(57)【要約】本発明はヒトバニロイド受容体様受容体（ＶＲ４と言う）及び前記受容体をコードするポリヌクレオチド配列に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のポリペプチドをコードする核酸配列を含む精製ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドの相補体。
【請求項２】
配列番号１の核酸配列を含む請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドの相補体又はその一部を含むアンチセンス分子。
【請求項４】
請求項３に記載のアンチセンス分子と医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項５】
請求項２に記載のポリヌクレオチドのオリゴマーを含む診断用組成物。
【請求項６】
ＶＲ４発現変化に関連する疾患の診断試験であって、
ａ）生体試料を提供する段階と、
ｂ）生体試料に請求項５に記載の診断用組成物を加える段階と、
ｃ）生体試料と診断用組成物を適当な条件下でハイブリダイズさせる段階と、
ｄ）ハイブリダイゼーション量を測定して試料値を得る段階と、
ｅ）試料値を標準値と比較し、ｖｒ４発現が変化しているか否かを判定する段階を含む前記方法。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項９】
ポリペプチドの生産方法であって、
ａ）ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養する段階と、
ｂ）宿主細胞培養物からポリペプチドを回収する段階を含む前記方法。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド（ＶＲ４）。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチド又はその一部を含む診断用組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載のポリペプチドと医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１０に記載の精製ポリペプチド又は前記ポリペプチドの一部に特異的な抗体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の抗体を含む診断用組成物。
【請求項１５】
ＶＲ４発現変化に関連する疾患の診断試験であって、
ａ）生体試料を提供する段階と、
ｂ）複合体形成に適した条件下で生体試料に請求項１３に記載の抗体を加える段階と、
ｃ）ＶＲ４と抗体の複合体形成量を測定し、試料量を得る段階と、
ｄ）試料中の複合体形成量を標準複合体形成量と比較し、試料量と標準複合体形成量の間に差がある場合には疾患が存在すると判定する段階を含む前記方法。
【請求項１６】
ＶＲ４受容体シグナル伝達モジュレーターとしての１種以上の試験化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと各試験化合物を接触させる段階と、
（ｂ）各試験化合物の調節効果を測定する段階を含む前記方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドがポリペプチドを発現する天然もしくは組換え全細胞又は前記細胞に由来する亜細胞フラクションに含まれる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
調節効果が試験化合物とポリペプチドの結合を含む請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
試験化合物がＶＲ４以外の少なくとも１種のＴｒｐ受容体に対して高親和性であるか又はＶＲ４以外の少なくとも１種のＴｒｐ受容体に対して低親和性である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
医薬的に許容可能な賦形剤と、ＶＲ４受容体シグナル伝達モジュレーターであって、請求項１６に記載の方法により同定される化合物を含む医薬組成物。
【請求項２１】
医薬的に許容可能な賦形剤と、
（ａ）ＶＲ４受容体、好ましくは少なくとも１種の他のＴｒｐ受容体と選択的に結合するか、又は
（ｂ）少なくとも１種の他のＴｒｐ受容体、好ましくはＶＲ４と選択的に結合し、請求項１９に記載の方法により同定される化合物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学の分野であり、より詳細には本発明は新規ヒトバニロイド受容体様受容体（ＶＲ４と言う）のアミノ酸配列及び前記受容体をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
本発明によると、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離精製ポリペプチドが提供される。本発明の第２の側面では、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離精製ポリヌクレオチドが提供される。１態様において、前記ポリヌクレオチドは配列番号１のヌクレオチド配列を含む。本発明は更に組換えＶＲ４受容体を発現する安定な細胞系と、受容体特異的医薬の設計及び開発のためのスクリーニング技術における前記細胞系の使用にも関する。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は新規ヒトバニロイド受容体様受容体（ＶＲ４）をコードするユニークなヌクレオチド配列を提供する。下記実施例に記載するようにｃＤＮＡ（以下、ｖｒ４と言う）を同定し、クローニングした。
【０００４】
本発明はＶＲ４の発現に関連する活性化、炎症又は疾患細胞及び／又は組織の診断又は治療におけるＶＲ４又はその変異体のヌクレオチド及びアミノ酸配列の使用に関する。本発明の他の側面はｖｒ４のアンチセンスＤＮＡ；ｖｒ４を含むクローニング又は発現ベクター；ＶＲ４を発現するように遺伝子組換えした宿主細胞又は生物；ＶＲ４の発現を解除、防止又は低減するように遺伝子組換えした宿主細胞又は生物；ＶＲ４を発現するように遺伝子組換えした宿主細胞から精製ＶＲ４を生産及び回収するための方法；ＶＲ４を含む前記宿主細胞の亜細胞フラクション；精製ＶＲ４タンパク質自体；ＶＲ４に関与するシグナル伝達モジュレーターを同定するためのアッセイ；及びＶＲ４に対する抗体に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本明細書で使用する大文字略語ＶＲ４は配列番号２のアミノ酸配列をもつ天然、組換え又は合成形態のバニロイド受容体様受容体タンパク質とその活性フラグメントを意味する。ｉｎ  ｖｉｖｏでＶＲ４ポリペプチドは相同受容体タンパク質とヘテロマー複合体の一部を形成することができる。１態様において、ポリペプチドＶＲ４は配列番号１のｃＤＮＡ（小文字略語ｖｒ４により表す）から転写されたｍＲＮＡによりコードされる。
【０００６】
本特許出願の主題である新規ヒトバニロイド受容体様受容体ＶＲ４はＭｅｒｃｋ．ＨＴＧ．Ｈｕｍａｎデータベースに含まれるＧｅｎｂａｎｋのヒトＨｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ（ＨＴＧ）フェーズ０〜２配列に存在する部分ｃＤＮＡ配列から発見された。
【０００７】
「オリゴヌクレオチド」はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でオリゴマー、アンプリマー又はプローブとして使用するのに十分な数の塩基をもつヌクレオチド残基配列である。オリゴヌクレオチドは一般に化学合成により製造される。その配列はｃＤＮＡ又はゲノム配列情報に基づいて決定され、特定細胞又は組織におる類似ＤＮＡ又はＲＮＡを増幅、検出又はその存在を確認するために使用される。オリゴヌクレオチド又はオリゴマーは少なくとも約１０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、一般には約２５ヌクレオチドをもつＤＮＡ配列の部分を含む。
【０００８】
「プローブ」は天然又は組換え１本鎖又は２本鎖核酸から誘導してもよいし、化学合成してもよい。プローブは同一又は類似配列の検出に有用である。
【０００９】
ポリヌクレオチド又は核酸の「部分」又は「フラグメント」はプローブとして使用可能な約６ｋｂ未満、好ましくは約１ｋｂ未満のヌクレオチド配列の全部又は一部を含む。このようなプローブはニック翻訳、Ｋｌｅｎｏｗフィルイン反応、ＰＣＲ又は当分野で周知の他の方法を使用してレポーター分子で標識してもよい。予備試験により反応条件を最適化し、疑陽性を排除した後に核酸プローブをサザン、ノーザン又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで使用し、ＶＲ４をコードするＤＮＡ又はＲＮＡが細胞種、組織又は臓器に存在するか否かを判定することができる。
【００１０】
「レポーター」分子は特定ヌクレオチド又はアミノ酸配列と結合し、その存在を検証し、その定量を可能にし得る放射性核種、酵素、蛍光、化学発光又は発色剤である。
【００１１】
ＶＲ４をコードする「組換えヌクレオチド変異体」は遺伝コードの「冗長」を利用することにより合成することができる。特定制限部位又はコドン使用特異的突然変異を生じるサイレント変異等の各種コドン置換を導入し、夫々プラスミドもしくはウイルスベクターへのクローニング又は特定原核もしくは真核宿主系での発現を最適化することができる。
【００１２】
「キメラ」分子は細胞内位置、分布、リガンド結合親和性、鎖間親和性、分解／ターンオーバー率、シグナル伝達等のＶＲ４特性の任意１種（又は２種以上）を変化させると予想される１種以上の付加ヌクレオチド配列を含むベクターに本発明のヌクレオチド配列の全部又は一部を導入することにより構築することができる。
【００１３】
「活性な」とは任意天然ＶＲ４の生体及び／又は抗原活性を保持する任意ＶＲ４ポリペプチドの形態、フラグメント又はドメインを意味する。
【００１４】
「天然に存在するＶＲ４」又は「天然ＶＲ４」とは遺伝子組換えしていない細胞により産生される該当ポリペプチドを意味し、特にポリペプチドの翻訳後修飾（限定しないが、例えばアセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化）により生じる各種ポリペプチドを意味する。
【００１５】
「誘導体」とはユビキチン化、標識（上記参照）、ペグ化（ポリエチレングリコール化）及びヒトタンパク質に天然に存在しないアミノ酸（例えばオルニチン）の化学的挿入又は置換等の技術により化学的に修飾されているポリペプチドを意味する。
【００１６】
「組換えポリペプチド変異体」とはアミノ酸挿入、欠失及び／又は置換により天然に存在するＶＲ４と相違しており、組換えＤＮＡ技術を使用して作製された任意ポリペプチドを意味する。活性又は利益を損なわずにどのアミノ酸残基を置換、付加又は欠失できるかを決定する指針は、ＶＲ４の配列を関連ポリペプチドの配列と比較し、高度に保存された領域に形成されたアミノ酸配列変異の数を最小にすることにより見出すことができる。
【００１７】
アミノ酸「置換」はロイシン→イソロイシンもしくはバリン、アスパラギン酸→グルタミン酸、又はスレオニン→セリンの置換のように、あるアミノ酸を類似構造及び／又は化学的性質の別のアミノ酸で置換する場合には保存性である。
【００１８】
「挿入」又は「欠失」は一般に約１〜５アミノ酸の範囲とする。許容される変異はペプチドを合成的に製造するか又は組換えＤＮＡ技術を使用してｖｒ４配列にヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換を合成的に行うことにより実験的に決定することができる。
【００１９】
「オリゴペプチド」はアミノ酸残基の短い配列であり、オリゴヌクレオチドから発現させることができる。オリゴペプチドはポリペプチドの「フラグメント」、「部分」又は「セグメント」と機能的に等価でもよいし、同一長でもよい（又は著しく短くてもよい）。このような配列は少なくとも約５アミノ酸、多くの場合には約１７アミノ酸以上、一般には少なくとも約９〜１３アミノ酸のアミノ酸残基の配列を含み、生体及び／又は抗原活性を示すに十分な長さである。
【００２０】
「阻害剤」は化学又は物理反応又は応答を抑制又は阻止する任意物質である。一般的な阻害剤としては限定しないが、アンチセンス分子、抗体、チャネル遮断剤及びアンタゴニストが挙げられる。
【００２１】
「標準」発現は定量的又は定性的比較測定である。このような発現は正常試料の統計的概数に基づいて設定され、診断アッセイの実施、臨床試験の実施又は患者治療プロフィルの追跡時に比較の指標として使用する。
【００２２】
本発明は新規ヒトバニロイド受容体様受容体を特異的に識別するヌクレオチド配列を提供する。核酸（ｖｒ４）、ポリペプチド（ＶＲ４）及びＶＲ４に対する抗体は受容体生産又は機能の亢進又は低下を調査する診断アッセイで有用である。ＶＲ４の過剰発現の診断試験は疼痛、特に熱による疼痛、関節炎疼痛及び神経障害性疼痛、炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病又は虚血に関連するもの等の神経変性、内分泌障害、心臓血管疾患、膀胱又は腸機能障害、気分障害（例えば鬱病）、肥満症及び癌に関連する異常状態の診断と適正な治療を早めることができる。
【００２３】
ＶＲ４をコードするヌクレオチド配列（又は遺伝コードの縮重によるその等価物）は分子生物学分野の当業者に公知の技術で多数の用途がある。これらの技術としてはハイブリダイゼーションプローブとしての使用、ＰＣＲ用オリゴマーの構築における使用、染色体及び遺伝子マッピングでの使用、ＶＲ４の組換え生産における使用、並びにアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ、その化学的類似体等の作製における使用が挙げられる。本明細書に開示するＶＲ４をコードするポリヌクレオチドの用途は公知技術の例であり、当業者に公知の技術におけるその使用を限定するものではない。更に、本明細書に開示するヌクレオチド配列は、新規技術が現在公知のヌクレオチド配列の性質（例えばトリプレット遺伝コード、特異的塩基対相互作用等）に依存するものである限り、まだ開発されていない分子生物学技術で使用することもできる。
【００２４】
当業者の自明の通り、遺伝コードの縮重の結果としてＶＲ４をコードする複数のヌクレオチド配列を作製することができる。これらの配列のうちには天然に存在するＶＲ４の発現を左右する天然ヌクレオチド配列と最小限の相同度しかもたないものもある。本発明は特に標準トリプレット遺伝コードに従ってＶＲ４をコードするポリヌクレオチドとなる前記天然ヌクレオチド配列の可能な全変異を検討した。図１（配列番号１）に示す変異体が好適である。
【００２５】
ＶＲ４（又はその誘導体もしくは変異体）をコードするヌクレオチド配列はストリンジェント条件下で天然ｖｒ４のヌクレオチド配列とハイブリダイズできることが好ましいが、ＶＲ４をコードするヌクレオチド配列又は実質的に異なるコドン使用をもつその誘導体を生産すると有利な場合もある。特定コドンが宿主により利用される頻度に応じて特定原核又は真核発現宿主でペプチドの発現が起こる率を増加するようにコドンを選択することができる。コードされるアミノ酸配列を変えずにＶＲ４及び／又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する他の理由としては、天然に存在する配列により生産される転写産物より望ましい性質（例えば半減期の延長）をもつＲＮＡ転写産物の生産が挙げられる。
【００２６】
ＶＲ４をコードするヌクレオチド配列は確立された組換えＤＮＡ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  ＮＹ  ；又はＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら（１９８９）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ）により種々の他のヌクレオチド配列と結合することができる。ｖｒ４との結合に有用なヌクレオチド配列としては各種クローニングベクター（例えばプラスミド、コスミド、λファージ誘導体、ファージミド等）が挙げられる。該当ベクターとしては発現ベクター、複製ベクター、プローブ作製ベクター、配列決定ベクター等が挙げられる。一般に、該当ベクターは少なくとも１種の生物で機能的な複製起点と、簡便な制限エンドヌクレアーゼ感受性部位と、１種以上の宿主細胞系の選択マーカーを含む。
【００２７】
本発明の別の側面はＶＲ４をコードする天然に存在するヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能なｖｒ４特異的ハイブリダイゼーションプローブを提供することである。このようなプローブは類似配列の検出にも使用することができ、ｖｒ４配列に由来するヌクレオチドの少なくとも５０％を含むことが好ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブは配列番号１として示すヌクレオチド配列又は天然遺伝子のプロモーター、エンハンサーもしくはイントロンを含むゲノム配列から誘導することができる。ハイブリダイゼーションプローブは当分野で周知の技術を使用して種々のレポーター分子で標識することができる。
【００２８】
米国特許第４，６８３，１９５号、４，８００，１９５号及４，９６５，１８８号に記載されているようなＰＣＲでは、ＶＲ４をコードするヌクレオチド配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドにも使用することができる。ＰＣＲで使用されるこのようなプローブは組換え起源でもよいし、化学合成してもよいし、両者の混合物でもよい。オリゴマーは特定組織におけるｖｒ４の識別又は診断用途に最適な条件下で使用される不連続ヌクレオチド配列を含むことができる。密接に関連するＤＮＡ又はＲＮＡの識別には低ストリンジェント条件下で同一の２個のオリゴマー、ｎｅｓｔｅｄ用の１組のオリゴマー又はオリゴマーの縮重プールを使用することができる。
【００２９】
ｖｒ４に特異的なハイブリダイゼーションプローブの他の作製手段としては、ＶＲ４又はＶＲ４誘導体をコードするヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブ生産用ベクターにクローニングする方法がある。このようなベクターは当分野で公知であり、市販されており、Ｔ７又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ等の適当なＲＮＡポリメラーゼや適当なレポーター分子の付加によりＲＮＡプローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成するために使用することができる。
【００３０】
ＤＮＡ配列又はその部分を完全に合成化学により生産することが可能である。合成後に当分野で周知の技術を使用してヌクレオチド配列を多数の市販ＤＮＡベクターとそれらの夫々の宿主細胞に挿入することができる。更に、合成化学を使用してヌクレオチド配列に突然変異を導入してもよい。あるいは、突然変異が所望される配列の一部を合成し、既存ゲノム又は組換え配列のもっと長い部分と組換えてもよい。
【００３１】
ｖｒ４のヌクレオチド配列は異常レベルのＶＲ４発現に関連する疾病状態を検出又は定量するためのアッセイで使用することができる。ｃＤＮＡは当分野で公知の方法により標識し、患者からの体液、細胞又は組織試料に加え、ハイブリダイゼーション条件下にインキュベートすることができる。インキュベーション時間後にレポーター分子を含む適合可能な液体で試料を洗浄する。適合可能な液体を洗い流した後にレポーター分子を定量し、上記に定義したような標準と比較する。ＶＲ４発現が標準発現と有意に異なるならば、アッセイは疾病又は他の異常を判定する。
【００３２】
ｖｒ４のヌクレオチド配列は天然遺伝子をマッピング又は他の種で相同遺伝子配列を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを構築するために使用することができる。遺伝子は周知マッピング技術を使用して特定染色体又は染色体の特定領域にマッピングすることができる。これらの技術としては染色体領域のｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（Ｖｅｒｍａら（１９８８）  Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ）、フロー選別染色体調製、又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１構築物もしくは単染色体ｃＤＮＡライブラリー等の人工染色体構築物が挙げられる。
【００３３】
染色体調製物のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションと、確立染色体マーカーを使用した連結分析等の物理的マッピング技術は遺伝子地図を拡張するのに非常に有益である。遺伝子地図データの例はＳｃｉｅｎｃｅの各年ゲノム号（例えば１９９４，２６５：１９８１ｆ）に記載されている。別種における対応配列遺伝子の配列と位置がわかると、例えばトランスジェニック「ノックアウト」動物の育種や下記アンチセンス技術の使用によりその機能を解明し易くなる。
【００３４】
本発明のヌクレオチド配列は正常個体とキャリヤーないし疾患個体間の遺伝子配列の相違を検出するためにも使用できる。
【００３５】
ＶＲ４の正確で完全なＤＮＡ配列がわかると、遺伝子機能の調査でアンチセンス技術のツールとして使用できるようになる。ｖｒ４のアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ又はゲノムフラグメントをｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで使用してｍＲＮＡの発現を阻害する。このような技術は当分野で現在周知であり、ヌクレオチド配列に沿って種々の位置でアンチセンス分子を設計することができる。細胞又は完全試験動物をこのようなアンチセンス配列で処理することにより、目的遺伝子は有効に遮断される。多くの場合には、細胞内、細胞、組織又は生物レベルの挙動（例えば致死率、分化機能の低下、形態変化等）を観察することにより遺伝子の機能を検証する。
【００３６】
特定オープンリーディングフレームの転写を阻止するために構築した配列の使用に加え、イントロン領域、プロモーター／エンハンサーエレメント、又はトランザクション調節遺伝子に対するアンチセンス配列を設計することにより遺伝子発現の改変が得られる。同様に、Ｈｏｇｅｂｏｏｍ塩基対合法（「三重螺旋」塩基対合としても知られる）を使用しても阻害が達成される。
【００３７】
アンチセンス治療用としてｖｒ４に相補的なヌクレオチド配列を合成することができる。これらのアンチセンス分子はＤＮＡでもよいし、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート等の安定なＤＮＡ誘導体でもよいし、ＲＮＡでもよいし、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ等の安定なＲＮＡ誘導体でもよいし、他のＶＲ４受容体アンチセンス類似物でもよい。ＶＲ４受容体アンチセンス分子はマイクロインジェクション、リポソームカプセル封入及びアンチセンス配列を組込んだベクターからの発現等の当分野で公知の方法により細胞に導入することができる。ＶＲ４受容体アンチセンス治療はＶＲ４受容体活性を低下させることが有益な疾病の治療に特に有用であると思われる。
【００３８】
ＶＲ４受容体遺伝子治療はＶＲ４受容体をターゲット生物の細胞に導入するために使用することができる。ＶＲ４受容体遺伝子は例えばレシピエント宿主細胞の感染によりＶＲ４受容体ＤＮＡの導入を媒介するウイルスベクターに連結することができる。利用可能なウイルスベクターとしてはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等が挙げられる。あるいは、リガンド−ＤＮＡ結合体又はアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ結合体を使用した受容体媒介ターゲットＤＮＡ送達、リポフェクション膜融合及び直接マイクロインジェクション等の非ウイルス技術によりＶＲ４受容体ＤＮＡを遺伝子治療用細胞に導入することもできる。これらの方法とその変法はｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ  ＶＲ４受容体遺伝子治療に適している。ＶＲ４受容体遺伝子治療はＶＲ４受容体発現を増加させることが有益な疾病の治療に特に有用である。
【００３９】
ＶＲ４をコードするヌクレオチド配列は周知組換えＤＮＡ技術を使用して精製オリゴペプチド又はポリペプチドを生産するために使用することができる。Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）は単離ヌクレオチド配列の発現を教示する多くの刊行物の１例である。組換えＤＮＡ技術によりオリゴペプチド又はポリペプチドを生産する利点としては、精製とアッセイの実施に十分な量が得られることや、簡単な精製法を利用できることが挙げられる。
【００４０】
上記のように得られたクローン化ＶＲ４  ｃＤＮＡは適当なプロモーターと他の適当な転写調節因子を含む発現ベクターに分子クローニングすることにより組換え発現させ、原核又は真核宿主細胞に導入して組換えＶＲ４を生産することができる。
【００４１】
本明細書において発現ベクターとはクローン化ＤＮＡの転写と適切な宿主におけるそのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として定義される。このようなベクターを使用すると、細菌、青緑藻類、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞等の種々の宿主で真核ＤＮＡを発現させることができる。特別に設計したベクターは細菌−酵母や細菌−動物細胞等の宿主間でＤＮＡを交換することができる。適切に構築した発現ベクターは宿主細胞で自律複製するたの複製起点と、選択マーカーと、制限数の有用な制限酵素部位と、高コピー数の可能性と、活性なプロモーターを含む。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡと結合させてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列として定義される。強力プロモーターとは高頻度でｍＲＮＡを開始させるプロモーターである。発現ベクターとしては制限されないが、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特殊設計プラスミド及びウイルスが挙げられる。
【００４２】
種々の哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞で組換えＶＲ４を発現させることができる。組換えＶＲ４発現に適切であると思われる市販哺乳動物発現ベクターとしてはｐＭＣ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＩＲＥＳ、ｐＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びワクシニアウイルストランスファーベクターｐＴＭＩが挙げられる。
【００４３】
ＶＲ４をコードするＤＮＡを発現ベクターにクローニングして宿主細胞で発現させてもよい。宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよく、限定しないが、細菌、酵母、哺乳動物細胞（限定しないが、ヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類由来細胞系）及び昆虫細胞（限定しないが、Ｓｆ９やショウジョウバエ由来細胞系）が挙げられる。利用可能な市販の哺乳動物種由来細胞系としては限定しないが、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）、ｔｓａ及びＬｔｋ細胞，ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）が挙げられる。
【００４４】
発現ベクターは当業者に公知の多数の技術の任意のものを使用して宿主細胞に導入することができ、例えば形質転換、形質導入、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションを利用できる。発現ベクターを含む細胞を個々に分析し、ＶＲ４タンパク質を産生するか否かを判定する。ＶＲ４を発現する細胞の識別は抗ＶＲ４抗体との免疫反応性や、宿主細胞内のＶＲ４関連活性の存在等の種々の手段により実施することができる。
【００４５】
ＶＲ４ＤＮＡの発現はｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産した合成ｍＲＮＡを使用して実施することもできる。合成ｍＲＮＡは例えばアフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロインジェクションにより小麦胚芽抽出物や網赤血球抽出物等の各種無細胞系や細胞系で効率的に翻訳することができる。
【００４６】
最適レベルの受容体活性及び／又はタンパク質産生が得られるＶＲ４ｃＤＮＡ配列はＶＲ４ｃＤＮＡの全長オープンリーディングフレームや、受容体タンパク質の選択されたドメイン又は再配置されたドメインのみをコードするｃＤＮＡの部分を含む構築物等の種々のＶＲ４ｃＤＮＡ分子を構築することにより識別することができる。このような全構築物はＶＲ４ｃＤＮＡの５’及び／又は３’非翻訳領域を全く含まないか、その全部又は一部を含むように設計することができる。ＶＲ４活性とタンパク質発現レベルはこれらの構築物を単独又は組合せて宿主細胞に導入した後に決定することができる。トランジェントアッセイで最適発現を生じるＶＲ４ｃＤＮＡカセットの識別後に、このＶＲ４ｃＤＮＡ構築物を哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、大腸菌、真菌細胞及び酵母細胞等の種々の発現ベクター（組換えウイルスを含む）に導入することができる。
【００４７】
トランスフェクトした細胞のＶＲ４受容体活性及び／又はＶＲ４タンパク質発現レベルは公知方法によりアッセイすることができる。ＶＲ４受容体活性の評価は一般に標識リガンド（特に放射性標識リガンド）を細胞に導入し、ＶＲ４を発現する細胞に結合するリガンドの量を測定する。受容体活性の結合アッセイはＦｒｅｙら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２４４，２３９−２５０，１９９３に記載されている。
【００４８】
宿主細胞におけるＶＲ４タンパク質レベルはプロテオミクス、免疫親和性及びリガンド親和性技術等の種々の技術により定量することができる。ＶＲ４特異的アフィニティービーズ又はＶＲ４特異的抗体を使用して３５Ｓ−メチオニンで標識するか又は未標識のＶＲ４タンパク質を単離することができる。標識タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析することができ、未標識タンパク質はウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡアッセイとＶＲ４特異的抗体を利用するタンパク質アレーにより分析することができる。
【００４９】
宿主細胞でＶＲ４の発現後に、ＶＲ４特異的リガンドに結合することが可能な活性形態でＶＲ４タンパク質を回収することができる。組換えＶＲ４は界面活性剤可溶化、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー等の標準タンパク質精製技術により細胞又は亜細胞フラクションから単離精製することができる。
【００５０】
更に、組換えＶＲ４は全長初期ＶＲ４又はＶＲ４のポリペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体から作製した免疫アフィニティーカラムにより他の細胞タンパク質から分離することができる。
【００５１】
ＶＲ４をコードするＤＮＡで形質転換した細胞はその細胞外、膜貫通又は細胞内ドメインの発現と細胞培養液からのこのようなペプチドの回収に適した条件下で培養することができる。組換え細胞により産生されたＶＲ４（又はその任意ドメイン）は使用する特定遺伝子構築物に応じて分泌してもよいし、細胞内に加えてもよい。一般に、可溶性形態で組換えタンパク質を調製するとより好都合である。精製工程は生産方法と生産される特定タンパク質により異なる。多くの場合には、オリゴペプチドはキメラヌクレオチド配列から生産することができる。これはタンパク質精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列にｖｒ４ヌクレオチド配列又はその所望部分をライゲートすることにより実施される（Ｋｒｏｌｌ  ＤＪら（１９９３）  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２：  ４４１−５３）。
【００５２】
組換え生産に加え、ＶＲ４のフラグメントは固相技術を使用する直接ペプチド合成により生産することができる（例えばＳｔｅｗａｒｔら（１９６９）  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ，Ｓａｎ  ＦｒａｎｃｉｓｃｏＣＡ  ；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ（１９６３）  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ８５  ：２１４９−２１５４）。自動合成は例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用することにより実施できる。更に、直接合成中にＶＲ４の特定を突然変異させ、化学的方法を使用してペプチドの他の部分と結合してもよい。
【００５３】
ＶＲ４に特異的な抗体はポリペプチド又は抗原フラグメントを適当な動物に接種することにより生産することができる。ポリペプチドのエピトープに対して生産され、天然又は組換えタンパク質の少なくとも一部に結合する場合に抗体はＶＲ４に特異的である。ＶＲ４の抗体誘導のために生体活性は必要ないが、タンパク質は抗原性でなければならない。特異的抗体を誘導するために使用するペプチドは少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも１０アミノ酸から構成されるＶＲ４配列の一部を含むことができる。ＶＲ４の抗原部分をキーホールリンペットヘモシアニン等の別のタンパク質と融合し、キメラ分子を抗体生産に使用してもよい。
【００５４】
抗体生産は動物注射による免疫応答の刺激のみならず、合成抗体の生産、特異的結合分子の組換え免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（例えばＯｒｌａｎｄｉ  Ｒら（１９８９）  ＰＮＡＳ  ８６：  ３８３３−３８３７，又はＨｕｓｅ  ＷＤら（１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：  １２７５−１２８１）又はリンパ球集団のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激等の類似方法も含む。現行技術（Ｗｉｎｔｅｒ  ＧとＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：  ２９３−２９９）により、抗体形成原理に基づいて多数の高度に特異的な結合試薬が得られる。ＶＲ４に特異的に結合する分子を生産するようにこれらの技術を応用してもよい。
【００５５】
ＶＲ４に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体を生産するには種々のアプローチを使用することができる。１つのアプローチでは、逆相ＨＰＬＣ分離からの変性タンパク質が７５ｍｇまでの量で得られる。この変性タンパク質を使用して標準プロトコールによりマウス又はウサギを免疫するが、マウスを免疫するには約１００μｇで十分であり、ウサギを免疫するには１ｍｇまでを使用する。マウスハイブリドーマを同定するには、変性タンパク質を放射性ヨウ化して使用し、抗体を産生する潜在的マウスＢ細胞ハイブリドーマをスクリーニングする。この方法は少量のタンパク質しか必要とせず、例えば数千個のクローンを標識及びスクリーニングするのに２０ｍｇで十分である。
【００５６】
第２のアプローチでは、ｃＤＮＡの翻訳から推定される適当なＶＲ４ドメインのアミノ酸配列を分析し、高抗原性領域を決定する。適当な親水性領域を含むオリゴペプチドを合成し、抗体を誘導するのに適した免疫プロトコールで使用する。適当なエピトープを選択するための分析はＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら（前出）に記載されている。免疫に最適なアミノ酸配列は一般にＣ末端と、Ｎ末端と、タンパク質がその天然コンホメーションにあるときに外部環境に暴露され易いポリペプチドの介在親水性領域に位置する。
【００５７】
一般には、約１５残基長のペプチドを選択し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４３１Ａを使用してｆｍｏｃ化学により合成し、Ｍ−マレイドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら，前出）との反応によりキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）又は他の適当な抗原と結合させる。必要に応じてペプチドのＣ又はＮ末端にシステインを導入して抗原に結合させる。ウサギ等の動物を適当なフロイントアジュバントに加えたペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫することができる。ペプチドをプラスチックに結合し、１％ウシ血清アルブミンでブロックし、抗血清と反応させ、洗浄し、（放射性又は蛍光）標識アフィニティー精製特異的ヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させることにより、得られた抗結成の抗ペプチド活性を試験する。
【００５８】
標準技術を使用してハイブリドーマを作製し、スクリーニングする。所望特異性をもつモノクローナル抗体を産生する融合体を識別するように標識ＶＲ４でスクリーニングすることにより該当ハイブリドーマを検出する。典型的なプロトコールでは、プレートのウェル（ＦＡＳＴ；  Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）にインキュベーション中にアフィニティー精製特異的ウサギ抗マウス（又は適当な抗種Ｉｇ）抗体１０ｍｇ／ｍｌをコーティングする。コーティングしたウェルを１％ＢＳＡでブロックし、洗浄し、ハイブリドーマからの上清と共にインキュベートする。洗浄後にウェルを１ｍｇ／ｍｌの標識ＶＲ４と共にインキュベートする。特異的抗体を含む上清はバックグラウンドで検出されるよりも多量の標識ＶＲ４と結合する。次に、特異的抗体を産生するクローンを増殖させ、制限希釈クローニングを２サイクル実施する。クローニングしたハイブリドーマを標準法により組織培養で増殖させる。ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；及びＧｏｄｉｎｇ（１９８６）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙに記載されているような標準方法により一般に少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは１０９〜１０１０以上の親和性をもつモノクローナル抗体を作製する。
【００５９】
米国特許第６，１７２，１９７Ｂ１号とその引用文献はモノクローナル抗体のスクリーニングと回収のための組換えＤＮＡ技術に基づく代替手段を記載している。
【００６０】
特定ＶＲ４抗体はシグナル伝達の調査や、ＶＲ４又は活性シグナル伝達カスケードの下流産物の量又は分布の差異を特徴とする感染又は遺伝疾患の診断に有用である。
【００６１】
ＶＲ４の診断試験としては抗体とラベルを使用してヒト体液、膜、細胞、組織又はその抽出物中のＶＲ４を検出する方法が挙げられる。本発明のポリペプチドと抗体は改変を加えるか又は加えずに使用する。多くの場合には、検出可能なシグナルを提供する物質と共有又は非共有結合することによりポリペプチドと抗体を標識する。多様なラベルと結合技術が公知であり、科学文献と特許文献のいずれにも広く報告されている。利用可能なラベルとしては放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、磁性粒子等が挙げられる。このようなラベルの使用を教示した特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、３，８５０，７５２号、３，９３９，３５０号、３，９９６，３４５号、４，２７７，４３７号、４，２７５，１４９号及び４，３６６，２４１号が挙げられる。更に、米国特許第４，８１６，５６７号に示されているように組換え免疫グロブリンを生産することもできる。
【００６２】
タンパク質に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用して可溶性又は膜結合ＶＲ４を測定するための種々のプロトコールが当分野で公知である。例えば、酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。ＶＲ４上の２種の相互に干渉しないエピトープに反応性のモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナル免疫アッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを利用してもよい。これらのアッセイは特にＭａｄｄｏｘ，ＤＥら（１９８３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １５８：１２１１ｆ）に記載されている。
【００６３】
天然又は組換えＶＲ４はＶＲ４に特異的な抗体を使用して免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。一般に、抗ＶＲ４抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合することにより免疫アフィニティーカラムを構築する。
【００６４】
ポリクローナル免疫グロブリンは硫安沈殿又は固相化タンパク質Ａでの精製により免疫血清から調製される（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）。部分精製免疫グロブリンをＣｎＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合する。製造業者の指示に従って抗体を樹脂に結合し、樹脂をブロックし、誘導体樹脂を洗浄する。
【００６５】
可溶性ＶＲ４を含む調製物を免疫アフィニティーカラムに通し、ＶＲ４の優先的吸着を可能にする条件下（例えば界面活性剤の存在下に高イオン強度緩衝液）でカラムを洗浄する。次に、抗体／タンパク質結合を停止させる条件下（例えばｐＨ２〜３の緩衝液又は高濃度の尿素もしくはチオシアネートイオン等のカオトロープ）でカラムを溶離させ、ＶＲ４を採取する。
【００６６】
本発明のＶＲ４受容体タンパク質又はその結合フラグメントは受容体活性を調節する化合物の同定のためのアッセイ手順で使用するのに適している。本明細書に記載する受容体活性の調節は受容体の阻害又は活性化が挙げられ、更に受容体活性の正常調節を直接又は間接的に操作することが挙げられる。受容体活性を調節する化合物としてはアゴニスト、アンタゴニスト及び受容体活性の正常調節を直接又は間接的に操作する化合物が挙げられる。
【００６７】
このようなアッセイで使用されるＶＲ４受容体タンパク質又はそのフラグメントは組換え又は天然源から得ることができる。一般に、ＶＲ４受容体モジュレーターを同定するためのアッセイ手順は本発明のＶＲ４受容体タンパク質と推定ＶＲ４受容体モジュレーターを含む試験化合物又は試料を使用する。試験化合物又は試料は例えば精製受容体タンパク質（天然又は組換え）で直接試験してもよいし、受容体タンパク質を含む受容体産生細胞（天然又は組換え）の膜調製物等の亜細胞フラクション、又は受容体タンパク質を発現する全細胞（天然又は組換え）で試験してもよい。試験化合物又は試料は公知標識又は未標識受容体リガンドの存在下又は不在下に受容体タンパク質に添加することができる。試験化合物又は試料の調節活性は例えば試験化合物又は試料が受容体に結合、受容体活性を活性化、受容体活性を阻害、他の化合物と受容体の結合を増進もしくは阻害、受容体調節を調節、又は細胞内活性を調節する能力を分析することにより決定することができる。
【００６８】
このようなアッセイにより同定されるモジュレーターは疼痛、特に熱による疼痛、関節炎疼痛及び神経障害性疼痛、炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病又は虚血に関連するもの等の神経変性、内分泌障害、心臓血管疾患、膀胱又は腸機能障害、気分障害（例えば鬱病）、肥満症及び癌に関連する異常状態の抑制又は緩和に有用であると予想される。
【００６９】
従って、本発明はＶＲ４シグナル伝達に作用する薬剤又は他の任意物質のスクリーニング方法を提供する。このような方法の１例では、ＶＲ４受容体タンパク質又はそのフラグメントをまずＶＲ４受容体に対して公知親和性のリガンド、次いで試験化合物と接触させ、試験化合物が受容体との結合について公知リガンドと競合する能力を測定する。一般に、公知リガンドを（例えば放射性同位体又は蛍光部分で）標識し、その検出と定量を容易にする。
【００７０】
ＶＲ１及び／又は他の関連Ｔｒｐ受容体に対する親和性について同一試験化合物の平行スクリーニングを実施すると、ＶＲ４受容体に選択的親和性をもつ化合物を同定できるので有利である。平行スクリーニングを使用すると、ＶＲ４に対する低親和性とＶＲ１及び／又は他のＴｒｐ受容体に対する高親和性を兼備する化合物性を同定することもできる。
【００７１】
ＦＬＩＰＲ（蛍光測定イメージングプレートリーダー：ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）又はＶＩＰＲ（電圧イオンプローブリーダー：ｖｏｌｔａｇｅ  ｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｄｅｒ）等の装置でＣａ選択的色素（例えばＦｌｕｏ３，Ｆｌｕｏ４又はＦｕｒａ２）による蛍光イメージング等のＡｕｒｏｒａレポーターアッセイを使用すると、試験化合物の高スループットスクリーニングを達成することができる。
【００７２】
ＶＲ４ポリペプチドに対する結合親和性をもつ化合物の高スループットスクリーニングに応用可能な別の薬剤スクリーニング技術は国際特許公開Ｗ０８４／０３５６４（公開日１９８４年９月１３日）に詳細に記載されている。要約すると、多数の異なる小ペプチド試験化合物をプラスチックピンや他の何らかの表面等の固体支持体上に合成する。ペプチド試験化合物をＶＲ４ポリペプチドと反応させ、洗浄する。その後、結合したＶＲ４ポリペプチドを当分野で周知の方法により検出する。
【００７３】
上記薬剤スクリーニング技術で使用するプレートに精製ＶＲ４を直接コーティングしてもよい。更に、非中和抗体を使用してペプチドを捕獲し、固体支持体に固相化してもよい。
【００７４】
本発明はＶＲ４と結合することが可能な抗体がＶＲ４ポリペプチド又はそのフラグメントとの結合について試験化合物と特異的に競合する競合的薬剤スクリーニングアッセイの使用も想定する。こうして、抗体を使用して１個以上の抗原決定基をＶＲ４と共有するペプチドの存在を検出する。
【００７５】
合理的な薬剤設計の目的は、相互作用する目的生体活性ポリペプチドもしくは小分子、アゴニスト、アンタゴニスト又は阻害剤の構造類似体を生産することである。これらの例の任意のものを使用してより活性もしくは安定な形態のポリペプチドである薬剤又はポリペプチドのｖｉｖｏ機能を亢進もしくは妨害する薬剤を創製することである（例えばＨｏｄｇｓｏｎ  Ｊ（１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：  １９−２１）。
【００７６】
１つのアプローチでは、ｘ線結晶分析、コンピューターモデル化、又は最も一般的にはこれらの２つのアプローチの組合せにより目的タンパク質又はタンパク質−阻害剤複合体の三次元構造を決定する。分子の構造を解明し、活性部位を決定するためにはポリペプチドの形状と電荷の両者を検証しなければならない。頻度は低いが、相同タンパク質の構造に基づくモデル化によりポリペプチドの構造に関する有用な情報が得られる。いずれの場合にも該当構造情報を使用して有効な阻害剤を設計する。合理的薬剤設計の有用な例としては参考資料として本明細書に組込むＢｒａｘｔｏｎ  ＳとＷｅｌｌｓ  ＪＡ（１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：  ７７９６−７８０１）により示されているように活性もしくは安定性が改善されている分子又はＡｔｈａｕｄａ  ＳＢら（１９９３  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１３：  ７４２−４６）により示されているように天然ペプチドの阻害剤、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する分子が挙げられる。
【００７７】
上記のように機能アッセイにより選択したターゲット特異的抗体を単離した後にその結晶構造を解明することが可能である。このアプローチにより原則として後続薬剤設計の基礎となる医薬コアが得られる。薬理的に活性な機能的抗体に対する高イディオタイプ抗体（抗ｉｄ）を作製することによりタンパク質結晶分析を全く省略することも可能である。鏡像の鏡像として、抗ｉｄの結合部位は元の受容体の類似体であると予想される。その後、抗ｉｄを使用して化学的又は生物学的に生産したペプチドバンクからペプチドを同定及び単離する。単離したペプチドをその後、医薬コアとして利用する。
【００７８】
本発明によると、Ｘ線結晶分析等の分析試験を実施するために十分な量のポリペプチドが得られるようになる。更に、ＶＲ４アミノ酸配列が分かると、ｘ線結晶分析の代用又はそれに加えてコンピューターモデル化技術の利用者への手引きとなる。
【００７９】
本発明の精製ＶＲ４は相互作用するＧタンパク質又は他のシグナル伝達経路タンパク質の同定、特性決定及び精製の研究ツールである。当分野で公知の種々の方法により選択したＶＲ４ドメインに放射性ラベルを組込み、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用して相互作用分子を捕獲する。１好適方法ではＶＲ４の第１級アミノ基を１２５Ｉ  Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬で標識する（Ｂｏｌｔｏｎ，ＡＥとＨｕｎｔｅｒ，ＷＭ（１９７３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １３３：  ５２９）。この試薬は生体活性低下を伴わずに種々の分子を標識するために使用されている（Ｈｅｂｅｒｔ  ＣＡら（１９９１）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：  １８９８９；  ＭｃＣｏｌｌ  Ｓら（１９９３）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５０  ：  ４５５０−４５５５）。
【００８０】
標識ＶＲ４は相互作用する分子の精製用試薬として有用である。アフィニティー精製の１態様では、膜に結合したＶＲ４をクロマトグラフィーカラムに共有結合する。滑膜細胞又は推定ターゲット細胞に由来する無細胞抽出物をカラムに通すと、適当な親和性をもつ分子はＶＲ４と結合する。ＶＲ４複合体をカラムから回収し、ＶＲ４結合リガンドを解離させ、例えばＮ末端タンパク質シーケンシング、プロテオミクス／質量分析又はＨＰＬＣ／質量分析により分析する。こうして同定されたアミノ酸配列は適当なｃＤＮＡライブラリーから該当遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用することができる。
【００８１】
別法では、ＶＲ４に対する抗体、特にモノクローナル抗体を誘導する。モノクローナル抗体をスクリーニングし、標識ＶＲ４の結合を阻害するものを同定する。その後、これらのモノクローナル抗体を治療に使用する。
【００８２】
ＶＲ４のアゴニスト、アンタゴニスト又は抗体を含む生体活性組成物は数種の方法の任意のものにより決定される適当な治療用量でヒト又は動物対象に投与することができ、例えば哺乳動物種で最大許容用量を決定したり、正常ヒト対象で安全用量を決定する臨床試験が挙げられる。更に、半減期等の安定性や薬理特性を増進する種々の確立化合物又は組成物と生体活性物質を併用してもよい。
【００８３】
ＶＲ４の抗体、阻害剤又はアンタゴニスト（又はシグナル伝達を制限するための他の治療薬；ＬＳＴ）は治療薬として投与する場合に種々の効果を提供する。ＬＳＴは非毒性で不活性で医薬的に許容可能なキャリヤー媒体中で調製する。水性キャリヤー媒体は好ましくはｐＨ約５〜８、より好ましくは６〜８であるが、ｐＨは処方する抗体、阻害剤又はアンタゴニストの特性と治療する疾患により異なる。ＬＳＴの特性としては分子の可溶性、半減期及び抗原性／免疫原性が挙げられる。以上及び他の特性は有効なキャリヤーを定義するのに役立つ。天然ヒトタンパク質がＬＳＴとして好ましいが、薬剤スクリーニングにより得られる有機又は合成分子も状況によっては有効である。
【００８４】
ＬＳＴは公知投与経路により送達され、限定しないが、局所クリーム及びゲル；経粘膜スプレー及びエアゾール；経皮パッチ及びバンデージ；注射用静脈内及び洗浄製剤；及び経口投与液剤及び特に胃酸と酵素に耐性に処方されたピルが挙げられる。特定処方、厳密な用量及び投与経路は主治医により決定され、各特異的状況によって異なる。
【００８５】
このような決定は治療する疾患、投与するＬＳＴ、及び特定ＬＳＴの薬物動態プロフィル等の多数の変数を考慮することにより行われる。考慮すべき付加因子としては疾患状態の重篤度、患者の年齢、体重、性別及び食事、ＬＳＴ投与時間及び頻度、他の薬剤との可能な併用、反応感度、及び治療耐性／応答が挙げられる。持続型ＬＳＴ製剤は特定ＬＳＴの半減期とクリアランス率に応じて３〜４日おき、毎週、又は２週間に一度投与すればよい。
【００８６】
通常用量は投与経路に応じて０．１〜１００，０００μｇから合計用量約１ｇまでとする。特定用量及び送達方法に関する手引きは文献に記載されており、米国特許第４，６５７，７６０号、５，２０６，３４４号又は５，２２５，２１２号を参照されたい。当業者は各種ＬＳに合わせて異なる処方を利用する。神経細胞等の細胞に投与するには血管内皮細胞等の他の細胞とは異なる方法で送達する必要がある。
【００８７】
異常シグナル伝達、外傷又はＶＲ４活性を誘発する疾患はＬＳＴで治療可能であると予想される。これらの状態又は疾患は上記試験により特異的に診断され、このような試験はウイルス、細菌又は真菌感染の疑いのある症例；アレルギー反応；外傷に関連する機械的損傷；遺伝病；リンパ腫もしくは癌；又はリンパ系組織の遺伝子を活性化する他の疾患で実施すべきである。
【００８８】
本発明の付加態様は疼痛、特に熱による疼痛、関節炎疼痛及び神経障害性疼痛、炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病又は虚血に関連するもの等の神経変性、内分泌障害、心臓血管疾患、膀胱又は腸機能障害、気分障害（例えば鬱病）、肥満症及び癌に関連する異常状態を治療するための生体活性剤としてのＶＲ４特異的抗体、阻害剤又はアンタゴニストの使用である。
【００８９】
以下、実施例により本発明を例証する。
【実施例１】
【００９０】
ヒトＶＲ４受容体をコードする遺伝子の同定とクローニング
Ｍｅｒｃｋ．ＨＴＧ．Ｈｕｍａｎデータベースに含まれるＧｅｎｂａｎｋのヒトＨＴＧ（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ）フェーズ０〜２配列でＢＬＡＳＴ２アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９７）  ２５，３３８９−４０２）とＶＲ１受容体のヒトタンパク質配列を使用してホモロジー検索を実施した。多数の部分ゲノムコンティグは他の公知バニロイド又はＴｒｐ受容体と同一ではないが相同の配列を含んでいた。少なくとも以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号（２０００年１０月２０日現在）：ａｃ０２７０４０、ａｃ０２５１２５、ａｃ０２７７９６、ａｃ０４０８９１で相同領域が同定された。これらのゲノム配列はヒトＶＲ１遺伝子の染色体位置に隣接するヒト染色体１７の染色体位置１７ｐｌ３．２に対応する。ヒトＶＲ１タンパク質配列との相同領域に相当するＶＲ４の推定エキソンを組合せ、開始メチオニン及びアミノ末端配列と２個の内部エキソンとカルボキシ末端配列を欠失する６２１アミノ酸の予測タンパク質配列が得られるようにＶＲ１に配置して連結した。
【００９１】
Ｇｅｎｅｈｕｎｔアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）により予測される多重配列に基づくプライマーを使用して５’及び３’ＲＡＣＥとアンカードＰＣＲにより５’及び３’末端の配列を延長した。Ｇｅｎｅｈｕｎｔによるエキソン予測はＮＣＢＩゲノムコンティグＮＴ＿０１０８１６（ＧＩ：１３６５３１４７）を利用した。全ＰＣＲ増幅はヒト脳もしくは脊髄（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来するか、又はヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＤＺ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２１４９）から調製したＲＮＡに由来する第１鎖ｃＤＮＡを使用した。初期ホモロジー検索では予測されなかった欠失内部エキソンの配列も同一ＲＮＡ起源からＲＴ−ＰＣＲにより得られた。ＰＣＲ反応で使用したオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列を下表に示す。
【００９２】
【表１】
2005522992.tif 000002
【００９３】
所定の５’非翻訳配列と推定コーディング領域と所定の３’非翻訳配列から構成されるＤＮＡを全脳及び神経芽細胞腫第１鎖ｃＤＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより４セグメントで増幅し、制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｐＥＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで適切に切断したクローニングベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に４フラグメントとして順次連結した。一旦連結し、ＤＮＡシーケンシングにより確認したら、構築物をｐＩＲＥＳ−ｅＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にＡｐａＩ−ＳａｃＩフラグメントとして再クローニングした。オリゴヌクレオチドプライマーの配列を下表に示す。
【００９４】
【表２】
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【００９５】
ヒトＶＲ４受容体タンパク質は７９０アミノ酸長であると予測される。
【００９６】
好適オープンリーディングフレームと推定アミノ酸配列を夫々配列番号１（図１）と配列番号２（図２）に示す。しかし、好適開始ＡＴＧコドンの５’ＤＮＡ配列を分析すると、付加インフレームＡＴＧコドンが認められる。この潜在的ＡＴＧのヌクレオチド頻度を分析（コザック配列分析）すると、開始コドンではないように思われる。しかし、このコドンを使用すると、配列番号２に示すＶＲ４配列のアミノ末端に付加配列ＭＧＰＬＮＳＬＫＬＰＬＳＰＲＰＥＨＬＰＣＧＣＩＰＡ（配列番号２３）が付加される。更に、配列番号１に示す配列は天然でも人工的に導入してもよい変異、多形及び突然変異を含むことができ、限定しないが、例えば１５４位のＧ→Ａ置換、３５１位のＡ→Ｇ置換、６３９位のＡ→Ｃ置換、又は２０９９位のＴ→Ｃ置換の１種以上が挙げられる。これらの置換の結果、配列番号２に示すＶＲ４受容体タンパク質のアミノ酸配列は塩基１５４のＧ→Ａ置換（バリン［Ｍ］→イソロイシン［Ｉ］のアミノ酸置換）や塩基２０９９のＴ→Ｃ置換（ロイシン［Ｌ］→プロリン［Ｐ］のアミノ酸置換）等に変異してもよいし、変異はサイレントでもよい（即ちアミノ酸配列は変わらない）。
【００９７】
オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＧＧＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡＧ（配列番号２４）及び５’−ＡＡＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＧ（配列番号２５）を使用して成人脳（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＲＴ−ＰＣＲにより推定遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ発現を確認した。３９１ｂｐの推定寸法のバンドをクローニングし、ＤＮＡシーケンシングとサザンブロッティング（図３（ａ））により確認した。成人組織アレー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でＲＴ−ＰＣＲによりメッセンジャーＲＮＡの分布も試験した（図３（ｂ））。更に、下表に示すオリゴヌクレオチドプローブを使用してＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により発現パターンを評価した（図３（ｃ））。
【００９８】
その結果、ＶＲ４をコードするｍＲＮＡはヒト後根神経節及び中枢神経系（脊髄、脳梁及び視床等）で発現されることが判明した。
【００９９】
【表３】
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【０１００】
ＶＲ４配列を分析すると、この配列はＴｒｐ受容体のｏＴｒｐファミリーのメンバーであり、バニロイド受容体ＶＲ１と４３％配列一致し、ヒトｏＴｒｐｃ４受容体と４２％配列一致することが示唆される。ちなみにＶＲ１とｏＴｒｐｃ４の配列一致度は４６％である。多重配列アラインメントを図４に示し（図中、ＶＲ２はＶＲＬ−１受容体を表し、ＶＲ３はｏＴｒｐＣ４受容体を表す）、拡張Ｔｒｐファミリーの配列類似性を表す系統樹を図５に示す。系統樹はペアワイズギャップ生成＝１３、ペアワイズギャップ延長＝０．２、ペアワイズマトリックス＝一致、多重ギャップ生成＝１５、多重ギャップ延長＝０．０２、多重マトリックス＝一致の設定で実施したＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アラインメントを使用して作成した。
【実施例２】
【０１０１】
マウスＶＲ４
ヒトＶＲ４の各エキソンに対応するタンパク質配列をクエリー配列として使用してマウスゲノム配列データベース（Ｍｅｒｃｋ．ＧＥＮＯＭＩＣ．ＭＳＣ．００，Ｍｅｒｃｋ．ＧＥＮＯＭＩＣ．ＭＳＣ．０１，Ｍｅｒｃｋ．ＧＥＮＯＭＩＣ．ＭＳＣ．０２，Ｍｅｒｃｋ．ＧＥＮＯＭＩＣ．ＭＳＣ．０３，Ｍｅｒｃｋ．ＧＥＮＯＭＩＣ．ＭＳＣ．０４）のホモロジー検索（ｂｌａｓｔ２：ｔｂｌａｓｔｎ）によりマウスＶＲ４遺伝子のＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を構築した。マウスＶＲ４のＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を夫々配列番号２９（図６）及び配列番号３０（図７）に示す。
【０１０２】
ヒトＶＲ４（上段）とマウスＶＲ４（下段）の遺伝子のＤＮＡ配列アラインメントを図８に示す。
【０１０３】
ヒトＶＲ４（上段）とマウスＶＲ４（下段）のアミノ酸配列アラインメントを図９に示す。
【実施例３】
【０１０４】
抗体
ウサギでポリクローナル抗体を生産するための抗原ペプチドとしてヒトＶＲ４に由来する配列ＲＴＤＦＮＫＩＱＤＳＳＲＮＮＳＫＴを選択した。配列ＲＴＤＦＮＫＩＱＤＳＳＲＮＮＳＫＴＣ（配列番号３１）をもつ合成ペプチドを合成し、標準技術を使用して免疫するためにＫＬＨと結合した。
【実施例４】
【０１０５】
機能性
電気生理学的記録によりＶＲ４機能の解明を行った。ｐＩＲＥＳ−ｅＧＦＰベクターに組込んだヒトＶＲ４受容体を一過的にトランスフェクトした（ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ）細胞をガラスカバースリップで単層培養し、パースペクスチャンバーに入れて倒立位相差顕微鏡の試料台に載せ、改変Ａ溶液（下記参照）で連続潅流した。
【０１０６】
慣用１２０ＴＦ−１０電極ガラスを使用して火炎研磨パッチピペットを引いた。ピペット先端直径はほぼ１．０〜２．０μｍとし、抵抗は約２〜３ＭΩとした。使用した細胞内ピペット溶液については以下に詳述する。
【０１０７】
２０ｍ秒、１ｍＶの電圧制御を周波数２Ｈｚでピペットに適用し、ｐＣｌａｍｐハードウェア及びソフトウェア（８．０）とオシロスコープを使用して電流振幅を連続モニターした。（浴に浸す前に）ピペットに正の内圧を加えた後に、Ｂｕｒｌｅｉｇｈパッチクランプドライバーを使用して被験細胞上を前進させた。ピペット先端が細胞膜に接触したらピペットから正圧を解放し、弱い吸引を加えた。この段階で電圧パルスは先端抵抗の増加を示す顕著なピペット電流を誘導しなかった。
【０１０８】
次に、膜パッチを−６０ｍＶに電圧クランプするために連続電圧制御をピペットに適用し、電圧パルスを１０ｍＶまで増加した。こうして、一般に１ＧΩを超えるシール抵抗が形成された。次に、吸引を更に加えると、膜時間定数の増加による容量性トランジェントの劇的な増加と見かけのピペット抵抗の低下から明らかなように、ピペット先端内の膜パッチが破裂した。容量性トランジェントと直列抵抗が補償された。
【０１０９】
異なる薬剤ないし異なる組成物を含む溶液を被験細胞に５〜６０秒間浸した後、大内径（５００μｍ）トリプルバレルピペットアセンブリを使用して迅速潅流により３０〜１２０秒間洗浄した。上部バレルには洗浄溶液を入れ、他の２個のバレルには異なる試験溶液を入れた。記録細胞を薬剤溶液に完全に浸すように潅流ピペットの位置を迅速に転換することにより溶液変化に対する応答を得た。これはＢｉｏｌｏｇｉｃ迅速溶液チェンジャーでバレルを所望位置に回転することにより行った。細胞に応じて洗浄バレルを配置し直すことにより迅速な洗浄が得られた。
【０１１０】
試験溶液の浸漬前後に電圧段階（５０ｍ秒で−６０ｍＶから−８０ｍＶまでとした後に電圧勾配として５００ｍ秒以内に＋８０ｍＶまで上げて５０ｍ秒段階（＋８０ｍＶ）後に−６０ｍＶまで戻すか、又は５００ｍ秒で−６０ｍＶから＋８０ｍＶまで上げた後に−６０ｍＶまで戻す）を３秒間実施した。このプロトコールによりアッセイの感度を上げた。
【０１１１】
ＶＲ４をトランスフェクトした細胞は、室温から４５℃までの勾配プロトコールを使用して加温した加熱改変Ａ溶液に浸すことにより機能活性化が得られた。ｐＩＲＥＳ−ｅＧＦＰベクターに組込んだヒトＶＲ４を一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（Ａ１）と空のｐＩＲＥＳ−ｅＧＦＰベクターを一過的にトランスフェクトした細胞（Ｂ）からの記録の１例を図１０に示す。加熱改変Ａ溶液（４５℃）の浸漬をトレース上の横線により示す。−６０から＋８０ｍＶまでの電圧勾配により誘導される電流もトレース記録値の上に示す（縦線）。破線はゼロ電流を示す。挿入図（Ａ２）はＡ１に示す熱誘導電流の電流−電圧関係を示し、多少の外側補正を加えた。
【０１１２】
ヒトＶＲ４をトランスフェクトした細胞とモック（空ベクター）トランスフェクト細胞の熱誘導及び漏れ電流の要約を下表に示す。
【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
【表５】
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【０１１５】
【表６】
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室温から５０℃までの勾配プロトコールを使用して加熱した加熱改変Ａ溶液を繰返して浸した効果を図１１に示す。本実施例では、ｐＩＲＥＳ−ｅＧＦＰベクターに組込んだヒトＶＲ４を一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞単層を熱プロフィルトレースに示すように周囲温度（２０℃）から５０℃まで加熱して周囲温度まで戻す４種４群の熱勾配で処理した。これらの１６種の加熱の記録を示す。電流振幅は最初の加熱の１６０ｐＡから１６番目の加熱の１５８０ｐＡまで増加した。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１（１）】ヒトＶＲ４をコードする遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１（２）】ヒトＶＲ４をコードする遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】ヒトＶＲ４の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３（ａ）】図３（ａ）は成人脳から単離したＲＮＡに由来するｖｒ４のフラグメントのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図３（ｂ）及び３（ｃ）は夫々成人組織アレー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）におけるヒトＶＲ４をコードするｍＲＮＡの分布をＲＴ−ＰＣＲにより示す。
【図３（ｂ）】図３（ａ）は成人脳から単離したＲＮＡに由来するｖｒ４のフラグメントのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図３（ｂ）及び３（ｃ）は夫々成人組織アレー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）におけるヒトＶＲ４をコードするｍＲＮＡの分布をＲＴ−ＰＣＲにより示す。
【図３（ｃ）】図３（ａ）は成人脳から単離したＲＮＡに由来するｖｒ４のフラグメントのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図３（ｂ）及び３（ｃ）は夫々成人組織アレー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）におけるヒトＶＲ４をコードするｍＲＮＡの分布をＲＴ−ＰＣＲにより示す。
【図４】ヒトＶＲ１、ＶＲＬ−１（ＶＲ２）、ｏＴｒｐＣ４（ＶＲ３）及びＶＲ４受容体をコードする遺伝子の多重配列アラインメントを示す。
【図５】拡張Ｔｒｐファミリーにおける配列類似性を示す系統樹を示す。
【図６（１）】マウスＶＲ４をコードするＤＮＡ配列（配列番号２９）を示す。
【図６（２）】マウスＶＲ４をコードするＤＮＡ配列（配列番号２９）を示す。
【図７】マウスＶＲ４の推定アミノ酸配列（配列番号３０）を示す。
【図８（１）】ヒト（上段）及びマウス（下段）ＶＲ４をコードする遺伝子の配列アラインメントを示す。
【図８（２）】ヒト（上段）及びマウス（下段）ＶＲ４をコードする遺伝子の配列アラインメントを示す。
【図８（３）】ヒト（上段）及びマウス（下段）ＶＲ４をコードする遺伝子の配列アラインメントを示す。
【図８（４）】ヒト（上段）及びマウス（下段）ＶＲ４をコードする遺伝子の配列アラインメントを示す。
【図９（１）】ヒト（上段）及びマウス（下段）ＶＲ４のアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【図９（２）】ヒト（上段）及びマウス（下段）ＶＲ４のアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【図１０】ｐＩＲＥＳ−ｅＧＦＰベクターに組込んだヒトＶＲ４を一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（Ａｌ，Ａ２）と、空のｐＩＲＥＳ−ｅＧＦＰベクターを一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（Ｂ）の電気生理学的試験の結果を示す。
【図１１】ｐＩＲＥＳ−ｅＧＦＰベクター中のヒトＶＲ４により一過的にトランスフェクトした単一細胞中における、反復加熱による熱誘導電流の増幅作用を示す。
【図１（１）】
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【図１（２）】
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【図２】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図３（ｃ）】
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【図４】
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【図５】
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【図６（１）】
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【図６（２）】
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【図７】
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【図８（１）】
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【図８（２）】
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【図８（３）】
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【図８（４）】
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【図９（１）】
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【図９（２）】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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