(57)【要約】活性化剤に対するモデル組織の反応を得る方法であって、生物人工組織モデルシステムを活性化剤と接触させ、そしてその収縮力及び組織の弾性の少なくともどちらか一つの細胞性機械的反応を計測することを含む方法。活性化剤に対するモデル組織の反応を得る方法は、生物人工組織モデルシステムを活性化剤と接触させ、そしてその収縮力及びヒストリシスの少なくともどちらか一つの細胞性機械的反応を計測することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬化学品をスクリーンし、作用剤のモデル組織システムの反応をえるための方法であって、少なくとも緊縮力と組織弾性のパラメーターを作用剤のモデル組織に接触させたときの反応として決める方法。
【請求項２】
パラメーターは、緊縮力と組織弾性である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
組織弾性は、少なくともヒストリシス、位相の遅れ、動的弾性である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
モデル組織システムは、リングシステムである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
活性剤は、薬剤可能な物質と既に知られた薬剤である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
モデル組織システムは、コラーゲンの中の細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
細胞は、筋肉細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
細胞は、非筋肉細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
モデル組織システムは、生きた人工のシステムである、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
システムは、生きたものである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
細胞は、血管内細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
細胞は、少なくとも心筋細胞の一つから選ばれる、請求項７記載の方法。
【請求項１３】
モデル組織のシステムは、細胞外マトリィクスとその中の細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項１４】
モデル細胞システムが作用剤に触れその機械的反応を計測する方法であって、この方法は、モデル細胞システムを作ることであり、作用剤を接触させることであり、作用薬の接触による細胞の機械的性質を計測し、少なくとも緊縮力とヒストリシスの一つのパラメーターを得ることである、方法。
【請求項１５】
細胞の機械的反応は、緊縮力とヒステリシスを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
機械的反応は組織の押し込み法を使い計測される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
組織の押し込みのシステムは、押し込み感受素子が力測定装置とコンピューターにつながったものである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
モデル組織システムは、生人工システムである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
生人工システムは生きたものである、請求項１９記載の方法。
【請求項２０】
モデル組織システムは、コラーゲンの中の細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
細胞は、筋肉と非筋肉細胞である、請求項２１記載の方法。
【請求項２２】
再合成されたモデル筋肉と非筋肉組織の機械的計測に基づく機械的反応や作用剤がモデル組織に接触したときの反応のプロファイルを得るためのシステムであって、そのモデル組織は、コラーゲンの中の細胞で再合成されたものであり、接触とは、再合成組織が作用剤と触れることで組織の機械的反応を計測することものであり、また、作用剤は、緊縮力と組織の弾性の少なくとも一つに反応を与える、システム。
【請求項２３】
細胞の反応は、力の発達と組織の弾性の少なくとも一つである、請求項２２記載のシステム。
【請求項２４】
組織の弾性は、ヒストリシス、位相の遅れ、動的弾性の少なくとも一つである、請求項２３記載のシステム。
【請求項２５】
細胞の反応は、力の発達と組織、弾性、ヒストリシスの少なくとも一つである、請求項２４記載のシステム。
【請求項２６】
細胞の反応は、押し込み方により特定される、請求項２３記載のシステム。
【請求項２７】
機械的反応は、押し込み方により特定される、請求項２３記載のシステム。
【請求項２８】
組織の押し込み方のシステムは、押し込み感受素子が力測定装置とコンピューターによるものである、請求項２７記載のシステム。
【請求項２９】
生人工システムは生きたものである、請求項２２記載のシステム。
【請求項３０】
生人工システムは生きたものである、請求項２３記載のシステム。
【請求項３１】
医薬品をスクリーンする方法であって、コラーゲンの中の細胞からなるモデル組織に効果的な量の医薬品となりうる物質を投与し、細胞の医薬品となりうる物質に対する反応を緊縮力と組織の弾性の少なくとも一つ見地から計測する、方法。
【請求項３２】
医薬品に対する細胞の反応は、緊縮力と組織の弾性である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
組織の弾性は、ヒストリシス、位相の遅れ、動的弾性の少なくとも一つである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
医薬品の投与による細胞の反応を位相の遅れと動的弾性により計測することである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
反応を計測するモデル組織であって、コラーゲンの中の細胞からなり、活性剤は次のものに対して働きかける：（ａ）細胞、（ｂ）コラーゲン、（ｃ）ＥＣＭ。
【請求項３６】
細胞は、筋肉と非筋肉細胞である、請求項３５記載のモデル組織。
【請求項３７】
一つやそれ以上の医薬品のライブラリーを管理する方法であって、それには、医薬作用剤に対するモデル組織の機械的反応のプロファイルを得ることが含まれ、データベースの中にプロファイルを保存し、少なくとも、もう一つのほかの医薬品のプロファイルを保存し、プロファイル同士を比較することも含まれる、方法。
【請求項３８】
予め定められたり、秩序だった基準になる比較に基づき、最初の医薬品のプロファイルを２つめの医薬品のプロファイルと比較することである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
それぞれの医薬品のモデル組織システムに対する機械的効果のプロファイルに基づき、医薬品の医薬的活発度の順でランク付けを行うことである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
モデル組織システムは、リングシステムか組織の押し込みシステムである、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
医薬品をその開発過程で、第二レべルの試験に進展させるのに使うランク付けである、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
医薬品は、化学品の群や種である、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
プロファイル比較は、緊縮力と組織の弾性に基づく、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
細胞マトリィクスのシステムは組織の押し込みシステムを使う、請求項３７記載の方法。
【請求項４５】
比較は、緊縮力と弾性からなる基底の機械的反応のデータを作り上げることである、請求項３７記載の方法。
【請求項４６】
システムは、生人工システムである、請求項３７記載の方法。
【請求項４７】
システムは生きたものである、請求項３７記載の方法。
【請求項４８】
細胞は、筋肉細胞である、請求項３７記載の方法。
【請求項４９】
細胞は、非筋肉細胞である、請求項３７記載の方法。
【請求項５０】
生きた細胞を含むモデル組織の医薬品に対する機械的反応のプロファイルを得る方法であって、その方法は、医薬品がモデル組織と接触し組織の反応を計測することである、方法。
【請求項５１】
モデル組織システムはリングシステムである、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
モデル組織システムは押し込みシステムを使う、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
プロファイルは、リングシステムをから得られる、請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
プロファイルは、押し込みシステムを使い得られる、請求項５０記載の方法。
【請求項５５】
医薬品となりうる物質のプロファイルは、既に知られた医薬品のプロファイルと比較され、ランク付けはその比較に基づき行われる、請求項５０記載の方法。
【請求項５６】
プロファイルは、組織の押し込みシステムを使い得られる、請求項５０記載の方法。
【請求項５７】
医薬品となりうる物質は、ある疾患に関与すると知られる細胞のシステムに対して審査され、その方法は、医薬品となりうる物質のプロファイル得て、医薬品となりうる物質の解く手に細胞への期待できる効能を予測することであり、既に効能の知られた医薬品のプロファイルと医薬品となりうる物質のプロファイルを比較することである、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
比較は、既にある知られた疾患に対する効能の知られた医薬品のプロファイルとその疾患に対する効果を知りたい医薬品となりうる物質のプロファイルを比較することである、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
比較は、特定の疾患に対して関与されると見られる細胞に対して既に知られた効果を示す医薬品のプロファイルに対して行われる、請求項５０記載の方法。
【請求項６０】
モデル組織のシステムであって、リング状に作られた組織で、それは、等尺力測定器に接続されコンピューターと電気的に接続され、ステップモターを制御し、組織を伸ばし、等尺力測定器とステップモターで力を測定し組織に歪を与える、システム。
【請求項６１】
与えられる力は、線形である、請求項６０記載のシステム。
【請求項６２】
与えられる力は、三角形である、請求項６０記載のシステム。
【請求項６３】
与えられる力は、サイン形である、請求項６０記載のシステム。
【請求項６４】
与えられる力は、２０％の組織の伸ばすことで行われる、請求項６０記載のシステム。
【請求項６５】
細胞の弾性は、モデル組織を伸ばし、歪の増加に対する力の変化を観測したものである、請求項６０記載のシステム。
【請求項６６】
組織は、筋肉組織である、請求項６０記載のシステム。
【請求項６７】
モデル組織のシステムであって、枠に支えられた膜状の再合成組織と感受素子の棒が等尺力測定器に接続されたものからなる、システム。
【請求項６８】
更に、コンピューターにつながれて、感受素子の膜の押し込みを司り、押し込みに対する抵抗力を計測する、請求項６７記載のシステム。
【請求項６９】
緊縮力は、最高点力と組織の弾性として計測され、それは、モデル組織を感受素子が接触し押し込むときの抵抗力として計測される、請求項６７記載のシステム。
【請求項７０】
組織の弾性は、組織に一定の伸びを与え歪の増加に伴う力の変化を計測することである、請求項６７記載のシステム。
【請求項７１】
モデル細胞システムを準備する方法であって、それは、リング状の組織を中心円柱の周りに形づくり、リング状の組織を中心円柱から取りはずし、それを定められた力により伸ばすことである、方法。
【請求項７２】
力は、常に与えられている、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
組織は、生きたものである、請求項７１記載の方法。
【請求項７４】
組織は、筋肉細胞である、請求項７１記載の方法。
【請求項７５】
細胞は、心筋細胞である、請求項７１記載の方法。
【請求項７６】
高速大量スクリーンシステムであって、少なくとも一つのモデル組織のシステムからなり、それは、細胞とＥＣＭが膜状に作られ、感受素子を受け入れ、感受素子を膜に対して押し込んだり引いたりする命令を受け入れ、感受素子のつながれた計測器は、電気的信号を伝達する容量を持ち、その信号は、電気的記録装置に保存され、感受素子の動きの信号を伝える、システム。
【請求項７７】
複数のウェルＰｌａｔｅシステムが膜のおき場所として使われる、請求項７６記載のシステム。
【請求項７８】
単体の個数は、約２から１０，０００である、請求項７６記載のシステム。
【請求項７９】
単体の個数は、約２から９６である、請求項７６記載のシステム。
【請求項８０】
細胞は、筋肉細胞である、請求項８０記載のシステム。
【請求項８１】
細胞は、非筋肉細胞である、請求項７６記載のシステム。
【請求項８２】
細胞は、筋肉細胞と心筋細胞である、請求項７６記載のシステム。
【請求項８３】
診断用キットであって、モデル組織のシステムと細胞活性剤で、細胞活性剤が、モデル組織と接触しその反応を計測するものである、キット。
【請求項８４】
モデル組織のシステムは、生きたシステムで、キットは持ち運び可能である、請求項８３記載のキット。
【請求項８５】
決定される反応は、緊縮力と組織の弾性である、請求項８３記載のキット。
【請求項８６】
決定される反応は、ヒストリシスである、請求項８３記載のシステム。
【請求項８７】
組織の押し込み法システムであって、組織からなり、その一つの端は、不動の位置につながれもう一つの端は感受素子につながれ、それは、コンピューターと接続し、感受素子が動きサンプル組織と接触しそれを押し込む、システム。
【請求項８８】
組織は、生きたものである、請求項８７記載のシステム。
【請求項８９】
組織は、筋肉組織である、請求項８７記載のシステム。
【請求項９０】
組織は、筋肉細胞である、請求項８７記載のシステム。
【請求項９１】
医薬品がモデル組織に接触したときの機械的反応のプロファイル形成する方法であって、機械的反応は、生人工システムで生きた細胞を持つモデル組織をつかい、少なくとも、緊縮力か弾性のうち一つを決めるものである、方法。
【請求項９２】
モデル組織中の細胞のプロファイルである、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
プロファイルは、リングシステムを使って得られる、請求項９１記載の方法。
【請求項９４】
プロファイルは、組織押し込みシステムを使って得られる、請求項９１記載の方法。
【請求項９５】
プロファイルは、細胞と細胞骨格の全体への影響に関与して決められる、請求項９１記載の方法。
【請求項９６】
モデル心筋組織を培養する方法であって、ファイブロブラストによりコンディションされた培養液を使う、方法。
【請求項９７】
ファイブロブラストは、心筋のファイブロブラストである、請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
培養液は、１％のＦＢＳを含むＤＭＥＭである、請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
コンディションすることは、ファイブロブラストを単一層としてや、ファイブロブラストの人工組織ともに培養するか、ファイブロブラストを組織に混合することである、請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
心筋細胞は、鳥かマウスの少なくとも一つが選ばれる、請求項１２記載の方法。
【請求項１０１】
心筋細胞は、鳥心筋細胞である、請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
心筋細胞は、マウスの心筋細胞である、請求項１００記載の方法。
【請求項１０３】
組織に対する薬品の効能を特定する方法と装置であって、この発明による組織で、反応を計測し、それらの反応の計測を標準的な薬の同一のまたは似通った組織に対する反応と比較する、装置。
【請求項１０４】
医薬的活動のある物質の組織に対する活動度を示すライブラリーのデータを検索する方法と装置であって、組織は、この発明にのっとり扱われ、反応が計測される。選択肢として、測定された反応は、標準的な薬の同一のまたは似通った組織に対する反応と比較される、装置。
【請求項１０５】
移植可能な人工心筋を製作するための組織培養の条件を最適にする方法であって、成長ホルモン、マトリィクス蛋白、ホルモンを含む、ここで発明されたモデル組織に加えられる様々ファクターの心筋発達への影響調べる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年８月１４日に米国で仮出された特許出願（No.60/312,322）の優先権を主張するものである。なお、仮出された特許出願は、参考文献として本明細書に組込まれる。
【背景技術】
【０００２】
この発明は、医薬品となりうる化学物質を選び出す（スクリーンする）方法とそのシステムに関したものである。さらに特定すれば、この発明は、モデル組織を使った、医薬品となりうる化学物質をスクリーンする方法とそのシステムに関したものである。
近年の平行合成法やコンビナトリアル合成法の進歩により、医薬品となりうる化学物質の効用をテストしなければならない件数が非常に上がって来ている。遺伝子発現研究の進歩により、医薬効果が期待される細胞内蛋白や受容体などのターゲット数も増えてきている。これらの状況下において、医薬品となる可能性が非常に高い化学物質を選び出すために、医薬品となりうる化学物質の特定の細胞に対する反応を、高速かつ定量的にスクリーンする方法の開発の要求が高まってきている。
【０００３】
現行の方法では、大規模な化学物質ライブラリーをそれらの特定のターゲットへの結合性の度合によって溶媒の中で初期スクリーンされる。シンチレイションプロキシミリ法や蛍光色素特定法（Sundberg, 2000）などが、高処理能力な方法としてしられている。これらの方法は一日に何千もの物質をスクリーンすることが出来るが、物質のターゲットへの結合性の強度と特異性は知ることができるが、それらの細胞への反応は知ることはできない。それゆえ、この初期スクリーンによって選択された物質は細胞への反応を基にして再度スクリーンされなくてはならない。これらの第二、第三のスクリーンを行うことにより、医薬品となる可能性が非常に高い化学物質の選定に要するコストと時間が高いものになっている。
受容体への刺激やイオンチャネルの活性化は蛍光色素を使ったカルシウムイオン濃度、細胞膜ポテンシャル、ペーハーなどをはかる方法で特定することが出来る。しばしば、イオン濃度変化やその移動は、細胞内シグナル伝達過程の比較的初期に起こり、それらにつづいてもっと特定の最終的な反応、例えば、特定の蛋白の活性化が発現される。それゆえ、先にあげた活性化の測定では医薬品による最終的な細胞の反応を特定することはできにくい。
【０００４】
一つの態様は、多数の細胞を含んだモデル組織のシステムを使って薬剤のモデル組織に対する薬剤の細胞への機械的反応を少なくとも収縮力や組織の弾性によって計測する方法である。
【０００５】
次の態様は、モデル組織のシステムを使って薬剤のモデル組織に対する薬剤の細胞への機械的反応を少なくとも収縮力や力のヒステリシスによって計測するシステムである。
更に次の申請内容は、再合成された筋肉や非筋肉モデル組織に対する薬剤の機械的反応のプロファイを収集するシステムであり、モデル組織システムは、細胞をコラーゲンのゲル内に再生成させたもので薬剤はその細胞に接触するものである。機械的反応は、少なくとも収縮力や組織の弾性である。
【０００６】
更に次の態様は、細胞をコラーゲンのゲル内に再生成させたモデル組織で医化学薬品の有効用量の特定を細胞の反応を少なくとも収縮力や組織の弾性を以って医薬品をスクリーンする方法である。
【０００７】
更に次の態様は、一つまたはそれ以上の数の医薬品や薬用化学品のライブラリーを管理する方法である、薬剤のモデル組織に与える機械的反応のプロファイルを取り、そのプロファイルをデータベースに集積し、少なくとも二つ以上のプロファイルがデータベースに記録され、少なくとも一つ以上のプロファイルを比較し、すでに構築されたまたは、整理された標準や序列を基に比較し、医薬品のモデル組織に対する機械的影響への活発性の順でランクづけをするものである。
【０００８】
更に次の態様は、多数のパラメーターから成る医薬品の細胞に与える機械的反応のプロファイル特定する方法である。
【０００９】
更に次の態様は、リング状に形成されモデル組織を均測力測定素子に接続させ電気的にコンピュターに接続されたシステムに使われるモデル組織である。モデル組織は、均測力測定装置とコンピュターにより制御されたステッピングモーターにより伸ばされ組織に歪み与えられ二極間に緊張される。
【００１０】
更に次の態様は、モデル組織は、フレイムに支えられ膜状に再合成組織を形成する。膜状の再合成組織の機械的性質は、均測力測定装置に接続された素子が組織に対して動き、それが伸ばされるときの抵抗により測られる。
更に次の申請内容は、モデル組織を形成する方法であり、その方法は、自動的に形成される組織をサポートにより形を作る方法で、その形成された組織を押し伸ばすのに使われる。
【００１１】
更に次の態様は、医薬品の細胞に与える機械的反応特にその緊張や緩和のプロファイル特定する方法で、モデル組織の機械的反応は、少なくとも収縮力や組織の弾性である。
その他には、ファイブロブラストによりコンディションされた組織培養溶剤を使い心筋組織を培養する方法である。
【００１２】
その他には、発明は、薬剤の組織に対する効能を特定する方法であり、この発明を利用して組織に対する効能を測定し、その結果、標準になる薬剤の同等また近似する組織に対する効能を測定する方法である。
【００１３】
その他には、この発明は、薬剤ライブラリーの中の一部のものの組織を活性化させる要素に関するデータ検索する方法であり、組織はこの発明を使って薬剤の効能を計測される。オプションとして、計測された薬剤効果は、標準になる薬剤の同等また近似する組織に対する効能を規則されたものと比較される事もある。
【００１４】
その他には、この発明は、移植可能な人工心筋組を合成するため、心筋の発達に関わる要素、例えば、成長剤やマトリックス蛋白やホルモン培養の紺の発明により合成されたモデル組織への投与適正量などの培養のための最良条件を整える方法である。
【発明の開示】
【００１５】
人体には、約２０〜３０兆の細胞で形成されており、それぞれの組織の性質や機能にあわせて振り分けられる。それらの細胞は筋肉と否筋肉細胞に分けられる。筋肉細胞は、緊縮力を起こす。筋肉細胞は、神経のシグナルに応答し伝達子であるカルシウムやCyclicAMPが送られ緊縮力の発生をつかさどられる。否筋肉細胞、例えば、ファイブロブラストや内皮細胞は、活性薬成長剤やホルモンに反応して緊縮力を発生させる。
【００１６】
これより使われる用語”投与または接触する（treat or contact with）“はさらされる（Exposed to）、接触する（Contact with）、または、接触するように与えられた（Place in contact with）という言い回しを含む。これより使われる用語”モデル組織（Tissue model）“は再合成された細胞と細胞外マトリックスを含むものである。これより使われる用語”等尺性力(Isometric Force）“は組織の長さやそのサイズを変えずに力の変化のことである。これより使われる用語”細胞外マトリックス“はファイブリン、ファイブロネクチン、ラミニン、などに似た構成物でまたポリ乳酸やポリグリコール酸などの人工の物質も含まれる。
【００１７】
細胞と細胞外マトリックス（ECM）から再合成された生物人工モデル組織などのモデル組織は、自然の組織を限りなく模倣するものである。それらのモデル組織は、多種あるいは、単一種の生きた細胞を含んだ均一なまたは非常に均一なコラーゲンのマトリックスである。
【００１８】
細胞骨格やマトリックス蛋白は、組織の張力や弾性をコントロールしている。細胞は、細胞骨格の構造やECMの変形をつかさどり組織発達や創傷治癒の間の機械的変化をもたらす。
【００１９】
緊縮力は、否筋肉ミオシンの活性化によるものである。この活性化による緊縮力の増加は、再合成された筋肉や否筋肉組織によって時間を追って計測することが出来る。これらの細胞の反応によって細胞骨格や細胞が含まれる細胞外マトリックス（ECM）が再構築さる。緊縮力の発生や細胞骨格のマトリックスの再構築は、医薬効果の期待できる薬品の細胞に与える効果を知るための指針となる。細胞のミオシンの活性化や非活性化、または、それ以外の細胞骨格の変化、細胞を含んでいる細胞外マトリックスの変化により緊縮力や弾性が変化する。
【００２０】
再合成組織の使用により分離された一つの細胞種や様々な種の組み合わせのモデル組織の形成を可能にする。それ故、これらの再合成組織を使い、他の種の細胞の複雑な影響を受けずに医薬効果の期待できる薬品に対する機械的性質の反応を計測される。特定の種の細胞と作用薬による緊縮力と弾性の変化の測定のプロファイルとが関連づけられる。
作用薬との効果的な接触により、再合成組織の中の細胞の緊縮と緩和による緊縮力と弾性が変化する。ここで使われる用語”作用薬“は、一つ以上の医薬効果細胞に対する効果のあるなしは特定できないが、医薬効果の期待できる薬品を含む。作用薬は活性剤や拮抗剤などを含む。ここで使われる用語”効果的接触“は、効果的活性剤の量をモデル組織に接触させることであり、例えば、作用剤をモデル組織加えることである。ここで使われる用語”医薬“は、医学と関連し動物や人間に影響を与えるものである。
使われる細胞は、様々な組織から採取され、モデル組織は、医薬効果の期待できる薬品の与えるその組織特有の情報を得るために使われる。
【００２１】
ここで使われる用語”細胞弾性“は、ある、決まった、長さに組織を伸ばすための力である。つまり、組織の弾性は、組織に与えられた力と組織の伸びとの比により与えられる。弾性体を伸ばすのに使われる力は、その伸び率の増加によって増加する。しかし、生物組織は粘弾性体である。粘性力は、伸びの速さにより、伸びに対する抵抗となる。粘性力の影響の測定は、弾性の伸びの速さに酔うる割合により決められる。線形的に弾性な物質では、力は、伸び率の増加により線形に増大する、つまり、弾性は、一定で、伸び率とは無関係である。生物組織や再合成モデル組織では、機械的に否線形で、組織の弾性は、伸び率とともに増加する。弾性は、組織から発され、外から与えられた広い範囲の力とともに線形的に増加する。この線形的変化は、力は伸び率の指数関数であるといえる。
【００２２】
組織の弾性を測定する方法に一つは、組織に対しモデル組織のシステムを使い比較的大きく均一の伸びを与え、歪の増加に伴う力の変化を計測することである。このような組織の弾性の計測により、ヒトリシス(面積)、相の遅れや動的弾性などのパラメーターの特定を可能にする。
【００２３】
組織の弾性の測定において、一度、予め定められた歪に達した後、伸び(歪)の度合いは、伸びの速さと同じ速さで、初めの歪と弾性の値に戻すことが出来る。力を歪に対して描かれた曲線で、歪の減少している間の曲線(引き取り曲線)は、常に歪が増加している間の曲線(積み込み曲線)より低い力のレベルである。以上に上げられた二つの曲線に囲まれた面積がヒトリシス面積であり、組織の粘性を示すものである。ヒトリシス面積は、以上の伸びと縮みの周期の間に失われたエネルギーの計りとなる。
【００２４】
組織の弾性を測定するもう一つの方法は、伸びの振幅、つまり、実験者により定められた周期で周期的な歪の伸縮(Sin関数など)を用いることである。力は伸びの周期と同じような増大または減少し、しかし、その相の移動、つまり、相の遅れを伴う。相の移動や遅れは、もう一つのモデル組織の粘性を表す指標と成る。振幅により測られた組織の弾性は、“動的弾性”である。動的弾性は、振幅の度合いにより(モデル組織が非線形であるだめ)、また、組織は、まさに粘性体あるゆえ動的弾性は振幅の周波数による。
この発明の具体的内容は、機械的計測は再合成されたモデル組織に対して行われる。発明はモデル結合組織にたいして定量的に機械的性質を与える方法であり、例えば、一つやそれ以上の活性剤を投与されそれに反応した他ファイブロブラストを含むマトリィクス（ＦＰＭ）単一方向に伸ばし測定をすることである。
【００２５】
生きた細胞とＥＣＭ、一般的に、タイプＩのコラーゲン、(人工生物体のシステム)から作られたモデル結合組織は緊縮力を増す活性剤の反応で弾性を増す。この発明のモデル組織システムの具体的内容において、組織は、リング状に形成され、モデル組織は、均測力測定装置とコンピュターにより制御されたステッピングモーターとの間に伸ばされ、緊縮力と歪が計測される。
【００２６】
その他の発明の申請な内容は、特に、大量高速スクリーンに適しており、組織の弾性増加を複数のウェルプレイシステムを使い押し込み法で計測するものである。押し込み法において、モデル組織に計測素子が押し当てられ、その抵抗として測られたときの緊縮力(最高点力として)を組織の弾性とともに計測される。多数の合成された組織を高速でここに申請された方法を用い組織の試薬に対する機械的反応として計測(大量高速)することが可能である。このシステムは、少量の試薬と小さなモデル組織を使うためその大きさと設計をうまく適合することが出来る。
【００２７】
緊縮力の反応を緩和するような医薬品となりうる化学物質を一般によく知られた活性剤による組織の弾性の増加を回避する能力によりスクリーンできる。さらに、細胞がコラーゲンを再構成するような医薬品となりうる化学物質がスクリーンされ、それ故、コラーゲンの硬直化や軟化がここに申請された発明の方法により計測される。
この発明は、一つやそれ以上の作用薬の再合成されたモデル組織に対する機械的性質の反応に基き、その試薬の特徴やプロファイルを築く方法を与えるものである。この発明により、高速で定量的にたくさんの細胞の緊縮、参謀骨格の変化、細胞とマトリィクスの結合性ややマトリィクスの再構成する可能性のある活性剤や緩和剤をスクリーンすることを可能にする。この方法は、組織の弾性の変化を定量的計測値として与え、それらを目安にして活性剤や緩和剤のミオシンの活発度や細胞とマトリィクスの結合性やマトリィクスの性質それ自体に与える影響を定量化したデータとして与える。
【００２８】
ここで解説され申請されるシステムと方法は、特一の申請内容に限られていない。そして、それぞれのシステムや方法は、他の部分とは別に、単独で別々に利用されることが出来る。それぞれの部分や方法は、別の部分と方法との組み合わせて利用できる。
ここで使われるコラーゲンは、クラス１-４で、タイプＩ−ＸＩＩＩを含み、それらの組み合わせも使われる。
【００２９】
試薬として使われるものは、活性剤として幼牛の血清（ＦＢＳ）、リゾフォスファチジン酸（ＬＰＡ），トロンビン、上皮増殖因子を含む増殖因子、血小板由来増殖因子、アンジオテンシンＩＩ，エンドシリンー１や、ベゾプレシンとこれらの組み合わせである。
阻害剤は、細胞外壁の受容体をブロックするアンジオテンシンＩＩ受容体などの拮抗剤や細胞内に働く阻害剤である。阻害剤として、使われるものは、ゲネシテン、ハービマイシンなどのシグナル伝達を阻害するものや、細胞骨格に作用する薬剤のどがある。これらの中には、サイトコレーゾンＤ、ラトランクリンＢ，パクリトキシル、ノコダゾル、カルクリンＡや、ブタンジオンモノキシム（ＢＤＭ）とそれらの組み合わせである。
再合成された組織中の細胞に投与される有効な試薬の量は、一般的に、Ｎａｎｏｍｏｌａｒから約１００Ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒの濃度である。有効量は、モデル組織に対して反応を十分に活性化させる量である。
以下に列挙された幾つかの機械的パラメターがここに申請された発明によって特定される。
リング状システム：
基底力：              ゼロ歪(伸ばし無し)で測られる力
動的弾性：     サイン波振動による伸びの振幅を振動する歪の振幅で割った値である。  測定は様々な歪のレベルで行われる。動的弾性は、三角波のよる大きな伸びの間にも測定される。
位相角度：     位相角度は、時間によるサンプルの粘性を示す。力の反応と与えられたサイン波振動との位相の遅れ角度である。計測は主にゼロ歪で行われるが、力の平均値が短時間の間、定常状態に達し次第、様々な歪でも行われる。
*貯蔵弾性率、Ｇ‘：   位相の合った張力(サンプルの断片面積で割った力)コンポーネントをサイン波振動の歪で割ったもの。
*喪失弾性率、Ｇ“：   位相の違った張力コンポーネントをサイン波振動の歪で割ったもの。
最高力：              三角波による伸びに対する最高点での力
ヒストリシス曲線面積：ヒストリシス曲線は、三角波による伸びに対する力の反応を歪に対して描写したものである。サンプルの押し伸ばし（Ｌｏａｄｉｎｇ）に対して反応して得た力は、常に押し戻し（Ｕｎｌｏａｄｉｎｇ）のときに得られる力よりも大きい。これら二つの曲線に囲まれた面積は、サンプルの粘性に深く関係している。
*Ｇ‘とＧ”は、サンプルの断面積を知ることで、動的弾性と位相角度から計算できる。Ｇ‘とＧ”は気サンプルの大きさや形に寄らない機械的特性示すパラメターである。
図１−１５の更なる詳細が以下に記載されている。モデル組織を使ったここで申請されている方法やシステムの特定の例が、ここに挙げられているが、この方法やシステムは、それらの特定の用例に限定されるものではない。
【００３０】
特に、図１は、リングを使ってＦＰＭを形成し測定する方法を簡略にイラストしてある。態様には、ＣＥＦ（２）をモノマーのコラーゲン（４）とをｐＨ７で、ＤＭＥＭ（６）の中でまぜ溶液（８）となる。この溶液（８）は、形を作る中央にポールのある型（１０）に流し込まれそれは３７度でポリマーになる。この他は、一日以上培養され細胞は、高分子化したコラーゲンのマトリィクスを縮め再合成する。培養の後、中央の柱（１２）が型から取り除かれ、ＦＰＭのリング（１４）は、柱から丁寧に取り除かれる。ＦＰＭリング（１４）は、力測定装置（均測力測定装置）（１６）と組織の歪を決めコントロールするステッピングモーター（１８）との間につながれる。
【００３１】
図２は、組織の伸びに対する力の反応を計測することである。連続した四つ伸縮サイクルに対するＦＰＭの典型的な力の反応が時間を追って描かれている。最初の伸縮サイクル(パネルａにあるように)は、それに続くサイクルに比べ特に大きい。その差よりも非常に小さい最高点減少が最初以外のサイクルにみられる（パネルａ）。図２のパネルｂ測定の再現性を示すため２つの異なるＦＰＭ(実線、グレーの点線)の伸びに対する反応を示している。２０％の幼牛血清〔緊縮力の増加〕や２ｕＭのＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎＤ〔組織の緊縮活動の無くす〕を投与したときの二つの組織に対する反応はほとんど同じである。伸縮のサイクルは、その他のテストを行うため依然使われていた６０分でわなく、３０分にセットされている。（しかし、３０分と６０分の力と歪そして弾性と歪の曲線には殆んど違いが無い。）
図３は、細胞の発する力に比べて測られた弾性を示すものである。この試験では、モデル組織は、１ヘルツのサイン波で０．３％の歪振動で伸縮される。弾性は、山から谷までの力の波型の変化により測られたものである〔ほぼ、時間軸のトレイス〕。それぞれの弾性を現す点は、５秒間の平均値である。
【００３２】
図３のグラフ（Ａ）は，ＦＢＳ（５％）の活性化による弾性の変化は、力の変化とほぼ同じであるのを示す。図３のグラフ（Ｂ）は、ＣｙｔｏｃｈａｌｓｉｎＤ（２ｕＭ）によるアクチンのフィラメントの分解を示す。図３のグラフ（Ａ）にあるように、弾性は力の変化とともに又変化する。
【００３３】
図３のグラフ（Ｃ）は、図３のグラフ（Ａ）と（Ｂ）のデータを弾性を力に対してプロットしたものである。力と弾性の関係で、ＦＢＳの投与の後に力（閉じた丸）が増加している時と、ＣｙｔｏｃｈａｌｓｉｎＤを当てられて力が減少しているときの力（開いた三角）と弾性の関係と非常に良く似ている。この図において、それぞれの丸と三角の点は、力と弾性を示す。弾性は力に対してほぼ線形的に増大する。
【００３４】
図４は、力と動的弾性が、ＣＤとＬＡ−Ｂの濃度に依存していることを示している。力と動的弾性は、２ｎＭの濃度ＣＤにより顕著に減少し始めさらに高い濃度のＣＤにより、続けて減少し続けた（Ａ，Ｂ）。それとは対照的に、ＬＡ−Ｂに対しては、力と動的弾性は、その濃度が、４０ｎＭに達して初めて減少し始め、６００ｎＭの濃度で最小値にたっした  （Ｃ，Ｄ）。この図は、光学顕微鏡を使ったアクチンフィラメント観察では変化を確認でいきないような低濃度のＣＤであっても、力と動的弾性の計測によって変化を察知することが出来るほど、この計測方法は敏感である。
【００３５】
図５は、リング状モデル組織を使った弾性（右のグラフ）の測定値と個々の細胞を押し付け法によって測定された弾性値（左のグラフ）の分散のデータの比較を示している。再合成組織は、個々の細胞の規則よりも統計的に高い信頼性のあるデータを数少ないデータ数で得ることが出来る。再合成組織をつかうと、個々の細胞よりも、数少ない測定で、統計的に高い信頼性のあるデータを得ることが出来る。それは、均一種の培養された細胞群であっても、様々な実験値において、細胞間にはある程度の違いが見られからである。それ故、数多くの個々の細胞の計測値を平均してその細胞群の性質を示すことになる。であるから、大量高速スクリーンの薬品の個々の細胞の生物的活動を大量高速スクリーンする装置は、統計的に意味のあるデータを得るためには、数多くの測定を要する。
テストに使われたモデル組織は、少なくとも１０，０００の細胞を含んでいるので、それぞれの計測は、組織の中の数多くの細胞の平均を代表している。それ故、大量高速スクリーンの合理性は、モデル組織を使うことにより、個々の細胞を使うより、高くすることが出来る。
【００３６】
図１１は、押し付け法による組織の機械的反応を測定する大量高速スクリーンシステムの例を挙げている。
ステンレス鉄鋼の約１ミリ径の針金で作られた、三角のフレイムが、再生組織のサンプルを支える枠組を成している。このイラストでは、Ｗｅｌｌは、そこに近いほどその幅が少しづつ狭まっていて、フレイムは安定してそこから１ｍｍほどに位置に置かれている。細胞を含む高分子化していないコラーゲンの溶液の混ざった細胞溶液をそのＷｅｌｌの底から３ｍｍのところまでに流し込まれる（図１１ａ）。９６−Ｗｅｌｌプレイトは、３７度と５％のＣＯ２で培養される。細胞培養の間、細胞はコラーゲンマリィクスを縮め、液体を絞り出し、よって、後の合計体積はほぼ十分の一に縮める。
針金フレイム無しでは、再生組織は、小さな球状に縮んで細胞培養溶液に浮かんでしまう。コラーゲンマリィクスは、長方形や円形などのフレイムの形によって様々な形に縮まる。枠組みは、金属、非金属や、プラスティクの一種である。この申請の中では、システムは細胞がモデル組織をそれを支える枠組みやフレイムに合わせ自動的に合成される。
【００３７】
三角のフレイムの上で、細胞は、図１１ａにあるように、三篇間に膜を形成する。他の図１１ｂにあるような針金フレイムの形では、違った幅は形の帯状の組織が形成される。ステンレス鉄鋼のように穴あきの無い材料でも、スポンジのような材料やＶｅｒｃｒｏのようなもの様なものは使われていない。膜の外側コラーゲンマリィクスは、非常に大きく縮められる。それ故、この外側の膜は細胞の発した張力に耐え、膜がフレイムから外れるのを防いでいる。
【００３８】
図１２は、上図１１にあるようなシステムで測られたデータを示している。データは、２０％の幼牛血清（ＦＢＳ）（図１２ａの矢印参照）で、活性化されたサンプルの力が頂点に達した後に平行なレベルに達するのを示している。この量のＦＢＳは、ファイブロブラストを活性化し、の非筋肉ミオシンによる緊縮力の増加による再合成組織の弾性の上昇を促す。ＦＢＳの投与から約１０分後、２５％の押し込み法に反応した緊縮力の最高点の上昇がみられる（図１２ａ）。培養液への４０ｎＭＣＤの投与（図の矢印ｂ）から約１５分後、投与前に比べ４０％の押し込み法に反応した緊縮力の最高点の減少がみられる（図１２）。さらに、２ｕＭＣＤの投与から約２０分後、更なる緊縮力の最高点の減少がみられる。図１２ｂは、図１２ａにプロットされたデータをプロットしなおしている、しかし、図１２ｂは、図１２ａと同じ条件で、力の押し込みの深さに対する関係を示している。
図１３は、上図１２にあるデータの最高点力とヒストリシスの面積の百分率変化を比べたものである。図１３ａは、ＦＢＳ投与以前、２０％ＦＢＳ投与以後、４０ｎＭＣＤ後と、２ｕＭＣＤでの後最高点力（ｄｙｎ）を示す。図１３ｃは、最高点力とヒストリシスの面積の変化の割合をＦＢＳ投与以前の値を基にして示している。
ヒストリシスの面積は、活性化とＣＤの投与による更に一段と変化を示す。それゆえ、ヒストリシスの面積は、モデル組織の機械的性質の変化を観察するに当たり、最高点力よりもさらに敏感なパラメターである。
【００３９】
図１４は、９６-ウェルＰｌａｔｅを使った、ミニ再合成組織の機械的性質の測定を描写している。多くのウェルＰｌａｔｅを使って、早く平衡に測定を進めることが出来るのでシステムは、大量高速スクリーン使われることが出来る。
図１４は、９６ウェルＰｌａｔｅを使って測定された機械的測定の力の曲線示している。小さい膜状再合成組織は、ステンレス鋼の針金で出来たフレイムで支えられている。均長力計測器につながれた垂直の棒が、膜を押し込みこの押し込みに対する抵抗力を計測する。１０％ＦＢＳの投与は、最高点力の高さを３０％増加される。ＣＤの投与は、最高点の高さを６０％低める。
【００４０】
この工程を９６ウェルＰｌａｔｅをつかって、オートメイション化することにより、または、さらに高度の平行化を行うことにより、この基本的コンセプトは、この発明を基に大量高速への応用が可能である。薬品のライブラリーは、モデル組織を利用してスクリーンされ、それらの生物的活動力により管理されることが出来る。
典型的には、緊縮力は、数分のうちに、作用剤のモデル組織システムへの投与の後、急速に増加する。緊縮力は、最高値に達し、そのままの最高値を１時間かそれ以上保ち続けるか、緊縮力は、その活性剤や細胞に特有の速さで、減少することもある。力の緩和についての原因は、それほど重要ではないが、この方法により、力や弾性の反応を形づくる更なるインフォメーションとデータを得ることが出来る。
活性化の間、違った活性剤によって異なる特定の組み合わせの酵素や共活性剤の関与する様々な道程をたどって、細胞壁の受容体により受けたシグナルを細胞内に運び、緊縮力を発生させる。それ故、緊縮力の発生と維持は、特定の細胞の活性剤に対する反応の細胞の受容体からミオシンの活性化へのシグナル伝達経路の指標（又は、プロファイル）となる。非筋肉細胞のプロファイルは、緊縮力の最高値と緊縮力を長時間維持することである。
【００４１】
この発明は、いかにあげられる例にさらに記述されるが、この発明はその例に特定されたり、限られるものではない。
例
モデル組織を形成する準備
生物人工的な生きたモデル組織は、細胞と細胞外マトリィクス（ＥＣＭ）により再合成される。それらのモデルは、自然の組織を限りなく模倣する。
鳥胎児ファイブロブラストは、１１日目の鳥胎児（Ｓｐａｆａｓ  Ｉｎｃ．プレストン、コネチカット）から隔離され、１０％幼牛血清（ＦＣＳ）、５０Ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリンと５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えられたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  細胞培養液により培養される。モデル組織を作るＣＥＦは、隔離されてから一度や二度パスされている。０．０２Ｍの酢酸に溶かされた単分子のコラーゲン（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ.レイクプラシッド、ニューヨーク）は、摂氏４度で、０．１Ｎの水酸化ナトリウムで中性化され、高濃度のＤＭＥＭと混合され普通の濃度のＤＭＥＭに戻される。トリプシンによる培養皿から隔離されたファイブロブラストは（図１ａ）、コラーゲンの溶液と混合され（図１ｂ）、その細胞を含む溶液は、テフロンの型に流し込まれ、（図１ｃ）摂氏３７度で５％二酸化炭素の条件で培養される（図１ｄ）。コラーゲンは、１５から３０分の間に高分子化されファイブロブラストは水分を含んだコラーゲンのゲルの中に取り込まれる。コラーゲンのゲルは、中央の円柱と円筒形の筒の内壁との間に、リング状（３ｍｍ幅で、３ｃｍの直径）に形成される。培養の過程で、細胞は、このリングを凝縮しその体積を１０分の一に縮める（２００−３００ｕｍ）。そして、リングは、中央の円柱（図１ｅと図１ｆ）から取り外され、下記に記述されるように計測装置（図１ｇ）に取り付けられる。
【００４２】
再合成組織を形成する細胞の種類は、ＣＥＦには限られていない。細胞の種類として機械的測定に適している細胞で、これまで使われてきたものは、鳥胎児ファイブロブラスト、鳥胎児心臓ファイブロブラスト、ラット心臓ファイブロブラスト、マウスマイオチューブ、マウス筋肉細胞ラインＣ２／Ｃ１２，Ｎｏｒｍａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  （ＮＭＵＭＧ）  細胞ライン  とＡ１  ａｎｄ  Ａ２インテグリンの欠けたミュータント、ＲＥＦ５２細胞ライン、Ａ７Ｒ５平滑筋細胞、ＣＣＬ３９ファイブロブラスト、ＮＲ６ファイブロブラストとこれらの細胞の組み合わせである。細胞は、鳥の胎児より分離されるかアメリカンタイプ培養コレククション（Ｍａｎａｓｓａｓ，バージニア）。
測定とリングシステムの機械的合成
機械的測定は、リングシステムを使って行われる。２日間の培養の後（最後の１２-１６時間は、血清無し）、中央円柱は型からはずされ、リング組織は、中央円柱から穏やかに取り外される。図１に示されたように、リング状モデル組織は、等尺力測定装置（モデル５２-９５４５、ハーバード装置、Ｓｏｕｔｈ  Ｎａｔｉｃｋ，マサチューセッツ）から細くしなやかな金の鎖につながれた三角上のフックに引っ掛けられる。リングは、さらにサンプルの張力と弾性率を測るためのマイクロステッピングドライバー（ＩＭ４８２  ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｍｏｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により制御されたステッピングモーター（Ｐ／Ｎ  １−１９−３４００  ２４ＶＤＣ  １．８ｄｅｇ  ステップ、Ｈａａｒｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，セントルイス、ミズーリ）によって、垂直直線運動可能なスライド素子につながれた水平の棒に掛けられる。マイクロステッピングドライバーは、コンピュターにつながれコンピュターソフトにより、ステッピングモーターの動きを切れ目無く滑らかにしている。コンピュターに搭載されたアナログとデジタルのシグナルの交換ボードにより、等尺力測定装置で発された電位のシグナルが、デジタルのシグナルに変換されデータ切ろう装置に記録される。ステッピングモーターは、組織の伸びを制御している。組織から発生された力は、金の鎖を通じて力測定装置に伝達される。
組織は、摂氏３７度に温度調節された臓器収容槽の中の５０ｍｌのＨＥＰＥＳ抑制剤入りのＤＭＥＭ（ｐＨ７．４）に浸される。リングは、二つの水平棒に掛けられリングのもともとの円周の長さ（中央柱の回りの長さ）を保たれるように最初にセットされる。
モデル組織のテストシステム
典型的には、弾性の測定に対して、モデル組織は、連続した伸縮のサイクルを繰り返される。それぞれのサイクルで、モデル組織は、ゆっくりと、３０分の間に、０から２０％の伸びを与えられ、モデル組織は、それから、同じ速さで、ステッピングモーターの動きによって、元の長さにまで戻される。それによる最初の緊縮力の増大は、その続きの伸縮で得られる力よりもはるかに大きい（図２ａ）。最初の伸縮の後の伸縮は、その最高点が少しづつ減少するが、十分な初期化の伸縮により、その量は殆んど無視できるほどになる。モデル組織は、血清の投与により活性化されたファイブロブラストにより、緊縮力を発生する。この緊縮力は、ＣｙｔｏｃｈｌａｓｉｎＤ（２ｕＭ）の投与によるアクチン細胞骨格の破壊により、無くなる（図２ｂ）。
【００４３】
力の反応の振幅を伸びの振幅で割ったものが、予め定められたサイン波によるサンプルの長さの変化に対する動的弾性に当たる。動的弾性は、様々な周波数や振幅において測られる。ＦＰＭの動的弾性と張力は、サンプルが０-２０％の歪率の間でサイン波の長さ変化（典型的に、振幅２０ｕｍ、歪０．５％、周波数０．５Ｈｚ）とともに等速（１０ｕｍ／分）に伸ばされているときや縮まっているときに、様々なレベルの歪で計測される（図１ｇ）。実験装置は、組織の長さを予め決められた速さと振幅で変えるようにセットされる。
【００４４】
細胞とマトリィクスそしてそれらの相互関係が、再合成されたモデル組織の弾性に影響を与えるので、この決定は、機械的反応のプロファイルを細胞とマトリィクスによって与えられた部分に分けることを達成させる。
図３にあるように、動的弾性の変化が、ＦＢＳでの活性化や、ＣＤ（図３ａ，ｂ）の投与においてもともとの組織の長さで測定されたとき、動的弾性は、等尺力（図３ｃ）に殆んど比例する。それゆえ、等尺力と動的弾性は再合成組織の機械的性質の分かりやすい指標となる。この方法の応用例としてアクチン細胞骨格を破壊する２つの違った作用剤の濃度に応じたモデル組織の力と弾性の減少を決定することを、以下に示している。この例にあるデータは、モデル結合組織の機械的性質を特定する、それは例えば、ファイブロブラストの生きているマトリィクス（ＦＰＭ）に対して単一方向の伸縮による測定である。このモデル組織は、自然の組織の持つ張力の歪に対する指数関数的変化や、ある歪に対おける弾性と力の比例関係を再現する。
リングシステムを使った、細胞とマトリィクスのモデル組織の機械的性質への影響の決定。
【００４５】
さらに特定な、細胞の活性化のプロファイルを求めることが好ましいので、細胞とマトリィクスの再合成されたモデル組織の機械的性質への影響が、決定された。幼牛血清による組織の力の活発化とＣＤによるＦ−アクチンの破壊により、活動的と受動的な組織の機械的性質をそれぞれ、細胞とマトリィクスに振り分ける。図４と１９で、既に一度伸ばした後、２０％のＣＳで活性化されたモデル組織の力の歪（ａ）、そして、動的弾性の歪（ｂ）に対する関係を表す曲線が”全体“とラベルして示してある。２ｕＭのＣＤを投与した後に得られた力と弾性の曲線は、鎖線で”受動的“とラベルして示してある。全体から受身の曲線の差が点線で示され”活動的“とラベルされている。すべての曲線がヒストリシスを示す。”活動的“曲線は、ほぼ歪に比例して増加し、”受動的“曲線は、ほぼ指数関数に増大する。動的弾性は、０．５Ｈｚの振動の下に測定された（ｂ）。動的弾性と力は、歪に対してほぼ同様に変化していることに注目されたい。これらの測定は、第１、第２の伸縮における大きな違い（図２参照）を避けるために、初期化伸縮の後の計測によっても行われた。”活動的“曲線と”受動的“曲線は、それぞれもモデル組織の細胞とマトリィクスの性質を知ることが出来ることが示されている。
細胞とマトリィクスの影響は、別々に、（そして適切に）計測することが出来る。細胞の影響は、アクチンフィラメントの断絶剤の効果的な量を投与することにより、細胞の弾性を減少させ、効果的に細胞の影響をマトリィクスから断絶することにより、特定される。これは、（例えば、）ＣＤを断絶剤として投与することで行うことが出来る。ＣＤは、下記に詳細されるように、細胞中のアクチンフィラメントのつながりを断絶する。そのため、活性剤や抑制剤の効果を細胞とマトリィクスに分けることが可能になる。これらの２つの機械的システムを別ベルに検査できる能力は、ここに上げられる方法にさらに、特有なものである。
ＣＤとＬａｔｒｕｎｃｕｌｉｎ−Ｂ（ＬＡＢ）は、アクチンフィラメントの細胞骨格を破壊する２つの作用剤であり、それ故、緊縮力の発現と細胞の機械的性質を弱める。モデル組織のＣＤとＬＡＢの濃度に寄った機械的性質などに対する反応が、特定される。
これ以下使用される用語”等尺力“は、組織の長さその物理的大きさをほぼ変えること無しで得られる、組織の力の変化などを示している。
【００４６】
実験の１６時間前に、血清を供給をたたれた２日たったモデル組織の等尺力と動的弾性は様々なＣＤの濃度の下に計測された。計測は、最小のＣＤの濃度から始められ、それぞれの組織で、徐々に濃度を上げて行われた。それぞれのモデル組織で、ＣＤが投与され、力と弾性を計測し、次の計測のために、さらに濃い濃度のＣＤが加えられた（図４Ａ、Ｂ）。  ＤＭＳＯが、ＣＤの溶媒として使われた。モデル組織を入れた浴槽投与されたＤＭＳＯの総量は、ＤＭＥＭの体積の０．１％以下に抑えられた。この量のＤＭＳＯは、ＦＰＭの力や弾性に殆んど何も影響を与えなかった。ここに示されたデータは、４つのサンプルの平均値で、同じ実験は少なくとも２回行われた。力と弾性は、２ｎＭ野ＣＤで顕著な減少を示した。この濃度で、コンフォーカル顕微鏡で観察されたＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎで装飾された平たい面に培養された細胞内のアクチンの細胞骨格には何の変化も見られなかった。力と弾性の両方とも、２ｕＭのＣＤまで連続して減少していった。この濃度では、力は殆んどゼロになり、弾性はその最低値に近づいた。２ｕＭより高いＣＤの濃度では、弾性は殆んどそれ以上減少しなかった（データ無記載）。力と弾性を約５０％にするために必要な濃度のＣＤは、だいたい０．２５ｕＭと推定された。
【００４７】
ＬＡ−Ｂのモデル組織の機械的性質に対する影響が、ＬＡ−Ｂの作用とＣＤのアクチン細胞骨格への作用のメカニズムの違いについて示された。ＬＡ−Ｂは、徐々にその濃度を増しながら、ＣＤの実験で行われたような、モデル組織の機械的計測が、連続的になされた。データは少なくとも３つのサンプルの平均値で、実験が２回以上行われた。ＦＰＭの張力と弾性に著しく効果を与えることが出来るＬＡ−Ｂの濃度ＣＤのそれよりもはるかに高いものであった。
【００４８】
ＬＡ−Ｂ濃度の力と弾性への影響は、シグモイド曲線のようであった。力と弾性を約５０％にするために必要な濃度のＬＡ−Ｂは、それぞれ５３ｎＭと６８ｎＭと推定された。ＬＡ−Ｂによる張力と弾性の減少は、１桁の濃度差に収まっているが、ＣＤにたいした反応は、３桁の濃度にまたがっていた。このことは、ＣＤとＬＡ−Ｂが異なったメカニズムで、アクチン細胞骨格を破壊していることが、強く推測される。最高濃度のＣＤとＬＡ−Ｂにおいて測られた力に少しの違いが見られた（図４）。
粘弾性体において、動的弾性は、伸びに対する抵抗の弾性と粘性によっている（データ無記載）。それゆえ、このシステムのおいて、ＣＤとＬＡ−Ｂは、組織の粘性に対して、比較的小さな効果が見られた。であるから、粘性の細胞とモデル組織の力と弾性に対する影響は、又、少ないと推測されるのは理にかなっている。これらの測定は、どれ程、力と弾性の測定が迅速かつ敏感に、これらの“抑制剤”のアクチンフィラメントへの効果を読み取れるかが分かる。
【００４９】
この発明の申請において使われる複数Ｗｅｌｌシステムの押し込み法では、機械的反応を示すパラメーターは、少なくとも１０万個の細胞の平均を測定したものである。ここに上げられたシステムを使い測定された再合成されたモデル組織の計測は、一つ一つの細胞を、一細胞の押し込み法で計測されたものと、比較された（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８２，  Ｚａｈａｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０）。例えば、再合成された組織の弾性は、リングシステムを使い、細胞の押し込み法に比べ、１０倍以下の少ないデータ計測点で、優れた統計的意義のある測定がなされる（図１０）。多くのシグナル伝達過程は、再合成組織の機械的性質に、緊縮力、細胞骨格構造や、細胞外マトリィクスの安定性を制御し、影響を与える。それゆえ、この発明を使い、再合成組織に対する機械的性質を特定することで、細胞内外の様々なターゲット分子するテストを行うことが出来る。
【００５０】
この発明の再合成モデル組織中の細胞のいる環境は、自然の組織や臓器の中の細胞の環境と似通うっている。それゆえ、この方法を使った検査実験の結果は、動物実験をしたのと似た結果が得られる。動物実験のいくつかは、モデル組織を使って行うことが可能である。例えば、皮膚に働く作用剤のいくつかの試験は、人工の生きた組織を使い行うことが可能である。
【００５１】
この申請内容では、以前に記述された方法は、毒生物の再合成組織の機械的性質への影響を感知することに使用される。例えば、発明者は、１０％のエタノールがモデル組織の力と弾性を顕著に減らすことを発見した。発明者は、細胞のウイルスによる感染が、力と弾性を弱めることを発見した。それゆえ、上記の方法は、トキシコロジー的な物質や生命体の景況を特定するのに使用可能である。
心臓筋肉モデル組織
鳥胎児から遊離された心筋細胞を使ったモデル組織は、自発的に緊縮する。鳥胎児からの抽出剤（ＣＥＥ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｂｉｌｌｅ，メリーランド州）は、自発的に緊縮する心筋人工組織に欠かせないことが知られている（ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １９９７  Ｊｕｌ；１１（８）：６８３−９４、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２０００  Ａｐｒ；１４（５）：６６９−７９）。心筋ファイブロブラストによりコンディションされた培養液はＣＥＥの代わりとなりうる。コンディションされた培養液（ＣＭ）は、２日間１０％のＦＢＳをふくむＤＭＥＭで予め培養された、直径１００ｍｍの培養皿いっぱいに増殖した心筋ファイブロブラストによる作られる。培養液は血清抜きのＤＭＥＭに変えられ、２４から４８時間にわたり培養してＣＭが作られる。１０％のＦＢＳを加えられたＣＭで培養された心筋モデル組織は、ＣＥＥを加えることなく、４，５日で自発的に緊縮を初める。ＣＭを使いモデル組織中に培養された心筋細胞（図５ａ）は、１０％ＦＢＳだけを含むＤＭＥＭを使い培養されたもの（図５ｂ）よりもとてもよく伸び広がった。  同じような差が細胞培養皿に培養された細胞に観測された。ＣＭ中に培養された心筋細胞（図５ｃ）は、１０％ＦＢＳだけを含むＤＭＥＭを使い培養されたもの（図５ｄ）よりもとてもよく伸び広がり、さらに大きな面を覆った。このことは、ファイブロブラストから分泌された因子が、心筋細胞の伸び広がりと自発的緊縮を誘発したと考えられる。培養液を心筋細胞が伸び広がり、自発的緊縮をするようにするにコンディションするには、モデル組織を心筋ファイブロブラストを培養させた培養皿に共に培養することである。培養液をモデル心筋組織が自発的緊縮をするようにするにコンディションするには、モデル結合組織をモデル心筋組織と共に培養することによりまた達成される。ファイブロブラストを心筋細胞と共に混合してモデル心筋組織を形成することが出来る。これにより、強い緊縮を４，５日の間に行うようになるが、この自発的緊縮は早くて、７-８日の培養の後に、停止する。図５の補助的表にある様々な条件を参照されたい。
マウス細胞の心筋組織
胎児の心臓はＥ１７−Ｅ１９のマウス胎児から遊離される。心筋細胞は、摂氏３７度で、１５分のトリプシン（０．２５％）の投与の後の何回かのコラギナーゼ（１６７ｕｇ／ｍｌ）の反応によって遊離される。心臓から遊離された細胞は、組織培養用プラスティク皿に１時間培養され非筋肉細胞を細胞培養皿に接合する速度（非筋肉細胞は筋肉細胞よりもかなり早く接合する）により取退く。接合しない細胞は、培養液と共に取り除かれ１５分の低速度の遠心分離機により分離される。１ｍｌの人工組織には、１億の心筋細胞と、０．７５ｍｇの酢酸（０．０２Ｎ）に解かされたラットの尾から採られたコラーゲンに水適当な水酸化のトリウム（０．１Ｎ）で中性化され、りん酸バッファのセーリンに溶かされた０．２５ｇのフィブリノーゲンと混合される。高濃度（１倍以上の）細胞培養液（ＤＭＥＭ）が、サンプル溶液に混ぜられ通常の培養液の濃度に保たれる。さらに、１ｕｌのトロンビン（１ｕｎｉｔ／ｍｌ）が溶液に加えられ、フィブリンの形成を始めさせる。フィブリノーゲンから変成したフィブリンコラーゲンと共に高分子化し強いゲルを形成する、このことにより、サンプルの扱いが楽になる。０．５ｍｌのサンプル溶液は、以上に記述された型に流し込まれ、細胞培養箱（５％ＣＯ２と摂氏３７度）で、３０分培養される。ゲルは型から取り外され、スペーサーと共に培養される−２つのステンレス鋼の棒（〜１ｍｍ直系）をステンレス鋼のブロックで広げたもの（図６）。５-７日の培養の後に胎児の心筋がコラーゲンとファイブリンのゲルに伸び広がり始発的に緊縮する。細胞は、それぞれにつながり合い共振的に緊縮する。
マウス胎児のモデル心筋組織の連続写真が、図７に示してある。写真の中の暗い影の点が、長方形の枠で囲まれている。この枠は、写真に対して不動の位置をとる。この点は、白矢印でイメージ１０と１８に示しているように、枠から周期的にはみ出る、これは、サンプルが、心筋細胞により緊縮していることを示す（図７）。
【００５２】
マウスの細胞を使い、マウスの心筋組織の機械的性質を模倣できるインビトロのモデル組織は、薬剤効果のありうる化学品の効能を試験するシステムとして有効である。特定の遺伝子をマウスから抜き取ることは、良く確立された方法で、すでに、心筋機能に影響を及ぼすと見られる分子を削除された、数多くの遺伝子操作されたマウスが形成されてきた。例えば、２００２年に発表されたものの一部でも、タイプ１ＮＯシンセイス（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００２，Ｊｕｎ２５；１０５（２５）：３０１１−６）、コネクシン４３（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ａｐｒ；１２９（８）：２０３１−４２）、遺伝的心臓肥大症の原因と見られるミオシン結合プロテインＣ（Ｃｉｒ  Ｒｅｓ  ２００２、Ｍａｒ２２；９０（５）：５９４−６０１）などの遺伝子を削除されたマウスなどが研究に使われている。モデル心筋組織は、遺伝子削除されたマウスの細胞作られ、特定のたんぱく質の心筋発達と機能に与える影響が、研究される。多くの遺伝子削除されたマウスは、生後や胎児のある段階を過ぎては生き延びない。それゆえ、これらの遺伝子削除されたマウスの心機能についての研究は限られている。退治や生後間もないマウスから取り出された心筋細胞を使い機能する組織を作ることが可能であるから、このシステムは、自然に発達した組織や動物全体の研究が不可能な、分子の機能を研究するのに使われる。遺伝子削除されたマウスの研究は、インビトロで、遺伝子治療の有用性を調べるのに有効である。
モデル組織のミニチュア化
モデル組織は、普通に使われる型（左側、図８ａ，ｂ）に代わり、小さな型（右側、図８ａ，ｂ）を使いミニチュア化される。サンプルの大きさは、中心柱の直径と型の内壁の直径で決まる。型を形成・する部分品の型形成の前（Ａ）と後（Ｂ）が、図８に示してある。小形と通常の中心柱の直径は、それぞれ３／１６と３／８インチである。小形と通常の型の内壁の直径は、それぞれ、９／３２と１７／３２インチである。小形の型を使うことにより、組織の体積は、５分の一に縮小された（１ｍｌから０．２ｍｌ）（＊が示す図８ｃとｄのサンプル組織）。モデル組織のミニチュア化で、通常サイズのサンプルを使った、図２，３，４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２３で示したのと同等の試験を、とても小さな臓器浴槽で、少量の培養液を使い、今までのほんの一部の化学品を使って、試験が可能である。少なくとも、化学品で使用量をサンプルサイズと同じく、五分の一にすることが出来る。
【００５３】
このコンセプトを実現化し証明するため、モデル心筋組織の血清とＹ２７６３２にたいする機械的反応が計測された（図９）。モデル組織は、通常の型を使い、鳥の心筋細胞腹作られた（図９ａ）。これらは通常、図８ｄに示されるモデル組織（*で示された）のようである。図９ｂは、また、図８ｃに示されたミニ組織によって測定された力の反応の奇跡を示している。両サイズの組織は、２０％（体積率）の幼牛血清に反応し力を増しＹ２７６３２の投与に対して力を減らす。これらの薬品による異なる大きさの組織に対する反応の大きさの違いは、２倍以下である。このことは、ミニシステムは、薬品になりうる化学品が起こすシグナルの変化を観測するのに十分大きなレンジを持っている。ミニシステムはまた、標準サイズの組織と同じように、機械的伸縮に反応した力の変化を示す。鳥心筋細胞により形成されたミニチュア化したサンプルは、心筋緊縮を示す。それゆえ、このシステムは、心機能不全に対処することが期待できる薬品の候補の反応を試験するのに利用することが出来る（図９ｂの挿入）。
複数のセルの押し込み法によるモデル組織測定システム（複数のＷｅｌｌを使った）
した再合成組織の合成と計測は、膜状と帯状に合成された再合成組織を９６−Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅの一つのＷｅｌｌに設置して行われた。
複数のＷｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ  システムの機械的構成
直径１ｍｍのステンレス鋼の針金で出来た三角の枠は、再合成組織が形成される支えの枠組みとして使われる。Ｗｅｌｌは、そこに近いほどその幅が少しづつ狭まっていて、枠は安定してそこから１ｍｍほどに位置に置かれている（図１１ａ）。細胞を含む高分子化していないコラーゲンの溶液の混ざった細胞溶液をそのＷｅｌｌの底から３ｍｍのところまでに流し込まれる（図１１ｂ）。９６−Ｗｅｌｌプレイトは、３７度と５％のＣＯ２で培養される。細胞培養の間、細胞はコラーゲンマリィクスを縮め、ゲルの穴から液体を絞り出す。枠無しでは、再合成組織は、縮まって小さな球状になり細胞培養液の中に浮かんでしまう。様々な形の枠を使うことによりよって、コラーゲンマリィクスは、枠の形にあった形状に伸縮することが発見された。三角の針金製枠が、三方の端に掛かる膜を形成することが、図１１ａにイラストされている。三角のフレイムの上で、細胞は、図１１ａにあるように、三篇間に膜を形成する。他の図１１ｂにあるような針金フレイムの形では、違った幅は形の帯状の組織が形成される。ステンレス鉄鋼のように穴あきの無い材料でも、スポンジのような材料やＶｅｒｃｒｏのようなもの様なものは使われていない。膜の外側コラーゲンマリィクスは、非常に大きく縮められる。それ故、この外側の膜は細胞の発した張力に耐え、膜がフレイムから外れるのを防いでいる。
膜状や帯状の組織の力、弾性、ヒストリシスの押し込み法による計測（Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅシステムにおいて）
モデル組織のサンプルを使って、作用薬の反応を試験するのに、組織サンプルの伸びに対する抵抗を力計測器につながれた感知素子に酔うって測定される。組織の弾性は、感知素子をそれが組織に接触してから、ある特定の長さだけ動かすのに必要な力に関係している。感知素子は、垂直のガラスのチューブの先端を火にあぶり滑らかにしたものが使われ、それが等尺力計測器取り付けられる（以上に記述）。感知素子の直径は約２−３ｍｍで先端の形は、平らか半球状である。感知素子は等尺力計測器の突起にしっかりと接着剤やロウで取り付けられている（図１１ａ）。力計測器は、不動の枠に取り付けられる。９６Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅは、垂直に動くことの出来るステージの上に置かれる。この方法をデモンストレーションするのに使われたステージは、コンピュータ制御されたステップモターのつながれたマイクロメーターによって予め与えられた速さでステージを上下させる。この方法で、ステージの動きの範囲は、０ｍｍから１５ｍｍで最高速度５００ｕｍ／秒で動かされる。同じ装置は、大きなスケ−ルの組織の機械的計測に使われている。詳細は、以下の力測定のセクションにのせてある。
押し込み法に使われる組織サンプルの準備
組織の形成中とモデル組織の継続的培養において、サンプルは、５％ＣＯ２と摂氏３７度の培養箱で１０％ＦＢＳ，ペニシリン、ストレプトマイシンを含む炭酸水素でバファーしたＤＭＥＭが使われる。力の測定には、培養液は、血清抜きの１５０ｕｌのＨＥＰＥＳでバファーしたＤＭＥＭに変えられる。
【００５４】
培養液の温度は、温度調整された循環ポンプにつながれた暖められた板の上にＰｌａｔｅを置くことにより、摂氏３７度に保たれる。
組織の押し込み法を使った測定（Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ  システムの中で）
ステージは、感知素子の先端が膜か帯上の再合成組織に接触するまで押し上げられる。先端がサンプルに接触することが、等尺力測定器に急速な力の上昇として感知される。その後、ステージは、５ｕｍ下げられる、つまり、先端がサンプルに接触した状態から引き離される。それから、ステージは、３．３ｕｍ／秒で１００ｕｍの振幅ののこぎり歯の波形によって垂直に動かされる。この動きの間、先端は、組織に接触し、それを伸ばす、その間、力は継続してデータ計測器に記録される。計測の感度を最適にするように、また、サンプルの粘性を計測するよう、先端の動きの速さを、変化させられる。
力が最高点に達しそこに安定した後に、サンプルは、２０％の幼牛血清（ＦＢＳ）（図１２ａの矢印）で、活性化される。この量のＦＢＳは、ファイブロブラストを活性化させ、非筋肉ミオシンが緊縮力を発生させ再合成組織を硬くさせる。ＦＢＳの投与の約１０分後になされた押し込みに対して、〜２５％の最高点力の増加が記録される（図１２ａ）。４０ｎＭのＣＤ（矢印ｂ）の培養液への投与から約１５分後、押し込みに対して、最高点力が、最初のレベルの〜４０％に減少した（図１２）。最高点力が、２ｕＭＣＤの投与から２０分後に、さらに減少するのが記録された。
【００５５】
膜の押し込みの間の力と押し込みの深さのプロットは、感知素子がサンプルから引き離され、張力が緩められるときに見られる曲線とは違った軌跡をたどり、この２つの曲線に囲まれた部分がヒストリシスの面積となる。ＦＢＳとＣＤの投与のあと、ヒストリシスの面積の変化が、図１２（ｂ）で比較される。以上の実験の最高点力とヒストリシスの面積の百分率変化が、図１３に比較されている。ヒストリシスの面積は、ミオシンの活性化による硬直化の間やＣＤの投与により大きく変化する。それゆえ、ヒストリシスの面積は、最高点力よりサンプルの機械的性質の変化を測るのに高い感度をもつパラメターである。
生理学的活性剤を使った伸縮無しの力の変化の試験
ラット胎児のファイブロブラストから引き出された細胞のライン（ＲＥＦ５２）を使ったリング状サンプルは、ここで、上記されたように準備される。試験の間、組織の長さは一定のレベルに保たれた。図１５のそれぞれの薬品は、一つのリング組織に加えられる。トロンビン、ヴェイゾプレシン、リゾフォスファチジン酸（ＬＰＡ）、ブレイダカイニン、エンドセリンは、リングと触れ違った力を違った反応時間で発生させた（図１５）。ノエピネフリンとフェニルエフリンはリングの緊張を緩和し、それゆえ、ノエピネフリンとフェニルエフリンは、リングのそれぞれの試験が始まったときの組織の初期基底力を緩和した（図１５）（作用剤はシグマ、セントルイス、ミズーリ、からのものが使われた）。
【００５６】
違った作用剤がリングサンプル投与されたときの緊縮反応のプロフィルは、鳥胎児の心筋ファイブロブラスト（ＣＥＣＦ）と成長したラットの心筋ファイブロブラスト（ＲＡＣＦ）が使われ、それらは、図１６（ａ）、１６（ｂ）、１６（ｃ）、１６（ｄ）と図１６（ｅ），１６（ｆ）、１６（ｇ）、１６（ｈ）にそれぞれ示されている。
ＲＡＣＦは、ヴェイゾプレシン（図１６f）とアンジオテンシンＩＩ（図１６ｇ）に反応したが、ＣＥＣＦは、ヴェイゾプレシンとアンジオテンシンＩＩ（図１６ｃ）には反応しなかった。ＣＥＣＦは、ＥＧＦのどんな濃度にも反応しなかった（図１６ｄ）。エンドセリンは、ＣＥＣＦ（図１６ｂ）とＲＡＣＦ（図１６ｈ）の両方で作られたリングを緊縮させた。ＦＢＳ（体積率２０％）の投与後の時間経過にそった力のプロファイルは、それ以前にすでに投与された違った作用剤によって異なったものを示す。
【００５７】
例えば、ＥＧＦをすでに投与された後のＦＢＳの投与は、二度の力の山を示した（図１６ｄ）。アンジオテンシンＩＩをすでに投与された後のＦＢＳの投与は、力のレベルを保ち続けた。しかし、エンドセリンヴェとイゾプレシンをすでに投与された後のＦＢＳの投与は、力をその最高点に達してから減少させ始めた。
この発明は、唯一つの化学薬品のプロファイルを管理するのに有効であるだけでなく、同じときまたは時間差を置いて、投与された幾つかの化学薬品の組み合わせのプロファイルを管理するのにも有効である。投与された幾つかの医薬品の組み合わせのプロファイルを管理することは、スクリーンする上と、また、幾つかの医薬品の組み合わせに酔うって引き起こされる予想されなかった結果を発見するのに有用である。
ミオシンのＡＴＰａｓｅの緩和剤ＢＤＭは、２０％のＦＢＳにより発せられた、完全に活性化された緊縮力を濃度の変化（図１７）によって減少させた。
【００５８】
マトリィクスの再編成と凝縮の間に発生されたリングサンプルの緊縮力は、コラーゲンがゲル化してから１−２時間の間に、リングを力計測装置に上述された様につなぎ、計測されることが出来る。細胞は、力をこのときからマトリィクスに掛け始める。そして、組織発達中の力の増大は、時間の経過とともに観測される。
【００５９】
リング組織の発達の間に計測された力のプロファイルが図１８（ａ）に示された。力は、一般に、１５から２０時間のうちに最高点に達する。この過程は、また、幾つかの抑制剤により、図１８（ｂ）（ｃ）（ｄ）にあるように、破壊される。タイロシンキネ−ゼ抑制剤、ハービマイシンＡ（図１８ｂ）は、ミクロチューブを破壊する作用剤、ノコダゾルのように（図１８ｃ）、最高点力を減少させる。サイトコレーゾンＤ（２ｕＭ）は、力の発達を初めから完全に消してしまった。
【００６０】
この発明は、広い用途があり、その中には、大量高速医薬品スクリーンとその有用性にテストを含んでいる。例えば、膜や帯状の再合成組織は、大量生産され９６Ｗｅｌｌ  ＰｌａｔｅのそれぞれのＷｅｌｌにフィットする９６の均一したサンプルを作り出される。同時期の力の測定は、４つやそれ以上の力測定計を使って行われる（図１１）。９６Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅは、ｘ−ｙステージに乗せられ、サンプルを押し込み法に最適の正しい位置に配置される。感受素子を取り付けた力測定計は、上下に動かされサンプルを押し込む（図１１ａ）。ｘ−ｙステージを使って９６Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅを再移動することにより、一つの力測定計で幾つものサンプルを短時間で押し込むことが出来る。化学品や小さいペプチドのサンプルへの投与、ステージや力測定計の動きは、すべて自動化されパーソナルコンピュータで制御される。コンピュータは、また、データを記録したり、会席するのに使われる。
【００６１】
遺伝子や蛋白質は、個々に挙げられる様々な方法で、組織中の細胞の中に送り込むことが出来る。
【００６２】
Ｐｌａｔｅ上のＷｅｌｌの数は、押し込みする上でのシステムの大きさにより変えられる。一般的に、Ｐｌａｔｅ上のＷｅｌｌの数は、約２から１０００やそれ以上あり、一つのＰｌａｔｅに約５０から５００のＷｅｌｌが好まれる。
この方法が利用されるのは、薬剤スクリーンとともに遺伝子を作用剤として細胞中に送り込む方法試験することがある。再合成組織サンプルは、細胞や組織の機械的性質に影響を与える遺伝子を取り除かれた細胞を使い形成されることが出来る。それゆえ、通常の機械的組織の特徴を取り戻させることは、効果的な遺伝子の送り込みを確かめる試験をするのに適している。
【００６３】
リングモデル組織のシステムは、幼牛血清の投与に対してコラーゲンのマトリィクスを縮め再編成させる力の発生を制御する遺伝子の削除の効果を発見できる。細胞は様々なＥＣＭと細胞膜に位置するインテグリンという特定の異種２分子からなる受容体を通して接触し結合する。それぞれにインテグリンはひとつのＡとひとつのＢ部分体から構成される。コラーゲンに結合するインテグリンは、Ａ１Ｂ１ｔｏＡ１Ｂ２である。ＮＭｕＭＧは、マウスの増殖し続けるが、移動性の無いＭａｍｍａｒｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  細胞ＬｉｎｅでＡ１とＡ２のインテグリンを持っていない。それゆえ、これらの細胞は、コラーゲンともし接合するとすれば非常に弱く接合する、それゆえ、ＥＣＭに力を伝えることが出来ず組織の弾性を発しそれを保つことが出来ない。図２０は、Ａ１とＡ２インテグリンの無い細胞は組織の発達の間の基底の力や、幼牛血清（ＣＳ）に反応して増す力を発することが出来ない（図２０ａ，ｂ）。また、通常のＡ２の再発現によりこれらの２つの機能を回復することが示されている。Ａ２の遺伝子を含む細胞は、通常マトリィクスに結合しそれを縮めＣＳに反応する（図２０ａ，ｂ）。この例は、この発明が、遺伝子の発現を確認する機械的反応のプロファイルを作り出し管理するのに使うことができることを示す。それゆえ、発明は、機械的反応のプロファイルを遺伝子発現による影響や遺伝子治療の例えば違った遺伝子伝達の方法の有効性などを管理するのに使われる。
再合成されたモデル組織は、数値的にかつ迅速に数多くの種類の医薬効果の期待できる化学品、毒素、病原体を作用剤としてそれらの細胞やマトリィクスの機械的性質への効果を特定するのに使用することが出来る。これらの機械的性質は、細胞の機械的システムの全体の構成特に細胞骨格、シグナル伝達過程の機能、組織発達の過程で細胞がマトリィクスに引き起こす構成の標準的な指標となる。それゆえ、それらは、広い範囲の病気に対して利用可能である。
医薬効果の期待できる化学品試験の例
再合成組織の張力を高血圧の治療に期待できるＹ２７６３２の濃度の変化によって緩和させることをデモンストレーションした。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞により形成されたモデル結合組織に、様々な量の医薬効果の期待できる化学品、Ｙ２７６３２が投与された。Ｒｈｏキネ−ゼに特定した抑制剤Ｙ２７６３２は、平滑筋の一片、例えば、ウサギの大動脈リングの張力を引き下げることが試験された（Ｎａｔｕｒｅ  ２３９（１９９７）９９０−９９３）。これは将来、高血圧の治療薬として期待できる薬品の一つである。組織の緊縮を活性化させる作用剤によって、張力の緩和が違っている（図２１）。Ｙ２７６３２は、モデル結合組織の張力を同じような濃度の変化によって引き下げる（図２１）。これは、このテクノロジーが医薬品になりうる化学品をスクリーンするのに使うことが出来ることを示している。
【００６４】
組織中のコラーゲンは、触媒の一系列であるマトリィクスメタロプロティエース（ＭＭＰ）により分解、回収され、また、ＭＭＰは、非活発な全触媒として分泌される。触媒は、アミノ端の切り離しにより活性化され、それらの活動は、Ｚｎ２＋とＣａ２＋の存在による。ＭＭＰ−２の活動は、腫瘍の侵攻に関与していることが知られている。非活動的と活動的なＭＭＰの存在は、ザイモグラフという方法で特定することが出来る。鳥心筋ファイブロブラストは、０．５％か０％の幼牛血清をふくむＤＭＥＭで２日間培養された。ＭＭＰ−２と９は、細胞から培養液に分泌され、それらの存在はザイモグラフで観測された。図２２で、コントロール列１１から１５は分離された非活動的ＭＭＰ−２と９が入れられた。これは、この方法を使い、少なくとも０．５ｎｇの触媒（１１列）が測定されること示される（図２２）。小さい活動的な触媒は、大きな非活動的な触媒より先に動き、活動的な触媒の帯は、非活動的なＭＭＰ−２の触媒の帯より下に位置する。何の表面処理されていない、ファイブロネクチン、コラーゲン処理された培養皿に培養された細胞がコンディションした培養液には活動的触媒の帯は観測されない。コラーゲンの３次元のマトリィクスに培養された細胞、つまり、モデル組織がコンディションした培養液には活動的触媒のＭＭ−２（９，１０列）の帯が観測される。このことは、二次元の面に培養された細胞は、非活動的触媒を分泌するが、それらは、活性化されない。触媒は、細胞が三次元のマトリィクスに培養されるまで活性化されない。それゆえ、細胞外マトリィクスを分解にえいきょうするＭＭＰ活動の研究、例えば、腫瘍の侵攻において用いられるモデルシステムとして三次元のマトリィクスに培養された細胞のモデル組織が使われる。これは、ＭＭＰの抑制剤を発見するのに特に重要である。
【００６５】
一般的なＭＭＰの抑制剤、ＧＭ６００１（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ペンシルベニア）（化学名略）の人工組織の機械的性質に与える効果が、探求された。心筋ファイブロブラストを使ったモデル組織は、５０ｕＭのＧＭ６００１とともに６日間培養された。組織培養液は、一日おきに新しいＧＭ６００１を含む培養液に変えられた。リング状モデル組織は、上記のような機械的計測試験を行われた。ＧＭ６００１を投与されたサンプル（図２３の破線）は、コントロールのものに比べ（実線）機械的構造の著しい低下を示した。ＧＭ６００１の心結合性係数（Ｋｉ）は、約ｎｍｏｌ／ｌであるが、ＧＭ６００１の動物実験における抑制効果は、高濃度の抑制剤にのみ観測される（数ｍｍｏｌ／ｌ）（Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １９９６  Ｊａｎ；７８（１）：３８−４３）。このことは、純粋なシステムで測定されたＫｉは、動物やモデル組織の生きた対象物に対する抑制効果とは、直接関係しないことが分かる。様々なモデル組織の機械的性質に効果のあるＭＭＰの抑制剤が、ここで上げられた大量高速システムにより、効果的に発見することが出来る。
この発明は、たくさんの付随した有用性がある。心臓疾患の治療を促すため、心筋細胞や心筋ファイブロブラストから出来たモデル再合成組織は、医薬品になりうる物質の試験として使われることが出来るし、また、高血圧により細胞がマトリィクスを再編成する過程、外傷や化膿による細胞の縮みなどの分野にも役立つ。この発明は、歯科結合組織の疾患、癌の広がり（緊縮、細胞移動時の摩擦力）、糖尿病（コラーゲンの共重合化による肌や組織の結合組織の硬直化）、肺疾患例えば肺気腫，継続的化膿（好中球から分泌されるエラスターゼ）、筋ジストロフィーや皮膚の老化などの治療を開発するのに有用である。
【００６６】
この発明は、また、医薬品のライブラリーを管理する方法示している。この方法は、薬剤がモデル組織に投与され、活性剤がモデル組織に与える機械的反応のプロファイルを得ることであり、そのプロファイルのデータを記録し、モデル組織に対してもう一つの医薬品のプロファイルを記録し、その２つを比較し、予め作られる標準やその比較の序列を築くものである。医薬品は、プロファイルに基き、モデル組織システム機械的効果の活性度により序列、ランク付けされる。
曲線を検討する可能なパラメーター
作用剤の投与による力の反応の時間的変化は、幾つかのパラメーターにより、その曲線の形が描写される。Ｆ０とＤＦｍａｘは、それぞれ、作用剤投与前の最初の力のレベルと最大の力の変化を示す。ＤＴｍａｘは、力のレベルの変化に要した時間を示す。力の曲線を時間で微分したものは、力の時間に対する変化の速さを示す。ｄＦ／ｄｔの最高値Ｖｍａｘは、力の曲線の最高の傾斜を示す。これらのパラメーターは、医薬品になりうる物質の人工組織の張力に変化をもたらすプロファイルを作るのに使われる（図２４）。
【００６７】
この申請には、医薬品になりうる物質のプロファイルは、既成の知られた医薬品のプロファイルと比べられ、ランク付けされ、序列される、その比較に基き、医薬品になりうる物質に医薬的効果があるかどうかの情報と案内を与えること示している。
さらに、もし望むならば、医薬品になりうる物質を特定の疾患に関与していると知られる細胞のシステムに対し、この発明にのっとって試験が行われる。この申請には、この発明のシステムを使った得た細胞の反応は、特定に細胞に対する医薬品になりうる物質の予想される活発度の指標を与えられる。さらに、医薬品は、モデル組織システムで、審査され、既に特定の疾患に対する有効性が知られた医薬品と比較される。
さらに、既に知られた医薬品のプロファイルは、既に知られた疾患に有効であることを知ることである。そして、この申請は、それゆえ、医薬品は、特定の疾患に関与していると知られる細胞に対する効果によって比較がなされる。この申請は、医薬品が、例えば、心臓病、高血圧、老化などを治療するのに効果が期待できるかどうかを判断するのに使われる。
【００６８】
高血圧は、血管の緊縮や弾性の上昇により引き起こされる。高血圧の薬は、この発明を使い特定される。それらの薬は、動物の血圧や、動物から遊離された血管の張力や弾性を下げるのに使われる。この発明は、組織培養した細胞と細胞外マトリィクスから出来た、血管を模倣した人工組織が使われ、この方法は、動物実験や動物から採られた組織を使う実験に取って代わるものである。
【００６９】
人工組織は、または、もっと複雑な組織を様々な細胞の組み合わせで作り、生物体の特定の機能や様々な臓器や組織、皮膚、筋肉、心臓、血管、を模倣するよう作られる。組織の機械的性質は、それらの構造的結合性に関係しているので、それらは、この発明にあるように、組織や臓器の生物的機能を示すパラメーターとして重要である。
さらに、この発明は、物質を人工組織の機械的性質のもたらす生物的活発度により高速でスクリーンするのに使われる。例えば、人工組織は、９６Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅの一つのＷｅｌｌ（直径４ｍｍ、深さ６ｍｍ）にフィットするように小さなサイズに作られる。著しく縮小されたサンプルは、物質の使用量を少なくとも既存の方法、例えば、Ａｏｔｉｃリングに比べ９０％少なくできる。動物の組織は手術により摘出されるため、その大きさと薬に対する反応はいつも同じであるとは言いがたい。
【００７０】
医薬物質の毒性は、この方法により感知することが出来る。例えば、様々な濃度のエタノールは、生きた細胞により保たれる基底の力のレベルを押し下げる。
他の面においては、モデル組織を作る細胞やマトリィクスの生化学的性質を、例えば、蛍光指標剤を使い、光学的に測定することが出来る。
【００７１】
発明を使い、医薬品の生きた人工組織の機械低性質に対する効果に基づいて、新しいライブラリーのプロファイルを築くことが出来る。この発明、つまり、押し込み法により活発度の確認できる物質の数は、たぶん、既存の試験管を使ったスクリーンにより確認出来る数よりもっと少ないであろう。化学的な効果を基にしたスクリーンで確認された物質は、生理学的な反応を全く示さないものを多く含んでいる。
人工組織を基にしてスクリーンされた化学物質は、動物や人間の本当の組織や臓器の機械的性質に人工組織に与えたと同じような効果を確認する確率が高いであろう。それゆえ、薬品スクリーンにおける最適性試験の段階で、動物のモデルを使った実験は、人工組織を基にした高速大量スクリーンの利用により著しく減少させることが出来る。この発明は、培養された細胞から作られたシステムの生理的反応示すことにより、動物実験に取って代わることが出来る。
【００７２】
一つの面では、スクリーンの結果により一つ以上の医薬になりうる物質を特定し、さらに次のステージの試験とスクリーンの段階に進み更には、マーケットに出る可能性がある。他の面では、スクリーンの結果は、さらに次のステージの試験とスクリーンを取りやめることになる。他の面では、方法と装置は、医薬品のターゲットを検査したり、査定したりするのに使われる。
【００７３】
この発明は、様々な申請内容の見地から叙述されてきたが、この分野に詳しい人々によりこの発明は認められそれを実際に更なる工夫を加え、次に挙げられる趣旨とクレイムをもって実行される。
【００７４】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】簡略的にイラストされたファイブロブラストとマトリィクスからなる組織（ＦＰＭs）（生きたモデル組織を含む）を形成し計測する方法が記述されている。図１は、全体の準備と計測の例をイラストしたものである。
【図２】モデル組織を伸縮したときに得られる力をイラストしたもので、FPMに与えたられた４つの連続した伸縮サイクルを時間の経過とともにイラストした。図２のプロファイルaは、最初のピークはそれに続くピークに対して非常に大きい。図２のプロファイルｂは、２つのFPMの力測定を同時に示すことで、測定の非常に高い再現性イラストしている。
【図３】組織の弾性を細胞が発した力に対してグラフにしたものである。図３aは、力と動的弾性の幼牛の血清を投与したときの変化示している。図３ｂは、細胞骨格が、２υMのCytochalasinD（CD）によって寸断されるときの力と動的弾性の変化示している。図３ｃは、３ａと３bのデータの総括として、動的弾性の力に対する線形性を示している。
【図４】収縮力と動的弾性のCDとLatrunculinB （LA-B, Calbiochem-Novabiochem,サンディエゴ、カルフォルニア）の濃度への依存度を示している。図４aと図４ｂは、そろぞれ、様々なCD濃度の投与が組織にもたらす伸縮力と弾性示すものである。図４ｃと図４ｄは、そろぞれ、色々なLA-B濃度の投与が組織にもたらす伸縮力と弾性示すものである。
【図５】心筋細胞が様々な組織培養条件の下で伸展する度合いを示したものである。  図５aは、心筋ファイブロブラストによりコンディションされた組織培養溶剤を使い心筋細胞がモデル心筋組織中に良く伸展した様子を示したものである。図５ｂの１０％の幼牛の血清を含むDulbecco`s modified Egle組織培養溶剤で培養された心筋細胞は、良く伸展していない。コンディションされた組織培養溶剤在りと無しの組織培養皿で培養された心筋細胞が、図５ｃと図５dにそれぞれ示されている。付属の表には、様々な培養条件で培養されたモデル心筋組織の自動伸縮性が掲載されてある。
【図６】図１ｃ、図１eに示されたように型からはずされたモデル組織を培養するステンレス鉄鋼のスペーサーである。
【図７】マウスの胚心臓から取られた細胞を含む自動伸縮するモデル心筋組織の映像をコマ撮りしたもの（１から３２まで２００ミリ秒の間隔）を続けて示してある。
【図８】標準と小形の型とモデル組織の写真画像が示してある。図８aは、ばらばらにされた図１eにイラストされた小形と標準サイズの型が示されている。図８bは、組み立てられた図１ｃにイラストされた小形と標準サイズの型が示されている。図８cは、小形の型で作られた小形のモデル組織がスペーサーによって支えられているのを写真で示している。図８ｄは、図六にイラストされた標準の型で作られた標準のモデル組織がスペーサーによって支えられているのを写真で示している。
【図９】それぞれの型で作られた小形と標準サイズのモデル心筋組織によって測られた力の記録の比較である。標準サイズの型で作られたモデル心筋組織によって測られた力の時間に対する変化が図９aに示されている。与えられた伸張やRho kinaseの抑制剤Y27632の投与に反応した力の時間に対する変化が図９ｂにしめされている。図９ｂの挿入には、サンプルが伸ばされた時の自発的緊縮を拡大してプロットしたものが示してある。
【図１０】リング状モデル組織の弾性を計測した結果（左側）と単体の細胞を押して計測した結果（右側）の統計的分散を比較したものである。
【図１１】図１１aは、三角のフレイムを使った大量高速解析システムをイラストしたもので、図１１ｂには、長方形（三角に変わる形）のフレイムがイラストされていり、フレイムは、ステンレス鉄鋼の約１ミリ径の針金が使われ、組織の緊縮力と弾性を押し付け法により計測されるときの再生組織のサンプルを支える枠組みとして使われる。
【図１２】緊縮力が最高に達した後の平衡したレベル力からモデル組織が２０％の幼牛血清（FBS）（図１２aの矢印a）によって更に緊縮力が増したのを示している。この量のFBSは、ファイブロブラストのい否筋肉ミオシンを活性化させる。図１２ｂは、図１２ａと同じように押し付けの深さに対する力の変化を示したもので、４０nMのCDと２uMのCDを投与したときの効果を含んでいる。
【図１３】図１３（a）、（b）、と（ｃ）は、組織の最高緊縮力とヒステリシス曲線により囲まれた面積（単位不定）を示している。
【図１４】連続した膜状のモデル組織を押し付けによる抵抗で測られた力イラストしたものである。９６−ウェルプレートの一つウェルに置かれた小さい膜は繰り返し押し付けられる（それぞれの山が一つの押し付け）。押し付けによる力の応答は、７０分に渡り計測された。山の最高点は、    １０％のFBSにより活性化されたミオシンより増加し、ところが、CytochalasinD (CD)の濃度に応じて最高点はアクチン細胞骨格の分解のため低められる(力の縦軸は、ゼロに初期化されていない)。これから用いられる用語”作用薬（Agonist）“は、細胞の反応を活性化させるものを指す。
【図１５】幾つかの作用薬によるリング状の平滑筋モデル組織が示す張力の変化を列挙した。パネルa, b, c, d, e, fとgは、それぞれ、トロンビン、ベイゾプレシン、LPA，  ブレイドカイニン、エンドセリン、ノエピネフリン、フェニルエフェリンによる作用のプロフィイルを示している。
【図１６】幾つかの作用薬によるリング状の鳥（a−ｄ）またはラット（e-ｈ）の心筋ファイブロブラストモデル組織が示す緊縮力の変化のプロフィイルを列挙した。
【図１７】予め、２０％のFBSで活発化された緊縮力のミオシンの活動抑制による力の減少をしめす。Butane dione monoxime (BDM)の様々な濃度による２０％のFBSで活発化された緊縮力の抑制を示す。パネルa, b,cとdは２，４，２０，４０ｕMのBDMが投与されている。
【図１８】リング状組織の発達過程の緊縮力の増加が示してあり、何の化学品の投与の無いもの  （A）、Herbimycin A  （B），  Nocodazole （C）, とCytochalasin D (D)がそれぞれ示してある。リングは、細胞によるマトリックスの形態変化や緊縮が起こる前、つまり、コラーゲンのゲル化の１時間後に力測定装置に設置される。
【図１９】FBSにより活性化された力がリング状モデル組織の歪の度合いによる関係を示している  (全体)。リングは、その後、２uMのCDを投与されて受動的と示された曲線を得られる。全体の曲線から受動的曲線を引いて得られたその差の曲線(活動的と記された)が得られる。図１９bは、同じ測定から得られた動的弾性である。
【図２０】コラーゲンのインテグリン受容体の無い細胞が、組織形態過程（図２０a）や、幼牛血清での啓発（図２０ｂ）によっても反応の無いことを示す。これらの不具合は、存在していなかったコラーゲンのインテグリンアルファ２受容体を差し入れることで改善される。
【図２１】様々なY27632の濃度を投与されたモデル組織の緊縮力の変化を比べたものである。
【図２２】様々な条件で培養された細胞から培養液に分泌されたMMPのザイモグラフである。
【図２３】MMP抑制剤、GM6001を投与されたものとそうでないモデル組織の伸縮による力の変化を比べたものである。
【図２４】様々なモデル組織に対する薬剤投与に対して記録された力の変化が、イラストされている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年7月27日(2004.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬化合物をスクリーニングする方法であって、薬剤に対する組織モデル系の応答を得るため、組織モデル系を薬剤と接触させ、パラメータとして収縮力と組織弾性のうちの少なくとも一方を明らかにする操作を含む方法。
【請求項２】
上記パラメータに収縮力と組織の弾性が含まれる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
上記組織弾性に、ヒステリシス、位相の遅れ、動的弾性のうちの少なくとも1つが含まれる、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
上記組織モデル系がリング系である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
アクティベータが、医薬候補または既知の医薬品である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
上記組織モデル系がコラーゲン中の細胞を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
上記細胞が筋細胞である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
上記細胞が非筋細胞である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
上記組織モデル系が人工バイオ系である、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
上記系が生きた系である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
上記細胞が内皮細胞である、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
上記細胞を少なくとも1個の心臓細胞の中から選択する、請求項7に記載の方法。
【請求項１３】
上記組織モデル系に細胞外マトリックスの細胞が含まれる、請求項7に記載の方法。
【請求項１４】
薬剤との接触に対する組織モデル系の機械的応答を得るための方法であって、組織モデル系を構成し、薬剤をこの組織モデル系と接触させ、薬剤が組織モデル系と接触したときの細胞の機械的応答としてパラメータである収縮力とヒステリシスのうちの少なくとも一方を測定する操作を含む方法。
【請求項１５】
細胞の上記機械的応答に、収縮力とヒステリシスが含まれる、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
組織押し込みシステムを用いて上記機械的応答を測定する、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
上記組織押し込みシステムが、力変換器とコンピュータとに接続された押し込みプローブを備える、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
上記組織モデル系が人工バイオ系である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
上記人工バイオ系が生きた系である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
上記組織モデル系がコラーゲン中の細胞を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
上記細胞に筋細胞と非筋細胞が含まれる、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
再構成した筋・非筋組織モデルを薬剤と接触させたときの応答に関する機械的測定結果に基づいて機械的応答プロファイルを得るための系であって、コラーゲン中に再構成した細胞を含む再構成した組織モデルを構成し、この再構成した細胞マトリックスを薬剤と接触させ、薬剤と接触したときの細胞の機械的応答として収縮力と組織弾性のうちの少なくとも一方を測定する操作を含む系。
【請求項２３】
上記細胞応答に、力の増大と組織弾性のうちの少なくとも一方が含まれる、請求項22に記載の系。
【請求項２４】
上記組織弾性に、ヒステリシス、位相の遅れ、動的弾性のうちの少なくとも1つが含まれる、請求項23に記載の系。
【請求項２５】
上記細胞応答に、力の増大、組織弾性、ヒステリシスが含まれる、請求項24に記載の系。
【請求項２６】
上記細胞応答を組織押し込み法によって測定する、請求項23に記載の系。
【請求項２７】
上記機械的応答を組織押し込みシステムを用いて測定する、請求項23に記載の系。
【請求項２８】
上記組織押し込みシステムが、押し込みプローブと、力変換器と、コンピュータを備える、請求項27に記載の系。
【請求項２９】
上記系が人工バイオ系である、請求項22に記載の系。
【請求項３０】
上記系が生きた系である、請求項23に記載の系。
【請求項３１】
医薬品のスクリーニング法であって、コラーゲン中の細胞を含む組織モデルを有効量の医薬候補と接触させ、その医薬候補に対する細胞応答として収縮力と組織弾性の少なくとも一方を測定する操作を含む方法。
【請求項３２】
医薬品に対する細胞の応答として収縮力と組織弾性を測定する操作をさらに含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
上記組織弾性に、ヒステリシス、位相の遅れ、動的弾性のうちの少なくとも1つが含まれる、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
上記医薬品と接触したときの細胞の応答を測定し、位相の遅れと動的弾性を明らかにする操作をさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
コラーゲン中に再構成した細胞を含むマトリックスをアクティベータに曝露したときの応答を測定してデータを得るため、
（a）細胞と；
（b）コラーゲンと；
（c）ECMを含む組織モデル。
【請求項３６】
上記細胞に筋細胞と非筋細胞が含まれる、請求項35に記載の組織モデル。
【請求項３７】
1種類以上の医薬品のライブラリを管理する方法であって、医薬品を組織モデルと接触させることによりその医薬品を組織モデル系と接触させたときの機械的応答のプロファイルを取得し、そのプロファイルをデータベースに記憶させ、組織モデル系における別の医薬品の少なくとも1つの追加プロファイルをそのデータベースに記憶させ、1つのプロファイルを別のプロファイルと比較する操作を含む方法。
【請求項３８】
あらかじめ確立した比較法または手順が整った標準的な比較法に基づき、第1の薬剤のプロファイルを第2の薬剤のプロファイルと比較する操作をさらに含む、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
組織モデル系に対する機械的効果に関する各医薬品の対応するプロファイルに基づき、医薬品の活性の順序に従って医薬品をランク付けする操作をさらに含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
上記組織モデル系が、リング系または組織押し込みシステムである、請求項37に記載の方法。
【請求項４１】
上記ランキングに基づき、医薬品を次のレベルのテストへと進める操作をさらに含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
上記医薬品が、化合物の1つのグループまたはクラスである、請求項37に記載の方法。
【請求項４３】
プロファイルの上記比較が、収縮力または組織弾性に基づいている、請求項37に記載の方法。
【請求項４４】
細胞マトリックス系において組織押し込みシステムを使用する、請求項37に記載の方法。
【請求項４５】
上記比較に、収縮力と組織弾性を含む機械的応答データのベースラインを確立する操作を含む、請求項37に記載の方法。
【請求項４６】
上記系が人工バイオ系である、請求項37に記載の方法。
【請求項４７】
上記系が生きた系である、請求項37に記載の方法。
【請求項４８】
上記細胞が筋細胞である、請求項37に記載の方法。
【請求項４９】
上記細胞が非筋細胞である、請求項37に記載の方法。
【請求項５０】
組織モデルの機械的応答プロファイルを得るため、生細胞を医薬品と接触させる操作を含む方法であって、組織モデルを医薬品と接触させ、その細胞応答を測定する操作を含む方法。
【請求項５１】
上記組織モデル系がリング系である、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
上記組織モデル系において組織押し込みシステムを使用する、請求項50に記載の方法。
【請求項５３】
上記プロファイルをリング系から取得する、請求項50に記載の方法。
【請求項５４】
上記プロファイルを押し込みシステムを用いて取得する、請求項50に記載の方法。
【請求項５５】
医薬候補のプロファイルを既知の医薬品のプロファイルと比較し、その比較結果に基づいてランキングを作る、請求項50に記載の方法。
【請求項５６】
上記プロファイルを組織押し込みシステムを用いて取得する、請求項50に記載の方法。
【請求項５７】
疾患に関与することが知られている細胞系に対する医薬候補の効果を評価するにあたり、医薬候補のプロファイルを取得して特定の細胞に対するその医薬候補の活性想定値を提示し、その医薬候補のプロファイルを既知の活性な医薬品のプロファイルと比較する操作を含む、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
既知の疾患に対して効果的な治療法を提供することが知られている既知の医薬品のプロファイルを、疾患に対する効果の所望される医薬候補のプロファイルと比較する、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
特定の疾患に関与することが知られている細胞に対して効果があることが知られている医薬品のプロファイルとの比較を行なう、請求項50に記載の方法。
【請求項６０】
コンピュータ制御のステッピング・モータに電気的に接続された等尺式力変換器を備えるシステムに取り付けられたリング状の組織を含み、その組織が、等尺式力変換器に張り渡されており、コンピュータ制御されるステッピング・モータがその組織に力を加えて歪を与える、組織モデル系。
【請求項６１】
印加される力が線形である、請求項60に記載の組織モデル系。
【請求項６２】
印加される力がランプ状である、請求項60に記載の組織モデル系。
【請求項６３】
力がサイン曲線状に印加される、請求項60に記載の組織モデル系。
【請求項６４】
組織を20％引き伸ばすように力が印加される、請求項60に記載の組織モデル系。
【請求項６５】
組織モデル系の組織を引っ張り、歪を増加させたときの力の変化を観察することによって組織の弾性を測定する、請求項60に記載の組織モデル系。
【請求項６６】
上記組織が筋組織である、請求項60に記載の組織モデル系。
【請求項６７】
再構成した組織からなる膜を備え、その膜には支持体が取り付けられており、プローブに接続された等尺式力変換器には棒が取り付けられている組織モデル系。
【請求項６８】
コンピュータをさらに備え、このコンピュータが、膜を押してその押し込みに抵抗する力を測定するためのプローブを制御する、請求項67に記載の組織モデル系。
【請求項６９】
収縮力が最大応力として測定され、組織弾性が、組織と接触するプローブにより、組織の押し込みに対する抵抗力として記録される、請求項67に記載の組織モデル系。
【請求項７０】
組織モデル系内の組織に一定の歪を与え、歪を増加させたときの力の変化を観察することによって組織弾性を測定する、請求項67に記載の組織モデル系。
【請求項７１】
組織モデル系の調製方法であって、心棒の周囲に組織をリングの形態に増殖させ、このリングの形態の組織を心棒から取り外し、次いでこのリングの形態の組織に標準的な力を加えることにより張力を与える操作を含む方法。
【請求項７２】
一定の力を加える、請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
上記組織が生きた組織である、請求項71に記載の方法。
【請求項７４】
上記組織が筋細胞である、請求項71に記載の方法。
【請求項７５】
上記組織が心臓細胞である、請求項71に記載の方法。
【請求項７６】
細胞とECMを含んでいてプローブを受け入れる膜の形態になった組織モデル系を含む少なくとも1つのユニットと、その膜に近づけるかその膜から遠ざかるかに関する命令を受信するプローブと、このプローブに接続されていて電気的記録システムに電気的伝送を行なうことができ、膜に近づける命令をプローブに提示する変換器とを備える高スループット・スクリーニング・システム。
【請求項７７】
膜を収容するためのマルチウエル・プレート・システムが設けられている、請求項76に記載のシステム。
【請求項７８】
上記ユニットの数が約2〜約10,000である、請求項76に記載のシステム。
【請求項７９】
上記ユニットの数が約2〜約96である、請求項76に記載のシステム。
【請求項８０】
上記細胞が筋細胞である、請求項76に記載のシステム。
【請求項８１】
上記細胞が非筋細胞である、請求項76に記載のシステム。
【請求項８２】
上記筋細胞が心臓細胞である、請求項76に記載のシステム。
【請求項８３】
組織モデル系と細胞アクティベータを含み、このアクティベータが組織モデル系と接触したときの応答を測定するキット。
【請求項８４】
上記組織モデル系が生きた系であり、上記キットが携帯式である、請求項83に記載のキット。
【請求項８５】
明らかにされる上記応答が、収縮力または組織弾性である、請求項83に記載のキット。
【請求項８６】
明らかにされる上記応答がヒステリシスである、請求項83に記載のキット。
【請求項８７】
組織を含んでおり、その組織の一端は固定位置に取り付けられ、他端はコンピュータに接続された送信プローブに取り付けられ、このプローブを組織サンプルに対して前後させることによってその組織を押す、組織押し込みシステム。
【請求項８８】
上記組織が生きた組織である、請求項87に記載のシステム。
【請求項８９】
上記組織が筋組織である、請求項87に記載のシステム。
【請求項９０】
上記組織が筋細胞である、請求項87に記載のシステム。
【請求項９１】
医薬化合物の機械的応答プロファイルを明確にする方法であって、医薬化合物を組織モデルに接触させ、収縮力と弾性のうちの少なくとも一方を利用し、生細胞からなる人工バイオ系を含むその組織モデルの機械的応答を明らかにする操作を含むシステム。
【請求項９２】
上記プロファイルに、組織モデルに存在する細胞を対応させる、請求項87に記載のシステム。
【請求項９３】
リング系を用いてプロファイルを取得する、請求項87に記載のシステム。
【請求項９４】
組織押し込みシステムを用いてプロファイルを取得する、請求項87に記載のシステム。
【請求項９５】
プロファイル全体に対する細胞とサイトカインの寄与を反映するプロファイルを明らかにする、請求項87に記載のシステム。
【請求項９６】
繊維芽細胞によって条件付けられた培地を利用する操作を含む、心臓組織モデルの培養方法。
【請求項９７】
繊維芽細胞が心臓繊維芽細胞である、請求項96に記載の方法。
【請求項９８】
上記培地が1％FBSを含むDMEMである、請求項97に記載の方法。
【請求項９９】
上記方法における条件を、供給した単層の繊維芽細胞との共存培養、繊維芽細胞を含む人工組織との共存培養、組織中への繊維芽細胞の混合の中から選択する、請求項98に記載の方法。
【請求項１００】
上記心臓細胞をニワトリとマウスのうちの少なくとも一方から選択する、請求項12に記載の方法。
【請求項１０１】
上記心臓細胞がニワトリの心臓細胞である、請求項100に記載の方法。
【請求項１０２】
上記心臓細胞がマウスの心臓細胞である、請求項100に記載の方法。
【請求項１０３】
薬剤が組織に及ぼす効果を明らかにするための方法と装置であって、本発明を利用して組織を処理し、その結果得られる効果を測定した後、その測定された効果を、同じ組織または同様の組織に対する標準薬の効果と比較する操作を含む、方法と装置。
【請求項１０４】
医薬部分ライブラリから組織内で活性な部分に関するデータを探索するための方法と装置であって、本発明を利用して組織を処理し、その結果得られた効果を測定し、場合によっては測定されたその効果を、同じ組織または似た組織に対して標準薬が及ぼす対応する効果の測定結果と比較する操作を含む方法と装置。
【請求項１０５】
心臓組織の増殖に影響を与えるさまざまな付加的因子（例えば増殖因子）、マトリックス・タンパク質、ホルモンを本発明の組織モデルに対して追加することによって組織培養条件を最適化し、移植可能な人工心臓組織を構成する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、2001年8月14日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願第60/312,322号の恩恵を主張する。なおこの出願は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。
【０００２】
本発明は、医薬化合物をスクリーニングするためのシステムと方法に関する。さらに詳細には、本発明は、組織モデルにおいて医薬化合物をスクリーニングするためのシステムと方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
効率的にテストせねばならない医薬化合物の数が非常に増加している。その主な原因は、並行コンビナトリアル化学合成法によって大きな化合物ライブラリが得られることにある。それに対応して、機能的ゲノミクスを応用して同定される治療標的（例えば受容体や細胞内調節タンパク質）の数も大きく増加している。したがって医薬化合物が特定の細胞応答を誘起する能力をスクリーニングし、医薬候補となるリード化合物を同定するための迅速かつ定量的な方法が必要とされている。
【０００４】
大きな化合物ライブラリに対する最初のスクリーニングは、溶液中で実施できるアッセイ法を利用して標的分子に特異的に結合するかどうかをテストするというものである。シンチレーション近接アッセイや蛍光検出法に基づいた高スループットの方法が開発されている（Sundberg、2000年）。これらの方法では1日に数千種類の化合物をスクリーニングできるが、化学的相互作用の強さと特異性に関する情報が得られるだけで、細胞応答についての情報は得られない。したがって溶液中で標的に結合できる能力に基づいて最初に選択した化合物を再度スクリーニングし、望む細胞応答を引き出す能力を調べる必要がある。このように2回目、3回目のスクリーニングを行なうと、有望な医薬化合物またはリード医薬化合物を検出するプロセスに余分なコストと時間がかかることになる。
【０００５】
受容体が刺激を受けたかどうかやイオン・チャネルが活性化したかどうかは、蛍光法を利用して例えばカルシウム・イオンの濃度、膜電位、pHの変化を検出することによって調べられている（Sundberg、2000年）。イオン濃度や輸送状態のこのような変化は、シグナル伝達プロセスの比較的早い段階でしばしば起こり、その後に、より特異的な最終応答（例えば特定の酵素の活性化）が起こる。したがってこのような応答を測定しても、テスト医薬化合物によって活性化されるか抑制されるかという最終的な細胞応答に関する情報が得られるとは限らない。
【発明の開示】
【０００６】
一実施態様では、薬剤に対する多細胞組織モデル系の応答を得るための方法であって、組織モデルを薬剤と接触させ、その接触に対する細胞の機械的応答として、収縮力と組織弾性のうちの少なくとも一方を明らかにする操作を含む方法が提供される。
【０００７】
別の実施態様では、薬剤に対する組織モデル系の応答を得る方法であって、組織モデル系を構成し、薬剤を提供し、この薬剤が組織モデル系と接触したときの細胞の機械的応答として収縮力とヒステリシスのうちの少なくとも一方を測定する操作を含む方法が提供される。
【０００８】
さらに別の実施態様では、再構成した筋組織モデルと非筋組織モデルが薬剤と接触したときの応答に関する機械的測定結果に基づいて機械的応答プロファイルを得るためのシステムであって、コラーゲン中に再構成した細胞を含む組織モデル系を構成し、この再構成した細胞を薬剤と接触させる操作を含むシステムが提供される。
【０００９】
さらに別の実施態様では、医薬品のスクリーンング法であって、コラーゲン中に再構成された細胞を含む組織モデルを有効量の医薬化合物と接触させ、その医薬化合物に対する細胞応答として収縮力と組織弾性の少なくとも一方を測定する操作を含む方法が提供される。
【００１０】
さらに別の実施態様では、1種類以上の医薬品または医薬化合物のライブラリを管理する方法であって、1つの医薬品を組織モデルと接触させたときの機械的応答のプロファイルを取得し、そのプロファイルをデータベースに記憶させ、そのデータベース内に別の医薬品に関する少なくとも1つの追加プロファイルを記憶させ、2つ以上のプロファイルを別のプロファイルと比較する手段を設け、あらかじめ確立した、または手順が整った標準式／ヒエラルキー式比較法に基づき、第1の医薬品のプロファイルを第2の医薬品のプロファイルと比較し、組織モデルに対する機械的効果に関する活性の順序に従って各医薬品をランク付けする操作を含む方法が提供される。
【００１１】
さらに別の実施態様では、組織モデルを医薬品と接触させたときの細胞応答を測定することにより、組織モデルに関する多パラメータ機械的応答のプロファイルを得る方法が提供される。
【００１２】
さらに別の実施態様では、コンピュータに電気的に接続された等尺式力変換器を備えるシステムに取り付けられたリング状組織を含む組織モデルが提供される。この組織モデルは、等尺式力変換器に張り渡されており、コンピュータ制御のステッピング・モータがその組織を引っ張って歪みを与える。
【００１３】
さらに別の実施態様では、再構成した組織からなる膜をフレームで支持したものを含む組織モデルが提供される。再構成した組織からなる膜の機械的特性は、等尺式力変換器に取り付けられたプローブに対してその組織を移動させたときの引っ張りに対する抵抗力から明らかになる。
【００１４】
さらに別の実施態様では、組織モデルの調製方法であって、支持体上に自己集合化組織をある形状に配置し、成形されたその組織を押すことによって引っ張り力を加える操作を含む方法が提供される。
【００１５】
さらに別の実施態様では、医薬品の機械的応答プロファイルを確立する方法であって、組織モデルを医薬品と接触させ、あるいは組織モデルを医薬品で弛緩させ、その組織モデルの機械的応答として収縮力と弾性の少なくとも一方を明らかにする操作を含む方法が提供される。
【００１６】
別の特徴によると、繊維芽細胞によって条件付けた培地を用いて心臓組織を培養する方法が提供される。
【００１７】
別の特徴によると、本発明には、組織に対する薬剤の効果を同定する方法であって、本発明を利用して組織を処理し、その結果として得られる効果を測定した後、その測定した効果を、同じ組織または同様の組織に対する標準薬の効果と比較する操作を含む方法が含まれる。
【００１８】
別の特徴によると、本発明には、医薬部分ライブラリから組織内で活性な部分に関するデータを探索するため、本発明を利用して組織を処理し、その結果得られた効果を測定する操作を含む方法が含まれる。オプションとして、測定されたその効果を、同じ組織または似た組織に対して標準薬が及ぼす効果を同様にして測定した結果と比較することができる。
【００１９】
別の特徴によると、本発明には、心臓組織の増殖に影響を与えるさまざまな付加的因子（例えば増殖因子）、マトリックス・タンパク質、ホルモンを本発明の組織モデルに対して追加することにより、組織培養条件を最適化して移植可能な人工心臓組織を構成する方法が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
この明細書では、“アゴニスト”という用語に、細胞応答を活性化する化学物質が含まれる。
【００２１】
発明の詳細な説明
ヒトの身体には20〜30兆個の細胞があり、それらが特徴や機能が異なる組織に分かれていると推定されている。そのような細胞には、筋細胞と非筋細胞が含まれる。筋細胞は収縮力を増大させる。筋細胞は、収縮力の発生を調節するメッセンジャー（例えばカルシウム・イオンやサイクリックAMP）を出す神経信号に応答する。非筋細胞（例えば繊維芽細胞や内皮細胞）は、アクティベータ（ポリペプチド増殖因子やホルモン）に応答して収縮力を発生させる。
【００２２】
この明細書では、“…で処理した”、あるいは“…と接触させた”という表現に、…に曝露したり、…に接触させたり、…と接触した状態にしたりすることが含まれる。この明細書では、“組織モデル”という用語に、生細胞や細胞外マトリックス材料から再構成した細胞や組織が含まれる。この明細書では、“等尺力”という用語に、組織の長さまたは組織の物理的大きさが実質的に変化することのない力の変化が含まれる。この明細書では、“細胞外マトリックス（ECM）”という用語に、フィブリン、フィブロネクチン、ラミニンのほか、これらに似た構成要素／成分や合成材料（例えばポリアクリル酸、ポリグリコール酸）が含まれる。
【００２３】
細胞や細胞外マトリックス（ECM）から再構成された組織モデル（例えば人工バイオ組織）は天然の組織を刺激する。このような組織モデルは、均一な、あるいは実質的に均一なコラーゲン性マトリックスの中に生細胞が多分散または単分散された集団を提供する。
【００２４】
細胞骨格とマトリックス・タンパク質は、組織モデルによって及ぼされる力と組織モデルの弾性を制御する。細胞は、細胞骨格構造を調節するとともにECMをリモデルするため、組織が増殖して傷が治る間に機械的な変化が起こる。
【００２５】
収縮力は、筋肉以外のミオシンの活性化によって発生する。活性化後、時間経過とともに増大する収縮力は、筋細胞および非筋細胞から再構成した組織の中で測定することができる。細胞がこのように応答すると、細胞内の細胞骨格が再構成されたり、細胞が埋め込まれている細胞外マトリックス（ECM）が再構成されたりする可能性がある。収縮力の増大や、細胞骨格やマトリックスが再構成されることの機械的効果は、医薬候補に対する細胞応答の指標となる。収縮力と弾性は、細胞のミオシンの活性化または不活性化によって、あるいは細胞骨格に対するこれ以外の擾乱によって、あるいは細胞が埋め込まれている細胞外マトリックスの擾乱によって生じる。
【００２６】
再構成した組織を用いて組織モデルを構成し、特別に単離したタイプの細胞を用いて、あるいはさまざまなタイプの細胞の組み合わせを用いてその組織モデルをテストすることができる。したがって医薬候補に対する再構成した組織の応答がこれらのタイプの細胞についての機械的測定結果を与える。このとき、天然の組織に一般に存在している他のタイプの細胞の寄与が混じることはない。特定のタイプの細胞と、その細胞に薬剤が接触したときに生じる力および弾性の変化を機械的に測定した結果のプロファイルとの間に関係が確立される。
【００２７】
収縮力と組織の弾性は、再構成した組織内の細胞が薬剤と効果的に接触したときに収縮したり弛緩したりすることにより変化する。この明細書では、“薬剤”という用語に、1種類以上の医薬候補が含まれる。その医薬候補には、何らかの薬理活性または細胞応答があってもなくてもよい。薬剤には、アクティベータ、アンタゴニストなども含まれる。この明細書では、“効果的な接触”という用語は、有効量のアクティベータを組織モデルと接触させることを意味する。そのためには、例えば薬剤を組織モデルに添加する。この明細書では、“医薬品”という用語は、動物またはヒトに影響を与える薬と関係があることを意味する。
【００２８】
組織系として使用する組織モデルから医薬候補に対する応答に関する組織特異的情報を得るため、使用する細胞はさまざまな組織供給源から取得する。
【００２９】
この明細書では、“組織の弾性”という用語は、組織を所定量引き伸ばすのに必要な力を意味する。言い換えるならば、組織の弾性は、組織に加えた力を組織が引き伸ばされた程度で割った値である。弾性物体を引き伸ばすのに必要な力は、その物体を引き伸ばす程度（“歪み”）が大きくなるにつれて増大する。しかし生物組織は粘弾性である。すなわち引っ張り率に依存する粘性力も、引っ張りに対する抵抗に寄与する。粘性力の寄与は、弾性が引っ張り率にどのように依存しているかから明らかにすることができる。線形な弾性を示す材料では、力が歪みに対して線形に増加する。すなわち弾性は、歪みとは独立に一定である。生物組織や再構成した組織モデルは機械的に非線形であり、組織の弾性は歪みの増大とともに大きくなる。ある範囲の力では、その力が組織内で発生した場合でも外部から加えられた場合でも、弾性が力に対して線形に変化する。この線形な変化は、力が歪みの指数関数であることを意味する。
【００３０】
組織の弾性を測定する1つの方法として、組織モデル系の組織に対して比較的大きな安定した引っ張り力を加え、歪みが大きくなったときの力の変化を観察するという方法がある。組織の弾性をこのようにして測定すると、ヒステリシス（面積）、位相の遅れ、動的弾性などのパラメータを測定して明らかにすることができる。
【００３１】
組織の弾性を測定している間に歪みがあらかじめ決めた値に達すると、今度は引っ張りの程度（歪み）を同じ速度で小さくして歪みと弾性を最初の値に戻す。歪みが小さくなるときの力を歪みの関数としてプロットした曲線（負荷解除曲線）は、歪みを大きくしていくときの力のレベル（負荷曲線）よりも常に下にある。これら2本の曲線に囲まれた面積がヒステリシス面積であり、組織の粘性の指標となる。ヒステリシス面積は、1回ごとの負荷-負荷解除サイクルの間に組織において失われるエネルギーを表わす。
【００３２】
組織の弾性を測定する別の方法では、振動性引っ張りが利用される。すなわち、実験者が選択した所定の周波数（例えばサイン曲線）で歪みを周期的に増減させる。力は対応するように同じ周波数で増減するが、位相のずれ、すなわち位相の遅れがおそらく伴う。位相のずれ、すなわち位相の遅れは、組織モデルの粘性に関する別の指標である。振動性引っ張りによって測定されるタイプの組織の弾性は、“動的弾性”である。動的弾性は、組織モデルが非線形であるため引っ張りの大きさに依存するとともに、組織が実際には粘性を有するため振動の周波数にも依存する。
【００３３】
本発明の実施態様では、再構成した組織モデルに対して機械的測定を行なう。本発明により、1種類以上のアクティベータとの接触に応答した後の一軸性引っ張り測定を通じ、結合組織モデル（例えば繊維芽細胞マトリックス（FPM））の機械的特性を定量化する方法が提供される。
【００３４】
結合組織モデル（選択した生細胞と、ECM（すなわち人工バイオ系で、通常はタイプIのコラーゲン）との複合体）は、収縮力を活性化するアクティベータと接触するために硬化するという応答を示す。本発明の組織モデル系に関する一実施態様では、組織をリングの形状にして系に取り付ける。この系では、収縮力と歪みを測定するため、組織が等尺式力変換器とコンピュータ制御されるステッピング・モータに張り渡される。
【００３５】
高スループットのスクリーニングに特に適した本発明の別の実施態様では、マルチウエル・プレート・システムを用いて組織の硬化を押し込み法で測定する。押し込み法では、収縮力を（最大応力として）測定するとともに組織の弾性を測定する。そのとき収縮力は、組織モデルと接触するプローブによって押されたときの組織モデルの抵抗力として記録する。プローブは力変換器に取り付ける。この実施態様では、試薬に対する多数の組織複合体の機械的応答を迅速に（高スループットで）テストすることができる。このシステムは、少量の組織モデルおよび試薬を使用するのに適したサイズと設計になっている。
【００３６】
よく特性のわかった活性剤によって引き起こされる硬化応答を妨げる能力に関して医薬候補をスクリーニングし、収縮応答を抑制するものを見つけることができる。さらに、細胞にコラーゲンをリモデルさせることによりコラーゲンを硬化または軟化させる候補試薬を、この明細書に開示した本発明の方法を利用してテストすることができる。
【００３７】
本発明により、再構成した組織モデルが1種類以上の薬剤と接触したときの機械的応答の特徴とプロファイルを明らかにするためのシステムと方法が提供される。本発明により、細胞の収縮、細胞骨格の変化、細胞-マトリックス相互作用、マトリックスのリモデリングに関する潜在的な多数のアクティベータまたは阻害剤を迅速かつ定量的にスクリーニングすることができる。本発明の方法により、組織の弾性が定量的に読み出される。それを較正することにより、ミオシンによる細胞骨格成分の変化の程度、細胞-マトリックス相互作用の活性化または抑制の程度、マトリックスそのものの特性に関する定量的データを提供することができる。
【００３８】
この明細書と請求項に記載したシステムと方法が、この明細書に記載した特定の実施態様に限定されることはない。さらに、各システムの要素とそれぞれの方法は、この明細書に記載した他の要素および方法と独立かつ別々に実施することができる。それぞれの要素と方法は、他の要素および方法と組み合わせて利用することができる。
【００３９】
有用なコラーゲンとしてはクラス1〜4のコラーゲンが挙げられる。その中には、タイプI〜XIIIのすべてとその組み合わせが含まれる。
【００４０】
アクティベータとして有用な薬剤としては、ウシ胎仔血清（FBS）、リゾホスファチジン酸（LPA）、トロンビン、増殖因子（例えば上皮増殖因子（EGF）、血小板由来増殖因子（PDGF））、アンギオテンシンII、エンドセリン-1、バソプレッシン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００４１】
阻害剤としては、細胞表面の受容体に作用する阻害剤（例えばアンギオテンシンII受容体に対する受容体アンタゴニスト）と、細胞内で作用する阻害剤が挙げられる。この明細書で有用な阻害剤はシグナル伝達プロセスを阻害する阻害剤であり、例えばゲニステイン、ハービマイシン、細胞骨格に作用する薬剤などが挙げられる。細胞骨格に作用する薬剤としては、サイトカラシンD、ラトルンクリンB、パクリトキソール、ノコダゾール、カリクリンA、ブタン-ジオン-モノオキシム（BDM）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００４２】
再構成した細胞に加える薬剤の量は、一般にはナノモル〜約100ミリモルの範囲の有効量である。有効量とは、組織モデルから応答を引き出すのに十分な量である。
【００４３】
本発明の実施態様を利用して明らかにすることのできる機械的パラメータがいくつかある。
リング・タイプの系：
ベースラインとなる力  歪み0で測定した力（引っ張り力なし）。
動的弾性       サイン曲線化型引っ張り力に対する力の応答の振幅を、加えた振動性歪みの振幅で割った値。測定は、さまざまなレベルの歪みに対して行なう。動的弾性は、ランプ状引っ張り力を加えている間に得ることもできる。
位相角         位相角は、サンプルの時間依存した粘性を示す。位相角は、力の応答とサイン形駆動関数の間の位相が角度にしてどれだけずれているかから得られる。測定は、通常は歪み0で行なわれるが、力の平均レベルが短時間で安定状態に達するのであれば、さまざまな歪みで測定することもできる。
*貯蔵弾性率、G'       サイン曲線型引っ張り力に対する応力（力をサンプルの断面積で割った値）の同相成分を歪みで割った値。
*損失弾性率、G"       サイン曲線型引っ張り力に対する応力の位相はずれ成分を歪みで割った値。
最大応力       ランプ状引っ張り力に応答する最大応力。
ヒステリシス曲線の面積ヒステリシス曲線は、ランプ状引っ張り力に応答した力を歪みに対してプロットしたものである。サンプルを引っ張っている間の力の応答は、サンプルを収縮させている間の力の応答よりも常に大きい。2本の曲線で囲まれた面積が、サンプルの粘性と関係している。
組織を押す手続き：
最大応力       組織を押したときに応答する最大応力。
ヒステリシス曲線の面積ヒステリシス曲線は、組織を押したときに応答した力をプロットしたものである。押している（負荷をかけている）の間の力の応答は、力を緩める（負荷解除の）間の力の応答よりも常に大きい。2本の曲線で囲まれた面積が、サンプルの粘性と関係している。
*G'とG"は、サンプルの断面積がわかると動的弾性と位相角から計算することができる。G'とG"は、サンプルのサイズや形状とは無関係にサンプルの機械的特性を示すパラメータである。
【００４４】
さらに詳しいことは、図1〜図15を参照して以下に説明する。この明細書では組織モデルを利用する方法とシステムの特別な具体例について記述するが、この方法とシステムがそのような特別な具体例に限定されることはない。
【００４５】
さらに詳しい説明に入る。図1は、（リングの形状になった）FPMを調製して測定するためのリング法の概略図である。一実施態様では、CEF（2）とコラーゲン・モノマー（4）をDMEM（6）の中でpH7にて混合し、懸濁液（8）にする。この懸濁液（8）を、心棒（12）を有する鋳型用ウエル（10）に注ぎ、37℃にて重合させる。鋳型用ウエル（10）を1日以上の期間にわたってインキュベートすると、その間に細胞が圧縮され、重合したコラーゲン・マトリックスになる。インキュベーションの後、心棒（12）を鋳型用ウエル（10）から外し、FPMリング（14）を心棒（12）からそっと外す。FPMリング（14）を、力測定装置（等尺式力変換器）（16）と、組織の歪みを制御するステッピング・モータ（18）とに取り付ける。
【００４６】
図2は、FPMを引っ張ったときに応答する力をどのようにして測定するかを示している。1つのFPMに対して4回の引っ張りサイクルを適用して得られた典型的な力の応答の時間変化を追跡した。（パネルaに示した）第1の引っ張りサイクルでは、以後のサイクルよりも実質的に大きな最大応力が生まれる。以後のそれぞれのサイクルでは、最大応力のはるかに小さな低下（約6％）が見られる（パネルa）。図2のパネルbには、2つのFPMでの引っ張りシークエンス（実線とグレイの破線）が描かれており、測定に再現性のあることがわかる。20％コウシ血清（収縮性を増大させる）と2μMのサイトカラシンD（組織の能動的収縮を阻害する）の両方で処理した効果はどちらのFPMでもほとんど同じである。このテストでは、追加のテスト操作を行なえるようにするため、1サイクルの時間を以前の60分間ではなく30分間に設定した。（しかし1サイクルの時間が30分間でも60分間でも力-歪み曲線と弾性-歪み曲線はほとんど同じである。）
【００４７】
図3は、弾性の測定データを細胞から発生した力と比較して示したものである。このテストでは、組織モデルを1Hzのサイン曲線に従って0.3％だけ引っ張った。弾性は、（この時間スケールにおける軌跡の幅によって近似される）力のピーク-ピーク間の変化として測定した。弾性を表わすそれぞれの点は、弾性を5秒間平均した値を表わしている。
【００４８】
図3のグラフ（a）は、弾性の大きさと時間変化が、FBS（5％）で刺激している間の力と似ていることを示している。図3のグラフ（b）は、サイトカラシンD（2μM）によってアクチン・フィラメントが破壊されることを示している。図3（a）と同様、弾性は、力が変化することに対応して変化する。
【００４９】
図3のグラフ（c）は、図3のグラフ（a）とグラフ（b）に示した測定データに関し、弾性を力の関数としてプロットしたものである。FBSを添加した後の力の増大に関する力-弾性の関係（●）は、サイトカラシンDを添加した後の力の低下に関する力-弾性の関係（△）と非常に似ている。この図のそれぞれの●と△は、力と弾性の両方を表わしている。弾性は力に対してほぼ線形に増大する。
【００５０】
図4は、力と動的弾性がCDとLA-Bの濃度に依存することを示している。力と動的弾性は、CDの濃度が2nMのときに有意に減少し、CDの濃度が増大するにつれて減少を続けた（A、B）。それとは対照的に、LA-Bについては、力と動的弾性は、濃度が40nMに達したときにようやく減少を始め、濃度が約600nMのときに最小値に達した（C、D）。この図は、この測定法が、アクチン細胞骨格に変化を引き起こさないような低濃度のCDにおいて力と動的弾性の変化を検出できる感度を有することを示している。なおアクチン細胞骨格の変化は、光顕微鏡法で検出することができる。
【００５１】
図10は、再構成した組織を用いてリング法で測定した組織モデルの弾性に関するデータ（左側の棒グラフ）と、個々の細胞を押すことによって測定した細胞の弾性に関するデータ（右側の棒グラフ）の違いを比較した結果を示している。再構成した組織は、単一の細胞での測定と比べて少ないデータ数で統計的に有意なデータを提供することができる。統計的に有意なデータを得るのに必要な測定の数は、単一の細胞を用いるよりも組織モデルを用いる場合のほうが少ない。それは、単一のタイプの培養細胞群においてさえ、多数の実験パラメータに関して細胞間で実質的に違いが存在しているからである。したがって個々の細胞での測定を多数平均してその集団を特徴づける必要がある。それゆえ単一の細胞群で化合物の生物活性を測定する高スループットのスクリーニング装置では、統計的に有意なデータを得るのに多数の測定を行なう必要がある。しかしテストした組織モデルは少なくとも10,000個の細胞を含んでいたため、それぞれの測定はその組織内の多数の細胞の平均になっている。したがって組織モデルに関する高スループット・スクリーニングの効率は、単一の細胞群の場合よりも改善される。
【００５２】
図11は、押し込み法を利用してこの組織系の機械的応答を測定する場合の高スループット・スクリーニング・システムを示している。
【００５３】
直径1mmのステンレス鋼製ワイヤーでできた三角形のフレームが、再構成する組織を表面に形成するための足場となる。図示した例では、ウエルを底部に向けてわずかに先細にし、フレームをウエルの底から1mm上方にしっかりと固定する（細胞と上記の適切な細胞培地を含む重合していないコラーゲンの溶液をウエルに注ぎ、底から3mmのレベルまで満たす（図11a））。96ウエルのプレートを5％CO2のもとで37℃にてインキュベートする。培養中に細胞がコラーゲン・マトリックスを圧縮して液体を押し出し、全体積が約10分の1になる。
【００５４】
ワイヤー・フレームがないと、再構成される組織は収縮して小さな球になり、組織培地内を浮遊する。コラーゲン・マトリックスは、さまざまな形状のフレーム（例えば円形や長方形になったワイヤー・フレームなどの支持体）を用いて圧縮することにより、いろいろな形にすることができる。支持体は、金属、非金属、プラスチックのいずれかにすることができる。一実施態様では、システムは自己集合化細胞系であり、細胞がフレームまたは支持体の形状に一致した組織モデルを形成する。
【００５５】
三角形のワイヤー・フレームに対し、細胞が3つの辺にまたがる膜を形成する。その様子を図11aに示してある。図11bに示したような別の形状のワイヤー・フレームだと、幅と形状が異なる組織ストリップが形成された。非ステンレス鋼からなる多孔性でないワイヤーの表面に組織を付着させる場合でさえ、組織を容易に付着させるのに多孔性支持体材料（例えばベルクロ社のファスナー）は使用しなかった。コラーゲンは、膜またはストリップの外側部分でより多く圧縮された。したがって膜のこの外側部分は、細胞によって生じる応力に耐えることができ、ワイヤー・フレームから膜を引きちぎろうとする応力の発生を防止することができる。
【００５６】
図12は、図11に示した上記のシステムを用いて得られたデータを示している。このデータは、最大応力が安定なレベルに達した後、サンプルを20％ウシ胎仔血清（FBS）で刺激することを示している（図12aの矢印を参照のこと）。この量のFBSによって繊維芽細胞の非筋肉ミオシンが活性化されて収縮力が生まれ、再構成した組織が硬化する。FBSを添加した約10分後、次の押し込みによる最大応力が約25％増加する（図12a）。培地に40nMのCDを添加（この図の矢印bを参照のこと）した約15分後、次の押し込みによる最大応力が最初のレベルから約40％低下した（図12）。2μMのCDを添加した20分後に最大応力のさらなる低下が記録された。図12bは、図12aに示したのと同じデータをプロットしたものであるが、図12bでは、図12aと同じ条件における力と押し込みの深さの関係が示してある。
【００５７】
図13は、上に示した図12のデータを取得したテストの間の最大応力とヒステリシスの面積を比較したグラフである。図13（a）は、FBSで処理する前（FBSなし）、20％FBSで処理した後、40nMのCDで処理した後、2μMのCDで処理した後に測定した最大応力（ダイン）を示している。図13（c）は、最大応力とヒステリシスの面積がFBSで処理しない場合の値と比べてどれだけ変化したかを示している。
【００５８】
ヒステリシスの面積は、刺激を与えたりCDを添加したりするとより大きく変化する。したがってヒステリシスの面積は、組織モデルの機械的特性の変化をモニターするためのパラメータとしては最大応力よりも感度がよい。
【００５９】
図14は、再構成した組織のミニチュア版の機械的特性を96ウエルのプレートを用いて測定した結果を示している。このシステムは、高スループット・スクリーニングで使用することができる。というのも、マルチウエル・プレートを用いて複数の測定を迅速に並行して実施できるからである。
【００６０】
図14は、96ウエルのプレートを用いて力を測定した結果を時間軸に沿って示したグラフである。再構成した組織からなる小さな膜をステンレス鋼製ワイヤー・フレームで支持する。等尺式力変換器に取り付けた鉛直な棒を膜に押し込み、その押し込みに抵抗する力を測定する。10％FBSを添加すると力のピークが30％大きくなる。CDを添加するとピークの高さが60％低下した。
【００６１】
96ウエルのプレート・システムを用いてこの手続きを自動化することにより、あるいはより高度な並行処理を行なうことにより、本発明を利用して基本的アイディアを高スループットの用途へと拡張することができる。組織モデルを利用することにより、化合物ライブラリをその生物活性に基づいてスクリーニングして管理することができる。
【００６２】
一般に、収縮力は、薬剤を組織モデル系に接触させてから数分の間に急速に大きくなる。収縮力は、最大値に達した後、1時間以上の期間にわたってその値を維持するか、あるいはアクティベータや細胞のタイプに固有の速度で低下する可能性がある。力が緩和する理由は重要ではないが、そこから力と弾性の応答を明らかにするための情報とデータがさらに得られる。
【００６３】
活性化の間、細胞表面の受容体で受信したシグナルがさまざまな経路を通じて細胞内へと伝達され、収縮力が発生する。したがって収縮力の増大および維持は、外来性アクティベータとの接触によって細胞表面の受容体の伝達経路が作動してミオシンの活性化に至るという細胞の特異的応答の指標（プロファイル）となる。非筋細胞のプロファイルとしては、収縮力の最大値、収縮力の維持などが挙げられる。
【００６４】
以下の実施例の中で本発明をさらに詳しく説明する。なお本発明がこれら実施例に限定されることはない。
【実施例】
【００６５】
組織モデルの調製
【００６６】
生きた人工バイオ組織モデルを、細胞と細胞外マトリックス（ECM）から再構成して調製した。このモデルは天然の組織を刺激する。
【００６７】
11日目のニワトリ胚から単離したニワトリ胚の繊維芽細胞（CEF）（スパファス社、プレストン、コネティカット州）を、10％ウシ胎仔血清（FCS）と、50単位/mlのペニシリンと、50μg/mlのストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の中に維持した。組織モデルを作るのに使用するCEFは、初代培養物から1回または2回継代培養した。0.02Mの酢酸に溶かしたコラーゲン・モノマー（アップステート・バイオテクノロジー社、レーク・プラシド、ニューヨーク州）を4℃にて0.1NのNaOHを用いて中和し、濃縮DMEMストックと混合し、通常濃度のDMEMを最終的に得た。トリプシンによって分散した繊維芽細胞（図1a）をこのコラーゲン溶液と混合し（図1b）、この細胞懸濁液をテフロン製鋳型用ウエルに注ぎ（図1c）、ウエルを37℃にて5％CO2の状態でインキュベートした（図1d）。コラーゲンが15〜30分で重合し、水和したコラーゲン・ゲルの内部に繊維芽細胞を捕獲した。コラーゲン・ゲルは、円筒形ウエルの内壁と中心にある心棒の間にリング（厚さ3mm、直径3cm）を形成した。培養物中で細胞がこのリングを圧縮している間に体積が約10分の1に減少した（厚さ200〜300μm）。次に、リングを心棒から取り外し（図1e、図1f）、測定装置に取り付けた（図1g）。それについて以下に説明する。
【００６８】
再構成する組織を形成するのに使用できる細胞のタイプがCEFに限られることはない。機械的測定に適した組織を形成するのに使用されてきた細胞のタイプとしては、ニワトリ胚の繊維芽細胞、ニワトリ胚の心臓繊維芽細胞、ニワトリ胚の心臓ミオサイト、ラットの心臓繊維芽細胞、マウスの筋管、マウスの骨格筋C2/C12細胞系、正常なマウスの乳腺（NMuMG）細胞系、このマウスでα1インテグリンとα2インテグリンが欠如した突然変異系、マウスの繊維芽細胞とその突然変異細胞系、REF52繊維芽細胞、A7R5平滑筋細胞、CCL39繊維芽細胞、NR6繊維芽細胞、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。細胞は、ニワトリ胚から単離すること、あるいはアメリカ培養物コレクション（マナサス、ヴァージニア州）から入手することが可能である。
【００６９】
リング系に関する測定とリング系の組み立て
【００７０】
リング系を用いて物理的測定を行なった。培養を2日間にわたって行なった（最後の12〜16時間は血清欠乏状態にした）後、鋳型用ウエルから心棒を取り外し、リング状組織モデルを心棒からそっと取り外した。図1に示したように、リング状組織モデルは、可撓性のある細い金の鎖により、等尺式力変換器（モデル52-9545、ハーヴァード・アパレイタス社、サウス・ナティック、マサチューセッツ州）に取り付けられた三角形のフックにループにして引っかけた。サンプルの応力と動弾性率を測定するため、このリングは、滑動部材に取り付けられた水平な棒に対してもループにして引っかけられている。なお滑動部材は、マイクロ-ステッピング・ドライバ（IM483、インテリジェント・モーション・システムズ社）によって制御されるステッピング・モータ（P/N 1-19-3400 24V DC ステップ・サイズ1.8°、ハワード・インダストリー社、セントルイス、ミズーリ州）によって鉛直方向に直線状に移動可能になっている。マイクロ-ステッピング・ドライバは、パーソナル・コンピュータを用いて制御した。このコンピュータにインストールしたソフトウエアのおかげでステッピング・モータは滑らかな動きをすることができた。コンピュータに接続したアナログ・ディジタル信号変換器（CIO-DAS1602/16、コンピュータ・ボーズ社、マンスフィールド、マサチューセッツ州）を用いて等尺式力変換器からの電圧信号をディジタル信号に変換し、データ記録装置に記録した。ステッピング・モータによって組織の引っ張り具合を制御した。組織から及ぼされる力、あるいは組織に対して及ぼす力は、金の鎖を通じて力変換器に伝えた。
【００７１】
組織サンプルを、37℃に維持した温度制御式有機浴（ハーヴァード・アパレイタス社、サウス・ナティック、マサチューセッツ州）に入れた50mlのヘペス緩衝DMEM（pH7.4）に浸した。ループになったリングが引っかけられる水平な2本の棒が、最初はリングを（心棒の周囲長に対応する）元の長さになった状態で保持するように設定した。
【００７２】
組織モデル系のテスト
【００７３】
一般に、弾性を測定するには組織モデルに対して一連の引っ張りサイクルを適用する。それぞれのサイクルにおいて、ステッピング・モータを作動させて組織モデルを30分間かけてゆっくりと0〜20％引っ張った後、同じ速度で元の長さに戻す。第1回目の引っ張りの間における収縮力の増加は、以後の引っ張りにおける収縮力よりも実質的に大きい（図2a）。第1回目の引っ張りの後、それぞれの引っ張りにおいて最大収縮力がさらに少し低下するが、この低下は、予備的な引っ張りを十分に行なった後には無視できる程度になる。組織モデルは、血清による繊維芽細胞の活性化に応答して収縮力を発生させた。この収縮力は、アクチン細胞骨格をサイトカラシンD（2μM）で破壊することによって消えた（図2b）。
【００７４】
応答した力の振幅を引っ張りの振幅で割った値は、あらかじめ選択したサイン曲線型の長さ変化をさせたサンプルの動的弾性に対応した。動的弾性は、さまざまな周波数と振幅で測定することができる。サンプルを歪みが20％になるまで一定速度（10μm/分）で伸ばしたり縮めたりすることに加え、サイン曲線型の長さ変化（典型値は、振幅が20μm、歪み0.5％、周波数0.5Hz）をさせることにより、FPMの動的弾性と張力をさまざまなレベルの歪みで測定した。装置は、組織の長さが所定の速度と振幅で変化するように設定する。
【００７５】
弾性は、得られる機械的応答プロファイルにおいて細胞とマトリックスの寄与を分離することによって明らかにすることができる。というのも、細胞、マトリックス、細胞とマトリックスの相互作用のすべてが、再構成した組織モデルの組織の弾性に寄与するからである。
【００７６】
図3に示したように、動的弾性は等尺力にほぼ比例する（図3c）。動的弾性と等尺力については、元の長さの組織がFBSによる刺激とCDの添加に応答した変化を測定した（図3a、図3b）。したがって等尺力と動的弾性の両方とも、再構成した組織の機械的特性のよい指標である。この方法を適用すると、異なる2種類の薬剤を用いてアクチン細胞骨格を破壊することにより引き起こされる組織モデルの力と動的弾性の低下が、投与量に依存していることが明らかになる。それについて以下に説明する。実施例からのデータにより、一軸性引っ張り測定を通じた結合組織モデル（例えば繊維芽細胞マトリックス（FPM））の機械的特性が明らかになる。組織モデルは、歪みの大きさが所定の値であるとき、応力が歪みの指数関数になるという点と、弾性が力に比例するという点で、天然の組織と似ている。
【００７７】
組織モデルの機械的特性に対する細胞とマトリックスの寄与をリング系を用いて明らかにする。
【００７８】
再構成した細胞のアクティベータに対する応答のより具体的なプロファイルを得ることが大いに望ましいため、再構成した組織モデルの機械的特性に対する細胞とマトリックスの寄与を明らかにした。ウシ胎仔血清によって細胞の収縮力を増大させ、CDによってF-アクチンを破壊すると、能動成分と受動成分が得られる。それぞれの成分には、機械的特性に対する細胞とマトリックスの寄与が強く表われている。図19には、20％CSで活性化させることによりあらかじめ引き伸ばした組織モデルについて、力と歪みの関係（a）、動的弾性と歪みの関係（b）が、“合計”と表記した実線で示してある。2μMのCDで処理した後に得られる力と動的弾性の関係を表わす曲線は、“受動”と表記した破線で示してある。合計と受動の曲線の差が“能動”であり、点線で表わしてある。すべての曲線がヒステリシスを示す。“能動”曲線は、歪みの増大ともにほぼ直線的に増加する。“受動”曲線は、ほぼ指数関数的に増大する。動的弾性は0.5Hzで測定した（b）。動的弾性と力が歪みに関してほぼ同じように変化することに注意されたい。第1回目の引っ張りと第2回目の引っ張りで大きな差が出ることを避けるため、これらの測定は、予備引っ張りサイクルを1回だけ行なった後に行なった（図2を参照のこと）。“能動”曲線と“受動”曲線が組織モデルの主として細胞部分とマトリックス部分に依存していることが明らかになった。
【００７９】
細胞とマトリックスの寄与を別々に（かつ十分に）調べる。細胞の寄与は、有効量のアクチン・フィラメント破壊剤を添加することによって細胞の弾性を低下させ、細胞をマトリックスから効果的に分離することによって除かれる。これは、（例えば）破壊剤としてCDを添加することによって実現される。CDは細胞内のアクチン・フィラメント構造を破壊する。これについては後で詳しく説明する。したがって、特に細胞またはマトリックスに対するアクティベータと阻害剤の効果を明らかにすることができる。これら2つの機械的システムを別々に調べられることが、この方法の別の特徴になっている。
【００８０】
CDとラトルンクリンB（LA-B）はアクチン・フィラメント細胞骨格を破壊する2つの薬剤であるため、両方とも収縮力の増大を阻止し、細胞の機械的特性を弱める。CDとLA-Bに対する組織モデルの応答（例えば投与量に依存した機械的特性）を明らかにした。
【００８１】
この明細書では、“等尺力”という用語に、組織の長さまたは組織の物理的サイズが実質的に変化しない力の変化が含まれる。
【００８２】
製造後2日間経った（実験を行なう前の16時間にわたって血清を欠乏させた）組織モデルの等尺力と動的弾性を、ある範囲の濃度のCDについて測定した。測定は、それぞれの組織モデルについて、最低濃度のCDから順番に行なった。それぞれの組織モデルに関し、CDを添加し、力と弾性を測定し、次いでCDの濃度を大きくして次の測定を行なった（図4A、図4B）。CDはDMSOに溶かした。組織モデルを含む有機浴に添加したDMSOの合計量は、DMEMの合計体積の0.1％未満であった。この量のDMSOだと、FPMの力と弾性に有意な効果をもたらすことはなかった。図示したデータは、4つのサンプルについての平均であり、同じ実験を少なくとも2回繰り返した。力と動的弾性は、CDの濃度が2nMと低いときに有意に低下した。共焦点顕微鏡を用いて観察したところ、この濃度では、単層細胞培養物中のローダミン・ファロイジンで染色したアクチン細胞骨格にいかなる効果も観察されなかった。力と動的弾性の両方とも、CDの濃度が2μMになるまで低下を続けた。この濃度で力はほぼゼロになり、弾性はほぼ最小値に達した。CDの濃度が2μMを超えると、弾性がそれ以上大きく低下することはなかった（データは示さず）。力と動的弾性を50％低下させるのに必要なCDの濃度は、ほぼ0.25μMであった。
【００８３】
組織モデルの力学にLA-Bが及ぼす効果を測定することにより、アクチン細胞骨格に対するLA-Bの作用メカニズムとCDの作用モードの違いが明らかになった。LA-Bを増加させつつ添加し、CDの場合のようにして組織モデルに関する物理的測定を順番に行なった。データは少なくとも3つのサンプルについて平均し、同じテストを少なくとも2回繰り返した。FPMの張力と弾性に対して有意な効果をもたらすのに必要なLA-Bの濃度は、必要なCDの濃度よりもはるかに大きかった（図4C、図4D）。
【００８４】
力と弾性は、LA-Bの濃度に対してS字形の依存を示した。力と弾性の値を半分に低下させるための推定濃度は、それぞれ53nMと68nMであった。張力と弾性のLA-Bに依存した低下がLA-Bの濃度の1桁の範囲に限られていたのに対し、CDに対する応答はほぼ3桁にわたっていた。これは、CDとLA-Bが異なるメカニズムで作用してアクチン細胞骨格を破壊することを強く示唆している。CDとLA-Bの上限濃度において、力の値に小さな違いが観察された（図4）。
【００８５】
粘弾性系の場合には、動的弾性は引っ張りに対する弾性抵抗と粘性抵抗の両方に依存する。粘性の寄与は、力と歪みの間の位相角δを測定することによって明らかにできる。
【００８６】
これらのテストでは、アクチン細胞骨格が破壊されるため、位相角δの変化は小さかった（データは示さず）。したがってこの系では、CDとLA-Bは組織の粘性に比較的小さな効果しか及ぼしていなかった。それゆえ組織モデルの力と弾性に対する細胞の粘性の寄与も小さいと仮定することが合理的である。これらの測定からは、力と弾性の測定結果が、アクチン・フィラメント系に対する効果を通じてこれら“阻害剤”の効果をいかに迅速かつ感度よく示しているかがわかる。
【００８７】
マルチウエル・プレート系における押し込み法を利用した本発明の一実施態様では、機械的応答パラメータを、少なくとも100,000個の細胞に関して平均して決定した。再構成した組織モデルに関してこの系を用いて得られた測定結果を、個々の細胞の押し込みによって得られた結果（Petersen他、1982年；Zahalak他、1990年）と比較した。例えば再構成した組織の弾性は、リング系を用いると、個々の細胞に細胞に対して押し込み測定を行なう場合に必要な測定点の10分の1で統計的に有意な測定ができた（図10）。
【００８８】
多くのシグナル伝達経路が、収縮力、細胞骨格の組織化、細胞外マトリックスの完全性を調節することにより、再構成した組織の機械的特性に寄与している。したがって、再構成した組織の機械的特性に対するシグナル伝達経路の効果を本発明を利用して明らかにすることにより、細胞内および細胞外の広範な標的分子を調べることができる。
【００８９】
本発明により再構成した組織モデル中の細胞は、天然の組織および器官の中にあるときの条件と似た環境にある。したがってこの方法を用いたアッセイの結果は、動物モデルを用いた場合に得られるのと似た結果になる。動物でのテストの一部は、組織モデルで代替することができる。例えば皮膚に作用する薬剤のテストの一部は、生きた人工組織を用いて行なうことができる。
【００９０】
一実施態様では、上記の方法を利用して、再構成した組織の機械的特性に毒性物質が及ぼす効果を検出することもできる。例えば本発明の発明者は、10％エタノール溶液が組織モデルの力と弾性を有意に低下させることを見いだした。発明者は、組織モデル中の細胞がウイルスに感染すると、力と弾性が低下する可能性のあることを観察した。したがって上記の方法を利用し、物質と生物材料の毒性効果を明らかにすることができる。
【００９１】
心臓組織モデル
【００９２】
ニワトリ胚から単離した心臓ミオサイトを用いた組織モデルは、自発的に収縮する。自発的に収縮する人工心臓組織を形成するのにニワトリ胚抽出物（CEE、ライフ・テクノロジーズ社、ロックヴィル、メリーランド州）が必要であることが知られている（FASEB J.、1997年7月、第11巻（8）、683〜694ページ；FASEB J.、2000年4月、第14巻（5）、669〜679ページ）。CEEの代わりに心臓繊維芽細胞で条件付けた培地を用いることができる。このならし培地（CM）は、10％FBSを添加したDMEMとともに2日間にわたってあらかじめインキュベートした100mmの皿の中で集密的細胞単層の心臓繊維芽細胞をインキュベートすることによって得た。この培地を無血清DMEMに変更し、24〜48時間にわたってインキュベートすることによりCMにした。10％FBSを添加したCMとともに培養した心臓組織モデルは、CEEをまったく添加しなくても4〜5日後に自発的に収縮を始める。組織モデルの中で増殖した心臓ミオサイト（図5A）は、10％FBSだけを含むDMEMで培養したもの（図5B）よりはるかによく広がる。同様の違いが、組織培養皿で増殖する細胞でも観察される。CMの中で培養した心臓ミオサイト（図5C）は、10％FBSだけを添加したDMEMで培養したもの（図5D）よりも広がり、より広い面積をカバーする。これは、繊維芽細胞から分泌された因子が、心臓ミオサイトの広がりを促進することと、自発的な収縮を促進することを示唆している。心臓ミオサイトを広がらせて自発的に収縮させる培地の条件付けは、心臓組織モデルを培養する組織培養皿の底部で単層の心臓繊維芽細胞と共存培養することによっても実現できる。心臓組織モデルの自発的収縮を促進する培地の条件付けは、心臓繊維芽細胞を含む結合組織モデルと共存培養することによっても実現できる。繊維芽細胞をミオサイトと混合して心臓組織モデルを形成することもできる。すると4〜5日後に強い収縮が起こるが、培養後7〜8日という早い段階で自発的収縮が停止する。図5に付属する表に示したさまざまな条件に関する説明を参照のこと。
【００９３】
マウスの細胞を含む心臓組織
【００９４】
胚段階の心臓をE17-E19段階のマウス胚から取り出す。37℃にて15分間にわたってトリプシン（0.25％）で処理した後にコラゲナーゼ（167μg/ml）で何回か消化せさせることにより、心臓ミオサイトを単離する。心臓から単離した細胞を組織培養グレードのプラスチック製の皿で1時間にわたって培養し、その組織培養グレードの皿への接着速度を手がかりにして非筋細胞を取り除く（非筋細胞は筋細胞よりもはるかに早く接着する）。接着しない細胞を培地とともに取り除き、低速の遠心分離で15分間にわたって沈殿させる。人工組織1mlにつき100万個のミオサイトを、適切な量のNaOH（0.1N）を添加することによって中和した酢酸（0.02N）の中に入れたラットの尾のコラーゲン0.75mg、およびリン酸緩衝溶液に入れたフィブリノーゲン0.25mgと混合した。培地の最終濃度を通常の値に維持するため、より大きな濃度（1倍超）の組織培地（DMEM）をサンプル溶液に添加する。トロンビン1ml（1単位/ml）も溶液に添加し、フィブリンの形成を開始させる。フィブリノーゲンが変化したフィブリンがコラーゲンと重合し、より強いゲルを形成する。そのためサンプルの取り扱いが容易になる。サンプル溶液0.5mlを上記の鋳型に注ぎ、組織培養インキュベータ（5％CO2、37℃）の中で30分間にわたってインキュベートする。ゲルを鋳型から取り出し、スペーサとともに培養する。スペーサは、ステンレス鋼製のブロックによって隔てられたステンレス鋼製の2本の棒（直径約1mm）である（図6）。5〜7日間にわたってインキュベートした後、胚ミオサイトをコラーゲン／フィブリン・ゲルの中に広げ、自発的に収縮させる。細胞が互いに接触し、同期した収縮が始まる。
【００９５】
マウス胚の心臓組織を撮影した一連の画像を図7に示してある。画像内の特徴的な暗い部分を長方形の枠で囲んである。それぞれの画像の枠は固定されている。特徴的な部分が周期的に枠の外に移動することが画像10と28に白い矢印で示してあるが、これは、心臓ミオサイトによってサンプルが収縮することを意味している（図7）。
【００９６】
マウスの細胞を用いてマウスの心臓組織の機械的特性を真似るように作ったインビトロの組織モデルは、医薬候補の効果を評価するのに有効なテスト系である。マウスの特定の遺伝子をノックアウトするというよく確立された方法により、心臓のいろいろな機能を調節する特定の分子が欠けた変異マウスが大量に作り出されている。例えばタイプ1のNOシンターゼが欠けたマウスを用いた研究（Circulation、2002年6月25日、第105巻（25）、3011〜3016ページ）、コネキシン43が欠けたマウスを用いた研究（Development、2002年4月、第129巻（8）、2031〜2042ページ）、家族性肥大型心筋症と関係のあるミオシン結合タンパク質Cが欠けたマウスを用いた研究（Circ. Res.、2002年3月22日、第90巻（5）、594〜601ページ）は、2002年に発表されたほんのわずかな例である。ノックアウト・マウスからの細胞を用いて心臓組織モデルを作り、心臓の発達と機能に関する特定のタンパク質分子の役割を研究することができる。多くのノックアウト・マウスは、誕生後生き延びることがない。あるいは所定の胚段階を超えて生き延びることがない場合さえある。したがってこれらノックアウト・マウスの心臓機能の研究には限界がある。マウス胚または新生マウスから単離した細胞を用いて機能的組織を作ることができるため、完全な組織または一匹の動物全体を用いた場合には不可能な分子の機能をこの系を用いて研究することができる。ノックアウト・マウスの研究は、インビトロで遺伝子治療の効果を研究するのに役立つ。
【００９７】
組織モデルのミニチュア化
【００９８】
通常使用される鋳型（図8Aと図8Bの右側）の代わりにそれよりも小さな鋳型（図8Aと図8Bの左側）を用いてサンプルをミニチュア化する。サンプルのサイズは、心棒の直径とウエルの内径によって決まる。部品を組み立てる前の鋳型（A）と組み立てた後の鋳型（B）を図8に示してある。小さなサイズの鋳型とレギュラー・サイズの鋳型の心棒の直径は、それぞれ3/16インチと3/8インチである。小さなサイズのウエルとレギュラー・サイズのウエルの内径は、それぞれ9/32インチと17/32インチである。小さな鋳型を用いることにより、組織のサイズが体積にして5分の1になる（1mlが0.2mlになる）（図8Cと図8Dの*は、組織サンプルを示している）。組織モデルをミニチュア化することにより、レギュラー・サイズのサンプルを用いた図2、図3、図4、図15、図16、図17、図18、図19、図20、図21、図23に示したのと同様のテストをより少量の培地を用いたはるかに小さな有機浴の中で行なうことができるため、テストで使用する化合物はわずかしか消費されない。サンプルの体積を少なくとも5分の1にすることができる。
【００９９】
この考え方が正しいことを確かめるため、血清とY27632による処理に対する心臓組織モデルの機械的応答を観察した（図9）。レギュラー・サイズの鋳型を用いてニワトリの心臓細胞で組織モデルを作った（図9a）。この組織モデルは、全体として図8Dに示した組織モデル（*で示す）と似ている。図9bにも、図8Cにおけるのと似たミニチュア化した組織で得られた力についての似たような軌跡が示してある。両方のサイズの組織において、20％(v/v)コウシ血清に応答して力が増大し、Y27632で処理することによって力が低下する。組織のサイズが異なっていても、これら薬剤に応答した変化の大きさの違いは2倍を超えない。これは、ミニチュア化した系が、医薬候補によって誘導される変化を検出するのに十分な大きさのシグナルを有することを示している。ミニチュア化した系でも、機械的引っ張りに対する力応答曲線は、レギュラー・サイズの組織の力応答曲線と似たものになる。ニワトリの心臓細胞を用いたミニチュア化サンプルは収縮力を示す。したがってこのシステムを用い、心臓の機能不全を治療するための医薬候補の効果をテストすることができる（図9bの中の挿入図）。
【０１００】
複数細胞押し込みシステムにおける組織モデルの測定（マルチウエル・プレートを使用）
【０１０１】
再構成した組織サンプルのミニチュア版を製造して測定を行なった。そのとき、再構成した組織からなる膜とストリップを96ウエル・プレート・システムのウエルに入れたものを用いた。
【０１０２】
マルチウエル・プレート・システムの組み立て
【０１０３】
直径1mmのステンレス鋼製ワイヤーでできた三角形のフレームを足場として用い、その上に再構成した組織を形成した。ウエルを底部に向けてわずかに先細にし、フレームをウエルの底から1mm上方にしっかりと固定する（図11a）。細胞と上記の適切な細胞培地を含む重合していないコラーゲンの溶液をウエルに注ぎ、底から3mmのレベルまで満たした（図11b）。96ウエルのプレートを5％CO2のもとで37℃にてインキュベートした。培養中に細胞が多孔性コラーゲン・マトリックスから液体を押し出してそのコラーゲン・マトリックスを圧縮した。ワイヤー・フレームがないと、再構成した組織は収縮して小さな球になり、組織培地内を浮遊する。コラーゲン・マトリックスは、さまざまな形状のワイヤー・フレームを用いて圧縮することにより、フレームの形状に対応した形にできることがわかった。例えば三角形のワイヤー・フレームの三辺に膜がまたがっている様子が図11aに示してある。図11bに示したようにワイヤー・フレームが別の形だと、異なる幅の組織ストリップになった。非ステンレス鋼からなる多孔性でないワイヤーの表面に組織を付着させる場合でさえ、組織を容易に付着させるのに多孔性支持体材料（例えばベルクロ社のファスナー）は必要でなかった。コラーゲンは、膜またはストリップの外側部分でより多く圧縮された。したがって膜のこの外側部分は、細胞によって生じる応力に耐えることができ、ワイヤー・フレームから膜を引きちぎろうとする応力の発生を防止することができる。
【０１０４】
（ウエル・プレート・システムにおいて）押し込み法を利用した、膜またはストリップの力、弾性、ヒステリシスの測定
【０１０５】
テスト薬剤に対する組織モデル・サンプルの応答を調べるため、力変換器に接続されたプローブを用い、引っ張りに対する組織サンプルの抵抗力を測定する。組織の弾性は、プローブが組織と接触したときにそのプローブを所定の量だけ移動させるのに必要な力と関係している。先端部を火仕上げすることによって滑らかにした鉛直なガラス管からなるプローブは、等尺式力変換器に取り付ける（既述）。プローブの直径は約2〜3mmであり、その先端部の形状は平坦または半球形にすることができる。このプローブは、梁にしっかりと取り付け、梁は力変換器に接着剤またはワックスで付着させる（図11a）。力変換器は静止フレームに取り付ける。96ウエルのプレートを、鉛直方向に移動するステージの上に載せる。このステージは、本発明の方法の正しさを証明するためのものであり、マイクロメータを利用している。このマイクロメータは、コンピュータ制御されたステッピング・モータによって駆動されて、所定の増加率でステージを上下させる。この実施態様では、ステージの運動範囲は、500μm/秒の最大速度で0mm〜15mmである。組織の物理的測定を大規模に行なうのに同じ装置が利用されている。力の測定に関しては、次のセクションでさらに詳しく説明する。
【０１０６】
（ウエル・プレート・システムにおいて）押し込み法を利用するための組織系サンプルの調製
【０１０７】
組織形成中と組織モデルの培養を継続している間、サンプルを、10％FBSと、ペニシリンと、ストレプトマイシンを添加した炭酸水素塩緩衝DMEMとともに、5％CO2の状態になったインキュベータの中で37℃に維持した。力を測定するため、培地を変更して150μlの無血清ヘペス緩衝DMEMにした。温度制御された循環浴に接続された加熱プレートの上にウエルを置くことにより、培地の温度を37℃に維持した。
【０１０８】
（ウエル・プレート・システムにおいて）組織押し込み法を利用した測定
【０１０９】
プローブの先端が再構成した組織からなる膜またはストリップと接触するまでステージを上昇させる。先端がサンプルと接触したことは、等尺式力変換器に記録される力が突然大きくなることによってわかる。次にステージを5μm下げる。すなわち、先端をサンプルとの接触位置から引っ込める。次に、ステージを鋸歯波形に従って3.3μm/秒の速度で鉛直方向に100μmの振幅で移動させる。このような軌跡を描いている間に先端が組織サンプルと接触してサンプルを引っ張ると、力がデータ記録装置に連続的に記録される。速度は、測定の感度が最適な状態でサンプルの粘性が測定できるように変えることができる。
【０１１０】
最大応力が安定レベルに達した後、サンプルを20％ウシ胎仔血清（FBS）で刺激する（図12aの矢印）。この量のFBSによって繊維芽細胞の非筋肉ミオシンが活性化されて収縮力が生まれ、再構成した組織が硬化する。FBSを添加した約10分後、次の押し込みによる最大応力が約25％増加する（図12a）。培地に40nMのCDを添加（矢印b）した約15分後、次の押し込みによる最大応力が最初のレベルから約40％低下した（図12）。2μMのCDを添加した20分後に最大応力のさらなる低下が記録された。
【０１１１】
膜が引っ張られている間の押し込みの深さと力の関係をプロットした曲線は、プローブがサンプルから離れることによって応力が解放されるときに見られるのとは異なった軌跡を描く。そのため2本の曲線の間にヒステリシス領域ができる。図12bでは、FBSまたはCDを添加したときのヒステリシス領域の違いを比較してある。上記実験中の最大応力とヒステリシスの面積の違いを図13に比較して示してある。ヒステリシスの面積は、ミオシンの活性化とCDの添加によって硬化が起こったときに大きく変化する。したがってヒステリシスの面積は、サンプルの機械的特性の変化をモニターするためのパラメータとしては最大応力よりも感度がよい。
【０１１２】
引っ張りなしで力の応答を活性化させるための生理学的アクティベータを用いたテスト
【０１１３】
ラット胚の繊維芽細胞に由来する細胞系（REF52）を用いて作ったリング状サンプルを、すでに説明したようにして調製した。テスト中、組織の長さを一定に維持した。図15に示したそれぞれの薬剤を単一のリング状組織に添加した。トロンビン、バソプレッシン、リゾホスファチジン酸（LPA）、ブラジキニン、エンドセリンがリングと接触すると、異なる応答時間で異なる力が発生した（図15）。ノルエピネフリンとフェニルエフリンはリングの収縮を緩和させた。すなわちノルエピネフリンとフェニルエフリンは、それぞれのテストの開始時に現われる組織の力の初期ベースライン値を低下させた（図15）（使用した試薬はシグマ社、セントルイス、ミズーリ州から入手する）。
【０１１４】
ニワトリ胚の心臓繊維芽細胞（CECF）と成熟ラットの心臓繊維芽細胞（RACF）を用いて作ったリング状サンプルにさまざまなアゴニストを適用し、収縮力の応答プロファイルを得た。それを図16a〜図16dと、図16e〜図16hにそれぞれ示してある。
【０１１５】
RACFはバソプレッシン（図16f）とアンギオテンシンII（図16g）に反応したのに対し、CECFはバソプレッシン（図16a）とアンギオテンシンII（図16c）には反応しなかった。CECFは、投与量に関係なくEGFによる刺激に反応しなかった（図16d）。エンドセリンの刺激により、CECF（図16b）で作ったリングとRACF（図16h）で作ったリングの両方が収縮した。FBS（20％v/v）の添加後に時間変化する力のプロファイルは、どのようなアゴニストで予備処理するかによって異なっていた。
【０１１６】
例えばEGFで予備処理した後には、FBSを添加することにより力にピークが2つ現われた（図16d）。アンギオテンシンIIで予備処理したシステムにFBSを添加した後は力のレベルが維持される。しかしバソプレッシンとエンドセリンで処理した後には、力のレベルがFBSで刺激したときのピークのレベルから低下を始めた（図16a、図16b）。
【０１１７】
本発明は、単一の化合物のプロファイルだけでなく、同時または異なるときに適用された多数の化合物の組み合わせのプロファイルを管理するのに役立つ。多数の医薬品の組み合わせのプロファイルを管理しておくと、スクリーニングを行なう上でも、多数の医薬品の組み合わせによって起こる予想外の結果を明らかにする上でも役に立つ。
【０１１８】
ミオシンのATPアーゼ阻害剤であるBDMは、以前に添加した20％FBSによる十分に活性化された収縮力を投与量に依存した形で低下させる（図17）。
【０１１９】
マトリックスがリモデルし圧縮されている間にリング状サンプルから発生する収縮力は、すでに説明したように、コラーゲンがゲル化してから約1〜2時間以内にそのリングを力測定装置に接続することによって測定できる。細胞は、この時間が経過した後にマトリックスに力を及ぼし始める。次に、組織が増殖している間（リモデリングと圧縮の間）の力の増加を、時間を追って観察する。
【０１２０】
リング状組織が増殖している間に測定した力のプロファイルを図18aに示してある。一般に15〜20時間以内に力が最大値に達する。図18b、図18c、図18dに示したように、このプロセスはいくつかの阻害剤によって阻止された。tチロシンキナーゼ阻害剤であるハービマイシンA（図18b）は、微小管を破壊するノコダゾールという試薬（図18c）と同様、力の最大値を低下させる。サイトカラシンD（2μM）は、テストの最初から力の増加を完全に抑えた。
【０１２１】
本発明には広い用途がある。例えば本発明を利用した医薬品の高スループット・スクリーニングや治療法のテストがある。例えば再構成した組織を膜またはストリップの形状にしたものを大量生産して均一な96個のサンプルにし、そのそれぞれを96ウエルのプレートの各ウエルに供給することができよう。4台以上の力変換器を用いて力の測定を同時に行なうこともできよう（図11）。96ウエルのプレートを、押し込み測定のためにサンプルを正確な位置に配置するx-yステージに載せる。力変換器に接続したプローブは、サンプルを押すために鉛直方向に移動する（図11a）。x-yステージを用いて96ウエルのプレートを再配置することにより、単一の力変換器を用いて短時間のうちにいくつかのサンプルを押すことができる。サンプルに対する化合物と小さなペプチドの添加、ステージの移動、力変換器はすべて、パーソナル・コンピュータで自動化して制御することができる。コンピュータは、データベースへのデータの記憶と、そのデータの解析にも使われる。
【０１２２】
この明細書で利用可能なさまざまな方法を利用し、薬剤としての遺伝子とタンパク質を、再構成した組織の細胞に届けることができる。
【０１２３】
プレート1つ当たりのウエルの数は、押し込み装置で使用する系のサイズに応じて異なっていてもよい。一般に、プレート1つ当たりのウエルの数は約2〜約1000であるが、約50〜約500であることが好ましい。
【０１２４】
この方法の応用としては、薬剤のスクリーニングに加え、遺伝子を薬剤として細胞に届けるための方法のテストがある。細胞および組織の機械的特性に寄与する遺伝子が欠けた細胞を用いて再構成した組織サンプルを作ることができる。したがって正常な組織の機械的特性が回復することで、遺伝子が効果的に届いたことがわかる。
【０１２５】
リング状組織モデル系は、コラーゲン・マトリックスの圧縮およびリモデリングの間と、コウシ血清に応答している間の両方で、細胞が力を発生させる能力に遺伝子の欠失が及ぼす効果を検出することができる。細胞は、その表面の膜に存在する特定のヘテロ二量体受容体（インテグリンと呼ばれる）を通じてさまざまなECMの構成要素と相互作用してその構成要素に接着する。それぞれのインテグリンは、1つのαサブユニットと1つのβサブユニットで構成されている。コラーゲンへの結合に関与するインテグリンは、α1β1とα1β2である。NMuMGは、不死化されているが悪性ではないマウス乳腺上皮細胞系であり、α1インテグリンとα2インテグリンを発現しない。したがってこの細胞はコラーゲン・マトリックスと相互作用するとしても弱く相互作用するため、力をECMに伝達して組織の弾性を生じさせてその弾性を維持することはできない。図20から、α1インテグリンとα2インテグリンがない細胞は、組織の増殖中にベースライン以上の力を出すことがなく、コウシ血清（CS）に反応して力を増大させることもないことがわかる（図20a、図20b）。また、正常なα2インテグリンを再び発現させることにより、これら2つの機能が回復することも示されている。α2遺伝子を含む細胞はマトリックスに正常に接着してマトリックスを圧縮し、CSに反応する（図20a、図20b）。この例は、遺伝子の発現を示す機械的応答のプロファイルを発生させて管理するのに本発明を有効に利用できることを示している。したがって本発明は、遺伝子型の指標および遺伝子治療の結果（例えば遺伝子を到達させるさまざまな方法の効率）の指標として機械的応答のプロファイルを管理するのに役立つ。
【０１２６】
再構成した組織モデルは、異なった多数のクラスの潜在的医薬品、毒物、病原体が薬剤として細胞やマトリックスの機械的特性に及ぼす効果を定量的かつ迅速に評価するのに用いることができる。機械的特性は、機械的システムとしての細胞の全体構造（特に細胞骨格）の一般的な指標、シグナル伝達経路の動作の一般的な指標、組織が増殖しているときに細胞がマトリックスに取らせる構造の一般的な指標となる。したがって機械的特性を広範な疾患で利用できる可能性がある。
【０１２７】
潜在的医薬候補をテストした実施例
【０１２８】
高血圧の治療において有望なY27632を用い、再構成した組織において応力が投与量に依存して緩和されることを確かめた。
【０１２９】
NIH 3T3細胞を用いて作った結合組織モデルをさまざまな量の薬剤候補Y27632で処理した。ρキナーゼ特異的阻害剤Y27632はこれまでにテストされており、平滑筋ストリップ（例えばウサギの大動脈輪）の張力を低下させることがわかっている（Nature、第239巻、1997年、990〜993ページ）。Y27632は、高血圧を治療するための将来的に有望な薬剤候補の1つである。組織の収縮を刺激するのにどのアゴニストを用いるかに応じ、歪低下の程度が異なる（図21）。Y27632は、投与量に依存した形で結合組織モデルの張力を低下させる（図21）。これは、この方法が医薬候補をスクリーニングするのに有効であることを示している。
【０１３０】
組織内のコラーゲンは、マトリックス・メタロプロテアーゼ（MMP）と呼ばれる酵素ファミリーによって分解されてリサイクルされる。この酵素は、潜在的なプロ酵素として分泌されるが、アミノ末端領域がタンパク質分解によって開裂することにより活性化する。その活性は、Zn2+とCa2+が存在しているかどうかに依存する。MMP-2の活性は、腫瘍細胞の浸潤においてある役割を果たしていることが知られている。プロ形態であれ活性化形態であれ、MMPが存在していることは、一般にザイモグラフィとして知られる方法で検出される。ニワトリの心臓繊維芽細胞を、コウシ胎仔血清なしのDMEM、または0.5％コウシ胎仔血清を添加したDMEMとともに2日間にわたって培養する。MMP-2とMMP-9が細胞から分泌されて培地に入るため、その存在がザイモグラフィによって検出される。図22では、対照レーン11〜15にMMP-2とMMP-9のプロ酵素を精製したものを充填してある。この図は、少なくとも0.5ngの酵素（レーン11）があればアッセイによって検出可能であることを示している（図22）。より少量の活性な酵素がプロ酵素よりも前の位置に存在し、活性な酵素のバンドが、不活性なMMP-2のバンドよりも下の位置に出現している。コーティングなしの組織培養皿、あるいはフィブロネクチンまたはコラーゲンによるコーティングのある組織培養皿の上で増殖している細胞によって条件付けられた培地では、活性な酵素のバンドがまったく現われない。3Dコラーゲン・マトリックス（すなわち組織モデル）中で増殖する細胞で条件付けられた培地では、活性なMMP-2のバンドが見られる（レーン9と10）。これは、2D基板上の細胞は不活性な酵素を培地の中に分泌するが、その酵素の活性化は起こらないことを示している。酵素は、細胞が3次元マトリックスの中で増殖するのでなければ決して活性化されることがない。したがって、腫瘍が浸潤している間などに細胞外マトリックスの分解に影響を与えるMMPの活性を調べるには、モデル系として、例えば細胞が3次元マトリックスの中で増殖する組織モデルが必要である。これは、MMPの阻害剤を発見する上で特に重要である。
【０１３１】
MMPの一般的な阻害剤であるGM6001（バイオモル・リサーチ・ラボラトリーズ社、プリマス・ミーティング、ペンシルヴェニア州）（N-[(2R)-2-(ヒドロキサミドカルボニルメチル)-4-メチルペンタノイル]-L-トリプトファンメチルアミド）が人工組織の機械的特性に及ぼす効果がこれまでに調べられている。心臓繊維芽細胞を用いて作った組織モデルを50μMのGM6001とともに6日間にわたってインキュベートする。組織培養培地に対し、GM6001を含む新鮮な培地を2日ごとに補充する。リング状組織モデルに対して上記のような機械的テストを行なう。GM6001で処理したサンプル（図23の破線）では、対照（実線）と比べて機械的特性が有意に低下する。さまざまなMMPに関するGM6001のKi値はほぼナノモル/lであるが、動物におけるGM6001の効果は、この阻害剤が高濃度（0.1ミリモル/lのオーダー）のときにだけ観察することができる（Circ. Res.、1996年1月、第78巻（1）、38〜43ページ）。これは、精製した系で測定したKi値が、生きた被験対象（例えば動物や組織モデル）における薬剤の抑制効果とは直接関係していないことを示唆する。さまざまな組織モデルの機械的特性に影響を与えるMMP阻害剤は、高スループットの系を用いると効率的に発見することができる。
【０１３２】
本発明には他の多くの用途がある。心臓疾患を治療するためのガイドにするため、心臓ミオサイトおよび／または心臓繊維芽細胞から再構成した組織モデルを利用し、過大な圧力によって発生する細胞やマトリックスのリモデリング・プロセスに対して医薬候補が及ぼす効果や、外傷や梗塞に応答して起こる組織の再構成に対して医薬候補が及ぼす効果をテストすることができる。本発明は、歯の結合組織の疾患、がんの転移（収縮、細胞の運動性における牽引力）、糖尿病（コラーゲンの架橋による結合組織や皮膚の硬化）、肺疾患（例えば気腫）、慢性の炎症（好中球から分泌されるエラスターゼ）、筋ジストロフィー、皮膚の老化を治療するためのガイドとして利用することができる。
【０１３３】
本発明には、医薬品のライブラリを管理する方法も含まれる。この方法は、医薬品を組織モデルと接触させることによりその医薬品を組織モデル系と接触させたときの機械的応答のプロファイルを取得し、そのプロファイルをデータベースに記憶させ、組織モデル系における別の医薬品の少なくとも1つの追加プロファイルをそのデータベースに記憶させ、1つのプロファイルを別のプロファイルと比較するための手段を設定し、あらかじめ確立した比較法または手順が整った標準的な比較法に基づき、第1の薬剤のプロファイルを第2の薬剤のプロファイルと比較する操作を含んでいる。医薬品は、それぞれのプロファイルに基づき、組織モデル系に対する機械的効果に関する活性の順序に従ってランク付けする。
【０１３４】
曲線を分析するための可能なパラメータ
【０１３５】
アゴニストの添加によって始まる力の応答を時間軸に従ってプロットしたグラフは、曲線の形を記述するいくつかのパラメータを用いて表わすことができる。F0とΔFmaxは、それぞれ、アゴニストを添加する前の最初の力のレベルと力の変化の最大値を表わしている。ΔTmaxは、力のレベルが変化し終わるまでに要する時間を表わす。力曲線の時間微分は、力の時間変化率を表わす。dF/dtの最大値Vmaxは、力曲線の最大勾配を表わす。これらのパラメータは、医薬候補について、人工組織の張力レベルの変化に関するプロファイルを作るのに役立つ（図24）。
【０１３６】
一実施態様では、医薬候補のプロファイルを既知の医薬品のプロファイルと比較し、その比較結果に基づいてランキングの作成または評価を行ない、医薬候補が効果的な医薬品になりそうかどうかの情報およびガイダンスを提供する。
【０１３７】
さらに、望むのであれば、本発明に従ってテストを行ない、特定の疾患に関与することが知られている特定の細胞系に関して医薬候補を評価する。この実施態様では、本発明のシステムを用いた細胞応答を利用し、医薬候補が特定のタイプの細胞に対して示すはずの活性の指標を提供する。さらに別の実施態様では、医薬品を組織モデル系において評価し、特定の疾患を治療するのに有効であることが知られている医薬品の評価と比較する。
【０１３８】
さらに別の実施態様では、既知の医薬品のプロファイルは、既知の疾患に対して有効な治療法となることがわかっているプロファイルである。この実施態様では、特定の疾患に関係することが知られている細胞でその医薬品を評価して比較を行なう。この実施態様は、ある医薬品が、例えば心臓疾患、高血圧、老化を治療する上で潜在的に有効であるかどうかを明らかにするのに役立つ。
【０１３９】
高血圧は、血管の収縮性と弾性が大きくなることによって発生する。高血圧のための薬剤は、本発明を利用して同定することができる。そのような薬剤を用いると、動物の血圧を低下させたり、動物から取り出した血管の張力や弾性を低下させたりすることができる。本発明では、培養した細胞や細胞外マトリックスからなる組織を用いて血管を模倣した人工組織を利用する。そのため本発明の方法をモデル動物または移植された組織の代わりに用いることができる。
【０１４０】
特定の生物機能またはさまざまなタイプの器官や組織（例えば皮膚、筋肉、心臓、血管）を模倣した人工組織を作ったり、単一の人工組織の中で異なったタイプの細胞を共存培養することでより複雑な組織を模倣した人工組織を作ったりする。組織の機械的特性は、本発明を利用して構造の完全性と関係付けることができるため、組織または器官の生物機能を示す重要なパラメータである。
【０１４１】
さらに、本発明を利用すると、人工組織の機械的特性に影響を与える生物活性に基づいて化合物を素早くスクリーニングすることができる。例えば96ウエルのプレートのウエル（直径4mm、高さ6mm）の1つにフィットするような小さなサイズの人工組織を作る。非常にミニチュア化したサンプルを調製すると、それぞれのテストで使用する化合物の量が、既知の方法（例えば大動脈輪を用いた方法）と比べて少なくとも90％少なくなる。動物の組織は動物から外科的に取り出すため、サイズにしても薬剤に対する応答にしても、必ずしも再現性のあるものにならない。
【０１４２】
本発明の方法を利用すると、医薬化合物の毒性を明らかにすることができる。例えばさまざまな量のエタノールは、生細胞によって維持されている力のベースラインを低下させる。
【０１４３】
別の実施態様では、組織モデルを含む細胞やマトリックスの生物学的特性を例えば蛍光マーカーを用いて光学的に測定する。
【０１４４】
本発明を利用すると、生きた人工組織の機械的特性に及ぼす効果に基づいて医薬品のプロファイルの新しいライブラリを作ることができる。押し込みシステムを用いた本発明によって作られるライブラリに含まれる活性化合物の数は、試験管に基づく従来のスクリーニング・システムで作られたライブラリに含まれる活性化合物の数よりも少なくなる可能性が大きい。化合物のスクリーニングによって選択される化合物の中には、生理学的応答を誘導する多数の化合物が含まれている可能性がある。
【０１４５】
人工組織をベースとした系によってスクリーニングした化合物は、動物やヒトの本物の組織や器官の機械的特性に対して同様の効果をもたらす可能性がより高くなろう。したがって、高スループット・スクリーニングに基づいた人工組織を用いると、薬剤をスクリーニングして最適なものを見つける段階でモデル動物を利用することが顕著に少なくなる可能性がある。培養細胞から構成した生理学的応答システムを本発明で提供することにより、動物でのテストに代えることができる。
【０１４６】
別の実施態様では、スクリーニングの結果を利用して1つ以上の医薬候補または薬剤を同定し、その医薬候補または薬剤に対してさらにテストまたは評価を行なう段階へと進む。その結果、その医薬候補または薬剤を市販できるようになる可能性もある。別の実施態様では、医薬品または医薬候補に関するテストまたはスクリーニングを終了させるために、あるいはテストまたはスクリーニングの方法を変更するために、スクリーニングの結果を利用する。別の実施態様では、この明細書に記載した方法と装置を利用し、薬剤または医薬候補の標的または到達位置を評価し確認する。
【０１４７】
本発明を具体的なさまざまな実施態様に関して説明してきたが、当業者であれば、請求項の精神ならびに範囲を逸脱することなく、本発明に対して変更をなしうることが理解できよう。
【０１４８】
参考文献：
1．Petersen, N.O.、W.B. McConnaughey、E.L. Elson、1982年、「局所的に測定した細胞変形性が、細胞上の位置、温度、サイトカラシンBにどのように依存するか」、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、第79巻、5327〜5331ページ。
2．Sundberg, S.A.、2000年、「高スループット・スクリーニングと超高スループット・スクリーニング：溶液をベースとした方法と細胞をベースとした方法」、Curr. Opin. Biotechnol.、第11巻、47〜53ページ。
3．Zahalak, G.I.、W.B. McConnaughey、E.L. Elson、1990年、「細胞を押すことによる細胞の機械的特性の測定と、白血球への応用」、Journal of Biomechanical Engineering、第112巻、283〜294ページ。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】繊維芽細胞マトリックス（FPM）（生組織モデルを含む）を調製して測定する方法の概略図である。この図には、調製して測定する方法全体の一例が示してある。
【図２】引っ張りに対する組織モデルの応答と、1つのFPMに対して4回の引っ張りサイクルを適用して得られたプロファイルの時間変化が示してある。この図のプロファイルでは、1回目の引っ張りサイクルにおいて、その後のサイクルよりもピークが実質的に大きくなっていることがわかる。この図のプロファイルbは、2つのFPMについて力の応答を測定した結果であり、測定結果の再現性がよいことがわかる。
【図３】組織弾性を細胞が発生する力の関数として示したグラフである。図3aは、ウシ胎仔血清による活性化に応答して力と動的弾性がどのように変化するかを示している。図3bは、2μMのサイトカラシンD（CD）によってアクチン細胞骨格が破壊されるときに力と動的弾性がどのように変化するかを示している。図3cは、図3aと図3bの両方からのデータをまとめた図であり、全体として動的弾性が力にどのように依存しているか（比例していること）を示している。
【図４】収縮力と動的弾性がCDとラトルンクリンB（LA-B、カルバイオケム-ノヴァバイオケム社、サンディエゴ、カリフォルニア州）の濃度にどのように依存するかを示している。図4Aと図4Bは、さまざまな濃度のCDで処理した後に組織モデルが発生する収縮力と弾性をそれぞれ示している。図4Cと図4Dは、さまざまな濃度のLA-Bで処理した後に組織モデルが発生する収縮力と弾性をそれぞれ示している。
【図５】さまざまな組織培養条件のときに心臓ミオサイトがどの程度広がるかを示している。図5Aは、心臓繊維芽細胞を用いて調製したならし培地の中に作った心臓組織モデルの中に心臓ミオサイトがよく広がっている様子を示している。10％ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養した心臓ミオサイトは、図5Bに示したようによく広がらない。ならし培地ありの場合となしの場合に組織培養皿の上で培養した心臓ミオサイトをそれぞれ図5Cと図5Dに示してある。図5に示した付属の表には、さまざまな培養条件で作った心臓組織モデルの自発的収縮能力が示してある。
【図６】図1cと図1eに示した鋳型から組織モデルを外した後にその組織モデルを培養するのに用いるステンレス鋼製スペーサである。
【図７】マウス胚の心臓に由来する細胞を用いた心臓組織モデルの自発的収縮を撮影し、得られた画像を時間軸に沿って並べた図である（1〜32の間隔はそれぞれ200ミリ秒）。
【図８】レギュラー・サイズと小サイズの組織用鋳型と組織モデルの写真である。図8Aは、小サイズとレギュラー・サイズの鋳型を分解した状態であり、図1eにその概略が示してある。図8Bは、小サイズとレギュラー・サイズの鋳型を組み立てた状態であり、図1cにその概略が示してある。図8Cは、小サイズの鋳型を用いて作った小サイズの組織モデルがスペーサによって保持されている状態の写真である。図8Dは、図6に概略を示したスペーサによって保持されているレギュラー・サイズの組織モデルについての写真である。
【図９】上記の鋳型を用いて作った小サイズとレギュラー・サイズの心臓組織モデルで観察された力の変化を比較した結果である。図9aに示した力の時間変化は、レギュラー・サイズの型を用いて作った心臓組織モデルで観察される。引っ張りとY27632（ρキナーゼによるミオシン活性化の阻害剤）を用いた処理に応答した力の時間変化を図9bに示してある。図9bに挿入されている図は、サンプルを引っ張ることによってサンプルが自発的に収縮しているときの力の時間変化をプロットした拡大図である。
【図１０】再構成した組織をリングにする方法（左側）と単一の細胞を押す方法（右側）を用いて組織の弾性を測定した結果の違いを比較した図である。
【図１１】図11aは、直径約1mmのステンレス鋼製ワイヤーからなる三角形のフレームと図11bに示した長方形（代わりの形）のフレームを用いた高スループットのシステムを示している。これらのフレームが足場用支持体となってその表面に再構成した組織が形成され、押し込み法で組織の収縮力と弾性を測定する際のサンプルとなる。
【図１２】収縮力のピークが安定レベルに達した後に組織モデルを20％ウシ胎仔血清（FBS）で活性化する（図12aの矢印）と力が増大することを示している。この量のFBSで繊維芽細胞の非筋ミオシンが活性化する。図12bは、図12aと同様のデータであり、力と押し込みの深さの関係をプロットしたグラフである。40nMのCDと2μMのCDを添加した効果も示してある。
【図１３】図13（a）、図13（b）、図13（c）は、図12と関係しており、組織の最大応力とヒステリシスの面積（単位は任意）の変化を示している。
【図１４】再構成した組織からなる膜を押したときの力の応答を示している。96ウエルのプレートのウエル内の小さな膜を繰り返して押した（それぞれのピークは1回の押しを表わす）。押したときの力の応答を70分間にわたって記録した。10％FBSを添加してミオシンを活性化させると押したときのピークが上昇した。それに対してサイトカラシンD（CD）は、アクチンの細胞骨格を破壊することにより、投与量に依存した形でピークを低下させた。（力のスケールはゼロから始めなかった。）
【図１５】平滑筋を用いたリング系の組織モデルにアゴニストを何種類か添加した一連のテストで得られた力（ダイン）を示している。パネルa、b、c、d、e、f、gは、それぞれトロンビン、バソプレッシン、LPA、ブラジキニン、エンドセリン、ノルエピネフリン、フェニルエフリンで処理した場合の力の応答のプロファイルを示している。
【図１６】ニワトリの心臓繊維芽細胞（パネルa〜d）とラットの心臓繊維芽細胞（パネルe〜h）で作ったリング系の組織モデルに対して一連のアゴニストを添加した場合の収縮力の応答プロファイルを示している。
【図１７】最初に20％FBSで刺激したミオシンの収縮を抑制することにより、収縮力が低下することを示している。この図は、すでに20％FBSで刺激した収縮応答が、さまざまな濃度のブタン-ジオン-モノオキシム（“BDM”）によって抑制されることを示している。パネルa、b、c、dは、それぞれ2、4、20、40mMのBDMで処理した場合を示す。
【図１８】化学薬品による処理なし（a）、ハービマイシンAで処理（b）、ナコダゾールで処理（c）、サイトカラシンで処理（d）の場合にリング系で組織が増殖している間に収縮力のプロファイルを示している。リングは、コラーゲンがゲル化した約1時間後、かつ細胞によるマトリックスのリモデリングと圧縮が顕著に起こる前に力測定システムに取り付けた。
【図１９】図19aは、FBSで刺激した後にリング系の組織モデルで測定した力が歪みにどのように依存するかを示している（“合計”と表記）。次にこのリング系を2μMのCDで処理してから測定を行なうと、“受動”と表記した曲線が得られる。合計と受動の差を“能動”と表記する。図19bは、同じ測定から得られた動的弾性を示している。
【図２０】適切なコラーゲン結合インテグリンが欠けている細胞は、組織のリモデリング期間中（図20a）に力を発生することがなく、コウシ血清に応答（図20b）して力を発生することもないことを示している。このような欠陥は、コラーゲン結合インテグリンの失われたサブユニット（α2）を回復させることによって正常になる。
【図２１】さまざまな濃度のY27632で処理した後に組織モデルと大動脈ストリップを用いて観察した収縮力の変化を比較した図である。
【図２２】さまざまな条件で培養した細胞が組織培地に分泌するMMPのザイモグラムである。
【図２３】MMP阻害剤であるGM6001とともに、あるいはGM6001なしで培養した組織モデルを引っ張ったときの力の応答を比較した図である。
【図２４】さまざまな処理を行なったときに記録された力の時間変化を表現できるパラメータである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2005523417.tif 000030
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2005523417.tif 000031
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2005523417.tif 000032
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
2005523417.tif 000033
【国際調査報告】
2005523417.tif 000034
2005523417.tif 000035
2005523417.tif 000036
2005523417.tif 000037