(57)【要約】本発明は、Ｃ５ａ受容体拮抗体であるＣ５ａアナフィラトキシン（Ｃ５ａ）の突然変異タンパク質に、Ｃ５ａアナフィラトキシンのこのような突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に、Ｃ５ａアナフィラトキシンのこのような突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する宿主細胞に、ならびにＣ５ａ受容体拮抗体として作用するＣ５ａアナフィラトキシンの突然変異タンパク質を含む医薬組成物に言及する。本発明の突然変異タンパク質は、配列位置６９に天然に生じるアミノ酸残基が突然変異化されるＣ５ａ受容体拮抗体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列位置６９に天然に生じるアミノ酸残基が突然変異化されるＣ５ａ受容体拮抗体であるＣ５ａアナフィラトキシンの突然変異タンパク質。
【請求項２】
配列位置６９のアミノ酸残基がロイシンまたは陽性荷電アミノ酸残基に取って代わられる請求項１記載の突然変異タンパク質。
【請求項３】
配列位置６７に天然に生じるアミノ酸残基が突然変異化される請求項１または２記載の突然変異タンパク質。
【請求項４】
天然アミノ酸配列の配列位置７０〜７４のアミノ酸残基の少なくとも１つが突然変異化されるかおよび／または前記配列位置７０〜７４のアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失される請求項１〜３のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項５】
配列位置６９の陽性荷電アミノ酸残基がＡｒｇまたはＬｙｓである請求項１〜４のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項６】
Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択される芳香族アミノ酸を配列位置６７に含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項７】
配列位置７０に疎水性アミノ酸残基を含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項８】
配列位置７０にＬｅｕまたはＡｌａを含む請求項７記載の突然変異タンパク質。
【請求項９】
配列位置７０にＳｅｒを含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１０】
配列位置７１または７２に疎水性アミノ酸残基を含む請求項１〜９のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１１】
配列位置７１にＬｅｕを含む請求項１０記載の突然変異タンパク質。
【請求項１２】
配列位置７２にＬｅｕを含む請求項１〜１１のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１３】
６７−ＦＫＲＳＬＬＲ−７３、６７−ＦＫＲＬＬＬＲ−７３、６７−ＦＫＲＳＣ−７１、６７−ＦＫＲＳＬＬＣ−７３、６７−ＦＫＲＬＬＬＹ−７３、６７−ＦＫＫＡＬＬＲ−７３、６７−ＦＫＲＳ−７０および６７−ＦＫＬＬＬＬＲ−７３からなる群から選択されるＣ末端配列を含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１４】
配列位置２７にＡｒｇをさらに含む請求項１〜１３のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１５】
配列番号１４（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ）；
配列番号１５（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｌｅｕ７０）；
配列番号１８（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｃｙｓ７１）；
配列番号１７（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｃｙｓ７３）；
配列番号１８（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｌｅｕ７０−Ｔｙｒ７３）；
配列番号１９（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｌｙｓ６９−Ａｌａ７０）；
配列番号２０（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｒｇ）−Ａ８Ｂ８−Ａｒｇ２７）；
配列番号２１（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｄｅｌ７１−７３）；
配列番号２２（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ３，Ｇｌｙ−２，−１，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ）；または
配列番号３９（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ５ａ）
のアミノ酸配列を有するヒトＣ５ａアナフィラトキシンの突然変異タンパク質。
【請求項１６】
Ｃ５ａ突然変異タンパク質を二量体化し得るＮ末端リンカー配列をさらに含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１７】
Ｎ末端リンカー配列が配列Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＣｙｓ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２を含む請求項１６記載の突然変異タンパク質。
【請求項１８】
突然変異タンパク質Ａ８ＢとＪｕｎ／Ｆｏｓ単独との、またはＪｕｎ／Ｆｏｓおよび繊維状Ｍ１３ファージ突然変異タンパク質Ａ８Ｂの小コートタンパク質（ｐＩＩＩ）との融合タンパク質という条件で、タンパク質またはペプチドタグに融合され、ここで、Ｊｕｎ／Ｆｏｓ部分が突然変異タンパク質Ａ８ＢのＮ末端に融合され、ならびにＮ末端に直接融合されたヘキサヒスチジンタグを有する突然変異Ａ８Ｂが排除される請求項１〜１７のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１９】
突然変異タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を強化する部分に接合される請求項１〜１８のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項のＣ５ａアナフィラトキシンの突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２１】
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２の突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２２】
核酸分子が調節配列に操作可能的に連結されて核酸分子の発現を可能にする請求項２０または２１記載の核酸分子。
【請求項２３】
前記調節配列がプロモーター配列を含む請求項２２記載の核酸分子。
【請求項２４】
ベクター内に含まれる請求項２０〜２３のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２５】
請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質を含む医薬組成物、および医薬上許容可能な担体。
【請求項２７】
哺乳類におけるＣ５ａ媒介性疾患または炎症性症状を治療するための薬剤の製造のための請求項１〜１９のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質の使用。
【請求項２８】
哺乳類におけるＣ５ａ媒介性疾患または炎症性症状の治療方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質および医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を該医薬組成物を必要とする哺乳類に投与する過程を包含する方法。
【請求項２９】
Ｃ５ａ受容体拮抗体である突然変異タンパク質の製造方法であって、以下の：
（ａ）Ｃ５ａポリペプチドの配列位置６９での残基を突然変異化するヌクレオチド配列をＣ５ａアナフィラトキシン（Ｃ５ａ）ポリペプチドをコードする核酸分子中に導入する過程、および
（ｂ）得られた核酸分子を発現のために適切な宿主細胞中にあるいは適切な細胞抽出物または細胞溶解物中に導入する過程
を包含する方法。
【請求項３０】
ロイシンまたは陽性荷電アミノ酸をコードするコドンが前記過程ａ）において導入される請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
配列位置６７をコードするヌクレオチド配列を突然変異化する過程をさらに包含する請求項２９または３０記載の方法。
【請求項３２】
Ｃ５ａポリペプチドの天然アミノ酸配列の配列位置７０〜７４をコードするヌクレオチド配列を欠失するかおよび／または突然変異化する過程をさらに包含する請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ５ａ受容体拮抗体であるＣ５ａアナフィラトキシン（Ｃ５ａ）の突然変異タンパク質（突然変異型タンパク質）に、ならびにＣ５ａ受容体拮抗体であるＣ５ａアナフィラトキシンのこのような突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に言及する。本発明はさらに、Ｃ５ａアナフィラトキシンのこのような突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する宿主細胞に、ならびにＣ５ａ受容体拮抗体として作用するＣ５ａアナフィラトキシンの突然変異タンパク質を含む医薬組成物に言及する。本発明はまた、薬剤の製造のためのＣ５ａ受容体拮抗体であるＣ５ａアナフィラトキシンの突然変異タンパク質の使用に、Ｃ５ａ媒介性疾患または炎症性症状の治療方法に、ならびにアナフィラトキシンＣ５ａの突然変異タンパク質の製造方法にも言及する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、損傷により引き出される局在的防御事象であり、これは、傷害作因および損傷組織の両方を破壊し、希釈しまたは遮断するのに役立つ。炎症は、血管透過性増大、血流量増大、ならびに流体および血漿タンパク質の滲出を伴う動脈、毛細血管および小静脈の拡張を含めた複雑な一連の事象を伴う。これらの過程の後にはしばしば、血管内皮への白血球の接着が急速に起こり、その後、周囲組織への該細胞の流入が生じる。
【０００３】
異物に対する主要免疫学的防御メカニズムである補体系は、炎症性応答を含む因子の各々に影響を及ぼすことが示されている。概して補体は、組織および血液から微生物およびその他の抗原を排除して免疫複合体を取り除き、Ｂ細胞応答を支持(support)するよう働く一組のタンパク質を含む。この働きは、補体構成成分単独により、あるいは抗体とまたは補体受容体を発現する細胞と協力して達成される。特にこの系は、約３０の血漿タンパク質、それらの対応する細胞受容体およびいくつかの膜調節タンパク質からなる（例えば［１］参照）。例えば抗原−抗体複合体または細菌表面構造による補体系の活性化は、補体構成成分のタンパク質分解的切断およびタンパク質アセンブリー事象の増幅カスケードを誘発し、これは最後に異物の破壊および最終的排除をもたらす（例えば［２］参照）。
【０００４】
補体系の活性化により、いくつかの生物学的に活性なペプチドが生成される。７４個のアミノ酸（配列番号１と比較）を含有し、グリコシル化形態で約１１，０００の分子量を有する糖タンパク質であるＣ５ａは、酵素Ｃ５コンバターゼ(convertase)による補体の第５構成成分であるＣ５のα鎖のＮ末端のタンパク質分解的切断により生成される［３］。
【０００５】
Ｃ５ａの生物学的特性は、急性および慢性の両炎症過程に関与する多数の細胞および組織に亘っている。それは種々の前炎症性エフェクター機能、例えば多形核好中球（ＰＭＮ）およびマクロファージの炎症部位への動員、ならびに増大レベルのサイトカイン、ケモカイン、リソソーム酵素、アラキドン酸代謝の産物およびヒスタミンを放出するためのこれらの細胞の活性化を媒介する（例えば［４］および［５］で再検討されている）。Ｃ５ａは、炎症の部位へのＰＭＮの誘引への中心的刺激剤である。さらに内皮細胞は、Ｐ−セレクチンを増大するよう刺激される［３］。
【０００６】
補体は、侵入微生物または腫瘍細胞のような適切な標的に向けられた場合に有益であるが、しかし不適切に活性化された場合には、明瞭な病原性能力を有する。例えばアナフィラトキシン、例えばＣ５ａがいくつかの炎症性疾患、例えば敗血症［６］、外因アレルギー性喘息（［７］〜［９］）、成人性呼吸促迫症候群および慢性関節リウマチ［１０、１１と比較］の病因における原因または悪化因子として結びつけられてきた。特に組織中のＣ５ａの異所性存在が、アレルギー性喘息［１２］、慢性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬および非心臓性肺水腫に罹患した患者において検出されている。Ｃ５ａは、炎症性白血球の動員および刺激、ならびに抗体産生の増強を含めた付加的活性による補体活性化により産生される主要炎症媒介物質であることが判明している（例えば［１３］参照）。
【０００７】
Ｃ５ａは炎症カスケードにおいて極初期に出現するという事実は、この分子を治療のための興味深い標的にする。Ｃ５ａは、いくつかのヒト細胞、例えば好中球、好酸球および単球由来細胞、肥満細胞ならびに活性化Ｂ細胞およびＴ細胞の膜中に見出される特定のＣ５ａ受容体と結合することにより、その種々の機能を発揮するため、Ｃ５ａ媒介性炎症性障害および症状を抑制するためのＣ５ａ受容体拮抗体の設計はかなりの注意を引いた。
【０００８】
米国特許［１４］および［１５］は、Ｃ５ａアナフィラトキシンのＣ末端類似体、例えばＣ末端でβターンに制約されるという主鎖配座を保有するデカペプチド類似体を開示する。安定化βターンは、ペプチド類似体の潜在能力の増大を付与し、そしてＣ５ａに関連したある種の生物学的応答に関して選択性を改良するために用いられる。ＷＯ公報［１６］は、Ｃ５ａの環状ペプチド拮抗体を記載する。環化は、ペプチド類似体の配座を制約するのに役立つ。
【０００９】
米国特許［１７］ならびに［１８］は、Ｃ５ａのＣ末端の修飾により得られた組換えヒトＣ５ａ受容体拮抗体を開示する。これらのポリペプチドは、ヒトＣ５ａの配列位置１〜７０に天然アミノ酸配列を有する。ただし、ＴｈｒによるＭｅｔ１の置換、ＳｅｒによるＣｙｓ２７の置換、そしてある場合にはＰｈｅによるＨｉｓ６７の置換を除く。これらのポリペプチドの拮抗体特性は、システインによるＧｌｎ７１の置換により達成された。位置７１にＣｙｓを含み、残基７２〜７４が欠失されるＣ５ａＲＡＭと呼ばれる突然変異タンパク質は、用いた実験条件下で８×１０−９ＭのＫｉを有するＣ５ａ受容体拮抗体であることが報告された。実験データは、Ｃ５ａＲＡＭ突然変異タンパク質がＣ５ａ受容体の活性化に関連した障害および疾患における薬理学的作用物質として適切であり得る、ということを示した。
【００１０】
Ｃ５ａ分子のＣ末端領域におけるＣｙｓ２７Ａｌａ置換および修飾を有し、そして拮抗体Ｃ５ａ受容体活性を示すＣ５ａ−［Ａ５Ａ］およびＣ５ａ−［Ａ８Ｂ］（後者はＣ５ａ−Ａ８とも呼ばれる）と呼ばれる２つのさらなるポリペプチドが、Ｃ５ａアナフィラトキシンとＣ５ａ受容体との相互作用に関する研究中に見出された（［１９］、［２０］、［２１］）。これらの研究において、Ｃ５ａアミノ酸配列の位置６７〜７３が無作為に突然変異化されるファージ表示ライブラリーが構築された。突然変異化タンパク質が発現され、そして融合相手としてタンパク質ＪｕｎおよびＦｏｓのヘテロ二量体を用いて、融合タンパク質として特性化された（Ｃ５ａ融合タンパク質の模式的説明に関しては、Heller等の図１参照）。
【００１１】
Ａ８Ｂ突然変異タンパク質は、ＪｕＮ／Ｆｏｓ融合タンパク質相手を伴わずに、しかしそのＮ末端にヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグを有して、これらの研究中に対照実験において発現された。ＪｕＮ／Ｆｏｓ−Ｃ５ａ融合タンパク質と対比して、このＡ８Ｂ−Ｈｉｓ６変異体は拮抗体活性を示さなかったが、しかしＨｉｓ６タグを備えた組換え野生型Ｃ５ａ分子と同一の作動体活性を保有した（［１９］の１０１ページの表２３）。したがってＪｕＮ／Ｆｏｓ融合タンパク質の拮抗体特性は、融合相手、すなわちＪｕＮ／Ｆｏｓヘテロ二量体に起因した。分子を基礎にして、Ａ８Ｂ突然変異体のＡｒｇ６９はＪｕｎまたはＦｏｓと、特にＡｒｇ６９の陽性荷電側鎖に関する静電受容体として作用し得るＦｏｓのロイシンジッパーの多数のグルタミン酸残基のうちの少なくとも１つと相互作用している、と推定された。Ｃ５ａおよびＪｕｎ／Ｆｏｓへテロ二量体のＣ末端領域間のこの相互作用は、Ｃ５ａ受容体とのＣ５ａのＣ末端の還元化または荷電結合をもたらすと考えられた（［１９］のｐ．１２０の最終段落）。したがって、Ｃ５ａ受容体との結合に関して１７．６ｎＭのＩＤ５０値を示し、そしてＣ５ａエフェクター機能をほぼ１００％まで遮断したＣ５ａの突然変異タンパク質ＪｕＮ／Ｆｏｓ−Ａ８Ｂは、Ｃ５ａ媒介性免疫複合疾患の治療のための強力な且つ特異的な治療薬とみなされた（［１９］、［２１］、［２２］）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
Ｃ５ａ受容体の拮抗体であり、そしてＣ５ａ受容体活性により媒介される障害における療法的適用に適しているその他の分子を提供することは、本発明の一目的である。Ｃ５ａ媒介性疾患または炎症性症状を治療するのに有用な医薬組成物を提供することは、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これらの問題は、独立した特許請求の範囲に定義されているような突然変異タンパク質および医薬組成物により、特に解決される。
【００１４】
Ｃ５ａアナフィラトキシンのこのような突然変異タンパク質は、配列位置６９に天然に生じるアミノ酸残基が突然変異化されるＣ５ａ受容体拮抗体である突然変異タンパク質である。
【００１５】
好ましい実施形態では、配列位置６９の残基は、陽性荷電アミノ酸残基により置換される。その他の好ましい実施形態では、位置６９の残基はロイシンにより置換される。
【００１６】
これは、本発明が天然に存在する残基（ヒトＣ５ａポリペプチドにおいてはＡｓｐ、ウシおよびブタタンパク質においてはＡｓｎ、ラットタンパク質においてはＧｌｙ、そしてネズミタンパク質においてはＰｒｏである）の代わりに、配列位置６９での突然変異の存在（例えば陽性荷電アミノ酸残基）が主として単離突然変異型タンパク質の拮抗体特性に寄与する、という意外な知見に基づいている、ということを意味する（突然変異タンパク質Ａ８Ｂ−Ａｓｐ６９におけるＡｓｐによるＡｒｇ６９の、あるいは突然変異Ａ８Ｂ−Ａｌａ６９におけるＡｌａによるＡｒｇ６９の置換がポリペプチドの作動体活性を生じることを示す図４および表１と比較）。この知見は、今のところ、配列位置６９が受容体結合残基であり得るかまたはＣ５ａとＣ５ａ受容体との相互作用にある程度関与し得るといういかなる徴候も存在しないため、特に意外である。むしろ受容体相互作用への配列位置６９の関与は除外されてきた（例えば［２３］、［２４］、［２５］参照）。
【００１７】
本発明の好ましいＣ５ａ突然変異タンパク質においては、配列位置６７に天然に生じるアミノ酸残基も突然変異化される。さらに好ましい実施形態では、Ｃ５ａの天然アミノ酸配列の配列位置６７および７０〜７４のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは突然変異化されるか、あるいは配列位置７０〜７４のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが欠失される。
【００１８】
本発明の知見に従って、本発明の突然変異型Ｃ５ａタンパク質は、好ましい一実施形態において、配列位置１〜６６および６８にＣ５ａアナフィラトキシンの天然アミノ酸配列を含む。
【００１９】
しかしながら、それらの突然変異が（単離）Ｃ５ａ突然変異タンパク質の拮抗体受容体活性を妨げない限り、天然に生じるポリペプチド配列の配列位置１〜６６および６８に突然変異を導入することもできる。これは、その結果生じるポリペプチドが三次元的安定構造にフォールディングする限り、例えば置換、欠失および挿入のような突然変異が天然アミノ酸配列中に導入され得ることも包含する。
【００２０】
考え得る変化の例は、変化が化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換である保存的修飾変異である。機能的に類似のアミノ酸を提供する表は、当該技術分野で既知である。保存的置換の例は、１）アラニン、セリン、トレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリシン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン；ならびに６）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン間の置換である。
【００２１】
しかしながら非保存的変化により本発明のＣ５ａ突然変異タンパク質の配列を修飾することも可能である。一例は、ＴｈｒによるＭｅｔ１の置換である（ｒｈＣ５ａのアミノ酸配列を示す配列番号１と比較）。さらなる例は、ＡｒｇによるＣｙｓ２７の置き換えである（配列番号２０と比較）。このような修飾は、ここに開示された突然変異タンパク質の拮抗体（抑制）効力をさらに改良するためにも用いられ得る。しかしながら突然変異タンパク質Ａ８Ｂ  Ａｒｇ２７（配列番号２０）は、Ｃｙｓ２７Ａｌａ置換を有する突然変異タンパク質Ａ８Ｂ（配列番号１４）と同一抑制効力を有する（表１参照）。
【００２２】
Ｃ５ａ突然変異タンパク質の配列は、安定性、産生、精製または適用可能性改良の目的のためにも修飾され得る。例えば機能的三次元構造へのフォールディングのためにきわめて重大というわけではないペプチドセグメントは、所望により、これらの目的のために除去され得る。ジスルフィド結合はシステイン残基の置換により排除され得るか、または新規のジスルフィド結合が別の部位に導入され得る。任意にシステイン残基は、例えば他の構成成分との化学的カップリングにより対応するタンパク質接合体を調製するために、新規に導入もされ得る。例えば金属イオンのようなさらなるリガンドのための結合部位も、Ｃ５ａ突然変異タンパク質に組立てられ得る。
【００２３】
「アミノ酸残基」という用語は、本明細書中で用いる場合、ＤまたはＬ形態のアミノ酸を指すか、あるいはアミド結合によりポリペプチド中に組み入れられ得るアミノ酸模倣物を指す。したがって位置６９の陽性荷電アミノ酸残基は、例えば生理学的条件下で陽性荷電される天然アミノ酸残基、例えばアルギニンまたはリシン、あるいは非天然模倣物、例えばそのαアミノ基が恒久的陽性電荷を有する（第四級）アンモニウム塩を生成するためにアルキル化されるリシン残基であり得る。
【００２４】
「拮抗体」という用語は、ここに開示されたポリペプチドがＣ５ａとＣ５ａ受容体の結合を妨害することによるＣ５ａの阻害剤であるということを、そしてこれらのポリペプチドが作動体またはアナフィラトキシン活性を（全く）有さないか、あるいは下記のように少なくとも実質的にこのような作動体またはアナフィラトキシン活性を有さない、ということを意味する。Ｃ５ａ突然変異タンパク質は、それらがＣ５ａ受容体との結合のためにＣ５ａと競合するという点でＣ５ａの競合的阻害剤であり得る。しかしながら本発明は、Ｃ５ａ結合の抑制の特定の分子メカニズムに限定されない。本明細書中で「抑制効力」としても言及されるＣ５ａ受容体との結合親和性は、［２０］に記載されているような、または本出願の実験の節に記載された競合的結合で得られるような、結合アッセイで得られるＩＣ５０値により表され得る。ＩＣ５０値は、半値抑制活性が起こる突然変異タンパク質の濃度を表す。本発明の突然変異タンパク質は、野生型ｒＣ５ａが１ｎＭの濃度で用いられる場合、これらのアッセイにおいて、好ましくは１μＭ未満の、さらに好ましくは１μｍ未満の、最も好ましくは１０ｎＭ未満のＩＣ５０値を示す。
【００２５】
上記のようなＣ５ａ受容体との結合が前提条件である当該Ｃ５ａ突然変異タンパク質の該拮抗体的（機能的）活性または拮抗作用は、［２０］または［２１］に記載されたような種々の方法により定量され得る。
【００２６】
拮抗体活性の定量のための好ましい方法は、［２３］に記載されたジブチリルｃＡＭＰ誘導性Ｕ９３７細胞を、あるいは［２５］に記載されたようなヒトＣ５ａ受容体で安定的にトランスフェクトされたラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞株２Ｈ３（Ｃ５ａＲ−ＲＢＬ）を用いた脱顆粒アッセイである。このアッセイで得られるＩＤ５０値は、１×１０−９Ｍの濃度の組換えヒトＣ５ａにより誘導されるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ放出の５０％を抑制するＣ５ａ突然変異型ポリペプチドの濃度である。異なるＣ５ａ突然変異タンパク質のＩＤ５０値は、表１に表されている。本発明の拮抗体性突然変異タンパク質は好ましくは、４×１０−６Ｍという高い濃度で用いられる場合、脱顆粒を誘導しない。
【００２７】
拮抗体効力は、［２６］に記載されたカルシウム上昇アッセイにおいてＩＤ５０としても定量され得る。このＩＤ５０値は、１×１０−１０Ｍまたは１×１０−９ＭのヒトＣ５ａを用いた挑戦投与（challenge dose）後、Ｃ５ａ受容体を保有するＰＭＮによるカルシウムイオンの細胞内可動化の５０％を抑制するＣ５ａ突然変異タンパク質の濃度と定義される（［１７］および［２１］も参照）。
【００２８】
拮抗体受容体活性を有する本発明の突然変異タンパク質は、作動体またはアナフィラトキシン活性を有さないかまたは実質的に有さないポリペプチドである。「アナフィラトキシン活性を有さない」または「作動体活性を実質的に有さない」という用語は、Ｃ５ａ突然変異タンパク質（Ｃ５ａ受容体拮抗体（Ｃ５ａＲＡ）としても互換的に言及される）と受容体との結合が１つまたは複数のＣ５ａエフェクター機能を全く引き起こさないか、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで重要でない最小度の１つまたは複数のエフェクター機能のみを生じる、ということを意味する。これは、Ｃ５ａ受容体との結合が内因性シグナル伝達事象を生じないし、結局、Ｃ５ａとその受容体との結合により引き起こされるアナフィラトキシン誘導性炎症に一般的に関連した生理学的応答、例えば細胞内Ｃａ２＋濃度のＣ５ａ誘導性変化、食細胞の活性化、平滑筋収縮、血管透過性増大ならびに炎症媒介物質、例えばヒスタミン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−６またはＩＬ−８の過剰産生を生じる、ということを意味する（例えば［４］または［５］参照）。拮抗体特性の定量的測定値は、Kohl［２３］および以下に記載された脱顆粒アッセイ、あるいは［２６］のカルシウム上昇アッセイを用いて得られる。
【００２９】
本発明の突然変異タンパク質は、哺乳類および非哺乳類種の天然Ｃ５ａ配列から得られる。それは、例えばヒト、ブタ、ネズミ、ウシまたはラット起源のものであり得る。好ましい実施形態では、突然変異タンパク質は、ヒトＣ５ａタンパク質の突然変異型タンパク質である。
【００３０】
好ましい実施形態では、Ｃ５ａ突然変異タンパク質の配列位置６９の陽性荷電アミノ酸残基は、ＡｒｇまたはＬｙｓである。
【００３１】
本発明のさらに好ましい実施形態では、突然変異タンパク質は、配列位置６７に疎水性アミノ酸残基を含む。芳香族疎水性アミノ酸Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＴｙｒは、配列位置６７の残基として特に好ましい。
【００３２】
さらにまた好ましい拮抗体は、配列位置７０、７１または７２の１つまたは複数に疎水性アミノ酸残基を含む突然変異タンパク質である。このような疎水性アミノ酸残基は、互いに独立して選択され、それらは同一であるかまたは異なり得る。好ましい疎水性残基は、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＡｌａである。
【００３３】
このような突然変異タンパク質は好ましくは、ＡｌａまたはＬｅｕから選択されるアミノ酸残基を配列位置７０に含む。その他の好ましい突然変異タンパク質は、配列位置７０にＳｅｒを含む。
【００３４】
配列位置７１の好ましいアミノ酸は、Ｌｅｕである。開示された拮抗体突然変異タンパク質は、好ましくは、配列位置７２のＬｅｕ残基も含み得る。
【００３５】
特に好ましい実施形態では、突然変異タンパク質は配列位置７０、７１および７２の全てにＬｅｕを含む。
【００３６】
Ｃ５ａ突然変異体中に存在する場合、すなわち欠失されていない場合、配列位置７３は好ましくは、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＳｅｒ残基により占められる。好ましい実施形態では、突然変異タンパク質は、７０、７１、７２または７３アミノ酸残基の長さを有する。概してＡｒｇ、Ｃｙｓ、ＴｙｒまたはＳｅｒも、切頭化突然変異タンパク質、すなわち７０、７１、７２または７３アミノ酸残基を有する突然変異タンパク質のＣ末端アミノ酸残基として好ましい。７０アミノ酸の長さを有する突然変異タンパク質の一例は、突然変異タンパク質Ｃ５ａ（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−ＦＫＲＳ−７０である（表１、配列番号１８と比較）。
【００３７】
さらに、位置６９の陽性荷電アミノ酸がＣ末端（最終）残基である突然変異タンパク質も本発明の範囲内である。したがって、このような突然変異タンパク質は、６９アミノ酸の長さを有し得る。しかしながら、例えば本発明の拮抗体タンパク質が６９未満のアミノ酸残基を含み得るよう、タンパク質のＮ末端領域に欠失を導入することも可能である。明快という理由で、このような欠失は、もちろん、配列位置７０〜７４の残基が欠失されないかまたは部分的に欠失されるだけである本発明の突然変異タンパク質中にも存在し得る、ということが再度、留意される。
【００３８】
本発明の突然変異タンパク質は好ましくは、Ｃ末端配列として、６７−ＦＫＲＳＬＬＲ−７３（突然変異タンパク質Ａ８Ｂ；配列番号１４参照）、６７−ＦＫＲＬＬＬＲ−７３（突然変異タンパク質Ａ８Ｂ−Ｌｅｕ−７０；配列番号１５参照）、６７−ＦＫＲＳＣ−７１（突然変異タンパク質Ａｂ８−Ｃｙｓ７１；配列番号１６参照）、６７−ＦＫＲＳＬＬＣ−７３（突然変異タンパク質Ａｂ８−Ｃｙｓ７３；配列番号１７参照）、６７−ＦＫＲＬＬＬＹ−７３（突然変異タンパク質Ａ８Ｂ−Ｌｅｕ７０−Ｔｙｒ７３；配列番号１８参照）、６７−ＦＫＫＡＬＬＲ−７３（突然変異タンパク質Ａ８Ｂ−Ｌｙｓ６９Ａｌａ７０；配列番号１９参照）、６７−ＦＫＲＳ−７０（突然変異タンパク質Ａ８Ｂ−Ｄｅｌ．７１〜７３；配列番号２１参照）および６７−ＦＫＬＬＬＬＲ−７３（Ａ５ａ；配列番号３９参照）からなる群から選択される配列を含む。明快性のために、番号はＣ５ａのアミノ酸位置を指し、すなわち６７−Ｆは、配列位置６７のアミノ酸としてフェニルアラニンが存在することを意味する（表１も参照）。
【００３９】
突然変異タンパク質はさらに、配列位置２７にＡｒｇ残基を含み得る（例えば突然変異タンパク質Ｃ５ａ−（１〜６６，Ｃｙｓ２７Ａｒｇ）−ＦＫＲＳＬＬＲ（Ａ８Ｂ−Ａｒｇ２７、配列番号２０）参照）。実際、位置２７のＡｒｇは、ブタおよびウシＣ５ａ中に見出される。さらにＣｙｓ２７Ａｒｇ置換を有するヒトＣ５ａの突然変異タンパク質が、Ｃ５ａ突然変異型ファージライブラリーから選択された［２７］。Ｃｙｓ２７Ａｒｇ置換のみを有するＣ５ａの突然変異タンパク質は、Ｃ５ａ受容体の作動体である［２７］。
【００４０】
配列番号１４（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ）；配列番号１５（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｌｅｕ７０）；配列番号１６（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｃｙｓ７１）；配列番号１７（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｃｙｓ７３）；配列番号１８（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｌｅｕ７０−Ｔｙｒ７３）；配列番号１９（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｌｙｓ６９−Ａｌａ７０）；配列番号２０（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｒｇ）−Ａ８Ｂ）；配列番号２１（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｄｅｌ．７１−７３）；配列番号２２（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ３，Ｇｌｙ−２，−１，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ）；および配列番号３９（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ５ａ）のアミノ酸配列を有するかまたは含むヒトＣ５ａアナフィラトキシンの突然変異タンパク質が特に好ましい。
【００４１】
本発明の突然変異型Ｃ５ａ拮抗体は、単離（組換え）タンパク質として存在するだけでなく、修飾もされ得る。一実施形態では、本発明の突然変異タンパク質は、同一のまたは異なる突然変異タンパク質を用いて二量体化されて、ホモ−またはヘテロ二量体を形成する。この目的のために、突然変異タンパク質は、Ｃ５ａ突然変異タンパク質を二量体化し得るＮ末端リンカー配列を含み得る。Ｎ末端に連結された好ましいリンカー配列の一例は、突然変異型タンパク質の組換え的産生の経過中にＣ５ａ突然変異タンパク質Ａ８Ｂの自発的二量体化のために用いられ得る配列Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含む（突然変異タンパク質Ｃ５ａ−（１−６６；Ｃｙｓ−３，Ｇｌｙ−２，−１；Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂと比較）。このような適切なリンカーの別の例は、Ｃｙｓ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２である。
【００４２】
突然変異タンパク質がＣ末端残基としてシステインを保有する場合（突然変異タンパク質Ａ８Ｂ−Ｃｙｓ７１およびＡ８Ｂ−Ｃｙｓ７３参照）、二量体化は、［１８］により記載されたように、これらのＣ末端システイン残基を介した２つの突然変異タンパク質のカップリングによっても起こり得る。二量体化は、適切な読取り枠中の突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、そのネイティブフォールディングでホモ二量体を形成するタンパク質をコードするヌクレオチド配列と連結することによっても達成され得る。核酸分子のその後の発現は、Ｃ５ａ突然変異型ポリペプチドに連結された二量体化モジュールからなる融合タンパク質を生じ、これは次に、自発的に二量体化する。二量体化モジュールとして用いられ得るこのようなタンパク質の例は、アルカリ性ホスファターゼ、スーパーオキシド−ジスムターゼまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである。これらのタンパク質の使用は、大腸菌のような細菌発現系における細胞周辺発現(periplasmic expression)により、それぞれの機能的融合タンパク質が容易に得られるため、特に有用である。アルカリ性ホスファターゼまたはスーパーオキシド−ジスムターゼのような二量体化モジュールの使用は、例えばアルカリ性ホスファターゼにより触媒される色素産生反応を用いてこのような融合タンパク質が容易に検出され得るというさらなる利点を提供する。これらの酵素のための適切な色素産生基質、例えばアルカリ性ホスファターゼのための５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートは、当業者に既知である。したがってそれらの融合タンパク質は、診断試薬として適している。
【００４３】
上記の段落の開示に従って、本発明の突然変異タンパク質は、さらなる実施形態においては、タンパク質またはペプチドタグに連結され、すなわちこの場合、Ｃ５ａ突然変異タンパク質を含有する融合タンパク質も本発明の一部である。しかしながら、［２１］から既知であるＪｕｎ／Ｆｏｓ単独とのそしてＪｕｎ／Ｆｏｓおよび突然変異タンパク質Ａ８ＢのＮ末端に融合される繊維状Ｍ１３ファージ小コートタンパク質（ｐＩＩＩ）との突然変異Ａ８Ｂの融合タンパク質は、本発明から除外される。同じことが、Ｎ末端に直接融合されるヘキサヒスチジンタグを有する突然変異タンパク質Ａ８Ｂに当てはまるが、これは、このポリペプチドが［１９］から既知であり、さらに重要なことはそれがＣ５ａ受容体の作動体であって、拮抗体ではないからである。
【００４４】
本発明の融合タンパク質は、融合相手がここに開示された突然変異タンパク質の拮抗体特性を妨害せず、そして例えば患者に投与される場合に突然変異タンパク質を作動体に転化する限り、任意の適切な融合相手、例えばアルカリ性ホスファターゼまたはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含み得る。治療目的に適している融合相手は、本発明の突然変異タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ（循環）半減期を増強し得るアルブミンのようなタンパク質である。融合相手は、Ｃ５ａ突然変異タンパク質のＮ末端に融合され得る。同様に、その拮抗体特性が保持される限り、任意のペプチドタグが突然変異タンパク質のＮ末端に融合され得る。適切な親和性タグの例は、ストレプ（Strep）−タグ（商標）（ストレプトアビジンまたはその変異体に対する特異的結合親和性を有する）、またはストレプ−タクチン（Tactin）（商標）（米国特許［２８］および［２９］参照）、フラグ−タグまたはｍｙｃ−タグ（これらは全て、アフィニティークロマトグラフィーによる突然変異タンパク質の精製のために用いられ得る）としての突然変異体である。
【００４５】
しかしながら、例えば作動体特性を付与する相手に接合または融合された本発明のＣ５ａ突然変異タンパク質の場合、拮抗体突然変異タンパク質は、（融合）相手にＣ５ａ突然変異タンパク質を連結する（ペプチド）結合の限定タンパク質分解、あるいは切断、例えば酵素的または化学的切断といったような処置により、その（融合）相手から容易に生成／放出され得る、ということに留意すべきである。したがって、例えば所望の治療用途に突然変異タンパク質が用いられる（したがって本発明の突然変異タンパク質の拮抗体活性が生成される）前に、この活性が排除され得る限り、例えばこの融合相手が作動体活性を付与する場合でも、突然変異タンパク質の精製改良のために融合相手を用いるということも、本発明の範囲内である。その拮抗体活性が（融合）相手により低減されるが、しかし完全に廃棄されるわけではない突然変異タンパク質を用いることも可能である。この場合、その（融合）相手からの切断により本発明の突然変異タンパク質を検討することは、したがって必要でない。むしろ、以下で説明されるような融合タンパク質または接合体が、所望の用途に用いられ得る。
【００４６】
本発明の突然変異タンパク質はまた、突然変異タンパク質の一次配列内の任意の適切な残基に結合され得る適切なペプチド性または非ペプチド性リンカーを介してタンパク質または異なる化学物質（高分子）部分に接合され得る。例えばタンパク質は、リシン残基の溶媒曝露αアミノ基ならびにリンカーとしてのグルタルアルデヒドを用いて、Ｃ５ａ突然変異タンパク質に接合され得る。別の適切なカップリング化学は、［３０］の９６ページに記載されたような５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）のビス（スクシンイミジルエステル）を用いるアミン−アミン架橋である。所望の用途によって、任意のタンパク質がＣ５ａ突然変異タンパク質と結合され得る。例えばストレプトアビジン、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはグリーン蛍光タンパク質との接合体は、細胞の表面または異なる区画内でＣ５ａ受容体を可視化するための診断試薬または研究ツールとして用いられ得る。
【００４７】
好ましい実施形態では、本発明の突然変異タンパク質は、突然変異タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増強する部分に接合される。このような接合体は、炎症の部位に拮抗体の長期存在が所望される慢性炎症性障害、例えば慢性関節リウマチ、紅斑性狼瘡、慢性肝炎または乾癬の治療のために本発明のＣ５ａ拮抗体が用いられる場合に、特に有用である。適切な部分(moiety)は、ヒト血清アルブミンのようなタンパク質である。非タンパク質（高分子）部分、例えばポリエチレングリコールを用いることも可能である。
【００４８】
その接合体または融合タンパク質を含めたＣ５ａ突然変異タンパク質は、補体系、特にＣ５ａおよびＣ５ａ受容体が関与する種々の損傷状態または疾患の治療および／または防止または予防に有用である。それらは、危険性の高いＣ５ａ媒介性組織破壊および死に直面した任意の哺乳類、例えばネコ、イヌ、サル、ウサギ、マウス、ラット、そしてもちろんヒトに投与される場合に、治療的に非常に適している。概して症状または疾患は通常は、Ｃ５ａが血清または組織中でタンパク質分解的に生成される炎症性障害のようなものである。
【００４９】
したがって本発明は、哺乳類におけるＣ５ａ媒介性疾患または炎症性症状の治療方法であって、単離または修飾化突然変異タンパク質を単独でまたはその他の医薬活性作用物質および医薬上許容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物をそれを必要とする哺乳類に投与する過程を包含する方法にも関する。
【００５０】
ここに記載された突然変異タンパク質で治療され得る疾患あるいは炎症性症状または障害の例としては、喘息、肺炎、成人性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、特発性肺線維症、肺炎症または損傷、慢性進行性非嚢胞性線維症、綿肺症、アスベスト誘導性炎症、心筋梗塞、心筋梗塞後炎症、虚血性心損傷、虚血／再還流（Ｉ／Ｒ）損傷、Ｉ／Ｒ誘導性限局性および遠隔性損傷、例えば出血、炎症性腸疾患（腸壁水腫）、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変炎症、慢性肝炎、膵炎、出血性膵炎、結腸炎、虚血性脳損傷、脳炎、髄膜炎における脳神経損傷、髄膜炎、ブドウ膜炎、プルチャー網膜症、免疫複合体媒介性糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、腎皮質壊死、痛風、血管炎、血清病、血管水腫、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチ、水疱性皮膚疾患、過敏症、乾癬、内毒素ショック、敗血症、重症外傷および熱傷が挙げられる。
【００５１】
本発明のＣ５ａ突然変異タンパク質は、移植片拒絶を蒙っている患者、免疫抑制療法または大量輸血を受けている患者、医療用具に曝露されている患者、ならびに血液透析および白血球交換療法（leukopheresis）後の肺機能不全を体験している患者を治療するための治療薬としても用いられ得る。
【００５２】
ここに開示されたＣ５ａ拮抗体はさらに、特に再灌流、例えば虚血後の再灌流、および医療用具との循環性接触により引き起こされる症状における、ならびに移植片拒絶を防止するための予防薬として用いられ得る。この場合、Ｃ５ａ拮抗体は、炎症を引き起こすかまたは既存の炎症症状を悪化させることが既知である事象の前またはそれと同時に適切に投与される。
【００５３】
本発明のＣ５ａ突然変異タンパク質は、所望により慣用的非毒性の医薬上許容可能な担体、アジュバントおよびビヒクルを含有する投薬単位処方物中で、タンパク質様薬剤のための任意の治療的に有効な経路により、例えば局所的に、非経口的に、鼻腔内に、直腸的にまたは頬に投与され得る。「非経口的」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、胸腔内、動脈内注射および注入技法のような送達方式を包含する。
【００５４】
本発明のＣ５ａ突然変異タンパク質の投薬量は、特定患者に関する所望の療法的応答を達成するために変更され得る。それらは、例えば特定拮抗体の活性、投与方式、治療中の症状の重症度、ならびに患者の医学的状態に拠る。
【００５５】
例えば急性短期障害、例えば敗血症性ショック、喘息発作または虚血／再灌流損傷の治療のためには、できるだけ高い用量が必要とされる。それに対比して、慢性障害、例えば慢性関節リウマチまたは乾癬の治療のためには、持続放出性処方物中で投与される低投薬量がより適している。所定の症状および患者のための治療的有効量の確定は、当業者のレベルの範囲内である。
【００５６】
概して約５００μｇ〜５０ｍｇ／体重１ｋｇ／日の治療投薬量レベルが、哺乳類宿主に毎日投与される。好ましい投薬量レベルは、長期治療のためには約５００μｇ／体重１ｋｇ〜約５ｍｇ／体重１ｋｇ／日、そして短期治療のためには５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。Ｃ５ａ突然変異タンパク質は、長期間に亘って単一連続投与として患者に投与され得る。しかしながら総有効投薬量は、所望により多数回用量に、例えば２〜４回の別々の用量／日に分けられ得る。
【００５７】
したがって本発明は、上記のような突然変異タンパク質および医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物も対象とする。
【００５８】
本発明のＣ５ａ類似体は、既知の医薬上許容可能な成分および調製方法を用いて、組成物中に処方され得る（例えば［３１］参照）。非経口投与のための適切な組成物は、医薬上許容可能な滅菌水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液または乳濁液、ならびに使用直前の滅菌注射溶液または分散液中での再構成のための滅菌粉末を含む。適切な水性および非水性担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの代表例としては、水、エタノール、ポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびそれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。流動性は、種々の手段により、例えばコーティング材料、例えばレシチンの使用、必要な粒子サイズの保持（分散液の場合）、ならびに界面活性剤により保持され得る。
【００５９】
医薬組成物は、局所投与のために、特に哺乳類患者の皮膚上への直接適用のためにも適合され得る。この目的のために、本発明の医薬組成物は、軟膏、クリームまたはチンキ剤の形態であり得る。投与方法は、アレルギー反応、例えばニッケルイオンのような金属イオンに対する接触性アレルギー、あるいは化粧品中に、または乾癬のような疾患に用いられるラテックス、ツタウルシ、有毒オーク、溶媒、リン酸エステルのような化合物に対する接触性アレルギーにより引き起こされる皮膚刺激のような症状の治療に特に適している。局所適用のための組成物は、軟膏の慣用的水中油型処方物を基礎にし得る。しかしながら適切な組成物は、本発明の突然変異タンパク質が溶解される植物油、例えばオリーブ油のような油性基剤も基礎にし得る。
【００６０】
組成物は、アジュバント、例えば防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールおよびソルビン酸、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム、あるいは吸収を遅延する作用物質、例えば一ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンも含有し得る。Ｃ５ａ受容体拮抗体は、緩徐または持続放出または標的化送達系、例えばポリマーマトリックス、リポソームおよびマイクロスフェア中に組み入れられ得る。
【００６１】
注射用処方物は、多数の手段により、例えば細菌保持フィルターを通す濾過により、あるいは使用直前に滅菌水またはその他の滅菌注射用媒質中に溶解または分散され得る滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組入れることにより、滅菌され得る。
【００６２】
Ｃ５ａ突然変異タンパク質および任意選択的にその他の任意の活性成分のほかに、医薬組成物は、沈殿防止剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微晶質セルロース、アルミニウムメタ水酸化物、ベントナイト、寒天、トラガカントゴムおよびそれらの混合物を含有し得る。
【００６３】
直腸または膣投与用の組成物は、通常は、本発明のポリペプチドを、室温では固体であるが、しかし体温で液体であり、したがって直腸または膣腔中で融解して、本発明の突然変異タンパク質を放出する適切な非刺激性賦形剤または担体、例えばココアバター、ポリエチレングリコールまたは座薬用蝋と混合することにより調製され得る座薬の形態である。
【００６４】
最後に、本発明の医薬組成物は、眼用処方物、眼用軟膏、粉末および溶液の形態でもあり得る。
【００６５】
さらに本発明は、本明細書中に開示されたＣ５ａアナフィラトキシンの突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子にも向けられる。好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号３９のＣ５ａ突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。遺伝暗号の縮重は同一アミノ酸を特定する他のコドンによるある種のコドンの置換を可能にし、それゆえ同一タンパク質を生じるため、本発明は、特定の核酸分子に限定されないが、しかし本発明の機能的Ｃ５ａ拮抗体をコードするヌクレオチド配列を含む全ての核酸分子を含む。
【００６６】
好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号２〜配列番号１１および配列番号４０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６７】
Ｃ５ａ突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む本明細書中に開示された核酸分子は、調節配列に操作可能的に連結されて核酸分子の発現を可能にする。
【００６８】
核酸分子、例えばＤＮＡは、それらが転写および翻訳情報を含有する調節ヌクレオチド配列を含有する場合、「核酸分子またはコードヌクレオチド配列を発現し得る」か、または「ヌクレオチド配列の発現を可能にし」得るとみなされ、そしてこのような配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と「操作可能的に連結」される。操作可能連結は、調節ＤＮＡ配列および発現されるよう求められるＤＮＡ配列が遺伝子配列発現を可能にするような方法で接続される連結である。遺伝子配列発現に必要とされる調節領域の明確な性質は生物によって変わり得るが、しかし概して、原核生物においては、プロモーターのみ、あるいはＲＮＡ転写の開始を指図するプロモーターと、ＲＮＡに転写される場合に合成の開始をシグナル伝達するＤＮＡ配列の両方を含有するプロモーター領域を含む。このような領域は、普通は、発現されるヌクレオチド配列に対して５’および３’に位置し、そして転写および翻訳の開始に関与する非コード領域、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列を含む。これらの領域は、例えばエンハンサー配列または翻訳化シグナル、あるいは宿主細胞の特定区画に生成ポリペプチドをターゲッティングするためのリーダー配列（これは本発明の組換え突然変異タンパク質を産生するために用いられる）も含有し得る。
【００６９】
したがって本発明の核酸は、調節配列、好ましくはプロモーター配列を含み得る。別の実施形態では、本発明の核酸は、細胞中に機能的な転写開始領域および細胞中に機能的な転写終結領域を含む。本発明に用いられ得る適切なプロモーター配列は、例えば細菌発現の場合には、ｌａｃプロモーター、ｔｅｔプロモーターまたはＴ７プロモーターである。真核生物系における発現に適したプロモーターの一例は、ＳＶ４０プロモーターである。
【００７０】
さらなる好ましい実施形態では、核酸分子は、ベクター中に、特に発現ベクター中に含まれる。このような発現ベクターは、上記の調節配列および本発明の突然変異タンパク質をコードする核酸配列のほかに、５’または／および３’方向に突然変異タンパク質をコードする核酸配列に隣接する制限切断部位をコードする配列を含み得る。このベクターは、発現されるタンパク質またはタンパク質部分をコードする別の核酸配列の導入も可能にする。発現ベクターは、好ましくは複製部位、ならびに発現のために用いられる宿主と適合性がある種に由来する制御配列も含有する。発現ベクターは、既知のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐｕＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等を基礎にし得る。
【００７１】
Ｃ５ａ突然変異タンパク質をコードするＤＮＡ分子、特に突然変異タンパク質のコード配列を含有するベクターは、遺伝子を発現し得る宿主細胞中で形質転換され得る。形質転換は、標準技法に従って実行され得る。したがって本発明は、上記のような核酸分子を含有する（組換え）宿主細胞にも関する。
【００７２】
形質転換化宿主細胞は、本明細書に開示されたＣ５ａ突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養される。代表的宿主細胞としては、原核生物、例えば大腸菌、バチルス属、例えば枯草菌、ストレプトミセス属、サルモネラ属、ならびに真核生物、例えば糸状真菌、例えばクロコウジカビ；酵母、例えば出芽酵母、ピキア酵母およびアルカン酵母；昆虫細胞、例えばバキュロウイルスが感染した（ＳＦ９）細胞、あるいは哺乳類細胞、例えばＨｅＬａ細胞またはＣＨＯ細胞または組織培養が挙げられる。適切な原核生物、真核生物および哺乳類発現系は、［３２］〜［３５］で再検討されている。
【００７３】
最後に本発明は、拮抗体Ｃ５ａ受容体活性を有する突然変異タンパク質の製造方法にも関する。この方法は、（ａ）Ｃ５ａポリペプチドの配列位置６９での残基を突然変異化するヌクレオチド配列をＣ５ａアナフィラトキシンポリペプチドをコードする核酸分子中に導入する過程、および（ｂ）得られた核酸分子を発現のために適切な宿主細胞中にあるいは適切な細胞抽出物または細胞溶解物中に導入する過程を包含する。
【００７４】
好ましくはロイシンまたは陽性荷電アミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、Ｃ５ａポリペプチドの配列位置６９に導入される。
【００７５】
本方法はさらに、好ましい実施形態において、配列位置６７をコードするヌクレオチド配列を突然変異化すること、および／またはＣ５ａポリペプチドの天然アミノ酸配列の配列位置７０〜７４をコードするヌクレオチド配列を欠失することを包含する。
【００７６】
過程（ａ）の修飾は、Ｃ５ａポリペプチドのみをコードする核酸を用いて、または発現ベクターのような核酸分子を用いて実施され得るが、この場合、Ｃ５ａコード配列は調節配列と操作可能的に連結され、そして任意選択的に親和性タグまたは別のタンパク質のような融合相手をコードする配列と融合される。後者のアプローチは、それがさらなるクローニング過程の必要性を回避するため、好ましい。突然変異化遺伝子の発現は、組換え細胞、例えば大腸菌または昆虫細胞、例えばＳＦ９細胞を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで実行され得る。あるいは発現は、ＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および／または対応するＲＮＡのポリペプチドへの翻訳のために必要な全ての因子および構成成分を含有する適切な細胞抽出物または細胞溶解物の使用により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでも達成され得る。
【００７７】
本発明のＣ５ａ拮抗体の組換え的産生のためには、適切なシグナル配列の使用により酸化チオール／ジスルフィド酸化還元環境を有する細胞区画にポリペプチドを向けることが好ましい。このような酸化環境は、大腸菌のような細菌の周縁細胞質中に、あるいは真核生物細胞の小胞体の管腔中に存在する。しかしながら宿主細胞、好ましくは大腸菌の細胞質ゾル中で本発明のポリペプチドを産生することも可能である。この場合、例えばポリペプチドは、封入体の形態で産生され、その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで復元される（例えば［１８］または［２３］と比較）。さらなる選択肢は、細胞質ゾル中に酸化環境を有し、したがって細胞質ゾル中でのネイティブタンパク質の産生を可能にする特異的突然変異化菌株の使用である。大腸菌が発現のための宿主として用いられる場合、周縁細胞質中へのポリペプチドの輸送のための好ましいシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列である。
【００７８】
以下の実施例、表および図により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００７９】
Ｃ５ａ突然変異タンパク質の生成
ベクターとしてｐＪｕＦｏ△ｐＩＩＩ−Ａ８Ｂ突然変異体を用いたＰＣＲにより、表１に示したＣ５ａ突然変異タンパク質を構築した［２１］。まず、３７℃で１時間、１５Ｕ／ＤＮＡ１μｇでＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩでベクターを消化することにより、Ｊｕｎカセットを欠失した。消化、線状化ベクター断片をアガロースゲル上で走行させ、予測サイズで帯域を切り取り、そしてガラスミルクビーズを用いて精製した。精製断片を再結繋した。５０μｌの結繋反応物は、２００ｎｇの消化ベクターを含み、６４０Ｕ  Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（Biolabs NEB）とともに１５℃で一晩インキュベートした。Ｊｕｎ部分が欠失される新規のベクター断片ｐＦｏ△ｐＩＩＩ−Ａ８Ｂを生成した。ＤＮＡシーケンシングにより欠失を確証した。次に、３７℃で１時間、１５Ｕ／ＤＮＡ１μｇでＳａｃＩおよびＫｐｎＩを用いてベクターを消化することにより、ｐＦｏ△ｐＩＩＩ−Ａ８Ｂベクター内のＦｏｓカセットを欠失した。さらにまた、消化、線状化ベクター断片をアガロースゲル上で走行させ、予測サイズで帯域を切り取り、そしてガラスミルクビーズを用いて精製した。このベクター（ｐ△ＪｕＦｏ△ｐＩＩＩ−Ａ８Ｂ＝ｐＡ８Ｂ）を次に鋳型として用いて、異なるＣ５ａ突然変異タンパク質のＰＣＲ断片を結繋したが、これは以下のように生成された：
【００８０】
Ｃ５ａ−（１〜６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂを調製するために、プライマーＪＫ１２４およびＪＫ１１６を用いた。Ｃ５ａ−（１〜６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｌｅｕ７０を調製するために、プライマーＪＫ１２４およびＪＫ１４６を用いた。Ｃ５ａ−（１〜６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ｃｙｓ７１を調製するために、プライマーＪＫ１２４およびＪＫ１４８を用いた。Ｃ５ａ−（１〜６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ｃｙｓ７３を調製するために、プライマーＪＫ１２４およびＪＫ１３０を用いた。Ｃ５ａ−（１〜６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ｌｅｕ７０Ｔｙｒ７３を調製するために、プライマーＪＫ１２４およびＪＫ１２６を用いた。Ｃ５ａ−（１〜６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ｌｙｓ６９−Ａｌａ７０を調製するために、プライマーＪＫ１２４およびＪＫ１４７を用いた。Ｃ５ａ−（１〜６６，Ｃｙｓ２７Ａｒｇ）−Ａ８Ｂを調製するために、プライマーＪＫ１５２およびＪＫ１５３を用いた。Ｃ５ａ−（１〜６６，Ａｌａ２７Ｃｙｓ）−Ａ８Ｂ−Ｄｅｌ．７１〜７３を調製するために、プライマーＪＫ１２４およびＪＫ１４９を用いた。Ｃ５ａ−（１〜６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ａｌａ６９を調製するために、プライマーＪＫ１２４およびＪＫ１５４を用いた。Ｃ５ａ−（１〜６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ａｓｐ６９を調製するために、プライマーＪＫ１２４およびＪＫ１５６を用いた。Ｃ５ａ−（１〜６６，Ｃｙｓ−３，Ｇｌｙ−２，−１，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂを調製するために、プライマー配列番号３７およびＪＫ１１６を用いた。Ｃ５ａ−（１〜６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ５Ａを調製するために、プライマーＪＫ１２４および配列番号３８を用いた。
【００８１】
異なるプライマーは以下のもの（５’〜３’）であった：
ＪＫ１２４：ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  Ａ；（配列番号２５）
ＪＫ１１６：ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＧＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＡＡＣ；（配列番号２６）
ＪＫ１４６：ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＧ；（配列番号２７）
ＪＫ１４８：ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＡＣＧ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＧ；（配列番号２８）
ＪＫ１３０：ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＧ；（配列番号２９）
ＪＫ１２６：ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＧ；（配列番号３０）
ＪＫ１４７：ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＡＣＴ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＧ；（配列番号３１）
ＪＫ１５２：ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＧＣＧ  ＴＴＡ  ＡＴＡ  ＡＴＧ  ＡＴＧ；（配列番号３２）
ＪＫ１５３：ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  Ｃ；（配列番号３３）
ＪＫ１４９：ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＡＣＧ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＧ；（配列番号３４）
ＪＫ１５４：ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＡＣＧ  ＣＴＴ  ＴＡＡ    ＡＡＧ；（配列番号３５）
ＪＫ１５６：ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＡＧＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ    ＡＡＧ  ＡＧ；（配列番号３６）
配列番号３７：ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＣＧＧ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  Ａ
配列番号３８：ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＧ。
【００８２】
１ｐｇの鋳型ＤＮＡｐＪｕＦｏ△ｐＩＩＩ−Ａ８Ｂ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの各プライマーおよびメーカー（Stratagene）により供給される反応緩衝液を含有する１００μｌ容量中で、ＰＣＲ反応を実施した。反応混合物に鉱油を被せ、サーモサイクラー中で９４℃で５分（ホットスタート）保持した。次に５ＵのＰｆｕポリメラーゼ（Stratagene）を添加し、混合物を３０回循環させ（９４℃で９０秒、５２℃で１２０秒、７２℃で１２０秒）、その後、７２℃で１０分間インキュベートした。
【００８３】
フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈降後、３７℃で１時間、６０Ｕ／ＤＮＡ１μｇを用いてＳａｃＩおよびＫｐｎＩ（Bioloabs, NEB）でＤＮＡ断片を消化した。線状化ベクターおよび消化ＰＣＲからなる結繋ミックスを、７０℃で３０分間加熱不活化し、フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈降により精製した後、５μｌのＴＥ中に再懸濁した。バイオラド（BioRad）パルサー組(set)を２５μＦ、２．５ｋＶおよび２００Ωで用いて、２．５μｌ各々の２部分を大腸菌ＴＧ１細胞（Stratagene）中に電気穿孔した。パルス直後に、１ｍｌの新たに調製したＳＯＣ培地を添加し、細胞を３７℃で１時間増殖させ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１％グルコースを補充したＴＹＥプレート（＝ＴＹＥ＋ａｍｐ＋ｇｌｕｃ）上にプレート化した。個々の形質転換体の総数を評点するために、１００μｌの適切な希釈液をＴＹＥ＋ａｍｐ＋ｇｌｕｃ上にプレート化した。
【００８４】
免疫アフィニティークロマトグラフィーによるＣ５ａ突然変異タンパク質の調製および精製
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０．１％グルコースを含有する２×ＴＹ＋ａｍｐ培地中で、発現プラスミドｐＡ８Ｂのそれぞれの誘導体を保有するＴＧ１細菌を増殖させた。６００ｎｍでの光学密度が０．９に達したところで、ＩＰＴＧを添加して、最終濃度を０．５ｍＭとした。室温で振盪しながら、細菌を一晩増殖させた。翌日、凍結し、解凍することにより、周縁細胞質分画を調製した。
【００８５】
精製のために、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Pharmacia, Uppsala, Sweden）を、メーカーの使用説明書に従ってＣ５ａ特異的ｍＡｂ５６１［３９］で被覆した。小カラム（BIOGNOSIS, Julich, Germany）に１００μｌのゲルマトリックスを装入した。Ｃ５ａ突然変異タンパク質のうちの１つで形質転換されたＴＧ１細胞から調製した周縁細胞質分画（ＰＢＳで１：５に希釈した４００μｌ）を、４℃で１時間、カラムに供した。カラムを２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、その後、予備溶離緩衝液（１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．８）を装入した。次に１００ｍＭのグリシン／ＨＣｌ緩衝液を用いてｐＨを２．５に変えることにより、結合Ｃ５ａ突然変異タンパク質を溶離した。次に５０μｌのアリコートを収集し、その後、ｍＡｂ５６１を用いてドット−ブロットで試験した。陽性分画をプールした。下記のようにＥＬＩＳＡにより、精製Ｃ５ａ突然変異タンパク質の濃度を確定した。
【００８６】
免疫アフィニティークロマトグラフィー後に純度を分析するために、ミニゲル対小室(twin chamber)（Biometra, Gottingen, Germany）を用いて、０．１％ＳＤＳ−１５％ＰＡＧＥによりＣ５ａ突然変異タンパク質を分離し、銀染色した（図２参照）。銀染色から判定して、本発明の突然変異タンパク質を精製して、均質にした。突然変異タンパク質Ｃ５ａ−（１〜６６，Ｃｙｓ−３，Ｇｌｙ−２，−１，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂの場合、還元および非還元条件下でのＰＡＧＥ分析は、Ｃ末端Ｃｙｓ残基のジスルフィド架橋の形成による自発的二量体化が大腸菌の周縁細胞質の酸化環境で起こる、ということを明示した（データは示されていない）。
【００８７】
精製Ｃ５ａ突然変異タンパク質の濃度を確定するためのＥＬＩＳＡ
Ｍａｂ５６１をＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌに希釈し、２２℃で一晩、ポリスチレン微小滴定プレート（Greiner, Germany）に被覆した。次にプレートをＰＢＳ中で３回すすぎ、３７℃で６０分間、２％脱脂粉乳を含有するＰＢＳで飽和した。５０ｍＭのトリス緩衝液、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＲＩＳ）で３回洗浄後、１０％脱脂粉乳を補充した５０ｍＭのトリス緩衝液、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＲＩＳ乳）中に希釈した精製Ｃ５ａを添加した。２２℃で９０分間インキュベーション後、プレートをＴＲＩＳで４回洗浄し、その後、２２℃で９０分間、ＴＲＩＳ乳中に希釈した５０μｌのビオチニル化抗Ｃ５ａｍＡｂ５５７（１０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。プレートを５０ｍＭのＴＲＩＳで４回洗浄した。その後、ＴＲＩＳ中に希釈した５０μｌのアビジン−アルカリ性ホスファターゼを添加し、２２℃で３０分間インキュベートした。プレートはｐ−ニトロフェノールホスフェート（ジエタノールアミン、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９中に希釈：１ｍｇ／ｍｌ）を用いて発色（developed）した。
【００８８】
競合的結合試験
競合的結合試験のために、トレーサー（約１７０００ｃｐｍ）として一定量の１２５Ｉ−ｒｈＣ５ａを含有する反応混合物４０μｌおよび漸増濃度の非標識化Ｃ５ａ突然変異タンパク質を、氷上の微小滴定プレート中でインキュベートした。したがってトレーサー濃度は、正確なＩＣ５０値の評価のための必要前提条件である組換えヒトＣ５ａのＫｄの１／１０未満であった。２５μｌの氷冷ＲＢＬ−Ｃ５ａＲ細胞懸濁液を添加することにより、結合反応を開始した。３０分間の氷上でのインキュベーション後、真空マニフォールド（Millipore）を用いて微小滴定膜プレート（Multiscreen（商標）-HV; 0.45μm, MAHV N45, Millipore）を通す６０μｌの濾過により、細胞結合および遊離１２５Ｉ−ｒｈＣ５ａを分離した。ウエルを１００μｌのＨＡＧ−ＣＭ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５％のＢＳＡおよび０．５ｍＭのグルコース）で１回洗い落とし、加熱ランプ（heat lamp）により乾燥し、膜パンチアセンブリー（Millipore）で型抜きした。型抜き膜をγ計数器（Packard, Canberra）で計数した。細胞結合１２５Ｉ−ｒｈＣ５ａ対非標識化競合体の濃度のプロットは、半値（half-maximal）抑制濃度（ＩＣ５０）を生じた（図３、表1と比較）。
【００８９】
ヒトＣ５ａ受容体トランスフェクト化ＲＢＬ細胞（Ｃ５ａＲ−ＲＢＬ細胞）からのグルコサミニダーゼ放出
Ｃ５ａＲ−ＲＢＬ細胞からのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼの放出を、記載された［４０］ように確定した。Ｃ５ａまたはＣ５ａ突然変異体のＥＤ５０を、半値酵素放出をもたらす濃度として確定した。１０−９ＭのＣ５ａにより誘導されるＣ５ａＲ−ＲＢＬ細胞からのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼの放出を抑制するＣ５ａ突然変異タンパク質の能力により、Ｃ５ａ突然変異タンパク質の拮抗体効力を試験した。要するに、７５μｌ／ウエルのＣ５ａＲ−ＲＢＬ細胞（２×１０６／ｍｌ）をＨＡＧ−ＣＭ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５％のＢＳＡおよび０．５ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４）中に懸濁し、３７℃で５分間平衡させた。一方、精製Ｃ５ａ突然変異タンパク質の連続希釈液２０μｌをＰＳ−微小滴定プレート（Greiner, Germany）に移し、３７℃で５分間インキュベートした。５分間の予備インキュベーション後、サイトカラシンＢ（２０μｇ／ｍｌ）を細胞に添加し、３７℃で３分間インキュベートした。その後、細胞をＣ５ａ突然変異タンパク質に移行し、３７℃で１０分間インキュベートした。次にＣ５ａを最終濃度１０−９Ｍで添加し、３７℃で５分間、反応を進行させた。４℃で３分間、１１５７ｇでの遠心分離により反応を停止させた。その後、７５μｌの上清を１００μｌの基質（ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）と混合した。７５μｌのグリシン／ＮａＯＨ、ｐＨ１０．４／ウエルを添加することにより、反応を停止させた。Ｔｉｔｅｒｔｅｋ−マルチスキャンＥＬＩＳＡ読取り器で吸光度（４０５ｎｍ）を確定した。１０−９ＭのｒｈＣ５ａにより誘導される半値酵素放出の抑制をもたらす濃度としてＣ５ａ突然変異タンパク質（配列番号１４〜２２）のＩＤ５０を確定したが、これは、本発明の突然変異タンパク質の拮抗体特性を示す。
【００９０】
【表１】
2005536986.tif 000002
【００９１】
（表１の説明）
ｒＣ５ａと比較した場合の本発明の好ましいＣ５ａ突然変異体の結合および機能的特性を要約する。表１は、ｒＣ５ａと比較した場合のこれらの好ましい突然変異タンパク質のアミノ酸配列における差も示す。表１中のＩＣ５０値は、細胞結合１２５Ｉ−ｒｈＣ５ａのプロットにより得られた半値抑制濃度（ＩＣ５０）対非標識化競合体の濃度を示す（図３、表１と比較）。Ｃ５ａ突然変異タンパク質（配列番号１４〜２２）のＩＤ５０を、１０−９ＭのｒｈＣ５ａにより誘導される半値酵素放出抑制をもたらす濃度として確定した。Ｃ５およびＣ５ａ突然変異タンパク質のＥＤ５０値は半値酵素放出、すなわち実施例に記載されたようなＣ５ａＲ−ＲＢＬ細胞からのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼの放出の抑制をもたらす濃度として確定した。表１から分かるように、このような酵素放出、したがって作動体特性は、４×１０−６Ｍという高いＣ５ａ突然変異タンパク質（配列番号１４〜２２）のタンパク質濃度に関しては観察されなかった。
【００９２】
以下の参考文献を本出願中で引用する。
【表２】
2005536986.tif 000003
【００９３】
【表３】
2005536986.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】［３６］に発表されたような組換えＣ５ａのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。
【図２】抗Ｃ５ａ特異的ｍＡｂ５６１を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィー後のＣ５ａ突然変異タンパク質の溶離分画の典型的ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。精製タンパク質をレーン１および２に載せた。銀染色により、タンパク質を可視化した。Ｍは、分子量マーカーとして用いられたマーカータンパク質を示す。
【図３】ヒトＣ５ａ受容体で安定的にトランスフェクトされたＲＢＬ細胞を用いたＣ５ａ受容体拮抗体であるｒｈＣ５ａおよびＣ５ａ突然変異タンパク質の競合的結合試験を示す［２５］。Ｃ５ａ突然変異タンパク質のＩＣ５０％は、組換えヒトＣ５ａ（ｒｈＣ５ａ）と比較した場合、８（Ｃ５ａ−（１−６６）−Ｃｙｓ２７Ａｌａ−Ａ８Ｂ−Ｌｅｕ７０−Ｔｙｒ７３）〜１６倍（Ｃ５ａ−（１−６７）−Ｃｙｓ２７Ａｒｇ−Ａ８Ｂ）低い；（表１も参照）。ｒｈＣ５ａに関する値（ｙ軸に最も近い「単離」曲線）を中黒丸として、突然変異タンパク質Ａ８Ｂに関するものを菱形として、Ａ８ＢＬｅｕ７０に関しては三角形として、Ａ８ＢＬｅｕ７０Ｔｙｒ７３に関しては四角形として、Ａ８ＢＡｒｇに関しては六角形として、Ａ８Ｂｄｅｌ７１−７３に関しては暗灰色丸として、そしてＡ８ＢＣｙｓ７３に関しては明灰色丸として示す。
【図４】ｒｈＣ５ａを用いた（中黒丸）、突然変異タンパク質Ｃ５ａＲＡ  Ａ８Ｂを用いた（菱形）、そしてＡｒｇ６９Ａｌａ（Ｃ５ａ−（１−６６）−Ｃｙｓ２７Ａｌａ−Ａ８Ｂ−Ａｌａ６９）（中白四角）またはＡｒｇ６９Ａｓｐ（Ｃ５ａ−（１−６６）−Ｃｙｓ２７Ａｌａ−Ａ８Ｂ−Ａｓｐ６９）（中白丸）置換を伴うＣ５ａＲＡ  Ａ８Ｂを用いた脱顆粒アッセイの結果を示す。突然変異タンパク質Ａ８Ｂ−Ａｒｇ６９ＡｌａおよびＡ８Ｂ−Ａｒｇ６９Ａｓｐは、Ｃ５ａと同様に脱顆粒を誘導する。実際、突然変異は、Ｃ５ａ突然変異タンパク質Ａ８Ｂの拮抗体機能を作動体機能に切り替えるが、これは、位置６９の陽性荷電残基の本発明の突然変異タンパク質の拮抗体特性への関与を示す。
【図５】本発明のＣ５ａ突然変異タンパク質（配列番号１４〜１８、２０、２１）の抑制効力を示す。漸増濃度の異なるＣ５ａ突然変異タンパク質を用いて、１０−９ＭのｒｈＣ５ａの刺激により誘導されるＣ５ａＲ−ＲＢＬ細胞からの酵素放出を抑制した。ＩＤ５０％は、７．９×１０−９Ｍ（Ｃ５ａ−（１−６６，Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｌｅｕ７０）〜９９．２×１０Ｍ−９（Ｃ５ａ−（１−６６，−Ｃｙｓ２７Ａｌａ）−Ａ８Ｂ−Ｃｙｓ７１）の範囲である。突然変異タンパク質Ａ８Ｂに関する値を黒丸として、Ａ８ＢＬｅｕ７０に関しては中白丸として、Ａ８Ｂｃｙｓ７１に関しては上方先細三角形として、Ａ８ＢＣｙｓ７３に関しては下方先細三角形として、Ａ８ＢＬｅｕ７０Ｔｙｒ７３に関しては菱形として、Ａ８ＢＡｒｇ２７に関しては六角形として、そしてＡ８Ｂｄｅｌ７１−７３に関しては暗灰色菱形として示す。
【図６】本発明の突然変異タンパク質の発現のために用いた発現ベクター（ｐ△ＪｕＦｏ△ｐＩＩＩ−Ａ８Ｂ＝ｐＡ８Ｂ）が基礎としたベクターｐＪｕＦｏ（４２６９ｂｐ、［３７］）の模式図を示す。実施例で説明したように、Ｃ５ａ突然変異タンパク質の構造遺伝子は、ｐｅｌＢの細菌シグナル配列を装備され、ｌａｃＺプロモーター／オペレーターの転写制御下で整列される。［３７］で説明されたように、ベクターｐＪｕｆｏは，［３８］に記載されるベクターｐＣｏｍｂに由来する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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