(57)【要約】  検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン及びポリアニオンの存在下に反応させ、該反応で生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。  本発明により、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを簡便かつ正確に測定するための方法が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン及びポリアニオンの存在下に反応させ、該反応で生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
【請求項２】
ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンドデシルアミンである請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度が０．２５〜１．０ｋＵ／Ｌであり、ポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が０．０６〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである請求項２記載の方法。
【請求項４】
ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンである請求項１記載の測定方法。
【請求項５】
反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度が０．５〜２．０ｋＵ／Ｌのコレステロール酸化酵素であり、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が０．０２〜０．０７５ｍｍｏｌ／Ｌである請求項４記載の方法。
【請求項６】
検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応が、さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質の存在下に行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
過酸化水素の測定が、過酸化水素測定用試薬を用いて行われる請求項１〜６のいずれかに記載の測定方法。
【請求項８】
ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
【請求項９】
ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンドデシルアミンである請求項８記載の試薬。
【請求項１０】
試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が０．２５〜１．０ｋＵ／Ｌであり、ポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が０．０６〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである請求項９記載の試薬。
【請求項１１】
ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンである請求項８記載の試薬。
【請求項１２】
試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が０．５〜２．０ｋＵ／Ｌであり、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が０．０２〜０．０７５ｍｍｏｌ／Ｌである請求項１１記載の試薬。
【請求項１３】
さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質を含有する、請求項８〜１２のいずれかに記載の試薬。
【請求項１４】
さらに、過酸化水素測定用試薬を含む請求項８〜１３のいずれかに記載の試薬。
【請求項１５】
ポリアニオンを含む第一試薬、コレステロール酸化酵素及びポリオキシエチレンアルキルアミンを含む第二試薬を含有し、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、及び、コレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項１６】
ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、及び、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物が第二試薬に含まれる請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンドデシルアミンである請求項１５又は１６記載のキット。
【請求項１８】
第二試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が１．０〜４．０ｋＵ／Ｌであり、第二試薬中のポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が０．２５〜１．２５ｍｍｏｌ／Ｌである請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンである請求項１５又は１６記載のキット。
【請求項２０】
第二試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が２．０〜８．０ｋＵ／Ｌであり、第二試薬中のポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が０．０７５〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含む、請求項１５〜２０のいずれかに記載のキット。
【請求項２２】
さらに、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有する請求項１５〜２１のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中に含まれる低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬという）中のコレステロール（以下、ＬＤＬ−Ｃという）の測定方法、測定用試薬及び測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＬＤＬは、末梢細胞にコレステロールを供給する役割を有し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の直接的因子である。ＬＤＬ−Ｃの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の１つであり、ＬＤＬ−Ｃを分別定量することは臨床上有用である。【０００３】
従来のＬＤＬ−Ｃの定量方法としては、超遠心法、電気泳動法、フリードワルド（Friedewald）式による演算方法などが挙げられる。超遠心法は、リポ蛋白の比重の差を利用し、超遠心分離機を用いてＬＤＬを分離した後、そのコレステロール量を測定する方法である（非特許文献１）が、超遠心法による分離操作は煩雑で、迅速性、簡便性などの面で欠点がある。電気泳動法としては、リポ蛋白の電荷の差を利用し、アガロースゲルなどを支持体として分離する方法やリポ蛋白の粒子サイズの差を利用し、ポリアクリルアミドゲルを支持体として分離する方法などがあるが、電気泳動法は定量性に乏しく、簡便性、経済性などの面で問題がある。フリードワルド式による演算方法では、総コレステロール（以下、ＴＣという）、高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬという）中のコレステロール（以下、ＨＤＬ−Ｃという）及び総トリグリセライド（以下、Ｔ−ＴＧという）の測定値から、次の計算式に従いＬＤＬ−Ｃ量を算出する（非特許文献２）が、この方法は、血清中のＴ−ＴＧの含有量や食事の影響を受けるため、正確性に問題がある。【０００４】
【数１】
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【０００５】
また近年、超遠心法などの分離操作を必要とせず、汎用の自動分析機装置に搭載可能なＬＤＬ−Ｃの定量方法も報告されており、この様なＬＤＬ−Ｃの定量方法として、例えば以下の方法が知られている。【０００６】
ＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素（以下、コレステロール測定酵素という）を作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、試料中のＨＤＬ、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬという）及びカイロミクロン中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、試料中の残存コレステロールを定量する第２工程とからなる試料中のＬＤＬ−Ｃの定量方法（特許文献１）。【０００７】
血清に対し、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ばれる界面活性剤、並びにコレステロール測定酵素を添加し、リポ蛋白質のうちＨＤＬ中及びＶＬＤＬ中のコレステロールを優先的に反応させた後に、残りのコレステロールの反応量を測定するＬＤＬ−Ｃの定量方法（特許文献２）。【０００８】
試料に対し、ポリオキシエチレン誘導体とポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、並びにコレステロール測定酵素を添加し、リポ蛋白質のうちＬＤＬ−Ｃを選択的に測定する方法（特許文献３）。【０００９】
試料に対し、ジメチル−α−シクロデキストリン又は／及びポリ−β−シクロデキストリンの存在下で測定する、ＬＤＬ−Ｃの測定法（特許文献４）。【００１０】
カイロミクロン、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬのいずれか１種以上を含む試料中のコレステロールを直接、選択的に測定する方法において、リン脂質、リン脂質類似基を含有する化合物の存在下、試料中のＬＤＬ−Ｃを定量する方法（特許文献５）。【００１１】
ＬｐＸは、胆汁うっ滞時に出現するＬＤＬと同じ比重をもつ、健常人では全く存在しない異常リポ蛋白であり、化学組成も、構成成分の１つであるコレステロールがほとんど遊離型コレステロールであり、また、アポＢを含まず、正常ＬＤＬとは大きく異なる。従って、異常リポ蛋白であるＬｐＸ中のコレステロールを測定すべきではない、と考えられている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平１０−３８８８８号公報
【特許文献２】特開平９−３１３２００号公報
【特許文献３】ＷＯ００／１７３８８パンフレット
【特許文献４】特開平１１−３０６１７号公報
【特許文献５】特開２００２−２０２３１４号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】アドバンスド・リピッド・リサーチ（Adv. Lipid Res.）、第6巻、1頁、1968年
【非特許文献２】クリニカル・ケミストリー（Clin. Chem.）、第18巻、499頁、1972年
【非特許文献３】医学検査、第59巻、第1号、38-43頁、2010年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、検体中のＬＤＬ−Ｃを簡便かつ正確に測定するための方法、試薬及びキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らはＬＤＬ−Ｃの測定方法について鋭意検討を重ねた結果、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリアニオン、および、必要に応じて、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質の存在下で、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを反応させることで、ＬＤＬ以外のリポ蛋白質中のコレステロールを消去することなく、また、リポ蛋白質の物理的な分画操作を行うことなく、検体中のＬＤＬ−Ｃを簡便かつ正確に測定できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、下記（１）〜（２２）に関する。【００１６】
（１）  検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン及びポリアニオンの存在下に反応させ、該反応で生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
（２）  ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンドデシルアミンである（１）記載の測定方法。
（３）  反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度が０．２５〜１．０ｋＵ／Ｌであり、ポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が０．０６〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである（２）記載の方法。
（４）  ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンである（１）記載の測定方法。
（５）  反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度が０．５〜２．０ｋＵ／Ｌのコレステロール酸化酵素であり、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が０．０２〜０．０７５ｍｍｏｌ／Ｌである（４）記載の方法。
（６）  検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応が、さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質の存在下に行われる、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）  過酸化水素の測定が、過酸化水素測定用試薬を用いて行われる（１）〜（６）のいずれかに記載の測定方法。【００１７】
（８）  ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
（９）  ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンドデシルアミンである（８）記載の試薬。
（１０）  試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が０．２５〜１．０ｋＵ／Ｌであり、ポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が０．０６〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである（９）記載の試薬。
（１１）  ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンである（８）記載の試薬。
（１２）  試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が０．５〜２．０ｋＵ／Ｌであり、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が０．０２〜０．０７５ｍｍｏｌ／Ｌである（１１）記載の試薬。
（１３）  さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質を含有する、（８）〜（１２）のいずれかに記載の試薬。
（１４）  さらに、過酸化水素測定用試薬を含む（８）〜（１３）のいずれかに記載の試薬。【００１８】
（１５）  ポリアニオンを含む第一試薬、コレステロール酸化酵素及びポリオキシエチレンアルキルアミンを含む第二試薬を含有し、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、及び、コレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
（１６）  ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、及び、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物が第二試薬に含まれる（１５）記載のキット。
（１７）  ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンドデシルアミンである（１５）又は（１６）記載のキット。
（１８）  第二試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が１．０〜４．０ｋＵ／Ｌであり、第二試薬中のポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が０．２５〜１．２５ｍｍｏｌ／Ｌである（１７）記載のキット。
（１９）  ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンである（１５）又は（１６）記載のキット。
（２０）  第二試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が２．０〜８．０ｋＵ／Ｌであり、第二試薬中のポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が０．０７５〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである（１９）記載のキット。
（２１）  さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含む、（１５）〜（２０）のいずれかに記載のキット。
（２２）  さらに、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有する（１５）〜（２１）のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、検体中のＬＤＬ−Ｃを簡便かつ正確に測定するための方法、試薬及びキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＬｐＸ検体のゲルろ過クロマトグラムを示す。横軸は、フラクション番号を、縦軸は、コレステロール濃度の測定値を表す。○は、総コレステロール（ＴＣ）濃度を、▲は、遊離型コレステロール（ＦＣ）濃度を、＊は、実施例５のキットを用いた測定でのコレステロール濃度を、◇は、実施例６のキットを用いた測定でのコレステロール濃度を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明による検体中のＬＤＬ−Ｃの測定法は、遠心分離などの物理的方法によるリポ蛋白の分画操作を必要としない方法である。また、ＬＤＬ−Ｃの測定に先立って検体中のＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することなく、検体中のＬＤＬ−Ｃを測定する方法である。またＬＤＬ−Ｃの測定に先立って、検体中のＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを測定することなく、検体中のＬＤＬ−Ｃを測定する方法である。
【００２２】
本発明の測定方法は、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン及びポリアニオンの存在下に反応させ、該反応で生成する過酸化水素を測定することを特徴とする方法である。
【００２３】
さらに、本発明の測定方法は、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリアニオン、及び、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質の存在下に反応させ、該反応で生成する過酸化水素を測定することを特徴とする方法である。
【００２４】
本発明の測定方法によれば、異常リポ蛋白であるＬｐＸ中のコレステロールを測定せず、正確なＬＤＬ−Ｃの測定が可能となる。
【００２５】
本発明の測定方法は、
［１］検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応を、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン及びポリアニオンの存在下に行う工程；
［２］上記［１］の工程で生成する過酸化水素を測定する工程；
［３］予め、既知濃度のＬＤＬ−Ｃを用いて作成された、ＬＤＬ−Ｃ濃度と、該過酸化水素由来の情報量との関係を表す検量線と、上記［２］での測定値とを相関付ける工程；及び、
［４］検体中のＬＤＬ−Ｃ濃度を決定する工程
を含む。ここで、上記［１］の反応は、さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質の存在下に行うこともできる。すなわち、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応は、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリアニオン、及び、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質の存在下に行うこともできる。
【００２６】
上記［１］工程及び［２］工程は、水性媒体中で行われることが好ましい。水性媒体としては、例えば後述の水性媒体等が挙げられる。
【００２７】
本発明の測定方法において、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応で生成する過酸化水素は、例えば過酸化水素電極や後述の過酸化水素測定用試薬を用いて測定することができる。
【００２８】
本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清等が挙げられ、血漿及び血清が好ましい。
【００２９】
本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。
【００３０】
コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素の他、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。
【００３１】
市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステラーゼ（ＣＯＥ−３１１；東洋紡績社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ−３１１；東洋紡績社製）、コレステロールエステラーゼIII（ＣＨＥIII；天野製薬社製）等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。
【００３２】
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修飾する基（化学修飾基）としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。
【００３３】
コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基又は構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基又は構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル（α−ヨードエステル等）等が挙げられる。
【００３４】
化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ−４１０１、サンブライトＭＥ−０５０ＡＳ、サンブライトＤＥ−０３０ＡＳ（いずれも日油社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ−１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズ、サンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日油社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ−３４００、Ｍ−ＥＰＯＸ−５０００（いずれもSheawater Polymers社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ無水二酢酸（DTPA anhydride；同仁化学研究所社製）等が挙げられる。
【００３５】
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができるが、本方法に限定されるものではない。まず、コレステロールエステル加水分解酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ緩衝液）に溶解し、０〜５５℃で０．０１〜５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分間〜５時間攪拌する。酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
【００３６】
本発明の測定方法におけるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度は通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌであり、０．０１〜３００ｋＵ／Ｌが好ましい。
【００３７】
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤＩ；協和発酵工業社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤＩ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ−ＣＥ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ−３２１；東洋紡績社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
【００３８】
コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
【００３９】
本発明の測定方法における反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、ポリオキシエチレンアルキルアミンとしてポリオキシエチレンドデシルアミンを用いる場合は、反応液中のポリオキシエチレンドデシルアミン０．０６〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌに対して、コレステロール酸化酵素０．２５〜１．０ｋＵ／Ｌが好ましく、ポリオキシエチレンアルキルアミンとしてポリオキシエチレンオクタデシルアミンを用いる場合は、反応液中のポリオキシエチレンオクタデシルアミン０．０２〜０．０７５ｍｍｏｌ／Ｌに対して、コレステロール酸化酵素０．５〜２．０ｋＵ／Ｌが好ましい。
【００４０】
本発明において、コレステロールエステル加水分解酵素の酵素活性（Ｕ）は、例えば酵素メーカーで値付けされた活性値を用いることができる。
【００４１】
本発明において、コレステロール酸化酵素の酵素活性（Ｕ）は、以下の酵素活性測定用試薬とコレステロール酸化酵素との３７℃での反応により、１分あたりコレステロール１μｍｏｌが反応する酵素量と定義される。
＜酵素活性測定用試薬＞
リン酸緩衝液（ｐＨ７．１５）                  ０．１５  ｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル    １０  ｇ／Ｌ
２−プロパノール                              ２．５％
４−アミノアンチピリン                        ０．２  ｇ／Ｌ
フェノール                                    １  ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２６  ｋＵ／Ｌ
コレステロール                                ０．１６  ｇ／Ｌ
【００４２】
ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルと略記する）におけるアルキルとしては例えばオクチル、ノニル、デシル、ドデシルなどが挙げられ、ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルにおけるアリールとしてはフェニル等が挙げられる。ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルにおけるＰＯＥ・ＰＯＡの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー等が挙げられる。
【００４３】
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルにおけるポリオキシアルキレン（ＰＯＡ）としては、ポリオキシエチレン以外のポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルの具体例としては、エマルゲンＬ４０等（花王社製）、アクロネセスＫＰ１８９Ｒ、アクロネセスＫＰ１８９Ｒ−４０、アクロネセスＮＰ−１８９Ｒ（以上、日油社製）等が挙げられる。
【００４４】
本発明の測定方法における反応液中のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルの濃度としては、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、通常、反応液中の濃度は０．００１〜２００ｇ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜５０ｇ／Ｌである。
【００４５】
ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物（以下、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物と略記する）におけるＰＯＥ・ＰＯＡの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー等が挙げられる。ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物におけるポリオキシアルキレン（ＰＯＡ）としては、ポリオキシエチレン以外のポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。ポリオキシアルキレン（ＰＯＡ）の分子量としては、５００〜６０００であり、好ましくは１５００〜４０００である。ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物の分子量としては、５００〜１２０００であり、好ましくは１５００〜８０００である。
【００４６】
ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物の具体例としては、プルロニックＬ−１２１、プルロニックＰ−１０３、プルロニックＦ−１０８（以上、ＡＤＥＫＡ社製）、プロノンＢ−２０４、アクロネセスＢ−２０８（以上、日油社製）等が挙げられる。
【００４７】
本発明の測定方法における反応液中のＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物の濃度としては、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、通常、反応液中の濃度は０．００１〜２００ｇ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜５０ｇ／Ｌである。
【００４８】
ポリオキシエチレンアルキルアミン（以下、ＰＯＥアルキルアミンと略記する）におけるアルキルとしては、例えば炭素数６〜３０の、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられ、炭素数１０以上のアルキルが好ましい。炭素１０以上のアルキルとしては、例えばデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。中でも、炭素数１２のアルキル［ドデシル（ラウリル）］と炭素数１８のアルキル［オクタデシル（ステアリル）］が特に好ましい。ＰＯＥアルキルアミンのポリオキシエチレンのオキシエチレンの重合度としては、１〜４０であり、好ましくは、２〜２０である。
【００４９】
ＰＯＥアルキルアミンの具体例（製品）としては、例えばナイミーンＬ−２０１（オキシエチレンドデシルアミン；日油社製）、ナイミーンＬ−２０２、ナイミーンＬ−２０７、ナイミーンＬ−２１５（以上、ポリオキシエチレンドデシルアミン；日油社製）、ナイミーンＳ−２０２、ナイミーンＳ−２０４、ナイミーンＳ−２１０、ナイミーンＳ−２１５、ナイミーンＳ−２２０（以上、ポリオキシエチレンオクタデシルアミン；日油社製）、ナイミーンＴ２−２０２、ナイミーンＴ２−２１０、ナイミーンＴ２−２３０［以上、ポリオキシエチレンアルキル（牛脂）アミン；日油社製］、ナイミーンＦ−２０２、ナイミーンＦ−２０３、ナイミーンＦ−２０５、ナイミーンＦ−２１０、ナイミーンＦ−２１５［以上、ポリオキシエチレンアルキル（ヤシ油）アミン；日油社製］、ブラウノンＬ−２０２、ブラウノンＬ−２０５、ブラウノンＬ−２０７、ブラウノンＬ−２１０、ブラウノンＬ−２３０（以上、ポリオキシエチレンドデシルアミン；青木油脂社製）、ブラウノンＳ−２０７、ブラウノンＳ−２１０、ブラウノンＳ−２１５、ブラウノンＳ−２２０、ブラウノンＳ−２３０（以上、ポリオキシエチレンオクタデシルアミン；青木油脂社製）、ブラウノンＳ−２０５Ｔ、ブラウノンＳ−２０８Ｔ、ブラウノンＳ−２１０Ｔ、ブラウノンＳ−２１５Ｔ、ブラウノンＳ−２３０Ｔ［以上、ポリオキシエチレンアルキル（牛脂）アミン；青木油脂社製］、ニューコールＯＤ４２０（ポリオキシエチレンオクタデシルアミン；日本乳化剤社製）、パイオニンＤ３１０４（ポリオキシエチレンドデシルアミン；竹本油脂社製）、パイオニンＤ３１１０（ポリオキシエチレンドデシルアミン；竹本油脂社製）、パイオニンＤ３６０５［ポリオキシエチレンアルキル（大豆）アミン；竹本油脂社製］、パイオニンＤ３６１５Ｔ［ポリオキシエチレンアルキル（牛脂）アミン；竹本油脂社製］等が挙げられる。
【００５０】
本発明の測定方法における反応液中のＰＯＥアルキルアミンの濃度としては、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、ＰＯＥドデシルアミンの場合は通常０．０６〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌであり、ＰＯＥオクタデシルアミンの場合は通常０．０２〜０．０７５ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００５１】
ポリアニオンとしては、例えばデキストラン硫酸もしくはその塩、ヘパリンもしくはその塩、リンタングステン酸又はその塩、硫酸化シクロデキストリン又はその塩、硫酸化オリゴ糖又はその塩等が挙げられるが、デキストラン硫酸もしくはその塩が好ましい。デキストラン硫酸としては、例えば分子量が４万、８万、２０万、５０万、１００万、２００万等のデキストラン硫酸等が挙げられる。硫酸化オリゴ糖としては、例えば硫酸化アガロース、硫酸化トレハロース、コンドロイチン硫酸等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。また、本発明においては、ポリアニオンを２種以上用いてもよい。
【００５２】
本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法における反応液中のポリアニオンの濃度としては、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常０．００５〜１００ｇ／Ｌであり、好ましくは０．０５〜１０ｇ／Ｌである。
【００５３】
本発明の測定方法において、さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩（以下、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩と略記する）およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質を用いることにより、低ＬＤＬ血症患者由来の血清等の、ＬＤＬが極僅かしか含まれない検体（以下、低ＬＤＬ検体という）中のＬＤＬ−Ｃの測定に好適に使用することができる。低ＬＤＬ検体を用いるＬＤＬ−Ｃの測定は、検体中のカイロミクロンや干渉物質等の影響を受け易く、従来の方法では、測定により決定されたＬＤＬ−Ｃ濃度が負の値となる場合があった。低ＬＤＬ検体には、ＬＤＬが僅かに含まれ、ＬＤＬ中にはコレステロールが含まれることから、低ＬＤＬ検体は僅かではあるがＬＤＬ−Ｃを含む。従って、測定により決定されるＬＤＬ−Ｃ濃度は、本来、正の値であり、負の値とはなることはない。本発明の測定方法において、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質を用いることにより、このような低ＬＤＬ検体においても、ＬＤＬ−Ｃを正確に測定することができる。
【００５４】
ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩としては、例えばポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンナフチルエーテル硫酸エステル塩等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩の具体例（市販品）としては、例えばニューコール７０７ＳＦ、ニューコールＢ４−ＳＮ（以上、日本乳化剤社製）等が挙げられる。
【００５５】
アリールスルホン酸誘導体としては、例えばナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物等が挙げられる。アリールスルホン酸誘導体の具体例（市販品）としては、例えばディスロールＳＨ（日本乳化剤社製）、デモールＲＮ、デモールＭＳ、デモールＳＮ−Ｂ（以上、花王社製）等が挙げられる。
【００５６】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定方法における反応液中のＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体それぞれの濃度としては、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、０．００５〜７．５ｇ／Ｌであり、好ましくは、０．０１〜６ｇ／Ｌである。
【００５７】
本発明において用いられる水性媒体は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
【００５８】
本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法におけるｐＨは、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とするｐＨであればいずれでもよいが、例えばｐＨ４〜１０が挙げられる。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
【００５９】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
【００６０】
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
【００６１】
本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法における反応温度は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする温度であれば特に制限はないが、１０〜５０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。汎用の自動分析装置で設定される反応温度は通常３７℃である。
【００６２】
本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法における反応時間は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする反応時間であれば特に制限はないが、１〜６０分間が好ましく、２〜３０分間がより好ましい。
【００６３】
本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法において、ＬＤＬ−Ｃの測定は、反応により生成した過酸化水素の量を測定することにより行うことができる。
【００６４】
生成した過酸化水素の量は、例えば過酸化水素電極や過酸化水素測定用試薬を用いて測定することができる。過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、発光等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化発色型色原体が挙げられる。検出可能な物質が発光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
【００６５】
過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を測定することにより、測定することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応してフォトンを生じ、生じたフォトンを測定することにより、測定することができる。
【００６６】
酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。ロイコ型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
【００６７】
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
【００６８】
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。
【００６９】
アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−（３，５−ジメトキシフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＤＯＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）、Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（ＭＡＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（Ｅｔ−ＭＡＳＥ）等が挙げられる。
【００７０】
フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
【００７１】
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてペルオキシダーゼを用いる場合は、１〜１００ｋＵ／Ｌが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、過酸化水素の測定に適した濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。
【００７２】
（ＬＤＬ−Ｃ測定用試薬・測定用キット）
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬は、ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有する試薬である。本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬は、さらに、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質を含むことができる。
【００７３】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬は、本発明のＬＤＬ−Ｃ測定方法に用いることができる。本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬は、保存、流通及び使用に適したキットの形態を取ることができる。本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられるが、第一試薬と第二試薬とからなる２試薬系のキットが好ましい。
【００７４】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬及び測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬又はキットを用いて検体中のＬＤＬ−Ｃを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。該水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。
【００７５】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬及び測定用キットにおいては、前述のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、ポリアニオン、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩、アリールスルホン酸誘導体、及び、過酸化水素測定用試薬を用いることができる。
【００７６】
第一試薬と第二試薬とからなる２試薬系のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含まれる。コレステロール酸化酵素は第一試薬に含まれず、第二試薬に含まれる。ＰＯＥ・ＰＯＡアリールエーテルは、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含まれてよいが、第二試薬に含まれる態様が好ましい。ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含まれてよいが、第二試薬に含まれる態様が好ましい。ＰＯＥアルキルアミンは、第二試薬に含まれる。ポリアニオンは第一試薬に含まれる。
【００７７】
ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含まれてよいが、第一試薬に含まれる態様が好ましい。
【００７８】
アリールスルホン酸誘導体は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含まれてよいが、第一試薬に含まれる態様が好ましい。
【００７９】
過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含む場合には、酸化カップリング型色原体の２つの化合物、すなわち、カプラーとアニリン類、又は、カプラーとフェノール類はそれぞれ別々の試薬に含まれる態様が好ましい。
【００８０】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬におけるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度は、通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌである。凍結乾燥された状態のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬においては、コレステロールエステル加水分解酵素の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜８００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌとなる含量である。
【００８１】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおけるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度は、通常０．００４〜３２００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは０．０４〜１２００ｋＵ／Ｌである。凍結乾燥された状態のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００４〜３２００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０４〜１２００ｋＵ／Ｌとなる含量である。
【００８２】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬におけるＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルの濃度は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常０．００１〜２００ｇ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜５０ｇ／Ｌである。凍結乾燥された状態のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬においては、ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルの含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜５０ｇ／Ｌとなる含量である。
【００８３】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおけるＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルの濃度は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常０．００４〜８００ｇ／Ｌであり、好ましくは０．０４〜２００ｇ／Ｌである。凍結乾燥された状態のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおいては、ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルの含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００４〜８００ｇ／Ｌ、好ましくは０．０４〜２００ｇ／Ｌとなる含量である。
【００８４】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬におけるＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物の濃度は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常０．００１〜２００ｇ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜５０ｇ／Ｌである。凍結乾燥された状態のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬においては、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜５０ｇ／Ｌとなる含量である。
【００８５】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおけるＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物の濃度は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常０．００４〜８００ｇ／Ｌであり、好ましくは０．０４〜２００ｇ／Ｌである。凍結乾燥された状態のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおいては、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００４〜８００ｇ／Ｌ、好ましくは０．０４〜２００ｇ／Ｌとなる含量である。
【００８６】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬におけるポリアニオンの濃度は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常０．００５〜１００ｇ／Ｌであり、好ましくは０．０５〜１０ｇ／Ｌである。凍結乾燥された状態のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬においては、ポリアニオンの含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００５〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｇ／Ｌとなる含量である。
【００８７】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおけるポリアニオンの第一試薬中の濃度は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常０．００５〜１５０ｇ／Ｌであり、好ましくは０．０５〜１５ｇ／Ｌである。凍結乾燥された状態のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおいては、ポリアニオンの第一試薬中の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００５〜１５０ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１５ｇ／Ｌとなる含量である。
【００８８】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬における、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体それぞれの濃度は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、０．００５〜７．５ｇ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜６ｇ／Ｌである。凍結乾燥された状態のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬においては、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体それぞれの含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００５〜７．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜６ｇ／Ｌとなる含量である。
【００８９】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおける、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体それぞれの濃度は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常０．００７〜１０ｇ／Ｌであり、好ましくは０．０１５〜８ｇ／Ｌである。凍結乾燥された状態のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおいては、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体それぞれの含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００７〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５〜８ｇ／Ｌとなる含量である。
【００９０】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬におけるコレステロール酸化酵素濃度は、通常ＬＤＬ−Ｃ測定用試薬中のＰＯＥドデシルアミン０．０６〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌに対して、０．２５〜１．０ｋＵ／Ｌであり、ＬＤＬ−Ｃ測定用試薬中のＰＯＥオクタデシルアミン０．０２〜０．０７５ｍｍｏｌ／Ｌに対して、０．５〜２．０ｋＵ／Ｌである。凍結乾燥された状態のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬においては、コレステロール酸化酵素濃度の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態でのコレステロール酸化酵素濃度が、ＰＯＥドデシルアミン０．０６〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌに対して、０．２５〜１．０ｋＵ／Ｌとなる含量であり、ＰＯＥオクタデシルアミン０．０２〜０．０７５ｍｍｏｌ／Ｌに対して、０．５〜２．０ｋＵ／Ｌとなる含量である。
【００９１】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおけるコレステロール酸化酵素の第二試薬中の濃度は、通常第二試薬中のＰＯＥドデシルアミン０．２５〜１．２５ｍｍｏｌ／Ｌに対して、１．０〜４．０ｋＵ／Ｌであり、第二試薬中のＰＯＥオクタデシルアミン０．０７５〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌに対して、２．０〜８．０ｋＵ／Ｌである。凍結乾燥された状態のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおいては、コレステロール酸化酵素の第二試薬中の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態でのコレステロール酸化酵素の濃度が、ＰＯＥドデシルアミン０．２５〜１．２５ｍｍｏｌ／Ｌに対して、１．０〜４．０ｋＵ／Ｌとなる含量であり、ＰＯＥオクタデシルアミン０．０７５〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌに対して、２．０〜８．０ｋＵ／Ｌとなる含量である。
【００９２】
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類等が挙げられる。
【００９３】
以下に、本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬の具体的態様を記すが、本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用試薬はこれらに限定されない。
・試薬１
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有する試薬。
・試薬２
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、ポリアニオン、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有する試薬。
【００９４】
・試薬３
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、及び、過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
・試薬４
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、ポリアニオン、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、及び、過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
【００９５】
以下に、本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットの具体的態様を記すが、本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットはこれらに限定されない。
・キット１
第一試薬
ポリアニオン
第二試薬
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット２
第一試薬
ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、コレステロール酸化酵素
・キット３
第一試薬
ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
【００９６】
・キット４
第一試薬
ポリアニオン、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質
第二試薬
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット５
第一試薬
ポリアニオン、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、コレステロール酸化酵素
・キット６
第一試薬
ポリアニオン、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
【００９７】
・キット７
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット８
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット９
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
【００９８】
・キット１０
第一試薬
ポリアニオン、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット１１
第一試薬
ポリアニオン、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット１２
第一試薬
ポリアニオン、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つの物質、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物、ＰＯＥアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
【００９９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例及び比較例においては、下記メーカーの試薬、酵素及び界面活性剤を使用した。
【０１００】
試薬
ＭＯＰＳ（同仁化学研究所社製）
ＤＯＳＥ（ダイトーケミックス社製）
硫酸ナトリウム（関東化学社製）
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）（アマシャム社製）
４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）
【０１０１】
酵素
ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）
ＣＨＯＤＩ（コレステロール酸化酵素；キッコーマン社製）
ＬＰＬ−３１１（コレステロールエステル加水分解酵素；東洋紡績社製）
【０１０２】
界面活性剤
ブラウノンＬ−２０５（ポリオキシエチレンドデシルアミン；青木油脂社製）
ナイミーンＳ−２０４（ポリオキシエチレンオクタデシルアミン；日油社製）
アクロネセスＫＰ１８９Ｒ（ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル；日油社製）
プルロニックＬ−１２１（ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物；ＡＤＥＫＡ社製）
ニューコール７０７ＳＦ（ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩）；日本乳化剤社製）
ニューコールＢ４−ＳＮ（ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩；日本乳化剤社製）
ディスロールＳＨ（アリールスルホン酸誘導体；日本乳化剤社製）
デモールＲＮ（アリールスルホン酸誘導体；花王社製）
デモールＭＳ（アリールスルホン酸誘導体；花王社製）
デモールＳＮ−Ｂ（アリールスルホン酸誘導体；花王社製）
【実施例１】
【０１０３】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＬＤＬ−Ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）            ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム        ０．７５  ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                    ２  ｇ／Ｌ
ＤＯＳＥ                          ０．３  ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                  １０  ｋＵ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）            ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン            ０．５  ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                  ２０  ｋＵ／Ｌ
アクロネセスＫＰ１８９Ｒ          １４  ｇ／Ｌ
プルロニックＬ−１２１            ７  ｇ／Ｌ
ブラウノンＬ−２０５              ０．２５〜１．７５  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１                    ３  ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ                        １．０〜８．０  ｋＵ／Ｌ【０１０４】
［比較例］  以下の第一試薬及び第二試薬からなるＬＤＬ−Ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）            ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム        ０．７５  ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                    ２  ｇ／Ｌ
ＤＯＳＥ                          ０．３  ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                  １０  ｋＵ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）            ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン            ０．５  ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                  ２０  ｋＵ／Ｌ
アクロネセスＫＰ１８９Ｒ          １４  ｇ／Ｌ
プルロニックＬ−１２１            ７  ｇ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１                    ３  ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ                        １．０〜８．０  ｋＵ／Ｌ
【実施例２】
【０１０５】
実施例１及び比較例の各キットを用いて、ヒト血清５０検体中のＬＤＬ−Ｃを以下の手順により測定した。
（１）検量線の作成
標準液として、生理食塩水（ＬＤＬ−Ｃ濃度：０．０ｍｇ／ｄＬ）及び血清（ＬＤＬ−Ｃ濃度：１４０ｍｇ／ｄＬ）を、キットとして、実施例１及び比較例の各キットを用いて、それぞれ日立７１７０Ｓ形自動分析装置により、ＬＤＬ−Ｃ濃度と「吸光度」との間の関係を示す検量線を作成した。
ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された２つの吸光度（Ｅ１及びＥ２）を基に、Ｅ２からＥ１を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液（３μＬ）と第一試薬（０．１５ｍＬ）とを添加し３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に第二試薬（０．０５ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。【０１０６】
（２）ヒト血清検体と実施例１及び比較例の各キットとの反応による当該検体における「吸光度」の測定
（１）の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用いる以外は（１）の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、当該検体に対する「吸光度」を測定した。【０１０７】
（３）ヒト血清検体中のＬＤＬ−Ｃ濃度の決定
（２）で測定出した「吸光度」と、（１）で作成した検量線とから、各検体中のＬＤＬ−Ｃ濃度を決定した。
次いで、キットとして、市販のＬＤＬ−Ｃ測定用キットであるデタミナーＬ  ＬＤＬ−Ｃ（協和メデックス社製）を用いて、検体として同じヒト血清５０検体を用いて、上記と同様の手順により、それぞれの検体中のＬＤＬ−Ｃを測定した。【０１０８】
実施例１及び比較例の各キットを用いた測定と、デタミナーＬ  ＬＤＬ−Ｃを用いた測定との間の相関係数を第１表に示す。【０１０９】
【表１】
2011136316.tif 000004
【０１１０】
第１表から明らかな様に、第二試薬中のＣＨＯＤＩが１．０〜４．０ｋＵ／Ｌ、第二試薬中のブラウノンＬ−２０５が０．２５〜１．２５ｍｍｏｌ／Ｌの実施例１のキットを用いる測定において、市販キットを用いる測定との間に良好な相関が得られることが判明した。
【実施例３】
【０１１１】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＬＤＬ−Ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム    ０．７５  ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                ２  ｇ／Ｌ
ＤＯＳＥ                      ０．３  ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ              １０  ｋＵ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン        ０．５  ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ              ２０  ｋＵ／Ｌ
アクロネセスＫＰ１８９Ｒ      １４  ｇ／Ｌ
プルロニックＬ−１２１        ７  ｇ／Ｌ
ナイミーンＳ−２０４          ０．０７５〜０．３７５  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１                ３  ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ                    １．０〜８．０  ｋＵ／Ｌ
【実施例４】
【０１１２】
実施例１のキットの代わりに実施例３のキットを用い、検体として実施例１の検体とは異なる検体（５０検体）を用いる以外は、実施例２に記載の方法と同様に、実施例３のキットを用いる測定と、デタミナーＬ  ＬＤＬ−Ｃを用いる測定との間の相関係数を算出した。その結果を第２表に示す。【０１１３】
【表２】
2011136316.tif 000005
【０１１４】
第２表から明らかな様に、第二試薬中のＣＨＯＤＩが２．０〜８．０ｋＵ／Ｌ、第二試薬中のナイミーンＳ−２０４が０．０７５〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌの実施例３のキットを用いる測定において、市販キットを用いる測定との間に良好な相関が得られることが判明した。
【実施例５】
【０１１５】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＬＤＬ−Ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム    ０．７５  ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                ２  ｇ／Ｌ
ＤＯＳＥ                      ０．３  ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ              １０  ｋＵ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン        ０．５  ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ              ２０  ｋＵ／Ｌ
アクロネセスＫＰ１８９Ｒ      １４  ｇ／Ｌ
プルロニックＬ−１２１        ７  ｇ／Ｌ
ブラウノンＬ−２０５          ０．７５  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１                ３  ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ                    ３  ｋＵ／Ｌ
【実施例６】
【０１１６】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＬＤＬ−Ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム    ０．７５  ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                ２  ｇ／Ｌ
ＤＯＳＥ                      ０．３  ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ              １０  ｋＵ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン        ０．５  ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ              ２０  ｋＵ／Ｌ
アクロネセスＫＰ１８９Ｒ      １４  ｇ／Ｌ
プルロニックＬ−１２１        ７  ｇ／Ｌ
ナイミーンＳ−２０４          ０．１５  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１                ３  ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ                    ４  ｋＵ／Ｌ【０１１７】
［試験例］
異常リポ蛋白の１つであるＬｐＸを多量に含む肝疾患患者由来の血清［以下、ＬｐＸ検体と記す］を用いて、本発明のＬＤＬ−Ｃ測定方法において、ＬｐＸ中のコレステロールに対する反応性が抑制されることを以下の方法により示した。【０１１８】
ＬｐＸは、その構成成分であるコレステロールが、ほとんど遊離型コレステロールのみであることを特徴とする。ＬｐＸ検体そのものを下記に示す方法でゲルろ過クロマトグラフィーに付すと、ＬｐＸ画分のピークがＶＬＤＬ画分のピークと同じ位置に出現する。そこで、先ず、ＬｐＸ検体を超遠心分離により、比重が１．００６よりも小さい上清画分を分離した。すなわち、超遠心分離用チューブに生理食塩水で希釈した試料を添加し、このチューブを日立ローター５０．４ＴＩローターにセットし、２９，０００ｒｐｍで１８．５時間、超遠心分離を行い、遠心分離終了後、チューブスライサーを用いて分離した上清（カイロミクロン及びＶＬＤＬを含む）を除き、ＬｐＸを含む画分を得た。【０１１９】
上記で得られたＬｐＸを含む画分を、以下の条件により、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して、得られた各フラクションについて、総コレステロール測定用キット及び遊離型コレステロール測定用キットを用いて、各フラクション中の総コレステロール濃度及び遊離型コレステロール濃度を測定した。同様に、各フラクションについて、各フラクション中のコレステロール濃度を、実施例５及び６それぞれのキットを用いて測定した。その結果（クロマトグラム）を図１に示す。【０１２０】
＜ゲルろ過カラムクロマトグラフィー＞
システム：ＢＩＯＣＡＤ７００Ｅ（PreSeptive Biosystems社製）
カラム：ＳｕｐｅｒｏｓｅＨＲ６カラム（ファルマシア社製）
溶出溶媒：ＥＤＴＡ（１ｍｍｏｌ／Ｌ）を含有する０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）
流速：０．３ｍＬ／分【０１２１】
＜濃度測定＞
発色試薬：
(1)総コレステロール（ＴＣ）測定用キット：デタミナーＬ  ＴＣ  ＩＩ（協和メデックス社製）
発色反応温度：３７℃
検出波長：主波長６００ｎｍ；副波長８００ｎｍ
サンプル量：４μＬ
(2)遊離型コレステロール（ＦＣ）測定用キット：デタミナーＬ  ＦＣ（協和メデックス社製）
発色反応温度：３７℃
検出波長：主波長６００ｎｍ；副波長７００ｎｍ
サンプル量：４μＬ【０１２２】
本ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおける溶出パターン（クロマトグラム）を図１に示す。図１に示されているように、最初に溶出されるフラクションにおいては、総コレステロールが遊離型コレステロールとほぼ同濃度であり、また、アポＢ測定用キットを用いた同様の測定により、当該フラクションにはアポＢが含まれないことが確認されていることから、当該フラクションがＬｐＸに該当することを確認した。すなわち、当該肝疾患患者由来の血清が異常リポ蛋白の１つであるＬｐＸを多量に含むことを確認した。尚、図１のクロマトグラムにおいてＬｐＸに次いで溶出されるフラクションは、ＬｐＹ（異常リポ蛋白の１つ）と微量のＬＤＬを含むフラクションであることが確認された。【０１２３】
一方、実施例５及び６のキットを用いて、本ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの各フラクション中のコレステロール濃度を測定した結果、図１に示す通り、ＬｐＸ中のコレステロールとは反応しないことが分かった。従って、本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットは、ＬｐＸ中のコレステロールと反応せず、本発明のＬＤＬ−Ｃ測定方法は、ＬｐＸ中のコレステロールに対する反応性が抑制された方法であることが判明した。
【実施例７】
【０１２４】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＬＤＬ−Ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム    ０．７５  ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                ２  ｇ／Ｌ
ＤＯＳＥ                      ０．３  ｇ／Ｌ
ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩またはアリールスルホン酸誘導体（その種類と濃度は第３表参照）
ペルオキシダーゼ              １０  ｋＵ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン        ０．５  ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ              ２０  ｋＵ／Ｌ
アクロネセスＫＰ１８９Ｒ      １４  ｇ／Ｌ
プルロニックＬ−１２１        ７  ｇ／Ｌ
ブラウノンＬ−２０５          ０．７５  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１                ３  ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ                    ４  ｋＵ／Ｌ【０１２５】
［試験例］
検体として、低ＬＤＬ血症患者由来の血清を用い、キットとして、実施例７のキットを用いる以外は、実施例２に記載の方法と同様の方法により、当該検体中のＬＤＬ−Ｃ濃度を決定した。その結果を第３表に示す。【０１２６】
【表３】
2011136316.tif 000006
【０１２７】
第３表から明らかなように、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩、アリールスルホン酸誘導体のいずれをも含まない実施例１のキットを用いた測定においては、ＬＤＬ−Ｃ濃度が負の値となったが、ＰＯＥ多環エーテル硫酸エステル塩、アリールスルホン酸誘導体のいずれかを含む実施例７のキットを用いた測定においては、ＬＤＬ−Ｃ濃度が正の値となり、正確なＬＤＬ−Ｃの測定が可能となることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明により、メタボリックシンドロームや動脈硬化等の診断に有用なＬＤＬ−Ｃの測定方法、測定用試薬及び測定用キットが提供される。
【図１】
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【国際調査報告】
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