(57)【要約】標的核酸をハイブリダイゼーションによって検出するための方法が開示される。この方法では、ａ）ハイブリダイゼーションが、固相に一方の端部によって結合している少なくとも１つのプローブ核酸を用いて行われ、この場合、プローブ核酸は、短い核酸配列の３’末端で、そして前記核酸配列に対して相補的である核酸配列の５’末端で接する標的核酸配列またはそれに対する相補的な配列を含み、これにより、ＤＮＡ二本鎖、および二本鎖特異的ヌクレアーゼにより切断され得る切断モジュールを形成し、かつ、プローブ核酸はその反対側の末端にマーカーを有する；ｂ）少なくとも１つの二本鎖特異的ヌクレアーゼを用いた少なくとも１つの処理が行われる；そしてｃ）工程ｂ）に従って固相に結合しているマーカーの量が測定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸をハイブリダイゼーションによって検出するための方法であって、該方法において、
ａ）ハイブリダイゼーションが、固相にその末端の一方によって結合している少なくとも１つのプローブ核酸を使用して行われ、この場合、プローブ核酸は、その３’末端で短い核酸配列が隣接し、かつ、その５’末端で、この核酸に対して相補的である核酸配列が隣接する標的核酸配列、またはそれに対して相補的である配列を有し、そのような核酸配列により、ＤＮＡ二本鎖が形成され、それにより、二本鎖特異的ヌクレアーゼによって切断され得る切断モジュールが形成され、そして、このプローブ核酸はその反対側の末端に標識を有するものであり；
ｂ）少なくとも１つの二本鎖特異的ヌクレアーゼを用いた少なくとも１つの処理が行われ；そして
ｃ）工程ｂ）の後で固相に結合している標識の割合が測定される
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
１つの方法論的設定において、互いに異なる標的配列を含有する複数のプローブ核酸が同時に使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つの手法において、互いに異なる切断モジュールであって、異なる二本鎖特異的ヌクレアーゼによって切断され得るものを有する複数のプローブ核酸が使用されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
プローブ核酸配列が、互いに異なる複数の標識を有することを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
標識が蛍光基（fluorophorees）および／または結合対の一方であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出するためのキットであって、該キットは、固相にその末端の一方によって結合している少なくとも１つのプローブ核酸を使用して少なくとも１つのハイブリダイゼーションを行うために使用され、この場合、プローブ核酸は、その３’末端で短い核酸配列が隣接し、かつ、その５’末端で、この核酸に対して相補的である核酸配列が隣接する標的核酸配列を有し、そのような核酸配列は、ＤＮＡ二本鎖およびそれにより切断モジュールを形成することができ、かつ、二本鎖特異的ヌクレアーゼによって切断されることが可能であり、そしてプローブ核酸はその反対側の末端に標識を有することを特徴とするキット。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか1項に記載される方法を実行するために好適であることを特徴とする、請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、固相に結合している標識されたオリゴヌクレオチド（これは下記ではプローブ核酸と称される）を使用して、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子（これらは下記では標的核酸と称される）を配列特異的な様式で検出するための方法に関する。
【０００２】
その塩基配列における相補的領域のために、本発明のプローブ核酸（これはＤＮＡまたはＤＮＡ／ＰＮＡキメラであり得る）は、二本鎖領域を含有する分子内二次構造を形成することができる。これらの二本鎖領域は、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（制限エンドヌクレアーゼ）によって認識および切断され得る配列モチーフ（これは本明細書では切断モジュールと称される）を含有する。プローブ核酸内における分子内切断モジュールの形成は、プローブ核酸が、試験されるサンプルにおける相補的な標的核酸とハイブリダイゼーションすることによって妨げられ、その結果、ハイブリダイゼーションしたプローブ核酸が、二本鎖特異的ヌクレアーゼによる切断の後、ハイブリダイゼーションしていないプローブヌクレアーゼから区別され得るようになる。
【０００３】
好ましい実施形態において、この方法は、特定の位置または規定された区域にすべてが固定化されている異なるように標識されたプローブ核酸を使用して、その塩基配列が同一でない種々の標的核酸を特異的に検出することを含む。非常に小さい区域における多くのそのような核酸の小型化された装置がバイオチップ技術から広く知られている。
【背景技術】
【０００４】
ＤＮＡアレイを調製するための定法的な方法では、非標識のプローブ核酸が、in situオリゴヌクレオチド合成［Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．ら、「大規模固定化ポリマー合成」、米国特許第５，４２４，１８６号］または印刷法［Ｃｈｅｕｎｇ，Ｖ．Ｇ．ら、「マイクロアレイの作製および読み取り」、Nature Genetics、第２１巻、１９９９年１月；Ｂｏｗｔｅｌｌ，Ｄ．Ｄ．Ｌ．、「マイクロアレイによって発現データを得るための選択可能な選択肢−始めから終わりまで」、Nature Genetics、第２１巻、１９９９年］によって固体マトリックスに付けられ、このマトリックスに共有結合的に連結される。プローブ核酸は、スポットと呼ばれる何らかの形態でＤＮＡアレイの表面に体系化される。ハイブリダイゼーション実験の前では、固体マトリックスに固定化されている核酸の量を明らかにすることは不可能である。標識されたサンプル核酸および第２の標識されたサンプル核酸（これは内部標準として役立つ）とのＤＮＡアレイのハイブリダイゼーション（二重標識、Ｗａｎｇ，Ｂ．、「定量的マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ」、米国特許第６，００４，７５５号）によってのみ、固体マトリックスに固定化されている非標識プローブ核酸の量の違いを計算によって補償することが可能である。
【０００５】
別の方法では、ヌクレアーゼ保護試験の原理［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、「Molecular Cloning」、２００１年、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］が、一本鎖特異的ヌクレアーゼを使用して、ハイブリダイゼーションしていない（すなわち、一本鎖の）標識されたプローブ核酸を分解するために使用されている［Ｋｕｍａｒ，Ｒ．ら、「ヌクレアーゼ保護アッセイ」、米国特許第５，７７０，３７０号］。この方法の精密性は、特に、プローブ核酸および標的核酸から構成される二重鎖の安定性に、そして用いられる一本鎖特異的ヌクレアーゼの特異性に依存する。ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＰＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＰＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡの二重鎖であり得る所与の核酸二重鎖の安定性は、水素結合により媒介される相補的な鎖の間でのワトソン−クリック塩基対形成の数および強さによって規定される［Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．、「Gene VI」、１９９７年、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；（および分子生物学の他の現在の教科書）］。その末端領域において、核酸二重鎖は、相補的な鎖の間における水素結合を弱める周囲の媒体（すなわち、Ｈ2Ｏ）の影響にさらされている。このため、二重鎖の末端領域は、一本鎖特異的ヌクレアーゼの反応を促進させる条件（３０℃〜３７℃）のもとでは部分的に一本鎖になり、ヌクレアーゼによって切断され得る。この方法の別の欠点は、一本鎖特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＴ１、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、ミクロコッカスヌクレアーゼまたはヌクレアーゼＰ１は、反応混合物における核酸およびヌクレアーゼの量比が精密に設定されていない場合、核酸を配列特異的な様式で切断せず、二本鎖領域を非常に容易に分解するということである［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、「Molecular Cloning」、２００１年、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］。
【０００６】
標識されていないサンプル核酸のハイブリダイゼーションを検出するために使用され得る別のシステムでは、分子ビーコンと呼ばれるもの［Ｔｙａｇｉ，Ｓ．ら、「検出可能に標識された二重立体配座オリゴヌクレオチドプローブ、アッセイおよびキット」、米国特許第５，９２５，５１７号］が、ガラスのマイクロ粒子またはナノ粒子に共有結合的に結合したプローブ核酸として使用される［Ｓｔｅｅｍｅｒｓ，Ｆ．Ｊ．ら、「ランダム配向の光ファイバー遺伝子アレイを用いた非標識ＤＮＡ標的のスクリーニング」、２０００、Nature Biotech.、第１８巻］。分子ビーコンは、分子内二次構造を形成することができるプローブ核酸で、その両端が、分子内二次構造の結果として互いに非常に空間的に接近する異なる蛍光基に共有結合的に連結されているプローブ核酸である。２つの蛍光基の一方（消光基）により、もう一方の蛍光基（放射体）によって放射される光子が吸収される。分子ビーコンが標的核酸とハイブリダイゼーションすると、分子内二次構造が解離し、従って、励起された蛍光基（放射体）により放射される光は、消光基によってもはや吸収され得ない。この方法は、シグナル／バックグラウンド比が約２５：１であるという重大な欠点を有している［Ｓｔｅｅｍｅｒｓ，Ｆ．Ｊ．ら、「ランダム配向の光ファイバー遺伝子アレイを用いた非標識ＤＮＡ標的のスクリーニング」、２０００、Nature Biotech.、第１８巻］。種々の遺伝子の転写比における差は分子ビーコンのシグナル／バックグラウンド比よりも実質的に大きくなり得るので、電子共鳴エネルギー転移または蛍光共鳴エネルギー転移に基づいて作動するシステムは、もっぱら、標的配列を増幅することにより標的核酸を定量的に測定する領域［Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．ら、「Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼの、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を利用することによる特異的ポリメラーゼ連鎖反応生成物の検出」、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８８巻および米国特許第５，２１０，０１５号（１９９３）；Ｔｙａｇｉ，Ｓ．ら、「分子ビーコン：ハイブリダイゼーション時に蛍光を発するプローブ」、１９９６、Nature Biotech.、第１４巻］、または非定量的な様式で核酸を測定する状況［Ｓｔｅｅｍｅｒｓ，Ｆ．Ｊ．ら、「ランダム配向の光ファイバー遺伝子アレイを用いた非標識ＤＮＡ標的のスクリーニング」、２０００、Nature Biotech.、第１８巻］においてである。
【０００７】
現在、１ｃｍ2あたり１００００個を超えるスポット、すなわち、１ｃｍ2あたり１００００個を超える異なる核酸プローブをＤＮＡアレイに固定化することが可能である［Ｂｏｗｔｅｌｌ，Ｄ．Ｄ．Ｌ．、「マイクロアレイによって発現データを得るための選択可能な選択肢−始めから終わりまで」、Nature Genetics、第２１巻、１９９９年１月］。互いに識別され得るサンプル点（スポット）の最大数は、達成することが技術的に可能である最小のスポットサイズによって規定される。ナノリットル規模での液体の量が、アレイを調製するときには移されるので、これは、移された液体の粘度および表面張力などの物理的特性に依存する。より低い限界をサンプルスポットのサイズに設定する別のパラメーターは、光学顕微鏡の光学的分解能である。これは、蛍光、発光またはリン光を検出するための装置はすべてが、光学顕微鏡（共焦点レーザー走査顕微鏡）の光学システムに対応する光学的システムとともに作動するからである。従って、無制限の数のサンプルスポットをＤＮＡアレイに固定することは不可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
従って、本発明は、標的核酸をハイブリダイゼーションによって検出するための方法に関する。この場合、この方法では、
ａ）ハイブリダイゼーションが、固相に一方の端部によって結合している少なくとも１つのプローブ核酸を使用して行われる。それぞれのプローブ核酸は、その３’末端で短い核酸配列が隣接し、かつ、その５’末端で、これに対して相補的である核酸配列が隣接する標的核酸配列を有し、そのような配列により、短いＤＮＡ二本鎖が形成され得る。この二本鎖は、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（制限エンドヌクレアーゼ）によって切断されることが可能であり、それにより、切断モジュールを形成する。また、プローブ核酸は、固相に結合していない反対側の末端に標識を示す。
ｂ）少なくとも１つの二本鎖特異的ヌクレアーゼを用いた少なくとも１つの処理が行われる。ヌクレアーゼによる消化は、二本鎖を形成している切断モジュールを切断するだけである。標的核酸が検出される核酸とハイブリダイゼーションしたために、二本鎖を形成することができない場合、二本鎖の切断モジュールは形成されず、核酸は切断されない。
ｃ）最後に、工程ｂ）の後で固相に結合している標識の量が測定される。
【０００９】
好ましい実施形態において、複数の異なるプローブ核酸（これらは異なる標的核酸を含有する）が１つの方法論的方法で使用される。
【００１０】
１つの方法では、異なる二本鎖特異的ヌクレアーゼによってその後に切断され得る異なる切断モジュールを有する複数のプローブ核酸を使用することもまた好ましい。同様に、プローブ核酸が異なる標識を有することもまた可能であり、この場合、標識は蛍光基および／または結合対の一方である。
【００１１】
本発明による方法の利点の１つは、本発明に従って使用されるプローブ核酸が種々の変数を含有するということである。一方で、標的配列を変化させることが可能であり、その結果として、試験されるサンプルにおいて非常に種々の核酸配列を検出することが可能である。他方で、切断分子は、様々な制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列を含有することができる。その結果として、プローブ核酸は、同時または順次のいずれかで、種々の制限エンドヌクレアーゼにより消化することができる。最後に、プローブ核酸はまた、異なる標識を有することができる。その場合、対応するＤＮＡアレイを、課題の性質とは無関係に設計することができ、そして、いくつかの異なる処理工程および評価工程を同時または順次のいずれかで行うことができ、これにより、最大量の情報を得ることが可能になる。
【００１２】
本発明はまた、標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出するためのキットに関しており、本発明に従って使用される少なくとも１つのプローブ核酸との少なくとも１つのハイブリダイゼーションを行うために本発明のキットを使用することが可能である。
【００１３】
他の核酸検出法から知られている技術もまた、本発明による方法に関連して使用することができる。ノーザンブロット、サザンブロットまたはヌクレアーゼ保護アッセイなどの方法では、標的核酸（これはＤＮＡまたはＲＮＡであり得る）の配列特異的な検出が、標的核酸および標識されたプローブ核酸（これはＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであり得る）から構成されるハイブリッド（二重鎖）の形成を検出することによって行われる。ＤＮＡアレイの場合、非標識のプローブ核酸が固体マトリックスに結合させられ、標識されたｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ（これらは下記ではサンプル核酸と称される）とハイブリダイゼーションさせられる。一般に、核酸におけるハイブリダイゼーション事象は、蛍光、化学発光、化学蛍光または放射能を検出することによって検出される［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、「Molecular Cloning」、２００１年、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］。多数の蛍光基、例えば、フルオレセイン、リサミン、フィコエリトリン、ローダミン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７およびフルオルＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）などを、例えば、サンプル核酸および／またはプローブ核酸を蛍光標識するために使用することができる［Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．、「Non isotopic DNA probe techniques」、１９９２年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ］。本明細書に列挙される蛍光基に加えて、本明細書において言及されていない他の蛍光基を、核酸を標識するために使用することもまた可能である。これらの蛍光基には、核酸に共有結合的に連結することができ、かつその励起極大および放射極大が赤外スペクトル領域または可視スペクトル領域またはＵＶスペクトル領域にある蛍光基のすべてが含まれる。サンプル核酸またはプローブ核酸が結合対の一方（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンまたは他のハプテンなど）で標識されている場合、検出可能な標識とコンジュゲート化されている結合対の第２の部分（ストレプトアビジオンまたは抗ジゴキシゲニンＡｂ）が、ハイブリダイゼーション後の二重鎖とインキュベーションさせられる。結合対の第２の部分の検出可能な標識は蛍光基であり得るか、または、光の放射（化学発光または化学蛍光）を伴って基質を変換する酵素（なかでも、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る［「Fluoresent and Luminescent Probes for biological activity」、１９９９年、第２版、Ｍａｓｏｎ，Ｗ．Ｔ．編］。
【００１４】
核酸は、そのヌクレオチド塩基が、蛍光基、結合対の一方（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンまたは他のハプテン）、あるいは反応基（ＮＨ2またはＳＨ）に共有結合的に連結されているヌクレオチド三リン酸の存在下でＤＮＡまたはＲＮＡの酵素触媒合成を行うことによって非放射能的に標識される。ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ（ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭｕＬＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、クレノウフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼなど）により触媒される合成の過程で、これらの修飾されたヌクレオチド三リン酸は、新しく形成されつつある核酸に取り込まれる［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、「Molecular Cloning」、２００１年、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］。標識されたサンプル核酸を合成するためのテンプレートとして使用されるｍＲＮＡの完全性は、この点に関して非常に重要である。プローブ核酸（これは、逆転写酵素によってＲＮＡから合成され、そして、ＰＣＲまたはインビトロ転写によってＤＮＡから合成される）の長さは、その塩基組成とともに、標識効率のためには基本的に重要である。標識される核酸が短いほど、少数の、検出可能な基で標識されたヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰ）が合成時に取り込まれる。ｍＲＮＡ集団がＲＮａｓｅによって分解される場合、このＲＮＡ集団から合成されたサンプル核酸は、一方では、非常に弱く標識されるだけであり、他方では、調べられる細胞タイプ、組織または器官において優勢である転写状態を表さない。代表するサンプル核酸は、完全に無傷なｍＲＮＡから合成され得るだけである。その塩基が上記の基で標識されているヌクレオチド三リン酸は、すべての知られているＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼによって取り込まれるが、この場合、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼは、非修飾のヌクレオチド三リン酸が取り込まれるよりも実質的に低い効率で、それぞれ、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成を触媒する［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．、「ＰＣＲによる蛍光性ＤＮＡ標識」、１９９９年、Molecular Dynamics Application Note#62］。従って、標識されたプローブ核酸の収率は、放射能システムと比較して低く、そして、合成後の精製工程から生じるサンプル物質の喪失が非常に大きい。
【００１５】
このため、分析されるｍＲＮＡが単離される比較的多量のサンプル材料（例えば、培養細胞または組織サンプル）を、例えば、ＤＮＡアレイをハイブリダイゼーションさせるために使用される非放射能的に標識された核酸を合成するために使用しなければならない。このため、ＤＮＡアレイは、分析のために得ることができるサンプル材料の量が制限される臨床診断などの領域では、限られた程度で使用され得るだけである。さらに、核酸は、汚れた粒子の表面に付着する傾向を有する。このため、汚れた粒子は、標識された核酸とのハイブリダイゼーションによって、固相に結合している非標識核酸の、特にＤＮＡアレイ上の検出をひどく損なうことがあり、この点で、偽陽性の結果をもたらし得る。
【００１６】
生物工学の分野、および特に臨床診断または産業での活発な化合物研究などの分野は、大きいサンプル処理能を確実にするための自動化された方法に依存しているので、これらの分野では、測定の結果が、何らかの複雑な校正測定を行うことなく標準化されることを可能にする発現分析を実行するための方法が求められている。核酸におけるハイブリダイゼーション事象を検出するためのシステムで、先行技術に従い、かつ発現分析の分野で使用されているシステムは、調べられることになるｍＲＮＡで、サンプル核酸として使用されるｍＲＮＡ、またはサンプル核酸を合成するためのテンプレートとして使用されるｍＲＮＡの完全性に大きく依存している。特に、ハイブリダイゼーションに供される、固相に結合していない核酸（サンプル核酸）が標識されるために、これらのシステムは、測定全体をゆがめ得る誤った解釈を受けやすい。
【００１７】
本発明による方法は、非標識の標的核酸と固相結合のプローブとの配列特異的なハイブリダイゼーションが、サンプル核酸の完全性にもかかわらず定量的に測定され得る発現分析のために使用することができる。表面において検出され得る異なるプローブ核酸の最大数は光学系およびマイクロ流体工学の領域における物理的制限によって制限されるが、本発明は、光学系およびマイクロ流体工学の領域における物理的制限によって制限されない一方で、規定された区域において検出され得るプローブ核酸の量が、先行技術に従っているシステムと比較して、顕著に増大し得るシステムを使用するＤＮＡアレイを開示する。
【００１８】
好ましい実施形態により、固相結合のプローブ核酸に対するハイブリダイゼーション事象を検出するための方法が開示され、この場合、そのような方法は、固相に結合している標識されたプローブを使用することによって、測定結果を標準化すること、標識されていないサンプル核酸または標的核酸を使用すること、そして、規定されたスポットにおいて種々の標的核酸の発現を同時に分析することを可能にする。本発明による固相結合のプローブ核酸は、ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＰＮＡキメラ［Ｆｉｎｎ，Ｐ．Ｊ．ら、「ＤＮＡ−ＰＮＡキメラオリゴマーの合成および性質」、１９９６、Nuc.Acids.Res.、第２４巻（１７）：Ｒａｔｉｌａｉｎｅｎ，Ｔ．ら、「ＤＮＡに対するＰＮＡの配列特異的な結合の熱力学」、２０００、Biochemistry、第３９巻：ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ，Ａ．Ｃ．ら、「ＰＮＡ−（５’）−ＤＮＡキメラの結合特性の最適化」、１９９８、Bioorg.Med.Chem.Lett.、第８巻］であり得るが、二本鎖特異的エンドヌクレアーゼによって認識および切断され得る分子内二次構造を、その配列のために形成する。分子内二次構造を形成することの結果として二本鎖である本発明によるプローブ核酸の成分は、二本鎖特異的エンドヌクレアーゼに対する接近性を確実にするために、主としてＤＮＡである。
【００１９】
本発明による固相結合のプローブ標的核酸が検出される核酸とハイブリダイゼーションする結果として、分子内二次構造、従って、二本鎖領域は解離し、二本鎖特異的エンドヌクレアーゼによってもはや認識および切断され得ない。ハイブリダイゼーションしていない固相結合のプローブヌクレオチドは酵素により切断される。本発明によるプローブ核酸の標識されている成分は酵素切断によって表面から分離し、周囲の媒体に拡散して、適する場合には洗い流され得る。ハイブリダイゼーションしていないプローブ核酸が酵素的に分解された後、酵素的に短縮化されていないハイブリダイゼーションしたプローブ核酸の蛍光が測定される。この方法のシグナル／バックグラウンド比は、用いられる二本鎖特異的エンドヌクレアーゼの特性に、そして、ハイブリダイゼーションしていないプローブ核酸が分離される完全度に依存するだけであり、放射能標識された核酸とのハイブリダイゼーションのシグナル／バックグラウンド比に対応する。
【００２０】
標識されるのは、特定のサンプル核酸または標的核酸ではなく、固相に結合しているプローブ核酸であるので、その励起極大または放射極大に関して分光的に識別され得る蛍光基が存在するのと同じくらい多くの、配列特異性が異なるプローブ核酸を、表面上の規定された区域またはスポットに固定化することができる。プローブ核酸に共有結合的に連結される蛍光基の数は、本方法の感度を所望するように増大させるために使用することができる。
【００２１】
知られている蛍光基に加えて、固相に結合しているプローブを標識するために結合対の一方（例えば、ジゴキシゲニン、ビオチンまたは他のハプテンなど）を使用することもまた可能である。異なるハプテンと特異的に結合する分子（免疫グロブリン、ストレプトアビジン）が、種々の基質特異性を有する酵素に共有結合的に連結される。これらの酵素は、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、酸性ホスファターゼなどであり得る。従って、利用可能な異なるハプテンの数および利用可能な異なる酵素コンジュゲートの数に依存して所望されるのと同じくらい多くの、配列特異性が異なるプローブ核酸を、表面上の規定された区域またはスポットに固定化することが可能である。
【００２２】
固定化されたプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせるために使用されるサンプル核酸または標的核酸は、標識されていないＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡまたはｍＲＮＡであり得る。従来のシステムとは対照的に、本システムではプローブ核酸が標識されるので、ハイブリダイゼーションのために使用されなければならないプローブ核酸の検出モジュールに対して相補的であるのは、標的核酸またはサンプル核酸の一部だけである。記載されたシステムの別の利点は、検出感度が、サンプル核酸が標識される効率に依存せず、しかし、その代わり、プローブ核酸の標識化にだけ依存するということである。しかしながら、後者は、非常にはるかに一層精密に決定することができる。
【００２３】
本発明によるプローブ核酸が図１Ａに概略的に表される。典型的なプローブ核酸は下記の成分を有する：
・固相に結合するための少なくとも１つの官能基（１）、例えば、アミノ基（ＮＨ2）もしくはチオール基（ＳＨ）、または結合対の一方、例えば、ビオチンもしくはジゴキシゲニン。
・スペーサーモジュール（２）、これは、好ましくは、長さが１１個以上のＣ２結合であり、その末端の一方が官能基に共有結合的に連結される。
・配列セグメントα（認識および切断のためのモジュール）、これは、好ましくは、長さが５ヌクレオチド〜１２ヌクレオチドであり、ＤＮＡからなり、その３’末端が、固相に連結されているスペーサーモジュールの末端に共有結合的に連結される。配列セグメントαは、制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列を含有する。
・配列セグメントβ（検出モジュール）、これは、好ましくは、長さが１２ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドであり、その３’末端が、配列セグメントα（認識および切断のためのモジュール）の５’末端に共有結合的に連結される。これは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであり得る。配列セグメントβは、検出される標的核酸とのヘテロ二重鎖を、好適な反応条件のもとでプローブとして形成することができる分子の一部を構成する。配列セグメントβのヌクレオチドおよび／または糖リン酸骨格またはプソイドペプチド(pseudopeptide)骨格が蛍光基に共有結合的に連結され得る。
・配列セグメントα’（認識および切断のためのモジュール）、これはＤＮＡからなり、その３’末端が配列セグメントβの５’末端に共有結合的に連結される。セグメントα’の配列はセグメントαの配列に対して相補的である。
・スペーサーモジュール（３）、これは、好ましくは、長さが１１個以上のＣ２結合であり、配列セグメントα’の５’末端に共有結合的に連結される。
・適する場合には、分岐用モジュール［Ｎｅｗｃｏｍｅ，Ｇ．Ｒ．ら、「Dendritic Molecules:Concepts,Synthesis,Perspective」、１９９６年、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ］（表されず）、これは、配列セグメントα’の５’末端に連結されていない、スペーサーモジュール（３）の端部に共有結合的に連結される。ｎ個までのさらなる分岐用モジュールをこの分岐用モジュールの個々の端部に結合させることができ、それにより、最大数で３n個の数の末端を生じさせることができる。そして
・蛍光基（４）または結合対の一方（ビオチンまたはジゴキシゲニン）、これはそれぞれの端部に結合する。
【００２４】
プローブはエレメント（１）によって固体マトリックスに結合する。この固体表面は、なかでも、平面表面（これはまた凸状または凹状であり得る）、無機材料もしくは有機材料から構成されるファイバーまたはマイクロ粒子またはナノ粒子であり得る。そのような固体マトリックスに結合する本発明によるプローブ核酸は、下記ではＤＮＡアレイと称される。配列セグメントαおよび配列セグメントα’は互いに相補的であり、好適な条件のもとでは、二本鎖領域、すなわち、二重鎖α−α’を形成することができる（図１Ｂを参照のこと）。この分子の場合、分子内の二重鎖形成によるヘアピン構造の形成が一本鎖の立体配座よりも熱力学的に有利である。従って、配列セグメントαまたは配列セグメントα’の平衡融解温度Ｔmよりも低い温度では、この分子は、配列特異的な様式で制限エンドヌクレアーゼによって切断され得る分子内二重鎖α−α’を含有するヘアピン構造としてもっぱら存在する。
【００２５】
制限エンドヌクレアーゼによる切断後、エレメント（１）およびエレメント（２）、そして適する場合にはエレメント（α）の数ヌクレオチドが固相に結合したままである。プローブの標識されたエレメントは周囲の媒体に拡散し、そして、適する場合には洗浄によって除かれる。
【００２６】
ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る標的核酸で、その配列が配列セグメントβの配列に対して相補的である標的核酸とハイブリダイゼーションした結果として、プローブは、部分的には、サンプル核酸との二重鎖として存在する。この場合、配列セグメントαおよび配列セグメントα’は一本鎖として存在し、制限エンドヌクレアーゼまたは他の二重鎖特異的ヌクレアーゼによって切断され得ない。分子内二重鎖α−α’と比較して、サンプル核酸および配列セグメントβから構成されるヘテロ二重鎖の十分な安定性を確実にするためには、配列セグメントβの平衡融解温度（Ｔm（β））は、配列セグメントαまたは配列セグメントα’の平衡融解温度よりも高くなければならない；すなわち、Ｔm（β）＞Ｔm（α）［Ｂｏｎｎｅｔ，Ｇ．ら、「構造化ＤＮＡプローブの高まった特異性の熱力学的基礎」、１９９９、Proc.Natl.Acad.Sci.、第９６巻］。理想的には、サンプル核酸および配列セグメントβから形成されるヘテロ二重鎖の平衡融解温度Ｔm（β）は、分子内二重鎖α−α’の平衡融解温度Ｔm（α）よりも１０℃〜２５℃の間で高い。二次構造を形成することができるプローブ核酸は、同じ標的核酸に関して、線状のプローブ核酸が有するよりも大きい配列特異性を有する。塩基の誤った対形成を全く含有しないプローブ／標的核酸二重鎖と、１塩基の誤った対形成を含有するプローブ／標的核酸二重鎖との間における平衡融解温度の差（すなわち、ΔＴm）は、二次構造を形成することができるプローブ核酸の場合には、線状のプローブ核酸の場合の約２倍大きい［Ｂｏｎｎｅｔ，Ｇ．ら、「構造化ＤＮＡプローブの高まった特異性の熱力学的基礎」、１９９９、Proc.Natl.Acad.Sci.、第９６巻］。
【００２７】
本発明による方法は、好ましくは、多重分析のために用いることができる。この場合、配列セグメントβにおいて、そして蛍光基の励起スペクトルおよび放射スペクトル［Ｖｅｔ，Ｊ．Ａ．Ｍ．ら、「分子ビーコンを使用する４つの病原性レトロウイルスの多重検出」、１９９９、Proc.Natl.Acad.Sci.、第９６巻；Ｍａｒｒａｓ，Ｓ．Ａ．Ｅ．ら、「分子ビーコンを使用する単一ヌクレオチド変化の多重検出」、１９９９，Genetic Analysis:Biomolecular Engineering、第１４巻］において、そして適する場合には、配列セグメントαおよび配列セグメントα’に存在する制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列に関して互いに異なるｎ個の異なるプローブ核酸が同じ区域に固定化される。印刷法が、等モル量のこれらのｎ個の異なるプローブ核酸を含有する水溶液を固体表面に置き、固定化するために使用される［Ｃｈｅｕｎｇ，Ｖ．Ｇ．ら、「マイクロアレイの作製および読み取り」、Nature Genetics、第２１巻、１９９９年１月；Ｂｏｗｔｅｌｌ，Ｄ．Ｄ．Ｌ．、「マイクロアレイによって発現データを得るための選択可能な選択肢−始めから終わりまで」、Nature Genetics、第２１巻、１９９９年１月］。この区域は、ＤＮＡアレイにおけるスポットであり得るか、またはマイクロ粒子もしくはナノ粒子の表面におけるスポットであり得る。
【００２８】
このようにして、配列が異なるｎ個の異なる標的核酸と、その配列セグメントαおよび配列セグメントα’が制限エンドヌクレアーゼに対する同じ認識配列を含有するｎ個の異なるプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを同時に分析することが可能である。プローブ核酸の配列セグメントαおよび配列セグメントα’が、ｎ個の異なる制限エンドヌクレアーゼに対するｎ個の異なる認識配列を含有する場合、配列が異なるｎ個の異なる標的核酸と、ｎ個の異なるプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを同時に、または好ましくは連続的に分析することが可能である。
【００２９】
本発明による方法は、プローブ核酸と標的核酸またはサンプル核酸とのハイブリダイゼーションに関して多重分析を実行する目的のために下記の方法で行うことができる。
【００３０】
固体マトリックスに結合している本発明による１つまたは複数のプローブ核酸から構成されるＤＮＡアレイが、下記に示される好ましい条件のもと、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る標識されていないサンプル核酸と接触させられる。ＤＮＡアレイは、４５℃で、１０分間〜２０分間、そして、ハイブリダイゼーションさせられる表面に従って、２０μｌ〜２００μｌの好適なハイブリダイゼーション緩衝液とインキュベーションされる。
【００３１】
０．１μｇ〜５０μｇの標識されていないサンプル核酸が３００μｌの好適なハイブリダイゼーション溶液に溶解され、ＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーションに先立って、この溶液は約９９℃で５分間加熱され、その後、約４５℃に５分間かけて冷却される。ハイブリダイゼーション緩衝液がＤＮＡアレイから除かれ、サンプル核酸を含有するハイブリダイゼーション溶液で置き換えられる。ＤＮＡアレイはサンプル核酸と４５℃〜６０℃で１６時間インキュベーションされる。サンプル核酸溶液が除かれた後、ＤＮＡアレイは、５０℃〜６５℃で、それぞれの場合において種々のイオン強度の洗浄緩衝液で洗浄される。好適なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件の選択は、サンプル核酸の性質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）およびその長さに、そしてまた、固定化されているプローブ核酸の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）およびその長さに依存する［Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．Ｍ．ら、「Nucleic acid Hybridization」、１９９８年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ；Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．、「DNA-Microarrays:A practical approach」、１９９９年、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ］。
【００３２】
α−α’二重鎖の領域における制限エンドヌクレアーゼによる非ハイブリダイゼーションプローブ核酸の切断が、好ましくは、製造者によって推奨される反応条件のもと、２５℃〜３７℃で行われる。制限エンドヌクレアーゼの活性は、脂質を反応混合物に添加することによって３４倍まで増大させることができる［Ｋｉｎｎｕｎｅｎら、「制限エンドヌクレアーゼを使用してＤＮＡまたはＲＮＡを消化するための材料および方法」、米国特許第５，８７９，９５０号］。洗浄工程の後、ＤＮＡアレイは、２５℃〜３７℃で２０分間〜６０分間、そして、ハイブリダイゼーションさせられる表面に従って、製造者により推奨される反応緩衝液の２０μｌ〜２００μｌとともに、α−α’二重鎖の領域においてプローブ核酸を切断する制限エンドヌクレアーゼの０．５Ｕ〜５Ｕを含有する緩衝液とインキュベーションされる。切断されたプローブ核酸、標識、および制限エンドヌクレアーゼは、室温で１×ＴＥ緩衝液による洗浄によってＤＮＡアレイの表面から除かれる。
【００３３】
本発明による方法によって得られるシグナルおよびデータは、好ましくは、下記の方法で検出および分析される：
印刷法［Ｃｈｅｕｎｇ，Ｖ．Ｇ．ら、「マイクロアレイの作製および読み取り」、Nature Genetics、第２１巻、１９９９年１月；Ｂｏｗｔｅｌｌ，Ｄ．Ｄ．Ｌ．、「マイクロアレイによって発現データを得るための選択可能な選択肢−始めから終わりまで」、Nature Genetics、第２１巻、１９９９年１月］を使用して標識プローブを固体表面に移し、標識プローブを固体表面に固定化する前に、それぞれのプローブ核酸の標識化の程度が決定される。核酸の濃度が、２６０ｎｍの波長における核酸水溶液の吸収を測定し、ランベルト−ベールの法則（Ａ260＝ε×ｄ×ｃ、式中、Ａ260はλ＝２６０ｎｍにおける吸収であり、εは核酸のモル吸光係数［ｃｍ-1Ｍ-1］であり（この係数は、調べられる核酸の塩基配列および長さに依存する）、ｄは、用いられたキュベットの路長であり、ｃは核酸の濃度［Ｍ］である）を使用することによって決定される。
【００３４】
プローブ核酸とコンジュゲート化されている蛍光基の濃度は、蛍光基の吸収極大に対応する波長（λmax）において標識プローブ核酸の水溶液の吸収を測定し、ランベルト−ベールの法則を使用することによって決定される。蛍光基とコンジュゲート化されている核酸の濃度を精密に決定することができるためには、ほとんどの蛍光基が、２６０ｎｍの波長を有する光を吸収するという事実を考慮しなければならない。蛍光基によりもたらされる寄与（これは、その吸収極大に対応する波長（λmax）における蛍光基の吸収と、補正係数ＣＦ260との積である）が、２６０ｎｍにおける総吸収から差し引かれる（すなわち、Ａ核酸＝Ａ260−（Ａλmax×ＣＦ260））。種々の蛍光基のモル吸光係数、および２６０ｎｍにおける吸収に対する補正係数ＣＦ260をこれらの蛍光基の製造者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＢｉｏＲａｄなど）から得ることができる。
【００３５】
プローブ核酸とコンジュゲート化されている蛍光基の濃度と、プローブ核酸の濃度との比は、プローブ核酸とコンジュゲート化されている蛍光基の量に等しい。標識されたプローブ核酸の特異的な蛍光を決定するために、これらのプローブ核酸の規定された量の蛍光が測定される。その後、特異的な蛍光は、固体マトリックスに結合しているプローブ核酸分子の数を、標的核酸またはサンプル核酸とのハイブリダイゼーションの前に精密に決定するために使用することができる。このようにして、固定化されているプローブ核酸の量の変動（そのような変動は標的核酸またはサンプル核酸とのハイブリダイゼーションに影響を及ぼす）を考慮に入れ、計算により補正することができる。従って、標的核酸またはサンプル核酸を本発明によるプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせることに基づいて行われる測定を標準化することが可能である。
【００３６】
ＤＮＡアレイにおけるそれぞれのサンプルスポットの蛍光放射は、好ましくは、共焦点レーザー走査顕微鏡によって測定される。小さい区域における蛍光放射を測定するための様々な装置が、数多くの製造者によって販売されており、生物工学の分野における実験室標準品になっている［Ｃｈｅｕｎｇ，Ｖ．Ｇ．ら、「マイクロアレイの作製および読み取り」、Nature Genetics、第２１巻、１９９９年１月；Ｂｏｗｔｅｌｌ，Ｄ．Ｄ．Ｌ．、「マイクロアレイによって発現データを得るための選択可能な選択肢−始めから終わりまで」、Nature Genetics、第２１巻、１９９９年１月］。測定結果を標準化するために、固定化されているプローブ核酸の蛍光がハイブリダイゼーションの前に測定される。特定の配列特異性を有し、かつ特定の蛍光基で標識されているプローブ核酸がアレイのそれぞれのサンプルスポットに固定化されている場合、蛍光が、この蛍光基の吸収極大に対応する波長（λabs.max）の光によって励起され、放射極大に対応する波長（λem.max）で検出される。ｎ個の異なるプローブ核酸（これらは、異なる配列特異性を有し、ｎ個の異なる分光的に識別可能な蛍光基で標識されている）がＤＮＡアレイのそれぞれのサンプルスポットに固定化されている場合、ｎ個の異なる蛍光基の蛍光が、これらの蛍光基の吸収極大に対応する波長（λabs.max）の光によって励起され、放射極大に対応する波長（λem.max）で検出される。用いられた装置に依存して、様々な蛍光基の蛍光を同時に、または連続して測定することができる。
【００３７】
本発明は下記の実施例によって明瞭にされる。
【実施例１】
【００３８】
二重に修飾されたオリゴデオキシヌクレオチド（その５’末端および３’末端が、それぞれの場合、Ｃ２２スペーサーによって、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）に、そして、それぞれ、アミノ基（ＮＨ2）（配列Ａ：ＦＩＴＣ−5'ｇｃｃｃｇｃｇｃＡＡＴＡＧＧＧＡＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡｇｃｇｃｇｇｇｃ3−（Ｃ２２）ＮＨ2および配列Ｂ：ＦＩＴＣ−5'ｇｃｃｃｇｃｇｃＴＴＡＧＡＧＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＣＧＣＣｇｃｇｃｇｇｇｃ3−（Ｃ２２）ＮＨ2）に共有結合的に連結されている）を１００μｌのカップリング緩衝液（５００ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ８．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した（濃度：５００ｐｍｏｌ／ｍｌ）。それぞれの場合、１００μｌのオリゴヌクレオチド溶液をマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏｗｅｌｌ  Ｍ  ＰＣＲプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ*  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のウエルにおいてＲＴ（室温）で３０分間インキュベーションすることによって、表１に示されるように、オリゴヌクレオチドをウエルの表面に共有結合的に結合させた：
【表１】
2005536983.tif 000002
【００３９】
その後、マイクロタイタープレートのウエルを２００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで５回洗浄した。マイクロタイタープレートのウエルに結合しているオリゴヌクレオチドの蛍光強度を、励起波長λabs.max＝４９０ｎｍおよび放射波長λem.max＝５２０ｎｍにおいて分光蛍光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ：Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ）で測定した。データが表３に列挙され、図２（ダイアグラム１）に示される。
【表２】
2005536983.tif 000003
【００４０】
マイクロタイタープレートのウエルを、それぞれの場合、０．１ｍｇ／ｍｌの剪断されたサケ精子ＤＮＡ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；０．５ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；１×ＭＥＳ（１００ｍＭ  ＭＥＳ、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％ツィーン２０）を含有する１２５μｌのハイブリダイゼーション溶液と６０℃で４時間プレハイブリダイゼーションした。
プレハイブリダイゼーション溶液を除いた後、１２５μｌのハイブリダイゼーション溶液（これは、１ｎｍｏｌのサンプルＲＮＡオリゴヌクレオチド（配列Ａ’＝5'ＵＧＵＵＧＡＧＣＣＡＵＣＣＣＵＡＵＵ3'、そして、それぞれ、配列Ｂ’＝5'ＧＧＣＧＣＵＵＵＣＡＵＵＵＵＧＣＡＣＵＣＵＡＡ3'）を、０．１ｍｇ／ｍｌの剪断されたサケ精子ＤＮＡ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；０．５ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；１×ＭＥＳ（１００ｍＭ  ＭＥＳ、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％ツィーン２０）に含有する）をマイクロタイタープレートのウエルに加えた。設定を表２に示す：
【表３】
2005536983.tif 000004
【００４１】
設定物は９５℃で２０分間加熱され、１時間かけて６０℃に冷却されて、６０℃で１６時間ハイブリダイゼーションさせられる。
【００４２】
サンプル核酸溶液を除いた後、マイクロタイタープレートのウエルを、「非ストリンジェント」な洗浄緩衝液（６×ＳＳＰＥ；０．０１％ツィーン２０）で、２５℃で５分間、１０回洗浄し、その後、「ストリンジェント」な洗浄緩衝液（１００ｍＭ  ＭＥＳ；０．１Ｍ  ＮａＣｌ；０．０１％ツィーン２０）で、５５℃で５分間、５回洗浄した。
洗浄後、マイクロタイタープレートのウエルを、３７℃で１０分間、１５０μｌの１×反応緩衝液（ＮＥＢ緩衝液３）で平衡化し、その後、それぞれの場合、２ユニットの制限エンドヌクレアーゼＡｃｉ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する１００μｌの１×反応緩衝液と３７℃で１時間インキュベーションした。反応を、１／５量の停止溶液（０．５％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、マイクロタイタープレートを７５℃に加熱することによって停止させた。その後、マイクロタイタープレートのウエルを、それぞれの場合、１５０μｌの１×ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０）で、室温で６回洗浄した。室温で行われていないインキュベーションはすべてが、蓋加熱によるＢｉｏｍｅｔｒａ  ＵＮＯ（商標）サーモブロックで行われた。マイクロタイタープレートの個々のウエルにおける蛍光強度を、励起波長λabs.max＝４９０ｎｍおよび放射波長λem.max＝５２０ｎｍにおいて分光蛍光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ：Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ）で測定した。データが表４に列挙され、ダイアグラム１（図２）に示される。
【表４】
2005536983.tif 000005
【００４３】
２Ａ〜２Ｈ、４Ａ〜４Ｈ、６Ａ〜６Ｈ、８Ａ〜８Ｈ、１０Ａ〜１０Ｈ、１２Ａ〜１２Ｈ、１Ｂ、１Ｄ、１Ｆ、１Ｈ、３Ａ、３Ｃ、３Ｅ、３Ｇ、５Ｂ、５Ｄ、５Ｆ、５Ｈ、７Ａ、７Ｃ、７Ｅ、７Ｇ、９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、９Ｈ、１１Ｂ、１１Ｄ、１１Ｅおよび１１Ｇのウエルの領域において検出可能であったシグナルは、このシステムのバックグラウンド蛍光に対応し、サンプル核酸（ＡおよびＢ）の領域において検出されたシグナルから差し引かれる。
【実施例２】
【００４４】
配列：
Ａ：ＦＩＴＣ−5'ｇｃｃｃｇｃｇｃＡＡＴＡＧＧＧＡＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡｇｃｇｃｇｇｇｃ3、
Ｂ：ＦＩＴＣ−5'ｇｃｃｃｇｃｇｃＴＴＡＧＡＧＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＣＧＣＣｇｃｇｃｇｇｇｃ3、および
Ｃ：ＦＩＴＣ−5'ｇｃｃｃｇｃｇｃＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−ｇｃｇｃｇｇｇｃ3'、
（コントロール：バックグラウンド蛍光の測定）
を有するフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識のサンプル核酸（これらは固体マトリックスにおいて種々のサンプルスポットに固定化されている）を、２５ｐＭのコントロールＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌの剪断されたサケ精子ＤＮＡ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；０．５ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；１×ＭＥＳ（１００ｍＭ  ＭＥＳ、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％ツィーン２０）において、５μｇのサンプルＲＮＡ（これはＫ５６２細胞から単離された）と５５℃で１６時間ハイブリダイゼーションさせる。サンプル核酸溶液を除いた後、ＤＮＡアレイを、「非ストリンジェント」な洗浄緩衝液（６×ＳＳＰＥ；０．０１％ツィーン２０）で、２５℃で５分間、１０回洗浄し、その後、「ストリンジェント」な洗浄緩衝液（１００ｍＭ  ＭＥＳ；０．１Ｍ  ＮａＣｌ；０．０１％ツィーン２０）で、５５℃で５分間、５回洗浄する。
【００４５】
洗浄後、ＤＮＡアレイを、３７℃で１０分間、１×反応緩衝液で平衡化する。その後、ＤＮＡアレイを、２ユニットの制限エンドヌクレアーゼＡｃｉ１を含有する１００μｌの１×反応緩衝液において３７℃で１時間インキュベーションする。反応を、１／５量の停止溶液（０．５％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、ＤＮＡアレイを７５℃に加熱することによって停止させる。その後、ＤＮＡアレイを、１×ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０）で、室温で４回〜８回洗浄する。ＤＮＡアレイに残っているハイブリダイゼーションしたプローブの蛍光を、波長λabs.max＝４９０ｎｍの光によって励起させ、放射される光を波長λem.max＝５２０ｎｍで検出する。サンプル核酸Ｃの領域において検出され得るシグナルは、このシステムのバックグラウンド蛍光に対応し、サンプル核酸Ａおよびサンプル核酸Ｂの領域において検出されるシグナルから差し引かれる。
【実施例３】
【００４６】
配列：
Ａ：（ＦＩＴＣ）−5'ｇｃｃｃｇｃｇｃＡＡＴＡＧＧＧＡＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡ−ｇｃｇｃｇｇｇｃ3'、
Ｂ：（カスケードブルー）−5'ｇｃｃｃｇｃｇｃＴＴＡＧＡＧＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＣＧＣＣｇｃｇｃｇｇｇｃ3、および
Ｃ：（ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ１４）−5'ｇｃｃｃｇｃｇｃＴＴＴＣＴＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＣＡＴＴＧＴＧｇｃｇｃｇｇｇｃ3'、
を有するサンプル核酸は、ＦＩＴＣ（λabs.max＝４９０ｎｍ、λEm.max＝５２０ｎｍ）、カスケードブルー（λabs.max＝４００ｎｍ、λEm.max＝４２０ｎｍ）およびＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ１４（λabs.max＝５９５ｎｍ、λEm.max＝６２５ｎｍ）の蛍光基で標識されており、規定された区域Ａ（サンプルスポットＡ）に一緒に固定化される。プローブ核酸：
Ｄ：（ＦＩＴＣ）−5'ｇｃｃｃｇｃｇｃＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−ｇｃｇｃｇｇｇｃ3'、
Ｅ：（カスケードブルー）−5'ｇｃｃｃｇｃｇｃＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−ｇｃｇｃｇｇｇｃ3'、および
Ｆ：（ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ１４）−5'ｇｃｃｃｇｃｇｃＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−ｇｃｇｃｇｇｇｃ3'、
は、バックグラウンド蛍光を測定するためのコントロールとして使用されるが、別の規定された区域Ｂ（サンプルスポットＤ）に一緒に固定化される。ＤＮＡアレイを、５５℃で１６時間、２５ｐＭのコントロールＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌの剪断されたサケ精子ＤＮＡ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）;０．５ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）:１×ＭＥＳ（１００ｍＭ  ＭＥＳ、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％ツィーン２０）において、０．１μｇのサンプルＲＮＡ（ｃＲＮＡ）（これは、配列Ｄ’＝5'ＵＧＵＵＧＡＧＣＣＡＵＣＣＣＵＡＵＵ3'、配列Ｅ’＝5'ＧＧＣＧＣＵＵＵＣＡＵＵＵＵＧＣＡＣＵＣＵＡＡ3'、および配列Ｆ’＝5'ＣＡＣＡＡＵＧＵＧＡＧＧＡＧＧＵＡＧＡＧＡＡＡ3'を含有する）とハイブリダイゼーションさせる。サンプル核酸溶液を除いた後、ＤＮＡアレイを、「非ストリンジェント」な洗浄緩衝液（６×ＳＳＰＥ；０．０１％ツィーン２０）で、２５℃で５分間、１０回洗浄し、その後、「ストリンジェント」な洗浄緩衝液（１００ｍＭ  ＭＥＳ；０．１Ｍ  ＮａＣｌ；０．０１％ツィーン２０）で、５０℃で５分間、５回洗浄する。
【００４７】
洗浄後、ＤＮＡアレイを、３７℃で１０分間、１×反応緩衝液で平衡化する。その後、ＤＮＡアレイを、２ユニットの制限エンドヌクレアーゼＡｃｉ１を含有する１００μｌの１×反応緩衝液において３７℃で１時間インキュベーションする。反応を、１／５量の停止溶液（０．５％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、ＤＮＡアレイを７５℃に加熱することによって停止させる。その後、ＤＮＡアレイを、１×ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０）で、室温で４回〜８回洗浄する。ＤＮＡアレイに残留し、ＦＩＴＣ、カスケードブルーまたはＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ１４で標識されているハイブリダイゼーションしたプローブの蛍光を、λAbs.max＝４９０ｎｍ、λAbs.max＝４００ｎｍおよびλAbs.max＝５９５ｎｍの波長の光によってそれぞれ励起させ、λEm.max＝５２０ｎｍ、λEm.max＝４２０ｎｍおよびλEm.max＝６２５ｎｍの各波長で放射される光でそれぞれ検出する。サンプルスポットＢの領域において検出され得るシグナルは、このシステムのバックグラウンド蛍光に対応し、サンプルスポットＡの領域において検出されるシグナルから差し引かれる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明によるプローブ核酸の概略図である。
【図２】マイクロタイタープレートのウエルに共有結合的に結合しているオリゴヌクレオチドの、ハイブリダイゼーションおよび制限消化の後における蛍光強度（×１０００）を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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