(57)【要約】  本発明は、昆虫嗅覚レセプター遺伝子および嗅覚レセプター遺伝子を同定するための方法に関する。本発明は、昆虫嗅覚レセプター遺伝子Ｏｒ８３ｂのヌクレオチド配列、それらがコードするタンパク質（ペプチドまたはポリペプチドを含む）のアミノ酸配列、ならびに関連製品および方法を提供する。本発明の核酸は、プロモーター配列へ操作的に連結させて宿主細胞内へ形質転換させることができる。Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質、およびそれらの誘導体およびアナログを（例、組み換え手段によって）産生する方法を提供する。Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質、およびそれらの誘導体およびアナログに対する抗体、を提供する。これらのＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子に結合する、またはそれらの活性を変調する分子を同定する方法を提供する。Ｏｒ８３ｂ遺伝子に結合する、またはその活性を変調することが見いだされた分子は、担体を提供することによって害虫防除剤に調製することができる。１の好適な実施形態では、他の種由来ではなく１の種由来のＯｒ８３ｂ遺伝子に結合する、またはその活性を変調する分子が望ましい。昆虫Ｏｒ８３ｂ臭気物質を改変することにより昆虫行動を改変する方法もまた提供する。
2005510209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１２のアミノ酸配列、またはその少なくとも１０アミノ酸のそのフラグメントを備える第１モチーフ備えるポリペプチド分子コードするヌクレオチド配列を備える、単離核酸であって、このとき前記ポリペプチド分子は、前記ポリペプチド分子の前記配列が配列番号：１０において見いだされないことを条件に、昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントである、単離核酸。
【請求項２】
更に、前記ポリペプチド分子は配列番号：１３のアミノ酸配列、または少なくとも１０アミノ酸のそのフラグメントを備える第２モチーフを備える、請求項１の単離核酸配列。
【請求項３】
更に、前記ポリペプチド分子は配列番号：１４のアミノ酸配列、または少なくとも１０アミノ酸のそのフラグメントを備える第２モチーフを備える、請求項１の単離核酸配列。
【請求項４】
配列番号：１４の前記フラグメントは少なくとも１５アミノ酸である、請求項３の単離核酸配列。
【請求項５】
配列番号：１４の前記フラグメントは少なくとも２０アミノ酸である、請求項３の単離核酸配列。
【請求項６】
前記第２モチーフは配列番号１５、１６および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を備える、請求項３、４または５の単離核酸配列。
【請求項７】
更に前記ポリペプチド分子は配列番号：１８のアミノ酸配列、または少なくとも１０アミノ酸のそのフラグメントを備える第２モチーフを備える、請求項１の単離核酸配列。
【請求項８】
配列番号：１８の前記フラグメントは少なくとも１５アミノ酸である、請求項７の単離核酸配列。
【請求項９】
配列番号：１８の前記フラグメントは少なくとも２０アミノ酸である、請求項７の単離核酸配列。
【請求項１０】
配列番号：１３のアミノ酸配列または少なくとも１０アミノ酸のそのフラグメントを備える第１モチーフを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸であって、このとき前記ポリペプチド分子は、前記ポリペプチド分子の配列が配列番号：１０において見いだされないことを条件に、昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチド又はそのフラグメントである単離核酸。
【請求項１１】
更に、前記ポリペプチド分子は配列番号：１４のアミノ酸配列、または少なくとも１０アミノ酸のそのフラグメントを備える第２モチーフを備える、請求項１０の単離核酸配列。
【請求項１２】
配列番号：１４の前記フラグメントは少なくとも１５アミノ酸である、請求項１１の単離核酸配列。
【請求項１３】
配列番号：１４の前記フラグメントは少なくとも２０アミノ酸である、請求項１１の単離核酸配列。
【請求項１４】
前記第２モチーフは配列番号１５、１６および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を備える、請求項１１、１２または１３の単離核酸配列。
【請求項１５】
更に、前記ポリペプチド分子は配列番号：１８のアミノ酸配列、または少なくとも１０アミノ酸のそのフラグメントを備える第２モチーフを備える、請求項１０の単離核酸配列。
【請求項１６】
配列番号：１８の前記フラグメントは少なくとも１５アミノ酸である、請求項１５の単離核酸配列。
【請求項１７】
配列番号：１８の前記フラグメントは少なくとも２０アミノ酸である、請求項１５の単離核酸配列。
【請求項１８】
配列番号：１４のアミノ酸配列または少なくとも１０アミノ酸のそのフラグメントを備える第１モチーフを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸であって、このとき前記ポリペプチド分子は、前記ポリペプチド分子の前記配列が配列番号：１０において見いだされないことを条件に、昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントである、単離核酸。
【請求項１９】
配列番号：１４の前記フラグメントは少なくとも１５アミノ酸である、請求項１８の単離核酸配列。
【請求項２０】
配列番号：１４の前記フラグメントは少なくとも２０アミノ酸である、請求項１８の単離核酸配列。
【請求項２１】
前記第１モチーフは配列番号１５、１６および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を備える、請求項１８、１９または２０の単離核酸配列。
【請求項２２】
更に、前記ポリペプチド分子はさらに配列番号：１８のアミノ酸配列、または少なくとも１０アミノ酸のそのフラグメントを備える第２モチーフを備える、請求項１８の単離核酸配列。
【請求項２３】
配列番号：１８の前記フラグメントは少なくとも１５アミノ酸である、請求項２２の単離核酸配列。
【請求項２４】
配列番号：１８の前記フラグメントは少なくとも２０アミノ酸である、請求項２２の単離核酸配列。
【請求項２５】
３つ以上の配列番号：１２、１３、１４または１８のアミノ酸配列または配列番号：１２、１３、１４または１８の少なくとも１０アミノ酸のフラグメントを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸であって、このとき前記ポリペプチド分子は、前記ポリペプチド分子の配列が配列番号：１０において見いだされないことを条件に、昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントである、単離核酸。
【請求項２６】
配列番号：１４の前記配列は配列番号１５、１６および１７からなる群から選択される、請求項２５の単離核酸配列。
【請求項２７】
配列番号：１２、１３、１４または１８のアミノ酸配列または配列番号：１２、１３、１４または１８の少なくとも１０アミノ酸のフラグメントを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸であって、このとき前記ポリペプチド分子は、前記ポリペプチド分子の配列が配列番号：１０において見いだされないことを条件に、昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントである、単離核酸配列。
【請求項２８】
配列番号：１４の前記配列は配列番号１５、１６および１７からなる群から選択される、請求項２７の単離核酸配列。
【請求項２９】
昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドをコードする核酸を同定する方法であって、前記方法は：
（ａ）配列番号：１２、１３または１４の少なくとも６アミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオチドまたはその相補体を備えるフォワードプライマーと、配列番号：１３、１４または１８の少なくとも６アミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオチドまたはその相補体を備えるリバースプライマーとを用いて昆虫ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅工程であって、このとき前記リバースプライマーが前記フォワードプライマーの下流であり、そして前記ＰＣＲ増幅が少なくとも１５０ヌクレオチドの産物を生じさせる、工程、および、
（ｂ）工程（ａ）によって産生した産物の検出工程を備え、
それにより昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドをコードする核酸を同定する、昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドをコードする核酸を同定する方法。
【請求項３０】
配列番号：１１に示した配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を備える精製ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が配列番号：１０において見いだされないことを条件とする、精製ポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドは配列番号：１１に示した前記配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも９０％同一性を有する、請求項３０の精製ポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドは配列番号：１１に示した前記配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも９５％同一性を有する、請求項３０の精製ポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号：１１に示したアミノ酸配列または少なくとも２０の連続アミノ酸のそのフラグメントを備える精製ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が配列番号：１０において見いだされないことを条件とする、精製ポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号：２に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３５７３が指定されたプラスミドのインサートによってコードされる配列の少なくとも２０の連続アミノ酸を備える、請求項３０、３１、または３２の精製ポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号：２に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７３が指定されたプラスミドのインサートによってコードされる配列の少なくとも３０の連続アミノ酸を備える、請求項３４の精製ポリペプチド。
【請求項３６】
配列番号：２に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７３が指定されたプラスミドのインサートによってコードされる配列の少なくとも５０の連続アミノ酸を備える、請求項３４の精製ポリペプチド。
【請求項３７】
配列番号：２に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７３が指定されたプラスミドのインサートによってコードされるアミノ酸配列を備える、精製ポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号：４に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３５７４が指定されたプラスミドのインサートによってコードされる配列の少なくとも２０の連続アミノ酸を備える、請求項３０、３１、または３２の精製ポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号：４に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７４が指定されたプラスミドのインサートによってコードされる配列の少なくとも３０の連続アミノ酸を備える、請求項３８の精製ポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号：４に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７４が指定されたプラスミドのインサートによってコードされる配列の少なくとも５０の連続アミノ酸を備える、請求項３８の精製ポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号：４に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７４が指定されたプラスミドのインサートによってコードされるアミノ酸配列を備える、精製ポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号：６に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７５が指定されたプラスミドのインサートによってコードされる配列の少なくとも２０の連続アミノ酸を備える、請求項３０、３１、または３２の精製ポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号：６に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７５が指定されたプラスミドのインサートによってコードされる配列の少なくとも３０の連続アミノ酸を備える、請求項４２の精製ポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号：６に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７５が指定されたプラスミドのインサートによってコードされる配列の少なくとも５０の連続アミノ酸を備える、請求項４２の精製ポリペプチド。
【請求項４５】
配列番号：６に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７５が指定されたプラスミドのインサートによってコードされるアミノ酸配列を備える、精製ポリペプチド。
【請求項４６】
配列番号：８に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７６が指定されたプラスミドのインサートによってコードされる配列の少なくとも２０の連続アミノ酸を備える、請求項３０、３１、または３２の精製ポリペプチド。
【請求項４７】
配列番号：８に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７６が指定されたプラスミドのインサートによってコードされる配列の少なくとも３０の連続アミノ酸を備える、請求項４６の精製ポリペプチド。
【請求項４８】
配列番号：８に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７６が指定されたプラスミドのインサートによってコードされる配列の少なくとも５０の連続アミノ酸を備える、請求項４６の精製ポリペプチド。
【請求項４９】
配列番号：８に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７６が指定されたプラスミドのインサートによってコードされるアミノ酸配列を備える、精製ポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、および配列番号：８からなる群から選択されるアミノ酸配列によって規定されるポリペプチドにも結合する抗体によって結合され得る、請求項３０、３１、または３２の精製ポリペプチド。
【請求項５１】
請求項３０、３１、または３２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を備える、単離核酸。
【請求項５２】
更に、複製起点を備える、請求項５１の単離核酸。
【請求項５３】
請求項３３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を備える、単離核酸。
【請求項５４】
更に、複製起点を備える、請求項５３の単離核酸。
【請求項５５】
前記ヌクレオチド配列はプロモーターへ操作的に連結している、請求項５１の単離核酸。
【請求項５６】
前記ヌクレオチド配列はプロモーターへ操作的に連結している、請求項５３の単離核酸。
【請求項５７】
請求項５２の核酸で形質転換された、宿主細胞。
【請求項５８】
Ｏｒ８３ｂレセプターに結合する分子を同定する方法であって、前記Ｏｒ８３ｂレセプターは配列番号：１１に示した配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を備え、前記アミノ酸配列が配列番号：１０において見いだされないことを条件としており、前記方法は：
（ａ）第１細胞および第２細胞と試験分子とを、前記Ｏｒ８３ｂレセプターと前記試験分子との結合を導く条件下で接触させる工程であって、このとき前記第１細胞は前記Ｏｒ８３ｂレセプターを発現し、そして前記第２細胞は前記Ｏｒ８３ｂレセプターを発現せず、さらにこのとき前記第１細胞および前記第２細胞は同一細胞タイプである、工程、および
（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞または前記第２細胞に結合するかどうかを決定する工程を備え、
このとき第１細胞に結合するが第２細胞には結合しない分子はＯｒ８３ｂレセプターに結合する分子である、Ｏｒ８３ｂレセプターに結合する分子を同定する方法。
【請求項５９】
昆虫防除剤調製物であって：
（ａ）担体と；および
（ｂ）請求項５８の方法によって同定された分子、を備える調製物。
【請求項６０】
防虫剤である、請求項５９の昆虫防除剤。
【請求項６１】
誘引剤である、請求項５９の昆虫防除剤。
【請求項６２】
Ｏｒ８３ｂレセプターのモジュレーターを同定する方法であって、前記Ｏｒ８３ｂレセプターは配列番号：１１に示した配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を備え、前記アミノ酸配列が配列番号：１０において見いだされないことを条件としており、前記方法は：
（ａ）第１細胞および第２細胞と試験分子とを、前記Ｏｒ８３ｂレセプターと前記試験物質との結合を導く条件下で接触させる工程であって、このとき前記第１細胞は前記Ｏｒ８３ｂレセプターを発現し、そして前記第２細胞は前記Ｏｒ８３ｂレセプターを発現せず、さらにこのとき前記第１細胞および前記第２細胞は同一細胞タイプである、工程、および
（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞または前記第２細胞におけるＧ−タンパク質活性を変調させるかどうかを決定する工程を備え、
このとき第１細胞においてはＧタンパク質活性を変調するが第２細胞においては変調しない分子はＯｒ８３ｂモジュレーターである、Ｏｒ８３ｂレセプターのモジュレーターを同定する方法。
【請求項６３】
Ｇ−タンパク質活性は細胞におけるカルシウムイオンまたは環状ＡＭＰ濃度を測定することによって決定される、請求項６２の方法。
【請求項６４】
該モジュレーターがアゴニストである、請求項６２の方法。
【請求項６５】
該モジュレーターがアンタゴニストである、請求項６２の方法。
【請求項６６】
昆虫防除剤調製物であって：
（ａ）担体；および
（ｂ）請求項６２の方法によって同定されたモジュレーター、を備える調製物。
【請求項６７】
防虫剤である、請求項６６の昆虫防除剤。
【請求項６８】
誘引剤である、請求項６６の昆虫防除剤。
【請求項６９】
第１種由来のＯｒ８３ｂレセプターには結合するが第２種由来のＯｒ８３ｂレセプターには結合しない分子を同定するための方法であって、前記方法は：
（ａ）前記第１種由来の第１Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する第１細胞と試験分子とを前記第１レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程；
（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞に結合するかどうかを決定する工程；
（ｃ）前記第２種由来の第２Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する第２細胞と前記試験分子とを前記第２レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、このとき前記第２細胞は前記第１細胞と同一細胞タイプである工程；および
（ｄ）前記試験分子が前記第２細胞に結合するかどうかを決定する工程を備え、
このとき前記第１細胞には結合するが前記第２細胞には結合しない試験分子は前記第１種由来のＯｒ８３ｂレセプターには結合するが前記第２種由来のＯｒ８３ｂレセプターには結合しない、第１種由来のＯｒ８３ｂレセプターには結合するが第２種由来のＯｒ８３ｂレセプターには結合しない分子を同定するための方法。
【請求項７０】
昆虫防除剤調製物であって：
（ａ）担体；および
（ｂ）請求項６９の方法によって同定された分子、を備える調製物。
【請求項７１】
防虫剤である、請求項７０の昆虫防除剤。
【請求項７２】
誘引剤である、請求項７０の昆虫防除剤。
【請求項７３】
第１種由来であるが第２種由来ではないＯｒ８３ｂレセプターのモジュレーターを同定するための方法であって、前記方法は：
（ａ）前記第１種由来の第１Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する第１細胞と試験分子とを前記第１レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程；
（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞におけるＧ−タンパク質活性を変調させるかどうかを決定する工程；
（ｃ）前記第２種由来の第２Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する第２細胞と前記試験分子とを前記第２レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、このとき前記第２細胞は前記第１細胞と同一細胞タイプである、工程；および
（ｄ）前記試験分子が前記第２細胞におけるＧ−タンパク質活性を変調させるかどうかを決定する工程を備え、
このとき前記第１細胞におけるＧ−タンパク質活性を変調させるが前記第２細胞におけるＧ−タンパク質活性を変調させない前記試験分子は、前記第１種由来のＯｒ８３ｂレセプターを変調させるが前記第２種由来のＯｒ８３ｂレセプターを変調させない、第１種由来であるが第２種由来ではないＯｒ８３ｂレセプターのモジュレーターを同定するための方法。
【請求項７４】
Ｇ−タンパク質活性は細胞におけるカルシウムイオンまたは環状ＡＭＰ濃度を測定することによって決定される、請求項７３の方法。
【請求項７５】
前記モジュレーターがアゴニストである、請求項７３の方法。
【請求項７６】
前記モジュレーターがアンタゴニストである、請求項７３の方法。
【請求項７７】
昆虫防除剤調製物であって：
（ａ）担体；および
（ｂ）請求項７３の方法によって同定されたモジュレーター、を備える調製物。
【請求項７８】
防虫剤である、請求項７７の昆虫防除剤。
【請求項７９】
誘引剤である、請求項７７の昆虫防除剤。
【請求項８０】
第１昆虫嗅覚レセプターに結合するが第２昆虫嗅覚レセプターには結合しない臭気物質を同定する方法であって、前記方法は：
（ａ）Ｏｒ８３ｂレセプターと第１昆虫嗅覚レセプターとを発現する第１細胞と、試験物質とを、第１レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、前記Ｏｒ８３ｂレセプターは配列番号：１１に示した配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を備え、前記アミノ酸配列が配列番号：１０において見いだされないことを条件とする、工程；
（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞に結合するかどうかを決定する工程；
（ｃ）Ｏｒ８３ｂレセプターと第２昆虫嗅覚レセプターとを発現する第２細胞とを、第２レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、このとき前記第２細胞は前記第１細胞と同一細胞タイプである、工程；および
（ｄ）前記試験分子が前記第２細胞に結合するかどうかを決定する工程を備え、
このとき前記第１細胞に結合するが前記第２細胞には結合しない前記試験分子が第１昆虫嗅覚レセプターには結合するが第２昆虫嗅覚レセプターには結合しない臭気物質である、第１昆虫嗅覚レセプターに結合するが第２昆虫嗅覚レセプターには結合しない臭気物質を同定する方法。
【請求項８１】
昆虫防除剤調製物であって：
（ａ）担体；および
（ｂ）請求項８０の方法によって同定されたモジュレーター、を備える調製物。
【請求項８２】
防虫剤である、請求項８１の昆虫防除剤。
【請求項８３】
誘引剤である、請求項８１の昆虫防除剤。
【請求項８４】
第１昆虫嗅覚レセプターの活性を変調するが第２昆虫嗅覚レセプターの活性を変調しない臭気物質を同定するための方法であって、前記方法は：
（ａ）Ｏｒ８３ｂレセプターおよび第１昆虫嗅覚レセプターを発現する第１細胞と試験物質とを、前記レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、前記Ｏｒ８３ｂレセプターは配列番号：１１に示した配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を備え、前記アミノ酸配列が配列番号：１０において見いだされないことを条件とする、工程；
（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞に結合するかどうかを決定する工程；
（ｃ）Ｏｒ８３ｂレセプターおよび第２昆虫嗅覚レセプターを発現する第２細胞と前記試験分子とを、第２レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、このとき前記第２細胞は前記第１細胞と同一細胞タイプである、工程；および
（ｄ）前記試験分子が前記第２細胞に結合するかどうかを決定する工程を備え、
このとき前記第１細胞に結合するが前記第２細胞には結合しない試験分子は第１昆虫嗅覚レセプターには結合するが第２昆虫嗅覚レセプターには結合しない臭気物質である、第１昆虫嗅覚レセプターの活性を変調するが第２昆虫嗅覚レセプターの活性を変調しない臭気物質を同定するための方法。
【請求項８５】
Ｇ−タンパク質活性は前記細胞におけるカルシウムイオンまたは環状ＡＭＰ濃度を測定することによって決定される、請求項８４の方法。
【請求項８６】
前記臭気物質がアゴニストである、請求項８４の方法。
【請求項８７】
前記臭気物質がアンタゴニストである、請求項８４の方法。
【請求項８８】
昆虫防除剤調製物であって：
（ａ）担体；および
（ｂ）請求項８４の方法によって同定された臭気物質、を備える調製物。
【請求項８９】
防虫剤である、請求項８８の昆虫防除剤。
【請求項９０】
誘引剤である、請求項８８の昆虫防除剤。
【請求項９１】
昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターに結合するが昆虫味覚レセプターには結合しない分子を同定する方法であって、前記方法は：
（ａ）Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する第１細胞と試験物質とを、前記レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、前記Ｏｒ８３ｂレセプターは配列番号：１１に示した配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を備え、前記アミノ酸配列が配列番号：１０において見いだされないことを条件とする、工程；
（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞に結合するかどうかを決定する工程；
（ｃ）昆虫味覚レセプターを発現する第２細胞と前記試験分子とを該レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、このとき前記第２細胞は第２細胞と同一細胞タイプである、工程；および
（ｄ）前記試験分子が前記第２細胞に結合するかどうかを決定する工程を備え、
このとき前記第１細胞に結合するが前記第２細胞には結合しない試験分子が昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターには結合するが昆虫嗅覚レセプターには結合しない分子である、昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターに結合するが昆虫味覚レセプターには結合しない分子を同定する方法。
【請求項９２】
昆虫防除剤調製物であって：
（ａ）担体；および
（ｂ）請求項９１の方法によって同定された分子、を備える調製物。
【請求項９３】
防虫剤である、請求項９２の昆虫防除剤。
【請求項９４】
誘引剤である、請求項９２の昆虫防除剤。
【請求項９５】
昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターを変調するが昆虫味覚レセプターを変調しない分子を同定する方法であって、前記方法は：
（ａ）Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する第１細胞と試験物質とを、前記レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、前記Ｏｒ８３ｂレセプターは配列番号：１１に示した配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を備え、前記アミノ酸配列が配列番号：１０において見いだされないことを条件とする、工程；
（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞におけるＧ−タンパク質活性を変調させるかどうかを決定する工程と；
（ｃ）昆虫味覚レセプターを発現する第２細胞と前記試験分子とを、前記レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、このとき前記第２細胞は前記第１細胞と同一細胞タイプである、工程；および
（ｄ）前記試験分子が前記第２細胞におけるＧ−タンパク質活性を変調させるかどうかを決定する工程を備え、
このとき前記第１細胞におけるＧ−タンパク質活性を変調させるが前記第２細胞におけるＧ−タンパク質活性を変調させない試験分子は昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターの活性を変調させるが昆虫味覚レセプターの活性を変調させない、昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターを変調するが昆虫味覚レセプターを変調しない分子を同定する方法。
【請求項９６】
Ｇ−タンパク質活性は細胞におけるカルシウムイオンまたは環状ＡＭＰ濃度を測定することによって決定される、請求項９５の方法。
【請求項９７】
該分子がアゴニストである、請求項９５の方法。
【請求項９８】
該分子がアンタゴニストである、請求項９５の方法。
【請求項９９】
昆虫防除剤調製物であって：
（ａ）担体；および、
（ｂ）請求項９５の方法によって同定されたモジュレーター、を備える調製物。
【請求項１００】
防虫剤である、請求項９９の昆虫防除剤。
【請求項１０１】
誘引剤である、請求項９９の昆虫防除剤。
【請求項１０２】
該担体が固体担体および液体担体からなる群から選択される、請求項５９、６６、７０、７７、８１、８８、９２、または９９の昆虫防除剤調製物。
【請求項１０３】
該固体担体がデンプン、活性炭、大豆粉末、小麦粉末、木粉、魚粉、粉乳、タルク、カオリン、ベントナイト、炭酸カルシウム、ゼオライト、珪藻土、微細シリカ粉末、粘土またはアルミナである、請求項１０２の昆虫防除剤調製物。
【請求項１０４】
該液体担体は、水、イソプロピルアルコール、エチレングリコール、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、ジオキサン、テトラハイドロフラン、灯油、軽油、キシレン、トリメチルベンゼン、テトラメチルベンゼン、メチルナフタレン、ソルベント・ナフサ、クロロベンゼン、ジメチルアセトアミド、グリセリンエステル、アセトニトリル、またはジメチルスルホキシドである請求項１０２の昆虫防除剤調製物。
【請求項１０５】
植物または動物と請求項１０２の昆虫防除剤調製物とを接触させる工程を備える、植物または動物を昆虫から保護するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．緒言
本発明は、昆虫Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子、および、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子を同定するための方法に関する。本発明は、昆虫Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子のヌクレオチド配列、それらがコードしたタンパク質（ペプチドまたはポリペプチドを含む）のアミノ酸配列、ならびにそれらの誘導体（例、フラグメント）およびアナログを提供する。本発明はさらに、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の１または２以上の高度に保存されたモチーフを備えるＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のフラグメント（およびそれらの誘導体およびアナログ）に関する。１の特定の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｏｒ８３ｂ遺伝子ではない。本発明の核酸は、プロモーター配列へ操作的に連結させて宿主細胞内へ形質転換させることができる。Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質、およびそれらの誘導体およびアナログを（例えば、組み換え手段によって）産生する方法を提供する。Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質に対する抗体、ならびにそれらの誘導体およびアナログが提供される。これらのＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子に結合する、またはそれらの活性を変調する分子を同定する方法を提供する。Ｏｒ８３ｂ遺伝子に結合する、またはその活性を変調することが見いだされた分子は、担体を提供することにより防除剤へ調製することができる。１の好適な実施形態では、１の種からのＯｒ８３ｂ遺伝子には結合する、またはその活性を変調するが、他の種からのＯｒ８３ｂ遺伝子には結合しない、またはその活性を変調しない分子が望ましい。昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターを改変することにより昆虫の行動を改変する方法もまた提供する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
昆虫は、世界中で農業やヒトの健康に著しい影響を及ぼしている。昆虫の活動に起因する損害や破壊は、平均すると、世界中の農作物、貯蔵された農産物、木材および家畜における損失の１０〜２０％に相当する。さらに、害虫の蔓延を防除するために課される検疫は、国際貿易および農産物の輸出入に深刻な影響を及ぼしている。極めて重篤かつ壊滅的な感染性疾患の多くは、蚊、ハエおよびダニのような吸血昆虫によってヒトへ伝達される。昆虫媒介性疾患に関連する死者数は年間１００万例を遙かに超えており、関連罹患率は３億例を上回る（例えば、ＷＨＯ疫学週報（Ｗｅｅｋｌｙ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｒｄ）、１９９９、７４：２６５−２７０を参照）。
【０００３】
現在、農産物害虫の蔓延および活動は主として、農場、温室、および貯蔵施設全体へ強力な広域化学的殺虫剤を広範囲に適用することにより制御されている。ヒトの健康を危険にさらす害虫は、住宅区域内またはその近傍での殺虫剤の広範囲噴霧の標的とされている。
【０００４】
しかし、従来型殺虫剤の使用には、環境、ヒトの健康、および再生不能な自然資源にとっての重大な危険が結び付いている。その結果として、世界中の政府機関は化学的殺虫剤の使用にますます厳重な規制や禁止を加えつつある。さらに、昆虫は長期使用後には殺虫剤への耐性を発生するので、より高レベルの殺虫剤の噴霧、または新規のより強力な殺虫剤調製物の開発が必要になる。
【０００５】
そこで、化学的殺虫剤は昆虫を殺滅するように設計されているが、それらがヒトの健康、環境および他の動物種へ及ぼす非選択的な作用はそれらに損害を与え、議論の的となっている。その結果、食品、資源およびヒトの健康にとっての脅威である昆虫集団を防除するための安全かつ効果的なツールを開発する極めて重大な必要がある。可能性のある１のアプローチは、昆虫防除の新規ストラジーを開発するために、昆虫の行動に関する知識および昆虫嗅覚の分子神経生物学における近年の刺激的な進歩を利用することである。
【０００６】
２．１．昆虫の嗅覚行動
ヒトを含むすべての動物の行動には、視覚系、聴覚系およびその他の感覚系による環境内の事象の認識、そしてこれらの感覚刺激の適切な筋反応への転換（translation）が含まれる。昆虫のような単純な生体では、感覚刺激の認識は極めて定型化した、または「組み込まれた（ｈａｒｄ−ｗｉｒｅｄ）」行動を生じさせる。そこで、環境性の合図の知覚を改変または遮断することによって、推定可能な方法でこのような動物の行動を変化させることができる。このような変化は、ヒトを刺す昆虫や農害虫の宿主発見行動のようなヒトの健康および福祉に破壊的作用をもたらす生得の行動を妨害または変化させる強力な手段を与える。
【０００７】
交配相手、栄養源および産卵に適切な場所の位置確認および選択のような多数の昆虫行動は、環境内での特定ニオイの認識によって推進される。例えば、雄ｈａｗｋｗｏｒｍ  ｍｏｔｈである、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａは、同一種の雌が産生する極めて低濃度のフェロモンと呼ばれる誘引性のニオイを検知でき、そしてこの感覚を使用して長距離に渡って雌を追跡する（ヒルデブランド（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ），１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’１  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：６７−７４）。カリフォルニアのアーモンドの害虫である雌ｎａｖｅｌ  ｏｒａｎｇｅｗｏｒｍ  ｍｏｔｈである、Ａｍｙｅｌｏｉｓ ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａは、アーモンドの実およびアーモンド上での接触する幼虫が発する揮発性ニオイに反応して誘引され、彼らにとって好ましい宿主植物上に産卵する（カーティス（Ｃｕｒｔｉｓ）およびクラーク（Ｃｌａｒｋ），１９７９，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８：３３０−３３３；フェラン（Ｐｈｅｌａｎ）ら，１９９１，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｃｏｌ．１７：５９９−６１４）。蟻のような社会性昆虫は、例えば他のコロニーからの侵入蟻の認識および攻撃における情報伝達において化学的合図を広範囲に使用する（ホルドブラー（Ｈｏｌｌｄｏｂｌｅｒ）およびウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ），１９９０，Ｔｈｅ  Ａｎｔｓ，Ｂｅｌｋｎａｐ  Ｐｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）。最後に、主要なマラリアキャリアーであるガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）を含む多数の種の雌の蚊は、ヒトに特異的な臭いを検出することによってヒト宿主に向かい、所在を確認する（タッケン（Ｔａｋｋｅｎ）およびクノルズ（Ｋｎｏｌｓ），１９９９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４４：１３１−１５７；Ｂｏｃｋ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｅｗ編集，１９９６，Ｏｌｆａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｓｑｕｉｔｏ−Ｈｏｓｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）、（Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ２００），Ｗｉｌｅｙ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ）。嗅覚の分子的機序の理解における近年の進歩は、それにより、これらのニオイ合図が特異的行動を引き出す機序についての重要な新しい洞察を提供する。これらの前進は、有害な昆虫種を行動に基づいて防除するための新規ツールを開発する刺激的な機会を提供する。
【０００８】
２．２．昆虫嗅覚の分子生物学
昆虫は、特別な嗅覚器官、つまり触角および上顎触肢を使用して環境中のニオイを認識する。触角は、頭部から伸びた高度に進化した構造であり、生体の全長に等しいサイズに達することがある。上顎触肢は、吻に隣接する１対の棍棒状の構造である。触角および上顎触肢は、たいていは無視できるほど低濃度の臭気物質を検出できる特殊な機構を備えた神経細胞を含有する極めて小さな感覚毛に覆われている。ニオイを検出する際の最初の工程は、これらの神経細胞の表面上に存在する特異的レセプター分子への臭気物質の結合を必要とする。
【０００９】
近年、嗅覚レセプターをコードするほぼ６０個の遺伝子のファミリーが昆虫モデルの果実蝿キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のゲノム内で同定されている（ヴォスシャル（Ｖｏｓｓｈａｌｌ）ら，１９９９，Ｃｅｌｌ，９６：７２５−７３６；クリン（Ｃｌｙｎｅ）ら，１９９９，Ｎｅｕｒｏｎ  ２２：３２７−３３８；ガオ（Ｇａｏ）およびチェス（Ｃｈｅｓｓ），１９９９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６０：３１−３９；ヴォスシャル（Ｖｏｓｓｈａｌｌ）ら，２０００，Ｃｅｌｌ，１０２：１４７−１５９）。これらの嗅覚レセプターは、７個の推定膜貫通ドメインを有しており、Ｇ−タンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）と呼ばれる大きなタンパク質スーパーファミリーに属する。これらのレセプター遺伝子のうちの４２の発現は、触角または上顎触肢内において小さな重複しない嗅覚ニューロンのサブセット内で検出されている（ヴォスシャル（Ｖｏｓｓｈａｌｌ）ら，２０００，Ｃｅｌｌ  １０２：１４７−１５９）。この遺伝子ファミリーの大きなサイズ、それらの７個の膜貫通ドメインを含有するＧＰＣＲとしての推定された同一性、および嗅覚ニューロン中でのそれらの選択的発現は、ハエにおける嗅覚認識のプロセスに関係することを強く意味している。より近年には、機能的研究（ウェッツェル（Ｗｅｔｚｅｌ）ら，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９３７７−９３８０；ストートクール（Ｓｔｏｒｔｋｕｈｌ）およびケットラー（Ｋｅｔｔｌｅｒ），２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：９３８１−９３８５）は、これらのショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）嗅覚レセプター遺伝子産物の１つに対する候補リガンドを同定し、それらが行動的に重要な臭気物質のレセプターとしての同一性を確証した。
【００１０】
個々の嗅覚ニューロンは単一嗅覚レセプター遺伝子を発現するという法則の１の顕著な例外は、触角および上顎触肢中の全部ではなくともほとんどの嗅覚ニューロンによって発現する嗅覚レセプターＯｒ８３ｂ（以前はＡ４５として知られていた；ヴォスシャル（Ｖｏｓｓｈａｌｌ）ら，１９９９，Ｃｅｌｌ，９６：７２５−７３６）である。そこで、嗅覚ニューロンは実際に２種の嗅覚レセプター遺伝子を発現すると思われる：「偏在性（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）」嗅覚レセプター遺伝子Ｏｒ８３ｂ、および他の「古典的（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）」嗅覚レセプター遺伝子の１種。
【００１１】
ショウジョウバエに関するまた別の分子遺伝学的研究は、昆虫における嗅覚処理の論理についての追加の洞察を提供してきた。昆虫の脳は触角が嗅いだものをどうやって知るのであろうか。発現に関する研究は、個々の嗅覚ニューロンは、各神経細胞がたった１の嗅覚レセプター遺伝子しか発現しないことを機能的特徴とすることを明らかにした（ヴォスシャル（Ｖｏｓｓｈａｌｌ）ら，１９９９，Ｃｅｌｌ，９６：７２５−７３６）。同一レセプターを発現する、そしてこのため同様のニオイに反応する嗅覚ニューロンは、脳内の一定の地点に収束する軸索を伸ばしている（ヴォスシャル（Ｖｏｓｓｈａｌｌ）ら，２０００，Ｃｅｌｌ  １０２：１４７−１５９）。様々のニューロンは様々な地点に収束する。その後には直ちに、所与のニオイが触角内の小群のニューロンを活性化させ、これは順に昆虫脳内の別個の空間的パターンを活性化させる。このため知覚されたニオイの質は脳内の活性化空間のパターンによって決定される。これらのパターンはその後で解釈されて、誘引、反発、飛翔、交配および摂食のような適切な行動反応が引き出される。有害または危害を加える昆虫種におけるこのような行動を変調する臭気物質は、これらの有害または危害を加える昆虫集団を防除する際に極めて価値があろう。
【００１２】
ここでの参考文献の言及は、このような参考文献を本発明の先行技術と是認したものと見なすべきではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
３．発明の要約
本発明者は、農業生産やヒトの健康に大きな影響を及ぼす種を含む数種の双翅目、鱗翅目および直翅目種において「偏在性（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）性」ショウジョウバエ嗅覚レセプター遺伝子Ｏｒ８３ｂのホモログを同定した。Ｏｒ８３ｂは昆虫種間で高度に保存されており、昆虫嗅覚機能においてこの遺伝子が重要な役割を果たすことを示唆している。Ｏｒ８３ｂの広範囲の発現は、農作物の害虫であるタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、マラリア蚊であるガンビエハマダラカ、イナゴ（ｌｏｃｕｓｔ）であるアメリカイナゴ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、および地中海ミバエのチチュウカイミバエ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ ｃａｐｉｔａｔａ）における嗅覚ニューロン中で検出された。このためこれらのデータは、Ｏｒ８３ｂ活性を標的とする化合物はヒトの健康および福祉に対して有害な数多くの昆虫種の防除において有用であるという考えを支持している。Ｏｒ８３ｂ活性を刺激または遮断する天然または合成化合物は嗅覚駆動行動を崩壊させるので、害虫種を防除および管理するための新規ツールとして有用であろう。
【００１４】
本発明者による害虫種におけるＯｒ８３ｂホモログの同定は、安全かつ有効な昆虫防除製品を開発するための以下のストラジーを可能にする：第１に、機能的嗅覚レセプター分子を培養細胞またはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞中で産生させる、またはトランスジェニック昆虫中で過剰発現させる。Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する細胞は、害虫嗅覚レセプターと相互作用する新規化合物を迅速かつ効率的に発見するためのスクリーニングツールとして使用できる。このスクリーニング方法を使用すると、「スーパーアゴニスト」として機能する化合物、すなわち天然アゴニストより高親和性でレセプターに結合する化合物を同定することができる。さらに、類似のスクリーニング法を使用すると、レセプター機能を不活性化または拮抗（アンタゴナイズ）する化合物を単離し、嗅覚駆動行動を妨害するための強力かつ選択的な化学薬品を提供することができる。
【００１５】
このようなスクリーニングにおいて同定される化合物は、罠または局所的毒素へ昆虫を引きつけるため、害虫をモニタリングするため、昆虫を個人または住宅区域へ寄せ付けないため、または昆虫が食品および宿主の位置を突き止めることができないように嗅覚系の機能を妨害するために使用できる。異なる昆虫種は餌および宿主に関して高度に特殊な嗜好を有しており、これらの行動を媒介する嗅覚レセプターは種間で極めて大きく相違するので、嗅覚を標的とする防除ストラジーは害虫を撲滅するための強力かつ選択的アプローチを提供する。非選択的殺虫剤とは対照的に、このような製品には害虫防除剤として幅広い適用性がある。殺虫剤、防虫剤または誘引剤のいずれのために使用しても、これらの物質は選択的に疾患媒介生物を標的とし、有益な昆虫種、昆虫捕食者およびその他の動物にとっては無害であると推定できる。さらに、行動に基づくストラジーは化学的殺虫剤および遺伝子組み換え作物より小さい選択的圧力を提示するので、これらのストラジーは殺虫剤耐性昆虫媒介生物の出現を減少させるのに役立つと推定される。そこで、この方法を使用して同定された化合物は虫害および疾患の蔓延を制御するための新規アプローチを提供し、そして組織的な昆虫防除プログラムへ直接的および間接的影響を及ぼして有毒殺虫剤への依存を大きく減少させるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
１の側面では、本発明は昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターまたはＯｒ８３ｂレセプターのフラグメントまたはモチーフをコードする核酸を提供する。
【００１７】
ある実施形態では、本発明は配列番号：１２のアミノ酸配列またはその少なくとも１０、１５または２０アミノ酸のフラグメントを備える第１モチーフを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸を提供するが、このとき前記ポリペプチド分子は昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントである。１の実施形態では、前記ポリペプチド分子の配列は配列番号：１０内では見いだされない。また別の実施形態では、前記ポリペプチド分子の配列は配列番号：１０ではない。
【００１８】
本発明はさらにまた配列番号：１２のアミノ酸配列またはその少なくとも１０、１５または２０アミノ酸のフラグメントを備える第１昆虫Ｏｒ８３ｂモチーフを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸を提供するが、このとき前記ポリペプチド分子は昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントであり、前記ポリペプチド分子はさらに配列番号：１３のアミノ酸配列または配列番号：１３の１０アミノ酸のフラグメントを備える第２モチーフを備える。
【００１９】
本発明はさらにまた配列番号：１２のアミノ酸配列またはその少なくとも１０、１５または２０アミノ酸のフラグメントを備える第１昆虫Ｏｒ８３ｂモチーフを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸を提供するが、このとき前記ポリペプチド分子は昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントであり、前記ポリペプチド分子はさらに配列番号：１４のアミノ酸配列または配列番号：１４の少なくとも１０アミノ酸のフラグメントを備える第２モチーフを備える。ある特定の実施形態では、配列番号：１４のフラグメントは少なくとも１５または２０アミノ酸である。他の特定の実施形態では、配列番号：１４のモチーフは配列番号：１５、１６または１７を備える。
【００２０】
本発明はさらにまた配列番号：１２のアミノ酸配列またはその少なくとも１０、１５または２０アミノ酸のフラグメントを備える第１昆虫Ｏｒ８３ｂモチーフを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸を提供するが、このとき前記ポリペプチド分子は昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントであり、前記ポリペプチド分子はさらに配列番号：１８のアミノ酸配列または配列番号：１８の少なくとも１０アミノ酸のフラグメントを備える第２モチーフを備える。ある特定の実施形態では、配列番号：１８のフラグメントは少なくとも１５または２０アミノ酸である。
【００２１】
本発明はさらにまた、配列番号：１３のアミノ酸配列またはその１０アミノ酸のフラグメントを備える第１モチーフを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸を提供するが、このとき前記ポリペプチド分子は昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントである。１の実施形態では、前記ポリペプチド分子の配列は配列番号：１０内では見いだされない。また別の実施形態では、前記ポリペプチド分子の配列は配列番号：１０ではない。
【００２２】
本発明はさらにまた配列番号：１３のアミノ酸配列またはその１０アミノ酸のフラグメントを備える第１昆虫Ｏｒ８３ｂモチーフを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸を提供するが、このとき前記ポリペプチド分子は昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントであり、前記ポリペプチド分子はさらに配列番号：１４のアミノ酸配列または配列番号：１４の少なくとも１０アミノ酸のフラグメントを備える第２モチーフを備える。ある特定の実施形態では、配列番号：１４のフラグメントは少なくとも１５または２０アミノ酸である。他の特定の実施形態では、配列番号：１４のモチーフは配列番号：１５、１６または１７を備える。
【００２３】
本発明はさらにまた配列番号：１３のアミノ酸配列またはその１０アミノ酸のフラグメントを備える第１昆虫Ｏｒ８３ｂモチーフを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸を提供するが、このとき前記ポリペプチド分子は昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントであり、前記ポリペプチド分子はさらに配列番号：１８のアミノ酸配列または配列番号：１８の少なくとも１０アミノ酸のフラグメントを備える第２モチーフを備える。ある特定の実施形態では、配列番号：１８のフラグメントは少なくとも１５または２０アミノ酸である。
【００２４】
そこで、本発明は、配列番号：１４のアミノ酸配列またはその少なくとも１０、１５または２０アミノ酸のフラグメントを備える第１昆虫Ｏｒ８３ｂモチーフを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸を提供するが、このとき前記ポリペプチド分子は昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントである。１の実施形態では、前記ポリペプチド分子の配列は配列番号：１０内では見いだされない。また別の実施形態では、前記ポリペプチド分子の配列は配列番号：１０ではない。ある特定の実施形態では、配列番号：１４のモチーフは配列番号：１５、１６または１７を備える。
【００２５】
本発明はさらにまた配列番号：１４のアミノ酸配列またはその少なくとも１０、１５または２０アミノ酸のフラグメントを備える第１昆虫Ｏｒ８３ｂモチーフを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸を提供するが、このとき前記ポリペプチド分子は昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントであり、前記ポリペプチド分子はさらに配列番号：１８のアミノ酸配列または配列番号：１８の少なくとも１０アミノ酸のフラグメントを備える。ある特定の実施形態では、配列番号：１８のフラグメントは少なくとも１５または２０アミノ酸である。
【００２６】
本発明はさらにまた、配列番号：１２、１３、１４または１８の３つ以上のアミノ酸配列または配列番号：１２、１３、１４または１８の少なくとも１０アミノ酸のフラグメントを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸を提供するが、このとき前記ポリペプチド分子は昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントである。あるいはまた、本発明は配列番号：１２、１３、１４および１８のアミノ酸配列または配列番号：１２、１３、１４および１８の少なくとも１０アミノ酸のフラグメントを備えるポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸を提供するが、このとき前記ポリペプチド分子は昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはそのフラグメントである。１の実施形態では、前記ポリペプチド分子の配列は配列番号：１０内では見いだされない。また別の実施形態では、前記ポリペプチド分子の配列は配列番号：１０ではない。ある特定の実施形態では、配列番号：１４は配列番号：１５、１６、または１７を備える。
【００２７】
本発明のまた別の態様では、昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドをコードする核酸を同定する方法が提供される。１の実施形態では、昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドをコードする核酸を同定する方法は、配列番号：１２、１３または１４の少なくとも６アミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオチドまたはその相補体を備えるフォワードプライマーと、配列番号：１３、１４または１８の少なくとも６アミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオチドまたはその相補体を備えるリバースプライマーと、を用いて昆虫ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する工程と；その後でＰＣＲ増幅産物を検出する工程と、それにより昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドをコードする核酸を同定する工程と、を備える。リバースプライマーは、フォワードプライマーの下流にある核酸配列に相当する。該実施形態の好ましい様式では、ＰＣＲ増幅は少なくとも１５０ヌクレオチドの産物を生じさせる。
【００２８】
本発明のさらにまた別の態様では、昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドおよび昆虫Ｏｒ８３ｂポリペプチドフラグメントが提供される。
【００２９】
ある実施形態では、本発明は配列番号：１１に示した配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも８０％、９０％、または９５％同一性を有するアミノ酸の配列を備える精製ポリペプチドを提供する。１の実施形態では、該アミノ酸配列は配列番号：１０内で見いだされない。また別の実施形態では、該アミノ酸配列は配列番号：１０を備えていない。１の好適な実施形態では、前記ポリペプチドは配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、および配列番号：８からなる群から選択されたアミノ酸配列によって規定されたポリペプチドにも結合する抗体によって結合され得る。
【００３０】
１の特定の実施形態では、本発明は配列番号：１１に示したアミノ酸配列またはその少なくとも２０の連続アミノ酸のフラグメントを備える精製ポリペプチドを提供する。１の実施形態では、該アミノ酸配列は配列番号：１０において見いだされない。また別の実施形態では、該アミノ酸配列は配列番号：１０を備えていない。
【００３１】
他の特定の実施形態では、本発明は配列番号：１１に示した配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも８０％、９０％、または９５％同一性を有するアミノ酸の配列を備える精製ポリペプチドを提供するが、このとき前記ポリペプチドは配列番号：２に示したような、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７３が指定されているプラスミドのインサートによってコードされた配列の少なくとも２０、３０または５０の連続アミノ酸を備える。ある特定の実施形態では、本発明は配列番号：２に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７３が指定されたプラスミドのインサートによってコードされたアミノ酸配列を備える精製ポリペプチドを提供する。
【００３２】
他の特定の実施形態では、本発明は配列番号：１１に示した配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも８０％、９０％、または９５％同一性を有するアミノ酸配列を備える精製ポリペプチドを提供するが、このとき前記ポリペプチドは配列番号：４に示したような、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７４が指定されているプラスミドのインサートによってコードされた配列の少なくとも２０、３０または５０の連続アミノ酸を備える。ある特定の実施形態では、本発明は配列番号：４に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７４が指定されたプラスミドのインサートによってコードされたアミノ酸配列を備える精製ポリペプチドを提供する。
【００３３】
さらにその他の特定の実施形態では、本発明は配列番号：１１に示した配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも８０％、９０％、または９５％同一性を有するアミノ酸配列を備える精製ポリペプチドを提供するが、このとき前記ポリペプチドは配列番号：６に示したような、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７５が指定されているプラスミドのインサートによってコードされた配列の少なくとも２０、３０または５０の連続アミノ酸を備える。ある特定の実施形態では、本発明は配列番号：６に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７５が指定されたプラスミドのインサートによってコードされたアミノ酸配列を備える精製ポリペプチドを提供する。
【００３４】
さらにその他の特定の実施形態では、本発明は配列番号：１１に示した配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも８０％、９０％、または９５％同一性を有するアミノ酸の配列を備える精製ポリペプチドを提供するが、このとき前記ポリペプチドは配列番号：８に示したような、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７６が指定されているプラスミドのインサートによってコードされた配列の少なくとも２０、３０または５０の連続アミノ酸を備える。ある特定の実施形態では、本発明は配列番号：８に示した、またはＡＴＣＣに寄託されてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３５７６が指定されたプラスミドのインサートによってコードされたアミノ酸配列を備える精製ポリペプチドを提供する。
【００３５】
本発明はさらにまた、上記のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を備える単離核酸を提供する。ある実施形態では、ヌクレオチド配列は機能的にプロモーターに連結している。本発明はさらにまた、上記のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を備えるベクターを提供する。本発明はさらにまた、上記のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を備える核酸を用いて形質転換された宿主細胞を提供する。
【００３６】
各配列番号がどのＯｒ８３ｂ関連配列に対応するのかを下記の表１に示す。
【００３７】
【表１】
2005510209.tif 000003
【００３８】
本発明のさらにまた別の態様では、例えば昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターに結合する、および／または昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターの活性を変調（すなわち、作用（アゴナイズ）または拮抗（アンタゴナイズ））する臭気物質のような分子を同定するためのスクリーニング方法を提供する。一般に、Ｏｒ８３ｂレセプターは配列番号：１１に示した配列の少なくとも２０の連続アミノ酸に対して少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を備える。最も好ましくは、該スクリーニング方法で使用する昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターは配列番号：１０によってコードされるキイロショウジョウバエＯｒ８３ｂレセプターではない、またはキイロショウジョウバエＯｒ８３ｂレセプターを備えていない。他の好適な実施形態では、該スクリーニング方法で使用する昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターは配列番号：１０によってコードされるキイロショウジョウバエＯｒ８３ｂレセプターにおいて存在しないアミノ酸配列を備える。
【００３９】
１の実施形態では、本発明はＯｒ８３ｂレセプターに結合する分子を同定する方法であって：（ａ）第１細胞および第２細胞と試験分子とをＯｒ８３ｂレセプターと前記試験分子との結合を導く条件下で接触させる工程であって、このとき第１細胞は好ましくは細胞表面上でＯｒ８３ｂレセプターを発現し、そして第２細胞はＯｒ８３ｂレセプターを発現せず、さらにこのとき第１細胞および第２細胞は同一細胞タイプである、工程と；および（ｂ）試験分子が第１細胞または第２細胞に結合するかどうかを決定する工程であって、このとき第１細胞には結合するが第２細胞には結合しない分子はＯｒ８３ｂレセプターに結合する分子である、工程と、を備える方法を提供する。
【００４０】
本発明はさらにまた、Ｏｒ８３ｂレセプターのモジュレーターを同定するための方法であって：（ａ）第１細胞および第２細胞と試験分子とをＯｒ８３ｂレセプターと前記試験分子との結合を導く条件下で接触させる工程であって、このとき第１細胞は好ましくは細胞表面上でＯｒ８３ｂレセプターを発現し、そして第２細胞はＯｒ８３ｂレセプターを発現せず、さらにこのとき第１細胞および第２細胞が同一細胞タイプである、工程と；および（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞または第２細胞においてＧ−タンパク質活性を変調するかどうかを決定する工程であって、このとき第１細胞においてＧ−タンパク質活性を変調するが第２細胞においてはＧ−タンパク質活性を変調しない分子はＯｒ８３ｂモジュレーターである、工程と、を備える方法を提供する。ある実施形態では、Ｇ−タンパク質活性は前記細胞中のカルシウムイオンまたは環状ＡＭＰを測定することによって決定される。
【００４１】
本発明はさらにまた、第１種からのＯｒ８３ｂレセプターには結合するが第２種からのＯｒ８３ｂレセプターには結合しない分子を同定するための方法であって：（ａ）前記第１種からの好ましくは細胞表面上で第１Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する第１細胞と試験分子とを前記第１レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞に結合するかどうかを決定する工程と；（ｃ）前記第２種からの第２Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する第２細胞と前記試験分子とを前記第２レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、このとき前記第２細胞は第１細胞と同一細胞タイプである、工程と；および（ｄ）前記試験分子が前記第２細胞に結合するかどうかを決定する工程であって、このとき第１細胞には結合するが第２細胞には結合しない試験分子は第１種からのＯｒ８３ｂレセプターには結合するが第２種からのＯｒ８３ｂレセプターには結合しない工程と、を備える方法を提供する。
【００４２】
本発明はさらにまた、第２種からではなく第１種からのＯｒ８３ｂレセプターのモジュレーターを同定するための方法であって：（ａ）前記第１種からの好ましくは細胞表面上で第１Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する第１細胞と試験分子とを前記第１レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞中のＧ−タンパク質活性を変調させるかどうかを決定する工程と；（ｃ）前記第２種からの第２Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する第２細胞と前記試験分子とを前記第２レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、このとき前記第２細胞は第１細胞と同一細胞タイプである、工程と；および（ｄ）前記試験分子が前記第２細胞中のＧ−タンパク質活性を変調させるかどうかを決定する工程であって、このとき第１細胞中のＧ−タンパク質活性を変調させるが第２細胞中のＧ−タンパク質活性を変調させない試験分子は第１種からのＯｒ８３ｂレセプターを変調させるが第２種からのＯｒ８３ｂレセプターを変調させない工程と、を備える方法を提供する。
【００４３】
本発明はさらにまた、昆虫嗅覚レセプターに結合する臭気物質を同定する方法であって：（ａ）第１細胞および第２細胞を昆虫嗅覚レセプターと前記試験分子との結合を導く条件下で試験分子と接触させる工程であって、このとき第１細胞は好ましくは細胞表面上で昆虫嗅覚レセプターおよびＯｒ８３ｂレセプターを発現し、そして第２細胞はどちらのレセプターも発現せず、または嗅覚レセプターだけを発現する、またはＯｒ８３ｂレセプターだけを発現し、さらにこのとき第１細胞および第２細胞は同一細胞タイプである工程と；および（ｂ）試験分子が第１細胞または第２細胞に結合するかどうかを決定する工程であって、このとき第１細胞に結合するが第２細胞には結合しない分子は昆虫嗅覚レセプターに結合する臭気物質である、工程と、を備える方法を提供する。
【００４４】
本発明はさらにまた、昆虫嗅覚レセプターの活性を変調する臭気物質を同定する方法であって：（ａ）第１細胞および第２細胞を昆虫嗅覚レセプターと前記試験分子との結合を導く条件下で試験分子と接触させる工程であって、このとき第１細胞は好ましくは細胞表面上で昆虫嗅覚レセプターおよびＯｒ８３ｂレセプターを発現し、そして第２細胞はどちらのレセプターも発現しないか、または、嗅覚レセプターだけを発現する、または、Ｏｒ８３ｂレセプターだけを発現し、さらにこのとき第１細胞および第２細胞は同一細胞タイプである、工程と；および（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞または第２細胞中のＧ−タンパク質活性を変調するかどうかを決定する工程であって、このとき第１細胞中のＧ−タンパク質活性を変調するが第２細胞中のＧ−タンパク質活性を変調しない分子は昆虫嗅覚レセプターの活性を変調する臭気物質である、工程と、を備える方法を提供する。ある実施形態では、Ｇ−タンパク質活性は前記細胞中のカルシウムイオンまたは環状ＡＭＰを測定することによって決定される。
【００４５】
本発明はさらにまた、第１昆虫嗅覚レセプターに結合するが第２昆虫嗅覚レセプターには結合しない臭気物質を同定する方法であって：（ａ）好ましくは細胞表面上でＯｒ８３ｂレセプター、そして、好ましくは細胞表面上で第１昆虫嗅覚レセプターを発現する第１細胞を、前記第１レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で、試験分子に接触させる工程と；（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞に結合するかどうかを決定する工程と；（ｃ）Ｏｒ８３ｂレセプター、および、第２昆虫嗅覚レセプターとを発現する第２細胞を、第２レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、このとき前記第２細胞は第１細胞と同一細胞タイプである、工程と；および（ｄ）前記試験分子が第２細胞に結合するかどうかを決定する工程であって、このとき第１細胞に結合するが第２細胞には結合しない試験分子が第１昆虫嗅覚レセプターには結合するが第２昆虫嗅覚レセプターには結合しない臭気物質である、工程と、を備える方法を提供する。
【００４６】
本発明はさらにまた、第１昆虫嗅覚レセプターの活性を変調するが第２昆虫嗅覚レセプターの昆虫嗅覚レセプターの活性を変調しない臭気物質を同定する方法であって：（ａ）好ましくは細胞表面上でＯｒ８３ｂレセプター、そして、好ましくは細胞表面上で第１昆虫嗅覚レセプターを発現する第１細胞と試験分子とを、レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞に結合するかどうかを決定する工程と；（ｃ）Ｏｒ８３ｂレセプターおよび第２昆虫嗅覚レセプターを発現する第２細胞を、該レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、このとき前記第２細胞は第１細胞と同一細胞タイプである、工程と；および（ｄ）前記試験分子が第２細胞に結合するかどうかを決定する工程であって、このとき第１細胞に結合するが第２細胞には結合しない試験分子は第１昆虫嗅覚レセプターには結合するが第２昆虫嗅覚レセプターには結合しない臭気物質である、工程と、を備える方法を提供する。
【００４７】
本発明はさらにまた、昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターに結合するが昆虫味覚レセプターには結合しない分子を同定する方法であって：（ａ）好ましくは細胞表面上でＯｒ８３ｂレセプターを発現する第１細胞と試験分子とを該レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞に結合するかどうかを決定する工程と；（ｃ）好ましくは細胞表面上で昆虫味覚レセプターを発現する第２細胞を該レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、このとき前記第２細胞は第２細胞と同一細胞タイプである、工程と；および（ｄ）前記試験分子が第２細胞に結合するかどうかを決定する工程であって、このとき第１細胞に結合するが第２細胞には結合しない試験分子が昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターには結合するが昆虫味覚レセプターには結合しない分子である、工程と、を備える方法を提供する。
【００４８】
本発明はさらにまた、昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターを変調するが昆虫味覚レセプターは変調しない分子を同定する方法であって：（ａ）好ましくは細胞表面上でＯｒ８３ｂレセプターを発現する第１細胞と試験分子とを該レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記試験分子が前記第１細胞中のＧ−タンパク質活性を変調させるかどうかを決定する工程と；（ｃ）好ましくは細胞表面上で昆虫味覚レセプターを発現する第２細胞を該レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程であって、このとき前記第２細胞は第１細胞と同一細胞タイプである、工程と；および（ｄ）前記試験分子が前記第２細胞中のＧ−タンパク質活性を変調させるかどうかを決定する工程であって、このとき第１細胞中のＧ−タンパク質活性を変調させるが第２細胞中のＧ−タンパク質活性を変調させない試験分子は昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターの活性を変調させるが昆虫味覚レセプターの活性を変調させない、工程と、を備える方法を提供する。
【００４９】
本発明のさらにまた別の態様では、上記のＯｒ８３ｂ結合分子またはモジュレーターの１または２以上および適切な担体を備える昆虫防除剤調製物が提供される。１の実施形態では、昆虫防除剤は防虫剤である。また別の実施形態では、昆虫防除剤は昆虫誘引剤である。担体は固体担体または液体担体であってよい。適切な担体の例は下記の５章９節に記載した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
４．  図面の簡単な説明
図１．キイロショウジョウバエＯｒ８３ｂのヌクレオチド酸配列（配列番号：９）およびアミノ酸配列（配列番号：１０）を示した。アミノ酸は１文字表記した。
図２．ＰＣＲ増幅によって入手されたチチュウカイミバエＯｒ８３ｂオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号：１）およびそのコードされたタンパク質（配列番号：２）を示した。
図３．タバコガ（Ｃｏｒｎ  Ｅａｒｗｏｒｍ）Ｏｒ８３ｂ  ｃＤＮＡの完全配列（配列番号：３）およびそのコードされた推定タンパク質（配列番号：４）を示した。
図４．ハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって入手されたガンビエハマダラカＯｒ８３ｂオープンリーディングフレーム（配列番号：５）のヌクレオチド配列およびそのコードされた推定タンパク質（配列番号：６）を示した。
図５．アメリカイナゴ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）Ｏｒ８３ｂ  ｃＤＮＡのコード領域（配列番号：７）およびそのコードされた推定タンパク質（配列番号：８）を示した。
図６．Ｏｒ８３ｂタンパク質の配列アライメント。ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ，  ＡｌｉｇｎＸ  ｐｒｏｇｒａｍ，  Ｉｎｆｏｒｍａｘ，  Ｉｎｃ．）を使用してＧＥＮＳＣＡＮまたはｃＤＮＡ配列から推定されるタンパク質配列をアライメントした。同一アミノ酸は黒色で示した；類似アミノ酸はグレーで陰影を付けた。ＣｌｕｓｔａｌＷアライメントから引き出されたコンセンサスＯｒ８３ｂアミノ酸配列（配列番号：１１）もまた示した。
図７Ａ〜Ｅ．嗅覚組織におけるＯｒ８３ｂ遺伝子の発現。
図７Ａ）代表的な昆虫嗅覚感覚毛の断面図を示した略図である。感覚毛は、臭気物質（赤色球）の中心空洞内への拡散を許容する孔を備える液体が充填された中空構造である。各感覚毛の下方に位置する嗅覚ニューロンのクラスター（青色）は感覚毛の腔内へ樹状突起を伸ばしている。臭気物質とこれらの樹状突起上に局在する嗅覚レセプターとの相互作用は、脳へ伝播される電気的信号の産生を生じさせる。
図７Ｂ）チチュウカイミバエＯｒ８３ｂアンチセンスプローブが成体触角の長手方向断片へハイブリダイズさせた。多数のＯｒ８３ｂ発現細胞が検出されている（矢印）。
図７Ｃ）成体雌ガンビエハマダラカ触角の長手方向断片がＯｒ８３ｂアンチセンスプローブを用いてハイブリダイズされ、アルカリホスファターゼにより可視化された。
代表的なＯｒ８３ｂ発現細胞を矢印で指示した。
図７Ｄ）タバコガＯｒ８３ｂアンチセンスプローブが成体雌触角の長手方向断片へハイブリダイズされた。多数のＯｒ８３ｂ発現細胞が嗅覚感覚毛の下方でクラスター形成している各触角セグメントにおいて検出されている。
図７Ｅ）アメリカイナゴＯｒ８３ｂアンチセンスプローブが成体雌触角の長手方向断片へハイブリダイズされた。多数のＯｒ８３ｂ発現細胞が嗅覚感覚毛の下方でクラスター形成している各触角セグメントにおいて検出されている。
図８Ａ〜８Ｈ．図８Ａ、８Ｃ、８Ｅ、および８Ｇは各々チチュウカイミバエ、ガンビエハマダラカ、タバコガ、およびアメリカイナゴＯｒ８３ｂレセプターの親水性プロットである（カイト（Ｋｙｔｅ）およびドゥーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ），１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２に記載されている通り）。図８Ｂ、８Ｄ、８Ｆ、および８Ｈは各々チチュウカイミバエ、ガンビエハマダラカ、タバコガ、およびアメリカイナゴＯｒ８３ｂレセプターの膜貫通ドメインの推定である（フォン・ヒエイネ（ｖｏｎ  Ｈｉｅｊｎｅ），１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２５：４８７−４９４に記載されている通り）。
【００５１】
５．発明の詳細な説明
ここに記載するのは、昆虫ゲノムにおける新規Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子を探索するためのストラジーである。このストラジーは、キイロショウジョウバエのＯｒ８３ｂレセプターに関連するＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質をコードする新規昆虫嗅覚レセプター遺伝子を同定することに成功した。様々な昆虫種間で高度に保存されたタンパク質をコードする新規昆虫嗅覚レセプター遺伝子は、害虫防除剤にとっての極めて有用な標的を構成する。
【００５２】
そこで本発明は、昆虫Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子によってコードされるタンパク質および昆虫Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。１の特定の実施形態では、本発明はチチュウカイミバエ、タバコガ、ガンビエハマダラカ、またはアメリカイナゴからのＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子によってコードされるタンパク質およびＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子の核酸配列に関する。本発明はさらにまた、そのようなＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のフラグメントおよびその他の誘導体およびアナログに関する。１の好適な実施形態では、これらのタンパク質、フラグメントおよびその他の誘導体およびアナログはキイロショウジョウバエ配列ではない。１の好適な実施形態では、これらのタンパク質、フラグメントおよびその他の誘導体およびアナログはキイロショウジョウバエ配列中では見いだされない。１の更に好適な実施形態では、これらのタンパク質、フラグメントおよびその他の誘導体およびアナログはキイロショウジョウバエ配列を備えていない。１の好適な実施形態では、これらのタンパク質、フラグメントおよびその他の誘導体およびアナログはキイロショウジョウバエ配列で見いだされる配列を備えていないが、このときキイロショウジョウバエ配列はキイロショウジョウバエアミノ酸配列の１０、２０、３０、５０、７５、１００または２００の連続アミノ酸である。このようなフラグメントまたは誘導体をコードする核酸もまた本発明の範囲内である。例えば組み換え法によるような、上記のタンパク質の製造を提供する。
【００５３】
本発明はさらに、多数のＯｒ８３ｂ種のアライメントから引き出されたコンセンサスＯｒ８３ｂ配列を提供する。
【００５４】
本発明はさらに、昆虫Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプターの１または２以上のモチーフを備えるＯｒ８３ｂタンパク質のフラグメント（およびそれらの誘導体およびアナログ）に関する。
【００５５】
更に、Ｏｒ８３ｂタンパク質に対する抗体、その他の誘導体およびアナログが提供される。
【００５６】
昆虫Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子のクローニングおよび特徴付けを特に開示している下記の第６章に記載した実施例によって本発明を具体的に説明する。
【００５７】
本発明の核酸およびポリペプチドは単離または精製することができる。
【００５８】
ここで核酸分子またはヌクレオチド配列を説明するときに使用する「単離（された）」または「精製（された）」は、核酸分子の天然源中に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子またはヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、「単離」核酸分子には、該核酸が由来する生体のゲノムＤＮＡにおいて核酸（好ましくはタンパク質コード配列）を自然に隣接する配列（すなわち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含んでいない。さらにｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は実質的に他の細胞性物質、または組み換え法によって精製したときは培地を含んでいなくてよい、または化学合成されたときは化学的前駆物質または他の化学薬品を実質的に含んでいなくてよい。ここで使用する単離核酸は、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリーまたは発現ライブラリーのようなライブラリー中に存在する核酸を含んでいない。１の特定の実施形態では、本発明の単離核酸はイントロンを含有していない。別の実施形態では、本発明の単離核酸はＧｅｎｂａｎｋ（ジーンバンク）受託番号ＡＬ１５２６２６に示された配列またはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＬ１４１７１２に示された配列を有していない。別の実施形態では、本発明の単離核酸はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＬ１５２６２６に示されたガンビエハマダラカ（アフリカのマラリア蚊）のＰＥＳＴ系統からのＮｏｔｒｅＤａｍｅｌライブラリーのクローン２４Ｍ０１、またはＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ａｌ１４１７１２に示されたガンビエハマダラカ（アフリカのマラリア蚊）のＰＥＳＴ系統からのＮｏｔｒｅＤａｍｅｌライブラリーのクローン０４Ｅ１５であるとして同定されたクローニングベクターおよびインサートではない。別の実施形態では、本発明の核酸はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＬ１５２６２６およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＬ１４１７１２の両方に示されたハマダラカ核酸配列に由来する配列を有する。
【００５９】
ここでタンパク質またはその生物学的に活性な部分（すなわち、ポリペプチドまたはペプチドフラグメント）を説明するときに使用する「単離（された）」または「精製（された）」は、そこから該タンパク質が由来する細胞または組織源からの細胞性物質または他の汚染タンパク質を実質的に含んでいない、または化学合成されるときは化学的前駆物質または他の化学薬品を実質的に含んでいないタンパク質またはその生物学的に活性な部分を意味する。実質的に細胞性物質を含んでいないタンパク質またはその生物学的に活性な部分（すなわち、ポリペプチドまたはペプチドフラグメント）には、（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％または５％未満の異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）または汚染タンパク質を有するタンパク質の調製物が含まれる。
【００６０】
用語「嗅覚レセプター（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」または「嗅覚レセプター（ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」は、嗅覚に関係するポリペプチドを意味する。「嗅覚レセプター核酸」は嗅覚に関係するポリペプチドをコードする核酸である。昆虫には２クラスの嗅覚レセプター遺伝子がある：触角および上顎触肢内の全部ではなくても大多数の嗅覚ニューロンによって発現するレセプターのＯｒ８３ｂクラス、および嗅覚ニューロンの重複しない小さなサブセット内で発現する「古典的（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）な」嗅覚レセプター遺伝子である。ここで使用する用語「Ｏｒ８３ｂレセプター」または「Ｏｒ８３ｂポリペプチド」は、以下の機能を特徴とする嗅覚レセプターのＯｒ８３ｂクラスのメンバーを意味する。
【００６１】
（ａ）図８Ａ、図８Ｃ、図８Ｅまたは図８Ｇに示したような親水性プロフィールを実質的に有している、例えば図８Ａ、図８Ｃ、図８Ｅまたは図８Ｇに示したような疎水性ピークの同一または類似の分布、または図８Ｂ、図８Ｄ、図８Ｆまたは図８Ｈに示したような膜貫通ドメイン分布を実質的に有している；または図８Ａ、図８Ｃ、図８Ｅまたは図８Ｇに示したような膜貫通ドメインの同一または類似の分布を有している；
（ｂ）昆虫触角および上顎触肢内の嗅覚ニューロンの大多数において発現する；
（ｃ）全体的なコンセンサスＯｒ８３ｂ配列（配列番号：１１）に対して少なくとも６５％同一であるタンパク質配列を備える；および
（ｄ）は該タンパク質の対応する領域において配列番号：１１のカルボキシ末端１５０アミノ酸に対して少なくとも８０％配列同一性を有する。
【００６２】
Ｏｒ８３ポリペプチドまたはＯｒ８３関連ポリペプチドのフラグメントは、少なくとも１０アミノ酸フラグメントである。好適な実施形態では、該フラグメントは２０、３０または５０アミノ酸である。他の好適な実施形態では、該フラグメントはキイロショウジョウバエ内で見いだされない、またはキイロショウジョウバエのＯｒ８３ｂポリペプチドではない、またはキイロショウジョウバエのＯｒ８３ｂポリペプチドを備えていない。
【００６３】
本発明のポリペプチドには様々な利用方法がある。それらは例えば種特異的害虫防除剤として使用できる。これらのポリペプチドは、下記の第５章８節で記載するように、害虫防除剤の行動を制御するために有用な臭気物質分子をスクリーニングするためにも使用できる。
【００６４】
明確に開示するために、そして限定するためではなく、本発明の詳細な説明を下記の節に分割する。
【００６５】
５．１．昆虫Ｏｒ８３ｂ核酸
ここではＯｒ８３ｂ遺伝子を含む昆虫Ｏｒ８３ｂ核酸について説明する。ここで使用するＯｒ８３ｂ遺伝子または遺伝子配列は以下を意味する：（ａ）図１〜５（配列番号：１、３、５、７、および９）のいずれか１つに示したヌクレオチド配列および／またはそのフラグメントの少なくとも１つ；（ｂ）図１〜６（配列番号：２、４、６、８、１０および１１）のいずれか１つに示したアミノ酸配列をコードするいずれかのヌクレオチド配列またはそのフラグメント；（ｃ）例えば約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、およびその後に約５０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中での１または２回以上の洗浄、または約６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム／７％  ＳＤＳ中でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、およびその後に約４２〜５５℃での０．２×ＳＳＣ／１％  ＳＤＳ中での１または２回以上の洗浄のようなストリンジェントな条件下、または当業者には周知の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、オースベル，エフ・エム（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら編集，１９８９，「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  第６．３．１−６．３．６および２．１０．３頁を参照）下で図１〜５（配列番号：１、３、５、７、および９）のいずれか１つに示したコーディングヌクレオチド配列の１の相補体にハイブリダイズするいずれかのヌクレオチド配列；（ｄ）例えば約４５℃での６×ＳＳＣ中でフィルターに結合した核酸へのハイブリダイゼーションおよびその後に約６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳ中での１または２回以上の洗浄、または約６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム／７％  ＳＤＳ中でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、およびその後に約６８℃での０．２×ＳＳＣ／１％  ＳＤＳ中での１または２回以上の洗浄のような高度にストリンジェントな条件下、または例えば下記に記載するような他のハイブリダイゼーション条件を含む、当業者には周知の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、オースベル，エフ・エム（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら編集、１９８９，「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  第６．３．１−６．３．６および２．１０．３頁を参照）下で図１〜５（配列番号：１、３、５、７、および９）のいずれか１つに示したコーディングヌクレオチド配列の１の補体にハイブリダイズするいずれかのヌクレオチド配列；（ｅ）（ｉ）実質的に図８Ａ、図８Ｃ、図８Ｅまたは図８Ｇに示したような親水性プロフィール、または、実質的に図８Ｂ、図８Ｄ、図８Ｆ��たは図８Ｈに示したような膜貫通ドメイン分布を備える、（ｉｉ）昆虫触角および上顎触肢中で大多数の嗅覚ニューロン中で発現する、（ｉｉｉ）総合的に共通Ｏｒ８３ｂ配列（配列番号：１１）に少なくとも６５％同一であるタンパク質配列を備える、および（ｉｖ）該タンパク質の対応する領域内の配列番号：１１のカルボキシ末端１５０アミノ酸、またはＯｒ８３ｂタンパク質のフラグメントをコードする核酸と少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであると定義されたＯｒ８３ｂポリペプチドをコードするいずれかの核酸配列；および（ｆ）上記の（ａ）〜（ｅ）に言及したＯｒ８３ｂ遺伝子または遺伝子配列のいずれかの相補体。
【００６６】
好ましくは、本発明の核酸分子は配列番号：９に記載した全体配列を有していない。他の実施形態では、本発明の核酸分子は配列番号：９に記載した配列全体を備えていない。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号：９のフラグメントが配列番号：９の２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００または５００連続核酸であることを条件に、配列番号：９に記載した核酸配列のフラグメントを備えていない。
【００６７】
好ましくは、ここに開示したＯｒ８３ｂ遺伝子配列の相補体にハイブリダイズする核酸分子は、ここに開示したＯｒ８３ｂ遺伝子配列（例えば長さ約１３５０〜１５００ヌクレオチド、より好ましくは長さ約１４１０〜１４７０ヌクレオチド、および最も好ましくは長さ約１４１６〜１４５８のオープンリーディングフレームを有する）と同一長さまたはほぼ同一長さである、および／またはさらに遺伝子産物、例えば上記の（ａ）（すなわち、長さ約４５０〜５００アミノ酸残基、より好ましくは長さ約４７０〜４９０アミノ酸残基、および最も好ましくは長さ約４７２〜４８６アミノ酸残基）のヌクレオチド配列によってコードされたＯｒ８３ｂ遺伝子産物と同一長さまたはほぼ同一長さである、および／または、上記の（ａ）のヌクレオチド配列によってコードされるＯｒ８３ｂ遺伝子産物に機能的に同等である、遺伝子産物をコードする。ここで使用する用語「機能的に同等」とは、ある実施形態では、上記に挙げたＯｒ８３ｂ遺伝子配列の１または２以上によってコードされた内因性Ｏｒ８３ｂ遺伝子産物と実質的に類似のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示すことのできる遺伝子産物（例、ポリペプチド）を意味する。あるいはまた、そして下記に記載するようなアッセイの一部として利用する場合のような一部の他の実施形態では、「機能的に同等」とは内因性Ｏｒ８３ｂ遺伝子産物の対応する部分がする実質的に類似する行状で他の細胞または細胞外分子と相互作用することのできるペプチドまたはその他の分子を意味することができる。このため機能的に同等の遺伝子産物には、同一の種または相違する種において存在する自然発生型Ｏｒ８３ｂ遺伝子産物を含むことができる。機能的に同等のＯｒ８３ｂ遺伝子産物には、さらに上記に記載した（例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６および配列番号：８からなる群から選択されたアミノ酸配列によって定義されたポリペプチドにも結合する抗体によって結合され得る、Ｇタンパク質活性を変調することのできる；またはリガンドに結合することのできる）Ｏｒ８３ｂ遺伝子産物の生物学的活性の少なくとも１つを保持する遺伝子産物が含まれる。そこで、本発明の機能的に同等のＯｒ８３ｂ遺伝子産物には、さらに上記に記載した（例えば、図２、４、６、８、および１０に示したコード配列によってコードされる）Ｏｒ８３ｂ遺伝子産物の１または２以上に対する抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって認識される、および結合する遺伝子産物が含まれる。
【００６８】
さらに、そして当業者にはより容易に理解されるように、所与の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列はさらにまた当業者には明白である多数の「縮重」核酸配列によってコードされることがある。そこで、本発明のＯｒ８３ｂ遺伝子配列にはさらに上記の（ａ）〜（ｅ）に記載した配列の縮重変異体が含まれる。
【００６９】
本発明のＯｒ８３ｂ遺伝子ヌクレオチド配列はさらに以下を含んでいる：（ａ）昆虫Ｏｒ８３ｂ遺伝子産物をコードするヌクレオチド；（ｂ）シグナル配列ドメイン、１または２以上の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、１または２以上の膜貫通ドメイン（ＴＭ）、１または２以上の細胞質ドメイン（ＣＤ）、１または２以上の細胞内ドメイン（ＩＤ）、および１または２以上の臭気物質結合ドメインを含むがそれらに限定されない１または２以上のその機能的ドメインに対応するＯｒ８３ｂ遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド；（ｃ）例えばＯｒ８３ｂ遺伝子産物のスプライス変異体をコードする配列を含むＯｒ８３ｂ遺伝子産物の１または２以上のスプライス変異体をコードするヌクレオチド配列；および（ｄ）ＴＭドメインの全部または一部が欠失しているＯｒ８３ｂ遺伝子産物の可溶型をコードする突然変異体、およびＣＤの全部または１部分が欠失している非機能的レセプターを含むがそれらに限定されないそのドメインの１の全部または１部分が欠失または変化しているＯｒ８３ｂ遺伝子産物の突然変異体をコードするヌクレオチド配列。さらにまた別の実施形態では、図８Ａ、図８Ｃ、図８Ｅまたは図８Ｇに示したような少なくとも２つの連続する疎水性ピークに類似する分布を備える２つまたは３つ以上の疎水性領域を有することを特徴とするＯｒ８３ｂタンパク質の１部分をコードするヌクレオチドが提供される。
【００７０】
本発明のＯｒ８３ｂ遺伝子ヌクレオチド配列にはさらにまた、例えば別のポリペプチドへ融合した上記の（ａ）〜（ｅ）に記載したいずれか１または２以上のＯｒ８３ｂ遺伝子産物を含有する融合タンパク質のような融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。融合タンパク質は、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（すなわち、本発明の同一ポリペプチド以外のポリペプチド）に操作的に連結したＯｒ８３ｂヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの全部または（好ましくは生物学的に活性な）一部を備える。代表的なＯｒ８３ｂ融合タンパク質はロードプシンのようなシャペロンタンパク質のアミノ末端を備える。
【００７１】
本発明のＯｒ８３ｂ遺伝子ヌクレオチド配列にはさらにまた、上記に記載したＯｒ８３ｂヌクレオチド配列（すなわち、上記の（ａ）〜（ｅ）に記載した配列およびその融合タンパク質）に対応するヌクレオチド配列が含まれるが、このとき１または２以上のエクソンまたはそれらのフラグメントが欠失している。
【００７２】
さらにまた、本発明のＯｒ８３ｂ遺伝子ヌクレオチド配列にはまた上記の（ａ）〜（ｅ）のＯｒ８３ｂ遺伝子ヌクレオチド配列の１または２以上に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列が含まれる。本発明のＯｒ８３ｂ遺伝子ヌクレオチド配列にはまた上記の（ａ）〜（ｅ）のＯｒ８３ｂ遺伝子ヌクレオチド配列のいずれかによってコードされた１または２以上のポリペプチドに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【００７３】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性率を決定するために、これらの配列は最適の比較を行うためにアライメントされる（例えば、第２アミノ酸または核酸配列との最適のアライメントのために第１アミノ酸の配列または核酸配列中にギャップを挿入することができる）。対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１配列内の位置が第２配列内の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められているときには、これらの分子はその位置では同一である。２つの配列間の同一性率はこれらの配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、同一性率（％）＝同一の重複する位置の＃／位置の総＃×１００％）。１の実施形態では、該２つの配列は同一長さである。
【００７４】
２つの配列間の同一性率の決定は、さらにまた数学的アルゴリズムを使用して遂行できる。２つの配列間を比較するために利用される好ましい数学的アルゴリズムの非限定的な例は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５８７７において改良された、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムはアルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−０のＮＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同であるヌクレオチド配列を入手するために、例えばスコア＝１００、ワード長＝１２のようなＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターセットを用いて実行できる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を入手するために例えばスコア＝５０、ワード長＝３のようなＸＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターセットを用いて実行できる。比較目的でギャップ付きアラインメントを入手するためには、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されたようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用できる。あるいはまた、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用すると分子間の遠位の関係（ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を検出する反復検索を実行できる（Ｉｄ．）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、各プログラム（例、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴの）のデフォルトパラメータを使用できる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムのまた別の好ましい非限定的例は、マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合は、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用できる。
【００７５】
２つの配列間の同一性率は、ギャップを許容して、またはギャップを許容せずに上記に記載した方法に類似する方法を使用して決定できる。同一性率を計算するときには、典型的には正確なマッチだけを計数する。
【００７６】
本発明の方法および組成物は、先行段落における（ａ）〜（ｅ）のＯｒ８３ｂ遺伝子ヌクレオチド配列へハイブリダイズする、そしてこのためＯｒ８３ｂ遺伝子ヌクレオチド配列の相補体である核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子を含んでいる。このようなハイブリダイゼーション条件は、上記の通りに高度にストリンジェントまたは余り高度ではないストリンジェントであってよい。上記に記載したＤＮＡ配列にハイブリダイズする本発明の核酸分子には、高度にストリンジェントまたはストリンジェントな条件下で先行段落に記載の（ａ）〜（ｅ）のＤＮＡ配列へハイブリダイズするオリゴデオキソオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）が含まれる。一般に、長さ１４〜７０ヌクレオチドのオリゴについては、融解温度（Ｔｍ）は式（数１）を用いて計算され、式中、Ｎはプローブの長さである。
【００７７】
【数１】
2005510209.tif 000004
【００７８】
ハイブリダイゼーションがホルムアミドを含有する溶液中で実施される場合は、融解温度（Ｔｍ）は式（数２）を用いて計算でき、式中、Ｎはプローブの長さである。
【００７９】
【数２】
2005510209.tif 000005
【００８０】
一般に、ハイブリダイゼーションはＴｍより約２０〜２５度下（ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対して）またはＴｍより約１０〜１５度下（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対して）で実施される。その他の代表的な高度にストリンジェントな条件は、例えば３７℃（１４塩基オリゴに対して）、４８℃（１７塩基オリゴに対して）、５５℃（２０塩基オリゴに対して）、および６０℃（２３塩基オリゴに対して）で６×ＳＳＣ／０．５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄を意味する。
【００８１】
これらの核酸分子は、本発明の方法および組成物において、例えばＯｒ８３ｂ遺伝子調節において有用であるＯｒ８３ｂ遺伝子アンチセンス分子として使用できる。該配列は、例えばＯｒ８３ｂ遺伝子核酸配列の増幅反応においてアンチセンスプライマーとして使用できる。さらに、このような相補的配列は、Ｏｒ８３ｂ遺伝子調節のためにも有用であるリボザイムおよび／または三重らせん配列の一部として使用できる。
【００８２】
本発明のＯｒ８３ｂ遺伝子およびＯｒ８３ｂ遺伝子ヌクレオチド配列のフラグメントは、長さが少なくとも１０ヌクレオチドであってよい。また別の実施形態では、該フラグメントは長さが約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００以上の連続ヌクレオチドであってよい。あるいはまた、該フラグメントはＯｒ８３ｂ遺伝子産物の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００以上の連続アミノ酸残基をコードする配列を備えていてよい。本発明のＯｒ８３ｂ遺伝子核酸分子のフラグメントはさらにまた上記に記載した核酸分子のエクソンまたはイントロン、ならびに細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＤ）のようなドメインをコードするこのような核酸分子のコード領域の部分にも関連する。ある特定の実施形態では、本発明はＯｒ８３ｂ遺伝子配列の少なくとも８ヌクレオチド（例、ハイブリダイズ可能な部分）からなる精製または単離核酸を提供する；他の実施形態では、該核酸はＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター配列または全長Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプターコード配列の少なくとも１２（連続）ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、または２００ヌクレオチドからなる。他の実施形態では、該核酸はＯｒ８３ｂ配列の少なくとも１２０（連続）ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、４２０ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、６２５ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、または１０００ヌクレオチドからなる。さらにまた他の実施形態では、該核酸は長さが３５、７５、２００、４５０、５２５、または６１０ヌクレオチドより小さい。別の実施形態では、該核酸は長さが１００〜２００、２００〜４００、４００〜６００、６００〜８００、または８００ヌクレオチドより長い。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。上記のように、本発明はさらにまた上記の配列またはそれらの逆相補体へハイブリダイズ可能な、またはそれらに相補的である核酸に関する。特定の側面では、Ｏｒ８３ｂ遺伝子の少なくとも１０、２５、５０、１００、または２００ヌクレオチドまたは全コード領域に相補的な配列を備える核酸が提供される。特定の側面では、Ｏｒ８３ｂ遺伝子の少なくとも７５、１２５、２５０、５００、または６５０ヌクレオチドまたは全コード領域に相補的な配列を備える核酸が提供される。
【００８３】
上記または代替実施形態では、本発明の核酸は２、５、７、１０、１５、または２０キロベース以下のヌクレオチド配列からなる。
【００８４】
本発明の方法および組成物は、さらにまた以下を使用する、そしてこのため以下を含んでいる、（ａ）前記のコード配列および／またはそれらの相補体（すなわち、アンチセンス）のいずれかを含有するＤＮＡベクター；（ｂ）前記コード配列の発現を指揮する調節エレメントと機能的に関連する前記のコード配列のいずれかを含有するＤＮＡ発現ベクター；および（ｃ）宿主細胞におけるコード配列の発現を指揮する異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）調節エレメントのような調節エレメントと機能的に結び付いた上記のコード配列のいずれかを含有する遺伝子組み換え宿主細胞。ここで使用する調節エレメントには、誘導性および非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび当業者に公知の発現を駆動および調節する他のエレメントが含まれるがそれらに限定されない。このような調節エレメントには、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ前初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージＡの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄ外皮タンパク質のコントロール領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼに対するプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母α接合因子（ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）のプロモーターが含まれるが、それらに限定されない。本発明には、ここに開示したＤＮＡ配列のいずれかのフラグメントが含まれる。
【００８５】
上記に記載した遺伝子配列に加えて、同一種または他の種に存在する可能性があるこれらの遺伝子配列、および／または、これらの遺伝子の全長コード配列のホモログは、当技術分野において周知の分子生物学的方法によって、必要以上の実験を実施せずに同定および単離することができる。
【００８６】
例えば、Ｏｒ８３ｂ遺伝子配列は標識して、種々の昆虫のゲノムライブラリーまたはＤＮＡライブラリーから入手されたｍＲＮＡから構築されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用できる。
【００８７】
本発明によると、「ゲノムＤＮＡライブラリー」は、所与のゲノムのＤＮＡからの代表的なヌクレオチド配列を含有するクローンライブラリーである。それは、ゲノムライブラリーするために、例えば当該の生体、器官、または組織からのＤＮＡを酵素的または機械的に断片化する工程と、該フラグメントを適切なベクターへ連結させる工程と、該ベクターを適切な細胞内へ導入する工程とによって、当技術分野において周知の様々な方法を使用して構築される。ゲノムライブラリーは、転写ＤＮＡフラグメントならびに非転写ＤＮＡフラグメントの両方を含有する。
【００８８】
相対的に、「ｃＤＮＡライブラリー」は転写ＤＮＡ配列だけを含有していて非転写ＤＮＡ配列を含有していない点がゲノムライブラリーと相違するクローンライブラリーである。これは、ｃＤＮＡライブラリーを確立するために、当技術分野において周知の方法、すなわち酵素ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、逆転写酵素）を使用して細胞質ｍＲＮＡ分子の集団から一本鎖ＤＮＡを作製するｍＲＮＡ（例、ポリＡ）の選択、一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡへ転換させる工程、結果として生じた分子をベクター内へクローニングする工程、該ベクターを適切な細胞内へ導入する工程を使用して確立される。あるいはまた、ｃＤＮＡライブラリーをベクター内へクローニングするおよび／または細胞内で確立する必要はないが、当技術分野において周知のように、遺伝子特異的プライマーでのＰＣＲを使用してスクリーニングすることができる。Ｏｒ８３ｂレセプターを同定するために特に有用なタイプのｃＤＮＡライブラリーは昆虫触角または上顎触肢ｃＤＮＡライブラリーである。
【００８９】
ハイブリダイゼーション条件は、ｃＤＮＡライブラリーが、該標識化Ｏｒ８３ｂ配列が由来する昆虫とは進化的に分岐する昆虫に由来する場合は低〜中等度のストリンジェンシーでなければならない。ｃＤＮＡスクリーニングは、さらに同一または相違する昆虫種において選択的にスプライシングされたＯｒ８３ｂ転写産物に由来するクローンを同定することもできる。低〜中等度のストリンジェンシー条件は当業者にはよく知られており、該ライブラリーおよび該標識化配列が由来する特定昆虫種に依存して推定可能に変動するであろう。このような条件に関するガイダンスについては、例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、１９８９、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。例えば、低ストリンジェンシー条件には以下のものが含まれる：ＤＮＡを含有するフィルターを、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で６時間、４０℃で前処理する。ハイブリダイゼーションは、以下の変更を加えた同一溶液中で実施する：０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容積）の硫酸デキストラン、および５〜２０×の１０６ｃｐｍ  ３２Ｐ標識化プローブを使用する。フィルターはハイブリダイゼーション混合液中で１８〜２０時間、４０℃でインキュベートし、その後２×ＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％のＳＤＳを含有する溶液中で１．５時間、５５℃で洗浄する。洗浄液を新鮮溶液と交換し、さらに１．５時間６０℃でインキュベートする。フィルターをブロット乾燥させ（ｂｌｏｔｔｅｄ  ｄｒｙ）、オートラジオグラフィーに曝露する。必要であれば、フィルターは６５〜６８℃で３回目の洗浄を行い、フィルムへ再曝露させる。ストリンジェンシーの上昇は、上記に記載したものよりストリンジェントな洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例、温度、イオン強度および％  ＳＤＳ）を使用することによって遂行できる。代表的な中程度のストリンジェンシー条件には、以下を備える溶液中で、３７℃での一晩のインキュベーションが含まれる：２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡ、その後にフィルターを約３７〜５０℃の１×ＳＳＣ中で洗浄する。
【００９０】
さらに、以前には知られていないＯｒ８３ｂ遺伝子は、上記の既知の１または２以上のＯｒ８３ｂ遺伝子配列内のヌクレオチド配列に基づいて設計された２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いるＰＣＲを実施することにより単離できる。
【００９１】
「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、複製コピーが１または２以上のプライマー、および逆転写酵素、またはＤＮＡポリメラーゼのような重合の触媒、および詳細には熱安定性ポリメラーゼ酵素を使用して標的核酸から作製される反応である。ＰＣＲのための方法は、米国特許第４，６８３，１９５号（マリス（Ｍｕｌｌｉｓ））および第４，６８３，２０２号（マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら）の中で教示されている。ＰＣＲまたは遺伝子クローニングにような同一核酸の複製コピーを作製するすべての工程は、以下では全部まとめて「増幅」と呼ぶ。
【００９２】
反応のための鋳型は、昆虫触角または上顎触肢組織、またはＯｒ８３ｂ遺伝子産物を発現すると疑われるいずれかの培養組織または細胞から調製したｍＲＮＡの逆転写によって入手されたｃＤＮＡであってよい。ＰＣＲ産物は、増幅させた配列がＯｒ８３ｂ遺伝子核酸配列の配列を表すことを確認するためにサブクローニングおよびシーケンシングすることができる。ＰＣＲプライマー対の設計は当技術分野において周知である。本発明において適切なプライマーは、Ｏｒ８３ｂの高度に保存されたモチーフ内で見いだされる配列の一般に少なくとも５、より好ましくは６連続アミノ酸をコードすることができる。そこで、それらのプライマーの長さは最も短くても好ましくは１５〜１８ヌクレオチドである。該プライマー対は、リバースプライマーがフォワードプライマーの下流にあるように選択する。Ｏｒ８３ｂ遺伝子またはｃＤＮＡの１部分を増幅させるための好ましいオリゴヌクレオチドは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして役立つ縮重オリゴヌクレオチドの対である。そこで１の実施形態では、適切なフォワードプライマーは配列番号：１２、１３または１４またはその相補体の少なくとも６アミノ酸をコードするものであり、そして適切なリバースプライマーは配列番号：１３、１４または１８またはその相補体の少なくとも６アミノ酸をコードするものである。例えばＭａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（オックスフォード・モレキュラー（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）社）およびＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ（インフォマックス（Ｉｎｆｏｒｍａｘ）社）のようなプライマー設計のために市販で入手できる様々なプログラムを利用できる。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、好ましくはＯｒ８３ｂ配列の増幅が少なくとも１５０ヌクレオチドの産物を生じさせるように選択する。典型的には、リバースプライマーは配列番号：１３、１４または１８に示したモチーフから選択する。そこで、フォワードプライマーを配列番号：１６から選択する場合は、リバースプライマーは配列番号：１３、１４または１８から選択することができる。フォワードプライマーを配列番号：１３から選択する場合は、リバースプライマーは配列番号：１４または１８から選択することができる。フォワードプライマーを配列番号：１４から選択する場合は、リバースプライマーは配列番号：１８から選択する。好適な実施形態では、フォワードプライマーは配列番号：１９を備え、そして、リバースプライマーは配列番号：２０を備える。昆虫ゲノムまたはｃＤＮＡからＯｒ８３ｂ核酸を増幅させるために適切な増幅条件には、５０μｌの反応液中で１μｇのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ鋳型および８０ｐｍｏｌの各プライマーを使用しついて９４℃で１分間、５１℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルを計４０サイクル、が含まれるが、これに限定されるものではない。このような条件下で、鋳型としての触角ｃＤＮＡ、本質的に配列番号：１９からなるフォワードプライマーおよび本質的に配列番号：２０からなるリバースプライマーを使用して、ほぼ２３５塩基対の産物を入手することができる。
【００９３】
その後、該ＰＣＲフラグメントを使用すると様々な方法によって全長ｃＤＮＡクローンを単離することができる。例えば、増幅フラグメントを使用するとバクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。あるいはまた、標識フラグメントを使用するとゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００９４】
ＰＣＲテクノロジーを利用すると、全長ｃＤＮＡ配列を単離することもできる。例えば、適切な細胞源または組織源から、標準方法にしたがってＲＮＡを単離することができる。逆転写反応は、第１鎖合成をプライミングするための増幅フラグメントのほとんどの５’末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＮＡ上で実施できる。結果として生じるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、標準ターミナルトランスフェラーゼ反応を使用してグアニンを用いて「テーリング（ｔａｉｌｅｄ）」することができ、該ハイブリッドはＲＮＡａｓｅＨを用いて消化でき、その後第２鎖合成はポリ−Ｃプライマーを用いてプライミングすることができる。そこで、増幅フラグメントの上流のｃＤＮＡ配列を容易に単離できる。使用できるクローニングストラジーについてのレビューについては、例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、１９８９、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。
【００９５】
当業者には理解されるように、本発明の方法によって同定されたＯｒ８３ｂのＤＮＡ配列多型は、典型的には個々の昆虫の集団内に（例えば、イナゴまたは地中海ミバエ集団内に）存在するであろう。このような多型は、例えば自然対立遺伝子変異に起因する集団内の個別昆虫間に存在することがある。このような多型には、アミノ酸配列における変化を引き起こす多型が含まれる。１の対立遺伝子は、あるいはまた所与の遺伝子座で発生する遺伝子群の対立遺伝子である。したがって、ここで使用する「対立遺伝子変異体」は所定の遺伝子座で発生するヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子産物を意味する。自然対立遺伝子変異は、典型的には所定の遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変異を生じさせるであろう。遺伝子のヌクレオチド配列における一定の対立遺伝子変異はサイレント変異であることがある、すなわち変異タンパク質をコードしない。
【００９６】
また別の（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）対立遺伝子または対立遺伝子変異体は、同一種の多数の様々な昆虫内で当該遺伝子をシーケンシングすることによって同定することができる。これは、個々の昆虫由来のゲノムＤＮＡからのＯｒ８３ｂ遺伝子産物のＰＣＲ増幅を使用することにより容易に実施できる。
【００９７】
ここで使用する用語「遺伝子」および「組み換え遺伝子」は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを備える核酸分子を意味する。この用語には、さらにまた上流および／またはエクソン／イントロン配列および構造を備える核酸分子が含まれる。
【００９８】
本発明のＯｒ８３ｂ遺伝子および遺伝子産物の対立遺伝子変異体に関しては、いずれか、および、すべての、遺伝子産物の自然対立遺伝子変異の結果であるＯｒ８３ｂ遺伝子および／または遺伝子産物のヌクレオチド変異体および／またはアミノ酸多型または変異体が本発明の範囲内に含まれることが意図されている。このような対立遺伝子変異体には、本発明のＯｒ８３ｂ遺伝子産物の機能的活性を変化させない対立遺伝子変異体が含まれるがそれらに限定されない。変異体には、「突然変異対立遺伝子」も含まれるがそれに限定されない。ここで使用する本発明のＯｒ８３ｂ遺伝子または遺伝子産物の「突然変異対立遺伝子」は、Ｏｒ８３ｂ遺伝子産物の機能的活性を変化させる対立遺伝子変異体である。突然変異Ｏｒ８３ｂ遺伝子のｃＤＮＡは、例えばＰＣＲを使用することによって、または突然変異対立遺伝子を有する昆虫の集団から調製したゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離できる。更に、正常Ｏｒ８３ｂ遺伝子またはその適切なフラグメント標識化され、該ライブラリーにおける対応突然変異対立遺伝子を同定するためのプローブとして使用できる。この突然変異Ｏｒ８３ｂ遺伝子を含有するクローンは、当技術分野においてルーチン的に実践される方法を通して精製し、そしてシーケンス解析を受けさせることができる。
【００９９】
本発明のＯｒ８３ｂ遺伝子のその他の対立遺伝子変異体および／または突然変異体には２つの対立遺伝子を有する両アリル性遺伝子ＳＮＰまたは両アリル性遺伝子マーカーを含む単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が含まれ、２の対立遺伝子はどちらも生体の集団において相当に高頻度で存在する。ＳＮＰを検出するための従来型方法には、例えば従来型ドットブロット解析、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析（例えば、オリタ（Ｏｒｉｔａ）ら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２７６６−２７７０）を参照）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、ヘテロ二本鎖解析、ミスマッチ切断検出、およびその他の当技術分野において周知のルーチン方法（例えば、シェフィールド（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）ら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：５８５５−５８９２；グロンペ（Ｇｒｏｍｐｅ），１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５：１１１−１１７）が含まれる。ＳＮＰを検出かつマッピングするまた別の好ましい方法には、マイクロシーケンシング法が含まれるが、このとき標的ＤＮＡ中のＳＮＰ部位は単一ヌクレオチドプライマー伸長反応（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって検出される。（例えば、ゴーレット（Ｇｏｅｌｅｔ）らの国際公開第  ９２／１５７１２号；マンディ（Ｍｕｎｄｙ）の米国特許第４，６５６，１２７号；ヴァリ（Ｖａｒｙ）およびダイアモンド（Ｄｉａｍｏｎｄ）の米国特許第４，８５１，３３１号；コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）らの国際公開第９１／０２０８７号；チー（Ｃｈｅｅ）らの国際公開第９５／１１９９５号；ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）ら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；ナイサーソン（Ｎｉｃｅｒｓｏｎ）ら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：９８２３−８９２７；パスティネン（Ｐａｓｔｉｎｅｎ）ら、１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６０６−６１４；パスティネン（Ｐａｓｔｉｎｅｎ）ら、１９９６，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：１３９１−１３９７；ヤランコ（Ｊａｌａｎｋｏ）ら、１９９２，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  ３８：３９−４３；シューメイカー（Ｓｈｕｍａｋｅｒ）ら、１９９６，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：３４６−３５４；キャスキー（Ｃａｓｋｅｙ）らの国際公開第９５／００６６９号を参照）。
【０１００】
種々の昆虫種の他の（例えば、それと相同である）Ｏｒ８３ｂ核酸間で保存された領域を備えるＯｒ８３ｂ核酸のフラグメントもまた提供される。Ｏｒ８３ｂ遺伝子のアミノ酸配列の配列アラインメントは高度保存領域を示した。特に、少なくとも１１アミノ酸残基の４つの領域またはモチーフが試験した各昆虫種において見いだされた。これらのモチーフは、配列番号：１２、１３、１４および１８に示した。１のモチーフ（配列番号：１４）について、フランキング領域は単一のアミノ酸のみの置換をもって高度に保存されていることが見いだされたので含めた。１の好適な実施形態では、他のＯｒ８３ｂ核酸が保存された領域を備えるＯｒ８３ｂ核酸のフラグメントは、配列番号：１２、１３、１４および１８のアミノ酸モチーフの全部または部分をコードするもののようなＯｒ８３ｂの高度に保存されたモチーフに対応する少なくとも１５、２０、３０または５０連続ヌクレオチドを含有する。一部の好適な実施形態では、該フラグメントはキイロショウジョウバエでは見いだされない。
【０１０１】
１の特定の実施形態では、当該連続配列を同定するためにＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子配列を含む当該データベースにクエリーするために新規Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子はＴＢＬＡＳＴＮプログラム（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）のようなプログラムを使用して同定できる。当該の連続配列に寄与する個々のＥＳＴ配列は同定することができ、ＲＡＣＥストラジー（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）を、新規Ｏｒ８３ｂ遺伝子によってコードされる完全コード領域を入手する目的で利用できる配列を伸長させるために使用することができる。
【０１０２】
上記の方法は、それによって嗅覚レセプター遺伝子のクローンを入手できる方法に関して限定することは意図されていない。
【０１０３】
５．２．昆虫Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子の発現
Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質をコードするヌクレオチド配列または、その機能的に活性なアナログまたはフラグメントまたはその他の誘導体は、例えば挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含有するベクターのような適当な発現ベクター内へ挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは、天然嗅覚レセプター遺伝子および／またはそのフランキング領域によって提供することもできる。そこで、該ヌクレオチド配列はプロモーターへ操作的に連結している。タンパク質コード配列を発現させるために様々な宿主−ベクター系を利用することができる。これらには、ウイルス（例、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母、またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡを用いて形質転換させた細菌のような微生物が含まれるがそれらに限定されない。ベクターの発現は、それらの強度および特異性において相違する。利用した宿主−ベクター系に依存して、多数の適切な転写および翻訳因子のいずれか１つを使用することができる。また別の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の１または２以上のモチーフを備えるＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のフラグメントを発現する。
【０１０４】
ベクター内へのＤＮＡフラグメントの挿入のために以前に記載した方法のいずれかを使用すると、適切な転写／翻訳コントロールシグナルおよびタンパク質コード配列からなるキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡおよび合成法ならびにｉｎ  ｖｉｖｏ組み換え体（遺伝子組み換え）を含むことができる。Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質またはペプチドフラグメントをコードする核酸配列の発現は、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプターポリペプチドが組み換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された宿主内で発現するように第２核酸配列によって調節することができる。例えば、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の発現は、当技術分野において公知のいずれかのプロモーター／エンハンサー因子によってコントロールできる。プロモーター／エンハンサーは同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）（例、天然）であっても異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）（例、非天然）であってもよい。Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子発現を制御するために使用できるプロモーターには、ＳＶ  ４０初期プロモーター領域（ベノイスト（Ｂｅｎｏｉｓｔ）およびチャンボン（Ｃｈａｍｂｏｎ），１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含有されるプロモーター（ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（ブルンスター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）ら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）、いずれかの組織中での発現のためのヒトサイトメガロウイルスの調節配列（フォーキング，エム（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ，Ｍ．）およびホフステッター，エイチ（Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ，Ｈ．），１９８６，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１−１０５；米国特許第５，１６８，０６２号）、β−ラクタマーゼプロモーター（ヴィラ−カーナロフ（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ）ら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、またはｌａｃプロモーター（デ・ブーア（ＤｅＢｏｅｒ）ら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２：７４−９４）のような原核生物発現ベクター、ノパリン合成酵素プロモーター領域（ハーレラ−エストレッラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ）ら  Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（ガードナー（Ｇａｒｄｎｅｒ）ら、１９８１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：２８７１）を備える植物発現ベクター、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター、（ハーレラ−エストレッラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ）ら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１１５−１２０）、例えばＧａｌ４反応性プロモーターのような、酵母または他の真菌からのプロモーター因子、ＡＤＨ（アルコールデヒ��ロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、組織特異性を示しトランスジェニック動物で利用されてきた以下の動物転写コントロール領域：膵腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子コントロール領域（スウィフト（Ｓｗｉｆｔ）ら、１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６；オーニッツ（Ｏｒｎｉｔｚ）ら、１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；マクドナルド（ＭａｃＤｏｎａｌｄ），１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）、膵β細胞中で活性な遺伝子コントロール領域（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ），１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）、リンパ球中で活性な免疫グロブリン遺伝子コントロール領域（グロッシェドル（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ）ら、１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８；アダムズ（Ａｄａｍｅｓ）ら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８；アレクサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）ら、１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、精巣、乳房、リンパおよび肥満細胞で活性なマウス乳腺癌ウイルスコントロール領域（レーダー（Ｌｅｄｅｒ）ら、１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）、肝で活性なアルブミン遺伝子コントロール領域（ピンカート（Ｐｉｎｋｅｒｔ）ら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝で活性なαフェトプロテイン遺伝子コントロール領域（クルムラウフ（Ｋｒｕｍｌａｕｆ）ら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；ハンマー（Ｈａｍｍｅｒ）ら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）、肝で活性なα１−アンチトリプシン遺伝子コントロール領域（ケルシー（Ｋｅｌｓｅｙ）ら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄細胞で活性なβグロビン遺伝子コントロール領域（モグラム（Ｍｏｇｒａｍ）ら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０；コリアス（Ｋｏｌｌｉａｓ）ら、１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）、脳のオリゴデンドロサイトで活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子コントロール領域（リードヘッド（Ｒｅａｄｈｅａｄ）ら、１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）；骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子コントロール領域（サニ（Ｓａｎｉ），１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）および視床下部で活性なゴナドトロピンホルモン放出ホルモン遺伝子コントロール領域（メイソン（Ｍａｓｏｎ）ら、１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）が含まれるがそれらに限定されない。
１の特定の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子核酸に操作的に連結したプロモーター、１または２以上の複製起点、および任意で１または２以上の選択可能なマーカー（例、抗生物質耐性遺伝子）を備えるベクターが使用される。
【０１０５】
１の特定の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプターコード配列を３種のｐＧＥＸベクター（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ発現ベクター；スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ），１９８８，Ｇｅｎｅ  ７：３１−４０）の各々のＥｃｏＲＩ制限部位内へサブクローニングすることによって発現構築物が作製される。これは、正しいリーディングフレーム内でのサブクローンからの嗅覚レセプタータンパク質産物の発現を許容する。
【０１０６】
また別の特定の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子に操作的に連結しているプロモーターは天然昆虫Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子プロモーターではない（例えば、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）プロモーターである）。
【０１０７】
特定組み換えＤＮＡ分子が同定かつ単離されると、それを増殖させるために当技術分野において周知の数種の方法を使用できる。適切な宿主系および増殖条件が確立されると、組み換え発現ベクターを大量に増殖させて調製できる。以前に説明したように、使用できる発現ベクターには以下のベクターまたはそれらの誘導体が含まれるが、それらに限定されない：小数例のみを挙げると、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例、ラムダファージ）、およびプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター。
【０１０８】
さらに、挿入された配列の発現を変調する、または所望の特定方法で該遺伝子産物を改変および処理する宿主細胞株を選択することができる。ある種のプロモーターからの発現は、ある種の誘発因子の存在下で上昇させることができる；そこで、遺伝子組み換え嗅覚レセプタータンパク質の発現は制御できる。さらに、様々な宿主細胞は、翻訳および翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的かつ特異的機序を有している（例、タンパク質のグリコシル化、リン酸化）。発現した外来性タンパク質の所望の改変およびプロセシングを保証するために、適切な細胞ラインまたは宿主系を選択することができる。例えば、細菌系における発現を使用すると非グリコシル化コアタンパク質産物を産生することができる。酵母における発現はグリコシル化産物を産生するであろう。昆虫および哺乳動物細胞およびアフリカツメガエル卵母細胞を含む動物細胞中での発現を使用すると、Ｏｒ８３ｂタンパク質の「天然」グリコシル化を保証することができる。
【０１０９】
他の特定の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質、フラグメント、アナログまたは誘導体は、融合、またはキメラタンパク質産物（（相違するタンパク質）の異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）タンパク質配列に結合したペプチドを介して結合されたタンパク質、フラグメント、アナログ、または誘導体を備える）として発現することができる。キメラタンパク質は、第２タンパク質またはその少なくとも１部分へのＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質、フラグメント、アナログ、または誘導体の融合が含まれてよいが、このとき１部分は前記第２タンパク質の１または２以上（好ましくは１０，１５、２０、３０、または５０）のアミノ酸である。第２タンパク質、またはその１または２以上のアミノ酸部分は相違する嗅覚レセプタータンパク質からであってよい、または昆虫嗅覚レセプタータンパク質ではないタンパク質からであってよい。このようなキメラ産物は、適切なコーディングフレーム内で所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を当技術分野において周知の方法によって相互にライゲーション（連結反応）させ、そして当技術分野において一般に公知の方法によってキメラ産物を発現させることによって作製できる。あるいはまた、このようなキメラ産物は例えばペプチド合成装置の使用のようなタンパク質合成技術によって作製できる。
【０１１０】
５．３．昆虫Ｏｒ８３ｂ遺伝子産物
特定の態様では、本発明は抗原決定基（例、抗体によって認識され得る）を備える、またはさもなければ機能的に活性であるＯｒ８３ｂタンパク質およびそのフラグメントおよび誘導体のアミノ酸配列、ならびに上記をコードする核酸配列を提供する。ここで使用する「機能的に活性な」嗅覚レセプター物質とは、例えばＯｒ８３ｂ関連タンパク質へ結合する、または特異的ヌクレオチドまたはＤＮＡ配列抗原性へ結合する（抗嗅覚レセプタータンパク質抗体へ結合する）、免疫原性、Ｇタンパク質の活性を変調する、および／またはＯｒ８３ｂリガンドへ結合するような全長（野生型）嗅覚レセプタータンパク質に関連する１または２以上の機能的活性を示す物質を意味する。
【０１１１】
本発明はさらにまた、該核酸配列のいずれかによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１１２】
１の特定の実施形態では、本発明は少なくとも１０アミノ酸、２０アミノ酸、５０アミノ酸、または少なくとも７５アミノ酸からなるＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のフラグメントを提供する。他の特定の実施形態では、本発明は少なくとも１００アミノ酸、１５０アミノ酸、２００アミノ酸、２５０アミノ酸または少なくとも３００アミノ酸からなるＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のフラグメントを提供する。他の特定の実施形態では、本発明は少なくとも８５アミノ酸、１７５アミノ酸、２７５アミノ酸、３１０アミノ酸または少なくとも３２５アミノ酸からなるＯｒ８３ｂタンパク質のフラグメントを提供する。Ｏｒ８３ｂタンパク質の上記の領域の一部または全部が欠如するフラグメント、またはフラグメントを備えるタンパク質もまた提供される。上記をコードする核酸が提供される。１の特定の実施形態では、該核酸は５または１０キロベース未満である。１の特定の実施形態では、上記のタンパク質またはフラグメントは２５、５０、１００、または２００以下の連続アミノ酸である。
【０１１３】
Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子配列を発現する組み換え体が同定されると、該遺伝子産物を解析できる。これは、該産物の放射標識、その後にゲル電気泳動法、イムノアッセイ等を含む該産物の物理的または機能的特性に基づくアッセイによって達成される。
【０１１４】
Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質が同定されると、クロマトグラフィー（例、イオン交換、親和性、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を含む標準方法、またはタンパク質精製のためのいずれか他の標準方法によって単離かつ精製することができる。
【０１１５】
あるいはまた、組み換えにより産生したＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質が同定されると、該タンパク質のアミノ酸配列は組み換え体内に含有されるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列から推定することができる。その結果として、該タンパク質は当技術分野において周知の標準的化学方法によって合成することができる（例えば、フンカピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ）ら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１０５−１１１を参照）。
【０１１６】
また別の実施形態では、天然Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質は、例えば上記のような標準方法（例、免疫親和性精製）によって天然源から精製できる。
【０１１７】
本発明の特定の実施形態では、組み換えＤＮＡ技術、化学合成方法または天然タンパク質の精製のいずれによって産生されたものであっても、このようなＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質には一次アミノ酸配列として、実質的に配列番号：２，配列番号：４、配列番号：６、または配列番号：８に示したアミノ酸配列、ならびにフラグメントおよび他の誘導体、およびそれらと相同であるタンパク質を含むそのアナログが実質的に全部または一部含有するものが含まれるが、それらに限定されない。
【０１１８】
本発明はさらにまた、嗅覚レセプタータンパク質、嗅覚レセプタータンパク質の誘導体（フラグメントを含むがそれに限定されない）、アナログ、および分子に関する。ここで使用する特定配列番号によって規定された分子は、その分子の配列がその配列番号からなることを意味すると解釈すべきである。Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の誘導体およびタンパク質アナログをコードする核酸もまた提供される。１の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質は上記の第５章１節に記載したＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター核酸によってコードされる。特定の側面では、タンパク質、誘導体、またはアナログは配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７に示した配列によってコードされるＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のタンパク質、誘導体、またはアナログである。
【０１１９】
Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質に関連する誘導体およびアナログの産生および使用は本発明の範囲内である。１の特定の実施形態では、例えば全長、野生型Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質に関連する１または２以上の機能的活性を示すことができるように、誘導体またはアナログは機能的に活性である。１の例として、所望の免疫原性または抗原性を有するこのような誘導体またはアナログは、イムノアッセイにおいて、免疫化のため、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター活性の阻害のために使用できる。さらにまた別の例として、所望の結合活性を有するこのような誘導体またはアナログは、Ｏｒ８３ｂ臭気物質リガンドに結合させるために使用できる（例えば、レヴァイン，エイ（Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．）ら、１９９７，Ｃｅｌｌ  ８８：３２３−３３１を参照）。所望のＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の所与の特性（例、Ｏｒ８３ｂタンパク質結合パートナーへ結合する）を保持する、あるいはまた欠如または阻害する誘導体またはアナログは、そのような特性およびその生理学的関連現象の各々誘発剤、または阻害剤として使用できる。特定の実施形態は、抗Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質抗体によって結合され得るＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質フラグメントに関する。Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の誘導体またはアナログは、下記に記すアッセイを含むがそれらに限定されない当技術分野において周知の方法によって所望の活性について試験することができる。
【０１２０】
特に、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター誘導体は、機能的に同等の分子を提供する置換、付加（例、挿入）、または欠失によって嗅覚レセプター配列を改変させることにより作製できる。配列をコードするヌクレオチドの縮重により、本発明の実践においてＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を使用できる。これらには配列内において機能的に同等のアミノ酸残基をコードする様々なコドンの置換によって変化し、こうしてサイレント変化を作り出すＯｒ８３ｂ遺伝子の全部または一部を備えるヌクレオチド配列が含まれるがそれに限定されない。同様に、本発明のＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター誘導体には、一次アミノ酸配列として機能的に同等のアミノ酸残基が配列内の残基と置換されてサイレント変化を生じさせている変化した配列を含む、Ｏｒ８３ｂタンパク質のアミノ酸配列の全部または一部を備えるものが含まれるが、それらに限定されない。例えば、該配列内における、１または２以上のアミノ酸残基は機能的同等物として作用し、結果としてサイレント変化を生じさせる類似の極性の別のアミノ酸によって置換され得る。該配列内の１のアミノ酸に対する置換は、それに該アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されてよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正電荷（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。このような置換は、一般に保存的置換であると理解されている。
【０１２１】
本発明の特定の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の少なくとも１０（連続）アミノ酸からなるＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のフラグメントからなる、またはそれを備えるタンパク質が提供される。他の実施形態では、該フラグメントは嗅覚レセプタータンパク質の少なくとも２０または少なくとも３０または少なくとも５０アミノ酸からなる。特定の実施形態では、そのようなフラグメントは３５、１００または２００アミノ酸以下である。１の特定の実施形態では、そのようなフラグメントは３０〜５０、５０〜１００、１００〜２２０または２００〜３９０アミノ酸である。Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の誘導体またはアナログには、Ｏｒ８３ｂタンパク質またはそのフラグメントと実質的に相同（例、様々な実施形態では、いずれの挿入または欠失を伴わずに同一サイズのアミノ酸配列に比較して、またはアラインメントが当技術分野において公知のコンピューターホモロジープログラムによって実施されたアラインメント配列に比較したときに少なくとも６０％または７０％または８０％または９０％または９５％を超える同一性）である領域を備える、またはそれのコード化核酸が高ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、または低ストリンジェンシー条件下で、コーディング嗅覚レセプター遺伝子配列へハイブリダイズすることのできるそれらの分子が含まれるがそれらに限定されない。好適な実施形態では、該フラグメントはキイロショウジョウバエ内で見いだされない、またはキイロショウジョウバエのＯｒ８３ｂポリペプチドではない。
【０１２２】
配列アラインメントに基づくと、Ｏｒ８３ｂ遺伝子はＣ末端における高度の保存を伴うタンパク質をコードすると推定される。好ましいＯｒ８３ｂポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントは、配列番号：１２、１３、１４および１８のモチーフを含む図７において同定したモチーフからの少なくとも１０の連続アミノ酸を有する。少なくとも１５または２０の連続アミノ酸のモチーフもまた熟慮されている。好ましくは、Ｏｒ８３ｂ遺伝子は１以上の高度に保存されたモチーフを有するタンパク質をコードする。より好ましくは、それらは３つまたは全４つの高度に保存されたモチーフを含有する。
【０１２３】
本発明のＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター誘導体およびアナログは、当技術分野において公知の様々な方法によって産生できる。それらの産生を生じさせる操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで発生することができる。例えば、クローン化Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子配列は、当技術分野において公知の数多くのストラジーのいずれかによって改変できる（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，１９８９，「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。該配列は、制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な部位で開裂し、その後さらに所望であれば酵素改変、そして、単離、およびライゲーションをｉｎ  ｖｉｔｒｏで行なうことができる。Ｏｒ８３ｂタンパク質の誘導体またはアナログをコードする改変遺伝子の産生においては、改変された遺伝子が所望の嗅覚レセプタータンパク質活性をコードする遺伝子領域内で翻訳停止シグナルによって中断されずに、天然タンパク質と同一翻訳リーディングフレーム内に留まっていることを保証するために注意を払わなければならない。
【０１２４】
さらに、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター核酸配列は、翻訳、開始および／または終止配列を作製するため、またはコード領域における変異を作製するため、および／または新規制限エンドヌクレアーゼ部位を形成する、または既存する制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊するため、さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏ改変を促進するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで突然変異させることができる。突然変異のために、化学的突然変異誘発、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（ハッチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）ら，１９７８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１）、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）の使用、突然変異を含有するプライマーを用いてのＰＣＲ等を含むがそれらに限定されない当技術分野において公知のいずれかの方法を使用できる。
【０１２５】
Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質配列の操作はさらにまたタンパク質レベルで行うこともできる。本発明の範囲内に含まれるのは、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子またはその他の細胞リガンドへの連結等による翻訳中または翻訳後にディファレンシャルに改変されている嗅覚レセプタータンパク質フラグメントまたは他の誘導体またはアナログである。多数の化学改変のいずれも、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８、プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成等による特異的化学的開裂を含むがそれらに限定されない既知の方法によって実施される。
【０１２６】
さらに、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のアナログおよび誘導体は化学的に合成できる。例えば、所望のドメインを備える、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の活性を媒介するＯｒ８３ｂタンパク質の１部分に対応するペプチドがペプチド合成装置の使用により合成できる。さらにその上、所望であれば非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログは該嗅覚レセプター配列内への置換または付加として導入できる。非古典的アミノ酸には、概して共通アミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、およびアミノ酸アナログのようなデザイナーアミノ酸が含まれるが、それらに限定されない。さらに、該アミノ酸はＤ型（右旋性）またはＬ型（左旋性）であってよい。
【０１２７】
１の特定の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質誘導体は相違するタンパク質のアミノ酸配列へ結合したペプチドを介してそのアミノ−カルボキシ末端で結合したＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質またはそのフラグメント（好ましくは、少なくとも該嗅覚レセプタータンパク質のドメインまたはモチーフ、またはＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の少なくとも１０アミノ酸）を備えるキメラまたは融合タンパク質である。１の特定の実施形態では、前記相違するタンパク質のアミノ酸配列は前記相違するタンパク質の少なくとも６、１０、２０または３０の連続アミノ酸、または機能的に活性である相違するタンパク質の部分である。１の特定の実施形態では、前記相違するタンパク質のアミノ酸配列は前記相違するタンパク質の少なくとも５０、７５、１００または１５０の連続アミノ酸、または機能的に活性である相違するタンパク質の１部分である。１の実施形態では、そのようなキメラタンパク質は該タンパク質（相違するタンパク質のためのコード配列へインフレームで結合したＯｒ８３ｂ嗅覚レセプターコード配列を備える）をコード化する核酸の組み換え発現によって産生する。このようなキメラ産物は、適切なコーディングフレーム内で所望のアミノ酸配列をコード化する適切な核酸配列を当技術分野において周知の方法によって相互にライゲーションさせ、そして当技術分野において一般に公知の方法によってキメラ産物を発現させることによって作製できる。あるいはまた、このようなキメラ産物は例えばペプチド合成装置の使用のようなタンパク質合成技術によって作製できる。いずれかの異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）タンパク質をコードする配列に融合したＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子の部分を備えるキメラ遺伝子を構築することができる。１の特定の実施形態は、少なくとも６アミノ酸のＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のフラグメント、または該嗅覚レセプタータンパク質の１または２以上の機能的活性を示すフラグメントを備えるキメラタンパク質に関する。
【０１２８】
また別の特定の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター誘導体は、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質との相同領域を備える分子である。一例として、様々な実施形態では、第１タンパク質領域は挿入または欠失のいずれをも伴わない第１領域内に含まれている数と同一数のアミノ酸の第２領域内のいずれかの配列と比較して、または当技術分野において公知のコンピューター相同プログラムによってアラインメントされている第２領域のアラインメント配列と比較して、第１領域のアミノ酸配列が少なくとも、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％同一であるときに、第２タンパク質領域と「相同である」と見なすことができる。例えば、１の分子はＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタードメインまたはその部分と相同である１または２以上の領域を備えることができる。
【０１２９】
１の特定の実施形態では、本発明はＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター誘導体およびアナログに関し、特に、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の１または２以上のドメインを備える、あるいはまたそれらからなるＯｒ８３ｂ嗅覚レセプターフラグメントおよびそのようなフラグメントの誘導体に関する。
【０１３０】
また別の特定の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の１または２以上のドメイン（またはその機能的部分）を備えるが、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の１または２以上のドメイン（またはその機能的部分）も欠如している分子が提供される。一例として、そのようなタンパク質はスペーサーによって分離されたそのようなドメインを保持することができる。また別の特定の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の１または２以上のドメイン（またはその機能的部分）を備えており、そしてＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の１または２以上の突然変異体（例、欠失または点突然変異によって）を有する（例、該突然変異体ドメインが野生型と比較して低下または増加した機能を有するように）分子が提供される。
【０１３１】
５．４．昆虫Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子およびタンパク質の構造
本発明のＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子およびタンパク質の構造は、当技術分野において公知の様々な方法によって分析できる。そのような方法の一部の例を下記に記載する。
【０１３２】
５．４．１．遺伝分析
Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子に対応するクローン化ＤＮＡまたはｃＤＮＡは、サザンハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７）、ノーザンハイブリダイゼーション（例えば、フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：４０９４−４０９８を参照）、制限エンドヌクレアーゼマッピング（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），１９８２，「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＤＮＡ配列解析を含むがそれらに限定されない方法によって分析できる。したがって、本発明はＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子を認識する核酸プローブを提供する。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号および第４，８８９，８１８号；ジレンスタイン（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｉｎ）ら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７６５２−７６５６；オクマン（Ｏｃｈｍａｎ）ら，１９８８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２０：６２１−６２３；ロー（Ｌｏｈ）ら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７−２２０）およびその後のＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子特異的プローブを用いてのサザンハイブリダイゼーションを行うと、例えば触角および上顎触肢における嗅覚ニューロンのような様々な細胞タイプからＤＮＡ中のＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子の検出を許容することができる。ＰＣＲ以外の増幅方法は一般に知られており、使用することができる。１の実施形態では、サザンハイブリダイゼーションを使用するとＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子の遺伝連鎖を決定することができる。ノーザンハイブリダイゼーションを使用するとＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子の発現を決定することができる。サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、使用される特定Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子プローブへの所望の関連性の度合を備える核酸の検出を保証するように操作することができる。これらの方法および当技術分野において一般に公知の、他の方法の改変を使用することができる。
【０１３３】
本発明の１の好ましい特定の実施形態では、ノーザンハイブリダイゼーションはサイズ標準物質と共にアガロースゲル上で分画化されてナイロン膜へブロッティングされた種々のポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ調製物（例、ＤＮＡ損傷剤を用いて処理した、または処理していない細胞）を使用して実施する。Ｏｒ８３ｂコード領域を含有するＤＮＡフラグメントは適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化したクローンから切り出し、アガロースゲル中での電気泳動法により分離し、ゲルから抽出し、そしてＲｅｄｉｐｒｉｍｅ標識システム（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社）を使用したランダムプライム法によって３２Ｐ標識する。ｍＲＮＡブロットへの標識プローブのハイブリダイゼーションは一晩実施する。このブロットは高ストリンジェンシー（６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ）で洗浄し、該プローブに特異的にハイブリダイズするｍＲＮＡ種はＸ線フィルムを使用したオートラジオグラフィーによって検出する。
【０１３４】
制限エンドヌクレアーゼマッピングを使用するとＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子の遺伝子構造を大まかに決定することができる。制限エンドヌクレアーゼ切断によって引き出された制限酵素地図は、ＤＮＡ配列解析によって確証できる。
【０１３５】
ＤＮＡ配列の解析は、マキサム  ギルバート（Ｍａｘａｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ）法（１９８０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：４９９−５６０）、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）  ジデオキシ法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５４６３）、Ｔ７  ＤＮＡ  ポリメラーゼの使用（テイバー（Ｔａｂｏｒ）およびリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ），米国特許第４，７９５，６９９号）または全自動ＤＮＡシークエネーター（例、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），フォスターシティ，カリフォルニア）を含むがそれらに限定されない当技術分野において公知のいずれかの方法によって実施できる。
【０１３６】
５．４．２．タンパク質分析
Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列からの推定によって、あるいはまた例えば全自動アミノ酸シーケンサーを用いた該タンパク質の直接シーケンシングによって引き出すことができる。
【０１３７】
Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質配列は、さらにまた親和性分析によって特徴付けることができる（ホップ（Ｈｏｐｐ）およびウッズ（Ｗｏｏｄｓ），１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４）。親水性プロファイルを使用すると、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の疎水性および親水性領域ならびにそのような領域をコードする遺伝子配列の対応する領域を同定することができる。
【０１３８】
特定二次構造を推定するＯｒ８３ｂタンパク質の領域を同定するために、構造予測解析（シュー（Ｃｈｏｕ）およびファスマン（Ｆａｓｍａｎ），１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２）もまた実施できる。
【０１３９】
マニュピュレーション、翻訳および二次構造推定、オープンリーディングフレーム推定およびプロッティングならびに配列相同性の決定もまた、当技術分野において利用できるコンピューターソフトウエアプログラムを使用して達成できる（第５章２節を参照）。
【０１４０】
構造解析のための他の方法もまた使用できる。これらには、Ｘ線結晶構造解析（エングストム（Ｅｎｇｓｔｏｍ），１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１１：７−１３）、核磁気共鳴分光法（クロア（Ｃｌｏｒｅ）およびゴーネンボーン（Ｇｏｎｅｎｂｏｒｎ），１９８９，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：４７９−５６４）およびコンピューターモデリング（フレッテリック（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ）およびゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ），１９８６，「分子生物学の最新コミュニケーションにおけるコンピューターグラフィックスと分子モデリング（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１４１】
５．５．Ｏｒ８３ｂタンパク質誘導体の分析
Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質、誘導体およびアナログの機能的活性は、当技術分野において公知の様々な方法によって分析できる。
【０１４２】
例えば、１の実施形態では、抗Ｏｒ８３ｂ抗体への結合、又は、抗Ｏｒ８３ｂ抗体の結合に対して野生型Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質と競合する能力をアッセイする場合、放射性免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫放射線測定法、ゲル拡散沈降反応法、免役拡散測定法、インサイチュー・免疫測定法（例、コロイド金、酵素、または放射性同位体標識を使用する）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集測定法（例、ゲル凝集測定法、血球凝集測定法）、補体結合反応、免疫蛍光測定法、プロテイン質Ａ測定法、および免疫電気泳動測定法等のような方法を使用する競合的および非競合的測定システムを含むがそれらに限定されない様々な免疫測定法を使用できる。１の実施形態では、抗体結合は一次抗体上の標識を検出することによって検出される。また別の実施形態では、該一次抗体は該一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらにまた別の実施形態では、二次抗体は標識される。免疫測定法における結合を検出するための種々の手段は知られており、本発明の範囲内である。Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター結合タンパク質が同定されるまた別の実施形態では、この結合は例えば当技術分野において周知の手段によってアッセイできる。
【０１４３】
また別の実施形態では、野生型嗅覚レセプター遺伝子の誘導体またはアナログであるＯｒ８３ｂ遺伝子突然変異体の表現型の作用を試験するために遺伝学研究を実施できる。そのようなその他の方法は当業者には容易に明白であり、本発明の範囲内である。
【０１４４】
さらにまた別の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ誘導体およびフラグメントのアッセイは、下記の第５章８節のスクリーニングアッセイにおいて記載するように、それらがＧタンパク質活性を変調する能力、またはリガンドへ結合する能力についてアッセイすることができる。
【０１４５】
５．６．抗体
本発明によると、Ｏｒ８３ｂタンパク質、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログは、免疫原に免疫特異的に結合する抗体を生成するためのそのような免疫原として使用することができる。そのような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーが含まれるがそれらに限定されない。また別の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のドメインに対する抗体が産生される。１の特定の実施形態では、親水性であると同定されたＯｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のフラグメントが抗体産生のための免疫原として使用される。
【０１４６】
当技術分野において公知の様々な方法は、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質または誘導体またはアナログに対するポリクローナル抗体を産生するために使用できる。１の特定の実施形態では、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８に示した配列またはそれらのサブシークエンスからなるＯｒ８３ｂタンパク質のエピトープに対するウサギポリクローナル抗体を入手できる。抗体を産生するためには、天然嗅覚レセプタータンパク質、または合成形（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｖｅｒｓｉｏｎ）、またはその誘導体（例、フラグメント）の注射によってウサギ、マウス、ラット等を含むがそれらに限定されない様々な宿主動物を免役することができる。免疫学的反応を増加させるためには、宿主の種に依存して、フロイント（完全および不完全）、例えば水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、スカシ貝（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに例えばＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））およびコリネバクテリウム・パルバム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）のような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むがそれらに限定されない様々なアジュバントを使用できる。
【０１４７】
Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質配列またはそのアナログに対するモノクローナル抗体を調製するためには、培養中で連続継代細胞ラインにより抗体分子の産生を提供するあらゆる方法を使用できる。例えば、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によって最初に開発されたハイブリドーマ技術（コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）、ならびにトリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コズバー（Ｋｏｚｂｏｒ）ら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）および、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（コール（Ｃｏｌｅ）ら，１９８５，「モノクローナル抗体および癌療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」，Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁）。本発明の更なる実施形態において、モノクローナル抗体は無菌動物において産生することができる。本発明によると、ヒト抗体を使用することができ、ヒト抗体はヒトハイブリドーマを使用すること（コール（Ｃｏｌｅ）ら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２０２６−２０３０）によって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥＢＶウイルスを用いてヒトＢ細胞を形質転換させること（コール（Ｃｏｌｅ）ら．，１９８５，「モノクローナル抗体および癌療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，第７７−９６頁）によって入手できる。実際に、本発明によると、Ｏｒ８３ｂタンパク質に特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる「キメラ抗体」を産生するために開発された方法（モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−６８５５；ノイバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；タケダ（Ｔａｋｅｄａ）ら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４）を使用できる；そのような抗体は本発明の範囲内である。また別の実施形態では、発明（米国特許第５，２２５，５３９号）によって「ヒト化抗体」もまた提供される。
【０１４８】
本発明によると、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター特異的一本鎖抗体を産生するため、一本鎖抗体の産生について記載された方法（米国特許第４，９４６，７７８号）を適合させることができる。本発明の追加の実施形態は、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質、誘導体、またはアナログに対する所望の特異性を備えるモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするため、Ｆａｂ’発現ライブラリー（ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１）の構築について記載された方法を利用する。
【０１４９】
該分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、既知の方法によって生成できる。例えば、そのようなフラグメントには該抗体分子のペプシン消化によって産生できるＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元させることによって生成できるＦ（ａｂ’）フラグメント、パパインおよび還元剤を用いて該抗体分子を処理することによって生成できるＦａｂフラグメント、およびＦｖフラグメントが含まれるがそれらに限定されない。
【０１５０】
抗体の製造においては、所望の抗体についてのスクリーニングは当技術分野において公知の方法（例、酵素結合免疫測定法またはＥＬＩＳＡ）によって実施できる。例えば、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質の特異的ドメインを認識する抗体を選択するために、このようなドメインを含有するＯｒ８３ｂ嗅覚レセプターフラグメントに結合する産物について生成したハイブリドーマをアッセイすることができる。第１Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプターホモログには特異的に結合するが相違するＯｒ８３ｂ嗅覚レセプターホモログには特異的に結合しない抗体を選択するためには、第１嗅覚レセプターホモログへの陽性結合および第２嗅覚レセプターホモログへの結合の欠如に基づき選択することができる。
【０１５１】
Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のドメインに対して特異的な抗体もまた提供される。Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質のエピトープに対して特異的な抗体もまた提供される。
【０１５２】
５．７．Ｏｒ８３ｂタンパク質に結合する化合物の同定
本発明は、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子およびタンパク質に結合する、またはさもなければそれと直接的に相互作用するタンパク質または他の化合物の同定において有用であるスクリーニング方法を提供する。このような化合物には、Ｏｒ８３ｂ機能を作動（アゴナイズ）または拮抗（アンタゴナイズ）する分子が含まれるであろう。
【０１５３】
スクリーニング方法は、当技術分野において周知の（例えば、これによりその全体がここに組み込まれる１９９６年１０月３１日に公開された国際公開第９６／３４０９９号を参照）。該タンパク質および化合物には、ｉｎ  ｖｉｖｏで同定された遺伝子およびタンパク質と相互作用する、およびこのために薬物的および治療的処置のための新規ターゲットを提供できる内因性細胞成分、ならびに、結合能力を有する、そしてこのために医薬物質の候補となる可能性がある、組み換え、合成、さもなければ、外因性の化合物が含まれる。そこで、一連の実施形態では、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子およびタンパク質の１つに結合するタンパク質またはその他の化合物について細胞溶解液または組織ホモジネートをスクリーニングすることができる。
【０１５４】
あるいはまた、天然型および／または合成型両方（例、小分子またはペプチドのライブラリー）の様々な外因性化合物のいずれも結合活性についてスクリーニングすることができる。結合化合物には、他の細胞タンパク質も含まれるがそれらに限定されない。結合化合物には、さらにまた例えばＩｇテール付き融合ペプチド（例えば、ラム（Ｌａｍ）ら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）ら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６を参照）を含むがそれらに限定されない可溶型ペプチドのようなペプチド、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗体、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦＡｂ発現ライブラリーフラグメント、およびそれらのエピトープ結合フラグメント）、および小有機又は無機分子）を含むことができるがそれらに限定されない。このような化合物には、ＥＣＤに結合して天然臭気物質リガンド（すなわち、アゴニスト）によって誘発される活性を模倣する有機分子（例、ペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ））；ならびにペプチド、その抗体またはそのフラグメント、およびＥＣＤ（またはその１部分）を模倣し、そして、天然臭気物質リガンドに結合して「中和する」他の有機化合物を含むことができる。Ｏｒ８３ｂに結合するためのスクリーニングにおいて同定されたそのような化合物は、下記の第５章８節に記載するようにＯｒ８３ｂシグナリングへの作用についてアッセイすることができる。
【０１５５】
コンピューターモデリングおよび検索技術は、Ｏｒ８３ｂ活性を変調できる化合物の同定を許容する。このような化合物または組成物が同定されると、好ましくは活性部位または領域が同定される。このような活性部位は、典型的には例えばＯｒ８３ｂポリペプチドとの臭気物質リガンドの相互作用ドメインのような臭気物質リガンド結合部位であってよい。該活性部位は、例えばペプチドのアミノ酸配列、核酸のヌクレオチド配列、またはＯｒ８３ｂポリペプチドとそれらの天然リガンドとの複合物の研究からを含む当技術分野において公知の方法を使用して同定することができる。後者のケースでは、Ｏｒ８３ｂポリペプチド上で複合臭気物質リガンドが見いだされる場所を見つけることによって活性部位を発見するために化学またはＸ線結晶構造解析方法を使用できる。
【０１５６】
該活性部位の三次元幾何学構造もまた決定できる。これは、完全分子構造を決定できるＸ線結晶構造解析方法を含む公知の方法によって実施できる。臭気物質リガンド／Ｏｒ８３ｂ複合体内の一部の分子内距離を決定するために固相または液相ＮＭＲを使用できる。部分的または完全な幾何学的構造を入手するためには、いずれか他の構造決定の実験的方法を使用できる。該幾何学的構造は、測定された活性部位構造の正確性を上昇させることのできる天然または人工の複合臭気物質リガンドを用いて測定できる。
【０１５７】
該構造を完成する（例、不完全または不十分に正確な構造が決定される実施形態において）またはその正確さを改良するために、コンピューターに基づく数値解析の方法を使用できる。タンパク質または核酸のような特定バイオポリマーに特異的なパラメーター化モデル、分子運動の計算に基づいた分子力学的モデル、熱アセンブルに基づく統計力学モデル、または結合モデルを含むがそれらに限定されないいずれかの当技術分野において認められているモデリング法を使用できる。大多数のタイプのモデルについて、構成原子および構成基間の力を表す標準分子力場が必要とされ、それは物理化学において公知の力場から選択できる。当技術分野において知られており、そしてそのような方法において使用できる代表的な力場には、Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｖａｌｅｎｃｅ  Ｆｏｒｃｅ  Ｆｉｅｌｄ（ＣＶＦＦ）、ＡＭＢＥＲ力場およびＣＨＡＲＭ力場が含まれるがそれらに限定されない。不完全またはそれほど正確ではない実験的構造は、これらのモデリング方法によって計算される完全およびより正確な構造上の制約として役立つことができる。
【０１５８】
最後に、実験的に、モデリングによって、または組み合わせのいずれかによって該活性部位の構造が決定されると、それらの分子構造に関する情報と共に化合物を含有するデータベースを検索することによって候補変調化合物を同定することができる。このような検索は、決定された活性部位構造に適合する、そして該活性部位を規定する基と相互作用する構造を有する化合物を探し出す。このような検索は、手動であってよいが、好ましくはコンピューターが利用される。この検索から見いだされたこれらの化合物は、化合物を変調する潜在的標的または経路ポリペプチドである。
【０１５９】
あるいはまた、これらの方法は既に公知の変調する化合物または臭気物質リガンドから改良された変調化合物を同定するために使用できる。既知の化合物の組成は改変することができ、該改変の構造的作用は新規組成物に適用される上記に記載の実験的およびコンピューターモデリング法を使用して決定できる。その後、変化した構造は改良された適合または相互作用が生じるかどうかを決定するために該化合物の活性部位構造と比較される。この方法では、改良した特異性または活性の改変した結合化合物または臭気物質リガンドを入手するため、例えば側鎖を変化させることによって、そのような組成物中の体系的変化を迅速に評価できる。
【０１６０】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ウォルサム、ＭＡ）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動的機能解析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構成、グラフィックモデリングおよび解析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子相互の行動の相互作用的構成、改変、可視化、および解析を可能にする。
【０１６１】
ロティヴィネン（Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎ）ら，１９８８，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｅｎｎｉｃａ  ９７：１５９−１６６；リプカ（Ｒｉｐｋａ），Ｊｕｎｅ  １６，１９８８，Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ５４−５７；マッキナリー（ＭｃＫｉｎａｌｙ）およびロスマン（Ｒｏｓｓｍａｎｎ），１９８９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９：１１１−１２２；ペリー（Ｐｅｒｒｙ）およびデイヴィス（Ｄａｖｉｅｓ），ＯＳＡＲ：「薬物設計における定量的構造−活性関係（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）」，第１８９−１９３頁（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８９）；およびルイス（Ｌｅｗｉｓ）およびディーン（Ｄｅａｎ），１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６：第１２５−１４０頁および第１−１６２頁のような、多数の論文は特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピューターモデリング法について論評している。化学品をスクリーニングしてグラフ表示する他のコンピュータープログラムは、バイオデザイン（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）社（パサディナ，ＣＡ）、アレリックス（Ａｌｌｅｌｉｘ）社（ミシサーガ、オンタリオ州、カナダ）、およびハイパーキューブ（Ｈｙｐｅｒｃｕｂｅ）社（ケンブリッジ、オンタリオ）のような企業から入手できる。
【０１６２】
上記では結合を変化させることのできる化合物の設計および生成に関連して記載したが、Ｏｒ８３ｂポリペプチドに結合する化合物について、天然産物または合成化学品を含む公知の化合物のライブラリー、およびタンパク質を含む生物学的に活性な物質もまたスクリーニングすることができよう。
【０１６３】
例えば第５章８節に記載したような技術によって同定される追加の化合物を同定するため、ならびに化合物の有効性を試験するためのアッセイは、下記の第５章８節で考察する。当業者には明白であるように、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質に結合する分子を同定するため、個々のタンパク質またはその他の化合物、ならびにタンパク質またはその他の化合物の大きなライブラリー（例、ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングする多数の他の方法がある。これらの方法はすべて、下記で詳細に説明するように、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質、フラグメントまたは突然変異体、または培養細胞を含むがそれに限定されない前記Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質、フラグメントまたは突然変異体を備える組成物を試験化合物と混合する工程と、結合が発生する時間を考慮に入れる工程と、および結合複合体についてアッセイする工程と、を備える。
【０１６４】
５．７．１．ｉｎ  ｖｉｖｏでＯｒ８３ｂに結合する小分子についてのスクリーニング
特に、Ｏｒ８３ｂレセプタータンパク質に結合する分子を同定するための方法が提供される。１の実施形態では、該方法は、Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する細胞と１の試験分子または複数の試験分子とを、該レセプターと前記試験分子との間の結合を誘導する条件下で接触させる工程と、および前記試験分子が該細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を備える。それによってＯｒ８３ｂレセプターに結合するがＯｒ８３ｂレセプターを発現しない対応する細胞には結合しない分子を同定できる。
【０１６５】
また別の実施形態では、第１種からのＯｒ８３ｂレセプターには結合するが第２種からのＯｒ８３ｂレセプターには結合しない分子が同定される。この方法は、どちらもＯｒ８３ｂレセプターを発現する２種の相違する細胞種と１の試験分子とを、該レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程を備える。前記試験分子の該細胞への結合が試験される。第１細胞上ではＯｒ８３ｂレセプターに結合するが第２細胞上では結合しない試験分子が同定される。
【０１６６】
また別の実施形態では、第１昆虫嗅覚レセプターには結合するが第２昆虫嗅覚レセプターには結合しない分子を同定するための方法が提供される。該方法は、Ｏｒ８３ｂレセプターおよび第１嗅覚レセプターを発現する第１細胞および該Ｏｒ８３ｂレセプターおよび第２嗅覚レセプターを発現する第２細胞と、１の試験分子または複数の試験分子とを、該レセプターと前記試験分子との間の結合を誘導する条件下で接触させる工程と、および前記試験分子が該細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を備える。それによって第１細胞、そしてこのため第１嗅覚レセプターには結合するが、第２細胞および第２昆虫嗅覚レセプターには結合しない分子を同定できる。
【０１６７】
また別の実施形態では、昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターには結合するが昆虫味覚レセプターには結合しない分子を同定するための方法が提供される。該方法は、Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する第１細胞および昆虫嗅覚レセプターを発現する第２細胞と１の試験分子または複数の試験分子とを、該レセプターと前記試験分子との間の結合を誘導する条件下で接触させる工程と、および前記試験分子が該細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を備える。それによって第１細胞、そしてこのためＯｒ８３ｂレセプターには結合するが、第２細胞および第２昆虫味覚レセプターには結合しない分子を同定できる。
【０１６８】
５．７．２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＯｒ８３ｂに結合する小分子についてのスクリーニング
本発明のＯｒ８３ｂポリペプチドに結合することのできる化合物を同定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムを設計できる。同定された化合物は、例えば野生型Ｏｒ８３ｂの活性を変調する、そしてそれにより昆虫行動を変調する際に有用なことがある。
【０１６９】
Ｏｒ８３ｂポリペプチドに結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理には、Ｏｒ８３ｂポリペプチドと１の試験化合物との反応混合物とを、２つの成分が相互作用かつ結合することを許容するために十分な、したがって該反応混合物から除去および／または検出できる複合体を形成できる条件下および時間で調製する工程が含まれる。これらのアッセイは、様々な方法で実施できる。例えば、そのようなアッセイを実施する１の方法には、Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたは試験物質を固相上に固定する工程と、および反応の終了時に該固相に固定されたＯｒ８３ｂポリペプチド／試験化合物複合体を検出する工程と、が含まれる。そのような方法の１の実施形態では、Ｏｒ８３ｂポリペプチドは固相表面上に固定することができ、そして固定していない試験化合物は直接的または間接的のいずれかにより標識することができる。
【０１７０】
実際には、固相としてはマイクロタイタープレートを好適に利用できる。固定された成分は、非共有または共有結合によって固定化できる。非共有結合は、タンパク質溶液で該固相表面を被覆し、乾燥させることによって単純に実施できる。あるいはまた、固定化されるタンパク質に特異的な、好ましくはモノクローナル抗体である固定化抗体を使用して該固相表面へ該タンパク質を固定することができる。該表面は前もって調製して保存することができる。
【０１７１】
該アッセイを実施するためには、該固定成分を含有する被覆面に非固定化成分が付加される。反応が完了した後、未反応成分は、形成されたあらゆる複合体が該固相表面上に固定化されたままで留まるような条件下で（例えば、洗浄によって）除去される。該固相表面上に固定された複合体の検出は、多数の方法で遂行できる。事前に固定化されていない成分が予め標識されている場合は、該表面上に固定化された標識の検出は複合体が見いだされたことを示す。事前に固定化されていない成分が予め標識されていない場合は、間接的標識を使用して該表面上に固定された複合体を検出することができる；例えば事前に固定化されていない成分に対して特異的である標識抗体を使用して（該抗体は、順に標識抗Ｉｇ抗体を用いて直接的または間接的に標識できる）。
【０１７２】
あるいはまた、液相では未反応成分から反応産物が分離され、そして複合体が検出される反応を実施できる；例えば、溶液中で形成された、いずれかの複合体を固定化するためにＯｒ８３ｂポリペプチドに対して特異的な固定化抗体、または該試験化合物、および固定化された複合体を検出するために可能性のある複合体の他の成分に対して特異的な標識抗体を使用して。
【０１７３】
１の例として、そして決して限定するためではなく、Ｏｒ８３ｂポリペプチドに結合する化合物を同定するためには本章に記載した方法のような方法を利用できる。例えば、Ｏｒ８３ｂポリペプチドはＯｒ８３ｂポリペプチド／化合物複合体を形成するために十分な時間にわたり化合物と接触させることができ、そしてその後そのような複合体を検出することができる。
【０１７４】
あるいはまた、該化合物はＯｒ８３ｂポリペプチド／化合物複合体を形成するために十分な時間にわたりＯｒ８３ｂポリペプチドと接触させることができ、そしてその後そのような複合体を該反応混合物から分離することができる。
【０１７５】
５．８．Ｏｒ８３ｂ活性を変調する分子についてのスクリーニング
Ｏｒ８３ｂタンパク質に結合する、またはＯｒ８３ｂタンパク質活性を変調できる実際に有用な分子は、臭気物質として機能する小分子、最も好ましくは揮発性小分子である。ここで使用する用語「臭気物質」は、嗅覚レセプターに結合する能力を有する分子を意味する。ここで使用する同等の用語には、「臭気物質リガンド」、「臭気物質分子」および「臭気物質化合物」が含まれる。ここで使用する臭気物質リガンドに関連する用語「結合」または「相互作用」は、リガンドが所与のレセプターまたはレセプター機能のアゴニストおよび／またはアンタゴニストのいずれかとして機能できる場合にリガンドと該レセプターポリペプチドとの相互作用を意味する。この作用は直接的ではなく、単に嗅覚レセプターの別のリガンドへの結合を変化させることによってでよい。このため臭気物質リガンドは、直接的にニオイの知覚を惹起することができる（アゴニスト）、またはニオイの知覚を遮断することができる（アンタゴニスト）。臭気物質リガンドには、嗅覚に関係するポリペプチドと相互作用する分子を含むことができるが、これに限定されるものではない。嗅覚レセプターと相互作用する臭気物質リガンドおよび分子は、一般的に小さな約１ｋＤ、より好ましくは約０．７５ｋＤ、より好ましくは約０．５ｋＤ、またはいっそうより好ましくは約０．３ｋＤの、様々な官能基を備える疎水性分子である。構造における小さな変化は、臭気物質リガンド結合における、および個体によって知覚されるニオイにおける重大な変化を誘発することができる。１の特定の実施形態では、臭気物質リガンドはＯｒ８３ｂリガンド、すなわちＯｒ８３ｂレセプター単独または古典的（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）嗅覚レセプターを結合したＯｒ８３ｂレセプターに結合するリガンドである。
【０１７６】
そこで、本発明はＯｒ８３ｂレセプター活性を変調する分子、より好ましくは小分子、最も好ましくは揮発性分子をスクリーニングする方法を提供する。ニューロン細胞中の嗅覚レセプターを使用して臭気物質化合物をスクリーニングする方法は当技術分野において公知である（フィレスタイン（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ）らの国際公開第９８／５００８１号；ダチャンプ−ヴィレット（Ｄｕｃｈａｍｐ−Ｖｉｒｅｔ）ら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：２１７１−２１７４；サトウ（Ｓａｔｏ）ら，１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓ．７２：２９８０−２９８９；マルニック（Ｍａｌｎｉｃ）ら，１９９９，Ｃｅｌｌ  ９６：７１３−７２３；ツァオ（Ｚｈａｏ）ら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：２３７−２４２）。臭気物質化合物をスクリーニングするために使用できるニューロン細胞を必要としない方法もあり、これらは当技術分野において公知である（カウヴァー（Ｋａｕｖａｒ）らの米国特許第５，７９８，２７５号；キーファー（Ｋｉｅｆｅｒ）ら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１６０７７−１６０８４；クラウトワースト（Ｋｒａｕｔｗｕｒｓｔ）ら，１９９８，Ｃｅｌｌ  ９５：９１７−９２６）。
【０１７７】
１の特定の実施形態では、Ｏｒ８３ｂレセプタータンパク質のモジュレーターを同定するための方法が提供される。該方法は、Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する第１細胞と１の試験分子または複数の試験分子とを該レセプターと前記試験分子との間の結合を誘導する条件下で接触させる工程と、および前記試験分子が第１細胞中のＧタンパク質活性を変調するが、Ｏｒ８３ｂレセプターを発現しない第２細胞中では変調しないかどうかを決定する工程と、を備える。それによりＯｒ８３ｂレセプターを変調する分子を同定できる。
【０１７８】
また別の実施形態では、第１種からのＯｒ８３ｂレセプターを変調するが第２種からのＯｒ８３ｂレセプターを変調しない分子が同定される。この方法は、どちらもＯｒ８３ｂレセプターを発現する２種の相違する種と１の試験分子とを、該レセプターと前記試験分子との結合を誘導する条件下で接触させる工程を備える。該細胞中のＧタンパク質活性が測定される。第１細胞上ではＯｒ８３ｂレセプターのＧタンパク質活性を変調するが第２細胞上では変調しない試験分子が同定される。
【０１７９】
また別の実施形態では、第１昆虫嗅覚レセプターの活性を変調するが第２昆虫嗅覚レセプターの活性を変調しない分子を同定するための方法が提供される。該方法は、Ｏｒ８３ｂレセプターおよび第１嗅覚レセプターを発現する第１細胞および該Ｏｒ８３ｂレセプターおよび第２嗅覚レセプターを発現する第２細胞と、１の試験分子または複数の試験分子とを、該レセプターと前記試験分子との間の結合を誘導する条件下で接触させる工程と、および前記試験分子が該細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を備える。それによって第１細胞、そしてこのための第１嗅覚レセプターを変調するが、第２細胞および第２昆虫嗅覚レセプターを変調しない分子を同定できる。
【０１８０】
また別の実施形態では、昆虫Ｏｒ８３ｂレセプターを変調するが昆虫味覚レセプターを変調しない分子を同定するための方法が提供される。該方法は、Ｏｒ８３ｂレセプターを発現する第１細胞および昆虫味覚レセプターを発現する第２細胞と１の試験分子または複数の試験分子とを、該レセプターと前記試験分子との間の結合を誘導する条件下で接触させる工程と、および前記試験分子が該細胞中のＧタンパク質活性を変調するかどうかを決定する工程と、を備える。それによって第１細胞におけるＧタンパク質の活性、および、このためＯｒ８３ｂレセプター変調するが、第２細胞および第２昆虫味覚レセプターを変調しない分子を同定できる。
【０１８１】
細胞中のカルシウムイオンまたは環状ＡＭＰ濃度を測定することを含むがそれらに限定されないＧタンパク質活性を変調する数種の方法は当業者には知られており、本発明の方法と結び付けて使用できる。このような方法は、それらの全体が参照してここに組み込まれるハワード（Ｈｏｗａｒｄ）ら，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２２（３）：１３２−４０；クラウトワースト（Ｋｒａｕｔｗｕｒｓｔ）ら，１９９９，Ｃｅｌｌ  ９５：９１７−９２６；チャンドラシェカー（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ）ら，２０００，Ｃｅｌｌ．１００（６）：７０３−１１；およびオダ（Ｏｄａ）ら，２０００，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７５（４７）：３６７８１−６に記載されている。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、全自動高スループットスクリーニングの長所を提供する蛍光イメージングプレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）システム（モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社）を使用することにより本出願のスクリーニングアッセイにおいて、細胞内カルシウム濃度が測定される。さらにまたサリヴァン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら，１９９９，「、蛍光イメージングプレートリーダーを使用した［Ｃａ２＋］ｉの測定」、カルシウムシグナリングプロトコルにおける（“Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ［Ｃａ２＋］ｉ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｌｕｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）”，Ｉｎ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｄ．Ｇ．編集，第１２５−１３６頁（ニュージャージー：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ））を参照；またはオッファーマンズ（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ）およびサイモン（Ｓｉｍｏｎ），１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２５）：１５１７５−８０；アングリン（Ｕｎｇｒｉｎ）ら，１９９９，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７２（１）：３４−４２；またはカルシウムイオンの色素としてＦｕｒａ−ＰＥ３（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社、ユージーン、ＯＲ）を使用する米国特許第６，００４，８０８号も参照されたい。カルシウムイオン濃度はＯｒ８３ｂＧタンパク質活性に比例する。
【０１８３】
また別の特定の実施形態では、ｃＡＭＰ濃度はフィッツジェラルド（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７５（１）：５４−６１の方法によって本出願のスクリーニングアッセイにおいて測定される。ｃＡＭＰ濃度はＯｒ８３ｂＧレセプター活性に比例する。
【０１８４】
５．８．１．Ｏｒ８３ｂポリペプチドと相互作用するタンパク質
本発明はさらにまた、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質、または誘導体、フラグメント、突然変異体またはそれらのアナログと相互作用するタンパク質を同定またはスクリーニングする方法を提供する。
【０１８５】
新規Ｏｒ８３ｂタンパク質−細胞タンパク質相互作用を同定するためにはタンパク質−タンパク質相互作用を検出するために適切ないずれかの方法を使用できる。使用できる特に古典的（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）な方法は、共免疫沈降法、架橋法およびグラジェントまたはクロマトグラフィーカラムを通しての共精製法である。これらのような方法を使用すると、Ｏｒ８３ｂポリペプチドと相互作用するタンパク質の同定が可能になる。一旦、同定されると、そのようなタンパク質を使用して、例えば、該タンパク質の内因性細胞の対応物（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）を介してのＯｒ８３ｂシグナリングを崩壊させ、それによってＯｒ８３ｂ誘導性行動を遮断することができる。一旦、同定されると、Ｏｒ８３ｂポリペプチドと相互作用するようなタンパク質を標準方法と結び付けて、Ｏｒ８３ｂポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードする対応遺伝子を同定するのに使用できる。例えば、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも１部分は、例えばエドマン分解技術（例えば、クライトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ），１９８３，「タンパク質：構造および分子原理（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，第３４−４９を参照）を介してのような当業者には周知の方法を使用して確定することができる。入手したアミノ酸配列は、遺伝子配列をスクリーニングするために使用できるオリゴヌクレオチド混合物を生成するための指針として使用できる。スクリーニングは、例えば標準ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によって実施できる。オリゴヌクレオチド混合物を生成させるため、および、スクリーニングするための方法は周知である。（例えば、上記のオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）および、ＰＣＲプロトコル：方法および適用の指針（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，１９９０，インニス  エム（Ｉｎｎｉｓ  Ｍ．）ら編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。
【０１８６】
さらに、Ｏｒ８３ｂポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードする遺伝子の同時同定を生じさせる方法を使用できる。これらの方法には、例えばlｇｔ１１ライブラリーの抗体精査の周知の方法に類似する方法でこのタンパク質を使用して標識Ｏｒ８３ｂポリペプチドを備える発現ライブラリーを精査する方法が含まれる。
【０１８７】
非限定的に例示するため、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質相互作用を検出する１の方法ツーハイブリッドシステムについて下記で詳細に説明する。このシステムの１のバージョンは記載されており（チーン（Ｃｈｉｅｎ）ら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：９５７８−９５８２）、クローンテック（パロアルト、ＣＡ）から市販で入手できる。
【０１８８】
簡潔には、このようなシステムを利用して、２つのハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドが構築される：１つは、この場合にはＯｒ８３ｂポリペプチドである既知のタンパク質に融合した転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインからなり、そしてもう１つは、好ましくはｃＤＮＡライブラリーの一部としてこのプラスミド内に組み換えられている昆虫触角または上顎触肢ｃＤＮＡであるｃＤＮＡによってコードされる未知のタンパク質に融合した該アクチベータータンパク質の活性化ドメインからなる。これらのプラスミドは、その調節領域が転写アクチベーターの結合部位を含有するレポーター遺伝子（例、ｌａｃＺ）を含有する、酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株内に形質転換させられる。ハイブリッドタンパク質単独は該レポーター遺伝子の転写を活性化できず、ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは活性化機能を提供しないために活性化できず、そして活性化ドメインハイブリッドは該アクチベーター結合部位に局在できないので活性できない。２つのハイブリッドタンパク質の相互作用は機能的アクチベータータンパク質を再構築し、そして該レポーター遺伝子の発現を生じさせ、これは該レポーターポリペプチドについてのアッセイによって検出される。
【０１８９】
ツーハイブリッドシステムまたは関連方法を使用すると、既知の「ベイト（ｂａｉｔ）」ポリペプチドと相互作用するタンパク質について活性化ドメインライブラリーをスクリーニングすることができる。一例として、そして限定するためではなく、Ｏｒ８３ｂポリペプチドはベイトポリペプチドとして使用できる。全ゲノムまたはｃＤＮＡ配列は活性化ドメインをコードするＤＮＡへ融合させられる。ＤＮＡ結合ドメインに融合したベイトポリペプチドのハイブリッドをコードするこのライブラリーおよびプラスミドは酵母レセプター株内へ共形質転換され、そして生じた形質転換体は該レセプター遺伝子を発現する形質転換体についてスクリーニングされる。非限定的に例えば、ベイト（例、Ｏｒ８３ｂ）遺伝子は、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡに翻訳に伴って融合しているよう、ベクター内にクローニングすることができる。これらのコロニーを精製し、レセプター遺伝子発現の要因であるライブラリープラスミドが単離される。その後ＤＮＡシーケンシングを使用してライブラリープラスミドによりコードされるタンパク質が同定される。
【０１９０】
ベイト（例、Ｏｒ８３ｂ）ポリペプチドと相互作用するタンパク質由来の細胞ラインのｃＤＮＡライブラリーは、当技術分野において日常的に実施される方法を使用して作製できる。ここに記載した特定システムによると、例えばｃＤＮＡフラグメントはそれらがＧＡＬ４の活性化ドメインに翻訳に伴って融合しているようにベクター内に挿入することができる。このライブラリーは、ベイト遺伝子−ＧＡＬ４融合プラスミドと共に、ＧＡＬ４活性化配列を含有するプロモーターによって駆動されたｌａｃＺ遺伝子を含有する酵母株内に共形質転換することができる。ベイトポリペプチドと相互作用する、ＧＡＬ４活性化ドメイン融合したｃＤＮＡをコードするタンパク質は、活性ＧＡＬ４タンパク質を再構築し、そしてそれによってｌａｃＺ遺伝子の発現を駆動するであろう。ｌａｃＺを発現するコロニーは、Ｘ−ｇａｌの存在下でそれらの青色によって検出できる。ｃＤＮＡはその後、これらの株から精製することができ、そして当技術分野において日常的に実践される方法を使用してベイト遺伝子相互作用タンパク質を生産かつ単離するために使用できる。
【０１９１】
５．８．２．Ｏｒ８３ｂシグナリングを妨害する化合物についてのアッセイ
本発明のＯｒ８３ｂポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、Ｇタンパク質を含むがそれらに限定されないタンパク質のような１または２以上の細胞高分子と相互作用することができる。このような高分子には、例えば上記の第５章８節に記載した方法のような方法を介して同定されたタンパク質を含むことができるが、それらに限定されない。そのような相互作用を破壊させる化合物は、Ｏｒ８３ｂポリペプチドの活性を調節し、それによって昆虫行動を変調させる際に有用なことがある。このような化合物には、抗体、ペプチド等のような分子を含むことができるがそれらに限定されない。
【０１９２】
Ｏｒ８３ｂポリペプチドとその１または２以上の細胞結合パートナーとの相互作用を妨害する化合物を同定するために使用されるアッセイの基本原理には、Ｏｒ８３ｂポリペプチドと結合パートナーを含有する反応混合物とを、これら２つが相互作用かつ結合し、そうして複合体を形成することを許容するために十分な条件と時間で調製する工程を含んでいる。化合物を阻害活性について試験するためには、該反応混合物は該試験化合物の存在下および不在下で調製される。該試験化合物は、最初に該反応混合物中に含めることができる、またはＯｒ８３ｂポリペプチドおよびその細胞結合パートナーの添加に続く時点で添加することができる。コントロール反応混合物は、該試験化合物を含めずに、またはプラセボと共にインキュベートされる。その後、Ｏｒ８３ｂポリペプチドと細胞結合パートナーとの複合体の形成が検出される。コントロール反応中では複合体が形成されるが、試験化合物を含有する反応混合物では形成されないことは、該化合物がＯｒ８３ｂポリペプチドと相互作用結合パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【０１９３】
Ｏｒ８３ｂポリペプチドおよび結合パートナーの相互作用を妨害する化合物のアッセイは、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）または同種（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）フォーマットで実施することができる。異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）アッセイには、Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたは結合パートナーのいずれかを固相上に固定する工程と、および反応の終了時に該固相上に固定された複合体を検出する工程と、が含まれる。同種（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）アッセイでは、全反応が液相上で実施される。いずれかのアプローチで、試験される化合物についての様々な情報を入手するために反応物質を添加する順序は変化させることができる。例えば、Ｏｒ８３ｂポリペプチドと結合パートナーとの相互作用を例えば、競合によって妨害する試験化合物は、該試験物質の存在下で反応を実施すること；すなわち、Ｏｒ８３ｂポリペプチドおよび相互作用細胞結合パートナーを添加する前または同時に、試験化合物を該反応混合物へ添加することによって同定できる。あるいはまた、予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物、例えば該複合体からの１の成分に置換する高い結合定数を備える化合物は、複合体が形成された後に該反応混合物に該試験化合物を添加することによって試験できる。下記では様々なフォーマットを簡潔に記載する。
【０１９４】
異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）アッセイシステムでは、Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたは相互作用細胞結合パートナーのいずれかが固相表面上に固定され、他方固定されなかった種は直接的または間接的のどちらかで標識される。実際には、マイクロタイタープレートが好適に利用される。固定された種は、非共有または共有結合によって固定化できる。非共有結合は、Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたは結合パートナーの溶液で該固相表面を被覆し、乾燥させることによって単純に実施できる。あるいはまた、固定化される種に特異的な固定化抗体を使用すると該固相表面へ該種を固定することができる。該表面は前もって調製して保存することができる。
【０１９５】
該アッセイを実施するためには、該固定化種のパートナーは該試験化合物を伴って、または伴わずに被覆面へ曝露させられる。反応が完了した後、未処理成分は除去され（例えば、洗浄によって）、形成されたあらゆる複合体が該固相表面上に固定化されたままで留まる。該固相表面上に固定された複合体の検出は、多数の方法で遂行できる。固定化されていない成分が前標識されている場合は、該表面上に固定化された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。固定化されていない種が前標識されていない場合は、間接的標識を使用して該表面上に固定された複合体を検出することができる；例えば最初に固定化されていない種に対して特異的である標識抗体を使用して（該抗体は、順に、標識抗Ｉｇ抗体を用いて直接的または間接的に標識できる）。反応成分の添加順序に依存して、複合体形成を阻害する、または予め形成された複合体を破壊する試験化合物を検出できる。
【０１９６】
あるいはまた、液相では該試験化合物の存在下または不在下で、未反応成分から反応産物が分離され、そして複合体が検出される反応を実施できる；例えば、溶液中で形成された複合体を固定化するために結合成分の１つに対して特異的な固定化抗体、および固定化された複合体を検出するために他のパートナーに対して特異的な標識抗体を使用して。さらに、液相への反応成分の添加順序に依存して、複合体形成を阻害する、または予め形成された複合体を破壊する試験化合物を検出できる。
【０１９７】
本発明のまた別の実施形態では、同種アッセイを使用できる。このアプローチでは、Ｏｒ８３ｂポリペプチドと相互作用細胞結合パートナーとの予め形成された複合体は、Ｏｒ８３ｂポリペプチドまたはその結合パートナーのいずれかが標識され、しかし、該標識によって生成したシグナルは複合体形成に起因して抑えられることで調製される（例えば、イムノアッセイのためにこのアプローチを利用するルーベンスタイン（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ）による米国特許第４，１０９，４９６号を参照）。予め形成された複合体からの１の種と競合してそれに置換する試験物質の添加は、バックグラウンドを超えるシグナルの生成を生じさせるであろう。この方法で、Ｏｒ８３ｂポリペプチド／細胞結合パートナー相互作用を崩壊する試験物質を同定できる。
【０１９８】
１の特定の実施形態では、標的ポリペプチドは組み換えＤＮＡ技術を使用して固定化のため調製できる。例えば、Ｏｒ８３ｂコード領域は、結果として生じる融合タンパク質中において、その結合活性が維持されるような方法で、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のような融合ベクターを使用してグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合させることができる。相互作用細胞結合パートナーを精製かつ使用すると、当技術分野において日常的に実践され、そして上記の第５章６節に記載したような方法を用いてモノクローナル抗体を産生することができる。この抗体は、当技術分野において日常的に実践される方法によって、例えば放射性同位体１２５Ｉを用いて標識できる。異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）アッセイでは、例えばＧＳＴ−Ｏｒ８３ｂ融合タンパク質はグルタチオン−アガロースビーズに固定することができる。その後、相互作用細胞結合パートナーは、相互作用および結合が発生するのを許容する方法で、該試験化合物の存在下または不在下で添加することができる。反応期間の終了時に、未結合物質は洗い流すことができ、そして標識モノクローナル抗体を該システムに添加させ、複合成分に結合させることができる。Ｏｒ８３ｂポリペプチドと相互作用細胞結合パートマーとの相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズと会合したままである放射能の量を測定することによって検出できる。該試験化合物による相互作用の阻害の成功は、測定された放射能の低下を生じさせるであろう。
【０１９９】
あるいはまた、ＧＳＴ−Ｏｒ８３ｂ融合タンパク質および相互作用細胞結合パートナーは、固形グルタチオン−アガロースビーズの不在下、液体中で共に混合することができる。該試験化合物は、該種が相互作用させられる間または後のどちらかに添加できる。この混合物はグルタチオン−アガロースビーズへ添加させることができ、未結合物質は洗い流される。さらに、Ｏｒ８３ｂポリペプチド／結合パートナー相互作用の阻害の程度は、標識抗体を添加し、該ビーズに会合した放射能を測定することによって検出できる。
【０２００】
本発明のまた別の実施形態では、これらの同様の方法を、Ｏｒ８３ｂポリペプチドおよび／または相互作用細胞結合パートナー（結合パートナーがタンパク質の場合に）の結合ドメインに対応するペプチドフラグメントを用いて、全長タンパク質の１つまたは両方に置き換えて、使用できる。当技術分野において日常的に実践される多数の方法を結合部位を同定かつ単離することに使用することができる。これらの方法には、タンパク質の１つをコードする遺伝子の突然変異誘発および共免疫沈降アッセイにおける結合の破壊についてのスクリーニングが含まれるが、それらに限定されない。その後、該複合体内の第２種をコードする遺伝子における補償的突然変異（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を選択することができる。各タンパク質をコードする遺伝子の配列解析により、相互作用結合に関連するタンパク質の領域に対応する突然変異が明らかになるであろう。あるいはまた、１のタンパク質を固形表面に固定し、例えばトリプシンのようなタンパク質分解性酵素を用いて処理されている、その標識結合パートナーと相互作用してそれに結合させることができる。洗浄後、該結合ドメインを備える短い標識ペプチドは、固相物質と結び付いたままで留まることができ、単離でき、かつ、アミノ酸配列解析によって同定できる。さらに、細胞結合パートナーをコードする遺伝子が一旦入手されると、短い遺伝子セグメントがタンパク質のペプチドフラグメントの発現のため操作することができ、これはその後結合活性について試験して精製または合成することができる。
【０２０１】
非限定的に例えば、Ｏｒ８３ｂポリペプチドはＧＳＴ−Ｏｒ８３ｂ融合タンパク質を作製し、それをグルタチオン−アガロースビーズへ結合させることによって、本章の上記に記載したように固形物質へ固定することができる。相互作用細胞結合パートナーは、３５Ｓのような放射性同位元素を用いて標識し、そしてトリプシンのようなタンパク質分解性酵素を用いて切断させることができる。切断産物は、その後固定されたＧＳＴ−Ｏｒ８３ｂ融合タンパク質に添加して、結合させることができる。未結合ペプチドを洗浄除去した後に、細胞結合パートナー結合ドメインを示す標識結合物質は、溶出し、精製し、そして周知の方法によってアミノ酸配列について解析することができる。このように同定されたペプチドは、周知の組み換えＤＮＡ技術を使用して合成的に産生できる、または適切な促通性タンパク質（ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）へ融合させることができる。
【０２０２】
５．９．Ｏｒ８３ｂモジュレーターの使用
本発明のまた別の実施形態では、農業において重要な害虫種を防除するときに昆虫嗅覚レセプター遺伝子を使用できる。非限定的に例えば、小分子、タンパク質および核酸を含むＯｒ８３ｂモジュレーターは、作物を損傷させる昆虫、または家畜または他の動物の害虫の成長、摂食および／または生殖の行動を改変することに活性を有することがある。さらに、一般に、有効な害虫防除剤は標的害虫に、誘引（例えばベイトまたはトラップ内への）、撃退、麻痺、発達阻害、または摂食の休止のような、活性障害を発揮する。害虫防除剤は、殺虫剤、防虫剤または誘引剤に分類できる。このような害虫には、ハエ、イナゴ、蚊、ノミ、蛾、甲虫、セミ、バッタ、およびコオロギの卵、幼虫、若体および成体形が含まれるがそれらに限定されない。
【０２０３】
作動（アゴニスト）性または拮抗（アンタゴニスト）性の組み換えまたは合成のＯｒ８３ｂタンパク質、アナログまたは誘導体、またはそのような作動（アゴニスト）性または拮抗（アンタゴニスト）性の組み換えまたは合成のＯｒ８３ｂタンパク質、アナログまたは誘導体をコードする核酸を昆虫誘引活性または防虫活性についてアッセイすることができる。昆虫誘引および防虫についての実験室および野外（フィールド）アッセイは当技術分野においてよく知られており、Ｏｒ８３ｂレセプターに結合する、またはＯｒ８３ｂレセプターを変調させる分子を試験するために使用できるものにはフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）ら，１９９７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４２：１２３−４６；「昆虫の嗅覚（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｏｌｆａｃｔｉｏｎ）」，ビー・エス・ハンソン（Ｂ．Ｓ．Ｈａｎｓｓｏｎ）編集，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；バーケット（Ｂｉｒｋｅｔｔ）ら，  ２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７（１６）：９３２９−３４；デ・モラエス（Ｄｅ  Ｍｏｒａｅｓ）ら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ．４１０（６８２８）：５７７−８０；クライン（Ｋｌｉｎｅ）ら，１９９０，Ｍｅｄ  Ｖｅｔ  Ｅｎｔｏｍｏｌ．４（４）：３８３−９１；フェラン（Ｐｈｅｌａｎ），１９８７，Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８０：７７９−７８３；およびレスキー（Ｌｅｓｋｅｙ）ら，２００１，Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｅｃｏｌ．  ２７（１）：１−１７によって記載されたものが含まれるが、それらに限定されない。
【０２０４】
１の実施形態では、Ｏｒ８３ｂタンパク質のドミナントネガティブ形をコードするＯｒ８３ｂ遺伝子は、標的害虫におけるドミナントネガティブＯｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子の発現を指揮する組み換えウイルス形態での昆虫防除剤として試験することができる。感染昆虫細胞中でタンパク質を発現させるために適切な組み換えウイルス系には、組み換えセムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）（ディ・チオッモ（ＤｉＣｉｏｍｍｏ）およびブレムナー（Ｂｒｅｍｎｅｒ），１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８０６０−６６）、組み換えシンドビスウイルス（ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ヒッグス（Ｈｉｇｇｓ）ら，１９９５，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４：９７−１０３；シーボー（Ｓｅａｂａｕｇｈ）ら，１９９８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４３：９９−１１２）、組み換えＰａｎｔｒｏｐｉｃレトロウイルス（マツバラ（Ｍａｔｓｕｂａｒａ）ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６１８１−８５；ジョーダン（Ｊｏｒｄａｎ）ら，１９９８，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：２１５−２２）、および最も好ましくは組み換えバキュロウイルスが含まれるがそれらに限定されない。昆虫のタンパク質の発現を操作するための手段、および昆虫防除剤としての組み換えバキュロウイルスの使用は、当技術分野において周知である。このアプローチには、宿主特異性、環境上の安全性、容易に操作できるベクター系の入手可能性、およびＯｒ８３ｂタンパク質の精製または調製の必要を伴わずに害虫防除剤としての組み換えウイルスの直接的な潜在的使用を含む多数の特異的な長所がある（コリー（Ｃｏｒｙ）およびビショップ（Ｂｉｓｈｏｐ），１９９７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７（３）：３０３−１３；米国特許第５，４７０，７３５号；米国特許第５，３５２，４５１号；米国特許第５，７７０，１９２号；米国特許第５，７５９，８０９号；米国特許第５，６６５，３４９号；米国特許第５，５５４，５９２号）。そこで、Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプター遺伝子の発現を指揮する組み換えバキュロウイルスは、制御された実験室条件下でＯｒ８３ｂタンパク質の害虫防除活性を試験するため、および野外での昆虫防除剤としてのどちらにも使用できる。あるいはまた、Ｏｒ８３ｂレセプター遺伝子のドミナントネガティブ活性を試験するために、ハンドラー（Ｈａｎｄｌｅｒ），２００１，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３１（２）：１１１−２８、またはアトキンソン（Ａｔｋｉｎｓｏｎ）ら，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４６：３１７−４６によって教示されるようにトランスジェニック昆虫を作製することができる。
【０２０５】
昆虫Ｏｒ８３ｂタンパク質、核酸、および最も好ましくは上記の第５章７節１項に記載した方法によって同定されたアゴニストおよびアンタゴニストのようなリガンドは、水、有機溶媒、および／または無機溶媒のような農業用に適切ないずれかの担体を用いて調製することができる。害虫防除剤組成物は、固体または液体組成物の形状であってよい、そして溶解、混合、製粉、顆粒形成、および分散を含むがそれらに限定されない基本的な調製工程によって調製できる。
【０２０６】
本発明は、溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）、担体、結合剤、ＵＶ遮断剤、接着剤、湿潤剤（ｈｅｍｅｃａｎｔ）、増粘剤、分散剤、保存料および昆虫誘引剤を含むがそれらに限定されない当技術分野において公知の農業用に許容される賦形剤との混合物中に昆虫Ｏｒ８３ｂ嗅覚レセプタータンパク質または遺伝子又はリガンドを含有する組成物を含んでいる。そこで、本発明の組成物は、例えば活性物質と微細に分離された固体担体とを備える固体として調製することができる。あるいはまた、該活性物質は分散剤、乳濁剤および懸濁剤を含む液体組成物中に含有することができる。例えば、顆粒、粉末、ベイト−ペレット（該活性物質および昆虫誘引剤または食品物質を含有する固体組成物）、マイクロカプセル、水分散性顆粒、エマルジョンおよび乳化濃縮物を含む適切な最終調製物を使用できる。
【０２０７】
本発明と併用するために適切な固体担体の例には、デンプン、活性炭、大豆粉末、小麦粉末、木粉、魚粉、粉乳、タルク、カオリン、ベントナイト、炭酸カルシウム、ゼオライト、珪藻土、微細シリカ粉末、粘土、アルミナ、ろう石、ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ  ｃｈａｌｋ、石灰、フラー土、綿実殻、軽石、ｔｒｉｐｏｌｉ、クルミ殻粉、レッドウッド粉、およびリグニンが含まれるがそれらに限定されない。
【０２０８】
本発明と一緒に使用するために適切な液体担体の例には、水、イソプロピルアルコール、エチレングリコール、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、灯油、軽油、キシレン、トリメチルベンゼン、テトラメチルベンゼン、メチルナフタレン、ソルベント・ナフサ、クロロベンゼン、ジメチルアセトアミド、グリセリンエステル、アセトニトリル、またはジメチルスルホキシドが含まれるがそれらに限定されない。
【０２０９】
非ヒト動物のための防虫剤調製物は、注入式（ｐｏｕｒ−ｏｎ）調製物、滴下式（ｓｐｏｔ−ｏｎ）調製物、スプレー、シャンプー、散布剤、含浸ストリップ、石けん、イヤータグまたはテールタグまたはゲルの形状であってよい。ヒト用の防虫剤調製物は、粉末、軟膏、ローション剤、ティッシュ、クリーム剤、石けん、侵食性スティックまたは衣服用パッチの形状であってよい。該調製物は、抗酸化物質およびＵＶ吸収剤を含んでいてよい。クリーム剤およびローション剤が特に興味深く、皮膚への投与のために適合する可能性がある。
【０２１０】
農業用には、本発明の誘引剤を含有する調製物は疑似餌、餌または罠を使用する。防虫剤を含有する調製物は、当業者に公知の従来型装置を使用することによって、スプレー剤、滴剤、マイクロフィルム、マイクロカプセル、または薄い規定層の形状で処理すべく木々、植物または領域に適用することができる。そのような調製物は、徐放性に調製できる。防虫剤調製物は、分散コーティング、フィルムコーティング、スプレーコーティング、マイクロカプセル化製剤、ポリマー徐放性液滴、小滴、パラフィンブロックのようなブロック、モノリス（ｍｏｎｏｌｉｔｈ）、増粘剤（ｐｕｆｆｅｒ）およびその他の当技術分野において公知のいずれか他の類似形状のような形状であってよい。様々な徐放系は「作物保護剤の制御放出（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃｒｏｐ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｔｓ）」，Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９０），アール・エム・ウィルキンス（Ｒ．Ｍ．Ｗｉｌｋｉｎｓ）編，特に第３および９編および「制御放出フェロモン系を用いた昆虫抑制（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」，第ＩおよびＩＩ巻，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ボーカラトーン、フロリダ（１９８２）に記載されている。
【０２１１】
下記の実施例は、本発明の様々な態様を単に例示する目的で提供されており、決して本発明を制限すると解釈されてはならない。
【実施例】
【０２１２】
６．実施例：昆虫Ｏｒ８３ｂ遺伝子のｃＤＮＡの同定および配列解析
低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを使用して、キイロショウジョウバエＯｒ８３ｂに関連する遺伝子は、極めて破壊的な農業害虫である地中海ミバエのチチュウカイミバエ；マラリアの蚊担体であるガンビエハマダラカ；タバコガ（ｃｏｒｎ  ｅａｒｗｏｒｍ、ｃｏｔｔｏｎ  ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、および一般的イナゴであるサバクバッタ（アメリカイナゴ）から同定されている。
【０２１３】
６．１．チチュウカイミバエにおけるＯｒ８３ｂ遺伝子の同定
図１に示したキイロショウジョウバエＯｒ８３ｂ遺伝子を使用して、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でチチュウカイミバエのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。数種の重複クローンを精製かつマッピングした。キイロショウジョウバエプローブへハイブリダイズしたゲノムＤＮＡフラグメントをサブクローニングして配列解析した。
【０２１４】
ＧＥＮＳＣＡＮ解析およびショウジョウバエＯｒ８３ｂ遺伝子との配列比較を使用してイントロン−エクソン構造を推定した。チチュウカイミバエ成体触角ｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲを使用して、Ｏｒ８３ｂ遺伝子の全オープンリーディングフレームを表すフラグメントを増幅したが、これらの結果は推定されたイントロン−エクソン構造を確証した。チチュウカイミバエＯｒ８３ｂ  ｃＤＮＡの配列は図２に示した。チチュウカイミバエおよびキイロショウジョウバエ推定ポリペプチドは８８％同一性および９２％類似性を示す。
【０２１５】
６．２．タバコガにおけるＯｒ８３ｂ遺伝子の同定
成体タバコガ（トウモロコシの害虫）触角から調製したｃＤＮＡライブラリーは、プローブとしてキイロショウジョウバエＯｒ８３ｂ遺伝子を使用して低ストリンジェンシーでスクリーニングした。数種のハイブリダイジングクローンを精製かつ解析した。図３に示したこれらの同定されたｃＤＮＡクローンの最長の配列解析により、キイロショウジョウバエＯｒ８３ｂへの高度の配列類似性が明らかになる。総合すると、タバコガおよびキイロショウジョウバエＯｒ８３ｂポリペプチドは６４％同一性および７６％類似性を示す。
【０２１６】
６．３．ガンビエハマダラカにおけるＯｒ８３ｂ遺伝子の同定
近年、マラリアの伝播の要因となる主要な媒介蚊であるガンビエハマダラカの完全ゲノム配列を決定するために大規模な試みが開始されてきた。フランスのＧｅｎｏｓｃｏｐｅおよびパスツール研究所の研究者らはハマダラカゲノムからの１７，０００のランダム配列からなるデータベースを公表した。このデータベースは１２，０００，０００塩基対、または全蚊ゲノムの大まかに５％を表している。このハマダラカ・データベースのＢＬＡＳＴ検索はキイロショウジョウバエＯｒ８３ｂ遺伝子を用いて実施され、キイロショウジョウバエＯｒ８３ｂの２種の領域に高度な配列類似性を示す２つの独立した配列を同定した。２つの配列フラグメントは、ハマダラカゲノムにおける単一Ｏｒ８３ｂ遺伝子の２つの隣接する部分を表すと考えられた。この考察は、これらの２つの配列にわたる３ｋｂフラグメントを増幅させるべくＰＣＲを使用して確証された。その後このフラグメントを使用してハマダラカゲノムＤＮＡライブラリーがスクリーニングされ、ハイブリダイジングクローンがサブクローニングして配列解析された。
【０２１７】
ＧＥＮＳＣＡＮ解析およびショウジョウバエＯｒ８３ｂ遺伝子との配列比較を使用してイントロン−エクソン構造を推定した。ハマダラカ成体頭部ｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲを使用して、Ｏｒ８３ｂ遺伝子の全オープンリーディングフレームを表すフラグメントを増幅したが、これらの結果は推定されたイントロン−エクソン構造を確証した。ガンビエハマダラカおよびキイロショウジョウバエＯｒ８３ｂ推定ポリペプチドは７７％同一性および８４％類似性を示す。同定されたガンビエハマダラカＯｒ８３ｂ遺伝子の配列は図４に示した。
【０２１８】
６．４．アメリカイナゴにおけるＯｒ８３ｂ遺伝子の同定
縮重ＰＣＲアプローチを使用してイナゴのアメリカイナゴからＯｒ８３ｂ遺伝子を同定した。簡潔には、縮重オリゴヌクレオチドプライマー［フォワードプライマー：Ａ４５  １．１（ＡＡＲ  ＴＡＹ  ＴＧＧ  ＧＴＩ  ＧＡＲ  ＭＧＩ  ＣＡ）、配列番号１９、対応するアミノ酸配列ＫＹＷＥＲＨ；リバースプライマー：Ａ４５  ２．２（ＡＰＩ  ＣＫＲ  ＴＴＩ  ＣＣＲ  ＡＡＤ  ＡＴＲ  ＣＡ）、配列番号：２０、配列ＣＩＦＧＮＲＬに対応する）を使用してアメリカイナゴ成体触角ｃＤＮＡからの２３５ｂｐフラグメントを増幅させた。その後このフラグメントを使用してアメリカイナゴ触角ｃＤＮＡライブラリーがスクリーニングされ、数種のクローンが単離して解析された。このアメリカイナゴＯｒ８３ｂ遺伝子のオープンリーディングフレームの配列および対応するアミノ酸配列を図５に示した。アメリカイナゴおよびキイロショウジョウバエＯｒ８３ｂのアミノ酸配列は、５９％同一性および７２％類似性を示す。
【０２１９】
６．５．昆虫Ｏｒ８３ｂ遺伝子の配列解析
同定されたＯｒ８３ｂホモログの推定アミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを図６に示した。この解析は、該タンパク質のＣ末端半分が昆虫種を超えて有意な程度の保存を示めしている。推定アミノ酸配列における推定膜貫通ドメインの解析は、これらのドメインの数を明らかにし、そして該タンパク質配列内のそれらの相対位置はキイロショウジョウバエＯｒ８３ｂに比較して保存されている。強力な配列保存領域は、例えばＲＳＡＩＫＹＷＥＲＨＫＨＶＶＲ；ＦＣＩＦＧＮ（ＲｏｒＳ）Ｌ；ＷＹＤＧＳＥＥＡＫ；ＦＡＳＶＬＧＡＶＶＴＹＦＭＶＬＶＱＬＫのような種々の昆虫種におけるＯｒ８３ｂの推定ホモログを単離かつ認識するために使用できるアミノ酸「サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」モチーフを表している。
【０２２０】
６．６．昆虫Ｏｒ８３ｂ遺伝子の発現
ＲＮＡインサイチュー・ハイブリダイゼーションを使用して、昆虫嗅覚組織中のこれらの同定されたＯｒ８３ｂ遺伝子の発現の空間的パターンを決定した。昆虫では、嗅覚ニューロンは触角および上顎触肢に限定される。ショウジョウバエのようなハエでは、嗅覚ニューロンは単一触角セグメントに位置する。これとは対照的に、蚊、鱗翅類および直翅類では、触角は長い多分節器官であり、嗅覚ニューロンは連続触角分節内に見いだされる。チチュウカイミバエおよびハマダラカＯｒ８３ｂ遺伝子の発現を成体触角の長手方向断片において試験した（各々、図７Ｂおよび７Ｃ）。両遺伝子の発現は多数の触角細胞中で検出された。触角の表面上の感覚毛の下方のこれらの細胞の位置、ならびにそれらの形態は嗅覚ニューロンとしてのそれらの同一性と一致している（図７Ａ）。
【０２２１】
タバコガＯｒ８３ｂ遺伝子の発現の空間的パターンをインサイチュー・ハイブリダイゼーションによって成体雌触角の長手方向断片において試験した（図７Ｄ）。さらに、この遺伝子の発現は触角断片の各々において多数の細胞で検出され、そしてそれらの位置および形態はそれらが嗅覚ニューロンとの同一性を強力に示唆した。
【０２２２】
アメリカイナゴＯｒ８３ｂ遺伝子の発現は成体イナゴ触角の長手方向断片において嗅覚ニューロンのクラスターにおいて検出された（図７Ｅ）。
【０２２３】
そこで、これらのデータは、ショウジョウバエにおけると同様にこれらの他の昆虫種においてＯｒ８３ｂは昆虫におけるニオイ認識におけるこれらの推定ＧＰＣＲにとって保存された、そして、本質的役割と一致して多数の嗅覚ニューロンによって発現する。
【０２２４】
７．微生物の寄託
以下のプラスミドは、２００１年７月３０日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、マナッサス、バージニア州に寄託され、下記に示す受託番号が指定されている：
微生物 ＡＴＣＣ受託番号
Ｃｃ８３ｂ−２ＰＴＡ−３５７３
Ｈｚ−８．１Ａ１０   ＰＴＡ−３５７４
Ａｇ８３ｂ−１ＰＴＡ−３５７５
Ｓａ８３ｂ    ＰＴＡ−３５７６
【０２２５】
Ｃｃ８３ｂ−２はｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター内のチチュウカイミバエＯｒ８３ｂ  ｃＤＮＡである；Ｈｚ−８．１Ａ１０はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−内のタバコガＯｒ８３ｂ  ｃＤＮＡである；Ａｇ８３ｂ−１はｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター内のガンビエハマダラカＯｒ８３ｂ  ｃＤＮＡである；およびＳａ８３ｂはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−内のアメリカイナゴＯｒ８３Ｂ  ｃＤＮＡである。
【０２２６】
本発明は、ここに記載した特定の実施形態によって範囲が限定されてはならない。実際に、ここに記載したものに加えて本発明の様々な改変は、上記の説明および添付の図面から当業者には明白になるであろう。そのような改変は、添付のクレームの範囲内に含まれることが意図されている。
【０２２７】
それらの開示はこれによりそれらの全体が参照して組み込まれる特許出願、特許および出版物を含む様々な参考文献は上記に言及されている。
【０２２８】
2005510209.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】キイロショウジョウバエＯｒ８３ｂのヌクレオチド酸配列（配列番号：９）およびアミノ酸配列（配列番号：１０）を示し、アミノ酸は１文字表記した。
【図２】ＰＣＲ増幅によって入手されたチチュウカイミバエＯｒ８３ｂオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号：１）およびそのコードされたタンパク質（配列番号：２）を示した。
【図３】タバコガ（Ｃｏｒｎ  Ｅａｒｗｏｒｍ）Ｏｒ８３ｂ  ｃＤＮＡの完全配列（配列番号：３）およびそのコードされた推定タンパク質（配列番号：４）を示した。
【図４】ハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって入手されたガンビエハマダラカＯｒ８３ｂオープンリーディングフレーム（配列番号：５）のヌクレオチド配列およびそのコードされた推定タンパク質（配列番号：６）を示した。
【図５】アメリカイナゴ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）Ｏｒ８３ｂ  ｃＤＮＡのコード領域（配列番号：７）およびそのコードされた推定タンパク質（配列番号：８）を示した。
【図６】Ｏｒ８３ｂタンパク質の配列アライメントであり、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ，  ＡｌｉｇｎＸ  ｐｒｏｇｒａｍ，  Ｉｎｆｏｒｍａｘ，  Ｉｎｃ．）を使用してＧＥＮＳＣＡＮまたはｃＤＮＡ配列から推定されるタンパク質配列をアライメントし、同一アミノ酸は黒色で示した；類似アミノ酸はグレーで陰影を付け、ＣｌｕｓｔａｌＷアライメントから引き出されたコンセンサスＯｒ８３ｂアミノ酸配列（配列番号：１１）もまた示した。
【図７】図７Ａ〜Ｅは、嗅覚組織におけるＯｒ８３ｂ遺伝子の発現を示し、図７Ａ）代表的な昆虫嗅覚感覚毛の断面図を示した略図である。感覚毛は、臭気物質（赤色球）の中心空洞内への拡散を許容する孔を備える液体が充填された中空構造で、各感覚毛の下方に位置する嗅覚ニューロンのクラスター（青色）は感覚毛の腔内へ樹状突起を伸ばし、臭気物質とこれらの樹状突起上に局在する嗅覚レセプターとの相互作用は、脳へ伝播される電気的信号の産生を生じさせる、図７Ｂ）チチュウカイミバエＯｒ８３ｂアンチセンスプローブが成体触角の長手方向断片へハイブリダイズさせ、多数のＯｒ８３ｂ発現細胞が検出されている（矢印）、図７Ｃ）成体雌ガンビエハマダラカ触角の長手方向断片がＯｒ８３ｂアンチセンスプローブを用いてハイブリダイズされ、アルカリホスファターゼにより可視化し、代表的なＯｒ８３ｂ発現細胞を矢印で指示した、図７Ｄ）タバコガＯｒ８３ｂアンチセンスプローブが成体雌触角の長手方向断片へハイブリダイズされ、多数のＯｒ８３ｂ発現細胞が嗅覚感覚毛の下方でクラスター形成している各触角セグメントにおいて検出されている、図７Ｅ）アメリカイナゴＯｒ８３ｂアンチセンスプローブが成体雌触角の長手方向断片へハイブリダイズされ、多数のＯｒ８３ｂ発現細胞が嗅覚感覚毛の下方でクラスター形成している各触角セグメントにおいて検出されている。
【図８】図８Ａ、８Ｃ、８Ｅ、および８Ｇは各々チチュウカイミバエ、ガンビエハマダラカ、タバコガ、およびアメリカイナゴのＯｒ８３ｂレセプターの親水性プロットを示し（カイト（Ｋｙｔｅ）およびドゥーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ），１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２に記載されている通り）、図８Ｂ、８Ｄ、８Ｆ、および８Ｈは各々チチュウカイミバエ、ガンビエハマダラカ、タバコガ、およびアメリカイナゴのＯｒ８３ｂレセプターの膜貫通ドメインの推定である（フォン・ヒエイネ（ｖｏｎ  Ｈｉｅｊｎｅ），１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２５：４８７−４９４に記載されている通り）。
【配列表】
2005510209.tif 000007
2005510209.tif 000008
2005510209.tif 000009
2005510209.tif 000010
2005510209.tif 000011
2005510209.tif 000012
2005510209.tif 000013
2005510209.tif 000014
2005510209.tif 000015
2005510209.tif 000016
2005510209.tif 000017
2005510209.tif 000018
【図１】
2005510209.tif 000019
【図１−１】
2005510209.tif 000020
【図１−２】
2005510209.tif 000021
【図２】
2005510209.tif 000022
【図２−１】
2005510209.tif 000023
【図３】
2005510209.tif 000024
【図３−１】
2005510209.tif 000025
【図３−２】
2005510209.tif 000026
【図４】
2005510209.tif 000027
【図４−１】
2005510209.tif 000028
【図５】
2005510209.tif 000029
【図５−１】
2005510209.tif 000030
【図６−１】
2005510209.tif 000031
【図６−２】
2005510209.tif 000032
【図６−３】
2005510209.tif 000033
【図７】
2005510209.tif 000034
【図７Ｂ】
2005510209.tif 000035
【図７Ｃ】
2005510209.tif 000036
【図７Ｄ】
2005510209.tif 000037
【図７Ｅ】
2005510209.tif 000038
【図８Ａ】
2005510209.tif 000039
【図８Ｂ】
2005510209.tif 000040
【図８Ｃ】
2005510209.tif 000041
【図８Ｄ】
2005510209.tif 000042
【図８Ｅ】
2005510209.tif 000043
【図８Ｆ】
2005510209.tif 000044
【図８Ｇ】
2005510209.tif 000045
【図８Ｈ】
2005510209.tif 000046