(57)【要約】本発明は、実質的に緩衝化されていない塩基水溶液を溶離剤として用いる１回または２回以上のクロマトグラフ法の精製段階およびそれに続く中和による、低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンの製造方法に関する。低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンは、免疫グロブリンＥ結合の欠乏または少なくともその低下と同時に、治療的に関連するＴ細胞刺激作用の保持によって識別される。従ってそれらは、特定の免疫療法のための副作用の少ない治療剤として用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に緩衝化されていない塩基水溶液を溶離剤として用いた１回または２回以上のクロマトグラフ法の精製段階およびそれに続く中和による、低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １の製造方法であって、用いる出発材料が、組換え法によって製造された溶解性のｒＢｅｔ ｖ １粗タンパク質であることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
組換え法によって製造された溶解性のｒＢｅｔ ｖ １粗タンパク質が、大腸菌に発現されたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クロマトグラフ法の精製段階が、陰イオン交換クロマトグラフ、疎水性相互作用クロマトグラフおよびゲルろ過を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
クロマトグラフ法の精製段階を、以下の順序：１回目のゲルろ過、陰イオン交換クロマトグラフ、疎水性相互作用クロマトグラフ、および２回目のゲルろ過、によって実施することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
溶離剤として用いる塩基を、５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲、好ましくは５ｍＭ〜４０ｍＭの濃度範囲において用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
溶離剤として用いる塩基がＮａＯＨであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
無機の中性塩および随意的にＮａＨＣＯ３を溶離剤に添加することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
溶離剤に添加する無機の中性塩がＮａＣｌであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
溶離剤に存在するＮａＯＨ、ＮａＣｌおよびＮａＨＣＯ３の濃度が、精製段階に続く中和段階において、生理的食塩水の典型的な濃度が設定できるように選択されることを特徴とする、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ｒＢｅｔ ｖ １粗タンパク質が、クロマトグラフにより、および／または塩析沈殿により、緩衝溶液中で前精製されていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １のＩｇＥ活性を低下させる方法であって、組換え法によって製造された溶解性のシラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １を、請求項１〜１０に記載の方法の一つに付すことを特徴とする、前記方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０に記載の方法の一つにより得ることのできる、低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １。
【請求項１３】
医薬としての、請求項１２に記載の、低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １。
【請求項１４】
請求項１２に記載の低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １、および／または薬学的に使用可能なそれらの誘導体、任意の比率におけるそれらの混合物の、シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １が関連して始まるアレルギーに対する、特定の免疫療法用の医薬の製造のための使用。
【請求項１５】
請求項１２に記載の低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １、および／または薬学的に使用可能なそれらの誘導体、任意の比率におけるそれらの混合物、ならびに、随意的に賦形剤および／または補助剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、免疫グロブリンＥ結合が欠如しているか少なくとも減少していること、すなわち低アレルギー性であることによって識別される、シラカバ花粉アレルゲンの製造方法に関する。これらのアレルゲンは、治療に関連するＴ細胞刺激作用は完全に保持している。従ってそれらは、特定の免疫療法のための副作用の少ない治療剤として用いることができる。
【０００２】
発明の背景
１型アレルギーは、近年世界中で飛躍的に増加している。先進工業国の人口の２０％までが、例えばアレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎または気管支喘息などを患っているが、これらの疾患は、種々の源、例えば植物花粉、ダニ類、哺乳動物（ネコ、イヌ、ウマ）およびカビ真菌などから放出され空気中に存在するアレルゲン（空気アレルゲン）によって引き起こされる。重篤なアレルギーは昆虫に刺されたり咬まれたりすることによっても引き起こされ、例えばハチやスズメバチなどである。１型アレルギーの誘発物質はタンパク質、糖タンパク質またはポリペプチドである。これらのアレルゲンは、感作された人々において刺されたり咬まれたりした後に、摂取後に粘膜を介して反応するか、または肥満細胞の表面に結合したＩｇＥ抗体と反応する。２個またはそれ以上のＩｇＥ抗体がアレルゲンによって互いに架橋されている場合は、エフェクター細胞によってメディエーター（例えばヒスタミン、プロスタグランジン）またはサイトカインが放出され、従ってアレルギー症状が引き起こされる。
【０００３】
シラカバ花粉は樹木の花粉の中で最もよくあるアレルギー反応の開始剤である（Jarolim E., et al., 1989, Allergy 44: 385-95）。シラカバ花粉アレルギー患者の９０％以上は、主要アレルゲンＢｅｔ ｖ １に対するＩｇＥ抗体を有する（Elfman, L. et al., 1997, Int. Arch. Allergy Immunol., 113: 249-51）。
ｃＤＮＡ配列の支援によって、アレルギーの診断および治療に用いることができる、組換えアレルゲンの製造が可能である（Scheiner and Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391）。組換えＢｅｔ ｖ １アレルゲン（ｒＢｅｔ ｖ １）および薬学的目的のためのそれらの精製は、例えばHoffmann-Sommergruberら（Protein Exp. Purif. 9(1), 1997: 33-39）によって記述されている。
【０００４】
さらに、組換えアレルゲンの特定の遺伝的改変が可能で、アレルギーポテンシャルの低下を実現することができる（Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162(4): 2406-2414; Valenta et al., 1999, Biol. Chem. 380: 815-24; Singh et al., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 119: 75-85）。この型のアレルゲンの変種は、１型アレルギーの特定の免疫療法に対する将来有望な候補である。
しかし、組換えアレルゲン変種の潜在的な欠点は、一次構造の改変が、治療の成功に必要なＴ細胞エピトープの反応性の損失または低下を引き起こすことである。この可能性は、天然のアレルゲンに対応する一次構造が組換えタンパク質の製造の基礎として使える場合にのみ、排除することができる。
【０００５】
シラカバ花粉主要アレルゲンＢｅｔ ｖ １の場合、組換え法によって治療目的に対する最適化すなわちＩｇＥ結合能力の低下を達成するため、製造は２分して（in two halves）（Vrtala, S., et al., 1997, J. Clin. Invest. 99: 1673-81）、または３量体として（as a trimer）（Vrtala, S., et al., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 118: 218-9）実施された。Ｔ細胞エピトープの損失の可能性およびタンパク質の非可溶性も、これらのアプローチに対して不利な効果を有する。ここでのさらなる欠点は、これらｒＢｅｔ ｖ １変種製造の複雑な方法に見ることができる。
【０００６】
治療目的に利用できる組換え主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １の製造の好適な出発点は、従って、一次構造が野生型に対応し、そのＴ細胞刺激作用において制限のない、しかし低下したＩｇＥ活性を有する分子、すなわち低アレルギー性の分子である。
【０００７】
本発明によりこの目的は、可溶性の組換え主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １を出発材料とした、それ自体既知の一連の生化学的精製段階を実施することによって達成される。驚くべきことには、この方法で精製されたタンパク質において、低下したＩｇＥ活性と同時に維持されたＴ細胞刺激作用が観察される。従って、本発明による方法は、改善された治療効力と、同時に副作用の大幅な低下または排除を提供する。
【０００８】
組換えアレルゲンの製造方法の様式はここでは特に重要であり、なぜならばこの方法の経過において、タンパク質の構造が、ＩｇＥ親和性を大幅に低下または排除し、かつ一定のＴ細胞刺激作用を有するものへと変換されるためである。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は生化学的精製方法に関し、該方法は、例えば組換え法により製造されるアレルゲンの、特定の溶離剤を用いる効率的な精製を介した、本発明により修飾された特性を有するタンパク質の製造をもたらす。これらの特性は、ＩｇＥ活性の欠如または少なくとも大幅な低下と、同時に、Ｔ細胞刺激作用の維持からなる。
【００１０】
本発明は従って、シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １のＩｇＥ活性を低下させる方法であって、可溶性の組換えシラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １の使用および、その精製のための、以下に記載されるクロマトグラフ法の段階および、続く中和段階からなる前記方法に関する。
【００１１】
本発明はさらに、低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １の製造方法であって、実質的に緩衝化されていない塩基水溶液を溶離剤として用いる、クロマトグラフ法の複数の精製段階および続く中和による前記方法であって、ここで用いられる出発材料は、組換え法により製造される可溶性ｒＢｅｔ ｖ １粗タンパク質である、前記方法に関する。
【００１２】
クロマトグラフ法の精製段階は、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフ、疎水性相互作用クロマトグラフおよびゲルろ過を含み、１回のみ、次々に複数回、または交互に複数回実施することができる。しかし、クロマトグラフ法の精製段階は以下の順序が好ましい：１回目のゲルろ過、陰イオン交換クロマトグラフ、疎水性相互作用クロマトグラフ、および２回目のゲルろ過。
【００１３】
クロマトグラフ法の精製段階は、通常は５〜１００ｍＭの塩基濃度、好ましくは５〜４０ｍＭ、特に好ましくは１０〜３０ｍＭの塩基濃度で行い、ここで用いる塩基物質はＮａＯＨが好ましい。純粋に水性の系の代わりに、混合系、例えば水およびメタノールを含む系を用いることもできる。非水系、例えばメタノール系も考えられる。しかし、水性の系の使用が好ましい。
それぞれのクロマトグラフ法の段階によっては、異なる濃度の中性塩、好ましくはＮａＣｌを、約５Ｍまで溶離剤に添加することができる。
【００１４】
比較的感度の高いタンパク質が許容する値に必要なｐＨの任意の低下は、炭酸水素ナトリウムの添加によって達成できる。
精製の最後において生理的条件を確立するとの意図は、クロマトグラフ法の段階の間における炭酸水素ナトリウムの存在の理由ともなり得る。ここで基本的に１００ｍＭまでの濃度が可能である。しかし、２０ｍＭより低い生理的範囲において、特に好ましくは１１ｍＭにおいて、操作が行われることが好ましい。
ｒＢｅｔ ｖ １の場合は、ｐＨの低下は不要である。しかしながら本発明の方法の適用において、精製の最後において簡単な方法で生理的濃度を確立することを可能にするため、一般に炭酸水素ナトリウムがｒＢｅｔ ｖ １に添加される。
【００１５】
本発明は従って、低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １の製造方法であって、実質的に緩衝化されていない塩基性溶離剤が、溶液中の精製すべきタンパク質をマイルドな条件下に、従ってクロマトグラフを適用できる状態に維持する、前記方法に関する。
【００１６】
本方法の好ましい態様においては、ｒＢｅｔ ｖ １粗タンパク質は、例えば疎水性相互作用クロマトグラフまたはイオン交換クロマトグラフ、および／または塩析沈殿などのクロマトグラフ法による実際の精製の前に、前精製され、そこでは、続いて行われる主要な精製とは異なり、緩衝化された溶離剤または緩衝化された溶液が用いられる。
【００１７】
本方法における出発材料は、細菌または他の好適なホスト細胞（例えばイースト菌）において発現された溶解性の組換えアレルゲンである。本方法はこれら発現製品の一般的な用途を示しており、異なる起源の溶解性アレルゲンもまた、本発明に従って、本方法により精製し、復元し形成することができる。特に、異なる起源のアレルゲンが、シラカバ花粉主要アレルゲンＢｅｔ ｖ １に対応する類似性を有する場合には、本発明による特性が達成されることが予想できる。しかし、本方法は特に、組換え法によって製造するシラカバ花粉主要アレルゲンＢｅｔ ｖ １を得るのに好適である。しかし、天然のシラカバ花粉主要アレルゲンｎＢｅｔ ｖ １もまた、出発材料として基本的に好適である。
【００１８】
ｐＨの修正によって組換え活性成分を最終的に中和することにより、―溶離剤成分の濃度を対応して選択すれば―、いつでも使用できる生理溶液を直接得ることができる。
薬学的に活性な成分は、中和後に直接、非経口用の製品として用いることができる。さらに、この再現可能で標準化可能な方法は、医薬品に必要な適正製造基準（Good Manufacturing Practice）（ＧＭＰ）条件下において実施できる。
【００１９】
本発明は従って、特定のアレルギー免疫療法のための、改善された調製物の製造方法に役立ち、これは本発明の方法によって達成される。ＩｇＥ活性の大幅な低下または欠如は、特定の免疫療法に有利な特性を提供する。この方法で製造した組換え低アレルギー性アレルゲンは、従って、アレルギー疾患に対する改善された療法に貢献することができる。
本発明は従って、本発明の方法によって得ることのできる低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １に関し、また特に、医薬としてのその使用に関する。
【００２０】
シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １の特性の付加的な作用のために、―例えばＩｇＥ活性の更なる低下またはＴ細胞刺激作用のさらなる増加を達成するために―、タンパク質に薬学的に許容可能な修飾を加えて該タンパク質の誘導体を製造することも、もちろん可能である。これらの修飾は、一方でＤＮＡレベルでの遺伝的修飾であってよく、例えばアミノ酸の挿入、削除および置換え、タンパク質を開裂してフラグメントにすること、およびタンパク質またはそのフラグメントと他のたんぱく質またはペプチドとの融合などが好適である。しかし、修飾はまた化学的な性質のものであってもよく、タンパク質レベルで起きてもよい。
【００２１】
本発明は従って、本発明による低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １および／または薬学的に使用可能なその誘導体、全ての比率におけるそれらの混合物の、その発症にシラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １が関連するアレルギーに対する、特定の免疫療法用の医薬の製造のための使用に関する。
【００２２】
最後に、本発明は、本発明による低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １および／または薬学的に使用可能なその誘導体、全ての比率におけるそれらの混合物を含む医薬組成物に関する。本発明による活性成分は、少なくとも１種の固体、液体および／または半液体の賦形剤または補助剤と共に、そして随意的に１種または２種以上のさらなる活性成分と組み合わせて、ここで好適な用量形態に変換することができる。
【００２３】
これらの組成物は、ヒトの医学または獣医学において治療剤として用いることできる。好適な賦形剤は、非経口的投与に好適な、低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １と反応しない、有機または無機の物質である。非経口的投与に好適であるのは、特に、溶液、好ましくはオイルベースの溶液または水溶液であり、さらに、懸濁液、乳濁液またはインプラントである。本発明による低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １は、凍結乾燥することもでき、得られた凍結乾燥物は、例えば注入調製物の製造に用いることができる。示された組成物は、滅菌すること、および／または補助剤を含むことができ、補助剤は例えば潤滑剤、保存剤、安定剤および／または湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整のための塩、緩衝物質および／または複数のさらなる活性成分などである。
さらに、本発明による低アレルギー性シラカバ花粉主要アレルゲンｒＢｅｔ ｖ １の対応する製剤は、例えば水酸化アルミニウムに吸着させることによって、デポー製剤を得ることを可能にする。
【００２４】
本発明による製造方法は、以下に一般的な形で記載される。この記載において、例の中で言及される全てのクロマトグラフ用材料は、Amersham Biosciences（フライブルク、ドイツ）より得た。核酸除去のための最初の前精製段階は、生理条件下（ｐＨ６〜８、非変性状態）で実施される疎水性相互作用クロマトグラフで構成されてよく、ここで同時に標的タンパク質が焦点となる。代替的に、塩析沈殿またはイオン交換クロマトグラフを実施してもよい。しかし、この最初の前精製段階は、本発明の効果を達成するために絶対必要というわけではない。
【００２５】
次の精製段階は、１０〜１００ｍＭの濃度範囲、例えば２０ｍＭのＮａＣｌの弱い生理食塩水溶離剤（weakly saline eluent）中にタンパク質を転換するため、例えばセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム上でのゲルろ過によって実施する。アルカリ性溶離剤を用いたイオン交換クロマトグラフの性能を促進するための条件がこうして創出される。この方法で製造されたタンパク質溶液は、次に、陰イオン交換クロマトグラフ、例えばソース（Source）Ｑカラムを用いたものに用いられる。ほとんどのアレルゲンはここで支持体に結合される。アルカリ性溶離剤は、元は僅かに溶解性または非溶解性のタンパク質でさえも、溶液中に残留させる。ＮａＣｌ勾配溶離により、細菌性の不純物および活性成分フラグメントが部分的に除去される。
【００２６】
２回のさらなる精製段階、すなわち疎水性相互作用クロマトグラフおよびゲルろ過において、前精製され平衡化されたアレルゲンは、まだ残留している細菌性不純物から実質的に分離される。このため基本的に、低モル塩基および異なる割合の無機中性塩からなる同じ溶離物質が用いられる。従って、アレルゲンは、例えば５ＭまでのＮａＣｌ、２０ｍＭのＮａＯＨおよび１１ｍＭのＮａＨＣＯ３を用いた疎水性相互作用クロマトグラフにおいてカラムに結合され、続いて、低塩または無塩のアルカリ溶液、例えば２０ｍＭのＮａＯＨを用いて溶離される。
【００２７】
最後のクロマトグラフ法の段階において溶離剤の変更を行い、精製された組換えタンパク質が、溶離剤中に存在する塩基に対応する酸を用いた簡単な中和によって、溶解性かつそのままで使用可能な形態で得られるようにする。溶離添加剤の好適な濃度を選択すれば、非経口性の製品として好適な生理溶液が形成される。
【００２８】
精製したアレルゲンは、既知の、物理的、化学的または生物学的特性を介して識別され、特にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび特定のモノクロナル抗体を用いて識別される。さらなる特性評価には、ＥＡＳＴ抑制検査（ＥＡＳＴは酵素アレルゲン溶媒試験（enzyme allegro sorbent test）を指す）が実施でき、これによって参照と比較したタンパク質の特定のＩｇＥ結合を決定でき、および／または、例えばＴ細胞増殖検査を実施することができる。溶媒はｐＨ測定および、Ｎａ＋およびＣｌ−、そして所望であればＣＯ３２−濃度の定量化によって試験される。これらの方法は一般に既知であり、記述されている。
本発明に従って製造されたアレルゲンの収率は、出発材料タンパク質に基づき通常７５〜９５％である。
【００２９】
従って本方法が関連するのは、最少の試料の処理、短い試料静置時間、好ましくは専用の薬学的に適合可能な物質の使用、一つの溶離剤が多様な分離原理に互換性があること、および、時間がかかりそして一定の状況下においては無効な方法、例えば透析の回避である。さらに、水酸化ナトリウム溶液は好ましくは塩基として用いられるが、それは有効な静菌剤として知られており、存在するタンパク質を分解からまたは微生物による汚染から保護する。細菌の発現において問題を引き起こす可能性のある内毒素、他の異種タンパク質およびＤＮＡも同様に、効果的に除去または分解される。
上記のクロマトグラフ法の段階の順序および数は、変更可能である。従って、特に、標的タンパク質の具体的な物理化学的特性を考慮することができる。
【００３０】
当業者は、さらなるコメントなしで、上記の説明をその最も広い範囲において利用できると考えられる。従って、以下に記載される好ましい態様は記述的な開示に過ぎず、どのような方法においても決して限定するものではないことが理解される。
【００３１】
本方法の特に好ましい態様を、以下のスキームに示す（表１）。
表１．本発明による製造方法の概要
【表１】
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【００３２】
本発明は、以下に、治療的に有効な組換えＢｅｔ ｖ １（ｒＢｅｔ ｖ １）の精製の例を通して記述される。全てのクロマトグラフ材料は、Amersham Biosciences（フライブルク、ドイツ）から市場で入手可能である。
【００３３】
例１：低アレルギー性ｒＢｅｔ ｖ １の製造
初めに、溶解性のｒＢｅｔ ｖ １アレルゲンを含む大腸菌溶菌液を、標準法（Breiteneder H., et al., EMBO J. 1989, 8: 1935-8; Hoffmann-Sommergruber et al., Protein Exp. Purif. 9(1), 1997: 33-39）により製造する。核酸を除去するため、疎水性相互作用クロマトグラフを、トリス／硫酸アンモニウム緩衝液（２０ｍＭのトリス／Ｈｃｌ、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ８．０）中のフェニル−セファロースを用いて実施する。溶離は蒸留水を用いて実施する。さらなる精製段階を弱いアルカリ溶離剤を用いて実施するため、残留硫酸アンモニウムを、セファデックスＧ−２５を通すゲルろ過により、２０ｍＭのＮａＣｌと置換する。
【００３４】
この方法により前精製したタンパク質溶液を、ソース（Source）１５Ｑを用いた陰イオン交換クロマトグラフに用いて、そこで支持体材料をアルカリ溶液（２０ｍＭのＮａＯＨ、１１ｍＭのＮａＨＣＯ３および２０ｍＭのＮａＣｌ）で平衡化する。出発溶液のｐＨが比較的高いため、実質的に全ての標的タンパク質が陰イオン交換剤に結合する。続く溶離はＮａＣｌ勾配を増加しながら（２０ｍＭのＮａＯＨ；１１ｍＭのＮａＨＣＯ３；２０ｍＭのＮａＣｌから、２０ｍＭのＮａＯＨ；１１ｍＭのＮａＨＣＯ３；０．５ＭのＮａＣｌへ）行い、不純物（ホスト細胞タンパク質）および活性成分フラグメントを除去する。
【００３５】
次のクロマトグラフ法の段階は、ソースＰＨＥを用いる疎水性相互作用クロマトグラフである。このために、イオン交換クロマトグラフからの溶離物は、対応する量の５ＭのＮａＣｌストック溶液、２ＭのＮａＯＨストック溶液および炭酸水素ナトリウムを添加することにより、３ＭのＮａＯＨ、２０ｍＭのＮａＯＨ、１１ｍＭのＮａＨＣＯ３に調節する。これらの条件下において、ｒＢｅｔ ｖ １はカラム材料に結合する。結合標的タンパク質の溶離は、２０ｍＭのＮａＯＨを用いて実施する。
最終段階において、アルカリ条件下においてスーパーデックス（Superdex）７５を通してゲルろ過を実施する。クロマトグラフ溶液は、溶離剤に添加した塩基の中和により、所望の最終組成物、すなわち生理食塩水の濃度に対応する１０ｍＭのＮａＯＨ、１１ｍＭのＮａＨＣＯ３および１４８．４ｍＭのＮａＣｌが得られるように選択する。ゲルろ過からの溶離物は、使用した塩基ＮａＯＨに対応する酸ＨＣｌを用いて最終的に中和され、中性のｐＨと共に生理食塩水における所望の塩含量をもたらす。これは、１／１０（ｖ／ｖ）の１００ｍＭのＨＣｌの添加によって達成される。
【００３６】
例２：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性評価
例１で得た低アレルギー性ｒＢｅｔ ｖ １の特性評価のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）を実施する。図１Ａに示すように、天然のｎＢｅｔ ｖ １（トラック２）、Hoffmann-Sommergruberら（Protein Exp. Purif. 9(1), 1997: 33-39）の方法によって従来方法により精製した組換えｒＢｅｔ ｖ １（トラック４）、および本発明に従って精製したｒＢｅｔ ｖ １（トラック３）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて同じ分子量を有する。
【００３７】
例３：血清プールを用いたＩｇＥ活性の決定
ＩｇＥ活性を決定するために、例２によるＳＤＳ−ＰＡＧＥをニトロセルロースにブロットする。シラカバ花粉症患者からの血清プールをブロットに添加した後、該ブロットを抗ＩｇＥ抗体およびアルカリ性ホスファターゼからなる接合体（conjugate）と共にインキュベートする。アルカリ性ホスファターゼによって促進された色反応（図１Ｂ）によれば、天然のｎＢｅｔ ｖ １および従来方法により精製した組換えｒＢｅｔ ｖ １のＩｇＥ活性は示されるが、本発明に従って精製したｒＢｅｔ ｖ １−ＭＦのＩｇＥ活性は示されない。
【００３８】
例４：個別血清を用いたＩｇＥ活性の決定
個別のシラカバ花粉症患者からの血清を用いてＩｇＥ活性を決定するために、ｎＢｅｔ ｖ １（位置３）、従来方法により精製した組換えｒＢｅｔ ｖ １（位置５）、および本発明に従って精製した組換えｒＢｅｔ ｖ １（位置４）を、図２Ａに示すようにニトロセルロース膜に適用し、例３と同様にして試験した。図２Ａによれば、本発明に従って精製したｒＢｅｔ ｖ １が弱いＩｇＥ活性を有している血清５を例外として、天然のｎＢｅｔ ｖ １および従来方法により精製した組換えｒＢｅｔ ｖ １のみはＩｇＥ活性を有するが、本発明に従って精製したｒＢｅｔ ｖ １はＩｇＥ活性を有さないことがわかる。
試験したアレルゲンの主体性（identity）を決定するために、ニトロセルロース膜は、種々のラビットのポリクローナル抗Ｂｅｔ ｖ １抗体（試料２１〜２６）およびマウスのモノクローナル抗Ｂｅｔ ｖ １抗体６Ｂ６（試料２７）と共にインキュベートし、続いて例３（図２Ｂ）と同様に処理した。
【００３９】
例５：ＩｇＥ結合の定量化
Suckらの方法（Int. Arch. Allergy Immunol. 2000; 121: 284-291）による、アレルギー患者の血清プールを用いるＥＡＳＴ阻害試験において、天然ｎＢｅｔ ｖ １、従来方法により精製した組換えｒＢｅｔ ｖ １、および本発明に従って精製した組換えｒＢｅｔ ｖ １を、互いにそのＩｇＥ結合強度について比較した（図３）。本発明に従って精製したｒＢｅｔ ｖ １のＩｇＥ活性は、他のＢｅｔ ｖ １タンパク質のそれと比べて、１００倍以上低下していることが見出された。
【００４０】
例６：Ｔ細胞刺激作用の決定
本発明によるｒＢｅｔ ｖ １アレルゲンのＴ細胞の成長への影響を決定するために、Ｔ細胞株（ＴＣＬｓ）およびＴ細胞クローン（ＴＣＣｓ）の増殖アッセイを、Schrammら（1999, J. Immunol. 162(4): 2406-2414）の方法によって実施した（図４）。刺激指数（ＳＩ）の比較から、試験した供与体のＴ細胞は、天然のｎＢｅｔ ｖ １または従来方法で精製した組換えｒＢｅｔ ｖ １との反応と少なくとも同じ程度には、ｒＢｅｔ ｖ １と反応することがわかる。ｒＢｅｔ ｖ １との反応は、選択した条件によっては、ｎＢｅｔ ｖ １またはｒＢｅｔ ｖ １との反応より最大で３分の１だけ上回っている。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】低アレルギー性ｒＢｅｔ ｖ １の特性評価のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。トラック１：分子量推定のための標準タンパク質。トラック２：天然ｎＢｅｔ ｖ １。トラック３：本発明に従って精製したｒＢｅｔ ｖ １。トラック４：従来方法により精製したｒＢｅｔ ｖ １。
【図１Ｂ】図１ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥのニトロセルロースブロットを示す。
【図２】図２Ａは個別患者の２０個の血清試料を用いた、ＩｇＥ活性決定のためのニトロセルロースブロットを示す。位置３：天然ｎＢｅｔ ｖ １。位置４：本発明に従って精製したｒＢｅｔ ｖ １。位置５：従来方法により精製したｒＢｅｔ ｖ １。  図２ＢはＢｅｔ ｖ １試料の主体性決定のためのニトロセルロースブロットを示す。ブロット２１〜２６：種々のラビットポリクローナル抗Ｂｅｔ ｖ １抗体。ブロット２７：マウスモノクローナル抗Ｂｅｔ ｖ １抗体６Ｂ６。
【図３】ＩｇＥ結合の定量化のための酵素アレルゲン溶媒試験（ＥＡＳＴ）を示す。  ＩｇＥ−Ｂｅｔ ｖ １結合の阻害剤の濃度をμｇ／ｍｌ単位で縦軸にプロットし、阻害率を［％］で横軸に示す。
【図４】Ｂｅｔ ｖ １変種によるＴ細胞刺激作用の決定を示す。  天然ｎＢｅｔ ｖ １、従来方法により精製した組換えｒＢｅｔ ｖ １、および本発明に従って精製した組換えｒＢｅｔ ｖ １の濃度と、種々のＴ細胞株（ＴＣＬｓ）およびＴ細胞クローン（ＴＣＣｓ）によって得たそれぞれの刺激指数（ＳＩ）を比較する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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