(57)【要約】本発明は、細菌由来の抗腫瘍薬に関連する組成物および方法に関する。特に、本発明は、抗腫瘍活性が高くヒトに対する毒性が減少した新規メイタンシノイド類似体の産生のためのアンサマイトシン生合成遺伝子クラスターを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストリンジェントな条件下においてアクチノシネマ・プレチオスムのアンサマイトシン遺伝子クラスターIに対して特異的にハイブリダイズする、少なくとも長さ12ヌクレオチドの単離された核酸。
【請求項２】
核酸が配列番号：56に示す配列またはその相補配列に対して特異的にハイブリダイズする、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項３】
核酸配列が、アンサマイトシン生合成活性を持つタンパク質をコードする配列に対して特異的にハイブリダイズする、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項４】
アンサマイトシン生合成活性が、β-ケトアシル-ACPシンターゼ活性、アシルトランスフェラーゼ活性、ACP活性、カルボン酸：ACPリガーゼ活性、β-ヒドロキシアシル-チオエステルデヒドラターゼ活性、β-ケトアシル-ACPレダクターゼ活性、およびエノイルレダクターゼ活性からなる群より選択されるポリケチドシンターゼ活性である、請求項3記載の単離された核酸。
【請求項５】
アンサマイトシン生合成活性が、メチルトランスフェラーゼ活性、アミドシンターゼ活性、オキシゲナーゼ活性、ハロゲナーゼ活性、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性、D-アラニル運搬タンパク質活性、COデヒドロゲナーゼ活性、O-メチルトランスフェラーゼ活性、3-O-メチルトランスフェラーゼ活性、3-O-アシルトランスフェラーゼ活性、O-カルバモイルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、aDHQデヒドラターゼ活性、およびAHBAシンターゼ活性からなる群より選択されるアンサマイトシン修飾活性である、請求項3記載の単離された核酸。
【請求項６】
アクチノシネマ・プレチオスムのアンサマイトシン遺伝子クラスターIに由来する少なくとも1つのオープンリーディングフレーム、該オープンリーディングフレームから生成されるタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする遺伝子、および該オープンリーディングフレームから生成されるタンパク質の生物学的に活性な変種をコードする遺伝子からなる群より選択される配列を含む単離された核酸。
【請求項７】
核酸が、配列番号：56の少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む、請求項6記載の単離された核酸。
【請求項８】
核酸がアンサマイトシン生合成活性を持つタンパク質をコードする、請求項6記載の単離された核酸。
【請求項９】
アンサマイトシン生合成活性が、β-ケトアシルACPシンターゼ活性、アシルトランスフェラーゼ活性、ACP活性、カルボン酸：ACPリガーゼ活性、β-ヒドロキシアシル-チオエステルデヒドラターゼ活性、β-ケトアシル-ACPレダクターゼ活性、およびエノイルレダクターゼ活性からなる群より選択されるポリケチドシンターゼ活性である、請求項8記載の単離された核酸。
【請求項１０】
アンサマイトシン生合成活性が、メチルトランスフェラーゼ活性、アミドシンターゼ活性、オキシゲナーゼ活性、ハロゲナーゼ活性、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性、D-アラニル運搬タンパク質活性、COデヒドロゲナーゼ活性、O-メチルトランスフェラーゼ活性、3-O-メチルトランスフェラーゼ活性、3-O-アシルトランスフェラーゼ活性、O-カルバモイルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、aDHQデヒドラターゼ活性、およびAHBAシンターゼ活性からなる群より選択されるアンサマイトシン修飾活性である、請求項8記載の単離された核酸。
【請求項１１】
請求項6記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
操作によって核酸に連結されたプロモーターおよびレギュレーターをさらに含む、請求項11記載のベクター。
【請求項１３】
プロモーターがpactIII-pactIプロモーターであり、レギュレーターがactII-ORF4レギュレーターである、請求項12記載のベクター。
【請求項１４】
請求項13記載のベクターを用いて形質転換した宿主細胞。
【請求項１５】
形質転換した宿主細胞が、ストレプトマイセス・コエリコロル細胞、ストレプトマイセス・リビダンス細胞、およびアクチノシネマ・プレチオスム細胞からなる群より選択される細菌細胞である、請求項14記載の形質転換した宿主細胞。
【請求項１６】
アンサマイトシン遺伝子クラスターにおける少なくとも一つの内因性遺伝子の破壊を伴うゲノムを有するトランスジェニックアクチノシネマ・プレチオスム細胞であって、該破壊が挿入、欠失、および置換からなる群より選択されるトランスジェニックアクチノシネマ・プレチオスム細胞。
【請求項１７】
少なくとも一つの内因性遺伝子が、asmB、asm19、asm15、およびasm12からなる群より選択される遺伝子を含む、請求項16記載のトランスジェニックアクチノシネマ・プレチオスム細胞。
【請求項１８】
少なくとも一つの内因性遺伝子が、アンサマイトシン遺伝子クラスターIIの遺伝子および二つのアンサマイトシン遺伝子クラスターの間の遺伝子からなる群より選択される遺伝子を含む、請求項16記載のトランスジェニックアクチノシネマ・プレチオスム細胞。
【請求項１９】
アクチノシネマ・プレチオスムのアンサマイトシン遺伝子クラスターIに由来する少なくとも一つのオープンリーディングフレーム、該オープンリーディングフレームから生成されるタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする遺伝子、および該オープンリーディングフレームから生成されるタンパク質の生物学的に活性な変種をコードする遺伝子からなる群より選択される配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された細菌宿主細胞によって産生されるメイタンシノイド。
【請求項２０】
細菌宿主細胞が、ストレプトマイセス・コエリコロル細胞、ストレプトマイセス・リビダンス細胞、およびアクチノシネマ・プレチオスム細胞からなる群より選択される、請求項19記載のメイタンシノイド。
【請求項２１】
発現ベクターが、asmA、asmB、asmC、asmD、およびasm09のオープンリーディングフレームを含む、請求項19記載のメイタンシノイド。
【請求項２２】
アンサマイトシン遺伝子クラスターにおける少なくとも一つの内因性遺伝子の破壊を含むゲノムを有するトランスジェニックアクチノシネマ・プレチオスム細胞によって産生されるメイタンシノイドであって、該破壊が挿入、欠失、および置換からなる群より選択されるメイタンシノイド。
【請求項２３】
トランスジェニックアクチノシネマ・プレチオスム細胞が少なくとも一つの異種生合成遺伝子をさらに含む、請求項22記載のメイタンシノイド。
【請求項２４】
異種生合成遺伝子がアミコラトプシス・メディテルラネイおよびストレプトマイセス・アクロモゲンス種ルブラジリスからなる群のメンバーに由来する、請求項23記載のメイタンシノイド。
【請求項２５】
異種生合成遺伝子がリファマイシン生合成遺伝子クラスターおよびルブラジリン遺伝子クラスターからなる群のメンバーに由来する、請求項24記載のメイタンシノイド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institute of Health）助成金番号第AI76461号により、一部、政府の援助を受けて実施された。従って、米国政府は本発明について権利の一部を保有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、細菌由来の抗腫瘍薬に関連する組成物および方法に関する。特に、本発明は、抗腫瘍活性が高くヒトに対する毒性が減少した新規メイタンシノイド(maytansinoid)類似体産生のためのアンサマイトシン(ansamitocin)生合成遺伝子クラスターを提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
メイタンシノイドは極めて強力な抗腫瘍薬であり、高等植物ファミリーであるニシキギ科（Celastraceae）、クロウメモドキ科（Rhamnaceae）、およびトウダイグサ科（Euphorbiaceae）のメンバー、ならびに蘚類のいくつかの種から最初に単離された（Kupchanら、J. Am. Chem. Soc. 94:1354-1356 [1972]；Waniら、J. Chem. Soc. Chem. Commun. 390: [1973]；Powellら、J. Nat. Prod. 46:660-666 [1983]；Sakaiら、J. Nat. Prod. 51:845-850 [1988]；およびSuwanboriruxら、Experientia 46:117-120 [1990]）。図1に示す通り、メイタンシノイドは、リファマイシンBおよびゲルダナマイシンのような微生物由来のアンサマイシン系抗生物質に関連する19員大環状ラクタムである（RinehartおよびShield, Fortschr. Chem. Org Naturst. 33:231-307 [1976]）。これらの化合物間の類似性によって、メイタンシノイド産生微生物の研究が刺激されて、放線菌アクチノシネマ・プレチオスム種プレチオスム(Actinosynnema pretiosum ssp. pretiosum)および変異株であるA.プレチオスム種アウランチクム(A. pretiosum ssp. auranticum)からアンサマイトシンが単離されるに至った（Higashideら、Nature 270:721-722 [1977]；およびAsaiら、Tetrahedron 35:1079-1085 [1978]）。アンサマイトシンの構造および抗腫瘍活性はいずれも、植物性起源から得られるメイタンシン(maytansine)およびその他のメイタンシノイドとほぼ等しいことが明らかとなった。
【０００４】
作用機序に関する研究より、メイタンシノイドはビンカアルカロイド結合部位と重複する部位にてチューブリンに結合して、チューブリンの重合を阻止することが示されている（Remillardら、Science 189:1002-1005 [1975]；Mandelbaum-Shavitら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 72:47-54 [1976]；およびHamel, Pharmac. Ther. 55:31-51 [1992]）。メイタンシンは、インビトロにおいて著しく低用量（例えば、10-3〜10-7μg/ml）で各種のマウス白血病細胞株およびヒトの癌および白血病細胞株の増殖を阻害することが見出された（IssellおよびCrooke, Cancer Treatment Reviews 5:199-207 [1978]。にも関わらず、癌患者を対象とした第I相および第II相臨床試験は期待はずれであった。第I相試験において、用量限定の消化管毒性および神経毒性が認められて、中程度の骨髄抑制も認められた（KomodaおよびKishi、in Douros and Cassady（編）Anticancer Agents Based on Natural Product Models (Academic Press, NY) pp. 353-389 [1980]；ならびにIssellおよびCrooke, Cancer Treatment Reviews 5:199-207 [1978]）。これらの初期試験では若干の部分的反応が認められ、これを受けて、異なるタイプの腫瘍を持つ患者における多くの第II相試験が実施された（ReiderおよびRoland、in Brossi（編）The Alkaloids (Academic Press, NY) vol 23, pp. 71-156 [1984]；Thigpenら、Am. J. Clin. Oncol. (CCT) 6:273-275 [1985]；Thigpenら、Am. J: Clin. Oncol. (CCT) 6:427-430 [1985]；Kalserら、Cancer Treatment Rep. 69:417-420 [1985]；ならびにRavryら、Am. J. Clin. Oncol. (CCT) 8:148-150 [1985]）。これらの第II相試験では、一貫してわずかな応答率が認められ、メイタンシンに関するさらなる臨床評価は許可されないという結論に達した。
【０００５】
それにも関わらず、メイタンシノイドの高い固有の作用強度はこれらの化合物の癌治療における価値を指し示している。特に、当技術分野では、安全かつ有効な新規メイタンシノイド類似体を作製することが今なお必要である。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、細菌に由来する抗腫瘍薬に関連する組成物および方法に関する。特に、本発明は、抗腫瘍活性が高くヒトに対する毒性が減少した新規メイタンシノイド類似体産生のためのアンサマイトシン生合成遺伝子クラスターを提供する。
【０００７】
本発明は、アクチノシネマ・プレチオスムのアンサマイトシン遺伝子クラスターIに対してストリンジェントな条件下において特異的にハイブリダイズする少なくとも12ヌクレオチドの長さの単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、この核酸は配列番号：56に示される配列またはその相補配列に対して特異的にハイブリダイズする。好ましい態様において、この核酸配列はアンサマイトシン生合成活性を持つタンパク質をコードする配列に対して特異的にハイブリダイズする。これらの態様の一部において、アンサマイトシン生合成活性は、β-ケトアシル-ACPシンターゼ活性、アシルトランスフェラーゼ活性、ACP活性、カルボン酸：ACPリガーゼ活性、β-ヒドロキシアシル-チオエステルデヒドラターゼ活性、β-ケトアシル-ACPレダクターゼ活性、およびエノイルレダクターゼ活性からなる群より選択されるポリケチドシンターゼ活性である。その他の態様において、アンサマイトシン生合成活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、アミドシンターゼ活性、オキシゲナーゼ活性、ハロゲナーゼ活性、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性、D-アラニル運搬タンパク質活性、COデヒドロゲナーゼ活性、O-メチルトランスフェラーゼ活性、3-O-メチルトランスフェラーゼ活性、3-O-アシルトランスフェラーゼ活性、O-カルバモイルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、aDHQデヒドラターゼ活性、およびAHBAシンターゼ活性からなる群より選択されるアンサマイトシン修飾活性である。
【０００８】
本発明はまた、アクチノシネマ・プレチオスムのアンサマイトシン遺伝子クラスターIに由来する少なくとも1つのオープンリーディングフレーム、このオープンリーディングフレームから産生されるタンパク質の生物学的に活性な部分をコードしている遺伝子、およびオープンリーディングフレームから産生されたタンパク質の生物学的に活性な変種をコードしている遺伝子からなる群より選択される配列を含む単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、この核酸は配列番号：56の少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む。好ましい態様において、この核酸はアンサマイトシン生合成活性を持つタンパク質をコードする。これらの態様の一部において、アンサマイトシン生合成活性は、β-ケトアシル-ACPシンターゼ活性、アシルトランスフェラーゼ活性、ACP活性、カルボン酸：ACPリガーゼ活性、β-ヒドロキシアシル-チオエステルデヒドラターゼ活性、β-ケトアシル-ACPレダクターゼ活性、およびエノイルレダクターゼ活性からなる群より選択されるポリケチドシンターゼ活性である。その他の態様において、アンサマイトシン生合成活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、アミドシンターゼ活性、オキシゲナーゼ活性、ハロゲナーゼ活性、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性、D-アラニル運搬タンパク質活性、COデヒドロゲナーゼ活性、O-メチルトランスフェラーゼ活性、3-O-メチルトランスフェラーゼ活性、3-O-アシルトランスフェラーゼ活性、O-カルバモイルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、aDHQデヒドラターゼ活性、およびAHBAシンターゼ活性からなる群より選択されるアンサマイトシン修飾活性である。また、アクチノシネマ・プレチオスムのアンサマイトシン遺伝子クラスターIに由来する少なくとも1つのオープンリーディングフレーム、このオープンリーディングフレームから産生されるタンパク質の生物学的に活性な部分をコードしている遺伝子、およびこのオープンリーディングフレームから産生されるタンパク質の生物学的に活性な変種をコードしている遺伝子からなる群より選択される配列を含む単離された核酸を含むベクターも提供する。いくつかの好ましい態様において、このベクターは操作によって核酸と連結されたプロモーターおよびレギュレーターをさらに含む。特に好ましい態様において、プロモーターはpactIII-pactIプロモーターであり、レギュレーターはactII-0RF4レギュレーターである。このベクターを用いて形質転換した宿主細胞も提供する。いくつかの好ましい態様において、形質転換した宿主細胞は、ストレプトマイセス・コエリコロル(Streptomyces coelicolor)細胞、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)細胞、およびアクチノシネマ・プレチオスム細胞からなる群より選択される細菌細胞である。
【０００９】
さらに、本発明は、アンサマイトシン遺伝子クラスターの少なくとも1つの内因性遺伝子の破壊を含むゲノムを有するトランスジェニックアクチノシネマ・プレチオスム細胞であり、この破壊が挿入、欠失、および置換からなる群より選択されるトランスジェニックアクチノシネマ・プレチオスム細胞を提供する。いくつかの好ましい態様において、この少なくとも1つの内因性遺伝子は、asmB、asm19、asm15、およびasml2からなる群より選択される遺伝子を含む。その他の態様において、この少なくとも1つの内因性遺伝子は、アンサマイトシン遺伝子クラスターIIの遺伝子および2つのアンサマイトシン遺伝子クラスターの間の遺伝子からなる群より選択される遺伝子を含む。
【００１０】
さらに、本発明は、アクチノシネマ・プレチオスムのアンサマイトシン遺伝子クラスターIに由来する少なくとも1つのオープンリーディングフレーム、このオープンリーディングフレームから産生されるタンパク質の生物学的に活性な部分をコードしている遺伝子、およびこのオープンリーディングフレームから産生されるタンパク質の生物学的に活性な変種をコードしている遺伝子からなる群より選択される配列を含む発現ベクターを用いて形質転換した細菌宿主細胞によって産生されるメイタンシノイドを提供する。いくつかの好ましい態様において、細菌宿主細胞はストレプトマイセス・コエリコロル細胞、ストレプトマイセス・リビダンス細胞、およびアクチノシネマ・プレチオスム細胞からなる群より選択される。また、発現ベクターがasmA、asmB、asmC、asmD、およびasm09のオープンリーディングフレームを含む態様も提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、アンサマイトシン遺伝子クラスターの少なくとも1つの内因性遺伝子の破壊を含むゲノムを有するトランスジェニックアクチノシネマ・プレチオスム細胞であり、この破壊が挿入、欠失および置換からなる群より選択されるトランスジェニックアクチノシネマ・プレチオスム細胞によって産生されるメイタンシノイドを提供する。いくつかの態様において、このトランスジェニックアクチノシネマ・プレチオスム細胞は少なくとも1つの異種生合成遺伝子をさらに含む。いくつかの好ましい態様において、この異種生合成遺伝子はアミコラトプシス・メディテルラネイ(Amycolatopsis mediterranei)およびストレプトマイセス・アクロモゲンス種ルブラジリス(Streptomyces achromogenes var rubradiris)からなる群のメンバーに由来する。これらの態様の一部において、異種生合成遺伝子はリファマイシン生合成遺伝子クラスターおよびルブラジリン(rubradirin)遺伝子クラスターからなる群のメンバーに由来する。
【００１２】
発明の詳細な説明
メイタンシノイドの強力な抗腫瘍活性は複数の化学的完全合成を促したが（SmithおよびPowell, in Pelletier（編）Alkaloids, (John Wiley and Sons, NY) vol 2, pp. 149-204 [1984]；ReiderおよびRoland, in Brossi（編）The Alkaloids, (Academic Press, NY) vol 23, pp. 71-156 [1984]；ならびにKomodaおよびKishi, in DourosおよびCassady（編）Anticancer Agents Based on Natural Product Models, (Academic Press, NY) pp. 353-358 [1980]）、構造と活性の相関性を解明することを目的とした研究は専ら天然物および半合成物に依存した。興味深いことに、C-3における異なるエステル側鎖や、C-15における4,5-エポキシド、N-メチル基、ハロゲン、および酸素ならびにC-14のメチル基の有無を含む、当然、多くの構造の変化に遭遇する（SmithおよびPowell、in Pelletier（編）Alkaloids (John Wiley and Son, NY) vol 2, pp. 149-204 [1984]）。かなりの構造の変化が許容されるが、抗白血病活性にはC-3のエステル基が必須であることが見出された（Kupchanら、J. Med. Chem. 21:31-37 [1978]）。エーテル誘導体は活性が非常に低いため、C-9の遊離水酸基も不可欠である。C-10の立体配置およびC-15のヒドロキシ官能基またはアシルオキシ官能基はほとんど影響しないが、エポキシド官能基はこの活性を修飾するようである。Takeda CompanyはアンサマイトシンP-3を化学的または微生物的に形質転換することによってさらなる修飾を導入して、多くのメイタンシノイド類似体を作製した（SmithおよびPowell, in Pelletier（編）Alkloids, (John Wiley and Sons, NY) vol 2, pp. 149-204 [1984]；ReiderおよびRoland, in Brossi（編）The Alkaloids, (Academic Press, NY) vol 23, pp. 71-156 [1984]；Izawaら、J. Antibiot. 34:1591-1595 [1981]；ならびにKawaiら、Chem. Pharm. Bull. 32:3341-3351 [1984]）。この形質転換には、N-脱メチル化、C-3の脱アシル化、C-15のヒドロキシル化、C-20のO-脱メチル化、エポキシドの脱塩素、脱酸素、およびスルフヒドリル基による9-ヒドロキシ基の置換えが含まれた。しかし、天然の開始物質が限られていたために、親化合物の分子構造に関する多くの中心構造の変化は探索することができなかった。
【００１３】
本発明の開発中に、A.プレチオスムに由来するアンサマイトシン生合成遺伝子クラスター（asm）のクローニング、配列決定および特徴付けが完了した。この作業によって、アンサマイトシンの生合成について遺伝的および生化学的なレベルでの詳細な分析が可能となり、遺伝子組換えにより作出されて、化学的方法では容易にアクセスすることのできない中心構造に変化を有するメイタンシノイド類似体を産生することが可能となる。
【００１４】
A.プレチオスムの発酵物に13C-および14C-標識前駆物質を加えた培養実験により確立されたアンサ鎖(ansa chain)および発色団の起源に基づいて（Hatanoら、J. Antibiot. 35:1415-1417 [1982]；およびHatanoら、Agric. Biol. Chem. 49:327-333 [1985]）、メイタンシノイドの生合成は開始ユニットである3-アミノ-5-ヒドロキシ安息香酸（AHBA）からのタイプIモジュラーポリケチドシンターゼ（PKS）上への炭素骨格の構築を含むことが予測できる。鎖伸長は、3つのプロピオン酸塩ユニットおよび3つの酢酸塩ユニット、ならびに通常は見られないヒドロキシル化された2-カーボンエキステンダーユニット（「グリコール酸ユニット」）を組み込んで19員大環状ラクタムを形成することによって進行する。続いて、この初期のプロアンサマイトシンが一連のポストPKS修飾を受けて、3つのメチル基、1つのハロゲン、1つのカルバモイル基、1つのエポキシ基、および1本のエステル側鎖が導入される。
【００１５】
アンサマイトシン生合成遺伝子クラスターの同定およびクローニング
A.プレチオスム種アウランチクム ATCC 31565におけるAHBAおよびアンサマイトシン生合成のための遺伝子の同定には、異種ハイブリダイゼーションを利用した。アミコラトプシス・メディテルラネイ S699由来のリファマイシンAHBAシンターゼをコードするrifK遺伝子を用いた最初のサザンブロット分析の結果（Kimら、J. Biol. Chem. 273:6030-6040 [1998]）、ゲノム内に2つの異なるrifK相同DNA断片が認められた。制限酵素であるBglII、EcoRI、およびSacI (S)を用いて、合計250Kbの連続DNAをクローニングしてマッピングし、図2Aに示す通り、rifK相同体の位置をそれぞれS20-22およびS33-34の2つの領域に決定した。リファマイシン遺伝子クラスターに由来するその他の5つのAHBA生合成遺伝子相同体（Augustら、Chem.&Biol. 5:69-79 [1998]；およびYuら、J. Biol. Chem. 276:12546-12555 [2001]）も存在し、S20-21（rifG、rifL、およびrifM相同体）およびS33-34（rifJおよびrifN相同体）であるSacI DNA断片と同一または近い位置にマッピングされた。
【００１６】
続いて、マッピングされた250Kb領域内の2つのクラスターの完全なヌクレオチド配列を決定した結果、アンサマイトシン生合成遺伝子が明らかとなった。クラスターI（配列番号：56）およびクラスターII（配列番号：57；GenBankアクセッション番号U33059）は合わせて、96Kbにわたる50個の完全オープンリーディングフレーム（ORF）と2つの部分ORFを含むことが示された（図2Aおよび図2Bを参照されたい）。配列決定された遺伝子およびそれらの産物の推定される機能を表1および表2に列記する。
【００１７】
AHBA遺伝子相同体の必須機能を扱いA.プレチオスムにおけるアンサマイトシン生合成遺伝子クラスター（asm）の境界を明らかにするために、2つの遺伝子破壊を実施例3に示す通り実施した。rifK-MおよびrifG相同体を持つ35.3KbのSacI DNA断片（S16-24）がゲノムから欠失したHGF056変異株（図2Aを参照されたい）は、もはやAHBA、アンサマイトシンP-3、またはいかなるアンサマイトシン関連代謝物も産生できなかった。しかし、アンサマイトシン産生は、培養にAHBAを補充することによって回復することが可能であった（表3を参照されたい）。一方、2つのrifK相同体間の領域にSacI DNA断片30.2Kbの欠失（S22-27）を有する変異型HGF057の場合、アンサマイトシン産生に顕著な影響はなかった（図2Aを参照されたい）。第二のrifK相同体およびそれに関連するAHBA合成遺伝子（S33-34）がS20-21の領域から65Kb離れているという事実にも関わらず、S30-35およびS39-45にわたる2つの大きな連続領域はタイプIのPKSプローブに対してハイブリダイゼーションの強力なシグナルを示した。2つのrifK相同体間において、無作為配列決定によりカルバモイルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼおよびハロゲナーゼ相同体が検出された（Freibergら、Nature 387:394-401 [1997]；HaraおよびHutchinson, J. Bacteriol. 174:5141-5144 [1992]；ならびにDairiら、Biosci. Biotechnol. Biochem. 59: 1099-1106 [1995]）。
【００１８】
（表１）アンサマイトシン遺伝子クラスターIにおけるORFの推定機能
2005510226.tif 000002
2005510226.tif 000003
【００１９】
（表２）アンサマイトシン遺伝子クラスターIIにおけるORFの推定機能
2005510226.tif 000004
【００２０】
（表３）アクチノシネマ・プレチオスム変異型
2005510226.tif 000005
【００２１】
asmポリケチドシンターゼ遺伝子
4つの大きなORFであるasmA-Dは、ローディングドメインおよび多機能性ポリケチドシンターゼ（PKS）の7つの鎖伸長モジュールをコードしている。AsmA（483.1kDa）は、アシル運搬タンパク質（ACP）およびアデニルトランスフェラーゼからなる鎖開始ドメインを含み（Admiraalら、Biochem. 40:6166-6123 [2001]）、これはおそらく開始ユニットであるAHBA、およびアンサマイトシンポリケチド鎖伸長において予想される最初の2つのモジュールの活性化に必要である。AsmB（313.2kDa）、AsmC（164.6kDa）、およびAsmD（339.3kDa）は、アンサマイトシンのポリケチド部分を完成するための鎖伸長の継続に必要な次の5つのモジュールを含む。AsmBのモジュール3のアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメインは通常見られないヒドロキシル化された2-カーボンエキステンダーユニットの認識を担うことが予測されるが、通常見られないいかなる配列シグネチャーも示さず、マロニル-またはメチルマロニル-CoAエキステンダーユニットを認識するその他のATドメインと識別することができる。位置決定されたasmDの直近の下流はasm9であり、これはリファマイシン生合成遺伝子クラスターに由来するrifFの遺伝子産物、および芳香族アミンのアミノ基をアセチル化する解毒酵素のアリルアミンN-アセチルトランスフェラーゼと極めて高い配列類似性を持つタンパク質をコードしている（Yuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9051-9056 [1999]；およびStratmannら、Microbiol. 145:3365-3375 [1999]）。十分に伸長したポリケチド鎖のカルボキシル末端をAsmDからAsm9タンパク質の保持されているシステイン残基に移動し、続いて19員大環状ラクタムであるプロアンサマイトシンを遊離させるために、芳香族分子のアミノ基と分子内でアミド結合を形成すると考えられている（図5を参照されたい）。
【００２２】
アンサマイトシン生合成における同定されたPKS遺伝子の機能を探索するために、変異型HGF051を作製し、asmB遺伝子のコード領域から2923アミノ酸残基を除去して、5つのアミノ酸残基PSNSIで置換した（配列番号：53および図3）。変異型HGF051はアンサマイトシンP-3またはバイオアッセイ法ならびにHPLCおよびLC-MS分析に基づく任意の既知の関連化合物を生成できなかった。asm生合成遺伝子クラスターに由来するクローニングされたPKS遺伝子の機能的受容能を、S.コエリコロル Yu105における二方向性actI/actIIIプロモーターおよびactII-orf4レギュレーターの制御下での異種発現によってさらに探索した（Yuら、J. Biol. Chem. 276:12546-12555 [2001]）。rifクラスターに由来するAHBAの合成に必要なすべての遺伝子を持つpHGF7612（Yuら、J. Biol. Chem. 276:12546-12555 [2001]）、およびasmAを持つpHGF7545の同時形質転換体では、ポリケチド関連中間体の蓄積はなかった。しかし、asmABカセットであるpHGF7547を用いてAHBA合成遺伝子を同時発現させると、そのN-アセチル誘導体としてのトリケチドが得られて、構造はAsmAタンパク質単独で構築される産物に期待される構造と一致する（図4を参照されたい）。
【００２３】
asmAHBA生合成遺伝子
上記のサザンハイブリダイゼーションによるマッピングに一致して、リファマイシン、マイトマイシン、アンサトリエニン、およびナフトマイシンの生合成遺伝子クラスターからクローニングされた遺伝子とほぼ等しい7つのAHBA生合成遺伝子（Augustら、Chem.&Biol. 5:69-79 [1998]；Maoら、Chem.&Biol. 6:251-263 [1999]；およびChenら、Eur. J. Biochem. 261:98-107 [1999]）が2つのグループに同定された（図2Bを参照されたい）。遺伝子asm22、sdm23、およびasm24は、asmABに近いことが明らかとなった。asm24はasmAの上流に位置して、asmAB PKS遺伝子と同じ転写ユニットを共有する可能性がある。その想定産物はリファマイシンAHBAシンターゼ（RifK）と極めて高い類似性を示し、これは5-デオキシ-5-アミノ-3-デヒドロシキメートの(アミノDHS）からAHBAへの脱水を触媒することが実証されている（Kimら、J. Biol. Chem. 272:6030-6040 [1998]）。asm24の上流に位置して反対方向に転写されるasm23の遺伝子は、シキミ酸経路のII型デヒドロキネートデヒドラターゼ、およびAHBA生合成において5-デオキシ-5-アミノ-3-デヒドロキネート（アミノDHQ）のアミノDHSへの脱水を触媒するRifJに相同なタンパク質をコードする（Yuら、J. Biol. Chem. 276:12546-12555 [2001]）。マイトマイシンおよびリファマイシンの生合成クラスターのMitSおよびRifNに対して最も高い類似性を示すasm22（Augustら、Chem.&Biol. 5:69-79 [1998]；Yuら、J. Biol. Chem. 276:12546-12555 [2001]；およびMaoら、Chem.&Biol. 6:251-263 [1999]）はアミコラトプシス・メディテルラネイのカノサミンキナーゼであるRifN（Arakawaら、J. Am. Chem. Soc. 124:10644-10645 [2002]）およびグルコース抑制に関与するストレプトマイセス・コエリコロルおよび巨大菌のグルコースキナーゼ（Angellら、Mol. Microbiol. 6:2833-2844 [1992]；およびSpathら、J. Bacteriol. 179:7603-7605 [1997]）に対して顕著な類似性を示す。asm43-47の遺伝子は単一のオペロンに配置されていると思われる。asm46が既知のいずれの遺伝子とも配列類似性を示さないことを除いて、asm43-47の想定タンパク質は、それぞれ、AHBAシンターゼ（RifK）、糖成分のヒドロキシル基とカルボニル基の間の相互変換に関与しているオキシドレダクターゼ（RifL）（Loosら、FEMS Microbiol. Lett. 107:293-298 [1993]）、グリコール酸酸化に関与するホスホグリコール酸ホスファターゼ（RifM）（Schaferjohannら、J. Bacteriol. 175:7329-7340 [1993]）、およびシキミ酸生合成経路の初期段階に関与するデヒドロキネートシンターゼ（RifG）を含むAHBA生合成遺伝子の既知の産物の配列と高い相同性を示す。面白いことに、双方の単離されたAHBAシンターゼ遺伝子は機能的に適格なAHBAシンターゼであることが示された。asm43は大腸菌内で発現してAHBAシンターゼ活性を示したが、asm24はA.メディテルラネイのrifK変異型の相補体であり、リファマイシン産生を回復させた。驚いたことに、徹底した配列決定およびサザンハイブリダイゼーション分析に関わらず、デノボでのAHBA生合成に必要なRifHに相当する3,4-ジデオキシ-4-アミノ-D-アラビノ-ヘプツロソネート7-リン酸（アミノDAHP）シンターゼ遺伝子は、asmクラスターを含む250KbのDNAクローニング領域には見出されなかった。
【００２４】
ヒドロキシル化2-カーボンエキステンターユニットの生合成に関与する遺伝子
asmCD-9遺伝子の同定された下流域4.3Kbである一連の4つの連続遺伝子asm13-16は、グラム陽性嫌気性細菌における酪酸産生およびブタノール産生の中心発酵経路ならびに真核生物における脂肪酸のβ-酸化に関連する産物をコードする遺伝子と相同である。asm13およびasm15の想定産物は、それぞれ、NAD依存性3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼおよびアシル-coAデヒドロゲナーゼと類似性を示す（Younglesonら、Gene 78:355-364 [1989]；およびMatsubaraら、J. Biol. Chem. 264:16321-16331 [1989]）。asm13およびasm14は、転写によって連結される可能性を持っている。asm14の産物（9.7kDa）はアシル運搬タンパク質、特にD-アラニル-リポテイコ酸合成において機能するD-アラニル運搬タンパク質に類似する（Boydら、J. Bacteriol. 182:6055-6065 [2000]）。asm16は、バシラス・ハロドゥランス(Bacillus halodurans)における脂肪酸生合成遺伝子クラスターの一つの遺伝子によってコードされている特徴付けされていないタンパク質に関連することが見出された（Takamiら、Biosci. Biotechnol. Biochem. 63:452-455 [1999]）。
【００２５】
asm15遺伝子がaac(3)IV遺伝子の挿入によって切断された変異型のHGF053が作出されて、エステル側鎖前駆物質であるイソ酪酸が存在する場合でもアンサマイトシンが産生されないことが示された。しかし、HPLC分析、ES-MS分析、およびNMR分析では、発酵物中に少量の10-デメトキシアンサマイトシンP-3が存在することが明らかとなった。この結果によって、asm15遺伝子産物がC-3エステル側鎖の形成に関与する可能性は排除される。代わって、おそらくasm17をさらに含む可能性のあるasm13-16サブクラスターが通常は見られないヒドロキシル化したポリケチドエキステンダーユニットの生成を司り、このユニットはアンサマイトシン骨格のC-9およびC-10に組み込まれていることを示している。見かけ上、asm13-16と共に転写されるasm17はO-メチルトランスフェラーゼをコードしている。最近、ヒドロキシル化された2-カーボンエキステンダーユニットを含むもう一つのマクロライド抗生物質であるFK-520の生合成遺伝子クラスターの分析により、asm13-17に類似した一連の5つの遺伝子fkbGHIJKが明らかとなっている（Wuら、Gene 251:81-90 [2000]）。このことは、asm13-17が通常は見られないヒドロキシル化された2-カーボンポリケチド鎖エキステンダーユニットの合成に関与するという知見をさらに裏付けるものである。
【００２６】
プロアンサマイトシンの合成後修飾に関する遺伝子
同定されたasmクラスターは、プロアンサマイトシンから最終的なアンサマイトシン構造のさらなる生成に関与すると思われる多くの遺伝子を含む。asm19の想定産物は、エステル結合の短いアシル鎖をマクロライドに接続させるそれぞれストレプトマイセス・ミカロファシエンス(Streptomyces mycarofaciens)およびストレプトマイセス・テルモトレランス(Streptomyces thermotolerans)に由来するMdmBおよびAcyAのような、3-O-アシルトランスフェラーゼファミリーに属する（Dairiら、Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:1099-1106 [1995]；およびEppら、Gene 85:293-301 [1989]）。アンサマイトシンの3-O-アシル基を接続させるアシルトランスフェラーゼとしての機能的割り付けは、フレーム欠失における内的549bpを介してasm19を不活化することによって確認された。変異型HGF052はアンサマイトシンP-3を産生しないが、対応する3-アルコールであるメイタンシノールを蓄積する代わりに、N-デメチル-デスエポキシ-メイタンシノールとして同定される化合物を合成した。
【００２７】
asm21は根粒菌属種（Freibergら、Nature 387:394-401 [1997]）およびダイズ根粒菌（Lukaら、J. Biol. Chem. 268:27053-27059 [1993]）の根粒形成タンパク質、ならびにセファマイシンおよびノボビオシン生合成のO-カルバモイル化工程を実施するストレプトマイセス・クラウリゲルス(Streptomyces clavuligerus)のcmcHおよびストレプトマイセス・スフェロイデス(Streptomyces spheroides)のnovNによりコードされるタンパク質（Coqueら、Gene 162:21-27 [1995]；およびSteffenskyら、Antimicrob. Agents. Chemother. 44:1214-1222 [2000]）と高い類似性を示す。関連する類似体化学に基づいて、asm21はアンサマイトシンの環状カルビノールアミド基を導入するという推定機能を持つものとされる（Hatanoら、Agric. Biol. Chem. 49:327-333 [1985]）。
【００２８】
asm30遺伝子産物は二機能性P450-NADPH：P450レダクターゼ、巨大菌に由来する脂肪酸モノオキシゲナーゼ（P450BM-3）に酷似している（Ruettingerら、J. Biol. Chem. 264:10987-10995 [1989]；およびSevrioukovaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1863-1868 [1999]）。ヘム-P450およびFMN/FAD含有レダクターゼドメインの双方は共に108.6kDaの単一のポリペプチド上で結合している。P450BM-3は自給自足型の脂肪酸ヒドロキシラーゼとして機能し、ラウリン酸、ミリスチン酸、およびパルミチン酸をオメガ-1、オメガ-2、およびオメガ-3ヒドロキシ類似体に転換する。類似点として、Asm30はアンサマイトシンのC-4およびC-5で起こる二重結合のエポキシ化を担うと考えられている。
【００２９】
アンサマイトシン生合成には、アリル窒素ならびにC-10およびC-20の酸素の3つのメチル化が必要であり、いずれもS-アデノシル-L-メチオニン（AdoMet）をメチル供与体として利用する（Hatanoら、Agric. Biol. Chem. 49:327-333 [1985]）。3つのAdoMet-依存性メチルトランスフェラーゼ遺伝子であるasm7、asm10、およびasm17がasmクラスター内で同定された。asm17の産物は、ストレプトマイセス・ミカロファシエンスのミデカマイシンクラスターに由来するMdmC（HaraおよびHutchinson、J. Bacteriol. 174:5141-5144 [1992]）、ストレプトマイセス・テルモトレランスのカルボマイシンクラスターに由来するO-メチルトランスフェラーゼ（Eppら、Gene 85:293-301 [1989]）、および植物に由来するカフェオイル-CoA 3-O-メチルトランスフェラーゼ（Martzら、Plant Mol. Biol. 36:427-437 [1998]）に類似するO-メチルトランスフェラーゼ相同体である。asm13-16に結合することから、asm17はC-10の位置にO-メチル基を導入するメチルトランスフェラーゼをコードする可能性が高いと考えられる。asm7はストレプトマイセス・アルボニゲル(Streptomyces alboniger)に由来するプロマイシンO-メチルトランスフェラーゼ（Lacalleら、Gene 109:55-61 [1991]）およびその他のストレプトマイセス抗生物質生合成O-メチルトランスフェラーゼ（Maoら、Chem.&Biol. 6:251-263 [1999]；およびMadduriら、J. Bacteriol. 175:3900-3904 [1993]）に極めて密接に関連する。この遺伝子はN-メチル化または芳香族（C-20）のO-メチル化を担う可能性がある。asm10はヒト型結核菌およびS.コエリコロルに由来する機能不明のタンパク質と顕著な類似性を示し、ストレプトマイセス・グラウセンス(Streptomyces glaucescens)におけるテトラセノマイシンC合成に関与するO-メチルトランスフェラーゼであるTcmPと弱い類似性を共有する（Deckerら、J. Bacteriol. 175:3876-3886 [1993]）。
【００３０】
asm10遺伝子はasm11およびasm12と共に多シストロン的に転写されると思われる。asm11およびasm12の想定産物はモノオキシゲナーゼおよびハロゲナーゼと類似性を示し、それぞれ、テトラサイクリン6-ヒドロキシル化および環状塩素化を担うストレプトマイセス・アウレオファシエンス(Streptomyces aureofaciens)のCts8およびCts4の等価物である（Dairiら、Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:1099-1106 [1995]）。asm11の機能は不明であるが、C-4／C-5のエポキシ化を触媒するための、asm30によってコードされるP450モノオキシゲナーゼの代替候補である可能性がある。Asm12をC-19に塩素を導入する芳香族ハロゲナーゼとして割り当てることは、asm12を不活化してもはやアンサマイトシンP-3を産生しない変異型であるHGF054を得ることによって確認された。HGF054は単一の化合物ではなく一連の19-デスクロロ-アンサマイトシン誘導体を蓄積し、ハロゲンの存在がいくつかのその他のポストPKS後飾反応の発生における絶対条件ではないことを示す。いずれにしても、機序の理解は本発明を利用するために必須ではない。
【００３１】
以上のように、A.プレチオスムおよび本発明の生成物に由来するasm遺伝子クラスターのクローニングは、高い有効性を持つ潜在的抗腫瘍薬としての評価のための新規メイタンシノイドの遺伝子工学に必要とされるツールを提供する。本明細書に記載する通り、この方法ではasm遺伝子を同定するためのプローブとして固有のリファマイシン生合成遺伝子（例えば、rifKおよびその他のAHBA合成遺伝子）を利用した。驚いたことに、A.プレチオスムにおいて68Kb離れて位置する2つのrifK相同体が見出された。周辺のDNAの配列分析の結果、いずれの相同体もAHBA産生に必要なフルセットの遺伝子に付随しないことが示された（Yuら、J. Biol. Chem. 276: 12546-12555 [2001]）。クラスターIにおいて同定されたrifK相同体は、アンサマイトシン生合成において予想される遺伝子のほぼ完全な補体に関連する（図5を参照されたい）。これらは、完全なI型ポリケチドシンターゼ（asmA-D）およびそのダウンローディング(downloading)酵素（asm9）の遺伝子、ならびにハロゲナーゼ（asm12）、カルバモイルトランスフェラーゼ（asm21）、3つのメチルトランスフェラーゼ（asm7、asm10、およびasm17）、アシルトランスフェラーゼ（asm19）をコードする予想される下流のプロセシング反応のすべての候補遺伝子、ならびにエポキシド化酵素の2つの候補遺伝子（asm11およびasm30）を含む。さらに、複数の可能性のある調節遺伝子およびトランスポート遺伝子ならびにグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子（asm25）が存在し、これらはasm41と共にグリコシル化／脱グリコシル化排出／抵抗性の系に含まれる可能性がある考えられているが（Vilchesら、J. Bacteriol. 174:161-165 [1992]）、これらの遺伝子がアンサマイトシンの生合成に関与するかどうかは今後解明されなければならない。
【００３２】
クラスターIには、AHBA形成に不可欠であることが知られているそれぞれオキシドレダクターゼおよびホスファターゼをコードするrifLおよびrifMの相同体のasm44およびasm45（Yuら、J. Biol. Chem. 276:12546-12555 [2001]）、ならびにアミノDHQシンターゼ遺伝子（asm47）がない；これらはクラスターIIの第二のrifK相同体に関連する。従って、アンサマイトシンの形成にはクラスターIおよびIIの双方が必要とされるはずであり、このことはそれぞれクラスターIのasmB遺伝子およびクラスターIIを含む大きなDNA断片の欠失によって確認された。アンサマイトシン産生はクラスターII欠失変異型であるHGF056ではAHBAを補充することによって回復することが可能であることから、クラスターIIは開始ユニットであるAHBAの形成に必要な遺伝子を含む。変異型HGF057ではasm37およびasm38の一部を含むこの領域の欠失が生物体に識別可能な表現型の変化を惹起しないため、2つのクラスター間に位置する30KbのDNAはアンサマイトシン形成または増殖維持のいずれかに必須の遺伝子を持たない。asm遺伝子が2つの異なるグループに分割される理由は明らかでない。それらが一時期、単一のクラスターとして存在し、比較的最近の事象においてゲノム配列の再構成によって分離されたと推測することができる。しかしながら、本発明の作製および使用のためには、機序を理解することは必ずしも必須でない。
【００３３】
RifKがアミノDHSを芳香族化する十分に特徴付けされたデヒドラターゼ活性（Kimら、J. Biol. Chem. 272:6030-6040 [1998]）およびアミコラトプシス・メディテルラネイのAHBA形成において窒素を炭水化物前駆体に導入するアミノトランスフェラーゼ活性（Yuら、J. Biol. Chem. 276: 12546-12555 [2001]）の2つの酵素活性を有する可能性があることを示す徴候がある。asm遺伝子クラスターに2つのrifK相同体が存在することはこの知見と一致する。双方の遺伝子産物はAHBAシンターゼとして機能的に適格であるが、それらはAHBA生合成における異なる反応、一つは窒素の導入、もう一つはその後の芳香族化反応のために最適化される可能性がある。面白いことに、asm遺伝子クラスターにはrifH相同体がない。アミノDAHPシンターゼ遺伝子がないことは、ストレプトマイセス・ラヴェンドゥラエ(Streptomyces lavendulae)に由来するマイトマイシンC生合成遺伝子クラスターについても報告されている（Maoら、Chem.&Biol. 6:251-263 [1999]）。従って、対応する初期段階のシキミ酸経路の酵素であるDAHPシンターゼはアミノDAHPの形成に関与して、アンサマイトシンおよびマイトマイシンの生合成に至る重要な進化的架橋を提供する。実際、一つの植物型DAHPシンターゼ遺伝子がA.プレチオスムにおいて同定されており、後にasmクラスターには結合しないことが示された。
【００３４】
アンサマイトシンのポリケチド骨格の形成は、rifクラスターのドメインに酷似する芳香族負荷ドメイン（Augustら、Chem.&Biol. 5:69-79 [1998]；およびSchuppら、FEMS Microbiol. Lett. 159:201-207 [1998]）および7つの鎖伸長モジュールを持つI型PKSをコードする38Kbにわたる4つの遺伝子によって触媒される。各モジュールは、分析した他のI型PKSのドメインと対応する配置を持つ鎖伸長および鎖修飾のための予測される機能ドメインを含み（Hopwood, Chem. Revs. 97:2465-2497 [1997]）、それらのモジュールは直線的に配置されて生合成構築プロセスにおいて機能する（図5を参照されたい）。PKS遺伝子asmABは、鎖の開始および伸長のための基質の合成および下流のプロセシングに関与するもう一つのasm生合成遺伝子セットによってasmCDから分離される。最後のPKS遺伝子には、「ダウンローディング（downloading）」酵素としてリファマイシン系を用いた研究に基づいて認識されるアミドシンターゼをコードする遺伝子が続く（Yuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9051-9056 [1999]；およびStratmannら、Microbiology 145:3365-3375 [1999]）。これはPKSからの完成されたポリケチド鎖の遊離、および分子内でのアミド結合形成による大環式ラクタムへの環化を触媒する。従って、AsmABCD＋9は、アンサマイトシンの最初の完全な環状ポリケチド前駆物質である仮定的プロアンサマイトシンの形成を触媒するために必要な最小限の酵素的仕組みを構築すると考えられる。
【００３５】
asmPKSによって合成されるポリケチドは2つの珍しい特徴を示す。一つは、第三の鎖伸長工程での稀なヒドロキシル化2-カーボンエキステンダーユニットの組み込みである。このような「グリコシル化」ユニットは、ゲルダナマイシン（Haberら、J. Am. Chem. Soc. 99:3541-3544 [1977]）、ロイコマイシン（Omuraら、J. Antibiot. 36:611-613 [1983]）、ソラフェン（Hillら、J.C.S. Chem. Commun. 2361-2362 [1998]）、FK-520およびFK-506（Byrneら、Dev. Ind. Microbiol. 32:29-45 [1993]）ならびにコンカナマイシンA（BindseilおよびZeeck, Liebigs Ann. Chem. 305-312 [1994]）のような他の多くの抗生物質に見られる。報告された様々な食餌実験からは、それらの起源は完全には明らかでない（Hatano Agric. Biol. Chem. 49:327-333 [1985]；Haber J. Am. Chem. Soc. 99:3541-3544 [1977]；Omuraら、J. Antibiot. 36:611-613 [1983]；Hillら、Chem. Comm. pp. 2361-2362 [1998]；Byrneら、Dev. Ind. Microbiol. 32:29-45 [1993]；BindseilおよびZeeck、Liebigs Ann. Chem. pp. 305-312 [1994]；ならびにOnoら、J. Antibiot. 51:1019-1028 [1998]）。このエキステンダーのC-2の水酸基は通常はメチル化されるが、この原則にはアフラスタチン（Onoら、J. Antibiot. 51: 1019-1028 [1998]）のように例外がある。オペロンを形成するasm13-17の5つの遺伝子のサブクラスターは、FK-520クラスター内の対応する遺伝子について先に提唱されている通り（Wuら、Gene 251:81-90 [2000]）、この特定の鎖伸長工程のための基質形成を担うことが明らかである。この示唆を支持してアンサマイトシンC-3エステル側鎖の形成における代替機能を排除する証拠は、asm15の不活化から得られたものであり、このasm15の不活化では、非効率的ではあるがヒドロキシマロン酸鎖伸長ユニットの代わりにマロン酸が組み込まれる。このサブクラスター内の遺伝子の一つであるasm14は、ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）基の転移によって活性化された後（Lambalotら、Chem.&Biol. 3:923-936 [1996]）にヒドロキシマロン酸エキステンダーユニットをチオエステルとしてPKSに運搬することのできるアシル運搬タンパク質をコードする。asm14は、アミノアシル基またはヒドロキシアシル基を運搬する可能性が高いペプチジル運搬タンパク質をコードすることから、PKSよりも非リボゾーム型ペプチドシンターゼ（NRPS）におけるACPに極めて類似する。鎖伸長基質のヒドロキシマロニル-ACPはこのACP上で合成されることが示唆されている（Wuら、Gene 251:81-90 [2000]）。メチルトランスフェラーゼ遺伝子のasm17はこれらの反応を担うオペロンの一部であることから、ヒドロキシル基のメチル化も合成の一部であり、鎖伸長基質はメトキシマロニル-ACPであることが考えられる。
【００３６】
アンサマイトシン構造の第二の珍しい特徴は、アンサ環の二重結合の位置が通常のPKSプロセシングが起こるC-10およびC-12ではなくC-11およびC-13の位置に存在する点である。この二重結合の珍しい位置は、完全ポリケチドの合成およびそのPKSからの放出後に生じる異性化の結果であり、またはポリケチド構築プロセスの一環としてPKS自体で生じる可能性がある。asmPKSのモジュール2および3、またはさらに言えば任意のモジュールにおける修飾ドメインは、何らかの通常は見られない触媒機能を示唆するような特徴を示さない。特に、DH3は通常の機能的に適格なデヒドラターゼドメインの配列シグネチャーを持つ。一方、合成後修飾反応としての二重結合の異性化を触媒することのできる一つまたは複数の酵素をコードする可能性のあるPKS領域の外部に、明らかな候補遺伝子はない。二重結合の「異常な」位置は、アンサマイトシンのポリケチド骨格のC-10の位置における余剰の酸素官能基、ヒドロキシまたはメトキシの存在に関連すると考えられる。しかし、asm15変異型において「異常な」位置に二重結合を持つ10-デメトキシアンサマイトシンが形成されることから、このような関連性は排除される。いずれにしても、本発明の作製および使用には、機序の理解は必ずしも必要でない。
【００３７】
仮定的プロアンサマイトシンであるasmPKSの最初の環式産物の正確な構造（図5を参照されたい）は、二重結合がポリケチドの構築および放出の前または後に移動するかどうか、ならびに第三の鎖伸長がヒドロキシマロン酸またはメトキシマロン酸を組み込むかどうかに依存するので定かではない。従って、少なくとも4つの異なる構造物が形成されるのが妥当である可能性がある。これらの可能性について調べるために、異種宿主でありS.コエリコロルにおいてasmPKS遺伝子と前駆物質の供給を確保する遺伝子カセットの発現について検討する。asmABに加えてAHBA合成カセットを発現している形質転換体によるN-アセチルトリケチドの合成は、この目的における最初の工程である。AsmA単独によって合成されるはずのこの産物の蓄積がAsmBタンパク質の付加的な存在を必要とするという不思議な事実は、このPKSの作用の興味深い面を示唆している。明らかに、AsmAの産物はタンパク質上の最後のACPドメインに付着している限りは酵素から遊離できない（図4を参照されたい）。しかし、基質が不足して次の鎖伸長反応が起こらない場合には、構築ラインの次のKSに転移されると偶発的な遊離の余地が生じる。
【００３８】
本発明の開発中に実施された実験は、天然産物に関連するものよりも良好な抗腫瘍活性とヒト毒性との分離達成を目的として、化学的方法では利用することのできない構造変化を含む新しいメイタンシノイドを作出するためのアンサマイトシン生合成経路の代謝工学のためのステージを用意した。本発明は、高等植物に見られるメイタンシノイドの生合成起源（例えば、おそらく微生物からの側方遺伝子伝達に起因してポリケチド骨格が植物自身によって合成されるかどうか、または植物がそれを内生微生物たはその他の関連する微生物から獲得するのかどうか）を評価するための方法も提供する。いずれにしても、本発明の作製および利用には機序の理解は必ずしも必須ではない。
【００３９】
定義
本発明の理解を助けるために、多くの用語が以下に定義および考察されている。
【００４０】
本明細書で用いられる「野生型」という用語は、自然発生性の起源から単離した場合、その遺伝子、遺伝子産物、または生物の特徴を持つ遺伝子、遺伝子産物、または生物を意味する。野生型遺伝子は集団内で最も高頻度に認められる遺伝子であり、従って、恣意的に遺伝子の「正常」型または「野生型」と称される。
【００４１】
これに対して、「変異型」および「突然変異」という用語は、野生型の遺伝子、遺伝子産物、または生物と比較した場合、配列およびまたは機能上の特性において修飾を示す（即ち、特性が変化した）遺伝子、遺伝子産物、または生物を意味する。変異型は遺伝子操作によって作出することが可能であり、あるいは単離されて野生型の遺伝子、遺伝子産物、または生物に比べて特性が変化しているという事実によって単離および識別される自然発生性の変異型である可能性がある。本発明の好ましい態様において、アクチノシネマ・プレチオスムの変異型はアンサマイトシン遺伝子クラスターの内因性遺伝子の破壊を伴って提供され、この遺伝子破壊は一つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって達成される。
【００４２】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆物質（例えば、asmA、asmB、asmC、asmDなど）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、DNA）配列を意味する。ポリペプチドは完全長のコード配列によって、または完全長もしくは断片の所望の活性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など）が保持限りコード配列の任意の部分によってコードされることが可能である。この用語はまた、構造遺伝子のコード領域、ならびに遺伝子が完全長mRNAの長さに対応するように、コード領域に隣接して5'および3'末端の双方に両端約1kbの距離で位置する含有配列（including sequences）を内包する。コード領域の5'に位置してmRNAに存在する配列は5'非翻訳配列を意味する。コード領域の3'または下流に位置してmRNAに存在する配列は、3'非翻訳配列を意味する。「遺伝子」という用語は、遺伝子のcDNAおよびゲノムDNAの双方を内包する。遺伝子のゲノム型またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列を間に挟むコード領域を含む。イントロンは核RNA（hnRNA）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンはエンハンサーのような調節要素を含む可能性がある。イントロンは核または一次転写産物から除去または「スプライスアウト（spliced out）」され、従ってイントロンはメッセンジャーRNA（mRNA）転写物に含まれない。mRNAは、翻訳に際して機能して、新生ポリペプチドにおける配列、即ち、アミノ酸の順序を指定する。
【００４３】
特に、「asm遺伝子」という用語は、完全長のasmヌクレオチド配列（例えば、配列番号：1〜41に含まれる）を意味する。しかし、この用語は完全長のasmヌクレオチド配列内のその他のドメイン同様、asm配列の断片も内包することを意図する。さらに、「asmヌクレオチド配列」または「asmポリヌクレオチド配列」という用語は、DNA、cDNA、およびRNA（例えば、mRNA）の配列を含む。
【００４４】
本明細書においてアミノ酸配列が自然発生性のタンパク質分子のアミノ酸配列に言及する際に記載される場合、アミノ酸配列およびポリペプチドまたはタンパク質のような類似物はアミノ酸配列を記載されたタンパク質分子に関連する完全な天然アミノ酸配列に限定することを意図しない。
【００４５】
本明細書で用いられるように、「をコードする核酸分子」、「をコードするDNA配列」、および「をコードするDNA」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を意味する。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。従って、DNA配列はアミノ酸配列をコードする。
【００４６】
本明細書で用いられる「相補的な」または「相補性」という用語は、塩基対則により関連づけられるポリヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）に言及する際に用いられる。例えば、「A-G-T」という配列は「T-C-A」の配列に対して相補的である。相補性は「部分的」である可能性があり、この場合、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対則に従って対応する。または、核酸と核酸の間に「完全」もしくは「総」相補性がある可能性がある。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの有効性および強度に大きく影響する。このことは、検出方法が核酸間の結合に依存する場合と同様に、増幅反応において特に重要である。
【００４７】
本明細書で用いられるように、「ハイブリダイゼーション」という用語は相補的核酸の対合に言及する際に用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（即ち、核酸間の結合の強度）は核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのTm、および核酸内のG：C比などの要因によって影響を受ける。
【００４８】
本明細書で用いられるように、「Tm」という用語は「融点」に言及する際に用いられる。融点は、二本鎖核酸分子の集団が、半分が一本鎖に解離する温度である。核酸のTmを算出するための等式は、当技術分野において周知である。標準的な参照により示される通り、核酸が1M NaClの水溶液である場合、Tm値の単純推定値は等式：Tm = 81.5 + 0.41(G + C (%))により算出することができる（例えば、AndersonおよびYoung, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization [1985]を参照されたい）。その他の参照には、Tmの算出において構造および配列の特性を考慮に入れるより複雑な計算方法が含まれる。
【００４９】
本明細書で用いられるように、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる、温度、イオン強度、および有機溶媒のようなその他の化合物の存在の条件に言及する際に用いられる。当業者は、「ストリンジェンシー」の条件は記載されるパラメータが個々にまたは同時に変動することによって変化する可能性があることを認識すると考えられる。「高ストリンジェントな」条件の場合、核酸塩基対合は相補的塩基配列を高い頻度で有する核酸断片間でのみ生じる（例えば、「高ストリンジェントな」条件下でのハイブリダイゼーションは、約85〜100％の同一性、好ましくは約70〜100％の同一性を持つ相同体間で生じることができる）。中程度にストリンジェントな条件の場合、核酸塩基対合は中間の頻度の相補的塩基配列を持つ核酸間で生じる（例えば、「中程度にストリンジェントな」条件下でのハイブリダイゼーションは約50〜70％の同一性を持つ相同体間で生じることができる）。従って、遺伝的に異なる生物に由来する核酸は、相補的配列の頻度が一般に低いために、「弱い」または「低い」ストリンジェンシーがしばしば必要とされる。
【００５０】
核酸ハイブリダイゼーションに言及する際に用いられる「高ストリンジェントな条件」および「ストリンジェントな条件」という用語は、約500ヌクレオチドの長さのプローブが用いられる場合、5×SSPE（43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O、および1.85g/l EDTA、NaOHを用いてpHを7.4に調整）、0.5％SDS、5×デンハート試薬、および100μg/ml変性サケ精子DNAからなる溶液中、42℃での結合またはハイブリダイゼーションと、その後の0.1×SSPE、1.0％SDSを含む42℃の溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【００５１】
核酸ハイブリダイゼーションに言及する際に用いられる「中程度にストリンジェントな条件」は、約500ヌクレオチドの長さのプローブが用いられる場合、5×SSPE（43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O、および1.85g/l EDTA、NaOHを用いてpHを7.4に調整）、0.5％SDS、5×デンハート試薬、および100μg/l変性サケ精子DNAからなる溶液中における42℃での結合またはハイブリダイゼーション、ならびにその後の1.0×SSPE、1.0％SDSを含む42℃の溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【００５２】
「低ストリンジェントな条件」は、約500ヌクレオチドの長さのプローブが用いられる場合、5×SSPE（43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O、および1.85g/l EDTA、NaOHを用いてpHを7.4に調整）、0.1％SDS、5×デンハート試薬［50×デンハート試薬は500ml当たり次を含む：5g Ficoll（400型、Pharmacia）、5g BSA（Fraction V；Sigma）］、および100μg/l変性サケ精子DNAからなる溶液中における42℃での結合またはハイブリダイゼーション、ならびにその後の5×SSPE、0.1％SDSを含む42℃の溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【００５３】
「サザンブロット」という用語は、DNAを大きさに基づいて分画化するためのアガロースゲルまたはアクリルアミドゲル上でのDNAの分析、およびこれに続くゲルからニトロセルロースまたはナイロン膜のような固相支持体へのDNAの移動を意味する。続いて、固定化されたDNAは、使用するプローブに対して相補的なDNA種を検出するための標識プローブを用いて探索される。DNAは、電気泳動前に制限酵素で切断することができる。電気泳動後、DNAは固相支持体への移動前または移動中に部分的に脱プリンおよび変性させることができる。サザンブロットは分子生物学の標準的ツールである（Sambrookら、Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pp 9.31-9.58 [1989]）。
【００５４】
本明細書で用いられる「ノーザンブロット」という用語は、RNAを大きさに基づいて分画化するためのアガロースゲル上でのRNAの電気泳動、およびそれに続くゲルからニトロセルロースまたはナイロン膜のような固相支持体へのRNAの移動によるRNA分析を意味する。続いて、固定化されたRNAは使用するプローブに相補的なRNA種を検出するための標識プローブを用いて探索される。ノーザンブロットは分子生物学の標準的ツールである（Sambrook,ら、前記、pp 7.39-7.52 [1989]）。
【００５５】
本明細書で用いられるように、「プローブ」という用語は、精製された制限消化産物として自然に生じたか、または合成、組換え、もしくはPCR増幅によって産生されたかを問わず、目的とするもう一つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）を意味する。プローブは一本鎖または二本鎖であることができる。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定、および単離に有用である。本発明で用いられる任意のプローブは、限定されるものではないが酵素（例えば、ELISAおよび酵素に基づく組織化学的アッセイ法）、蛍光性、放射性、および発光のシステムを含む任意の検出システムにおいて検出可能であるように任意の「レポーター分子」で標識されると考えられている。本発明は任意の特定の検出システムまたは標識に限定されることを意図しない。
【００５６】
「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」のように、ヌクレオチドに関連づけて用いられる「単離された」という用語は、同定されて、天然起源内で通常会合している少なくとも一つの混入核酸から分離された核酸配列を意味する。単離された核酸は、自然状態で見られる場合とは異なる形態または状態で存在する。一方、非単離核酸は、自然界で存在する状態で認められるDNAおよびRNAなどの核酸である。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖の形態で存在することができる。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがタンパク質の発現に利用される場合、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは最小限のセンス鎖またはコーディング鎖を含む（即ち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖である可能性がある）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の双方を含むことができる（即ち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖である可能性がある）。
【００５７】
本明細書で用いられるように、（「所与のヌクレオチド配列の部分」のように）ヌクレオチド配列に言及する際に用いられる「部分」という用語は、その配列の断片を意味する。断片のサイズは、12ヌクレオチドから、ヌクレオチド1個を差し引いた全ヌクレオチド配列までの範囲をとることができる。いくつかの態様において、部分という用語は、少なくとも長さ24ヌクレオチドの核酸断片を意味する。好ましい態様において、断片は少なくとも長さ48ヌクレオチドであり、特に好ましい態様においては、断片は少なくとも長さ96ヌクレオチドである。
【００５８】
本明細書で用いられるように、（「所与のタンパク質の部分」のように）タンパク質に言及する際の「部分」という用語は、そのタンパク質の断片を意味する。断片のサイズは、連続した4個のアミノ酸残基から、アミノ酸1個を差し引いた全アミノ酸配列までの範囲をとることができる。いくつかの態様において、部分という用語は少なくともアミノ酸8個の長さのポリペプチドを意味する。好ましい態様において、ポリペプチドは少なくともアミノ酸16個の長さであり、特に好ましい態様においては、ポリペプチドは少なくともヌクレオチド32個の長さである。
【００５９】
本明細書で用いられるように、「遺伝子クラスター」という用語は、機能的に関連する産物をコードする密接に連鎖する一連の遺伝子、および通常ゲノム内で一緒にグループ化される密接に連鎖する一連の遺伝子を意味する。
【００６０】
「遺伝子組換え」という用語は、もう一つの種に由来する少なくとも一つの遺伝子または遺伝子断片が導入されている、または内因性遺伝子が特異的に不活化されている任意の生物を意味する。
【００６１】
「導入遺伝子」は、人工的に細胞に挿入された遺伝子で、細胞、株化細胞、組織または生物のゲノムの一部となる遺伝子を意味する（即ち、安定的に統合されるか、または安定した染色体外要素）。導入される遺伝子は実験的操作によって生物のゲノムに導入される任意の核酸（例えば、遺伝子配列など）とすることが可能であり、導入された遺伝子が自然発生性の遺伝子と同一の位置に存在しない限り、その生物中に見られる遺伝子配列を含むことができる。
【００６２】
「内因性」という用語は、調査中の生物学的な系、種、またはゲノムに固有の遺伝子または遺伝子産物を意味する。「内因性」遺伝子は、本来正常な状態でそれが見られるゲノム以外の起源によってコードされる核酸因子を含まない。これに対して、「外因性」および「異種性」という用語は、調査中の生物学的な系、種、またはゲノムに対して異物である遺伝子または遺伝子産物を意味する。
【００６３】
本明細書で用いられるように、「オープンリーディングフレーム」および「ORF」ならびに「コード配列」という用語は、翻訳開始コドンから終止コドンに至るアミノ酸配列をコードするコドンの直線的配列を意味する。アクチノシネマ・プレチオスムのような細菌の場合、ATGに加えてGTG、TTG、ATT、およびCTGが翻訳開始コドンとして機能する。
【００６４】
本明細書で用いられるように、「生物学的に活性な」という用語は、アンサマイトシン遺伝子クラスターIまたはII由来の遺伝子によってコードされる野生型アクチノシネマ・プレチオスムタンパク質の構造的、制御的、およびまたは生化学的な機能を持つ分子を意味する。いくつかの場合において、生物学的に活性な分子はアンサマイトシン遺伝子の相同体によりコードされ、その他の場合には、生物学的に活性な分子はアンサマイトシン遺伝子の一部によってコードされる。本発明の組成物および方法において用途を見出すその他の生物学的に活性な分子には変異型（例えば、少なくとも一つの欠失、挿入、または置換を持つ変種）アンサマイトシン遺伝子によってコードされるタンパク質が含まれるが、これに限定されるものではない。生物学的な活性は、例えば、アンサマイトシン遺伝子、その誘導体、またはその一部を含む発現ベクターを用いた細胞のトランスフェクションによって、このような活性を欠く細胞におけるアンサマイトシン遺伝子活性の回復（例えば、相補性）または導入によって決定される。アンサマイトシン遺伝子活性の評価に有用な方法には、当技術分野において既知であるペニシリウム・アヴェルラネウム(Penicillium avellaneum)に対するアンサマイトシンの阻害活性の測定を含むバイオアッセイ法が含まれるが、これに限定されるものではない（例えば、HankaおよびBarnett, Antimicrob. Agents Chemother. 6:651-652 [1974]を参照されたい）。アンサマイトシン遺伝子活性の評価に有用なさらなる方法には、酢酸エチルを用いた培養物からのアンサマイトシンおよび関連化合物の抽出、これに続く高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による単離、およびエレクトロスプレー質量分析（ES-MS）による分析が含まれる。
【００６５】
本明細書で用いられる「保存的置換」という用語は、それらの側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で生じる変化を意味する。遺伝的にコードされたアミノ酸は4つのファミリーに分けることができる：（1）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；（2）塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；（3）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；および（4）非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンはまとめて芳香族アミノ酸に分類されることもある。同様に、アミノ酸レパートリーは、（1）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；（2）塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、（3）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、この場合、セリンおよびスレオニンは選択的に脂肪族ヒドロシキルとして別にグループ分けされる；（4）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（5）アミド（アスパラギン、グルタミン）；ならびに（6）硫黄含有（システインおよびメチオニン）としてグループ分けすることができる（例えば、Stryer編、Biochemistry, pg. 17-21, 第2版、WH Freeman and Co. [1981]）。ペプチドのアミノ酸配列の変化によって機能的相同体が生じるかどうかは、変種ペプチドが野生型タンパク質と同様の様式で機能する能力を評価することによって容易に判定することができる。複数の置き換えのあるペプチドは、同様の方法で容易に検査することができる。これに対して、「非保存的置換」という用語は、一つのファミリーのアミノ酸がもう一つのファミリーのアミノ酸で置き換えされる変化（例えば、グリシンのトリプトファンでの置き換え）を意味する。生物学的な活性を失うことなく置換、挿入、または欠失の可能なアミノ酸残基を調べるための指針は、コンピュータプログラム（例えば、LASERGENEソフトウェア、DNASTAR Inc., Madison, WI）を用いて見出すことができる。
【００６６】
本明細書で用いられるように、「ベクター」という用語は、外来DNAを取り込んで一つの細胞からもう一つの細胞に伝達することのできる任意の核酸分子を意味する。ベクターは、しばしば、プラスミド、バクテリオファージ、または植物もしくは動物のウイルスに由来する。同様に、「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列、および特定の宿主生物において機能的に連結したコード配列の発現に必要な適切な核酸配列を含む組換えDNA分子を意味する。
【００６７】
「プロモーター」という用語は、RNAポリメラーゼ分子に結合した際に転写を開始するDNAヌクレオチド配列を意味する。「レギュレーター」という用語は、直接またはそのコードされたタンパク質を介して、特定のコード配列の転写、それらの機能タンパク質への翻訳、またはこれらのタンパク質の機能に対して、ポジティブまたはネガティブに影響を及ぼすDNAヌクレオチド配列を意味する。
【００６８】
本明細書で用いられるように、「組換え」という用語は、分子生物学的技術を用いて結合されて一体となったDNAセグメントを含むDNA分子、またはそのようにして結合されたDNAによりコードされるタンパク質を意味する。
【００６９】
「形質転換した宿主細胞」という用語は、遊離DNAの取り込みによる細胞の遺伝的修飾を意味する。好ましい態様において、形質転換した宿主細胞は細菌細胞である。細菌の「形質転換」は、一般的には、熱または浸透圧ショック、電気穿孔法、またはもう一つの細菌種との接合により引き起こされる。
【００７０】
本明細書で用いられるように、宿主細胞という用語は、インビトロまたはインビボにおいて存在するかを問わず、任意の真核細胞または原核細胞（例えば、大腸菌のような細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、および昆虫細胞）を意味する。例えば、宿主細胞はトランスジェニック動物内に存在することができる。
【００７１】
本明細書で用いられる「細菌」および「細菌性」という用語は、原核生物（例えば、古細菌、真正細菌、ラン藻類）を意味する。好ましい態様において、「細菌」という用語は真正細菌を意味し、グラム染色を用いた着色に基づいてさらに細分することができる（例えば、グラム陽性およびグラム陰性）。
【００７２】
本明細書で用いられるように、「ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）」という用語は、クローニングまたは精製を行うことなくDNA混合物中の標的配列のセグメント濃度を増加させるための方法を意味する（例えば、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,965,188号を参照されたい）。標的配列を増幅するためのこのプロセスは、所望の標的配列を含むDNA混合物への極めて過剰な量の2つのオリゴヌクレオチドプライマーの導入、それに続くDNAポリメラーゼの存在下における熱周期の正確な連鎖からなる。2つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれらのそれぞれの鎖に対して相補的である。増幅を達成するために、混合物を変性させて、続いてプライマーを標的分子内でそれぞれの相補配列にアニーリングさせる。アニーリング後、相補的鎖の新しいペアを形成させるために、ポリメラーゼでプライマーを伸長させる。所望の標的配列の高濃度の増幅セグメントを得るために、変性、プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼによる伸長の工程を多くの回数にわたって反復することができる（即ち、変性、アニーリング、および伸長を1「サイクル」とする）。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは互いのプライマーの相対的位置によって決定され、従って、この長さは制御可能なパラメータである。このプロセスの反復局面の長所から、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以後、「PCR」）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅セグメントが混合物中で（濃度に関して）優勢な配列となるので、それらは「PCR増幅」されると呼ばれる。鋳型がRNAである場合、逆転写（RT）工程は増幅サイクルの前に完了する。従って、この変法は「RT-PCR」と呼ばれる。
【００７３】
本明細書で用いられるように、「メイタンシノイド」という用語はメイタンシンに類似する化合物を意味する。「メイタンシン」は、メイテヌス(Maytenus)属の様々な亜熱帯樹木および低木から単離される抗腫瘍薬に言及する際に用いられる。メイタンシンは、Chemical Abstract Service (CAS) 番号35846-53-8に割り付けられている。この化合物の構造を図1に示す。
【００７４】
本明細書で用いられる「リファマイシン」という用語は、ストレプトマイセス属またはアミコラトプシス属の細菌によって産生される抗生物質を意味する。この群の抗生物質は、自然のアンサ構造により特徴付けられる（長い脂肪族ブリッジによって架橋される発色団ナフトヒドロキノン基（O'Neilら（編）、The Merck Index, 第13版、Merck&Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, pp. 1474-1475 [2001]。「リファマイシン」という用語はリファマイシンB、O、S、SV、およびXを含むが、これに限定されるものではない。
【００７５】
本明細書で用いられるように、「ルブラジリン」という用語は放線菌類細菌によって産生される抗生物質を意味する。
【００７６】
「アンサマイトシン」という用語は、放線菌類であるアクチノシネマ・プレチオスムによって産生されるメイタンシノイドを意味する。
【００７７】
本明細書で用いられるように、「アンサマイトシン生合成活性」という用語は、より基本的物質からのアンサマイトシンの構築に関与する酵素活性の少なくとも一つを意味する。アンサマイトシン生合成活性は、ポリケチドシンターゼ活性およびアンサマイトシン修飾活性の双方を意味する。
【００７８】
本明細書で用いられる「ポリケチドシンターゼ」という用語は、プロピオン酸塩、酢酸塩、および／またはグリコール酸塩のユニットによって3-アミノ-5-ヒドロキシ安息香酸（AHBA）のような開始ユニットの鎖伸長を触媒する一つまたは複数の酵素を意味する。好ましい態様において、「ポリケチドシンターゼ活性」という用語はasmA、asmB、asmC、および／またはasmDの遺伝子産物によって触媒される一種類または数種類の活性を意味する。
【００７９】
本明細書で用いられるように、「アンサマイトシン修飾活性」という用語は、新生（例えば、アンサマイトシン介在性）アンサマイトシン遺伝子産物の変質に関与する酵素活性の少なくとも一つを意味する。好ましい態様において、「アンサマイトシン修飾活性」は、次の活性の任意の一種類または数種類を含むが、これに限定されるものではない：メチルトランスフェラーゼ活性、アミドシンターゼ活性、オキシゲナーゼ活性、ハロゲナーゼ活性、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性、D-アラニル運搬タンパク質活性、COデヒドロゲナーゼ活性、O-メチルトランスフェラーゼ活性、3-O-メチルトランスフェラーゼ活性、3-O-アシルトランスフェラーゼ活性、O-カルバモイルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、aDHQデヒドロゲナーゼ活性、およびAHBAシンターゼ活性。特に、「アンサマイトシン修飾活性」という用語は、asm7、asm9、asm10、asm11、asm12、asm13、asm14、asm15、asm16、asm17、asml9、asm21、asm22、asm23、および／またはasm24の遺伝子産物によって触媒される一種類または数種類の活性を意味する。
【００８０】
実験
次の実施例は本発明の特定の好ましい態様および局面を示してさらに例示するために提供するものであり、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００８１】
以下に続く実験の開示では、次の略号が適用される：℃（摂氏温度）；aa（アミノ酸）；bp（塩基対）；Kb（キロベース対）；kDa（キロダルトン）；
gm（グラム）；μg（マイクログラム）；mg（ミリグラム）；ng（ナノグラム）；μl（マイクロリットル）；ml（ミリリットル）；mm（ミリメートル）；nm（ナノメートル）；μm（マイクロメートル）；M（モル）；mM（ミリモル）；μM（マイクロモル）；U（ユニット）；MW（分子量）；sec（秒）；min(s）（分）；hr（s）（時間）；DMSO（ジメチルスルホキシド）；MgCl2（塩化マグネシウム）；NaCl（塩化ナトリウム）；PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；PBS（リン酸緩衝生理食塩液［150 mM NaCl、10mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2］）；PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）；PEG（ポリエチレングリコール）；PMSF（フェニルメチルスルホニルフッ化物）；RT-PCR（逆転写PCR）；SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）；Tris（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；w/v（重量 対 容量）；v/v（容量 対 容量）；YAC（酵母人工染色体）；HPLC（高速液体クロマトグラフィー）；ES-MS（エレクトロスプレー質量分析）；LC-MS（液体クロマトグラフィー質量分析）；Applied Biosystems（Applied Biosystems, Foster City, CA）；ATCC（アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）、Rockville, MD）；Difco（Difco Laboratories, Detroit, MI）；Gene Codes（Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI）；GIBCO BRLまたはGibco BRL（Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）；Sigma（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）；およびStratagene（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA）。
【００８２】
実施例1
A.プレチオスムの培養
この実施例では、A.プレチオスムの増殖について記載する。簡潔に言うと、アクチノシネマ・プレチオスム種アウランチクム(Actinosynnema pretiosum ssp. auranticum)（例えば、ATCC 31565）はATCCから入手した。アンサマイトシン産生のため、この菌株を0.4％酵母抽出物、1％麦芽抽出物、および0.4％ブドウ糖を加えたpH 7.3のYMG培地で培養した。試験を通して、接合セットにおけるクローニング宿主および一時的宿主として、それぞれ、大腸菌 XL1-Blue MRF'株（Stratagene）およびET12567/pUZ8002（MacNeilら、Gene 111:61-68 [1992]）を使用した。大腸菌およびA.プレチオスムの接合は、当技術分野において既知の通り実施した（例えば、Kieserら、Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, United Kingdom [2000]を参照されたい）。新たに培養したA.プレチオスム 菌糸体および一晩培養した大腸菌細胞を混合して、10mM MgCl2を補充したYMG寒天プレートに播種した。37℃にて16時間インキュベーション後、プレートにナリジクス酸1mg（Sigma）および50mg/mlチオストレプトンDMSO溶液10μl（Sigma）を含む脱イオン水1mlを重層した。28℃にて5〜7日間さらにインキュベートして、A.プレチオスム接合コロニーを選択した。A.プレチオスムプロトプラストは、10mg/mlリゾチーム（Sigma）を含むP緩衝液（Kieserら、Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, United Kingdom [2000]）中で、37℃、1時間にて調製した。PEGに基づく形質転換（Kieserら、Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, United Kingdom [2000]）は、当技術分野において既知の方法により変性プラスミドDNAを用いて実施した。
【００８３】
実施例2
コスミドライブラリーの構築およびDNA配列分析
この実施例では、A.プレチオスムコスミドライブラリーの構築、および関心対象のクローンの配列決定のために用いられる方法について記載する。pBluescript SK(-)（Stratagene）は、これらの実験において用いられる日常的なクローニングベクターであった。プラスミド、コスミドおよびゲノムDNAの調製、DNAの制限消化、DNA断片の分画化、DNA断片の単離、ならびに連結反応の実施には、標準的な方法を用いた（例えば、SambrookおよびRussell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版(Cold Spring Harbor University Press, NY) [2001]を参照されたい）。A.プレチオスム種アウランチクム ATCC 31565のクロモゾームDNAはSau3AIで部分的に消化して、脱リン酸化し、予めXbaIで消化、脱リン酸化、およびBamHで消化しておいたSuperCos 1（Stratagene）に連結させた。ゲノムライブラリーは、Gigapack III Gold（Stratagene）を用いた連結混合物のパッケージング、および大腸菌 SURE細胞（Stratagene）への形質導入により作製した。全体のasm遺伝子クラスターは、rifK相同体を含む一次コスミドクローンを伸長するための逐次的クロモソーム歩行によって得られた。
【００８４】
配列決定用の鋳型は、超音波処理による断片化または制御された部分的HinP1I消化によって作製された選択されたコスミドから1.5から3.0KbのDNA断片を無作為にサブクローニングして得られた。二本鎖DNAテンプレートについての自動DNA配列決定は、Applied Biosystemsモデル373Aシーケンサーを用いてジデオキシヌクレオチド鎖終止法により実施された。散発的な配列ギャップは、合成内部オリゴヌクレオチドプライマーを用いたコスミドクローンの直接的な配列決定によってふさがれた。配列の編集は、Sequencher プログラム（Gene Codes）を用いて行われた。各種データベースのDNAおよびタンパク質の配列ホモロジー検索は、National Center for Biotechnology Informationのサーバーにあるストレプトマイセス DNAおよびBLASTプログラムのコドンのバイアスを用いることによって行った。
【００８５】
実施例3
Asm遺伝子の不活化
この実施例では、Asm遺伝子を不活化するために使用した手法について説明する。HGF051、HGF052、HGF056、およびHGF057のノックアウトは次の通り調製し、D1、D2およびD3の欠失により作出するために用いた方法の詳細を本明細書に示す。チオストレプトン抵抗性に関するtsr遺伝子を持つpIJ101のDNA断片1.1Kb（KendallおよびCohen, J. Bacteriol. 170:4634-4651 [1988]）および0.7KbのRK2複製oriT起点（Labigne-Rousselら、J. Bacteriol. 169:5320-5323 [1987]）は、定型通り選択マーカーとして、および遺伝子破壊構造物のために使用した。標的遺伝子、または欠失させるべき領域を含むDNA断片を図2Aに示す。コスミド8C2をSacIで消化して連結し、続いてpHGF9027に由来するtsr-oriTカセットを挿入後、このコスミド8C2を用いてD1を欠失させ（S16-24）、pHGF9029を作出した。pHGF9011の作出には、4.6Kb EcoRI(#2)-SacI(#22)および5.2Kb SacI(#27)-EcoRI(#3)のDNA断片を、EcoRIで前処理したpDH5（Hillemannら、Nucl. Acids Res. 19:727-731 [1991]）に連結してD2を欠失させた（S22-27）。asmBを切断するD3欠失は、asmB（pDDc7サブクローンのセットから回収した）の5'および3'末端配列を含む2.5KbのKpnI-EcoRIおよび3.5KbpのEcoRI-HindIII挿入部を、KpnI-HindIIIで前処理したpDH5に連結して行った。pHGF9001の作出には、得られたクローンにoriT断片をさらに付加した。pHGF9001、pHGF9027、およびpHGF9029のすべての構造物を、PEGに基づく形質転換または大腸菌を用いた接合によりA.プレチオスムに送達した。送達されたDNAベクターと野生型A.プレチオスムとの間の相同組換えによって得られるチオストレプトン抵抗性組換え体を選択して、さらに3ラウンドの弛緩培養のためにTSBブロス（Difco）に移し、第二ののクロスオーバー事象に由来するチオストレプトン感受性組換え体をスクリーニングした。チオストレプトン感受性組換え体に加えてクロモソームへのプラスミドの組み込みは、十分に確立された方法による全ゲノムDNAのサザンブロット分析によって確認した（例えば、Ausubelら(編）Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., NYを参照されたい）。asmBにおけるD3の欠失を確認するために用いられた典型的なサザンブロットを図3Bに示す。簡潔に言うと、野生型および変異型HGF051の菌株に由来するKpnI消化ゲノムDNA 1μgが分離された0.7％アガロースゲルをブロットして、図3Aに示す32P標識DNAプローブを用いてハイブリダイズさせた。
【００８６】
ノックアウトのHGF053およびHGF054は、それぞれ、asm15およびasm12にアプラマイシン遺伝子を挿入して調製した。この方法の詳細は、asm15ノックアウトとして本明細書に示す。asm13-17オペロンは、A232（XhoI／ScaI消化）およびS125（EcoRI / ScaI消化）のクローンの断片を予めEcoRIおよびXhoIで消化しておいたpBluescript SK(-)に連結することによって、再構成した。このクローンであるpHGF9125をPmlIで処理して、アプラシン抵抗性遺伝子aac(3)IVを含む1.4kbのDNA断片をこの固有の部位に平滑末端連結した。得られたクローンであるpHGF9201は、PstIを用いてマッピングすることによって、破壊されたasm15と同じ配置にaac(3)IV遺伝子を含むことが示された。破壊されたasm15と共にasm13-17を含む6.23kbのSspI/HindIII断片を抽出して、oriTおよびチオストレプトン抵抗性遺伝子（tsr）を運搬する自殺ベクターであるpHGF9824に連結して、pHGF9211-1を得た。このベクターは、大腸菌を用いた接合により、A.プレチオスムに送達された。チオストレプトンおよびアプラマイシンの双方に感受性である組換え型（pHGF9211-1およびA.プレチオスムの相同組換えにより得られる）は、TSB培地でのさらに3ラウンドの弛緩培養を通して増殖させた。続いて、400個の単一コロニーをスクリーニングして、アプラマイシに対する抵抗性を保持していた3つを単離したが、チオストレプトンに対しては感受性であった。破壊されたasm15対立遺伝子を持つ組換え体は、全ゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーションにより確認された。
【００８７】
実施例4
asmAおよびasmAB遺伝子の異種発現
この実施例では、A.プレチオスムのasmAおよびasmAB遺伝子をS.コエリコロルで発現させるために用いられた方法について記載する。asmAコード領域のN末端の383アミノ酸を、センスプライマーMAY003PacI
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およびアンチセンスプライマーMAY004KpnI
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を用いてpDDc7を鋳型としてPCRで増幅した。プライマーの制限部位を下線で示す。asmA全体は、PacI/KpnIで制限した1.2KbのPCR産物と、pDDc7に由来するC末端のasmAを持つ12.9KbのKpnI/EcoRI断片連結し、PacI/EcoRIで制限したpHGF7505におけるpactIプロモーターの下流をクローニングして再構成し（Yuら、J. Biol. Chem. 276:12546-12555 [2001]）、pHGF7544を得た。pHGF7544に由来するasmAおよびactII-orf4調節遺伝子を持つ15.8KbのHindIII/EcoRI挿入部位を移動させて、アプラマイシン抵抗性のaac(3)IV遺伝子（Blondelet-Rouaultら、Gene 190:315-317 [1997]）の挿入によりtsr遺伝子が不活化されているpHGF7612（Yuら、J. Biol. Chem. 276: 12546-12555 [2001]）の誘導体である大腸菌-ストレプトマイセス二機能性プラスミドpHGF7543におけるAHBA合成遺伝子を持つ9.4KbのHindIII/EcoRI挿入断片で置換して、pHGF7545を得た。同一の方法を用いて、pHGF7545の12.9KbのKpnI/EcoRI挿入断片を、pDDc7に由来するC末端のasmAおよびasmBを含む22.1KbのKpnI/EcoRI断片で置き換えることによって、asmAB全体を構築するためにpHGF7547を構成した。
【００８８】
実施例5
アンサマイトシンの検出および分析
この実施例では、アンサマイトシン産生を検出するために用いられた生化学的手法について記載する。酢酸エチルを用いて培養物からアンサマイトシンおよび関連する化合物を抽出して、バイオアッセイ法により分析するか、または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で単離してエレクトロスプレー質量分析（ES-MS）により分析した。バイオアッセイ法では、当技術分野において既知であるペニシリウム・アヴェルラネウムに対するアンサマイトシンの阻害活性の測定が行われた（例えば、HankaおよびBarnett, Antimicrob. Agents Chemother. 6:651-652 [1974]を参照されたい）。アッセイ法は標準的なペーパーディスクアッセイ法として実施され、被験生物の菌叢上の試料を含んだペーパーディスク周辺の阻害域の直径を測定した。液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）は、Fisons Quattro II質量分析計に接続したShimadzu LC-10ADポンプを用いて実施した。
【００８９】
本明細書に上記されるすべての刊行物および特許は、参照として本明細書に組み入れられる。記載される本発明の方法および系についての様々な変法および変化は当業者に自明であり、本発明の範囲および精神から逸脱するものではない。本発明は特定の好ましい態様と関連づけて説明されているが、特許請求の範囲に示される本発明はこのような特定の態様に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、本発明を実施するための記載した様式についての様々な変法は関連分野の事業者には明白であり、本発明の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
以下の図は本明細書の一部であり、本発明のある種の局面および態様をさらに説明するために加えられる。本発明は、これらの図の一つまたは複数を本明細書に示される具体的態様についての詳細な説明と併せて参照することによって、より深く理解されることができる。しかしながら、本発明はこれらの図に示される特定の態様に限定されることは意図しない。
【００９１】
【図１】メイタンシノイドであるメイタンシンおよびアンサマイトシン、ならびに構造的に関連するアンサマイシン抗生物質であるゲルダナマイシンおよびリファマイシンの構造を示す。
【図２】アンサマイトシン生合成遺伝子クラスターの構成を示す。パネルAはゲノム領域の制限酵素地図、ならびにクラスターのマッピングおよび配列決定に用いられる14個のコスミドクローンの重複する挿入を示す。BglII（B1-4）、EcoRI（E1-4）、およびSacI（S1-57）の制限酵素部位を地図上に示す。突然変異型HGF056、HGF057、およびHGF051では、それぞれ、D1、D2、およびD3の領域が欠失していた。パネルBはクラスターIおよびIIにおけるヌクレオチド配列から推定されるORFの転写方向および相対的サイズを示す。矢印上の文字または数字は、表1および表2に記載するORFおよびasm遺伝子産物に対応する。
【図３】アンサマイトシンasmB遺伝子座の破壊を示す。パネルAはasmAのC末端、ならびにasmBおよびasm25遺伝子のORF全体を含むA.プレチオスム種アウランチクムゲノムのKpnI（K1-5）制限酵素地図を示す。パネルBはA.プレチオスム HGF051においてasmBの7.2KbのDNA断片（例えば、D3領域）が欠失していることを確認するサザンブロットを示す。パネルAにおいて長方形で示される2.5Kbおよび3.5KbのDNA断片は、パネルBに示されるブロットのための32P-dCTP標識プローブとして用いられた。
【図４】N-アセチルトリケチドの蓄積を示す。pactIII-pactIプロモーターおよびactII-ORF4レギュレーターの制御下において、pHGF7545のasmA遺伝子およびpHGF7612の7つのAHBA生合成遺伝子（rifGH、rifK-N、およびrifJ）の同時発現を試みたが、期待したトリケチド産物は得られなかった。これに対して、pHGF7547のasmAB遺伝子およびpHGF7612のこの7つのrif遺伝子を同時に発現させると、トリケチド誘導体が得られた。
【図５】asmPKSのドメインの構成およびアンサマイトシンP-3形成のための生合成モデルを示す。各モジュールは必須のKS、AT、およびACPのドメインを組み込み、同時に1つを除くすべてのモジュールが選択的修飾活性（KR、DH、ER）を含む。略号は次の通りである：ADE、アデニル化またはカルボン酸：ACPリガーゼ；ACP、アシル運搬タンパク質；KS、β-ケトアシル-ACPシンターゼ；AT、アシルトランスフェラーゼ；DH、β-ヒドロキシアシル-チオエステルデヒドラターゼ；KR、β-ケトアシル-ACPレダクターゼ；ER、エノイルレダクターゼ。鎖伸長サイクルの予想中間体、および異なる生合成工程に関与するasm遺伝子を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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