(57)【要約】  本発明は磁気によって固定化した生体分子の修飾、とりわけ、温度制御した修飾のための装置および方法を提供する。
2005510228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を修飾する方法であって、
a)磁性粒子と結合した生体分子をカラム内の磁化可能なマトリックスに磁場を印加することによって磁気分離装置に固定化すること、および
b)固定化された生体分子を修飾すること、ここで、修飾は修飾に好適な温度で行われる、を含む、方法。
【請求項２】
修飾された生体分子をカラムから溶出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
修飾が少なくとも第1の酵素による酵素的修飾であり、装置が第1の酵素がその最大活性の少なくとも10%を示す第1の温度で第1の期間維持される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
c)固定化された生体分子を第2の酵素により修飾すること、ここで、装置が第2の酵素がその最大活性の少なくとも10%を示す第2の温度で第2の期間維持される、
をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生体分子がポリペプチドを含み、かつ修飾が、リン酸化、脱リン酸化、ニトロシル化、アセチル化、脱グリコシル化、グリコシル化、アシル化、メチル化、ADPリボキシル化、ユビキチン化、脂質化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、およびヌクレオチド化からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生体分子がポリペプチドを含み、かつ修飾が検出可能な標識により標識することである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
固定化される生体分子がポリヌクレオチドを含み、かつ修飾が、固定化されたポリヌクレオチドの少なくとも一部と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む第2の生体分子とのハイブリダイゼーションを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
固定化される生体分子がポリヌクレオチドであり、かつ修飾が、固定化されたポリヌクレオチド内のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを合成することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
固定化される生体分子がポリヌクレオチドを含み、かつ修飾が、固定化されたポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチドの合成、固定化されたポリヌクレオチドの5'末端へのヌクレオチドの付加、固定化されたポリヌクレオチドの3'末端へのヌクレオチドの付加、固定化されたポリヌクレオチドへの一本鎖ポリヌクレオチドのライゲーション、固定化されたポリヌクレオチドへの二本鎖ポリヌクレオチドのライゲーション、固定化されたポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ認識部位での切断、固定化されたポリヌクレオチドからのヌクレオチドの除去、固定化されたポリヌクレオチドを鋳型として用いるポリペプチドの合成、および固定化されたポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基のメチル化からなる群から選択される酵素的修飾である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
固定化される生体分子がポリヌクレオチドを含み、かつ修飾が非酵素的修飾である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
固定化される生体分子がポリヌクレオチドを含み、かつ修飾が固定化されたポリヌクレオチドにポリペプチドを結合させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
固定化される生体分子が第1のポリペプチドを含み、かつ修飾が、固定化されたポリペプチドに第2のポリペプチドを結合させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
固定化される生体分子が二本鎖ポリヌクレオチドを含み、かつ修飾が、DNAリガーゼの存在下で約16℃の温度にて、固定化されたポリヌクレオチドを、約6〜約20ヌクレオチド長の二本鎖ポリヌクレオチドと接触させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
核酸分子を合成する方法であって、
a)磁性粒子と結合した生体分子をカラム内の磁化可能なマトリックスに磁場を印加することによって磁気分離装置に固定化すること、ここで、固定化される生体分子はポリヌクレオチドを含み、かつ磁性粒子は、固定化される生体分子の一部と相補的であり、核酸合成でのプライマーとなる、該磁性粒子と結合されたオリゴヌクレオチドを含む、
b)固定化されたポリヌクレオチドをデオキシヌクレオチドの存在下で核酸分子を合成することができる酵素と接触させること、ここで、装置は酵素がその最大活性の少なくとも10%を示す温度で一定期間維持される、および 
c)固定化されたポリヌクレオチドを鋳型として用いて核酸分子を合成すること
を含む、方法。
【請求項１５】
少なくとも1つのデオキシヌクレオチドが検出可能な標識を含み、かつ合成された核酸分子が少なくとも1つの検出可能なように標識されたデオキシヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
固定化されるポリヌクレオチドがmRNA分子であり、酵素が逆転写酵素であり、上記工程(c)を約32℃〜約42℃の温度にて行い、合成される核酸分子がcDNA分子である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
d)cDNA分子を約37℃の温度にてRNアーゼHと接触させること、および
e)cDNA分子を溶出すること、
をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
核酸分子を合成する方法であって、
a)磁性粒子と結合した生体分子をカラム内の磁化可能なマトリックスに磁場を印加することによって磁気分離装置に固定化すること、ここで、固定化される生体分子はポリヌクレオチドを含む、
b)固定化されたポリヌクレオチドをデオキシヌクレオチドの存在下で核酸の合成に好適な条件下にて、第1のオリゴヌクレオチドプライマーおよび核酸分子を合成することができる酵素と接触させること、および
c)固定化されたポリヌクレオチドを鋳型として用いて核酸分子を合成すること、
を含む、方法。
【請求項１９】
上記工程(b)の間、装置が酵素がその最大活性の少なくとも10%を示すように一定期間維持される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記工程(b)を約55℃の温度にて行い、および／または上記工程(c)を約60℃〜約72℃の温度にて行う、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
d)カラムを、合成された核酸を変性させる温度に加熱すること、
e)合成された核酸分子を、該合成された核酸分子の一領域とハイブリダイズする第2のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること、
f)第2のプライマーの合成された核酸分子とのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な温度にカラムを冷却して、ハイブリダイゼーションを起こすこと、および
g)カラムの温度を、起こるべき第2のプライマーからの第2の核酸の合成に好適な温度にすること、
をさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
上記工程(d)の加熱が約90℃〜約96℃であり、および／または(f)における冷却が約55℃までであり、および／または(g)における合成に好適な温度が約60℃〜約72℃である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記変性、冷却および合成工程のサイクルを2〜約30回繰り返すことをさらに含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
核酸分子を合成する方法であって、
a)磁性粒子と結合した生体分子を、カラム内の磁化可能なマトリックスに磁場を印加することによって磁気分離装置に固定化すること、ここで、固定化される生体分子はポリ(A)部分を含むポリヌクレオチドを含み、かつ磁性粒子は約6ヌクレオチド〜約30ヌクレオチドのオリゴ-dT分子と結合される、
b)固定化されたポリヌクレオチドを、デオキシヌクレオチドの存在下で、核酸分子を合成することができる酵素と接触させること、ここで、装置は酵素がその最大活性の少なくとも10%を示す温度で一定期間維持される、および
c)固定化されたポリヌクレオチドを鋳型として用いて核酸分子を合成すること、
を含む、方法。
【請求項２５】
固定化されるポリヌクレオチドがmRNA分子であり、合成される核酸分子がcDNA分子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
固定化されたmRNAおよび合成されたcDNA分子をRNアーゼHと接触させることをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも1つのデオキシヌクレオチドが検出可能な標識を含み、ここで、検出可能なように標識されたデオキシヌクレオチドが合成された核酸分子に組み込まれている、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
生体分子を固定化し、修飾するための機器であって、
少なくとも1つの分離チャンバーと、
各分離チャンバーに収容された湿潤性のフロースルー型熱伝導性マトリックスと、
各分離チャンバーと熱的に連結された制御可能な熱源とを含む、機器。
【請求項２９】
各分離チャンバーと連結された制御可能な冷却源をさらに含む、請求項２８に記載の機器。
【請求項３０】
制御可能な各熱源が各々、制御可能な冷却源としても機能する、請求項２９に記載の機器。
【請求項３１】
制御可能な各熱源を電源と連結している制御器をさらに含み、ここで、該制御器は、制御可能な各熱源に供給される電力量を制御してその温度を制御するように機能する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３２】
制御可能な各熱源の温度について制御器にフィードバックするための、制御可能な各熱源に付属するフィードバックセンサーをさらに含む、請求項３１に記載の機器。
【請求項３３】
各フィードバックセンサーが熱電対を含む、請求項３２に記載の機器。
【請求項３４】
湿潤性のフロースルー型熱伝導性マトリックスが内部磁化可能である、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３５】
制御可能な熱源が少なくとも1つの加熱フィルムを含む、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３６】
制御可能な熱源が少なくとも1つの電気抵抗式発熱体を含む、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３７】
制御可能な熱源が少なくとも1つのペルティエ素子を含む、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３８】
制御可能な熱源が空気加熱系を含む、請求項２８〜３７のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３９】
制御可能な熱源が油圧加熱系を含む、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の機器。
【請求項４０】
制御可能な熱源が少なくとも1つの輻射発熱体を含む、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の機器。
【請求項４１】
各輻射発熱体が赤外線発光ダイオードを含む、請求項４０に記載の機器。
【請求項４２】
制御可能な熱源が少なくとも1つの誘導発熱体を含む、請求項２８〜４１のいずれか一項に記載の機器。
【請求項４３】
各誘導発熱体が1スプールの巻線を含む、請求項４２に記載の機器。
【請求項４４】
生体分子を修飾する方法であって、
a)磁性粒子と結合した生体分子を分離チャンバー内の磁化可能なマトリックスに磁場を印加することによって請求項２８〜４３のいずれか一項に記載の機器に固定化すること、および
b)固定化された生体分子を修飾すること、ここで、修飾は修飾に好適な温度にて行う、
を含む、方法。
【請求項４５】
生体分子を固定化し、修飾するための分離ユニットであって、
そこに少なくとも1つのノッチが形成された磁性体ヨーク、
少なくとも1つの各ノッチの内に位置する磁石対、ここで、該磁石対の間に分離チャンバーを受け入れるのに適したギャップが形成されている、および
各磁石対と熱的に連結された制御可能な熱源
を含む、ユニット。
【請求項４６】
磁石と制御可能な熱源とを分離する絶縁層をさらに含む、請求項４５に記載のユニット。
【請求項４７】
制御可能な各熱源が各々、制御可能な冷却源としても機能する、請求項４６に記載のユニット。
【請求項４８】
制御可能な各熱源を各磁石対と熱的に連結する熱伝導性素子をさらに含む、請求項４５または４６に記載のユニット。
【請求項４９】
各熱伝導性素子が、分離チャンバーに熱を伝えるように分離チャンバーに接触するよう構成されている、請求項４８に記載のユニット。
【請求項５０】
制御可能な熱源の少なくとも1つが加熱フィルムを含む、請求項４５〜４９に記載のユニット。
【請求項５１】
制御可能な熱源の少なくとも1つがペルチェ型熱源を含む、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載のユニット。
【請求項５２】
制御可能な熱源の少なくとも1つが電気抵抗式熱源を含む、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載のユニット。
【請求項５３】
制御可能な熱源の少なくとも1つが、それを通って循環する液体から熱を伝えるのに適した液体駆動素子を含む、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載のユニット。
【請求項５４】
制御可能な熱源の少なくとも1つが輻射発熱体を含む、請求項４５〜５３に記載のユニット。
【請求項５５】
各輻射発熱体が赤外線発光ダイオードを含む、請求項５４に記載のユニット。
【請求項５６】
制御可能な熱源の少なくとも1つが誘導発熱体を含む、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載のユニット。
【請求項５７】
各誘導発熱体が1スプールの巻線を含む、請求項５６に記載のユニット。
【請求項５８】
その温度を制御する制御可能な各熱源に供給される電力量を制御するように機能する、制御可能な各熱源を電源と連結している制御器をさらに含む、請求項４５〜５７のいずれか一項に記載のユニット。
【請求項５９】
制御可能な各熱源の温度について制御器にフィードバックするための、制御可能な各熱源に付属するフィードバックセンサーをさらに含む、請求項４５〜５８のいずれか一項に記載のユニット。
【請求項６０】
各フィードバックセンサーが熱電対を含む、請求項５９に記載のユニット。
【請求項６１】
生体分子を固定化し、修飾するための分離ユニットであって、
そこに少なくとも1つのノッチが形成された磁性体ヨーク、
少なくとも1つの各ノッチの内に位置する磁石対、ここで、該磁石対の間に分離チャンバーを受け入れるのに適したギャップが形成されている、および
各磁石対と熱的に連結された制御可能な冷却源
を含む、ユニット。
【請求項６２】
HGMS分離ユニットと整合させるのに適した外部温度調節ユニットであって、
ベース部、
ベース部から伸び、分離カラムを支えるHGMS分離ユニット内のスロットにはめ込むのに適したフィンガーエレメント、および
ギャップ内の各分離カラムに制御された熱量を加えるのに適した、各フィンガーエレメントの一末端にある制御可能な発熱体
を含む、外部温度調節ユニット。
【請求項６３】
ベース部が熱伝導性材料で作製された熱伝導体を含む、請求項６２に記載の調節ユニット。
【請求項６４】
フィンガーエレメントが熱伝導体と同じ熱伝導性材料で形成された、請求項６２または６３に記載の調節ユニット。
【請求項６５】
各フィンガーエレメントがそれを挿入するギャップの幅に実質的に等しい幅を有し、その結果、フィンガーがカラムがギャップ内に挿入された後に残るギャップの余剰部分を実質的に埋める、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の調節ユニット。
【請求項６６】
各フィンガーエレメントが、フィンガーエレメントの一末端とカラムとの接触を可能にするのに十分な長さを有し、一方でベース部を分離ユニットと接近させた状態に維持する、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の調節ユニット。
【請求項６７】
各フィンガーエレメントが、ギャップ内の各カラムの周囲の一部に沿い、それと厳密に整合させるのに適した凹面を有する一末端を含む、請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の調節ユニット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はin situにて生体分子を修飾するための高勾配磁気分離(HGMS)技術の使用および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
高勾配磁気分離とは、磁場に置いたチャンバーまたはカラム内に磁性材料を選択的に保持する方法を指す。この技術は磁性粒子で標識した非磁性標的に適用することもできる。この技術の一用途において、標的材料、典型的には、生体物質が、標的材料を磁性粒子と接着させることによって標識される。この接着は、一般に、標的材料の、結合のために官能基を提供する粒子のコーティングと結合する特定の結合パートナーとの結合によるものである。他の種類の接着も記載されている。例えば、コロイド磁性デキストラン鉄粒子をデキストランと標的細胞表面抗原との両方に対して特異性を有する二重特異性抗体を使用して標的細胞と選択的に結合することができる（LansdorpおよびThomas (1990) Mol. Immunol. 27: 659）。さらに、磁性粒子の標的材料との直接化学的結合または物理的結合も可能である。
【０００３】
このようにして磁性「標識」を付けた目的の材料を液体に懸濁し、その後、これをチャンバーに適用する。チャンバー全域に提供された磁気勾配の存在下では、磁性標識した標的がチャンバー内に保持される。チャンバーにマトリックスが収容されている場合には、それがマトリックスと結合することになる。磁性標識のない材料はチャンバーを通過する。保持された材料は、その後、磁場の強さを変更することによって、または磁場を消滅させることによって溶出することができる。あるいは、保持された粒子を、磁化された液体を供給することによって溶出してもよい。米国特許第5,411,863号。磁場は永久磁石によって、または電磁石によって提供することができる。所望の標的材料に対する選択性は、磁性粒子と結合した特定の結合パートナーによって、磁性粒子の標的との直接化学的結合または物理的結合により与えられる。全域に磁場が印加されるチャンバーには、多くの場合、チャンバー内に局部的に高磁場勾配を誘導する好適な磁化率を有する材料のマトリックスがマトリックスの表面積に近いボリュームで提供される。これによって微弱磁化粒子の保持が可能になり、このアプローチを高勾配磁気分離(HGMS)という。
【０００４】
磁気分離を用いた細胞または分子の捕捉に関し、種々の方法が記載されている。米国特許第4,452,773号は、磁性鉄-デキストランミクロスフェアの調製を記載しており、生体物質との接着に好適な粒子の調製についての種々の手段を記載している技術の概要を提供する。米国特許第4,230,685号は、アクリル酸ポリマーまたは多糖類でコーティングした粒子が、例えば、グルタルアルデヒドを介して、プロテインAの調製物と結合することができ、その後、免疫反応性Fab領域が露出された状態でFc部分を介して抗体を選択的に結合することができるという、特異的な結合剤を磁性粒子と接着することでの改善について記載している。米国特許第6,020,210号は、細胞を保持するためのHGMSの使用を記載している。米国特許第6,159,378号は、液体中での磁性粒子の取扱い方法を記載している。米国特許第6,159,689号は、磁性粒子を用いた分子の捕捉方法を記載している。
【０００５】
HGMSに用いる種々の形式の装置も記載されている。米国特許第4,738,773号は、例えば、ステンレス鋼またはテフロン(登録商標)(ポリテトラフルオロエチレン)製のヘリカル中空チューブ材料を使用し、ヘリックスが印加磁場に置かれる分離装置を記載している。米国特許第4,664,796号は、磁場の位置を分離カラム全域で変化させることができる構造を記載している。Kronick、米国特許第4,375,407号は、分離しようとする粒子を含む液体をヒドロゲルポリマーでコーティングしたフィラメント材料を通過させるHGMS用装置を記載している。
【０００６】
in vitroでの生体分子の修飾には、現在種々の方法が利用可能である。これらの方法の多くでは、修飾が起こる温度を慎重に制御する必要がある。修飾する分子の構造、修飾反応における反応物質、または2つの分子間の相互作用が温度依存性または温度感受性である理由で、多くの場合には、温度条件の制御が重要である。反応物質を生成物または中間体と分離しなければならないことが多くあり、これは、一般に、洗浄(例えば、DNAのフェノール／クロロホルム沈殿)によって、または修飾反応後のカラム分離(例えば、ゲル濾過)によって達成される。さらに、単一分子に2以上の修飾反応を行わなければならない場合、または1つの分子の修飾によって第2の分子が生じる場合には、その後、2つの修飾工程間に第2の分子の修飾、分離工程を行うことが多い。
【０００７】
こういった方法の1つの欠点が、反応槽から分離カラム(またはその他の分離装置)へと材料を移し換える必要があることであり、これによって必然的に生成物の損失が起こる。この不利益は生成物が限られた量である場合に、特に問題となる。さらに、このような方法は多大な時間を必要とする困難なものであり、一般的には自動化に適合しない。
【０００８】
当技術分野では、生体分子を温度制御された条件下で修飾するための、複数の移動工程を必要としない改良された装置および方法が必要である。本発明はこの必要性の問題を取り扱う。
【０００９】
文献
米国特許第5,711,871号; 第5,705,059号; 第5,691,208号; 第5,543,289号; 第5,779,892号; および第6,020,201号。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、高勾配磁気分離(HGMS)機器を用いて生物学的分子(「生体分子」)を修飾する方法を提供する。本方法は、一般に、磁性標識した生体分子を、それが分離装置内にある際に標識した生体分子に磁場を印加することによって磁気分離装置に固定化すること、および磁気によって固定化した生体分子を修飾することを含む。多くの実施形態では、1以上の修飾工程が温度制御された条件下で行われる。いくつかの実施形態では、本方法が反応生成物を固定化された生体分子と分離する工程をさらに含む。その他の実施形態では、本方法が修飾された生体分子をカラムから溶出する工程をさらに含む。さらに別の実施形態では、本方法が2つ以上の修飾工程、所望により、さらに中間溶出および／または洗浄工程の実施を含む。
【００１１】
さらに別の実施形態では、本方法が磁気によって固定化した生体分子に少なくとも1つの修飾工程を行うこと、および修飾された生体分子または新たに合成された生体分子を磁気分離装置内の第2の結合部分に捕捉すること、所望により、さらに中間溶出および／または洗浄工程を含む。修飾された生体分子または新たに合成された生体分子を捕捉した後、修飾された生体分子または新たに合成された生体分子をさらに修飾および／または精製する。
【００１２】
本方法の有利な点は、修飾および分離工程、ならびに精製および洗浄工程が1つの装置で(または装置内の1つのユニット、例えば、装置内のチャンバー内で)行うことができることであり、それによって、生成物の損失などの不利益を伴う非固定化修飾標的材料の従来の精製が回避される。
【００１３】
本方法のさらなる有利な点は、いったん修飾が完了すれば、修飾に用いた酵素をカラムから洗い流すことができることである。従って、不活性化工程またはさらなる精製工程の必要性がなくなり、その結果として、時間が節約され、生成物の損失が減少する。さらに、酵素を除去するための標準プロトコールで用いられる毒性試薬は必要でなくなる。よって、最終生成物の純度は高くなる。
【００１４】
本発明はさらに、磁気によって固定化された生体分子を修飾すること(ここで、生体分子が懸濁状態で固定化される)を提供する。分離装置に印加する磁場の強さは、生体分子が結合した磁性粒子の懸濁物の形成がなされるように調整することができる。印加磁場の強さに応じて、生体分子を所定の位置に固定化することができ、または懸濁物に固定することもできる。生体分子の均質な修飾が望まれるいくつかの用途では、生体分子を懸濁状態で維持することが有利である。懸濁物は、例えば、マトリックスの一定の高磁場または勾配領域に、または分離装置の全空隙容量に局在させることができる。
【００１５】
さらなる有利な点は、修飾反応の温度を実施する反応の性質に従って、制御し、変更することができることである。
【００１６】
本発明は、HGMS分離機器に配置されるカラムの温度を制御するための種々の装置を含む。分離ユニットには、in situにて少なくとも1つの分離チャンバー内の温度を制御するための制御可能な熱源が提供されている。各分離チャンバーには、湿潤性、フロースルー型熱伝導性マトリックスが収容されていてもよい。あるいは、またはさらには、分離ユニットには、分離チャンバーが備え付けられる各位置と連結された制御可能な冷却源が提供されていてもよい。いくつかの例では、加熱および冷却機能が同一の制御可能な供給源によって果たされている。
【００１７】
その温度を制御する制御可能な各供給源に供給される電力量を制御するために機能するよう、制御可能な各熱／冷却源を電源と連結する制御器を提供してもよい。
【００１８】
1以上のフィードバックセンサーが制御可能な熱／冷却源を備え、制御器に制御可能な熱／冷却源の温度についてフィードバックしてもよい。
【００１９】
分離ユニット内に加熱および／または冷却機構を提供する代わりとして、本発明はさらに、HGMS分離ユニットと整合させ、それによって支えられるカラムの温度を制御するのに適した種々の外部温度調節ユニットを提供する。外部調節ユニットの例としては、ベース部、ベース部から伸び、分離カラムを支えるHGMS分離ユニット内のスロットにはめ込むのに適したフィンガーエレメント、およびギャップ内の各分離カラムに制御された熱量／冷却を加えるのに適した、各フィンガーエレメントの一末端にある制御可能な発熱体が挙げられる。
【００２０】
ベース部は、熱伝導性材料で作製された熱伝導体を含んでなってよい。フィンガーエレメントが熱伝導体と同じ熱伝導性材料で形成されていてもよい。
【００２１】
本発明のこれらおよびその他の目的、有利な点、および態様については、当業者ならば以下にさらに十分に説明する装置および方法の詳細を解釈することで 分かるであろう。
【００２２】
定義
本明細書において用語「生体分子」とは、生物源由来の分子を指し、通常は生物学的存在(例えば、動物、植物、真正細菌、始原細菌、真菌類、糸状菌、酵母、藻類など)とは関連がなくとも、生物学的存在と通常関連する分子の修飾物または類似体である合成分子を含む。用語「生体分子」は、異質または同質であってよい複数の生体分子をさらに包含する。この用語はそのようなものとして、生体分子の合成および半合成類似体のライブラリーをさらに包含する。生体分子としては、限定されるものではないが、ポリヌクレオチド; ポリペプチド; 多糖類; 脂質; ポリヌクレオチド、多糖類、脂質、およびポリペプチドのうちの1種以上を含み、限定されるものではないが、リポ多糖類、リポ蛋白、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、ペプチド、核酸などをはじめとする分子が挙げられる。生体分子は、限定されるものではないが、アシル化、アセチル化、リン酸化、硫黄基の付加などをはじめとする1以上の修飾を含んでなっていてよい。
【００２３】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、本明細書においては互換的に使われ、いずれの長さであってもよいヌクレオチドの重合形を指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体を含んでいてもよい。ヌクレオチドが三次元構造を有していてもよく、それらが既知の機能または未知の機能を果たしてもよい。用語「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖、二本鎖および三重ヘリックス分子が挙げられる。「オリゴヌクレオチド」とは、一般に、一本鎖または二本鎖DNAの約5〜約100ヌクレオチド間のポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示内容の用途では、オリゴヌクレオチドの長さには上限は存在しない。オリゴヌクレオチドはまた、オリゴマーまたはオリゴとしても知られており、遺伝子から単離してもよいし、または当技術分野で公知の方法によって化学合成してもよい。
【００２４】
以下は、ポリヌクレオチドの限定されない実施形態である: 遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれの配列を有していてもよい単離されたDNA、いずれの配列を有していてもよい単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー。核酸分子はまた、メチル化核酸分子などの修飾核酸分子および核酸分子類似体を含んでなってよい。プリンおよびピリミジンの類似体については、当技術分野では公知である。核酸は天然に存在する、例えば、DNAまたはRNAであってもよいし、または当技術分野では公知の合成類似体であってもよい。このような類似体は、アッセイ条件下での優れた安定性によりプローブとして使用されることが好ましい。骨格、糖または複素環式塩基の改変をはじめとする天然構造の修飾によって、細胞内安定性と結合親和性が高まることが分かってきた。骨格化学の有用な変化には、ホスホロチオエート; 両方の非架橋酸素が硫黄で置換されているホスホロジチオエート; ホスホロアミダイト; アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートがある。アキラルホスフェート誘導体としては、3'-O'-5'-S-ホスホロチオエート、3'-S-5'-O-ホスホロチオエート、3'-CH2-5'-O-ホスホネートおよび3'-NH-5'-O-ホスホロアミダートが挙げられる。ペプチド核酸は、全てのリボースホスホジエステル骨格をペプチド結合で置き換えたものである。
【００２５】
糖修飾はまた、安定性および親和性を高めるのに用いられる。天然β-アノマーに対し、塩基が逆転しているデオキシリボースのα-アノマーを用いてもよい。リボース糖の2'-OHを改変して2'-O-メチルまたは2'-O-アリル糖を形成し、親和性について妥協することなく分解に対する耐性を与えてもよい。
【００２６】
複素環式塩基の修飾では、適切な塩基対合を維持する必要がある。有用な置換としては、デオキシチミジンの場合はデオキシウリジンで; デオキシシチジンの場合は5-メチル-2'-デオキシシチジンおよび5-ブロモ-2'-デオキシシチジンでの置換が挙げられる。デオキシチミジンおよびデオキシシチジン各々の代わりに5-プロピニル-2'-デオキシウリジンおよび5-プロピニル-2'-デオキシシチジンで置換した場合に、親和性および生物活性が高まることが分かってきた。
【００２７】
本明細書においては互換的に使われる用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、いずれの長さであってもよいアミノ酸の重合形を指し、コード化されたアミノ酸および非コード化アミノ酸、化学的にまたは生化学的に修飾したまたは誘導体化したアミノ酸、およびペプチド骨格を修飾したポリペプチドを挙げることができる。この用語には、限定されるものではないが、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、N末端メチオニン残基を含むまたは含まない異種および同種リーダー配列との融合物; 免疫学的タグ付きタンパク質などといった融合タンパク質も含まれる。
【００２８】
本明細書において「選ばれた生体分子」(「標的材料」ともいう)は、実施者が修飾することを所望する生体分子である。生体分子は、不均質懸濁物中の他の生体分子とは異なり、それを磁性粒子で標識し、固定化し、修飾することを可能にするいくつかの特徴を有する。しかしながら、全ての用途において生体分子をその他の生体分子と分離する必要はない。本発明によれば、選ばれた生体分子がHMGカラムに保持され、カラムに保持されている間に修飾される。修飾がなされた選ばれた生体分子は後に溶出することができる。あるいは、修飾によって少なくとも1種の第2の生体分子が生じ、この第2の生体分子が後に溶出される。
【００２９】
選ばれた生体分子が「保持」されることで、選ばれた生体分子が確実に装置(または装置内のチャンバー)内に残存し、所望でない生体分子が除去される。典型的には、選ばれた生体分子の保持は固定化によるものである。
【００３０】
本明細書において、磁気細胞分離にて選ばれた生体分子を「固定化する」とは、カラム内で実質的に固定された位置に生体分子を保持することを指す。用語「実質的に固定された」とは、生体分子はカラム内のある位置に残存するが、その位置は印加磁場の強さによって実質的に経時変化する可能性があるという事実を指す。従って、例えば、印加磁場については、印加磁場領域内での生体分子の移動を考慮に入れる。
【００３１】
選ばれた生体分子の磁気細胞分離カラムからの「除去」では、保持または固定化の後に磁性標識を有するまたは有さない選ばれた生体分子の溶出を必要とする。高純度の選ばれた生体分子が望まれる状況では、選ばれた生体分子を除去し、好適なバッファーに再懸濁するとよい。あるいは、本明細書に記載の装置で選ばれた生体分子を修飾した後、選ばれた生体分子を除去し、最初の懸濁物に戻してもよい。選ばれた生体分子の修飾の結果として生じた少なくとも1種の第2の生体分子の除去では、その生成後に第2の生体分子の溶出を必要とする。
【００３２】
用語「結合(conjugated, attached,およびlinked)」(ならびに類似用語、例えば、「連結(conjugation, attachment,およびlinkage)」)は、本明細書においては互換的に使われ、2つの分子、例えば、核酸分子とポリペプチドとの化学的結合を指す。化学的結合は共有結合であってもよいし、または非共有結合であってもよい。2つの分子を直接結合させてもよいし、または、例えば、リンカー(「スペーサー」)分子、固体支持体などを介して間接的に結合させてもよい。
【００３３】
本明細書において「標識する」とは、生体分子にマーカーを取り付けて、時に、さらなる処理の後に、これらの生体分子の不均質懸濁液からの分離および／または検出、解析または計数を可能にする方法である。標識は特に選ばれた生体分子を対象とするが、必ずしもその必要はない。このようなマーカーまたは標識としては、限定されるものではないが、抗体と結合する着色、放射性、蛍光、または磁性分子もしくは粒子、あるいは特定の生体分子または生体分子種と結合することが分かっているその他の生体分子もしくは粒子が挙げられる。抗体の代わりとなり得るその他の生物学的反応性標識成分としては、限定されるものではないが、遺伝子プローブ、脂質、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、酵素、補酵素、補因子、抗生物質、ステロイド、ホルモン、またはビタミンが挙げられる。
【００３４】
本明細書において、生体分子を「磁性標識する」とは、生体分子に磁性標識を固定することであって、このような標識化が、前記生体分子に磁気特性を有する粒子または分子を固定することによって達成されることを指す。磁性粒子と結合した抗体、タンパク質、または核酸分子を含む磁性標識は、Miltenyi Biotec GmbH(Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Germany)から商業的に入手可能である。このような標識は、所望により、蛍光または放射性粒子もしくは成分もまた含んでいてもよい。
【００３５】
超常磁性粒子の作製方法は、米国特許第4,770,183号に記載されている。専門用語については、当技術分野での一般用法と同じである。
【００３６】
本明細書において用いる、および第1の規準に近いものとして、「反磁性」とは、磁場の存在下でさえ磁気特性を獲得しない、すなわち、磁化率がかなり低い材料を指す。
【００３７】
「常磁性」材料は、弱い磁化率しか有さず、磁場が除かれるとその弱磁性は直ちに失われる。これらは組織化マトリックスを介して互いに結合していない不対電子を含むことを特徴としている。常磁性材料が溶液中イオンまたはガス中のイオンであってよいが、組織化子形態でも存在し得る。
【００３８】
「強磁性」材料は、磁場の影響を強く受けやすく、磁場が除かれても磁気特性を保持することができる。材料の不対電子が結晶格子に含まれる場合のみ、それによって不対電子の結合が可能になり、強磁性が起こる。永久磁化を有する強磁性粒子は、これらの粒子の懸濁物が、粒子が互いに高磁力であるために凝集しやすいことから、生体物質分離への適用にはかなりの不都合がある。
【００３９】
「超常磁性」材料は、磁気の影響を強く受けやすく、例えば、磁場に置くとそれらは強磁性となるが、その磁性は急速に失われる。超常磁性は強磁性材料において結晶径を臨界値未満の値に小さくした場合に起こる。HGMSにおいては超常磁性粒子が好ましい。
【００４０】
便宜上、上記の定義を用いるが、結晶サイズおよび粒子組成に応じ、常磁性、超常磁性、および強磁性間に一連の性質が存在することは容易に理解されるであろう。よって、これらの用語は単に便宜上用いるものであって、「超常磁性」とは、その指定された二つの限界の間に入る範囲の磁気特性を含むことを意図している。
【００４１】
本発明をさらに説明する前に、本発明が記載した特定の実施形態に限定されるものではなく、それ自体変更可能であるものと理解すべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、本明細書にて使用する専門用語は単に特定の実施形態を記載することを目的とするものであり、限定を意図するものではないことも理解すべきである。
【００４２】
ある範囲の値を示す場合には、その範囲の上限値と下限値の間の任意の値を指し、特に明示されない限り、下限値の単位の10分の1までのその間の各値、およびその他の任意の記載の値またはその記載範囲にある任意の値が本発明に含まれるものと理解される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、独立にそのより小さい範囲に含まれ、記載範囲で特に排除される限界を条件として、本発明にも含まれ得る。記載範囲が一方または両方の限界を含む場合には、含まれる限界のいずれかまたは両方を排除した範囲もまた本発明に含まれる。
【００４３】
特に断りのない限り、本明細書にて使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似したまたはそれに匹敵する方法および材料を本発明の実施または試験に用いてもよいが、好ましい方法および材料についてはこれから説明する。本明細書に記載の全ての刊行物は、刊行物を開示することに関連して方法および／または材料を開示し、記載するために参照により本明細書に組み入れられる。
【００４４】
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において、単数形「1つの(a)」、「および(and)」、および「その(the)」とは、特に明示されない限り、複数指示語を含むものであることに留意しなければいけない。よって、例えば、「生体分子(a biomolecule)」への言及は、複数のかかる生体分子を含み、「修飾(the modification)」への言及は、1以上の修飾および当業者には公知のその等価物などへの言及を含む。
【００４５】
本明細書に記載の刊行物は、本願の出願日に先立つそれらの開示としてのみ示している。本明細書において、本発明が先行発明であることを理由にかかる刊行物に先行する権利が与えられていないことが認められていると解釈されてはならない。さらに、付与される公開日は独立して承認される必要があり、実際の公開日とは違っている場合がある。
【発明の詳細な説明】
【００４６】
本発明は磁気によって固定化した生体分子の修飾、とりわけ、温度制御した修飾のための装置および方法を提供する。
【００４７】
高勾配磁気分離機器
本発明は磁気によって固定化した生体分子の修飾のためのHGMS機器を提供する。各機器には、少なくとも1つの分離／修飾チャンバーが含まれる。これは開放注入口および流出口が備わった分離カラムとして設計し得るが、単一のカップまたはマルチウェルカップなどとしても作製することもできる。処理中のその温度を制御するために、温度調節装置が提供され、チャンバー内の内容物に加熱または冷却を与える熱伝導性マトリックス(所望により、内部磁化可能であり得るもの)が各分離チャンバー内に提供される。このようにして、処理中の分離チャンバー内の液相の温度をモニターし、制御し、随意変更することができる。本発明の装置の温度制御範囲は、約-30℃〜約100℃、約4℃〜約65℃、または約12℃〜約42℃である。
【００４８】
図1は、本発明のHGMS機器の一例100を示している。示した例は複数のマイクロカラム200を支えるのに適した分離ユニット302を有するマイクロカラム系のものであるが、本発明が単一カラムの実施形態、ならびに単一カラム系および複数カラム系(例えば、図1および3A-12に示すような加熱MicroMACS(商標)と適合する4分離チャンバーの実施形態; または96マルチウェルプラットフォーマットと適合する8、12または96分離チャンバーを有する射出成形品)に適用でき、大型カラムを使用してもよいことに留意される。また、上記のように、本発明は分離カラムの形態以外の、例えば、投入はなされるが、フロースルー型の場合のような排出がなされないカップ状チャンバーなどに構成された1以上の分離チャンバーを採用する機器に適用できる。さらに、本発明は自動化された機器に適用できる。
【００４９】
図1に示す各マイクロカラム200は、以下に示す生体分子種の少量のサンプルの処理を最適にするよう構成されている。マイクロカラム200は、最適な流速を維持しながら、空隙容量を実質的に少なくしており、高勾配磁場での、特異的な生物学的／化学的相互作用によって磁気結合した生体分子の、他の分子または細胞からの分離、および少量の生体分子の溶出に向けて設計されている。
【００５０】
図2に関し、マトリックス210がカラム200の分離チャンバー内に準備されており、この例では、大直径部分210aと大直径部分の下方に小直径部分210bを有している。この形状のカラムについては、その全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、2000年4月20日出願の「磁性微量分離カラムおよびその使用方法（Magnetic Micro Separation Column and Method of Using It）」と題する、同一出願人による同時係属出願番号09/556,179にてかなり詳細に記載されている。マトリックス210は、ボール、粒子、スチールウール、または所望の間隙率を有するその他の統合された三次元メッシュなどの強磁性材料220を含む。強磁性材料は、ラッカーなどのようなコーティング剤でコーティングして、マトリックス中のボールまたは粒子の相対的な配置を維持する。また、メッシュまたはフリットをコーティング剤とともにまたはその代わりに用いて、相対的な配置を維持してもよい。ボールまたは粒子は約100ミクロンより大きく、または約200ミクロンより大きく、かつ約1000ミクロンより小さい大きさである。
【００５１】
マイクロカラムは、親水性プラスチックから製造して、または、例えば、ポリビニルピロリドンなどの親水性材料で内面コーティングして親水性にしてもよい。コーティング剤は、用いれば、マトリックスの物質の溶液への放出が防げ、かつ／または、所望により、分離または修飾工程の実施に有用であるコーティング剤自体から物質を放出させるよう設計し得る。好ましくは、用いるコーティング剤が生体分子の非特異的な結合に対して不活性である。所望により、これが特定の生体分子の結合に対して特異的であってもよい。例えば、酵素などの修飾剤を除去するために、抗原特異的な抗体またはリガンドをマトリックスに含めることができる。限定されない一例として、修飾酵素が修飾反応の生成物とともに溶出しないように、マトリックスに修飾酵素に対して特異的な抗体を含めてもよい。別の方法として、洗浄バッファーを親水性の低いカラムに用いてもよい。マイクロカラムに注ぎ込むバッファーはまた、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの界面活性剤を含んでいてもよい。
【００５２】
各カラムは、所望により、処理中に分離チャンバーを閉鎖系にするための注入口部封止装置230および流出口部封止装置240を有していてもよい。このような閉鎖系を提供することで、例えば、高温でのインキュベーション工程間の分離チャンバー内の液体の蒸発をさせないか、またはかなり減少させる。注入口部封止装置230 は使い捨ての栓または再使用可能な栓であってよい。注入口部封止装置230はインキュベーション中のみ挿入され、例えば、洗浄、溶出などのような他のあらゆる工程段階中には外される封止部分であってよい。注入口部封止装置は、球形、円錐または円筒型部分または封止部分を外したときには定位置にあり、注入口を完全には封止するものではないが蒸発を減少させる役割を果たす1以上のフィルターまたはメッシュに加えて、今述べた封止部分を含んでいてよい。さらに別の方法として、注入口部封止装置は分離チャンバーの注入口の所定の位置に永久的にあってよく、1以上のフィルター、メッシュ、小球／粒子(例えば、ガラス球)、そこを通り抜ける1以上の小さな穴の開いたカバー、ニードルを通して液体を分離チャンバーに加える際にニードルで突き刺すことが可能なメンブランなどを含んでなってよい。使い捨ての注入口部封止装置230はステンレス鋼などの金属またはプラスチックの栓234からなってよく、好ましくは射出成形熱可塑性物質であり、後にこれには、例えば、パラフィルム、シリコーンゴム、エラストマーまたはサーモプラスト製の封止チップ232が提供される。別の例では、使い捨ての注入口部封止装置230は、射出成形熱可塑性の栓234を、好ましくは射出成形熱可塑性の栓234と同じ材料のものであり、または二成分成形法にて栓234とともに射出成形した、シリコーンゴム、エラストマーまたはサーモプラストでできた統合された封止チップ232とともに含む。
【００５３】
再使用可能な注入口部封止装置230は、例えば、清浄液および／または滅菌工程に耐え得、その後もなお正しく機能する性質を有するパラフィルム、シリコーンゴム、エラストマーまたはサーモプラストの封止チップ232が提供されたステンレス鋼などの金属またはプラスチックの栓234として形成され得る。あるいは、上記のような再使用可能な栓234に、例えば、その都度使用前に取り替えられるパラフィルム、シリコーンゴム、エラストマーまたはサーモプラストの使い捨てのカバーが提供されていてもよい。
【００５４】
さらに、注入口部封止装置230は、鉱油などの好適なオイル、または沸点が水より高いその他の液体であってよく、生体適合性を有する流体カバー(例えば、グリセリン、オイル、アルカン、その混合物など)であってよく、例えば、蒸発をかなり減少させるか、または蒸発させないように機能するが、同時にそこを通る液体の添加を可能にするものである。添加する液体の濃度に応じて、流体カバーを添加する液体の上部に「浮かばせて」もよいし、またはカラムを通過させてもよい。所望により、流出口部封止装置240もまた、使い捨てのものまたは再使用可能なものであってよい。使い捨ての流出口部封止装置および再使用可能な流出口部封止装置はいずれも、一末端が閉鎖しているゴムスリーブ、一末端が閉鎖しており、その閉鎖している末端がカラムの流出口として貫通しており、インキュベーション工程中、流出口を封止するためにカラムの末端をスライドさせることが可能であるゴムスリーブ、シリコーンゴムキャップ、および弾性シート(例えば、パラフィルム)、カップ状の栓などとして作製してよい。流出口部封止装置240の作製に好適な材料としては、ゴム、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、処理を施す材料に対して不活性であるその他のポリマー、射出成形フォーム、ステンレス鋼、その他の相対的に不活性であり、かつ生体適合性を有する金属、前記金属のシートまたはホイル、グリセリンまたはその他の生体適合性を有するオイルなどで構成される流体カバーが挙げられる。流出口部封止装置240は、流出口を封止するためだけでなく、さらにカラムの流出口が誤って破損しないよう保護する役割を果たし得る。
【００５５】
高勾配磁場はマトリックス210内でそれを磁場に置くと起こる。そのため、カラム200を分離ユニット302内に配置すると、マトリックス210の反対側にある磁石が磁場を提供し、マトリックス210内に高勾配磁場を起こす。それを磁場から外すと、マトリックス210は直ちに消磁する。磁場に存在すれば、マトリックス210の磁化粒子は、カラム200に投入された、変化する粘度の溶液または反応混合物からそれらと結合する超常磁性マイクロビーズおよび材料(すなわち、「生体分子」)だけを保持し、そうすることで、目的の生体分子を固定化する。いったん固定化すれば、生体分子のさらなる処理がin situにて分離チャンバー内で行うことができる。処理(または少なくとも1つの処理段階)が完了すれば、磁場のマトリックス210への印加の強さを下げるか、または印加を全くやめて、固定化された生体分子を放出させることができ、その結果として、超常磁性マイクロビーズがマトリックス210から放出される。
【００５６】
図3Aに関し、加熱機能を有するHGMS機器300の部分断面図を示している。分離ユニット302はユニットの基本的な枠組みをなし、磁場を集中させるヨーク310を含む。ヨークは、カラムを受ける各領域にノッチ312を含むよう形状が決められている。各ノッチ312には、磁石の磁場を集中させる場所でありHGMS手順を行う際にマイクロカラム200を受ける場所である狭い(narrower)ギャップ316を形成するよう磁石対314が取り付けられる。
【００５７】
分離ユニット302の鉄スタンドなどの強磁性装置への接着または取付けを容易にするために、ヨーク310の裏面に2つの磁石318を取り付けてもよい。当然のことながら、異なる数の磁石318を用いてもよい。さらに、またはその代わりに、クランプ、スクリュー、ボルト、接着剤などのようなその他の取付け手段をユニットを取り付けるのに用いることができる。
【００５８】
この実施形態では、発熱体は、処理の際に配置されるカラム200を、少なくとも一部を囲む、所望により、完全に囲み込むように各ギャップ316に与えられ、それに熱を与える加熱フィルム332を含む。各加熱フィルム332は図3Bにてよくわかるように、熱伝導体338と熱的に(例えば、接着によって)連結されている。各熱伝導体338は、アルミニウムまたは優れた熱伝導特性を有するその他の金属などの金属の薄板であってよい。熱伝導体は加熱フィルム332によって与えられる熱を伝え、カラム200の周囲に均等に熱を加える役割もする。
【００５９】
加熱だけを必要とする実施形態では、発熱体332が所望の温度範囲を達成させるために特別に設計された電気抵抗を有する加熱フィルムであってよい。加熱フィルムの例としては、カプトン絶縁材体、シリコーンゴム絶縁材、マイラー絶縁材(LCD加熱に用いられる)を含む透明な加熱フィルムなどが挙げられる。軟質フィルムは前記の材料のうちの1つで作製され、例えば、抵抗回路を形成するためにフィルムに蛇行金属フィルム回路をかぶせる。発熱体332の有効加熱面積は典型的には約0.3〜36cm2の範囲内であり、電気抵抗が典型的には約5.5〜360オームの範囲内である。このタイプの加熱装置は、それがほとんど場所を取らず、抵抗および可能加熱範囲に関しては顧客の設計書に容易に合わせられ、要する電力が相対的に低いことにおいて有利である。このような発熱体の特別な例は、Telemeter Electronic GmbH, 86609 Donauworth, Germany製造品、モデル HK-913-H, Art.-No.33/584, Spec: 15Ω, 15x48mm, 1.4cm2有効加熱面積である。
【００６０】
発熱体332は熱伝導性素子338と熱的に連結され、これが順に磁石314と熱的に連結され、さらにカラムが分離ユニット302内に取り付けられるとカラム200とも連結される。熱伝導性素子は銅、(陽極酸化)アルミニウム、ステンレス鋼または十分な熱伝導特性を有するその他の金属などの熱伝達係数の高い材料で作製されていてよく、それらがカラムと整合する場所でカラムと密着するような形状である。
【００６１】
磁石が約100℃より高い温度に達すると磁場が起こりにくくなる傾向があるため、所望により、磁石314の過度の加熱を防ぐように磁石314と発熱体332との間に絶縁層317を提供してもよい。絶縁層は多孔質ポリマーまたは磁石314の過熱を有効に防ぐその他の材料で作製されていてよい。発熱体332と直接整合させる磁石の少なくとも表面を被覆し、さらに所望により、磁石314の全表面を絶縁層317で被覆してもよい。この態様は図3Aおよび3Bにしか示していないが、これはこれらの図に示した実施形態に限定されるものではなく、本明細書に記載のその他の実施形態および特許請求の範囲の適用を受けるものに等しく適用し得る。
【００６２】
電子制御ボード334はユニット302内にまたは外部ユニットとして提供され、各発熱／冷却体または熱／冷却源332と必要な熱量を発生させ、温度、ならびに発熱速度を制御するのに十分な電力を供給することが可能であり、制御ボード334に適切な電力が供給されるよう調整する外部電源330と電気的に連結される。電子制御ボード334によって、電力レベルをさらに高めたり、または下げたりし得る。典型的な電源はSchuricht GmbH & Co. KG, Bremen, Germanyから入手可能な、40W, 100-250V AC入力, 12V出力を特徴とするモデル SSL40-7612 12C/3Aである。電源330をユニット302と連結している電源コード342は、オス型およびメス型部材を有する数多くの周知のジャックカプラーのいずれかによって、電子制御ボード334へとつながる電源コード344と開放可能なように連結され得る。加熱フィルム332は各々の電気導体346によって独立に電子ボード334と連結され、制御ボード334による各供給源332に対する独立した温度制御が可能になっている。
【００６３】
例えば、熱電対などのフィードバックセンサー348が、例えば、少なくとも1つの発熱体上に、各発熱体332上のものと同数に、熱伝導性素子338とのインターフェースにまたはカラムと接触させる熱伝導性素子の表面上に提供され、各熱電対によって測定された温度を表すシグナルをフィードバックするよう制御ボード334と電気的に連結されていてよい。制御ボード334は、熱電対からの入力を受け入れ、それらを温度測定値に変換する温度制御ユニット／調節器または温度低減器(例えば、マイクロプロセッサ、バイメタルリレー)を含み、その温度をオペレーターが制御ボードに手入力した、またはプログラム化された温度設定と比較し、各々の供給源の加熱、冷却または静止が必要かどうかを決定する。電源330から入力される電力量を制御することによって適切な処理がなされる。以下に記載する処理の種々の工程およびサイクルで各熱／冷却源の温度を自動制御するためにプログラムルーチンを制御ボードに保存してもよい。
【００６４】
ユニットは、適正な位置にカラムを保持し、ユニット302の内部コンポーネントを保護し、さらに、ユニットを見た目に魅力的にし、洗浄／滅菌を容易にする壊れにくい(non-fragile)カバーリングまたはハウジング320に完全に入れられる。カバーリング320は、例えば、ポリウレタン樹脂などの樹脂、射出成形熱可塑性物質、アルミニウム／ステンレス鋼ミルドなどの独立気泡、プラスチックハードフォームカバーであってよい。
【００６５】
図4Aは、図3Aとは少し配置の異なった加熱フィルム332'を有する分離ユニット302'を使用する機器300'の変形を示す。この例では、1枚の大面積の加熱フィルム332'が、各熱伝導体338と熱的に連結された大面積の金属板333と熱的に(例えば、接着によって)連結されている(図4Bを参照)。このように、1つのインプット346は加熱フィルム332と連結され、このことによって、それに電力が供給され、これが後に加熱フィルム332'によって熱に変換され、1つの制御スキーム下で全ての熱伝導体338に均等に分配される。熱電対などの1以上のフィードバックセンサーは、図3Aの例に関する以上の記載のように、金属板333と熱的に連結され、制御ボード334と電気的に連結されていてもよい。
【００６６】
図4Aの例の変形として、1枚の大面積の加熱フィルム332'が、各熱伝導体338と熱的に連結された大面積の金属板333と熱的に(例えば、接着によって)連結されている(図4Bを参照)。加熱フィルム332'はまた、温度制御ユニットまたは温度センサーを入れずに、電源ケーブル342および344によって直接電源330と連結されていてもよい。この簡略化した配置では、熱伝導体338の温度は電源330の出力を調整することによって調整され、加熱フィルム332'の抵抗の関数である。
【００６７】
使用し得る別のタイプの発熱体は、図5Aに示される電気抵抗式発熱体432である。この例では、機器400に電気抵抗式加熱を採用する分離ユニット402が提供されている。電気抵抗素子432は、熱伝導体438と熱的に連結され、電子制御ボード334を介して電源330と電気的に連結されている。電気抵抗素子432および熱伝導体438には、カラム200を受け入れるための各ギャップ316が与えられている。このタイプの加熱装置は、一般に、上記の加熱フィルム素子よりも動力が大きく、より高い温度範囲が必要とされる状況で、または加熱応答時間が早いほど有利である状況で用いることができる。一般に、金属プロフィール冷却用放熱シンクに取り付けるよう設計されたハウジングの抵抗は、抵抗により生じた熱が抵抗ハウジングを定義された平面から放たれるように、この場合においては、電気抵抗素子としての役割を果たす。さらに具体的に言えば、この実施形態に用いる電力素子は、RS Components GmbH, Morfelden-Walldorf, Germany: Vishay-Sfemice, TO-220 ハウジングにて20W 抵抗、0.1Ω〜10kΩ 抵抗、または金属プロフィール冷却用放熱シンクへの取付けに好適なアルミニウムハウジングに組み込まれるArcol、10、15、25、50、100、150、200、300または600Wタイプ、22オーム〜50kオーム抵抗; またはセラミックハウジング抵抗 1オーム〜10kオームの場合、4、7、11または17Wタイプから得られる。1以上の熱電対などの1以上のフィードバックセンサーは、図3Aに関する記載と同様に、金属板333と熱的に連結され、制御ボード334と電気的に連結されていてもよい。
【００６８】
図5Bは、図5Aの実施形態に用いられる熱伝導体438の独立した上面図である。熱伝導体438は、鋳造金属または陽極酸化金属または優れた熱伝導特性を有するその他の金属(例えば、アルミニウム、ステンレス鋼、銅など)で作製されていてよい。電気抵抗素子432を受け入れるよう形状が決められている内腔440またはその他の開口部は、(図5Cの側面図の透視図に示すように)各熱伝導体438を貫いて提供される。さらに、電気抵抗素子が開口部440内に挿入され、例えば、接着によって(例えば、Electrolube, Berkshire, EnglandのTBS熱接着系)、熱伝導体と熱的に連結される。
【００６９】
上記の例は全て、処理中、in situにてカラムの内容物が加熱されるように加熱機能をカラムに提供するための配置として記載してきた。しかしながら、上記の配置はいずれも、以下の記載にてより明らかとなるように、in situにて得られた機器に冷却、ならびに加熱機能を与える冷却配置と連結されていてもよい。
【００７０】
熱電気ペルティエ効果は、熱を大量供給するのに電気を利用する最も直接的な方法である。ペルティエ素子は発熱／冷却体532として使用し得、加熱および冷却機能の両方を提供する。電流によってペルティエ素子の片側を高エネルギー状態に近づけると、そこで熱が吸収されるため、この方の側付近に冷却効果がもたらされる。ペルティエ素子のもう一方の側を低エネルギー状態に向かわせると、そこで熱が放出され、そのことによってその付近に加熱効果がもたらされる。電流を逆に流すと各々の側にその相反する効果がもたらされるため、カラムまたは磁石に面する側を利用して、カラムを加熱するまたはそれを冷却することができる。
【００７１】
図6Aに示す例では、外部調節ユニット500には、図1に関して示され、以上に記載した機器100などの標準HGMS機器に使用可能であるものが提供される。外部調節ユニット500は、熱伝導性素子内に取り付けられたペルティエ素子532を含み、このペルティエ素子532は外部調節ユニット500が分離ユニット300と整合している際にペルティエ素子532が各カラム200と一直線になるよう一定の間隔があけられている。熱伝導性素子は、例えば、アルミニウム、または優れた熱伝導特性を有するその他の金属で作製されていてもよい。熱伝導性素子530のフロントおよびバック各々、534および536はサイド537によって一体化され、ペルティエ素子532を完全に囲み込み、熱伝導性素子全体にわたり効率的な熱伝達を可能にする。フロント534、バック536およびサイド537は、必ずしも必要ではないが、全てが同じ材料、通常、アルミニウムで作製されることが好ましい。
【００７２】
熱伝導性素子530のフロント534、すなわち、分離ユニット300と整合させる部分には、分離ユニット300のギャップ316内にはめ込むのに必要な大きさで、一定の間隔があけられた熱伝導性フィンガー538が提供される。各フィンガーの末端には、カラムとフィンガー間の優れた熱伝達を確立するためにカラム200の周囲の一部と接触し、それと密着させるのに適した凹面538aが与えられている。各フィンガー538の幅はギャップ317の幅と実質的に同じであるか、または最小ではギャップ317の幅より小さく、その結果、フィンガーがカラムが挿入された後に残るギャップの余剰部分を実質的に埋める。最良の結果を出すには、フィンガーの高さがマトリックスおよびカラム200内で処理する材料の高さと少なくとも同等であるべきである。フィンガー538の長さは末端538aとカラム200との接触を可能にする長さが好ましく、その結果として、熱伝導性素子530のフロント534を分離ユニット300と接近させた状態に配置する。熱伝導性素子530と分離ユニット300との間に生じたギャップによって二成分間での多くの熱損失が見込まれるため、長いフィンガーを用いるほど、それらの効率が下がる。短いフィンガーではフィンガーの末端とカラムとの接触が起こらないため、満足の得られるような機能は望めない。
【００７３】
冷却用放熱／冷却シンク550は熱伝導性素子と熱的に連結され、(カラム200の冷却中)熱の放散を助け、または(カラム200の加熱中)熱を集めてペルティエ素子532に熱を伝える。冷却用放熱／冷却シンクは、例えば、陽極酸化アルミニウム、ステンレス鋼、不動態化銅(クロム／ニッケルめっき)などの優れた熱伝導性の金属で作製されていてもよく、冷却用放熱シンクの製造におけるスキルを有するものであれば知っているように、厚さ比に対して大表面積を有するように形成すべきである。示した例では、冷却用放熱／冷却シンクが大型チャンネル構造をなしており、その間に相対的に薄い壁体552と大きな空隙554が形成されている。所望により、熱放散を向上させるために空隙554を通る空気の流れを強めるよう、送風機556を提供してもよい。1以上の送風機を用いてよく、冷却用放熱シンク(示される)内、またはその端に置いてもよい。送風機への電力供給は、ペルティエ素子532に電力を供給する同じ電源にて行ってもよいし、または別の電源、ACまたはDCにて行ってもよい。示した例では、オプションの送風機556がアルミニウムなどの優れた熱伝導性の金属からなる支柱に取り付けられている。
【００７４】
冷却用放熱／冷却シンクはまた、所望により、その利用可能な表面積を増大させるためにフィン(fin)(図には示さず)を設けて作製してもよい。冷却用放熱シンクには、熱エネルギーを加えていないときの磁石を冷却するための応答時間を長くするために、以上に記載したその他の加熱例を提供してもよい。
【００７５】
ペルティエ素子532は、電源を外部調節ユニット500と連結する電源コード342'によって、およびペルティエ素子532を相互に連結させる電気導体346'によって電源330(図には示されていない、上記のものと同じであってよい)と電気的に連結されている。1以上の熱電対などの1以上のフィードバックセンサーは、以上の図3Aに関する記載と同様に、フィンガー538と熱的に連結され、制御ボード(図には示されていない)と電気的に連結されていてもよい。
【００７６】
図7Aに示す機器600の分離ユニット602の場合と同様に、分離ユニット内部にペルティエ素子532を提供してもよい。この構成では、電力線(図には示さず)が上記実施形態に記載されるような外部電源を構成し、ペルティエ素子532各々と電気的に連結されている。独立したペルティエ素子がカラム200を受け入れる各ギャップの裏側に取り付けられる。例えば、アルミニウムなどの熱伝導体638は、各ペルティエ素子と熱的に連結され、カラム200および磁石314と接触し、それと整合するよう構成されている。冷却用放熱／冷却シンク650は、熱伝導体638が熱的に連結される反対の側で各ペルティエ素子532と熱的に連結され、さらに熱放散を助けるようヨーク310と熱的に連結されていてもよい。あるいは、ヨーク310がそれに対して冷却用放熱／冷却シンクとしての役割を果たすよう直接各ペルティエ素子532と熱的に連結されていてもよい。所望により、その機器の熱を放散させる機能を高めるために、いずれかの配置を、ヨークを金属スタンドまたはその他の強磁性器材(図には示されていない)と熱的に連結させるようにさらに改変してもよい。1以上のフィードバックセンサーを提供し、上記の実施形態に関して以上に記載したように連結して、温度を制御するのに用いるフィードバックループを提供してもよい。
【００７７】
図8A-8Bは、図7A-7Bに示すような内部ペルティエ配置の修飾を示し、その違いは冷却用放熱シンクとしての役割を果たすようペルティエ素子をヨーク310と熱的に連結していることに加え、ヨーク310が冷却用放熱／冷却シンク550に関する上記の特性を与えて構成されている外部冷却用放熱／冷却シンク650'とさらに熱的に連結されることにある。また、冷却用放熱／冷却シンクには、所望により、熱放散機能を高めるために1以上の送風機556を提供してもよい。分離602'のハウジング620は、開口部が、直接熱接触および冷却用放熱／冷却シンク650'のヨーク310への取付けを可能にするよう、その後部に設けられていることを除いて、本質的には以上に記載したハウジング320と同じである。所望により、冷却用放熱／冷却シンク650'および／またはヨークは、その機器の熱を放散させる機能を高めるために、機器を支える金属スタンド(図には示されていない)またはその他の強磁性材料(示されていない)とさらに熱的に連結されてもよい。
【００７８】
図9Aでは、空気加熱および冷却を含むHGMS機器700の部分断面図を示す。気送管742は、当技術分野では公知の数多くの空気コネクターのいずれであってもよいエアチャックを介して加熱／冷却ユニット730を分離ユニット702と連結する。空気配管系統744は、実質的に分離ユニット702の長さにわたり、気送管742を空気配管系統746と連結する。配管系統746は供給空気を分離ユニット702内に取り付けられた各々の分離カラム200に供給する。配管系統746は、図9Bの断面図に示されるように、分離ユニット702内の所定の位置にある場合、マトリックス210の位置にてカラム200と接するかまたは極めて近づく。水配管系統748は、所望により、ヨーク310および分離ユニット702全体を加熱または冷却するよう、一般には、配管系統が温度制御されたエアーをカラム200に供給するため、配管系統746の熱損失または取得を最小限にするよう、およびカラム200内で実施されている処理の温度制御を安定させるため、機器全体をより一定の温度にするよう、ヨーク310を通るように据え付けてよい。
【００７９】
分離ユニット702の外部に配置される圧縮機732は、例えば、ペルティエ加熱／冷却ユニットであってよい加熱／冷却ユニット730に供給される圧縮空気を生み出す。使用する場合、オプションの水配管系統748を通る水は、水を加熱／冷却ユニット730に通すことによって加熱または冷却してもよく、水路752が水を加熱／冷却ユニット730から配管系統748へと送り込み、配管系統754が水を配管系統748から循環を推進するのに用いられるポンプ756へと再循環させる。また、水路は、その中の水の温度を制御するよう個々の熱交換器を通して水を送り出す。個々の熱交換器は、ペルティエタイプか、または圧縮系、あるいはその他の公知の熱交換設計であってよい。また、水以外の公知の冷却／加熱液をこのオプションの系に通してもよい。制御器734は、加熱／冷却ユニットを、入力された圧縮空気を加熱するのかまたは冷却するのかどうかについて制御し、さらに圧縮空気が加熱／冷却ユニット730から出力される温度を制御するよう、手動で設定してもよいし、または自動プログラム化されていてもよい。サーモスタット制御の出力バルブ(示されていない)を加熱／冷却ユニットの出力側に取り付け、空気が所定の温度に達するまで空気流が加熱／冷却ユニットから抜け出ないようにする。例えば、RS components, Morfelden-Walldorf, Germanyから入手可能な1/8" 24V DCバルブを用いればよい。制御器734は、サーモスタット制御のバルブが開放される温度を調整し、さらに、水／液体-加熱／冷却管およびポンプ756の温度を制御するよう構成されている。さらに、カラムの場所の温度をより正確に制御するために1以上の熱電対またはその他のフィードバック機構を提供してもよい。
【００８０】
図9Aおよび9Bは、カラム200の空気加熱／冷却のために配管系統を内部に組み込んだHGMS機器の一例を示しているが、代わりに外部配置を提供してもよい。このような外部配置は、上記の図6Aに関して記載されるような熱伝導性素子を使用する。しかしながら、この例は、熱伝導性素子にペルティエ素子を使用するよりも、熱伝導性素子を通る空気配管系統を含み、外部熱伝導性素子を分離ユニットと整合させる場合、フィンガーを通り抜けて正面からカラム200と接するかまたは近づく。
【００８１】
図10では、HGMS機器800は、油圧加熱／冷却配置を採用している。油圧管路842は、当技術分野では公知の数多くの油圧コネクターのいずれであってもよい油圧コネクターを介して加熱／冷却ユニット830を分離ユニット802と連結する。油圧配管系統844は、実質的に分離ユニット802の長さにわたり、油圧管路842を油圧配管系統846と連結する。配管系統846は、温度制御された液体を分離ユニット702内に取り付けられた各々の分離カラム200に送り込む。配管系統846は、分離ユニット802内の所定の位置にある場合、マトリックス210の位置にてカラム200と接するかまたは極めて近づく。また、配管系統846は、カラムと隣接した、例えば、アルミニウムまたは銅などの優れた熱伝導性の材料で作製され、そこを通る液体の流れに対し構成される、まさにラジエーターのような薄いフィン(図には示さず)の配置を含んでもよい。いずれの構成においても、温度制御された液体がカラム200のそばを通って循環し、その際、必要に応じて、カラムが温められまたは冷却される。循環する液体は、分離ユニット802から液体を送り出す帰り油圧配管系統848に戻され、帰り油圧管路852によって貯蔵器832に戻る。
【００８２】
貯蔵器832は、記載のように、例えば、ペルティエ加熱／冷却ユニットであってよい熱交換器830への圧媒液の循環、および分離ユニット802を通る循環を推進するポンプを含む。制御器834は示すように外部に提供してもよいし、または以上に記載した制御ボードと同様に、ユニット800の内部に提供してもよい。制御器834は、液体温度およびそれが機器を通って送り出される速度を調節することによって、加熱／冷却ユニットおよびポンプを制御し、最終的に分離カラムの温度を制御するよう、手動で設定してもよいし、または自動プログラム化されていてもよい。制御器834は、各熱電対によって測定された温度を表す、上記の熱電対と同様にカラムの場所に配置されたフィードバックセンサー(示されていない)からの入力を受け入れる。制御器834は、フィードバックセンサーからの入力を温度測定値に変換するマイクロプロセッサを含み、その温度測定値をオペレーターが制御器に手入力した、またはプログラム化された温度設定と比較し、各々の供給源の冷却、加熱または静止が必要かどうかを決定する。
【００８３】
図10に示す例は、全てのカラムを同時に加熱、冷却、または静止状態に維持するバッチ処理機構であるが、加熱、冷却および静止に対する独立した制御にて各カラムへの独立したフィードバックループを形成することは当業者のスキルの範囲内である。
【００８４】
一般に、熱／冷却源および熱電対が各々のカラムに提供される配置では、図3Aおよび5A-10Aに示され、記載した例の場合のように各カラムの温度は独立に制御され、調節され得る。このような制御は、カラム温度のより正確な調整を与えるのに(例えば、極めて正確に制御するバッチ処理の場合)、または異なるカラムを同時に異なる温度に曝すのに(例えば、同じ系に維持された種々のカラムが異なる温度プロフィールである)使用することが有利である。
【００８５】
制御するカラムに隣接する位置に入るまたは出る管路の電気制御の絞りバルブ(図には示さず)または同等の流量調整機構を制御して、1以上の配管系統／発熱体846を通って循環する加熱／冷却液の流量を変えることによって適切な処理がなされる。さらに、制御器834は、加熱から冷却への変更、または逆の場合の変更が必要であることが決定されると、配管系統／発熱体846を通る流れのサイクルを逆にするよう構成されている。以下に記載する処理の種々の加熱／冷却工程およびサイクルで配管系統／発熱体846の温度を自動制御するためにプログラムルーチンを制御器834(または場合によっては、制御ボード)に保存してもよい。
【００８６】
図10は、カラム200の油圧加熱／冷却のために配管系統を内部に組み込んだHGMS機器の一例を示しているが、代わりに外部配置を提供してもよい。このような外部配置は、上記の図6Aに関して記載されるような熱伝導性素子を使用する。しかしながら、この例は、熱伝導性素子にペルティエ素子を使用するよりも、熱伝導性素子を通る油圧配管系統を含み、外部熱伝導性素子を分離ユニットと整合させる場合、フィンガーを通って循環して正面からカラム200と接するかまたは近づく。帰り管路は、図10の内部配置に関する上述の記載と同様の様式で、フィンガーから圧媒液の流れを、外部ユニットからポンプへと再循環させる。標準ダイレクト・トゥー・リキッド(Direct-to-Liquid)加熱／冷却素子は、例えば、Telemeter Electronic GmbH, Donauwoerth, Germanyから入手可能である(例えば、DL-046-12-00, 37W 入力)。
【００８７】
さらに、内部実施形態および外部実施形態の両方が、各ステーション／カラムが独立に加熱／冷却制御されるよう、各スロット316への独立した油圧管路を与えて構成される。いずれの配置においても、水または水性溶液が、現在、冷却液として好ましいものであるが、クロロフルオロカーボンなどのその他の液体、または熱伝達に用いるその他の公知の液体を用いてもよい。
【００８８】
図11は分離ユニット902内のカラム200を加熱するための配置のもう1つの例である。この配置では、例えば、赤外線LED(発光ダイオード、例えば、TO39 GaAlAs, タイプOD50L, RS Components, Morfelden-Walldorf, Germanyがある)などの輻射タイプの放射素子932が、カラムが分離ユニット902内に位置するときに、マトリックス210付近の分離カラム200と接するかまたは近づくように、分離カラム200を受け入れる分離ユニット内の各位置またはギャップ316に提供されている。各放射素子932は、図11に示すように、各カラムホルダー938に、各々のカラム200の裏面とぴったりと整合するように取り付けられていてもよい。例えば、カラムホルダー938には、カラム200とぴったり合うように適合した凹面の円筒型の末端が提供されている。このように、エミッター932からの輻射がカラムに直接与えられる。
【００８９】
電子制御ボード934はユニット902内に提供され、放射素子または放射源932各々および以上の図3Aに関して記載された例に用いられるタイプのものであってよい外部電源930と電気的に連結される。
【００９０】
電源930をユニット902と連結している電源コード342は、オス型およびメス型部材を有する数多くの周知のジャックカプラーのいずれかによって、電子制御ボード934へとつながる電源コード344と開放可能なように連結され得る。エミッター932は各々の電気導体346によって独立に電子ボード934と連結され、制御ボード934による各供給源332に対する独立した温度制御が可能になっている。
【００９１】
例えば、赤外線検出器または熱電対などのフィードバックセンサー948が、例えば、カラム200と接触させるカラムホルダー素子938の表面上の各放射素子932の近くに提供され、各フィードバックセンサー948によって測定された温度を表すシグナルをフィードバックするよう制御ボード934と電気的に連結されていてよい。制御ボード934は、熱電対からの入力を受け入れ、それらを温度測定値に変換するマイクロプロセッサを含み、その温度をオペレーターが制御ボードに手入力した、またはプログラム化された温度設定と比較し、各々の供給源の加熱、冷却または静止が必要かどうかを決定する。電源930から入力される電力量を制御することによって適切な処理がなされる。以下に記載する処理の種々の工程およびサイクルで各熱／冷却源の温度を自動制御するためにプログラムルーチンを制御ボードに保存してもよい。
【００９２】
図11は、エミッターおよび制御ボードを内部に組み込んだHGMS機器の一例を示しているが、代わりに外部配置を提供してもよい。このような外部配置は、上記の図6Aに関して記載されるような熱伝導性素子を使用する。しかしながら、この例は、熱伝導性素子にペルティエ素子を使用するよりも、熱伝導性素子のフィンガーの末端に放射素子932を含み、外部熱伝導性素子を分離ユニットと整合させる場合、正面からカラム200と接するかまたは近づく。
【００９３】
熱源は赤外線LEDまたは赤外線加熱ランプ(例えば、RS Components, Morfelden-Walldorf, Germanyの100W Philips)であってよい。外部配置では、LEDまたは加熱ランプは全てのカラムに対して1つの光源、または各カラムに与えられており、それと整合する各フィンガーに組み込まれた各光源で(スロット、鏡、ガラスファイバー光導体などにより)カラム200に集めることができる。
【００９４】
制御ボード934は、外部配置に組み込まれていてもよいし、または別の位置からそれと電気的に連結されていてよい。1以上の赤外線検出器または熱電対などのフィードバック機構もまた、フィンガーに組み込まれていてもよい。
【００９５】
分離ユニット1002内のカラム200を加熱するためのさらにもう1つの配置が図12に示されており、その配置では巻線のスプール1032が分離ユニットのスロット316に取り付けられている。各スプール1032は実質的に環状であり、そこにカラム200を受け入れるのに必要な大きさの中央開口部1034を有している。各スプール1032は、示される電気接続管路342、344および346を介して電源1030と電気的に連結される。電源1030は、スプール1032に交流を印加するよう構成されている。カラム200をスプール内に置き、交流を印加すると、スプールのワイヤーを通る交流によってマトリックス210の導電性部材(例えば、鉄球)に熱が誘導される。
【００９６】
図12は、スプール1032を内部に組み込んだHGMS機器の一例を示しているが、代わりに外部配置を提供してもよい。このような外部配置は、上記のその他の外部実施形態のような構造特性を有する、外部熱伝導性素子のフィンガーにスプール1032を使用する。フィンガーは、スロット316に挿入されると、図12の実施形態に関して以上に記載したのと同じ様式で、カラム200を受け入れるよう配置する。
【００９７】
生体分子を修飾する方法
本発明は、本発明の磁気分離装置および／または機器などの磁気分離装置を用いて磁気によって固定化した生体分子を修飾する方法を提供する。本方法は、一般に、生体分子を本発明の装置および／または機器に固定化すること、および固定化された生体分子を修飾することを含む。いくつかの実施形態では、磁気分離装置にかける前に生体分子を磁性標識する。その他の実施形態では、磁性標識した第2のメンバーとの結合によって生体分子がカラム上に固定化されるように、生体分子を磁気標識した第2のメンバーと結合させる。
【００９８】
多くの実施形態では、1以上の修飾工程が温度制御された条件下で行われる。温度制御された条件は、一般に、本発明の装置および／または機器の温度を調整することによって達成される。いくつかの実施形態では、本方法が反応生成物を固定化された生体分子と分離する工程をさらに含む。その他の実施形態では、本方法が修飾された生体分子をカラムから溶出する工程をさらに含む。さらに別の実施形態では、本方法が2つ以上の修飾工程の実施を含む。全ての実施形態において、1以上の中間溶出および／または洗浄工程および／または不活性化工程などのさらなる工程を含んでもよい。よって、本発明はさらに、修飾された生体分子を単離する方法であって、本明細書に記載のように生体分子を修飾すること、および修飾された生体分子を単離することを含む方法を提供する。
【００９９】
さらに、重要な数多くの実施形態では、選ばれた生体分子の修飾によって少なくとも1種の第2の生体分子が生じる。これらの実施形態のいくつかにおいては、第2の生体分子が修飾された生体分子、例えば、磁気によって固定化した第1の生体分子の修飾体である。その他の実施形態では、第2の生体分子が新たに合成された生体分子、例えば、第2の生体分子を合成するための情報源として磁気によって固定化した生体分子を用いて新たに合成された生体分子である。いくつかの実施形態では、第2の生体分子を溶出する。その他の実施形態では、第2の生体分子を、分離装置に固定された第2の結合部分によって捕捉する。これらの実施形態のいくつかにおいては、捕捉された第2の生体分子をさらに修飾するか、または修飾せずに精製する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本発明は生体分子を修飾する方法を提供する。本方法は、一般に、a)磁性粒子と結合した生体分子をカラム内の磁化可能なマトリックスに磁場を印加することによって磁気分離装置に固定化すること、およびb)固定化された生体分子を修飾すること(ここで、修飾が修飾に好適な温度で行われる)を含む。修飾に好適な温度は、カラムの温度を、例えば、本発明の装置を用いて調整することによって得られる。これらの実施形態のいくつかにおいては、修飾が少なくとも第1の酵素による酵素的修飾であり、装置が第1の酵素がその最大活性の少なくとも10%を示す第1の温度で第1の期間維持される。いくつかの実施形態では、本方法はc)固定化された生体分子を第2の酵素により修飾する(ここで、装置が第2の酵素がその最大活性の少なくとも10%を示す第2の温度で第2の期間維持される)工程をさらに含む。多くの実施形態では、本方法は修飾された生体分子をカラムから溶出する工程をさらに含む。
【０１０１】
その他の実施形態では、本発明は核酸分子を合成する方法を提供する。本方法は、一般に、磁性粒子と結合した生体分子をカラム内の磁化可能なマトリックスに磁場を印加することによって磁気分離装置に固定化すること(ここで、固定化される生体分子はポリヌクレオチドを含み、磁性粒子はそれと結合された状態の、固定化される生体分子の一部と相補的であり、核酸合成でのプライマーとなるオリゴヌクレオチドを含む)、固定化されたポリヌクレオチドをデオキシヌクレオチドの存在下で核酸分子を合成することができる酵素と接触させること(ここで、装置は酵素がその最大活性の少なくとも10%を示す温度で一定期間維持される)、および 固定化されたポリヌクレオチドを鋳型として用いて核酸分子を合成することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのデオキシヌクレオチドが検出可能な標識を含み、合成された核酸分子が少なくとも1つの検出可能なように標識されたデオキシヌクレオチドを含む。
【０１０２】
その他の実施形態では、本発明は核酸分子を合成する方法を提供する。本方法は、一般に、磁性粒子と結合した生体分子をカラム内の磁化可能なマトリックスに磁場を印加することによって磁気分離装置に固定化すること(ここで、固定化される生体分子はポリヌクレオチドを含む)、固定化されたポリヌクレオチドをデオキシヌクレオチドの存在下、第1のオリゴヌクレオチドプライマーおよび核酸分子を合成することができる酵素と接触させること(ここで、装置は酵素がその最大活性の少なくとも10%を示すように一定期間維持される)、および固定化されたポリヌクレオチドを鋳型として用いて核酸分子を合成することを含む。
【０１０３】
その他の実施形態では、本発明は核酸分子を合成する方法を提供する。本方法は、一般に、磁性粒子と結合した生体分子をカラム内の磁化可能なマトリックスに磁場を印加することによって磁気分離装置に固定化すること(ここで、固定化される生体分子はポリ(A)部分を含むポリヌクレオチドを含み、磁性粒子は約6ヌクレオチド〜約30ヌクレオチドのオリゴ-dT分子と結合される)、固定化されたポリヌクレオチドをデオキシヌクレオチドの存在下で核酸分子を合成することができる酵素と接触させること(ここで、装置は酵素がその最大活性の少なくとも10%を示す温度で一定期間維持される）、および固定化されたポリヌクレオチドを鋳型として用いて核酸分子を合成することを含む。
【０１０４】
生体分子
種々の生体分子のうちいずれかのものは、本発明の方法を用いた修飾に好適であり、これらのものとしては、限定されるものではないが、ポリペプチド; ポリヌクレオチド; 脂質; 多糖類; リポ蛋白; 糖タンパク質; ペプチド核酸(PNA); ロックされた(locked)核酸分子(LNA); ならびに上記のものの誘導体および類似体が挙げられる。
【０１０５】
生体分子は、異なるカテゴリーの生体分子(例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖類、および脂質)に属する2種以上の部分を含んでなっていてよく、例えば、生体分子がポリペプチド部分とポリヌクレオチド部分(例えば、ペプチド核酸)とを含んでなっていてよい。さらに、生体分子はその各々が異なる化学種の化合物に属する2種以上の部分を含んでなっていてよい。このような生体分子の例が複合体である。
【０１０６】
核酸分子と非核酸分子との複合体、およびその作製方法は、当技術分野では公知であり、例えば、その各々が、複合体についてのそれらの教示に関する、参照により本明細書に組み入れられるWO 98/16427、WO 98/55495、WO 00/21556に記載されている。核酸複合体に関するさらなる教示は、S.L. Beaucage編 (1999) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons; およびKisakurekら編 (2000) Frontiers in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sonsに見られる。非核酸部分がペプチドである場合、複合体のペプチド部分はペプチドのアミン、チオール、またはカルボキシル基を通じて核酸分子と結合し得る。ペプチド抗原が好適な反応性基(例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)を有する場合には、免疫調節核酸分子をリジン残基のイプシロンアミノ基と直接反応させることができる。複合体のペプチド部分は、固体支持体化学を通じて核酸分子の3'末端と結合させることができる。例えば、核酸分子部分を固体支持体上でプレ合成したポリペプチド部分に添加してもよい(例えば、Haralambidisら (1990) Nucl. Acid. Res. 18: 493-499頁; Haralambidisら (1990) Nucl. Acid. Res. 18: 501-505頁を参照)。あるいは、核酸分子を、それを3'末端から伸びる切断可能であるリンカーを通じて固体支持体と結合させるように合成してもよい。支持体からの核酸分子の化学的切断では、末端チオール基、または末端アミノ基は核酸分子の3'末端に残される(例えば、Zuckermannら (1987) Nucl. Acids Res. 15: 5305-5321頁; Nelsonら (1989) Nucl. Acids. Res. 17: 1781-1794頁)。アミノ修飾した核酸分子のペプチドのアミノ基との結合は、記載されるように実施し得る(例えば、Benoitら (1987) Neuromethods 6: 43-72頁を参照)。チオール修飾した核酸分子のペプチド抗原のカルボキシル基との結合は、記載されるように実施し得る(例えば、Sinahら (1991) Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Pressを参照)。付加マレイミドを有する核酸分子のペプチドのシステイン残基のチオール側鎖との結合もまた、実施し得る(例えば、Tungら (1991) Bioconj. Chem.I 2: 464-465頁を参照)。
【０１０７】
複合体のペプチド部分は、核酸分子の5末端と、その合成中に核酸分子に組み込まれたアミン、チオール、またはカルボキシル基を通じて結合し得る(例えば、Agrawalら (1986) Nucleic Acids Res. 14: 6227-6245頁; Bischoffら (1987) Anal. Biochem. 164: 336-344頁; および米国特許第4,849,513号; 第5,015,733号; 第5,118,800号; および第5,118,802号を参照)。
【０１０８】
核酸分子の脂質との結合は、公知の標準方法を用いて形成し得る。これらの方法としては、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド-リン脂質複合体、オリゴヌクレオチド-脂肪酸複合体、およびオリゴヌクレオチド-ステロール複合体の合成が挙げられる(例えば、Yanagawaら (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19: 189-192頁; Grabarekら (1990) Anal. Biochem. 185: 131-135頁; およびBoujradら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5728-5731頁を参照)。
【０１０９】
核酸分子のオリゴ糖または多糖類との結合は、限定されるものではないが、O'Shannessyら (1985) J. Applied. Biochem. 7: 347-355頁に記載の方法をはじめとする公知の標準方法を用いて実施し得る。
【０１１０】
複合体は、以上に記載のように共有結合によって形成し得る。複合体はまた、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、および／またはファンデルワールス力などの非共有的相互作用によっても形成し得る。
【０１１１】
非核酸部分がポリペプチドである場合、ポリペプチドは核酸分子と直接結合してもよいし、または間接的に、例えば、リンカー分子を介して核酸分子と結合してもよい。幅広い種類のリンカー分子が当技術分野では公知であり、複合体に用いることができる。ペプチドの核酸分子への結合は、ペプチド反応性側鎖、またはペプチドのN末端もしくはC末端を介したものであってよい。核酸分子のペプチドへの結合は、3'末端もしくは5'末端、または内部のいずれかでのものであってよい。リンカーは有機、無機、または半有機分子であってよく、有機分子のポリマー、無機分子のポリマー、または無機分子と有機分子との両方を含むコポリマーであってもよい。リンカーはまた、核酸分子と抗原との結合に好適な基を有するように誘導体化されたビーズであってもよい。生分解性ビーズをはじめとする幅広い種類のビーズ、ならびに分子をビーズと結合させる方法は、当業者ならば周知である。
【０１１２】
存在するならば、リンカー分子は、一般に、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドと結合されるポリペプチドとが核酸分子とポリペプチドとの間でのフレキシブルな移動をさせることを可能にするのに十分な長さのものである。リンカー分子は、一般に、約6〜50原子長である。リンカー分子はまた、例えば、アリールアセチレン、2〜10モノマー単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二価酸、アミノ酸、またはその組合せであってよい。本開示内容に照らして、オリゴヌクレオチドと結合することができるその他のリンカー分子を用いてもよい。
【０１１３】
修飾する生体分子集団は、一部分に関しては同質または実質的に同質であるが、第1および第2の(またはさらなる)部分が異なる化学種に属する場合には、第2の部分に関して異質であることがある。例えば、生体分子集団全てが同じポリヌクレオチド部分(例えば、ヌクレオチドの同一配列)を含んでなってもよいが、生体分子集団のメンバーによって異なるペプチド部分を含んでなってもよい。
【０１１４】
なおさらに、修飾する生体分子集団は、一部分に関しては同質または実質的に同質であるが、第1および第2の(またはさらなる)部分が同じ化学種に属する場合には、第2の部分に関して異質であることがある。例えば、生体分子集団は集団の全てのメンバーにおいて同一であるポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、および集団のメンバーによって異なるポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含んでなってよい。例えば、生体分子集団の全てのメンバーは特定のタンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチド配列; および集団のメンバーによって異なる配列を有するポリヌクレオチドを含んでなってよい。
【０１１５】
生体分子の調製
生体分子は、生物源(例えば、動物、植物、ウイルス、細菌、原生動物など)から単離してもよいし、従来の方法を用いて合成してもよいし、組換え体であってもよいし、または生物学的存在から単離して、合成または酵素によって修飾してもよい。いくつかの実施形態では、磁気分離装置にかける前に異質混合物から生体分子または生体分子集団を単離する。その他の実施形態では、磁気分離装置にかける前に生体分子を修飾する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、分離装置にかけるサンプルを修飾する生体分子について、それが天然で見られる環境と比べて、または合成された生体分子、または生物源から単離された生体分子を含む混合物などの出発サンプルと比べて、強化した後に修飾する。生体分子は精製してもよく、精製するとは、生体分子がその他の成分、例えば、その他の生体分子を実質的に含まない組成物に存在することを意味し、ここで、実質的に含まないとは、組成物の90%未満、一般的には60%未満、より一般的には50%未満が修飾する生体分子以外の成分(例えば、その他の生体分子)で構成されていることを意味する場合のものである。
【０１１７】
重要なある実施形態では、例えば、目的の生体分子を生物学的存在から単離すると、生体分子はそれが天然に存在する環境に存在する構成物質を実質的に含まない組成物に存在する。例えば、生体分子を含む組成物は、それがその天然環境でともに存在する、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質などのその他の生物学的構成物質を完全に含まないわけではないが、実質的に含まない。これらの実施形態の生体分子組成物は、それ自体、天然源からタンパク質を精製することによって調製されるものとは必然的に異なり、天然源から調製された組成物には、少なくとも微量のタンパク質の自然環境構成物質がなお存在する。
【０１１８】
生体分子はまた、単離物として存在することがあり、単離物とは、生体分子がその他の天然に存在する生体分子および／または合成生体分子、特に構造には無関係であるその他の生体分子(例えば、生体分子がポリヌクレオチドである場合、構造には無関係の生体分子としては、多糖類、オリゴ糖、タンパク質およびその断片が挙げられる)などを実質的に含まないことを意味し、ここで、実質的に含まないとは、この場合、単離された生体分子を含む組成物の70%未満、一般的には60%未満、より一般的には50%未満、40%未満、30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、または約2%未満が単離された生体分子以外の生体分子であることを意味する。いくつかの実施形態では、修飾する生体分子を修飾する生体分子の構造には無関係のその他の生体分子から、および構造には関係あるが修飾されないその他の生体分子から単離する。
【０１１９】
ある実施形態では、生体分子が実質的に純粋な形態で存在し、ここで、実質的に純粋な形態とは少なくとも95%、一般的には少なくとも97%、より一般的には少なくとも99%純粋であることを意味する。いくつかの実施形態では、生体分子集団(異質集団であってよい、例えば、cDNA分子の異質集団; ポリペプチドの異質集団)をその他の生体分子から単離する。単離された生体分子集団はその他の生体分子、例えば、目的の修飾を含まない生体分子、または構造には無関係のその他の生体分子実質的に含まず、多くの場合には、実質的に純粋である。
【０１２０】
ポリペプチドは生物源から単離してもよいし、合成によって作製してもよいし、または組換えによって作製してもよい。すなわち、ポリペプチドをコードするコード領域を含むポリヌクレオチドが発現ベクターに挿入し、コード領域を転写および翻訳させてもよい。
【０１２１】
ポリペプチドは、生物源から、当技術分野では公知のタンパク質精製の標準方法、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、塩析沈殿、または前記のものの2以上の組合せを用いて単離することができる。
【０１２２】
固相ペプチド合成技術を使用する場合もあるが、このような技術は当業者ならば公知である（Jones, The Chemical Synthesis of Peptides (Clarendon Press, Oxford)(1994)を参照）。一般に、こういった方法では、伸長するペプチド鎖を結合した固相に活性化したモノマー単位を連続的に添加することによってペプチドを作製する。
【０１２３】
発現には、発現カセットを使用してよい。発現ベクターは、コード領域が転写開始領域、および転写および翻訳終結領域の転写制御下で機能しうる形で連結される、誘導可能または構成的である転写および翻訳開始領域を提供する。これらの制御領域は、目的の遺伝子の本来のものであってよいし、または外来起源から誘導してもよい。
【０１２４】
発現ベクターは、一般に、プロモーター配列近くに位置する有利な制限部位を有しており、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供する。発現宿主において有効な選択マーカーが存在していてもよい。発現ベクターは、外来融合ペプチドがさらなる機能、すなわち、タンパク質合成の増大、安定性、タンパク質可溶性、細胞膜透過性、特定のリガンドとの反応性、規定の抗血清との反応性、酵素マーカー、例えば、β-ガラクトシダーゼなどを提供する融合タンパク質の作製に用いてもよい。
【０１２５】
発現カセットは、転写開始領域、遺伝子またはその断片、および転写終結領域を含むよう調製する。ポリペプチドは、発現の目的に応じ、従来の方法に従って原核生物または真核生物で発現させてもよい。タンパク質の大規模生産では、大腸菌(E. coli)などの単細胞生物、枯草菌(B. subtilis)、S.セレビシエ(S. cerevisiae)、昆虫細胞をバキュロウイルスまたは非ウイルスベクターと組み合わせて、または脊椎動物、例えば、哺乳類、などの高等生物の細胞、例えば、COS7細胞、を発現宿主細胞として用い得る。いくつかの状況においては、遺伝子をタンパク質が本来の折りたたみおよび翻訳後修飾から恩恵を受ける真核生物細胞で発現させることが望ましい。小ペプチドはまた、実験室で合成することができる。完全アミノ酸配列のサブセットであるポリペプチドを用いて、機能に重要であるタンパク質の部分を同定し、研究してもよいし、またはこれらの領域に対して向けられた抗体を高めてもよい。
【０１２６】
タンパク質またはその断片を大量に安定供給するには、発現宿主を使用して、従来の方法に従ってタンパク質を単離し、精製してもよい。発現宿主の溶解物を調製し、溶解物をHPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、またはその他の精製技術を用いて精製してもよい。
【０１２７】
ポリヌクレオチドは、多くの異なる方法で調製することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、当技術分野では公知の標準単離技術を用いて調製することができる。例えば、Short Protocols in Molecular Biology, (1999) F. Ausubel,ら編, Wiley & Sons; Sambrook, Maniatis, およびFritsch, (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; およびAusubel, F. M.,ら編. (1995) Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照。あるいは、当技術分野では公知の固相合成技術を用いて核酸分子を合成してもよい。オリゴヌクレオチド合成はまた、Edge,ら, (1981) Nature 292: 756頁; Duckworthら, (1981) Nucleic Acids Res 9: 1691頁およびBeaucage,ら, (1981) Tet. Letts 22: 1859頁に記載されている。
【０１２８】
磁性標識
修飾する生体分子をまず、磁性粒子と直接または間接的に結合させる。生体分子を磁性標識する方法は、当技術分野では公知であり、いずれの公知の方法を用いてもよい。例えば、米国特許第6,020,210号は、磁性粒子を調製し、それと生体分子を結合させる方法を記載している。特定の結合対の第1のメンバーを磁性粒子と結合させることができ、ここで、修飾する生体分子は特定の結合対のメンバーと結合する部分を含む。
【０１２９】
磁性粒子と結合することができる特定の結合対のメンバーの例としては、限定されるものではないが、オリゴdT(例えば、3'末端のポリA部分を含む核酸分子との結合の場合); 特定のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド(相補ヌクレオチド配列を含む核酸分子との結合の場合); アビジン(例えば、ストレプトアビジン)(ビオチン化生体分子との結合の場合); 抗原結合ポリペプチド、例えば、免疫グロブリン(Ig)またはそのエピトープ結合断片(Igによって認識されるエピトープを含む生体分子との結合の場合); ポリヌクレオチド結合タンパク質(ポリヌクレオチドとの結合の場合)、例えば、転写因子、翻訳因子など; NiまたはCoキレート(ポリ-ヒスチジンタグ付きタンパク質を固定するため); 受容体-リガンド系、またはその他の特異的なタンパク質-タンパク質結合対; アプタマー(例えば、三次元分子標的の核酸リガンド); レクチン(糖タンパク質の結合の場合);脂質およびリン脂質(脂質結合タンパク質との結合)、例えば、ホスファチジルセリンおよびアネキシン Vが挙げられる。当業者ならば、磁性粒子と結合させ得る特定の結合対のその他のメンバーが理解されよう。
【０１３０】
生体分子はまた、磁性粒子と直接化学的結合によって、または物理的結合によって(共有または非共有結合によって)結合させることができる。このような方法は当技術分野では周知である。生化学的結合は、例えば、「Bioconjugate Techniques（Greg T. Hermanson, Academic Press）」に記載されている。イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、および／またはファンデルワールス力などの非共有結合を用いても生体分子を磁性粒子と結合させることができる。例えば、生体分子をクロマトグラフィーマトリックスと結合させるのに用いる標準非共有結合を用いてもよい。生体分子を磁性粒子と結合させるのに用いることができるこのような非共有結合の1つの限定されない例が、カオトロピック塩の存在下でのシリカとのDNA結合である。当業者ならば、その他のこのような非共有結合およびそれを果たすための条件を把握している。例えば、Molecular Cloning, SambrookおよびRussell, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照。
【０１３１】
磁場
磁性標識した生体分子を分離装置にかけると、磁場が印加される。印加磁場の強さに応じて、生体分子を所定の位置に固定化することができ、または懸濁物に固定することもできる。懸濁物は、例えば、マトリックスの一定の高磁場または勾配領域に、または分離装置の全空隙容量に局在させることができる。
【０１３２】
一般に、印加磁場は約0.1〜約1.5テスラ、約0.2〜約0.8テスラの範囲内である。いくつかの実施形態では、磁場がゼロまで低下させる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、磁性標識した生体分子が懸濁状態で固定化される。分離装置に印加する磁場の強さは、生体分子が結合した磁性粒子の懸濁物の形成がなされるように調整することができる。生体分子の均質な修飾が望まれるいくつかの用途では、生体分子を懸濁状態で維持することが有利である。
【０１３４】
修飾
生体分子は分離装置にかける前に修飾してもよいし、および／または分離装置にかけ、そこに固定化した後に修飾してもよい。生体分子は、分離装置にかける前および／または後に2以上の修飾に付してよい。本明細書において「修飾」とは、磁気によって固定化した生体分子の構造を改変すること、別の分子を磁気によって固定化した生体分子と(例えば、核酸／核酸、タンパク質／核酸、またはタンパク質／タンパク質結合によってなど)結合させること; および磁気によって固定化した生体分子を鋳型または情報源として用いて新しい生体分子を合成すること(例えば、磁気によって固定化したmRNAを用いてcDNAを合成すること; 磁気によって固定化したmRNAを用いてポリペプチドを合成すること; 磁気によって固定化したDNAを用いてDNAを合成することなど)が挙げられる。
【０１３５】
上記のように、生体分子は異なる生体分子種、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖類に属する2種以上の部分を含んでなっていてよい。修飾は生体分子の1種類の部分だけに向けられたものであってよい。よって、例えば、生体分子がペプチド核酸である場合、ポリペプチドを修飾する方法は生体分子のペプチド部分に適用される。従って、ポリペプチドの「修飾」とは、全てがポリペプチドである生体分子の修飾、およびポリペプチド部分以外に、非ポリペプチド部分を含む生体分子のポリペプチド部分の修飾が挙げられる。
【０１３６】
多くの実施形態では、修飾が酵素的修飾である。これらの実施形態のいくつかにおいては、酵素を溶解状態で分離装置に添加する。その他の実施形態では、酵素を分離装置に固定化する。これらの実施形態のいくつかにおいては、修飾反応の前および／または後、酵素を不活性状態に維持する。酵素は、温度を酵素が活性である温度より低く下げることによって、酵素の阻害剤を加えることによって、補因子により活性化されるまで不活性であるアポ酵素を用いることによって、酵素活性に必要なイオン(例えば、Ca2+、Mg2+など)を枯渇させることによって、pHを酵素が不活性であるpHに調整することによってなど、不活性状態に維持することができる。酵素反応の後、酵素を、温度を上昇させるか、または低下させることによって、酵素の阻害剤を添加することによって、酵素をタンパク質分解により消化することによって、酵素活性に必要なイオン(例えば、Ca2+、Mg2+など)を枯渇させることによって、pHを酵素が不活性であるpHに調整することによってなど、不活性化することができる。酵素は酵素を(共有または非共有結合によって、直接またはリンカーを介して)マトリックス材料、例えば、ビーズまたはその他の固体支持体と結合させることによって分離装置に固定化することができる。
【０１３７】
生体分子または生体分子の一部がポリペプチドである場合、ポリペプチドに対する修飾としては、酵素反応による修飾および非酵素反応による修飾が挙げられる。ポリペプチドの修飾としては、限定されるものではないが、その他のポリペプチドとの結合、脱グリコシル化、グリコシル化、リン酸化、脱リン酸化、ニトロシル化、ヌクレオチド化、アシル化、アセチル化、ADP-リボシル化、メチル化、ユビキチン化、オキシドシャッフリング(例えば、レドックス剤の存在下でのジスルフィド架橋の形成)、標識化(例えば、検出可能な標識を用いる)、脂質化(例えば、ミリスチル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、ポリペプチドの一部を除去するためのタンパク質分解による切断、タンパク質を特異的な断片へと切断するためのタンパク質分解による切断、タグ、例えば、ポリヒスチジン、エピトープタグなどの付加； 核酸分子との結合、および検出可能な標識での標識化が挙げられる。
【０１３８】
検出可能な標識としては、直接標識または間接標識が挙げられる。直接標識としては、放射性同位元素; 生成物を検出することが可能な酵素(例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼなど); 蛍光標識(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、シアニン染料、カスケードブルー、Cy5、アロフィコシアニン、Cy5PEまたは異なる蛍光色素のその他のタンデム複合体、テキサスレッドなど); 蛍光性金属、例えば、152Eu、またはEDTAなどの金属キレート基を介してタンパク質と結合するランタニド系のその他のもの; 化学発光化合物、例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩など; 生物発光化合物、例えば、ルシフェリン、エクオリン(緑色蛍光タンパク質)など; および金属化合物が挙げられる。間接標識としては、ポリペプチドと結合する標識された分子、例えば、ポリペプチドに対して特異的な抗体、この場合、標識された結合する分子は上記のように標識される; および特定の結合対のメンバー、例えば、ビオチン(特定のビオチン-アビジン結合対のメンバー)、ジゴキシゲニン(特定のジゴキシゲニン-抗ジゴキシゲニン抗体結合対のメンバー)などが挙げられる。
【０１３９】
生体分子または生体分子の一部がポリヌクレオチドである場合、ポリヌクレオチドに対する修飾としては、酵素反応による修飾および非酵素反応による修飾が挙げられる。ポリヌクレオチドの修飾としては、限定されるものではないが、一本鎖核酸分子を鋳型として用いた、例えば、逆転写酵素、熱安定DNAポリメラーゼ(例えば、Thermus aquaticus由来のTaq DNAポリメラーゼ、Thermococcus litoralis由来のVent DNAポリメラーゼ、Pyrococcus furiosus由来のPfu DNAポリメラーゼ)または非熱安定DNAポリメラーゼの作用による二本鎖核酸分子の合成; 例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、またはポリ(A)ポリメラーゼの作用による、ポリヌクレオチドの5'末端および／または3'末端への1以上のヌクレオチドの付加; 例えば、DNAポリメラーゼのクレノウ断片(例えば、大腸菌DNAポリメラーゼI)によるポリヌクレオチドへのポリヌクレオチドの組込み; 一本鎖または二本鎖リンカーまたはアダプター(例えば、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖リンカー)の、例えば、クローニングを目的としたポリヌクレオチドとのライゲーション; ポリヌクレオチドの(例えば、制限エンドヌクレアーゼによる)制限切断; ポリヌクレオチドの一方または両方の末端の、限定されるものではないが、リン酸化をはじめとする修飾; 脱リン酸化; 塩基除去(例えば、マングビーンヌクレアーゼの使用、など); ポリヌクレオチドの、例えば、テロメラーゼによる伸長; ポリヌクレオチドへの1以上の変異の導入; ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳(例えば、RNAポリメラーゼまたは酵母抽出物を使用); 核酸のニッキングまたは分解(例えば、cDNA合成での逆転写酵素後にRNアーゼHを使用); ポリヌクレオチドの、例えば、cre-loxP系を用いた組換え; 核酸のメチル化; 酵素反応中の修飾反応に用いられる成分および／または反応物質のサブグループの、例えば、DNアーゼおよび／またはプロテアーゼの作用による除去; ポリヌクレオチドの1以上のその他の核酸分子とのハイブリダイゼーション; ポリペプチドのポリヌクレオチドとの結合(例えば、転写因子、翻訳因子、などの結合); およびポリヌクレオチドの検出標識化が挙げられる。ポリヌクレオチドに対する検出可能な標識としては、直接標識および間接標識が挙げられ、ポリペプチドに対する上記のような標識が挙げられる。
【０１４０】
酵素的修飾は、酵素がその最大活性の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%を示す温度にて行われる。いくつかの実施形態では、酵素的修飾は、特定の酵素にとって最適な温度で、またはその付近で行われる。幅広い種類の修飾酵素の最適温度条件は当技術分野では周知である。最適温度条件は酵素の由来である生物、および特定酵素の特異的な性質にある程度依存している。従って、例えば、商業的に入手可能なDNAリガーゼは最適温度条件が約16℃であるT4 バクテリオファージ由来のものであり、また、DNAリガーゼは最適温度条件が約45℃であるThermus aquaticus由来のものである。本明細書において、用語「最適温度条件で、またはその付近で」とは、酵素がその最大活性の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%を保持さえすれば、特定の酵素にとって最適な温度の約5%以内、約10%以内、または約15%以内である温度を指す。
【０１４１】
本明細書において「修飾」とは、ヌクレオチド配列を含む生体分子の、固定化されたポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを含む。そのため、いくつかの実施形態では、本方法がポリヌクレオチドを含む生体分子を固定化すること、およびハイブリダイゼーションに有利に働く条件下でポリヌクレオチドを含む第2の生体分子を固定化されたポリヌクレオチドと接触させることを含む。第2の生体分子の少なくとも一部が、ハイブリダイゼーションが起こり得るように固定化されたポリヌクレオチドに対して実質的な相補性を有する。1つの限定されない例として、固定化される生体分子が約6〜約50、約8〜約40、約10〜約30、または約12〜約20ヌクレオチド長のオリゴd(T)部分を含んでなってもよく、第2の生体分子が 約6〜約50、約8〜約40、約10〜約30、または約12〜約20アデノシン残基の連続するストレッチを含んでなっていてもよい。
【０１４２】
もう1つの限定されない例として、固定化されるポリヌクレオチドが、第2の生体分子の連続するヌクレオチドの対応するストレッチと実質的に相補的である、約6〜約50、約8〜約40、約10〜約30、または約12〜約20ヌクレオチドを有していてもよい。例えば、サブトラクティブハイブリダイゼーションを適用する場合には、固定化されるポリヌクレオチドが全長cDNA分子であってよい。従って、固定化されるポリヌクレオチドが、第2の生体分子の連続するヌクレオチドの対応するストレッチと実質的に相補的である、約100〜約1000、約1000〜約2000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、または約5000〜約10,000、あるいはそれ以上のヌクレオチドを有していてもよい。
【０１４３】
本明細書において「修飾」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを合成するための固定化されたポリヌクレオチド(例えば、固定化された生体分子がポリヌクレオチドを含む)の鋳型としての使用を含む。よって、いくつかの実施形態では、本方法がポリヌクレオチドを含む生体分子を固定化すること(ここで、生体分子が直接または間接的に磁気分離カラムの磁性粒子と結合する)、および固定化されたポリヌクレオチドと実質的に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを合成することを含む。
【０１４４】
ポリペプチドを、mRNAを鋳型として含む固定化された生体分子を用いて合成するための条件は、当技術分野では周知であり、cDNAを、mRNAを鋳型として含む固定化された生体分子を用いて合成するための条件およびポリヌクレオチドを、DNA分子を鋳型として含む固定化された生体分子を用いて合成するための条件は、当技術分野では周知であり、本明細書にて詳細に説明する必要はない。固定化されたポリヌクレオチドと接触させる修飾酵素としては、逆転写酵素(例えば、固定化されたポリヌクレオチドがmRNA分子を含む場合); 熱安定DNAポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ(例えば、固定化されたポリヌクレオチドがDNA分子を含む場合)が挙げられる。いくつかの実施形態では、合成反応が複数の合成工程を含む。よって、例えば、固定化された生体分子がDNA分子を含む場合、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)が行われる。
【０１４５】
PCR法は当技術分野では周知であり、例えば、PCR2: A Practical Approach (1995) M.J. McPhersonら編 Oxford Univ. Pressといった多くの刊行物に記載されている。PCR反応条件の限定されない例は以下の通りである: 約90℃〜約99℃、約92℃〜約96℃、または約94℃にて30秒〜2分間の変性; 約55℃にて約10秒〜約30秒間のアニーリング; および約60℃〜約70℃、または約72℃にて約15秒〜1分間の伸長。変性、アニーリング、および伸長工程を何回繰り返してもよく、一連の変性、アニーリング、および伸長を1つの「サイクル」として、いずれのサイクル数でも(例えば、約2〜約50、約4〜約40、または約8〜約25サイクル)実施することができる。
【０１４６】
新たに合成された生体分子または修飾された生体分子の捕捉
本発明の方法では、結果として、修飾された生体分子、または新たに合成された生体分子が生じる。これらの実施形態のいくつかにおいては、新たに合成された生体分子または修飾された生体分子を分離装置内の第2の結合部分(「捕捉部分」)によって捕捉する。捕捉部分は、捕捉される生体分子もまた固定化するよう、マトリックス上に固定されている。これらの実施形態のいくつかにおいては、捕捉された生体分子をさらに修飾するか、または修飾せずに精製する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、修飾工程によって、新たに合成されたポリペプチドがもたらされ、新たに合成されたポリペプチドは、捕捉部分によって捕捉される。捕捉部分がポリペプチドと特異的に結合する特定の結合対の一メンバーであってよい。好適な捕捉部分としては、限定されるものではないが、ポリペプチドのリガンド; ポリペプチドに対して特異的な抗体; 新たに合成されたポリペプチドが特異的に結合するポリペプチド; 新たに合成されたポリペプチドが特異的に結合する核酸などが挙げられる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、新たに合成されたポリペプチドが、ポリペプチドと、カルボキシル末端、アミノ末端に対してインフレームに、または内部で融合されたタグを含み、捕捉部分がタグと結合する分子である。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、タグが免疫学的タグ(「エピトープタグ」)である。免疫学的タグは当技術分野では公知であり、典型的には、エピトープに対して特異的な抗体によって認識されるエピトープを含む約6〜約50アミノ酸間の配列である。このようなタグの非限定的な例が、血球凝集素(HA; 例えば、CYPYDVPDYA; 配列番号1)、FLAG(例えば、DYKDDDDK; 配列番号2)、c-myc(例えば、CEQKLISEEDL; 配列番号3)などである。これらの実施形態では、捕捉部分がエピトープタグに対して特異的な抗体である。
【０１５０】
その他の実施形態では、タグが金属イオンキレートタグ、例えば、ポリヒスチジンタグ(例えば、2〜20、2〜10、または2〜5の連続するヒスチジン残基; または少なくとも約30%ヒスチジン残基を含む約10〜約20アミノ酸からなる配列など)であり、捕捉部分がニッケルまたはコバルトキレートリガンドである。金属イオンキレートタグおよび好適なリガンドは、文献に記載されている。例えば、米国特許第5,594,115号; 第5,284,933号; 第5,047,513号; および第5,310,663号を参照。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、タンパク質分解による切断部位がタグと残りの新たに合成されたポリペプチドとの間に向けられる。これらの実施形態では、新たに合成されたものを捕捉部分に捕捉し、捕捉に引き続いて、残りのポリペプチドからタグをタンパク質分解により切断する。その後、残りのポリペプチドを溶出することができる。これらの実施形態のいくつかにおいては、タンパク質分解による切断を行う酵素が、タンパク質分解による切断を行う酵素が溶出されるポリペプチドに混入しないように、カラム(本明細書に記載のもの)上に固定化される。
【０１５２】
タンパク質分解による切断部位は当業者には公知である。幅広い種類のものが知られており、例えば、Handbook of Proteolytic Enzymes (1998) AJ Barrett, ND Rawlings, およびJF Woessner編, Academic Pressといった文献にて十分に記載されている。タンパク質分解による切断部位としては、限定されるものではないが、エンテロキナーゼ切断部位: (Asp)4Lys(配列番号4); 第Xa因子切断部位: Ile-Glu-Gly-Arg(配列番号5); トロンビン切断部位、例えば、Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(配列番号6); レニン切断部位、例えば、His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His(配列番号7); コラゲナーゼ切断部位、例えば、X-Gly-Pro(式中、Xはいずれのアミノ酸でもよい); トリプシン切断部位、例えば、Arg-Lys; ウイルスプロテアーゼ切断部位、例えば、限定されるものではないが、ピコルナウイルスのプロテアーゼ2A切断部位(例えば、Sommergruberら (1994) Virol. 198: 741-745頁を参照)、A型肝炎ウイルス3C切断部位(例えば、Schultheissら (1995) J. Virol. 69: 1727-1733頁を参照)、ヒトライノウイルス2Aプロテアーゼ切断部位(例えば、Wangら (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 235: 562-566頁を参照)、ピコルナウイルス3プロテアーゼ切断部位(例えば、Walkerら (1994) Biotechnol. 12: 601-605頁を参照)をはじめとするウイルス2Aまたは3Cプロテアーゼ切断部位; およびカスパーゼプロテアーゼ切断部位、例えば、活性化カスパーゼ-3によって認識され、切断されるDEVD(配列番号8)(この場合、2番目のアスパラギン酸残基の後に切断が起こる)が挙げられる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位のカルボキシル末端および／またはアミノ末端に2〜約12、または約4〜約8のアミノ酸が付加され、この付加されるアミノ酸はプロテアーゼの本来の基質に見られるものである。
【０１５３】
その他の実施形態では、新たに合成された生体分子が核酸であり、捕捉部分が新たに合成された核酸の一部と相補的である核酸である。新たに合成された核酸がcDNA分子(例えば、磁気によって固定化される生体分子がmRNAであり、逆転写酵素によってcDNA分子が生じる)またはDNA分子(例えば、磁気によって固定化される生体分子がDNAであり、ポリメラーゼ鎖反応などのDNAポリメラーゼ反応によって新たに合成されたDNA分子が生じる)であってよい。
【０１５４】
ある実施形態では、磁気によって固定化される生体分子が核酸の混合集団のメンバーであり、それゆえ、新たに合成された生体分子が核酸の異質集団である。捕捉部分がポリヌクレオチド、例えば、異質集団のサブセット、例えば、オリゴヌクレオチド捕捉部分と実質的に相補的である配列を含む核酸を含むサブセットと特異的に、または選択的に(例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にて)ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
【０１５５】
その他の実施形態では、捕捉部分は修飾された生体分子と結合するが、修飾を含まない同じ生体分子とは結合しない。このような捕捉部分としては、限定されるものではないが、抗ホスホチロシン抗体(タンパク質のリン酸化されたチロシン残基と結合する); アビジン(ビオチン化された生体分子と結合する); 修飾に対して特異的なリガンド; 修飾に対して特異的な抗体; などが挙げられる。
【０１５６】
温度
いくつかの実施形態では、分離装置または分離装置の一部の温度は、分離装置に固定化された生体分子の修飾前および／またはその間および／またはその後に変更される。分離装置の温度は所望の効果を達成するよう制御される。装置(または修飾する磁性標識した生体分子を固定するその部分)は、所望の効果を達成するのに十分な時間、所定の温度に維持される。
【０１５７】
所望の効果を達成するのに十分である時間を決定することは、当業者のスキルのレベルで十分に対応できる範囲にある。例えば、酵素的修飾の場合、製造業者が示す好適な時間に従ってもよいし、または酵素反応によって一定時間に生ずる生成物の量を測定することによって好適な時間を決定してもよい。ほとんどの酵素反応では、典型的には、約30秒〜60分の間で十分である。結合反応(例えば、タンパク質-タンパク質結合、タンパク質-核酸結合、核酸-核酸ハイブリダイゼーション)の場合、当業者ならば好適な時間を容易に決定することができる。例えば、核酸-核酸ハイブリダイゼーションの好適な時間は約1分〜約60分の範囲である。
【０１５８】
装置の温度は、種々の効果を達成するために、1回以上変更(調整)してもよい。
【０１５９】
分離装置の温度は、限定されるものではないが、2つの核酸分子のハイブリダイゼーションに影響を及ぼすために、例えば、ハイブリダイゼーションを達成するために、デハイブリダイゼーションを達成するために; 酵素反応を、例えば、温度を、酵素にとって最適な温度より高いまたは低い温度に変えることによって遅延させるまたは停止させるために; 酵素反応を進行させるために; 修飾酵素にとって最適な活性を提供するために; 液体の粘度を変えるために、液量を(例えば、蒸発によって)減少させるために; 酵素濃度またはバッファーの塩濃度を(蒸発によって)高めるために; 反応を開始させるために(例えば、酵素は薬剤との結合により不活性状態にあり、酵素反応を開始させるために、遮断薬を不活性化させるように温度を高める); 1種以上の生体分子のコンホメーションを変えるために(例えば、RNA分子のヘアピン構造がなくなる温度に高める; 二本鎖核酸分子を変性させるために; 分子を溶出させるために(例えば、合成されたポリヌクレオチドが溶出される温度に高める); および1つの生体分子の別の分子との結合に影響を及ぼすために、など、生体分子の修飾に影響を及ぼすために変更してもよい。
【０１６０】
分離装置の温度は、2つの核酸分子のハイブリダイゼーションに影響を及ぼすために変更してもよい。核酸分子の、分離装置上に固定化されている核酸分子とのハイブリダイゼーションに影響を及ぼすことを利用して、特定の条件のハイブリダイゼーションストリンジェンシー下にて固定化された核酸分子と結合する核酸分子を選択することができる。低ストリンジェンシー条件を用いて、特定の核酸分子の相同体、例えば、固定化されたポリヌクレオチドと約75%未満、約70%未満、または約65%未満のヌクレオチド配列同一性を有している核酸分子を同定してもよい。高ストリンジェンシー条件を用いて、固定化されたポリヌクレオチドと少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%以上のヌクレオチ配列同一性を有している核酸分子を同定してもよい。
【０１６１】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」条件下にて実施することができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを高める条件は広く知られており、当技術分野では公開されている。例えば、Sambrookら (1989); および米国特許第5,707,829号を参照。適切な条件の例として(ストリンジェンシーの低い方から順に): インキュベーション温度 25℃、37℃、50℃および68℃; バッファー濃度 10xSSC、6xSSC、1xSSC、0.1xSSC(ここで、SSCは0.15M NaClおよび15mM クエン酸バッファーである)およびその他のバッファー系を用いたそれらの等価物; ホルムアミド濃度 0%、25%、50%、および75%; インキュベーション時間 5分〜24時間; 1、2、またはそれ以上の洗浄工程; 洗浄インキュベーション時間 1、2、または15分; および洗浄液 6xSSC、1xSSC、0.1xSSC、または脱イオン水が挙げられる。ストリンジェントな条件の例は、50℃以上にて、0.1xSSC(9mM NaCl/0.9mMクエン酸ナトリウム)でのハイブリダイゼーションおよび洗浄である。
【０１６２】
「Tm」とは、ワトソン-クリック塩基対合により逆平行に水素結合した相補鎖からなるポリヌクレオチド二本鎖の50%が試験条件下にて一本鎖に解離する摂氏温度である。Tmは標準式に従って推測し得る。例えば:
Tm=81.5+16.6log[X+]+0.41(%G/C)-0.61(%F)-600/L
(式中、[X+]はカチオン濃度(一般的には、ナトリウムイオン、Na+)(mol/L)であり; (%G/C)は二本鎖中の全残基に占めるGおよびC残基の数であり; (%F)は溶液中のホルムアミド濃度(wt/vol)であり; およびLは二本鎖の各鎖におけるヌクレオチドの数である)。
【０１６３】
洗浄
生体分子を修飾する本発明の方法は、所望により、1以上の洗浄工程を含んでなってよい。生体分子を分離装置にかけた後、固定化された生体分子の修飾の前に、1以上の洗浄工程を実施してもよい。結合していない成分を除去するのに洗浄を利用してもよい。生体分子の修飾後、1以上の洗浄工程を実施してもよい。このような洗浄工程は、修飾反応の修飾成分の除去; 修飾反応の所望でない副生成物の除去; 特定の修飾反応の停止; バッファーの交換; 脱塩; 核酸断片の除去; 酵素の除去; 補因子の除去; タンパク質の除去; 非特異的結合分子の除去; 装置で行われる反応の原因となる阻害剤の除去(例えば、ピロリン酸塩、ポリメラーゼまたは逆転写酵素反応の生成物の除去); pHの変更; および中間体の安定化といった種々の働きをし得る。さらに、2以上の修飾工程を実施する場合、工程間に分離装置を洗浄してもよい。
【０１６４】
洗浄液の組成および温度は、所望の効果によって様々である。当業者ならば、固定化された生体分子および／または固定化された生体分子と結合する分子の既知の性質をもとにして洗浄液の最適な組成および温度を容易に決定することができる。
【０１６５】
洗浄液はバッファーを含んでなってよく、必要に応じて、限定されるものではないが、キレート剤、例えば、EGTA、EDTA; 洗浄剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、Triton X-100、CHAPSなど; 種々のイオン、例えば、Ca++、Mg++、K+、Ni+など; 還元剤(例えば、DTT、DTE、β-メルカプトエタノール、およびシステイン); 塩; グリセロール; tRNA; ヌクレアーゼ阻害剤; プロテアーゼ阻害剤; 補因子; ポリアミン; ヌクレオチド; ヌクレオチド類似体; グリコーゲン; アルブミン; イミダゾール; 変性剤(例えば、尿素、塩化グアニジニウムなど); ペプチド(例えば、グルタチオン); などをはじめとする追加成分をさらに含んでなってもよい
溶出
修飾工程後、固定化された生体分子またはその他の成分を分離装置から溶出させてもよい。いくつかの実施形態では、固定化された生体分子をカラムに保持し、修飾反応の生成物だけを溶出させる。その他の実施形態では、固定化された生体分子と修飾反応の生成物との両方(修飾反応の生成物が固定化された生体分子以外のものである場合)を溶出させる。修飾反応によって固定化された生体分子を修飾するというさらに別の実施形態では、修飾された固定化生体分子だけを溶出させる。固定化される生体分子は、要すれば、例えば、1以上の修飾工程後に、修飾された固定化生体分子を好適な酵素(例えば、タンパク質分解による切断部位で特異的に作用するタンパク質分解酵素; 制限エンドヌクレアーゼ認識部位で作用する制限エンドヌクレアーゼ)と接触させることが可能なように、および修飾された固定化生体分子をカラムから放出させることが可能なように、タンパク質分解による切断のための部位、または制限エンドヌクレアーゼによる切断のための部位を有していてもよいし、またはそれらを有するように修飾してもよい。生体分子は、磁性粒子とともに、または磁性粒子とは別に溶出させることができる、例えば、磁性粒子をカラムに保持する一方で、生体分子を磁性粒子から放出させる。
【０１６６】
有用性
本発明の方法および装置は幅広い種類の用途において有用である。このような用途としては、限定されるものではないが、DNAアレイのプロービングに用いる標識DNAプローブの作製用途、遺伝子発現の連続分析(SAGE)用途などが挙げられる。
【０１６７】
本発明の方法が有用性を発揮する1つの限定されない用途の例としては、DNAに基づくアレイでプローブとして用いるための、例えば、外部または内部シグナルに応じて発現されるcDNAを同定するための、標識cDNA集団の作製が挙げられる。 このような用途では、本明細書に記載の単一装置で、検出可能なように標識されたcDNA集団を合成し、精製することができる。装置には複数のカラムが備わっており、その各々が遺伝子発現に影響を及ぼす異なる外部または内部シグナルを受けた細胞または細胞集団由来のcDNA集団を合成するのに用いられる。標識cDNAプローブは、その後、DNA分子のアレイとハイブリダイズするのに用いられ、標識プローブとのハイブリダイゼーションが公知の方法を用いて検出される。DNAアレイおよびそれらの使用は文献にて十分に記載されている。
【０１６８】
遺伝子発現に影響を及ぼす外部および内部シグナルとしては、限定されるものではないが、微生物、限定されるものではないが、細菌(例えば、マイコバクテリウム(Mycobacterium)種、シゲラ(Shigella)種、クラミジア(Chlamydia)種など)、原生動物(例えば、トリパノソーマ(Trypanosoma)種、プラスモジウム(Plasmodium)種、トキソプラズマ(Toxoplasma)種など)、真菌類、酵母(例えば、カンジダ(Candida)種)、またはウイルス(ヒト免疫不全ウイルス、口蹄疫ウイルス 、エプスタインバー・ウイルスなどの哺乳類細胞に感染するウイルス; 植物細胞に感染するウイルス; などを含む)をはじめとする微生物による細胞の感染; 細胞が維持される培地のpH変化または内部pHの変化; 細胞または多細胞生物の正常範囲と比較して必要以上に高い温度; 細胞または多細胞生物の正常範囲と比較して必要以上に低い温度; ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、神経伝達物質などのエフェクター分子; 薬剤の摂取または適用; 細胞表面受容体のリガンド; 細胞の内部に存在する受容体、例えば、核内受容体のリガンド; 低酸素状態; 光; 闇; 限定されるものではないが、リポ多糖類(LPS)、ヤマゴボウマイトジェンをはじめとするマイトジェン; 抗原; 睡眠パターン; 電荷; 細胞が維持される培地のイオン濃度または内部イオン濃度、ナトリウムイオン、カリウムイオン、塩化物イオン、カルシウムイオンなどをはじめとする典型的なイオン; 栄養素の存在または不在; 金属イオン; 細胞周期の調節異常; 転写因子; 腫瘍サプレッサー; 細胞-細胞接触などが挙げられる。
【０１６９】
SAGEの適用については、当技術分野において説明されている。例えば、米国特許第5,695,937号; 第5,866,330号; 第6,221,600号; 第6,261,782号; および第6,297,017号を参照。1つの限定されない例として、二本鎖cDNAの集団を、例えば、ビオチン化したオリゴ dTプライマーを用いて合成し、ビオチン化したds cDNAを、cDNA分子が固定化されるようにアビジン結合磁性粒子を含む本発明の分離装置にかけ、固定化されたcDNA分子を制限エンドヌクレアーゼで切断し、切断したcDNA分子を、DNA分子のオーバーハングする末端とアニーリングし、制限部位を再生するオーバーハングする末端を含んでいてよく、またプライマーとなるオーバーハングする末端を含んでいてもよい二本鎖アダプター分子とライゲートし、ライゲートした分子集団を装置から放出させる。その後、分子集団をSAGE用途に用いることができる。
【実施例】
【０１７０】
次の実施例は、当業者に本発明を作製し、使用する方法を十分に開示し、説明するために示されるが、本発明者が発明として考えるものの範囲を限定するためのものではなく、また、以下の試験が実施される試験の全てである、または唯一の試験であると示すものでもない。用いる数値(例えば、量、温度など)に関し、正確さを確保するよう努力を注いできたが、少しの試験誤差および逸脱は考慮されたい。特に断りのない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０１７１】
実施例1: マイクロアレイハイブリダイゼーションのためのプローブの作製
DNAマイクロアレイは、異なる細胞種または組織にて、または特定の条件に応じた遺伝子の発現レベルを解析し、比較するために用いられる。これらの用途、すなわち、発現プロファイリングでは、mRNAは、一般に、cDNAへと逆転写することにより、標識したヌクレオチドの導入によって修飾される。各々を異なる検出可能な標識で標識したcDNA分子の2つの集団をDNAマイクロアレイとハイブリダイズし、関係遺伝子の発現パターンを反映するそれらのシグナル強度を比較する。
【０１７２】
マイクロアレイハイブリダイゼーションのためのプローブの作製は、mRNA単離、cDNA合成およびcDNA標識化、標識したcDNAのRNアーゼH消化および精製をはじめとする種々の工程からなる複合工程である。これらの全ての工程は、磁性粒子、分離カラムおよび温度制御可能な磁石を用いて、1つのマトリックスで実施される。
【０１７３】
mRNA単離では、分離目的で磁性粒子および磁場に置いたカラムを用いる、Miltenyi BiotecのmRNA単離プロトコールに従って、細胞を処理した。要するに、溶解バッファー系を用いた細胞溶解によってmRNAを放出させ、細胞残屑を濾過ユニットで除去することによって、均質な細胞溶解物を得た。mRNA分子のポリ(A)テールを小型磁性マイクロビーズのオリゴ(dT)配列とハイブリダイズし、MACS分離カラム タイプμに添加した。磁気によって固定化したmRNA分子の精製では、一連の洗浄工程を実施してDNA、タンパク質、およびリボソームRNAなどの混入分子を除去した。よりストリンジェントな精製では、溶解バッファーでの洗浄に続いて、洗浄バッファーによる数回の洗浄工程を行った。その後、mRNAはカラム上に固定化された状態であった。cDNAは、Superscript II(Life technologies)、Expand Reverse Transcriptase(Roche)、Stratascript(Stratagene)またはOmniscript(Qiagen)を用いて合成した。反応混合物には、逆転写酵素の他、好適なバッファー系中、1組の非標識デゾキシヌクレオチド-dATP、dCTP、dGTP、dTTP-(Life Technologies, Roche, Qiagen)を最終濃度最大1mMで; Cy3またはCy5標識dCTP(Amersham Pharmacia Biotech)を最終濃度0.1mMで; ジチオスレイトールを最終濃度10mMで; さらにRNアーゼ阻害剤(Roche, Life Technologies)を含めた。cDNA合成の前に、逆転写に向けてmRNAを2x100μlバッファーで平衡状態にした。平衡化後、20〜30μlの上記反応混合物をμ-カラムに添加し、用いる酵素に応じておよび最適温度条件に関する製造業者の仕様書に従って、磁石の加熱機器を37℃または42℃にある酵素の最適温度条件に変えて、逆転写を開始した。45〜60分間のインキュベーション時間の後、合成を停止させ、μカラムに2×100μl逆転写酵素バッファーを添加することによって同時にcDNAを精製した。
【０１７４】
一般的に用いられる逆転写酵素にはRNアーゼH活性がないか、または低いRNアーゼ活性しかない。そのため、ほとんどのcDNA分子がそれらのmRNA鋳型と結合する。mRNAを除去するため、好適なバッファー系中にRNアーゼH(Roche, Life Technologies)を含有する20〜30μlの溶液をμ-カラムに添加し、磁石の加熱機器を37℃に変えることによって反応を開始した。25分後、消化を完了し、残りのmRNA断片を100μlリン酸緩衝生理食塩水での2回の洗浄工程により除去した。
【０１７５】
これらの最終的な洗浄工程の後、蛍光標識した一本鎖純粋cDNAを磁気によってμ-カラム上に固定化した。cDNAを溶出させるため、cDNAを磁性粒子と分離する20〜30μlの放出試薬(Miltenyi Biotec)をカラムに添加し、室温にて10分間のインキュベーション後、cDNAをTris-EDTAベースのバッファー系で溶出した。純粋なcDNAを沈殿させ、ハイブリダイゼーションバッファーに溶かし、製造業者の使用説明書(GeneScan Europe)に従って、DNAマイクロアレイとハイブリダイズさせた。
【０１７６】
実施例2: DNアーゼI活性
mRNA分子は、細胞または組織の遺伝子発現を解析する種々の用途に用いられる。オリゴ(dT)配列の転写物のポリ(A)テールとのハイブリダイゼーションによるmRNAの単離後、mRNAは、主としてオリゴ(dT)配列の分子内アデノシンストレッチとの非特異的結合の結果生じる微量のゲノムDNAを含んでいるが極めて純粋である。ほとんどの下流適用では、このゲノムDNAがその結果を妨げることはないが、cDNA発現ライブラリーの作製などのいくつかの用途では、mRNAがゲノム混入物質不含でなければならない。そのため、このような用途では、mRNA単離後にDNアーゼI消化を行う。集中精製工程を回避するため、酵素反応後にDNアーゼI消化を、消化後のmRNAの簡便な精製を可能にするカラムで実施した。
【０１７７】
オリゴ(dT)マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を製造業者の使用説明書に従って用いてmRNAを単離した。何度も洗浄した後、mRNAはμ-カラムから溶出させず、その代わりにDNアーゼI酵素の好適な反応バッファーでいったん平衡状態にした。平衡化した後、20〜30μl反応混合物をカラムに添加してそれ自身の反応を行った。反応混合物は、好適なバッファー系(Roche)中にDNアーゼIを含むものであった。室温または30℃の各々にて10分間のインキュベーション後、mRNAを再度、mRNA精製に用いる2×200μl溶解バッファーおよび2×200μl洗浄バッファー(Miltenyi Biotec)で洗浄した。溶出では、120μlの溶出バッファーをカラムに添加した。液滴2〜4には混入ゲノムDNAを含まない純粋なmRNAが含まれる。
【０１７８】
実施例3: SAGE技術の適用の過程におけるリンカーのライゲーションおよびDNAの制限切断
ストレプトアビジン結合ユニットを介して固定化されたビオチン化核酸の修飾を含む多くの複合技術が存在する。固定化中に一連の反応が行われるその応用がSAGE技術であり、この技術によって何千もの転写物がそれらの発現状況に関して詳細に解析される(Velculescuら (1995) Science 270: 484-7頁)。
【０１７９】
mRNAから出発し、ビオチン化されたオリゴ(dT)プライマーを用いて二本鎖cDNAを合成した。合成後、好適な制限酵素によりcDNAを切断した。最適な大きさの断片を作製するため、通常、4塩基対認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼを用いた。
【０１８０】
2つのMACSカラム タイプ μ(Miltenyi Biotec)をMACS分離装置の磁場に置いた。カラムは、各々を100μlの核酸用平衡化バッファー(Miltenyi Biotec)および100μl結合バッファー(500,mM NaCl、1mM EDTA、10mM Tris-HCl、pH 8.0)で2回で洗浄することによって準備した。カラムの準備後、MAGmol ストレプトアビジンマイクロビーズをビオチン化されたcDNAを含有する溶液に添加した。最適結合条件を作り出すため、上記結合バッファーにて100〜500μlの間の最終量で結合を実施した。ビオチン化された制限断片の捕捉は、一般に、数秒後に完了した。結合溶液の半分を各μ-カラムに添加し、結合バッファーで3〜4回洗浄した。
【０１８１】
リンカーのライゲーションでは、20〜30μlのライゲーション混合物をμ-カラムに添加し、16℃にて少なくとも3時間インキュベートした。そのため、磁石の冷却機器を用いて、カラムの温度を調整した。ライゲートしていないリンカーおよびライゲーション反応の他のあらゆる成分を除去するため、カラムを100μl結合バッファーで3〜4回洗浄した。
【０１８２】
リンカーとライゲートしたcDNA断片を磁性粒子と、それゆえカラムから分離する次の制限工程では、制限エンドヌクレアーゼを含有する混合物をμ-カラムに20〜30μlの量で添加した。カラムの温度を、磁石の加熱機器を作動させることにより、一般に、65℃または37℃にある酵素の最適反応温度(酵素に応じて異なる)に調整した。
【０１８３】
制限DNA断片の溶出では、少なくとも100μlのバッファーをカラムに添加した。さらなる工程は、標準プロトコールに従って実施した。
【０１８４】
実施例4: DNAのビオチン化および単離
ビオチンのストレプトアビジンとの結合は最も強い生物学的非共有結合の1つである。そのため、ビオチン化されたDNAをμMACS ストレプトアビジンマイクロビーズから除去するには、MACS分離装置の磁場に置かれたカラムで制限エンドヌクレアーゼによる酵素反応を行う。固定化されたビオチン化DNAは、ビオチン基に近接した制限部位にて切断する制限エンドヌクレアーゼにより酵素的に切断される。酵素反応に必要な温度は、加熱可能なμMACS分離装置にてまたは好適なインキュベーターでの全分離ユニットのインキュベーションにより準備することができる。ビオチン化断片はμMACS ストレプトアビジンマイクロビーズによって保持されているが、制限エンドヌクレアーゼの作用によって形成された非ビオチン化DNAは洗い流し、回収することができる。ビオチン化断片の溶出もまた可能である。
【０１８５】
ビオチン化DNAの作製
既知のDNA配列を増幅し、同時に、1つの5'ビオチン化プライマーを用いてPCR反応にてビオチン化する。DNAを、μMACS ストレプトアビジンマイクロビーズ(Miltenyi Biotec, Inc.)によって保持される断片の末端でビオチン化する。あるいは、DNAプラスミドなどの核酸を商業的に入手可能なビオチン化キット(例えば、フォトビオチンにて)を用いてビオチン化する。
【０１８６】
ビオチン化DNAのμMACS ストレプトアビジンマイクロビーズとの結合
結合反応は、制限エンドヌクレアーゼの場合に用いるのと同じ反応バッファーで行われる。(1)DNA; (2)結合溶液(5μlの10×制限酵素バッファー); および(3) μMACS ストレプトアビジンマイクロビーズを含有し、(4)脱イオン水(dH2O)で最終量50μlにした溶液。溶液を素早く混合し、室温にて2分間維持する。100μlのμMACS ストレプトアビジンマイクロビーズは、一般に、最大約100 pmol ビオチン化オリゴヌクレオチドを結合する。μMACSマイクロビーズによるDNAの捕捉は、一般に、数秒後に完了する。捕捉中の温度が室温より低い場合には、捕捉時間を最大15分延長する。最高の結果をもたらすには、μMACS ストレプトアビジンマイクロビーズの希釈を1:10以下にすべきである。
【０１８７】
酵素溶液の調製
DNAμg当たり約5〜10単位の制限酵素(酵素に応じて異なる)を用いる。酵素を好適なバッファー(例えば、酵素製造業者によって供給されるバッファー、または酵素製造業者が推奨するバッファー)で希釈する。カラムでの制限反応のための酵素の量は従来の試験管での制限反応の場合と同じである。典型的には、酵素溶液は、(1)2μlの10×制限酵素バッファー; (2)x単位の制限酵素; および(3)dH2Oを含む総量20μlのものである。この溶液を室温にて1時間インキュベートする。
【０１８８】
カラムの準備
MACS μカラムを(加熱可能な)μMACS 分離装置の磁場に置く。カラムは、100μlのタンパク質用平衡化バッファーおよび2×100μlの1x制限酵素の反応バッファーで洗浄することによって準備する。
【０１８９】
制限消化
結合溶液をカラムマトリックスの上部に添加し、通過させる。磁性標識したDNAはカラム内に保持される。その後に、酵素溶液をカラムの上部に添加する。加熱可能な磁石を37℃または制限酵素に好適なその他の温度に調整する(あるいは、磁石が備わったカラムを所望の温度のインキュベーター内に置く)。この装置を好適な温度にて1時間維持する。
【０１９０】
溶出
加熱可能な磁石のスイッチを切る(または磁石が備わったカラムをインキュベーターから取り出す)。非ビオチン化DNA断片を溶出させるには、カラムを200μlの好適なバッファー(例えば、TE pH 8.0)で洗浄し、画分を回収する。ビオチン化DNA断片を溶出させるには、カラムを磁石から外し、200μlの好適なバッファー(例えば、TE pH 8.0)を添加する。
【０１９１】
解析
解析前に、エタノール沈殿によりDNAを沈殿させ、量を減少させる。必要に応じて、DNAを、95℃にて5分間、0.1%SDSととともにインキュベートすることによってマイクロビーズから解放し、その後、直ちに15,000×gにて1分間の遠心分離を行う。次いで、上清(DNAを含む)を新しい試験管に移し、この手順を2回繰り返す。
【０１９２】
本発明をその特定の実施形態を参照して説明してきたが、本発明の真の精神および範囲を逸脱しない限り、種々の変更をしてもよく、同等の物で置き換えてもよいことは、当業者ならば理解できよう。さらに、特定の状況、材料、組成物、工程、工程段階または工程を本発明の目的、精神および範囲に適合させるように多くの修飾を加えてもよい。このような全ての改変は、本明細書に添付する特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】本発明のHGMS機器の一例の平面図。
【図２】図1のライン2-2に沿ったマイクロカラムの断面図。
【図３】図３Ａは、本発明の加熱フィルムを使用するHGMS機器の一例の部分断面略図。図３Ｂは、参照番号3で示される図3Aの一部の拡大図である。
【図４】図４Ａは、本発明の加熱フィルムを使用するHGMS機器のもう1つの例の部分断面略図であり、図４Ｂは、図4Aの実施形態で用いる金属板の独立した図である。
【図５】図５Ａは、電気抵抗式加熱を採用する本発明のHGMS機器のもう1つの例の部分断面略図であり、図５Ｂは図5Aの実施形態で用いる熱伝導体の独立した上面図であり、図５Ｃは図5Aの実施形態で用いる熱伝導体の独立した側面図である。
【図６Ａ】ペルチェ型加熱／冷却を採用する、本発明のHGMSユニットと連動した外部調節ユニットの部分断面図。
【図６Ｂ】図6Aの外部調節ユニットの端面図。
【図７Ａ】本発明のペルティエ発熱体を使用するHGMS機器の一例の部分断面略図。
【図７Ｂ】図7Aに示す実施形態のライン7-7に沿った断面図。
【図８Ａ】本発明のペルティエ発熱体を使用するHGMS機器のもう1つの例の部分断面略図。
【図８Ｂ】図8Aに示す実施形態のライン8-8に沿った断面図。
【図９Ａ】本発明の空気加熱および冷却を含むHGMS機器の部分断面図。
【図９Ｂ】図9Aに示す実施形態のライン9-9に沿った断面図。
【図１０】本発明の油圧加熱／冷却を含むHGMS機器の部分断面図。
【図１１】本発明の輻射加熱を含むHGMS機器の部分断面図。
【図１２】本発明の誘導加熱を採用するHGMS機器の部分断面図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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