(57)【要約】本発明は，Ｓｍａｃを使用して，種々の腫瘍および自己反応性免疫細胞の，細胞が次にアポトーシスを起こす種々のプロアポトーシス刺激に対する感受性を高めることに関する。したがって，Ｓｍａｃは，癌および自己免疫疾患の治療用の医薬を製造するための化合物として用いることができる。細胞の感受性化は，細胞透過性形のＳｍａｃを既知の抗癌剤と組み合わせて適用するか，または蛋白質を過剰発現させることにより達成される。本発明の目的は，アポトーシスの制御のためにＳｍａｃアゴニストを用いることにより，癌および自己免疫疾患の治療における新規な方法を提供することである。すなわち，Ｓｍａｃアゴニストは，耐性腫瘍および免疫細胞においても細胞障害性療法の効力を高める，癌および自己免疫疾患の新規かつ有望な治療である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＦ８７７１６に開示されるＳｍａｃ蛋白質，またはその誘導体またはフラグメント，および
（ｉｉ）キャリア
を含むＳｍａｃ蛋白質／キャリア構成体であって，
Ｓｍａｃ蛋白質，そのフラグメントまたは誘導体およびキャリアは，Ｓｍａｃ／キャリア構成体が細胞膜を通って細胞内に浸透することができるように一緒に連結されていることを特徴とする構成体。
【請求項２】
Ｓｍａｃのフラグメントまたは誘導体がアミノ酸配列５６−７０を含むペプチドである，請求項１記載の構成体。
【請求項３】
Ｓｍａｃのフラグメントまたは誘導体がＳｍａｃのアミノ酸５６−６２を含むペプチドである，請求項１または２に記載の構成体。
【請求項４】
Ｓｍａｃのフラグメントまたは誘導体がＳｍａｃのアミノ酸５６−５９を含む，請求項１−３のいずれかに記載の構成体。
【請求項５】
前記キャリアが，蛋白質，そのフラグメントまたは誘導体である，請求項１−４のいずれかに記載の構成体。
【請求項６】
前記キャリアが，ＴＡＴ，インフルエンザウイルスヘマグルチニン，ヘルペス単純ウイルスのＶＰ２２蛋白質，アンテナペディア，線維芽細胞成長因子，ガルパラン（トランスポータン），ポリ−アルギニン，およびＰｅｐ−１，およびこれらのフラグメントおよび誘導体，および脂質およびカチオン性脂質からなる群より選択される，請求項１−５のいずれかに記載の構成体。
【請求項７】
前記蛋白質が，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ４５９２１に開示されるＴＡＴ蛋白質またはそのフラグメントまたは誘導体である，請求項１−６のいずれかに記載の構成体。
【請求項８】
ＴＡＴ蛋白質のフラグメントまたは誘導体がＴＡＴのアミノ酸３７−７２を含む，請求項１−７のいずれかに記載の構成体。
【請求項９】
前記キャリアがＴＡＴのアミノ酸４７−５７を含むＴＡＴの蛋白質伝達ドメインである，請求項１−８のいずれかに記載の構成体。
【請求項１０】
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＦ８７７１６に開示されるＳｍａｃ蛋白質，またはその誘導体またはフラグメント，および
（ｉｉ）キャリア，
を含むＳｍａｃ蛋白質／キャリア構成体であって，
Ｓｍａｃ蛋白質はＳｍａｃのアミノ酸５６−６２または５６−５９を含むフラグメントまたは誘導体であり，
前記キャリアはＴＡＴのアミノ酸４７−５７を含むＴＡＴの蛋白質伝達ドメインであり，
およびＳｍａｃ蛋白質，そのフラグメントまたは誘導体およびキャリアは，Ｓｍａｃ／キャリア構成体が細胞膜を通って細胞内に浸透することができるように一緒に連結されていることを特徴とする構成体。
【請求項１１】
少なくとも１つの活性なアポトーシス誘導性または増殖阻害性化合物と任意に組み合わせられている，医薬品として使用するための請求項１−１０のいずれかに記載の構成体。
【請求項１２】
放射線療法と任意に組み合わせられている，医薬品として使用するための請求項１−１０のいずれかに記載の構成体。
【請求項１３】
活性化合物が細胞成長抑制性化合物である，医薬品として使用するための請求項１１記載の構成体。
【請求項１４】
細胞成長抑制性化合物が，抗代謝剤，好ましくはシタラビン，フルダラビン，５−フルオロ−２’−デオキシウリジン，ゲムシタビン，ヒドロキシウレアまたはメトトレキセート；ＤＮＡ−フラグメント化剤，好ましくはブレオマイシン，ＤＮＡ架橋剤，好ましくはクロラムブシル，シスプラチン，シクロホスファミドまたはナイトロジェンマスタード；インターカレート剤，好ましくはアドリアマイシン（ドキソルビシン）またはミトキサントロン；蛋白質合成阻害剤，好ましくはＬ−アスパラギナーゼ，シクロヘキシミド，ピューロマイシンまたはジフテリアトキシン；トポイソメラーゼＩ毒素，好ましくはカンプトテシンまたはトポテカン；トポイソメラーゼＩＩ毒素，好ましくはエトポシド（ＶＰ−１６）またはテニポシド；微小管指向性薬剤，好ましくはコルセミド，コルチシン，パクリタキセル，ビンブラスチンまたはビンクリスチン；キナーゼ阻害剤，好ましくはフラボピリドール，スタウロスポリン，ＳＴＩ５７１（ＣＰＧ５７１４８Ｂ）またはＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）；その他の研究用試薬，好ましくはＰＳ−３４１，フェニルブチレート，ＥＴ−１８−ＯＣＨ3，またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ−７３９７４９，Ｌ−７４４８３２）；ポリフェノール，好ましくはケルセチン，レスベラトロール，ピセアタンノール，没食子酸エピガロカテキン，テアフラビン，フラバノール，プロシアニジン，ベツリン酸；ホルモン，好ましくはグルココルチコイドまたはフェンレチニド；ホルモンアンタゴニスト，好ましくはタモキシフェン，フィナステリドまたはＬＨＲＨアンタゴニスト；植物由来細胞成長抑制剤（Ｖｉｓｃｕｍ由来，およびその誘導体）；アルカロイド，好ましくはビンデシン；ポドフィロトキシン，好ましくはビノレルビン；アルキル化剤，好ましくはニムストリン，カルムストリン，ロムスチン，エストラムストリン，メルファラム，イフォスファミド，トロフォスファミド，ベンダムスチン，ダカルバジン，ブスルファン，プロカルバジン，トレオスルファン，トレモゾールアミド，チオテパ；細胞障害性抗生物質，好ましくはアクラルビシン，ダウノルビシン，エピルビシン，イダルビシン，マイトマイシン，ダクチノマイシン；抗代謝剤，例えば，葉酸類似体，好ましくはメトトレキセート，プリン類似体，好ましくはクラドリビン，メルカプトプリン，チオグアニンおよびピリミジン類似体，好ましくはシタラビン，フルオロウラシル，ドセタキセル；他の抗新生物，白金化合物，好ましくはチオプラチン，カルボプラチン，オキザリプラチン；アムサクリン，イリノテカン，インターフェロン−α，トレチノイン，ヒドロキシカルバミド，ミルテフォシン，ペントスタチン，アルデスロイキン；臓器に由来する抗新生物化合物，例えば，モノクローナル抗体，好ましくはトラスツズマブ，リツキシマブ，または酵素由来抗新生物化合物，好ましくはペガスパルガーゼ；ホルモンに属する内分泌影響性抗新生物化合物，例えば，エストロゲン，好ましくはポリエストラジオール，フォスフェストリオール，エチニルエストラジオール，ゲスタゲン，好ましくはメドロキシプロゲステロン，ゲストノロンカプロート，メゲストロール，ノレチステロン，リネストレノール，視床下部ホルモン，好ましくはトリプトレリン，ロイプロレリン，ブセレリン，ゴセレリン，他のホルモン，好ましくはテストラクトン，テストステロン；ホルモンアンタゴニストに属する内分泌影響性抗新生物化合物，例えば，抗エストロゲン剤，好ましくはトレミフェン；抗アンドロゲン剤，好ましくはフルタミド，ビカルタミド，シプロテラン；酵素阻害剤に属する内分泌影響性抗新生物化合物，好ましくはアナストロール，エキセメスタン，レトロゾール，フォルメスタン，アミノグルテチミドからなる群より選択され，これらはすべて場合によりいわゆる保護剤，好ましくはカルシウムフォリナト，アミフォスチン，レノグラスチン，モルグロモスチン，フィルグラスチン，メスナまたはいわゆる添加剤，好ましくはレチノパルミトレート，サイマスＤ９，アミロマーとともに投与することができる，医薬品として使用するための請求項１１または１３に記載の構成体。
【請求項１５】
細胞成長抑制性化合物がドキソルビシン，シスプラチンおよびエトポシド（ＶＰ−１６）からなる群より選択される，医薬品として使用するための請求項１１，１３または１４のいずれかに記載の構成体。
【請求項１６】
活性化合物が，デスレセプターリガンド，その誘導体またはフラグメントである，医薬品として使用するための請求項１１記載の構成体。
【請求項１７】
デスレセプターリガンドが，腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α)，腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β，リンホトキシン−α，ＬＴ−β（リンホトキシン−β），ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌ），ＣＤ９５（Ｆａｓ，ＡＰＯ−１）リガンド，ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３，Ａｐｏ−３）リガンド，ＤＲ４リガンド，ＤＲ６リガンド，ならびに前記リガンドのいずれかのフラグメントおよび誘導体からなる群より選択される，医薬品として使用するための請求項１６記載の構成体。
【請求項１８】
デスレセプターリガンドがＴＲＡＩＬである，医薬品として使用するための請求項１６または１７に記載の構成体。
【請求項１９】
活性化合物が，デスレセプター，その誘導体またはフラグメントに対する抗体である，医薬品として使用するための請求項１１記載の構成体。
【請求項２０】
デスレセプターリガンドに対する抗体が，抗ＣＤ９５抗体，抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）抗体，抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）抗体，抗ＤＲ６抗体，抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体および抗ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３）抗体，ならびに前記抗体のいずれかのフラグメントおよび誘導体からなる群より選択される，医薬品として使用するための請求項１９記載の構成体。
【請求項２１】
デスレセプターに対する抗体が抗ＣＤ９５抗体である，医薬品として使用するための請求項１９または２０に記載の構成体。
【請求項２２】
任意に少なくとも１つの活性なアポトーシス誘導性化合物と組み合わせて癌の治療用の医薬を製造するための，請求項１−１０のいずれかに記載のＳｍａｃ／キャリア構成体の使用。
【請求項２３】
治療すべき癌が，神経芽細胞腫，直腸癌，結腸癌，家族性腺腫様ポリポーシス癌，遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌，食道癌，口唇癌，喉頭癌，下咽頭癌，舌癌，唾液腺癌，胃癌，腺癌，髄質甲状腺癌，乳糖甲状腺癌，腎臓癌，腎臓実質癌，卵巣癌，子宮頸癌，子宮体癌，子宮内膜癌，絨毛膜癌，膵臓癌，前立腺癌，精巣癌，乳癌，子宮癌，黒色腫，脳腫瘍，好ましくは神経膠芽細胞腫，星状細胞腫，髄膜腫，髄芽細胞腫および末梢神経外胚葉腫瘍，ホジキンリンパ腫，非ホジキンリンパ腫，バーキットリンパ腫，急性リンパ性白血病（ＡＬＬ），慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ），急性骨髄性白血病（ＡＭＬ），慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ），成人Ｔ細胞白血病リンパ腫，肝細胞癌，胆嚢癌，気管支癌，小細胞肺癌，非小細胞肺癌，多発性骨髄腫，基底細胞腫，奇形腫，網膜芽細胞腫，脈絡膜黒色腫，セミノーマ，横紋筋肉腫，頭蓋咽頭腫，骨肉腫，軟骨肉腫，筋肉腫，脂肪肉腫，線維肉腫，ユーイング肉腫および形質細胞腫からなる群より選択される，請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
治療すべき癌が，神経芽細胞腫，神経膠芽細胞腫，乳癌，黒色腫，前立腺癌および膵臓癌からなる群より選択される，請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
請求項１−１０のいずれかに記載のＳｍａｃ／キャリア構成体および薬学的に許容しうるキャリアを含む，癌を治療するための医薬品。
【請求項２６】
任意に少なくともつの活性なアポトーシス誘導性化合物との組み合わせて自己免疫疾患を治療するための医薬を製造するための，請求項１−１０のいずれかに記載のＳｍａｃ／キャリア構成体の使用。
【請求項２７】
治療すべき自己免疫疾患が，コラーゲン疾患，特に慢性関節リウマチ，播種性紅斑性狼瘡，シャープ症候群，ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症，レイノー症候群，食道運動障害，末端血管拡張症），皮膚筋炎，脈管炎（ヴェーゲナー病）およびシェーグレン症候群，腎臓疾患，特にグッドパスチャー症候群，急速進行性糸球体腎炎およびＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎，内分泌疾患，特にＩ型糖尿病，自己免疫多発性内分泌腺症−カンジダ症−外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ），自己免疫上皮小体欠損症，悪性貧血，性腺機能不全，突発性アジソン病，甲状腺機能亢進症，ハシモト甲状腺炎および原発性粘液水腫，皮膚疾患，特に尋常性天疱瘡，水疱性類天疱瘡，妊娠性疱疹，表皮水疱症および水痘型多型紅斑症，肝臓疾患，特に原発性胆汁性肝硬変，自己免疫胆管炎，自己免疫１型肝炎，自己免疫２型肝炎，原発性硬化性胆管炎，神経性疾患，特に，多発性硬化症，重症筋無力症，筋無力性ランバート−イートン症候群，後天性神経筋緊張，ギヤン−バレー症候群（ミュラー−フィッシャー症候群），スティッフマン症候群，小脳変性，運動失調，眼球クローヌス，感覚器ニューロパシーおよびアカラシア，血液疾患，特に自己免疫溶血性貧血，特発性血小板減少性紫斑病（ヴェルルホフ病），感染性疾患，特にＡＩＤＳ，マラリアおよびシャーガス病からなる群より選択される，請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
請求項１−１０のいずれかに記載のＳｍａｃ／キャリア構成体および薬学的に許容しうるキャリアを含む，自己免疫疾患の治療用の医薬。
【請求項２９】
活性化合物と組み合わせて，神経芽細胞腫，神経膠芽細胞腫，前立腺癌，結腸癌，小細胞および非小細胞肺癌の治療用の医薬を製造するための，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２６２２４０に開示される全長Ｓｍａｃ遺伝子，またはその誘導体またはフラグメントを有する発現プラスミドの使用。
【請求項３０】
開示される全長Ｓｍａｃ遺伝子が，開示されるコーディング配列のヌクレオチド２０−１８４を欠失したＳｍａｃＤＮＡフラグメントで置き換えられている，請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
活性化合物が，シスプラチン，ドキソルビシン，およびＶＰ−１６からなる細胞成長抑制性化合物の群より選択される，請求項２９または３０に記載の使用。
【請求項３２】
活性化合物が，腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α)，腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β，リンホトキシン−α），ＬＴ−β（リンホトキシン−β），ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌ），ＣＤ９５（Ｆａｓ，ＡＰＯ−１）リガンド，ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３，Ａｐｏ−３）リガンド，ＤＲ４リガンド，ＤＲ６リガンド，ならびに前記リガンドのいずれかのフラグメントおよび誘導体からなるデスレセプターリガンドの群より選択される，請求項２９または３０に記載の使用。
【請求項３３】
デスレセプターリガンドがＴＲＡＩＬである，請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
活性化合物がデスレセプターに対する抗体である，請求項２９または３０に記載の使用。
【請求項３５】
デスレセプターに対する抗体が抗ＣＤ９５抗体である，請求項３４記載の使用。
【請求項３６】
上述の少なくとも１つの活性化合物，およびＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ２６２２４０に開示される全長Ｓｍａｃ遺伝子，またはその誘導体またはフラグメントを有する発現プラスミドを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，癌細胞および免疫系の自己反応性細胞においてアポトーシスを引き起こすための，いわゆるＳｍａｃ蛋白質およびその誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は西洋諸国では死因の第４位を構成する。西洋の集団の平均年齢は着実に上昇しており，したがって，癌関連死亡も上昇している。このことは，２１世紀には癌が最も一般的な死因の１つとなるであろうことを示す。攻撃的な癌細胞表現型は，細胞内シグナリング経路の破壊につながる種々の遺伝的および後成的変更の結果である。癌細胞は一般に，いわゆる"プログラムされた細胞死"もしくは"アポトーシス"，すなわち細胞組織が異常に成長することを防止するうえで鍵となる役割を果たすシグナリングのプロセスを進むことができない。すなわち，アポトーシス欠陥は，多くの腫瘍に現在の治療プロトコルに対する耐性を付与して腫瘍の進行につながるため，癌治療における主要な問題であるようである。
【０００３】
腫瘍において見られるアポトーシス欠陥に加え，アポトーシス耐性により免疫系の自己反応性細胞を排除する能力の欠陥が，自己免疫疾患の病因において鍵となる役割を果たしていると考えられる。自己免疫疾患は，免疫系の細胞が自分自身の臓器および分子に対する抗体を産生するか，または組織を直接攻撃して組織を破壊することにより特徴づけられる。これらの自己反応性細胞がアポトーシスを行うことができないと，疾患が現れる。アポトーシスの制御の欠如は，自己免疫疾患，例えば，播種性紅斑性狼瘡または慢性関節リウマチにおいて認められている。
【０００４】
アポトーシス経路には，多様なグループの分子が関与する。アポトーシスにおける関与が示唆されているメディエータの１つの組は，その基質をアスパラギン酸残基のところで特異的に切断するシステインプロテアーゼである，いわゆるカスパーゼである。カスパーゼは蛋白質分解カスケード中でアポトーシスシグナルを与える。カスパーゼは他のカスパーゼを切断し活性化し，これは次に他の細胞性標的を分解し，最終的には細胞が破壊される。腫瘍細胞においてこのカスケード中の１またはそれ以上の工程が阻害されれば，これらの細胞はアポトーシスを達成することができず，したがって成長を続ける。カスパーゼの活性化それ自体は，いわゆるデスレセプターとして当業者に知られるある種の細胞表面レセプターに影響を与える外部刺激により，またはミトコンドリア蛋白質の放出につながる，ミトコンドリアを介する細胞内ストレス応答により，誘発されることができる。アポトーシスを媒介する既知のデスレセプターには，腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプタースーパーファミリーのメンバー，例えば，ＣＤ９５（ＡＰＯ−１／Ｆａｓ）またはＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）レセプター１および２が含まれる。アポトーシス誘導性物質によるデスレセプターの刺激は，特にカスパーゼ−８の活性化につながり，これは次に他のカスパーゼおよび別の群のアポトーシスのメディエータのメンバーを活性化する。この群は，Ｂｃｌ−２ファミリーと称されており，ミトコンドリア蛋白質の放出を制御し，したがって，下流で作用する蛋白質分解性カスパーゼカスケードを制御するために両方の経路を一緒につなげると考えられている。
【０００５】
カスパーゼカスケードの活性化の失敗は，いわゆるアポトーシス蛋白質阻害剤（ＩＡＰ）の作用により引き起こされる。ＩＡＰは初期の活性なカスパーゼに結合し，このことによりアポトーシスのプロセスが進行することを防止する。これらは多くの腫瘍において高レベルで発現され，カスパーゼを阻害することにより，アポトーシス誘導に対する癌の耐性に寄与する。
【０００６】
カスパーゼカスケードの活性化における主要な役割は，ヒトにおいてＳｍａｃと称される（またはマウスにおけるＤＩＡＢＬＯ）哺乳動物蛋白質に帰せられる。とりわけＤｕら（Ｃｅｌｌ１０２，２０００，３３−４２）により開示されるように，Ｓｍａｃは約２５０００ダルトンの分子量を有する２３９アミノ酸のミトコンドリア蛋白質である（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＦ８７７１６）。例えば，ＣＤ９５デスレセプターまたはＴＲＡＩＬデスレセプターによる刺激によるアポトーシス性応答の経過中において，Ｓｍａｃは，チトクロームｃ等の他の蛋白質とともにミトコンドリアから放出される。Ｓｍａｃは，いったんサイトゾル中に放出されると，ＩＡＰ，特にカスパーゼの最も強力な阻害剤であるいわゆるＸ連鎖ＩＡＰ（ＸＩＡＰ）に結合しうることが初期に示されている。ＳｍａｃがＸＩＡＰに結合すると，カスパーゼの蛋白質分解性活性化が促進され，アポトーシスが生ずる。
【０００７】
ＩＡＰ依存性のメカニズムによりカスパーゼの活性化が阻害される癌細胞と同様に，自己反応性Ｔ細胞の排除の失敗は，アポトーシスシグナリングの遮断によるものであるかもしれない。活性化リンパ球を生理学的に排除するためには，デスレセプター系，例えばＣＤ９５が鍵となる役割を果たす。活性化Ｔ細胞におけるＩＡＰまたはＢｃｌ−２ファミリーのメンバーの発現の増加は，ミトコンドリアからのＳｍａｃの放出を防止し，後者の機能を阻害する。
【０００８】
前述したことから，ミトコンドリアからサイトゾル内へのＳｍａｃおよび他の蛋白質の放出の欠陥が，腫瘍細胞および免疫系の細胞のアポトーシスに対する耐性を引き起こしうることが明らかになる。Ｓｍａｃ遺伝子を有する発現プラスミドで細胞をトランスフェクトしてＳｍａｃを過剰発現させることは，ＩＡＰにより引き起こされるカスパーゼの阻害に打ち勝って，アポトーシスの速度を高める１つの方法である。この方法の後に別の研究グループが続き，種々のタイプの癌，例えば，黒色腫，乳癌または前立腺癌をこのようにして治療しうることが見いだされた。しかし，これまでの研究は，Ｓｍａｃまたは関連する蛋白質を過剰発現させることにより神経芽細胞腫または神経膠芽細胞腫を治療することを述べておらず，そのヒントも与えていない。
【０００９】
蛋白質の細胞内への直接デリバリーは，しばしば細胞膜の透過性が低いことにより制限される。最近，Ｃａｒｓｏｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２（２００２）１８−２３）は，精製Ｓｍａｃを用いて，これを単独でまたはチトクロームｃとともに，最初はアポトーシスに対して耐性であった前立腺癌細胞のサイトゾル内にマイクロインジェクションした。しかし，生物学的に活性な化合物を細胞内にデリバリーするためにマイクロインジェクションを用いると，種々の問題点に遭遇しうる。問題点には，低い移動効率または複雑な操作が含まれ，これはこれらをインビボで日常的に使用することを妨げるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は，細胞取り込みにより，腫瘍細胞およびＴ細胞等の免疫系の細胞中に急速に内在化される形態のＳｍａｃを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的は，
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＦ８７７１６に開示されるＳｍａｃ蛋白質，またはその誘導体またはフラグメント，および
（ｉｉ）キャリア
を含むＳｍａｃ蛋白質／キャリア構成体であって，Ｓｍａｃ蛋白質，そのフラグメントまたは誘導体およびキャリアは，Ｓｍａｃ／キャリア構成体が細胞膜を通って細胞内に浸透することができるよう一緒に連結されていることを特徴とする構成体により達成される。
【００１２】
前記構成体を，以下Ｓｍａｃ／キャリア構成体と称する。
【００１３】
本発明の別の目的は，これまでＳｍａｃ蛋白質を用いて治療することができなかった癌および自己免疫疾患の治療である。
【００１４】
本発明の文脈においては，Ｓｍａｃ蛋白質の誘導体またはフラグメントとの用語は，ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＦ８７７１６に開示される２３９アミノ酸の配列の１またはそれ以上のアミノ酸が元のアミノ酸と異なる１またはそれ以上のアミノ酸で置き換えられていてもよいペプチド，またはそのアミノ酸配列が元のＳｍａｃ蛋白質のアミノ末端，またはカルボキシ末端または両方の末端で延長されているか，短縮されているか，またはその両方であるペプチドであって，ただし，Ｓｍａｃ蛋白質の機能は影響されないままであるペプチドを表す。
【００１５】
さらに別の態様においては，本発明は，好ましくはＳｍａｃのアミノ酸５６−７０を含むペプチドを含む。より好ましいペプチドは，Ｓｍａｃのアミノ酸５６−６２を含む。以下，後者をＳｍａｃペプチドと称する。
【００１６】
最も好ましくは，前記誘導体またはフラグメントは，Ｓｍａｃのアミノ末端の４アミノ酸５６−５９を含む。この領域はＳｍａｃ蛋白質とＩＡＰとの相互作用を媒介する。
【００１７】
キャリアは，好ましくは蛋白質，またはそのフラグメントまたは誘導体であり，Ｓｍａｃ蛋白質，そのフラグメントまたは誘導体に結合することにより，Ｓｍａｃ／キャリア構成体が細胞膜を通過して細胞内に浸透することを可能とするベヒクルとして作用する。適当なキャリア，特に蛋白質は，当業者に知られており，例えば，ＴＡＴ，インフルエンザウイルスヘマグルチニン，ヘルペス単純ウイルスのＶＰ２２蛋白質，アンテナペディア，線維芽細胞成長因子，ガルパラン（トランスポータン），ポリ−アルギニン，Ｐｅｐ−１が挙げられる。蛋白質には属さないが分子の細胞内への内在化を媒介する当業者に知られる他のキャリアには，脂質およびカチオン性脂質が含まれる。
【００１８】
蛋白質がキャリアとして用いられる場合，蛋白質の誘導体またはフラグメントとの用語は，１またはそれ以上のアミノ酸が元のアミノ酸とは異なる他のアミノ酸で置き換えられていてもよいペプチド，またはそのアミノ酸配列が元の配列のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかまたはその両方の末端で延長されているか短縮されているかまたはその両方であるが，ただしＳｍａｃの細胞取り込みのためのキャリアとしての機能は影響を受けないままであるペプチドを表す。上述の定義は，ＴＡＴ，インフルエンザウイルスヘマグルチニン，ヘルペス単純ウイルスのＶＰ２２蛋白質，アンテナペディア，線維芽細胞成長因子，ガルパラン（トランスポータン），ポリ−アルギニンおよびＰｅｐ−１に関連する。
【００１９】
“キャリア”との用語は，Ｓｍａｃ／キャリア構成体の安定性を増加させるために目的とする蛋白質Ｓｍａｃと連結されているか会合されている化合物または蛋白質／ペプチド，例えば，アルファ−エステル，チオアミド，スルホンアミド，Ｎ−ヒドロキシアミドを含まない。さらに，“キャリア”との用語は，細胞／細胞抽出物中に融合蛋白質を存在させるために，または細胞／細胞抽出物から融合蛋白質を精製するために，目的とする蛋白質（Ｓｍａｃ）に連結されている化合物または蛋白質／ペプチドを含まない。そのようなペプチドまたは化合物の例は，ＦＬＡＧ−タグ，ｍｙｃ−タグ，ＨＩＳ−タグ，ＧＳＴ−タグ，蛍光色素，酵素，例えばルシフェラーゼである。
【００２０】
Ｓｍａｃ蛋白質，そのフラグメントまたは誘導体はキャリアに連結されている。これは，当業者に知られる任意の化学的相互作用，例えば，配位結合，化学吸着，双極子−双極子相互作用等により生じさせることができる。キャリアが蛋白質である場合，好ましくは，キャリアは，化学結合により，特に共有結合によりＳｍａｃ蛋白質に連結させる。この結合は，細胞膜を浸透する前およびその間に変化を受けず，Ｓｍａｃ蛋白質のＩＡＰとの相互作用に必要な場合には，切断されることができるようなものでなければならない。一般に，Ｓｍａｃ／キャリア構成体は，必要な程度でＩＡＰと相互作用することができ，切断は必要ではない。
【００２１】
本発明の好ましい態様においては，キャリアはＴＡＴまたはその誘導体もしくはフラグメントである。ＴＡＴは８６アミノ酸からなるヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）のトランス活性化蛋白質である。より好ましくは，ＴＡＴのフラグメントまたは誘導体は，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ４５９２１（完全ＨＩＶ配列についてはＭ１５６５４も参照）に開示されるＴＡＴのアミノ酸３７−７２を含む。開示される配列のアミノ酸残基４７から５７に延びる蛋白質の領域を含む，ＴＡＴ（ＰＴＤ）のいわゆる蛋白質伝達ドメインをキャリアとして用いることがさらに好ましい。本発明のこの好ましい態様においては，ＰＴＤをＳｍａｃまたはそのフラグメントもしくは誘導体に連結する。
【００２２】
本発明に開示されるＳｍａｃ／キャリア構成体は，任意に放射線療法および／または少なくとも１つの活性化合物と組み合わせて，医薬品として使用することができる。これは本発明のさらに別の態様である。
【００２３】
まず，“放射線療法”との用語は，新生物の治療において電磁気または粒子の放射を使用することを表す。放射線療法は，標的領域に供給された高用量の照射により腫瘍組織および正常組織の両方において繁殖細胞が死ぬという原理に基づく。放射線照射の照射計画は，一般に，放射線吸収量（ｒａｄ），時間および分割法に関して定義され，腫瘍学専門家が注意深く決定しなければならない。患者が受ける照射の量は，種々の事項によって異なるであろうが，最も重要な２つの事項は，身体の他の重要な構造または組織に対する腫瘍の位置，および，腫瘍が広がっている程度である。放射線療法剤の例は，限定されないが，放射線療法において提供され，当該技術分野において知られている。放射線療法における最近の進歩には，３次元原体外部ビーム照射，強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ），定位放射線手術および近接照射療法（間質放射線療法）が含まれ，後者は，放射線源を移植された“種”として腫瘍内に直接配置する。これらのより新しい治療モダリティーは，腫瘍により高い量の照射を与え，標準的な外部ビーム放射線療法と比較して，より高い有効性を与える。
【００２４】
ベータ放出放射性核種を用いるイオン化照射は，電離粒子（電子）の中程度の線エネルギー付与（ＬＥＴ）および中間の範囲（典型的には組織中で数ミリメートル）のため，放射線治療用途に最も有用であると考えられる。ガンマ線は，低レベルの用量をはるかに遠い距離で運ぶ。アルファ粒子は反対の極端である。これは，非常に高いＬＥＴ用量を運ぶが，非常に限定された範囲を有し，したがって，治療すべき組織の細胞と密接に接触させなければならない。さらに，アルファ放出物質は一般に重金属であり，このことは，可能な化学を制限し，治療すべき領域からの放射性核種の漏出による過度の危険を与える。治療すべき腫瘍に応じて，あらゆる種類のエミッターが本発明の範囲内で考えられるが，本発明の目的にはガンマ線照射が好ましいであろう。さらに，本発明は，種々の非イオン化照射，例えば，紫外線（ＵＶ）照射，高エネルギー可視光，極超短波照射（高熱療法），赤外線（ＩＲ）照射およびレーザーを包含する。
【００２５】
一般に，放射線療法は，以下に挙げられる他の活性化合物と時間的に組み合わせて，治療の結果を改善することができる。放射線療法を他の活性化合物とともに投与することの時間的関係を記述する種々の用語がある。以下の例は，好ましい治療計画であり，当業者に一般に知られているものである。これは，例示のためにのみ提供され，他の組み合わせの使用を制限することを意図するものではない。放射線療法を他の活性化合物とともに投与することは，“逐次的”，すなわち別々の投与を可能とするよう時間的に別々に，“付随的”（同じ日に投与することを表す），および，さらに，“交互に”（他の活性化合物を投与しない日に放射線療法を投与することを表す）でありうる。
【００２６】
"活性化合物"との用語は，Ｓｍａｃ，そのフラグメントまたは誘導体以外の，アポトーシスを誘導しうるかまたは細胞増殖を阻害しうる化合物を表す。
【００２７】
アポトーシスを誘導しうる活性化合物は当業者に知られている。活性化合物の１つの群は，細胞成長抑制効果または抗新生物効果を有する化学化合物（"細胞成長抑制性化合物"）である。本発明に含まれる細胞成長抑制性化合物としては，限定されないが，（ｉ）抗代謝剤，例えば，シタラビン，フルダラビン，５−フルオロ−２’−デオキシウリジン，ゲムシタビン，ヒドロキシウレアまたはメトトレキセート；（ｉｉ）ＤＮＡ−フラグメント化剤，例えば，ブレオマイシン，（ｉｉｉ）ＤＮＡ架橋剤，例えば，クロラムブシル，シスプラチン，シクロホスファミドまたはナイトロジェンマスタード；（ｉｖ）インターカレート剤，例えば，アドリアマイシン（ドキソルビシン）またはミトキサントロン；（ｖ）蛋白質合成阻害剤，例えば，Ｌ−アスパラギナーゼ，シクロヘキシミド，ピューロマイシンまたはジフテリアトキシン；（ｖｉ）トポイソメラーゼＩ毒素，例えば，カンプトテシンまたはトポテカン；（ｖｉｉ）トポイソメラーゼＩＩ毒素，例えば，エトポシド（ＶＰ−１６）またはテニポシド；（ｖｉｉｉ）微小管指向性薬剤，例えば，コルセミド，コルチシン，パクリタキセル，ビンブラスチンまたはビンクリスチン；（ｉｘ）キナーゼ阻害剤，例えば，フラボピリドール，スタウロスポリン，ＳＴＩ５７１（ＣＰＧ５７１４８Ｂ）またはＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）；（ｘ）その他の研究用試薬，例えば，ＰＳ−３４１，フェニルブチレート，ＥＴ−１８−ＯＣＨ3，またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ−７３９７４９，Ｌ−７４４８３２）；ポリフェノール，例えば，ケルセチン，レスベラトロール，ピセアタンノール，没食子酸エピガロカテキン，テアフラビン，フラバノール，プロシアニジン，ベツリン酸およびその誘導体；（ｘｉ）ホルモン，例えば，グルココルチコイドまたはフェンレチニド；（ｘｉｉ）ホルモンアンタゴニスト，例えば，タモキシフェン，フィナステリドまたはＬＨＲＨアンタゴニストが挙げられる。
【００２８】
本発明に含まれる他の細胞成長抑制性化合物としては，植物由来細胞成長抑制剤（Ｖｉｓｃｕｍ由来，およびその誘導体）；アルカロイド，例えばビンデシン；ポドフィロトキシン，例えばビノレルビン；アルキル化剤，例えば，ニムストリン，カルムストリン，ロムスチン，エストラムストリン，メルファラム，イフォスファミド，トロフォスファミド，ベンダムスチン，ダカルバジン，ブスルファン，プロカルバジン，トレオスルファン，トレモゾールアミド，チオテパ；細胞障害性抗生物質，例えば，アクラルビシン，ダウノルビシン，エピルビシン，イダルビシン，マイトマイシン，ダクチノマイシン；葉酸類似体等の抗代謝剤，例えば，メトトレキセート，プリン類似体，例えば，クラドリビン，メルカプトプリン，チオグアニン，およびピリミジン類似体，例えば，シタラビン，フルオロウラシル，ドセタキセル；白金化合物，例えば，チオプラチン，カルボプラチン，オキザリプラチン；アムサクリン，イリノテカン，インターフェロン−α，トレチノイン，ヒドロキシカルバミド，ミルテフォシン，ペントスタチン，アルデスロイキン；臓器に由来する抗新生物化合物，例えば，モノクローナル抗体，例えば，トラスツズマブ，リツキシマブ，または酵素に由来する抗新生物化合物，例えばペガスパルガーゼ；ホルモンに属する内分泌影響性抗新生物化合物，例えば，エストロゲン，例えば，ポリエストラジオール，フォスフェストリオール，エチニルエストラジオール，ゲスタゲン，例えば，メドロキシプロゲステロン，ゲストノロンカプロート，メゲストロール，ノレチステロン，リネストレノール，視床下部ホルモン，例えば，トリプトレリン，ロイプロレリン，ブセレリン，ゴセレリン，他のホルモン，例えば，テストラクトン，テストステロン；ホルモンアンタゴニストに属する内分泌影響性抗新生物化合物，例えば，抗エストロゲン剤，例えば，トレミフェン；抗アンドロゲン剤，例えば，フルタミド，ビカルタミド，シプロテラン；酵素阻害剤に属する内分泌影響性抗新生物化合物，例えば，アナストロール，エキセメスタン，レトロゾール，フォルメスタン，アミノグルテチミドが挙げられ，これらはすべて場合によりいわゆる保護剤，例えば，カルシウムフォリナト，アミフォスチン，レノグラスチン，モルグロモスチン，フィルグラスチン，メスナ，またはいわゆる添加剤，例えば，レチノパルミトレート，サイマスＤ９，アミロマーとともに投与することができる。
【００２９】
本発明において用いることができる別の群の活性化合物は，デスレセプターに結合することによりアポトーシスを誘導しうる化合物（"デスレセプターリガンド"）である。これらには，腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α)，腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β，リンホトキシン−α），ＬＴ−β（リンホトキシン−β），ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌ），ＣＤ９５（Ｆａｓ，ＡＰＯ−１）リガンド，ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３，Ａｐｏ−３）リガンド，ＤＲ４リガンド，ＤＲ６リガンド，ならびに前記リガンドのいずれかのフラグメントおよび誘導体が含まれる。好ましくは，デスレセプターリガンドは，ＴＮＦ−α，そのフラグメントまたは誘導体，およびＴＲＡＩＬ，そのフラグメントおよび誘導体からなる群より選択される。
【００３０】
他の活性化合物には，デスレセプターに対するアゴニスト性抗体，例えば，抗ＣＤ９５抗体，抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）抗体，抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）抗体，抗ＤＲ６抗体，抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体および抗ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３）抗体，ならびに前記抗体のいずれかのフラグメントおよび誘導体が含まれる。好ましくは，アゴニスト性抗体は，抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体，抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体，抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体および前記抗体のいずれかのフラグメントおよび誘導体からなる群より選択される。
【００３１】
本発明の好ましいＳｍａｃ／キャリア構成体は，ＰＴＤと結合させたＳｍａｃペプチドであり，これは以下Ｓｍａｃペプチド／ＰＴＤと称される。
【００３２】
本発明においては，Ｓｍａｃ／キャリア構成体と組み合わせて用いられる細胞成長抑制性化合物は，好ましくは，ドキソルビシン，シスプラチンおよびエトポシド（ＶＰ−１６）からなる群より選択される。Ｓｍａｃ／キャリア構成体と組み合わせて用いられる本発明のさらに別の好ましい活性化合物は，ＴＲＡＩＬ，抗ＣＤ９５抗体および前記アゴニストのいずれかの誘導体およびフラグメントからなるデスレセプターアゴニストの群より選択される。
【００３３】
Ｓｍａｃ／キャリア構成体は，単独でまたは１またはそれ以上の活性化合物との組み合わせで投与することができる。後者は，Ｓｍａｃ／キャリア構成体の投与の前，後または同時に投与することができる。Ｓｍａｃ／キャリア構成体または活性化合物のいずれかの投与量，ならびにインキュベーションの期間および温度は様々であることができ，治療すべき標的によって異なる。
【００３４】
本発明のさらに別の目的は，有効量の少なくとも１つのＳｍａｃ／キャリア構成体および／または少なくとも１つの活性化合物および薬学的に許容しうるキャリア，すなわち，１またはそれ以上の薬学的に許容しうるキャリア物質および／または添加剤を含む医薬製剤である。
【００３５】
本発明にしたがう医薬品は，例えば，丸薬，錠剤，ラッカー錠，糖衣錠，顆粒，硬質および軟質ゼラチンカプセル，水性，アルコール性または油性の溶液，シロップ，乳濁液または懸濁液の形で経口的に，または，例えば，坐剤の形で直腸に投与することができる。投与はまた，注射または注入用溶液の形で，非経口的に，例えば，皮下，筋肉内または静脈内に行うことができる。他の適当な投与形態としては，例えば，経皮または局所投与，例えば，軟膏，チンキ剤，スプレーまたは経皮治療系の形で，または鼻中スプレーまたはエアロゾル混合物の形での吸入投与，または，例えば，マイクロカプセル，インプラントまたはロッドの形が挙げられる。好ましい投与形態は，例えば，治療すべき疾病およびその重篤度によって異なる。
【００３６】
医薬品組成物の製造は，それ自体知られる方法により行うことができる。この目的のために，Ｓｍａｃ／キャリア構成体および／または活性化合物を，１またはそれ以上の固体または液体医薬品キャリア物質および／または添加剤（または補助物質）とともに，所望の場合には治療または予防作用を有する他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて，適当な投与形態または用量形態とし，次にこれをヒトにおける医薬品または獣医薬として使用することができる。
【００３７】
丸薬，錠剤，糖衣錠および硬ゼラチンカプセルを製造するためには，例えば，ラクトース，澱粉，例えばトウモロコシ澱粉または澱粉誘導体，タルク，ステアリン酸またはその塩等を用いることができる。軟ゼラチンカプセルおよび坐剤用のキャリアは，例えば，脂肪，ワックス，半固体および液体のポリオール，天然のまたは硬化油等である。溶液，例えば注射溶液，またはエマルジョンまたはシロップを製造するための適当なキャリアとしては，水，生理学的塩化ナトリウム溶液，エタノール等のアルコール，グリセロール，ポリオール，ショ糖，転化糖，グルコース，マンニトール，植物油等が挙げられる。Ｓｍａｃ／キャリア構成体および／または活性化合物を凍結乾燥し，得られた凍結乾燥物を用いて，例えば，注射または注入用の製剤を製造することも可能である。マイクロカプセル，移植またはロッド用の適当なキャリアは，例えば，グリコール酸と乳酸とのコポリマーである。
【００３８】
医薬品製剤はまた，添加物，例えば，充填剤，崩壊剤，結合剤，潤滑剤，湿潤剤，安定剤，乳化剤，分散剤，保存剤，甘味料，着色料，香味料，芳香剤，増粘剤，希釈剤，緩衝物質，溶媒，溶解剤，デポ効果を得るための試薬，浸透圧を変化させるための塩，コーティング剤または抗酸化剤を含んでいてもよい。
【００３９】
投与すべき１またはそれ以上の活性化合物との組み合わせにおけるＳｍａｃ／キャリア構成体の投与量は，個々の症例により異なり，慣用のように最適な効果を達成するために個々の状況に適合させる。すなわち，これは，治療すべき疾患の性質および重篤度により異なり，また，性別，年齢，体重および治療すべきヒトまたは動物の個々の応答性，用いる化合物の作用の効力および持続性，療法が急性であるか慢性であるか予防的であるか，またはＳｍａｃ／キャリア構成体に加えて他の活性化合物を投与するか否かによっても異なる。
【００４０】
本発明にしたがうＳｍａｃ／キャリア構成体，これらを含む医薬は，ＩＡＰの発現のためにアポトーシスに対して耐性であるすべてのタイプの癌の治療に用いることができる。そのような癌のタイプの例には，神経芽細胞腫，腸の癌，例えば，直腸癌，結腸癌，家族性腺腫様ポリポーシス癌および遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌，食道癌，口唇癌，喉頭癌，下咽頭癌，舌癌，唾液腺癌，胃癌，腺癌，髄質甲状腺癌，乳糖甲状腺癌，腎臓癌，腎臓実質癌，卵巣癌，子宮頸癌，子宮体癌，子宮内膜癌，絨毛膜癌，膵臓癌，前立腺癌，精巣癌，乳癌，子宮癌，黒色腫，脳腫瘍，例えば，神経膠芽細胞腫，星状細胞腫，髄膜腫，髄芽細胞腫および末梢神経外胚葉腫瘍，ホジキンリンパ腫，非ホジキンリンパ腫，バーキットリンパ腫，急性リンパ性白血病（ＡＬＬ），慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ），急性骨髄性白血病（ＡＭＬ），慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ），成人Ｔ細胞白血病リンパ腫，肝細胞癌，胆嚢癌，気管支癌，小細胞肺癌，非小細胞肺癌，多発性骨髄腫，基底細胞腫，奇形腫，網膜芽細胞腫，脈絡膜黒色腫，セミノーマ，横紋筋肉腫，頭蓋咽頭腫，骨肉腫，軟骨肉腫，筋肉腫，脂肪肉腫，線維肉腫，ユーイング肉腫および形質細胞腫が含まれる。
【００４１】
本発明にしたがうＳｍａｃ／キャリア構成体，これを含む医薬の使用が特に有益である癌のタイプの例としては，神経芽細胞腫，神経膠芽細胞腫，乳癌，黒色腫，前立腺癌，膵臓癌，肝細胞癌，結腸癌，小細胞および非小細胞肺癌が挙げられる。
【００４２】
本発明にしたがうＳｍａｃ／キャリア構成体，これを含む医薬は，さらに，ＩＡＰまたはＢｃｌ−２ファミリーのメンバーの発現のためにアポトーシスに対して耐性であるすべての自己免疫疾患の治療のために用いることができる。そのような自己免疫疾患の例は，コラーゲン疾患，例えば，慢性関節リウマチ，播種性紅斑性狼瘡，シャープ症候群，ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症，レイノー症候群，食道運動障害，末端血管拡張症），皮膚筋炎，脈管炎（ヴェーゲナー病）およびシェーグレン症候群，腎臓疾患，例えば，グッドパスチャー症候群，急速進行性糸球体腎炎およびＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎，内分泌疾患，例えばＩ型糖尿病，自己免疫多発性内分泌腺症−カンジダ症−外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ），自己免疫上皮小体欠損症，悪性貧血，性腺機能不全，突発性アジソン病，甲状腺機能亢進症，ハシモト甲状腺炎および原発性粘液水腫，皮膚疾患，例えば，尋常性天疱瘡，水疱性類天疱瘡，妊娠性疱疹，表皮水疱症および水痘型多型紅斑症，肝疾患，例えば，原発性胆汁性肝硬変，自己免疫胆管炎，自己免疫１型肝炎，自己免疫２型肝炎，原発性硬化性胆管炎，神経疾患，例えば，多発性硬化症，重症筋無力症，筋無力性ランバート−イートン症候群，後天性神経筋緊張，ギヤン−バレー症候群（ミュラー−フィッシャー症候群），スティッフマン症候群，小脳変性，運動失調，眼球クローヌス，感覚器ニューロパシーおよびアカラシア，血液疾患，例えば，自己免疫溶血性貧血，特発性血小板減少性紫斑病（ヴェルルホフ病），自己免疫反応を伴う感染性疾患，例えば，ＡＩＤＳ，マラリアおよびシャーガス病である。
【００４３】
本発明のさらに別の態様においては，細胞におけるＳｍａｃの過剰発現と組み合わせて活性化合物を投与することにより，神経芽細胞腫および神経膠芽細胞腫細胞または免疫系の自己反応性細胞を治療する。過剰発現は，当業者に知られる方法により，好ましくはＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ２６２２４０に開示される全長Ｓｍａｃ遺伝子またはその誘導体またはフラグメントを有する発現プラスミドで細胞をトランスフェクトすることにより，行うことができる。
【００４４】
上述の治療において用いることができる活性化合物としては，細胞成長抑制性化合物の群，例えば抗代謝剤，例えば，シタラビン，フルダラビン，５−フルオロ−２’−デオキシウリジン，ゲムシタビン，ヒドロキシウレアまたはメトトレキセート；ＤＮＡフラグメント化剤，例えば，ブレオマイシン，ＤＮＡ架橋剤，例えば，クロラムブシル，シスプラチン，シクロホスファミドまたはナイトロジェンマスタード；インターカレート剤，例えば，アドリアマイシン（ドキソルビシン）またはミトキサントロン；蛋白質合成阻害剤，例えば，Ｌ−アスパラギナーゼ，シクロヘキシミド，ピューロマイシンまたはジフテリアトキシン；トポイソメラーゼＩ毒素，例えば，カンプトテシンまたはトポテカン；トポイソメラーゼＩＩ毒素，例えば，エトポシド（ＶＰ−１６）またはテニポシド；微小管指向性薬剤，例えば，コルセミド，コルチシン，パクリタキセル，ビンブラスチンまたはビンクリスチン；キナーゼ阻害剤，例えば，フラボピリドール，スタウロスポリン，ＳＴＩ５７１（ＣＰＧ５７１４８Ｂ）またはＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）；その他研究用試薬，例えば，ＰＳ−３４１，フェニルブチレート，ＥＴ−１８−ＯＣＨ3，またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ−７３９７４９，Ｌ−７４４８３２）；ポリフェノール，例えば，ケルセチン，レスベラトロール，ピセアタンノール，没食子酸エピガロカテキン，テアフラビン，フラバノール，プロシアニジン，ベツリン酸およびこれらの誘導体；ホルモン，例えば，グルココルチコイドまたはフェンレチニド；ホルモンアンタゴニスト，例えば，タモキシフェン，フィナステリドまたはＬＨＲＨアンタゴニスト；植物由来細胞成長抑制剤（Ｖｉｓｃｕｍ由来，およびその誘導体）；アルカロイド，例えば，ビンデシン；ポドフィロトキシン，例えば，ビノレルビン；アルキル化剤，例えば，ニムストリン，カルムストリン，ロムスチン，エストラムストリン，メルファラム，イフォスファミド，トロフォスファミド，ベンダムスチン，ダカルバジン，ブスルファン，プロカルバジン，トレオスルファン，トレモゾールアミド，チオテパ；細胞障害性抗生物質，例えば，アクラルビシン，ダウノルビシン，エピルビシン，イダルビシン，マイトマイシン，ダクチノマイシン；葉酸類似体等の抗代謝剤，例えばメトトレキセート，プリン類似体，例えば，クラドリビン，メルカプトプリン，チオグアニンおよびピリミジン類似体，例えば，シタラビン，フルオロウラシル，ドセタキセル；他の抗新生物，白金化合物，例えば，チオプラチン，カルボプラチン，オキザリプラチン；アムサクリン，イリノテカン，インターフェロン−α，トレチノイン，ヒドロキシカルバミド，ミルテフォシン，ペントスタチン，アルデスロイキン；臓器に由来する抗新生物化合物，例えば，トラスツズマブ，リツキシマブ等のモノクローナル抗体，またはペガスパルガーゼ等の酵素に由来する抗新生物化合物；ホルモンに属する内分泌影響性抗新生物化合物，例えば，エストロゲン，例えば，ポリエストラジオール，フォスフェストリオール，エチニルエストラジオール，ゲスタゲン，例えば，メドロキシプロゲステロン，ゲストノロンカプロート，メゲストロール，ノレチステロン，リネストレノール，視床下部ホルモン，例えば，トリプトレリン，ロイプロレリン，ブセレリン，ゴセレリン，他のホルモン，例えば，テストラクトン，テストステロン；ホルモンアンタゴニストに属する内分泌影響性抗新生物化合物，例えば，抗エストロゲン剤，例えば，トレミフェン；抗アンドロゲン剤，例えば，フルタミド，ビカルタミド，シプロテラン；酵素阻害剤に属する内分泌影響性抗新生物化合物，例えば，アナストロール，エキセメスタン，レトロゾール，フォルメスタン，アミノグルテチミドが挙げられ，これらはすべて場合によりいわゆる保護剤，例えば，カルシウムフォリナト，アミフォスチン，レノグラスチン，モルグロモスチン，フィルグラスチン，メスナまたはいわゆる添加剤，例えば，レチノパルミトレート，サイマスＤ９，アミロマーとともに投与することができる。
【００４５】
好ましい活性化合物は，シスプラチン，ドキソルビシン，およびＶＰ−１６からなる群より選択される。
【００４６】
Ｓｍａｃを過剰発現する腫瘍細胞および免疫系の自己反応性細胞の治療に用いることができる他の活性化合物には，デスレセプターリガンド，例えば，腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α)，腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β，リンホトキシン−α），ＬＴ−β（リンホトキシン−β），ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌ），ＣＤ９５（Ｆａｓ，ＡＰＯ−１）リガンド，ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３，Ａｐｏ−３）リガンド，ＤＲ４リガンド，ＤＲ６リガンド，ならびに前記リガンドのいずれかのフラグメントおよび誘導体が含まれる。好ましくは，デスレセプターリガンドは，ＴＮＦ−α，そのフラグメントまたは誘導体，およびＴＲＡＩＬ，そのフラグメントおよび誘導体からなる群より選択される。
【００４７】
Ｓｍａｃを過剰発現する腫瘍細胞を治療するためには，デスレセプターに対するアゴニスト性抗体，例えば，抗ＣＤ９５抗体，抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）抗体，抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）抗体，抗ＤＲ６抗体，抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体および抗ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３）抗体，ならびに前記抗体のいずれかのフラグメントおよび誘導体も用いることができる。好ましくは，アゴニスト性抗体は，抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体，抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体，抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体および前記抗体のいずれかのフラグメントおよび誘導体からなる群より選択される。
【００４８】
Ｓｍａｃ遺伝子の誘導体またはフラグメントとの用語は，ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ２６２２４０に開示される１３５８ヌクレオチドのコーディング配列の１またはそれ以上のヌクレオチドが，元のヌクレオチドと異なる１またはそれ以上のヌクレオチドで置き換えられていてもよいＤＮＡ配列，またはそのヌクレオチド配列が５’末端または３’末端または両方の末端で延長されているか短縮されているかまたはその両方であるＳｍａｃＤＮＡ配列を表し，ただし，コードされるＳｍａｃ蛋白質の機能は影響を受けない。
【００４９】
本発明において腫瘍細胞中で過剰発現させるべきＳｍａｃ遺伝子の好ましいフラグメントには，開示されるコーディング配列の，いわゆるミトコンドリアターゲティング配列（対応するＳｍａｃ蛋白質のアミノ酸１−５５）をコードするヌクレオチド２０−１８４が欠失しており，このためＳｍａｃの作用の好ましい部位であるサイトゾルにおいて直接Ｓｍａｃの過剰発現が可能であるＳｍａｃ  ｃＤＮＡが含まれる。
【００５０】
上述したように，処置すべき細胞におけるＳｍａｃの過剰発現と組み合わせて活性化合物を投与することにより，神経芽細胞腫および神経膠芽細胞腫および関連するタイプの癌，例えば，結腸癌，肝細胞癌または小細胞および非小細胞肺癌を首尾良く治療することができる。すなわち，本発明のさらに別の目的は，少なくとも１つの上述の活性化合物，およびＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ２６２２４０に開示される全長Ｓｍａｃ遺伝子またはこれらの誘導体またはフラグメントを有する発現プラスミドを含むキットである。前記キットは，神経芽細胞腫，神経膠芽細胞腫および関連する癌の治療において医薬として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
図面の説明
図１は，ミトコンドリアまたはサイトゾルＳｍａｃの過剰発現がガンマ線照射誘導性アポトーシスに及ぼす影響を示す。ベクター対照（Ａ；白棒），ミトコンドリアＳｍａｃ（Ｂ；斜線棒）またはサイトゾルＳｍａｃ（Ｃ；黒棒）でトランスフェクトしたＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞を０．３−１０Ｇｙのガンマ線照射により処理した。アポトーシスは，１０日後にヨウ化プロピジウム染色ＤＮＡのＦＡＣＳ分析により判定した。代表的な実験の３回の実験の平均および標準偏差を示す。Ｘ軸は照射線量（Ｇｙ）を示し，Ｙ軸はアポトーシスのパーセンテージ（％）を示す。
【００５２】
実施例
Ｓｍａｃの過剰発現はデスレセプターまたは薬剤誘導性アポトーシスに対する感受性を高める
全長Ｓｍａｃコンストラクトを用いて，種々のプロアポトーシス刺激に対して中間の感受性を示すＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞をトランスフェクトした。次に，高レベルのＳｍａｃを過剰発現するクローン＃２８を用いて代表的な実験を行った。Ｓｍａｃの過剰発現は，用量および時間依存的様式で，ベクター対照細胞と比較してＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを強化し，抗ＣＤ９５抗体または細胞障害性薬剤により誘導されるアポトーシスを顕著に増加させた。Ｓｍａｃの過剰発現はデスレセプターおよび薬剤誘導性アポトーシスの両方を増強したため，Ｓｍａｃは，これらの２つの経路が集まる共通の点で，例えば，カスパーゼのポストミトコンドリア活性化のレベルで作用する。
【００５３】
Ｓｍａｃは，ＸＩＡＰの作用と拮抗することによりアポトーシスに対する感受性を高める
Ｓｍａｃのアポトーシス促進効果が顕著なカスパーゼ阻害剤であるＸＩＡＰの作用と拮抗することにより生ずるか否かを調べた。Ｓｍａｃでトランスフェクトした細胞においては，ベクター対照細胞と比較して，ＴＲＡＩＬで処理するとミトコンドリアからサイトゾルへのＳｍａｃの放出が増強された。Ｆｌａｇタグ付きＳｍａｃの免疫沈殿は，ＴＲＡＩＬで処理するとＳｍａｃがＸＩＡＰに結合したことを示した。また，内因性ＸＩＡＰの免疫沈殿は，Ｓｍａｃでトランスフェクトした細胞においては，ベクター対照細胞と比較して，ＴＲＡＩＬ処理によりＳｍａｃのＸＩＡＰへの結合が増強され，その結果ＸＩＡＰのカスパーゼ−９からの完全な解離が生じたことを明らかにした。さらに，Ｓｍａｃの過剰発現は，ＴＲＡＩＬまたはドキソルビシンで処理したとき，カスパーゼ−８，−９，−３の活性化，カスパーゼ基質であるＰＡＲＰおよびＤＦＦ４５の切断，およびＢｉｄおよびＸＩＡＰの切断を増強した。これらの知見は，Ｓｍａｃの過剰発現が，カスパーゼカスケード中の遠位および近位の両方の事象のＸＩＡＰの阻害と拮抗することにより，アポトーシスを促進したことを示す。
【００５４】
サイトゾルＳｍａｃはＢｃｌ−２阻害をバイパスする
Ｂｃｌ−２はミトコンドリアからのＳｍａｃの放出を防止することができるため，Ｂｃｌ−２でトランスフェクトしたＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞においてＳｍａｃの機能を分析した。Ｂｃｌ−２の過剰発現は，ＴＲＡＩＬで処理したときに，ミトコンドリアからのＳｍａｃおよびチトクロームｃの放出を防止した。また，Ｂｃｌ−２はカスパーゼ−３の活性フラグメントへの活性化およびカスパーゼ−３の基質であるＰＡＲＰおよびＤＦＦ４５の切断を阻害した。しかし，興味深いことに，Ｂｃｌ−２は，カスパーゼ−３のｐ２４中間体フラグメントへの最初の切断またはカスパーゼ−８の切断を減少させたが防止せず，このことは，例えばＸＩＡＰによるポストミトコンドリアレベルでのブロックと一致した。ミトコンドリアターゲティング配列を有しないサイトゾルＳｍａｃがＢｃｌ−２ブロックをバイパスしうるか否かを調べた。ＧＦＰタグ付きＳｍａｃのサイトゾルにおける異所性発現は，蛍光顕微鏡により管理した。重要なことに，サイトゾルＳｍａｃの異所性発現は，Ｂｃｌ−２を過剰発現しているＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞のアポトーシス誘導に対する感受性を高めた。また，サイトゾルＳｍａｃはさらに，ＳＨＥＰベクター対照細胞において処理誘導性アポトーシスを増強し，このことは，これらの細胞におけるＸＩＡＰ発現が高いことと一致する。サイトゾルＳｍａｃの発現はそれ自体細胞障害性効果を示さなかった。このことは，ＳｍａｃによるＩＡＰ阻害からの解放は，アポトーシス誘導の際にのみ関連するようになることを示す。Ｂｃｌ−２を過剰発現している別の細胞株を用いて研究をさらに拡張した。サイトゾルＳｍａｃの異所性発現は，ＴＲＡＩＬ，抗ＣＤ９５抗体またはドキソルビシンを用いる処理に対して，Ｂｃｌ−２でトランスフェクトした神経膠芽細胞腫（Ｕ８７ＭＧ／Ｂｃｌ−２，ＬＮ１８／Ｂｃｌ−２，ＬＮ２２９／Ｂｃｌ−２）および乳癌（ＭＣＦ７／Ｂｃｌ−２）細胞の感受性を高めた。すなわち，サイトゾルＳｍａｃは，いくつかのタイプの細胞において，かつ異なるプロアポトーシス刺激に応答して，Ｂｃｌ−２阻害をバイパスするのかもしれない。
【００５５】
さらに，ミトコンドリアまたはサイトゾルＳｍａｃの過剰発現は，ガンマ線照射誘導性アポトーシスに対する神経芽細胞腫細胞の感受性を高めた（図面を参照）。このことは，Ｓｍａｃアゴニスト，例えばＳｍａｃペプチドは，放射線照射と組み合わせて，放射線治療の効果を増強するために用いることができることを示した。
【００５６】
Ｓｍａｃペプチドは，デスレセプターまたは薬剤誘導性アポトーシスに対する耐性腫瘍細胞の感受性を高める
ＸＩＡＰの不活性化に，したがってアポトーシス誘導に必須であるＳｍａｃのＮ末端の４残基およびこれに続く３残基を，ＴＡＴ蛋白質の蛋白質伝達ドメインに連結して，細胞内デリバリーを容易にした（Ｓｍａｃペプチド／ＰＴＤ）。Ｓｍａｃペプチドの細胞への取り込みは，フローサイトメトリおよび蛍光顕微鏡により管理した。Ｓｍａｃペプチドは，ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを顕著に増強し，抗ＣＤ９５抗体または細胞障害性薬剤による処理に対する感受性を高めた。さらに，Ｓｍａｃペプチドは，アポトーシスシグナリングに欠陥のあるいくつかの耐性細胞株，例えば，Ｂｃｌ−２が過剰発現している神経芽細胞腫細胞（ＳＨＥＰ／Ｂｃｌ−２），カスパーゼ−８発現が欠失した神経芽細胞腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ），Ａｐａｆ−１発現に欠陥のある黒色腫細胞（Ｍｅｌ−ＨＯ）またはＲａｓ／ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔシグナリング（Ｐａｎｃ−１）に欠陥のある膵臓癌細胞の，ＴＲＡＩＬまたはドキソルビシンによる処理に対する感受性を高めた。
【００５７】
この知見が長期培養で維持された細胞株に限定されることを除くために，神経芽細胞腫を有し腫瘍が再発して不応疾病となった患者の悪性胸水に由来する初代腫瘍細胞を調べた。重要なことには，Ｓｍａｃペプチドは，これらの患者に由来する高レベルのＸＩＡＰおよびＢｃｌ−２を有する耐性神経芽細胞腫細胞の，エクスビボでＴＲＡＩＬまたは抗癌剤により誘導したアポトーシスに対する感受性を高めた。
【００５８】
Ｓｍａｃペプチドはインビボで神経膠芽細胞腫におけるＴＲＡＩＬの抗腫瘍効果を増強し，腫瘍の根絶を誘導する
インビボで神経膠芽細胞腫腫瘍モデルにおいてＳｍａｃの効果を調べた。神経膠腫細胞を無胸腺マウスの右線条体に移植し，腫瘍接種後第７日および第９日にＳｍａｃペプチドおよび／またはＴＲＡＩＬを局所的に投与した。重要なことには，Ｓｍａｃペプチドは，ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対して神経膠芽細胞腫細胞の感受性を顕著に高めたが，Ｓｍａｃペプチドのみを用いる処置は抗腫瘍効果を示さなかった。予め確立した神経膠芽細胞腫腫瘍の完全な根絶は，ＳｍａｃペプチドとＴＲＡＩＬとの組み合わせで処置したマウスにおいてのみ，３３％（２／６）または５０％（３／６）の腫瘍で見られた。ＳｍａｃペプチドとＴＲＡＩＬとの組み合わせ投与は，化合物の神経学的スコアにより評価して，急性または遅延型の神経毒性を示さなかったが，ＴＲＡＩＬのみで処置した６匹のマウスのうち２匹は神経学的欠損を発症し，このことは，ＳｍａｃペプチドとＴＲＡＩＬとの組み合わせが神経学的帰結をも改善しうることを示す。
【００５９】
材料および方法
細胞培養
神経芽細胞腫（ＳＨＥＰ，ＳＨ−ＳＹ５Ｙ），神経膠芽細胞腫（Ｕ８７ＭＧ，ＬＮ１８，ＬＮ２２９），Ｐａｎｃ−１膵臓癌またはＭＣＦ−７乳癌は，先に記載されるように，ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で維持した。０．５ｘ１０5細胞／ｍｌを，アポトーシスの判定用には２４ウエルプレートで，蛋白質単離用には７５ｃｍ2フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で培養した。
【００６０】
アポトーシスの判定
細胞を，組換えヒトＴＲＡＩＬ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ），シスプラチン（Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ドキソルビシン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ＶＰ−１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）または抗ＣＤ９５（ＡＰＯ１）モノクローナル抗体とともにインキュベートした。アミノ酸５６−６２に対応するＳｍａｃペプチドを，Ｔａｔ蛋白質の蛋白質伝達ドメイン（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ  ＧｍｂＨ，Ｕｌｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に連結させた。細胞取り込みの評価のためには，ＦＩＴＣ標識ペプチドを用いた。ＤＮＡフラグメント化の定量は，先に記載されるように，ヨウ化プロピジウム染色核の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析により行った。
【００６１】
ウエスタンブロット分析および免疫沈殿
ウエスタンブロット分析および免疫沈殿は，先に記載されるように，マウス抗カスパーゼ−８モノクローナル抗体Ｃ１５（ハイブリドーマ上清の１：１０希釈），マウス抗カスパーゼ−３モノクローナル抗体（１：１０００，Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ），ウサギ抗カスパーゼ−９ポリクローナル抗体（１：１０００，Ｐｈａｒ  Ｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），マウス抗ＸＩＡＰモノクローナル抗体（１：１０００，Ｈ６２１２０，Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），マウス抗ＤＦＦ４５モノクローナル抗体（１：１０００，Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ウサギ抗ＡＩＦポリクローナル抗体（１：５０００，Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒより贈与），ウサギ抗Ｓｍａｃポリクローナル抗体（１：５０００，Ｘ．Ｗａｎｇより贈与），マウス抗ＣＯＸ４モノクローナル抗体（１：１０００，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ），マウス抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体（１：１０００，Ｓｉｇｍａ）またはマウス抗β−アクチンモノクローナル抗体（１：５０００，Ｓｉｇｍａ）を用いて，次にヤギ抗マウスＩｇＧまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５０００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて行った。検出には増強化学発光（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた。β−アクチンの発現を等量のゲル負荷の対照として用いた。
【００６２】
トランスフェクション実験
ＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞は，リポフェクタミントランスフェクション試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて，全長Ｓｍａｃ  ｃＤＮＡを含む発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１ベクターまたは空のベクターでトランスフェクトし，０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で培養した。遺伝子ポータートランスフェクション試薬を用いて，ＧＦＰタグ付きＳｍａｃを含みミトコンドリア標的配列（アミノ酸１−５５）（２６）を含まないｐＥＧＦＰＣ１ベクターによる過渡的トランスフェクションを行った。
【００６３】
ミトコンドリアまたはサイトゾル抽出物の調製
ミトコンドリアまたはサイトゾル抽出物の調製は，ＡｐｏＡｌｅｒｔ細胞分画キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて，製造元の指針にしたがって行った。
【００６４】
動物実験
５ｘ１０4個のＵ８７ＭＧヒト神経膠芽細胞腫細胞を，無胸腺マウス（ＣＤ１  ｎｕ／ｎｕ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の右線条体に定位的に移植した。第７日または第７日および第９日に，マウスをＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（２μｇ／４μｌ緩衝液）および／またはＳｍａｃ（１ｍｇ／４μｌ緩衝液）または緩衝液のみで局所的に処置した。腫瘍細胞移植後第２１日または第３５日に，先に記載されるようにして腫瘍細胞体積を測定した。神経学的症候（覚醒，挙動，体重減少，限局性神経学的欠損）を毎日評価し，すべてのカテゴリーの化合物スコアを作成した（＋＋：重篤な欠損，＋：欠損，−：関連する欠損なし）。統計学的有意性はＡＮＯＶＡを用いて評価した。
【００６５】
放射線照射実験
ベクター対照（図面の白棒），ミトコンドリアＳｍａｃ（斜線棒）またはサイトゾルＳｍａｃ（黒棒）でトランスフェクトしたＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞を，０．３−１０Ｇｙのガンマ線照射により処理した。アポトーシスは，１０日後にヨウ化プロピジウム染色ＤＮＡのＦＡＣＳ分析により判定した。代表的な実験の３回の実験の平均および標準偏差を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は，ミトコンドリアまたはサイトゾルＳｍａｃの過剰発現がガンマ線照射誘導性アポトーシスに及ぼす影響を示す。
【図１】
2005536457.tif 000002
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月16日(2004.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＦ８７７１６に開示されるＳｍａｃ蛋白質，またはその誘導体またはフラグメント，および
（ｉｉ）キャリア
を含むＳｍａｃ蛋白質／キャリア構成体であって，
Ｓｍａｃ蛋白質，そのフラグメントまたは誘導体およびキャリアは，Ｓｍａｃ／キャリア構成体が細胞膜を通って細胞内に浸透することができるように一緒に連結されており，
キャリアは化学結合によりＳｍａｃ蛋白質に連結されており，および前記キャリアは，ＴＡＴ，インフルエンザウイルスヘマグルチニン，ヘルペス単純ウイルスのＶＰ２２蛋白質，アンテナペディア，線維芽細胞成長因子，ガルパラン（トランスポータン），ポリ−アルギニン，およびＰｅｐ−１，およびこれらのフラグメントおよび誘導体からなる群より選択されることを特徴とする構成体。
【請求項２】
前記蛋白質がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ４５９２１に開示されるＴＡＴ蛋白質またはそのフラグメントまたは誘導体である，請求項１記載の構成体。
【請求項３】
ＴＡＴ蛋白質のフラグメントまたは誘導体がＴＡＴのアミノ酸３７−７２を含む，請求項１または２に記載の構成体。
【請求項４】
前記キャリアがＴＡＴのアミノ酸４７−５７を含むＴＡＴの蛋白質伝達ドメインである，請求項１−３のいずれかに記載の構成体。
【請求項５】
Ｓｍａｃのフラグメントまたは誘導体がアミノ酸配列５６−７０を含むペプチドである，請求項１−４のいずれかに記載の構成体。
【請求項６】
Ｓｍａｃのフラグメントまたは誘導体がＳｍａｃのアミノ酸５６−６２を含むペプチドである，請求項１−５のいずれかに記載の構成体。
【請求項７】
Ｓｍａｃのフラグメントまたは誘導体がＳｍａｃのアミノ酸５６−５９を含む，請求項１−６のいずれかに記載の構成体。
【請求項８】
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＦ８７７１６に開示されるＳｍａｃ蛋白質，またはその誘導体またはフラグメント，および
（ｉｉ）キャリア，
を含むＳｍａｃ蛋白質／キャリア構成体であって，
Ｓｍａｃ蛋白質はＳｍａｃのアミノ酸５６−６２または５６−５９を含むフラグメントまたは誘導体であり，
前記キャリアはＴＡＴのアミノ酸４７−５７を含むＴＡＴの蛋白質伝達ドメインであり，および
Ｓｍａｃ蛋白質，そのフラグメントまたは誘導体およびキャリアは，Ｓｍａｃ／キャリア構成体が細胞膜を通って細胞内に浸透することができるように一緒に連結されており，および
キャリアは化学結合によりＳｍａｃ蛋白質に連結されていることを特徴とする構成体。
【請求項９】
少なくとも１つの活性なアポトーシス誘導性または増殖阻害性化合物と任意に組み合わせられている，医薬品として使用するための請求項１−８のいずれかに記載の構成体。
【請求項１０】
活性化合物が細胞成長抑制性化合物である，医薬品として使用するための請求項９記載の構成体。
【請求項１１】
細胞成長抑制性化合物が，抗代謝剤，好ましくはシタラビン，フルダラビン，５−フルオロ−２’−デオキシウリジン，ゲムシタビン，ヒドロキシウレアまたはメトトレキセート；ＤＮＡ−フラグメント化剤，好ましくはブレオマイシン，ＤＮＡ架橋剤，好ましくはクロラムブシル，シスプラチン，シクロホスファミドまたはナイトロジェンマスタード；インターカレート剤，好ましくはアドリアマイシン（ドキソルビシン）またはミトキサントロン；蛋白質合成阻害剤，好ましくはＬ−アスパラギナーゼ，シクロヘキシミド，ピューロマイシンまたはジフテリアトキシン；トポイソメラーゼＩ毒素，好ましくはカンプトテシンまたはトポテカン；トポイソメラーゼＩＩ毒素，好ましくはエトポシド（ＶＰ−１６）またはテニポシド；微小管指向性薬剤，好ましくはコルセミド，コルチシン，パクリタキセル，ビンブラスチンまたはビンクリスチン；キナーゼ阻害剤，好ましくはフラボピリドール，スタウロスポリン，ＳＴＩ５７１（ＣＰＧ５７１４８Ｂ）またはＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）；その他の研究用試薬，好ましくはＰＳ−３４１，フェニルブチレート，ＥＴ−１８−ＯＣＨ3，またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ−７３９７４９，Ｌ−７４４８３２）；ポリフェノール，好ましくはケルセチン，レスベラトロール，ピセアタンノール，没食子酸エピガロカテキン，テアフラビン，フラバノール，プロシアニジン，ベツリン酸；ホルモン，好ましくはグルココルチコイドまたはフェンレチニド；ホルモンアンタゴニスト，好ましくはタモキシフェン，フィナステリドまたはＬＨＲＨアンタゴニスト；植物由来細胞成長抑制剤（Ｖｉｓｃｕｍ由来，およびその誘導体）；アルカロイド，好ましくはビンデシン；ポドフィロトキシン，好ましくはビノレルビン；アルキル化剤，好ましくはニムストリン，カルムストリン，ロムスチン，エストラムストリン，メルファラム，イフォスファミド，トロフォスファミド，ベンダムスチン，ダカルバジン，ブスルファン，プロカルバジン，トレオスルファン，トレモゾールアミド，チオテパ；細胞障害性抗生物質，好ましくはアクラルビシン，ダウノルビシン，エピルビシン，イダルビシン，マイトマイシン，ダクチノマイシン；葉酸類似体等の抗代謝剤好ましくはメトトレキセート，プリン類似体，好ましくはクラドリビン，メルカプトプリン，チオグアニンおよびピリミジン類似体，好ましくはシタラビン，フルオロウラシル，ドセタキセル；他の抗新生物，白金化合物，好ましくはチオプラチン，カルボプラチン，オキザリプラチン；アムサクリン，イリノテカン，インターフェロン−α，トレチノイン，ヒドロキシカルバミド，ミルテフォシン，ペントスタチン，アルデスロイキン；臓器に由来する抗新生物化合物，例えば，モノクローナル抗体，好ましくはトラスツズマブ，リツキシマブ，または酵素に由来する抗新生物化合物，好ましくはペガスパルガーゼ；ホルモンに属する内分泌影響性抗新生物化合物，例えば，エストロゲン，好ましくはポリエストラジオール，フォスフェストリオール，エチニルエストラジオール，ゲスタゲン，好ましくはメドロキシプロゲステロン，ゲストノロンカプロート，メゲストロール，ノレチステロン，リネストレノール，視床下部ホルモン，好ましくはトリプトレリン，ロイプロレリン，ブセレリン，ゴセレリン，他のホルモン，好ましくはテストラクトン，テストステロン；ホルモンアンタゴニストに属する内分泌影響性抗新生物化合物，例えば，抗エストロゲン剤，好ましくはトレミフェン；抗アンドロゲン剤，好ましくはフルタミド，ビカルタミド，シプロテラン；酵素阻害剤に属する内分泌影響性抗新生物化合物，好ましくはアナストロール，エキセメスタン，レトロゾール，フォルメスタン，アミノグルテチミドからなる群より選択され，これらはすべて場合によりいわゆる保護剤，好ましくはカルシウムフォリナト，アミフォスチン，レノグラスチン，モルグロモスチン，フィルグラスチン，メスナまたはいわゆる添加剤，好ましくはレチノパルミトレート，サイマスＤ９，アミロマーとともに投与することができる，医薬品として使用するための請求項９または１０に記載の構成体。
【請求項１２】
細胞成長抑制性化合物が，ドキソルビシン，シスプラチンおよびエトポシド（ＶＰ−１６）からなる群より選択される，医薬品として使用するための請求項９−１１のいずれかに記載の構成体。
【請求項１３】
活性化合物が，デスレセプターリガンド，その誘導体またはフラグメントである，医薬品として使用するための請求項９記載の構成体。
【請求項１４】
デスレセプターリガンドが，腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α)，腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β，リンホトキシン−α），ＬＴ−β（リンホトキシン−β），ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌ），ＣＤ９５（Ｆａｓ，ＡＰＯ−１）リガンド，ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３，Ａｐｏ−３）リガンド，ＤＲ４リガンド，ＤＲ６リガンド，ならびに前記リガンドのいずれかのフラグメントおよび誘導体からなる群より選択される，医薬品として使用するための請求項１３記載の構成体。
【請求項１５】
デスレセプターリガンドがＴＲＡＩＬである，医薬品として使用するための請求項１３または１４に記載の構成体。
【請求項１６】
活性化合物が，デスレセプターに対する抗体，その誘導体またはフラグメントである，医薬品として使用するための請求項９記載の構成体。
【請求項１７】
デスレセプターリガンドに対する抗体が，抗ＣＤ９５抗体，抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）抗体，抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）抗体，抗ＤＲ６抗体，抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体および抗ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３）抗体，ならびに前記抗体のいずれかのフラグメントおよび誘導体からなる群より選択される，医薬品として使用するための請求項１６記載の構成体。
【請求項１８】
デスレセプターに対する抗体が抗ＣＤ９５抗体である，医薬品として使用するための請求項１６または１７に記載の構成体。
【請求項１９】
任意に少なくとも１つの活性なアポトーシス誘導性化合物と組み合わせて，癌の治療用の医薬を製造するための，請求項１−８のいずれかに記載のＳｍａｃ／キャリア構成体の使用。
【請求項２０】
治療すべき癌が，神経芽細胞腫，直腸癌，結腸癌，家族性腺腫様ポリポーシス癌，遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌，食道癌，口唇癌，喉頭癌，下咽頭癌，舌癌，唾液腺癌，胃癌，腺癌，髄質甲状腺癌，乳糖甲状腺癌，腎臓癌，腎臓実質癌，卵巣癌，子宮頸癌，子宮体癌，子宮内膜癌，絨毛膜癌，膵臓癌，前立腺癌，精巣癌，乳癌，子宮癌，黒色腫，脳腫瘍，好ましくは神経膠芽細胞腫，星状細胞腫，髄膜腫，髄芽細胞腫および末梢神経外胚葉腫瘍，ホジキンリンパ腫，非ホジキンリンパ腫，バーキットリンパ腫，急性リンパ性白血病（ＡＬＬ），慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ），急性骨髄性白血病（ＡＭＬ），慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ），成人Ｔ細胞白血病リンパ腫，肝細胞癌，胆嚢癌，気管支癌，小細胞肺癌，非小細胞肺癌，多発性骨髄腫，基底細胞腫，奇形腫，網膜芽細胞腫，脈絡膜黒色腫，セミノーマ，横紋筋肉腫，頭蓋咽頭腫，骨肉腫，軟骨肉腫，筋肉腫，脂肪肉腫，線維肉腫，ユーイング肉腫および形質細胞腫からなる群より選択される，請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
治療すべき癌が，神経芽細胞腫，神経膠芽細胞腫，乳癌，黒色腫，前立腺癌および膵臓癌からなる群より選択される，請求項１９または２０に記載の使用。
【請求項２２】
請求項１−８のいずれかに記載のＳｍａｃ／キャリア構成体および薬学的に許容しうるキャリアを含む，癌を治療するための医薬品。
【国際調査報告】
2005536457.tif 000003
2005536457.tif 000004
2005536457.tif 000005
2005536457.tif 000006
2005536457.tif 000007
2005536457.tif 000008
2005536457.tif 000009
2005536457.tif 000010
2005536457.tif 000011
2005536457.tif 000012
2005536457.tif 000013
2005536457.tif 000014