(57)【要約】  本発明では、サルコイドーシス患者の診断情報および予後情報を提供するバイオマーカーとして使用し得る遺伝子およびその遺伝子の発現産物であるｍＲＮＡとポリペプチドを同定する。これらのバイオマーカーはサルコイドーシスの重篤度および進行度のモニター、および当該疾患の処置に有用な薬物の同定に使用することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、
（ａ）該対象から生体サンプルを採取すること、
（ｂ）当該サンプル中の遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出すること、
（ｃ）該遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２が当該生体サンプル中に有意のレベルで発現されているかを判定し、その場合に、当該遺伝子の有意なレベルでの発現がなければＩ型サルコイドーシスであると同定し、当該遺伝子の有意なレベルでの発現があればＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスであると同定する、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、
（ａ）該対象から生体サンプルを採取すること、
（ｂ）当該サンプル中の遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２に対応するポリペプチド産物の発現レベルを検出すること、
（ｃ）該遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２に対応するポリペプチド産物が当該生体サンプル中に有意のレベルで発現されているかを判定し、その場合に、当該遺伝子の有意なレベルでの発現がなければＩ型サルコイドーシスであると同定し、当該遺伝子の有意なレベルでの発現があればＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスであると同定する、
ことを特徴とする方法。
【請求項３】
生体サンプルが、組織生検、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、のう胞液、尿、ＣＳＦ、喀痰、または気管支吸引物からなる群より選択される請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
生体サンプルが、組織生検細胞サンプルまたはその培養細胞である請求項３記載の方法。
【請求項５】
サンプルが当該細胞サンプルの溶解液である請求項４記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドの存在を該ポリペプチドと特異的に結合する試薬により検出する請求項２記載の方法。
【請求項７】
試薬が、抗体、抗体誘導体、および抗体フラグメントからなる群より選択される請求項６記載の方法。
【請求項８】
患者のサルコイドーシスがＩ型であるかまたはＩＩ＆ＩＩＩ型であるかの判定に使用するテストキットであって、該生体サンプルとの接触に適した容器中に請求項６または７記載の試薬を含んでなるテストキット。
【請求項９】
試薬が抗体を含んでなり、その場合に該抗体が請求項２記載の遺伝子発現産物に対応するポリペプチドと特異的に結合するものである請求項８記載のテストキット。
【請求項１０】
遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２がコードするポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項２記載の方法。
【請求項１１】
標識化プローブが抗体である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ｍＲＮＡの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ、実時間定量ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護およびミクロアレイからなる群より選択される技法により検出する請求項１記載の方法。
【請求項１４】
サルコイドーシスを有する対象またはサルコイドーシスの発症する危険のある対象の作用物質による処置の有効性をモニターする方法であって、
（ａ）該作用物質の投与前に対象から投与前サンプルを採取すること、
（ｂ）表２、３、４または５に記載した遺伝子からなる群より選択される遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出すること、
（ｃ）対象から１種以上の投与後サンプルを採取すること、
（ｄ）投与後サンプル中の少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出すること、
（ｅ）投与前サンプル中の少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルと投与後サンプル中の少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルとを比較すること、および
（ｆ）それに応じて作用物質の投与を調節すること、
を特徴とする方法。
【請求項１５】
サルコイドーシスを有する対象またはサルコイドーシスの発症する危険のある対象の作用物質による処置の有効性をモニターする方法であって、
（ａ）該作用物質の投与前に対象から投与前サンプルを採取すること、
（ｂ）表２または４に記載した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出すること、
（ｃ）対象から１種以上の投与後サンプルを採取すること、
（ｄ）投与後サンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出すること、
（ｅ）投与前サンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルと投与後サンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルとを比較すること、および
（ｆ）それに応じて作用物質の投与を調節すること、
を特徴とする方法。
【請求項１６】
サルコイドーシスの処置に使用する作用物質の同定方法であって、
（ａ）サルコイドーシスの疑いのある対象から採取した生体サンプルを候補作用物質と接触させること、
（ｂ）該サンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出すること、その場合の遺伝子が表２、３、４または５に記載した遺伝子からなる群より選択される遺伝子であること、
（ｃ）候補作用物質存在下のサンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルと、候補作用物質不存在下のサンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルとを比較し、その場合に、候補作用物質不存在下のサンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルに比例して、候補作用物質存在下のサンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルが変化し、それがサルコイドーシスの処置に有用な作用物質を示唆するものであること、
を特徴とする方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
標識化プローブが抗体である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
作用物質が小型分子からなる群から選択される請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
サルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該対象から採取した生体サンプル中の表４に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
（ｂ）未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表４に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
（ｃ）第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。
【請求項２２】
生体サンプルが、組織生検、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、のう胞液、尿、ＣＳＦ、喀痰、または気管支吸引物からなる群より選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
工程（ａ）および（ｂ）におけるｍＲＮＡの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ、実時間定量ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護およびミクロアレイからなる群より選択される技法により検出する請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
サルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該対象から採取した生体サンプル中の表４に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
（ｂ）未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表４に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
（ｃ）第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。
【請求項２５】
生体サンプルが、組織生検、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、のう胞液、尿、ＣＳＦ、喀痰、または気管支吸引物からなる群より選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
工程（ａ）および（ｂ）におけるポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
プローブが抗体である請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
抗体がモノクローナル抗体である請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
サルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該対象から採取した生体サンプル中の表５に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
（ｂ）未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表５に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
（ｃ）第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。
【請求項３０】
工程（ａ）および（ｂ）におけるｍＲＮＡの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ、および実時間定量ＰＣＲからなる群より選択される技法により検出する請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
サルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該対象から採取した生体サンプル中の表５に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
（ｂ）未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表５に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
（ｃ）第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。
【請求項３２】
工程（ａ）および（ｂ）におけるポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
プローブが抗体である請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
抗体がモノクローナル抗体である請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、
（ａ）該対象から採取した生体サンプル中の表２に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
（ｂ）未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表２に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
（ｃ）第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。
【請求項３６】
工程（ａ）および（ｂ）におけるｍＲＮＡの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ、および実時間定量ＰＣＲからなる群より選択される技法により検出する請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、
（ａ）該対象から採取した生体サンプル中の表２に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
（ｂ）未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表２に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
（ｃ）第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。
【請求項３８】
工程（ａ）および（ｂ）におけるポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
プローブが抗体である請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
抗体がモノクローナル抗体である請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、
（ａ）該対象から採取した生体サンプル中の表３に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
（ｂ）未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表３に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
（ｃ）第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。
【請求項４２】
工程（ａ）および（ｂ）におけるｍＲＮＡの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ、および実時間定量ＰＣＲからなる群より選択される技法により検出する請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、
（ａ）該対象から採取した生体サンプル中の表３に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
（ｂ）未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表３に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
（ｃ）第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。
【請求項４４】
工程（ａ）および（ｂ）におけるポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
プローブが抗体である請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
抗体がモノクローナル抗体である請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
サルコイドーシスの処置方法であって、かかる処置の必要な対象に、表１、２、３または４に示した遺伝子の１種以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調節する化合物を投与し、サルコイドーシスの少なくとも１つの症候を改善することを特徴とする方法。
【請求項４８】
化合物が、アンチセンス分子、二本鎖ＲＮＡ、リボザイム、小型分子化合物、抗体または抗体フラグメントからなる群より選択される請求項２０記載の方法。
【請求項４９】
サルコイドーシスに罹患しているかまたは罹患する危険のある対象のサルコイドーシスの進行状況をモニターする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表２または４に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを経時的に測定することからなり、その場合に、少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルが経時的に上昇しているならば、該対象のサルコイドーシスが進行していることを示唆するものであるとすることを特徴とする方法。
【請求項５０】
サルコイドーシスに罹患しているかまたは罹患する危険のある対象のサルコイドーシスの進行状況をモニターする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表２または４に示した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを経時的に測定することからなり、その場合に、少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルが経時的に上昇しているならば、該対象のサルコイドーシスが進行していることを示唆するものであるとすることを特徴とする方法。
【請求項５１】
ｍＲＮＡの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ、実時間定量ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイおよびミクロアレイからなる群より選択される技法により検出する請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも一つの遺伝子が、ヒトＮＦ−カッパ−Ｂ転写因子ｐ６５サブユニット（ＮＦＫＢ）、ヒトサイクリックＡＭＰ−応答要素モジュレーターｍＲＮＡ（ＣＲＥＭ）、ヒトサイクリックＡＭＰ−応答要素モジュレーター・ベータイソタイプＳ６８１３４（ＣＲＥＭ、ベータイソタイプ）、ヒトＣＤ６９遺伝子（ＣＤ６９）からなる群より選択される請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
少なくとも一つの遺伝子が、ヒトＴ−細胞レセプター・アルファ鎖Ｃ領域およびヒトインターロイキン−１０レセプターｍＲＮＡからなる群より選択される請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
サルコイドーシスに罹患しているかまたは罹患した疑いのある患者の処置方法であって：１）該患者から採取した生体サンプル中の表２または表３に示した遺伝子から選択される１種以上の遺伝子の遺伝子発現に対応するｍＲＮＡの発現レベルまたは該遺伝子がコードするポリペプチドもしくはタンパク質のレベルを定量すること；２）このレベルまたはレベルのパターンと、正常対照者または既知タイプの疾患患者のレベルとを比較すること；および３）その結果、該患者のレベルまたはレベルのパターンがＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスであるとされた患者を免疫抑制療法により処置すること；を特徴とする方法。
【請求項５５】
遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２（ヒトＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲ２−Ｄｗ１２ｍＲＮＡ ＤＱｗ１−ベータ；ジェンバンク寄託番号Ｍ１６２７６）である請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
免疫抑制療法が、コルチコステロイド、シクロスポリン、メトトレキセート、アザチオプリン、クロランブシル、またはシクロホスファミドからなる群より選択される請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
免疫抑制療法が、シクロスポリンにより、１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の投与量で処置することからなる請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
免疫抑制療法が、シクロスポリンにより、２〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の投与量で処置することからなる請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
免疫抑制療法が、シクロスポリンにより、３〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の投与量で処置することからなる請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出するための手段を含有してなるサルコイドーシス患者同定用キット。
【請求項６１】
表２、３、４または５に示された少なくとも一つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出するための手段を含有してなるサルコイドーシス患者同定用キット。
【請求項６２】
サルコイドーシス患者がＩ型であるかまたはＩＩ＆ＩＩＩ型であるかを同定するためのキットであって、表２または３に示された少なくとも一つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出するための手段を含有してなるキット。
【請求項６３】
ｍＲＮＡの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ、実時間定量ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護およびミクロアレイからなる群より選択される技法により検出する請求項６０ないし６２記載の方法。
【請求項６４】
遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２がコードするポリペプチドの発現レベルを検出するための手段を含有してなるサルコイドーシス患者同定用キット。
【請求項６５】
表２、３、４または５に示された少なくとも一つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出するための手段を含有してなるサルコイドーシス患者同定用キット。
【請求項６６】
サルコイドーシス患者がＩ型であるかまたはＩＩ＆ＩＩＩ型であるかを同定するためのキットであって、表２または３に示された少なくとも一つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出するための手段を含有してなるキット。
【請求項６７】
ポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項６４または６６記載のキット。
【請求項６８】
標識化プローブが抗体である請求項６７記載のキット。
【請求項６９】
抗体がモノクローナル抗体である請求項６８記載のキット。
【請求項７０】
さらに対象から生体サンプルを採取する手段を含有してなる請求項６０ないし６９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明はサルコイドーシスのモニター法、予後判定法および処置法に関する。より詳しくは、本発明はサルコイドーシスのタイプ、予後および処置の必要性を判定するための、遺伝子発現分析の使用または遺伝子発現産物の測定に関する。
【０００２】
関連技術の記載
サルコイドーシスは原因不明の疾患である。該疾患は１種以上の臓器系において非乾酪化肉芽腫の存在することを特徴とする。最も共通する関連部位は、肺および縦隔と肺門域のリンパ節である。しかしながら、サルコイドーシスは全身性疾患であり、様々な臓器系または組織が原発性または随伴性の臨床的発症および発症率の起源であり得る。サルコイドーシスの臨床経過は非常に多様であり、緩和なまたは無症候でさえある自発消散性の疾患から、慢性進行性で臓器系不全に至る疾患にまで及び、症例の１〜５％が死に至る。参照：Cecil Textbook of Medicine, 21st Edition, Goldman L., Bennett, J.C. Editors, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 2000 (pages 433-436)。
【０００３】
サルコイドーシスは北ヨーロッパ、北アメリカおよび日本で比較的よく起こる。米国の場合、サルコイドーシスは白人よりも黒人に頻度が高く、年齢調整年間発症数はそれぞれ１００,０００人につき１０人および３５.５人と報告されている。サルコイドーシス発症ピークの年齢は２０歳代と３０歳代にあり、男性よりも女性でやや罹患率が高い。
【０００４】
サルコイドーシスの原因は不明である。しかし、情報の実体は、免疫メカニズムが疾患の病因に重要であることを示唆しており、また仮説として、様々な外来因子が、感染性、非感染性を含め、可能のあるサルコイドーシスの原因であるとされている。これらの因子はミコバクテリア、真菌類、スピロヘータ、およびホウイップル病関連因子である。
【０００５】
サルコイドーシスの病原性には、ＴＨ１表現型のＣＤ４リンパ球のオリゴクローナル拡張の始動が、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの産生と共に関与している。ＩＬ−２はさらなるＣＤ４細胞の増殖を引き起こし、それがマクロファージを肉芽腫形成に取り込むサイトカインを生成する。
【０００６】
サルコイドーシスはその多様な臨床上の発現および様々な予測し得ない経過がとりわけ顕著である。この疾患は臓器系に影響を及ぼし、この疾患の臨床的提示と発達病歴は、一定の臓器系においてさえ、非常に多様である。呼吸器系は最も共通して影響を受けやすく、患者の約９０％が胸部ラジオグラフ上、胸腔内の関りを示す。患者では胸腔外の疾患が発症している場合もしていない場合もあるが、いずれも無症状であるか、あるいは臨床像の顕著な構成部分となり得る。共通の影響を受ける肺以外の臓器系は、皮膚、眼、心臓、肝臓、および中枢神経系である。
【０００７】
サルコイドーシスの診断評価は臨床医に幾つかの問題を突きつける。診断は１ケ所以上の罹患臓器系または組織に明瞭な形の非乾酪化肉芽腫を見出すことにより確認し得るが、他の原因の肉芽腫、初期感染性疾患を排除するためにさらに適切な検討を行うことが必要である。診断ではしばしば胸部ラジオグラフを最初に実施する。さらに、コンピュータートモグラフィー（ＣＴ）または核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）が補助手段となり得る。肺または他の組織の組織生検は不定数のリンパ球の縁取りに囲まれた上皮様組織球からなる典型的な非乾酪化肉芽腫を示す。
【０００８】
胸部ラジオグラフは胸腔内サルコイドーシスの段階を判定するために使用される。一般的に使用される方法は肺門のアデノパシーと実質病、例えば、肺浸潤または線維症の有無にしたがって０〜４の病期を割り振ることである。したがって、胸腔内変化には５つのレントゲン像上の段階またはタイプがある（表１参照）。参照：Silzbach, L.E. (1967) Med. Clin. N. Am. 51:483; Hunninghake, G.W. (1999) サルコイドーシス、脈管炎および瀰漫性肺疾患；16:149-173 and Cecil Textbook of Medicine, 21st Edition, Goldman L, Bennett, J.C. Editors, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 2000 (Pages 433-436)。
【０００９】
［表１］
【表１】
2005510251.tif 000002
【００１０】
しかし、すでに検討したように非常に多様なサルコイドーシスの発達病歴を予言し得る簡単な試験法は存在しない。本疾患は自発的に解消するか、または持続性かつ慢性的であり、ステロイドまたは他の強力かつ毒性の高い免疫抑制剤による広範囲の処置を必要とする。この疾患が臨床的に余りに多様であるため、それが治療を始めるべきか、何時始めるべきかを決めることを非常に難しくしている。サルコイドーシス患者の３分の２は自然軽快するが、２０％までが慢性的機能欠損となり、疾患の１〜５％が死に至る。一部患者において、臨床的表徴とラジオグラフの病期分類は一部予後の判定を可能とする。しかしながら、感度のよい予測法と疾患活性度のマーカーがなく、自然軽快の割合が高いことと相俟って、何時処置をし、どのくらいの期間とすべきか、また有意な数の患者の発症可能性を知ることは難しい。
【００１１】
サルコイドーシスの発症に至らしめる環境要因と遺伝子因子の確認には多くの関心が向けられている。肉芽腫形成が抵抗性の細胞内抗原、例えば、ミコバクテリアまたはベリリウムに対する身体の遺伝子応答であると思われる限りにおいて、抗原が原因の可能性もあると思われる。さらに、肺エフェクター細胞上のＨＬＡクラスＩＩ分子の密度が増大することも示されている。参照：Spurzem, J.R., et al. 1989：サルコイドーシス患者の肺胞マクロファージにおけるＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現。Am. Rev. Respir. Dis. 140:89-94; Haslem, P.L. et al. 1990：サルコイドーシスにおける肺胞マクロファージ上でのＨＬＡ−ＤＱ、ＤＰ、ＤＲおよびトランスフェリンレセプターの増大およびアレルギー性肺胞炎と線維化肺胞炎との比較、Chest 97:651-661; およびＴ−細胞レセプター（ＴＣＲ）は最新の抗原刺激の証拠を示す；参照：Du Bois, R.M. et al., 1992：サルコイドーシスの肺に蓄積するＴ−リンパ球はＴ−細胞抗原レセプターの最新の刺激の証拠をもつ；Am. Rev. Rev. Respir. Dis. 145:1205-1211。
【００１２】
多くの感染性および非感染性作用因子がサルコイドーシスの原因として提案されているが、その罹患患者からそれと一致するものは単離されていない。参照：Saboor, S.A., et al. 1992：サルコイドーシスおよび結核におけるポリメラーゼ連鎖反応によるミコバクテリアＤＮＡの検出：Lancet 339:1012-1015；Almenoft, P.L. et al. 1996：サルコイドーシス患者の血液からの抗酸菌Ｌ型の増殖：Thorax 51:530-533; Di Alberti, L., et al. 1997：サルコイド組織におけるヒトヘルペスウイルス８変異体、Lancet 350: 1655-1661；Ishigi, I., et al. 1999：日本人サルコイドーシス患者のリンパ節におけるミコバクテリアおよびプロピオニバクテリアＤＮＡの定量的ＰＣＲ：Lancet 354:120-123。繰返しとなるが、ＨＬＡ−クラスＩＩアレル（対立遺伝子）、とりわけＨＬＡ−ＤＲアレルはサルコイドーシスに感染し易い遺伝子であると主張されている；参照：Kunikane, H., et al., 1987：サルコイドーシスの日本人患者におけるＨＬＡ−ＤＲ抗原の役割；Am. Rev. Respir. Dis. 135:688-691; Shousake, A., E. et al., 1987；ＨＬＡ−ＤＲとサルコイドーシスとの関連：Chest 92:488-490; Martinetti, M., C. et al. 1995：ヨーロッパ２カ国における臨床免疫遺伝学知見の共同調査；Am. J. Respir Crit Care. Med. 152:557-564; Berlin, M., A. et al. 1997：ＨＬＡ−ＤＲはスカンジナビアのサルコイドーシス患者における予後を予告する；Am. J. Respir Crit. Care Med. 156:1601-1605。これらの知見および家族事例の一群についての多くの報告はサルコイドーシス発症における遺伝的背景の重要な役割を強調している。参照：Headings, V.E., et al., 1976：７家族に多発して存在する家族性サルコイドーシス：遺伝性の可能なメカニズム；Ann. N.Y. Acad. Sci. 278:377-385; Harrington, D.W., et al., 1993：家族性サルコイドーシス；９１家族の分析：Sarcoidosis 11:210-243；および人種間の広がりと表現型における差；参照：Luisetti, M., et al., 2000: サルコイドーシスの遺伝的側面；Eur. Respir. J. 16:768-780。
【００１３】
最近、サルコイドーシスの病因について理解には多くの進歩がなされている。マクロファージの蓄積、そしてとりわけＣＤ４陽性Ｔリンパ球が疾患の活性部位に存在し、後に集塊して肉芽腫を形成する。参照：Hunninghake, G.W., and R.G. Crystal, 1981：疾患活性部位での過剰なヘルパーＴ−リンパ球活性により成立する疾病；N. Engl. J. Med. 305:429-434；Hunninghake, G.W., et al. 1981：間質性肺疾患患者の肺実質における炎症性および免疫エフェクター細胞の特性化；Am. Rev. Respir. Dis. 123:407-412。この細胞性拡張に寄与する現在判明しているメカニズムは：（１）ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ランテスおよびＩＬ−８などの強力な走化性因子の影響下に血液からのＣＤ４陽性Ｔリンパ球と単球の活性な移行；参照：J. Immunol. 151(5): 2852-2863; Car, B.D. et al. 1994；特発性肺線維症と肺サルコイドーシス患者の気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−８およびＭＣＰ−１の上昇；Am. J. Respir. Crit Care Med. 149:655-659; Girgis, R., et al. 1995：活性肺サルコイドーシス患者の気管支肺胞洗浄液中のサイトカイン；Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152:71; Lida, K. et al. 1997：肺サルコイドーシス患者におけるＴ細胞サブセットとβケモカインの分析；Thorax 52:431-437; Kodoma, N., et al. 1998：非喫煙間質性肺疾患個体における気管支肺胞洗浄細胞によるランテスの発現；Am. J. Respir. Cell Col. Biol. 18:526-531; Ziegenhagen, M.W., et al. 1998：進行性間質性肺線維症およびサルコイドーシス患者の気管支肺胞洗浄細胞における炎症前サイトカインの発現増加；J. Invest. Med. 46:223-231; および（２）リンパ球の組織中増殖（ＩＬ−２介在）；参照：Hunginghake, G.W et al. 1983：活性肺サルコイドーシスにおける肺Ｔ−細胞によるインターロイキン−２放出の役割；Am. Rev. Respir. Dis. 128:634-638; Pinkston, P. et al. 1983：活性肺サルコイドーシスにおける肺Ｔ−リンパ球によるインターロイキン−２の自発放出；N. Engl. J. Med. 308:793-800; Semenzato, G., et al. 1984 Clin. Exp. Immunol. 57:331-337; Muller-Quernheim, J. et al. 1989：肺サルコイドーシスにおける気管支肺胞洗浄リンパ球によるインターロイキン−２レセプター遺伝子発現；Am. Rev. Respir. Dis. 140:82-88。サルコイドーシスには疾患活性部位にインターロイキン２レセプターを保持する細胞（可能性としてマクロファージ）の証拠がある。参照：Agostini, C., et al. 1987：サルコイドーシスと過敏性間質性肺炎患者からの肺胞マクロファージ：モノクローナル抗体による特性化；J. Clin. Immunol. 7:64-70。
【００１４】
自己制限疾患における炎症と進行性疾患における慢性化と線維化の封じ込めに導く因子は未だ説明されていない。参照：Textbook of Medicine, 21st Edition, Goldman L., Bennett, J.C. Editors, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 2000 (esp. pages 433-436)。
【００１５】
今日まで、サルコイドーシスの研究はＰＣＲを利用する比較的少数の遺伝子の実験に限られていた。しかしながら、現在ではサルコイドーシスにおける抗原のプロセシング／提示および認識、Ｔ−リンパ球とエフェクター細胞の活性化、免疫調節と組織改造作用の重要な領域に光を当てる高処理能力アレイと確認技術を使用することが可能である。サルコイドーシスに対する家族集団についての多くの報告が遺伝的罹病性を強く支持している。参照：Headings, V.E., D. Weston, R.C. Young, and R.L. Hackney, 1976：７家族に多発する家族性サルコイドーシス：可能性のある遺伝メカニズム；Ann. N.Y. Acad. Sci. 278:377-385; Harrington, D.W., et al. 1993：家族性サルコイドーシス：９１家族の分析：Sarcoidosis 11:210-243; および人種間の広がりと表現型における差； Luisetti, M., et al., 2000: サルコイドーシスの遺伝的側面；Eur. Respir. J. 16:768-780。
【００１６】
シューマン（Schuman）はＭＨＣ領域に隣接し、それに及ぶ７種の多型についてドイツの５５家族から１２２人の罹患姉妹細胞を遺伝子型分類し、その全領域に有意な多点非要因のつながりを見出した。参照：Schuman, M., et al. 2000：家族性サルコイドーシスは主要組織適合性遺伝子複合体につながりがある；Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162(3 pt 1):861-864。
【００１７】
本発明において、進行型サルコイドーシスとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２遺伝子の発現とのつながりを新たに見出したことは、ＭＨＣ複合体に関る他の研究に、またしたがって、サルコイドーシスにおける抗原提示、罹患性および疾患の結果に関る研究に重みを加える。近年、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、サルコイドーシスの病因において鍵となる細胞であるＣＤ−４陽性Ｔ−リンパ球の外来抗原提示と選択的活性化において重要な役割をもつという観点で最も注目を集めている。日本の研究では、ＨＬＡ−ＤＲ５Ｊ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１／１２）は疾患の非自発性軽快と有意に関連性があった。参照：Shousake, A., et al., 1987：ＨＬＡ−ＤＲとサルコイドーシスとの関連性；Chest 92:488-490; Kunikane, H. et al., 1987：日本人サルコイドーシス患者におけるＨＬＡ−ＤＲの役割；Am. Rev. Respir. Dis. 135:688-691。
【００１８】
イタリア−チェコの研究において、ＨＬＡ−ＤＲ４（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４）はIII型ラジオグラフ病と有意に関連する。参照：Martinetti, M., et al., 1995：“サルコイドーシス・マップ”：ヨーロッパ２カ国における臨床的免疫遺伝学的知見の共同調査；Am. J. Respir Crit Care. Med. 152:557-564。興味深いことに、スカンジナビアでの研究では、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１が、対照群と比較してサルコイド集団に有意に過剰な提示のない一方、慢性疾患とは有意に関連していた；慢性とはその疾患が２年以上活性であったと診断される場合と定義する（６０％に対し対照対象で３０％、ｐ＜０.００１）。参照：Berlin, M., et al., 1997：ＨＬＡ−ＤＲはスカンジナビア人サルコイドーシス患者の予後を予言する；Am. J. Respir Crit. Care Med. 156:1601-1605。このグループはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４０１との同様の関連性も記載している。
【００１９】
このＨＬＡ−ＤＲ分子の重要な役割についての可能なメカニズムは幾つか存在する。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２は誇張されたＴ−細胞活性化と自己永続的炎症カスケードを刺激する非常に効率的な抗原提示分子であり得る。あるいは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２が不適切に抗原を提示し、結果として抗原不寛容となる無効な最初の免疫応答に導き得る、したがって疾患慢性となり得る。この後者の仮説は、抗原不寛容が慢性的免疫応答を維持するために必要であるために最も可能性が高いが、一方で高効率抗原提示は有効な免疫応答と抗原クリアランス／トレランスに導く可能性がある。
【００２０】
サルコイドーシスと関連する予後の不確定性は臨床医にとって深刻な問題であったが、その理由は唯一有効な既知の処置がまったく良好でないからである。これらの処置は、高投与量のコルチコステロイドまたは細胞毒性作用物質、例えば、メトトレキセート、アザチオプリン、クロランブシル、またはシクロホスファミドなど、または他の免疫抑制療法である。これらの作用物質は有意な有害作用、例えば、血液学的および胃腸毒性、催奇形性および発癌性を有する。
【００２１】
したがって、わずかな処置で、あるいは処置なして自然軽快を示すサルコイドーシス患者と、該疾患のより重症の慢性型に進展する患者とを識別し得る方法が強く要望されている。後者のグループでは、関連する臓器へ拡大すること、重症化することを最小とするために、攻撃的な早期の処置が必要とされる。
【００２２】
発明の要約
本発明は、サルコイドーシス患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に発現される複数の遺伝子を同定することにより、該疾患の予測される重症度と慢性度を判定する現在利用可能な方法の欠陥を克服する。これら遺伝子の発現レベルを利用してサルコイドーシスの診断を確認するか、または予後を判定することが可能であり、したがって、サルコイドーシス患者の処置の必要性を判定することができる。これらの遺伝子に対応するｍＲＮＡ転写物およびタンパク質は、例えば、疾患の予後および必要な処置の代替マーカーまたはインジケーターとしての用途を有する。
【００２３】
したがって、本発明の一側面は、サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、該対象から生体サンプルを採取すること、当該サンプル中の遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出すること、および該遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２が当該生体サンプル中に有意のレベルで発現されているかを判定し、その場合に、当該遺伝子の有意なレベルでの発現がなければＩ型サルコイドーシスであると同定し、当該遺伝子の有意なレベルでの発現があればＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスであると同定することを特徴とする方法にある。
【００２４】
本発明のもう一つの側面は、サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、該対象から生体サンプルを採取すること、当該サンプル中の遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２に対応するポリペプチド産物の発現レベルを検出すること、および該遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２に対応するポリペプチド産物が当該生体サンプル中に有意のレベルで発現されているかを判定し、その場合に、当該遺伝子の有意なレベルでの発現がなければＩ型サルコイドーシスであると同定し、当該遺伝子の有意なレベルでの発現があればＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスであると同定することを特徴とする方法にある。
【００２５】
上記方法のいずれにおいても、生体サンプルとして、組織生検、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、のう胞液、尿、ＣＳＦ、喀痰、または気管支吸引物からなる群より選択されるサンプルおよび多様な試薬類を使用することができる。
【００２６】
本発明のもう一つの側面は、患者のサルコイドーシスがＩ型であるかまたはＩＩ＆ＩＩＩ型であるかの判定に使用するテストキットであって、該生体サンプルとの接触に適した容器中に上記の試薬を含んでなるテストキットにある。
【００２７】
もう一つの側面において、本発明はサルコイドーシスを有する対象またはサルコイドーシスの発症する危険のある対象の作用物質による処置の有効性をモニターする方法であって、該作用物質の投与前に対象から投与前サンプルを採取すること、表２、３、４または５に記載した遺伝子からなる群より選択される遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出すること、対象から１種以上の投与後サンプルを採取すること、投与後サンプル中の少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出すること、投与前サンプル中の少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルと投与後サンプル中の少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルとを比較すること、およびそれに応じて作用物質の投与を調節することを特徴とする方法を提供する。
【００２８】
もう一つの側面において、本発明はサルコイドーシスを有する対象またはサルコイドーシスの発症する危険のある対象の作用物質による処置の有効性をモニターする方法であって、該作用物質の投与前に対象から投与前サンプルを採取すること、表２または４に記載した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出すること、対象から１種以上の投与後サンプルを採取すること、投与後サンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出すること、投与前サンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルと投与後サンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルとを比較すること、およびそれに応じて作用物質の投与を調節することを特徴とする方法を提供する。
【００２９】
さらに、本発明はサルコイドーシスの処置に使用する作用物質の同定方法であって、サルコイドーシスの疑いのある対象から採取した生体サンプルを候補作用物質と接触させること、該サンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出すること、その場合の遺伝子が表２、３、４または５に記載した遺伝子からなる群より選択される遺伝子であること、候補作用物質存在下のサンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルと、候補作用物質不存在下のサンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルとを比較し、その場合に、候補作用物質不存在下のサンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルに比例して、候補作用物質存在下のサンプル中の少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルが変化し、それがサルコイドーシスの処置に有用な作用物質を示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
【００３０】
さらに、本発明はサルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表４に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表４に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
【００３１】
本発明のもう一つの側面は、サルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表４に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表４に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであることを特徴とする方法にある。
【００３２】
さらに、本発明はサルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表５に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表５に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
【００３３】
本発明のもう一つの側面は、サルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表５に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表５に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
【００３４】
さらに、本発明はサルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表２に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表２に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
【００３５】
さらなる態様において、本発明はサルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表２に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表２に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
【００３６】
さらに、本発明はサルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表３に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表３に示した少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
【００３７】
さらに、本発明はサルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表３に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表３に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
【００３８】
さらなる態様において、本発明はサルコイドーシスの処置方法であって、かかる処置の必要な対象に、表１、２、３または４に示した遺伝子の１種以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調節する化合物を投与し、サルコイドーシスの少なくとも１つの症候を改善することを特徴とする方法を提供する。該化合物は、アンチセンス分子、二本鎖ＲＮＡ、リボザイム、小型分子化合物、抗体または抗体フラグメントからなる群より選択し得る。
【００３９】
さらに、本発明はサルコイドーシスに罹患しているかまたは罹患する危険のある対象のサルコイドーシスの進行状況をモニターする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表２または４に示した少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを経時的に測定することからなり、その場合に、少なくとも１つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルが経時的に上昇しているならば、該対象のサルコイドーシスが進行していることを示唆するものであるとすることを特徴とする方法を提供する。
【００４０】
本発明はまたサルコイドーシスに罹患しているかまたは罹患する危険のある対象のサルコイドーシスの進行状況をモニターする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表２または４に示した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを経時的に測定することからなり、その場合に、少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルが経時的に上昇しているならば、該対象のサルコイドーシスが進行していることを示唆するものであるとすることを特徴とする方法を提供する。
【００４１】
さらなる側面において、本発明はサルコイドーシスに罹患しているかまたは罹患した疑いのある患者の処置方法であって、該患者から採取した生体サンプル中の表２または表３に示した遺伝子から選択される１種以上の遺伝子の遺伝子発現に対応するｍＲＮＡの発現レベルまたは該遺伝子がコードするポリペプチドもしくはタンパク質のレベルを定量すること；このレベルまたはレベルのパターンと、正常対照者または既知タイプの疾患患者のレベルとを比較すること；およびその結果、該患者のレベルまたはレベルのパターンがＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスであるとされた患者を免疫抑制療法により処置することを特徴とする方法を提供する。
【００４２】
発明の詳細な記載
本発明はサルコイドーシス患者において個別的に発現される遺伝子の対照群と比較しての同定、およびＩ型サルコイドーシス患者において個別的に発現される遺伝子のＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシス患者と比較しての同定に関する。
【００４３】
本出願に開示された特定の遺伝子はすべて、特にＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２としての遺伝子および表２、３、４、および５の遺伝子は、本発明の意味する範囲内で、自然界に存在するその多型変異体を含む。表２、３、４、および５に具体的に開示した遺伝子は好適な態様の代表である。
【００４４】
本明細書にて使用する場合、“疾患の型”という用語は、サルコイドーシス患者との関連で使用するとき、これらの用語について下に定義するように、該疾患が“Ｉ型”と分類するかまたは“ＩＩ＆ＩＩＩ型”と分類するかを意味するものとする。
【００４５】
本明細書にて使用する場合、“Ｉ型”サルコイドーシスとはサルコイドーシスの症候を示す患者の胸部ラジオグラフがシルズバッハ（Silzbach）の分類にしたがい０または１の病期とされた患者をいう；また、本明細書にて使用する場合、“ＩＩ＆ＩＩＩ型”サルコイドーシスとはサルコイドーシスの症候を示す患者の胸部ラジオグラフがシルズバッハの分類にしたがいＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの病期とされた患者をいう。参照：Silzbach, L.E. (1967) Med. Clin. N. Am. 51:483；Hunninghake, G.W. (1999)：サルコイドーシス、脈管炎および彌慢性肺疾患；16:149-173 and Cecil Textbook of Medicine, 21st Edition, Goldman L., Bennett, J.C. Editors, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 2000 (esp. pages 433-436)。
【００４６】
表２および３に示した遺伝子、すなわち、ヒトＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲ２−Ｄｗ１２ｍＲＮＡ ＤＱｗ１−ベータ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２）、ヒトＮＦ−カッパ−Ｂ転写因子ｐ６５サブユニット（ＮＦＫＢ）、ヒトサイクリックＡＭＰ−応答要素モジュレーターｍＲＮＡ（ＣＲＥＭ）、ヒトＣＤ６９遺伝子（ＣＤ６９）、ヒトＴ−細胞レセプターアルファ鎖Ｃ領域（ＴＲＡ＠）およびヒトインターロイキン１０レセプターｍＲＮＡ−（ＩＬ１０ＲＡ）などの遺伝子の発現度合い間に、また病型、すなわち、Ｉ型またはＩＩ＆ＩＩＩ型の間に、したがって、サルコイドーシス患者の予後と処置の必要性の間に、統計的に有意な高い相関が見出された。
【００４７】
ＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスの患者はＩ型サルコイドーシス患者よりも予後が悪く、また非常に慢性疾患に進行し易い。さらに、Ｉ型サルコイドーシス患者では、通常、疾患が自己制限的であり、処置を必要としない。対して、ＩＩ＆ＩＩＩ型病患者では、該疾患の有害な長期作用を最少化するために、免疫抑制剤での早期の介入を要求するのが適当である。
【００４８】
したがって、これら遺伝子の発現度とその発現産物のレベルは、サルコイドーシスの患者またはその危険のある患者の管理、予後予測および処置に使用することができる。これらの遺伝子を表２および３に具体的に示す。これら遺伝子の完全な配列は、表２および３に示したユニジーンクラスター（Unigene Cluster）発現番号とジェンバンク寄託番号により利用可能である。
【００４９】
ポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現の異常に低下または上昇したレベルの検出は、本発明疾患対象の罹病性の診断または判定にも使用することが可能である。ｍＲＮＡの発現レベルを検出する方法は技術上周知である。発現の低下または上昇は、ポリヌクレオチド定量の技術的に既知の方法のいずれか、例えば、核酸増幅法、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、実時間定量ＰＣＲ、ＲＮアーゼ、ノーザンブロット法および他のハイブリッド形成法などによりＲＮＡレベルで測定し得る。
【００５０】
開示した遺伝子の１種以上から得られるｍＲＮＡ転写物のレベルを検出する特に有用な方法は、オリゴヌクレオチドの定序配列に標識化ｍＲＮＡをハイブリッド形成させることである。かかる方法では遺伝子発現のプロフィールまたはパターンを生成させるために、これら複数の遺伝子の転写レベルを同時に決定することを可能とする。対象から採取したサンプル由来の遺伝子発現プロフィールは、もう一つの態様において、未罹患対象から採取したサンプル由来の遺伝子発現プロフィールと比較することが可能であり、それによって対象がサルコイドーシスに罹患しているか、またはその危険状態にあるかを判定することができる。
【００５１】
したがって、本発明は異なるタイプのサルコイドーシス患者に別々に発現される複数の遺伝子を提供する。これら遺伝子のいずれか、少なくとも一つを選択し、該疾患のタイプと予後の判定に、バイオマーカーとして利用することができる。ある有用な態様においては、これら複数の遺伝子を選択し、そのｍＲＮＡ発現を同時にモニターして種々の局面で有用な発現プロフィールを提供することができる。特に好適な態様において、遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２（ヒトＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲ２−Ｄｗ１２ｍＲＮＡ ＤＱｗ１−ベータ；ジェンバンク寄託番号Ｍ１６２７６）を測定し、サルコイドーシスのタイプと予後の判定に、バイオマーカーとして使用することができる。もう一つの好適な態様において、遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２のタンパク発現産物のレベルを、サルコイドーシス患者からの生体サンプルにて測定し、このレベルを該疾患のタイプと予後の判定に、バイオマーカーとして使用する。
【００５２】
さらに、正常対照と比較して、サルコイドーシス患者での遺伝子発現のレベル間には統計的に有意な相関が見出されている。すべてのタイプのサルコイドーシス患者で発現レベルの上昇する遺伝子を、対照と比較して、表４に示す。対照に比較してすべてのタイプのサルコイドーシス患者で発現レベルの低下する遺伝子を表５に示す。これら遺伝子の完全な配列は、表４および５に示したユニジーンクラスター（Unigene Cluster）発現番号とジェンバンク寄託番号により利用可能である。
【００５３】
したがって、もう一つの態様において、本発明は遺伝子の発現レベルが、特にサルコイドーシス患者で、正常個体におけるよりも有意に高いかまたは低い複数の遺伝子を提供する。これら遺伝子のいずれか、少なくとも一つを選択し、サルコイドーシスの診断バイオマーカーとして利用することができる。さらに、該疾患過程に関係するこれら遺伝子の発現の差を使用して、該疾患を処置し得る作用物質を同定することが可能であり、また該疾患の範囲または進行をモニターするために使用することができる。ある有用な態様においては、これら複数の遺伝子を選択し、そのｍＲＮＡ発現（またはポリペプチド発現産物）を同時にモニターして種々の局面で有用な発現プロフィールを提供することができる。
【００５４】
本発明のさらなる態様において、遺伝子発現産物（タンパク質またはポリペプチド）はサルコイドーシスに罹患したまたはその疑いのある患者からの生体サンプルおよび正常対照者からのサンプル中でモニターすることができる。
【００５５】
本明細書にて使用する場合、“生体サンプル”という用語は組織、細胞もしくは生物学的液体のサンプルまたはその単離物であって、試験対象者から取り出せるもの、ならびに対象内の組織、細胞もしくは生物学的液体のサンプルまたはその単離物を意味する。これらは限定されるものではないが、あらゆる種類の生検サンプル、かかるサンプルの無細胞溶解物および体液、例えば、限定されるものではないが、血液、血漿、血清、リンパ液、ＣＳＦ、のう胞液、腹水、尿、糞便および胆汁などである。宿主由来のサンプル中のタンパク質、例えば、本発明のポリペプチドのレベルを決めるために使用し得るアッセイ技法は当業者周知である。かかるアッセイ法とは、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ法などである。
【００５６】
本明細書にて使用する場合、“類似の生体サンプル”という用語は一人の患者のサンプルであって、別の患者のサンプルと同じ全身起源または部位からのサンプルを意味する。例えば、両者のサンプルが同じ臓器または身体領域からの血液、血清、血漿または生検サンプルである。
【００５７】
この発現産物のレベルは遺伝子発現の程度を示すために使用することが可能であり、したがって、サルコイドーシスの予後を判定するための、または対象の疾患のタイプと応答性および免疫抑制処置の必要性を判定するための簡単かつ簡便な試験法を提供する。さらに、これら発現産物のレベルは当該疾患の処置に有効たり得る薬物の同定に使用可能であり、また個々の患者の疾患の重症度または進行度をモニターするためにも使用し得る。
【００５８】
さらに、これら遺伝子の一つまたは複数の発現プロフィールは、サルコイドーシスの経過と予後における多様性を分子レベルで試験するための価値ある分子的手段、またサルコイドーシスを処置する薬物の有効性を評価するための分子的手段を提供する。細胞を種々変化させた条件にさらすこと、例えば、薬物または他の活性分子と接触させることの間に、発現プロフィールがベースラインのプロフィールからどのくらい変化するかは、このような効果の指標として使用することができる。
【００５９】
したがって、本発明は異なる臨床型のサルコイドーシスにおいて、また正常対照者と比較した該疾患患者において別々に発現する遺伝子の同定法を提供する。これら遺伝子の差別的発現手段によって、これらの遺伝子および／またはその発現産物を利用して、診断の確度を上げること、該疾患の重症度または進行度をモニターすること、または特定患者の予後を判定すること、またその患者が免疫抑制療法もしくは他の療法を必要としているかどうかを判定すること、およびサルコイドーシスに対する有用な新規処置法を同定することが可能である。これらの遺伝子を表２、３、４、および５に掲載する。開示した遺伝子の発現レベルは、遺伝子の発現に対応するｍＲＮＡまたは該遺伝子がコードするポリペプチドもしくはタンパク質を測定することにより検出することができる。該ポリペプチドは何らかの生体サンプル、例えば、生検標本において、または簡便な体液、例えば、限定されるものではないが、血液、血漿、血清、リンパ液、ＣＳＦ、のう胞液、腹水、尿、糞便および胆汁などで測定し得る。
【００６０】
したがって、本発明はサルコイドーシスを有する対象をスクリーニングする方法であって、該対象の疾患が自然軽快するか、または慢性となって攻撃的な処置、例えば、これに限定されるものではないが、免疫抑制療法、例えば、高用量のコルチコステロイドまたは細胞毒剤（メトトレキセート、シクロスポリン、アザチオプリン、クロランブシル、またはシクロホスファミドなど）による処置などを必要とするか、その可能性を判定する方法を提供する。
【００６１】
さらに、本発明はサルコイドーシスに罹患しているか、またはその疑いのある患者の処置方法を提供する。この方法は：１）該患者から採取した生体サンプル中の本明細書に開示した遺伝子の１種以上の遺伝子発現に対応するｍＲＮＡの発現レベルまたは該遺伝子がコードするポリペプチドもしくはタンパク質のレベルを定量すること；２）このレベルまたはレベルのパターンと、正常対照者または既知タイプの疾患患者のレベルとを比較すること；および３）その結果、該患者のレベルまたはレベルのパターンがＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスであるとされた患者を免疫抑制療法により処置すること；を特徴とする方法である。好適な態様において、本発明はサルコイドーシスに罹患しているか、またはその疑いのある患者からの生体サンプル中に、遺伝子ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２（ヒトＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲ２−Ｄｗ１２ｍＲＮＡ ＤＱｗ１−ベータ；ジェンバンク寄託番号Ｍ１６２７６）のｍＲＮＡまたはタンパク質発現産物のレベルを測定すること、２）このレベルまたはレベルのパターンと、正常対照者または既知タイプの疾患患者のレベルとを比較すること；および３）該患者のレベルまたはレベルのパターンがＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシスであるとされた患者を免疫抑制療法により処置することからなる。この免疫療法は限定されるものではないが、高用量のコルチコステロイドまたは細胞毒剤、例えば、シクロスポリン、メトトレキセート、アザチオプリン、クロランブシル、もしくはシクロホスファミド、または他の免疫抑制療法による処置である。好適な態様において、この処置はシクロスポリンにより、１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量で、より好ましくは２〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、最も好ましくは３〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量で処置することからなる。
【００６２】
さらに、本発明は純粋に臨床的根拠に基づいてなされた診断を確認するために、対象をスクリーニングしてサルコイドーシスのバイオマーカーが存在するか否かを判断する方法を提供する。本発明はまた個々人における該疾患の重症度または進行度をモニターする方法およびサルコイドーシスの新規有用な処置の確認法を提供する。
【００６３】
【表２】
2005510251.tif 000003
【００６４】
【表３】
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【００６５】
【表４】
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【００６６】
【表５】
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【００６７】
［転写状態測定］
転写状態の測定は、好ましくは、転写物アレイへのハイブリッド形成により実施するが、これについてはこのサブセクションに記載する。一部他の転写状態測定法についてはこのサブセクションの後半に記載する。
【００６８】
転写物アレイ一般
好適な態様において、本発明では“転写物アレイ”（本明細書では“マイクロアレイ”とも呼ぶ）を使用する。転写物アレイは細胞の転写状態の解析に、また癌または他の疾患細胞の転写状態の測定に採用することができる。
【００６９】
一態様において、転写物アレイは細胞中に存在するｍＲＮＡ転写物を提示する検出可能に標識したポリヌクレオチド（例えば、全細胞ｍＲＮＡから合成される蛍光標識ｃＤＮＡ）をマイクロアレイにハイブリッド形成させることにより製造する。マイクロアレイは細胞または生体のゲノム中の遺伝子の多く、好ましくは遺伝子のほとんどまたはほとんどすべての産物の結合（例えば、ハイブリダイゼーション）部位の規則的な配列の面である。マイクロアレイは多くの方法で調製し得るが、その幾つかについて以下に記載する。どのように調製した場合にも、マイクロアレイはある特性を共有する：配列は再現性があり、調製すべき所定の配列の多数コピーが可能であり、互いに容易に比較し得るものとする。好ましくは、マイクロアレイは小型で、通常、５ｃｍ２未満であり、結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）条件下に安定な材料から造る。マイクロアレイの所定の結合部位または結合部位のユニークセットは、細胞中の単一遺伝子の産物に特異的に結合する。そこには特異的ｍＲＮＡあたり１つ以上の結合部位（以下、“部位”）が存在するが、明確にするために、以下の考察では単一の部位が存在すると仮定する。具体的態様において、各位置に既知配列の付着核酸を含むその位置を追跡し得るアレイを使用する。
【００７０】
認識すべきは、細胞のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを造り、それを適切なハイブリダイゼーション条件下にマイクロアレイにハイブリッド形成させる場合、特定の遺伝子に対応する配列において当該部位にハイブリッド形成するレベルは、当該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの細胞における優先性を反映していることである。例えば、検出可能に標識化（例えば、発蛍光団により）した全細胞ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡをマイクロアレイにハイブリッド形成させるとき、該細胞中で転写されていない遺伝子（すなわち、遺伝子産物に特異的に結合し得る）に対応する配列上の部位は、ほとんどまたはまったくシグナル（例えば、蛍光シグナル）を発せず、エンコードされたｍＲＮＡが優勢である遺伝子では比較的強いシグナルを発する。
【００７１】
マイクロアレイの調製
マイクロアレイは技術的に既知であり、配列が遺伝子産物（例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ポリペプチド、およびそのフラグメント）に対応するプローブが、既知の位置で特異的にハイブリッド形成するか、または結合することの可能な表面から構成される。一態様において、マイクロアレイは遺伝子がコードする産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）に対し個別的な結合部位を各位置で提示する配列（すなわち、マトリックス）であり、その結合部位が生体のゲノムにおける遺伝子のほとんどまたはほとんどすべての産物に対して存在する配列である。好適な態様において、“結合部位”（以下“部位”）は核酸または核酸類似体であり、それに対して特定の同族ｃＤＮＡは特異的にハイブリッド形成することができる。結合部位の核酸または類似体は、例えば、合成オリゴマー、全長のｃＤＮＡ，全長未満のｃＤＮＡ、または遺伝子フラグメントであり得る。
【００７２】
好適な態様において、マイクロアレイは標的生体ゲノムのすべてのまたはほとんどすべての遺伝子産物に対して結合部位を有するが、このような包括力は必ずしも必要ではない。通常、マイクロアレイは少なくとも約５０％のゲノム遺伝子、多くの場合少なくとも約７５％、より多くの場合少なくとも約８５％、さらにより多くの場合約９０％以上、そして最も多くの場合少なくとも約９９％に対応する結合部位を有する。好ましくは、該マイクロアレイは対象の生物学的ネットワークモデルのテストおよび確認に関連する遺伝子に対する結合部位をもつ。“遺伝子”は、好ましくは、少なくとも５０、７５、または９９個のアミノ酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として同定されるが、ここからメッセンジャーＲＮＡが生物体（例えば、単一の細胞であるなら）にて、または多細胞生物体のある細胞において転写される。ゲノム中の遺伝子数は生物体により発現されるｍＲＮＡの数から、またはゲノムのよくキャラクタリゼーションされた部位からの外挿法によって推定される。対象生物体のゲノムが配列決定されている場合には、ＤＮＡ配列の解析によりＯＲＦの数を決定し、ｍＲＮＡコード領域を同定することができる。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は完全に配列決定がなされており、９９アミノ酸よりも長い約６２７５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有すると報告されている。これらのＯＲＦの解析ではタンパク質産物を特定すると思われる５８８５のＯＲＦが存在することを示している（Goffeau et al., 1996, ６０００の遺伝子をもつ生命、Science 274:546-567（すべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする）。対照的に、ヒトのゲノムはおおよそ１０５個の遺伝子を含むと予測される。
【００７３】
マイクロアレイ用核酸の調製
上記のように、特定の同族ｃＤＮＡが特異的にハイブリッド形成する“結合部位”は、通常、その結合部位に付着した核酸または核酸類似体である。一態様において、マイクロアレイの結合部位は生物体ゲノム中の各遺伝子の少なくとも一部に対応するＤＮＡポリヌクレオチドである。これらのＤＮＡは、例えば、ゲノムｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ（例えば、ＲＴ−ＰＣＴにより）、またはクローン化配列からの遺伝子セグメントのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により入手し得る。ＰＣＲプライマーは遺伝子またはｃＤＮＡの既知配列に基づき選択し、それがユニークフラグメント（すなわち、マイクロアレイ上の他のいずれのフラグメントとも１０塩基を超えて隣接する同一の配列を共有しないフラグメント）の増幅に至る。コンピュータープログラムは必要とされる特異性と最適増幅性をもつプライマーの設計に有用である。参照：例えば、Origo pl バージョン５.０（ナショナルバイオサイエンス）。非常に長い遺伝子に対応する結合部位の場合、遺伝子の３’末端に近いセグメントを増幅することが場合によっては望ましく、それによってオリゴ−ｄＴ感作ｃＤＮＡがマイクロアレイにハイブリッド形成するとき、完全長未満の長さのプローブが効率的に結合する。典型的に、マイクロアレイ上の各フラグメントは約５０ｂｐと２０００ｂｐの間、より典型的には約１００ｂｐと約１０００ｂｐの間にあり、通常、約３００ｂｐと約８００ｂｐとの間である。ＰＣＲ法は周知であり、例えば、Innis et al. eds., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（ＰＣＲプロトコール：方法と応用の手引き）、Academic Press Inc. San Diego, Calif.（すべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする）に記載がある。コンピューター制御ロボットシステムは核酸を単離・増幅するために有用であることは明らかである。
【００７４】
マイクロアレイ用の核酸を生成させる代替手段は、Ｎ−ホスホネートまたはホスホロアミダイト化学を用いる合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの合成によるものである（Froehier et al., 1986, Nucleic Acid Res 14:5399-5407; McBride et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24:245-248）。合成配列は鎖中の約１５と約５００塩基間に、より典型的には約２０と約５０塩基間にある。一部態様において、合成核酸とは非天然塩基、例えば、イノシンなどである。上記のように、核酸類似体をハイブリダイゼーションの結合部位として使用することができる。適切な核酸類似体はペプチド核酸である（参照：例えば、Egholm et al., 1993, ＰＮＡはワトソン−クリック水素結合規則にしたがい相補性オリゴヌクレオチドにハイブリッド形成する；Nature 365:566-568; 米国特許第５,５３９,０８３号公報も参照）。
【００７５】
代わり得る態様において、結合（ハイブリダイゼーション）部位は遺伝子のプラスミドもしくはファージクローン、ｃＤＮＡ（例えば、発現配列タグ）、またはその挿入物から調製する（Nguyen et al., 1995, 配列したｃＤＮＡクローンの定量的ハイブリダイゼーションにより検定したマウス胸腺内での差別的遺伝子発現；Genomics 29:207-209）。さらに他の態様において、結合部位のポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【００７６】
固体表面に対する核酸の付着
核酸または類似体は固体支持体に付着するが、該支持体はガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、または他の材料から作製し得る。核酸を表面に付着させる好適な方法はガラスプレート上にプリントすることによる（一般的記載例：Schena et al., 1995, 相補性ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現パターンの定量的モニター；Science 270:467-470）。この方法はｃＤＮＡのマイクロアレイの調製に特に有用である。参照例：DeRisi et al., 1996, ヒト癌における遺伝子発現パターンを解析するためのｃＤＮＡマイクロアレイの使用；Nature Genetics 14:457-460; Shalon et al., 1996, 二色蛍光プローブハイブリダイゼーションによる複雑なＤＮＡサンプルの解析用ＤＮＡマイクロアレイシステム；Genome Res. 6:639-645; および Schena et al., 1995, 平行ヒトゲノム解析；１０００遺伝子のマイクロアレイに基づく発現；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10539-11286。上記の文献はそれぞれ、すべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする。
【００７７】
マイクロアレイを作製する第二の好適な方法は、高密度オリゴヌクレオチド配列を作製することによる。面上の定まった位置に原位置合成写真平板技法により、定まった配列に相補的な数千のオリゴヌクレオチドを含むアレイを製造する技法は既知であり（参照：Fodor et al., 1991, 光指向空間的接近平行化学合成；Science 251:767-773; Pease et al., 1994, 迅速ＤＮＡ配列分析用光指向オリゴヌクレオチドアレイ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026; Lockhart et al., 1996, 高密度オリゴヌクレオチド配列に対するハイブリダイゼーションによる発現モニター；Nature Biotech 14:1675; 米国特許第５,５７８,８３２号、第５,５５６,７５２号および第５,５１０,２７０号公報；これらの文献はそれぞれ、すべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする）、また定まったオリゴヌクレオチドの他の迅速合成沈着法も既知である（Blanchard et al., 1996, 高密度オリゴヌクレオチドアレイ；Biosensors & Bioelectronics 11:687-90）。これらの方法を使用する場合、既知配列のオリゴヌクレオチド（例えば、２０マー）は誘導化したガラススライドなどの表面に直接合成する。通常、調製した配列はＲＮＡ１個あたり数個のオリゴヌクレオチド分子と重複している。オリゴヌクレオチドプローブは選択的にスプライスしたｍＲＮＡを検出するために選択することができる。
【００７８】
マイクロアレイの他の作製法、例えば、マスキング法（Maskos and Southern, 1992, Nuc. Acids Res. 20:1679-1684）も使用可能である。原則として、いずれのタイプのアレイも、例えば、ナイロンハイブリダイゼーション膜上のドットブロット（参照：Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 本文献はすべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする）も使用し得るが、当業者が認識しているように、ハイブリダイゼーション容積が小さいために、極小のアレイが好適である。
【００７９】
標識プローブの生成
全長およびポリ（Ａ）＋ＲＮＡの調製法は周知であり、上記の Sambrook et al.上記に一般的な記載がある。一態様において、ＲＮＡは本発明対象の種々の種類の細胞から、チオシアン酸グアニジニウム溶解を用いて抽出し、次いで、ＣｓＣｌ遠心分離に付す（Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294-5299）。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡはオリゴｄＴ−セルロースによる選択により選択する（参照：Sambrook et al., 上記）。対象の細胞は、野生型細胞、薬物接触野生型細胞、修飾／摂動細胞性成分をもつ細胞、および薬物接触細胞である。
【００８０】
標識化ｃＤＮＡはオリゴｄＴ−感作またはランダム感作逆転写から調製するが、両方ともに技術的に周知である（参照：例えば、Klug and Berger, 1987, Methods Enzymol. 152:316-325）。逆転写は検出可能な標識に結合したｄＮＴＰ（最も好ましいのは蛍光標識ｄＮＴＰ）の存在下に実施し得る。別法として、標識したｄＮＴＰの存在下に、単離したｍＲＮＡは二本鎖ｃＤＮＡのインビトロ転写により合成した標識アンチセンスＲＮＡに変換し得る（Lockhart et al., 1996, 高密度オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションによる発現のモニター；Nature Biotech. 14:1675; 本文献はすべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする）。別途態様において、ｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブは検出可能標識の不在下に合成し、次いで、ビオチニル化ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰ、あるいはある種同様の手段（例えば、ビオチンのプソラレン誘導体をＲＮＡに光架橋すること）を取り込ませることにより標識し、さらに標識化ストレプトアビジン（例えば、フィコエリスリン接合ストレプトアビジン）またはその等価物を添加することができる。
【００８１】
蛍光標識プローブを使用する場合、多くの適切な発蛍光団、例えば、フルオレセイン、リサミン、フィコエリスリン、ローダミン（パーキンエルマー・シータス）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３.５、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ（アマシャム）、その他が既知である（参照：例えば、Kricka, 1992, 非同位体ＤＮＡプローブ技法、Academic Press San Diego, Calif.）。発蛍光団の対は両者が容易に識別し得るように別個の発光スペクトルを選ぶのがよい。
【００８２】
もう一つの態様においては、蛍光標識以外の標識を用いる。例えば、放射活性標識、または一対の別個の放射スペクトルを有する放射活性標識を使用することができる（参照：Zhao et al., 1995, 高密度ｃＤＮＡフィルター分析：遺伝子発現の大規模定量分析の新規方法；Gene 156:207; Pietu et al., 1996；高密度ｃＤＮＡアレイの定量的ハイブリダイゼーションにより明らかとなったヒト筋肉に優先的に発現される新規遺伝子転写物；Genome Res. 6:492）。しかしながら、放射活性粒子の散乱があり、その結果広範な空間的結合部位を必要とするために、放射性同位体の使用は余り好ましい態様ではない。
【００８３】
一態様において、標識ｃＤＮＡは０.５ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰプラス０.１ｍＭ−ｄＴＴＰプラス蛍光デオキシリボヌクレオチド（例えば、０.１ｍＭローダミン１１０ＵＴＰ（パーキンエルマー・シータス）または０.１ｍＭ−Ｃy３ｄＵＴＰ（アマシャム）を含む混合物を逆転写酵素（例えば、スーパースクリプトＴＭ.II、ＬＴＩ Inc.）と４２℃で６０分間インキュベートすることにより合成する。
【００８４】
マイクロアレイへのハイブリダイゼーション
核酸のハイブリダイゼーションと洗浄条件は、プローブが特定の配列部位に“特異的に結合する”かまたは“特異的にハイブリッド形成する”ように、すなわち、プローブが相補的核酸配列をもつ配列アレイ部位にハイブリッド形成、二重鎖形成または結合するが、非相補的核酸配列をもつ部位にはハイブリッド形成しないように選択する。本明細書にて使用する場合、一つのポリヌクレオチド配列は、もしそのポリヌクレオチドの短い方が２５塩基以下であるならば塩基対合規則を用いることにミスマッチはなく、またはもしポリヌクレオチドの短い方が２５塩基よりも長いならばミスマッチは５％を超えないとする場合、もう一方に対して相補性であるとする。好ましくは、該ポリヌクレオチドは完全に相補的（ミスマッチなし）である。特異的なハイブリダイゼーション条件が、陰性対照を含むハイブリダイゼーションアッセイを実施することで、結果として特異的なハイブリダイゼーションに至ることを証明するのは容易である（参照：例えば、Shalon et al., 上記、およびChee et al., 上記）。
【００８５】
最適なハイブリダイゼーション条件は標識プローブおよび固定化ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ（例えば、２００塩基以上のポリヌクレオチドに対するオリゴマー）とタイプ（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ）に左右される。核酸についての特異的（すなわち、ストリンジェント）ハイブリダイゼーション条件の一般的パラメータについては上記文献（Sambrook et al.）および以下の文献：Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York（本文献はすべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする）に記載がある。シェナら（Schena et al.）のｃＤＮＡマイクロアレイを使用する場合、代表的なハイブリダイゼーション条件は、５×ＳＳＣプラス０.２％ＳＤＳ中、６５℃、４時間のハイブリダイゼーションと、引き続く低ストリンジェント性洗浄バッファー（１×ＳＳＣプラス０.２％ＳＤＳ）による２５℃での洗浄と高ストリンジェント洗浄バッファー（０.１×ＳＳＣプラス０.２％ＳＤＳ）による２５℃、１０分間の洗浄である（Shena et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10614）。有用なハイブリダイゼーション条件はまた、例えば、Tijessen, 1993, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Elsevier Science Publishers B.V. and Kricka, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press San Diego, Calif, にも提供されている。
【００８６】
シグナル検出およびデータ解析
蛍光標識したプローブを用いる場合、転写物アレイの各部位での蛍光発光は、好ましくは、走査共焦点レーザーマイクロスコープ法により検出し得る。一態様において、個別の走査は、適切な励起光を用いて、使用する２種の発蛍光団のそれぞれについて実施する。あるいは使用した発蛍光団に特異の波長での標本照射を可能とするレーザーを用い、発蛍光団からの発光を分析する。好適な態様において、該アレイはコンピューター制御Ｘ−Ｙステージと顕微対物レンズをもつレーザー蛍光スキャナーで走査する。発蛍光団の連続励起は多重線混合ガスレーザーにより実施し、放出される光は波長によって分かれ、光増幅管によって検出する。蛍光レーザー走査装置は、Schena et al., 1996, Genome Res. 6:639-645 および本明細書に引用した他の文献に記載がある。あるいは、線維光学束 (Ferguson et al., 1996, Nature Biotech. 14:1681-1684) を使用して、多数の部位で同時にｍＲＮＡの存在量レベルをモニターすることもできる。
【００８７】
シグナルを記録し、好適な態様では、コンピューターにより、例えば、１２ビットのアナログ／デジタルボードを用いて解析する。一態様において、走査像はグラフィックプログラム（例、ハイジャーク（Hijaak）グラフィックスーツ）を用いて干渉模様を除き、次いで各部位で各波長での平均ハイブリダイゼーションのスプレッドシートを生じる画像格子プログラムを用いて解析する。
【００８８】
要すれば、２つの蛍光体用チャンネル間の“クロストーク”（またはオーバーラップ）は、実験的に決定し補正し得る。転写物アレイ上のいずれかの特定のハイブリダイゼーション部位については、２つの発蛍光団の発光比は好適に計算される。この比は同族体遺伝子の絶対的発現レベルからは独立しているが、その発現が薬物投与、遺伝子欠失、または何らかの他の試験事象により有意に調節される遺伝子にとっては有用である。
【００８９】
好ましくは、摂動を陽性または陰性と確認することに加えて、摂動の大きさを決定することが有利である。これは当業者にとって容易に明らかとなる方法により実施し得る。
【００９０】
転写状態測定の他の方法
細胞の転写状態は技術上既知の他の遺伝子技法により測定し得る。
【００９１】
タックマン（TAQMANTM）に基づくｍＲＮＡレベルの解析
ＲＴ−ＰＣＲ（実時間定量ＰＣＲ）アッセイでは、ｍＲＮＡ鎖などのＲＮＡ鎖からＤＮＡ鎖する合成する触媒、ＲＮＡ逆転写酵素を利用する。得られるＤＮＡは特異的に検出・定量可能であり、この工程を使用してｍＲＮＡの具体的種のレベルを定量することができる。これを実施するための一方法はタックマン（TAQMAN）(ＰＥアプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア)の商標で知られいるが、この方法はＰＣＲ反応に際し、プローブの特異形状を切断するために、アンプリタック・ゴールド（AMPLITAQ GOLDTM）ＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用する。これはタックマン（TAQMANTM）プローブという。参照：Luthra R, et al., 濾胞性リンパ腫患者におけるｔ(１４;１８)(ｑ３２；ｑ２１)検出のための新規５’エキソヌクレアーゼに基づく実時間ＰＣＲアッセイ；Am J Pathol., Vol 153, (1998), pp:63-68。このプローブは５’−レポーター色素と３’−消光色素をもつオリゴヌクレオチド（通常〜２０マー）からなる。ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）などの蛍光レポーター色素はオリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合している。レポーターは３’末端に位置するリンカーの腕を介して付着するＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルローダミン）により消光する。参照：Kuimelis RG, et al., 実時間定量ＰＣＲ用タックマンプローブの構造類似体；Nucleic Acids Symp Ser., Vol 37, (1997), pp:255-256; and Mullah B, et al., 二重色素標識オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの効率的合成と実時間ＰＣＲアッセイにおけるその応用；Nucleic Acids Res., Vol 15, (1998), pp:1026-1031。この反応に際し、プローブの切断がレポーター色素と消光色素を分断し、レポーターの蛍光を増大させる。
【００９２】
ＰＣＲ産物の蓄積はレポーター色素の蛍光増大をモニターすることにより直接検出する。参照：Heid CA, et al., 実時間定量ＰＣＲ：Genome Res., Vol 6, (1996), pp:986-994。反応は、ＰＣＲ産物の増幅が所定サイクル数後に蓄積したＰＣＲ産物の量よりも、むしろ先に検出されるサイクルの時点が特徴である。核酸標的の開始コピー数の高い方が、蛍光の有意な増加がより早期に観察される。参照：Gibson UE, et al., 実時間定量ＲＴ−ＰＣＲの新規方法；Genome Res., Vol 6, (1996), pp:995-1001。
【００９３】
プローブが未変化である場合、レポーター色素が消光色素に近接していると、主としてフォースター（Forster）型エネルギー転移によりレポーター蛍光の抑制が起こる。参照：Lakowicz JR, et al., タンパク質におけるチロシン残基の酸素消光と蛍光脱分極；J Biol Chem., Vol 258, (1983), pp:4794-4801。ＰＣＲに際し、もし対象の標的が存在するならば、プローブは前進および逆向きプライマー部位の間に特異的にアニールする。アンプリタック・ゴールド（AMPLITAQ GOLDTM）ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’核開裂活性は、プローブが標的にハイブリッド形成する場合にのみ、レポーターと消光剤間でプローブを切断する。プローブフラグメントは次いで標的から置換わり、鎖のポリマー化が継続する。この工程はすべてのサイクルで起こり、産物の対数的蓄積を阻害しない。プローブの３’末端はブロックされてＰＣＲに際してのプローブの伸張を妨げる。
【００９４】
受動対照標準はタックマンＴＭバッファーに含まれる色素であり、５’ヌクレアーゼアッセイには関与していない。受動対照標準は内部基準を提供するが、この基準に対してレポーター色素シグナルは解析に際し標準化される。標準化は濃度または容積の変化による蛍光のゆらぎを補正するために必要である。
【００９５】
標準化はレポーター色素の発光強度を受動対照標準の発光強度で割って、所定の反応チューブに対するＲｎｎ（標準化レポーター）と定義する比を得ることにより実施する。
【００９６】
閾値サイクルまたはＣｔ値は、統計的に有意な増加ΔＲｎが最初に検出されるサイクルである。Ｒｎ対サイクル数のグラフ上、閾値サイクルは、配列検出適用がＰＣＲ産物の対数増加と関連したシグナルの増大を検出することで始まるときに起こる。
【００９７】
定量測定を遂行するために、ｃＲＮＡ（標準）の段階希釈を各実験に含め、正確で素早いｍＲＮＡ定量に必要な標準曲線を作成する。この技法の再現性を評価するために、同じｃＲＮＡサンプルの増幅を数回実施してもよい。
【００９８】
細胞の転写状態を測定する他の技法では、電気泳動分析のために限度はあるが複雑な制限フラグメントのプールを生じる；例えば、二重制限酵素消化とフェージングプライマーとを組み合わせる方法（参照：例えば、欧州特許第０ ５３４８５８Ａ１公報；１９９２年９月２４日出願；Zabeau et al.）、または限定されたｍＲＮＡ末端に最も近接する部位をもつ制限フラグメントを選択する方法（参照：例えば、Prashar et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:659-663）などである。他の方法では統計的にｃＤＮＡプールを試験する；例えば、多数のｃＤＮＡのそれぞれの十分な塩基（例えば、２０〜５０塩基）の配列を決定するか、または限定されたｍＲＮＡ末端（参照：例えば、Velculescu, 1995, Science 270:484-487）経路パターンに比例して既知位置に生成する短いタグ（例えば、９〜１０塩基）の配列を決定する。
【００９９】
他の状況の測定
本発明の様々な態様において、転写状態以外の生物学的状態の状況、例えば、翻訳状態、活性状態、または混合状況などは、薬物応答および経路応答を得るために測定し得る。これらの態様の詳細をこのセクションで記載する。
【０１００】
翻訳状態測定
遺伝子がコードするタンパク質の発現は、検出可能に標識したプローブまたは後に続いて標識し得るプローブにより検出し得る。一般に、該プローブは発現されたタンパク質を認識する抗体である。
【０１０１】
本明細書にて使用する場合、抗体という用語は、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体、および抗体フラグメントのタンパク質に対する結合に十分な生物学的に機能する抗体フラグメントを包含する。
【０１０２】
開示した遺伝子の一つがコードするタンパク質に対する抗体を製造するには、種々の宿主動物にポリペプチドまたはその一部分を注射して免疫する。かかる宿主動物は、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、およびラットなど、ほんの一部ではあるが例示される。免疫応答を上昇させるために種々のアジュバントを使用し得る；これは宿主の種により、フロイントの（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（無菌化ウシ型結核菌）やコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントなどであるが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物などの抗原またはその抗原性機能誘導体により免疫した動物の血清から由来する不均一な抗体分子の集団である。ポリクローナル抗体の産生には、上記のような宿主動物にエンコードタンパク質またはその一部分を上記のアジュバントと共に注射し、免疫する。
【０１０４】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は特定の抗原に対する抗体の均一な集団であり、連続細胞株の培養による抗体分子の生産に供されるいずれの技法によっても入手し得る。これらの方法は、制限されるものではないが、コーラーとミルシュタインのハイブリドーマ技法（Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); および米国特許第４,３７６,１１０号公報）；コスボールらのヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kosbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983); Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030 (1983); およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985); などである。かかる抗体は免疫グロブリンクラスのもので、ＩgＧ、ＩgＭ、ＩgＥ、ＩgＡ、ＩgＤなどとそのサブクラスを包含する。本発明のｍＡｂ産生ハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養し得る。高力価のｍＡｂをインビボで生産することが現在の好適な生産方法である。
【０１０５】
さらに、“キメラ抗体”生産用に開発された技法（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 81:6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984); Takdea et al., Nature, 314:452-454 (1985) は、適切な抗原特異性をもつマウスの抗体分子からの遺伝子と、適切な生物活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子とをつなぎ合わせるもので、これらの技法も使用し得る。キメラ抗体は異なる部分が異なる動物種由来の分子であり、マウスｍＡｂ由来の可変もしくは超可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とをもつ抗体である。
【０１０６】
別法として、一本鎖抗体生産について記載した技法（米国特許第４,９４６,７７８号公報；Science, 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988); and Ward et al., Nature, 334:544-546 (1989)）は、別個に発現された遺伝子−一本鎖抗体を生産するために適合する。一本鎖抗体はＦv領域の重鎖と軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋を介してつなぎ、一本鎖ポリペプチドとすることにより形成する。
【０１０７】
より好ましくは、“ヒト化抗体”の生産に有用な技法がタンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体に対する抗体を生産するのに適合させ得る。かかる技法は以下の米国特許に記載されている：５,９３２,４４８；５,６９３,７６２；５,６９３,７６１；５,５８５,０８９；５,５３０,１０１；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,６６１,０１６；および５,７７０,４２９。
【０１０８】
抗体フラグメントは特定のエピトープを認識するものであり、既知技法により生成させることができる。例えば、かかるフラグメントは限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により製造し得るＦ(ａｂ'ａｂ’)２フラグメント、Ｆ(ａｂ'ａｂ’)２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成させ得るＦａｂａｂフラグメントなどである。あるいは、Ｆａｂａｂ発現ライブラリーを構築し（Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定し得るようにしてもよい。
【０１０９】
次に、既知タンパク質がサンプル中に発現されている程度を、上記の抗体を利用するイムノアッセイ法により定量する。かかるイムノアッセイ法は限定されるものではないが、ドットブロット法、ウエスタンブロット法、競合・非競合タンパク結合アッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）、およびその他の一般的に使用され、科学文献および特許文献に広く記載され、かつ商業的に採用される多くの方法を含む。
【０１１０】
検出が容易であるという点で特に好適なのはサンドイッチＥＬＩＳＡであり、これについては多くの変法があるが、本発明ではそのすべてを包含するものとする。例えば、典型的なフォワードアッセイ法では、未標識抗体を固体基板に固相化し、適当な時間インキュベーションした後に、テストするサンプルを結合した分子と十分な時間接触させて、抗体−抗原二元複合体を形成させる。この時点で、検出可能なシグナルを誘発し得るレポーター分子で標識した第二抗体を加えてインキュベートし、十分な時間を掛けて抗体−抗原−標識抗体の三元複合体を形成させる。未反応物質はすべて洗い流し、抗原の存在をシグナル観察により判定するか、または既知量の抗原を含む対照サンプルを比較することにより定量し得る。フォワードアッセイの変法は同時アッセイも含み、その場合、サンプルと抗体の両方を結合した抗体に同時に添加する；逆進アッセイでは標識した抗体と試験するサンプルを最初に組合せ、インキュベートした後に、未標識表面結合抗体に加える。これらの技法は当業者周知であり、わずかな変更の可能性は容易に明らかとなる。本明細書にて使用する場合、“サンドイッチ”アッセイとは基本的な２つの部位による技法に関するすべての変法を包含するものとする。本発明のイムノアッセイにとって、唯一の制限因子は標識抗体が対象とする遺伝子の発現するタンパク質に特異的な抗体でなければならないということである。
【０１１１】
このタイプのアッセイに最も共通に使用されるレポーター分子は、酵素、発蛍光団−または放射性核−含有分子である。酵素イムノアッセイの場合、酵素は第二抗体に、通常、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸により接合させる。しかし、容易に分かるように、多様な連結反応法が存在することが、当業者周知である。一般的に使用される酵素としては、とりわけ、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼである。特定の酵素と共に使用すべき基質は、一般に、対応する酵素による加水分解により、検出可能な色調変化を生ずるように選択する。例えば、ｐ−ニトロフェニルリン酸エステルはアルカリホスファターゼ接合体との使用に適しており、ペルオキシダーゼ接合体には１,２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが共通して使用される。発蛍光基質を採用することも可能であり、その場合は上記の色素原基質よりもむしろ蛍光性産物を生じる。適切な基質を含有する溶液を次いで三級複合体に加える。この基質を第二抗体に連接した酵素と反応させて、定量的可視シグナルを生じさせ、このシグナルを通常分光光度法によりさらに定量して、血清サンプル中に存在するタンパク質量を評価する。
【０１１２】
フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光化合物を、その結合能力を変化させることなく交互に抗体に化学的に共役させる。特定波長の光の照射により活性化した場合、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子に励起状態を誘発し、次いで特徴的な長波長にて光を放出する。放出光は光学顕微鏡により可視的に検出し得る特徴的な色として現れる。免疫蛍光とＥＩＡ技法は共に技術的によく確立されており、とりわけ本発明では好適である。しかし、放射性同位体、化学発光または生物発光分子などの他のレポーター分子も採用し得る。必要な用途に合致させるために手法をどのように変更するかは当業者にとって容易に明らかである。
【０１１３】
翻訳状態の測定もまた幾つかのさらなる方法にしたがって実施し得る。例えば、タンパク質についての全ゲノムのモニター（すなわち、“プロテオーム”、Goffeau et al., 上記）は、その結合部位が細胞ゲノムのコードする複数のタンパク質種に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体からなるマイクロアレイを構築することにより実施し得る。好ましくは、抗体はエンコードされたタンパク質の実質的な画分に対し、または少なくとも対象の生物学的ネットワークモデルのテストまたは確認に関連するタンパク質に対し存在する。モノクローナル抗体の作製方法は周知である（参照：例えば、Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; すべての目的のためにその全文を一部とする）。一態様において、モノクローナル抗体は細胞のゲノム配列に基づいて設計した合成ペプチドフラグメントに対して起こす。かかる抗体アレイにより、細胞からのタンパク質はアレイに接触させ、その結合を技術上既知のアッセイ法によりアッセイする。
【０１１４】
別法として、タンパク質は二次元ゲル電気泳動システムにより分離することができる。二次元ゲル電気泳動法は技術上周知であり、典型的には第一の次元に沿う等電点電気泳動と引き続く第二の次元に沿うＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動からなる。参照：例えば、Hames et al., 1990, タンパク質のゲル電気泳動：実用法；IRL Press, New York; Shevchenko et al., 1996, Proc. Natl Acad. Sci. USA 93:1440-1445; Sagliocco et al., 1996, Yeast 12:1519-1533; Lander, 1996, Science 274:536-539。得られる電気泳動図は幾つかの技法、例えば、質量スペクトル技法、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロット法および免疫ブロット解析、および内部およびＮ−末端ミクロ配列決定法などにより解析し得る。これらの技法を用い、所定の生理的条件下、例えば、薬物に接触した細胞、または例えば、特定遺伝子の欠失または過剰発現により修飾された細胞などで産生されたすべてのタンパク質の実質的画分を同定することが可能である。
【０１１５】
生物学的状態の他の観点に基づく態様
ｍＲＮＡの存在量以外の細胞構成成分のモニターは、ｍＲＮＡのモニターに際しては遭遇することのなかったある種の技術的難しさが現在存在するが、当業者にとって、細胞機能の特性化に関連するタンパク質の活性を測定し得る本発明の使用、すなわち、本発明の態様がかかる測定に基づくものであることは明らかである。活性の測定は特性化すべき特定の活性に適切な機能的、生物化学的、または物理的手段により実施し得る。その活性が化学的形質転換に関る場合、細胞性タンパク質を天然の基質と接触させ、その形質転換率を測定する。その活性が多重合単位における会合、例えば、ＤＮＡとの活性化ＤＮＡ結合複合体の会合に関る場合、会合したタンパク質の量または会合の二次的結果、例えば、転写されたｍＲＮＡの量を測定する。また、機能的活性のみが判明している場合、例えば、細胞サイクル制御における機能など、その機能の仕事能力を観察し得る。それが既知であり測定されていたとしても、タンパク質活性の変化は本発明の前記方法により解析された応答データを形成する。
【０１１６】
別の制限のない態様において、応答データは細胞の生物学的状態の混じりあった側面から形成されることもある。応答データは、例えば、あるｍＲＮＡの存在量の変化、あるタンパク質存在量の変化、およびあるタンパク質活性の変化から構成し得る。
【０１１７】
マーカーとしての核酸およびタンパク質の検出
特定の態様において、マーカーに対応するｍＲＮＡのレベルは、技術上既知の方法を用い生体サンプル中にインシトゥ形式およびインビトロ形式の両方により決定し得る。“生体サンプル”という用語は、対象から採取した組織、細胞、生体液およびその分離株、ならびに対象内に存在する組織、細胞および体液を含むものとする。多くの発現検出法で単離したＲＮＡを使用する。インビトロ法では、ＲＮＡ単離技法としてｍＲＮＡの単離に反しない方法を選択し、細胞からのＲＮＡ精製に使用することができる（参照：例えば、Ausubel, et al., Ed., Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1987-1999)。さらに、大量の組織サンプルは当業者周知の技法、例えば、チョムチンスキーの一工程ＲＮＡ単離方法（Chomczynski, 米国特許第４,８４３,１５５号公報（１９８９））により容易に処理加工し得る。
【０１１８】
単離したｍＲＮＡはハイブリダイゼーションまたは増殖アッセイ、例えば、限定されるものではないが、サザンもしくはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイなどに使用し得る。ｍＲＮＡレベルの一つの好適な診断検出法は、検出すべき遺伝子がコードするｍＲＮＡにハイブリッド形成し得る核酸分子（プローブ）と該単離ｍＲＮＡとを接触させることからなる。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡまたはその一部分、例えば、長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、本発明のマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにストリンジェント条件下で特異的にハイブリッド形成するのに十分なものである。本発明の診断アッセイに使用する他の適切なプローブを本明細書に記載する。ｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションは問題のマーカーが発現していることを示すものである。
【０１１９】
一形式において、ｍＲＮＡは固体面に固定し、例えば、単離ｍＲＮＡをアガロースゲル上走行させ、次いでゲルからニトロセルロースなどの膜にｍＲＮＡを移動させることによりプローブと接触させる。代替の形式では、プローブを固体面に固定し、ｍＲＮＡとプローブとを、例えば、アフィメトリックス（Affymetrix）遺伝子チップアレイにて接触させる。当業者は本発明のマーカーがコードするｍＲＮＡのレベル検出に使用する既知のｍＲＮＡ検出法を適合させることができる。
【０１２０】
サンプル中本発明のマーカーに対応するｍＲＮＡレベルを決定する代替法は、核酸増幅法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲによる方法である（実験態様については以下参照：Mullis, 米国特許第４,６８３,２０２号公報；リガーゼ連鎖反応、Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193 (1991); 自己持続性配列複製；Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874-1878 (1990); 転写増幅システム；Kwoh et al., Proc. Natl. Ac. Sci. USA, 86:1173-1177 (1989); Ｑ−ベータレプリカーゼ；Lizardi et al., Bio/Technology, 6:1197 (1988); 回転環式複製；Lizardi et al., 米国特許第５,８５４,０３３号公報（１９８８）；または他の核酸増幅法とそれに続く当業者周知の技法による増幅分子の検出）。これらの検出工程図は核酸分子の検出のために、かかる分子が非常に低い分子数で存在する場合にとりわけ有用である。本明細書にて使用する場合、増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域（それぞれプラス鎖とマイナス鎖、またはその逆）にアニールし、かつその間に短い領域を含み得る一対の核酸分子と定義する。一般に、増幅プライマーは長さが約１０ないし３０個のヌクレオチドからなり、長さ約５０ないし２００個のヌクレオチドの領域に隣接する。適切な条件下、適切な試薬類により、かかるプライマーは該プライマーが隣接するヌクレオチド配列からなる核酸分子の増幅を可能とする。
【０１２１】
インシトゥ法の場合、ｍＲＮＡは検出に先立って細胞から単離する必要がない。かかる方法において、細胞または組織サンプルは既知の組織学的方法を用い、調製／処理加工する。次いで、サンプルを支持体、一般にはガラススライドに固定化し、次いで該マーカーをコードするｍＲＮＡにハイブリッド形成し得るプローブと接触させる。
【０１２２】
マーカーの絶対的発現レベルに基づき判定する代替法としては、該マーカーの標準化発現レベルに基づいて判定を下してもよい。発現レベルは、その発現と、マーカーではない遺伝子、例えば、構成的に発現する自家保有の遺伝子の発現とを比較することによりマーカーの絶対的発現レベルを補正して標準化する。標準化に適した遺伝子はアクチン遺伝子などの自家保有遺伝子または表皮細胞特異遺伝子である。この標準化は一サンプル、例えば、患者のサンプルの発現レベルと別のサンプルとの比較、または異なる起源からのサンプル間の比較を可能とする。
【０１２３】
あるいは、発現レベルは相対的発現レベルとして提供し得る。マーカーの相対的発現レベルの決定のために、正常サンプルと疾患生体サンプルからの１０以上のサンプル、好ましくは５０以上のサンプルにつき、問題サンプルの発現レベル決定前に、マーカーの発現レベルを決定する。大量のサンプルにてアッセイした遺伝子それぞれの平均発現レベルを決定し、それをマーカーの発現レベルのベースラインとして使用する。次いで、テストサンプルについて決定されたマーカーの発現レベル（絶対的発現レベル）をそのマーカーについて得られた平均発現値で割る。これが相対的発現レベルとなる。
【０１２４】
好ましくは、ベースライン決定に使用したサンプルはサルコイドーシスに罹患していない患者からのものである。細胞源の選択は相対的発現レベルの使用に依存する。平均発現スコアとして正常組織に見出される発現を使用することは、アッセイしたマーカーが特異的である（正常細胞に対して）か否かを確認する上での助けとなる。さらに、より多くのデータが蓄積された場合には、平均発現値を改正し、蓄積データに基づく改善相対発現値とする。
【０１２５】
ポリペプチドの検出
本発明のもう一つの態様においては、マーカーに対応するポリペプチドを検出する。本発明のポリペプチドを検出する好適な作用物質は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドに結合し得る抗体であり、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリクローナルでもよいし、より好ましくはモノクローナル抗体である。未処理抗体、またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２）を使用し得る。プローブまたは抗体に関連して“標識化”という用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質を接合（すなわち、物理的連結）させることによるプローブまたは抗体の直接標識化、ならびに直接標識したもう一つの作用物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識化を包含するものとする。間接的標識化の例は、蛍光標識した第二抗体による第一抗体の検出、および蛍光標識したストレプトアビジンで検出し得るようにＤＮＡプローブをビオチンで標識することである。
【０１２６】
サルコイドーシス患者からのタンパク質は、当業者周知の技法を用いて単離することができる。採用されるタンパク質単離方法は、例えば、以下に記載がある：Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)。
【０１２７】
サンプルが所定の抗体に結合するタンパク質を含んでいるかどうかを判断するためには様々な方式を採用し得る。かかる方式の例は、限定されるものではないが、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット分析および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などである。当業者は細胞が本発明のマーカーを発現するかどうかの判定に使用し得るように、既知のタンパク質／抗体検出法を容易に改造し得る。
【０１２８】
一方式において、抗体または抗体フラグメントは発現したタンパク質検出のために、ウエスタンブロットまたは免疫蛍光技法などの方法に使用し得る。かかる使用において、固体支持体上に抗体またはタンパク質のいずれかを固定化することが一般に好ましい。適当な固相支持体または担体は抗原または抗体を結合し得る支持体である。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、および磁鉄鉱である。
【０１２９】
当業者は抗体または抗原を結合する多くの他の適切な担体を知っていようし、本発明で使用し得るようにかかる支持体を改造することも可能である。例えば、患者細胞から単離されるタンパク質はポリアクリルアミドゲル電気泳動上で走行させ、ニトロセルロースなどの固相支持体に固定化することができる。次いで、支持体は適当なバッファーで洗浄し、検出可能に標識した抗体で処理する。固相支持体は、次いでバッファーで二度目の洗浄を行い、未結合抗体を除去する。固体支持体上に結合した標識の量は次いで常套手段で検出し得る。
【０１３０】
本発明ではまた生体サンプル（例えば、肺関連体液、血清、血漿、リンパ液、のう胞液、尿、糞便、ｃｓｆ、腹水、または血液）中の本発明マーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の存在を検出するキットをも包含する。かかるキットは対象がサルコイドーシスに罹患している場合、その予後を判定するために使用し得る。例えば、該キットは生体サンプル中本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出し得る標識化合物または作用物質、および該サンプル中のポリペプチドまたはｍＲＮＡの量を決定する手段（例えば、該ポリペプチドに結合する抗体または該ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を含んでなる。キットはまたキットを使用して得られる結果の解釈についての指示書を含む。
【０１３１】
抗体ベースのキットの場合、該キットは、例えば、１）本発明マーカーに対応するポリペプチドに結合する第一抗体（例えば、固体支持体に付着）；および選択肢として２）該ポリペプチドまたは第一抗体のいずれかに結合し、検出可能な標識に接合する第二の異なる抗体；を含有してなる。
【０１３２】
オリゴヌクレオチドベースのキットの場合、該キットは、例えば、１）本発明マーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識したオリゴヌクレオチド；または２）本発明のマーカーに対応する核酸分子を増幅するのに有用な一対のプライマー；を含んでなる。該キットはまた、例えば、バッファー試薬、保存剤、またはタンパク質安定化剤を含んでなる。該キットはさらに検出可能な標識を検出するために必要な成分（例えば、酵素または基質）をさらに含んでなる。該キットはまた一つの対照サンプルまたは一連の対照サンプルであって、これをアッセイして試験サンプルと比較するためのサンプルを含み得る。該キットの各成分は個々の容器に納め得るものであり、その容器はすべて本キットを使用して実施したアッセイの結果を解釈するための指示書と共にひとつのパッケージに収め得る。
【０１３３】
細胞への抗体導入
抗体はいろいろな様式で、例えば、抗体のマイクロインジェクション（Morgan et al., 1988, Immunology Today 9:84-86）または所望の抗体をコードするｍＲＮＡによるハイブリドーマの形質転換（Burke et al., 1984, Cell 36:847-858）などにより、細胞中に導入することができる。さらなる技法において、組換え抗体を設計し、広範な非リンパ球細胞型中で異所性に発現させて、標的タンパク質に結合させること、また標的タンパク質の活性を遮断することができる（Biocca et al., 1995, Trends in Cell Biology 5:248-252）。該抗体の発現は、好ましくは、Ｔｅｔプロモーターなどの制御可能プロモーター、または構成的に活性なプロモーター（摂動を飽和させる産生用）の制御下にある。第一工程では標的タンパク質に適切な特異性をもつ特定のモノクローナル抗体を選択する（下記参照）。選択した抗体の可変領域をコードする配列は、様々に設計した抗体方式、例えば、全抗体、ＦａｂＦａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（ペプチドリンカーにより結合させたＶＨとＶＬ領域）（“ＳｃＦｖ”フラグメント）、ジアボディ（diabodies）(異なる特異性をもつ２つ会合したＳｃＦｖフラグメント)などにクローン化することができる（Hayden et al., 1997, Current Opinion in Immunology 9:210-212）。細胞内に発現される様々な方式の抗体は種々の既知細胞内リーダー配列との融合体として発現し、細胞性区画（例えば、細胞質、核、ミトコンドリアなど）を標的とすることができる（Bradbury et al., 1995, Antibody Engineering (vol.2)(Borrebaeck ed.), pp.295-361, IRL Press）。特に、ＳcＦv方式が細胞質標的化にとりわけ適していると思われる。
【０１３４】
有用な抗体型の多様性
抗体のタイプは、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーである。標的タンパク質に対するポリクローナル抗体の産生には技術上既知の種々の手法が使用し得る。抗体を生産するには、種々の宿主動物に標的タンパク質を注射して免疫するが、かかる宿主動物としては限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどである。宿主の種類に応じて、種々のアジュバントを使用して免疫応答を上昇させることができるが、アジュバントとしては、限定されるものではないが、フロイントの（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール、および無菌化ウシ型結核菌（ＢＣＧ）やコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントなどである。
【０１３５】
モノクローナル抗体
標的タンパク質に向けてのモノクローナル抗体の調製には、培養連続細胞株による抗体分子の製造技法が使用し得る。かかる技法は、制限されるものではないが、コーラーとミルシュタインが最初に開発したハイブリドーマ技法（Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)）；トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72); およびヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96); などである。本発明のさらなる態様において、モノクローナル抗体は最新の技法を利用して無菌動物で製造することができる（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５）。本発明によると、ヒト抗体が使用可能で、ヒトのハイブリドーマを用いることにより（Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030）またはＥＢＶウイルスによりインビトロでヒトＢ細胞を形質転換することにより（Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）入手し得る。事実、本発明によると、標的タンパク質に特異的なマウス抗体分子からの遺伝子と、適切な生物活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子とを繋ぐことによる“キメラ抗体”の製造のために開発された技法を使用し得る（Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454）; かかる抗体は本発明の範囲内にある。
【０１３６】
さらに、モノクローナル抗体が有利な場合、ファージディスプレイ技法を用いて大型の抗体ライブラリーから二者択一的に選択し得る（Marks et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:16007-16010）。この技法を使用し、１０１２までの異なる抗体のライブラリーはｆｄ繊維状ファージの表面に発現され、モノクローナル抗体の選択に利用し得る抗体の“シングルポット”インビトロ免疫系を生じる（Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13:3245-3260）。かかるライブラリーから抗体を選択するには、技術上既知の技法にしたがい、例えば、ファージと固定化標的タンパク質とを接触させること、標的に結合したファージを選択しクローニングすること、および抗体可変領域をコードする配列を、所望の抗体フォーマットを発現する適切なベクターへサブクローニングすることにより実施する。
【０１３７】
本発明によると、一本鎖抗体の製造について記載した技法（米国特許第４,９４６,７７８号公報）を標的タンパク質に特異的な一本鎖抗体を製造するために適合させることができる。本発明のさらなる態様では、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について記載した技法（Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281）を利用して、標的タンパク質に対し所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とする。
【０１３８】
抗体フラグメントが標的タンパク質のイディオタイプを含む場合には技術上既知の技法により生成させ得る。例えば、かかるフラグメントは限定されるものではないが以下のとおりである：抗体分子のペプシン消化により製造し得るＦ(ａｂ')２フラグメント；Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成させ得るＦａｂ’フラグメント；抗体分子をパパインと還元剤で処理することにより生成させ得るＦａｂフラグメント;およびＦｖフラグメント。
【０１３９】
抗体製造において、所望の抗体のスクリーニングは技術上既知の技法、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）により実施し得る。標的タンパク質に特異的な抗体を選択するためには、標的タンパク質に結合する抗体について生成したハイブリドーマまたはファージディスプレイ抗体ライブラリーをアッセイし得る。
【０１４０】
用語集および定義
以下の定義は本明細書にてしばしば使用される正確な用語の理解を容易にするために提供するものである。
“有意なレベル”：本明細書にて使用する場合、特定の対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２）からのｍＲＮＡまたはポリペプチド産物の発現レベルに関連して、問題の対立遺伝子が存在したと当業者が信じるに足る発現レベルを意味する。
【０１４１】
“抗体”：本明細書にて使用する場合、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントを包含する。
【０１４２】
“単離した”：自然状態からヒトの手で変化させたことを意味する。すなわち、それが自然界に存在する場合、その当初の環境から変化したか、または取り出されたか、またはその両方である。例えば、生物体に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは“単離した”ものではなく、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドであっても、その自然状態の共存する物質から分離されたものは“単離した”ものであり、本明細書ではこの用語を採用する。さらに、形質転換、遺伝子操作または他の組換え方法により生物に導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、たとえそれが当該生物（生きていてもいなくてもよい）になお存在していたとしても、“単離した”ものである。
【０１４３】
“ポリヌクレオチド”：一般的にはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはポリデオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）をいい、未修飾または修飾したＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。“ポリヌクレオチド”には制限がなく、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合したＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合したＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡからなる混成分子であって一本鎖またはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖の混合物でもよい混成分子などである。さらに、“ポリヌクレオチド”はＲＮＡまたはＤＮＡからなるか、またはＲＮＡとＤＮＡの両方からなる三本鎖領域をいう。“ポリヌクレオチド”という用語は１種以上の塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定化またはその他の理由で修飾したバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡをも包含する。
【０１４４】
“修飾した”塩基とは、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの特殊な塩基である。ＤＮＡおよびＲＮＡに対しては様々な修飾がなし得る；したがって、“ポリヌクレオチド”とは自然界に一般に見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾した形状のもの、ならびにウイルスや細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形状のものを包含する。“ポリヌクレオチド”はまた比較的短いポリヌクレオチド、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ぶヌクレオチドも包含する。
【０１４５】
“ポリペプチド”：２個以上のアミノ酸がペプチド結合または修飾ペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソスター）により互いに結合しているポリペプチドをいう。“ポリペプチド”は短鎖のもの（一般的にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーという）、および長鎖のもの（一般的にタンパク質という）の両者をいう。ポリペプチドは２０個の遺伝子エンコードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。“ポリペプチド”は自然の工程、例えば、翻訳後プロセシングなどにより、または技術上周知の化学的修飾技法により修飾したアミノ酸配列も含む。かかる修飾については基礎的教科書およびより詳細な研究論文、ならびに膨大な数の研究文献に記載されている。修飾はポリペプチドのどの場所にも、例えば、ペプチドバックボーン、アミノ酸の側鎖、およびアミノまたはカルボキシ末端でも起こり得る。
【０１４６】
同じタイプの修飾が所定のポリペプチドの数ヶ所に同じ程度にまたは様々な程度で存在し得ることは認識し得る。また、所定のポリペプチドは多くのタイプの修飾を含み得る。ポリペプチドはユビキチン化の結果として分岐し得るものであり、分枝をもち得る環状であってもよい。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドは翻訳後の自然過程で生じ得るし、あるいは合成方法により調製してもよい。修飾とは、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチニル化、フラビンの共有結合付着、ヘム部分の共有結合付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付着、脂質または脂質誘導体の共有結合付着、ホスホチジルイノシトールの共有結合付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋結合形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファーＲＮＡが介在するアルギニル化などのアミノ酸のタンパク質への付加、およびユビキチン化などである（参照：例えば、タンパク質−構造と分子特性、2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., 翻訳後タンパク質の修飾：展望と慨観、翻訳後タンパク質の共有結合修飾１−１２、B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al.,“タンパク質修飾と非タンパク補助因子の分析”、Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990, and Rattan et al., “タンパク質合成：翻訳後修飾と加齢”、Ann NY Acad Sci. 663, 48-62, 1992）。
【０１４７】
“フラグメント”：ポリペプチド配列のフラグメントは、基準の配列よりも短いが、実質的に基準ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチド配列をいう。
【０１４８】
“変異体”：基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その実質的な性質を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。ポリヌクレオチドの代表的変異体は基準のポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列における変化は基準のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのアミノ酸配列を変えるものであってもなくてもよい。ヌクレオチドの変化は以下に考察するように、基準配列がコードするポリペプチドにおいて、アミノ酸の置換、付加、欠失、融合および末端切断を生じる。ポリペプチドの代表的変異体はそのアミノ酸配列が基準ポリペプチドと異なる。一般に、変更は、基準ポリペプチドと変異体の配列が全体として密接に類似しており、多くの領域で一致するように制限される。変異体と基準ポリペプチドは１つ以上の置換、挿入、欠失、その組合せによりアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入アミノ酸残基は遺伝子コードがコードするものであってもなくてもよい。典型的な保存置換はＧly、Ａla；Ｖal、lie、Ｌeu；Ａsp、Ｇlu：Ａsn、Ｇln−Ｉ Ｓer、Ｔhr；Ｌys、Ａrg；およびＰheとＴyrである。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は対立遺伝子などの天然産でもよく、または自然界に存在することの不明な変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然産変異体は変異誘発技法により、または直接合成により調製してもよい。さらに変異体としては、１種以上の翻訳後修飾、例えば、糖鎖形成、リン酸化、メチル化、ＡＤＰリボシル化などを有するポリペプチドを包含する。その態様はＮ末端アミノ酸のメチル化、セリンおよびスレオニンのリン酸化、およびＣ末端グリシンの修飾である。
【０１４９】
“対立遺伝子（アレル）”：ゲノムの所定の遺伝子座に存在する遺伝子の２種以上の代替形状の一つをいう。
“多型性”：集団内のゲノムの所定位置におけるヌクレオチド配列（およびもし関連するならエンコードされるポリペプチド）の変化をいう。
【０１５０】
“単一ヌクレオチド多型性”（ＳＮＰ）：集団内のゲノムの単一ヌクレオチドの位置におけるヌクレオチドの可変性の発生をいう。ＳＮＰは遺伝子内に、またはゲノムの遺伝子間に発生し得る。ＳＮＰはアレル特異増幅（ＡＳＡ）によりアッセイすることができる。この方法には、少なくとも３種のプライマーが必要である。共通のプライマーはアッセイすべき多型性に対して逆の補体として用いる。この共通のプライマーは多型性塩基からの５０〜１５００ｂｐである。他の２つ（またはそれ以上）のプライマーは互いに同一であるが、ただし、最終３’塩基は多型性を構成する２つ（またはそれ以上）のアレルに対合するようにゆらぐ。２つ（またはそれ以上）のＰＣＲ反応は次いでサンプルＤＮＡ上で実施し、それぞれ共通のプライマーおよびアレル特異プライマーの一つを使用する。
【０１５１】
“スプライスバリアント”：本明細書にて使用する場合、同じゲノムＤＮＡ配列から最初に転写されたＲＮＡから産生されるｃＤＮＡ分子であるが、別のＲＮＡのスプライシングを受けている分子をいう。別のＲＮＡスプライシングは一次ＲＮＡ転写がスプライシングを受けるときに起こるが、一般にはイントロンの除去のために起こり、結果としてそれぞれが異なるアミノ酸配列をエンコードし得る１つを超えるｍＲＮＡ分子の産生に至る。スプライスバリアントという用語は上記のｃＤＮＡ分子がコードするタンパク質をいう。
【０１５２】
“同一性”：２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映し、該配列の比較により決定される。一般に、同一性は比較すべき２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列につき、その配列の全長にわたって、ヌクレオチドからヌクレオチドまたはアミノ酸からアミノ酸それぞれを正確に対応させることをいう。
【０１５３】
“％同一性”：正確な対応のない配列については、“％同一性”を決定し得る。一般に、比較すべき２つの配列を整列させ、配列間に最大の相関が得られるようにする。この場合、整列の度合いを上げるために、一方または両方の配列に“ギャップ”を挿入することがある。％同一性は比較すべき２３の配列（いわゆる、グローバルアラインメント）のそれぞれ全長にわたり決定し得るが、これは特に同一のまたは非常に類似している長さの配列にとって適している；またより短い明確な長さ（いわゆる、ローカルアラインメント）についても決定可能であり、これは長さの等しくない配列により適している。
【０１５４】
“類似性”：類似性は２つのポリペプチド間の関係性のさらにより複雑な基準である。一般に、“類似性”とは２つのポリペプチド鎖の残基ごとのアミノ酸間の比較を意味するが、（同一性に関して）比較すべき配列のそれぞれ１つについての残基間の対の間の正確な対応のみならず、正確な対応がない場合には、進化に基づき、１つの残基を可能性のある他のものに置換えてみることも考慮すべきである。可能性は関連のある“スコア”を有し、そのスコアから２つの配列の“％同一性”を決定し得る。
【０１５５】
２つ以上の配列の同一性と類似性を比較する方法は技術上周知である。したがって、例えば、ウィスコンシン配列解析パッケージ、バージョン９.１にて利用可能なプログラム（Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984; Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA から入手可能）、例えば、プログラム・ベストフィットとギャップ（BESTFIT and GAP）が２つのポリヌクレオチド間の％同一性および２つのポリペプチド配列間の％類似性の決定に使用し得る。ベストフィットはスミスとウオーターマンの“局所相同性”アルゴリズム（Smith and Waterman, J Mol Biol, 147, 195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981）を使用し、２つの配列間の最良の単一類似性領域を見出す。ベストフィットは長さの異なる２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドを比較するのに適しており、このプログラムでは短い方の配列が長い方の一部を表すもの推定する。比較に際し、ギャップ（ＧＡＰ）は２つの配列を整列し、ネードルマンとブンシュのアルゴリズム（Neddleman and Wunsch, J Mol Biol, 48, 443-453, 1970）にしたがって“最大類似性”を見出す。ギャップは略同じ長さの配列を比較するのにより適しており、整列させると全長におよぶことが期待される。
【０１５６】
好ましくは、各プログラムに使用するパラメータ“ギャップウエイト”および“長さウエイト”はポリヌクレオチド配列についてはそれぞれ５０および３、またポリペプチド配列については１２および４である。好ましくは、％同一性および類似性は、比較すべき２つの配列が最適に整列したときに決定される。
【０１５７】
配列間の同一性および／または類似性を決定する他のプログラムもまた技術上既知であり、例えば、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）系統のプログラム（Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997; 国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）（ベセスダ、メリーランド、米国）から入手可能であり、ＮＣＢＩのホームページ、www.ncbi.nlm.nih.gov、からアクセス可能）およびファスタ（ＦＡＳＴＡ）（Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990; Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448, 1988, ウィスコンシン配列解析パッケージの一部として入手可能）がある。
【０１５８】
好ましくは、ブロサム（ＢＬＯＳＵＭ）６２アミノ酸置換マトリックス（Henikoff S and Henikoff J G, Proc. Nat. Acad Sci. USA, 89, 10915-10919, 1992）をポリペプチド配列比較に使用するが、ヌクレオチド配列については、比較の前に先ずアミノ酸配列に翻訳する。
【０１５９】
好ましくは、プログラム・ベストフィットは基準となるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して問題のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の％同一性を決定するために使用する；問題の配列および基準配列は、すでに記載したように、最適に整列させ、プログラムのパラメータはデフォルト値にセットする。
【０１６０】
“同一性指標”：候補配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）と基準配列を比較するために使用し得る配列関連性の基準である。したがって、例えば、基準のポリヌクレオチド配列と比較して、０.９５の同一性指標を有する候補ポリヌクレオチド配列は、候補ポリヌクレオチド配列が基準配列の各１００個のヌクレオチド当たり平均５個までの差異を含む点を除き基準配列と同一である。かかる差異は少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、置換（転移と転換を含む）、または挿入からなる群より選択される。これらの差異は基準ポリヌクレオチド配列の５’または３’末端位置に、またはこれら末端位置間のいずれかの位置に生じ、基準配列のヌクレオチド内に個々に散在するか、または基準配列内の１個以上の相接する群に散在する。換言すると、基準ポリヌクレオチド配列に比較して、０.９５の同一性指標を有するポリヌクレオチド配列を得るためには、基準配列内の１００個のヌクレオチドのいずれについても平均５個までの上記のような欠失、置換もしくは挿入、またはその組合せがあってもよい。同様のことが他の同一性指標の値、例えば、０.９６、０.９７、０.９８および０.９９についても必要な変更を加えて適用される。
【０１６１】
同様に、ポリペプチドについては、例えば、基準ポリペプチド配列に比較して０.９５の同一性指標を有する候補ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列が基準配列の各１００個のアミノ酸当たり平均５個までの差異を含み得る点を除き、基準配列と同一である。かかる差異は少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保存および非保存置換を含む）、または挿入からなる群より選択される。これらの差異は基準ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端位置に、またはこれら末端位置間のいずれかの位置に生じ、基準配列のアミノ酸内に個々に散在するか、または基準配列内の１個以上の相接する群に散在する。換言すると、基準ポリペプチド配列に比較して、０.９５の同一性指標を有するポリペプチド配列を得るためには、基準配列内の１００個のアミノ酸のいずれについても平均５個までの上記のような欠失、置換もしくは挿入、またはその組合せがあってもよい。同様のことが他の同一性指標の値、例えば、０.９６、０.９７、０.９８および０.９９についても必要な変更を加えて適用される。
【０１６２】
ヌクレオチドまたはアミノ酸の差の数と同一性指標との間の関係は以下の等式にて表すことができる：
ｎa≦Ｘa−（Ｘa・Ｉ）
ただし、式中、
ｎaはヌクレオチドまたはアミノ酸の差の数である；
Ｘaは配列番号１または配列番号３または配列番号２または配列番号４それぞれのヌクレオチドまたはアミノ酸の総数である；
Ｉは同一性指標である；
・は掛け算の記号であり、ＸaとＩの積が非整数であれば、Ｘaから引き算する前に最も近い整数に切り下げる。
【０１６３】
“相同体”：ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が基準配列に対して高程度の配列関連性を有することを示す技術上使用される一般的用語である。かかる関連性はすでに定義したように、２つの配列間の同一性および／または類似性の程度を決定することにより定量化し得る。この一般用語に入る用語は、“オルソログ”および“パラログ”である。“オルソログ”はポリヌクレオチドまたはポリペプチドが他の種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的等価物をいう。“パラログ”とは機能的に類似である同じ種内のポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。
【０１６４】
“融合タンパク質”：２種の無関係の融合遺伝子またはそのフラグメントがコードするタンパク質をいう。例は米国特許第５,５４１,０８７および５,７２６,０４４号公報（両特許をすべての目的のために参照により本明細書の一部とする）に開示されている。Ｆc−ＰＧＰＣＲ−３の場合、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦc領域を採用することが、Ｆc−ＰＧＰＣＲ−３またはＰＧＰＣＲ−３のフラグメントの機能的発現を遂行して、治療に使用する場合のかかる融合タンパク質の薬物動態特性を改善するために、また二量体のＦc−ＰＧＰＣＲ−３を生成させるために有利である。Ｆc−ＰＧＰＣＲ−３ＤＮＡ構築物は５’から３’方向に、分泌カセット、すなわち、哺乳動物細胞からの放出の引き金を引くシグナル配列、融合パートナーとしての免疫グロブリンＦc領域フラグメントをコードするＤＮＡ、およびＦc−ＰＧＰＣＲ−３またはそのフラグメントをコードするＤＮＡを含有してなる。一部用途において、機能的なＦc側を変異させ、一方、融合タンパク質の残り部分には手を着けないか、または発現後にＦc部分を完全に除去することにより、固有の機能的性質（相補的結合、Ｆc−レセプター結合）を変え得るようにすることが望ましい。
【実施例１】
【０１６５】
方法
１９９９年８月から２０００年８月までの間に発病した急性サルコイドーシスを示す１２名の継続性ステロイド感受性症候患者を本潜在研究に含めた。患者と１２名の健常対照者は年齢と性別を合わせ、非喫煙者、非アトピー性とし、悪性腫瘍、慢性炎症性疾患またはコルチコステロイドによる処置の前歴のない者とした。参加した対象はすべてアイルランド西部出身ケルト族起源のコーカサス白人種とした。非アトピー状態はその病歴と、ハウスダストダニ、草花粉、ネコとイヌの鱗屑などに対する皮膚プリック誘発に陰性であることにより確認した。無機ダストとの接触、カビおよびミコバクテリア感染を排除した後に、サルコイドーシスの診断は、９名の患者では気管支経由肺生検により、また結節性紅斑と両側肺門リンパ節症を示す３名の患者では気管支肺胞洗浄ＣＤ４／ＣＤ８比＞３.５により組織学的に確認した。Costabel, U. 1992、サルコイドーシスにおけるＢＡＬ知見の感受性と特異性、Sarcoidosis 9 (Suppl.1): 211-214; Winterbauer, R., et al. 1993, サルコイドーシスの診断における気管支肺胞洗浄細胞集団、Chest 104:352-361。
【０１６６】
すべての患者が６ヶ月目に胸部放射線撮影と肺機能試験などの臨床追跡を受けた。胸部放射線図はシルツバッハ（Silzbach）の分類にしたがって階層化した。参照：Silzbach, L.E. 1967, サルコイドーシス：臨床上の特徴と管理、Med. Clin. N. Am. 51:483。肺気量と拡散能力をセンサーメディックスＶmax２２シリーズにより測定した。
【０１６７】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は基準来診時に採血したヘパリン化全血５０ｍＬから勾配遠心分離（フィコールパック（Ficoll Paque; コピーライト）、ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）により分離した。白血球層を注意深く回収し、培地（例えば、市販品として入手可能な商標名ＡＩＭ Ｖとして販売されている培地；ライルテクノロジー・ペイスレイ（Paisley）、英国）中で３回洗浄した。細胞ペレットを凍結し、−８０℃で保存した。
【０１６８】
プローブアレイ・ハイブリダイゼーション実験のために、市販品として入手可能なプローブアレイ（商標名ジェネチップ（GENECHIP；登録商標）プローブアレイとして販売；参照：Duggan, D.J., et al. 1999, ｃＤＮＡミクロアレイを用いる発現プロフィール、Nature Genetics 21 (Suppl.1): 10-14; DeRisi, J.L. et al. 1996, ヒト癌における遺伝子発現パターンを解析するためのｃＤＮＡミクロアレイの使用、Nature Genetics 14:457-460; DeRisi, J.L., et al. 1997, ゲノムスケールでの遺伝子発現の代謝と遺伝子制御の探求、Science 278:680-686: Brutsche, M.H., et al. 2001, アトピーおよび喘息におけるアポトーシスシグナル、Clin Exp Immunol 123(2): 181-187; Brutsche, M.H., et al. 2001, アトピーおよび喘息におけるＢ細胞イソタイプ制御、Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280(4): L627-637）を使用し、ＰＢＭＣから抽出したＲＮＡを、例えば、商標名スーパースクリプト（SUPERSCRIPT; コピーライト）チョイスシステム（ライフテクノロジー、米国）として販売されている市販品として入手可能なキットを用い、逆転写した。次いで、ｃＤＮＡをインビトロで転写した；その際、商標名バイオアレイ（登録商標）ハイイールド（BIOARRAY High Yield）ＲＮＡ転写物標識キット（エンゾー（Enzo）米国）として販売されている市販品として入手可能なキットを用い、ビオチン標識ｃＲＮＡを形成した。市販品として入手可能な商標名ジェネチップ（GENECHIP；登録商標）プローブアレイ（１２.６ｋアフィメトリックス（Affymetrix））として販売されているプローブアレイに対するプローブハイブリダイゼーション、洗浄、染色および走査は、製造業者（アフィメトリックス（Affymetrix））の指示書にしたがって実施した。発現の変化した特異遺伝子の確認検査のために、確認検査実験を実時間ＲＴ−ＰＣＲにより実施した；その際、商標名タックマン（TAQMAN; 登録商標）として販売されている市販品として入手可能なキット（タックマン（TaqMan）逆転写試薬キットＰＥアプライドバイオシステムズ；フォスターシティ、カナダ）を使用した。
【０１６９】
クラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲ分子に対するタンパク質レベルでのＨＬＡハプロタイプの確認検査実験は、生検で証明されたか、または臨床放射線学的特徴をもつ１０３人の患者と１０５人の健常対照者について、潜在症例−制御関連研究において実施した。末梢血４ｍｌを、３.２％クエン酸を容れたチューブに引き抜いた。血清学的分類は標準的リンパ球毒性技法、例えば、商標名ＨＬＡクラスＩＩダイナビーズ（Dynabeads; 登録商標）（２１０.０３ダイナル（Dynal）ＡＳ、オスロ、ノルウェー）およびＨＬＡ−ＤＲトレイ（ゲン・トラック・インク（Gen Trak. Inc.）、リバティ、ノースカロライナ、米国）として販売されている市販品として入手可能なキットを採用して実施した。
【０１７０】
データ解析と探索のために、我々は商標名ジーンスプリング（GENE SPRINGTM）(バージョン４.０.０、シリコンジェネティックス)およびＳＰＳＳ（登録商標）（ｖ１０.０２、ＳＰＳＳインク）として販売されている市販品として入手可能なデータ解析ソフトウエアパッケージを使用した。サルコイドーシス患者と健常対照者間の２群の遺伝子発現比較はマン−ホットニー（Mann-Whitney）Ｕテストを使用して実施した。Clin Exp Immunol 123(2): 181-187; Brutsche, M.H., et al. 2001, アトピーと喘息におけるＢ細胞イソタイプ制御、Am J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280(4): L627-637。ｐ値＜０.０５の場合のみ、３群、すなわち、健常対照、Ｉ型サルコイドーシスおよびＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシス患者についての比較、また他の２群、すなわち、２つの表現型間の比較を実施した。肺機能パラメータ（ＤＬＣＯ、ＦＥＶ１、ＦＶＣ）と遺伝子発現の相関はスピーマン（Speaman）ランク相関により解析した。ジーンチップ（登録商標）実験とタックマン（登録商標）による試験結果の相関はピアソン（Pearson）相関により実施した。簡便な有意水準を０.０５としたが、有意試験が多数に及んだため、慎重な解釈が必要であった。
【０１７１】
結果
患者の臨床上の特徴を表６に示す。
【０１７２】
【表６】
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【０１７３】
【表７】
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【０１７４】
Ｉ型サルコイドーシスと結節性紅斑を示す７人の患者については、すべてが追跡で完全に疾患の退行した自己限定性疾患であった。当初間質性肺疾患（ＩＩ＆ＩＩＩ型）を示した５人の患者については、すべてが免疫抑制療法を必要とし、当初評価で２人、また追跡で３人が進行性疾患によるものであった。
【０１７５】
１２’６２６の遺伝子と発現した試験配列タグの内、４’１５２（３２.８％）は、２０％を超えるプローブに発現されることが判明した。遺伝子発現は表現型間でよく相関した（Ｒ２乗０.９７、ｐ＜０.００１）。サルコイドーシス患者と対照間の有意差のある発現レベルは、それぞれ１’８６０（１４.９％）および７２９（５.８％）の遺伝子産物について、ｐ＝０.０５およびｐ＝０.０１のレベルで確認された。
【０１７６】
サルコイドーシスの病因に関連する介在経路における遺伝子の発現結果を以下に要約する。
ＨＬＡクラスＩＩ分子に対する抗原プロセシング：我々は対照に比較して、患者でのカテプシン遺伝子Ｌ、ＳおよびＺの一貫したアップレギュレーションを見出した。
抗原提示：健常対照対象の８／１２（６７％）がＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２陽性であった。自己限定性疾患患者はいずれもＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２陽性ではなかったが、持続性疾患の患者はすべて陽性であった。対照に比較し、ＩＩ＆ＩＩＩ型疾患の患者におけるＴ−細胞レセプターアルファ鎖Ｃ領域の発現には有意なダウンレギュレーションがあった。
【０１７７】
共刺激：共刺激遺伝子ＣＤ４０Ｌの発現は対照に比較し患者で有意にダウンレギュレーションを受けた。共刺激分子ＣＤ２８、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現に差はなかった。
Ｔ−細胞活性化：ＣＤ７１（トランスフェリンレセプター）は最新のＴ−細胞活性化と矛盾なくすべての患者でアップレギュレーションを受けていた。より強いＴ−細胞活性化が持続性疾患の患者に見出され、ＣＤ６９がこれらの患者においてアップレギュレーションを受けていた。ＣＤ２７遺伝子は対照に比較し、すべての患者でダウンレギュレーションを受けていた。ＩＮＦ−ガンマ、ＩＬ２およびＩＬ２ＲＢ鎖レセプター遺伝子の発現に差はなかった。
【０１７８】
転写因子：ＮＦＫＢとＣＲＥＭの発現はＩＩ＆ＩＩＩ型疾患の患者で有意にアップレギュレーションを受けていた。
エフェクター細胞活性化：単球およびマクロファージが主に発現分泌するＩＬ１およびＩＬ８遺伝子の発現は、サルコイドーシス患者において首尾一貫してアップレギュレーションを受けていた。同様に、ＴＮＦ−アルファ発現はＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシス患者でアップレギュレーションを受けていた。Ｂ−細胞由来免疫グロブリン遺伝子の発現は、アップレギュレーションを受けた免疫グロブリン−ＧとＦc−ガンマ−レセプター、およびダウンレギュレーションを受けた免疫グロブリン−Ｅと高親和性Ｆc−イプシロンＲＩレセプターを示し、ＩgＧ１ Ｂ−細胞イソタイプが優位にあることを暗示していた。
【０１７９】
細胞転移と接着：ケモカインレセプター遺伝子複合体ＣＣＲ２／ＣＣＲ５／ＣＣＲ６およびＧＲＯベータとガンマ遺伝子は有意に、特にＩ型疾患患者でアップレギュレーションを受けていた。ＩＩ＆ＩＩＩ型疾患においてはより高い発現可変性のために、ＧＲＯベータとガンマ遺伝子のアップレギュレーションが統計的な有意性に達しなかった。ケモカインＭＣＰの発現は対照と比較して変化がなかった。測定した接着分子の中、ニンジュリン、インテグリンベータ−５およびアルファ−３、ならびにＣＤ１１ｂ（ＣＣＲ３）はアップレギュレーションを受けた。
【０１８０】
増殖因子：エンドセリン−１、血小板由来増殖因子−１およびメタロプロティナーゼ組織インヒビター（ＴＩＭＰ１）−１遺伝子の発現は、Ｉ型疾患の患者で有意にアップレギュレーションを受けていたが、ＩＩ＆ＩＩＩ型疾患においてはその傾向があるのみであった。ヘパリン結合エンドセリン増殖因子と血管エンドセリン増殖因子は高レベルで発現するのみならず、肺機能で測定した疾患の重症度と相関した。
【０１８１】
免疫応答に関るメカニズム：アポトーシス阻害遺伝子Ｂcl−２およびＢfl−１はアップレギュレーションを受けており、アポトーシス死前ドメイン・レセプター−３と抗Ｆas誘導アポトーシス遺伝子はダウンレギュレーションを受けていた。この一群は正味の抗アポトーシスの状況と矛盾しない。制御サイトカインＩＬ１０とＴＧＦ−ベータの発現は対照と比較してもサルコイドーシス患者で変わりがなかった。ＴＧＦ−ベータレセプター遺伝子の発現はすべての患者で有意に減少しており、ＩＬ１０レセプター遺伝子の発現はＩＩ＆ＩＩＩ型疾患患者で減少していた。
【０１８２】
確認検査実験ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）
潜在症例−制御クラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルの関連性研究（データは下記表８に示す）：患者１０３名の内の４６名（４５％）、および対照１０５名の内の２８名（２７％）はＨＬＡ ＤＲ２（ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１５／１６）陽性であった。ＨＬＡ ＤＲ２（ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１５／１６）は予後不良と関連があった。診断の２年以内に疾患の退行のあった６名の患者（２１％）のみ、診断後２年以上疾患が活性の患者２２名（４７％）に比較して、ＨＬＡ ＤＲ２（ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１５／１６）陽性であった。
【０１８３】
［表８］
ＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＲＮＡの最初の量に標準化するために、ベータアクチンを基線として用いた（ベータアクチンのＲＮＡレベルが一定であるという仮定に基づく）。比はサンプル中ベータアクチンに対して報告されたＨＬＡ−ＤＲ２−Ｄｗ１２の量を表す。ＮＤ：検出されず。
【０１８４】
【表８】
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【０１８５】
考察
末梢血についてのこの高密度遺伝子アレイ法により、健常個体と急性発症肺サルコイドーシス患者との間の遺伝子発現に明瞭な差異のあることが証明できる。この知見は抗原−プロセシング／提示、Ｔ−リンパ球の活性化、エフェクター細胞（Ｂリンパ球、単球）の活性化、細胞転移と組織改造作用などの増大を、炎症関与メカニズムの変化と共に示すものである。
【０１８６】
さらに、これらの結果は自己制限疾患型の患者に比較して、進行性のサルコイドーシス患者間に特別の差があることを証明している。とりわけ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２陽性は、慢性かつより重症の疾患、免疫抑制療法の必要性、および予後不良と関連があった。逆に、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２を発現しない患者はすべて６〜１２ヶ月以内に完全な自発的疾患退行を示したが、このことは抗原提示の差が免疫応答を変え得ること、いずれも急性期に発赤を生じさせ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２の存在しない場合には自発的に応答が鎮まるか、または存在する場合には免疫応答がより低く慢性型となることを示唆している。１０３名のサルコイドーシス患者による潜在関連研究において、疾患の罹病性における、また成果の乏しい予測因子としてのＨＬＡ−ＤＲ２（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５／１６）の重要性が確認された。
【０１８７】
自己制限サルコイドーシス患者における免疫系の差別的活性化の存在を強調するもにはＩ型疾患におけるより顕著にアップレギュレーションを受けたＩＬ１Ｂおよびケモカイン／レセプター（ＧＲＯ−ベータ／−ガンマ、ＣＣＲ２／５／６），ならびにＩＩ＆ＩＩＩ型サルコイドーシス患者におけるＴ−リンパ球活性化のより明白なマーカーおよびアップレギュレーションを受けた転写因子ＮＦＫＢとＣＲＥＭがある。ノックアウトマウスモデルはＴh１−特異的遅延型過敏性反応に対するＮＦＫＢの重要性を示している；参照：Aronica M.A., et al. 1999, １型にはあるが、２型にはないＴ細胞依存性インビボ免疫応答におけるＮＦ−カッパＢ／ＲｅＩシグナル伝達に対する優先的役割、J. Immunol. 63:5116-5124; サルコイドーシスに観察される場合。これらの知見は抗原除去のための免疫応答に対応し、Ｉ型疾患ではそれがよりエフェクター細胞に基づいており、一方、ＩＩ＆ＩＩＩ型疾患はＴ−ヘルパーリンパ球の活性化により依存し、より顕著な慢性的遅延型過敏性反応を示す。
【０１８８】
引用文献
すべての出版物および参照文献は、限定されるものではないが、本明細書に引用された出版物、特許、特許出願、ジェンバンク寄託番号、ユニジーン・クラスター番号およびタンパク質寄託番号を含め、これら全文を参照により本明細書の一部とする。それぞれの出版物または参照文献は具体的かつ個々にそれが発表された完全なものとして参照により本明細書の一部とすることを示していたものとする。本出願が優先権を要求するいずれの特許出願も、出版物および参照文献について上に記載した様式同様に、その全文を参照により本明細書の一部とする。
【０１８９】
本発明は本明細書に記載した特定態様の用語に限定されるものではなく、本発明の個々の側面の単なる説明を意図したものである。本発明の多くの修飾および変更は当業者に自明のようにその精神と範囲を逸脱せずに実施し得るものである。本発明の範囲内において機能的に等価の方法および装置類は、本明細書に列挙したものに加えて、本明細書の記載とその添付の図面から当業者には自明である。かかる修飾および変更も添付の請求項の範囲に包含されるものとする。本発明は添付の請求項によってのみ制限されるものであり、かかる請求項はその等価の全範囲についても権利を有する。
【国際調査報告】
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