(57)【要約】  本発明は遺伝子発現を分析するための方法に関し、これは、細胞型、組織または生物中に存在する翻訳状態を考慮しながら、検討すべき遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を前記ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の量と高い信頼性で相関させることを可能とする。検討すべき遺伝子から転写され、特定のタンパク質をコードする全ｍＲＮＡ変異体の翻訳効率の測定により、とりわけ、特定の細胞型、組織または生物中で優先的に翻訳されるｍＲＮＡ変異体を同定することが可能となる。検討すべきタンパク質をコードする優先的に翻訳されたｍＲＮＡ変異体の量および翻訳効率に基づき、細胞型、組織または生物中で発現されるタンパク質の量を高信頼性で予測することが可能となる。
2005510247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の遺伝子のゲノムヌクレオチド配列の部分である１０〜４０連続ヌクレオチドを有する少なくとも２種の１本鎖核酸（=プローブ）が種々の点に固定化されている固体マトリックスであって、
第１のプローブは遺伝子の第１のｍＲＮＡ変異体またはこの変異体に相当するｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分に相補的であり、
第１のプローブは遺伝子の第２のｍＲＮＡ変異体またはこの変異体に相当するｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分に相補的ではなく、
第２のプローブは遺伝子の第１のｍＲＮＡ変異体またはこの変異体に相当するｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分に相補的であり、かつ、
第２のプローブは遺伝子の第２のｍＲＮＡ変異体またはこの変異体に相当するｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分に相補的である、
ことを特徴とする固体マトリックス。
【請求項２】
遺伝子の第１のｍＲＮＡ変異体またはこの変異体に相補的なｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分に相補的であり、
遺伝子の第２のｍＲＮＡ変異体またはこの変異体に相当するｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分に相補的であり、かつ、
遺伝子の第３のｍＲＮＡ変異体またはこの変異体に相当するｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分に相補的である、
第３のプローブを含むことを特徴とし、
ここで第１および第２のプローブは遺伝子の第３のｍＲＮＡ変異体またはこの変異体に相当するｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分に相補的ではない、
ことを特徴とする、請求項１記載の固体マトリックス。
【請求項３】
固体マトリックス上に固定化されたプローブの少なくとも１種が分析すべき遺伝子のコーディング領域の部分であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載のマトリックス。
【請求項４】
固体マトリックス上のプローブが、分析すべき遺伝子の５’または３’非コーディング領域の完全ゲノムヌクレオチド配列を実質的に含むことを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の固体マトリックス。
【請求項５】
固体マトリックス上のプローブが、分析すべき遺伝子の非コーディング領域の完全ゲノムヌクレオチド配列を実質的に含むことを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の固体マトリックス。
【請求項６】
固体マトリックス上のプローブが、分析すべき遺伝子の完全ゲノムヌクレオチド配列を実質的に含むことを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の固体マトリックス。
【請求項７】
各々が試料の発生源である生物のハウスキーピング遺伝子、細菌の遺伝子、および植物の遺伝子よりなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列の部分である１０〜４０連続ヌクレオチドを各々有する１種以上の別のプローブが固体マトリックスに固定化されていることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の固体マトリックス。
【請求項８】
固体マトリックスがＤＮＡアレイとして設計されていることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載のマトリックス。
【請求項９】
試料中のタンパク質をコードする少なくとも１種の遺伝子の発現を分析するための方法であって、
ａ）適切な場合は試料中に存在する分析すべき遺伝子の種々のｍＲＮＡ変異体の数および名称を確認し；
ｂ）試料中に存在する分析すべき遺伝子の種々のｍＲＮＡ変異体の各々の量を確認し；
ｃ）工程ｂ）で確認された量に基づき、かつ、種々のｍＲＮＡ変異体の各々の翻訳効率に基づき、試料中に存在する、分析すべき遺伝子によりコードされるタンパク質の量を確認する、
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
ａａ）試料から取得またはこれより調製された組成物であって、かつ、ｍＲＮＡまたはこれより誘導された核酸を含むものを準備し；
ｂｂ）請求項１から８のいずれかに記載の固体マトリックスを準備し；
ｃｃ）ａａ）の組成物を固体マトリックスと接触させ；
ｄｄ）適切な場合は、ａａ）の組成物内に存在する分析すべき遺伝子によりコードされる核酸の種々の変異体の数および名称を確認し；
ｅｅ）ａａ）の組成物内に存在する分析すべき遺伝子によりコードされる核酸の種々の変異体の各々の量を確認し；
ｆｆ）工程ｅｅ）で確認された量に基づき、かつ、分析すべき遺伝子の種々のｍＲＮＡ変異体の各々の翻訳効率に基づき、組成物の取得元または調製元である試料中に存在する、遺伝子によりコードされるタンパク質の量を確認する；
ことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
試料が、哺乳類の組織または臓器に由来する哺乳類細胞の培養物を発生源としていることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ａａ）の試料から取得されたまたは調製された組成物が全ＲＮＡ、ｐｏｌｙＡ+ＲＮＡ、ｃＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ａａ）由来の組成物中に存在する核酸が工程ｃｃ）の実施前に標識されることを特徴とする、請求項９から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２種のＲＮＡ変異体が分析すべき遺伝子から転写されることを特徴とする、請求項９から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
種々のｍＲＮＡ変異体が５’末端で異なるか、３’末端で異なるか、および／または、遺伝子の種々のスプライシング形態を示すことを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
工程ｆｆ）がデータベースモジュールおよび分析モジュールにより実施されることを特徴とする、請求項９から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
データベースモジュールが、分析すべき遺伝子の種々のｍＲＮＡ変異体の各々の翻訳効率を保存する保存媒体を含むことを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
分析モジュールが処理装置（ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）およびデータ保存装置（ｓｔｏｒｅ）を含むことを特徴とする、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
試料中の少なくとも１種の遺伝子の発現を分析するためのキットであって：
ａ）成分１として、請求項１から８のいずれかに記載の固体マトリックス；
ｂ）成分２として、分析すべき遺伝子の種々のｍＲＮＡ変異体の各々の翻訳効率を保存する保存媒体；
を含むキット。
【請求項２０】
核酸含有組成物を固体マトリックスに接触させた後に各々のプローブに結合している核酸の各々の量を測定するための装置を更に含むことを特徴とする、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
成分２が、試料の由来元でもある細胞、組織または生物に由来する転写プロファイルを更に含むことを特徴とする、請求項１９または２０のいずれかに記載のキット。
【請求項２２】
成分２が、疾患により改変された細胞、組織または生物に由来する転写プロファイルを更に含むことを特徴とする、請求項１９から２１のいずれかに記載のキット。
【請求項２３】
疾患が、神経変性障害、がん、自己免疫疾患、高齢者の慢性障害、心臓血管障害、ウィルス性疾患および薬剤耐性よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
成分２が、１種以上の治療薬で処理された腫瘍細胞に由来する転写プロファイルを更に含むことを特徴とする、請求項１９から２３のいずれかに記載のキット。
【請求項２５】
障害を測定または分析する方法であって、請求項１から８のいずれかに記載の固体マトリックスを用いて作成した転写プロファイルを病理学的に改変された細胞、組織または生物の転写プロファイルと比較することを特徴とする方法。
【請求項２６】
検討すべき細胞に対する外的影響の作用を測定または分析する方法であって、請求項１から８のいずれかに記載の固体マトリックスを用いて作成されており、かつ細胞、組織または生物から作成された転写プロファイルを、外的影響への曝露後の同じ細胞または同じ組織もしくは生物の転写プロファイルと比較することを特徴とする方法。
【請求項２７】
ＲＮＡの二次構造を測定するための方法であって、ＲＮＡを部分的ＲＮＡｓｅ消化に付し、かつその後、請求項１から８のいずれかに記載の固体マトリックスに接触させることを特徴とする方法。
【請求項２８】
試料中のタンパク質濃度を測定するための、請求項１から８のいずれかに記載の固体マトリックスの使用。
【請求項２９】
障害を測定または分析するための、請求項１から８のいずれかに記載の固体マトリックスの使用。
【請求項３０】
検討すべき細胞に対する外的影響の作用を測定または分析するための、請求項１から８のいずれかに記載の固体マトリックスの使用。
【請求項３１】
ＲＮＡ分子の二次構造を測定するための、請求項１から８のいずれかに記載の固体マトリックスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は転写分析の領域における方法に関し、特に、翻訳制御される遺伝子発現のための方法およびキットを含む。方法は検討すべき遺伝子１種以上から転写されたｍＲＮＡ変異体の５’ＵＴＲの翻訳効率の分析に基づく。検討すべき１種以上の遺伝子から転写された種々のｍＲＮＡ変異体の翻訳効率に関するデータは、好ましくは、転写分析のために特別に設計されたツールとともに、１種以上の遺伝子から転写された種々のｍＲＮＡ変異体の同定および定量を通じて、検討すべき細胞型、組織または器官におけるタンパク質の量に関して、精密な予測を可能にするデータベースシステムの一部である。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現の産物、即ちタンパク質は細胞機能を有している。遺伝子発現の調節は胚発生、組織修復、加齢または新生物性形質転換のような生物学的過程において本質的な役割を果たしていることが明らかにされている。真核生物における遺伝子発現は転写レベル、転写後（ＲＮＡのポリアデニル化、ｍＲＮＡスプライシング、細胞質内への核からの成熟ｍＲＮＡの輸出またはＲＮＡのターゲティングされた分解）、翻訳レベルまたは翻訳後に制御される［０］。翻訳レベルでの発現の制御は遺伝子発現の制御のための新しい重要な調節機序である［１］。翻訳制御発現は種々の生育因子、サイトカイン、ホルモン受容体、タンパク質キナーゼ、転写因子、翻訳装置の要素に関して、かつ、細胞周期およびアポトーシスの調節に関して、明らかにされている［２、３、４、５および６］。発現が翻訳制御下にある遺伝子をコードするｍＲＮＡは特徴的な構造により識別される。大部分のｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は通常は１０ヌクレオチド（Ｎ）〜２００Ｎ長の範囲にある［７、８］。プロトオンコジーンまたは細胞分裂に関与する因子をコードするｍＲＮＡの約３分の２は２００Ｎより長い５’ＵＴＲを有し、および／または、１個より多い開始コドンを含む。ｍＲＮＡの５’ＵＴＲを用いながらタンパク質生合成の開始を制御する機序で今日までわかっているものを以下に記載する。
【０００３】
長構造体化５’ＵＴＲによる翻訳の調節：グアニンおよびシトシン塩基を高比率で含有する安定な二次構造および配列セグメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに存在する場合、リボソームスキャニングモデルによればタンパク質生合成のＣＡＰ依存性開始を極めて効率的に抑制することができる［１］。インビトロの検討によれば、３０〜７０ｋｃａｌ／モルの自由エネルギーを有するｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のヘアピン構造が効率的に翻訳を抑制することができることがわかっている。即ち、特定のタンパク質をコードし、そのような構造を示す５’ＵＴＲを有するｍＲＮＡは極めて弱く翻訳されるに過ぎないのに対し、同じタンパク質をコードし、より弱い構造のより短い５’ＵＴＲを有するｍＲＮＡはさらに効率的に翻訳されることも示された［５、９］。
【０００４】
上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）による翻訳の調節：翻訳開始のリボソームスキャニングモデルによれば、タンパク質合成は５’近位の開始コドンで開始される［１０、１１］。コーディング領域の第１の開始コドンから上流の１個以上の別の開始コドンまたは１個以上のｕＯＲＦを含む長５’ＵＴＲを有する多くのｍＲＮＡが下流コーディング領域の翻訳に対して抑制作用を有する［６］。特定のタンパク質をコードし、その５’ＵＴＲが比較的短く、かつ別の開始コドンまたはｕＯＲＦを含まないｍＲＮＡは、１個以上の別の開始コドンまたはｕＯＲＦを有する長５’ＵＴＲを有する同じタンパク質をコードするｍＲＮＡよりも、遥かに効率的に翻訳される［１，２，３，６，１２及び１３］。
【０００５】
内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）による翻訳の調節：翻訳の内部開始は当初はｍＲＮＡが５’キャップ構造を有さず、約１０００Ｎ長であり更に多数のｕＯＲＦを有する構造体化５’ＵＴＲを有しているピコルナウィルスにおいて発見された。リボソームスキャニングモデルによれば翻訳の開始を効果的に抑制する［１１］５’ＵＴＲの構造にもかかわらず、ピコルナウィルスのＲＮＡはインビトロおよびインビボで効率的に翻訳される。ピコルナウィルスＲＮＡの５’ＵＴＲにおける二次構造はリボソームサブユニットの結合および翻訳のＣＡＰ非依存性の開始（内部リボソームエントリー部位→ＩＲＥＳ）に好都合である。同様の構造を有する５’ＵＴＲはまた種々の他のウィルスのＲＮＡにおいても発見されている［１４、１５］。同様に真核細胞において転写される種々の細胞ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中の１個以上のＩＲＥＳを検出することも可能である［１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４］。ＩＲＥＳを含む５’ＵＴＲのｍＲＮＡは５’−7メチル−Ｇキャップ構造とは無関係に真核細胞開始因子ｅＩＦ  ４Ｅを過剰発現する細胞においても翻訳されえる［６、１１］。更にまた、これと関連して、特定のタンパク質をコードし、短い弱く構造体化された５’ＵＴＲを有するｍＲＮＡは、同じタンパク質をコードするがその５’ＵＴＲがＩＲＥＳを含むｍＲＮＡよりも遥かに効率的に翻訳されることも明らかにすることができた［２４］。ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのＩＲＥＳエレメント１個以上がウィルス感染後、またはｅＩＦ４Ｅ過剰発現細胞中で、このｍＲＮＡの効率的な翻訳を可能とする。通常の条件下で、このような長さを有する構造体化５’ＵＴＲはＣＡＰ依存性の翻訳開始を防止する。
【０００６】
翻訳レベルにおいて調節される発現の遺伝子から複数のｍＲＮＡ変異体が転写されることがわかっている。特定の遺伝子から転写された全てのｍＲＮＡ変異体はコーディング領域の同一配列を有する。検討された例の大部分において、主要な転写物は長構造体化５’ＵＴＲを有していたのに対し、副次的な転写物はより弱い構造のより短い５’ＵＴＲを有している。これらのｍＲＮＡ変異体の発生源は異なる転写開始部位の使用および前ｍＲＮＡのオルタナティブスプライシングに起因している［２、１２、２４］。
【０００７】
例えば２種のｍＲＮＡ変異体はｂｃｌ−２遺伝子から転写される。ｂｃｌ−２遺伝子の主要な転写物は１０００Ｎより長く複数のｕＯＲＦを有する５’ＵＴＲを有している。副次的なｂｃｌ−２転写物は約８０Ｎの長さであり、弱く構造体化され、優先的に翻訳される５’ＵＴＲを有している。副次的転写物の比率はｂｃｌ−２ｍＲＮＡの総量の約５％である［２、１２］。放射線、薬剤、細胞分裂抑制剤、ホルモン、サイトカイン、成長因子またはストレスのような外的影響により誘発された優先的に翻訳されるｂｃｌ−２転写物の転写率が倍加されることにより、タンパク質の濃度も倍加する。ｂｃｌ−２ｍＲＮＡの総量は全体で５％増大する。転写分析の従来の方法［２６、２９］ではこのような変化を、タンパク質量変化を予測できるほど十分正確に測定することは不可能である。
【０００８】
成長因子、サイトカイン、ホルモン受容体、タンパク質キナーゼ、転写因子、翻訳装置の要素および細胞周期およびアポトーシスの調節物質のようなタンパク質は、神経変性障害、自己免疫疾患または癌の発症および病因において重要な役割を果たしている。多剤耐性腫瘍細胞の発生およびいわゆる免疫からの逃避の領域は同様に上記タンパク質により影響される［２５］。これらのタンパク質をコードする遺伝子の多くの発現は翻訳レベルで調節される［１、６］。これらのタンパク質の量の変化は「プロテオミクス」という用語で総括される方法を用いて分析することができる［３０］。しかしながら、タンパク質を分析および／または定量するための全ての知られた方法には、例えば２Ｄゲルの限定的な分解能、タンパク質を染色するための方法の選択性または抗体の入手容易性を含む制約がある。更にまた、タンパク質を分析するためのほぼ全ての方法が時間と労力を要するものであり、場合によっては、かなりの装置の費用がかかるため、臨床における日常的な使用やハイスループットの操作法においてはそのまま利用することはできない。
【０００９】
プロテオミクスに関わる問題を回避するために、一般的に特定のタンパク質の量の変化はそのタンパク質をコードするｍＲＮＡの量の変化を用いて予測される。１種以上の遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を測定可能とするために利用できる方法には、ノーザンブロッティング、スロットおよびドットブロッティング、ヌクレアーゼ保護試験、ＰＣＲおよびＤＮＡアレイが含まれる［２６］。特に転写分析のためのＰＣＲに基づく方法およびＤＮＡアレイによれば、それらの操作が比較的簡素であり自動化できることから、大量の試料の分析が可能となる。現在の研究室の慣行においては、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量はこのｍＲＮＡのコーディング領域を検出することにより測定される。検討されている遺伝子の５０％超では、タンパク質の検出量はＲＮＡの検出量とは相関しないため、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡの量は実際に存在する相当するタンパク質の量の十分正しいインジケーターとはならない［２９］。特定の遺伝子の発現が翻訳のレベルで調節される場合、上記した方法によりこの遺伝子から転写される全てのｍＲＮＡ変異体の総量のみが測定され得る。
【００１０】
組織または細胞型に存在するタンパク質の量の比較的精密な推定は、ポリソームに結合した転写物が能動的に翻訳されたｍＲＮＡを示すことから、これらを分析することにより達成できる［２９、３１、３２および３３］。翻訳の制御は主に開始期に起こると一般的に考えられているため、ポリソーム結合ｍＲＮＡ分子の数は相当するタンパク質の翻訳率の信頼性の高いインジケーターとなる［２９、３４］。ポリソーム結合ｍＲＮＡの単離には、ＲＮＡタンパク質複合体またはＲＮＡリボソーム複合体の解離を防止する条件下に細胞質ＲＮＡを単離することが必要である。次にスクロース勾配の超遠心分離によりポリソームをモノソームおよび未結合ｍＲＮＡから分離する［２９、３１、３２および３３］。核ＲＮＡと細胞質ＲＮＡの分離［３６］およびその後の超遠心分離の工程のため、方法を自動化することにより大量の試料を平行して処理することは困難である。
【００１１】
試料のハイスループットを確保するために自動化された方法に依存している臨床診断または工業用の薬剤の研究のような分野においては、タンパク質の発現量の信頼性の高い予測を可能とするような好都合な発現分析を行うための方法が必要とされている。転写分析によるタンパク質の量の精密な予測により、細胞、組織または生物における機能的関連性を説明することが可能となり、これにより薬剤の作用、副作用および標的分子の測定が可能となる。しかしながら、検討すべきタンパク質１種以上をコードするｍＲＮＡはそのコーディング領域を用いてのみ検出されるため、自動化されたシステムまたはハイスループットのルーチンに組み込むことのできる従来技術の発現分析法は細胞の翻訳状態を考慮していない。従ってこれらのシステムでは検討すべき細胞、組織または生物におけるタンパク質の量の信頼性のある予測や機能的関連性の説明ができない。検討すべき細胞、組織または生物の翻訳状態を考慮した発現分析方法、例えばポリソームおよび非ポリソームＲＮＡの比較分析は、タンパク質の量に関する信頼性の高い予測を可能とするが、それらはハイスループットの操作法において、または、日常的な臨床診断において使用するためには、それが労作の多い性質であることから、不適当である。
【００１２】
本発明の１つの目的は遺伝子の発現分析のための好都合な方法を提供することである。
【００１３】
本発明は遺伝子発現を分析するための方法に関し、この方法は、細胞型、組織または生物中に存在する翻訳状態を考慮しながら、検討すべき遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量とこのｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量との間に信頼できる相関を見出せるようにするものである。検討すべき遺伝子から転写され、特定のタンパク質をコードする全てのｍＲＮＡ変異体の翻訳効率の測定により、とりわけ、特定の細胞型、組織または生物中で優先的に翻訳されるｍＲＮＡ変異体の同定が可能となる。検討すべきタンパク質をコードする優先的に翻訳されるｍＲＮＡ変異体の量および翻訳効率に基づき、細胞型、組織または生物中で発現されるタンパク質の量を高い信頼性において予測することが可能となる。方法は遺伝子の複数の翻訳制御された発現の同時分析、かつこれにより、細胞型、組織または生物中の機能的関連性の分析を可能とする。方法は優先的に翻訳されるｍＲＮＡの転写の速度の測定を通じて組織または細胞型内の検討すべきタンパク質１種以上の量を予測できるようにする。
【００１４】
従って、本発明は試料中のタンパク質をコードする少なくとも１種の遺伝子の発現を分析するための方法であって、これは、適宜、試料中に存在する分析すべき遺伝子の種々のｍＲＮＡ変異体の数および名称を確認すること；試料中に存在する分析すべき遺伝子の種々のｍＲＮＡ変異体の各々の量を確認すること；および、種々のｍＲＮＡ変異体の確認された量および各々の翻訳効率に基づいて、分析すべき遺伝子によりコードされるタンパク質の試料中に存在する量を確認することを包含する。
【００１５】
試料は通常は細胞、組織または器官の一部を包む組成物である。例えば生検検体または細胞培養中の細胞であることができる。試料は好ましくは哺乳類の組織または器官に由来する哺乳類細胞の培養物から得る。
【００１６】
試料は通常はそれ自体を直接分析するのではなく、逆に、それよりｍＲＮＡであるかこれより誘導された核酸を含む組成物を取得または調製する。この組成物は好ましくは試料から取得または調製された全ＲＮＡまたはｐｏｌｙＡ+ＲＮＡの標品である。組成物中に存在する核酸も同様にｃＲＮＡまたはｃＤＮＡであってよい。これらの種類の標品は単にｍＲＮＡを含有する組成物から調製することができる。組成物を分析し、組成物中の分析すべき遺伝子の種々の核酸変異体の数、名称および／または量の値より、試料中の分析すべき遺伝子の種々の核酸変異体の数、名称および／または量を決定することができる。
【００１７】
好ましくは、種々のマトリックス地点において少なくとも２種の異なる１本鎖核酸が固定化されている固体マトリックスをまず準備する（＝プローブ）。これらのプローブは好ましくは各々が１０〜４０連続ヌクレオチドを含むか、または、１０〜４０連続ヌクレオチドよりなり、その各々が分析すべき遺伝子のヌクレオチド配列の部分であり、第１のプローブは遺伝子の第１のｍＲＮＡ変異体またはこの変異体に相当するｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分に相補的であるが、この第１のプローブは遺伝子の第２のｍＲＮＡ変異体またはこの変異体に相当するｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分に相補的ではない。更に、第２のプローブは遺伝子の第１のｍＲＮＡ変異体またはこの変異体に相当するｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分に相補的であり、この第２のプローブは遺伝子の第２のｍＲＮＡ変異体またはこの変異体に相当するｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分に同様に相補的である。このことは、第１のプローブが第１のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ変異体に対して特異的であるが、第２のプローブは第１および第２のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ変異体にハイブリダイズ可能であることを意味する。
【００１８】
更なる工程において、固体マトリックスは試料から取得または調製された組成物に固体マトリックスを接触させることができ、この場合、組成物中の核酸分子と１種以上のプローブとのハイブリダイゼーションが起こることができる。別の工程において、適切な場合は、次に、分析すべき遺伝子によりコードされる核酸の組成物中に存在する種々の変異体の数および名称を確認する。同様に、分析すべき遺伝子によりコードされる核酸の組成物中に存在する種々の変異体の各々の量も確認する。最終段階において、この方法で確認された量および分析すべき遺伝子の種々のｍＲＮＡ変異体の各々の翻訳効率に基づいて、組成物の取得または調製の原料となった試料中に存在する、遺伝子によりコードされるタンパク質の量を確認する。
【００１９】
固体マトリックスはまた、第３のｍＲＮＡ変異体または相当するｃＤＮＡと相補的であるためにこれらとハイブリダイズできる第３のプローブを含んでよい。これはまた、相補性により、第１および第２のｍＲＮＡ変異体または相当するｃＤＮＡにハイブリダイズしてよい。しかしながら第３のｍＲＮＡ変異体または相当するｃＤＮＡは第１および第２のプローブにより認識されない。即ち、プローブは第１のｍＲＮＡ変異体が全３種のプローブにより認識され、第２のｍＲＮＡ変異体は第２および第３のプローブによってのみ、そして第３のｍＲＮＡ変異体は第３のプローブによってのみ認識されるものとして定義される。より多種のｍＲＮＡ変異体を識別するために必要なプローブの数は相応により多数となる。当業者の知るとおり、種々のｍＲＮＡ変異体を識別するために理論的に必要な数より多いプローブを使用することができる。
【００２０】
通常は固体マトリックスに固定化されているプローブ少なくとも１種が分析すべき遺伝子のコーディング領域の部分であるヌクレオチド配列を含む。マトリックスに固定化されているプローブは種々の実施形態において、分析すべき遺伝子の３’非コーディング領域、５’非コーディング領域または完全非コーディング領域の完全ゲノムヌクレオチド配列を「カバー」している。最後に、プローブはまた、分析すべき遺伝子の完全ゲノムヌクレオチド配列を含んでよい。更に、個々のプローブのヌクレオチド配列は重複していてよい。
【００２１】
各々が細菌の遺伝子、植物の遺伝子および／または試料の原料である生物のハウスキーピング遺伝子のヌクレオチド配列の部分を含むプローブ１種以上が固体マトリックスに固定化されていることも好ましい。これらのプローブは通常は１０〜４０ヌクレオチドの長さを有する。ハウスキーピング遺伝子の例は例えば、β−アクチン、ＧＡＰＤＨまたはＬ３２をコードする遺伝子である。
【００２２】
固体マトリックスはスポットの形態でプローブが固定化されたＤＮＡアレイとして設計されることが特に好ましい。
【００２３】
２種の異なるｍＲＮＡ変異体を分析すべき遺伝子から転写してよいが、３種以上の異なる変異体を転写することも可能である。異なる変異体はまた５’末端および／または３’末端で異なっていてよく、かつ／または遺伝子の異なるスプライス型を示してもよい。
【００２４】
本発明はまた本発明の方法に関して記載した固体マトリックスにも関する。
【００２５】
本発明の別の態様は試料中の遺伝子少なくとも１種の発現分析のためのキットである。キットは成分１として、上記した固体マトリックス、および成分２として、分析すべき遺伝子の種々のｍＲＮＡ変異体の各々の翻訳効率を保存する保存媒体を含む。更にまた核酸含有組成物を固体マトリックスに接触させた後に各々のプローブに結合している核酸の各々の量を測定するための装置を含んでよい。成分１の固体マトリックスの好ましい実施形態は上記した方法におけるマトリックスの好ましい実施形態に相当する。更にまた、転写プロファイルが成分２内に存在してよい。この点に関し、転写プロファイルをまず疾患により改変された細胞、組織または生物から誘導してよい。このような疾患の例は癌、神経変性障害、自己免疫疾患、高齢者の慢性障害、心臓血管障害、ウィルス性疾患および薬剤耐性である。
【００２６】
転写プロファイルは１種以上の治療薬で処理されている腫瘍細胞から特に誘導してよい。成分２の更に別の転写プロファイルを翻訳効率として同じ保存媒体に保存してよいが、それらは１種以上の個別の保存媒体に保存してもよい。
【００２７】
本発明の更に別の態様は、試料中のタンパク質濃度を測定するため、障害を測定または分析するため、検討すべき細胞に対する外的影響の作用を測定または分析するため、かつ、ＲＮＡ分子の二次構造を測定するための、上記した固体マトリックスの使用である。
【００２８】
方法を実施するためのシステムは通常は２種の成分よりなる。成分１は通常は検討すべき遺伝子１種以上から転写された全てのｍＲＮＡ変異体を同定および定量するためのＤＮＡアレイである。種々の遺伝子の転写の定量的測定のほか、これらの遺伝子およびこれらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡ変異体の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲにおけるスプライス変異体の代替利用される転写開始位置を、成分１に含まれる特別に設計されたＤＮＡアレイを用いて分析し、定量的に測定する。ヌクレアーゼ保護試験、ノーザンブロッティングおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲ［２６］の組み合わせから得られる情報がＤＮＡアレイにより作成可能となる。成分２はデータベースモジュールおよび分析モジュールよりなるソフトウエアパッケージである。データベースにおいては、適切な場合は保存媒体上に、種々の条件下で検討すべき遺伝子から転写された全てのｍＲＮＡ変異体の翻訳効率に関する数値が組織化（ｏｒｇａｎｉｚｅ）される。データベースは特定の細胞型、組織または生物中で翻訳されるタンパク質の量の信頼できる予測を転写プロファイルに基づいて可能とするために必要なデータの全てを含む。成分２に包埋される分析モジュールは、成分１およびデータベースにより作成された転写パターンに基づいて、優先的に翻訳されるｍＲＮＡ変異体または特定の条件下、細胞型、組織または生物中の検討すべき遺伝子１種以上により転写されるｍＲＮＡ変異体の量を確認する。
【００２９】
１つの実施形態において、システムは検討すべき細胞型、組織または生物に対する種々の外的影響の作用および二次的作用を測定し、分析するための方法に関する。これらの外的影響には、特に、薬剤（薬品）、サイトカイン、ホルモン、成長因子、環境の影響（温度、気圧、薬品）または栄養補給が包含される。上記した影響の１種以上に曝露された細胞、組織または生物に由来するＰｏｌｙＡ+ｍＲＮＡ、全細胞ＲＮＡまたはこれらのＲＮＡ集団から調製したｃＤＮＡを成分１で分析する。これらの転写プロファイルを上記した外的影響に曝露されていない同一または同様の細胞、組織または生物の転写プロファイルと比較する。システムは例えば新しい腫瘍治療薬の開発において、細胞に対する作用および多剤耐性表現型の発生の可能性を分析するための薬剤の研究において使用することができる。
【００３０】
システムは更に、とりわけ、神経変性障害、癌、自己免疫疾患、高齢者の慢性障害、心臓血管障害、ウィルス性疾患および／または薬剤耐性を包含する病理学的常態を分析するための方法を含む。新生物疾患の診断の分野において、システムは腫瘍の転移の可能性および攻撃性の分析および評価のため、および、治療効率における改善を達成し治療の個体別タイプを設計することを可能とするための腫瘍の多剤耐性の分析および評価のために用いることを意図している。成分２のデータベースモジュールはこの場合、成分１により作成された腫瘍細胞の転写プロファイルおよび腫瘍細胞の臨床データを含むデータレコードにより拡張される。更に、これらのデータレコードは種々の腫瘍治療薬を投与されている培養腫瘍細胞の成分１により作成された転写プロファイル、および、治療薬に対するこれらの細胞の応答（応答プロファイル）に関するデータ（例えば細胞分裂速度、アポトーシス速度等）を含む。
【００３１】
別の実施形態においては、本発明はｍＲＮＡ分子の二次構造を確認するための方法に関する。特に、リボザイムと称される触媒活性を有するＲＮＡ、または、ｍＲＮＡの調節領域、例えば内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）の２次構造を信頼性高く確認することが可能である。ＤＮＡアレイの特定の設計（成分１）は一般的な実験室作業において使用されているヌクレアーゼ保護試験［２６］を完全に代行する。従来のヌクレアーゼ保護試験においては、プローブ標的二本鎖のどの領域が２本鎖、即ちヌクレアーゼから保護されているかを明白に確認することは必ずしも可能ではなかった。本発明の多大な利点は、「保護された」領域の厳密な配列が示される点である。検討すべきＲＮＡ分子を部分的ＲＮＡａｓｅ消化に付し、その後、ＤＮＡアレイとハイブリダイズさせる。ＤＮＡアレイ（成分１）は検討すべきＲＮＡ分子内の２本鎖領域を同定可能とする。核酸の二次構造を計算するための一般的なアルゴリズム［２４］に従い、これらのデータを用いて検討すべきＲＮＡ分子の折りたたみの信頼できるモデルを作成することができる。即ち、スペクトル分析やＸ線構造分析を用いることなく、ＩＲＥＳエレメント、酵素活性ＲＮＡ（リボザイム）または他のＲＮＡの構造の３次元モデルの作成が始めて可能になったのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
成分１（ＤＮＡアレイ）
成分１は好ましくはシステムの必要性に応じて特別に適合させ設計され、そして、これを用いることにより、全ＲＮＡ、ｐｏｌｙＡ+ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであってよい試料核酸のある量において、その検討すべき１種以上の遺伝子より転写されるｍＲＮＡ変異体を同定し、定量することが可能となるＤＮＡアレイである。ＤＮＡアレイは検討すべき細胞型、組織または生物に対する１種以上の特定の外的影響の作用の分析、診断および解釈のために必要な全てのｍＲＮＡ変異体を検出するためのプローブ核酸を包む。これらの外的影響には、特に、酸素分圧、栄養補給、温度、大気圧、および、サイトカイン、ホルモン、細胞分裂抑制剤または他の薬剤の作用、および、病理学的変化、例えば癌、神経変性症候群、自己免疫疾患、心臓血管障害、ウィルス感染症および薬剤耐性が包含される。
【００３３】
ＤＮＡアレイの設計および解釈
１つの実施形態においては、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類縁体例えばＰＮＡ（ペプチド核酸）［２７］であってよく、そして、その塩基配列が検討すべき遺伝子の５’非コーディング領域（５’ＮＣＲ）、コーディング領域（ＣＲ）および、適切な場合は、３’非コーディング領域（３’ＮＣＲ）の塩基配列と同一である１本鎖核酸を最小１０最大４０ヌクレオチドの長さＬｘを有するオリゴヌクレオチドに分割する。全オリゴヌクレオチドの平衡融点は同じでなければならない（Ｔｍ＝ｃｏｎｓｔ）。個々のオリゴヌクレオチドの厳密な長さＬｘは所定の平衡融点（Ｔｍ）およびそれらの塩基組成（％ＧＣ）の関数、即ちＬｘ(Tm=const)＝ｆ(Tm:%GC)［３７、３８、３９、４０、４１および４２］であり、かつ、
Ｌｘ(Tm=const.)＝１０＋ｎヌクレオチド
である。
【００３４】
方法の分解能は、以下にプローブ核酸と称するセグメントの長さＬｘに依存している。プローブ核酸の長さＬｘ、および、検討すべき配列に応じた分解能は、検討すべき配列内のＧＣヌクレオチドの含量に応じて変化する。方法の分解能Ａはヌクレオチドとは無関係に固体マトリックス上のセグメントの第１のセットに平衡して固定化されている重複セグメントにより増大することができる（Ａ＝Ｌｘ／ｎ、式中ｎ＝１→Ｌｘ）。
【００３５】
検討すべき遺伝子の塩基配列に相当する合成オリゴヌクレオチド（以下、プローブ核酸と称する）は、好ましくは共有結合により、固体マトリックスに結合する。固体マトリックスは平板の領域（ＤＮＡアレイ）、繊維、または、プラスチック（例えばポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロースまたはガラスよりなる微小粒子［４５］の表面であってよい。一方、固体マトリックスへのオリゴヌクレオチドプローブの共有結合はインサイチュのオリゴヌクレオチド合成［４６，４７，４８および４９］によるか、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであってよい修飾オリゴヌクレオチドの活性表面への適用［５０，５１］により行ってよい。ＤＮＡアレイの印刷のための装置は多くの供給元により製造販売されている［５７］。プローブ核酸は標準的なバイオテクノロジーの実験室プロトコルにより合成する［５２］。共有結合したプローブ核酸は検討すべき遺伝子の塩基配列に相当する配列に配置され、これにより、検討すべき遺伝子の塩基配列を収容しているＤＮＡ鎖がマトリックス上で５’−３’の方向にシミュレーション（リモデリング）される（「タイルドアレイ（ｔｉｌｅｄ  ａｒｒａｙ）」。このようにしてマトリックス上に固定化されたプローブ核酸は３領域に分割される。
【００３６】
領域Ａ、領域Ｂまたは領域Ｃは、その塩基配列が検討すべき遺伝子の５’非コーディング領域（５’ＮＣＲ）、コーディング領域（ＣＲ）または３’非コーディング領域（３’ＮＣＲ）の塩基配列と同一である全てのプローブ核酸を含んでいる。
【００３７】
マトリックス結合プローブ核酸を相補１本鎖核酸のハイブリダイゼーションによる二本鎖の形成が可能となる条件下、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡまたはｃＤＮＡであってよい１本鎖試料核酸と接触させる［２６］。ｃＤＮＡを試料核酸として使用する場合は、プローブ核酸の塩基配列は検討すべき遺伝子の暗号鎖(codogenic strand)（センス鎖）のものと同一である。ｍＲＮＡまたはｃＲＮＡを試料核酸として使用する場合は、プローブ核酸の塩基配列は検討すべき遺伝子の非暗号鎖(noncodogenic strand)（アンチセンス鎖）のものと同一である。ハイブリダイゼーションの発生を検出するためには、試料核酸を放射標識するか、または、蛍光団または結合対の要員（ビオチン、ストレプトアビジン）で標識するか［２６］、または、プローブ核酸を蛍光団または結合対の要員(part)（ビオチン、ストレプトアビジン）で標識する［２７、２８］。
【００３８】
検討すべき遺伝子の配列セグメントであって、この遺伝子から転写されたｍＲＮＡ変異体の塩基配列中に存在しないものは、固相結合プローブ核酸とハイブリダイズしない（図１参照）。これらの配列セグメントはイントロン配列、特定のｍＲＮＡ変異体の転写の個々の開始部の上流に位置する検討すべき遺伝子の５’ＮＣＲの配列セグメント（プローブ領域Ａ）、および、特定のｍＲＮＡ変異体の３’末端より下流に位置する検討すべき遺伝子の３’ＮＣＲ（プローブ領域Ｃ）内の配列セグメントを包含する。検討すべき遺伝子から転写された全てのｍＲＮＡ変異体のコーディング領域は、その塩基配列が検討すべき遺伝子のコーディング領域（プローブ領域Ｂ）のものと同一であるプローブ核酸にハイブリダイズする。
【００３９】
プローブ領域Ｂにおいて検出可能なハイブリダイゼーションシグナルのシグナル強度（ＩB(CR)）は検討すべき遺伝子から転写された個々のｍＲＮＡ変異体の検出可能なハイブリダイゼーションシグナルのシグナル強度の合計（Σ（I(RNA1), I(RNA2), ・・・, I(RNAn)）と等しい。
【数１】
2005510247.tif 000003
【００４０】
プローブ領域Ｂにおいて検出可能なハイブリダイゼーションシグナルと同様のシグナル強度（ＩB(CR)）を示すプローブ領域Ａまたはプローブ領域Ｃにおいて検出可能なハイブリダイゼーションシグナル（ＩA(5'-NTR)またはＩC(3'-NTR)）は検討すべき遺伝子から転写される全てのｍＲＮＡ変異体中に存在するコーディング領域の外部の配列モチーフに相当する。
【００４１】
コーディング領域から上流（５’方向）の最も遠い距離にある転写開始部は、試料核酸とのハイブリダイゼーションの後の検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを示すプローブ領域Ａ内の第１のプローブ核酸により示される（1ＩA(1)）。僅か１個のみのｍＲＮＡ変異体がこの転写開始部から転写される場合は、下記式：
【数２】
2005510247.tif 000004
が成立し、その際、プローブ領域Ａ内の全てのプローブ核酸は、プローブ領域Ｂ内のハイブリダイゼーションシグナルのシグナル強度と同一の強度のハイブリダイゼーションシグナルを示す。下記式が成立する。
【数３】
2005510247.tif 000005
【００４２】
プローブ領域Ａ、ＢまたはＣ内のハイブリダイゼーションシグナルの強度の変化を補償するため、および、測定の誤差（標準偏差、平均の偏差）を推定可能とするために、測定されたシグナル強度の平均または中央値を以下の通り計算する。
【数４】
2005510247.tif 000006
【００４３】
別のｍＲＮＡ変異体を第１の転写開始部の下流に位置する開始点から転写する場合、プローブ領域Ａの第１の転写開始部から転写されたｍＲＮＡ変異体１のハイブリダイゼーションシグナルの強度はプローブ領域Ｂ内のハイブリダイゼーションシグナルのシグナル強度より低値となる。下記式が成立する。
【数５】
2005510247.tif 000007
【００４４】
第１の転写開始部（転写開始部１）の下流に位置する次（転写開始部２）の転写開始部の位置は、転写開始部１から転写されたｍＲＮＡ変異体（ＲＮＡ１）と特異的にハイブリダイゼーションするプローブよりも、試料核酸とのハイブリダイゼーションの後において、より高い強度のハイブリダイゼーションシグナルを示すプローブ領域Ａにおける第１のプローブ核酸により示される（2ＩA(1)）。２つのｍＲＮＡ変異体が異なる転写開始部から検討すべき遺伝子により転写される場合、即ち、異なる長さの５’ＵＴＲである場合、下記式：
【数６】
2005510247.tif 000008
が成立し、
その際、ＲＮＡ２と特異的にハイブリダイズするプローブ領域Ａ内の全てのプローブ核酸は、プローブ領域Ｂ内のハイブリダイゼーションシグナルのシグナル強度と同一の強度のハイブリダイゼーションシグナルを示す。下記式が成立する。
【数７】
2005510247.tif 000009
【００４５】
プローブ領域Ｂにおいて検出可能なハイブリダイゼーションシグナルのシグナル強度（ＩB(CR)）は検討すべき遺伝子から転写された個々のｍＲＮＡ変異体の検出可能なハイブリダイゼーションシグナルのシグナル強度の合計（Σ（I(RNA1), I(RNA2), ・・・, I(RNAn)）と等しいため、下記式が成立する。
【数８】
2005510247.tif 000010
【００４６】
プローブ領域ＡおよびＢにおけるハイブリダイゼーションシグナルに基づき、以下の結果が得られる。
【数９】
2005510247.tif 000011
【００４７】
ｍＲＮＡ変異体が第１の転写開始部から下流に位置するｎ−１開始点より検討すべき遺伝子から転写される場合、プローブ領域Ａ内のコーディング領域の第１の開始コドンの前の最後のものを除き、全ての開始点から転写されるｍＲＮＡ変異体のハイブリダイゼーションシグナルの強度はプローブ領域Ｂ内のハイブリダイゼーションシグナルのシグナル強度より低値である（上記参照）。下記式が成立する。
【数１０】
2005510247.tif 000012
【００４８】
検討すべき遺伝子から転写された種々のｍＲＮＡ変異体の総量中の各ｍＲＮＡ変異体の比率は、ハイブリダイゼーション強度に基づいて求めることができる。
【００４９】
プレｍＲＮＡのオルタナティブスプライシングを介して生じる２種のｍＲＮＡ変異体が１つの転写開始点より検討すべき遺伝子から転写される場合、２種のｍＲＮＡの転写開始部は試料核酸のハイブリダイゼーション後の検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを示すプローブ領域Ａにおける第１のプローブ核酸により示される（1ＩA(1)）。ハイブリダイゼーションシグナルの強度は２種のｍＲＮＡ変異体（スプライシングされたもの：ｍＲＮＡｓ、および未スプライシングのもの：ｍＲＮＡ）の強度の合計に相当し、かつ、プローブ領域Ｂにおけるハイブリダイゼーションシグナルの強度に等しい。
【数１１】
2005510247.tif 000013
【００５０】
スプライシング部位の領域においては、ハイブリダイゼーションシグナルの強度（1SＩA(1)）は、下記式：
【数１２】
2005510247.tif 000014
より低値である。
【００５１】
プローブ領域ＡおよびＣ内のプローブ核酸による検討すべき全ゲノム配列を提示／リモデリングすることが必要であるか、または、転写開始部およびスプライシング部位をフランキングする配列領域のみでよいかどうかは、成分１の使用の範囲に依存している。検討すべき１種以上の遺伝子から転写された既知のｍＲＮＡ変異体の発現を測定しなければならない場合、個々のｍＲＮＡ変異体の同定および定量のために必要なプローブ核酸の数のみをプローブ領域ＡまたはＣ内に固定化する必要がある。成分１を用いて新しいｍＲＮＡ変異体を同定するか、または、ｍＲＮＡの二次構造を解明することを意図している場合、プローブ領域ＡおよびＣは検討すべき全ゲノム配列を示すことが必要である。ＤＮＡアレイはまた、ハウスキーピング遺伝子の多くのｍＲＮＡと、そして、プラスミド、細菌または植物のＲＮＡの種々のものとも特異的にハイブリダイズするプローブ核酸を含む別の領域を含んでいてよい。このプローブ領域は第１に、プローブ領域Ａ、ＢおよびＣ内のハイブリダイゼーションシグナルを標準化するため、そして、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを確認するために機能する。
【００５２】
ＤＮＡアレイのハイブリダイゼーション
別の実施形態において、標識されたｃＤＮＡをスターターオリゴヌクレオチドとしてオリゴ−ｄＴまたはｐ（ｄＮ）6を用いて逆転写により全ＲＮＡまたはｐｏｌｙＡ+ｍＲＮＡから合成する。逆転写によるｃＤＮＡの酵素的合成は実験室の操作法における標準的なバイオテクノロジーである［２６］。試料ＲＮＡの逆転写は、検出可能な基、好ましくは蛍光団または結合対の一方にコンジュゲートしたｄＮＴＰの存在下に実施する。別の可能性として、単離されたｍＲＮＡを逆転写により２本鎖ｃＤＮＡに変換し、そして、後者より、検出可能な基にコンジュゲートしたｒＮＴＰの存在下のインビトロの転写により標識ｃＲＮＡを合成することもできる［２６，５３］。
【００５３】
別の好ましい実施形態においては、ＤＮＡアレイに固定化されたプローブを標識する。この標識は１種以上の蛍光団または結合対の要員であってよい。未標識の全ＲＮＡ、ｐｏｌｙＡ+ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡまたはｃＤＮＡとのアレイのハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄工程の後、未ハイブリダイズ（１本鎖）のプローブ核酸をアレイから酵素的に除去し、アレイに残存するプローブ核酸の量を測定する［２８］。
【００５４】
試料およびプローブ核酸の蛍光標識のためには、多くの蛍光団を用いることができ、例えばフルオレセイン、リサミン、フィコエリスリン、ローダミン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）等が挙げられる［５３］。上記した蛍光団のほかに、上記しなかった別の蛍光団を標識のために用いることも可能である。これらには核酸に共有結合でき、その励起および発光の最大値がスペクトルの赤外領域、可視光領域、またはＵＶ領域にあるような全ての蛍光団が包含される。試料またはプローブ核酸がビオチンまたはジゴキシゲニンのような結合対の要員で標識される場合、ハイブリダイゼーションの後、検出可能な標識にコンジュゲートされた結合対の第２要員（ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニン）をハイブリッドとともにインキュベートする。結合対の第２要因の検出可能な標識は蛍光団または発光（ケミルミネッセンスまたはケミフルオレセンス）を伴いながら基質を変換する酵素（特に、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）であってよい［５４，５５］。
【００５５】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、試料核酸が固体マトリックスに固定化された特定のプローブ核酸に特異的に結合するか、または、このプローブ核酸に特異的にハイブリダイズできるように調節する。このことは、試料核酸が試料核酸に相補的な配列を有する固定化されたプローブ核酸に対してはこれと結合するか、ハイブリダイズするか、または、二本鎖を形成するが、非相補の塩基配列を有する固定化プローブ核酸に対してはそうではないことを意味する。ポリヌクレオチド配列は、この点に関して、どちらかより短いほう（プローブ核酸）が最大２５Ｎ長であるような２種のポリヌクレオチドのハイブリッドがより短いポリヌクレオチドの全長にわたり塩基対形成の標準的な規則に従って塩基ミスマッチを示さない場合に、もう一方に対して相補的であると表現される。更にまた、２種のポリヌクレオチドのうちのより短いほうが２５Ｎより長いような２種のポリヌクレオチドのハイブリッドは塩基対形成の標準的規則にしたがって５％より多いミスマッチを含んではならない。ポリヌクレオチドは相互に完全に相補的であり、ハイブリッドがミスマッチを含まないことが好ましい。至適ハイブリダイゼーション条件は第１に固体マトリックス上に固定化されたプローブの長さおよび種類（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）により、そして、使用する試料核酸の種類（ＤＮＡまたはＲＮＡ）による。一般的には、特定の（即ちストリンジェントな）ハイブリダイゼーションのために有効なパラメーターは核酸をハイブリダイズするための慣用的なハンドブックおよびプロトコルに記載されている［２６，５６］。
【００５６】
シグナル検出
プローブおよび蛍光団で標識された試料核酸を用いて成分１のＤＮＡアレイ上のハイブリダイゼーションの発生を検出する場合、蛍光発光は好ましくは共焦点レーザー走査顕微鏡により各試料点（スポット）において測定することができる。ケモルミネセンスまたはケモフルオレセンスによる核酸中のハイブリダイゼーションの発生の検出は、同様に共焦点レーザー走査顕微鏡の原理に従って機能する装置を用いて適当なフィルターおよび検出器により行うことができる。バイオチップ上のシグナル検出のための装置は多くの製造元により開発され販売されている［５７］。
【００５７】
成分２（データベースおよび分析）
システムの成分２は好ましくはデータベースモジュールおよび分析モジュールよりなる。データベースはその発現が翻訳レベルで調節される遺伝子から転写される全てのｍＲＮＡ変異体の翻訳効率に関するデータを含む。データベースモジュール内で組織化されているデータは、例えば、１種以上の遺伝子から転写される種々のｍＲＮＡ変異体の翻訳効率に対する、５’ＵＴＲの影響、コーディング領域および３’ＵＴＲの影響、および、細胞型、組織または生物の影響を記述するものである。別のデータレコードは検討すべきｍＲＮＡ変異体の翻訳効率に対する外的影響の作用を記述することができる。これらの外的影響には、特に、酸素分圧、栄養補給、温度、大気圧、および、サイトカイン、ホルモン、細胞分裂抑制剤または他の薬剤の作用が包含される。翻訳制御発現により遺伝子から転写され、種々の細胞型、組織または生物において優先的に翻訳されるｍＲＮＡ変異体もまた成分２のデータベースモジュールの要素である。
【００５８】
データの獲得
翻訳制御発現による遺伝子の同定
同一のコーディング領域を有するがその５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲの長さおよび塩基配列において異なるｍＲＮＡ変異体の複数のものを翻訳制御発現により遺伝子から転写する。１つの遺伝子から転写される種々のｍＲＮＡ変異体および細胞型、組織または生物中で優先的に翻訳されるｍＲＮＡ変異体のそれぞれの量を測定することが可能となるためには、転写開始点、スプライシング変異体、検討すべき遺伝子から転写されたｍＲＮＡ変異体の数、細胞型、組織または生物中で転写されるｍＲＮＡの量、および、個々のｍＲＮＡ変異体の翻訳効率を知ることが必要である。
【００５９】
検討すべき遺伝子の５’非コーディング領域中の細胞型、組織または生物中で利用される転写開始部は、ヌクレアーゼ保護試験、ＰＣＲ法またはＤＮＡアレイ（成分１）によるハイブリダイゼーションを用いて同定し位置決めされる［２６］。スプライシング部位、即ち、検討すべきｍＲＮＡの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの領域内のイントロン−エクソン連結点のマッピングは、ヌクレアーゼ保護試験、ＰＣＲ法またはＤＮＡアレイ（成分１）によるハイブリダイゼーションにより行われる［２６］。検討すべき遺伝子の転写開始部およびスプライシング変異体を検討するためのヌクレアーゼ保護法において使用されるハイブリダイゼーションプローブの塩基配列は検討すべき遺伝子の塩基配列に相当する。全細胞ＲＮＡ［２６，３６］またはｐｏｌｙＡ+ｍＲＮＡ［２６，４３］は検討すべき細胞型、組織または生物から単離され、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡであってよい標識されたプローブとハイブリダイズされる。ハイブリッドの１本鎖領域の消化および得られたフラグメントのゲル電気泳動分画［２６，４４］は標準的なバイオテクノロジーの実験室プロトコルにより行う。ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）による検討すべき遺伝子の５’非コーディング領域または３’非コーディング領域内の転写開始部およびスプライシング領域のマッピングのためには、全細胞ＲＮＡ［２６，３６］またはｐｏｌｙＡ+ｍＲＮＡ［２６，４３］を検討すべき細胞型、組織または生物から単離し、そして、逆転写によりｃＤＮＡに転写される［２６］。ＰＣＲプライマーは、検討すべき遺伝子のコーディング領域および５’非コーディング領域、および、この遺伝子から転写されるｍＲＮＡ変異体のコーディング領域および５’ＵＴＲの５’部分であるフラグメントの特異的増幅をもたらすオリゴデオキシヌクレオチドである。検討すべき遺伝子から転写されたｍＲＮＡ変異体の３’ＵＴＲをマッピングしたい場合は、使用するＰＣＲプライマーは検討すべき遺伝子のコーディング領域および３’非コーディング領域またはこの遺伝子から転写されたｍＲＮＡ変異体の３’部分であるフラグメントの増幅を可能とするものである。５’ＵＴＲの塩基配列が異なるｍＲＮＡ変異体を調べるためには、１種以上の３’プライマー（３’プライマーは増幅すべきＤＮＡフラグメントの３’末端に結合する）を検討すべき遺伝子のコーディング領域の５’領域に入れる。５’プライマー（５’プライマーは増幅すべきＤＮＡフラグメントの５’末端に結合する）の集団は検討すべき遺伝子の第１の転写開始位置を越える位置までコーディング領域の開始部から伸長する。５’プライマーの位置および配列は、３’プライマーとともに、各々の場合において、コーディング領域内の第１のプライマー対から常時各々３０〜６０ｂｐの分だけ伸長する長さを有するフラグメントの増幅がもたらされるように選択する。２０００ｂｐ領域にわたる検討すべき遺伝子の５’領域内に存在する転写開始点およびスプライシング部位をマッピングするために３’プライマーを使用可能とするためには、分解能に応じて３５〜７０種の相当する５’プライマーが必要である。反応はゲノムＤＮＡ、遺伝子の必要な領域を含むプラスミド、および、検討すべき細胞型、組織ま���は生物に由来するｍＲＮＡを用いて行う。転写開始点およびスプライシング部位は、フラグメントの大きさおよび量を比較することにより同定することができる。
【００６０】
検討すべき遺伝子から転写されたｍＲＮＡ変異体の定量的測定
検討すべき遺伝子から転写されたｍＲＮＡ変異体の総量における個々のｍＲＮＡ変異体の比率は定量的ＰＣＲ法（ＴａｑＭａｎ（登録商標）または分子ビーコン［５８，５９］）、マルチプローブヌクレアーゼ保護試験、または、ＤＮＡアレイ（成分１）を用いて測定する［２６］。ＰＣＲプライマーは検討すべき１種以上の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ変異体を同定するために使用されるものに相当する。定量的測定に用いられるものは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブまたは分子ビーコン［５８，５９］であり、これらを用いることにより、種々のｍＲＮＡ変異体がそれぞれの５’ＵＴＲを用いて特異的に検出され、定量される。更に使用されるものとしては、ＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブまたは分子ビーコンであり、これらを用いることにより種々のハウスキーピング遺伝子が特異的に検出される。使用される鋳型は全細胞ＲＮＡ［２６，３６］またはｐｏｌｙＡ+ｍＲＮＡ［２６］からの逆転写により合成されるｃＤＮＡである。マルチプローブヌクレアーゼ保護試験において使用されるｃＤＮＡまたはｃＲＮＡであってよいハイブリダイゼーションプローブは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により良好な相互の識別が容易に行い得るように、異なる長さを有している［２６］。ハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列は検討すべき種々のｍＲＮＡ変異体の５’ＵＴＲのヌクレオチド配列、および、種々のハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡのコーディング配列に相補的である。定量的ＰＣＲおよびマルチプローブヌクレアーゼ保護試験は標準的なバイオテクノロジーの実験室プロトコルにより行われる。好ましくは、検討すべき１種以上の遺伝子から転写されるｍＲＮＡ変異体の転写率は全細胞ＲＮＡ、ｐｏｌｙＡ+ｍＲＮＡまたは標識ｃＤＮＡとシステムの成分１（ＤＮＡアレイ）とのハイブリダイゼーションにより行う（上記参照）。検討すべき１種以上の遺伝子から転写されるｍＲＮＡ変異体の上記方法で確認された転写率を例えばβ−アクチン、ＧＡＰＤＨ、Ｌ３２のような１種以上ハウスキーピング遺伝子の転写率に対して標準化する。翻訳制御された発現により遺伝子から種々の細胞型、組織または生物において転写されるｍＲＮＡ変異体の定量的測定は、好ましくはシステムの成分１のＤＮＡアレイを用いて行う。使用するＤＮＡアレイを検討すべき細胞から単離した全細胞ＲＮＡ、ｐｏｌｙＡ+ｍＲＮＡまたは標識されたｃＤＮＡとハイブリダイズする。ここでは、ＮＣＩ−６０パネル［３５］に存在し、極めて包括的に特性化されている細胞系統を基にする。更に、翻訳制御発現された遺伝子からのｍＲＮＡ変異体の転写は臨床試料および他の樹立された細胞系統において測定される。
【００６１】
細胞型、組織または生物において優先的に翻訳されるｍＲＮＡ変異体の測定
遺伝子１種以上から転写されるｍＲＮＡ変異体の転写率の変化および相当するタンパク質の発現率の変化は、通常は種々の外的影響の関数として計測する。これらの外的影響には、特に、酸素分圧、栄養補給、温度、大気圧の変化、および、サイトカイン、ホルモン、細胞分裂抑制剤または他の薬剤の作用が包含される。外的影響の関数としての転写率または発現率の変化は、理想的な生育条件下に生育された細胞、組織または生物における検討すべき１種以上の遺伝子の転写率または発現率を、上記した外的影響の１種以上に曝露された細胞におけるものと比較することにより測定する。全細胞ＲＮＡまたはｐｏｌｙＡ+ｍＲＮＡは検討すべき細胞型、組織または生物から単離する。検討すべき１種以上のものに由来するｍＲＮＡ変異体の転写率は定量的ＲＴ−ＰＣＲ、マルチプローブヌクレアーゼ保護試験によるか、または好ましくは上記したＤＮＡアレイ（成分１）を用いることにより測定する（上記参照）。相当する遺伝子の発現率は、ウエスタンブロット、免疫沈降またはＥＬＩＳＡのような免疫学的方法により相当するタンパク質の濃度の測定により行う［６５，６６および６７］。翻訳の制御は初期の段階で主に生じると一般的には考えられているため［２９，３４］、細胞型、組織または生物中で検出可能なタンパク質の量は、相当するｍＲＮＡ変異体の量に直接比例する。外的影響の関数としての転写率が相当するタンパク質の発現率と合致するｍＲＮＡ変異体は、特定の細胞型、組織または生物において優先的に翻訳されるｍＲＮＡである。検討すべき遺伝子から転写されるｍＲＮＡ変異体のどれが優先的に翻訳されるかは、ｍＲＮＡ変異体の５’ＵＴＲの配列のほかに、翻訳の開始に影響する細胞、組織または生物に特異的に発現される因子に依存している。翻訳制御発現により遺伝子から種々の細胞型、組織または生物において転写されるｍＲＮＡ変異体の定量的測定は、好ましくはシステムの成分１のＤＮＡアレイを用いて行う。ＤＮＡアレイを検討すべき細胞から単離した全細胞ＲＮＡ、ｐｏｌｙＡ+ｍＲＮＡまたは標識ｃＤＮＡとハイブリダイズさせる。ｍＲＮＡ変異体から翻訳されたタンパク質の量は標準的な免疫化学的方法により測定する。ここでは、ＮＣＩ−６０パネル［３５］に存在し、極めて包括的に特性化されている細胞系統を基にする。更に、翻訳制御発現された遺伝子からのｍＲＮＡ変異体の転写は臨床試料および他の樹立された細胞系統において測定される。
【００６２】
検討すべき遺伝子から転写された種々のｍＲＮＡ変異体の翻訳効率の測定
タンパク質合成の律速段階は開始期である。リボソームサブユニットの開始因子およびオープンリーディングフレームの第１の開始コドンへの全リボソームの移行の複合化は、本質的には、検討すべきｍＲＮＡの５’ＵＴＲの長さおよび構造に応じて、即ち最終分析においては塩基配列に依存する。検討すべき１種以上の遺伝子から転写された種々のｍＲＮＡ変異体の翻訳効率はレポーター遺伝子試験により調べられる。検討すべき１種以上の遺伝子から転写された種々のｍＲＮＡの５’ＵＴＲを、全ＲＮＡまたはｐｏｌｙＡ+ｍＲＮＡから逆転写ＰＣＲ［２６］を用いることにより、または、ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲを用いることにより増幅し、単離する。ＰＣＲプライマーは３’プライマーの５’ヌクレオチドがコーディング領域の開始コドン前の５’ＵＴＲの最後のヌクレオチドに相当するように選択する。相当す５’プライマーは検討すべきｍＲＮＡ変異体の転写開始部に可能な限り近傍に位置する。制限エンドヌクレアーゼの認識配列をＰＣＲプライマーの５’領域に組み込むことにより、適当なレポーター遺伝子ベクター（特にｐＧＬ３ｂａｓｉｃ；Ｐｒｏｍｅｇａ）内へのフラグメントのライゲーションを促進することができる［２６］。検討すべきｍＲＮＡ変異体の翻訳効率に対するコーディング領域の影響の測定を特に可能とするような種々のシステムを使用する。
【００６３】
ウサギ網状赤血球溶解物における翻訳効率の測定：検討すべき種々の５’ＵＴＲをＰＣＲにより増幅し、そして、Ｔ７プロモーターの３’末端とｐｈｏｔｉｎａｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードする遺伝子の５’末端の間においてプラスミドベクター（ｐＧＬ−３／Ｔ７）内にライゲーションする［６８，６９］。適当なＥ．ｃｏｌｉ宿主菌株中のプラスミドベクターのトランスフェクションおよび複製のため、および、宿主生物からのプラスミドＤＮＡの単離のための標準的なバイオテクノロジーの実験室プロトコルがある［２６］。プラスミドベクターを適当な制限エンドヌクレアーゼを用いてルシフェラーゼ遺伝子の３’末端において切り開ける。線状化されたプラスミドＤＮＡをファージコードＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）により触媒されたインビトロの転写反応において鋳型として用いる［２６］。５’キャップ構造を有するｍＲＮＡはインビトロの転写反応にキャップ類縁体［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ］を添加することにより合成することができる。ｐｈｏｔｉｎａｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ酵素は、インビトロの翻訳系（ウサギ網状赤血球溶解物）を用いてインビトロ合成されたｐｈｏｔｉｎａｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼｍＲＮＡ変異体から合成する。検討すべき５’ＵＴＲを有する種々のｐｈｏｔｉｎａｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼｍＲＮＡの等モル量をインビトロ翻訳において使用する。種々の混合物中のルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定する［２６，７０］。全測定について用いるベースライン値（１００％）は、５’ＵＴＲが排他的にＫｏｚａｋコンセンサス配列を含むｐｈｏｔｉｎａｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼｍＲＮＡが翻訳されているインビトロの翻訳混合物のルシフェラーゼ活性とする［７，８］。インビトロのｍＲＮＡの翻訳に対する検討すべき種々の５’ＵＴＲの影響をこれらの測定により調べる。実験パラメーターを変化させることにより、検討すべきｍＲＮＡが５’キャップ構造とは無関係に翻訳され得るかどうか、即ち、このｍＲＮＡの５’ＵＴＲがＩＲＥＳエレメントを含むかどうかを確認することができる。５’キャップ構造に対する翻訳効率の依存性を検討するために、特定の５’ＵＴＲおよび５’キャップ構造を有するｍＲＮＡの翻訳効率を同じ５’ＵＴＲを有するが５’キャップ構造は有さないｍＲＮＡの翻訳効率と比較する。検討すべきｍＲＮＡの５’領域における可能なＩＲＥＳエレメントを同定するために、安定なヘアピンループを形成できるＤＮＡフラグメントを、Ｔ７プロモーターの３’末端と検討すべき５’ＵＴＲの５’末端との間において、上記したレポーター遺伝子ベクター内にライゲーションする。このプラスミドＤＮＡをインビトロの転写反応における鋳型として用いる場合、合成されたｍＲＮＡは５’末端に安定なヘアピン構造を有する。この構造は、リボソームスキャニングモデルに従って翻訳の開始を極めて効率的に妨害する［１］。特定の５ＵＴＲおよび５’ヘアピン構造を有するｍＲＮＡの翻訳効率の、この５’ＵＴＲは有するが５’ヘアピン構造は有さないｍＲＮＡの翻訳効率に対する比を設定する。この比が１より大きい場合、このｍＲＮＡの翻訳は内部リボソーム進入により開始することができる。インビトロ翻訳による特定のｍＲＮＡの翻訳効率の確認、および、その後のレポーター遺伝子の測定により、検討すべき１種以上のｍＲＮＡ変異体の翻訳効率に関する基本的データが得られる。この測定システムにおいては、検討すべきｍＲＮＡの翻訳効率に対する種々の細胞型、組織または生物の特定の影響は考慮されていない。
【００６４】
インビボの翻訳効率の測定：細胞型、組織または生物の関数としての検討すべき１種以上のｍＲＮＡの翻訳効率に対する細胞因子の影響を検討するために、マーカー遺伝子の５’末端に検討すべきｍＲＮＡ変異体の５’ＵＴＲを含む真核生物の発現ベクターを培養された細胞、組織試料または生物内にトランスフェクトする。種々の細胞型、組織または生物の関数として種々の５’ＵＴＲを有するレポーター遺伝子ｍＲＮＡの翻訳効率を検討したい場合は、レポーター遺伝子のコンストラクトを以下の通り設計する。検討すべきｍＲＮＡの５’ＵＴＲをウィルスプロモーター（ＣＭＶ、ＲＳＶまたはＳＶ４０プロモーター）の３’末端とレポーター遺伝子（ｐｈｏｔｉｎａｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ、ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰまたはその他）のコーディング領域の５’末端との間にライゲーションする。この発現コンストラクトを培養された細胞、組織試料または生物中で発現させる。翻訳効率における変動を補償するために、別のレポーター遺伝子コンストラクトを同時トランスフェクトする。二重ルシフェラーゼシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）がこれに適する理由は、実際の測定（ｐｈｏｔｉｎａｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ）および対照コンストラクトの発現（ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ）の両方ともが１つの混合物中のこのシステムで実施できるからである［７１，７２］。種々の混合物中のルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定する（ルシフェラーゼアッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ，２６］。全測定について用いるベースライン値（１００％）は、５’ＵＴＲが排他的にＫｏｚａｋコンセンサス配列を含むｐｈｏｔｉｎａｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼｍＲＮＡをコードするレポーター遺伝子ベクターでトランスフェクトされた細胞、組織または生物の溶解物を含有する混合物中のルシフェラーゼ活性とする［７，８］。検討すべきｍＲＮＡの翻訳に対する特定の細胞型、組織または生物内で発現される細胞因子の影響は、インビトロおよびインビボにおける検討すべき１種以上のｍＲＮＡの翻訳効率を比較することにより調べられる。種々のｍＲＮＡのＣＡＰ依存性およびＣＡＰ非依存性の翻訳に影響する因子には、翻訳開始因子［６０，６１］、腫瘍抑制因子、例えばｐ５３［６２，６３］および多くのその他のタンパク質［６４，６５］が包含される。
【００６５】
検討すべきｍＲＮＡの翻訳効率に対する５’ＵＴＲおよびコーディング領域の複合影響はレポータータンパク質の酵素活性を用いて発現率を測定するレポーター遺伝子試験によっては測定することができない。アミノ末端の半分が検討すべきタンパク質よりなり、カルボキシ末端の半分がレポータータンパク質よりなる融合タンパク質の折り込みは２種の未融合のタンパク質のものとは異なる場合が多い。従って融合タンパク質におけるレポータータンパク質部分の酵素活性はレポータータンパク質の融合相手であるタンパク質に依存している。この問題を回避するために、検討すべきタンパク質を短いマーカーペプチドにカルボキシ末端で融合する。このマーカーペプチドは取り分けＣＢＰタグ（カルモジュリン結合ペプチド；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＦＬＡＧタグ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＨｉｓタグ（５−７連続ヒスチジン残基）である［７３，７４］。検討すべき、遺伝子１種以上から転写されたｍＲＮＡ変異体をＲＴ−ＰＣＲ［２６］により増幅し、単離する。使用する５’プライマーの５’末端は種々の５’ＵＴＲの５’末端に相当し、そして、使用する３’プライマーは３’末端に、即ち、検討すべきｍＲＮＡのコーディング領域中の最後のコドンに相当する（停止コドンは省略される）。ＰＣＲ産物をウィルスプロモーター（ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０その他）の３’末端とマーカーペプチドをコードする配列の５’末端の間で発現プラスミド内にライゲーションすることにより、検討すべきｍＲＮＡのコーディング領域がマーカーペプチドをコードする配列に融合されるようにする。上記した融合タンパク質を発現するためのプラスミドベクターは市販されている（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。プラスミドによるＥ．ｃｏｌｉ宿主菌株のトランスフェクト、プラスミドの複製およびプラスミドＤＮＡの単離は標準的なバイオテクノロジーの実験室プロトコルに従って行う［２６］。検討すべき種々の細胞型、組織または生物を、１種以上の遺伝子から転写された種々のｍＲＮＡ変異体の５’ＵＴＲおよびコーディング領域のｃＤＮＡ配列を含む上記した発現コンストラクトでトランスフェクトする。トランスフェクション効率を測定するためには、ｐｈｏｔｉｎａｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼまたはｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼを発現するレポーター遺伝子プラスミドを同時トランスフェクトする。発現プラスミドにより発現される種々のｍＲＮＡ変異体の翻訳効率はウエスタンブロッティングまたはスロットブロッティング法により測定する［６５，６６］。
【００６６】
融合タンパク質はマーカーペプチドに特異的に結合する抗体またはタンパク質を用いることにより検出する。タンパク質の定量的検出は標準的なバイオテクノロジーの実験室プロトコルにより行う。全測定について用いるベースライン値（１００％）は、５’ＵＴＲが排他的にＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む検討すべきｍＲＮＡ変異体のｃＤＮＡ配列を収容している発現コンストラクトでトランスフェクトされている細胞、組織または生物の溶解物を含む混合物中の融合タンパク質の検出可能な量である［７，８］。検討すべきｍＲＮＡの翻訳に対する５’ＵＴＲおよび細胞因子の影響のほかに、検討すべきｍＲＮＡ変異体の翻訳に対するコーディング領域の配列の影響は、１種以上の遺伝子から転写された検討すべきｍＲＮＡ変異体の５’ＵＴＲを有するレポーター遺伝子ｍＲＮＡの翻訳効率を、完全ｍＲＮＡ変異体の翻訳効率と比較することにより調べる。上記したものと同じ発現コンストラクトを用いて種々の外的影響下に検討すべきｍＲＮＡ変異体の翻訳効率を調べる。検討すべきｍＲＮＡ変異体の翻訳効率の検出はレポーター遺伝子の酵素活性を測定するか、または、マーカーペプチドに融合したタンパク質の免疫化学的検出により行う（上記参照）。発現プラスミドでトランスフェクトされた細胞を、特に、酸素分圧、栄養補給、温度、大気圧の変化、および、サイトカイン、ホルモン、細胞分裂抑制剤または他の薬剤の作用を含む種々の外的影響に曝露する。本明細書に記載した測定はＮＣＩ−６０パネル［３５］に存在し、極めて包括的に特性化されている細胞系統において行う。更に、検討すべきｍＲＮＡ変異体の翻訳効率は臨床試料および他の樹立された細胞系統において測定される。
【００６７】
成長、アポトーシスまたは増殖のような細胞機能に対する外的影響の作用の測定
検討すべき細胞、組織または生物に対する外的影響の作用は特にアポトーシス速度、増殖速度および細胞の成長を含む多くのパラメーターに基づいて調べる。本明細書に記載する外的影響とは特に、酸素分圧、栄養補給、温度、大気圧の変化、および、サイトカイン、ホルモン、細胞分裂抑制剤または他の薬剤の作用を包含する。検討すべき細胞、組織または生物を培養物中に維持し、２４〜４８時間１種以上の所定の外的影響に曝露する。検討すべき外的影響の種々の用量水準の作用を調べるために、投与細胞において特に細胞の成長、アポトーシス速度および／または増殖速度を測定する。培養細胞における成長速度、増殖速度および／またはアポトーシス速度の測定は標準的なバイオテクノロジーまたは細胞生物学の実験室プロトコルにより行う［７５，７６，７７，７８および７９］。例えば細胞の成長を５０％抑制する外的影響の量（ＧＩ50→成長抑制（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ））［３５］は細胞型、組織または生物１種以上に対する外的影響１種以上の種々の用量水準で、成長速度、アポトーシス速度または増殖速度を外挿することにより確認する。アポトーシス速度または増殖に基づき、検討細胞の５０％でアポトーシスを誘発（ＡＩ50→アポトーシス誘導（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ））する、または、増殖を５０％抑制（ＰＩ50→増殖抑制（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ））する外的影響の用量を確認する。
【００６８】
臨床データの組み込み
システムを新生物疾患の診断のために使用する場合、成分２のデータベースモジュールは、薬剤を使用する治療の種類、薬剤の用量、治療に用いられる薬剤の忍容性または作用、初回の疾患と再発または転移までの時間、および、検討すべき腫瘍のシステムの成分１により与えられる発現特徴１種以上に関するデータを含んでよい。神経変性障害、自己免疫疾患、心臓血管障害、ウィルス性疾患または薬剤耐性のような病理学的状態を分析したい場合は、成分２のデータベースモジュールは好ましくは、薬剤を使用する治療の種類、薬剤の用量、治療に用いられる薬剤の忍容性または作用、および診断上関連する組織試料のシステムの成分１により与えられる発現特徴１種以上に関するデータを含む。
【００６９】
分析および解釈
成分１（ＤＮＡアレイ）により与えられた発現データの分析および解釈は成分２に存在するデータベースおよび分析モジュールを用いて２つのレベルで行う。解釈の第１レベルにおいては、翻訳効率を、成分１を用いて同定定量された各ｍＲＮＡ変異体に割り付ける。解釈の第２レベルでは、成分１を用いて得られた完全な発現特徴を成分２のデータベース中に存在する他の発現特徴と比較し、特定の発現型に割り付ける。この特定の発現型への割付により、細胞因子の関数としての解釈のレベル１において同定定量された全ｍＲＮＡ変異体の翻訳効率を決定でき、そして、検討される細胞型、組織または生物において優先的に翻訳されるｍＲＮＡを同定できるようになる。
【００７０】
タンパク質濃度の予測
検討すべき細胞型、組織または生物に存在する１種以上のタンパク質の量を予測するために必要な測定項目は、特定の１種以上のタンパク質をコードするｍＲＮＡ変異体の全転写率、および、これらのタンパク質をコードする個々のｍＲＮＡ変異体の転写率を包含し、システムの成分１（ＤＮＡアレイ）を用いて測定される。特定の１種以上のｍＲＮＡの転写率は、検討すべきｍＲＮＡに特異的なハイブリダイゼーションシグナルの強度に基づいて成分１（ＤＮＡアレイ）において測定される。成分１の相当するプローブ核酸を用いて検討すべきｍＲＮＡ変異体のハイブリダイゼーションシグナルを標準化するためには、全ての細胞型、組織または生物において転写されるｍＲＮＡ（ハウスキーピング遺伝子と称される）からのハイブリダイゼーションシグナルの強度を測定する。ハイブリダイゼーションシグナルの標準化のために用いられるハウスキーピング遺伝子の発現は翻訳のレベルでは確認することができない。同じおよび／または他の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ変異体と比較したこのｍＲＮＡ変異体の翻訳効率、細胞因子に対する翻訳効率の依存性、および、特定の細胞型、組織型または生物において優先的に翻訳されるｍＲＮＡ変異体を含むデータレコードを成分１（ＤＮＡアレイ）の各プローブ核酸および特定のｍＲＮＡ変異体を示すプローブ核酸の各群に割り付ける。成分２のデータベースモジュールに存在する発現特徴と組織試料によりもたらされた発現特徴を比較することにより、特定の細胞または組織型に検討試料を割り付けることができるようになり、かつ、検討される細胞型または組織の翻訳状態を評価できるようになる。検討すべき１種以上のｍＲＮＡ変異体の細胞型特異的または組織特異的な翻訳効率（Ｐ(RNA-Var.1x)）と検討すべきｍＲＮＡ変異体の成分１を用いて測定された転写率（Ｔ(RNA-Var.1x)）との積がｍＲＮＡ変異体に相当するタンパク質の検討組織中に存在する量に相当する値（ＣProt.x）を与える。したがって、下記式が成立する。
【数１３】
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【００７１】
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【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は検討すべき遺伝子から転写された種々のｍＲＮＡ変異体のプローブ、固相結合プローブ（アレイ）およびハイブリダイゼーションデータの分析を示す概略図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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