(57)【要約】  アルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型を判定する方法であって、前記遺伝子を含む固形被検試料を、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、前記遺伝子を増幅する工程と、前記増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する工程とを含む、遺伝子型を判定する方法によって、安全、迅速、かつ安価にアルコールに対する感受性に関連する遺伝子の遺伝子型を判定する方法が提供できる。
2011043365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型を判定する方法であって、
前記遺伝子を含む固形被検試料を、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、前記遺伝子を増幅する工程と、
前記増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する工程とを含む、遺伝子型を判定する方法。
【請求項２】
前記アルコール感受性関連遺伝子が、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子である、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
前記固形試験試料が血液を乾燥させたものである、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項４】
前記固形試験試料が毛根である、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項５】
前記固形試験試料が唾液を乾燥させたものである、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項６】
アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子から選ばれる少なくともいずれか２つを同時に増幅し、同時に遺伝子型を判定する、請求の範囲第２項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコールに対する感受性に関連する遺伝子（アルコール感受性関連遺伝子）を含む固形被検試料から、当該固形被検試料に含まれる遺伝子の遺伝子型を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコール脱水素酵素ＡＤＨ（Alcohol  Dehydrogenase）は、体内におけるアルコールからアセトアルデヒドへの分解に関与する酵素であり、複数種類が知られている。そのうちＡＤＨ１Ｂ（旧名ＡＤＨ２）の遺伝子には、アルコール代謝速度が遅い低活性型と呼ばれる遺伝子型ＡＤＨＢ１  ＊１／＊１があり、そのような遺伝子型を有する人は、飲酒後の顔面紅潮、動悸などのいわゆるフラッシング症状を呈し、アルコールの分解速度が遅いために体内にアルコールが残りやすく、アルコール依存症になりやすい体質であるといわれている。【０００３】
またアルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ（Aldehyde  Dehydrogenase）は、体内におけるアセトアルデヒドから酢酸への分解に関与する酵素の一つであり、複数種類が知られている。このうち、アセトアルデヒドの血中濃度が低い場合に作用するＡＬＤＨ２の遺伝子にも不活性型と呼ばれる遺伝子型ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２、ＡＬＤＨ２  ＊２／＊２とが知られており、そのような遺伝子型を有する人は、アセトアルデヒドの分解速度が遅いために飲酒で赤くなり二日酔いを起こしやすい体質であるといわれている。【０００４】
遺伝子型ＡＤＨＢ１  ＊１／＊１については日本人の５％程度、遺伝子型ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２については日本人のほぼ４０％程度存在することが分かっている。アルコール、アルデヒドには発癌性があり、上述した遺伝子型ＡＤＨＢ１  ＊１／＊１や遺伝子型ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２を有する人は、飲酒量の増加を介して口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、肝臓癌、乳癌、直腸結腸癌など発癌しやすい傾向にあり、特に、遺伝子型ＡＤＨＢ１  ＊１／＊１と遺伝子型ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２とを併せ持つ人は、その危険性は倍増するといわれている（たとえば、Akira  Yokoyama  et  al.,  "Genetic  polymorphisms  of  alcohol  and  aldehyde  dehydrogenases  and  glutathione  S-transferase  M1  and  drinking,  smoking,  and  diet  in  Japanese  men  with  esophageal  squamous  cell  carcinoma",  Carcinogenesis,  Vol.  23,  no.  11,  (2002),  pp.  1851-1859（非特許文献１）、Akira  Yokoyama  et  al.,  "Alcohol  and  aldehyde  dehydrogenase  gene  polymorphisms  and  oropharyngolaryngeal,  esophageal  and  stomach  cancers  in  Japanese  alcoholics",  Carcinogenesis,  Vol.  22,  no.  3,  (2001),  pp.433-439（非特許文献２）、Akira  Yokoyama  et  al.,  "Macrocytosis,  a  new  predictor  for  esophageal  squamous  cell  carcinoma  in  Japanese  alcoholic  men",  Carcinogenesis,  Vol.  24,  no.  11,  (2003),  pp.1773-1778（非特許文献３）、Takahiro  Asakage  et  al.,  "Genetic  polymorphisms  of  alcohol  and  aldehyde  dehydrogenases,  and  drinking,  smoking  and  diet  in  Japanese  men  with  oral  and  pharyngeal  squamous  cell  carcinoma",  Carcinogenesis,  Vol.  28,  no.  4,  (2007),  pp.865-874（非特許文献４）などを参照。）。【０００５】
また、チトクロームＣＹＰ２Ｅ１（Cytochrome  P450  2E1）は、第２のアルコール代謝経路と呼ばれる肝ミクロソーム酸化系においてアルコールの代謝に関連することが知られており、アルコール感受性の異なる２つの遺伝子型ＣＹＰ２Ｅ１  ＊ｃ１、ＣＹＰ２Ｅ１  ＊ｃ２が存在することが知られている（たとえば、野村文夫「第２のアルコール代謝経路Microsomal  Ethanol-Oxidizing  System（MEOS）とチトクロームP450  2E1（CYP2E1）」、千葉医学、78,  (2002),  pp.69-73（非特許文献５）、山田裕一「日本人のアルコール代謝酵素の遺伝的多形と飲酒行動および飲酒による健康障害の関係」、金医大誌、30,  (2005),  pp.448-455（非特許文献６）、Yan-Mel  Guo  et  al.,  "Genetic  polymorphisms  in  cytochrome  P4502E1,  alcohol  and  aldehyde  dehydrogenases  and  the  risk  of  esophageal  squamous  cell  carcinoma  in  Gansu  Chinese  males",  World  J  Gastroenterol,  14(9),  (2008),  pp.1444-1449（非特許文献７）などを参照。）。【０００６】
したがって、上述したアルコール脱水素酵素ＡＤＨの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨの遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子などのアルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型の判定は、特に、日本人の飲酒に関連する疾患や発癌のリスクの回避、また、個人の健康管理の上で重要な意義があると考えられる。【０００７】
このように個体の基礎代謝、性質、疾患などの差異を生じさせる、生物の個体間での野生型とは異なる塩基配列を有する遺伝子多型（ＳＮＰ：Single  Nucleotide  Polymorphism）の検出は、従来よりＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法などを利用した遺伝子解析として様々な研究が進められている。たとえば特開２００５−２４５２７３号公報（特許文献１）にはアルデヒド脱水素酵素遺伝子多型について、また、特開２００５−２４５２７２号公報（特許文献２）、特開２００６−７５１３４号公報（特許文献３）にはアルコール脱水素酵素遺伝子多型について、検出する方法がそれぞれ開示されている。しかしながら、これら特許文献１〜３に開示された方法はいずれも、ＰＣＲ法に利用するためのＤＮＡの精製などが煩雑であり、より簡便な方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２４５２７３号公報
【特許文献２】特開２００５−２４５２７２号公報
【特許文献３】特開２００６−７５１３４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Akira  Yokoyama  et  al.,  "Genetic  polymorphisms  of  alcohol  andaldehyde  dehydrogenases  and  glutathione  S-transferase  M1  and  drinking,  smoking,  and  diet  in  Japanese  men  with  esophageal  squamous  cell  carcinoma",  Carcinogenesis,  Vol.  23,  no.  11,  (2002),  pp.  1851-1859
【非特許文献２】Akira  Yokoyama  et  al.,  "Alcohol  and  aldehyde  dehydrogenase  gene  polymorphisms  and  oropharyngolaryngeal,  esophageal  and  stomach  cancers  in  Japanese  alcoholics",  Carcinogenesis,  Vol.  22,  no.  3,  (2001),  pp.433-439
【非特許文献３】Akira  Yokoyama  et  al.,  "Macrocytosis,  a  new  predictor  for  esophageal  squamous  cell  carcinoma  in  Japanese  alcoholic  men",  Carcinogenesis,  Vol.  24,  no.  11,  (2003),  pp.1773-1778
【非特許文献４】Takahiro  Asakage  et  al.,  "Genetic  polymorphisms  of  alcohol  and  aldehyde  dehydrogenases,  and  drinking,  smoking  and  diet  in  Japanese  men  with  oral  and  pharyngeal  squamous  cell  carcinoma",  Carcinogenesis,  Vol.  28,  no.  4,  (2007),  pp.865-874
【非特許文献５】野村文夫「第２のアルコール代謝経路Microsomal  Ethanol-Oxidizing  System（MEOS）とチトクロームP450  2E1（CYP2E1）」、千葉医学、78,  (2002),  pp.69-73
【非特許文献６】山田裕一「日本人のアルコール代謝酵素の遺伝的多形と飲酒行動および飲酒による健康障害の関係」、金医大誌、30,  (2005),  pp.448-455
【非特許文献７】Yan-Mel  Guo  et  al.,  "Genetic  polymorphisms  in  cytochrome  P4502E1,  alcohol  and  aldehyde  dehydrogenases  and  the  risk  of  esophageal  squamous  cell  carcinoma  in  Gansu  Chinese  males",  World  J  Gastroenterol,  14(9),  (2008),  pp.1444-1449
【非特許文献８】Michael  P.  and  Andrew  L.,  Nucleic  Acids  Reserch,  19,  1151,(1991)
【非特許文献９】Henke  W.,  Herdel  K.,  Jung  K.,  Schnorr  D.  and  Loening  A.  S.,  Nucleic  Acids  Reserch,  25,  3957,(1997)
【非特許文献１０】Waleed  A.  A.  and  Peter  R.,  J.clin.  Microbiol.,  39,  485-493,  (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、安全、迅速、かつ安価にアルコールに対する感受性に関連する遺伝子の遺伝子型を判定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、アルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型を判定する方法であって、前記遺伝子を含む固形被検試料を、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、前記遺伝子を増幅する工程と、前記増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する工程とを含むことを特徴とする。【００１２】
本発明におけるアルコール感受性関連遺伝子は、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子であることが、好ましい。【００１３】
本発明における固形試験試料は、血液を乾燥させたものであるか、毛根であるか、または、唾液を乾燥させたものであることが望ましい。【００１４】
本発明の遺伝子型判定方法は、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子から選ばれる少なくともいずれか２つを同時に増幅し、同時に遺伝子型を判定することが、好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、安全、迅速、かつ安価にアルコールに対する感受性に関連する遺伝子の遺伝子型を判定する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の好ましい一例を模式的に示す図である。
【図２】アルコールが体内で分解されて体外へ排泄されるまでを模式的に示す図である。
【図３】実施例１の結果を示す電気泳動写真である。
【図４】実施例２の結果を示す電気泳動写真である。
【図５】実施例３の結果を示す電気泳動写真である。
【図６】実施例４の結果を示す電気泳動写真である。
【図７】実施例５の結果を示す電気泳動写真である。
【図８】実施例６におけるＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図である。
【図９】実施例６におけるＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である。
【図１０】実施例６におけるＲｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図である（乾燥ろ紙唾液使用）。
【図１１】実施例６におけるＲｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙唾液使用）。
【図１２】実施例６におけるＲｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図である（乾燥ろ紙血液使用）。
【図１３】実施例６におけるＲｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙血液使用）。
【図１４】実施例６におけるＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図である（乾燥ろ紙唾液使用）。
【図１５】実施例６におけるＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙唾液使用）。
【図１６】実施例６におけるＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図である（乾燥ろ紙血液使用）。
【図１７】実施例６におけるＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙血液使用）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
図１は、本発明の好ましい一例を模式的に示す図である。本発明は、アルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型を判定する方法であって、前記遺伝子を含む固形被検試料を、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated  Isothermal  Amplification）法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、前記遺伝子を増幅する工程と、前記増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する工程とを含む。以下、図１を参照しながら、本発明の方法について詳細に説明する。
【００１８】
図１に示す例では、まず、直接固形被検試料を採取するか、または液状物を乾燥することで、検査対象から、アルコール感受性関連遺伝子を含む固形被検試料を採取する。
【００１９】
直接固形被検試料を採取する場合、検査対象の毛根、口腔粘膜および細胞組織から選ばれる固形物を、固形被検試料として直接次の工程に供する。なお、毛根は、毛髪、眉毛、鼻毛、ひげ、陰毛、腋毛を含む全ての体毛由来のものであれば特に限定されない。毛根は、根元から毛を抜くことで得られるため、比較的痛みをともなわない採取が可能であり、口腔粘膜は口中に皮膚を綿棒などで軽くこすることで痛みをともなわず採取することが可能である。また、口腔粘膜は、採取後そのまま室温に置くことで乾燥させた固形状態のものであってもよい。細胞組織については、そのまま用いられる程度に乾燥していることが好ましく、水分含有量は０％以上５０％未満であることが特に好ましい。また、細胞組織については、細かく粉砕されることが好ましい。
【００２０】
また液状物を乾燥させることで固形被検試料を採取する場合、検査対象の鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液、血清、血漿、髄液、唾液（通常、口腔粘膜が含まれる）、尿、汗、精液および細胞組織から選ばれる液状物を乾燥させることで得られる固形物を次の工程に供する。ここで、液状物に含まれる細胞組織は、水分含有量が５０％以上のものを示すものとする。なお、上述した口腔粘膜も、適宜乾燥させた後に用いても良い。
【００２１】
ここで、液状物を乾燥させる方法としては、ろ紙に液状物をしみこませ、水分を蒸発させる方法や、自然乾燥または凍結乾燥など、公知の乾燥方法を選ぶことができる。ただし、糞便由来の固形被検試料を得るためには、糞便を植物繊維体に塗布し、植物繊維体を自然乾燥した後にシリカゲルとともに密閉し１時間以上保持することが好ましい。植物繊維体とは、紙、綿などの植物性の繊維体をいうものとする。
【００２２】
液状物を乾燥させて固形被検試料とすることで、液状物にもともと含まれるプロテアーゼ、アミラーゼおよびヌクレアーゼなどの酵素活性を阻害することができ、生体組織細胞、微生物およびウイルスを完全に死滅させることなく生命活動を休止させることができる。したがって、固形被検試料の輸送、保存などは室温で行なうことができ、より簡便となる利点がある。
【００２３】
本発明の遺伝子型判定方法においては、上述した中でも、採取され得る細胞の数が一定しており、安定した量の鋳型を遺伝子型判定に供することができ、再現性に優れる観点から、固形被検試料が血液または唾液を乾燥させたものであるか、または、毛根であることが好ましく、また、上述したように根元から毛を抜くことで得られるため、比較的痛みを伴わない採取が可能であることから、固形被検試料が毛根であることが特に好ましい。なお、固形被検試料が血液を乾燥させたものである場合、従来のアルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型の判定方法と比較すると、血液の採取量が少なくて済むという利点がある。図１には、検査対象から、毛根２を含む頭髪１を注意深く引き抜き、固形被検試料として採取した例が示されている。
【００２４】
ここで、図２は、アルコールが体内で分解されて体外へ排泄されるまでを模式的に示す図である。体内に摂取されたアルコールは、通常、まず、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ、肝ミクロソーム酸化系のチトクロームＣＹＰ２Ｅ１などによってアセトアルデヒドに分解される。アセトアルデヒドはアルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）によって酢酸に分解される。その後、酢酸は水と二酸化炭素に分解された後、体外へ排泄される。本発明における「アルコール感受性関連遺伝子」は、このようなアルコールの代謝に関連する酵素の遺伝子を指し、好ましくは、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子である。
【００２５】
上述したように、アルコール脱水素酵素ＡＤＨＢ１の遺伝子には、遺伝子型ＡＤＨＢ１  ＊１（配列番号１に示す塩基配列）と、遺伝子型ＡＤＨＢ１  ＊２（配列番号２に示す塩基配列）とが存在し、日本人の約６０％はアルコール脱水素酵素ＡＤＨが正常な活性（酵素活性：２００）を有する対立遺伝子ＡＤＨＢ１  ＊２／＊２を有し、日本人の約３５％はアルコール脱水素酵素ＡＤＨが正常な活性（酵素活性：１００）を有する対立遺伝子ＡＤＨＢ１  ＊１／＊２を有し、日本人の約５％はアルコール脱水素酵素ＡＤＨが低い活性（酵素活性：１）を有する対立遺伝子ＡＤＨＢ１  ＊１／＊１を有することが知られている。
【００２６】
また、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子には、遺伝子型ＡＬＤＨ２  ＊１（配列番号３に示す塩基配列）と、遺伝子型ＡＬＤＨ２  ＊２（配列番号４に示す塩基配列）とが存在し、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２が正常な活性（酵素活性：１００）を有する約５６％の日本人は対立遺伝子ＡＬＤＨ２  ＊１／＊１を有し、アルコール脱水素酵素ＡＤＨの活性が低い（酵素活性：６）約４０％の日本人は対立遺伝子ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２を有し、アルコール脱水素酵素ＡＤＨが不活性型である（酵素活性：０）約４％の日本人は対立遺伝子ＡＬＤＨ２  ＊２／＊２を有することが知られている。
【００２７】
さらに、チトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子には、遺伝子型ＣＹＰ２Ｅ１  ＊ｃ１（配列番号５に示す塩基配列）と、遺伝子型ＣＹＰ２Ｅ１  ＊ｃ２（配列番号６に示す塩基配列）とが知られている。
【００２８】
なお、本発明におけるアルコール感受性関連遺伝子は、その長さとしては、通常２０〜数十万塩基程度まで適用できるが、５０〜３０００塩基であることが好ましい。
【００２９】
本発明の遺伝子型判定方法では、次に、上述したようにして採取した固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して、固形被検試料に含まれるアルコール感受性関連遺伝子を増幅する。
【００３０】
本工程では、プレート状またはチューブ状の担体上で、上述した遺伝子を増幅することが好ましい。具体的には、まず、プレート状またはチューブ状の担体上に試薬を置く。チューブ状の担体である場合には、その内部に試薬を投入し、プレート状の担体である場合には、その表面に試薬を置く。この試薬は、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液とプライマーＤＮＡとを含有する。そして試薬と固形被検試料とが直接接触するように担体上に固形被検試料を配置し、公知の方法によってポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法で遺伝子を増幅する。なお、担体上に固形被検試料を置き、その後に担体上に試薬を置いてもよい。図１には、チューブ状の担体３の内部にＰＣＲ反応液４を投入し、さらに、担体３に固形被検試料である頭髪１を投入することで、固形被検試料をＰＣＲ反応液と接触させた後、チューブ状の担体３に蓋５をして、ＰＣＲ反応を行なう例が示されている。
【００３１】
本工程においては、ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼに代表される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのものであれば特に制限されないが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。バッファーは固形被検試料中に含まれるＰＣＲ反応を阻害する物質存在下でもＤＮＡ増幅可能なものであれば、特に制限されないが、ＥｚＷａｙ（商標）（ＫＯＭＡ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）（島津製作所）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  ｋｉｔバッファー（Ｎｅｗ  ＥＮＧＬＡＮＤ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）、ＫＯＤ  ＦＸバッファー（東洋紡績）などを用いることが好ましく、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ用に開発されたＫＯＤ  ＦＸバッファー（東洋紡績）を用いることが特に好ましい。
【００３２】
アルコール感受性関連遺伝子を構成する核酸がＤＮＡの場合においては、直接ＰＣＲ法またはＬＡＭＰ法などを行なうことができる。また、該核酸がＲＮＡ断片の場合においては、ＲＮＡ鎖断片の場合は逆転写反応を行なった後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅（ＳＤＡ：Strand  Displacement  Amplification）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ（Reverse  Transcription）−ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、逆転写ＬＡＭＰ法（ＲＴ−ＬＡＭＰ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ：Nucleic  Acid  Sequence-Based  Amplification）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ：Transcription-Mediated  Amplification）、ローリングサークル型増幅などの遺伝子増幅法を用いて増幅することができる。なお、ＰＣＲなどの増幅の条件は、特異的な増幅が起こる限り特に制限されず、適宜設定することができる。なお、本発明においては、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子、アルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子およびチトクロームＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子から選ばれる少なくともいずれか２つを同時に増幅し、同時に遺伝子型を判定するようにすることが好ましい。
【００３３】
本発明においてＰＣＲ法に用いるプライマーＤＮＡは、アルコール感受性関連遺伝子を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されず、また、適宜公知の方法で設計することができる。なお、簡便な手順で遺伝子型の判定が可能となることから、ＰＣＲ法の中でも、対立遺伝子増幅（ＡＳＰ：Allele  Specific  Primer）−ＰＣＲ法およびＰＣＲ−ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型：Restriction  Fragment  Length  Polymorphism）法を利用することが好ましく、そのために設計されたプライマーＤＮＡを用いることが好ましい。
【００３４】
また本発明においては、ＰＣＲ法としてＴａｑＭａｎ法を利用することもできる。ＴａｑＭａｎ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを利用した方法である（たとえばGenet.  Anal.,  14143-149(1999),  J.  Clin.  Microbiol.,  34,  2933-2936(1996)などを参照。）。目的の配列を含む領域にプライマーを設計し、ＴａｑＭａｎプローブをその間に設定する。このプローブの５’末端側にリポーター蛍光色素（Ｒ）を３’末端側にクレンチャー蛍光色素（Ｑ）をラベルする。プローブのＴｍ値をプライマーのＴｍ値より１０℃位高めに設計することで、プローブが先にハイブリダイズする。そしてプライマーがハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって、ＴａｑＭａｎプローブが一塩基ずつ加水分解され、レポーター蛍光色素を遊離する。この遊離したリポーター色素の強度が、ＰＣＲ産物に比例することを利用している。
【００３５】
ＴａｑＭａｎ法で遺伝子解析する場合には、プライマーとプローブの具体的なヌクレオチド配列は、適宜決定することができる。５’末端側のリポーター蛍光色素と３’末端側にクレンチャー蛍光色素の２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれに公知のものを用いることができる。好適な具体例として、６−ＦＡＭ（登録商標）、ＶＩＣ（登録商標）、およびＴＥＴ（登録商標）のいずれかの組合せが挙げられる。
【００３６】
なお、上述したプライマーおよびプローブは、単なる一例であって、オリゴヌクレオチドプライマーであれば目的の増幅反応を支障なく行なえる限度において、他方オリゴヌクレオチドプローブであれば目的のハイブリダイゼーション反応を支障なく行なえる限度において、一部の塩基配列に欠失、置換、挿入および／または付加などの改変がされていてもよい。改変にかかる塩基数は、たとえば１〜５個、好ましくは１〜３個である。なお、このような改変は、原則として多型部位に対応する塩基以外の部分において行なわれる。
【００３７】
多型解析用オリゴヌクレオチド（プローブ、プライマー）には、解析方法に応じて適宜ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片が用いられる。多型解析用オリゴヌクレオチドの塩基長はそれぞれの機能が発揮される長さであればよく、プライマーとして用いられる場合の塩基長の例としては、１５〜３０塩基長、好ましくは１８〜２５塩基長程度である。
【００３８】
増幅するポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には２０〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長である。
【００３９】
本発明のプライマーおよびプローブには、その配列の末端に、検出のための適当な標識が付加されたものも含むものとする。標識としては、たとえば、ＲＯＸ（登録商標）、ＦＩＴＣ（登録商標；フルオレセイン）、ＴＥＴ（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、ＨＥＸ（登録商標）、ＮＥＤ（（登録商標））、６−ＦＡＭ（登録商標）、ＲＯＸ（登録商標）、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎ）またはその誘導体などの蛍光色素、酵素、タンパク、放射性物質、ビオチン、チオールなどを挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素で塩基を標識する方法は、公知の方法を用いることができる。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる。
【００４０】
多型解析用オリゴヌクレオチド（プライマー、プローブ）の合成は、具体的には通常のホスホルアミダイト法、リン酸トリエステル法などの化学合成法によることもでき、また市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置（たとえば、Pharmacia  LKB  Gene  Assembler  Plus：ファルマシア社製）などを使用して合成することもできる。あるいは、custom-synthesizedされたものを用いることもできる。
【００４１】
ここで、本発明でいう「不溶性担体」としては、プラスチック、ガラスなどからなるチューブのほか、９６穴ウェルなどを挙げることができる。チューブ状とは、中空状態のものをいい、底があるＰＣＲチューブや、エッペンドルフチューブのような形状であってもよい。
【００４２】
上述のように、担体表面にはプローブＤＮＡが固定化されていることが特に好ましい。これは、固形被検試料中のアルコール感受性関連遺伝子をチューブ状の担体に固定したオリゴＤＮＡ（プローブＤＮＡ）を介してハイブリダイゼーションで捕捉して、ＲＴ−ＰＣＲ法にて遺伝子増幅ができ、または、担体上の液相で特定遺伝子を増幅し、同時に、プレート状担体に固定した複数種のプローブＤＮＡで多種の生物の特異的遺伝子を検出したり、遺伝子多型（ＳＮＰ）を網羅的に検出できるという利点があるためである。
【００４３】
そして、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法によって、アルコール感受性関連遺伝子が増幅される。
【００４４】
本発明の遺伝子型判定方法では、次に、上述したようにして増幅された遺伝子から、当該遺伝子の遺伝子型を判定する。本工程における解析法は、増幅された遺伝子の検出または定量が可能なものであれば特に制限されず、ＤＮＡシーケンス法、ゲル電気泳動法、平板状のＤＮＡチップまたはビーズによるハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ法、およびプローブＤＮＡを利用した伸張反応またはハイブリダイゼーションによる遺伝子検出法から選ばれるいずれかの方法が挙げられる。ゲル電気泳動法によれば、ＰＣＲ増幅産物の量、およびその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行なうことができる。リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出しその１０を乗じた蛍光値をスレショルド値とし、そのスレッショルド値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレショルド値（Ｃｔ値）という。したがって、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲの特定遺伝子に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。
【００４５】
本発明によれば、アルコール感受性関連遺伝子の遺伝子型を安全、迅速、かつ安価に判定することができる。これによって、従来と比較して格段に安全、迅速、かつ安価なアルコール感受性関連遺伝子の検査システムの構築が可能となる。このような遺伝子検査システムは、未成年者飲酒防止のためのアルコール健康教育、遺伝子診断によるオーダーメイド医療普及・理解に向けた啓蒙活動、アルコールに対する安心・安全のための健康管理などに有用であると考えられる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４７】
＜実施例１＞
〔１〕ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による遺伝子型の判定
以下の手順で、検査対象からそれぞれ採取した血液（全血）、唾液（口腔内細胞を含む）、毛根について、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子およびアルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子の遺伝子多型の検出を行なった。血液および唾液については、ろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）にしみこませ、自然乾燥させて、固形被検試料として採取した。通常行なうＤＮＡの抽出・精製する過程を省略し、この乾燥ろ紙の直径１ｍｍのパンチ片をそのまま、チューブ状の担体内のＰＣＲ反応液に投入した。また、毛根についてはそのまま、チューブ状の担体内のＰＣＲ反応液に投入した。ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲキットＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績（株）製）を使用して、添付のプロトコールに従って、それぞれ以下の試薬を含む２５μＬ反応液を調整した。【００４８】
（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用ＰＣＲ反応液）
・２×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸ：７．５μＬ、
・ｄＮＴＰｓ：１．５μＬ、
・プライマー１（ＡＤＨ１Ｂ−Ｆ）（１０μＭ）：０．６μＬ、
・プライマー２（ＡＤＨ１Ｂ−Ｒ）（１０μＭ）：０．６μＬ、
・ＫＯＤ  ＦＸ：０．３μＬ、
・ＤＷ（distilled  water）：４．５μＬ。【００４９】
（ＡＬＤＨ２遺伝子用ＰＣＲ反応液）
・２×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸ：７．５μＬ、
・ｄＮＴＰｓ：１．５μＬ、
・プライマー３（ＡＬＤＨ２−Ｆ）（１０μＭ）：０．６μＬ、
・プライマー４（ＡＬＤＨ２−Ｒ）（１０μＭ）：０．６μＬ、
・ＫＯＤ  ＦＸ：０．３μＬ、
・ＤＷ（distilled  water）：４．５μＬ。【００５０】
なお、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用のＰＣＲ−ＲＦＬＰプライマーとしては、以下の２種類を用いた。【００５１】
・プライマー１（ＡＤＨ１Ｂ−Ｆ）：５’−ＣＣＴＴＧＧＧＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＡＴＣＴＴ−３’（配列番号７）、
・プライマー２（ＡＤＨ１Ｂ−Ｒ）：５’−ＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＣ−３’（配列番号８）。【００５２】
またＡＬＤＨ２遺伝子用のＰＣＲ−ＲＦＬＰプライマーとしては、以下の２種類を用いた。【００５３】
・プライマー３（ＡＬＤＨ２−Ｆ）：５’−ＴＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴ−３’（配列番号９）、
・プライマー４（ＡＬＤＨ２−Ｒ）：５’−ＧＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＡＣＣＣＴＣＴＣ−３’（配列番号１０）。【００５４】
チューブ状の担体に蓋をして、以下の増幅条件でＰＣＲ反応を行なった。
（増幅条件）
熱変性：９５℃、５分、
９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→７４℃、４５秒を４０サイクル、
伸長反応：７４℃、２分。【００５５】
ＰＣＲ反応後に得られたＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物は３４９ｂｐであった。このＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物を以下の組成の反応液で３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。【００５６】
（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用制限酵素反応液）
・１０×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４：２μＬ、
・ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物：６μＬ、
・Ｍｓｌ  １：０．２５μＬ、
・ＤＷ（distilled  water）：１１．７５μＬ。【００５７】
またＰＣＲ反応後に得られたＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物は４３０ｂｐであった。このＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物を以下の組成の反応液で３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。【００５８】
（ＡＬＤＨ２遺伝子用制限酵素反応液）
・１０×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４：２μＬ、
・８×ＳＡＭ：２．５μＬ、
・ＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物：６μＬ、
・Ａｃｕ  １：０．２５μＬ、
・ＤＷ（distilled  water）：９．２５μＬ。【００５９】
反応後のＡＤＨ１Ｂ遺伝子、ＡＬＤＨ２遺伝子の制限酵素処理片をそれぞれアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された遺伝子を確認した。図３は、実施例１の結果を示す電気泳動写真である。なお、図３から、１８９ｂｐ、１６０ｂｐのＡＤＨ１Ｂ遺伝子の制限酵素処理片、２９６ｂｐ、１３４ｂｐのＡＬＤＨ２遺伝子の制限酵素処理片がそれぞれ得られていることが分かる。【００６０】
図３（ａ）において、各レーンは以下の結果を示している。
・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ  ＊２／＊２（血液）、
・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ  ＊２／＊２（唾液）、
・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ  ＊２／＊２（毛根）、
・レーン４：ＡＬＤＨ２  ＊２／＊２（血液）、
・レーン５：ＡＬＤＨ２  ＊２／＊２（唾液）、
・レーン６：ＡＬＤＨ２  ＊２／＊２（毛根）。【００６１】
図３（ｂ）において、各レーンは以下の結果を示している。
・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ  ＊２／＊２（血液）、
・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ  ＊２／＊２（唾液）、
・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ  ＊２／＊２（毛根）、
・レーン４：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊１（血液）、
・レーン５：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊１（唾液）、
・レーン６：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊１（毛根）。【００６２】
図３（ｃ）において、各レーンは以下の結果を示している。
・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ  ＊２／＊２（血液）、
・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ  ＊２／＊２（唾液）、
・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ  ＊２／＊２（毛根）、
・レーン４：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２（血液）、
・レーン５：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２（唾液）、
・レーン６：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２（毛根）。【００６３】
図３（ｄ）において、各レーンは以下の結果を示している。
・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊１（血液）、
・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊１（唾液）、
・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊１（毛根）、
・レーン４：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊１（血液）、
・レーン５：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊１（唾液）、
・レーン６：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊１（毛根）。【００６４】
図３（ｅ）において、各レーンは以下の結果を示している。
・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊１（血液）、
・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊１（唾液）、
・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊１（毛根）、
・レーン４：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２（血液）、
・レーン５：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２（唾液）、
・レーン６：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２（毛根）。【００６５】
図３（ｆ）において、各レーンは以下の結果を示している。
・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊２（血液）、
・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊２（唾液）、
・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊２（毛根）、
・レーン４：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊１（血液）、
・レーン５：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊１（唾液）、
・レーン６：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊１（毛根）。【００６６】
図３（ｇ）において、各レーンは以下の結果を示している。
・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊２（血液）、
・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊２（唾液）、
・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊２（毛根）、
・レーン４：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２（血液）、
・レーン５：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２（唾液）、
・レーン６：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２（毛根）。【００６７】
＜実施例２＞
実施例１と同様にろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）にしみこませ、自然乾燥させて固形被検試料として採取した血液を乾燥ろ紙の直径１ｍｍのパンチ片をそのまま、チューブ状の担体内のＰＣＲ反応液に投入した。ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲキットＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績（株）製）を使用して、添付のプロトコールに従って、それぞれ以下の試薬を含む２５μＬ反応液を調整した。【００６８】
（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用ＰＣＲ反応液）
・２×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸ：１０μＬ、
・ｄＮＴＰｓ：２μＬ、
・プライマー５（ＡＤＨ１Ｂ−Ｆ）（１０μＭ）：０．８μＬ、
・プライマー６（ＡＤＨ１Ｂ−Ｒ）（１０μＭ）：０．８μＬ、
・ＫＯＤ  ＦＸ：０．４μＬ、
・ＤＷ（distilled  water）：６μＬ。【００６９】
（ＡＬＤＨ２遺伝子用ＰＣＲ反応液）
・２×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸ：１０μＬ、
・ｄＮＴＰｓ：２μＬ、
・プライマー７（ＡＬＤＨ２−Ｆ）（１０μＭ）：０．８μＬ、
・プライマー８（ＡＬＤＨ２−Ｒ）（１０μＭ）：０．８μＬ、
・ＫＯＤ  ＦＸ：０．４μＬ、
・ＤＷ（distilled  water）：６μＬ。【００７０】
なお、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用のＰＣＲ−ＲＦＬＰプライマーとしては、以下の２種類を用いた。【００７１】
・プライマー５（ＡＤＨ１Ｂ−Ｆ）：５’−ＧＧＡＡＧＧＴＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＡＧＡＣＴＧ−３’（配列番号１１）、
・プライマー６（ＡＤＨ１Ｂ−Ｒ）：５’−ＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＴＴＴＣＧＴＣＴＣＴＣＡＴＴＧ−３’（配列番号１２）。【００７２】
またＡＬＤＨ２遺伝子用のＰＣＲ−ＲＦＬＰプライマーとしては、以下の２種類を用いた。【００７３】
・プライマー７（ＡＬＤＨ２−Ｆ）：５’−ＴＧＧＧＣＧＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＧＡＣＴ−３’（配列番号１３）、
・プライマー８（ＡＬＤＨ２−Ｒ）：５’−ＣＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＣＴＧＧＣＡＧＧＣ−３’（配列番号１４）。【００７４】
チューブ状の担体に蓋をして、以下の増幅条件で、それぞれ別個に独立してＡＤＨ１Ｂ遺伝子、ＡＬＤＨ２遺伝子のＰＣＲ反応を行なった。【００７５】
（増幅条件）
熱変性：９５℃、１０分、
９８℃、１０秒→６２℃、３０秒→７４℃、３０秒を４０サイクル、
伸長反応：７４℃、２分。【００７６】
ＰＣＲ反応後に得られたＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物は４２８ｂｐであった。このＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物を以下の組成の反応液で３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。【００７７】
（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用制限酵素反応液）
・１０×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４：２μＬ、
・ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物：６μＬ、
・Ｍｓｌ  １：０．５μＬ、
・ＤＷ（distilled  water）：１１．５μＬ。【００７８】
またＰＣＲ反応後に得られたＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物は１６９ｂｐであった。このＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物を以下の組成の反応液で３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。【００７９】
（ＡＬＤＨ２遺伝子用制限酵素反応液）
・１０×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４：２μＬ、
・８×ＳＡＭ：２．５μＬ、
・ＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物：６μＬ、
・Ａｃｕ  １：０．５μＬ、
・ＤＷ（distilled  water）：９．２５μＬ。【００８０】
反応後のＡＤＨ１Ｂ遺伝子、ＡＬＤＨ２遺伝子の制限酵素処理片をそれぞれアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された遺伝子を確認した。なお、コントロールとして、ＤＷもアプライした。図４は、実施例２の結果を示す電気泳動写真である。なお、図４から、２１７ｂｐ、２１１ｂｐのＡＤＨ１Ｂ遺伝子の制限酵素処理片、４８ｂｐ、１２１ｂｐのＡＬＤＨ２遺伝子の制限酵素処理片がそれぞれ得られていることが分かる。【００８１】
図４（ａ）において、各レーンは以下の結果を示している。
・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊２、
・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊１、
・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊２、
・レーン４：ＤＷ。【００８２】
図４（ｂ）において、各レーンは以下の結果を示している。
・レーン１：ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２、
・レーン２：ＡＬＤＨ２  ＊２／＊２、
・レーン３：ＡＬＤＨ２  ＊２／＊２、
・レーン４：ＤＷ。【００８３】
＜実施例３＞
実施例２と同様にして得られたＡＤＨ１Ｂ遺伝子、ＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物を、以下の制限酵素反応液を用いて同時に３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。【００８４】
（制限酵素反応液）
・１０×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４：２μＬ、
・ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物：３μＬ、
・ＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物：３μＬ、
・８×ＳＡＭ：２．５μＬ、
・Ｍｓｌ  １：０．５μＬ、
・Ａｃｕ  １：０．５μＬ、
・ＤＷ（distilled  water）：８．５μＬ。【００８５】
反応後のＡＤＨ１Ｂ遺伝子、ＡＬＤＨ２遺伝子の制限酵素処理片をそれぞれアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された遺伝子を確認した。なお、コントロールとして、ＤＷもアプライした。図５は、実施例３の結果を示す電気泳動写真である。【００８６】
図５において、各レーンは以下の結果を示している。
・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊２、ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２、
・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊１、ＡＬＤＨ２  ＊２／＊２、
・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊２、ＡＬＤＨ２  ＊２／＊２、
・レーン４：ＤＷ。【００８７】
＜実施例４＞
実施例１と同様にろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）にしみこませ、自然乾燥させて固形被検試料として採取した血液を乾燥ろ紙の直径１ｍｍのパンチ片をそのまま、チューブ状の担体内のＰＣＲ反応液に投入した。ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲキットＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績（株）製）を使用して、添付のプロトコールに従って、以下の試薬を含む２５μＬ反応液を調整した。【００８８】
（ＰＣＲ反応液）
・２×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸ：１０μＬ、
・ｄＮＴＰｓ：２μＬ、
・プライマー５（ＡＤＨ１Ｂ−Ｆ）（１０μＭ）：０．４μＬ、
・プライマー６（ＡＤＨ１Ｂ−Ｒ）（１０μＭ）：０．４μＬ、
・プライマー７（ＡＬＤＨ２−Ｆ）（１０μＭ）：０．８μＬ、
・プライマー８（ＡＬＤＨ２−Ｒ）（１０μＭ）：０．８μＬ、
・ＫＯＤ  ＦＸ：０．４μＬ、
・ＤＷ（distilled  water）：５．２μＬ。【００８９】
チューブ状の担体に蓋をして、以下の増幅条件で、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子、ＡＬＤＨ２遺伝子について同時にＰＣＲ反応を行なった。【００９０】
（増幅条件）
熱変性：９５℃、１０分、
９８℃、１０秒→６２℃、３０秒→７４℃、３０秒を４０サイクル、
伸長反応：７４℃、２分。【００９１】
得られたＰＣＲ増幅産物を、以下の制限酵素反応液を用いて同時に３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。【００９２】
（制限酵素反応液）
・１０×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４：２μＬ、
・ＰＣＲ増幅産物：６μＬ、
・８×ＳＡＭ：２．５μＬ、
・Ｍｓｌ  １：０．５μＬ、
・Ａｃｕ  １：０．５μＬ、
・ＤＷ（distilled  water）：８．５μＬ。【００９３】
反応後の制限酵素処理片をそれぞれアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された遺伝子を確認した。なお、コントロールとして、ＤＷもアプライした。図６は、実施例４の結果を示す電気泳動写真である。【００９４】
図６において、各レーンは以下の結果を示している。
・レーン１：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊２、ＡＬＤＨ２  ＊１／＊２、
・レーン２：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊１、ＡＬＤＨ２  ＊２／＊２、
・レーン３：ＡＤＨ１Ｂ  ＊１／＊２、ＡＬＤＨ２  ＊２／＊２、
・レーン４：ＤＷ（distilled  water）。【００９５】
＜実施例５＞
実施例１と同様にろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）にしみこませ、自然乾燥させて固形被検試料として採取した血液を乾燥ろ紙の直径１ｍｍのパンチ片をそのまま、チューブ状の担体内のＰＣＲ反応液に投入した。ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲキットＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績（株）製）を使用して、添付のプロトコールに従って、それぞれ以下の試薬を含む２５μＬ反応液を調整した。【００９６】
（ＰＣＲ反応液）
・２×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸ：１２．５μＬ、
・ｄＮＴＰｓ：２．５μＬ、
・プライマー９（ＣＹＰ２Ｅ１−Ｆ）（１０μＭ）：１μＬ、
・プライマー１０（ＣＹＰ２Ｅ１−Ｒ）（１０μＭ）：１μＬ、
・ＫＯＤ  ＦＸ：０．５μＬ、
・ＤＷ（distilled  water）：７．５μＬ。【００９７】
なお、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子用のＰＣＲ−ＲＦＬＰプライマーとしては、以下の２種類を用いた。【００９８】
・プライマー９（ＣＹＰ２Ｅ１−Ｆ）：５’−ＣＣＡＧＴＣＧＡＧＴＣＴＡＣＡＴＴＧＴＣＡ−３’（配列番号１５）、
・プライマー１０（ＣＹＰ２Ｅ１−Ｒ）：５’−ＴＴＣＡＴＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号１６）。【００９９】
チューブ状の担体に蓋をして、以下の増幅条件で、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子のＰＣＲ反応を行なった。【０１００】
（増幅条件）
熱変性：９５℃、１０分、
９８℃、１０秒→５５℃、３０秒→７４℃、３０秒を４０サイクル、
伸長反応：７４℃、２分。【０１０１】
ＰＣＲ反応後に得られたＣＹＰ２Ｅ１遺伝子の増幅産物は４１０ｂｐであった。このＣＹＰ２Ｅ１遺伝子の増幅産物を以下の組成の反応液で３７℃、１時間の制限酵素反応を行なった。【０１０２】
（制限酵素反応液）
・１０×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４：２μＬ、
・ＰＣＲ増幅産物：６μＬ、
・８×ＳＡＭ：２．５μＬ、
・Ｐｓｔ  １：０．５μＬ、
・ＤＷ（distilled  water）：１１．５μＬ。【０１０３】
反応後の制限酵素処理片をそれぞれアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された遺伝子を確認した。図７は、実施例５の結果を示す電気泳動写真である。【０１０４】
図７において、各レーンは以下の結果を示している。
・レーン１：ＣＹＰ２Ｅ１  ＊ｃ１／＊ｃ１、
・レーン２：ＣＹＰ２Ｅ１  ＊ｃ１／＊ｃ２、
・レーン３：ＣＹＰ２Ｅ１  ＊ｃ２／＊ｃ２。【０１０５】
＜実施例６＞
以下の手順で、検査対象（被検者Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）からそれぞれ採取した唾液（口腔内細胞を含む）または血液について、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子およびアルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子の遺伝子多型の検出をリアルタイムＰＣＲ装置ＡＢＩ７３００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＴａｑＭａｎ（登録商標）法により行なった。唾液または血液については、ろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）にしみこませ、自然乾燥させて、固形被検試料として採取した。Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）の場合、通常行うＤＮＡの抽出・精製過程を省略し、この乾燥ろ紙の直径２ｍｍのパンチ片１枚を水１０μＬの入っているエッペンドルフチューブに投入し、９０℃で１０分間加熱した。その上清５μＬをＴａｑＭａｎ反応液に投入した。【０１０６】
Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）およびＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合、乾燥ろ紙唾液または乾燥ろ紙血液加熱処理上清は以下のように調整した。乾燥ろ紙唾液または乾燥ろ紙血液の直径２ｍｍのパンチ片１枚を１Ｍ  ベタインを含むＰＣＲ用緩衝液１０μＬの入っているエッペンドルフチューブに投入し、９０℃で１０分間加熱した。その上清５μＬをＴａｑＭａｎ反応液に投入した。ここで、血液中にはＰＣＲを阻害する物質が多く含まれており、これらを鋳型としたＰＣＲは成功しないことが知られている。これまでに血液をサンプルとしたＰＣＲにおいてはＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅよりもＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが有利なことや、血液中の阻害物質はＨｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎであり、その影響を回避する添加剤としてＢＳＡやＢｅｔａｉｎｅが有用であることが報告されている。一方、抗血液凝固剤であるヘパリンもＰＣＲを阻害することが知られている（たとえば、Michael  P.  and  Andrew  L.,  Nucleic  Acids  Reserch,  19,  1151,(1991)（非特許文献８）、Henke  W.,  Herdel  K.,  Jung  K.,  Schnorr  D.  and  Loening  A.  S.,  Nucleic  Acids  Reserch,  25,  3957,(1997)（非特許文献９）、Waleed  A.  A.  and  Peter  R.,  J.clin.  Microbiol.,  39,  485-493,  (2001)（非特許文献１０）などを参照。）。【０１０７】
ＴａｑＭａｎ法による遺伝子判定には、プローブおよびプライマーセットはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓキット、ＰＣＲ増幅はＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）またはＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用して、それぞれ以下の試薬を含む２０μＬ反応液を調整した。遺伝子型判定は、本反応の結果、添付のプロトコールに従って、検出される２色の蛍光強度により判定した。【０１０８】
（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用ＴａｑＭａｎプローブ・プライマーセット）
・ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
・Ｇｅｎｅ  Ｎａｍｅ：  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １Ｂ（ｃｌａｓｓ  Ｉ），  ｂｅｔａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、
・ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ  ＩＤ：  Ｃ＿２６８８４６７＿２０。【０１０９】
（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用ＴａｑＭａｎ反応液）
＜Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した場合＞
・Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：１０μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ  Ｃ＿２６８８４６７＿２０：１μｌ、
・乾燥ろ紙唾液加熱処理上清：５μｌ、
・ＤＷ（distilled  water）：４μｌ。【０１１０】
＜Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
・Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：１０μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ  Ｃ＿２６８８４６７＿２０：１μｌ、
・乾燥ろ紙唾液加熱処理上清：５μｌ、
・ＤＷ（distilled  water）：４μｌ。【０１１１】
＜Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
・Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：１０μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ  Ｃ＿２６８８４６７＿２０：１μｌ、
・乾燥ろ紙血液加熱処理上清：５μｌ、
・ＤＷ（distilled  water）：４μｌ。【０１１２】
＜ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
・ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：１０μｌ、
・２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4：１μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ  Ｃ＿２６８８４６７＿２０：１μｌ、
・乾燥ろ紙唾液加熱処理上清：５μｌ、
・ＤＷ（distilled  water）：３μｌ。【０１１３】
＜ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
・ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：１０μｌ、
・２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4：１μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ  Ｃ＿２６８８４６７＿２０：１μｌ、
・乾燥ろ紙血液加熱処理上清：５μｌ、
・ＤＷ（distilled  water）：３μｌ。【０１１４】
（ＡＬＤＨ２遺伝子用ＴａｑＭａｎプローブ・プライマーセット）
・ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
・Ｇｅｎｅ  Ｎａｍｅ：ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ２  ｆａｍｉｌｙ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ）、
・ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ  ＩＤ：Ｃ＿１１７０３８９２＿１０。【０１１５】
＜Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した場合＞
・Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：１０μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ  Ｃ＿１１７０３８９２＿１０：１μｌ、
・乾燥ろ紙唾液加熱処理上清：５μｌ、
・ＤＷ（distilled  water）：４μｌ。【０１１６】
＜Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
・Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：１０μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ  Ｃ＿１１７０３８９２＿１０：１μｌ、
・乾燥ろ紙唾液加熱処理上清：５μｌ、
・ＤＷ（distilled  water）：４μｌ。【０１１７】
＜Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
・Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：１０μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ  Ｃ＿１１７０３８９２＿１０：１μｌ、
・乾燥ろ紙血液加熱処理上清：５μｌ、
・ＤＷ（distilled  water）：４μｌ。【０１１８】
＜ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
・ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：１０μｌ、
・２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4：１μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ  Ｃ＿１１７０３８９２＿１０：１μｌ、
・乾燥ろ紙唾液加熱処理上清：５μｌ、
・ＤＷ（distilled  water）：３μｌ。【０１１９】
＜ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用した場合＞
・ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：１０μｌ、
・２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4：１μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ  Ｃ＿１１７０３８９２＿１０：１μｌ、
・乾燥ろ紙血液加熱処理上清：５μｌ、
・ＤＷ（distilled  water）：３μｌ。【０１２０】
（増幅条件）
熱変性：９５℃、１０分、
９５℃、１５秒→６０℃、１分を４０サイクル。【０１２１】
サンプルは以下のとおりであった。【０１２２】
【表１】
2011043365.tif 000003
【０１２３】
ここで、図８は、Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図であり、図９は、Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である。また、図１０は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図であり（乾燥ろ紙唾液使用）、図１１は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙唾液使用）。図１２は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図であり（乾燥ろ紙血液使用）、図１３は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙血液使用）。図１４は、ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図であり（乾燥ろ紙唾液使用）、図１５は、ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙唾液使用）。図１６は、ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂの判定結果を示す図であり（乾燥ろ紙血液使用）、図１７は、ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２の判定結果を示す図である（乾燥ろ紙血液使用）。【０１２４】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図１】
2011043365.tif 000004
【図２】
2011043365.tif 000005
【図８】
2011043365.tif 000006
【図９】
2011043365.tif 000007
【図１０】
2011043365.tif 000008
【図１１】
2011043365.tif 000009
【図１２】
2011043365.tif 000010
【図１３】
2011043365.tif 000011
【図１４】
2011043365.tif 000012
【図１５】
2011043365.tif 000013
【図１６】
2011043365.tif 000014
【図１７】
2011043365.tif 000015
【図３】
2011043365.tif 000016
【図４】
2011043365.tif 000017
【図５】
2011043365.tif 000018
【図６】
2011043365.tif 000019
【図７】
2011043365.tif 000020
【配列表】
2011043365000001.app
【国際調査報告】
2011043365.tif 000021
2011043365.tif 000022
2011043365.tif 000023
2011043365.tif 000024