(57)【要約】本発明は、真菌をプラスミドまたは適切なＤＮＡ発現ベクターで遺伝的に形質転換することによる組換えポリペプチド、タンパク質またはペプチドの生産のためのシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種で組換えポリペプチドを生産する方法であって：
ａ）シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）の株を発現ベクターで遺伝的に形質転換させ；そして
ｂ）工程ａ）の該形質転換したシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）の株を、該発現ベクターからの組換えポリペプチドの合成が可能となる条件下で培養する、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項２】
工程ａ）の上記形質転換がプロトプラストの遺伝的形質転換である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）の上記株が、シュードザイマ  アンタールクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、シュードザイマ  アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｐｈｉｄｉｓ）、シュードザイマ  フロッキュローサ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）  シュードザイマ  フシホルマータ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｆｕｓｉｆｏｒｍａｔａ）、シュードザイマ  プロリフィカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｐｒｏｌｉｆｉｃａ）、シュードザイマ  ルグローサ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｒｕｇｕｌｏｓａ）またはシュードザイマ  ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記発現ベクターがプラスミド、発現カセットまたは適合性のあるウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記発現ベクターが組換えタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列、およびシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属で活性なプロモーターを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記発現ベクターが発現した組換えタンパク質またはペプチドの分泌を可能とするプレ領域を含んでなる請求項４に記載の方法。
【請求項７】
上記プロモーターがシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）の株に天然の請求項４に記載の方法。
【請求項８】
上記プロモーターが遍在性または誘導性プロモーターである請求項４に記載の方法。
【請求項９】
組換えポリペプチドを生産するために遺伝的に形質転換されたシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属の真菌。
【請求項１０】
組換えタンパク質および他の組換えポリペプチドの生産のための宿主−ベクター系の宿主としてのシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種の真菌株の使用。
【請求項１１】
組換えポリペプチドの生産のためのシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属の遺伝的に形質転換した真菌を含んでなる組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は宿主−ベクター系の宿主としての真菌の使用、および組換え産物の生産法に関する。本発明の方法および系は、種々の組換えポリペプチドを生産するために容易な規模的順応性の能力を提供する手段に特に適している。また本発明は他の種類の微生物を使用する系で可能な特性よりも複雑な立体配置的特性を持つ組換えポリペプチドの生産を可能とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
遺伝子操作技術により、バクテリア、酵母および真菌、動物細胞培養（ヒト、哺乳動物および昆虫細胞）を用いて、あるいはトランスジェニック植物および動物を用いて大量の有用タンパク質および他の組換え産物（ペプチド、ポリペプチド等）を生産することが可能となった。
【０００３】
工業的観点から理想的な宿主系は、安全で、精製が容易で、天然タンパク質と同一の生物学的活性を有する組換え産物を高い収量および経済的に魅力のある経費で生産することができるべきである。すべての前記宿主系は組換え産物を生産する（潜在的）能力を有するが、これらの系が莫大な多様な組換え産物を効率的に生産するために完全に満足されているわけではない。例えば小胞膜内で自然に発現されるタンパク質はバクテリアで広く発現され得るが、バクテリアにはフォールディングを行うために必要な細胞装置が無いので正しくフォールディングされない。したがってフォールディングを必要とするタンパク質は、バクテリアで生産された時に活性が無いか、または大変低く、そしてタンパク質をフォールディングするためさらなる処置が必要となる。逆に真核生物のタンパク質は外来の昆虫または哺乳動物細胞の適切な細胞小器官で発現され得るが、低収量およびこれらの技法に伴う過度な経費により役に立たなくなる。
【０００４】
これらの技術の代わりは、真核生物細胞であり、そしてかなりの速度で増幅する真菌内での外因性タンパク質の発現である。真菌はタンパク質、特に、加水分解酵素の実質的量を分泌する。担子菌類の真菌であるシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種は、真菌の最も進化したクラスの員であり、そして他のいかなる微生物のクラスよりも系統発生的に動物細胞に近い。このことはそれらが酵母のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）のようなより低級の真菌、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種のようなバクテリアよりも複雑なタンパク質を合成することを示す。しかしシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種は系統学以外、遺伝学および生理学的にほとんど知られていない。例えば数種のシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）は、工業的に重要な天然の酵素的タンパク質を生産することが知られている。
【０００５】
特許文献１は、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種から天然のアスパラギン酸プロテアーゼを生産する方法を記載する。
【０００６】
特許文献２は、シュードザイマ  アルタールクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）（カンジダ  アルタールクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）としても知られている）に由来する天然のリパーゼＢを記載する。
【０００７】
過去数年、真菌を含む多くの生物に関する遺伝的形質転換系が成功裏に開発された。しかしシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種は、これらの生物内での遺伝的形質転換も組換え産物の生産を行うための方法も現時点で知られていないので、無視されたようだ。
【０００８】
上に挙げた方法の状況を考慮すると、組換えポリペプチドを生産するための新たな、そして代替的な生物系および方法を提供する広い余地が未だに存在する。
【参考文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０１／９６５３６号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，３５２，８４１号明細書
【発明の開示】
【００１０】
本発明の１つの目的は、組換えタンパク質および他の組換え産物の生産のための宿主−ベクター系の宿主として、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種の真菌株の使用を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、真菌シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）株で組換えタンパク質を生産する方法を提供することであり、この方法はシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）株を発現ベクターを用いて形質転換させ（これはプロトプラストの形質転換を介して行うことができる）、そして形質転換した株を、発現ベクターから組換え産物の合成が可能となる条件下で培養する工程を含んでなる。
【００１２】
当業者は、プロトプラストの形質転換が目的の組換えポリペプチドの生産のための発現ベクターを含む真菌の調製を促進することを認識するだろう。
【００１３】
本発明に従い、組換えタンパク質を生産する方法が提供され、ここでそのようなタンパク質を生産するために使用するシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）株は、シュードザイマ  アルタールクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、シュードザイマ  アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｐｈｉｄｉｓ）、シュードザイマ  フロッキュローサ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）  シュードザイマ  フシホルマータ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｆｕｓｉｆｏｒｍａｔａ）、シュードザイマ  プロリフィカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｐｒｏｌｉｆｉｃａ）、シュードザイマ  ルグローサ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｒｕｇｕｌｏｓａ）、シュードザイマ  ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）あるいは常法および／または分子同定技術に基づきシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属の員と同定され得る任意の真菌株でよい。
【００１４】
本発明で使用する発現ベクターはプラスミド、発現カセット、またはウイルスでよく、そして組換えタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列、およびシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属内で機能的に活性なプロモーターを含んでなることができる。ベクターは発現された組換え産物が正しい細胞小器官または細胞の範囲外に分泌されることを可能とする標的配列を含んでなることもできる。
【００１５】
発現ベクター中の組換え産物の生産を駆動するプロモーターは、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種内で機能的な任意のプロモーターであり得る。これらのプロモーターには天然のプロモーター、すなわち真菌属のゲノム内に自然に見いだされるプロモーター、ならびに外因性プロモーターを含む。プロモーターはその制御下で遺伝子の発現を構成的に駆動することができるか、または誘導性プロモーターであることができる。
【００１６】
本発明の別の目的は、組換えタンパク質またはペプチドを生産するために遺伝的に形質転換されたびシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属の真菌を提供することである。
【００１７】
本発明の目的のために、以下の用語は次のように定義する。
【００１８】
本明細書で使用する用語「真菌（ｆｕｎｇｕｓ）」および「真菌（ｆｕｎｇｉ）」は、クロロフィルを欠き、そしてキチン、セルロースまたは両方を含む細胞壁を有する単−または多−細胞生物を意味することを意図する。真菌は糸状菌および酵母を含むと理解されている。
【００１９】
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、タンパク質（もしくはポリペプチド）またはその機能的断片の生産の原因となるＤＮＡ配列を意味することを意図する。これにはまず第一に、ポリペプチド中のアミノ酸の特別な順序を指図する実際のコード配列を含む。
【００２０】
用語「組換えタンパク質」および「組換え産物」は、１つの核酸分子を形成するように連結された少なくとも２種類の核酸分子から派生する少なくとも２つの部分を含む核酸分子から発現されるタンパク質を意味することを意図する。本明細書で使用する「組換えタンパク質」および「組換え産物」は、以下に定義するようにヘテロロガスおよびホモロガスな（内因性）タンパク質の両方を意味することを意図する。
【００２１】
本明細書で使用する表現「ヘテロロガスなポリペプチド」および「ヘテロロガスな産物」とは、本発明の真菌宿主に天然ではない任意のタンパク質、ペプチド、ポリペプチド等を意味することを意図する。ヘテロロガスなタンパク質をコードするヘテロロガスな遺伝子は、したがってヒトを含む動物、植物、真菌、バクテリアまたは任意の他の生物種に由来するものでよい。加えてヘテロロガスな遺伝子はヒトの手により専ら合成されたか、または自然に生産され、そしてさらに該ヒトの手により修飾された合成遺伝子であることができ、ここでヘテロロガスな産物は宿主細胞中で自然に見いだされるものとは異なる。故に組換えポリペプチドは真菌自体に由来し得る（ホモロガスなポリペプチド）が、生産目的に遺伝的に操作されている。
【００２２】
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、遺伝子プロモーターまたは調節配列と呼ぶことができるコード配列の開始近くに通常位置する転写の非コード調節配列を意味することを意図する。極度に単純化されてはいるが、基本的には正しい様式で、プロモーターは所定のコード配列が転写され、そして遺伝子にコードされる実際のタンパク質に最終的に翻訳され得るかどうかを決定する転写因子と呼ばれる種々の特異化されたタンパク質と互いに作用し合う。
【００２３】
本明細書で使用する用語「ベクター」は核酸配列、例えばプラスミド、コスミド、ウイルスに由来するか、または化学的もしくは酵素的手段により合成されたＤＮＡを指し、この中に１以上の核酸の断片が挿入もしくはクローン化され、ここで核酸は特定の遺伝子をコードする。ベクターはこの目的に１以上の独自な制限部位を含むことができ、そしてクローン化された配列が再生されるように定めた宿主もしくは生物中で自律的に複製することができる。ベクターは直線状、環状またはスーパーコイル状の立体配置を有することができ、そして特定の目的に他のベクターもしくは他の物質と複合化することができる。ベクターの成分は限定するわけではないがＤＮＡを包含するＤＮＡ分子；切り出し（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）タンパク質もしくは他の所望する生成物をコードする配列；および転写、翻訳、ＲＮＡ安定性および複製のための調節要素を含むことができる。
【００２４】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、任意のアミノ酸配列、オリゴペプチド、ペプチド、またはタンパク質配列、または任意のこれらの断片、および自然に存在するか、または合成分子を指す。本明細書で引用する「ポリペプチド」が自然に存在するタンパク質分子のポリペプチド配列を指す場合、「ポリペプチド」等の用語はアミノ酸配列を、引用したタンパク質分子に関連する完全な天然のアミノ酸配列に限定しない。「ポリペプチド」は内因性、外因性、自然に存在するもの、または組換え体でよい。
【００２５】
「コード配列」および「構造的配列」という表現は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド配列をコードする連続する順次のＤＮＡトリプレットの領域を指す。
【００２６】
本明細書で使用する用語「発現」は、対応するｍＲＮＡを生成するための遺伝子の転写、およびペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のような対応する遺伝子産物を生成するためのｍＲＮＡの翻訳を意味する。
【００２７】
用語「遺伝子」は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはＲＮＡ分子をコードする染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他のＤＮＡ、および発現の調節に関与するコード配列を挟む領域を指す。
【００２８】
本明細書で使用する表現「機能的断片」とは、組換えコード配列の発現を与えるために少なくとも十分な分子要素を有するヌクレオチド酸断片を意味することを意図する。
発明の実施様式
今、本発明を添付する図面を参照にしてより完全にこれから記載し、これには本発明の好適態様が示される。しかし本発明は多くの異なる形態で具現化されることができ、そして本明細書に説明する態様に限定されると解釈すべきではない；むしろこれらの態様はこの開示が詳細かつ完全となり、そして当業者に本発明の範囲を完全に伝達するために提供される。
【００２９】
本発明に従い、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属に属する遺伝的に形質転換された真菌の使用を介して組換えタンパク質、ペプチドおよびポリペプチドを生産する方法が提供される。そのような遺伝的に形質転換されたシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）は、大量のヘテロロガスまたはホモロガス組換え遺伝子産物を合成および生産することができる。本明細書で述べるように、従来技術には組換え産物の生産に宿主としてシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種を使用する方法または単にその使用を示した報告はない。
【００３０】
組換えタンパク質は、そのタンパク質が酵母で得られる量をはるかに越える収量で生産されることができ、そしてシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種は、低級の単細胞微生物よりも複雑なタンパク質を合成できることが観察された。
【００３１】
本発明の１つの態様では、生産法は組換え産物を生産するための宿主−ベクター系の宿主としてシュードザイマ  アルタールクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、シュードザイマ  アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｐｈｉｄｉｓ）、シュードザイマ  フロッキュローサ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）  シュードザイマ  フシホルマータ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｆｕｓｉｆｏｒｍａｔａ）、シュードザイマ  プロリフィカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｐｒｏｌｉｆｉｃａ）、シュードザイマ  ルグローサ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｒｕｇｕｌｏｓａ）、シュードザイマ  ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）の株、あるいは常法および／または分子同定技術に基づきシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属の員と同定され得る任意の真菌株を使用する。
【００３２】
本発明のさらなる態様では、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）のプロトプラストを、組換え産物をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換し、そして組換え産物の発現を可能とする適切な培地を用いて、形質転換した株の成長を可能とする工程を含んでなる組換え産物の調製法が提供される。
【００３３】
シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）のプロトプラストは、真菌の細胞壁を除去し、したがって細胞の最も外側の境界として細胞質膜を残すことにより調製される。真菌のプロトプラスト調製は、主に真菌細胞の細胞壁を好ましくは酵素を使用して剥ぎ取ることからなる。
【００３４】
バクテリア、酵母、動物および植物細胞はすべて形質転換された。任意の種類の細胞を形質転換する時、形質膜および／または細胞壁は細胞を永久的に傷害することなく貫通されなければならない。真菌の場合、細胞壁の除去は形質膜を通して直接ＤＮＡを導入する前に必要な最初の、そして重要な工程である。プロトプラスト生成後、細胞膜は電気穿孔、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または当業者に知られている他の形質転換法を使用することによりＤＮＡに対して透過性とすることができる。
【００３５】
本発明の特別な態様は、目的の遺伝子が挿入されてＤＮＡ構築物が形成される組換え発現ベクターを提供することである。このベクターは組換えＤＮＡの手法に都合良く供され得る任意のベクターでよく、そしてベクターの選択はベクターが導入される宿主細胞にしばしば依存する。このようにベクターは自律的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体の複製からは独立している染色体外の物体として存在するベクター、例えばプラスミドであり得る。あるいはベクターは宿主細胞に導入された時、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体と同時に複製するものであることができる。
【００３６】
目的の遺伝子はＤＮＡ構築物として発現ベクターに挿入される。このＤＮＡ構築物は合成ＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子またはそれらの組み合わせから組換え的に作成することができる。ＤＮＡ構築物は好ましくは当該技術分野で既知の標準的技術に従い、種々の断片を互いに連結することにより作成される。
【００３７】
組換え産物をコードする遺伝子は、発現ベクターの一部であることができる。好ましくは発現ベクターはＤＮＡベクターである。ベクターは都合よく目的の遺伝子の正しい発現を促進する配列を含んでなる。これらの配列は典型的にはプロモーター配列、転写開始部位、転写終止部位およびポリアデニレーション機能を含んでなる。さらにベクター系は選択マーカーをコードするＤＮＡ配列を含んでなることができる。好ましくはこの選択マーカーは形質転換で宿主生物のゲノムに包含されることができ、そして形質転換前の宿主により機能的に発現されなかった。次いで形質転換した細胞は、包含された選択マーカーに基づき非形質転換細胞から選択そして単離されることができる。
【００３８】
プロモーター配列は好ましくは目的の遺伝子の上流に挿入され、そしてその発現を調節する。プロモーター配列は転写については非コード調節配列であり、通常はコード配列の開始付近に配置され、これを遺伝子プロモーターまたは調節配列と呼ぶことができる。極度に単純化されてはいるが、基本的には正しい様式で、プロモーターは所定のコード配列が転写され、そして遺伝子にコードされる実際のタンパク質に最終的に翻訳され得るかどうかを決定する転写因子と呼ばれる種々の特異化されたタンパク質と互いに作用し合う。
【００３９】
当業者は任意の適合性のあるプロモーターを、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）の組換え発現に使用できると認識するだろう。例えば本発明の範囲を限定するわけではないが、真菌または他の生物の他の種に由来するプロモーター、ならびに内因性、合成またはキメラプロモーターは、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）での組換え発現に設計された発現ベクターに含まれる転写要素の一部となることができる。
【００４０】
プロモーター自体は活性化配列、エンハンサー配列またはそれらの組み合わせの上流に先行することができる。これらの配列は当該技術分野では細胞中で強力な転写活性を表すＤＮＡ配列、および細胞外または細胞内タンパク質をコードする遺伝子に由来することが知られている。
【００４１】
当業者は、終止およびポリアデニレーション配列もプロモーターと同じ供給源に適切に由来することができることを認識している。
【００４２】
本発明の１つの態様では、標的配列はタンパク質を特定の細胞の位置に標的させるために発現ベクターに挿入され得る。好ましくは標的配列は目的遺伝子に隣接して挿入され、そしてそのオープンリーディングフレイムを保存する。したがって遺伝子産物はその全体が発現されるが、この遺伝子産物を特定の細胞小器官を介して方向付けるアミノ酸配列を宿す。真菌細胞内の任意の細胞小器官を選択することができるが、生産細胞を傷つけずに組換え遺伝子産物の回収を促進するために、本明細書では細胞外の環境が好ましい。標的配列はタンパク質を成功裏に小胞体、輸送小胞、ゴルジ装置および分泌小胞に向けることができ、分泌小胞は細胞質膜と融合して（エキソサイトーシス）、タンパク質を細胞外に放出する。分泌小胞から細胞外の環境へのタンパク質の放出は、構成的または誘導性であることができる。発現産物を宿主細胞の分泌経路に効率的に向けることを確実にするために、ベクターに提供される標的配列は、自然に存在するシグナル、リーダーペプチド、合成配列、それらの機能的部分または細胞からのタンパク質の分泌を提供するそれらの組み合わせであることができる。このように標的配列はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種に由来するアルファ−因子を含む任意の供給源に由来する分泌タンパク質をコードする遺伝子から誘導することができる。
【００４３】
組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列、標的配列、プロモーターおよびターミネーターは選択マーカーを含むベクターに挿入されるか、または宿主細胞に導入するための別個のベクターに挿入することができる。ベクター（１つまたは複数）は、直線状または閉じた環状分子でよい。本発明の１つの態様では、１つは選択マーカーをコードするＤＮＡ配列を持ち、そしてもう１つは組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列、標的配列および遺伝子発現を促進する機能を持つ２つのベクターを宿主細胞に導入することができる。［実施例］
【００４４】
本発明は、本発明の範囲を限定するのではなくそれを具体的に説明するために与える以下の実施例を参照にして、さらに容易に理解されるだろう。
【実施例１】
【００４５】
真菌シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種のプロトプラストの調製
Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）（ＤＡＯＭ１９６９９２）およびＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）（ＣＢＳ５１６．８３）は、１００ｍｌの酵母麦芽ペプトンデキストロースブロス（ＹＭＰＤＢ）を含有する５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で１５０ｒｐｍで３日間、２５℃にて別個に培養した。細胞（１０９／ｍｌ）を遠心により集め、２０ｍｌの２５ｍＭ  β−メルカプトエタノールおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０に懸濁し、そして室温で２０分間、穏やかな振盪に供した。次いで細胞を集め、そしてＫＣＥ（０．６Ｍ  ＫＣｌ、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウムおよび０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ５．８）中に調製した種々の酵素溶液（表１を参照にされたい）に再懸濁し、そして２５℃で２時間、インキューベーションした。試験した酵素は：Ｇｌｕｃａｎｅｘ（５％）；Ｎｏｖｏｚｙｍ２３４（０．５％、トリコダルマ  ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来）；ドリセラーゼ（ｄｒｉｓｅｌａｓｅ）（２％、担子菌類由来）；および溶解（Ｌｙｓｉｎｇ）酵素（５％、リゾクトニア  ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）由来）であった。すべての酵素はノボノルディスクファーメント（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｆｅｒｍｅｎｔ）社（Ｄｉｔｔｉｎｇｅｎ（商標）、スイス）から購入したＧｌｕｃａｎｅｘを除き、シグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社（トロント、カナダ）から得た。プロトプラストは小さい綿の塊を通す濾過により精製し、そして４℃にて１５分間の遠心（５０００ｒｐｍ）により回収した。次いでプロトプラストは、低融点寒天を含有する１０ｍｌの安定化された酵母麦芽デキストロース寒天（ＹＭＰＤＡ）と混合し、そして直ちに１０ｍｌの安定化されたＹＭＰＤＡ培地（再生培地）を含有するプレートに２５℃で３時間広げ、そして再生したプロトプラストを個別のコロニーとして計数した。
【００４６】
Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）のプロトプラスト調製物からの結果は、種々の酵素カクテルが胞子からプロトプラストを効率的に放出するために使用できることを示す（表１）。
【００４７】
【表１】
2005536989.tif 000002
【００４８】
Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）およびＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）の両方に由来するプロトプラストをＮｏｖｏｚｙｍ／Ｇｌｕｃａｎｅｘ酵素カクテルで調製した時、プロトプラストの再生率（コロニーを形成するプロトプラストの割合）は、Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）については約７５％、そしてＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）については約７４％であった。これらの結果はプロトプラストの品質が形質転換に適し、そして全体としてシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種がプロトプラスト調製を介する形質転換法に有用かつ効率的な宿主であることを確証する。
【実施例２】
【００４９】
シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種の形質転換
Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）またはＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）に由来するプロトプラストは、実施例１に記載したように得た。プロトプラストは綿を通す濾過により精製し、そして４℃で１５分間の遠心（５０００ｒｐｍ）により回収した。形質転換手順を容易にするために、得られたプロトプラストをＫＴＣ（０．８Ｍ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および５０ｍＭ  ＣａＣｌ２）溶液で２回洗浄した。
【００５０】
形質転換は、選択マーカー遺伝子（ハイグロマイシンＢに対する耐性をコードするｈｐｈ遺伝子）を含むｐＳｃｅＩ（ブリティッシュコロンビア大学のＪ．Ｋｒｏｎｓｔａｄ博士により寄付された）を用いて行った。
【００５１】
プラスミドはＸｈｏＩで直線化し、そして各１０μｇ量のＤＮＡをプロトプラストを形質転換するために使用した。２００μｌのＫＴＣ溶液中のプロトプラスト（１０８）を、直線化プラスミドＤＮＡに加え、そして５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２中の５０μｌのＰＥＧ４０００（６６％；ＢＤＨ、プール、ドーセット、英国）中で室温にて２０分間インキュベーションした。さらに２．５ｍｌのＰＥＧ溶液を１滴、０．５ｍｌそして残り（約２ｍｌ）の順次のアリコートで加えた。さらに２０分間インキュベーションした後、反応混合物をＫＴＣ溶液の１ｍｌ、５ｍｌおよび２９ｍｌのアリコートで希釈した。プロトプラストは４℃で１５分間の遠心（５０００ｒｐｍ）により集め、浸透圧安定化剤として０．８Ｍシュクロースを含有する５ｍｌのＹＭＰＤブロスに再懸濁し、そして室温で３時間インキュベーションした。次いでプロトプラストを１０ｍｌの安定化ＹＭＰＤＡ（低融点寒天を含む）培地と混合し、そして即座に１０ｍｌの安定化ＹＭＰＤＡ培地および１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するプレートにまいた。このプレートを２５℃で７〜１４日間、インキュベーションした。
【００５２】
形質転換したシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）細胞からのコロニーはハイグロマイシンＢ培地上で成長したが、野生型のシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）はハイグロマイシン培地上では成長しなかった。形質転換したシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）コロニーからのコロニーをＰＣＲ分析にかけて、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の存在について確認した。
【００５３】
選択的なＹＭＰＤＡ培地で成長する１０個の推定される形質転換体を無作為に選択し、そしてＰＣＲ分析にかけて、ｈｐｈ遺伝子の存在を実証した。特異的プライマーであるリバース
【００５４】
【表２】
2005536989.tif 000003
【００５５】
を使用して、プロモーター領域およびプラスミドＤＮＡのｈｐｈ遺伝子を増幅した。非選択培地での野生型シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）を対照として使用した。ＰＣＲは以下の条件を使用して行った。最初の変性は９４℃で５分間行い、続いて３０サイクルの変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、３０秒）、およびプライマー延長（７２℃、１分）、そして最後に１回の延長（７２℃で１０分）を行った。
【００５６】
ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動では、予想されたサイズのバンドが試験したすべての形質転換体で観察されることが示された。対照からＰＣＲ産物は得られなかった。
【００５７】
結論すると、Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）およびＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）は、ＰＣＲ分析でｈｐｈ遺伝子の存在が試験したすべての形質転換体で確認されるように、遺伝的形質転換を受けることができる。したがって遺伝的形質転換は、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種の宿主株により組換えタンパク質を調製するための有用かつ効率的な方法である。
【実施例３】
【００５８】
シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種での組換えタンパク質の発現
ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ
プロトプラスト調製および遺伝的形質転換は、Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）（ＤＡＯＭ１９６９９２）を用い、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｈｐｈ遺伝子を含む１つのプラスミド（ｐＣＰＦ．Ｈｙｇ）での形質転換を使用して実施例１および２のように行った。プラスミドｐＣＰＦ．Ｈｙｇは、ＨＳＰ７０プロモーター、ｈｐｈ遺伝子およびｐＳｃｅＩに由来する終止配列をＸｈｏＩ−ＳａｃＩ断片として、突出末端を適当に修飾したＸｈｏＩ／ＳａｃＩで消化したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（ストラタジーン：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングすることにより構築した。
【００５９】
形質転換したシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）細胞に由来するコロニーはハイグロマイシンＢ培地で成長したが、野生型のシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）はハイグロマイシン培地では成長しなかった。
【００６０】
選択的なＹＭＰＤＡ培地で成長する形質転換体を無作為に選択し、そしてＰＣＲ分析にかけて、ｈｐｈ遺伝子の存在を実証した。特異的プライマーであるリバース
【００６１】
【表３】
2005536989.tif 000004
【００６２】
を使用して、プロモーター領域およびプラスミドＤＮＡのｈｐｈ遺伝子を増幅した。非選択培地での野生型シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）を対照として使用した。ＰＣＲは以下の条件を使用して行った。最初の変性は９４℃で５分間行い、続いて３０サイクルの変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、３０秒）、およびプライマー延長（７２℃、１分）、そして最後に１回の延長（７２℃で１０分）を行った
ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動では、予想されたサイズのバンドが試験したすべての形質転換体で観察されることが示された。対照からＰＣＲ産物は得られなかった。
【００６３】
結論するとハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼは、ＰＣＲ分析およびＰ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）にハイグロマイシン耐性を付与するこのタンパク質の生物学的活性により確認されるように、Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）で成功裏に発現された。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）
プロトプラスト調製および遺伝的形質転換は、Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）（ＤＡＯＭ１９６９９２）を用い、そしてｈｐｈ遺伝子（選択マーカー）を含むプラスミドｐＳｃｅＩおよびクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来するＧＦＰ遺伝子（Ｓ６５Ｔ）を含む別のプラスミド（ｐＣＰＦ．ＧＦＰ）での同時形質転換を使用して、実施例１および２のように行った。プラスミドｐＣＰＦ．ＧＦＰは、プライマーｇＧＦＰ−ＣｌａＩ．ｆｏｒ
【００６４】
【表４】
2005536989.tif 000005
【００６５】
およびｇＧＦＰ−ＥｃｏＲ．ｒｅｖ
【００６６】
【表５】
2005536989.tif 000006
【００６７】
を使用して、プラスミドｇＧＦＰ（Ａ．Ｓｈａｒｏｎ博士（テルアビブ大学、テルアビブ、イスラエル）により寄付された）に由来するＧＦＰ遺伝子を増幅することにより構築した。ＧＦＰ遺伝子を含む合成した断片を、ＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩにより消化し、そしてｐＣＰＦにこれらの部位で挿入した。
【００６８】
形質転換したシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）細胞に由来するコロニーは選択（ハイグロマイシンＢ）培地で成長したが、野生型のシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）はハイグロマイシン培地では成長しなかった。形質転換したシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）のコロニーに由来するコロニーを蛍光分析にかけて、ＧＦＰタンパク質の存在について確認した。
【００６９】
ＧＦＰタンパク質の活性は、ＧＦＰ形質転換体の３日目のカルチャーを４８８ｎｍで蛍光顕微鏡で観察した。これらの結果から形質転換体はＧＦＰを分生子および菌糸体形の両方で発現したが、野生型のＰ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）は蛍光を示さないことが確認された（図１）；可視光でのＰ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）陰性対照（Ａ）；４８８ｎｍでは何も見えない陰性対照としてのＰ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）（Ｂ）；ＧＦＰを発現している形質転換したＰ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）の菌糸体（Ｃ）；ＧＦＰを発現している形質転換したＰ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）の分生子（Ｄ）。
【００７０】
結論すると、組換えＧＦＰはＰ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）中のタンパク質の蛍光により確認されるように、Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）で成功裏に発現された。
ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＷＬ）
プロトプラスト調製および遺伝的形質転換は、Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）（ＤＡＯＭ１９６９９２）を用い、そしてｈｐｈ遺伝子（選択マーカー）を含むプラスミドｐＳｃｅＩおよびＨＥＷＬ遺伝子を含む別のプラスミドｐＣＰＦ．ＨＥＷＬでの同時形質転換を使用して、実施例１および２のように行った。プラスミド（ｐＣＰＦ．ＨＥＷＬ）は、プライマーＨＥＷＬ−ＣｌａＩ．ｆｏｒ
【００７１】
【表６】
2005536989.tif 000007
【００７２】
およびＨＥＷＬ−ＥｃｏＲ．ｒｅｖ
【００７３】
【表７】
2005536989.tif 000008
【００７４】
を使用して、プラスミドｐＳＫ４−２２（Ａ．Ａｓｓｅｌｉｎ博士（ラベル大学、ケベック州、カナダ）により寄付された）に由来するＨＥＷＬ遺伝子を増幅することにより構築した。ＨＥＷＬ遺伝子を含む合成した断片を、ＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩにより消化し、そしてｐＣＰＦにこれらの部位で挿入した。
【００７５】
形質転換したシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）細胞に由来するコロニーは選択（ハイグロマイシンＢ）培地で成長したが、野生型のシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）はハイグロマイシン培地では成長しなかった。形質転換したシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）のコロニーに由来するコロニーをＰＣＲ分析にかけて、ＨＥＷＬ遺伝子の存在について確認した。
【００７６】
特異的プライマーであるＨＥＷＬ−ＣａｌＩ．ｆｏｒおよびＨＥＷＬ−ＥｃｏＲ．ｒｅｖは、プラスミドＤＮＡのＨＥＷＬ遺伝子を増幅するために使用した。非選択培地の野生型のシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）を、対照として使用した。ＰＣＲは以下の条件で行った。最初の変性は９４℃で５分間行い、続いて３０サイクルの変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、３０秒）、およびプライマー延長（７２℃、１分）、そして最後に１回の延長（７２℃で１０分）を行った
ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動では、予想されたサイズのバンドが試験した形質転換体で観察されることが示された。対照からＰＣＲ産物は得られなかった。
【００７７】
ＨＥＷＬタンパク質の活性は、以前に記載されように（Ａｕｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，９２Ｂ：５２３−５２７）、０．２％のオートクレーブ処理したミクロコッカス  リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）細胞を含む電気泳動ゲルで溶解活性を測定した。
【００７８】
リゾチーム活性は暗い背景上の溶解ゾーンにより明らかとなる。これらの結果では、形質転換体が試験した形質転換体で機能的なＨＥＷＬタンパク質を発現したが、野生型のＰ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）はＨＥＷＬ活性を示さないことが確認された（図２）；Ｌ−１、Ｌ−２７およびＬ−３１：機能的ＨＥＷＬを発現する３種のＰ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）形質転換体；ＰＦ１：Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）対照；ＨＥＷＬ；精製したニワトリ卵白リゾチーム。
【００７９】
結論すると、組換えＨＥＷＬはＰＣＲ分析およびＰ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）に由来するタンパク質の生物学的（溶解）活性により確認されるように、Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）で成功裏に発現された。
ヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）
プロトプラスト調製および遺伝的形質転換は、Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）（ＤＡＯＭ１９６９９２）を用い、そしてｈｐｈ遺伝子（選択マーカー）を含むプラスミドｐＳｃｅＩおよびヒトＰＤＧＦＬ遺伝子を含む別のプラスミド（ｐＣＰＦ．ＰＤＧＦ）での同時形質転換を使用して、実施例１および２のように行った。プラスミドｐＣＰＦ．ＰＤＧＦは、以下のように構築した：
ＰＤＧＦ遺伝子は、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位によりベクターｐＥＴ１１ａ（ノバジェン：Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入されたプラスミドｐＳＭ−１（ＡＴＣＣ５７０５０）に含まれる遺伝子を増殖することにより構築されたプラスミドとして得られた。Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）への形質転換についてＰＤＧＦ遺伝子は、プライマーＰＤＧＦ−ＣｌａＩ．ｆｏｒ
【００８０】
【表８】
2005536989.tif 000009
【００８１】
およびＰＤＧＦ−ＥｃｏＲ．ｒｅｖ
【００８２】
【表９】
2005536989.tif 000010
【００８３】
を使用してこの構築物からのＰＤＧＦ遺伝子を増殖することにより得られた。ＰＤＧＦ遺伝子を含む合成した断片をＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＣＰＦにこれらの部位で挿入した。
【００８４】
形質転換したシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）細胞に由来するコロニーは選択（ハイグロマイシンＢ）培地で成長したが、野生型のシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）はハイグロマイシン培地では成長しなかった。形質転換したシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）のコロニーに由来するコロニーをＰＣＲ分析にかけて、ＰＤＧＦ遺伝子の存在について確認した。
【００８５】
特異的プライマーであるＰＢＳ
【００８６】
【表１０】
2005536989.tif 000011
【００８７】
およびＦｏｒ．ターミネーター
【００８８】
【表１１】
2005536989.tif 000012
【００８９】
を使用して、プラスミドＤＮＡのＰＤＧＦ遺伝子を増幅した。非選択培地の野生型のシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）を、対照として使用した。ＰＣＲは以下の条件で行った。最初の変性は９４℃で５分間行い、続いて３０サイクルの変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、３０秒）、およびプライマー延長（７２℃、１分）、そして最後に１回の延長（７２℃で１０分）を行った。
【００９０】
ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動では、予想されたサイズのバンドが試験した形質転換体で観察されることが示された。対照からＰＣＲ産物は得られなかった。
【００９１】
形質転換体のＥＬＩＳＡ分析は、ＰＤＧＦの存在を確認するために抗−ｈＰＤＧＦ−ｂｂ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ、＃ＡＢ−２２０−ＮＡ）を用いて行った。抗体は不活性モノマー（ＰＤＧＦ−Ｂ）および活性ダイマー（ＰＤＧＦ−ＢＢ）の両方を認識する。
【００９２】
ＰＤＧＦ形質転換体のタンパク質抽出は、ＹＭＰＤブロス中、７０時間後の液体カルチャーで行った。野生型Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）を対照とした。真菌細胞を遠心（２１，０００×ｇ、２０分間）により培養基から分離した。培養基を凍結乾燥し、そして１／１０希釈した汎用的プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、オークヴィル、オンタリオ州、カナダ）を加えたＹＢＢバッファー（キバイオジェン（Ｑｂｉｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリフォルニア州）に再懸濁した。真菌のペレットは、１／１０希釈した汎用的プロテアーゼインヒビターカクテルを加えたＹＢＢバッファーで、製造元の仕様書に従いＦａｓｔＰｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｍａｔｒｉｘシステム（キバイオジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用した可溶性タンパク質抽出にかけた。
【００９３】
ＥＬＩＳＡ分析は培養基および可溶性タンパク質画分の両方について、抗−ｈＰＤＧＦ−ｂｂ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ、＃ＡＢ−２２０−ＮＡ）を使用して、製造元の仕様書に従い抗−ヤギＩｇＧアルカリホスファターゼ（シグマ）を使用して行った。ＰＤＧＦの存在は、精製したＰＤＧＦ−ＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢを陽性対照として使用して、４０５ｎｍでのＥＬＩＳＡプレートリーダー（マルチスカン  アセント  ラボシステムズ：Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）で明かとなった。
【００９４】
結果は、ＰＤＧＦが形質転換体の可溶性タンパク質画分ならびに幾つかの培養基で発現され、そして野生型の真菌はＰＤＧＦを発現しなかったことを示した。
【００９５】
Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）で発現するＰＤＧＦタンパク質の形態を同定するために、ウエスタンブロット分析をＥＬＩＳＡ分析で最高度の発現を示す形質転換体ならびに野生型真菌について行った。形質転換体ならびに野生型真菌を、５０ｍｌＹＭＰＤブロスで２５℃にて７２時間培養した（１５０ｒｐｍ）。培養基を遠心し（１５，０００×ｇで１０分）、そして真菌細胞ペレットを２５ｍＬのＰＢＳバッファーに懸濁した。細胞は１４０００〜１６０００ｐｓｉの圧に設定したフレンチＲ圧力細胞プレス（ＳＬＭ  アミンコ  インスツルメンツ（Ａｍｉｎｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社、アーバナ、イリノイ州）に２回通すことにより溶解させた。ライゼートを１５，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心した。ペレットを１０ｍＬのＴＥ＋バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）に懸濁した。２μｇのペレットおよび可溶性（上清）画分を、１５％の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せた。電気泳動分離の後、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜は１時間、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中の５％ミルクでブロックした。膜は０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（商標）を含むＰＢＳ中の０．５％ミルクで１／１０００に希釈した抗−ｈＰＤＧＦ−ＢＢと１時間インキュベーションし、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回、５分間洗浄した。次いで膜を１／１０，０００の抗−ヤギペルオキシダーゼ（ジャクソン  イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、＃７０５−０３５−００３）と３０分間インキュベーションし、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回、８分間洗浄した。ＰＤＧＦの存在は、化学発光により明らかとなった。
【００９６】
形質転換体ならびに野生型真菌のウエスタンブロット分析では、形質転換体が１４ｋＤａのモノマーＰＤＧＦ−Ｂを発現しただけでなく、還元状態でも２８ｋＤａのダイマーＰＤＧＦ−ＢＢを発現し、そしてタンパク質がほとんど真菌のペレットで排他的に回収されることが確認された（図３）；ＭＷ：分子量マーカー；ＰＤ１ｂ：ＰＤＧＦを発現する形質転換したＰ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）；ＰＦ−１；Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）対照；Ｃｕｌｏｔ：真菌ペレットに由来するタンパク質抽出物；Ｓｕｒ：可溶性タンパク質抽出物；ＹＭ：培養基抽出物；Ａｌｌ：培養基＋可溶性タンパク質抽出物；ＣＴＲ；ＰＤＧＦ−Ｂ対照。
【００９７】
ＰＤＧＦタンパク質の活性は、以前に記載されたように（Ｌａｒｉｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ  Ｒｅｇ，１１：７９−８９）、（３Ｈ）−チミジン取り込み（ＣＰＭ）によるラット腎臓細胞におけるインビトロの分裂促進活性により測定した。このアッセイは形質転換体の測定可能な分裂促進活性を示したが、野生型真菌の処置および未処置細胞では活性が観察されず、生物活性ダイマー（ＰＤＧＦ−ＢＢ；図４）の存在が確認された；ＰＤ１：ＰＤＧＦ活性を発現する形質転換したＰ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）；対照：非処置細胞。
【００９８】
結論すると、ＰＤＧＦはＰＣＲ分析、Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）に由来する組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットアッセイおよび生物学的（分裂促進）活性により確認されるように、Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）中のその活性なダイマー形態で成功裏に発現された。
【実施例４】
【００９９】
種々のシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種を用いたＧＦＰの発現
Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）での発現に加えて、ＧＦＰは実施例３と同一の方法を使用してＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）（ＣＢＳ５１６．８３）で発現した。
【０１００】
これらの結果により、形質転換体はＧＦＰを発現するが、野生型のＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）は蛍光を示さないことを確認した（図５）；可視光中でのＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）陰性対照（Ａ）；４８８ｎｍで陰性対照としてのＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）（Ｂ）；可視光中での形質転換したＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）（Ｃ）；４８８ｎｍでの形質転換したＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）（Ｄ）。
【０１０１】
結論すると、組換えＧＦＰはタンパク質の蛍光により確認されるようにＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）で成功裏に発現された。
【０１０２】
全体として、結果は種々のシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種が組換え産物の発現に宿主として有用であることを確認する。
【実施例５】
【０１０３】
種々のベクターを用いたＧＦＰの発現
Ｐ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）のプラスミドｐＳｃｅＩおよびｐＣＰＥ．ＧＦＰを用いた同時形質転換に加えて、ＧＦＰは以下のように単一のｐＳＰＦ．ＧＦＰを使用してＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）でも発現された。
【０１０４】
プロトプラスト調製および遺伝的形質転換は、Ｐ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）（ＣＢＳ５１６．８３）を用い、そしてｈｐｈ遺伝子（選択マーカー）およびクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来するＧＦＰ遺伝子（Ｓ６５Ｔ）を含むプラスミドｐＳＰＦ．ＧＦＰでの単一プラスミド形質転換を使用して、実施例１および２のように行った。プラスミドｐＳＰＦ．ＧＦＰは、プライマーＫｐｎＩ−ｐｒｏ−ｇＧＦＰ
【０１０５】
【表１２】
2005536989.tif 000013
【０１０６】
およびＳａｃＩ−ｔｅｒ−ｇＧＦＰ
【０１０７】
【表１３】
2005536989.tif 000014
【０１０８】
を使用して、ｈｓｐ７０プロモーター、ＧＦＰ遺伝子およびプラスミドｐＣＰＦ．ＧＦＰからのｈｓｐ７０ターミネーター配列を増幅することにより構築した。得られた断片をＫｐｎＩおよびＳａｃＩで消化し、そしてｐＳｃｅＩ−ＨｙｇのＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位の間に挿入して、発現ベクターｐＳＰＦ．ＧＦＰを得た。
【０１０９】
形質転換したシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）細胞に由来するコロニーは選択（ハイグロマイシンＢ）培地で成長したが、野生型のシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）はハイグロマイシン培地では成長しなかった。形質転換したシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）のコロニーに由来するコロニーを分析にかけて、ＧＦＰタンパク質の存在について確認した。
【０１１０】
ＧＦＰタンパク質の活性は、ＧＦＰ形質転換体の３日目のカルチャーを４８８ｎｍで蛍光顕微鏡により観察した。これらの結果から形質転換体はＧＦＰを発現したが、野生型のＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）は蛍光を示さないことが確認された（図６）；可視光でＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）陰性対照（Ａ）；４８８ｎｍで陰性対照としてのＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）（Ｂ）；可視光で形質転換されたＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）（Ｃ）および４８８ｎｍでの形質転換されたＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）（Ｄ）。
【０１１１】
結論すると、組換えＧＦＰはＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）中のタンパク質の蛍光により確認されるように、Ｐ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）種で成功裏に発現された。
【０１１２】
全体として、これらの結果により種々のベクター／形質転換法をシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種での組換え産物の発現に使用できることが確認される。
【実施例６】
【０１１３】
種々の調節配列を用いた組換えタンパク質の発現  
ＨＳＰ７０短縮化プロモーター
ＨＳＰ７０プロモーターの５’−末端からの連続する１００ｂｐの削除は、以下のように行った。
【０１１４】
鋳型としてｐＳｃｅＩを用いた増幅は、以下のフォワードプライマー：
【０１１５】
【表１４】
2005536989.tif 000015
【０１１６】
を使用して行った。ＰＣＲはフォワードプライマーの１つ、およびプライマーａｎｔｉｐｒｏ−ａｌｌ．ｒｅｖ
【０１１７】
【表１５】
2005536989.tif 000016
【０１１８】
を使用して行い、削除されたＨＳＰ７０プロモーターの５種の変形を得た。
【０１１９】
５種の増幅されたＤＮＡ配列をＸｈｏＩおよびＮｃｏＩで消化し、そしてプラスミドｐＳｃｅＩにこの部位で挿入した。生成したプラスミドは、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｈｐｈ遺伝子を駆動する、連続して１００ｂｐが削除されたＨＳＰ７０プロモーターを別個に含んだ。
【０１２０】
プロトプラスト調製およびＰ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）の形質転換は、ＨＳＰ７０プロモーターの短縮化変形を含む５種のプラスミド、ならびに元の完全長のプロモーター（ｐＳｃｅＩ）を含むプラスミドを用いて実施例１および２のように行った。
【０１２１】
結果はプロモーターのすべての変形が、形質転換した真菌（表２）でハイグロマイシンＢ耐性により示されるように、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能とすることを示した。
【０１２２】
【表１６】
2005536989.tif 000017
【０１２３】
これらの結果により、種々のプロモーター配列がシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種でタンパク質を成功裏に発現させるために使用できることが確認される。
【０１２４】
本発明はその具体的態様に関連して記載してきたが、さらなる修飾が可能であり、そして本出願は一般に本発明の原理に従い、そして本発明に関連する当該技術分野内で知られているか、または普通のプラクティスであるような、およびこれまでに説明した本質的特徴に応用できるような、および添付する特許請求の範囲に従うような本発明の開示からの逸脱を含め、本発明の任意の変形、用途または適合を網羅することを意図していると理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、シュードザイマ  フロッキュローサ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）での組換えＧＦＰの発現を具体的に説明する。
【図２】Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）での機能的組換えＨＥＷＬの発現を具体的に説明する。
【図３】Ｐ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）での組換えＰＤＧＦのウエスタンブロット分析を具体的に説明する。
【図４】分裂促進活性測定によるＰ．フロッキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）での機能的組換えＰＤＧＦの発現を具体的に説明する。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、Ｐ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）での組換えＧＦＰの発現を具体的に説明する。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、Ｐ．アンタールクティカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）の単一プラスミド形質転換による組換えＧＦＰの発現を具体的に説明する。
【配列表】
2005536989.tif 000018
2005536989.tif 000019
2005536989.tif 000020
2005536989.tif 000021
2005536989.tif 000022
【図１】
2005536989.tif 000023
【図２】
2005536989.tif 000024
【図３】
2005536989.tif 000025
【図４】
2005536989.tif 000026
【図５】
2005536989.tif 000027
【図６】
2005536989.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月15日(2004.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種で組換えポリペプチドを生産する方法であって：
ａ）シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）の株を発現ベクターで遺伝的に形質転換させ；そして
ｂ）工程ａ）の該形質転換したシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）の株を、該発現ベクターからの組換えポリペプチドの合成が可能となる条件下で培養する、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項２】
工程ａ）の上記形質転換がプロトプラストの遺伝的形質転換である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）の上記株が、シュードザイマ  アンタールクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、シュードザイマ  アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｐｈｉｄｉｓ）、シュードザイマ  フロッキュローサ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）  シュードザイマ  フシホルマータ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｆｕｓｉｆｏｒｍａｔａ）、シュードザイマ  プロリフィカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｐｒｏｌｉｆｉｃａ）、シュードザイマ  ルグローサ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｒｕｇｕｌｏｓａ）またはシュードザイマ  ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記発現ベクターがプラスミド、発現カセットまたは適合性のあるウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記発現ベクターが組換えタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列、およびシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属で活性なプロモーターを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記発現ベクターが発現した組換えタンパク質またはペプチドの分泌を可能とするプレ領域を含んでなる請求項４に記載の方法。
【請求項７】
上記プロモーターがシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）の株に天然の請求項４に記載の方法。
【請求項８】
上記プロモーターが遍在性または誘導性プロモーターである請求項４に記載の方法。
【請求項９】
組換えポリペプチドを生産するために遺伝的に形質転換されたシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属の真菌。
【請求項１０】
組換えタンパク質および他の組換えポリペプチドの生産のための宿主−ベクター系の宿主としてのシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種の真菌株の使用。
【国際調査報告】
2005536989.tif 000029
2005536989.tif 000030