(57)【要約】治療上のクローニングによって製造される活性化ヒト胚は、治療的移植片を得るための自系細胞からヒト分化全能および分化多能性幹細胞を生じさせることができる。本発明は、移植に適切な自系細胞または組織を得ることができる分化全能および分化多能性幹細胞の発生に用いることができる活性化ヒト胚を製造するための方法を提供する。実施形態の一つにおいて、本発明は、単為生殖による活性化ヒト胚の製造方法を提供し、別の実施形態において、本発明は、分化したヒトドナー細胞の前記遺伝物質は、治療的移植片のための自系、同系な細胞から得られる前記幹細胞の発生を指示することができる2倍体ヒト前核を形成するために再プログラムされるところによる、体細胞核移植による活性化ヒト胚の製造方法を提供する。自系ヒト胚を創造するための前記能力は、再生治療において免疫拒絶の前記問題を克服するために用いることができる免疫適合性幹細胞を発生するために重要な工程を表す。本発明によって製造された前記活性化ヒト胚は、また、後成の刷り込みの前記分子メカニズムおよび胚形成と発達との前記遺伝的調節を特定および分析するためのモデルシステムを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化したヒト細胞の核を卵母細胞の細胞質にさらすことを含む2倍体ヒト前核を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療的クローニング、分化全能および分化多能性幹細胞を産出することができる活性化ヒト胚の製造、および、これらからの移植患者に自系である移植に適切な細胞や組織の誘導の分野に関する。特に本発明は、ヒト胚の単為生殖的活性化をすること、および卵母細胞内に核移植をしてヒト体細胞の遺伝物質の再プログラムを発動させ、治療的移植片のための自系同系細胞が誘導される幹細胞の産出を細胞に指示することができる２倍体のヒト前核を形成することによるヒト細胞の治療的クローニングに関する。また本発明は、後成の刷り込みの分子メカニズムならびに胚形成および発生の遺伝制御の研究分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
この出願は、引用によりその全体が開示される2001年11月26日に出願された米国仮出願60/332,510の優先権を主張する。
【０００３】
最近まで、哺乳類の異なる種類の体細胞への幹細胞からの分化は、分化する細胞を特定の体細胞の種類に特有な遺伝的発現パターンに委託するクロマチンの構造および機能の不可逆な構造変換に関係していると考えられていた。核移植(NT)に誘導されたウシ未分化胚芽細胞が、卵丘細胞を用いて産出されたとき(Collas P, and Barnes FL. (1994) 内部細胞塊および顆粒膜細胞核の微量注入による核移植 Mol Repord Dev 38:264-267.(非特許文献1))、体細胞のゲノムが分化する間に不可逆にプログラムされるという概念は、信頼できないものとされた。分化した体細胞の核が、胚形成を方向付けることが可能な状態に再プログラムされうるということは、後にウィルムット等による静止期の乳腺由来の細胞からの成体羊のクローニング(Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, and Campbell KHS. (1997) 胎児および成人哺乳類細胞から誘導される生育できる子孫 Nature 385:810-813.(非特許文献2))、およびシベリ等による活発に分裂している胎児の線維芽細胞からの成体ウシのクローニング(Cibelli JB, Stice SL, Golueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, Ponce de Leon FA, and Robl JM. (1998) 静止していない胎児線維芽細胞から製造されるクローン遺伝子変異仔ウシ Science 280:1256-1258.(非特許文献3))により確証された。これら先駆的な結果に続いて、体細胞を用いたNTのためのプロトコルは、改良され、新しい哺乳類種まで拡張された。しかしながら、分化した細胞の遺伝物質(すなわち、クロマチン、核基質、核質、遺伝的調整因子、複合体を形成するゲノムＤＮＡやタンパク質)が、卵質により“再プログラム”され、全能、ほぼ全能もしくは多能性の幹細胞である娘細胞、またはそれらを産生する娘細胞の産生を方向付けることができる２倍体前核を形成するプロセスの基礎となるメカニズムおよび前記プロセスをコントロールするパラメーターについてはほとんど理解されていない。
【非特許文献１】Collas P, and Barnes FL. (1994) 内部細胞塊および顆粒膜細胞核の微量注入による核移植 Mol Repord Dev 38:264-267.
【非特許文献２】Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, and Campbell KHS. (1997) 胎児および成人哺乳類細胞から誘導される生育できる子孫 Nature 385:810-813.
【非特許文献３】Cibelli JB, Stice SL, Golueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, Ponce de Leon FA, and Robl JM. (1998) 静止していない胎児線維芽細胞から製造されるクローン遺伝子変異仔ウシ Science 280:1256-1258.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
移植片のレシピエントと組織適合性がある治療的移植片のための細胞および組織の新しい供与源が、現在大いに必要である。レシピエントとの組織適合性がなければ、移植された細胞および組織は、移植片のレシピエントの免疫系によって拒絶される。拒絶は、移植片のレシピエントによる移植組織片上の同種抗原または異種抗原に対する適応的免疫反応の結果として起こる。前記同種抗原または異種抗原は、通常の‘非自己’タンパク質、すなわち前記移植片のレシピエントの免疫系により異質と識別される、抗原性タンパク質上に存在する。最も強い拒絶を引き起こす移植された組織表面上のタンパク質は、MHC(主組織適合性複合体)遺伝子によってコードされた抗原性タンパク質である。移植組織中に存在するMHCの型とレシピエントのそれとを適合させるために、移植する組織の細胞上および移植片のレシピエントの細胞上に存在するMHCの型を特定する検査が行われる。細胞、組織および器官の移植片が必要な人々の数は、移植に適切な細胞、組織および器官の利用可能な供給よりもはるかに多い。その結果として、レシピエントのMHCタンパク質と移植片として入手可能な細胞または組織のそれらとのよい適合を得ることがしばしば不可能となる。従って、多くの移植片のレシピエントが、MHC適合移植片が入手可能になることを待つかまたは適合しないMHCの移植片を受け入れなければならない。もし後者が必要なら、前記移植片のレシピエントは、大量の免疫抑制薬の服用に依存しなければならず、MHCの適合が可能なケースに比べて大きなリスクに直面しなければならない。そのような移植が必要な非ヒト哺乳類の治療的移植片のための組織適合性細胞および組織の新しい供与源もまた獣医学において必要とされている。
【０００５】
治療のための細胞および組織の供給源としての幹細胞
胚幹(ES)細胞は、胚盤胞胚の内部細胞塊に由来する未分化幹細胞である。ES細胞は、無限に増殖する潜在能力を持つとされ、３つの胚葉(内胚葉、中胚葉および胚盤葉上層)全ての体細胞系統および生殖細胞系を含む哺乳類の全ての特殊化した細胞の型に分化することができる。例えば、インビトロでES細胞は、心筋細胞(Paquin et al., Proc. Nat. Acad. Sci.(2002) 99:9550-9555)、造血細胞(Weiss et al., Hematol. Oncol. Clin. N. Amer. (1997) 11(6):1185-98; 米国特許第6280718号)、インシュリン分泌β細胞(Assdy et al., Diabetes (2001) 50(8):1691-1697)、星状細胞、乏枝神経膠細胞および成熟神経細胞へ分化できる神経前駆体細胞(Reubinoff et al., Nature Biotechnology (2001) 19:1134-1140; 米国特許第5851832号)への分化を誘導されることができる。疾病対策予防センター(ＣＤＣ)からのデータによると、毎日3000人もの数のアメリカ人が、将来はES細胞に由来する組織で治療可能かもしれない疾患によって死んでいる。例えば、心筋細胞、インシュリン分泌β細胞または神経細胞のような機能代替細胞の産生に加えて、ES細胞は、血管、心筋‘パッチ’、腎臓、さらに心臓全体をも含む、より複雑な組織および器官を再構築できるかもしれない(Atala, A. & Lanza, R.P. Methods of Tissue Engineering, Academic Press, San Diego, CA, 2001)。
【０００６】
ES細胞および分化全能、ほぼ分化全能または分化多能性幹細胞からの移植片のための細胞および組織製造の潜在的な恩恵の完全な実現化のためには、例えば、移植片を必要とする人と組織適合性がある十分量の幹細胞の供与源を見つけなければならず、必要とされる異なる細胞全てに分化することを幹細胞に方向付ける方法および移植片のためにそれらを精製する手段を得なければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
核移植クローニングによって製造された幹細胞
この出願の譲受人であるAdvanced Cell Technology, Inc.(ACT)およびその他のグループは、子供や大人の体細胞または生殖細胞の核中の遺伝的情報を未受精卵細胞に移植する方法、および、その結果得た細胞を卵割させ、核ドナー細胞である体細胞または生殖細胞の遺伝子型を有する胚盤胞胚を形成させる培養方法を開発してきた。このような方法によるクローニング方法は、通常ドナー細胞として体細胞が使用されるので「体細胞核移植」と呼ばれるが、例えば、米国特許第5994619号、第6235969号および第6252133号に記載され、これらの内容は、この参照により開示に含まれる。体細胞核移植によって発生する胚盤胞の内部細胞塊由来の分化全能ESまたは似ES細胞は、体細胞性核ドナー細胞のゲノムDNAを有し、そのようなES細胞由来の分化した細胞は、体細胞性ドナー細胞が得られた個体との組織適合性がある。従って、移植治療に適切な組織適合性のある細胞および組織の不足を克服する一つのアプローチは、そのような移植が必要なヒトまたは非ヒト哺乳類からの体細胞性ドナー細胞を用いた核移植クローニングを行い、生じた胚盤胞からES細胞を得て、前記ES細胞を移植が必要とされる種類の細胞への分化を引き起こすまたは指示するような条件下で培養することである。幹細胞の発生の手段としての核移植によるクローニングは、マウス(7-9)およびウシ(10)において成し遂げられたにもかかわらず、体細胞性ドナー細胞を用いたヒトを含む霊長類の胚のクローニングは問題があり、いまだ報告されていない。
【０００８】
体細胞核移植クローニングによる細胞および組織の発生は、ほとんど完全な自系である。すなわち卵母細胞に由来する細胞のミトコンドリアによってコードされるものを除く前記細胞タンパク質の全ては、患者自身のDNAによってコードされる。体細胞核移植クローニングにより得られ、同系移植レシピエントに移植された細胞の同種ミトコンドリアが移植の拒絶を引き起こすという懸念は、核移植クローニングにより産生され、同系のウシに移植された細胞および組織が拒絶を引き起こさないことを示すACTの研究者の最近の研究によって軽減されている。ウシ体細胞性核移植片クローニングによって得られた3つの異なる型の分化したウシ細胞種を含む組織工学の構成物は、同系のウシの中へ移植された。それらは、12週の間拒絶することなく残存し成長したが、異系対照細胞は拒絶された。Lanza et al.(Nature Biotechnology, 2002, 20:689-695)参照。なお、前記文献の内容は、この参照によりその全体が開示に含まれる。体細胞核移植片クローニングによって製造された細胞および組織は、そのようにして、外部からの細胞または組織が移植されたときに生じる深刻な拒絶反応を引き起こすことなく、同系個体への治療上の組織移植または移植されることができる。従って、体細胞核移植片クローニングによって製造された同系細胞および組織の移植片のレシピエントは、異系移植の拒絶を防ぐための免疫抑制薬および/または免疫調節プロトコルの使用に関係する、重大な危険および潜在的に生命を脅かす合併症にさらされる必要がない。
【０００９】
移植治療のための、移植片レシピエントとの組織適合性を有する細胞および組織を製造するための核移植クローニングを用いる方法は、以下のもので説明される。2001年3月5日に出願された本願出願人による同時係属の米国出願第09/797,684号では、移植片のための細胞および組織の免疫適合を決定するための分析方法をさらに説明している。2002年4月2日に出願された米国出願第10/122,939号では、また、幹細胞を移植治療に有用な細胞種の分化を誘導する方法を説明している。2001年8月24日に出願された米国仮出願第60/314,316号の優先権を主張する2002年8月26日に出願された米国出願第10/227,282号では、幹細胞を移植治療に有用な細胞種に分化するように誘導する条件を特定するためのスクリーニングの方法を説明している。そのような方法は、2001年11月29日に出願された本願出願人による同時係属米国出願第09/995,659号および2002年7月18日に出願された国際出願第PCT/US02/22857号において、雄核発生および雌核発生による移植片のための組織適合性細胞および組織を生成する方法がさらに説明されている。2000年4月5日に出願された米国出願第09/520,879号では、ドナー動物の細胞と相対的に向上した能力を有する“若返り”または“ハイパーヤング”細胞を製造するための方法がさらに説明されている。そのような方法は、2002年8月27日に出願された本願出願人による同時係属米国出願第10/228,296号および第10/228,316号において説明されており、分化した体細胞のそれぞれ分化転換および逆分化による移植片のための組織適合性の細胞および組織を作るさらなる方法が説明されている。上に挙げられた出願の全ての開示は、引用によりその全体が開示される。
【００１０】
細胞移植治療のための同型接合MHC対立遺伝子を持つES細胞のバンク
同系ES細胞をデ・ノボに製造するための核移植クローニングを用いることおよび治療的移植片の必要な患者ごとにこれらを必要な細胞に分化させることを引き起こすことに代わるべき手段として、核移植クローニングは、各々が少なくとも一つのMHC遺伝子が同型接合である、前もって作られるES細胞株のバンクの調製に用いられることができる。ヒトの場合、HLA(ヒト白血球抗原)遺伝子または対立遺伝子と呼ばれる前記MHC遺伝子は、高多型であり、ヒト個体群中に存在する種々のMHC対立遺伝子の各々の同型接合であるES細胞株を含む、異なるES細胞系のバンクが、多量の異なるES細胞系を含んでいる。ひとたび、ホモ接合のMHC対立遺伝子を有するES細胞のそのようなES細胞バンクが設立されれば、患者のものに適合するMHC対立遺伝子を有するES細胞株をES細胞バンクから選択し、増殖させ、その患者が必要とする細胞のタイプへ前記ES細胞が分化するように誘導することで、移植が必要な患者へMHCが適合した細胞や組織を提供できる。前記対立遺伝子が同型接合であるES細胞系のバンクの調製および移植治療のためのMHC適合の細胞と組織とを供給するためにこれらを用いる方法は、本願出願人による同時係属米国特許出願“核移動により作られた同型接合MHC対立遺伝子を有する移植のための幹細胞バンクおよびそのような幹細胞バンクを作製し用いる方法”の表題で説明され、引用により開示する。
【００１１】
本発明の発展に先立ち、分化全能、ほぼ分化全能または分化多能性幹細胞を生じさせることができるような娘細胞の発生を指示することができる再プログラムされた遺伝物質を含む2倍体ヒト前核の製造に帰着する、ヒト核ドナー細胞を用いた幹細胞核移植に関する公知文献は存在しない。従って、移植に適した自系同系細胞および組織が誘導できるような細胞の発生を指示することが可能な、再プログラムされた遺伝物質を含むヒト前核の製造方法が必要である。
【００１２】
雄核発生および雌核発生胚からの移植片のための細胞および組織
ヒトへの移植片に適合した組織適合性細胞および組織は、雌または雄移植片のレシピエントの遺伝子DNAを有するために製造された、雌核発生または雄核発生胚から生じることができる。そのような胚は、一般的に発生不能であるが、移植片に適合した自系細胞および組織の発生が可能な幹細胞の供給源としておよび胚形成、発達、分化に対する遺伝子制御のメカニズムを研究するためのモデルシステムとして役に立つ。
【００１３】
インビボまたはインビトロにおいて計画的にもしくは自然に発生するかもしれない条件下で、全雄または全雌起源の遺伝子DNAを含む卵母細胞は、活性化され、卵割および続いて起こる有糸分裂を経ることができる接合体または似接合体を製造する場合がある。雌核発生は、全雌DNAを含む卵母細胞が活性化され、胚を製造する現象として広範囲に定義される。雌核発生は、生じる胚に遺伝物質を与えることができない精細胞によって前記卵母細胞が減数分裂の完了を活性化される工程による、全雌遺伝子DNAを有する胚の製造を含む。単為生殖は、全雌DNAを含む卵母細胞が雄配偶子との相互作用なしに胚を製造するために活性化される雌核発生の典型である。単為生殖的に活性化された卵母細胞は、減数分裂の完了の間に、例えば、倍数体または混倍数体である胚のような異常な遺伝子構成の胚を製造するような異常を経る場合もある。雄核発生は、多くの点で雌核発生と反対である。すなわち、雄起源の遺伝子DNAを独占的に含む卵母細胞が、全雌細胞DNAを有する胚の中で発育するために製造され、活性化される。母方および父方の染色体は構造的および機能的に互いに異なり、両種の染色体が一般的に普通の胚発生工程に必要とされるので、雌核発生および雄核発生胚は、典型的に胚形成のかなり早い段階において発育が止まる。1倍体と2倍体との両方の雌核発生および雄核発生胚は、非ヒト卵母細胞から発生する。しかし、本発明以前には、ヒト単為生殖の報告はなかった。移植の必要があるヒトへの、そのような移植に適合している自系の細胞および組織を発生することができる、ヒト雌核発生および雄核発生胚を製造する改善された新しい方法が必要である。
【００１４】
刷り込みおよび後成の染色体の修正
母方および父方の染色体のどちらにも存在するが、それらが母方または父方どちらの染色体に局在しているかどうかに依存して差別的に発現される遺伝子は、刷り込みされていると呼ばれる。刷り込みされた遺伝子の例は、第7染色体に局在化しているlgf2遺伝子であり、強い胚有糸分裂促進物質であるインシュリン様成長因子II(IGFII)をコードしてい
る。第7染色体の父方コピー上のlgf2遺伝子は、胚細胞中に積極的に発現されるが、一方で第7染色体の母方のコピーは不活性である。前記胚細胞中の刷り込みされた遺伝子の差別的な発現は、母方および父方染色体の間の後成の構造的な違いのため；すなわち母方および父方染色体上に存在する遺伝子のヌクレオチド配列における違いを生じない構造的修正である。遺伝子発現パターンは、また、成体哺乳類の細胞中のゲノム刷り込みによって影響される。ヒトの中でゲノム刷り込みに関係している症候群および疾患は、プラダー-ウィリ症候群、アンゲルマン症候群、単為生殖のイソダイソミー(isodisomy)、Beckwith-Wiedermann症候群、ウィルムス腫瘍発ガンおよびフォンヒッペル-リンダウ病を含む。動物におけるゲノム刷り込みは、毛色に関係している。例えば、マウスのテンジクネズミ遺伝子は、野生の毛色を授け、Aiapy対立遺伝子の差別的な発現は、遺伝子の上流の調節配列のメチル化状態と関連がある。現在、胚の雄配偶子に由来する染色体が、構造的および機能的に、例えば、刷り込みされた遺伝子の異なる発現制御や、後成の差異の胚発生における役割において、雌配偶子に由来する染色体とどのように異なるかを選択することが、大きな興味の対象となっている。それゆえ、1倍体や2倍体の雄核発生および雌核発生ヒト胚、および、核移植により導入された2倍体遺伝物質の再プログラムがなされている胚の製造方法が必要である。なぜなら、このような胚は、精子と卵子との染色体間の後成の構造上の差異や、その胚発生上の役割を研究するモデル系として有用だからである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本願に用いられた用語
ここで用いられる“幹細胞”は、培養中で繁殖する能力を有し、比較的未分化のまま残っているいくつかの娘細胞および細胞種に特殊化された一つまたはそれ以上の細胞を生じさせる他の娘細胞を製造する細胞である。“分化”は、特殊化された機能を果たすために必要な生化学的および構造的性質を得る細胞の進歩的な変化プロセスを指す。従って幹細胞は発生の系図の分枝点に直接先行して存在する。
【００１６】
ここで用いられる“胚幹細胞”(ES細胞)は、桑実胚または胚盤胞内部細胞塊から分離されたネズミの胚幹細胞の特徴を有する細胞系である(Martin, G., Proc. Matl. Acad. Sci. USA (1981) 78:7634-7638; Evans, M and Kaufman, M., Nature (1981) 292: 154-156によって報告されている)。すなわち、ES細胞は、無期限に繁殖することができ、3つの胚葉、全ての体細胞系統および生殖系を含む生物の特殊化された全ての細胞種への分化が可能である。
【００１７】
ここで用いられる、“胚似幹細胞”(似ES細胞)は、動物内部細胞塊または平らなモルフォロジーの顕著な核小体を有する胚盤葉上層から単離された細胞系の細胞であり、不朽であり、そして全ての体細胞系への分化が可能である。しかし、その他の胚盤胞となった場合、通常は生殖細胞にはならない。一例は、Thomsonらによって報告された霊長類“ES細胞”である(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1995) 92:7844-7848)。
【００１８】
ここで用いられる、“内部細胞塊-由来細胞”(ICM由来細胞)は、単離された継続的なES、似ES細胞系を確立する事なく、ICMsまたは桑実胚に直接由来する細胞である。ICM由来細胞の作成および使用方法は、本願出願人による米国特許第6235970号において説明されており、引用により開示されている。
【００１９】
ここで用いられる“胚生殖細胞”(EG細胞)は、それらの繁殖を引き起こし、胚幹細胞と一致しないが似た分化の状態を成し遂げる条件中の始原生殖細胞の培養によって得られた細胞系の細胞である。例は、Matsui et al, 1992, Cell 70: 841-847およびResnick et al, Nature. 359: 550-551によって報告されたネズミのEG細胞である。EG細胞は、インビトロで胚様体に分化することができ、インビボで奇形癌を形成することができる(Labosky et al, Development (1994) 120:3197-3204)。免疫組織化学分析は、EG細胞によって製造された胚様体は3つ全ての胚葉の派生物である分化した細胞を含むということを証明する(Shamblott et al, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1998) 95:13726-13731)。
【００２０】
ここで用いられる“分化全能”細胞は、体内における発生の中で一般的に起こる刺激のようなものへの露出に続く、生殖系を含むどんな細胞種にでも分化するための“全体の能力”を有する幹細胞である。そのような細胞の一例は、ES細胞、EG細胞、ICM由来細胞または胚盤胞の後期段階の胚盤葉上層から培養された細胞である。
【００２１】
ここで用いられる“ほぼ分化全能性細胞”は、発生の中で一般的に起こる刺激のようなものへの露出に続く、体内においてほとんどまたは全てに近い細胞種に分化する能力を有する幹細胞である。一例は、似ES細胞のような細胞である。
【００２２】
ここで用いられる“分化多能性細胞”は、ほとんどまたは全ての細胞種ではないが、多様な体細胞種に分化することが可能な幹細胞である。これは例として以下のものを含むがこれらに制限されない。骨、軟骨および筋肉に分化可能な間充織の幹細胞；血液、内皮および心筋に分化可能な造血幹細胞；ニューロンおよびグリアに分化可能なニューロン幹細胞等。
【００２３】
幹細胞
本発明の方法によって作られ、用いられる幹細胞は、おそらく適切な分化全能、ほぼ分化全能または分化多能性幹細胞である。そのような細胞は、胚発生プロセスの後期から得られた一部分が分化した多能性胚幹細胞だけでなく、内部細胞塊(ICM)細胚盤胞幹細胞(ES)、胚生殖(EG)細胞、一つまたはそれ以上の細胞を含む胚、胚様体細胞、桑実胚由来細胞および成体幹細胞を含む。前記成体幹細胞は以下を含むがこれに限定されない。ネスチン(nestin)神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、膵臓幹細胞、髄質幹細胞、内皮前駆幹細胞、骨髄幹細胞、表皮幹細胞、肝臓幹細胞およびその他の細胞系に拘束された成体前駆細胞の系統関係である。
【００２４】
本発明中で用いる分化全能、ほぼ分化全能または分化多能性幹細胞およびそれらからの細胞は、そのような細胞のいかなる供給源から得ることができる。本発明中で用いるための分化全能、ほぼ分化全能または分化多能性幹細胞およびそれらからの細胞を製造する手段の一つは、適切な受容細胞中への核移植を経たものである。例えば、米国特許第545577号および米国特許第6215041号はこの参照により開示に含まれる。成体細胞は、しばしば胚細胞よりも容易にトランスフェクトするので、核ドナーとして成体分化細胞を用いた核移植は、本発明の出発物質としてトランスフェクトした幹細胞および遺伝的に修正された幹細胞の回収を容易にする。分化全能、ほぼ分化全能または分化多能性幹細胞の製造に至る核移植によるクローニングの他の態様は、また、背景技術の項目において上記した本願出願人による同時係属米国特許出願において引用により開示する。
【００２５】
移植のための自系細胞の製造
胚幹細胞に基づいた技術の出現は、多くの新しい治療形式のための可能性を提供する。しかし、臨床の実施は、組織適合性の問題の最終的な解決が必要である。核移植(NT)技術を用いて患者の核ゲノムを有する分化全能性幹細胞を発生しうる能力は、移植医療におけるこの最後の主要な難関に打ち勝つだろう(1)。それは、患者の核ゲノムを有する、ほとんど全ての細胞および組織種の製造を可能にするだろう。そして出発体細胞は、インビトロでその核ドナー細胞としての機能を失うことなしに培養されることができるので、前記出発体細胞は、遺伝子ターゲティング(2)によって遺伝子的に修正されることができ、核移植における核ドナー細胞としての前記修正型細胞の使用によって製造され生じた細胞もまた、遺伝子修正を有する。臨床での応用は、損傷した心組織の交換のための心臓筋細胞の製造、糖尿病患者のためのインシュリンを製造するB-細胞、その他多くを含む(3)。しかし、これらの治療の実行は、幹細胞単離を目的とした初期段階の胚の産生に依存する。
【００２６】
胚の再構築および再プログラム
核移植による胚の再構築は、卵母細胞の質、摘出および核移植工程、卵母細胞活性化のような物理的、化学的および生物学的な変量の数に依存している。卵割およびさらなる発生を経ることができる再構築された胚の製造を成功させるには、ドナー体細胞の遺伝物質が卵母細胞により再プログラムされる必要がある。前記再プログラムのメカニズム、関連する核の成分および制御しているパラメーターは、理解されていない。再プログラムは、ドナー核の遺伝物質の機能およびおそらく構造に影響する工程であるとみなされている。再プログラムの間に生化学的に修正される核成分は、ゲノムDNA、ヒストンおよび非ヒストンクロマチンタンパク質、核基質、並びに遺伝子発現のパターンを調節または制御する調節因子(刺激および抑制の転写因子、複合体等)を含有する可溶性タンパク質、ペプチドおよび核質の他の核構成成分を含む。再プログラムは、DNAメチル化およびヒストンアセチル化のパターン変化のようなドナー核のクロマチンの後成の構造的修正を含む。再プログラムは、また、核ドナー細胞と卵母細胞との両方の発生段階および細胞周期状態に影響されるように見える(6,16-23)。前記ドナー核の再プログラムの最も重要な効果は、胚細胞の遺伝的発現特性のパターンに分化した細胞からの遺伝子発現のパターンを変えることあるように思われ−最終的に胚細胞に有糸分裂および分化全能、ほぼ分化全能または分化多能性幹細胞である娘細胞または生じる娘細胞の形成を指示する能力がある。
【００２７】
2倍体前核の製造
本発明は、分化したヒト細胞の核がヒト卵母細胞中へ導入させることができる分化した細胞の遺伝物質は、卵母細胞の細胞質の内側に2倍体前核を形成するという発見によって確かな根拠を与えられる。2倍体前核に分化した細胞の遺伝物質のトランスフォーメーションは、分化全能、ほぼ分化全能または分化多能性幹細胞である娘細胞もしくはそれらを生じる娘細胞の発生を指示することができる、分化した細胞の遺伝物質の再プログラムのプロセスにおいて不可欠な工程である。本発明は、核が2倍体前核にトランスフォームするような条件下で、分化したヒト細胞の核が卵質にさらされる方法を提供する。さらに本発明は、前記遺伝物質が分化全能、ほぼ分化全能または分化多能性幹細胞であるようなまたはそれらを生じる娘細胞の発生を指示することができる再プログラムされるような条件下において、分化したヒト細胞の核中の遺伝物質が卵細胞質にさらされる方法を提供する。受精後の卵母細胞および精核のリモデリングから生じた自然の前核は1倍体であり、配偶子融合の間のそれらの融合は、単一の2倍体前核の形成を起こさない。本発明によって製造された2倍体ヒト前核は、自然には起こらず、人の関与がなければ存在しない。
【００２８】
本発明の実施形態の一つは、レシピエント卵母細胞から内生の染色体を除去することとほぼ同時に、前記ヒト卵母細胞に分化したヒト細胞の核を導入することを含む。卵母細胞の細胞質をさらした結果、前記導入した核の遺伝物質は、2倍体前核にトランスフォームされる。
【００２９】
卵細胞質に接触させることによって製造された前記2倍体前核は、移植治療に適切な、同系な細胞を生じる胚発生に用いることができる。例えば、本発明によって製造された2倍体前核は、前記遺伝物質は、それが遺伝的に活性化されたとき(およそ前記8細胞段階)、胚発生を命令するよう再プログラムされるように、再構築された卵母細胞中に残すことができる。前記胚が、内部細胞塊(ICM)を有する胚盤胞中で発達するとき、前記ICM細胞は、下に示すような胚幹(ES)細胞発生のために分離および培養されることができる。この方法で製造されたヒトES細胞は、移植治療に適切な分化多能性幹細胞および分化した細胞種の形成を引き起こすことができる。
【００３０】
もう一つの方法として、本発明によって製造された２倍体前核は、再構築された卵母細胞から抜き出し、遺伝子的活性に適当な胚発生を命令できる他の除核した卵母細胞中または除核された受精接合体中へ導入させることができる。そのような二重核移植法の例は、Campbellの国際出願第PCT/GB00/00086号およびHeindryckx等(Biol. Reprod., 2002, 67(6):1790-5)において説明されており、この参照により開示に含まれる。そのような方法のための前核を抜き取り移動する方法は、従来公知である。例えば、Liu等による(Hum.Reprod., 2000, 15(9):1997-2002)およびIvakhenko等による(Hum.Reprod., 2000, 15(4):911-6)はこの参照により開示に含まれる。
【００３１】
本発明によって製造された２-細胞、４-細胞、８-細胞桑実胚および胚盤胞を含む初期のヒト再構築胚は、公知の方法によってバラバラにされることができ、一つ以上の胚細胞が、細胞が移植治療に適した同系な細胞の発生に用いることができる胚に発生することを続行するであろう、空の帯(evacuated zona)に挿入されることができる。多数の同一の胚を製造するのに用いられる、そのような方法の例は、Johnson等(Vet.Record, 1995, 137:15-16)、Willadsen等(J. Reprod. Fert, 1980, 59:357-62)およびWilladsen等(Vet.Record, 1981, 108:211-3)の中で説明されており、この参照により開示に含まれる。ESを生じるICM細胞を製造するために多くの胚を培養するほど、ES細胞を得る可能性は大きくなるということが、当業者等によって認識されている。
【００３２】
本発明によって製造された２-細胞、４-細胞、８-細胞桑実胚および胚盤胞を含む初期のヒト再構築胚は、また、公知の方法によってバラバラにされることができる。個々の胚細胞は、移植治療に適している同系細胞の発生に用いることができる胚の製造のために、核ドナー細胞として用いることができ、核移植によるクローニングの公知の方法を用いて除核した卵母細胞と融合できる。多数の同一の胚を製造するのに用いられる、そのような方法の例は、Takano等(Theriogenology, 1997, 147:1365-73)およびLavoir等(Biol.Reprod, 1997, 56:194-199)の中で説明されており、この参照により開示に含まれる。
【００３３】
本発明はまた、露出した核またはヒト卵母細胞中への核移植とは別の方法によって卵細胞質に分化したヒト細胞の遺伝物質を含む２倍体前核を製造する方法を含む。例えば、卵質は、卵母細胞細胞質を含む疱(blebs)を有する細胞の融合によって分化したヒト細胞に入れられることができる。これは、Chapmanの本願出願人による同時係属米国出願第09/736268号において説明されており、この参照により開示に含まれる。卵質は、また、エレクトロポレーションによって分化したヒト細胞に入れることができる。これは、Dominko等の本願出願人による同時係属米国出願第10/228316号において説明されており、この参照により開示に含まれる。
【００３４】
ヒト２倍体前核は、また、例えば核移植などによる、露出した核または分化した非ヒト卵母細胞の卵細胞質のヒト細胞の遺伝物質よって製造されることができる。例えば、Robl等の本願出願人による同時係属米国出願第 09/685061号において説明されており、この参照により開示に含まれる。
【００３５】
本発明により形成された再構築胚の開裂によって形成された胚細胞は、また、染色体分析に有用である。Verlinskey等による(Fertil. Steril., 1999, 72(6):1127-33)はこの参照により開示に含まれる。
【００３６】
分化したヒト細胞の核再プログラム
下記の手順は、発明の実施の手順を説明する為に示されている。ヒト２倍体前核は、分化したヒト細胞の核をヒト卵母細胞中へ移動することによって生じる。これらの手順は、ヒト核移植を用いる、ヒト２倍体前核を製造すること、分化した体細胞の前記遺伝物質の再プログラムを生じさせること、および分化全能とほぼ分化全能と分化多能性細胞とを生じることができる胚細胞を発生することを含む。当業者は、以下に説明する前記方法の様々な工程のパラメータの値は、変更することができ、前記方法中において用いられる試薬は、実質的に前記手順またはその結果の特徴を変えることもしくはここに示す前記発明から離れることがなければ、類似した性質を有する異なる試薬によって代用させることができるということを十分理解するだろう。
【００３７】
A.卵母細胞の収集-この方法によって得られた前記卵母細胞は、核移植による体細胞核の再プログラムまたは単為生殖活性化のどちらかに用いることができる。
1.卵母細胞は、hCG投与後30から50時間で公知の手順によって卵胞から吸い出される。例えば、超音波導糸針の使用等である。
2.卵母細胞は、公知の方法によって卵丘細胞を剥ぎ取られる。例えば、ヒアルロニダーゼを含む培地中(例えば、ハンクス培地中の1mg/mlヒアルロニダーゼ等)における精密に吸い込むことができる(finely pulled)ピペットを用いた上下のピペッティング運動による方法である。
3.露出した卵母細胞は、1％ウシ血清アルブミン(BSA)を伴うハンクスまたは1％ヒト血清アルブミン(HSA)を伴うハンクス培地のような適切な培地中に置かれ、単為生殖活性化または核移植手順が行われる研究所へ輸送される。
4.回収後0から約12時間以内に、前記卵母細胞は、ミネラルオイルを重層した適切な細胞を伴うG1(SERIESIII)、KSOMまたはGEM培養培地液滴中に置かれ、単為生殖活性化または
核移植手順が行われるまで培養される。例えば、よい結果は、卵母細胞をミネラルオイルを重層した5mg/mlHSAを伴う500μlのG1(SERIESIII)、KSOMまたはGEM培養培地液滴中へ置き、単為生殖活性化または核移植手順が行われるまで6％CO2を含む大気下37℃で培養することによって得られる。
【００３８】
A.体細胞調製
1.分化した体細胞性ドナー細胞のインビトロでの培養は、カルシウム-フリーのダルベッコ加リン酸緩衝生理食塩水(DPBS,Sigma)中のトリプシン-EDTA溶液を用いて分離および懸濁される。例えば、室温で5分間である。一度単一細胞の懸濁液が得られたら、前記酵素活性を、例えば、30％ウシ胎児血清を加えることによって中和する。
2.前記細胞懸濁液は、前記細胞を沈殿するために緩やかに遠心される。例えば、500 gで10分間である。
3.前記上澄みは捨てられ、前記細胞沈殿は、例えば、1mg/mlのHSAを含むヒト細管流体中(HTF)等の適切な培地中において再懸濁させた。前記細胞は、分離後0-24時間以内は核移植のためのドナー細胞として用いることができる。
【００３９】
あるいは-
核ドナー細胞として用いられる細胞(例えば、白血細胞または卵母細胞からの顆粒層/卵丘細胞)は、ヒトドナーから直接得られ、例えば、1mg/mlのHSAを含むHTF等の適切な培地中へ置かれる。前記細胞は、単離後0-5日以内に核移植のためのドナー細胞として用いられる。
【００４０】
B.核移植
1.卵母細胞は、ミネラルオイルを重層した少量のG1(SERIESIII)、KSOMまたはGEM+培養培
地から取り出し、33342ヘキストを含む少量のG1(SERIESIII)、KSOMまたはGEM+培養培地
へ移し、前記卵母細胞のクロマチンを標識するために約6-18分間培養される。例えば、前記卵母細胞は、ミネラルオイルを重層した1μg/mlの33342ヘキスト染料を含む5mg/mlのHSAを伴う500μmのG1(SERIESIII)、KSOMまたはGEM+培養培地へ移され、6％CO2を含む大気下37℃で15分間培養される。
2.体細胞性ドナー細胞は、ミネラルオイルを重層した1mg/mlHSA、20%FCSおよび10μg/mlサイトカラシンBを含む100μlのHTF操作用液滴中に置かれる。
3.卵母細胞は、体細胞性ドナー細胞を含む水滴に隣接した、ミネラルオイルを重層した、1mg/mlHSA、20%FCSおよび10μg/mlサイトカラシンBを含む100μlのHTF操作液滴中に移され、全プレート(例えば100mmファルコンプレート)は、前記顕微鏡の37℃加熱試料台に置かれる。
4.約15分後-
a.前記卵母細胞中における中期II赤道面(染色体の)は、紫外線下において5秒だけ視覚化され、レーザー(    )は、隣接した前記卵母細胞のMII板透明帯に20ミクロンの穴を開けるために用いられる。
b.MII赤道面の染色体は、卵母細胞の完全性を傷つけることなく、炎で研磨された内径20μm(I.D.)ガラスピペット中への吸い込みによって除かれる。
c.小さい体細胞の一つは、炎で研磨された内径20μmのガラスピペットを用いて選ばれ、前記卵母細胞の卵黄周囲腔に置かれる。
【００４１】
レーザーを用いて前記透明帯に穴をあける代わりに-
前記透明帯に穴をあけるために傾斜(beveled)ピペットが用いられる；または
孵化をアシストする間に用いられる前記手順に似た前記透明帯に穴をあけるためにtyroid酸で満たされたピペットが用いられる；または
圧電装置(Prime Tech)は、前記MII赤道面に直接隣接するポイントに鋭くないガラスピ
ペットを打ち込むために用いられる。
5.上記の手順によって製造されたカプレット(卵母細胞および体細胞)は、前記操作用液滴から、5μg/mlHSAを含む500μlのG1(SERIESIII) 培養培地、KSOMまたはGEM液滴中へ移され、融合が行われるまでミネラルオイルを重層した6％CO2を含む大気下37℃で培養される。
6.細胞移植から0-24時間後、前記卵母細胞は、ミネラルオイルを重層したG1(SERIESIII)
、KSOMまたはGEM+培養培地液滴の外へ移され、1mg/mlのHSAを含む3mlのHTFを含む培養プレート(例えば、30mmファルコンプレート)の中へ移され30秒間培養される。
7.前記カプレットは、次に1mg/mlHSAを伴う50％HTFおよび50％融合培地(ソルビトールベース)溶液中へ1分間移される。
8.カプレットは、100％融合培地中へ移される。
9.前記カプレットは、融合培地で満たされたBTX融合チャンバー(500μl gap)に移され、2つの電極の間に置かれる。
10.前記カプレットの整列は、前記体細胞および卵母細胞の軸が、電極軸に対して垂直になるように、ガラスピペットを用いて手動で行われる。
11.15μ秒間の間150ボルトの1-10融合パルスが与えられる。
12.前記カプレットは、すぐに1mg/mlのHSAを含む50％HTFおよび50％融合培地(ソルビトールまたはマニトールまたはグルコースベース)の溶液中へ1分間移される。
13.前記カプレットは、1mg/mlのHSAを含む3mlのHTFを含む培養プレート(例えば30mmファルコンプレート)へ1分間移される。
14.前記カプレットは、5mg/mlHSAを含む500μlのG1(SERIESIII)またはKSOMまたはGEM培養培地液滴中に移され、活性化が行われるまでミネラルオイルを重層した37℃の6％CO2を含む大気下で培養される。
【００４２】
あるいは-
圧電装置(Prime Tech)は、体細胞の核を注入する、鋭くないガラスピペットを打ち込むために用いられる。
【００４３】
C.卵母細胞活性化
1.hCG投与後30-50時間の間のいずれかで、融合再構築した胚は、1mg/mlHSAを伴うHTF中のイオノマイシンの10μM溶液中に1-20分間置かれる。
2.再構築した胚は、5mg/mlHSAを含むG1(SERIESIII)、KSOMまたはGEM培養培地中500μlの6-DMAP2mM溶液中に移され、ミネラルオイルを重層した37℃の6％CO2を含む大気下で、0.5-24時間培養される。
3.再構築した胚は、DMAP溶液から取り出され、異なる3つの1mg/mlHSAを含むHTFのプレート(30mmファルコン)中で3回濯がれる。
4.再構築した胚は、5mg/mlHSAを含むG1(SERIESIII)、KSOMまたはGEM培養培地の500μl液滴中に移され、ミネラルオイルを重層した37℃の6％CO2を含む大気下で培養される。
【００４４】
D.胚の培養
1.はじめの72時間の間、前記再構築した胚は、5mg/mlHSAを含むG1(SERIESIII)、KSOMまたはGEM培養培地の500μl液滴中で培養され、ミネラルオイルを重層した37℃の6％CO2を含む大気下において培養される。
2.残りの培養期間(73時間から胚盤胞まで)、前記胚は、ミネラルオイルを重層した37℃の6％CO2を含む大気下において、5mg/mlHSAおよび過剰排卵されるヒト卵母細胞ドナーから得られる10%不活性熱卵胞液の500μlのKSOM+AA+グルコース(特性培地)中で培養される。
3.一度胚盤胞が発生すると、内部細胞塊(ICM)は単離される。
【００４５】
E.内部細胞塊分離
1.孵化した胚盤胞は、透明帯が消化されるまでtyroid酸中に数秒間置かれ、次に1mg/mlHSAを伴うHTFに2分間まで移される。
2.前記胚盤胞は、HSAを伴わないG1(SERIESIII)、KSOMまたはGEM中BeWo細胞に対するポ
リクローナル抗体血清の溶液(1:5)に1時間移される。
3.胚は、1mg/mlHSAを伴うHTFで3回濯がれ、HSAを伴わないG1(SERIESIII)、KSOMまたはGEM中テンジクネズミ補体の溶液(1:3)に栄養膜溶解が起こるまで移される。
4.前記ICMは、1mg/mlHSAを伴うHTFで濯がれ、例えば、15%胎児性仔ウシ血清を伴うDMEM中、有糸分裂で培養された不活性マウス胎児線維芽細胞等の適切なフィーダー細胞層上に置かれる。
【００４６】
全てのオスまたはメス起源のDNAを含有する卵母細胞を含む哺乳類の卵母細胞の人工活性化は、物理的および化学的な刺激の広い種類によって引き起こされることができることが知られている。そのような方法の例を、以下の表に列挙している。
【表１】
2005510232.tif 000002
【００４７】
上記と同様の核移植手順を用いると、分化したヒト体細胞である、線維芽細胞および卵丘細胞の２つの異なる種類の核は、除核されたヒト卵母細胞中へ移動され、２倍体前核の形成および前記胚細胞を分割したものへ移動した核の遺伝物質を再プログラムすることになる。これらの結果およびそれらを得るために用いられる前記方法は、以下の例でさらに詳しく説明されている。
【００４８】
治療上の適用
本発明の発展に至った前記研究に着手するに先立ち、前記出願人は、前記譲受人Advanced Cell Technologyの調査の方向を指導するために集められた倫理顧問機関-独立した倫理学者、弁護士、受胎専門家およびカウンセラーに意見を聞いた。前記倫理委員会は、前記仕事を続行することを勧める前に、５つの鍵となる問題を検討した。(Cibelli et al., Scientific American, November 24, 2001, pp. 45-51参照)
【００４９】
治療上のクローニングは、クローンされた子どもの誕生に至らせるためにクローンされた胚を女性の子宮へ移植する狙いである生殖のクローニングとは別である。本発明の前記発明者等は、生殖のクローニングは、現在母親および胎児の両方に許されない危険の可能性を有するということを信じており、それを取り巻く安全性のおよび倫理的な問題が解決されるまで生殖目的のクローニングを制限することを支持する。完全な有機体を製造する狙いの生殖のクローニングと異なり、ヒト治療のクローニングは、最も早い着床前段階を超える発生を得ることを求めない。
【００５０】
治療上のクローニングの目標は、患者へ戻すことができる自系の細胞および組織を発生させるために患者自身の細胞からの前記遺伝物質を用いることである。治療上のクローニングを用いると、再生治療のための細胞の供給源として、胚盤胞の内部細胞塊からの胚幹細胞等のインビトロで始原幹細胞を得ることが可能である(３)。治療上のクローニングによって発生した前記移植細胞は同系であるので、それらは、前記患者のHLAタイプと適応し、移植された細胞の免疫拒絶反応は、仮に起こったとしても弱められるだろう。動物の研究は、本発明の前記治療上のクローニングの方法によって製造される分化全能、ほぼ分化全能および分化多能性細胞および組織は、糖尿病、関節炎、エイズ、脳卒中、癌およびパーキンソン病、アルツハイマー病のような神経退行性疾患を含むヒトの疾患状態の広い範囲の治療において重要な役割を務めるということを示唆している(24-27)。例えば、前記開示された治療上のクローニング技術によって製造された幹細胞は、糖尿病の治療のためのすい島を発生させることや傷つけられた脊髄の修復のための神経細胞を発生させることに用いることができる。個々のまたは小グループの交換した細胞の発生に加え、ここで開示された前記方法によって製造される前記細胞は、また、血管、心筋の“パッチ”、腎臓および心臓全体でさえを含む、より複雑な組織および器官の再構築に用いることができる(28、29)。
【００５１】
ここで開示される技術は、これら様々な組織の移植に伴う免疫反応を減少するまたは除去する可能性を有し、従って、組織適合性移植片が見つけることができないので、非組織適合性細胞および組織の移植片を受けることを強いられる多くの患者の生命を重大で潜在的に脅かす合併症の危険性をもたらす、免疫抑制薬および/または免疫調節プロトコルの必要性を減少するまたは除去する可能性を有している。
【００５２】
最近の研究は、同種異系幹細胞は、免疫拒絶反応の引き金となる抗原性細胞表面タンパク質を製造し、従って、本発明の方法によって供給できる治療的移植片に適切な前記同系自系の細胞が大いに必要であるということを示している。
【００５３】
本発明の前記方法によって製造される治療的移植片に適切な細胞は、前記移植片のレシピエントと同系であり、HLA適合である。移植拒否反応の引き金となる自己/非自己の主な表面タンパク質決定因子について、本発明よって製造される治療的移植片のための前記細胞は、移植片のレシピエントと組織適合性である。最近の研究は、前記細胞は異なる動物からのミトコンドリアを有するという事実にもかかわらず、核移植によって製造されたクローン細胞は、同系移植片のレシピエント中において免疫拒絶反応を引き出さないということを明らかにしている。Lanza等(Nat. Biotech., 2002, 20:689-695参照)。同様の研究が、霊長類(カニクイザル)を用いて行われている。それらは、核移植によって製造された細胞中の前記異系ミトコンドリアによってコードされた抗原、または単為生殖によって製造された細胞中の遺伝子組換えから生じる抗原のために本願発明により製造された自系および/または同系移植片は拒絶されるという可能性を残している。それにもかかわらず、本発明によって製造された前記自系細胞と自系または同系レシピエントのものとの間の前記HLAが適合するために、そのような抗原によって引き出された免疫拒絶反応は、同種移植片によって引き出されたものよりもかなり弱いと予想される。
【００５４】
核移植クローニングによって製造された胚からの細胞および組織
本発明の実施形態の１つにおいて、細胞治療における使用にとって重要な治療上の可能性を有している細胞は、核移植クローニングによって製造される初期段階の胚に由来する。これは、移植に適した細胞または組織を誘導することができる胚を製造するための、ドナー細胞またはそのような細胞の核、染色体の卵母細胞への移動すること、および連携した卵母細胞遺伝子DNAを除去することを含むクローニングの方法である。例えば、2000年9月6日に出願された本願出願人による同時係属米国出願第09/655815号および2001年3月5日に出願された米国出願第09/797684号に説明されており、この参照により開示に含まれる。
【００５５】
移植片に適切な組織適合性細胞および組織を提供するために、核移植クローニングは、移植片のレシピエントである前記ヒトまたは非ヒト哺乳類からのドナー生殖または体細胞を用いて実行されており、前述の米国特許文献において説明されている。あるいは、移植に適切な細胞および組織は、前記治療的移植片のものと適合するMHC対立遺伝子を含むDNAを有するドナー細胞との核移植クローニングを行うことによって得ることができる。そのような方法によって製造された胚から由来の細胞および組織は、前記移植レシピエントの細胞と同系ではないが、同じMHC抗原を有するので、前記レシピエントによる拒絶は抑えられる。このことは、2002年5月24日に出願された“核移植により得られる同型接合体MHC対立遺伝子を有する治療的移植片のための幹細胞のバンクおよびそのような幹細胞バンクの製造、使用方法”において説明されており、この参照により開示に含まれる。
【００５６】
本発明は、移植治療が必要な患者に単為生殖に起因する治療上のクローニングまたは細胞治療を提供することを可能にする。現在のところ、試みは、神経および心臓系の疾患ならびに糖尿病と、自己免疫異常と、血液および骨髄を含む疾患とに集中している。
【００５７】
クローン細胞から神経細胞を得る技術が完成されると、前記発明者等は、脊髄の損傷を回復できるだけでなく、ドーパミンと呼ばれる物質を作る脳細胞の死が制御できない震えおよび麻痺を引き起こす、パーキンソン病のような脳障害も治療することができると予想している。アルツハイマー病、脳卒中および癲癇もまた、そのようなアプローチに屈服するかもしれない。
【００５８】
糖尿病の治療のためのインシュリンを製造するすい島細胞の他に、クローン胚からの幹細胞は、また、うっ血心不全、不整脈および心臓麻痺による心臓組織傷のための治療として心筋細胞になることを刺激されることができる。
【００５９】
より興味深い応用の可能性は、クローン幹細胞を促して血液および骨髄細胞に分化させることを含む。多発生硬化症および慢性関節リウマチのような自己免疫異常は、骨髄から発生する前記免疫システムの白血細胞が前記体自身の組織を攻撃する場合に発生する。予備研究は、自己免疫異常を有する癌患者は、前記癌の治療のための高投与量化学療法によって殺された彼等自身の髄質を取り替える骨髄移植を受けた後、自己免疫の病状からの緩和を得たということを示した。造血(blood-forming)または造血(hematopoietic)クローン幹細胞の注入は、自己免疫異常を有する人々の前記免疫システムを"再起動する"かもしれない。
【００６０】
上記で関連付けた特許および未解決出願において説明されているように、本発明による核移植胚を製造するために核移植に用いられた前記ドナー体細胞は、体内のいかなる種類の生殖細胞または体細胞になることができる。例えば、前記ドナー細胞は、線維芽細胞、B細胞、T細胞、樹状細胞、ケラチン細胞、脂肪細胞、上皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞、メラニン形成細胞、造血細胞、マクロファージ、単球および単核細胞からなる群から選択される生殖細胞または体細胞である。前記ドナー細胞は、体内のいかなる器官または組織から得られることができる；例えば、肝臓、胃、腸、肺、膵臓、角膜、皮膚、胆嚢、卵巣、精巣、腎臓、心臓、膀胱および尿道からなる群から選択される器官から得ることができる細胞である。
【００６１】
ここで用いられたように、摘出(enucleation)は、例えばレシピエント卵母細胞等の細胞から前記遺伝子DNAを除去することを言う。従って、摘出は、例えば中期赤道面の染色体の除去等の、核膜によって囲まれていない遺伝子DNAの除去を含む。上記で関連付けた特許および同時係属出願において説明されているように、前記レシピエント細胞は、核移植前、同時にまたは後のいずれでも、いかなる公知の方法によって摘出されることができる。例えば、レシピエント卵母細胞は、前記卵母細胞が分裂中期に捕獲されたとき、卵母細胞減数分裂期が分裂終期に進行したときまたは減数分裂期が終了し母系前核が形成したときに摘出されてよい。
【００６２】
上記の特許および同時係属出願において説明されているように、ドナーゲノムは、注入またはドナー核細胞とレシピエント細胞との融合によって前記レシピエント細胞に取り入れられる。例えば、電気融合またはセンダイウィルスを介した融合等である。適切な試験およびマイクロインジェクション法は公知であり、多くの発行済み特許の主題である。前記ドナー細胞、核または染色体は、増殖性細胞(例えば、細胞周期がG1、G2、S、またはM期の細胞)からであることができ、あるいは、それらは静止した細胞(G0期)から誘導される。
【００６３】
上記の特許および同時係属出願において説明されているように、前記レシピエント細胞は、核移植の前、同時にまたは後に活性化される。
【００６４】
胚からの治療上の細胞および組織の直接回収
移植のための細胞または組織は、単細胞から発育約６週間までの原腸胚を形成する胚の形成のために、インビトロで培養された核移植胚から得ることができる。例えば、移植のための細胞または組織は、15日から約4週間までの胚から得られる。あるいは、非ヒトNT胚の場合、移植のための細胞または組織は、NT胚の適切な母系レシピエントへの移動および前記NT胚を子宮中で6週間までまたはそれ以上成長させることによって、6週間までまたはそれ以上の原腸胚を形成する胚から得られる。その結果として、それは、前記母系レシピエントの子宮から回収され、移植のための細胞または組織の供給源として用いられる。
【００６５】
単細胞から発育約６週間までの成長段階の原腸胚形成胚から得られる前記治療上の細胞は、分化多能性幹細胞および/または特別な細胞系に引き渡されることが始まる細胞でありうる；例えば、肝細胞、心筋細胞、膵臓の細胞、血管芽細胞、造血の前駆、CNSの前駆およびその他のものである。
【００６６】
分化多能胚幹細胞からの治療上の細胞および組織の発生
上記において説明した原腸胚を形成する胚から移植のための細胞および組織を得ることに加えて、本発明による治療上の移植のための細胞および組織は、本発明により製造された核移植胚由来の分化多能および/または分化全能性幹細胞から発生させることができる。同時係属米国出願第09/655815号および米国出願第09/797684号において説明され、引用により開示に含まれている、本発明による核移植法により製造された分化多能および分化全能性幹細胞は、生殖細胞を含む特定の見分けがつく細胞種に分化する細胞系統を生じる公知の方法および条件を用いて培養されることができる。これらの方法は以下を含む；
a)ドナー細胞またはそのような細胞の前記核、染色体を卵母細胞または他の適切なレシピエント細胞に挿入し、同時に核移植胚を製造するために卵母細胞または他のレシピエント細胞の遺伝子DNAを除去する；および
b)前記ドナー細胞の遺伝子DNAを有する前記胚から、移植に必要とされる幹細胞および/または分化した細胞および組織を生じる。
そのような方法は、分化多能性幹細胞および/または分化全能性胚幹(ES)細胞の発生に用いることができる。この方法において製造された分化多能性幹細胞は、特定の見分けがつく細胞種に分化する細胞系統を生じるために培養されることができる。核移植によって製造された前記分化全能性ES細胞は、生殖細胞を含む体の全ての細胞種に分化する能力を有する。例えば、核移植胚由来の前記分化多能および/または分化全能性幹細胞は、免疫細胞、神経細胞、骨格筋芽細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、皮膚細胞、すい島細胞、造血細胞、腎臓細胞および肝細胞からなる群から選択される本発明による移植片に適切な細胞に分化することができる。そのような方法により製造された前記分化多能および分化全能性幹細胞は、前記患者自身の遺伝子DNAを有しているので、これらの幹細胞から生じた前記分化した細胞および組織は、ほとんど完全に自系である。前記卵母細胞由来の、前記細胞のミトコンドリアによりコードされたものを除く前記細胞タンパク質の全ては、前記患者自身のDNAによりコードされる。従って、そのような核移植法によって製造された幹細胞から生じる分化した細胞および組織は、無関係の細胞または組織が移植されたときに生じる、過酷な拒否反応を起こすことなしに移植に用いられることができる。
【００６７】
本発明による霊長類ゲノムDNAを有する前記分化多能および分化全能性幹細胞の調製において、一つは、James A. Thomsonの2001年3月13日に出願された米国特許第6200806号“霊長類胚細胞”において説明される方法を用いることができる。例えば、前記Thomson特許は、以下を含む、ヒト分化多能性幹細胞を調整する方法を説明している；
a)ヒト胚盤胞を単離する
b)胚盤胞の内部細胞塊からの細胞を単離する
c)内部細胞塊由来細胞集団を形成するために、胚線維芽細胞上の前記内部細胞塊細胞培養する
d)前記集団を分離された細胞に分離する
e)胚フィーダー細胞上の前記分離された細胞を再培養する
f)密なモルフォロジーコロニーと、核に対する高い比の細胞質および顕著な核小体の細胞  とを選択する
g)分化多能ヒト胚幹細胞系の発生のために前記選択された細胞を培養する
【００６８】
Thomsonの米国特許第6200806号はこの参照により開示に含まれる。
【００６９】
本発明によって移植に有用な前記分化多能ヒト胚幹細胞の造血細胞への分化を引き起こす方法は、2001年8月28日に出願されたKaufman等の、米国特許第6280718号“ヒト分化多能胚幹細胞の造血分化”に説明されており、詳細が開示されている。Kaufman等の前記特許において開示されている前記方法は、メチルセルロース培養中に置いたときに、造血細胞コロニー形成ユニットを形成する造血細胞を形成するための前記幹細胞の少なくともいくつかが分化を引き起こすために、分化多能ヒト胚幹細胞の哺乳類造血間質細胞への培養をさらすことを含む。
【００７０】
移植のための“ハイパーヤング”細胞および組織の発生
核移植クローニング法は、また、移植片に適切な細胞または組織を誘導できる“ハイパーヤング胚”を発生させるに用いることができる。ヒトまたは非ヒト哺乳類のドナー体細胞のゲノムDNAを有する、若返った“ハイパーユースフル”幹細胞および前記分化した体細胞を生じるための方法は、2000年3月16日に出願された本願出願人による同時係属米国特許出願第09/527026号、2000年4月5日に出願された第09/520879号および2000年9月6日に出願された第09/656173号において説明されており、この参照により開示に含まれる。例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳類のドナー体細胞のゲノムDNAを有する、若返った“ハイパーユースフル”細胞は、以下を含む方法によって製造できる：
a)ヒトまたは非ヒト哺乳類ドナーからの普通の体細胞を単離し、そうでなければ前記細胞を継代させるまたは阻止チェックポイント、老化またはほとんど老化の状態に誘導する
b)そのようなドナー細胞、前記細胞の核または前記細胞の染色体をレシピエント卵母細胞に移動させ、同時に前記卵母細胞から卵母細胞ゲノムDNAを取り除いて胚を発生
c)前記ドナー細胞のゲノムDNAを有する前記胚から若返った細胞を得る
【００７１】
前記胚から得られる前記若返った細胞は、分化多能性幹細胞または部分的、最終的にに分化した体細胞になることができる。上記において説明された同時係属出願によると、若返った分化多能および/または分化全能性幹細胞は、前記胚を用いる胚盤胞、胚盤細胞、内部細胞塊細胞または奇形腫細胞を得ること、および前記胚盤胞、内部細胞塊細胞、胚盤胞板細胞または奇形腫細胞から前記分化多能および/または分化全能性幹細胞を発生させること含む方法によって核移植胚から生じることができる。
【００７２】
上記において説明された同時係属出願によると、本発明によって核移植胚から誘導される若返った胚は、核移植技術による発生ではない同じタイプおよび種類の年齢が対応する対照細胞のものと同様またはそれ以上の長いテロメアおよび増殖寿命を有することで優れている。その上、そのような若返った細胞の前記テロメアを含む前記直列反復(TTAGGG)nの前記ヌクレオチド配列は、より均一および規則的である；すなわち、核移植による発生ではない同じタイプおよび種類の年齢が対応する対照細胞の前記テロメアが存在しているよりも、特に少ない非テロメアヌクレオチド配列を有する。そのような若返った細胞は、また、若い細胞の特徴である遺伝子発現のパターンを有する；例えば、そのような若返った細胞中のEPC-１およびテロメラーゼの活性は、核移植技術による発生ではない同じタイプおよび種類の年齢が対応する対照細胞よりも典型的に大きい。さらに、核移植手順により製造されたクローン動物の免疫システムは高められることが示される。すなわち、核移植技術による発生でない動物のものより大きな免疫応答性を有する。例えば細胞治療の必要があるヒトまたは非ヒト哺乳類のような患者に取り入れたとき、そのような“ハイパーヤング”胚から誘導される前記細胞および組織は、例えば、心臓、脳、肝臓、骨、骨髄、腎臓または細胞治療の必要がある他の器官等の、所望の標的位置に効果的に進入および増殖する能力がある。そのような“ハイパーヤング”胚から誘導される造血前駆細胞は、患者に進入し、例えば血液および骨髄等の前記免疫システムへの移動による個体の前記免疫システムを若返らせることが予想される。同じように、そのような“ハイパーヤング”胚から誘導されるCNS前駆細胞は、例えば、パーキンソン、アルツハイマー、ALSまたは加齢性老化を患う患者等の脳へ優先的に移動することが予想される。
【００７３】
ヒト卵母細胞の単為生殖活性化
前記発明者等は、また、精子による受精または除核およびドナー細胞の注入無しに、ヒト卵子を初期胚に分割することを引き起こすことが可能かどうかを決定するよう努めた。成熟した卵子および精子は、受精に続き胚が２重セットの遺伝子を有するのを妨げるために普通は典型的な体細胞の前記遺伝物質の半分のみを有するけれども、卵子は、それらの遺伝子的補完物を成熟周期の中で比較的遅く２等分する。もしその段階前に活性化されれば、それらは、遺伝子の完全なセットを保持している。
【００７４】
そのような単為生殖活性化から誘導される幹細胞は患者自身の細胞と非常に類似しているので、それらは、移植後に拒否されることなく、患者の免疫システムに馴染みのない多くの分子は製造されないだろう。(それらは、卵子および精子の形成の間にいつも起こる前記遺伝子シャッフリングが原因で、前記個々の細胞と一致しないだろう)。また、１部の人にとって、そのような細胞は、生じる倫理的なジレンマはクローン初期胚から誘導される幹細胞よりも少ないかもしれない。
【００７５】
一つの筋書きの下に、心臓病をもつ女性は、胚盤胞を生じるために前記研究所において彼女自身の卵子の収集および活性化が行われた。科学者たちは、前記胚盤胞から単離される幹細胞を誘導するために成長因子の組み合わせを用い、心筋細胞を前記女性へ移植することができる研究所の皿で成長させ、前記心臓の病んだ部分にパッチをすることができた。男性の治療のための幹細胞の創造のために雄性発生と呼ばれる類似した技術は、扱いにくい。しかしそれは、前記男性の精子の２つの核を、寄与された核を奪われた卵子へ移動することを含む。
【００７６】
研究者たちは、以前電気ショックのような異なる化学的または物理的刺激物に晒すことによって胚に分割するためにネズミおよびウサギの卵子を刺激することを報告した。早くも１９８３年、現在ハーバート大学にいるElizabeth J Robertsonは、単為生殖ネズミ胚から単離される幹細胞は、神経および筋肉を含む様々な組織を形成することができるということを証明した。以前の研究は、ヒト単為生殖の発展の可能性を示した。１９９６年にRhoton-Vlasak等(13)は、カルシウムイオノホアでの短い培養は、前核の形成を引き起こすことができるということを示し、最近Nakagawaおよび本願出願人による研究者等(14)は、カルシウムイオノホアとプロマイシンまたはDMAPとの組み合わせは、前核形成の引き金を引くことだけでなくすばやく卵割することができるということを証明した。同様の実験記録は、非ヒト霊長類の卵母細胞に応用できることを示した(15)。
【００７７】
ここに開示した前記結果は、本発明ヒト卵母細胞の単為生殖活性化、胚開裂および前記分割腔の形成の効果的なプロトコルを提供するということを示している。この発明は、父方の寄与無しのヒト分化全能性幹細胞の発生の代わるべき手段を提供する。
【００７８】
２つの雌PNと雄PNとの取り替え(好ましくは１つのX染色体を有する)
さらに、前記単為生殖メス前核の除去および前記２つの雄精核の移動は、前記胚の製造および雄ドナーのための幹細胞を生じることを許す。
なぜ自系移植はいまだに拒否されるのか
DNAの再結合は、遺伝子発現のパターンを変えるかもしれないので移植片は免疫反応の引き金になる。
しかしHLA適応によって、免疫拒絶のかなりの減少が予想される
取り掛かるための多彩なトピックス
分化したヒトドナー細胞の選択
どのような分化細胞でも
体細胞または生殖細胞
若返り細胞の製造のための老化/似老化ドナー細胞の使用
卵母細胞の供給源
ドナー細胞およびレシピエント卵母細胞の細胞サイクル
活性化の方法
体細胞。
【００７９】
(実施例)
ヒト調査ガイドライン
この研究の遂行のための完全なガイドラインは、Advanced Cell Technologyから独立した倫理顧問機関(EAB)によって確立された。生殖のクローニングのどんな可能性も防ぐために、前記EABは、研究に用いられる全ての卵母細胞および胚の注意深い記録を必要としている。NT技術によって創作された胚で14日以上の発達が継続されたものはない。また前記EABは、今回の研究に用いた前記ヒト卵母細胞を供給するドナープログラムのためのガイドラインおよび取り締まりを確立した。これは、ドナーの危険を最小限にすること、ドナーは前記リスクについて完全に知らされること、および彼等の同意が自由であり、および知らされることを保証するための広い取り組みを含んでいた。この主題の更なる情報は、Advanced Cell Technology'sのインターネットウェブサイトで得ることができる。前記倫理学上の問題の批評は、(12)を参照。
【実施例１】
【００８０】
体細胞核移植によるヒト体細胞前核再プログラムのための手順：
A.卵母細胞収集
1．卵母細胞は、hCG投与後33−34時間で、超音波穿刺を用いて卵胞から吸いだされる。
2.卵母細胞は、1mg/mlヒアルロニダーゼを含むハンクス培地中、精密に吸い込むことができる(finely pulled)ピペットを用いた上下のピペッティング操作によって卵丘細胞を剥ぎ取られる。
3.卵丘細胞を除いた後、前記卵母細胞は、1%牛血清アルブミン(BSA)または1%ヒト血清アルブミン(HSA)を含むハンクス培地中に置き、核移植工程が行われる研究所に運ぶ。
4.回収から1-2時間以内に、前記卵母細胞は、ミネラルオイルを重層した5mg/mlHSAを含む500μlのG1(SERIESIII)培養培地液滴中に置き、6％CO2を含む大気下37℃で核移植工程が行われるまで培養された。この工程によって得られた卵母細胞は、自系の幹細胞の発生に用いることができる単為生殖の前核を製造するために活性化することができる(下記参照)。
【００８１】
B.体細胞性核ドナー細胞の調製
1.体細胞性核ドナー細胞の密集していない培養液は、カルシウムフリーDPBSのトリプシン-EDTA溶液を用いて室温下で5分間、分離および懸濁される。単一細胞の懸濁液が得られると、前記酵素の活性中和のために30%胎児ウシ血清が加えられる。
2.細胞の懸濁液は、500 gで10分間遠心される。
3.上澄み液は捨てられ、細胞の沈殿は、1mg/mlのHSAを含むヒト細管流動体(HTF;Irvine Scientific, Santa Ana, CA)を用いて再懸濁させる。前記核ドナー細胞は、分離から2時間以内に核移植に用いられる。
【００８２】
あるいは−
体細胞は、ドナー(例えば、白血細胞または卵母細胞からの顆粒層/卵丘細胞)から直接得られ、および1mg/mlのHSAを含むHTF中に置かれ、単離から2時間以内に核移植に用いられる。
【００８３】
C.核移植
１.卵母細胞は、ミネラルオイルを重層した5mg/mlHSAを含む500μlのG1(SERIESIII)
培養培地液滴から得られ、1μg/ml 33342ヘキスト染料を含む5mg/mlHSAを伴う500μlのG1(SERIESIII)培養培地液滴に移され、6％CO2を含む大気下37℃においてミネラルオイルを重層して15分間培養される。
2.体細胞性核ドナー細胞は、ミネラルオイルを重層した1mg/mlのHSA、20%FCSおよび10ug/mlのシトカラシンBを含む100μlのHTFの操作用液滴中に置かれる。
3.卵母細胞は、体細胞を含む前記液滴に隣接した、ミネラルオイルを重層した1mg/mlのHSA、20%FCSおよび10ug/mlのシトカラシンBを含む100μlのHTF操作用液滴に移され、前記全プレート(100mmファルコン)は37℃で前記顕微鏡の加温試料台に置かれる。
4.培養から10分後、前記卵母細胞の中期II赤道面は、5秒だけ紫外線ランプを用いて視覚化される；そしてレーザー(    )は、前記卵母細胞の中期II赤道面に隣接した透明帯に20ミクロンの穴を開けるために用いられる。
5.前記卵母細胞染色体は、卵母細胞の完全性を傷つけることなく、炎で研磨された内径20μmガラスピペット中への吸い込みによって除かれる。
6.小さい体細胞の一つは、炎で研磨された内径20μmガラスピペットを用いて取り上げられ、前記卵母細胞の卵黄周囲腔に置かれる。
7.カプレット(卵母細胞および体細胞)は、操作用液滴からミネラルオイルを重層した5mg/mlHSAを含む500μlのG1(SERIESIII)培養培地液滴に移され、融合が行われるまで、
6％CO2を含む大気下37℃で培養される。
8.細胞移動から15分後、前記カプレットは、5mg/mlHSAを含む500μlのG1(SERIESIII)培養培地液滴から1mg/mlHSAを含む3mlのHTFを含む30mmファルコンプレートに30秒間移される。
9.前記カプレットは、1mg/mlのHSAを伴う50%HTFおよび50%融合培地(ソルビトールベース)の溶液に1分間移される。
10.前記カプレットは、100%ソルビトール融合培地の溶液に移される。
11.前記カプレットは、ソルビトール融合培地で満たされたBTX融合チャンバー(500μl gap)に移され、2つの電極の間に置かれる。
12.前記カプレットの整列は、前記体細胞および卵母細胞の軸が、電極軸に対して垂直になるように、ガラスピペットを用いて手動で行われる。
13.15μ秒の間150ボルトの融合パルスが与えられる。
14.前記カプレットは、すぐに1mg/mlのHSAを含む50％HTFおよび50％ソルビトール融合培地の溶液中へ1分間移される。
15.前記カプレットは、1mg/mlのHSAを含む3mlのHTFを含む30mmファルコンプレートへ1分間移される。
16.前記カプレットは、活性化が行われるまで、ミネラルオイルを重層した6％CO2を含む大気下37℃で5mg/mlHSAを含む500μlのG1(SERIESIII)培養培地液滴中に移しインジェクターの中に移された。
【００８４】
D.活性化
1.hCG投与後45時間で、融合再構築した胚は、1mg/mlHSAを含むHTF中の10μMイオノマイシン溶液中に5分間置かれる。
2.再構築した胚は、ミネラルオイルを重層した6％CO2を含む大気下37℃の、5mg/mlHSAを含むG1(SERIESIII)培養培地中2mM 6-DMAP溶液500μl中に4時間移される。
1-再構築した胚は、DMAP溶液から取り出され、異なる3つの1mg/mlHSAを含むHTFの30mmプレート中で3回濯がれる。
2-再構築した胚は、ミネラルオイルを重層した6％CO2を含む大気下37℃、5mg/mlHSAを含む500μlのG1(SERIESIII)培養培地液滴中に移される。
【００８５】
E.再構築した前記胚の培養
1.はじめの72時間の間、再構築した胚は、ミネラルオイルを重層した、5mg/mlHSAを含む500μlのG1(SERIESIII)培養培地液滴中、6％CO2を含む大気下37℃で培養される。
2.残りの培養期間(73時間から胚盤胞まで)、前記胚は、ミネラルオイルを重層した、5mg/mlHSAおよび過剰排卵されたヒト卵母細胞ドナーから得られた10%不活性熱卵胞液の500μlのKSOM+AA+グルコース(特性培地)中、6％CO2を含む大気下37℃で培養される。
【００８６】
F.内部細胞塊分離
一度胚盤胞が発生すると、内部細胞塊(ICM)は分離されることができる。
1.孵化された胚盤胞は、透明帯が消化されるまでtyroid酸中に数秒間置かれ、続いて1mg/mlHSAを含むHTFに2分間移される。
2.胚盤胞は、HSAを含まないG1(SERIESIII)培地のBeWo細胞に対する血清ポリクローナル
抗体溶液(1:5)に1時間移される。
3.胚は、1mg/mlHSAを含むHTFで3回濯がれ、HSAを伴わないG1(SERIESIII)培養培地の
テンジクネズミ補体溶液(1:3)に栄養膜溶解が起こるまで移される。
4.ICMは、1mg/mlHSAを含むHTFで濯がれる。前記ICMは、15%胎児性仔ウシ血清を含むDMEM中、有糸分裂不活性マウス胎児線維芽細胞の層の上に置かれ、胚幹細胞の発生のために培養される。
【実施例２】
【００８７】
過剰排卵および卵母細胞回収
卵母細胞のドナーは、24歳から32歳の間の少なくとも1人の生物学的子どもを持つ12人の女性であった。前記ドナーは、ミネソタ多面的人格指数試験、ホルモンプロファイリングおよびPAPスクリーニングによる査定を含む精神的および肉体的な試験受けた。前記ドナーは、また、肝炎ウイルスB,C、ヒト免疫不全ウイルスおよびヒトT-細胞白血病ウイルスを含む伝染性の疾患に対して注意深く審査された。ドナーの卵巣は、少なくとも2週間の経口避妊薬によってダウンレギュレーションされたのちに、1日に2回75−150ユニットの殖腺刺激ホルモンの注入によって卵巣の過度の刺激を調節された。下垂体の抑圧は、数人のドナーは経口避妊薬の中断前に最初の3日間および性腺刺激ホルモン注入を始める前5日間、1日2回のシナレル投与を付随することによって、残りのドナーは、卵胞が直径12mmに達してからアンティゴネを注入することによって保たれた。卵巣の刺激は、卵母細胞の減数分裂の続行を刺激するためのヒト絨毛性ゴナドトロビン(hCG)注入の日における前記ドナーの血清エストラジオールのレベルが3500pg/mlより大きくならないことを保証することによって、卵巣の過度刺激症候群のリスクが最小になるように計算された。血清エストラジオールのレベルは、少なくとも2日ごとに測定され、主な卵胞が超音波試験によって少なくとも18mmに到達したとき、hCGは投与された。卵母細胞は、超音波穿刺吸引によって麻酔をかけられたドナーの胞状卵胞から殺菌されたテストチューブの中に集められた。それらは、ヒアルロニダーゼにより卵丘細胞が取り除かれ、減数分裂の段階が直接調べられることで記録された。
【００８８】
卵母細胞の成熟プロフィール
合計71個の卵母細胞が、7人の志願者から得られた(表1)。取り出し時、5個の卵母細胞が卵核胞段階であり、さらなる発達は、培養から48時間後に観測されなかった。9個の卵母細胞が、分裂中期I(MI)段階であり、3時間までの培養の後、系統的に活性化またはNTのために用いられた。分裂中期II(MII)段階であった57個の卵母細胞が、すぐにNTまたは単為生殖活性化実験のために用いられた。
【表２】
2005510232.tif 000003
【実施例３】
【００８９】
核移植により再構成された胚におけるヒト体細胞の核/クロマチンの再プログラム
A.体細胞単離
成体ヒト線維芽細胞は、体細胞核ドナー細胞として用いるために、3-mm皮膚バイオプシーから単離された。皮膚バイオプシーが行われた人々は、承諾した一般に健康なまたは核移植によるクローニングによって製造された自系の細胞の治療的移植の恩恵を受けるかもしれない、糖尿病や精髄損傷のような疾患を有する、様々な年齢の成人の志願者から得られた。皮膚外植片は、37℃の5％CO2下、ウシ胎児血清(HyClone, Logan, UT)を含むDMEM(Gibco Grand Island. NY)中で三週間培養された。細胞の発育が観察されたら、線維芽細胞および角質細胞は、0.25％トリプシン、1mMEDTA(GibcoBRL, GrandIsland, NY)およびPBS(GibcoBRL)を用いて酵素で解離され、1:2で継代した。線維芽細胞は、第2の継代に用いられた。前記これら細胞の同一性は、後の免疫細胞化学によって確証され、これら細胞のシードストックは、細胞ドナーとして用いられるまで液体窒素中に冷凍保存された。
【００９０】
卵丘細胞は、卵母細胞取り出し後、すぐに用いられ、以前に述べられた方法(11)で処理された。卵丘−卵母細胞複合体は、卵丘細胞を分散させるために、1mg/mlヒアルロニダーゼを含むHEPES-CZB培地(Chatot et al., 1989, J. Reprod. Fertil. 86:679-688)で処理された。続く分散で、前記卵丘細胞は、12％(w/v)PVPを含むHEPES-CZB培地中へ移動させ、注入前に3時間まで室温に保たれた。
【００９１】
B.卵母細胞摘出および核移植
操作に先だち、卵母細胞は、1μg/mlビスベンゾイミド(Sigma, St. Louis, MO)およびシトカラシンB(5 ng/ml; Sigma)を含む胚培地中で20分間培養された。全ての操作は、オイルで重層されたHEPESバッファーHTF中でされた。染色体は、ホフマン光学および落射蛍光(epifluorescent)紫外線ライトを備えた倒立顕微鏡上で倍率200Xによって見ることができた。摘出は、特に前記マイクロマニピュレーションの間に発生するダメージを最小限にするよう設計された、圧電装置(Prime Tech, Japan)を用いて行われた。浸透能力および工程の精度の調節を可能にするために先端近くに水銀を含んだ、内径10μmlの切れ味の悪い針は、透明帯に緩やかに浸透させるためおよび染色体と隣接した細胞質ゾルとを吸引するために用いられた。核ドナー細胞は、培養培地中12％ポリビニルピロリドン(PVP, Irvine Scientific)の溶液中で保たれ、内径およそ5μmの圧電駆動針中へ装填された。ドナー核は、前記細胞のピペットを通した出し入れ吸引によって線維芽細胞から単離された。単離された各線維芽細胞核は、摘出された卵母細胞の前記細胞質ゾル中へすぐに注入された。卵丘細胞は、線維芽細胞の大きさの半分で、各卵丘細胞は、完全な細胞として摘出された卵母細胞内へ注入された。核移植後、前記再構築された細胞は、インキュベーター中へ戻され、1〜3時間後に活性化された。
【００９２】
C.再構築された卵母細胞の活性化および培養
外因性hCG刺激から35−45時間後、卵母細胞は、5μMのイノミシン(Calbiochem, La, Jolla, CA)で4分間、続いて2mMの6−ジメチルアミノプリン(DMAP; Sigma)で3時間、G1.2倍地中で培養することで活性化された。前記卵母細胞は、HTF中で3回濯がれ、37℃で5％CO2中のG1．2またはクック-卵割培養培地(Cook IVF, Indianapolis, IN)中へ72時間置かれた。培養から4日目、胚に似ている卵割した卵母細胞は、活性化後7日までG2.2またはクック-胚盤胞培養培地へ移された。
【００９３】
D.ドナー細胞核の核移植および再プログラム
7人の志願者からの卵母細胞は、核移植工程に用いられた。全部で19個の卵母細胞が、線維芽細胞および卵丘細胞からの核を用いて再構築された。線芽細胞核を伴う再構築から12時間後、7個の卵母細胞(再構築された卵母細胞の69％)が、形態的に精子と受精した卵母細胞で観測されるものに似た、単独の大きな前核を示した。突出した核小体(10まで)を伴う前核の一つのみが、各再構築された卵母細胞内で観測された。今回の研究において前記線維芽細胞核によって再構築された胚は、卵割が行われなかった。卵丘細胞を注入された8個の卵母細胞のうちの4個が、前核に発達し、これらのうちの3個が、4または6に開裂した。これらの核移植の結果は、表2にまとめている。
【表３】
2005510232.tif 000004
【００９４】
図1−4は、前記核ドナー細胞として卵丘細胞を用いた核移植によって製造された、再構築された卵母細胞由来の胚の卵割段階を示している。図1および2は、それぞれ12hおよび36hにおける胚の前核段階を示している。縮尺の棒は、100μmである。図3および4は、72hにおけるの4細胞胚および6細胞胚をそれぞれ示している。前記胚の核は、ビスベンゾイミド(Sigma)で染色されており、UV光の下で見ることができる。縮尺の棒は、50μmである。
【００９５】
これらの結果は、成人卵丘細胞および皮膚線維芽細胞の2種類の異なる細胞を用いた核移植に続く、胚の前核の製造を証明する。ドナーとして卵丘細胞を用いると、3個の卵母細胞が、2細胞、4細胞および6細胞段階へそれぞれ卵割した。培養された成人線維芽細胞を伴う再構築された卵母細胞は、前核に発達したが、卵割しなかった。
【００９６】
E.線維芽細胞核を伴う再構築された卵母細胞による卵割
上記のうちの一つに類似した次の研究において、2個のヒト皮膚線維芽細胞の前記核は、上記方法を用いて摘出されたヒト卵母細胞中へ移され、前記再構築された胚のうちの1つは、図5に示された前記胚卵割段階を製造するために卵割を受けた。
【実施例４】
【００９７】
卵母細胞の単為生殖活性化による自系細胞の製造
3人の志願者からの卵母細胞が単為生殖活性化のために用いられた。前記ドナーは、hCG注入に先立つ11日の少量(75IU bid) gの生殖腺刺激ホルモン注入によって過剰排卵を引き起こされた。全部で22個の卵母細胞が、前記ドナーからHCG刺激後34時間で得られ、hCG刺激後40−43時間で活性化された。
【００９８】
前記卵母細胞は、0日で上述のイノミシン/DMAP活性化プロトコルを用いて活性化された。活性化から12時間後、20個の卵母細胞(90％)が、一つの前核に発達し、2日で2細胞から4細胞段階に開裂した。培養から5日目、明らかに認知できる内部細胞塊を表す前記胚はないにもかかわらず、明らかな分裂膣が、単為生殖物(parthenotes)のうちの6個(卵割された卵母細胞の30％)で確認された。ヒト卵母細胞の単為生殖活性化の結果は、表3にまとめられる。
【表４】
2005510232.tif 000005
【００９９】
図7−10は、ヒト卵母細胞の単為生殖活性化によって製造された胚および幹細胞を示している。図7は、取り出しを行ったときのMII卵母細胞を示している。図8は、活性化から48時間後の4から6細胞胚を示している。区別できる単核の分裂球(図6中でｎと分類)が、終始一貫観測された。図9は、6日目に検知され7日目まで持続された分裂膣を伴う胚を示している。図7−9の縮尺の棒は、100μmである。
【０１００】
上記のうちの一つと類似した調査において、イノミシン/DMAPにより活性化され、インビトロで培養されたヒト卵母細胞は、図10に示すように、単前核に発達し、卵割を受け、明らかに内部細胞塊が認知できる胚盤胞に発達した。単為生殖胚は、続く前記内部細胞塊細胞の単離するための免疫手術工程を受けた。
a.3個の20μlプロナーゼ(プロテアーゼ)液滴がオイル重層下で作られ、胚盤胞は液滴1から3へと連続的に移された。それらは、透明帯が溶けるまで液滴3に残された。前記帯が消えてすぐに、それらは除かれ、HTF+HSAで6回濯がれた。
b.3個の20μl抗体(G1中1:5に希釈されたBeWoヒト栄養膜に対して製造されたポリクローナル抗体)液滴が、オイル重層下で作られ、胚盤胞は液滴1から3へと連続的に移され、30分間液滴3に残され、HTF+HSAで6回濯がれた。
c.G1中に1:3で希釈された3個の20μlテンジクネズミ補体液滴が油下で作られ、胚盤胞は液滴1から3へと移され、30分間液滴3に残された。前記胚胞は、処理に応じて崩壊した。前記ICMsは、HTF+HSAで6回濯がれ、次に述べる培養培地中で、D12胎児(strain129)由来の有糸分裂不活性マウス胚線維芽細胞上で培養された。
DMEM  (高グルコース)(Gibco#11960-044)            425ml
ウシ胎児血清  (Hyclone)                          75ml
MEM non essential AA×100  (Gibco#11140-050)      5ml
L-グルタミン                                      4mM
2-メルカトエタノール  (Gibco#21985-023)          1.4ml
前記細胞は、4,5日ごとに機械的に継代させた。前記培養されたICM細胞は、初めの週を過ぎると数は増加し、ヒトES細胞から区別のつかない細胞が、一つのICMから成長したことが観測された。これらのESに似た細胞は、図11に示すように、明らかな境界を伴うコロニーとして接近した集合体中で成長した。それらは、細胞質に対して高い比の核および顕著な核小体を有し、インビトロで多数の分化細胞種への分化が観測された。
【０１０１】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】12時間における前核段階の胚を示している。縮尺の棒は、100μmである。
【図２】36時間における前核段階の胚を示している。縮尺の棒は、100μmである。
【図３】72時間における4細胞胚を示している。前記胚の核は、ビスベンゾイミド(Sigma)で染色されており、UV光の下で見ることができる。縮尺の棒は、50μmである。
【図４】72時間における胚の6細胞胚を示している。前記胚の核は、ビスベンゾイミド(Sigma)で染色されており、UV光の下で見ることができる。縮尺の棒は、50μmである。
【図５】ヒト皮膚線維芽細胞からのドナー核を用いた核移植によって製造された前核段階の胚を示している。
【図６】ヒト皮膚線維芽細胞から製造された再構築された卵母細胞によって生成した卵割段階の胚を示している。
【図７】取り出しを行ったときのMII卵母細胞を示している。縮尺の棒は、100μmである。
【図８】活性化から48時間後の4から6細胞胚を示している。区別できる単核の分裂球(ｎ)が、終始一貫観測された。縮尺の棒は、100μmである。
【図９】6日目および7日目まで培養が持続され検知された単為生殖活性化によって製造された胚中の分割腔を示している。縮尺の棒は、100μmである。
【図１０】内部細胞塊を有するヒト単為生殖胚を示す。
【図１１】培養されたICM細胞由来のヒト似ES細胞を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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