【手続補正書】
【提出日】令和1年12月25日(2019.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
三構成要素複合体であって、
（ａ）（ｉ）ターゲットＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡターゲティング配列、（ｉｉ）Ｃａｓ９結合配列、および、（ｉｉｉ）ＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）を含む、ポリヌクレオチドと；
（ｂ）該Ｃａｓ９結合配列に結合するＣａｓ９タンパク質と；
（ｃ）該ＰＢＳに結合するＰＵＦドメインと
を含み、該Ｃａｓ９タンパク質または該ＰＵＦドメインが、以下：
メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、および、脱ミリストイル化活性
からなる群より選択される酵素活性を示す異種ポリペプチドに融合される、
三構成要素複合体。
【請求項２】
細胞中の前記三構成要素複合体が、前記ターゲットＤＮＡを修飾する、または、ターゲットＤＮＡ会合ポリペプチドを修飾する、請求項１に記載の三構成要素複合体。
【請求項３】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質、エンドヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質、および、Ｃａｓ９ニッカーゼからなる群より選択される、請求項１または２に記載の三構成要素複合体。
【請求項４】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質である、請求項３に記載の三構成要素複合体。
【請求項５】
前記ｄＣａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質に対して点突然変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを含む、請求項４に記載の三構成要素複合体。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、２またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の三構成要素複合体。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項６に記載の三構成要素複合体。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、１０またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項７に記載の三構成要素複合体。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、２５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項８に記載の三構成要素複合体。
【請求項１０】
前記ＰＢＳが、５’−ＵＧＵＡＵＧＵＡ−３’または５’−ＵＵＧＡＵＡＵＡ−３’の配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の三構成要素複合体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の三構成要素複合体を含む、細胞。
【請求項１２】
キットであって、
（ａ）（ｉ）ターゲットＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡターゲティング配列、（ｉｉ）Ｃａｓ９結合配列、および、（ｉｉｉ）ＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）を含む、ポリヌクレオチドと；
（ｂ）該Ｃａｓ９結合配列に結合するＣａｓ９タンパク質、または、該Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドと；
（ｃ）該ＰＢＳに結合するＰＵＦドメイン、または、該ＰＵＦドメインをコードするポリヌクレオチドと
を含み、該Ｃａｓ９タンパク質または該ＰＵＦドメインが、以下：
メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、および、脱ミリストイル化活性
からなる群より選択される酵素活性を示す異種ポリペプチドに融合される、
キット。
【請求項１３】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質、エンドヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質、および、Ｃａｓ９ニッカーゼからなる群より選択される、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記ｄＣａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質に対して点突然変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、２またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、１０またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドが、２５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記ＰＢＳが、５’−ＵＧＵＡＵＧＵＡ−３’または５’−ＵＵＧＡＵＡＵＡ−３’の配列を含む、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２１】
細胞において、ターゲットＤＮＡを修飾する、または、ターゲットＤＮＡ会合ポリペプチドを修飾するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、該方法は、該細胞内に、
（ａ）（ｉ）ターゲットＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡターゲティング配列、（ｉｉ）Ｃａｓ９結合配列、および、（ｉｉｉ）ＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）を含む、ポリヌクレオチドと；
（ｂ）該Ｃａｓ９結合配列に結合するＣａｓ９タンパク質、または、該Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドと；
（ｃ）該ＰＢＳに結合するＰＵＦドメイン、または、該ＰＵＦドメインをコードするポリヌクレオチドと
を導入する工程を含み、該Ｃａｓ９タンパク質または該ＰＵＦドメインが、以下：
メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、および、脱ミリストイル化活性
からなる群より選択される酵素活性を示す異種ポリペプチドに融合され、そして、（ａ）のポリヌクレオチド、（ｂ）のＣａｓ９タンパク質、および、（ｃ）のＰＵＦドメインが組み立てられて、該細胞内の該ターゲットＤＮＡまたは該ターゲットＤＮＡ会合ポリペプチドを修飾する三構成要素複合体を形成する、方法。
【請求項２２】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質、エンドヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質、および、Ｃａｓ９ニッカーゼからなる群より選択される、請求項２１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２３】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質である、請求項２２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２４】
前記ｄＣａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質に対して点突然変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを含む、請求項２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドが、２またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドが、５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項２５に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが、１０またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項２６に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドが、２５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項２７に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２９】
前記ＰＢＳが、５’−ＵＧＵＡＵＧＵＡ−３’または５’−ＵＵＧＡＵＡＵＡ−３’の配列を含む、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項３０】
メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、および、脱ミリストイル化活性
からなる群より選択される酵素活性を示す異種ポリペプチドに融合されたＰＵＦドメインを含む、融合タンパク質。
【請求項３１】
前記融合タンパク質が、（ｉ）ターゲットＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡターゲティング配列、（ｉｉ）Ｃａｓ９結合配列、および、（ｉｉｉ）ＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）を含むポリヌクレオチドに結合する、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
ＰＵＦドメイン結合配列を含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項３３】
２またはそれより多い、５またはそれより多い、１０またはそれより多い、あるいは、２５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項３２に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項３４】
５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項３３に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項３５】
１０またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項３４に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項３６】
前記ＰＢＳが、５’−ＵＧＵＡＵＧＵＡ−３’または５’−ＵＵＧＡＵＡＵＡ−３’の配列を含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。