(57)【要約】本発明は、組織工学を含む様々な目的のために使用される足場を製造するための方法および組成物に関する。より詳しくは、本発明は、フレームワークを形成するための、融合塩結晶等の融合結晶の使用に関する。本発明の足場を製造するための方法は、先行技術の方法と比較して、多孔性、相互接続性、および製作の容易さを改善する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む方法：
a) i)ポロゲンを含む複数の粒子、および ii)ポリマーを含む溶液、を提供する段階； b)ポロゲンが互いに融合して、融合ポロゲンの間にフレームおよびフリースペースを含むフレームワークが生じる条件に、該粒子を曝露する段階； c)該溶液が実質的にフリースペースを満たすような条件下でフレームワークを該溶液に接触させる段階； d)ポリマーが足場を形成するように該溶液を処理する段階；ならびに e)融合ポロゲンを足場から除去する段階。
【請求項２】
75%を超えるフリースペースが段階（c）において満たされる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ポロゲンが塩結晶を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
塩結晶が、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、および塩化マグネシウムからなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
ポリマー溶液中のポリマーが、ポリエステル、ポリ（アルファ-ヒドロキシエステル）、ポリエーテル、ポリスチレン、およびポリメチルメタクリレートからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
ポリエステルがポリ（ラクチド-コ-グリコリド）である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ポリエーテルがポリエチレンオキシドまたはポリエチレングリコールである、請求項5記載の方法。
【請求項８】
段階（d）の処理がポリマー溶媒を蒸発させる工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
段階（e）の除去が融合塩結晶を溶解させる工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
段階（b）の条件が、塩結晶を約90%〜約100%の相対湿度に約8〜約28時間曝露する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
段階（e）後の足場が細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
以下の段階を含む方法：
a) i)ポロゲンを含む複数の粒子、および ii)生体適合性ポリマーを含む溶液、を提供する段階； b)ポロゲンが互いに融合して、融合ポロゲンの間にフレームおよびフリースペースを含むフレームワークが生じるような湿度に、該粒子を曝露する段階； c)該溶液が実質的にフリースペースを満たすような条件下でフレームワークを該溶液に接触させる段階； d)該ポリマーが足場を形成するように該溶液を処理する段階；ならびに e)融合ポロゲンを足場から除去する段階。
【請求項１３】
75%を超えるフリースペースが段階（c）において満たされる、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
ポロゲンが塩結晶を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
塩結晶が、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、および塩化マグネシウムからなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
ポリマー溶液中のポリマーが、ポリエステル、ポリ（アルファ-ヒドロキシエステル）、ポリエーテル、ポリスチレン、およびポリメチルメタクリレートからなる群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１７】
ポリエステルがポリ（ラクチド-コ-グリコリド）である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
ポリエーテルがポリエチレンオキシドまたはポリエチレングリコールである、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
段階（d）の処理がポリマー溶媒を蒸発させる工程を含む、請求項12記載の方法。
【請求項２０】
段階（e）の除去が融合塩結晶を溶解させる工程を含む、請求項12記載の方法。
【請求項２１】
段階（b）の条件が、塩結晶を約90%〜約100%の相対湿度に約8〜約28時間曝露する工程を含む、請求項12記載の方法。
【請求項２２】
段階（e）後の足場が細胞を含む、請求項12記載の方法。
【請求項２３】
段階b）が、融合ポロゲンの間のフリースペースが制御されるような陽圧に、ポロゲンを曝露することをさらに含む、請求項12記載の方法。
【請求項２４】
以下の段階を含む方法：
a) i)ポロゲンを含む複数の粒子、および ii)ポリマーを含む溶液、を提供する段階； b)ポロゲンが互いに融合して、融合ポロゲンの間にフレームおよびフリースペースを含むフレームワークが生じる条件に、該粒子を曝露する段階； c)該溶液が実質的にフリースペースを満たすような条件下でフレームワークを該溶液に接触させる段階； d)固体物質が形成されるように、フレームワークおよび溶液を圧縮する段階； e)該固体物質を高圧ガスに曝露する段階；f）ガス圧力を周囲圧力まで下げる段階；ならびにg）融合ポロゲンを足場から除去する段階。
【請求項２５】
圧縮が100〜2000psiである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
ガス圧力が400〜1200psiである、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
固体物質が半固体である、請求項24記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共に米国国立衛生研究所（National Institute of Health）からの、助成金R01-DE-13349および研修助成金T32 GM 08353のもと、部分的に政府の支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、組織工学に使用するための足場（scaffold）の製造のための方法および組成物に関する。より詳しくは、本発明は、多孔性ポリマー足場の孔構造の制御に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
組織工学は、組織置換術用の生物学的代替物を開発するための生細胞の使用を伴う。しかし、組織工学を実用的なものにするために、自然な組織成長に近似する組織成長を考慮に入れた足場が開発されなければならない。
【０００４】
いくつかの技術が組織工学的足場を開発するために採用され、様々な程度の成功を収めている。例えば、生分解性ポリマーから構成される多孔性足場は、いくつかの組織種の工学的操作における広範な使用が見出されている（Hutmacher, D.W., "Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage" Biomaterials 21:2529 2000；Chaignaud, B.E.ら、"The history of tissue engineering using synthetic biodegradable polymer scaffolds and cells" In: Atala, A., Mooney, D.J., 編、 Synthetic biodegradable polymer scaffolds. Boston, MA: Birkhauser, 1997, pp. 1-14）。様々な組織工学ストラテジーに、インビトロで細胞を播種して移植(transplantation)するための三次元の基板として（細胞ベースのアプローチ）、またはインビボ直接埋植（implantation）用の伝導性および誘導性基板として（伝導性アプローチ）、足場材料が採用されている（Murphy, W.L. および Mooney, D.J., "Controlled delivery of inductive proteins, plasmid DNA and cells from tissue engineering matrices" J Periodontal Res 34:413 1999）。これらスキームの成功の度合いは、ある程度足場系の内部構造に依存している。神経および線維血管（fibrovascular）の内部成長を増進し、細胞播種の均一性を促進し、かつ播種された細胞および隣接するインビボ部位から移動する（migrating）細胞の両方の移動を助長するために、足場系中の高度に相互接続されたマクロ多孔性構造が数多くの応用に必要とされる。
【０００５】
足場はフレームワーク上に構築される。フレームワークは、足場材料の相互接続性と孔サイズとを調節する助けとなる。足場が形成された後、フレームワークは除去されなければならない。上記の組織工学的足場を作出する現行アプローチに伴う難点としては、最終産物の一貫性の問題、足場の相互接続性および孔サイズを調節する際の困難性、ならびに足場形成後にフレームワーク材料を取り除く際の問題が挙げられる。
【０００６】
製造が容易で費用がかからず、足場相互接続性および孔サイズにおける一貫性を考慮に入れた、かつ足場形成後のフレームワーク材料の容易な除去を可能にする、機能的な組織工学的足場を作出するための経済的な方法が必要とされている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、組織工学に使用される足場の製造のための方法および組成物に関する。より詳しくは、本発明は多孔性ポリマー足場の孔構造の制御に関する。
【０００８】
本発明の態様は概して、組織工学的足場を含むがそれらに限定されない多孔性材料の製造のための方法および組成物に関する。より詳細には、本発明の態様は、孔の相互接続性および多孔性が制御された、製造が容易なマクロ多孔性の生分解性組織工学的足場を製造するための組成物および方法に関する。さらにより詳細には、本発明の態様は、生分解性ポリマーに関して孔サイズおよび孔の相互接続の程度を制御するためのプロセシング方法を改善する組成物および方法に関する。
【０００９】
孔は、結晶および非晶質材料を含むがそれらに限定されない可融性粒子の融合を経て接続される（および形状とサイズとが規定される）ことが想定される。1つの態様において、可融性粒子または粒子は、塩ポロゲン（porogen）（例えば塩結晶）を含む。融合段階は、三次元ポリマー足場の形成前に行われることが想定される。本発明の態様は、いかなる特定の塩にも限定されない。任意の塩が使用されうる。本発明の態様はいかなる特定の塩にも限定されないが、本発明に使用されうる適した塩の例は、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、および塩化マグネシウムである。本発明の好ましい態様において、塩化ナトリウムが使用される。
【００１０】
本発明の塩結晶は市販されている（例えばMallinkrodt, Paris, Kentucky）。塩結晶は、種々の直径範囲で購入でき、例えば所望のサイズを得るためにふるいにかけてもよい。
【００１１】
本発明の塩結晶は、塩結晶が部分的に互いに融合することを可能とする長さの時間で、処理条件（例えば湿度）に供されることが想定される。本発明の態様は、いかなる特定の湿度のパーセントにも限定されず、いかなる特定の時間の長さにも、いかなる特定の融合程度にも限定されない。例えば、1つの態様において、塩結晶は50%〜100%の湿度に曝露される。もう1つの態様において、塩結晶は75%〜99%の湿度に曝露される。さらにもう1つの態様において、塩結晶は92%〜98%の湿度に曝露される。同様に、1つの態様において、塩結晶は湿度に10分間〜48時間曝露される。もう1つの態様において、塩結晶は湿度に12〜36時間曝露される。さらにもう1つの態様において、塩結晶は湿度に18〜30時間曝露される。さらにもう1つの態様において、塩結晶は湿度に22〜26時間曝露される。
【００１２】
湿度以外の処理条件が想定される。例えば、酸および塩基および有機溶媒がポロゲン（例えば塩結晶）を融合させるために使用されうる。
【００１３】
本発明の態様は、いかなる融合程度にも限定されない。当業者は、特定の目的のために必要とされる融合の程度が、培養される細胞の種類ならびに必要な相互接続性の程度および孔サイズに依存して変わることを認識すると思われる。種々の融合レベルを生じる条件を本明細書に記載する。
【００１４】
本発明の1つの態様において、生分解性または非生分解性ポリマーが塩結晶格子に注入されることが想定される。もう1つの態様において、非生分解性ポリマーは熱可塑性物質であることが想定される。加えて、生分解性または非生分解性のポリマーは注入を助長するために溶媒中に溶解されることが想定される。本発明の態様は、いかなる特定の生分解性もしくは非生分解性ポリマーまたは溶媒にも限定されない。生体適合性ポリマー-溶媒の組み合わせが融合塩結晶格子を溶解しない限り、様々な生分解性または非生分解性ポリマー-溶媒の組み合わせが本発明の態様により想定される。例えば、想定されるポリマーには、任意のポリエステル（ポリ（アルファ-ヒドロキシエステル）を含む）、ポリエーテル（ポリエチレンオキシドを含む）、ポリスチレン、およびポリメチルメタクリレートが含まれるがそれらに限定されない。1つの態様において、熱可塑性物質を材料として使用することが想定される。もう1つの態様において、非生分解性ポリマーが足場の形成のために想定される。好ましい態様において、その生体適合性、自然な代謝物への制御可能な生分解性、およびマクロ多孔性組織工学的足場系として以前に使用されていたことより、コポリマーポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（PLG）が選択される。使用されるポリマー溶媒は、そのポリマーを溶解する特性、およびポロゲン（例えば塩結晶）に対して溶媒にならないというその特性について選ばれる。加えて、融合した粒子成分（例えば塩フレームワーク）を、ポリマー足場を溶解しない任意の溶媒で除去することが想定される。好ましい態様において、溶媒は水である。
【００１５】
好ましい態様において、本発明は、以下の段階を含む方法を想定する：a) i)塩結晶を含む複数の粒子（例えば可融性粒子）、および ii)ポリマー（例えば溶媒に溶解または懸濁したポリマー）を含む溶液、を提供する段階； b)塩結晶が互いに融合して、融合塩結晶の間にフレームおよびフリースペースを含むフレームワーク（または格子）を生じる条件に、前記粒子を曝露する段階； c)前記溶液が実質的にフリースペースを満たすような条件下で、フレームワークを前記溶液に接触させる段階； d)ポリマーが連続性または半連続性の足場を形成するように前記溶液を処理する（すなわちポリマーが溶液から出て硬化するように処理する）段階；ならびに e)融合塩結晶を足場から除去する（得られる足場は、このプロセスにおいて使用される融合塩結晶のフリースペースにより規定される孔を有する）段階。75%を超える、かつ一部の態様においてはさらに95%をも超えるフリースペースが段階（c）において満たされることが好ましい。段階（d）の好ましい処理は、ポリマー溶媒を蒸発させる工程を含む。段階（e）の好ましい除去は、融合塩結晶を溶解させる工程を含む。段階（b）の好ましい条件は、前記塩結晶を約90%〜約100%の相対湿度に約8〜約28時間曝露する工程を含む。
【００１６】
採用されるポリマーが生体適合性および／または生分解性であることも好ましい。1つのそのような態様において、本発明は、以下の段階を含む方法を想定する： a) i)塩結晶を含む複数の粒子、および ii)生体適合性ポリマーを含む溶液、を提供する段階； b)塩結晶が互いに融合して、融合塩結晶の間にフレームおよびフリースペースを含むフレームワークが生じるのに十分な湿度に、前記粒子を曝露する段階； c)前記溶液が実質的にフリースペースを満たすような条件下で、フレームワークを前記溶液に接触させる段階； d)前記ポリマーが足場を形成するように前記溶液を処理する段階；ならびに e)融合塩結晶を足場から除去する（やはり、得られる足場は孔を有する）段階。
【００１７】
もちろん、本発明は、上記方法によって製造された足場も（重要な組成物として）想定する。1つの態様において、段階（e）後の足場は細胞を含む。
【００１８】
1つの態様において、本発明の足場は、細胞および組織の培養において使用されることが想定される。本発明の態様のこのような足場は、特定の細胞または組織種に限定されない。任意の非造血および造血組織または細胞種を、本発明の組織工学的足場上にて培養することができる。1つの態様において、本発明は、本発明の組織工学的足場上での筋および神経の細胞および組織の成長を想定する。
【００１９】
神経組織内部成長は神経系の適用において重要である上に、機能的骨格筋、心組織、および腎組織のような知覚制御を要する他の組織において非常に重要である可能性がある。線維血管内部成長は、発達中の組織へのおよび発達中の組織からの大量輸送を促進し、細胞が酸素および養分の調達ならびに代謝不要物の排出のための手段を持たない大容量組織（すなわち、骨、肝臓、骨格筋等）の工学的操作に特に必要である。さらに、均一な細胞播種および容易な細胞移動が、伝導性、誘導性、および細胞ベースの組織工学アプローチにおける発達中の組織の均質性を促進するために重要である。
【００２０】
他の態様において、本発明は、細胞または組織を前もって足場に加えることなく、足場を生物に埋植することを想定する。1つの態様において、足場を埋植し、細胞を周辺組織から足場に移動させる。もう1つの態様において、足場は、所望の細胞種の移動を増進し、所望でない細胞種の移動を妨げるように設計される。細胞種の移動は、例えば、足場の多孔性および孔サイズを制御することによって、または足場の構築のための材料の選択によって調節されると考えられる。本発明において、足場の多孔性および孔サイズは、塩の粒子サイズ、ならびに足場が構築されるフレームワークの構築中に塩粒子が曝露される時間の長さおよび湿度のパーセントの選択により制御されると考えられる。
【００２１】
もう1つの態様において、本発明は、足場に細胞を誘導性移動させるように設計された足場を想定する。例えば、足場は、埋植後に周辺環境へサイトカインを放出するように設計される。サイトカインの放出により、足場へ特定の細胞種が移動する。さらにもう1つの態様において、足場は、プラスミドDNAを局所環境へ放出し、それによって局所部位で多数の細胞をトランスフェクションすることになる。
【００２２】
本発明は、足場の多孔性および孔サイズが、フレームワークの構築に使用される塩粒子のサイズ、塩粒子の融合に使用する湿度のパーセント、および塩粒子を融合させる時間の長さによって制御される態様を想定する。もう1つの態様において、本発明は、孔の形状および方向の制御を想定する。例えば、長方形、正方形、球形、または楕円形の塩粒子（そして一部の態様においては、混合形状）が、孔の形状および方向を制御するために使用される。さらにもう1つの発明において、本発明は、塩フレームの形成のために水以外の溶媒を使用することを想定する。例えば、酸、塩基、および有機溶媒等の溶媒が想定される。ポリマーフレームワークのポリマー化後のフレームワークを溶解するために、これらの溶媒を使用することも想定される。さらなるもう1つの態様において、塩粒子を加熱する工程、塩粒子を圧力に供する工程、および電場または磁場に供する工程が、塩フレームワークを形成するための方法として想定される。さらなるもう1つの態様において、粒子フレームは、孔方向および孔サイズを制御するために、融合の間、指向性の機械力、電力、または磁力に供される。
【００２３】
さらにもう1つの態様において、本発明は、例えば、薬物、成長因子、ペプチド、抗体、抗生物質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド等をポリマーフレームワークに組み込むことを想定する。本発明はいかなる特定のメカニズムにも限定されないが、組み込まれた物質はフレームワークから局所環境へ滲出し、そこで細胞走化性、細胞のトランスフェクション、疾病および感染との闘病等を補助すると考えられる。本発明の1つの態様において、組織工学的足場を製造するための方法は、以下の4つの段階を含むことが想定される：1）ポロゲンとして作用する塩フレームワークの製造、2）ポリマー溶液の塩フレームワークへの導入、3）ポリマーのポリマーマトリックスへの硬化、および4）ポロゲンのポリマーマトリックスからの組織工学的足場を残した除去。1つの態様において、ポリマーは生分解性である。
【００２４】
本発明の態様は、以下の段階を含む方法を想定する；a) i)塩結晶、および ii)生分解性ポリマー、を提供する段階、 b)塩結晶が互いに融合してフレームおよびフリースペースを生じる条件に、塩結晶を曝露する段階、 c)フレーム中のフリースペースを満たしてまたは実質的に満たして足場を形成するような条件下で、フレームを生分解性ポリマーに接触させる段階、ならびに d)フレームを足場から除去する段階。
【００２５】
本発明の態様はまた、フレームを作製するために、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、および塩化マグネシウムの塩結晶を使用することも想定する。
【００２６】
本発明の態様は、ポリエステル、ポリエーテル、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、およびポリ（ラクチド-コ-グリコリド）を、足場を製造するための生分解性ポリマーとして使用することを想定する。本発明の態様は加えて、ポリエステルがポリ（アルファ-ヒドロキシエステル）であり、ポリエーテルがポリエチレンオキシド（PEO）またはポリエチレングリコール（PEG）であることも想定する。1つの態様において、生分解性ポリマーはポリ（ラクチド-コ-グリコリド）である。
【００２７】
本発明は、特定のポリマーまたはポリマー源に限定されることを意図しない。本発明は、ホモポリマー、コポリマー、および／またはポリマーの混合物を想定する。1つの態様において、ポリマー源は、固有粘性（inherent viscosity）が約1.6のポリ（L-乳酸）（PLLA）である。もう1つの態様において、ポリマーは、固有粘性が0.5〜0.6のポリ（D,L-乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）である。もう1つの態様において、ポリマーは、分子量が約103,000のポリ（d,l-乳酸）（PDLLA）である。前記ポリマーは市販されており、Boehringer Ingelheim（Ingelheim, Germany）および／またはSigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から購入されうる。特定の態様において、ポリマーは、固有粘性が0.78の85:15ポリ（D,L-ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーである。加えて、これらのポリマーは、さらに精製せずに使用される。
【００２８】
また、本発明は、特定の溶媒に限定されることを意図しない。1つの態様において、溶媒はジオキサン（D）である。もう1つの態様において、溶媒はジオキサンおよび水の溶液（D/W）である。もう1つの態様において、溶媒はテトラヒドロフラン（THF）である。もう1つの態様において、溶媒はN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）である。もう1つの態様において、溶媒はピリジンである。もう1つの態様において、溶媒はメタノールである。もう1つの態様において、溶媒はアセトンである。さらにもう1つの態様において、溶媒はクロロホルムである。
【００２９】
本発明の態様は、以下の段階を含む方法を想定する；a) i)塩結晶、および ii)生分解性ポリマー、を提供する段階、 b)塩結晶が互いに融合してフレームおよびフリースペースを生じる湿度に、塩結晶を曝露する段階、 c)フレーム中のフリースペースを満たしてまたは実質的に満たして足場を形成するような条件下で、フレームを生分解性ポリマーに接触させる段階、ならびに、 d)フレームを足場から除去する段階。
【００３０】
本発明の態様はまた、塩結晶融合に使用する湿度が、約90%〜100%であることを想定する。1つの態様において、ポロゲンは、24時間未満、およびより好ましくは10時間未満の間、湿度に曝露される。1つの態様において、本発明はまた、塩結晶は、約20〜28時間湿度に曝露されることを想定する。加えて、本発明の態様は、足場形成条件にガス発泡（gas foaming）が含まれることを想定する。さらに、本発明の態様は、足場形成条件に溶媒注入成形（solvent casting）が含まれることを想定する。
【００３１】
本発明の態様は、以下の段階により製造される足場を想定する；a) i)塩結晶、および ii)ポリマー、を提供する段階、 b)塩結晶が互いに融合してフレームおよびフリースペースを生じる条件に、塩結晶を曝露する段階、 c)フレーム中のフリースペースを満たしてまたは実質的に満たして足場を形成するような条件下で、フレームを生分解性ポリマーに接触させる段階、ならびに d)フレームを足場から除去する段階。
【００３２】
本発明の態様は、塩結晶が、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、および塩化マグネシウムであることを想定する。他の態様において、本発明は、足場が、ポリエステル、ポリエーテル、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、およびポリ（ラクチド-コ-グリコリド）より選択されるポリマーから作製されることを想定する。1つの態様において、ポリマーは生分解性である。
【００３３】
さらに他の態様において、本発明は、足場のポリマーが、ポリ（アルファ-ヒドロキシエステル）、ポリエーテル ポリエチレンオキシド、またはポリエチレングリコールからなる群より選択されることを想定する。
【００３４】
本発明の態様は、以下の段階により製造される足場を想定する；a) i)塩結晶、および ii)ポリマー、を提供する段階、 b)塩結晶が互いに融合してフレームおよびフリースペースを生じる湿度に、塩結晶を曝露する段階、 c)フレーム中のフリースペースを満たしてまたは実質的に満たして足場を形成するような条件下で、フレームをポリマーに接触させる段階、ならびに d)フレームを足場から除去する段階。1つの態様において、湿度は約90%〜100%である。もう1つの態様において、塩結晶は、約20〜28時間湿度に曝露される。
【００３５】
本発明の態様は、ガス発泡および溶媒注入成形により製造される足場を想定する。
【００３６】
本発明の態様は、細胞も含む、本発明の態様により作製される足場を想定する。本発明は細胞の供給源により限定されない。例えば、細胞は任意の多細胞生物のものでありうる。1つの態様において、細胞は植物および動物から選択される。もう1つの態様において、細胞は哺乳類のものである。さらにもう1つの態様において、細胞はヒトのものである。
【００３７】
本発明の1つの態様は、以下の段階を含む方法を想定する；a) i)ポロゲンを含む複数の粒子、および ii)ポリマーを含む溶液、を提供する段階； b)ポロゲンが互いに融合して、融合ポロゲンの間にフレームおよびフリースペースを含むフレームワークをが生じる条件に、前記粒子を曝露する段階； c)前記溶液がフリースペースを実質的に満たすような条件下で、フレームワークを前記溶液に接触させる段階； d)固体物質が形成されるように、フレームワークおよび溶液を圧縮する段階； e)前記固体物質を高圧ガスに曝露する段階；f）ガス圧力を周囲圧力まで下げる段階；ならびにg）融合ポロゲンを足場から除去する段階。もう1つの態様において、前記方法は、圧縮が100〜2000psiであることを想定する。さらにもう1つの態様において、前記方法は、ガス圧力が400〜1200psiであることを想定する。さらにまたもう1つの態様において、前記方法は、固体物質が半固体であることを想定する。
【００３８】
定義
本発明をよりよく理解するために、以下の定義を提供する。
【００３９】
「生体適合性ポリマー」は、生物学的系に適合性（すなわち非毒性）である合成または天然の材料として定義される。
【００４０】
「生分解性、生体適合性ポリマー」は、生物学的系に曝露されるまたは置かれると分解する（すなわち崩壊する）生体適合性ポリマーとして定義される。分解速度は本発明の態様によってどのようにも限定されず、速くてもよく（例えば、数分で分解が起こってもよい）、または遅くてもよい（例えば、数時間、数日、数週間、または数ヶ月かかって分解が起こってもよい）。
【００４１】
「塩結晶」および「塩ポロゲン」は、ポリマー組織工学的足場を構築するためのフレームワークを作出するために本発明の態様において使用される塩結晶である。
【００４２】
「融合」は、互いに集まって一緒になることとして定義される。本発明の1つの態様において、塩結晶は、局所環境または大気において、湿度、および時に熱によって、互いに融合される。もう1つの態様において、本発明はまた、ポロゲン（例えば塩結晶）が、酸、塩基、または有機溶媒により融合されることを想定する。
【００４３】
「可融性粒子」は、粒子が融解する条件に曝露される場合に、融解する条件が除去された時、粒子が互いに実質的に接続されて、融合した粒子マトリックス内に組み込まれたフリースペースを有するように、互いに融合される粒子として定義される。可融性粒子は、粒子の差し渡し最長寸法が約0.02mm〜5mmである。可融性粒子は、上記のように反応する任意の物質から作製される。複数の種類の可融性粒子を共に使用してもよい。
【００４４】
「半連続性」は、マトリックスの文脈において、マトリックスの他の部分と連続している（すなわち2つ以上の場所で接続されている）が、マトリックスの全ての部分がマトリックスの他の部分と連続している（すなわち1つの場所のみで接続されている）必要はない、マトリックスの部分を有するマトリックスとして定義される。
【００４５】
「湿度」および「相対湿度」は、塩結晶の局所大気（空気）における水分として定義される。湿度は、その温度および大気圧で空気が保持しうる水蒸気の最大量と比較した、大気中の水蒸気量を測定する。水蒸気で完全に飽和した空気は、100%相対湿度を有する。
【００４６】
「組織培養」および「細胞培養」は、生体外の無菌条件における細胞の成長として定義される。
【００４７】
「足場」は、その上で細胞が成長しうる三次元構造として定義される。
【００４８】
「実質的に満たす」は、フリースペースの領域を許容量または許容量近くまで満たすこととして定義される。1つの態様において、実質的に満たすとは、フリースペースが約50%より多く満たされる（例えばポリマーまたはポリマー溶液で満たされる）ことを意味する。もう1つの態様において、実質的に満たすとは、フリースペースが約75%より多く満たされることを意味する。さらにもう1つの態様において、実質的に満たすとは、フリースペースが約90%より多く満たされることを意味する。さらなるもう1つの態様において、実質的に満たすとは、フリースペースが約95%より多く満たされることを意味する。
【００４９】
「フリースペース」は、本発明において具体化される塩結晶フレーム（例えば融合ポロゲン）間の領域として本明細書において定義される。「フレーム」は、内部に開放スペース（すなわちフリースペース）を有する固体または半固体材料として本明細書において定義される。
【００５０】
「伝導性移動」は、細胞の移動を誘導することが知られるまたは誘導すると考えられるサイトカインまたは他の生体物質（例えばペプチドまたはDNA）を使用せずに、細胞が足場に移動することとして定義される。
【００５１】
「誘導性移動」は、細胞の移動を誘導することが知られるまたは誘導すると考えられるサイトカインまたは他の生体物質（例えばペプチドまたはDNA）の補助により、細胞が足場に移動することとして定義される。
【００５２】
「ポロゲン」は、ポリマー溶液をポロゲン隅々およびポロゲンの間に分布させることによってマトリックス中に孔を形成させるために使用されうる物質として、本明細書において定義される。ポリマー（またはポリマー溶液）の前記分布は、ポロゲンがフレームワークへと融合する前でも後でもよい。ポロゲンは、そうである必要はないが、結晶物質でもよい。
【００５３】
「溶媒」は、溶液中に別の物質を保持する液体または気体（例えばCO2）として定義される。本発明のある態様において、溶媒は、生体適合性（および生分解性）ポリマーを含むがそれに限定されないポリマーを溶液中に保持する液体である。また、本発明は、特定の溶媒に限定されることを意図しない。1つの態様において、溶媒はジオキサン（D）である。もう1つの態様において、溶媒はジオキサンおよび水の溶液（D/W）である。もう1つの態様において、溶媒はテトラヒドロフラン（THF）である。もう1つの態様において、溶媒はN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）である。もう1つの態様において、溶媒はピリジンである。もう1つの態様において、溶媒はメタノールである。もう1つの態様において、溶媒はアセトンである。さらにもう1つの態様において、溶媒はクロロホルムである。さらなるもう1つの態様において、溶媒は、ポリマー溶液が導入された後にポリマーが硬化された融合塩フレームワークを溶解するために使用される水等の液体である。
【００５４】
「ポリマー」は、（モノマー）ユニットまたは多量体が繰り返されて作られた巨大分子として本明細書において定義される。本発明の文脈において、ポリマーは、「ポリマー溶液」を形成するために適切な「溶媒」に溶解または懸濁される。1つの態様において、ポリマーは、溶媒の除去によりポリマー化される。もう1つの態様において、溶媒の除去により、単に液体ポリマー溶液から固体の連続性ポリマーマトリックスへと相変化が起こる。
【００５５】
「ポリマー化」は、複数のモノマーの鎖を作出することとして定義される。
【００５６】
「ポリマー溶液」は、溶解または懸濁した（例えば溶媒中に溶解または懸濁した）ポリマーを含む溶液として本明細書において定義される。
【００５７】
「ポリマー溶媒」は、ポリマーを溶解しうるが、同時にポロゲンとして使用されている物質をはっきりと認められるほどには溶解しない溶媒として、本明細書において定義される。
【００５８】
「熱可塑性物質」は、規定の温度より上に加熱されると融解し、この温度よりも下に冷却されると固化する、ポリマーのクラスとして定義される。
【００５９】
「固体」は、本発明の文脈において、剛性の尺度を定義する相対的な用語である。この「固体」という用語は、「半固体」という用語を含む。半固体は、展性である特性を保持する固体である。
【００６０】
発明の全体的な説明
本発明は、組織工学に使用される足場を製造するための方法および組成物に関する。より詳しくは、本発明は、足場（組織工学的足場を含むがそれに限定されない）が上に構築されうるフレームワークを形成する様々な条件下で、塩化ナトリウム結晶および他の塩を使用することに関する。しかし、本発明の方法は、結晶物質の使用に限定されない。非晶質物質もまた、足場の製造について想定される。本発明の組織工学的足場を製造するための新規方法は、先行技術の方法と比較して、多孔性、相互接続性、および製作の容易さを改善し、さらにこれらの属性をよりよく制御する。
【００６１】
組織工学とは、ドナー宿主に埋植し戻すための部分的または完全な機能的組織または器官を製造するために、合成性の生分解性足場上の細胞から新しい結合組織または器官を成長させることである。1つの態様において、本技術は、(移植よりむしろ)埋植から成長させる器官であり、そのために免疫学的拒絶がない器官を想定する。もう1つの態様において、本技術は、ドナーから細胞を移植することを想定する。さらにもう1つの態様において、本技術は、インビボ細胞を足場に移動させるために組織工学的足場を埋植することを想定する。一部の態様において、任意の組織工学的器官のための開始点が、組織工学的器官の将来のレシピエントから組織を少量採取することであることが想定される。いくつかの応用について、これは2mmの小ささのパンチ生検でありうる。
【００６２】
二次元表面上で成長させると、相互作用して自身を機能組織へと組織化する細胞の能力が制限される。対照的に、三次元のフレームワークは、細胞が生体内の対応物にさらに厳密に類似する組織へと発達および集合することを可能にする。
【００６３】
通常の成長および発達において、生体は、各器官に三次元構造を提供する「支質」すなわち生体マトリックスを形成するために、特殊化した結合組織細胞を使用する。支質はまた、付着部位を提供し、器官細胞の機能組織への発達を促進する成長因子を産生する。支質の特定の成分および配置は器官によって異なりうるが、三次元の支質支持の基本的原理は、体内のほとんどの器官に当てはまる。
【００６４】
手順を手短に述べると、足場より始め、それを必要なように形づくり、それに生細胞を播種し、そしてそれを培養培地および成長因子に浸す。細胞が増殖して足場を満たし、三次元の組織へと成長し、そして一旦体内に埋植されると、細胞は企図された組織機能を再現する。血管が新しい組織へ付着し、足場は溶解して、そして新しく成長した組織は最終的に周辺に溶け込む。
【００６５】
1つの態様において、器官特異的細胞は、体内環境をシミュレートする密閉式（closed）バイオリアクター系内で三次元足場上に播種されてもよい。例えば、皮膚組織工学において、細胞は付着して分裂し、細胞外マトリックスタンパク質および成長因子を分泌して、完全なヒトの機能的組織を形成する。
【００６６】
組織工学は、1992年に初めて単離された未成熟細胞の一種である幹細胞を伴うことが多い。幹細胞は、培養皿または体内において曝露される成長因子に従って特異的な細胞種に分化するので、適切な位置に埋植することにより、骨から腱、軟骨まですべてを生成することができる。
【００６７】
本発明の態様は特定の使用に限定されないが、組織工学的足場および組織工学は多くの組織および器官を再現するために使用されうる。1例としては、軟骨修復である。関節軟骨に対する外傷性損傷は、年間約900,000の症例が起こる。成体性軟骨は通常は、スポーツによる損傷および他の物理的損傷後に正常に再生せず、合併症を引き起こす。もう1つの例は、骨修復である。米国だけでも年間推定800,000人の患者が重度の骨折により入院しており、そのうち半数が開放性骨折整復手技を必要とする。これら骨折のかなりの部分は適正に治癒せず、このため骨移植等の付加的手順を必要とする。他の骨折はどのような取り組みにも非応答性であるが、組織工学への理想的な候補となるかもしれない。さらにもう1つの例は、皮膚の創傷治癒である。皮膚の創傷を適正に治癒できないことにより、米国において年間推定260万人の患者が影響を受けている。これらの創傷は、糖尿病、血行障害、および固定（immobilization）等の他の症状の合併症の結果であることが多い。これらの創傷は、数ヶ月または数年でも治癒しないことが多く、感染症等の深刻で生命を脅かす合併症を引き起こす。往々にして、罹患した末端部の切断術が必要とされる。
【００６８】
好ましい態様の詳細な説明
A. 溶媒注入成形およびガス発泡
組織工学的足場は伝統的に、溶媒注入成形（Mikos, A.G.ら、"Preparation and characterization of poly(L-lactic acid) foams" Polymer 35:1068, 1994）およびガス発泡（Harris, L.D.ら、"Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming" J Biomed Mater Res 42:396, 1998）プロセスにより作製されてきた。溶媒注入成形プロセス（Mikos, A.G.ら、"Preparation and characterization of poly(L-lactic acid) foams" Polymer 35:1068, 1994）では、適した溶媒中にポリマーを溶解してポロゲンを含む型枠（mold）に加え、ポロゲンを分散させる。次いで溶媒を周囲（ambient）条件下で混合物から蒸発させて、ポロゲンを含むポリマーマトリックスを残し、その後これを適切な溶媒中に滲出させることができる。ガス発泡プロセス（Harris, L.D.ら、"Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming" J Biomed Mater Res 42:396, 1998）では、ポリマー粒子をポロゲン粒子と混合し、混合物を圧縮して、ポロゲンを散りばめた不連続なポリマーの固体混合物にする。この後、得られるペレットを高圧CO2ガスに曝露し、時間を経過させて圧力を平衡にした後、圧力を急速に放出させて混合物のポリマー成分中に熱力学的不安定性を引き起こす。不安定性によりポリマーが発泡し、もとは不連続であったポリマー粒子が互いに融合して、散らばっているポロゲン粒子の周りに連続的なポリマーマトリックスを形成し、その後ポロゲン粒子を溶媒中に滲出させる。これらプロセスの各々において、得られる足場中の孔間の相互接続の程度は、それぞれ溶媒蒸発またはポリマー発泡段階中の、ポロゲン粒子の相互接続によって決まる。ポロゲンは、融合前にポリマー内に分散させるので、ポロゲン粒子間の相互接続の程度は積極的には制御されず、最終足場産物中の孔の相互接続性は制御されない。
【００６９】
足場内の孔相互接続性の実質的利点という観点から、ポロゲン相互接続性の増強および制御が、様々な組織工学ストラテジーにおいて重要な関心事であると考えられる。本発明のある態様は、足場多孔性および相互接続性の制御におけるこれら問題を解決する。本発明の好ましい態様において、ポロゲンは分散されない。むしろポロゲンはフレームワーク（または格子）を作出するために融合され、ポリマー溶液がこのフレームワーク上およびフレームワークの中へ導入される。
【００７０】
B. 細胞培養
本発明は、細胞の供給源によって限定されることを意図しない。1つの態様において、組織工学に使用される細胞は、生検由来である。生検由来の細胞は、「細胞バンク」を作出するために、外植片またはコラゲナーゼ消化物から培養される。これら細胞はさらに、埋植用の組織工学的構築体を形成するために適正な生理学的条件下、基板および足場上で培養される。本プロセスは、無菌環境を維持するために組織培養設備において行われる。細胞の生化学的および物理学的活性は、成長因子またはサイトカインを加えることによって、および物理的刺激を使用することによっても増強することができる。一部の応用においては、微小な物理的負荷を適用する装置により、足場中に存在する細胞集団が刺激されて、器官形成および組織修復に通常関係する生化学的および生物物理学的活性が導かれる。適正な条件下でのさらなる組織培養後、構築体を、細胞が初めに取り去られた患者に埋植し戻すことができる。この技術により、組織工学的組織は患者自身の細胞から成長しているため、患者の体の自然な一部として許容されうることから、抗拒絶薬の必要性が取り除かれると考えられる。
【００７１】
C. ポロゲン融合
本発明のある態様において、塩結晶を、ある条件（例えば約95%の湿度）への曝露を経て融合させ、溶媒注入成形およびガス発泡PLG足場の双方内の孔相互接続性を増強することができる。溶媒注入成形前に塩マトリックスを融合させることにより孔壁中に穴が形成され、これらの穴の直径および球形度は塩融合処理の増加と共に増加する。塩融合処理により、おそらく孔壁中の穴近傍に厚い輪状の支柱が形成されることによって、溶媒注入成形足場の圧縮係数（compressive modulus）が増加する。増強された孔の相互接続性は、様々な組織工学的応用、特に緊密な細胞-細胞接触が要求されるもの（すなわち神経および筋応用）において有用であると考えられる。また、塩融合方法により、溶媒注入成形およびガス発泡プロセスの両方において孔の相互接続性が改善されることから、このコンセプトは、相互接続性が高いマクロまたはミクロの多孔性材料系を製造するための他の固体ポロゲンベースの方法に応用可能であると考えられる。
【００７２】
融合した塩の型枠を溶媒注入成形粒子滲出法において利用することにより、足場中の孔壁の間に穴が形成される。塩融合時間の増加により、足場断面内の孔構造の秩序性が低くなった。秩序だった孔構造の明らかな欠如は塩融合試料の良好な相互接続性によるものであり、これが十分に秩序だった、大きく分離された（largely closed-off）孔の存在を減少させる。足場を二分すると、孔の多くが連続的な孔壁の欠如によって平滑になっている。実際、融合塩マトリックスの連続性が増加することにより、対応する不連続性がポリマーマトリックス中に作出され、孔の間に大きな間隙ができ、優れた相互接続性が生じる。また、完全な試料は、48時間以上の塩融合時間を使用して作ることはできない。これは、塩マトリックスの連続性と組織工学的足場の連続性との間の逆相関をさらに支持する。塩を分散させる溶媒注入成形粒子滲出プロセスを使用する従来の研究によっては、本研究において示される孔壁中の穴による孔の相互接続性を制御できない（Mikos, A.G.ら、"Preparation and characterization of poly(L-lactic acid) foams" Polymer 35:1068, 1994；Kaufmann, P.M.ら、"Highly porous polymer matrices as a three-dimensional culture system for hepatocytes" Cell Transplant 6:463, 1997；Murphy, W.L.ら、"Growth of continuous bone-like mineral within porous poly(lactide-co-glycolide) scaffolds in vitro" J Biomed Mater Res 50:50, 2000）。最近の研究において、研究者らは、溶媒注入成形の前に、ポリマー性ポロゲン粒子を互いに融合させるために熱を用いた（Ma, P.X. および Choi, J. "Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnected spherical pore network" Tissue Eng 7:23, 2001）。熱の使用がいくつかの組織工学的応用において有用であるとの証明になりうるが、本明細書に記載する局所溶解アプローチは、いくつかの種類のポロゲン粒子（有機および無機の両方）を室温融合する可能性、および生物活性誘導性因子を含むプロセシング技術（すなわちガス発泡/粒子滲出）に加えられる可能性があることから、より広い応用可能性を持つと考えられる。
【００７３】
ガス発泡の前にPLG/NaCl混合物内でNaCl結晶を融合することはまた、孔構造に明らかな効果を有する。塩融合（salt fusion, SF）ガス発泡足場の24時間以内の孔はお互いに直接食い込んでいるように見え、足場圧縮係数の大幅な減少を伴わない非常に高度な相互接続性を示唆する（例えば図6bを参照されたい）。ガス発泡プロセスは従来、血管組織の内部成長を促進するため、生物学的に活性な血管内皮成長因子（Sheridan, M.ら、"Bioabsorbable polymer scaffolds for tissue engineering capable of sustained growth factor delivery" J Control Rel 64:91, 2000；Murphy, W.L.ら、"Sustained release of vascular endothelial growth factor from mineralized poly(lactide-co-glycolide) scaffolds for tissue engineering" Biomaterials 21:2521, 2000）および血小板由来成長因子をコードするプラスミドDNA（Shea, L.D.ら、"DNA delivery from polymer matrices for tissue engineering" Nat Biotech 17:551, 1999）を含む足場を加工するために使用されてきた。本発明の新規塩融合方法をガス発泡および溶媒注入成形方法に加えることにより、組織工学的足場の内部全体に渡って、高度に相互接続された血管供給が形成される。足場系内に最大限の深さまで血管内部成長を達成させることは、大容量組織工学ストラテジーにおける実質的最終目標であり、本発明の高度に相互接続した孔構造は、最適な血管組織内部成長のために有利である。
【００７４】
湿度の高い環境に曝露されると、隣接する塩結晶は「ケーキング（caking）」とよばれるプロセスで融合し、これにより岩塩または不適切に保存された食塩の大きな凝塊の形成が起こることが多い（ケイ酸カルシウム等の抗ケーキング剤がケーキングを防ぐために食塩に添加される。これは基本的に、パッケージ内部の、そうでなければ塩粒子表面に吸収される水分を吸収することによるものである）。好ましい態様においては、本発明は抗ケーキング剤の使用を想定しない。固体塩結晶格子内での原子の拡散率は、吸収された水の存在により増加する。拡散の増加により、接触する塩粒子の表面が癒着し、非ガラス質のセラミック材料の固体焼結（solid sintering）に用いられるものと同様のプロセスで、粒子間にブリッジが形成される。本プロセスにおいて塩粒子の合計表面積が減少して表面エネルギーが減少することにより、個々の粒子が癒着し始める（Van Vlack, L. H. "Elements of Materials Science and Engineering," 4ed. Addison-Wesley Publishing Company, Reading, MA, pp. 120 & 316, 1980）。各塩粒子の球形度の増加はまた、各粒子の合計表面エネルギーを減少させるため、熱力学的にも好ましい。
【００７５】
D. 足場造型
溶媒注入成形足場は、塩融合の24時間後に有意に圧縮係数が増加したが、ガス発泡足場はそうではなかった。溶媒注入成形足場は、塩粒子の丸くなった角部および端部により空けられたスペース中に形成することが可能となったPLG材料のより厚い支柱が、足場中のPLGの容積部分における増加なしに、より硬い構造を形成した。ガス発泡足場の係数における同様の増加は、NaClの融合時間を増加させることによっては起こらなかった。これは、ガス発泡プロセスにおける塩融合中にPLG粒子が存在することに起因しうる。両種の粒子（NaClおよびPLG）の存在下でさえ、隣接するNaCl結晶の間の相互作用について何らかの空スペースがあることに疑いの余地はない。拡散に起因する塩表面の転置は、利用可能な空スペース内での動きに限られた。これを支持する証拠は、溶媒注入成形足場には存在しない微小穿孔シートから足場が構成されている図5（bおよびd）において明らかであり、NaCl融合プロセスの間、動いている塩結晶表面は、より小さなPLG粒子により邪魔され、おそらくその周りをさまよっていたことを示唆している。このように、ブリッジは隣接する塩粒子の間に形成されたものの、結晶表面の動きはPLG粒子の存在によって束縛された。これにより、PLG足場中の厚いセクションの支柱の形成を起こす塩構造中の空スペースの成長が防止された可能性があり、なぜガス発泡足場において孔相互接続性が増加したのに圧縮係数が増加しなかったのかを説明する。
【００７６】
E. 例示的応用
いかなる特定の応用にも限定されないが、本発明の態様の塩融合方法は、孔の相互接続性に依存するため、神経および筋組織工学に応用可能である。神経組織欠損のブリッジング（軸索伸長）および機能的骨格筋組織の発達（筋芽細胞融合）における再生プロセスは、緊密な細胞-細胞相互作用を必要とする生理学的プロセスの例である。様々な天然および合成の足場材料を使用して神経のギャップを埋める（bridge）ためのストラテジーは、ギャップの長さが10mm未満でさえ、ほんの控えめにしか成功しておらず（Valentini, R.F.ら、"Collagen- and laminin- containing gels impede peripheral nerve regeneration through semipermeable nerve guidance channels" Exp Neurol 98:350, 1987；Aldini, N.N.ら、"Effectiveness of a bioabsorbable conduit in the repair of peripheral nerves" Biomaterials 17:959, 1996）、多くの場合において失敗の理由としては、十分な孔相互接続性が欠如していること、および導管（conduit）の機械的完全性が不十分であることが挙げられる。
【００７７】
神経再生のために、多孔性ポリ（ラクティック-コ-グリコール酸）（Evans, G.R.D.ら、"Tissue engineered conduits: the use of biodegradable poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) scaffolds in peripheral nerve regeneration" In: Stark, G.E., Horch, R., Tanczos, E., Eds. Biological Matrices and Tissue Reconstruction. Berlin: Springer, 1998, pp. 225-235）およびポリ（L-乳酸）（Evans, G.R.D.ら、"In vivo evaluation of poly (L-lactic acid) porous conduits for peripheral nerve regeneration" Biomaterials 20:1109, 1999）足場を用いた最近の研究は、ラット坐骨神経モデルにおける12mmの神経欠損において将来性を示した。この基本コンセプトを、より大きく重大な神経欠損まで拡張することは、血管内部成長を可能にし、軸索伸長の間の再生している線維が剪断されることを防ぎ、かつ伸長している軸索がその標的器官に達することを保証する、制御された孔の相互接続性を必要とする。
【００７８】
増強され制御された孔の相互接続性は、筋芽細胞融合の成功を促進するために必要な足場特性である。さらに、機能する筋のオルガノイド（organoid）内での細胞の生存は拡散律速され（diffusion limited）（Dennis, R.G. および Kosnik, P.E., "Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro" In Vitro Cell Dev Biol - Animal 36:327, 2000）、したがって、血管組織の内部成長は、収縮特性を増幅させる目的で機能的筋構築体の最大直径を増加させるために不可欠である。いかなる特定の応用にも限定されないが、本発明のある態様（例えば塩融合プロセス）は、神経および筋応用のための高度に相互接続された足場の調製に特に応用可能である。本発明はいかなる特定の理論にも限定されないが、三次元細胞-細胞相互作用を促進することにおける孔相互接続性の実質的な利点は、組織工学的足場中で神経組織および筋組織の成長を補助することであると考えられる。
【００７９】
実験例
以下の実施例は、本発明のある特定の好ましい態様および局面を例証するために供されるものであり、その範囲を限定すると解すべきものではない。
【００８０】
以下の実験の開示において、以下の略語が適用される：
eq（当量）；M（モル濃度）；μM（マイクロモル濃度）；N（規定濃度）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μmol（マイクロモル）；nmol（ナノモル）；g（グラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；L（リットル）；dl（デカリットル）；ml（ミリリットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメートル）；℃（セ氏度）；RDA（representational difference analysis、表現差解析）；nts（ヌクレオチド）；kV（キロボルト）。
【００８１】
実施例1
本実施例において、NaClフレームおよび生分解性ポリマー足場を製造する。塩粒子（Mallinkrodt, Paris, Kentucky）は、ある一定範囲のサイズにするため、ふるいにかけた。直径約250〜425μmのNaCl結晶を使用した。
【００８２】
多孔性足場を、粒子ポロゲンとしてNaClを使用して、溶媒注入成形/粒子滲出またはガス発泡/粒子滲出プロセスのいずれかにより調製した。溶媒注入成形足場は、基本的にMikos, A.G.ら（"Preparation and characterization of poly(L-lactic acid) foams" Polymer 35:1068, 1994；参照として本明細書に組み入れられる）によって記載されているように調製した。溶媒注入成形前にNaCl結晶を融合させるために、NaCl結晶（直径約250〜425μm）を95%の湿度に0〜24時間供してNaCl型枠を作製した。37℃に維持した密閉式ウォータージャケット細胞培養インキュベーター（closed, water-jacketed cell culture incubator、Forma Scientific社）を使用してNaCl結晶融合用の95%の湿度環境を作り出した。
【００８３】
ラクチド：グリコリド比が85:15のポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（PLG）ペレットを、Medisorb社（固有粘度（intrinsic viscosity, I.V.）=0.78dl/g）およびBoehringer-Ingelheim社（I.V.=1.5dl/g）から得た。溶媒注入成形プロセスにおいて、比較的高い多孔性（〜97%）に関わらず十分な機械的完全性を足場が保持することを確かにするために、高固有粘性PLGを使用した。PLGペレットをクロロホルム（Mallinkrodt, Paris, Kentucky）に溶解して10%重量/体積（w/v）溶液とした。次いでポリマー溶液を、上記のように塩結晶が融合されたNaClを含む型枠に注いだ。溶媒蒸発後、蒸留水に約48時間浸漬することによって塩を除去した。
【００８４】
ガス発泡足場は、基本的にHarris, L.D.ら（"Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming" J Biomed Mater Res 42:396, 1998；参照として本明細書に組み入れられる）によって記載されているように調製した。溶媒注入成形前にNaCl結晶を融合させるために、NaCl結晶（直径約250〜425μm）を95%の湿度に0〜24時間供してNaCl型枠を作製した。95%の湿度における処理に続いて、試料を、さらにプロセシングする前に減圧デシケーター中48時間乾燥させた。37℃に維持した密閉式ウォータージャケット細胞培養インキュベーター（Forma Scientific社）を使用してNaCl結晶融合用の95%の湿度環境を作り出した。PLGペレット（上記のように調製した）をクロロホルムに溶解した。融合したNaClのフレームをPLGと混合してアルミニウム金型（直径1.35cm；Aldrich Chemical社, Milwaukee, Wisconsin）に入れ、Carver Laboratory Press（Fred S. Carver社, Menominee Falls, Wisconsin）を使用して1500Psiで1分間圧縮し、固体ディスク（厚さ約3.4mm）を得た。次に試料を高圧CO2ガス（800psi）に24時間曝露してポリマーをガスで飽和させた。ガスの圧力を周囲圧力まで下げることによって熱力学的不安定性を作り出した。これによりポリマーマトリックス内で核生成およびCO2孔の成長が引き起こされる。続いて、マトリックスを蒸留水中48時間滲出させることにより、NaCl粒子をマトリックスから除去した。プロセシング段階は全て周囲温度で行った。
【００８５】
足場は、直径約12mm厚さ約3mmの円形ディスクであった。孔サイズ範囲は、プロセシングにおいて直径約250〜425μmのNaCl粒子を使用することによって制御した。足場の全体の多孔性を、固体ポリマーの既知の密度、足場の測定したポリマー質量、および足場の測定した外部体積を使用して計算した。
【００８６】
実施例2
本実施例において、足場を特徴付ける。95%の湿度中でNaCl結晶をインキュベーションすることにより結晶が融合し、高度に相互接続されたNaClマトリックスが作出された（図1a〜b）。溶媒注入成形前にNaCl結晶融合の程度を観察するため、融合した塩型枠を二分割してイメージ化した。加えて、ポリマー足場を調製後に凍結割断により二分割した。カーボンコーティングを各二分割塩型枠およびポリマー足場の表面上で蒸発させ、20〜30kVで操作するHitachi S-3200N SEMを使用して高減圧下、試料をイメージ化した。クロロホルム中にPLGを加える前の塩結晶の融合（溶媒注入成形）により、足場内の孔相互接続性が増強された。足場内の孔構造（図2）は、期待通り、融合塩マトリックスの構造（図1a〜b）と同様であると思われた。1時間塩融合（SF）試料の断面内の孔は孔壁中に断続性の穴を持つはっきりとした孔構造を示す（図2a、2c）が、24時間SF試料から作出された足場の断面は孔壁中にかなり秩序性の低い孔構造および非常に大きな密度の穴を示す（図2b、2d）。穴サイズは、1時間融合後の平均直径31±10μmから24時間融合後の78±21μmへと、融合時間と共に有意に増加した（p<0.05）。加えて、24時間SF足場中の孔壁は、孔壁中の穴付近の領域において、かつ壁の外径に沿って、壁が厚く見えるような厚み輪郭（thickness contour）を示す（図2d）。24時間SF足場内の孔壁の高倍率視野はさらに、孔壁の輪郭づけられた構造を示す（図2e）。塩融合プロセスは足場の多孔性に効果がなく、各塩融合時間についての溶媒注入成形足場の計算した全多孔性は97±1%であった。
【００８７】
NaCl融合の1および24時間後に形成された溶媒注入成形足場の電子顕微鏡像の綿密な検討によって、95%の湿度への曝露が塩粒子の構造にいくつかの重要な変化を引き起こしていることが示される。接触点での粒子間のブリッジの形成に加えて、塩の個々の粒子における端部および角部の湾曲の半径が増加している（図1aおよびb）。これら変化は図式的に示される（図3）。塩結晶の湾曲の半径は、Microsoft（商標） Paint（商標）ソフトウェアを使用して電子顕微鏡像から計算した。各イメージについてのピクセルサイズを較正し、ペンシルツールを使用して結晶端部上の正接点（tangent point）をマークした。次いで較正値およびピクセル座標を使用して正接点間のコード長を計算し、(2/2を掛けて湾曲の結晶半径を得た。孔壁中の穴の直径を、マイクロソフトペイントを使用して各穴の大直径軸および小直径軸を測定して平均をとることによって決定した。塩の各粒子の端部および角部での湾曲半径の増加により各粒子の球形度が増加し（図4）、これが足場中に得られる各孔となる。結晶端部の湾曲の平均半径は、19±10μmから、95%の湿度への曝露12時間後に32±15μmへと、次いで全24時間の曝露後に62±18μmへと増加した（図4）。結果として、小さめの結晶の多くは、融合の24時間後には形状がほぼ球形になった。1つのさらなる結論は、より厚いポリマー支柱が、各塩結晶の角部および端部により空けられたスペース中に形成することができ、これにより孔壁中の上記厚さ輪郭および異なる機械的特性を与えうるということである。
【００８８】
また、ガス発泡前にPLG/NaClペレット中で塩結晶を融合することにより、孔構造にはっきりしたバリエーションが得られた。1時間SF試料の断面（図5a、5c）により、溶媒注入成形1時間SF試料中のものと同様の孔壁中の小さな穴が示される。24時間塩融合試料は明確な孔構造を欠き、孔は単に互いに食い込んでいるように見える（図5b、5d）。ガス発泡SF足場は、溶媒注入成形SF試料中に観察される孔壁中のいかなる輪郭も示さない。やはり、塩融合プロセスは、全足場多孔性について効果がなかった。各塩融合時間についてのガス発泡足場の全多孔性は、94±1%であった。
【００８９】
24時間の塩結晶の融合により、溶媒注入成形足場の圧縮係数が2倍増加した（図6a）。足場の圧縮係数は、MTS Bionix 100機械的試験系を使用して決定した。試料を、圧盤の間で、1mm/分の一定変形速度で圧縮した。圧縮プレートは45mmの直径を有し、足場の12mm直径表面全てを覆った。試験前に足場表面全体が圧縮プレートに接触することと、および各試験前のプレート間の距離が試験する足場の測定した厚みと等しいこととを確実にするために、各試料に少量の予備負荷をかけた。圧縮係数を、塩融合なしの足場について、かつ4つの試料の各々について各塩融合時間について、決定した。グラフ上の値は、平均および標準偏差とを示す。統計的解析は、InStat（商標）ソフトウェア、バージョン2.01を使用して行った。圧縮係数における有意差を明らかにするために、スチューデントt検定により、各時点で実験係数を対照係数と比較した。塩融合の1時間または12時間後には、有意な係数変化は観察されない。代わりに、塩融合を使用して加工されたガス発泡足場の圧縮係数に、対照足場と比較して統計的に有意な減少があった（図6b）。
【００９０】
実施例3
本実施例において、本発明の足場を細胞培養に使用する。足場を、ガンマ線照射、エチレンオキシド、または冷却滅菌剤により滅菌する。細胞を、必要であれば任意の必要な成長因子を含む適切な培養培地中で足場上に播種する。細胞培養培地は、バッチフィーディングまたは灌流法によって置換されうる。無菌性を常に保つ。
【００９１】
実施例4
本実施例において、本発明の足場を、組織を試験対象の体内に埋植するために使用する。他の例において、足場は、生体からの細胞の伝導性および誘導性移動を可能にするために、組織または細胞なしで直接埋植に使用される。16匹のマウスから生検を得る。生検は、任意の非造血または造血組織から得る。生検は、全ての試験動物から同じ組織源より得る。本実施例は、所望の数の組織種について行いうる。細胞を、コラゲナーゼ処理により基底膜およびシンシチウムから離す。8匹のマウスからの細胞をペトリ皿で培養する。他の8匹のマウスからの細胞を本発明の足場上で培養する。約7〜21日間培養後、細胞または細胞を含む足場を、それぞれのマウスに埋植し戻す。経過観察により、本発明の細胞/足場埋植体は血管に取り込まれて（invaginated）三次元構造を維持することが示される。経過観察により、本発明の足場なしで培養された細胞は、宿主動物中に消散し、取り込まれず、見分けることができる三次元構造も保たないことが示される。細胞が周辺組織から足場へと移動する例において、経過観察により、循環脈管の取り込みと共に足場における細胞の確立が示される。
【００９２】
以上より明らかなように、本発明は、組織工学的足場を製造するための新規組成物および方法を想定する。これら新規組成物および方法は、一貫した孔サイズおよび相互接続性の生体適合性構造を効率的に製造することを考慮に入れる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図1aおよび1bは、95%の湿度中a)12時間または b)24時間の処理を経て融合した塩結晶NaClマトリックスの断面の電子顕微鏡像を示す。
【図２】図2a、2b、2c、2d、および2eは、塩融合プロセスを使用して調製された溶媒注入成形組織工学的足場の断面の電子顕微鏡像を示す。塩融合1時間により孔壁に低密度の穴（31±10μm直径）ができる（A、C）一方、24時間融合処理では孔壁に高密度のより大きな（78±21μm）穴ができる（B、D）。24時間塩融合足場はまた、相互接続する穴に直に接する厚い輪を持つ輪郭づけられた孔壁を示し（B、D）、これは高倍率で特に明らかである（E）。
【図３】図3aおよび3bは、溶媒に富む（約95%の湿度）大気における固体拡散による塩融合プロセスを示す。（A）融合前、塩粒は、端部および角部に小さな接触領域および尖った半径を有する。（B）95%の湿度への曝露24時間後、接触点付近の拡散により粒子間に厚い塩ブリッジが形成され、各塩粒子の端部および角部での湾曲の半径が増大した。
【図４】溶媒注入成形/粒子滲出方法におけるポリマー添加前の、塩結晶端部の湾曲の半径における増加を示す。半径は、0、12、および24時間融合した塩結晶の電子顕微鏡像から測定した。ANOVAとその後の群平均間の比較（ボンフェローニt検定）に基づいて、0〜12時間の平均端部半径における変化は有意でなかった（p>0.05）が、12時間〜24時間の変化は極めて有意であった（p<0.001）。
【図５】図5a、5b、5c、および5dは、塩融合プロセスを使用して調製したガス発泡組織工学的足場の断面の電子顕微鏡像を示す。塩融合1時間により、溶媒注入成形足場におけるものと同様に、孔壁にいくつかの非常に小さな穴ができた（A、C）。24時間塩融合足場により、隣接する孔が互いに食い込んでいるように見える、秩序が乱れた孔構造が示される（B、D）。
【図６】図6aおよび6bは、様々な時間の塩融合に供され、溶媒注入成形（a）またはガス発泡（b）のいずれかを経て調製された足場の圧縮係数を示す。値は平均および標準偏差（n=4）を表し、*は対照と比べて統計的に有意な相違を示す（p<0.05）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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