(57)【要約】本発明は、１．３ｘ１０５Ｄａの分子量をもち、そして比率０．５：２．５：１．７５：１０．２５におけるラムノース、アラビノース、ガラクトースおよびガラクツロン酸からなる、エキナセア・アングスチホリアの根の多糖に関する。多糖は、次に示す段階：ａ）溶媒による抽出によって非多糖成分を根から除去し；ｂ）前段階から直接得られる根から多糖フラクションを抽出し；ｃ）多糖フラクションのクロマトグラフィーによって多糖を単離すること、を含んでなる方法によって自然のまたは栽培したエキナセア・アングスチホリアの根から回収される。その免疫刺激特性により、多糖は、免疫系身体防御を増強することが望まれる場合に投与すべき医薬、食品サプリメントもしくは栄養学的（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）組成物の製造のために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１．３ｘ１０５Ｄａの分子量をもち、そして比率０．５：２．５：１．７５：１０．２５におけるラムノース、アラビノース、ガラクトースおよびガラクツロン酸からなる、エキナセア・アングスチホリアの根の多糖。
【請求項２】
直鎖状部分がα−（１−４）結合を介して結合した部分的にアセチル化およびメチル化したガラクツロン酸残基からなり、そして分枝状部分が比率２．５：１．７５においてアラビノースとガラクトースを含有する側鎖が結合しているガラクツロン酸およびラムノースの改変体（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）からなる、交互の直鎖状と分枝状部分をもつ骨格を特徴とする、請求項１に記載の多糖。
【請求項３】
次に示す段階：
ａ）溶媒による抽出によって根から非多糖成分を除去し；
ｂ）前段階から直接得られる根から多糖フラクションを溶媒により抽出し；
ｃ）多糖フラクションのクロマトグラフィーによって多糖を単離すること、
を含んでなる請求項１もしくは２の多糖の製造方法。
【請求項４】
段階ａ）において使用される溶媒がアセトンもしくは１〜３個の炭素原子のアルコールである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
溶媒が水との混合液において存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
溶媒の水含量が４０％以上ではない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
溶媒が８０〜９５％の濃度範囲をもつエタノールである、請求項４〜６のいずれか１つ  に記載の方法。
【請求項８】
抽出温度が２０℃〜溶媒の沸騰温度の範囲である、請求項４〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
段階ｂ）において使用される溶媒が、水または水とアセトンとの混合液または水と１〜３個の炭素原子のアルコールとの混合液である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
溶媒混合液の水含量が６０％もしくはそれ以上である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
溶媒が１５％エタノールである、請求項９もしくは１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
抽出が２０℃〜溶媒の沸騰温度の温度範囲で実施される、請求項９〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
段階ｃ）のクロマトグラフィーがサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーである、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
段階ｃ）のクロマトグラフィー前に、段階ｂ）からの多糖フラクションが１つ以上の予備精製処理にかけられる、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
予備精製処理が、
ｃ１）水と５０〜７０％のアセトンまたは水と５０〜７０％の１〜３個の炭素原子のアルコールの混合液中への溶解による多糖類に富んだフラクションの沈殿および単離；
ｃ２）水を用いる処理による不溶性多糖フラクションの除去；
ｃ３）イヌリナーゼによる処理；
ｃ４）１０，０００Ｄａまたはそれ以上のカットオフによる限外濾過、
から選ばれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
予備精製処理ｃ１）およびｃ２）が実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
場合によっては１方または両方の精製処理ｃ１）およびｃ２）によって先行されて、予備精製処理ｃ３）が実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
場合によっては１方または両方の精製処理ｃ１）およびｃ２）によって先行されて、予備精製処理ｃ４）が実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
請求項３〜１８のいずれか１つの方法を用いて得られるエキナセア・アングスチホリアの多糖。
【請求項２０】
医薬として使用するための請求項１、２および１９のいずれか１つの多糖。
【請求項２１】
請求項１、２および１９のいずれか１つの多糖を含有する製薬学的および栄養学的（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）組成物、および食品サプリメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類の分野、特にエキナセア・アングスチホリア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）の多糖およびその製造方法に関する。多糖は、免疫防御を強化することが望まれる病理学的症状の処置において使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
エキナセアは北アメリカおよびメキシコを起源とする植物であり；その治療学的性質は土着のアメリカ人にはよく知られていて、彼らは傷を治癒させるためにそれを使用した。前世紀の初期に、エキナセアが感染症に対する抵抗を増大できると考えられた事から、局所および全身の感染症の処置におけるその使用が普及した。エキナセア、特にエキナセア・アングスチホリアは、今日、インフルエンザ症候群の処置、特に、風邪の処置、傷の治癒および真菌症の処置のために非常に推奨される。
【０００３】
一般的作用は明らかに免疫系の非特異的刺激ならびに化学療法剤および抗生物質に対する微生物および病原体の感受性化に帰せられる。瘢痕化特性は、植物中に含有される有効成分の１つ、すなわち、エキナコシド（ｅｃｈｉｎａｃｏｓｉｄｅ）によって発揮されるヒアルロニダーゼ阻害を介するヒアルロン酸安定化能、ならびに多糖類によって誘導される大量の（ｍａｓｓｉｖｅ）マクロファージ活性化に基づくと考えられる。この面では、いかなる感染病巣も局所に留まり、そして修復過程に必要なムコ多糖類およびヒストプラスティック（ｈｙｓｔｏｐｌａｓｔｉｃ）材料の蓄積が有利にはこばれる。
【０００４】
エキナセアの多糖類の大きなフラクションはイヌリンからなり、これが上記性質に関与するとは考えられないので、活性のある多糖を同定し、そしてそれの抽出および精製のために効果的な方法を提供するニーズが存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、１．３ｘ１０５Ｄａの分子量をもち、そして比率０．５：２．５：１．７５：１０．２５におけるラムノース、アラビノース、ガラクトースおよびガラクツロン酸からなる、エキナセア・アングスチホリアの根からの多糖（以降、「多糖」という）である。多糖の骨格では、直鎖状と分枝状部分が交互に現れ、そして直鎖状部分は、α−（１−４）結合を介して結合した部分的にアセチル化（９％）およびメチル化（３５％）したガラクツロン酸残基からなり、そして分枝状部分は、比率２．５：１．７５においてアラビノースとガラクトースを含有する側鎖が結合しているガラクツロン酸およびラムノースの改変体（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）からなる。多糖は図１−３に示されるような１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルおよびＧＣＰプロフィールを特徴とする。
【０００６】
多糖は、次に示す段階：
ａ）溶媒による抽出によって根から非多糖成分を除去し；
ｂ）前段階から直接得られる根から多糖フラクションを抽出し；
ｃ）多糖フラクションのクロマトグラフィーによって多糖を単離すること、
を含んでなる方法によって自然のまたは栽培したエキナセア・アングスチホリアの根から回収される。
【０００７】
段階ａ）の目的は、根の非多糖成分、主としてエキナコシドおよびその類似体、ならびにまたエキナセア・アングスチホリアの特徴的成分である大群のアルキルアミド（Ｒ．Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８，５０５，１９８９；Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．５５，３６７，１９８９）を除去することである。したがって、根は、場合によっては水との混合液において、アセトンもしくは１〜３個の炭素原子のアルコールから選ばれる溶媒を用いて、２０℃〜沸騰温度の温度範囲で、好ましくは還流下で抽出される。溶媒の水含量は４０％（ｖ／ｖ）を越えてはならない。濃度８０〜９５％（ｖ／ｖ）のエタノールが好適な溶媒である。
【０００８】
段階ｂ）の目的は、根から多糖成分の混合物を抽出することである。抽出は、水、水との混合液において、アセトンもしくは１〜３個の炭素原子のアルコールを用いて、２０℃〜溶媒の沸騰温度の温度範囲で、好ましくは４０〜７０℃において実施される。溶媒の混合液が使用される場合、水含量は６０％もしくはそれ以上、好ましくは８５％（ｖ／ｖ）である。本発明の好適な実施態様によれば、溶媒は１５％（ｖ／ｖ）エタノールである。
【０００９】
段階ｃ）は、段階ｂ）からの抽出物の分画および抽出物の他の極性成分からの多糖の分離を提供する。この段階は、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーに存する。
【００１０】
最初の場合では、多糖はその分子の大きさに基づいて精製される：事実、多糖はすべての他の成分とは異なる特徴的質量を有する。適当に架橋した樹脂は異なる大きさをもつ化学種を分離することができる；この種類の樹脂（例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−６５ＳおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ（Ｒ）２００ＨＲ）を通して段階ｂ）からの抽出物を処理することによって本発明の多糖を精製することが可能である。
【００１１】
イオン交換クロマトグラフィーによる多糖の精製は、ガラクツロン酸単位におけるカルボキシ官能基の存在による多糖の酸性特性に基づく。陰イオン交換樹脂を通しての段階ｂ）からの抽出物の処理は、多糖とすべての他の酸性成分（少量で存在する）のみを保持し、そしてすべての中性もしくは塩基性成分を除去することを可能にする。樹脂は生理食塩水もしくは酸性水溶液で洗浄されて樹脂によって捕捉された分子が回収される。精製溶液中の塩もしくは酸は、その後、限外濾過透析によって除去される。十分に高いカットオフ（例えば、１０，０００もしくは１００，０００Ｄａ）が選択されて、また出発抽出物中の、かつ陰イオン樹脂によって保持された酸性不純物が除去される。
【００１２】
好適な陰イオン交換樹脂は強イオン交換樹脂、例えばＤｉａｉｏｎ  ＨＰＡ２５およびＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗである。
【００１３】
段階ｃ）に述べたクロマトグラフィー法の１つにしたがって得られた多糖精製溶液は、次に濃縮され、そして真空乾燥または凍結乾燥される。多糖は象牙色の粉末である。
【００１４】
また段階ｃ）はクロマトグラフィーを容易にさせるために有用な予備精製段階を含んでもよい。必ずしも必要ではなくても、これらの段階は、段階ｂ）の抽出物から最初の一定分量の不純物を除去し、そして樹脂の量を減じることを可能にする。
【００１５】
予備処理は次に示す段階から選ばれる：
ｃ１）減圧下で段階ｂ）からの抽出物の濃縮およびそれに続く水とアセトンまたは水と１〜３個の炭素原子のアルコール、好ましくはエタノールの混合液を用いる処理による精製。混合液はアルコールもしくはアセトンの５０〜７０％、好ましくは６６．５％を含有できる。本発明の好適な実施態様によれば、抽出物の濃縮から得られる残渣は、室温において３の割合の水で溶解され、そして７倍量の９５％エタノールにより撹拌下で希釈される。多糖を含有する沈殿フラクションが濾過によって収集され、５０〜７０％濃度のエタノールで洗浄され、そしてクロマトグラフィー精製にかけられる。
【００１６】
ｃ２）段階ｂ）からの多糖フラクションまたは段階１ｃ）からの強化フラクションの、室温における水による処理。この方法では、水中に高度に溶解しうる本発明の多糖は、他のやや解けにくい多糖類から分離される。段階ｂ）から得られる抽出物（または段階ｃ１）からの多糖類に富んだフラクション）は室温で水中に懸濁され、そして撹拌して溶解を促進する。不溶性残渣は分離され、そして水溶液がクロマトグラフィーにかけられる。
【００１７】
ｃ３）段階ｂ）からの抽出物の主な不純物の１つを表すイヌリン様オリゴ糖類および多糖類を加水分解するために有用な酵素処理。抽出物（または段階ｃ１）もしくはｃ２）からの部分精製産物の１つ）は、水溶液において触媒量のイヌリナーゼにより１０〜２４時間処理される。次いで、酵素は熱−またはトリプシン失活され、そして加水分解において形成された炭水化物フラクションは透析（１０，０００Ｄａ、好ましくは１００，０００Ｄａ以上のカットオフによる接面（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）限外濾過）によって除去される。かくして得られた保留液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）は、次にクロマトグラフィーにかけられる。
【００１８】
ｃ４）低分子量の不純物を除去するための高カットオフ限外濾過（１０，０００Ｄａ、好ましくは１００，０００Ｄａ以上のカットオフ）。この場合には、段階ｂ）からの抽出物（または段階ｃ１）もしくはｃ２）からの部分精製産物の１つ）は、好ましくは１０もしくは２０倍量の水に溶解され、そして透析される。次いで、本発明の多糖を含有する保留液がクロマトグラフィーにかけられる。
【００１９】
マウスにおいて免疫刺激特性を示した、特にＴリンパ球活性化を刺激し、かつシクロスポリンＡの効果を打ち消すことができると証明された本発明の多糖は、かくして、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）の感染による死亡率を減少した。したがって、本発明の多糖は、免疫系身体防御の増強が望まれる状況において投与されるべき医薬、食品サプリメントもしくは栄養学的（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）組成物の製造のために使用することができる。
【００２０】
多糖は、慣用の技術、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＸＶＩＩ  ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．に記述される技術にしたがって製剤化することができる。
【００２１】
本発明は以下に若干の実施例によって具体的に説明される。
【００２２】
実施例
すべての次の実施例では、多糖のＨＰＬＣタイターの決定は、流速０．５ｍｌ／分における無勾配条件下でトリエチルアミン０．５％を含有する水で溶出するＴｏｓｏＨａａｓ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ５０００  ＰＷＸＬカラムにより実施される。３０分継続する分析の間、カラムは５０℃に維持される。注入容量は５０μｌである。気化検出器ＥＬＳＤ（Ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｅｒ）Ｓｅｄｅｘ  ｍｏｄ．７５（Ｓ．Ｅ．Ｄ．Ｅ．Ｒ．Ｅ．）−これの噴霧器は２．２ｂａｒのガス圧とともに６０℃に維持される−がカラムに結合される。
【実施例１】
【００２３】
エキナセア・アングスチホリアの根の抽出（段階ａ）およびｂ））
エキナセア・アングスチホリアの摩砕した根６００ｇを９０％（ｖ／ｖ）エタノール２．５Ｌを用いて還流下で４時間抽出する。浸出液を回収し、そして同じ溶媒によるさらに７回の抽出（段階ａ））を実施する。得られる抽出物を廃棄する。次いで、この根を１５％（ｖ／ｖ）エタノールを用いて７０℃で７回抽出するが、各抽出は４時間継続する。合わせた浸出液を濾過し、そして真空濃縮して褐色の残渣１７０ｇを得る（全多糖類抽出物、段階ｂ））。
【実施例２】
【００２４】
溶媒を用いる予備精製および陰イオン交換クロマトグラフィーによる多糖の回収
実施例１の段階ｂ）からの全多糖類抽出物１７０ｇを水５７０ｍｌに溶解し、次いでエタノール１．１３Ｌを添加する。混合液を約１時間撹拌し、沈殿物を約２０分間デカントし、濾過し、６６．５％（ｖ／ｖ）エタノール８５０ｍｌで洗浄し、そして４８時間真空下５５℃で乾燥して、薄茶色の固形物１４０ｇを得る。この固形物を水２．１Ｌを用いて採取し、そして得られる懸濁液を２０分間撹拌下で放置し、次いで不溶性残渣を分離する（これを廃棄する）。
【００２５】
本発明の多糖に富んだ水溶液は３８．７ｇの乾燥残渣を与える。この溶液をｐＨ６．１のＡｃＯＨ／ＡｃＮＨ４バッファーで条件を整えたＤｉａｉｏｎ  ＨＰＡ２５樹脂０．９Ｌを含有するクロマトグラフィーカラムに負荷する。樹脂をｐＨ６．１のＡｃＯＨ／ＡｃＮＨ４バッファー溶液５．４Ｌで洗浄し、そして多糖を含有するフラクションを０．５ＭＡｃＮＨ４水溶液５．４Ｌで溶出する。溶出液を減圧下で０．３Ｌに濃縮する。濃縮溶液を、ポリエーテルスルホンの１０，０００Ｄａカットオフの渦巻状に巻いた膜を使用して、純水６Ｌを用いる接面限外濾過による透析にかける。
【００２６】
保留液を回収し、そして減圧濃縮し、そして残渣を真空下で熱乾燥して、象牙色粉末（多糖ＨＰＬＣタイター：９６％）７．１ｇを得る。
【００２７】
多糖は、＜Ｍｎ  １４３２０（ｓ＝２１８０）を含む、１．３ｘ１０５Ｄａ（ｓ＝５３６５）の平均分子量を有し、これはＬＡＬＬＳ（Ｌｏｗ  Ａｎｇｌｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）による測定と一致し、そして比率１０．２５：１．７５：２．５：０．５におけるガラクツロン酸、ガラクトース、アラビノースおよびラムノースからなる（ＨＰＡＥＣ分析）。多糖はそれぞれ図１−３に示されるように特徴的な１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルおよびＧＣＰプロフィールを有する。
【実施例３】
【００２８】
限外濾過予備精製およびサイズ排除クロマトグラフィーによる多糖の回収
実施例１の段階ｂ）からの全多糖類抽出物１７０ｇを純水８５０ｍｌに溶解する。この溶液を、ポリエーテルスルホンの５０，０００Ｄａカットオフの渦巻状に巻いた膜を使用して、純水１０Ｌを用いる接面限外濾過によって透析する。
【００２９】
精製抽出物１１０．５ｇを含有する保留液を回収し、そして普通の圧力下で維持され、かつ水で条件を整えたＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−６５Ｓ樹脂２２Ｌを含有するクロマトグラフィーカラムに負荷する。溶出を純水で実施し、そして溶出液をフラクション各２００ｍｌに分ける。フラクションをＧＰＣで分析し、そして十分に純粋な多糖を含有するフラクションをプールする。
【００３０】
次いで、プールしたフラクションを減圧濃縮し、そして残渣を真空下で熱乾燥して、象牙色粉末（多糖ＨＰＬＣタイター：９５％）５．７ｇを得る。
【実施例４】
【００３１】
酵素的予備精製および陰イオン交換クロマトグラフィーによる多糖の回収
実施例１の段階ｂ）からの全多糖類抽出物１７０ｇを純水３２３０ｍｌに溶解し、そして酵素イヌリナーゼ８５０ｍｇを添加する。この混合液を弱い撹拌下で４０℃、２４時間放置し、次いで酵素を３６℃で２時間撹拌しながらトリプシン８０ｍｇにより失活させる。溶液を８５℃で２時間加熱し、そして減圧下で１．７Ｌまで濃縮する。
【００３２】
濃縮した溶液を、ポリエーテルスルホンの１００，０００Ｄａカットオフの渦巻状に巻いた膜を使用して、純水１７Ｌを用いる接面限外濾過による透析にかける。保留液（精製抽出物１１．５ｇを含有する）を回収し、そしてｐＨ６．１のＡｃＯＨ／ＡｃＮＨ４バッファーで条件を整えたＤｉａｉｏｎ  ＨＰＡ２５樹脂０．８Ｌを含有するクロマトグラフィーカラムに負荷する。樹脂をｐＨ６．１のＡｃＯＨ／ＡｃＮＨ４バッファー溶液４．８Ｌで洗浄し、そして多糖を含有するフラクションを０．５ＭＡｃＮＨ４水溶液４．８Ｌで溶出する。溶出液を減圧下で１５０ｍｌに濃縮し、そして濃縮液を、ポリエーテルスルホンの５０，０００Ｄａカットオフの渦巻状に巻いた膜を使用して、純水１．５Ｌを用いる接面限外濾過によって透析する。
【００３３】
保留液を減圧濃縮し、そして残渣を真空下で熱乾燥して、象牙色粉末（多糖ＨＰＬＣタイター：９７％）６．９ｇを得る。
【００３４】
生物学的項目
実験１
Ｔリンパ球におけるγ−インターフェロンの産生試験（Ｚｕｃｃａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９６，１９，３９−４６）
ナイロンウールカラムにおいて脾細胞の分離によって得られたマウスＴリンパ球を、場合によってはα−ＣＤ３（インターフェロン産生に関与する細胞機能アクチベーターとしての抗ＣＤ３モノクローナル抗体）とともに前インキュベートしたミクロタイタープレートにおける胎児ウシ血清４％を含む１６４０ＲＰＭＩ培養基において培養した。試験すべき物質をウエルに添加し、そして４８時間後に培養基に遊離したγ−インターフェロンを評価した。
【００３５】
【表１】
2005536588.tif 000002
【００３６】
実験２
マウスにおいてカンジダ・アルビカンスによって誘導した死亡率に及ぼす効果
（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，１４６，１８８１−９）
酵母をＳａｂｏｕｒａｕｄ寒天培地で培養し、そしてシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）１ｍｇ／Ｋｇ  ｉｐにより免疫抑制したマウスに２．９ｘ１０５の濃度で静脈内に接種した。マウスは、すべての対照マウス（未処置マウス）が死ぬまで、本発明の多糖５および１０ｍｇ／Ｋｇ  ｉ．ｐ．により毎日処置した。結果は処置群における生存動物として評価した。
【００３７】
【表２】
2005536588.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】多糖１の１ＨＮＭＲスペクトル
【図２】多糖１の１３ＣＮＭＲスペクトル
【図３】多糖１のＧＰＣプロフィール
【図１】
2005536588.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
2005536588.tif 000007
2005536588.tif 000008
2005536588.tif 000009