(57)【要約】高塩および／または高培養密度に耐性を有する細胞および生物について報告する。それらの細胞では、二つの特定の遺伝子が不活性化されており、これによって環境ストレス耐性を有する。また、それらの細胞および生物の創製および使用の方法も記載する。細胞および生物は高塩および／または高密度耐性が有益である多くの異なる適用に使用できる。例として細胞培養（例えば酵母培養）を伴う産業用製品および食料品の加工がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である、少なくとも１つの不活性化された遺伝子を含む細胞であって、該細胞は、活性型の該遺伝子を含む対応する細胞より高濃度塩化ナトリウムに対して高い耐性を示す上記細胞。
【請求項２】
該細胞が酵母細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
該細胞がサッカロミセス・セレビジエ細胞である、請求項２記載の細胞。
【請求項４】
該細胞がアスペルギルスまたはサッカロミセス細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項５】
該細胞が真菌細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項６】
該細胞が植物細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項７】
該細胞の培養が高密度細胞培養である、請求項１記載の細胞。
【請求項８】
該細胞が高塩条件中にある、請求項１記載の細胞。
【請求項９】
該細胞が高い塩耐性を提供する少なくとも１つの更なる遺伝子特性を更に含む、請求項１記載の細胞。
【請求項１０】
該更なる遺伝子特性が高いナトリウムポンプ活性を提供する、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
該細胞が高い培養密度に対しても耐性を示す、請求項１記載の細胞。
【請求項１２】
該高培養密度が少なくとも100%高い、請求項１１記載の細胞。
【請求項１３】
高塩環境中の塩耐性細胞集団であって、該細胞はYgl039wもしくはYgl157wまたはその両方と機能的に相同である不活性化された遺伝子を少なくとも１つ含み、該細胞は塩耐性とされており、該細胞は該高塩環境中で増殖することを特徴とする上記集団。
【請求項１４】
該細胞が酵母細胞である、請求項１３記載の細胞。
【請求項１５】
該細胞がサッカロミセス・セレビジエ細胞である、請求項１４記載の細胞。
【請求項１６】
該細胞がアスペルギルスまたはサッカロミセス細胞である、請求項１３記載の細胞。
【請求項１７】
該細胞が真菌細胞である、請求項１３記載の細胞。
【請求項１８】
該細胞が植物細胞である、請求項１３記載の細胞。
【請求項１９】
該細胞の培養が高密度細胞培養である、請求項１３記載の細胞。
【請求項２０】
該細胞が高塩条件中にある、請求項１３記載の細胞。
【請求項２１】
該細胞が高い塩耐性を提供する少なくとも１つの更なる遺伝子特性を更に含む、請求項１３記載の細胞。
【請求項２２】
該更なる遺伝子特性が高いナトリウムポンプ活性を提供する、請求項２１記載の細胞。
【請求項２３】
該細胞が高い培養密度に対しても耐性を有する、請求項１３記載の細胞。
【請求項２４】
該高い培養密度が少なくとも100%高い、請求項２３記載の細胞。
【請求項２５】
Ygl039wもしくはYgl157wまたはその両方と機能的に相同である少なくとも１つの遺伝子が不活性化された細胞を含む塩耐性生物。
【請求項２６】
該生物が真菌である、請求項２５記載の塩耐性生物。
【請求項２７】
該生物が植物である、請求項２５記載の塩耐性生物。
【請求項２８】
該遺伝子の該不活性化によって塩耐性が与えられる、請求項２５記載の塩耐性生物。
【請求項２９】
該遺伝子の該不活性化によって高密度まで増殖する能力が与えられる、請求項２５記載の塩耐性生物。
【請求項３０】
該遺伝子の該不活性化によって高濃度の溶解成分を含有する溶液に対する耐性が与えられる、請求項２５記載の塩耐性生物。
【請求項３１】
少なくとも１つの人工的な遺伝子の変更を含む酵母であって、該酵母は該少なくとも１つの人工的な遺伝子の変更を含まない同遺伝子型の酵母より塩耐性が高く、より高い培養密度まで活発に増殖する上記酵母。
【請求項３２】
該少なくとも１つの人工的な遺伝子の変更が少なくとも１つの遺伝子の不活性化を含む、請求項３１記載の酵母。
【請求項３３】
対応する野生株より塩耐性が高く、栄養培地中でより高い密度まで増殖する酵母株。
【請求項３４】
該対応する野生株が認可された寄託機関に寄託されている指定標準野生株である、請求項３３記載の酵母株。
【請求項３５】
YPD培地中でOD600が少なくとも15となるまで増殖するサッカロミセス・セレビジエ酵母株。
【請求項３６】
0.9M NaClを含有するYPD中でBY4743株より高い密度まで増殖するサッカロミセス・セレビジエ酵母株。
【請求項３７】
親細胞に比較して、塩の存在に対してより高い耐性を示し、増殖条件下でより高い密度まで増殖する変異細胞。
【請求項３８】
該変異によって少なくとも１つの遺伝子が不活性化されている、請求項３７記載の細胞。
【請求項３９】
保存装置中に封入された、YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である不活性化された遺伝子を含む複数の細胞を含む培養キット。
【請求項４０】
該細胞の増殖のための説明書を更に含む、請求項３９記載のキット。
【請求項４１】
該細胞の増殖に好適な培地を更に含む、請求項３９記載のキット。
【請求項４２】
該細胞が酵母細胞である、請求項３９記載のキット。
【請求項４３】
該細胞が真菌細胞である、請求項３９記載のキット。
【請求項４４】
該細胞が植物細胞である、請求項３９記載のキット。
【請求項４５】
細胞を高密度まで増殖させる方法であって、
YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である不活性化された遺伝子を含む細胞を増殖条件下で指数増殖期に細胞が高密度となるまで増殖させること
を含み、該高細胞密度が、同じ増殖条件下で遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって指数増殖期に得られるものより高い上記方法。
【請求項４６】
該高細胞密度が少なくとも100%高い、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
該細胞が酵母細胞である、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
該細胞がサッカロミセスまたはアスペルギルス細胞である、請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
該細胞が真菌細胞である、請求項４５記載の方法。
【請求項５０】
該細胞が植物細胞である、請求項４５記載の方法。
【請求項６２】
該細胞を静止期まで増殖させる、請求項５２記載の方法。
【請求項６３】
該細胞を静止期まで増殖させ、該細胞の静止期での密度が、同じ増殖条件下で遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって静止期に得られるものより高い、請求項６０記載の方法。
【請求項５２】
細胞産物の生成量を増加させる方法であって、
YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である不活性化された遺伝子を含む細胞を増殖条件下で培養し；そして
該細胞産物を精製する
ことを含む上記方法。
【請求項５３】
該細胞を、同じ増殖条件下で遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって指数増殖期に得られるものより少なくとも50%高い細胞密度まで増殖させる、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
該細胞を、同じ増殖条件下で遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって指数増殖期に得られるものより少なくとも100%高い細胞密度まで増殖させる、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
該細胞が酵母細胞である、請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
該細胞がサッカロミセスまたはアスペルギルス細胞である、請求項５２記載の方法。
【請求項５７】
該細胞が真菌細胞である、請求項５２記載の方法。
【請求項５８】
該細胞が植物細胞である、請求項５２記載の方法。
【請求項５９】
該細胞を静止期まで増殖させ、静止期での該細胞の密度が、同じ増殖条件下で遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって静止期に得られるものより高い、請求項７０記載の方法。
【請求項６０】
高塩条件において細胞を増殖させる方法であって、
YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である不活性化された遺伝子を含む細胞を高塩増殖条件下で培養することを含み、該高塩増殖条件によって、遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞の増殖が阻害される上記方法。
【請求項６１】
該高塩条件が少なくとも0.9Mのナトリウムを含有する、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
該細胞が酵母細胞である、請求項７２記載の方法。
【請求項６３】
該細胞がサッカロミセスまたはアスペルギルス細胞である、請求項７４記載の方法。
【請求項６４】
該細胞が真菌細胞である、請求項６０記載の方法。
【請求項６５】
該細胞が植物細胞である、請求項７２記載の方法。
【請求項６６】
細胞培養を利用するプロセスで食料品を製造する方法であって、該プロセスにおいてYGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である不活性化された遺伝子を含む細胞を培養することを含む上記方法。
【請求項６７】
該製品がしょうゆ、ビール、ワイン、チーズ、および酵母を主成分とする栄養補助食品からなる群から選択される、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
該プロセスが発酵である、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
該培養が液体培養で行われる、請求項６６記載の方法。
【請求項７０】
該液体培養を静止期まで増殖させ、静止期における該細胞の密度が、同じ増殖条件下で遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって得られるものより高い、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
該液体培養が活発に増殖する連続培養として維持され、該連続培養物の細胞密度が、遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞を同じ培養条件下で活発に増殖するように維持した場合に得られるものより高い、請求項６６記載の方法。
【請求項７２】
該細胞が酵母細胞である、請求項６６記載の方法。
【請求項７３】
該細胞がサッカロミセスまたはアスペルギルス細胞である、請求項８８記載の方法。
【請求項７４】
該細胞が真菌細胞である、請求項６６記載の方法。
【請求項７５】
該細胞が植物細胞である、請求項６６記載の方法。
【請求項７６】
高レベルの溶解性物質に対して耐性のある細胞を生成する方法であって、
該細胞中のYGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方とマッチする配列を有する遺伝子の型を不活性化し；そして
高レベルの溶解性物質に対する該細胞の耐性を試験する
ことを含む上記方法。
【請求項７７】
該細胞が酵母細胞である、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
該細胞が植物細胞である、請求項７６記載の方法。
【請求項７９】
該細胞が真菌細胞である、請求項７６記載の方法。
【請求項８０】
該不活性化が該遺伝子の少なくとも一部の欠失を伴う、請求項７６記載の方法。
【請求項８１】
該不活性化が該遺伝子における挿入を伴う、請求項７６記載の方法。
【請求項８２】
YGLO39wおよびYGL157wとマッチする配列を有する遺伝子を含む細胞がYGLO39wおよびYGL157wとマッチする配列を有する少なくとも３つの異なる遺伝子を含み、YGLO39wおよびYGL157wとマッチする配列を有する遺伝子の全ての組み合わせを有する細胞を不活性化し、試験する、請求項７６記載の方法。
【請求項８３】
該高レベルの溶解性物質が高レベルの塩化ナトリウムを含む、請求項７６記載の方法。
【請求項８４】
該高レベルの溶解性物質が高レベルの細胞培養産物を含む、請求項７６記載の方法。
【請求項８５】
YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方とマッチする配列を有する遺伝子を同定することを更に含む、請求項７６記載の方法。
【請求項８６】
該同定が配列アラインメントの実施を含む、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
該同定が低ストリンジェントPCRを使用してYGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方とマッチする配列を含む配列を増幅することを含む、請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
該同定がYgl039w遺伝子産物もしくはYgl157w遺伝子産物、またはその両方と反応する活性系プローブと反応するポリペプチドを同定することを含む、請求項８５記載の方法。
【請求項８９】
該活性系プローブがYgl039w遺伝子産物もしくはYgl157w遺伝子産物、またはその両方の中のチロシン残基と反応する、請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
高密度まで増殖する細胞を生成する方法であって、
細胞中のYGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方とマッチする配列を有する遺伝子を不活性化し；そして
該細胞を、活性型の該遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって得られるものより高い密度となるまで指数増殖を持続する能力に関して試験する
ことを含む上記方法。
【請求項９１】
該細胞が酵母細胞である、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
該細胞が植物細胞である、請求項９０記載の方法。
【請求項９３】
該細胞が真菌細胞である、請求項９０記載の方法。
【請求項９４】
該不活性化が少なくとも１つの該遺伝子の少なくとも一部の欠失を伴う、請求項９０記載の方法。
【請求項９５】
該不活性化が少なくとも１つの該遺伝子における挿入を伴う、請求項９０記載の方法。
【請求項９６】
YGLO39wおよびYGL157wとマッチする配列を有する不活性化された遺伝子を有する細胞がYGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方とマッチする配列を有する少なくとも３つの異なる遺伝子を含み、YGLO39wおよびYGL157wとマッチする配列を有する遺伝子の全ての組み合わせを有する細胞を不活性化し、試験する、請求項９０記載の方法。
【請求項９７】
YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方とマッチする配列を有する遺伝子を同定することを更に含む、請求項９０記載の方法。
【請求項９８】
該同定が配列アラインメントの実施を含む、請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
該同定が低ストリンジェントPCRを使用してYGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方とマッチする配列を有する配列を増幅することを含む、請求項９７記載の方法。
【請求項１００】
該同定がYgl039w遺伝子産物もしくはYgl157w遺伝子産物、またはその両方と反応する活性系プローブと反応するポリペプチドを同定することを含む、請求項９７記載の方法。
【請求項１０１】
該活性系プローブが、Ygl039w遺伝子産物もしくはYgl157w遺伝子産物、またはその両方の中のチロシン残基と反応する、請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
高塩条件下で生物を成長させる方法であって、高塩増殖条件下で遺伝子YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である少なくとも１つの不活性化された遺伝子を含む生物を培養することを含み、該高塩増殖条件によって、遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性型遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である生物の成長が阻害される、上記方法。
【請求項１０３】
該高塩増殖条件が少なくとも0.9Mのナトリウムを含む、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０４】
該生物が酵母である、請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】
該生物が真菌である、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０６】
該生物が植物である、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０７】
該植物が飼料植物である、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０８】
該植物が穀草である、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０９】
土壌改良の方法であって、
高レベルの塩を含有する土壌中で、YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同な少なくとも１つの不活性化された遺伝子を含む少なくとも１つの植物を栽培し；そして
少なくとも10日間の栽培期間後に該植物の少なくとも一部を除去し、ここで該部分は高レベルの塩を含有する
ことを含む上記方法。
【請求項１１０】
該植物を少なくとも90日間栽培する、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
該栽培および該除去を複数回実施する、請求項１１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に環境ストレス条件、特に高塩および／または高培養密度条件に耐性を示す生物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景に関する以下の記載は単に本開示の理解を容易にするために提供するものであり、本発明の以前の技術を記述または構成するものと認めるものではない。
【０００３】
種々の塩（例えば塩化ナトリウム）または他の溶解性成分の存在または蓄積は、それらの状態に暴露された生物の成長を著しく阻害しうる。例えば植物では、高濃度の塩は水の吸収に干渉し、他の必要なイオンの吸収を阻害し、膨圧の喪失および気孔の閉塞を引き起こし、光合成および生長を阻害する。同様に、酵母のような生物では、高塩培地によって細胞の脱水が起こると同時に代謝が妨害され、ここでも成長の阻害が起こりうる。従って、塩耐性生物を提供することは、通常は有用なレベルの成長が持続されないような、または全く成長が持続されないような不利な条件下で生物を成長させるのに有用である。そのような塩耐性生物を提供するために、多くの異なる技術が使用されてきた。
【０００４】
DNAの直接操作を伴わない方法では、慣例的な選択法を使用して塩耐性の選択が行われてきた。例えばDobrenzらの米国特許第6,005,165号（“Salt Tolerant Alfalfa”）を参照されたい。更に、植物細胞およびカルスにおける塩耐性の選択がインビトロで行われてきた。例えばDix, The Plant Journal 3:309-313 (1993)を参照されたい。
【０００５】
更に、塩耐性に関係するある種の遺伝子が同定されている。これらの遺伝子の発現によって生物における塩耐性が向上する。例えば以下を参照されたい：Gaxiolaら, EMBO J. 11:3157-3164 (1992)；Glaserら, EMBO J. 12:3105-3110 (1993)；およびMuriagaら, Science 259:508-510 (1995)。場合によっては、それらの発現は、例えば酵母における、非相同発現である。非相同発現の例はGasserらの米国特許第5,859,337号（“Genes Conferring Salt Tolerance and Their Uses”）に記載されているが、これは酵母におけるある種のArabidopsis遺伝子の発現について報告している。
【０００６】
同様に、Murataの米国特許第6,281,412号（“Method for Creating Osmotic-Pressure-Tolerant Plant”）は塩耐性植物を提供するためのコリンオキシダーゼの非相同発現について報告している。
【０００７】
アンチポーター（antiporter）遺伝子の発現（または過剰発現）によっても塩耐性が得られる。例えばWaditeeら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:4109-4114 (2002)）は、淡水シアノバクテリウムにおける塩耐性シアノバクテリウム由来のNa+/H+アンチポーター遺伝子の発現によって塩耐性が向上することを報告している。同様に、ナトリウムアンチポーターの発現によって植物に塩耐性が創製されることが証明されている。例えばZhangら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:12832-12836 (2001)）は、Brassica napusにおけるナトリウムアンチポーター発現および塩耐性について報告しており、Zhangら（Nat. Biotechnol. 19:765-768 (2001)）はトマトにおける同様の効果を報告している。同様に、Apseら（Science 285:1256-1258 (1999)）はArabidopsisにおけるナトリウムアンチポーター発現および塩耐性について報告している。
【０００８】
別の方法は、塩耐性を誘導する物質の適用を伴う。それらの物質の一例はジベレリンである（Zhao Ke-fuら, Aust. J. Plant Physiol., 13:547-551 (1986)）。別のそれらの物質は5-アミノレブリン酸（またはその塩）である。これらの化合物の適用によって塩耐性が向上されることが示唆されている（Kuramochiらの米国特許第5,661,111号, “Method for Improving Plant Salt Tolerance”）。
【０００９】
塩耐性である酵母も得られる。例えばParkら（J. Biol. Chem. 276:28694-28699 (2001)）は、酵母においてカルシニュリンを連続的に活性化するとPMR2遺伝子の発現が増加されることによって塩耐性表現型が得られることを示している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明は環境ストレス条件、特に高塩および／または高培養密度条件に耐性のある細胞を生成および使用するための方法、並びに細胞そのものおよび関係する組成物を提供する。それらの細胞は一般に特定の遺伝子を不活性化することによって得られる。これによって多くの異なる細胞および生物（例えば酵母および植物）から改変された株を創製することができる。得られる改変型細胞および生物を、高塩、高培養密度、および／または他の環境ストレス条件に対する耐性が有益である広範なプロセスに使用することができる。
【００１１】
従って、第一の観点では、本発明はYGLO39wと機能的に相同、もしくはYGL157wと機能的に相同、または両者に機能的に相同な不活性化された遺伝子を少なくとも１つ有する細胞（単数または複数）（好ましくは単離または精製された細胞）を提供する。遺伝子の不活性化の結果として、細胞は活性化型の遺伝子を有する対応する細胞と比較して、高塩（例えば塩化ナトリウム（および好ましくは更なる溶解性物質および／または高培養密度））濃度に対してより高い耐性を有する。ある態様では、複数の遺伝子（例えば２、３、４、またはそれ以上）を不活性化する。
【００１２】
それらの遺伝子の活性化およびそれによる塩耐性は種々の異なる細胞で得ることができる。従って種々の態様において、細胞は酵母細胞、好ましくはサッカロミセス細胞、最も好ましくはサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である。同様に、細胞がアスペルギルス種からのものであってもよい。より一般的には、細胞は真菌細胞または植物細胞であってもよい。好ましい態様では、細胞は細胞培養物中に、好ましくはそれらの細胞の集団中に存在する。好ましくは細胞培養物は液体培養物である。好ましい態様では、細胞培養物は高密度細胞培養物である。
【００１３】
好ましい態様では、細胞は高塩培養条件中に存在する；細胞（単数または複数）は塩耐性を向上させる更なる遺伝子特性を少なくとも一つ更に含む。例えば更なる遺伝子特性は変異（単数または複数）または非相同遺伝子（単数または複数）であってもよく、これは例えばナトリウムポンプ（アンチポーター）活性を高めるものであってもよい；塩耐性の向上に加え、細胞はYGLO39wおよび／またはYGL157wと機能的に相同である活性型遺伝子を有する対応する細胞に比較して高い培養密度および／または飢餓状態にも耐性を示し、好ましくは密度が少なくとも25%、50%、100%、150%、200%、300%、400%、500%、700%、1000%、またはそれ以上であるような高い培養密度に耐性を示す；そして／または、細胞は、活性型の遺伝子を有する細胞より高い密度まで活発な増殖を持続する。例えば細胞はより高い密度まで指数増殖期を持続できる。ある態様では、細胞（または培養物もしくは集団）は高塩かつ高密度である培養物中に存在する。上に示す態様は、例えば限定された種類の細胞型を特定する観点によって、その逆を示さない限り、本発明の他の観点にも適用される。
【００１４】
関連する観点では、本発明は高塩環境中の塩耐性細胞集団を提供し、ここで細胞はYGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同であり、それによって細胞を塩耐性とする、不活性化された遺伝子を少なくとも１つ有する。従って塩耐性細胞は高塩環境で増殖する。
【００１５】
別の関連する観点では、本発明はYGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である少なくとも１つの遺伝子が不活性化された細胞を有する塩耐性生物を提供する。特に好ましくは、遺伝子の不活性化により、塩耐性および／または高密度まで増殖する能力および／または高濃度の溶解性成分（例えば種々のイオン（例えば種々の金属）および／または細胞もしくは生物培養の産物）を含有する溶液に対する耐性が与えられる。
【００１６】
別の観点では、本発明は少なくとも１つの人工的な遺伝子の変更を有する酵母を提供し、ここで酵母は少なくとも１つの人工的な遺伝子の変更を有さない同遺伝子型の酵母より塩耐性が高く、より高い培養密度まで活発に増殖する。それらの変更には上記のもの、例えば少なくとも１つの遺伝子を不活性化する変更がある。
【００１７】
関連する観点では、本発明は対応する野生株より塩耐性が高く、栄養培地中でより高い密度まで増殖する酵母株を提供する。好ましくは対応する野生株は認可された寄託機関に寄託されている指定標準野生株である。
【００１８】
別の関連する観点では、本発明はYPD培地中で少なくともOD600が15となるまで増殖するサッカロミセス・セレビジエ酵母株を含む。好ましくは株は0.9M NaClを含有するYPD培地中で、BY4743株より高い密度まで活発に増殖する。
【００１９】
更に別の関連する観点は、0.9M NaClを含有するYPD培地中で、BY4743株より高い密度まで、そして／またはより速く増殖するサッカロミセス・セレビジエ酵母株に関する。
【００２０】
別の関連する観点は、増殖条件下で親細胞より塩の存在に対して高い耐性を示し、より高い密度まで増殖する変異細胞に関する。変異は少なくとも１つの遺伝子（例えばYGLO39wおよび／またはYGL157wと機能的に相同である遺伝子）の不活性化を含んでもよい。
【００２１】
別の観点では、本発明は保存装置に封入された上記の観点で記載した複数の細胞（例えばYGLO39wおよび／またはYGL157wと機能的に相同である不活性化された遺伝子を少なくとも１つ含む細胞）を含む培養キットを提供する。好ましくはキットは細胞を増殖させるための説明書および／または細胞を増殖させるのに好適な１つ以上の培地も含む。例えば培地は液体（濃縮液または通常使用される濃度）、乾燥された形態、または少なくとも部分的に培地を提供するために合一される複数成分の形態で提供してもよい。培地は高塩培地であってもよい。
【００２２】
好ましい態様では、細胞は上記の観点で記載されるタイプ、または本明細書で本発明における使用に好適であると記載されるタイプのものである。真菌細胞を含むキットでは、真菌細胞は胞子であってもよい。同様に、植物細胞を含むキットでは、植物細胞は種子、実生、挿木、または他の生長可能な植物形態であってもよい。保存装置は、例えば、単数または複数の箱、バイアル、試験管、薬袋、缶、および／または袋を含んでもよい。
【００２３】
別の観点では、本発明はYGLO39wおよび／またはYGL157w遺伝子と機能的に相同である少なくとも１つの不活性化された遺伝子を有する細胞を、増殖条件下で、指数増殖期の間に高い細胞密度となるまで培養することによって、細胞を高密度まで増殖させる方法を提供する。この高い細胞密度は、同じ増殖条件下でYGLO39wおよびYGL157w遺伝子と機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって指数増殖期に得られるものより、好ましくは少なくとも25%、50%、80%、100%、200%、またはそれ以上高い。好ましい態様では、細胞は上記の観点で記載されるタイプ、または本明細書で本発明における使用に好適であると記載されるタイプである。
【００２４】
ある態様では、細胞を静止期まで増殖させる。好ましくは静止期に得られる細胞密度は、同じ増殖条件下でYGL157wおよびYGL157w遺伝子と機能的に相同である活性型遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって静止期に得られるものより、例えば少なくとも25%、50%、80%、100%、もしくは200%、またはそれ以上高い。
【００２５】
別の観点では、本発明の細胞がより高い密度まで増殖する能力（活発な増殖の間および／または最終の細胞密度）によって、細胞産物の生成量を増加させる方法が提供される。この方法は、YGLO39wおよび／またはYGL157w遺伝子と機能的に相同である不活性化された遺伝子を少なくとも１つ有する細胞を増殖条件下で培養し、所望の産物（単数または複数）を精製することを伴う。好ましい態様では、細胞を指数増殖期において、同じ増殖条件下でYGLO39wおよび／またはYGL157w遺伝子と機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって指数増殖期に得られるものより少なくとも25%、50%、80%、100%、または200%（またはそれ以上）高い細胞密度まで増殖させる。細胞は静止期まで増殖させる。好ましくは静止期での該細胞の密度は、同じ増殖条件下でYGLO39wおよびYGL157w遺伝子と機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって静止期に得られるものより、例えば少なくとも25%、50%、80%、100%、もしくは200%、またはそれ以上高い。好ましくは細胞は上記の観点で記載されるタイプ、または本明細書で本発明における使用に好適であると記載されるタイプである。
【００２６】
同様に、関連する観点では、本発明はYGLO39wおよび／またはYGL157w遺伝子と機能的に相同である不活性化された遺伝子を少なくとも１つ有する細胞を高塩増殖条件下で培養することによって高塩条件中で細胞を増殖させる方法を提供し、ここで、高塩増殖条件は、YGL039wおよび／またはYGL157w遺伝子と機能的に相同である活性型遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞の増殖を阻害する。高塩条件におけるイオン（例えばナトリウムイオン）のレベルまたは濃度は特定の細胞型によって様々でありうる。特定の態様では、ナトリウム濃度（例えば塩化ナトリウム由来の）は0.9M（モル）±0.1M、または少なくとも0.9Mである。好ましい態様では、細胞は本明細書で本発明に好適であることが示されるタイプのものである。
【００２７】
別の観点では、本発明は細胞培養を利用するプロセスにおいて食料品を製造する方法を提供し、これは該プロセスにおいてYGLO39wおよび／またはYGL157w遺伝子と機能的に相同である不活性化された遺伝子を少なくとも１つ有する細胞を培養することを伴う。好ましくは細胞は上記の観点で記載されるものである。細胞培養プロセスを利用する食料品の例には、しょうゆ（発酵）、ビール、ワイン、チーズ、およびある種の栄養サプリメント、例えば酵母を主成分とする栄養サプリメントがある。プロセスに使用される細胞は種々のタイプのものであってもよく、特定のプロセスに好適なように選択されるが、それらには本明細書で本発明での使用に好適であると記載されるタイプの細胞が含まれる。
【００２８】
ある場合には、プロセスは発酵である。一般に、培養は液体培養中で行われる。培養は連続活性培養で行うか、またはバッチ式培養で（例えば静止期まで）行う。好ましい態様では、バッチ式培養での（例えば静止期の）、または連続活性培養での細胞密度は、同じ増殖条件下でYGLO39wおよび／またはYGL157w遺伝子と機能的に相同である活性型遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって得られるものより高い。
【００２９】
二つの関連する観点では、高レベルの溶解性物質に対して耐性を示す細胞の生成法、および高培養密度に対して耐性を示す細胞の生成法を提供する。この方法は、細胞中のYGLO39wおよび／またはYGL157wとマッチする配列を有する型の遺伝子を不活性化し、そしてそれらの細胞の高レベルの溶解性物質（例えば塩化ナトリウムのような塩）および／または高培養密度に対する耐性を試験することを含む。細胞のタイプは多くの異なるタイプであることができ、例えば本明細書に本発明に使用されるものとして記載されるものであってもよい。
【００３０】
分子生物学の当業者に認識されるように、遺伝子の不活性化は種々の方法で行うことができる。例として、限定されるわけではないが、遺伝子の少なくとも一部の欠失；遺伝子における挿入（典型的には非相同配列の挿入）の創製；転写の阻害；転写産物のプロセシングの阻害；および翻訳の阻害、並びにポリペプチドまたはタンパク質の阻害が含まれる。食料品の製造および不活性化の長期安定性が有益であるような他の適用における使用では、好ましくは欠失または挿入による不活性化を使用する。
【００３１】
種々の型の細胞がYGLO39wおよび／またはYGL157wとマッチする配列を有する複数の遺伝子、例えば2つ以上の遺伝子、例えばマッチする配列を含む3、4、5、またはそれ以上の遺伝子（および／または遺伝子産物）を保有することができる。例えばサッカロミセス・セレビジエはマッチする配列を保有する4つの異なる遺伝子を有するが、YGLO39wおよびYGL157wは不活性化されると塩および高培養密度に対する耐性を与えることが見出された遺伝子である。従ってある態様では、細胞はYGLO39wおよび／またはYGL157wとマッチする配列を有する少なくとも2、3、4、または5つの異なる遺伝子を含有する。これらの不活性化された遺伝子を（例えば２つずつの）異なる組み合わせで含有する細胞を試験して、機能性相同体を同定する。好ましくは、少なくとも全ての２つずつの組み合わせの不活性化された遺伝子を有する細胞を試験し、より好ましくは全ての組み合わせの不活性化された遺伝子を有する細胞を試験する。
【００３２】
高レベルの溶解性物質は、種々の異なる成分、例えば高レベルの塩化ナトリウムおよび／または高レベルの細胞培養産物を含んでもよい。
【００３３】
本発明の方法はまた、YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方（または対応する遺伝子産物）とマッチする配列を有する遺伝子および／または遺伝子産物を同定することを含んでもよい。それらの同定は多くの異なる方法で行うことができる。好適な方法は当業者に周知である。例として、YGLO39wおよびYGL157w遺伝子の配列とマッチする配列を有する配列を増幅するための低ストリンジェンシーPCRを使用し、YGLO39wおよび／またはYGL157wと反応する活性系プローブを使用する、配列アラインメントの実施がある。活性系プローブを使用する好ましい態様では、プローブはYGLO39wおよび／またはYgl157wペプチド中のチロシンと反応する。種々の方法をいずれの組み合わせで使用してもよい。
【００３４】
本発明はまた、別の観点において、高塩条件下で生物を成長させるための方法を提供する。この方法は、YGLO39wおよび／またはYGL157w遺伝子と機能的に相同な不活性化された遺伝子を少なくとも１つ有する生物を高塩増殖条件下で培養することを伴い、ここで高塩増殖条件は、不活性化された遺伝子の活性型を有することを除いて同遺伝子型である生物の増殖を阻害する。
【００３５】
高塩条件は、例えば生物の型によって、種々のレベルまたは濃度であってもよい。好ましい態様では、（例えば塩化ナトリウム由来の）ナトリウムイオンの濃度は少なくとも0.3M、0.4M、0.5M、0.7M、0.8M、少なくとも0.9M±0.1Mナトリウム、または少なくとも0.9Mナトリウムである。植物または植物細胞を伴う態様では、水または培地に溶解されるナトリウムイオン濃度は、好ましくは少なくとも0.02M、0.04M、0.05M、0.08M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、またはそれ以上である。
【００３６】
生物は記載の遺伝子を有する任意のタイプのもの、例えば酵母、真菌、もしくは植物、または本発明に好適であると示唆される他の生物であってもよい。植物には、例えば飼料植物（例えばアルファルファおよび牧草）、穀草（例えば小麦、大麦、オーツ麦、米、およびトウモロコシ）、および野菜、並びに多くの他の型の植物がある。
【００３７】
別の観点では、土壌改良の方法を提供する。この方法は、高レベルの塩を含有する土壌においてYGLO39wおよび／またはYGL157wと機能的に相同な不活性化された遺伝子を少なくとも１つ有する少なくとも１つの植物を栽培し、少なくとも10日間の栽培期間後、植物または少なくとも植物の一部を除去することを伴う。除去した植物部分は高レベルの塩を含有する。従って植物または植物部分の除去によって過剰の塩が除去される。ある態様では、土壌中のナトリウムと供給される水の組み合わせから生じる溶解性ナトリウムの濃度は上記の観点に示す通りである。
【００３８】
多くの場合、植物をより長い期間（例えば少なくとも30日間、60日間、90日間、180日間、1年間、2年間、5年間、10年間、またはそれ以上）栽培する。ある態様では、植物は一年生または多年生である。栽培および除去は、再植することによって、および／または切断後再生長する植物を用いて、反復して行うことができる。特定の態様では、少なくとも2、5、10、20、40回、またはそれ以上反復する。
【００３９】
細胞に関連して“単離された”という用語は、細胞を当初の環境（例えば自然環境）から、または混合集団から除去したことを意味する。
【００４０】
“有意な”という用語は、増加のレベルがそれらの増加を行った者にとって有用であることを示すために使用され、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも5から10倍、またはそれ以上である。
【００４１】
また目的によっては、細胞が精製された形態であることが有益である。細胞に関して“精製された”という用語は、（例えば均質な培養物のように）完全に純粋であることを必要とするのではなく、細胞が当初の環境（例えば自然環境）より相対的により純度が高いことを表すものである。当初のレベルに比較して、このレベルは（例えば、細胞／mLまたは細胞／cm3で）少なくとも2から5倍高くあるべきである。好ましくは精製された細胞は、存在しうる細胞のタイプに好適な単離方法によって検出できるようなレベルで存在する他の細胞を含有しない。
【００４２】
遺伝子に関連して“不活性化された”という用語は、通常は機能性産物をコードする遺伝子由来の遺伝子産物が改変または処理されることによって、遺伝子が産物を生成しないか、完全に不活性な産物を生成するか、もしくは十分に低レベルの機能性産物を生成し、それによって本発明に記載する効果が得られること、または遺伝子産物の発現もしくは活性が十分に阻害されていて本発明に記載する効果が得られることを意味する（本発明に有用な遺伝子で）。好ましくは遺伝子産物の活性の低下は少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、更に好ましくは少なくとも95%、そして最も好ましくは少なくとも97、98、99、または100%（検出不能の活性）である。YGLO39wおよびYGL157wの場合のように、１つより多いの遺伝子を共に不活性化することによって所望の効果を得てもよい。そのような不活性化は例えば以下のような種々の方法で行うことができる：遺伝子の全部または一部の欠失；遺伝子における別の配列（単数または複数）の挿入；遺伝子もしくは対応するmRNAとセンス、アンチセンス、リボザイム、もしくはトリプルへリックス型配列、またはそれらの組み合わせとの接触；遺伝子発現の抑制的制御；転写物のプロセシングの阻害；mRNAの翻訳の阻害；および／またはポリペプチドもしくはタンパク質の作用の阻害。従って遺伝子の不活性化に関する記載は、より限定的であることを明示しない限り、DNA、RNA、および／またはタンパク質レベルでの不活性化を含みうる。
【００４３】
“YGLO39w”、“YGLO39w遺伝子”、“YGLO39w遺伝子産物”、“YGLO39w”などの用語は、表１にSEQ ID NO.1および2で表すサッカロミセス・セレビジエのコード配列、遺伝子、およびコードされるペプチドを指す。
【００４４】
“YGL157w”、“YGL157w遺伝子”、“YGL157w遺伝子産物”、“Ygl157w”などの用語は、表2にSEQ ID NO.3および4で表すサッカロミセス・セレビジエのコード配列、遺伝子、およびコードされるペプチドを指す。Ygl157wはコードされるペプチドを指す。
【００４５】
本発明の配列に関しては、特に記載しない限り、“配列のマッチ”および“マッチする配列”、そして同様の意味の用語は、修飾なしで使用される場合、配列が、参照配列と少なくとも最小レベルのヌクレオチドまたはアミノ配列の同一性（または類似性）を有することを示す。マッチするヌクレオチド配列（例えば遺伝子配列またはコード配列）は、少なくとも60ヌクレオチド、好ましくは少なくとも75、90、105、120、150、もしくは200ヌクレオチドの少なくとも１つの配列ウィンドウ、または全ORFもしくは全遺伝子にわたって、少なくとも60%、または好ましくは少なくとも70%の配列同一性（2つ以上の核酸配列のコンピューターによるアラインメントでの最大塩基マッチングで）を示し、より好ましくは少なくとも80%または85%、更に好ましくは少なくとも90%、そして最も好ましくは少なくとも95%である。
【００４６】
マッチ配列を有するポリペプチド（典型的には配列がマッチする遺伝子の産物）は少なくとも20個の連続するアミノ酸残基のウィンドウ（または以下に示すようなより大きなウィンドウ）にわたって、好ましくは25、30、35、40、45、または50アミノ酸、より好ましくは少なくとも100アミノ酸にわたって、参照ポリペプチドの配列と少なくとも20%の同一性を有する。最も好ましくは、マッチする配列はORFにコードされるポリペプチドの全長または全遺伝子にわたって少なくとも20%の同一性を有する。好ましくは、比較はYGLO39wおよび／またはYgl157wポリペプチド（または他の機能的に相同なポリペプチド（単数または複数））に対して行う。より好ましくはアミノ酸の同一性レベルは25%、27%、30%、32%、35%、37%、またはそれ以上である。
【００４７】
“類似性”などの用語を、ポリペプチド配列のマッチを表すのに使用してもよい。本明細書で使用する場合、この用語は同一アミノ酸および保存的に変更されたアミノ酸の両者とマッチする配列マッチの尺度をいう。周知のように、アミノ酸残基に関連して“類似する”という用語は、置換するアミノ酸が置換されるアミノ酸と類似した化学-物理学的特性を有するアミノ酸をいう。類似した化学-物理学的特性には帯電、かさ高さ、疎水性、親水性などの類似性がある。アミノ酸類似性を相同性の比較に使用する場合、類似性のレベルは少なくとも45%、より好ましくは少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、またはそれ以上である。
【００４８】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の比較では、配列のマッチを％配列同一性で表す場合、パーセンテージはBLASTプログラムを（デフォルトパラメーター（Altschulら, 1997, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acid Res. 25:3389-3402）を用いて）使用して測定してもよい。比較結果が得られる当該分野で周知の種々のアルゴリズムを、同等の結果を得られるように調整したパラメーターと共に使用することもできる。配列検索における３つの異なるアルゴリズムの演算特性についてはSalamovら, 1999, "Combining sensitive database searches with multiple intermediates to detect distant homologues." Protein Eng.  12:95-100に報告されている。別の代表的なプログラムパッケージはウィスコンシン大学からのGCG(パッケージである。
【００４９】
あるいはまた配列のマッチは、ギャップペナルティーまたは他の計算を導入せずに２つの同じ長さの配列を最大のマッチとなるように整列させた場合の、参照配列と比較した比較配列中の同一（または類似）ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の最大数で表すことができる。従って、配列マッチの尺度として％同一性を使用する場合、％同一性は、（同一残基数）÷（各配列中の残基総数）ｘ（100）として算出する。ポリペプチドでは、類似性を使用する場合、％配列マッチ性（または類似性）は（同一残基数＋類似残基数）÷（各配列中の残基総数）ｘ（100）として算出する。アラインメントは手動で行ってもよいが、好ましくはアラインメントはコンピューターに基づくアラインメントプログラムを使用して実施する。このアラインメントおよび計算を使用して定義されるマッチのパーセントは、ここでは“等長マッチ”とも呼ぶ。
【００５０】
核酸配列については、配列マッチはまた、あるいは追加的に、２つの相補的核酸鎖が上記のような配列マッチレベルでのハイブリダイズを可能とする好適なストリンジェンシーの条件下で互いにハイブリダイズする能力により特徴づけてもよい。従って、マッチするヌクレオチド配列は10個中3個までのミスマッチを含む参照配列と識別的にハイブリダイズする（すなわち２つの等しい長さの配列中、少なくとも70%の塩基がマッチする）。好ましくは、許容されるミスマッチのレベルは10個中2個までのミスマッチ、または10個中1個までのミスマッチ、より好ましくは20個中1個までのミスマッチである（もちろんこれらの割合はより長い配列に適用できる）。ハイブリダイゼーションは典型的には、そして好ましくは、プローブ長の核酸分子、好ましくは20-100ヌクレオチド長で行う。少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列が安定してハイブリダイズし、それより低い相補性を有するものがハイブリダイズしないようなハイブリダイズ条件のストリンジェンシーをどのように推定および調整するかは、当業者に理解される。ハイブリダイゼーション条件およびパラメーターの例として、例えば以下を参照されたい：Sambrookら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring, N.Y.；Ausubel, F.M.ら (1994) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Secaucus, N.J.。従って、マッチする遺伝子配列は目的とする任意の核酸配列を使用して同定することができる。
【００５１】
典型的なハイブリダイゼーションは、例えば標識した目的とするプローブに加えて、核酸鎖相互作用を安定化させるための6X SSC（NaClおよびクエン酸ナトリウム塩基）のような塩溶液、0.5% SDSのような穏和な界面活性剤を、他の一般的な添加剤（例えばデンハルト溶液およびサケ精子DNA）と併せて利用する。探索すべき固定化配列に溶液を添加し、好適な温度でインキュベートして、好ましくは非特異結合を最低限にしつつ特異的結合をさせる。インキュベーションおよびその後の洗浄の温度はハイブリダイゼーションの成功および明確性に重要である。ストリンジェント条件では、非ストリンジェント条件より相対的に高温、低塩濃度、および／またはより多くの界面活性剤を使用する。ハイブリダイゼーション温度は試験する配列の長さ、相補性のレベル、および性質（すなわち“GC含量”）に依存する。典型的なストリンジェントのハイブリダイゼーションおよび洗浄は少なくとも40℃の温度で行い、低ストリンジェント・ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、一般に37℃から室温（25℃まで）で行う。当業者に認識されるように、これらの条件は上記のパラメーターによって様々であり、ホルムアミドおよび硫酸デキストランのようなある種の添加剤を添加して条件に影響を与えてもよい。
【００５２】
“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”は、少なくとも以下のようなストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を意味する：50%ホルムアミド、5X SSC、50mM NaH2PO4、pH 6.8、0.5% SDS、0.1mg/mL音波処理サケ精子DNA、および5X デンハルト溶液中、42℃で一晩ハイブリダイゼーション；そして0.2X SSC、0.1% SDSを用いて45℃で洗浄。別の例においては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では20個の連続するヌクレオチド長にわたって３塩基以上が異なる2個の核酸はハイブリダイズしない。
【００５３】
“耐性のある”、“より高い耐性”、および同様の意味の用語は、細胞または生物が、所定の環境条件で参照細胞または生物より良好に生存および増殖する能力をいう。一般に本発明では、参照細胞または生物は野生型の細胞もしくは生物、または特定の遺伝子の相違を除いて同遺伝子型である細胞もしくは生物である。
【００５４】
“塩耐性”という用語は高レベルの溶解性塩（例えばNaCl）に対する耐性を含むが、他の高レベルの溶解性塩（例えばカリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩）に対する耐性も含みうる。
【００５５】
“対応する細胞”および“同遺伝子型の”という用語は、特定の明確な遺伝子の相違を除いて目的とする細胞または生物と同一である細胞または生物をいう。例えば野生型細胞は、その変異（単数または複数）を除いてその細胞の変異型と同遺伝子型である。従って“同遺伝子型の”という用語は、細胞または生物が参照細胞または生物と（個々の変異を除いて）同じ遺伝子相補体（genetic complement）を有することを意味する。この用語は、変異または誘導された細胞または生物が特定の遺伝的変化に関してのみ異なるが、参照細胞と同じ遺伝的バックグラウンドを有することを示すものとして使用される。
【００５６】
遺伝子および遺伝子産物に関連する“活性型”という用語は、特定の遺伝子が生物中に存在しかつ発現され、遺伝子産物がその正常な生物学的活性を有することを意味する。
【００５７】
本明細書で使用する“細胞（単数または複数）”という用語は、細胞に関する慣例的な生物学的理解を含むが、細胞および／または複雑な生物に発達する能力がある生物体（例えば種子および胞子）、および繁殖体（例えば花粉）も含む。特に示さない限り、この用語は全ての状況での細胞（例えば単細胞、単細胞の培養物、および多細胞生物の細胞）を含む。
【００５８】
“生物”という用語はその通常の生物学的意味を有し、天然の組織化された形態をなす自己複製型の生命体をいう。
【００５９】
“酵母”という用語はその通常の生物学的意味で使用し、ライフサイクルの少なくとも一時期に単細胞である真菌をいう。場合によっては、酵母は直鎖状の不完全に分離した発芽細胞からなる仮性菌糸を形成する。
【００６０】
“真菌”という用語は通常の生物学的意味で使用し、酵母および糸状菌の両方を含む。真菌には多核構造を有するものがある。
【００６１】
“胞子”は好適な条件下で活性生物に発達する能力を有する、生物の天然の保存形態をいう。例として真菌胞子がある。
【００６２】
“植物”という用語はその通常の生物学的意味で使用する。
【００６３】
同様に、“種子”という用語はその通常の生物学的意味で使用し、受粉後、種子植物の胚珠から形成される構造をいう。
【００６４】
本明細書の文脈では“培養”という用語は、細胞もしくは生物のサイズおよび／もしくは数が増加する条件下、または、それらのサイズおよび／もしくは数の増加を試験することを意図する条件下で、細胞または生物を成長させる過程をいう。例えば、培養は液体または固体培地中での酵母細胞の増殖、並びに土壌中での植物の栽培を含む。従って、培養は単なる細胞または生物の保存とは区別される。
【００６５】
“細胞培養”という用語は細胞の培養を指して使用し、これは植物のような多細胞生物を培養することとは異なる。すなわち、細胞は組織のような天然の複合構造に組織化されていない一般的に分離された細胞として存在する。通常、細胞培養は液体培地を用いて行われ、細胞は表面（単数または複数）上にあって培地中に浸漬されているか、または培地中に懸濁されている。
【００６６】
本明細書では、“培養密度”という用語は、培養物中の細胞の密度（細胞培養の場合）または生物の密度をいう。典型的には、この用語は細胞培養に適用される（例えば細胞/mL）。この文脈においては、“高密度”または“高細胞密度”という用語は、参照となる条件のものより高い細胞（または生物）密度をいい、これは一般的には、特定の遺伝子の変更を除いて同遺伝子型である細胞（例えばYGLO39wおよび／またはYGL157wと機能的に相同な遺伝子の不活性化）によって得られる密度である。
【００６７】
本明細書で使用する“高塩条件”という句は、塩（例えば塩化ナトリウム（またはナトリウムイオン））が溶液または可溶化される個所に、目的とする特定の細胞型または生物にとって通常より高い濃度で存在することをいう。従って、例えば液体培養物中の酵母については、この用語は液体培地中の塩濃度をいい、土壌中の植物では、この用語は土壌および／または植物が吸収できる水の中の塩濃度をいう。
【００６８】
本明細書で使用する“キット”という用語は、特定の使用またはいくつかの使用を組み合わせたものに適するように選択され、共に包装された２つ以上の品目の組み合わせをいう。好ましくはキットは販売に適するように調製される。
【００６９】
キットに関連して使用する“保存装置”という用語は、内容物を保持し、予期される条件下での損失から保護することのできる容器をいう。非制限的な例としてビン、袋、スリーブ管、薬袋、バイアル、試験管、および缶がある。
【００７０】
本発明の文脈では、“増殖条件”という用語は参照細胞または生物が増殖すること（好ましくは数の増加を含む）が可能な条件をいう。
【００７１】
“指数増殖期”という用語はその通常の生物学的意味で使用し、補充を行わない培地中で活発な増殖が起こる細胞（例えば酵母）の増殖期間をいう。細胞数を時間に対する片対数グラフとしてプロットする場合、指数増殖期は一般に曲線中の直線部分として表され、一般にこれは上向きにカーブする初期増殖期（一般に誘導期および増殖の誘導を表す）と細胞数の増加速度が実質的に低下し、通常本質的に停止するために傾きが減少する曲線の後部分（静止期）の間である。
【００７２】
前記と同様に“静止増殖期（stationary growth phase）”または“静止期”という用語は、補充を行わない培地中で細胞数の増加速度が実質的に低下し、一般的には停止する細胞の増殖期間をいう。例えば培地交換および細胞の除去により、連続培養で細胞を指数増殖期に維持することもできる。
【００７３】
特定の細胞産物に関して“生成量の増加”という用語は、培養物が参照培養物より多くの量の産物を生成する、または所定の時間により多くの量を生成することを意味する。例えば増加は特定の容量の培養物中により高い密度（数）の細胞が存在するためであってもよい。好ましくは、より多くの量とは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも50%、更に好ましくは少なくとも75%、そして最も好ましくは少なくとも100%以上である。増加は更に高く、例えば200%、300%、400%、500%、またはそれ以上であってもよい。
【００７４】
“細胞産物”という用語は細胞または生物の生物学的作用によって生成される産物をいう。一般に目的とする細胞産物は細胞によって生成される分子である。産物は天然の細胞産物であるか、または外因性の遺伝子の存在または遺伝子変異によって生成されてもよい。
【００７５】
“精製”という用語は、特定の組成物（例えば分子または細胞）を、共存する他の組成物の少なくともいくつかから分離する過程をいう。特定の組成物を精製して均質とすることもできるが、この用語はより低いレベルの分離も含む。
【００７６】
細胞もしくは生物の増殖、または生体分子の活性に関連する“阻害する”、“増殖を阻害する”などの用語は、物質（単数または複数）の存在または環境条件に由来する活性または増殖速度の低下をいう。
【００７７】
“食料品”という用語は一般に、ヒトの食用または飲用に適すると見なされる製品をいう。従ってこの用語は食品および飲料品の両方を含む。
【００７８】
本明細書で使用する“細胞培養を利用するプロセス”という句は、プロセスにおいて細胞の存在が企図され、有意かつ好ましい作用が得られるプロセスをいう。例としてビール、ワイン、しょうゆ、発酵パン、およびチーズの製造での発酵過程における酵母または他の真菌類の存在がある。従ってこの用語はプロセスにおける細胞の偶発的な存在、または好ましくない影響を与える意図しない細胞の存在を含まない。
【００７９】
“発酵”という用語はその通常の意味を有し、主として呼吸過程ではない代謝過程（および関連する培養過程）をいう。従って、発酵は一般に嫌気性過程である。
【００８０】
ここで使用する“液体培養”という用語は、主として液体増殖培地に懸濁された細胞または生物で実施される細胞または生物の培養をいう。
【００８１】
遺伝子変異に関連する“欠失”という用語は、先の核酸配列からの１つ以上のヌクレオチドを除去することをいう。従ってこの用語は、コード配列のほとんど、もしくは全部、または全遺伝子の除去を含む。それらの欠失により、コードされたペプチドから１つ以上のアミノ酸残基が除去されることも起こりうる。本発明において使用する場合、好ましくは欠失によって欠失が起こる遺伝子が不活性化される。
【００８２】
遺伝子変異に関連する“挿入”という用語は、核酸配列における１つ以上のヌクレオチドの添加をいう。コード配列において、それらの挿入によって、もしインフレームに挿入されればキメラ産物が得られるか、またはフレームシフトが起こりうる。本発明において使用する場合、挿入は通常、非相同配列の挿入であるが、自己由来配列の挿入であってもよい。挿入は欠失を伴って行っても、伴わないで行ってもよい。本発明において使用する場合、好ましくは挿入によって、挿入が起こる遺伝子が不活性化され、そして／またはコードされた産物にタグが提供される。
【００８３】
核酸および／またはアミノ酸配列に関連する“配列アラインメント”という用語はその通常の意味を有し、２つ（またはそれ以上）の配列中の同一または類似の残基をマッチングさせてマッチする残基の最大数を同定する過程をいう。この過程は手動で行うこともできるが、一般にそれらのアラインメントは広く入手できるソフトウェアを使用してコンピューターで行う。
【００８４】
“低ストリンジェントPCR”という用語は、使用する１つ以上のプライマーが標的配列からの実質的なミスマッチを有する場合でも増幅が起こるようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）過程をいう。従ってこの過程によって、参照配列に基づくプライマーを使用して相同な配列を増幅することができる。
【００８５】
“活性系プローブ”という用語は、標的分子の活性部位で反応させることによって特定の群のタンパク質（一般に酵素）を同定するために使用される分子をいい、それによってその群の中から活性なメンバーが同定される。プローブは直接的または間接的なタグ（例えばビオチンもしくは蛍光部分、または光散乱部分）を有する。活性系プローブおよびその使用は、例えば以下に報告されている：米国特許出願第02/03808号（“Activity Based Probe Analysis”）、米国特許出願第02/06234号、米国特許仮出願第60/339,424号（“Affinity Labeling of ATP Dependent Enzymes”）、米国特許仮出願第60/363,762号（“Tethered Activity-Based Probes and Uses Therefore”）、米国特許出願第00/34187号（国際特許公開WO01/77684）（“Proteomic Analysis”）、および米国特許出願第00/34167号（国際特許公開WO01/77668）（“Proteomic Analysis”）（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８６】
更なる観点および態様は以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明白となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
図面の簡単な説明
図１は、サッカロミセス・セレビジエ株（それぞれ左から右へ野生型、YGLO39w/YGL157wダブルノックアウト、YGLO39wシングルノックアウト、およびYGL157wシングルノックアウト）の栄養培地（YPD）および高NaCl条件下での増殖の比較を表す二つの培養プレートの組の画像を示す。図に示すように、ダブルノックアウト株は高塩条件で野生型またはシングルノックアウト株より高密度まで増殖する。
【００８８】
図２は、サッカロミセス・セレビジエ株（それぞれ野生型、YGLO39w/YGL157wダブルノックアウト、YGLO39wシングルノックアウト、およびYGL157wシングルノックアウト）の栄養培地中での増殖曲線（光学密度）を示すグラフである。グラフに示されるように、ダブルノックアウト株は野生型およびシングルノックアウト株より有意に高い密度まで増殖する。
【００８９】
緒言
本発明は、親細胞（例えば野生型細胞）より高い塩耐性を示し、より高い密度まで増殖する細胞を創製できるという、驚くべき発見に基づく。例えば特定の遺伝子の不活性化により、塩耐性であり、そして／または高培養密度によって生じる環境ストレスに耐性を示す生物が得られる。高培養密度に対する耐性能力は、細胞が環境からのフィードバックによって正常な細胞の増殖の停止が起こる時点（例えば飢餓または代謝産物の蓄積）を超えて活発な増殖を継続できることを示す。従って細胞は飢餓状態および／または高培養密度に対して耐性となることができる。
【００９０】
この塩耐性細胞の創製の発見は、一般に塩耐性を与える遺伝子（例えばナトリウムポンプ遺伝子）の発現もしくは過剰発現、または塩耐性を誘引する化合物の投与を伴う従前の塩耐性の生成法とは対照的である。従って内因性遺伝子の不活性化によって、外来DNAの導入および塩耐性を誘導するための化学物質の連続適用を行わずに塩耐性細胞または生物を生成するための機構が提供される。
【００９１】
不活性化によって塩耐性および／または高培養密度耐性となる代表的な遺伝子がサッカロミセス・セレビジエにおいて同定された。２つの遺伝子は、同定されたサッカロミセス・セレビジエにおいて同定されたオープン・リーディング・フレームに使用される標準的な命名法でYGLO39wおよびYGL157wと同定された。２つの遺伝子の配列を、コードされるポリペプチドと共に表１および２にSEQ ID NO. 1-4として記載する。また、配列の配列受託番号も記載する。これら２つの遺伝子はコードされたポリペプチド間で70%より高い、高レベルの相同性を有した。驚くべきことに、YGL157w遺伝子の不活性化により、増殖培地中の高レベルの塩に対して、野生型に比較して実質的により高い耐性となることが明かとなった。更に意外な発見で、YGLO39wおよびYGL157wの両方のダブルノックアウトは、YGL157wシングルノックアウトより実質的に塩耐性が高く、かつ、栄養培地中でより高密度まで増殖することが明かとなった。
【００９２】
YGLO39wおよびYGL157w配列（および／または対応するポリペプチド配列）に基づいて、他の生物（特に他の真菌および植物）中のマッチする配列を、慣例的な配列マッチングソフトウェアを使用して同定することができる。例えば、種々の生物由来の現在入手可能な配列の検索により、Ygl039w遺伝子産物とマッチする有意なアミノ酸配列を有する以下の代表的な配列が明かとなった：
【表１】
2005523697.tif 000002
【００９３】
これらの配列の例は、同定された特定の酵母遺伝子とマッチする配列が植物に広く分布し、酵母および他の真菌に限定されないことを示している。従って、以下により詳細に記載するように、上記で同定された配列並びに他の同定されたマッチ配列を試験して、Ygl039wおよびYgl157w遺伝子産物の機能性相同体を特性決定することができる。既知の方法を使用して、他の生物において更なる機能性相同体を同定し、特性決定することができる。
【００９４】
ダブル遺伝子ノックアウトが塩耐性を有し、野生型より高い密度まで活発に増殖するという驚くべき確認により、トランスジェニック生物の創製をせずに、商業的価値のある特性を有する修飾型細胞を提供するための有益な方法が得られる。ダブルノックアウト生物は塩耐性により野生型生物より広い範囲の条件で活発に増殖することができ、高培養密度に対する耐性によって、発酵および他の培養過程においてより効率的に使用される。
【００９５】
サッカロミセス・セレビジエ遺伝子の同定およびノックアウトの創製
オープン・リーディング・フレームYGLO39wおよびYGL157wをシーケンシングし、それらの名称をサッカロミセス・セレビジエのシーケンシングで特定した。しかしながら、これらの遺伝子の機能は知られていない。事実、これらの遺伝子の不活性化により塩耐性および高培養密度に対する耐性が起こるという発見は全く偶発的なものであった。最初にこれらの遺伝子を、フルオロホスホネート活性系プローブを使用する方法で標識し、サッカロミセス・セレビジエにおける活性なセリンヒドロラーゼを同定した。同定されたタンパク質の２つはセリンヒドロラーゼ機能と一致しないと考えられる配列を有した。
【００９６】
ポリペプチド配列に基づき、対応する核酸配列をYGLO39wおよびYGL157wであるとして同定した。サッカロミセス・セレビジエのゲノムは配列決定されているので、この同定はコンピューター検索で行った。これらの遺伝子産物を特性決定するために、遺伝子をそれぞれクローニングして、細菌内で過剰発現させた。いずれの遺伝子産物もフルオロホスホネートプローブで標識されることが確認された。各タンパク質由来の特定の標識されたアミノ酸を慣例的な質量分析法によって同定した。各タンパク質のチロシン残基を標識した（モチーフfYny(c/s)で：大文字のYは修飾されるチロシンである）。既に報告されているように、これらの遺伝子はいずれも酵母の生存能力に本質的ではない（スタンフォード酵母欠失プロジェクト（the Stanford yeast deletion project）においては、多大な努力により、全ての遺伝子について個々の欠失が行われているが、得られた生存可能なノックアウトのほとんどで、詳細な特性決定はほとんど行われていなかった（以下のアドレス名のウェブサイトを参照されたい：www being:  sequence.stanford.edu/group/yeast＿deletion＿project/deletions3.html））。
【００９７】
ダブルノックアウトを生成するために、標準的なPCRに基づく方法を使用して、欠失したYGLO39wを有する購入株においてYGL157w遺伝子のノックアウトを行った。ダブルノックアウトは単純な交配では生成せず、これは２つの遺伝子が同一染色体上で互いに近接していることによって、組換えが起こる確率が低くなるためである。購入株は公共の欠失努力（上記）の一部として生成されたもので、InvitrogenのユニットであるResearch Geneticsから購入した。実施例２に記載されているように、YGL157w遺伝子のほとんどを欠失させた。
【００９８】
ダブルノックアウト変異体の特性決定
得られたダブルノックアウト酵母は生存能力を有し、コロニー形態学および顕微鏡による形態学的に正常な外観であった。ダブルノックアウトの表現型を探すために、酵母を種々の条件下で増殖させ、ダブルノックアウトが野生型酵母より脆弱な条件を探した。しかしながら、その反対が明らかになった。ダブルノックアウトは野生型酵母より高密度まで増殖することが可能であった。更に、ダブルノックアウト株の塩耐性は野生株のものより高く、いずれのシングルノックアウトよりも高かった。
【００９９】
事実、ダブルノックアウトでは塩耐性に対して相乗的な寄与が得られた。図１に示すように、YGLO39wシングルノックアウト株は0.9M NaClに対する耐性が野生株より（もし高いにしても）わずかに高いに過ぎず、YGL157wシングルノックアウトは0.9M NaClを含有する栄養培地中で、野生型の約10倍の細胞数まで増殖した。これに対してダブルノックアウトは野生型の約100倍の細胞数まで増殖した。
【０１００】
記載するように、ダブルノックアウト株は活発な増殖の際に高密度まで増殖した。事実上、ダブルノックアウト株は野生型またはシングル遺伝子ノックアウトのいずれよりも実質的に高い細胞密度まで、指数増殖期を持続した。
【０１０１】
配列がマッチする遺伝子の同定
上記のように、YGLO39wおよびYGL157wとマッチする配列を有する遺伝子は種々の異なる生物に見出すことができ、不活性化および試験して、本発明において使用することができる。配列がマッチする遺伝子は種々の既知の技術を使用して同定できる。配列がマッチする遺伝子の位置を決定するためには、最も簡単な方法は既知の配列の配列比較を使用するものである。好ましくは、配列比較はアミノ酸レベルで実施するが、対応するヌクレオチド配列を使用して行うこともできる。それらの比較は手作業で行ってもよいが、より好ましくはコンピュータによる分析を使用する。この分析では、マッチするアミノ酸（またはヌクレオチド）が最大となるように２つの配列のアラインメントを行う。通常、マッチは同一性についてのものであるが、アミノ酸では類似性を使用することもできる。
【０１０２】
本発明における配列マッチの同定では、配列マッチとして同定されるアミノ酸配列は、Yglo39wおよび／またはYgl157w（または他の機能的に相同な配列）に対する比較で、少なくとも50アミノ酸ウィンドウ、好ましくは少なくとも100アミノ酸、そして最も好ましくはORFにコードされる完全長のポリペプチドにわたって、少なくとも20%の同一性を有する。より好ましくはアミノ酸の同一性のレベルは25%、27%、30%、32%、35%、37%、またはそれ以上である。アミノ酸の類似性を使用する場合、類似性のレベルは少なくとも45%、より好ましくは50%、55%、60%、65%、70%、またはそれ以上である。
【０１０３】
配列がマッチするポリペプチドが生物中で同定されれば、それらのポリペプチドを下記のように試験し、いずれが機能性相同体を構成するか、すなわちいずれの配列マッチによってYgl039wおよびYgl157ｗの不活性化で現れる効果が得られるのかを試験することができる。
【０１０４】
既知の配列での使用に加え、配列アラインメントおよび配列マッチの測定は、一般に、他の技術によって明らかになった配列マッチ（または他の可能性のある機能性相同体）で行う。例えば、配列のマッチは低ストリンジェントなPCRおよび増幅された配列のシーケンシングを用いて同定できる。同様に、可能性のある機能性相同体を活性系プローブを使用して同定し、次いでタンパク質の特性決定を（例えばシーケンシングによって）行うこともできる。次いで、対応するコード配列の同定を、例えば特定のポリペプチドもしくはその一部をコードする核酸配列の探求、または変性プローブおよび／もしくは低ストリンジェントなPCRを使用して対応するコード配列を得ることによって行うことができる。典型的には、ハイブリダイゼーションプローブのスクリーニングはcDNAライブラリーを使用して行い、PCRはゲノムおよび／またはcDNAライブラリーを使用して行ってもよい。種々の技術を組み合わせて使用することもできる。
【０１０５】
記載するように、低ストリンジェントPCRを使用してマッチする配列を同定することができ、これはよく知られた方法である。一般に、この方法は既知の配列（この場合、YGLO39wおよびYGL157w遺伝子（または同定された機能性相同体）のヌクレオチド配列）に基づいて設計されたPCRプライマーの使用を伴う。選択したレベルのミスマッチのプライマーを許容するようなハイブリダイゼーション条件を（増幅条件の一部として）使用する。従って、選択された条件下でプライマーがハイブリダイズできる配列がサンプル中に存在すれば伸長が起き、これによって部分的なミスマッチを有するプライマーが存在する可能性にもかかわらず、標的配列の増幅が起こる。異なる配列を有する種々の組のプライマーを試験し、好適な増幅が得られるプライマーのセットを得てもよい。プライマーはユニークなまたは重複の低い領域に対応するように選択できる。更に、配列のマッチが特定の細胞または生物で同定されれば、それらのマッチ配列の配列を使用して更なるプライマー（またはプローブ）設計を行うことができる。
【０１０６】
代替法として、最初に低ストリンジェントPCRを進める代わりに（またはそれに加えて）、マッチ配列の参照配列（例えばYGLO39wおよび／またはYGL157w遺伝子配列）（すなわちハイブリダイゼーションプローブ）へのハイブリダイゼーションを使用して生物中のマッチ配列の存在を明らかにすることができる。好ましくはコード配列を使用する。ハイブリダイズした配列の検出は、種々の方法で行うことができる。生物由来の増幅していない核酸を使用してハイブリダイゼーションを行う場合、検出方法は高感度（例えば１つまたは数個のコピーを検出する能力がある）べきである。それらの検出法の一例は光拡散粒子（例えば金および／または銀）の使用である。例えばYguerabideらの米国特許第6,214,560号参照。あるいはまた、ハイブリダイゼーションを低ストリンジェントPCRと併用することもできる。この場合、検出方法は同様に高感度である必要はない。光散乱に加え、蛍光および放射性同位体標識のような標識も使用できる。低ストリンジェントPCRを使用するため、プローブはユニークなまたは重複の低い標的領域に対応するように選択できる。
【０１０７】
マッチ配列の存在が確認されると、慣例的な方法を使用して全コード配列を単離しシーケンシングできる。ハイブリダイゼーションを使用して（アフィニティークロマトグラフィーとして効率的に使用）シーケンシングに十分な物質を単離できるが、好ましくは増幅によって得る。それらの増幅は低ストリンジェントPCRとして行うことができる。プライマーはハイブリダイゼーションプローブに基づくことができる。好ましくは初めの配列マッチ測定により、完全長のコード配列、または全長遺伝子が得られる。完全長配列が最初に得られなければ、既に得られている部分配列を使用して厳密にマッチするプローブを得、より長いフラグメントまたはcDNAを単離し、失われた配列部分を得て、完全長配列を得ることができる。
【０１０８】
例えば部分配列を使用して高ストリンジェントのハイブリダイゼーションに好適なプローブを得ることができる（好ましくは完全にマッチするものを提供）。それらのプローブを使用してゲノムまたはcDNAクローン挿入配列を検出し、完全なコード配列または完全な遺伝子を含有するクローンを同定することができる。好ましくは、便宜な挿入配列の単離およびシーケンシングを可能とする隣接配列を用いてクローンを構築する。
【０１０９】
完全配列が同定されるか、またはコード配列の一部だけでも明らかになれば、以下に記載するように機能性相同体を同定する過程で遺伝子産物を不活性化することができる。
【０１１０】
可能な機能性相同体は、少なくとも最初に活性系プローブを使用して同定することができる。記載したように、通常は活性部位のセリンヒドロラーゼと反応する、フルオロホスホネートの活性系プローブを使用して、Ygl039wおよびYgl157wを興味深いものとして同定した。この場合、プローブは、これらの２つの遺伝子産物中の例外的に求核性であるチロシンと反応する。従ってそれらの、またはYgl039wまたはYgl157w遺伝子産物（または同定された機能性相同体）と反応する他の活性系プローブを使用して、可能性のある機能性相同体と反応させることができる。それらの可能性のある機能性相同体をYgl039wおよびYGL157wについて行ったように少なくとも部分的にシーケンシングすることができ、プローブが反応する残基を慣例的な質量分析法を使用して同定することができる。
【０１１１】
ポリペプチドのシーケンシングに基づいてコード配列を同定することができる。コード配列の同定は、コード配列がコンピューター上で入手可能であれば、コンピュータ配列サーチで即時に行うことができる。コンピューター上で入手可能でない場合は、ハイブリダイゼーションおよび／またはPCRを伴う慣例的な方法で、変性プローブおよび／またはプライマーを使用し、相同なヌクレオチド配列の配置および／または増幅を行うことによりコード配列を得ることができる。次いでヌクレオチド配列を慣例的な方法でシーケンシングできる。その後、ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列をチェックし、正しいヌクレオチド配列が得られたことを確認することができる。
【０１１２】
配列マッチ遺伝子の不活性化
記載するように、生物中のマッチ配列の核酸配列の十分な部分（または好ましくは全部）が（例えば配列データベースから、および／または別の測定から）入手できれば、それらのマッチ配列を不活性化して、塩耐性および／または高培養密度耐性の創製のために試験することができる。サッカロミセス・セレビジエは４つのマッチ配列を含有することが明らかになったが、Ygl039wおよびYgl157wのみが、不活性化したときに塩耐性および培養密度耐性を与えた。従って、３つ以上の配列マッチ遺伝子が細胞または生物中で同定される場合、不活性化された時に（好ましくは組み合わせて不活性化された時に）塩耐性および／または培養密度耐性の機能的効果を与える機能性相同体の識別ができるような方法で不活性化すべきである。
【０１１３】
この識別は系統的な方法で、例えば全ての組み合わせでのマッチ配列の不活性化によって行うことができる。しかしながら、他のスキームにしたがってもよい。例えば第一の試験では、全ての配列マッチ遺伝子を一つの株で不活性化し、それによって一組のマッチ配列に必要な機能性相同体が含有されているかどうかを立証することができる（配列がマッチする遺伝子の全組の不活性化によって、細胞または生物が生存不能となるかまたは塩耐性および培養密度測定を妨害する表現型を有さない限り）。あるいはまた、第一の試験で、重複している配列マッチ遺伝子のサブセットを不活性化し、機能性相同体の同定を更に限定することができる。
【０１１４】
遺伝子の不活性化は多くの異なる方法で実施できる。代表的な方法は相同組換えを使用して標的遺伝子中に不活性化する欠失を創製するものであり、これは多くの場合非相同配列の挿入を伴う。この方法をYGL157wの不活性化に使用した。
【０１１５】
方法の別の例はGlazerの米国特許第5,776,744号（METHODS AND COMPOSITIONS FOR EFFECTING HOMOLOGOUS RECOMBINATION）に報告されている。更なる例は以下に報告されている：Wangら, 1995, "Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation", Mol. Cell. Biol. 15(3):1759-1768；Rooneyら, 1995, Anti-parallel, intramolecular triplex DNA stimulates homologous recombination in cells", Proc. Natl. Acad. Sci. 92:2141-2144；Kimら, 1994, "Parallel DNA triplexes and homologous recombination", in Structural Biology: The State of the Art, Proceeding of the Eighth Conversation, Adenine Press, Albany, New York, pp.67-74。
【０１１６】
多くの場合植物に使用される系はCre-lox系を利用する。この系の使用に関しては以下に報告されている：Bayleyら, "Exchange of Gene Activity in Transgenic Plants Catalyzed by the Cre-Lox Site-Specific Recombination System", Plant Molecular Biology 18:353-361 (1992)。更なる例は以下に報告されている：Qinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1706-1710 (1994)；Sauer, Methods in Enzymology 225:890-900 (1993)。
【０１１７】
使用できる別の代表的な方法は不活性化挿入（例えばトランスポゾン挿入またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）T-DNA（または類似の要素）での挿入）に基づく（BouchezおよびHofte, 1998, Plant Physiol. 118:725-732；Martienssen, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2021-2026；Azpiroz-LeehanおよびFeldmann, 1997, Trends Genet. 13:152-156）。系統的な挿入ノックアウト法の一例はthe Arabidopsis Knockout Facility creation of knockouts of Arabidopsis thalianaに記載されている（例えばSussmanら, 2000, Plant Physiol. 124:1465-1467参照）。遺伝子サイレンシングについての更なる手引きはVaucheretおよびFagard, 2001, Trends Genet. 17(1):29-35に報告されている。
【０１１８】
不活性化遺伝子変異を伴う方法に加え、マッチする遺伝子産物を試験して機能性相同体を識別する目的で、mRNAレベルまたは転写レベルでの発現ブロッキングを伴う方法を使用できる。それらの方法の一つはRNA干渉（RNAi）を使用する（例えばChuangおよびMeyerowitz, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990；Schmitzら, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. 99:1064-1069参照）。一般にこの方法は特定の遺伝子を標的とするdsRNA-発現コンストラクトの細胞への導入を伴う。導入されるコンストラクトは、染色体外ベクター中に存在するか、またはホスト細胞のゲノムに取り込まれるように設計することができる。
【０１１９】
それらの別の方法は、リボザイム（または他の触媒ヌクレオチド含有分子、例えば触媒DNA（ここでは全てリボザイムと呼ぶ））を使用して特定のmRNAを部位特異的に切断し、それによって特定のメッセージ発現を阻害する。典型的には、リボザイムは（例えばベクターから）細胞において発現されるか、または安定化されたリボザイムを（例えばリポソーム運搬を使用して）外部から導入する。それらのリボザイムおよびそれらを利用する方法は当該分野で知られている。
【０１２０】
mRNAレベルでの発現を阻害する別の方法はアンチセンス（またはセンス）分子の使用を伴う。リボザイムの場合のように、アンチセンス分子はヌクレオチド含有分子であり、細胞で発現されるか、または外部から細胞に導入する。細胞への導入では、ヌクレチド類似体および／または非リボヌクレオチド部分の導入によってアンチセンス分子（またはリボザイム）を安定化するのが非常に好ましい。それらのアンチセンス分子は一般に、翻訳を阻害し、そして／または内因性の細胞成分によるメッセージの切断を誘導することによって作用する。この方法の一例はBaucherら, Plant Mol. Biol. 39:437-447 (1999)に報告されている。更なる阻害は以下に報告されている：Lapierreら, Plant Physiol. 119:153-164 (1999)およびMacKayら, Science 277:235-239 (1997)。
【０１２１】
多くの場合、リボザイムまたはアンチセンス法は発現を完全に削除するのではなく、マッチ配列が機能性相同体であるかどうかの指標を提供するのに十分なように発現のレベルを低下させる。
【０１２２】
リボザイムまたはアンチセンスを使用する場合、種々の方法で試験を行うことができる。例えば機能性相同体の存在を確認するために、リボザイムまたはアンチセンス分子がマッチ配列の一部または全部の間で同一である配列を標的とするようにできる。機能性相同体の存在が確認されれば、マッチ配列と十分異なる配列を標的とし、特異的阻害または特異的複合阻害を提供するリボザイムまたはアンチセンス分子を用いて異なる組み合わせを試験し、機能性相同体を選択することができる。同様に、最初に十分に異なる配列を標的とし、マッチ配列の組み合わせの第一段階の試験とすることができる。また、リボザイムおよびアンチセンス分子の両方で、複数のリボザイムおよび／またはアンチセンス分子を特定の転写産物に標的化するようにし、それによってより高レベルの阻害を得ることができる。
【０１２３】
発現阻害はトリプルへリックス構造の形成による転写の阻害によって行うこともできる。そのような阻害を行うための方法およびコンストラクトは当該分野で知られている（例えばBlumeら, 1992, Nucl. Acids Res. 20; 1777；Grigorievら, 1993 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3501；Ingら, 1993, Nucl. Acids Res. 21:2789参照）。
【０１２４】
遺伝子抑制法の更なる例は以下に報告されている：国際特許WO01/49844号；国際特許WO00/68374号；国際特許WO00/49035号；国際特許WO00/44914号；国際特許WO99/61631号；国際特許WO99/53050号；国際特許WO99/49029号；国際特許WO9932619号；国際特許WO92/15680号；国際特許WO98/36083号；国際特許WO98/53083号；米国特許第5,107,065号；米国特許第5,759,829号；米国特許第5,190,931号；米国特許第5,208,149号；米国特許第5,272,065号；米国特許第5,5,922,602号；米国特許第5,231,020号；米国特許第5,283,184号；および米国特許第6,232,122号。
【０１２５】
遺伝子の発現を阻害またはブロッキングするための上記の方法または他の技術を本発明に使用することができる。２つ以上の異なる技術を特定の生物中の特定の遺伝子（単数または複数）に併用することもできる。それらの組み合わせは、特定の遺伝子を不活性化または十分に阻害するのが困難であった場合に特に有用でありうる。配列マッチ遺伝子を不活性化するために使用される方法または方法の組み合わせがどのようなものでも、配列マッチ遺伝子の不活性化および試験によって機能性相同体でもあるマッチ配列の選択を行うことができる。その選択によって細胞または生物株が得られ（または変異性不活性化によって得ることができる）、原株が好適であるような種々のプロセスに、また、塩耐性の向上および／または細胞密度耐性の向上によって実用的となった新たなプロセスに使用できる。
【０１２６】
酵母および他の真菌類は一般に、不活性化、試験、および／または複雑な生物と共に培養するために、典型的には、液体培地中または固体培地上で培養できるが、多くの場合細胞培養または組織培養を利用することが望ましい。植物からの細胞および組織培養を行うための好適な技術は周知である。代表的は報告は以下である：Makiら, "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants"（Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glichら編, pp. 67-88 CRC Press, 1993）；そしてPhillipsら, "Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation"（Corn & Corn Improvement, 第３版；Spragueら編, pp. 345-387) American Society of Agronomy Inc., 1988）。
【０１２７】
細胞への核酸の導入
核酸に基づく遺伝子不活性化を行うためには（または非相同遺伝子、コード配列、または調節配列の導入のような他の適用のためには）、多くの場合核酸配列をそれぞれの細胞に導入する必要がある。多くのそのような方法が知られており、それらを特定の細胞型に基づく特定の選択と共に利用できる。例えば酵母細胞を（例えばザイモリアーゼ、リチカーゼ、またはグルスラーゼを用いて）プロトプラストに変換し、その後核酸およびポリエチレングリコール（PEG）を添加して形質転換することができる。次いでPEG処理したプロトプラストを増殖培地中、例えば選択的条件下で培養することによって再生させる。例えばBeggs, Nature 275:104-108 (1978)；およびHinnenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933 (1978)参照。別の方法は細胞壁の除去を伴わず、代わりに塩化リチウムまたは酢酸リチウムおよびPEGでの処理を利用し、その後選択培地で増殖させる。例えばItoら, J. Bact. 153:163-168 (1983)参照。酵母の形質転換、酵母ゲノムへの遺伝子の組み込み、および酵母株の増殖および選択のための種々の方法がCurrent Protocols in Molecular Biology, Vols. 1 and 2, Ausubelら編, John Wiley & Sons, New York (1997)に報告されている。
【０１２８】
サッカロミセス・セレビジエの形質転換のための代表的な方法は以下の通りである。酵母株をYPD（酵母抽出物、ペプトン、デキストロース）培地中、約30℃で一晩培養する。得られた培養物を約200mlのYPD培地でA600が約0.2となるまで希釈し、約30℃でA600が約0.8になるまでインキュベートする。遠心分離して細胞のペレットを得、これを約20mlの無菌水で洗浄する。次いで酵母細胞ペレットを約10mlのTEL（10mMトリス、pH7.5、1mM EDTA、0.1M酢酸リチウム、pH7.5）バッファーに再懸濁する。遠心分離して細胞のペレットを得、約2mlのTELに再懸濁する。約100マイクログラムのよくシアリングした１本鎖DNAおよびプラスミドDNAをエッペンドルフチューブに添加する。このチューブに約100マイクロリットルのコンピテント酵母細胞を添加した後、撹拌する。細胞／DNA混合物に約0.8mlの40%PEG-3350／TELを添加した後、十分撹拌する。この混合液を30℃で約30分間インキュベートし、その後42℃で20分間熱ショックを行う。混合液を遠心分離して上清を除去し、細胞のペレットを得る。酵母細胞ペレットを約1mlのTEで洗浄し、再び遠心分離してペレットを得、その後選択培地に播種する。
【０１２９】
他の真菌に適用できる技術も十分知られており、それらを利用することができる。例えば上で引用したBeggsおよびHinnenの文献、並びにYeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1740-1747 (1984)；Russell, Nature 301:167-169 (1983)；および米国特許第4,935,349号を参照されたい。
【０１３０】
同様に、種々の異なる植物種を形質転換する技術もよく知られている。例えばWeisingら, Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988)参照。代表的な方法は以下を利用する：エレクトロポレーション（例えばFrommら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824 (1985)；Shimamotoら, Nature 338:274-276 (1989)）、PEGポレーション（例えばPaszkowskiら, EMBO J. 3:2717-2722 (1984)）、粒子衝撃（例えばKleinら, Nature 327:70-73 (1987)；Liら, Plant Cell rep. 12:250-255)）；植物細胞プロトプラストまたは胚形成カルス（embryogenic callus）、および形質転換ベクターのマイクロインジェクション、例えばアグロバクテリウムが介在する形質転換（例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンスが介在する形質転換）（好ましくはT-DNA隣接領域を有する）（例えばHorschら, Science 233:496-498 (1984)；Fraleyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983)；Hieiら, Plant J. 6:271-282 (1994)；Rogersら, Methods in Enzymology 153:253-305 (1987)）。植物発現ベクターおよびレポーター遺伝子の一般的な記載、および形質転換のプロトコールは以下に見られる：Gruberら, "Vectors for Plant Transformation, in Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology"（Glichら編, pp. 89-119, CRC Press, 1993)。
【０１３１】
形質転換技術（およびトランスジェニック植物）の更なる例は以下に報告されている：Sautterら, 米国特許第5,877,023号；Sandford, Trends in Biotechnology 6:299-302；Christouら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7500-7504 (1989)；Christouら, Plant Physiol. 87:671-674 (1988)；Oardら, Plant Physiol. 92:334-339 (1990)；Tomesら, 米国特許第6,258,999号；D'Halliun, 米国特許第6,140,553号；Bytebierら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (1987)；米国特許第5,164,310号；米国特許第5,187,073号；米国特許第5,177,010号；国際特許公開WO92/09696号；ヨーロッパ特許公開EP 0604662 A1号；およびヨーロッパ特許公開EP 0672752 A1号。
【０１３２】
植物細胞および組織の場合、形質転換後、植物の完全体を再生することが有用でありうる。それらの再生は特定の植物型に好適な既知の方法で行うことができる。多くの場合、再生は胚、プロトプラスト、分裂細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根尖、花、種、莢、または茎を使用して行う。再生法の一例がTomesらの米国特許第6,258,999号に報告されており、これは以下の属からの種を含む多くの異なる植物に好適であることが示唆されている：フラガリア（Fragaria）、ロータス（Lotus）、ウマゴヤシ（Medicago）、Onogrychis、トリフォリウム（Trifolium）、トリゴネラ（Trigonella）、ササゲ（Vigna）、ミカン（Citrus）、アマ（Linum）、フウロソウ（Geranium）、Manicot、ニンジン（Daucus）、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、アブラナ（Brassica）、ダイコン（Raphanus）、シロガラシ（Sinapis）、ベラドンナ（Atropa）、トウガラシ（Capsicum）、チョウセンアサガオ（Datura）、ヒヨス（Hyoscyamus）、Lycopersionn、タバコ（Nicotiana）、ナス（Solanum）、ペチュニア（Petunia）、ジギタリス（Digitalis）、Marorana、キコリウム（Cichorium）、ヒマワリ（Helianthus）、アキノノゲシ（Lactuca）、スズメノチャヒキ（Bromus）、クサスギカズラ（Asparagus）、キンギョソウ（Antirrhinum）、ワスレグサ（Hemerocallis）、ネメシア（Nemesia）、ペラルゴニウム（Pelargonium）、キビ（Panicum）、チカラシバ（Pennisetum）、ラナンキュラス（Ranunculus）、セネキオ（Senecio）、サルピグロッシス（Salpiglossis）、キュウリ（Cucumis）、ブロワリア（Browallia）、ダイズ（Glycine）、ドクムギ（Lolium）、トウモロコシ（Zea）、コムギ（Triticum）、モロコシ（Sorghun）。従って主な穀物、例えばトウモロコシ、ライ麦、大麦、小麦、モロコシ、エン麦、キビ、米、ヒマワリ、ナタネ、および大豆、並びに家畜飼料または飼料用アルファルファを含む。植物の再生はD'Halliunの米国特許第6,140,553号にも記載されている。植物組織の一般的な培養法は例えば以下に報告されている：Makiら, "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants"（Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glichら編, pp. 67-88 CRC Press, 1993）；およびPhillipsら, "Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation"（Corn & Corn Improvement, 第３版；Spragueら編, pp. 345-387, American Society of Agronomy Inc., 1988）。
【０１３３】
また、導入された遺伝子の発現を制御することは有用でありうる。それらの制御の例はOliverの米国特許第5,925,808号およびここに引用する文献に報告されている。
【０１３４】
単一遺伝子の不活性化
更に、単一遺伝子の不活性化（シングル遺伝子ノックアウト）の試験は有用である。YGL157wシングルノックアウトに関して示したように（図１参照）、シングルノックアウト株は野生型に比較して有用なレベルの塩耐性を提供できる。例えばYGL157wシングルノックアウト株では、0.9M NaCl中で、野生株またはYGLO39wシングルノックアウトの約１０倍の細胞数となる。その耐性のレベルはダブルノックアウトの塩耐性より有意に低いが、シングルノックアウトの結果は、他の生物中の機能性相同体のシングルノックアウトも塩耐性細胞および生物の創製に有用であることを示唆している。
【０１３５】
有用なシングルノックアウト相同体を同定するためには、遺伝子不活性化法を、特定の細胞もしくは生物中の個々の配列マッチ遺伝子（好ましくは全ての配列マッチ遺伝子）のシングル遺伝子ノックアウトを用いて直接使用するか、または１つ以上の機能性相同体を含有することが明かとなっているマルチノックアウトを有する株からの絞り込みで使用することができる。
【０１３６】
不活性化された配列マッチ遺伝子を有する細胞の試験
不活性化された配列マッチ遺伝子を有する細胞の試験は慣例的な増殖アッセイを使用して実施できる。従って細胞を、その細胞型に好適であるが塩濃度（または他の溶解性成分）が通常の濃度より高い増殖培地中で増殖させる。不活性化型マッチ配列を有する株がストレス条件中で増殖する能力を測定し、それらの条件下で増殖させた参照株の能力と比較する。
【０１３７】
高培養密度に関する試験は一般に、代表的なサッカロミセス・セレビジエ株についてここに記載するようにして実施できる。例えば別々の培養物中でそれぞれの株の数を標準化し、それぞれの培養物を同じ条件下で、少なくとも野生株、親株、または他の参照株が活発に増殖し、静止期となる（または増殖速度が有意に低下する）のに十分な時間、増殖させる。好ましくは全ての株が静止期となるまでに十分な時間、増殖を継続する。少なくとも最大細胞密度を測定する（例えば光学密度または生存可能な細胞の数または密度または濃度として）。好ましくは細胞密度を複数の時点で測定し、それによって増殖曲線を作成できるようにする。最終密度（または総数）および／または増殖曲線は相対的な増殖指標となる。
【０１３８】
増殖試験の実施において、培養条件（増殖培地を含む）は特定の細胞または生物に好適であるように選択すべきである。酵母では、代表的な培地はYPD（1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%デキストロース、水（重量％））を含む。
【０１３９】
不活性化された機能性相同体遺伝子を含有する細胞および生物の使用
シングル、ダブル、または他のノックアウトの組み合わせのいずれかを、生物または細胞の型によって、種々の方法で使用できる。一般にノックアウト株は、細胞または生物が通常の塩（または他の溶解性成分）濃度より高い濃度で増殖すること、または野生型もしくは他の参照株より高い濃度まで活発に増殖すること、あるいはその両方が有用であるようなプロセスに有用である。更に、それらのストレス条件の耐性によって、特定の型の生物のための更なる新しい用途を開発することができる。多くの場合、本発明の株または細胞タイプはコストを低減し、そして／または所望の産物の生成量を増加させることができる。
【０１４０】
例えば、液体培養で増殖させる培養（細胞または生物）では、高培養密度耐性によって、より高密度の培養物中で効率的に運転する培養が可能となる。これはバッチ培養および連続培養の両方に適用される。バッチ培養では、耐性生物によってより高い細胞密度まで培養することが可能となり、これによって一般に、そのバッチとしてはより多くの量の産物および／またはより速い産生が得られる。連続培養では、耐性株の培養はより高い培養密度で行うことができ、それでも活発な細胞増殖が維持される。そのようなより高い細胞密度によって、培養物からより多くの細胞産物が産出される。
【０１４１】
細胞および生物は多くの異なる製造プロセス（食料品の製造を含む）に使用できる。確立されたプロセスでは、日常的に使用される株を、その株中の個々の機能的に相同な遺伝子を不活性化することによって改変し、培養ストレスに対してより耐性の高い株を提供する。更に、プロセスにおいて、改変された株をより高い密度で、しかも活発な増殖を維持しながら培養できる。
【０１４２】
それらの確立されたプロセスの例には、ビール、ワイン、発酵しょうゆ、およびチーズの製造に使用されるものがある。それらのプロセスは各々の分野で周知である。
【０１４３】
改変された生物の使用は、培養物から単離される産物の細胞培養による生成にも非常に有用である。産物の中には培地から単離されるものもあれば、細胞を溶解または破砕した後に生物から単離されるものもある。本発明はいずれの場合にも適用できる。
【０１４４】
更に、植物を伴う適用では、本発明によって土壌および／または水中に高レベルの塩を含有するような条件での成長が可能となる。この特性により、少なくとも２つのタイプの適用が提供される。第一に、高レベルの塩（例えばNaCl）および／または他の溶解性無機質もしくは他のイオンを含有する水を与えても植物は生長し、それによってわずかに塩分を含んだ水の使用が可能になる。第二に、植物は高レベルの塩または水中に移動させることができる他の成分を含有する土壌で生長でき、それによって限界土壌での増殖が可能となる。更に、高塩条件で増殖し、かつ少なくとも一部の組織が高塩濃度であるような植物を選択すれば、植物を栽培および収穫できる。収穫によって植物中に濃縮された塩が除去され、それによって土壌から塩が除去される。この過程を反復することによって土壌からかなりの量の塩を除去できる。この過程は多年にわたって実施できる。そのような使用では、植物によって土壌が安定化し、塩の除去によって土壌が向上する。塩除去の適用では、好ましくは植物は毎年多くの収穫をもたらす多年生である。収穫物そのものは商業用作物など、特にアルファルファ、小麦、トウモロコシ、大麦、および米であってもよい。水中に移動させることができ、植物に吸収させることができる他の土壌成分の除去に、この工程を適用することもできる。
【実施例１】
【０１４５】
Ygl039wおよびYgl157wの標識および同定
酵母BY4743株（ATCC201390株）の培養物を栄養培地中でOD600が約5となるまで増殖させた。細胞を沈殿させ、リン酸バッファー（pH7.4）に再懸濁した。DTTを用いて細胞壁中のジスルフィド結合を還元した後、高圧ホモジナイザーで細胞を溶解した。細胞溶解物を15,000xgで遠心分離し、15,000xg回転からの上清を100,000xgで遠心分離した。Ygl039wおよびYgl157wを精製した画分は100,000xg遠心分離からの上清であった。10mgの分解物を4μMのFP-テトラメチルローダミン（セリンヒドロラーゼのための活性系プローブ）と室温で１時間反応させた。
【０１４６】
反応後、尿素を用いてタンパク質を変性させ、DTTを用いてジスルフィド結合を還元し、ヨードアセトアミドでシステインをアルキル化した。酢酸アンモニウム／尿素バッファーへのゲル濾過の後、標識されたタンパク質をクロマトグラフィーで単離した。活性系プローブで標識されたタンパク質サンプルは、抗ローダミン抗体アフィニティー精製カラム（セファロース）（結合された抗体が、標識されたタンパク質に結合したローダミンプローブを認識する）を通過した。このようにして精製した標識タンパク質を標準的な一次元SDS-PAGE（12.5%）で分離し、レーザー誘導型蛍光を使用してフラットベッドレーザースキャナーを用いて可視化した。スポットピッカー（Amersham）を用いて蛍光タンパク質をゲルから物理的に除去する。
【０１４７】
蛍光タンパク質を含有するゲルスポットを洗浄し、トリプシン処理した。次いで標識されたタンパク質由来のトリプシン処理で得られたペプチドを、イオントラップ質量分析計に接続した液体クロマトグラフィーで分離した。ペプチドは一般に２次元の質量分析法で分析する。第一の次元で全ペプチド（またはペプチド-プローブ・コンジュゲート）の質量と帯電の割合を観察する。第二の次元では、ペプチドを予測可能な様式で（一般にアミド結合の位置で）フラグメント化する。このフラグメント化によって、例えばペプチドの末端から１、２、および３個のアミノ酸が除去されたものを含む種が生成される。質量分析計により、無傷、-1、-2、および-3フラグメントの質量を観察する方法が提供される。全てのアミノ酸の質量は既知であるため、この方法によって質量分析計でペプチドのシーケンシングを行うことが可能になる。質量分析計から得られたデータを、サッカロミセス・セレビジエ（これからサンプルが誘導された）から生成されたタンパク質配列データベースと比較し、予測されるペプチド配列を含むタンパク質を同定した。この方法で37kD領域から同定された２つのタンパク質はYgl039wおよびYgl157wであった。
【０１４８】
Ygl039wおよびYgl157wのアミノ酸配列を使用して、既知のサッカロミセス・セレビジエORF配列から対応する核酸配列を得た。
【０１４９】
同様に、（例えば他の生物由来の）他のタンパク質についても同定および／またはシーケンシングを実施できる。ポリペプチドおよび／またはORF配列が未だ明かとなっていない生物では、アミノ酸配列（好ましくは完全なポリペプチド）を使用して、慣例的な方法によって対応する核酸配列を得ることができる。例えば、対応するコード配列または遺伝子を、変性ハイブリダイゼーションプローブセットおよび／または低ストリンジェントPCR（変性プライマーデザインを使用できる）を、プローブおよび／またはプライマー（好ましくはアミノ酸配列に基づく）と共に使用して得ることができる。好ましくはプローブおよび／またはプライマーは、ユニークなまたは重複の低い領域と相補的になるように設計する。
【実施例２】
【０１５０】
Ygl039wおよびYgl157wの不活性化
YGL157wの最初と最後からの配列が隣接するＵＲＡ２配列（pYES2（invitrogen）から増幅）を含有するPCR産物を生成した。YGLO39wノックアウト株へのPCR産物の形質転換によって隣接配列の組換えが起こり、YGL157w遺伝子のほとんど全体がＵＲＡ２のもので置換される。これによって組換え体の選択およびYGL157wの欠失が可能となる。組み込みが適切であることをPCRで確認した。欠失PCRに使用したオリゴヌクレオチドは以下である：ATGACTACTGATACCACTGTTTTCGTTTCTGGCGCAACCGGTTTCATTGCTCTACACATTcctttttcaatgggtaataa（SEQ ID NO. 5）TTAGGCTTCATTTTGAACTTCTAACATTTGCGCCGCGGTGTCAACTATGCAATCCTTTAAtagcttttcaattcaattca（SEQ ID NO. 6）。
【０１５１】
5'プライマーを最初に記載する。それぞれ、大文字はYGL157wの部分とマッチする配列を示し、小文字の配列はURA2遺伝子の付近の配列にアニールする。
【実施例３】
【０１５２】
不活性化されたYgl039wおよびYgl157wを有する細胞の特性決定
２つのシングル欠失株および野生型酵母と比較した、ダブル欠失株の増殖表現型を検討するために２つのアッセイを実施した。第一のアッセイで、４つの株をYPD中で一晩増殖させ、OD600が5.0となるまで希釈した。OD600 5.0ストックの1/10の連続希釈を1対10,000まで行った。各希釈液の３マイクロリットルをYPDプレート、および0.9M NaClを補充したYPDプレート上にスポットした。プレートを30℃で2-4日間インキュベートした。結果を図１に示すが、この結果は、ダブル欠失株は0.9M NaCl補充培地中で、野生型およびシングル欠失株に比較して有意に良好に増殖することを示していた。また、YGL157wシングル欠失株は野生型またはYGLO39wシングル欠失株のいずれよりも有意に増殖することも明らかである。
【０１５３】
第二の実験では、４つの株をYPD中で一晩増殖させ、希釈してOD600を標準化し、YPD中、30℃で増殖させた。約１日間にわたって、いくつかの時点で各培養物からサンプルを採取し、培養物のOD600を測定した。結果をグラフにし、図２に示す。図に示されるように、ダブル欠失株は他の３株のいずれよりも有意に高い密度まで増殖した。他の株は全て、同様の密度まで増殖した。
【実施例４】
【０１５４】
他の株のYgl039wおよびYgl157wのマッチ配列の同定
Ygl039をクエリー配列として使用し、基本的なタンパク質-タンパク質BLAST分析を行った。配列が類似したタンパク質が多くの植物種（コメ、トウモロコシ、およびアラビドーシス（Arabidopsis）を含む）で発見された。代表的なマッチ配列は上記で示される。これらのタンパク質は一般に250-300アミノ酸にわたって25%のオーダーの同一性を有する。このように、これらのタンパク質は高い配列類似性があり、機能的に類似している可能性が高いと考えられる。
【０１５５】
本明細書に記載する全ての特許および文献は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。本明細書に引用する全ての文献は、それぞれの文献が参照により個々に全体が組み込まれたのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
当業者に容易に認識されるように、本発明は記載した目的および利益、並びにそれら固有のものを得るのに十分適合する。現在の好ましい態様の代表としてここに記載する方法、変形、および組成物は例証であり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。当業者が本発明について行う変更および他の使用は本発明の意図に含まれ、特許請求の範囲として定義される。
【０１５７】
当業者に容易に認識されるように、種々の置換および修飾を、本発明の範囲および意図を逸脱することなく、ここに開示する本発明に施与してもよい。例えば他の細胞型および生物の使用は全て本発明の範囲内である。従ってそれらの更なる態様は本発明の範囲および別記の特許請求の範囲内である。
【０１５８】
ここに例証的に記載した本発明は、ここに特に記載していない要素（単数または複数）、制限（単数または複数）無しで適切に実施してもよい。従って、例えばここに記載するそれぞれの例で、“含む”、“本質的に・・・からなる”、および“・・・からなる”という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれと置き換えてもよい。使用された用語および表現は、制限ではなく説明のための用語として使用されるものであり、それらの用語および表現の使用において表示および記載する特徴と同等のものまたはそれらの部分を除外することを意図するものではないが、認識されるように、請求する本発明の範囲内で種々の修飾を行うことが可能である。従って、好ましい態様および更なる特徴によって本発明について具体的に開示したが、ここに開示するコンセプトの修飾および変更が当業者によって行われてもよく、それらの修飾および変更は添付の特許請求の範囲で定義する本発明の範囲内であると見なされる。
【０１５９】
更に、本発明の特徴または観点をマーカッシュのグループまたは他のグループの言葉で記載しているが、当業者に認識されるように本発明はマーカッシュのグループまたは他のグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの言葉でもそれに関して記載される。
【０１６０】
また、その逆を記載しない限り、種々の多くの値が態様に提供される場合、更なる態様は範囲の上下限として任意の異なる２つの値をとって記載される。それらの範囲も記載する本発明の範囲内である。
【０１６１】
従って、更なる態様は本発明の範囲および別記の特許請求の範囲内である。
【０１６２】
【表２】
2005523697.tif 000003
【０１６３】
【表３】
2005523697.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】図１は、サッカロミセス・セレビジエ株の栄養培地（YPD）および高NaCl条件下での増殖の比較を表す二つの培養プレートの組の画像を示す。
【図２】図２は、サッカロミセス・セレビジエ株の栄養培地中での増殖曲線（光学密度）を示すグラフである。
【図１】
2005523697.tif 000005
【図２】
2005523697.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月4日(2005.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である、少なくとも１つの不活性化された遺伝子を含む細胞であって、該細胞は、活性型の該遺伝子を含む対応する細胞より高濃度塩化ナトリウムに対して高い耐性を示す上記細胞。
【請求項２】
該細胞が酵母細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
該細胞がサッカロミセス・セレビジエ細胞である、請求項２記載の細胞。
【請求項４】
該細胞がアスペルギルスまたはサッカロミセス細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項５】
該細胞が真菌細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項６】
該細胞が植物細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項７】
該細胞の培養が高密度細胞培養である、請求項１記載の細胞。
【請求項８】
該細胞が高塩条件中にある、請求項１記載の細胞。
【請求項９】
該細胞が高い塩耐性を提供する少なくとも１つの更なる遺伝子特性を更に含む、請求項１記載の細胞。
【請求項１０】
該更なる遺伝子特性が高いナトリウムポンプ活性を提供する、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
該細胞が高い培養密度に対しても耐性を示す、請求項１記載の細胞。
【請求項１２】
該高培養密度が少なくとも100%高い、請求項１１記載の細胞。
【請求項１３】
高塩環境中の塩耐性細胞集団であって、該細胞はYgl039wもしくはYgl157wまたはその両方と機能的に相同である不活性化された遺伝子を少なくとも１つ含み、該細胞は塩耐性とされており、該細胞は該高塩環境中で増殖することを特徴とする上記集団。
【請求項１４】
Ygl039wもしくはYgl157wまたはその両方と機能的に相同である少なくとも１つの遺伝子が不活性化された細胞を含む塩耐性生物。
【請求項１５】
該生物が真菌である、請求項１４記載の塩耐性生物。
【請求項１６】
該生物が植物である、請求項１４記載の塩耐性生物。
【請求項１７】
該遺伝子の該不活性化によって塩耐性が与えられる、請求項１４記載の塩耐性生物。
【請求項１８】
該遺伝子の該不活性化によって高密度まで増殖する能力が与えられる、請求項１４記載の塩耐性生物。
【請求項１９】
該遺伝子の該不活性化によって高濃度の溶解成分を含有する溶液に対する耐性が与えられる、請求項１４記載の塩耐性生物。
【請求項２０】
少なくとも１つの人工的な遺伝子の変更を含む酵母であって、該酵母は該少なくとも１つの人工的な遺伝子の変更を含まない同遺伝子型の酵母より塩耐性が高く、より高い培養密度まで活発に増殖する上記酵母。
【請求項２１】
該少なくとも１つの人工的な遺伝子の変更が少なくとも１つの遺伝子の不活性化を含む、請求項２０記載の酵母。
【請求項２２】
対応する野生株より塩耐性が高く、栄養培地中でより高い密度まで増殖する酵母株。
【請求項２３】
該対応する野生株が認可された寄託機関に寄託されている指定標準野生株である、請求項２２記載の酵母株。
【請求項２４】
YPD培地中でOD600が少なくとも15となるまで増殖するサッカロミセス・セレビジエ酵母株。
【請求項２５】
0.9M NaClを含有するYPD中でBY4743株より高い密度まで増殖するサッカロミセス・セレビジエ酵母株。
【請求項２６】
親細胞に比較して、塩の存在に対してより高い耐性を示し、増殖条件下でより高い密度まで増殖する変異細胞。
【請求項２７】
該変異によって少なくとも１つの遺伝子が不活性化されている、請求項２６記載の細胞。
【請求項２８】
保存装置中に封入された、YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である不活性化された遺伝子を含む複数の細胞を含む培養キット。
【請求項２９】
該細胞の増殖のための説明書を更に含む、請求項２８記載のキット。
【請求項３０】
該細胞の増殖に好適な培地を更に含む、請求項２８記載のキット。
【請求項３１】
細胞を高密度まで増殖させる方法であって、
YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である不活性化された遺伝子を含む細胞を増殖条件下で指数増殖期に細胞が高密度となるまで増殖させること
を含み、該高細胞密度が、同じ増殖条件下で遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって指数増殖期に得られるものより高い上記方法。
【請求項３２】
細胞産物の生成量を増加させる方法であって、
YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である不活性化された遺伝子を含む細胞を増殖条件下で培養し；そして
該細胞産物を精製する
ことを含む上記方法。
【請求項３３】
該細胞を、同じ増殖条件下で遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって指数増殖期に得られるものより少なくとも50%高い細胞密度まで増殖させる、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
該細胞を、同じ増殖条件下で遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって指数増殖期に得られるものより少なくとも100%高い細胞密度まで増殖させる、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
該細胞を静止期まで増殖させ、静止期での該細胞の密度が、同じ増殖条件下で遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって静止期に得られるものより高い、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
高塩条件において細胞を増殖させる方法であって、
YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である不活性化された遺伝子を含む細胞を高塩増殖条件下で培養することを含み、該高塩増殖条件によって、遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞の増殖が阻害される上記方法。
【請求項３７】
該高塩条件が少なくとも0.9Mのナトリウムを含有する、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
細胞培養を利用するプロセスで食料品を製造する方法であって、該プロセスにおいてYGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である不活性化された遺伝子を含む細胞を培養することを含む上記方法。
【請求項３９】
該製品がしょうゆ、ビール、ワイン、チーズ、および酵母を主成分とする栄養補助食品からなる群から選択される、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
該プロセスが発酵である、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
該培養が液体培養で行われる、請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
該液体培養を静止期まで増殖させ、静止期における該細胞の密度が、同じ増殖条件下で遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって得られるものより高い、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
該液体培養が活発に増殖する連続培養として維持され、該連続培養物の細胞密度が、遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞を同じ培養条件下で活発に増殖するように維持した場合に得られるものより高い、請求項３８記載の方法。
【請求項４４】
高レベルの溶解性物質に対して耐性のある細胞を生成する方法であって、
該細胞中のYGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方とマッチする配列を有する遺伝子の型を不活性化し；そして
高レベルの溶解性物質に対する該細胞の耐性を試験する
ことを含む上記方法。
【請求項４５】
該不活性化が該遺伝子の少なくとも一部の欠失を伴う、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
該不活性化が該遺伝子における挿入を伴う、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
YGLO39wおよびYGL157wとマッチする配列を有する遺伝子を含む細胞がYGLO39wおよびYGL157wとマッチする配列を有する少なくとも３つの異なる遺伝子を含み、YGLO39wおよびYGL157wとマッチする配列を有する遺伝子の全ての組み合わせを有する細胞を不活性化し、試験する、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
該高レベルの溶解性物質が高レベルの塩化ナトリウムを含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
該高レベルの溶解性物質が高レベルの細胞培養産物を含む、請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
高密度まで増殖する細胞を生成する方法であって、
細胞中のYGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方とマッチする配列を有する遺伝子を不活性化し；そして
該細胞を、活性型の該遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって得られるものより高い密度となるまで指数増殖を持続する能力に関して試験する
ことを含む上記方法。
【請求項５１】
該不活性化が少なくとも１つの該遺伝子の少なくとも一部の欠失を伴う、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
該不活性化が少なくとも１つの該遺伝子における挿入を伴う、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
YGLO39wおよびYGL157wとマッチする配列を有する不活性化された遺伝子を有する細胞がYGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方とマッチする配列を有する少なくとも３つの異なる遺伝子を含み、YGLO39wおよびYGL157wとマッチする配列を有する遺伝子の全ての組み合わせを有する細胞を不活性化し、試験する、請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
高塩条件下で生物を成長させる方法であって、高塩増殖条件下で遺伝子YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同である少なくとも１つの不活性化された遺伝子を含む生物を培養することを含み、該高塩増殖条件によって、遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性型遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である生物の成長が阻害される、上記方法。
【請求項５５】
該高塩増殖条件が少なくとも0.9Mのナトリウムを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
土壌改良の方法であって、
高レベルの塩を含有する土壌中で、YGLO39wもしくはYGL157wまたはその両方と機能的に相同な少なくとも１つの不活性化された遺伝子を含む少なくとも１つの植物を栽培し；そして
少なくとも10日間の栽培期間後に該植物の少なくとも一部を除去し、ここで該部分は高レベルの塩を含有する
ことを含む上記方法。
【請求項５７】
該植物を少なくとも90日間栽培する、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
該栽培および該除去を複数回実施する、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
該細胞を静止期まで増殖させる、請求項３１記載の方法。
【請求項６０】
該細胞を静止期まで増殖させ、該細胞の静止期での密度が、同じ増殖条件下で遺伝子YGLO39wおよびYGL157wと機能的に相同である活性遺伝子を有することを除いて同遺伝子型である細胞によって静止期に得られるものより高い、請求項５９記載の方法。                                                                             
【国際調査報告】
2005523697.tif 000007