(57)【要約】本発明は、ＢｓｅＲＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＭ．ＢｓｅＲＩをコードする組換えＤＮＡ、当該組換えＤＮＡを含有する大腸菌におけるＢｓｅＲＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＭ．ＢｓｅＲＩの発現に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルスの種Ｒ由来のＢｓｅＲＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
ＢｓｅＲＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡセグメントが挿入されたベクターを含んでなる組換えＤＮＡベクター。
【請求項３】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３７３８から入手可能である、ＢｓｅＲＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＢｓｅＲＩメチラーゼをコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載の単離されたＤＮＡを含んでなるベクター。
【請求項５】
請求項２又は４に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの発現に好適な条件下で、請求項２又は４に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含んでなる、組換えＢｓｅＲＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢｓｅＲＩ制限エンドヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼ）及びＢｓｅＲＩメチルトランスフェラーゼ（メチラーゼ）をコードする組換えＤＮＡ並びに当該組換えＤＮＡを含有する大腸菌におけるＢｓｅＲＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼは、バチルスの種Ｒの株（ＣＡＭＢ２６６９）（ニューイングランド・バイオラブス社の株収集）に見出される。それは二本鎖ＤＮＡ配列５’ＧＡＧＧＡＧ３’Ｎ１０／Ｎ８（配列番号１）を認識して、上の鎖のＮ１０及び下の鎖のＮ８にて下流の配列を切断して、２塩基からなる３’突出末端（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ）を生成する。ＢｓｅＲＩメチラーゼ（Ｍ．ＢｓｅＲＩ）もまた同じ株から見出される。それは二本鎖のＤＮＡ配列の５’ＧＡＧＧＡＧ３’（配列番号１）を認識して、おそらく上の鎖のＮ６アデニンまたは下の鎖５’ＣＴＣＣＴＣ３’（配列番号２）のＮ４シトシンを修飾する。
【０００３】
ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは細菌やある種のウイルスに天然に存在する種類の酵素である。細菌やウイルスから、その他の蛋白質を除去して精製すれば、制限エンドヌクレアーゼは実験室に於いて、分子クローニング及び遺伝子特性解析用にＤＮＡ分子を小さい断片に切断する際に利用できる。
【０００４】
制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子のヌクレオチドの特別な配列（「認識配列」）を認識して結合する。いったん結合すると、制限エンドヌクレアーゼは、認識配列内で（例えばＢａｍＨＩ）、一方の側で（例えばＳａｐＩ）、又は両側で（例えばＴｓｐＲＩ）分子を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列に対して親和性を有する。今日までに研究されてきた数百もの細菌種の中で、独特の特異性を有する２１１を越える制限エンドヌクレアーゼが同定されている（Roberts及びMacelis、Nucl. Acids Res. 27: 312−313 (1999)）。
【０００５】
制限酵素は通常、それらが発見された細菌にちなんで命名されている。従って、例えばデイノコッカス・ラジオフィルス種は、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩ、ＤｒａＩＩＩという名の三種の異なる制限酵素を産生する。これらの酵素はそれぞれ、５’ＴＴＴ／ＡＡＡ３’（配列番号３）、５’ＰｕＧ／ＧＮＣＣＰｙ３’（配列番号４）、５’ＣＡＣＮＮＮ／ＧＴＧ３’（配列番号５）を認識して切断する。一方、大腸菌ＲＹ１３はＥｃｏＲＩというたった一つの酵素のみを産生し、その酵素は５’Ｇ／ＡＡＴＴＣ３’（配列番号６）を認識する。
【０００６】
細菌／ウイルスの制限−修飾（Ｒ−Ｍ）システムに於ける第二の構成成分はメチラーゼである。これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと共存し、細菌がそれ自体のＤＮＡを保護して、外来ＤＮＡからそれを区別することを可能にする手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識して結合するが、ＤＮＡを切断する代わりにメチル基を付加することにより、配列の中で一つの特定のヌクレオチドを化学的に修飾する（Ｃ５メチルシトシン、Ｎ４メチルシトシン、又はＮ６メチルアデニン）。メチル化されると、認識配列はもはや同起源の制限エンドヌクレアーゼにより切断されない。細菌細胞のＤＮＡは、その修飾メチラーゼの活性により常に完全に修飾されているのでＤＮＡは、内在性の制限エンドヌクレアーゼの存在に完全に非感受性である。修飾されていない、それゆえ同定可能な外来のＤＮＡだけが制限エンドヌクレアーゼ認識及び切断に対して感受性がある。ＤＮＡ複製の間及び後では、通常、片方だけメチル化されたＤＮＡ（一本鎖のみメチル化されたＤＮＡ）もまた、同起源の制限消化に対しては抵抗性がある。
【０００７】
組換えＤＮＡ技術の進歩により、現在では遺伝子をクローニングして大量の酵素を過剰生産することが可能である。１０−３乃至１０−４程度の低い頻度で存在する場合の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する鍵となるのは、ゲノムのＤＮＡライブラリー、例えば「ショットガン」法によるクローンの集団から、かかるクローンを同定する有効な方法を開発することである。好ましくはその方法は、望ましい希少なクローンが生き残る一方で、メチラーゼの挿入を伴わない不要なクローンが分解されるというような、選択的なものでなければならない。
【０００８】
多くのＩＩ型制限−修飾システムがクローニングされている。制限エンドヌクレアーゼクローンを同定する又は選抜する手段として、バクテリオファージ感染が最初のクローニング方法として用いられた（ＥｃｏＲＩＩ：Kosykhら、Mol. Gen. Genet. 178: 717−719, (1980) 、ＨｈａＩＩ：Mannら、Gene 3: 97−112, (1978)、ＰｓｔＩ：Walderら、Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 1503−1507, (1981)）。細菌における制限−修飾システムの発現により細菌は、バクテリオファージによる感染に対して抵抗性を有するようになるため、クローニングされた制限−修飾遺伝子を有する細胞は、原則として、ファージにさらされたゲノムＤＮＡライブラリーからの生き残りとして選択的に単離される。しかしながらこの方法では、成功率が限定されることが見出された。具体的には、クローニングされた制限−修飾遺伝子は、常に選択的な生き残りを達成できるような十分なファージ抵抗性を必ずしも与えないことが見出された。
【０００９】
もう一つのクローニングへのアプローチには、当初、プラスミド由来の大腸菌にクローニングするベクターとして特徴付けされた転移システムが関与する。（ＥｃｏＲＶ：Bougueleretら、Nucl. Acids. Res. 12: 3659−3676, (1984)、ＰａｅＲ７：Gingeras及びBrooks、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 80: 402−406, (1983)、Theriault及びRoy、Gene 19: 355−359, (1982)、ＰｖｕＩＩ：Blumenthalら、J. Bacteriol. 164: p.501−509 (1985)、Ｔｓｐ４５Ｉ：Wayneら、Gene 202: 83−88, (1997)）。
【００１０】
第三のアプローチは、メチラーゼ遺伝子が活性に発現しているものを選択することである（メチラーゼ選択）（米国特許第５２００３３３号及びＢｓｕＲＩ：Kissら、Nucl. Acids. Res. 13: 6403−6421, (1985)）。制限−修飾遺伝子は互いに接近していることが多いので、両遺伝子が同時にクローニングされる場合が多い。この選択によって必ずしも完全な制限システムが得られるとは限らないが、その代わりにメチラーゼ遺伝子だけが得られる（ＢｓｐＲＩ：Szomolanyiら、Gene 10: 219−225, (1980)、ＢｃｎＩ：Janulaitisら、Gene 20: 197−204 (1982)、ＢｓｕＲＩ：Kiss及びBaldauf、Gene 21: 111−119 (1983)、ＭｓｐＩ：Walderら、J. Biol. Chem. 258: 1235−1241, (1983)）。
【００１１】
ごく最近の方法として、ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ融合を含む大腸菌の指示株に基づいて、大腸菌の中に熱安定性の制限エンドヌクレアーゼを直接クローニングする、「エンドブルー法」が開示されている。（米国特許第５４９８５３５号(1996)、Fomenkovら、Nucl. Acids Res. 22: 2399−2403, (1994)）。この方法は、制限エンドヌクレアーゼあるいは非特異的ヌクレアーゼによるＤＮＡ損傷に続く大腸菌のＳＯＳ応答シグナルを利用するものである。多くの熱安定性ヌクレアーゼ遺伝子（ＴａｑＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ。ＢｓｏＢＩ、Ｔｆヌクレアーゼ）が本方法によりクローニングされている（米国特許第５４９８５３５号）。本方法の欠点は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むいくつかの陽性の青色クローンは、同起源のメチラーゼ遺伝子が欠如しているために培養が困難であることである。
【００１２】
修飾される位置及び塩基に基づいて、主として３群のＤＮＡメチルトランスフェラーゼが存在する（Ｃ５シトシンメチラーゼ、Ｎ４シトシンメチラーゼ、Ｎ６アデニンメチラーゼ）。Ｎ４シトシンメチラーゼ及びＮ６アデニンメチラーゼは、アミノメチルトランスフェラーゼである（Maloneら、J. Mol. Biol. 253: 618−632、(1995)）。ＤＮＡの制限部位がメチラーゼにより修飾（メチル化）されると、同起源の制限エンドヌクレアーゼによる消化に対して抵抗性になる。起源の異なるメチラーゼによるメチル化によっても、制限消化に対してＤＮＡの部位を抵抗性にすることができる場合がある。例えば５’ＣＣＷＧＧ３’（配列番号７）（Ｗ＝ＡまたはＴ）のＤｃｍメチラーゼ修飾はまた、ＰｓｐＧＩ制限消化に対してＤＮＡを抵抗性にすることができる。もう一つの例としては、ＣｐＭメチラーゼがＣＧのジヌクレオチドを修飾して、ＮｏｔＩ部位（５’ＧＣＧＧＣＣＧＣ３’（配列番号８））をＮｏｔＩにより消化されにくくすることができることが挙げられる（ニューイグランド・バイオラブス社、カタログ２０００−２００１、２２０頁）。従って、メチラーゼは特定のＤＮＡ配列を修飾して、制限酵素により切断できないようにするツールとして使うことができる。
【００１３】
精製された制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼは実験室で組換え分子を製造するための有用なツールであることから、組換えＤＮＡ技術により大量の制限酵素を産生する細菌株を入手するのに強い市場の関心が注がれている。かかる過剰発現株はまた酵素の精製を単純化するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、バチルスの種Ｒ由来のＢｓｅＲＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡを、ゲノムＤＮＡから直接ＰＣＲと逆ＰＣＲ増幅により大腸菌にクローニングする方法に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
メチラーゼ選抜の定法によりｂｓｅＲＩＭ遺伝子をクローニングすることは非常に難しいこと判明した。まず、Ｓａｕ３ＡＩ部分ゲノムＤＮＡライブラリー、ＡａｔＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ完全ゲノムＤＮＡライブラリーが構築された。ＢｓｅＲＩによる処理の後、生存している形質転換体から真のメチラーゼ陽性クローンは同定されなかった。メチラーゼ選抜の定法で陽性クローンを生じなかったことから、天然のＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼを精製することに努力が向けられた。
【００１６】
ＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼは、ヘパリンハイパーＤ、ソースＱ、ヘパリンｔｓｋカラム、及びゲル濾過カラムセファデックス７５を通すクロマトグラフィーにより、天然のバチルスの株の細胞抽出物から精製された。二つの主要な蛋白質がＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定され、一つは〜５５ｋＤａ、もう一方は〜１２０ｋＤａであった。両蛋白質はＮ末端アミノ酸配列を得るための配列決定へと付された。ＧｅｎＢａｎｋの蛋白質配列とのアミノ酸配列の比較により、〜５５ｋＤａの蛋白質はバチルスグルタミニルｔＲＮＡシンテターゼに非常に高い相同を有することが示された。したがって、この蛋白質はＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼではないとされた。〜１２０ｋＤａの蛋白質のＮ末端アミノ酸配列が決定され、当該配列はＧｅｎＢａｎｋの蛋白質とは顕著な相同性を示さなかった。〜１２０ｋＤａの蛋白質は最もＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼらしいものであると結論付けられた。
【００１７】
〜４６ｋＤａの蛋白質もまた、ＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼ（ロット８，９及び１２）の調製において同定された。この蛋白質もまた配列決定され、〜１２０ｋＤａの蛋白質と類似のＮ末端アミノ酸配列を生じた。〜４６ｋＤａの蛋白質は、〜１２０ｋＤａの蛋白質のプロテアーゼ分解物であるのかもしれない。縮重プライマーがアミノ酸配列に基づいて合成された。９２塩基のコーディングＤＮＡが縮重プライマーを用いたＰＣＲにより増幅され、ｐＵＣ誘導体へクローニングされ、配列決定された。ＤＮＡ配列から予想されたアミノ酸配列は、ＢｓｅＲＩ蛋白質由来の実際のアミノ酸配列と非常によく合致した。
【００１８】
逆ＰＣＲとＤＮＡ配列決定が、ｂｓｅＲＩＲ遺伝子の残りの部分を得るために行われた。逆ＰＣＲ増幅を５回とＤＮＡ配列決定を行った後、全長ｂｓｅＲＩＲエンドヌクレアーゼ遺伝子が配列決定されて、３３４５塩基であり、制限ドメイン、保存されたメチラーゼドメイン、特異的なドメイン（Ｒ−Ｍ−Ｓ）の融合蛋白質をコードしていることが見出された。
【００１９】
特定のＲ−ＭシステムにおけるＲ−Ｍ遺伝子は、通常、近傍に存在しているため、隣接したＤＮＡ配列を同定する努力がなされた。逆ＰＣＲ増幅を４回行った後、３９３０塩基の大きなＯＲＦがｂｓｅＲＩＲ遺伝子の上流に見出された。この大きなＯＲＦは、融合してＢｓｅＲＩメチラーゼを形成する、二つのアミノ−メチラーゼ（Ｎ４シトシンメチラーゼ及びＮ６アデニンメチラーゼ）をコードしている。
【００２０】
前修飾した発現宿主ＥＲ２５６６[ｐＡＣＹＣ−ＢｓｅＲＩＭ]を構築された。ｂｓｅＲＩＲ遺伝子はゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅され、Ｔ７発現ベクターｐＡＩＩ１７にクローニングされた。発現株はＥＲ２５６６[ｐＡＣＹＣ−ＢｓｅＲＩＭ、ｐＡＩＩ１７−ＢｓｅＲＩＲ]であった。誘導されたＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼ蛋白質の約１２０−１２５ｋＤａのバンドがＩＰＴＧ誘導された細胞抽出物において検出されたが、非誘導抽出物においては見出されなかった。細胞抽出物はλＤＮＡに於いて組換えＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼ活性を示すことが確認された。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
メチラーゼ選抜の定法によりｂｓｅＲＩＭ遺伝子をクローニングすることは非常に困難であった。Ｓａｕ３ＡＩの部分ゲノムＤＮＡライブラリー並びにＡａｔＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩの完全ゲノムＤＮＡライブラリーが構築され、ｂｓｅＲＩＭ遺伝子をクローニングするためにメチラーゼ選択方法が試みられた。ＢｓｅＲＩによる処理に続く，ライブラリーの集中的なスクリーニングの後、真のメチラーゼ陽性クローンは同定されなかった。これはおそらくＢｓｅＲＩメチラーゼが大腸菌において天然ＤＮＡの状況であまり発現されなかったか、またはメチラーゼ遺伝子がライブラリー構築中に解裂されたためであろう。メチラーゼ選抜の定法で陽性クローンを生じなかったことから、N末端アミノ酸配列を得るために天然のＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼを精製することに努力が向けられた。目標は、Ｎ末端のアミノ酸配列を使用して、ゲノムＤＮＡから直接コードしている配列を増幅させるためのプライマーをデザインすることである。このアプローチによりＢｓｅＲＩ  Ｒ−Ｍ遺伝子のクローニングが成功したことが証明された。
【００２２】
下記の工程に従って、大腸菌においてＢｓｅＲＩメチラーゼ遺伝子及びＢｓｅＲＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子が好適にクローニングされ、発現する方法を以下に示す。
【００２３】
１．天然株からＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼを精製する
ＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼは天然のバチルスの種Rの細胞から、ヘパリンハイパーＤ、ソース１５Ｑ、ヘパリンｔｓｋカラム、及びゲル濾過カラムセファデックス７５を介したクロマトグラフィーによって精製された。活性分画が集められ、ＳＤＳ−ＰＡＧゲルで分析された。二つの主要な蛋白質バンドが同定され、一つは５５ｋＤａでもう一つは〜１２０ｋＤａであった。両方の蛋白質はＮ末端のアミノ酸配列を得るためにプロテインシークエンシングに供された。
【００２４】
２．ＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列解析
精製された蛋白質は、膜へとブロッティングされた。膜はそれから染色され、５５ｋＤａと〜１２０ｋＤａのバンドが切除されて自動シークエンサーにおける配列分解に供された。５５ｋＤａの蛋白質のＮ末端アミノ酸配列は、コンピュータプログラムブラストＰを用いてＧｅｎＢａｎｋの公知である全ての蛋白質と比較された。配列比較の結果、この蛋白質はバチルスグルタミニルｔＲＮＡシンテターゼに高い相同性を有することが示された。この蛋白質はＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼではないと結論づけられた。〜１２０ｋDaの蛋白質のN末端アミノ酸配列が決定され、それは以下のＮ末端アミノ酸配列を含んでいた。
ＭＮＮＳＥＫＱＶＥＬＡＲＥ  Ｃ／Ｓ  ＩＩＡＳＬＧＬＩＲＧＧＫＶＥＤＶＩＲＨＸＦ  （Ｃ／ＳはＣ又はＳを表し、不確定なアミノ酸を示すＸは、未知のアミノ酸を表す）（配列番号１３）
この配列はＧｅｎＢａｎｋのどの蛋白質とも顕著な相同性を示すものではない。〜１２０ｋＤａの蛋白質はＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼであろうと結論付けられた。
〜４６ｋＤａの蛋白質もまた、ＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼ（ＮＥＢロット８，９、１２）の調製に於いて見出された。この蛋白質もまたＮ末端アミノ酸配列に供され、〜１２０ｋＤａの蛋白質と類似のＮ末端アミノ酸配列を産生した。〜４６ｋＤａの蛋白質は、〜１２０ｋＤａの蛋白質のプロテアーゼ分解物かもしれないと結論づけられた。ゲノムＤＮＡからコード配列を直接増幅するために縮重プライマーが合成された。Ｓｅｒコドンはａｇｙコドンと、ｔｃｎコドンを伴うことから、二つの縮重フォワードプライマーを合成することは非常に重要である。ａｇｙコドンを用いたプライマーによるＰＣＲは機能したが、ｔｃｎコドンを用いたプライマーによるＰＣＲは失敗であった。
【００２５】
３．ＰＣＲによるＮ末端コード配列の増幅
９２塩基のコーディングＤＮＡ断片が縮重プライマーを用いたＰＣＲにより増幅され、ｐＵＣ誘導体へクローニングされ、配列決定された。ＤＮＡ配列から予想されたアミノ酸配列は、ＢｓｅＲＩ蛋白質由来の実際のアミノ酸配列と非常によく合致した。予想されたアミノ酸配列は以下に示す。
ＭＮＮＳＥＫＱＶＥＬＡＲＥＣＩＩＡＳＬＧＬＩＲＧＧＫＶＥＤＶＩＲＨＳＦＴＳ（配列番号１４）
【００２６】
４．ｂｓｅＲＩエンドヌクレアーゼの逆ＰＣＲによる増幅
逆ＰＣＲ増幅を５回とDNA配列決定を行った後、全長ｂｓｅＲＩＲエンドヌクレアーゼ遺伝子が配列決定されて、３３４５塩基であり、予想される分子量が１２５ｋＤａである１１１４アミノ酸の蛋白質をコードしていることが見出された。
【００２７】
５．ｂｓｅＲＩＭ遺伝子の逆ＰＣＲによる増幅
特定のＲ−ＭシステムにおけるＲ−Ｍ遺伝子は、通常、近傍に存在しているため、隣接したＤＮＡ配列を同定する努力がなされた。逆ＰＣＲ増幅を４回行った後、３９３０塩基の大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始コドンが見出された。この大きなＯＲＦは、融合されてＢｓｅＲＩメチラーゼを形成する二つのアミノ−メチラーゼ（Ｎ４シトシンメチラーゼとＮ６アデニンメチラーゼ）をコードしている。これは、最も大きなＩＩ型メチラーゼのうちの一つである。
【００２８】
６．大腸菌におけるＢｓｅＲＩＭ遺伝子の発現
ｂｓｅＲＩＭ遺伝子はゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅された。ＤＮＡ精製し、ＳｐｈＩで切断した後、生じたＤＮＡはｐＡＣＹＣ１８４にクローニングされた。１０のプラスミド単離物がＢｓｅＲＩ消化に対して抵抗性であることを示し、これはベクター内の二つのＢｓｅＲＩ部位が完全にＢｓｅＲＩメチラーゼにより修飾されていたことを示している。抵抗性のプラスミドは前修飾された発現宿主ＥＲ２５６６[ｐＡＣＹＣ−ＢｓｅＲＩＭ]を産生するために、ＥＲ２５６６を形質転換するのに用いられた。
【００２９】
７．大腸菌におけるＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼの発現
ｂｓｅＲＩＲ遺伝子はＶｅｎｔＤＮＡを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅され、Ｔ７発現ベクターｐＡＩＩ１７にクローニングされた。発現株はＥＲ２５６６[ｐＡＣＹＣ−ＢｓｅＲＩＭ、ｐＡＩＩ１７−ＢｓｅＲＩＲ]であった。ＩＰＴＧで誘導した細胞抽出物が調製された。誘導及び非誘導の細胞抽出物の蛋白質発現プロファイルを図４に示す。誘導された約１２５ｋＤａのバンドがＩＰＴＧ誘導された細胞抽出物において検出されたが、非誘導の抽出物においては見出されなかった。細胞抽出物において高いＢｓｅＲＩ活性を示すクローンの一つを図５に示す。
本発明はさらに以下の実施例に於いて詳しく説明されている。この実施例は本発明の理解を助けるものであって、これらに限定されるものではない。
上記及び以下に引用される参考文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例１】
【００３０】
大腸菌におけるＢｓｅＲＩ制限−修飾システムのクローニング
１．ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡはバチルスの種Ｒ（ニューイングランド・バイオラブス社のコレクション）から以下の工程からなる定法に従って調製された。
（ａ）リゾチーム（最終濃度２ｍｇ／ｍｌ）、スクロース（最終濃度１％）及び５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０の添加による細胞溶解。
（ｂ）最終濃度０．１％でのＳＤＳ添加による更なる細胞溶解
（ｃ）１％のトリトンＸ−１００、６２ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０の添加による更なる細胞溶解。
（ｄ）フェノール−ＣＨＣｌ３によるＤＮＡの抽出３回（等容量）及びＣＨＣｌ３抽出１回による蛋白質の除去。
（ｅ）４リットルのＴＥ緩衡液におけるＤＮＡ透析、３回溶液を変える。
（ｆ）ＲＮａｓｅ  Ａを処理によるＲＮＡ分解、及び９５％エタノールによるゲノムＤＮＡの沈殿、遠心、洗浄、乾燥及びＴＥ緩衡液における再懸濁。
【００３１】
２．ゲノムＤＮＡの制限酵素による消化とゲノムＤＮＡライブラリーの構築
繰り返し２倍希釈によって制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを希釈した。５から１０μグラムのゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分的に消化した。Ｓａｕ３ＡＩで消化したゲノムＤＮＡを２つのＢｓｅＲＩ部位を含む、ＢａｍＨＩで消化し、ＣＩＰ処理したｐＲＲＳベクターに連結した。バチルスの種ＲのゲノムＤＮＡはまたＡａｔＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで完全に消化し、適合する末端にてｐＲＲＳ−２ＢｓｅＲＩに連結した。連結したＤＮＡをエレクトロポレーションによりＤＮａｓｅＩを含まない大腸菌ＲＲ１コンピーテント細胞（ＥＲ２５０２）を形質転換するのに用いた。約３６，０００のＡｐＲ  （アンピシリン耐性形質転換体）がＳａｕ３ＡＩライブラリーから得られ、〜６０００のＡｐＲ  （アンピシリン耐性形質転換体）がＡａｔＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩライブラリーから見出された。ＡａｔＩＩ，ＢａｍＨＩ、ＢｓｔＩ及びＳａｕ３ＡＩライブラリーはそれぞれ、Ａｐを含む１リットルのＬＢ中で一晩増幅した。プラスミドＤＮＡはキアゲンマキシプレップカラム（Qiagen Maxi-prepcolumns）により調製し、ＢｓｅＲＩで一晩処理した。ＢｓｅＲＩで消化したＤＮＡはＥＲ２５０２コンピーテント細胞の形質転換に用いた。形質転換体を接種した１．５ｍｌの細胞培養物からプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｓｅＲＩの消化に対する抵抗性についてスクリーニングした。３６のプラスミドミニ調製物が個々のライブラリーに対して作られたが、真の耐性クローンは検出されなかった。ＢｓｅＲＩメチラーゼが大腸菌においてあまり発現されていないか、メチラーゼ遺伝子がライブラリー構築中に解裂されたためかもしれないと結論づけられた。定法のメチラーゼ選抜が陽性のクローンを生じなかったことから、Ｎ末端アミノ酸配列を得るために、天然のＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼを精製することに努力が向けられた。
【００３２】
３．天然株からのＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼの精製
バチルスの種Ｒの細胞の１００ｇを、４００ｍｌの超音波破砕緩衡液（sonication buffer）に懸濁し、４℃で１分間の超音波破砕を２０回繰り返した。透明の上清を７０ｍｌのヘパリンハイパーＤカラムに流した。カラムは低塩緩衡液Ａ（１０ｍＭのＫＰＯ４、ｐＨ７．０、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）１４０ｍｌで十分に洗浄した。緩衡液Ａ内の０〜１．５Ｍの塩勾配の塩化ナトリウムをカラムに添加することにより蛋白質を溶出した。溶出された分画はλＤＮＡでＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼ活性測定に付され、高いＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼ活性を有する分画１７〜２１は集められ、緩衡液Ｂ（５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）で３時間、２回透析した。
ＢｓｅＲＩ蛋白質をさらに２０ｍｌのソースＱカラムに流して精製した。４０ｍｌの低塩緩衡液Ｂで洗浄後、カラムに３００ｍｌの緩衝液Ｂ中の５０ｍＭ〜１Ｍの塩勾配を添加した。個々の分画のＢｓｅＲＩ活性をλＤＮＡにおける活性分析により同定した。分画１９と２０を集め、約６０ｍＭの塩化ナトリウムを含むトリス塩酸緩衡液で希釈した。
【００３３】
蛋白質を１０ｍｌのヘパリンｔｓｋゲルカラムに添加し、低塩緩衡液Ｃ（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）２０ｍｌで洗浄した後、蛋白質は１５０ｍｌの０〜１．５Ｍの塩勾配を含む緩衡液Ｃで溶出された。ＢｓｅＲＩ分画を集め、希釈し１０ｍｌのソースＱカラムに添加して、１５０ｍｌの０〜１Ｍ塩勾配で溶出した。活性分画を再び同定し、集めて緩衡液Ｄ（０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）でゲル濾過カラムスーパーデックス７５（Ｈｉロード２６／６０）に添加した。活性分画３８〜４０を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧゲルで分析した。２個の主要な蛋白質バンドが同定され、一つは５５ｋＤａでもう一つは〜１２０ｋＤａであった。両方の蛋白質はＮ末端アミノ酸配列を得るためにプロテインシークエンシングに供された。
【００３４】
４．ＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列解析
精製した蛋白質を電気泳動で、膜にブロットした。次いで膜をクマシーブルーＲ−２５０で染色し、５５ｋＤａと〜１２０ｋＤａのバンドを切除して、自動シークエンサーＡＢＩモデル４７０Ａによる配列分解に付した。５５ｋDaの蛋白質は以下のN末端アミノ酸配列を含んでいた。
（Ｍ）ＮＥＶＲＶＲＹＡＰＳＰＴＧＨ（配列番号１５）
このアミノ酸配列はコンピュータプログラムブラストＰを用いてＧｅｎＢａｎｋの公知である全ての蛋白質と比較された。配列比較の結果、この蛋白質はバチルスグルタミニルｔＲＮＡシンテターゼに高い相同性を有することが示された。この蛋白質はＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼではないと結論づけられた。
〜１２０ｋDaの蛋白質の配列が決定され、それは以下のＮ末端アミノ酸配列を含んでいた。
ＭＮＮＳＥＫＱＶＥＬＡＲＥ  Ｃ／Ｓ  ＩＩＡＳＬＧＬＩＲＧＧＫＶＥＤＶＩＲＨＸＦ（配列番号１６）  （Ｃ／Ｓは、Ｃ又はＳを表し、不確定なアミノ酸を示すＸは、未知のアミノ酸を表す）
【００３５】
ＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼ（ロット８，９、１２）の調製の際に、〜４６ｋＤａの位置にも蛋白質のバンドが検出された。この蛋白質もまたＮ末端アミノ酸配列決定に供され、以下のアミノ酸配列を生じた。
ＭＮＮ  Ｓ／Ｇ  ＥＫＱＶＥＬＡＲＥ  Ｃ／Ｓ  ＩＩＡＳＬＧＬＩＲＧＧＫＶＥＤＶＩＲＨＳＦＴＳ（配列番号１７）  （Ｓ／ＧはＳ又はＧを表し、Ｃ／ＳはＣ又はＳを表す）
４６ｋＤａの蛋白質と〜１２０ｋＤａの蛋白質のＮ末端アミノ酸配列は一致した。〜４６ｋＤａの蛋白質は、〜１２０ｋＤａの蛋白質のプロテアーゼ分解物かもしれないと結論づけられた。このアミノ酸配列をＧｅｎｂａｎｋの全ての蛋白質と比較されたが、公知の蛋白質との顕著な相同性は検出されなかった。〜１２０ｋＤａ蛋白質（あるいはその〜４６ｋＤａ誘導体）は真のＢｓｅＲＩ蛋白質であると結論づけられた。ゲノムＤＮＡからコード配列を直接増幅するために縮重プライマーを合成した。
【００３６】
５．ＰＣＲによるＮ末端コード配列の増幅
以下の配列を有する二つのフォワードプライマーが製造された。
ＤＮＡ  ５’ａｔｇ  ａａｙ  ａａｙ  ａｇｙ  ｇａｒ  ａａｒ  ｃａ３’（２０２−１３８）  （配列番号１８）
ＤＮＡ  ５’ａｔｇ  ａａｙ  ａａｙ  ｔｃｎ  ｇａｒ  ａａｒ  ｃａ３’（２０２−１３９）  （配列番号１９）
蛋白質      Ｍ      Ｎ      Ｎ      Ｓ      Ｅ      Ｋ      Ｑ  （配列番号２０）
逆プライマーは以下の配列を有している。
ＤＮＡ  ５’ａｔｎ  ａｃｒ  ｔｙｃ  ｔｃｎ  ａｃｙ  ｔｔ３’  （２０２−１４０）  （配列番号２１）
蛋白質      Ｉ      Ｖ      Ｄ      Ｅ      Ｖ      Ｋ  （ＫＶＥＤＶＩの逆）  （配列番号２２）
【００３７】
最初のＰＣＲセットはプライマー２０２−１３８及び２０２−１４０を用いて、ＰＣＲの２番目のセットはプライマー２０２−１３９及び２０２−１４０を用いてセットアップされた。ＰＣＲ条件は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて、９５℃で３０秒、５０℃で１分、７２℃で３０秒を３５サイクルであった（０．１μｇのゲノムＤＮＡ１０μｌ、０．１２μｇ／μｌの個々のプライマー２μｌ、５ｍＭのｄＮＴＰ５．４μｌ、１０μｌの１０Ｘ緩衡液、７０μｌのｓｄＨ２Ｏ、５ｕ／μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１μｌ）。ＰＣＲ産物はプライマー２０２−１３８（Ｓｅｒコドンａｇｙ）及び２０２−１４０を用いた最初のセットのＰＣＲでは見出された。プライマー２０２−１３９（Ｓｅｒコドンｔｃｎ）と２０２−１４０を用いたＰＣＲでは、ＰＣＲ産物は検出されなかった。ＰＣＲ反応はより多くのＤＮＡを得るために繰り返され、得られたＤＮＡは低融点アガロースゲルを通して精製された。９２塩基の断片がｐＵＣ誘導体に連結され、大腸菌に形質転換された。３６プラスミドミニ調製物をスクリーニングした後、一つのクローンが所望の挿入物を含んでいることが見出された。このクローンの挿入物は、ｐＵＣユニバーサルプライマーを用いて配列決定され、コード配列は精製された天然ＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼの蛋白質由来の正しいアミノ酸配列をコードしていることが見出された。ＤＮＡ配列から予想されたこのアミノ酸配列は、ＢｓｅＲＩ蛋白質由来の実際のアミノ酸配列と非常によく合致している。この予想されたアミノ酸配列は以下に示される。
ＭＮＮＳＥＫＱＶＥＬＡＲＥＣＩＩＡＳＬＧＬＩＲＧＧＫＶＥＤＶＩＲＨＳＦＴＳ（配列番号２３）
【００３８】
６．ｂｓｅＲＩエンドヌクレアーゼの逆ＰＣＲによる増幅
以下の配列を有する二つのプライマーが合成された。
５’ｇａｔｔａｔａｃａｃｔｃｔｃｔａｇｃｔａｇｃｔｃ３’  （２２６−１８）  （配列番号２４）
５’ｇｃｔａｇｔｔｔｇｇｇｃｔｔａａｔｔｃｇａｇｇｇｇｇ３’（２２６−１９）  （配列番号２５）
ゲノムＤＮＡはＡａｔＩＩ、ＡｐｏＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｔＵＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＮｓｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ及びＴｆｉＩでそれぞれ消化された。消化されたＤＮＡはキアゲンスピンカラムを介して精製した。２μｇ／ｍｌという低いＤＮＡ濃度で、一晩、１６℃で自己連結させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは６５℃、３０分で不活性化し、２０μｌの連結した産物を、逆ＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲの条件は９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクルであった。１．１ｋｂの逆ＰＣＲ産物がＡｐｏＩ鋳型に於いて見出された。ＤＮＡのＰＣＲ産物を低い融点のアガロースゲルで精製し、２２６−１８および２２６−１９のプライマーで配列決定した。初回ラウンドの逆ＰＣＲより、１１４０塩基のＤＮＡが得られ、そのうちの７３０塩基のＤＮＡがＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼのコード配列を有するものであった。
【００３９】
逆ＰＣＲプライマーの第２のセットは、以下の配列で合成された。
５’ａｔｔｔｇｔｇａｇｔｔａｃｃｔａａｇａｇａｔａａ３’  （２２８−２４）  （配列番号２６）
５’ｃｔａｃａｃｃａｔａｇａｔｔａｇｔａａｔｃａｔｔ３’  （２２８−２５）  （配列番号２７）
ゲノムＤＮＡは、ＡｆｌＩＩ、ＡｖｒＩＩ，ＣｌａＩ、ＤｒａＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＮｈｅＩ、ＮｓｐＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｔｙＩ及びＳｓｐＩでそれぞれ消化された。消化されたＤＮＡはキアゲンスピンカラムを介して精製した。２μｇ／ｍｌという低いＤＮＡ濃度で、一晩、１６℃で自己連結させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは６５℃、３０分で不活性化し、２０μｌの連結した産物を、逆ＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲの条件は９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分を３６サイクルであった。１９００塩基、１５００塩基、１８５０塩基、１８００塩基及び１８００塩基のＰＣＲ産物が、ＣｌａＩ、ＤｒａＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩ及びＮｌａＩＩＩ鋳型に於いて見出された。ＰＣＲ産物は低い融点のアガロースゲルで精製し、２２８−２４、２２８−２５及び新しい配列のプライマーで配列決定された。新たに生じたｂｓｅＲＩＲ遺伝子配列は既に存在する配列と結合され、結合された配列は約１３４５塩基で、終止コドンは見出されなかった。
【００４０】
以下の配列を有する３番目の逆ＰＣＲプライマーセットが合成された。
５’ｔｃｔａａａｔｇａａａｔａｇａａａｔｔｇ３’  （２２８−１３０）  （配列番号２８）
５’ｃａｔｔｇｔｇｔｔｇｃｃｔｃｔａｔｃｇａｔ３’  （２２８−１２９）  （配列番号２９）
ゲノムＤＮＡはＡｆｌＩＩ、ＡｖｒＩＩ，ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＹＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ及びＳｓｐＩでそれぞれ消化された。消化されたＤＮＡはキアゲンスピンカラムを介して精製した。２μｇ／ｍｌという低いＤＮＡ濃度で、一晩、１６℃で自己連結させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは６５℃、３０分で不活性化し、２０μｌの連結した産物を、逆ＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲの条件は９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクルというものであった。２４００塩基と９００塩基のＰＣＲ産物がＢｇｌＩＩとＢｓｔＹＩ鋳型に於いて見出された。ＰＣＲ産物は低い融点のアガロースゲルで精製し、２２８−１３０及び２２８−１２９のプライマーで配列決定された。ＢｇｌＩＩＰＣＲＤＮＡは解読可能な配列を生じなかったが、ＢｓｔＹＩのＰＣＲ産物であるＤＮＡは約３８０塩基の新たなＤＮＡ配列を生じた。この新しい配列では終止コドンは検出されなかった。
【００４１】
以下の配列を有する４番目の逆ＰＣＲプライマーセットが、合成された。
５’ｃｔｃｔａｔｃｃｔｃａａｔｃａｔｔｃｃａａｔｔｇ３’  （２２９−４２）  （配列番号３０）
５’ｔｔｇａｇａｇｃｔｔｔｇｔｔａｇｔｇｃｔａｃｃｔ３’  （２２９−４３）  （配列番号３１）
ゲノムＤＮＡは、ＡｐｏＩ、ＢｓｒＦＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｆｅＩ、ＮｃｏＩ、ＳａｌＩ、ＴｓｅＩでそれぞれ消化された。消化されたＤＮＡはキアゲンスピンカラムを介して精製した。２μｇ／ｍｌという低いＤＮＡ濃度で、一晩、１６℃で自己連結させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは６５℃、３０分で不活性化し、１０μｌの連結した産物を、逆ＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲの条件は９５℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分を３５サイクルというものであった。〜３０００塩基と１５００塩基のＰＣＲ産物が、ＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ鋳型に於いて見出された。ＰＣＲ産物は低い融点のアガロースゲルで精製し、２２９−４２及び４３のプライマーで配列決定された。それは２３０塩基の新たなＤＮＡ配列を生じた。新たに生じた配列において、終止コドンは見出されなかった。
【００４２】
以下の配列を有する第５番目の逆ＰＣＲプライマーセットが合成された。
５’ｇａａｔａａｔｃｃｃｔａｃｃａａｃａｇｇｔ３’  （２２９−１４０）  （配列番号３２）
５’ｔｃｔａｔｃｔｔｇｃｔｔａｇａｇｃｔａｇｃ３’  （２２９−１４１）  （配列番号３３）
ゲノムＤＮＡはＡｇｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩ、ＭｆｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩ及びＳａｌＩでそれぞれ消化された。消化されたＤＮＡはキアゲンスピンカラムを介して精製した。２μｇ／ｍｌという低いＤＮＡ濃度で、一晩、１６℃で自己連結させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは６５℃、３０分で不活性化し、１０μｌの連結した産物を、逆ＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲ条件は９５℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分を３５サイクルというものであった。〜２７００塩基のＰＣＲ産物がＢｇｌＩＩ鋳型に於いて見出された。ＰＣＲ産物は低い融点のアガロースゲルで精製し、２２９−１４０及び１４１のプライマーで配列決定された。８つの更なるＰＣＲシークエンシングプライマーにより、全長２．７ｋｂが配列決定された。新たに生じた配列では終止コドンが見出された。ｂｓｅＲＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の全長は３３４５塩基で、予想される分子量が１２５ｋＤａの１１１４アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。
【００４３】
７．ｂｓｅＲＩＭ遺伝子の逆ＰＣＲによる増幅
特定のＲ−ＭシステムにおけるＲ−Ｍ遺伝子は、通常、近傍に存在しているため、隣接したＤＮＡ配列を同定する努力がなされた。ｂｓｅＲＩＲ遺伝子の上流配列に基づいて、以下の配列を有する逆ＰＣＲプライマーセットが合成された。
５’ｇａｃｃｔｔｇｔｇｇｇｔｇａａｔａａｇｇａａａｃ３’  （２３３−５３）  （配列番号３４）
５’ｇａｇａａｇｔｔａｇｃａｔｃａａｔａａｃｔｇｔａ３’  （２３３−５４）  （配列番号３５）
ゲノムＤＮＡは、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｖｒＩＩ，ＢｇｌＩＩ、ＤｒａＩ、ＨｈａＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ，ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｓｐＩ、ＳｔｙＩ及びＸｂａＩでそれぞれ消化された。消化されたＤＮＡはキアゲンスピンカラムを介して精製した。２μｇ／ｍｌという低いＤＮＡ濃度で、一晩、１６℃で自己連結させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは６５℃、３０分で不活性化し、１０μｌの自己連結した産物を、逆ＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲ条件は９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクルというものであった。１４００塩基及び１６００塩基のＰＣＲ産物が、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ鋳型に於いて見出された。ＰＣＲ産物は低い融点のアガロースゲルで精製し、２３３−５３及び新しい配列のプライマーで配列決定され、〜１２００塩基の新たなｂｓｅＲＩＭ遺伝子配列を生じた。
【００４４】
逆ＰＣＲプライマーの第２のセットは、以下の配列で合成された。
５’ｔａｃａｇｃｃｔｃｔｔｃｔｇｔａａｔｔｇａｔｃ３’  （２３３−２３３）  （配列番号３６）
５’ｃｔｔｃｃｔｔｃｔｇｃａａｔｔｇｔｔｇｃｔａｇｃ３’  （２３３−２３４）  （配列番号３７）
ゲノムＤＮＡは、ＡｓｅＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｃＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｔｙＩ、ＴａｑＩ及びＸｂａＩでそれぞれ消化された。消化されたＤＮＡはキアゲンスピンカラムを介して精製した。２μｇ／ｍｌという低いＤＮＡ濃度で、一晩、１６℃で自己連結させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは６５℃、３０分で不活性化し、１０μｌの自己連結した産物を、逆ＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲ条件は９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクルというものであった。５００塩基、１．２ｋｂ及び４００塩基のＰＣＲ産物が、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｔｙＩ及びＴａｑＩ鋳型に於いて見出された。ＳｔｙＩＰＣＲ産物は低い融点のアガロースゲルで精製し、２３３−２３３及び２３４、並びに新しいプライマーで配列決定され、ｂｓｅＲＩＭ遺伝子の〜１１００塩基の新たな配列を生じた。
【００４５】
以下の配列を有する３番目の逆ＰＣＲプライマーセットが合成された。
５’ａａｇｇｇａａｔａａｃｔｃａｔｇｃｃｃａｔ３’  （２３４−２３９）  （配列番号３８）
５’ｇｔｇａｔａｔｃｃｔｇｃｔｃｔａｔａｔａａａｔｃ３’  （２３４−２４０）  （配列番号３９）
ゲノムＤＮＡはＡｐｏＩ、ＢａｍＨＩ，ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＹＩ、ＢｓｒＧＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＭｆｅＩ、ＮｓｐＩ、ＳｐｅＩ、ＴａｑＩ及びＸｂａＩでそれぞれ消化された。消化されたＤＮＡはキアゲンスピンカラムを介して精製した。２μｇ／ｍｌという低いＤＮＡ濃度で、一晩、１６℃で自己連結させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは６５℃、３０分で不活性化し、１０μｌの自己連結した産物を、逆ＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲ条件は９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクルというものであった。７００塩基と３００塩基のＰＣＲ産物がＴａｑＩ及びＡｐｏＩ鋳型に於いて見出された。両方のＰＣＲ産物は低い融点のアガロースゲルで精製し、２３４−２３９及び２４０のプライマーで配列決定され、ｂｓｅＲＩＭ遺伝子の〜４５０塩基の新たな配列を生じた。
【００４６】
以下の配列を有する４番目の逆ＰＣＲプライマーセットが合成された。
５’ｇｔｇｔｔｃａｇａｔｔｇｔａａｃａａａｇａａｇｔａｇｃ３’  （２３５−８３）  （配列番号４０）
５’ａｃｇｔｃａｃｔｃｃａａａｔａｃｔｇｔｇｔｃｇａ３’  （２３５−８４）  （配列番号４１）
ゲノムＤＮＡは、ＡｌｕＩ、ＡｐｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＤｄｅＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＭｆｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｓｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｐｅＩ，ＳｓｐＩ、ＳｔｙＩ及びＴｆｉＩでそれぞれ消化された。消化されたＤＮＡはキアゲンスピンカラムを介して精製した。２μｇ／ｍｌという低いＤＮＡ濃度で、一晩、１６℃で自己連結させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは６５℃、３０分で不活性化し、１０μｌの自己連結した産物を、逆ＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲ条件は９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクルというものであった。２５００塩基のＰＣＲ産物が、ＮｓｐＩ鋳型に於いて見出された。ＰＣＲ産物は低い融点のアガロースゲルで精製し、２３５−８３及び８４のプライマーで配列決定され、〜５００塩基の新たなｂｓｅＲＩＭ遺伝子配列を生じた。３９３０塩基の大きなオープンリーディングフレームにおいて開始コドンが見出された。この大きなＯＲＦはＢｓｅＲＩメチラーゼを形成するために互いに融合している二つのアミノメチラーゼ（Ｎ４シトシンメチラーゼ及びＮ６アデニンメチラーゼ）をコードしている。これは最も大きいＩＩ型メチラーゼの一つである。
【００４７】
８．大腸菌におけるＢｓｅＲＩＭ遺伝子の発現
以下の配列を有する二つのプライマーが合成された。
５’ｔａｔａｔｃｇｃａｔｇｃｇｇａｇｇｔａａａａａａａｔｇａａｇｇｇａａａｔｃａｇａｔａａｔａｇａｃａａｃ３’  （２３５−５３）  （配列番号４２）
５’ｇｔｃｇａｃｇｃａｔｇｃｔｔａｔｔｔａｔｔｔｃｔａａａａｇａａａｇｃｔｔｔｔｃ３’  （２４７−３４７）  （下線部の塩基はＳｐｈＩ部位）（配列番号４３）
ＢｓｅＲＩＭ遺伝子はゲノムＤＮＡからＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲにより増幅された。ＰＣＲ条件は９４℃を２分で１サイクル、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で４分を３０サイクルというものであった。ＰＣＲ産物であるＤＮＡはフェノール−ＣＨ３Ｃｌ抽出により精製し、エタノール沈殿に付し、ＳｐｈＩで消化した。生じたＤＮＡは、適合する末端でＣＩＰ処理されたｐＡＣＹＣ１８４に連結した。連結したＤＮＡを形質転換により大腸菌Ｅ２６８３に導入し、ＣｍＲ（カナマイシン耐性）形質転換体を選択した。３６のプラスミドをスクリーニングした後、１０のプラスミドがＢｓｅＲＩ消化に対して抵抗性を示し、これはベクター内の二つのＢｓｅＲＩ部位が完全にＢｓｅＲＩメチラーゼにより修飾されていることを示すものである。抵抗性のプラスミドを前修飾された発現宿主ＥＲ２５６６[ｐＡＣＹＣ−ＢｓｅＲＩＭ]を産生するために、ＥＲ２５６６の形質転換に用いた。
【００４８】
９．大腸菌におけるＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼの発現
ＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼは、保存アミノメチラーゼドメイン及び特異的なドメインに連結した制限ドメインの三つのドメインの融合物である。このタイプの酵素はＦ型（あるいはＩＶ型）と命名され、Ｆは、制限及びメチラーゼ／特異的ドメインの融合（ｆｕｓｉｏｎ）を表している。F型の酵素は、通常その認識配列のさらに下流を切断するＩＩ型（ｔｙｐｅ  ＩＩｓ）の制限酵素のサブセットである。例えば、プロトタイプＥｃｏ５７Ｉ（５’ＣＴＧＡＡＧ３’  Ｎ１６／Ｎ１４）のＢｐｍＩ及びＧｓｕＩは、それらの認識配列（５’ＣＴＧＧＡＧ３’  Ｎ１６／Ｎ１４  （配列番号４４））の１６及び１４塩基下流を切断する。認識配列と解裂配列が離れていることから、そのような機能を遂行するためには大きな蛋白質が必要とされるであろう。
以下の配列を有する二つのＰＣＲプライマーが合成された。
５’ｇｇａｇａｇａａｔｃａｔａｔｇａａｃａａｔａｇｔｇａａａａｇｃａａｇｔｔｇａｇ３’  （２４７−３４８）  （配列番号４５）
５’ｃｔａｇｇａｔｃｃｔｔａａａｃｔｃｃａｔａａａｇａｔｔａｃｇｇｃａｃｇｃ３’  （２４７−３４９）  （配列番号４６）
【００４９】
ｂｓｅＲＩＲ遺伝子はＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅された。ＰＣＲ条件は９４℃を２分で１サイクル、９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で４分を２５サイクルというものであった。ＰＣＲ産物であるＤＮＡはフェノール−ＣＨ３Ｃｌ抽出により精製し、エタノール沈殿に付し、次いでＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化した。キアゲンスピンカラムを介して精製した後、ＰＣＲ産物であるＤＮＡはＴ７発現ベクターｐＡＩＩ１７に連結され，連結したＤＮＡは前修飾した宿主ＥＲ２５６６[ｐＡＣＹＣ−ＢｓｅＲＩＭ]の形質転換に用いた。アンピシリン耐性とカナマイシン耐性の形質転換体が選択され、プラスミドがｂｓｅｒＲＩＲ遺伝子挿入物に対してスクリーニングされた。ＰＣＲ挿入物のためにプラスミドを４バッチスクリーニングした後、挿入物を有するクローンはＩＰＴＧで誘導され、細胞抽出物が調製され、λＤＮＡにおけるＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼ活性が分析された。結果は以下のとおりであった。
【００５０】
実験    プラスミド        挿入物を有するクローン      ＢｓｅＲＩ活性
実験１  ３６              ７                          ２活性
実験２  １８              ４                          １活性
実験３  ３６              ２                          １活性
実験４  ３６              ２                          １活性
【００５１】
１０ｍｌ及び５００ｍｌのＩＰＴＧ誘導の細胞培養物由来の細胞抽出物が調製され、ＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼ活性が試験された。ＩＰＴＧを後期対数増殖期の細胞培養物に最終濃度０．５ｍＭで添加し、誘導された細胞を３７℃で３時間培養した。誘導された細胞抽出物及び誘導されなかった細胞抽出物の蛋白質の発現プロファイルを図４に示す。誘導された約１２５ｋＤａのバンドがＩＰＴＧ誘導された細胞抽出物に於いて検出されたが、誘導されなかった抽出物に於いては見出されなかった。細胞抽出物に於いて高いＢｓｅＲＩ活性を示したクローンの一つを図５に示す。
【００５２】
株ＮＥＢ＃１３４１、ＥＲ２５６６[ｐＡＣＹＣ−ＢｓｅＲＩＭ、ｐＡＩＩ１７−ＢｓｅＲＩ]はブタペスト条約の協約と条件下で、アメリカンタイプカルチャーコレクションに２００１年９月２８日に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７３８を受領した。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１はＢｓｅＲＩ  Ｒ−Ｍシステムの遺伝子構成を示す。  ｂｓｅＲＩＲはＢｓｅＲＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子であり、ＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼは制限及びメチラーゼの融合物である（Ｒ−Ｓ−Ｍ）。ｂｓｅＲＩＭはＢｓｅＲＩメチラーゼ遺伝子であり、ＢｓｅＲＩメチラーゼは二つのアミノ−メチラーゼの融合物である。
【図２】図２はＢｓｅＲＩメチラーゼ遺伝子配列（配列番号９）（ｂｓｅＲＩＭは３９３０塩基）及びコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図３】図３はＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼ遺伝子配列（配列番号１１）（ｂｓｅＲＩＲは３３４５塩基）及びコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図４】図４はＳＤＳ−ＰＡＧゲル上のＢｓｅＲＩ産生クローンの蛋白質発現プロファイルで、レーン１はプロテインサイズマーカー；レーン２及び３は非誘導細胞抽出物（陰性コントロール）；レーン４、５、７はＢｓｅＲＩ陽性であるＩＰＴＧ誘導の細胞抽出物；レーン６はＢｓｅＲＩ陰性であるＩＰＴＧ誘導の細胞抽出物を示す。
【図５】図５は細胞抽出物における組換えＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼ活性を示す。レーン１−１１は組換えＢｓｅＲＩエンドヌクレアーゼを含む細胞抽出物で消化されたλＤＮＡを示す。レーン１−５は５００ｍｌのＩＰＴＧ誘導の細胞培養物から調製された細胞抽出物；レーン６−１１は１０ｍｌのＩＰＴＧ誘導の細胞培養物から調製された細胞抽出物である。レーン１，２は各々１および２μｌの細胞抽出物と共にインキュベートされたλＤＮＡ、レーン３，４，５は、１：１０、１：２０、１：４０に希釈された抽出物２μｌと共にインキュベートされたλＤＮＡ。レーン６−１１は２μｌの細胞抽出物と共にインキュベートされたλＤＮＡ。レーン１２は精製された天然のＢｓｅＲＩで消化されたλＤＮＡを示す。
【図１】
2005522985.tif 000002
【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
2005522985.tif 000004
【図２−Ｃ】
2005522985.tif 000005
【図２−Ｄ】
2005522985.tif 000006
【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
2005522985.tif 000008
【図３−Ｃ】
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【図３−Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2005522985.tif 000013