(57)【要約】死後の動物から遺伝物質を誘導し、核転移方法において使用することにより、クローン化された胚および死後の動物と同一の遺伝子的性質を有する生存クローン動物を生産する。方法は特に、畜産動物の維持と育種、望ましい遺伝子形質を有する動物の生産、および、それらの遺伝子形質の選択的育種事業への組み込みに適用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
ａ）死後の非ヒト哺乳類組織から得られるドナー細胞から得たＤＮＡを卵母細胞に転移させて核転移単位を形成すること；および、
ｂ）該核転移単位を培養して胚を樹立すること；
を包む、クローン化された、または、遺伝的に修飾された非ヒト哺乳類の胚を生産する方法。
【請求項２】
下記工程：
ａ）２以上の異なる動物から得た２以上の死後組織試料を供給すること；
ｂ）予め選択された身体的、遺伝的および／または表現型的基準について試料をスクリーニングすること；
ｃ）１以上の動物から得られる１以上のドナー細胞から得たＤＮＡを卵母細胞に転移させて核転移単位を形成すること；および、
ｄ）該核転移単位を培養して胚を樹立すること；
を包む、クローン化された、または、遺伝的に修飾された非ヒト哺乳類の胚を生産する方法。
【請求項３】
一群の動物の遺伝的、表現型的または身体的特性を改善する方法であって、
ａ）死後の非ヒト哺乳類組織から得られる第１のドナー細胞から得たＤＮＡを第１の卵母細胞に転移させて第１の核転移単位を形成すること；
ｂ）該第１の核転移単位を培養して第１の胚を樹立すること；
ｃ）該第１の胚をレシピエント雌に転移させて完全な胎仔へ発育し、出産される第１の胎仔を生産して第１の出生動物を発生させること；
ｄ）該第１の出生動物を前記一群の１以上の動物と交配させること；
を包含する前記方法。
【請求項４】
該胚をレシピエント雌に転移させて完全な胎仔へ発育し、出産される胎仔を生産して出生動物を発生させることを更に含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
該動物がウシである、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
該動物がブタである、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項７】
該非ヒト胚が出生動物まで発育することができる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
該組織を約１０℃以下に冷却しておく、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項９】
該組織を約０℃以下に冷却しておく、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１０】
該組織が死後少なくとも約２時間である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１１】
該組織が死後少なくとも約３０分である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも約１０の試料を予め選択された基準についてスクリーニングする、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも約５０の試料を予め選択された基準についてスクリーニングする、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
該組織試料が動物の群れ５つ以上から得られるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
該ドナー細胞が組織試料の由来する組織とは異なる組織から得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
該組織が性質についてスクリーニングされる、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
該組織が脂肪および筋肉の組織から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
該組織がプライム以上と評点されている、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
該組織が遺伝的特性についてスクリーニングされる、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
下記工程：
ａ）死後の非ヒト哺乳類組織から得られる第２のドナー細胞から得たＤＮＡを第２の卵母細胞に転移させて第２の核転移単位を形成すること；
ｂ）該第２の核転移単位を培養して第２の胚を樹立すること；
ｃ）該第２の胚をレシピエント雌に転移させて完全な胎仔へ発育し、出産される第２の胎仔を生産して第２の出生動物を発生させること；
ｄ）該第２の出生動物を前記一群の１以上の動物と交配させること；
を更に含む請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
第１のドナー細胞および第２のドナー細胞が同じ組織から得られるものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１のドナー細胞および第２のドナー細胞が異なる組織から得られるものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
第１のドナー細胞および第２のドナー細胞が異なる性から得られるものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
第１のドナー細胞および第２のドナー細胞が異なる性から得られるものであり、第１の出生動物および第２の出生動物を前記一群の動物１つ以上と、または、相互に交配させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）第１のドナー細胞および第２のドナー細胞が異なる性に由来し、
ｂ）第１のドナー細胞および第２のドナー細胞が実質的に同一の遺伝子型、表現型または身体特性を共有し、
ｃ）第１の出生動物と第２の出生動物とを交配させる、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
下記工程：
ａ）雌性ウシ複数匹および１匹の雄性繁殖雄を含む群れを供給すること、
ｂ）雌性ウシと雄性繁殖雄を交配させて雄性および雌性の仔を複数生産すること、
ｃ）上記複数の雄性および雌性の仔から選択された１匹の起源となる雄性または雌性仔をクローン化してクローンを生産すること、
ｄ）繁殖雄のウシまたは前記雌性ウシの１匹を該クローンで置き換えること、および、
ｅ）工程ｂ）を１回以上反復して改良された雄性および雌性の仔複数匹を生産すること、
を含むウシ育種事業におけるウシの生産方法。
【請求項２８】
ａ）前記の起源となる雄性仔がクローン化され、雄性クローンが繁殖雄の雄ウシと置き換わり、
ｂ）前記の起源となる雄性仔を出産した雌ウシを群れから除去する、
請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
更に下記工程：
ｆ）起源となる雄性仔の２回目のクローン化を行うことにより第２の雄性クローンを生産すること；
ｇ）第２の雌性ウシ複数匹および第２の雄性繁殖ウシ１匹を含む第２の群れを準備すること；
ｈ）第２の雄性繁殖ウシを該第２の雄性クローンと置き換えること；
を含む、起源となる雄性仔がクローン化され、雄性クローンが繁殖用雄ウシを置き換える、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
更に下記工程：
ｆ）該改良された雄性および雌性の仔から選択された改良された起源となる雄性仔をクローン化して改良された雄性クローンを生産すること、
ｇ）雄性繁殖ウシを該改良された雄性クローンと置き換えること、および、
ｈ）工程ｂ）を１回以上反復して２倍改良された雄性および雌性の仔複数匹を生産すること、
を含む、前記の起源となる雄性仔がクローン化され、雄性クローンが繁殖用雄ウシと置き換わる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ａ）前記の起源となる雌性仔がクローン化され、雌ウシ１匹を置き換えるために使用され、
ｂ）該雄性繁殖ウシを置き換える、
請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
更に下記工程：
ａ）起源となる雌性仔の２回目のクローン化を行うことにより第２の雌性クローンを生産すること；および、
ｂ）該群れ中の第２の雌性ウシを該第２の雌性クローンと置き換えること；
を含む、前記の起源となる雌性仔がクローン化され、雌ウシ１匹を置き換えるために使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
更に下記工程：
ｆ）第２の起源となる雌性仔のクローン化を行うことにより第２の雌性クローンを生産すること；および、
ｇ）該群れ中の第２の雌性ウシを該第２の雌性クローンと置き換えること；
を含む、前記の起源となる雌性仔がクローン化され、雌ウシ１匹を置き換えるために使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
更に下記工程：
ｆ）該改良された雄性および雌性の仔から改良された起源となる雌性仔をクローン化して改良された雌性クローンを生産すること、
ｇ）該群れ中の１匹の雌性ウシを該改良された雌性クローンと置き換えること、および、
ｈ）工程ｂ）を１回以上反復して２倍改良された雄性および雌性の仔複数匹を生産すること、
を含む、前記の起源となる雌性仔がクローン化され、雌ウシ１匹を置き換えるために使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
更に下記工程：
ｆ）起源となる雌性仔の２回目のクローン化を行うことにより第２の雌性クローンを生産すること；
ｇ）第２の雌性ウシ複数匹および第２の雄性繁殖ウシ１匹を含む第２の群れを供給すること；
ｈ）該第２の群れ中の雌性ウシを該第２の雌性クローンと置き換えること；
を含む、前記の起源となる雌性仔がクローン化され、その雌ウシ１匹を置き換えるために使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
更に下記工程：
ｆ）起源となる雌性仔をクローン化して雌性クローンを生産すること、
ｇ）第２の雌性ウシ複数匹および第２の雄性繁殖ウシ１匹を含む第２の群れを準備すること；
ｈ）該第２の群れ中の雌性ウシを該第２の雌性クローンと置き換えること；
を含む、前記の起源となる雄性仔がクローン化され、その繁殖雄の雌ウシ１匹を置き換えるために使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
工程ｃ）の前に該雄性仔を去勢することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
工程ｃ）の前に該雄性および雌性の仔を屠殺することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
該交配が人工授精による、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物生産の分野にあり、そして特に、人間が使用し消費するための種畜及び家畜化された成育家畜の群れの全体的遺伝的性質を改良するための動物クローン化操作法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝学および選択的育種は数世紀にわたり動物の飼育において役割を果たしている。創世記第３０章に記載されている選択的育種のしばしば繰り返されている例の１つにおいて、聖書の大司教ヤコブは自分の群れのヒツジと義父ラバンの所有する群れのヒツジとの間の選択的育種を用いることにより、彼の義父の出費により自分の群れのヒツジの数および忍容性を大きく向上させた。
【０００３】
しかしながら最近数年までは、畜産動物の遺伝学は一般的には単に遺伝的に優秀な雄性種畜による雌性育種家畜の自然または人工授精により改良されるのみであった。この方法は着実に育種群れの遺伝的性質を改良するが、緩徐にしか進行せず、そして高水準の一貫性や確実性は伴っていない。仔が両親の遺伝特性を受け継ぎ、そして、親から付与された遺伝特性の優性を予測する方法がないため、仔の遺伝子の品質は保証できない。更にまた、より高度な育種事業により雌性遺伝子がその育種プログラムに組み込まれていたが、大部分の育種事業は、特にウシの場合、雄性の優秀な遺伝子を群れに組み込むことに単に依存していた。受精は、育種プログラムを実施するために利益を生む経済的活動から雌ウシを取り出さなければならない必要があるため、育種業者等にとって高級牛乳生産乳牛のような多くの高価値雌性動物から急速に遺伝子を増殖させることは不可能である。
【０００４】
過去１０年間に開発された動物のクローン化技術は群れの遺伝子の改良のための育種者側の戦略に新しい領域をもたらした。選択された動物をクローン化し、クローン化動物を育種プールに組み込むことにより、育種者等は連続する世代の動物における測定可能な群れの改良を観察する前に必要な世代的な時間のずれを低減することができる。更にまた、育種者は同様の容易さで雌性および雄性の動物をクローン化でき、そしてこれにより、優秀な雌性動物を畜産動物の群れに容易に組み込むことができる。
【０００５】
このような進歩にも関わらず、既存のクローン化技術はなお幾つかの難点を有している。主な難点の１つは選択的育種のためにクローン化すべき動物を的確に特定する必要性である。これは特に、所望の肉質に基づいてクローン化したいと望む場合に当てはまることであり、その理由は、屠殺して、冷却して、食肉処理場で等級付けするまで動物を特定できないためである。クローン化はこのような場合、或いは、クローン化すべき動物が既に死亡している場合は、育種者にとって可能な選択肢ではない。
【０００６】
更にまた、多くの状況において、動物の屠殺後まで所望の遺伝特性を特定することはあきらかに非現実的なことである。例えば、希少な遺伝形質を特定するために動物の大集団から組織試料を得ること、或いは、このような動物における遺伝子形質の独特の組み合わせを特定することは、不可能ではなくとも困難である。このことは特に、スクリーニングすべき群れが複数の団体により所有されている場合に当てはまる。食肉処理場は動物の群れに関わる所有権の問題を提示しない、そして、生存動物から組織試料を採取することに関わる難点を有さない組織の試料採取とスクリーニングのための中枢化された位置を提供する。しかしながらここでもまた、クローン化すべき動物が不妊化されているか既に死亡している場合には、クローン化は育種者にとって可能な選択肢ではなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（本発明の目的）
本発明の目的は、動物育種者が使用可能であって、種畜及び家畜の遺伝的性質を改良するための選択肢を改善することである。
【０００８】
本発明の別の目的は食肉処理場において評点される畜肉の品質のような死後観察される動物の特性に基づいて動物をクローン化することである。
【０００９】
本発明の更に別の目的は死後得られた組織試料からクローン化した動物の遺伝的特徴を畜産動物生産者の種畜および家畜に導入することである。
【００１０】
本発明の更に別の目的は所望の遺伝子形質に関する畜産動物の広範なスクリーニングおよびこれらの遺伝子形質に基いた動物のクローン化を容易にすることである。
【００１１】
本発明の更に別の目的は、クローン化操作における死後組織の使用を可能とし、死亡した動物の遺伝的特徴を普及させ、そして、これらの遺伝的特徴を種畜群れに再度導入することである。
【００１２】
本発明の更に別の目的は核転移技術の異種移植的および他の遺伝子導入的な用途における核転移の使用を増大することである。
【００１３】
本発明の更に別の目的は治療および研究目的のための幹細胞の開発における核転移の使用を増大することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは意外にも遺伝物質が死後の動物から得ることができ、そしてそのような遺伝物質を核転移方法において使用することによりクローン化された胚および死後の動物と同一の性質を有する生存クローン化動物を生産できることを見出した。発明者らの発見は、育種畜産動物の維持および改良、所望の遺伝形質を有する動物の生産、および、選択的育種事業へのこれらの遺伝性質の組み込みに特に利用できる。
【００１５】
従って、広範な意味において、本発明は下記工程：
ａ）死後の非ヒト哺乳類組織から得られるドナー細胞から得たＤＮＡを卵母細胞に転移させて核転移単位を形成すること；および、
ｂ）該核転移単位を培養して核転移胚を樹立すること；
を包む、クローン化された、または、遺伝的に修飾された非ヒトの該胚を生産する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
好ましい実施態様においては、このようにして生産された胚をレシピエント雌に転移させて完全な胎仔へ発育し、出産される胎仔を生産して出生動物を発生させる。
【００１７】
死後の組織を用いて畜産動物をクローン化する能力は畜産動物の操作の効率を改善するための一連の機会を与えるものである。主な利点の１つは多くの動物、特に畜肉としての価値のために育成され屠殺される動物の価値は、その動物が屠殺され、畜肉の品質が評価されるまでは不明であるという事実に関する。例えば、牛肉産業においては動物の屠殺後約４０から４８時間以内、典型的には死骸を約０℃に冷却した後に、品質に関して死骸を等級付けることが一般的である。この手法を用いることにより、所望の品質を示す死骸を優先的に選択してクローン化し、その後クローン化された仔を動物育種事業に組み込むことができる。
【００１８】
本発明において使用される組織は死後に得られるものであるため、本発明の別の実質的利点は、核転移のためにドナー細胞を得る原料となる組織は所望の特性が観察される組織と必ずしも同様である必要はないという点である。即ち、今回新たにクローン化操作法に関わる開発効率を改良するドナー細胞、例えば、当然ながら死亡前には使用できない生殖管組織から得られる細胞等を使用することが可能となっている。
【００１９】
死後組織を用いて畜産動物をクローン化する別の主な利点はそのようなクローン化操作が動物育成操作に対して必ずもたらす影響の幅および深さである。クローン化は従来は動物群れ中の数種の最高価値の動物のみ（典型的には所望の遺伝子特性を最も急速に増殖できる繁殖雄の雄ウシ）を複製するために用いられていたが、畜肉の品質に基づくクローン化は、動物群れに大きな遺伝子的改良を達成するためにクローン化される動物の数がより多数になるため、育種事業の改良のためのプラットフォームとしてより広範に機能する。これらの作用を達成するためにより多数の動物をクローン化するが、群れは最終的には、（１）クローン化された動物の所望の遺伝的特徴がより広範に拡張され、そして（２）所望の遺伝的特徴が、過去には遺伝子濃縮化の労作を希釈していた雄性および雌性を介して伝播され、そして（３）より低い遺伝的品質を有する育種群れの動物を除去し、育種系内で置き換えるという点で、利益をこうむるようになる。即ち、本発明の別の実施態様においては、クローン化された育種動物複数引きを含む畜産動物育種事業が与えられ、この場合、クローン化された動物は死後動物組織を用いた核転移クローン化により得られる。
【００２０】
本発明の更に別の利点は、死後に得られる動物組織の完全な量および所望の遺伝子特性に関してそれらの組織を容易にスクリーニングできる能力である。例えば畜産動物所有者においては、所望の畜肉特性をもたらす遺伝子における多形のような選択された遺伝子特性についてその群れをスクリーニングすることは一般的になりつつある。このような多形または遺伝子特性を示す動物をその後、おそらくは有利にクローン化して増殖させる。しかしながら現在までは生存中の動物のみがクローン化できると考えられていたことから、生存中の動物のみが上記した遺伝子形質についてスクリーニングされていた。スクリーニングはもはや所有者がスクリーニングを意図する特定の群れに限定されず、むしろ、食肉処理場または他の下流の畜肉処理操作を介して統合された複数の群れに属する動物集団を用いて行うことができる。即ち、更に別の実施態様においては、本発明は下記工程：
ａ）２以上の異なる動物から得た２以上の死後組織試料を供給すること；
ｂ）予め選択された身体的、遺伝的および／または表現型的基準について試料をスクリーニングすること；
ｃ）１以上の動物から得られる１以上のドナー細胞から得たＤＮＡを卵母細胞に転移させて核転移単位を形成すること；および、
ｄ）該核転移単位を培養して核転移胚を樹立すること；
を包む、クローン化された、または、遺伝的に修飾された非ヒトの該胚を生産する方法を提供する。
【００２１】
（その他の考察）
上記したとおり、１つの特定の実施態様において、本発明は下記工程：
ａ）死後の非ヒト哺乳類組織から得られるドナー細胞から得たＤＮＡを卵母細胞に転移させて核転移単位を形成すること；および、
ｂ）該核転移単位を培養して胚を樹立すること；
を包む、クローン化された、または、遺伝的に修飾された非ヒト哺乳類の該胚を生産する方法を提供する。
【００２２】
特に好ましい実施態様においては、方法は更に該胚をレシピエント雌に転移させて完全な胎仔へ発育し、出産される胎仔を生産して出生動物を発生させることを更に含む。
【００２３】
本発明は何れかの哺乳類動物種を用いて実施できるものとする。「哺乳類」とは本明細書においては哺乳類綱の何れかの動物を指すものとする。哺乳類綱には更にイヌ（イヌ科の動物、例えばオオカミ、ジャッカル、キツネまたはイエイヌ）、ネコ（ネコ科の動物、例えばライオン、トラ、レパード、チータ、クーガまたはイエネコ）、ネズミ（ネズミ科の動物、例えばマウスまたはラット）、ウサギ（ウサギ科の動物、例えばウサギ）、クマ（クマ科の動物、例えばクマ）、イタチ（イタチ科の動物、例えばイタチ、フェレット、カワウソ、ミンクまたはスカンク）、霊長類（霊長類目の動物、例えばテナガザル、サル、チンパンジーまたはキツネザル）、有蹄類（例えば以前有蹄類として知られていた多系統の群の動物、例えばラクダ、カバ、ウマ、バク、ゾウ、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ）、ヒツジ即ちヒツジ科の動物（例えばヒツジ）、ブタ（ブタ科の動物、例えばブタまたは雄ブタ）、ウマ（ウマ科の動物、例えばゼブラ、ロバまたはウマ）、ウシ（ウシ科の動物、例えばアンテロープ、雄ウシ、乳牛、バイソンまたはヤギ）、ヤギ（ヤギ科の動物、例えばヤギ）、およびシカ（シカ科の動物、例えばシカ）が包含される。本発明を実施する際に好ましい哺乳類は、有蹄類、ｏｖｉｄ、ブタおおよびウシである。本発明を実施する際に特に好ましい哺乳類は、ウシおよびブタである。
【００２４】
「死後」という用語は死亡した、即ち、全ての生命機能が回復の可能性なく終了した動物から得られた組織を指す。死亡のタイミングは本発明に関しては重要ではない。即ち、本発明において使用するドナー細胞は死亡直後の動物、少なくとも約１．２、５、１０、２０または４０時間前に死亡した動物、および３日、７日、３０日または１年前に死亡した動物から得ることができる。上記した死亡の時期は動物が死亡した時点からドナー動物由来の遺伝物質が核転移操作において卵母細胞に転移されるまで測定される。上限もまた上記した時間限度に対して適用でき、これにより、２０年、１０年、５年、１年、６０日、３０日、７日、３日、４０時間または２０時間に渡る範囲とすることができる。
【００２５】
死後の組織は好ましくは死亡直後またはその後まもなく（即ち約６、１２または２４時間以内に）冷却する。組織を冷却する温度は本発明では重要ではないが、一般的に約２０、１５、１０、５、０または−５℃未満である。下限を上記した温度範囲に適用でき、２５、２０、１５または１０℃の範囲とすることができる。
【００２６】
上記したとおり、本発明は特に所望の身体的、表現型および／または遺伝的形質について動物の大集団をスクリーニングする際に特に適しているが、その理由は食肉処理場または他の下流の畜肉処理または流通操作においては、試料採取するために典型的に使用される動物数が多いためである。即ち、別の実施態様において、本発明は下記工程：
ａ）２以上の異なる動物から得た２以上の死後組織試料を準備すること；
ｂ）予め選択された身体的、遺伝的および／または表現型的基準について試料をスクリーニングすること；
ｃ）１以上の動物から得られる１以上のドナー細胞から得たＤＮＡを卵母細胞に転移させて核転移単位を形成すること；および、
ｄ）該核転移単位を培養して胚を樹立すること；
を包む、クローン化された、または、遺伝的に修飾された非ヒトの該胚を生産する方法を提供する。
【００２７】
一連の好ましい実施態様においては、４、１０、２５、５０、１００、２５０または１０００個超の試料を、選択された基準についてスクリーニングする。上限もまた上記した飼料数に対して適用でき、これにより、１０００、２５０、１００、５０、２５、１０または４個の試料の範囲とすることができる。試料は動物の１、２、５、１０またはそれ以上の群れから得ることができる。「群れ」という用語は人間の世話または管理のもとに集められて飼育されている１種類の家畜化された動物の群を指す。
【００２８】
好ましい実施態様においては、スクリーニングされる組織試料は人間が消費することを意図した畜肉（即ち筋肉組織および包埋された脂肪）を意味する。上記したとおり、核転移操作に使用されるドナー細胞は実際にスクリーニングされた組織試料から得ることができるが、これは好ましくはそのような組織がより高いクローン化効率を示す選択された動物の他の組織から得られる。１つの好ましい実施態様においては、組織はウシの死骸から選択され、より好ましい実施態様においては、組織は腎臓から得られる。
【００２９】
組織は多くの身体的、表現型的および／または遺伝的形質に基づいてクローン化のために選択できる。１つの実施態様においては、組織は食肉処理場においてその組織に割り付けられた畜肉の品質または収率の等級に基いたクローン化のために選択される。例えば、米国農務省（ＵＳＤＡ）は牛肉、豚肉、子牛肉、ラム肉、１年子羊肉および羊肉について品質等級を有することが知られている。牛肉の品質の等級はＵＳＤＡプライム、チョイス、セレクト、スタンダード、コマーシャル、ユーティリティー、カッターおよびキャンナーである。同様にラム肉はＵＳＤＡプライム、チョイス、グッド、ユーティリティーおよびカルに等級付けられる。更にまた、ＵＳＤＡは牛肉、豚肉およびラム肉に対して収率等級（即ち赤身の廃棄物に対する収量の比）を有しており、ＹＧ１〜ＹＧ５の範囲であり、ＹＧ１は最も赤身の多い肉片でありＹＧ５は最も脂身の多いものである。これらの品質または収率の等級に基づいてクローン化する動物を選択できるが、好ましくはプライムまたはＹＧ１と等級付けられるか、または他の高い商業上の価値または経費節約機会を有する畜肉のみがクローン化のために選択される。クローン化の決定の根拠となりえる他の物理的特性は霜降り度、肋骨眼球筋肉領域、下処理の比率および畜肉の柔らかさを包含する。
【００３０】
動物はまた、所望の栄養特性の存在に基づいてクローン化のために選択できる。例えば、畜肉は蛋白、ナイアシン、ビタミンＢ６およびＢ１２、鉄、リンおよび亜鉛の摂取源となる。逆に、やはり全ての畜肉中に存在する脂肪、飽和脂肪およびコレステロールのような望ましくない栄養特性が欠如していることに基づいて動物をクローン化することもできる。動物は上記した栄養特性の何れか、またはこれらの特性の何れかの組み合わせに基づいてクローン化を選択できる。
【００３１】
畜肉はまた、所望の遺伝的特性に関してスクリーニングできる。例えば国際公開公報第０２／０２８２２号は、牛肉の柔らかさの変動に関与する遺伝子の１つに相当する２対立遺伝子が存在し、その１つは牛肉の柔らかさを増強し（ｔ＋対立遺伝子）そして１つは柔らかさを低減する（ｔ−対立遺伝子）であることを示している。ｔ＋ｔ＋対立遺伝子は平均してより低いＷａｒｎｅｒ  Ｂｒａｔｚｌｅｒ剪断力を有する牛肉を与えるため、ｔ−ｔ−遺伝子型を有する動物よりも柔らかい肉質である。同様に、国際公開公報第０１／９２５７０号は改良された畜肉の品質特性を有する筋肉組織の遺伝的素因を有するブタを特定するための試験を記載している。好ましいマーカーはｉ）ＳＷ４１３、ＳＷ１４８２、ＳＷ４３９、Ｓ０００５、ＳＷ９０４またはその間に渡る染色体５の領域；またはｉｉ）ＳＷＲ６８、Ｓ００２４、ＳＷ８２７、ＳＷ７２７、ＳＷ５３９またはその間に渡る染色体９の領域；またはｉｉｉ）ＳＷ２０９３、ＳＷ２１１６またはその間に渡る染色体９の領域である。国際公開公報第０１／７５１６１号は、ドリップがないこと、霜降り、ｐＨおよび色を含む好ましい畜肉の品質の形質に関わるブタメラノコルチン−４受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子における遺伝子マーカーを記載している。国際公開公報第００／６９８８２号は種々の市販されている畜産動物（特にブタ）における体重増加速度、胴体の長さ、および同腹仔数に関わるＣＹＰ１１ａｌ遺伝子における多形を記載している。国際公開公報第９４／２１６８１号は筋肉塊を形成する際に関与するとされる生育分化因子−８（ＧＤＦ−８）を開示している。上記した遺伝子型のいずれも、本発明の実施のために選択できる、
【００３２】
育種および選択された形質の濃縮のためのクローン化の使用
更に別の実施態様は畜産動物の群れからクローン化した遺伝的特徴の動物群れへの組み込み、および、畜産動物の群れへこのような遺伝的特徴を組み込む方法に関する。本発明の適用に特に適する１つの実施態様においては、これらの方法はドナー細胞の原料として死後の組織を用いながら実施される。しかしながら、本発明の方法は生存中の動物から得た組織に対しても同様に拡張することができる。
【００３３】
即ち、別の実施態様において、本発明は一群の動物の遺伝的、表現型的または身体的特性を改善する方法であって：
ａ）非ヒト哺乳類組織から得られるドナー細胞から得たＤＮＡを卵母細胞に転移させて核転移単位を形成すること；
ｂ）該核転移単位を培養して核転移胚を樹立すること；
ｃ）該胚をレシピエント雌に転移させて完全な胎仔へ発育し、出産される胎仔を生産して出生動物を発生させること；および、
ｄ）該出生動物を前記一群の１以上の動物を交配させること；
を包含する前記方法を提供する。
【００３４】
本発明の最も確実な特徴の１つは育種プログラムにウシのクローン化を組み込むその能力である。本発明の方法においては、畜産動物製造者は雄性および雌性の両方を含むウシの群れ１つ以上を維持する。１匹の繁殖雄の雄ウシは、群れを増殖させるために、典型的には繁殖雄当たり約２０から１００、３０から７０または４０から６０匹の雌の比率となるように、準備される。雄性および雌性の仔は一般的には「末端仔」と考えれられ、十分な成熟度に達した時点で市場において販売される。雄性仔を育種過程および繁殖雄の交配の妨害とならないようにするために、それらは典型的には出生後まもなく去勢される。雌性仔は一般的には育種過程に参入することを許されず、そして典型的には畜舎等の群れから隔離され、それらが販売できるようになるまではそのような参入を防止する。
【００３５】
群れに伴っている雄性の繁殖雄は最終的には齢、健康状態または繁殖能力のような理由から、または、遺伝的改良および／または群れの仔の改変を行うために、別の繁殖雄に交換される。雄性の繁殖雄は一般的にはそれが別の群れにローテーションされるか、またはその畜肉としての価値のために屠殺される前に、約１から１０年間は群れの一部となる。
【００３６】
雌性は典型的には群れのローテーションからはずされ、末端仔の出生（典型的には２から８仔を出生）の数年後により若い雌性要員により置き換えられる。ローテーションに組み込まれた雌性動物は群れの雌性仔から得られたものであるか、または、群れの外部より移入されたものである。１つより多くの群れを用いる更に大規模なウシ飼育操作は、雌性動物または繁殖雄のローテーション先となる、ある群れに対して明らかな家族的関係を有する別の群れに属する雌性動物または繁殖雄を、その群れ内にローテーション入りさせる能力を有する。このことはウシの生産者に最終的な仔の遺伝的性質を良好に予測したり管理することを可能ならしめるのである。
【００３７】
クローン化はその群れにより生成される仔の特性および価値を更に改良するためにウシ生産者により使用されることのできる重要な道具である。前述したとおり、死後の組織を用いてウシをクローン化する能力は多大な育種能力を付与する。これらの利点は、
・非常に優れた形質を示すがその遺伝能力が虚勢または屠殺により予め除去されている雄ウシの遺伝的特徴を回復させ、
・既知遺伝的形質を有するクローン化雄ウシを育種過程に組み込み、そして、
・優秀な雌性動物の遺伝的特徴を永続させる、
という機会が存在する場合に、制御された育種においてより顕著なものとなる。
【００３８】
従って、１つの実施態様においては、本発明は、ａ）雌性ウシ複数匹および一匹の雄性繁殖雄を含む群れを準備すること、ｂ）雌性ウシと雄性繁殖雄を（自然または人工授精、ＩＶＦまたは他の方法による）交配をさせて雄性および雌性の仔複数を生産すること、ｃ）これら複数の雄性および雌性仔から選択した、１匹の起源となる雄性または雌性仔をクローン化してクローンを生産すること、ｄ）繁殖雄の雄ウシまたは該雌性ウシの雌ウシ１匹を該クローンで置き換えること、および、ｅ）工程ｂ）を１回以上反復して改良された雄性および雌性の仔複数匹を生産すること、を含むウシ育種事業におけるウシの生産方法を提供する。
【００３９】
ウシ育種事業とは、選択された群れまたは全体の事業の遺伝子的性質の狭小化および／または拡大のための所定のプログラムを実施するために必要に応じて群れの間の雌性および雄性のウシの転移が起こるように、単独の事業管理の下にある群れ１つ以上として定義される。群れの組成は不変ではなく、反復される場合に本発明の１工程は前回の工程と同じ群れの組成または雄性の繁殖雄を用いて厳密に実施する必要はないと考えられる。実際、本発明の的確性は、優秀な起源仔が特定されれば遺伝的に優秀なクローンで群れ内の雄性または雌性動物を持続的に交換することができ、これにより特定の群れの遺伝的性質を急速に限定して増強することができるという能力に存する。即ち、別の実施態様において、本発明は更に、下記工程：
ａ）該改良された雄性および雌性の仔から改良された起源となる雄性の仔をクローン化して改良された雄性クローンを生産すること、
ｂ）雄性繁殖雄を該改良された雄性クローンと置き換えること、および、
ｃ）工程ｂ）を一回以上反復して２回改良された雄性および雌性の仔複数匹を生産すること、
を含む。
【００４０】
雌性の遺伝的特徴が連続した世代においてクローン化される場合、本発明は更に、下記工程：
ｆ）該改良された雄性および雌性の仔から改良された起源となる雌性の仔をクローン化して改良された雌性クローンを生産すること、
ｇ）該群れ中の雌性のウシを該改良された雌性クローンと置き換えること、および、
ｈ）工程ｂ）を一回以上反復して２倍改良された雄性および雌性の仔複数匹を生産すること、
を含む。
【００４１】
この一般的テーマの多数の変法が本発明の利用性を更に増強すべく実施することができる。例えば、遺伝的特徴はクローンをその親の群れまたは事業内の別の群れに導入することにより伝播させることができる。当然ながら、クローンをその親の群れに導入する場合は、群れから親を除去することによりクローンのその親との交配を回避するよう留意しなければならない。
【００４２】
同様に、起源となる雄性または雌性の仔を１回以上クローン化することができる。１回より多く起源となる雄性の仔をクローン化することは、相当する数の群れに雄性クローン複数匹を会合させることにより全育種事業内での遺伝的特徴を狭小化することを可能にする。一方、１回より多く起源となる雌性の仔をクローン化することは、同じ群れに遺伝子的に同一の雌性クローン複数匹の導入を可能とする。一部の遺伝子の変動を確認するために、第２の起源となる雌性の仔もまた１回より多くクローン化し、第２のセットの雌性クローンもまた群れに導入できる。このようにして、群れは２５、１５、１０または５未満のセットの雌性クローンを含むことができる（各セットは１匹の起源となる雌から得られるものとして定義される）。
【００４３】
核転移
核転移操作法においては、核ドナー細胞または核自身をレシピエント細胞に導入する。核転移操作法は、Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４３  １８１（１９９５）；Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３８  ２６４−２６７（１９９４）；Ｋｅｅｆｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５０  ９３５−９３９（１９９４）；Ｓｉｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６１４３−６１４７（１９９３）号；国際公開公報９４２６８８４号；国際公開公報９４２４２４７号；国際公開公報９８０７８４１号；国際公開公報９００３４３２；米国特許４，９９４，３８４号；および米国特許５，０５７，４２０号に記載されているとおり文献既知であり、これらの各々はその全体が参照して本明細書に組み込まれる。
【００４４】
卵母細胞
「卵母細胞」という用語は卵子形成の最終産物である成熟動物卵子および前駆形態の卵原細胞、一次卵母細胞および二次卵母細胞をそれぞれ指すものとする。特段の記載が無い限り、本明細書においては、「卵母細胞」という用語はその天然の有核状態またはその除核された（即ち核内に典型的に存在する遺伝物質が除去されている）状態における未受精の卵を指す。卵母細胞中に典型的に存在する遺伝物質は本明細書においては母方遺伝物質とも称する。母方遺伝物質はミトコンドリアＤＮＡは包含しない。特段の記載が無い限り本明細書においては「卵母細胞」という用語は活性化された、または活性化されていない卵母細胞を包含する。「ドナー遺伝物質」とは、卵母細胞に導入されたドナー細胞から得られた遺伝物質である。ドナー遺伝物質はクローン化すべき、そしてクローン化された非ヒト哺乳類内に存在すべき遺伝物質を含有する。核転移胚すなわち「ＮＴ胚」はドナー遺伝物質を卵母細胞に導入し、そして胚を活性化して有糸分裂誘発を誘導した結果生じるものである。即ち、ＮＴ胚は受精卵の核転移等価物である。ＮＴ胚は母方遺伝物質が転移の前に卵母細胞から除去されている（即ち卵母細胞が除核されている）か否かに関わらず、そのような時点において存在する。１細胞ＮＴ胚はまた接合体と称する。本発明の一部の局面においては、核転移単位即ち「ＮＴ単位」はＮＴ胚に先行する段階において生産される。「ＮＴ単位」は、卵母細胞内部、例えば卵黄周囲の空間（即ち卵母細胞と透明帯の間の空間）内部へのドナー細胞からの核物質の転座の結果生じる。ＮＴ胚は卵母細胞中に元々存在していた母方遺伝物質を含有してよい。
【００４５】
ウシおよびブタの卵母細胞は好ましくは卵胞から吸引された場合に約１３０から約２３０ミクロンである。より好ましい実施態様においては、卵母細胞は直径約１５０から約２００ミクロン、最も好ましくは約１８０ミクロンである。
【００４６】
典型的には卵母細胞は哺乳類の卵巣または生殖管から得られる。食肉処理場物質は卵母細胞の容易に入手可能な原料を提供する。或いは、卵母細胞は外科的に除去し本発明の方法で使用することができる。卵母細胞の単離方法は当該分野でよく知られている。例えば、未成熟のウシ卵母細胞の採取についてはＷｅｌｌｓら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６０，９９６−１００５（１９９９））に記載されており、そして未成熟ブタ卵母細胞の採取についてはＡｂｅｙｄｅｅｒａら．（Ｚｙｇｏｔｅ  ７，２０３−１０（１９９９））およびＳｔｉｃｅら，（米国特許５，９４５，５７７号）に記載されている。全卵母細胞または２分割の卵母細胞を本発明において使用できる。好ましくは全卵母細胞を用いる。
【００４７】
卵母細胞は発生の何れかの段階の卵胞、例えば始原卵胞、一次卵胞、二次卵胞、成長卵胞、嚢胞卵胞、成熟卵胞およびグラーフ卵胞から単離してよい。ブタ卵巣からの卵母細胞の選択は好ましくは約２ｍｍの大きさ、より好ましくは約３から８ｍｍの大きさである卵胞から手作業により行う。卵胞の種々の発生段階からの卵母細胞の単離のための材料および方法は当業者の知るとおりである。例えば、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｔｔｌｅ  Ｅｍｂｒｙｏｓ，１９９４，Ｉａｎ  Ｇｏｒｄｏｎ，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ａｎａｔｏｍｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆａｒｍ  Ａｎｉｍａｌｓ  （５ｔｈ  Ｅｄ．），１９９２，Ｒ．Ｄ．Ｆｒａｎｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｔ．Ｌ．Ｓｐｕｒｇｅｏｎ，Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒを参照できる。実際には、卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を卵胞から吸引採取し、その後ＣＯＣをインビトロで成熟させる。或いは、ドナー動物から採取直後にその卵丘細胞からインビボ誘導の卵母細胞を剥離し、本発明の方法において使用する。卵丘を除去する方法は当該分野でよく知られている（Ｔａｏら，Ａｎｉｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｓｃｉ．，５６，１３３−４１（１９９９）；Ｓｔｉｃｅら，（米国特許５，９４５，５７７号））。使用前に卵母細胞の減数分裂の段階を当該分野でよく知られた方法を用いて決定する。
【００４８】
インビトロ誘導の卵母細胞は典型的には卵母細胞が未成熟の時期に卵胞の吸引によりまず採取する。未成熟の卵母細胞は有糸分裂前期の卵母細胞である。典型的には、その後、未成熟の卵母細胞を培地中で培養し、インビトロ条件下に成熟させる。卵母細胞のインビトロ成熟化のために使用できる培地は本明細書においては成熟培地またはインビトロ成熟（ＩＶＭ）培地と称する。その例としては組織培養培地１９９（ＴＣＭ−１９９）、ウェイマスおよびＮＣＳＵ−２３が挙げられる（Ａｂｅｙｄｅｅｒａら，（Ｚｙｇｏｔｅ  ７，２０３−１０（１９９９））に記載されている）。好ましくは、ＴＣＭ−１９９がウシに対して使用され、そして、ＮＣＳＵ−２３およびＴＣＭ−１９９がブタに対して使用される。卵母細胞のインビボ成熟は当該分野でよく知られている。（例えばＰｒａｔｈｅｒら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，４８：１−８，１９９１；Ｗａｎｇら，（Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．１１１  １０１−１０８（１９９７）を参照できる）。
【００４９】
当該分野でよく知られている他の種々の培地を使用してインビトロで卵母細胞を成熟させることができる。例えば（ｉ）ウマ卵母細胞に関してはＡｌｍ  ＆  Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，１９９６，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．１０７：２１５−２２０およびＡｌｍ  ＆  Ｔｏｒｎｅｒ，１９９４，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４２：３４５−３４９；（ｉｉ）ヤギおよびヒツジの卵母細胞に関してはＬｅｄｄａら，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  １０９：７３−７８；Ｂｙｒｄら，１９９７，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４７：８５７−８６４；Ｗｉｌｍｕｔら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３；およびＬｅＧａｌ，１９９６，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４５：１１７７−１；（ｉｉｉ）ウサギ卵母細胞に関してはＬｏｒｅｎｚｏら，１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  １０７：１０９−１１７およびＪｅｌｉｎｋｏｖａら，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｏｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３７：２１０−２１５；（ｉｖ）イヌ卵母細胞に関してはＮｉｃｋｓｏｎら，１９９３，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．（Ｓｕｐｐｌ．４７）：２３１−２４０；Ｙａｍａｄａら，１９９３，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．（Ｓｕｐｐｌ．４７）：２２７−２２９；およびＭａｈｉ  ＆  Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ，１９７６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｚｏｏｌｏｇｙ  １９６；１８９−１９６；（ｖ）シカ卵母細胞に関してはＦｕｋｕｉら，１９９１，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３５：４９９−５１２およびＰｏｌｌａｒｄら，１９９５，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４３：３０１；そして（ｖｉ）ラクダ卵母細胞に関してはＤｅｌ  Ｃａｍｐｏら，１９９５，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４３：２１−３０；およびＤｅｌ  Ｃａｍｐｏら，１９９４，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４１：１８７を参照できる。卵母細胞は低温保存し、次に、卵母細胞を成熟培地に入れる前に解凍する。
【００５０】
典型的には、卵母細胞はそれが減数分裂の細胞周期の有糸分裂中期ＩＩ（ＭＩＩ）に達した時点で成熟とみなされる。しかしながら、米国特許出願２００１／００５３５５０号におけるＳｔｉｃｅ等が説明するとおり、卵母細胞は有糸分裂中期Ｉ（ＭＩ）において十分成熟しており、そして、本発明の方法において使用できる。本発明において使用する場合は、特段の記載が無い限り、「成熟した」卵母細胞という用語は許容される形態学的特性により決定される場合に有糸分裂中期ＩＩに達している卵母細胞を指すものとする。
【００５１】
レシピエントの卵母細胞は核転移を行う際には除核されていることが好ましいが必須ではない。卵母細胞はまた例えば紫外線照射により「機能的に除核されている」ものであることもできる。例えばＢｒａｄｓｈａｗら．（１９９５），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４１：５０５−１２を参照できる。
【００５２】
インビボ誘導の卵母細胞は非過剰排卵または過剰排卵のドナーから得ることができる。ドナーは当該分野でよく知られた方法で過剰排卵を誘導できる。例えば、過剰排卵ブタまたはウシのドナーはＰＭＳＧ（妊娠母動物血清ゴナドトロピン）またはＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）の投与により得られる。好ましくは、卵母細胞はドナーが発情期開始後まもなく（約１２時間）である時点でドナー動物から得る。卵母細胞を得ることができる発情期開始後の期間は動物の型により異なり、当業者の知るとおりである。例えば、ドナー動物がウシまたはブタである場合は、卵母細胞は好ましくは発情期開始後それぞれ約２４時間または約４８時間以内に得る。
【００５３】
ドナー細胞
ドナー遺伝物質は卵母細胞に導入され、そしてクローン化された非ヒト哺乳類内に存在すべき遺伝物質を含有する。ドナー遺伝物質はドナー細胞、即ち遺伝物質が通常存在する細胞から単離できる。例えば、核または有糸分裂中期のプレートをドナー細胞から単離し、次に卵母細胞に導入してよい。有糸分裂中期のプレートは後に詳述する。或いは、そして好ましくは、ドナー遺伝物質はドナー遺伝物質が卵母細胞に導入されるよりも前にドナー細胞から単離されず、即ち、後に記載するとおり、卵母細胞の卵黄周囲腔内にドナー細胞を導入し、次いで、卵母細胞にドナー細胞を融合させることにより、ドナー細胞そのものを卵母細胞内に導入する。場合により、ドナー遺伝物質は遺伝子操作により得られた、または、トランスジェニックなＤＮＡを含有してよい。
【００５４】
本発明の方法において使用するドナー細胞は、未分化または分化した細胞、好ましくは分化した細胞であることができる。分化した哺乳類細胞は初期の胚段階を超えた段階の細胞である。より詳しくは、分化した細胞は早期の胚の盤状段階（例えばウシの胚形成の約第１０日またはブタの胚形成の約８日）を少なくとも超えた以降のものである。胚の盤状段階を少なくとも超えた胚の形成段階を本明細書においては後期胚形成段階と称する。胎仔段階の細胞とは異型性の少なくとも約２０日目から約３０日目以降出生時までの細胞である。成体段階の細胞は出生以後の動物中に存在するものである。分化した細胞は内胚葉、中胚葉または外胚葉から誘導してよく；好ましくはそれらは中胚葉または内胚葉から誘導する。
【００５５】
ドナー細胞として使用するための非ヒト哺乳類細胞は当該分野でよく知られた方法で得てよい。本発明において有用な哺乳類細胞は身体の細胞、例えば上脾細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、線維芽細胞、心筋細胞および他の筋肉細胞を包含する。本発明の方法において使用できる哺乳類細胞は種々の臓器、例えば皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、子宮および他の泌尿器から得てよい。哺乳類細胞は胚、胎仔または成体組織から得た、または、培養細胞系統から得た、好ましくは成体組織から得た体細胞または２倍体の生殖細胞であってよい。成体細胞の使用は所望の特性を有する動物のクローン化を可能とすることから好都合である。これらはドナー遺伝物質の原料として使用できる適切な細胞の例示に過ぎない。好ましくは、細胞は線維芽細胞または肉芽腫細胞である。
【００５６】
本発明の１つの局面において、ドナー細胞は、それが卵母細胞内に直接導入されるものであるか、または、卵母細胞に導入されるドナー核またはドナー有糸分裂中期プレートの原料として用いられるかに関わらず、静止期の細胞（即ちＧ０の細胞、例えばＷｉｌｍｕｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３８５，８１０−３（１９９７）；Ｃａｍｐｂｅｌｌら，国際公開公報第９７／０７６６９号参照）、増殖細胞（Ｓｔｉｃｅら，米国特許５，９４５，５７７）、有糸分裂中期細胞、中期において停止した細胞、または後期Ｇ１期で停止した細胞である。ドナー細胞が静止期、増殖、中期、中期停止または後期Ｇ１期停止であるかどうかは、当該分野でよく知られた方法により決定できる。例えば、中期にあるドナー細胞は有糸分裂の前期段階を含む細胞周期を経た細胞であり；縮合した姉染色分体に結合した動原体が細胞の赤道面の領域に存在し、核膜は存在しない。中期の細胞の染色体の出現は当該分野でよく知られており、中期プレートと称される。例えば、後期Ｇ１期に有るドナー細胞は調節蛋白、例えばサイクリンＡおよびサイクリンＥの細胞内濃度が他の細胞周期の段階における細胞中よりも高値となっている細胞である。中期で停止した、または、後期Ｇ１期で停止したドナー細胞は、それぞれ、中期またはＧ１を越えて有糸分裂後期またはＳ期に進行することが不可能であり、このため、もはや増殖できない。静止期の細胞は細胞周期の４段階（即ちＧ１、Ｓ、Ｇ２またはＭ）のいずれにもない。静止期の細胞は典型的にはＧ０状態にあると考えられ、これによりそれらが周期を通して正常に進行しないことが示される。静止期のＧ０細胞の核は２倍体である。即ち、静止期の細胞とは対照的に、中期において停止した細胞は核を有さず、そしてＤＮＡ含量は４倍体である。静止期の細胞とは対照的に、後期Ｇ１期において停止した細胞はＤＮＡ複製を起こすように調製されるが、なお２倍体である。
【００５７】
好ましくは、ドナー細胞は静止期、Ｇ１停止、中期または中期停止のものである。中期のドナー遺伝物質を卵母細胞に入れることは、それが卵母細胞に導入されているドナー遺伝物質をリプログラミングするために必要な細胞質リプログラミング因子への追加的曝露を促進するという理由で、好都合なことである。後期Ｇ１停止のドナー遺伝物質を卵母細胞に入れることは、ドナー核がＮＴ胚の初回の細胞周期のＳ期におけるＤＮＡ複製を起こすように調製されるという理由で、好都合なことである。
【００５８】
ドナー細胞は細胞を少なくとも１種の停止剤に曝露することにより中期において停止できる。有用な停止剤はノコダゾール、デミコルチン、コルヒチン、コルセミド、パクリタキセル、ドセタキセル、オトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンオレルビン、モナストロールおよびタキソールを包含し、好ましくはノコダゾールである。好ましくは、ドナー細胞の停止状態は可逆、即ち、細胞は停止剤を除去すれば増殖を再開する。ドナー細胞集団の停止剤への曝露は典型的には全ドナー細胞の停止をもたらすものではなく、即ち、停止した（従って典型的には中期に有る）細胞は停止していないものと分離することができる。中期において停止した細胞は典型的には停止細胞を分離できるような改変された形態を有する。例えば、表面上で生育し、その後停止剤に曝露された停止細胞は「丸まった」外観を有するが、増殖中の細胞は比較的平坦である。
【００５９】
ドナー細胞は停止剤少なくとも１種に細胞を曝露することによりＧ１期において停止してよい。有用な停止剤には、ミモシン、アフィドコリンおよびＣＤＫ２キナーゼの抑制剤、例えばロスコビチンまたはオロモウシンが包含される（例えばＡｌｅｓｓｉら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，２４５，８−１８参照）。好ましくは、ロスコビチンまたはオロモウシン、より好ましくはロスコビチンを使用するが、接触阻止が別の特に好ましい手法である。好ましくは、ドナー細胞の停止状態は可逆、即ち、細胞は停止剤を除去すれば増殖を再開する。ドナー細胞集団の停止剤への曝露は典型的には全ドナー細胞の停止をもたらすものではなく、即ち、停止した（従って典型的には後期Ｇ１に有る）細胞は停止していないものと分離することができる。Ｇ１において停止した細胞は典型的には停止細胞を分離できるような改変された形態を有する。例えば、停止細胞は典型的には後期Ｇ１で停止しなかった細胞よりも小型である。好ましくは、約１５μＭから約２０μＭの大きさを有する後期Ｇ１停止ドナー細胞を選択して卵母細胞への導入に供する。ドナー細胞は血清枯渇および接触阻止（即ちコンフルエントとなるまでの培地中の生育）のような静止期を誘導する種々の従来の方法を用いて静止期に入るように誘導することができる。好ましい方法は接触阻止である。
【００６０】
ドナー遺伝物質は静止期の細胞、増殖中の細胞、中期にある細胞、中期で停止した細胞、またはＧ１期で停止した細胞から、当該分野でよく知られた方法を用いて単離することができる（例えばＣｏｌｌａｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８，２６４−２６７（１９９４）参照）。典型的にはドナーの核は細胞膜を除去することにより単離でき、または、ドナー核を通常包囲している細胞質の少なくとも一部を除去することにより更に単離することができる。
【００６１】
種々のドナー細胞培養方法が当該分野に存在する。例えば、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），１９９４，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  （ｅｄ．），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （ｖｏｌ．１），（１９９８），Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｌｅｉｎｗａｎｄ  （ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；およびＡｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａ，１９９４，Ｄａｒｌｉｎｇ  ＆  Ｍｏｒｇａｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．を参照できる。
【００６２】
核転座
核ドナーは当業者でよく知られた方法の種々のものを用いて卵母細胞、最も好ましくは除核された卵母細胞内に転座することができる。単離されたドナー遺伝物質を卵母細胞に直接注射してＮＴ胚を生産してよい（例えばＣｏｌｌａｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８，２６４−２６７（１９９４）；およびＴａｏら，Ａｎｉｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｓｃｉ．，５６，１３３−４１（１９９９）参照）。圧電エレメント系のマイクロマニピュレーターを用いてマイクロインジェクション作業を容易に行ってよい（例えばＷａｋａｙａｍａら，Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３６９−７４（１９９８）参照）。核膜は卵母細胞に導入される中期プレート周囲に形成することが予測される。
【００６３】
或いは、ドナー細胞を卵母細胞の卵黄周囲腔（即ち卵母細胞と透明体の間の空間）内にドナー細胞を入れた後に卵母細胞と細胞を融合し、ＮＴ単位を生産することにより卵母細胞と同じ動物種の単一のドナー細胞を導入してもよい。このような方法は当該分野でよく知られている（例えばＳｔｉｃｅら，（米国特許５，９４５，５７７号）参照）。種々の電気融合媒体が使用でき、例えばスクロース、マンニトール、ソルビトールおよびリン酸塩緩衝食塩水が上げられる。融合はまた、融合誘導剤としてセンダイウィルスを用いる（Ｇｒａｈａｍ，Ｗｉｓｔｅｒ  Ｉｎｏｔ．Ｓｙｍｐ．Ｍｏｎｏｇｒ．，９，１９，１９６９））か、または、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる（Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈら，米国特許５，４９６，７２０号）ことにより行うこともできる。細胞融合の非電気的方法の別の例はトリプシン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、レクチンおよび凝集素ウィルスを含有する溶液中でのインキュベーションを包含する。ＮＴ単位を構成するドナー細胞と卵母細胞の融合によりＮＴ胚が得られる。
【００６４】
典型的には、ブタ卵母細胞とドナー細胞の電気融合においては、約１５０Ｖ／ｍｍから約３５０Ｖ／ｍｍの範囲、より好ましくは約２５０Ｖ／ｍｍの融合パルスを使用する。パルスの持続時間は約２０μ秒であってよい。ウシ卵母細胞とドナー細胞の電気融合の場合は、約４０Ｖ／１５０μｍの融合パルスを使用してよい。パルスの持続時間は約２０μ秒である。複数のパルスを用いて細胞融合を良好に誘導することができる。結果として１細胞ＮＴ胚が形成される。
【００６５】
ＮＴ胚
所望により、ＮＴ胚は培地中で培養できる。培地の型は卵母細胞の種により異なる。例えば豚の細胞の場合、ＮＣＳＵ−２３または他のブタ胚培養用培地（例えばＴａｏら，Ａｎｉｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｓｃｉ．，５６，１３３−４１（１９９９）参照）を使用できる。好ましくは、ブタ細胞の場合は、逐次的培地系（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉａ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いる。逐次的培地系の第１の培地はアラニン、アラニルグルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、塩化カルシウム、ＥＤＴＡ、グルコース、グルタメート、グリシン、ヒト血清アルブミン、硫酸マグネシウム、ペニシリンＧ、塩化カリウム、プロリン、セリン、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、乳酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウムおよびタウリンを含有する重炭酸塩緩衝培地を使用する。このような培地は商品名Ｇ１．２（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ，Ｉｎｃ．，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｏｌｏ．）の元に入手可能である。逐次的培地系の第２の培地はアラニン、アラニルグルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、塩化カルシウム、パントテン酸カルシウム、塩化コリン、シスチン、葉酸、グルコース、グルタメート、グリシン、ヒスチジン、ヒト血清アルブミン、ｉ−イノシトール、イソロイシン、ロイシン、リジン、硫酸マグネシウム、メチオニン、ナイアシンアミド、ペニシリンＧ、フェニルアラニン、塩化カリウム、プロリン、ピリドキシン、リボフラビン、セリン、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、乳酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、チアミン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンを含有する重炭酸塩緩衝培地である。このような培地は商品名Ｇ２．２（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ，Ｉｎｃ．，）の元に入手可能である。逐次的培地系は本明細書においてはＧ１／Ｇ２またはＧ１．２／Ｇ２．２と称する。ウシ細胞の場合は、Ｇ１／Ｇ２、ＫＳＯＭ、ＣＲまたはＴＣＭ−１９９、Ｇ１／Ｇ２を使用できる。ＮＴ胚は典型的には約１０時間インキュベートする。好ましくは、ＮＴ胚は染色体が相互に解離し始めたり、かつ／または、活性化後に小核が形成されるほど長時間はインキュベートしない。或いは、ＮＴ胚を培地中で培養する必要はない。
【００６６】
ＮＴ胚を生産するために使用する卵母細胞が除核されていない場合は、ＮＴ胚は培地中でインキュベートされるか否かに関わらず、場合により除核することができる。ＮＴ胚の除核は、ＮＴ胚の母方遺伝物質の除去が含まれるが、ドナー遺伝物質の除去は行わない。ＮＴ胚の除核は後に記載する。好ましくは、ＮＴ胚を生産するために使用する卵母細胞が除核されていない場合は、本発明の方法は好ましくはＮＴ胚の除核を含む。更にまた、ＮＴ胚を生産するために使用する卵母細胞が活性化されていない場合は、方法は好ましくはＮＴ胚の活性化を包含する。ＮＴ胚の活性化は除核工程の前または後の何れかに行うことができる。
【００６７】
除核
卵母細胞はドナー遺伝物質の導入の前に除核してよい。卵母細胞の除核は極体および隣接する細胞質を除去するためにマイクロピペットを使用して顕微手術的に行うか、または、化学的処理により行ってよい（例えばＢａｇｕｉｓｉら，Ｔｈｅｒｉｏｌ．，５３，２９０（２０００）参照）。ドナー遺伝物質の導入よりも前に除核を行う場合は、ＭＩＩ卵母細胞の除核に関して以前に記載されている方法（Ｔａｏら，Ａｎｉｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｓｃｉ．，５６，１３３−４１（１９９９））を用いるか、またはＧｏｔｏら（Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．Ｊ，７０，２４３−２４５（１９９９））の記載した方法により行ってよい。次に卵母細胞をスクリーニングして良好に除核されたものを特定する。このスクリーニングは、ＤＮＡに特異的に結合する検出可能なマーカー（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝ハムスター胚培地（ＨＥＣＭ，Ｓｅｓｈａｇｉｎｅら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４０，５４４−６０６，（１９８９））中１μｇ／ｍｌ３３３４２Ｈｏｅｃｈｓｔ染料）で卵母細胞を染色し、そして次に卵母細胞または除核操作法の間に除去された細胞質および母方遺伝物質の何れかを１０秒未満の間紫外線照射の下で観察することにより行うことができる。次に除核が成功した卵母細胞を適切な培地、例えばＴＣＭ−１９９、Ｇ１／Ｇ２またはＣＲ１ａａ＋１０％血清中に入れる（Ｓｔｉｃｅら，米国特許５，９４５，５７７）。
【００６８】
ドナー遺伝物質の導入の前に除核されるインビトロ成熟卵母細胞は、それらが適切な段階、例えば未成熟卵核胞、成熟途中（ＭＩからＭＩＩ）または成熟状態となった時点で除核することができる。ドナー遺伝物質の導入の前に除核されるインビボ成熟卵母細胞は、単離後、好ましくは単離直後に除核できる。
【００６９】
ＮＴ胚を生産するために使用する卵母細胞が除核されていない場合は、ＮＴ胚を除核できる。ＮＴ胚内部において、母方遺伝物質は例えばＮＴ胚内のドナー核の位置、第１の極体の形成またはそれらの組み合わせによりドナー遺伝物質と識別できる。ＮＴ胚内のドナー遺伝物質の既知の位置は、母方遺伝物質の位置に対して卵黄周囲腔内のどこに位置していたかによる。母方遺伝物質はドナー遺伝物質の転移の間に透明体内に位置する開口部の近傍にあり、好ましくはドナー遺伝物質はその領域から隔たって位置する。従って、細胞質のその領域（透明体の開口部近傍）は除核ピペットを使用するか、透明体中の開口部を介した細胞質の排除により、好ましくは除核ピペットにより除去できる（例えばＰｒａｔｈｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，３７，８５９（１９８７）；およびＧｏｔｏら，Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．Ｊ，２０，２４３−２４５（１９９９）参照）。ＭＩ卵母細胞を核転移方法に用いる場合、卵母細胞はドナー遺伝物質の導入後に減数分裂においてＭＩＩに進行する。その場合、第１の極体はまた母方の遺伝物質を特定するための目印として使用できる。ヘキストの染料を用いて除去された細胞質中の母方の遺伝物質の存在の確認など、遺伝物質の可視化を行える。これらの方法は単独で、または、相互に組み合わせて使用することにより、染色体の位置を確認し、卵母細胞の除核を確認できる。
【００７０】
母方およびドナーの遺伝物質の両方を含むＮＴ胚は即座に除核する必要はなく、または、本発明の一部の局面においては全く除核しない。即ちＮＴ胚は少なくとも一時的には母方遺伝物質とドナー遺伝物質の両方を含む。例えばＷｉｌｌａｄｓｅｎら．（Ｎａｔｕｒｅ，３２０，６３−６５（１９８６））はＭＩＩ卵母細胞から得た非除核ＮＴ胚を用いてクローン化されたヒツジ胚を生産している。母方遺伝物質は胎盤のみに寄与しており、即ち、発生して最終的に胎児または仔を形成する細胞は母方遺伝物質を含まないと予測される。
【００７１】
活性化
卵母細胞またはＮＴ胚は当該分野でよく知られた人工活性化法を用いて活性化してもよい（例えばＳｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈら，（米国特許５，４９６，７２０号）；およびＳｔｉｃｅら，（米国特許５，９４５，５７７号）参照）。卵母細胞はドナー遺伝物質の導入前に、または、ドナー遺伝物質の導入と同時に活性化してよい。或いは、そして好ましくは、ＮＴ胚を活性化してよい。典型的には、卵母細胞をドナー遺伝物質の導入前に活性化する場合は、活性化された卵母細胞は活性化の直後、または、約１０時間以内に使用する。ＮＴ胚を活性化する場合は、活性化はドナー遺伝物質の導入と概ね同時に、または、導入後約１０時間までに行う。
【００７２】
活性化は細胞の蛋白ホスホリル化を低減する、細胞による蛋白合成を低減する、または、細胞におけるカチオン濃度を上昇させる薬剤の使用を包含する。蛋白ホスホリル化はホスホリル化を抑制する薬剤、例えば、セリンスレオニンキナーゼ抑制剤、例えば６−ジメチルアミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリンまたはスフィンゴシンを用いて低減することができる。蛋白のホスホリル化は蛋白の脱ホスホリル化を誘発する薬剤、例えばホスファターゼＡまたはＢの使用により低減することもできる。細胞による蛋白の合成を低減する薬剤は、例えばシクロヘキシミドを包含する。細胞内のカチオン濃度を上昇させる薬剤は、例えばイオノマイシン、イオノフォア、エタノール、Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋非含有培地、ホルボールエーテルおよび電気ショックを包含する。使用できる他の試薬はチメラソールおよびＤＴＴを包含する（Ｍａｃｈａｔｙら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５７，１１２３（１９９７））。
【００７３】
活性化方法の特定の例を以下に示す。
【００７４】
１．イオノマイシンおよびＤＭＡＰによる活性化：１−  卵母細胞を４分間ＤＭＡＰを２ｍＭ含有するイオノマイシン（５μＭ）中に入れ；２−  ＤＭＡＰを２ｍＭ含有する培地中に卵母細胞を移して４時間保持し；３−  ４回洗浄して培地に入れる。
【００７５】
２．イオノマイシン、ＤＭＡＰおよびロスコビチンによる活性化：１−  卵母細胞を４分間ＤＭＡＰを２ｍＭ含有するイオノマイシン（５μＭ）中に入れ；２−  ＤＭＡＰを２ｍＭおよびロスコビチンを２００μＭ含有する培地中に卵母細胞を移して３時間保持し；３−  ４回洗浄して培地に入れる。
【００７６】
３．イオノマイシン、ついてサイトカラシンおよびシクロヘキシミドへの曝露による活性化：１−  卵母細胞を４分間イオノマイシン（５μＭ）中に入れ；２−  ５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢおよび５μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含有する培地に卵母細胞を移して５時間維持し；３−  ４回洗浄して培地に入れる。
【００７７】
４．電気パルスによる活性化：１−  卵を１００μＭＣａＣｌ２含有マンニトール培地に入れ；２−  各パルス間２２分としながら２０μｓｅｃの１．０ｋＶｃｍ−１のパルスを３回与え；３−  ５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含有する培地に卵母細胞を移し、３時間維持する。
【００７８】
５．エタノール、次いでサイトカラシンおよびシクロヘキシミドへの曝露による活性化：１−  卵母細胞を１分間７％エタノール中に入れ；２−  ５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢおよび５μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含有する培地に卵母細胞を移して５時間維持し；３−  ４回洗浄して培地に入れる。
【００７９】
６．アデノホスチンのマイクロインジェクションによる活性化：１−  アデノホスチン１０μＭを含有する溶液を１０から１２ピコリットル卵母細胞に注射し；２−  卵母細胞を培地に入れる。
【００８０】
７．精子因子のマイクロインジェクションによる活性化：１−  例えば霊長類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、ラット、ウサギまたはハムスターから単離した精子因子１０から１２ピコリットルを卵母細胞に注射し；２−  卵を培地に入れる。
【００８１】
８．組み換え精子因子のマイクロインジェクションによる活性化。
【００８２】
９．ＤＭＡＰ、次いでシクロヘキシミドおよびサイトカラシンＢへの曝露による活性化：１−  約１時間約２ｍＭのＤＭＡＰ中に卵母細胞またはＮＴ単位をいれ、その後、約２から１２時間、好ましくは約８時間、５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢおよび５μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド中でインキュベートする。
【００８３】
ブタ卵母細胞およびＮＴ胚の活性化は、ＫＳＯＭまたはＧ１／Ｇ２培地中約１から約２０％ＥＴＯＨ、好ましくは８％ＥＴＯＨを１０分間、その後、ＫＳＯＭまたはＧ１／Ｇ２培地中約１ｍＭから約１０ｍＭのＤＭＡＰ、好ましくは約２ｍＭのＤＭＡＰ中を５時間使用してよい。好ましくは、ブタ卵母細胞およびＮＴ胚は約５０Ｖ／ｍｍから約２００Ｖ／ｍｍ（直流）、より好ましくは約７５Ｖ／ｍｍのパルスを２回適用することにより活性化する。２パルスは各々好ましくは６０μ秒の長さとし、そして好ましくは、約５秒間の間隔をあける。好ましくは、活性化はＺｉｍｍｅｒｍａｎ融合培地中において行う（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．，６７，１６５−１８２（１９８２））。
【００８４】
ウシ卵母細胞およびＮＴ胚はＹａｎｇ等の方法（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４２（Ｓｕｐｐｌ．１），１１７（１９９２））により、より好ましくは、ウシ卵母細胞を約１μＭから約１００μＭのイオノマイシン、好ましくは約５０μＭのイオノマイシンに１０分間、そして約１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド、好ましくは約１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドに約２時間から約１０時間、好ましくは約６時間曝露することにより活性化してよい。好ましくは、ウシ卵母細胞およびＮＴ胚は、細胞中のカチオン濃度を上昇させる薬剤への曝露、次いで、細胞中の蛋白合成を低減する薬剤および／またはマイクロフィラメント抑制剤である薬剤への曝露により活性化する。より好ましくは、ウシ卵母細胞およびＮＴ胚は約１μＭから約１００μＭのカルシウムイオノフォア、好ましくは約５μＭカルシウムイオノフォアに約１０分間曝露する。その後、約１μｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ、好ましくは約５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ、および、約１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌシクロヘキシミド、好ましくは約１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド中で約１時間インキュベートする。その後、約１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌシクロヘキシミド、好ましくは約１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド中で約５時間インキュベートする。好ましくは、活性化処理の後、ウシＮＴ胚をＢＡＲＣ培地中で培養する（Ｐｏｗｅｌｌら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎ．，５５，２８７（２００１））。
【００８５】
ブタまたはウシの卵母細胞またはブタまたはウシのＮＴ胚が活性化されているかどうかは、ドナー核の膨潤、および、活性化後約１０時間から約３０時間の胚の分裂を観察することにより決定できる。
【００８６】
人工的な活性化方法を用いる代わりに、または、人工的な活性化方法と組み合わせて、受精卵母細胞の細胞質を用いて卵母細胞またはＮＴ胚を活性化することもできる。卵母細胞またはＮＴ胚を活性化するための受精卵母細胞原形質の使用は本明細書においては「自然活性化」と称する。受精卵母細胞細胞質は精子を受精させた卵母細胞から細胞質を除去することにより得ることができる。受精卵母細胞細胞質はピペッティングにより除去し、その後、活性化すべき卵母細胞またはＮＴ胚に直接注射する。受精卵母細胞細胞質は活性化すべき卵母細胞またはＮＴ胚の容量の約１０％から約５０％容量までの容量で注射できると予測される。
【００８７】
上記したとおり、活性化は核転移の前、同時または後に行ってよい。一般的に活性化は核転移および融合の約４０時間前から核転移および融合の約４０時間後、より好ましくは核転移および融合の約２４時間前から核転移および融合の約２４時間後、そして最も好ましくは核転移および融合の約４から９時間前から核転移および融合の約４から９時間後に行う。
【００８８】
良好な核リプログラミングの評価および活性化ＮＴ胚の転移
良好な核リプログラミングは活性化されたＮＴ胚が発生して胚盤胞段階となったかどうかを調べることにより評価する。ブタおよびウシの両方について、活性化されたＮＴ胚の胚盤胞までの発生は７日以内に完了し、典型的には栄養膜および内細胞塊を含む。
【００８９】
活性化されたＮＴ胚はレシピエント動物に即座に転移させるか、または、例えばＫＳＯＭ培地、ＮＣＳＵ−２３培地、ＢＡＲＣ培地、Ｇ１．２／Ｇ２．２培地、または他の当該分野でよく知られた培地中で約８日まで培養する（例えばＳｔｉｃｅら，米国特許５，９４５，５７７号；Ｗｅｌｌｓら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６０，９９６−１００５（１９９９）；およびＴａｏら，Ａｎｉｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，Ｓｃｉ．，５６，１３３−４１（１９９９））。好ましくは、活性化ＮＴ胚は約１２時間から約３６時間（ブタＮＴ胚の場合）または約７から約８日間（ウシＮＴ胚の場合）培養する。次に、未損傷のＮＴ胚（一部は分裂）を同調させたレシピエント動物に転移させ、即ち、転移させたＮＴ胚は、受精胚がレシピエント内にある場合と同様の段階、または約１日前または１日後となるようにする。ブタの場合は、約１から約３００個のＮＴ胚を各レシピエント動物に転移させることができるが、典型的には約５０から約１５０胚を転移させ、そして理想的には１００胚を転移させる。動物における外科的または非外科的な転移は当該分野でよく知られている。例えばブタにおける外科的または非外科的な転移はＣｕｒｎｏｃｋら（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，３７，９７−９８（１９７６））およびＨａｚｅｌｅｇｅｒら（Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌ．，５１，８１−９１（１９９９））により記載されている。好ましくは、動物はＮＴ胚のドナー遺伝物質と同様の種のものとする。
【００９０】
どのレシピエントが妊娠しているかを調べるには超音波と発情期への回帰がないことを用いる。組織または細胞の移植のために必要であれば、ＮＴ胎仔を外科的回収法により妊娠期間中に採取できる。生存しているウシまたはブタが必要である場合は、妊娠をそれぞれ約２８５日または１１４日継続させ、そして一部の仔は酸素の供給および他の介入などの形態の新生児補助を必要とする場合がある（Ｈｉｌｌら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌ．，５１，１４５１（１９９９））。
【００９１】
他の情報源
卵母細胞の成熟、卵母細胞の除核、細胞の活性化、インビトロの胚の発生、および他の方法の説明を一般的に哺乳類との関連において本明細書に記載する場合、以下の参考文献に特定の哺乳類に対するそのような方法が更に説明されている。以下の参考文献は本発明を理解するために提示したものであり、本発明の従来技術を説明したり構成するものではない。ブタに関しては、研究者らは卵母細胞の成熟、卵母細胞の除核、細胞の活性化、インビトロの胚の発生および他の方法に関する材料および方法を報告している。例えば、Ｇｒｏｃｈｏｌｏｖａら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌｏｇｙ  ２７７：４９−５６；Ｓｃｈｏｅｎｂｅｃｋら，１９９３，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４０：２５７−２６６；Ｐｒａｔｈｅｒら，１９８９，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ４１：  ４１４−４１８；  Ｐｒａｔｈｅｒら，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２８：  ４０５−４０９；  Ｊｏｌｌｉｆｆ  ＆  Ｐｒａｔｈｅｒ，１９９７，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５６：５４４−５４８；Ｍａｔｔｉｏｌｉら，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３０：１０９−１２５；Ｔｅｒｌｏｕｗら，１９９２，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３７：３０９；Ｐｒｏｃｈａｚｋａら，１９９２，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．９６：７２５−７３４；Ｆｕｎａｈａｓｈｉら，１９９３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３６：３６１−３６７；Ｐｒａｔｈｅｒら，Ｂｉｏ．Ｒｅｐ．Ｖｏｌ．５０  Ｓｕｐ  １：２８２；Ｎｕｓｓｂａｕｍら，１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４１：７０−７５；  Ｆｕｎａｈａｓｈｉら，１９９５，Ｚｙｇｏｔｅ  ３：２７３−２８１；Ｗａｎｇら，１９９７，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ５６：１３７６−１３８２；Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａら，１９８９，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ５８：  １３２１−１３２９；Ｍａｃｈａｔｙら，１９９７，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ５７：８５−９１；およびＭａｃｈａｔｙら，１９９５，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ５２：７５３−７５８を参照できる。
【００９２】
ウシに関しては、研究者らは卵母細胞の成熟、卵母細胞の除核、細胞の活性化、インビトロの胚の発生、および他の方法に関する材料および方法を報告している。例えば米国特許５，４５３，３５７号および５，６７０，３７２号、「多能性胚性幹細胞およびその製造方法」、Ｈｏｇａｎ；  Ｓｉｍｓ  ＆  Ｆｉｒｓｔ，１９９３，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３９：３１３；Ｋｅｅｆｅｒら，１９９４，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３８：２６４−２６８；米国特許４，９９４，３８４号、「ウシ胚の複製」、Ｐｒａｔｈｅｒら，；米国特許５，０５７，４２０号、「ウシ核移植」、Ｍａｓｓｅｙ  ＆  Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ；  Ｄｅｌｈａｉｓｅら，１９９５，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．７：１２１７−１２１９；Ｌａｖｉｏｒ  １９９４，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３７：４１３−４２４；ＰＣＴ出願国際公開公報第９５／１０５９９号、表題「胚性幹細胞様細胞」；Ｓｔｉｃｅら，１９９６，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５４：１００−１１０；Ｓｔｒｅｌｃｈｅｎｋｏ，１９９６，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４５；１３０−１４１；国際公開公報第９７／３７００９号、表題「培養内細胞塊−有蹄類胚から得た系統」、Ｓｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｇｏｌｕｅｋｅ，１９９７年１０月９日公開；米国特許５，２１３，９７９号、表題「インビトロウシ胚培養」、Ｆｉｒｓｔら，１９９３年５月２５日；米国特許５，０９６，８２２号、表題「ウシ胚培地」、Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｓ，Ｊｒら，１９９２年３月１７日；Ｓｅｉｄｅｌ  ａｎｄ  Ｅｌｓｄｅｎ，１９９７，酪農用ウシにおける胚の転移、Ｗ．Ｄ．Ｈｏａｒｄ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｃｏ．，Ｈｏａｒｄｓ  Ｄａｉｒｙｍａｎ；  Ｓｔｉｃｅ  ＆  Ｋｅｅｆｅｒ，１９９３，「多世代のウシ胚クローン化」、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ４８：７１５−７１９；  Ｗａｇｏｎｅｒら，１９９６，「ウシ卵母細胞の機能的除核：遠心分離および紫外線の影響」、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４６：２７９−２８４；  Ｐｉｅｔｅｒｓｅら，１９８８，「卵巣の経膣的超音波走査の間のウシ卵母細胞の吸引」、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３０：７５１−７６２；Ｓａｉｔｏら，１９９２，Ｒｏｕｘ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０１：１３４−１４１；および米国特許５，４９６，７２０号、表題「単為生殖卵母細胞活性化」、１９９６年５月５日、Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈら．を参照できる。
【００９３】
ヒツジおよびヤギについては、研究者らは卵母細胞の成熟、卵母細胞の除核、細胞の活性化、インビトロの胚の発生、および他の方法に関する材料および方法を報告している。例えば、Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：６３−６６；Ｒｕｆｆｉｎｇら，１９９３，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ４８：  ８８９−９０４；Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗｉｌｍｕｔ，１９８９，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ４０：１０２７−１０３５；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら，１９９１，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３５：２４０；Ｃａｍｐｂｅｌｌら，１９９５，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４３：１８１；Ｃａｍｐｂｅｌｌら，１９９６，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４５：２８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４−６６；Ｗｉｌｍｕｔら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３；Ｌｅｄｄａら，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  １０９：７３−７８；Ｂｙｒｄら，１９９７，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４７：８５７−８６４；Ｗｉｌｍｕｔら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３；ＬｅＧａｌ，１９９６，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４５：１１７７−１；Ｐａｗｓｈｅら，１９９６，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４６：９７１−９８２；Ｇａｌｌら，１９９３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３６：５００−５０６；Ｗａｌｋｅｒら，１９９６，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ５５：７０３−７０８；およびＧａｒｄｎｅｒら，１９９４，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ５０：３９０−４００を参照できる。
【００９４】
トランスジェニック用途
特に好ましい実施態様においては、本発明の胚、胎仔および／または動物はトランスジェニックである。「トランスジェニック」という用語は本明細書においては、そのゲノムが組み換えＤＮＡ技術を用いて改変されている細胞１個以上を含む胚、胎仔または動物を指す。好ましい実施態様においては、トランスジェニック胚、胎仔または動物はトランスジェニック細胞１個以上を含む。生殖細胞系統の伝達は、その用語を本明細書において使用される際にはトランスジェニック胚、胎仔または動物の要件ではないが、特に好ましい実施態様においては、トランスジェニック胚、胎仔または動物は生殖細胞を通してそのトランスジェニック特性を受け渡すことができる。特定の実施態様においては、トランスジェニック胚、胎仔または動物は外来性遺伝子、例えば外来性ＲＮＡおよび蛋白分子１種以上を発現する。最も好ましくは、トランスジェニック胚、胎仔または動物はトランスジェニック核ドナー細胞を用いた核転移操作法により得られるものである。
【００９５】
当業者が容易に入手できる材料および方法を利用して本発明の核ドナー細胞をトランスジェニック細胞に変換することができる。核ドナーの細胞において核ＤＮＡが修飾されれば、これらの細胞より生じる胚、胎仔および動物もまた修飾された核ＤＮＡを含むことができる。従って、当業者が容易に入手できる材料および方法を核ドナー細胞に適用してトランスジェニックなクローン化されたキメラ動物を生産することができる。例えば欧州特許出願２５４１６６、表題「乳汁中に望ましい蛋白を分泌するトランスジェニック動物」、国際公開公報第９４／１９９３５号、表題「乳汁中からの目的の成分の単離」、国際公開公報第９３／２２４３２号、表題「トランスジェニックな移植前の胚の特定方法」、国際公開公報第９５／１７０８５号、表題「乳汁中の抗体のトランスジェニック名生産」、Ｈａｍｍｅｒら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５．８０−６８５；Ｍｉｌｌｅｒら，１９８６，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２０：４８１４８８；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，１９９２，Ｊ．Ａｎｉ．Ｓｃｉ．７０：２２０７−２１１１；Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａら，１９９８，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５８：１３２１−１３２９；Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａら，１９９７，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．（ｓｕｐｐｌ．）５２：２４５−２５４；およびＮｏｔｔｌｅら，１９９７，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．（ｓｕｐｐｌ．）５２：２４５−２５４を参照でき、これらの各々は全ての図、図面および表を含むその全体が参照して本明細書に組み込まれる。
【００９６】
トランスジェニック細胞を発生させるための方法は典型的には（１）細胞の核：ＤＮＡ内に特定のＤＮＡ配列を挿入するために有用な適切なＤＮＡコンストラクトを組み立てること；（２）細胞内にＤＮＡ配列をトランスフェクトすること；（３）ランダム挿入および／または相同組み換えを起こすこと、を包含する。このような方法から生じる修飾は標的ゲノム内への適切なＤＮＡコンストラクトの挿入；標的ゲノムからのＤＮＡの欠失；および／または標的ゲノムの突然変異を包含する。
【００９７】
ＤＮＡコンストラクトは目的の遺伝子並びに種々のエレメント、例えば調節プロモーター、インスレーター、エンハンサーおよびリプレッサー並びにＤＮＡコンストラクトから転写されたＲＮＡへのリボソーム結合のためのエレメントを含むことができる。ＤＮＡコンストラクトはまたリボザイムおよびアンチセンスＤＮＡおよび／またはＲＮＡをコードすることができる。更にまた、ＤＮＡコンストラクトは形質転換体の薬剤選択のための遺伝子のような選択エレメントを含むことができる。これらの例は当該分野でよく知られており、限定的なものではない。
【００９８】
データベースおよび商業セクターにおいて容易に得られる調節エレメントおよび遺伝子のＤＮＡ配列と組み合わせて使用できる効果的な組み換えＤＮＡ手法により、当業者は容易に本明細書に記載した材料および方法を用いてトランスジェニック細胞を樹立するために適するＤＮＡコンストラクトを容易に発生することができる。例えば、トランスフェクション手法は当該分野でよく知られており、細胞へのＤＮＡコンストラクトのトランスフェクションを実施するための材料および方法は市販されている。例えば、ＤＮＡコンストラクトで細胞をトランスフェクトするために使用できる材料は親油性化合物、例えばリポフェクチン（商標）、スーパーフェクト（商標）、リポＴＡＸＩ（商標）およびＣＬＯＮフェクチン（商標）である。特定の親油性化合物を誘導することにより、細胞へのＤＮＡコンストラクトのトランスフェクションを媒介するためのリポソームを形成することができる。更にまた、当該分野でよく知られているカチオン系のトランスフェクション剤を利用することにより核酸分子で細胞をトランスフェクトできる（例えばリン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＲデキストラン、ポリブレン、ポリアミン）。トランスフェクション試薬として蛋白系または両親媒性のポリアミンを使用する他の手法も当該分野でよく知られている。更にまた、当該分野で知られているエレクトロポレーションの手法を利用して核酸分子を細胞内に転座させてよい。パーティクルガン手法もまた外因性ＤＮＡを細胞内に導入するために当該分野でよく知られている。
【００９９】
ＤＮＡコンストラクトに由来する標的配列は、ＤＮＡコンストラクトの合理的設計により分子ＤＮＡの特定の領域に挿入できる。このような設計の手法および方法は当該分野でよく知られている。例えば、米国特許５，６３３，０６７号、「トランスジェニックウシまたはトランスジェニックウシ胚の生産方法」、ＤｅＢｏｅｒら，１９９７年５月２８日発行；米国特許５，５１２，２０５号、「哺乳類細胞における相同組み換え」、Ｋａｙら，１９９７年３月１８日発行；およびＰＣＴ出願国際公開公報第９３／２２４３２号、「トランスジェニック移植前胚の特定方法」が参照でき、これらの各々は、全ての図、図面および表も含めてその全体が参照して本明細書に組み込まれる。所望のＤＮＡ配列が細胞の核ＤＮＡ内に挿入された後、挿入領域の位置並びに所望のＤＮＡ配列が核ゲノム内に挿入された頻度を、当該分野でよく知られた方法により確認できる。
【０１００】
所望のＤＮＡ配列は、特定の寄生虫、疾患および感染性物質に対するクローン化トランスジェニック動物の耐性を増強するために細胞の核ＤＮＡ内に挿入できる。寄生虫の例は蠕中、ハエ類、ダニ類およびノミ類を包含する。トランスジーンは疾患または寄生状態の症状を完全になくすか部分的に軽減することにより、または、寄生虫または疾患を制御する蛋白を生産することにより、特定の寄生虫または疾患への耐性を付与できる。感染性物質の例は細菌、カビおよびウィルスを包含する。疾患の例は萎縮性鼻炎、コレラ、レプトスプラ症、仮性狂犬病、膿疱症およびブルセラ症を包含する。これらの例は限定的なものではなく、本発明は当該分野でよく知られた如何なる疾患または寄生虫または感染性物質にも関するものである。例えばＨａｇａｎ  ＆  Ｂｒｕｎｅｔｓの家畜動物の感染性疾患（第７版）、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ＆  Ｔｉｍｏｎｅｙ，１９８１，Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｔｈａｃａ  ＮＹを参照できる。
【０１０１】
広範な種類の転写および翻訳の調節配列を核ドナー細胞の核ＤＮＡ内に挿入してよい。転写および翻訳の調節シグナルは、ウイルス原料、例えばアデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウィルス、シミアンウィルス等から誘導してよく、調節シグナルは高い濃度の発現が可能である特定の遺伝子配列に関わるものである。更にまた、アクチン、カゼイン、αラクトアルブミン、ウロプラキン、コラーゲン、ミオシン等のような哺乳類発現産物から得たプロモーターも使用してよい。遺伝子産物の発現がモジュレートできるように抑制または活性化を可能とする転写調節シグナルを選択してよい。有利なものは、化学物質または薬品のような外因性の因子により抑制または開始できる調節シグナルである。これらの例は限定的なものではなく、本発明は如何なる調節エレメントにも関する。調節エレメントの他の例は本明細書に記載するとおりである。
【０１０２】
トランスジェニック細胞の創生に適するＤＮＡコンストラクト内部に保有される遺伝子により種々の蛋白およびポリペプチドをコードできる。これらの蛋白またはポリペプチドにはホルモン、成長因子、酵素、凝固因子、アポリポ蛋白、受容体、薬剤、医薬品、バイオ薬品、栄養薬品、癌原生物質、腫瘍抗原、腫瘍抑制剤、サイトカイン、ウィルス抗原、寄生虫抗原、細菌抗原および化学的に合成された重合体および化学的、細胞および／または酵素的過程により生合成および／または修飾された重合体が包含される。これらの化合物の特定の例には、プロインスリン、インスリン、成長ホルモン、アンドロゲン受容体、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン成長因子結合蛋白、表皮成長因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、皮膚成長因子、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、血管形成因子（例えば酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子およびアンジオゲニム）、血管形成抑制剤（例えばエンドスタチンおよびアンジオスタチン）、マトリックス蛋白（ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ラミニン）、癌遺伝子（ｒａｓ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｓｉｓ、ｊｕｎ）、Ｅ６またはＲ７形質転換配列、ｐ５３蛋白、サイトカイン受容体、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２、α、βまたはγＩＦＮ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ウィルスカプシド蛋白およびウィルス、細菌および寄生虫の生物に由来する蛋白が包含される。発現できる他の特定の蛋白またはポリペプチドには、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α−１−抗トリプシン、コレステロール−７β−ヒドロキシラーゼ、トランケーションされたアポリポ蛋白Ｂ、リポ蛋白リパーゼ、アポリポ蛋白Ｅ、アポリポ蛋白Ａ１、ＬＤＬ受容体、酸化されたリポ蛋白に対するスカベンジャー受容体、各ＶＥＧＦの分子変異体、およびこれらの組み合わせが包含される。他の例としては抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、抗体フラグメント、凝固因子、アポリポ蛋白、薬剤、腫瘍抗原、ウィルス抗原、寄生虫抗原、モノクローナル抗体および細菌抗原が挙げられる。当業者の知るとおり、これらの蛋白は広範な蛋白のクラスに属し、そして、これらのクラス内またはこれらのクラス外の他の蛋白も使用できる。これらは例示に過ぎず、如何なる点においても限定する意図はない。
【０１０３】
本発明の何れかの局面に従って調製したブタは移植治療のための組織の原料として使用してよい。同様に、この方法で調製したブタ胚またはそれから発生させた細胞系統も細胞移植治療において使用してよい。従って、本発明の別の局面において、上記した方法により調製された胚または動物から細胞が調製されている、患者にブタ細胞を投与することを含む治療方法が提供される。本発明のこの局面は医療、例えば細胞移植治療におけるこのような細胞の使用、そして、移植のための細胞または組織移植片の調製におけるこのような胚から誘導した細胞の使用にも至るものである。細胞は組織化されて器官、例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、角膜、神経（例えば脳、中枢神経系、脊髄）、皮膚となってよく、または、細胞は血液細胞（例えば血球、即ち赤血球、白血球）または造血幹細胞または他の幹細胞（例えば骨髄）となってよい。従って本発明の方法は異種移植片の調製における利用性も与える。これらの方法は、患者への治療的移植のための胚細胞のインビトロ分化、例えば細胞を遺伝子的に修飾して医学上の欠損を是正する場合を包含する。このような用途は糖尿病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、ＡＩＤＳ等のような疾患、または、罹患した個体の細胞または臓器の機能の損失を特徴とする疾患状態の治療を包含する。
【０１０４】
天然のブタ組織のヒト抗体誘導超急性拒絶反応のため、移植拒絶を回避するために種々の手段を用いて組織が修飾されている。１つの特定の実施態様においては、ブタにおいて１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼブタ遺伝子をノックアウト（即ち遺伝子の発現を抑制する）することにより超急性拒絶反応の危険性または発生率を最小限としている。ノックアウトの方法は当該分野でよく知られており、ＭａｃｋａｔｙらのＰＣＴ出願国際公開公報第９８／５７５３８号に詳細に説明されている。
【０１０５】
幹細胞の用途
ドナー核が転移されているレシピエント細胞は、胚の発生の適切な段階に達するまでインビトロまたはインビボで培養してよい。本発明は幹細胞系統の誘導において、胚の所望の細胞、例えば内細胞塊から細胞系統を誘導することを包含する。胚は胚盤胞段階まで培養するのが適切である。
【０１０６】
対象となる胚性または幹様細胞は、ドナー細胞を除核された卵母細胞と融合させ、上記した胚性または幹様細胞を取得し、そして、このような細胞を所望の細胞型への分化を促進する条件下に培養することにより、何れかの所望の分化した細胞を得るために用いることができる。分化した細胞の例は、とりわけ、ＡＩＤＳ、白血病、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳおよび脳性麻痺の治療のための造血幹細胞および神経細胞を包含する。
【０１０７】
二重核転移
ＮＴ方法から得た胚を種々の方法で操作できる。本発明は核転移少なくとも１回により生じるクローン化された胚、細胞、細胞系統、胎仔および動物に関する。ＮＴ操作２回以上を行って全能の胚、胎仔および動物の生産および／または胎盤発達の核転移効率を増強してよい。クローン化された胚、胎仔および動物のための方法にＮＴサイクル２回以上を組み込むことは、更なる利点を与える。例えば、複数のＮＴ操作を組み込むことにより、クローン化された胚、胎仔および動物の数を倍加するための方法が提供される。更にまた、遺伝子ターゲティング方法はある遺伝子をノックアウトまたは置き換えるためには２倍体細胞中の遺伝子の両方のコピーがターゲティングされることを必要とする。このような方法は、遺伝子を効率的にターゲティングするためには２回以上のＮＴ操作を必要とする場合がある。当業者の知るとおり、そのような操作に必要とされる方法は目的の動物種により異なる。
【０１０８】
ＮＴサイクル２回以上を組み込むＮＴ手法のためには、活性化工程と同時にＮＴサイクル１回以上を進行、続行および／または実施してよい。前述において定義したとおり、活性化工程は、本明細書において定義する電気的および／または非電気的な手段により行ってよい。活性化工程はまた、ＮＴサイクルと同じ時期（例えばＮＴサイクルと同時）に行ってもよく、および／または、活性化工程はＮＴサイクルより前に行ってよい。ＮＴサイクルにより得られるクローン化された胚は（１）分離するか、または、（２）更に発生を進行させることができる。
【実施例】
【０１０９】
材料および方法
細胞株の樹立
ＵＳＤＡ認可食肉処理場において処理されたウシを用いて一次細胞系統を作製した。組織試料は種々の試料部位（腎臓、前足、肋間領域等）から、１）食肉処理後であるが死骸が冷却器に入れる直前、２）−２．０℃で２４時間の後、または３）−２．０℃２４時間および更に２から４．０℃２４時間の後に採取した。組織を死骸からはずし、細胞培養実験室に輸送するために、氷上でＰＢＳ＋１０．０％（ｖ：ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１０，０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、Ｓｉｇｍａ）中に入れた。組織試料を小片に裁断し、体外移植組織を、５．０％ＣＯ２および空気の湿潤雰囲気下、３５ｍｍの組織培養プレート中、３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔａｋｅｒ  Ｉｎｃ．）および１．０％（ｖ：ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）Ｆ−１２（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。細胞培養物樹立の後、体外移植組織を取り出し、細胞をトリプシン処理により採取し、７５ｃｍ２の組織培養フラスコ中に播種した。細胞がコンフルエントに達した時点で、トリプシン処理により採取し、２０．０％ＦＢＳおよび１０．０％ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２中に凍結した。解凍後、細胞を培養（１０．０％ＦＢＳおよび１．０％（ｖ：ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２）して概ね８０％コンフルエントとし、１５μＭロスコビチン（Ｓｉｇｍａ）を添加し、約２４時間後に核転移を行った。ロスコビチン処理の後、細胞をトリプシン処理し、核転移用に使用できるようにした。その後の核転移プロトコルは以下に記載するとおりである。
【０１１０】
レシピエント細胞質調製
ウシ卵母細胞のインビトロ成熟および除核は既に報告されているとおり、即ち、Ｃｉｂｅｌｌｉら，非静止期の胎児線維芽細胞から生産したクローン化トランスジェニックウシ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８０：１２５６−１２５８；Ｗｅｌｌｓら，培養成体壁性顆粒膜細胞を用いた核転移後のクローン化ウシの生産、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９９９，６０：９９６−１００５；およびＡｒａｔら，除核卵母細胞へのトランスフェクトされた顆粒膜細胞の転移によるトランスジェニックウシ胚の生産、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．２００１，６０：２０−２６に従って行う。慨すれば、ウシ卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を食肉処理場から得られた卵巣上の洞卵胞（直径３から８ｍｍ）の吸引により採取する。緻密非閉鎖性の卵丘卵放射冠および均質な卵質を有するＣＯＣのみを選択する。卵母細胞を１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム、１％ｖ：ｖペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１０，０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）、１ｎｇ／ｍｌｒＩＧＦ−１（Ｓｉｇｍａ）、０．０１Ｕ／ｍｌｂＬＨおよび０．０１Ｕ／ｍｌｂＦＳＨ（Ｓｉｏｕｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｓｉｏｕｘ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＩＡ）を添加したＴＣＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で成熟させる。成熟は１６から１８時間、空気中湿潤５％ＣＯ２下、３９℃において、鉱物油被覆された４穴のプレート中で行う。成熟化の後、ＣＯＣを１００Ｕ／ｍｌヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）含有ＴＬＨｅｐｅｓ培地中で攪拌することにより卵丘−冠を除去する。成熟した卵母細胞は小容量の周囲細胞質中の第１の極体およびＭＩＩプレートを吸引することにより１５μｍ（内径）のガラスピペット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｗｅｓｔｂｕｒｇ，ＮＹ）を用いて除核する。卵母細胞は予め１０から１５分間２μｇ／ｍｌＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２および７．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴＬＨｅｐｅｓ中で染色し、その除核中は７．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを添加したＴＬＨｅｐｅｓ中に維持する。除核は紫外線下に行い、卵母細胞の染色質の除去を確認する。
【０１１１】
ドナー細胞の調製およびＮＴ
ドナー細胞を１０％ＦＢＳと共に培養してコンフルエント（Ｇ１／Ｇ０）とする。ドナー細胞を除核された卵母細胞に転移させる直前に、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）でトリプシン処理することにより細胞を解離させる。細胞をペレット化し、ＤＭＥＭＦ−１２＋１０％ＦＢＳ中に再懸濁する。Ｃｉｂｅｌｉら．（１９９８）（前出）の記載するとおり１５μｍ（内径）のガラスピペットを用いて除核された卵母細胞の卵黄周囲腔に単細胞を挿入する。転移のためには、各トランスジェニック細胞系統における最も輝度の高い細胞をＦＩＴＣフィルターセットを用いてＵＶ光下に選択する。卵母細胞−細胞複合体を融合が起こるまで５％ＣＯ２中３９℃の１０％ＦＣＳ含有ＴＣＭ１９９中に入れる。
【０１１２】
卵母細胞−細胞複合体の融合および活性化
卵母細胞−細胞複合体は、針型電極を用いて、Ａｒａｔら，（２００１）（前出）；およびＭｉｙｏｓｈｉら，（インビトロ生産胚盤胞からのブタ細胞系統の樹立および細胞の除核卵母細胞への転移、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２０００，６２：１６４０−１６４６）の記載に従い、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎの融合培地中で融合させる（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら，電場誘導の細胞と細胞の融合、Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１９８２，６７：１６５−１８２）。単細胞−卵母細胞対を直線状に配置されマイクロマニピュレーターに連結された２本のワイアの間に挟む。細胞質体とドナー細胞の間の接触面は電極に垂直とする。電極間の距離は約１５０μｍ（卵母細胞の直径）とする。２０μｓｅｃの期間４０Ｖの単回の直流パルスをＬＦ１０１融合装置（ＴＲ  Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ）を用いて適用する。パルス後、複合体を１０％ＦＢＳ添加ＴＣＭ１９９中２時間培養し、融合率を測定する。ＮＴ単位の活性化は、Ａｒａｔら，（２００１）（前出）；およびＬｕｉら，（化学的活性化の後の新しく成熟させたウシ卵母細胞の単為生殖的発生および蛋白パターン、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．１９９８，４９：２９８−３０７）により以前に記載されている方法の変法により実施する。慨すれば、融合２時間後、核転移卵母細胞を１０分間５μＭカルシウムイオノフォアに曝露し、その後、空気中５％ＣＯ２中３９℃で１時間１０％ＦＢＳ、２．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＤ（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）添加ＴＣＭ１９９中、そして５％ＣＯ２、５％Ｏ２および９０％Ｎ２中３９℃で５時間１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド添加ＴＣＭ１９９中でインキュベートする。
【０１１３】
ＮＴ胚のインビトロ培養
活性化の後、Ａｒａｔら，（２００１）（前出）；およびＰｏｗｅｌｌら．（トランスフェクトされた細胞を用いたウシ核転移の成功に対する線維芽細胞原料と組織培養用培地の影響、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００１  ５５（１）：２８７）に記載のとおりウシ血清アルブミンを含有するＢＡＲＣ培地の５０μｌ培養液滴中でＮＴ卵母細胞を培養し、５日間５％ＣＯ２、５％Ｏ２および９０％Ｎ２中３９℃で鉱物油被覆された６０ｍｍ培養プレート内に入れ、そして解離したＮＴ胚を５％ＦＢＳ含有ＢＡＲＣ＋ＢＳＡ培地の５０μｌ培養液滴中に移し、更に２日間培養する。
【０１１４】
倍数性の検討および胚盤胞の細胞数
第７日の胚盤胞を２．５時間０．０４μｇ／ｍｌデモコルシン（Ｓｉｇｍａ）および２００μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ）含有培地中で培養する。このインキュベーション期間の後、胚盤胞を４分間ｄＨ２Ｏ中０．５％クエン酸ナトリウム（３８℃）で処理し、次に１５から３０秒間冷メタノール、酢酸、水（ｖ／ｖ、３：２：１）で処理し、スライドガラス上に置く。スライドガラスを１時間室温で乾燥し、そして、５分間５％ギムザ溶液で染色する。少なくとも６個の中期拡散／胚盤胞を光学顕微鏡下１０００倍の倍率で計数する。細胞数を検討するために、５から１０胚盤胞／細胞系統を計数する。胚盤胞段階の胚の核をＰＢＳ溶液およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を１ｍｇ／ｍｌ含有する１０％グリセロール中でスライド上染色する。１から３胚を含む染色溶液の液滴（〜２０μｌ）をスライドガラスの中心に添加し、カバーガラスを液滴上におき、端部を密封する。核はＵＶ光を用いて可視化して計数する。
【０１１５】
結果
【０１１６】
【表１】
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【０１１７】
（結語）
明細書全体を通じて、「含む」または「含んでいる」等の変形語は記載した要素、数または工程または要素、数または工程の群を包含する意図で使用しているものであり、他の要素、数または工程または要素、数または工程の群を排除するものではない。
【０１１８】
「ある（冠詞ａ）」という語は、特段の記載が無い限り複数の対象も含むものとする。即ち、本発明の実施においては、ある細胞培養とは複数の細胞培養を可能ならしめるものである。同様に、ある細胞培養からのある卵母細胞の優先的選択はその細胞培養からの複数の卵母細胞の優先的選択を可能ならしめるものである。
【０１１９】
本出願を通して、種々の出版物を参考にしている。これらの出版物の開示は、本発明が関連する技術の現状を更に詳細に説明するために、その全体が参照して本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
当業者の知るとおり種々の変更や変形が本発明の範囲または精神を超えることなく可能である。本発明の他の実施態様は本明細書に記載した本発明の明細および実施を考慮すれば当業者には明らかである。明細書および実施例は例示のみに過ぎず、本発明の真の範囲および精神は以下の請求項に示されるものである。
【国際調査報告】
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