(57)【要約】  標的核酸及びゲノム核酸を含む細胞から標的核酸のサンプルを取得する方法であって、培養ブロスから細胞を分離する工程;水性媒体中に細胞を懸濁し、標的核酸を水性媒体中に細胞からリークさせる工程;及び水性媒体から核酸のサンプルを取得する工程;を含み、細胞が前記工程の間で実質的に溶解されず、細胞内にゲノム核酸を実質的に維持する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸及びゲノム核酸を含む細胞から標的核酸のサンプルを取得する方法であって、
培養ブロスから細胞を分離する工程;
水性媒体中に細胞を懸濁し、標的核酸を水性媒体中に細胞からリークさせる工程;及び
水性媒体から核酸のサンプルを取得する工程;
を含み、細胞が前記工程の間で実質的に溶解されず、細胞内にゲノム核酸を実質的に維持する方法。
【請求項２】
60℃未満の温度で、且つ細胞のポレーションを引き起こすことが可能な電場の不存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
40℃未満の温度で実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞タンパク質が細胞内で実質的に維持される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
標的核酸が非ゲノム核酸である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ゲノム核酸が宿主細胞染色体DNAまたはリボソームRNAである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
標的核酸サンプルがベクター、プラスミド、サテライト若しくはコスミドDNA、またはベクターRNAである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
標的核酸サンプルがプラスミドDNAである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞がグラム陰性微生物である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が大腸菌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
水溶性媒体が水、低塩バッファー、塩溶液、二価若しくは三価金属塩溶液、または糖溶液である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
水性媒体がpH6から9の間のpHを有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
低塩バッファーがTris. HClを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
Tris. HClバッファーが5mMから50mMの間の濃度を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Tris. HClバッファーが更にEDTAを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
Tris. HClバッファーが約8.5のpHを有する、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
低塩バッファーが酢酸カリウム/KClを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１８】
酢酸カリウム/KClが10mMから30mMの間の濃度を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
酢酸カリウム/KClが約4のpHを有する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
塩溶液が塩化ナトリウム溶液である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項２１】
塩化ナトリウム溶液が約50mMから250mMの間の濃度、及び/または約pH7のpHを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
二価金属イオン溶液がCaCl2溶液である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項２３】
CaCl2溶液が10から250mMの間の濃度である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
糖溶液が0.05から1.0Mの間の濃度のスクロース溶液である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項２５】
水性媒体が更にプロテイナーゼを含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
プロテイナーゼがプロテイナーゼKである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
水性媒体が更に界面活性剤を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
水性媒体が更にRNAヌクレアーゼ、及び/またはDNAヌクレアーゼ、及び/またはプロテアーゼを含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
標的核酸のサンプル中に存在する標的核酸を精製する工程を更に含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
標的核酸のサンプルを単離する工程を更に含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
標的核酸のサンプルを分析する工程を更に含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
標的核酸のサンプルを増幅する工程を更に含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
標的核酸のサンプルを配列決定する工程を更に含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
標的核酸の単離がイオン交換、電気泳動、シリカ固相抽出、沈降、凝集、濾過、ゲル濾過、遠心分離、アルコール沈降、及び/または荷電スイッチ物質の使用による、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の精製に関し、特に標的核酸及びゲノムDNAまたはRNAを含む細胞から、標的核酸のサンプルを取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベクターDNAまたはRNAのような非ゲノム核酸を精製する現在の方法は、リゾチームのような細胞溶解酵素、カオトロピズム剤、または極端なpH及び熱を使用して、細胞内に存在する核酸を放出するために、過度の細胞溶解または細胞壁の分解に依存している(例えば、Maniatis, 'Molecular Cloning, A Laboratory Manual', Book 1, Sections 1.21-1.23, Cold Spring Harbor Press, 1989に記載の方法を参照)。しかしながら、このアプローチが細胞から非ゲノム核酸を放出する一方、細胞内に含まれる大多数の他の宿主ゲノム核酸、及び細胞エンドトキシンのような不純物を伴う。これは、これらの不純物から標的核酸分子を精製するために、困難で時間を消費する一連の精製工程を必要とする。RNAまたは宿主染色体DNAは、標的核酸のサンプル中に存在すると、標的核酸の下流の分析または官能性を妨げ得るため、これらの工程が必要である。更に、過度の細胞溶解はしばしば、更なる精製を困難とする細胞物質の粘性の塊の生成を生ずる。
【０００３】
Calvin及びHanawalt(J.Bacteriol, 170(6):2796-2801, 1988)は、大腸菌からのプラスミドDNAの回収のための逆エレクトロポレーションの使用を開示している。この方法ではプラスミドを回収された一方で、試験された条件のほとんどが、細胞DNA及びRNAの抽出をも導いた。プラスミド得るために、13,000-15,000V/cmの強さを電場が必要とされた。
【０００４】
WO 00/29563 (Cambridge Molecular Technologies Limited)は、水非混和性有機溶媒、カオトロープ、及び少なくとも65℃への加熱を使用する、ゲノムDNAからのプラスミドの分離方法を開示している。これは、有機相へのプラスミドDNAの抽出を導く。
【０００５】
EP 0 657 530 A (Gen-Probe Inc)は、80-100℃への加熱と組み合わせた、非イオン性界面活性剤とEDTAのような金属キレート化剤とを含む浸透化剤を使用する、細菌細胞からの核酸の抽出方法を開示している。
【非特許文献１】Calvin及びHanawalt, J.Bacteriol, 170(6):2796-2801, 1988
【特許文献１】WO 00/26563
【特許文献２】EP 0 657 530 A
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
更なる問題点は、不純物からの標的核酸のサンプルの精製方法が、典型的にいくつかの遠心分離工程を必要とし、精製方法の間で、サンプルの体積が有意に変化することである。これらの要素は、存在する精製プロトコールが熟練者によって実施されることを必要とし、容易に自動化できないことを意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
広義には本発明は、標的核酸及びゲノムDNAまたはRNAを含む細胞から、標的核酸を含むサンプルを取得する方法を提供する。従来技術のプロトコールに対して、この方法は、標的核酸を含む細胞を溶解する必要がなく、その代わりに培養ブロスまたは培地から分離した後に、細胞を水性媒体に再懸濁でき、標的核酸が、細胞溶解の必要なく細胞壁を通じて水性媒体に放出できるという観察に基づく。本発明は、好ましい実施態様では、多くの従来技術の核酸抽出法で使用される過熱工程を避けても良い。本発明は特に、宿主細胞染色体及びリボソームRNAのようなゲノム核酸から、細胞ベクターDNAまたはRNA、自己複製サテライト核酸、またはプラスミドDNAのような非ゲノム核酸の分離に適用可能である。
【０００８】
従って、第一の特徴点では、本発明は、標的核酸及びゲノム核酸を含む細胞から標的核酸のサンプルを取得する方法であって、
培養ブロスから細胞を分離する工程;
水性媒体中に細胞を懸濁し、標的核酸を水性媒体中に細胞からリークさせる工程;及び
水性媒体から核酸のサンプルを取得する工程;
を含み、細胞が前記工程の間で実質的に溶解されず、細胞内にゲノム核酸を実質的に維持する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
好ましくは前記方法は、細胞エンドトキシンの放出を実質的に引き起こさず、それによって細胞エンドトキシンから、さらにはゲノム核酸またはRNAに対して、標的核酸の分離を可能にする。
【００１０】
いずれかの理論によって結び付けられることを望まないが、培養ブロスにおける条件から、典型的により低いイオン強度での水性媒体における条件に細胞の環境を変化させると、標的核酸、特にベクターのような核酸に対して、細胞壁を「リーキー」にし、またはわずかに多孔性とすると本発明者らは考えている。これは、例えば細胞をリゾチーム、カオトロープ、または極端なpHまたは熱と接触させることによって細胞を溶解する必要なく、標的核酸を水性媒体中に拡散させ、その結果、ゲノムDNA及び細胞タンパク質のような不純物を細胞が維持し、それによって、これらの物質を不純物及び標的核酸を含むサンプルから除去する複雑な方法の必要性を避けることができる。本発明の好ましい実施態様では、標的核酸は、100kb以下であり、より好ましくは50kb以下であり、より好ましくは20kb以下であり、更により好ましくは10kb以下のサイズであってよい。核酸のサイズは、例えばポリアクリルアミドまたはアガロースゲルを使用するゲル電気泳動法を使用して、当業者によって測定できる。Ausubel等, 'Short Protocols in Molecular Biology', John Wiley and Sons, NY, 1992参照。
【００１１】
本発明では、「実質的に溶解されない」は、好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満、より好ましくは5％未満、より好ましくは2％未満、もっとも好ましくは1％未満の細胞が、本発明の方法によって処理される集団中で溶解されることを意味する。細胞溶解の度合いは、例えば顕微鏡の下でサンプル中に存在する溶解細胞と非溶解細胞をカウントすることによって容易に測定できる。
【００１２】
好ましくは標的核酸は、細胞内部で維持されるゲノム核酸から分離される非ゲノム核酸である。非ゲノム核酸は、ベクター、プラスミド、自己複製サテライト核酸若しくはコスミドDNA、またはベクターRNAを含む。他の形態の標的核酸は、Lambdaのようなバクテリオファージ、M13、及びウイルス核酸を含んでよい。好ましい実施態様では、非ゲノム核酸サンプルはプラスミドDNAである。
【００１３】
本発明の方法は、多くの各種のタイプの宿主細胞に広く適用可能である。例えばグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌、繊維状細菌またはStreptomycesのような糸状菌、酵母細胞、植物細胞、及び植物プロトプラストが挙げられる。大腸菌株、例えばJM109株またはHB101株のようなグラム陰性細菌の使用が好ましい。
【００１４】
典型的に前記細胞は、0から90℃の間の環境温度で処理される。多くの従来技術の方法と異なり、本発明の好ましい実施態様は、約60℃未満、より好ましくは約40℃未満の温度を使用して良い。本発明の方法で使用される好ましい温度範囲は、0から60℃の間、0から40℃の間、もっとも好ましくは15から40℃の間である。
【００１５】
本発明は、周囲の水性媒体中に細胞から標的核酸の放出を引き起こすための広範な各種の条件の使用を含む。好ましい水性媒体の例は、水、NaClのような塩を含み、低張性または高張性条件を含む。低塩バッファーの例は、好ましくは10から250mMの間、より好ましくは50から150mMの間の濃度で、任意にEDTAを含むTris.HCl(例えばpH6-9で)、任意にKClを含む酢酸カリウムのようなカリウム塩、またはCaCl2のような二価または三価金属塩を含む。
【００１６】
別法としてまたは加えて、0.05から1.0Mの間、より好ましくは0.1から0.5Mの間の濃度での糖溶液を使用することもできる。好ましい糖溶液はスクロース溶液である。
【００１７】
任意に水性媒体は、標的核酸の収率を改良するための、プロテイナーゼKのようなプロテイナーゼを更に含んでも良い。特に本発明者らは、二価または三価金属イオン塩とプロテイナーゼを含むと、細胞からの標的核酸の漏れが増大することを見出した。プロテイナーゼKとCaCl2の使用が特に好ましい。
【００１８】
好ましい実施態様では、水性媒体は低塩バッファーである。好ましくは低塩バッファーは、任意にEDTAと組み合わせたTris HClを含む。この場合、好ましくは低塩バッファーは、5mMから50mMのTris HCl、もっとも好ましくは約10mM Tris HClを含む。EDTAが存在する場合、それは好ましくは、0.1mMから100mMの間の濃度、より好ましくは0.1から50mMの間の濃度、もっとも好ましくは約1mMの濃度で存在する。
【００１９】
別の好ましい実施態様では、低塩バッファーは、10mMから30mMの間の濃度、もっとも好ましくは約16mMの濃度でのカリウム塩である。カリウム塩溶液の好ましいpHは約pH4である。
【００２０】
好ましくは水性媒体は、pH3から11の間のpH、より好ましくはpH6から9の間のpH、もっとも好ましくは約8.5のpHを有する。
【００２１】
例えば、好ましくは約50mMから250mMの間、より好ましくは約150mMである濃度での、例えば塩化ナトリウムを含む水性媒体を使用することによって、わずかに高い塩濃度を使用することもできる。塩化ナトリウム溶液の好ましいpHは、約pH7である。塩溶液または水性媒体は、例えばMES、MOPS、HEPES、または酢酸バッファー、またはPBSのようなリン酸バッファーといった生物学的バッファーのような標準的な実験室用バッファーで緩衝されても良い。
【００２２】
水性媒体は、単独で、またはここに記載される一つ以上の他の成分と組み合わせてのいずれかで、界面活性剤を含んでも良い。界面活性剤は、例えば分析方法において、標的核酸の後の使用を阻害しないTween20のような非イオン性界面活性剤である。水性媒体は更に、周囲の媒体に放出される混合物から非所望のRNAまたはDNA標的を選択的に分解するために、RNAヌクレアーゼまたはDNAヌクレアーゼを含んでも良い。更に、いずれかの放出されたタンパク質を分解するために、プロテアーゼを使用しても良い。
【００２３】
本発明は、核酸を精製するために多くの従来技術の方法で使用される過度の条件を避けることが可能である。条件がより過度である場合、細胞壁は徹底的に分解され、かなりの量の非所望の核酸が放出される。過度の条件の例は、0.1M NaOH、または1% SDSを含む0.1M NaOHを含むが、これらに制限されない。ある場合では、過度の条件は、65℃以上の温度の使用、及び/または水非混和性有機溶媒の使用、及び/またはエレクトロポレーションの使用を含む。かくして、本発明の方法は、例えば10,000V/vmを越える電解強度を有するポレーションを生ずることが可能な電場の不存在下で好ましくは実施される。
【００２４】
ある実施態様では、本発明の方法は、
(a)標的核酸の単離;または
(b)標的核酸の分析;または
(c)標的核酸の増幅;または
(d)標的核酸の配列決定；
の一つ以上の更なる工程を含んでも良い。
【００２５】
これらの工程は、以下により詳細に議論される。
【００２６】
本発明の更なる実施態様では、プラスミドのような標的核酸は、本発明により細胞から分離でき、生成した水性媒体、即ち上清は、更なる生成工程のための、例えばPCRまたは他の分析方法のための必要条件に直接使用できる。
【００２７】
細胞からリークし、水性媒体に存在する核酸を精製するために、数多くの方法が当業者に利用可能である。精製法の例は、イオン交換、電気泳動、シリカ固相を使用するカオトロープ塩抽出、沈降、凝集、濾過、ゲル濾過、遠心分離、アルコール沈降、及び/または継続出願である欧州特許出願第98957019.7号、米国特許出願第09/736,632号、及びWO 02/48164に記載された荷電スイッチ物質の使用、及び当該技術分野で周知の他の精製法または分離法を含む。好ましい実施態様では、標的核酸は、例えば固相、ピペットチップ、ビーズ(特に磁性ビーズ)、多孔性膜、フリット、焼結製品、プローブまたはディップスティック、チューブ（PCRチューブ、エッペンドルフチューブ）、またはマイクロアレイに存在する荷電スイッチ物質を使用して精製される。荷電スイッチ物質は、固相でも良く可溶性でも良い。それらはイオン化可能な基を含み、第一のpH(典型的にpH5.0から9.0の間)で核酸を結合し、第二のより高いpH(典型的に10.5未満)でそれを放出可能である。固相荷電スイッチ物質の例は、(1)イオン化可能な基が、共有結合若しくはイオン結合によって、または吸着によって、固相支持体に別個に固定化されたもの、(2)イオン化可能な基がポリマーに別個に結合し、前記ポリマーが、共有結合若しくはイオン結合によって、または吸着によって、固相支持体に固定化されたもの、(3)イオン化可能な基が、任意に架橋剤によって重合しており、前記ポリマーが、共有結合若しくはイオン結合によって、または吸着によって固相支持体に固定化されたものである。例として、荷電スイッチ物質における荷電した基は、生物学的バッファー(例えばTris、Bis-Tris、ポリTris、またはポリBis-Tris)、ポリヒドロキシル化アミン、石鹸または界面活性剤、炭水化物、核酸塩基、複素環窒素含有化合物、モノアミン、生物学的色素、または約3.0から7.0の間のpKaを有する負にイオン化可能な基、及び前記第一のpHで正に荷電し、任意に前記第二のpHでも正に荷電する金属酸化物によって提供されて良い。
【００２８】
標的核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応を簡便に使用して、増幅の対象であっても良い。核酸の増幅のためのPCR法は、米国特許第4,683,195号に記載されている。一般的に、そのような方法は、標的配列の末端由来の配列情報が既知であって、増幅のための標的であるポリヌクレオチド配列と同一または相同なように、正及び逆のオリゴヌクレオチドプライマーをデザイン可能であることが必要である。PCRは、テンプレート核酸の変性工程(二本鎖である場合)、標的に対するプライマーのアニリング工程、及び重合工程を含む。増幅反応でテンプレートとしてプローブされるまたは使用される核酸は、ゲノムDNA、cDNA、またはRNAであって良い。PCRは、ゲノムDNA由来の特異的配列、mRNAから転写された特異的RNA配列及びcDNA、バクテリオファージまたはプラスミド配列を増幅するために使用できる。PCR法の一般的使用のための参考文献は、Mullis等, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, (1987)、Ehrlich(編), PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989、Ehrlich等, Science, 252: 1643-1650, (1991), "PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Innis等編, Academic Press, New York, (1990)を含む。
【００２９】
ある実施態様では、本発明の方法は、培養ブロス中の細胞を培養する工程、またはプレート上の選択培地において生育させる工程のような、一つ以上の初期工程を含んでも良い。細胞/コロニーを分離し、次いで水性媒体に配置する。分離は、遠心分離、濾過、磁性ビーズ分離によって、またはプローブ若しくはディップスティックを使用して達成されて良い。
【００３０】
かくして、一つの実施態様では、本発明の方法は、ブロスまたは培養倍地中で細胞を成育させる工程、細胞を分離する工程、及び水性媒体に細胞を再懸濁し、細胞をリーキーにして標的核酸を放出させる工程を含む。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様は、例として機能し、制限的なものではない、添付の図面を参考にして、より詳細に記載されるであろう。
【実施例】
【００３２】
実施例１：
pUC19プラスミドを含むJM109のオーバーナイト5mlカルチャーを遠心分離にかけて細胞をペレット化し、500μlの10mM Tris.HCl, 10mM EDTA, pH8.5に再懸濁した。5分間のインキュベーションに引き続き、細胞を遠心分離にかけ、プラスミドを含む透明な上清を得た。サンプルをPCR分析のために採取し、残りのプラスミドを、166μlの1.6M酢酸カリウムバッファーでpH4に調節し、次いで正に荷電した基で誘導化された1mgの磁性ビーズを加えて精製した。磁性ビーズを1分間インキュベートしてプラスミドを結合させ、磁石で分離し、水で二度洗浄し、100μlの10mM Tris.HCl pH8.5で溶出してDNAを回収した。プラスミドの純度をゲル電気泳動によって確認し、同一性をPCRと配列決定によって確認した。
【００３３】
実施例２：
pUC19プラスミドを含むXL-1 Blueのオーバーナイト5mlカルチャーを遠心分離にかけて細胞をペレット化し、500μlの10mM Tris.HCl, 10mM EDTAに再懸濁した。5分間のインキュベーションに引き続き、細胞を遠心分離にかけ、プラスミドを含む透明な上清を得た。サンプルをPCR分析のために採取し、残りのプラスミドを、166μlの1.6M酢酸カリウムバッファーでpH4に調節し、次いで正に荷電した基で誘導化された1mgの磁性ビーズを加えて精製した。磁性ビーズを1分間インキュベートしてプラスミドを結合させ、磁石で分離し、水で二度洗浄し、100μlの10mM Tris.HCl pH8.5で溶出してDNAを回収した。プラスミドの純度をゲル電気泳動によって確認し、同一性をPCRと配列決定によって確認した。
【００３４】
実施例３：
pUC19プラスミドを含むXL-1 Blueのオーバーナイト5mlカルチャーを遠心分離にかけて細胞をペレット化し、500μlの水に再懸濁した。5分間のインキュベーションに引き続き、細胞を遠心分離にかけ、プラスミドを含む透明な上清を得た。プラスミドの純度をゲル電気泳動によって確認し、同一性をPCRによって確認した。
【００３５】
実施例４：
pUC19プラスミドを含むXL-1 Blueのオーバーナイト5mlカルチャーを遠心分離にかけて細胞をペレット化し、500μlの0.15M NaClに再懸濁した。5分間のインキュベーションに引き続き、細胞を遠心分離にかけ、プラスミドを含む透明な上清を得た。プラスミドの純度をゲル電気泳動によって確認し、同一性をPCRによって確認した。
【００３６】
実施例５：
pUC19プラスミドを含むXL-1 Blueのオーバーナイト5mlカルチャーを遠心分離にかけて細胞をペレット化し、500μlの10mM酢酸カリウム、10mM塩化カリウム、pH4に再懸濁した。5分間のインキュベーションに引き続き、細胞を遠心分離にかけ、プラスミドを含む透明な上清を得た。プラスミドの純度をゲル電気泳動によって確認し、同一性をPCRによって確認した。
【００３７】
実施例６：
pUC19プラスミドを含むXL-1 Blueのオーバーナイト5mlカルチャーを遠心分離にかけて細胞をペレット化し、500μlの10mM Tris HCl, 1% Tween20に再懸濁した。5分間のインキュベーションに引き続き、細胞を遠心分離にかけ、プラスミドを含む透明な上清を得た。プラスミドの純度をゲル電気泳動によって確認し、同一性をPCRによって確認した。
【００３８】
実施例７：
pUC19プラスミドを含むXL-1 Blueのオーバーナイト5mlカルチャーを遠心分離にかけて細胞をペレット化し、500μlの10mM Tris HCl, 1% Teen 20に再懸濁した。5分間のインキュベーションに引き続き、細胞とプラスミドを含む上清を、直接的分析のためPCR反応に加えた。
【００３９】
実施例８：
pUC19プラスミドを含むJM109のオーバーナイト5mlカルチャーを遠心分離にかけて細胞をペレット化し、500μlの10mM Tris.HCl, 10mM EDTA, pH8.5プラス20μg/mlのRNアーゼAに再懸濁した。5分間のインキュベーションに引き続き、細胞を遠心分離にかけ、プラスミドを含む透明な上清を得た。サンプルをPCR分析のために採取し、残りのプラスミドを、166μlの1.6M酢酸カリウムバッファーでpH4に調節し、次いで正に荷電した基で誘導化された1mgの磁性ビーズを加えて精製した。磁性ビーズを1分間インキュベートしてプラスミドを結合させ、磁石で分離し、水で二度洗浄し、100μlの10mM Tris.HCl pH8.5で溶出してDNAを回収した。プラスミドの純度をゲル電気泳動によって確認した。
【００４０】
実施例９：
10mM Tris HCl、10mM EDTA、pH8.5の溶液を、以下のパーセンテージ濃度(%)：100、20、15、10及び5に水で希釈した。次いで200ml pUC19/XL1-Blueオーバーナイトカルチャーから得た5×15mlカルチャーを遠心分離して細胞をペレット化した。上清を取り出した。約500μlずつのバッファー濃度の範囲を、5μlのプロテイナーゼK(20mg/ml)及び5μlのRNアーゼA(5mg/ml)を有する5のチューブに加えた。5のサンプルを十分に再懸濁し、室温で15分間インキュベートした。15分後、サンプルを再び遠心分離して細胞をペレット化した。上清を新しいチューブに回収し、ペレットを捨てた。各チューブに対して、40μlの荷電スイッチ磁性ビーズを有する500μlの1.5M酢酸カリウムバッファー、pH4(PB)を加え、ビーズを十分に再懸濁し、1分間インキュベートし、磁性ラックで分離し、二度洗浄し、50μlの溶出バッファー(EB)で溶出した。10μlの各サンプルを、図１に示されるようにエチジウムブロマイドで染色した1％アガロースゲルで移動させた。
【００４１】
実施例１０：
スクロースを以下の濃度(M)：0.5、0.4、0.3、0.2及び0.1で調製した。200ml pUC19/XL1-Blueオーバーナイトカルチャーから得た5×15mlカルチャーを遠心分離して細胞をペレット化した。上清を取り出した。約500μlずつのスクロース濃度(M)の範囲を5のチューブに加えた。5μlのプロテイナーゼK及び5μlのRNアーゼAを、前述のように各チューブに加えた。5のサンプルを十分に再懸濁し、室温で15分間インキュベートした。15分後、サンプルを再び遠心分離して細胞をペレット化した。上清を新しいチューブに回収し、ペレットを捨てた。500μlのPB及び40μlのCST磁性ビーズを加え、チューブを十分に再懸濁し、1分間インキュベートし、磁性ラックで分離し、二度洗浄し、50μlの溶出バッファー(EB)で溶出した。10μlの各サンプルを、図２に示されるようにエチジウムブロマイドで染色した1％アガロースゲルで移動させた。
【００４２】
実施例１１：
CaCl2を以下の濃度(mM)：200、175、150、125及び100で調製した。200μl pUC19/XL1-Blueオーバーナイトカルチャーから得た5×1.5mlカルチャーを遠心分離して細胞をペレット化した。上清を取り出した。約500μlずつのCaCl2濃度の範囲を5のチューブに加えた。5μlのプロテイナーゼK及び5μlのRNアーゼAを、前述のように各チューブに加えた。5のサンプルを十分に再懸濁し、室温で15分間インキュベートした。15分後、サンプルを再び遠心分離して細胞をペレット化した。上清を新しいチューブに回収し、ペレットを捨てた。500μlのPB及び40μlの荷電スイッチ磁性ビーズを加え、チューブを十分に再懸濁し、1分間インキュベートし、磁性ラックで分離し、二度洗浄し、50μlの溶出バッファー(EB)で溶出した。10μlの各サンプルを、図３に示されるようにエチジウムブロマイドで染色した1％アガロースゲルで移動させた。
【００４３】
実施例１２：
リークしたDNAがpUC19ベクタープラスミドであることを確認するために、pUC19ベクタープライマーを使用して4のPCR反応を実施し、700bpのPCR断片を増幅した。リーキーな細胞抽出から得たDNAを使用して2を実施し、研究室のベクターストックから得たpUC19のサンプルを使用して2を実施した。10μlの各産物を、エチジウムブロマイドで染色した1％アガロースゲルで移動し、図４に示されるように1kbの伸長ラダーを得た。
【００４４】
実施例１３：
200μl pUC19/XL1-Blueオーバーナイトカルチャーから得た9×1.5mlカルチャーを遠心分離して細胞をペレット化した。上清を取り出した。以下の範囲の100mM CaCl2容量(μl)：25、50、100、200、300、400、500、600及び700を、9のサンプルに加えた。5μlのプロテイナーゼK及び5μlのRNアーゼAを、前述のように各チューブに加えた。9のサンプルを十分に再懸濁し、室温で15分間インキュベートした。15分後、サンプルを再び遠心分離して細胞をペレット化した。上清を新しいチューブに回収し、ペレットを捨てた。500μlの沈降バッファー及び40μlのCST磁性ビーズを加え、チューブを十分に再懸濁し、1分間インキュベートし、磁性ラックで分離し、二度洗浄し、50μlの溶出バッファー(EB)で溶出した。10μlの各サンプルを、図５に示されるようにエチジウムブロマイドで染色した1％アガロースゲルで移動させた。
【００４５】
ここで引用される参考文献は、完全に参考として全て明白に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、エチジウムブロマイドで染色したアガロースゲルで移動させた、本発明によって精製されたプラスミドDNAサンプルを示す。図面には、各精製で使用される条件(試薬及び濃度)が付されている。核酸バンドは、スーパーコイル形態、ニック化形態、直線形態で、全てプラスミドから由来する。ゲノムDNAについてのバンドは観察されず、本発明の方法の選択性を示す。
【図２】図２は、エチジウムブロマイドで染色したアガロースゲルで移動させた、本発明によって精製されたプラスミドDNAサンプルを示す。図面には、各精製で使用される条件(試薬及び濃度)が付されている。核酸バンドは、スーパーコイル形態、ニック化形態、直線形態で、全てプラスミドから由来する。ゲノムDNAについてのバンドは観察されず、本発明の方法の選択性を示す。
【図３】図３は、エチジウムブロマイドで染色したアガロースゲルで移動させた、本発明によって精製されたプラスミドDNAサンプルを示す。図面には、各精製で使用される条件(試薬及び濃度)が付されている。核酸バンドは、スーパーコイル形態、ニック化形態、直線形態で、全てプラスミドから由来する。ゲノムDNAについてのバンドは観察されず、本発明の方法の選択性を示す。
【図４】図４は、エチジウムブロマイドで染色したアガロースゲルで移動させた、本発明によって精製されたプラスミドDNAサンプルを示す。図面には、各精製で使用される条件(試薬及び濃度)が付されている。核酸バンドは、スーパーコイル形態、ニック化形態、直線形態で、全てプラスミドから由来する。ゲノムDNAについてのバンドは観察されず、本発明の方法の選択性を示す。
【図５】図５は、エチジウムブロマイドで染色したアガロースゲルで移動させた、本発明によって精製されたプラスミドDNAサンプルを示す。図面には、各精製で使用される条件(試薬及び濃度)が付されている。核酸バンドは、スーパーコイル形態、ニック化形態、直線形態で、全てプラスミドから由来する。ゲノムDNAについてのバンドは観察されず、本発明の方法の選択性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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