(57)【要約】【課題】  本発明は、生理活性物質の活性を保持しつつ、当該生理活性物質の生体内安定性を向上させるペプチドフラグメント、及び、当該ペプチドフラグメントを付加した生理活性物質を提供することを課題とする。【解決手段】  本発明は、GAモジュール（配列番号１）の部分配列からなり、アミノ酸配列Ile-Asp-Glu-Ile-Leu（配列番号２）を含む、アミノ酸数が5〜25個のGAモジュールの部分ペプチド、及び、当該GAモジュールの部分ペプチドと生理活性物質とが結合されてなる生理活性複合体に関する。生理活性物質としては、GLP-1、GLP-2、GIP、VIP、ソマトスタチン、アミリン、グレリン、及びそれらの誘導体等が挙げられる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ile-Asp-Glu-Ile-Leuを含み、アミノ酸数が5〜25個である、GAモジュールの部分ペプチド。
【請求項２】
前記GAモジュールが連鎖球菌G148に由来するGAモジュールである、請求項１に記載のGAモジュールの部分ペプチド。
【請求項３】
アミノ酸数が5〜17個である、請求項１に記載のGAモジュールの部分ペプチド。
【請求項４】
式：Y22-Y23-Y24-Y25-Y26-Y27-Y28-Y29-Y30-Y31-Y32-Y33-Y34-Y35-Y36-Y37-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Y43-Y44-Y45-Y46
［式中、Y22はLys又は欠失、Y23はAsn又は欠失、Y24はLeu又は欠失、Y25はIle又は欠失、Y26はAsn又は欠失、Y27はAsn又は欠失、Y28はAla又は欠失、Y29はLys又は欠失、Y30はThr又は欠失、Y31はVal又は欠失、Y32はGlu又は欠失、Y33はGly又は欠失、Y34はVal又は欠失、Y35はLys又は欠失、Y36はAla又は欠失、Y37はLeu又は欠失、Y43はAla又は欠失、Y44はAla又は欠失、Y45はLeu又は欠失、Y46はPro又は欠失を意味する。ただし、欠失は、Y22及び／又はY46からの連続的な欠失（Y22又はY46単独の欠失及びY22とY46の2箇所のみの欠失を含む）に限る。]
で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のGAモジュールの部分ペプチド。
【請求項５】
以下の群から選択される、請求項４に記載のGAモジュールの部分ペプチド。
Ile-Asp-Glu-Ile-Leu（配列番号2）
Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号3）
Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号4）
Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号5）
Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号6）
Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala（配列番号7）
Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号8）
Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号9）
Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号10）
Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu（配列番号11）
Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu（配列番号12）
Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号13）
Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro（配列番号14）
Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro（配列番号15）
Lys-Asn-Leu-Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro（配列番号16）  
【請求項６】
配列番号１に示されたGAモジュールのアミノ酸の22位から38位のうち1つで始まり、アミノ酸42位から46位のうち1つで終わる、請求項１に記載のGAモジュールの部分ペプチド。  
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のGAモジュールの部分ペプチドと、生理活性物質が結合されてなる生理活性複合体。
【請求項８】
前記生理活性物質が消化管ホルモン若しくはそれらの誘導体、又は、Exendin-4若しくはそれらの誘導体である、請求項７に記載の生理活性複合体。
【請求項９】
前記消化管ホルモンが、GLP-1、GLP-2、GIP、VIP、ソマトスタチン、アミリン、及びグレリンからなる群から選択される、請求項８に記載の生理活性複合体。
【請求項１０】
リンカーを介して、前記GAモジュールの部分ペプチドと前記生理活性物質とが結合されてなる、請求項７に記載の生理活性複合体。
【請求項１１】
前記GLP-1又はその誘導体が、
式：His-X8-X9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-X18-X19-X20-Glu-X22-X23-Ala-X25-X26-X27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-X40-X41-X42-X43-X44-X45
[式中、X8は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Lys、又はAibであり、X9は、Glu、Gly、Asp、又はLysであり、X16は、Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Tyr、Glu、Asp、Trp、又はLysであり、X18は、Ser、Ala、Arg、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、又はLysであり、X19は、Tyr、Phe、Trp、Glu、Gln、Asp、又はLysであり、X20は、Leu、Met、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、Tyr、又はLysであり、X22は、Gly、Ala、Glu、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Asp、Lys、Arg、Cys、又はAibであり、X23は、Gln、Arg、Glu、Asp、Asn、又はLysであり、X25は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、又はLysであり、X26は、Lys、Gln、Glu、Asp、His又はArgであり、X27は、Glu、Ala、Asp、Lys、又はLeuであり、X30は、Ala、Glu、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Asp、Lys、Gln、Tyr、His、又はArgであり、X33は、Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp又はLysであり、X34は、Lys、Arg、Glu、Asp、His、Ala、Gly、又はAsnであり、X35は、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Lys、His、Pro、又はAibであり、X36は、Arg、Gly、Lys、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X37は、Gly、Pro、Glu、Lys、Ala、Thr、Ser、Asp、Leu、Ile、Val、His又は欠失であり、X38は、Ser、Lys、Arg、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X39は、Ser、Arg、Lys、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X40は、Gly、Glu、Lys、Asp、又は欠失であり、X41は、Ala、Lys、Phe、Trp、Tyr、Glu、Asp又は欠失であり、X42は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X43は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X44は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X45は、Ser、Lys、Val、Glu、Asp、又は欠失である。]
で示されるアミノ酸配列からなりGLP-1活性を有するGLP-1又はGLP-1誘導体である、請求項９に記載の生理活性複合体。
【請求項１２】
前記GLP-1又はGLP-1誘導体が、GLP-1(7-37)，[Ser8]-GLP-1(7-37)，[Gly8]-GLP-1(7-37)，[Val8]-GLP-1(7-37)，[Glu22]-GLP-1(7-37)，[Lys22]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22]-GLP-1(7-37)，[Val8，Lys22]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu22]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Lys22]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu30]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu30]-GLP-1(7-37)，[Val8，His37]-GLP-1(7-37)，[Gly8，His37]-GLP-1(7-37)，[Arg34]-GLP-1(7-37)，[Lys18]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu22，Gly36]-GLP-1(7-37)，[Aib8，Aib22]-GLP-1(7-37)，[Aib8，Aib35]-GLP-1(7-37)，[Aib8，Aib22，Aib35]-GLP-1(7-37)，[Glu22，Glu23]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu22，Glu23]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Glu23]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Val25]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Ile33]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Val25，Ile33]-GLP-1(7-37)、及びこれらの37位が欠失したGLP-1(7-36)型、並びにこれらの36位と37位とが欠失したGLP-1(7-35)型からなる群より選択される、請求項１１に記載の生理活性複合体。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれかに記載のGAモジュールの部分ペプチドを、生理活性物質に結合することを特徴とする、生理活性物質の生体内安定性を改善する方法。
【請求項１４】
前記生理活性物質がGLP-1又はその誘導体であり、前記GAモジュールの部分ペプチドをGLP-1又はその誘導体のC末端に結合することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質等の生体内安定性を向上させるためのペプチド、及び該ペプチドと生理活性物質とが結合されたペプチド複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内における生理活性物質等（タンパク質又はペプチドなど）の急速な消失は、これらが医薬品として応用される場合にその効能を制限することがある。例えば、GLP-1(glucagon like peptide-1)の生理作用は糖尿病用医薬品として有用と考えられているが、その血中消失半減期は2〜3分であり、有効性を十分に得るためには持続注入や頻回投与が必要とされている。そのため、解決策の一つとして、脂肪酸修飾したGLP-1の研究が行われている(非特許文献1、特許文献1)。すなわち、GLP-1を脂肪酸修飾することにより、血液タンパク質であるアルブミンへの親和性を付与した結果、酵素分解および腎排泄が回避され、血中消失半減期の向上を達成している。しかし、脂肪酸やポリエチレングリコール(PEG)などの疎水性長鎖分子またはポリエーテルを用いて修飾すると、生産工程の煩雑化および生産収率の低下という問題が生じる。【０００３】
ところで、ある種のグラム陽性菌由来のタンパク質、例えばプロテインGにはアルブミンに高い親和性を有する領域が知られており、この能力を有する最小領域としてGAモジュール（GA module）又はABD（Albumin binding domain）などと呼ばれるアミノ酸46残基のペプチドが知られている(非特許文献2)。実際にGAモジュールを付加したある種の抗体タンパク質は、付加していないものに比べて、生体内安定性が向上することが知られている(非特許文献3)。また、同様に、ブドウ球菌プロテインA又は連鎖球菌性プロテインGに由来し、血清アルブミン又は免疫グロブリンGに結合するペプチド断片を、生理活性タンパク質に結合させることにより、生体内半減期を延長させることができることが知られている（特許文献3）。GAモジュール配列からなるペプチドは、GAモジュールの第2ヘリックス及び第3ヘリックス部分で、アルブミン結合能が見られることが知られている（特許文献2、非特許文献4）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO1996/029342
【特許文献２】WO2009/016043
【特許文献３】WO91/001743
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J  Med  Chem，2000，43(9)，1664-1669
【非特許文献２】Biochemistry，1992，31(5)，1451-1457
【非特許文献３】Protein  Eng  Des  Sel，2007，20(11)，569-576
【非特許文献４】Protein  Eng  Des  Sel，2008，21(8)，515-527
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の通り、GAモジュールは、生理活性物質等に付加することにより、当該生理活性物質等の生体内安定性を向上させることが予測される。しかし、本発明者らが検討したところ、生理活性物質等にGAモジュール46残基のペプチドを付加すると、付加していないものに比べて著しく活性が低下するという新たな問題を見出した。従って、本願発明は、生理活性物質等の活性を保持しつつ、生体内安定性を向上させることができるペプチドフラグメントを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、GAモジュール46残基のペプチドを生理活性物質等に付加した場合に著しい活性低下を示す原因は、付加アミノ酸配列長の違いであるとの考えの下、GAモジュール46残基の内の第3ヘリックス部分を中心にして、生理活性物質等の生体内安定性の向上に特に必須な部位を見出すべく鋭意検討した。その結果、生理活性物質の活性低下を有意に避けることができ、かつ、生体内安定性を向上させるGAモジュールの部分配列からなるペプチド（以下、GAモジュールの部分ペプチドと呼ぶ。）を見出し、本発明を完成させた。【０００８】
即ち、本発明の主な構成は次のとおりである。
(1)アミノ酸配列Ile-Asp-Glu-Ile-Leuを含み、アミノ酸数が5〜25個である、GAモジュールの部分ペプチド。
(2)前記GAモジュールが連鎖球菌G148に由来するGAモジュールである、(1)に記載のGAモジュールの部分ペプチド。
(3)アミノ酸数が5〜17個である、(1)に記載のGAモジュールの部分ペプチド。【０００９】
(4)式：Y22-Y23-Y24-Y25-Y26-Y27-Y28-Y29-Y30-Y31-Y32-Y33-Y34-Y35-Y36-Y37-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Y43-Y44-Y45-Y46
［式中、Y22はLys又は欠失、Y23はAsn又は欠失、Y24はLeu又は欠失、Y25はIle又は欠失、Y26はAsn又は欠失、Y27はAsn又は欠失、Y28はAla又は欠失、Y29はLys又は欠失、Y30はThr又は欠失、Y31はVal又は欠失、Y32はGlu又は欠失、Y33はGly又は欠失、Y34はVal又は欠失、Y35はLys又は欠失、Y36はAla又は欠失、Y37はLeu又は欠失、Y43はAla又は欠失、Y44はAla又は欠失、Y45はLeu又は欠失、Y46はPro又は欠失を意味する。ただし、欠失は、Y22及び／又はY46からの連続的な欠失（Y22又はY46単独の欠失及びY22とY46の2箇所のみの欠失を含む）に限る。]
で示されるアミノ酸配列からなる(1)に記載のGAモジュールの部分ペプチド。【００１０】
(5)以下の群から選択される、(4)に記載のGAモジュールの部分ペプチド。
Ile-Asp-Glu-Ile-Leu（配列番号2）
Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号3）
Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号4）
Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号5）
Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号6）
Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala（配列番号7）
Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号8）
Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号9）
Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号10）
Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu（配列番号11）
Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu（配列番号12）
Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala（配列番号13）
Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro（配列番号14）
Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro（配列番号15）
Lys-Asn-Leu-Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro（配列番号16）【００１１】
(6)配列番号１に示されたGAモジュールのアミノ酸22位から38位のうち1つで始まり、アミノ酸42位から46位のうち1つで終わる、GAモジュールの部分ペプチド。
(7)(1)〜(6)のいずれかに記載のGAモジュールの部分ペプチドと、生理活性物質とが結合されてなる生理活性複合体。
(8)前記生理活性物質が消化管ホルモン若しくはそれらの誘導体、又は、Exendin-4若しくはそれらの誘導体である、(7)に記載の生理活性複合体。【００１２】
(9)前記消化管ホルモンが、GLP-1、GLP-2、GIP、VIP、ソマトスタチン、アミリン、及びグレリンからなる群より選択される、(8)に記載の生理活性複合体。
(10)リンカーを介して、前記GAモジュールの部分ペプチドと、前記生理活性物質とが結合されてなる、(7)に記載の生理活性複合体。【００１３】
(11)前記GLP-1又はその誘導体が、式：
His-X8-X9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-X18-X19-X20-Glu-X22-X23-Ala-X25-X26-X27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-X40-X41-X42-X43-X44-X45
[式中、X8は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Lys、又はAibであり、X9は、Glu、Gly、Asp、又はLysであり、X16は、Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Tyr、Glu、Asp、Trp、又はLysであり、X18は、Ser、Ala、Arg、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、又はLysであり、X19は、Tyr、Phe、Trp、Glu、Gln、Asp、又はLysであり、X20は、Leu、Met、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、Tyr、又はLysであり、X22は、Gly、Ala、Glu、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Asp、Lys、Arg、Cys、又はAibであり、X23は、Gln、Arg、Glu、Asp、Asn、又はLysであり、X25は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、又はLysであり、X26は、Lys、Gln、Glu、Asp、His又はArgであり、X27は、Glu、Ala、Asp、Lys、又はLeuであり、X30は、Ala、Glu、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Asp、Lys、Gln、Tyr、His、又はArgであり、X33は、Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp又はLysであり、X34は、Lys、Arg、Glu、Asp、His、Ala、Gly、又はAsnであり、X35は、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Lys、His、Pro、又はAibであり、X36は、Arg、Gly、Lys、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X37は、Gly、Pro、Glu、Lys、Ala、Thr、Ser、Asp、Leu、Ile、Val、His又は欠失であり、X38は、Ser、Lys、Arg、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X39は、Ser、Arg、 Lys、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X40は、Gly、Glu、Lys、Asp、又は欠失であり、X41は、Ala、Lys、Phe、Trp、Tyr、Glu、Asp又は欠失であり、X42は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X43は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X44は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X45は、Ser、Lys、Val、Glu、Asp、又は欠失である。]
で示されるアミノ酸配列からなりGLP-1活性を有するGLP-1又はGLP-1誘導体である、(9)に記載の生理活性複合体。【００１４】
(12)前記GLP-1又はGLP-1誘導体が、GLP-1(7-37)，[Ser8]-GLP-1(7-37)，[Gly8]-GLP-1(7-37)，[Val8]-GLP-1(7-37)，[Glu22]-GLP-1(7-37)，[Lys22]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22]-GLP-1(7-37)，[Val8，Lys22]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu22]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Lys22]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu30]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu30]-GLP-1(7-37)，[Val8，His37]-GLP-1(7-37)，[Gly8，His37]-GLP-1(7-37)，[Arg34]-GLP-1(7-37)，[Lys18]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu22，Gly36]-GLP-1(7-37)，[Aib8，Aib22]-GLP-1(7-37)，[Aib8，Aib35]-GLP-1(7-37)，[Aib8，Aib22，Aib35]-GLP-1(7-37)，[Glu22，Glu23]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu22，Glu23]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Glu23]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Val25]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Ile33]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Val25，Ile33]-GLP-1(7-37)、及びこれらの37位が欠失したGLP-1(7-36)型、並びにこれらの36位と37位とが欠失したGLP-1(7-35)型からなる群より選択される、(11)に記載の生理活性複合体。【００１５】
(13)(1)〜(6)のいずれかに記載のGAモジュールの部分ペプチドを、生理活性物質に結合することを特徴とする、生理活性物質の生体内安定性を改善する方法。
(14)前記生理活性物質がGLP-1又はその誘導体であり、前記GAモジュールの部分ペプチドをGLP-1又はその誘導体のC末端に結合することを特徴とする、(13)に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本願発明のGAモジュールの部分ペプチドを生理活性物質に結合させることにより、生理活性物質の活性を保持しつつ、その血中安定性等、生体内安定性の向上を達成することができる。尚、生理活性物質としては、消化管ホルモン又はそれらの誘導体に特に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】GAモジュールのアミノ酸配列を示す。GAm(1-46)はGAモジュール46残基全長を示し、GAm(17-46)はGAモジュールの17位から46位のものを示し、GAm(28-44)はGAモジュールの28位から44位のものを示す。
【図２】MIN6細胞に各GLP-1ペプチド複合体を処理した際に分泌されるインスリン分泌量を、1000pMの天然GLP-1を処理した際のインスリン分泌量を100%としたときの相対値を示す。
【図３】MIN6細胞に各GLP-1ペプチド複合体を処理した際に分泌されるインスリン分泌量を、1000pMの天然GLP-1を処理した際のインスリン分泌量を100%としたときの相対値を示す。
【図４】各GLP-1ペプチド複合体を2型糖尿病モデルマウスであるdb/dbマウスに皮下投与した際の随時血糖低下作用を測定した結果を示す。
【図５】各GLP-1ペプチド複合体を2型糖尿病モデルマウスであるdb/dbマウスに皮下投与した際の随時血糖低下作用を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書においてアミノ酸配列にて示されるペプチドは、標記の慣例に従って、左端がN末端、右端がC末端である。
GAモジュールの部分ペプチドとは、配列番号１に示されたGAモジュールの部分配列からなるペプチドをいう。「GAモジュールの部分配列」とは、GAモジュール配列の一部分からなる配列をいう。具体的には、配列番号1に示されたGAモジュールの一方の末端又は両方の末端から、一アミノ酸残基又は連続したアミノ酸残基が欠失した断片配列をいう。本発明のGAモジュールの部分ペプチドは、配列番号2によって定められる少なくとも5つの連続したアミノ酸を含むペプチドであり、そのアミノ酸数は、5〜25個であり、5〜17個がより好ましい。本発明のGAモジュールの部分ペプチドは、アミノ酸配列で示すと、
式：Y22-Y23-Y24-Y25-Y26-Y27-Y28-Y29-Y30-Y31-Y32-Y33-Y34-Y35-Y36-Y37-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Y43-Y44-Y45-Y46
［式中、Y22はLys又は欠失、Y23はAsn又は欠失、Y24はLeu又は欠失、Y25はIle又は欠失、Y26はAsn又は欠失、Y27はAsn又は欠失、Y28はAla又は欠失、Y29はLys又は欠失、Y30はThr又は欠失、Y31はVal又は欠失、Y32はGlu又は欠失、Y33はGly又は欠失、Y34はVal又は欠失、Y35はLys又は欠失、Y36はAla又は欠失、Y37はLeu又は欠失、Y43はAla又は欠失、Y44はAla又は欠失、Y45はLeu又は欠失、Y46はPro又は欠失を意味する。ただし、欠失は、Y22及び／又はY46からの連続的な欠失（Y22又はY46単独の欠失及びY22とY46の2箇所のみの欠失を含む）に限る。]
となる。
【００１９】
GAモジュールは、アルブミンに高い親和性を有することで知られており、ABD（Albumin binding domain）と呼ばれることもある。GAモジュールとして報告されている配列は、天然に存在する菌では、16種類のペプチド配列が報告されている(Biochemistry，2006，45(10)，3263-3271)。GAモジュールの1つとして、連鎖球菌(Streptococcus)G148株のプロテインG（streptococcal protein G）の特定の領域であって、アミノ酸46残基からなる配列があり、配列番号1に示す。本発明の実施例では、連鎖球菌G148に由来するGAモジュールを用いた。
【００２０】
本発明のGAモジュールの部分ペプチドは、生理活性物質等に付加することにより、生理活性物質等の機能を補強するペプチドである。当該ペプチドを置換又は付加する部位は、生理活性物質等によって異なるが、生理活性物質等の性質及び特徴に基づき、公知の方法に従って、最適部位を適宜選択することができる。例えば、GLP-1は、N末端にペプチドを結合させると活性が著しく損なわれることから、C末端に付加するのが好ましい。アミリンは、N末端に修飾しても活性を示すことが知られていることから、N末修飾が可能である（WO2007/022123）。また、VIPは、N末端のアセチル化若しくはCyclic peptide化、又はC末端のアミノ酸修飾によっても、活性を示す事が知られており（WO2008/003612)、C末端修飾が可能である。
【００２１】
「生理活性物質」とは、本来的には、生体の働きを調節する物質であり、通常、ペプチド若しくはタンパク質、又はそれらと機能が非常に類似している物質のことで、疾病の治療又は診断の目的で利用することができる。通常、ペプチド性のものが多いので、生理活性ペプチドということもある。生理活性物質としては、消化管ホルモン、成長ホルモン、又はそれらの誘導体などがある。消化管ホルモンには、グルカゴン、GLP-1(Glucagon like peptide-1)、GLP-2、GIP(Gastric Inhibitory Polypeptide)、ガストリン、セレクチン、コレシストキニン、モチリン、ニューロテンシン、ソマトスタチン(Somatostatin)、アミリン(Amylin)、グレリン(Ghrelin)、及びVIP(Vasoactive Intestinal Polypeptide)などがある。ここで、生理活性物質とは、天然物だけでなく人工合成物をも含む。すなわち、天然の生理活性物質の一部のアミノ酸が置換、欠失又は付加（例えば、挿入）されたものも含む。このようなペプチドデザインは、効果の増強、選択性の強化、又はペプチド分解に対する安定性などを目的として成され、生理活性物質によって異なるが、当業者に周知の方法で行うことができる。また、糖鎖、脂肪酸、脂質、核酸などがペプチド鎖に結合している生理活性物質であってもよい。
尚、Exendin-4は、アメリカ毒トカゲの唾液腺の分泌物から発見されたGLP-1様活性を有する生理活性ペプチドであり、Exendin-4(1-39)の他に、Exendin-4(1-39)-LysLysLysLysLys、Exendin-4(1-39)-LysLysLysLysLysLys等の誘導体が知られており、GLP-1の誘導体とみなすこともできる。
【００２２】
「GLP-1誘導体」とは、GLP-1（GLP-1誘導体との差異を強調するために天然GLP-1と呼ばれることもある。）の一部のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたものであって、GLP-1と実質的に同様の活性を有する。つまり、GLP-1誘導体は、好ましくは天然GLP-1と比べて50％〜150％の活性を有する。GLP-1誘導体においては、8位の置換、22位及び23位、又は、26位及び34位の置換などによって、酵素耐性が増すことが知られている。この他にもGLP-1およびGLP-1誘導体が、WO91/11457、WO96/29342、WO98/08871、WO99/43341、WO99/43708、WO99/43707、WO99/43706、WO99/43705、WO00/07617、WO08/005527、WO00/34331、WO02/046227、WO02/098348、WO03/087139、WO03/018516、WO05/000892、WO05/027978、及びWO06/087354等にそれぞれ記載されている。これらの文献から、以下のようなアミノ酸配列を有するGLP-1誘導体であれば、天然GLP-1と実質的に同様の活性を有するGLP-1誘導体であると言える。尚、天然GLP-1は、GLP-1(7-36)だけでなく、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-35)も同等の活性を有する天然GLP-1として知られており、これらのC末端は、アミド体であってもカルボン酸体であっても、同様の活性を有する。
【００２３】
GLP-1誘導体のアミノ酸配列は、以下のような多様性を示すものとして、知られている。
X7-X8-X9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-X18-X19-X20-Glu-X22-X23-Ala-X25-X26-X27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-X40-X41-X42-X43-X44-X45
[式中、X7はHis、X8は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Lys、又はAibであり、X9は、Glu、Gly、Asp、又はLysであり、X16は、Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Tyr、Glu、Asp、Trp、又はLysであり、X18は、Ser、Ala、Arg、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、又はLysであり、X19は、Tyr、Phe、Trp、Glu、Gln、Asp、又はLysであり、X20は、Leu、Met、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、Tyr、又はLysであり、X22は、Gly、Ala、Glu、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Asp、Lys、Arg、Cys、又はAibであり、X23は、Gln、Arg、Glu、Asp、Asn、又はLysであり、X25は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、又はLysであり、X26は、Lys、Gln、Glu、Asp、His又はArgであり、X27は、Glu、Ala、Asp、Lys、又はLeuであり、X30は、Ala、Glu、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Asp、Lys、Gln、Tyr、His、又はArgであり、X33は、Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp又はLysであり、X34は、Lys、Arg、Glu、Asp、His、Ala、Gly、又はAsnであり、X35は、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Lys、His、Pro、又はAibであり、X36は、Arg、Gly、Lys、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X37は、Gly、Pro、Glu、Lys、Ala、Thr、Ser、Asp、Leu、Ile、Val、His又は欠失であり、X38は、Ser、Lys、Arg、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X39は、Ser、Arg、Lys、Glu、Asp、His、又は欠失であり、X40は、Gly、Glu、Lys、Asp、又は欠失であり、X41は、Ala、Lys、Phe、Trp、Tyr、Glu、Asp又は欠失であり、X42は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X43は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X44は、Pro、Lys、Glu、Asp、又は欠失であり、X45は、Ser、Lys、Val、Glu、Asp、又は欠失である。]
これらの中でも、X7〜X37の配列を有するGLP-1又はその誘導体（X7〜X37は上述の通り）が、本発明のGAモジュールの部分ペプチドが適用される好適なGLP-1又はその誘導体である。
【００２４】
尚、GLP-1又はその誘導体としては、具体的には、次のものがよく知られている。
GLP-1(7-37)，[Ser8]-GLP-1(7-37)，[Gly8]-GLP-1(7-37)，[Val8]-GLP-1(7-37)，[Glu22]-GLP-1(7-37)，[Lys22]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22]-GLP-1(7-37)，[Val8，Lys22]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu22]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Lys22]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu30]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu30]-GLP-1(7-37)，[Val8，His37]-GLP-1(7-37)，[Gly8，His37]-GLP-1(7-37)，[Arg34]-GLP-1(7-37)，[Lys18]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu22，Gly36]-GLP-1(7-37)，[Aib8，Aib22]-GLP-1(7-37)，[Aib8，Aib35]-GLP-1(7-37)，[Aib8，Aib22，Aib35]-GLP-1(7-37)，[Glu22，Glu23]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu22，Glu23]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Glu23]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Val25]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Ile33]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Val25，Ile33]-GLP-1(7-37)、及びこれらの37位が欠失したGLP-1(7-36)型、並びにこれらの36位と37位とが欠失したGLP-1(7-35)型。
【００２５】
天然VIPは、以下のような配列を有する28アミノ酸残基のペプチドとして知られている。
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2
また、VIPの誘導体として、His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-NH2  からなるPACAP-27、His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys-NH2  からなるPACAP-38、Na-acetyl-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys*-Tyr-Leu-Asn-Asp*-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2（17位Metはノルロイシンに置換、*:21位Lysと25位Asp間でラクタム環形成）からなるRO25-1553等が知られている。
【００２６】
天然ソマチスタチンは、以下のような配列を有する14アミノ酸残基のペプチドとして知られている。
Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NH2
ここで、3位と14位のシステイン残基間でジスルフィド結合している。尚、8位TrpをD-Trpに置換することが可能である。また、構造機能解析によって、ソマトスタチンの7位から10位までのPhe-Trp-Lys-Thrのβターン断片が活性に必要な配列であることが明らかとなっている[Nature，1979，280(5722)，512-514、Nature，1981，292(5818)，55-58]ことから、1位から6位および11位から14位のアミノ酸は削除することも可能と考えられる。そのようなソマトスタチン誘導体は、アミノ酸配列Phe-Trp-Lys-Thrを含む天然ソマトスタチンの部分ペプチド（N末及び／又はC末からの連続的な欠失が可能）ということができる。なお、他にソマトスタチン誘導体としては、D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol（システイン残基間でジスルフィド結合を形成）からなるオクトレオチドや、D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr、D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr（システイン残基間でジスルフィド結合を形成）、およびD-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thp（システイン残基間でジスルフィド結合を形成）等の報告がある。
【００２７】
天然アミリンは、以下のような配列を有する37アミノ酸残基のペプチドとして知られている。
Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2
ここで、2位と7位のシステイン残基間でジスルフィド結合している。尚、25位AlaをProに置換、28位SerをProに置換、29位SerをProに置換することが可能であり、これらは、それぞれ単独での置換だけでなく、任意の複数箇所の置換も可能である。また、N末にGLP-1を結合したペプチドアナログも知られている。
【００２８】
天然グレリンは、以下のような配列を有する28アミノ酸残基のペプチドとして知られている。
Gly-Ser-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg-NH2
この中で、グレリンの1位から5位までのアミノ酸配列Gly-Ser-Ser-Phe-Leuで十分な活性が担保されていることが知られ(Biochem Biophys Res Commun，2001，284(3)，655-659)、6位から28位のアミノ酸は削除することも可能と考えられる。そのようなグレリン誘導体は、アミノ酸配列Gly-Ser-Ser-Phe-Leuを含む天然グレリンの部分ペプチド（C末からの連続的な欠失が可能）ということができる。尚、グレリンは、3位のSerがOctanoyl化されているが、このOctanoyl基を構造変換させても活性を維持する可能性がある(J Med Chem，2000，43(23)，4370-4376)。
【００２９】
本発明において、「生理活性複合体」とは、生理活性物質と本発明のGAモジュールの部分ペプチドとが結合した物質をいう。通常、生理活性物質1分子に対し、本発明のGAモジュールの部分ペプチド1分子が結合される。生理活性複合体のC末端はアミド体又はカルボン酸体のいずれでも良い。これは、生理活性物質の生体内安定性の補強には、C末端の形体に関わらず、本発明のGAモジュールの部分ペプチドとの結合が重要であるからである。
【００３０】
前記生理活性物質と本発明のGAモジュールの部分ペプチドとの結合の手段として、生理活性物質と本発明のGAモジュールの部分ペプチドとの間に短いアミノ酸リンカー配列を挿入しても良い。「リンカー」とは、主にスペーサーとして働くことができるもの全てを意味する。リンカーは、好ましくは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸から構成される。なかでも、1〜3個のアミノ酸からなるものが好ましく、とりわけ、Gly-Pro(GP)又はGly-Pro-Ser(GPS)が最適である。
【００３１】
本明細書において、「生体内安定性」とは、循環血中、採取された血漿や血清、各種生体組織、採取された各種組織ホモジネートにおける物質の安定性をいう。例えば、血中安定性の指標の一つとして、物質の血中濃度が最高値になってから半減するまでの時間である血中消失半減期（血中半減期、血中濃度半減期と称されることもある）が用いられる。
【００３２】
本発明のGAモジュールの部分ペプチド又は生理活性複合体の合成方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、固相合成法、液相合成法などの化学合成法や、酵素合成法、組換えDNA技術などの方法を用いれば良い。DNA配列又は組換えベクターを導入する宿主細胞は、本発明のペプチドを生産できる如何なる細胞であってもよく、バクテリア、酵母、及びより高度な真核細胞が含まれる。例えば、BHK又はCHO株化細胞などが挙げられる。後述する実施例は、いずれも汎用性が広い固相合成法を用いているが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００３３】
本発明のGAモジュールの部分ペプチドがGLP-1に応用されたGLP-1ペプチド複合体は、GLP-1受容体刺激が有効である各種疾患に応用可能である。即ち、本発明のGLP-1ペプチド複合体は、例えば2型糖尿病の処置、1型糖尿病の処置、肥満の処置、または/及び、食欲抑制等のために使用することができる。GLP-1ペプチド複合体の投与量は、各種疾患の個々の患者に応じて当業者によって適宜決定される。一般的に、その投与量は約1μｇ/日〜約10ｍｇ/日と考えられる。Exendin-4に適用する場合も、この投与量でよい。本発明のGLP-1ペプチド複合体は、生体内での安定性が高く持続性があるため、個々のGLP-1ペプチド複合体の生体内安定性に基づいて、投与スケジュールを決めることができる。
【００３４】
また、本発明のGAモジュールの部分ペプチドが、VIP、ソマトスタチン、アミリン、又はグレリン等に応用された生理活性複合体については、それぞれの生理活性物質が適用できる各種疾患に応用可能である。それら生理活性複合体の投与量は、VIPが約50μｇ/日〜約1ｍｇ/日、ソマトスタチンが約50μｇ/日〜約1ｍｇ/日、アミリンが約5μｇ/日〜約500μｇ/日、及び、グレリンが約100μｇ/日〜約1ｍｇ/日である。これら以外の生理活性物質について本発明のGAモジュールの部分ペプチドを適用する場合についても、その生理活性物質の知られている投与量から、複合体の投与量を容易に設定することができる。すなわち、モル換算で同等となるような投与量の設定をして、そこから、最適値に調整していけばよい。
【００３５】
本発明の生理活性複合体は、様々な投与経路で投与することができる。一般的には、治療が必要な患者に対して、皮下、静脈、肺等から投与される。その他に、応用範囲、生理活性複合体の性質、投与技術の組み合わせによっては、経口、鼻粘膜、表皮、眼球等からの投与経路が適宜選択される。また、それぞれの生理活性物質の既に知られている投与経路での投与を選択してもよい。
【実施例】
【００３６】
本発明は、以下の実験例によって、さらに詳しく説明されるが、これらは本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。
Ｉ  GLP-1ペプチド複合体の合成
生体内安定性が低い生理活性物質としてGLP-1を選択し、検証を行った。GLP-1又はGLP-1誘導体のC末端に本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加し、GLP-1ペプチド複合体とした。GLP-1ペプチド複合体の合成は固相合成によって行い、HPLCにより精製後、マススペクトルにより合成品を確認した。-NH2は、C末端がアミド化されていることを示す。
GLP-1としては、主としてGLP-1(7-35)を使用し、8位は天然のアラニンか、セリンまたはグリシンに置換したものを用いた。［Ser8］は、配列番号24で示される天然GLP-1の左から2番目、即ち8位のアラニンがセリンに変換されていることを示し、8Sと同義である。尚、この分野においては、GLP-1前駆体のN末を1位とする関係で、天然GLP-1においては、左端のN末を7位とするのが一般的である。【００３７】
付加したペプチドとしては、配列番号1に示された46残基のGAモジュール又はその部分ペプチドを用いた。配列番号1で示されたペプチドは、GAモジュールの1番目のアミノ酸から始まり46番目のアミノ酸で終わる配列のペプチドであるからGAm(1-46)と略記し、GAモジュールの部分ペプチドは、配列番号1に示されたGAモジュールのうち、Ｘ位のアミノ酸から始まりＹ位のアミノ酸で終わる配列のペプチドをGAm(Ｘ-Ｙ)と略記した。
尚、配列番号1〜23は、GAモジュールの全配列又は部分配列からなるペプチドを示し、配列番号24〜58は、生理活性物質であるGLP-1又はその誘導体を示す。【００３８】
実施例1．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(38-42)-NH2  配列番号28（GAm：配列番号2）
実施例2．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(38-44)-NH2  配列番号29（GAm：配列番号3）
実施例3．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(37-44)-NH2  配列番号30（GAm：配列番号4）
実施例4．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(35-44)-NH2  配列番号31（GAm：配列番号5）
実施例5．GLP-1(7-35)-GAm(38-42)-NH2  配列番号32（GAm：配列番号2）
実施例6．GLP-1(7-35)-GAm(35-44)-NH2  配列番号33（GAm：配列番号5）
実施例7．GLP-1(7-35)-GAm(33-43)-NH2  配列番号34（GAm：配列番号7）
実施例8．GLP-1(7-35)-GAm(33-44)-NH2  配列番号35（GAm：配列番号8）
実施例9．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(33-44)-NH2  配列番号36（GAm：配列番号8）
実施例10．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(32-44)-NH2  配列番号37（GAm：配列番号9）
実施例11．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(31-44)-NH2  配列番号38（GAm：配列番号10）
実施例12．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(30-42)-NH2  配列番号39（GAm：配列番号11）
実施例13．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(28-42)-NH2  配列番号40（GAm：配列番号12）
実施例14．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(28-44)-NH2  配列番号41（GAm：配列番号13）
実施例15．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(27-46)-NH2  配列番号42（GAm：配列番号14）
実施例16．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(25-46)-NH2  配列番号43（GAm：配列番号15）
実施例17．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(22-46)-NH2  配列番号44（GAm：配列番号16）
実施例18．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(28-44)  配列番号41（GAm：配列番号13）
実施例19．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(33-44)  配列番号36（GAm：配列番号8）
実施例20．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(37-44)  配列番号30（GAm：配列番号4）
実施例21．GLP-1(7-35)-Gly-Pro-GAm(35-44)-NH2  配列番号45（GAm：配列番号5）
実施例22．GLP-1(7-35)-Gly-Pro-GAm(34-44)-NH2  配列番号46（GAm：配列番号6）
実施例23．GLP-1(7-35)-Gly-Pro-Ser-GAm(34-44)-NH2  配列番号47（GAm：配列番号6）
実施例24．GLP-1(7-35)-Gly-Pro-Ser-GAm(33-44)-NH2  配列番号48（GAm：配列番号8）【００３９】
比較例1．GLP-1(7-36)-NH2  配列番号24
比較例2．[Ser8]-GLP-1(7-36)-NH2  配列番号26
比較例3．Exendin-4(1-39)-NH2  配列番号27
比較例4．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(1-46)-NH2  配列番号49（GAm：配列番号1）
比較例5．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(17-46)-NH2  配列番号50（GAm：配列番号17）
比較例6．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(21-46)-NH2  配列番号51（GAm：配列番号18）
比較例7．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(28-40)-NH2  配列番号52（GAm：配列番号19）
比較例8．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(28-37)-NH2  配列番号53（GAm：配列番号20）
比較例9．[Ser8]-GLP-1(7-35)-GAm(39-44)-NH2  配列番号54（GAm：配列番号21）
比較例10．GLP-1(7-35)-GAm(38-41)-NH2  配列番号55（GAm：配列番号22）
比較例11．GLP-1(7-35)-GAm(38-40)-NH2  配列番号56（GAm：配列番号23）
比較例12．[Gly8]-GLP-1(7-35)-RPSS-NH2  配列番号57
比較例13．[Ser8,Glu22,Glu23]-GLP-1(7-35)-GPSSGAPPPS-NH2  配列番号58【００４０】
＜試験例1＞  GLP-1ペプチド複合体の血漿安定性の評価
GLP-1ペプチド複合体の生体内安定性を検証するため、in vitroで、血漿中での安定性を評価した。
１．方法
SDラットをジエチルエーテルで麻酔し、全採血を行い、血漿画分を分離した。最終濃度が0.5μmol/Lになるように各GLP-1ペプチド複合体を血漿中に添加し、37度で静置した。0、8、48時間後にサンプルを回収し、GLP-1ペプチド複合体の量をHPLC/MSで測定することで残存率を評価した。GLP-1ペプチド複合体の残存率は、0時間で回収したサンプルのHPLC/MS測定結果を100%として、8時間後、48時間後の血漿中に残存する比率を算出することで評価した。【００４１】
２．結果及び考察
各GLP-1ペプチド複合体について、血漿安定性を解析した結果を残存率として表１及び表２に示す。
（１）GAモジュールの部分ペプチドの効果
ペプチドを付加していない天然GLP-1（比較例1）及び8S-GLP-1（比較例2）は、48時間後には血漿中で完全に分解されていた。また、GAモジュール配列ではないペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体（比較例12及び13）でも、48時間後の血漿中残存率は0％もしくは12％であり、天然GLP-1(比較例1）や8S-GLP-1（比較例2）と同程度の極めて低い血漿安定性であった。【００４２】
一方、GAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体（実施例1〜実施例20）は、48時間後のラット血漿中でも殆ど分解されない状態で残存しており、天然GLP-1（比較例1）や8S-GLP-1（比較例2）よりも著しく高い血漿安定性を獲得していた。また、実施例5〜8が示すように、天然GLP-1に当該ペプチドを付加した場合であっても、8S-GLP-1に付加した場合と同等の血漿安定性を獲得していることが明らかとなった。天然GLP-1は極めて血漿安定性が低いにもかかわらず、こうような結果を示したことは、驚くべきことである。尚、実施例18〜20はC末端のカルボン酸体であるが、アミド体と同等であった。【００４３】
GAモジュールの鎖長については、長鎖のGAm(1-46)及びGAm(17-46)をそれぞれ付加したGLP-1ペプチド複合体（比較例4及び5）は、48時間後の血漿中残存率105％と極めて高い血漿安定性を示した。また、GAm(38-42)を付加したGLP-1ペプチド複合体（実施例1及び5）もまた、驚くべきことに、48時間後の血漿中残存率がそれぞれ71％及び83％と著しく高い血漿安定性を示し、5残基のGAモジュールの部分ペプチドであっても、30残基のGAモジュールの部分ペプチド又はGAモジュールの全長ペプチドとほぼ同等の血漿安定性を付与できることが明らかとなった。【００４４】
これに対して、GAm(39-44)、GAm(38-41)、及びGAm(38-40)をそれぞれ付加したGLP-1ペプチド複合体（比較例9,10,11）は、いずれも48時間後の血漿中残存率は0％で、完全に分解されていた。また、GAm(28-40)及びGAm(28-37)をそれぞれ付加したGLP-1ペプチド複合体（比較例7,8）も、48時間後の血漿中残存率はそれぞれ4％及び0％で、ほぼ完全に分解されていた。このことから、GAモジュールの部分ペプチドにおいて、血漿安定性を得るためには、38位のIle及び42位のLeuが必須であることがわかる。即ち、血漿安定性を得るために必要な最小のアミノ酸配列は、GAm(38-42)で示されるIle-Asp-Glu-Ile-Leu (IDEIL)の5残基であることが示された。【００４５】
（２）リンカーを介した本発明のGAモジュールの部分ペプチドの付加
実施例21〜実施例24は、リンカーを介してGAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体であるが、これらのGLP-1ペプチド複合体においても、48時間後において、十分な血漿中残存率を示した。このことから、リンカーを介してGAモジュールの部分ペプチドを付加した場合でも、血漿安定性が確保されることが確認された。【００４６】
【表１】
2011136361.tif 000002
【００４７】
【表２】
2011136361.tif 000003
【００４８】
＜試験例2＞  GLP-1ペプチド複合体の活性強度比較
試験例1において、高い血漿安定性が示されたGLP-1ペプチド複合体の活性強度を評価するために、in vitroのインスリン分泌能を解析した。
１．方法
内在性のGLP-1レセプターを発現する、マウス由来のインスリノーマ細胞であるMIN6（宮崎純一氏より分与）を用いて、インスリン分泌能を評価した。MIN6をマルチプレートに播種し、48時間37℃で培養した。その後、2mMグルコース溶液を含むKRH緩衝液（NaCl 119mM，KCl 4.74mM，CaCl2  2.54mM，MgCl2  1.19mM，KH2PO4  1.19mM，10mMHEPES緩衝液pH7.3，0.1% BSAを含む)を用いて2回洗浄後、1時間37℃で静置した。上記の溶液を吸引除去後、GLP-1ペプチド複合体を含む15mMグルコース含有KRH緩衝液を添加し1時間37℃で静置し、その上澄みを回収しインスリン分泌量を測定した。インスリンの測定は酵素結合免疫固着アッセイ(ELISA)で行い、基質添加後450nm（副波長620nm）の吸光度を測定した。尚、試験は以下の４つのパートから構成される。【００４９】
[Part1]
天然GLP-1（比較例1）と8S-GLP-1-GAm(1-46)（比較例4）について、30，100，300，1000pMの濃度で活性評価を行い、EC50値を算出した。
[Part2]
天然GLP-1（比較例1）、8S-GLP-1-GAm(17-46)（比較例5）、及び8S-GLP-1-GAm(28-44)（実施例14）について、Part1と同様にEC50値を算出した。
[Part3]
MIN6細胞における天然GLP-1の最大活性を示すのに必要と考えられる1000pMの濃度で、各GLP-1ペプチド複合体の活性評価を行い、天然GLP-1の活性強度と比較した。【００５０】
[Part4]
中鎖型GAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体として、8S-GLP-1-GAm(32-44)（実施例10：GAm 13残基）、GLP-1-GAm(33-44）（実施例8：GAm 12残基）、GLP-1-GAm(35-44)（実施例6：GAm 10残基）、及びGLP-1-GPS-GAm(34-44)（実施例22：GAm 11残基）を選択し、短鎖型GAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体として、8S-GLP-1-GAm(38-44)（実施例2：GAm 7残基）及び8S-GLP-1-GAm(38-42)（実施例1：GAm 5残基）を選択し、Part2と同様にEC50値を算出し、GAモジュールの部分ペプチド付加による生理活性への影響を詳細に検証した。【００５１】
２．結果及び考察
[Part1]
全長GAモジュールであるGAm(1-46)を付加したGLP-1ペプチド複合体8S-GLP-1-GAm(1-46)（比較例4）及び天然GLP-1（比較例1）のインスリン分泌能を図2に示す。このように、8S-GLP-1-GAm(1-46)（比較例4）は、天然GLP-1（比較例1）に比べて、著しく活性が損なわれることが明らかとなった。【００５２】
[Part2]
次に、GAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体及び天然GLP-1（比較例1）のインスリン分泌能を図3に示す。30残基のGAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体である8S-GLP-1-GAm(17-46)（比較例5）では、活性は殆ど検出されず、最高濃度の1000pMで処理した場合でも天然GLP-1（比較例1）の最大活性に対して40%未満の活性を示すのが限界であった。一方、17残基のGAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体である8S-GLP-1-GAm(28-44)（実施例14）は、天然GLP-１とほぼ同等の活性を維持していた。
これまでの試験から、30残基以上の長鎖のGAモジュールの部分ペプチドを付加した場合、GLP-1ペプチド複合体の血漿安定性は向上するものの、その生理活性は著しく損なわれることが明らかとなった。
図2および図3で示した結果をもとに、天然GLP-1の最大活性に対して50％の活性を示すのに必要な各GLP-1ペプチド複合体の濃度(EC50)を解析し、表３に示す。解析方法は以下の計算式を用いて計算した。Contorlは、1000pM濃度における天然GLP-１のインスリン分泌能を最大活性として設定した。
Control=(1000pM濃度における天然GLP-１のインスリン分泌量)-(15mM Glucoseにおけるインスリン分泌量)
活性強度(%)=[{(各GLP-1ペプチド複合体のインスリン分泌量)-(15mM Glucoseにおけるインスリン分泌量)}/Control]x100
EC50値：50% of controlを示すのに必要なGLP-1ペプチド複合体の濃度
このように、全長GAモジュール又はその部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体の内、8S-GLP-1-GAm(1-46)（比較例4）及び8S-GLP-1-GAm(17-46)（比較例5）は、8S-GLP-1-GAm(28-44)（実施例14）と比較して著しく活性が減少していることが、EC50値からも明らかである。【００５３】
【表３】
2011136361.tif 000004
【００５４】
[Part3]
各GLP-1ペプチド複合体について、1000pMの濃度で天然GLP-1（実施例1）との活性強度比較を行った結果を表４及び表５に示す。25残基のGAモジュールの部分ペプチドを付加した8S-GLP-1-GAm(22-46)（実施例17）が天然GLP-1（比較例1）と同等の活性を保持していたのに対し、26残基のGAモジュールの部分ペプチドを付加した8S-GLP-1-GAm(21-46)（比較例6）の活性強度は45％と、著しく活性が低下していた。25残基以下のGAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体（実施例1〜実施例24）は、天然GLP-1（比較例1）と同等の活性を保持していることが示された。【００５５】
【表４】
2011136361.tif 000005
【００５６】
【表５】
2011136361.tif 000006
【００５７】
[Part4]
表６に示すように、中鎖型、短鎖型、いずれの本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体においても、天然GLP−1と比較して遜色ない十分な活性を保持していることが、EC50値からも示された。以上の結果は、本発明のGAモジュールの部分ペプチドを生理活性物質に付加した場合、その生理活性を保持したまま、高い生体内安定性を得ることができることを示している。【００５８】
【表６】
2011136361.tif 000007
【００５９】
＜試験例3＞  2型糖尿病モデルマウスにおけるGLP-1ペプチド複合体の血糖低下持続作用
１．方法
生体内安定性の向上を、in vivoにおける血糖低下持続作用を指標にして評価した。すなわち、2型糖尿病モデルマウスであるdb/dbマウス（日本チャールスリバー）を個別飼育し、これに、各GLP-1ペプチド複合体を皮下投与し、その後の血糖値の持続的変化を検証した。尚、GLP-1ペプチド複合体は100μMに調製し、試験時まで-80℃で保存した。試験時に生理食塩水にて所定の濃度に希釈して使用した。薬物溶液は10ml/kgの容量で、いずれのGLP-1ペプチド複合体も50nmol/kgで皮下投与した。血糖値測定のための尾採血は、ヘパリン処理ガラス管を用いてGLP-1ペプチド複合体の投与直前および投与後の所定の時間（30分、1時間、2時間、4時間、6時間）に行った。血糖値の測定はグルコーステストワコー（和光純薬工業）を用いて行った。尚、本発明のGLP-1ペプチド複合体としては、実施例1、6、8、9、10、14、及び21のGLP-1ペプチド複合体を使用し、比較対照としては、比較例1の天然GLP-1及び比較例2の8S-GLP-1を使用した。【００６０】
２．試験結果
各GLP-1ペプチド複合体を皮下投与した後の随時血糖低下作用を図4および図5に示す。天然GLP-1（比較例1）および8S-GLP-1（比較例2）の血糖低下作用は、それぞれ投与後1時間および2時間で消失した。一方で、本発明のGAモジュールの部分ペプチドをそれぞれ付加したGLP-1ペプチド複合体の血糖低下作用は、投与後1時間で最大効果に達し、その後6時間以上持続することを確認した。以上の結果は、本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加したGLP-1ペプチド複合体は血糖低下作用の持続性が顕著に向上していることを示している。
これらの結果から、GLP-1への本発明のGAモジュールの部分ペプチドの付加は、十分な血糖低下強度を保持し、かつ、顕著に持続的な血糖低下作用を示すことが明らかとなった。また、このようなGLP-1やその他生理活性物質への本発明のGAモジュールの部分ペプチドの付加は、生体における急速な消失というこれら生理活性物質の医療応用上の課題を解決するのに有用と考えられた。【００６１】
ＩＩ  VIPペプチド複合体の合成
GLP-1以外の生体内安定性が低い生理活性物質としてVIPを選択し、検証を行った。VIPのC末端に本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加し、VIPペプチド複合体とした。VIPペプチド複合体の合成は、固相合成によって行い、HPLCにより精製後、マススペクトルにより合成品を確認した。-NH2は、C末端がアミド化されていることを示す。
実施例25．VIP(1-28)-GAm(37-44)-NH2  配列番号60（GAm：配列番号4）
実施例26．VIP(1-28)-GAm(32-44)-NH2  配列番号61（GAm：配列番号9）
実施例27．VIP(1-28)-GAm(28-44)-NH2  配列番号62（GAm：配列番号13）
比較例14．VIP(1-28)-NH2  配列番号59【００６２】
＜試験例4＞  VIPペプチド複合体の血漿安定性の評価
VIPペプチド複合体の生体内安定性を検証するため、in vitroの血漿安定性を評価した。
１．方法
SDラットをジエチルエーテルで麻酔し、全採血を行い、血漿画分を分離した。最終濃度が0.5μmol/LになるようにVIP又はVIP-ペプチド複合体を血漿中に添加し、37度で静置した。0、8、48時間後にサンプルを回収し、VIP又はVIPペプチド複合体の量をHPLC/MSで測定することで残存率を評価した。VIP又はVIPペプチド複合体の残存率は、0時間で回収したサンプルのHPLC/MS測定結果を100%として、8時間後、48時間後の血漿中に残存する比率を算出することで評価した。【００６３】
２．実験結果
VIP又はVIPペプチド複合体について、血漿安定性を解析した結果を、残存率として表７に示す。GAモジュールの部分ペプチドを付加していない天然VIP（比較例14）は、8時間後には血漿中で完全に分解されていたのに対して、GAモジュールの部分ペプチドを付加したVIPペプチド複合体（実施例25，26，27）は、8時間後のラット血漿中では全く分解されない状態で残存しており、48時間後においてもそれぞれ、118%，47%，35%まで残存していた。このことから、GLP-1と同様に本発明のGAモジュールの部分ペプチド付加により、VIPペプチド複合体は著しく高い血漿安定性を獲得できることが明らかとなった。【００６４】
【表７】
2011136361.tif 000008
【００６５】
＜試験例5＞  VIPペプチド複合体の活性強度比較
試験例4において、血漿安定性が示されたVIPペプチド複合体の活性強度を評価するために、in vitroのcAMP産生能を解析した。
１．方法
内在性のVIPレセプターを発現する、ヒトT細胞由来のSUP-T1細胞（ATCCより購入）を用いて、細胞内cAMP産生能を評価した。48時間以上浮遊培養したSUP-T1をチューブに移し、培地(RPMI-1640)で細胞を2回洗浄した。その後、cAMPの分解酵素阻害剤であるIBMX（3-Isobutyl-1-methylxanthine）を添加した培地を加え、15分37℃で静置した。遠心分離後に上清を除き、VIPペプチド複合体を含むIBMX含有培地を添加して30分37℃で反応した。反応後のチューブを遠心分離し、上清を除いて細胞溶解液を添加した。30分37℃で静置して細胞を溶解し、cAMPを測定してその産生能を評価した。cAMPの測定は酵素結合免疫固着アッセイ(ELISA)を用いて化学発光により検出した。
天然VIP(比較例14)とVIPペプチド複合体（実施例25，26，27）について、3，10，30，100，300，1000，3000nMの濃度で活性評価を行い、cAMP産生量の最大値を算出した。VIPペプチド複合体の活性強度(%)は以下の式により算出した。
活性強度(%)=[{(各VIPペプチド複合体のｃAMP産生量の最大値)/(天然VIPのｃAMP産生量の最大値)]x100【００６６】
２．実験結果
VIP又はVIPペプチド複合体について、cAMP産生能を解析した結果を、活性強度として表８に示す。GAモジュールの部分ペプチドを付加していない天然VIP（比較例14）に対し、VIPペプチド複合体（実施例25，26，27）の活性強度はそれぞれ、81%，85%，67%であり、GAモジュールの部分ペプチド付加でもVIP活性を保持することを確認した。これらの結果から、本発明のGAモジュールの部分ペプチド付加は、著しく高い血漿安定性の獲得と生理活性の保持により、生体内安定性が問題となる生理活性物質を実用化するための極めて有用な手段として利用できることが判明した。【００６７】
【表８】
2011136361.tif 000009
【００６８】
ＩＩＩ  ソマトスタチン(SRIF)ペプチド複合体の合成
GLP-1以外の生体内安定性が低い生理活性物質としてソマトスタチン(SRIF)を選択し、検証を行った。SRIFのC末端およびN末端に本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加し、SRIFペプチド複合体とした。SRIFペプチド複合体の合成は、固相合成によって行い、HPLCにより精製後、マススペクトルにより合成品を確認した。-NH2は、C末端がアミド化されていることを示す。
実施例28．SRIF(1-14)-GAm(28-44)-NH2  配列番号64（GAm：配列番号13）
実施例29．GAm(28-44)-SRIF(1-14)-NH2  配列番号65（GAm：配列番号13）
比較例15．SRIF(1-14)-NH2  配列番号63【００６９】
＜試験例6＞  ソマトスタチンペプチド複合体の血漿安定性の評価
ソマトスタチンペプチド複合体の生体内安定性を検証するため、in vitroの血漿安定性を評価した。
１．方法
SDラットをジエチルエーテルで麻酔し、全採血を行い、血漿画分を分離した。最終濃度が0.5μmol/Lになるようにソマトスタチン又はソマトスタチンペプチド複合体を血漿中に添加し、37度で静置した。0、8、48時間後にサンプルを回収し、ソマトスタチン又はソマトスタチンペプチド複合体の量をHPLC/MSで測定することで残存率を評価した。ソマトスタチン又はソマトスタチンペプチド複合体の残存率は、0時間で回収したサンプルのHPLC/MS測定結果を100%として、8時間後、48時間後の血漿中に残存する比率を算出することで評価した。【００７０】
２．実験結果
各ソマトスタチン又はソマトスタチンペプチド複合体について、血漿安定性を解析した結果を、残存率として表９に示す。GAモジュールの部分ペプチドを付加していない天然ソマトスタチン（比較例15）は、8時間後には血漿中で完全に分解されていたのに対して、C末およびN末にGAモジュールの部分ペプチドを付加したソマトスタチンペプチド複合体（実施例28及び29）は、8時間後のラット血漿中でも56%および80%残存しており、48時間後においてもN末付加体では、23%まで残存していた。このことから、GLP-1と同様に本発明のGAモジュールの部分ペプチド付加により、ソマトスタチンペプチド複合体は著しく高い血漿安定性を獲得できることが明らかとなった。以上より、本発明のGAモジュールの部分ペプチドは、ソマトスタチンのような14残基の短いペプチドにも応用され、C末修飾だけでなく、Ｎ末修飾においても応用可能であることが判明した。また、ソマトスタチンはシステイン残基間において分子内架橋が存在することが報告されている。本試験の結果は、環状構造を有するペプチドにおいても、本発明のGAモジュールの部分ペプチドによる生体内安定性の改善が可能であることをも示している。【００７１】
【表９】
2011136361.tif 000010
【００７２】
＜試験例7＞  ソマトスタチンペプチド複合体の活性強度比較
試験例6において、血漿安定性が示されたソマトスタチンペプチド複合体の活性強度を評価するために、in vitroのインスリン分泌抑制能を解析した。
１．方法
内在性のSSTR5を発現する、マウス由来のインスリノーマ細胞であるMIN6（宮崎純一氏より分与）を用いて、インスリン分泌抑制を評価した。MIN6をマルチプレートに播種し、48時間37℃で培養した。その後、2mMグルコース溶液を含むKRH緩衝液（NaCl 119mM，KCl 4.74mM，CaCl2  2.54mM，MgCl2  1.19mM，KH2PO4  1.19mM，10mMHEPES緩衝液pH7.3，0.1% BSAを含む)を用いて2回洗浄後、1時間37℃で静置した。上記の溶液を吸引除去後、ソマトスタチンペプチド複合体を含む20mMグルコース含有KRH緩衝液を添加し1時間37℃で静置し、その上澄みを回収しインスリン分泌量を測定した。インスリンの測定は酵素結合免疫固着アッセイ(ELISA)で行い、基質添加後450nm（副波長620nm）の吸光度を測定した。
尚、本試験では、天然SRIF(比較例15)とGAm(28-44)-SRIF-NH2（実施例29）について、1，3，10，30，100，300，1000nMの濃度で活性評価を行い、インスリン分泌の最大抑制率(%)を算出した。ソマトスタチンペプチド複合体のインスリン分泌の最大抑制率(%)は以下の式により算出した。
インスリン分泌の最大抑制率(%)=[{(SRIFペプチド複合体のインスリン分泌抑制の最大値)/(天然SRIFのインスリン分泌抑制の最大値)]x100【００７３】
２．実験結果
ソマトスタチンペプチド複合体について、インスリン分泌抑制率を解析した結果を、活性強度として表１０に示す。GAモジュールの部分ペプチドを付加していない天然ソマトスタチン（比較例15）に対し、ソマトスタチンペプチド複合体（実施例29）のインスリン分泌抑制率は90%であり、GAモジュールの部分ペプチド付加でもソマトスタチン活性を保持することを確認した。これらの結果から、本発明のGAモジュールの部分ペプチドは、生理活性物質への付加により、生理活性物質の著しく高い血漿安定性の獲得と生理活性の保持を可能にし、生体内安定性が問題となる生理活性物質を実用化するための極めて有用な手段として利用できることが判明した。【００７４】
【表１０】
2011136361.tif 000011
【００７５】
ＩＶ  アミリン複合体の合成
GLP-1以外の生体内安定性が低い生理活性物質としてアミリンを選択し、検証を行った。アミリンのN末端に本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加し、アミリンペプチド複合体とした。アミリンペプチド複合体の合成は、固相合成によって行い、HPLCにより精製後、マススペクトルにより合成品を確認した。-NH2は、C末端がアミド化されていることを示す。
実施例30．GAm(28-44)-Amylin(1-37)-NH2  配列番号67（GAm：配列番号13）
比較例16．Amylin(1-37)-NH2  配列番号66【００７６】
＜試験例8＞  アミリン複合体の血漿安定性の評価
アミリンペプチド複合体の生体内安定性を検証するため、in vitroの血漿安定性を評価した。アミリン又はアミリンペプチド複合体を血漿中で一定時間処理した後に、未分解のアミリンペプチド（複合体）の変化量をHPLC/MSで測定し、評価した。
１．方法
SDラットをジエチルエーテルで麻酔し、全採血を行い、血漿画分を分離した。最終濃度が0.5μmol/Lになるようにアミリン又はアミリンペプチド複合体を血漿中に添加し、37度で静置した。0、0.5、2、8時間後にサンプルを回収し、アミリン又はアミリンペプチド複合体の量をHPLC/MSで測定することで残存率を評価した。アミリン又はアミリンペプチド複合体の残存率は、0時間で回収したサンプルのHPLC/MS測定結果を100%として、0.5、2、8時間後の血漿中に残存する比率を算出することで評価した。【００７７】
２．実験結果
アミリン又はアミリンペプチド複合体について、血漿安定性を解析した結果を、残存率として表１１に示す。GAモジュールの部分ペプチドを付加していない天然アミリン（比較例16）は、2時間後には血漿中で15%に分解されていたのに対して、N末にGAモジュールの部分ペプチドを付加したアミリンペプチド複合体（実施例30）は、2時間後において、67%まで残存していた。このことから、GLP-1と同様に本発明のGAモジュールの部分ペプチド付加により、アミリンペプチド複合体は著しく高い血漿安定性を獲得できることが明らかとなった。以上より、本発明のGAモジュールの部分ペプチドは、生体内安定性が問題となる生理活性物質を実用化するための極めて有用な手段として利用できる。【００７８】
【表１１】
2011136361.tif 000012
【００７９】
Ｖ  グレリン[(n-Octanoyl)Ghrelin]ペプチド複合体の合成
GLP-1以外の生体内安定性が低い生理活性物質としてグレリン[(n-Octanoyl)Ghrelin]を選択し、検証を行った。グレリンのC末端に本発明のGAモジュールの部分ペプチドを付加し、グレリンペプチド複合体とした。グレリンペプチド複合体の合成は、固相合成によって行い、HPLCにより精製後、マススペクトルにより合成品を確認した。-NH2は、C末端がアミド化されていることを示す。
実施例31．Ghrelin(1-28)-GAm(28-44)-NH2  配列番号69（GAm：配列番号13）
比較例17．Ghrelin(1-28)-NH2  配列番号68【００８０】
＜試験例9＞  グレリンペプチド複合体の血漿安定性の評価
グレリンペプチド複合体の生体内安定性を検証するため、in vitroの血漿安定性を評価した。グレリン又はグレリンペプチド複合体を血漿中で一定時間処理した後に、未分解のグレリン又はグレリンペプチド複合体の変化量をHPLC/MSで測定し、評価した。
１．方法
SDラットをジエチルエーテルで麻酔し、全採血を行い、血漿画分を分離した。最終濃度が0.5μmol/Lになるようにグレリン又はグレリン ペプチド複合体を血漿中に添加し、37度で静置した。0、0.5、2、8時間後にサンプルを回収し、グレリン又はグレリンペプチド複合体の量をHPLC/MSで測定することで残存率を評価した。グレリン又はグレリンペプチド複合体の残存率は、0時間で回収したサンプルのHPLC/MS測定結果を100%として、0.5、2、8時間後の血漿中に残存する比率を算出することで評価した。【００８１】
２．実験結果
グレリン又はグレリンペプチド複合体について、血漿安定性を解析した結果を、残存率として表１２に示す。GAモジュールの部分ペプチドを付加していない天然グレリン（比較例17）は、2時間後には血漿中で14%に分解されていたのに対して、C末にGAモジュールの部分ペプチドを付加したグレリンペプチド複合体（実施例31）は、2時間後においても49%残存していた。以上より、本発明のGAモジュールの部分ペプチドは、脂肪酸付加されたペプチドにおいても応用されることが示された。このことから生体内安定性が問題となる生理活性物質を実用化するための極めて有用な手段として利用できる。【００８２】
【表１２】
2011136361.tif 000013
【図１】
2011136361.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2011136361.tif 000018
【配列表】
2011136361000001.app
【国際調査報告】
2011136361.tif 000019
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