(57)【要約】本発明は、核酸の高分解能分離および高感度検出のための新規な電気泳動方法を提供する。前記方法は、優れた核酸の分離および検出を達成するために、高分解能バッファーと、逆行する高親和性インターカレーション型色素とを電気泳動システム中に利用することを伴う。試料中の核酸を電気泳動によって分離し検出するためのキットも提供される。前記キットは、φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐの核酸断片と２８２ｂｐの核酸断片との間に少なくとも２．０の分解能を有する高分解能インターカレーション型色素と、正の電荷および少なくとも１０−６Ｍ−１のＤＮＡ親和定数を有する、高親和性インターカレーション型色素とを含むゲルバッファーを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる核酸を電気泳動によって分離し検出する方法であって、（ａ）陽極端および陰極端を有する電気泳動システムを用意するステップと、
（ｂ）前記陰極端から前記システムに前記試料を装荷するステップと、
（ｃ）φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片sと２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０の分解能を提供する高分解能バッファー存在下で、前記陰極端から前記陽極端に向けて両極間に電圧を印加することによって、前記試料中に含まれる核酸を移動させて該核酸を分離するステップと、
（ｄ）前記陽極端から前記陰極端に向けて両極間に印加された電圧の下で移動して、分離された前記核酸との複合体を形成し、正電荷と少なくとも１０−６Ｍ−１のＤＮＡ親和定数とを有する高親和性インターカレーション型色素を、前記陽極端から前記システム内に装荷するステップと、
（ｅ）前記複合体を検出するステップとを含む、試料中に含まれる核酸を電気泳動によって分離し検出する方法。
【請求項２】
前記電気泳動は毛管電気泳動であり、前記電気泳動システムは、φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０の分解能を有する高分解能バッファーで満たされた、陽極端と陰極端とを有する毛管である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料中に含まれる核酸を分離するステップと、該核酸を検出するステップとは、複数のインターカレーション型色素を用いるレーザ誘起蛍光検出−毛管電気泳動法によって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記高親和性インターカレーション型色素は、チアゾール・オレンジ（ＴＯ）、ＳＹＢＲグリーンＩ、ヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−１、ヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−３およびヨウ化と−ＰＲＯ−５からなるグループから選択される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記高分解能バッファーは、φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０の分解能を提供する高分解能インターカレーション型色素を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記高分解能色素は、臭化エチジウム（ＥＢ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびアクリジン・オレンジ（塩酸塩）からなるグループから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記高親和性インターカレーション型色素は、前記核酸を分離するステップ（ｃ）の前に前記電気泳動システム内に装荷される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記高親和性インターカレーション型色素は、前記核酸を分離するステップ（ｃ）の間に前記電気泳動システム内に装荷される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸は、核酸断片、増幅されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡおよびｍＲＮＡからなるグループから選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸断片は、１０ｂｐから１００ｋｂｐまでの範囲内のサイズである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出するステップは、レーザ誘起蛍光（ＬＩＦ）検出または２５４ｎｍでの紫外線検出を利用して実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
アルゴンレーザが蛍光を誘起するために用いられ、前記蛍光は５２０ｎｍで検出される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記電気泳動システムは、高分解能バッファーで満たされた微細管を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記高分解能バッファーは、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）バッファー、トリス−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）およびＭＯＰＳ−トリスからなるグループから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記高親和性インターカレーション型色素は、前記核酸を分離するステップ（ｃ）の間に毛管内に装荷される、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記毛管の陽極端は陽極貯液槽と流体連通しており、前記毛管の陰極端は、陰極貯液槽と流体連通しており、前記毛管、陰極貯液槽および陽極貯液槽は前記高分解能バッファーで満たされ、前記装荷するステップ（ｄ）は、前記陽極貯液槽に前記高親和性インターカレーション型色素を添加することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
試料中の核酸を電気泳動によって分離し検出するためのキットであって、
φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐの核酸断片と２８２ｂｐの核酸断片との間で少なくとも２．０の分解能を有する高分解能インターカレーション型色素を含むゲルバッファーと、
正の電荷と少なくとも１０−６Ｍ−１のＤＮＡ親和定数とを有する高親和性インターカレーション型色素とを含む、キット。
【請求項１８】
前記高親和性インターカレーション型色素は、チアゾール・オレンジ（ＴＯ）、ＳＹＢＲグリーンＩ、ヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−１、ヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−３およびヨウ化−ＰＲＯ−５からなるグループから選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記高分解能色素は、臭化エチジウム（ＥＢ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびアクリジン・オレンジ（塩酸塩）からなるグループから選択される、請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、電気泳動による分離および検出に関する。具体的には、本発明は、逆行するインターカレーション型色素を用いる電気泳動法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的な液体試料からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を分離し検出するためのさまざまな方法が本発明の技術分野で知られている。かかる技術の１つである電気泳動法は、電流が流れる電解質中に溶解または懸濁された電荷分子種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の移動を伴う。自由ゾーン電気泳動、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動（ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）および毛管電気泳動を含む、さまざまなな従来の形式の電気泳動が知られている。
【０００３】
伝統的には、核酸の分離および同定は、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルのようなポリマーゲルのゲル電気泳動によって達成されてきた。ポリマーゲルはさまざまなタイプおよびサイズで調製することができ、これらの多孔度も変化させることができるため、ポリマーゲルには広い用途がある。しかし、時間が経つと不安定になること、重合過程の再現性が低いこと、媒体が脆弱であること、および分離後に検出することのために、ゲル電気泳動は、大規模で高速の用途には一般的には適さない（非特許文献１）。
【非特許文献１】Ｈ．−Ｔ．ＣｈａｎｇおよびＥ．Ｓ．Ｙｅｕｎｇ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ（１９９５）６６９、１１３
【０００４】
毛管電気泳動（ＣＥ）は、核酸の電気泳動分析における顕著な改良技術である。例えば、ＣＥは、局部的なジュール熱の発生が少ない非常に小口径（典型的には５０−１００μｍ）の管状材料（ｔｕｂｉｎｇ）内で実施されるため、従来の電気泳動システムで使われるよりも１０−１００倍高い電場をかけることができる。これは、非常に高速な運転と、改善された分解能と、高い再現性とを可能にする。また、ＣＥは、紫外線（ＵＶ）分光法、電流滴定測定法、導電度測定法、レーザ誘起蛍光法（ＬＩＦ）または熱光学的検出法を含む、オンカラム検出手段に適している。さらにＣＥは、便利なオンライン注入、検出および実時間データ分析を提供するため、自動化に好適である。
【０００５】
典型的なＣＥ分析に注入される試料体積のサイズが小さいため、ＣＥの実用的な用途は敏感な検出システムに強く依存する（非特許文献２）。蛍光インターカレーション型色素（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｄｙｅｓ）またはインターカレート剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）が用いられるＣＥ−ＬＩＦ法によるＤＮＡ分析の感度が高いことについて複数の報告がある。インターカレート剤は、核酸の塩基対またはこれに類する構造の間に挟まって配置される平面的分子である。
【非特許文献２】Ｊ．ＳｋｅｉｄｓｖｏｌｌおよびＰ．Ｍ．Ｕｅｌａｎｄ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（１９９５）２３１，３５９−３６５
【０００６】
インターカレート剤の蛍光は、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合すると数倍増大するので、少量の核酸を検出することが可能になる（特許文献１）。臭化エチジウム（ＥＢ）は、ゲルおよび毛管電気泳動の両方で最も慣用されるＤＮＡインターカレート剤である。その蛍光特性に加えて、ＥＢは、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の高分解能ＣＥを提供することが報告されている（特許文献１、非特許文献１）。ＥＢを用いて達成される高分解能ＣＥ分離は、ＥＢ−ＤＮＡ複合体が形成されるときＤＮＡの電気泳動度が低下するためとされてきた。この泳動度の低下は、該ＤＮＡの分子量が増大するにつれて著しくなる（非特許文献３）。しかし、ＥＢとＤＮＡとの結合は比較的弱いため（Ｋｄｉｓｓ＝１０−６Ｍ−１）、ＥＢを用いるＤＮＡ検出の感度は低い。一般に、検出限界は、ゲル上の１ｍｍ  ｘ  ５ｍｍのバンド中の２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）約１ｎｇである（特許文献２）。
【特許文献１】米国特許第５，７３４，０５８号明細書
【非特許文献３】Ａ．ＧｕｔｔｒｎａｎおよびＮ．Ｃｏｏｋｅ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）６３，２０３８−２０４２
【特許文献２】米国特許第５，３１２，９２１号明細書
【０００７】
最近、非対称性シアニン色素のチアゾール・オレンジ（ＴＯ、ヨウ化４−［３−メチル−２，３−ジヒドロ−（ベンゾ−ｌ，３−チアゾール）−２−エチリデン］−キノリニウム、４−［３−ｍｅｔｈｙｌ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−（ｂｅｎｚｏ−ｌ，３−ｔｈｉａｚｏｌｅ）−２−ｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ］−ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）がＥＢの代替品として示唆されている（特許文献２）。本色素は、ＥＢよりもＤＮＡとの親和性が高く、感度は１０倍高い（非特許文献２）が、ＴＯはＥＢと同じＤＮＡ分離能を提供することはない。例えば、ＥＢの濃度はＤＮＡ分離に影響はないが、ＤＮＡ分離の質はＴＯを用いるときのＤＮＡ対色素の割合に非常に敏感である。ＤＮＡ対色素の割合が９：１の外側になるときにはＤＮＡのピーク形状が非常に悪くなることが報告されている。したがって、ＴＯが用いられるときには、ピークの広がりがなだらかで、ピークの高さが比較的低いことが観察される。ピークの広がりがなだらかなことの１つの考えられる説明は、ＴＯはインターカレーションを起こすだけではなく、別々のＤＮＡ鎖の結合も起こすことである。また、過剰量のＴＯはＤＮＡの二重らせんを不安定化するので、ピークの広がりがなだらかになるのかもしれない（非特許文献４）。
【非特許文献４】Ｈ．Ｅ．ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＫ．Ｊ．Ｕｌｆｅｌｄｅｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，６４，１７３７−１７４０
【０００８】
核酸色素としてのＴＯの発見以来、より緊密なＤＮＡとの結合能と、より高い水溶性を有する色素を提供するために、ＴＯおよびそのトリメチンホモログの複数の改良技術が開発されてきた（特許文献２および３）。これらの色素は、一般的には、前記色素のキノリニウム部分の修飾を伴い、かなり高価である。
【特許文献３】米国特許第５，３２１，１３０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
要約すると、ＥＢのようないくつかの従来のインターカレーション型色素は、高いＤＮＡ分解能を提供するが、親和性およびＤＮＡ検出感度が低い。これに対し、ＴＯのような他の従来のインターカレーション型色素は、高い検出感度を提供するが、望ましい分解能を提供しない。したがって、特に試料中の非常に低濃度で存在するＤＮＡを検出する高分解能／高感度な技術を開発することに継続的な関心がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
従来の電気泳動システムの上述の欠点を考慮して、核酸を分離検出するための高分解能／高感度な電気泳動法を提供することが、本発明の目的である。毛管電気泳動の態様で実施可能な、かかる方法を提供することは特に望ましい。
【００１１】
本発明のこれらおよびその他の目的は、核酸は陽極から陰極へと移動するが、高親和性インターカレーション型色素は逆行する、電気泳動システムを提供することによって達成される。したがって、本発明の１つの側面は、試料中に含まれる核酸を電気泳動によって分離し検出するための方法に向けられる。前記方法は、
（ａ）陽極端と陰極端とを有する電気泳動システムを用意するステップ、
（ｂ）前記試料を陰極端から装荷するステップ、
（ｃ）φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０の分解度を提供する高分解能バッファーの存在下で、陰極端から陽極端に向けて両端間に電圧を印加して前記核酸を移動させることによって、前記試料中に含まれる前記核酸を分離するステップ、
（ｄ）正電荷と、少なくとも１０−６Ｍ−１のＤＮＡ親和定数とを有し、陽極端から陰極端に向けて両端の間に印加された電圧の下で移動する高親和性インターカレーション型色素を、前記システムに陽極端から装荷して、前記インターカレーション型色素が分離された前記核酸との複合体を形成するステップ、および
（ｅ）前記複合体を検出するステップを含む。
【００１２】
前記高親和性インターカレーション型色素は、チアゾール・オレンジ（ＴＯ）、ＳＹＢＲグリーンＩ、ヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−１、ヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−３およびヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−５（モレキュラープローブ社、ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ）からなるグループから選択される場合がある。前記高分解能バッファーは、高分解能インターカレーション型色素を含む場合があり、該高分解能色素は、φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０の分解能を提供する。１つの実施態様では前記高分解能色素は、臭化エチジウム（ＥＢ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびアクリジン・オレンジ（塩酸塩）からなるグループから選択される。
【００１３】
本発明の別の側面は、試料中に含まれる核酸を毛管電気泳動によって分離し検出する方法を含む。前記方法は、
（ａ）φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０の分解能がある高分解能バッファーを満たした、陽極端と陰極端とを有する毛管を用意するステップ、
（ｂ）陰極端から前記毛管内に前記試料を装荷するステップ、
（ｃ）陽極と陰極との間に電圧を印加して、前記高分解能バッファー存在下で前記核酸を陰極端から陽極端に向けて移動させることによって、前記試料中に含まれる核酸を分離するステップ、
（ｄ）正電荷と、少なくとも１０−６Ｍ−１のＤＮＡ親和定数とを有し、陽極端から陰極端に向けて両端の間に印加された電圧の下で移動して、分離された前記核酸と複合体を形成する高親和性インターカレーション型色素を陽極端から前記毛管内に装荷するステップ、および
（ｅ）前記複合体を検出するステップを含む。
【００１４】
本発明のさらに別の側面は、複数のインターカレーション型色素を用いるレーザ誘起蛍光検出毛管電気泳動法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中に含まれる核酸を分離し検出する方法に向けられる。前記方法は、
（ａ）φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０の分解能がある高分解能インターカレーション型色素を含むゲルバッファーを満たした、陽極端と陰極端とを有する毛管を用意するステップ、
（ｂ）前記試料を陰極端から前記毛管内に装荷するステップ、
（ｃ）陽極と陰極との間に電圧を印加して、前記高分解能バッファーの存在下で、陰極から陽極に向けて前記核酸を移動させることによって、前記試料中に含まれる核酸を分離するステップ、
（ｄ）正電荷と、少なくとも１０−６Ｍ−１のＤＮＡ親和定数を有し、陽極端から陰極端に向けて両端間に印加された電圧の下で移動して、分離された前記核酸と複合体を形成する高親和性インターカレーション型色素を前記毛管内に陽極端から装荷するステップ、および
（ｅ）前記複合体を検出するステップを含む。
【００１５】
別の側面では、本発明は、試料中の核酸を電気泳動による分離および検出用キットを提供する。前記キットは、
φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０の分解能がある高分解能インターカレーション型色素を含むゲルバッファーと、
正電荷と、少なくとも１０−６Ｍ−１のＤＮＡ親和定数を有する高親和性インターカレーション型色素とを含む。
【００１６】
本発明は、従来の方法よりも多くの経済的および技術的な利点を提供する。本発明は、高分解能の核酸分離と高感度および信頼性とを組み合わせることを可能にする。さらに、本発明の方法は、新たな設備を全く必要とせず、利用可能ないかなる電気泳動システムでも実施することができる。例えば、本発明の方法は、ＣＥＱ（商標）２０００  ＤＮＡアナリシスシステム、Ｐ／ＡＣＥ（商標）ＭＤＱ毛管電気泳動システム、Ｐａｒａｇｏｎ  ＣＺＥ（登録商標）２０００毛管電気泳動システム（ベックマン・コールター、カリフォルニア州、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）、ＡＢＩのＰｒｉｓｍ３１０ジェネティックアナライザ、３１００ジェネティックアナライザ、３７００ＤＮＡアナライザ（ｈｔｔｐ：／／ｈｏｍｅ．ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）、アジレント２１００バイオアナライザ（ｗｗｗ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）に限定されないがこれらのような市販の毛管電気泳動システムとともに実施される場合がある。
【００１７】
また、高分解能バッファーおよび高親和性色素のシステムが使われるので、広範な入手可能で新規に開発された高親和性インターカレーション型色素が、電気泳動における分解能に関係なく利用できる。その結果、このシステムの感度および分解能は、さまざまな用途の要求に応えるために容易に適合させることができる。
【００１８】
上記およびその他の本発明の特徴とその実現方法とは、以下の説明を添付図面とともに参照することによって、より明らかになり、最もよく理解できる。これらの図面は、本発明の典型的な実施態様のみを示すものであってその範囲を限定するものではない。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、核酸の高分解能分離および高感度検出用の新規な電気泳動法を提供する。これらの新規な方法は、高分解能バッファーと、逆行する高親和性インターカレーション型色素とのシステムを利用することによって、核酸の優れた電気泳動分離および検出が達成できるという予想外の発見に基づく。
【００２０】
したがって、本発明の１つの側面は、試料中に含まれる核酸の電気泳動による分離および検出のための方法を提供する。前記方法は、
（ａ）陽極端と陰極端とを有する電気泳動システムを用意するステップ、
（ｂ）陰極端から前記試料を前記システムに装荷するステップ、
（ｃ）φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と、２８２ｂｐ核酸断片との間で、少なくとも２．０の分解能を提供する高分解能バッファーの存在下で、前記核酸を陰極端から陽極端に向けて両極間に電圧を印加して移動させることにより前記試料中に含まれる前記核酸を分離するステップ、
（ｄ）正電荷と、少なくとも１０−６Ｍ−１のＤＮＡ親和定数とを有する高親和性インターカレーション型色素を陽極端から前記システム内に装荷して、陽極端から陰極端に向けて両極間に印加された電圧の下で移動させて、分離された前記核酸との複合体を形成させるステップ、および
（ｅ）前記複合体を検出するステップを含む。
【００２１】
本発明の電気泳動システムは、いかなる特定のタイプにも限定されない。本質的に上記の方法は、自由ゾーン電気泳動、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動および毛管電気泳動を含むが、これらに限定されない、いかなるタイプの電気泳動にも適用可能である。本発明の電気泳動システムは、いかなる電気泳動装置であってもよい。例えば、本発明の方法は、ＣＥＱ（商標）２０００ＤＮＡアナリシスシステム、Ｐ／ＡＣＥ（商標）ＭＤＱ毛管電気泳動システム、Ｐａｒａｇｏｎ  ＣＺＥ（登録商標）２０００毛管電気泳動システム（ベックマン・コールター、カリフォルニア州、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）、ＡＢＩのＰｒｉｓｍ３１０ジェネティックアナライザ、３１００ジェネティックアナライザ、３７００ＤＮＡアナライザ（ｈｔｔｐ：／／ｈｏｍｅ．ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）、アジレント２１００バイオアナライザ（ｗｗｗ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）に限定されないがこれらのような市販の毛管電気泳動システムとともに用いられる場合がある。典型的には、前記電気泳動装置に印加される電圧勾配は、１００から１０００Ｖ／ｃｍまでの範囲内にある。
【００２２】
本発明では試料は、核酸の混合物に加えて、バッファー、溶媒、制限酵素およびその他の核酸の単離および／または試料の調製に用いられる試薬のような他の成分を含む場合がある。本発明はかかる追加成分の数およびタイプにはいかなる制限も課さない。
【００２３】
また本発明では、ＰＣＲ反応産物が、ＤＮＡ試料の前処理なしで直接電気泳動システムに導入することができる。例えば、１本鎖ＤＮＡ試料を得るためのＰＣＲ反応産物のエタノール沈殿、ホルムアミド再溶解および熱処理は不要である。核酸は、ウイルス、細菌および真核生物のＤＮＡおよびＲＮＡのようなさまざまな出所に由来するものであってもよい。代替的には、核酸は合成オリゴ分子種でもかまわない。核酸は、核酸断片、増幅されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＲＮＡおよびｍＲＮＡからなるグループから選択される場合がある。１つの実施態様では、前記核酸断片は、１０から１００，０００塩基対までの範囲内のサイズである。核酸の量は、電気泳動に用いられる従来の量の範囲内であることが一般的である。
【００２４】
ここで定義されるところの「インターカレーション型色素（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｄｙｅ）」とは、一般に、二重らせんの塩基対の間に挟まることによって可逆的で非共有結合的なやり方で核酸に結合する、平面的な芳香族の環状発色団をいう。好ましいインターカレーション型色素は本発明の技術分野で知られている。いくつかの非限定的な例は、ＰＩＣＯ  ＧＲＥＥＮ  （Ｐ−７５８１、モレキュラープローブ社）、ＥＢ（Ｅ−８７５１、シグマ社）、ヨウ化プロピジウム（Ｐ−４１７０、シグマ社）、アクリジン・オレンジ（Ａ−６０１４、シグマ社）、７−アミノアクチノマイシンＤ（Ａ−１３１０、モレキュラープローブ社）、シアニン色素（例えば、ＴＯＴＯ、ＹＯＹＯ、ＢＯＢＯおよびＰＯＰＯ）、ＳＹＴＯ、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲ、ＳＹＴＯＸ  グリーン、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ１０、ＳＹＴＯ１７、ＳＹＢＲ１４、ＦＵＮ−ｌ、ＤＥＡＤ  レッド、ヨウ化ヘキシヂジウム（Ｈｅｘｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）、ジヒドロエチジウム、エチジウム・ホモ２量体、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン、ＤＡＰＩ、ＤＩＰＩ、インドール色素、イミダゾール色素、アクチノマイシンＤ、ヒドロキシスチルバミジン（Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｉｌｂａｍｉｄｉｎｅ）およびＬＤＳ７５１（米国特許第６，２１０，８８５号明細書）を含む。
【００２５】
インターカレーション型色素は、ＤＮＡに対する親和性が異なる。本発明の目的のためには、「高親和性インターカレーション型色素」とは、少なくとも１０−６Ｍ−１のＤＮＡ親和定数を有するインターカレーション型色素をいう。本発明の高親和性インターカレーション型色素は、電気泳動の際に陽極から陰極に移動することを担保するために、正の電荷を有することが必要である。１つの実施態様では、前記高親和性インターカレーション型色素は、チアゾール・オレンジ（ＴＯ）、ＳＹＢＲグリーンＩ、ヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−１、ヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−３およびヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−５（モレキュラープローブ社、ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ）からなるグループから選択される。
【００２６】
高親和性インターカレーション型色素は、前記核酸を分離するステップ（ｃ）の前に前記電気泳動システムに装荷される場合がある。代替的には、高親和性インターカレーション型色素は、前記核酸を分離するステップ（ｃ）の後であって、分離された前記核酸が検出器に到達するか、前記電気泳動装置の陽極端で（ゲルのような）分離媒体から出て行くかのいずれかの前に、前記電気泳動システムに装荷される場合がある。
【００２７】
本発明の高分解能バッファーは、φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０の望ましい核酸分解能を提供するいかなる溶液またはゲルであってもよい。適当な高分解能バッファーの例は、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）バッファー、トリス−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）およびＭＯＰＳ−トリスを含むが、これらに限定されない。１つの実施態様では、前記高分解能バッファーは、インターカレーション型色素を含む。前記高分解能バッファーのインターカレーション型色素は、高分解能インターカレーション型色素であることが好ましい。本発明の目的のためには、「高分解能インターカレーション型色素」とは、φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０の分解能を提供するインターカレーション型色素をいう。例えば前記高分解能色素は、ＥＢ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）またはアクリジン・オレンジの場合がある。
【００２８】
１つの実施態様では核酸は、電気泳動の前に高分解能インターカレーション型色素で染色される。色素のＤＮＡに対する好ましい割合は、１０個の塩基対あたり色素約２分子である。別の実施態様では、高分解能インターカレーション型色素は、クロマトグラフィーの移動相に含まれる。有利なことには、多くのかかる色素（例えばＥＢ）は、固有蛍光（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を有さず、ポリヌクレオチドの間に挟まれるときにのみ蛍光を実際に示す。
【００２９】
前記電圧が陰極と陽極との間に印加された後、核酸は陽極に向かって移動しながら高分解能バッファー中で分離する。同時に、前記高親和性インターカレーション型色素分子は、その正電荷のために逆行する。逆行する前記高親和性色素分子が分離された前記核酸と接すると、核酸との複合体を形成する。ＤＮＡの電荷の絶対値が前記高親和性インターカレーション型色素の電荷の絶対値よりも大きいほうが、新たに形成された複合体全体の電荷が負となって該複合体が陽極に向けて移動するので、好ましい。
【００３０】
前記高分解能バッファーが高分解能インターカレーション型色素を含む実施態様では、前記電圧が陰極と陽極との間に印加された後、核酸が前記高分解能インターカレーション型色素分子との複合体を形成する。これらの複合体は負の電荷を有し、陰極から陽極への向きに移動する。同時に、前記高親和性インターカレーション型色素分子は、正電荷のため、陽極から陰極へ逆行する。逆行する前記高親和性色素分子が、分離された核酸の前記高分解能色素との複合体に接すると、前記高親和性色素分子が前記高分解能色素分子と置換する。かかる置換が効果を奏することを担保するために、前記高親和性色素は前記高分解能色素よりも高いＤＮＡ親和性を有するべきである。前記置換の結果、前記核酸と前記高親和性色素分子との負電荷複合体が新たに形成され、陽極に向けて移動する。
【００３１】
いずれかの従来の検出システムを、分離された前記核酸と高親和性インターカレーション型色素との複合体を検出するために利用してもかまわない。かかる検出システムの例は、レーザ誘起蛍光検出と、２５４ｎｍでの紫外線検出とを含むが、これらに限定されない。用いられる特定の高親和性インターカレーション型色素に応じて、励起光が該色素の主吸光帯域内にあるように選択される。例えば、高親和性インターカレーション型色素のＴＯまたはＳＹＢＲグリーンＩが用いられるときには、蛍光を誘起するためにアルゴンレーザが用いられてもよく、該蛍光は５２０ｎｍで検出されてもよい。
【００３２】
本発明の１つの実施態様では、核酸の分離および検出は、毛管電気泳動（ＣＥ）法によって実施される。ここで用いられるところの「毛管電気泳動」という用語は、その通常の意味で用いられ、小孔径プラスチックチューブ、ガラス毛管または平行な板の間の薄い流体フィルムのような比較的体積の小さいシステムで実行される電気泳動分離をさす。
【００３３】
好ましい実施態様では、毛管（あるいはキャピラリ）が用いられる。毛管は、電気泳動に用いる水溶液を保持することができる中空の管であることが典型的である。通常、これは、５−５００μｍの口径の管を意味するが、正確な限界は表面特性および前記溶液中に存在する成分に依存する。毛管電気泳動用毛管の長さは、広い範囲内で変更されてもよいが、たいていの場合には、５−１００ｃｍの範囲内である。商業的に入手可能か、あるいは、自作された毛管または毛管カラムが本発明に使用される場合がある。例えば、さまざまなサイズの毛管がＰｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（アリゾナ州、ツーソン）から購入できる。実施例１および２に記載の１つの実施態様では、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（アリゾナ州、ツーソン）製の毛管は、内径１００μｍ、長さ２７ｃｍである。
【００３４】
多くの材料が毛管を作成するために使われてもよいが、石英ガラスの毛管を使うのが典型的である。石英の毛管は、通常、裸のままの石英ガラスが極めて壊れやすいので、機械的強度を与えるために外部保護コーティングで覆われる。このコーティングの小部分が検出窓を作るために除去される。前記毛管の内面は、該毛管壁に異なる物質を共有結合で結合（コーティング）することによって化学的に修飾することができる。これらのコーティングは、試料の吸着を低減するため、または、前記毛管壁のイオン電荷を変化させるためのような、さまざまな目的のために用いられる。しかし、本発明はいずれかの特定のタイプの毛管に限定されないことが理解されるべきである。例えば、１つの実施態様では、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）でコーティングされた石英ガラス毛管が用いられる。
【００３５】
毛管電気泳動法による分離では、毛管はバッファーで満たされ、それぞれの端は同一のバッファーのバイアルの中に浸される。被検体の試料は、電気作用（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｓｉｓ）か、圧力かのいずれかによって、一方の端に注入され、１００ないし７００ボルト／ｃｍの電場が前記毛管にわたって印加される。前記被検体の混合物が印加された電場のために毛管を通って移動するにつれて、電気泳動移動度の違いがそれぞれの成分を駆動して、離散したバンドを形成する。毛管の他の端で、分離された前記被検体のそれぞれが検出され定量される。本発明では毛管電気泳動は、このやり方、または他のいずれかの従来のやり方で実施される場合がある。したがって本発明は、有利なことには、従来の毛管電気泳動のフォーマットの使用を可能にして、標準的な毛管電気泳動設備の改変を全く必要としない。
【００３６】
核酸の量は、０．１から１００μｇ／ｍｌまでの範囲の電気泳動に用いられる従来の量である。１つの実施態様では、１０μｇ／ｍｌのφＸ１７４ＨＡＩＩＩ断片（シグマ社、ミズーリ州、セントルイス）の試料が用いられる。
【００３７】
毛管電気泳動で分離された核酸の検出は、レーザ誘起蛍光法および２５４ｎｍでの紫外線検出（かなり低い感度）のような知られた従来技術のいずれかによって達成される場合がある。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションした原子団の検出は、オンカラムでの（ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ）レーザ誘起蛍光検出法によって達成される。
【００３８】
したがって、本発明の別の側面は、試料中に含まれる核酸の毛管電気泳動法による分離および検出方法を提供し、
（ａ）φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０の分解能の高分解能バッファーで満たされた、陽極端と陰極端とを有する毛管を用意するステップ、
（ｂ）陰極端から前記試料を前記毛管内に装荷するステップ、
（ｃ）高分解能バッファー存在下で陽極と陰極との間に電圧を印加して陰極から陽極に向けて前記核酸を移動させることによって、試料中に含まれる核酸を分離するステップ、
（ｄ）陽極端から陰極端に向けて両極間に印加された電圧の下で移動して、分離された核酸との複合体を形成し、正の電荷と少なくとも１０−６Ｍ−１のＤＮＡ親和定数とを有する高親和性インターカレーション型色素を、陽極端から前記毛管内に装荷するステップ、および
（ｅ）前記複合体を検出するステップを含む。
【００３９】
毛管電気泳動用の高分解能バッファーは、φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０という望ましい核酸分解能を提供するいずれかのバッファーまたはゲルでかまわない。好ましい実施態様では、電気泳動毛管は高分解能ゲルで満たされる。例えば、１つの実施態様では、ポリアクリルアミドの取り換え可能なゲルまたは固定されたゲルが用いられる。別の実施態様では、直線状ポリアクリルアミドが高分解能ゲルとして用いられる。
【００４０】
前記高分解能バッファーまたはゲルは、高分解能インターカレーション型色素を含む場合もある。例えば、前記高分解能色素は、ＥＢ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）またはアクリジン・オレンジであってもよい。実施例１および２に記載の１つの実施態様では、毛管は、ＥＢ（最終濃度３０μＭ）を混合したポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）ゲルで満たされる。
【００４１】
正電荷と、少なくとも１０−６Ｍ−１のＤＮＡ親和定数を有するいずれかの高親和性インターカレーション型色素が本発明に用いられる場合がある。例えば高親和性インターカレーション型色素は、ＴＯ、ＳＹＢＲグリーンＩ、ヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−１、ヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−３およびヨウ化ＴＯ−ＰＲＯ−５（モレキュラープローブ社、ｗｗｗ．ｐｒｏｂｓ．ｃｏｍ）からなるグループから選択される場合がある。
【００４２】
前記高親和性インターカレーション型色素は、前記核酸を分離するステップ（ｃ）の前に電気泳動システム（毛管）内に装荷される場合がある。代替的に、高親和性インターカレーション型色素は、前記核酸を分離するステップ（ｃ）の後で、分離された前記核酸が、検出装置に達するか、電気泳動装置の陽極端から毛管を出るかのいずれかの前に、電気泳動システム内に装荷される場合がある。
【００４３】
１つの実施態様では、前記毛管はバッファーで満たされ、毛管の第１の端は陰極貯液槽に浸され、毛管の第２の端は陽極の貯液槽に浸される。両方の貯液槽は同じバッファーで満たされる。その後、前記装荷するステップ（ｄ）は、前記高親和性インターカレーション型色素を、バッファーで満たされた前記陽極貯液槽に添加することか、前記陽極貯液槽を満たす前に該色素を前記陽極のバッファーに予め混合することかを含む場合がある。電圧が陰極と陽極との間に印加されると、正電荷を有する高親和性色素は毛管内に入って、陰極に向かって動く。代替的に前記高親和性インターカレーション型色素は、前記毛管の陽極端に直接注入される場合もある。
【００４４】
いかなる高分解能バッファーが本発明の内容にしたがって用いられてもよいが、１つの実施態様では、前記高親和性バッファーは高親和性インターカレーション型色素を含む。したがって本発明は、複数のインターカレーション型色素を用いる毛管電気泳動−レーザ誘起蛍光法によって、試料中に含まれる核酸を分離し検出する方法を提供する。前記方法は、
（ａ）φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０の分解能を有する高分解能インターカレーション型色素を含むゲルバッファーで満たされた、陽極端と陰極端とを有する毛管を用意するステップ、
（ｂ）前記陰極端から前記毛管内に、前記試料を装荷するステップ、
（ｃ）前記陽極と陰極との間に電圧を印加して前記高分解能バッファー存在下で前記核酸を陰極から陽極に向けて移動することによって、前記試料中に含まれる前記核酸を分離するステップ、
（ｄ）陽極端から陰極端に向けて両極間に印加された電圧の下で移動して、分離された前記核酸との複合体を形成し、正電荷と少なくとも１０−６Ｍ−１のＤＮＡ親和定数を有する、高親和性インターカレーション型色素を前記毛管内に陽極端から装荷するステップ、および
（ｅ）前記複合体を検出するステップを含む。
【００４５】
図１は、本発明の１つの実施態様に従うかかる方法を示す。図１に示すとおり、入口（陰極端）２と、出口（陽極端）３とを有する毛管１は、低親和性、高分解能インターカレーション型色素（ＨＲＩＤ）を含まれるバッファーで満たされた。前記毛管の出口は、出口（陽極）貯液槽４と流体連通している。前記毛管の入口は、入口（陰極）貯液槽５と流体連通している。前記陽極貯液槽は、高親和性インターカレーション型色素（ＨＡＩＤ）を含む出口バッファーで満たされた。核酸試料は入口２を通して前記毛管内に注入された。
【００４６】
前記陰極と陽極との間に電圧が印加された後で、ＤＮＡ−ＨＲＩＤ複合体が形成され、陽極に向けて移動した。同時に、ＨＡＩＤの分子は、正電荷のために、陽極から陰極に逆行した（図１ｂ）。
【００４７】
逆行するＨＡＩＤ分子が、分離されたＤＮＡ−ＨＲＩＤ複合体に接すると、ＨＡＩＤ分子は、ＤＮＡ親和性がより高いため、前記ＤＮＡ複合体中のＨＲＩＤと置換した。その結果、新たなＤＮＡ−ＨＡＩＤ複合体が形成された（図１ｃ）。
【００４８】
前記ＤＮＡの電荷の絶対値はＨＡＩＤの電荷の絶対値より大きいため、前記新しい複合体の全体の電荷は負で、前記複合体は陽極に向けて移動した。これらの新たに形成された複合体が前記検出窓に達すると、従来の検出方法の１つによって検出された（図１ｄ）。
【００４９】
検出された核酸のバンドは、用途によって必要なときには、抽出され、インターカレーションした蛍光色素から単離される場合がある。かかる抽出には、いかなる標準的な方法が用いられてもかまわない。かかる方法は、当業者に知られており、ここでは説明しない。
【００５０】
別の側面では、本発明は、試料中の核酸の電気泳動による分離および検出用キットを提供する。前記キットは、
φＸ１７１ＨＡＩＩＩの２７１ｂｐ核酸断片と２８２ｂｐ核酸断片との間で少なくとも２．０の分解能を有する高分解能インターカレーション型色素を含むゲルバッファーと、
正電荷と、少なくとも１０−６Ｍ−１のＤＮＡ親和定数を有する高親和性インターカレーション型色素とを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下の実施例は、本発明の範囲を例示することを意図するものであって、制限することは意図しない。かかる実施例は、使用されるかもしれない実施例の典型的なものではあるが、当業者に知られた他の手順が代替的に用いられる場合もある。実際、当業者はここの内容に基づいて、過度の実験を要することなく、さらなる実施態様を容易に想到し作成することができる。
【実施例１】
【００５２】
毛管電気泳動装置の立ち上げ
内径１００μｍ、長さ２７ｃｍの毛管（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、アリゾナ州、ツーソン）が以下の実施例では用いられた。前記毛管は、使用前にポリビニルアルコール（ＰＶＡ）でコーティングされた。ＥＢ、ＳＹＢＲグリーンＩおよびＴＯはモレキュラープローブ社（オレゴン州、ユージーン）から購入された。
【００５３】
前記ゲルマトリクスは、アルドリッチ社（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から購入されたポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）で調製された。簡潔には、前記ＰＥＯゲルは以下のとおり調製された。２．５ｇのＰＥＯ（平均分子量４，０００，０００）と２ｇのＰＥＯ（平均分子量９００，０００）とが、ゆっくりと（終夜）撹拌しながら、室温で４４５ｍｌの水に添加された。それから、２５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−トリスｐＨ７．５５を５０ｍｌと、１０％  ＮａＮ３を３２５μｌとが、前記溶液に添加された。得られたゲルは室温で保存された。
【００５４】
濯ぎ用バッファーは、ＰＥＯゲルをＥＢ（最終濃度は３０μＭ）と混合することによって調製された。出口バッファーは、ＰＥＯゲルをＳＹＢＲグリーンＩ（１：５００希釈）と混合することによって調製された。別の実験では、前記出口バッファーは、ＰＥＯゲルをＴＯ（最終濃度は３μｇ／ｍｌ）と混合することによって調製された。
【００５５】
ＤＮＡ試料は、φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ  φＸ１７４ＨＡＩＩＩ断片（シグマ社、ミズーリ州、セントルイス）であった。
【００５６】
ＤＮＡの注入濃度は１０μｇ／ｍｌであった。注入は、５．４ｋＶ１０秒間実施された。前記濯ぎ用バッファーは、ＰＥＯゲルをＥＢ（最終濃度は３０μＭ）と混合して調製された。前記出口バッファーは、ＰＥＯゲルをＳＹＢＲグリーンＩ（１：５００）と混合して調製された。別の実験では、前記出口バッファーは、ＰＥＯゲルをＴＯ（最終濃度は３μｇ／ｍｌ）と混合して調製された。印加された電圧勾配は、１００Ｖ／ｃｍないし４００Ｖ／ｃｍの範囲内であった。
【実施例２】
【００５７】
２つのインターカレーション型色素を用いる毛管電気泳動−レーザ誘起蛍光法によるＤＮＡ分析
毛管は、前記ＰＥＯゲルとＥＢとを含むゲルバッファーで満たされた。出口電極バイアル（陽極）は、前記ＰＥＯゲルとＳＹＢＲグリーンＩまたはＴＯとを含む出口バッファーで満たされた。ＤＮＡ試料は陰極から前記毛管内に注入された。電圧が陰極と陽極との間に印加された後、前記ＤＮＡ−ＥＢ複合体が形成され、陽極に向けて移動した。同時に、前記ＳＹＢＲグリーンＩまたはＴＯ分子が、正電荷のために、陽極から陰極に逆行した。
【００５８】
反対方向に移動するＳＹＢＲグリーンＩまたはＴＯ分子が分離されたＤＮＡ−ＥＢ複合体と接すると、これらの分子は、ＥＢに比べてＤＮＡ親和性が高いために、前記ＤＮＡ複合体中のＥＢと置換した。その結果、ＤＮＡ−ＳＹＢＲグリーンＩまたはＤＮＡ−ＴＯの新規な複合体が形成された。ＤＮＡの電荷の絶対値はＳＹＢＲグリーンＩおよびＴＯの電荷の絶対値より大きいため、前記新規複合体の電荷の合計が負となり、前記複合体は陽極に向けて移動した。これらの新規に形成された複合体が検出窓に達すると、前記色素はアルゴン−イオンレーザによって励起され、５２０ｎｍの波長で検出された。ＥＢおよびＳＹＢＲグリーンＩを用いる毛管電気泳動−レーザ誘起蛍光法の結果を図２に示す。毛管電気泳動−レーザ誘起蛍光法とＥＢおよびＴＯとの組み合わせの結果を図３に示す。
【００５９】
図２および３に記載の結果は、核酸を分離するための高分解能インターカレーション型色素（例えば、ＥＢ）と、分離された核酸を検出するための高親和性インターカレーション型色素（例えば、ＳＹＢＲグリーンＩまたはＴＯ）とを用いることによって、本発明が迅速な高分解能／高感度な核酸の分析を実現することを証明する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】一方が高分解能インターカレーション型色素で、他方が高親和性インターカレーション型色素である、２つのインターカレーション型色素を用いるレーザ誘起蛍光検出−毛管電気泳動法による核酸の分離および検出を示す模式図。
【図２】インターカレーション型色素のＥＢおよびＳＹＢＲグリーンＩを用いるレーザ誘起蛍光検出−毛管電気泳動法によるＤＮＡ分析の電気泳動結果図。
【図３】インターカレーション型色素のＥＢおよびＴＯを用いるレーザ誘起蛍光検出−毛管電気泳動法によるＤＮＡ分析の電気泳動結果図。
【符号の説明】
【００６１】
１    毛管
２    入口（陰極端）
３    出口（陽極端）
４    出口（陽極）貯液槽
５    入口（陰極）貯液槽
【図１】
2005523013.tif 000002
【図２】
2005523013.tif 000003
【図３】
2005523013.tif 000004
【国際調査報告】
2005523013.tif 000005
2005523013.tif 000006
2005523013.tif 000007