(57)【要約】  本発明は、世界中で単離された７７種類の異なるＨＣＶ１ｂのＥ２で見いだされる最も保存されたアミノ酸のコンセンサス配列を含む合成Ｅ２蛋白質のアミノ酸及び推定核酸配列に関する。本発明はさらに、ＨＶＲ１を欠失したＥ２蛋白質の切断変種に関する。本発明の他の態様は、Ｅ２蛋白質を含むワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３又はそれらの変種から成る群から選択された配列を有する精製単離されたＥ２蛋白質。
【請求項２】
他のポリペプチドとさらに結合した請求項１に記載の精製単離されたＥ２蛋白質。
【請求項３】
本質的に請求項１又は２に記載のＥ２蛋白質及び適切な担体から成る組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のＥ２蛋白質をコードする精製単離された核酸。
【請求項５】
配列番号４〜６から成る群から選択されたヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のＥ２蛋白質をコードする精製単離された核酸。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターで形質転換又は形質移入された宿主生物。
【請求項８】
請求項７の宿主生物によって産生されたＥ２蛋白質。
【請求項９】
十分な濃度の保護抗体の産生を刺激できる量で請求項３に記載の組成物を個体に投与することを含むＣ型肝炎の予防方法。
【請求項１０】
ＨＣＶに対する免疫応答を起こさせることができる量で請求項３の組成物をＨＣＶキャリアに投与することを含むＣ型肝炎の治療方法。
【請求項１１】
本質的に薬剤として許容される担体中の請求項１又は２に記載のＥ２蛋白質から成る、Ｃ型肝炎に対して個体を免疫するためのワクチン。
【請求項１２】
請求項６に記載の発現ベクターを含む組成物。
【請求項１３】
十分濃度の保護抗体の産生を刺激できる量で請求項１２に記載の組成物を個体に投与することを含むＣ型肝炎の予防方法。
【請求項１４】
ＨＣＶに対する免疫応答を起こさせることができる量で請求項１２の組成物をＨＣＶキャリアに投与することを含むＣ型肝炎の治療方法。
【請求項１５】
薬剤として許容される担体中の本質的に請求項６に記載の発現ベクターから成る、Ｃ型肝炎に対して個体を免疫するワクチン。
【請求項１６】
配列番号１〜３から成る群から選択されたＥ２アミノ酸配列に対して特異的な結合親和性を有する抗Ｅ２抗体。
【請求項１７】
ＨＣＶの攻撃から個体を防御するために有効な量で請求項１６の抗体を前記個体に投与することを含むＣ型肝炎の予防方法。
【請求項１８】
ＨＣＶワクチン組成物を製造するための請求項１又は２に記載のＥ２蛋白質の使用。
【請求項１９】
慢性的ＨＣＶキャリアにＨＣＶに対する免疫を導入するための請求項１又は２に記載のＥ２蛋白質の使用。
【請求項２０】
その他の任意の治療の前後、又は同時に慢性ＨＣＶキャリアにＨＣＶに対する免疫を導入するための、請求項１９に記載のＥ２蛋白質の使用。
【請求項２１】
肝臓移植の前後、又は感染が疑われるときにＨＣＶ感染個体にＨＣＶに対する免疫を導入するための、請求項１又は２に記載のＥ２蛋白質の使用。
【請求項２２】
ＨＣＶに対する免疫を予防的に導入するための請求項１又は２に記載のＥ２蛋白質の使用。
【請求項２３】
ＨＣＶワクチンとして使用するための請求項１から３までのいずれかに記載のＥ２蛋白質又は組成物。
【請求項２４】
慢性ＨＣＶキャリアにＨＣＶに対する免疫を導入するための請求項１から３までのいずれかに記載のＥ２蛋白質又は組成物。
【請求項２５】
その他の任意の治療の前後、又は同時に慢性ＨＣＶキャリアにＨＣＶに対する免疫を導入するための、請求項２４に記載のＥ２蛋白質又は組成物。
【請求項２６】
肝臓移植前後、又は感染の疑われるときにＨＣＶ感染個体にＨＣＶに対する免疫を導入するための、請求項１から３までのいずれかに記載のＥ２蛋白質又は組成物。
【請求項２７】
ＨＣＶに対する免疫を予防的に導入するための請求項１から３までのいずれかに記載のＥ２蛋白質又は組成物。
【請求項２８】
ＨＣＶ感染を治療又は予防するための請求項１６に記載の特異的抗体の使用。
【請求項２９】
適切な容器に入れた請求項１又は２に記載のＥ２蛋白質を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体を検出するためのキット。
【請求項３０】
ＨＣＶ抗体を検出するためのイムノアッセイであって、
（１）請求項１又は２に記載のＥ２蛋白質を提供することと、
（２）抗体−抗原複合体が形成される条件下で生物学的試料を前記Ｅ２蛋白質とインキュベートすることと、
（３）前記Ｅ２蛋白質を含む前記抗体−抗原複合体が形成されているかどうかを測定することとを含むイムノアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝炎ウイルス学の分野に関する。本発明は、世界中から単離された７７種の異なるＨＣＶ  １ｂ単離物のＥ２で発見された最も保存されたアミノ酸配列のコンセンサス配列を含む論理的に設計された合成Ｅ２蛋白質のアミノ酸配列に関する。より具体的には、本発明は合成Ｅ２蛋白質を含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ属の１種として分類されている一本鎖の陽性ＲＮＡウイルスである（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｈｍａｎｎ、２０００、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；８１  Ｐｔ７：１６３１〜４８）。そのゲノムは、高度に保存された５’非翻訳領域と、それに続くアミノ酸３０１０〜３０３３個のポリ蛋白質前駆体として翻訳されるヌクレオチド約１００００個の単一のオープンリーディングフレームから構成される。その後、宿主及びＨＣＶによってコードされたプロテアーゼによる酵素的分解によって（Ｈｉｊｉｋａｔａ他、  １９９１  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８、  ５５４７〜５１；  Ｌｉｎ他、  １９９４  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８、５０６３〜７３；Ｌｉｎ他、１９９４  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８、８１４７〜５７  Ｇｒａｋｏｕｉ他、１９９３  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０、１０５８３〜７；Ｇｒａｋｏｕｉ他、１９９３  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７、２８３２〜４３）、構造によって分類できる少なくとも１０種類の異なるポリペプチド、すなわちコア及び外被蛋白質並びに非構造蛋白質、すなわちヘリカーゼ、プロテアーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが生じる。それらによって、ＨＣＶウイルス粒子が構成される（Ｍｉｙａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｕｒａ、  １９９３  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １（６）：  ２２９−３１；  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｈｍａｎｎ、  ２０００  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；  ８１  Ｐｔ  ７：１６３１〜４８）。ＨＣＶは、慢性肝疾患、場合によっては肝細胞癌に陥る厳しい感染症を引き起こす能力があるので、公衆衛生上重大な関心事である（Ｈｏｏｆｎａｇｅｌ、  １９９７  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２６  （３  Ｓｕｐｐｌ  １）：１５Ｓ〜２０Ｓ）。現在、抗ウイルス治療は不十分であるため、より良い治療薬及び効果的なＨＣＶワクチンの開発は最優先事項である（概説については、Ｒｏｓｅｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｔｃｈ、  １９９９  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ  ５（９）：  ３９３〜９を参照のこと）。
【０００３】
ＨＣＶワクチンを含めた有効な抗ＨＣＶ薬の開発は、ＨＣＶが１〜６の遺伝子型から得られる少なくとも６種類の異なる蛋白質の一団として存在する事実が妨げとなっている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ他、  １９９３  Ｊ  ｏｆ  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４、  ２３９１〜９）。ますます困難なことに、ＨＣＶに感染した患者は、主要な一遺伝子型から派生した多種多様なＨＣＶ亜種を含むようである（Ｆｏｒｎｓ他、  １９９９  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７（１０）：  ４０２〜１０）。ＨＣＶ本来の高度な変異性の原因は、忠実度の低いＨＣＶ  ＲＮＡポリメラーゼである（ＮＳ５Ｂ；  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｈｍａｎｎ、  ２０００  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；  ８１  Ｐｔ  ７：１６３１〜４８）。したがって、親水性の性質を有し、表面で発現するある種のＨＣＶペプチドモチーフは、免疫原でありながら非常に変異性があり、免疫の監視から逃れることができる。これらの特性を備えた１種類のモチーフによって可変領域Ｉ（ＨＶＲ１）が作り出され、外被蛋白質Ｅ２のＮ’末端に２７個のアミノ酸伸長部分を形成する。ＨＶＲ１は、いくつかのＴ及びＢ細胞エピトープを含有しており（Ｗｅｉｎｅｒ他、  １９９２  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９（８）：３４６８〜７２；Ｓｃａｒｓｅｌｌｉ他、１９９５  Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６９（７）：４４０７〜１２；Ｚｉｂｅｒｔ  ｅｔ  ａ１、１９９５  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０８、  ６５３〜６１）、このドメインに対する抗体は、ヒト繊維芽細胞に対するＨＣＶ結合及び感染の阻害を示し（Ｚｉｂｅｒｔ他、  １９９５  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０８、６５３〜６１；Ｓｈｉｍｉｚｕ他、１９９６  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２３（２）：４０９〜１２）、結合中和（ＮＯＢ）アッセイにおいてＭＯＬＴ−４細胞に対するＥ２  ＣＨＯ結合を部分的に阻害し（Ｒｏｓａ他、１９９６  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３、１７５９〜６３）、免疫沈殿アッセイにおいてＨＣＶを捕捉し（Ｅｓｕｍｉ  ｅｔ  ａ１、１９９６  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５９（１２）：９１〜８）、チンパンジーにおけるＨＣＶ感染を少なくとも部分的に寛解する（Ｆａｒｃｉ他、１９９４  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１（１６）：７７９２〜６；Ｆａｒｃｉ他、１９９６  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３、１５３９４〜９；Ｓｈｉｍｕｚｕ他、１９９６  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２３（２）：４０９〜１２）。
【０００４】
ワクチン候補としてのＨＶＲ１を研究するために、多大な努力が尽くされた。たとえば、Ｇｏｔｏ他（２００１  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：２７０〜２８３）はチンパンジーを合成ＨＶＲ１ペプチドで免疫して、予防を実現した。Ｃａｒｌｏｓ他（２０００、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｗｅｅｋｌｙ、Ｊｕｌｙ  ２６  ｐ．１７）の報告では、ウイルスの超可変領域に一般的に見いだされるいくつかの変異を取り入れた合成構築物を設計している。このペプチド構築物には、ウイルスのＨＶＲ１及びＨＶＲ２に見いだされる物質が含まれる。
【０００５】
Ｅ１／Ｅ２を含む予防ワクチンによって生じる過免疫血清のＨＶＲ１に対する結合力価は非常に低いので、ＨＣＶ中和に関与する他の重要なドメインは、ＨＶＲ１の外側にあると考えられる（Ｃｈｏｏ他、１９９４  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：１２９４〜１２９８）。しかし、Ｃｈｏｏのワクチンは、ＨＣＶの類似株に対してのみ保護する。
【０００６】
免疫にＥ２蛋白質を使用するためにいくつかの試みがなされてきた。Ｂｕｋｈ他は、ＷＯ２００１２１８０７でＨＶＲ１を欠失したＨＣＶをコードする核酸分子及び免疫におけるその使用を開示している。Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉ他、（２００１  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３３：６９２〜７０３）は、強力な液性応答を誘導できるＥ２蛋白質の外部ドメインと融合したある種のＨＶＲ１ペプチド擬態（ミモトープ）を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、全体としてＥ２外被蛋白質はＨＣＶ感染を中和するためにふさわしい標的部位であるようである。したがって、異種ＨＣＶサブタイプに適した予防ワクチン並びに治療ワクチンとして適切なＥ２抗原を開発することは、最も重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、７７種類の異なるＨＣＶ  １ｂ単離物のＥ２に見いだされる最も保存されたアミノ酸（「Ｅ２主要部分」）のコンセンサス配列を含む合成Ｅ２蛋白質のアミノ酸配列及び推定核酸配列に関する。本発明は又、ＨＶＲ１を欠失した切断Ｅ２蛋白質（「Ｅ２主要部分  ｗ／ｏ）のアミノ及び推定ヌクレオチド配列及びＨＶＲ１がＲ９ミモトープと置換されたＥ２主要部分蛋白質（Ｐｕｎｔｏｒｉｅｒｏ他、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．１７、Ｎｏ．１３  ｐｐ３５２１−３５３３、１９９８）（「Ｅ２主要部分Ｒ９」）のアミノ及び推定ヌクレオチド配列に関する。本発明は又、開示された配列と少なくとも９８％の相同性を有する本発明のＥ２主要部分蛋白質の変種に関する。
【０００９】
本発明はさらに、本明細書で開示した配列に由来する蛋白質に関する。
【００１０】
これらの蛋白質は、本発明のＥ２蛋白質をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入し、宿主細胞で組換え蛋白質を発現させることによる組換え方法によって産生することが可能である。
【００１１】
本発明の一態様は、ワクチンとしてのこれらの蛋白質の使用に関する。
【００１２】
本発明の他の態様は、核酸に基づいたワクチンとしての、本発明のＥ２蛋白質をコードする核酸配列を含む発現ベクターの使用に関する。
【００１３】
本発明はさらに、個体のＣ型肝炎の予防又は治療において使用するための、本発明の蛋白質を含む医薬組成物に関する。
【００１４】
本発明の蛋白質は又、生物学的試料中のＨＣＶに特異的な抗体を検出するために使用することができる。したがって、ＨＣＶ感染、疾患の進行及びＨＣＶ感染治療期間中の治療薬の効果を確認したり、モニターしたりする診断手段として使用することができる。
【００１５】
本発明の他の態様は、生物学的試料中のＨＣＶに特異的な抗体の検出キットであって、精製単離された本発明の蛋白質を本質的に含むキットである。
【００１６】
本発明の他の態様は、本発明のＥ２蛋白質に対する抗体及び受動的免疫治療又は予防におけるこのような抗体の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ここでは、本発明を例示するためのものであって、制限するものではない以下の実施例を参考とする。
【００１８】
実施例
本発明は、合成された、非天然改変Ｅ２蛋白質（「Ｅ２主要部分」、「Ｅ２主要部分Ｒ９」及び「Ｅ２主要部分ｗ／ｏ」）が、様々なＨＣＶ遺伝子型に感染した患者から得られた血清及び様々な形態のＥ２で免疫したマウスの過免疫血清によって認識されるという驚くべき発見に関する。さらに、これらの合成蛋白質は、動物モデルにおけるＨＣＶ感染を中和できる強い免疫応答を引き起こすことができる。これらの結果によって、合成Ｅ２蛋白質特有の構造は、様々な形態のＥ２に対して免疫応答を引き起こすことができるので、ワクチンとして理想的な候補であることが示唆される。
【００１９】
材料及び方法
一般的な材料は全て、Ｓｉｇｍａ（Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。哺乳動物Ｅ２  ＣＨＯは、Ａｕｓｔｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（ＣＡ）から購入した。
【００２０】
以下に説明した発現及び精製方法は全て、本発明で開示したＥ２の全種類（「Ｅ２主要部分」、「Ｅ２主要部分Ｒ９」及び「Ｅ２主要部分ｗ／ｏ」）並びに天然Ｅ２に対するものである。
【００２１】
合成ＨＣＶ  Ｅ２  ｃＤＮＡの作製
１．Ｅ２主要部分Ｒ９
この構築体は、第１及び第２の２つの個別のＰＣＲ反応を使用した反復ＰＣＲによって合成した。第１ＰＣＲ反応では、以下の５センスプライマ及び５アンチセンスプライマを１本の試験管で一緒に混合した。
【００２２】
プライマデータは削除した
この第１ＰＣＲでは、センスプライマ（１〜５番）及びアンチセンスプライマ（１〜５番）の全てを保存濃度２５ｐｍｏｌ／μｌで一緒に混合した。混合したプライマの一定分量３μｌを、以下の手順を使用したＰＣＲのために取り出した。９５℃、３分、９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃１分を３０回、その後Ｂｉｏ−Ｘ−Ａｃｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）で７２℃で５分伸長。
【００２３】
第１ＰＣＲに続いて、１μｌを取り出して、外部隣接領域、小オリゴヌクレオチドを使用した第２ＰＣＲを行った。この反応で、センスプライマは５’  ｃｇｃ−ｇｇａ−ｔｃｃ−ｃａｇ−ａｃｃ−ａｃｃ−ｇｔｇ−ｇｔｔ−ｇ  ３’で、アンチセンスプライマは５’ｃｃｇ−ｇａａ−ｔｔｃ−ｔｔａ−ｔｃａ−ｇｔｇ−ｇｔｇ−ｇｔｇ−ｇ  ３’であった。使用したＰＣＲ条件は、サイクルが２０回であること以外は第１ＰＣＲと同様であった。ＰＣＲ断片は、１％アガロースで電気泳動し、ＵＶ下で臭化エチジウムで視覚化し、その後のＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）によるクローニングの前に精製した。精製断片を酵素的にＢａｍＨ１及びＥｃｏＲＩ制限酵素で切断して、予めＢａｍＨ１及びＥｃｏＲＩで消化したバキュロウイルス発現プラスミドｐＡｃＧＰ６７Ｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）に連結した。
【００２４】
２．Ｅ２主要部分ｗ／ｏ
ＰＣＲを、既に説明した組換えＥ２主要部分Ｒ９ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＧＰ６７Ｂで、以下のセンス及びアンチセンスプライマを使用して実施した。
【００２５】
プライマデータは削除した
ＰＣＲ条件は前記の第１反応と同じであった。得られたＰＣＲ断片をゲルで精製し、ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲＩで消化して、同様に消化したｐＡｃＧＰ６７Ｂプラスミドに連結した。
【００２６】
３．Ｅ２主要部分
Ｅ２主要部分は、制限酵素消化と反復ＰＣＲを組み合わせて使用して構築した。
【００２７】
ａ）Ｅ２主要部分Ｒ９をＢａｍＨ１及びＡｓｃＩ制限酵素で完全に消化した。消化物を１％アガロースゲルで電気泳動して、約１０ｋｂより大きい断片を切除して、精製した。
【００２８】
ｂ）反復ＰＣＲ反応は、以下の２５マーオーバーハングを有する１９×約５０マーオリゴヌクレオチドを使用した第１反応で実施した。
【００２９】
プライマデータは削除した
得られた約４００ｂｐまでの断片を１％アガロースゲルで電気泳動し、精製し、ＢａｍＨ１／ＡｓｃＩで消化し、再度精製した。その後、この断片を既に作成した消化Ｅ２主要部分Ｒ９プラスミドに連結した（前記の（ａ）項）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞に形質転換した後、細菌コロニーを増殖させて、プラスミドＤＮＡを単離して、ＤＮＡ配列決定を行った。予測されたＤＮＡ配列に合致するクローンをさらに増殖させ、プラスミドＤＮＡを抽出して、組換えプラスミドｐＡｃＧＰ６７Ｂ  Ｅ２主要部分を作製した。
【００３０】
バキュロウイルス細胞株
接着性ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を、イーストレート、ラクトアルブミン加水分解物、１０％牛胎児血清、及びゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌを補給したＧｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）（ＴＮＭ−ＦＨ培地）で維持した。これらの細胞は形質移入、終点希釈分析（ＥＰＤＡ）及び高力価組換えウイルスの作製に関与する方法のためにのみ使用した。Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）を接着培養又は振盪培養で維持して、血清を含まない培地（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｘｐｒｅｓｓ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、ＭＤ、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ４０５培地、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｎｄｏｖｅｒ  ＵＫ）で増殖させた。これらの細胞を蛋白質発現研究のために使用した。細胞は全て冷蔵インキュベータ（ＶＥＬＰ  Ｓｃｅｎｔｉｆｉｃ）で２７℃で維持した。
【００３１】
組換えバキュロウイルスの作製
組換えバキュロウイルスは全て、直線化ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して作製した。ＥＰＤＡ及び高力価組換えウイルス力価保存液（２×１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を作製するためのウイルス増幅方法は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎの指示書に従って実施した。
【００３２】
バキュロウイルスＥ２主要部分蛋白質の発現及び精製
Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞の適応及び感染
蛋白質発現を研究する前に、Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞を振盪フラスコに適応させた。簡単に説明すると、フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、ＭＡ）から接着細胞（ｍｌ当たり１０６細胞）を１ｌのエルレンマイヤポリカーボネートフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＡ）に移し、血清を含まない培地５００ｍｌ中で１５０ｒｐｍで２４時間振盪した。その後フラスコを取り出し、クリーンベンチに入れ、５分間傾けて非凝集細胞から凝集細胞を分離させた。均一な、単細胞を取り出して新しいエルレンマイヤフラスコに移し、１ｍｌ当たり１×１０６細胞の密度で接種して、感染多重度（ＭＯＩ）＝３でＥ２主要部分組換えバキュロウイルスのパネルを感染させた。感染３日後、振盪培養物を収集し、遠心によって上清を集めて、滅菌濾過して４℃又は−７０℃で保存した。
【００３３】
バキュロウイルスＥ２主要部分感染Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞のＲＴ−ＰＣＲ
Ｅ２主要部分蛋白質の発現及び精製が、その特異的組換えバキュロウイルス由来であることを確認するために、いくつかの発現実験中に、５×１０６細胞を採取して、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ  ＢＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＯＨ）を使用してＲＮＡ単離を行った。ＲＮＡの一定分量を取り出し、オリゴーｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）を使用しＡＭＶ及びＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）の触媒によって逆転写（ＲＴ）させた。ｃＤＮＡを、ｐＡｃＧＰ６７Ｂセンスプライマ及びアンチセンスプライマ（前記参照）を使用したＰＣＲのために取り出した。ＰＣＲ操作は、９４℃で３分（１回）、９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１．５分（３３回）行い、その後７２℃で５分の最後の伸長段階を行った。ＰＣＲ断片は、ゲルで精製して、ｐＡｃＧＰ６７Ｂセンスプライマ及びアンチセンスプライマ（前記参照）を使用した直接的ＤＮＡ配列決定を行った。
【００３４】
感染バキュロウイルスＥ２主要部分上清の濃度
様々な量のバキュロウイルスＥ２主要部分上清（２５０ｍｌから７ｌ）を、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０、２００（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）又はセルロース濃縮装置で改造したＰｅｌｌｉｃｏｎ−ＸＬ５０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ）を使用して約１０倍に濃縮した。濃縮物をＰＢＳ又はＮａＨＰＯ４  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、イミダゾール  １０ｍＭから成るネイティブ溶解緩衝液（ＮＬＢ、ｐＨ＝８）で４℃で一晩透析した。ＮＬＢのみに対して透析した後の物質に対して、ＮＬＢに溶かした１０％トリトン−Ｘ  １００の１／２０希釈物を添加した。透析物質全てをその後滅菌濾過して、精製を行った。
【００３５】
バキュロウイルスＥ２主要部分上清のＦＰＬＣ精製
ニッケル（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースカラムによる精製
ニッケル−ＮＴＡアガロース４．５から３０ｍｌの範囲のカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）をＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｃカラムで調製した。カラムをＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＮＪ）に連結して、３カラム体積のＮＬＢを用いて流速１分当たり３ｍｌで洗浄した。Ｅ２主要部分上清を１分当たり１〜２分の速度で添加し、イミダゾール２０ｍＭを含有するＮＬＢ５カラム体積で１分当たり３ｍｌで洗浄した。Ｅ２主要部分は、イミダゾール３００ｍＭを含有するＮＬＢ５をカラム体積用いて、１分当たり３ｍｌで溶出させた。溶出した画分の光学密度は、２８０ｎｍで測定し、収集し、ＰＢＳに対して４℃で十分に透析した。
【００３６】
抗Ｅ２ｍＡｂ１８複合ストレプトアビジンセファロースカラムによる精製
精製したｍＡｂ１８（以下参照）２５ｍｇをビオチン（Ｐｉｅｃｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＩＬ）１．２５ｍｇに結合させて、ＰＢＳで十分に透析した。ビオチン標識ｍＡｂ１８（２２ｍｇ）をゆっくり撹拌することによって室温で３０分間ストレプトアビジンセファロースＨｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＮＪ）１０ｍｌに結合させ、その後ＨＲ１０／１０カラムに充填した。結合したビオチン標識ｍＡｂ１８は、物質を通過する流れを分光光度測定することによって確認し、カラムをＰＢＳで洗浄した。既にＰＢＳで透析した濃縮Ｅ２上清をカラムに１分当たり２ｍｌの速度で添加した。５カラム体積のＰＢＳで洗浄後、結合した物質を０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ＝３）の画分１ｍｌで溶出し、すぐに１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ＝９）５０μｌで中和した。溶出画分の光学密度を２８０ｎｍで測定して、収集してＰＢＳで４℃で十分に透析した。
【００３７】
蛋白質濃度の測定
精製蛋白質の濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ）で測定した。
【００３８】
免疫ブロット分析
粗又は精製蛋白質試料（１００〜２００ｎｇ）を還元条件下で（β−メルカプトエタノール３６０ｍＭの存在下で９５℃で５分間加熱）、又は非還元条件下で（β−メルカプトエタノール無しで３７℃で１０分間）ＬＤＳ添加緩衝液を補足して、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲルに添加して、ＭＥＳ実行緩衝液（Ｎｏｖｅｘ、サンディエゴ）で電気泳動した。蛋白質をＸＣｅｌｌ  ＩＩ  ブロット  モジュール（Ｎｏｖｅｘ、サンディエゴ）を使用して湿った状態でニトロセルロース膜にエレクトロブロットして移し、ブロック緩衝液（ＰＢＳ−０．０４％Ｔｗｅｅｎ−０．３％ミルク蛋白質）で４℃で一晩ブロックした。ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）、マウス又はヒト抗Ｅ２ｍＡｂ  ０．０２〜２μｇ／ｍｌを添加した後、ブロットを新鮮なブロック緩衝液に入れ、室温で３時間インキュベートした。同様の方法を様々な希釈度のＨＣＶ患者の血清を使用して実施した。ブロック緩衝液で５分ずつ別々に３回洗浄した後、ブロットをペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス（１：１００００）か、又はヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：２００００、Ｚｙｍｅｄ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、サウスサンフランシスコ）でインキュベートして増強化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）を行った。
【００３９】
マウス抗Ｅ２ｍＡｂの作製
免疫
抗Ｅ２ｍＡｂ１８
ＢＡＬＢ／Ｃ（５週齢）をＥ２  １０μｇと完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、ＭＩ）１：１を足蹠に免疫した。マウスに２回、２週間間隔でＥ２  ５μｇと不完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、ＭＩ）１：１を足蹠に追加免疫した。マウスからその後の融合のための脾臓を取り出す３日前にＥ２  １μｇで追加免疫した（静脈内）。
【００４０】
過免疫血清及び抗Ｅ２主要部分Ｒ９ｍＡｂ２１
ＢＡＬＢ−Ｃマウス（５週齢）をＣｐＧ（５’ｔｃｃ−ａｔｇ−ａｃｇ−ｔｔｃ−ｃｔｇ−ａｃｇ−ｔｔ  ３’、Ｇｅｎｓｅｔ、フランス）及び２％Ａｌｕｍ（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）２５μｌを含有するホスホロチオ酸１００μｇと共にＥ２又はＥ２主要部分Ｒ９  １０μｇで免疫した。この抗原混合物を撹拌して、腹腔内への免疫前に３０分間氷上に置いた。脾臓を融合用に取り出す３日前に、マウスをさらに抗原２μｇで静脈内で免疫した。
【００４１】
マウス脾臓の融合
脾臓細胞をヒト−マウスヘテロミエローマＨＭＭＡ２．１１ＴＧ／０と３：１の比で混合した。融合は５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で実施し、融合細胞はヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ）補給物を含有する完全ＲＰＭＩ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）の入った９６ウェルＵ底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ．Ｉｎｃ）にウェル当たり３００００細胞の濃度で接種した。１週間後、細胞に新鮮なＨＡＴ培地を与えた。融合の２週間後に上清を収集し、特異的抗体の存在をそれぞれの免疫原に対するＥＬＩＳＡで調べた。培地に新たにヒポキサンチン、チミジン（ＨＴ）含有培地を補給した。特異的抗Ｅ２又は抗Ｅ２主要部分Ｒ９ｍＡｂを分泌するハイブリドーマ培養物は、希釈を９６Ｕ底マイクロタイタープレートで０．５細胞／ウェルに制限することによってクローニングした。
【００４２】
クローン１８及び２１の腹水調製
ＢＡＬＢ−Ｃマウスにプリスタン（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）５００μｌを腹腔内注射した。１０日後、マウス特異的モノクローナル抗体５×１０６個を腹腔内注射した。３又は４週間後、腹腔洗浄を実施して、腹水を取り出した。
【００４３】
腹水の精製
腹水をＰＢＳで１：１に希釈して、５ｍｌ  Ｈｉ−ｔｒａｐ  蛋白質Ｇカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＮＪ）に１分当たり５ｍｌで添加した。ＰＢＳ４０ｍｌで洗浄後、結合したｍＡｂを０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ＝２．７）３０ｍｌで溶出して、ＰＢＳで十分に透析した。ＭＡｂを−２０℃で１ｍｇ／ｍｌの濃度で保存した。
【００４４】
ＥＬＩＳＡ
ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、Ｉｎｃ）をＰＢＳに溶かしたＥ２抗原２μｇ／ｍｌ（ウェル当たり５０μｌ）で４℃で一晩コーティングした。ウェル当たり２００μｌのＰＢＳ／１％  ＢＳＡで３７℃で２時間ブロックした後、マウス血清の連続希釈（１：１００〜１：２０００００）又は精製ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）をウェルに添加して３７℃で２時間おいた。ＰＢＳ／０．０４％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄後、ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）１：１００００希釈を添加して３７℃で１時間おき、その後基質として３，３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジン二塩酸塩（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を使用して４５０ｎｍで比色定量した。
【実施例１】
【００４５】
Ｅ２主要部分は、（ジーンバンクが保管する配列のうちの）７７種類の異なるＥ２蛋白質の配列を比較することによって構築した。各位置で最も頻繁に生じるアミノ酸を選択して、それに従って構築物を合成した。Ｅ２主要部分ｗ／ｏは、ＨＶＲ１を含む最初の２７アミノ酸を欠失したＥ２主要部分切断変種である。Ｅ２主要部分Ｒ９は、ＨＶＲ１領域内に既に同定されたＲ９と称するＨＶＲ１ミモトープ（長さ２７アミノ酸）を含有する。Ｅ２主要部分、Ｅ２主要部分ｗ／ｏ及びＥ２主要部分Ｒ９は、通常であれば同一である（図１、配列リスト、配列番号１はＥ２主要部分、配列番号２はＥ２主要部分ｗ／ｏ、配列番号３はＥ２主要部分Ｒ９を示す）。（Ｘで示した）位置３１のアミノ酸は、フェニルアラニン（Ｆ）か、又はイソロイシン（Ｉ）であることが可能である。
【００４６】
合成構築体は、反復ＰＣＲ法によって作製した。ショットガン法を使用して、完全なコーディング主要部分配列を含む２０量体の５’及び３’オーバーハングを有するそれぞれのプライマ（約１００量体）を混合して、ＰＣＲを行った（方法を参照）。ｐＡｃＧＰ６７Ｂにクローニングするための最終ＰＣＲ産物を作製するために、５’ＢａｍＨＩ及び３’ＥｃｏＲＩコーディング部位を含有するより小さな５’及び３’プライマを設計した。３’プライマは、精製を可能にするヒスチジンタグを有していた。
【００４７】
Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞は、振盪培養によって増殖させ、多重感染度（ＭＯＩ）３で組換えＥ２（主要部分、主要部分Ｒ９又は主要部分ｗ／ｏ）バキュロウイルスで感染させた。その後７２時間にわたって上清試料を採取し、蛋白質ゲルで抗Ｈｉｓ又は抗Ｅ２ｍＡｂで調べた。非常にかすかではあるが、感染して８時間の早さで免疫反応Ｅ２（Ｍｗ＝５０ｋＤ）が観察され、感染後７２時間まで増加した。上清の収集のためにその後この時間を選択した。
【００４８】
純粋なＥ２主要部分蛋白質を得るために、蛋白質を含有する上清を濃縮し、透析し、説明したようにＮｉｃｋｅｌ−ＮＴＡアガロースカラム又は抗Ｅ２ｍＡｂアフィニティカラムのいずれかに添加した（方法参照）。同一の、素通り（ＦＴ）、洗浄及び溶出（Ｅｌｎ）画分を別々のＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加して、抗ＨｉｓｍＡｂ反応用に処理して、精製効率を試験するためにそれぞれをクーマシー染色することができる。
【実施例２】
【００４９】
合成主要部分蛋白質の機能性を調べるために、非還元イムノブロットを実施して、様々なＨＣＶ遺伝子型の血清で調べた（図２及び３）。図２に示したウェスタンブロットでは、バキュロウイルスが発現したＥ２調製物、同等量（１００ｎｇ）のＥ２  ＣＨＯ及びチオレドキシンをゲルに流した。適切な血清希釈範囲（１：２５００〜１：１００００）を使用したところ、試験したほとんどの種類の血清でＥ２主要部分Ｒ９及びＥ２主要部分ｗ／ｏ（列３及び列４）で強いシグナルが認められた。その他のＥ２蛋白質も又、異なる血清と反応を示した。列２のＥ２ｗ／ｏＨＶＲ１調製物は、Ｅ２のＮ末端の３１個のアミノ酸、すなわち、ＨＶＲ１＋他の４アミノ酸を欠失しており、どの血清とも反応しないただのＥ２調製物である。このことは、これらの４アミノ酸が抗体認識を可能にさせる正確なＥ２構造の保存に非常に重要であることを示唆している。ＡＢＸＴＬ６８（０．５μｇ／ｍｌ）、完全なヒト抗Ｅ２ｍＡｂは陽性対照として使用し、一方α−ＨＣＶ陰性及びα−ＨＢＣ陽性血清（いずれも１：２５００に希釈）は、陰性対照として使用した。
【００５０】
別の実験で、非還元イムノブロットを行い、ＨＣＶ遺伝子型１〜４からの血清でプローブした（図３）。Ｅ２主要部分はすべての血清型及びＡＢＸＴＬ６８によって認識された。
【実施例３】
【００５１】
マウスを天然Ｅ２、Ｅ２主要部分Ｒ９、及びＥ２主要部分ｗ／ｏで免疫した。過免疫血清をマウスから得て、ＥＬＩＳＡによって固定抗原に対する反応性を評価した。Ｅ２主要部分Ｒ９、及びＥ２主要部分ｗ／ｏで免疫したマウスから得られた過免疫血清は、４種類のバキュロウイルス産生Ｅ２蛋白質全てに対して最高の反応性を示した（図４Ａ）。興味深いことに、顕著な反応性は又、哺乳動物Ｅ２（Ｅ２  ＣＨＯ）に対して認められ、天然Ｅ２で免疫したマウスの過免疫血清では効果は認められなかった。過免疫血清は、チオレドキシンに対して反応性が認められなかった（図４Ａ）。これらのデータを支持するように、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｅ２主要部分Ｒ９又はＥ２主要部分ｗ／ｏで免疫したマウスの過免疫血清では、バキュロウイルス発現Ｅ２抗原全て並びにＥ２ＣＨＯに対して特異的で広範な反応性が示された（図４Ｂ）。反対に、天然Ｅ２で免疫したマウスの過免疫血清では、限定された反応パターンが示された（図４Ｂ）。これらの結果から、主要な蛋白質は、注射した抗原にのみ反応する特異的応答を生じることができる天然Ｅ２とは対照的に、広範なＥ２蛋白質に対して免疫応答を誘発することが可能である。広範な免疫応答によって、主要蛋白質はワクチンとして天然Ｅ２よりも有利である可能性が示された。
【００５２】
同様に、Ｅ２主要部分Ｒ９に対して生じたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、数種類のＥ２と反応し、一方天然Ｅ２に対して生じたｍＡｂの認識範囲はより限定されていた。マウスをＥ２又はＥ２主要部分Ｒ９で免疫して、その後脾臓を融合して、２種類の異なるｍＡｂを産生させた。これらのｍＡｂの結合特性を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験したところ、α−Ｅ２ｍＡｂ１８は天然Ｅ２（ＨＶＲ１を有する又は有さない）のみを認識するが、抗Ｅ２主要部分Ｒ９ｍＡｂ２１は、バキュロウイルス発現Ｅ２抗原全て及びＥ２ＣＨＯを認識した（図５）。
【実施例４】
【００５３】
様々なＥ２調製物に対する血清の生物学的活性の特徴は、以下のＨＣＶ−Ｔｒｉｍｅｒａ動物モデル、安定したヒト肝臓片の移植を可能にするために処理したマウス、を使用して明らかにした。処理には、ｓｃｉｄ（重症複合免疫不全症）マウス骨髄を移植した後集中的にＸ線照射することが含まれた。ヒト肝臓片のウイルス感染は、ＨＣＶ陽性ヒト血清を使用して生体外で実施した（米国特許第５８４９９８７号）。
【００５４】
ＨＣＶ−ＲＮＡ７．５×１０５コピー／ｍｌを含有し、抗Ｅ２ＩｇＧが検出されないヒト血清試料０．５ｍｌを以下の様々な抗血清と共に室温で３時間予めインキュベートした。
天然Ｅ２（３００μｇ）で免疫したマウスのＩｇＧ画分
Ｅ２主要部分Ｒ９（３００μｇ）で免疫したマウスのＩｇＧ画分
Ｅ２主要部分ｗ／ｏ（３００μｇ）で免疫したマウスのＩｇＧ画分
陰性対照としての予備免疫血清
【００５５】
その後予めインキュベートした血清を使用して正常なヒト肝臓片を生体外で感染させた。感染後、肝臓片をマウスに移植して、１９日後に血清中のＨＣＶ−ＲＮＡを測定した。図６は、平均ウイルス負荷量及びＨＣＶ−ＲＮＡ陽性マウスの割合の両方によって、ＨＣＶによる肝臓感染を阻害する様々な抗Ｅ２抗体調製物の効果を示す。天然Ｅ２、Ｅ２主要部分Ｒ９及びＥ２主要部分ｗ／ｏに対して生じた血清は、ウイルス負荷量及び感染動物の割合を有意に減少させた。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】主要部分Ｅ２、Ｅ２主要部分Ｒ９及びＥ２主要部分−ｗ／ｏアミノ酸配列を示した図である。グリコシル化の予測部位には下線を引いてある。
【図２】様々なＥ２蛋白質に対する様々なＨＣＶ血清遺伝子型の反応性を示したウェスタンブロットの写真である。精製バキュロウイルス産生ＨＣＶ  Ｅ２蛋白質（レーン１〜４）、哺乳類チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞産生Ｅ２（レーン５）、及び関連の無い陰性対照蛋白質チオレドキシン（レーン６）を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ／２ｃ、３ａ、４、５及び６を示す様々な人血清で調べた。対照には以下のものが含まれる。陽性対照として抗ヒスチジンモノクローナル抗体（α−Ｈｉｓ  ｍＡｂ）、ＡＢＸＴＬ６８ヒト抗Ｅ２ｍＡＢを使用し、抗ＨＣＶ陰性（αＨＣＶ−ｖｅ）及び抗Ｂ型肝炎コア陽性（αＨＢＣ＋ｖｅ）血清を陰性対照として含めた。
【図３】様々なＥ２蛋白質に対する様々なＨＣＶ血清の反応性を示したウェスタンブロットの写真である。精製したバキュロウイルス産生天然Ｅ２及び主要部分Ｅ２蛋白質（レーン１及び２）、及び関連の無い陰性対照蛋白質チオレドキシン（レーン３）を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ、２ａ／２ｃ、３ａ、及び４を示す様々なヒト血清で調べた。陽性対照としてＡＢＸＴＬ６８ヒト抗Ｅ２ｍＡｂを使用した。
【図４】様々なＥ２蛋白質で未処置のマウスを免疫することによって生じた過免疫血清の結合特性を示したグラフである。（Ａ）では、様々な抗原でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用して結合を調べた。各四角はコーティングに使用した様々な抗原を示す。データは、Ｏ．Ｄ．測定値を血清希釈度の関数として示す。（Ｂ）では、様々なＥ２調製物をゲルで泳動し、様々な過免疫血清と反応させるウェスタンブロットを使用して結合を調べた。
【図５】様々なＥ２調製物及び陰性対照であるチオレドキシンに対するマウスモノクローナル抗体の結合特性を示したグラフである。ｍＡｂ１８は天然Ｅ２に対して産生させ、ｍＡｂ２１はＥ２主要部分Ｒ９に対して産生させた。結合は、様々なＥ２調製物をゲルに流し、異なるモノクローナル抗体と反応させたウェスタンブロットを使用して調べた。ブロットの左側に記した数字は、予測分子量をｋＤで示す。
【図６】移植１９日後の血清における平均ウイルス負荷量及びＨＣＶ  ＲＴ−ＰＣＲシグナルが陽性のＨＣＶ−Ｔｒｉｍｅｒａマウスの割合（括弧内の数字）を示したグラフである。棒は異なる実験群、移植肝臓をＨＣＶ感染血清及び予備免疫血清で予備インキュベートした群（対照）、移植肝臓をＨＣＶ感染血清及び様々なＥ２  ＩｇＧ調製物で予備インキュベートした群を表している。
【配列表】
2005510211.tif 000002
2005510211.tif 000003
2005510211.tif 000004
2005510211.tif 000005
2005510211.tif 000006
2005510211.tif 000007
2005510211.tif 000008
【図１】
2005510211.tif 000009
【図２】
2005510211.tif 000010
【図３】
2005510211.tif 000011
【図４Ａ】
2005510211.tif 000012
【図４Ｂ】
2005510211.tif 000013
【図５】
2005510211.tif 000014
【図６】
2005510211.tif 000015
【国際調査報告】
2005510211.tif 000016
2005510211.tif 000017
2005510211.tif 000018