(57)【要約】本発明は、ハイブリッドシャペロンなどのタンパク質シャペロン、及びこうしたタンパク質シャペロンをタンパク質に加えることなどによってタンパク質及びタンパク質活性を安定させる方法に関する。また、本発明は、タンパク質に結合した前記タンパク質シャペロンを含む、安定化されたタンパク質処方物を提供する。本発明はさらに、ハイブリッドタンパク質シャペロンを形成することによる従来のシャペロン活性の増強方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質及び／またはタンパク質活性を安定させるためのハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項２】
前記ハイブリッドが異なる起源を有する２以上の部分からなる巨大分子である請求項１に記載のハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項３】
前記部分がタンパク質領域またはタンパク質シャペロン若しくはその機能的ホモログの構造領域をコードする核酸配列である請求項１に記載のハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項４】
構造ドメインが、タンパク質シャペロン若しくはその機能的ホモログの中央ドメイン、Ｎ−またはＣ末端領域である請求項３に記載のハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項５】
タンパク質シャペロンが熱ショックタンパク質である先行するいずれかの請求項に記載のハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項６】
熱ショックタンパク質がＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ６０からなる群から選択される請求項５に記載のハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項７】
熱ショックタンパク質が小さな熱ショックタンパク質（ｓＨＳＰ）である請求項１〜６のいずれかに記載のハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項８】
ｓＨＳＰが、αＡ−クリスタリン、αβ−クリスタリン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ２０、ＭＫＢＰ、ＨＳＰＢ３、ＨＳＰＢ４、ＨＳＰＢ５、ｃｖＨＳＰ、ＨＳＰＢ８及びＨＳＰＢ９からなる群から選択される請求項７に記載のハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項９】
前記部分がｓＨＳＰのサブドメインまたはｓＨＳＰの残基を含む請求項７または８に記載のハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項１０】
前記残基がアルギニン１２０である請求項９に記載のハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項１１】
前記サブドメインがＣ末端領域である請求項９に記載のハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項１２】
シャペロンの一部が他の起源のシャペロンに由来する同様の部分で置き換えられている先行するいずれかの請求項に記載のハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項１３】
αβ−クリスタリンのＣ末端部分がＨＳＰ２７のＣ末端部分で置き換えられたもの（αＢ−ＨＳＰ２７）である先行するいずれかの請求項に記載のハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項１４】
αＢ−ＨＳＰ２７がαβ−クリスタリンのＮ末端部分及び中央部分とＨＳＰ２７のＣ末端尾部を含む請求項１３に記載のハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項１５】
先行するいずれかの請求項に記載のハイブリッドタンパク質シャペロンと結合した少なくとも１種類のタンパク質を含む安定化されたタンパク質処方物。
【請求項１６】
前記処方物中におけるタンパク質対ハイブリッドタンパク質シャペロンの比が２５：１〜１：１００である請求項１５に記載の安定化されたタンパク質処方物。
【請求項１７】
前記処方物中におけるタンパク質対ハイブリッドタンパク質シャペロンの比が１：0.0625〜１：４０である請求項１５に記載の安定化されたタンパク質処方物。
【請求項１８】
水溶液に請求項１〜１４のいずれかに記載のハイブリッドタンパク質シャペロンを加えることを含む、水溶液中におけるタンパク質の安定化または水溶液中におけるタンパク質安定性の固定化方法。
【請求項１９】
安定化されるべきタンパク質が、酵素、治療用タンパク質、診断用タンパク質、抗体、抗体断片または抗体複合体である先行するいずれかの請求項に記載の方法またはハイブリッドタンパク質シャペロン。
【請求項２０】
タンパク質がホモシステイン・デスルフラーゼである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗体複合体が酵素レポーターに共有結合している請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
酵素レポーターが、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）またはルシフェラーゼである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
安定化が、折りたたみが開かれる過程の防止または停止及びタンパク質活性／機能の保持である請求項１８〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質活性／機能の保持が、タンパク質が正しく折りたたまれるのを支援しタンパク質を折りたたまれた立体構造に維持することにより達成される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ハイブリッドタンパク質シャペロンが、αＢ−ＨＳＰ２７であり、タンパク質がルシフェラーゼである請求項１８〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ハイブリッドタンパク質シャペロンが、αＢ−ＨＳＰ２７であり、タンパク質がインシュリン、ＨＲＰ複合体またはルシフェラーゼである請求項１８〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜１４のいずれかに記載のハイブリッドタンパク質シャペロンを使用するタンパク質凝集の防止方法。
【請求項２８】
請求項１〜１４のいずれかに記載のハイブリッドタンパク質シャペロンを使用する細胞死阻害剤またはゲノムの安定化経路。
【請求項２９】
請求項１〜１４のいずれかに記載のハイブリッドタンパク質シャペロンを使用する折りたたみが開かれる過程にあるタンパク質の識別方法。
【請求項３０】
請求項１〜１４のいずれかに記載のハイブリッドタンパク質シャペロンを使用する、タンパク質立体構造の変化が関与する疾病の治療方法。
【請求項３１】
請求項１〜１４のいずれかに記載のハイブリッドタンパク質シャペロンを使用する、タンパク質立体構造の変化が関与する疾病の治療剤の製造方法。
【請求項３２】
疾病が、心筋症、白内障または神経変性疾病である請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＨＳＰ１７．５、α−クリスタリン、ＨＳＰ２７、αＢ−クリスタリン、αＡ−クリスタリンまたはＨＳＰ２５を使用するインシュリンの安定化方法。
【請求項３４】
水溶液にＨＳＰ１７．５、α−クリスタリン、ＨＳＰ２７、αＢ−クリスタリン、αＡ−クリスタリンまたはＨＳＰ２５を添加することを含む水溶液中におけるインシュリンの安定化方法。
【請求項３５】
ＨＳＰ１７．５を使用する３７℃でインシュリンを安定させる請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＨＳＰ２７またはクリスタリンを使用する４４℃でインシュリンを安定させる請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３７】
αＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン、α−クリスタリン、ＨＳＰ２５またはＨＳＰ２７を使用するクエン酸合成酵素の安定化方法。
【請求項３８】
水溶液にαＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン、α−クリスタリン、ＨＳＰ２５またはＨＳＰ２７を添加することを含む水溶液中におけるクエン酸合成酵素の安定化方法。
【請求項３９】
α−クリスタリンを使用する５０℃でクエン酸合成酵素を安定化させる請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＨＳＰ１７．５、ＨＳＰ２７またはα−クリスタリンを使用するルシフェラーゼの安定化方法。
【請求項４１】
水溶液にＨＳＰ１７．５、ＨＳＰ２７またはα−クリスタリンを添加することを含む水溶液中におけるルシフェラーゼの安定化方法。
【請求項４２】
αＢ−クリスタリンまたはＨＳＰ１７．５を使用する室温でルシフェラーゼを安定化させる請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＨＳＰ２７、ＨＳＰ２５、αＢ−クリスタリン、α−クリスタリンまたはαＡ−クリスタリンを使用するホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体の安定化方法。
【請求項４４】
水溶液にＨＳＰ２７、ＨＳＰ２５、αＢ−クリスタリン、α−クリスタリンまたはαＡ−クリスタリンを添加することを含む水溶液中におけるＨＲＰ複合体の安定化方法。
【請求項４５】
ＨＳＰ２７とＨＳＰ２５を使用する室温でＨＲＰ複合体を安定化させる方法。
【請求項４６】
ＨＳＰ２７、ＨＳＰ２５またはαＢ−クリスタリンを使用するＨＲＰ複合体を３７℃で安定化させる方法。
【請求項４７】
ＨＳＰ２７を使用する抗体、抗体断片または抗体複合体の安定化方法。
【請求項４８】
水溶液にＨＳＰ２７を添加することを含む水溶液中における抗体、抗体断片または抗体複合体の安定化方法。
【請求項４９】
ＨＳＰ２７を使用する室温で抗体を安定させる請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
以下のａ）及びｂ）の工程を含む発現された組換えタンパク質を安定させる方法：
ａ）組換えタンパク質及び請求項１〜１４のいずれかに記載のハイブリッドタンパク質シャペロンを発現することができる細胞を提供する工程；及び
ｂ）前記組換えタンパク質及び前記ハイブリッドタンパク質シャペロンを前記細胞中で発現させる工程。
【請求項５１】
組換えタンパク質及び請求項１〜１４のいずれかに記載のハイブリッドタンパク質シャペロンを発現する細胞。
【請求項５２】
請求項１〜１４のいずれかに記載のハイブリッドタンパク質シャペロンをコードする核酸配列。
【請求項５３】
請求項５２に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項５４】
前記ハイブリッドタンパク質シャペロンによって安定化する組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む請求項５３に記載のベクター。
【請求項５５】
前記組換えタンパク質が治療上重要なタンパク質である請求項５０、５１または５４のそれぞれに記載の方法、細胞またはベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリッドシャペロンなどのタンパク質シャペロン、及びこうしたタンパク質シャペロンをタンパク質に加えることなどによってタンパク質及びタンパク質活性を安定させる方法に関する。また、本発明は、タンパク質に結合した前記タンパク質シャペロンを含む、安定化されたタンパク質処方物を提供する。本発明はさらに、ハイブリッドタンパク質シャペロンを形成することによる天然シャペロンの活性増強方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質シャペロンは、それらの主要な配列及びシャペロン特性に基づく4つの主なタンパク質ファミリーに細分できる。これらはＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０及びｓＨＳＰタンパク質クラスを含んでいる。ＨＳＰという接頭辞は「熱ショックタンパク質（Heat Shock Protein）」を表わし、これらのタンパク質が、当初、どのように発見されたかを示している。これらのタンパク質は、ストレスを受けた細胞において非常に顕著なのである。こうした細胞において、それらは、標的となる様々なタンパク質目標の全範囲にわたって折りたたみを容易にし、細胞中において、様々なタンパク質が一連の活性を維持するのを助ける（非特許文献１：Saibil,2000）。
【０００３】
過去十年間にわたって、ｓＨＳＰが保護作用を有するのは、凝集過程にあるタンパク質と結合する能力を有するためであることが明らかになってきた（非特許文献２：Lindner et al., 2001）。これら不安定化されたタンパク質は、折りたたみが開かれる過程にあろうがなかろうが、細胞内タンパク質が集中的に析出するポイントとなるので、細胞全体を危険にさらす（非特許文献３：Schubert et al., 2000）。従って、ｓＨＳＰは、この内的な危険から細胞を保護して、そのような破綻を防ぐ細胞防御メカニズムの重要な部分である。
【０００４】
その後の研究で、ｓＨＳＰを含むタンパク質シャペロンは、ストレスを受けていない正常な細胞にも存在して活性な状態にあることがわかった。つまり、シャペロン活性はストレスを受けた細胞においてのみ重要なわけではない（非特許文献１：Saibil,2000）。細胞内ではタンパク質濃度が高く（非特許文献４：Ellis and Hartl, 1999）、タンパク質翻訳機構での誤り発生率も高いが（非特許文献３：Schubert et al. , 2000）、こうした条件はタンパク質の誤った折りたたみ、及びこれに起因するタンパク質凝集を引き起こす方向に働く。従って、シャペロン活性は細胞生存の不可欠な要素である。
【０００５】
特許文献１（欧州特許公開第599344号）は、ＨＳＰ２５（哺乳類ｓＨＳＰ）の働きによりタンパク質がインビトロで安定されることを論じている。特に、この文献はタンパク質凝集を扱っているが、酵素活性を安定させた例は１つしかない。
【０００６】
しかし、特許文献１（欧州特許公開第599344号）の出願日以降、3つの点で基本的な進展があり、それらは、特許文献１（欧州特許公開第599344号）の開示内容に疑問を投げ掛けた。
【０００７】
第1の重要な進展は、哺乳類細胞だけでも相異なる１１種類のｓＨＳＰが識別同定された点である（表１）。
【０００８】
【表１】
2005523693.tif 000002
【０００９】
過去２年間で３種のＨＳＰが発見されているので（非特許文献５：Kappe et al., 2001；非特許文献６：Krief et al., 1999）、ここに挙げたものが完全なリストであると考えるのは妥当ではない。さらに広く、小さな熱ショックタンパク質ファミリー内では、配列相同性は限定的であるが、機能的及び構造的相同性が保存された新たなメンバーが発見されつつある。特定の細胞機能と関連付けられているのは一部のみであり、このリストは絶えず成長している。例えば、酵素（キナーゼ）活性（ＭＫＢＰ）最大化に関わっているものもあれば（非特許文献７：Suzuki et al., 1998）、細胞中の多重タンパク質複合体（コンジュゲート）を安定化させるもの（ＨＳＰ２７及びαＢ−クリスタリン）もある（非特許文献８：Perng et al.,1999a）。また、タンパク質αＢ−クリスタリンは、ＤＮＡと結合して（非特許文献９：Pietrowski et al., 1994）ゲノムの安定性に関与する（非特許文献１０：Andley et al., 2001）ことも示されており、一方、ＨＳＰ２７（非特許文献１１：Mehlen et al., 1996）とαＢ−クリスタリン（非特許文献１２：Kamradt et al., 2001）は、両者ともアポトーシス誘導物質からの細胞保護を助けることが示されていた。ＨＳＰ２７とαＢ−クリスタリンは、アミロイドフィブリル重合を阻害し得る（非特許文献１３：Hatters et al., 2001;非特許文献１４： Kudva et al., 1997）。また、ＨＳＰ２７とαＢ−クリスタリンは、ＭＫＢＰそのものほどではないが、インビトロでＭＫＢＰ標的キナーゼの活性を増加させることができる（非特許文献７：Suzuki et al., 1998）。実際、ｓＨＳＰの１種、ＨＳＰＢ８は、ケラチノサイトの細胞成長に不可欠なｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼである（非特許文献１４：Aurelian et al., 2001）。他方、ＨＳＰ２７は、ＨＳＰ２０の機能である（非特許文献１５：Niwa et al., 2000）血小板凝集を阻害することができない。
【００１０】
従って、第2の重要な進展は、様々なｓＨＳＰは、その生理学役割が等価ではないということである。ｓＨＳＰは、細胞骨格の安定化からゲノム安定化まで非常に広範囲の活性に関与している。これらの観察結果は、インビボでは、種々のｓＨＳＰがそれぞれに専門的な役割を有していることを示す。インビトロでのシャペロンアッセイでも、非生理学的物質を用いた場合、種々のｓＨＳＰが果たす効果は様々である（非特許文献１６：van de Klundert et al., 1998）。しかし、このようなインビトロアッセイで使用される基質は広い範囲に及び、これは、ｓＨＳＰが広範囲のタンパク質を安定させる際に潜在的な適用可能性を有しているが、商業的に実用化するためにはそれぞれ最適化する必要があると示唆している。
【００１１】
文献（非特許文献１７：Reddy et al., 2000）に現われている第３の重要な進展は、異なるｓＨＳＰｓの活性プロフィールは温度とともに変化し得るものである。こうした可能性は特許文献１（欧州特許公開第599344号）では考えられていない。従って、これらの新しい発展を踏まえると、特許文献１（欧州特許公開第599344号）で示唆されていたようにあらゆる機能のクラス全体について「絶対的に最も良好な」代表として１種類のｓＨＳＰを採り上げることは不可能である。
【００１２】
【特許文献１】欧州特許公開第599344号
【非特許文献１】Saibil,2000
【非特許文献２】Lindner et al., 2001
【非特許文献３】Schubert et al., 2000
【非特許文献４】Ellis and Hartl, 1999
【非特許文献５】Kappe et al., 2001
【非特許文献６】Krief et al., 1999
【非特許文献７】Suzuki et al., 1998
【非特許文献８】Perng et al.,1999a
【非特許文献９】Pietrowski et al., 1994
【非特許文献１０】Andley et al., 2001
【非特許文献１１】Mehlen et al., 1996
【非特許文献１２】Kamradt et al., 2001
【非特許文献１３】Hatters et al., 2001
【非特許文献１４】Aurelian et al., 2001
【非特許文献１５】Niwa et al., 2000
【非特許文献１６】van de Klundert et al., 1998
【非特許文献１７】Reddy et al., 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的の１つは、上記の問題点の少なくとも1つを除去及び／または緩和することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、部分的には、ｓＨＳＰにおいて１または複数の領域を他のｓＨＳＰに由来する同様の領域に置き替えてハイブリッドｓＨＳＰを作成すれば、天然のｓＨＳＰと比較して活性を改善し得るという本発明者の得た知見に基づいている（この点に関しては、従来は進化圧の下でこれまでに選択された配列を変更すれば活性が減少するであろうと考えられていた）。
従って、本発明は、第1に、タンパク質及び／またはタンパク質活性を安定させるためのハイブリッドタンパク質シャペロンを提供する。
【００１５】
本発明によれば、「ハイブリッド」は、異なる起源の２以上の部分から構成された任意の巨大分子を意味する。典型的には、このハイブリッドは２以上のタンパク質を有する巨大分子を含み、少なくともその一部が異なる起源の同様の部分で置き替えられたものである。例えば、この巨大分子はＤＮＡでもよく、これは、ハイブリッドタンパク質産物、好ましくはハイブリッドタンパク質シャペロンに翻訳される。巨大分子のこうした部分的置換では、巨大分子の残りが、例えば短縮していないタンパク質産物の翻訳を可能とするように、読み枠のずれがないように（すなわち、「インフレーム」で）なされるべきである。
【００１６】
典型的には、前述の部分はその機能的ホモログを含む。従って、特定の理論に拘束されるものではないが、本発明による機能的ホモログは、タンパク質シャペロンのファミリーの全体にわたって保存されたタンパク質または核酸配列の領域（例えば、シャペロン特性の機能を保持する構造ドメイン）を意味するものと理解すべきである。より詳細に言えば、構造ドメインは、哺乳類ｓＨＳＰファミリーについて公表された構造機能研究（Kim et al., 1998；van Montfort et al., 2001）に基づいて決定してもよい。そのような出版物、及びパブリックドメインにおいて利用可能な全ｓＨＳＰについての配列アラインメント（de Jong et al., 1998;Kappe et al. , 2002;さらに、ftp.cmbi.kun.nl/pub/molbiol/kappe/で入手可能な１４０種のｓＨＳＰファミリーによる配列アラインメントプロフィール参照）から見て、相同領域はタンパク質中の特定の構造領域と関連している。上記の参考文献で言及されているすべてのＨＳＰは、ハイブリッドシャペロンを生成するのに適したものとして本発明内に含まれる。従って、一般にｓＨＳＰは、Ｎ及びＣ末端領域（これらは配列、長さ及び構造において変動がある）に挟まれたある種の中央ドメイン（α−クリスタリンと呼ばれる）のモデルに適合する（de Jong et al., 1998）。小さな熱ショックタンパク質を含むいくつかのシャペロンでは、配列よりも機能や構造の類似性によってのみｓＨＳＰファミリーと関連する点に留意すべきである（de Jong et al., 1998van Montfort et al., 2001）。ＨＳＰ９０共同シャペロンｐ２３は、配列では関係ないものの、位相的にはＨＳＰ１６．９に似ており、これからは、さらに機能的なモノマータンパク質を生成するためのｓＨＳＰ修正戦略を提示する（van Montfort et al., 2001）。従って、機能的なホモログとは、タンパク質シャペロンファミリーと配列上の類似性は高くないが、シャペロンファミリーと機能的な特性の類似性の高いシャペロンタンパク質/核酸配列またはその一部を意味し得るという点も理解すべきである。
【００１７】
好ましくは、本発明による前記部分は、一般に、ＨＳＰファミリータンパク質の中央ドメイン（α−クリスタリンドメイン）Ｎ末端領域またはＣ末端領域から選択される。
本発明によるＮ末端領域は、本発明及び／または図１０に示すタンパク質シャペロンのうちの任意の一つの開始コドン、メチオニン以下５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個までのアミノ酸残基を含むことが理解されるべきである。
【００１８】
本発明によるＣ末端領域は、本発明及び／または図１０に示すタンパク質シャペロンのうちの任意の一つの停止コドンに先立つ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個までのアミノ酸残基を含むことと考えられる。例えば、保存されたアミノ酸部位Ｅ１６４（登録番号Ｐ０２５１１）と図１０中に示すαＢ−クリスタリンの停止コドンの間に位置する１２アミノ酸部分である。
しかし、遺伝研究と組み合わせた実験的研究によれば、ある種のｓＨＳＰについてはその機能にとって不可欠のサブドメイン及び特定の残基があることが明らかになった。従って、前記部分は、場合によってこうしたサブドメインまたは残基を含んでもよい。
【００１９】
より詳細には、αＢ−クリスタリンについての研究により、アルギニン１２０（ｓＨＳＰファミリー全体を通じて高度に保存されている残基（Perng et al., 1999b））の重要性が明らかになった。この残基がグリシンに変異すると、心筋症及び白内障の遺伝疾患を引き起こす（Vicart et al., 1998）。この同じ残基が、関連ｓＨＳＰであるαＢ−クリスタリンにおいてシステインに変異した場合も白内障を引き起こす（Litt et al., 1998）。しかし、現時点での構造−機能予測は未だ実験的な確認を要する（van Montfort et al., 2001）。例えば、最近公表された他の研究で、最近公表した、αＢ−クリスタリンに対してＣ末端領域の重要性が明らかである（Berry et al., 2001）。
【００２０】
コード枠を変更しＣ末端領域の配列を変化させる点突発変異は、別の遺伝性白内障の遺伝的基礎になっていることが示されている。これらのデータは、この領域がαＢ−クリスタリンにおいて重要であるという何よりも明確な証拠となる。ＨＳＰ２５による構造研究は、この領域がシャペロン活性に影響を及ぼす場合があることをさらに示した（Lindner et al., 2001）。しかし、ある種の哺乳類のｓＨＳＰでは、この領域は事実上存在しない（Kappe et al., 2001）。
【００２１】
本発明によるハイブリッドタンパク質シャペロンは、前記シャペロンの一部分が異なる起源のシャペロン由来の同様の部分と置き替えられたタンパク質シャペロンを意味するものとして理解される。例えば、あるシャペロンのＣ末端は、多数の他のタンパク質シャペロンのうち任意の対応するＣ末端領域で置き替えることができる。好ましくは、前記ハイブリッドのタンパク質シャペロン活性はその適用のために最適化される。特定の説明に拘束されるものではないが、多種多様なハイブリッドを様々な応用場面に用いることで様々な効果を得ることができると考えられる。
【００２２】
本発明の１つの実施態様では、前記ハイブリッドは、αＢ−クリスタリンのＣ末端部分をＨＳＰ２７のＣ末端部分と交換することによりハイブリッド、αＢ−ＨＳＰ２７として調製される。すなわち、αＢ−ＨＳＰ２７は、αＢ−クリスタリンのＮ末端と中央部分及びＨＳＰ２７のＣ末端尾部を含むものと考えられる。
【００２３】
前記ハイブリッドは既知の技術を使用して構築するのが便利である。例えば、当業者には周知（例えば、Sambrook et al., 2001を参照）の部位特異的突然変異を使用して、制限酵素サイトをタンパク質シャペロン遺伝子のＣ末端領域に上流に導入することができる。これにより、様々な遺伝子産物の種々のＮ末端領域やＣ末端領域を、適当な制限酵素による消化によって生産できる。従って、タンパク質シャペロンのＣ末端領域をコードする消化された遺伝子部分を、同様に制限酵素に消化されたＮ末端領域をコードする「親」タンパク質シャペロン遺伝子中にライゲートすることができる（この際、ライゲートする部分は、それがライゲートされる消化された遺伝子と読み枠が合うようにする）。次いで、このハイブリッド遺伝子コンストラクトを、ハイブリッドタンパク質シャペロン遺伝子のタンパク質発現のための適当なベクター中にクローニング（ライゲート）する。このようにして、ハイブリッドタンパク質シャペロン遺伝子産物は、機能的な、すなわち、タンパク質またはタンパク質活性を安定化させるタンパク質シャペロンを生じさせる。所望のタンパク質についてインビトロで試験を行なうためには、これを、タンパク質シャペロンと共にまたはタンパク質シャペロンを伴わずに、タンパク質についての機能的な試験に供すれば簡単に試験できる。試験条件は、タンパク質シャペロンが存在しない場合にはタンパク質を不安定することが示される条件とする。当業者には理解されるであろうが、前記ハイブリッドは、例えば、ＰＣＲ法を用いたり本来の制限酵素サイトを有する制限酵素を使用するなど、当業者には既知の他の方法を使用して構築してもよい。
【００２４】
本発明によるタンパク質シャペロン（その機能的なホモログを含む）は、異種起源のタンパク質をタンパク質凝集を防ぐことにより損傷から保護し、タンパク質活性を保持及び／または以前に損傷を受けたタンパク質の活性を回復するといった、シャペロン様活性を示す、タンパク質またはその部分である。典型的には、こうしたタンパク質は、原核生物または真核生物に由来するシャペロンタンパク質ファミリー――熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）とも呼ばれる――のメンバー（ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０及び小ＨＳＰを含む）である。好ましくは、前記タンパク質シャペロンは、クリスタリン類（例えば、αＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン）を含む、小さな熱ショックタンパク質（ｓＨＳＰ）のファミリーに属する。哺乳類のｓＨＳＰファミリーのメンバーはＨＳＰ２７、ＨＳＰ２０、ＭＫＢＰ、ＨＳＰＢ３、ＨＳＰＢ４、ＨＳＰＢ５、ｃｖＨＳＰ、ＨＳＰＢ８及びＨＳＰＢ９を含む。本発明のタンパク質シャペロンのアミノ酸配列及び／またはタンパク質をコードする核酸配列には、活性を維持しつつ残基の置換、付加、欠失を有するタンパク質シャペロンファミリーのメンバーが含まれる。
【００２５】
典型的には、ｓＨＳＰは、タンパク質の折りたたみが開かれるを阻止することにより大きなタンパク質複合体（コンジュゲート）を形成して機能する。場合によっては、安定化されたタンパク質基質の再折りたたみに他のタンパク質シャペロン、例えば、ＨＳＰ７０が必要となることもある。好都合なことに、哺乳類ｓＨＳＰがタンパク質安定化物質として機能するためにはエネルギー源（例えば、ＡＴＰまたはＧＴＰ）を必要としない。
【００２６】
本発明の別の面では、本発明によるハイブリッドタンパク質シャペロンに結合した少なくとも１つのタンパク質を含む安定化されたタンパク質処方物が提供される。典型的には、前記処方物中のタンパク質とハイブリッドタンパク質シャペロンの比率は、２５：１〜１：１００、例えば、１：０．０６２５〜１：４０である。
本発明のさらに別の面としては、水溶液にハイブリッドタンパク質シャペロンを加えることを含む、タンパク質及び／または水溶液中におけるタンパク質安定性の安定化方法が提供される。
【００２７】
本発明による方法は任意のタンパク質に適用できる。好ましくは、本発明による方法は、温度感受性であれ他の理由であれ、凝集する傾向のあるタンパク質に適用される。従って、本発明による方法を適用するための重要な分野は、生体診断、特に使用されるタンパク質試薬の製品貯蔵寿命及び／または安定性を増大させるための分野である。タンパク質試薬の１つの例は、ホモシステイン・デスルフラーゼである。
【００２８】
例えば、前記タンパク質試薬は、イムノアッセイ診断キット（抗体、抗体断片及び抗体複合体を含むＥＬＩＳＡなど）で使用される試薬を含む。特に、前記タンパク質試薬は、共有結合的に結合した酵素リポーター（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、ルシフェラーゼ）を有する抗体複合体を含む。
本発明のさらなる適用例は、タンパク質凝集防止剤として、または細胞死阻害剤及びゲノム安定経路としての、本発明によるハイブリッドタンパク質シャペロンの使用を含む。
【００２９】
本発明の方法及びハイブリッドタンパク質シャペロンは、品質管理（ＱＣ）試験開発及び抗原安定化の領域に適用しても便利である。例えば、ＱＣ試験では、ハイブリッドタンパク質シャペロンは、折りたたみが開かれる過程にあるタンパク質を認識するために使用できる。これには、多重タンパク質複合体（例えば、フィラメント構造の形成、特にアミロイドの形成）の認識が挙げられる。同様に、本発明による方法は、市販の診断のキットを使用して検出される抗原を認識し安定化させるために使用してもよい。タンパク質（抗原）は、折りたたみを開いた状態ではタンパク質分解を生ずる攻撃に過敏になる上、前記ハイブリッドタンパク質シャペロンによる安定化はそうしたタンパク質の貯蔵寿命を必ず増加させるであろうという事実があるため有利であろう。
【００３０】
本発明による「安定化」は、折りたたみが開かれる過程の防止または停止及びタンパク質活性／機能の保持を意味する。典型的には、これは、例えば、タンパク質が正しく折りたたみされるのを支援しタンパク質を折りたたまれた立体構造に維持する（これにより、タンパク質の機能が保持され凝集が防止される）ことにより達成される。
効果を最大にするためには、それぞれの用途に応じた特異的なハイブリッドタンパク質シャペロンが必要とされることもある。
【００３１】
従って、本発明のさらに別の面としては、αＢ−クリスタリンハイブリッドを用いたルシフェラーゼ活性などの酵素活性の保護方法が提供される。この方法は、好ましくは、インシュリン、ＨＲＰ複合体、ルシフェラーゼ、ホモシステイン・デスルフラーゼ及び抗体の安定化など、タンパク質安定化にαＢ−ＨＳＰ２７ハイブリッドタンパク質シャペロンを使用する。
【００３２】
本発明のさらに別の面としては、本発明によるハイブリッドタンパク質シャペロンの使用したタンパク質立体構造の変化が関与する疾病の治療方法を提供する。そのような疾病の例としては、心筋症、白内障及びある種の神経組織変成性疾病が挙げられる。
さらに別の面としては、本発明は、ハイブリッドタンパク質シャペロンを使用したタンパク質立体構造の変化が関与する疾病の治療用薬剤の製造方法を提供する。
【００３３】
本発明はさらに以下に述べる方法を提供する：
ＨＳＰ１７．５、α−クリスタリン、ＨＳＰ２７、αＢ−クリスタリン、αＡ−クリスタリンまたはＨＳＰ２５を使用するインシュリンの安定化方法。
水溶液にＨＳＰ１７．５、α−クリスタリン、ＨＳＰ２７、αＢ−クリスタリン、αＡ−クリスタリンまたはＨＳＰ２５を添加することを含む水溶液中におけるインシュリンの安定化方法。
【００３４】
好ましくは、３７℃でインシュリンを安定させるためにＨＳＰ１７．５を使用する。より好ましくは、４４℃でインシュリンを安定させるためにＨＳＰ２７またはクリスタリンを使用する。
αＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン、α−クリスタリン、ＨＳＰ２５またはＨＳＰ２７を使用するクエン酸合成酵素の安定化方法。
水溶液にαＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン、α−クリスタリン、ＨＳＰ２５またはＨＳＰ２７を添加することを含む水溶液中におけるクエン酸合成酵素の安定化方法。
【００３５】
好ましくは、クエン酸合成酵素を安定化するために、αＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリンまたはα−クリスタリンを使用する。より好ましくは、クエン酸合成酵素を安定化するために、５０℃でα−クリスタリンを使用する。
ＨＳＰ１７．５、ＨＳＰ２７またはα−クリスタリンを使用するルシフェラーゼの安定化方法。
水溶液にＨＳＰ１７．５、ＨＳＰ２７またはα−クリスタリンを添加することを含む水溶液中におけるルシフェラーゼの安定化方法。
【００３６】
好ましくは、ルシフェラーゼを安定化するために、αＢ−クリスタリンまたはＨＳＰ１７．５を使用する。より好ましくは、室温でルシフェラーゼを安定化させるためにαＢ−クリスタリンまたはＨＳＰ１７．５を使用する。
ＨＳＰ２７、ＨＳＰ２５、αＢ−クリスタリン、α−クリスタリンまたはαＡ−クリスタリンを使用するホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の安定化方法。
水溶液にＨＳＰ２７、ＨＳＰ２５、αＢ−クリスタリン、α−クリスタリンまたはαＡ−クリスタリンを添加することを含む水溶液中におけるＨＲＰ複合体の安定化方法。
【００３７】
好ましくは、室温でＨＲＰ複合体を安定化させるためにはＨＳＰ２７とＨＳＰ２５を使用する。場合によっては、ＨＲＰ複合体を３７℃で安定化させるためにＨＳＰ２７、ＨＳＰ２５またはαＢ−クリスタリンを使用してもよい。
ＨＳＰ２７を使用する抗体、抗体断片または抗体複合体の安定化方法。
前記水溶液にＨＳＰ２７を添加することを含む水溶液中における抗体、抗体断片または抗体複合体の安定化方法。
好ましくは、室温で抗体を安定させるためにＨＳＰ２７を使用する。
【００３８】
本発明はさらに別の面では、以下のａ）及びｂ）の工程を含む発現された組換えタンパク質を安定させる方法を提供する：
ａ）組換えタンパク質及び請求項１〜１４のいずれかに記載のハイブリッドタンパク質シャペロンを発現することができる細胞を提供する工程；及び
ｂ）前記組換えタンパク質及び前記ハイブリッドタンパク質シャペロンを前記細胞中で発現させる工程。
本発明はさらに別の面では、本発明による組換えタンパク質及びハイブリッドタンパク質シャペロンを発現できる細胞が提供される。
本発明による組換えタンパク質の例としては、治療上重要なタンパク質を含む選択された組換えタンパク質が挙げられる。
【００３９】
本発明はさらに別の面では、本発明によるハイブリッドタンパク質シャペロンをコードし得る核酸配列が提供される。
本発明はさらに別の面では、本発明によるハイブリッドタンパク質シャペロンをコードし得る核酸配列を含むベクターが提供される。ベクターは、当業者に知られており、例えば、Sambrook, 2001に記載されている。
さらに別の面では、本発明のベクターは、前述の核酸配列によってコードされる本発明のハイブリッドタンパク質シャペロンによって安定させるべき組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。組換えタンパク質の意味は前述の定義の通りである。
【００４０】
以下、実施例、添付する方法及び図面を参照して本発明をより詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
方法
αＢ−クリスタリンの尾部を他の多数のｓＨＳＰ（ＨＳＰ２７を含む）の尾部に置き換えることにより、αＢ−クリスタリンからハイブリッドタンパク質シャペロンを構築した。ｓＨＳＰは、分子コアから突出した短く柔軟で溶媒にさらされるＣ末端伸張部分を有する。これらの伸張部分の共通した特性は、それらが有極性で、タンパク質の可溶性の維持にとって重要であるという点である。キメラを、以下のようにして調製した。
Ｃ−尾部交換によりユニークなｓＨＳＰを設計するクローニング戦略
【００４２】
尾部の始まりは、ｓＨＳＰ（図１０）の配列比較及びマルチプルアラインメントによって識別した。最初にＣ−尾部結合部位に一意的な制限部位を導入し、次いで、カセット突然変異により新しい「尾部」配列を導入する一般的な戦略を採った。
出発原料：ヒトαＢ−クリスタリン遺伝子をバクテリアの発現ベクターｐＥＴ２３にクローニングした。カセット突然変異生成によって、天然のαβ−クリスタリンのＣ−尾部配列を、他のヒトｓＨＳＰ（ＨＳＰ２０、ＨＳＰ２７、ＭＫＢＰ、ｃｖＨＳＰ及びαＡ−クリスタリン）及び植物ｓＨＳＰ（クリのＣｓＨＳＰ１７．５）の可変かつ柔軟なＣ−尾部に置き替えた。Ｃ−尾部を有しないαＢ−クリスタリン野生型及びαＢ−クリスタリンを対照として使用した。
【００４３】
第一段階では、ｓＨＳＰ間で保存されたα−クリスタリンドメインと可変Ｃ−尾部ドメインとの間の結合部位に、ヒトαＢ−クリスタリン遺伝子の部位特異的変異によって一意的な制限酵素サイト（Ａｖａｌ）を導入した。ＮｃｏＩサイトとＥｃｏＲＩサイト間のαＢ−クリスタリンコード配列を含むバクテリアベクターｐＧＥＭＴｅａｓｙを突然変異生成のために使用した。クリスタリン領域Ｃ尾部結合に近い保存されたアミノ酸サイト（登録番号Ｐ０２５１１中のＥ１６４）にＡｖａＩサイトを導入した。この突然変異生成ステップは、サイレントコード変異の導入及びＤＮＡ配列の位置４８９上のＡｖａＩサイトの生成の両方をもたらす（図１１）。発現ベクターは、αＢ−クリスタリンの一意的なＳａｃＩサイト３’から停止コドンまでを含む。オリゴヌクレオチドは、αＢ−クリスタリンＣ−尾部配列を他の選択されたｓＨＳＰのＣ−尾部配列に置き換えるべく設計した。次いで、これらを、αＢ−クリスタリン発現コンストラクトのＡｖａＩ−ＳａｃＩサイトにそれぞれ挿入した。生産後に、ＡｖａＩ−ＳａｃＩによって消化したヒトαＢ−クリスタリン及びＤＮＡに尾部をクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ｐｌｙｓ株中でタンパク質精製を行なうために様々なコンストラクトをｐＥＴ２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクター中にクローニングした。
【００４４】
分析原理
インシュリンアッセイ
インシュリンは、ジスルフィド結合で連結した２つの鎖Ａ及びＢを有する。ＤＴＴによる還元はタンパク質立体構造を不安定化にし、凝集を引き起こす。凝集は３６０ｎｍにおける吸光度の測定（１０／１５分間）によってモニタリングされる。インシュリン濃度は５８μｍ（３５０μｇ／ｍｌに相当）とし、ｓＨＳＰに対するインシュリン（シグマＩ−５５００）の比は４：１（ｗ：ｗ）とした。アッセイは、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ６４０分光測光器において３７℃と４４℃で行なった。アッセイは刊行物記載の方法（Farahbakhsh, 1995）に基づいて行なった。
【００４５】
クエン酸塩合成酵素アッセイ
これはインシュリンアッセイと同じ原理に基くが、熱的凝集アッセイである。クエン酸合成酵素（Ｓｉｇｍａ＃Ｃ−３２６０）を６μｍの濃度（３００μｇ／ｍｌに相当）とし、ｓＨＳＰに対するクエン酸合成酵素の比は４：１（ｗ：ｗ）とした。アッセイは、Buchneret al.,1998に記載される方法を用いた。
【００４６】
ＨＲＰ複合体アッセイ
このアッセイは、酵素活性の保持率を測定するものであり、従って、タンパク質の安定性のみ測定するインシュリンアッセイ及びクエン酸塩アッセイのいずれとも異なる。
このアッセイは、シグマから得られるストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ＃Ｓ−９４２０）の固有の不安定性を用いて開発した。この複合体は不安定性であるため、それを用いてｓＨＳＰに対するその効果を試験した。ストレプトアビジン−ＨＲＰは、開放ベンチに保存した場合には活性を失うため、この観察に関しては非最適化アッセイを開発した。
【００４７】
このアッセイでは、複合体を捕捉するためにビオチンコーティングを施したプレート（Ｐｉｅｒｃｅ＃１５１５１）を使用する。ＴＭＤ基質により発色させ、次いで停止試薬を添加し４５０ｎｍで吸光度を測定した。複合体を室温及び３７℃で実効的な強度（１Ｕ：６０００または０．９ｍｇ／ｍｌ）で保存し、複数時点でアッセイを行ない、どのｓＨＳＰがタンパク質シャペロン効果が最も有効からを決定した。ｓＨＳＰは重量の４０倍過剰で加えた。
【００４８】
ルシフェラーゼアッセイ
マイクロタイタープレート上のルシフェラーゼにルシフェリン基質及びＡＴＰ基質（Ｂｉｏｔｈｅｍａルシフェラーゼ分析ｋｉｔ＃４８４−００１）を添加した際の発光を測定した。発光はＡｎｔｈｏｓルーシー１照度計によって測定した。ルシフェラーゼは実効的な強度で保存し、室温及び３７℃で活性を経時的にモニタリングした。このアッセイは、さらに酵素活性の保持を測定する。
【実施例】
【００４９】
実施例１
インシュリンアッセイ
ｓＨＳＰによるインシュリンの凝集からの保護を図１及び２に詳細に示す。ＳＨＳＰを添加しないインシュリンをベースラインに取り、これに比較して保護率を計算した。
このデータは、種々のｓＨＳＰが異なる活性を有しており、異なるシャペロンを混合することにより活性が改善できることを示す。すなわち、α−クリスタリンはαＡ−クリスタリンまたはαＢ−クリスタリンより好結果であり、αＡ−クリスタリンはαＢ−クリスタリンに劣る。さらに、このアッセイではある種のｓＨＳＰ（例えば、ＨＳＰ２０）はシャペロン活性を有しない。ＨＳＰ２７とαＢ−クリスタリンは両方とも良好なシャペロン活性を示し、ＨＳＰ１７．５が最良であった。先行技術（欧州特許公開第599344号）は、異なるｓＨＳＰでも同等な活性を有することを示唆するが、これらのデータはこの仮定を支持しない。
【００５０】
図２に示すデータは、ｓＨＳＰが温度依存性をを有することを示す。例えば、αＢ−クリスタリン、ＨＳＰ２５及びＨＳＰ２７はすべてそれらの相対的な活性が３７℃よりも４４℃で改善される。これらのデータは欧州特許公開第599344号における前記特許請求の範囲の内容と一致しない。ＨＳＰ２７とαＢ−クリスタリンも良好であり、２つのうちではＨＳＰ２７の方が良好である。
【００５１】
実施例２
クエン酸合成酵素
クエン酸合成酵素アッセイを４２℃及び５０℃で行なった。結果はインシュリンアッセイと同様に計算した（図３及び４）。
クエン酸合成酵素の結果も、ｓＨＳＰが様々な活動を有することを示す。このアッセイでは、両方の温度で、αＡ−クリスタリンはαＢ−クリスタリンよりも良好であった。ＨＳＰ２０はここでも不活性であった。ＨＳＰ２７の活性は４２℃と５０℃のいずれでも一定であるようであったが、αＢ−クリスタリンは５０℃で効果が低減した。αＡ／αＢクリスタリンの天然存在比の混合物（α−クリスタリン）は、５０℃で個々のタンパク質より良好であった。
【００５２】
実施例３
ルシフェラーゼ
ルシフェラーゼ活性を３７℃で１時間および室温で７日間保存した後に測定した（図５）。これらの研究結果から、αＢ−クリスタリンとＨＳＰ１７．５は両方とも、室温でルシフェラーゼの酵素活性を保持する効果があることは明らかである。ここでも、個々のシャペロンの間に違いがあることは明白であり、効果の乏しいもの（例えば、αＡ−クリスタリン、ＨＳＰ２０）もあれば良好なシャペロンもある。これらのデータは、どうすればルシフェラーゼの寿命を延ばすことができるかを示しており、これに基づいて、生体診断産業においてルシフェラーゼの新たな利用分野が開かれる。酵素固有の信頼性から利用分野は、応用バイオテクノロジー内に限定されており、従って、現在、市場は研究分野に限られている。シャペロン添加により、ルシフェラーゼの新たな商業的利用分野が開かれる。
【００５３】
実施例４
ＨＲＰ複合体
基質とともにインキュベートし、複合体を室温で７日間および３７℃で１時間保存した後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した（図６）。これは保持された酵素活性を測定するものである。
ＨＲＰ複合体については、ＨＳＰ２７およびＨＳＰ２５が室温での保存に最良の結果を示した。３７℃では、αＢ−クリスタリンもＨＳＰ２５とＨＳＰ２７に同様の活性を示す。
前記特許では、一般に、ｓＨＳＰはタンパク質およびタンパク質活動を安定化させる点において有効であるとしている。しかし、これらのデータは、個々のｓＨＳＰが他のものよりいくつかの分析においてより良好であることを明白に示している。従って、すべてのアッセイにおいて最良の結果を示す１種類の天然ｓＨＳＰシャペロンを選択するのは困難である。
【００５４】
実施例５
抗体凝集
凍結解凍すると凝集し沈殿することが知られている抗体を用いて、ｓＨＳＰの抗体保護能力を評価した。抗体０．２ｍｇ／ｍｌを１０倍過剰量のｓＨＳＰと混合した。次いで、試料をドライアイス中で凍結し、室温で解凍する凍結解凍サイクルを３回行なった。沈殿したタンパク質を、１０，０００ｇで遠心分離によって除去した。凝集していない抗体の量を２８０ｎｍでの吸収により測定した。結果を図１０に示し、また、以下の実施例６で論じる。
【００５５】
実施例６
ハイブリッドタンパク質シャペロンを、αＢ−クリスタリンの尾部をＨＳＰ２７を含む他の多くのｓＨＳＰの尾部で置き換えることにより、αＢ−クリスタリンから構築した。このハイブリッドをインシュリンとともに（図７）、室温で１０日間保存した後ＨＲＰ複合体とともに（図８）、室温で２２週保存した後ルシフェラーゼとともに（図９）試験した。抗体を凍結解凍を繰り返すことによって引き起こされる凝集に対するｓＨＳＰハイブリッドの保護能力も試験した（図１０）。
【００５６】
インシュリンアッセイでは、ＭＫＢＰ尾部を有するものとＨＳＰ２７尾部を有するものの両者ともαＢ−クリスタリンに対して増強された活性を示した。同様に、ＨＲＰ複合体とルシフェラーゼＢ−ＨＳＰ２７シャペロンについては、ＨＲＰ複合体は、αＢ−クリスタリンあるいはＨＳＰ２７のいずれかよりも有効である。抗体保護に関しては、ＨＳＰ２７ハイブリッドでもαＢ−クリスタリンハイブリッドでも同様の結果が得られた。このハイブリッドはＨＳＰ２７よりも大きな活性を有していた。これらのデータは、ハイブリッドｓＨＳＰ、αＢ−ＨＳＰ２７が、ここで試験した４つの基質すべて保護することができ、いずれの場合も最良であることを示した。
【００５７】
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【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】３７℃で行なった、タンパク質シャペロンによるインシュリンの凝集からの保護についてのアッセイ結果を示すグラフである。図中、１はα−クリスタリン、２はαＡ−クリスタリン、３はαＢ−クリスタリン、４はＨＳＰ２０、５はＨＳＰ２５、６はＨＳＰ２７、７はＨＳＰ１７．５である。ｓＨＳＰを添加しないインシュリンをベースラインに採り、これに対する保護効果を計算した。
【図２】図１と同様に、４４℃で行なったインシュリンに関する同様のアッセイ結果を示す。図中、１はα−クリスタリン、２はαＡ−クリスタリン、３はαＢ−クリスタリン、４はＨＳＰ２０、５はＨＳＰ２５、６はＨＳＰ２７である。
【図３】４２℃で行なったクエン酸合成酵素アッセイの結果を描くグラフである。図中、１はα−クリスタリン、２はαＡ−クリスタリン、３はαＢ−クリスタリン、４はＨＳＰ２０、５はＨＳＰ２５、６はＨＳＰ２７、７はＨＳＰ無添加である。結果は、図１及び２のインシュリンアッセイの場合と同様にして計算した。
【図４】図３と同様に、５０℃で行なったクエン酸合成酵素に関する同様のアッセイ結果を示す。図中、１はα−クリスタリン、２はαＡ−クリスタリン、３はαＢ−クリスタリン、４はＨＳＰ２０、５はＨＳＰ２５、６はＨＳＰ２７である。
【図５】３７℃で１時間及び室温で７日間保存した後のルシフェラーゼに関するアッセイ結果を描くグラフである。図中、１はα−クリスタリン、２はαＡ−クリスタリン、３はαＢ−クリスタリン、４はＨＳＰ２５、５はＨＳＰ２７、６はＨＳＰ２０、７はＨＳＰ１７．５、８はＢＳＡ、９はＨＳＰ無添加である。
【図６】室温で７日間及び３７℃で１時間保存した後のＨＲＰ複合体に関するアッセイ結果を描くグラフである。図中、１はα−クリスタリン、２はαＡ−クリスタリン、３はαＢ−クリスタリン、４はＨＳＰ２５、５はＨＳＰ２７、６はＢＳＡ、７はＨＳＰ無添加である。
【図７】３７℃で行なった、タンパク質シャペロンによるインシュリンの凝集からの保護についてのアッセイ結果を示すグラフである。図中、１はαＢ−クリスタリン、２はαＢ−ＭＫＢＰ、３はαＢ−αＡ、４はαＢ−ＨＳＰ２７、５はαＢ−ＨＳＰ１７．５である。ｓＨＳＰを添加しないインシュリンをベースラインに採り、これに対する保護効果を計算した。
【図８】図７と同様に、室温で１０日間保存した後のＨＲＰ複合体に関する同様のアッセイ結果を示す。図中、１はＨＳＰ無添加、２はαＢ−クリスタリン、３はαＢ−ＭＫＢＰ、４はαＢ−αＡ、５はαＢ−ＨＳＰ２７、６はαＢ−ＨＳＰ１７．５、７はＨＳＰ２７である。
【図９】図７と同様に、室温で２２日間保存した後のルシフェラーゼに関する同様のアッセイ結果を示す。図中、１はαＢ−ＨＳＰ２７、２はαＢ−ＨＳＰ１７．５、３はαＢ−クリスタリン、４はＨＳＰ無添加である。
【図１０】３回凍結解凍した後の抗体の保護についての結果を示す。図中、１はαＢ−αＡ、２はαＢ−ＨＳＰ２７、３はＨＳＰ２７、４はＨＳＰ無添加である。
【図１１】１１種類のｓＨＳＰの配列アラインメント（手作業により結果を改善した）を示す。ＨＳＰ１６．９についてのβストランド（アラインメントに下線で示す）はタンパク質の結晶構造から決定した（van Montfort et al., 2001）。登録番号（アクセッション番号）は、ＨＳＰＢ１／ＨＳＰ２７（Ｐ０４７９２）、ＨＳＰＢ８（Ｑ９ＵＫＳ３）、ＨＳＰＢ２／ＭＫＢＰ（Ｑ１６０８２）、αＡ−クリスタリン（Ｐ０２４８９）、αＢ−クリスタリン（Ｐ０２５１１）、ＨＳＰ２０（Ｏ１４５５８）、ＨＳＰ１７．５（ＡＪ００９８８０）、ＨＳＰＢ３（Ｑ１２９８８）、ＨＳＰＢ７／ＣＶＨＳＰ（Ｑ９ＵＢＹ９）、ＨＳＰＢ９（ＡＪ３０２０６８）、ＨＳＰ１６．９（Ｓ２１６００）である。
【図１２】αＢ野生型と変異αＢ−クリスタリンの配列アラインメントを示す。変異Ｔ４８９Ｇを太字で示す。これはサイレント変異（タンパク質配列を変更しない）であるが、ユニークなＡｖａＩサイト（下線）を生成する。これをベクター由来のＳａｃＩサイトと共に用いて後でカセット変異を行ない、αＢ−クリスタリンに新たなＣ末端配列を導入する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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