(57)【要約】新規のＧＡＶＥ８ポリペプチド、タンパク質、および核酸分子が開示される。単離された完全長ＧＡＶＥ８タンパク質に加えて、単離されたＧＡＶＥ８融合タンパク質、抗原性ペプチドおよび抗ＧＡＶＥ８が提供される。本発明はまた、ＧＡＶＥ８核酸分子、該核酸分子を含む組換え発現ベクター、発現ベクターが導入された宿主細胞、および、ＧＡＶＥ８遺伝子が導入または破壊された非ヒトトランスジェニック動物を提供する。ＧＡＶＥ８組成物またはＧＡＶＥ８と結合する分子を利用した診断、スクリーニング、および治療方法も提供される。ＧＡＶＥ８アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストなどを同定する方法が説明される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳および血液細胞では発現されるが心臓、腎臓または骨格筋では発現されない、ＧＡＶＥ８のヌクレオチド配列（配列番号１）またはＧＡＶＥ８変異体のヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
配列が、配列番号２のアミノ酸配列を有するＧＡＶＥ８ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
核酸が、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびｃＤＮＡからなる群より選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
付加、欠失または置換変異をコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
変異が、野生型とは異なるシグナリング活性を有するＧＡＶＥ８ポリペプチドにある、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
少なくとも１つの機能的に同等のアミノ酸残基を提供する置換変異をコードする、請求項４に記載の核酸。
【請求項７】
配列番号１のヌクレオチド配列または配列番号１の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、配列番号１は、脳および血液細胞で発現されるが心臓、腎臓または骨格筋では発現されない、上記核酸。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２の第三細胞内を含む精製されたポリペプチド。
【請求項１０】
発現調節要素に操作可能に結合した請求項１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１１】
発現調節要素が、構成的な調節配列、細胞特異的な調節配列、および、誘導性の調節配列からなる群より選択される、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項１３】
発現調節要素に操作可能に結合した請求項１に記載の核酸を含む培養細胞。
【請求項１４】
請求項１０に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質転換され、該ベクターを含む核酸がコードするポリペプチドを発現する、培養細胞または該細胞の後代。
【請求項１５】
細胞が、真核細胞および原核細胞からなる群より選択される、請求項１２に記載の培養細胞。
【請求項１６】
ベクターを含む核酸がコードするポリペプチドの発現が可能な条件下で請求項１２に記載の細胞を培養することを含む、タンパク質を生産する方法。
【請求項１７】
ＧＡＶＥ８に特異的に結合する抗体。
【請求項１８】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
抗体が、リガンドのＧＡＶＥ８への結合を妨げる、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２０】
ＧＡＶＥ８のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストを治療の必要がある患者に投与することを含む、該患者のＧＡＶＥ８のシグナリング活性またはシグナル伝達を調節するための治療方法。
【請求項２１】
（ｉ）可能性のあるアゴニストとＧＡＶＥ８を発現する細胞とを接触させること、および、
（ii）該可能性のあるアゴニストの存在下で、ＧＡＶＥ８のシグナリング活性が、該可能性のあるアゴニストの非存在下でのＧＡＶＥ８の活性に比べて増加するかどうかを決定すること
を含む、ＧＡＶＥ８のアゴニストを同定する方法。
【請求項２２】
（ｉ）可能性のあるインバースアゴニストとＧＡＶＥ８を発現する細胞とを接触させること、および、
（ii）該可能性のあるインバースアゴニストの非存在下、および、リガンドまたはアゴニストの非存在下でのＧＡＶＥ８の活性に比べて、該可能性のあるインバースアゴニストの存在下でＧＡＶＥ８の活性が減少するかどうか決定すること
を含む、ＧＡＶＥ８のインバースアゴニストを同定する方法。
【請求項２３】
リガンドがスフィンゴシン−１−ホスフェートである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）可能性のあるアンタゴニストとＧＡＶＥ８を発現する細胞とを接触させること、および、
（ii）リガンドまたはアゴニストの存在下でのＧＡＶＥ８の活性に比べて、該可能性のあるアンタゴニストの存在下でＧＡＶＥ８のシグナリング活性が減少するかどうかを決定すること
を含む、ＧＡＶＥ８のアンタゴニストを同定する方法。
【請求項２５】
リガンドがスフィンゴシン−１−ホスフェートである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＧＡＶＥ８のシグナリング活性またはシグナル伝達を調節できるＧＡＶＥ８のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニスト、および、製薬上許容できるキャリアー、添加剤または希釈剤を含む治療用組成物。
【請求項２７】
ＧＡＶＥ８のシグナリング活性またはシグナル伝達を調節できるＧＡＶＥ８のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニスト、および、製薬上許容できるキャリアー、希釈剤または添加剤を含む治療用組成物を、治療の必要がある患者に投与することを含む、病気を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞のシグナル伝達を担う内在性膜タンパク質の大きなファミリーである。ＧＰＣＲは、神経伝達物質、ホルモン、臭気物質および光などの多様な細胞外シグナルに応答し、細胞内で第２メッセンジャー応答を開始させるように細胞膜を超えてシグナルを伝達させることができる。該受容体は、血管拡張、心拍、気管支拡張、内分泌および消化管蠕動などの多様な生理学的応答を媒介するために、現在用いられている多くの治療剤はＧＰＣＲを標的にする。
【０００２】
ＧＰＣＲは、細胞外のリガンド結合ドメイン、７回膜貫通ドメイン、および、シグナリングに関する細胞の要素と相互作用する細胞内ドメインで特徴付けられる。受容体が行う機能、例えばリガンドやＧタンパク質との結合は、特定の位置の特定のアミノ酸の存在に関する。
【０００３】
分子クローニングにより、内皮の分化遺伝子（Ｅｄｇ）として知られるＧＰＣＲのサブファミリーが同定された。ＥｄｇのＧＰＣＲは、サブファミリーとして３１％〜３４％のアミノ酸配列同一性を示すが、より大きい構造および機能の類似性を有する２つのホモロジークラスターを含む。１つのホモロジークラスターとしては、Ｅｄｇ−２、Ｅｄｇ−４、Ｅｄｇ−７およびＥｄｇ−８タンパク質が挙げられ、これらは、スフィンゴ脂質ではなくリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）と結合する。第二のホモロジークラスターとしては、Ｅｄｇ−１、Ｅｄｇ−３およびＥｄｇ−５が挙げられ、これらは、ＬＰＡではなくスフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ１ＰまたはＳＰＰ）と結合する（Ｇｏｅｔｚｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ（１９９９）４６９：２５９−２６４）。
【０００４】
Ｓ１Ｐは、例えば血小板活性化の際に放出される、有効な細胞外のリソリピッドリン酸メディエイターである（Ｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９２）１１６：１５１７−１５２６）。Ｓ１Ｐは細胞による多様な応答を引き出すが、そのなかでも顕著なのは、細胞増殖（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９１）１１４：１５５−１６７；Ｂｏｒｎｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９５）１３０：１９３−２０６；および、Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９６）５０：４５１−４５７）、および、抗アポトーシス（Ｃｕｖｉｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８１：８００−８０３；Ｅｄｓａｌｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（１９９７）１７：６９５２−６９６０）である。
【０００５】
様々な研究により、ＧＰＣＲにおけるアミノ酸配列の差が、天然リガンド、または、低分子物質アゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかに対する親和性における差の原因となることが示されている。言い換えれば、配列におけるわずかな差が、異なる結合親和性および活性の原因となり得る。（例えばＭｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９６）２７１（５０）：３２０１６−２０；Ｂｕｒｄ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３（５１）：３４４８８−９５；および、Ｈｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９９）７２（１）：４１３−２１を参照）。特に、研究により、第三細胞内ドメインにおけるアミノ酸配列の差が、異なる活性を生じさせ得ることが示されている。Ｍｙｂｕｒｇｈ等は、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体を研究しており、該受容体の細胞内ループＩＩＩにおけるアラニン２６１が、Ｇタンパク質カップリングおよび受容体内在化に不可欠であることを実証している（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（１９９８）３３１（第３部）：８９３−６）。Ｗｏｎｅｒｏｗ等は、チロトロピン受容体を研究しており、第三細胞内ループにおける欠失により構成的な受容体活性が生じるこを実証している（Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３（１４）：７９００−５）。これは、Ｇタンパク質共役受容体の第三細胞内ループ内のアミノ酸欠失により構成的な受容体活性が生じることを実証する初めての報告である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
病気においてＧＰＣＲが役割を有し、ＧＰＣＲ活性を調節することにより病気を治療する能力を有するとすれば、これまで知られていなかったＧＰＣＲの同定および特徴づけにより、ＧＰＣＲ活性が関与する病状のための、新しい組成物および治療方法を提供することができる。本発明は、新規のＧＰＣＲ、ＧＡＶＥ８の発現を同定および特徴づけし、その発見を関連する病気の同定および治療に適用するための組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、新規に同定されたＧタンパク質共役受容体に関する。特に、本発明のＧタンパク質共役受容体は、脾臓および脳で特異的に発現される。さらに脳での発現は、白質に局在化される。該情報およびその他の情報によれば、ＧＡＶＥ８と同定された新規の受容体が、多発性硬化症などの多様な炎症性疾患および様々な免疫系の混乱（peturbation）、同様に、神経系、特に中枢神経系の疾患に関与することが示唆される。
【０００８】
一つの観点において、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸の脊椎動物タンパク質をコードする単離された核酸、それらの変異体、突然変異体および断片、ならびに、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む単離された核酸、それらの変異体、突然変異体および断片からなる群より選択される単離された核酸に関する。さらに、本発明は、配列番号１に結合する核酸ハイブリダイゼーションプローブおよび相補断片、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸に結合するハイブリダイゼーションプローブおよび相補断片に関する。さらに、本発明は、配列番号１に対して約９０％〜９９％の同一性を有する核酸、加えて、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸に対して約９０％〜９９％の同一性を有する核酸に関する。関連する観点において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも８個のヌクレオチドを含み、ハイブリダイゼーション法は、相補オリゴヌクレオチドと、配列番号１に記載のヌクレオチドを含む核酸とを、該相補体と該核酸とのハイブリダイゼーションが可能な条件下で接触させる工程を含むと考えられる。さらに、相補断片は、インビボおよびインビトロでＧＡＶＥ８の発現を阻害する方法のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドとして利用することができる。このような方法は、配列番号１に記載のヌクレオチドの相補体からなるオリゴヌクレオチド配列を提供する工程、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを含むヒト細胞を提供する工程、および、該オリゴヌクレオチドを該細胞に導入する工程を含んでもよく、この場合、ＧＡＶＥ８の発現は、翻訳の阻害、三重らせん形成および／または細胞中でｍＲＮＡ分解を生じさせるヌクレアーゼ活性化などのメカニズムにより阻害される。
【０００９】
本発明はまた、配列番号２に記載のアミノ酸配列の精製されたポリペプチド、それらの変異体、突然変異体および断片、ならびに、該ポリペプチドに機能的な特性を与える付加アミノ酸残基を有する精製されたポリペプチドからなる群より選択される単離されたポリペプチドに関する。
【００１０】
本発明はさらに、発現調節要素（expression control elements）に操作可能に結合した核酸、例えば単離された核酸を含むベクターに関する。本発明はさらに、本発明の核酸を含むように形質転換された培養細胞、および、ポリペプチド生産方法に関し、該方法は、本発明の核酸を含む形質転換された細胞を培養する工程、発現させる工程、および、細胞または細胞が培養された培地からポリペプチドを精製する工程を含む。
【００１１】
本発明のさらなる観点は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体などの、本発明のポリペプチドに結合する単離された抗体を含む。さらに、関連する観点において、抗体生産方法、および、ＧＡＶＥ８に結合する抗体でＧＡＶＥ８関連病を治療する方法が開示される。
【００１２】
本発明のさらなる観点は、診断目的で、生物学的サンプルおよび／または組織サンプルにおけるＧＡＶＥ８の存在または非存在を決定するための方法を含む。
【００１３】
本発明の他の観点において、ＧＡＶＥ８シグナル伝達を調節するための治療方法が開示され、該方法は、ペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストおよび／または抗体を、それらが必要な患者に投与することを含む。
【００１４】
本発明の他の観点において、ＧＡＶＥ８のモジュレーターを同定する方法が開示され、該方法は、化学成分を提供する工程、ＧＡＶＥ８を発現する細胞を提供する工程、および、該化学成分が、ＧＡＶＥ８のシグナリング活性を調節するかどうかを決定する工程、例えばこのような調節が内因性リガンドの存在または非存在のいずれかで生じるかを決定する工程を含む。関連する観点において、該化学成分としては、これらに限定されないが、ペプチド、抗体、アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストが挙げられる。
【００１５】
本発明の他の観点は治療用組成物を含み、このような組成物は、核酸、抗体、ポリペプチド、アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストを含む。さらに、本発明の方法はまた、このような治療用組成物をそれらが必要な患者に投与することにより、病状を治療する方法、および、ＧＡＶＥ８のシグナリング活性を調節する方法を含む。
【００１６】
血液細胞および神経細胞にＧＡＶＥ８が存在するために、本発明は、末梢血液細胞を試験することにより、神経細胞におけるＧＡＶＥ８の構造および機能を推測および決定する方法に関する。
【００１７】
本発明のこれらおよびその他の観点は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより、明確になる。加えて、様々な参考文献を示すが、これらは特定の手順または組成物をより詳細に説明するものである。これら参考文献のいずれも、全体を参照により本発明に加入され、個々に加入が特記されたものとする。
【００１８】
発明の詳述
本発明は、内因性リガンド、スフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ、ＳＰＰ−１またはＳＳＰ）に結合するＧタンパク質共役受容体スーパーファミリーのメンバーであるヒトＧＡＶＥ８をコードするｃＤＮＡ分子の発見に基づく。ヒトＧＡＶＥ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列を図１に示す（配列番号１）。ＧＡＶＥ８タンパク質のアミノ酸配列を図２に示す（配列番号２）。
【００１９】
図１のＧＡＶＥ８のｃＤＮＡ（配列番号１）は、非翻訳領域を含む約２５８９個のヌクレオチド長であり、約４１.８ｋＤａの分子量を有するタンパク質をコードする（翻訳後修飾を除く）。
【００２０】
ＴａｑＭａｎ(R)分析を用いて、特異的なｍＲＮＡ断片が脳および脾臓で発現される。さらに、ＧＡＶＥ８発現は、末梢血液細胞で実証された。
【００２１】
これらおよびその他の組織におけるＧＡＶＥ８の存在により、ＧＡＶＥ８が、免疫機能に関する様々な病状および様々な神経変性病（例えば多発性硬化症）に関与することが示
される。これら組織におけるＧＡＶＥ８を同定し、ＧＡＶＥ８をコードする遺伝子をクローニングすることにより、ＧＡＶＥ８発現および活性を調節するための様々な治療上のアプローチが提供され、ＧＡＶＥ８に関する病気の処置に治療上のアプローチが提供される。
【００２２】
ヒトＧＡＶＥ８は、特定の保存された構造的および機能的な特徴を有する分子のＥｄｇファミリーに関する。用語「ファミリー」は、本発明のタンパク質および核酸分子について言及される場合、全般に共通する構造ドメインを有し、本明細書において定義される十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列同一性を有する２またはそれ以上のタンパク質または核酸分子を意味することが意図される。このようなファミリーメンバーは、天然に存在するものでもよいし、同じ種または異なる種のいずれかからのものでもよい。例えば、ファミリーは、第一のヒト起源タンパク質、および、マウス起源の該タンパク質の相同体、同様に、第二の、別個のヒト起源タンパク質、および、該タンパク質のマウス相同体を含み得る。ファミリーメンバーはまた、共通の機能的な特徴を有し得る。
【００２３】
Ｅｄｇ−１受容体は、ホルボールエステルによるヒト内皮細胞系の刺激を受けて、ＨｌａおよびＭａｃｉａｇにより初めて単離され、細胞分化に関与する遺伝子であることが同定された（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９０）２６５：９３０８−９３１３）。その際に、Ｅｄｇ−１は、受容体を活性化するリガンドが不明であったためにオーファンＧＰＣＲと分類された。後に、Ｌｅｅ等が、スフィンゴシン−１−ホスフェートと呼ばれる血清中のリン脂質をＥｄｇ−１受容体の内因性リガンドとして同定した（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２７９：１５５２−１５５５）。
【００２４】
ＧＡＶＥ８発現の特有の組織分布は、免疫系および神経系に対する取り組みに向けられた。
該受容体はまた、保存されており、例えば、ヒト、マウスおよびラットで見出される。特定のドメインが、種を超えてよく保存されている。
ＧＡＶＥ８はまた、アポトーシスに関する発現の調節を示した。従って、ＧＡＶＥ８を操作することによって、プログラム細胞死を誘導または抑えることができる。
【００２５】
一実施形態において、ＧＡＶＥ８タンパク質は、第三細胞内ループドメインを含み、これは、配列番号２の第三細胞内ループドメインと、少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは約８５％、９５％または９８％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸約２１４〜約２５２である。
【００２６】
本明細書において、用語「同等のアミノ酸残基」は、２またはそれ以上の配列が分析のために並べられた際に、タンパク質配列内の実質的に同じ位置を占めるアミノ酸を意味する。本発明の好ましいＧＡＶＥ８ポリペプチドは、配列番号２の第三細胞内ループドメインのコンセンサスアミノ酸配列に十分同一なアミノ酸配列を有する。本明細書において、用語「十分に同一な」は、第二のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して、十分な数の、または最少数の同一または同等の（例えば類似の側鎖を含む）アミノ酸残基またはヌクレオチドを含み、それにより第一および第二のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能的な活性を有するような第一のアミノ酸またはヌクレオチド配列に言及するのに用いられる。例えば、約６５％の同一性、好ましくは７５％の同一性、より好ましくは８５％、９５％または９８％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸またはヌクレオチド配列は、本明細書において十分に同一と定義される。
【００２７】
その他の対象のドメインとしては、これらに限定されないが、膜貫通（ＴＭ）ドメイン（配列番号２に記載の、ＴＭ１、アミノ酸残基約３８〜約６２；ＴＭ２、アミノ酸残基約
７０〜約９５；ＴＭ３、アミノ酸残基約１１２〜約１３１；ＴＭ４、アミノ酸残基約１５１〜約１７６：ＴＭ５、アミノ酸残基約１９３〜約２１３；ＴＭ６、約２５３〜約２７３；および、ＴＭ７、アミノ酸残基約２９０〜約３１０）；細胞質（細胞内ループ）ドメイン（配列番号２に記載の、アミノ酸残基約６３〜約６９；アミノ酸残基約１３２〜約１５０；アミノ酸残基約２１４〜約２５２：および、アミノ酸残基約３１１〜約３９８）：および、細胞外ドメイン（配列番号２に記載の、アミノ酸残基約１〜約３７：アミノ酸残基約９６〜約１１１；アミノ酸約１７７〜約１９２：および、アミノ酸残基約２７４〜約２９０）が挙げられる。関連する観点において、対象のドメインとしてはまた、これらに限定されないが、コンセンサスグリコシル化部位、脂質結合部位およびリン酸化部位が挙げられる。
【００２８】
本明細書において交換可能に用いられるように、「ＧＡＶＥ８活性」、「ＧＡＶＥ８の生物活性」または「ＧＡＶＥ８の機能的な活性」は、標準的な技術に従ってインビボまたはインビトロで測定された、ＧＡＶＥ８タンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子によりＧＡＶＥ８反応細胞で作用する活性を意味する。ＧＡＶＥ８活性は、直接的な活性、例えば第二のタンパク質との結合や第二のタンパク質における酵素活性でもよいし、または、間接的な活性、例えばＧＡＶＥ８タンパク質と第二のタンパク質との相互作用が介在する細胞のシグナリング活性でもよい。好ましい実施形態において、ＧＡＶＥ８活性は、少なくとも１またはそれ以上の下記の活性を含む：（ｉ）ＧＡＶＥ８シグナリング経路においてタンパク質と相互作用する能力；（ii）ＧＡＶＥ８リガンドと相互作用する能力；および、（iii）細胞内の標的タンパク質と相互作用する能力。例えば、ＧＡＶＥ８活性としては、これらに限定されないが、蛍光変化（ＦＬＩＰＲ(R)分析による）のような手段により測定され得るスフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ−１−Ｐ）の結合、または、配列番号１を含む発現ベクターで形質転換された細胞における標識Ｓ−１−Ｐの結合が挙げられる。
【００２９】
従って、本発明の他の実施形態は、単離されたＧＡＶＥ８タンパク質およびＧＡＶＥ８活性を有するポリペプチドを特徴とする。
本発明の様々な観点を以下の章でさらに詳細に説明する。
【００３０】
Ｉ．単離された核酸分子
本発明の一つの観点は、ＧＡＶＥ８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分をコードする単離された核酸分子に関し、同様に、ＧＡＶＥ８をコードする核酸（例えばＧＡＶＥ８ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子、および、ＧＡＶＥ８核酸分子の増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するための断片に関する。本明細書で用いられる用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）およびヌクレオチド類似体を用いて作製されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むことが意図される。該核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよい。
【００３１】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸が誘導される生物のゲノムＤＮＡにおいて、天然に核酸の側にある（すなわち核酸の５’および３’末端に位置する）配列（好ましくはタンパク質をコードする配列）を含まない。例えば、様々な実施形態では、単離されたＧＡＶＥ８核酸分子は、核酸が誘導される細胞のゲノムＤＮＡにおいて天然に核酸分子の側にあるヌクレオチド配列を、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂまたは０.１ｋｂ未満で含み得る。その上、「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術で生産された場合、実質的に他の細胞物質または培地を含まず、または、化学合成された場合、実質的に化学前駆体または他の化学物質を含まない。
【００３２】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、または、該ヌクレオチド配列のいずれかの相補体を、標準的な分子生物学技術や本明細書で提供される配列情報を用いて単離することができる。配列番号１の核酸配列の全部または部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いることにより、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ.，ｅｄｓ.，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”２ｎｄ  ｅｄ.，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載された）を用いてＧＡＶＥ８核酸分子を単離することができる。
【００３３】
本発明の核酸分子は、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを用い、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って増幅することができる。例えば、このようなプライマーは、これらに限定されないが、５’−ＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣ−３’（配列番号３）、および、５’−ＴＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＴＴＣ−３’（配列番号４）を含み得る。このようにして増幅された核酸を適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴付けることができる。その上、ＧＡＶＥ８ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準的な合成技術で、例えば自動化ＤＮＡシンセサイザーを用いて調製することができる。
【００３４】
他の好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の相補体またはそれらの部分である核酸分子を含む。所定のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子とは、所定のヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それにより安定な二本鎖を形成することができる、所定のヌクレオチド配列に十分に相補的なものである。
【００３５】
その上、本発明の核酸分子は、ＧＡＶＥ８をコードする核酸配列の部分のみを含んでもよく、例えば、プローブまたはプライマーとして用いることができる断片、または、ＧＡＶＥ８の生物学的に活性な部分をコードする断片である。例えば、このような断片は、これらに限定されないが、配列番号２に記載のアミノ酸残基１〜３９８をコードする領域を含み得る。ヒトＧＡＶＥ８遺伝子クローニングから決定されたヌクレオチド配列により、他の細胞型で、例えば他の組織からＧＡＶＥ８相同体を同定および／またはクローニングすること、同様に、他の哺乳動物からのＧＡＶＥ８相同体を同定および／またはクローニングすることに用いるのに設計されたプローブおよびプライマーを作製することができる。一般的に、該プローブ／プライマーは、十分に精製されたオリゴヌクレオチドで構成される。一般的に、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１のセンスもしくはアンチセンス配列または配列番号１の天然に存在する突然変異体の、少なくとも約１２、好ましくは約２５、より好ましくは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。ヒトＧＡＶＥ８ヌクレオチド配列に基づくプローブは、類似または同一なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するのに用いることができる。該プローブは、それらに結合する標識基、例えば、放射線同位体、蛍光性化合物、酵素または酵素補因子を含んでもよい。このようなプローブは、例えば、被験細胞サンプル中のＧＡＶＥ８をコードする核酸のレベルを測定すること、例えば、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡレベルを検出すること、または、ゲノムＧＡＶＥ８遺伝子が変異を受けているか欠失しているかを決定することによりＧＡＶＥ８タンパク質を不適切に発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として用いることができる。
【００３６】
「ＧＡＶＥ８の生物学的に活性な部分」をコードする核酸断片は、ＧＡＶＥ８生物活性を有するポリペプチドをコードする配列番号１の部分を単離すること、ＧＡＶＥ８タンパ
ク質のコードされた部分を（例えばインビトロでの組換え発現により）発現させること、および、ＧＡＶＥ８のコードされた部分の活性を評価することにより、調製することができる。例えば、ＧＡＶＥ８の生物学的に活性な部分をコードする核酸断片は、第三細胞内ループドメイン、例えば、配列番号２に記載の約２１４〜約２５２のアミノ酸残基を含む。本発明は、遺伝子コードの縮重のために配列番号１のヌクレオチド配列とは異なるが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列でコードされたのと同じＧＡＶＥ８タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む。
【００３７】
配列番号１で示されたヒトＧＡＶＥ８ヌクレオチド配列に加えて、ＧＡＶＥ８のアミノ酸配列において変化をもたらすＤＮＡ配列多型が、個体群（例えばヒト個体群）内に存在してもよいことは当業者には明白である。ＧＡＶＥ８遺伝子におけるこのような遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異により、個体群内の個体間で存在してもよい。対立遺伝子は、二者択一的に所定の遺伝子座に発生する遺伝子群の一つである。本明細書で用いられる用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＧＡＶＥ８タンパク質、好ましくは哺乳動物のＧＡＶＥ８タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を意味する。本明細書で用いられる語「対立遺伝子変異体」は、ＧＡＶＥ８遺伝子座で発生するヌクレオチド配列、または、該ヌクレオチド配列でコードされるポリペプチドを意味する。二者択一的な対立遺伝子は、多数の異なる固体において、対象の遺伝子を配列解析することによって同定することができる。これは、ハイブリダイゼーションプローブを用いて、様々な個体において同じ遺伝子座を同定することにより容易に実行することができる。このようなヌクレオチド変異、および、それにより生じる、天然の対立遺伝子変異の結果であってＧＡＶＥ８の機能的な活性を変化させないＧＡＶＥ８におけるアミノ酸多型または変異体のいずれかおよび全部は、本発明の範囲内であるとする。
【００３８】
その上、ヒトＧＡＶＥ８のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有するその他の種からのＧＡＶＥ８タンパク質をコードする核酸分子（ＧＡＶＥ８相同体）は、本発明の範囲内であるとする。標準的なハイブリダイゼーション技術に従い、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはそれらの部分を用いることによって、本発明のＧＡＶＥ８のｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子を、本明細書で開示されたヒトＧＡＶＥ８核酸に対する同一性に基づき単離することができる。
【００３９】
従って、他の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、長さが少なくとも３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００または１１００個のヌクレオチドであり、配列番号１のヌクレオチド配列、好ましくはコーディング配列、またはそれらの相補体を含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、少なくとも６０％（６５％、７０％好ましくは７５％またはそれ以上）互いに同一なヌクレオチド配列が、一般的に互いにハイブリダイズし続けるようなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を説明することが意図される。このようなストリンジェントな条件は当業者既知であり、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６.３.１−６.３.６）で見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、続いて、５０〜６５℃で０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄、である。好ましくは、配列番号１の配列またはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書で用いられる「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在する（例えば野生型タンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を意味する。
【００４１】
個体群に存在し得るＧＡＶＥ８配列の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、配列番号１のヌクレオチド配列への変異により変化を導入し、それにより、ＧＡＶＥ８タンパク質の生物活性を変化させることなくコードされたＧＡＶＥ８タンパク質のアミノ酸配列を変化させることができることは、当業者であればさらに理解することができる。例えば、「非必須」アミノ酸残基にアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を変化させることなくＧＡＶＥ８の野生型配列（例えば配列番号２の配列）より変化させることができる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物活性に必要な残基である。例えば、様々な種のＧＡＶＥ８間で、保存されていないアミノ酸残基または半分だけ保存されたアミノ酸残基は、活性に非必須であり得るため、改変のための標的になる可能性が高い。あるいは、様々な種のＧＡＶＥ８タンパク質間で保存されたアミノ酸残基は、活性に必須であり得るため、改変のための標的になる可能性が低い。
【００４２】
従って、本発明の他の観点は、活性に必須ではないアミノ酸残基において変化を有するＧＡＶＥ８タンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＧＡＶＥ８タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２とは異なるが、生物活性を保持し続ける。一実施形態において、単離された核酸分子としては、配列番号２のアミノ酸配列に、少なくとも約８７％同一、９０％、９３％、９５％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。
【００４３】
配列番号２とは異なる配列を有する、ＧＡＶＥ８タンパク質をコードする単離された核酸分子は、１またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失が、コードされたタンパク質に導入されるように、配列番号１のヌクレオチド配列に１またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作製することができる。
【００４４】
変異は、部位特異的変異誘発やＰＣＲ媒介変異誘発のような標準的な技術により導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１またはそれ以上の予測された非必須アミノ酸残基でなされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換された置換をいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当業界で定義されている。該ファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐した側鎖を有するアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、ＧＡＶＥ８における予測の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換されることが好ましい。あるいは、変異は、飽和変異導入などによりＧＡＶＥ８のコーディング配列の全部または部分に沿ってランダムに導入することもでき、得られた突然変異体をＧＡＶＥ８生物活性に関してスクリーニングし、活性を保持する突然変異体を同定することができる。変異誘発に続いて、コードされたタンパク質を組換え発現させることができ、タンパク質の活性を測定することができる。
【００４５】
好ましい実施形態において、突然変異ＧＡＶＥ８タンパク質は：（１）ＧＡＶＥ８シグナリング経路におけるタンパク質と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力；（２）ＧＡＶＥ８リガンド（例えばＳ１Ｐ）と結合する能力；または、（３）細胞内の標
的タンパク質に結合する能力に関して分析することができる。さらなる他の好ましい実施形態において、突然変異ＧＡＶＥ８を、細胞増殖または細胞分化を調節する能力に関して分析することができる。
【００４６】
本発明は、アンチセンス核酸分子、すなわち、タンパク質をコードするセンス核酸に相補的な、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な分子、を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合できる。アンチセンス核酸は、ＧＡＶＥ８コーディング鎖全体またはそれらの部分のみ、例えば、タンパク質をコードする領域（またはオープンリーディングフレーム）の全部または部分に相補的であり得る。アンチセンス核酸分子は、ＧＡＶＥ８をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の非コーディング領域に対してアンチセンスであり得る。非コーディング領域（「５’および３’非翻訳領域またはフランキング領域」）は、コーディング領域の側に存在するアミノ酸に翻訳されない５’および３’配列である。
【００４７】
本発明で開示されたＧＡＶＥ８をコードするコーディング鎖配列（例えば配列番号１）を考慮して、本発明のアンチセンス核酸をワトソン−クリック塩基対の法則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡのコーディング領域全体に相補的であるものが可能であるが、より好ましくは、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡのコーディング領域または非コーディング領域の一部分のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的であるものが可能であり、例えば配列５’−ＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＣＴＣＣＡＴＧ−３’（配列番号５）を有するオリゴヌクレオチドおよび５’−ＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＡＡＧＧ−３’（配列番号６）を有するオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、化学合成および酵素的ライゲート反応を用いて、当業界既知の手順を用いて、構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）を、天然に存在するヌクレオチドを用いて、または、分子の生物学的な安定性もしくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成された二本鎖の物理的な安定性を高めるために設計された様々に改変されたヌクレオチドを用いて化学合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体、ホスホネート誘導体、および、アクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。
【００４８】
アンチセンス核酸を得るのに用いることができる改変ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ6−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ6−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ブトキソシン（ｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードラシル、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および、２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸をアンチセンス方向に（すなわち挿入された核酸から転写されたＲＮＡが、対象の標的核酸に対してアンチセンス方向にある、以下の章でさらに説明される）核酸がサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に作製することができる。
【００４９】
一般的に、本発明のアンチセンス核酸分子は、ＧＡＶＥ８タンパク質をコードする細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズまたは結合するように、被験者に投与されるか、または、インサイチュで生産され、それにより、例えば転写および／または翻訳を阻害することによってタンパク質発現を阻害することができる。ハイブリダイゼーションとは、通常のヌクレオチド相補性により安定な二本鎖を形成すること、または、例えばアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝における特異的な相互作用を介してＤＮＡ二本鎖に結合することであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子投与経路の例としては、組織部位への直接的な注入が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的にするために改変することができ、続いて、全身投与することができる。例えば、全身投与のためには、アンチセンス分子が選択された細胞表面で発現された受容体または抗原に特異的に結合するように改変することができ、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結させることによって改変することができる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書において説明されるベクターを用いて細胞に運搬することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）II またはｐｏｌ III プロモーターの制御下に置かれるようなベクター構築物が好ましい。
【００５０】
本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子が可能である。α−アノマー核酸分子は、相補ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（この場合、その鎖は互いに平行に並ぶ）（Ｇａｕｌｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７）１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、メチルリボヌクレオチドを含んでもよく（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ.，（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ１５：６１３１−６１４８）、または、キメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体を含んでもよい（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ.，（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２１５：３２７−３３０）。
【００５１】
本発明はまた、リボザイムを含む。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性のＲＮＡ分子であり、これは、ｍＲＮＡのような一本鎖核酸に相補的な領域を有し、それらを開裂させることができる。従って、リボザイム（例えばハンマーヘッド型リボザイム（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３４：５８５−５９１で説明された））を、ＧＡＶＥ８  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に開裂させるのに用いることができ、それにより、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＧＡＶＥ８をコードする核酸に特異性を有するリボザイムを、本発明で開示されたＧＡＶＥ８のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば配列番号１）に基づき設計することができる。例えば、テトラヒメナＬ−１９ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築することができ、ここで、活性部位のヌクレオチド配列は、ＧＡＶＥ８をコードするｍＲＮＡにおいて開裂されるヌクレオチド配列に相補的である。例えばＣｅｃｈ等の米国特許第４,９８７,０７１号；および、Ｃｅｃｈ等の米国特許第５,１１６,７４２号を参照。あるいは、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡを、特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性のＲＮＡをＲＮＡ分子のプールから選択するのに用いることができる。例えばＢａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６１：１４１１−１４１８を参照。
【００５２】
本発明はまた、三重らせん構造を形成する核酸分子を含む。例えば、ＧＡＶＥ８の調節領域（例えばＧＡＶＥ８プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的にすることによりＧＡＶＥ８遺伝子発現を阻害し、標的細胞におけるＧＡＶＥ８遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することができる。一般的には、Ｈｅ
ｌｅｎｅ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓ（１９９１）６（６）：５６９；Ｈｅｌｅｎｅ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９２）６６０：２７；および、Ｍａｈｅｒ，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ（１９９２）１４（１２）：８０７を参照。
【００５３】
好ましい実施形態において、本発明の核酸分子を、塩基成分、糖成分、または、リン酸主鎖において改変して、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を改善することができる。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸主鎖を改変して、ペプチド核酸を生産することができる（Ｈｙｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）４：５を参照）。本明細書で用いられる用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、核酸ミミックを意味し、例えばデオキシリボースリン酸主鎖がシュードペプチド主鎖で置き換えられ、４種の天然核酸塩基のみが保持されたＤＮＡミミックを意味する。ＰＮＡの中性の主鎖は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡと特異的ハイブリダイゼーションが可能であることが示されている。標準的な固相ペプチド合成プロトコール（上述したＨｙｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ.（１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−ＯＫｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９６）９３：１４６７０で説明された）を用いて、ＰＮＡオリゴマーの合成を行うことができる。
【００５４】
ＧＡＶＥ８のＰＮＡを、治療および診断用途に用いることができる。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳の停止の誘導または複製の阻害による配列特異的な遺伝子発現調節のためのアンチセンスまたはアンチジーン剤として用いることができる。ＧＡＶＥ８のＰＮＡはまた、例えばＰＣＲクランピングに向けられたＰＮＡによる遺伝子における単一塩基対変異の分析において；他の酵素、例えばＳ１ヌクレアーゼ（上述したＨｙｒｕｐ（１９９６））との組み合わせで用いる場合は、人工制限酵素として、または、ＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして（上述したＨｙｒｕｐ（１９９６）；上述したＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ.（１９９６））、用いることができる。
【００５５】
他の実施形態において、親油性または他のヘルパー基をＰＮＡに付着させることにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、または、リポソームまたは当業界既知のその他のドラッグデリバリー技術の使用により、ＧＡＶＥ８のＰＮＡを改変し、例えばそれらの安定性、特異性または細胞の取り込みを強化することができる。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、上述したＨｙｒｕｐ（１９９６），Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９６）２４（１７）：３３５７−６３，Ｍａｇ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８９）１７：５９７３；および、Ｐｅｔｅｒｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ（１９７５）５：１１１９で説明されたように行うことができる。
【００５６】
II．単離されたＧＡＶＥ８タンパク質および抗ＧＡＶＥ８抗体
本発明の一つの観点は、単離されたＧＡＶＥ８タンパク質、および、生物学的に活性なそれらの部分、同様に、例えば抗ＧＡＶＥ８抗体を生じさせる免疫原として用いるのに適したポリペプチド断片に関する。一実施形態において、標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームにより、細胞または組織源から、野生型のＧＡＶＥ８タンパク質を単離することができる。他の実施形態において、ＧＡＶＥ８タンパク質は、組換えＤＮＡ技術により生産される。組換え発現の代わりに、標準的なペプチド合成技術を用いてＧＡＶＥ８タンパク質またはポリペプチドを化学合成することができる。
【００５７】
「単離された」または「精製された」タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分は、細胞性の物質またはＧＡＶＥ８タンパク質が誘導される細胞または組織源からのその他の不純タンパク質を実質的に含まないか、または、化学合成された場合は、化学前駆体
またはその他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性の物質を実質的に含まない」という言い回しは、ＧＡＶＥ８タンパク質が細胞の細胞成分から分離され、これから単離または組換え生産された、ＧＡＶＥ８タンパク質の調製物を含む。従って、細胞性の物質を実質的に含まないＧＡＶＥ８タンパク質とは、非ＧＡＶＥ８タンパク質（または本明細書においては「不純タンパク質」と称される）が約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量で）未満であるＧＡＶＥ８タンパク質の調製物を含む。また、ＧＡＶＥ８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分が組換えにより生産される場合、実質的に培地を含まないことが好ましく、すなわち、培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％、１０％または５％未満で存在することが好ましい。ＧＡＶＥ８タンパク質が化学合成で生産される場合、化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、タンパク質合成に伴う化学前駆体またはその他の化学物質と分離されていることが好ましい。従って、このようなＧＡＶＥ８タンパク質調製物において、化学前駆体または非ＧＡＶＥ８化学物質が約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量で）未満で存在する。
【００５８】
ＧＡＶＥ８タンパク質の生物学的に活性な部分としては、ＧＡＶＥ８タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号２で示されたアミノ酸配列）と十分に同一なアミノ酸配列、または、ＧＡＶＥ８タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号２で示されたアミノ酸配列）から誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられ、該ペプチドは、全長ＧＡＶＥ８タンパク質より少ないアミノ酸を含み、ＧＡＶＥ８タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。一般的に、生物学的に活性な部分は、ＧＡＶＥ８タンパク質少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＧＡＶＥ８タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００個またはそれ以上のアミノ酸のポリペプチドであり得る。好ましい生物学的に活性なポリペプチドとしては、１またはそれ以上の同定されたＧＡＶＥ８構造ドメイン、例えば第三細胞内ループドメイン（例えば配列番号２）が挙げられる。
【００５９】
その上、タンパク質のその他の領域が欠失している生物学的に活性なその他の部分を、組換え技術で調製することができ、１またはそれ以上の野生型のＧＡＶＥ８タンパク質の機能的な活性に関して評価することができる。
【００６０】
好ましいＧＡＶＥ８タンパク質は、配列番号２で示されたアミノ酸配列を有する。他の有用なＧＡＶＥ８タンパク質は、配列番号２と実質的に同一であり、配列番号２のタンパク質の機能的な活性を保持するが、天然の対立遺伝子変異または変異誘発によりアミノ酸配列は異なる。例えば、このようなＧＡＶＥ８タンパク質およびポリペプチドは、本明細書において説明される少なくとも１つの生物活性を有する。
【００６１】
従って、有用なＧＡＶＥ８タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８８％、好ましくは９０％、９３％、９５％または９９％同一なアミノ酸配列を含み、配列番号２のＧＡＶＥ８タンパク質の機能的な活性を保持するタンパク質である。他の例において、ＧＡＶＥ８タンパク質は、ＧＡＶＥ８の第三細胞内ループドメイン（配列番号２）に対して、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％または９９％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質である。好ましい実施形態において、ＧＡＶＥ８タンパク質は、配列番号２のＧＡＶＥ８タンパク質の機能的な活性を保持する。
【００６２】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸のパーセント同一性を決定するために、最適な比較目的にあうように配列を並べる（例えば、第一のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入することにより、第二のアミノまたは核酸配列との最適なアライメントを得ることができる）。続いて、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置が、第二の配列において対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められていた場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列が共有する同一な位置の数の関数である（すなわちパーセント同一性＝同一な位置の数／位置の総数（例えばオーバーラップする位置）×１００）。一実施形態において、２つの配列は同じ長さである。
【００６３】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較で用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例としては、Ｋａｒｌｉｎ等のアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４）が挙げられる（Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９３）９０：５８７３−５８７７におけるように改変された）。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ（１９９０）２１５：４０３）に取り込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝１００、語長＝１２で行い、本発明のＧＡＶＥ８核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、語長＝３で行い、本発明のＧＡＶＥ８タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップ入りのアライメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９で説明されたように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を行うのに使用可能である。上述したＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ.，（１９９７）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照。
【００６４】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの他の好ましい非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ等のアルゴリズムである（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ.，ＣＡＢＩＯＳ（１９８８）４：１１−１７）。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれている。アミノ酸配列を比較するのにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０の重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティが１２、および、ギャップペナルティが４で使用可能である。
【００６５】
２つの配列間のパーセント同一性は、上述した技術と類似の技術をギャップ有り、または無しで用いて決定することができる。パーセント同一性を計算する際、正確な適合のみを計数する。
【００６６】
本発明はまた、ＧＡＶＥ８キメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書で用いられるように、ＧＡＶＥ８の「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＧＡＶＥ８ポリペプチドに操作可能に結合したＧＡＶＥ８ポリペプチドを含む。「ＧＡＶＥ８ポリペプチド」は、ＧＡＶＥ８に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、それに反して、「非ＧＡＶＥ８ポリペプチド」は、ＧＡＶＥ８タンパク質と実質的に同一ではないタンパク質（例えばＧＡＶＥ８タンパク質と異なるタンパク質、および、同じ生物または異なる生物から誘導されたタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ＧＡＶＥ８融合タンパク質中で、ＧＡＶＥ８ポリペプチドは、ＧＡＶＥ８タンパク質の全部または部分、好ましくは、ＧＡＶＥ８タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分に対応し得る。融合タンパク質中で、用語「操作可能に結合した」は、ＧＡＶＥ８ポリペプチドおよび非ＧＡＶＥ８ポリペプチドが、互いにフレーム内で融
合していることが意図される。非ＧＡＶＥ８ポリペプチドは、ＧＡＶＥ８ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。１つの有用な融合タンパク質は、ＧＡＶＥ８配列がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列のＣ末端に融合したＧＳＴ−ＧＡＶＥ８融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換えＧＡＶＥ８の精製を容易にすることができる。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明の第三細胞内ループ（ＩＬ３）（すなわち配列番号２の約２１４〜約２５２）は、ＩＬ３のＰＣＲ増幅および産物のベクター（例えばｐＧＥＸ−２Ｔ）へのサブクローニングにより、ＧＳＴと融合される。得られた構築物を、宿主細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）に導入することができ、前記構築物からの発現を適切な低分子物質（例えばイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）により誘導することができ、その後精製することができる（例えばＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ（１９９６）２７１（１９）：１１２７２−１１２７９を参照）。
【００６８】
特定の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）において、ＧＡＶＥ８の発現および／または分泌を、異種シグナル配列の使用により増加させることができる。例えば、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のｇｐ６(R)分泌配列を異種シグナル配列として用いることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ.，ｅｄｓ.，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２）。真核性の異種シグナル配列の他の例としては、メリチン分泌配列、および、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌配列（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。さらなる他の例において、有用な原核性異種シグナル配列としては、ｐｈｏＡ分泌シグナル（上述したＳａｍｂｒｏｏｋ等）、および、プロテインＡ分泌シグナル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）が挙げられる。
【００６９】
さらに他の実施形態において、融合タンパク質は、ＧＡＶＥ８の全部または部分が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーから誘導された配列に融合したＧＡＶＥ８−免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明のＧＡＶＥ８−免疫グロブリン融合タンパク質を医薬組成物に含ませ、被験者に投与することにより、ＧＡＶＥ８リガンドとＧＡＶＥ８タンパク質との細胞表面上での相互作用を阻害し、それによりＧＡＶＥ８介在シグナル伝達をインビボで抑制することができる。ＧＡＶＥ８−免疫グロブリン融合タンパク質を、ＧＡＶＥ８と同種のリガンドの生物学的利用能に影響を与えるのに用いることができる。ＧＡＶＥ８リガンド−ＧＡＶＥ８相互作用の阻害は、血管増殖性疾患および分化に関する疾患を治療すること、および、細胞の生存を調節すること（例えば促進または阻害すること）のいずれに関しても、治療上有用である可能性がある。その上、本発明のＧＡＶＥ８−免疫グロブリン融合タンパク質を、被験体において抗ＧＡＶＥ８抗体を生産させるための免疫原、ＧＡＶＥ８リガンドを精製するための免疫原、および、スクリーニング分析においてＧＡＶＥ８とＧＡＶＥ８リガンドとの相互作用を阻害する分子を同定するための免疫原として用いることができる。
【００７０】
好ましくは、本発明のＧＡＶＥ８キメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により作製することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、通常の技術に従って、例えばライゲートのための平滑または突出末端を用い、制限酵素消化により適切な末端を提供し、必要に応じて付着端を充填し、アルカリホスファターゼ処理により望ましくない結合を防ぎ、そして酵素ライゲーションを行うことにより、フレーム内に共にライゲートされる。他の実施形態において、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡシンセサイザーなどの通常の技術により合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を２つの連続した遺伝子断片間で相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いて行うことができ、続いて、アニールし、再増幅してキメラ遺伝子配列を作製することができる（例えば上述したＡｕｓｕｂｅｌ等を参照）。その上、多くの発現ベクターは、すでに融合成分（例えばＧＳＴポリペプチド）をコードした市販品が利用可能である。融合成分がフレーム内でＧＡＶＥ８タンパク質に結合するように、ＧＡＶＥ８をコードする核酸をこのような発現ベクターにクローニングすることができる。
【００７１】
本発明はまた、ＧＡＶＥ８タンパク質の変異体（すなわちＧＡＶＥ８アミノ酸配列の配列と異なる配列を有するタンパク質）に関する。このような変異体は、ＧＡＶＥ８アゴニスト（ミメティックス）またはＧＡＶＥ８アンタゴニストのいずれかとして機能し得る。ＧＡＶＥ８タンパク質の変異体は、変異誘発、例えばＧＡＶＥ８タンパク質の散在した点突然変異またはトランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）により、生産することができる。ＧＡＶＥ８タンパク質のアゴニストは、実質的に、同じ、または、部分的なＧＡＶＥ８タンパク質の天然に存在する形態の生物活性を保持し得る。ＧＡＶＥ８タンパク質のアンタゴニストは、例えば、ＧＡＶＥ８タンパク質を含む細胞のシグナリングカスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することによって、ＧＡＶＥ８タンパク質の天然に存在する形態の１またはそれ以上の活性を阻害することができる。従って、特異的な生物学的な効果は、限定された機能を有する変異体で治療することにより引き出すことができる。タンパク質の天然に存在する形態の生物活性の一部を有する変異体を用いた被験者の治療は、ＧＡＶＥ８タンパク質の天然に存在する形態での治療に比べて被験者の副作用をより少なくできる。
【００７２】
ＧＡＶＥ８アゴニスト（ミメティックス）またはＧＡＶＥ８アンタゴニストのいずれかとして機能するＧＡＶＥ８タンパク質の変異体は、ＧＡＶＥ８タンパク質の突然変異体、例えばトランケーション変異体（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ）のコンビナトリアルライブラリーを、ＧＡＶＥ８タンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングすることによって同定することができる。一実施形態において、多様なＧＡＶＥ８変異体ライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異導入で作製され、多様な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＧＡＶＥ８変異体の多様なライブラリーを作製することができ、これは、例えば、可能性のあるＧＡＶＥ８配列のディジェネレートセットが、個々のポリペプチドとして、またあるいは、ＧＡＶＥ８配列のセットを含むより大きい融合タンパク質のセット（例えばファージディスプレイ用）として発現可能なように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることによりなされる。ディジェネレートオリゴヌクレオチド配列から可能性のあるＧＡＶＥ８変異体のライブラリーを作製するのに用いることができる様々な方法がある。ディジェネレート遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡシンセサイザーで行い、続いて、合成遺伝子を適切な発現ベクターにライゲートすることができる。遺伝子のディジェネレートセットの使用により、１つの混合物において、可能性のあるＧＡＶＥ８配列の望ましいセットをコードする配列の全ての供給が可能である。ディジェネレートオリゴヌクレオチドを合成する方法は当業界既知である（例えばＮａｒａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９８３）３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８４）５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）１９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８３）１１：４７７を参照）。
【００７３】
加えて、ＧＡＶＥ８タンパク質をコードする配列の断片のライブラリーを用いて、スクリーニングのためのＧＡＶＥ８断片の多様な群を作製することができ、その後、ＧＡＶＥ８タンパク質の変異体を選択することができる。一実施形態において、コーディング配列の断片のライブラリーの作製は、分子あたり約１回だけニック導入が起こる条件下でＧＡＶＥ８のコーディング配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、ＤＮＡを再生して二本鎖ＤＮＡを形成すること（該二本鎖ＤＮＡ
は異なるニック導入された産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る）、Ｓ１ヌクレアーゼ処理により再生された二本鎖からの一本鎖化された部分を除去すること、および、得られた断片ライブラリーを発現ベクターにライゲートすること、によってなすことができる。この方法により、様々な大きさのＧＡＶＥ８タンパク質のＮ末端および内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【００７４】
選択された特性を有する遺伝子産物に関して点突然変異またはトランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、数々の技術が当業界既知である。このような技術は、ＧＡＶＥ８タンパク質のコンビナトリアル変異導入により作製された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用される。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット分析に適用しやすい最も広く用いられている技術としては、一般的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、得られたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および、望ましい活性の検出により、その生産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になるような条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現すること、を含む。再帰的アンサンブル変異誘発（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）は、ライブラリー中で機能的突然変異体の頻度を高める技術であり、これをスクリーニング分析と組み合わせて用いることにより、ＧＡＶＥ８変異体を同定することができる（Ａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ
ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９３）６（３）：３２７−３３１）。
【００７５】
単離されたＧＡＶＥ８タンパク質、またはそれらの部分もしくは断片は、免疫原として用いて、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製に関する標準的な技術を用いてＧＡＶＥ８に結合する抗体を生産することができる。完全長ＧＡＶＥ８タンパク質を用いることができ、またあるいは、本発明は、免疫原として用いられるＧＡＶＥ８の抗原性ペプチド断片を提供する。ＧＡＶＥ８の抗原性ペプチドは、配列番号２で示されたアミノ酸配列の少なくとも８個（好ましくは１０、１５、２０、または３０個）のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して生産された抗体がＧＡＶＥ８と特異的な免疫複合体を形成するように、ＧＡＶＥ８のエピトープを含む。一実施形態において、エピトープは、配列番号２に記載の残基を含む８−ｍｅｒで構成され得る。
【００７６】
関連する観点において、抗原性ペプチドに含まれるエピトープは、タンパク質表面に存在するＧＡＶＥ８の領域であり、例えば親水性領域である。ヒトＧＡＶＥ８タンパク質配列の疎水性分析によれば、配列番号２のアミノ酸約１〜約３７間、アミノ酸約９６〜約１１１間、アミノ酸約１７７〜約１９２間、および、アミノ酸約２７４〜約２９０間の領域が特に親水性であり、それゆえに、抗体産生目的に有用な表面残基をコードする可能性が高いことが示される。
【００７７】
一般的に、ＧＡＶＥ８免疫原は、適切な被験体（例えばウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳動物）を免疫原で免疫化することにより抗体を調製するのに用いられる。適切な免疫原調製物は、例えば、組換え発現させたＧＡＶＥ８タンパク質、または、化学合成されたＧＡＶＥ８ポリペプチドを含み得る。該調製物はさらに、フロイント完全または不完全アジュバントのようなアジュバント、または類似の免疫促進性の物質を含み得る。適切な被験体の免疫原性ＧＡＶＥ８調製物での免疫化は、ポリクローナル抗ＧＡＶＥ８抗体応答を誘導する。
【００７８】
従って、本発明の他の観点は、抗ＧＡＶＥ８抗体に関する。本明細書で用いられる用語
「抗体」は、免疫グロブリン分子、および、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち特異的にＧＡＶＥ８に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。ＧＡＶＥ８に特異的に結合する分子とは、サンプル中、例えばＧＡＶＥ８を天然に含む生物学的なサンプル中で、ＧＡＶＥ８に結合するが、実質的にその他の分子と結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、Ｆ(ab)およびＦ(ab')2断片があり、これらは、ペプシンのような酵素で抗体を処理することにより得られる。本発明は、ＧＡＶＥ８に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、ＧＡＶＥ８の特定のエピトープで免疫反応が可能な抗原結合部位を一つだけ含む抗体分子の群を意味する。従って、モノクローナル抗体組成物は、一般的に、特定の該組成物と免疫反応を起こすＧＡＶＥ８タンパク質に対する単一の結合親和性を提示する。
【００７９】
ポリクローナル抗ＧＡＶＥ８抗体は、上述のように、ＧＡＶＥ８免疫原で適切な被験体を免疫化することにより調製することができる。免疫化された被験体における抗ＧＡＶＥ８抗体のタイターは、例えば固定化ＧＡＶＥ８を用いた酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な技術により長期にわたりモニターすることができる。
【００８０】
必要に応じて、ＧＡＶＥ８に対して向けられた抗体分子を哺乳動物から（例えば血液から）単離することができ、例えばＩｇＧ分画を得るためのプロテインＡクロマトグラフィーのような周知の技術により、さらに精製することができる。免疫化した後適切な時間で、例えば、抗ＧＡＶＥ８抗体タイターが最も高くなった時点で、被験体から抗体産生細胞を得ることができ、標準的な技術でモノクローナル抗体を調製するのに用いることができ、この標準的な技術としては、例えば、ハイブリドーマ技術（もともとはＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７で説明された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９８５），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ.，ｐｐ．７７−９６）、または、トリオーマ技術がある。ハイブリドーマ製造技術は、周知である（一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ.，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ.，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照）。簡単に言えば、不死細胞系（一般的には骨髄腫）を、上述のようにＧＡＶＥ８免疫原で免疫化された哺乳動物からのリンパ球（一般的に脾細胞）に融合し、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ＧＡＶＥ８に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定することができる。
【００８１】
リンパ球と不死化細胞系とを融合するのに用いられる多くの周知のプロトコールのいずれも、抗ＧＡＶＥ８モノクローナル抗体を生産する目的に適用することができる（例えば、上述したＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６：５５０５２．Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ.，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）；および、Ｌｅｒｎｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（１９８１）５４：３８７−４０２を参照）。その上、有用となり得る方法の多くのバリエーションがあることは当業者に明白である。一般的に、不死細胞系（例えば骨髄腫細胞系）は、同じ哺乳動物種からリンパ球として誘導される。例えば、マウスのハイブリドーマは、本発明の免疫原調製物で免疫化されたマウスからのリンパ球と、不死化マウス細胞系、例えばヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性の骨髄腫細胞系とを融合することによって作製することができる。多数の骨髄腫細胞系のいずれも、標準的な技術に従って融合のための相方として用いることができ、該骨髄腫細胞系としては、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫系がある。このような骨髄腫系は、ＡＴＣＣから入手可能である。一般的に、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞に融合される。続いて、この融合により得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地を用いて選択する［ＨＡＴ培地は、未融合の骨髄腫細胞や非生産的に融合した骨髄腫細胞を死滅させる（未融合の脾細胞は形質転換されていないために数日後死滅する）］。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡ分析を用いてＧＡＶＥ８と結合する抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。
【００８２】
モノクローナル抗体生産ハイブリドーマを調製する代わりに、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージディスプレイライブラリー）をＧＡＶＥ８でスクリーニングし、それによりＧＡＶＥ８に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより、モノクローナル抗ＧＡＶＥ８抗体を同定および単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１：および、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＳｕｒｆＺＡＰ(R)ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。
【００８３】
加えて、特にスクリーニング  抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに適用できる方法および試薬の例は、以下に見出すことができる：例えば、米国特許第５,２２３,４０９号；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／１８６１９；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９１／１７２７１：ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／２０７９１；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／１５６７９：ＰＣＴ公報番号ＷＯ９３／０１２８８；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／０１０４７：ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／０９６９０；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ.，Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９９２）３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４６：１２７５−１２８１；および、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ.，ＥＭＢＯ  Ｊ（１９９３）２５１２：７２５−７３４。
【００８４】
加えて、組換え抗ＧＡＶＥ８抗体、例えばヒト部分と非ヒト部分との両方を含むキメラやヒト化モノクローナル抗体は、標準的な組換えＤＮＡ技術で作製することができ、これらは本発明の範囲内である。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は当業界既知の組換えＤＮＡ技術により作製することができ、例えば、以下で説明される方法を用いることができる：ＰＣＴ公報番号ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願第号１８４,１８７；欧州特許出願第号１７１,４９６；欧州特許出願第号１７３,４９４；ＰＣＴ公報番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４,８１６,５６７号；欧州特許出願第号１２５,０２３；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８７）８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７）１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８７）８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ（１９８７）４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ（１９８８）８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８６）４：２１４；米国特許第５,２２５,５３９号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４；および、Ｂｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８８）１４１：４０５３−４０６０。
【００８５】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療処置に特に望ましい。このような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて生産させることができる。該トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えばＧＡＶＥ８全体または部分を用いて通常の様式で免疫化される。該抗原に対して向けられたモノクローナル抗体を通常のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが保持するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の際に再編成され、その後、クラススイッチおよび体細胞変異を受ける。従って、このようなエピトープを用いて、例えばＧＡＶＥ８活性を阻害する抗体が同定される。非ヒト抗体の重鎖および軽鎖をクローニングし、ファージディスプレイＦａｂ断片を作製するのに用いる。例えば、重鎖が細菌から分泌されるように重鎖遺伝子をプラスミドベクターにクローニングすることができる。軽鎖がファージ表面で発現されるように軽鎖遺伝子をファージコートタンパク質遺伝子にクローニングすることができる。ファージに融合したヒト軽鎖のレパートリー（ランダムコレクション）は、非ヒト重鎖を発現する細菌に感染させるのに用いられる。得られた後代ファージは、ハイブリッド抗体（ヒト軽鎖／非ヒト重鎖）を提示する。選択された抗原は、選択された抗原に結合するファージを選択するためのパニングスクリーニングで用いられる。このようなファージを同定するのに数回の選択を必要とすることがある。次に、選択された抗原と結合する選択されたファージからヒト軽鎖遺伝子を単離する。続いて、これら選択されたヒト軽鎖遺伝子は、ヒト重鎖遺伝子の選択を先導するのに以下のように用いられる。選択されたヒト軽鎖遺伝子を細菌で発現させるためにベクターに挿入する。選択されたヒト軽鎖を発現する細菌を、ファージに融合したヒト重鎖のレパートリーで感染させる。得られた後代ファージは、ヒト抗体（ヒト軽鎖／ヒト重鎖）を提示する。
【００８６】
次に、選択された抗原は、選択された抗原と結合するファージを選択するためのパニングスクリーニングに用いられる。この工程で選択されたファージは、最初に選択された非ヒトモノクローナル抗体により認識されるエピトープと同じエピトープを認識する完全ヒト抗体を提示する。重鎖および軽鎖の両方ををコードする遺伝子は、容易に単離され、ヒト抗体生産のためにさらに加工することができる。この技術はＪｅｓｐｅｒｓ等により説明されている（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２：８９９−９０３）。
【００８７】
抗ＧＡＶＥ８抗体（例えばモノクローナル抗体）を、親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術によりＧＡＶＥ８を単離するのに用いることができる。抗ＧＡＶＥ８抗体は、野生型ＧＡＶＥ８を細胞から精製すること、および、宿主細胞で発現された組換えにより生産されたＧＡＶＥ８を生成することを容易にすることができる。その上、ＧＡＶＥ８タンパク質を（例えば細胞溶解産物または細胞上清で）検出し、ＧＡＶＥ８タンパク質発現の量およびパターンを評価するのに、抗ＧＡＶＥ８抗体を用いることができる。抗ＧＡＶＥ８抗体を、臨床的な試験手順の一部として組織内のタンパク質レベルをモニターするのに診断的に用いることができ、例えば、所定の治療方式の有効性を決定することができる。抗体と検出可能な物質とをカップリングすることにより検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質，生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン、および、アビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、所定の蛍光性タンパク質、または、フィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、および、エクオリンが挙げられる；および、適切な放射活性物質の例としては、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3Ｈが挙げられる。
【００８８】
III．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の他の観点は、ＧＡＶＥ８（またはそれらの部分）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それに結合させた他の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲート可能な環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。ベクターのその他のタイプはウイルスベクターであり、この場合、追加のＤＮＡセグメントはそのウイルスゲノムにライゲートさせることができる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自発的な複製が可能である（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムへ統合され、それにより宿主ゲノムと共に複製される。その上、特定のベクター、発現ベクターは、ベクターに操作可能に結合した遺伝子を発現させるように仕向けることができる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミド（ベクター）の形態である。しかしながら、本発明は、このような他の形態の発現ベクター、例えば同等の機能を提供するウイルスベクター（例えば複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むことが意図される。
【００８９】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸発現に適切な形態で本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択された１またはそれ以上の調節配列を、発現しようとする核酸に操作可能に結合した状態で含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「操作可能に結合した」とは、対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現が可能な様式で（例えば、インビボでの転写／翻訳系において、または、ベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）調節配列に結合していることを意味することが意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現調節要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｍｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に説明されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を導くような配列（例えば組織特異的な調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換され得る宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベルなどのファクターに依存し得ることは当業者であれば明白である。本発明の発現ベクターを、宿主細胞に導入することができ、それにより、本明細書において説明される核酸によりコードされたタンパク質またはペプチド（例えばＧＡＶＥ８タンパク質、ＧＡＶＥ８の突然変異型、融合タンパク質など）を生産することができる。
【００９０】
原核または真核細胞、例えば細菌細胞、例えばＥ．Ｃｏｌｉ、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いた）、酵母細胞または哺乳動物細胞において、本発明の組換え発現ベクターをＧＡＶＥ８の発現のために設計することができる。適切な宿主細胞は、上述したＧｏｅｄｄｅｌにおいてさらに考察されている。あるいは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて組換え発現ベクターをインビトロで転写および翻訳することができる。
【００９１】
原核生物におけるタンパク質発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を導く構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを有す
るＥ．ｃｏｌｉ中で行われる。融合ベクターは、それがコードするタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加させる。一般的に、このような融合ベクターは、以下の３つの目的の役に立つ：１）組換えタンパク質の発現を増加させること；２）組換えタンパク質の溶解性を高めること；および、３）親和性精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合成分と組換えタンパク質との結合部分にタンパク質分解の開裂部位を導入し、組換えタンパク質を融合成分から分離し、続いて融合タンパク質を精製することができるようにする。このような酵素およびそれらの同種の認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。一般的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．：Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ.，Ｇｅｎｅ（１９８８）６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられ、これらは、それぞれグルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを、標的組換えタンパク質に融合させる。
【００９２】
適切な誘導性非融合Ｅ．Ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｍ  ｅｔ  ａｌ.，Ｇｅｎｅ（１９８８）６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１８５：６０−８９）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子の発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子の発現は、共発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎｌ）が介在するＴ７ｇｎｌ−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にＴ７ｇｎｌ遺伝子を保持するレジデントλプロファージから、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【００９３】
Ｅ．ｃｏｌｉで組換えタンパク質発現を最大化する１つの方法は、タンパク質を、組換えタンパク質をタンパク質分解により開裂させる能力が欠損した宿主細菌中で発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１８５：１１９−１２８）。他の方法は、各アミノ酸の個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉで優先的に利用されるように発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変することである（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９２）２０：２１１１−２１１８）。このような本発明の核酸配列の改変を、標準的なＤＮＡ合成技術で行うことができる。
【００９４】
他の実施形態において、ＧＡＶＥ８発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現させるためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ.，ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８７）６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｅｌｌ（１９８２）３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ.，Ｇｅｎｅ（１９８７）５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。
【００９５】
あるいは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中でＧＡＶＥ８を発現させることができる。培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）でのタンパク質発現に利用可能なバ
キュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ.，Ｍｏｌ
Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９８３）３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ.，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７０：３１−３９）が挙げられる。
【００９６】
さらに他の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（を参照ｄ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ.，ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８７）６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞で用いる場合、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルス調節要素により提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０から誘導される。原核および真核細胞の両方に適切な発現系のその他のものについては、上述したＳａｍｂｒｏｏｋ等の１６および１７章を参照。
【００９７】
他の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸を発現させることができる（例えば組織特異的な調節要素が核酸を発現させるのに用いられる）。組織特異的な調節要素は当業界既知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ.，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ（１９８７）１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｄｖ  Ｉｍｎｕｎｏｌ（１９８８）４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ.，ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８９）８：７２９−７３３）、および、免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｅｌｌ（１９８３）３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｅｌｌ（１９８３）３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えばニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｍｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：９１２−９１６）、および、乳腺特異的プロモーター（例えばミルクホエイプロモーター；米国特許第４,８７３,３１６号および欧州出願公報第２６４,１６６号）が挙げられる。発達上調節されるプロモーターはまた、例えばマウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：３７４−３７９）、および、α−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ（１９８９）３：５３７−５４６）も含む。
【００９８】
本発明は、さらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。これは、ＤＮＡ分子が、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現が可能な様式（ＤＮＡ分子の転写により）で調節配列に操作可能に結合していることである。アンチセンス方向でクローニングされた核酸に操作可能に結合した調節配列としては、多様な細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を導く調節配列を選択することができ、例えばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーであり、または、調節配列として、アンチセンスＲＮＡの構成的な組織特異的または細胞型特異的発現を導く調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態が可能であり、これらにおいて、高効率の調節領域の制御下でアンチセンス核酸が生産され、その活性をベクターが導入された細胞型により決定することができる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察に関しては、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ等（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６）を参照。
【００９９】
本発明の他の観点は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書において交換可能に用いられる。このような用語が、特定の被験細胞のみを意味するのではなく、このような細胞の後代または可能性のある後代をも意味することが理解される。変異または環境的影響のいずれかのために特定の改変が後続の世代に生じる可能性があるため、このような後代は、実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で用いられる用語の範囲内に含まれる。
【０１００】
宿主細胞は、原核または真核細胞のいずれでも可能である。例えばＧＡＶＥ８タンパク質は、細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現させることができる。他の適切な宿主細胞が、当業者既知である。ベクターＤＮＡを通常の形質転換またはトランスフェクション技術により原核または真核細胞に導入することができる。本明細書で用いられる用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な当業界で認められる技術を意味することが意図され、該技術としては例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションがある。
【０１０１】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションに関して、用いられた発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞のほんのわずかな分画が、外来ＤＮＡをゲノムに統合する可能性があることが知られている。このような統合体を同定および選択するために、選択マーカー（例えば抗生物質耐性に関する）をコードする遺伝子が、一般的に、対象の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択マーカーとしては、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を付与するマーカーが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸の宿主細胞への導入は、ＧＡＶＥ８をコードしたのと同じベクター上になされてもよいし、または、別々のベクターになされてもよい。導入核酸で安定してトランスフェクトされた細胞を、物質選択により同定することができる（例えば選択マーカー遺伝子を取り込ませた細胞は生き残り、一方で他の細胞は死滅する）。
【０１０２】
本発明の宿主細胞、例えば培養された原核または真核性宿主細胞を、ＧＡＶＥ８タンパク質を生産（すなわち発現）させるのに用いることができる。従って、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を用いたＧＡＶＥ８タンパク質生産方法を提供する。一実施形態において、該方法は、本発明の宿主細胞（ＧＡＶＥ８をコードする組換え発現ベクターが導入された）をＧＡＶＥ８タンパク質が生産されるように適切な培地で培養することを含む。他の実施形態において、該方法はさらに培地または宿主細胞からＧＡＶＥ８を単離することを含む。
【０１０３】
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物の作製に用いることができる。例えば、一実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＧＡＶＥ８をコードする配列が導入された受精した卵母細胞または胚幹細胞である。続いて、このような宿主細胞は、外因性ＧＡＶＥ８配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物、または、内因性ＧＡＶＥ８配列が改変された相同組換え動物を作製するのに用いることができる。このような動物は、ＧＡＶＥ８の機能および／または活性を研究するため、および、ＧＡＶＥ８活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書において用いられる「トランスジェニック動物」は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはげっ歯類、例えばラットまたはマウスであり、該動物の１またはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、雌牛、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、トランスジェニック動
物が発達する元となる細胞のゲノムに統合され、成熟した動物のゲノム中に残存する外因性ＤＮＡであり、そのためにトランスジェニック動物の１またはそれ以上の細胞型または組織でコードされた遺伝子産物の発現が導かれる。本明細書で用いられる「相同組換え動物」は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、これら動物において、動物の発生前に内因性遺伝子とその動物の細胞（例えばその動物の胚細胞）に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって内因性ＧＡＶＥ８遺伝子が改変されている。
【０１０４】
本発明のトランスジェニック動物の作製は、例えばマイクロインジェクション、レトロウイルスの感染によりＧＡＶＥ８をコードする核酸を、受精した卵母細胞のオス前核に導入すること、および、偽妊娠のメスフォスター動物中で卵母細胞を発生させることにより行うことができる。ＧＡＶＥ８のｃＤＮＡ配列、例えば配列番号１の配列を、導入遺伝子として、非ヒト動物のゲノムに導入することができる。あるいは、ヒトＧＡＶＥ８遺伝子の非ヒト相同体、例えばマウスＧＡＶＥ８遺伝子をヒトＧＡＶＥ８ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションに基づき単離することができ、導入遺伝子として用いることができる。導入遺伝子の発現効率を高めるために、導入遺伝子にイントロン配列およびポリアデニル化シグナルが含まれていてもよい。特定の細胞にＧＡＶＥ８タンパク質を発現させるように、組織特異的調節配列をＧＡＶＥ８導入遺伝子に操作可能に結合させることができる。特にマウスのような動物での胚操作およびマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物を作製する方法は当業界で通常であり、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号および第４,８７０,００９号、米国特許第４,８７３,１９１号、ならびに、Ｈｏｇａｎ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ.，１９８６）で説明されている。他のトランスジェニック動物の作製には類似の方法が用いられる。続いて、トランスジェニック初代動物を、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させるのに用いることができる。その上、ＧＡＶＥ８をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物はさらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物と交配することもできる。
【０１０５】
相同組換え動物を作製するために、ＧＡＶＥ８遺伝子を改変（例えば機能的に破壊）するために欠失、付加または置換が導入されたＧＡＶＥ８遺伝子（例えばＧＡＶＥ８遺伝子のヒトまたは非ヒト相同体、例えばマウスＧＡＶＥ８遺伝子）の少なくとも部分を含むベクターが調製される。好ましい実施形態において、相同組換えの際に、内因性ＧＡＶＥ８遺伝子が機能的に破壊されるようにベクターを設計する（すなわち機能的なタンパク質がすでにコードされない；あるいは「ノックアウト」動物とも呼ばれる）。あるいは、相同組換えの際に、内因性ＧＡＶＥ８遺伝子が変異するか、または改変されるが、それでも機能的なタンパク質がコードされるようにベクターを設計することができる（例えば上流の調節領域が改変され、それにより内因性ＧＡＶＥ８タンパク質の発現を改変することができる）。相同組換えベクターにおいて、ＧＡＶＥ８遺伝子の改変された部分は、ＧＡＶＥ８遺伝子の付加核酸により５’および３’末端の側に存在し、それにより、ベクターによりもたらされた外因性ＧＡＶＥ８遺伝子と、胚幹細胞中の内因性ＧＡＶＥ８遺伝子との間に相同組換えを起こすことができる。付加のフランキングＧＡＶＥ８核酸は、内因性遺伝子での良好な相同組換えに十分な長さを有する。一般的に、数キロ塩基のフランキングＤＮＡ（５’および３’末端の両方における）は、ベクターに含まれる（例えば、相同組換えベクターの説明に関するＴｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｅｌｌ（１９８７）５１：５０３を参照）。該ベクターを胚幹細胞系に導入し（例えばエレクトロポレーションにより）、導入されたＧＡＶＥ８遺伝子が内因性ＧＡＶＥ８遺伝子で相同組換えされた細胞が選択される（例えばＬｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｅｌｌ（１９９２）６９：９１５を参照）。続いて、選択された細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入し、集合キメラを形成させる（例えばＢｒａｄｌｅｙ  ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ.，ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，（１９８７）ｐｐ．１１３−１５２を参照）。次に、キメラ胚を適切な偽妊娠メスフォスター動物に移植し、胚を発生させる。生殖細胞において相同組換えされたＤＮＡを保持する後代を、生殖細胞の導入遺伝子の伝達により全ての細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を繁殖させるのに用いることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）２：８２３−８２９、ならびに、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９０／１１３５４、ＷＯ９１／０１１４０、ＷＯ９２／０９６８およびＷＯ９３／０４１６９でさらに説明される。
【０１０６】
他の実施形態において、導入遺伝子の発現を調節することができる選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。このようなシステムの一例としては、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系がある。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明に関しては、例えば、Ｌａｋｓｏ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：６２３２−６２３６を参照。リコンビナーゼ系の他の例としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系がある（Ｏ’Ｇｏｒｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するのに用いられる場合、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択されたタンパク質との両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、例えば２つのトランスジェニック動物（一つは、選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、もう一つは、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む）を交配することにより「ダブル」トランスジェニック動物を構築することによって提供することができる。
【０１０７】
本明細書において説明された非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ公報番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９で説明された方法に従って作製することができる。簡単に言えば、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞を単離し、成長周期を抜けてＧ0期に入らせるように誘導することができる。続いて、例えば電気パルスの使用により、休止細胞を、休止細胞が単離されたのと同じ種の動物からの除核した卵母細胞に融合させることができる。続いて、再構築された卵母細胞が桑実胚または未分化胚芽細胞に発達するように培養し、続いて、偽妊娠メスフォスター動物に移植する。そのメスフォスター動物から生まれた子孫は、それから細胞、例えば体細胞が単離される動物のクローンである。
【０１０８】
IV．医薬組成物
本発明のＧＡＶＥ８核酸分子、ＧＡＶＥ８タンパク質および抗ＧＡＶＥ８抗体（または本明細書において「活性化合物」とも称される）は、投与に適切な医薬組成物に含ませることができる。一般的に、このような組成物は、核酸分子、タンパク質または抗体、および、製薬上許容できるキャリアーを含む。本明細書で用いられるように、「製薬上許容できるキャリアー」という言い回しは、医薬投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのいずれかおよび全部を含むことが意図される。製薬上活性な物質のためのこのような媒質および物質の使用は当業界周知である。通常の媒質または物質のいずれかが活性化合物と適合しない場合を除いては、組成物におけるそれらの使用が考慮される。補足の活性化合物を組成物に含ませてもよい。
【０１０９】
本発明の医薬組成物は、目的とする投与経路に適合するように配合される。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所的）、経粘膜および直腸内投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含ませることができる：滅菌希釈剤、例えば注入用の水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；緩衝剤、例えばアセテート、シトレートまたはホスフェート；および、張度を調節するための物質、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。酸性度（ｐＨ）は、ＨＣｌまたはＮａＯＨのような酸または塩基で調節することができる。非経口製剤は、アンプル、ディスポーザブルのシリンジまたはガラスまたはプラスチック製の複数回用量バイアルに封入することができる。
【０１１０】
注入用途に適切な医薬組成物は、滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時製剤のための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌粉末を含む。静脈内投与に関して、適切なキャリアーとしては、生理食塩水、静菌性の水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ(R)（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌されていなければならず、容易な注入が可能な程度流体であるべきである。組成物は製造および貯蔵条件下で安定であり、細菌や菌類などの微生物の汚染作用に対抗して保存されなければならない。キャリアーは溶媒または分散媒が可能であり、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、および、それらの適切な混合物が挙げられる。適切な流動度は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合必要な粒度を維持することにより、および、界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合において、組成物中に、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含ませることが好ましい。注射可能な組成物の持続性吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることによって達成することができる。
【０１１１】
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に、必要量の活性化合物（例えばＧＡＶＥ８タンパク質または抗ＧＡＶＥ８抗体）を上記で列挙された成分の一つまたはそれらの組み合わせと共に含ませ、必要に応じてろ過滅菌することによって製造することができる。一般的に、分散液は、上記で列挙されたものからの基礎の分散媒と必要とされるその他の成分とを含む滅菌ビヒクルに、活性化合物を含ませることによって製造される。滅菌注射用溶液を製造するための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それにより、活性成分と追加の望ましい成分のいずれかとの粉末が、予めろ過滅菌したそれらの溶液から得られる。
【０１１２】
一般的に、経口用組成物は、不活性な希釈剤または食用キャリアーを含む。経口用組成物は、ゼラチンカプセルに封入してもよいし、錠剤に圧縮してもよい。経口治療投与目的において、活性化合物は、添加剤と合体させてもよいし、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で用いてもよい。経口用組成物はまた、口内洗浄剤として用いるための液状キャリアーを用いて製造することができ、この場合、液状キャリアー中の化合物を経口的に適用し、うがいし、吐き出すかまたは飲み込む。
【０１１３】
製薬上適合可能な結合剤および／またはアジュバント物質を該組成物の一部として含ませることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は、以下の、類似の性質を有する成分または化合物のいずれかを含ませることができる：結合剤、例えば微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；添加剤、例えばスターチまたはラクトース；崩壊剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ；潤滑剤、例えばステ
アリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ；滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；または、矯味矯臭剤、例えばペパーミント
、サリチル酸メチルまたはオレンジ着香剤。吸入による投与に関しては、該化合物は、適切な噴射剤（例えば二酸化炭素のようなガス）を含む加圧されたコンテナーもしくはディスペンサーまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で運搬される。
【０１１４】
全身投与は経粘膜または経皮により行うこともできる。経粘膜または経皮投与に関しては、透過させたいバリアに適した浸透剤が製剤に用いられる。一般的にこのような浸透剤は当業界既知であり、例えば、経粘膜投与に関しては、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内噴霧または坐剤の使用により達成することができる。経皮投与に関しては、活性化合物は、一般的に当業界既知のオイントメント、軟膏、ゲルまたはクリームに配合される。該化合物はまた、坐剤（例えばカカオバターおよびその他のグリセリドのような通常の坐剤ベースと共に）、または、直腸へ運搬するための保留浣腸の形態で調製することができる。
【０１１５】
一実施形態において、活性化合物は、迅速な体外排出から化合物を保護するキャリアー（例えば制御放出製剤）と共に調製され、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化した運搬システムが挙げられる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を用いることができる。このような製剤を製造する方法は、当業者には明白である。Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎやＮｏｖａ  Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から物質を購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染させた細胞を標的とするリポソームを含む）はまた、製薬上許容できるキャリアーとして用いることができる。これらは、当業者既知の方法（例えば米国特許第４,５２２,８１１号で説明される方法）に従って製造することができる。
【０１１６】
投与の簡易性と投与量の均一性のために、経口または非経口用組成物を投与量単位形態で配合することが特に有利である。本明細書で用いられる投与量単位形態は、１回分の投与に相当する物理的に別個の単位を意味し、各単位は、予め決められた活性化合物量（必要な製剤用キャリアーと共同して望ましい治療効果を奏するように計算された）を含む。患者へ投与するための初期の候補投与量は、例えば１回またはそれ以上の別々の投与または連続的な注入のいずれの場合においても、病気のタイプおよび重症度に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０.１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体である。一般的な１日投与量は、上述の要素に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。数日またはそれ以上にわたる繰り返しの投与に関しては、状態に応じて、病気症状の望ましい抑制が生じるまで治療が継続される。しかしながら、その他の投与量方式も有用であり得る。治療の進行は、通常の技術および分析により容易にモニターされる。典型的な投薬方式は、ＷＯ９４／０４１８８に開示されている。本発明の投与量単位形態に関する明細は、活性化合物の特有の性質、および、達成されるべき特定の治療効果、および、個体を治療するためのこのような活性化合物の調剤に関する当業界で特有の制限により決定されるか、または、それらに直接依存する。本発明の核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターの被験者への運搬は、例えば、静脈注射、局所投与により（米国特許第５,３２８,４７０号）、または、定位注入により（例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ１  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：３０５４−３０５７を参照）なされ得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容できる希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含ませてもよいし、または、遺伝子運搬用ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスで構成されてもよい。あるいは、組換え細胞から完全遺伝子運搬ベクターが無傷で生産され得る場合（例えばレトロウイルスベクター）、医薬製剤は、遺伝子運搬システムを生産する１またはそれ以上の細胞を含み得る。
【０１１７】
医薬組成物は、投与のための説明書と共にコンテナー、パックまたはディスペンサーに
入れることができる。
【０１１８】
Ｖ．本発明の使用および方法
本明細書において説明された核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体および抗体を、以下の方法の１またはそれ以上で用いることができる：ａ）スクリーニング分析；ｂ）検出分析（例えば、染色体マッピング、組織型別、法医生物学）：ｃ）予測医学（例えば診断分析、予後分析、臨床試験のモニターおよび薬理ゲノム学）：および、ｄ）処置方法（例えば治療および予防方法）。ＧＡＶＥ８タンパク質は、他の細胞タンパク質と相互作用し、従って、以下に用いることができる：（ｉ）細胞増殖の調節；（ii）細胞分化の調節；および、（iii）細胞生存の調節。本発明の単離された核酸分子は、ＧＡＶＥ８タンパク質を発現させること（例えば、遺伝子治療用途においては宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して）、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡ（例えば生物学的なサンプルにおいて）またはＧＡＶＥ８遺伝子における遺伝子の損傷を検出すること、および、ＧＡＶＥ８活性を調節することに用いることができる。加えて、ＧＡＶＥ８タンパク質は、ＧＡＶＥ８活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングすること、同様に、ＧＡＶＥ８タンパク質の不十分または過剰な生産、または、ＧＡＶＥ８野生型タンパク質に比べて減少した活性または異常な活性を有するＧＡＶＥ８タンパク質型の生産により特徴づけられる疾患を治療すること、に用いることができる。加えて、本発明の抗ＧＡＶＥ８抗体は、ＧＡＶＥ８タンパク質を検出および単離すること、および、ＧＡＶＥ８活性を調節することに用いることができる。本発明は、さらに、上述のスクリーニング分析により同定された新規の物質、および、本明細書において説明された治療のためのそれらの使用に関する。
【０１１９】
Ａ．スクリーニング分析
本発明は、モジュレーター、すなわち、ＧＡＶＥ８タンパク質に結合するか、または、例えばＧＡＶＥ８発現またはＧＡＶＥ８活性に対して刺激または阻害効果を有する候補化合物もしくは試験化合物または物質（例えばペプチド、ペプチドミメティックス、低分子物質またはその他の薬物）を同定するための方法（本明細書においては「スクリーニング分析」とも称される）を提供する。
【０１２０】
一実施形態において、本発明は、膜結合型ＧＡＶＥ８タンパク質もしくはポリペプチドまたは生物学的に活性なそれらの部分に結合するか、または、それらの活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするための分析法を提供する。本発明の試験化合物は、当業界既知のコンビナトリアルライブラリー方法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができ、該アプローチとしては：生物学的なライブラリー；空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー方法；「１−ビーズ−１−化合物」ライブラリー方法；および、親和性クロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー方法が挙げられる。生物学的なライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、一方で、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子物質の化合物ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ（１９９７）１２：１４５）。
【０１２１】
分子ライブラリー合成方法の例は、当業界で見出すことができ、例えば：ＤｅＷｉｔｔ
ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９３）９０：６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｍ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（１９９４）３７：２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ（１９９４）３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ（１９９４）３３：２０６１；および、Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（１９９４）３７：１２３３で見出すことができる。
【０１２２】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２）１３：４１２−４２１）、または、ビーズ上（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５,２２３,４０９号）、胞子（特許第号５，５７１，６９８；第５,４０３,４８４号；および、第５,２２３,４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：１８６５−１８６９）またはファージ（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：６３７８−６３８２；および、Ｆｅｌｉｃｉ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９１）２２２：３０１−３１０）に存在させることが可能である。
【０１２３】
ＧＡＶＥ８リガンドはＳ１Ｐであるため、ＧＡＶＥ８に関与する特定のそれらの部分を決定するために、既知の方法を用いてＳ１Ｐを調査することができる。その特定の領域を、既知の生合成方法、例えば炭水化物合成および酵素反応を組み合わせて用いることにより合成することができる。そのＳ１Ｐの部分は「エピトープ」に等しい。ＧＡＶＥ８エピトープを他のモノマーまたは非炭水化物成分を用いて改変し、それにより、強化された特性（例えば血清中半減期、ＧＡＶＥ８との結合定数など）を有する改変エピトープを得ることができる。エピトープ変異体のいずれか一つの適合性は、本明細書で教示する結合分析およびスクリーニング分析を用いて決定することができる。
【０１２４】
一実施形態において、分析は、細胞に基づく分析であって、該分析において、細胞表面で膜結合型ＧＡＶＥ８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分を発現する細胞と試験化合物とを接触させ、試験化合物がＧＡＶＥ８タンパク質に結合する能力を決定する。該細胞としては、例えば、酵母細胞または哺乳動物起源の細胞が可能である。試験化合物がＧＡＶＥ８タンパク質に結合する能力を決定することは、例えば、複合体において標識された化合物を検出することによって試験化合物とＧＡＶＥ８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分との結合が決定できるように、試験化合物と放射線同位体または酵素標識とをカップリングすることによって達成することができる。例えば、試験化合物を125Ｉ、35Ｓ、14Ｃまたは3Ｈで直接的または間接的のいずれかにより標識することができ、放射線同位体を放射線放出の直接計数またはシンチレーション計数により検出することができる。あるいは、試験化合物を、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、適切な基質の生成物への変換を測定することにより酵素標識を検出することができる。好ましい実施形態において、分析は、膜結合型ＧＡＶＥ８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分を細胞表面で発現する細胞と、ＧＡＶＥ８に結合する既知化合物とを接触させて分析混合物を形成すること、分析混合物と試験化合物とを接触させること、および、試験化合物がＧＡＶＥ８タンパク質と相互作用する能力を決定すること、を含み、該分析において、試験化合物がＧＡＶＥ８タンパク質と相互作用する能力を決定することは、既知化合物に比べて、ＧＡＶＥ８または生物学的に活性なそれらの部分に優先的に結合する試験化合物の能力を決定することを含む。
【０１２５】
他の実施形態において、分析は、細胞に基づく分析であって、該分析は、膜結合型ＧＡＶＥ８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分を細胞表面で発現する細胞と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の活性を調節する（例えば刺激または阻害する）試験化合物の能力を決定すること、を含む。ＧＡＶＥ８または生物学的に活性なそれらの部分の活性を調節する試験化合
物の能力を決定することは、例えば、ＧＡＶＥ８標的分子に結合またはＧＡＶＥ８標的分子と相互作用するＧＡＶＥ８タンパク質の能力を決定することにより達成することができる。本明細書で用いられる「標的分子」とは、ＧＡＶＥ８タンパク質が、自然状態で結合または相互作用する分子、例えば、ＧＡＶＥ８タンパク質を発現する細胞の表面上の分子、第二の細胞の表面上の分子、細胞外の環境に存在する分子、細胞膜の内部表面と結合する分子、または、細胞質の分子である。ＧＡＶＥ８標的分子は、非ＧＡＶＥ８分子でも、または本発明のＧＡＶＥ８タンパク質もしくはポリペプチドでもよい。一実施形態において、ＧＡＶＥ８標的分子は、シグナル伝達経路の成分であって、該成分は、細胞外シグナル（例えば化合物と膜結合型ＧＡＶＥ８分子との結合により生じるシグナル）を細胞膜を通過して細胞に容易に伝達させる。標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または、下流シグナリング分子とＧＡＶＥ８との結合を容易にするタンパク質であり得る。
【０１２６】
他の実施形態において、ＧＡＶＥ８は、既知の技術（例えばＷＯ００／２２１３１およびＷＯ００／２２１２９を参照）を用いて構成的にシグナル化され、本明細書において示された標的細胞で発現させ、続いて、細胞を様々な候補モジュレーターに晒し、それにより、シグナリング活性（本明細書においてそのモニター法が説明されている）が増強したか（候補アゴニストを示す）、それとも減少したか（候補アンタゴニストを示す）を決定することができ、または、活性が基準レベル未満に減少したかどうか（候補インバースアゴニスト）を決定することができる。
【０１２７】
ＧＡＶＥ８標的分子と結合または相互作用するＧＡＶＥ８タンパク質の能力を決定することは、直接的な結合を決定することについて上述された方法の一つにより達成することができる。好ましい実施形態において、ＧＡＶＥ８標的分子と結合または相互作用するＧＡＶＥ８タンパク質の能力を決定することは、標的分子の活性を決定することにより達成することができる。例えば、標的の細胞の第２メッセンジャー（例えば、これらに限定されないが、細胞内Ｃａ2+ジアシルグリセロールおよびＩＰ３が挙げられる）の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（例えば、検出可能なマーカー（例えばルシフェラーゼ）をコードする核酸に操作可能に結合したＧＡＶＥ８反応性調節要素）の誘導を検出すること、または、細胞応答、例えば細胞分化または細胞増殖を検出することによって、標的分子の活性を決定することができる。
【０１２８】
さらに他の実施形態において、本発明の分析は、細胞非含有分析であり、該分析は、ＧＡＶＥ８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分に結合する試験化合物の能力を決定すること、を含む。試験化合物がＧＡＶＥ８タンパク質に結合することを、上述のように直接的または間接的のいずれかにより決定することができる。好ましい実施形態において、該分析は、ＧＡＶＥ８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分とＧＡＶＥ８に結合する既知化合物とを接触させ、分析混合物を形成すること、分析混合物と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ８タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定すること、を含み、該分析において、試験化合物がＧＡＶＥ８タンパク質と相互作用する能力を決定することは、既知化合物に比べて、ＧＡＶＥ８または生物学的に活性なそれらの部分に優先的に結合する試験化合物の能力を決定すること、を含む。
【０１２９】
他の実施形態において、分析は細胞非含有分析であって、該分析は、ＧＡＶＥ８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分と試験化合物とを接触させること、および、
ＧＡＶＥ８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の活性を調節する（例えば刺激または阻害する）試験化合物の能力を決定すること、を含む。例えば、直接的な結合を
決定することについて上述された方法の一つにより、ＧＡＶＥ８タンパク質の、ＧＡＶＥ８標的分子と結合する能力を決定することによって、ＧＡＶＥ８の活性を調節する試験化合物の能力を決定することを達成することができる。その代わりの実施形態において、ＧＡＶＥ８タンパク質がＧＡＶＥ８標的分子をさらに調節する能力を決定することによって、ＧＡＶＥ８の活性を調節する試験化合物の能力決定することを達成することができる。例えば、適切な基質における標的分子の触媒活性／酵素活性を、これまでに述べられたようにして決定することができる。
【０１３０】
さらに他の実施形態において、細胞非含有分析は、ＧＡＶＥ８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分とＧＡＶＥ８に結合する既知化合物とを接触させ、分析混合物を形成すること、分析混合物と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ８タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定すること、を含み、該分析において、試験化合物がＧＡＶＥ８タンパク質と相互作用する能力を決定することは、ＧＡＶＥ８標的分子に優先的に結合する、またはＧＡＶＥ８標的分子の活性を調節するＧＡＶＥ８タンパク質の能力を決定すること、を含む。
【０１３１】
本発明の細胞非含有分析は、可溶性形態または膜結合型のＧＡＶＥ８両方の使用に適用することができる。膜結合型ＧＡＶＥ８を含む細胞非含有分析の場合、膜結合型ＧＡＶＥ８が溶液中に維持されるように可溶化剤を利用することが望ましい。このような可溶化剤の例としては、非イオン性界面活性剤、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ(R)、イソトリデシポリ（エチレングリコール−エーテル）n、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートが挙げられる。
【０１３２】
本発明の上記した分析方法の１を超過する実施形態において、ＧＡＶＥ８または標的分子のいずれかを固定することが望ましい場合があり、それにより、一方または両方のタンパク質の複合体形態を分離して容易に非複合体形態にすることができ、同様に、分析の自動化を達成することができる。候補化合物の存在および非存在において、試験化合物がＧＡＶＥ８へ結合すること、または、ＧＡＶＥ８と標的分子との相互作用は、反応物を入れるのに適した任意の容器の中で達成することができる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠沈管が挙げられる。一実施形態において、一方または両方のタンパク質をマトリックスへ結合させるドメインを付加した融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＧＡＶＥ８融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させ、続いてこれを、試験化合物と結合させるか、または、試験化合物と非吸着標的タンパク質またはＧＡＶＥ８タンパク質のいずれかと結合させ、その混合物を、複合体形成を助けるような条件下で（例えば塩およびｐＨに関して生理学的な条件下で）インキュベートすることができる。インキュベートした後、ビーズまたはマイクロタイタープレートプレートウェルを洗浄して、すべての未結合成分を除去し、複合体形成を例えば上述のように直接的または間接的のいずれかにより測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させることができ、ＧＡＶＥ８の結合または活性レベルを標準的な技術を用いて測定することができる。
【０１３３】
タンパク質をマトリックスに固定するためのその他の技術も、本発明のスクリーニング
分析において用いることができる。例えば、ＧＡＶＥ８またはその標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。当業界周知の技術を用いて（例えばビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、ビオチン化ＧＡＶＥ８または標的分子をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製することができ、ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウェルに固定化することができる。あるいは、ＧＡＶＥ８または標的分子と反応するがＧＡＶＥ８タンパク質の標的分子への結合を妨害しない抗体を、プレートのウェルに誘導体化することができ、未結合標的またはＧＡＶＥ８は、抗体との結合によりウェルに捕獲される。このような複合体を検出する方法としては、上述のＧＳＴ固定化複合体に関する方法のほかにも、ＧＡＶＥ８または標的分子と反応する抗体を用いた複合体の免疫検出、同様に、ＧＡＶＥ８または標的分子に関する酵素活性の検出に基づく酵素結合分析、が挙げられる。
【０１３４】
他の実施形態において、ＧＡＶＥ８発現のモジュレーターは、細胞と候補化合物とを接触させ、細胞におけるＧＡＶＥ８のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定される。候補化合物の存在下におけるＧＡＶＥ８のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと、候補化合物の非存在下におけるＧＡＶＥ８のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルとを比較する。続いて、その比較に基づき、候補化合物をＧＡＶＥ８発現のモジュレーターと同定することができる。例えば、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下で、それが存在しない場合より高い（統計学的に有意に高い）場合、その候補化合物は、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物質と同定される。あるいは、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下で、それが存在しない場合より低い（統計学的に有意に低い）場合、その候補化合物は、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤と同定される。細胞におけるＧＡＶＥ８のｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡまたはタンパク質の検出に関して本明細書において説明された方法により決定することができる。
【０１３５】
本発明のさらに他の観点において、ＧＡＶＥ８タンパク質を、２−ハイブリッド分析または３−ハイブリッド分析において「ベイトタンパク質」として用いて（例えば米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：２
２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９３）１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３）８：１６９３−１６９６；および、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９４／１０３００を参照）、ＧＡＶＥ８と結合または相互作用するその他のタンパク質（「ＧＡＶＥ８結合タンパク質」または「ＧＡＶＥ８−ｂｐ」）を同定し、ＧＡＶＥ８活性を調節することができる。このようなＧＡＶＥ８結合タンパク質はまた、例えばＧＡＶＥ８経路の上流または下流要素としてＧＡＶＥ８タンパク質によるシグナル伝達に関与する可能性が高い。
【０１３６】
本発明は、さらには、上述のスクリーニング分析で同定された新規の物質、および、本明細書において説明される治療のためのそれらの使用に関する。
【０１３７】
Ｂ．検出分析
本発明で同定されたｃＤＮＡ配列（および対応する完全遺伝子配列）の部分または断片を多数の方法でポリヌクレオチド試薬として用いることができる。例えば、該配列を、（ｉ）それぞれの遺伝子を染色体上にマッピングし、それにより遺伝病に関連する遺伝子領域を位置決定すること；（ii）わずかな生物学的なサンプル（組織型別）から個体を同定すること；および、（iii）生物学的なサンプルの法医学的な同定を補助すること、に用いることができる。このような用途を以下の章で説明する。
【０１３８】
Ｉ．染色体マッピング
遺伝子の配列（またはその配列の部分）が単離されたら、配列を、遺伝子の位置を染色体にマッピングすることに用いることができる。従って、本明細書において説明されたＧＡＶＥ８核酸分子またはそれらの断片は、ＧＡＶＥ８遺伝子の位置を染色体にマッピングすることに用いることができる。ＧＡＶＥ８配列の染色体へのマッピングは、病気に関連する遺伝子を有する配列を関係付ける重要な第一工程である。
【０１３９】
簡単に言えば、ＧＡＶＥ８配列からＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することによって、ＧＡＶＥ８遺伝子を染色体にマッピングすることができる。ＧＡＶＥ８配列のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおいて増幅プロセスを複雑にする１を超過するエキソンにかからないようなプライマーを選択することができる。続いて、プライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドをＰＣＲスクリーニングするのに用いることができる。ＧＡＶＥ８配列に対応するヒト遺伝子を含む上記ハイブリッドのみが増幅断片を生産する。
【０１４０】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物（例えばヒトおよびマウス細胞）からの体細胞を融合させることにより調製される。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドが成長し分割するにつれて、細胞は次第にランダムな順番でヒト染色体を失うが、マウス染色体は保持される。マウス細胞は成長できないが（特定の選択酵素が含まれないため）、ヒト細胞は成長できる培地を用いることにより、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体は保持される。様々な培地を用いることにより、ハイブリッド細胞系のパネルを確立することができる。パネル中の各細胞系は、１つのヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、および、マウス染色体の完全なセットを含み、個々の遺伝子を特異的なヒト染色体に簡単にマッピングすることができる。（Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２２０：９１９−９２４）。ヒト染色体の断片のみを含む体細胞ハイブリッドも、転座および欠失を有するヒト染色体を用いて調製することができる。
【０１４１】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に割り当てるための迅速な手順である。ＧＡＶＥ８配列をオリゴヌクレオチドプライマー設計に用いて、サブローカライゼーションを特定の染色体からの断片のパネルを用いて達成することができる。ＧＡＶＥ８配列をその染色体にマッピングするのに同様に用いることができる他のマッピング方法としては、インサイチュハイブリダイゼーション（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：６２２３−２７で説明された）、標識され、フロー分類された染色体を用いたプレスクリーニング、および、染色体に特異的なｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼーションによるプレ選択が挙げられる。
【０１４２】
さらに分裂中期染色体分布へのＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、正確な染色体位置を１工程で提供することができる。染色体分布は、その分割が分裂中期において有糸分裂紡錐体を破壊する化学物質（例えばコルセミド）によりブロックされている細胞を用いて作製することができる。染色体をトリプシンで短時間で処理し、続いて、ギムザ染色することができる。染色体がそれぞれ同定できるようにバンドの明暗パターンを各染色体に関して展開させた。ＦＩＳＨ技術を５００または６００塩基の長さのＤＮＡ配列と共に用いることができる。しかしながら、１,０００塩基を超過する長さのクローンが、簡単に検出するのに十分なシグナル強度を有する特有の染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは１,０００塩基、より好ましくは２,０００塩基が、適度な時間で良好な結果を得るのに十分であり得る。該技術のレビューに関しては、Ｖｅｒｍａ等を参照（Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８８））。
【０１４３】
染色体マッピングのための試薬は、その染色体上で単一の染色体または単一の部位を個々にマークするのに用いることができ、または、試薬のパネルは、複数部位および／または複数の染色体をマークするのに用いることができる。遺伝子の非コーディング領域に対応する試薬はまた、マッピング目的で用いることができる。いくつかのコーディング配列は、遺伝子ファミリー内で保存されており、そのため、染色体マッピングの際のクロスハイブリダイゼーションの機会が増加する。
【０１４４】
正確な染色体位置に配列がマッピングされたら、染色体上の配列の物理的位置を、遺伝子地図データと関係付けることができる。（このようなデータは、例えばＶ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ，ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｏｎ−ｌｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙで見出される）。続いて、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と病気との関係を連鎖分析により同定することができ（物理学的に隣接した遺伝子の共遺伝（ｃｏ−ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ））、例えばＥｇｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２５：７８３−７８７で説明される。
【０１４５】
その上、ＧＡＶＥ８遺伝子に関連する病気に罹った個体と罹っていない固体との間のＤＮＡ配列における差を決定することができる。ある突然変異体が罹患した個体のいくつかまたは全部で観察されるが、罹患していない個体では観察されない場合、その突然変異体は、特定の病気の原因因子である可能性がある。一般的に、罹患した個体と罹患していない個体との比較は、初めに、染色体分布から見てわかる、またはＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲで検出可能な欠失や転座のような染色体における構造的改変を探すことを含む。最終的には、数々の個体からの遺伝子の完全な配列解析を行い、突然変異体の存在を確認し、突然変異体を多型と区別することができる。
【０１４６】
２．組織型別
本発明のＧＡＶＥ８配列はまた、わずかな生物学的なサンプルから個体を同定するのに用いることができる。アメリカ合衆国軍は、例えば、兵士の同定のために制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を使用することを考慮している。その技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１またはそれ以上の制限酵素で消化され、サザンブロットで調査され、同定のための特有のバンドを得ることができる。該方法は、失われたり、切り替えられたり、盗難されたりして明確な同定を困難にする現状の「認識票（Ｄｏｇ  Ｔａｇ）」の制限を受けない。本発明の配列は、ＲＦＬＰのための追加のＤＮＡマーカーとして有用である（米国特許第５,２７２,０５７号で説明された）。
【０１４７】
その上、本発明の配列を用いて、ゲノムの選択された部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定する代替技術を提供することができる。従って、本明細書において説明されたＧＡＶＥ８配列を、配列の５’および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製するのに用いることができる。続いて、プライマーを、ゲノムＤＮＡを増幅するのに用い、その後、その配列を提供することができる。
【０１４８】
各個体は対立遺伝子の違いによりこのようなＤＮＡ配列の特有のセットを有するために、その方法で調製された個体からの対応するＤＮＡ配列のパネルから、特有の個体を同定することができる。本発明の配列を、個体および組織からのこのような同定配列を得るのに用いることができる。本発明のＧＡＶＥ８配列は、ヒトゲノムの部分に特異的に相当する。対立遺伝子の変異は、配列のコーディング領域ではある程度発生し、非コーディング
領域ではより多く発生する。個々のヒト間の対立遺伝子変異は、５００塩基ごとに約１回の頻度で発生すると推測される。本明細書において説明される各配列は、ある程度は、個体からのＤＮＡと同定目的で比較可能な標準として用いることができる。より多数の多型が非コーディング領域で発生する場合は、より少ない配列で個体を識別することができる。配列番号１の非コーディング配列は、約１０〜１,０００種のプライマーのパネル（それぞれ１００塩基の増幅された非コーディング配列を生じる）を用いた陽性個体の同定を提供することができる。予測されたコーディング配列（例えば配列番号１の配列）が用いられる場合、陽性個体の同定のためのより適切な数のプライマーは、５００〜２,０００種であり得る。
【０１４９】
本明細書において説明されたＧＡＶＥ８配列からの試薬パネルを用いて個体に特有の同定データベースを作成した場合、後々、その同じ試薬をその個体からの組織を同定するのに用いることができる。特有の同定データベースを用いれば、個体が生きていても死んでいても、きわめて少量の組織サンプルから陽性の同定が可能である。
【０１５０】
３．法医生物学における部分的なＧＡＶＥ８配列の使用
ＤＮＡに基づく同定技術はまた、法医生物学に用いることができる。法医生物学とは、例えば犯罪の加害者を陽性同定する手段として、犯罪現場で発見された生物学的な証拠の遺伝子型決定を用いる科学的な分野である。このような同定を行うために、ＰＣＲ技術を、組織、例えば、犯罪現場で発見された髪もしくは皮膚、または体液（例えば血液、唾液または精液）のような非常に少量の生物学的なサンプルから得られたＤＮＡ配列を増幅するのに用いることができる。続いて、増幅された配列と標準とを比較し、それにより、生物学的なサンプルの起源を同定することができる。
【０１５１】
本発明の配列を用いて、ポリヌクレオチド試薬、例えば、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座を標的としたＰＣＲプライマーを提供することができ、これらは、例えば、他の「同定マーカー」（すなわち特定の個体に特有の他のＤＮＡ配列）を提供することにより、ＤＮＡに基づく法医学的同定の信頼度を高めることができる。上述したように、実際の塩基配列情報を、制限酵素で生じた断片により形成されたパターンの正確な代替物として、同定に用いることができる。より多くの多型が非コーディング領域で発生するため、配列番号１の非コーディング領域を標的とした配列がそのような使用に特に適切であり、その技術を用いてより簡単に個体を識別することができる。ポリヌクレオチド試薬の例としては、ＧＡＶＥ８配列またはそれらの部分、例えば少なくとも２０または３０塩基の長さの配列番号１の非コーディング領域から誘導された断片、が挙げられる。
【０１５２】
本明細書において説明されたＧＡＶＥ８配列を用いて、ポリヌクレオチド試薬、例えば、標識されたプローブまたは標識可能なプローブをさらに提供することができ、これらを例えばインサイチュハイブリダイゼーション技術で用いて、特定の組織（例えば脳組織）を同定することができる。法医学病理学者に起源が未知の組織が提出された場合、この技術は非常に有用であり得る。このようなＧＡＶＥ８プローブのパネルを、種および／または器官タイプで組織を同定するのに用いることができる。
【０１５３】
類似の様式において、該試薬、例えばＧＡＶＥ８プライマーまたはプローブは、汚染に関して組織培養物をスクリーニングする（すなわち異なるタイプの細胞の混合物が培養物中に存在するかどうかをスクリーニングする）のに用いることができる。
【０１５４】
Ｂ．予測医学
本発明はまた、予測医学の分野に関し、該分野において、予後（予測）目的のために、診断分析、予後分析、薬理ゲノム学および臨床試験のモニターが用いられ、それにより、予防的に個体を処置することができる。従って、本発明の一つの観点は、生物学的なサン
プル（例えば血液、尿、便、血清、細胞、組織）においてＧＡＶＥ８タンパク質および／または核酸発現、同様に、ＧＡＶＥ８活性を決定するための診断分析に関し、該分析により、個体が異常なＧＡＶＥ８発現または活性に関連する病気または疾患に罹患しているか、または、疾患を発症させる危険があるかどうかを決定することができる。本発明はまた、個体が、ＧＡＶＥ８タンパク質、核酸発現または活性に関する疾患を発症させる危険があるかどうかを決定することための、予後（または予測）分析を提供する。例えば、ＧＡＶＥ８遺伝子における変異を、生物学的なサンプルにおいて分析することができる。このような分析を、予後または予測目的で用い、それにより、ＧＡＶＥ８タンパク質、核酸発現または活性により特徴づけられるかまたは、それらに関する疾患が発病する前に、個体を予防的に処置することができる。
【０１５５】
本発明の他の観点は、個体においてＧＡＶＥ８タンパク質、核酸発現またはＧＡＶＥ８活性を決定する方法を提供し、該方法により、その個体に適した治療剤または予防剤を選択することができる（本明細書においては「薬理ゲノム学」とも称される）。薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型（例えば、特定の物質に反応する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝子型）に基いて、個体の治療的または予防的処理のために物質（例えば薬物）を選択することを可能にする。
【０１５６】
本発明のさらに他の観点は、臨床試験において、物質のＧＡＶＥ８の発現または活性に対する影響をモニターすること（例えば薬物またはその他の化合物）に関する。
これらおよびその他の物質を以下の章でさらに詳細に説明する。
【０１５７】
１．診断分析
生物学的なサンプルにおいてＧＡＶＥ８の存在または非存在を検出する典型的な方法は、被験者から生物学的なサンプルを得ること、および、生物学的なサンプルと、ＧＡＶＥ８タンパク質、または、ＧＡＶＥ８タンパク質をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出することが可能な化合物または物質とを生物学的なサンプルにおいてＧＡＶＥ８の存在が検出されるように接触させることを含む。ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するのに好ましい物質は、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズすることが可能な標識された核酸プローブである。該核酸プローブは、例えば、完全長ＧＡＶＥ８核酸でもよいし、例えば配列番号１の核酸またはそれらの部分、例えば、長さが少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００個のヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でＧＡＶＥ８のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドでもよい。本発明の診断分析において使用するための他の適切なプローブは、本明細書において説明されている。
【０１５８】
ＧＡＶＥ８タンパク質を検出するのに好ましい物質は、ＧＡＶＥ８タンパク質と結合可能な抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体でもよいが、より好ましくはモノクローナル抗体である。完全抗体またはそれらの断片（例えば、Ｆab またはＦ(ab')2）を用いることができる。プローブまたは抗体に関して、用語「標識した」は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング（すなわち物理学的に結合すること）することによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、同様に、直接的に標識された他の試薬と反応させることによりプローブまたは抗体を間接的に標識すること、を含むことが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いて一次抗体を検出すること、および、蛍光標識されたストレプトアビジンで検出可能なようにビオチンでＤＮＡプローブを末端標識すること、が挙げられる。用語「生物学的なサンプル」は、被験者から単離された組織、細胞および生物学的な液体、同様に、被験者中に存在する組織、細胞および液体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、インビボおよびインビトロで、生物学的なサンプルにおいてＧＡＶＥ８のｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出することができる。例えば、インビボでのＧＡＶＥ８のｍＲＮＡの検出技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。インビトロでのＧＡＶＥ８タンパク質の検出技術としては、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および、免疫蛍光法が挙げられる。インビトロでのＧＡＶＥ８ゲノムＤＮＡの検出技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。その上、インビボでのＧＡＶＥ８タンパク質の検出技術としては、被験者に標識された抗ＧＡＶＥ８抗体を導入することが挙げられる。例えば、抗体を放射性マーカーで標識し、被験者におけるその存在および位置を標準的なイメージング技術で検出することができる。
【０１５９】
一実施形態において、生物学的なサンプルは、被験者からのタンパク質分子を含む。あるいは、生物学的なサンプルは、被験者からのｍＲＮＡ分子、または、被験者からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的なサンプルは、通常の手段で被験者から単離された末梢血液白血球サンプルである。
【０１６０】
他の実施形態において、該方法は、コントロール被験者から生物学的なコントロールサンプルを得ること、生物学的なサンプルにおいてＧＡＶＥ８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が検出されるように、コントロールサンプルと、ＧＡＶＥ８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出可能な化合物または物質とを接触させること、および、コントロールサンプルにおけるＧＡＶＥ８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と、試験サンプルにおけるＧＡＶＥ８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在とを比較すること、をさらに含む。
【０１６１】
本発明はまた、生物学的なサンプル（試験サンプル）においてＧＡＶＥ８の存在を検出するためのキットを含む。このようなキットを用いて、ＧＡＶＥ８の異常な発現に関連する疾患（例えば免疫疾患）に罹っているのかどうか、または、それらを発症させる危険が増加しているのかどうかを決定することができる。例えば、該キットは、生物学的なサンプルにおいてＧＡＶＥ８タンパク質またはｍＲＮＡを検出することが可能な標識された化合物または物質、および、サンプル中のＧＡＶＥ８の量を決定する手段（例えば、ＧＡＶＥ８（例えば配列番号１）をコードするＤＮＡに結合する抗ＧＡＶＥ８抗体またはオリゴヌクレオチドプローブ）、を含み得る。キットはまた、ＧＡＶＥ８タンパク質またはｍＲＮＡの量が正常値より高いかまたは低い場合、試験された被験者が、ＧＡＶＥ８の異常な発現に関連する疾患に罹った、または、それらを発症させる危険があることを調べるための説明書を含んでもよい。
【０１６２】
抗体ベースのキットに関しては、該キットは、例えば：（１）ＧＡＶＥ８タンパク質に結合する第一の抗体（例えば固体支持体に付着させた）；および、必要に応じて，（２）ＧＡＶＥ８タンパク質または第一の抗体に結合し、検出可能な物質と結合する第二の異なる抗体、を含んでもよい。
【０１６３】
オリゴヌクレオチドベースのキットに関しては、該キットは、例えば：（１）ＧＡＶＥ８核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、または（２）ＧＡＶＥ８核酸分子増幅に有用な１対のプライマー、を含んでもよい。
【０１６４】
該キットはまた、例えば緩衝剤、保存剤またはタンパク質安定化剤を含んでもよい。該キットはまた、検出可能な物質（例えば酵素または基質）を検出するのに必要な成分を含んでもよい。該キットはまた、含まれた試験サンプルを分析し、比較することができるコントロールサンプルまたは一連のコントロールサンプルを含んでもよい。該キットの各成分は、通常、個別のコンテナーに封入され、各種コンテナーは全て、試験された被験者が、ＧＡＶＥ８の異常な発現に関連する疾患に罹っているかどうか、または、それを発症させる危険があるかどうかを調べるための説明書と共に、１つのパッケージに入れられる。
【０１６５】
２．予後分析
その上、本明細書において説明された方法を、診断または予後分析として利用して、異常なＧＡＶＥ８発現または活性に関連する病気または疾患を有する、または、それらを発症させる危険がある被験者を同定することができる。例えば、上述の診断分析または以下の分析などの、本明細書において説明される分析を用いて、ＧＡＶＥ８タンパク質、核酸発現または活性に関する疾患、例えば、免疫系または神経系の疾患（例えば多発性硬化症の発病に関連する免疫反応）を有する、または、それらを発症させる危険がある被験者を同定することができる。あるいは、該予後分析を用いて、このような病気または疾患を有する、または、それらを発症させる危険がある被験者を同定することができる。従って、本発明は、試験サンプルを被験者から採取し、ＧＡＶＥ８タンパク質または核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出する方法を提供し、該方法において、ＧＡＶＥ８タンパク質または核酸の存在が、異常なＧＡＶＥ８発現または活性に関連する病気または疾患を有する、または、それらを発症させる危険がある被験者に関する診断に用いられる。本明細書で用いられる「試験サンプル」は、対象の被験者から得られた生物学的なサンプルを意味する。例えば、試験サンプルは、生物学的な液体（例えば血清）、細胞サンプルまたは組織であり得る。その上、本明細書において説明される予後分析を用いて、被験者に、物質（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模擬体、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子物質またはその他の薬物候補）を投与できるかどうかを決定し、異常なＧＡＶＥ８発現または活性に関連する病気または疾患を治療することができる。例えば、このような方法を用いて、特定の物質または物質クラス（例えばＧＡＶＥ８活性を減少させるタイプの物質）で効果的に被験者を治療することができるかどうかを決定することができる。従って、本発明は、異常なＧＡＶＥ８発現または活性に関連する疾患のための物質で被験者を効果的に治療することができるかどうかを決定する方法を提供し、該方法において、試験サンプルを採取し、ＧＡＶＥ８タンパク質または核酸を検出する（例えば、該方法において、ＧＡＶＥ８タンパク質または核酸の存在が、異常なＧＡＶＥ８発現または活性に関連する疾患を治療するための物質を投与することができる被験者に関する診断に用いられる）。
【０１６６】
また本発明の方法を用いて、ＧＡＶＥ８遺伝子における遺伝子の損傷または変異を検出し、それにより損傷した遺伝子を有する被験者が、異常な細胞増殖および／または分化を特徴とする疾患に関する危険を有するかどうかを決定することもできる。好ましい実施形態において、該方法は、被験者からの細胞サンプルにおいて、ＧＡＶＥ８−タンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を与える少なくとも１つの改変、または、ＧＡＶＥ８遺伝子の誤った発現を特徴とする遺伝子の損傷または変異の存在または非存在を検出することを含む。例えば、このような遺伝子の損傷または変異は、以下の少なくとも１つが存在することを確認することによって検出することができる：１）ＧＡＶＥ８遺伝子からの１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失；２）ＧＡＶＥ８遺伝子への１またはそれ以上のヌクレオチドの付加；３）ＧＡＶＥ８遺伝子の１またはそれ以上のヌクレオチドの置換；４）ＧＡＶＥ８遺伝子の染色体の配列換え；５）ＧＡＶＥ８遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写レベルにおける改変；６）ＧＡＶＥ８遺伝子の異常な改変、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターン；７）ＧＡＶＥ８遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非野生型スプライシングパターンの存在；８）ＧＡＶＥ８−タンパク質の非野生型レベル；９）ＧＡＶＥ８遺伝子の対立遺伝子の損失；および、１０）ＧＡＶＥ８タンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において説明されるように、ＧＡＶＥ８遺伝子における損傷を検出するのに用いることができる当業界既知の多数の分析技術がある。好ましい生物学的なサンプルは、通常の手段で被験者から単離された末梢血液白血球サンプルである。
【０１６７】
特定の実施形態において、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲのよ
うなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第号４,６８３,１９５および第４，６８３，２０２号を参照）、またあるいは、ライゲート連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばＬａｎｄｅｇｒａｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：１０７７−１０８０；および、Ｎａｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：３６０−３６４を参照）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、ＬＣＲは、ＧＡＶＥ８遺伝子における点突然変異を検出するのに特に有用であり得る（例えばＡｂｒａｖａｙａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９５）２３：６７５−６８２を参照）。該方法は、患者から細胞サンプルを回収する工程、サンプル細胞から核酸（例えばゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）を単離する工程、核酸サンプルと、ＧＡＶＥ８遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅（存在する場合）が起こるような条件下でＧＡＶＥ８遺伝子に特異的にハイブリダイズする１またはそれ以上のプライマーとを接触させる工程、および、増幅産物の存在または非存在を検出する工程、または、増幅産物の大きさを検出する工程、および、コントロールサンプルに対して長さ比較する工程、を含み得る。本明細書において説明される変異を検出するのに用いられる技術のいずれかの使用と共に、ＰＣＲおよび／またはLCRを予備的な増幅工程として用いることが望ましいと考えられる。
【０１６８】
その代わりの増幅方法としては、自律的な配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：１１９７）、またはその他の任意の核酸増幅方法が挙げられ、その後、当業者周知の技術を用いて増幅された分子を検出する。このような分子が非常に少量で存在する場合、検出スキームが核酸分子を検出するのに特に有用である。
【０１６９】
その代わりの実施形態において、サンプル細胞からのＧＡＶＥ８遺伝子における変異を制限酵素開裂パターンにおける改変により同定することができる。例えば、サンプルＤＮＡおよびコントロールＤＮＡを単離し、増幅し（場合により）、１またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化させ、断片長サイズをゲル電気泳動により決定し、比較する。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間の断片長サイズの差は、サンプルＤＮＡにおける変異を示す。その上、配列特異的リボザイムの使用（例えば米国特許第５,４９８,５３１号を参照）により、リボザイム開裂部位の発生または損失による特異的変異の存在に関して評価することができる。
【０１７０】
他の実施形態において、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズすることにより、ＧＡＶＥ８における遺伝子変異を同定することができる（Ｃｒｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ（１９９６）７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９６）２：７５３−７５９）。例えば、光発生ＤＮＡプローブを含む二次元アレイ（上述したＣｒｏｎｉｎ等において説明された）でＧＡＶＥ８における遺伝子変異を同定することができる。簡単に言えば、第一のプローブのハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプル中のＤＮＡの長いストレッチを通してスキャンし、連続的にオーバーラップするプローブの直線状アレイを作製することにより配列間の塩基変化を同定することができる。この工程により点突然変異が同定できる。この工程に続いて、第二のハイブリダイゼーションアレイを行い、検出された全ての変異体または突然変異体に相補的な、より少ない特殊化したプローブアレイを用いて特定の変異を特徴付けることができる。各変異アレイは、パラレルプローブセットから成り、１つは野生型遺伝子に相補的であり、他方は、突然変異遺伝子に相補的である。
【０１７１】
さらに他の実施形態において、当業界既知の様々な配列解析反応のいずれかを用いて、直接的にＧＡＶＥ８遺伝子を配列解析し、サンプルＧＡＶＥ８の配列と、対応する野生型（コントロール）配列とを比較することにより変異を検出することができる。配列解析反応の例としては、Ｍａｘｉｍ＆Ｇｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
ＵＳＡ（１９７７）７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３）により開発された技術に基づく技術が挙げられる。診断分析を行う際に様々な自動化配列解析手順のいずれかを用いることも考慮され（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９５）１９：４４８）、例えば質量分析による配列解析がある（例えばＰＣＴ公報番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｄｖ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ（１９９６）３６：１２７−１６２；および、Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９３）３８：１４７−１５９を参照）。
【０１７２】
ＧＡＶＥ８遺伝子において変異を検出するその他の方法としては、開裂剤からの保護を用いて、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２）。一般的に、「ミスマッチ開裂」の技術は、野生型ＧＡＶＥ８配列を含む（標識した）ＲＮＡまたはＤＮＡと、組織サンプルから得られた突然変異体である可能性があるＲＮＡまたはＤＮＡとをハイブリダイズすることにより形成されたヘテロ二本鎖分子を提供することが必要である。二本鎖分子は、コントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチにより存在するような二本鎖分子の一本鎖化された領域を開裂させる物質で処理される。ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖分子をＲＮアーゼで処理することによりミスマッチ領域を消化することができ、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理して、ミスマッチ領域を消化することができる。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖分子のいずれかをヒドロキシルアミンまたは４酸化オスミウムで処理し、および、ピペリジンで処理することにより、ミスマッチ領域を消化することができる。続いて、ミスマッチ領域を消化した後、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲルで大きさで分離し、変異部位を決定することができる。例えばＣｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８８）８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９２）２１７：２８６−２９５を参照。好ましい実施形態において、コントロールＤＮＡまたはＲＮＡを検出のために標識することができる。
【０１７３】
さらに他の実施形態において、細胞サンプルから得られたＧＡＶＥ８のｃＤＮＡにおいて点突然変異を検出し、マッピングするために定義されたシステムにおいて、ミスマッチ開裂反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１またはそれ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチリペア」酵素）を用いる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチにおけるＡを開裂させ、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチにおけるＴを開裂させる（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（１９９４）１５：１６５７−１６６２）。典型的な実施形態に従って、ＧＡＶＥ８配列（例えば野生型ＧＡＶＥ８配列）に基づくプローブは、試験細胞からのｃＤＮＡまたはその他のＤＮＡ産物にハイブリダイズする。二本鎖をＤＮＡミスマッチリペア酵素で処理し、開裂産物が存在すれば電気泳動プロトコールなどにより検出することができる。例えば米国特許第５,４５９,０３９号を参照。
【０１７４】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化を用いて、ＧＡＶＥ８遺伝子における変異を同定することができる。例えば、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）を用いて、突然変異体と野生型核酸との電気泳動の移動度の差を検出することができる（Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：２７６６；または、Ｃｏｔｏｎ，Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ（１９９３）２８５：１２５−１４４；Ｈａｙａｓｈｉ，Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ  Ｔｅｃｈ  Ａｐｐｌ（１９９２）９：７３−７９を参照）。サンプルおよびコントロールＧＡＶＥ８核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、再生させる。一本鎖核酸の２次構造は配列に応じて変化し、電気泳動の移動度において生じた変化によりただ１つの塩基変化でされも検出できる。ＤＮＡ断片を標識するか、または、標識されたプローブで検出することができる。ＲＮＡ（ＤＮＡよりむしろ）を用いて分析の感度を増強することができ、それにおいて、２次構造は、配列における変化に対してより高感度である。好ましい実施形態において、本方法は、ヘテロ二本鎖分析を用いて、電気泳動の移動度の変化に基づいて二本鎖化したヘテロ二本鎖分子を分離することができる（Ｋｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ（１９９１）７：５）。
【０１７５】
さらに他の実施形態において、変性剤の勾配を有するポリアクリルアミドゲルにおける突然変異体または野生型断片の移動を、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いて分析する（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：４９５）。ＤＧＧＥを分析方法として用いる場合、ＤＮＡは、完全には変性しないように改変される（例えば、高融点のＧＣリッチＤＮＡの約４０ｂｐのＧＣクランプをＰＣＲで加えることにより）。さらなる実施形態において、変性剤勾配の代わりに温度勾配を用いて、コントロールＤＮＡとサンプルＤＮＡとの移動度の差を同定することができる（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ（１９８７）２６５：１２７５３）。
【０１７６】
点突然変異を検出するその他の技術の例としては、これらに限定されないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸長が挙げられる。例えば、既知の変異を中心に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを調製することができ、続いて、完全な適合が見出される場合にのみハイブリダイゼーションが可能な条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズさせる（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２４：１６３；Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：６２３０）。このような対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲで増幅される標的ＤＮＡ、または、多数の異なる変異にハイブリダイズ、その際、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズメンブレンに付着し、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズする。
【０１７７】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅による対立遺伝子特異的な増幅技術を本発明と共に用いることができる。特異的な増幅のためのプライマーとして用いられたオリゴヌクレオチドは、分子の中心に対象の変異を有する（増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように）（Ｇｉｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８９）１７：２４３７−２４４８）、または、１つのプライマーの３’末端の一番端に対象の変異を有し、この場合、適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を妨害または減少させる（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ，Ｔｉｂｔｅｃｈ（１９９３）１１：２３８）。加えて、変異領域に新規の制限部位を導入して、開裂に基づく検出を行うことも望ましい（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ（１９９２）６：１）。特定の実施形態において、増幅のためのＴａｑリガーゼを用いて増幅を行うことも考えられる（Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９１）８８：１８９）。このような場合において、５’配列の３’末端で完全な適合が存在する場合のみライゲートが起こり、増幅の存在または非存在を調べることによって、特異的な部位における既知の変異の存在を検出することができる。
【０１７８】
本明細書において説明された方法は、例えば、本明細書において説明される少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパッケージされた診断キットを用いることによって行うことができ、該キットは、例えば臨床条件においてＧＡＶＥ８遺伝子に関す
る病気または疾病の症状を示す患者または家族歴を診断するのに便利に用いることができる。
【０１７９】
その上、ＧＡＶＥ８が発現される細胞型または組織のいずれも本明細書において説明される予後分析において利用することができる。
【０１８０】
３．薬理ゲノム学
本明細書において説明されたスクリーニング分析により同定された、ＧＡＶＥ８活性（例えばＧＡＶＥ８遺伝子発現）に対して刺激または阻害効果を有する物質またはモジュレーターを個体に投与して、ＧＡＶＥ８活性に関連する疾患（例えば、これらに限定されないが、多発性硬化症に関連する免疫反応など）を処置する（予防的または治療的に）ことができる。このような治療と共に、個体の薬理ゲノム学（すなわち個体の遺伝子型と、その個体の外来化合物または薬物に対する応答との関係の研究）も考慮することができる。薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度との関係が変化するために、治療剤の代謝における差により、深刻な毒性または治療的な失敗が生じる可能性がある。従って、個体の薬理ゲノム学により、個体の遺伝子型の考察に基づく予防的または治療的処置に効果的な物質（例えば薬物）を選択することができる。このような薬理ゲノム学はさらに、適切な投与量および治療方式を決定するのに用いることができる。従って、個体におけるＧＡＶＥ８タンパク質の活性、ＧＡＶＥ８核酸の発現、または、ＧＡＶＥ８遺伝子の変異内容を決定し、それにより、個体の治療的または予防的処置に適した物質を選択することができる。
【０１８１】
薬理ゲノム学は、罹患したヒトにおける変化した薬物の性質および異常な作用による薬物に対する応答における臨床的に顕著な遺伝的変異に対処する。例えばＬｉｎｄｅｒ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ（１９９７）４３（２）：２５４−２６６を参照。一般的に、２つのタイプの遺伝薬理学的な条件を区別することができる。薬物が身体に作用する方法を改変する単一の因子として伝達される遺伝的条件は、「改変された薬物作用」と称される。体が薬物に作用する方法を改変する単一の因子として伝達される遺伝的条件は、「改変された薬物代謝」と称される。遺伝薬理学的な条件は、まれな欠陥または多型のいずれかとして生じる。例えば、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠損症（Ｇ６ＰＤまたはソラマメ中毒症）は、代表的な遺伝性酵素病であり、それにおいて、主な臨床的合併症は、酸化剤（抗マラリア剤、サルファ剤、鎮痛剤、ニトロフラン）の摂取、および、ソラマメ摂取の後の溶血である。
【０１８２】
説明のための実施形態として、薬物を代謝する酵素の活性は、薬物作用の強度および持続時間の両方の主要な決定因子である。薬物を代謝する酵素（例えばＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）、ならびに、シトクロムＰ４５０酵素、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多型の発見は、なぜある患者は標準的で安全な用量の薬物を摂取した後に予想された薬物効果が得られないのか、または、過剰な薬物応答や深刻な毒性を示すのか、ということに対する説明を提供する。多型は、個体群における２つの表現型、迅速代謝群（ＥＭ）および不全代謝群（ＰＭ）において発現される。ＰＭの罹患率は、異なる個体群で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、高度の多型であり、数々の変異がＰＭで同定されており、その変異の全てが機能的なＣＹＰ２Ｄ６の非存在を生じさせる。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の不全代謝群は、標準的な用量を摂取した場合、かなり頻繁に過剰な薬物応答および副作用を経験する。ＣＹＰ２Ｄ６が形成する代謝産物（モルヒネ）が介在するコデインの鎮痛効果に関して実証されたように、代謝産物が活性治療成分である場合、ＰＭは治療反応を示さない。その他の極端な例は、標準的な用量に反応しないいわゆる代謝能が極端に速い群である。近年、極端に速い代謝の分子機構は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅によることが同定されている。
【０１８３】
従って、個体におけるＧＡＶＥ８タンパク質の活性、ＧＡＶＥ８核酸の発現、または、
ＧＡＶＥ８遺伝子の変異内容を決定することにより、個体の治療的または予防的処置に適した物質を選択することができる。加えて、薬理ゲノム学研究を用いて、薬物を代謝する酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型決定に適用し、個体の薬物反応性表現型を同定することができる。この知識を投薬または薬物選択に適用した場合、それにより副作用または治療の失敗を回避することができ、従って、ＧＡＶＥ８モジュレーターで、例えば本明細書において説明される典型的なスクリーニング分析の一つにより同定されたモジュレーターで被験者を処置する際に、治療効率または予防効率を高めることができる。
【０１８４】
４．臨床試験の際の効果のモニター
ＧＡＶＥ８の発現または活性に対する物質（例えば薬物、化合物）の影響（例えば異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）をモニターすることは、基本的な薬物スクリーニングの際だけでなく、臨床試験においても適用可能である。例えば、ＧＡＶＥ８遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を増加させることが本明細書において説明されたスクリーニング分析により決定された物質の有効性を、ＧＡＶＥ８遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性の減少を示す被験者の臨床試験においてモニターすることができる。あるいは、ＧＡＶＥ８遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を減少させることがスクリーニング分析によって決定された物質の有効性を、ＧＡＶＥ８遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性の増加を示す被験者の臨床試験においてモニターすることができる。このような臨床試験において、ＧＡＶＥ８発現または活性、および、好ましくは、例えば細胞増殖疾患に関与するその他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫反応のマーカーとして用いることができる。
【０１８５】
例えば、制限する目的ではないが、ＧＡＶＥ８活性（例えば本明細書において説明されるスクリーニング分析により同定された）を調節する物質（例えば化合物、薬物または低分子物質）での処理により細胞で調節されるＧＡＶＥ８などの遺伝子を同定することができる。従って、細胞増殖疾患に対する物質の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、ＧＡＶＥ８遺伝子および疾患に関与するその他の遺伝子の発現レベルを分析することができる。遺伝子発現レベル（すなわち遺伝子発現パターン）は、本明細書において説明されるようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、またあるいは、生産されたタンパク質の量を本明細書において説明される方法の一つによって測定することによって、または、ＧＡＶＥ８遺伝子またはその他の遺伝子の活性レベルを測定することによって定量することができる。その方法において、遺伝子発現パターンは、細胞の物質に対する生理学的な応答を示すマーカーとして役立たせることができる。従って、応答状態は、個体の物質での治療の前、およびその間の様々な時点で決定することができる。
【０１８６】
好ましい実施形態において、本発明は、物質（例えば、本明細書において説明されるスクリーニング分析で同定されたアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティックス、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子物質またはその他の薬物候補）を用いた被験者の治療有効性をモニターする方法を提供し、該方法は、（ｉ）物質の投与の前に被験者から投与前サンプルを得る工程；（ii）投与前サンプルにおけるＧＡＶＥ８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する工程；（iii）被験者から１またはそれ以上の投与後サンプルを得る工程；（iv）投与後サンプルにおけるＧＡＶＥ８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性を検出する工程；（ｖ）投与前サンプルにおけるＧＡＶＥ８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性と、投与後サンプルにおけるＧＡＶＥ８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性とをを比較する工程；および、（vi）それに応じて被験者への物質の投与を改変する工程、を含む。例えば、物質の投与を増すことにより、検出されたレベルより高いレベルにＧＡＶＥ８の発現または活性を高めること、すなわち物質の有効性を高めることが望ましい。あるいは、物質の投与を少なくすることにより、検出されたレベル
より低いレベルにＧＡＶＥ８の発現または活性を減少させること、すなわち物質の有効性を減少させることが望ましい。
【０１８７】
Ｃ．処置方法
本発明は、異常なＧＡＶＥ８発現または活性に関連する疾患の危険がある（または起こしやすい）被験者、または、該疾患を有する被験者を処置する予防方法および治療方法の両方を提供する。このような疾患としては、これらに限定されないが、多発性硬化症に関連する免疫反応が挙げられる。
【０１８８】
１．予防方法
一つの観点において、本発明は、ＧＡＶＥ８発現または少なくとも１つのＧＡＶＥ８活性を調節する物質を被験者に投与することにより、被験者において異常なＧＡＶＥ８発現または活性に関連する病気または状態を予防する方法を提供する。異常なＧＡＶＥ８発現または活性により発症するまたはそれらに起因する病気の危険がある被験者は、例えば、本明細書において説明される診断または予後分析のいずれか、またはその組み合わせにより同定することができる。予防剤の投与は、病気または疾患を予防する、またあるいは進行を遅らせるように、ＧＡＶＥ８異常の症状特徴が現れる前に行うことができる。ＧＡＶＥ８異常のタイプに応じて、例えば、ＧＡＶＥ８アゴニストまたはＧＡＶＥ８アンタゴニスト剤を被験者の治療に用いることができる。適切な物質を、本明細書において説明されるスクリーニング分析に基づき決定することができる。
【０１８９】
２．治療方法
本発明の他の観点は、治療目的でＧＡＶＥ８発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞と、その細胞に関連するＧＡＶＥ８タンパク質活性の１またはそれ以上の活性を調節する物質とを接触させることを含む。ＧＡＶＥ８タンパク質活性を調節する物質は、本明細書において説明された物質、例えば核酸またはタンパク質、ＧＡＶＥ８タンパク質、ペプチドの天然に存在する同種のリガンド、ＧＡＶＥ８ペプチドミメティックスまたはその他の低分子物質であり得る。該物質は、アゴニスト、インバースアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。一実施形態において、該物質は、１またはそれ以上のＧＡＶＥ８タンパク質の生物活性を刺激する。このような刺激剤の例としては、活性なＧＡＶＥ８タンパク質、および、細胞に導入されたＧＡＶＥ８をコードする核酸分子が挙げられる。他の実施形態において、該物質は、１またはそれ以上のＧＡＶＥ８タンパク質の生物活性を阻害する。このような阻害剤の例としては、アンチセンスＧＡＶＥ８核酸分子、および、抗ＧＡＶＥ８抗体が挙げられる。調節方法は、インビトロで（例えば物質と共に細胞を培養することにより）、またあるいは、インビボで（例えば物質を被験者に投与することにより）行うことができる。従って、本発明は、ＧＡＶＥ８タンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする病気または疾患に罹っている個体を治療する方法を提供する。一実施形態において、該方法は、物質（例えば本明細書において説明されるスクリーニング分析で同定された物質）、または、ＧＡＶＥ８発現または活性を調節する（例えばアップレギュレートまたはダウンレギュレートする）物質の組み合わせを投与することを含む。他の実施形態において、該方法は、減少したＧＡＶＥ８発現または活性または異常なＧＡＶＥ８発現または活性を埋め合わせるために、治療として、ＧＡＶＥ８タンパク質または核酸分子を投与することを含む。
【０１９０】
ＧＡＶＥ８活性の刺激は、ＧＡＶＥ８が異常にダウンレギュレートされる状態および／または増加したＧＡＶＥ８活性が有益な効果を持つ可能性がある状態において望ましい。逆に、ＧＡＶＥ８活性の阻害は、ＧＡＶＥ８が異常にアップレギュレートされる状態および／または減少したＧＡＶＥ８活性が有益な効果を持つ可能性がある状態において望ましい。
【０１９１】
本発明は以下の実施例によりさらに説明されるが、限定と解釈すべきではない。本願を通して引用された全ての参考文献の内容、特許および公開特許出願の内容は、参照により本発明に加入される。
【実施例１】
【０１９２】
ｈＧＡＶＥ８のクローニング
部分的なヒトＧＡＶＥ８コーディング領域（ＡＣ０２６５１０）をＦＡＳＴＡアルゴリズムによりヒトゲノムデータベースから同定した。ヒトＧＡＶＥ８コーディング領域：５’ＣＧＣＧＧＴＧＣＧＣＧＣＴＡＣＣＡＧ３’（配列番号７）、および、５’ＧＣＧＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣ３’（配列番号８）に特異的なプライマーをＰＣＲスクリーニングに用いて、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからクローンを単離した。主要な組換えクローンを有するヒトｃＤＮＡライブラリーを９０のプールに細分した。約３×１０4種のクローンを含む各プールをＰＣＲ増幅用の９６−ウェルＰＣＲプレートのウェルにローディングした。以下のＰＣＲプロトコールを用いた：９４℃で３分間保持；９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間および６８℃で４５秒間を４０サイクル。９６−ウェルＰＣＲプレートの各ウェルからのＰＣＲ産物を２％アガロースゲルでの電気泳動により調べた。サブプールは、推定１８５ｂｐのＧＡＶＥ８クローンの可能性のあるＰＣＲ断片を示した。その後、さらなるＰＣＲスクリーニングのために、陽性のサブプールをさらに９０のプールに細分した。第二回目からの、陽性のサブプールの限られた数のコロニーを寒天プレートにプレーティングし、陽性プラスミドをＰＣＲで確認し、ＤＮＡ配列解析分析を行った。
【実施例２】
【０１９３】
ｈＧＡＶＥ８を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞の作製
さらなる実験のために相当量のｈＧＡＶＥ８を提供するために、ｈＧＡＶＥ８をコードするｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトさせた。
【０１９４】
ｈＧＡＶＥ８を過剰発現するＨＥＫ２９３を作製するために、ＨＥＫ２９３細胞を、６−ウェルの３５ｍｍ組織培養プレート（ウェルあたり３×１０5のＨＥＫ２９３細胞）（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１５７３（Ｃｏｓｔａｒ，カタログ番号３５１６）に、２ｍｌのＦ１２ＨＡＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１１７６５−０５４）中で、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１６００−０４４）の存在下で、プレーティングした。
【０１９５】
次に、細胞が５０〜８０％の密集度になるまで、細胞を３７℃で、ＣＯ2インキュベーターでインキュベートした。ｐｃＤＮＡ３．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｖ７９０−２０）において上述された手順を用いて、クローニングされたｈＧＡＶＥ８のｃＤＮＡ核酸配列を挿入した。２μｇのＤＮＡを１００μｌの無血清Ｆ１２ＨＡＭ培地に希釈した。別々に、２５μｌのリポフェクトアミン試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１８３２４−０２０）を１００μｌの無血清Ｆ１２ＨＡＭ培地に希釈した。次に、ＤＮＡ溶液およびリポフェクトアミン溶液を、穏やかに混合し、室温で４５分間インキュベートし、ＤＮＡ−脂質複合体を形成させた。
【０１９６】
細胞を２ｍｌの無血清Ｆ１２ＨＡＭ培地で１回リンスした。各トランスフェクション（６−ウェルプレートで６回のトランスフェクション）に関しては、０.８ｍｌの無血清Ｆ１２ＨＡＭ培地をＤＮＡ−脂質複合体を含む溶液に加え（総量０.２ｍｌ）、穏やかに混合した。次に、得られた混合物（本明細書においては以降「トランスフェクション混合物」とする）を、リンスした細胞に重ねた（０.８ｍｌ＋０.２ｍｌ）。抗菌試薬は加えなかった。次に、細胞を、脂質−ＤＮＡ複合体と共に１６時間、３７℃で、ＣＯ2インキュベーターでインキュベートし、トランスフェクションさせた。
【０１９７】
インキュベート時間が終了した後、初めにトランスフェクション混合物を除去しないで、１０％ウシ胎仔血清を含む１ｍｌのＦ１２ＨＡＭ培地を細胞に重ねた。トランスフェクションした後１８時間で、細胞に重ねられた培地を吸引した。次に、細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ２〜４）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１００１０−０２３）で洗浄し、ＰＢＳを５％血清を含むＦ１２ＨＡＭ培地（「選択培地」）で置き換えた。トランスフェクションした後７２時間で、抗菌剤ジェネテシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１１８１１）を４００μｇ／ｍｌで含む選択培地に細胞を１０倍希釈した。
【実施例３】
【０１９８】
アゴニスト分析
ヒトＧＡＶＥ８のアゴニストに関してスクリーニングするために、ｈＧＡＶＥ８をＧaqi5シグナリングパッケージに人工的にカップリングする。Ｇqメカニズムの活性化は、細胞内での筋小胞体からのＣａ2+の放出を刺激する。Ｃａ2+が細胞質に放出され、その場合、放出はＣａ2+キレート染料を用いて検出することができる。蛍光イメージングプレートリーダーまたはＦＬＩＰＲ(R)装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）が、遺伝子システムを伝えるルシフェラーゼを用いて蛍光において生じた全ての変化をモニターするのに用いられる。アゴニスト活性は、蛍光における増加により示される。
【０１９９】
ｈＧＡＶＥ８を発現するＨＥＫ２９３細胞を、Ｇqタンパク質（Ｇaqi5）の無差別型を発現するように予め加工する。このような細胞を調製するために、Ｇα１６結合ＨＥＫ２９３細胞を用いて、実施例２におけるプロトコールに従って細胞内でのｈＧＡＶＥ８発現を容易にさせる。
【０２００】
３７℃で、５％ＣＯ2で、１０％ウシ胎仔血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１５１４０−１４８）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（カタログ番号１５１４０−１４８，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、４００μｇ／ｍｌゲネチシン（Ｇ４１８）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１０１３１−０３５）および２００μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｒ２５０−０５）を含むＦ１２ＨＡＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１１７６５−０５４）で、細胞を対数成長期に維持する。分析の２４時間前、ウェル容量５０μｌの３８４−ウェルの底が透明な分析プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ／Ｍａｒｓｈ，カタログ番号Ｎ５８１０２）に、９６／３８４マルチドロップ装置（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｙｐｅ８３２）を用いて、１２,５００細胞／ウェルのＨＥＫ２９３細胞をプレーティングする。細胞を、３７℃で、加湿した５％ＣＯ2インキュベーター（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ社のＣＯ2ウォータージャケット付きインキュベーターモデル３１１０）で、インキュベートする。
【０２０１】
以下のストック溶液を調製する：１ＭのＨｅｐｅｓストック溶液（ｐＨ７．５）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１５６３０−０８０）；１ＮのＮａＯＨ中で作製された２５０ｍＭのプロベネシドストック溶液（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ８７６１）；および、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ２６５０）中で作製された１ｍＭのＦｌｕｏ４−ＡＭダイストック溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｆｌ４２０２）。１０００ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（Ｆｉｓｈｅｒ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，カタログ番号ＭＴ２１０２３）、２０ｍｌの１ＭのＨｅｐｅｓストック溶液、および、１０ｍｌの２５０ｍＭプロベネシドストック溶液で反応緩衝液を調製する。ローディング緩衝液を調製するため、１.６ｍｌの１ｍＭのＦｌｕｏ４−ＡＭダイストック溶液を０.３２ｍｌのプルロニック酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｐ６８６６）と混合し、続いて、４００ｍｌの上記反応緩衝液および４ｍｌのウシ胎仔血清と混合する。
【０２０２】
分析の前１時間で、５０μｌの新しく調製したローディング緩衝液を３８４−ウェルプレートの各ウェルに９６／３８４マルチドロップ装置を用いて加える。細胞を、３７℃で、加湿したインキュベーターでインキュベートし、染料の取り込みを最大化する。分析直前に、プレートの底部の少なくとも１０ｍｍ上に設置された吸引ヘッドを有する３８４ＥＭＢＬＡセルウォッシャー（Ｓｋａｔｒｏｎ；モデル番号１２３８６）を用いて、細胞を、９０μｌの反応緩衝液で２回洗浄し、ウェルあたり４５μｌの緩衝液を残す。
【０２０３】
ＦＬＩＰＲ(R) II（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）器具のＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）は、ｆ−ストップ２．０、露光０．４秒に設定される。カメラは、染料ローディングの精度に関して細胞プレートをモニターするために用いられる。
【０２０４】
可能性のあるアゴニストを含む化合物ライブラリーを、生理学的な塩緩衝液中で１０μＭ濃度で試験する。化合物添加の前に、蛍光における変化を１０秒間測定する。化合物を添加した後、蛍光を、３分間の総実験分析時間の間に、最初の１分間は毎秒測定し、続いて、６秒毎に露光を行う。１０回目のスキャンの後、１００μＭのストック化合物の５μｌのアリコートを加え、細胞において最終化合物濃度を１０μＭにする。最初の８０回のスキャンにおける最大蛍光変化をアゴニスト活性の測定値として記録し、１０μＭのＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａ９０６２）で誘導された最大蛍光変化と比較する。
【実施例４】
【０２０５】
アンタゴニスト分析
ヒトＧＡＶＥ８のアンタゴニストに関してスクリーニングするために、ｈＧＡＶＥ８をＧqシステムに人工的にカップリングさせる。実施例３と同様に、ＦＬＩＰＲ(R)装置を用いて、生じた全ての蛍光変化をモニターする。アンタゴニスト活性は、蛍光の減少で示される。
【０２０６】
実施例３で上述したように、ｈＧＡＶＥ８を発現するＨＥＫ２９３細胞を、Ｇqタンパク質の無差別型（Ｇaqi5）を発現するように予め加工する。１０％ウシ胎仔血清，１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１５１４０−１４８）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（カタログ番号１５１４０−１４８，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、４００μｇ／ｍｌのゲネチシン（Ｇ４１８）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１０１３１−０３５）および  ２００μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｒ２５０−０５）を含むＦ１２ＨＡＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１１７６５−０５４）中で、細胞を、３７℃で、５％ＣＯ2で、対数成長期に維持する。分析の２４時間前に、ウェル容量５０μｌ３８４−ウェルの底が透明な分析プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ／Ｍａｒｓｈ，カタログ番号Ｎ５８１０２）に、９６／３８４マルチドロップ装置を用いて、１２,５００細胞／ウェルのＨＥＫ２９３細胞をプレーティングする。細胞を、３７℃で、加湿した５％ＣＯ2で、インキュベートする。
【０２０７】
以下のストック溶液を調製する：１ＭのＨｅｐｅｓストック溶液（ｐＨ７.５）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１５６３０−０８０）；１ＮのＮａＯＨ中で作製された２５０ｍＭのプロベネシドストック溶液（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ８７６１）；ＤＭＳＯ中で作製された１ｍＭのＦｌｕｏ４−ＡＭダイストック溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｆ１４２０２）（Ｓｉｇｍａ  Ｄ２６５０）；および、４８０μＭのＳＰＰ−１ストック溶液（ＢｉｏＭｏｌ）。１０００ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（Ｆｉｓｈｅｒ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，カタログ番号ＭＴ２１０２３）、２０ｍｌの１ＭのＨｅｐｅｓストック溶液、１０ｍｌの２５０ｍＭのプロベネシドストック溶液および１ｍＭのＣａＣｌ2を用いて、反応緩衝液を調製する。ローディング緩衝液を調製するため、８０μｌの１ｍＭのＦｌｕｏ４−ＡＭダイストック溶液を、１６μｌのプルロニック酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｐ６８６６）と混合し、続いて、２０ｍｌの上記反応緩衝液および０.２ｍｌのウシ胎仔血清と混合する。
【０２０８】
分析の３０分間前に、３０μｌの新しく調製したローディング緩衝液を、３８４−ウェルプレートの各ウェルに、９６／３８４マルチドロップ装置を用いて加える。細胞を３７℃で、加湿したＣＯ2インキュベーターで、染料の取り込みを最大化する時間でインキュベートする。分析直前に、１００μｌの反応緩衝液で、プレート底部の少なくとも４０ｍｍ上に設置された吸引ヘッドを有する３８４ＥＭＢＬＡセルウォッシャーを用いて細胞を３回洗浄し、ウェルあたり４５μｌの緩衝液を残す。
【０２０９】
５μｌの１００μＭのストック化合物を、Ｐｌａｔｅｍａｔｅ−３８４ピペッター（Ｍａｔｒｉｘ）を用いて細胞に加える。インキュベート工程の際の化合物濃度は、約１０μＭである。続いて、細胞をＦＬＩＰＲ(R) II に置き、プレートの蛍光を、３分間の総実験分析時間の間に、最初の１分間は毎秒測定し、続いて、６秒毎に露光を行う。１０回目のスキャンの後、スフィンゴシン−１−ホスフェート（１０μＭ，ＢｉｏＭｏｌ  ＳＬ１４０）を加える。各添加の後、３８４−チップを２０μｌの０.０１％ＤＭＳＯ水溶液で１０回洗浄する。
【実施例５】
【０２１０】
受容体結合分析
ｈＧＡＶＥ８受容体を含む膜分画を調製するために、ｈＧＡＶＥ８を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞系を１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（１０ｍｌ）でインキュベートすることにより採取した。細胞を１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（１０ｍｌ）でさらに３回洗浄し、その後、５ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）（Ｓｉｇｍａ  Ｔ６７９１）、５ｍＭのＭｇＣｌ2（Ｓｉｇｍａ  Ｍ８２６６）、および１ｍＭのＥＧＴＡ（Ｓｉｇｍａ  ０３９６）を含む）で再懸濁する。
【０２１１】
続いて、組織ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ，Ｋｉｎｅｍｅｔｉｃａ，モデルＰＴ１０／３５）で１分間細胞を破壊する。得られたホモジネートを、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＲＣ３Ｂの冷却遠心分離機で、４９,０００×ｇで、４℃で２０分間遠心分離する。得られたペレットを２５ｍｌの緩衝液Ａに再懸濁し、遠心分離工程を３回繰り返す。最後の遠心分離の後、ペレットを５ｍｌの緩衝液Ａに再び再懸濁し、アリコートに分け、−７０℃で保存する。
【０２１２】
膜分画とトレーサーとして放射標識したスフィンゴシン−１−ホスフェート（またはＳＰＰ−１）とを用いて、受容体結合分析を行った。９６−ウェルプレート（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で分析を行う。結合反応は、放射性のＳＰＰ−１の存在下（０.０１μＭ〜２５μＭ）で、最終量０．２ｍｌの緩衝液Ａ［０.１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号３４２８７）を含む］中で、１８μｇのＨＥＫ２９３細胞調製物からなる（Ｉｍ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２０００）２７５（１９）：１４２８１−１４２８６を参照）。反応を室温で１時間インキュベートする。Ｗｈａｔｍａｎ社のＧＦ／Ｃフィルターで、０．３％ポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ３１４３）および０.１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間前処理したマルチチャンネルハーベスター（Ｂｒａｎｄｅｌｌ）でろ過することにより反応を止める。混合物をフィルターに適用し、１時間インキュベートする。フィルターを１ｍｌの氷冷した５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７.６）で６回洗浄する。放射能を測定することにより、各トレーサー濃度における総結合と非特異的結合（バックグラウンド）との差に基づき特異的結合を計算する。リガンドと受容体との平衡状態で達成されたリガンドの受容体への結合（平衡結合パラメーター）、および、放射性ＳＰＰ−１の受容体への結合に関して競合するのに必要な非放射性ＳＰＰ−１の量（競合結合値）を決定するためには、８〜１６の濃度データポイントが必要である。結合の５０％阻害（ＩＣ50）を達成するのに必要な濃度を決定するために、阻害曲線を作製する。
【実施例６】
【０２１３】
ノーザンブロット分析
数々のヒト組織サンプルから得られたＲＮＡに関するノーザンブロット分析を行い、その組織がｈＧＡＶＥ８受容体遺伝子を発現するかどうかを決定する。複数のヒト組織からのＲＮＡを含む市販のフィルター（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いることができる。用いられたプローブは、Ｐ32で標識された完全長ｈＧＡＶＥ８のｃＤＮＡである。
【０２１４】
プローブ調製
Ｐ32で標識されたｈＧＡＶＥ８のｃＤＮＡを以下のように調製する。上述のように調製された２５ｎｇのｈＧＡＶＥ８ｃＤＮＡを、４５μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）；１ｍＭのＥＤＴＡに、マイクロ遠心管中で再懸濁し、９５℃で５分間加熱する。続いて、管を、氷上でさらに５分間冷却する。冷却後、管に含まれる混合物を、４５μｌのＧＡＶＥ８ｃＤＮＡおよび緩衝液で上述のように再懸濁し、ＲＴＳ  ＲａｄＰｒｉｍｅ  Ｍｉｘ（ＲＴＳ  Ｒａｄ  ＰｒｉｍｅＤＮＡ標識システムが提供されている）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１０３８７−０１７）と混合した。５μｌのＰ32で標識されたα−ｄＣＴＰ（特異的活性：３０００Ｃｉ／ｍＭ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡＡ０００５）を穏やかに、ただし徹底的に混合しながら加える。得られた混合物を３７℃で１０分間インキュベートする。５μｌの０.２ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）を添加してインキュベートを止める。混合物の５μｌのアリコートを取り、放射活性を測定することにより、放射性α−ｄＣＴＰのｈＧＡＶＥ８ｃＤＮＡへの取り込みを評価する。
【０２１５】
ＲＮＡ抽出
細胞または組織を、培養皿に１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１５５９６）を添加することにより直接溶解させる。続いて、細胞溶解物をピペットに数回通過させ、溶解産物をホモジナイズする（その後、細胞溶解物を試験管に移す）。ホモジナイズの後、溶解産物を５分間、３０℃でインキュベートし、核タンパク質複合体を完全に解離させる。インキュベートの後、Ｔｒｉｚｏｌ試薬１ｍｌあたり０.２ｍｌのクロロホルム（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｃ５３１２）を溶解産物に加え、試験管を１５秒間強く振盪する。続いて、溶解産物を３０℃で３分間インキュベートする。インキュベートに続いて、１２,０００×ｇで１５分間、４℃で溶解産物を遠心分離する。得られた水相を新しい試験管に移し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬１ｍｌあたり０.５ｍ１のイソプロピルアルコールを加える。続いて、水相サンプルを３０℃で１０分間インキュベートし、１２,０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離する。遠心分離の後、上清を除去し、残留したＲＮＡペレットを７０％エタノールでリンスする。続いて、リンスしたサンプルを７５００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、得られた上清を捨て、続いて、残留したＲＮＡペレットを乾燥させ、ＲＮアーゼ非含有水（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１０９７７−０１５）に再懸濁する。
【０２１６】
ゲル電気泳動
２ｇのアガロース（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ａ０１６９）を水、５×ホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液（以下の説明を参照）および２.２Ｍのホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ８２０３１）に溶解させてアガロースゲルを調製する。
【０２１７】
ゲル電気泳動用サンプルを以下のように調製する：
ＲＮＡ  ４.５μｌ（トータルで５μｇ）、
５×ホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液  ２.０μｌ、
ホルムアルデヒド  ３.５μｌ、
ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｆ９０３７）１０.０μｌ、
ここで、５×ホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液は、０.１Ｍの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ７.０）（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｍ５１６２）；４０ｍＭの酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｓ７６７０）；および、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｅ７８８９）である。
【０２１８】
サンプルを１５分間、６５℃でインキュベートし、続いて、氷上で冷却する。冷却した後、サンプルを５秒間遠心分離する。続いて、２μｌのホルムアルデヒドゲルローディング緩衝液；５０％グリセロール（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｇ５５１６）；１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）；０.２５％ブロモフェノールブルー（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号１８０４６）；０.２５％キシレンシアノールＦＦ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号３３５９４０）を、サンプルに加える。
あるいは、様々な器官からの複数のＲＮＡサンプルを含む市販の（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ハイブリダイゼーションフィルターを購入してもよい。
【０２１９】
ゲルを５分間、５Ｖ／ｃｍでプレランする。プレランの後、サンプルをゲルにローディングした。続いて、ゲルをホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液に浸して４Ｖ／ｃｍで泳動する。泳動中、緩衝液を２時間で交換する。
【０２２０】
ゲルからニトロセルロースへのＲＮＡのトランスファー
ＲＮＡが分解しないようにエチジウムブロマイド（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｅｌ３８５）（０.１Ｍの酢酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号０９６８９）中で、０.５μｇ／ｍｌ）でゲルを３０分間染色する。続いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編集で説明されたプロトコール（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐｐ．７.４６−７.５１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を用いて、ＲＮＡをアガロースゲルからニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｉｎｃ，カタログ番号７４３３０−０２６）へトランスファーする。
【０２２１】
Ｐ32で標識されたｃＤＮＡのハイブリダイゼーション
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，カタログ番号８０１５−１）を６８℃で２時間インキュベートする。インキュベートに続いて、１５ｍｌの温めたハイブリダイゼーション溶液を複数の組織サンプルノーザン（ＭＴＮ）メンブレンに注ぐ。ＭＴＮメンブレンを６８℃でハイブリダイゼーション溶液に浸して振盪しながら放置する。１時間が経過した後、９５℃で５分間煮沸することにより予め変性させたｈＧＡＶＥ８のｃＤＮＡプローブを濃度１０6カウント／ｍｌで加える。続いて、ゲルを覆うハイブリダイゼーション溶液を、振盪しながら６８℃で２時間〜一晩インキュベートし続ける。
【０２２２】
続いて、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液からＭＴＮメンブレンを取り出し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ洗浄溶液１（２×ＳＳＣ；０.０５％ＳＤＳ）で、３回連続洗浄し、この洗浄は、それぞれ、メンブレンを１５ｍｌの溶液に室温で４０分間振盪しながら浸す（４０分間毎に溶液を交換する）ことによりなされる。続いて、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ洗浄溶液２（０.１×ＳＳＣ；０.１％ＳＤＳ）で６０℃で１時間洗浄する。続いて、メンブレンをＣｌｏｎｔｅｃｈ洗浄溶液２（０.１×ＳＳＣ；０.１％ＳＤＳ）で３回連続で洗浄し、この洗浄は、メンブレンを１５ｍｌの溶液に振盪しながら６０℃で６０分間浸すことによりなされる。洗浄溶液は１５分間毎に交換する。
【０２２３】
現像
メンブレンを増感紙を用いてＫｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲ（Ｋｏｄａｋ，カタログ番号１６５１５７９）に一晩−７０℃で露光する。
結果
ｈＧＡＶＥ８は、ヒト脾臓、脳およびＰＢＬで高レベルに発現される。特有の転写物の大きさは約２.４ｋｂである。
【実施例７】
【０２２４】
ＰＣＲ分析
ＴａｑＭａｎ(R)またはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、サンプル中でメッセンジャーＲＮＡを検出するための有力なツールである。その技術により、ＰＣＲの際にＴａｑＭａｎ(R)プローブを開裂させるＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ(R)ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性が利用される。ＴａｑＭａｎ(R)プローブは、プローブの５’末端にレポーター染料（実験において：６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン））、および、プローブの３’末端に消光染料（実験において：ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン））を含む。ＴａｑＭａｎ(R)プローブは、フォワードプライマー部位とリバースプライマー部位の間の対象の標的ｃＤＮＡとハイブリダイズするように特異的に設計されている。プローブが完全である場合、３’末端の消光染料は、５’末端のレポーター染料の蛍光を抑制する。ＰＣＲの際、５’から３’へのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ(R)ＤＮＡポリメラーゼ活性により、５’末端のレポーター染料と３’末端の消光染料との間でプローブが開裂し、レポーター染料が置換される。一度置換されると、レポーター染料の蛍光はもう消光染料により抑制されない。従って、標的とされたｃＤＮＡテンプレートから生じたＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター染料の蛍光の増加をモニターすることにより検出される。
【０２２５】
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（モデル番号ＡＢＩ７７００）からのＡＢＩプリズム配列検出システムが、ＰＣＲの際にレポーターの蛍光の増加をモニターするのに用いられる。レポーターシグナルは、不働基準の発光に標準化される。
【０２２６】
ｃＤＮＡテンプレートの調製
数々の組織からのトータルＲＮＡおよびポリＡ+ＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入する（カタログ番号に関しては表１および２を参照）。
【０２２７】
【表１】
2005522184.tif 000002
【０２２８】
【表２】
2005522184.tif 000003
【０２２９】
５μｇのトータルＲＮＡを２μｌ（５０μｇ／μｌ）のランダムな６量体プライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１８０９０）と混合する（総反応容量７μｌ）。得られた混合物を７０℃で１０分間加熱し、迅速に氷上で冷却する。続いて、それを、混合物（４μｌの５×ファーストストランドバッファー、２μｌの０.１ｍＭのＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰおよび１μｌの水）に加える。混合物を穏やかに混合し、３７℃で２分間インキュベートする。インキュベートした後、５μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１８０９０）を加える。続いて、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。１μｌの２．５ｍＭのＥＤＴＡの添加により反応を止める。続いて、混合物を６５℃で１０分間インキュベートする。
【０２３０】
ＰＣＲおよびＴａｑＭａｎ(R)分析を９６−ウェルプレートのＭｉｃｒｏＡｍｐ光学試験管（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，カタログ番号Ｎ８０１−０９３３）で行う。２５μｌのＴａｑＭａｎ(R)ＰＣＲ混合物（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，カタログ番号Ｎ８０８−０２３０）、１μｌのフォワードプライマー（５’−ＴＧＧＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＧＴ−３’）（配列番号９）、１μｌのリバースプライマー（５’−ＴＴＧＣＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣ−３’）（配列番号１０）、１μｌのＴａｑＭａｎ(R)プローブ（５）−ＡＧＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＣＧＴ−３’）（配列番号１１）、１μｌのｃＤＮＡ、および、２１μｌの水を含む反応混合物を、各ウェルに置く。ＴａｑＭａｎ(R)サンプルを、以下のｃＤＮＡテンプレート濃度：５、２、１、０.５、０.２５、０.１２５、０.０６２５ｎｇ／μｌ（テンプレートｃＤＮＡ濃度が最終濃度である）で、各組織サンプルにつき二連で作製する。続いて、プレートをＭｉｃｒｏＡｍｐ光学８−ストリップキャップ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，カタログ番号Ｎ８０１−０９３５）で密封する。
【０２３１】
ヒトβ−アクチン遺伝子（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，カタログ番号４０１８４６）を用いて、標準曲線を二連で実施する。標準曲線の各ｃＤＮＡテンプレート濃度に関して、多数の増幅された分子を得る。既知遺伝子の標準曲線増幅を有することにより、各未知標的遺伝子に関して増幅されたｃＤＮＡ分子の定量化、および、内部コントロールでの基準化が可能になる。
【０２３２】
上記ＴａｑＭａｎ(R)反応からの結果を、フォールド調節として任意選択された組織（例えば、心臓におけるＧＡＶＥ８発現値／脳におけるＧＡＶＥ８発現値）と比較して示す。中枢神経系に関しては、ＧＡＶＥ８の発現が比較される参照として小脳が選択され、相対的なフォールド発現が推測される。
【０２３３】
上記実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、本発明の本質から逸脱することなく様々な改変が可能であることが理解される。従って、本発明は、本願の請求項によってのみ限定される。
【０２３４】
本願において言及された全ての引用された特許および出版物は、本明細書において参照によりその全体が加入される。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】ＧＡＶＥ８の核酸配列を提供する（配列番号１）。
【図２】ＧＡＶＥ８のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。
【図３】様々なヒト組織から得られたＲＮＡのノーザンブロットのコンピューター表示である。
【図４】脳の様々な部分におけるＧＡＶＥ８発現に関するノーザンブロットのコンピューター表示である。
【図５】Ａは脳の様々な領域におけるＧＡＶＥ８のＴａｑＭａｎ(R)発現特徴を提供し、Ｂは視床下部におけるＧＡＶＥ８のＴａｑＭａｎ(R)発現特徴を提供する。
【図６】Ａは末梢組織におけるＧＡＶＥ８のＴａｑＭａｎ(R)発現特徴を提供し、Ｂは末梢組織におけるＧＡＶＥ８のＴａｑＭａｎ(R)発現特徴を提供する。
【図７】Ｓ１Ｐ（ＳＰＰ）（０.０１〜１０のＳ１Ｐ濃度範囲の第一の棒グラフ群）およびＬＰＡ（０.２６〜２６のＬＰＡ濃度範囲の第二の棒グラフ群）で刺激されたＧＡＶＥ８発現細胞（ＨＥＫ形質転換体、Ｇqi5タンパク質およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する改変２９３細胞系）を用いた分析における、ルシフェラーゼ読み出しにおける変化を示す。ＬＰＡはネガティブコントロールである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2005522184000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成14年10月9日(2002.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳および血液細胞では発現されるが心臓、腎臓または骨格筋では発現されない、ＧＡＶＥ８のヌクレオチド配列（配列番号１）またはＧＡＶＥ８変異体のヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
配列が、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
核酸が、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびｃＤＮＡからなる群より選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
付加、欠失または置換変異をコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
変異により、配列番号２のポリペプチドの活性とは異なるシグナリング活性を有するポリペプチドが生じる、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
少なくとも１つの機能的に同等のアミノ酸残基を提供する置換変異をコードする、請求項４に記載の核酸。
【請求項７】
配列番号１のヌクレオチド配列または配列番号１の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、配列番号１は、脳および血液細胞で発現されるが心臓、腎臓または骨格筋では発現されない、上記核酸。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２の第三細胞内ループを含む精製されたポリペプチド。
【請求項１０】
発現調節要素に操作可能に結合した請求項１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１１】
発現調節要素が、構成的な調節配列、細胞特異的な調節配列、および、誘導性の調節配列からなる群より選択される、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項１３】
発現調節要素に操作可能に結合した請求項１に記載の核酸を含む培養細胞。
【請求項１４】
請求項１０に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質転換され、該ベクターを含む核酸がコードするポリペプチドを発現する、培養細胞または該細胞の後代。
【請求項１５】
細胞が、真核細胞および原核細胞からなる群より選択される、請求項１２に記載の培養細胞。
【請求項１６】
ベクターを含む核酸がコードするポリペプチドの発現が可能な条件下で請求項１２に記載の細胞を培養することを含む、タンパク質を生産する方法。
【請求項１７】
配列番号２のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項１８】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
抗体が、リガンドの配列番号２のポリペプチドへの結合を妨げる、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２０】
配列番号２のポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストを患者に投与することを含む、治療方法。
【請求項２１】
（ｉ）可能性のあるアゴニストと配列番号２のポリペプチドを発現する細胞とを接触させること、および、
（ii）該可能性のあるアゴニストの存在下で、配列番号２のポリペプチドのシグナリング活性が、該可能性のあるアゴニストの非存在下でのポリペプチドの活性に比べて増加するかどうかを決定すること
を含む、アゴニストを同定する方法。
【請求項２２】
（ｉ）可能性のあるインバースアゴニストと配列番号２のポリペプチドを発現する細胞とを接触させること、および、
（ii）該可能性のあるインバースアゴニストの非存在、および、リガンドまたはアゴニストの非存在でのポリペプチドの活性に比べて、該可能性のあるインバースアゴニストの存在下で配列番号２のポリペプチドの活性が減少するかどうかを決定すること
を含む、インバースアゴニストを同定する方法。
【請求項２３】
リガンドがスフィンゴシン−１−ホスフェートである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）可能性のあるアンタゴニストと配列番号２のポリペプチドを発現する細胞とを接触させること、および、
（ii）該可能性のあるアンタゴニストの存在下で、配列番号２のポリペプチドのシグナリング活性が、リガンドまたはアゴニストの存在下でのポリペプチドの活性に比べて減少するかどうかを決定すること
を含む、アンタゴニストを同定する方法。
【請求項２５】
リガンドがスフィンゴシン−１−ホスフェートである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号２のポリペプチドのシグナリング活性またはシグナル伝達を調節できる該ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニスト、および、製薬上許容できるキャリアー、添加剤または希釈剤を含む治療用組成物。
【請求項２７】
配列番号２のポリペプチドのシグナリング活性またはシグナル伝達を調節できる該ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニスト、および、製薬上許容できるキャリアー、希釈剤または添加剤を含む治療用組成物を、治療の必要がある患者に投与することを含む、病気を治療する方法。
【請求項２８】
配列番号２のポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードしたポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子。
【請求項２９】
生物学的に活性な部分が、配列番号２のポリヌクレオチドの第三細胞内ループドメインを含む、請求項２８に記載の核酸分子。
【請求項３０】
生物学的に活性な部分が、配列番号２のアミノ酸残基約２１４〜残基約２５２の部分を含む、請求項２８に記載の核酸分子。
【請求項３１】
請求項１に記載の核酸によりコードされた精製されたポリペプチド。
【請求項３２】
請求項７に記載の核酸によりコードされた精製されたポリペプチド。