(57)【要約】  マイクロチャンバー間距離を小さくし、アレイを高密度化することができるマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法及びその装置を提供する。  マイクロチャンバー３２を高密度に配置し、平均１分子のＤＮＡが捕捉されるように希釈したＤＮＡ溶液３４を前記マイクロチャンバー３２内に封入し、前記平均１分子のＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡを合成し、このｍＲＮＡをもとに細胞外でタンパク質３７の合成を行う。
2011070776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロチャンバーを高密度に配置し、平均１分子のＤＮＡが捕捉されるように希釈したＤＮＡ溶液を前記マイクロチャンバー内に封入し、前記平均１分子のＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡを合成し、該ｍＲＮＡをもとに細胞外タンパク質の合成を行うことを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法。
【請求項２】
請求項１記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法において、前記マイクロチャンバーが２００フェムトリットル以下の体積のマイクロチャンバーであることを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法。
【請求項３】
請求項２記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法において、前記マイクロチャンバーが直径７μｍ程度、前記マイクロチャンバーの中心間距離１０μｍ程度を隔てて配置されることを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法。
【請求項４】
請求項１から３の何れか一項記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法において、前記ＤＮＡ溶液が、通常の反応溶液のバルク濃度４．２ｎＭに対して、５００倍に希釈してバルク濃度８．０ｐＭにしたことを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法。
【請求項５】
請求項１から３の何れか一項記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法において、前記ＤＮＡ溶液が、通常の反応溶液のバルク濃度４．２ｎＭに対して、４００倍に希釈してバルク濃度１０．５ｐＭにしたことを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法。
【請求項６】
請求項１から５の何れか一項記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法において、前記細胞外タンパク質の吸着を抑えるために、前記マイクロチャンバーの表面へポリマーにより表面修飾を行うことを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法。
【請求項７】
請求項６記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法において、前記ポリマーがＭＰＣ−ポリマー〔ｐｏｌｙ（２−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ−ｃｏ−３−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）〕であることを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法。
【請求項８】
マイクロチャンバーが高密度に配置され、各マイクロチャンバー内において平均１分子のＤＮＡから細胞外タンパク質を合成することによって、高密度・高純度のタンパク質アレイを作製することを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置。
【請求項９】
請求項８記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記マイクロチャンバーが２００フェムトリットル以下の体積のマイクロチャンバーであることを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置。
【請求項１０】
請求項９記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記マイクロチャンバーが直径７μｍ程度、前記マイクロチャンバーの中心間距離１０μｍ程度を隔てて配置されることを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置。
【請求項１１】
請求項８から１０の何れか一項記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記マイクロチャンバーに希釈したＤＮＡ溶液を導入することにより、平均１分子のＤＮＡからタンパク質合成を行うことを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置。
【請求項１２】
請求項１１記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記ＤＮＡ溶液が、通常の反応溶液のバルク濃度４．２ｎＭに対して、５００倍に希釈してバルク濃度８．０ｐＭとしたことを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置。
【請求項１３】
請求項１１記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記ＤＮＡ溶液が、通常の反応溶液のバルク濃度４．２ｎＭに対して、４００倍に希釈してバルク濃度１０．５ｐＭとしたことを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置。
【請求項１４】
請求項８から１３の何れか一項記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記細胞外タンパク質の吸着を抑えるために、前記マイクロチャンバーの表面修飾を行うポリマーを設けることを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置。
【請求項１５】
請求項１４記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記ポリマーがＭＰＣ−ポリマー〔ｐｏｌｙ（２−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ−ｃｏ−３−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）〕であることを特徴とするマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法及びその装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
全ての細胞内で、タンパク質はリボソームと呼ばれるプロセッシブ酵素によって合成される。リボソームによるメッセンジャーＲＮＡ上の遺伝情報の翻訳過程のダイナミクスは未だ完全には解明されていない（下記非特許文献１，２参照）。マイクロメーターサイズの液滴やチャンバーは一分子酵素学的解析法において、非常に有用性の高いツールとなっている。油中水滴エマルジョンはタンパク質合成のための酵素や遺伝子ライブラリーを分画するために利用されている（下記非特許文献３，４参照）。また、マイクロチャンバーも一分子酵素学的解析（下記特許文献１，非特許文献５参照）やタンパク質合成のために用いられる（下記非特許文献６参照）。油中水滴エマルジョンの水滴では、一分子のＤＮＡからのタンパク質合成に成功している。この際、油中水滴エマルジョンは各液滴中に一分子以下のＤＮＡだけ含むように調製される。これに対してマイクロチャンバーを用いたタンパク質合成は立ち遅れている（下記非特許文献６参照）。これまでに、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マイクロリアクターのアレイやナノウエルチップを用いて体積約１００ｎＬの細胞外タンパク質を合成した例が報告されている（下記非特許文献７−９参照）。さらに、容量の小さいものでは、１ｐＬのＰＤＭＳチャンバーの中にポリマーのビーズに固定した遺伝子ＤＮＡを導入して、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の合成を行った例が挙げられる（下記非特許文献６参照）。この方法ではタンパク質合成の検出には、チャンバー当たり最低１０分子のＤＮＡが必要であった。こうしたタンパク質合成用マイクロチャンバーのアレイを小型化することにより、非常に高密度のタンパク質チップを作製することが可能になる。実際、細胞外タンパク質合成とＤＮＡチップ技術を融合させたタンパク質チップを作製する方法が近年報告されている（下記非特許文献１０−１４参照）。従来、タンパク質チップは、生細胞内でタンパク質を合成し、これを精製したものをアレイ状にプリントすることにより作製されていた。この方法は煩雑であり、コストも高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３７２７０２６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｎｄｒｅｉ  Ｋｏｒｏｓｔｅｌｅｖ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｙ  Ｆ．Ｎｏｌｌｅｒ，「Ｔｈｅ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｉｎ  Ｆｏｃｕｓ：Ｎｅｗ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｂｒｉｎｇ  Ｎｅｗ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ」，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．９，ｐｐ．４３４−４４１（２００７）
【非特許文献２】Ｒ．Ａｎｄｒｅｗ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃｏｌｉｎ  Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ  Ａｉｔｋｅｎ，Ｍａｇｄａｌｅｎａ  Ｄｏｒｙｗａｌｓｋａ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｄ．Ｐｕｇｌｉｓｉ，「Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｌｅｖｅｌ」，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．７７，ｐｐ．１７７−２０３（２００８）
【非特許文献３】Ｂｏｒｉｓ  Ｒｏｔｍａｎ，「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｆ  β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ」，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｖｏｌ．４７，ｐｐ．１９８１−１９９１（１９６１）
【非特許文献４】Ｄａｎ  Ｓ．Ｔａｗｆｉｋ  ａｎｄ  Ａｎｄｒｅｗ  Ｄ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，「Ｍａｎ−Ｍａｄｅ  Ｃｅｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．６５２−６５６（１９９８），
【非特許文献５】Ｙａｎｎｉｃｋ  Ｒｏｎｄｅｌｅｚ，Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｔｒｅｓｓｅｔ，Ｋａｚｕｈｉｔｏ  Ｖ  Ｔａｂａｔａ，Ｈｉｄｅｙｕｋｉ  Ａｒａｔａ，Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｆｕｊｉｔａ，Ｓｈｏｊｉ  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，ａｎｄ  Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｎｏｊｉ，「Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  ｆｅｍｔｏｌｉｔｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒｓ  ａｌｌｏｗ  ｓｉｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，ｐｐ．３６１−３６５（２００５）
【非特許文献６】Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｋｉｎｐａｒａ，Ｒｙｕｔａ  Ｍｉｚｕｎｏ，Ｙｕｊｉ  Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｍａｓａａｋｉ  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓｈｏｕｈｅｉ  Ｙａｍａｕｒａ，Ｑｕａｍｒｕｌ  Ｈａｓａｎ，Ｙａｓｕｔａｋａ  Ｍｏｒｉｔａ，Ｈｉｄｅｏ  Ｎａｋａｎｏ，Ｔｓｕｎｅｏ  Ｙａｍａｎｅ，ａｎｄ  Ｅｉｉｃｈｉ  Ｔａｍｉｙａ，「Ａ  Ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１３６，Ｎｏ．２，ｐｐ．１４９−１５４（２００４）
【非特許文献７】Ｔａｋａｔｏｋｉ  Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔａｋａｈｉｋｏ  Ｎｏｊｉｍａ  ａｎｄ  Ｔｅｒｕｏ  Ｆｕｊｉｉ，「ＰＤＭＳ−Ｇｌａｓｓ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｏｒ  Ａｒｒａｙ  ｗｉｔｈ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄｅｖｉｃｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．１９７−２０２（２００２）
【非特許文献８】Ｍａｒｉ  Ｔａｂｕｃｈｉ，Ｍａｍｉ  Ｈｉｎｏ，Ｙａｓｕｏ  Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｎｏｂｕ  Ｂａｂａ，「Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  ａ  Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ」，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．２．ｐｐ．４３０−４３５（２００２）
【非特許文献９】Ｐｈｉｌｉｐｐ  Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ，Ｌａｊｏｓ  Ｎｙａｒｓｉｋ，Ｗｉｔｏｌｄ  Ｓｚａｆｌａｒｓｋｉ，Ｊｏｒｎ  Ｇｌｏｋｌｅｒ，Ｋｎｕｄ  Ｈ．Ｎｉｅｒｈａｕｓ，Ｈａｎｓ  Ｌｅｈｒａｃｈ，Ｄｏｌｏｒｅｓ  Ｊ．Ｃａｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｉｋａ  Ｌｕｅｋｉｎｇ，「Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓａｙ  ｉｎ  Ｎａｎｏｗｅｌｌ  Ｃｈｉｐ  Ｆｏｒｍａｔ」，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．７６，Ｎｏ．７，ｐｐ．１８４４−１８４９（２００４）
【非特許文献１０】Ｐｈｉｌｉｐｐ  Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ，Ｊｕｒｇｅｎ  Ｋｒｅｕｔｚｂｅｒｇｅｒ，Ｊｏｒｎ  Ｇｌｏｋｌｅｒ，ａｎｄ  Ｊｏｒｇ  Ｄ．Ｈｏｈｅｉｓｅｌ，「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｂｙ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｐｕｒｉｆｉｅｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．９，ｐｐ．１６５８−１６６６（２００６）
【非特許文献１１】Ｓｈｅｎｇ−Ｃｅ  Ｔａｏ  ａｎｄ  Ｈｅｎｇ  Ｚｈｕ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｎａｓｃｅｎｔ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１０，ｐｐ．１２５３−１２５４（２００６）
【非特許文献１２】Ｎｉｒｏｓｈａｎ  Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｊａｃｏｂ  Ｖ  Ｒａｐｈａｅｌ，Ｅｕｇｅｎｉｅ  Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ，Ｇｏｋｈａｎ  Ｄｅｍｉｒｋａｎ，Ｍａｎｕｅｌ  Ｇ  Ｆｕｅｎｔｅｓ，Ａｎｄｒｅａｓ  Ｒｏｌｆｓ，Ｙａｎｈｕｉ  Ｈｕ  ａｎｄ  Ｊｏｓｈｕａ  ＬａＢａｅｒ，「Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．５３５−５３８（２００８）
【非特許文献１３】Ｍｉｎｇｙｕｅ  Ｈｅ，Ｏｄａ  Ｓｔｏｅｖｅｓａｎｄｔ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ａ  Ｐａｌｍｅｒ，Ｆａｒｉｄ  Ｋｈａｎ，Ｏｌｌｅ  Ｅｒｉｃｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｔａｕｓｓｉｇ，「Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ  ｆｒｏｍ  ＤＮＡ  Ａｒｒａｙｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．１７５−１７７（２００８）
【非特許文献１４】Ｏｄａ，Ｓｔｏｅｖｅｓａｎｄｔ，Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｊ．Ｔａｕｓｓｉｇ  ａｎｄ  Ｍｉｎｇｙｕｅ，Ｈｅ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．１４５−１５７（２００９）
【非特許文献１５】Ｐａｕｌｏ  Ｐ．Ａｍａｒａｌ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｅ．Ｄｉｎｇｅｒ，Ｔｉｍ  Ｒ．Ｍｅｒｃｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｓ．Ｍａｔｔｉｃｋ，「Ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｅ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ  Ｍａｃｈｉｎｅ」，ＳＣＩＥＮＣＥ  Ｖｏｌ．３１９  Ｎｏ．２８，ｐｐ．１７８７−１７８９（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記した生細胞内でタンパク質を合成し、これを精製したものをアレー状にプリントするタンパク質アレイの作製方法に対して、最近ＮＡＰＰＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙ）（下記非特許文献１２）やＤＡＰＡ（ＤＮＡ  Ａｒｒａｙ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙ）（下記非特許文献１３）など、アレイ上でタンパク質をｉｎ  ｓｉｔｕ合成する方法が報告されている。タンパク質は第１の基盤上にスポットされた遺伝子ＤＮＡから合成され、また、第２の基盤上に結合するようにタグを施しておく。この第２の基盤がタンパク質チップとなる。この方法は、数千のタンパク質の合成が一つの仕切りのない空間中で行われるために、合成されたタンパク質が拡散してしまい、スポット間のタンパク質の相互共雑が生じる可能性があるといった問題がある。この問題を解決するために、ＮＡＰＰＡ法では、遺伝子ＤＮＡにタグをつけて基盤表面に固定するとともに、タンパク質のカルボキシ末端にタグを導入し、これを認識する抗体で捕捉することによって合成されるタンパク質を対応する遺伝子近辺に局在化させることを試みている。しかしながら、この方法は煩雑であり、実用的ではないといった問題があった。【０００６】
一方、ＤＡＰＡ法では、遺伝子ＤＮＡのスポット間の距離を大きく取り（０．５ｍｍ）、またタンパク質の拡散を防ぐためフィルター膜を用いることにより共雑を防ぐようにしている。いずれの方法も一区画からなるマイクロ流体デバイスを用いているために、合成されるタンパク質の拡散や希釈が起こり、遺伝子ＤＮＡから高濃度のタンパク質のスポットを得ることは非常に困難であり、また、スポット間距離が大きいため、アレイを高密度化することが困難であるといった問題があった。【０００７】
本発明は、上記状況に鑑みて、マイクロチャンバー間距離を小さくし、アレイを高密度化することができるマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法及びその装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕マイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法において、マイクロチャンバーを高密度に配置し、平均１分子のＤＮＡが捕捉されるように希釈したＤＮＡ溶液を前記マイクロチャンバー内に封入し、前記平均１分子のＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡを合成し、このｍＲＮＡをもとに細胞外タンパク質の合成を行うことを特徴とする。【０００９】
〔２〕上記〔１〕記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法において、前記マイクロチャンバーが２００フェムトリットル以下の体積のマイクロチャンバーであることを特徴とする。
〔３〕上記〔２〕記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法において、前記マイクロチャンバーが直径７μｍ程度、前記マイクロチャンバーの中心間距離１０μｍ程度を隔てて配置されることを特徴とする。【００１０】
〔４〕上記〔１〕から〔３〕の何れか一項記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法において、前記ＤＮＡ溶液が、通常の反応溶液のバルク濃度４．２ｎＭに対して、５００倍に希釈してバルク濃度８．０ｐＭにしたことを特徴とする。
〔５〕上記〔１〕から〔３〕の何れか一項記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法において、前記ＤＮＡ溶液が、通常の反応溶液のバルク濃度４．２ｎＭに対して、４００倍に希釈してバルク濃度１０．５ｐＭにしたことを特徴とする。【００１１】
〔６〕上記〔１〕から〔５〕の何れか一項記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法において、前記細胞外タンパク質の吸着を抑えるために、前記マイクロチャンバーの表面へポリマーにより表面修飾を行うことを特徴とする。
〔７〕上記〔６〕記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法において、前記ポリマーがＭＰＣ−ポリマー〔ｐｏｌｙ（２−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ−ｃｏ−３−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）〕であることを特徴とする。【００１２】
〔８〕マイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、マイクロチャンバーが高密度に配置され、各マイクロチャンバー内において平均１分子のＤＮＡから細胞外タンパク質を合成することによって、高密度・高純度のタンパク質アレイを作製することを特徴とする。
〔９〕上記〔８〕記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記マイクロチャンバーが２００フェムトリットル以下の体積のマイクロチャンバーであることを特徴とする。【００１３】
〔１０〕上記〔９〕記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記マイクロチャンバーが直径７μｍ程度、前記マイクロチャンバーの中心間距離１０μｍ程度を隔てて配置されることを特徴とする。
〔１１〕上記〔８〕から〔１０〕の何れか一項記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記マイクロチャンバーに希釈したＤＮＡ溶液を導入することにより、平均１分子のＤＮＡからタンパク質合成を行うことを特徴とする。【００１４】
〔１２〕上記〔１１〕記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記ＤＮＡ溶液が、通常の反応溶液のバルク濃度４．２ｎＭに対して、５００倍に希釈してバルク濃度８．０ｐＭとしたことを特徴とする。
〔１３〕上記〔１１〕記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記ＤＮＡ溶液が、通常の反応溶液のバルク濃度４．２ｎＭに対して、４００倍に希釈してバルク濃度１０．５ｐＭとしたことを特徴とする。【００１５】
〔１４〕上記〔８〕から〔１３〕の何れか一項記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記細胞外タンパク質の吸着を抑えるために、前記マイクロチャンバーの表面修飾を行うポリマーを設けることを特徴とする。
〔１５〕上記〔１４〕記載のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置において、前記ポリマーがＭＰＣ−ポリマー〔ｐｏｌｙ（２−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ−ｃｏ−３−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）〕であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、中心間距離０．０１ｍｍ程度隔てて配置された微小体積の反応容器（２００フェムトリットル程度）において、平均一分子のＤＮＡからタンパク質を合成することができ、各マイクロチャンバーにおいてタンパク質をコードするｍＲＮＡの純度が保証され、なおかつ、高密度なタンパク質アレイ（原理的には従来の２５００倍以上）を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明に係るマイクロチャンバー内でのタンパク質合成の概念図である。
【図２】本発明に係るタンパク質合成用のマイクロチャンバーを有するＰＤＭＳチップのＳＥＭ画像である。
【図３】本発明に係る天然型ＧＦＰとＥｍＧＦＰのタンパク質合成反応の経時変化を示す図である。
【図４】本発明に係るマイクロチャンバー内でのＧＦＰ合成量の比較を示す図である。
【図５】本発明に係るＥｍＧＦＰ合成反応中のタンパク質合成用のマイクロチャンバーの蛍光顕微鏡像の反応中の経時変化を示す図である。
【図６】本発明に係るＥｍＧＦＰ合成反応中のタンパク質合成用マイクロチャンバーの蛍光強度の経時変化を示す図である。
【図７】本発明に係るマイクロチャンバー内でのタンパク質合成反応の統計的解析を示す図である。
【図８】ＥｍＧＰＦおよびＹＦＰ用の特殊なフィルターを用いて７時間後に撮影された本発明にかかるマイクロチャンバーアレイの蛍光画像である。
【図９】本発明に係るマイクロチャンバーを有する高密度のＰＤＭＳチップを示す概念図である。
【図１０】本発明のタンパク質合成法を応用したＲＮＡチップの作製法の概念図である。
【図１１】本発明のタンパク質合成法によるタンパク質チップの作製法の概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
マイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法は、マイクロチャンバーを高密度に配置し、平均１分子のＤＮＡが捕捉されるように希釈したＤＮＡ溶液を前記マイクロチャンバー内に封入し、前記平均１分子のＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡを合成し、このｍＲＮＡをもとに細胞外タンパク質の合成を行う。
また、マイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成装置は、マイクロチャンバーが高密度に配置され、各マイクロチャンバー内において平均１分子のＤＮＡから細胞外タンパク質を合成することによって、高密度・高純度のタンパク質アレイを作製する。
【実施例】
【００１９】
図１は本発明に係るマイクロチャンバー内でのタンパク質合成の概念図である。
タンパク質の合成では、転写と翻訳反応が共役して行われる。ＧＦＰをコードするＤＮＡ（１）が転写されてｍＲＮＡ（２）が作られる。このｍＲＮＡ（２）がタンパク質合成系の因子によってタンパク質（ＧＦＰ）（３）へと翻訳される。なお、ＤＮＡ（１）はリボソーム（４）に結合し、タンパク質合成の鋳型になる。ここで、マイクロチャンバー内に個別化されるのは、タンパク質合成用基質（ＤＮＡ）であり、酵素（ここではリボソーム）ではない。各マイクロチャンバーは効率的なタンパク質合成に十分な翻訳コンポーネント分子（リボソーム，ヌクレオチド，翻訳因子）を含み、これらの因子は制限されない。【００２０】
本発明は最小限の遺伝子ＤＮＡ、すなわち、平均一分子のＤＮＡを用いて、マイクロサイズの区画に高純度のタンパク質を簡便に合成することを可能にした。  この方法は、そのマイクロチャンバーの表面への単一のＤＮＡ分子の付着に依存しないということに留意されたい。そのＤＮＡ分子はそのマイクロチャンバー内に自由に拡散される状態で残る。
この方法は、高濃度のタンパク質のスポットをアレイ化した高密度のチップの作製を可能とする。【００２１】
まず、タンパク質合成用のＰＤＭＳチップを作製する。ＰＤＭＳチップとこれを作製するための鋳型は、ネガティブタイプのフォトレジスト（ＳＵ−８  ２００５；ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ，Ｃｏ．）を用いて一般的なレプリカ形成法とフォトリソグラフィーによって作製した。円筒（直径７μｍ、高さ５μｍ）（図８，図１０参照）をパターン化した構造を鋳型として用い、マイクロチャンバーとして使用されるＰＤＭＳを作製した。鋳型からのＰＤＭＳの離脱を容易にするために、反応性イオンエッチング装置〔ＲＩＥ−１０ＮＲ；サムコ（株）〕を用いて、鋳型にＣＨＦ3 プラズマを照射しフッ化炭素の層をコートした。ＰＤＭＳのポリマー前駆体〔ＳＩＬＯＰＴ  １８４；東レ・ダウコーニング（株）〕と硬化剤とを重量比１０：１で混合し、鋳型上に注ぐ。１１０℃のオーブンに３０分間放置し、ＰＤＭＳを硬化させ、これを鋳型から剥がして取った。こうして作製したＰＤＭＳチップの表面を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（２−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＭＰＣポリマー〔ＬＩＰＩＤＵＲＥ−ＣＲ１７０１；日油（株）〕で修飾した。この修飾は、タンパク質のＰＤＭＳ表面への吸着を防ぎ、また、ＰＤＭＳ表面が親水性になることから微小なマイクロチャンバー内への反応容液の導入を容易にする効果がある（上記非特許文献７，９参照）。【００２２】
図２はこのようにして作製したＰＤＭＳチップの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像であり、図２（ａ）は未修飾、つまり、ＭＰＣコーティングを施していないもの、図２（ｂ）は修飾、つまり、ＭＰＣコーティングを施したものを４５度傾けて観察したものである。
このＰＤＭＳチップ上の各チャンバーの容積は約１９０フェムトリットル（ｆＬ）である。このＳＥＭ画像は、各チャンバーの構造を破壊することなく、ＭＰＣポリマーによってＰＤＭＳチップを修飾することができることを示している。このようにＭＰＣポリマーで修飾したＰＤＭＳチップをマイクロチャンバーでタンパク質合成反応を行っている最中に容器の反応溶液が蒸発してしまうのを防ぐために一晩水中に浸し、使用する直前に取り出した。【００２３】
細胞外タンパク質の合成は、市販のキット（ＲＴＳ  １００  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＹ  Ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏ．）を用い、ＧＦＰあるいはエメラルドＧＦＰ（ＥｍＧＦＰ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を合成した。このキットは生体外タンパク質合成に必要な全てのファクターを含み、使用法に従って使用した。バルク合成では、タンパク質の合成量の経時変化は、マルチラベルリーダー〔ＡＲＶＯ（登録商標）  Ｘ２；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ，ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ；４８５ｎｍ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ；５３５ｎｍ）を用いて測定した。ＰＤＭＳチップと顕微鏡用カバーガラスの間にタンパク質合成用の溶液の液滴を挟み込むことによって、反応溶液をマイクロチャンバー内に導入した。余剰の溶液はＰＤＭＳチップを先端を丸くしたプラスチックの棒などで押し付けることによって取り除いた。このようにして、各マイクロチャンバー内に溶液を密封することができる（上記特許文献１，非特許文献５参照）。密封されたマイクロチャンバーを光学顕微鏡のステージ上にセットし、室温（２５℃）で反応させた。タンパク質合成の様子は高感度のＥｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ  Ｃｈａｒｇｅｄ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ（ＥＭＣＣＤ）ｃａｍｅｒａ（ｉＸｏｎEM＋８８５ＥＭＣＣＤ  Ｃａｍｅｒａ，Ａｎｄｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌｃ）を用いて観察した。【００２４】
まず、最初にＲＴＳ１００キットを用いて天然型ＧＦＰとＥｍＧＦＰのバルク合成（反応容量５０μＬ）を行った。
図３は天然型ＧＦＰとＥｍＧＦＰのタンパク質合反応の経時変化を示す図である。
これらのタンパク質の励起波長と発光波長にはわずかなずれがあるため、現行の実験セットアップではタンパク質合成量の正確な比較を行うことはできない。しかしながら、図３で見られるように、ＥｍＧＦＰと天然型ＧＦＰでは大きな違いが確認された。つまり、ＲＴＳ１００システムを用いた場合、ＥｍＧＦＰの合成速度は天然型ＧＦＰの合成速度よりずっと速く効率も高い。このことはＥｍＧＦＰのタンパク質の折り畳みと成熟が速いこととよく相関している。【００２５】
次に、マイクロチャンバーを用いて一分子のＤＮＡからの細胞外タンパク質合成を行った。ＲＴＳ１００キットと４００倍に希釈して１つのチャンバー当たり平均一分子のＤＮＡが入るように１０．５ｐＭに濃度調節したＤＮＡ溶液をＰＤＭＳチップ上におき、上述の方法でマイクロチャンバー内に密封し室温（２５℃）で保存して反応させた。
なお、ＤＮＡ溶液が、通常のバルク反応溶液では、４．２ｎＭであるに対して、５００倍に希釈してＤＮＡ濃度８．０ｐＭにすると１つのマイクロチャンバーあたり１分子のＤＮＡを捕捉することができる。【００２６】
図４はマイクロチャンバー内でのＧＦＰ合成量の比較を示した反応開始後２００分の蛍光顕微鏡画像であり、図４（ａ）は未修飾ＰＤＭＳマイクロチャンバーを使用した場合、図４（ｂ）はＭＰＣコーティングを施したＰＤＭＳチップを使用した場合をそれぞれ示している。
図４に示すように、ＰＤＭＳチップにＭＰＣコーティングを行った場合、ＭＰＣコーティングを行わない場合に比べてタンパク質合成の効率が向上することがわかった。また、この実験結果からマイクロチャンバーの表面をなんらかの方法でコーティングすることが必須であることがわかった。【００２７】
図５はＥｍＧＦＰ合成反応中のタンパク質合成用マイクロチャンバー内の蛍光顕微鏡画像の経時変化を示しており、図５（ａ）は反応開始直後、図５（ｂ）は１００分経過後、図５（ｃ）は２００分経過後を示している。また、図６はＥｍＧＦＰ合成反応中のタンパク質合成用マイクロチャンバーの蛍光強度の経時変化を示しており、図６（ａ）は明るさの異なる４つのクラスのチャンバーの蛍光強度の経時変化の代表例、図６（ｂ）は図５からランダムに選んだ５０個のチャンバーの蛍光強度の平均値の経時変化を示している。【００２８】
図５において、マイクロチャンバーの蛍光強度が時間を追うごとに少しづつ増加していく様子が見受られる。各マイクロチャンバーに平均１分子のＤＮＡを導入したことから予測されるように、マイクロチャンバーの蛍光強度にばらつきが見られる〔図５（ｂ），（ｃ）参照〕。このマイクロチャンバーの蛍光強度のばらつきはいくつかのレベル（暗い、中程度、明るい、非常に明るい）に量子化されている様子が見られる。【００２９】
図５に見られるマイクロチャンバーを蛍光強度別に４つのクラス（暗い、中程度、明るい、非常に明るい）に区別し、それぞれのクラスの蛍光強度の平均値を求めた。この値の経時変化を図６（ａ）に示す。マイクロチャンバー内でのタンパク質合成は図３に示すバルク合成と同様の挙動を示す。各マイクロチャンバーの蛍光シグナルは時間とともに増加し、２００分でプラトーに達する。各クラスのＥｍＧＦＰの合成速度（グラフの傾き）は明らかに異なる。図５中の５０個のマイクロチャンバーをランダムに選出し、図６（ｂ）に示すように、チャンバー内の蛍光強度の平均値の経時変化（合成開始後の１００分から１６０分）をプロットした。このグラフの勾配はタンパク質合成の速度に対応している。既知のＧＦＰの濃度の溶液を封入し含まれる分子の数に応じて蛍光信号をプロットすることにより、システム較正を行うことができる。これにより、分ごとにマイクロチャンバー内で合成されたＧＦＰ分子の数を推定することができる。マイクロチャンバー内でのタンパク質合成速度には、いくつかの等間隔に量子化したピークが見られる。これらのピークは１つのマイクロチャンバー内に存在するそれぞれ１分子、２分子、３分子のＤＮＡからのタンパク質合成速度を示している。【００３０】
図７はマイクロチャンバー内でのタンパク質合成反応の統計的解析を示す図である。図７（ａ）は図５に示した全てのマイクロチャンバー（１００個）における蛍光強度の変化勾配とこの勾配値をもつチャンバー数の相関図である。５つのピークはそれぞれマイクロチャンバー内に分子数０〜４個のＤＮＡが封入されていることに対応している。図７（ｂ）は１マイクロチャンバー当たりのＤＮＡ分子が１．２５の場合〔○付き線〕および０．６２５の場合〔△付き線〕の占有分布を示している。ここで、○と△は期待値に一致する。つまり、図７（ａ）により求められた１つのマイクロチャンバー当たりのＤＮＡの分子数の分布を示している。この実験結果はポアソン分布によく当てはまる。【００３１】
この概念の実現性は、ＥｍＧＰＦ遺伝子および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子を有する２つの異なった種類のＤＮＡ分子でもって示される。ＤＮＡ分子はそれぞれ１マイクロチャンバー当たりの０．３１ＤＮＡ分子の濃度で無細胞タンパク質合成系に付加される。ＤＮＡ分子を有する合成系は、ＰＤＭＳマイクロチャンバー内で培養される。図８は、ＥｍＧＦＰまたはＹＦＰ用の特殊なフィルターを用いて７時間後に撮影されたマイクロチャンバーアレイの蛍光画像である。ここで、ＥｍＧＦＰは緑色〔図８（ａ）参照〕、ＹＦＰは赤色〔図８（ｂ）参照〕に色付けされている。組合せ画像〔図８（ｃ）参照〕において、マイクロチャンバーがＥｍＧＰＦを含んでいるか、ＹＦＰを含んでいるか、およびそれらの両方を含んでいるかに対応して、マイクロチャンバーはそれぞれ緑色、赤色、および黄色で色付けされている。なお、バー・スケールは３０μｍである。画像に示されているように、純タンパク質スポットは２つの異なる種類のＤＮＡ分子の混合によって得ることができる。このことから、完全ゲノムをコードするＤＮＡライブラリーからタンパク質スポットを得ることが期待される。【００３２】
このように、１９０フェムトリットルの容積のマイクロチャンバー内で平均１分子のＤＮＡから細胞外タンパク質合成を行った。マイクロチャンバー内でＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡが合成され、このｍＲＮＡをもとにタンパク質が合成される。本発明を用いることで、マイクロチャンバー内に含まれる平均１分子のＤＮＡから効率良くＲＮＡやタンパク質を合成することができる。なお、本発明では、図９に示すように、横１２ｍｍ、縦４ｍｍのＰＤＭＳチップ１１に１２００×４００個の高密度のマイクロチャンバー１２を形成するようにしている。図９の拡大部Ａに示されるように、マイクロチャンバー１２は、直径が７μｍで、隣り合うマイクロチャンバー間の間隔１３を３μｍとなるようにＰＤＭＳチップ１１を形成している。マイクロチャンバー１２をこのように高い密度で配置することにより、高密度のＲＮＡチップやタンパク質チップの作製を容易に行うことができる。【００３３】
ＲＮＡ分子は細胞内で情報伝達、構造、触媒、遺伝情報制御分子として重要な役割を果たしている。ゲノム解析によりヒトゲノムではおよそ１．５％がタンパク質をコードしていることが明らかにされた。６０〜７０％は、タンパク質をコードしないＲＮＡ分子となる（上記非特許文献１５参照）。図１０は本タンパク質合成法を応用したＲＮＡチップの作製法の概念図であり、図１０（ａ）はＲＮＡチップを作製するためのＰＤＭＳチップを示す図、図１０（ｂ）は図１０（ａ）のＢ部拡大図、図１０（ｃ）はＰＤＭＳチップから剥がしたＲＮＡチップを示す図である。【００３４】
図１０において、２１はＰＤＭＳチップ、２２はマイクロチャンバー、２３はＲＮＡチップ、２４は生体外転写（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のための溶液、２５は鋳型ＤＮＡ、２６は合成されてタグを付けられたＲＮＡを固定するように処理されたカバーガラス表面、２７はカバーガラス表面２６へ固定されたＲＮＡである。
図１１は本発明のタンパク質合成法によるタンパク質チップの作製法の概念図であり、図１１（ａ）はタンパク質チップを作製するためのＰＤＭＳチップを示す図、図１１（ｂ）は図１１（ａ）のＣ部拡大図、図１１（ｃ）はＰＤＭＳチップから剥がしたタンパク質チップを示す図である。【００３５】
図１１において、３１はＰＤＭＳチップ、３２はマイクロチャンバー、３３はタンパク質チップ、３４は細胞外タンパク質合成用溶液、３５は円形又は直線状のＤＮＡ、３６は合成されてタグをつけられたタンパク質を固定するように処理されたカバーガラスの表面、３７はカバーガラス表面３６へ固定されたタンパク質である。
なお、図１１においては、タンパク質合成反応は、下部に配置されるカバーガラスを介して倒立型の蛍光顕微鏡（図示なし）によって観察するようにしている。【００３６】
上記したように、微小なマイクロチャンバーを使用することにより、ＲＮＡやタンパク質合成用の高価な試薬類の使用量が少なくてすむので、ＲＮＡ又はタンパク質チップ作製のコストを大幅に抑えることができる。マイクロチャンバーを密に配置することにより、原理的には数ミリメートル四方の一枚のチップに一種類または数種類の全ゲノム上にコードされたタンパク質を高密度に呈示するタンパク質チップをＤＮＡライブラリーを用いて作製することができる。このようにして、一種あるいは数種類の全ゲノムを対象とした遺伝子の機能解析や薬物スクリーニングテストを容易に行うことができる。また、本発明のタンパク質（ＲＮＡ）チップ作製法にあるタンパク質（あるいはＲＮＡ）変異遺伝子のライブラリーを用いれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化法の有力なツールになる。【００３７】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のマイクロチャンバーに捕捉されるＤＮＡ分子からのタンパク質の合成方法及びその装置は、マイクロチャンバー間距離を大きくとることなく、アレイを高密度化することができる、タンパク質の合成のためのツールとして利用可能である。
【図３】
2011070776.tif 000003
【図７】
2011070776.tif 000004
【図１】
2011070776.tif 000005
【図２】
2011070776.tif 000006
【図４】
2011070776.tif 000007
【図５】
2011070776.tif 000008
【図６】
2011070776.tif 000009
【図８】
2011070776.tif 000010
【図９】
2011070776.tif 000011
【図１０】
2011070776.tif 000012
【図１１】
2011070776.tif 000013
【国際調査報告】
2011070776.tif 000014
2011070776.tif 000015
2011070776.tif 000016
2011070776.tif 000017