(57)【要約】  本発明は、効率よく観察を行うことができる顕微鏡装置および制御方法に関する。  画像処理部３２は、サンプル１２の内部における平面形状の観察断面での画像を取得する。駆動制御部３１は、ガルバノスキャナ１５およびＺ駆動部１７を制御して、画像に現れる観察対象の断面が細長くなる方向に、観察断面の全体を傾斜させ、観察断面を徐々に傾斜させて観察断面において観察対象の断面の端部が検出されると、その端部を通る軸を中心に、この軸を境界として観察対象の断面が現れていない側の観察断面の一部を、観察対象の断面が現れる方向に傾斜させて屈折する形状の観察断面を形成する。本発明は、例えば、極短パルスレーザ光をスキャンさせて画像を取得する顕微鏡装置に適用できる。
2011030844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を観察する顕微鏡装置において、
前記試料の内部における平面形状の観察断面の画像を取得する画像取得手段と、
前記画像に現れる観察対象の断面の形状及び輝度値の少なくとも一方に基づいて、前記観察断面の全体を傾斜させる傾斜手段と、
前記傾斜手段により前記観察断面を傾斜させて取得した前記画像から前記観察対象の断面の端部を特定し、前記端部を通る軸を中心にして、前記軸を境界として前記観察対象の断面が現れていない側の前記観察断面の一部を、前記観察対象の断面が現れる方向に傾斜させて、前記軸で屈折する形状の前記観察断面を形成する屈折手段と
を備えることを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記屈折手段は、前記観察対象の断面が現れる方向に傾斜させた側の前記観察断面の一部において、前記観察対象の断面の端部を新たに特定した場合には、新たに検出された前記端部を通る軸を中心にして、前記観察断面の一部をさらに傾斜させる
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記画像取得手段は、前記屈折手段により形成される屈折した前記観察断面の形状を維持したまま、屈折した前記観察断面を回転移動または平行移動させて、屈折した前記観察断面での複数の画像を取得する
ことを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記断面の形状に基づく傾斜方向は、最も細長くなる方向である
ことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記断面の輝度値に基づく傾斜方向は、最も輝度値が高くなる方向である
ことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
試料を観察する顕微鏡装置の制御方法において、
前記試料の内部における平面形状の観察断面の画像を取得する画像取得ステップと、
前記画像に現れる観察対象の断面の形状及び輝度値の少なくとも一方に基づいて、前記観察断面の全体を傾斜させる傾斜ステップと、
前記傾斜ステップにより観察断面を傾斜させて取得した前記画像から前記観察対象の断面の端部を特定し、前記端部を通る軸を中心にして、前記軸を境界として前記観察対象の断面が現れていない側の前記観察断面の一部を、前記観察対象の断面が現れる方向に傾斜させて、前記軸で屈折する形状の前記観察断面を形成する屈折ステップと
を含むことを特徴とする制御方法。
【請求項７】
前記屈折ステップでは、前記観察対象の断面が現れる方向に傾斜させた側の前記観察断面の一部において、前記観察対象の断面の端部を新たに特定した場合には、新たに検出された前記端部を通る軸を中心にして、前記観察断面の一部をさらに傾斜させる
ことを特徴とする請求項６に記載の制御方法。
【請求項８】
前記画像取得ステップでは、前記屈折ステップにより形成される屈折した前記観察断面の形状を維持したまま、屈折した前記観察断面を回転移動または平行移動させて、屈折した前記観察断面での複数の画像を取得する
ことを特徴とする請求項６または７に記載の制御方法。
【請求項９】
前記断面の形状に基づく傾斜方向は、最も細長くなる方向である
ことを特徴とする請求項６から８のいずれか一項に記載の制御方法。
【請求項１０】
前記断面の輝度値に基づく傾斜方向は、最も輝度値が高くなる方向である
ことを特徴とする請求項６から８のいずれか一項に記載の制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置および制御方法に関し、特に、効率よく観察を行うことができるようにした顕微鏡装置および制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞切片や生体内（In VIVO）での神経細胞などの試料の観察において、光軸に直交するＸＹ平面の観察断面で、光軸方向のＺ座標を変えながら複数枚の画像を撮像し、その複数枚の観察断面の画像をＺ方向に積み重ねる画像処理（ボリュームレンダリング）によって、試料内部の直方体的な領域の三次元画像を構築して、試料の立体的な観察を行う観察方法がある。このような観察方法において、ユーザは、例えば、Ｚ座標を調整しつつＸＹ平面の観察断面での画像をライブ観察しながら、三次元画像のＺ方向の範囲（Ｚスタック）を決定する。【０００３】
例えば、特許文献１には、標本の三次元画像を取得し、その三次元画像に基づいて光刺激を行う領域を指定して、光刺激を行ったことによる標本の変化を観察する観察方法が開示されている。【０００４】
ところで、神経細胞は、神経細胞体から伸びるように樹状突起が形成される構造をしており、観察時の試料の姿勢によって、樹状突起が縦方向や斜め下方向などに伸びるように配置される。従って、ユーザが、ＸＹ平面の観察断面での画像をライブ観察していても、個々の画像には、それぞれの観察断面における樹状突起が点で表示されるだけであり、観察断面の画像を取得しただけでは、神経細胞の全体的な構造を把握することは困難である。【０００５】
そこで、例えば、特許文献２および３には、標本全体の三次元画像を取得して概略的な構造を把握して、その三次元画像に基づいて樹状突起に沿った観察領域を指定し、観察領域内を詳細に観察する観察方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３８０５号公報
【特許文献２】特開２００５−２４６４２号公報
【特許文献３】特開２００３−１９５１７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、上述したような試料内部の直方体的な領域の三次元画像を構築して試料の観察する観察方法では、複数の観察断面で画像を撮像する処理や、それらの画像をＺ方向に積み重ねる処理に時間が掛かるため、効率よく観察を行うことは困難であった。【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、効率よく観察を行うことができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の顕微鏡装置は、試料を観察する顕微鏡装置であって、前記試料の内部における平面形状の観察断面の画像を取得する画像取得手段と、前記画像に現れる観察対象の断面の形状及び輝度値の少なくとも一方に基づいて、前記観察断面の全体を傾斜させる傾斜手段と、前記傾斜手段により前記観察断面を傾斜させて取得した前記画像から前記観察対象の断面の端部を特定し、前記端部を通る軸を中心にして、前記軸を境界として前記観察対象の断面が現れていない側の前記観察断面の一部を、前記観察対象の断面が現れる方向に傾斜させて、前記軸で屈折する形状の前記観察断面を形成する屈折手段とを備えることを特徴とする。【００１０】
本発明の制御方法は、試料を観察する顕微鏡装置の制御方法であって、前記試料の内部における平面形状の観察断面の画像を取得する画像取得ステップと、前記画像に現れる観察対象の断面の形状及び輝度値の少なくとも一方に基づいて、前記観察断面の全体を傾斜させる傾斜ステップと、前記傾斜ステップにより観察断面を傾斜させて取得した前記画像から前記観察対象の断面の端部を特定し、前記端部を通る軸を中心にして、前記軸を境界として前記観察対象の断面が現れていない側の前記観察断面の一部を、前記観察対象の断面が現れる方向に傾斜させて、前記軸で屈折する形状の前記観察断面を形成する屈折ステップとを含むことを特徴とする。【００１１】
本発明の顕微鏡装置および制御方法においては、試料の内部における平面形状の観察断面での画像が取得され、その画像に現れる観察対象の断面の形状及び輝度値の少なくとも一方に基づいて、観察断面の全体が傾斜される。そして、観察断面を傾斜させて取得した画像から観察対象の断面の端部を特定し、その端部を通る軸を中心にして、軸を境界として観察対象の断面が現れていない側の観察断面の一部を、観察対象の断面が現れる方向に傾斜させて、軸で屈折する形状の観察断面が形成される。これにより、観察対象の形状に沿って屈折する形状の観察断面により観察対象を立体的に観察できるので、複数枚の画像を積み重ねる処理を行う必要がなく、効率よく観察を行うことができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の顕微鏡装置および顕微鏡装置の制御方法によれば、効率よく観察を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明を適用した顕微鏡装置の一実施の形態の構成例を示すブロック図である。
【図２】屈折観察断面について説明する図である。
【図３】屈折観察断面の画像を取得する画像取得方法について説明する図である。
【図４】顕微鏡装置が屈折観察断面の画像を取得する処理を説明するフローチャートである。
【図５】屈折観察断面に対する操作を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１５】
図１は、本発明を適用した顕微鏡装置の一実施の形態の構成例を示すブロック図である。
【００１６】
顕微鏡装置１１では、観察の対象となるサンプル１２がステージ１３に載置されており、サンプル１２に励起光を照射することによりサンプル１２に含まれている蛍光成分が励起される。そして、サンプル１２から発せられる蛍光（観察光）を検出し、その蛍光に基づいてサンプル１２の画像データが構築される。
【００１７】
レーザ光源１４は、サンプル１２の染色に用いる蛍光試薬の特性に対応した波長の励起光を射出する。また、レーザ光源１４には、例えば、非常に時間幅の短い（例えば、100フェムト秒の）パルス状のレーザ光である極短パルス光の射出が可能な極短パルスレーザ光源を採用することができ、顕微鏡装置１１では、極短パルスレーザ光が励起光として用いられる。
【００１８】
ガルバノスキャナ１５は、レーザ光源１４から射出される励起光を、サンプル１２に向かう光軸Ｌ１に沿って反射する。また、ガルバノスキャナ１５は、駆動制御部３１の制御に従って駆動する２枚のミラーを有しており、それらのミラーが駆動することにより、光軸Ｌ１に沿ってサンプル１２に向かう励起光を、光軸Ｌ１に直交する方向に走査する。
【００１９】
対物レンズ１６は、光軸Ｌ１に沿って入射する励起光を集光し、サンプル１２の内部の所定箇所にスポットを形成する。上述したように、極短パルスレーザ光源が励起光として用いられており、励起光による多光子励起によってサンプル１２内のスポットでのみ蛍光が発現する。これにより、極めて局所的な範囲での励起が可能となる。
【００２０】
Ｚ駆動部１７は、駆動制御部３１の制御に従って、対物レンズ１６を光軸方向に駆動させ、対物レンズ１６により形成されるスポットを光軸の方向に移動させる。例えば、Ｚ駆動部１７は、ピエゾ素子により構成され、対物レンズ１６を高速に駆動させることができる。
【００２１】
このように、顕微鏡装置１１では、駆動制御部３１の制御に従って、ガルバノスキャナ１５によりスポットが光軸に直交する方向（以下、適宜、Ｘ方向およびＹ方向と称する）に走査され、Ｚ駆動部１７によりスポットが光軸方向（以下、適宜、Ｚ方向と称する）に移動される。
【００２２】
このとき、駆動制御部３１は、ＸＹ方向へのスポットの走査速度に対してＺ方向への対物レンズ１６の移動速度を適切に制御することで、光軸Ｌ１に対して傾斜した軸に直交する平面にスポットを走査することができる。例えば、本願出願人が出願した特開平１０−１６１０３４号公報には、光軸に対して傾斜した軸に直交する断片像を取得する技術が開示されている。
【００２３】
そして、サンプル１２内のスポットから発せられる蛍光は、対物レンズ１６を介して、ガルバノスキャナ１５と対物レンズ１６との間に配置されている検出ユニット１８に入射する。
【００２４】
検出ユニット１８は、サンプル１２内で走査（スキャン）されるスポットから発せられる蛍光をデスキャンせずに検出する検出器（いわゆる、Non-Descanned Detector）であり、４つのダイクロイックミラー２１乃至２４、および、４つのＰＭＴ（光電子増倍管：Photo multiplier）２５乃至２８を備えて構成される。
【００２５】
ダイクロイックミラー２１乃至２４は、所定の波長領域の光のみを反射するとともに、他の波長領域の光を透過するミラーであり、ダイクロイックミラー２１は、光軸Ｌ１上に配置され、ダイクロイックミラー２２乃至２４は、光軸Ｌ１に略直交する光軸Ｌ２上に一列に配置される。
【００２６】
ダイクロイックミラー２１は、光軸Ｌ１に沿ってガルバノスキャナ１５から対物レンズ１６に向かう励起光を透過し、対物レンズ１６を介して入射する蛍光を、光軸Ｌ１に略直交する光軸Ｌ２に沿って反射する。
【００２７】
ダイクロイックミラー２２乃至２４は、それぞれ対応する波長領域の蛍光を反射する。ダイクロイックミラー２２により反射された蛍光はＰＭＴ２５に入射し、ダイクロイックミラー２２を透過してダイクロイックミラー２３により反射された蛍光はＰＭＴ２６に入射し、ダイクロイックミラー２２および２３を透過してダイクロイックミラー２４により反射された蛍光はＰＭＴ２７に入射し、ダイクロイックミラー２２乃至２４を透過した蛍光はＰＭＴ２８に入射する。
【００２８】
ＰＭＴ２５乃至２８は、それぞれに入射する蛍光を検出して光電変換を行い、受光した蛍光の光量（蛍光の明るさ）に応じた電圧の検出信号を画像処理部３２に供給する。
【００２９】
画像処理部３２は、ＰＭＴ２５乃至２８から供給される検出信号にそれぞれ対して、駆動制御部３１の制御に従ったスポットの位置に基づいて画像を構築する画像処理を施し、ＰＭＴ２５乃至２８が受光した波長領域の蛍光の光量に基づいた画像を生成して、表示部３３に表示する。
【００３０】
例えば、画像処理部３２は、光軸Ｌ１に直交する観察断面でサンプル１２を切断したような画像を光軸Ｌ１方向に積み重ねる画像処理により、サンプル１２の内部の直方体的な領域の三次元的な画像を構築することができる。
【００３１】
また、顕微鏡装置１１では、光軸Ｌ１に対して傾斜した軸に直交する観察断面での画像を取得することができ、傾斜角度がそれぞれ異なる複数の観察断面を組み合わせて、平面を屈折させたように形成された立体的な面（以下、適宜、屈折観察断面と称する）での画像を取得することができる。
【００３２】
図２を参照して、屈折観察断面について説明する。
【００３３】
一般的に、神経細胞４１は、図２に示すように、樹木の枝のように分岐しながら屈曲する形状の樹状突起４２が、神経細胞体４３から伸びるようにして構成されている。顕微鏡装置１１では、樹状突起４２の屈曲する形状に応じて屈折する屈折観察断面に沿ってスポットを走査することで、屈折観察断面での画像Ｐを取得することができる。
【００３４】
図３を参照して、屈折観察断面の画像Ｐを取得する画像取得方法について説明する。
【００３５】
まず、顕微鏡装置１１は、Ｙ軸に直交する平面形状の観察断面（ＸＺ平面）での画像Ｐ１を取得する。即ち、駆動制御部３１が、ガルバノスキャナ１５を制御してＸ方向にスポットを１ライン走査するごとに、Ｚ駆動部１７を制御してＺ方向に走査ラインを移動させることで、Ｙ軸に直交する観察断面に沿ってスポットが走査され、画像処理部３２により観察断面での画像Ｐ１が取得される。このとき、例えば、図３に示すように、画像Ｐ１には、複数の樹状突起の断面が散りばめられて表示される。
【００３６】
次に、ユーザは、画像Ｐ１に表示される複数の樹状突起のうちの、観察対象とする樹状突起αを指定する。これにより、駆動制御部３１は、樹状突起αが検出されたＺ方向の深さでＸ方向に延びる軸を、観察断面を傾斜させるときの中心とする中心軸β０として特定する。
【００３７】
そして、駆動制御部３１は、中心軸β０を中心として観察断面の全体を傾斜させる処理を行う。例えば、Ｘ方向にスポットを走査する走査ラインをＹ方向に移動させる移動速度と、走査ラインをＺ方向に移動させる移動速度とが等しいとき、ＸＹ平面に対する観察断面の傾斜角度は４５度となる。また、Ｘ方向にスポットを走査する走査ラインをＹ方向に移動させる移動速度が、走査ラインをＺ方向に移動させる移動速度より低いと、ＸＹ平面に対する観察断面の傾斜角度が大きくなり、Ｘ方向にスポットを走査する走査ラインをＹ方向に移動させる移動速度が、走査ラインをＺ方向に移動させる移動速度より高いと、ＸＹ平面に対する傾斜角度が小さくなる。
【００３８】
このとき、ユーザは、例えば、中心軸β０を中心として観察断面を右方向および左方向の両方に若干傾斜させ、樹状突起αの断面が細長く伸びるように現れる方向を、観察断面を傾斜させる方向に決定する。即ち、図２に示したように、樹状突起は所定の方向に伸びる細長い形状をしており、例えば、観察断面において樹状突起の断面が円形に近ければ、観察断面が樹状突起に直交するように配置されることになり、観察断面において樹状突起の断面が細長くなれば、観察断面が樹状突起に沿うように配置されることになる。従って、樹状突起αの断面が細長くなる方向に観察断面を傾斜させることで、観察断面が樹状突起に沿うように配置される。
【００３９】
駆動制御部３１は、中心軸β０を中心として観察断面を微小角度ずつ傾斜させていき、ユーザは、観察断面の傾斜に応じて変化する画像を観察して、樹状突起αの断面形状が最も長くなる角度まで観察断面を傾斜させ、その観察断面での画像Ｐ２が取得される。  
【００４０】
そして、駆動制御部３１は、観察断面上で検出される樹状突起αの端部でＸ方向に延びる中心軸β１を特定し、中心軸β１を境界として観察断面を屈折させる。即ち、駆動制御部３１は、観察断面での画像Ｐ２において樹状突起αの端部より先端側の観察断面の一部（中心軸β１を境界として樹状突起αが現れていない側の観察断面の一部）を、中心軸β１を中心として傾斜させる。このとき、駆動制御部３１は、後端側の観察断面（中心軸β１を境界として樹状突起αが現れている側の観察断面）は維持したままとする。
【００４１】
このとき、ユーザは、例えば、中心軸β１を中心として、先端側の観察断面を右方向および左方向の両方に若干傾斜させ、画像Ｐ２に現れていた樹状突起αの続きが現れる方向を、中心軸β１より先端側の観察断面を傾斜させる方向として決定する。
【００４２】
このように、中心軸β１より先端側の観察断面を傾斜させることにより、中心軸β１において屈折する屈折観察断面での画像Ｐ３が取得される。
【００４３】
さらに、駆動制御部３１は、樹状突起αの断面形状が最も長くなる角度まで、中心軸β１を中心として先端側の観察断面を傾斜させ、先端側の観察断面上で検出される樹状突起αの端部でＸ方向に延びる中心軸β２を特定する。そして、中心軸β２を境界として、さらに先端側の観察断面を屈折させる。これにより、中心軸β１およびβ２において屈折する屈折観察断面での画像Ｐ４が取得される。
【００４４】
このように、樹状突起αが最も長くなる端部を通る回転軸を中心に、回転軸よりも先端側の観察断面を傾斜させる処理を繰り返すことにより、樹状突起αに沿って複数箇所で屈折する屈折観察断面での画像が取得される。
【００４５】
なお、例えば、画像処理部３２が、画像Ｐ１に表示される樹状突起の断面積を求める画像処理を行い、断面積が最も大きな樹状突起、即ち、最も太い樹状突起を観察対象として特定し、その樹状突起αを駆動制御部３１に通知するようにしてもよい。また、画像処理部３２が、画像Ｐ２に現れる樹状突起の断面形状を認識する画像処理を行い、駆動制御部３１の制御に従って観察断面を微小角度ずつ徐々に傾斜させるたびに、その傾斜の前後で得られる樹状突起の断面形状を比較することで、樹状突起の断面形状が最も長くなる傾斜角度を求めることができる。
【００４６】
次に、図４は、図１の顕微鏡装置１１が屈折観察断面の画像を取得する処理を説明するフローチャートである。
【００４７】
例えば、ユーザが、ステージ１３にサンプル１２を載置して処理を開始する操作をすると処理が開始され、ステップＳ１１において、Ｙ軸に直交するＸＺ平面の観察断面での画像（図３の画像Ｐ１）を取得し、処理はステップＳ１２に進む。
【００４８】
ステップＳ１２において、画像処理部３２は、ステップＳ１１で取得された画像に表示されている樹状突起の断面積を求める画像処理を行い、断面積が最も大きな樹状突起を観察の対象として指定し、処理はステップＳ１３に進む。
【００４９】
ステップＳ１３において、駆動制御部３１は、ステップＳ１２で指定された樹状突起の中心におけるＺ方向の深さで、Ｘ方向に延びる軸を中心軸として特定し、処理はステップＳ１４に進む。
【００５０】
ステップＳ１４において、駆動制御部３１は、ステップＳ１３で特定した中心軸を中心に、樹状突起の断面形状が長くなる方向に観察断面を所定角度で傾斜させ、傾斜後の観察断面での画像を取得して、処理はステップＳ１５に進む。
【００５１】
ステップＳ１５において、画像処理部３２は、ステップＳ１４で取得された画像に現れる樹状突起の断面形状を認識する画像処理を行い、観察断面において観察対象の樹状突起の端部が検出されたか否かを判定する。そして、観察断面において観察対象の樹状突起の端部が検出されなかったと判定された場合、処理はステップＳ１４に戻り、観察断面を所定角度でさらに傾斜させて画像を取得する処理が繰り返される。
【００５２】
このように、顕微鏡装置１１では、観察断面において観察対象の樹状突起の端部が検出されなかった場合、樹状突起の断面形状が長くなるように観察断面を所定角度ずつ傾斜させて順次画像が取得され、画像処理部３２は、それらの画像における樹状突起の断面形状を順次認識して、傾斜の前後での画像を比較する。そして、画像処理部３２は、伸びていた樹状突起の断面形状が短くなった直前の観察断面における樹状突起の先端を、その観察断面での樹状突起の端部として検出する。
【００５３】
ステップＳ１５において、画像処理部３２が、観察断面において観察対象の樹状突起の端部が検出されたと判定した場合、処理はステップＳ１６に進む。
【００５４】
ステップＳ１６において、駆動制御部３１は、ステップＳ１５で検出された樹状突起の端部におけるＺ方向の深さで、Ｘ方向に延びる軸を次の中心軸として特定し、処理はステップＳ１７に進む。
【００５５】
ステップＳ１７において、駆動制御部３１は、ステップＳ１６で特定した中心軸を中心に、樹状突起の断面形状が長くなる方向に、その回転軸より先端側の観察断面を所定角度で傾斜させる。そして、画像処理部３２は、傾斜後の観察断面での画像を取得して、処理はステップＳ１８に進む。
【００５６】
ステップＳ１８において、画像処理部３２は、ステップＳ１５での処理と同様に、先端側の観察断面において観察対象の樹状突起の端部が検出されたか否かを判定する。
【００５７】
ステップＳ１８において、画像処理部３２が、先端側の観察断面において観察対象の樹状突起の端部が検出されたと判定した場合、処理はステップＳ１６に戻り、以下、同様の処理が繰り返される。
【００５８】
一方、ステップＳ１８において、画像処理部３２が、先端側の観察断面において観察対象の樹状突起の端部が検出されていないと判定した場合、処理はステップＳ１９に進む。
【００５９】
ステップＳ１９において、画像処理部３２は、屈折観察断面が完成したか否かを判定する。例えば、画像処理部３２は、ステップＳ１８での判定処理を所定回数繰り返しても、観察対象の樹状突起の端部が検出されない場合、現時点での端部が、樹状突起の先端であるとして、屈折観察断面が完成したと判定する。または、観察断面を屈折させる回数が設定されている場合、その回数だけ観察断面を屈折させたとき、屈折観察断面が完成したと判定される。
【００６０】
ステップＳ１９において、画像処理部３２が、屈折観察断面が完成していないと判定した場合、処理はステップＳ１７に戻り、以下、同様の処理が繰り返され、屈折観察断面が完成したと判定した場合、処理は終了される。
【００６１】
以上のように、顕微鏡装置１１では、樹状突起に沿って複数箇所で屈折する屈折観察断面を形成することで、樹状突起に沿った観察断面での画像を取得することができる。これにより、樹状突起の形状を三次元的に観察することができる。
【００６２】
ここで、上述したように、樹状突起の断面が細長なる方向に観察断面を傾斜させる処理が行われるが、この細長さの判断基準としては、例えば、画像に表示されている観察対象の樹状突起に外接する楕円の長軸や、樹状突起に外接する長方形の対角線の長さなどを用いることができる。即ち、この楕円の長軸が最も長くなった観察断面、または、長方形の対角線の長さが最も長くなった観察断面の画像が、屈折観察断面の画像となる。そして、このような細長さの判断の仕方としては、画像をユーザが目視して判断する場合や、画像処理により長さを算出し、その長さを表示部に表示してユーザが判断する場合、画像処理部が長さを算出するとともに、比較処理判断（自動処理判断）をする場合等が挙げられる。
【００６３】
なお、本実施形態では、樹状突起の断面が細長なる方向に観察断面を傾斜させるようにしたが、これに限らず、画像の平均輝度値が大きくなるような方向に観察断面を傾斜させてもよく、この場合、平均輝度値が最も大きくなった観察断面の画像が屈折観察断面の画像となる。また、注目画素の輝度値が大きくなるような方向に観察断面を傾斜させてもよく、この場合、注目画素の輝度値が最も大きくなった画像が屈折観察断面の画像となる。そして、このような画像の平均輝度値または注目画素の輝度値の判断の仕方としては、画像をユーザが目視して判断する場合、画像処理により画像の平均輝度値または注目画素の輝度値を算出し、その平均輝度値または輝度値を表示部に表示してユーザが判断する場合、画像処理部が平均輝度値または輝度値を算出するとともに、比較処理判断（自動処理判断）する場合等が挙げられる。
【００６４】
また、従来は、光軸に直交する観察断面での画像を光軸方向の座標を変えながら複数枚撮像し、その複数の画像を光軸方向に積み重ねる画像処理（ボリュームレンダリング）を行うことで樹状突起の立体的な構造を観察していた。これに対し、顕微鏡装置１１では、そのような画像処理を行うことなく、屈折観察断面により樹状突起の立体的な構造を観察することができるので、観察に要する時間を短縮することができ、神経細胞を効率よく観察することができる。さらに、サンプル１２への励起光の照射量を低減させることができるので、サンプル１２の劣化を抑制することができる。
【００６５】
なお、駆動制御部３１は、屈折観察断面の三次元的な形状を記憶しておくことができ、屈折観察断面が完成した後に、その形状を維持したまま屈折観察断面を移動させることができる。
【００６６】
例えば、図５のＡに示すように、屈折観察断面Ｐの形状を維持したままＺ方向を向く軸を中心に回転させたり、図５のＢに示すように、屈折観察断面Ｐの形状を維持したままＸＹ方向を向く軸を中心に回転させたり、図５のＣに示すように、屈折観察断面Ｐの形状を維持したまま平行に移動させることができる。
【００６７】
これにより、観察対象である樹状突起に沿った形状で、その樹状突起の周囲を観察することができる。また、一般的に、サンプル１２では、複数の神経細胞が所定の間隔で同方向に伸びるような配置となっており、屈折観察断面Ｐの形状を維持したまま平行に移動させることで、ある神経細胞を観察した後に、所定の間隔で離れた位置にある隣の神経細胞の観察を容易に行うことができる。
【００６８】
また、図５のＣに示すように、屈折観察断面Ｐの形状を維持したまま平行に移動させる際に、移動前の屈折観察断面と移動後の屈折観察断面との間で、所定の間隔で複数枚の屈折観察断面での画像を取得し、それらの画像を移動方向に積み重ねる画像処理を行うことで、屈折観察断面の形状で厚みのある立体的な領域の画像を取得することができる。これにより、観察に必要な領域の立体的な画像を効率よく取得することができる。
【００６９】
さらに、例えば、屈折観察断面Ｐの一部の平面だけを回転させることができる。例えば、図５のＤに示すように、Ｚ方向を向く軸を中心に、屈折観察断面Ｐの先端側の一部だけを回転させることができる。これにより、例えば、屈折観察断面Ｐ内の軸を中心に先端側を傾斜させても、樹状突起の続きを検出することができない場合でも、このように回転させることで検出範囲を広げることができ、樹状突起の続きを検出することができるようになることがある。
【００７０】
なお、本実施の形態では、対物レンズ１６を駆動させることにより、サンプル１２内に形成されるスポットをＺ方向に走査させているが、対物レンズ１６とサンプル１２との距離を相対的に調整することができればよく、例えば、対物レンズ１６を固定し、ステージ１３をＺ方向に駆動させる駆動部（図示せず）によりステージ１３を駆動させて、対物レンズ１６に対してサンプル１２を移動させてもよい。
【００７１】
なお、上述のフローチャートを参照して説明した各処理は、必ずしもフローチャートとして記載された順序に沿って時系列に処理する必要はなく、並列的あるいは個別に実行される処理（例えば、並列処理あるいはオブジェクトによる処理）も含むものである。
【００７２】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００７３】
１１  顕微鏡装置，  １２  サンプル，  １３  ステージ，  １４  レーザ光源，  １５  ガルバノスキャナ，  １６  対物レンズ，  １７  Ｚ駆動部，  １８  検出ユニット，  ２１乃至２４  ダイクロイックミラー，  ２５乃至２８  ＰＭＴ，  ３１  駆動制御部，  ３２  画像処理部，  ３３  表示部，  ４１  神経細胞，  ４２  樹状突起，  ４３  神経細胞体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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