(57)【要約】ポリメラーゼ及び又はターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼの基質であるオリゴヌクレオチドタグ化ヌクレオシド三リン酸（ＯＴＮＴＰ）、並びにこれらのＯＴＮＴＰを作製する方法が提供される。さらに、オリゴヌクレオチド鎖に結合したエネルギー移動色素を含む蛍光色素を有するＯＴＮＴＰ、オリゴヌクレオチド配列に組込まれた天然にはない塩基を有するＯＴＮＴＰ、及びＤＮＡ又はＲＮＡにこれらのＯＴＮＴＰを取り込むための方法が提供される。また、上記の増幅法を用いてＯＴＮＴＰ上のオリゴ配列を増幅するためにＯＴＮＴＰ上でオリゴヌクレオチドを用いるための方法も提供される。さらに、反応性の二官能性アミド、これらの化合物を作製する方法、及び上記のＯＴＮＴＰを用いて一塩基多型を検出するための方法が提供される。ＯＴＮＴＰを用いて示差的な遺伝子発現を検出するための方法、及びＯＴＮＴＰを用いて、特別に修飾ＤＮＡ又はＲＮＡを分離するための方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造を含むＯＴＮＴＰ。
【化１】
2005536211.tif 000004
式中、Ｒ及びＲ′は独立にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ３、Ｎ３、ＳＨ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＳＣＮ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ又はＮＲ″Ｒ″′であり（ただし、Ｒ″及びＲ″′は独立にＨ又は短鎖Ｃ１〜Ｃ５アルキルである。）、
ＸはＯ、Ｓ、ＣＨ３又はＢＨ３であり、
塩基はウラシル、シトシン、チミン、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、キサンテン、デアザアデニン、デアザグアニン又はこれらのアナログであり、
リンカーはＮ、Ｏ、Ｓ及びＰからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を含む線状又は枝分れアルキニル、アルケニル、アルキル、アルキルアリール、アリール又はアリールアルキルであって、上記塩基に結合しており、
Ｎはリボース、デオキシリボース、天然もしくは非天然のデオキシリボヌクレオシド又は天然もしくは非天然のリボヌクレオシドであって、適宜検出可能な原子団を含んでおり、
ｎは２〜１００の整数であり、
各々のＮはホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホネート結合又は他の結合で他の１個以上のＮに結合している。
【請求項２】
ｎが１０〜１００から選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｎが２〜２５から選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｎの１以上が蛍光色素で標識されている、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｎの１つがドナー色素に結合し、別のＮがアクセプター色素に結合していて、ドナー色素の励起時にドナーとアクセプターの間でエネルギー移動が起こる、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ及びＲ′共にＨである、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
次の構造の化合物。
【化２】
2005536211.tif 000005
式中、Ｒは非反応性の極性又は非極性基であり、Ｒ′はアルキル又はシアノエチルであり、Ｒ″及びＲ″′は独立にＣ１〜Ｃ６線状又は枝分れアルキルから選択されるか、或いはＲ″とＲ″′で５〜７員環構造を形成し、
リンカーは、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を適宜含んでいてもよい線状又は枝分れ、飽和又は不飽和非環式、環式又は芳香族化合物である。
【請求項８】
次の構造の化合物。
【化３】
2005536211.tif 000006
式中、Ｒは非反応性の極性又は非極性基であり、Ｒ′はアルキル又はシアノエチルであり、Ｒ″及びＲ″′は独立にＣ１〜Ｃ６線状もしくは枝分れアルキルから選択されるか、或いはＲ″とＲ″′で５〜７員環構造を形成し、
リンカーは線状又は枝分れ、飽和又は不飽和非環式、環式又は芳香族化合物であって、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。
【請求項９】
次の構造の化合物。
【化４】
2005536211.tif 000007
式中、Ｒ′はアルキル又はシアノエチルであり、Ｒ″及びＲ″′は独立にＣ１〜Ｃ６線状もしくは枝分れアルキルから選択されるか、或いはＲ″とＲ″′で５〜７員環構造を形成し、
リンカーは線状又は枝分れ、飽和又は不飽和非環式、環式又は芳香族化合物であって、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。
【請求項１０】
以下の段階を含む遺伝子解析法。
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡ試料と配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）核酸ポリメラーゼと、特有のオリゴヌクレオチド配列を有する請求項１記載の構造の４種１組のＯＴＮＴＰターミネーターとを添加して混合物を形成する段階、
ｃ）ＯＴＮＴＰの取込みに十分な時間、ポリメラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、及び
ｄ）標識プローブとのハイブリダイゼーションによって、取込まれたＯＴＮＴＰを検出する段階。
【請求項１１】
前記試料が増幅試料である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記検出段階の前に取込まれていないＯＴＮＴＰを除去する段階をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
以下の段階を含む遺伝子解析法。
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡ試料と配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）核酸ポリメラーゼと、検出可能な標識を有する請求項１記載の構造の４種１組のＯＴＮＴＰターミネーターとを添加して混合物を形成する段階、
ｃ）ＯＴＮＴＰの取込みに十分な時間、ポリメラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、及び
ｄ）ＯＴＮＴＰに結合した標識を検出することによって、取込まれたＯＴＮＴＰを検出する段階、
【請求項１４】
前記試料が増幅試料である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記標識が蛍光部分である、請求項１３記載の遺伝子解析法。
【請求項１６】
前記検出段階の前に取込まれていないＯＴＮＴＰを除去する段階をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
以下の段階を含む遺伝子解析法。
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡ試料と配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）核酸ポリメラーゼと、エネルギー移動に適した距離でドナーとアクセプターを有する請求項１記載の構造の４種１組のＯＴＮＴＰターミネーターであって各アクセプター色素が特定の塩基に特異的で他のアクセプター色素とは異なる波長で発光するＯＴＮＴＰターミネーターの組とを添加して混合物を形成する段階、
ｃ）ＯＴＮＴＰの取込みに十分な時間、ポリメラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、及び
ｄ）ドナー色素を励起させ、アクセプター色素からの発光を測定することによって、取込まれたＯＴＮＴＰを検出する段階。
【請求項１８】
前記試料が増幅試料である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記検出段階の前に取込まれていないＯＴＮＴＰを除去する段階をさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
以下の段階を含む遺伝子解析法。
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡと配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）ポリメラーゼと請求項１記載の構造の１組のＯＴＮＴＰターミネーターとを添加して混合物を形成し、ＯＴＮＴＰの取込みに十分な時間、ポリメラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、
ｃ）ＯＴＮＴＰオリゴヌクレオチド配列を増幅させる段階、及び
ｄ）増幅配列を同定する段階。
【請求項２１】
前記増幅段階が、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、３ＳＲ、Ｑβ、レプリカーゼ及びＲＣＡからなる群から選択される公知の方法で実施される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記検出段階の前に取込まれていないＯＴＮＴＰを除去する段階をさらに含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
以下の段階を含む遺伝子解析法。
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡと配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）ポリメラーゼと請求項１記載の構造の１組のＯＴＮＴＰターミネーターとを添加して混合物を形成し、ＯＴＮＴＰの取込みに十分な時間、ポリメラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、
ｃ）各々ＯＴＮＴＰの４種類のオリゴヌクレオチド配列のいずれかに相補的な配列部分を有する４種１組の一本鎖環状ＤＮＡを添加する段階、
ｄ）ＲＣＡに必要な試薬を添加する段階、
ｅ）増幅に十分な時間、適温でインキュベートすることによってＲＣＡを実施する段階、及び
ｆ）ＲＣＡ産物と配列特異的ａｍｐｌｉｆｌｏｕｒｓ又は分子ビーコンをハイブリダイズすることによってシグナルを検出する段階。
【請求項２４】
前記増幅段階の前に取込まれていないＯＴＮＴＰを除去する段階をさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
以下の段階を含む遺伝子解析法。
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡと配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）ポリメラーゼと請求項１記載の構造の１組のＯＴＮＴＰターミネーターとを添加して混合物を形成し、ターミネーターの取込みに十分な時間、ポリメラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、
ｃ）伸長プライマーから、取込まれていないターミネーターを分離する段階、
ｄ）各々他とは異なる配列を有していて各配列のＧ、Ａ、Ｔ及びＣの比率が他と実質的に異なっており、同時にＯＴＮＴＰの４種類のオリゴヌクレオチド配列のいずれかに相補的な配列部分を有する４種１組の一本鎖環状ＤＮＡを添加する段階、
ｅ）ＲＣＡに適したＤＮＡポリメラーゼ、１組のγ標識ｄＮＴＰ及びＲＣＡに必要な他の試薬及びＲＣＡ条件下で機能するホスファターゼを添加する段階、
ｆ）増幅に十分な時間又は全てのヌクレオチドが消費されるまで適温でインキュベートすることによってＲＣＡを実施する段階、及び
ｇ）遊離色素の比率を測定して増幅配列を同定する段階。
【請求項２６】
以下の段階を含む遺伝子解析法。
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡと配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）ポリメラーゼと請求項１記載の構造の１組のＯＴＮＴＰターミネーターであって、各ＯＴＮＴＰのオリゴヌクレオチドが４種類の天然塩基のうちの３種類のみからなり、欠失塩基が各ＯＴＮＴＰで異なるＯＴＮＴＰターミネーターの組を添加し、ターミネーターの取込みに十分な時間、ポリメラーゼ活性に適した温度で試料をインキュベートする段階、
ｃ）伸長プライマーから、取込まれていないターミネーターを除去する段階、
ｄ）各々４種類の天然塩基のうち３種類だけを含む配列を有していて、同時にＯＴＮＴＰの４種類のオリゴヌクレオチド配列のいずれかに相補的な配列部分を有する４種１組の一本鎖環状ＤＮＡを添加する段階、
ｅ）ＲＣＡに適したＤＮＡポリメラーゼ、４種１組のγ標識ｄＮＴＰ及びＲＣＡに必要な他の試薬及びＲＣＡ条件下で機能するホスファターゼを添加する段階、
ｆ）増幅に十分な時間適温でインキュベートすることによってＲＣＡを実施する段階、及び
ｇ）遊離色素の比率もしくは同一性、又は遊離色素の比率と同一性を測定して増幅配列を同定する段階。
【請求項２７】
前記ＯＴＮＴＰのオリゴヌクレオチド配列の各々及び一本鎖環状ＤＮＡが、４種類の天然塩基又はそのアナログのうちの１〜２種類からなり、各組のＯＴＮＴＰ及び一本鎖環の１又は２種類の塩基の組合せが他の組のＯＴＮＴＰ及び一本鎖環状ＤＮＡとは異なる、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
ターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、ＤＮＡ又はＲＮＡに請求項１記載の構造のＯＴＮＴＰを取り込む方法であって、
ａ）ＤＮＡもしくはＲＮＡ又はその両方を含む生物試料とＯＴＮＴＰ及びターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼを水性緩衝液中で混合して混合物を形成する段階、及び
ｂ）ターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階
を含む方法。
【請求項２９】
ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素を用いてＤＮＡに請求項１記載の構造のＯＴＮＴＰを取り込む方法であって、
ａ）ＤＮＡ又はＲＮＡテンプレートとプライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素及び本発明の１種以上のＯＴＮＴＰを添加する段階、及び
ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素の活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階
を含む方法。
【請求項３０】
請求項１記載の構造のＯＴＮＴＰを作製する方法であって、
ａ）ＤＮＡ塩基の保護基の高速脱保護を利用したＤＮＡ合成法を用いて固体支持体上で所望のオリゴヌクレオチド配列を合成する段階、
ｂ）請求項７、請求項８又は請求項９のいずれか１項記載の反応性二官能性アミダイトを用いてオリゴヌクレオチドに反応性基を付加する段階、
ｃ）二官能性アミダイトの第二の反応性官能基と反応し得る官能基を有する官能化ＮＴＰと共に固体支持体をインキュベートする段階、及び
ｄ）支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、塩基を脱保護する段階、
を含む方法。
【請求項３１】
請求項１記載の構造のＯＴＮＴＰを作製する方法であって、
ａ）固体支持体上で所望の配列のオリゴヌクレオチドを合成し、オリゴヌクレオチドの５′位に保護アミノ又はチオール修飾リンカーを結合させるか或いは５′末端にホスホロチオエート骨格を有する段階、
ｂ）支持体からオリゴを切断し、塩基及び５′−アミノ又はチオール基を脱保護する段階、及び
ｃ）塩基部にマレイミド、エポキシド又はＮＨＳエステルを含むように修飾したＮＴＰを官能化オリゴと反応させる段階、
を含む方法。
【請求項３２】
ＲＮＡポリメラーゼ又はプライマーゼを用いて、ＲＮＡに請求項１記載の構造の１種以上のＯＴＮＴＰを取り込む方法であって、
ａ）ＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼ又はプライマーゼを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）ＯＴＮＴＰの１種以上を添加する段階、及び
ｃ）ＲＮＡポリメラーゼ又はプライマーゼの活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、
を含む方法。
【請求項３３】
ａ）請求項２８、請求項２９又は請求項３２のいずれか１項記載の方法によって、ＤＮＡ又はＲＮＡにアフィニティータグとして特定のオリゴヌクレオチド配列を有するＯＴＮＴＰを取り込む段階、
ｂ）相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する固体支持体と共にインキュベートして、標的化ＤＮＡ又はＲＮＡを捕獲する段階、及び
ｃ）洗浄によって捕獲されていない物質を除去する段階、
によって、特異的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を分離する方法。
【請求項３４】
変性緩衝液を用いて、捕獲ＤＮＡ又はＲＮＡを洗浄することによって捕獲ＤＮＡ又はＲＮＡを遊離する段階をさらに含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
取込み後、アフィニティータグを用いる前に組込まれていないＯＴＮＴＰを分離する、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
２つの異なる組織において示差的な遺伝子発現を定量する方法であって、
ａ）２つの組織試料において、各組織試料に特異的な異なるオリゴタグを有するＯＴＮＴＰの１種以上を用いて請求項２９に記載の方法でメッセンジャーのｃＤＮＡコピーを別々に作製する段階、
ｂ）２つの試料を混合し、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドチップにｃＤＮＡをハイブリダイズさせる段階、
ｃ）部位を検出する段階、及び
ｄ）各オリゴヌクレオチドタグの量を定量する段階、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
塩基に結合したランダムな又は所定の配列のオリゴヌクレオチドを含み、ポリメラーゼ及びターミタルヌクレオチジルトランスフェラーゼの基質である新規なヌクレオシド三リン酸について開示する。本発明はさらに、新規ヌクレオシド三リン酸の合成に使用し得る新規な反応性二機能性リンカーアミダイトについても開示する。さらに、本発明は、これらのアミダイト及び三リン酸塩を合成する方法、並びに遺伝子解析にこれらのヌクレオシド三リン酸を用いる方法について開示する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト及び他のゲノムの配列決定によって、例えばヒト及び動物の健康、食物及び水の安全性、科学捜査、作物保護などの改善のための遺伝子解析の機会が生じた。個体及び集団の遺伝子型決定によって、固体又は患者の群に適したテーラーメード治療の実施が可能になる。遺伝子多形性に基づいて患者群で代謝相違性を同定することによって、投与レジメンの改善、薬物有効性及び安全性の増強が得られる。疾患の遺伝的基礎を理解することによって新規な薬物標的が得られ、薬物開発費用が減少し、臨床開発における成功の機会が増大して、全体として市場性が最大化される。同様に動物及び植物における疾患の遺伝的基礎を理解することによって、疾患耐性の動物及び作物の操作が補助され、所望の特徴が増強される。
【０００３】
遺伝的相違を見ることに加えて、種々の遺伝子の種々の発現解析が極めて重要である。多くの場合、特定の疾患に関する遺伝子は極めて低いコピー数でしか発現され得ない。これらの低コピー数遺伝子を同定及び定量するには、極めて高い感度のアッセイが必要であり、一般には、幾つかのタイプの増幅を要する。多数の増幅法、例えば、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）としても知られる３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ＱＢレプリカーゼ増幅（ＱＢ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が開発されている（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９１，３５，１１７〜１２６）。一般的に許容される増幅の定義及び増幅という用語は、本明細書では、元の配列及び／又は相補的な配列のコピーを作製する段階を含む。これらの方法のほとんどが高いバックグラウンドを有する。増幅されている配列は特有だが実質的にはゲノムの他の領域の配列と異なることはないからである。従って、増幅及び／又は検出のための標的に対する高度に特有の配列を付加する方法によって、さらに高い感度を得ることが可能になり、所望される。
【０００４】
蛍光検出方法は、放射性標識に比較したその高い感度及び低い毒性に起因してＤＮＡ又はＲＮＡの検出のために広範に用いられる。多数の用途のために、特に多重化のために、識別可能な特徴を有する幾つかの発蛍光団が必要である。例えば、配列決定において、４つの異なる蛍光色素を用いて異なるヌクレオシド塩基を識別する。理想的な組の色素は同じ波長で吸収するが、容易に弁別可能な波長では同様の強度で発光する。不幸にも、このような組の色素を見出すことは極めて困難である。この問題を回避するため、蛍光エネルギー移動システムが設計されているが、これは単一の色素を用いてエネルギーを吸収し、これが次にドナーとして働いて、異なる波長で発光する１組のアクセプター色素にエネルギーを伝達する。配列決定を始めとする遺伝子解析のために、エネルギー移動システムは以下の２通りの方法で用いられている。エネルギー移動色素で標識したプライマー（Ｊｕ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９２，４３４７〜４３５１；Ｈｕｎｇ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２４３，１５〜２７及びＨｕｎｇ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７，２５２，７８〜８８）、及びエネルギー移動色素で標識したヌクレオシド三リン酸（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  Ｂ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４５００〜４５０４；Ｌｅｅ  Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５，２８１６〜２８２２；Ｎａｍｐａｌｌｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２０００，４１，８８６７〜８８７１；Ｌｅｅ  Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ，１９９９，米国特許第５８６３７２７号；Ｋｕｍａｒ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ，２０００，国際公開第００／１３０２６号；Ｒａｏ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２００１，２０，６７３−６７６）。標識プライマーから標識産物を分離するよりも標識産物から標識ヌクレオシド三リン酸を分離する方が容易であるので、後者が望ましい。さらに標識プライマーは、全ての伸長産物が標識されるのでさらに高いバックグラウンドを生じる。
【特許文献１】米国特許第５８６３７２７号明細書
【特許文献２】国際公開第００／１３０２６号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９１，３５，１１７〜１２６
【非特許文献２】Ｊｕ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９２，４３４７〜４３５１
【非特許文献３】Ｈｕｎｇ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２４３，１５〜２７
【非特許文献４】Ｈｕｎｇ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７，２５２，７８〜８８）
【非特許文献５】Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  Ｂ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４５００〜４５０４
【非特許文献６】Ｌｅｅ  Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５，２８１６〜２８２２
【非特許文献７】Ｎａｍｐａｌｌｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２０００，４１，８８６７〜８８７１
【非特許文献８】Ｒａｏ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２００１，２０，６７３−６７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、プライマー上の異なる塩基に結合した色素間のエネルギー移動は、色素が他のリンカーを介してお互いに結合しる場合よりも効果的であることが見出されている。この理由は、十分には理解されていないが、現在までに試みられたリンカーを用いた正しい高次構造は、達成されていないか、又はＤＮＡ塩基がいくらかエネルギー移動を促進するという可能性がある。従って、両方のシステムの所望の特性を組合せることが所望される。
【０００６】
従って、容易に多重化される、高感度の、高特異性の方法が必要である。この課題には以下でさらに詳細に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記の増幅技術の多くのバックグランドを低下して、これによって感度を増大する方法を提供する。本発明は、ポリメラーゼ及びターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼについての基質であるオリゴヌクレオチドタグ化ヌクレオシド三リン酸ＯＴＮＴＰ、並びにこれらのＯＴＮＴＰを作成する方法を提供する。本発明はさらに、オリゴヌクレオチド鎖に結合した、エネルギー移動色素を含む蛍光色素を有するＯＴＮＴＰ、オリゴヌクレオチド配列に組込まれた天然にはない塩基を有するＯＴＮＴＰ、及びＤＮＡ又はＲＮＡにこれらのＯＴＮＴＰを取り込むための方法を提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、上記の増幅法を用いてＯＴＮＴＰ上のオリゴ配列を増幅するためにＯＴＮＴＰ上でオリゴヌクレオチドを用いるための方法を提供する。本発明は、反応性の二官能性アミド、これらの化合物を作製する方法、及び本発明のＯＴＮＴＰを用いて一塩基多型を検出するための方法を提供する。さらに、本発明は、本発明のＯＴＮＴＰを用いて示差的な遺伝子発現を検出するための方法を提供する。最終的に、本発明は、本発明のＯＴＮＴＰを用いて、特別に修飾ＤＮＡ又はＲＮＡを分離するための方法を提供する。
【０００９】
反応性の二機能性のアミド及びＯＴＮＴＰの組成及び作成方法、並びにＤＮＡ又はＲＮＡにこれらのＯＴＮＴＰを取り込む方法が開示される。これらの方法は、遺伝子変異、種々の遺伝子発現を検出するために有用である。２つのレベル（標的特異的ハイブリダイゼーション及びプライマー伸長）での標的識別、及びエネルギー移動色素に起因する多重化の容易さに起因して、この方法は、高い感度及び特異性を要する遺伝子解析に適切である。天然ではない塩基をコードし、かついかなる天然塩基もコードしないＯＴＮＴＰのオリゴヌクレオチド配列に別の天然ではない塩基を取り込むことによって、及び／又はこの天然塩基の１以上を省略することによって、さらに感度を上げることができる。多くのアッセイが低感度である理由の１つは、標的に対するプローブの非特異的ハイブリダイゼーションによって生じるバックグラウンドである。これは、ハイブリダイゼーション後にシグナルがさらに増幅されるアッセイでは大きな問題となり得る。天然ではない塩基を取り込むことによって、又はＯＴＮＴＰのオリゴヌクレオチド配列における天然塩基の１以上を省略することによって、この配列に対するプローブ又は標的の非特異的ハイブリダイゼーションを制御することが容易になり、これによってバックグラウンドが低下して、そのため感度が増強されるはずである。本発明の好ましい実施形態は、予め増幅された標的に対してプライマーをハイブリダイズさせる段階、蛍光ドナー及びアクセプター色素を有する本発明のＯＴＮＴＰターミネーターを取り込む段階、標識プライマーから取込まれていないＯＴＮＴＰを分離する段階、組込まれたＯＴＮＴＰを同定する段階とからなる。ＯＴＮＴＰターミネーターとは、このターミネーターの取り込み後、それ以上のプライマー伸長を支持しないＯＴＮＴＰである。
【００１０】
本発明の別の好ましい実施形態は、プライマーの標的特異的ハイブリダイゼーションと、ＯＴＮＴＰを有するプライマーの伸長（種々の塩基に相当する各々のターミネーターがその塩基に関連する特異的オリゴヌクレオチド配列を有する）と、取込まれていないターミネーターの除去と、ローリングサークル増幅を用いて取込まれたＯＴＮＴＰ配列を増幅する段階、先行技術で公知の方法を用いる増幅配列の検出とからなる。本発明の別の好ましい実施形態は、本発明のＯＴＮＴＰを用いてｃＤＮＡを標識する段階からなる。本発明の上記の特徴は、本発明の以下の詳細な説明が添付の図面と組合せて読まれる場合、さらに明確になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、塩基にオリゴヌクレオチドを有するヌクレオシド三リン酸が、ＤＮＡポリメラーゼの基質であるという発見に基づく。当業者は、取り込み後に、この塩基のオリゴヌクレオチド配列が任意の他のオリゴヌクレオチド配列として機能し得るということを理解する。従って、これは、追加の操作、例えば増幅のためのテンプレートもしくはプライマーとして、又は標的プローブのための標的として用いることができる。
【００１２】
ＤＮＡ配列に対して今日用いられる主な方法は、サンガー法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９７７，７４，５４６３）であり、ＤＮＡ鎖ターミネーターとしてジデオキシヌクレオシド三リン酸が使用される。あらゆるハイスループット配列決定システムで、蛍光色素の使用と組合せてこのアプローチが用いられる。色素は、ターミネーターに結合していてもよいし、又はプライマーの一部であってもよい。前者のアプローチは、終止したフラグメントが標識される場合にのみ好ましい。多重化について初期に記載された通り、エネルギー移動蛍光色素が、単一の色素の使用よりも好ましい。
【００１３】
蛍光共鳴エネルギー移動プライマーの使用は、Ｊｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９２，４３４７〜４３５１）によって記載されている。フルオレセインは共通のドナーとしてプライマーの５′末端に結合しており、ローダミン色素（Ｒ１１０、ＲＥＧ、ＴＡＭＲＡ及びＲＯＸ）がプライマーにおいて修飾Ｔを用いて至適の距離で結合しているという概念に基づいてプライマーを設計した。ドナーとアクセプターの色素の間の距離を変化させることによりアクセプター色素の発光を測定することによって至適の距離を決定した。この距離は、色素のこの組合せについては１０塩基であることが見出された。至適の距離は、用いられる色素の組合せによって変化することが予想される。至適の距離よりもいくらか短いか又は長くても、検出のための適切な十分なエネルギー移動が生じる限りこれも許容できる。
【００１４】
別のアプローチでは、両方のドナー及びアクセプターを有する無塩基のオリゴを合成して、ジスルフィド結合を用いてプライマーの５′末端に結合させた（Ｂｅｒｔｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，２９２，１８８〜１９７）。しかし、両方の場合とも、標識はプライマー上であった。当技術分野では、標識プライマーの使用は一般に、標識ターミネーターよりも高いバックグラウンドを生じることが周知である。従って、本発明の目的は、高い量子収量を有するエネルギー移動色素を有するＤＮＡ鎖ターミネーターを提供することである。本発明は、ドナー及びアクセプターの両方を有する標識オリゴヌクレオチドが、ターミネーターの一部であり、プライマーは、これらのＯＴＮＴＰの１つが組込まれる場合にのみ標識されるという点で先行技術とは異なる。
【００１５】
エネルギー移動色素を用いて標識されている本発明のＯＴＮＴＰターミネーターは、２つの色素（ドナー及びアクセプターの色素）が一緒に連結されていないが、ＯＴＮＴＰオリゴ上で異なる塩基に結合しており、２つの色素の間の距離をこえて良好かつ容易な制御を可能にするという点で、先行技術（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  Ｂ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４５００〜４５０４；Ｌｅｅ  Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５，２８１６〜２８２２；Ｎａｍｐａｌｌｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２０００，４１，８８６７〜８８７１；Ｌｅｅ  Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ，１９９９，米国特許第５８６３７２７号；Ｋｕｍａｒ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ，２０００，ＰＣＴ  ＷＯ  ００／１３０２６；Ｒａｏ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２００１，２０，６７３〜６７６）において公知のエネルギー移動ターミネーターとは異なる。本発明のＯＴＮＴＰは、以下の構造式１で表される。
【００１６】
【化１】
2005536211.tif 000002
【００１７】
式中、Ｒ及びＲ′は独立にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ３、Ｎ３、ＳＨ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＳＣＮ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ又はＮＲ″Ｒ″′であり（ただし、Ｒ″及びＲ″′は独立にＨ又は短鎖、例えばＣ１〜Ｃ５アルキルである。）、
ＸはＯ、Ｓ、ＣＨ３又はＢＨ３であり、
塩基はウラシル、シトシン、チミン、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、キサンテン、デアザアデニン、デアザグアニン又はこれらのアナログであり、
リンカーはＮ、Ｏ、Ｓ及びＰからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を含む線状又は枝分れアルキニル、アルケニル、アルキル、アルキルアリール、アリール又はアリールアルキルであり、修飾塩基が用いられる場合、ピリミジンのＮ４又はＣ５位で塩基に結合しているか、或いはプリンのＮ６、Ｃ７又はＣ８部位その他の部位で塩基に結合しており、
Ｎはリボース、デオキシリボース、天然もしくは非天然のデオキシリボヌクレオシド又は天然もしくは非天然のリボヌクレオシドであって、適宜検出可能な原子団を含んでおり、
ｎは２〜１００の整数であり、
各々のＮはホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホネート結合又は他の結合で他の１個以上のＮに結合している。
【００１８】
本発明は、ＤＮＡ又はＲＮＡ重合酵素を用いて、ＤＮＡ又はＲＮＡ中に本発明のＯＴＮＴＰを取り込む方法について開示する。これらの方法は、本発明の１種以上のＯＴＮＴＰ及び１以上のＤＮＡ又はＲＮＡ重合酵素の存在下で、プライマーのの存在下又は非存在下でＤＮＡ又はＲＮＡ試料をインキュベートする段階を包含する。ＤＮＡ重合酵素としては、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼが挙げられる。ＲＮＡ重合酵素としては、ＲＮＡポリメラーゼ、プライマーゼ及びターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼが挙げられる。
【００１９】
本発明は、生物試料において特定のヌクレオチド配列を検出する方法について開示する。本発明は以下の段階を含む。
１）標的分子に特異的プライマーをハイブリダイズさせる段階、
２）構造式１の１組のＯＴＮＴＰを用いて配列特異的にプライマーを伸長させる段階、
３ａ）ＯＴＮＴＰに結合した標識を検出するか又はＯＴＮＴＰ配列に特異的な標識プローブを用いることによって組込まれた塩基を検出するか、或いは
３ｂ）幾つかの公知の増幅法のいずれかを用いてＯＴＮＴＰ配列を増幅し、当技術分野で公知の方法を用いて増幅生成物を検出すかのいずれかの段階、及び
４）組込まれた量を必要に応じて定量する段階。
【００２０】
ＯＴＮＴＰのオリゴヌクレオチド配列は、ＯＴＮＴＰが組込まれたオリゴヌクレオチド／ＤＮＡ配列を分離するためのアフィニティータグとして使用し得る。本発明のこの局面では、ＯＴＮＴＰのオリゴヌクレオチド配列は、アフィニティータグとして機能する。このアフィニティータグは、特にポリメラーゼ及びＯＴＮＴＰのうちの１つを用いて配列を付加し得る。次いで、特定のＯＴＮＴＰを取り込むＤＮＡ又はＲＮＡのみを単離するために、これは、相補的なオリゴヌクレオチド配列（アフィニティータグの配列に相補的）を用いて固体支持体に捕獲し得る。一端捕獲されれば、未結合の物質は、容易に洗い流すことが可能で、捕獲配列は、変性緩衝液を用いた洗浄によって固体支持体から溶出し得る。
【００２１】
あるいは、ターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼ（デオキシヌクレオチジル又はリボヌクレオチジル）及びデオキシリボ又はリボース糖を有するＯＴＮＴＰを用いて、試料に存在する全てのＤＮＡ又はＲＮＡに対してこのアフィニティータグを付加することができる。これは、試料中のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及び他の成分の混合物からＤＮＡ又はＲＮＡを分離するために有用である。
【００２２】
ＯＴＮＴＰ上のオリゴヌクレオチドの長さは、変化してもよく、所望の長さは、これらのＯＴＮＴＰが加えられる用途の関数である。十分な試料が利用可能であり、これらのＯＴＮＴＰが組込まれた塩基を識別するためにのみ用いられる用途では、用いられる色素のエネルギー移動効率又はプローブの長さに依存して、２〜１５ヌクレオチドの長さが十分であるかもしれない。他方では、オリゴヌクレオチドタグが、例えばＲＣＡにおいて、プライマーとして用いられる場合、６以上のヌクレオチド長さが必要である。好ましくは、この長さは１０〜２５ヌクレオチドの間である。最終的に、ターミネーター上のオリゴヌクレオチドがテンプレートとして用いられる場合、さらに長い長さが必要であるかもしれない。本発明の実施形態によって構造式１のＯＴＮＴＰが得られるが、ここではオリゴヌクレオチドは２〜１００塩基の長さにわたる塩基の配列に相当して、標識を含んでも含まなくてもよい。標識とは、先行技術で用いられる任意の方法によって検出し得る部分であり、これには着色色素、蛍光化合物、質量タグ、蛍光を生じる化合物、放射性標識、電気化学的タグが挙げられる。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態によって、１ａ〜１ｈの構造のＯＴＮＴＰが得られ（図１参照）、ここでは各々のオリゴヌクレオチドは、特有の蛍光色素で標識される。
【００２４】
本発明の別の実施形態によって、１ａ〜１ｈの構造のＯＴＮＴＰが得られ、ここでは各々のオリゴヌクレオチドは、４つ全てのヌクレオチド及びアクセプター色素に共通であり、各々のヌクレオチドに特有である、ドナー色素の結合によって修飾される。さらに、エネルギー移動に適した距離でこれらの色素は隔てられる。最も一般的に用いられるエネルギー移動の対はフルオレセイン／ローダミンであるが、他のＥＴの対であるＣｙ３／Ｃｙ５、フルオレセイン／Ｃｙ５、フルオレセイン／Ｃｙ５．５なども首尾よく使用されており（米国特許第６２４５５１４号Ｂ１及びそこに引用される参考文献）、参考として本明細書に援用される。
【００２５】
本発明の別の実施形態によって、１ａ〜１ｈの構造のＯＴＮＴＰが得られ、オリゴヌクレオチド配列はドナー及びアクセプター色素で標識した無塩基ヌクレオチドからなり、ドナー色素は全てのＯＴＮＴＰに共通であるが、アクセプター色素は各ＯＴＮＴＰで異なる。さらにドナー及びアクセプター色素はエネルギー移動に適した距離で隔てられる。本実施形態におけるＯＴＮＴＰのオリゴヌクレオチド配列は、それ以上の増幅のためのテンプレート又はプライマーとして用いることができない。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡ試料と配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）ポリメラーゼと、特有のオリゴヌクレオチド配列を有する４種１組のＯＴＮＴＰターミネーターとを添加して混合物を形成する段階、
ｃ）ポリメラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、及び
ｄ）標識プローブとのハイブリダイゼーションによって、取込まれたＯＴＮＴＰを検出する段階
を含む遺伝子解析法について開示する。
【００２７】
プローブは、固有に同定できる任意の検出可能部分を用いて標識し得る。このような検出可能な部分としては、蛍光色素、着色されるか発光の部分、質量タグ及び電気化学的タグが挙げられる。これらの部分の例は、化学文献において広範に利用可能である。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡ試料と配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）ポリメラーゼと、検出可能な標識を有する４種１組のＯＴＮＴＰターミネーターとを添加して混合物を形成する段階、
ｃ）ＯＴＮＴＰの取込みに十分な時間、ポリメラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、及び
ｄ）標識を検出することによって、取込まれたＯＴＮＴＰを検出する段階
を含む遺伝子解析法について開示する。
【００２９】
標的ＤＮＡ又はＲＮＡとしては、依然として配列に特異的にハイブリダイズし得る化学的に修飾ＤＮＡ、例えば重亜硫酸処理ＤＮＡが挙げられる。ＯＴＮＴＰターミネーターとは、ＯＴＮＴＰの取り込み後に、プライマーのそれ以上の伸長が実現不能であるような、修飾糖、例えばジデオキシリボースを有するＯＴＮＴＰである。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡ試料と配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）ポリメラーゼ、ＯＴＮＴＰ特異的蛍光色素を有する４種１組のＯＴＮＴＰターミネーターを添加して混合物を形成する段階、
ｃ）ＯＴＮＴＰの取込みに十分な時間、ポリメラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、及び
ｄ）取込まれた色素を検出することによって、取込まれたＯＴＮＴＰを検出する段階
を含む遺伝子解析法について開示する。
【００３１】
種々の蛍光色素が市販されており、これには２〜３例を挙げると、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ｂｏｄｉｐｙ色素、クマリンが挙げられる。取り込み条件下で安定である任意の蛍光色素を使用し得る。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡ試料と配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）核酸ポリメラーゼと、エネルギー移動に適した距離でドナー色素とアクセプター色素を有する４種１組のＯＴＮＴＰターミネーターであって各アクセプター色素が特定の塩基に特異的で他のアクセプター色素とは異なる波長で発光するＯＴＮＴＰターミネーターの組とを添加して混合物を形成する段階、
ｃ）ＯＴＮＴＰの取込みに十分な時間、ポリメラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、及び
ｄ）ドナー色素を励起させ、アクセプター色素からの発光を測定することによって、取込まれたＯＴＮＴＰを検出する段階
を含む遺伝子解析法について開示する。
【００３３】
上記のように、増幅のためにＯＴＮＴＰのオリゴヌクレオチド配列を使用することが可能である。この配列は、特有であるだけでなく、天然に見出される任意の可能な配列から大幅に異なるようにも選択することが可能である。これは、配列自体又は他の天然ではない塩基のいずれかをコードする配列に対して天然にはない塩基を付加することによって達成できる。これらの天然にはない塩基の例は、Ｌｅｉ  Ｗａｎｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，５０１０〜５０１１及びその中の引用文献に挙げられており、参考として本明細書に援用される。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡと配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）ポリメラーゼと１組のＯＴＮＴＰターミネーターとを添加して混合物を形成する段階、
ｃ）ＯＴＮＴＰの取込みに十分な時間、ポリメラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、
ｄ）取込まれていないＯＴＮＴＰから伸長プライマーを分離する段階、
ｅ）各々ＯＴＮＴＰの４種類のオリゴヌクレオチド配列のいずれかに相補的な配列部分を有する４種１組の一本鎖環状ＤＮＡを添加する段階、
ｆ）ＲＣＡに適したＤＮＡポリメラーゼ及びＲＣＡに必要な他の試薬（ｄＮＴＰｓ、緩衝液、塩など）を添加する段階、
ｇ）増幅に十分な時間、適温でインキュベートすることによってＲＣＡを実施する段階、及び
ｈ）ＲＣＡ産物と配列特異的ａｍｐｌｉｆｌｏｕｒｓ又は分子ビーコンをハイブリダイズすることによってシグナルを検出する段階、
による、遺伝子解析法について開示する。
【００３５】
ａｍｐｌｉｆｌｏｕｒｓ及び分子ビーコンは、蛍光色素及びクエンチャー（消光）色素を有するオリゴヌクレオチドである。従って、これらのオリゴヌクレオチドは、三次元構造で存在して、その蛍光色素の蛍光は完全に又は部分的に消光（クエンチ）される。標的（この場合には増幅ＲＣＡ生成物）に対するハイブリダイゼーションの際、蛍光色素及びクエンチャーは引き離されて、蛍光はもはや消光される。
【００３６】
本発明の別の実施形態によって、オリゴヌクレオチドが１以上の天然にはない塩基を含む、図１の１ａ〜１ｈに示される構造のＯＴＮＴＰが得られる。
【００３７】
別のタイプの同種のアッセイでは、γ標識したｄＮＴＰｓを増幅の間に使用してもよい。この方法で用いられるγ標識ｄＮＴＰｓは、ｄＮＴＰから遊離された後及びリン酸基の除去後にのみ蛍光を発するか、又は遊離の色素として種々の波長で発光する色素で標識される。これらの色素の例としては、２〜３例を挙げれば、７−ヒドロキシ−アクリジン−２−オン、７−ヒドロキシ−クマリン、レゾルフィンなどが挙げられるがこれらに限定されない。蛍光色素に加えて、測定可能な異なる特性を有する他の色素生産性基質を、それらがｄＮＴＰのγリン酸基に結合している場合に、遊離形態で用いることができる。本発明において有用な色素生産性基質の幾つかの例は、米国特許第５１９１０７３号、同第５２０８３２６号、同第４９３２８７１号、同第５１８３７４３号、同第４８１０６３６号及び同第５１２２６０８号に記載されており、本明細書において参考として援用される。本明細書に記載の色素は、例を提供する目的であり、決して本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡと配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）ポリメラーゼと１組のＯＴＮＴＰとを添加して混合物を形成する段階、
ｃ）ターミネーターの取込みに十分な時間、ポリメラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、
ｄ）伸長プライマーから、取込まれていないターミネーターを分離する段階、
ｅ）各々他とは異なる配列を有していて各配列のＧ、Ａ、Ｔ及びＣの比率が他と実質的に異なっており、同時にＯＴＮＴＰの４種類のオリゴヌクレオチド配列のいずれかに相補的な配列部分を有する４種１組の一本鎖環状ＤＮＡを添加する段階、
ｆ）ＲＣＡに適したＤＮＡポリメラーゼ、４種１組のγ標識ｄＮＴＰ（上記）及びＲＣＡに必要な他の試薬（緩衝液、塩など）及びホスファターゼを添加する段階、
ｇ）増幅に十分な時間又は全てのヌクレオチドが消費されるまで適温でインキュベートすることによってＲＣＡを実施する段階、及び
ｈ）遊離色素の比率を測定してこれによって増幅配列を同定する段階、
による遺伝子解析法について開示する。
【００３９】
異なる環におけるＧ、Ａ、Ｔ、Ｃの比は、１つの環の増幅について遊離色素の比が、異なる環が増幅された場合に遊離色素の比とは容易に識別できるように、お互いに実質的に異なっていなければならない。例えば、１つの環の増幅から遊離色素の比が、１：１：１：１であり、異なる環については１：１：０．９５：１である場合、この２つの間で識別することができなくてもよい。一方でこれらの比が１：１：０．５：１対１：１：１：１．２５である場合、それらは容易に識別されるはずである。
【００４０】
さらに、この配列において１又は２つの塩基を全く省略することによって、天然塩基を用いてかなり特有の配列を作成することが可能である。上述の実施形態においては、ＲＣＡに用いられる環状テンプレート及びＯＴＮＴＰ上のオリゴヌクレオチドタグは、４種類の天然塩基のうち３つだけに相当するヌクレオチドからなるということがさらに好ましい。各々の環で失われている塩基及び相補的なオリゴヌクレオチドタグは、他の環における失われている塩基及びオリゴヌクレオチドタグとは異なる。好ましい実施形態では、各々のγ標識ｄＮＴＰが異なる色素で標識される場合、４つの色素のうちの３つだけが遊離されて、これによって増幅される配列が容易に同定される。
【００４１】
前に記載した通り、標的オリゴヌクレオチドの増幅のためには多数の増幅法が開発されており、本発明と組合せて用いることができる。例えば、取込まれたＯＴＮＴＰ上のオリゴヌクレオチドタグは、ＰＣＲ、ＬＣＲ又はＳＤＡにおけるプライマー又はテンプレート、３ＳＲ及びＲＣＡにおけるプライマー（上記のように）、又はＱβレプリカーゼによる増幅のための標的として機能し得る。
【００４２】
従って、本発明の別の実施形態は、
ａ）標的ＤＮＡ又はＲＮＡと配列特異的プライマーを水性緩衝液中で混合する段階、
ｂ）ポリメラーゼと１組のＯＴＮＴＰターミネーターとを添加して混合物を形成する段階、
ｃ）ターミネーターの取込みに十分な時間、ポリメラーゼ活性に適した温度で混合物をインキュベートする段階、
ｄ）取込まれていないＯＴＮＴＰを分離する段階、
ｅ）当技術分野で公知のいずれかの増幅法を用いてターミネーターオリゴヌクレオチド配列を増幅させる段階、
ｆ）当技術分野で公知の方法のいずれかによって増幅配列を同定する段階、
による遺伝子解析法について開示する。
【００４３】
取込まれていないターミネーターの分離は必須であってもなくてもよく、又は増幅後に実施してもよい。例えば、元のプライマーが表面に結合する場合、取込まれたＯＴＮＴＰのオリゴヌクレオチドタグは、表面に固着され、これによってこのタグの任意の増幅は、表面に固着したままでもよい。従って、たとえ取込まれていないＯＴＮＴＰが増幅の前に取り除かれなくても、それらは引き続く段階において洗い流せばよい。固着されていない生成物を分離することなく、内部反射率蛍光顕微鏡を用いて、この固着生成物を検出することもできる。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、本発明のＯＴＮＴＰを用いることによって異なる遺伝子発現を検出する方法について開示する。異なる組織（異なる組織タイプ、異なる発達段階の同じタイプの組織、又は正常組織対疾患組織）での異なる遺伝子の発現をモニタリングすることは、種々の器官又は疾患の発達における種々の遺伝子の役割を決定することにおいて極めて重要である。この示差的な発現を検出するための方法は、以下の段階：
ａ）標識ＮＴＰを用いて標識メッセンジャーの複数のコピーを作製するか、又は標識ｄＮＴＰを用いて対応する標識ｃＤＮＡの複数のコピーを作製することによって、２つの組織におけるメッセンジャーを別々に増幅する段階（各々の組織試料には異なる標識が用いられる）と、
ｂ）２つの増幅生成物を混合する段階、
ｃ）ハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上の標識メッセンジャー又はｃＤＮＡコピーを分離する段階、及び
ｄ）チップ上の２つの標識の部位及び比を検出する段階
を含む。
【００４５】
遺伝子が発現されている部位を決定すれば、この比は異なる組織でのその遺伝子の発現の量を示す。本発明のＯＴＮＴＰは、この目的で使用し得る。この場合、１オリゴ配列を有するＯＴＮＴＰを、１つの組織試料のメッセンジャーに組込んで、同じ塩基だが異なるオリゴ配列を有するＯＴＮＴＰを、他の組織試料のメッセンジャーに取り込む。試料を混合して、チップ上でメッセンジャーを分離した後、ＯＴＮＴＰの２つのオリゴ配列の部位及び量を、上記の方法のいずれかによって決定し得る。オリゴタグ対他の検出可能な部分例えば蛍光色素を用いることの利点は、オリゴタグ配列を増幅することによってシグナルがさらに増幅し得ることである。
【００４６】
これらのＯＴＮＴＰを作成するために、種々の方法が利用可能であるが、この方法は２つのカテゴリー、固相法及び混合固体／溶液相に分類可能である。固相法では、固体支持体上でかつ切断後に完全なＯＴＮＴＰを合成して、遺伝子解析における使用のために脱保護を精製する。混合固体／溶液相の方法では、オリゴヌクレオチドを固体支持体上で合成して、次いで溶液中でヌクレオチド三リン酸に結合させる。従って、本発明の別の実施形態では、以下の段階：
ａ）ＤＮＡ塩基の保護基の高速脱保護を用いる慣用的な自動的ＤＮＡ合成を用いて固体支持体上で所望のオリゴヌクレオチド配列を合成する段階、
ｂ）本明細書において以下に記載される反応性二官能性アミダイトを用いてオリゴヌクレオチドに反応性基を付加する段階、
ｃ）官能基が二官能性アミダイトの第二の反応性官能基と反応し得る官能化ヌクレオシド三リン酸と共にこの固体支持体をインキュベートする段階、
ｄ）支持体からこのオリゴヌクレオチドを切断してこの塩基を脱保護する段階
を含む、固体支持体上でこれらのＯＴＮＴＰを作成する方法（図５）が得られる。
【００４７】
ｄｄＮＴＰ上の官能基は、二官能性アミダイトのＮＨＳエステル基、マレイミドと反応するチオール基などと反応し得る、アミノであってもよい（例えば、ヌクレオチドを標識するために慣用的に用いられるプロパラギルアミノ基、Ｐｒｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３８，３３６〜３４１）。
【００４８】
本発明の別の実施形態は、以下の段階：
ａ）ＤＮＡ塩基の保護基の高速脱保護を用いる慣用的な自動的ＤＮＡ合成を用いて固体支持体上で所望のオリゴヌクレオチド配列を合成する段階、
ｂ）この塩基でアミダイト部分を担持する修飾ヌクレオシドアミダイトを用いて伸長させる段階（実施例１に示されるような）と、
ｃ）５′−ＯＨ基を脱保護して、５′−ＯＨ基をリン酸化して、本明細書に記載されるような三リン酸塩を得る段階、
ｄ）支持体からこのＯＴＮＴＰを切断してこの塩基を脱保護する段階
を含む、固体支持体上でＯＴＮＴＰを作成する方法を提供する。
【００４９】
本発明の別の実施形態は、以下の段階：
ａ）固体支持体上で所望の配列のオリゴヌクレオチドを合成し、オリゴヌクレオチドの５′位置に対して保護アミノもしくはチオール修飾リンカーを結合させる段階又は５′末端にホスホロチオエート骨格を有する段階、
ｂ）この支持体からオリゴを切り離す段階及びこの塩基及び５′−アミノ又はチオール基を脱保護する段階、
ｃ）この塩基にマレイミド、エポキシド又はＮＨＳエステルを含むように、官能化オリゴと修飾ヌクレオシド三リン酸を反応させる段階
を含む、固体／溶液においてＯＴＮＴＰを作成する方法について開示する。
【００５０】
本発明の別の実施形態は、以下に記載される構造の反応性二官能性アミダイトを提供する。
【００５１】
【化２】
2005536211.tif 000003
【００５２】
本発明の別の実施形態は、反応性の二官能性アミダイトを作成する方法を記載している。これらのアミダイトは、二官能性のリンカーアルコールを用いること及び非ヒドロキシル官能基に反応性の基を結合させることによって作成し得る。次いで、このヒドロキシ基は、テトライソプロピルシアノエチルビス−ホスホラミダイトと反応して、本発明の反応性の二官能性アミダイトが得られる。この二官能性のアミダイトの非アミダイト反応性官能基は、オリゴヌクレオチド合成に用いられる、少なくとも１サイクルのカップリング（テトラゾール／アセトニトリル）及び酸化（ヨウ素／水／ピリジン又は３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬））条件に十分安定である。
【００５３】
本発明はさらに、以下の実施例を参照して記載される。これらの実施例は、例示の目的でのみ提供されており、添付の特許請求の範囲及び本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本発明は、本明細書に記載の教示から明白になる任意のかつ全てのバリエーションを包含すべきである。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例は、例示目的のみのためであって、決して添付の特許請求の範囲を限定するために用いられるべきではない。以下に太字でみられる数は、図２〜４において番号付けした化合物をいう。
【００５５】
実施例１：オリゴヌクレオチドターミネーターの合成のための中間体、ジデオキシヌクレオシドリンカーアミドの合成（図２参照）
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−プロパギルアミノ−２′，３′−ジデオキシウリジン（３）
５−プロパギルトリフルオロアセトアミド２′，３′−ジデオキシウリジン（１，１．０ｇ，２．７ｍｍｏｌ）を、乾燥ピリジン（２×１０ｍｌ）と共に同時エバポレーションすることによって乾燥し、次いで、これを乾燥ピリジン（１０ｍｌ）に溶解し、ここにＤＭＴ−Ｃｌ（１．１２ｇ，３．３ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で２．５時間撹拌して、ジクロロメタン（７５ｍｌ）で希釈して、水（５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を乾燥して（硫酸ナトリウム）、エバポレートして残滓を、トルエンと共に同時エバポレーションして、微量のピリミジンを除去した。得られた泡状物をメタノール（２０ｍｌ）に溶解して、ここに水酸化アンモニウム（２０ｍｌ）を添加した。混合物を室温で３時間撹拌して、小容積までエバポレートさせた。ジクロロメタンを用いて、水層を抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて、エバポレートさせた。溶出物として０〜６％メタノール−ジクロロメタンを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残滓を精製した。生成物を含む適切な画分を収集してエバポレートして１．１５ｇの３を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）：δ：１．８−２．２５（ｍ，３Ｈ），２．４５（ｍ，１Ｈ），３．１０（ｂｒ，２Ｈ），３．２（ｄｄ，１Ｈ），３．５（ｄｄ，１Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），４．２５（ｍ，１Ｈ），５．２５（ｓ，１Ｈ），６．０５（ｄｄ，１Ｈ），６．８０（ｍ，４Ｈ），７．２０−７．５０（ｍ，９Ｈ），８．２５（ｓ，１Ｈ），１１．６０（ｓ，１Ｈ）。
【００５６】
アミノヘキサノール誘導体（６）の合成
乾燥ピリジン（１０ｍｌ）を用いた同時エバポレーションによって化合物３を乾燥させた。乾燥した基質を、乾燥ジクロロメタン（１５ｍｌ）及びピリジン（５ｍｌ）の混合物に溶解して、ここに無水コハク酸（０．３ｇ，３ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で１８時間撹拌して、水（１ｍｌ）の添加によって反応をクエンチした。３０分後、ジクロロメタン（７５ｍｌ）を用いて希釈して、水を用いて洗浄した。有機層を乾燥して（硫酸ナトリウム）、エバポレートさせた。
【００５７】
上記のように得られた生成物を、乾燥ＤＭＦ（２×１０ｍｌ）を用いた同時エバポレーションによって乾燥した。この乾燥物質をＤＭＦ（８ｍｌ）に溶解して、ここにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２８ｇ、２．５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（０．６５ｇ，３．４ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．４７ｍｌ，３．４ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を室温で一晩撹拌した。ＤＭＦをエバポレートして残滓をジクロロメタンと水の間で分割した。有機層を乾燥させてエバポレートさせた。この残滓をジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解して、６−アミノ−１−ヘキサノール（０．７ｇ，６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌して、ジクロロメタンを用いて希釈して水を用いて洗浄した。水層をジクロロメタンで抽出して、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて、エバポレートして、その残滓を、溶出液として０〜５％のメタノール−クロロメタンを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して０．７５ｇの６．１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１．２０−１．５０（ｍ，７Ｈ），１．８０−２．２０（ｍ  ４Ｈ），２．３０（ｍ，３Ｈ），２．９０−３．４０（ｍ，８Ｈ），３．７０（ｓ，６Ｈ），３．８１（ｄ，１Ｈ），４．２０（ｍ，１Ｈ），４．３０（ｔ，１Ｈ），５．９０（ｄｄ，１Ｈ），６．９０（ｍ，４Ｈ），７．１５−７．４５（ｍ  ９Ｈ），７，７５（ｔ，１Ｈ），７．８２（ｓ，１Ｈ），８．２０（ｔ，１Ｈ）。
【００５８】
ホスホラミダイト７の合成
無水アセトニトリル及びトルエンの混合物との同時エバポレーションによって化合物６を乾燥させた。この残滓を乾燥アセトニトリル（１０ｍｌ）に溶解して、ここに２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．３５ｍｌ，１．１ｍｍｏｌ）、続いてテトラゾール（７７ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で添加した。この反応混合物を室温で４５分間撹拌して、ジクロロメタン（５０ｍｌ）を用いて溶解して、冷炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍｌ）を用いて洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて、エバポレートさせて、その残滓をカラムクロマトグラフィーによって精製して、０．６２ｇの７．３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）：δ１４７．９４ｐｐｍを得た。
【００５９】
固体支持体上でのオリゴヌクレオチドとのカップリング及び５′−ヒドロキシルの脱保護後に、前に考察された方法（Ｒ．Ｋ．Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．１９９２，３３，３３０１−３３０４；Ａ．Ｖ．Ｌｅｂｅｄｅｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２００１，２０，１４０３及びその中に引用される引用文献）によって、これを固体支持体上でリン酸化して三リン酸に変換してもよい。
【００６０】
実施例２：反応性二官能性アミダイトの合成
４−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルベンゾエート（９）
４−（ヒドロキシメチル）安息香酸を含むジクロロメタン（１５ｍｌ）及びピリジン（３ｍｌ）の溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミジルトリフルオロ酢酸（３．４８ｇ，１６．５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。添加後に、反応を０℃で５分間続け、次いで氷浴を取り除いて暖めさせた。２０分後、この反応混合物を、ジクロロメタン（５０ｍｌ）を用いて希釈して、水（３×５０ｍｌ）を用いて洗浄した。有機層をメタノール（１０ｍｌ）を用いて処置した。これを室温で２０分間維持して、硫酸ナトリウムで乾燥して、エバポレートさせた。この残滓をトルエン（１０ｍｌ）と共に同時エバポレートさせて、高真空下で乾燥して１．２７ｇの生成物を得た。
【００６１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．８５（ｓ，４Ｈ），４．６０（ｓ，２Ｈ），７．５５（ｄ，２Ｈ），８．０５（ｄ，２Ｈ）。
【００６２】
ホスホラミダイト（１０）
９（０．７５ｇ，３ｍｍｏｌ）を含む乾燥アセトニトリル（１２ｍｌ）の溶液に、アルゴン雰囲気下で、テトラゾール（０．２３ｇ，３．３ｍｍｏｌ）、続いて２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．０６ｍｌ，３．３ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で３０分間撹拌して、ジクロロメタン（１００ｍｌ）で希釈して、冷０．５％重炭酸ナトリウム溶液を用いて洗浄した。有機層を乾燥させて（硫酸ナトリウム）、エバポレートさせた。最終的に、溶出液として０．５％ピリジン−ジクロロメタンを利用するカラムクロマトグラフィーによってこれを精製して、１．２７ｇの生成物を得た。
【００６３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）：δ１．２０（ｍ，１２Ｈ），２．７０（ｔ，２Ｈ），２．８５（ｓ，４Ｈ），３．６０−４．００（２ｍ，４Ｈ），４．８０（ｍ，２Ｈ），７．６０（ｄ，２Ｈ），８．１０（ｄ，２Ｈ）；３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）：δ１４９．６８ｐｐｍ。
【００６４】
実施例３：ＦＡＭ−アミノヘキサノール−Ｌ−ＰＡｄｄＵＴＰ
ｄｉＰｉｖＦＡＭ−アミノヘキサノール１１（５０ｍｇ）及び二官能性−リンカー−ホスホラミダイト１０（３５ｍｇ）を含む乾燥アセトニトリル（１ｍＬ）の溶液に、テトラゾール（２２ｍｇ）を添加して、混合物を室温で５分間維持した。この反応混合物をジクロロメタンで希釈して、冷０．５％  ＮａＨＣＯ３溶液を用いて洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて、乾燥するまでエバポレートさせた。この残滓をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解して、酸化溶液（０．１Ｎ，０．８５ｍＬ）を滴下して加えた。添加の２分後、この反応混合物をジクロロメタンで希釈して０．５％  ＮａＨＳＯ３溶液を用いて洗浄した。有機層を乾燥させてエバポレートさせ、その残滓をトルエンと共に同時エバポレートさせた。
【００６５】
約２０ｍｇの上で得られた物質を含むＤＭＦ（１ｍＬ）に、ＰＡｄｄＵＴＰ（２０μｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１ｍＬ）の溶液を添加した。２時間の撹拌後、８ｍＬのｐＨ９．５緩衝液（炭酸塩／重炭酸塩）及び４ｍＬのＤＭＦを添加して反応を室温で２０時間続けた。反応混合物を１０ｍＬのＮＨ４ＯＨを用いて２時間処理して、ほぼ乾燥するまでエバポレートさせた。この残滓を水で希釈して、イオン交換によって、続いて逆相カラムクロマトグラフィーによって精製した。
【００６６】
実施例４：溶液中での標識ＯＴＮＴＰの合成
ジピバロイルフルオレセイン−５−カルバキサミドヘキサノールのＤＭＴスペーサーホスホラミダイトとのカップリング
フルオレセイン誘導体（１１，０．２６ｇ、０．４ｍｍｏｌ）及びテトラゾール（８４ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）を含む乾燥アセトニトリル（１ｍｌ）の部分溶液にＤＭＴスペーサーホスホラミダイト（無塩基ヌクレオシドアミダイト，１２，０．２５ｇ，０．４ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル（１ｍｌ）の溶液を添加した。反応混合物を室温で２０分間撹拌して、ジクロロメタンを用いて希釈して、冷０．５％炭酸水素ナトリウム溶液を用いて洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥してエバポレートさせた。得られた残滓をアセトニトリル（３ｍｌ）に溶解して、酸化溶液（０．０５Ｎヨウ素を含む水及びピリジン、８ｍｌ）を添加した。３０分後、ジクロロメタンを用いて希釈して、冷０．５％亜硫酸ナトリウム溶液を用いて洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥してエバポレートさせた。この残滓をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、０．２７ｇの１３を得た。３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）：δ−１．２５，−１．０６  ｐｐｍ。
【００６７】
化合物１３からのＤＭＴの除去
１３（０．２７ｇ）を含むジクロロメタン（３ｍｌ）の溶液に２％ＤＣＡを含むジクロロメタン（１０ｍｌ）の溶液を添加した。この反応混合物を室温で２０分間撹拌して、この反応を無水エタノール（０．６ｍｌ）及び乾燥ピリジン（０．９ｍｌ）の添加によってクエンチした。反応混合物をジクロロメタンを用いて希釈して、水を用いて洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥してエバポレートさせた。この残滓をトルエンと共に同時エバポレートして、微量のピリジンを除去して、最終的にこれをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、０．１７ｇの脱トリチル化生成物１４を得た。
【００６８】
第二スペーサーアミダイトのカップリング
１３について記載されたのと同じ方式で、化合物１４（０．１７ｇ，０．２ｍｍｏｌ）をテトラゾール（４２ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）の存在下で、乾燥アセトニトリル（３ｍｌ）に含まれるスペーサーホスホラミダイト（０．１２５ｇ，０．２ｍｍｏｌ）とカップリングさせて、この上で０．０５Ｎヨウ素溶液を用いた酸化によって酸化生成物１５（０．１８ｇ）を得た。ＤＣＡ溶液での脱トリチル化及びシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製によって０．１２ｇの化合物１６を得た。
【００６９】
化合物１６と二官能性のアミダイト１０とのカップリング
上記と同じ方式で、４５ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）の化合物１７及び１８ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）の二官能性試薬を、テトラゾール（８．４ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）の存在下で、乾燥アセトニトリル中において反応させて、酸化の際、生成物をカップリングさせて化合物１７を得た。
【００７０】
プロパルギルアミノ−ｄｄＡＴＰと化合物１７との結合
化合物１７（２０ｍｇ）を含むＤＭＳＯ（１ｍｌ）の溶液に、２〜３滴の水を含む三リン酸塩含有ＤＭＳＯ（１．５ｍｌ）の溶液を添加した。この反応混合物を室温で１晩撹拌し、次いで濃縮水酸化アンモニウム（８ｍｌ）で処理した。４時間後、小容積までエバポレートさせて、水で希釈して、０．１Ｍ  ＴＥＡＢ＋４０％アセトニトリルから１．０Ｍ  ＴＥＡＢ＋４０％アセトニトリルの勾配を用いて１時間、イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
【００７１】
実施例５：ＦＡＭ−Ｔ６−ｄｄＵＴＰの合成
市販のＦＡＭ−ＣＰＧを用いて３′−フルオレセイン修飾ＴＴＴＴＴＴオリゴヌクレオチドを合成した。後者を二官能性アミダイト１０との反応によってさらに伸長した。次いでＮＨＳエステルをプロパルギルアミノジデオキシウリジン三リン酸と反応させて、標識したＯＴＮＴＰを得た。結合後、このオリゴを、濃水酸化アンモニウムを用いた処理によって固体支持体から脱ブロックして、イオン交換によって、それに続く逆相カラムクロマトグラフィーによって精製した。
【００７２】
実施例６：ＦＡＭ−ＬｐＬｐＬｐＬｐＬｐＬｐＬｐＴ＊−リンカー−ｄｄＵＴＰの合成（Ｌｐはデオキシリボース−３′ホスフェート）
市販のＦＡＭ支持体を、無塩基糖メチルホスホラミダイトを用いてＤＮＡシンセサイザー上で伸長した。オリゴをさらに、Ｔ＊と呼ばれる修飾Ｔアミダイトを用いて支持体上で伸長させたが、これはアクセプター色素に結合するために使用し得る塩基の保護アミノ官能化基を含む。オリゴはさらにアミダイト１０を用いて伸長され、次いでアミノプロパルギルｄｄＵＴＰと反応させた。支持体からの切断及び脱保護後、ＯＴＮＴＰを配列決定に用いた。エネルギー移動ＯＴＮＴＰを作成するために、Ｔ＊のアミノ基を図６に示されるように、官能化アクセプター色素と反応させてもよい。
【００７３】
実施例７：ＯＴＮＴＰを用いるＭ１３テンプレートの配列決定
ＡＢＩ３７７シーケンサーでの配列決定のためには標準的な配列決定プロトコールを用いた。結果を図７〜１０に示す。全ての場合において、ターミネーターを取り込んで、正確な配列決定情報を得た。
【００７４】
Ｍ１３ｍｐ１８テンプレートＤＮＡ配列を標準的な「−４０」プライマーを用いて生成した。この反応混合物（２０μｌ）は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの各々を２００μＭ及び１０００μＭ  ｄＩＴＰ、約５００ｎＭのＯＴＮＴＰ、２ｐｍｏｌ−４０プライマー、２００ｎｇ  Ｍ１３ｍｐ１８  ＤＮＡを含んだ。２０単位のＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎｎａｓｅ  ＩＩ又は変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．０００８単位のＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ無機ピロホスファターゼ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５，３５ｍＭ  ＫＣｌ及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んだ。
【００７５】
この反応混合物をサーマルサイクラー中で９５℃、３０秒；６０℃、６０秒の２５サイクルでインキュベートさせた。サイクル後、この反応生成物を、標準的な手順を用いてエタノールで沈殿させて、洗浄して、ホルムアミドロード緩衝液に再懸濁させた。この試料をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ  ３７７装置にロードして、結果を標準的なソフトウェア方法を用いて解析した。
【００７６】
他の同様のヌクレオシド三リン酸、検出可能標識（色素、エネルギー移動色素など）を、正常な又は修飾オリゴヌクレオチドなどの構造に結合させて、配列決定又は他の遺伝子解析反応に用い得るということが上の実施例を用いて明らかになる。
【００７７】
本明細書に言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が関与する当業者のレベルの指標である。本開示に引用される全ての参考文献は、各々の参考文献が個々にその全体が参考として援用されているのと同じ程度まで参考として援用される。
【００７８】
当業者は、本発明が目的を実行して、言及された目的及び利点、並びに本明細書に固有の目的及び利点を得るのに十分適合されているということを容易に理解する。本明細書に記載されるヌクレオチド、色素、代替物及び標的物質は、好ましい実施形態の現在の代表として、例示的であって、本発明の範囲を限定するとして解釈されない。本明細書における変化及び他の用途は、当業者に明白であり、これは本発明の趣旨に包含され、特許請求の範囲に規定される。
【００７９】
種々の代替物及び改変が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく本明細書に開示される本発明になし得ることは当業者には明らかである。例えば、本発明のＯＴＮＴＰは、種々の修飾ヌクレオシドリン酸塩（一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩など）、モノマー又はオリゴマー、種々の色素部分、リンカー、結合基、及び反応性基を組込んでもよく、種々の異なる標的物質に結合し得るということは、当業者に容易に認識される。従って、このような追加の実施形態は、本発明の範囲及び添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【００８０】
さらに、本発明の特徴又は局面は、マーカッシュ形式又は他の分類の代替物として記載されており、当業者は、本発明がマーカッシュ形式又は他の分類の任意の個々のメンバー又はサブグループのメンバーとして記載されるということを認識する。従って、追加の実施形態が本発明の範囲内及び添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】好ましいＯＴＮＴＰの構造。
【図２】ＯＴＮＴＰを作成するためのヌクレオシドアミダイトの合成。
【図３】二機能性リンカーアミダイトの合成。
【図４】取込み後の直接検出のための蛍光標識したＯＴＮＴＰの合成。
【図５】オリゴヌクレオチドタグとしてのＴ６配列を有するフルオレセイン標識したＯＴＮＴＰの合成。
【図６】エネルギー移動オリゴヌクレオチドタグ化ジデオキシヌクレオシド−５′−トリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）の合成。
【図７】ＦＡＭ−リンカー−ｄｄＵＴＰ（ここではＦＡＭはカルボキシ−フルオレセイン）を用いるＭ１３（Ｍ１３ｍｐ１８（＋））テンプレートの配列決定からの配列データ。
【図８】化合物１９（図４参照）ＦＡＭ−ＬｐＬｐ−リンカー−ｄｄＡＴＰ（ここでＬｐはデオキシリボース−３′−ホスフェート）を用いるＭ１３テンプレートの配列決定からの配列データ。
【図９】ＦＡＭ−（Ｔ）６−ｄｄＵＴＰを用いるＭ１３テンプレートの配列決定からの配列データ。
【図１０】ＦＡＭ−ＬｐＬｐＬｐＬｐＬｐＬｐＬｐＴ＊−リンカー−ｄｄＵＴＰを用いるＭ１３テンプレートの配列決定からの配列データ；Ｌｐは実施例において規定される通り。
【図１】
2005536211.tif 000008
【図２】
2005536211.tif 000009
【図３】
2005536211.tif 000010
【図４】
2005536211.tif 000011
【図５】
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【図６】
2005536211.tif 000013
【図７】
2005536211.tif 000014
【図８】
2005536211.tif 000015
【図９】
2005536211.tif 000016
【図１０】
2005536211.tif 000017
【国際調査報告】
2005536211.tif 000018
2005536211.tif 000019