(57)【要約】ジペプチジルペプチダーゼＩＶの結晶、該ジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標、該ジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の３次元構造座標の取得方法、該ジペプチジルペプチダーゼＩＶとジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬との複合体の結晶の３次元構造座標の取得方法、作用薬のファーマコフォーを同定する方法、該作用薬の設計、同定、評価又は検索方法、該作用薬、並びに該３次元構造座標を使用するためのプログラム及びその媒体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ線結晶構造解析により、その３次元構造を側鎖のレベルまで解析しうる分解能を得るに十分な性状を有してなる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの結晶。
【請求項２】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶが、ヒトの全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶにおける膜外に表在する領域からなる可溶性ポリペプチドである、請求項１記載の結晶。
【請求項３】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶが、配列番号：２のアミノ酸配列において、膜貫通領域が除去され、かつ所望により、Ｃ末端側又はＮ末端側にタグペプチドが付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１又は２記載の結晶。
【請求項４】
結晶の空間群がＰ212121であり、単位格子の格子定数が｜ａ｜＝１１８．０±５．０Å、｜ｂ｜＝１２５．９±５．０Å、｜ｃ｜＝１３６．８±５．０Åであり、かつα＝β＝γ＝９０°の斜方晶系である、請求項１〜３いずれか１項に記載の結晶。
【請求項５】
図４に示される構造座標を有してなる、請求項１〜４いずれか１項に記載の結晶。
【請求項６】
タンパク質のゆらぎを介して、図４に示される構造座標とは異なる構造座標を有してなる、請求項１〜４いずれか１項に記載の結晶。
【請求項７】
図４に示される構造座標からなる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標。
【請求項８】
タンパク質のゆらぎを介して、図４に示される構造座標とは異なる構造座標からなる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標。
【請求項９】
タンパク質のゆらぎが、分子振動又は温度により生じ、かつ生体内でジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性を呈する状態である、請求項８記載の３次元構造座標。
【請求項１０】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶが、ヒトの全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶにおける膜外に表在する領域からなる可溶性ポリペプチドである、請求項７〜９いずれか１項に記載の３次元構造座標。
【請求項１１】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶが、配列番号：２のアミノ酸配列において、膜貫通部位の領域が除去され、かつ所望により、Ｃ末端側又はＮ末端側にタグペプチドが付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項７〜１０いずれか１項に記載の３次元構造座標。
【請求項１２】
下記（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740と、
図４に示される構造座標又は該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、該Ser630、Asp708及びHis740のそれぞれの近傍に位置するアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基群と
により特徴づけられる領域
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740と、
図４に示される構造座標又は該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、該Ser630、Asp708及びHis740のそれぞれの近傍に位置するアミノ酸残基群のアミノ酸のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基群と
により特徴づけられる領域、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群と、
図４に示される構造座標又は該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、該アミノ酸残基群の近傍に位置するアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基群と
により特徴づけられる領域、並びに
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群と、
図４に示される構造座標又は該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、該アミノ酸残基群の近傍に位置するアミノ酸残基群のアミノ酸のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基と
により特徴づけられる領域、
からなる群より選択された領域の３次元構造座標を含有してなる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと該ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬との結合又は相互作用に関与するジペプチジルペプチダーゼＩＶ中の領域の３次元構造座標。
【請求項１３】
物理化学的性質が、立体構造における形状の特徴、疎水性、電荷及びｐＫからなる群より選ばれた性質である、請求項１２記載の３次元構造座標。
【請求項１４】
請求項７〜１３いずれか１項に記載の３次元構造座標の全部及び／又は一部に基づき、配列番号：２のアミノ酸配列からなるジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の電子密度図を精密化して、３次元構造座標を得ることを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の３次元構造座標の取得方法。
【請求項１５】
請求項７〜１３いずれか１項に記載の３次元構造座標の全部及び／又は一部を用いることを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと該ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬との複合体の結晶の３次元構造座標の取得方法。
【請求項１６】
請求項７〜１３いずれか１項に記載の３次元構造座標の全部及び／又は一部と、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の立体配置とに基づき、ファーマコフォーを同定することを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬のファーマコフォーを同定する方法。
【請求項１７】
請求項７〜１３いずれか１項に記載の３次元構造座標の全部及び／又は一部に基づき、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに作用しうる化合物を設計、同定、評価又は検索することを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の設計、同定、評価又は検索方法。
【請求項１８】
(i)  請求項７〜１３いずれか１項に記載の３次元構造座標の全部及び／又は一部とジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の立体配置とに基づき、作用薬との結合又は相互作用の標的となるジペプチジルペプチダーゼＩＶ中の領域を同定するステップ、
(ii)  前記領域において、候補化合物中の存在原子又は原子団との間で、共有結合、イオン性相互作用、イオン−双極子間相互作用、双極子−双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、静電気相互作用及び疎水性相互作用からなる群より選ばれた少なくとも１種の分子間相互作用を生じうる原子又は原子団を同定するステップ、並びに
(iii)  前記ステップ(i)及び／又は(ii) の情報に基づき、化合物を設計するステップ、
を含む、請求項１７記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の設計、同定、評価又は検索方法。
【請求項１９】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶと、設計、同定、評価又は検索された候補化合物との間の相互作用を検出し、相互作用が検出された場合に、該相互作用の程度を指標として、該候補化合物が、該ジペプチジルペプチダーゼＩＶに結合しうる化合物であることを同定するステップ
をさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶと、設計、同定、評価又は検索された候補化合物とを接触させ、ついで、該ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性を測定し、該活性が増加又は減少している場合、該増加又は減少の程度を指標として、該設計、同定、評価又は検索された候補化合物が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性に対する亢進作用又は阻害作用を有する化合物であることを同定するステップ
をさらに含む、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１７〜２０いずれか１項に記載の方法によって得られる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬。
【請求項２２】
請求項７〜１３いずれか１項に記載の３次元構造座標の全部及び／又は一部が記録されてなる、請求項７〜１３いずれか１項に記載の３次元構造座標を使用するためのプログラム及びその媒体。
【請求項２３】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶに結合しうる化合物又は該ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性に対する亢進作用又は阻害作用を有する化合物を同定、検索、評価又は設計するための手段を備えてなる、請求項２２記載のプログラム及びその媒体。
【請求項２４】
分子の３次元グラフィック表示を表示する手段をさらに備えてなる、請求項２３記載のプログラム及びその媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの結晶、３次元構造座標及びその応用に関する。より詳しくは、本発明は、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用な、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）の開発に有用な、結晶、３次元構造座標、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の３次元構造座標の取得方法、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと該ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）との複合体の結晶の３次元構造座標の取得方法、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）のファーマコフォーを同定する方法、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性に影響を及ぼす部位の同定方法、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）の設計、同定、評価又は検索方法、該３次元構造座標を使用するためのプログラム及びその媒体並びに免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用な、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（以下、ＤＰＰＩＶとも称す）は、小腸、前立腺、尿細管、胆管等の上皮細胞、活性化したＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等に見出されている細胞膜タンパク質である。かかるＤＰＰＩＶは、生体内においては、Ｃ末端側のＤＰＰＩＶとしての推定活性部位が、細胞外に位置し、Ｎ末端側が細胞質内に位置している。また、前記ＤＰＰＩＶは、免疫系において、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−１３、腫瘍壊死因子−β等の種々のサイトカインやＲＡＮＴＥＳ等のケモカインの活性との関係が示唆されている [臨床免疫、第34巻、増補19、第45-53 頁、科学評論社発行 (2000) 等] 。
【０００３】
前記ジペプチジルペプチダーゼＩＶについて、阻害剤を用いた生化学実験や部位特異的変異により創出した変異体を用いた実験により、いくつかのアミノ酸残基が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性の発現に関与しうることが示されている [例えば、ミスミ(Misumi)ら、Biochim. Biophys. Acta, 1131, 333-336 (1992) 、オガタ(Ogata) ら、Biochemistry, 31, 2582-2587 (1992)等を参照のこと] 。
【０００４】
しかしながら、前記情報からは、活性部位の立体構造を知ることは、困難である。したがって、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと、該ジペプチジルペプチダーゼＩＶに作用する化合物との間の立体構造レベルでの相互作用、該ジペプチジルペプチダーゼＩＶに結合して、作用しうる新規化合物を同定、検索、評価又は設計するための立体構造的な情報を得ることが困難であるのが現状である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の目的は、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用なジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）の設計、同定、評価又は検索のための情報としての３次元構造座標の提供に有用なジペプチジルペプチダーゼＩＶの結晶を提供することにある。本発明の第２の目的は、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用なジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）の設計、同定、評価又は検索のための情報を提供しうる、該結晶の３次元構造座標を提供することにある。また、本発明の第３の目的は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の３次元構造座標の精密化を、より簡便に行なうことができる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の３次元構造座標の取得方法を提供することにある。さらに、本発明の第４の目的は、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用であり、結合力、生物学的活性、生物学的な安定性、生体への吸収性等に優れ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに良好に作用しうるジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）の設計、同定、評価又は検索のための情報を提供しうる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと該ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）との複合体の結晶の３次元構造座標の取得方法を提供することにある。本発明の第５の目的は、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用であり、結合力、生物学的活性、生物学的な安定性、生体への吸収性等に優れ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに良好に作用しうる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）の設計、同定、評価又は検索のための情報を提供することができる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと該ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）のファーマコフォーを同定する方法を提供することにある。本発明の第６の目的は、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用であり、結合力、生物学的活性、生物学的な安定性、生体への吸収性等に優れ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに良好に作用しうるジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）を、論理的、かつ簡便に提供することができる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）の設計、同定、評価又は検索方法を提供することにある。本発明の第７の目的は、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用なジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）を提供することにある。さらに、本発明の第８の目的は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬（例えば、阻害剤）の設計、同定、評価又は検索を迅速、かつ簡便に行なうことができる、プログラム及びその媒体を提供することにある。
【０００６】
即ち、本発明は、
〔１〕  Ｘ線結晶構造解析により、その３次元構造を側鎖のレベルまで解析しうる分解能を得るに十分な性状を有してなる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの結晶、
〔２〕  ジペプチジルペプチダーゼＩＶが、ヒトの全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶにおける膜外に存在する領域からなる可溶性ポリペプチドである、前記〔１〕記載の結晶、
〔３〕  ジペプチジルペプチダーゼＩＶが、配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、膜貫通領域が除去され、かつ所望により、Ｃ末端側又はＮ末端側にタグペプチドが付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである、前記〔１〕又は〔２〕記載の結晶、
〔４〕  結晶の空間群がＰ212121であり、単位格子の格子定数が｜ａ｜＝１１８．０±５．０Å、｜ｂ｜＝１２５．９±５．０Å、｜ｃ｜＝１３６．８±５．０Åであり、かつα＝β＝γ＝９０°の斜方晶系である、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の結晶、
〔５〕  図４に示される構造座標を有してなる、前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の結晶、
〔６〕  タンパク質のゆらぎを介して、図４に示される構造座標とは異なる構造座標を有してなる、前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の結晶、
〔７〕  図４に示される構造座標からなる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標、
〔８〕  タンパク質のゆらぎを介して、図４に示される構造座標とは異なる構造座標からなる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標、
〔９〕  タンパク質のゆらぎが、分子振動又は温度により生じ、かつ生体内でジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性を呈する状態である、前記〔８〕記載の３次元構造座標、
〔１０〕  ジペプチジルペプチダーゼＩＶが、ヒトの全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶにおける膜外に存在する領域からなる可溶性ポリペプチドである、前記〔７〕〜〔９〕いずれか１項に記載の３次元構造座標、
〔１１〕  ジペプチジルペプチダーゼＩＶが、配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、膜貫通部位の領域が除去され、かつ所望により、Ｃ末端側又はＮ末端側にタグペプチドが付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである、前記〔７〕〜〔１０〕いずれか１項に記載の３次元構造座標、
〔１２〕  下記（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740と、
図４に示される構造座標又は該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、該Ser630、Asp708及びHis740のそれぞれの近傍に位置するアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基群と
により特徴づけられる領域；
（ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740と、
図４に示される構造座標又は該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、該Ser630、Asp708及びHis740のそれぞれの近傍に位置するアミノ酸残基群のアミノ酸のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基群と
により特徴づけられる領域；
（ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群と、
図４に示される構造座標又は該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、該アミノ酸残基群の近傍に位置するアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基群と
により特徴づけられる領域；並びに
（ｄ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群と、
図４に示される構造座標又は該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、該アミノ酸残基群の近傍に位置するアミノ酸残基群のアミノ酸のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基と
により特徴づけられる領域；
からなる群より選択された領域の３次元構造座標を含有してなる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと該ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬との結合又は相互作用に関与するジペプチジルペプチダーゼＩＶ中の領域の３次元構造座標、
〔１３〕  物理化学的性質が、立体構造における形状の特徴、疎水性、電荷及びｐＫからなる群より選ばれた性質である、前記〔１２〕記載の３次元構造座標、
〔１４〕  前記〔７〕〜〔１３〕いずれか１項に記載の３次元構造座標の全部及び／又は一部に基づき、配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の電子密度図を精密化して、３次元構造座標を得ることを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の３次元構造座標の取得方法、
〔１５〕  前記〔７〕〜〔１３〕いずれか１項に記載の３次元構造座標の全部及び／又は一部を用いて、３次元構造座標を得ることを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと該ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬との複合体の結晶の３次元構造座標の取得方法、
〔１６〕  前記〔７〕〜〔１３〕いずれか１項に記載の３次元構造座標の全部及び／又は一部と、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の立体配置とに基づき、ファーマコフォーを同定することを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬のファーマコフォーを同定する方法、
〔１７〕  前記〔７〕〜〔１３〕いずれか１項に記載の３次元構造座標の全部及び／又は一部に基づき、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに作用しうる化合物を設計、同定、評価又は検索することを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の設計、同定、評価又は検索方法、
〔１８〕  (i)前記〔７〕〜〔１３〕いずれか１項に記載の３次元構造座標の全部及び／又は一部とジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の立体配置とに基づき、作用薬との結合又は相互作用の標的となるジペプチジルペプチダーゼＩＶ中の領域を同定するステップ、
(ii)前記領域において、候補化合物中の存在原子又は原子団との間で、共有結合、イオン性相互作用、イオン−双極子間相互作用、双極子−双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、静電気相互作用及び疎水性相互作用からなる群より選ばれた少なくとも１種の分子間相互作用を生じうる原子又は原子団を同定するステップ、並びに
(iii)前記ステップ(i)及び／又は(ii) の情報に基づき、化合物を設計するステップ、
を含む、前記〔１７〕記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の設計、同定、評価又は検索方法、
〔１９〕  ジペプチジルペプチダーゼＩＶと、設計、同定、評価又は検索された候補化合物との間の相互作用を検出し、相互作用が検出された場合に、該相互作用の程度を指標として、該候補化合物が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに結合しうる化合物であることを同定するステップ
をさらに含む、前記〔１８〕記載の方法、
〔２０〕  ジペプチジルペプチダーゼＩＶと、設計、同定、評価又は検索された候補化合物とを接触させ、ついで、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性を測定し、該活性が増加又は減少している場合、該増加又は減少の程度を指標として、該設計、同定、評価又は検索された候補化合物が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性に対する亢進作用又は阻害作用を有する化合物であることを同定するステップ
をさらに含む、前記〔１８〕又は〔１９〕記載の方法、
〔２１〕  前記〔１７〕〜〔２０〕いずれか１項に記載の方法によって得られる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬、
〔２２〕  前記〔７〕〜〔１３〕いずれか１項に記載の３次元構造座標の全部及び／又は一部が記録されてなる、前記〔７〕〜〔１３〕いずれか１項に記載の３次元構造座標を使用するためのプログラム及びその媒体、
〔２３〕  ジペプチジルペプチダーゼＩＶに結合しうる化合物又はジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性に対する亢進作用又は阻害作用を有する化合物を同定、検索、評価又は設計するための手段を備えてなる、前記〔２２〕記載のプログラム及びその媒体、並びに
〔２４〕  分子の３次元グラフィック表示を表示する手段をさらに備えてなる、前記〔２３〕記載のプログラム及びその媒体、
に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本明細書において、アミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された下記略号を用いて表される。また、特に明示しない限り、ペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように表示され、また、Ｎ末端が１番目の残基になるように表示される。Ａｌａ：アラニン残基；Ａｓｐ：アスパラギン酸残基；Ｇｌｕ：グルタミン酸残基；Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基；Ｇｌｙ：グリシン残基；Ｈｉｓ：ヒスチジン残基；Ｉｌｅ：イソロイシン残基；Ｌｙｓ：リジン残基；Ｌｅｕ：ロイシン残基；Ｍｅｔ：メチオニン残基；Ａｓｎ：アスパラギン残基；Ｐｒｏ：プロリン残基；Ｇｌｎ：グルタミン残基；Ａｒｇ：アルギニン残基；Ｓｅｒ：セリン残基；Ｔｈｒ：スレオニン残基；Ｖａｌ：バリン残基；Ｔｒｐ：トリプトファン残基；Ｔｙｒ：チロシン残基；Ｃｙｓ：システイン残基。
【０００８】
本発明の結晶は、Ｘ線結晶構造解析により、その３次元構造を側鎖のレベルまで解析しうる分解能を得るに十分な性状を有してなる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの結晶である。
【０００９】
前記「３次元構造を側鎖のレベルまで解析しうる分解能を得るに十分な性状」としては、例えば、
（１）結晶の単位胞中の分子が、高い規則性で繰返した状態であること、すなわち、高分解能の回折を与えること、
（２）形及び大きさが適当であること；例えば、少なくとも１辺が約０．２〜約０．５ｍｍに成長した結晶であって、好ましくは３辺とも同様に成長した角型の結晶又は幅、厚みが約０．２ｍｍ以上の針状結晶等が望ましい、
（３）化学的安定性、力学的安定性、物理学的安定性を有すること、
等をいう。かかる用語は、比較的分子量の大きなポリペプチドであるジペプチジルペプチダーゼＩＶの場合、３Å以下、好ましくは２．８Å以下、より好ましくは２．６Å以下の分解能を得るに十分な性状を意味する。
【００１０】
本発明の結晶の作製に用いられるジペプチジルペプチダーゼＩＶは、結晶を形成させるに十分に高い純度であればよい。本発明において、結晶の作製に用いられるジペプチジルペプチダーゼＩＶとしては、ヒトの全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶにおける膜外に存在する領域からなる可溶性ポリペプチドが挙げられ、例えば、配列番号：２のヒトの全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶのアミノ酸配列から、Ｎ末端側の膜貫通領域〔すなわち、膜貫通部位の領域（配列番号：２の少なくともアミノ酸番号：１〜２８を含む領域、好ましくは、アミノ酸番号：１〜３２の領域）〕が除去され、かつ所望により、Ｃ末端側又はＮ末端側にタグペプチドが付加されたポリペプチドが挙げられる。具体的には、例えば、(I)配列番号：２に示されるヒトの全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶのアミノ酸配から、Ｎ末端側に存在する膜貫通領域が除去されたポリペプチド、(II)前記(I)のポリペプチドのＣ末端側又はＮ末端側にタグペプチドが付加されたポリペプチドが挙げられる。かかるポリペプチドは、膜貫通領域が除去されているため、膜へのアンカリングを防ぐことができ、かつ分泌型であり、可溶性であるという優れた性質を有する。前記タグペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、ポリヒスチジンペプチド（４〜２０のヒスチジン残基からなるオリゴペプチド）等がタグペプチドとして好適に用いられる。
【００１１】
配列番号：２は、ヒトの大腸由来の全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶのアミノ酸配列を示す。
【００１２】
全長型ジペプチジルペプブチダーゼＩＶとは、Ｎ末端側の膜貫通部位を含有する領域を含むジペプチジルペプチダーゼＩＶポリペプチドを意味する。全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶとしては、配列番号：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられるが、これに限定されず、その自然発生的な変異体、人為的に改変された変異体、異種生物に由来するホモログ及びオルソログ等が包含される。
【００１３】
すなわち、全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶとしては、配列番号：２のアミノ酸配列を含有したポリペプチドの他、保存的置換変異体（conservative substitution variants）、自然発生対立変異体（naturally occurring allelic variants）等が挙げられる。また、全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶとしては、配列番号：２のアミノ酸配列を含有したポリペプチドと比較して、少なくとも１個、すなわち、１又はそれ以上の保存的アミノ酸置換（conservative amino acid substitutions）を有するポリペプチドが挙げられる。
【００１４】
前記したポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を含有したポリペプチドと同様の生物学的活性（すなわち、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性）を有するものであればよい。具体的には、例えば、配列番号：２のアミノ酸配列の全長と比較して、通常、約８０％以上、好ましくは、約９０％以上、より好ましくは、約９５％以上のアミノ酸レベルのホモロジーを有するポリペプチド、配列番号：１の核酸配列（ヒト大腸の全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶをコードする核酸配列）からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる核酸又はその相補物にコードされるポリペプチド、配列番号：２のアミノ酸配列において、少なくとも１個、すなわち、１又は複数個、好ましくは、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド等が挙げられる。
【００１５】
アミノ酸の欠失、置換又は付加は、生物学的活性〔すなわち、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性〕が失われない程度であればよく、通常１〜約１５０個、好ましくは１〜約７５個、より好ましくは１〜約４０個である。
【００１６】
結晶化は、目的のタンパク質を含む溶液（タンパク質溶液という）を過飽和状態にすることにより、タンパク質が溶液状態から非溶解状態になり、特定の条件を満たす場合に、結晶として析出するという性質に基づき、行なわれる。具体的には、タンパク質の析出は、下記１．又は２．：
１．タンパク質の実効濃度を上昇させること：
すなわち、タンパク質溶液に、塩、ポリエチレングリコール、有機溶媒等の沈殿剤を添加すること；タンパク質溶液中における溶媒量を蒸発等により減少させること等
２．タンパク質分子の間の反発力を減少させるか、あるいは引力を増大させること
すなわち、タンパク質溶液にアルコール等の有機溶媒を添加すること；タンパク質溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）又は温度を変化させること等
の操作によって行なわれうる。
【００１７】
結晶化の条件として、水素イオン濃度（ｐＨ）、用いる緩衝液の種類及びその濃度、添加する沈殿剤の種類及びその濃度、タンパク質濃度、塩濃度、温度等の物理的及び化学的な因子が関与しうる。かかる因子の調節及び検討の手法としては、例えば、ブルンデル(Blundell, T. L.) ら, PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY, 59-82 (1976), アカデミックプレス(Academic Press)社発行等に記載のバッチ法、透析法、蒸気拡散法（ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法等）等が挙げられる。
【００１８】
結晶化の手法としては、前記バッチ法、透析法、蒸気拡散法等が挙げられる。かかる手法により、水素イオン濃度（ｐＨ）、用いる緩衝液の種類及び濃度、添加する沈殿剤の種類及び濃度等の物理的及び化学的な因子、さらには、タンパク質濃度、塩濃度、温度等の物理的及び化学的な因子の決定を行ないうる。
【００１９】
水素イオン濃度（ｐＨ）は、緩衝液により調整されうる。かかる緩衝液は、幅広い範囲のｐＨにおいて緩衝能を有し、結晶化の際に用いる溶液中における共存イオン、沈殿剤等との間での非タンパク質性の結晶の析出を抑制しうる緩衝液が望ましい。かかる緩衝液としては、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、カコジル酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。
【００２０】
沈殿剤は、タンパク質の実効濃度を上昇させること、又はタンパク質溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）を変化させることが可能である物質であればよい。一般的には、前記沈殿剤としては、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム等の塩；約２００、約１０００、約２０００、約４０００、約６０００、約８０００、約２００００等の各種平均分子量のポリエチレングリコール；２−メチル−２，４−ペンタジオール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン等の有機溶媒等が挙げられる。
【００２１】
前記タンパク質濃度は、結晶化するに適した濃度であればよく、例えば、１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、５〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、７〜１５ｍｇ／ｍｌであることが望ましい。
【００２２】
温度条件は、３〜２５℃、好ましくは、１２〜２２℃であることが望ましい。
【００２３】
前記バッチ法により、結晶化を行なう場合、結晶化は、沈殿剤、緩衝液等を含有した沈殿剤溶液を、ジペプチジルペプチダーゼＩＶを含有した溶液の上層になるように、徐々に添加して、混合物を得ること、又は該ジペプチジルペプチダーゼＩＶを含有した溶液を、該沈殿剤溶液の上層になるように、徐々に添加して、混合物を得ること
により行なわれうる。ここで、前記混合物は、密閉容器内で放置される。
【００２４】
前記透析法により、結晶化を行なう場合、結晶化は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶを含有した溶液をサイズ排除半透膜内に配置し、該サイズ排除半透膜の外部に外液として、前記沈殿剤溶液を配置することにより、該半透膜を介して、外液を、該ジペプチジルペプチダーゼＩＶを含有した溶液中に拡散させることにより行なわれうる。
【００２５】
前記蒸気拡散法におけるハンギングドロップ法により、結晶化を行なう場合、結晶化は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶを含有した溶液と前記沈殿剤溶液との混合溶液を、密閉容器中において、前記沈殿剤溶液をリザーバー溶液として入れたリザーバー溶液貯留部の上部空間に位置するように配置させて、ぶら下げることにより行なわれ得、ここで、該リザーバー溶液貯留部中の該リザーバー溶液の蒸気圧は、該混合溶液の蒸気圧より低くなるように設定される。
【００２６】
前記蒸気拡散法におけるシッティングドロップ法により、結晶化を行なう場合、結晶化は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶを含有した溶液と前記沈殿剤溶液との混合溶液を、密閉容器中において、前記沈殿剤溶液をリザーバー溶液として入れたリザーバー溶液貯留部の液面よりも高い位置に配置させることにより行なわれ得、ここで、該リザーバー溶液貯留部中の該リザーバー溶液の蒸気圧は該混合溶液の蒸気圧より低くなるように設定される。
【００２７】
結晶化は、良質で大きな結晶を得るという観点から、シッティングドロップ法より行なわれうる。
【００２８】
得られた結晶が、Ｘ線構造解析に供するに不十分な結晶である場合、得られた結晶を種結晶として用い、マクロシーディング法、マイクロシーディング法等のシーディング法等により結晶を成長させてもよい。
【００２９】
前記マクロシーディング法を行なう場合、種結晶は、例えば、顕微鏡下の操作で単離可能な単結晶であり、外形がきれいな（優れた結晶性を有する）結晶が望ましい。また、前記種結晶は、前記沈殿剤溶液を、例えば、０．５〜１．０倍に希釈して得られた溶液等のドロップにより洗浄することが望ましい。種結晶のシーディングに用いる溶液は、結晶は成長するが、結晶核は生成しない程度の過飽和度のタンパク質溶液であることが望ましい。一方、マイクロシーディング法を行なう場合、種結晶の形状、大きさは、特に限定されるものではない。
【００３０】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ及び該ジペプチジルペプチダーゼＩＶをコードするｃＤＮＡの配列情報は、既知情報源〔ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：Ｘ６０７０８；ミスミ(Misumi)ら, Biochim. Biophys. Acta, 1131, 333-336, (1992)あるいはＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：Ｍ８０５３６；ダームール（Ｄａｒｍｏｕｌ）ら、J.Biol.Chem., 267, 4824-4833, (1992)など〕から得られる。したがって、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ又はその可溶性ポリペプチドは、前記配列情報をもとに、慣用の遺伝子工学的手法を用いて製造されうる。
【００３１】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ又はその可溶性ポリペプチドの製造に用いられる核酸は、コードされたポリペプチドが、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性を呈するものであればよい。例えば、ヒトの全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶから、Ｎ末端側に存在する膜貫通領域（少なくともアミノ酸番号：１〜２８を含む領域、好ましくは、アミノ酸番号：１〜３２の領域）が除去され、かつ所望により、そのアミノ酸配列のＣ末端側又はＮ末端側にタグペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸である。
【００３２】
かかる核酸は、慣用のＤＮＡ組換え技術により、例えば、全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶをコードする核酸若しくはその−部を含む断片を取得し、得られた断片を適宜アレンジすることにより得られうる。
【００３３】
配列番号：１は、ヒトの腸(colon)の全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶをコードする核酸の配列を示す。
全長型ジペプチジルペプチダーゼＩＶをコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）としては、例えば、配列番号：１の核酸配列のヒトの核酸を含有した核酸が挙げられるが、これに限定されず、自然発生的な変異体、人為的に改変された変異体、異種生物に由来するホモログ及びオルソログ等が挙げられる。
【００３４】
すなわち、配列番号：１の核酸配列を含有した核酸のほか、配列番号：１の核酸配列を含有した核酸とストリンジェントな条件下、より好ましくは、ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸又はその相補物（相補的配列を有する核酸）が挙げられる。
【００３５】
前記核酸の具体例としては、例えば、配列番号：１の核酸配列と、通常、約７０％以上、好ましくは、約８０％以上、より好ましくは、約８５％以上、さらに好ましくは、約９０％以上、さらに−層好ましくは、約９５％以上の相同性を有するものであり、また、前記核酸にコードされたポリペプブチドが、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性を有するものであることが好ましい。
【００３６】
前記ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性は、例えば、１．５ｍｌの反応混合物〔組成：１．５ｍＭ  基質（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−パラニトロアニリド）、７１ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ８．７）〕中、３７℃で１０分間インキュベートし、遊離したパラニトロアニリドを、４０５ｎｍにおける吸光度で測定することにより測定されうる。なお、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのパラニトロアニリドを遊離させる酵素量として定義される。
【００３７】
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダゼーションは、通常のストリンジェントな条件では、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０〜７０℃の温度条件下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行ない、必要に応じ、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で、予備洗浄を行ない、その後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行なうことにより実施されうる。また、ハイブリダイゼーションは、より高いストリンジェンシーを有する条件（ハイストリンジェントな条件）では、前記において、洗浄を０．１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で行なうことにより実施されうる。
【００３８】
結晶化に用いられるジペプチジルペプチダーゼＩＶは、結晶を形成させうる純度であり、かかる純度は、慣用の純度確認手段（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により画分を泳動し、銀染色法により可視化する方法等）により確認されうる。
【００３９】
結晶のＸ線構造解析データは、本発明の結晶を、当業者に公知のＸ線による結晶構造解析[例えば、ブルンデル(Blundell, T. L.) ら, PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY, 59-82 (1976), アカデミックプレス(Academic Press)社発行等を参照のこと]に供することにより得られ得、それにより、該結晶の３次元構造座標（各原子の空間的な位置関係を示す値）及び３次元構造モデルが得られうる。具体的には、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標は、１）本発明の結晶に、単色化されたＸ線を照射し、Ｘ線の回折像を得るステップ、２）該Ｘ線の回折像からＸ線回折強度データを得るステップ、３）フーリエ変換により、電子密度図を得るステップ、４）結晶に用いたポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、電子密度図にポリペプチド鎖及びその側鎖を割りつけるステップ、を含む手順により、原子座標として得られる。さらには、３次元構造は、３次元構造座標を基に、分子モデリングすることにより、３次元構造が明らかにされる。したがって、本発明の結晶より得られるジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標も本発明の範囲に含まれる。
【００４０】
本発明の結晶のＸ線回折強度データにより、結晶の結晶学的パラメーターが得られる。本発明の結晶は、空間群がＰ２1２1２1であり、単位格子の格子定数が｜ａ｜＝１１８．０±５．０Å、｜ｂ｜＝１２５．９±５．０Å、｜ｃ｜＝１３６．８±５．０Åであり、α＝β＝γ＝９０°の斜方晶系の結晶である。前記結晶は、Ｘ線結晶構造解析により、分解能２．６Å、すなわち、ポリペプチドの側鎖のレベルまで解析しうる分解能を得るに十分な性状を有する結晶である。
【００４１】
同一のタンパク質が、異なる条件でも結晶化しうることは、当業者において周知の事実である。したがって、本発明は、前記結晶化条件にのみに限定されるものではなく、実質的に本発明と同一の結晶学的定数を与える結晶も、本発明の範囲に含まれる。
【００４２】
本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの結晶は、より具体的には、図４に示される構造座標、又はタンパク質のゆらぎを介して、該図４に示される構造座標とは異なる構造座標を有するものである。
【００４３】
また、本発明の結晶は、用いられたジペプチジルペプチダーゼＩＶに類似の３次元構造を有するポリペプチド、例えば、他の生物種由来であるジペプチジルペプチダーゼＩＶ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ様タンパク質、ホモログタンパク質等の結晶化を行なう際の種結晶として用いられうる。
【００４４】
本発明の結晶にＸ線を照射する場合、後述の実施例に記載のように、低温測定を行なってもよい。
【００４５】
前記Ｘ線構造解析データは、ＭＯＳＦＩＬＭプログラムパッケージ（バージョン６．１）を用いてＸ線回折における強度を評価し、構造因子に変換される。また、位相の情報を得るために、例えば、実施例に記載のように、重原子置換法等を行なうことができる。
【００４６】
構造解析には、ＣＣＰ４ (Collaborative Computational Project, Number 4. 1994. "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography". Acta Cryst. D50, 760-763)プログラム等が用いられる。
【００４７】
本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標は、例えば、以下のようにして得られうる。最初に、フーリエ変換計算を、２種類の水銀の同型置換体結晶から得られた回折強度と、自然型結晶から得られた回折強度との差を用い、得られたパターソン図上において重原子（水銀）が与える大きなピークを精査することにより、実空間の単位格子内でのそれぞれの水銀原子の位置を決定することにより行なう。得られた水銀原子の位置座標を用いて、自然型結晶の結晶構造因子の位相を決定する。さらに、自然型結晶の結晶構造因子と２種類の水銀同型置換体結晶の結晶構造因子とを用いて精密化を行ない、それぞれの水銀原子の座標をより正確に決定する。精密化された水銀原子の座標から計算される自然型結晶の結晶構造因子の位相を用いて、実空間におけるジペプチジルペプチターゼＩＶの結晶の電子密度図を得る。さらに、溶媒領域の電子密度図の平滑化とヒストグラムマッチングとを行なって電子密度図の改良を行ない、分子モデルを構築するのに必要十分な電子密度図を得ることができる。ついで、ＱＵＡＮＴＡ（アクセルリス社製）を用いて、電子密度図上にジペプチジルペプチターゼＩＶのアミノ酸残基に相当する部位を同定し、分子モデルを構築し、３次元構造座標を得る。
【００４８】
本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標を図４に示す。図４は、当業者に一般的に用いられている表記法であるプロテイン・データ・バンクの形式に従って、得られた３次元構造座標を示す。
【００４９】
なお、図４に示される３次元構造座標は、結晶内における単位格子の原点を３次元空間における原点として表記されたものである。なお、得られた分子モデルの正確さの指標とされるＲ因子は、２４．８９％、フリーＲ因子は、３０．１５％である。また、立体構造の理想状態からの原子間結合距離のずれ(rms-deviation) 及び結合角のずれは、それぞれ、０．００６Å及び１．３０５°である。例えば、本発明の３次元構造座標をコンピューターによる計算に用いる場合、各原子の相対的な配置を変化させずに、３次元空間内で並進、回転、対称等の数学的な移動操作を施した結果として得られる新たな構造座標も本発明の範囲に含まれる。さらに、本発明の３次元構造座標の全部のみならず、その一部も、本発明の範囲に含まれる。
【００５０】
本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標によれば、例えば、図３に示されるように、３次元構造モデルの立体図を３次元グラフィック表示し、構造活性相関、定量的構造活性相関を評価するのに用いられうる。また、図４に示される３次元構造座標により、本発明の結晶の構造的特徴をより具体的に示しうる。かかる３次元構造モデルによる、構造活性相関又は定量的構造活性相関の評価も本発明の範囲に含まれる。
【００５１】
本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標によれば、非対称単位中に２７３分子の結合水を有し、ジペプチジルペプチターゼＩＶ  １分子あたり５分子のＮ−アセチルグルコサミン残基を有するというジペプチヂルペプチダーゼＩＶの１つの特徴が見出される。
【００５２】
本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標によれば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する既知の作用薬の原子若しくは原子団が、分子間相互作用を介して相互作用する、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの側鎖の原子若しくは原子団の情報を得ることができる。
【００５３】
さらに、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標によれば、作用薬との結合又は分子間相互作用を生じやすいジペプチジルペプチダーゼＩＶ中の領域の情報を得ることもできる。
【００５４】
また、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標によれば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ以外のタンパク質には見出されないジペプチジルペプチダーゼＩＶに特異的な構造の情報を得ることができる。したがって、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ以外のタンパク質を標的とする作用薬がジペプチジルペプチダーゼＩＶにも作用する場合、該作用薬のより高い選択性が、デザインされうる。
【００５５】
前記分子間相互作用としては、共有結合、イオン性相互作用、イオン−双極子間相互作用、双極子−双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、静電気相互作用、疎水性相互作用等が挙げられる。
なお、本明細書においては、前記分子間相互作用を介して相互作用する作用薬の原子又は原子団及びジペプチジルペプチダーゼＩＶの側鎖の原子又は原子団を「ファーマコフォー」という。
【００５６】
また、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標によれば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ以外のタンパク質には見出されないジペプチジルペプチダーゼＩＶに特異的な構造の情報を提供することができる。
【００５７】
また、例えば、Ｘ線回折における測定条件が異なる場合、あるいは多次元のＮＭＲを用いて、溶液中における複合体の３次元構造を解析した場合等には、前記図４に示される３次元構造座標と異なる場合もある。かかる３次元構造座標は、タンパク質のゆらぎ等により変動するものであり、本発明の範囲に含まれる。
【００５８】
本明細書においては、前記「タンパク質のゆらぎ」とは、分子振動、温度等により生じ、かつ生体中において、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性を呈しうる構造変化を伴う状態をいう。
【００５９】
また、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標によれば、該ジペプチジルペプチダーゼＩＶの各種活性阻害剤を用いた実験により推定される活性に関与するアミノ酸残基、Ser630、Asp708及びHis740が、１次配列上では離れた位置に存在しているにもかかわらず、近傍に存在するというジペプチヂルペプチダーゼＩＶの１つの特徴が見出される。具体的には、Asp708のＯδ2原子とHis740のＮδ1 原子との間の距離、及びHis740のＮε2 原子とSer630のＯγ原子との間の距離が、水素結合可能な距離にある。
【００６０】
したがって、本発明には、下記（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740と、
図４に示される構造座標又は該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、該Ser630、Asp708及びHis740のそれぞれの近傍に位置するアミノ酸残基群の全部又はその一部と
により特徴づけられる領域,、
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740と、
図４に示される構造座標又は該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、該Ser630、Asp708及びHis740のそれぞれの近傍に位置するアミノ酸残基群のアミノ酸のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群の全部又はその一部と
により特徴づけられる領域、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群と、
図４に示される構造座標又は該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、該アミノ酸残基群の近傍に位置するアミノ酸残基群の全部又はその一部と
により特徴づけられる領域、並びに
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群と、
図４に示される構造座標又は該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、該アミノ酸残基群の近傍に位置するアミノ酸残基群のアミノ酸のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群の全部又はその一部と
により特徴づけられる領域、
からなる群より選択された領域の３次元構造座標を含む、ジペプチジルペプチダーゼＩＶとその作用薬との結合又は相互作用に関与するジペプチジルペプチダーゼＩＶ中の領域の３次元構造座標も含まれる。
【００６１】
本明細書において、「近傍（の領域）」とは、アミノ酸残基に対して、共有結合、イオン性相互作用、イオン−双極子間相互作用、双極子−双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、静電気相互作用、疎水性相互作用等に関与する領域、具体的には、１０Å以内、好ましくは、８Å以内、より好ましくは、５Å以内の領域をいう。
【００６２】
前記物理化学的性質としては、立体構造における形状の特徴、疎水性、電荷、ｐＫ等が挙げられる。
【００６３】
前記「生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸」は、図４に示される３次元構造座標におけるアミノ酸残基の側鎖を、例えば、生物学的等価性(bioisosterism) を示す他の側鎖に置換して得られたアミノ酸アナログ残基であってもよい。あるいは、例えば、図４に示される３次元構造座標におけるアミノ酸残基は、下記グループＩ〜ＶＩ：
Ｉ    グリシン、アラニン；
ＩＩ    バリン、イソロイシン、ロイシン；
ＩＩＩ    アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；
ＩＶ    セリン、スレオニン；
Ｖ    リジン、アルギニン；
ＶＩ    フェニルアラニン、チロシン；
のいずれかのグループにおいて、同じグループに属する他のアミノ酸の残基に置換されてもよい。
【００６４】
なお、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標によれば、ポリペプチドの３次元構造座標は、本発明の結晶の作製に用いられるジペプチジルペプチダーゼＩＶとアミノ酸配列レベルで高い相同性（例えば、少なくとも２０％、好ましくは、３０％以上、より好ましくは４０％以上）を示すポリペプチドであれば、他の生物種由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ又はジペプチジルペプチダーゼＩＶ様タンパク質であっても、正確なアミノ酸配列が決定されれば、容易に導き出されうる。
【００６５】
さらには、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標は、本発明の結晶の作製に用いられるジペプチジルペプチダーゼＩＶと有意な相同性を有するアミノ酸配列を有する他のタンパク質の結晶等のＸ線結晶構造解析において使用されうる。具体的には、分子置換法 [例えば、ブルンデル(Blundell, T. L.) ら, PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY, 446-464 (1976), アカデミックプレス(Academic Press)社発行等を参照のこと] により、構造座標が未知の上記のようなタンパク質の結晶においても、その構造座標を決定する際に、重原子同型置換法を用いることなく、その結晶のＸ線回折像より得られる構造因子から、その３次元構造座標を迅速、かつ容易に導き出すことができる。
【００６６】
本明細書において、前記「有意な相同性」とは、アミノ酸配列間において、２０％以上、好ましくは３０％以上一致している場合をいう。
【００６７】
分子置換法を行なう際には、例えば、Ｘ−ＰＬＯＲ又はＣＮＸ（アクセルリス社製）、ＡＭＯＲＥ[ＣＣＰ４(Collaborative Computational Project, Number4), Acta Crystallogr. D50, 670-673(1994)のプログラムの１つ]等のプログラムを、該プログラムが動作可能なコンピューターで実行することができる。ここで、分子置換法が適用可能であるかどうかは、実際に目的の結晶のＸ線回折像から計算された構造因子に分子置換法を適用し、有意な解が得られることにより、判断されうる。
【００６８】
すなわち、分子置換法により構造解析して得られた３次元構造座標は、有意な解が得られるものであれば、本発明の範囲に含まれる。また、本発明は、前記手法により導き出された他の生物種のジペプチジルペプチダーゼＩＶ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ様タンパク質、すなわち、ホモログタンパク質等の３次元構造座標をも包含する。
【００６９】
したがって、本発明により、本発明の３次元構造座標に基づき、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含有したジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の電子密度図を精密化して、３次元構造座標を得ることを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の３次元構造座標の取得方法も提供される。また、同様に、本発明の３次元構造座標に基づき、ジペプチジルペプチダーゼＩＶとジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用薬との複合体の結晶の３次元構造座標の取得方法も提供される。
【００７０】
本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標によれば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの公知の作用薬、例えば、阻害剤等との結合領域を解析すること、又はジペプチジルペプチダーゼＩＶと、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの公知の作用薬との間の相互作用をシミュレーションすることに基づき、ジペプチジルペプチダーゼＩＶとジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用薬との間の結合又は相互作用の標的となる領域・部位の同定方法が提供される。
【００７１】
また、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標とジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用薬の立体配置とに基づき、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用薬のファーマコフォーを同定することができる。前記ファーマコフォーを同定する方法も提供される。前記方法によれば、より結合力が高い、生物学的活性が高い、生物学的な安定性が高い、熱力学的な安定性が高い、生体への吸収性が高い、毒性が低い等の優れた性質を有する作用薬のデザインに有用である。
【００７２】
具体的には、例えば、１）ジペプチジルペプチダーゼＩＶと、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの公知の作用薬、例えば、阻害剤等との複合体の結晶を得、かかる結晶の３次元構造座標を、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標とジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用薬の立体配置とに基いて取得し、それにより、該ジペプチジルペプチダーゼＩＶと、該作用薬との結合領域の３次元構造座標を取得すること、又は２）本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標とジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の立体配置とに基いて、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する公知の作用薬との間の分子間相互作用をシミュレーションすること
等により、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと該ジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用薬との結合又は相互作用に関与する標的となる領域・部位が同定されうる。
【００７３】
前記複合体の結晶は、例えば、本発明の結晶を、作用薬を含有した溶液中でインキュベートすること、前記ジペプチジルペプチダーゼＩＶと作用薬との複合体を形成させて、得られた複合体を結晶化させること等により得られうる。
【００７４】
また、前記複合体の結晶の３次元構造座標を取得する場合には、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標により規定される３次元構造モデルを利用して、差フーリエ図を計算することにより、前記複合体における作用薬の立体構造が容易に得られ、該ジペプチジルペプチダーゼＩＶと該作用薬との特異的な相互作用形式及び相互作用部位を容易に明らかにすることができる。
【００７５】
また、前記分子間相互作用をシミュレーションする場合、例えば、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標とジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用薬の立体配置とに基いて、共有結合、イオン性相互作用、イオン−双極子間相互作用、双極子−双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、静電気相互作用、疎水性相互作用等が生じうる空間領域、残基等をシミュレーションできる。
【００７６】
さらに、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標によれば、ジペプチジルペプチーゼＩＶの活性中心、該活性中心に間接的に作用する部位、作用薬との結合又は相互作用に関与する領域・部位等の３次元構造座標又は該３次元構造座標に基づく３次元構造モデルを得、それにより、ジペプチヂルペプチーゼＩＶに特異的に作用する化合物の設計、同定、評価又は検索を行なうことができる。
【００７７】
例えば、図４の構造座標及び該構造座標により規定される三次元構造モデルにおいて、Ser630、Asp708及びHis740と、該Ser630、Asp708及びHis740の近傍に位置するアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基群とにより特徴づけられる領域に基づき、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性を調節しうる化合物を設計、同定、評価又は検索することができる。
【００７８】
したがって、本発明により、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の設計、同定、評価又は検索方法が提供される。
【００７９】
本発明の作用薬の設計、同定、評価又は検索方法は、本発明の３次元構造座標に基づき、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに作用しうる化合物を設計、同定、評価又は検索することを１つの大きな特徴とする。
【００８０】
本発明の作用薬の設計、同定、評価又は検索方法によれば、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標に基づくため、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ以外のタンパク質には見出されないジペプチジルペプチダーゼＩＶに特異的な構造の情報を得ることができる。したがって、本発明の作用薬の設計、同定、評価又は検索方法によれば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の選択性を高めることができるという優れた効果を発揮する。
【００８１】
また、本発明の作用薬の設計、同定、評価又は検索方法によれば、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標に基づくため、コンピューター等を用いて、視覚的検討及び／又はエネルギー計算をすることができる。したがって、公知の阻害剤よりも結合力が高い、生物学的活性が高い、生物学的な安定性が高い、熱力学的な安定性が高い、生体への吸収性が高い、毒性が低い等の優れた性質を有する化合物を設計、同定、評価又は検索することができ、３次元空間における論理的設計をすることができるという優れた効果を発揮する。
【００８２】
本明細書において、「作用薬」としては、活性を阻害又は亢進する化合物（すなわち、阻害剤又は亢進剤）が挙げられ、天然物化合物又は合成化合物のいずれでもよく、高分子化合物又は低分子化合物のいずれでもよい。
【００８３】
本発明の作用薬の設計、同定、評価又は検索方法としては、具体的には、
(i)  本発明の３次元構造座標の全部及び／又は一部とジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の立体配置とに基づき、該作用薬との結合又は相互作用の標的となるジペプチジルペプチダーゼＩＶ中の領域を同定するステップ、
(ii)  前記領域において、候補化合物中の存在原子又は原子団との間で、共有結合、イオン性相互作用、イオン−双極子間相互作用、双極子−双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、静電気相互作用及び疎水性相互作用からなる群より選ばれた少なくとも１種の分子間相互作用を生じうる対応の原子又は原子団を同定するステップ、並びに
(iii)  前記ステップ(i)及び／又は(ii) の情報に基づき、化合物を設計するステップ、
を含む方法が挙げられる。
【００８４】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶに結合しうる化合物の設計、同定、評価又は検索に用いられる３次元構造座標としては、３次元空間内に固定された座標であってもよく、３次元空間の中で、並進や回転を行ない、さらに、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ中のアミノ酸残基において、化学的な共有結合を切断されない範囲で移動させて、化合物との結合等の強度を計算させることができる。
【００８５】
前記ステップ(i)において、「ジペプチジルペプチダーゼＩＶ中の標的となる領域」としては、好ましくは、ジペプチジルペプチーゼＩＶの活性中心、該活性中心に間接的に作用する部位等が挙げられ、例えば、図４の構造座標及び該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、Ser630、Asp708及びHis740と、該Ser630、Asp708及びHis740の近傍に位置するアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基群とにより特徴づけられる領域等が挙げられる。かかる活性中心、該活性中心に間接的に作用する部位等の３次元構造座標に基づき、適合しうる原子又は原子団を同定し、それにより、候補原子又は候補原子団を得ることができる。
【００８６】
前記ステップ(ii)において、前記ステップ(i)で同定された情報に基づき、例えば、前記領域における原子又は原子団との間で、分子間相互作用を介して会合しうる原子又は原子団、具体的には、共有結合、イオン性相互作用、イオン−双極子間相互作用、双極子−双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、静電気相互作用、疎水性相互作用等を生じうる対応の原子又は原子団を検索して、抽出する。
【００８７】
ついで、前記ステップ(iii) において、前記ステップ(i)及び／又は(ii)で検索された対応の原子又は原子団を組み合わせ、化合物を設計する。
【００８８】
その後、所望により、前記ステップ(iii) で設計された化合物が、本発明の３次元構造座標により規定されるジペプチジルペプチダーゼＩＶ中の側鎖及び原子又は原子団と、前記分子間相互作用を介して適合するかどうかをシミュレーションすることができる。
【００８９】
以上のステップにより設計、同定、評価又は検索された化合物（以下、本明細書においては、候補化合物ともいう）については、その化合物に応じて、一般的に用いられている化学合成の手法を用いることで得ることができる。
【００９０】
また、本発明の作用薬の設計、同定、評価又は検索方法においては、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと候補化合物との間の相互作用を検出するステップをさらに行なってもよい。ここで、相互作用が検出された場合、該相互作用は、前記候補化合物が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに結合しうる化合物であることを示す指標となる。
【００９１】
前記相互作用は、例えば、共鳴プラズモン解析装置、質量分析計、滴定型等温カロリメトリ、ＮＭＲ等により検出することができる。例えば、共鳴プラズモン装置の場合、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ固定化マトリックスに候補化合物を接触させ、光学的検出（光度計、偏向光度計等）等により分析し、複合体形成を示すセンサーグラムが呈示された場合、候補化合物とジペプチジルペプチダーゼＩＶとの間に相互作用が生じることの指標となる。例えば、質量分析計の場合、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ固定化マトリックスに候補化合物を接触させ、質量分析計（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計：ＥＳＩ−ＭＳ等）により分析し、複合体形成を示すスペクトルが呈示された場合、候補化合物とジペプチジルペプチダーゼＩＶとの間に相互作用が生じることの指標となる。例えば、滴定型等温カロリメトリ相互作用解析の場合、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ溶液に、候補化合物とを接触させ、その時に出入りする熱を熱伝対等で観測することにより、複合体形成を示す滴定曲線が呈示された場合、候補化合物とジペプチジルペプチダーゼＩＶとの間に相互作用が生じることの指標となる。例えば、ＮＭＲの場合、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと候補化合物を混在させた溶液を、ＮＭＲにより分析し、複合体形成を示すスペクトルが呈示された場合、候補化合物とジペプチジルペプチダーゼＩＶとの間に相互作用が生じることの指標となる。
【００９２】
さらに、本発明の作用薬の設計、同定、評価又は検索方法においては、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと、候補化合物とを接触させ、ついで、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性を測定するステップをさらに行なってもよい。ここで、前記ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性が増加又は減少している場合、前記候補化合物が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性に対する亢進作用又は阻害作用を有する化合物であることを示す指標となる。
【００９３】
前記ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性は、候補化合物の存在下、例えば、１．５ｍｌの反応混合物〔組成：１．５ｍＭ  基質（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−パラニトロアニリド）、７１ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ８．７）〕中、３７℃で１０分間インキュベーションし、遊離したパラニトロアニリドを、４０５ｎｍにおける吸光度で測定することにより測定されうる。かかる活性の測定に際しては、反応時に、適切な希釈律の化合物を添加した反応系を用いることにより、候補化合物の評価を行ないうる。
【００９４】
本発明の作用薬の設計、同定、評価又は検索方法は、本発明の３次元構造座標に基づき、例えば、複数の化合物の構造が入力されたコンピューター中のデータベースを利用して、データベース中の化合物とジペプチジルペプチダーゼＩＶとの相互作用、又は設計された化合物とジペプチジルペプチダーゼＩＶとの相互作用を、視覚的方法によって、逐次、選別する方法（視覚的選別方法）；及び／又はコンピューターにより結合強度の大きさを逐次計算し、安定にジペプチジルペプチダーゼＩＶと相互作用する化合物をデータベースの中から検索する方法（コンピューター支援結合強度評価法）等によって行なわれうる。
【００９５】
前記視覚的選別方法において、化合物の構造のデータベースは、３次元構造座標が決定され入力されたデータベースであってもよく、また、低分子化合物の場合には、そのコンフォメーションは、比較的自由に変化させることができ、各コンフォメーションの３次元構造座標を計算で導くことも比較的短時間で可能であるため、低分子化合物の化学的な共有結合情報を入力されたデータベースであってもよい。
【００９６】
具体的には、視覚的選別方法では、まずコンピューターの画面上にジペプチジルペプチダーゼＩＶと候補化合物との予想される複合体又はその一部について、本発明の３次元構造座標に基づいて表示させる。ついで、コンピューター上で化学的相互作用を考慮しながら、データベース中にある化合物とジペプチジルペプチダーゼＩＶ結合領域との分子間相互作用結合をシミュレーションする。また、化合物について、コンピューター上で化学的な修飾のシミュレーションを行ない、その結果により生じる相互作用の変化をコンピューターの画面上で観察する。この際、コンピューターの画面上にタンパク質の３次元構造を、シリコングラフィクス社から供給されているクリスタル・アイ（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｅｙｅｓ）眼鏡に対応するように、表示させること；当業者において頻繁に用いられる「立体視」と呼ばれる、右目及び左目の視野に対応して、対象物の表示の際の傾きを調整した２種の画面を同時に表示させること等により、３次元空間を容易に理解できる。また、３次元構造の立体的な表示以外の手法により、視覚的に検討することもできる。
【００９７】
適切な相互作用を生じる候補化合物は、コンピューターで適当なコンフォメーションの候補群を表示させ、これらから選択すること；又は低いエネルギー状態の構造をコンピューターで計算すること等により得られうる。ついで、候補化合物の中からジペプチジルペプチダーゼＩＶとのより好ましい結合が生じうる化合物の誘導体を検索すればよい。
【００９８】
より具体的には、３次元構造レベルにおいて、
１  化合物中のカルボキシル基、ニトロ基、ハロゲン基等の陰性電荷を帯びやすい基が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ中のリジン、アルギニン、ヒスチジン等の正電荷を有するアミノ酸残基に相互作用すること；
２  化合物中のアミノ基、イミノ基、グアニジル基等の正電荷を帯びやすい基が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ中のグルタミン酸、アスパラギン酸といった負電荷を持つアミノ酸残基に相互作用すること；
３  化合物中の脂肪族基、芳香族基等の疎水性の官能基が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ中のアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン等の疎水性のアミノ酸残基と相互作用すること；
４  水酸基、アミド基等の水素結合に関与する基が、主鎖や側鎖部分と水素結合ができるようにすること；
５  化合物中のカルボキシル基、ニトロ基、ハロゲン基等の負電荷を帯びやすい基又は原子が、主鎖や側鎖部分の正電荷を帯びた原子に相互作用すること；
６  化合物中のアミノ基、イミノ基、グアニジル基等の正電荷を帯びやすい基又は原子が、主鎖や側鎖部分の負電荷を帯びた原子に相互作用すること；
７  直鎖状部分を環状化する等により、化合物の３次元構造の自由度を低下させること
等を考慮すればよい。例えば、前記誘導体は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのアミノ酸残基において、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の正電荷を有するアミノ酸残基の側鎖の近傍に、候補化合物の負電荷を持つ原子が配置され、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのアミノ酸残基においてグルタミン酸、アスパラギン酸等の負電荷を有するアミノ酸残基の側鎖の近傍に、候補化合物の正電荷を有する原子が配置されるように設計し、合成すればよい。また、化合物とジペプチジルペプチダーゼＩＶとの間に疎水性相互作用を形成しうる部分には、疎水性相互作用形成に好適な基を導入して誘導体を設計し、合成すればよい。また、化合物とジペプチジルペプチダーゼＩＶとの間に水素結合を形成しうる部分には、水素結合形成に好適な基を導入して誘導体を設計し、合成すればよい。前記設計において、ファンデルワールス相互作用ができるだけ大きく、かつ各原子間で立体的な障害が生じないことが望ましい。さらには、化合物の変化により新たな空隙部分ができないようにし、既に空隙部分が存在する領域においては、その空隙部分をできるだけ充填するようにすることが望ましい。
【００９９】
前記したように、分子間相互作用やその他の因子を、コンピューター画面上で視覚的に総合的に考慮して、最終的な化合物の設計、同定、評価又は検索を行なうことができる。
【０１００】
コンピューター支援結合強度評価法では、新たな化合物の設計の妥当性を決定するため、また、データベースの中の化合物から、安定して相互作用しうる化合物を求めるために、化合物とジペプチジルペプチダーゼＩＶとの間の、分子力場を計算することによるエネルギーに基づく結合評価、化学的性質に基づく結合評価、又は、プロテイン・データ・バンク（ＰＤＢ）に基づく結合評価等を行なうドッキングソフト（ＤＯＣＫ、ＧＯＬＤ、ＦｌｅｘＸ、Ｇｌｉｄｅ等）を用いる。さらに、化合物とジペプチジルペプチダーゼＩＶとからなるモデル系又は溶媒分子等をさらに含有したモデル系について、分子動力学計算、又は、モンテカルロ計算により、結合の自由エネルギー、結合状態数と非結合状態数から得られる比等の、結合強度を示す指数を求め、安定して相互作用しうる化合物へ誘導してもよい。分子力場計算、分子動力学計算のプログラムには、ＡＭＢＥＲ、ＣＨＡＲＭｍ、ＤＩＳＣＯＶＥＲ、ＰＲＥＳＴＯ等が挙げられ、用いられる力場としては、ＡＭＢＥＲ、ＣＨＡＲＭｍ、ＯＰＬＳ、ＭＭＣＦ、ＣＶＦＦ等が挙げられる。また、ジペプチジルペプチダーゼＩＶにおいて相互作用するアミノ酸残基の３次元構造座標を与えることにより、自動的に候補化合物の候補を出力するＬｕｄｉ等のプログラムを用いてもよい。
【０１０１】
前記視覚的選別方法及びコンピューター支援結合強度評価法は、単独で又は組み合わせて実施されうる。組み合わせて実施する場合、視覚的検討により、より望ましい化合物であると予想されるものについて、実際に結合強度の計算を行ない、その妥当性の評価をする。前記計算及び評価を繰り返し行なうことで、より優れた化合物を設計、同定、評価又は検索すればよい。
【０１０２】
ついで、設計、同定、評価又は検索された化合物を、さらに優れた化合物、例えば、体内動態が優れること、毒性や副作用の少ないこと等、医薬品として、より優れた性質を有する化合物；作用薬として、さらに生物学的活性の高い化合物；医薬品として経口投与の観点で、有利な構造を有する化合物等に最適化する。
【０１０３】
もたらされた候補化合物は、化合物の種類に応じて、一般的に用いられている化学合成の手法を用いることで得られうる。
【０１０４】
本発明の作用薬の設計、同定、評価又は検索方法によって得られる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用薬も本発明に含まれる。前記作用薬が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性を阻害又は亢進しうる化合物である場合、該作用薬（阻害剤又は亢進剤）は、例えば、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤であることが期待される。
【０１０５】
本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標は、該３次元構造座標に基づき、分子の３次元構造を表現し、電気通信回線を通じた提供等が可能な、コンピューター・プログラム、媒体等として提供されうる。これにより、コンピューター等を用いて、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造を詳細に表現し、本発明の作用薬の設計、同定、評価又は検索方法をより迅速、簡便かつ論理的に行なうことが可能になる。
【０１０６】
本発明には、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造座標の全部及び／又は一部が記録された、該３次元構造座標を使用するためのプログラム及びその媒体も包含される。
【０１０７】
前記媒体としては、本発明の３次元構造座標をコンピューターにおいて動作するプログラム上に導くことができるものであればよく、例えば、メモリーと呼ばれる電気的な記憶媒体；ＦＤ、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープ等の半永久的な記憶媒体等が挙げられる。また、本発明の３次元構造座標を使用するためのプログラム及びその媒体には、インターネット等に代表される電気通信回線を介してやりとりされる形態も包含される。
【０１０８】
また、本発明の３次元構造座標を使用するためのプログラム及びその媒体は、分子の３次元グラフィック表示を表示する手段をさらに備えていてもよい。かかる３次元グラフィック表示を表示しうる手段を備えたプログラム及びその媒体は、視覚的検討及び／又は結合強度計算を行なうことがより簡便になり、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの公知の作用薬よりも結合力が高い、生物学的活性が高い、生物学的な安定性が高い、熱力学的な安定性が高い、生体への吸収性が高い、毒性が低い等の優れた性質を有する化合物を得るための、３次元構造レベルでの論理的設計がより簡便になるという優れた効果を発揮する。
【０１０９】
前記３次元グラフィック表示を表示しうる手段として、一般に、分子の３次元構造座標の入力手段、該座標のコンピューター画面への視覚的表現、表現された分子内における各原子間の距離、結合角等を測定する手段、該座標の追加又は修正を行う手段等を提供することができるように作成されたプログラムを用いてもよい。さらに、分子の座標を元に分子の構造エネルギーを計算する手段、水分子等の溶媒分子を考慮して結合の自由エネルギー及び結合状態数と非結合状態数との比を計算する手段を提供することができるように作成されたプログラムを用いてもよい。かかる目的に好適なプログラムの例としては、例えば、アクセルリス社から市販されているコンピューター・プログラムであるＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ、ＱＵＡＮＴＡ等が挙げられるが、本発明はこれらのプログラムに限定されるものではない。また、前記プログラムは、例えば、シリコングラフィクス社、サンマイクロシステムズ社等から供給されているワークステーションと呼ばれるコンピューターに導入されて使用することができる。
【０１１０】
本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの結晶によれば、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用な、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用薬の設計、同定、評価又は検索のための情報としての３次元構造座標を得ることができ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶと公知作用薬との複合体の結晶の作製を容易に行なうことができるという優れた効果を奏する。また、本発明の３次元構造座標によれば、前記作用薬の設計、同定、評価又は検索することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の３次元構造座標の取得方法によれば、３次元構造が不明であるジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の３次元構造座標を、より簡便かつ迅速に提供することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶと該ジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用薬との複合体の結晶の３次元構造座標の取得方法によれば、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用であり、より結合力が高い、生物学的活性が高い、生物学的な安定性が高い、熱力学的な安定性が高い、生体への吸収性が高い等の優れた性質を有する前記作用薬のデザインのための標的を得ることができるという優れた効果を奏する。また、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶと該ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬のファーマコフォーを同定する方法によれば、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用であり、より結合力が高い、生物学的活性が高い、生物学的な安定性が高い、熱力学的な安定性が高い、生体への吸収性が高い等の優れた性質を有する前記作用薬のデザインのための標的を得ることができるという優れた効果を奏する。本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用薬の設計、同定、評価又は検索方法によれば、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用であり、より結合力が高い、生物学的活性が高い、生物学的な安定性が高い、熱力学的な安定性が高い、生体への吸収性が高い等の優れた性質を有する前記作用薬を、論理的、かつ簡便に提供することができるという優れた効果を奏する。本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用薬によれば、免疫応答の調節、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防を行なうことができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のプログラム及びその媒体によれば、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用薬の設計、同定、評価又は検索方法を、より迅速、かつ簡便に行なうことができるという優れた効果を奏する。
【０１１１】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、何らこれに限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、反応条件、操作等は、用いた試薬に添付の説明書、モレキュラークローニング  ア  ラボラトリーマニュアル第３版、ザンブルーク(Sambrook)ら、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 発行(2001) 等の記載が参照されうる。
【実施例１】
【０１１２】
可溶性ヒトジペプチジルペプチダーゼＩＶの発現用組換えバキュロウイルスの構築
（１）可溶性ヒトジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ｓｈＤＰＰＩＶ）  ｃＤＮＡのクローニング
細胞株Ｃａｃｏ−２〔アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection；ATCC）供給〕を、２０重量％  不活化ウシ胎仔血清（インビトロジェン社製；５６℃、３０分のインキュベーションで不活化させたもの）と１重量％  非必須アミノ酸（インビトロジェン社製）とを含むダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン社製）を用いて、５体積％  ＣＯ2存在下３７℃で培養した。
【０１１３】
ついで、得られたＣａｃｏ−２細胞から、全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡの抽出は、ニッポンジーン社製、商品名：ＩＳＯＧＥＮを用い、添付された説明書に従って行なわれた。得られた全ＲＮＡを後述のＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法における鋳型として用いた。
【０１１４】
シグナルペプチド配列を除いた可溶性ヒトＤＰＰＩＶ（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  アクセッション番号：Ｐ２７４８７のアミノ酸番号：３３−７６６）に対応する核酸を得るため、まず、前記Ｃａｃｏ−２の全ＲＮＡを鋳型とし、ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法により、ヒトＤＰＰＩＶ遺伝子のｃＤＮＡ断片配列を増幅させた。
【０１１５】
前記ＰＣＲにおけるサーマルプロファイルは、９４℃、３０秒での変性と、５５℃、３０秒でのアニーリングと、７２℃、１分でのポリメラーゼ伸長反応とを１サイクルとした３０サイクルである。
【０１１６】
増幅されたＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動法にて分離し、対応するバンド部分のゲル小片を切り出した。その後、得られたゲル小片から、バイオ１０１社製、商品名：ＧＥＮＥ  ＣＬＥＡＮ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔを用いて、前記ＤＮＡ断片を抽出し、精製した。得られた断片を、インビトロジェン社製のＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）  Ｋｉｔに含まれるベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯに挿入して、ｐＣＲ−ｓｈＤＰＰＩＶを構築した。
【０１１７】
得られたｃＤＮＡ断片が、目的のポリペプチドをコードするものであるかどうかを確認するため、前記ＤＮＡ断片に関する種々の長さの欠失変異体を作製し、以下のように、該ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
【０１１８】
まず、前記ｐＣＲ−ｓｈＤＰＰＩＶを、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとにより二重消化して得られた２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）中の対応する制限酵素部位へ挿入して、プラスミドｐＵｓｈＤＰＰＩＶを構築した。前記プラスミドｐＵｓｈＤＰＰＩＶを用い、慣用の方法により、種々のデリーションプラスミドを作製した。
【０１１９】
得られたデリーションプラスミド又はプラスミドｐＣＲ−ｓｈＤＰＰＩＶと、パーキンエルマーシータス社製、商品名：Ｔａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔと、アプライドバイオシステムズ社製、モデル３７３Ｓシーケンサーとを用いて、前記ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
【０１２０】
また、前記塩基配列に基づき、前記ＤＮＡ断片にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を決定した。
【０１２１】
決定されたアミノ酸配列を、配列番号：２に示したヒト腸(colon)由来の全長型ＤＰＰＩＶの配列と比較した。その結果、対応する領域（膜貫通領域を除く領域）が一致することが確認された。
【０１２２】
かくして、前記ＤＮＡ断片が目的とするポリペプチドのｓｈＤＰＰＩＶ、すなわち、ヒトの全長型ＤＰＰＩＶにおける膜貫通領域（Ｎ末端側アミノ酸番号：１〜３２）が除去され、かつＣ末端側にポリヒスチジンペプチドが付加されたポリペプチドをコードすることが確認された。
【０１２３】
（２）組換えバキュロウイルスの作製
プラスミドｐＵｓｈＤＰＰＩＶを、制限酵素により消化して、ｓｈＤＰＰＩＶ遺伝子をコードするＤＮＡ断片を得、得られた断片を、ｐＡｃＧＰ６７Ｂ（ＢＤ  ファーミンジェン社製）上に挿入して、バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＧＰ６７Ｂ−ｓｈＤＰＰＩＶを構築した。
【０１２４】
トランスフェクション１５分前、１０重量％  ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地でＳｆ２１細胞を２回洗浄し、ついで、該Ｓｆ２１細胞を、６穴プレートに１ウェル当たり２．４×１０6 個となるように入れた。
【０１２５】
また、２〜５μｇの前記バキュロウイルストランスファーベクターと、０．５μｇの直鎖状バキュロウイルスＤＮＡ（商品名：ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄウイルスＤＮＡ、ＢＤ  ファーミンジェン社製）とを混合し、室温で５分間静置した。次に、得られた混合物に、１ｍｌのトランスフェクションバッファーＢ（ＢＤ  ファーミンジェン社製）を添加し、よく混合し、トランスフェクションバッファーＢ／ＤＮＡ混合物を得た。
【０１２６】
前記６穴プレートのウェル中の培地と該ウェルに接着していない細胞とを除去し、該ウェル中に、１ｍｌのトランスフェクションバッファーＡ（ＢＤ  ファーミンジェン社製）を添加した。６穴プレートを静かに攪拌しながら、前記トランスフェクションバッファーＢ／ＤＮＡ混合物を、前記６穴プレートのウェルにゆっくり滴下した。前記６穴プレートのウェル中、細胞を２８℃で４時間インキュベートした。その後、トランスフェクションバッファーを除去し、前記６穴プレートのウェルに、１０重量％  ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地  ３ｍｌを添加した。前記６穴プレートのウェル中、細胞を２８℃で５日間培養し、培養上清を回収した。かかる培養上清を、Ｓｆ２１細胞を用いるウイルスの増幅に使用し、ウイルスストック溶液を得た。
【実施例２】
【０１２７】
ｓｈＤＰＰＩＶの調製及び結晶化
（１）昆虫細胞におけるｓｈＤＰＰＩＶの発現
Ｓｆ２１細胞は、無血清培地ＥＸ−ＣＥＬＬ  ４００（ＪＲＨ  バイオサイエンシーズ社製) とＴフラスコとを用い、Ｔｎ５細胞（インビトロジェン社供給）は、無血清培地ＥＸ−ＣＥＬＬ  ４０１（ＪＲＨ  バイオサイエンシーズ社製）とＴフラスコとを用いて、それぞれ２８℃で培養した。細胞の増殖が、７０％  コンフルエントに達した時点で、古い培地を除去し、それぞれ、２２５ｃｍ2フラスコ１個当たり４０ｍｌの新鮮な培地を添加した。ついで、３回増幅後のウイルスストック溶液１．５ｍｌ〔Multiplicity of infection(MOI)が約２である〕を細胞に添加することにより感染させ、２８℃で４日間インキュベーションした。感染４日後の培養上清を回収し、−２０℃で保存した。かかる培養上清を、以下のｓｈＤＰＰＩＶタンパク質の精製に用いた。
【０１２８】
（２）ｓｈＤＰＰＩＶタンパク質の精製
ｓｈＤＰＰＩＶの精製における各ステップにおいて、ＤＰＰＩＶの活性は、１．５ｍＭの基質〔ペプチド研究所製、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−パラニトロアニリド（ｐＮＡ）〕、７１ｍＭ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．７）と、ＤＰＰＩＶとを含む反応混合液  ０．１ｍｌをインキュベートし、遊離したｐＮＡを検出することにより測定した。なお、反応混合液は、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーションの間、４０５ｎｍの吸光度をモニターした。
【０１２９】
また、タンパク質濃度は、バイオラッド社製、商品名：ＤＣプロテインアッセイキットＩＩを用いて定量した。
【０１３０】
さらに、タンパク質の精製度は、ラエムリ(Laemmli) らの方法に従い、各ステップにおけるタンパク質試料を、７．５％  ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して確認した。
【０１３１】
前記（１）において、−２０℃で保存していた培養上清を、４℃で融解し、ついで、ボトルトップフィルター（ベクトンディッキンソン社製）又は０．４５μｍフィルター（クラボウ社製）に供して、不溶化物を除去した。ろ過後の上清を、濃縮装置ＶｉＶａｆｌｏｗ５０（商品名、ザルトリウス社製）又はアミコン撹拌式セルモデル８４００（ミリポア社製) を用いて、約１／１０体積になるよう濃縮して、濃縮溶液を得た。
【０１３２】
得られた濃縮溶液をバッファーＡ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に対して、４℃で一晩透析後、バッファーＡで平衡化されたニッケルカラム〔アマシャムファルマシア社製、商品名：ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム (５ｍｌ×２）にニッケルを付加したもの〕に負荷した。カラムをバッファーＡで１０カラム容量洗浄し、ついで、５０ｍＭ  イミダゾールを含むバッファーＡで洗浄した。ｓｈＤＰＰＩＶを含むフラクションの溶出は、５０ｍＭ〜５００ｍＭ  イミダゾールのリニアグラジェントにより行なった。ＤＰＰＩＶ活性がみられたフラクションを集め、バッファーＢ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して４℃で一晩透析した。透析後、サンプルを、バッファーＢで平衡化された陰イオン交換カラム〔アマシャムファルマシア社製、商品名：Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（６ｍｌ）〕を用いて精製した。カラムをバッファーＢで洗浄後、ｓｈＤＰＰＩＶを１５カラム容量の５０ｍＭ〜５００ｍＭ  ＮａＣｌのリニアグラジェントにより溶出した。ＤＰＰＩＶ活性が見られたフラクションを集め、精製標品とした。
【０１３３】
（３）結晶化用タンパク質試料の調製
前記（２）で得られたｓｈＤＰＰＩＶ精製標品（９ｍｌ）を、ミリポア社製、商品名：セントリコン１０により、タンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるまで濃縮した。
【０１３４】
得られた産物を結晶化用タンパク質試料とした。前記結晶化用タンパク質試料を、４℃で保存した。
【０１３５】
０．１８Ｍ  グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ９．５）と０．１８Ｍ  硫酸ナトリウムと１８重量％  ＰＥＧ４０００とを含有した沈殿剤溶液と、１０ｍｇ／ｍｌ  ジペプチジルペプチダーゼＩＶ溶液とを混合し、ついで、得られた混合溶液のドロップを商品名：Ｃｒｙｓｃｈｅｍ  Ｐｌａｔｅ（ハンプトンリサーチ社製）にのせ、上記沈殿剤溶液をリザーバー溶液として２０℃で静置して結晶化を行なった。
【０１３６】
（４）ｓｈＤＰＰＩＶの結晶化
ｓｈＤＰＰＩＶの結晶化は、蒸気拡散法の１つであるシッティングドロップ法により行なった。
【０１３７】
結晶の形成については、経時的に、実体顕微鏡により観察した。その結果、約２週間後に最大５００μｍ×３００μｍ×１００μｍの大きな結晶が得られた。かかる結晶を自然型結晶ともいう。得られた結晶の顕微鏡写真を図１に示す。図１において、視野範囲は、４０００μｍ×３０００μｍである。
【実施例３】
【０１３８】
結晶の３次元構造解析
（１）Ｘ線回折
前記実施例２で得られた結晶を、クライオプロテクティング緩衝液〔組成：０．１８Ｍ  グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ９．５）、１９重量％  ＰＥＧ４０００、０．１８Ｍ  酢酸ナトリウム、１５％  グリセロール〕に浸した後、直ちに窒素気流（１００Ｋ）下に入れ、急速冷凍した。
【０１３９】
前記結晶のＸ線回折強度データは、窒素気流（１００Ｋ）中、株式会社リガク製商品名：Ｒ−ＡＸＩＳ  ＩＶを用いて、分解能３．０Åまで収集し、プログラムＭＯＳＦＬＭ（バージョン６．１１）を用いて構造因子に変換した。回折写真を図２に示す。
【０１４０】
得られた回折強度データから、結晶の属する晶系は、斜方晶系、空間群は、Ｐ２1２1２1、格子定数は、ａ＝１１８．０±５．０Å、｜ｂ｜＝１２５．９±５．０Å、｜ｃ｜＝１３６．８±５．０Åと決定された。
【０１４１】
（２）重原子同型置換
電子密度図を導き出すために、重原子同型置換法を行なった。すなわち、塩化水銀を飽和になるまで溶かした結晶化溶液に、前記実施例２で得られた結晶を３日間及び４日間浸漬することにより、結晶中に水銀原子を含む異なる２種類の同型置換体結晶を得た。Ｘ線回折強度データの収集は、前記自然型結晶と同様にして行なった。
【０１４２】
構造解析における位相決定には、ＣＣＰ４ (Collaborative Computational Project, Number 4. 1994. "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography". Acta Cryst. D50, 760-763)プログラムを用いた。
【０１４３】
最初に、２種類の水銀の同型置換体結晶から得られた回折強度と、自然型結晶から得られた回折強度との差を用いたフーリエ変換計算をＣＣＰプログラムパッケージに含まれるＭＬＰＨＥＲＥを用いて行なった。得られたパターソン図上において重原子（水銀）が与える大きなピークを精査することにより、実空間の単位格子内でのそれぞれの水銀原子の位置を決定した。得られた水銀原子の位置座標を用いて、自然型結晶の結晶構造因子の位相を決定した。さらに、ＣＣＰプログラムに含まれるＤＭとＳＯＬＯＭＯＮを用いてそれぞれの水銀原子の座標をより正確に決定するために、自然型結晶と２種類の水銀同型置換体結晶との３つの結晶構造因子を用いて精密化を行なった。
【０１４４】
精密化された水銀原子の座標から計算される自然型結晶の結晶構造因子の位相を用いて、実空間におけるジペプチジルペプチターゼＩＶの結晶の電子密度図を得た。さらに、溶媒領域の電子密度図の平滑化とヒストグラムマッチングとを行なって電子密度図の改良を行ない、分子モデルを構築するのに必要十分な電子密度図を得た。
【０１４５】
（３）分子モデルの構築
ＱＵＡＮＴＡ（アクセルリス社製）を用いて、電子密度図上にジペプチジルペプチターゼＩＶのアミノ酸残基に相当する部位を同定し、分子モデルの構築を行なった。
【０１４６】
格子定数から予測されたとおり、非対称単位中に２分子のジペプチジルペプチターゼＩＶ分子が存在しており、それぞれの分子についてモデルの構築を行なった。得られた分子モデルの精密化には、ＣＮＸ（アクセルリス社製）を用いて行ない、得られた改善した電子密度図に対して、再度、ＱＵＡＮＴＡを用いて分子モデルの修正を行なった。この操作を繰り返し行ない、より正しい分子モデルの構築を行なった。なお、最終座標の精密化には、新しくＲ−ＡＸＩＳ  ＩＶ（株式会社リガク製）にＯＳＭＩＣ  Ｘ線集光ミラー（株式会社リガク製）を導入した後、再測定した回折強度データを使用した。
【０１４７】
この結果、分解能は、先の３．０Åから２．６Åへ改善された。また、構造座標から、非対称単位中に２７３分子の結合水、並びにジペプチジルペプチターゼＩＶ１分子あたり５分子のＮ−アセチルグルコサミン残基が同定された。得られた分子モデルの正確さの指標とされるＲ因子は２４．８９％、精密化の段階で独立に精密化の計算に入れなかったフリーＲ因子は３０．１５％であった。このとき、立体構造の理想状態からの原子間結合距離のずれ(rms-deviation) 及び結合角のずれは、それぞれ、０．００６Å及び１．３０５°であった。本結晶の３次元構造モデルの立体図を図３に、座標を図４に示す。本座標データは、ＰＤＢ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）に登録済である〔ＰＤＢ  ｃｏｄｅ  Ｎｏ：１Ｊ２Ｅ、ＲＳＣＢ  ｃｏｄｅ  Ｎｏ：００５５４４〕。
【０１４８】
なお、結晶中で決まった構造をとっていなかった（無秩序状態）領域、すなわち、Asp38 及びそれよりＮ末端側の領域、並びにＣ末端側のタグペプチド（ポリヒスチジンペプチド）領域については分子モデルを構築することができなかった。この他、分子表面に突出している残基の側鎖の一部についても、決まった構造をとっていなかった。しかしながら、これらの残基は、酵素の機能において重要な働きをする部分ではなかった。
【０１４９】
本実施例により明らかになったジペプチジルペプチダーゼＩＶの３次元構造において、該ジペプチジルペプチダーゼＩＶの各種実験により推定されている活性に関与するアミノ酸残基、Ser630、Asp708及びHis740は、１次配列上では離れた位置に存在しているにもかかわらず、Asp708のＯδ2原子とHis740のＮδ1 原子との間、及びHis740のＮε2 原子とSer630のＯγ原子との間で水素結合を形成していることが明らかとなった。したがって、図４の構造座標及び該構造座標により規定される３次元構造モデルにおいて、Ser630、Asp708及びHis740と、該Ser630、Asp708及びHis740の近傍に位置するアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基群とにより特徴づけられる領域が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性の発現及び作用薬との結合又は相互作用に際して重要な役割を果たすことが示唆され、かかる領域の立体構造に適合する化合物が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性に影響を与えることも示唆される。
【０１５０】
本発明は、その精神又はその主要な特徴から逸脱することなく、他の種々の形で実施することができる。そのため、前述の実施例等は、あらゆる点で単なる例示にすぎず、限定的に解釈してはならない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によって示すものであり、明細書本文には、なんら拘束されない。さらに特許請求の範囲の均等範囲に属する変形や変更は、すべて本発明の範囲内である。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶの結晶によれば、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用なジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の設計、同定、評価又は検索のために適した３次元構造座標の情報を得ることができる。また、本発明の３次元構造座標によれば、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用なジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の設計、同定、評価又は検索のために適した情報を得ることができる。さらに、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の３次元構造座標の取得方法によれば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのホモログタンパク質の３次元構造座標の精密化を、より簡便に行なうことができる。さらに、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶと該ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬との複合体の結晶の３次元構造座標の取得方法によれば、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用であり、結合力、生物学的活性、生物学的な安定性、生体への吸収性等に優れ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに良好に作用しうるジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の設計、同定、評価又は検索のために適した３次元構造座標の情報を得ることができる。また、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶと該ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬のファーマコフォーを同定する方法によれば、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用であり、結合力、生物学的活性、生物学的な安定性、生体への吸収性等に優れ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに良好に作用しうる、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の設計、同定、評価又は検索のために適した３次元構造座標の情報を得ることができる。さらに、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の設計、同定、評価又は検索方法によれば、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用であり、結合力、生物学的活性、生物学的な安定性、生体への吸収性等に優れ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに良好に作用しうるジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬を、論理的、かつ簡便に得ることができる。また、本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬は、免疫応答の調節剤、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防剤として有用である。さらに、本発明のプログラム及びその媒体によれば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する作用薬の設計、同定、評価又は検索を迅速、かつ簡便に行なうことができる。したがって、本発明は、免疫応答の調節、糖尿病、炎症、多発性硬化症、Graves病、慢性関節リウマチ、AIDS、癌等の治療又は予防に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの結晶の顕微鏡写真の図である。なお、かかる図において、視野範囲は、４０００μｍ×３０００μｍである。
【０１５３】
【図２】図２は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの結晶のＸ線回折写真の図である。
【０１５４】
【図３】図３は、プログラムＱＵＡＮＴＡ（アクセルリス社製）を用いて表示させたジペプチジルペプチターゼＩＶの結晶の３次元構造図である。
【０１５５】
【図４】図４は、ジペプチジルペプチターゼＩＶの結晶の３次元座標を示す図である。
【０１５６】
【図５】図５は、図４の続きの図である。
【０１５７】
【図６】図６は、図４の続きの図である。
【０１５８】
【図７】図７は、図４の続きの図である。
【０１５９】
【図８】図８は、図４の続きの図である。
【０１６０】
【図９】図９は、図４の続きの図である。
【０１６１】
【図１０】図１０は、図４の続きの図である。
【０１６２】
【図１１】図１１は、図４の続きの図である。
【０１６３】
【図１２】図１２は、図４の続きの図である。
【０１６４】
【図１３】図１３は、図４の続きの図である。
【０１６５】
【図１４】図１４は、図４の続きの図である。
【０１６６】
【図１５】図１５は、図４の続きの図である。
【０１６７】
【図１６】図１６は、図４の続きの図である。
【０１６８】
【図１７】図１７は、図４の続きの図である。
【０１６９】
【図１８】図１８は、図４の続きの図である。
【０１７０】
【図１９】図１９は、図４の続きの図である。
【０１７１】
【図２０】図２０は、図４の続きの図である。
【０１７２】
【図２１】図２１は、図４の続きの図である。
【０１７３】
【図２２】図２２は、図４の続きの図である。
【０１７４】
【図２３】図２３は、図４の続きの図である。
【０１７５】
【図２４】図２４は、図４の続きの図である。
【０１７６】
【図２５】図２５は、図４の続きの図である。
【０１７７】
【図２６】図２６は、図４の続きの図である。
【０１７８】
【図２７】図２７は、図４の続きの図である。
【０１７９】
【図２８】図２８は、図４の続きの図である。
【０１８０】
【図２９】図２９は、図４の続きの図である。
【０１８１】
【図３０】図３０は、図４の続きの図である。
【０１８２】
【図３１】図３１は、図４の続きの図である。
【０１８３】
【図３２】図３２は、図４の続きの図である。
【０１８４】
【図３３】図３３は、図４の続きの図である。
【０１８５】
【図３４】図３４は、図４の続きの図である。
【０１８６】
【図３５】図３５は、図４の続きの図である。
【０１８７】
【図３６】図３６は、図４の続きの図である。
【０１８８】
【図３７】図３７は、図４の続きの図である。
【０１８９】
【図３８】図３８は、図４の続きの図である。
【０１９０】
【図３９】図３９は、図４の続きの図である。
【０１９１】
【図４０】図４０は、図４の続きの図である。
【０１９２】
【図４１】図４１は、図４の続きの図である。
【０１９３】
【図４２】図４２は、図４の続きの図である。
【０１９４】
【図４３】図４３は、図４の続きの図である。
【０１９５】
【図４４】図４４は、図４の続きの図である。
【０１９６】
【図４５】図４５は、図４の続きの図である。
【０１９７】
【図４６】図４６は、図４の続きの図である。
【０１９８】
【図４７】図４７は、図４の続きの図である。
【０１９９】
【図４８】図４８は、図４の続きの図である。
【０２００】
【図４９】図４９は、図４の続きの図である。
【０２０１】
【図５０】図５０は、図４の続きの図である。
【０２０２】
【図５１】図５１は、図４の続きの図である。
【０２０３】
【図５２】図５２は、図４の続きの図である。
【０２０４】
【図５３】図５３は、図４の続きの図である。
【０２０５】
【図５４】図５４は、図４の続きの図である。
【０２０６】
【図５５】図５５は、図４の続きの図である。
【０２０７】
【図５６】図５６は、図４の続きの図である。
【０２０８】
【図５７】図５７は、図４の続きの図である。
【０２０９】
【図５８】図５８は、図４の続きの図である。
【０２１０】
【図５９】図５９は、図４の続きの図である。
【０２１１】
【図６０】図６０は、図４の続きの図である。
【０２１２】
【図６１】図６１は、図４の続きの図である。
【０２１３】
【図６２】図６２は、図４の続きの図である。
【０２１４】
【図６３】図６３は、図４の続きの図である。
【０２１５】
【図６４】図６４は、図４の続きの図である。
【０２１６】
【図６５】図６５は、図４の続きの図である。
【０２１７】
【図６６】図６６は、図４の続きの図である。
【０２１８】
【図６７】図６７は、図４の続きの図である。
【０２１９】
【図６８】図６８は、図４の続きの図である。
【０２２０】
【図６９】図６９は、図４の続きの図である。
【０２２１】
【図７０】図７０は、図４の続きの図である。
【０２２２】
【図７１】図７１は、図４の続きの図である。
【０２２３】
【図７２】図７２は、図４の続きの図である。
【０２２４】
【図７３】図７３は、図４の続きの図である。
【０２２５】
【図７４】図７４は、図４の続きの図である。
【０２２６】
【図７５】図７５は、図４の続きの図である。
【０２２７】
【図７６】図７６は、図４の続きの図である。
【０２２８】
【図７７】図７７は、図４の続きの図である。
【０２２９】
【図７８】図７８は、図４の続きの図である。
【０２３０】
【図７９】図７９は、図４の続きの図である。
【０２３１】
【図８０】図８０は、図４の続きの図である。
【０２３２】
【図８１】図８１は、図４の続きの図である。
【０２３３】
【図８２】図８２は、図４の続きの図である。
【０２３４】
【図８３】図８３は、図４の続きの図である。
【０２３５】
【図８４】図８４は、図４の続きの図である。
【０２３６】
【図８５】図８５は、図４の続きの図である。
【０２３７】
【図８６】図８６は、図４の続きの図である。
【０２３８】
【図８７】図８７は、図４の続きの図である。
【０２３９】
【図８８】図８８は、図４の続きの図である。
【０２４０】
【図８９】図８９は、図４の続きの図である。
【０２４１】
【図９０】図９０は、図４の続きの図である。
【０２４２】
【図９１】図９１は、図４の続きの図である。
【０２４３】
【図９２】図９２は、図４の続きの図である。
【０２４４】
【図９３】図９３は、図４の続きの図である。
【０２４５】
【図９４】図９４は、図４の続きの図である。
【０２４６】
【図９５】図９５は、図４の続きの図である。
【０２４７】
【図９６】図９６は、図４の続きの図である。
【０２４８】
【図９７】図９７は、図４の続きの図である。
【０２４９】
【図９８】図９８は、図４の続きの図である。
【０２５０】
【図９９】図９９は、図４の続きの図である。
【０２５１】
【図１００】図１００は、図４の続きの図である。
【０２５２】
【図１０１】図１０１は、図４の続きの図である。
【０２５３】
【図１０２】図１０２は、図４の続きの図である。
【０２５４】
【図１０３】図１０３は、図４の続きの図である。
【０２５５】
【図１０４】図１０４は、図４の続きの図である。
【０２５６】
【図１０５】図１０５は、図４の続きの図である。
【０２５７】
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【０２５８】
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【図１０８】図１０８は、図４の続きの図である。
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【０２６１】
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【図１１１】図１１１は、図４の続きの図である。
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【図１１５】図１１５は、図４の続きの図である。
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【０２７４】
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【０２７５】
【図１２４】図１２４は、図４の続きの図である。
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【０２７６】
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【０２７７】
【図１２７】図１２７は、図４の続きの図である。
【０２７８】
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【０２７９】
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【０２８０】
【図１３０】図１３０は、図４の続きの図である。
【０２８１】
【図１３１】図１３１は、図４の続きの図である。
【０２８２】
【図１３２】図１３２は、図４の続きの図である。
【０２８３】
【図１３３】図１３３は、図４の続きの図である。
【０２８４】
【図１３４】図１３４は、図４の続きの図である。
【０２８５】
【図１３５】図１３５は、図４の続きの図である。
【０２８６】
【図１３６】図１３６は、図４の続きの図である。
【０２８７】
【図１３７】図１３７は、図４の続きの図である。
【０２８８】
【図１３８】図１３８は、図４の続きの図である。
【０２８９】
【図１３９】図１３９は、図４の続きの図である。
【０２９０】
【図１４０】図１４０は、図４の続きの図である。
【０２９１】
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【０２９４】
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【０２９５】
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【０２９７】
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【０２９８】
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【０２９９】
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【０３００】
【図１５０】図１５０は、図４の続きの図である。
【０３０１】
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【０３０２】
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【０３０５】
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【０３０６】
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【０３１０】
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【０３１３】
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【０３１４】
【図１６４】図１６４は、図４の続きの図である。
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【０３２５】
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【図１８０】図１８０は、図４の続きの図である。
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【０３３８】
【図１８８】図１８８は、図４の続きの図である。
【０３３９】
【図１８９】図１８９は、図４の続きの図である。
【０３４０】
【図１９０】図１９０は、図４の続きの図である。
【０３４１】
【図１９１】図１９１は、図４の続きの図である。
【０３４２】
【図１９２】図１９２は、図４の続きの図である。
【０３４３】
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【０３４４】
【図１９４】図１９４は、図４の続きの図である。
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【図１９５】図１９５は、図４の続きの図である。
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【０３４８】
【図１９８】図１９８は、図４の続きの図である。
【０３４９】
【図１９９】図１９９は、図４の続きの図である。
【０３５０】
【図２００】図２００は、図４の続きの図である。
【０３５１】
【図２０１】図２０１は、図４の続きの図である。
【０３５２】
【図２０２】図２０２は、図４の続きの図である。
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【図２０４】図２０４は、図４の続きの図である。
【０３５５】
【図２０５】図２０５は、図４の続きの図である。
【０３５６】
【図２０６】図２０６は、図４の続きの図である。
【０３５７】
【図２０７】図２０７は、図４の続きの図である。
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【図２０８】図２０８は、図４の続きの図である。
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【図２０９】図２０９は、図４の続きの図である。
【０３６０】
【図２１０】図２１０は、図４の続きの図である。
【０３６１】
【図２１１】図２１１は、図４の続きの図である。
【０３６２】
【図２１２】図２１２は、図４の続きの図である。
【０３６３】
【図２１３】図２１３は、図４の続きの図である。
【０３６４】
【図２１４】図２１４は、図４の続きの図である。
【０３６５】
【図２１５】図２１５は、図４の続きの図である。
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【図２１６】図２１６は、図４の続きの図である。
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【図２１７】図２１７は、図４の続きの図である。
【０３６８】
【図２１８】図２１８は、図４の続きの図である。
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【図２１９】図２１９は、図４の続きの図である。
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【図２２０】図２２０は、図４の続きの図である。
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【図２２２】図２２２は、図４の続きの図である。
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【図２２３】図２２３は、図４の続きの図である。
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【図２２４】図２２４は、図４の続きの図である。
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【０３７６】
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【０３７７】
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【０３８０】
【図２３０】図２３０は、図４の続きの図である。
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【図２３１】図２３１は、図４の続きの図である。
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【図２４２】図２４２は、図４の続きの図である。
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【図２４３】図２４３は、図４の続きの図である。
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【図２４４】図２４４は、図４の続きの図である。
【０３９５】
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【図２４６】図２４６は、図４の続きの図である。
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【図２４７】図２４７は、図４の続きの図である。
【０３９８】
【図２４８】図２４８は、図４の続きの図である。
【０３９９】
【図２４９】図２４９は、図４の続きの図である。
【０４００】
【図２５０】図２５０は、図４の続きの図である。
【０４０１】
【図２５１】図２５１は、図４の続きの図である。
【０４０２】
【図２５２】図２５２は、図４の続きの図である。
【０４０３】
【図２５３】図２５３は、図４の続きの図である。
【図２５４】図２５４は、図４の続きの図である。
【０４０４】
【図２５５】図２５５は、図４の続きの図である。
【０４０５】
【図２５６】図２５６は、図４の続きの図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３５】
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【図３６】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５７】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１２０】
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【図２４８】
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【図２４９】
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【図２５０】
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【図２５１】
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【図２５２】
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【図２５３】
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【図２５６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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