(57)【要約】本発明者らは、疾患の治療方法または予防方法で使用するためのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を記載する。治療または予防有効量のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を個体に投与するステップを含む、罹患個体の治療方法または個体の疾患の発症を予防する方法も記載する。好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドおよび核酸は、それぞれ配列番号１および配列番号２を含む。
2005522988.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患の治療方法または予防方法で使用するためのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体。
【請求項２】
治療または予防有効量のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を個体に投与するステップを含む、罹患個体の治療方法または個体の疾患の発症を予防する方法。
【請求項３】
前記疾患には炎症性疾患、好ましくは湿疹が含まれる、特定の用途のための請求項１に記載のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体、または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記炎症性疾患が、新生児慢性肺疾患、新生児呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、肺線維症、気腫、間質性炎症性肺疾患、サルコイドーシス、肺炎、慢性炎症性肺疾患、新生児慢性炎症性肺疾患からなる群から選択される炎症性肺疾患である、特定の用途のためのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体、または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患がアレルギーを含む、特定の用途のための請求項１に記載のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体、または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記アレルギーが、イエダニ（ヒョウヒダニ属）、好ましくはヤケヒョウヒダニまたはコナヒョウヒダニ、または菌類もしくは菌類胞子、好ましくはアスペルギルス・フミガーツスによるものである、特定の用途のためのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体、または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アレルギーが、季節性呼吸器アレルギー、アレルギー性鼻炎、花粉症、非アレルギー性鼻炎、血管運動神経性鼻炎、刺激性鼻炎、草本の花粉、木本の花粉、または動物の鱗屑に対するアレルギー、アレルギー性喘息に関連するアレルギー、食品アレルギー、およびアレルギー性眼疾患からなる群から選択される、特定の用途のためのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体、または請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患が、細菌感染およびウイルス感染を含む微生物感染に関連し、好ましくは肺の微生物感染である、特定の用途のための請求項１に記載のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体、または請求項２に記載の方法。
【請求項９】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を個体に投与するステップを含む、個体の気道過敏症、血清ＩｇＥレベル、または好酸球増多症を軽減する方法。
【請求項１０】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を個体に投与するステップを含む、好ましくはアポトーシス肺胞マクロファージのクリアランスの増強もしくは壊死肺胞マクロファージのクリアランスの増強またはその両方による個体の肺胞マクロファージ数を減少させる方法。
【請求項１１】
前記ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドが、配列番号１に記載の配列を含むか、好ましくは配列番号１に記載の配列からなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体、または疾患の治療方法もしくは予防方法。
【請求項１２】
前記ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体をコードする核酸、好ましくは配列番号２に記載の配列を含む核酸を個体に投与する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１３】
疾患の治療方法または予防方法におけるｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の使用。
【請求項１４】
配列番号１に記載の配列、またはそのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を有するＳＰ−Ｄフラグメントを含む、組換えポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換えポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項１６】
前記核酸が配列番号２に記載の配列を含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の核酸配列を含む、ベクター、好ましくは発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と共に、請求項１４に記載の組換えポリペプチド、請求項１５または１６に記載の核酸、請求項１７に記載のベクター、または請求項１８に記載の宿主細胞を含む医薬組成物。
【請求項２０】
候補分子にｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、またはは誘導体を曝露するステップと、前記候補分子がｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドなどに結合するかどうかを検出するステップとを含む、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドに結合する分子の識別方法。
【請求項２１】
（ａ）細胞または生物を得るステップと、
（ｂ）前記細胞または生物をｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体に曝露するステップと、
（ｃ）前記細胞を候補分子に曝露するステップと、
（ｄ）ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）媒介効果を検出するステップと
を含む、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法。
【請求項２２】
前記ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）媒介効果が、末梢血好酸球増多症の軽減、血清ＩｇＥレベルの低下、血清ＩｇＧ１レベルの低下、気道過敏症の軽減、肺胞マクロファージ数の減少、洗浄物中のリン脂質レベルの低下、エオタキシン発現のダウンレギュレーション、ＭＣＰ−１発現の減少、ＭＩＰ−１α発現のダウンレギュレーション、およびＭＩＰ−２発現のダウンレギュレーションからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、選択または同定された分子を単離または合成するステップをさらに含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法を使用して同定または選択された分子。
【請求項２５】
１つまたは複数の以下の成分：肺抽出物（好ましくは、ウシ、好ましくは子牛肺抽出物）もしくはその成分、リン脂質（好ましくは、ホスファチジルコリンもしくは飽和ホスファチジルコリン）、脂肪酸、サーファクタント関連タンパク質（好ましくは、サーファクタント関連タンパク質Ｂまたはサーファクタント関連タンパク質Ｃ）、セチルアルコール、長鎖反復アルコール、チロキサポール、パルミチン酸コルホセリル（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、パルミチン酸、トリパルミチン、ポラクタントα、および塩化ナトリウムと共に、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体を含む組成物。
【請求項２６】
サーファクタント補充療法における、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の使用。
【請求項２７】
サーファクタント補充療法で使用するためのサーファクタント補充療法におけるｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体。
【請求項２８】
前記疾患が、アテローム性動脈硬化症、成長異常、早産後の新生児肺疾患における異常な出生後の肺発達、炎症組織の再造形欠損に関連する疾患、細胞増殖、および癌からなる群から選択される、特定の用途のための請求項１〜２７のいずれかに記載の使用のためのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体または疾患の治療もしくは予防方法。
【請求項２９】
細胞表面上への遊離ＤＮＡの産生に関する病態の治療のための組成物の製造におけるＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの使用。
【請求項３０】
前記ＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントがその炭水化物結合ドメインを介して核酸に結合する、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
薬学的有効量のＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントを治療を必要とする患者に投与するステップを含む、細胞表面上への遊離ＤＮＡの産生に関する病態を罹患した患者の治療方法。
【請求項３２】
肺内に遊離核酸が蓄積する慢性感染の治療のための組成物の製造におけるＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの使用。
【請求項３３】
嚢胞性線維症の治療のための組成物の製造におけるＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの使用。
【請求項３４】
壊死およびアポトーシス細胞のクリアランスのための組成物の製造におけるＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの使用。
【請求項３５】
薬学的有効量のＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントを治療を必要とする患者に投与するステップを含む、嚢胞性線維症、肺疾患、ＣＯＰＤ、慢性炎症、慢性細菌感染、慢性ウイルス感染、慢性菌類感染、および慢性喘息からなる群から選択される疾患を罹患した患者の治療方法。
【請求項３６】
自己免疫疾患における自己抗体産生の治療のための組成物の製造におけるＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの使用。
【請求項３７】
薬学的有効量のＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントを治療を必要とする患者に投与するステップを含む、自己免疫疾患を罹患した患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の治療および診断方法ならびにこのような方法で使用するための分子および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、サーファクタントタンパク質Ｄの組換えフラグメントおよびこのタンパク質をコードする核酸を開示する。本発明者らは、このフラグメントはサーファクタントタンパク質Ｄの有利な性質を保持することを証明し、種々の疾患の治療に使用することができることを示す。これらの疾患には、慢性肺疾患、新生児慢性肺疾患、特にイエダニに起因するアレルギー喘息を含む喘息ならびに他の疾患を含む炎症性疾患が含まれる。本発明者らが開示する組換えサーファクタントタンパク質Ｄフラグメントを使用して、種々のアレルギーを治療することもできる。
【発明の開示】
【０００３】
本発明者らは、ＳＰ−Ｄはその炭水化物結合活性を介して遊離核酸、特にＤＮＡに結合すると判断した。遊離ＤＮＡの認識は、少なくともいくつかのＳＰ−Ｄの有利な効果を担うと考えられる。さらに、本発明者らは、ＳＰ−ＤのＤＮＡ結合特性およびこの分子の他の性質は、ｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）と命名した組換えフラグメントで保持されると判断した。したがって、本発明の第１の態様によれば、本発明者らは、疾患の治療方法または予防方法で使用するためのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を提供する。
【０００４】
本発明の第２の態様によれば、治療または予防有効量のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を個体に投与するステップを含む、罹患個体の治療方法または個体の疾患の発症を予防する方法を提供する。
【０００５】
疾患には、好ましくは炎症性疾患、好ましくは湿疹が含まれる。
【０００６】
疾患には、炎症性疾患、好ましくは、新生児慢性肺疾患、新生児呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、肺線維症、気腫、間質性炎症性肺疾患、サルコイドーシス、肺炎、慢性炎症性肺疾患、新生児慢性炎症性肺疾患からなる群から選択される炎症性肺疾患を含んでもよい。
【０００７】
好ましくは、疾患は、新生児慢性肺疾患、肺気腫、慢性閉塞性気道疾患、嚢胞性線維症、および喘息からなる群から選択される。
【０００８】
疾患には、アレルギーを含み得る。アレルギーは、好ましくはイエダニ（ヒョウヒダニ属：Dermatophagoides）、好ましくはヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）またはコナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）、または菌類もしくは菌類胞子、好ましくはアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）によるものである。アレルギーは、好ましくは、季節性呼吸器アレルギー、アレルギー性鼻炎、花粉症、非アレルギー性鼻炎、血管運動神経性鼻炎、刺激性鼻炎、草本の花粉、木本の花粉、または動物の鱗屑に対するアレルギー、アレルギー性喘息に関連するアレルギー、食品アレルギー、およびアレルギー性眼疾患からなる群から選択される。
【０００９】
疾患は、細菌感染およびウイルス感染を含む微生物感染、好ましくは肺の微生物感染に関連する疾患であり得る。
【００１０】
本発明者らは、本発明の第３の態様によれば、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を個体に投与するステップを含む、個体の気道過敏症、血清ＩｇＥレベル、または好酸球増多症を軽減する方法を提供する。
【００１１】
本発明の第４の態様として、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を個体に投与するステップを含む、好ましくはアポトーシス肺胞マクロファージのクリアランスの増強もしくは壊死肺胞マクロファージのクリアランスの増強またはその両方による個体の肺胞マクロファージ数を減少させる方法を提供する。
【００１２】
好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドが、配列番号１に記載の配列を含むか、好ましくは配列番号１に記載の配列からなる。
【００１３】
好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体をコードする核酸、好ましくは配列番号２に記載の配列を含む核酸を個体に投与する。
【００１４】
本発明者らは、本発明の第５の態様によれば、疾患の治療方法または予防方法におけるｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体の使用を提供する。
【００１５】
本発明は、第６の態様では、配列番号１に記載の配列、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を有するＳＰ−Ｄフラグメントを含む組換えポリペプチドを提供する。
【００１６】
本発明の第７の態様では、本発明の第６の態様の組換えポリペプチドをコードする配列を含む核酸を提供する。好ましくは、核酸は、配列番号２に記載の配列を含む。
【００１７】
本発明の第８の態様によれば、本発明者らは、本発明の第７の態様の核酸配列を含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。
【００１８】
本発明者らは、本発明の第９の態様によれば、本発明の第８の態様のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１９】
本発明の第１０の態様によれば、薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と共に、本発明の第６の態様の組換えポリペプチド、本発明の第７の態様の核酸、本発明の第８の態様の核酸を含むベクター、または本発明の第９の態様の宿主細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
本発明の第１１の態様として、本発明者らは、候補分子にｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、またはは誘導体を曝露するステップと、前記候補分子がｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドなどに結合するかどうかを検出するステップとを含む、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドに結合する分子の識別方法を提供する。
【００２１】
本発明の第１２の態様によれば、本発明者らは、（ａ）細胞または生物を得るステップと、（ｂ）前記細胞または生物をｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体に曝露するステップと、（ｃ）前記細胞を候補分子に曝露するステップと、（ｄ）ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）媒介効果を検出するステップとを含む、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを識別する方法を提供する。
【００２２】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）媒介効果は、好ましくは、末梢血好酸球増多症の軽減、血清ＩｇＥレベルの低下、血清ＩｇＧ１レベルの低下、気道過敏症の軽減、肺胞マクロファージ数の減少、洗浄物中のリン脂質レベルの低下、エオタキシン発現のダウンレギュレーション、ＭＣＰ−１発現の減少、ＭＩＰ−１α発現のダウンレギュレーション、およびＭＩＰ−２発現のダウンレギュレーションからなる群から選択される。この方法は、好ましくは、選択または同定された分子を単離または合成するステップをさらに含む。
【００２３】
本発明の第１３の態様によれば、本発明の第１２の態様の方法を使用して同定または選択された分子を提供する。
【００２４】
本発明者らは、本発明の第１４の態様によれば、１つまたは複数の以下の成分：肺抽出物（好ましくは、ウシ、好ましくは子牛肺抽出物）もしくはその成分、リン脂質（好ましくは、ホスファチジルコリンもしくは二飽和ホスファチジルコリン）、脂肪酸、サーファクタント関連タンパク質（好ましくは、サーファクタント関連タンパク質Ｂまたはサーファクタント関連タンパク質Ｃ）、セチルアルコール、長鎖反復アルコール、チロキサポール、パルミチン酸コルホセリル（colfosceril palmitate、ジパルミトイルホスファチジルコリン）、パルミチン酸、トリパルミチン、ポラクタントα（poractant alfa）、および塩化ナトリウムと共にｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体を含む組成物を提供する。
【００２５】
本発明の第１５の態様として、サーファクタント補充療法におけるｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の使用を提供する。
【００２６】
本発明者らは、本発明の第１６の態様によれば、サーファクタント補充療法で使用するためのサーファクタント補充療法におけるｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を提供する。
【００２７】
第１７の態様によれば、細胞表面上への遊離ＤＮＡの産生に関する病態の治療のための組成物の製造におけるＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの使用を提供する。ｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）を含むＳＰ−Ｄおよびそのフラグメントは、その炭水化物結合能力を介してＤＮＡに結合する。したがって、ＳＰ−Ｄのフラグメントは、天然のＳＰ−Ｄの炭水化物結合活性を有利に保持する。本発明は、さらに、薬学的有効量のＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントをこのような治療を必要とする患者に投与するステップを含む、細胞表面上への遊離ＤＮＡの産生に関する病態を罹患した患者の治療方法を提供する。
【００２８】
本発明は、肺内に遊離核酸が蓄積する慢性感染の治療のための組成物の製造におけるＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの使用を提供する。例えば、感染は、細菌、ウイルス、または菌類感染であり得る。
【００２９】
本発明は、さらに、嚢胞性線維症の治療のための組成物の製造におけるＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの使用を提供する。嚢胞性線維症では、肺内の細菌細胞によって遊離核酸が産生されて、細菌バイオフィルムの形成および持続的な細菌肺感染を起こす。ＳＰ−Ｄおよびそのフラグメントはまた、嚢胞性線維症治療の有効性が増大する多数の肺病原体をオプソニン化するように作用する。
【００３０】
さらなる態様では、壊死およびアポトーシス細胞のクリアランスのための組成物の製造におけるＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの使用を提供する。このような細胞は、その表面に、食細胞媒介クリアランスのためのＳＰ−Ｄおよびそのフラグメントによって結合されたＤＮＡを有する。したがって、本発明は、ＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントを使用したＣＯＰＤ、慢性炎症、および慢性喘息などの肺疾患および病態の治療のための組成物ならびに薬学的有効量のＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントをこのような治療を必要とする患者に投与するステップを含む、嚢胞性線維症、肺疾患、ＣＯＰＤ、慢性炎症、慢性細菌感染、慢性ウイルス感染、慢性菌類感染、および慢性喘息からなる群から選択される疾患を罹患した患者の治療方法に拡大される。
【００３１】
なおさらなる態様では、自己免疫疾患における自己抗体産生の治療のための組成物の製造におけるＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの使用ならびに薬学的有効量のＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントをこのような治療を必要とする患者に投与するステップを含む、自己免疫疾患を罹患した患者の治療方法を提供する。
【００３２】
壊死またはアポトーシス細胞由来の遊離ＤＮＡまたはＤＮＡの破片は、自己抗体を産生させる自己抗原として作用することができる。ＳＰ−Ｄおよびそのフラグメントによるこのような遊離ＤＮＡのクリアランスにより、自己抗体産生が減少する。
【００３３】
本発明の他の態様を、以下の説明だけでなく、独立請求項および従属請求項に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明者らは、本明細書中で、「ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド」と呼ばれる組換えＳＰ−Ｄフラグメントの配列、および産生方法を開示する。本発明者らが承知している限りでは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドの配列および産生は、以前に公知ではなかった。本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、溶液中で互いに会合して三量体を形成することができることを示す。
【００３５】
非常に好ましい実施形態では、本発明者らは、特に新生児のサーファクタント補充療法として使用するための、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の使用を記載する。新生児肺疾患、特に新生児慢性肺疾患の治療のために、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を適切に使用することができる。
【００３６】
本発明者らは、サーファクタントタンパク質Ｄを欠くアレルゲンで攻撃誘発されたノックアウトマウスに投与された場合、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは末梢血好酸球増多症、総血清ＩｇＥレベル、およびＩｇＧ１レベルを減少させることを証明する。したがって、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、個体のアレルギー性過敏反応のモジュレーターとしての使用に適切である。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドはまた、末梢血好酸球増多症、血清ＩｇＥレベルの上昇、ＩｇＧ１レベルの上昇、またはこれらの任意の組み合わせで特徴付けられる任意の疾患または症候群の治療での使用に適切である。
【００３７】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドを、肺のマクロファージ媒介炎症の制御、病原体の侵入からの防御、ならびに感染およびアレルゲン性刺激に対する炎症反応の調整で使用することもできる。
【００３８】
イエダニアレルゲンで感作および攻撃誘発したマウス（例えば、Ｃ５７Ｂ１１６野生型マウス）は、アレルギー性喘息に特徴的な気道過敏症を示す。このようなマウスへのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドの投与により、気道過敏症が軽減する。したがって、アレルギー性喘息を含む気道過敏症を発症する任意の疾患または症候群を治療するためにｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドを個体に投与することができる。
【００３９】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド処置を使用することができる他の疾患には、皮膚病（例えば、湿疹（Ｔｈ２媒介疾患））および一般的なアレルギーが含まれる。このようなアレルギーには、食品アレルギー（例えば、卵、ナッツ類、ピーナッツ、およびミルクなどのアレルゲンに対するもの）が含まれる。他の一般的なアレルゲンには、花粉、塵、カビ、白カビ、ならびに昆虫、ペット（イヌ、ネコ、トリ）、ならびに植物アレルゲンが含まれる。一般に花粉症と呼ばれる季節性呼吸器アレルギー、空気アレルゲン（イエダニ、菌類胞子、草本の花粉、木本の花粉、および動物の鱗屑が含まれる）に対するアレルギーも含まれる。
【００４０】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）で処置することができるアレルギーの他のカテゴリーは、アレルギー症状を引き起こす主な要因である気道過敏症、血清ＩｇＥ、および好酸球増多症の軽減から利益が得られるものである。これには、アレルギー性喘息の治療が含まれる。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を、細胞媒介免疫系のアップレギュレーションから恩恵を受ける病態のための有効な治療として使用することもできる。これには、抗細菌作用および肺感染治療が含まれる。
【００４１】
ナチュラルキラー細胞の活性および免疫系細胞によるサイトカインＩＦＮγの分泌のアップレギュレーションから恩恵を受ける病態の有効な治療としてｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を使用することができる。これには、肺癌および他の癌ならびに新生物の治療が含まれる。
【００４２】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での内因性の天然ＳＰ−Ｄの補足から恩恵を受ける病態の有効な治療としてｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を使用することもできる。これには、内因性の天然のＳＰ−Ｄレベルが異常に低い病態の治療が含まれる。また、これには、内因性の天然ＳＰ−Ｄレベルが異常に低い肺サーファクタント系障害を有する新生児の治療が含まれる。また、これには、内因性の天然の肺ＳＰ−Ｄレベルが異常に低い嚢胞性線維症患者の治療も含まれる。また、これには、内因性の天然ＳＰ−Ｄレベルが異常に低い他の肺感染症患者の治療も含まれる。
【００４３】
さらなる実施形態では、ＳＰ−Ｄの抗アレルギー性を利用して、アレルギー性眼疾患と戦うことができる。したがって、本発明は、アレルギー性眼疾患の治療のためのＳＰ−Ｄ、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）などのそのフラグメントを提供する。
【００４４】
本発明者らは、ヒトの涙液に含まれるサーファクタントタンパク質Ｄレベルを測定し、これが１３２ｎｇ／ｍｌであることを見出した。ＳＰ−Ｄが本明細書中に記載のように抗アレルギー性を有し、ヒト涙液に存在するという事実により、このタンパク質が涙液の天然の抗アレルギー効果に関与することが示唆される。ＳＰ−ＤまたはｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）を、例えば、コンタクトレンズによる刺激／炎症の補正を補助するためのコンタクトレンズ用溶液添加することができる。さらに、例えば、シェーグレン症候群（（ヒト唾液および涙腺成分に対する自己抗体によって生じる）ドライアイおよび口内乾燥によって特徴付けられる自己免疫疾患）の治療に有益に付加される。現在、これは人工涙液の補足（hypermellose eye dropsなど）で治療されており、このような製剤へのＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの添加により眼感染症および角膜炎に対する人工涙液の保護効果が向上する。
【００４５】
基準を上記のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）に合わせる場合、これを、ポリペプチド自体、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を指称するように使用すべきである。
【００４６】
基準を疾患の治療に合わせる場合、これを、この疾患の症状の緩和の基準を含むように使用すべきである。好ましくは、この疾患を有する個体の実質的に全ての症状を緩和または除去する。「疾患」は、個体の健康または健康状態（well-being）に影響を与える任意の症状および任意の病態を含むように使用すべきである。好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を投与された個体が、疾患または病態の少なくとも１つの症状が緩和する（すなわち、実質的に正常な非罹患状態の個体に戻る）。これを、医師が関連する臨床パラメータを使用して評価することができる。例えば、気道過敏症を、実施例に記載の方法を使用して測定することができる。
【００４７】
本発明の実施には、特記しない限り、当業者の能力の範囲内の化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献中に例示されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９５および定期増補版、「現代の分子生物学プロトコール」、第９、１３、および１６章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｋａｈｎ、１９９６、「ＤＮＡの単離と配列決定：基本的技術」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、「インサイチューハイブリッド形成：原理と実践」；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４、「オリゴヌクレオチド合成：実践アプローチ」、Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；およびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、「酵素学方法論：ＤＮＡ構造パートＡ：ＤＮＡの合成と物理的分析」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（これらの各一般書は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと。
【００４８】
［サーファクタントタンパク質ＤのｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）］
サーファクタントタンパク質Ｄは、例えば、Ｒｕｓｔら、１９９１、「ヒトサーファクタントタンパク質Ｄ：ＳＰ−ＤはＣ型レクチン炭水化物認識ドメインを含む」、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２９０（１）、１１６〜１２６；Ｌｕら、１９９２、「ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄの精製、キャラクタリゼーションとｃＤＮＡクローニング」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８４、７８５〜８０２；Ｃｒｏｕｃｈら、１９９３、「ヒトサーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）のゲノム組織。ＳＰ−Ｄは染色体１０ｑ．２２．２−２３．１にコードされている」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６８（４）、２９７６〜２９８３；Ｋｏｌｂｌｅら、１９９３、「ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄ遺伝子（ＳＦＴＰ４）のサーファクタントタンパク質Ａ遺伝子クラスター付近の１０ｑ２２−ｑ２３への割り当て」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１７（２）、２９４〜２９８、１９９３で以前に同定およびキャラクタライズされている。
【００４９】
用語「サーファクタントタンパク質Ｄ」、「ＳＰ−Ｄ」、「ｈＳＰ−Ｄ」、および「天然のＳＰ−Ｄ」を使用する場合、これらを、任意のサーファクタントタンパク質Ｄのポリペプチドまたは核酸をいうために使用すべきである（文脈により必要な場合）。しかし、好ましくは、これらの用語を、ヒトサーファクタントタンパク質Ｄ（例えば、上記引例またはＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００３０１９．１、ＸＭ＿００５７７６．２、Ｘ６５０１８．１、およびＬ０５４８５．１に開示の配列）をいうために使用すべきである。より好ましくは、サーファクタントタンパク質Ｄは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００３０１９．１のヒトサーファクタントタンパク質Ｄである。このようなヒトＳＰ−Ｄの核酸およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３および配列番号４に示す。
【００５０】
［組換えサーファクタントタンパク質ＤのＲＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド］
本発明者らは、本発明者らがｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）と呼ぶサーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）のポリペプチドフラグメントを提供する。このようなｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドの配列を、配列番号１に示す。ｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）を、本明細書中で「ｒｈＳＰ−Ｄ」ともいい、２つの用語を同意語と見なすべきである。
【００５１】
用語ｒＳＰ−Ｄを使用する場合、これを、一般に、全長ＳＰ−Ｄに対応するかに関係なく、組換えＳＰ−Ｄ、好ましくはヒトＳＰ−Ｄ（組換え様式で発現する）またはこのフラグメントをいうために使用すべきである。好ましくは、用語ｒＳＰ−Ｄを、ＳＰ−Ｄ、好ましくはヒトＳＰ−Ｄの組換えフラグメントをいうために使用すべきである。好ましくは、文脈が必要な場合、「ｒＳＰ−Ｄ」を、上記の組換えＳＰ−ＤフラグメントｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）をいうために使用すべきである。
【００５２】
本明細書中に開示のポリペプチドは、配列番号１に記載の特定のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）配列に限定されないが、そのフラグメントも含むと理解される。特に好ましいフラグメントには、１つまたは複数のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の生物活性を有するものが含まれる。
【００５３】
さらに、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドには、一般に、Ｎ末端ドメインおよび／またはコラーゲンドメイン、好ましくはその両方を欠くＳＰ−Ｄ、好ましくはヒトＳＰ−Ｄの任意の組換えフラグメントが含まれる。したがって、好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、実質的に残基１〜１７８を欠く配列番号４に記載のＳＰ−Ｄ、好ましくはヒトＳＰ−Ｄの組換えフラグメントである。さらに好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、実質的に残基１７９〜３５５を含む配列番号４に記載のＳＰ−Ｄ、好ましくはヒトＳＰ−Ｄ配列の組換えフラグメントである。
【００５４】
好ましい実施形態では、ヒトＳＰ−Ｄ配列（配列番号４）の２００位に対応するプロリン残基が別の残基に置換されている。好ましくは、プロリン残基を非荷電の極性残基（例えば、システイン、セリン、トレオニン、またはメチオニン残基）に置換する。非常に好ましい実施形態では、プロリン残基を、セリン残基に置換する。したがって、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、配列番号１に記載の配列を含み得る。
【００５５】
上記の各配列のフラグメント、ホモログ、変異体、および誘導体もまた含まれる。
【００５６】
好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、実質的に以下の残基を含む「ヘッド」領域または炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を含む。
【化１】
2005522988.tif 000003
【００５７】
好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、別のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドとの多量体化手段、好ましくは三量体化を含む。このような手段には、例えば、別のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド上で、アビジンまたはストレプトアビジン部分と相互作用および結合するビオチン部分を含み得る。
【００５８】
さらに好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、実質的に以下の残基を含む「ネック」領域を含む。
【化２】
2005522988.tif 000004
【００５９】
好ましくは、このようなネック領域は、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）のＮ末端である。
【００６０】
好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、少なくとも１つのＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａストレッチ、好ましくは複数のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ反復を含む配列、最も好ましくは８つのＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ反復を含む配列をさらに含む。好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、実質的に
【化３】
2005522988.tif 000005
を含むＮ末端配列をさらに含む。
【００６１】
大いに好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、配列番号１に記載の配列を含み、好ましくは配列番号１に記載の配列からなる。したがって、本明細書中で使用される、用語「ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド」を、好ましくは、以下の配列、
【化４】
2005522988.tif 000006
（配列番号１）、ならびにそのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体をいうために使用すべきである。
【００６２】
開示のポリペプチドには、任意の供給源（例えば、関連ウイルス／細菌タンパク質）から得た相同配列、細胞ホモログ、および合成ペプチド、ならびにその変異体または誘導体も含まれる。したがって、ポリペプチドには、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）、詳細には霊長類、より詳細にはヒトなどの動物を含む他の種由来のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）のホモログをコードするポリペプチドも含まれる。より詳細には、ホモログには、ヒトホモログが含まれる。
【００６３】
したがって、本発明者らは、配列番号１に記載のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）配列のアミノ酸配列の変異体、ホモログ、または誘導体ならびにこのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の変異体、ホモログ、または誘導体を開示する。
【００６４】
好ましくは、本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメント、および誘導体は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の１つまたは複数の性質、好ましくはｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の１つまたは複数の生物活性を含む。したがって、変異体などは、好ましくは、１つまたは複数の活性（炭水化物結合活性、多量体化活性（三量体化活性を含む）、ケモカインのダウンレギュレーション、気道過敏症の軽減、肺胞マクロファージ数の減少、リン脂質レベルの低下（ＳＰ−Ｄを欠く動物に投与した場合）、アポトーシスおよび／または壊死マクロファージのクリアランスの増大、末梢血好酸球増多症の軽減、血清ＩｇＥの減少、血清ＩｇＧ１の減少、および実施例に開示の任意の生物活性または性質が含まれるが、これらに限定されない）を含む。
【００６５】
本明細書の文脈では、相同配列とは、配列番号１に記載のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）配列を含む少なくとも５０または１００超、好ましくは２００、３００、４００、または５００個のアミノ酸のアミノ酸レベルで少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％または９８％同一のアミノ酸配列を含むように使用する。特に、典型的には、必須ではない周辺配列よりもむしろタンパク質機能に必須であることが公知の配列領域に関して相同と見なすべきである。遠縁の生物由来の相同配列を考慮する場合、これは特に重要である。
【００６６】
相同性を類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）という用語で考慮することもできるが、本発明の文脈では、相同性は配列同一性の用語で示すことが好ましい。
【００６７】
目視、より一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムの支援によって相同性比較を行うことができる。このような公的に、および有料で利用可能なコンピュータプログラムは、２つまたはそれ以上の配列の間の相同％を計算することができる。
【００６８】
連続した配列に対して相同性％を計算することができる（すなわち、一方の配列を他の配列に整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較する）。これを、「非ギャップ（ungapped）」アラインメントという。典型的には、このような非ギャップアラインメントを、比較的少ない残基数（例えば、５０個未満の連続するアミノ酸）に対してのみ行う。
【００６９】
これは非常に単純且つ一貫した方法であるにもかかわらず、例えば、同一の配列対でなければ１つの挿入または欠失以降のアミノ酸残基がアラインメントから除外されることを考慮できないので、アラインメント全体で行った場合相同性％は大きく減少するかもしれない。したがって、ほとんどの配列比較法は、全体の相同性スコアに過度にペナルティーを科すことなく可能な挿入および欠失を考慮する至適アラインメントが得られるようにデザインされている。局所相同性を最大にしようとするために配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによってこれを行う。
【００７０】
しかし、これらのより複雑な方法では、同数の同一のアミノ酸について可能な限り少数のギャップ（２つの比較配列間でより高い関連性を反映する）を含む配列アラインメントが多数のギャップを含む配列アラインメントよりも高いスコアが得られるようにアラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てる。典型的には、ギャップの存在に比較的高いコストを課し、ギャップ中のその後の各残基のペナルティーをより小さくする「アフィンギャップコスト」を使用する。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。勿論、高いギャップペナルティーにより、より少ないギャップを含む最適化アラインメントが得られる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを修正可能である。しかし、このような配列比較ソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（以下を参照のこと）を使用した場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップについては−１２であり、各伸長については−４である。
【００７１】
したがって、最大相同性％の計算には、ギャップペナルティーを考慮した最適なアラインメントの作製が最初に必要である。このようなアラインメントを実行するための適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，３８７）である。それ以外の配列比較を行うことができるソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９、前出、第１８章を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３〜４１０）、および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ総合ソフトウェアが含まれるがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは共にオフラインおよびオンライン検索が可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９、前出、７−５８〜７−６０頁を参照のこと）。しかし、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。
【００７２】
最終相同性％を同一性に関して測定することができるにもかかわらず、アラインメントプロセス自体は、典型的には全か無かの対比較に基づいていない。そのかわり、一般に、化学的類似性または進化距離に基づく各対比較にスコアを割り当てる比較類似性スコア行列を使用する。一般的に使用されるこのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列−ＢＬＡＳＴプログラムパッケージのデフォルト行列である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、公表されたデフォルト値または供給されている場合はあつらえのシンボル比較を使用する（さらなる詳細についてはユーザマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケージの公表されたデフォルト値または他のソフトウェアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。
【００７３】
一旦ソフトウェアにより最適なアラインメントが得られると、相同性％、好ましくは配列同一性％を計算可能である。典型的には、ソフトウェアは配列比較の一部としてこれを行い、数値として結果を示す。
【００７４】
本発明のアミノ酸配列に関する用語「変異体」または「誘導体」には、得られたアミノ酸配列が非改変配列と実質的に同一の活性を保持する（好ましくは、配列番号１に記載のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドと同一の活性を有する）場合、配列からまたは配列への１つ（または複数の）アミノ酸の任意の置換、変化、改変、置換、欠失、または付加が含まれる。
【００７５】
実施例に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはホモログを、本明細書中に記載の方法および組成物で使用するために改変することができる。典型的には、配列の生物活性が維持されるように改変を行う。改変配列が改変されていない配列の生物活性を保持する場合、アミノ酸置換（例えば、１、２または３〜１０、２０、または３０個の置換）を行うことができる。あるいは、本明細書中に記載のポリペプチドの１つまたは複数の機能ドメインを意図的に不活化させるように改変することができる。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の機能ドメインには、コラーゲンドメイン、ネック領域、および炭水化物認識ドメインが含まれる。アミノ酸置換には、例えば、治療目的で投与したポリペプチドの血漿半減期を増大させるための非天然類似体の使用を含んでもよい。
【００７６】
例えば、以下の表にしたがって、保存的置換を行うことができる。第２列中の同一のブロックおよび好ましくは第３列中の同一行中のアミノ酸を互いに置換することができる。
【表１】
2005522988.tif 000007
【００７７】
ポリペプチドには、サーファクタントタンパク質Ｄの全長配列のフラグメントも含まれる。好ましくは、フラグメントは、少なくとも１つのエピトープを含む。エピトープの識別方法は、当分野で周知である。フラグメントは、典型的には、少なくとも６個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１０、２０、３０、５０、または１００個のアミノ酸を含む。
【００７８】
ｒ−ＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を含む組換えＳＰ−Ｄを、典型的には、組換え手段（例えば、以下の実施例に記載の手段）によって作製する。しかし、固相合成などの当業者に周知の技術を使用した合成手段によってこれらを作製することもできる。タンパク質を、例えば、抽出および精製を補助するために融合タンパク質として産生することもできる。融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）、およびβ−ガラクトシダーゼが含まれる。融合タンパク質配列を除去するために、融合タンパク質パートナーと目的のタンパク質配列との間にタンパク質分解部位を含むように変換することもできる。好ましくは、融合タンパク質は、目的のタンパク質配列の機能を妨害しない。動物細胞由来の細胞抽出物の精製によってタンパク質を得ることもできる。
【００７９】
本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、その変異体、ホモログ、フラグメント、および誘導体は、実施的に単離した形態であり得る。このようなポリペプチドを、タンパク質の意図する目的を妨害しないキャリアまたは希釈剤と混合することができ、依然として実質的に単離されていると見なされると理解される。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の変異体、ホモログ、フラグメント、または誘導体はまた、実質的に精製された形態であり得る（この場合、一般に、調製物中に９０％を超える（例えば、調製物中に９５％、９８％、または９９％のタンパク質がタンパク質である）タンパク質を含む）。
【００８０】
本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、その変異体、ホモログ、フラグメント、および誘導体を、標示標識（revealing label）で標識することができる。標示標識は、ポリペプチドなどを検出可能な任意の適切な標識であり得る。適切な標識には、放射性同位体（例えば、125Ｉ）、酵素、抗体、ポリヌクレオチド、ビオチンなどのリンカーが含まれる。標識されたポリペプチドを、サンプル中のポリペプチドの量を決定するための免疫アッセイなどの診断方法において使用することができる。ポリペプチドまたは標識ポリペプチドを、標準的なプロトコールを使用した動物およびヒトでのポリペプチドに対する免疫反応の検出のための血清学的または細胞媒介免疫アッセイで使用することもできる。
【００８１】
任意選択的に標識された本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、その変異体、ホモログ、フラグメント、および誘導体を、固相（例えば、免疫アッセイウェルまたはディップスティックの表面）に固定することもできる。このような標識ポリペプチドおよび／または固定ポリペプチドを、安定な試薬、コントロール、および説明書などと共に適切な容器中のキットにパッケージングすることができる。このようなポリペプチドおよびキットを、免疫アッセイによるポリペプチドまたはその対立遺伝子もしくは種変異体に対する抗体の検出方法で使用することができる。
【００８２】
免疫アッセイ法は当分野で周知であり、一般に、（ａ）タンパク質に対する抗体によって結合することができるエピトープを含むポリペプチドを得るステップと、（ｂ）抗体−抗原複合体が形成する条件下で生体サンプルとポリペプチドをインキュベートするステップと、（ｃ）ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されるかどうかを判断するステップとを含む。
【００８３】
本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、その変異体、ホモログ、フラグメント、および誘導体をインビトロまたはインビボ細胞培養系で使用して、疾患での機能を含む細胞機能におけるその対応する遺伝子およびホモログの役割を研究することができる。例えば、短縮ポリペプチド（truncated polypeptide）または改変ポリペプチドを、細胞に組み込んで、細胞で生じる正常な機能を破壊することができる。組換え発現ベクターからのポリペプチドのインサイチュー発現によって、ポリペプチドを細胞に組み込むことができる（以下を参照のこと）。発現ベクターは、任意選択的に、ポリペプチド発現を調節するための誘導プロモーターを含む。
【００８４】
組換え発現産物に対して最適な生物活性を付与することが必要であり得るので、昆虫細胞または哺乳動物細胞などの適切な宿主細胞の使用により、このような翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、短縮、脂質化、ならびにチロシン、セリン、またはトレオニンのリン酸化）が得られることが予想される。本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、その変異体、ホモログ、フラグメント、および誘導体を発現するこのような細胞培養系をアッセイ系で使用して、細胞中のポリペプチドの機能を妨害または増強する候補物質を同定することができる。
【００８５】
［組換えサーファクタントタンパク質ＤのＲＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）核酸］
本発明者らは、本発明者らが「ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸」と呼ぶｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明者らはまた、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の変異体、ホモログ、誘導体、およびフラグメントをコードする核酸、ならびにｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸のフラグメント、ホモログ、誘導体、および変異体を提供する。
【００８６】
好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸は、天然のＳＰ−Ｄ配列（例えば、配列番号３に記載のヒトＳＰ−Ｄ配列）に由来する。より好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸は、Ｎ末端ドメインおよび／またはコラーゲンドメイン、好ましくはそれらの両方をコードする配列を欠く。好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸は、実質的に残基１〜５９４、その任意のフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を欠く配列番号３に記載のＳＰ−Ｄ、好ましくはヒトＳＰ−Ｄの組換えフラグメントである。さらに好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸は、実質的に残基５９５〜１１２８を含む配列番号３に記載のＳＰ−Ｄ、好ましくはヒトＳＰ−Ｄ配列の組換えフラグメントである。上記各配列のフラグメント、ホモログ、変異体、および誘導体もまた含まれる。
【００８７】
好ましい実施形態では、ヒトＳＰ−Ｄ配列（配列番号４）の２００位に対応するプロリン残基をコードするトリプレットを、別の残基をコードするコドンに置換する。好ましくは、プロリン残基を、非荷電の極性残基（例えば、システイン、セリン、トレオニン、またはメチオニン残基）に置換する。非常に好ましい実施形態では、プロリン残基を、セリン残基に置換する。したがって、好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸は、配列番号３に記載のヒトＳＰ−Ｄ配列の５９８〜５６０位にセリンをコードするコドンを含み得る。したがって、このような置換コドンは、ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、およびＴＣＴを含み得る。最も好ましくは、置換コドンは、ＡＧＣを含む。
【００８８】
好ましくは、このようなｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸は、配列番号１に記載の配列を有するｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドをコードする。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸は、好ましくは配列番号２に記載の配列を含み、より好ましくは配列番号２に記載の配列からなる。
【００８９】
本明細書中で使用される、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」は、互いに類義であることが意図される。「ポリヌクレオチド」は、一般に、改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖、より典型的には二本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、あるいはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域をいう。用語「ポリヌクレオチド」はまた、１つまたは複数の改変された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性もしくは他の理由のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「改変された」塩基には、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの通常でない塩基が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡに対して種々の改変が行われているので、「ポリヌクレオチド」は、天然で典型的に見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を含む。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドを含む。
【００９０】
多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸は、遺伝コードの縮重の結果として同一のポリペプチドをコードすることができることが当業者に理解される。さらに、通常の技術を使用して、当業者によって、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するための本明細書中に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチドの置換が行われることが理解される。
【００９１】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸、変異体、フラグメント、誘導体、およびホモログは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。これらは、一本鎖または二本鎖であり得る。これらはまた、合成ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドの範囲内に含まれるポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なる改変型が当分野で公知である。これらには、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端へのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的のために、ポリヌクレオチドを当分野で利用可能な任意の方法によって改変することができると理解される。目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増大させるためにこのような改変を行うことができる。
【００９２】
ヌクレオチド配列に関する用語「変異体」、「ホモログ」、または「誘導体」には、配列由来または配列に対するの１つ（または複数の）核酸の任意の置換、変形、改変、置換、欠失、または付加が含まれる。好ましくは、変異体、ホモログ、または誘導体は、生物活性を有するポリペプチドをコードする。
【００９３】
上記のように、配列相同性に関して、本明細書中の配列表に記載の配列と好ましくは少なくとも５０％または７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％相同である。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％相同である。上記のように、核酸相同性を比較することができる。好ましい配列比較プログラムは、上記のＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトスコアリング行列は、各同一のヌクレオチドについては１０、各ミスマッチについては−９の適合値を有する。各ヌクレオチドについてのデフォルトギャップ作製ペナルティーは−５０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティーは−３である。
【００９４】
本発明者らは、本明細書中に示す配列またはその任意の変異体、フラグメント、もしくは誘導体または任意の上記の相補物に選択的にハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列をさらに記載する。ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２０、３０、４０、または５０ヌクレオチド長である。
【００９５】
本明細書中で使用される、用語「ハイブリッド形成」は、「核酸の鎖が塩基の組み合わせ（pairing）によって相補鎖と連結するプロセス」ならびにポリメラーゼ連鎖反応技術で実施される増幅プロセスを含む。
【００９６】
本明細書中に記載のヌクレオチド配列またはその相補物と選択的にハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドは、本明細書中に記載の対応するヌクレオチド配列に対して、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個または３０個、例えば少なくとも４０個、６０個、または１００個またはそれ以上の連続したヌクレオチド領域に対して一般に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％または９０％、およびより好ましくは少なくとも９５％または９８％相同である。
【００９７】
用語「選択的にハイブリッド形成可能な」は、プローブとして使用されるポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドがバックグラウンドを有意に超えるレベルでプローブとハイブリッド形成することが見出される条件下で使用することを意味する。例えば、スクリーニングされるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー中に存在する他のヌクレオチドのために、バックグラウンドハイブリッド形成が起こり得る。この事象では、バックグラウンドは、標的ＤＮＡで認められる特異的相互作用の１／１０未満、好ましくは１／１００未満の強度のプローブとライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーとの間の相互作用によって得られるシグナルレベルを意味する。相互作用の強度を、例えば、プローブの放射性標識（例えば、32Ｐを使用する）によって測定することができる。
【００９８】
ハイブリッド形成条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７、「分子クローニング技術ガイド」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で教示されている核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、以下に説明のように「ストリンジェンシー」の定義を参照のこと。
【００９９】
最大ストリンジェンシーは、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）；高ストリンジェンシーはＴｍより約５℃〜１０℃低い温度、中程度のストリンジェンシーはＴｍより約１０℃〜２０℃低い温度、低ストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜５０℃低い温度で得られる。当業者が理解するように、最大ストリンジェンシーハイブリッド形成を使用して、同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出することができ、中程度（または低）ストリンジェンシーハイブリッド形成を使用して、類似のまたは関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出することができる。
【０１００】
好ましい態様では、本発明者らは、ストリンジェントな条件下（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）））で、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸、フラグメント、変異体、ホモログ、または誘導体とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を提供する。
【０１０１】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二重鎖の両鎖（個別または組み合わせのいずれか）は、本明細書中に記載の方法および組成物に含まれる。ポリヌクレオチドが一本鎖の場合、ポリヌクレオチドの相補配列も含まれると理解される。
【０１０２】
本発明の配列に１００％相同ではないが本発明の範囲内に含まれるポリヌクレオチドを、多数の方法で得ることができる。配列の他の変異体を、例えば、一定範囲の個体（例えば、異なる集団由来の個体）から作製したＤＮＡライブラリーの探索によって得ることができる。例えば、ＳＰ−Ｄホモログを、他の個体または他の種から同定することができる。さらなる組換えＳＰ−Ｄ核酸およびポリペプチドを、ホモログ中の対応する位置の同定および本明細書中に記載の分子の合成または産生によって産生することができる。さらに、このようなホモログ中のコラーゲン領域、ネック領域、および炭水化物結合ドメインを、例えば、配列の目視またはコンピュータ支援比較によって同定し、非ヒトであるが１つまたは複数のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の生物活性を有する組換えＳＰ−Ｄへの組み合わせまたは産生について選択することができる。
【０１０３】
さらに、ＳＰ−Ｄの他のウイルス／細菌または細胞ホモログ、特に哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ、および霊長類の細胞）で見出される細胞ホモログを得ることができ、このようなホモログおよびそのフラグメントは、一般に、ヒトＳＰ−Ｄと選択的にハイブリッド形成することができる。このようなホモログを使用して、非ヒトｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸、フラグメント、変異体、およびホモログをデザインすることができる。さらなる変種（variety）を産生するために、当分野で公知の手段によって変異誘発を行うことができる。
【０１０４】
ＳＰ−Ｄホモログ配列を、中程度から高ストリンジェンシー条件下での他の動物種由来のゲノムＤＮＡライブラリーから作製したｃＤＮＡライブラリーの探索およびｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸、フラグメント、変異体、およびホモログの全部もしくは任意の一部、またはＳＰ−Ｄの他のフラグメントを含むプローブでのこのようなライブラリーの探索によって得ることができる。
【０１０５】
類似の検討材料を適用して、本明細書に開示のポリペプチドまたはヌクレオチド配列の種ホモログおよび対立遺伝子変異体を得る。
【０１０６】
変異体および株／種ホモログを、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸配列内の保存アミノ酸配列をコードする変異体およびホモログ内の配列を標的するようにデザインしたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを使用しても得ることができる。例えば、アミノ酸配列のいくつかの変異体／ホモログとの整列によって保存配列を予想することができる。当分野で公知のコンピュータソフトウェアを使用して、配列アラインメントを行うことができる。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵＰプログラムが広く一般に使用されている。
【０１０７】
縮重ＰＣＲで使用されるプライマーは、１つまたは複数の縮重点を含み、既知の配列に対して１つの配列プライマーを使用した配列のクローニングで使用したものよりも低いストリンジェンシー条件で使用される。遠縁の生物由来の配列間の総ヌクレオチド相同性が非常に低いようなので、これらの条件下では、縮重ＰＣＲは、標識フラグメント（ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）配列）を使用したライブラリーのスクリーニングよりもむしろ最適な方法であり得る。
【０１０８】
さらに、ＢＬＡＳＴプログラムスーツなどの検索アルゴリズムを使用したヌクレオチドおよび／またはタンパク質データベースの検索によって相同配列を同定することができる。
【０１０９】
あるいは、このようなポリヌクレオチドを、特定決定された配列（例えば、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸、またはその変異体、ホモログ、誘導体、またはフラグメント）の部位特異的変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞のコドン優先度を至適化するために配列のサイレントなコドンを変化させる必要がある場合に有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するためまたはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの性質または機能を変化させるために、他の配列の変化を所望することができる。
【０１１０】
本明細書中に記載のポリヌクレオチドを使用して、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー（別の増幅反応用のプライマー））、プローブ（例えば、放射性または非放射性標識を使用して従来の手段によって標示標識を使用して標識）を産生することができるか、ポリヌクレオチドをベクターにクローン化することができる。このようなプライマー、プローブ、および他のフラグメントは、少なくとも８、９、１０、または１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０、または４０ヌクレオチド長であり、これらもまた本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」に含まれる。
【０１１１】
ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドおよびプローブを、組換え、合成、または当業者が利用可能な任意の手段によって作製することができる。これらを、標準的な技術によってクローン化することもできる。
【０１１２】
一般に、プライマーを、所望の核酸配列の一度に１ヌクレオチドの段階的製造を含む合成手段によって産生する。自動化技術を使用してこの手段を行う技術は、当分野で容易に利用可能である。
【０１１３】
一般に、組換え手段（例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術の使用）を使用してより長いポリヌクレオチドを産生する。これは、クローン化を所望する脂質ターゲティング配列領域に隣接するプライマー対（例えば、約１５〜３０ヌクレオチド）を作製するステップと、プライマーを動物またはヒト細胞から得たｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させるステップと、所望の領域を増幅する条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行うステップと、増幅されたフラグメントを単離するステップ（例えば、アガロースゲルでの反応混合物の精製）と、増幅されたＤＮＡを回収するステップとを含む。プライマーを、増幅されたＤＮＡを適切なクローニングベクターにクローン化することができる適切な制限酵素認識部位を含むようにデザインすることができる。
【０１１４】
ポリヌクレオチドまたはプライマーは、標示標識を保有することができる。適切な標識には、32Ｐおよび35Ｓなどの放射性同位体、酵素標識、ビオチンなどの他のタンパク質標識が含まれる。このような標識をポリヌクレオチドまたはプライマーに付加し、それ自体公知の技術を使用して検出することができる。当業者は、ヒトまたは動物体内のポリヌクレオチドの検出または配列決定のための核酸ベースの試験において、標識または非標識のポリヌクレオチドもしくはプライマーまたはそのフラグメントを使用することができる。
【０１１５】
このような検出試験は、一般に、ハイブリッド形成条件下でＤＮＡまたはＲＮＡを含む生体サンプルをポリヌクレオチドまたはプローブを含むプローブと接触させるステップと、サンプル中でプローブと核酸との間に形成された任意の二重鎖を検出するステップとを含む。ＰＣＲなどの技術を使用するか、固体支持体上のプローブの固定、サンプル中のプローブとハイブリッド形成しない核酸の除去、およびプローブとハイブリッド形成した核酸の検出によって、このような検出を行うことができる。あるいは、サンプル核酸を、固体支持体に固定し、このような支持体に結合したプローブの量を検出することができる。これの適切なアッセイ方法および他の形式を、例えば、ＷＯ８９／０３８９１およびＷＯ９０／１３６６７で見出すことができる。
【０１１６】
ヌクレオチド（例えば、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸）の配列決定試験は、ハイブリッド形成条件下で標的ＤＮＡまたはＲＮＡを含む生体サンプルをポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブと接触させるステップと、例えば、サンガーのダイデオキシ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）によって配列を決定するステップとを含む。
【０１１７】
このような方法は、一般に、適切な試薬の存在下で標的ＤＮＡまたはＲＮＡに相補的な鎖の合成によってプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴ／Ｕ残基で伸長反応を選択的に停止させるステップと、鎖伸長反応および停止反応を起こさせるステップと、伸長産物をサイズによって分離して選択的に終結したヌクレオチド配列を決定するステップとを含む。適切な試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、緩衝液、ならびにＡＴＰが含まれる。ダイデオキシヌクレオチドを、選択的終結のために使用する。
【０１１８】
［核酸ベクター］
ポリヌクレオチド（例えば、本明細書中に記載のもの）を、組換え複製ベクターに組み込むことができる。ベクターを使用して、適合する宿主細胞中で核酸を複製することができる。したがって、さらなる実施形態では、本発明者らは、複製ベクターにポリヌクレオチドを移入するステップと、適合する宿主細胞にベクターを移入するステップと、宿主細胞をベクターが複製する条件下で増殖させるステップとによってポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターを宿主細胞から回収することができる。適切な宿主細胞には、大腸菌などの細菌、酵母、哺乳動物細胞株、および他の真核細胞株（例えば、昆虫Ｓｆ９細胞）が含まれる。
【０１１９】
好ましくは、ベクター中のポリヌクレオチドを、宿主細胞によってコード配列を発現することができる調節配列に作動可能に連結する（すなわち、ベクターは発現ベクターである）。用語「作動可能に連結された」は、記載の成分がその意図する様式で機能する関係にあることを意味する。コード配列に、「作動可能に連結された」調節配列を、調節配列に適合する条件下でコード配列が発現する方法でライゲーションする。
【０１２０】
例えば、さらなる転写調節エレメントの付加によって調節配列を改変して、転写モジュレーターに、より反応性を示す調節配列によって指示された転写レベルを得ることができる。
【０１２１】
ベクターを、以下に記載のように、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトして、タンパク質を発現させることができる。このプロセスは、タンパク質をコードするコード配列のベクターによって発現する条件下で上記の発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するステップと、任意選択的に発現したタンパク質を回収するステップとを含み得る。使用した宿主細胞に適合するベクターを選択する。
【０１２２】
ベクターは、例えば、複製起点、任意選択的にポリヌクレオチド発現用のプロモーター、および任意選択的にプロモーターのレギュレーターを使用して得たプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子（例えば、細菌プラスミドの場合は、アンピシリン耐性遺伝子または哺乳動物ベクターにはネオマイシン耐性遺伝子）を含み得る。例えば、ベクターを使用して、宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換することができる。
【０１２３】
ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された調節配列には、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルが含まれる。これらの調節配列を、発現ベクターが使用されるようにデザインされた宿主細胞に適合するように選択することができる。用語「プロモーター」は、当分野で周知であり、最小プロモーターから上流エレメントおよびエンハンサーを含むプロモーターまでの、サイズおよび複雑さの範囲の核酸配列を含む。
【０１２４】
プロモーターは、典型的には、哺乳動物細胞において機能するプロモーターから選択されるが、原核プロモーターおよび他の真核細胞（昆虫細胞など）において機能するプロモーターを使用することができる。プロモーターは、典型的には、ウイルスまたは真核生物遺伝子のプロモーター配列由来である。例えば、発現する細胞のゲノム由来のプロモーターであり得る。真核プロモーターに関して、これらは普遍的様式（αアクチン、βアクチン、チューブリンプロモーターなど）または組織特異的様式（ピルビン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターなど）で機能するプロモーターであり得る。これらはまた、特異的な刺激に反応するプロモーター（例えば、ステロイドホルモン受容体に結合するプロモーター）であり得る。ウイルスプロモーターも使用することができる（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、またはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター）。
【０１２５】
細胞の生存期間中に異種遺伝子の発現レベルを調節することができるように誘導可能なこともまたプロモーターに有利であり得る。「誘導可能な」とは、プロモーターを使用して得られた発現レベルを調節することができることを意味する。
【０１２６】
さらに、任意のこれらのプロモーターを、さらなる調節配列（例えば、エンハンサー配列）の付加によって改変することができる。上記の２つまたはそれ以上の異なるプロモーター由来の配列エレメントを含むキメラプロモーターを使用することもできる。
【０１２７】
アンチセンスＲＮＡを産生するために、ポリヌクレオチドを、アンチセンス方向で上記のベクターに挿入することができる。合成手段によって、アンチセンスＲＮＡまたは他のアンチセンスポリヌクレオチドを産生することもできる。このようなアンチセンスポリヌクレオチドを、本明細書中に記載の任意の１つのポリヌクレオチドを含む遺伝子から転写されたＲＮＡのレベルを調製する方法に使用することができる。
【０１２８】
［宿主細胞］
ベクター／ポリヌクレオチドを複製し、そして／またはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する目的で、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を含むかコードするベクターおよびポリヌクレオチドを宿主細胞に移入することができる。宿主細胞として原核細胞を使用してポリペプチドを産生することができるが、真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞（特に、哺乳動物細胞など））を使用することが好ましい。
【０１２９】
ベクター／ポリヌクレオチドを、当分野で公知の種々の技術（トランスフェクション、形質転換、およびエレクトロポレーションなど）を使用して適切な宿主細胞に移入することができる。ベクター／ポリヌクレオチドを動物に投与する場合、いくつかの技術が当分野で公知である（例えば、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびアデノウイルスなどの組換えウイルスベクターでの感染、核酸の直接注射、および遺伝子銃形質転換など）。
【０１３０】
［タンパク質の発現および精製］
ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を使用して、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドなどのポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を発現することができる。宿主細胞を、タンパク質が発現する適切な条件下で培養することができる。ポリペプチドの発現は、これらが継続的に産生されるような構成性、または誘導性であって、発現を開始させる刺激を必要とし得る。誘導発現の場合、例えば、培養培地へのインデューサー物質（例えば、デキサメタゾンまたはＩＰＴＧ）の添加が必要な場合に、タンパク質産生を開始することができる。
【０１３１】
ポリペプチドを、当分野で公知の種々の技術（酵素溶解、化学的および／または浸透圧溶解、ならびに物理的破壊を含む）によって宿主細胞から抽出することができる。
【０１３２】
ポリペプチドを、ＴｎＴ（登録商標、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）ウサギ網状赤血球系などのインビトロ無細胞系で組換え産生することもできる。
【０１３３】
［抗体］
本発明はまた、ポリペプチドまたはそのフラグメントに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を提供する。したがって、本発明は、さらに、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生プロセスを提供する。
【０１３４】
ポリクローナル抗体を所望する場合、選択した哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、ポリペプチド由来のエピトープを保有する免疫原性ポリペプチドで免疫する。免疫動物由来の血清を回収し、公知の手順にしたがって処理する。ポリペプチド由来のエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清が他の抗原に対する抗体を含む場合、ポリクローナル抗体を、免疫親和性クロマトグラフィによって精製することができる。ポリクローナル抗血清の産生および処理技術は、当分野で公知である。このような抗体を作製することができるように、本発明はまた、動物またはヒトにおける免疫原として使用するための別のポリペプチドに対してハプテン化したポリペプチドまたはそのフラグメントを提供する。
【０１３５】
ポリペプチド中のエピトープに対するモノクローナル抗体を、当業者は容易に産生することもできる。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の一般的な作製方法は周知である。不死化抗体産生細胞株を、細胞融合、癌性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接的な形質転換、またはエプスタイン・バーウイルスでのトランスフェクションなどの他の技術によっても作製することができる。ポリペプチド中のエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルを、種々の性質（すなわち、イソ型およびエピトープ親和性）についてスクリーニングすることができる。
【０１３６】
別の技術は、例えば、ファージがその外殻表面上にｓｃＦｖフラグメントを発現するファージディスプレイライブラリーを非常に多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）でスクリーニングするステップを含む。この技術は、当分野で周知である。
【０１３７】
ポリペプチド由来のエピトープに対する抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方）は特に診断で有用であり、中和する抗体は、受動免疫治療で有用である。特にモノクローナル抗体を使用して、抗イディタイプ抗体を惹起することができる。抗イディオタイプ抗体は、保護が望まれる薬剤の抗原の「内部イメージ」を有する免疫グロブリンである。
【０１３８】
抗イディオタイプ抗体を惹起する技術は、当分野で公知である。これらの抗イディオタイプ抗体もまた、治療に有用であり得る。
【０１３９】
本発明の目的のために、用語「抗体」は、特記しない限り、標的抗原への結合活性を保持する全抗体のフラグメントが含まれる。このようなフラグメントには、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）、およびＦ（ａｂ’）2フラグメントならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。さらに、抗体およびそのフラグメントは、例えば、欧州特許第２３９４００号に記載のヒト化抗体であり得る。
【０１４０】
（ａ）抗体を得るステップと、（ｂ）抗体−抗原複合体を形成する条件下で生体サンプルを抗体とインキュベートするステップと、（ｃ）抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されたかを判断するステップとを含む方法による生体サンプル中に存在するポリペプチドの検出方法で抗体を使用することができる。
【０１４１】
適切なサンプルには、脳、乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉、および骨組織などの組織由来の抽出物またはこのような組織由来の新生物成長物由来の抽出物が含まれる。
【０１４２】
抗体を、固体支持体に結合させ、そして／または適切な試薬、コントロール、および説明書などを含む適切な容器中のキットにパッケージングすることができる。
【０１４３】
［アッセイ］
本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体に結合する物質の同定に適切なアッセイを開示する。
【０１４４】
一般に、このような結合アッセイは、候補分子にｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を曝露するステップと、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体と候補分子との間の相互作用または結合を検出するステップを含む。結合アッセイを、インビトロまたはインビボで行うことができる。
【０１４５】
本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドの活性を増強することができる物質の同定アッセイを開示する。このような化合物を、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのアゴニストとして使用することができ、例えば、任意の所望の効果を増強するために個体に同時投与することができる。
【０１４６】
一般に、このような物質または化合物の同定アッセイは、細胞または生物を得るステップと、細胞または生物をｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体に曝露するステップと、細胞を候補分子に曝露するステップと、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）に関連する効果を検出するステップとを含む。本明細書中（特に、実施例）に開示の任意のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド媒介効果を検出することができる。
【０１４７】
特に、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド媒介効果を、末梢血好酸球増多症の軽減、血清ＩｇＥレベルの低下、血清ＩｇＧ１レベルの低下、気道過敏症の軽減、肺胞マクロファージ数の減少、洗浄物中のリン脂質レベルの低下、エオタキシン発現のダウンレギュレーション、ＭＣＰ−１発現の減少、ＭＩＰ−１α発現のダウンレギュレーション、およびＭＩＰ−２発現のダウンレギュレーションからなる群から選択することが好ましい。
【０１４８】
アゴニストを同定するために、さらなる効果、または好ましくは相乗効果を検出する。したがって、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのみで、例えば、分子のレベルまたは数を減少させるか分子発現をダウンレギュレーションすることができ、アッセイは分子のレベルまたは数をさらに減少させるか分子発現をさらにダウンレギュレーションする分子を同定する。したがって、好ましくは、候補分子は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体と共に、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのみと比較して、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、またはそれ以上の発現をダウンレギュレーションするかレベルまたは数を減少させる。したがって、例えば、アゴニストとしての使用に適切な候補分子は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのみで達成される肺胞マクロファージ数の減少を１０％超増強することができる分子である。
【０１４９】
逆に、アンタゴニストの同定アッセイは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド媒介効果の減少の検出を含む。好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドによって達成される発現のダウンレギュレーションまたは数もしくはレベルの低下は、適切な候補分子の存在下で減少する。好ましくは、減少は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのみのみと比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、またはそれ以上である。したがって、例えば、アンタゴニストとしての使用に適切な候補分子は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのみで達成される肺胞マクロファージ数の減少を１０％超減少することができる分子である。
【０１５０】
例示のように、Ｎ１が非処置生物中の肺胞マクロファージ数であり、Ｎ２はｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体に曝露した生物中の数であり場合、肺胞マクロファージ数は、Ｒ＝（Ｎ１−Ｎ２）／Ｎ１×１００％減少する。アゴニストはｘが１以上である因数ｘ（例えば、ｘ＝１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００など）でＲを増加させ、アンタゴニストはｘが１未満である因数ｘ（例えば、ｘ＝０．９、０．９、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１など）でＲを減少させる。
【０１５１】
例えば、生物を、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体および候補分子に曝露し、末梢好酸球レベル、血清ＩｇＥ、血清ＩｇＧ１、または任意の組み合わせを検出することができる。候補分子と共にｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体に曝露した生物の気道過敏症または肺胞マクロファージ数を検出することもできる。
【０１５２】
好ましい候補分子は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）と組み合わせてさらなる効果または相乗効果を提供する分子である。
【０１５３】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのアンタゴニストを同定するためのアッセイもまた開示する。このようなアッセイは、候補分子と組み合わせたｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体への細胞または生物の曝露に対する効果の減少を検出するステップを含む。
【０１５４】
好ましい実施形態では、細胞よりもむしろ生物全体に対してアッセイを行う。好ましくは、生物は、本明細書中に開示の疾患を罹患しているか、このような疾患の１つまたは複数の症状を示す生物である。非常に好ましい実施形態では、生物は、サーファクタントタンパク質Ｄを発現しない生物である。好ましくは、このような生物は、ＳＰ−Ｄ遺伝子が破壊または欠失している。より好ましくは、生物は、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、好ましくは、Ｂｏｔａｓ，Ｃ．ら、「サーファクタントタンパク質Ｄを欠くマウスのサーファクタントのホメオスタシスの変化および肺胞ＩＩ型細胞の形態学」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５（２０）、１１８６９〜７４頁に記載のように作製したＳＰ−Ｄノックアウトマウスである。
【０１５５】
［候補分子］
上記アッセイで使用するための適切な候補分子には、特にアミノ酸サイズが約５〜３０または１０〜２５のペプチドが含まれる。ランダムな配列または最大に多様なペプチドパネルを一貫して得るために変化させた配列を含むペプチドパネル由来のペプチドを使用することができる。
【０１５６】
適切な候補分子には、抗体産物（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、およびＣＤＲグラフト抗体）も含まれる。さらに、コンビナトリアルライブラリー、ペプチド、ペプチド模倣物、定義された化学物質、オリゴヌクレオチド、および天然物のライブラリーを活性についてスクリーニングすることができる。候補分子を、例えば、反応あたり１０種の分子のバッチおよび個別に試験したｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド媒介効果の増強または減少を示すバッチの分子における最初のスクリーニングで使用することができる。
【０１５７】
［ライブラリー］
ポリペプチドまたは核酸のライブラリーなどの候補分子のライブラリーを、本明細書中に記載の方法および組成物で使用することができる。このようなライブラリーを、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体の存在下で細胞または生物に曝露し、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド媒介効果を検出する。
【０１５８】
ファージディスプレイ技術に代表される巨大ライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコールは当分野で公知である。種々のペプチド配列が糸状バクテリオファージの表面上にディスプレイされるような系（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９０，前出）は、標的抗原に結合する特異的抗体フラグメントのインビトロ選択および増幅のための抗体フラグメント（およびこれをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーの作製に有用であることが証明されている。ＶH領域およびＶL領域をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌の原形質周囲の空間に指向させるリーダーシグナルをコードする遺伝子フラグメントに連結し、結果として、典型的にはバクテリオファージ外殻タンパク質（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）への融合物として得られた抗体フラグメントがバクテリオファージの表面上にディスプレイされる。あるいは、抗体フラグメントは、λファージのキャプシド（ファージボディ）の外面上にディスプレイされる。ファージベースのディスプレイ系の利点は、生物系であるので、細菌細胞中に選択されたライブラリーメンバーを含むファージの成長によって選択されたライブラリーメンバーを単純に増幅することができるという点である。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージまたはファージミドベクター上に含まれるので、配列決定、発現、およびその後の遺伝子操作が比較的簡単である。
【０１５９】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築方法は、当分野で周知である（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，１９９０，前出；Ｋａｎｇら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４３６３；Ｃｌａｃｋｓｏｎら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４；Ｌｏｗｍａｎら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１０８３２；Ｂｕｒｔｏｎら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９，４１３３；Ｃｈａｎｇら，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，１９９１，Ｇｅｎｅ，１０４，１４７；Ｍａｒｋｓら，１９９１，前出；Ｂａｒｂａｓら，１９９２，前出；Ｈａｗｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２，８６７；Ｍａｒｋｓら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１６００７；Ｌｅｒｎｅｒら，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８，１３１３（引用することにより本明細書の一部をなすものとする））。一般にポリペプチドライブラリーの発現のためにこのような技術を必要に応じて修正することができる。
【０１６０】
１つの特に有利なアプローチは、ｓｃＦｖファージ−ライブラリーの使用であった（Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３〜６；Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５，５８７９〜５８８３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１０６６〜１０７０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，１９９０，前出；Ｃｌａｃｋｓｏｎら，１９９１，前出；Ｍａｒｋｓら，１９９１，前出；Ｃｈｉｓｗｅｌｌら，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０，８０；Ｍａｒｋｓら，１９９２，前出）。バクテリオファージ外殻タンパク質上にディスプレイされるｓｃＦｖライブラリーの種々の実施形態が記載されている。ファージディスプレイアプローチの改良も公知である（例えば、ＷＯ９６／０６２１３号およびＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌら）およびＷＯ９７／０８３２０号（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、前出）（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載）。
【０１６１】
別のライブラリー選択技術には、バクテリオファージプラークまたは溶原菌コロニー（共に以前に記載されている）として直接スクリーニングすることができるλバクテリオファージ発現系が含まれ（Ｈｕｓｅら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５；Ｃａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７；Ｍｕｌｌｉｎａｘら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，８０９５；Ｐｅｒｓｓｏｎら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２４３２）、本発明で使用されている。これらの発現系を使用して、ライブラリーの多数の異なるメンバーを約１０6またはそれ以上のオーダーでスクリーニングすることができる。他のスクリーニング系は、例えば、ライブラリーメンバーの直接的化学合成に依存する。１つの初期の方法は、ＷＯ８４／０３５６４号などに記載のピンまたはロッドのセットでのペプチド合成を含む。各ビーズが各ライブラリーメンバーであるペプチドライブラリーを形成するビーズ上でのペプチド合成を含む類似の方法は、米国特許第４，６３１，２１１号に記載されており、関連する方法は、ＷＯ９２／０００９１号に記載されている。ビーズベースの方法の有意な改良は、各ライブラリーメンバーのアミノ酸配列の同定を容易にするためのオリゴヌクレオチドなどの固有の識別タグでの各ビーズのタグ化を含む。これらの改良されたビーズベースの方法は、ＷＯ９３／０６１２１号に記載されている。
【０１６２】
別の化学合成法は、アレイ中の不連続の所定の位置にそれぞれ異なるライブラリーメンバー（例えば、固有のペプチド配列）を位置付ける様式での表面上でのペプチドアレイ（またはペプチド模倣物）の合成を含む。各ライブラリーメンバーの同一性を、アレイ中のその空間的位置によって決定する。所定の分子（例えば、受容体）と反応性ライブラリーメンバーとの間で結合相互作用が起こるアレイ中の位置を決定し、それにより、空間的位置を基本として反応性ライブラリーメンバーの配列を同定する。これらの方法は、米国特許第５，１４３，８５４号；ＷＯ９０／１５０７０号およびＷＯ９２／１００９２号；Ｆｏｄｏｒら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，７６７；Ｄｏｗｅｒ  ａｎｄ  Ｆｏｄｏｒ，１９９１，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２６，２７１に記載されている。
【０１６３】
ポリペプチドまたはヌクレオチドのライブラリーを作製するための他の系は、ライブラリーメンバーのインビトロ合成のための無細胞酵素機構の使用を含む。１つの方法では、ＲＮＡ分子を、標的リガンドに対する別ラウンドの選択およびＰＣＲ増幅によって選択する（Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８）。類似の技術を使用して、所定のヒト転写因子に結合するＤＮＡ配列を同定することができる（Ｔｈｉｅｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｃｈ，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，３２０３；Ｂｅａｕｄｒｙ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，６３５；ＷＯ９２／０５２５８およびＷＯ９２／１４８４３）。類似の方法では、巨大ライブラリーの作製方法としてインビトロ翻訳を使用して、ポリペプチドを合成することができる。一般に安定化ポリソーム複合体を含むこれらの方法は、ＷＯ８８／０８４５３号、ＷＯ９０／０５７８５号、ＷＯ９０／０７００３号、ＷＯ９１／０２０７６号、ＷＯ９１／０５０５８号、およびＷＯ９２／０２５３６号にさらに記載されている。ＷＯ９５／２２６２５号およびＷＯ９５／１１９２２（Ａｆｆｙｍａｘ）などに開示のファージベースではない別のディスプレイ系は、選択のためのポリペプチドのディスプレイのためにポリソームを使用する。これらおよび全ての上記の書類はまた、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１６４】
［コンビナトリアルライブラリー］
ライブラリー（特に、候補分子のライブラリー）は、コンビナトリアルライブラリー（コンビナトリアル化合物ライブラリーとしても公知）の形態で適切に存在し得る。
【０１６５】
本明細書中で使用される、用語「コンビナトリアルライブラリー」は、ランダムに選択されたサブユニットからなる多種の化合物の集団である。コンビナトリアルライブラリーを、細胞または生物に曝露した場合にｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド媒介効果を増大、増強、減少、または最小化することができる分子についてスクリーニングすることができる。
【０１６６】
タンパク質分解もしくは非タンパク質分解酵素に活性なライブラリー、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のアゴニストおよびアンタゴニストのライブラリー、非ＧＰＣＲ標的（例えば、インテグリン、イオンチャネル、ドメイン相互作用、核受容体、および転写因子）に活性なライブラリー、ならびにホールセル腫瘍学および抗感染性標的のライブラリーなどを含む化合物の種々のコンビナトリアルライブラリーが現在利用可能である。コンビナトリアルライブラリーの概説、特にその構築および使用は、Ｄｏｌｌｅ  ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１巻，第４号，２３５〜２８２に記載されている。「コンビナトリアルペプチドライブラリープロトコール」（Ｓｈｍｕｅｌ  Ｃａｂｉｌｌｙ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ｃ１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第８７巻）も参照のこと。
【０１６７】
コンビナトリアル化合物ライブラリー、その産生および使用を記載したさらなる引例には、「分子多様性の化学的作製」、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｐａｖｉａ，Ｓｐｈｉｎｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（１９９５年７月公開）；「コンビナトリアルケミストリー：未来へのストラテジー  ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓはそのプロジェクトライブラリーが多様性ライブラリーを管理する役割を果たすと考察する」（１９９５年７月公開）；「リード化合物の発見およびＳＡＲ組織化における固相コンビナトリアルケミストリー」、Ａｄｎａｎ  Ｍ．Ｍ．Ｍｊａｌｌｉ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｙ  Ｅ．Ｔｏｙｏｎａｇａ、Ｏｎｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９９５年７月公開）；「構造的に指示された非ペプチドライブラリー由来の非ペプチドブラジキニン受容体アンタゴニスト」，Ｓａｒｖａｊｉｔ  Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ，Ｂａｂｕ  Ｊ．Ｍａｖｕｎｋｅｌ，Ｒｏｂｉｎ  Ａｎｄｙ，Ｄｏｎａｌｄ  Ｊ．Ｋｙｌｅ＊、Ｓｃｉｏｓ  Ｎｏｖａ  Ｉｎｃ．（１９９５年７月公開）；「薬理作用団の多様性を使用したコンビナトリアルケミストリーライブラリーのデザイン」、Ｋｅｉｔｈ  Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｖｅ  Ｂｒｉａｎｔ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．（１９９５年７月公開）；「組み合わせ合成実験のためのデータベースシステム」、Ｃｒａｉｇ  Ｊａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｗｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｄａｙｌｉｇｈｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（１９９５年７月公開）；「コンビナトリアルケミストリーのための情報管理機構」，Ｋｅｉｔｈ  Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｗｈｉｔｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．（１９９５年７月公開）；「化学的多様性に取り組むための新規のソフトウェアツール」，Ｒ．Ｓ．Ｐｅａｒｌｍａｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ（１９９６年６月／７月公開）；「創薬の新規のストラテジーによって付与される計算機化学の機会：見解」、Ｙｖｏｎｎｅ  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  Ｍａｒｔｉｎ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１９９６年６月／７月公開）；「ルイビル大学でのコンビナトリアルケミストリーおよび分子多様性コース：説明」，Ａｒｎｏ  Ｆ．Ｓｐａｔｏｌａ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ（１９９６年６月／７月公開）；「化学的に作製したスクリーニングライブラリー：現在と未来」、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｐａｖｉａ、Ｓｐｈｉｎｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（１９９６年６月／７月公開）；「創薬プロセスへの炭水化物分子の多様性を導入するための化学的ストラテジー」、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｓｏｆｉａ、Ｔｒａｎｓｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（１９９６���６月／７月公開）；「コンビナトリアルケミストリーのためのデータ管理」，Ｍａｒｙｊｏ  Ｚａｂｏｒｏｗｓｋｉ，Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｉｌａ  Ｈ．ＤｅＷｉｔｔ，Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９５年１１月公開）；および「バイオベースの産業におけるＲ＆Ｄに対する高処理有機合成の影響」，Ｊｏｈｎ  Ｐ．Ｄｅｖｌｉｎ（１９９６年３月公開）を含むＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｔｓｃｉ．ｏｒｇ／Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｃｏｍｂｉｃｈｅｍ／から利用可能な引例が含まれる。
【０１６８】
コンビナトリアルケミストリーにおける技術は、新規の薬学的リード化合物の作製のための現代的方法で広範に許容されつつある（Ｇａｌｌｏｐ，Ｍ．Ａ．ら，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７、１２３３〜１２５１；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７、１３８５〜１４０１）。１つのコンビナトリアルアプローチの使用は、固相支持体の各粒子上に異なる構造を含むライブラリーの合成、ライブラリーの可溶性受容体との相互作用、高分子標的と相互作用する「ビーズ」の同定、および同定した「ビーズ」によって保有される構造の決定を含むストラテジーに基づく（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８２〜８４）。このアプローチの代替法は、固体支持体からの定義された化合物アリコートの連続的放出、およびその後の溶液中の活性の決定、活性な化合物が放出される粒子の同定、直接的配列決定によるその構造の解明（Ｓａｌｍｏｎ，Ｓ．Ｅ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、１１７０８〜１１７１２）、またはそのコードの解読（Ｋｅｒｒ，Ｊ．Ｍ．ら、１９９３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１５、２５２９〜２５３１；Ｎｉｋｏｌａｉｅｖ，Ｖ．ら、１９９３、Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．，６、１６１〜１７０；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、１０９２２〜１０９２６）である。
【０１６９】
可溶性のランダムなコンビナトリアルライブラリーを、Ｆｕｒｋａ（Ｆｕｒｋａ，Ａ．ら，１９８８，第１０回医薬品化学国際シンポジウム，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，１９８８；Ｆｕｒｋａ，Ａ．ら，１９８８，第１４回国際生化学会議，Ｐｒａｇｕｅ，１９８８；Ｆｕｒｋａ，Ａ．ら，１９９１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，３７，４８７〜４９３）によって最初に記載されたペプチドの等モル混合物の作製のための簡単な原理を使用して合成することができる。反復性スクリーニングのための可溶性ライブラリーの構築も記載されている（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．ら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８４〜８６）。Ｋ．Ｓ．Ｌａｍは、不溶性のランダムなコンビナトリアルライブラリーの新規且つ予想外に強力な使用技術を開示した。Ｌａｍは、固相支持体上でランダムなコンビナトリアルライブラリーを合成し、その結果、各支持体は均一な分子構造の試験化合物を有し、固相結合プロトコールによる支持体からの試験化合物の事前の除去を行うことなくライブラリーをスクリーニングした（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５４、８２〜８４）。
【０１７０】
したがって、候補分子のライブラリーは、合成コンビナトリアルライブラリー（例えば、コンビナトリアル化合物ライブラリー）、細胞抽出物、体液（例えば、尿、血液、涙液、汗、または唾液）、または合成産物もしくは天然産物の他の混合物（例えば、小分子または発酵混合物のライブラリー）であり得る。
【０１７１】
分子のライブラリーには、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質のフラグメント；核酸（例えば、アンチセンス；ＤＮＡ；ＲＮＡ；またはペプチド核酸、ＰＮＡ）；アプタマー；または炭水化物もしくは多糖類を含み得る。ライブラリーの各メンバーは単独であるか、混合物の一部（例えば、圧縮ライブラリー（compressed library））であり得る。ライブラリーは、精製化合物を含み得るか、「汚れて」いてもよい（すなわち、有意な量の夾雑物を含む）。本明細書中に記載の方法と共に市販のライブラリー（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＡｒＱｕｌｅ、Ｎｅｏｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｒｃｏ、Ｃｉｄｄｃｏ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐａｎｌａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、Ｓｉｇｍａ、またはＴｒｉｐｏｓｅ）を使用することもできる。
【０１７２】
上記のライブラリーに加えて、多様性ファイル（diversity file）と呼ばれる特定のライブラリーを使用して、新規の方法の特異性、信頼性、または再現性を評価することができる。多様性ファイルは、多数の化合物（例えば、１０００またはそれ以上の小分子）（アッセイにおいて潜在的に非特異的に検出することができる多数のクラスの化合物の代表）を含む。多様性ファイルは市販されているか、上記の業者から市販されている各化合物から構築することもできる。
【０１７３】
［候補物質］
適切な候補物質には、特に、実施例に記載のポリペプチド配列に基づいて約５〜３０個または１０〜２５個のアミノ酸サイズのペプチドまたは１つまたは複数の残基が置換されたこのようなペプチドの変異体が含まれる。ランダムな配列または最大に多様なペプチドパネルを一貫して得るために変化させた配列を含むペプチドパネル由来のペプチドを使用することができる。
【０１７４】
適切な候補物質には、ポリペプチドに特異的な抗体産物（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、およびＣＤＲグラフティング抗体）も含まれる。さらに、コンビナトリアルライブラリー、ペプチド、ペプチド模倣物、定義された化学物質、オリゴヌクレオチド、および天然物のライブラリーを、細胞分裂周期機構（例えば、分裂／減数分裂装置（微小管など））へのポリペプチド結合のインヒビターとしての活性についてスクリーニングすることができる。候補物質を、例えば、反応あたり１０種の分子のバッチおよび個別に試験した阻害を示すバッチの物質において、最初のスクリーニングで使用することができる。次いで、下記などのインビトロスクリーニングで活性を示す候補物質を、インヒビターに曝露して細胞周期の任意の段階における阻害について試験する哺乳動物細胞などのホールセル系で試験することができる。
【０１７５】
［ポリペプチド結合アッセイ］
ポリペプチドに結合する物質を同定するための１つのアッセイ型は、固体支持体上に固定したポリペプチドを固定されていない候補物質に接触させるステップと、ポリペプチドおよび候補物質が互いに結合したかどうかおよび／または結合範囲を決定するステップを含む。あるいは、候補物質を固定し、ポリペプチドを固定しないことが可能である。これを使用して、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体に結合することができる物質を検出することができる。
【０１７６】
好ましいアッセイ法では、ポリペプチドをアガロースビーズなどのビーズに固定する。典型的には、細菌、酵母、または高等真核細胞株中のＧＳＴ−融合タンパク質としてのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の発現およびグルタチオン−アガロースビーズを使用した粗細胞抽出物からのＧＳＴ−融合タンパク質の精製によってこれを行う（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８）。コントロールとして、固定化ポリペプチドへのＧＳＴ−融合タンパク質ではない候補物質の結合を、ポリペプチドの非存在下で決定する。次いで、固定化ポリペプチドへの候補物質の結合を決定する。このアッセイ型は、ＧＳＴプルダウンアッセイとして当分野で公知である。また、候補物質を固定化し、ポリペプチドを固定化されないようにすることができる。
【０１７７】
１つの成分（例えば、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースおよびヒスチジンタグ化成分）の固定化のための異なる親和性精製系を使用して、このアッセイ型を実施することも可能である。
【０１７８】
候補物質へのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の結合を、当分野で周知の種々の方法によって決定することができる。例えば、固定化されていない成分を、標識することがきる（例えば、放射性標識、エピトープタグ、または酵素−抗体抱合体を使用）。あるいは、免疫学的検出技術によって結合を決定することができる。例えば、反応混合物をウェスタンブロッティングし、ブロットを固定化されていない成分を検出する抗体で探索することができる。ＥＬＩＳＡ技術を使用することもできる。
【０１７９】
候補物質を、典型的には、１〜１０００ｎｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌの最終濃度まで添加する。抗体の場合、使用最終濃度は、典型的には、１００〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２００〜３００μｇ／ｍｌである。
【０１８０】
［ＤＮＡ結合］
核環境から放出した場合、ＤＮＡなどの核酸により、周辺組織が炎症を起こし得る。いくつかのＤＮＡ結合タンパク質が公知であるが、肺および他の組織からのＤＮＡのクリアランスに関連するタンパク質または受容体は、明確に確立されていない。本発明者らは、ＳＰ−Ｄが細菌、バクテリオファージ、および染色体起源のＤＮＡ（および全ＲＮＡ）に有効に結合することを発見した。
【０１８１】
電子顕微鏡法は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の組換えフラグメント（ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ））が有効にＤＮＡに結合することができることを示す。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、ヌクレオチド（ＤＮＡの基礎単位）は、マンナンとｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）への結合を競合することができると判断し、これにより、このタンパク質はその炭水化物結合活性を解してＤＮＡに結合することができることが示唆される。さらに、この組換えフラグメント中の短いコラーゲン様フラグメントの存在により、ＤＮＡに有効に結合するさらなる能力が得られる。さらに、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）は、ヨウ化プロピジウムとアポトーシス細胞上のＤＮＡの結合を競合し、タンパク質がこれらの細胞表面上で見出されるＤＮＡに結合することを示す。表面上のＤＮＡ認識は、肺からのアポトーシス細胞の重要なクリアランス様式の１つのようである。
【０１８２】
ＳＰ−Ｄおよびそのフラグメント（詳細には、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ））へのいくつかの適用は、これらの分子のＤＮＡ結合性を介して媒介される。例えば、
１）いくつかの疾患（その多くは慢性細菌、菌類、およびウイルス感染に関する）により肺内の遊離核酸が蓄積される。嚢胞性線維症は、このような疾患の１つであり、細胞外遊離ＤＮＡを必要とする細菌のバイオフィルム形成後のみに肺内の感染が持続する。天然のＳＰ−ＤおよびｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）は遊離ＤＮＡに結合するので、これらのタンパク質はＤＮＡのクリアランスを増強し、バイオフィルム形成を最小にする。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）はまた、多数の肺内微生物をオプソニン化し、潜在的に嚢胞性線維症患者の病原体コロニー形成を減少または排除するように作用する。
２）ＳＰ−ＤおよびｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）は、ＤＮＡに結合することができる。したがって、アポトーシス細胞および壊死細胞などのその表面上にＤＮＡを含む細胞はまた、ＳＰ−ＤおよびｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）によって認識される。これらの事実により、炎症起因細胞がインビボでの食細胞媒介クリアランスについてｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）によって認識されるという機械的な説明が得られる。ＳＰ−Ｄおよびそのフラグメントを使用して、ＣＯＰＥ、慢性炎症、および慢性喘息などの肺疾患および病態を治療することができる。
３）壊死細胞およびアポトーシス細胞由来の遊離ＤＮＡまたはＤＮＡ破片は、自己抗原として作用することができる。したがって、遊離ＤＮＡ（またはＲＮＡ）のクリアランスでは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）は、自己免疫疾患における自己抗原産生の減少を補助する。
【０１８３】
［炎症性疾患］
用語「炎症」は、損傷に対する生きた組織の反応をいうために本明細書中で使用される。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、このような疾患を罹患する個体へのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の投与によって、炎症（炎症性疾患を含む）を治療することができる。
【０１８４】
炎症の原因には、物理的損傷、化学物質、微生物、または他の作用因子が含まれる。好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、炎症性疾患を治療するが、これを使用して任意の原因に起因する任意の炎症を治療することができる。
【０１８５】
炎症反応は、血流の変化、血管透過性の増加、および血液から組織への細胞の脱出からなる。急性炎症は、持続時間が短く、数日間しか持続しない。しかし、持続時間がより長い場合、慢性炎症という。認識することができる急性炎症の種々の例は、咽頭痛、擦過傷または火傷もしくは虫刺されに対する皮膚の反応、および急性肝炎などである。しかし、肺炎などの散発性の歴史的例外（historical exception）、肺炎および胸膜炎よりもむしろ肺の炎症、胸膜炎よりもむしろ胸膜の炎症が存在する。
【０１８６】
〈微生物感染〉
ウイルスは、細胞内増殖によって各細胞を死滅させる。細菌は、特異的外毒素（細菌によって合成される、特異的に炎症を引き起こす化合物）または細胞壁に結合する内毒素を放出する。さらに、いくつかの生物は、過敏反応を介した免疫学的に媒介された炎症を引き起こす。寄生虫感染および結核菌感染は、過敏症が重要な例である。
【０１８７】
〈過敏反応〉
免疫学的応答状態の変化により組織に損傷を与える不適切または過剰な免疫反応が引き起こされた場合に過敏反応が起こる。全て炎症に関連するものに類似の細胞または化学的メディエーターを有する。
【０１８８】
〈物理的作用因〉
炎症に対して誘導される組織損傷は、身体外傷、紫外線、または他の電離放射線、火傷、または過剰な冷却（「凍傷」）を介して引き起こされる。
【０１８９】
〈刺激物および腐食性薬品〉
腐食性薬品（酸、アルカリ、酸化剤）は、全身的な組織損傷を介して炎症を引き起こす。しかし、感染菌は、直接的に炎症を引き起こす特定の化学的刺激物を放出することができる。
【０１９０】
炎症は、典型的には、少なくとも１つの以下の特徴を含む。
組織壊死：不適切な血流（梗塞）に起因する酸素および栄養素の欠如由来の組織の死滅は、強力な炎症刺激である。新しい梗塞の端部は急性炎症反応を示す。赤み（紅潮）：急性に炎症を起こした組織は赤くなる（例えば、日焼けに影響を受けた皮膚、細菌感染による蜂巣炎、または急性結膜炎）。これは、損傷領域内の毛細血管の拡張による。熱（熱）：身体の末梢部（皮膚など）のみで温度上昇が認められる。これは、血管が拡張して領域に温血を送達させる領域を介した血流の増加（充血）による。炎症のいくつかの化学的メディエーターに起因する全身性の熱もまた、局所温度に寄与する。腫脹（腫瘍）；腫脹は、浮腫、滲出物の一部としての過剰な血管中の空間中の流動物の蓄積、さらにより狭い範囲では、領域に移動する炎症細胞の物理的質量に起因する。痛み（痛覚）：患者について、痛みは、急性炎症の最も公知の特徴の１つである。これは、炎症性浮腫による組織の拡大および変形、特に、膿瘍の空洞中の圧力下での膿に部分的に起因する。ブラジキニン、プロスタグランジン、およびセロトニンを含む急性炎症のいくつかの化学的メディエーターは、痛みを誘導することが知られている。機能不全：炎症領域の移動は、痛みによって故意且つ反射的に阻害され、重篤な浮腫は組織を物理的に固定化することができる。
【０１９１】
したがって、本発明者らは、炎症または炎症性疾患を罹患した固体へのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の投与による、上記の症状を含む炎症の症状の緩和を提供する。
【０１９２】
［炎症性肺疾患］
非常に好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、炎症性肺疾患を治療する。
【０１９３】
本明細書中で使用される、用語「炎症性肺疾患」は、肺、肺の任意の部分、または気道、気管などの関連系の炎症を含む任意の疾患または病態を意味するために使用すべきである。炎症性肺疾患は急性または慢性であってよく、いくつかの他の疾患または症候群の結果またはこれらに伴って発症し得る。好ましい実施形態では、炎症性肺疾患は、慢性炎症性肺疾患を含む。
【０１９４】
炎症性肺疾患の例には、新生児慢性肺疾患、新生児呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、肺線維症、気腫、間質性炎症性肺疾患、サルコイドーシス、肺炎、慢性炎症性肺疾患、新生児慢性炎症性肺疾患が含まれる。
【０１９５】
個体へのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の投与によってこのような疾患を罹患した個体を治療するか、その症状を緩和することができる。好ましくは、このような治療により、肺胞マクロファージ、好ましくはアポトーシス肺胞マクロファージがクリアランスされる。治療により、壊死マクロファージもさらにまたは代わりにクリアランスすることができる。下記のアッセイによって壊死およびアポトーシス細胞を検出および区別することができる。
【０１９６】
［新生児慢性肺疾患］
新生児慢性肺疾患は、早産後の再発性炎症および感染に関連する多因子病態である。早産、換気、新生児期の再発性感染症、サーファクタント欠損、および新生児期の炎症マーカーの増加（気管吸引サンプル中の肺胞マクロファージ数を含む）を含む、慢性肺疾患の発症リスクを増大させる多数の因子が存在する。早産児は、ＳＰ−Ｄを含むサーファクタントタンパク質の欠損が公知である。
【０１９７】
ヒト新生児慢性肺疾患は、典型的には早産後、長期間の補助換気後の炎症性損傷および酸化ストレスから発症する。新生児呼吸窮迫症候群治療のための人工サーファクタント補充療法の出現以来、早産後の生存率は劇的に増加したが、妊娠２８週未満での出生後に生存した乳児の４０％までが慢性炎症性肺疾患を発症する。現在のサーファクタント補充ストラテジーは、サーファクタントタンパク質Ｄを含まない。この背景での肺損傷は、活性化肺胞マクロファージによって媒介される。ＳＰ−Ｄ欠損マウスは、多数の活性化肺胞マクロファージの存在によって特徴づけられる肺内のマクロファージ媒介炎症モデルを提供する。
【０１９８】
本発明者らは、実施例で、ＳＰ−Ｄ欠損マウスへのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の鼻腔内投与よって、活性化マクロファージ数の減少およびその表現型の変化による肺の炎症プロセスを調整されることを証明する。この結果は、ｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）の強力な抗炎症性を証明し、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の直接投与または現在のサーファクタント療法の製剤へのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の含有によって、新生児の慢性炎症性肺疾患の予防におけるｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の直接的臨床適用を示す。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）をコードする核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、および誘導体を使用することもできる。気腫を発症する慢性肺炎症（例えば、天然のＳＰ−Ｄレベルの不十分な喫煙者）を、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の投与によって治療することも可能である。
【０１９９】
したがって、本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の投与による新生児慢性肺疾患またはこのような疾患の任意の症状の治療を提供する。
【０２００】
［サーファクタント補充療法］
本節は、本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を適切に使用するサーファクタント補充療法を記載する。特に、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を、新生児のサーファクタント補充療法に使用することができる。
【０２０１】
サーファクタント補充療法は、Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃａｒｅ，１９９４，３９（８），８２４〜８２９に記載されており、本節はこれに由来する。サーファクタント補充療法のガイダンス（例えば、ＡＡＲＣ臨床的治療法ガイドライン）が発行されている。臨床医は、このようなガイダンスにしたがって、サーファクタント補充療法プログラムの一部として、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を投与することができる。
【０２０２】
天然の内因性サーファクタントは、肺胞表面と肺胞気との間に層を形成し、肺胞内の表面張力の減少によって肺胞虚脱を軽減する（３〜５）、リン脂質、中性脂質、およびタンパク質（１〜５）から構成される化合物である。サーファクタント欠損症は、そのほとんどが未熟な肺の硝子膜の形成および呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）（未熟児の罹患および死亡の主な原因）の発症に関連する（３）。サーファクタントがない場合、肺胞は決して膨張することができないか、呼気時に虚脱し得るので、吸気時の再拡大に法外な力が必要となり、ＲＤＳを発症する（３、５）。ＲＤＳの罹患率は、在胎齢よりも肺の未熟さに関連する（６）。しかし、一般に、より未熟な乳児ほどサーファクタント産生が低く、ＲＤＳの可能性が増大する（４、６）。サーファクタントの直接気管内点滴注入により、ＲＤＳ乳児の死亡率および罹患率が減少することが示されている（７〜２５）。
【０２０３】
サーファクタントを、動物の肺洗浄物およびヒト羊水から抽出するか、合成物質から生成することができる。本明細書中に記載の方法および組成物によれば、特に新生児のサーファクタント補充療法にｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用することができる。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を、単独または公知のサーファクタント補充療法と組み合わせて使用することができる。
【０２０４】
以下の２つの基本的なサーファクタント補充ストラテジーが明らかとなっている。（１）ＲＤＳ発症リスクの高い乳児の出生時または出生直後にサーファクタントを投与する予防治療および（２）ＲＤＳが臨床的に確認された乳児における機械換気開始後にサーファクタントを投与する救助または治療の執行（２、１０〜１２、２６、２７）。
【０２０５】
サーファクタント補充療法を、典型的には、分娩室または新生児集中治療室で訓練された人材によって施す。
【０２０６】
〈サーファクタント補充療法の適応〉
（４．１）（４．１．１）肺の未熟が強く示唆される、短い妊娠期間（３２週未満）（８、１０〜１２、２１、２５〜２９）または低出生時体重（１，３００ｇ未満）（２１〜２５、２８）のためにＲＤＳ発症リスクが高い乳児、（４．１．２）レシチン／スフィンゴミエリン比が２：１未満（１１、１４、２８、３０、３１）、肺未熟を示すバブル安定試験（１５，３２）、またはホスファチジルグリセロールの非存在（１１、１４、２２〜２４、２８、３０）などのサーファクタント欠損の実験的証拠が存在する乳児に予防的投与を指示することができる。（４．２）（４．２．１）（４．２．１．１）呼吸数の増加、胸骨下および胸骨上の退縮、グランティング、および鼻発赤（８、１１、１４〜１６、２９、３３〜３５）（４．２．１．２）青白い皮膚の色、動揺、および０を超えるＦＩＯ２の増加を指示するＰａＯ２、ＳａＯ２、またはＳｐＯ２の減少（４０１１、１２、１５、２６、３３、３６〜３８）によって示される酸素の必要性の増加のために気管内挿管および機械換気が必要であり、（４．２．２）（４．２．２．１）ＲＤＳに特徴的な胸部Ｘ線写真（８、１１〜１６、３３、３４、３６、３７、４０〜４２）、（４．２．２．２）適切なＰａＯ２、ＳａＯ２、またはＳｐＯ２を維持するための７ｃｍ  Ｈ２Ｏを超える気道内圧（１１、１４、１５、２６、４３）を含むＲＤＳの臨床的証拠（１３、３９）を有する早産または満期産の乳児に救助または治療の執行を指示する。
【０２０７】
〈禁忌〉
以下の病態へのサーファクタント補充療法を禁忌する。（５．１）新生児期を超えた生存に不適合な先天性奇形の存在（８、１４、１５、２６、２８、２９、３１、３３、３６、４１、４４）、（５．２）肺未熟と実験で証明された乳児の呼吸窮迫（９、１４、２７〜２９、３３、３６、４１）。
【０２０８】
サーファクタント補充療法から生じる危険性および厄介な問題には以下が含まれる。（６．１）サーファクタント投与に起因する手順の複雑さには、（６．１．１）サーファクタントによる気管内チューブ（ＥＴＴ）の挿入（２）；（６．１２）ヘモグロビン脱飽和および追加Ｏ２の必要性の増加（１１、３３、４１）；（６．１．３）低酸素症による徐脈（９、３３、４１、４５）；（６．１．４）ＥＴＴへのサーファクタントの逆流にともなう動揺による徐脈（３４、４１）；（６．１．５）サーファクタントの咽頭沈着；（６．１．６）一方の肺のみへのサーファクタントの投与；（６．１．７）再構成における計算ミスまたはエラーに対する最適下限用量の二次的投与が含まれる。（６．２）サーファクタント補充療法の生理学的に厄介な問題には、（６．２．１）無呼吸（７、１３、１５）；（６．２．２）肺出血（１２、１５、１８、３２、３４、３８、４６、４７）；（６．２．３）粘液栓（４８）；（６．２．４）ＰＤＡ治療の必要性の増大（１８、２９、３０）；（６．２．５）未熟児の網膜症の限界的増加（１１）；（６．２．６）サーファクタント補充後の肺コンプライアンスの増加およびそれによる人工呼吸器の設置の変化の失敗に起因する気圧障害（３０、４９）が含まれる。
【０２０９】
ＲＤＳを発症していない数人の乳児にサーファクタントを予防的に投与することができる（１０、１２、２６、３３）。分娩室でサーファクタントを予防的に投与した場合、ＥＴＴの配置がＸ線写真によって確認することができず、その結果、肺の一方のみまたは胃へ不注意に投与された（２６）。サーファクタントの予防投与は、患者の安定化を遅延し得る（２６）。治療投与前にアテレクターゼおよび肺損傷が起こり得る（２６、３３）。サーファクタント投与後は気管吸引を回避すべきである（９、１１、１３、１４、２７、３３、３８、４４、５０）。サーファクタントの単回投与で処置した全ての乳児が正の反応を示すわけでも（３９）、反応が一過性であるわけでもない。サーファクタント投与に推奨される位置決めにより、乳児をさらに不安定にし得る（９、１１、１２、１４、１６、２８、３３、３８〜４０）。
【０２１０】
臨床医は、適応が妥当であるかを決定するために必要な評価を行うことができる。典型的には、これのために以下を行う。（８．１）妊娠期間および出生時体重ならびに／または気管もしくは胃の吸引の実験評価によるサーファクタントの予防的投与前の肺未成熟の評価、（８．２）胸部Ｘ線写真の基準および短期の妊娠および／または低出生時体重における機械換気要件によるＲＤＳ診断の確立。
【０２１１】
以下に従って結果を評価する。（９．１）ＦＩＯ２要件の減少（１２、３３、３４、３６〜３９、４１、４４）、（９．２）呼吸の減少（５１）、（９．３）胸部Ｘ線写真によって示された肺容量および肺野の改善（１３、１６、３３、４０）、（９．４）肺機構（例えば、コンプライアンス、気道耐性、ＶＴ、ＶＥ、経肺圧）および肺容量（すなわち、ＦＲＣ）の改善（４２、４３、５０、５２〜５９）、（９．５）換気要件（ＰＩＰ、ＰＥＥＰ、Ｐａｗ）の減少（２、８、９、１２、１３、２７、３０、３３、３６〜３９、４１、４４、５０、５２）、（９．６）動脈：肺胞ＰＯ２比（ａ／Ａ  ＰＯ２）の改善、酸素指数（１３、１６、２８、３０、３３、３４、３７〜４１、４４）。
【０２１２】
〈供給源〉
サーファクタントの特定の調製物で推奨される投与手順は、以下に従うべきである。（１０．１）装置（１０〜１４、１６、２６〜２８、３３、３４、３９、４０、５０、６０）（（１０．１．１）投与装置（（１０．１．１．１）室温に加温した一定用量のサーファクタントを含むシリンジ（１１、１２、１６、３８、４０）、（１０．１．１．２）送達ポートに接続した５−Ｆｒ栄養管またはカテーテルまたは気管内チューブ、（１０．１．１．３）機械人工呼吸器または手動人工呼吸器（蘇生バッグ）（８、１６、３３、３６、３８〜４０、４４、５０、５２））、（１０．１．２）蘇生装置（（１０．１．２．１）咽頭鏡および気管内チューブ（１０〜１２、１４、１６、２６、３８）、（１０．１．２．２）手動蘇生バッグ（９〜１２、１６、２６〜２８、３６、３９、４０、５０）、および気道マノメーター、（１０．１．２．３）ブレンドした酸素供給源（９、１６、２８、４４）、（１０．１．２．４）吸引装置（すなわち、カテーテル、滅菌グローブ、回収ボトル、およびチュービング、真空発生装置）（９、３３、５０、６０）、（１０．１．２．５）完成品の放射熱ウォーマー）、（１０．１．３）モニタリング装置（（１０．１．３．１）利用可能な場合の１回換気量のモニター（５０））、（１０．１．３．２）気道圧モニター、（１０．１．３．３）パルス酸素濃度計または経皮ＰＣＯ２モニター（１１、２６、３４、３９〜４１、５２）、（１０．１．３．４）心臓性呼吸モニター）、（１０．２）人材。サーファクタント補充療法を医師の指示の下で、以下を的確に証明する認定された人材（例えば、ＣＲＴＴ、ＲＲＴ、ＲＮ）によって行われるべきである。（１０．２．１）サーファクタント補充療法の装置および技術的知識を適切に使用、理解、および精通している者、（１０．２．２）新生児人工呼吸器管理ならびに肺解剖学および病態生理学の包括的知識および理解を有する者、（１０．２．３）副作用および／または手順の厄介な問題を認識して対応する能力を含む、新生児患児評価スキルを有する者、（１０．２．４）患者の病歴および臨床症状の知識および理解を有する者、（１０．２．５）気道管理の知識および理解を有する者、（１０．２．６）モニターおよび測定された血液ガスの変化および生命徴候を解釈する能力を有する者、（１０．２．７）救急蘇生装置および手順を適切に使用、理解、および精通している者、（１０．２．８）結果を評価および報告する能力を有する者（第９．０節）、（１０．２．９）普遍的予防手段を理解し、適切に適用する者。
【０２１３】
〈モニタリング〉
サーファクタント補充療法の一部として、以下をモニターすべきである。（１１．１）サーファクタント投与時にモニターすべき変数（（１１．１．１）送達デバイスの適切な位置付けおよび位置、（１１．１．２）ＦＩＯ２および人工呼吸器の設定（８、９、１１、１３〜１５、２７〜２９、３３、３６、３８、４４）、（１１．１．３）ＥＴＴへのサーファクタントの逆流（３４、４１）、（１１．１．４）患者の位置（すなわち、頭部の方向）（９、１１、１３）、（１１．１．５）胸壁の動き（６１）、（１１．１．６）パルス酸素濃度計による酸素飽和（１１、２６、３４、３９〜４１、５２）、（１１．１．７）心拍数、呼吸、胸部拡張、皮膚の色、および活力（１６、２６、２７、３４、４１、４５、５２））、（１１．２）サーファクタント投与後にモニターすべき変数（（１１．２．１）動脈血液ガスの侵襲性および非侵襲性の測定（８、９、１１、１２〜１６、２６〜２９、３３、３６、３８、３９、４１、４４）、（１１．２．２）胸部Ｘ線写真（１１〜１６、２８、３６、３８〜４０、４４）、（１１．２．３）人工呼吸器の設定（ＰＩＰ、ＰＥＥＰ、Ｐａｗ）およびＦＩＯ２（８、９、１１、１３〜１６，２８、２９、３３、３６、３８）、（１１．２．４）肺の機構および容量、（１１．２．５）心拍数、呼吸、胸部拡張、皮膚の色、および活力（１６、２６、２７、３４、４１、４５、５２）、（１１．２．６）呼吸音（１１、３８）、（１１．２．７）血圧（３、１６、３３、４０、４４、４５））。
【０２１４】
〈頻度〉
サーファクタントの反復投与は、ＲＤＳの連続診断を条件とする。サーファクタント補充を行う頻度は、患者の臨床状態および手順実施の指示に依存すべきである。６〜２４時間間隔でのサーファクタントのさらなる投与を、人工呼吸器の必要性が増し、最初の投与後にその病態を改善できない乳児に指示することができる（７、９、１１、１２、１４、１５、２６、３０、３４、３７、３９、５２）。
【０２１５】
〈感染予防〉
（１３．１）普遍的な予防手段（６２）を実施すべきである。（１３．２）無菌法を実施すべきである。（１３．３）患者のための適切な感染予防ガイダンスを入手してそれに従うべきである。
【０２１６】
［嚢胞性線維症］
本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドが肺胞マクロファージ数を減少させることができることを実施例に示す。したがって、肺胞マクロファージが炎症プロセスで役割を果たす肺疾患（例えば、嚢胞性線維症、喘息、および気腫）にｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体を投与することができる。ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）はまた、他の部位でのマクロファージ媒介炎症プロセス（例えば、アテローム性動脈硬化症）で治療特性を有する。
【０２１７】
嚢胞性線維症は、小児および成人のほぼ両方で罹患する遺伝病である。
【０２１８】
嚢胞性線維症により、肺および膵臓などの器官の管壁細胞内からその外面へのナトリウムおよび塩化物（塩）の誤った輸送により身体に異常に多量の粘液が産生される。多量の嚢胞性線維症粘液はまた、膵臓を妨害し、食物の分解および消化を補助するための腸への酵素の到達を妨害する。
【０２１９】
嚢胞性線維症は、種々の症状を有する。最も一般的には、非常に塩辛い皮膚；持続的な咳、喘鳴、または肺炎；食欲は過剰であるが体重増加は軽微であること；および大量の排泄物である。汗試験は、汗中の塩分を測定する嚢胞性線維症の標準的な診断試験である。高塩レベルは、患者が嚢胞性線維症であることを示す。
【０２２０】
嚢胞性線維症治療は、疾患の段階および関連する器官に依存する。１つの治療手段である胸部理学療法は、肺由来の多量の粘液を除去するための背中および胸部の（カップ状にした手による）積極的な軽打按摩を必要とする。抗生物質を使用して、肺感染症を治療し、これを静脈内、丸薬、および／または詰まった気道を開けるために吸入するための薬剤混入蒸気で投与する。嚢胞性線維症が消化系に影響を与える場合、身体は十分な栄養分を吸収しない。したがって、嚢胞性線維症患者は、栄養価を高めた食事を摂取し、代替ビタミンおよび酵素の両方を摂取する必要があり得る。
【０２２１】
本明細書中に記載の方法および組成物によれば、嚢胞性線維症患者の症状を、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の投与によって緩和する。嚢胞性線維症の症状には、好ましくは、上記の任意の症状が含まれる。好ましくは、嚢胞性線維症患者を、このようなポリペプチド、ホモログ、フラグメント、または誘導体の投与によって治療する。
【０２２２】
［アレルギー］
既存のアレルギー治療は、典型的には、免疫系を弱めるためのステロイドの長期使用を含む。長期ステロイド治療には、望ましくない副作用が存在する。本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、アレルギーの症状を緩和するかアレルギーを治療することができることを証明する。
【０２２３】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での治療では、マウスでは病的影響は認められないようであり、ヒトでは望ましくない副作用は認められないようである。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での短期治療単位により、根本的なアレルギー感作を逆転して有効な免疫療法を得ることができる。これは、典型的に何年にもわたる一連のアレルゲン注射を含む既存の感作免疫治療プロトコールを有意に改良する。
【０２２４】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体での治療に適切なアレルギーには、季節性呼吸器アレルギー、アレルギー性鼻炎、花粉症、非アレルギー性鼻炎、血管運動神経性鼻炎、刺激性鼻炎、草の花粉、木の花粉、または動物の鱗屑に対するアレルギー、アレルギー性喘息に関連するアレルギー、および食品アレルギーが含まれる。特に、本明細書中に記載のように、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、イエダニ（ヒョウヒダニ属）、好ましくはヤケヒョウヒダニまたはコナヒョウヒダニ、または菌類もしくは菌類胞子、好ましくはアスペルギルス・フミガーツスに対するアレルギーを治療することができる。好ましくは、アレルギーは、ヒョウヒダニ属の排泄物から構成される。
【０２２５】
［喘息］
喘息は、気管支の気道閉塞の発作によって特徴づけられる呼吸器疾患である。この閉塞によって引き起こされる症状には、咳、胸苦しさ、喘鳴、および息切れが含まれる。問題はしばしば無症状器官によって分けられるが、喘息は慢性疾患である。
【０２２６】
広範な種々の「要因」により、喘息が誘発され得る。最も一般的な要因は、アレルゲン、アスピリン、およびタルトラジン、刺激物、食品添加物および防腐剤、ウイルスの呼吸器感染、ならびに身体活動である。
【０２２７】
アレルゲンは、感受性個体がアレルギーを引き起こし得る物質である。これらは、小児および成人における問題の主な原因である。一般的なアレルゲンには、植物の花粉（木、草、および雑草）、動物の鱗屑、イエダニ類、カビ、および一定の食品が含まれる。アレルギー個体がこれらのアレルゲンの１つに接触した場合、一連の事象により、一定の化学物質類（メディエーター）が身体に放出され、喘息を誘発する。
【０２２８】
喘息患者の１０〜２０％が、アスピリンの摂取後に有意な肺機能の低下を経験し、非ステロイド系抗炎症薬と呼ばれる薬物の関連群およびタルトラジン（食用色素の黄色５号）で類似の反応が起こり得る。冷気、煙、工業用化学薬品、香水、塗料、およびガソリンの臭気は、全ておそらく気道での刺激物受容体の刺激によって喘息を引き起こし得る刺激物の例である。これらの受容体は、その後、気道周囲の筋肉を収縮させて喘息発作を起こす。稀に、亜硫酸塩などの食品添加物が喘息を誘発し得る。ウイルスの呼吸器感染は、急性喘息発作の主な原因である。
【０２２９】
喘息発作時に、一定の誘発物に反応して喘息患者の過剰反応した気管支が狭まる。発作時に、気管支周囲の筋肉が収縮し、気道を狭める。気道上皮が炎症も起こし、腫れてさらに気道サイズが減少する。さらに、気道内部の粘膜腺から過剰な粘液が生成されて、既に狭まった気道に蓄積する。最終的な結果として、呼吸、特に呼気が非常に困難になる。狭まった気道の後ろに空気が捕捉され、身体が利用可能な酸素が減少する。
【０２３０】
気管支拡張薬は、喘息治療に最も一般的に処方されている薬物である。これらは、気道周囲の筋肉を弛緩させて、気管支を拡張させる。気管支拡張薬を、吸入、経口、または注射で投与することができる。例えば、口腔を介した運動中に吸入した乾いた冷気によっても喘息を発症し得る。
【０２３１】
喘息症状の治療で使用されている現在の薬物には、持続性テオフィリン、吸入もしくは経口βアゴニスト（クロモリン）、または吸入もしくは経口ステロイドが含まれる。アレルギー性喘息患者のために、免疫療法（アレルギー注射）により、回避できないアレルゲンを軽減することができる。免疫療法により、喘息症状を促す患者のアレルゲンへの耐性が増大される。
【０２３２】
［アレルギー性喘息］
喘息を、アレルゲンへの曝露によって誘発することもできる（「アレルギー性喘息」）。
アレルギー性喘息は、アレルゲン刺激に反応して初期および後期過敏反応を引き起こす気道過敏症（ＡＨＲ）期によって特徴付けられる。初期反応は、ヒスタミンおよび他の気管支収縮薬の放出と共に気道肥満細胞の脱顆粒によって媒介される。後期の反応は、好酸球およびリンパ球などの炎症細胞の流入後に開始され、その後炎症メディエーターおよびサイトカインが放出され、慢性ＡＨＲを発症する。
【０２３３】
イエダニは、アレルギー性喘息の主な原因の１つである（Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ，Ｔ．Ａ．ａｎｄ  Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ，１９８７，「チリダニ類：免疫学、アレルギー性疾患、および環境制御」，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８０，７５５〜７５；Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ，Ｔ．Ａ．，Ｅ．Ｂ．Ｍｉｔｃｈｅｌ，Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ，ａｎｄ  Ｐ．Ｗ．Ｈｅｙｍａｎｎ，１９８７，「チリダニアレルギー；その臨床的有意性」，Ｈｏｐｓ  Ｐｒａｃｔ（Ｏｆｆ  Ｅｄ），２２，９１〜３，９７〜１００；Ｐｏｌｌａｒｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ，ａｎｄ  Ｔ．Ａ．Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ，１９８７，「ハウスダスト感受性および環境制御」，Ｐｒｉｍ．Ｃａｒｅ、１４、５９１〜６０３）。
【０２３４】
例えば、本明細書中に記載のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、アレルギー性喘息を治療することができる。好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、イエダニに起因するアレルギーまたはアレルギー性喘息を治療する。
【０２３５】
イエダニは、ヒョウヒダニ属の任意の生物をいう。好ましくは、ヒョウヒダニ属生物は、ヤケヒョウヒダニまたはコナヒョウヒダニである。アレルギー性喘息はまた、個体への菌類または菌類胞子への曝露の結果として発症することができ、本明細書中に記載の方法および組成物には、アスペルギルス・フミガーツス抗原に対するアレルギーを含むこのような喘息またはアレルギーの治療が含まれる。
【０２３６】
［肺気腫および慢性閉塞性肺疾患］
特定の実施形態では、例えば、本明細書中に記載のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、肺気腫または慢性閉塞性肺疾患を治療する。
【０２３７】
気腫は、満足に治療されない大きな公衆衛生上の問題である。タバコの煙は、インビトロ（Ａｏｓｈｉｂａ，Ｋ．，Ｔａｍａｏｋｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｎａｇａｉ，Ａ．，２００１、「急性のタバコの煙への曝露により、肺胞マクロファージのアポトーシスが誘導される」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８１、Ｌ１３９２）およびインビボ（Ａｏｓｈｉｂａら、前出）で、肺胞マクロファージアポトーシスを誘導し、Ｍａｊｏらは、最近、喫煙者由来の肺組織サンプルのアポトーシスは、気腫を有する喫煙者で急速に増加する喫煙量との双一次関係を示すことを報告しており、アポトーシスが気腫を発症する肺破壊機構の１つであり得ると結論付けている（Ｍａｊｏ，Ｊ．，Ｇｈｅｚｚｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｃｏｓｉｏ，Ｍ．Ｇ．，２００１、「喫煙者の肺におけるリンパ球の産生およびアポトーシスならびに気腫とのその関係」、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，１７，９４６）。本発明者らは、喫煙者でＳＰ−Ｄが欠損していることおよびこれによりアポトーシスが促進され、この患者群で気腫に寄与することを提案する。本発明者らは、ＳＰ−Ｄ欠損マウスへのｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）の投与によりアポトーシス細胞数が減少するので、ヒトにおけるｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）治療により喫煙によって誘発される気腫に寄与する機構を阻害することができることを証明する。
【０２３８】
［サイトカイン］
さらなる実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、個体のサイトカインレベルを調整する。好ましくは、炎症性サイトカインがダウンレギュレーションされる。炎症性サイトカインの例には、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および肺への肺胞マクロファージの移動を媒介して細胞増殖を増加させるように作用する任意のサイトカインが含まれる。
【０２３９】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の投与によるＧＭ−ＣＳＦレベルの調整を、実施例９に示す（図１４）。
【０２４０】
用語「サイトカイン」を、免疫応答を調節するための特異的受容体を介して非酵素的に作用する免疫系細胞によって放出される任意の多数の可溶性分子（例えば、糖タンパク質）をいうために使用することができる。サイトカインは、低濃度で作用して特異的受容体と高親和性で結合するという点でホルモンに類似する。好ましくは、用語「サイトカイン」は、ナノモル濃度からピコモル濃度で体液性レギュレーターとして作用し、正常または病理学的条件下で各細胞および組織の機能的活性を調整する多様な可溶性タンパク質およびペプチド群をいう。
【０２４１】
本発明に記載の方法および組成物での使用に適切なサイトカインの特定の例には、インターロイキン、リンホカイン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、および顆粒−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＧＳＦ、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。
【０２４２】
したがって、ＩＬ１、ＩＬ２、およびＩＬ４などのインターロイキンならびにＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γなどのインターフェロンが含まれる。腫瘍壊死因子ＴＮＦα（カシェチン（cachetin））、ＴＮＦ−β（リンホトキシン）を、適切に使用することもできる。
【０２４３】
好ましいサイトカインは、免疫応答（例えば、樹状細胞または細胞傷害性Ｔ細胞活性の刺激）を補強することができるか、マクロファージを標的部位に補強することができるものである。非常に好ましい実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧＳＦを含む。
【０２４４】
［アポトーシス］
本明細書中に記載の方法および組成物によれば、個体へのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の投与により、肺胞マクロファージ数、特にアポトーシス肺胞マクロファージ数、もしくは壊死肺胞マクロファージ数またはその両方を減少させることができる。特定の理論には拘束されることを意図しないが、本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体は、個体の身体のアポトーシスおよび／または壊死マクロファージのクリアランスの増強によってこれを達成すると予想する。
【０２４５】
好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体での処置により、アポトーシスおよび／または壊死マクロファージの少なくとも１０％を超えるクリアランス、好ましくは、少なくとも２０％超がクリアランスされる。より好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体での処置により、アポトーシスおよび／または壊死マクロファージの少なくとも４０％、６０％、８０％、またはそれ以上がクリアランスされる。
【０２４６】
２つの個別の機構（壊死またはアポトーシス）のいずれかによって細胞死が起こり得る。さらに、一定の化合物および細胞が、細胞に細胞傷害性を示す、すなわち、その細胞死を招くといわれている。
【０２４７】
「壊死」（「偶発的」細胞死ともいわれる）は、細胞が重篤な物理的または化学的損傷に曝された場合に起こる病理学的プロセスをいう。細胞が原形質膜に損傷を与え得る生理学的条件（例えば、低体温症、低酸素症）由来の極端な変化に曝された場合に壊死が起こる。生理学的条件下で、原形質膜への直接的損傷は、補体および溶菌ウイルスのような作用因子によって誘発される。壊死は、水および細胞外イオンが流入する細胞のホメオスタシスの維持能力の欠陥から開始される。細胞内オルガネラ（最も顕著には、ミトコンドリア）および細胞全体が膨張して破裂する（細胞融解）。原形質膜の決定的な破壊により、リソソーム酵素を含む細胞質の内容物が、細胞外液に放出される。したがって、インビボでは、壊死性細胞死は、しばしば強い炎症反応を起こす広範な組織損傷に関連する。
【０２４８】
「アポトーシス」（「通常の」または「プログラムされた」細胞死）は、発達および他の正常な生物学的プロセスの間に望ましくないか、または無用の細胞を除去する生理学的プロセスをいう。アポトーシスは、正常な生理学的条件下で起こす細胞死様式であり、細胞は、細胞自体の死（「細胞自殺」）に積極的に関与する。これは、正常な細胞の代謝回転および組織ホメオスタシス、胚形成、免疫寛容の誘導および維持、神経系の発達、および内分泌腺依存性組織萎縮時に最も頻繁に認められる。アポトーシスを受けた細胞は、特徴的な形態学的および生化学的特徴を示す。これらの特徴には、クロマチン凝集、核および細胞質の濃縮、リボゾーム、形態学的にインタクトなミトコンドリア、および核物質を含む膜結合小胞（アポトーシス体）への細胞質および核の分配が含まれる。インビボでは、これらのアポトーシス体は容易に認識され、マクロファージまたは隣接する上皮細胞のいずれかによって食菌される。この有効なインビボでのアポトーシス細胞の除去機構により、炎症反応は誘発されない。インビトロでは、アポトーシス体および残存する細胞フラグメントは、最終的に膨張して最後に溶解する。インビトロ細胞死のこの終末過程は、「二次的壊死」と呼ばれている。
【０２４９】
表１は、壊死およびアポトーシスの間の、種々の観察可能な相違をまとめている。細胞死がアポトーシスまたは壊死のいずれかによって起こったかを決定するために、任意のこれらの相違（単独または組み合わせ）をアッセイすることができる。
【０２５０】
【表２】
2005522988.tif 000008
【０２５１】
アポトーシスおよびアポトーシスによる細胞死についての種々の測定アッセイを詳細に記載している以下の文献を参照のこと。Ｓｃｈｗａｒｔｚｍａｎ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｃｉｄｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ａ、１９９３，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．，１４、１３３；Ｖｅｒｍｅｓ，Ｉ．ａｎｄ  Ｈａａｎａｎ，Ｃ．，１９９４，Ａｄｖ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３１，１７７；Ｂｅｒｋｅ，Ｇ．，１９９１，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １２，３９６；Ｋｒａｅｈｅｎｂｕｅｈｌ，Ｏ．ａｎｄ  Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．，１９９１，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１２，３９９；Ｖａｎ  Ｆｕｒｔｈ，Ｒ．ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｚｗｅｔ，Ｔ．Ｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０８、４５、Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｊ．，１９９３，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４，１２６；Ｓａｖｉｌｌ，Ｊ．Ｓ．ら，１９８９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８３、８６５；Ｗｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．，１９８０，Ｎａｔｕｒｅ，２８４，５５５；Ｌｅｉｓｔ，Ｍ．ら，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，第３号，１８〜２０；Ｆｒａｓｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｅｖａｎ，Ｇ．，１９９６、Ｃｅｌｌ，８５，７８１〜７８４；Ｄｕｋｅ，Ｒ．Ｃ．，１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，６３６１；Ｄｕｋｅ，Ｒ．Ｃ．＆Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｊ．，１９８６，Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，５，２８９；Ｔｒａｕｔｈ，Ｂ．Ｃ．ら、１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６３，３２，増補４０；Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，Ｐ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ；Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５，１８５；Ｋａｅｃｋ，Ｍ．Ｒ．，１９９３；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０８，３９３；Ｐｒｉｇｅｎｔ，Ｐ．ら，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６０、１３９；Ｈｕａｎｇ，Ｐ．＆Ｐｌｕｎｋｅｔｔ，Ｗ．，１９９２；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０７，１６３，Ｂｏｒｔｎｅｒ，Ｃ．Ｄ．ら，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５，２１；Ｇｏｌｄ，Ｒ．ら，１９９４；Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７１、２１９。
【０２５２】
アポトーシスおよび細胞媒介細胞傷害性は、膜分解前のゲノムＤＮＡの個別のフラグメントへの切断によって特徴づけられる。したがって、アポトーシスを、例えば、ＤＮＡラダーの存在の観察によるＤＮＡ断片化の測定によってアッセイすることができる。ＤＮＡフラグメントを、例えば、細胞集団由来の「ラダー」（ラダーの「段」としての１８０ｂｐの複合物）として、または例えばＥＬＩＳＡによるヒストン複合体化ＤＮＡフラグメントの定量化によってアッセイすることができる。このようなアッセイは、ヌクレオソーム検出のためのワンステップサンドイッチ免疫アッセイに依存する。手順は、遠心分離による細胞のペレット化および上清（インキュベーション中に膜から漏れた壊死細胞由来のＤＮＡを含む）の破棄を含む。細胞は、溶解緩衝液にし懸濁し、インキュベートする。溶解後、インタクトな核を、遠心分離によってペレット化する。上清のアリコートを、マイクロタイタープレートのストレプトアビジンで被覆されたウェルに移し、上清中のヌクレオソームを、２つのモノクローナル抗体、抗ヒストン（ビオチン標識）および抗ＤＮＡ（ペルオキシダーゼ抱合）に結合させる。抗体−ヌクレオソーム複合体を、ストレプトアビジンによってマイクロタイタープレートに結合させる。固定化された抗体−ヒストン複合体を、３回洗浄して免疫反応性を示さない細胞成分を除去し、サンプルをペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ（登録商標））とインキュベートした。染色産物（固定化された抗体−ヒストン複合体）の量を、分光光度法で測定する。
【０２５３】
いくつかのプロテアーゼは、初期アポトーシスに関連する。したがって、アポトーシスを、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ３）などのアポトーシス誘導プロテアーゼの存在の検出、さらにまたはその代わりにその活性のアッセイによってアッセイすることもできる。カスパーゼの活性化を、異なる方法（例えば、カスパーゼの捕捉による細胞溶解物のインビトロ酵素アッセイおよび適切な基質のタンパク質分解の測定）で分析することができる。さらに、カスパーゼを、ＰＡＲＰ（ポリ−ＡＤＰ−リボース−ポリメラーゼ）などのインビボカスパーゼ基質の切断の検出によってアッセイすることができる。ＰＡＲＰの切断フラグメントを、抗ＰＡＲＰ抗体などの適切な抗体を使用して検出することができる。プロテアーゼアッセイおよびＤＮＡ断片化アッセイは、細胞集団のアポトーシスのアッセイに特に適切である。
【０２５４】
ＩＳＮＴおよびＴＵＮＥＬ酵素標識アッセイなどの各細胞のアポトーシスの研究方法も利用可能である。上記のように、広範なＤＮＡ分解は、アポトーシスの初期段階でしばしば起こる特徴的な事象である。ＤＮＡの切断により、二本鎖の低分子量のＤＮＡフラグメント（モノおよびオリゴヌクレオソーム）および高分子量ＤＮＡ中の一本鎖分解物（「ニック」）が得られる。ＴＵＮＥＬでは、このようなＤＮＡ鎖の分解物を、適切な修飾ヌクレオチド（Ｘ−ｄＵＴＰ、Ｘ＝ビオチン、ＤＩＧ、または蛍光色素など）での遊離３’−ＯＨ末端の酵素標識によって検出する。適切な標識酵素には、ＩＳＮＴ（「インサイチューニック翻訳」）でのＤＮＡポリメラーゼ（ニック翻訳）およびＴＵＮＥＬ（「ＴｄＴ媒介Ｘ−ｄＵＴＰニック末端標識」）での末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（末端標識；Ｈｕａｎｇ，Ｐ＆Ｐｌｕｎｋｅｔｔ，Ｗ．，１９９２、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０７，１６３；Ｂｏｒｔｎｅｒ，Ｃ．Ｄ．ら，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５、２１）が含まれる。
【０２５５】
アポトーシスを、膜の変化（細胞表面糖タンパク質の側鎖由来の末端シアル酸残基の喪失を含む）の測定、新規の糖残基の曝露、トロンボスポンジンなどのマクロファージ分泌接着分子の受容体として作用することができる表面糖タンパク質の出現、および細胞膜リン脂質の非対称性の喪失、膜表面の疎水性および電荷の変化によってアッセイすることもできる。特に、ヒト抗凝結薬アネキシンＶは、３５〜３６ｋＤａで、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に対する親和性が高いＣａ２＋依存性リン脂質結合タンパク質である。正常な生存細胞では、ＰＳは、細胞膜の細胞質表面に存在する。しかし、アポトーシス細胞では、ＰＳは内部から原形質膜の外側の小葉状部分（ｏｕｔｅｒ  ｌｅａｆｌｅｔ）に移行し、それによりＰＳが外部細胞環境に曝される。したがって、アネキシンＶを使用して、アポトーシス細胞表面上に非対称に曝露されたホスファチジルセリンを検出することができる（Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｃ．Ｈ．Ｅ．ら、１９９５、Ｂｌｏｏｄ、８５、５３２；Ｖｅｒｈｏｖｅｎ，Ｂ．ら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８２、１５９７）。さらに、分染のためにＤＡＰＩ、臭化エチジウム、およびヨウ化プロピジウムなどのＤＮＡ色素を使用して、生存細胞と非生存細胞とを区別することができる。ＤＮＡ含有率のプロフィールを使用することができるので、透過アポトーシス細胞は低分子量のＤＮＡを漏出し、「サブＧ１ピーク」または「Ａ０」細胞（Ｇ１細胞よりもＤＮＡ染色が低い細胞）を、例えば、フローサイトメトリーによって検出することができる。アポトーシスに特徴的な形態学的変化を、この様式で検出することもできる。
【０２５６】
抗体の使用によるアポトーシス関連タンパク質（ｃｅｄ−３、ｃｅｄ−４、ｃｅｄ−９（Ｅｌｌｉｓ，Ｈ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．Ｒ．，１９８６、Ｃｅｌｌ、４４、８１７〜８２９；Ｙｕａｎ，Ｊ．Ｙ．ａｎｄ  Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．Ｒ．，１９９０、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１３８、３３〜４１；Ｈｅｎｔｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．Ｒ．，１９９２、Ｎａｔｕｒｅ、３５６、４９４〜４９９）、Ｆａｓ（ＣＤ９５／Ａｐｏ−１；Ｅｎａｒｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３８０、７２３〜７２６）、Ｂｃｌ−２（Ｂａｆｆｙ，Ｇ．ら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８、６５１１〜６５１９；Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｔ，ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．，１９９３、Ｂｌｏｏｄ、８１、１５１〜１５７；Ｏｌｔｖａｉ，Ｚ．Ｎ．，Ｍｉｌｌｉｍａｎ，Ｃ．Ｌ．ａｎｄ  Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｊ．，１９９３、Ｃｅｌｌ、７４、６０９〜６１９）、ｐ５３（Ｙｏｎｉｓｈ−Ｒｏｕａｃｈ，Ｅ．ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、３４５〜３４７）など）の検出を使用して、アポトーシスをアッセイすることもできる。
【０２５７】
［他の適応症］
実施例に示した所見は、アポトーシスおよび壊死肺胞マクロファージのクリアランスまたは制御の欠損が慢性肺炎に寄与する疾患におけるｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の治療上の役割を支持する。このような適応症の例（特に、慢性肺炎による気腫の発症リスクを有する未熟な新生児および喫煙者（ＳＰ−Ｄレベルが低下している）の慢性肺疾患などの相対ＳＰ−Ｄ欠損の背景）を上で考察した。
【０２５８】
実施例に示したデータは、ＳＰ−Ｄがアポトーシス細胞の制御およびクリアランスに関与し、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、アポトーシス肺胞マクロファージなどのアポトーシス細胞のクリアランスを増強することができることを示す。したがって、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、アテローム性動脈硬化症、成長異常（例えば、早産後の新生児肺疾患における異常な出生後の肺発達）、炎症組織の再造形欠損に関連する疾患、細胞増殖、および癌を治療することができる。
【０２５９】
〈アテローム性動脈硬化症〉
本発明の好ましい実施形態では、炎症性疾患は、アテローム性動脈硬化症を含む。
【０２６０】
アテローム性動脈硬化症は、適切な遺伝的背景に有効となる種々のリスク因子の作用に基づく多因子疾患である。アテローム性動脈硬化症は、泡沫細胞（すなわち、化学修飾された例えば酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）を取り込んだマクロファージおよび平滑筋細胞）の形成によって特徴付けられる。本発明者らは、特にマクロファージが非常に異常且つ泡状であり、肺のリン脂質代謝回転が妨害されている、実施例に記載のＳＰ−Ｄノックアウトマウスの肺表現型を証明した。特に、一定の疾患状態でＳＰ−Ｄが血清中に大量に存在することが知られている。
【０２６１】
したがって、本発明者らは、血清中の脂質代謝回転の妨害によりアテローム性動脈硬化症のリスクが増大することを提供する。したがって、ｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）を使用して、アテローム性動脈硬化症を治療することができる。
【０２６２】
本発明者らは、野生型マウスおよびノックアウトマウスの血清コレステロールレベルを測定し、ノックアウトマウスでコレステロールレベルが高いことを示す（図１７を参照のこと）。高レベルのコレステロールは、アテローム性動脈硬化症の発症リスクを増大させることが公知である。したがって、本発明者らは、組換えＳＰ−Ｄ（例えば、ｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ））を静脈内に補給することによりこの異常を矯正することを開示する。
【０２６３】
さらに、最近、アポトーシスが血管細胞のアテローム硬化性病変の発症を調整する役割を果たすことが示されている（Ｍａｒｔｉｎｅｔ  Ｗ，Ｋｏｃｋｘ  ＭＭ．，「アテローム硬化症のアポトーシス：酸化脂質および炎症の注目」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．，２００１年１０月，１２（５），５３５〜４１；Ｋｏｃｋｘ  ＭＭ．，Ｈｅｒｍａｎ  ＡＧ．，「アテローム性硬化症のアポトーシス：有利か有害か？」、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，２０００年２月，４５（３），７３６〜４６）。アポトーシス体が除去された場合、マクロファージのアポトーシスは、プラーク安定性に有利であり得る。しかし、プラーク中で除去されないアポトーシス細胞は、トロンビンを活性化してプラーク内血栓症をさらに誘導し得る。プラーク破裂および血栓症を引き起こし得るので原発性アテローム性動脈硬化症のアポトーシスは有害であると結論付けることができる。本発明者らは、実施例で組換えＳＰ−Ｄでの治療より、ＳＰ−Ｄノックアウトマウスの肺のアポトーシスマクロファージ数が減少することを示す。
【０２６４】
したがって、静脈内投与した組換えＳＰ−Ｄの潜在的適用は、アテローム性動脈硬化症の発症リスクを減少させることができる血管内の有害なアポトーシス細胞（例えば、マクロファージ）の減少である。したがって、ｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）を使用して、アテローム性動脈硬化症の１つまたは複数の任意の症状を治療または予防することができる。
【０２６５】
［医薬組成物］
本発明者らは、サーファクタント製剤を含むｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）またはエアゾール適用、噴霧、鼻腔内または気管支内投与によるｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の個別の同時投与を最初に開発可能にする、生物活性形態のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドを、低コストで大量に産生することができることを示す。凍結乾燥および再懸濁後に調製物は安定であり、生物活性が保持され、保存が容易である。望ましくない全身性副作用を有する副腎皮質ステロイドを使用した現在の治療と異なり、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）は、マウスでは病的影響は認められないようであり、ヒトでは副作用は認められないようである。
【０２６６】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドまたは核酸を含む組成物を単独で投与することが可能であるが、医薬製剤として有効成分を処方することが好ましい。したがって、本発明者らはまた、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を含む医薬組成物を開示する。このような医薬組成物は、記載の症状の治療または緩和のための個体へのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の送達に有用である。
【０２６７】
組成物は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体、構造的に関連する化合物、またはその酸性塩を含んでもよい。医薬製剤は、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアと共に有効量のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を含む。「有効量」のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体は、記載の疾患（例えば、炎症性疾患（好ましくは、湿疹）、炎症性肺疾患、新生児慢性肺疾患、新生児呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、肺線維症、気腫、間質性炎症性肺疾患、サルコイドーシス、肺炎、慢性炎症性肺疾患、新生児慢性炎症性肺疾患、イエダニ（ヒョウヒダニ属）に対するアレルギー、好ましくはヤケヒョウヒダニまたはコナヒョウヒダニ、または菌類もしくは菌類胞子、好ましくはアスペルギルス・フミガーツスによる、季節性呼吸器アレルギー、アレルギー性鼻炎、花粉症、非アレルギー性鼻炎、血管運動神経性鼻炎、刺激性鼻炎、草本の花粉、木本の花粉、または動物の鱗屑に対するアレルギー、アレルギー性喘息に関連するアレルギー、食品アレルギー、細菌感染およびウイルス感染を含む微生物感染（好ましくは肺の微生物感染））などの疾患の少なくとも１つの症状の緩和に十分な量である。
【０２６８】
有効量は、治療または緩和すべき特定の疾患または症候群、患者の年齢および体重、疾患などの病態がどのようにして進行するか、患者の身体全体の健康、症候群の重症度、およびｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体が単独または他の治療薬との組み合わせのいずれで投与されるかを含む他の要因によって変化する。
【０２６９】
適切な薬学的に許容可能なキャリアは当分野で周知であり、医薬製剤の所望の投与形態および様式によって変化する。例えば、これらは、希釈剤または充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、および潤滑剤などの賦形剤を含み得る。典型的には、キャリアは、固体、液体、または蒸発可能なキャリアまたはその組み合わせである。各キャリアは、製剤中の他の成分と適合可能であり、且つ患者に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。キャリアは、宿主に投与した場合に副作用（例えば、免疫応答）を誘発しないで生物学的に許容可能でなければならない。
【０２７０】
本明細書中に記載の医薬組成物には、局所および経口投与に適切なものが含まれ、影響を受ける組織が主に皮膚または表皮（例えば、乾癬、湿疹、および他の表皮疾患）である局所用製剤が好ましい。局所製剤には、組成物を治療すべき皮膚表面との直接的接触によって外部から適用する薬学的形態が含まれる。局所適用のための従来の薬学的形態には、浸漬（ｓｏａｋ）、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スティック、スプレー、エアゾール、バスオイル、および溶液などが含まれる。局所治療薬を、種々の賦形剤（賦形剤の選択は、重要であり、一般に治療される疾患が急性または慢性のいずれであるかに関連する）によって送達させる。例として、急性皮膚増殖疾患を、一般に、水性乾燥調製物で治療し、慢性皮膚増殖疾患を、水和調製物で治療する。浸漬は、急性湿性発疹の最も簡単な乾燥方法である。ローション（粉末を含む水性懸濁物）および溶液（溶媒中に溶解させた薬物）は、被毛部および間擦部に理想的である。軟膏または油中水型乳濁液は、最も有効な水和剤であり、乾燥発疹に適切であるが、ベタベタし、病変部位によっては望ましくない場合がある。必要に応じて、特に、病変への薬剤組成物の浸透性を増大させることが望ましい場合、これらを、包帯と組み合わせて適用することができる。クリームまたは水中油滴型乳濁液ならびにゲルは、吸収性を示し、患者に最も美容的に許容されている（Ｇｕｚｚｏら、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第９版，１５９３〜１５９５０，１９９６）。クリーム製剤には、一般に、石油、ラノリン、ポリエチレングリコール、鉱物油、グリセリン、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸グリセリル、セテアリルアルコール、酢酸トコフェロール、イソプロピルミリステート、ラノリンアルコール、シメチコン、カルボメン、メチルクロリソチアゾリノン、メチルイソチアゾリノン、シクロメチコン、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびにその混合物などの成分が含まれる。
【０２７１】
他の局所適用製剤には、シャンプー、石鹸、およびシェイクローション（shake lotion）など、特に、頭皮などの基礎となる皮膚上の残渣を除去するために処方された製剤が含まれる（Ａｒｎｄｔら，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２，２８３８，１９９３）。
【０２７２】
一般に、局所用製剤中のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の組成物濃度は、組成物の約０．５〜５０重量％、好ましくは約１〜３０重量％、より好ましくは約２〜２０重量％、および最も好ましくは約５〜１０重量％の量である。使用濃度は、上限からはじめ、治療を継続するにつれて濃度を減少させるか、製剤の適用頻度を減少させることができる。１日２回局所適用する場合もある。しかし、高用量を１日１回投与するか、低用量をより頻繁に投与すると有効であり得る。角質層は、貯蔵所として作用することができ、長期間にわたり生存している皮膚層に薬物を段階的に浸透させることができる。
【０２７３】
局所適用では、所望の薬理的効果を得るために十分量の有効成分を患者の皮膚に浸透させなければならない。一般に、皮膚への薬物の吸収は、薬物の性質、賦形剤の挙動、および皮膚の機能であると理解される。以下の３つの主要な可変要素は、異なる局所用薬物または異なる賦形剤中の同一の薬物の吸収速度または流動速度の相違を説明する；賦形剤中の薬物濃度、角質層と賦形剤との間の薬物の分配係数；角質層中の薬物の拡散係数。治療に有効であるために、薬物は、皮膚のバリア機能を担う角質層を通過しなければならない。一般に、高いインビトロ透過性を発揮する局所用製剤は、インビボで有効である。Ｏｓｔｒｅｎｇａら、（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６０，１１７５〜１１７９，１９７１）は、局所的に適用したステロイドのインビボでの有効性は、インビトロでの皮節化した（dermatomed）ヒト皮膚へのステロイド浸透速度に比例することを証明した。
【０２７４】
皮膚表面から表皮角化細胞への活性な化合物の浸透を増大させるために、皮膚科学的に許容可能且つ薬剤と適用可能な皮膚浸透増強剤を製剤に組み込むことができる。皮膚への活性な化合物の吸収を増大させる皮膚増強剤により、有効な治療に必要な薬剤の量が減少し、製剤の効果がより長く持続する。皮膚浸透増強剤は、当分野で周知である。例えば、ジメチルスルホキシド（米国特許第３，７１１，６０２号）；オレイン酸、１，２−ブタンジオールサーファクタント（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，７３、１１５３〜１１５６，１９８４）；エタノールとオレイン酸またはオレイルアルコールとの混合物（欧州特許第２６７，６１７号）、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＷＯ８７／０３４９０）；デシルメチルスルホキシドおよびＡｚｏｎｅ．ＲＴＭ（Ｈａｄｇｒａｆｔ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，２１、１６５〜１７３、１９９６）；アルコール、スルホキシド、脂肪酸、エステル、Ａｚｏｎｅ．ＲＴＭ、ピロリドン、尿素、およびポリオール（Ｋａｌｂｉｔｚら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５１，６１９〜６３７，１９９６）。
【０２７５】
１，８−シネオール、メンソン、リモネン、ネロリドール（Ｙａｍａｎｅ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ＆Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、４７、９７８〜９８９、１９９５）；Ａｚｏｎｅ．ＲＴＭおよびトランスクトール（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．，１３、５４２〜５４６、１９９６）；ならびにオレイン酸、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール（Ｓｉｎｇｈら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５１，７４１〜７４４，１９９６）などのテルペンは、有効成分の皮膚浸透を改善することが公知である。
【０２７６】
薬剤または組成物の浸透レベルを、当業者に公知の技術によって測定することができる。例えば、当業者は、試験化合物の皮膚浸透を決定するいくつかの方法を使用して、活性な化合物の放射性標識およびその後の皮膚によって吸収された放射性標識化合物の量の測定によって吸収された組成物レベルを決定することができる。皮膚浸透研究に関する刊行物には、Ｒｅｉｎｆｅｎｒａｔｈ，Ｗ．Ｇ．ａｎｄ  Ｇ．Ｓ．Ｈａｗｋｉｎｓ．，「経皮浸透を測定するための動物モデルとしての離乳ヨークシャーブタ」、Ｓｗｉｎｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍ．Ｅ．Ｔｕｍｂｌｅｓｏｎ編）、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６およびＨａｗｋｉｎｓ，Ｇ．Ｓ．，「インビトロ皮膚浸透の実施方法」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｋｉｎ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，Ｂ．Ｗ．Ｋｅｍｐｐａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｒｅｉｆｅｎｒａｔｈ編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９０，６７〜８０頁；およびＷ．Ｇ．Ｒｅｉｆｅｎｒａｔｈ，Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ＆Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ，１１０，３〜９，１９９５が含まれる。
【０２７７】
いくつかの応用のために、ポリマーなどの当分野で公知の製剤を使用した薬剤または組成物の長期作用形態を投与することが好ましい。処置すべき領域への薬物の送達効率を増大させるために、当分野で公知の方法にしたがって薬剤を皮膚パッチ（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｎｏｒｄｉｃａ，４，１１７，１９９２；Ｔｈａｃｈｒｏｄｉら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１６，１４５〜１４８，１９９５；Ｎｉｅｄｎｅｒ  Ｒ．，Ｈａｕｔａｒｚｔ，３９，７６１〜７６６，１９８８）または包帯に組み込むことができる。
【０２７８】
任意選択的に、本発明の局所製剤は、さらなる賦形剤（例えば、メチルパラベン、ベンジルアルコール、ソルビン酸、または第四級アンモニウム化合物などの防腐剤；ＥＤＴＡなどの安定剤；ブチル化ヒドロキシトルエンまたはブチル化ヒドロキシアニソールなどの抗酸化剤；およびクエン酸塩およびリン酸塩などの緩衝液）を有することができる。
【０２７９】
医薬組成物を、錠剤、カプセル、または溶液の形態の経口製剤で投与することができる。有効量の経口製剤を、疾患の症状が緩和するまで患者に１日１〜３回投与する。薬剤の有効量は、患者の年齢、体重、および病態に依存する。一般に、薬剤の１日の経口投与量は、１２００ｍｇ未満且つ１００ｍｇ超である。好ましい１日の経口用量は、約３００〜６００ｍｇである。経口製剤は、単位投与形態で存在することが都合がよく、薬学分野で公知の任意の方法によって調製することができる。組成物を、適切な薬学的に許容可能なキャリアと共に任意の所望の投与形態に処方することができる。典型的な単位投与形態には、錠剤、丸薬、粉末、溶液、懸濁液、乳濁液、顆粒、カプセル、座剤が含まれる。一般に、製剤を、薬剤組成物を液体キャリアまたは細かく砕いた固体キャリアまたはその両方と均一且つ十分に合わせ、必要に応じて、生成物を成形することによって調製する。有効成分を、液体、粉末、錠剤、またはカプセル形態の種々の基剤に組み込んで疾患を治療するための有効量の有効成分を得ることができる。
【０２８０】
本明細書中の使用に適切な他の治療薬は、意図する目的で有効な任意の適合可能な薬物または薬製剤（agent formulation）に相補的な薬物である。併用療法で使用される製剤を、組み合わせ効果が得られるように他の治療と同時または連続的に投与することができる。
【０２８１】
［サーファクタント治療組成物］
サーファクタント治療薬を含むｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の開発を、現在の製剤の代わりまたは現在の製剤と組み合わせて新生児呼吸窮迫症候群の治療に適用することができる。
【０２８２】
新生児呼吸窮迫症候群のための現在のサーファクタント療法には、以下が含まれる。
【０２８３】
〈Ｂｅｒａｃｔａｎｔ（Ｓｕｒｖａｎｔａ）〉
Ｂｅｒａｃｔａｎｔ（Ｓｕｒｖａｎｔａ）は、リン脂質、脂肪酸、およびサーファクタント関連タンパク質Ｂ（７ｍｃｇ／ｍＬ）およびＣ（２０３ｍｃｇ／ｍＬ）を含む半合成ウシ肺抽出物である。Ｂｅｒａｃｔａｎｔは、１００ｍｇ（すなわち、４ｍＬ）／ｋｇの小児用量を４つのアリコートに分けて少なくとも６時間あけて投与する（気管内）。
【０２８４】
〈Ｃａｌｆａｃｔａｎｔ（Ｉｎｆａｓｕｒｆ）〉
Ｃａｌｆａｃｔａｎｔ（Ｉｎｆａｓｕｒｆ）は、リン脂質、脂肪酸、およびサーファクタント関連タンパク質Ｂを含む新生児ウシ肺抽出物である。Ｒｏｓｓが製造しており、（２６０ｍｃｇ／ｍＬ）およびＣ（３９０ｍｃｇ／ｍＬ）で投与する。
【０２８５】
〈ＳＵＲＶＡＮＴＡ（登録商標）（ｂｅｒａｃｔａｎｔ）気管内用懸濁液〉
ＳＵＲＶＡＮＴＡ（登録商標）（ｂｅｒａｃｔａｎｔ）は、気管内使用を意図する滅菌無発熱物質肺サーファクタントである。これは、組成物を標準化し、天然の肺サーファクタントの表面張力低下性を模倣するために、パルミチン酸コルホセリル（ｃｏｌｆｏｓｃｅｒｉｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、パルミチン酸、およびトリパルミチンを添加した、リン脂質、中性脂質、脂肪酸、およびサーファクタント関連タンパク質を含む天然のウシ肺抽出物である。得られた組成物から、２５ｍｇ／ｍＬリン脂質（１１．０〜１５．５ｍｇ／ｍＬの二飽和ホスファチジルコリン）、０．５〜１．７５ｍｇ／ｍＬトリグリセリド、１．４〜３．５ｍｇ／ｍＬ遊離脂肪酸、および１．０ｍｇ／ｍＬ未満のタンパク質が得られる。これを、０．９％の塩化ナトリウム溶液中に懸濁し、熱滅菌する。ＳＵＲＶＡＮＴＡは、防腐剤を含まない。そのタンパク質は、一般にＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃとして公知の２種の疎水性で低分子量のサーファクタント関連タンパク質からなる。ＳＰ−Ａとして公知の、親水性で高分子量のサーファクタント関連タンパク質は含まない。
【０２８６】
〈ＩＮＦＲＡＳＵＲＦ気管内懸濁液（Ｆｏｒｅｓｔ）〉
Ｉｎｆａｓｕｒｆ（登録商標）（ｃａｌｆａｃｔａｎｔ）気管内懸濁液は、気管内点滴注入のみを意図する滅菌無発熱物質肺サーファクタントである。これは、リン脂質、中性脂質、および疎水性サーファクタント関連タンパク質ＢおよびＣ（ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃ）を含むウシ肺由来の天然サーファクタントの抽出物である。これは、防腐剤を含まない。
【０２８７】
Ｉｎｆａｓｕｒｆは、０．９％の塩化ナトリウム水溶液中にｃａｌｆａｃｔａｎｔを含むオフホワイトの懸濁液である。ｐＨは５．０〜６．０である。各Ｉｎａｓｕｒｆは、３５ｍｇの総リン脂質（２６ｍｇのホスファチジルコリンを含み、そのうちの１６ｍｇが二飽和ホスファチジルコリンである）および０．２６ｍｇのＳＰ−Ｂを含む０．６５ｍｇのタンパク質を含む。
【０２８８】
〈気管内懸濁液用のＥＸＯＳＵＲＦ  Ｎｅｏｎａｔａｌ（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）〉
気管内懸濁液用のＥＸＯＳＵＲＦ  ＮＥＯＮＡＴＡＬ（パルミチン酸コルホセリル、セチルアルコール、チロキサポール）は、滅菌凍結乾燥粉末として真空下で保存した無タンパク質合成肺サーファクタントである。ＥＸＯＳＵＲＦ  ＮＥＯＮＡＴＡＬは、気管内点滴注入による投与前に注射用無防腐剤滅菌水で再構成する。各１０ｍＬのバイアルは、１０８ｍｇパルミチン酸コルホセリル（一般に、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｄ  ＰＰＣ）として公知）、１２ｍｇセチルアルコール、８ｍｇチロキサポール、および４７ｍｇ塩化ナトリウムを含む。ｐＨを調製するために、水酸化ナトリウムまたは塩酸を添加することができる。８ｍＬの注射用滅菌水で再構成した場合、ＥＸＯＳＵＲＦ  ＮＥＯＮＡＴＡＬ懸濁液は、０．１ＮのＮａＣｌ中に１３．５ｍｇ／ｍＬパルミチン酸コルホセリル、１．５ｍｇ／ｍｌセチルアルコール、および１ｍｇ／ｍＬチロキサポールを含む。懸濁液は、ｐＨ５〜７で乳白色であり、浸透圧１８５ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【０２８９】
ＥＸＯＳＵＲＦ  ＮＥＯＮＡＴＡＬ化合物の化合物名は、以下である。パルミチン酸コルホセリル：（Ｒ）−４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−１０−オキソ−７−［（１−オキソヘキサデシル）オキシ］−３，５，９−トリオキサ−４−ホスファペンタコサン−１−水酸化アルミニウム内部塩４−オキシド；セチルアルコール：（１−ヘキサデカノール）：およびチロキサポール：ホルムアルデヒドおよびオキシランを含む４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノールポリマー。
【０２９０】
タンパク質を含まないＥＸＯＳＵＲＦ  ＮＥＯＮＡＴＡＬでは、セチルアルコールは、気体−液体境界でのＤＰＰＣの展着剤として作用する。チロキサポール（高分子長鎖反復アルコール）は、ＤＰＰＣおよびセチルアルコールの両方を分散させるように作用する非イオン性サーファクタントである。浸透圧を調整するために塩化ナトリウムを添加する。
【０２９１】
〈ＣＵＲＯＳＵＲＦ（登録商標）〉
商標名：Ｃｕｒｏｓｕｒｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ：ｐｏｒａｃｔａｎｔαの力価：１２０ｍｇリン脂質／１．５ｍＬまたは２４０ｍｇリン脂質／３ｍＬ、ウイルス投薬形態：気管内懸濁液、会社名：Ｄｅｙ，ＬＰ、利用可能性：処方箋薬、業務用、ＦＤＡ承認日：１９９９年１１月１８日。
【０２９２】
したがって、本発明者らは、サーファクタント治療薬として、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体と組み合わせた上記開示の治療薬の任意の成分（好ましくは、有効成分）を含む組成物の使用を開示する。したがって、本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体と組み合わせた肺抽出物を含む組成物を開示する。肺抽出物は、リン脂質（ホスファチジルコリンおよび二飽和ホスファチジルコリン）および／または脂肪酸を含むウシ、好ましくは子牛の肺抽出物を含み得る。組成物は、さらに、サーファクタント関連タンパク質（例えば、サーファクタント関連タンパク質Ｂまたはサーファクタント関連タンパク質Ｃ）を含み得る。セチルアルコール、長鎖反復アルコール、チロキサポール、パルミチン酸コルホセリル（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、パルミチン酸、およびトリパルミチン、ｐｏｒａｃｔａｎｔα、および塩化ナトリウムなどの他の成分を添加することもできる。
【０２９３】
特に、本発明者らは、それぞれＢｅｒａｃｔａｎｔ（Ｓｕｒｖａｎｔａ）；Ｃａｌｆａｃｔａｎｔ（Ｉｎｆａｓｕｒｆ）；ＳＵＲＶＡＮＴＡ（登録商標）（ｂｅｒａｃｔａｎｔ）；ＩＮＦＲＡＳＵＲＦ；ＥＸＯＳＵＲＦ  Ｎｅｏｎａｔａｌ；およびＣＵＲＯＳＵＲＦに対応する組成物を開示し、各組成物は、さらに、治療有効量のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を含む。
【０２９４】
［さらなる態様］
さらなる態様には、以下が含まれる。
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を個体に投与するステップを含む、個体のＭＣＰ−１レベルまたはＭＩＰ１αレベルまたはその両方を増加させる方法。
【０２９５】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を個体に投与するステップを含む、個体のサイトカインレベル、好ましくはＩＦＮγレベルを増加させる方法。
【０２９６】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の投与による、個体の細胞媒介免疫系の成分をアップレギュレーションする方法、ナチュラルキラー細胞の活性をアップレギュレーションする方法、またはその両方も開示する。
【実施例１】
【０２９７】
［材料と方法］
〈組換えサーファクタントタンパク質Ｄフラグメント（ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）〉
これらの実施例で使用される組換えサーファクタントタンパク質Ｄフラグメント（ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）は、ヒトＳＰ−Ｄの短縮形態である。標準的な発酵手順を使用してｐＥＴベクターに挿入し、大腸菌に形質転換したヒトＳＰ−Ｄ（構築物）のフラグメントのｃＤＮＡを含むプラスミド由来の大腸菌中のフラグメントを発現させる。
【０２９８】
構築物は、２位でプロリンがセリンに置換された８個のＮ末端Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレット（斜体で示す）およびその後の２８残基のネック領域（太字で示す）およびヒトＳＰ−Ｄの１２５残基の炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）の短ストレッチから構成される。
【化５】
2005522988.tif 000009
【０２９９】
ｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）の構造を示す略図を、図１Ａに示す。（Ａ）はサーファクタントタンパク質Ｄの十二量体であり、（Ｂ）はＳＰ−Ｄの三量体であり、（Ｃ）はＳＰ−Ｄのヘッド−ネック領域の全構造のリボン図である。
【０３００】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２に記載の配列を有する。
【０３０１】
〈ｐＥＴベクターｐＥＴ２１ｄ中でのｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）の発現構築物の作製〉
ヒトＳＰ−Ｄ（ネック／ＣＲＤ）をコードし、８個のＮ末端Ｇｌｙ−Ｘａａ  Ｙａａトリプレットをコードする短ストレッチを含む配列を、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄ−３での消化によって前に作製したヒトＳＰ−ＤクローンｐＢＣＳＫ１（Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｕ．ら、「ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄのαヘリックスネック領域はリポ多糖類およびリン脂質への炭水化物認識ドメインの結合に不可欠である」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９６，３１８（Ｐｔ２），５０５〜１１頁）から切り出した。次いで、得られたフラグメントを、アガロース電気泳動によって精製し、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄ３で消化したｐＥＴ−２１ｄベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ製）にライゲーションする。ｐＥＴ−２１ｄベクターは、Ｎｏｖｅｇｅｎ（カタログ番号６９７４３−３）から利用可能である。その配列は当分野で公知であり、例えば、Ｎｏｖａｇｅｎの文献（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｏｖａｇｅｎ．ｃｏｍ／で見出される）に記載されている。
【０３０２】
〈ｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）の調製〉
このようにして作製した新規の構築物を使用して、コンピテント細胞（ＤＨ５α）と形質転換した。ｒＳＰ−Ｄ（ネック／ＣＲＤ）についてこの構築物を含むプラスミドＤＮＡを、細胞成長後に標準的方法によって形質転換コロニーから精製する。
【０３０３】
ｐＥＴベクター中のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）（ネック／ＣＲＤ）のｃＤＮＡを含むプラスミドを、ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、１つのコロニーを選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＬＢ+）を補足した１ｍｌのＬＢで希釈する。これを、１０００倍に希釈し、１００μｌをアガロースプレート上に広げ、一晩インキュベートする。得られたコロニーのローンを、平たいスパチュラでの掻爬によって回収し、５０ｍｌのＬＢ+に懸濁する。これの５ｍｌアリコートを使用して、５００ｍｌのＬＢ+を含む２Ｌフラスコをインキュベートする。この手順は、成長倍地中での成長および一晩の培養のより一般的な操作よりも優れていることが見出された。静止期でのコロニー成長により、細胞間の接触が軽減され、摂取物中の発現プラスミドを保有しない変異体の比率が減少する。
【０３０４】
至適発現レベルを達成するために、５００ｍｌ  ＬＢ／２Ｌフラスコを超えないことが重要であることも見出された。
【０３０５】
培養物を、Ａ600で０．６〜０．８に成長させ、その後０．４ｍＭのＩＰＴＧと２〜３時間インキュベートする。
【０３０６】
〈組換えサーファクタントタンパク質Ｄフラグメント（ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ））の精製〉
遠心分離によって細胞を採取し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ｖ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ（ｐＨ７．５）に溶解し、３分間超音波処理を行う。不溶性封入体中でｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を発現させ、１００００×ｇの遠心分離によって採取する。このステップを３回繰り返し、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を含む精製封入体ペレットを、１００ｍｌの８Ｍ尿素、１００ｍＭの２−メルカプトエタノール（ｐＨ７．５）に溶解し、高速遠心分離によって明澄化した。
【０３０７】
尿素溶液を、１Ｌの２０ｍＬ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈し、および５０ｍｌのＱ−Ｓｅｐｈｅｒｏｓｅ陰イオン交換樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を添加し、２０℃で３０分混合する。吸着した樹脂を、ＦＰＬＣカラムに詰め、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で十分に洗浄し、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出する。
【０３０８】
ピーク画分由来のタンパク質を、４℃で３０分間のアセトンでの１０倍希釈によって沈殿させる。沈殿物を、高速遠心分離で採取し、１００ｍｌの８Ｍ尿素に溶解し、１０Ｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ2（ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析する。
【０３０９】
次いで、透析物を、２０ｍｌのマルトース−アガロースを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ2（ｐＨ７．４）と数時間から一晩混合する。この長時間インキュベーションステップにより、最終段階の活性タンパク質への再折りたたみが適切に促進される。
【０３１０】
マルトース−アガロースをＦＰＬＣカラムに詰め、１ＭのＮａＣｌを含む同一の緩衝液で洗浄して、非特異的タンパク質を除去する。高塩洗浄により、カラムに結合していた全ＯＤ280吸着物質の約２５〜５０％が溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、おそらく正確な三次元構造に完全に折りたたまれなかった低親和性ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）である微量（約１０％）のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を示す。これらのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）調製物を、マウスでの構造研究および実験で使用すべきであり、この画分を含まないことが望ましいと見なされる。さらに、高塩中の全ＯＤ280吸着物質は、このｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）に寄与することができるものよりもはるかに大量であり、おそらく細菌ＤＮＡおよび動物への投与用調製物で望ましくないと考えられる他の物質による。
【０３１１】
次いで、結合したｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を、５ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム（ｐＨ７．４）で溶離して、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ＣＲＤ媒介結合に必要なＣａを除去した。
【０３１２】
ピーク画分を、１００００ＭＷＣＯメンブレンを具備したＡｍｉｃｏｎを使用して撹拌細胞を５ｍｌに濃縮し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、００２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム（ｐＨ７．４）の溶離緩衝液を含む、１００ｍｌのＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にロードする。分子量６０ｋＤａに対応する単一ピークとしてｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）が溶出された。
【０３１３】
このステップにより、この段階で同時に精製されたと考えられる全ての夾雑物が最終的に分離され、ＥＤＴＡの存在下で任意の炭水化物がｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）から分離され、低分子量であるので、カラムの総封入体積（１００ｍｌ）に溶離されたと予想される。
【０３１４】
このステップにより、タンパク質ピークの対称性およびショルダーの非存在によるタンパク質調製物の均一性も評価される。主ピークの外側の画分を破棄する。プールした画分を回収し、２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、次のステップに進む。ゲル濾過後のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の回収率は、典型的にはロードした全ＯＤ280吸収物質の８０％である。これは、これの少なくとも２０％はｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）に起因せず、最終ステップとしてゲル濾過を含める必要が強まることを示す。
【０３１５】
精製ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム（ｐＨ７．４）の１０ｍＭのＰｏｌｙｍｉｘｉｎＢカラム（Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）への通過によって内毒素レベルが減少する。
【０３１６】
〈ＦＩＴＣ標識によるｒＳＰ−Ｄの修飾〉
マウスのＢＡＬによって単離されたマクロファージへのインビトロ結合を評価するために、ｒＳＰ−Ｄを、製造者の説明書に従って、アミン反応性プローブＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）で標識する。簡単に述べれば、５０μｇのＦＩＴＣを、１ｍｇのｒＳＰ−Ｄを含む２００ｍｌの０．１Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）と室温で２時間インキュベートする。
【０３１７】
次いで、標識したタンパク質を、Ｇ−２５カラムを使用してＦＩＴＣから分離する。ＦＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄ（２０μｇ／ｍｌ）を、野生型マウスおよびＳＰ−Ｄノックアウトマウスから新たに単離した肺胞マクロファージと結合緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ2）中でインキュベートし、Ｃｏｎｓｏｒｔ３２  ＦＡＣｓシステムでのフローサイトメトリーによって以下に概説するようにヨウ化プロピジウムまたはＰＥ標識アネキシンＶとの同時標識について評価する。
【０３１８】
〈アスペルギルス・フミガーツス抗原の調製（Ａｆｕ  ｌｗｃｆ）〉
アスペルギルス・フミガーツス（Ａｆｕ）を、合成培地（Ｍ１９９、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）にて静置培養として３７℃で１週間成長させる。Ａｒｒｕｎｄａら（Ａｒｒｕｄａ，Ｌ．Ｋ．，Ｂ．Ｊ．Ｍａｎｎ，ａｎｄ  Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ，１９９２，「アスペルギルス・フミガーツスにおける主要なアレルゲンおよび細胞毒素（Ａｓｆ  ｆＩ）の選択的発現：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ関連疾患の免疫病原性の影響」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９、３３５４〜９）は、Ａｓｐ  ｆ１（主要なアレルゲン）の発現は１週間後が最大であり、それより長いインキュベーションで減少する傾向があることを証明している。
【０３１９】
１週間培養物は、１２時間の０．１％チメロサールの添加によって死滅する。培養物をガラスウールで濾過し、最終的に０．４５μｍのメンブレンで濾過して、全ての微粒子および可能な胞子を除去し、その後、３回緩衝液を交換しながら水に対して透析した。透析物を凍結乾燥して褐色粉末を得た。
【０３２０】
Ａｓｐ  ｆ１に対応する１８ｋＤａの主バンドが存在する。Ａｓｐ  ｆ２に対応するバンド（３７ｋＤａ）も明白である。１８ｋＤａのバンドのＮ末端配列決定を行って、Ａｓｐ  ｆ１のＮ末端配列に対応する配列ＡＴＷＴＣＩＮＱＱＬＮＰを得た。
【０３２１】
１週間培養物の濾過物（１ｗｃｆ）は、英国国立生物学的製剤研究所から入手したＡｆｕアレルギー患者由来のヒト血清によって認識されることもＥＬＩＳＡによって証明された。
【０３２２】
〈トランスジェニック株〉
本発明者らは、以前に、遺伝子ターゲティングＳＰ−Ｄ欠損マウスの作製を報告している（Ｂｏｔａｓ，Ｃ．，Ｐｏｕｌａｉｎ，Ｆ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｊ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．，Ａｌｌｅｎ，Ｌ．，Ｇｏｅｒｋｅ，Ｊ．，Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｊ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｅ．，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ａ．Ｍ．，Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｃ．＆Ｈａｗｇｏｏｄ，Ｓ．，１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、１１８６９〜７４）。
【０３２３】
Ｃ５７Ｂ１６バックグラウンドに１０世代戻し交配したＳＰ−Ｄ欠損マウスに自由に餌を与え、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｕｎｉｔ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの無病原体環境下で隔離飼育器に格納する。コントロール実験のための無病原体Ｃ５７Ｂ１６野生型マウスを、Ｈａｒｌａｎ−ＯＬＡＣ、Ｓｈａｗ’ｓ  ｆａｒｍ、Ｂｉｃｅｓｔｅｒ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅから入手する。全実験プロトコールは、適切なＵ．Ｋ．Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ  ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓおよびオックスフォード大学倫理委員会に承認されている。
【０３２４】
〈ｒＳＰ−Ｄ、ｒＳＰ−Ａ、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の投与〉
６週齢のＳＰ−Ｄ欠損マウスに、３つのプロトコールのうちの１つを使用して３〜６週間にわたりタンパク質またはＰＢＳのみを複数鼻腔内投与した。
【０３２５】
各タンパク質投与のために、マウスをイソフルランで軽く麻酔し、その後ｒＳＰ−Ｄまたはコントロールタンパク質（３０μｇ、２５μｇ、または１０μｇのｒＳＰ−Ｄ、ｒＳＰ−Ａ、またはＢＳＡを含む５０μｌのＰＢＳ）を、滅菌マイクロピペットを使用して鼻孔に投与する。全流動物が吸入されるまでマウスを直立させたままにする。最初の処置プロトコールでは、１２匹のマウスに６週齢から３０μｇのｒＳＰ−Ｄを３日間毎日投与した。３週間後に肺胞マクロファージ数および肺胞リン脂質含有量のアッセイのために６匹のマウスを屠殺する。治療群の残りの６匹のマウスは６週間の治療を完了させ、その後屠殺およびアッセイを行った。第２の治療プロトコールでは、マウスに１２週齢から１０μｇのｒＳＰ−Ｄ、ｒＳＰ−Ａ、ＢＳＡで１週間に５回を３週間処置し、その後屠殺およびアッセイを行った。さらなるコントロールは非処置マウスであり、マウスをＰＢＳで処置した。４週齢から処置効果を評価するために、肺胞マクロファージ数が有意に増加する前に、第３のプロトコールにて６匹のマウスを３０μｇのｒＳＰ−Ｄで２週間処置する。リン脂質および肺胞マクロファージ数のアッセイのためにこれらのマウスを６週齢で屠殺し、非処置の年齢の適合したコントロールと比較した。
【０３２６】
〈気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）〉
肺胞マクロファージの単離のために（例えば、アポトーシスアッセイのため）、各治療群の４〜６匹のマウスを二酸化炭素での窒息によって屠殺し、滅菌ＲＰＭＩを使用して気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行う。
【０３２７】
滅菌カニューレを気管に挿入し、縫合糸で所定の位置に連結する。２ｍｌシリンジを使用して、１ｍｌの洗浄緩衝液で４回肺を洗浄して、全部で約３ｍｌの洗浄液を得る。次いで、ＢＡＬ液を、室温にて５分間、２５０ｇで遠心分離して、肺胞マクロファージをペレット化する。細胞を、１ｍｌのＰＢＳへの再懸濁によって洗浄し、ベンチトップ遠心分離機での１０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によって再度ペレット化する。次いで、細胞を再懸濁し、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムと１０分間インキュベートする。次いで、サンプルを、ＦＡＣＳフローサイトメトリーによって染色について分析する。
【０３２８】
〈肺胞マクロファージのサイトスピン調製物〉
０．２５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳを使用した気管支肺胞洗浄および２５０ｇでの遠心分離によって単離した肺胞マクロファージを、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁する。標準的な手順を使用したマラカイトグリーンまたはクリスタルバイオレットでの染色、およびサイトスピンスライドの調製後に、血球計による全細胞の計数のためにアリコートを採取する。Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＭｃＧａｗ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）での染色後のサイトスピン調製物による細胞数の相違により、この方法で単離された細胞の９８％が肺胞マクロファージであることが確認される。
【０３２９】
〈マウス肺胞マクロファージのインビトロ標識〉
野生型およびノックアウトマウスのＢＡＬから単離した肺胞マクロファージを、蛍光グリーンおよびオレンジ細胞追跡色素でインビトロ標識する。Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｏｒａｎｇｅは、ＣＭＴＭＲ（５−（および６−）−（（（４−クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン）混合異性体およびＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）からなる。
【０３３０】
ＣＭＦＤＡ（５−クロロメチルフルオレセイン二酢酸）からなるＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）は、穏やかなチオール反応性クロロメチル基を含む。一旦細胞内に入ると、クロロメチル基が細胞内チオールと反応し、プローブが細胞不透過性蛍光色素のエーテル付加物に変換される。過剰な非抱合試薬は、細胞外培地に受動拡散する。Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅは、蛍光性を示すエステラーゼ活性を必要とせず、細胞内エステラーゼが切断されるまでｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎは無色である。
【０３３１】
〈気管支肺胞洗浄液の総リン脂質およびタンパク質の測定〉
各実験で示された測定点で、各治療群の４〜６匹のマウスを、二酸化炭素での窒息によって屠殺し、０．２５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳでの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。１ｍｌで肺を４回洗浄して、全部で約３ｍｌの洗浄液を得る。ＢＡＬ液を、室温にて５分間、２５０ｇで遠心分離する。無細胞上清中の総タンパク質濃度を、基質としてビシンコニン酸を使用して測定する。無細胞ＢＡＬ液を、クロロホルム−メタノールに抽出し、リン濃度から総リン脂質を測定した。
【０３３２】
〈マウスＢＡＬ液のｒＳＰ−Ｄレベル〉
ｒＳＰ−Ｄ処置マウス由来の無細胞ＢＡＬＦの連続希釈物を、組換えヒトＳＰ−Ｄに対して生じたビオチン化および非ビオチン化単一特異性ポリクローナル抗体を使用した標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ法によってｒＳＰ−Ｄ含有量について分析する。この抗体は、マウスＳＰ−ＡやマウスＳＰ−Ｄと交差反応性を示さなかった。組換えヒトＳＰ−Ｄを使用した検量線を使用して、投与後の特定の測定点で回収された肺胞ｒＳＰ−Ｄの絶対量を計算する。
【０３３３】
〈アポトーシス細胞および壊死細胞のフローサイトメトリーおよび検出〉
ＲＰＭＩでＳＰ−Ｄ欠損マウスのＢＡＬから単離した細胞を、ＰＢＳに再懸濁し、サイズおよび粒度によってマクロファージ集団をキャラクタライズするために、Ｃｏｎｓｏｒｔ３２ＦＡＣｓシステム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析する。明らかに血液染色された細胞集団を破棄する。アポトーシス細胞および壊死細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＬＵＯＳ染色キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって検出する。アポトーシス細胞および壊死細胞を、通常は細胞内細胞膜の小葉状部分から外型の小葉状部分に存在するホスファチジルセリン（ＰＳ）に曝露し、アネキシンＶが細胞表面でＰＳに結合する（Ｖｅｒｍｅｓ，Ｉ．，Ｈａａｎｅｎ，Ｃ．，Ｓｔｅｆｆｅｎｓ−Ｎａｋｋｅｎ，Ｈ．＆Ｒｅｕｔｅｌｉｎｇｓｐｅｒｇｅｒ，Ｃ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８４，３９〜５１）。細胞アリコートを、蛍光標識アネキシンＶで染色し、ＰＩで対比染色して、一次または二次壊死細胞を検出する。同時標識実験では、蛍光シグナルの重複についての補正後にＰＩまたはＰＥ標識アネキシンＶ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した細胞へのＦＩＴＣ標識ｒＳＰ−Ｄの結合も評価する。
【０３３４】
〈データ分析〉
結果を、平均±平均の標準誤差（ｘ±ＳＥ）として示す。不平等な分散（unequal variance）を推測する両側ｔ検定を使用して、各測定点での動物群間の比較を行う。Ｐ＜０．０５で有意と見なす。
【実施例２】
【０３３５】
［アスペルギルス・フミガーツスに対するアレルギー性過敏症のマウスモデルにおけるアレルギー性過敏症の調整］
大腸菌で発現および精製され、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）と呼ばれるネックおよびＣＲＤドメインの三量体から構成されるヒトＳＰ−Ｄの短縮形態は、マウスにおけるアレルギー性過敏反応のモジュレーターとして機能的に活性である。本研究では、好酸球増多症、血清ＩｇＥおよびＩｇＧ１の調整を、Ｃ５７ＢＬ／６で再現し、効果はＢＡＬＢ／ｃマウスに固有でないことを証明した。
【０３３６】
本研究で測定したパラメータは、アスペルギルス・フミガーツスアレルゲンに対するアレルギーのマウスモデル全てで有意に増加し、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での鼻腔内処置によって全て有意に減少する血清ＩｇＥおよびＩｇＧ１ならびに末梢血好酸球増多症である。
【０３３７】
任意の特定の理論に拘束されることを意図するわけではないが、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）は、Ｔｈ２からＴｈ１へのＴリンパ球集団の変化を促進すると提案する。これにより、アレルギーの主な構成要素である血清ＩｇＥおよび好酸球増多症の減少が認められる。
【０３３８】
〈ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の調製〉
コラーゲンストーク（８−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）の短領域および成熟タンパク質配列の代表的な残基１７９〜３５５を含むネック／ＣＲＤのｃＤＮＡを、ヒト肺ライブラリーＤＮＡからクローン化し、ｐＥＴ−２１ｄベクター（Novagen, Nottingham)に挿入する。プラスミドをＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、１つのコロニーを選択し、再プレーティングして１００〜４００コロニー／プレートを得る。これらを掻き取り、これを使用して１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補足した５００ｍｌのＬＢ培地を含む震盪フラスコに接種し、０．６〜０．８のＯＤ６００まで成長させ、その後０．４ｍＭのＩＰＴＧで２〜３時間誘導する。細胞を遠心分離によって回収し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１ｍＭのＰＭＳＦ（ｐＨ７．５）に溶解し、３分間超音波処理を行う。不溶性封入体中でｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）が発現し、遠心分離で回収し、１００００×ｇで４回洗浄した。ペレットを、１００ｍｌの８Ｍ尿素、１００ｍＭの２−メルカプトエタノール（ｐＨ７．５）に溶解し、遠心分離によって明澄化し、１０Ｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ2（ＴＢＣ）に対する一晩の透析によって再折りたたみを行う。再折りたたみされたｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を、マルトース−アガロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）への吸着によって変性ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）から分離し、夾雑物を除去するための１ＭのＮａＣｌを含むＴＣＢでの第１のカラム洗浄後に５ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌで溶離する。最終精製は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム（ｐＨ７．４）（ＴＳＥ）の溶離緩衝液でのゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＫ）による。分子量６０ｋＤａに対応する単一のピークとしてｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）が溶離された。精製ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の１０ｍｌ  ＰｏｌｙｍｉｘｉｎＢカラム（Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ、Ｐｉｅｒｃｅ＆Ｗａｒｒｉｎｅｒ、ＵＫ）への通過によって内毒素レベルが減少し、５ｐｇ／μｇ未満のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を含む調製物のみを使用する。
【０３３９】
〈アスペルギルス・フミガーツス抗原（Ａｆｕ  １ｗｃｆ）〉
アスペルギルス・フミガーツス（Ａｆｕ）を、合成培地（Ｍ１９９，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）にて静置培養として３７℃で１週間成長させる。Ａｒｒｕｎｄａら（Ａｒｒｕｄａ，Ｌ．Ｋ．，Ｍａｎｎ，ＢＪ，Ｃｈａｐｍａｎ  Ｍ．Ｄ．，「アスペルギルス・フミガーツスにおける主要なアレルゲンおよび細胞毒素（Ａｓｆ  ｆＩ）の選択的発現：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ関連疾患の免疫病原性の影響」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９２，１４９，３３５４〜９）は、Ａｓｐ  ｆ１（主要なアレルゲン）の発現は１週間後が最大であり、それより長いインキュベーションで減少する傾向があることを証明している。１週間培養物を、４℃で１２時間の０．１％（ｗ／ｖ）チメロサールの添加によって死滅させる。培養物をガラスウールで濾過し、最終的に０．４５μｍのメンブレンで濾過して、全ての微粒子および胞子を除去し、その後、３回緩衝液を交換しながら水に対して透析した。透析物を凍結乾燥して褐色粉末を得た。１ｗｃｆのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１Ｂ）によってＡｓｐ  ｆ１に対応する１８ｋＤａの主バンドが明らかとなった。Ａｓｐ  ｆ２に対応するバンド（３７ｋＤａ）も明白である。１８ｋＤａのバンドのＮ末端配列決定を行って、Ａｓｐ  ｆ１のＮ末端に対応する配列ＡＴＷＴＣＩＮＱＱＬＮＰを得た。１週間培養物の濾過物（１ｗｃｆ）は、国立生物学的製剤研究所から入手したＡｆｕアレルギー患者由来のヒト血清によって認識されることもＥＬＩＳＡによって証明された。
【０３４０】
〈感作〉
本研究では、６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によってミョウバンと混合した２００μｇ  Ａｆｕ  １ｗｃｆ（１：４ｖ／ｖ）を含む１００μｌＰＢＳで１週間に１回を４週間感作する。
【０３４１】
〈アレルゲンでの攻撃誘発および処置〉
感作マウスを、１０μｇのＡｆｕ  １ｗｃｆを含む５０μｌにて鼻腔内（ｉ．ｎ．）に攻撃誘発する。これの後に、ＰＢＳまたは１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を含む５０μｌのＰＢＳでｉ．ｎ．で処置する。結果に記載のように、攻撃誘発および処置を毎日行う。いくつかの実験では、全長組換えヒトＳＰ−Ａのコントロールタンパク質（Ｂｙｋ  Ｇｕｌｄｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌより贈与）を、１０μｇ／５０μｌの濃度で使用する。個別の実験では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の運命を、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を含む５０μｌのＰＢＳでの鼻腔内適用後の種々の時間での異なるマウスからのＢＡＬの獲得およびマウスＳＰ−ＤまたはＳＰ−Ａを認識しないｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）に対して生じたポリクローナル抗体を使用したｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）のアッセイによってモニターする。これらの結果は、投与から３０分後に採取したＢＡＬにおいてはｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の少なくとも５０％を占め得るが、２４時間後では測定することができないことを示す。
【０３４２】
〈末梢血好酸球〉
好酸球の評価のために、マウス（ｎ＝４〜６／群）の尾静脈から採血する。自動細胞計数器で総白血球数を測定し、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色血液塗抹標本の分画によって好酸球の比率を測定する。結果を、１０6細胞／ｍｌで示す。
【０３４３】
〈血清ＩｇＥおよびＡｆｕ特異的ＩｇＧ１〉
マウスＩｇＥの検量線に関して線形である値を得るために最大で２０倍に希釈した連続希釈血液におけるサンドイッチＥＬＩＳＡ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｃｏｗｌｅｙ、ＵＫ）によって総血清ＩｇＥを測定する。結果を、μｇ／ｍｌで示す。Ａｆｕ特異的ＩｇＧ１を、Ａｆｕアレルゲン抽出物で被覆した９６ウェルプレートを使用したＥＬＩＳＡによって測定する。抗体を、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ１で検出する。結果を、相対吸収単位（ＯＤ４５０）として示す。
【０３４４】
〈肺内の内因性マウスＳＰ−ＤおよびＳＰ−Ａ〉
ＣＯ2窒息による無痛屠殺の直後に、３×１ｍｌ  ＰＢＳを使用して、気管支肺胞洗浄を行い、これをプールし、全サンプルについてＰＢＳの添加によって体積を４ｍｌに調整し、遠心分離して細胞を除去する。組換えマウスＳＰ−ＤおよびＳＰ−Ａに対して生じたポリクローナル抗体（Ｐ．Ｌａｗｓｏｎ博士から提供）を使用したＥＬＩＳＡによってＳＰ−ＤおよびＳＰ−Ａを測定する。これらの抗体は、ヒトＳＰ−ＤまたはＳＰ−Ａとの交差反応性を示さず、それぞれマウスＳＰ−ＤまたはＳＰ−Ａに特異的である。結果を、μｇ／ｍｌＢＡＬで示す。
【０３４５】
〈細胞内サイトカイン染色〉
処置後、マウスをＣＯ2窒息によって無痛屠殺し、その脾臓を取り出し、ＰＢＳ中でホモジナイズする。ホモジネートを濾過し、赤血球を塩化アンモニウム溶解試薬（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で溶解し、４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで２０分間固定する。細胞を、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む３％（ｖ／ｖ）熱変性ウシ胎児血清を補足したＰＢＳ（ＦＳＢ）で洗浄し、１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含むＦＳＢに再懸濁し、−８０℃で保存する。細胞を、Ｃｙｔｏｐｅｒｍ洗浄緩衝液（ＣＰＢ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｗｌｅｙ、ＵＫ）にて４℃で１５分間浸透させ、１０6細胞のアリコートを、５０μｇ／ｍｌラットＩｇＧを補足したＣＰＢとの４℃で３０分間のインキュベーションによってブロックする。細胞内サイトカインを、４℃で６０分間インキュベートした１μｇ  ＰＥ抱合抗マウスサイトカインモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色する。細胞をＣＰＢで洗浄後、ＦＳＢで洗浄し、５００ｍｌのＦＳＢに再懸濁する。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用したＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、フローサイトメトリーを行う。２００００個の細胞についてデータを収集する。脾臓細胞の平均ＦＳＣは、全ての場合で１００である。染色細胞（ＦＳＣ＞１００、ＦＬ２＞１００）がゲーティングし、これらの細胞染色強度比（ＰＥ＞１０００）を計算する。結果を、ラットＩｇＧ（％ＰＥ＞１０００）と共にインキュベートした非染色細胞のバックグラウンド蛍光の差し引き後に強力に染色された細胞の％として示す。
【０３４６】
〈肺組織学〉
処置直後、各治療群由来の２〜４匹の肺を、１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝化ホルマリンで固定し、個別の分析に供する。肺を、パラフィンに包埋し、区分化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。気管支周囲の炎症についてスライドを評価し、それぞれ正常から重症までのスコアに対応する０〜４のスケールで割り当てる（Ｓｕｒ．Ｓ，Ｗｉｌｄ  ＪＳ，Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ＢＫら、「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドによるマウス喘息モデルのアレルギー性肺炎の長期予防」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１６２，６２８４〜９３）。
【０３４７】
〈全身プレチスモグラフィ〉
この研究では、気道過敏症を、４つのチャンバーシステム（Ｂｕｘｃｏ、Ｓｈａｒｏｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）を備えた非制御（ｕｎｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ）全身プレチスモグラフ法（Ｈａｍｅｌｍａｎｎ  Ｅ．，Ｓｃｈｗａｒｚｅ  Ｊ．，Ｔａｋｅｄａ  Ｋ．ら、「気圧プレチスモグラフィを使用したアレルギーマウスの気道反応の非侵襲性測定」、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１９９７，１５６，７６６〜７５）を使用して測定する。最初に、マウスを鼻腔内抗原で攻撃誘発し、２時間で回収し、その後チャンバーに置き、その呼吸を１０分間モニターする。順応した時点で、そのベースライン反応を５分間測定する。次いで、マウスにエアゾール化したＰＢＳに１分間供し、その後メタコリンの用量を漸増させる（５、１０、２０、３０、４０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ）。それぞれの場合においてベースラインＰｅｎｈに戻らせる短い間隔で反応を５分間記録する。
【０３４８】
各群は、４〜８匹のマウスを含んでいた。結果を、メタコリンの攻撃誘発後のベースラインを超えるＰｅｎｈの平均上昇％として示す。
【０３４９】
〈統計〉
結果は、４〜８匹マウス／群の平均であり、エラーバーは、±ＳＥＭである。スチューデント両側ｔ検定によって有意性を決定する。Ｐ＜０．０５で有意ととみなす。
【０３５０】
［実施例２の結果］
組換えＳＰ−Ｄでの感作マウスの処置の結果を、図２、３、４、および５に示す。
【０３５１】
血清ＩｇＥ、Ａｆｕ特異的ＩｇＧ、および末梢血好酸球増多症は、異なる遺伝的背景でｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）によって軽減される。
【０３５２】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置が異なる遺伝的背景で有効であるかを決定するためにＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてＡＢＰＡモデルを確立し、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）がアレルゲン攻撃誘発時にアレルギー性過敏症を調整することができるかを決定するために、感作マウスを最初に１０μｇのＡｆｕ  １ｗｃｆで攻撃誘発し、１時間後に処置する。アレルゲン攻撃誘発マウスへの１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での５日間の鼻腔内処置後に３日間測定した血清ＩｇＥは有意に減少し（Ｐ＜０．００１）、この減少は、１週間後に１０μｇのＡｆｕ  １ｗｃｆを３日間毎日投与する再攻撃誘発後に維持される（図２Ａ）。アレルゲン攻撃誘発マウスの処置および１週間後のアレルゲンのみでの再攻撃誘発後に（図３）Ａｆｕ特異的ＩｇＧ１（図２Ｂ）および末梢血好酸球増多症でも類似の有意な減少が測定された。
【０３５３】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置により、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γが上昇し、ＩＬ−４が低下する
【０３５４】
ＩｇＥおよび末梢血好酸球増多症の減少により、サイトカインレベルの全身性調整が示唆され、これらのサイトカインを細胞内染色によって測定する。アレルゲン攻撃誘発マウスへの１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での２日間の鼻腔内投与から１日後に脾臓中で測定されたＩＬ−１２（図４Ａ）は、ＩＦＮ−γ（図４Ｂ）のように有意に減少する（Ｐ＜０．０５）。ＩＬ−４の測定は、非感作マウスで測定されたレベルまでの減少を示した（図４Ｃ）。ｒｈＳＰ−Ａ（組換えヒトサーファクタントタンパク質Ａ、ＳＰ−Ａ）での同一の処置では、これらの効果は認められなかった。
【０３５５】
〈ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置により、気道過敏症が緩和する〉
アレルゲン攻撃誘発から１〜２時間後に１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）で４日間毎日処置したマウスは、試験した全てのメタコリン用量での処置（７日目）の完了後の３日間のアレルゲンでの再攻撃誘発に対して気道過敏症の有意な軽減（Ｐ＜０．０５）を示した（図５Ａ）。同一の方法で１０μｇのｒｈＳＰ−Ａ（組換えヒトサーファクタントタンパク質Ａ）で処置したマウスでは、ＡＨＲの有意な軽減は認められなかった（図５Ｂ）。
【０３５６】
〈ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置により肺炎が軽減する〉
本研究での感作マウスのうち、６匹のＰＢＳ処置マウスのうちの４匹のスコアは２＋であり、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置群の５匹のうち４匹のスコアが１であった。非感作マウスのスコアは０である。肺切片は、肺への細胞侵襲の軽減を示す（図６）。
【０３５７】
〈内因性マウスＳＰ−ＤおよびＳＰ−４〉
アレルギーマウスのＢＡＬ中で測定されたＳＰ−Ｄの内因性レベルは、正常なマウス由来のＢＡＬ中の０．２５±０．０１５μｇ／ｍｌから１．４±０．１５μｇ／ｍｌまでのレベルに６倍上昇し、正常な感作および処置されたマウスＢＡＬで１．３±０．１μｇ／ｍｌの測定された内因性ＳＰ−Ａレベルについての相違は認められない。１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での５日間の毎日の処置では、内因性ＳＰ−ＤまたはＳＰ−Ａレベルにおいていかなる変化も認められなかった。
【実施例３】
【０３５８】
［マウスアレルギー性過敏症モデルにおけるイエダニ（ヤケヒョウヒダニ）に対するアレルギー性過敏症の調整］
〈Ｄｅｒｐ／ＩＬ−２／肺〉
図７Ａは、ｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）での鼻腔内処置により、Ｄｅｒ  ｐアレルギーマウスの肺におけるアレルゲン攻撃誘発に対するＩＬ−１２の応答が増強されることを示す。
【０３５９】
細胞内サイトカイン染色およびその後のＩＬ−１２陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感作マウスの肺ホモジネート中のＩＬ−１２の分析。ＰＢＳとは、ＰＢＳで処置した非感作マウスである。ＨＰとは、ＰＢＳで処置した感作マウスである。ＨＲとは、１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウスである。感作マウスを、最初に、５０ＡＵのＤｅｒ  ｐアレルゲン抽出物で鼻腔内に攻撃誘発した。処置は、攻撃誘発直後に投与した１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の鼻腔内点滴注入による。４日間連続して攻撃誘発および処置を繰り返した。処置の４日後にマウスをＤｅｒ  ｐのみで再攻撃誘発し、翌日に屠殺した。
【０３６０】
〈Ｄｅｒｐ／ＩＬ−２／脾臓〉
図７Ｂは、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での鼻腔内処置によりＤｅｒ  ｐアレルギーマウスの脾臓におけるアレルゲン攻撃誘発に対するＩＬ−１２の応答が増強されることの証拠を示す。
【０３６１】
細胞内サイトカイン染色およびその後のＩＬ−１２陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感作マウスの脾臓ホモジネート中のＩＬ−１２の分析。ＰＢＳは、ＰＢＳで処置した非感作マウスである。ＨＰは、ＰＢＳで処置した感作マウスである。ＨＲとは、１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウス。ＨＢ＝１０μｇのＢＳＡで処置した感作マウスである。感作マウスを、最初に、５０ＡＵのＤｅｒ  ｐアレルゲン抽出物で鼻腔内に攻撃誘発した。処置は、攻撃誘発直後に投与した１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の鼻腔内点滴注入による。４日間連続して攻撃誘発および処置を繰り返した。処置の４日後にマウスをＤｅｒ  ｐのみで再攻撃誘発し、翌日に屠殺した。（ｎ＝４〜８／群。１．７倍上昇）。
【０３６２】
〈Ｄｅｒｐ／ＩＮＦ−α／脾臓〉
図７Ｃは、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での鼻腔内処置によりＤｅｒ  ｐアレルギーマウスの脾臓におけるアレルゲン攻撃誘発に対するＩＦＮ−γの応答が増強されることの証拠を示す。
【０３６３】
細胞内サイトカイン染色およびその後のＩＦＮ−γ陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感作マウスの脾臓ホモジネート中のＩＦＮ−γの分析。ＰＢＳとは、ＰＢＳで処置した非感作マウスである。ＨＰとは、ＰＢＳで処置した感作マウスである。ＨＲとは、１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウスである。感作マウスを、最初に、５０ＡＵのＤｅｒ  ｐアレルゲン抽出物で鼻腔内に攻撃誘発した。処置は、攻撃誘発直後に投与した１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の鼻腔内点滴注入による。４日間連続して攻撃誘発および処置を繰り返した。処置の４日後にマウスをＤｅｒ  ｐのみで再攻撃誘発し、翌日に屠殺した。（ｎ＝４〜８／群。Ｐ＜０．０５。２．７倍上昇）。
【０３６４】
〈Ｄｅｒｐ／ＴＮＦ−α／脾臓〉
図７Ｄは、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での鼻腔内処置によりＤｅｒ  ｐアレルギーマウスの脾臓におけるアレルゲン攻撃誘発に対するＴＦＮ−αの応答が増強されることの証拠を示す。
【０３６５】
細胞内サイトカイン染色およびその後のＴＦＮ−α陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感作マウスの脾臓ホモジネート中のＴＦＮ−αの分析。ＰＢＳとは、ＰＢＳで処置した非感作マウスである。ＨＰとは、ＰＢＳで処置した感作マウスである。ＨＲとは、１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウスである。感作マウスを、最初に、５０ＡＵのＤｅｒ  ｐアレルゲン抽出物で鼻腔内に攻撃誘発した。処置は、攻撃誘発直後に投与した１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の鼻腔内点滴注入による。４日間連続して攻撃誘発および処置を繰り返した。処置の４日後にマウスをＤｅｒ  ｐのみで再攻撃誘発し、翌日に屠殺した。（ｎ＝４〜８／群。１．５倍上昇）。
【実施例４】
【０３６６】
［マウスアレルギー性過敏症モデルにおけるイエダニ（ヤケヒョウヒダニ）に対する気道過敏症に対するｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での治療効果］
アレルギー性喘息は、気道過敏症（ＡＨＲ）期間によって特徴付けられる。ＡＨＲは、呼気時間の延長を含む呼吸パターンが変化することが公知である。この変化を、呼気停止の増大の測定によって定量することができる（Ｐｅｎｈ）。
【０３６７】
この研究では、気道過敏症を、４つのチャンバーシステム（Ｂｕｘｃｏ、Ｓｈａｒｏｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）を備えた非制御全身プレチスモグラフ法を使用して測定する。ＣＯ2の蓄積を防止するために、上記システムによって、一定の空気のバイアス流れを生じさせる。マウスチャンバー中でマウスが呼吸するにつれて、トランスデューサによって圧力変動を測定し、基準チャンバーと比較する。これらの変動は、呼吸周期の間の胸郭体積の変化によって生じる。気管支収縮により、圧力可動域の形状の相違が生じ、呼気中に最も明らかである。これらの形状の変化を、呼気の困難さを示し、喘息における呼吸に特徴的である休止増強（enhanced pause）アルゴリズム（Ｐｅｎｈ）によって定量することができる。
【数１】
2005522988.tif 000010
（Ｔｅは、呼気時間であり、Ｔｒは弛緩時間であり、ＰＥＰはピーク呼気圧であり、ＰＩＰはピーク吸息圧である）
【０３６８】
ＡＨＲは、インサイチューでのマウスの噴霧メタコリンへの曝露によって誘発される。メタコリン（アセチル−β−メチルコリンクロリド）は、神経伝達物質アセチルコリンの代謝的に安定な類似体であり、平滑筋を収縮させて気管支収縮を誘発する。喘息マウスの誘発されたＡＨＲを、正常なマウスと比較したＰｅｎｈの増加によって測定する。
【０３６９】
〈方法〉
感作。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ミョウバンを含む標準化Ｄｅｒ  ｐ抽出物（Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｓ．，ＵＳＡ）の４週間毎のｉ．ｐ．注射によって感作する。
【０３７０】
気道炎症の誘導および治療。感作マウスに、４日間連続して先にＰＢＳまたは１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）をｉ．ｎ．投与し、その後、５０アレルギー単位のＤｅｒ  ｐ抽出物を含むＰＢＳを鼻腔内投与する（連続的同時投与という）。動物を少なくとも３０分間回復させ、その後、第２のｉ．ｎ．投与を行う。
【０３７１】
全身プレチスモグラフィ。マウスを４つのチャンバーに入れ、その呼吸を１０分間モニターする。順応後、そのベースライン反応を、５分間測定する。次に、マウスにＰＢＳを１分間噴霧し、その後メタコリン用量を段階的に増加させる。ベースラインに回復するまで短期間の間隔をおいてそれぞれの場合の応答を５分間記録する。
【０３７２】
統計。各群は、４〜８匹のマウスを含む。Ｐｅｎｈを、各群のマウスのベースライン値に対する増大％として示す。エラーバーは、±ＳＥＭである。両側ｔ検定によって有意性を決定する。
【０３７３】
［実施例４の結果］
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置により、処置終了時の全身プレチスモグラフィにおけるＰｅｎｈ応答によって測定したところ、ＡＨＲが有意に減少する（ｐ＜０．００１）（図８Ａ；２０ｍｇ／ｍｌメタコリン）。図８Ｂに示すように、治療から４日後にアレルゲンでマウスを再攻撃誘発した場合に、この有意な減少が維持された（ｐ＜０．００２）。
【０３７４】
マウスイエダニアレルギーモデルに対するこの研究は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の鼻腔内投与により、喘息の主な特徴である気道過敏症が有意に軽減することをはじめて示す。これは、アレルギー性喘息を含む呼吸器アレルギー性過敏反応の症状の治療でのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の有用性の証拠を提供する。
【０３７５】
Ｄｅｒ  ｐアレルゲンとの連続的同時投与時のその有効性によって証明されるように、持続的なアレルゲンの曝露においてさえもｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）はＡＨＲを軽減することができることは有意である。これは、季節性アレルギーの被験体またはイエダニアレルギーの主な問題である空気アレルゲンに常に曝露された被験体が遭遇する条件を反映する。
【０３７６】
最も顕著な所見は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置は、アレルゲンのみでの再攻撃誘発に対するＡＨＲの有意な軽減によって示されるように、基礎となる機構に対して長期間有効であることである。したがって、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置により、アレルギーおよびアレルギー性喘息患者のための有効な脱感作ストラテジーが得られる。
【実施例５】
【０３７７】
［ノックアウトマウスに対する組換えＳＰ−Ｄの効果］
以下の３つの実施例は、組換えヒトＳＰ−Ｄを使用してＳＰ−ＤノックアウトマウスのＳＰ−Ｄ機能が置換されるのを記載する。
【０３７８】
ＳＰ−Ｄを発現しないＳＰ−Ｄノックアウトマウスは、マクロファージ数が増加し、その多くの外観が異常である。肺胞空隙中に過剰なサーファクタントリン脂質が存在し、ＳＰ−Ｄの非存在下で慢性的な低レベルの炎症過程を示す。これらのマウスは、肺損傷、線維症、および気腫を発症し、ＳＰ−Ｄ欠損による肺損傷および肺炎モデルが得られる（それぞれ先天性および後天性ＳＰ−Ｄ欠損症の患者群である早産児および喫煙者で認められる）。この炎症過程に対する組換え発現短縮フラグメント（ヒトｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ））での治療効果を、ＳＰ−Ｄノックアウトマウスで評価する。
【０３７９】
Ｂｏｔａｓ，Ｃ．ら、「サーファクタントタンパク質Ｄ欠損マウスにおけるサーファクタントホメオスタシスおよびＩＩ型肺胞細胞の形態学の変化」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５（２０），１１８６９〜７４に記載のように、ＳＰ−Ｄノックアウトマウスを作製する。上記のように組換えヒトＳＰ−Ｄを作製する。
【０３８０】
組換えＳＰ−ＤまたはＢＳＡコントロールを、６週齢のマウスに鼻腔内投与する。動物が１２週齢になるまで、６週間にわたり３０μｇを全部で７回投与する。処置３週間後に４匹のマウスを屠殺し、肺胞マクロファージ数およびリン脂質の評価のために気管支肺胞を洗浄した。記載の実験を、３回繰り返した。
【０３８１】
これらの実験は、炎症性肺疾患の有効な治療としてｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を使用することができることを証明する。
【実施例６】
【０３８２】
［肺胞マクロファージ数によってアッセイした、ノックアウトマウスに対する組換えＳＰ−Ｄの効果］
マラカイトグリーンまたはクリスタルバイオレットで染色したマクロファージ数を血球計で計数し、マクロファージの形態学をサイトスピン後に評価する。
【０３８３】
図９は、非処置マウスで計数された肺胞マクロファージ数を示し、６週間で細胞数は野生型マウスの約３倍であり、９週間および１２週間では野生型のほぼ４倍であることを証明する。非処置マウスでマクロファージ数は維持され、１６週での洗浄液から採取した細胞数に匹敵する。しかし、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での処置後、ＳＰ−ＤノックアウトＢＡＬ中の肺胞マクロファージ数は、約５０％減少する（匹敵する年齢の野生型マウスで認められる数の約２倍のレベル）。図９はまた、ＳＰ−Ｄ欠損マウスの肺胞マクロファージ数が１５週齢の野生型マウスと比較して増加することを示す。
【０３８４】
ＢＡＬ液から単離した肺胞マクロファージ数に対するｒＳＰ−Ｄでの処理効果を示す。ｒｈＳＰ−Ａ、ＢＳＡ、またはＰＢＳでの処置と対照的に、マクロファージ数は、９、１２、および１５週齢のｒＳＰ−Ｄ処置ＳＰ−Ｄ欠損マウスで有意に減少する。ｒＳＰ−Ｄ処置動物におけるマクロファージ数は、全年齢の野生型マウスよりも高いままである。
【０３８５】
図１０Ａは、気管支肺胞洗浄における細胞のサイトスピンを示す。細胞を、マラカイトグリーン（上のパネル）またはクリスタルバイオレット（下のパネル）で染色する。非処置またはＢＳＡ処置マウスと比較してｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）処置マウスで肺胞マクロファージ数はより少なく、より多数が正常な外観を有し、高倍率で非常に少数の拡大した泡状のマクロファージが認められることが明らかである。
【０３８６】
図１０Ｂは、気管支肺胞洗浄における細胞のサイトスピンを示す。ＳＰ−Ｄ欠損マウス由来の細胞は、巨大で、泡状で、しばしば多核である。ＢＳＡまたはＳＰ−Ａ処置マウスと対照的に、ｒＳＰ−Ｄ処置マウス由来の肺胞マクロファージは、より多数の外観正常であり、巨大化した泡状の細胞はより少ない。この効果を、前記および側方散乱フローサイトメトリーによって定量する。
【実施例７】
【０３８７】
［サーファクタントリン脂質分析によってアッセイした、ノックアウトマウスに対する組換えＳＰ−Ｄの効果］
ＢＡＬからリン脂質を抽出し、Ｂａｒｔｌｅｔｔリンアッセイ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｇ．Ｒ．，「カラムクロマトグラフィでのリンアッセイ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５９、２３４、４６６〜４６８）によってリン脂質を定量した。
【０３８８】
結果を図１１に示す。９週齢に達した治療３週間後のマウスで検出可能なリン脂質の相違は認められず、処置６週間後の洗浄液中の回収可能なリン脂質の量は非常に減少する。
【０３８９】
無細胞ＢＡＬ中の総リン脂質およびタンパク質測定に関するさらなる結果を、図１１Ｂに示す。６週齢のＳＰ−Ｄ欠損マウスでＢＡＬリン脂質レベルの顕著な増加が認められる。未処理の６週齢のマウスと比較して、４週齢マウス由来の２週間のｒＳＰ−Ｄ処理を受けたマウスでリン脂質レベルの相違は認められない。
【０３９０】
６週齢から３週間または６週間処置する肺胞マクロファージ数実験（図９）で使用した同一のマウスも、無細胞ＢＡＬリン脂質についてアッセイする。非処置の９週齢コントロールと比較して、処置３週間後（屠殺年齢は９週齢）でＢＡＬリン脂質に相違は認められない。しかし、６週間処置したマウス（アッセイ年齢１２週齢で屠殺）は、非処理の１２週齢コントロールと比較して過剰なリン脂質の減少（５０％）を示す（Ｐ＜０．０５）。いかなる年齢においても洗浄液の総タンパク質レベルに対して有意な処置効果は認められない。
【０３９１】
図１７に示すように、ＳＰ−Ｄ欠損マウスにおける血漿コレステロールレベルを決定する。この図は、野生型マウスとＳＰ−Ｄ欠損マウスとの間で血漿コレステロール（ｍＭ）を比較する。仮定した相違を０とする両側検定を行った。平均差は、０．９８８であり、ＤＦは８であり、Ｔ値は−２．８８５であり、Ｐ値は０．０２０４である。
【実施例８】
【０３９２】
［ケモカインレベルによってアッセイした、ノックアウトマウスに対する組換えＳＰ−Ｄの効果］
肺胞マクロファージ数減少の所見を説明することができる機構を評価するために、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）処置ノックアウトマウス肺および非処置コントロールから総ＲＮＡを単離し、走化性因子数についてのｍＲＮＡレベルを、製造者の説明書に従ってＰｈａｒｍｉｎｏｇｅｎから入手したｍＣＫ−５マルチプローブテンプレートを使用したリボヌクレアーゼ保護アッセイによってアッセイした。総肺ＲＮＡについてリボヌクレアーゼ保護アッセイを行う。
【０３９３】
Ｌ３２およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡシグナルを使用して総肺ＲＮＡの等しい負荷をチェックするために、結果をサンプルに合わせて標準化する。各群あたり３匹のマウスを使用して、各サンプルを２つの濃度で２回負荷する。
【０３９４】
結果を図１２に示す。ＳＰ−Ｄノックアウトマウスと野生型マウスとの間でベースラインｍＲＮＡレベルの有意な相違が存在することが認められる。詳細には、エオタキシンレベル（特異的な好酸球走化性因子）は、野生型と比較してノックアウトマウスで１００％増加する。さらに、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での処理によってこれが減少する。これらの所見は、対応のないデータについてのｔ検定を使用した５％レベルで統計的に有意である。ＭＣＰ−１  ｍＲＮＡレベルは、野生型と比較してノックアウトマウスで６倍に増加し、これもｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での処理によって減少する。ＭＩＰ−２  ｍＲＮＡレベルについてｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）処置が有意な効果を示さないこと以外は、ＭＩＰ−１αレベルおよびＭＩＰ２に対して類似の効果が認められる。最終的な所見は、野生型マウスに対してノックアウトマウスでＴＣＡ−３レベルが４倍に増加するが、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での処置ではＴＣＡ−３発現の増加に効果がないことである。
【実施例９】
【０３９５】
［ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）はアポトーシス肺胞マクロファージのクリアランスを促進する］
アポトーシスによる細胞死の制御過程により、細胞壊死およびその後の炎症後の細胞内容物の放出が回避される。ＳＰ−Ｄノックアウトマウスにおける過剰な肺胞マクロファージ数が過剰である場合、ノックアウトマウスにおけるアポトーシスを受けた細胞数を測定し、野生型と比較する。
【０３９６】
多数の肺胞マクロファージの存在によって媒介された肺損傷は、アポトーシス肺胞マクロファージのクリアランスの低下に一部起因し、その結果肺胞マクロファージ壊死の増加によって炎症反応が誘発されると仮定した。
【０３９７】
〈アポトーシス細胞および壊死細胞のフローサイトメトリーおよび検出〉
上記の気管支肺胞洗浄によってマウスから肺胞マクロファージを単離する。
【０３９８】
図１３Ａは、野生型マウスと比較したＳＰ−Ｄ欠損マウスにおける前方散乱（細胞サイズ）および側方散乱（粒度）フローサイトメトリーの代表的な結果を示す。各群（ｎ＝６／群）由来の各マウスで１００００個の細胞を計数する。ヒストグラムは、野生型マウスから単離されたものと比較したＳＰ−Ｄ欠損マウス中の巨大化した泡状マクロファージのサイトスピンの外観と一致するＳＰ−Ｄ欠損マウスのより巨大且つ多数の顆粒細胞集団を示す。
【０３９９】
細胞集団の前方散乱および側方散乱に対するｒＳＰ−Ｄ処置の効果を代表的なヒストグラムの重複を使用して示し、サイトスピンの外観と一致した異常に巨大且つ顆粒状の肺胞マクロファージがより少ない細胞集団を示す。ｒｈＳＰ−Ａ、ＰＢＳ、またはＢＳＡでの処置は、前方散乱および側方散乱ヒストグラムの形状に影響を与えなかった。
【０４００】
〈肺胞マクロファージのアポトーシスおよび壊死〉
上記の気管支肺胞洗浄によってマウスから肺胞マクロファージを単離し、ＦＡＣＳ分析によるＦＩＴＣ標識アネキシンＶ（アポトーシス細胞上に曝された表面ホスファチジルセリンに結合する）およびヨウ化プロピジウム（壊死細胞に結合する）結合の測定によってアポトーシスおよび壊死についてアッセイする。
【０４０１】
図１３Ｂ、１３Ｃ、および１３Ｄに示すように、野生型と比較してＳＰ−Ｄノックアウトマウス由来の洗浄液中のアポトーシスおよび壊死マクロファージの数に大きな相違が認められる。
【０４０２】
〈新たに単離した肺胞マクロファージのアネキシンＶおよびＰＩ染色〉
図１３Ｂは、野生型マウスと比較したＳＰ−Ｄ欠損マウス由来のマクロファージのアネキシンＶおよびＰＩの典型的な染色パターンを示す。一貫して、アネキシンＶで染色されたマクロファージ数は、野生型と比較してＳＰ−Ｄ欠損マウスで有意に多く、ＳＰ−Ｄ欠損マウスにおいてアネキシンＶおよびＰＩの両方に染色された細胞数は３〜４倍である。細胞集団を４つに分割した図に示す任意の分割により、それぞれの場合におけるＰＩまたはアネキシンＶで染色された細胞の比率を計算する。
【０４０３】
〈アネキシンＶおよび／またはＰＩ陽性細胞のＦＩＴＣ標識ｒＳＰ−Ｄでの同時標識〉
図１３Ｃは、アネキシンＶおよび／またはＰＩ陽性細胞でのＦＩＴＣ標識ｒＳＰ−Ｄの同時標識範囲を示す。結果は、３つの実験の代表である。ドットプロットは、初期アポトーシス（アネキシンＶ陽性）および壊死（ＰＩ陽性）細胞へのＦＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄ結合の優先度を示す。概して、野生型と比較して、ノックアウトマウスから単離したより多くの細胞集団がＦＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄに結合する（１５＋／−１．８％に対して４５＋／−６％）。野生型マウスの少数のアネキシンＶ陽性細胞のうち、アネキシンＶ陰性細胞のたった１＋／−０．５％と比較して８０＋／−６％がＦＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄに結合する。ノックアウトマウスでは、アネキシンＶ陰性細胞のたった３．５＋／−１．７％と比較して、５５＋／−４％のアネキシンＶ陽性ＡＭがＦＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄに結合する。野生型またはノックアウトマウス由来のＰＩで染色された全ての細胞は、ＦＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄに結合する。したがって、アネキシンＶまたはＰＩ陽性細胞への結合と比較して、野生型マウスおよびノックアウトマウス由来の健常な細胞（ＰＩ陰性、アネキシンＶ陰性）へのＦＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄの結合レベルは低い。新たに単離した細胞のＦＩＴＣ−アネキシンＶおよび非標識ｒＳＰ−Ｄとの同時インキュベーションでは、アネキシンＶ結合に有意に影響を与えず（示さず）、アネキシンＶとｒＳＰ−Ｄとの間に直接的な相互作用もｒＳＰ−ＤによるそのホスファチジルセリンリガンドへのアネキシンＶ結合のいかなる競合も存在しないことを示す。
【０４０４】
〈ｒＳＰ−Ｄでの分析および処置〉
図１３Ｄは、ＳＰ−Ｄ欠損マウスは、野生型欠損マウスと比較して、気管支肺胞洗浄物中のアポトーシス肺胞マクロファージの比率が１０倍であり（野生型６％＋／−２％に対してノックアウトでは７４％＋／−８％）、壊死肺胞マクロファージの比率が６倍である（野生型４％＋／−２％に対してノックアウトでは２５％＋／−８％）ことを示す。ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での３〜６週間の鼻腔内補充療法により、ＳＰ−Ｄ欠損動物中の肺胞空隙からのアポトーシスおよび壊死肺胞マクロファージのクリアランスが増加するが、ウシ血清アルブミンまたはサーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）での類似の処置では効果がなかった。
【０４０５】
ＰＩまたはアネキシンＶのいずれかでの細胞染色率に対するｒＳＰ−Ｄでの処置効果も図に示す。
【０４０６】
アポトーシスマクロファージの割合は、コントロールで７６％＋／−１０％であるのに対してｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）処置マウスでは２５％＋／−４％である。ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での処置により、ＳＰ−Ｄノックアウトマウスの洗浄物中の壊死マクロファージの割合（約２５％）は、野生型に匹敵するレベルに減少する（４％に対して５％）。ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での全処置効果は、炎症性サイトカインレベルおよび５０％過剰なサーファクタントリン脂質と共に肺内の肺胞マクロファージの絶対数が減少することである。
【０４０７】
アネキシンＶおよび／またはＰＩで染色された細胞の比率に対するｒｈＳＰ−Ａ、ＢＳＡ、またはＰＢＳでの有意な処置効果は認められない。対照的に、ｒＳＰ−Ｄ処置により、アネキシンＶおよび／またはＰＩ陽性細胞数が依然として野生型より有意に多いにもかかわらず、ＳＰ−Ｄ欠損マウスのＢＡＬ中のアネキシンＶおよび／またはＰＩ陽性細胞数は有意に減少する。
【０４０８】
〈気管支肺胞洗浄物中のＧＭ−ＣＳＦレベルの調整〉
気管支肺胞洗浄物中のＧＭ−ＣＳＦレベルの調整を、図１４に示す。認められるように、野生型マウスの気管支肺胞洗浄物中のＧＭ−ＣＳＦ濃度は、ＳＰ−Ｄノックアウトマウスの約１８５ｐｇ／ｍｌと比較して５０ｐｇ／ｍｌである。このようなノックアウトマウスのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での処置により、ＧＭ−ＣＳＦレベルが約１２０ｐｇ／ｍｌに減少する。
【０４０９】
フローサイトメトリーおよび生化学的分析由来の結果は、気管支肺胞洗浄物から採取した肺胞マクロファージの肺組織学およびサイトスピン実験の結果と一致する。
【０４１０】
〈共焦点顕微鏡法〉
図１５は、ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰ（緑）で染色した野生型（パネルＡおよびＢ）およびノックアウトマウス（パネルＣおよびＤ）由来のマクロファージの共焦点顕微鏡法を示す。アポトーシスが進行した細胞は緑色に染色され、初期アポトーシス細胞を、末端標識ＤＮＡフラグメントの特徴的な点状染色によって同定する。
【０４１１】
〈緑色に染色された新たに単離したマクロファージによる橙色染色壊死およびアポトーシスマクロファージの貪食作用の検出〉
細胞を、上記のようにノックアウトマウスから単離し、Ｏｒａｎｇｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ色素と室温で一晩インキュベートする。アネキシンＶ−ＦＩＴＣでの同時標識により、これらの細胞の８０〜９０％が橙色素と二重標識され、アネキシンＶ陽性であることが確認される。新たに単離された細胞を、製造者の説明書に従ってＣｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎとインキュベートする。多数の細胞が生きた細胞に依存してＣｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎで染色されず（図１６、四分割した左下、パネルＡ）、細胞の集団（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）は首尾よく標識された（図１６、四分割した右下、パネルＡ）。
【０４１２】
パネルＡは、橙色および緑色細胞集団の直接混合の結果を示す。非染色細胞およびバックグラウンド二重蛍光（パネルＢに示す）を排除するために示したゲートを使用して、パネルＣおよびＤは、３７度で１５分間、無ＳＰ−Ｄ（パネルＣ）および４ｍｃｇ／ｍｌのＳＰ−Ｄ（パネルＤ）との細胞の同時インキュベーション後の二重標識を示す。二重標識細胞数は、ＳＰ−Ｄの存在下で８０％増加する。
【０４１３】
ＳＰ−Ｄノックアウトマウスにおけるこれらの結果によりアポトーシスおよび壊死マクロファージのクリアランスの制御におけるＳＰ−Ｄの重要な役割が明らかとなり、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）ベースの処置により肺胞マクロファージ媒介炎症過程および他の疾患を含む肺疾患領域における新規のアプローチが得られることを示す。
【０４１４】
しかし、アポトーシス細胞の制御およびクリアランスにおけるＳＰ−Ｄの関与に関して示したデータはまた、異常発達（例えば、早産後の新生児肺疾患における異常な出生後肺発達）、炎症組織の再造形、細胞増殖、および癌にも関与する。
【実施例１０】
【０４１５】
ＳＰ−ＤおよびｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）（ＳＰ−Ｄの組換えフラグメント（ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ））という）のＤＮＡへの結合を、種々の方法で試験する。第１のアッセイでは、電子顕微鏡法を使用して、ＤＮＡとＳＰ−Ｄとの間およびＤＮＡとｒｆ−ＳＰ−Ｄとの間の複合体形成を示す。図１８を参照のこと。電子顕微鏡法から得た画像は、ＳＰ−ＤおよびｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）はＤＮＡに有効に結合することを証明する。
【０４１６】
図１９に示す第２のアッセイでは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）と炭水化物であるマンナンとの結合はデオキシリボヌクレオチドと競合するので、ＳＰ−Ｄは炭水化物結合能力によってＤＮＡに結合することが示唆される。デオキシリボヌクレオチドは、固定化マンナンとＳＰ−Ｄへの結合を有効に競合し、溶液中でヌクレオチドが結合することを示す。
【０４１７】
図２０に示す第３のアッセイでは、ＳＰ−Ｄノックアウトマウスから単離した肺胞マクロファージ（主に、アポトーシス）を、表示濃度のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）およびその後ヨウ化プロピジウムとインキュベートし、細胞に結合した赤色ヨウ化プロピジウムを、ＦＡＣＳ分析で測定した。４および２０μｇ／ｍＬのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の存在下で、タンパク質の非存在下での１６．８％と比較して、それぞれ１１．４％および２．１％の細胞を含んでいた。これらの結果は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）がアポトーシス細胞上のＤＮＡに結合することを示す。
【０４１８】
インビボでのＤＮＡのクリアランスの欠損を証明するために、本発明者らは、ＳＰ−Ｄノックアウトマウス（ＳＰ−Ｄ(-/-)）から肺胞マクロファージを単離し、野生型およびＳＰ−Ａノックアウトマウス（ＳＰ−Ａ(-/-)）とＤＮＡ取り込み能力について比較した。データ（図２１）は、ＳＰ−Ｄ欠損マウスから単離した肺胞マクロファージのＤＮＡ除去（４．０％）は、野生型（１０．５％）またはＳＰ−Ａ欠損マウス（１３．２）と比較して低いことを示す。これらの結果により、ＳＰ−Ｄは肺内のＤＮＡ除去経路で重要な役割を果たすことが示唆される。
【０４１９】
［参考文献］
【表３Ａ】
2005522988.tif 000011
【表３Ｂ】
2005522988.tif 000012
【表３Ｃ】
2005522988.tif 000013
【表３Ｄ】
2005522988.tif 000014
【表３Ｅ】
2005522988.tif 000015
【表３Ｆ】
2005522988.tif 000016
【表３Ｇ】
2005522988.tif 000017
【表３Ｈ】
2005522988.tif 000018
【表３Ｉ】
2005522988.tif 000019
【表３Ｊ】
2005522988.tif 000020
【０４２０】
本明細書中に記載の各特許出願および特許、これらの各特許出願および特許で引用または参照した書類（各特許出願および特許の実施中を含む）（「出願引用書類」）、ならびに各特許出願および特許ならびに任意の出願引用書類に引用もしくは記載された任意の生成物についての任意の製造者の説明書またはカタログは、本明細書中で引用することにより本明細書の一部をなすものとする。さらに、本明細書中で引用された全ての書類、本明細書中で引用された書類で引用もしくは参照された全ての書類、ならびに本明細書中で引用もしくは記載された任意の生成物についての任意の製造者の説明書もしくはカタログは、本明細書中で引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０４２１】
本発明の記載の方法および系の種々の修正形態および変形形態は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者に自明である。本発明は、特定の好ましい実施形態と共に記載されているが、このような特定の実施形態に特許請求の範囲に記載の本発明が過度に制限されないと理解すべきである。実際、分子生物学分野または関連分野の当業者に自明の本発明の記載の実施様式の修正形態が特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０４２２】
［配列表］
【化６Ａ】
2005522988.tif 000021
【化６Ｂ】
2005522988.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【０４２３】
【図１Ａ】ヒトＳＰ−Ｄ（ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ））の組換えフラグメントの構造を示す図である。これは、ネック領域および炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）の三量体から構成され、オックスフォード大学のＭＲＣ免疫化学研究所（Ｕｎｉｔ）で発現、精製、およびキャラクタライズした。
【図１Ｂ】主に１８ｋＤａのバンドを示すアスペルギルス・フミガーツスの１週間培養濾過物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２Ａ】Ａｆｕ  １ｗｃｆでの鼻腔内攻撃誘発後および１週間後にＡｆｕのみでの再攻撃誘発後に１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）またはＰＢＳを５日間毎日鼻腔内投与する処置から３日後に測定したＡｆｕマウスモデルの血清ＩｇＥを示す図である。Ｐは、ＰＢＳ処置非感作マウス、ＡＰは、ＰＢＳ処置感作マウス、ＡＲは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置感作マウス、ＡＰｒｃは、ＰＢＳで処置したＡｆｕ再攻撃誘発マウス、ＡＲｒｃは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）で処置したＡｆｕ再攻撃誘発マウスである。
【図２Ｂ】ＡｆｕマウスモデルにおけるＡｆｕ特異的ＩｇＥを示す図である。上記の図２Ａと同様であるが、Ａｆｕ特異的ＩｇＧ１を測定する。
【図３】Ａｆｕ  １ｗｃｆでの鼻腔内攻撃誘発後および１週間後にＡｆｕのみでの再攻撃誘発後に１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）またはＰＢＳを４日間毎日鼻腔内投与する処置から１日後に測定したＡｆｕマウスモデルの末梢血好酸球増多症を示す図である。Ｐは、ＰＢＳ処置非感作マウス、ＡＰは、ＰＢＳ処置感作マウス、ＡＲは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置感作マウス、ＡＰｒｃは、ＰＢＳで処置したＡｆｕ再攻撃誘発マウス、ＡＲｒｃは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）で処置したＡｆｕ再攻撃誘発マウスである。
【図４Ａ．４Ｂ．４Ｃ】Ａｆｕ  １ｗｃｆでの鼻腔内攻撃誘発後に１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）で２日間毎日鼻腔内投与する処置から１日後に測定したＡｆｕマウスモデルのサイトカインを示す図である。図４Ａ：脾臓中で測定したＩＬ−１２、図４Ｂ：脾臓中で測定したＩＦＮ−γ、図４Ｃ：脾臓中で測定したＩＬ−４。Ｐ＝ＰＢＳ処置非感作マウス、ＡＰは、ＰＢＳ処置感作マウス、ＡＲは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置感作マウス、ＡＡは、ｒｈＳＰ−Ａ処置感作マウス。
【図５Ａ．５Ｂ】Ａｆｕマウスモデルの気道過敏症。マウスに、Ａｆｕ  １ｗｃｆでの鼻腔内攻撃誘発後に１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）で４日間毎日鼻腔内投与する処置を行う。処置の完了後にＡｆｕ  １ｗｃｆのみを３日間投与する鼻腔内攻撃誘発から２時間後にプレチスモグラフィを測定した。図Ａ：漸増用量のメタコリンに対する用量応答。図５Ｂ：Ａｆｕ  １ｗｃｆでの鼻腔内攻撃誘発後に１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）またはｒｈＳＰ−４を４日間毎日鼻腔内投与する処置後の３０ｍｇ／ｍｌメタコリンに対する応答。Ｐは、ＰＢＳ処置非感作マウス、ＡＰは、ＰＢＳ処置感作マウス、ＡＲは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置感作マウス、ＡＡは、ｒｈＳＰ−Ａ処置感作マウスである。
【図６】処置（図６Ａ：ＰＢＳ、図６Ｂ：ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）、またはｃ：ＰＢＳで処置した非感作マウス）後の感作マウスのＡｆｕマウスモデルのＨ＆Ｅ染色肺切片を示す図である。
【図７Ａ】細胞内サイトカイン染色およびその後のＩＬ−１２陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感作マウスの肺ホモジネート中のＩＬ−１２の分析を示す図である。ＰＢＳは、ＰＢＳで処置した非感作マウス。ＨＰは、ＰＢＳで処置した感作マウス。ＨＲは、１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウス。
【図７Ｂ】細胞内サイトカイン染色およびその後のＩＬ−１２陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感作マウスの脾臓ホモジネート中のＩＬ−１２の分析を示す図である。ＰＢＳは、ＰＢＳで処置した非感作マウス。ＨＰは、ＰＢＳで処置した感作マウス。ＨＲは、１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウス。ＨＢは、１０μｇのＢＳＡで処置した感作マウス。
【図７Ｃ】細胞内サイトカイン染色およびその後のＩＦＮ−γ陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感作マウスの脾臓ホモジネート中のＩＦＮ−γの分析を示す図である。ＰＢＳ＝ＰＢＳで処置した非感作マウス。ＨＰ＝ＰＢＳで処置した感作マウス。ＨＲ＝１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウス。
【図７Ｄ】細胞内サイトカイン染色およびその後のＴＦＮ−α陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感作マウスの脾臓ホモジネート中のＴＦＮ−αの分析を示す図である。ＰＢＳは、ＰＢＳで処置した非感作マウス。ＨＰは、ＰＢＳで処置した感作マウス。ＨＲは、１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウス。
【図８Ａ】（タイトル「処置４日目の２０ｍｇ／ｍｌメタコリンでの１分間の攻撃誘発に対する平均Ｐｅｎｈ応答」）は、処置の最後の４日間に測定したアレルギーマウスの気道過敏症（ＡＨＲ）に対するｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置の効果を示すグラフである。アレルギーマウスを、ヤケヒョウヒダニで感作する。ＰＢＳコントロールは、ＰＢＳで処置した非感作マウスを示す。処置４日目の２０ｍｇ／ｍｌメタコリンでの１分間の攻撃誘発に対する平均Ｐｅｎｈ応答を示す。Ｘ軸：左：ＰＢＳコントロール、中央：Ｄｅｒ  ｐ−ＰＢＳ、右：Ｄｅｒ  ｐ−ｒＳＰＤ；Ｙ軸：バックグラウンドを越えるＰｅｎｈの％。
【図８Ｂ】（タイトル「メタコリン攻撃誘発によって誘導されたアレルギーマウスの気道過敏症」）は、ＰＢＳまたはｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置から４日後のアレルゲンでの再攻撃誘発後のメタコリンに対する用量応答を示すグラフである。アレルギーマウスを、ヤケヒョウヒダニで感作する。ＰＢＳ−ＰＢＳコントロールは、ＰＢＳで処置した非感作マウスを示す。メタコリン攻撃誘発によって誘導されたアレルギーマウスで気道過敏症（ＡＨＲ）を測定する。Ｘ軸：メタコリン（ｍｇ／ｍｌ）；菱形：ＰＢＳ−ＰＢＳ、四角：Ｄｅｒ  ｐ−ＰＢＳ、三角：Ｄｅｒ  ｐ−ｒＳＰＤ。
【図９】洗浄後の肺胞マクロファージ数に対するｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置の効果を示すグラフである。Ｘ軸：週齢；Ｙ軸：肺胞マクロファージ数×１０4／マウス洗浄物。
【図１０Ａ】気管支肺胞洗浄物中の細胞のサイトスピンを示す図である。サイトスピン後に肺胞マクロファージをマラカイトグリーン（上のパネル）またはクリスタルバイオレット（下のパネル）で染色する。処置なし（左上のパネル）、ＢＳＡ処置（右上のパネル）、およびｒ−ＳＰ−Ｄ処置（下のパネル）についての形態学を示す。
【図１０Ｂ】気管支肺胞洗浄物中の細胞のサイトスピンを示す図である。左上：ＳＰ−Ｄ欠損マウス由来の非処置細胞；右上：野生型マウス由来の細胞；左下：ＢＳＡで処置したＳＰ−Ｄ欠損マウス由来の細胞；右下：ｒＳＰ−Ｄで処置したＳＰ−Ｄ欠損マウス由来の細胞。
【図１１】（タイトル「マウスあたりの無細胞洗浄物上清中のリン脂質」）は、総ＢＡＬリン脂質レベルに対するｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置の効果を示すグラフである。マウスあたりの無細胞洗浄液上清中のリン脂質を示す。Ｘ軸：週齢；Ｙ軸：リン脂質（μｇ）／マウス。
【図１２】（タイトル「ＷＴと比較したＳＰ−Ｄ  ＫＯマウスのケモカインｍＲＮＡレベルおよびｒＳＰ−Ｄ処置の効果」）は、野生型と比較したＳＰ−ＤノックアウトマウスのケモカインｍＲＮＡレベルおよびｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）処置の効果を示すグラフである。
【図１３Ａ】野生型マウスと比較したＳＰ−Ｄ欠損マウスにおける前方散乱（細胞サイズ）および側方散乱（粒度）フローサイトメトリーの代表的な結果を示す図である。
【図１３Ｂ】野生型マウスと比較したＳＰ−Ｄ欠損マウス由来のマクロファージの典型的なアネキシンＶおよびＰＩ染色パターンを示す図である。
【図１３Ｃ】アネキシンＶおよび／またはＰＩ陽性細胞でのＦＩＴＣ標識ｒＳＰ−Ｄの同時標識範囲を示す図である。
【図１３Ｄ】非処置ＳＰ−Ｄノックアウトマウス、野生型マウス、ｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）処置マウス、ＰＢＳ処置マウス、ＳＰ−Ａ処置マウス、およびＢＳＡ処置マウスの気管支肺胞洗浄物中のアポトーシス細胞（上のパネル）および壊死細胞（下のパネル）の割合を示すグラフである。
【図１４】野生型マウス、ＳＰ−Ｄノックアウトマウス、およびｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）で処置したＳＰ−Ｄノックアウトマウスの気管支肺胞洗浄物中のＧＭ−ＣＳＦ濃度を示すグラフである。
【図１５】ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰ（緑）で染色した野生型（パネルＡおよびＢ）およびノックアウトマウス（パネルＣおよびＤ）由来のマクロファージの共焦点顕微鏡法を示す図である。アポトーシスが進行した細胞は緑色に染色され、初期アポトーシス細胞を、末端標識ＤＮＡフラグメントの特徴的な点状染色によって同定する。
【図１６】新たに単離した緑色のマクロファージによるアポトーシス（橙色標識）マクロファージの貪食作用の増強を示す図である。
【図１７】野生型およびＳＰ−Ｄノックアウトマウスにおける血漿コレステロールレベル（ｍＭ）を示す図である。
【図１８】ゲノムＤＮＡおよびＳＰ−ＤとＤＮＡとの複合体の陰性染色された透過型電子顕微鏡画像を示す図である。Ａ：ゲノムＤＮＡ。ＢおよびＣ：ｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）と複合体化したゲノムＤＮＡ。Ｄ：天然のＳＰ−Ｄと複合体化したゲノムＤＮＡ。
【図１９】ｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）とマンナンとの間の結合が、デオキシリボヌクレオチドと競合することを示す図である。固定濃度のｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）（１００μｇ／ｍＬ）は、表示濃度のヘキソース（Ａ）またはｄＮＴＰ（Ｂ）を含む５ｍＭ  ＣａＣｌ2含有生理食塩水緩衝液の存在下でＳＡ  ＢＩＡｃｏｒｅチップ上に固定したビオチン化マンナンに結合した。
【図２０】ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）によるヨウ化プロピジウム結合の阻害を示す図である。
【図２１】ＳＰ−Ｄノックアウトマウスから単離した肺胞マクロファージがＤＮＡ除去で欠損することを示す図である。肺胞マクロファージを、野生型（Ａ、Ｄ）またはＳＰ−Ａノックアウトマウス（ＳＰ−Ａ(-/-)）（Ｂ、Ｅ）、またはＳＰ−Ｄノックアウトマウス（ＳＰ−Ｄ(-/-)）（Ｃ、Ｆ）の肺洗浄物から単離し、洗浄し、緩衝液（Ａ、Ｂ、Ｃ）またはＣｙ３標識（赤色）肺ＤＮＡ（Ｄ、Ｅ、Ｆ）のいずれかとインキュベートした。ＤＮＡ取り込みを、ＦＬ２−ＨでのＦＡＣＳによってモニターし、非特異的ＦＬ１−Ｈに対してグラフ化した。ＤＮＡを取り込んだ肺胞マクロファージの割合を、図に示した（Ｄ、Ｅ、Ｆ）。
【配列表】
2005522988.tif 000023
2005522988.tif 000024
【図１Ａ】
2005522988.tif 000025
【図１Ｂ】
2005522988.tif 000026
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
2005522988.tif 000029
【図４Ａ】
2005522988.tif 000030
【図４Ｂ】
2005522988.tif 000031
【図４Ｃ】
2005522988.tif 000032
【図５Ａ】
2005522988.tif 000033
【図５Ｂ】
2005522988.tif 000034
【図６】
2005522988.tif 000035
【図７Ａ】
2005522988.tif 000036
【図７Ｂ】
2005522988.tif 000037
【図７Ｃ】
2005522988.tif 000038
【図７Ｄ】
2005522988.tif 000039
【図８Ａ】
2005522988.tif 000040
【図８Ｂ】
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【図９】
2005522988.tif 000042
【図１０Ａ】
2005522988.tif 000043
【図１０Ｂ】
2005522988.tif 000044
【図１１】
2005522988.tif 000045
【図１２】
2005522988.tif 000046
【図１３Ａ】
2005522988.tif 000047
【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
2005522988.tif 000051
【図１５】
2005522988.tif 000052
【図１６】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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