(57)【要約】【課題】  本発明は基質分子に作用する酵素のリン酸化又は脱リン酸化活性を測定するための蛍光に基づくアッセイ法を提供する。【解決手段】  基質は酵素によるリン酸化又は脱リン酸化を受けて産物を生じ得る１以上の部分を含んでなり、蛍光色素で標識されていて、色素標識基質のリン酸化により、又は色素標識リン酸化基質の脱リン酸化により、蛍光強度及び蛍光寿命の変化を示し得るものである。好ましい実施形態において、基質はアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識されている。本発明はまた測定すべき酵素のリン酸化又は脱リン酸化活性に影響を与える試験作用物質のスクリーニング法を提供する。
2005523024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質分子に作用する酵素のリン酸化活性を測定する方法であって、基質が酵素によりリン酸化されてリン酸化産物を生じ得る１以上の部分を含んでなり、かつ基質が蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
ｉ）蛍光標識基質の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程；
ｉｉ）酵素と基質分子とをリン酸供与体の存在下に結合させる工程；及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の結合に続いて、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命における変化を測定する工程；
からなり、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命における変化を酵素のリン酸化活性測定に使用する、方法。
【請求項２】
基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識したものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
基質分子に作用する酵素のリン酸化活性を測定する方法であって、基質が酵素によりリン酸化されてリン酸化産物を生じ得る１以上の部分を含んでなり、かつ基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
ｉ）蛍光標識基質の蛍光強度を測定する工程；
ｉｉ）酵素と基質分子とをリン酸供与体の存在下に結合させる工程；及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の結合に続いて、蛍光標識の蛍光強度の増加を測定する工程；
からなり、蛍光標識の蛍光強度の増加を酵素のリン酸化活性測定に使用する、方法。
【請求項４】
基質分子が天然のタンパク質（糖タンパク質及びリポタンパク質などの翻訳後修飾タンパク質を含む）及び合成ペプチドから選択される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
基質分子がリン酸化を受け得る１以上のアミノ酸を含んでなる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
リン酸化を受け得るアミノ酸がチロシン、セリン、スレオニン及びヒスチジンから選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
基質がチロシンキナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼ及びヒスチジンキナーゼから選択される１種以上の酵素によりリン酸化を受け得るものである、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
リン酸化産物が１以上のホスホ−チロシン残基を含んでなる、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
基質のチロシン残基がチロシンキナーゼによりリン酸化されており、測定工程ｉ）及びｉｉｉ）がさらに蛍光標識の蛍光寿命測定を含んでなり、その場合に蛍光寿命の延長を使用して非リン酸化基質濃度に相関するリン酸化産物の濃度を測定する、請求項３乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
基質がセリン、スレオニン及びヒスチジンから選択される残基でリン酸化される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
基質が式：
【化１】
2005523024.tif 000007
（式中、
基Ｒ2及びＲ3はＺ1環構造に結合しており、基Ｒ4及びＲ5はＺ2環構造に結合している；
Ｚ1及びＺ2は独立して１又は２つの縮合環芳香族又はへテロ芳香族系を完結するために必要な原子を表し、各環は複数の炭素原子から選択される５又は６個の原子と選択肢として酸素、窒素及びイオウから選択される２個を超えない原子を有する；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は独立して水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル置換アミノ、スルフィドリル、カルボニル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、アラルキル；基−Ｅ−Ｆ（ただし、Ｅは炭素、窒素、酸素、イオウ及びリン原子からなる基から選択される１〜６０個の原子鎖をもつスペーサーであり、Ｆは標的結合基である）；及び基−（ＣＨ2）nＹ（ただし、Ｙはスルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎはゼロ又は１〜６の整数である）から選択される）
で示される蛍光色素で標識されている、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
基質が式：
【化２】
2005523024.tif 000008
（式中、
基Ｒ3及びＲ4はＺ1環構造に結合しており、基Ｒ5及びＲ6はＺ2環構造に結合している；
Ｚ1及びＺ2は独立して１又は２つの縮合環芳香族又はへテロ芳香族系を完結するために必要な原子を表し、各環は複数の炭素原子から選択される５又は６個の原子と選択肢として酸素、窒素及びイオウから選択される２個を超えない原子を有する；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は独立して水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル置換アミノ、スルフィドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、アラルキル；基−Ｅ−Ｆ（ただし、Ｅは炭素、窒素、酸素、イオウ及びリン原子からなる基から選択される１〜６０個の原子鎖をもつスペーサーであり、Ｆは標的結合基である）；及び基−（ＣＨ2）nＹ（ただし、Ｙはスルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎはゼロ又は１〜６の整数である）から選択される）
で示される蛍光色素で標識されている、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
基質がリンカー基により固体支持体に結合している、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
基質が第二ペプチド又はタンパク質に接合している、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
試験作用物質が酵素のリン酸化活性に及ぼす作用を測定する試験作用物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）作用物質の存在下及び不存在下に、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法を実施する工程；及び
（ｂ）作用物質の存在下及び不存在下に酵素のリン酸化活性を測定する工程；
からなり、その場合に、作用物質の存在下及び不存在下の酵素のリン酸化活性間の差を酵素のリン酸化活性に対する試験作用物質の作用を示すものであるとする、スクリーニング方法。
【請求項１６】
試験作用物質が酵素のリン酸化活性に及ぼす作用を測定する試験作用物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）試験作用物質の存在下に、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法を実施する工程；及び
（ｂ）試験作用物質の不存在下に酵素のリン酸化活性値と酵素活性の対照値とを比較する工程；
からなるスクリーニング方法。
【請求項１７】
酵素がチロシンキナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼ及びヒスチジンキナーゼから選択される、請求項１５又は請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
基質分子に作用する酵素の脱リン酸化活性を測定する方法であって、基質が酵素により脱リン酸化されて産物を生じ得る１以上のリン酸化部分を含んでなり、かつ基質が蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
ｉ）蛍光標識基質の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程；
ｉｉ）酵素と基質分子とを結合させて産物を生じさせる工程；及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の結合に続いて、蛍光強度と蛍光寿命における変化を測定する工程；
からなり、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命における変化を酵素の脱リン酸化活性測定に使用する、方法。
【請求項１９】
基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識したものである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
基質分子に作用する酵素の脱リン酸化活性を測定する方法であって、基質が酵素により脱リン酸化されて産物を生じ得る１以上のリン酸化部分を含んでなり、かつ基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
ｉ）蛍光標識基質の蛍光強度を測定する工程；
ｉｉ）酵素と基質分子とを結合させて産物を生じさせる工程；及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の結合に続いて、蛍光強度の低下を測定する工程；
からなり、蛍光標識の蛍光強度の低下を酵素の脱リン酸化活性測定に使用する、方法。
【請求項２１】
基質分子が天然のタンパク質（糖タンパク質及びリポタンパク質などの翻訳後修飾タンパク質を含む）及び合成ペプチドから選択される、請求項１８乃至請求項２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
基質分子が脱リン酸化を受け得る１以上のリン酸化アミノ酸を含んでなる、請求項１８乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
リン酸化アミノ酸がチロシン、セリン、スレオニン及びヒスチジンのリン酸化誘導体から選択されるものである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
酵素が基質におけるホスホ−チロシン残基からリン酸基を除去し、測定工程ｉ）及びｉｉｉ）がさらに蛍光標識の蛍光寿命測定を含んでなり、その場合に蛍光寿命の短縮を使用して産物の濃度に相関するリン酸化基質の濃度を測定する、請求項２０乃至請求項２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
基質が式：
【化３】
2005523024.tif 000009
（式中、
基Ｒ2及びＲ3はＺ1環構造に結合しており、基Ｒ4及びＲ5はＺ2環構造に結合している；
Ｚ1及びＺ2は独立して１又は２つの縮合環芳香族又はへテロ芳香族系を完結するために必要な原子を表し、各環は複数の炭素原子から選択される５又は６個の原子と選択肢として酸素、窒素及びイオウから選択される２個を超えない原子を有する；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は独立して水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル置換アミノ、スルフィドリル、カルボニル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、アラルキル；基−Ｅ−Ｆ（ただし、Ｅは炭素、窒素、酸素、イオウ及びリン原子からなる基から選択される１〜６０個の原子鎖をもつスペーサーであり、Ｆは標的結合基である）；及び基−（ＣＨ2）nＹ（ただし、Ｙはスルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎはゼロ又は１〜６の整数である）から選択される）
で示される蛍光色素で標識されている、請求項１８乃至請求項２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
基質が式：
【化４】
2005523024.tif 000010
（式中、
基Ｒ3及びＲ4はＺ1環構造に結合しており、基Ｒ5及びＲ6はＺ2環構造に結合している；
Ｚ1及びＺ2は独立して１又は２つの縮合環芳香族又はへテロ芳香族系を完結するために必要な原子を表し、各環は複数の炭素原子から選択される５又は６個の原子と選択肢として酸素、窒素及びイオウから選択される２個を超えない原子を有する；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は独立して水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル置換アミノ、スルフィドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、アラルキル；基−Ｅ−Ｆ（ただし、Ｅは炭素、窒素、酸素、イオウ及びリン原子からなる基から選択される１〜６０個の原子鎖をもつスペーサーであり、Ｆは標的結合基である）；及び基−（ＣＨ2）nＹ（ただし、Ｙはスルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎはゼロ又は１〜６の整数である）から選択される）
で示される蛍光色素で標識されている、請求項１８乃至請求項２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
基質がリンカー基により固体支持体に結合している、請求項１８乃至請求項２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
基質が第二のペプチド又はタンパク質に融合している、請求項１８乃至請求項２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
試験作用物質が酵素の脱リン酸化活性に及ぼす作用を測定する試験作用物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）作用物質の存在下及び不存在下に、請求項１８乃至請求項２８のいずれか１項記載の方法を実施する工程；及び
（ｂ）作用物質の存在下及び不存在下に酵素の脱リン酸化活性を測定する工程；
からなり、その場合に、作用物質の存在下及び不存在下の酵素の脱リン酸化活性間の差を酵素の脱リン酸化活性に対する試験作用物質の作用を示すものであるとする、スクリーニング方法。
【請求項３０】
試験作用物質が酵素の脱リン酸化活性に及ぼす作用を測定する試験作用物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）試験作用物質の存在下に、請求項１８乃至請求項２８のいずれか１項記載の方法を実施する工程；及び
（ｂ）試験作用物質の不存在下に酵素の脱リン酸化活性値と酵素活性の対照値とを比較する工程；
からなるスクリーニング方法。
【請求項３１】
酵素がホスファターゼである、請求項１８乃至請求項３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
細胞環境における基質のリン酸化状態を測定する方法であって、基質が細胞性酵素によりリン酸化又は脱リン酸化されて産物を生じ得る１以上のの部分を含んでなり、かつ基質が蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
ｉ）無細胞環境における蛍光標識基質の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程；
ｉｉ）液体培地中１個以上の細胞に基質を加える工程；及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）に続いて、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程；
からなり、蛍光強度と蛍光寿命の変化を基質のリン酸化状態を示すために使用する、方法。
【請求項３３】
基質がキナーゼ基質又はホスファターゼ基質である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
蛍光色素がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択されるものである、請求項３１又は請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
基質が第二のペプチド又はタンパク質に接合している、請求項３２乃至請求項３４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
基質が担体又は輸送ペプチドに接合している、請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
各酵素が異なる基質に特異的であり、その２種以上の異なる酵素のキナーゼ活性を同時に測定する方法であって、各基質が酵素によりリン酸化されて産物を生じ得る１以上の部分を含んでなり、かつ各基質が蛍光色素セットの異なる１つにより標識されているものであり、当該方法が、
ｉ）蛍光標識基質それぞれの蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程；
ｉｉ）リン酸源の存在下に酵素の混合物と各基質分子とを結合する工程；及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の結合に続いて、各蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命の増加を測定する工程；
からなり、各蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命の増加を各酵素のリン酸化活性の定量に使用する、方法。
【請求項３８】
セット中の蛍光色素がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
酵素が単離酵素である、請求項３７又は請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
１種以上の酵素が細胞溶解液の成分である、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
工程ｉｉ）の結合を細胞環境中で実施し、異なる基質のそれぞれが担体又は輸送ペプチドに接合している、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
測定するキナーゼ活性がチロシンキナーゼである、請求項３７乃至請求項４１のいずれか１項記載の方法。
【請求項４３】
以下の成分：
ｉ）キナーゼ酵素に対する基質であって、基質が酵素によりリン酸化されてリン酸化産物を生じ得る１以上の部分を含んでなり、かつ基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識されている基質；及び
ｉｉ）リン酸供与体及びキナーゼから選択される成分；
を含んでなる組成物。
【請求項４４】
１種以上のの酵素のキナーゼ活性を測定する試験キットであって、
ｉ）各基質がリン酸化されて産物を生じ得る部分を含んでなり、かつ各基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素セットの異なる１つにより標識されている基質；及び選択肢として、
ｉｉ）各酵素が異なる基質に特異的な１種以上の異なる酵素；
を含んでなる試験キット。
【請求項４５】
１種以上のの酵素のホスファターゼ活性を測定する試験キットであって、
ｉ）各基質が脱リン酸化されて産物を生じ得るリン酸化部分を含んでなり、かつ各基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素セットの異なる１つにより標識されている基質；及び選択肢として、
ｉｉ）各酵素が異なる基質に特異的な１種以上の異なる酵素；
を含んでなる試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロテインキナーゼ及びホスファターゼ活性を測定するための蛍光に基づくアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼ及びプロテインホスファターゼがそれぞれ触媒するタンパク質のリン酸化及び脱リン酸化は、真核細胞における細胞機能を調節する重要な細胞内プロセスである。タンパク質中のセリン、スレオニン及びチロシン残基の可逆的リン酸化は、タンパク質の生物学的性質を調節する非常に有効な手段であり、代謝、細胞分裂、遺伝子の転写と翻訳、及び細胞におけるシグナル伝達メカニズムなど多様なプロセスを変調する。総説については、Ｈｕｎｔｅｒ，  Ｔ．，  Ｃｅｌｌ，  （１９９５），  ８０，  ２２５−２３６；  Ｋａｒｉｎ，  Ｍ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  （１９９１），  ３，  ４６７−４７３  参照。従って、タンパク質のリン酸化及び脱リン酸化は生体の維持、適応、及び病気に対する感受性において重要な事象である。タンパク質のリン酸化及び脱リン酸化プロセスにおける機能不全は、細胞の調節メカニズムにとって深刻な結果を招き、その理由で、プロテインキナーゼとホスファターゼは新規治療薬処置の発展において重要な大量処理スクリーニングアッセイ法開発のための好ましい標的である。
【０００３】
従来のキナーゼ活性の検出測定アッセイ法は、リン酸を標的に取込ませるリン酸源として［32Ｐ］−又は［33Ｐ］−標識ＡＴＰを用いる放射活性検出法に基づく方法である。放射活性同位体を用いる方法は、一般にシンチレーションカウンターでの計測に先立ち、標識産物を単離する分離工程を必要とする（Ｓｏｎｇｙａｎｇ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  （１９９５），  ３７３，  ５３６−５３９）。
【０００４】
あるいは、非放射活性検出によるアッセイ法が、例えば、リン酸化されたタンパク質及びペプチドを検出するための抗体を使用して、採用されている。検出様式は蛍光偏光及び時間分解蛍光共鳴エネルギー転移などである。
【０００５】
国際公開第９９／２９８９４号パンフレット（Ｅｐｐｓら）は、蛍光検出によるタンパク質キナーゼとホスファターゼの大量処理スクリーニングアッセイ法に関する。この方法では競合イムノアッセイ手法を利用し、酵素によりリン酸化（又は脱リン酸化）される基質量を定量する。酵素活性の定量は標識抗体−生成物接合体の蛍光偏光を測定することにより実施する。あるいは、蛍光消光又は蛍光相関スペクトル法を用いることも可能である。
【０００６】
国際公開第００／７５１６７号パンフレット（Ｓｐｏｒｔｓｍａｎら）は、リン酸化されたペプチドに特異的に結合する結合パートナーと発光ペプチドとを接触させることにより基質へのリン酸基付加又は基質からの除去を検出する方法に関する。
【０００７】
マックロイら（Ｍｃｌｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  （１９９１），  １９５，  １４８−１５２）は抗体選択をしないプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の代替蛍光アッセイ法を報告している。このアッセイ法では、ＰＫＣリン酸化部位を取込むアクリロダン−標識２５アミノ酸の合成ペプチドがリン酸化により２０％の蛍光低下を受けると報告している。このアッセイは０．２ｎＭレベルまでのＰＫＣ検出を可能とするが、同様濃度のサイクリックＡＭＰ依存性又はＩＩ型カルモジュリン依存性プロテインキナーゼはペプチド蛍光に変化を生じなかった。特開２００１−１９７００号公報は蛍光強度の変化を測定することにより、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ活性又はタンパク質脱リン酸化活性を検出するために、発蛍光基質の使用について記載している。
【０００８】
時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を採用するこれらの方法においては、１種を超える検出試薬を必要とする。かかる試薬の調製及び添加は、しばしば相当の時間と、努力、費用を要する。アッセイ法の多くが真に均一ではなく、反応が始まった後で試薬の添加が必要である。ＴＲ−ＦＲＥＴは検出試薬間の距離に依存するが、このことは基質をその要求に叶うように調製しなければならないことを意味する。さらに、多くのアッセイが複数の標識を必要とする。殆どの場合、例え望ましくとも、天然の基質を使用することは不可能であり、その理由はタンパク質をビオチニル化し、抗体を加える必要性がそれらの使用を不可能とするからである。
【特許文献１】国際公開第９９／２９８９４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第００／７５１６７号パンフレット
【特許文献３】特開２００１−１９７００号公報
【非特許文献１】Ｈｕｎｔｅｒ，  Ｔ．，  Ｃｅｌｌ，  （１９９５），  ８０，  ２２５−２３６；  Ｋａｒｉｎ，  Ｍ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  （１９９１），  ３，  ４６７−４７３
【非特許文献２】Ｓｏｎｇｙａｎｇ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  （１９９５），  ３７３，  ５３６−５３９）
【非特許文献３】Ｍｃｌｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  （１９９１），  １９５，  １４８−１５２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、技術上簡単に実施し得る新規簡便迅速かつ高感度のキナーゼとホスファターゼ活性測定法にあっては、技術的に余り手を加えずに実施可能であり、ロボット自動化の余地が十分にあることが要件となる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第一の態様においては、基質分子に作用する酵素のリン酸化活性を測定する方法であって、基質が酵素によりリン酸化されてリン酸化産物を生じ得る１以上の部分を含んでなり、かつ基質が蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
ｉ）蛍光標識基質の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程；
ｉｉ）酵素と基質分子とをリン酸供与体の存在下に結合させる工程；及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の結合に続いて、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命における変化を測定する工程；
からなり、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命における変化を酵素のリン酸化活性測定に使用する、方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、基質はアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識する。
【００１２】
本発明の第二の態様においては、基質分子に作用する酵素のリン酸化活性を測定する方法であって、基質が酵素によりリン酸化されてリン酸化産物を生じ得る１以上の部分を含んでなり、かつ基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
ｉ）蛍光標識基質の蛍光強度を測定する工程；
ｉｉ）酵素と基質分子とをリン酸供与体の存在下に結合させる工程；及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の結合に続いて、蛍光標識の蛍光強度の増加を測定する工程；
からなり、蛍光標識の蛍光強度の増加を酵素のリン酸化活性測定に使用する、方法が提供される。
【００１３】
第一及び第二の態様によると、適切には、基質分子は天然のタンパク質（糖タンパク質及びリポタンパク質などの翻訳後修飾タンパク質を含む）及び合成ペプチドから選択する。これらの実施形態において、基質分子はリン酸化を受け得る１以上のアミノ酸を含んでなる。
【００１４】
あるいは、基質はモノ−もしくはビス−燐酸ホスファチジルを包含するイノシトール脂質などの脂質から選択するか、又はモノ−もしくはポリ−多糖類であってもよく、基質分子はリン酸化を受け得る１以上のヒドロキシル基を含んでなる。
【００１５】
好ましい実施形態において、基質はタンパク質又はペプチドであり、リン酸化を受け得るアミノ酸はチロシン、セリン、スレオニン及びヒスチジンから選択する。これらの実施形態において、基質はプロテインキナーゼにより、例えば、チロシンキナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼ及びヒスチジンキナーゼから選択される１種以上の酵素によりリン酸化を受け得るものである。
【００１６】
基質がチロシン残基でチロシンキナーゼによりリン酸化される場合の第二の態様による実施形態において、リン酸化産物は１以上のホスホ−チロシン残基を含んでなる。この実施形態において、測定工程ｉ）及びｉｉｉ）はさらに蛍光標識の蛍光寿命を測定することを含んでなり、その場合、蛍光寿命の延長が非リン酸化基質の濃度に相関するリン酸化産物の濃度測定に使用される。従って、この方法は実時間での酵素反応の進行とともに変化する基質の量とそれによって生じた相当するリン酸化産物の量の増加についての連続的記録のために使用し得る。
【００１７】
別の実施形態において、基質はセリン、スレオニン及びヒスチジンから選択される残基でリン酸化を受ける。
【００１８】
第一又は第二態様による好ましい実施形態においては、試験作用物質が酵素のリン酸化活性に及ぼす作用を測定する試験作用物質のスクリーニング方法が提供される。当該方法は、（ａ）作用物質の存在下及び不存在下に第一又は第二態様による方法を実施する工程；及び（ｂ）作用物質の存在下及び不存在下に酵素のリン酸化活性を測定する工程；からなり、その場合に、作用物質の存在下及び不存在下の酵素のリン酸化活性間の差を酵素のリン酸化活性に対する試験作用物質の作用を示すものであるとする、スクリーニング方法である。あるいは、スクリーニングは試験作用物質の存在下に当該方法を実施し、次いで、試験作用物質の不存在下に酵素のリン酸化活性値と酵素活性の対照値とを比較することによって実施することができる。対照値は便宜的には電子的にデータベースに、又は他の電子的フォーマットに保存するとよい。
【００１９】
“リン酸供与体”という用語は、ＡＴＰ又はＧＴＰなどの高エネルギーリン酸供与体を意味するものとする。
【００２０】
第三の態様においては、基質分子に作用する酵素の脱リン酸化活性を測定する方法であって、基質が酵素により脱リン酸化されて産物を生じ得る１以上のリン酸化部分を含んでなり、かつ基質が蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
ｉ）蛍光標識基質の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程；
ｉｉ）酵素と基質分子とを結合させて産物を生じさせる工程；及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の結合に続いて、蛍光強度と蛍光寿命における変化を測定する工程；
からなり、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命における変化を酵素の脱リン酸化活性測定に使用する、方法が提供される。
【００２１】
好ましくは、基質はアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識されている。
【００２２】
本発明の第四の態様においては、基質分子に作用する酵素の脱リン酸化活性を測定する方法であって、基質が酵素により脱リン酸化されて産物を生じ得る１以上のリン酸化部分を含んでなり、かつ基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
ｉ）蛍光標識基質の蛍光強度を測定する工程；
ｉｉ）酵素と基質分子とを結合させて産物を生じさせる工程；及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の結合に続いて、蛍光強度の低下を測定する工程；
からなり、蛍光標識の蛍光強度の低下を酵素の脱リン酸化活性測定に使用する、方法が提供される。
【００２３】
適切には、第三及び第四の態様による酵素はホスファターゼである。
【００２４】
適切には、第三及び第四の態様によると、基質分子は天然のタンパク質（糖タンパク質及びリポタンパク質などの翻訳後修飾タンパク質を含む）及び合成ペプチドから選択される。これらの実施形態において、基質分子は脱リン酸化を受け得る１以上のリン酸化アミノ酸を含んでなる。
【００２５】
あるいは、基質はリン脂質（ホスホイノシチドなど）から選択するか、又は単糖もしくは多糖類のリン酸化誘導体であってもよい。この実施形態において、基質分子は脱リン酸化可能な１以上のリン酸化ヒドロキシル基を含んでなる。
【００２６】
好ましい実施形態において、基質はリン酸化タンパク質又はリン酸化ペプチドであり、脱リン酸化されるリン酸化アミノ酸はホスホ−チロシン、ホスホ−セリン、ホスホ−スレオニン及びホスホ−ヒスチジンから選択し得る。また、ホスファターゼはリン酸化アミノ酸から酵素的にリン酸基を除去する。
【００２７】
第四の態様の特定の実施形態において、基質はリン酸化されたチロシン残基を含んでなり、酵素は基質中のホスホ−チロシン残基からリン酸基を除去する。この実施形態において、測定工程ｉ）及びｉｉｉ）はさらに蛍光標識の蛍光寿命を測定することを含んでなり、その場合、蛍光寿命の短縮が生成物の濃度に相関するリン酸化された基質の濃度測定に使用される。従って、この方法は実時間での酵素反応の進行とともに変化するリン酸化された基質の量とそれによって生じた相当する産物の量の増加についての連続的記録のために使用し得る。
【００２８】
好ましい実施形態においては、試験作用物質が酵素の脱リン酸化活性に及ぼす作用を測定する試験作用物質のスクリーニング方法が提供される。当該方法は、（ａ）作用物質の存在下及び不存在下に第三又は第四の態様による方法を実施する工程；及び（ｂ）作用物質の存在下及び不存在下に酵素の脱リン酸化活性を測定する工程；からなり、その場合に、作用物質の存在下及び不存在下の酵素の脱リン酸化活性間の差を酵素の脱リン酸化活性に対する試験作用物質の作用を示すものである。あるいは、スクリーニングは試験作用物質の存在下に当該方法を実施し、次いで、試験作用物質の不存在下に酵素の脱リン酸化活性値と酵素活性の対照値とを比較することにより実施し得る。対照値は便宜的には電子的にデータベースに、又は他の電子的フォーマットに保存するとよい。
【００２９】
本発明による実施形態において、キナーゼ又はホスファターゼ基質はリンカー基により固体支持体に結合させることができる。これらの実施形態において、酵素のリン酸化又は脱リン酸化活性を測定するアッセイは固相において実施することができる。
【００３０】
他の実施形態において、キナーゼ又はホスファターゼ基質は、米国特許第５８０７７４６号、国際公開第９９／６４４５５号、同第９７／１２９１２号、同第９９／０５３０２号に記載されている担体もしくは輸送ペプチドなどの第二ペプチド又はタンパク質に接合（又は融合）させることができる。Ｒｏｊａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  （１９９８），  １６，  ３７０−３７５；  Ｈａｗｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  （１９９９），  ８９−９４も参照されたい。かかる実施形態において、担体ペプチドはキナーゼ又はホスファターゼ基質を細胞膜を通過させ、細胞内に輸送するために採用可能であり、結果として、細胞環境内での基質のリン酸化状況の研究が可能となる。
【００３１】
キナーゼ活性を測定しようとする場合、天然のプロテインキナーゼ基質の選択はアッセイすべき特定のキナーゼに左右される。プロテインキナーゼの基質特異性は多様に変化し、リン酸化部位に隣接する狭い配列がプロテインキナーゼによる基質の認識に重要な役割を演じることが知られている。従って、キナーゼアッセイのための特定の基質の選択は、その配列に存在するリン酸化部位モチーフに左右される。表１は一部既知プロテインキナーゼ基質と本発明によるアッセイでの使用に適した相当するキナーゼを示す。
【００３２】
【表１】
2005523024.tif 000003
【００３３】
キナーゼ基質特異性に関係する知識の進歩は、新たに配列決定されたタンパク質の潜在的酵素認識部位を同定すること、また合成ペプチドのモデル基質を構築することをも可能にした。この分野の総説については、以下の文献参照：Ｋｅｎｎｅｌｌｙ，  Ｐ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｋｒｅｂｓ，  Ｅ．Ｇ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  （１９９１），  ２６６，  １５５５５−５８；  Ｋｅｍｐ，  Ｂ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｒ．Ｂ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  （１９９０），  ３４３。適切な合成ペプチド基質は当業者周知の方法により調製し得る；例えば、固相支持体に（要すればリンカー基を介して）連結した保護アミノ酸の逐次付加による固相ペプチド合成法により調製し得る（”Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，  Ａｔｈｅｒｔｏｎ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ｒ．Ｃ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））。
【００３４】
ホスファターゼはインビトロで一般に広い基質特異性を示す（キナーゼと異なる点）；参照：Ｈｅｌｐｓ，  Ｎ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  （２０００），  ３４９，  ５０９−５１８；  Ｍａｊｅｔｉ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，  Ａ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  （２００１），  １０１，  ２４４１−２４４８；  Ｃｏｈｅｎ，  Ｐ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  （２００２），  １１５，  ２４１−２５６。インビボにおけるホスファターゼの触媒ドメインは調節サブユニットと会合しそれによって標的となる。この組合せはインビボでのホスファターゼ基質特異性が非常に特異的であり得ることを意味する。しかし、インビトロのアッセイでは、触媒ドメインのみがアッセイされる。その結果として、インビトロでのホスファターゼはペプチドとタンパク質基質両方の幅広い範囲に作用し得る。
【００３５】
本発明によりキナーゼとホスファターゼアッセイに使用する基質は、色素標識基質のリン酸化、又は色素標識リン酸化基質の脱リン酸化により、蛍光強度及び蛍光寿命の変化を示し得る蛍光色素で標識する。従って、色素標識基質のリン酸化による蛍光強度及び蛍光寿命の上昇があり得る。あるいは、色素標識リン酸化基質の脱リン酸化による蛍光強度及び蛍光寿命の低下があり得る。本発明での使用に適した色素は蛍光寿命色素である。本発明との関連で、“寿命色素”という用語は測定可能な蛍光寿命をもつ色素を意味するものとし、色素が励起を受け、その励起状態のままで存在する平均時間量と定義する（Ｌａｃｋｏｗｉｃｚ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  （蛍光スペクトル法の原理），  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９９９））。適切には、蛍光色素はアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される。標的物質の蛍光検出用の標識として使用するアクリドン及びキナクリドン誘導体については、国際公開第０２／０９９４２４号及び同第０２／０９９４３２号に記載されている。
【００３６】
本発明方法での使用に適したアクリドン色素は一般式（Ｉ）：
【００３７】
【化１】
2005523024.tif 000004
【００３８】
（式中、
基Ｒ2及びＲ3はＺ1環構造に結合しており、基Ｒ4及びＲ5はＺ2環構造に結合している；
Ｚ1及びＺ2は独立して１又は２つの縮合環芳香族又はへテロ芳香族系を完結するために必要な原子を表し、各環は複数の炭素原子から選択される５又は６個の原子と選択肢として酸素、窒素及びイオウから選択される２個を超えない原子を有する；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は独立して水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル置換アミノ、スルフィドリル、カルボニル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、アラルキル；基−Ｅ−Ｆ（ただし、Ｅは炭素、窒素、酸素、イオウ及びリン原子からなる基から選択される１〜６０個の原子鎖をもつスペーサーであり、Ｆは標的結合基である）；及び基−（ＣＨ2）nＹ（ただし、Ｙはスルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎはゼロ又は１〜６の整数である）から選択される）
で示される色素である。
【００３９】
本発明方法での使用に適したキナクリドン色素は一般式（ＩＩ）：
【００４０】
【化２】
2005523024.tif 000005
【００４１】
（式中、
基Ｒ3及びＲ4はＺ1環構造に結合しており、基Ｒ5及びＲ6はＺ2環構造に結合している；
Ｚ1及びＺ2は独立して１又は２つの縮合環芳香族又はへテロ芳香族系を完結するために必要な原子を表し、各環は複数の炭素原子から選択される５又は６個の原子と選択肢として酸素、窒素及びイオウから選択される２個を超えない原子を有する；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は独立して水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル置換アミノ、スルフィドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、アラルキル；基−Ｅ−Ｆ（ただし、Ｅは炭素、窒素、酸素、イオウ及びリン原子からなる基から選択される１〜６０個の原子鎖をもつスペーサーであり、Ｆは標的結合基である）；及び基−（ＣＨ2）nＹ（ただし、Ｙはスルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎはゼロ又は１ないし６の整数である）から選択される）
で示される色素である。
【００４２】
適切には、標的結合基Ｆは反応性基又は官能性基である。式（Ｉ）又は式（ＩＩ）による蛍光色素の反応性基は、適切な条件下で基質の官能性基と反応し得る；式（Ｉ）及び式（ＩＩ）による化合物の官能性基は、適切な条件下で基質の反応性基と反応し得る。これらの反応性基及び官能性基により、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で示される蛍光色素は基質と反応し、共有結合により結合する；その結果、基質は蛍光色素で標識される。
【００４３】
好適には、Ｆが反応性基である場合、この基はスクシニミジルエステル、スルホ−スクシニミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、カルボジイミド、ヒドラジド及びホスホルアミダイトから選択する。好適には、Ｆが官能性基である場合、この基はヒドロキシ、アミノ、スルフィドリル、イミダゾール、アルデヒドとケトンを含むカルボニル、リン酸エステル及びチオリン酸エステルから選択する。
【００４４】
アクリドンとキナクリドン色素の好ましい例（及びその相当する寿命（ｎｓｅｃ；ナノ秒））を化合物（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）として表２に示す。
【００４５】
【表２】
2005523024.tif 000006
【００４６】
色素標識タンパク質及びペプチドの基質は、当業者周知の技法により、反応性蛍光色素誘導体をタンパク質又はペプチドに直接化学的にカップリング結合させることによって調製し得る。別の標識法は、基質を蛍光ポリペプチドなどのポリペプチド標識体にカップリング結合（又は連結）することである。本発明にて使用するペプチド及びタンパク質の基質は、末端のアミノ酸位置で、あるいは１個以上の内部のアミノ酸位置で標識することができる。
【００４７】
タンパク質及びペプチドを蛍光色素で標識する化学については多くの文献があり、また様々なペプチド化学修飾のための化学が利用可能である。一般に、標識試薬の選択は標識すべきタンパク質又はペプチドのアミノ酸組成により決定する。特に好ましいのは、アミン反応性及びチオール反応性蛍光標識色素である。最初の例としては、標識用官能基が一級アミノ基であり、この基はリジンのε−アミノ基由来のものでもよい；あるいはペプチド又はタンパク質のアミノ末端でもよい。ε−アミノリジン残基を標識するための反応性基の特別の例は、蛍光色素のイソチオシアネート−及びＮ−ヒドロキシスクシニミジル（ＮＨＳ）エステル誘導体である。遊離のチオール基を有するタンパク質及びペプチドは比較的少ないが（それらは一般にジスルフィド基として存在する）、チオール標識手法はタンパク質及びペプチドの標識に非常に有用であることが証明されており、この手法ではチオール反応性試薬、例えば、蛍光色素のヨードアセチル及びマレイミジル誘導体を使用する。蛍光色素標識試薬を使用するタンパク質標識の総説と例については、以下の文献を参照されたい：”Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”  （非放射活性標識、実用入門），  Ｇａｒｍａｎ，  Ａ．Ｊ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７；  “Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  −  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  （生物接合−生物医科学のためのタンパク質カップリング技法），  Ａｓｌａｍ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｎｔ，  Ａ．，  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，  （１９９８）。合成ペプチドの部位特異的標識を得るためのプロトコールは入手可能である；例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｇ．Ｔ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （生物接合技法），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）参照。代表的な例では、アクリドン色素のＮ−ヒドロキシスクシニミジル（ＮＨＳ）エステルをｐＨ９の弱い炭酸塩バッファー中でポリペプチドに連結し得る。反応は、適切な時間、一般には３０〜６０分の範囲で進行させることができる。未反応又は遊離の色素はゲル排除クロマトグラフィーにより、又は透析により除去し得る。基質の部位特異的蛍光色素標識は、ペプチドの合成の間に、合成工程中で標識したアミノ酸を使用するか、又は合成の完了時点で他の潜在的に反応性の残基を脱保護する前に、対象の残基の特異的な脱保護と標識を行うことにより、得られる。
【００４８】
本発明によるアッセイ法は、適切には、マルチウエルプレートのウエル中で、例えば、２４穴、９６穴、３８４穴又はそれ以上の数のウエル、例えば、１５３６穴のマイクロタイタープレートにて実施する。別法として、アッセイはアッセイチューブ中又は微量液ディバイスのミクロチャンネル中にても実施し得る。第一の態様による代表的なキナーゼアッセイにおいては、ＡＴＰ又はＧＴＰなどの高エネルギーリン酸供与体の存在下にキナーゼと基質分子とを接触させる。反応は、水性アッセイバッファー中、適切には５ｍＭ−ＭｇＣｌ2含有の、１０ｍＭ−ＭＯＰＳ、５０ｍＭ−トリス又は５０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ中に当初存在する基質及びリン酸供与体とで実施する。アッセイは試験作用物質サンプルの存在下又は不存在下に実施し得る。適切には、反応混合物から開始剤を引いた成分をマイクロタイタープレートのウエルに予め配分する。次いで、酵素を加えて反応を開始する。あるいは、適切なバッファー溶液に酵素と基質を含む反応混合物を調製する。この場合、反応はリン酸供与体を添加することにより開始させる。
【００４９】
一般に、キナーゼアッセイは“ストップト”条件下に実施する。従って、反応は予め定めた時間進行させ、次いで、反応を停止試薬（通常は多くの場合非特異的な酵素活性のインヒビター）により停止させる。停止試薬の例はＥＤＴＡであるが、この試薬は酵素活性にとって通常必要な金属イオンを取込むために使用する。
【００５０】
蛍光強度と蛍光寿命の測定は検出器としての光電子倍増管を備える装置により実施し得る。一般に、蛍光寿命の測定法は、ｉ）時間相関単一光子計測、又はｉｉ）周波数領域（ラコウイッツが「蛍光スペクトル法の原理」に記載；Ｊ  Ｒ  Ｌａｋｏｗｉｃｚ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  １９９９，  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ４  ａｎｄ  ５，  Ｋｌｕｗｅｒ／Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に基づくか、又は時間ゲート（参照例：Ｓａｎｄｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  （１９９５），  ２２７（２），  ３０２−３０８）に基づくものである。蛍光強度の変化は電荷結合素子（ＣＣＤ）撮像装置（走査撮像装置又は領域撮像装置など）などにより測定し、マイクロタイタープレートすべてのウエルを画像化することができる。ＬＥＡＤシーカー（ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ）（商標）システムは１回の通過で高密度マイクロタイタープレートの蛍光画像化を可能とするＣＣＤカメラが特徴である。画像化は定量的かつ迅速であり、画像化に適した器具の使用によりマルチウエルプレートの全体を画像化することが、現在可能である。
【００５１】
キナーゼ活性について試験作用物質の活性を測定するためにアッセイを定型化する場合、アッセイは基質蛍光の連続的測定下に実施するとよい。このフォーマットにおいて、蛍光標識した基質の強度は連続的に変化する。標識した基質は酵素反応の生成物から分離する必要はなく、従って、反応の時間経過を得ることが可能で、速度論的研究を実時間で実施することが可能となる。
【００５２】
第一又は第二の態様の特定実施形態においては、酵素がチロシンキナーゼであり、基質がＡｂｌペプチドなど、酵素に特異的なペプチド基質である。アッセイはマイクロタイタープレート中で、水性条件下、ｐＨ７〜８のＨＥＰＥＳ、トリス又はＭＯＰＳバッファーを用いて実施し得る。一般に、バッファー濃度は約５０ｍＭである。活性を測定すべき酵素によっては、塩化ナトリウム又は塩化カリウムなどの塩を加えてもよい。好ましいリン酸供与体はＡＴＰであり、このものは一般に２×Ｋmの濃度、すなわち、３０〜２００μＭの範囲で存在する。酵素基質はＫm以下の最適濃度で存在すべきであり、一般には１〜１００μＭの範囲である。さらなる補助因子、例えば、Ｍｇ2+イオンは所定の酵素に適当な濃度で存在し、一般には１〜１０ｍＭの範囲である。
【００５３】
基質はアクリドン群色素から選択した色素、好ましくは、Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエートで標識する。非リン酸化ペプチド基質は、非リン酸化基質に結合した色素の寿命とリン酸化基質に結合した色素の寿命との間の差を検出測定することにより、リン酸化形状の基質と識別し得る。従って、強度と寿命、両方の変化を同時にモニターすることが可能であり、それによってアッセイの二重パラメータの測定が可能となる。これには多くの利点がある。第一に、アッセイの生物学を酵素反応生成物に特徴的な寿命の出現により確認することが可能であり、生成物の強度を同時にモニターし得る。第二に、基質の除去は、その特徴的な蛍光寿命によりモニター可能であり、色素標識基質の蛍光強度が低下するのを観察し得る。第三に、各種の強度間の定量的関連性を測定することが可能である；これは反応をオンライン実時間でモニターするための濃度単位に直接変換することができる。
【００５４】
ホスファターゼの活性を測定しようとする場合には、先ずリン酸化基質を調製する。ペプチド基質を合成し、次いでリン酸化するか、又は１個以上のリン酸化アミノ酸を合成に際してペプチド鎖に取込むことができる。化学的に合成したペプチドへの取込みに適したリン酸化アミノ酸は市販品として、例えば、バッケム（Ｂａｃｈｅｍ）Ａ．Ｇ．から入手し得る。リン酸化ペプチドの蛍光色素標識は、上記のように、ペプチドの合成に際して、合成過程で標識したアミノ酸を使用するか、又は合成の完了時点で他の潜在的に反応性の残基を脱保護する前に、対象の残基の特異的な脱保護と標識を行うことにより得られる。タンパク質ホスファターゼ基質は本発明によるアッセイに使用するために、先ず、適当なリン酸化の形状にあるか、又はその形状に変換しなければならない。例えば、ホスホリラーゼｂ（脱リン酸化形状）はホスホリラーゼａを得るためにホスホリラーゼキナーゼを用いて１個のセリン残基にリン酸化し得る。次いで、リン酸化基質を蛍光色素標識試薬、好ましくは、アクリドン又はキナクリドンなどで標識する。
【００５５】
ホスファターゼのアッセイ法は水性バッファー媒体中で実施し得るが、この場合のバッファーは一般にｐＨ７〜８で１０〜２００ｍＭの範囲にあり、例えば、５０ｍＭトリスｐＨ７．２（又は代替として、ＨＥＰＥＳ又はＭＯＰＳ）である。さらに、塩化ナトリウムなどの塩を１０〜１００ｍＭの範囲で添加してもよい。他のファクター、例えば、１〜５ｍＭ−ＤＴＴ、１００μＭ〜２ｍＭ−ＥＤＴＡ及び０．０５〜０．１％Ｂｒｉｊ（商標）などもアッセイ混合物に含有させ得る。色素標識リン酸化基質は１０〜２００μＭの範囲で存在する。反応はホスファターゼの添加により開始する。一般的に、反応は３０℃で３０〜６０分間インキュベートし、次いで以前同様、停止試薬の添加により停止させる。
【００５６】
本発明による方法は細胞に基づくアッセイにより、細胞性環境に存在するキナーゼとホスファターゼ基質のリン酸化状態を測定するためにも採用し得る。
【００５７】
従って、本発明の第五の態様においては、細胞環境における基質のリン酸化状態を測定する方法であって、基質が細胞性酵素によりリン酸化又は脱リン酸化されて産物を生じ得る１以上のの部分を含んでなり、かつ基質が蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
ｉ）無細胞環境における蛍光標識基質の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程；
ｉｉ）液体培地中１個以上の細胞に基質を加える工程；及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）に続いて、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程；
からなり、蛍光強度と蛍光寿命の変化を基質のリン酸化状態を示すために使用する、方法が提供される。
【００５８】
適切には、第五の態様による基質はキナーゼ基質又はホスファターゼ基質である。
【００５９】
好ましくは、蛍光色素は本明細書にすでに記載したように、アクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される。
【００６０】
適切には、基質は担体もしくは輸送ペプチドなどの第二ペプチド又はタンパク質に接合（又は融合）させることで、基質の細胞膜通過、細胞内輸送を容易にする。
【００６１】
一般に、培養細胞は、適切な細胞培地中０．１〜１００μＭ濃度で、細胞増殖に適切な条件下に、０．５〜２４時間の範囲の時間、接合体とインキュベートする。細胞は標準的な細胞培養技法により培養する、例えば、細胞は無菌環境下の適切な容器中で、３７℃、加湿した９５％空気／５％ＣＯ2ガスからなるインキュベーター中で培養する。容器には撹拌又は静置培地を容れる。種々の細胞培養培地を使用することが可能であり、例えば、ウシ胎仔血清などの未限定の生体液を含む培地、又は２９３ＳＦＭＩＩ無血清培地（ライフ・テクノロジー（株）、パルスレイ（Ｐａｉｓｌｅｙ）、英国）などの確定した培地などである。多様な細胞型の培養については確立された利用可能なプロトコールがある（参照例：Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（動物細胞の培養）；  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．  １９８７）。
【００６２】
本発明方法は標準的組織培養プラスティックウエアで培養し得る接着細胞又は非接着細胞のいずれについても使用し得る。かかる細胞型は、種（例えば、ヒト、げっ歯類、サル）、組織起源（例えば、脳、肝臓、肺、心臓、腎臓、皮膚、筋肉）及び細胞型（例えば、上皮、内皮）に関して認知された起源、例えば、哺乳動物、植物、細菌、ウイルス又は真菌など由来の正常又は形質転換細胞すべてを含む。細胞培養又は組織培養において増殖した細胞に基質を送達する必要のある場合は、単に接合体を培地に加える。
【００６３】
第五の態様の特定実施形態において、細胞は、基質のリン酸化状態に及ぼす影響を判定しようとする基質の存在下に接合体と接触させ得る。この実施形態において、検出段階ではリン酸化状態に及ぼす試験物質の影響を測定することができ、特定の細胞型に対する代謝と毒性学について研究段階にある化合物、例えば、薬物、酵素インヒビターなどに適用し得る。
【００６４】
アクリドン及びキナクリドン群色素それぞれについて、蛍光色素はその異なる寿命により互いに識別することが可能である。従って、２種以上の異なる基質は、それぞれをアクリドン色素セットの異なる１つで（又はキナクリドン色素セットの異なる１つで）標識して多重アッセイに使用可能であり、この場合、異なる酵素のキナーゼ活性測定を同時に実施し得る。
【００６５】
本発明の第六の態様においては、各酵素が異なる基質に特異的であり、その２種以上の異なる酵素のキナーゼ活性を同時に測定する方法であって、各基質が酵素によりリン酸化されて産物を生じ得る１以上の部分を含んでなり、かつ各基質が蛍光色素セットの異なる１つにより標識されているものであり、当該方法が、
ｉ）蛍光標識基質それぞれの蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程；
ｉｉ）リン酸源の存在下に酵素の混合物と各基質分子とを結合する工程；及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）に続いて、各蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命の増加を測定する工程；
からなり、各蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命の増加を各酵素のリン酸化活性の定量に使用する、方法が提供される。
【００６６】
好ましくは、セットの蛍光色素は本明細書にすでに記載したように、アクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される。
【００６７】
第六の態様による一実施形態において、本方法は単離酵素を用いてインビトロで実施し得るし、又は代わりに１種以上の酵素が細胞溶解液の成分であってもよい。
【００６８】
第六態様の別の実施形態において、本方法は細胞環境内で実施し得る。この実施形態においては、異なる基質のそれぞれを担体もしくは輸送ペプチドなどの第二ペプチド又はタンパク質に接合（又は融合）させることで、記載のように、基質の細胞膜通過、細胞内輸送を容易にする。
【００６９】
好ましくは、測定するキナーゼ活性はチロシンキナーゼの測定による。
【００７０】
第七の態様においては、以下の成分：
ｉ）キナーゼ酵素に対する基質であって、基質が酵素によりリン酸化されてリン酸化産物を生じ得る１以上の部分を含んでなり、かつ基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識されている基質；及び
ｉｉ）リン酸供与体及びキナーゼから選択される成分；
を含んでなる組成物が提供される。
【００７１】
第八の態様においては、１種以上のの酵素のキナーゼ活性を測定する試験キットであって、
ｉ）各基質がリン酸化されて産物を生じ得る部分を含んでなり、かつ各基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素セットの異なる１つにより標識されている１種以上の異なる基質；及び選択肢として、
ｉｉ）各酵素が異なる基質に特異的な１種以上の異なる酵素；
を含んでなる試験キットが提供される。
【００７２】
第九の態様においては、１種以上のの酵素のホスファターゼ活性を測定する試験キットであって、
ｉ）各基質が脱リン酸化されて産物を生じ得るリン酸化部分を含んでなり、かつ各基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素セットの異なる１つにより標識されている１種以上の異なる基質；及び選択肢として、
ｉｉ）各酵素が異なる基質に特異的な１種以上の異なる酵素；
を含んでなる試験キットが提供される。
【００７３】
発明の効果
本発明は必要とされる工程数を減らすことにより通常のアッセイ方式を簡略化するものである。通常の（放射活性に基づく）キナーゼアッセイにおいて、リン酸供与体の濃度は最適な濃度で利用することができない。例えば、放射活性アッセイにおいて、ＡＴＰ濃度は多くの場合Ｋmの１／１０であり得る（一般的には１〜１０μＭ）が、一方、キナーゼアッセイは通常ＡＴＰのＫmの２倍以上で実施することが推奨されている。本発明では、ＡＴＰ濃度は読み出しに影響することがなく、従って、蛍光読取り方法に関わりなく、アッセイの最適レベルで利用することができる。
【００７４】
本発明方法によると、必須の成分を除き、いずれの試薬もどのような順序ででも混合物に添加することができる。従って、反応混合物は、ＡＴＰを除き、他のすべての反応成分を含めて調製することができる。ＡＴＰ（開始剤）を添加する前に、非特異的影響について反応をモニターすることができる。また、さらなるコントロールのための酵素なしに、混合物を構築することが可能である。反応の性質によっては、最終成分を添加し、反応開始した後に実時間で、又は反応を停止することにより、変化をモニターすることが可能である。
【００７５】
さらに、本発明にて利用し得る蛍光寿命の測定値は、蛍光強度を定量することのみに基づく従来の蛍光法によるよりも有意な特徴を提供し得る。蛍光寿命は同じスペクトルの分解強度シグナルから決め得るが、さらに時間的ドメインに分解する。蛍光寿命法はシグナルが‘バックグラウンド・ノイズ’に殆ど影響されないため、非常に高い感度を与える。この技法によるさらなる特徴は、識別可能な寿命をもつラベルを選択することにより、数種の異なる事象を同時に測定することができ、従って複合化できることである。さらに、蛍光寿命の測定値は濃度効果及び光脱色の影響を受けない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
本発明について、後記の図面及び実施例を参照し、さらに説明する。
【実施例】
【００７７】
実施例１：Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエートによるＨ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ2の標識
１．１  Ｈ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−リンク・アミド樹脂；Ｈ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−リンク・アミド樹脂
Ｈ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−リンク・アミド樹脂及びＨ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−リンク・アミド樹脂は、市販入手可能なアプライド・バイオシステムズ・モデル４３３Ａ自動ペプチド合成機とファストモック（ＦａｓｔＭｏｃ）（商標）化学を用いて、全工程、機器製造業者の推奨手法に従い合成した。合成は両方とも、０．２５ミリモルスケールで実施した。
【００７８】
１．２  Ｈ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ2（Ａｂｌキナーゼ基質）の合成
粗製のペプチドは、９５％トリフルオロ酢酸：２．５％水：２．５％トリイソプロピルシランの混合物を用いて脱保護し、固相から切断した。切断反応から得られた粗製のペプチドは常套のＣ−１８逆相ＨＰＬＣにより、直線勾配の水／アセトニトリル（双方０．１％トリフルオロ酢酸含有）を用いて精製した。精製後、ペプチドを凍結し、マルディ（Ｍａｌｄｉ）ＴＯＦマススペクトル法及びＨＰＬＣにより特性化した。
【００７９】
１．３  Ｈ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ2の合成
本品はＨ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−リンク・アミド樹脂を用い、上記の１．２と同様に調製した。
【００８０】
１．４  Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエート（Ａｃｅ−１４）によるＨ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ2の標識
Ｈ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−リンク・アミド樹脂は、Ｎ−末端において、固相上、Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエート（１．５当量）（アマーシャム・バイオサイエンス）により、ジメチルスルホキシド及びジイソプロピルエチルアミン（４％容量）中、室温で一夜、標識した。樹脂はＤＭＳＯと、次いでメタノール、最後にジクロロメタンで洗浄し、次いで、減圧下乾燥した。標識したペプチドは、９５％トリフルオロ酢酸：２．５％水：２．５％トリイソプロピルシランの混合物を用いて脱保護し、固相から切断した。粗製物質を冷ジエチルエーテルからの沈殿により単離し、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣにより、直線勾配の水／アセトニトリル（双方０．１％トリフルオロ酢酸含有）を用いて精製した。精製後、モノ標識ペプチドを凍結し、マルディＴＯＦマススペクトル法、ＵＶ及びＨＰＬＣにより特性化した。
【００８１】
１．５  Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエート（Ａｃｅ−１４）によるＨ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ2の標識
本品は上記１．４同様に調製したが、ただし、Ｈ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−リンク・アミド樹脂を使用した。
【００８２】
実施例２：Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエートによるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の標識
ｉ）方法１
ＭＢＰ１００ｍｇ（１００ｍｇ；７ｍｇ／ｍｌ）を０．１ｍのＮａＨＣＯ3溶液中、＋４℃で一夜、透析した。Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエート（１０ｍｇ）をＤＭＳＯ（アルドリッチ）１ｍｌに溶かし、透析したＭＢＰサンプルに加えた。得られた混合物を４５分間撹拌した。１０本のＰＤ１０カラム（アマーシャム・バイオサイエンス）を１０ｍｌの１０ｍＭ−ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）で平衡化した。標識したＭＢＰ（１．３ｍｌ分割部）を各カラムに加え、カラムを１０ｍＭ−ＭＯＰＳ（１ｍｌ）で洗浄した。各カラムを３ｍｌの１０ｍＭ−ＭＯＰＳで溶出し、溶出液をプールした。最終のタンパク質濃度はＢＳＡを基準（０．１ｍｇ／ｍｌ）として、バイオラッド・プロテイン・アッセイ（５００−００６）により決定した。ＭＢＰの最終濃度は全容量３０ｍｌにおいて１．４４ｍｇ／ｍｌであった。標識したＭＢＰはアミコン・セントリプレップス（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐｓ）ＹＭ−１０（１０，０００ＮＭＷＬ）（１５分間回転）により濃縮した。引続くタンパク質定量では濃度４．５ｍｇ／ｍｌ（７．１ｍｌ）であった。アクリドン標識ＭＢＰは、５００ｍＭ−ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、５０ｍＭ−ＭｇＣｌ2、１ｍＭ−ＡＴＰ及びＰＦ−Ｈ2Ｏにより、濃度１６．６μＭに希釈した。
【００８３】
ｉｉ）方法２
ＭＢＰ（１００ｍｇ；７ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ溶液（０．０１Ｍリン酸バッファー、０．００２７Ｍ塩化カリウム及び０．１３７Ｍ塩化ナトリウム；ｐＨ７．４）（シグマＰ−４４１７）中、＋４℃で一夜、透析した。Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエート（１０ｍｇ）をＤＭＳＯ（アルドリッチ）１ｍｌに溶かし、透析したＭＢＰに加えた。この混合物を＋４℃で一夜ローラー混合した。１０本のＰＤ１０カラム（アマーシャム・バイオサイエンス）を１０ｍｌの１０ｍＭ−ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）で平衡化した。標識したＭＢＰ１．３ｍｌ分割部分を各カラムに加え、各カラムをさらに１ｍｌの１０ｍＭ−ＭＯＰＳで洗浄した。各カラムを３ｍｌの１０ｍＭ−ＭＯＰＳで溶出し、溶出液をプールした。タンパク質濃度はＢＳＡを基準（０．１ｍｇ／ｍｌ）として、バイオラッド・プロテイン・アッセイ（５００−００６）により決定した。標識したＭＢＰの濃度は全容量２８ｍｌにおいて１．４ｍｇ／ｍｌであることが分かった。標識したＭＢＰはアミコン・セントリプレップスＹＭ−１０（１０，０００ＮＭＷＬ）（１０分間回転）により濃縮した。引続くタンパク質定量では総容量９．７ｍｌ中、３．２５ｍｇ／ｍｌの濃度を示した。色素標識ＭＢＰは、５００ｍＭ−ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、５０ｍＭ−ＭｇＣｌ2、１ｍＭ−ＡＴＰ及びＰＦ−Ｈ2Ｏにより、濃度１６．６μＭに希釈した。
【００８４】
実施例３：Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエートによるＨ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の標識
３．１  Ｈ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−リンク・アミド樹脂（Ｌｃｋキナーゼ基質）；Ｈ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−リンク・アミド樹脂
Ｈ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−リンク・アミド樹脂及びＨ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−リンク・アミド樹脂は、市販入手可能なアプライド・バイオシステムズ・モデル４３３Ａ自動ペプチド合成機とファストモック  （商標）化学を用いて、全工程、機器製造業者の推奨手法に従い合成した。合成は０．２５ミリモルスケールで実施した。
【００８５】
３．２  Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエート（Ａｃｅ−１４）によるＨ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の標識
Ｈ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−リンク・アミド樹脂は、Ｎ−末端において、固相上、Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエート（１．５当量）（アマーシャム・バイオサイエンス）により、ジメチルスルホキシド及びジイソプロピルエチルアミン（４容量％）中、室温で一夜、標識した。樹脂はＤＭＳＯと、次いでメタノール、最後にジクロロメタンで洗浄し、次いで、減圧下乾燥した。標識したペプチドは、９５％トリフルオロ酢酸：２．５％水：２．５％トリイソプロピルシランの混合物を用いて脱保護し、固相から切断した。粗製物質を冷ジエチルエーテルからの沈殿により単離し、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣにより、直線勾配の水／アセトニトリル（双方０．１％トリフルオロ酢酸含有）を用いて精製した。精製後、モノ標識ペプチドを凍結し、マルディＴＯＦマススペクトル法、ＵＶ及びＨＰＬＣにより特性化した。
【００８６】
３．３  Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエート（Ａｃｅ−１４）によるＨ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の標識
本品は上記３．２同様に調製したが、ただし、Ｈ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−リンク・アミド樹脂を使用した。
【００８７】
３．４  Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（２−アセトアミド−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエート（Ａｃｅ−１７）によるＨ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の標識
これらの合成は実施例３．２に記載した通りに実施したが、ただし、Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエート（Ａｃｅ−１４）の代わりにＯ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（２−アセトアミド−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエート（Ａｃｅ−１７）を使用した。
【００８８】
実施例４：Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエートによるＨ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＮＨ2の標識
これらの合成は実施例３．２に記載した通りに実施したが、ただし、Ｈ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−リンク・アミド樹脂を使用した。非リン酸化ペプチドは同様の方法で合成した。
【００８９】
実施例５：Ａｂｌペプチドによるリン酸化及び非リン酸化ペプチドの検出
リン酸化及び非リン酸化形状のＡｂｌペプチドの１μＭ溶液を１０ｍＭ−ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．２）中で調製した。溶液の蛍光強度と寿命を比較した。
【００９０】
結果
２つのペプチド間に明確な差が認められる。非リン酸化ペプチドの強度が約７×１０4ｒｆｕであるのに対し、リン酸化ペプチドの強度は約９×１０4ｒｆｕであった。また、非リン酸化ペプチドの寿命が約１０ナノ秒であるのに対し、リン酸化ペプチドの寿命は１５ナノ秒であった。図１参照。
【００９１】
実施例６：チロシンキナーゼＡｂｌのアッセイ
Ａｂｌの反応混合物は、１ｍｌの反応バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ2、１ｍＭ−ＥＧＴＡ、２ｍＭジチオスレイトール（ｐＨ７．５、２５℃））、１０μｌの１０ｍＭ−ＡＴＰ、２μｌの６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエート標識Ａｂｌペプチド基質（非リン酸化）（ＤＭＳＯ中５００μＭ）を混合し、調製した。この混合物１００μｌをブラック平底マイクロタイタープレートのウエルに入れた。予め反応バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ2、１ｍＭ−ＥＧＴＡ、２ｍＭジチオスレイトール、０．０１％Ｂｒｉｊ３５（ｐＨ７．５、２５℃））に１０μｌあたり１００単位の濃度に希釈したＡｂｌキナーゼ（ニューイングランド・バイオラボ、コードＰ６０５０Ｌロット５）（１００，０００単位／ｍｌ又は１００単位／μｌ）１０μｌを添加することにより反応を開始した。
【００９２】
反応は、生成物と基質の特性である寿命と強度の変化両方につき、３０秒間隔でモニターした。
【００９３】
結果
図２に示すように、反応の進行は実時間でモニターし得る。特に、生成物の強度変化は、単離ペプチドの検討から予測したように、基質の強度変化よりも大きい。さらに、この反応は分離工程がなくとも実施可能であり、またそれぞれの蛍光寿命に基づいて、基質と生成物を識別することが可能である。
【００９４】
実施例７：Ｅｒｋキナーゼによるミエリン塩基性タンパク質の時間依存性リン酸化
Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエートにより標識したミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（実施例２、方法１により調製）（１ｍｌ）を水で１０ｍｌに希釈し、５０ｍＭ−ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、５ｎＭ−ＭｇＣｌ2、１００μＭ−ＡＴＰ及び１．６６μＭ−ＭＢＰ含有溶液を得た。７部分に分割した反応混合物２００μｌをそれぞれＥｒｋ１キナーゼ（１．８ｍｇ／ｍｌ）５μｌと混合した。反応物を室温で様々な時間インキュベートし、１００μｌの分割部分を引き出し、各分割部分の蛍光を測定した。
【００９５】
結果
この結果を図３に示す。結果は蛍光が時間依存的に増大していることを示す。
【００９６】
実施例８：スタウロスポリンによるＥｒｋキナーゼの阻害
Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０イル）ヘキサノエートにより標識したミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（実施例２、方法１により調製）（１ｍｌ）を水で１０ｍｌに希釈し、５０ｍＭ−ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、５ｎＭ−ＭｇＣｌ2、１００μＭ−ＡＴＰ及び１．６６μＭ−ＭＢＰ含有溶液を得た。７部分に分割した１００μｌを、スタウロスポリンに関して０〜１００μＭの濃度とした。最後に、Ｅｒｋ１キナーゼ（１．８ｍｇ／ｍｌ）２μｌを各反応混合物に加えた。反応混合物を室温で３時間インキュベートし、その後、１００ｍＭ−ＥＤＴＡ１００μｌ加え、反応を停止させた。次いで、反応の蛍光強度を測定した。
【００９７】
結果
酵素反応は、図４に示すように、スタウロスポリンにより容量依存的に阻害される。
【００９８】
実施例９：チロシンキナーゼＬｃｋによるリン酸化の時間経過
５０ｍＭ−トリス／１０ｍＭ−ＭｇＣｌ2／２．５ｍＭ−ＭｎＣｌ2（ｐＨ７．２）中、５０μＭ−ＡＴＰの存在下、Ｎ−（６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）−ヘキサノイル）−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−アミドの複製（５００ｎＭ）を１００μｌ容量ずつ、ピペットでブラック９６穴マイクロプレート（コースター（Ｃｏｓｔａｒ）コード３６５０）のウエルに入れた。１２．７ミリ単位のＬｃｋ酵素（アップステート・バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）コード１４−３７９）を１０μｌ容量ずつ添加し、反応経過を追跡した。反応は１分間隔、外界温で、基質と生成物両方の特性である寿命と強度変化両方についてモニターした。
【００９９】
結果
図５に示すように、結果は生成物の形成が時間依存性であることを示している。
【０１００】
実施例１０：チロシンキナーゼＬｃｋによるリン酸化のＡＴＰ依存性
５０ｍＭ−トリス／１０ｍＭ−ＭｇＣｌ2／２．５ｍＭ−ＭｎＣｌ2（ｐＨ７．２）中、種々濃度のＡＴＰの存在下、Ｎ−（６−（２−アセトアミド−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）−ヘキサノイル）−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−アミドの複製（５００ｎＭ）を１００μｌ容量ずつ、ピペットでブラック９６穴マイクロプレート（コースター、コード３６５０）のウエルに入れた。１２．７ミリ単位のＬｃｋ酵素（アップステート・バイオテクノロジー、コード１４−３７９）を１０μｌ容量ずつ添加し、反応を開始した。室温で６０分間インキュベートした後、各ウエルに０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．０）（２０μｌ）を加えて反応を停止した。反応は、基質と生成物両方の特性である寿命と強度変化両方につき、モニターした。
【０１０１】
結果
結果は図６に示す。図６は生成物の形成がＡＴＰ濃度に依存することを示している。
【０１０２】
実施例１１：チロシンキナーゼＬｃｋによるリン酸化の酵素依存性
５０ｍＭ−トリス／１０ｍＭ−ＭｇＣｌ2／２．５ｍＭ−ＭｎＣｌ2（ｐＨ７．２）中、５０μＭ−ＡＴＰの存在下、Ｎ−（６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）−ヘキサノイル）−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−アミドの複製（５００ｎＭ）を１００μｌ容量ずつ、ピペットでブラック９６穴マイクロプレート（コースター、コード３６５０）のウエルに入れた。Ｌｃｋ酵素（アップステート・バイオテクノロジー、コード１４−３７９）を１０μｌ容量ずつ添加し、反応を開始した。室温で９０分間インキュベートした後、各ウエルに０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．０）（２０μｌ）を加えて反応を停止した。反応は、基質と生成物両方の特性である寿命と強度変化両方につき、モニターした。
【０１０３】
結果
結果は図７に示す。図７は生成物の形成が酵素濃度に依存することを示している。
【０１０４】
実施例１２：チロシンキナーゼＬｃｋによるスタウロスポリン阻害曲線
スタウロスポリン（シグマ、コードＳ４４００、ＤＭＳＯ中１ｍＭ）をアッセイバッファー（５０ｍＭ−トリス／１０ｍＭ−ＭｇＣｌ2／２．５ｍＭ−ＭｎＣｌ2（ｐＨ７．２））中に１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯで希釈し、以下のスタウロスポリン濃度を調製する：１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ及び１ｎＭ。反応混合物を以下のように調製した：１０ｍｌアッセイバッファー＋２．５μｌのＮ−（６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）−ヘキサノイル）−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−アミド（１ｍＭ）＋２０μｌのＡＴＰ（１０ｍＭ）。各阻害剤濃度の５つの複製（１０μｌ）をピペットでブラック９６穴マイクロプレート（コースター、コード３６５０）のウエルに入れた。反応混合物（１００μｌ）を各ウエルに添加した。１２．７ミリ単位のＬｃｋ酵素（アップステート・バイオテクノロジー、コード１４−３７９）を１０μｌ容量ずつ添加し、反応を開始した。室温で６０分間インキュベートした後、各ウエルに０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．０）（２０μｌ）を加えて反応を停止した。反応は、基質と生成物両方の特性である寿命と強度変化両方につき、モニターした。
【０１０５】
結果
図８の結果はスタウロスポリンによるＬｃｋキナーゼ活性の阻害を示す；ＩＣ50値は１６ｎＭである。パークら（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  （１９９９），  ２６９，  ９４−１０４）は、最終濃度２μＭのＡＴＰと類似のペプチド配列を用いて、時間分解蛍光フォーマットアッセイにより、ＩＣ50値は約１０ｎＭであると報告している。
【０１０６】
実施例１３：タンパク質チロシンホスファターゼによる脱リン酸化反応の時間経過
トリスバッファー塩溶液（ｐＨ７．６）中、Ｎ−（６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）−ヘキサノイル）−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＮＨ2（１μＭ）１００μｌずつの複製をピペットでブラック９６穴マイクロプレート（コースター、コード３６５０）のウエルに入れた。８８単位のタンパク質−チロシンホスファターゼ酵素（シグマ、コードＰ９８６４）を１０μｌ容量ずつ添加して、時間経過を開始した。反応は１分間隔、外界温度で、基質と生成物両方の特性である寿命と強度変化両方につき、モニターした。
【０１０７】
結果
図９はこのホスファターゼによる基質の脱リン酸化を示すプロットである。脱リン酸化産物の出現もモニターする。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】実施例５によるＡｂｌペプチドのリン酸化により観察される寿命と強度の差を示す。
【図２】実施例６のタンパク質チロシンキナーゼＡｂｌによるペプチドのリン酸化を示す。
【図３】実施例７のＥｒｋキナーゼによるミエリン塩基性タンパク質の時間依存性リン酸化を示すプロットである。
【図４】実施例８のスタウロスポリンによるＥｒｋキナーゼの阻害を示すプロットである。
【図５】実施例９のチロシンキナーゼＬｃｋによるリン酸化の時間経過である。
【図６】実施例１０のチロシンキナーゼＬｃｋによるリン酸化のＡＴＰ依存性を説明するプロットである。
【図７】実施例１１のチロシンキナーゼＬｃｋによるリン酸化の酵素依存性を示すプロットである。
【図８】実施例１２のスタウロスポリンによるＬｃｋキナーゼ活性の阻害を示すプロットである。
【図９】実施例１３のタンパク質−チロシンホスファターゼによる脱リン酸化反応の時間経過である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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