。その量は決定的ではなく、そして、例えば、１〜１０ｍｏｌ％(モノマー当たり)の範囲内で、当業者により容易に選択される。フリーラジカル開始剤の適当な量を決めるときの基本的な考慮は、単純には、その実質的過剰が重合に負の影響を有するかもしれない一方で、過少量は望ましい結果のためには不十分であり得る、ことであろう。
【００２５】
グラフト化化合物上の反応性基、支持体上に存在する二重結合および上で議論されたフリーラジカル開始剤の間のラジカル反応は、加熱、ＵＶ光照射、化学物質の添加等のような、任意の従来の方法によって開始されることができる。これに代えて、重合は、その場合には開始剤が存在する必要のない、ガンマ線もしくは電子線照射によって開始されることできる。もし加熱が用いられるならば、加熱浴、オーブン等を使用し得る。正確な温度は、例えばグラフト化化合物およびフリーラジカル開始剤の性質に依存するであろうが、しかし、例えば、約７０℃のように約５０℃以上であり得て、２〜２０時間の間ような適当な時間の期間の間継続し得る。
【００２６】
上述のように、本発明の利点の一つは、方法の単純性である。かくして、上で説明された重合反応は、従来の化学に基づき、そして工程はいかなる特異的な装置等も必要としないで、当業者により適するように容易に適応化される。当然、任意の従来のフリーラジカル重合方法に対すると同一な考慮が、ここでも適用され得て、そこでは、例えば、酸素等と接触することなく作業することの利点が利用され得る。しかしながら、そのような詳細は、当業者には周知であって、請求項によって定義されるように本発明の概念を変えるものではない。
【００２７】
本発明のさらなる利点は、それが純粋な型の共重合を提供することである。したがって、二官能性ポリマーが二つ以上のタイプのモノマーを用いて生産される、例えばＵＳ  ５,９６８,３６３と比較すると、本後修飾は、ポリマー鎖長のさらに均一な分布をもたらして、そのことが、マクロ細孔はクロマトグラフィーにおけるその後の使用に対してなお利用可能である一方で、上で説明されたミクロ細孔を閉塞することに対する可能な理由である。ラジカル重合においては、ビニルエーテルは、ゆっくりと単独重合して、短い鎖を与える。無水マレイン酸のような強力な電子吸引性モノマーと共重合されるときは、しかしながら、それらは、交互コポリマー鎖構造を持つさらに長い鎖を形成するであろう。これらの長い鎖は、マクロ細孔もまた望ましくない様式で容易に閉塞し得る。また、鎖中のカルボン酸無水物基の存在は、それらが容易に加水分解してカルボン酸基を形成するので、ＲＰＣ、ＨＩＣおよび陰イオン交換の適用では望ましくない。
【００２８】
大部分の場合には、本発明にしたがう後修飾はまた、工程(ｃ)で説明されたように、グラフト化されたゲルポリマー支持体を洗浄するための工程を含む。そのような洗浄は、用いられたグラフト化化合物およびポリマー支持体に依存して、水、メタノール、エタノール、アセトンまたは任意の他の適当な緩衝液もしくは溶液を用いて、例えば、実施され得る。ゲルに共有結合的に結合されない過剰なモノマー、オリゴマーおよびポリマーのそのような除去は、当分野における従来の措置であって、当業者は容易にその条件を決めることができる。
【００２９】
本発明にしたがって後修飾の後にどの程度二重結合がポリマー性支持体上に残存するかを決めるためには、最も便利な方式は、単純に重量法を使用することである。異なるように置いて、支持体が後修飾の前後で秤量され、そして重量増加がグラフト化された化合物を表わすであろう。より特異的には、グラフト化されたポリマーの量は、残存する二重結合の数に逆比例するであろう。これに代えて、結果は、この分野で従来用いられるように、ＩＲを用いて評価され得る。かくして、当業者は、本発明にしたがう後修飾の定量的もしくは定性的な結果を決めるために、対照実験を容易に実施し得る。
【００３０】
マクロ孔質ポリマー性支持体は有利には、疎水性ベースマトリックス、例えばポリビニルベンゼンおよびポリスチレンから(任意にお互いのコポリマー等として)作成される、粒子(ビーズ)もしくは連続的(モノリス)形態にあるマトリックスの支持体のような、クロマトグラフィー支持体である。マトリックスは、分離に付すべきところの液体試料を接触させるためであるところの支持体上に、即ち、外部表面上および細孔表面上の両方に、疎水性基を曝しているポリマー性ネットワークから構築されている。有利な実施態様においては、本支持体は、一つもしくはそれ以上の粒子の形態にある。
【００３１】
かくして、一つの実施態様において、当該マクロ孔質ポリマー性支持体は、モノマーとしてメタクリレートおよび／もしくはスチレン誘導体から作成されるクロマトグラフィー支持体である。
【００３２】
本方法の特異的な実施態様において、マクロ孔質ポリマー支持体は、ジビニルベンゼン(ＤＶＢ)を含んでいて、例えば、懸濁重合もしくは活性化された膨潤方法によって作成される、任意の市販されているマクロ孔質ビーズであり得る。
【００３３】
かくして、一つの実施態様においては、後修飾されるべきマクロ孔質ポリマー性支持体は、SOURCE[登録商標](Amersham Biosciences AB)、Dynospheres[登録商標]等のようにビーズ上に存在し得る。本発明にしたがって特に有利に用いられるところの物質は、不飽和基の支持体密度が比較的高いものであって、その理由はそのような物質が、その後のクロマトグラフィーの適用に有用な誘導体化に対して利用できる大多数の部位を提供するからである。
【００３４】
有利な実施態様において、グラフト化化合物は、ヒドロキシル基のような、容易に誘導体化される官能基であるところの基を含む。ヒドロキシルは、例えばグリシドールで誘導体化され得る。グリシドールの複数分子が、三フッ化ホウ素エーテラートの付加によりヒドロキシルにポリマー的に付着されて、複数のヒドロキシルを含むポリマー鎖を含む共有結合性コーティングを生成し得る。これに代えて、ヒドロキシルは酸化されて、複数のカルボン酸基を生成し得る。もう一つの実施態様では、ヒドロキシルは、エピブロモヒドリンのような、エピハロヒドリンのような化合物と反応させると、共有結合性のコーティング上での末端ハロゲン化物を製造し、それはアミンと反応して、第四級アミンを製造し得る。
【００３５】
通常、グラフト化化合物はモノマー化合物を指して、それ故に以下ではモノマーが議論されるであろう。グラフト化反応の間に、添加されたモノマーは、支持体上に存在する未反応の二重結合と直接反応するであろう。しかしながら、同時に幾つかのモノマーが最初に互いに反応して、より短いポリマー鎖を形成し、それがひいては当該未反応の二重結合を介して支持体にグラフトされるということが起こりうる。
【００３６】
本方法の一つの態様は、グラフト化合物(複数を含む)が、一般式(Ｉ)：
【化１】
2005510609.tif 000002
[式中、
Ｒ＝一つもしくはそれ以上のヒドロキシル、アミン、カルボニル、エーテル、酸素または最終の支持体の性質に全く無いかもしくは最少の負の影響を持つところの任意の他の適当な基で任意に置換されている、Ｃ０〜Ｃ３０のアルキル鎖；
Ｒ'＝ＨもしくはＣＨ３；
Ｒ''＝Ｃ０〜Ｃ３０の脂肪族もしくは芳香族基；または酸素；そして
Ｘ＝Ｏｎ、｛式中、もしＲ''が酸素もしくは芳香族基であるならば、そのときはｎは０であって、もしＲ''がアルキル鎖であるならば、そのときはｎは１であるという条件で、ｎが０〜１の整数である｝]、
によって説明される、マクロ孔質ポリマー支持体の後修飾の方法である。
【００３７】
一つの実施態様において、ＲはＣ１〜Ｃ３０のアルキル鎖であって、Ｒ''はＣ０〜Ｃ３０の脂肪族基もしくは酸素である。
【００３８】
かくして、グラフト化化合物は有利には、任意に一つもしくはそれ以上の炭素原子により互いから分離されている、一つの二重結合および一つのエーテル官能基を含むことが、見出されている。好ましくは、グラフト化化合物は、炭素鎖が少なくとも２個の炭素より成るビニルエーテル、即ち、エチルビニルエーテルである。
【００３９】
より特異的には、一つの実施態様においては、グラフト化化合物は、式(Ｉ)[式中、ＲはＣ１−Ｃ１０アルキル鎖であり、Ｒ'はＨであり、Ｒ''はＯであり、ｎは整数０である]によって説明される。もう一つの特異的な実施態様では、ＲはＣ１７アルキル鎖であり、一方Ｒ'はＨであり、Ｒ''はＯであり、ｎは整数０である。かくして、この実施態様では、グラフト化化合物はビニルエーテルである。現在、市販されている約１５０の異なるビニルエーテルがある。特異的な実施態様では、グラフト化化合物は、一種類のビニルエーテルのホモポリマーかまたは二つもしくはそれ以上の異なるビニルエーテルの混合物のどちらかである。その項で述べられたように、ビニルエーテルは、陽イオン条件下で容易に重合すると公知であるが、しかし本発明は、ポリマー性支持体をグラフト化するという目的に対して満足できるところのそのフリーラジカル重合を、初めて開示する。一般的には、それらが簡便に取り扱われるので、約１００℃以上の沸点を有する液体形態のビニルエーテルが好ましい。かくして、エチルビニルエーテル、ｎ‐ブチルビニルエーテル、イソ‐ブチルビニルエーテル、ｔｅｒｔ‐ブチルビニルエーテル、シクロヘキシルビニルエーテル、オクタデシルビニルエーテル、ヒドロキシブチルビニルエーテル、エチレングリコールモノビニルエーテル、シクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテル、等のような任意のビニルエーテルが、簡便に用いられる。ビニルエーテルがグラフト化化合物として用いられるときに特に観察される技術的な効果は、それらがマクロ細孔中およびビーズ支持体上におけるその後の誘導体化のために利用可能な大多数の部位を提供するに十分に効果的であるところの重合を提供している一方で、同時に、得られた重合はマクロ細孔を閉塞するには十分に効率的ではないように思われる、ということである。この結果は予期されないものであって、本発明によって得られる利点に寄与する。
【００４０】
本発明の一つの実施態様において、グラフト化化合物は、反応性二重結合に加えて少なくとも一つの官能基を含み、その官能基は、そのように修飾された支持体の表面上のリガンドとして利用可能である。したがって、二もしくは多官能性ポリマー性支持体を本方法により作成することができる。
【００４１】
マクロ孔質ポリマー性支持体の後修飾の本方法のもう一つの態様においては、グラフト化化合物は、一般式(ＩＩ)
【化２】
2005510609.tif 000003
[式中、環は、最終生成物の望ましい性質に全く無いか最小の負の影響を有するところの任意の適当な置換基を所持し得る]によって説明される。したがって、この実施態様はまた、式(ＩＩ)の誘導体、即ち、スチレン誘導体を包含する。適当なスチレン誘導体は、任意にその日常的な試験の後に、当業者により容易に選択される。
【００４２】
有利な実施態様において、本方法は、逆相クロマトグラフィー(ＲＰＣ)樹脂の作成に適する。
特異的な実施態様において本方法は、クロマトグラフィーにおいて、好ましくは逆相クロマトグラフィー(ＲＰＣ)において、そのように作成された 後修飾されたクロマトグラフィー支持体を用いる、さらなる工程(ｄ)を含む。
【００４３】
ＲＰＣは、例えばペプチドおよびより小さなタンパク質の分離と精製のためにしばしば用いられる方法である。本発明者は驚くべきことに、本発明にしたがった方法によって後修飾されたポリマー性支持体が、ＲＰＣで用いられるならば、効率および選択性に関して大きく改良された結果を提供し得るということを見出している。インスリンとのような、幾つかの場合には、シリカマトリックスを用いる従来のＲＰＣは、ジビニル‐ベースのマトリックスよりも優れた結果を与えることが見出されている。しかしながら、この文脈でのシリカの使用は、そのアルカリに対する感受性に因る欠点を含む。シリカベースの物質は、そこでのクリーニング(ＣＩＰ)が実施される、方法での使用に対しては、そのようなクリーニングが通常水酸化ナトリウムを用いるので、その結果不適当である。したがって、シリカベースマトリックスの寿命は、余り短かすぎて経済的ではない。しかしながら、ジビニルベースマトリックスの後修飾は、以下の実験の部で示されるように、例えば分解能に関してより優れた結果を与えるところの物質をもたらすと本発明者らによって示されている。したがって、特に有利な実施態様においては、本方法を用いて、上で説明されたように後修飾されているところのマトリックスを用いるＲＰＣにより、インスリンを精製する。本発明にしたがうそのような精製は、例えば、インスリンが組換え的に作成される方法での最終工程であり得て、そして粗い捕捉工程が最初に、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより行われ、次に上で議論されたようなＲＰＣにより行われる。これに代えて、本支持体は、インスリンの精製における捕捉‐工程で用いられる。当然、本発明は、他のおよび類似のたんぱく質についても、例えば、ＲＰＣを用いる高純度にまでの最終精製についてもまた有利である。特に、その後の薬学的用途を有するところのタンパク質は、それがその産業内で要求されるほど高レベルの純度に達することを可能にするので、この方式によって特に有利に精製される。本発明にしたがって後修飾されたマクロ孔質ポリマー性支持体を用いるＲＰＣが利用され得る、もう一つの有利な例は、分析目的のため、即ち、上で議論された分取クロマトグラフィーより小スケールにおける例、である。
【００４４】
本発明はまた、上で説明された方法を用いて後修飾されているところのポリマー支持体も包含する。そのような支持体は、例えば、粒子、モノリスもしくは膜でさえもあり得て、クロマトグラフィーもしくはバッチ式の分離において有用である。かくして、本発明はまた、クロマトグラフィーにおいて上で定義されたような後修飾されたマクロ孔質ポリマー性支持体の使用を包含する。
【００４５】
本発明の最後の態様は、上で定義されたような後修飾されたマクロ孔質ポリマー性支持体を含むクロマトグラフィーカラムである。そのようなカラムは、例えば、充填カラムであり得て、そして、例えば、ＲＰＣのようなクロマトグラフィーにおいて使用のためのキットの部分もしくは産業的スケールでの精製用の大スケールカラムであり得る。
【００４６】
図の詳細な説明
図１は、未反応のビニル基を持つジビニルベンゼン(ＤＶＢ)樹脂(SOURCE[登録商標]、Amersham Biosciences AB, スウェーデン)および実施例１で説明されるようなオクタデシルビニルエーテルによる後修飾の後の対応するＤＶＢ樹脂を示すＩＲスペクトルである。図から現れるように、殆ど全ての残存するビニル基は消費されて(９８５ｃｍ−１)そして顕著な量のオクタデシルビニルエーテルが樹脂に挿入(１０９６ｃｍ−１)されている。
図２は、未修飾の樹脂(下)および実施例１で説明される後修飾された樹脂(上)を用いるＲＰＣによる、四つのペプチドの分離を示す。
【００４７】
図３は、未反応のビニル基を持つＤＶＢ樹脂(SOURCE[登録商標]および実施例２で説明されるようなヒドロキシブチルビニルエーテルによる後修飾の後の対応するＤＶＢ樹脂を示すＩＲスペクトルである。図から現れるように、殆ど全ての残存するビニル基は消費されて (９８５ｃｍ−１) そして顕著な量のヒドロキシブチルビニルエーテルが樹脂に挿入(１０９６ｃｍ−１および３４００ｃｍ−１)されている。
図４は、未反応のビニル基を持つＤＶＢ樹脂(SOURCE[登録商標](下)および実施例３で説明されるようなスチレンによる後修飾の後の対応するＤＶＢ樹脂を用いる、ＲＰＣによる四つのペプチドの分離を示すクロマトグラムである。
【実施例】
【００４８】
実験の部
本実施例は、単に例示目的のみのために本明細書中に含まれていて、付随の請求項により定義されるように本発明を限定するものと解釈されるべきではない。以下 および本明細書中の他の所において含まれる全ての参考文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
【００４９】
実施例１：オクタデシルビニルエーテルにより後修飾されて、ＲＰＣで用いられる支持体
２,２'‐アゾ‐ビス(２,４‐ジメチルバレロニトリル(Ｖ‐６５)１.０ｇｒ.をトルエン２.０ｍＬ中に溶解して、次いで、オクタデシルビニルエーテル４０.０ｍＬに３０℃で加えた。ラジカル重合のために利用可能な残存ビニル基を持つマクロ孔質ＤＶＢ樹脂４.００ｇr.を、モノマー／開始剤溶液中に浸した。反応混合物を７０℃で１５時間、機械的撹拌器で穏やかに撹拌した。完全な反応の後、樹脂に共有結合的に結合されなかった過剰のモノマー、オリゴマーおよびポリマーを、溶媒としてヘキサンを用いる洗浄手順により除去した。オクタデシルビニルエーテルで修飾された樹脂４.７５ｇｒ.が得られて、１９％の質量の増加を生じた。ＩＲスペクトル(図１)に示されるように、殆ど全ての残存するビニル基が消費され(９８５ｃｍ−１)、そして顕著な量のオクタデシルビニルエーテルがマクロ孔質ＤＶＢ樹脂の中に挿入(１０９６ｃｍ−１)されていた。さらに、マクロ孔質ＤＶＢ樹脂からオクタデシルビニルエーテルをグラフトすることの正の効果が、当業者には周知である標準的手順にしたがって作成されて、実施されたＲＰＣによる４つのペプチド(Ｉｌｅ７‐アンジオテンシン‐ＩＩＩ、Ｖａｌ４‐アンジオテンシン‐ＩＩＩ、アンジオテンシン‐Ｉ、アンジオテンシン‐ＩＩＩ；図２を参照)の分離について示される。
【００５０】
実施例２：ヒドロキシブチルビニルエーテルによって後修飾された支持体からイオン交換体の作成
２,２'‐アゾ‐ビス(２,４‐ジメチルバレロニトリル(Ｖ‐６５)１.０ｇｒ.をヒドロキシブチルビニルエーテル４０.０ｍＬ中に溶解した。ラジカル重合のために利用可能な残存ビニル基を持つマクロ孔質ＤＶＢ樹脂４.００ｇr.を、モノマー／開始剤溶液中に浸した。反応混合物を７０℃で１５時間、機械的撹拌器で穏やかに撹拌した。完全な反応の後、樹脂に共有結合的に結合されなかった過剰のモノマー、オリゴマーおよびポリマーを、溶媒としてメタノールを用いる洗浄手順により除去した。ヒドロキシブチルビニルエーテルで修飾された樹脂４.９４ｇｒ.が得られて、２４％の質量の増加を生じた。ＩＲスペクトル(図３)に示されるように、殆ど全ての残存するビニル基が消費され(９８５ｃｍ−１)、そして顕著な量のヒドロキシブチルビニルエーテルがマクロ孔質ＤＶＢ樹脂の中に挿入(１０９６および３４００ｃｍ−１)されていた。５Ｍ  ＮａＯＨ１０ｍＬを、ヒドロキシブブチルビニルエーテルでグラフト化された樹脂２.０ｇｒ.と３０分間反応させた。過剰の塩基を、“最初の亀裂”がろ過ケーキ中に観察されるまで、ろ過により除去した。次いで、樹脂を塩化グリシジルトリ‐メチルアンモニウム水溶液１０ｍＬに加えて、室温で２０時間、機械的撹拌器を用いて反応させた。完全な反応の後、過剰の塩化グリシジルトリ‐メチルアンモニウムを、溶媒として水を用いる洗浄工程により除去した。作成された陰イオン‐交換樹脂の滴定は、５４μｍｏｌＣｌ−／ｍＬの容量を示した。
【００５１】
実施例３：ＲＰＣで使用のためのスチレンで後修飾された支持体
２,２'‐アゾ‐ビス(２,４‐ジメチルバレロニトリル(Ｖ‐６５)１.０ｇｒ.を、スチレン２４.０ｍＬおよびトルエン１６ｍＬの溶液中に溶解した。ラジカル重合のために利用可能な残存ビニル基を持つマクロ孔質ＤＶＢ樹脂４.００ｇを、モノマー／開始剤溶液中に浸した。反応混合物を７０℃で１５時間、機械的撹拌器で穏やかに撹拌した。完全な反応の後、樹脂に共有結合的に結合されなかった過剰のモノマー、オリゴマーおよびポリマーを、溶媒としてジクロロメタンを用いる洗浄手順により除去した。スチレンで修飾された樹脂４.９０ｇｒ.が得られて、２３％の質量の増加を生じた。図４において、マクロ孔質ＤＶＢ樹脂からスチレンをグラフトすることの効果が、実施例１で説明されたようなＲＰＣによる４つのペプチドの分離について示される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、未反応のビニル基を持つジビニルベンゼン(ＤＶＢ)樹脂(SOURCE[登録商標]、Amersham Biosciences AB、スウェーデン)および実施例１で説明されるようなオクタデシルビニルエーテルによる後修飾の後の対応するＤＶＢ樹脂を示す、ＩＲスペクトルである。
【図２】図２は、未修飾の樹脂(下)および上で説明された後修飾された樹脂(上)を用いるＲＰＣによる、四つのペプチドの分離を示す。
【図３】図３は、未反応のビニル基を持つＤＶＢ樹脂(SOURCE[登録商標])および実施例２で説明されるようなヒドロキシブチルビニルエーテルによる後修飾の後の対応するＤＶＢ樹脂を示す、ＩＲスペクトルである。
【図４】図４は、未反応のビニル基を持つＤＶＢ樹脂(SOURCE[登録商標])(下)および実施例３で説明されるようなスチレンによる後修飾の後の対応するＤＶＢ樹脂を用いる、ＲＰＣによる四つのペプチドの分離を示す、クロマトグラムである。
【図１】
2005510609.tif 000005
【図２】
2005510609.tif 000006
【図３】
2005510609.tif 000007
【図４】
2005510609.tif 000008
【国際調査報告】
2005510609.tif 000009
2005510609.tif 000010
2005510609.tif 000011