(57)【要約】本発明は、リンパ管内皮細胞と血管内皮細胞において示差的に発現されるポリヌクレオチドおよび遺伝子を提供する。これらの遺伝子はリンパ水腫などのリンパ管の病気、種々の炎症性疾患、およびリンパ系を通じた癌転移を治療するための有用な標的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮細胞（ＢＥＣ）またはリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）の増殖または分化を示差的に調節する方法であって、
内皮細胞を、血管またはリンパ管内皮細胞を示差的に調節する薬剤を含んでなる組成物と接触させることを含んでなり、
該薬剤が、
（ａ）  ＢＥＣポリペプチドもしくはＬＥＣポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチド、または該ポリペプチドの活性断片；
（ｂ）  （ａ）のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ポリヌクレオチド；
（ｃ）  （ａ）のポリペプチドと特異的に結合する、抗体；
（ｄ）  （ｃ）の抗体のフラグメントを含んでなる、ポリペプチド（ここで、このフラグメントおよび抗体は該ポリペプチドと結合する）；
（ｅ）  （ａ）のポリペプチドをコードするヒト遺伝子またはｍＲＮＡに対する、アンチセンス核酸；
（ｆ）  （ａ）のポリペプチドをコードするヒト遺伝子またはｍＲＮＡに対する、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）
からなる群より選択される、方法。
【請求項２】
内皮細胞が組成物とex vivoで接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組成物が、医薬上許容される希釈剤、アジュバント、または担体を含んでなり、かつ、
接触工程が、哺乳類被験体に組成物を投与して、哺乳類被験体においてＢＥＣまたはＬＥＣを示差的に調節することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＬＥＣの過剰増殖を特徴とする疾患を有するヒト被験者を同定し；かつ
そのヒト被験者に組成物を投与し、ここで、この薬剤はＢＥＣの増殖と比べてＬＥＣの増殖を示差的に阻害する
ことを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＬＥＣの過剰増殖を特徴とする疾患を有するヒト被験者を同定し；
被験者のＬＥＣをスクリーニングして、表３に示されるポリペプチドの過剰発現を同定し；かつ
そのヒト被験者に組成物を投与し、ここで、この薬剤は、スクリーニング工程によって同定されたポリペプチドの発現を阻害することにより、ＢＥＣの増殖と比べてＬＥＣの増殖を示差的に阻害する
ことを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ヒト被験者においてリンパ管内皮細胞の増殖を調節する、請求項３に記載の方法であって、
過少増殖性のリンパ管疾患を有するヒト被験者を同定し；
被験者をスクリーニングして、表３に示されるＬＥＣポリペプチド（該タンパク質は表１または２に示されるものではない）の発現不足または活性不足を同定し；
そのヒト被験者に組成物を投与する（ここで、この薬剤はスクリーニング工程によって同定されたＬＥＣポリペプチド（ａ）、もしくは該ポリペプチドの活性断片を含んでなるか、またはそのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド（ｂ）を含んでなる）
ことを含んでなる、方法。
【請求項７】
血管内皮細胞（ＢＥＣ）またはリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）の増殖または分化を示差的に調節するための薬物の製造を目的とした薬剤の使用であって、
該薬剤が、
（ａ）  ＢＥＣポリペプチドもしくはＬＥＣポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチド、または該ポリペプチドの活性断片；
（ｂ）  （ａ）のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ポリヌクレオチド；
（ｃ）  （ａ）のポリペプチドと特異的に結合する、抗体；
（ｄ）  （ｃ）の抗体のフラグメントを含んでなる、ポリペプチド（ここで、このフラグメントおよび抗体は該ポリペプチドと結合する）；
（ｅ）  （ａ）のポリペプチドをコードするヒト遺伝子またはｍＲＮＡに対する、アンチセンス核酸；
（ｆ）  （ａ）のポリペプチドをコードするヒト遺伝子またはｍＲＮＡに対する、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）
からなる群より選択される、使用。
【請求項８】
ポリペプチドが、表３に示されるＬＥＣポリペプチド群から選択されるＬＥＣポリペプチドであり、かつ、薬剤がＢＥＣの増殖または分化よりもＬＥＣの増殖または分化を示差的に調節する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項９】
ポリペプチドが、表４に示されるＢＥＣポリペプチド群から選択されるＢＥＣポリペプチドであり、かつ、薬剤がＬＥＣの増殖または分化よりもＢＥＣの増殖または分化を示差的に調節する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１０】
ポリペプチドが表１または２に示されるものではない、請求項８または９に記載の方法または使用。
【請求項１１】
ＬＥＣポリペプチドが、配列番号８１、１８７、２０７、２１１、２２１、２３５、２４１、２９３および３９１からなる群より選択されるアミノ酸を含んでなる、請求項８に記載の方法または使用。
【請求項１２】
ＬＥＣポリペプチドが、配列番号３１〜３４、４６および４８からなる群より選択されるアミノ酸を含んでなる、請求項８に記載の方法または使用。
【請求項１３】
薬剤が（ｃ）の抗体または（ｄ）のポリペプチドを含んでなる、請求項１２に記載の方法または使用。
【請求項１４】
薬剤が（ａ）のポリペプチドの細胞外ドメイン断片、または該細胞外ドメイン断片をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
薬剤がアンチセンス分子を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１６】
遺伝性リンパ水腫を治療する方法であって、
リンパ水腫を有し、かつ、表３に示されるＬＥＣタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子における突然変異を有するヒト被験者を同定し、ここで、この突然変異はヒト被験者におけるリンパ水腫と関係があり、ただし、該ＬＥＣタンパク質はＶＥＧＦＲ−３ではなく；かつ
該被験者に、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドからなる群より選択されるリンパ増殖剤を含んでなる組成物を投与する
ことを含んでなる、方法。
【請求項１７】
表３に示されるＬＥＣ遺伝子における突然変異から起こる遺伝性リンパ水腫の治療のための薬物の製造における、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドからなる群より選択されるリンパ増殖剤の使用（ただし、ＬＥＣ遺伝子はＶＥＧＦＲ−３ではない）。
【請求項１８】
内皮細胞疾患または該疾患に対する疾病素因をスクリーニングする方法であって、
ヒト被験者から内皮細胞ｍＲＮＡを含む生体サンプルを得；かつ
ＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子から転写されたサンプル中のｍＲＮＡの量からＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子の発現を測定する（ここで、このＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子は表３または４に示されるポリペプチドをコードしてなる）
ことを含んでなる、方法。
【請求項１９】
内皮細胞に対する薬物の効力または毒性をモニタリングする方法であって、
哺乳類被験体に薬物を投与する前および投与した後、その被験体の内皮細胞における少なくとも一つのＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子の発現を測定する工程（ここで、この少なくとも一つのＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子は表３または表４に示されるポリペプチドをコードし、かつ、ＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子の発現の変化は内皮細胞に対する薬物の効力または毒性と相関する）
を含んでなる、方法。
【請求項２０】
内皮細胞の増殖を調節する化合物を同定する方法であって、
化合物の存在下および不在下で内皮細胞を培養し；かつ
その細胞において少なくとも一つのＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子の発現を測定する（ここで、ＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子は表３および表４に示されるポリペプチドをコードする遺伝子から選択され、化合物の不在下と比べて存在下での少なくとも一つのＢＥＣ遺伝子の発現に変化があれば、その化合物はＢＥＣ増殖のモジュレーターであると同定され、また化合物の不在下と比べて存在下での少なくとも一つのＬＥＣ遺伝子の発現に変化があれば、その化合物はＬＥＣ増殖のモジュレーターであると同定される）
ことを含んでなる、方法。
【請求項２１】
ＢＥＣまたはＬＥＣの増殖または分化を選択的に調節する化合物をスクリーニングする、請求項２０に記載の方法であって、
前記測定工程が、細胞において少なくとも一つのＢＥＣ遺伝子および少なくとも一つのＬＥＣ遺伝子の発現を測定することを含んでなり、かつ、
少なくとも一つのＬＥＣ遺伝子の発現に比べて少なくとも一つのＢＥＣ遺伝子の発現を示差的に調節する化合物を選択することにより、ＢＥＣまたはＬＥＣの増殖または分化を選択的に調節する化合物に関してスクリーニングすることを含んでなる、方法。
【請求項２２】
配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、８１、１８７、２０７、２１１、２２１、２３５、２４１、２９３および３９１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドと、
医薬上許容される希釈剤、担体またはアジュバントと
を含んでなる、組成物。
【請求項２３】
配列番号１４〜３０、４５、４７、４９、５１、８２、９３、１１１、１８８、２０８、２１２、２２２、２３６、２４２、２９４および３９２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、またはそのポリペプチドをコードするその断片を含んでなる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、８１、１８７、２０７、２１１、２２１、２３５、２４１、２９３および３９１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドと、機能的に連結された発現制御配列を含んでなる、発現ベクター。
【請求項２５】
該ポリヌクレオチドを含む複製欠陥アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである、請求項２４に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２４または２５に記載の発現ベクターと、医薬上許容される希釈剤、担体またはアジュバントとを含んでなる、組成物。
【請求項２７】
哺乳類被験体のリンパ系を調節するために該被験体に組成物を投与するためのプロトコールとともにパッケージングされた、請求項２２、２３または２６のいずれか一項に記載の組成物を含んでなる、キット。
【請求項２８】
請求項２４に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項２９】
ＬＥＣポリペプチドを生産する方法であって、細胞がポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現する条件下で請求項２８に記載の宿主細胞を増殖させる工程を含んでなる、方法。
【請求項３０】
配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、８１、１８７、２０７、２１１、２２１、２３５、２４１、２９３および３９１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、精製および単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
（ａ）  配列番号３１〜３４、４６、４８、２０７、６７６、８５９および８６１；
（ｂ）  （ａ）のアミノ酸配列のうち少なくとも１０個のアミノ酸からなる細胞外ドメイン断片
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、精製および単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号３１〜３４、４６、４８、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列の細胞外ドメイン断片を含んでなり、ポリペプチドがトランスメンブランドメインを欠いている、請求項３１に記載の精製および単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項３３】
細胞内ドメインを欠いている、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
免疫グロブリン定常領域を含んでなる免疫グロブリン断片と融合した、請求項３２または３３に記載のポリペプチドを含んでなる、融合タンパク質。
【請求項３５】
請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはタンパク質と、医薬上許容される希釈剤、担体またはアジュバントとを含んでなる、組成物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の組成物と、哺乳類被験体のリンパ系を調節するために該被験体に該医薬組成物を投与するためのプロトコールとを含んでなる、キット。
【請求項３７】
請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチドと特異的に結合する、抗体。
【請求項３８】
ヒト化抗体である、請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを含んでなるタンパク質であって、該ポリペプチドと特異的に結合する、タンパク質。
【請求項４０】
ＬＥＣ核酸を同定する方法であって、
（ａ）  候補ＬＥＣ核酸を含む生体サンプルを、配列番号１〜３０、４５、４７、４９、５１、８２、９３、１１１、１８８、２０８、２１２、２３６、２４２、２９４および３９２からなる群より選択される配列の少なくとも１４の連続するヌクレオチドからなる断片を含んでなるポリヌクレオチド、またはその相補体と、下記のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件：
（ｉ）  ５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳおよび０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃にて２０時間のハイブリダイゼーション、および
（ii）  １×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃にて３０分間の洗浄
の下で接触させ；かつ
（ｂ）  該候補ＬＥＣ核酸と該ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出し、それによりＬＥＣ核酸を同定する
ことを含んでなる、方法。
【請求項４１】
ＬＥＣタンパク質を同定する方法であって、
（ａ）  候補ＬＥＣタンパク質を含む生体サンプルを、請求項３７に記載の抗体または請求項３９に記載のタンパク質からなる群より選択されるＬＥＣタンパク質結合相手と、それらの間の結合に適した条件下で接触させ；かつ
（ｂ）  該候補ＬＥＣタンパク質と該ＬＥＣ結合相手の間の結合を検出し、それによりＬＥＣタンパク質を同定する
ことを含んでなる、方法。
【請求項４２】
ＬＥＣを同定する方法であって、
（ａ）  細胞を含む生体サンプルをＬＥＣ結合相手と、それらの間の結合に適した条件下で接触させ（ここで、該ＬＥＣ結合相手は配列番号３１〜３４、４６、４８、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択される配列を含んでなるポリペプチドと結合する抗体を含んでなるか、または該抗体の抗原結合フラグメントを含んでなり；かつ
（ｂ）  細胞とＬＥＣ結合相手との間の結合を検出することによりＬＥＣを同定し、ここで、ＬＥＣ結合相手と細胞が結合していれば、ＬＥＣであると確認される
ことを含んでなる、方法。
【請求項４３】
遺伝性リンパ水腫の発症リスクをアッセイする方法であって、
（ａ）  遺伝性リンパ水腫の表現型と関連があり、かつ、ヒト被験者の少なくとも一つの対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列が、対応する野生型対立遺伝子によりコードされているポリペプチドのアミノ酸配列と比べた場合に変更されている突然変異に関してヒト被験者の核酸をアッセイし、ここで、この野生型ポリペプチドは表３に示されているポリペプチドである
ことを含んでなる、方法。
【請求項４４】
遺伝性リンパ水腫の発症リスクをアッセイする方法であって、
（ａ）  遺伝性リンパ水腫の表現型と関連があり、かつ、ヒト被験者の少なくとも一つの対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列が、対応する野生型対立遺伝子によりコードされているポリペプチドのアミノ酸配列と比べた場合に変更されている突然変異に関してヒト被験者の核酸をアッセイし、ここで、この野生型ポリペプチドは配列番号３１〜４４、４６、４８、５２、５４、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり；かつ
（ｂ）  核酸における該突然変異の有無と、遺伝性リンパ水腫の発症リスクを相関させ、ここで、核酸に該突然変異が存在する場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがあることと関連づけ、核酸に該突然変異が不在である場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがないことと関連づける
ことを含んでなる、方法。
【請求項４５】
遺伝性リンパ水腫の発症リスクをアッセイする方法であって、
（ａ）  ヒト被験者の少なくとも一つの転写因子対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列、および、その対立遺伝子によりコードされている転写因子ポリペプチドの転写調節活性が、野生型対立遺伝子によりコードされている転写因子ポリペプチドの転写調節活性と比べた場合に変更されている突然変異に関してヒト被験者の核酸をアッセイし、ここで、この野生型転写因子ポリペプチドは配列番号８１、配列番号２１１、配列番号２４１、および表５の配列によりコードされている転写因子からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり；かつ
（ｂ）  核酸における該突然変異の有無と、遺伝性リンパ水腫の発症リスクを相関させ、ここで、核酸に該突然変異が存在する場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがあることと関連づけ、核酸に該突然変異が不在である場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがないことと関連づける
ことを含んでなる、方法。
【請求項４６】
野生型転写因子対立遺伝子が、配列番号５４で示されるＳｏｘ１８アミノ酸配列を含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
アッセイにより、Ｓｏｘ１８対立遺伝子によりコードされるタンパク質のトランス活性化またはＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を変更する突然変異が確認される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
該突然変異が、野生型ＳＯＸ１８による該遺伝子の転写の活性化と比べてＳＯＸ１８応答性遺伝子の転写活性化を低下させる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
遺伝性リンパ水腫の発症リスクをアッセイする方法であって、
（ａ）  ヒト被験者の少なくとも一つのＬＥＣ対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列が、また、そのＬＥＣ対立遺伝子によりコードされている接着ポリペプチドの結合親和性が、野生型対立遺伝子によりコードされている接着ポリペプチドの結合親和性と比べた場合に変更されている突然変異に関するヒト被験者の核酸をアッセイし、ここで、この野生型接着ポリペプチドは配列番号３１〜３４、４６、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり；かつ
（ｂ）  核酸における該突然変異の有無と、遺伝性リンパ水腫の発症リスクを相関させ、ここで、核酸に該突然変異が存在する場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがあることと関連づけ、核酸に該突然変異が不在である場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがないことと関連づける
ことを含んでなる、方法。
【請求項５０】
アッセイにより突然変異の存在が確認され、相関工程によりその患者の遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクが確認される、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがあるかどうかヒト被験者をスクリーニングする方法であって、表３のアミノ酸配列を含んでなる少なくとも一つのポリペプチドのコードされているアミノ酸配列を変更する突然変異に関してヒト被験者の核酸をアッセイすることを含んでなる、方法。
【請求項５２】
ポリペプチドが、遺伝性リンパ水腫の発症リスクと相関する様式で、配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２および５４、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ポリペプチドが配列番号５４に示されるＳＯＸ１８アミノ酸配列を含んでなる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
（ａ）  ヒト被験者の少なくとも一つのポリヌクレオチドの少なくとも一つのコドンのヌクレオチド配列を決定すること；
（ｂ）  ヒト被験者由来の核酸が１以上の参照配列と同じヌクレオチド配列を有するか、異なるヌクレオチド配列を有するかを決定するためにハイブリダイゼーションアッセイを行うこと；
（ｃ）  ヒト被験者由来の核酸が１以上の参照配列と同じヌクレオチド配列を有するか、異なるヌクレオチド配列を有するかを決定するためにポリヌクレオチド移動アッセイを行うこと；
（ｄ）  ヒト被験者由来の核酸が１以上の参照配列と同じヌクレオチド配列を有するか、異なるヌクレオチド配列を有するかを決定するために制限エンドヌクレアーゼ消化を行うこと
からなる群より選択される少なくとも一つの手順を含んでなる、請求項４３〜５３に記載の方法。
【請求項５５】
該ＬＥＣポリヌクレオチドのコード配列を含んでなる核酸を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、および増幅された核酸のヌクレオチド配列を決定することを含んでなる、請求項４３〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
ヒト被験者において遺伝性リンパ水腫の遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  該被験者由来の核酸を含んでなる生体サンプルを準備し；かつ
（ｂ）  該核酸を、ヒト被験者において少なくとも一つの遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列を、配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、５４、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヒト遺伝子と比べて変更する突然変異が存在するかどうか分析し、ここで、ヒト被験者に、コードされるアミノ酸配列を、ヒト被験者のリンパ水腫と相関する様式で変更する突然変異が存在していれば、遺伝性リンパ水腫の遺伝子型と確認される
ことを含んでなる、方法。
【請求項５７】
該生体サンプルが細胞サンプルである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
該分析が該核酸の一部を配列決定することを含んでなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
ヒト被験者が本スクリーニング方法により同定される遺伝性リンパ水腫の遺伝子型を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも一つの遺伝子が、配列番号５４で示されるアミノ酸配列をコードするヒトＳｏｘ１８遺伝子に相当する、請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
リンパ管形成を阻害する方法であって、被験体にＬＥＣトランスメンブランポリペプチドの阻害剤を投与することを含んでなり、ここで、このＬＥＣトランスメンブランポリペプチドが配列番号３１〜３４、４６、４８、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり、かつ、
この阻害剤が
（ａ）  ＬＥＣトランスメンブランポリペプチドの可溶性細胞外ドメイン断片；
（ｂ）  ＬＥＣトランスメンブランポリペプチドの細胞外ドメインと結合する抗体；
（ｃ）  （ｂ）の抗体の抗原結合ドメインを含んでなるポリペプチド；および
（ｄ）  ＬＥＣトランスメンブランポリペプチドまたはその相補体をコードする核酸と相補的なアンチセンス核酸
からなる群より選択される、方法。
【請求項６２】
阻害剤がＬＥＣポリペプチドの細胞外ドメイン断片を含んでなるポリペプチドであり、該細胞外ドメインの配列が配列番号３１のアミノ酸１〜１５２、配列番号３２のアミノ酸１〜６９５および配列番号３３のアミノ酸１〜２４８からなる群より選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
該被験体が腫瘍を含むヒトである、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
哺乳類被験体においてリンパ管形成を調節する方法であって、
リンパ管形成の調節を必要とする哺乳類被験体に、ＬＥＣポリヌクレオチド（このＬＥＣポリヌクレオチドは配列番号１４〜３０、４５、４７、４９および５１、２０８、６７７、８６０および８６２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでなる）に対するアンチセンス分子を、ＬＥＣポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドの転写または翻訳を阻害するのに有効な量で投与することを含んでなる、方法。
【請求項６５】
遺伝性リンパ水腫を治療する方法であって、
（ａ）  遺伝性リンパ水腫を有し、かつ、ヒト被験者の少なくとも一つのポリペプチドのコードされているアミノ酸配列を、配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、５４、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのアミノ酸配列と比べて変更する突然変異を有するヒト被験者を同定し；かつ
（ｂ）  該被験者に、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−ＤポリヌクレオチドおよびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドからなる群より選択されるリンパ増殖因子を投与する
ことを含んでなる、方法。
【請求項６６】
内皮細胞または内皮前駆細胞の増殖を調節する方法であって、内皮細胞または内皮前駆細胞を、細胞においてｐｒｏｘ−１の転写調節を調節する薬剤を含んでなる組成物と接触させることを含んでなり、その薬剤が
（ａ）  ｐｒｏｘ−１ポリペプチド；
（ｂ）  ｐｒｏｘ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）  ｐｒｏｘ−１に対するアンチセンス分子；
からなる群より選択される、方法。
【請求項６７】
細胞が培養内皮細胞または内皮前駆細胞を含み、接触がex vivoで行われる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
接触が培養培地に薬剤を含めることを含んでなる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
細胞が内皮前駆細胞を含む、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
細胞が、接触工程の後に哺乳類被験体に導入される、請求項６６〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
被験体がヒトである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ヒト被験者がＬＥＣ疾患を有する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ヒト被験者においてＬＥＣ機能を増強する方法であって、
ヒト被験者から内皮細胞または内皮前駆細胞を単離し；
内皮細胞を、ｐｒｏｘ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトしてＬＥＣの分化および増殖を促進し；かつ
形質転換またはトランスフェクション工程の後にそのＬＥＣ細胞をヒト被験者に投与する
ことを含んでなる、方法。
【請求項７４】
単離工程と投与工程のヒト被験者が同一である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ヒト被験者がリンパ水腫を有する、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
ベクターおよび形質転換またはトランスフェクション方法がｐｒｏｘ−１の一時的発現向けに選択される、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
発現ベクターが複製欠陥アデノウイルスベクターを含んでなる、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
配列番号３１のアミノ酸６１〜１２７と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項７９】
配列番号３１のアミノ酸３０〜１５２と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含んでなる、請求項７８に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
配列番号３１で示されるアミノ酸配列の断片を含んでなる可溶性ポリペプチドであって、該断片が配列番号３１のトランスメンブランおよび細胞内アミノ酸を欠いている、可溶性ポリペプチド。
【請求項８１】
配列番号３２の少なくとも一つのロイシン豊富な領域を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項８２】
配列番号３２のトランスメンブランアミノ酸を欠いている、請求項８１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８３】
配列番号３３の少なくとも一つのロイシン豊富な領域を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項８４】
配列番号３３のトランスメンブランアミノ酸を欠いている、請求項８１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８５】
配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、少なくとも一つのＩ型トロンボスポンジンリピート配列を含む断片と、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項８６】
該断片が配列番号１１１の６つのＩ型トロンボスポンジンリピート配列を含む、請求項８５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８７】
配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、少なくとも一つのＣ−２型免疫グロブリンドメインを含む断片と、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項８８】
該断片が配列番号１１１の３つのＣ−２型免疫グロブリンドメイン配列を含む、請求項８５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８９】
請求項７８〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチドと異種ポリペプチドを含んでなる、融合タンパク質。
【請求項９０】
請求項７８〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチドと特異的に結合する、抗体。
【請求項９１】
請求項７８〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項９２】
発現制御配列と機能的に連結された請求項９１に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項９３】
複製欠陥アデノウイルスベクターである、請求項９２に記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リンパ管内皮細胞において特異的に発現されるポリヌクレオチドおよびタンパク質に関する。
【０００２】
関連技術
リンパ管内皮増殖因子と癌のリンパ管内増殖および転移との関連に関する最近の証拠から(Mandriota, et al., EMBO J. 20:672-682頁 (2001); Skobe, et al., Nat. Med. 7:192-198頁 (2001); Stacker, et al., Nat. Med. 7:186-191頁 (2001); Karpanen, et al., Cancer Res. 61:1786-1790頁 (2001)) 、腫瘍治療のさらなる標的としてリンパ管を利用することができるという希望が見えてきた。癌細胞は、周辺組織への直接浸潤、体腔への拡散、血管系への浸潤（血行性転移）、ならびにリンパ系を通じた拡散（リンパ行性転移）によって体内に広がる。局所リンパ節播種はいくつかの頻度の高い癌の転移におけるの第一段階であり、疾病の予後と大いに関係している。腫瘍領域からの組織液の排出に関与するリンパ節はセンチネル節と呼ばれ、これらのリンパ節を発見し、また、転移が疑われる場合はそれらを除去するための診断尺度である。しかしながら、その臨床的妥当性にもかかわらず、血流を通じてまたはリンパ管を通じて転移に至る機構についてはほとんど分かっていない。
【０００３】
最近まで、リンパ管は医学におけるそれらの重要性にもかかわらず、血管ほど注目されていなかった。リンパ管は大部分の組織の間質腔からタンパク質を豊富に含む液体と白血球を集め、それらを白濁流体、リンパ液、として血液循環内に輸送する。小リンパ管が合流し、リンパ液を胸管を通って頚部にて大静脈に注ぎ込む大きな管になる。リンパ節はリンパ管に沿って濾過ステーションとしての機能を果たし、リンパ液は集合リンパ管周囲の平滑筋の収縮により、また身体の動きにより流れ、その流れる方向は静脈内では弁により保証されている。毛細リンパ管は内皮細胞で覆われており、この内皮細胞はいくつもの大きな内皮間ギャップと異なる部分で連絡している。毛細リンパ管はまた、連続した基底膜がなく、周皮細胞を欠いている。アンカーリングフィラメント(Anchoring filament)はリンパ管内皮細胞の管外側の面を血管周囲の細胞外基質と繋ぎ、組織に浮腫が存在する場合に血管の開通性を維持するよう協力する。通常、感染、外科処置、または放射線治療、および、まれに、遺伝的欠陥の結果であるリンパ管の欠如または閉塞により、組織においてタンパク質を豊富に含む（protein-rich）液体の貯留、リンパ水腫が起こる。リンパ系はまた、腸管からの脂肪吸収および免疫応答においても重要である。細菌、ウイルス、およびその他の異物はリンパ管に取り込まれ、リンパ節（ここで、異物は免疫細胞に提示され、かつ、樹状細胞はリンパ管を通って遊走する）に輸送される。リンパ管を操作する能力の理解は遅々として進んでいない。
【０００４】
リンパ管ＥＣの発生または機能異常によりリンパ管腫またはリンパ管拡張症などのリンパ管の腫瘍または奇形を引き起こすことがある。Witte, et al., Regulation of Angiogenesis (Goldber, I.D. & Rosen, E.M.編) 65-112頁 (Birkauser, Basel, Switzerland, 1997)。ＶＥＧＦＲ−３チロシンキナーゼ受容体は正常なリンパ管内皮細胞において発現され、カポジ肉腫をはじめとする種々の血管腫瘍においてアップレギュレートされる。Jussila, et al., Cancer Res 58, 1955-1604頁 (1998); Partanen, et al., Cancer 86:2406-2412頁 (1999)。感染、外科処置、放射線治療からまたは遺伝的欠陥から起こる可能性のあるリンパ管の欠如または機能異常が、組織におけるタンパク質を豊富に含む液体の慢性的な貯留によって腫脹をもたらすリンパ水腫を引き起こす。外観を損ない、障害を引き起こす四肢の腫脹をもたらす皮膚リンパ管の形成不全を特徴とする疾病、家族性リンパ水腫の遺伝学においては、リンパ管形成に関するＶＥＧＦＲ−３によるシグナル伝達の重要性が明らかにされた。Witte, et al., Regulation of Angiogenesis (Goldber, I.D. & Rosen, E.M.編) 65-112頁 (Birkauser, Basel, Switzerland, 1997); Rockson, S.G., Am. J. Med. 110, 288-295頁 (2001)。リンパ浮腫を有する家族の何人かが、不活性受容体タンパク質を生じさせるチロシンキナーゼドメインをコードするＶＥＧＦＲ３エクソンのミスセンス変異のために異型接合性である。Karkkainen, et al., Nature Genet. 25:153-159頁 (2000); Irrthum, et al., Am. J. Hum. Genet. 67:295-301頁 (2000)。
【０００５】
内皮細胞の多様性を制御する転写プログラムに関する情報および血管形成およびリンパ管形成の機構への情報が当技術分野において必要とされている。また、腫瘍転移をはじめとする数多くのリンパ管の病気の研究において有用な標的として用い得る新しい血管マーカーも当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の組成物としては、単離されたポリヌクレオチド、特に、リンパ管内皮遺伝子、ポリペプチド、これらのポリヌクレオチドによりコードされている単離されたポリペプチド、組換えＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子またはその変性変異体、とりわけ、変異型対立遺伝子などの天然に存在する変異体、およびこのようなポリペプチドに存在する一つ以上のエピトープを特異的に認識する抗体が挙げられる。
【０００７】
本発明の組成物としては、さらに、本発明のポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作されている細胞およびこのようなポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作されている細胞を含む発現ベクターをはじめとするベクターを含む。
【０００８】
限定した態様では、本発明のこのような単離されたポリヌクレオチドは、記載する、例えば、配列番号１〜３０のいずれかの配列で示されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを意味する。
【０００９】
本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、限定されるものではないが、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１〜３０のヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド；中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１〜３０のヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド；上記ポリヌクレオチドの変異型対立遺伝子であるポリヌクレオチド；上記タンパク質の種間相同物をコードするポリヌクレオチド；配列番号１〜３０のいずれか一つによりコードされているポリペプチドの特定のドメインまたは末端切断部分を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも挙げられる。典型的な高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下は５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳおよび０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃にて２０時間のハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃にて３０分間の洗浄である。
【００１０】
本発明の別の態様では、上記ポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドをはじめとするＬＥＣおよびＢＥＣポリペプチドが意図される。いくつかの態様では、ポリペプチドは本発明のポリペプチドの成熟型である。配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、８１、１８７、２０７、２１１、２２１、２３５、２４１、２９３および３９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる精製および単離されたポリペプチド；ならびに（ａ）配列番号３１〜３４、４６、４８、２０７、６７６、８５９および８６１；および（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列のうち少なくとも１０個のアミノ酸からなる細胞外ドメイン断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる精製および単離されたポリペプチドが明確に意図される。さらに、本発明のこの態様は、配列番号３１〜３４、４６、４８、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群から選択されるアミノ酸配列の細胞外ドメイン断片を含んでなる、すぐ上に記載したような、精製および単離された可溶性ポリペプチド（ただし、このポリペプチドはトランスメンブランドメインを欠いている）を包含する。このようなポリペプチドは細胞内ドメインをさらに欠いている。また、本発明は、免疫グロブリン定常領域を含んでなる免疫グロブリン断片と融合した、上記のようなポリペプチドを含んでなる融合タンパク質も意図する。
【００１１】
関連する態様では、本発明は、上記のようなポリペプチドまたはタンパク質と医薬上許容される希釈剤、担体またはアジュバントを含んでなる組成物を提供する。本発明のポリペプチド組成物は親水性などの許容される担体、例えば、医薬上許容される担体を含んでなってよい。さらに、このような組成物と、哺乳類被験体のリンパ系を調節するために該被験体に該医薬組成物を投与するためのプロトコールを含んでなるキットが提供される。本発明はまた、上記のようなポリペプチドと特異的に結合する抗体、また、いくつかの態様では、ヒト化抗体である抗体を提供する。さらに、本発明は、以上に記載したようなポリペプチドと特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを含んでなるタンパク質であって、該ポリペプチドと特異的に結合するタンパク質を提供する。
【００１２】
本発明はまた、ポリペプチドを生産する方法であって、好適な培養培地で本発明の細胞の培養物を増殖させること、およびその培養物から、または細胞抽出物からタンパク質を精製することを含んでなる方法に関する。特に、本発明は、ＬＥＣポリペプチドを生産する方法であって、細胞がポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現する条件下で、本明細書に記載するような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を増殖させる工程を含んでなる方法を意図する。
【００１３】
本明細書に記載する生成物および組成物を同定する方法もまた、本発明により提供される。特に、本発明は、ＬＥＣ核酸を同定する方法であって、（ａ）候補ＬＥＣ核酸を含む生体サンプルを、配列番号１〜３０、４５、４７、４９、５１、８２、９３、１１１、１８８、２０８、２１２、２３６、２４２、２９４および３９２からなる群から選択される配列の少なくとも１４の連続するヌクレオチドからなる断片を含んでなるポリヌクレオチド、またはその相補体と、下記のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件：（ｉ）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳおよび０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃にて２０時間のハイブリダイゼーション、および（ii）１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃にて３０分間の洗浄
の下で接触させること；および（ｂ）該候補ＬＥＣ核酸と該ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出し、それによりＬＥＣ核酸を同定することを含んでなる方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、ＬＥＣタンパク質を同定する方法であって、（ａ）候補ＬＥＣタンパク質を含む生体サンプルを、本明細書に記載するような抗体または本明細書に記載するようなタンパク質もしくはポリペプチドからなる群から選択されるＬＥＣタンパク質結合相手と、それらの間の結合に適した条件下で接触させること；および（ｂ）該候補ＬＥＣタンパク質と該ＬＥＣ結合相手の間の結合を検出し、それによりＬＥＣタンパク質を同定することを含んでなる方法を提供する。
【００１５】
本発明の別の関連する態様は、ＬＥＣを同定する方法であって、（ａ）細胞を含む生体サンプルをＬＥＣ結合相手と、それらの間の結合に適した条件下で接触させること（ここで、該ＬＥＣ結合相手は配列番号３１〜３４、４６、４８、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群から選択される配列を含んでなるポリペプチドと結合する抗体を含んでなるか、または該抗体の抗原結合フラグメントを含んでなる）；および（ｂ）細胞とＬＥＣ結合相手との間の結合を検出することによりＬＥＣを同定すること（ここで、ＬＥＣ結合相手と細胞が結合していれば、ＬＥＣであると確認される）を含んでなる方法である。
【００１６】
本発明のポリヌクレオチドは、分子生物学の分野のスキルを有する人には公知の種々の技術において数多くの用途がある。これらの技術としては、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、ＰＣＲでのプライマーとしての使用、染色体および遺伝子マッピングでの使用、タンパク質の組換え生産における使用、およびアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、それらの化学的類似体などの作製における使用が挙げられる。例えば、ｍＲＮＡの発現がリンパ管内皮細胞などの特定の細胞または組織種のみに限定される場合、例えば、in situ ハイブリダイゼーションを利用して、サンプル中の特定の細胞または組織のｍＲＮＡの存在を検出するためにハイブリダイゼーションプローブとして本発明のポリヌクレオチドを使用することができる。
【００１７】
別の態様では、本発明は、配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、８１、１８７、２０７、２１１、２２１、２３５、２４１、２９３および３９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド；および医薬上許容される希釈剤、担体またはアジュバントを含んでなる組成物を提供する。いくつかの態様では、組成物が配列番号１４〜３０、４５、４７、４９、５１、８２、９３、１１１、１８８、２０８、２１２、２２２、２３６、２４２、２９４および３９２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、またはそのポリペプチドをコードするその断片を含んでなる。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、８１、１８７、２０７、２１１、２２１、２３５、２４１、２９３および３９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドと機能的に連結された発現制御配列を含んでなる発現ベクターである。いくつかの態様では、発現ベクターが該ポリヌクレオチドを含む複製欠陥アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである。本発明の関連する態様は、上記のような発現ベクターと医薬上許容される希釈剤、担体またはアジュバントを含んでなる組成物である。さらに、本発明は、哺乳類被験体のリンパ系を調節するために該被験体に組成物を投与するためのプロトコールとともにパッケージングされた、上記のポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかと医薬上許容される希釈剤、担体またはアジュバントを含む組成物を含んでなるキットを提供する。
【００１９】
本発明はさらに、上記のような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００２０】
他のタンパク質に現在適用されている従来の種々の手順および方法において本発明のポリペプチドを使用することができる。さらに、そのポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製するために本発明のポリペプチドを使用してもよい。
【００２１】
本発明の一つの態様では、血管内皮細胞（ＢＥＣ）またはリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）の増殖または分化を示差的に調節する方法であって、内皮細胞を、血管またはリンパ管内皮細胞を示差的に調節する薬剤を含んでなる組成物と接触させることを含んでなり、該薬剤が、（ａ）ＢＥＣポリペプチドもしくはＬＥＣポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または該ポリペプチドの活性断片；（ｂ）（ａ）のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｃ）（ａ）のポリペプチドと特異的に結合する抗体；（ｄ）（ｃ）の抗体のフラグメントを含んでなるポリペプチド（なお、このフラグメントおよび抗体は該ポリペプチドと結合する）；（ｅ）（ａ）のポリペプチドをコードするヒト遺伝子またはｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸；（ｆ）（ａ）のポリペプチドをコードするヒト遺伝子またはｍＲＮＡに対する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）からなる群から選択される方法を提供する。本方法は、内皮細胞の組成物とのex vivoまたはin vivoでの接触を含んでよい。組成物が医薬上許容される希釈剤、アジュバント、または担体を含んでなり、かつ、接触工程が哺乳類被験体に組成物を投与して、哺乳類被験体においてＢＥＣまたはＬＥＣを示差的に調節することを含んでなってもよい。
【００２２】
さらに、本方法は、ＬＥＣの過剰増殖を特徴とする疾患を有するヒト被験者を同定すること；およびそのヒト被験者に組成物を投与すること（なお、この薬剤はＢＥＣの増殖と比べてＬＥＣの増殖を示差的に阻害する）を含んでなってもよい；あるいは、本方法は、ＬＥＣの過剰増殖を特徴とする疾患を有するヒト被験者を同定すること；表３に示されるポリペプチドの過剰発現を同定するために被験者のＬＥＣをスクリーニングすること；およびそのヒト被験者に組成物を投与すること（なお、この薬剤は、スクリーニング工程によって同定されたポリペプチドの発現を阻害することにより、ＢＥＣの増殖と比べてＬＥＣの増殖を示差的に阻害する）を含んでなってもよい。
【００２３】
本発明のこの態様はまた、ヒト被験者においてリンパ管内皮細胞の増殖を調節する方法であって、過少増殖性のリンパ管疾患を有するヒト被験者を同定すること；表３に示されるＬＥＣポリペプチド（該タンパク質は表１または２に示されるものではない）の発現不足または活性不足を同定するために被験者をスクリーニングすること；そのヒト被験者に組成物を投与すること（なお、この薬剤はスクリーニング工程によって同定されたＬＥＣポリペプチド（ａ）、もしくは該ポリペプチドの活性断片を含んでなるか、またはそのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド（ｂ）を含んでなる）工程を含んでなる方法を意図する。
【００２４】
本発明の関連する態様では、血管内皮細胞（ＢＥＣ）またはリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）の増殖または分化を示差的に調節するための薬物の製造を目的とした薬剤の使用であって、該薬剤が、（ａ）ＢＥＣポリペプチドもしくはＬＥＣポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または該ポリペプチドの活性断片；（ｂ）（ａ）のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｃ）（ａ）のポリペプチドと特異的に結合する抗体；（ｄ）（ｃ）の抗体のフラグメントを含んでなるポリペプチド（ここで、このフラグメントおよび抗体は該ポリペプチドと結合する）；（ｅ）（ａ）のポリペプチドをコードするヒト遺伝子またはｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸；（ｆ）（ａ）のポリペプチドをコードするヒト遺伝子またはｍＲＮＡに対する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）からなる群から選択される使用が意図される。
【００２５】
別の態様では、本発明は、内皮細胞の増殖を調節する化合物を同定する方法であって、化合物の存在下および不在下で内皮細胞を培養すること；およびその細胞において少なくとも一つのＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子の発現を測定すること（ここで、ＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子は表３および表４に示されるポリペプチドをコードする遺伝子から選択され、化合物の不在下と比べて存在下での少なくとも一つのＢＥＣ遺伝子の発現に変化があれば、その化合物はＢＥＣ増殖のモジュレーターであると同定され、また化合物の不在下と比べて存在下での少なくとも一つのＬＥＣ遺伝子の発現に変化があれば、その化合物はＬＥＣ増殖のモジュレーターであると同定される）を含んでなる方法を提供する。本方法を利用して、ＢＥＣまたはＬＥＣの増殖または分化を選択的に調節する化合物に関してスクリーニングしてもよい（ここで、測定工程は細胞において少なくとも一つのＢＥＣ遺伝子および少なくとも一つのＬＥＣ遺伝子の発現を測定することを含んでなり、かつ、本方法は少なくとも一つのＬＥＣ遺伝子の発現に比べて少なくとも一つのＢＥＣ遺伝子の発現を示差的に調節する化合物を選択することにより、ＢＥＣまたはＬＥＣの増殖または分化を選択的に調節する化合物に関してスクリーニングすることを含んでなる）。
【００２６】
さらに、本発明は、ポリペプチドが、表３に示されるＬＥＣポリペプチド群から選択されるＬＥＣポリペプチドであり、かつ、薬剤がＢＥＣの増殖または分化よりもＬＥＣの増殖または分化を示差的に調節する、上記の本発明の態様の方法または使用を包含する。いくつかの態様では、ＬＥＣポリペプチドが配列番号８１、１８７、２０７、２１１、２２１、２３５、２４１、２９３および３９１からなる群から選択されるアミノ酸を含んでなり；その他の態様では、ＬＥＣポリペプチドが配列番号３１〜３４、４６および４８からなる群から選択されるアミノ酸を含んでなる。これらの態様では、薬剤は上記のようなＬＥＣポリペプチドと特異的に結合する抗体、またはこのような抗体のペプチド断片であってよい。さらに、その薬剤は上記ポリペプチドの細胞外ドメイン、細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチド、またはアンチセンス分子もしくは核酸であってよい。あるいは、ポリペプチドが、表４に示されるＢＥＣポリペプチド群から選択されるＢＥＣポリペプチドであり、かつ、薬剤がＬＥＣの増殖または分化よりもＢＥＣの増殖または分化を示差的に調節する。好ましくは、ポリペプチドが表１または２に示されるものではない。
【００２７】
本発明の方法はさらに、サンプル中の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在を検出する方法に関する。このような方法は、例えば、上記のような疾患の予後および診断評価の一環として、また、このような状態に対する素因を示す被験体の同定に利用することができる。さらに、本発明は、薬物の効力を評価し、リンパ管内皮細胞の疾患の治療に向けた臨床試験に参加している患者の進捗状況をモニタリングする方法を提供する。
【００２８】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節する化合物を同定する方法を提供する。このような方法は、例えば、上記のような配列番号１〜３０のいずれか一つによりコードされているタンパク質の発現に関連した疾患の症状を改善することができる化合物の同定に利用することができる。このような方法としては、限定されるものではないが、本発明のポリペプチドと相互作用する（例えば、結合する）化合物およびその他の物質を同定するアッセイが挙げられる。
【００２９】
さらに、本発明は、遺伝性リンパ水腫の発症リスクをアッセイする方法であって、（ａ）遺伝性リンパ水腫の表現型と関連があり、かつ、ヒト被験者の少なくとも一つの対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列が、対応する野生型対立遺伝子によりコードされているポリペプチドのアミノ酸配列と比べた場合に変更されている突然変異に関してヒト被験者の核酸をアッセイすること（なお、この野生型ポリペプチドは表３に示されているポリペプチドである）を含んでなる方法を提供する。また、遺伝性リンパ水腫の発症リスクに関してアッセイする方法は、（ａ）遺伝性リンパ水腫の表現型と関連があり、かつ、ヒト被験者の少なくとも一つの対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列が、対応する野生型対立遺伝子によりコードされているポリペプチドのアミノ酸配列と比べた場合に変更されている突然変異に関してヒト被験者の核酸をアッセイすること（なお、この野生型ポリペプチドは配列番号３１〜４４、４６、４８、５２、５４、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる）；（ｂ）核酸における該突然変異の有無と遺伝性リンパ水腫の発症リスクを相関させること（ここで、核酸に該突然変異が存在する場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがあることと関連づけ、核酸に該突然変異が不在である場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがないことと関連づける）を含んでなる。
【００３０】
遺伝性リンパ水腫の発症リスクをアッセイする別の方法では、その工程が、（ａ）ヒト被験者の少なくとも一つの転写因子対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列が、また、その対立遺伝子によりコードされている転写因子ポリペプチドの転写調節活性が、野生型対立遺伝子によりコードされている転写因子ポリペプチドの転写調節活性と比べた場合に変更されている突然変異に関してヒト被験者の核酸をアッセイすること（なお、この野生型転写因子ポリペプチドは配列番号８１、配列番号２１１、配列番号２４１、および表５の配列によりコードされている転写因子からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる）；および（ｂ）核酸における該突然変異の有無と遺伝性リンパ水腫の発症リスクを相関させること（ここで、核酸に該突然変異が存在する場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがあることと関連づけ、核酸に該突然変異が不在である場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがないことと関連づける）を含んでなる。本方法では、該野生型転写因子対立遺伝子が配列番号５４で示されるＳｏｘ１８アミノ酸配列を含んでなってよい。本方法のいくつかの態様では、アッセイにより、Ｓｏｘ１８対立遺伝子によりコードされるタンパク質のトランス活性化またはＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を変更する突然変異が確認され；本方法の他のいくつかの態様では、該突然変異が野生型ＳＯＸ１８による該遺伝子の転写の活性化と比べてＳＯＸ１８応答性遺伝子の転写活性化を低下させる。
【００３１】
関連する態様では、本発明は、遺伝性リンパ水腫の発症リスクに関してアッセイする方法であって、（ａ）ヒト被験者の少なくとも一つのＬＥＣ対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列が、また、そのＬＥＣ対立遺伝子によりコードされている接着ポリペプチドの結合親和性が、野生型対立遺伝子によりコードされている接着ポリペプチドの結合親和性と比べた場合に変更されている突然変異に関してヒト被験者の核酸をアッセイすること（なお、この野生型接着ポリペプチドは配列番号３１〜３４、４６、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる）；および（ｂ）核酸における該突然変異の有無と遺伝性リンパ水腫の発症リスクを相関させること（ここで、核酸に該突然変異が存在する場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがあることと関連づけ、核酸に該突然変異が不在である場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがないことと関連づける）を含んでなる方法を提供する。本方法のいくつかの態様では、少なくとも一つの遺伝子が、配列番号５４で示されるアミノ酸配列をコードするヒトＳｏｘ１８遺伝子に相当する。
【００３２】
遺伝性リンパ水腫の発症リスクをアッセイする本発明の方法では、アッセイにより突然変異の存在が確認され、相関工程によりその患者の遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクが確認される。
【００３３】
本発明の関連する方法は、遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがあるかどうかヒト被験者をスクリーニングする方法であって、表３のアミノ酸配列を含んでなる少なくとも一つのポリペプチドのコードされているアミノ酸配列を変更する突然変異に関してヒト被験者の核酸をアッセイすることを含んでなる方法である。本方法のいくつかの態様では、ポリペプチドが、遺伝性リンパ水腫の発症リスクと相関する様式で、配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２および５４、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、また、ポリペプチドが配列番号５４に示されるＳＯＸ１８アミノ酸配列を含んでなることが明確に意図される。
【００３４】
本発明の関連する態様では、上記のような、遺伝性リンパ水腫の発症リスクをアッセイまたはスクリーニングする方法であって、（ａ）ヒト被験者の少なくとも一つのポリヌクレオチドの少なくとも一つのコドンのヌクレオチド配列を決定すること；（ｂ）ヒト被験者由来の核酸が１以上の参照配列と同じヌクレオチド配列を有するか、異なるヌクレオチド配列を有するかを決定するためにハイブリダイゼーションアッセイを行うこと；（ｃ）ヒト被験者由来の核酸が１以上の参照配列と同じヌクレオチド配列を有するか、異なるヌクレオチド配列を有するかを決定するためにポリヌクレオチド移動アッセイを行うこと；および（ｄ）ヒト被験者由来の核酸が１以上の参照配列と同じヌクレオチド配列を有するか、異なるヌクレオチド配列を有するかを決定するために制限エンドヌクレアーゼ消化を行うことからなる群から選択される少なくとも一つの手順を含んでなる方法が意図される。
【００３５】
本発明の関連する態様では、上記のような、遺伝性リンパ水腫の発症リスクをアッセイまたはスクリーニングする方法であって、該ＬＥＣポリヌクレオチドのコード配列を含んでなる核酸を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、および増幅された核酸のヌクレオチド配列を決定することを含んでなる方法を提供する。
【００３６】
さらに、本発明により、ヒト被験者において遺伝性リンパ水腫の遺伝子型に関してスクリーニングする方法であって、（ａ）該被験者由来の核酸を含んでなる生体サンプルを準備すること；および（ｂ）該核酸を、ヒト被験者において少なくとも一つの遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列を、配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、５４、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヒト遺伝子と比べて変更する突然変異が存在するかどうか分析すること（ここで、ヒト被験者に、コードされるアミノ酸配列を、ヒト被験者のリンパ水腫と相関する様式で変更する突然変異が存在していれば、遺伝性リンパ水腫の遺伝子型と確認される）を含んでなる方法が提供される。本方法のいくつかの態様では、該生体サンプルが細胞サンプルである。本方法のその他の態様では、該分析が該核酸の一部を配列決定することを含んでなる。本方法のさらなる態様では、ヒト被験者が本スクリーニング方法により同定される遺伝性リンパ水腫の遺伝子型を有する。
【００３７】
本発明の別の態様では、リンパ管形成を阻害する方法であって、被験体にＬＥＣトランスメンブランポリペプチドの阻害剤を投与することを含んでなり、このＬＥＣトランスメンブランポリペプチドが配列番号３１〜３４、４６、４８、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、かつ、この阻害剤が（ａ）ＬＥＣトランスメンブランポリペプチドの可溶性細胞外ドメイン断片；（ｂ）ＬＥＣトランスメンブランポリペプチドの細胞外ドメインと結合する抗体；（ｃ）（ｂ）の抗体の抗原結合ドメインを含んでなるポリペプチド；および（ｄ）ＬＥＣトランスメンブランポリペプチドまたはその相補体をコードする核酸と相補的なアンチセンス核酸からなる群から選択される方法を提供する。本方法のいくつかの態様では、阻害剤がＬＥＣポリペプチドの細胞外ドメイン断片を含んでなるポリペプチドであり、該細胞外ドメインの配列が配列番号３１のアミノ酸１〜１５２、配列番号３２のアミノ酸１〜６９５および配列番号３３のアミノ酸１〜２４８からなる群から選択される。本方法のいくつかの態様では、該被験体が腫瘍を含むヒトである。
【００３８】
関連する態様では、本発明は、哺乳類被験体においてリンパ管形成を調節する方法であって、リンパ管形成の調節を必要とする哺乳類被験体に、ＬＥＣポリヌクレオチド（このＬＥＣポリヌクレオチドは配列番号１４〜３０、４５、４７、４９および５１、２０８、６７７、８６０および８６２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる）に対するアンチセンス分子を、ＬＥＣポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドの転写または翻訳を阻害するのに有効な量で投与することを含んでなる方法を提供する。
【００３９】
また、本発明の方法として、上記のようなリンパ管内皮細胞の疾患を治療する方法であって、このような疾患に関係のある症状または傾向を示す個体にこのような化合物を投与することを含む方法も挙げられる。
【００４０】
別の態様では、本発明は、遺伝性リンパ水腫を治療する方法であって、（ａ）遺伝性リンパ水腫を有し、かつ、ヒト被験者の少なくとも一つのポリペプチドのコードされているアミノ酸配列を、配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、５４、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのアミノ酸配列と比べて変更する突然変異を有するヒト被験者を同定すること；および（ｂ）該被験者に、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−ＤポリヌクレオチドおよびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドからなる群から選択されるリンパ増殖因子を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００４１】
本発明はまた、遺伝性リンパ水腫を治療する方法であって、リンパ水腫を有し、かつ、表３に示されるＬＥＣタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子における突然変異を有するヒト被験者を同定すること（この突然変異はヒト被験者におけるリンパ水腫と関係があり、また、該ＬＥＣタンパク質はＶＥＧＦＲ−３ではない）；および該被験者に、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドからなる群から選択されるリンパ増殖剤を含んでなる組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。本発明はまた、表３に示されるＬＥＣ遺伝子における突然変異から起こる遺伝性リンパ水腫の治療のための薬物の製造における、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドからなる群から選択されるリンパ増殖剤の使用（ただし、この遺伝子はＶＥＧＦＲ−３ではない）を包含する。
【００４２】
さらに、本発明は標的とする遺伝子産物の全活性を調節する化合物およびその他の物質を投与することによって、このような疾病または疾患を治療する方法を包含する。化合物およびその他の物質は標的とする遺伝子の発現レベルまたは標的とするタンパク質の活性レベルのいずれかでこのような調節をなし得る。これらの治療方法は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを内皮細胞、例えば、ＬＥＣおよび／またはＢＥＣに投与すること、またはヒト患者などの生物に投与することを含む。本発明のこの態様での典型的な方法は、少なくとも一つの本発明のポリヌクレオチドの発現を調節することができるアンチセンスポリヌクレオチド、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体または抗体フラグメント、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドおよび可溶性ＶＥＧＦＲ−３ポリペプチドからなる群から選択される治療用物質を投与することである。
【００４３】
別の態様では、本発明は、内皮細胞疾患または該疾患に対する疾病素因に関してスクリーニングする方法であって、ヒト被験者から内皮細胞ｍＲＮＡを含む生体サンプルを得ること；および該遺伝子から転写されたサンプル中のｍＲＮＡの量からＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子の発現を測定すること（ここで、このＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子は表３または４に示されるポリペプチドをコードする）を含んでなる方法を提供する。
【００４４】
本発明は、リンパ管内皮細胞の増殖を阻害する方法であって、その細胞を、増殖を阻害することができる薬剤と結合した少なくとも一つの抗体を含んでなる組成物と接触させること（ここで、薬剤が細胞傷害性薬剤および細胞増殖抑制剤からなる群から選択され、かつ、抗体が配列番号１４〜１７、４５、４７、８６０および８６２からなる群から選択される配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドと特異的に結合する）を含んでなる方法に関する。本方法の特定の態様では、ポリペプチドは配列番号３１〜３４、４６、４８、８５９および８６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００４５】
本発明はさらに、リンパ管内皮細胞を検出する方法であって、その細胞を、蛍光分子または放射性標識化分子などの検出可能な薬剤と結合した少なくとも一つの抗体を含んでなる組成物と接触させることを含んでなる方法に関する。特定の態様では、抗体は配列番号１４〜１７、４５、４７、８６０および８６２からなる群から選択される配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドと特異的に結合する。本方法のさらなる特定の態様では、ポリペプチドは配列番号３１〜３４、４６、４８、８５９および８６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００４６】
本発明はさらに、リンパ管内皮細胞を単離する方法であって、その細胞をその細胞の細胞膜のトランスメンブラン型タンパク質と結合することができる少なくとも一つの抗体を含んでなる固体マトリックスと接触させること、およびその抗体マトリックスと特異的に結合する細胞を単離することを含んでなる方法に関する。特定の態様では、抗体は配列番号１４〜１７、４５、４７、８６０および８６２からなる群から選択される配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドと特異的に結合する。本方法のさらなる特定の態様では、ポリペプチドは配列番号３１〜３４、４６、４８、８５９および８６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００４７】
本発明はまた、アゴニストまたはアンタゴニストのリンパ管内皮細胞への投与であって、リンパ管内皮細胞特異的タンパク質と特異的に結合することができる抗体、ペプチドまたは小分子量化合物（ここで、抗体、ペプチドまたは小分子量化合物が増殖因子受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、または造血系受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストである）を選択すること、および抗体、ペプチドまたは小分子量化合物を増殖刺激または抑制を必要とするリンパ管内皮細胞と接触させることを含んでなる投与に関する。特定の態様では、このようなリンパ管内皮細胞はリンパ水腫、リンパ管腫、リンパ管骨髄腫、リンパ管腫症、リンパ管拡張症、リンパ肉腫、およびリンパ管硬化症に関与している。
【００４８】
本発明はまた、細胞傷害性薬剤または細胞増殖抑制剤のリンパ管内皮細胞への投与であって、リンパ管内皮細胞特異的タンパク質と特異的に結合することができる抗体、ペプチドまたは小分子量化合物（ここで、抗体、ペプチドまたは小分子量化合物が細胞傷害性薬剤または細胞増殖抑制剤と複合体化されている）を選択することを含んでなる投与に関する。特定の態様では、リンパ系を通じて転移拡散する傾向にある悪性腫瘍疾患の治療においてこのような複合体の投与が有用である。
【００４９】
本発明はまた、内皮細胞に対する薬物の効力または毒性をモニタリングする方法であって、哺乳類被験体に薬物を投与する前および投与した後、その被験体の内皮細胞において少なくとも一つのＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子の発現を測定する工程（ここで、この少なくとも一つのＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子は表３または表４に示されるポリペプチドをコードし、かつ、ＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子の発現の変化は内皮細胞に対する薬物の効力または毒性と相関する）を含んでなる方法を提供する。
【００５０】
本発明は、配列番号１４〜１７からなる群から選択されるポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号１４〜１７のいずれか一つとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含んでなるリンパ管内皮細胞マーカータンパク質に関する。特定の態様では、リンパ管内皮細胞マーカータンパク質は配列番号３１〜３４からなる群から選択されるポリペプチドを含んでなる。
【００５１】
本発明はまた、配列番号３１〜３４からなる群から選択されるポリペプチドを含んでなるリンパ管内皮細胞マーカータンパク質と特異的に結合することができる抗体に関する。
【００５２】
本発明はさらに、リンパ管内皮細胞を検出する方法であって、その細胞を検出可能なように標識した抗体と接触させることを含んでなる方法に関する。
【００５３】
本発明はさらに、リンパ管内皮細胞の少なくとも一つの生物活性を阻害する方法であって、その細胞を、配列番号１４〜１７、４５、４７、８６０および８６２のいずれか一つによりコードされている少なくとも一つのポリペプチドと結合することができる薬剤と接触させること（ここで、薬剤と接触させていないポリペプチドの活性と比べてポリペプチドの活性を低下させる）を含んでなる方法に関する。
【００５４】
本発明はまた、リンパ管内皮細胞の増殖を阻害する方法であって、その細胞を、配列番号１〜３０、４５、４７、８６０および８６２からなる群から選択される少なくとも一つのポリヌクレオチドと特異的に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含んでなる方法に関する。特定の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号１〜３０、４５、４７、８６０および８６２のいずれか一つの約１２〜約２５の連続するヌクレオチドから本質的になる。
【００５５】
本発明のさらなる特徴および変形は本願の全てから当業者には分かるであろう。また、このような特徴の全てを本発明の態様とする。
【発明の詳細な説明】
【００５６】
リンパ管構造の主要な役割は、毛細血管から常に漏れ出る過剰な、タンパク質を豊富に含む間質液を除去すること、およびそれを血液循環に戻すことである(Witte, M.H., et al., Microsc. Res. Tech. 55:122-145頁. 2001; Karpanen, T., et al., J. Exp. Med. 194:F37-F42頁. 2001; Karkkainen, M.J., et al., Trends Mol. Med. 7:18-22頁. 2001)。さらに、リンパ系はリンパ液およびその抗原を一連のリンパ節で濾過することにより恒常的な免疫監視機構を提供し、また、腸管から脂質を吸収するための主要な経路の一つとしての役割も果たす。種々の癌ではリンパ管が腫瘍転移の主要な経路を提供し、局所リンパ節播種が疾病の進行と関係していることは長年知られていた。遺伝性リンパ水腫、術後の二次的なリンパ水腫およびフィラリア症におけるリンパ管閉塞は全て、外観を損ない、障害を引き起こす、リンパ管の機能不全または閉塞と関係がある患部の腫脹を特徴とする。Witte, M.J., et al., Microsc. Res. Tech 55:122-145頁 (2001)。
【００５７】
医学においてリンパ管が重要であるにもかかわらず、脈管系のこの部分についての細胞生物学は最近までほとんど注目されていなかった。過去４年間の研究で受容体チロシンキナーゼＶＥＧＦＲ−３に対するリガンドとしての機能を果たすリンパ管特異的血管内皮細胞増殖因子ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄの存在が発見され、リンパ管の正常な発生にとってのそれらの重要性が立証された（Jeltsch, M., et al., Science 276:1423-1425頁 (1997); Veikkola, T., et al., EMBO J. 20:1223-1231頁 (2001); Makinen, T., et al., Nat. Med. 7:199-205頁 (2001)を参照)。これらの分子はまた、リンパ水腫の発症およびリンパ行性転移に関与しているようにも思われる（Karpanen, T., et al., J. Exp. Med. 194:F37-F42頁 (2001); Karkkainen, M.J., et al., Trends Mol. Med. 7:18-22頁. 2001)。
【００５８】
増殖因子、血管内皮細胞増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）、ならびにＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｃ変異体および類似体をコードする、天然ヒト、非ヒト哺乳類、および鳥類ポリヌクレオチド配列については、１９９８年２月２日に出願され、国際公開番号ＷＯ９８／３３９１７として１９９８年８月６日に公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１９７３; Joukov et al., J. Biol. Chem., 273(12): 6599-6602頁 (1998); およびJoukov et al., EMBO J., 16(13): 3898-3911頁 (1997)（これらの全ては全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる）で詳細に記載されている。そこで詳細に説明されているように、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ（配列番号８６３）は、４１９個のアミノ酸からなるプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドとして、ヒト細胞において最初に作製されたものである。ヒトＶＥＧＦ−Ｃ（配列番号８６４）をコードするｃＤＮＡは、ブダペスト条約の規定によって、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 (USA)に寄託されている(寄託日  １９９５年７月２４日、ＡＴＣＣ受託番号  ９７２３１）。その他の種由来のＶＥＧＦ−Ｃ配列もまた、報告されている。例えば、引用することにより本明細書の一部とされるＧｅｎｂａｎｋ受託番号  ＭＭＵ７３６２０（ハツカネズミ）；およびＣＣＹ１５８３７（ウズラ）を参照。
【００５９】
プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは、多段階でプロセシングを受けて、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価されるように約２１〜２３ｋＤの成熟した、最も活性化されているＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド（配列番号８６３）を生み出す。このようなプロセシングとしては、シグナルペプチド（残基１〜３１）の切断；約２９ｋＤの部分的にプロセシングを受けた形態を生み出すカルボキシル末端ペプチド（およそアミノ酸２２８〜４１９に相当し、バルビア二環３タンパク質（ＢＲ３Ｐ）配列によく似たシステイン残基の間隔パターンを有する［Dignam et al., Gene, 88:133-40頁 (1990); Paulsson et al., J. Mol. Biol., 211:331-49頁 (1990)］)の切断；および約２１〜２３ｋＤの完全にプロセシングを受けた成熟形態を生み出すアミノ末端ペプチド（およそアミノ酸３２〜１０３に相当する）の（明らかに細胞外での）切断が挙げられる。部分的にプロセシングを受けた形態のＶＥＧＦ−Ｃ（例えば、２９ｋＤ型）はＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４受容体）と結合することができるのに対し、ＶＥＧＦＲ−２との高い親和性での結合は完全にプロセシングを受けた形態のＶＥＧＦ−Ｃでしか起こらないことが実験的証拠により立証された。ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは非ジスルフィド結合した二量体として自然に結合しているものと思われる。
【００６０】
ＶＥＧＦ−Ｃのアミノ酸１０３〜２２７は、その全てがＶＥＧＦ−Ｃ機能の維持に必要というわけではないことが示されてきた。アミノ酸１１３〜２１３（なお、残基１０３〜１１２および２１４〜２２７を欠いている）からなるポリペプチドはＶＥＧＦ−Ｃ受容体と結合し、それを刺激する能力を保持しているが、およそ残基１３１〜およそ残基２１１にわたるポリペプチド がＶＥＧＦ−Ｃ生物活性を保持していると推測される。１５６位のシステイン残基はＶＥＧＦＲ−２結合能力にとって重要であることが分かってきた。しかしながら、ＶＥＧＦ−ＣΔＣ１５６ポリペプチド（すなわち、欠失または置換によりこのシステインを欠いている類似体）はＶＥＧＦＲ−３の有力なアクチベーターであり続ける。ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの１６５位のシステインはいずれの受容体との結合にも必須であるが、８３または１３７位のシステインを欠いている類似体は両受容体との結合において天然ＶＥＧＦ−Ｃと競争し、両受容体を刺激する。
【００６１】
ＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦ−Ｃと構造および機能的に最も密接な関係がある［引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第６，２３５，７１３号および国際特許公開ＷＯ９８／０７８３２を参照］。ＶＥＧＦ−Ｄのポリヌクレオチド配列は配列番号８６６を参照；コードされているアミノ酸配列は配列番号８６５で示される。ＶＥＧＦ−Ｃと同様に、ＶＥＧＦ−Ｄは最初に、Ｎ末端およびＣ末端のタンパク質分解プロセシングを受け、非共有的に結合した二量体を形成するプレプロ−ペプチドとして発現される。ＶＥＧＦ−Ｄはin vitroで内皮細胞の細胞分裂誘起反応を刺激する。胚形成時に、ＶＥＧＦ−Ｄは複雑な時間的および空間的パターンで発現され、その発現は成人の心臓、肺、および骨格筋内にとどまる。ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣと呼ばれる、生物学的に活性なＶＥＧＦ−Ｄ断片の単離については、引用することにより本明細書の一部とされる国際特許公開ＷＯ９８／０７８３２に記載されている。ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣはアフィニティータグペプチド  ＦＬＡＧ（商標）、またはその他の配列と機能的に連結されたＶＥＧＦ−Ｄのアミノ酸残基９３〜２０１（配列番号２６）からなる。
【００６２】
プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドは２１個のアミノ酸からなる推定シグナルペプチドを有し、プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃのプロセシングと類似した様式でタンパク質分解プロセシングを明らかに受ける。残基１〜９２および２０２〜３５４を欠いている「組換えにより成熟した」ＶＥＧＦ−Ｄは受容体ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３を活性化する能力を保持し、非共有的に結合した二量体として結合していると思われる。よって、好ましいＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドとしては、アミノ酸９３〜２０１をコードするヌクレオチド配列を含んでなるこれらのポリヌクレオチドが挙げられる。機能温存修飾をＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドに導入するための上記指針はまた、機能温存修飾をＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドに導入するのにも好適である。本発明の別の態様として、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの代わりにＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドを使用する本発明の方法の実施が意図されている。
【００６３】
血管内皮細胞と比べて、リンパ管内皮細胞は特定の形態的および分子的特徴を示す。例えば、毛細リンパ管は毛細血管よりも大きく、赤血球を含まない不揃い、の、または崩れた内腔、細胞間結合部複合体をオーバーラップする不連続な基底膜、およびリンパ管内皮細胞を細胞外基質と繋ぐアンカーリングフィラメントを有する(Witte, M.H., et al., Microsc. Res. Tech. 55:122-145頁 (2001))。毛細血管とは異なり、毛細リンパ管は周皮細胞の被覆がない。分子レベルでは、ＶＥＧＦＲ−３、Ｐｒｏｘ−１転写因子、ヒアルロナン受容体  ＬＹＶＥ−１、膜ムコタンパク質  ポドプラニン、β−ケモカイン受容体  Ｄ６、細胞骨格タンパク質  デスモプラキンＩおよびIIならびにマクロファージマンノース受容体Ｉといったいくつかのリンパ管特異的マーカーが同定されている(Wigle, J.T. & Oliver, G., Cell 98:769-778頁 (1999); Banerji, S., et al., J. Cell Biol. 144:789-801頁 (1999): Breiteneder-Geleff, S., et al., Am. J. Pathol. 154:385-394頁 (1999): Nibbs, R.J., et al., Am. J. Pathol. 158:867-877頁 (2001); Ebata, N., et al., Microvasc. Res. 61:40-48頁. (2001); Irjala, H., et al., J. Exp. Med. 194:1033-1041頁 (2001))。本発明は遺伝子プロファイリングアプローチを利用した毛細リンパ管内皮細胞と血管内皮細胞の遺伝的同一性に関する。
【００６４】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」とは、オリゴヌクレオチドなどの核酸がその標的配列と特異的にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、さまざまな状況により異なる。長い核酸は短い配列よりも高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、特定の配列の規定のイオン強度およびｐＨでの融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔｍは平衡状態で標的配列と相補的な核酸の５０％が標的配列とハイブリダイズしている温度（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度条件下）である。「相補的な」とは、２つの核酸分子のヌクレオチド間の標準的なワトソン・クリック塩基対合を指す。通常、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３にて、かつ、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合、少なくとも約３０℃であり、長いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドの場合、少なくとも約６０℃である温度にて、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、通常、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（または他の塩）であるものである。ストリンジェントな条件はまた、当技術分野では公知のように、ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加により達成してもよい。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳおよび０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃にて２０時間のハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃にて３０分間の洗浄である。
【００６５】
本発明によれば、血管およびリンパ管内皮細胞で異なる遺伝子発現プロフィールが発見された。これらの結果は内皮細胞の表現型多様性を理解する上での新たな手掛かりとなり、血管形成またはリンパ管形成異常を特徴とする疾病の治療法に重要な標的を提供する可能性のある新たなリンパ管内皮分子候補を明確にしている。
【００６６】
炎症プロセス、ならびに細胞−細胞および細胞−基質相互作用が介在するプロセスに関わるタンパク質をコードする遺伝子の発現における違いを発見した。さらに、内皮細胞生物学において、これまで知られていなかった、２つの細胞系統において示差的に発現されるいくつかの遺伝子を同定した。シナプスの高分子の取り込み、ならびにシナプス形成および再構築（ニューロンのペントラキシンＩおよびII(Kirkpatrick, L.L., et al., J. Biol. Chem. 275:17786-17792頁. 2000）、シナプス小胞のトラフィッキング（ＮＡＰ−２２(Yamamoto, Y., et al., Neurosci. Lett. 224:127-130頁. 1997）、ピッコロ(Fenster, S.D., et al., Neuron 25:203-214頁 (2000)）、ならびに軸索成長および軸索誘導（Ｎｒ−ＣＡＭ(Grumet, M., Cell Tissue Res. 290:423-428頁 (1997)、リーリン(Rice, D.S. & Curran, T., Annu. Rev. Neurosci. 24:1005-1039頁 (2001)）に関与する遺伝子をはじめとするこれらの遺伝子のいくつかのものは、当初、神経組織からクローニングしていた。
【００６７】
さらに、ＬＥＣはとりわけ、当初、神経組織でクローニングされ、その組織で高く発現した、数多くのまだ同定されていない遺伝子を発現した（ＫＩＡＡ遺伝子(Kikuno, R., et al., Nucleic Acids Res. 30:166-168頁. 2002)。それゆえ、本明細書において開示する遺伝子発現プロファイリングデータは、神経系細胞のポジショニング制御、軸索成長円錐のそれらの特定の標的への誘導およびシナプス形成に関わる同じ分子機構が、脈管系の発生およびＢＥＣとＬＥＣの同定においても一般的に使用し得るという見方を裏づけている。神経系の発生において最初に記載される他のシグナル伝達分子は脈管構造の発生にすでに関与しており、またその逆もそうである(Shima and Mailhos, Curr. Opin. Genet. Dev. 10:536-542頁 (2000); Oosthuyse, et al., Nat. Genet. 28:131-138頁 (2001); Sondell, et al., Eur. J. Neurosci. 12:4243-4254頁 (2000))。
【００６８】
ＬＥＣでは、平滑筋細胞（ＳＭＣ）および周皮細胞で発現することがこれまでに分かっている、マトリックス  Ｇｌａ、血管および組織石灰化の阻害に関わるミネラル結合細胞外基質タンパク質(Luo, G., et al., Nature 386:78-81頁 (1997))、モノアミンオキシダーゼＡ、モノアミンホルモンおよび神経伝達物質の主要な分解酵素(Rodriguez, M.J., et al., Cell Tissue Res. 304:215-220頁 (2001))、インテグリンα９ (Palmer, E.L., et al., J. Cell Biol. 123:1289-1297頁 (1993))およびアポリポタンパク質Ｄ(Hu, C.Y., et al., J. Neurocytol. 30:209-218頁 (2001))などの数種類の遺伝子の発現が見られた。ＬＥＣおよびＳＭＣ間の遺伝子発現パターンの類似は、毛細リンパ管周囲のＳＭＣが欠如していることといくぶん関係している。それどころか、ＬＥＣはそれ自身でＳＭＣの機能をいくらか果たしていることがある。例えば、リンパ流はＬＥＣが本来持っている血管ＳＭＣの収縮能力によく似た収縮性により維持されている(Witte, M.H., et al., Microsc. Res. Tech. 55:122-145頁 (2001))。
【００６９】
リンパ管および血管の分子識別は血管および／またはリンパ管の病気の研究に、また、このような病気の標的治療には必須である。今日までに、いくつかのリンパ管内皮特異的なマーカーを同定したが、それらの中にはリンパ管のサブセットでのみ発現されるものもあれば、いくつかの血管内皮細胞または他の細胞種で起こるものもあり、また、それらの発現パターンは病的状態において変化する可能性がある(例えば、ＶＥＧＦＲ−３(Valtola, R., et al., Am. J. Pathol. 154:1381-1390頁. 1999))。本発明の新たな血管マーカーの同定は、病的状況にある血管およびリンパ管のより信頼度の高い解析を、最終的にはよりよい診断および治療を提供するはずである。さらに、血管形成および／またはリンパ管形成の調節に関わる特定の分子の機能の阻害により腫瘍増殖および転移を予防することが知られているが、病的状態によっては血管またはリンパ管の増殖の促進が有益であることも分かってきた。よって、本発明により同定されるＢＥＣおよびＬＥＣ特異的な分子レギュレーターは血管形成およびリンパ管形成異常を特徴とする疾病の治療に新たな標的を提供するであろう。
【００７０】
新たなＬＥＣ遺伝子のうちいくつかのものはリンパ管内皮細胞に対して特異的な分子マーカーであるトランスメンブラン型タンパク質をコードする（表６）。これらの遺伝子およびコードされるタンパク質はリンパ管の病気の標的治療に有用である。また、ＬＥＣ特異的タンパク質に対する抗体を病的および生理学的状況にある血管とリンパ管を区別するのに用いることができるため、これらも抗体の作製に有用である。抗体はまた、リンパ管内皮細胞の単離にも有用である。これらのタンパク質はまた、リンパ管形成の調節でも役割を果たし、リンパ水腫などのリンパ管の病気に関する新たな候補遺伝子を提供することができる。
【００７１】
リンパ管内皮細胞特異的な表面分子は、増殖因子受容体、サイトカインおよびケモカイン受容体、およびヘモポイエチン受容体のシグナル伝達、細胞接着ならびに細胞外基質または他の細胞表面分子との細胞相互作用に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る抗体、ペプチドおよび小分子量化合物を用いた分子薬剤ターゲッティングに用いることができる。このような分子はまた、細胞傷害性薬剤または細胞増殖抑制剤のリンパ管内皮細胞へのターゲッティングに、また、リンパ管と関わりのある疾病の過程をイメージングするための電子密度の高い、放射線不透性のまたは放射性のマーカーの結合に用いることもできる。このような疾病としては、リンパ水腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管腫症、リンパ管拡張症、リンパ肉腫およびリンパ管硬化症が挙げられる。
【００７２】
リンパ管内皮細胞表面分子は、例えば、抗体でコーティングしたリポソーム（カーゴとしてタンパク質または遺伝子を含有する）による遺伝子治療またはウイルス性形質導入ベクター、例えば、キャプシド／外膜タンパク質を改変したアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスによる遺伝子治療のターゲッティングに用いてもよい。リンパ管内皮細胞特異的な分子の取扱いは、リンパ管壁を流れる液体輸送の増加による、例えば、内皮細胞−細胞または細胞−基質相互作用の調節による、または経内皮輸送の促進を介する組織の浮腫と関わりのある疾病の過程の治療に適用できる。リンパ管内皮細胞の、例えば、細胞傷害性または細胞増殖抑制性化合物を用いるターゲッティングは、リンパ系を通じて転移拡散する傾向にある悪性腫瘍疾患において有益であると考える。
【００７３】
リンパ管内皮細胞分子は、リンパ管内皮細胞のin vitro増殖、ならびに術後やさまざまなリンパ水腫などでリンパ管が損傷を受けている疾病で用いるリンパ管のin vitro組織工学の向上も可能にし得る。細胞表面タンパク質のリガンドはさらに、例えば、バイオインプラントの細胞接着に向けた種々の高分子基質のコーティングにも適用し得る。
【００７４】
リンパ管内皮細胞特異的な分子、例えば、表面分子は、白血球遊走および免疫認識、ならびに二次的免疫応答の誘導に関与する炎症、自己免疫および感染プロセスの調節のための重要なツールを提供することができる。このようなプロセスとしては、抗原提示細胞の、リンパ節をはじめとするリンパ系への遊走、ならびにリンパ球および他の白血球サブクラスの経内皮細胞トラフィッキングおよびあらゆる種類の白血球のホーミング、生存および機能が挙げられる。
【００７５】
これらの分子は腸管からの脂肪酸／カイロミクロン（chylomicron）吸収および種々の器官内の脂肪組織、例えば、皮下組織および動脈壁における脂肪蓄積の調節をはじめとする脂肪酸の代謝の調節を可能にする。
【００７６】
リンパ管内皮細胞特異的な分子はさらに、腸管からの脂肪酸／カイロミクロン吸収および種々の器官内の脂肪組織、例えば皮膚の皮下組織および動脈壁における脂肪蓄積の調節をはじめとする脂肪酸の代謝の調節を可能にする。
【００７７】
リンパ管細胞特異的なトランスメンブラン型タンパク質は、細胞接着（例えば、リンパ管内皮細胞−リンパ管内皮細胞間、リンパ管内皮細胞−平滑筋細胞間、リンパ管内皮細胞−免疫系細胞（例えば、リンパ球または樹状細胞）間の接着）、細胞−細胞外基質接触において、または受容体、例えば、増殖因子、サイトカイン、ケモカインもしくは微生物受容体もしくはイオンチャネルとして作用すると思われる。トランスメンブラン型タンパク質は細胞増殖、細胞移動、細胞アポトーシス、細胞分化もしくは細胞接着または内皮細胞に特異的な他の細胞機能、例えば、白血球に対する接着受容体の発現、一酸化窒素の放出、抗凝固タンパク質、周辺組織からの液体およびタンパク質の取り込みおよび腸管または脂肪組織から脂肪の取り込みを誘導し得る細胞内分子と連結している。短い細胞内ドメインを有するＴＭタンパク質は他のＴＭタンパク質との複合して補助受容体の役割を果たすことができる。
【００７８】
トランスメンブラン型タンパク質およびそれらの細胞内結合相手分子は正常状態および病気の状態にあるリンパ管内皮細胞の分子マーカーとして用いることができるし、また、病的および生理学的状況にある血管とリンパ管を区別するのに用いることができる。
【００７９】
リンパ管特異的なトランスメンブラン型タンパク質に対する抗体、ならびにペプチドおよび小分子化合物のリンパ管特異的なＴＭタンパク質の細胞外ドメインとの結合を、リンパ管と関わりのある疾病の過程をイメージングするための電子密度の高い、放射線不透性のまたは放射性のマーカーの結合に用いることもできる。このような疾病としては、リンパ水腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管腫症、リンパ管拡張症、リンパ肉腫およびリンパ管硬化症が挙げられる。同様に、例えば、リンパ水腫においてなど、リンパ管の増殖不全を患う患者の治療中、あるいは、例えば、腫瘍におけるリンパ管の増殖の阻止を目的とした治療中にリンパ管を視覚化し、その結果、本発明の治療法のモニタリングを容易にすることができる。
【００８０】
ＬＥＣ特異的なＴＭタンパク質に対する抗体はリンパ管内皮細胞の単離に有用であるとも思われる。
【００８１】
リンパ管特異的なトランスメンブラン型タンパク質に対する抗体、またはペプチドもしくは小分子化合物のリンパ管特異的なＴＭタンパク質の細胞外ドメインとの結合は、リンパ管内皮細胞への、例えば、抗体、ペプチドまたは小分子化合物を細胞傷害性または細胞増殖抑制性化合物と結合させることによる、薬剤送達ターゲッティングにおいても有用であると思われる。このように結合する化合物は、リンパ系を通じて転移拡散する傾向にある悪性腫瘍疾患の治療において、さらに、このような疾病に関係のある症状の改善において治療用物質として有用である。抗体、ペプチドまたは小分子化合物はまた、増殖因子、サイトカインおよびケモカインなどの刺激リンパ管内皮分子と結合して刺激を促進することもできる。
【００８２】
さらに、リンパ管特異的なＴＭタンパク質に対する抗体、ペプチド、または小分子化合物のリンパ管特異的なＴＭタンパク質の細胞外ドメインとの結合は、例えば、抗体でコーティングしたリポソーム（カーゴとしてタンパク質、遺伝子または他の分子を含有する）による遺伝子治療またはウイルス性形質導入ベクター、例えば、キャプシド／外膜タンパク質を改変したアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスなどによる遺伝子治療のターゲッティングに用いてもよい。リンパ管内皮細胞特異的な分子の取扱いは、リンパ管壁を流れる液体輸送の増加による、例えば、内皮細胞−細胞または細胞−基質相互作用の調節による、または経内皮輸送の促進による感染、外科処置、放射線治療または遺伝的欠陥から起こる可能性のあるリンパ管の相対的な欠如、または相対的な機能異常という要因を背景とした組織の浮腫と関わりのある疾病の過程の治療に適用できると思われる。
【００８３】
リンパ管内皮細胞分子は、リンパ管内皮細胞のin vitro増殖、ならびに術後やさまざまなリンパ水腫などでリンパ管が損傷を受けている疾患または疾病の治療に、また、本明細書に記載するような他の用途に用いるリンパ管のin vitro組織工学を向上させると思われる。細胞表面タンパク質のリガンドはさらに、例えば、バイオインプラントの細胞接着に向けた種々の高分子基質へのコーティングとしても適用し得る。
【００８４】
白血球遊走および免疫認識に関与する炎症、自己免疫および感染プロセス、例えば、抗原提示細胞の、リンパ節をはじめとするリンパ系への遊走、ならびにリンパ球および他の白血球サブクラスの経内皮細胞トラフィッキングおよびあらゆる種類の白血球のホーミング、生存および機能は、これらの細胞接着プロセスを媒介している内皮細胞特異的なＴＭタンパク質をターゲッティングすることにより調節することができる。
【００８５】
リンパ管特異的な遺伝子の、例えば、癌におけるアップレギュレーションは診断マーカーとして有用であると考えられ、このようにアップレギュレートされた発現の、リンパ管内皮細胞特異的なタンパク質に対する抗体を用いた、例えば、組織の免疫染色によるまたはリンパ管内皮細胞特異的なｍＲＮＡと、例えば、本明細書に記載するようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るプローブを用いることによるモニタリングが意図される。
【００８６】
リンパ管内皮細胞特異的な転写因子は、胚幹細胞、内皮前駆細胞、または血管内皮細胞からのリンパ管内皮細胞の分化に有用であると思われる。
【００８７】
リンパ管内皮転写因子は、リンパ管内皮細胞のin vitro増殖を向上させ、さらに術後やさまざまなリンパ水腫などでリンパ管が損傷を受けている疾患または疾病の治療に、また、本明細書にて開示する他の用途に用いるリンパ管のin vitro組織工学を促進すると思われる。
【００８８】
リンパ管内皮細胞増殖、分化、アポトーシス、移動または接着を調節するシグナル伝達経路に関与している細胞内シグナル伝達タンパク質は、これらのシグナル伝達事象、およびこのようなシグナル伝達に依存した細胞機能を阻害する小分子化合物の有用な標的であると思われる。シグナル伝達タンパク質はまた、ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達経路にも関与していると考えられ、ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達により少なくとも部分的に制御される細胞の活動、例えば、リンパ管形成を調節するのに有用であると思われる。
【００８９】
リンパ管内皮細胞分子は、リンパ管内皮細胞のin vitro増殖、ならびに術後やさまざまなリンパ水腫などでリンパ管が損傷を受けている疾病または疾患の治療に、また、本明細書に記載するような他の用途に用いるリンパ管のin vitro組織工学を向上させると思われる。
【００９０】
リンパ管特異的な転写因子はまた、例えば、血管内皮細胞または内皮前駆細胞において他のリンパ管特異的な遺伝子の発現を誘導するように内皮細胞における遺伝子発現を調節するのに有用であると思われる。
【００９１】
リンパ管特異的な遺伝子転写物は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による発現阻止に向けた有用な標的を提供すると思われる。ＲＮＡｉ技術は、本発明の方法、例えば、過剰増殖性および過少増殖性の内皮細胞関連疾病および疾患を治療するのに有効な治療法、ならびに、このような疾病または疾患の症状を改善する方法において有用であると思われる。ＲＮＡｉ方法論は当技術分野では公知であり、知られているＲＮＡｉ技術は本発明の種々の態様において有用であると考えられる。その各々が引用することにより本明細書の一部とされるFire et al., Nature 391:806-811頁. (1998)およびSharp, P., Genes and Dev. 13:139-141頁. (1999)を参照。ＲＮＡｉ化合物は発現の所望の標的のコード領域の一部または全てに相当する二本鎖ＲＮＡ分子であることが好ましい。
【００９２】
記載したように、新規ＬＥＣ遺伝子のいくつかのものは、細胞の運命を制御し得（イロクォイ(iroquois)関連ホメオボックス遺伝子）、リンパ管内皮細胞の分化において重要な役割を有し得る転写因子をコードしている。本明細書にて開示する転写因子は、例えば、リンパ管内皮細胞の増殖に関与する遺伝子の転写を制御し得、リンパ管の増殖の重要な分子レギュレーターであり得る（表５）。リンパ管内皮細胞特異的な転写因子は、胚幹細胞、内皮前駆細胞、または血管内皮細胞からのリンパ管内皮細胞の分化に用いることができる。
【００９３】
リンパ管内皮転写因子は、リンパ管内皮細胞のin vitro増殖、ならびに術後やさまざまなリンパ水腫などでリンパ管が損傷を受けている疾病で用いるリンパ管のin vitro組織工学の向上も可能にし得る。
【００９４】
本発明のポリヌクレオチド
一般に、本発明の単離されたポリヌクレオチドとしては、示差的発現を示す、表３、４、１４、１５および１６に示されたＬＥＣおよびＢＥＣポリヌクレオチドが挙げられる。これらのポリヌクレオチドの配列を、該当する場合には、これらの既知のデータベース受託番号とともに表１６に示している。表１４および１５では、これらの受託番号は固有の配列識別子に対応しているため、引用された配列識別子により受託番号の確認が可能である。ポリヌクレオチド配列はコード領域を含んでよく、また、当業者ならば容易に確認できる非コードフランキング配列を含んでもよい。本発明は、フランキング領域、例えば、ポリＡ配列、５’非コード配列などを含んでも含まなくてもよいコード領域の一部または全てを含んでなるポリヌクレオチドを意図する。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、限定されるものではないが、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１のいずれか一つのヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド；中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１のいずれか一つのヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド；上記ポリヌクレオチドの変異型対立遺伝子であるポリヌクレオチド；上記タンパク質の種間相同物をコードするポリヌクレオチド；または配列番号３１〜４４、４６、４８、５０および５２のいずれか一つポリペプチドの特定のドメインまたは末端切断部分を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも挙げられる。このようなポリヌクレオチドは上記の条件下で配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１のいずれか一つの相補体と、または配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１のいずれか一つの断片（ここで、断片は少なくとも約１０ｂｐより大きく、また、代わりの態様では、約２０〜約５０ｂｐであり、または、必要に応じて、約１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、または８００ｂｐより大きい）とハイブリダイズする。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドはまた、上記ポリヌクレオチドの変異体であるポリヌクレオチドを提供する。通常、このような変異配列は本明細書に記載したものの一つと約２０％異なっているに過ぎない、すなわち、対応する参照配列と比べた際の類似配列中のヌクレオチドの置換、付加、および／または欠失数を変異配列中の全ヌクレオチド数で除すと約０．２以下である。このような配列を、記載した配列と８０％配列同一性を有するという。このような変異配列は上述のアルゴリズムの適用により慣例的に確認することができる。
【００９６】
一つの態様では、本発明の変異ポリヌクレオチド配列は記載した配列と１０％異なっているに過ぎない、すなわち、対応する参照配列と比べた際の変異配列中のヌクレオチドの置換、付加、および／または欠失数を変異配列中の全ヌクレオチド数で除すと約０．１以下である。このような配列を、記載した配列と９０％配列同一性を有するという。このような変異配列は上述のアルゴリズムの適用により慣例的に確認することができる。
【００９７】
代わりの態様では、本発明の変異配列は記載した配列と５％異なっているに過ぎない、すなわち、対応する参照配列と比べた際の変異配列中のヌクレオチドの置換、付加、および／または欠失数を変異配列中の全ヌクレオチド数で除すと約０．０５以下である。このような配列を、記載した配列と９５％配列同一性を有するという。このような変異配列は上述のアルゴリズムの適用により慣例的に確認することができる。
【００９８】
さらにもう一つの代わりの態様では、本発明の変異配列は記載した配列と２％異なっているに過ぎない、すなわち、対応する参照配列と比べた際の変異配列中のヌクレオチドの置換、付加、および／または欠失数を変異配列中の全ヌクレオチド数で除すと約０．０２以下である。このような配列を、記載した配列と９８％配列同一性を有するという。このような変異配列は慣例的に確認することができる。
【００９９】
本発明のポリヌクレオチドを種々の他のヌクレオチド配列と十分に確立された組換えＤＮＡ技術により連結してもよい(Sambrook J et al. (第二版; 1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYを参照)。ポリペプチドとの連結に有用なヌクレオチド配列としては、当技術分野では周知のベクター、例えば、プラスミド、コスミド、λファージ誘導体、ファージミドなどの取り合わせが挙げられる。よって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよびそのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。一般に、ベクターは少なくとも一種の生物において機能的な複製起点、便宜な制限エンドヌクレアーゼ部位、および宿主細胞の選択マーカーを含む。本発明のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、配列決定ベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。本発明の宿主細胞は原核細胞または真核細胞であってよく、また、単細胞生物または多細胞生物の一部であってよい。当業者ならば多数の好適なベクターおよびプロモーターを知っており、本発明の組換え構築物を作製する際にはこれらは商業的に入手可能である。
【０１００】
本発明の範囲にある配列は本明細書にて記載した特定の配列に限定されないだけでなく、その変異型対立遺伝子も包含する。変異型対立遺伝子は、配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１のいずれか一つで示される配列、その典型中間断片、または配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１のいずれか一つと少なくとも９９．９％同一なヌクレオチド配列を、同一種の別の単離物の配列と比較することにより慣例的に決定することができる。さらに、コドンの変化に対応するように、本発明は本明細書にて開示する特定のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の場合のように、同一アミノ酸配列をコードする核酸分子を包含する。言い換えると、ＯＲＦのコード領域において、一つのコドンが同一アミノ酸をコードする別のものと置換されていることが明確に意図される。
【０１０１】
本明細書に別途規定のない限り、全ての用語は当技術分野で公知であるように、例えば、引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第６，３５０，４４７号で使用されているように定義される。
【０１０２】
また、本発明のＬＥＣまたはＢＥＣポリヌクレオチドの配列に基づくアンチセンスポリヌクレオチドも意図される。このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、表３、４、１４〜１６に記載の配列で、また、本開示内容を通じて示される、ＬＥＣおよびＢＥＣにおいて示差的に発現される本発明のポリヌクレオチド、またはその断片の配列と実質的に相補的であり（例えば、少なくとも９０％相補性）、好ましくは、完全に相補的である。これらのポリヌクレオチド配列としては、配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１のいずれか、または少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含んでなるその断片が挙げられる。アンチセンス核酸はタンパク質をコードする「センス」核酸と相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的であるか、またはｍＲＮＡ配列と相補的である）ヌクレオチド配列を含んでなる。アンチセンスヌクレオチドの設計および最適化に関する方法については、Lima et al., (J Biol Chem, ;272:626-38頁. 1997)およびKurreck et al., (Nucleic Acids Res., ;30:1911-8頁. 2002)で記載されている。一つの態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０または５００のヌクレオチドまたは全コード鎖と相補的である配列を含んでなるアンチセンス核酸分子が提供される。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野では公知の手順を用いる化学合成または酵素的ライゲーション反応により構築することができる。
【０１０３】
一つの態様では、アンチセンス核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。「コード領域」とは、アミノ酸残基へと翻訳されるコドンを含んでなるヌクレオチド配列の領域を指す。別の態様では、アンチセンス核酸分子は、ポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コンシーディング(conceding)領域」に対してアンチセンスである。「コンシーディング領域」とは、アミノ酸へと翻訳されないコード領域にフランキングする５’および３’配列(すなわち、５’および３’非翻訳領域ともいう）を指す。
【０１０４】
本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンとクリックまたはホーホステーン(Hoogsteen)の塩基対合ルールに従い、設計することができる。アンチセンス核酸分子は、本発明のポリヌクレオチドのｍＲＮＡの全コード領域と相補的であり得るが、より好ましくは、ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部に対してのみアンチセンスなオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長である。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野では公知の手順を用いる化学合成または酵素的ライゲーション反応により構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然ヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を高めるように、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二本鎖（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを用いてもよい）の物理学的安定性を高めるように設計された、種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学合成することができる。
【０１０５】
本発明のアンチセンス核酸分子は、それらが相補ポリヌクレオチドをコードする細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、または結合することにより、（例えば、転写および／または翻訳を阻止することによって）タンパク質の発現を阻害するように、通常、被験体に投与されるか、またはin situで生成される。ハイブリダイゼーションは従来のヌクレオチド相補性を反映し、安定した二本鎖を形成する、または、例えば、ＤＮＡ二本鎖と結合するアンチセンス核酸分子の場合では二重らせんの主溝における特定の相互作用による。
【０１０６】
本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位への直接注入が挙げられる。また、アンチセンス核酸分子は、選択される細胞をターゲッティングするように改変した後、全身投与してもよい。例えば、全身投与では、アンチセンス分子を、それらが選択された細胞の表面で発現される受容体または抗原と特異的に（例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面受容体または抗原と結合するペプチドまたは抗体と結合させることにより）結合するように改変してもよい。本発明ではアンチセンス治療にさらなる経路、例えば、局所投与、経皮投与［Brand in Curr. Opin. Mol. Ther. 3:244-8頁. 2001で概説される］ ナノ粒子系を用いるアンチセンス投与［Lambert et al., Adv. Drug. Deliv. Rev. 47:99-112頁. 2001］、またはペプチドと結合したアンチセンスヌクレオチドの投与［Juliano et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 2:297-303頁. 2000］を利用してもよい。
【０１０７】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドの、遺伝子治療に向けた使用またはＬＥＣ遺伝子の活性を調節し得、また、リンパ水腫などのＬＥＣ疾患の治療法において有用である本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを作製する組換え発現ベクターでの使用を意図する。本発明のポリペプチドをコードする機能遺伝子の好適な細胞への送達はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルス）をはじめとするベクターによりex vivo、in situ、もしくはin vivo で、または物理的ＤＮＡ導入法（例えば、リポソームまたは化学処理)によりex vivoで達成される。例えば、Anderson, Nature, 第392巻の増補、第6679号、25-20頁 (1998)を参照。遺伝子治療技術のさらなる概説については、Friedmann, (Science, 244: 1275-1281頁. 1989); Verma, (Scientific American: 263:68-72頁, 81-84頁. 1990); およびMiller, (Nature, 357: 455-460頁. 1992)を参照。本発明のヌクレオチドのいずれか一つまたは本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の導入はまた、染色体外基質（一時的発現）または人工染色体（安定した発現）で達成してもよい。また、このような細胞を増殖させ、または 細胞に対する所望の効果、または細胞における活性を生じさせるために、細胞をex vivoで、本発明のタンパク質の存在下にて培養してもよい。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現するベクターを含んでなる細胞をex vivoで培養し、ＬＥＣ疾病または疾患の治療を必要とする個体に投与してもよい。
【０１０８】
核酸構築物についての上述の開示内容によれば、配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１のいずれかの配列を含んでなる遺伝子の遺伝子産物を日常的な組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術によって作製することができる。種々の発現ベクター／宿主系を利用して、コード配列を含め、発現させてもよい。これらとしては、限定されるものではないが、微生物、例えば、組換えバクテリオファージで形質転換した細菌、プラスミド、ファージミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクター；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で形質転換するか、または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系さえもが挙げられる。組換えタンパク質産生に有用である哺乳類細胞としては、限定されるものではないが、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞(例えば、ＣＯＳ−７）、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２およびＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。
【０１０９】
本発明のポリペプチド
一般に、本発明の単離されたＬＥＣおよびＢＥＣポリペプチドは、上記の、示差的に発現される本発明のＬＥＣおよびＢＥＣポリヌクレオチドによりコードされる。ＬＥＣおよびＢＥＣポリペプチドの配列を、該当する場合には、これらの既知のデータベース受託番号とともに表１６に示している。表１４および１５では、これらの受託番号は固有の配列識別子に対応しているため、引用された配列識別子により受託番号の確認が可能である。本発明の単離されたポリペプチドとしては、限定されるものではないが、配列番号３１〜４４、４６、４８、５０および５２のいずれか一つで示されるアミノ酸配列もしくは配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１で示されるヌクレオチド配列のいずれか一つによりコードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または対応する全長もしくは成熟タンパク質が挙げられる。本発明はまた、配列番号３１〜４４、４６、４８、５０および５２で示されるアミノ酸配列のいずれかの生物学的に活性、または免疫学的に活性な変異体、または対応する全長もしくは成熟タンパク質を提供する。好適な変異ポリペプチドは、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、一般的には、少なくとも約９５％、９６％、９７％、より一般的には、少なくとも約９８％、または最も一般的には、少なくとも約９９％アミノ酸同一性であり、かつ、生物活性を保持する配列を有する。本明細書にて開示する配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含んでなり、かつ、対応する全長タンパク質の生物活性を示し得る本発明のタンパク質の断片もまた、本発明に含まれる。
【０１１０】
タンパク質のコード配列は配列表で、開示されたヌクレオチド配列の翻訳により確認される。このようなタンパク質の成熟型は、全長ポリヌクレオチドの好適な哺乳類細胞または他の宿主細胞での発現により得られる。成熟型タンパク質の配列はまた、全長型アミノ酸配列からも決定することが可能である。本発明のタンパク質が膜結合する、可溶型タンパク質もまた提供される。このような形態では、タンパク質が発現される細胞からそれが十分に分泌されるように、タンパク質の膜結合を引き起こす領域の一部または全てが欠失している。
【０１１１】
当技術分野では公知の種々の方法論を用いて、本発明の単離されたポリペプチドまたはタンパク質のいずれか一つを得ることができる。最も簡単なレベルでは、商業的に入手可能なペプチド合成装置を用いてアミノ酸配列を合成することができる。あるいは、本発明のポリペプチドおよびタンパク質を、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するよう改変した細胞から精製してもよい。本明細書においては、細胞が通常では生成しないか、または 通常では低レベルでしか生成しないポリペプチドまたはタンパク質を生成するように細胞が遺伝子操作により作製されるとき、細胞が所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するよう改変されたという。当業者ならば、本発明のポリペプチドまたはタンパク質のうちの一つを生成する細胞を作製するために、組換え配列または合成配列のいずれかを真核細胞または原核細胞へと導入し、発現するための手順を容易に適合させることができる。
【０１１２】
ポリペプチドの「断片」とは、ペプチドコア、ペプチドコアの変異体、またはポリペプチドの細胞外領域などの分子のいろいろな部分を意味する。ポリペプチドの「変異体」とは、構造および生物活性において 完全分子、またはその断片のいずれかと実質的に類似している分子を意味する。よって、２つの分子が類似した活性を有するならば、たとえ分子のうちの一つの組成または二次、三次、もしくは四次構造が他のもので見られるものと同一でなくても、またはアミノ酸残基の配列が同一でなくても、それは本明細書において使用される用語の「変異体」とみなされる。ポリペプチドまたは遺伝子配列の「類似体」とは、機能および構造において単離されたポリペプチドまたは遺伝子配列と実質的に類似しているタンパク質または遺伝子配列を意味する。
【０１１３】
保存的アミノ酸置換は、とりわけ、このような置換の数が小さい場合に生物学的または免疫学的活性を保持するポリペプチドを生じさせると思われる配列番号３１〜４４、４６、４８、５０および５２配列のいずれか一つを含んでなる精製および単離されたポリペプチドに対して行われるものであることは本明細書において分かる。「保存的アミノ酸置換」とは、類似した化学的特性の側鎖を有するアミノ酸とのアミノ酸置換を意味する。保存的置換を行うための類似アミノ酸としては、酸性側鎖（グルタミン酸、アスパラギン酸）；塩基性側鎖（アルギニン、リジン、ヒスチジン）；極性アミド側鎖（グルタミン、アスパラギン）；疎水性脂肪族側鎖（ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）；芳香族側鎖（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）；小型側鎖（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）；または脂肪族ヒドロキシル側鎖（セリン、スレオニン）を有するものが挙げられる。
【０１１４】
マイクロアレイ
本発明の別の態様は、特定の細胞種に固有の遺伝子発現パターンの検出および特定の細胞種、例えば、リンパ管内皮細胞の発現パターンの変化の検出に用いる複数のポリヌクレオチドプローブを含んでなる組成物である。例えば、本発明は、配列表に記載されるポリヌクレオチド配列から選択される少なくとも１０の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含んでなるマイクロアレイなどのアレイを包含する。
【０１１５】
また、配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１からなる群から選択される少なくとも１０の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含んでなるマイクロアレイも意図される。本発明のマイクロアレイは少なくとも３のポリヌクレオチドを含んでなる（なお、並べられる各ポリヌクレオチドは配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１からなる群から選択される異なる配列を有する）。このようなマイクロアレイはまた、複製ポリヌクレオチドおよびさらなるポリヌクレオチド、例えば、マイクロアレイを用いるハイブリダイゼーションに基づくアッセイに用いる対照ポリヌクレオチドを含んでもよい。４以上の異なる本発明のポリヌクレオチド、例えば、少なくとも５、７、９、２０、５０以上のこのようなポリヌクレオチドを含む、マイクロアレイをはじめとするアレイは、種々の内皮細胞種などの生体サンプルを微細に区別する能力、またはこのようなアレイの広い用途において、例えば、特定の内皮細胞に関するスクリーニング、異常または病気の細胞および組織などに関するスクリーニングにおいて、異なる、一般的には高い信頼度を与える能力を有する本発明のアレイとして認識される。
【０１１６】
「マイクロアレイ」とは、ハイブリダイズ可能なアレイエレメントの規則正しい配列を指す。アレイエレメントは、好ましくは、少なくとも３以上の異なるアレイエレメント、より好ましくは、少なくとも１００のアレイエレメント、最も好ましくは、少なくとも１，０００のアレイエレメントが固体支持体上に存在するように配列される。好ましくは、固体支持体は１ｃｍ２基質表面、ビーズ、紙、ナイロンもしくはその他各種メンブラン、フィルター、チップ、ガラススライド、または他の好適な固体支持体である。アレイエレメント各々からのハイブリダイゼーションシグナルは個々に識別できる。好ましい態様では、アレイエレメントはポリヌクレオチドプローブを含んでなる。
【０１１７】
ハイブリダイゼーションとは、２以上の核酸を塩基対合に好適な条件下で接触させることを意味する。ハイブリダイゼーションは、部分的または完全に相補的な核酸間の相互作用を含む。好適なハイブリダイゼーション条件については、当業者ならば周知である。特定の用途においては、低ストリンジェンシー条件を求めることが好ましい。これらの条件下では、たとえ相互作用している鎖の配列が完全に相補的ではなくてもハイブリダイゼーションが起こるが、一つ以上の位置でミスマッチする可能性がある。当技術分野における情報に従い、条件を調整することにより、例えば、塩濃度を高めるおよび／または温度を下げることにより条件のストリンジェンシーを下げてもよい。好適なハイブリダイゼーション条件は、遺伝子などの同定可能な発現ユニットの遺伝子発現の検出を可能にする条件である。好ましいハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％硫酸デキストランを含有する溶液（すなわち、ハイブリダイゼーション溶液）中、４２℃にてのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する洗浄液中、６５℃にて３０分間の洗浄などのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件である。Ausubel, et al. (編), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), 6.0.3〜6.4.10頁に記載されるように、温度およびバッファー、または塩濃度を変化させることにより等価なストリンジェンシー条件を達成することができることは当技術分野では理解される。ハイブリダイゼーション条件の変更は、経験的に判断してもよいし、またはプローブの長さおよびグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対合の割合に基づいて正確に算出してもよい。ハイブリダイゼーション条件は、Sambrook, et al., (編), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (第二版; 1989), 9.47〜9.51頁に記載のように算出してもよい。
【０１１８】
本発明のプローブおよびプライマーを使用する一つの方法は、ヒト細胞における遺伝子発現の検出においてである。ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてもよいが、通常、標的は発現されたＲＮＡである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび標的結合部位（すなわち、配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１で示される配列のサブセットに相当するプローブの配列）を変更することにより、相同性の違いに応じたハイブリダイゼーションが起こると思われる。
【０１１９】
マイクロアレイは、多数の標的ポリヌクレオチドの大規模遺伝子発現解析に用いることができる。マイクロアレイはまた、疾病の診断および治療のモニタリングに用いることもできる。さらに、マイクロアレイはある疾病に対する個体の疾病素因を調査するのに使用することができる。さらに、マイクロアレイは感染、薬物治療などに対する細胞応答を調査するのに使用することができる。
【０１２０】
核酸プローブは、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡまたはｍＲＮＡポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、あるいはペプチド核酸、分枝ＤＮＡなどのようなＲＮＡ様もしくはＤＮＡ様物質であってよい。プローブはセンスまたはアンチセンスヌクレオチドプローブであってよい。標的ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、プローブはセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかである。標的ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、プローブは相補的一本鎖である。一つの態様では、プローブはｃＤＮＡである。目的のＤＮＡ配列の大きさは多様であり、好ましくは、１００〜１０，０００ヌクレオチド、より好ましくは、１５０〜３，５００ヌクレオチドである。
【０１２１】
プローブは当技術分野では周知の種々の合成的または酵素的技術を用いて作製することができる。当技術分野では周知の化学的手法を用いて、完全にまたは部分的にプローブを合成することができる(Caruthers et al., Nucleic Acids Res., Symp. Ser., 215-233頁, 1980)。
【０１２２】
医薬製剤および投与経路
本発明のタンパク質（どんな起源のものでもよい、例えば、組換え起源および非組換え起源のもの)は、必要とする患者に単独で投与してもよいし、または種々の疾患を治療または改善する用量で好適な担体、希釈剤、アジュバントまたは賦形剤と混合された医薬組成物として投与してもよい。このような組成物はまた、（タンパク質および担体に加えて）希釈剤、増量剤、塩類、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および当技術分野では周知の他の材料を含有してもよい。「医薬上許容される」とは、有効成分の生物活性の効果を妨げない非毒性材料を意味する。担体の性質は投与経路によって異なる。本発明の医薬組成物はまた、サイトカイン、ケモカイン、リンフォカイン、増殖因子、または他の造血因子、例えば、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ（特に、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ）、ＶＥＧＦＲ−３（細胞外ドメインを含んでなる可溶性ＶＥＧＦＲ−３ペプチドを含む)、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、および赤血球生成促進因子を含有してもよい。これらのポリペプチドの種々の形態、例えば、単離されたホロタンパク、サブユニット、断片（例えば、可溶性断片）、およびペプチド融合物なども意図される。医薬組成物はさらに、タンパク質の活性を増強するか、または治療においてその活性または使用を補うその他の薬剤を含有してもよい。このようなさらなる因子および／または薬剤は、本発明のタンパク質との相乗効果を生むか、または副作用を最小限に抑えるために医薬組成物に含めてもよい。逆に、本発明のタンパク質を、サイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗血栓因子、または抗炎症薬の副作用を最小限に抑えるために特定のサイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗血栓因子、または抗炎症薬の処方に含めてもよい。本発明のタンパク質はそれ自身のタンパク質または他のタンパク質とのマルチマー（例えば、ヘテロ二量体またはホモ二量体）または複合体において活性であることがある。結果として、本発明の医薬組成物は本発明のタンパク質をこのようなマルチマー形態または複合体形態で含んでなってよい。
【０１２３】
本願の化合物の製剤および投与に関する技術は、"Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 最新版に見出せる。治療上有効な用量とは、さらに、症状の改善、例えば、関連した病状の治療、治癒、予防、または改善、またはこのような状態の有利な変更、治癒、予防または改善の速度の増加をもたらすのに十分な化合物の量を指す。各有効成分の単独投与として適用する場合には、治療上有効な用量とは、その成分だけを指す。組合せに適用する場合には、治療上有効な用量とは、組み合わせ投与、逐次投与、同時投与を問わず、治療効果をもたらす有効成分の併用量を指す。
【０１２４】
本発明の治療または使用方法の実施において、本発明のタンパク質の治療上有効な量を治療すべき状態または疾患を有する哺乳類に投与する。本発明のタンパク質は本発明の方法に従い、単独投与してもよいし、または他の治療法、例えば、サイトカイン、リンフォカインまたは 他の造血因子を使用する治療と組み合わせて投与してもよい。一つ以上のサイトカイン、リンフォカインまたは他の造血因子と同時投与する場合は、本発明のタンパク質をサイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、血栓溶解または抗血栓因子と同時に投与してもよいし、または逐次的に投与してもよい。逐次投与する場合は、医師が本発明のタンパク質をサイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、血栓溶解または抗血栓因子と組み合わせて投与するための好適な順序を判断する。
【０１２５】
投与経路
好適な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、または腸管投与；筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、経鼻、または眼内注射といった非経口送達が挙げられる。医薬組成物に用いる本発明のタンパク質または本発明の方法を実施するための本発明のタンパク質の投与は、種々の従来の方法、例えば、経口摂取、吸入、局所適用または皮膚、皮下、腹腔内、非経口または静脈注射で行われる。ヒト患者などの哺乳類への静脈投与が好ましい。また、化合物の投与は全身的よりも局所的に、例えば、目的とする作用部位に化合物を注入することにより行われる。
【０１２６】
組成物／製剤
よって、本発明に用いる医薬組成物は、医薬として使用し得る製剤への活性化合物の加工を助ける賦形剤および助剤を含んでなる一つ以上の生理学上許容される担体を用いて従来の方法により製剤される。これらの医薬組成物は、それ自体公知である方法で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣丸作製、粉末化、乳化、カプセル化、包括または凍結乾燥工程を利用して製造し得る。適した製剤は選択される投与経路によって異なる。本発明のタンパク質の治療上有効な量を経口投与する場合には、本発明のタンパク質は錠剤、カプセル剤、散剤、液剤またはエリキシル剤の形態をとる。錠剤形態で投与する場合、本発明の医薬組成物はさらに、ゼラチンなどの固体担体またはアジュバントを含有してもよい。錠剤、カプセル剤および散剤は約５〜９５％の本発明のタンパク質、好ましくは、約２５〜９０％の本発明のタンパク質を含有する。液体形態で投与する場合、水、石油、動物または植物起源の油、例えば、落花生油、鉱油、大豆油、または胡麻油、または合成油などの液体担体を添加してもよい。液体形態の医薬組成物はさらに、を含有してもよい。生理食塩水溶液、ブドウ糖または他の糖類溶液、またはグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール。液体形態で投与する場合、医薬組成物は約０．５〜９０重量％の本発明のタンパク質、好ましくは、約１〜５０％の本発明のタンパク質を含有する。
【０１２７】
本発明のタンパク質の治療上有効な量を静脈、皮膚または皮下注射により投与する場合には、本発明のタンパク質はパイロジェンフリーの、非経口的に許容される水溶液の形態をとる。ｐＨ、等張性、安定性などを十分考慮するこのような非経口的に許容されるタンパク質溶液の調製は、当業界の技術で対応できる範囲にある。静脈、皮膚、または皮下注射に好ましい医薬組成物は、本発明のタンパク質に加えて、生理食塩液、リンガー液、ブドウ糖液、ブドウ糖および生理食塩液、乳酸加リンガー液などの等張ビヒクル、または当技術分野では公知のような他のビヒクルを含むはずである。本発明の医薬組成物はまた、安定剤、防腐剤、緩衝剤、酸化防止剤、または当業者には公知の他の添加剤を含有してもよい。注入では、本発明の薬剤を水溶液中、好ましくは、ハンクス液、リンガー液、または生理食塩水緩衝溶液などの生理学上適合性のあるバッファー中に入れて製剤してもよい。経粘膜投与では、浸透させるべきバリアに対して好適な浸透剤を製剤に用いる。このような浸透剤は当技術分野では一般に知られている。
【０１２８】
経口投与では、活性化合物を当技術分野では周知の医薬上許容される担体と組み合わせることにより容易に化合物を製剤することができる。このような担体により、本発明の化合物を 治療すべき患者による経口摂取を目的とした錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに製剤することができる。経口用医薬製剤は、固体賦形剤と混合し、所望により、得られた混合物を粉砕し、必要に応じて、好適な助剤を添加した後、顆粒混合物を加工し、錠剤または糖衣丸コアを得ることにより得ることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールをはじめとする糖類；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの増量剤である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩といった崩壊剤を添加してもよい。糖衣丸コアには好適なコーティングが施される。この目的には、濃縮糖溶液が使用され得、これには、所望により、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー液、ならびに好適な有機溶剤または溶剤混合物を含めてもよい。識別に、または活性化合物の量の異なる組合せを特徴付けるために錠剤または糖衣コーティングに染料または色素を添加してもよい。
【０１２９】
経口使用し得る医薬製剤としては、ゼラチンから作製した押し込み型カプセル剤、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から作製した密閉型軟カプセル剤が挙げられる。押し込み型カプセル剤は、有効成分をラクトースなどの増量剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤および所望により、安定剤と混合して含み得る。軟カプセル剤では、活性化合物を脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体に溶解するか、または懸濁する。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与を目的とする全ての製剤はこのような投与に好適な用量にあるべきである。口内投与では、組成物は従来の方法で製剤された錠剤またはトローチ剤の形態をとってよい。
【０１３０】
吸入による投与では、本発明に従って用いる化合物は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを用い、加圧パックまたは 噴霧器からエアゾールスプレー剤として便宜に送達される。加圧エアゾールの場合、定量を送達するバルブを提供することにより用量単位が決められる。吸入器または吹き入れ器に用いる、例えば、ゼラチンのカプセル剤およびカートリッジ剤を、化合物の粉末ミックスとラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤を含めて製剤してもよい。化合物を注入、例えば、ボーラス注射または点滴による非経口投与に向けて製剤してもよい。注入用の製剤は防腐剤を添加した単位投与形、例えば、アンプルまたは複数投与用容器で与えてもよい。組成物は懸濁液、溶液または油性または水性ビヒクル中のエマルションのような形態をとってよく、また、懸濁化剤、分解防止剤および／または分散剤などの処方剤を含有してもよい。
【０１３１】
非経口投与用の医薬製剤としては、水溶性形態の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、好適な油性注入懸濁液として活性化合物の懸濁液を調製してもよい。好適な親油性溶剤またはビヒクルとしては、胡麻油などの脂肪油、または、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド、またはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性注入懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含有してもよい。所望により、懸濁液はまた、好適な安定剤または化合物の溶解性を高めて、高濃度溶液の調製を可能にする薬剤を含有してもよい。また、有効成分が使用前に好適なビヒクル、例えば、パイロジェンフリーの滅菌水で構成する散剤形態であってもよい。
【０１３２】
化合物をまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物に製剤してもよい。これまでに記載した製剤に加えて、化合物はまた、デポー製剤として製剤してもよい。このような長時間作用性製剤は植込み（例えば、皮下または筋肉内）によりまたは筋肉注射により投与し得る。よって、例えば、化合物を好適な高分子もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂とともに、または難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として製剤してもよい。
【０１３３】
本発明の疎水性化合物用の医薬担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機高分子、および水相を含んでなる補助溶剤系である。補助溶剤系はＶＰＤ補助溶剤系であってよい。ＶＰＤは、３％ｗ／ｖベンジルアルコール、８％ｗ／ｖ非極性界面活性剤ポリソルベート８０、および６５％ｗ／ｖポリエチレングリコール３００の無水エタノール溶液である。ＶＰＤ補助溶剤系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、５％ブドウ糖水溶液で１：１希釈したＶＰＤからなる。この補助溶剤系は疎水性化合物を十分に溶解し、全身投与においては、それ自身による毒性は低い。当然ながら、補助溶剤系の割合は、その溶解性および毒性特性を壊すことなく大きく変更し得る。さらに、補助溶剤成分自体を変更してもよい：例えば、ポリソルベート８０の代わりに他の低毒性非極性界面活性剤を用いてもよい；ポリエチレングリコールの分量を変更してもよい；ポリエチレングリコールを他の生体適合性のある高分子、例えば、ポリビニルピロリドンに置き換えてもよい；および他の糖または多糖をブドウ糖の代用にしてもよい。また、疎水性医薬化合物用の他の送達系を使用してもよい。リポソームおよびエマルションは疎水性薬剤の送達ビヒクルまたは担体のよく知られた例である。また、ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶剤を、通常、高い毒性を犠牲にするが、使用し得る。さらに、持続放出製剤、 例えば、治療薬を含有する固体疎水性高分子の半透性支持体を用いて化合物を送達してもよい。種々の持続放出性材料が確立されており、当業者ならば周知である。持続放出カプセル剤は、それらの化学的性質に応じて、数週間〜最大１００日にわたって化合物を放出し得る。治療用試薬の化学的性質および生物学的安定性により、タンパク質の安定化に向けたさらなる戦略を採用してもよい。
【０１３４】
医薬組成物はまた、好適な固相もしくはゲル相担体または賦形剤を含んでなってよい。このような担体または賦形剤の例としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどの高分子が挙げられる。数多くの、プロテイナーゼ阻害する本発明の化合物を、医薬上適合性のある対イオンを有する塩として提供してもよい。このような医薬上許容される塩基付加塩は、遊離酸の生物学的効果および特性を保持し、また、無機または有機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、アンモニア、トリアルキルアミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、二塩基アミノ酸、酢酸ナトリウム、安息香酸カリウム、トリエタノールアミンなどとの反応により得られる塩である。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、タンパク質またはペプチド抗原との本発明のタンパク質の複合体形態をとってよい。本発明の医薬組成物は、本発明のタンパク質を、他の医薬上許容される担体に加えて、ミセル、不溶性単分子層、液晶、または水溶液中ラメラ層として凝集形態で存在する脂質などの両親媒性薬剤と組み合わせたリポソーム形態をとってよい。リポソーム製剤に好適な脂質としては、限定されるものではないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチドsulfatides, リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられる。このようなリポソーム製剤の調製は、例えば、その各々が引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第４，２３５，８７１号；同第４，５０１，７２８号；同第４，８３７，０２８号；および同第４，７３７，３２３号に開示されるように、当技術分野のスキルレベルで対応できる範囲にある。
【０１３６】
医薬組成物における本発明のタンパク質の量は、治療する状態の性質および重篤度、ならびに患者が受けたそれまでの治療の性質によって異なる。最終的には、一人一人の患者を治療するための本発明のタンパク質の量を医師が判断する。最初に、医師は本発明のタンパク質を低用量で投与し、患者の応答を観察する。患者にとって最適な治療効果が得られるまで、また、用量がこれ以上高められないといった時点まで本発明のタンパク質の用量を高めて投与する。本発明の方法の実施に用いる種々の医薬組成物は、ｋｇ体重当たり本発明のタンパク質を約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは、約０．１μｇ〜約１ｍｇ）含有すべきと考えられる。投与では、本発明において用いる治療用化合物はパイロジェンフリーの生理学上許容される形態をとる。本発明のタンパク質以外の、所望により、上記のような組成物にも含めてもよい治療上有用な薬剤は、あるいは、またはさらに、本発明の方法において組成物と同時にまたは逐次的に投与してもよい。
【０１３７】
本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療に使用することもできる。このようなポリヌクレオチドは、哺乳類被験体での発現を目的としてin vivoまたはex vivoのいずれかで細胞に導入することができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、核酸（限定されるものではないが、ウイルスベクターまたはネイキッドＤＮＡの形態などで)を細胞または生物へと導入する他の公知の方法により投与してもよい。また、細胞は、増殖させ、またはこのような細胞に対する所望の効果またはこのような細胞における活性を生じさせるために、本発明のタンパク質の存在下でex vivoで培養してもよい。その後、処置された細胞は治療目的でin vivo導入することができる。
【０１３８】
有効用量
本発明における使用に好適な医薬組成物としては、本来の用途を達成するのに有効な量で有効成分が含まれる組成物が挙げられる。さらに具体的に言うと、治療上有効な量とは、治療する被験体の、進行を妨げる、または現在の症状を改善するのに有効な量を意味する。有効用量の決定に利用し得る好適な特性としては、ＬＥＣおよび／またはＢＥＣ増殖の刺激または阻害の測定、ＬＥＣおよび／またはＢＥＣへの細胞分化の速度または程度、細胞発現パターンのＬＥＣ特異的またはＢＥＣ特異的な発現パターンに近づくまたはＬＥＣ特異的またはＢＥＣ特異的な発現パターンから離れる傾向などが挙げられる。有効量の決定は、とりわけ、本明細書に示す詳細の開示内容に照らして、当業者の能力で十分に対応できる範囲にある。本発明の方法において用いる化合物では、治療上有効な用量は細胞培養物アッセイから最初に推測することができる。例えば、阻害方法では、用量は、細胞培養物で決定されるＩＣ５０（すなわち、５０％阻害濃度を達成する試験化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて決定される。このような情報を利用して、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定することができる。
【０１３９】
治療上有効な用量とは、症状の改善または、生命を脅かすような状態では、患者の生存の延長をもたらす化合物の量を指す。このような化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死に至る量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な量）を決定するために、標準調剤手順により細胞培養物または試験動物において決定することができる。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０およびＥＤ５０間の比率として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られるデータをヒトに用いる用量範囲を決定するのに利用することができる。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くない、ＥＤ５０をはじめとする循環濃度の範囲内にある。用量は使用する投与形および採用する投与経路に応じ、この範囲内で変更してもよい。厳密な処方、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して各医師によって決定される。例えば、Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 第1章 1頁を参照。
【０１４０】
投与する組成物の量は、当然のことながら、治療する被験体によって異なり、被験体の体重、苦痛の重さ、投与様式および処方する医師の判断による。
【０１４１】
パッケージング
組成物は、必要に応じて、有効成分を含有する一つ以上の単位投与形を含み得るパックまたはディスペンサー装置で与えてもよい。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置には、投与の際の使用説明書が同封される。また、適合性のある医薬担体中に製剤された本発明の化合物を含んでなる組成物では、調製され、好適な容器に入れられ、指定される状態の治療に関するラベルが付けられる。
【０１４２】
さらに、本発明は、ＬＥＣおよび／またはＢＥＣの過剰増殖性および過少増殖性の疾患、例えば、リンパ水腫、リンパ管腫、リンパ管骨髄腫、リンパ管腫症、リンパ管拡張症、リンパ肉腫、またはリンパ管硬化症を有する細胞または生物、例えば、ヒト患者の、本発明の組成物の有効量または用量を細胞または生物に投与することを含んでなる治療を目的とした薬物を製造するためのこのような組成物の使用を包含する。好適な組成物としては、限定されるものではないが、本発明のポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスポリヌクレオチド）、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを特異的に認識する抗体、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節するのに有効な小分子化合物などが挙げられる。ＬＥＣまたはＢＥＣ関連疾病または疾患に伴う症状を改善するための薬物の製造を目的とした本発明の組成物の使用もまた、意図される。
【０１４３】
抗体
相対的特異性を有する抗体を容易に作製する能力と、抗体をヒト治療法に採用するための技術の継続的な向上により、抗体は本発明のポリペプチドの調節に有用である。よって、本発明は、目的のポリペプチドに特異的な抗体（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二価性／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体（本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物など））の本発明への使用を意図する。好ましい抗体は、全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる１９９３年６月２０日公開のＷＯ９３／１１２３６に記載の方法に従い、作製され、同定されるヒト抗体、例えば、トランスジェニック動物で作製されたものである。Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、およびＦｖをはじめとする抗体フラグメントもまた、本発明により提供される。「〜に特異的な」とは、本発明の抗体を説明するために用いる場合には、本発明の抗体の可変領域が、他の物質と結合するレベルと検出可能なように異なり、またそれよりも大きいレベルで目的のポリペプチドを認識し、それと結合する（すなわち、ファミリーのメンバー間の部分的配列同一性、相同性、または類似性が存在する可能性にもかかわらず、測定可能な結合親和性の違いに基づいて目的のポリペプチドを同一ファミリーの他の既知のポリペプチドと区別することが可能である）ことを示す。当然のことながら、特異的な抗体はまた、他のタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ技術では黄色ブドウ球菌(S. aureus)プロテインＡまたは他の抗体）とも抗体の可変領域の外側、特に、分子の定常領域内の配列との相互作用により相互作用する。本発明の抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは当技術分野では周知であり、慣例的に実施されている。このようなアッセイの網羅的な議論については、Harlow et al. (編), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), 第6章を参照。
【０１４４】
非ヒト抗体は当技術分野では公知の方法によりヒト化し得る。好ましい「ヒト化抗体」はヒト定常領域を有するが、抗体の、可変領域、または少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）は非ヒト種由来である。非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野では周知である。（米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号を参照）。一般に、ヒト化抗体は一つ以上のアミノ酸残基が非ヒトである起源のそのフレームワーク領域に導入されている。ヒト化は、例えば、Jones et al.［Nature 321: 522-525頁, (1986)］、Riechmann et al.,［Nature, 332: 323-327頁, (1988)］およびVerhoeyen et al.［Science 239:1534-1536頁, (1988)］に記載の方法を用い、齧歯動物ＣＤＲの少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域の代わりに用いることにより実施することができる。組み込まれた抗体を作製する数多くの技術については、例えば、Owens and Young, J. Immunol. Meth., 168:149-165頁 (1994)に記載されている。さらに、親和性または免疫原性を調節するために抗体フレームワークにさらなる変更を加えることができる。
【０１４５】
本発明はさらに、本発明の抗体を産生するハイブリドーマを提供する。本発明の抗体は本発明のポリペプチドの検出および／または精製に有用である。
【０１４６】
本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはまた、ポリペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を得るために動物に免疫性を与えるのに用いてもよい。このような抗体は、免疫原として完全ポリペプチドまたはその断片のいずれかを使用して得られる。ペプチド免疫原はさらに、カルボキシル末端にシステイン残基を有し得、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）などのハプテンと結合し得る。このようなペプチドを合成する方法は、例えば、R. P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154頁 (1963); J. L. Krstenansky, et al., FEBS Lett. 211: 10頁 (1987)においてのように当技術分野では公知である。本発明のタンパク質と結合しているモノクローナル抗体が、ポリペプチドの免疫検出に有用な診断用薬であり得る。ポリペプチドと結合している中和モノクローナル抗体は、ポリペプチドと関連する状態に向けた有用な治療用物質、同時にポリペプチドの発現異常が関与しているある種の癌の治療における有用な治療用物質でもあり得る。癌細胞または白血病細胞の場合、ポリペプチドに対する中和モノクローナル抗体はポリペプチドが媒介する癌細胞の転移拡散を検出または予防するのに有用である。一般に、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに所望の抗体を産生することができるハイブリドーマを作製する技術は当技術分野では周知である(Campbell, A. M., Monoclonal Antibodies Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1984); St. Groth et al., J. Immunol. 35:1-21頁 (1990); Kohler and Milstein, Nature 256:495-497頁 (1975))、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozbor et al., Immunology Today 4:72頁 (1983); Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96頁)。
【０１４７】
本発明のペプチドまたはポリペプチドにより、抗体を産生することが知られている動物（マウス、ウサギなど）に免疫性を与えることができる。免疫化方法は当技術分野では周知である。このような方法としては、ポリペプチドの皮下または腹腔内注射が挙げられる。当業者ならば、免疫化に用いる本発明のＯＲＦによりコードされるポリペプチドの量が免疫性を与える動物、ペプチドの抗原性および注射部位によって異なることは分かるであろう。タンパク質の抗原性を高めるために、免疫原として用いるタンパク質をアジュバントで修飾するか、またはアジュバントに含めて投与してもよい。タンパク質の抗原性を高める方法は当技術分野では周知であり、限定されるものではないが、抗原を異種タンパク質（例えば、グロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ) と結合させることまたは免疫化中アジュバントを含めることが挙げられる。
【０１４８】
モノクローナル抗体の場合、免疫性を与えた動物由来の脾臓細胞を取り出し、骨髄腫細胞、例えば、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合し、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とする。当技術分野では周知の多数の方法のうちのいずれか一つを用いて、所望の特性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定することができる。これらとしては、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット解析、またはラジオイムノアッセイによるハイブリドーマのスクリーニング(Lutz et al., Exp. Cell Research. 175:109-124頁. 1988)が挙げられる。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、当技術分野では公知の手順によりクラスおよびサブクラスを決定する(Campbell, A. M., Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1984))。単鎖抗体の作製に関して記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を本発明のポリペプチドに対する単鎖抗体の作製に適応させることもできる。
【０１４９】
ポリクローナル抗体の場合、免疫性を与えた動物から抗体含有抗血清を単離し、上記の手順の一つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在に関してスクリーニングする。本発明はさらに、検出可能なように標識した形態の上記の抗体を提供する。抗体は放射性同位元素、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジンなど）、酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣまたはローダミンなど)、常磁性原子などを用いて検出可能なように標識することができる。このような標識化を達成する手順は当技術分野では周知である；例えば、Sternberger, L. A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315頁. 1970; Bayer, E. A. et al., Meth. Enzym. 62:308頁 (1979); Engval, E. et al., Immunol. 109:129頁. 1972; およびGoding, J. W. J. Immunol. Meth. 13:215頁. (1976)を参照。
【０１５０】
標識した本発明の抗体は、目的のポリペプチドの断片が発現される細胞または組織を同定するin vitro、in vivo、およびin situアッセイに用いることができる。抗体はまた、治療法または他の診断に直接用いてもよい。本発明はさらに、固体支持体に固定化された上記の抗体を提供する。このような固体支持体の例としては、ポリカーボネートなどのプラスチック、アガロースおよびセファロースなどの複合炭水化物、ならびにポリアクリルアミドおよびラテックスビーズなどのアクリル樹脂が挙げられる。抗体をこのような固体支持体と結合させる技術は当技術分野では周知である(Weir, D. M. et al., "Handbook of Experimental Immunology" 第四版, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, 第10章 (1986); Jacoby, W. D. et al., Meth. Enzym. 34 Academic Press, N.Y. (1974))。固定化した本発明の抗体は、本発明のタンパク質のin vitro、in vivo、およびin situアッセイに、ならびに免疫アフィニティー精製に用いることができる。
【０１５１】
コンピューター可読配列
この態様の一つの用途では、本発明のヌクレオチド配列をコンピューター可読媒体に記録することができる。本明細書において「コンピューター可読媒体」とは、コンピューターにより直接読み出し、また、アクセスすることができる媒体を指す。このような媒体としては、限定されるものではないが、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープなどの磁気記録媒体；ＣＤ−ＲＯＭなどの光学記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭなどの電気記憶媒体；および磁気／光学記憶媒体などのこれらのカテゴリーの複合型が挙げられる。現在知られているコンピューター可読媒体をいかに用いて、本発明のヌクレオチド配列をそこに記録しているコンピューター可読媒体を含んでなる製造物を創出するのかは当業者ならば、容易に理解できる。本明細書において「記録される」とは、情報をコンピューター可読媒体に記憶するプロセスを指す。当業者ならば、情報をコンピューター可読媒体に記録する現在知られている方法を容易に選択して、本発明のヌクレオチド配列情報を含んでなる製造物を生み出すことができる。
【０１５２】
当業者が本発明のヌクレオチド配列をそこに記録しているコンピューター可読媒体を作製するのに、種々のデータ記憶構造が利用できる。データ記憶構造の選択は、一般に、記憶された情報にアクセスするために選択される手段に基づいて行われる。さらに、本発明のヌクレオチド配列情報をコンピューター可読媒体に記憶するのに、種々のデータ処理装置のプログラムおよび形式を使用することができる。配列情報は、ワードパーフェクトおよびマイクロソフト社製ワードなどの市販のソフトウェアの書式の文書処理テキストファイルで表示されるか、またはＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、オラクルなどのデータベースアプリケーションに記憶されるＡＳＣＩＩファイルの形式で表示される。当業者ならば、本発明のヌクレオチド配列情報をそこに記録しているコンピューター可読媒体を得るために、かなり多数のデータ処理装置構成形式（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を容易に適合させることができる。配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１のヌクレオチド配列もしくはその典型断片、または 配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１と少なくとも９９．９％同一なヌクレオチド配列をコンピュータに読み込み可能な形式で提供することにより、当業者は種々の用途で配列情報に慣例的にアクセスすることができる。コンピューターソフトウェアは公的に利用可能であり、これにより当業者はコンピュータ可読媒体により提供される配列情報にアクセスすることが可能になる。次の実施例では、いかにＢＬＡＳＴ(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410頁. 1990)およびＢＬＡＺＥ(Brutlag et al., Comp. Chem. 17:203-207頁 (1993))検索アルゴリズムをＳｙｂａｓｅシステムで実行するソフトウェアを利用して、核酸配列内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定するかを例示している。このようなＯＲＦはタンパク質をコードする断片であり得、また、発酵反応および商業的に有用な代謝産物の生産に利用する酵素などの商業的に重要なタンパク質を作製するのに有用であり得る。
【０１５３】
本明細書において「コンピューターに基づくシステム」とは、本発明のヌクレオチド配列情報を解析するのに利用するハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段を指す。本発明のコンピューターに基づくシステムの最小ハードウェア手段は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、およびデータ記憶手段を含んでなる。現在利用可能なコンピューターに基づくシステムのいずれか一つが本発明における使用に好適であることは、当業者ならば容易に理解できる。上記のように、本発明のコンピューターに基づくシステムは、本発明のヌクレオチド配列をそこに記録しているデータ記憶手段、および必要なハードウェア手段および検索手段に対応し、それを実行するソフトウェア手段を含んでなる。本明細書において「データ記憶手段」とは、本発明のヌクレオチド配列情報を記憶できる記憶装置、または本発明のヌクレオチド配列情報をそこに記録している製造物にアクセスできるメモリーアクセス手段を指す。
【０１５４】
本明細書において「検索手段」とは、標的配列または標的構造モチーフをデータ記憶手段内に記憶されている配列情報と比較するために、コンピューターに基づくシステムで実行される一つ以上のプログラムを指す。検索手段を用いて、特定の標的配列または標的モチーフに一致する既知の配列の断片または領域を特定する。種々の既知のアルゴリズムは公開されており、検索手段を管理する種々の商業的に入手可能なソフトウェアは本発明のコンピューターに基づくシステムで使用される、また、使用することができる。このようなソフトウェアの例としては、限定されるものではないが、MacPattern（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＡ（NPOLYPEPTIDEIA）が挙げられる。相同性検索を実施するのに利用可能なアルゴリズムのいずれか一つまたは実行ソフトウェアパッケージを本コンピューターに基づくシステムにおける使用に適応させることができることは、当業者ならば容易に理解できる。本明細書において「標的配列」とは、６以上のヌクレオチドまたは２以上のアミノ酸からなる核酸またはアミノ酸配列であり得る。標的配列が長い程、標的配列がデータベースにランダム発生的に存在する可能性が少ないことは、当業者ならば容易に理解できる。標的配列の最も好ましい配列長は約１０〜１００アミノ酸または約３０〜３００ヌクレオチド残基である。しかしながら、商業的に重要な断片、例えば、遺伝子発現およびタンパク質プロセシングに関与する配列断片の検索ではそれよりも長さが短い場合もあることは十分に理解される。
【０１５５】
本明細書において「標的構造モチーフ」または「標的モチーフ」とは、合理的に選択された配列または標的モチーフの折り畳みで形成される三次元構造に基づいて、その配列が選択される配列の組合せを指す。当技術分野では公知の種々の標的モチーフが存在する。タンパク質標的モチーフとしては、限定されるものではないが、酵素活性部位およびシグナル配列が挙げられる。核酸標的モチーフとしては、限定されるものではないが、プロモーター配列、ヘアピン構造および誘導発現エレメント（タンパク質結合配列）が挙げられる。
【０１５６】
診断アッセイおよびキット
本発明はさらに、ＬＥＣまたはＢＥＣなどの内皮細胞の過剰増殖性および／または過少増殖性の疾患または疾病に関する診断アッセイ、および関連キットを提供する。これらのアッセイは、本発明の核酸プローブまたは抗体を用いて試験サンプル中の本発明のＯＲＦの一つ、またはその相同体の存在または発現を同定する方法を含んでなる。
【０１５７】
一般に、本発明のポリヌクレオチドを検出する方法は、サンプルを、ポリヌクレオチドと結合し、それと複合体を形成する化合物と、複合体を形成するのに十分な時間接触させること、および複合体が検出される場合には、サンプル中の本発明のポリヌクレオチドを検出するために複合体を検出することを含んでなる。
【０１５８】
このような方法はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、サンプルを、このような条件下で本発明のポリヌクレオチドとアニーリングする核酸プライマーと接触させること、およびポリヌクレオチドが増幅される場合には、サンプル中の本発明のポリヌクレオチドを検出するためにアニーリングしたポリヌクレオチドを増幅することを含んでなってよい。
【０１５９】
一般に、本発明のポリペプチドを検出する方法は、サンプルを、ポリペプチドと結合し、それと複合体を形成する化合物と、複合体を形成するのに十分な時間接触させること、および複合体が検出される場合には、サンプル中の本発明のポリペプチドを検出するために複合体を検出することを含んでなる。詳細には、このような方法は、試験サンプルを一つ以上の本発明の抗体または一つ以上の本発明の核酸プローブとともにインキュベートすること、および核酸プローブまたは抗体の試験サンプル内の成分との結合に関してアッセイすることを含んでなる。
【０１６０】
核酸プローブまたは抗体を試験サンプルとともにインキュベートする条件は様々である。インキュベーション条件は、アッセイに使用する形式、使用する検出方法、ならびにアッセイに使用する核酸プローブまたは抗体の種類および性質により異なる。商業的に入手可能なハイブリダイゼーション、増幅または免疫学的アッセイ形式のうちのいずれか一つを本発明の核酸プローブまたは抗体を使用するのに容易に適応させることができることは、当業者ならば分かるであろう。このようなアッセイの例は、Chard, T., An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock, G. R. et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, Fla. 第1巻 (1982), 第2巻 (1983), 第3巻 (1985); Tijssen, P., Practice and Theory of immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985)に見出せる。本発明の試験サンプルとしては、細胞、細胞のタンパク質もしくは膜抽出物、または唾液、血液、血清、血漿、または尿などの体液が挙げられる。上記の方法に使用する試験サンプルは、アッセイ形式、検出方法の性質ならびにアッセイすべきサンプルとして用いる組織および細胞または抽出物により異なる。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製する方法は当技術分野では周知であり、使用する系と適合性のあるサンプルが得られるように容易に適応させることができる。
【０１６１】
本発明の別の態様では、本発明のアッセイを実施するのに必要な試薬を含むキットが提供される。一つの態様では、本発明は、厳重な管理下で、
（ａ）本発明のプローブまたは抗体のうちの一つを含んでなる第１の容器；および
（ｂ）洗浄試薬、結合したプローブまたは抗体の存在を検出することができる試薬、を一つ以上含んでなる一つ以上の他の容器、
を含む一つ以上の容器を収容するコンパートメントキットを提供する。
【０１６２】
詳細には、コンパートメントキットとしては、試薬が個別の容器に収容されているキットが挙げられる。このような容器としては、小型ガラス容器、プラスチック容器またはプラスチックもしくは紙のストリップが挙げられる。このような容器では、サンプルと試薬が交差汚染しないように、試薬をあるコンパートメントから他のコンパートメントへと効率的に移すことが可能であり、また、各容器の薬剤または溶液をあるコンパートメントから他のものへと定量的に添加することができる。このような容器としては、試験サンプルを受け入れる容器、アッセイに使用する抗体を収容している容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓバッファーなど）を収容している容器、および結合した抗体またはプローブを検出するのに使用する試薬を収容している容器を含む。検出試薬の種類としては、標識化核酸プローブ、標識化二次抗体、あるいは、一次抗体を標識する場合には、標識した抗体と反応することができる酵素または抗体結合試薬が挙げられる。開示した本発明のプローブおよび抗体を、当技術分野では周知の確立されたキット形式の一つに容易に組み入れることができることは、当業者ならば容易に理解できるであろう。
【実施例】
【０１６３】
実施例に使用する方法は以下の通りである：
【０１６４】
抗体
ヒトＶＥＧＦＲ−３に対するモノクローナル抗体（クローン  ２Ｅ１１Ｄ１１；ＷＯ０３／００６１０４として公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／２２１６４を参照）、ＰＡＬ−Ｅ（Monosan）、ＣＤ３１（Dako）、Ｎ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン、β−カテニンおよびプラコグロビン、ならびにポリクローナルウサギ抗ヒトポドプラニンを使用した(Breiteneder-Geleff, S., et al., Am. J. Pathol. 154:385-394頁 (1999))。マウス抗ヒトインテグリンα９はDr. Dean Sheppard (カリフォルニア大学サンフランシスコ校, San Francisco)およびDr. Curzio Rugg (ローザンヌ大学医学部, Lausanne, Switzerland)から提供されたものであった。蛍光色素結合二次抗体はJackson Immunoresearchから入手した。
【０１６５】
細胞培養物およびトランスフェクション
ヒト羊膜上皮細胞を５％ウシ胎児血清の存在下、Ｍｅｄ１９９培地で培養した。ヒト皮膚微小血管内皮細胞はPromoCell(Heidelberg, Germany)から入手した。細胞分離では、抗ポドプラニン抗体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と結合したＭＡＣＳコロイド状超常磁性マイクロビーズ(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)、ＬＤおよびＭＳ分離カラムならびにＭｉｄｉ／ＭｉｎｉＭＡＣＳ分離器(Miltenyi Biotech)を製造業者の使用説明書に従い使用した。単離された細胞は、記載されているように(Makinen, T., et al., EMBO J. 20:4762-4773頁. 2001)、フィブロネクチンコーティング(１０μｇ／ｍｌ, Sigma, St. Louis, MO)プレート上で培養した。
【０１６６】
ＲＮＡ単離、ノーザンブロッティングおよびマイクロアレイ解析
全ＲＮＡを単離し、ＲＮｅａｓｙカラム(Qiagen, Valencia, CA)でＤＮＡｓｅＩ処理した。Ａｔｌａｓフィルター(Clontech)とのハイブリダイゼーション用の３２Ｐ標識プローブを、プローブをＮｉｃｋ−２５カラム(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を用いて精製することを除き、製造業者の使用説明書に従い、２〜５μｇの全ＲＮを用いて調製した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、Fuji BAS 100 ホスホイメージャーを用いてメンブランを解析した。Affymetrix（商標）解析では、四つの独立したＢＥＣおよびＬＥＣのサンプル調製およびハイブリダイゼーションを、４ロットの、異なる個体から単離された細胞から抽出したＲＮＡを用いて実施した。Affymetrix（商標）発現解析では、カスタムスーパースクリプト  ｄｓ−ｃＤＮＡ合成キット(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いた二本鎖ｃＤＮＡの合成に５μｇの全ＲＮＡを用いた。次いで、Enzo BioArrayTMHighYieldTMRNA Transcript標識キット(Affymetrix, Santa Clara, CA)を用いて、ビオチン標識したｃＲＮＡを調製し、ＲＮｅａｓｙカラム(Qiagen, Valencia, CA)を用いて、組み込まれていないヌクレオチドを除去した。特性不明のＥＳＴ配列を主として含むヒトゲノム９５Ａｖ２マイクロアレイ（ｐｒｏｘ−１試験の場合）および９５１３−Ｅマイクロアレイのハイブリダイゼーション、洗浄および染色を、製造業者の使用説明書に従い(Affymetrix, GeneChip Expression Analysis Technical Manual)行った。プローブアレイを、Ａｇｉｌｅｎｔ
【０１６７】
GeneArray（商標）スキャナーを用いて５７０ｎｍにてスキャンし、定量的スキャニングでの測定値をAffymetrix（商標）マイクロアレイスイートバージョン５．０およびデータマイニングツールバージョン３．０により解析した。比較解析では、グローバルスケーリング強度１００を用いてハイブリダイゼーション強度を算出した。
【０１６８】
示差的に発現された配列を、国立バイオテクノロジーインフォメーションセンター(National Center for Biotechnology Information)および米国国立医学図書館(National Library of Medicine)（ＮＣＢＩ／ＮＬＭ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースでＥＳＴコンティグを検索するのに用い、オープンリーディングフレームを、ＮＣＢＩ／ＮＬＭにて入手可能なｏｒｆ  ファインダーソフトウェアを用いて推測した。ＳＯＳＵＩシステムをタンパク質配列からのトランスメンブランヘリックスおよびシグナル配列の推定に用い、他のタンパク質ドメイン構造をＰｆａｍ(Protein families database of alignments and HMMs)を用いて解析した。
【０１６９】
免疫蛍光検査法と免疫組織化学
細胞をカバースリップ上で培養し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で浸透化し、一次抗体で染色した。インテグリンα９について、染まっている生細胞を抗体とともに氷上で１５分間インキュベートし、その後、固定した。細胞をさらにＦＩＴＣまたはＴＲＩＴＣ結合二次抗体で染色した。Ｆ−アクチンをテキサスレッド結合ファロイジン(Molecular Probes, Eugene, OR)を用いて染色した。細胞をHoechst 33258 蛍光色素(Sigma)で対比染色し、Zeiss Axioplan 2 蛍光顕微鏡を用いて調べた。
【０１７０】
外科切除により得られた正常ヒト皮膚をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（商標）(Sakura, The Netherlands)で包埋し、冷凍し、切片にした。切片（６μｍ）を冷アセトンで１０分間固定し、一次抗体で染色し、次ぎに、ベクタステイン  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット(Vector Laboratories, Burlingame, CA)および３−アミノ−９−エチルカルバゾール(Sigma, St. Louis, MO)を用いてペルオキシダーゼ染色を行った。
【０１７１】
実施例１
示差的に発現された遺伝子の同定
血管およびリンパ管内皮細胞（各々、ＢＥＣおよびＬＥＣ）をヒト皮膚微小血管内皮細胞培養物から磁気マイクロビースおよびリンパ管内皮細胞表面マーカー、ポドプラニンに対する抗体を用いて単離した(Breiteneder-Geleff, S., et al., Am. J. Pathol. 154:385-394頁 (1999); Makinen, T., et al., EMBO J. 20:4762-4773頁 (2001))。単離されたＢＥＣおよびＬＥＣ集団の純度は、ＶＥＧＦＲ−３またはポドプラニンに対する抗体を用いた免疫蛍光検査法による評価では、９９％を上回っていることが確認された。単離された細胞を２継代培養し、培養物からＲＮＡを抽出し、約１２，０００種の既知の遺伝子、すなわち、全推定ヒト転写物総数の約１／３の配列を含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイとのハイブリダイゼーションに使用した。
【０１７２】
予想どおり、既知のリンパ管内皮細胞マーカーである、ポドプラニン、デスモプラキンＩ／IIおよびマクロファージマンノース受容体が特異的にＬＥＣにおいて見られた。Breiteneder-Geleff, S., et al., Am. J. Pathol. 154:385-394頁 (1999); Ebata, N., et al., Microvasc. Res. 61:40-48頁. (2001); およびIrjala, H., et al., J. Exp. Med. 194:1033-1041頁 (2001)を参照。Since これらの結果がin vivoおよびin vitroでの既知遺伝子の発現パターンと一致していたため、遺伝子発現プロフィールのさらなる特性決定を行った。反復解析で再現性のあるシグナルｌｏｇ２ 比  １．０（２倍の差）を選択した場合、４００個を超える遺伝子がＬＥＣおよびＢＥＣ間で示差的に発現されることが判明した。表１では示差的に発現される遺伝子のいくつかの例に機能的注釈をつけており、表２〜４では示差的に発現される遺伝子の完全な一覧表を示している。表３および４ではＧｅｎＢａｎｋ受託番号および 独立に採取したＢＥＣおよびＬＥＣ間の発現レベル変動（シグナルｌｏｇ２比±ｓ．ｄ．）を含む、示差的に発現される遺伝子の完全な一覧表を示している。マイクロアレイデータは３１種の選択された遺伝子に関するノーザンブロッティングまたは免疫蛍光検査法により実証した（図１参照）。
【０１７３】
表３および４に示す各遺伝子は、ＮＣＢＩにより維持管理されているＧｅｎＢａｎｋデータベースなどの公開ゲノムデータベースに見出せる遺伝子の配列と関連する遺伝子受託番号により確認される。これらの配列は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１７４】
【表１】
2005536186.tif 000002
2005536186.tif 000003
【０１７５】
【表２】
2005536186.tif 000004
【０１７６】
実施例２
炎症に関与する遺伝子のＢＥＣ特異的な発現
内皮細胞は炎症反応のいくつかの工程において重要な役割を果たしている。それらは白血球を炎症病巣に補充し、特殊な内皮細胞（高内皮細静脈）が二次リンパ器官へのリンパ球ホーミングに関与する。さらに、内皮細胞は白血球の活性化を調節し、逆の場合も同じである。それらは白血球により分泌された分子によって活性化された状態になる。細胞培養物でのそれらの活性化と一致し、ＢＥＣは高レベルの前炎症性サイトカインおよびケモカイン（幹細胞因子、インターロイキン−８、単球遊走因子１（ＭＣＰ−１））ならびに受容体（ＵＦＯ／ａｘｌ、ＣＸＣＲ４、ＩＬ−４Ｒ）を発現した（表Ｉ参照）。ＣＸＣＲ４およびそのリガンド、ストローマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）は、正常リンパ球、単球、および造血幹細胞および造血前駆細胞のトラフィッキングにおいて重要な役割を果たしている。ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１のいずれかの標的不活性化は心臓発生異常、血液生成および血管新生をもたらす(Tachibana, et al., Nature 393:591-594頁. 1998)。ＳＤＦ-１ｂは主としてＬＥＣにより生成され、このケモカインがＣＸＣＲ４発現細胞のＬＥＣ主導の走化性に関与し得ることを示唆した。さらに、ＢＥＣおよびＬＥＣにおけるＣＸＣＲ４およびＳＤＦ−１の相互の発現パターンにより、２つの細胞種がこれらの分子をパラクリンコミュニケーションに使用することが示される。
【０１７７】
実施例３
細胞接着、細胞−細胞相互作用および細胞骨格分子における相違
ＢＥＣおよびＬＥＣ間で検出された最も著しい相違は、細胞骨格および細胞−細胞または細胞−基質相互作用に関与する遺伝子の発現であった（表３および４参照）。例えば、内皮細胞のＳＭＣおよび周皮細胞との相互作用に関与するＮ−カドヘリン(Gerhardt, et al., Dev. Dyn. 218:472-479頁. 2000)は、特に、ＢＥＣにおいて検出された。このことは  毛細リンパ管がＳＭＣにより被覆されない事実と一致している。免疫染色では、Ｎ−カドヘリンはＢＥＣにて排他的に検出されたが、一方、ＶＥ−カドヘリンは両細胞種に存在していた（図２ａ−ｄ）。カドヘリンの細胞質ドメインは、それらをα−アクチン、ビンキュリン、ＺＯ−１、ＺＯ−２およびスペクトリンを介してアクチン細胞骨格と連結するβ-カテニン、プラコグロビン（γ−カテニン）およびｐ１２０ｃｔｎと相互作用する(Provost, E. & Rimm, Curr. Op. Cell Biol. 11:567-572頁. 1999)。ＢＥＣは有意に高いレベルのβ-カテニン（図２ｅ，ｆ）およびビンキュリンを発現したが、一方、プラコグロビンはＬＥＣにて主に存在した（図２ｇ，ｈ）。また、ＬＥＣおよびＢＥＣの染色ではアクチン細胞骨格の構成が著しく異なることが明らかになった。ＢＥＣはＬＥＣではほとんど完全に存在しない数多くのストレスファイバーを示し、ＬＥＣでは代わりにアクチンの皮質分布が見られた（図２ｉ，ｊ）。
【０１７８】
インテグリンは細胞接着の重要なメディエーターである(Giancotti & Ruoslahti, Science 285:1028-1032頁. 1999)。それらは２つのポリペプチド、αおよびβサブユニットからなるトランスメンブラン型タンパク質である。それらの外部領域は細胞外基質タンパク質と結合し、一方、細胞質ドメインは細胞骨格と、また、シグナル変換に関与するタンパク質と相互作用する。フィブロネクチン受容体のサブユニットとして作用するインテグリンα５は、主としてＢＥＣにおいて発現された。これに対し、ラミニンおよびコラーゲンに対する受容体およびオステオポンチンおよびテネイシンに対する受容体にサブユニットを提供するインテグリンα１およびα９は各々、ＬＥＣにおいて発現された（図１ａおよび図２ｋ，ｌ）。ヒト皮膚では、インテグリンα９に対する抗体は毛細リンパ管を特異的に染色したが、一方、血管内皮細胞はネガティブであった（図２ｍ〜ｏ）。さらに、インテグリンα９は、これまでに報告されたように動脈平滑筋細胞において検出された(Palmer, et al., J. Cell Biol. 123:1289-1297頁. 1993)。興味深いことに、インテグリンα９がリンパ系の正常な発生に重要であることがわかってきた。インテグリンα９β1欠損マウスは、胸膜（恐らくリンパ管）滲出液の貯留が原因で呼吸不全を起こし、生後６〜１２日以内に死亡する(Huang, et al., Mol. Cell Biol. 20:5208-5215頁. 2000)。
【０１７９】
ＢＥＣは、ラミニンおよび種々のタイプのコラーゲンの両方を生成したが、ＬＥＣは生成しなかった（表４）。共培養では、ＬＥＣの接着および増殖にこれらの基底膜成分が必要であると考えられる(Makinen, T., et al., EMBO J. 20:4762-4773頁. 2001)。さらに、いくつかの基質メタロプロテイナーゼ、ヒト組織およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子、ならびにプラスミノーゲン活性化因子阻害剤Ｉをはじめとする基質分解および再構築に関与する多くのタンパク質が主としてＢＥＣにおいて検出されたが、一方、基質メタロプロテイナーゼ−３（ＴＩＭＰ−３）の組織阻害剤は主としてＬＥＣにおいて検出された（表３および図１）。可溶性である他のＴＩＭＰとは異なり、ＴＩＭＰ−３は細胞外基質の一成分である。組換えＴＩＭＰ−３は、脈管形成因子に応答する内皮細胞移動および管形成を阻害すること、また、腫瘍モデルで発現した場合には、おそらく、腫瘍拡大、細胞外基質からの増殖因子の放出、または血管形成を妨げることにより腫瘍増殖を阻害することが報告された、(Anand-Apte, et al., Biochemistry & Cell Biology 74:853-862頁. 1996)。
【０１８０】
これまで未知であったさらなる遺伝子が、マイクロアレイにおいてＬＥＣ特異的な転写因子またはトランスメンブラン型タンパク質であると分かった。表５および６参照。
【０１８１】
【表３】
2005536186.tif 000005
【０１８２】
【表４】
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【０１８３】
さらに、表１０および１１では、同定された既知ＬＥＣ遺伝子とそれらの受託番号、および示差的に発現された遺伝子とそれらの受託番号を各々示している。また、表１２では、スクリーニングで同定された他の未知のタンパク質を示している。
【０１８４】
実施例４
Ｐｒｏｘ−１によるＬＥＣ遺伝子の示差的調節
リンパの分化プログラムに関与する機構を調査した。Ｐｒｏｘ−１ホメオボックス転写因子がＬＥＣにおいて特異的に発現されることが分かり、マウスにおけるｐｒｏｘ−１の標的破壊によりリンパ管発生が阻止されたことが報告された(Wigle et al., Cell, 98:769-778頁. 1999)。１０年近く前にｐｒｏｘ−ｌ遺伝子が発見されたという事実にもかかわらず、Ｐｒｏｘ−１標的遺伝子はまだ同定されていない。ホメオドメイン転写因子Ｐｒｏｘ−１がＬＥＣおよびＢＥＣ表現型の分化に寄与するかどうかを調べるため、上記の同定された遺伝子を一次ＢＥＣおよびＬＥＣにおける発現に関して、Ｐｒｏｘ−１過剰発現の存在および不在下で解析した。
【０１８５】
一次内皮細胞におけるｐｒｏｘ−１のアデノウイルス媒介性遺伝子導入を利用して、ＢＥＣにおいて遺伝子発現を誘導した。アデノウイルス感染によって起こる遺伝子発現の変化を排除するため、（β-ガラクトシダーゼをコードする) ＡｄＬａｃＺを対照としてＢＥＣに導入した。
【０１８６】
ｐｒｏｘ−ｌ  ｃＤＮＡを、全ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ヒト内皮細胞ならびにプライマー  ５’−ＧＣＣＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＴＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴ−３’（配列番号６１）および５’−ＧＣＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＧＣＡＣＡ−３’（配列番号６２）から増幅した。ＰＣＲ産物をｐＡＭＣ発現ベクターにクローニングし、Ｎ末端にＭｙｃタグの付いたｐｒｏｘ−１が産生した。次いで、この構築物をｐＡｄＣＭＶにサブクローニングして、アデノウイルス産生用のＡｄＰｒｏｘ−１を得た。ＡｄＰｒｏｘ−１およびＡｄＬａｃＺウイルスストックは、記載されているように作製した。アデノウイルス産生される分子量約８５ｋＤａのＰｒｏｘ−１は移動し、それはＰｒｏｘ−１  Ｃ末端ペプチドに対する抗体によっても認識された。変異型Ｐｒｏｘ−１  Ｎ６２５Ａ／Ｒ６２７Ａ（コドン６２５におけるアスパラギンからアラニンへの変化、コドン６２７におけるアルギニンからアラニンへの変化）は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, CA) および次のプライマー：
５’−ＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＴＴＴＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＧＴＡＧＴＴＴＴＡＣＴＡＣ−３’（配列番号６３）および
５’−ＧＴＡＧＴＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＧＡＡＧＣＧＣＴＡＡＡＣＣＡＣＴＴＧＡＴＧＡＧ−３（配列番号６４）
を用いて作製した。
【０１８７】
ヒト皮膚微小血管内皮細胞、冠動脈内皮細胞（ＣＡＥＣ）、伏在静脈内皮細胞（ＳＡＶＥＣ）、ＢＥＣおよびＬＥＣをアデノウイルス感染前に２４時間、８，０００細胞／ｃｍ２の密度で培養し、血清フリー培地で５０〜１００ＰＦＵ／細胞にて１時間感染させた。インキュベーション終了時に細胞を洗浄し、次いで、完全培地で２０〜２４時間培養した。全ＲＮＡの単離およびアレイハイブリダイゼーションを上記のように行った。
【０１８８】
力価試験では、ＡｄＰｒｏｘ−１またはＡｄＬａｃＺでのヒト微小血管内皮細胞の感染により、感染後２４時間において細胞の＞９０％にアデノウイルスによりコードされるタンパク質の核発現がもたらされることが分かった。Ｐｒｏｘ−１により誘導される遺伝子発現の変化を調査するために、一般細胞代謝に重要であることが分かっている約１，０００種の遺伝子、ならびに心臓血管機能または血液生成の調節に特異的に関与する遺伝子を含むヒトｃＤＮＡフィルターアッセイを利用した。Ａｄｐｒｏｘ−１は２８種のＬＥＣ遺伝子の発現をアップレギュレートし、６３種のＢＥＣ遺伝子の発現をダウンレギュレートした（以下の表７参照）。このことは、ノーザンブロッティングにより、１１種の選択された遺伝子のうちの１０種で確認された。ＬＥＣおよびＢＥＣにおいて示差的に発現される遺伝子と比べて、Ｐｒｏｘ−１により調節された１５種の遺伝子（すなわち、約３０％）が培養ＬＥＣおよびＢＥＣ間で示差的に発現されることが分かり、Ｐｒｏｘ−１がリンパ管内皮細胞自体の重要なレギュレーターであることが示唆された。
【０１８９】
【表５】
2005536186.tif 000007
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2005536186.tif 000009
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【０１９０】
ＢＥＣにおける組換えＰｒｏｘ−１発現（通常はそれが存在しない）によりこれらの細胞の転写プログラムをリンパ管内皮細胞表現型へと変更し得るかどうかも調査した。対照のＡｄＬａｃＺでは、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析により分かるように、ＢＥＣ特異的またはＬＥＣ特異的な転写物の発現が有意に変更されなかった。これに対し、ＡｄＰｒｏｘ−１では、数多くのＬＥＣ特異的なｍＲＮＡ、例えば、ＶＥＧＦＲ−３、ｐ５７Ｋｉｐ２、デスモプラキンＩ／IIおよびα−アクチニン関連ＬＩＭタンパク質、の発現が高まった（表８参照）。驚くべきことに、Ｐｒｏｘ−１はまた、ＢＥＣにおいて特異的に発現される遺伝子の約４０％、例えば、転写因子ＳＴＡＴ６、ＵＦＯ／ａｘｌ受容体チロシンキナーゼ、ニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）、単球遊走因子−１（ＭＣＰ−１）およびインテグリンα５の発現を抑制した（表７および表８）。これらの遺伝子発現の結果は、リンパ管のin vivo研究と一致している。例えば、ＶＥＧＦＲ−３およびデスモプラキンＩ／IIはリンパ管内皮細胞において見られ(Ebata et al., Microvasc. Res. 61:40-48頁. 2001; Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:3566-70頁. 1995)、ＢＥＣではＰｒｏｘ−１により抑制されるＶＥＧＦ補助受容体ＮＲＰ−１は、マウス皮膚における血管では発現されるが、リンパ管では発現されないことが判明した。
【０１９１】
【表６】
2005536186.tif 000011
【０１９２】
Ｐｒｏｘ−１により誘導される遺伝子発現における変化が細胞種特異的なものであるかどうかを調べるために、ＡｄＰｒｏｘ−１またはＡｄＬａｃＺ感染後の遺伝子発現の変化をさらなる内皮細胞種、すなわち、冠動脈内皮細胞（ＣＡＥＣ）および伏在静脈内皮細胞（ＳＡＶＥＣ）、ならびに非内皮細胞種、すなわち、羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）で解析した。これらの細胞種全てにおいて、ＡｄＰｒｏｘ−１はサイクリンＥ１およびＥ２、ヒストンＨ２Ｂ、ならびにＰＣＮＡを強くアップレギュレートした。しかしながら、ＡｄＰｒｏｘ−１はＣＡＥＣおよびＳＡＶＥＣでのみＶＥＧＦＲ−３発現を誘導したが、ＡＥＣでは誘導しなかった。
【０１９３】
これらの結果は、Ｐｒｏｘ−１欠損胚でのリンパの分化の欠如と一致している。興味深いことに、一次内皮細胞におけるＰｒｏｘ−１の発現により、妊娠中期以降のリンパ管内皮細胞に特異的であり、正常なリンパ管の増殖および機能に必要なＶＥＧＦＲ−３受容体チロシンキナーゼのアップレギュレーションがもたらされる(Karkkainen and Petrova, Oncogene 19:5598-5605頁. 2000)。例えば、ヒトおよびマウスにおけるＶＥＧＦＲ−３の不活性化突然変異により、リンパの形成不全およびリンパ水腫が起こる(Jeltsch et al., Science 276:1423-1425頁. 1997; Karkkainen et al., Nat. Genet., 25:153-159頁. 2000; Karkkainen et al, Trends Mol. Med. 7:18-22頁. 2001)。そのため、上記の結果からは、Ｐｒｏｘ−１によるＶＥＧＦＲ−３発現のアップレギュレーションがリンパ管内皮細胞自体の確立に関与する主要な経路の一つであることが示唆され、また、成人血管内皮の異なる表現型の細胞は形成力があり、内皮細胞に作用する本発明の治療法において有用な転写リプログラミングに反応しやすいことも示唆される。
【０１９４】
実施例５
ＡｄＰｒｏｘ−１トランスフェクト細胞によるｅｘ−ｖｉｖｏ細胞刺激およびリンパ水腫の遺伝子治療
Ｐｒｏｘ−１の、ＬＥＣ発生に特異的に関与する遺伝子を調節する能力は、ＬＥＣ疾患またはＬＥＣ遺伝子発現レベルの上昇または低下のいずれかの結果として起こる状態を示す個体の治療のための手段を提供する。Ｐｒｏｘ−１によるアップレギュレーションは、リンパ水腫などの広範囲に起こる危険性を特徴とする状態のリンパ系の発達不十分を特徴とするＬＥＣ疾患の治療として、ＬＥＣ発生を促進するのに有用である。逆に、Ｐｒｏｘ−１による阻害は、リンパ水腫などのリンパ系の過剰発達を特徴とするＬＥＣ疾患の治療として、ＬＥＣ発生をダウンレギュレートするのに有用である。細胞をex vivoでトランスフェクトし、続いて、これらの細胞を患者へ導入することが、導入した特定の遺伝子のin vivoレベルをアップレギュレートする、また、遺伝子の発現不足の結果として起こる疾病を軽減するのに有効な方法であることは当技術分野では公知である(Gelse et al., Arthritis Rheum. 48:430-41頁. 2003; Huard et al, Gene Ther. 9:1617-26頁. 2002; Kim et al., Mol. Ther. 6:591-600頁 2002)。
【０１９５】
ＬＥＣ発生の異常を治療するための治療法を開発するために、ＣＡＥＣ、ＳＡＶＥＣ、ＬＥＣまたはＢＥＣなどの内皮細胞をＬＥＣ疾患（例えば、リンパ水腫）患者から単離した後、好適な培養培地（上記参照）で培養して、細胞の増殖および生存を促進する。次いで、細胞を上記のようなＡｄＰｒｏｘ−１ベクターで記載されているようにトランスフェクトして、in vitroで非ＬＥＣのＬＥＣ分化を起こし、また、ＬＥＣの培養増殖を促進する。その後、これらのトランスフェクト細胞を罹患患者に治療上有効な数で導入してin vivoでのＬＥＣ拡大を促進する。好ましい態様では、操作する細胞は自己細胞である。これらの細胞は、通常、注射を含む一種以上の投与により送達される。細胞はリンパ水腫などのＬＥＣ疾病または疾患局部にまたは全身に送達される。
【０１９６】
Ｐｒｏｘ−１トランスフェクト細胞をリンパ水腫を有する患者に与えることで補足的ＬＥＣを提供し、これがリンパ管の発生を促進するリンパ網に組み込まれ、リンパのクリアランスを遂行してリンパ水腫の症状を軽減する。内皮細胞へのＡｄＰｒｏｘ−１トランスフェクションおよびトランスフェクト細胞の投与を含んでなる方法がＬＥＣ数または活性の変化を特徴とする疾病、例えば、リンパ水腫、リンパ管腫、リンパ管骨髄腫、リンパ管腫症、リンパ管拡張症、リンパ肉腫、およびリンパ管硬化症の治療において有用であると考えられる。さらに、このような方法はこのような疾病と関連した症状を改善するのに有用である（例えば、リンパ水腫の場合のリンパ誘導性腫脹）。
【０１９７】
実施例６
ＬＥＣ特異的な遺伝子の特性決定
ＬＥＣ特異的な遺伝子をＬＥＣおよびＢＥＣ遺伝子間のサブトラクションライブラリーを用いてさらに解析した。ライブラリーを構築するために、全ＲＮＡをこれまでに記載しているように単離し、５μｇの全ＲＮＡをＳＭＡＲＴ（商標）  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ  合成キット(BD Biosciences Clontech)を用いてプレ増幅した。ＲｓａＩ消化後、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡサブトラクションを両方向において実施し、その結果として、示差的に発現された配列の選択的増幅をもたらし、サブトラクション済みＬＥＣおよびＢＥＣ ｃＤＮＡライブラリーを調製した(BD Biosciences Clontech)。サブストラクティブハイブリダイゼーションを両方向において１（テスター）：３０（ドライバー）比で実施し、サブトラクション済みｃＤＮＡプールをＰＣＲにより増幅した。サブトラクション済みライブラリーの構築に向けて、４０ｎｇの精製したＰＣＲ増幅産物をpＡｔｌａｓベクター（ＰＵＣに基づくベクター）にクローニングしたが、当技術分野では公知の数多くの他のベクターを構築に使用してもよい。
【０１９８】
ＰＣＲ−セレクトディファレンシャルスクリーニングキットユーザーマニュアル(BD Biosciences Clontech)に記載されているように、サブトラクション済みＬＥＣ特異的ライブラリーの示差的スクリーニングを実施した。ＬＥＣ特異的なサブトラクション済みライブラリーを培養し、各細菌クローンを選抜し、増殖させた。ＤＮＡ抽出後、挿入物をＰＣＲにより増幅し、配列決定に用いた。また、１アリコートのＰＣＲ増幅した挿入物各々をナイロンメンブラン上にアレイし、３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションに用いた。サブトラクション済みＬＥＣ特異的（テスター）ｃＤＮＡプローブおよびサブトラクション済みＢＥＣ特異的（ドライバー）ｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果を発現差の解析に用いた。
【０１９９】
ＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)を用いて、ヌクレオチド、タンパク質およびＥＳＴ配列データベースと配列を比較した。未知の配列の場合、ＥＳＴコンティグを検索し、ＯＲＦファインダーを用いてオープンリーディングフレームを推測した。タンパク質ドメイン構造はＰｆａｍ(Protein families database of alignments and HMMs)およびＳｍａｒｔ(Simple Modular Architecture Research Tool)を用いて解析した 。
【０２００】
ＬＥＣとＢＥＣにおいて示差的に発現されたクローンのヌクレオチド配列を上記の方法により解析した。最初のスクリーニングで検出されたいくつかのＥＳＴまたは未知の遺伝子断片を、既知遺伝子配列とのそれらの配列の類似性を調べるために、また、オープンリーディングフレームおよび機能的ドメインの類似性を確認するためにさらに調査した。これらの結果を表９にまとめている。
【０２０１】
【表７】
2005536186.tif 000012
【０２０２】
ＬＥＣ特異的な遺伝子のいくつかが未知のヒトタンパク質をコードする大きなヌクレオチドＥＳＴクローンであるＫＩＡＡ遺伝子配列に相当することが判明した。(Kazusa DNA Research Institute, 1532-3, Yana Kisarazu, Chiba, 292-0812, Japan)。これらのＬＥＣ特異的な遺伝子をいくつかの利用可能なデータベースでさらに解析し、種間相同体の存在およびこれらの相同体における類似度を調べ、また、保存されているタンパク質ドメインとの類似性を示すアミノ酸配列も明示した。
【０２０３】
国立衛生研究所(National Institutes of Health)が提供し、米国国立バイオテクノロジーインフォメーションセンター(U.S. National Center for Biotechnology Information)が維持管理するＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースを利用して、ＬＥＣクローン配列の解析を実施し、種間相同体およびオルソログならびに新たに単離されたヒトＬＥＣ特異的な遺伝子とのそれらの類似度を調べた。ＵｎｉＧｅｎｅによって代表される、補正し、計算した遺伝子相同体の情報資源を利用して、またはゲノム配列の注釈付け、一般にはＵｎｉＧｅｎｅのＥＳＴおよびｍＲＮＡ配列、ならびに注釈付けしたゲノム配列から抽出された転写物の比較により、配列の解析を実施した。(Zhang, et al., J. Comp. Biol. 7:203-14頁. 2000)。ある生物のヌクレオチド配列の別の生物のヌクレオチド配列とのベストマッチングは、最小のアラインメント１００塩基対での二配列間の類似度による。二配列間の類似性は、アラインメントスコアによって決められた。配列対のアラインメントスコアは、アラインした二配列の部分の類似性スコアの合計である。
【０２０４】
ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ解析では、ＫＩＡＡ０６２６、ＫＩＡＡ０６４４、およびＫＩＡＡ００６２に相当するヒトＬＥＣ遺伝子が、マウス（全て）、ラット（ＫＩＡＡ００６２、ＫＩＡＡ０６４４）、ウシ（ＫＩＡＡ００６２）、ブタ（ＫＩＡＡ０６２６、ＫＩＡＡ０６４４）およびゼノパス（ＫＩＡＡ０６４４）のＥＳＴおよび未知の遺伝子配列と相同であることが示されている。クローンはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅにより相同体であると確認される遺伝子と約８０％（±３％）類似性を示し、ＫＩＡＡ０６４４はブタＥＳＴ配列ＢＥ２３３０２８．１とほぼ８６％相同性、また、アフリカツメガエル(X. laevis)遺伝子とほぼ７２％類似性を示した。
【０２０５】
ＬＥＣ遺伝子のＰｆａｍ比較による解析では、ＫＩＡＡ０６２６（配列番号１４）、ＫＩＡＡ０６４４（配列番号１５）、ｈＬｙｒｐ（配列番号１６）、ＸＭ＿０８４６５５（配列番号４５）およびＫＩＡＡ００６２（配列番号４７）に対応するヌクレオチド配列が、コードされるトランスメンブランドメインの特徴を示すヌクレオチド配列モチーフを示すことが明らかになり、対応するポリペプチド（そのアミノ酸配列は各々、配列番号３１、３２、３３、４６および４８で示される）が細胞表面で発現されることが示された。ＫＩＡＡ１６７３、ＫＩＡＡ０５８２およびＫＩＡＡ０１０１では、トランスメンブランドメインが明示されず、細胞質または核タンパク質であると思われる。ノーザンブロットによる組織発現のアッセイでは、ＫＩＡＡ０１０１は腎臓、胸腺、結腸および小腸で検出でき、また、ＫＩＡＡ０５８２は心臓、骨格筋、および卵巣では強く、腎臓および胎盤では少し下回って、さらに、脳、肺、胸腺、小腸および前立腺ではより弱く発現されることが明示される。
【０２０６】
ＫＩＡＡ０６２６転写物のノーザンブロット解析では、ＫＩＡＡ０６２６がＬＥＣで特異的に発現され、心臓、骨格筋および腎臓において認められることが分かる。in situ解析では、マウス胎生期１１日（Ｅ１１）の胚がＫＩＡＡ０６２６を、中胚葉節組織および血管周囲の周皮細胞で、ならびに卵黄嚢血管、内皮細胞  およびその周囲の周皮細胞で発現することを示している。ＫＩＡＡ０６２６（配列番号１４）のポリヌクレオチド配列はシグナル配列（アミノ酸１〜２９位）、Ｉｇ  スーパーファミリードメイン（およそａａ  ６１〜１２７）、短いトランスメンブラン領域（およそａａ  １５３〜１７５）および長い２３４個のアミノ酸からなる細胞質ドメイン（およそアミノ酸１７６〜４０９）を有する４０９個のアミノ酸（４０９  ａａ）からなるタンパク質（配列番号３１）をコードする。Ｉｇ  ドメインが存在することからタンパク質のそのリガンドとの結合を手助けしていると考えられ、また、長い細胞質ドメインがＫＩＡＡ０６２６がＬＥＣにおける細胞内シグナル伝達に関与していることが分かる。
【０２０７】
ノーザンブロット解析により、ＫＩＡＡ０６４４（配列番号１５）は主として心臓および脳組織において検出される。Ｅ１０マウス胚のin situアッセイでは、ＫＩＡＡ０６４４が胚全体で発現されることが分かる。ＫＩＡＡ０６４４ポリヌクレオチドは合計１３のロイシン豊富な領域を示す８１１個のアミノ酸からなるポリペプチド（配列番号３２）をコードする。ロイシン豊富な領域は、細胞接着および受容体分子の役割を果たすタンパク質に存在する約２０〜２８個のアミノ酸からなる短い配列モチーフを含んでなる。ロイシン豊富な領域（以下、ＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴと呼ぶ）には、システイン豊富なドメインがフランキングすることが多い。ＫＩＡＡ０６４４タンパク質は、ロイシン豊富なＮ末端領域（ＬＲＲＮＴ：ａａ  ２６〜５４）、１１のロイシン豊富な内部領域（ＬＲＲ１：ａａ８４〜１０７、ＬＲＲ２：ａａ１０８〜１３１、ＬＲＲ３：ａａ１３２〜１５５、ＬＲＲ４：ａａ１５６〜１７９、ＬＲＲ５：ａａ１８０〜２０３、ＬＲＲ６：ａａ２０４〜２２３、ＬＲＲ７：ａａ２３０〜２５３、ＬＲＲ８：ａａ２５４〜２７７、ＬＲＲ９：ａａ２７８〜３０１、ＬＲＲ１０：ａａ３０２〜３２５、およびＬＲＲ１１：ａａ３２６〜３４９）およびロイシン豊富なＣ末端領域（ＬＲＲＣＴ）（およそアミノ酸３５９〜４０４）を含む。ＫＩＡＡ０６４４のトランスメンブランドメインは、およそアミノ酸６９６〜７１８に及び、残りが約９５個のアミノ酸（ａａ７１９〜８１１）からなる細胞質ドメインである。ＫＩＡＡ０６４４遺伝子のロイシン豊富な領域により細胞接着またはリガンド結合特有のタンパク質−タンパク質相互作用に関与する。
【０２０８】
ｈＬｙｒｐ（配列番号１６）ｍＲＮＡは、骨格筋組織で検出でき、また、in situハイブリダイゼーションにより、マウス胚のＥ１１、卵黄嚢におけるＰｒｏｘ−１染色と比べてリンパ管に限局される。ＫＩＡＡ０６４４と同様に、ｈＬｙｒｐタンパク質（配列番号３３）は、ロイシン豊富なＮ末端領域（ＬＲＲＮＴ：ａａ２７〜５５）から始まり、５のロイシン豊富な内部領域（ＬＲＲ１：ａａ５７〜８０、ＬＲＲ２：ａａ８１〜１０４、ＬＲＲ３：ａａ１０５〜１２８、ＬＲＲ４：ａａ１２９〜１５３、ＬＲＲ５：ａａ１５４〜１７６）を通じて及び、ロイシン豊富なＣ末端領域（ＬＲＲＣＴ）（およそａａ１８６〜２４０）で終わる一連のロイシン豊富な領域を含む。また、ｈＬｙｒｐポリペプチドは、アミノ酸２４９〜２７２のトランスメンブランドメイン、残る２２個のアミノ酸からなる短い細胞質ドメインを含む。ｈＬｙｒｐポリペプチドにいくつかの連続するロイシン豊富な領域が存在することから、そのポリペプチドが細胞接着分子および／または細胞表面受容体の役割を果たすことが分かる。
【０２０９】
ＬＥＣで特異的に発現される全長ｍＲＮＡ配列を用いて表３に示したいくつかのさらなる配列を単離した。これらの配列のドメインの推定により、ＫＩＡＡ０７１１（配列番号８１および８２）がおよそアミノ酸１７１〜２６９に及ぶＢＰＢ／ＰＯＺドメインを含むことが分かり、このドメインがタンパク質−タンパク質相互作用で機能すると考えられる。ＰＯＺドメインは、転写抑制を媒介し、ヒストン脱アセチル化酵素複合体の成分と相互作用する亜鉛フィンガータンパク質などの転写補因子に現れる。ＫＩＡＡ０７１１はまた、アミノ酸３８６〜４３７、４３９〜４８０、および４８４〜５２５に及ぶ３つのＫｅｌｃｈリピート配列を有し、Ｋｅｌｃｈモチーフがβシート構造の形成に関わっている。さらに、ＫＩＡＡ０７１１  ｍＲＮＡは種々の組織で発現される。ＫＩＡＡ０７１１  ｍＲＮＡは、最大の発現レベルから最小の発現レベルのものまで、脳および腎臓；肝臓；脾臓；肺；卵巣、膵臓および心臓；平滑筋および精巣で認められる。この発現パターンはＲＴ−ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡの一回の実施で得たものであるため、発現プロフィールがかなりの試験間変動を含んでいる可能性がある。よって、発現プロフィールは組織特異的な発現に関する遺伝子の定性的レベルでのスクリーニングに最も好適である。より正確な定量的発現プロフィールが求められる場合には、統計学上より信頼性のあるアプローチを使用するべきであろう（例えば、マルチプルＲＴ−ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ測定法、ＤＮＡチップ解析、ＲＮＡブロット解析など）。
【０２１０】
ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４０２２２（配列番号９３）に対応する配列のドメインマッピングでは、Ｎ末端シグナルペプチド（アミノ酸１〜２３）、２つの内部リピートドメインおよびミオシリン、パンコルチン、およびラトロフィリンなどのタンパク質で検出されるオルファクトメジンドメイン（アミノ酸３６１〜６１６）の存在が示される。ミオシリンのＯＬＦドメイン内での突然変異は緑内障と関係がある。
【０２１１】
ＫＩＡＡ１２３３（配列番号１１１）のドメインマッピングでは、ＫＩＡＡ配列が細胞外基質タンパク質で認められる、一般に、細胞−細胞相互作用に、さらに具体的に言うと、補体活性化経路に、血管形成の阻害に、およびアポトーシスに関与する６つのＩ型トロンボスポンジンリピート配列を含むことが示される。ＫＩＡＡ１２３３はまた、数多くの糖タンパク質と類似した３つのＣ−２型免疫グロブリンドメインを含む。また、トロンボスポンジンリピート配列と免疫グロブリンドメインの両方を有するタンパク質は、細胞接着およびアポトーシスなどの細胞内相互作用に関与している。ＫＩＡＡ１２３３  ｍＲＮＡは、最大の発現レベルから最小の発現レベルのものまで、脊髄；心臓、脳一般、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脳の種々の領域（小脳扁桃、脳梁、尾状核、海馬、黒質、視床、および視床下核）および胎児肝臓；胎児脳；脾臓；ならびに精巣で認められる。
【０２１２】
ＫＩＡＡ０８４６（配列番号１８８）タンパク質は、グアニンヌクレオチド交換因子に見られるモチーフを含み、それゆえ、細胞内タンパク質であるかもしれないし、シグナル伝達タンパク質であるかもしれない。ＫＩＡＡ０８４６はまた、カルシウム依存性の構造変化を受け、緩衝化／輸送タンパク質でも認められるシグナル伝達タンパク質（例えば、カルモデュリン、Ｓ１００Ｂ）に見られる２つのＥＦ−ハンドモチーフを示す。ＫＩＡＡ０８４６  ｍＲＮＡは、最大の発現レベルから最小の発現レベルのものまで、腎臓；心臓、脳および肺；肝臓、脾臓および卵巣；膵臓、平滑筋および精巣で認められる。
【０２１３】
タンパク質ＦＬＪ１３１１０（配列番号２０７および２０８）は、ＴＢ２／ＤＰ１、ＨＶＡ２２ファミリータンパク質ドメインおよび２つの短いトランスメンブラン領域（配列番号２０７のアミノ酸４〜２２および４３〜６５）を示す。ＨＶＡ２２ファミリーとしては、重症度の高い臨床型の家族性大腸腺腫症、常染色体優性遺伝性腫瘍症で欠失しているＴＢ２／ＤＰ１（重症家族性大腸腺腫症で欠失している）タンパク質をはじめとする、種々の真核生物由来のメンバーが挙げられる。
【０２１４】
また、ＬＥＣ特異的な遺伝子のスクリーニングにより、タンパク質ＫＩＡＡ０９３７（配列番号２１１および２１２）も同定した。ＫＩＡＡ０９３７は、３つのその保存されている残基に因んで名づけられ、ユビキチンおよびＡＤＰリボース結合系での特定のタンパク質−タンパク質相互作用を媒介すると推測されるＷＷＥドメイン（配列番号２１１のおよそアミノ酸３０〜１１２、および１１３〜１８９）を含む。また、ＫＩＡＡ０９３７は、亜鉛フィンガードメイン（配列番号２１１のアミノ酸４４３〜５０１）を含むと推測され、細胞内転写因子であると考えられる。ＫＩＡＡ０９３７  ｍＲＮＡは、最大の発現レベルから最小の発現レベルのものまで、脊髄；視床下核および脳の小脳；脳一般（扁桃体、脳梁および胎児脳を含む）および卵巣；胎児肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓および脳の一部（尾状核および海馬）；精巣および膵臓；ならびに平滑筋で認められる。
【０２１５】
ＫＩＡＡ０９５２（配列番号２４１および２４２）は、Ｂｒｏａｄ−Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＴｒａｍｔｒａｃｋおよびＰＯＺ（ポックスウイルスおよび亜鉛フィンガー）ドメインとしても知られるＢｒｉｃ−ａ−ｂｒａｃドメインを含む。これらのドメインは、数種類のＣ２Ｈ２型転写因子のＮ末端、ならびにＳｈａｗ型カリウムチャネルに認められるタンパク質−タンパク質相互作用ドメインであることが知られている。これらのドメインの既知の構造から、Ｎ末端ポリペプチド鎖とらせん構造との間の相互作用によって形成された、強固に結合した二量体であることが示される。
【０２１６】
ＫＩＡＡ０４２９（配列番号３９１および３９２）と呼ばれるタンパク質は、転移抑制タンパク質と類似しており、アクチン結合ＷＨ２ドメイン（およそアミノ酸４６７〜４８４）、ならびにプロリン豊富な領域（アミノ酸３４８〜４６６）を含む。
【０２１７】
タンパク質ＦＬＪ２３４０３（アミノ酸配列、配列番号８５９；ポリヌクレオチド配列、配列番号８６０）は、未知のマウスタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿１２９０００）と約８５％相同性を示し、アミノ酸４４〜６６、８６〜１０８、１１５〜１３７および４５２〜４７４に及ぶ一連の４つのトランスメンブランドメインを含む。
【０２１８】
さらなるＬＥＣ特異的な、アップレギュレートされた遺伝子としては、これまで未確認のタンパク質ＫＩＡＡ０１８６（配列番号２２１および２２２）、ＫＩＡＡ０５１３（配列番号２３５および２３６）およびＦＬＪ１３９１０（配列番号２９３および２９４）と呼ばれるタンパク質が挙げられる。
【０２１９】
リンパ管内皮細胞特異的な分子の操作は、組織の浮腫を伴う疾患であるＬＥＣ疾病の治療に適用できると考えられる。理論にとらわれることなく、このような分子の操作によって、内皮細胞−細胞または細胞−基質タンパク質相互作用が調節されるか、または経内皮輸送に作用することによりリンパ管壁を流れる液体輸送の状態が変更されると思われる。さらに、このような分子は、増殖因子、有糸分裂促進剤などのような治療用化合物、ならびに当業者には公知の細胞増殖抑制剤または細胞傷害性薬剤の送達に標的を提供する。治療薬を、例えば、ＬＥＣ表面マーカーの結合相手（例えば、抗体)と結合することにより、これらの治療用化合物をこのような細胞へとターゲッティングさせる。本明細書に記載するトランスメンブラン型タンパク質、特に、ロイシン豊富なタンパク質もまた、リンパのクリアランスに不可欠な細胞接着事象を調節するのに有用な標的を提供する。
【０２２０】
実施例７
ＬＥＣ関連疾患およびリンパ関連疾患を検出するマイクロアレイ解析
本明細書に記載するＬＥＣ特異的な遺伝子は、in vivoでのＬＥＣの検出に、また、サンプルのリンパ管構造の程度を判定するのに有用である。ＬＥＣ特異的な遺伝子はまた、リンパ水腫および他のＬＥＣ関連疾患の診断にも有用であると考えられる。
【０２２１】
本発明の別の態様は、特定の細胞種に特有の遺伝子発現パターンの検出に用いる、また 特定の細胞種、例えば、リンパ管内皮細胞の発現パターンの変化を検出するための複数のポリヌクレオチドプローブを含んでなる組成物である。 本明細書において「ポリヌクレオチドプローブ」とは、配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１で示される核酸配列のいずれか一つもしくはその断片、または配列番号３１〜４４、４６、４８および５０で示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列もしくはその断片を指す。好ましくは、その断片は少なくとも１０のヌクレオチド長であり；より好ましくは、少なくとも２０のヌクレオチド長である。このような組成物は、リンパ管内皮細胞の機能異常または機能不全が関わるか、または疑われる状態または疾病の診断および治療に使用される。一つの態様では、本発明は、ポリヌクレオチドプローブの少なくとも一つのサブセットが、上記のＬＥＣ特異的な遺伝子の集団から単離された、発現遺伝子の少なくとも一部を含んでなる複数のポリヌクレオチドプローブを含む組成物を提供する。また、その各々が配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１からなる群から選択される独特の配列を含んでなるこのようなプローブの少なくとも一つのサブセットを含む複数のポリヌクレオチドプローブを含む組成物も意図される。好ましくは、組成物が、その各々が配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１からなる群から選択される異なる配列を有する少なくとも３のポリヌクレオチドの１サブセットを含んでなる。また、配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１からなる群から選択される配列を有する少なくとも５、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５の異なるポリヌクレオチドを含む組成物も好ましい。
【０２２２】
組成物は、複数の標的ポリヌクレオチドの発現をモニタリングするマイクロアレイにおいてハイブリダイズ可能なアレイエレメントのセットとして特に有用である。マイクロアレイは基質とハイブリダイズ可能なアレイエレメントを含んでなる。マイクロアレイは、例えば、リンパ管内皮細胞の活性異常から起こる疾病、例えば、リンパ水腫、リンパ管腫、リンパ管骨髄腫、リンパ管腫症、リンパ管拡張症、リンパ肉腫、およびリンパ管硬化症、の診断および予後に使用される。組成物は二以上の細胞種の同定に有用であり得、また二以上の疾病、疾患または状態の診断および予後において有用であり得る。さらに、シグナルを生じるプローブから、また、シグナルを生じないプローブから有用な情報が得られる。
【０２２３】
配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１のいずれか一つの配列を含んでなるポリヌクレオチドは、配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１によりコードされる遺伝子のいずれか一つの発現異常が関係する状態または疾病の診断に使用し得る。例えば、配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１で示される配列のいずれか一つを含んでなるポリヌクレオチドは、リンパ水腫患者または別のリンパ関連疾病患者の遺伝子発現の異常を検出するための体液または組織（例えば、生検から得られたもの)のハイブリダイゼーションまたはＰＣＲアッセイに使用し得る。さらに、配列番号３１〜４４、４６、４８または５０で示されるアミノ酸配列をコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドは、これらのアミノ酸配列のいずれか一つを有するポリペプチドの発現異常と関係する状態または疾病の診断に有用である。また、少なくとも１０のヌクレオチドを含んでなる断片は、これらの診断法にも有用である。
【０２２４】
配列番号１〜３０、４５、４７、４９および５１を含んでなる本発明の組成物を用いて、発現プロフィールを得る。マイクロアレイにより得られた発現プロフィールを使用して、疾病に関与する遺伝子の発現の変化を検出する。
【０２２５】
実施例８
ＢＥＣおよびＬＥＣにおける転写因子
ＬＥＣにおいて選択的に発現される転写因子には、ジンクフィンガー因子ｃ−ｍａｆおよびＭＡＤＳファミリー転写因子ＭＥＦ２Ｃが含まれていた（図１）。ＭＥＦ２Ｃの標的化突然変異誘発により、一次脈管構造の再構築障害および心内膜発生異常が原因でＥ９．５〜１０にて胚死亡が起こる(Bi, et al., Dev. Biol. 211:255-267頁. 1999)。ＭＥＦ２Ｃは、転写因子Ｓｏｘ１８と結合すること、また、内皮細胞におけるその活性を増強することが報告されている(Hosking, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 287:493-500頁. 2001)。ＭＥＦ２Ｃ複合体を破壊するＳｏｘ１８に同型接合性突然変異を有する子マウスは、いくつかの遺伝的背景により乳糜性腹水を起こす(Pennisi, D., et al., Nat. Genet. 24:434-437頁. 2000)ことから、両方のタンパク質がリンパ管の発生の調節に関与していることが示唆される。この仮説どおりに、ＭＥＦ２Ｃ−／−胚のＲＴ−ＰＣＲ解析ではＶＥＧＦＲ−３発現の低下を示した(Bi, et al., Dev. Biol. 上記)。
【０２２６】
ＩＬ−４に応答して活性化されるＳＴＡＴ６転写因子はＢＥＣにおいて特異的に発現された。この観察結果と一致して、本明細書での結果はＩＬ−４受容体がＭＣＰ−１およびＣＸＣＲ４などのＩＬ−４標的ケモカインおよび受容体であるように、ＢＥＣにおいて選択的に発現されたことを示している。ＶＥＧＦ刺激およびＶＥＧＦＲ−２の活性化により、内皮細胞におけるＳＴＡＴ６のリン酸化および活性化が起こることも知られている(Bartoli, et al., J. Biol. Chem. 275:33189-33192頁. 2000)。よって、ＬＥＣにＳＴＡＴ６が存在しないことから、ＢＥＣとＬＥＣとではＶＥＧＦＲ−２の下流のシグナル伝達経路が異なっていることが示唆される。表５では他の転写因子の発現パターンを示している。
【０２２７】
実施例９
Ｓｏｘ１８および遺伝性リンパ水腫
転写因子ＭＥＦ２Ｃの発現はＬＥＣにおいてアップレギュレートされる。マウスではＭＥＦ２Ｃと相互作用することが報告されているＳｏｘ１８（配列番号５３、およびコードＳｏｘ１８、配列番号５４）もまた、リンパ管内皮細胞の発生において潜在的な役割を果たすことが分かった。Ｓｏｘ１８のヒトリンパ水腫における役割を調査するために、ヒトＳｏｘ１８変異体のヒト遺伝性リンパ水腫との相関関係を調べた。
【０２２８】
ＳＯＸタンパク質、ＳＲＹ転写因子ファミリーの相同体は、推定高移動度群（ＨＭＧ）ＤＮＡ結合ドメインを含む遍在性の転写因子である。(Wegner, M.,  Nucl. Acids Res. 27:1409-20頁. 1999)。ＳＯＸタンパク質は、７量体ＳＯＸコンセンサス結合配列［５’−（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＣＡＡ（Ａ／Ｔ）Ｇ−３’］にて、それらのＤＮＡ標的と結合する(Pennisi et al., Mol. Cell Bio. 20:9331-36頁. 2000)が、通常、標的遺伝子の転写調節をもたらす二重らせんの主溝よりもむしろ、副溝のＤＮＡと結合する。また、ＳＯＸタンパク質は、他のＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ−タンパク質複合体への補充にも関わり、その結果として転写調節を手助けすると思われる(Wegner, 上記)。ＳＯＸ１８はＳＯＸ７およびＳＯＸ１７のいずれとも、グループＦ  Ｓｏｘ遺伝子の全てのメンバーと相同性を共有している。
【０２２９】
Ｓｏｘ１８は血管新生に関与しており、発生中の血管新生性の心血管系および部位に限局している。Ｓｏｘ１８のＲａｇｇｅｄ（Ｒａ）突然変異の同型接合マウスは、リンパ水腫のＣｈｙマウスモデル(Lyon et al., Mouse News Lett. 71: 26頁. 1984)と同様に、乳糜性腹水および浮腫を示す(Pennisi et al., Nat. Genet. 24:434-37頁. 2000)。Ｒａマウスでの突然変異がトランス活性化ドメインの末端切断を引き起こすフレームシフト突然変異であると決定された(Pennisi et al., Nat. Genet. 24:434-37頁. 2000)。しかしながら、Ｓｏｘ１８ヌルマウスは、毛嚢の発生においてわずかしか表現型の変化を示さないが、浮腫または血管新生異常の徴候は示さない(Downes and Koopman, Trends Cardio. Med. 11:318-24頁. 2001)。この表現型は、グループＦ  Ｓｏｘメンバー、ＳＯＸ７およびＳＯＸ１７の過剰によると思われる。これらのタンパク質が不在のＳｏｘ１８の機能の代わりをするが、Ｒａ突然変異などのＳｏｘ１８ドミナントネガティブな変異体に打ち勝つことはできない。従って、グループＦファミリー全てをノックアウトすることにより、Ｒａｇｇｅｄマウスと類似したリンパ水腫表現型が生み出せる。
【０２３０】
マウスおよびヒトＳＯＸ１８は、約８０個のアミノ酸からなるＤＮＡ結合ＨＭＧボックス（９７％相同）、マウスでは約９３個のアミノ酸からなるトランス活性化ドメイン（９０％相同）、およびＣ末端ドメイン（９２％相同）を含む相同タンパク質である(Downes and Koopman, 上記)。ヒトＳＯＸ１８ ＨＭＧボックスは、アミノ酸８４〜１５１に対応するヌクレオチド３９５〜５９８に限局された。マウスＨＭＧボックスは、アミノ酸７８〜１４８に対応するヌクレオチド３２０〜５３２によりコードされる。ヒトトランス活性化ドメインは今日まで明確に叙述されたことはないが、当業者ならば、マウスＳＯＸ１８のアミノ酸２５２〜３４６に見られる相同マウス配列を用いてヒトトランス活性化ドメインを容易に得ることができる(Hosking et al., Gene 262:239-47頁. 2001)。ヒトＳＯＸ１８タンパク質は、一次構造レベルではマウスＳｏｘ１８と類似性を示すが、ヒトＳｏｘ１８変異体と遺伝性リンパ水腫などの疾病または状態との関係は分かっていない。
【０２３１】
ヒトＳｏｘ１８は、染色体２０ｑ．１３．３にマッピングされている(Stanojcic et al., Biochem. Biophys. Acta. 1492:237-41頁. 2000)。遺伝性リンパ水腫と関係しているこの染色体上の位置またはその位置付近の遺伝性突然変異の解明は、疾病の遺伝的な根拠の確認において、遺伝性リンパ水腫を患う患者のスクリーニングにおいて、患者の遺伝性リンパ水腫または他の種類のリンパ水腫の発症に対する素因に関するスクリーニングにおいて、さらに、遺伝性突然変異の克服に向けられた標的治療計画の基礎としても有用である。
【０２３２】
Ｓｏｘ１８のリンパ水腫との関連を調べるため、連鎖解析および候補遺伝子の位置解析の実施を目的として遺伝性リンパ水腫を有する家族を同定する。家族のメンバーが、片足または両足に非対称性の腫脹または明らかな腫脹を示している場合、またはリンパ水腫の医学的診断を受けたことがある場合、または四肢の腫脹または非対称性についての個人または家族の調査報告書がある場合には遺伝性リンパ水腫を患っていると考えられる。
【０２３３】
その家族のメンバーから生体サンプルを得て、遺伝解析を実施する。ＤＮＡは、Miller et al.,(Nucleic Acids Res. 16:1215頁. 1998)の方法により、ＥＤＴＡで抗凝固処理した全血から、また、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ単離キット(Gentra Systems, Minneapolis, MN)を用いて細胞採取用ブラシによる標本(cytobrush specimen)から単離する。ゲノムスキャンに使用するマーカーの解析は、当技術分野では一般的な方法により行う。Browman et al., Am. J. Hum. Genetic., 63:861-869頁 (1998)を参照；さらに、ＮＨＬＢＩ哺乳類遺伝子タイピングサービス(NHLBI Mammalian Genotyping Service)も参照。
【０２３４】
Ｓｏｘ１８のリンパ水腫における潜在的な役割を調査するため、Ｓｏｘ１８遺伝子の一部を直接配列決定することにより、リンパ水腫の家族の発端者を変異に関してスクリーニングする。配列決定戦略では、Ｓｏｘ１８  ｃＤＮＡ配列（配列番号５３）に基づいて作製した増幅プライマーと関連Ｓｏｘ遺伝子のゲノム機構 (イントロン−エクソンデータ、同定されたドメインモチーフ）についての情報を使用する。変異位置（単一ヌクレオチド多型）および特異的な配列プライマーを用いて、解析に使用するドメイン内に位置する各変異部位にフランキングする配列を増幅する。
【０２３５】
正常個体およびリンパ水腫罹患個体両方由来のＳｏｘ１８ゲノムＤＮＡを配列決定し、非罹患個体と比べてリンパ水腫患者のＳｏｘ１８遺伝子で検出される突然変異のマップを作製する。リンパ水腫患者で一般的に検出される突然変異、例えば、保存的または非保存的なヌクレオチドの変化、欠失、または挿入、から、特定のヌクレオチドにおける突然変異がリンパ水腫の発症に対する素因を与えていることが分かる。罹患個体のゲノムＤＮＡの解析によりＳｏｘ１８ゲノム配列における突然変異とリンパ水腫を相互に関連付ける。
【０２３６】
Ｓｏｘ１８突然変異とリンパ水腫の発症との相関関係を確認するため、各々が引用することにより本明細書の一部とされる米国特許出願番号ＵＳ２００３０２６７５９およびＰＣＴ/ＵＳ９９/０６１３３に記載される遺伝的多型の同定方法で示されるように、遺伝的連鎖研究を行う。
【０２３７】
異型接合状態で８０％浸透度、同型接合状態で９９％浸透度、および１％表現型模写率と予測される常染色体優性モデルを用いて二点連鎖解析を実施する。疾患対立遺伝子の頻度は１／１０，０００に設定する。マイクロサテライトマーカー対立遺伝子の頻度は、創始対立遺伝子を計数し、伝達されない対立遺伝子数を加えることにより算出される。サウサンプトン大学医学部提供のロケーションデータベースの距離を使用して多点解析を実施する。多点および二点解析は、ＶＩＴＥＳＳＥ（ｖ１．１）プログラムを用いて容易に実施される。(O'Connell, and Weeks, Nature Genet., 11:402-408頁. 1995)。
【０２３８】
ゲノムスキャンに使用するマーカーの解析は、当技術分野では一般的な方法により行う。［Browman et al., Am. J. Hum. Genetic., 63:861-869頁 (1998)を参照；さらに、ＮＨＬＢＩ哺乳類遺伝子タイピングサービスおよび分子遺伝学センター(Center for Molecular Genetics)(Marshfield, WI)提供のデータベースも参照。当業者ならば、Ｓｏｘ１８が限局している第２０染色体（特に、２０ｑ１３．３）で同定される遺伝的連鎖マーカーを容易に選択する(Stanojcic et al., 上記)。
【０２３９】
ＳＬＩＮＫ(Weeks et al., Am. J. Hum. Genet. 47:A204頁. 1990)を用いて連鎖シミュレーション行い、ＭＳＩＭ(Ott, J., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:4175-4178頁. 1989)を用いて連鎖を解析し、評価の対象の家族の潜在的な力を二点連鎖解析により評価する。有効な個体を用い、マーカーの遺伝子型を、連鎖（θ＝０）モデルおよび非連鎖（θ＝０．５）モデルで異型接合性０．８７５のマーカーに対してシミュレートする。シミュレーションは連鎖の検出能力がＺ（θ）２．０のＬＯＤスコア閾値に対して９０％を上回り、無病誤診率が５％未満であるように設定する。
【０２４０】
遺伝性リンパ水腫と強く相関する突然変異は、ＳＯＸ１８タンパク質の機能ドメイン、例えば、ＨＭＧボックスドメインまたはトランス活性化ドメイン内に突然変異が存在していると思われる。典型的な突然変異としては、非保存的置換をもたらすミスセンス変異、Ｓｏｘ１８ コード領域でフレームシフトをもたらすヌクレオチド欠失もしくは挿入、機能ドメインに影響を及ぼすものなどのインフレーム欠失もしくは挿入、またはＳｏｘ１８発現のレベルに影響を及ぼす制御領域の変化が挙げられる。
【０２４１】
Ｓｏｘ１８リンパ水腫関連突然変異の同定では、単離された変異型Ｓｏｘ１８対立遺伝子を含むＳｏｘ１８変異型発現ベクターを、例えば、２９３Ｔまたは内皮細胞にて発現させる。また、Ｓｏｘ１８変異体ＤＮＡをｐＧＡＬ４などの哺乳類２ハイブリッド系で有用なプラスミドに組み込んで、その結合相手、例えば、ＭＥＦ２ＣとのＳＯＸ１８相互作用を測定してもよい(Hosking et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 287: 493-500頁. 2001)し、またはＳＯＸ１８の結合相手に関してスクリーニングしてもよい。例えば、ｐＧＡＬ４  Ｓｏｘ１８ベクターでＳｏｘ１８遺伝子を酵母Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインと連結し、転写アクチベーターを別のベクターにあるＳＯＸ１８結合相手と連結させる。これらのベクターを宿主細胞へと同時導入することで、Ｓｏｘ１８の結合相手または候補結合相手との相互作用の結果として起こる検出可能なリポーター遺伝子の発現がもたらされる。ルシフェラーゼリポーター系を用いて検出されるＳｏｘ１８結合活性を有する遺伝子融合物を構築し、発現するこのアッセイには、各々、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインおよびＮＦ−κＢ転写ドメインを含むｐＣＭＶ−ＢＤおよびｐＣＭＶ−ＡＤベクターが有用である(BD Biosciences Clontech)。
【０２４２】
このような２ハイブリッドアッセイでは、トランス活性化ドメインを介したＳｏｘ１８結合に影響を及ぼす突然変異を含むＳｏｘ１８リンパ水腫関連変異体はルシフェラーゼリポーター活性の量を低下させる。このことから、Ｓｏｘ１８リンパ水腫関連突然変異は、そのトランス活性化ドメインを通じてその結合相手と結合するその能力の異常によりリンパ水腫を引き起こすことが分かる。
【０２４３】
また、Ｓｏｘ１８対立遺伝子は、いくつかの技術によりそのＨＭＧボックスＤＮＡ結合ドメイン内の突然変異について評価される。ＤＮＡ結合は、ＳＯＸ１８が結合するＤＮＡ配列、例えば、５’−（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＣＡＡ（Ａ／Ｔ）Ｇ−３’およびその並べ替え配列(permutation)が２ハイブリッドアッセイでの標的プラスミドと類似のプロモーター／リポーター遺伝子構築物の前に（すなわち、その上流にまたは５’に）配置される１ハイブリッドアッセイで評価される。さらに、リポーターアッセイでは、ＳＯＸ１８タンパク質とその推定ＤＮＡ結合配列間の結合を検出する。また、ＤＮＡ結合は、精製されたＳＯＸ１８タンパク質をＳＯＸ１８ＤＮＡ結合配列を含む３２Ｐ末端標識したＤＮＡ断片とともにインキュベートすることにより行うゲルシフトアッセイを用いても評価される。さらに、反応生成物は非変性ポリアクリルアミドゲルで解析され、ＤＮＡと結合したＳＯＸ１８または自由なＳＯＸ１８の移動性が測定される。ＳＯＸ１８ポリペプチドの推定結合部位に対する特異性は、ＳＯＸ１８の結合部位を含むＤＮＡ断片もしくはヌクレオチドまたは他の無関係のＤＮＡ配列を用いる競合試験により確立される。
【０２４４】
さらに、ＤＮＡ／タンパク質結合を検出するための蛍光に基づくアッセイが用いられる。ＳＯＸ１８  ＤＮＡ結合は、ＤＮＡまたはタンパク質のいずれかと結合する単一蛍光団の蛍光測定により検出される。これらのアッセイでは、タンパク質結合がＤＮＡ−タンパク質複合体が形成した時の蛍光強度または偏光の変化によって決定される。あるいは、各々がタンパク質結合部位の半分を含む２つのＤＮＡ断片を作製する。２つの二本鎖ＤＮＡ断片は、タンパク質結合部位の一部を含んでなる相補的一本鎖オーバーハングを有する。一方のＤＮＡ断片を蛍光供与体で標識し、もう一方を受容体で標識して、蛍光を蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）で検出する。タンパク質結合では、２つのＤＮＡ断片のオーバーハングがアニーリングし、蛍光供与体と受容体とが近接することで蛍光エネルギーの転移が起こり、これにより受容体の検出可能な蛍光を生じる。Heyduk, et al., Nat. Biotechnol. 20:171-6頁. 2002を参照。
【０２４５】
ヒトＳｏｘ１８ゲノムの突然変異とリンパ水腫の発症リスクとの相関関係から遺伝性リンパ水腫罹患個体の診断および／または治療のための別の方法を提供する。リンパ水腫と関係のあるＳｏｘ１８突然変異を解明することで、突然変異により破壊されるＳｏｘ１８タンパク質活性、例えば、ＤＮＡ結合またはタンパク質結合を判定することが可能になり、リンパ水腫患者の治療のための方向性が示される。 
【０２４６】
さらに、リンパ管新生障害を克服するための、Ｓｏｘ１８により誘導されたリンパ水腫を有する患者の、ＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄなどのリンパ増殖因子による治療が意図される。例えば、ＶＥＧＦＲ−３欠損動物をＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄにより治療することでＶＥＧＦＲ−３のシグナル伝達能力障害を克服し、それにより、リンパ管形成を促進し、リンパ水腫の症状を改善する。Ｓｏｘ１８により誘導されたリンパ水腫の患者は 治療上有効な量のＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄで治療される。さらなる態様では、リンパ水腫の症状を軽減するよう設計された他の治療法と併用してＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄが上記の患者に投与される。
【０２４７】
実施例１０
ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄノックアウトマウスにより、外因性ＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの投与により克服できる血管新生異常を例示することができる。Ｓｏｘ１８の転写調節により、ＶＥＧＦＲ−３プロモーターとのその潜在的な相互作用およびＶＥＧＦＲ−３プロモーターに及ぼす転写の影響によるこの欠陥を克服できるかどうかを判定するために、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄノックアウトマウスを細胞特異的なプロモーター（例えば、Ｋ−１４ケラチンプロモーター）またはレトロウイルスベクターからＳｏｘ１８を過剰発現するマウスと異種交配することにより遺伝的に交雑する。Ｓｏｘ１８活性がリンパ水腫に及ぼす影響を、実施例１０で記載しているように、リンパ水腫および血管新生の測定を通して評価する。
【０２４８】
ＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄノックアウトマウス／Ｓｏｘ１８過剰発現マウスでのノックアウトマウスの生存およびリンパ管の発生の検出により、Ｓｏｘ１８がＶＥＧＦＲ−３ シグナル伝達を誘導し、リンパ管形成において主要な役割を果たすことが示される。
【０２４９】
ＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現マウス（Ｋ−１４−ＶＥＧＦ−Ｃ  Ｔｇ）は、リンパ管構造の大規模なネットワークを示し、腫瘍転移しやすく、アップレギュレートされたＶＥＧＦＲ−３発現およびリンパ水腫の症状を例示する（米国特許第６，３６１，９４６号）。Ｓｏｘ１８がＶＥＧＦＲ−３を通じたＶＥＧＦ−Ｃシグナル伝達を調節するかどうかを判定するために、Ｋ−１４−ＶＥＧＦ−Ｃ  Ｔｇマウスを自然変異型Ｓｏｘ１８（Ｒａｇｇｅｄ突然変異）または当技術分野では公知の部位特異的突然変異誘発および標準ノックアウト技術を用いて構築した実験室設計変異体を発現する動物と交雑して、ＳＯＸタンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたはトランス活性化ドメインのいずれかに突然変異をもたらし、Ｋ−１４−ＶＥＧＦ−Ｃ  Ｔｇ／Ｓｏｘ１８−／−マウスを得る。
【０２５０】
Ｋ−１４−ＶＥＧＦ−Ｃ  Ｔｇ単一変異型動物と比べてＫ−１４−ＶＥＧＦ−Ｃ  Ｔｇ／Ｓｏｘ１８−／−二重変異型動物により示されたリンパ管形成の低下、腫瘍転移発生率の低下、およびＶＥＧＦＲ−３レベルの低下により、Ｓｏｘ１８分子がＶＥＧＦＲ−３を通じたＶＥＧＦ−Ｃシグナル伝達を妨害することおよびＳｏｘ１８変異体でのＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達の阻害が活性化されたＶＥＧＦＲ−３のリンパ管形成作用をダウンレギュレートすることが分かる。
【０２５１】
また、Ｋ−１４−ＶＥＧＦ−Ｃ  Ｔｇマウスを過剰発現されるＳｏｘ１８対立遺伝子のトランスジェニックマウス（上記参照）と交雑し、Ｓｏｘ１８アップレギュレーションの影響を測定する。Ｋ−１４−ＶＥＧＦ−Ｃ  Ｔｇ単一変異と比べてＫ−１４−ＶＥＧＦ−Ｃ  Ｔｇ／Ｓｏｘ１８過剰発現二重変異型動物により示されたリンパ管形成の低下、腫瘍転移発生率の低下、およびＶＥＧＦＲ−３レベルの低下により、Ｓｏｘ１８転写調節がＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達を阻害し、リンパ管形成をネガティブに調節する因子であり得ることが分かる。
【０２５２】
Ｓｏｘ１８がリンパ管形成のネガティブレギュレーターであることを示す結果から、腫瘍発生におけるリンパ管形成またはリンパ管肉腫などの大規模なリンパ管構造を介した疾患を、ＳＯＸ１８転写因子を過剰に提供し、それによりリンパ管形成シグナルの誘導を妨害するベクターの投与により治療する方法を提供する。
【０２５３】
実施例１１
リンパ管の発生におけるＳｏｘ１８
リンパ管内皮細胞は、ＶＥＧＦＲ−３およびＰｒｏｘ−１などのいくつかのＬＥＣ特異的な遺伝子により高度に調節された特有の発生パターンを示す。Ｓｏｘ１８は、ＤＮＡ結合タンパク質および転写因子として、これらのＬＥＣ特異的な遺伝子の調節に関わり、ＬＥＣ細胞の運命の詳細に貢献すると思われる。マウスではＳｏｘ１８は転写因子ＭＥＦ２Ｃと結合する、Ｓｏｘ１８変異型およびＭＥＦ２Ｃ欠損マウスのいずれもがＶＥＧＦＲ−３変異型マウスと類似したリンパ水腫症状を示す、また、ＶＥＧＦＲ−３プロモーターはＭＥＦ２Ｃ結合部位を含んでいるといういくつかの証拠により、Ｓｏｘ１８がＶＥＧＦＲ−３の転写調節に関与していることが示されている(Iljin et al, FASEB J. 15:1028-36頁. 2001)。これらの観察結果は、リンパ管の発生におけるＳＯＸ１８の役割を裏付けている。
【０２５４】
ＬＥＣ特異的な増殖因子の転写に影響を及ぼすＳｏｘ１８の能力を解析するために、血管内皮細胞を誘導し、ＡｄＰｒｏｘ−１ベクターを投入してＬＥＣに発達させる。Ｓｏｘ１８  ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルはＰｒｏｘ−１ベクターの投入前および後に測定する。Ｐｒｏｘ−１ベクターの投入後のＳｏｘ１８のアップレギュレーションはリンパ管内皮細胞の発生と関係していると思われ、Ｓｏｘ１８がＬＥＣ分化における一因子であることが分かる。また、Ｓｏｘ１８のＤＮＡ結合またはトランス活性化能力のいずれかを部位特異的突然変異誘発によって破壊し、その結果として、ドミナントネガティブまたは不活性Ｓｏｘ１８タンパク質のいずれかを生み出す。Ｓｏｘ１８を破壊した対立遺伝子を含むプラスミドをＡｄＰｒｏｘ−１ベクターでＢＥＣに同時トランスフェクトし、機能異常のＳｏｘ１８遺伝子の存在下でＬＥＣの発生を評価する。また、リンパ管の発生を調節するＳｏｘ１８の能力を測定するこれらの試験ではＬＹＶＥ−１およびポドプラニンなどのＬＥＣ特異的なマーカーの検出も利用する。さらにまた、変異型Ｓｏｘ１８をＬＥＣ特異的なタンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ−３、Ｐｒｏｘ−１、ＬＹＶＥ−１）をコードするベクターで２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトし、これらの遺伝子の活性を調節する変異型Ｓｏｘ１８の能力を評価する。例えば、Ｓｏｘ１８の存在下および不在下でＶＥＧＦ−Ｃにより刺激されたＶＥＧＦＲ−３同時トランスフェクト２９３Ｔ細胞におけるシグナル伝達をリン酸化アッセイによりを評価する。
【０２５５】
リンパ管構造の発生は、Ｒａマウス、Ｓｏｘ１８ヌルマウス、およびリンパ水腫の疾病素因と関係している本明細書に記載の突然変異のＳｏｘ１８トランスジェニックマウスをはじめとするＳｏｘ１８変異型マウスでも評価できる。リンパ水腫の症状を示すＳｏｘ１８トランスジェニックマウスを、ヒト突然変異と相同のマウス遺伝子における突然変異を発現するよう操作するか、またはリンパ水腫特異的な突然変異を含むヒトＳｏｘ１８遺伝子を発現するよう操作する。これらの動物における脈管構造の発生は、米国特許第６，３６１，９４６号(Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 92:3566-70頁. 1995も参照)で示されているように、ＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦＲ−３  ｍＲＮＡ発現を検出するin situ ハイブリダイゼーション、ＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦＲ−３タンパク質のin vivoでの抗体検出、およびＬＥＣの発生程度を判定し、in vivoで有効なリンパドレナージを視覚化するエヴァンスブルー染料による検出などの当技術分野では公知の技術を用いて解析する。
【０２５６】
ドミナントネガティブなＳｏｘ１８変異型形質転換体におけるＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達の増加により、Ｓｏｘ１８発現がＶＥＧＦＲ−３媒介性の活性に悪影響を与えることが示される。本発明は、この種の突然変異を克服する治療法であって、ヒト患者などの哺乳類にＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達を妨害するＳｏｘ１８の能力に干渉するドミナントネガティブな遺伝子またはドミナントネガティブなＳｏｘ１８リガンドなどのＳｏｘ１８阻害剤を含んでなる組成物を投与することを含んでなる方法を意図する。また、Ｓｏｘ１８活性化がＶＥＧＦＲ−３活性を促進する場合には、このことによりリンパ水腫の治療法がＳｏｘ１８転写活性を促進する組成物、例えば、ex-vivoで与えられるＳｏｘ１８を過剰発現する細胞を含んでなることが示される。
【０２５７】
実施例１２
リンパ水腫におけるＳｏｘ１８治療法
本発明の別の態様は、細胞に基づく治療用化合物、特に、ＬＥＣ細胞に基づく組成物を生産するためのＳｏｘ１８の使用である。一つの態様では、細胞が自己細胞、すなわち、リンパ系の疾病または疾患の治療を受けている生物（例えば、ヒト患者）の細胞である。本発明は、Ｓｏｘ１８の内生的発現を、例えば、相同組換えなどの組換え技術による発現制御領域、例えば、プロモーターの変更により高めることを意図する。あるいは、細胞を単離されたＳｏｘ１８、例えば、in vivoまたはex vivoのいずれかでの異種Ｓｏｘ１８発現のために異種Ｓｏｘ１８で形質転換またはトランスフェクトする。
【０２５８】
例えば、Ｓｏｘ１８は、転写因子ＭＥＦ２Ｃと、ＶＥＧＦＲ−３プロモーターと結合することによりＶＥＧＦＲ−３転写を誘導し、ＶＥＧＦＲ−３タンパク質発現およびシグナル伝達レベルに作用する複合体と相互作用する。レトロウイルスまたはアデノウイルスベクターにより推進されるＳｏｘ１８遺伝子の、ＶＥＧＦＲ−３を発現するＬＥＣへの挿入によりＶＥＧＦＲ−３媒介性のシグナル伝達がアップレギュレートされると考えられる。
【０２５９】
さらに、これらのＳｏｘ１８発現細胞は遺伝性リンパ水腫または外傷性リンパ水腫などのＬＥＣ疾病または疾患を有する患者の治療において治療用化合物として使用される。これらの細胞は、リンパ管腫、リンパ管骨髄腫、リンパ管腫症、リンパ管拡張症、リンパ肉腫、およびリンパ管硬化症などのＶＥＧＦＲ−３の発現の低下と関係のある疾病または状態を治療するのに使用される。
【０２６０】
さらに、Ｓｏｘ１８ポリペプチドまたはペプチド断片はリンパ水腫の症状を軽減するためにリンパ水腫患者に投与される。全長ＳＯＸ１８ポリペプチドまたはＤＮＡ結合ドメインまたはトランス活性化ドメインのいずれかを含むＳＯＸ１８の断片のいずれかを投与して、in vivoでその同種の結合相手と結合させ、ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達を促進し、またはリンパ管形成プロセスでは下流の事象を開始させる。そうすることで、リンパ水腫と関係のあるＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達またはＶＥＧＦ−Ｃリガンド結合の障害を回避すると考えられる。
【０２６１】
関連する態様では、ＳＯＸ１８発現が転写因子結合またはＤＮＡ結合を減少させることによりＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達を阻害する場合、ＳＯＸ１８を阻害することで、ＶＥＧＦＲ−３の代償性アップレギュレーションが起こり、ＶＥＧＦＲ−３発現不足と関係のある有害な症状を改善すると考えられる。Ｓｏｘ１８がＶＥＧＦＲ−３活性をネガティブに調節する場合においては、Ｓｏｘ１８遺伝子に特異的なアンチセンス治療の実施により、ＳＯＸ１８活性が阻害され、それにより、ＶＥＧＦＲ−３媒介性のシグナル伝達およびリンパ管の増殖が可能になる。しかしながら、グループＦ  Ｓｏｘタンパク質（ＳＯＸ７／１７／１８）の潜在的な機能的冗長性により、３つ全てのタンパク質を、グループＦタンパク質全てのＤＮＡ結合活性を阻害する機構を通じて不活性化しなければならない。このことは、例えば、全てのタンパク質の間で高度に相同であるＤＮＡ結合ドメインをターゲッティングすることにより達成される。変異型ＤＮＡ結合ドメインを発現する組換えＳＯＸ７／１７／１８タンパク質は、医薬組成物（３つ全ての変異型ペプチドを含む）として投与する場合、ＶＥＧＦＲ−３の Ｓｏｘ１８ダウンレギュレーションを阻害し、ＶＥＧＦＲ−３ シグナル伝達活性を誘導するか、または促進すると考えられる。本発明の特定の態様は例示を目的として本明細書で記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り、種々の変形も可能であることは上述から明らかであろう。
【０２６２】
本明細書にて引用されているおよび／または［出願データシート］で示される上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公開の全ては、全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
【０２６３】
【表８】
2005536186.tif 000013
2005536186.tif 000014
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【０２６４】
【表９】
2005536186.tif 000029
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2005536186.tif 000031
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【０２６５】
【表１０】
2005536186.tif 000049
【０２６６】
【表１１】
2005536186.tif 000050
【０２６７】
【表１２】
2005536186.tif 000051
【０２６８】
表５、６および１２での括弧内の数字は配列表の配列番号を示す。以下の表１３では、これらの配列をポリペプチド配列、配列番号３１〜４４および４６（オープンリーディングフレーム、ＯＲＦ’ｓ）と関連付けている。
【０２６９】
【表１３】
2005536186.tif 000052
【０２７０】
【表１４】
2005536186.tif 000053
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【０２７１】
【表１５】
2005536186.tif 000064
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【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１】ＬＥＣおよびＢＥＣにおいて示差的に発現された遺伝子の例。指定転写物のノーザンブロッティングおよびハイブリダイゼーション。ＧＡＰＤＨのプロービングにより同等のローディングであることが確認された。マイクロアレイ解析では、ＶＥＧＦ−Ｃ（ＬＥＣ／＋Ｃ）の存在下で培養したＬＥＣからＲＮＡを抽出した。アレイの結果を立証する場合には、ＶＥＧＦ−Ｃを添加していないＬＥＣの培養物（ＬＥＣ／−Ｃ）からも対照としてＲＮＡを抽出した。
【図２】ＢＥＣおよびＬＥＣにおける細胞骨格構造、カドヘリン複合体およびインテグリンα９の発現。ＬＥＣおよびＢＥＣの混合培養物を、Ｎ−カドヘリン（ａ）、ＶＥ−カドヘリン（ｃ）、β−カテニン（ｅ）、プラコグロビン（ｇ）、Ｆ−アクチン（ｉ）およびインテグリンα９（ｋ）、ならびにＬＥＣに特異的なマーカー、ポドプラニン（緑色；ｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ、ｌ）について二重染色した。インテグリンα９はリンパ管内皮細胞では発現している（矢）が、血管内皮細胞では発現していない（矢の根）。ヒト皮膚の近接する切片をインテグリンα９（ｍ）、ＶＥＧＦＲ−３（ｎ）または血管内皮細胞抗原ＰＡＬ−Ｅ（ｏ）に対する抗体で染色した。
【図１】
2005536186.tif 000078
【図２】
2005536186.tif 000079
【配列表】
2005536186000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月8日(2004.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮細胞（ＢＥＣ）またはリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）の増殖または分化を示差的に調節する方法であって、
内皮細胞を、血管またはリンパ管内皮細胞を示差的に調節する薬剤を含んでなる組成物と接触させることを含んでなり、
該薬剤が、
（ａ）  ＢＥＣポリペプチドもしくはＬＥＣポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチド、または該ポリペプチドの活性断片；
（ｂ）  （ａ）のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ポリヌクレオチド；
（ｃ）  （ａ）のポリペプチドと特異的に結合する、抗体；
（ｄ）  （ｃ）の抗体のフラグメントを含んでなる、ポリペプチド（ここで、このフラグメントおよび抗体は該ポリペプチドと結合する）；
（ｅ）  （ａ）のポリペプチドをコードするヒト遺伝子またはｍＲＮＡに対する、アンチセンス核酸；
（ｆ）  （ａ）のポリペプチドをコードするヒト遺伝子またはｍＲＮＡに対する、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）
からなる群より選択される、方法。
【請求項２】
内皮細胞が組成物とex vivoで接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組成物が、医薬上許容される希釈剤、アジュバント、または担体を含んでなり、かつ、
接触工程が、哺乳類被験体に組成物を投与して、哺乳類被験体においてＢＥＣまたはＬＥＣを示差的に調節することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＬＥＣの過剰増殖を特徴とする疾患を有するヒト被験者を同定し；かつ
そのヒト被験者に組成物を投与し、ここで、この薬剤はＢＥＣの増殖と比べてＬＥＣの増殖を示差的に阻害する
ことを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＬＥＣの過剰増殖を特徴とする疾患を有するヒト被験者を同定し；
被験者のＬＥＣをスクリーニングして、表３に示されるポリペプチドの過剰発現を同定し；かつ
そのヒト被験者に組成物を投与し、ここで、この薬剤は、スクリーニング工程によって同定されたポリペプチドの発現を阻害することにより、ＢＥＣの増殖と比べてＬＥＣの増殖を示差的に阻害する
ことを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ヒト被験者においてリンパ管内皮細胞の増殖を調節する、請求項３に記載の方法であって、
過少増殖性のリンパ管疾患を有するヒト被験者を同定し；
被験者をスクリーニングして、表３に示されるＬＥＣポリペプチド（該タンパク質は表１または２に示されるものではない）の発現不足または活性不足を同定し；
そのヒト被験者に組成物を投与する（ここで、この薬剤はスクリーニング工程によって同定されたＬＥＣポリペプチド（ａ）、もしくは該ポリペプチドの活性断片を含んでなるか、またはそのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド（ｂ）を含んでなる）
ことを含んでなる、方法。
【請求項７】
血管内皮細胞（ＢＥＣ）またはリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）の増殖または分化を示差的に調節するための薬物の製造を目的とした薬剤の使用であって、
該薬剤が、
（ａ）  ＢＥＣポリペプチドもしくはＬＥＣポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチド、または該ポリペプチドの活性断片；
（ｂ）  （ａ）のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ポリヌクレオチド；
（ｃ）  （ａ）のポリペプチドと特異的に結合する、抗体；
（ｄ）  （ｃ）の抗体のフラグメントを含んでなる、ポリペプチド（ここで、このフラグメントおよび抗体は該ポリペプチドと結合する）；
（ｅ）  （ａ）のポリペプチドをコードするヒト遺伝子またはｍＲＮＡに対する、アンチセンス核酸；および
（ｆ）  （ａ）のポリペプチドをコードするヒト遺伝子またはｍＲＮＡに対する、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）
からなる群より選択される、使用。
【請求項８】
ポリペプチドが、表３に示されるＬＥＣポリペプチド群から選択されるＬＥＣポリペプチドであり、かつ、薬剤がＢＥＣの増殖または分化よりもＬＥＣの増殖または分化を示差的に調節する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項９】
ポリペプチドが、表４に示されるＢＥＣポリペプチド群から選択されるＢＥＣポリペプチドであり、かつ、薬剤がＬＥＣの増殖または分化よりもＢＥＣの増殖または分化を示差的に調節する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１０】
ポリペプチドが表１または２に示されるものではない、請求項８に記載の方法または使用。
【請求項１１】
ＬＥＣポリペプチドが、配列番号８１、１８７、２０７、２１１、２２１、２３５、２４１、２９３および３９１からなる群より選択されるアミノ酸を含んでなる、請求項８に記載の方法または使用。
【請求項１２】
ＬＥＣポリペプチドが、配列番号３１〜３４、４６および４８からなる群より選択されるアミノ酸を含んでなる、請求項８に記載の方法または使用。
【請求項１３】
薬剤が（ｃ）の抗体または（ｄ）のポリペプチドを含んでなる、請求項１２に記載の方法または使用。
【請求項１４】
薬剤が（ａ）のポリペプチドの細胞外ドメイン断片、または該細胞外ドメイン断片をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
薬剤がアンチセンス分子を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１６】
遺伝性リンパ水腫を治療する方法であって、
リンパ水腫を有し、かつ、表３に示されるＬＥＣタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子における突然変異を有するヒト被験者を同定し、ここで、この突然変異はヒト被験者におけるリンパ水腫と関係があり、ただし、該ＬＥＣタンパク質はＶＥＧＦＲ−３ではなく；かつ
該被験者に、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドからなる群より選択されるリンパ増殖剤を含んでなる組成物を投与する
ことを含んでなる、方法。
【請求項１７】
表３に示されるＬＥＣ遺伝子における突然変異から起こる遺伝性リンパ水腫の治療のための薬物の製造における、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドからなる群より選択されるリンパ増殖剤の使用（ただし、ＬＥＣ遺伝子はＶＥＧＦＲ−３ではない）。
【請求項１８】
内皮細胞疾患または該疾患に対する疾病素因をスクリーニングする方法であって、
ヒト被験者から内皮細胞ｍＲＮＡを含む生体サンプルを得；かつ
ＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子から転写されたサンプル中のｍＲＮＡの量からＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子の発現を測定する（ここで、このＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子は表３または４に示されるポリペプチドをコードしてなる）
ことを含んでなる、方法。
【請求項１９】
内皮細胞に対する薬物の効力または毒性をモニタリングする方法であって、
哺乳類被験体に薬物を投与する前および投与した後、その被験体の内皮細胞における少なくとも一つのＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子の発現を測定する工程（ここで、この少なくとも一つのＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子は表３または表４に示されるポリペプチドをコードし、かつ、ＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子の発現の変化は内皮細胞に対する薬物の効力または毒性と相関する）
を含んでなる、方法。
【請求項２０】
内皮細胞の増殖を調節する化合物を同定する方法であって、
化合物の存在下および不在下で内皮細胞を培養し；かつ
その細胞において少なくとも一つのＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子の発現を測定する（ここで、ＢＥＣまたはＬＥＣ遺伝子は表３および表４に示されるポリペプチドをコードする遺伝子から選択され、化合物の不在下と比べて存在下での少なくとも一つのＢＥＣ遺伝子の発現に変化があれば、その化合物はＢＥＣ増殖のモジュレーターであると同定され、また化合物の不在下と比べて存在下での少なくとも一つのＬＥＣ遺伝子の発現に変化があれば、その化合物はＬＥＣ増殖のモジュレーターであると同定される）
ことを含んでなる、方法。
【請求項２１】
ＢＥＣまたはＬＥＣの増殖または分化を選択的に調節する化合物をスクリーニングする、請求項２０に記載の方法であって、
前記測定工程が、細胞において少なくとも一つのＢＥＣ遺伝子および少なくとも一つのＬＥＣ遺伝子の発現を測定することを含んでなり、かつ、
少なくとも一つのＬＥＣ遺伝子の発現に比べて少なくとも一つのＢＥＣ遺伝子の発現を示差的に調節する化合物を選択することにより、ＢＥＣまたはＬＥＣの増殖または分化を選択的に調節する化合物に関してスクリーニングすることを含んでなる、方法。
【請求項２２】
配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、８１、１８７、２０７、２１１、２２１、２３５、２４１、２９３および３９１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドと、
医薬上許容される希釈剤、担体またはアジュバントと
を含んでなる、組成物。
【請求項２３】
配列番号１４〜３０、４５、４７、４９、５１、８２、９３、１１１、１８８、２０８、２１２、２２２、２３６、２４２、２９４および３９２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、またはそのポリペプチドをコードするその断片を含んでなる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、８１、１８７、２０７、２１１、２２１、２３５、２４１、２９３および３９１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドと、機能的に連結された発現制御配列を含んでなる、発現ベクター。
【請求項２５】
該ポリヌクレオチドを含む複製欠陥アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである、請求項２４に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２４または２５に記載の発現ベクターと、医薬上許容される希釈剤、担体またはアジュバントとを含んでなる、組成物。
【請求項２７】
哺乳類被験体のリンパ系を調節するために該被験体に組成物を投与するためのプロトコールとともにパッケージングされた、請求項２２、２３または２６のいずれか一項に記載の組成物を含んでなる、キット。
【請求項２８】
請求項２４に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項２９】
ＬＥＣポリペプチドを生産する方法であって、細胞がポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現する条件下で請求項２８に記載の宿主細胞を増殖させる工程を含んでなる、方法。
【請求項３０】
配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、８１、１８７、２０７、２１１、２２１、２３５、２４１、２９３および３９１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、精製および単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
（ａ）  配列番号３１〜３４、４６、４８、２０７、６７６、８５９および８６１；
（ｂ）  （ａ）のアミノ酸配列のうち少なくとも１０個のアミノ酸からなる細胞外ドメイン断片
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、精製および単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号３１〜３４、４６、４８、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列の細胞外ドメイン断片を含んでなり、ポリペプチドがトランスメンブランドメインを欠いている、請求項３１に記載の精製および単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項３３】
細胞内ドメインを欠いている、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
免疫グロブリン定常領域を含んでなる免疫グロブリン断片と融合した、請求項３２または３３に記載のポリペプチドを含んでなる、融合タンパク質。
【請求項３５】
請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはタンパク質と、医薬上許容される希釈剤、担体またはアジュバントとを含んでなる、組成物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の組成物と、哺乳類被験体のリンパ系を調節するために該被験体に該医薬組成物を投与するためのプロトコールとを含んでなる、キット。
【請求項３７】
請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチドと特異的に結合する、抗体。
【請求項３８】
ヒト化抗体である、請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを含んでなるタンパク質であって、該ポリペプチドと特異的に結合する、タンパク質。
【請求項４０】
ＬＥＣ核酸を同定する方法であって、
（ａ）  候補ＬＥＣ核酸を含む生体サンプルを、配列番号１〜３０、４５、４７、４９、５１、８２、９３、１１１、１８８、２０８、２１２、２３６、２４２、２９４および３９２からなる群より選択される配列の少なくとも１４の連続するヌクレオチドからなる断片を含んでなるポリヌクレオチド、またはその相補体と、下記のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件：
（ｉ）  ５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳおよび０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃にて２０時間のハイブリダイゼーション、および
（ii）  １×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃にて３０分間の洗浄
の下で接触させ；かつ
（ｂ）  該候補ＬＥＣ核酸と該ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出し、それによりＬＥＣ核酸を同定する
ことを含んでなる、方法。
【請求項４１】
ＬＥＣタンパク質を同定する方法であって、
（ａ）  候補ＬＥＣタンパク質を含む生体サンプルを、請求項３７に記載の抗体または請求項３９に記載のタンパク質からなる群より選択されるＬＥＣタンパク質結合相手と、それらの間の結合に適した条件下で接触させ；かつ
（ｂ）  該候補ＬＥＣタンパク質と該ＬＥＣ結合相手の間の結合を検出し、それによりＬＥＣタンパク質を同定する
ことを含んでなる、方法。
【請求項４２】
ＬＥＣを同定する方法であって、
（ａ）  細胞を含む生体サンプルをＬＥＣ結合相手と、それらの間の結合に適した条件下で接触させ（ここで、該ＬＥＣ結合相手は配列番号３１〜３４、４６、４８、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択される配列を含んでなるポリペプチドと結合する抗体を含んでなるか、または該抗体の抗原結合フラグメントを含んでなり；かつ
（ｂ）  細胞とＬＥＣ結合相手との間の結合を検出することによりＬＥＣを同定し、ここで、ＬＥＣ結合相手と細胞が結合していれば、ＬＥＣであると確認される
ことを含んでなる、方法。
【請求項４３】
遺伝性リンパ水腫の発症リスクをアッセイする方法であって、
（ａ）  遺伝性リンパ水腫の表現型と関連があり、かつ、ヒト被験者の少なくとも一つの対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列が、対応する野生型対立遺伝子によりコードされているポリペプチドのアミノ酸配列と比べた場合に変更されている突然変異に関してヒト被験者の核酸をアッセイし、ここで、この野生型ポリペプチドは表３に示されているポリペプチドである
ことを含んでなる、方法。
【請求項４４】
遺伝性リンパ水腫の発症リスクをアッセイする方法であって、
（ａ）  遺伝性リンパ水腫の表現型と関連があり、かつ、ヒト被験者の少なくとも一つの対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列が、対応する野生型対立遺伝子によりコードされているポリペプチドのアミノ酸配列と比べた場合に変更されている突然変異に関してヒト被験者の核酸をアッセイし、ここで、この野生型ポリペプチドは配列番号３１〜４４、４６、４８、５２、５４、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり；かつ
（ｂ）  核酸における該突然変異の有無と、遺伝性リンパ水腫の発症リスクを相関させ、ここで、核酸に該突然変異が存在する場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがあることと関連づけ、核酸に該突然変異が不在である場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがないことと関連づける
ことを含んでなる、方法。
【請求項４５】
遺伝性リンパ水腫の発症リスクをアッセイする方法であって、
（ａ）  ヒト被験者の少なくとも一つの転写因子対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列、および、その対立遺伝子によりコードされている転写因子ポリペプチドの転写調節活性が、野生型対立遺伝子によりコードされている転写因子ポリペプチドの転写調節活性と比べた場合に変更されている突然変異に関してヒト被験者の核酸をアッセイし、ここで、この野生型転写因子ポリペプチドは配列番号８１、配列番号２１１、配列番号２４１、および表５の配列によりコードされている転写因子からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり；かつ
（ｂ）  核酸における該突然変異の有無と、遺伝性リンパ水腫の発症リスクを相関させ、ここで、核酸に該突然変異が存在する場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがあることと関連づけ、核酸に該突然変異が不在である場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがないことと関連づける
ことを含んでなる、方法。
【請求項４６】
野生型転写因子対立遺伝子が、配列番号５４で示されるＳｏｘ１８アミノ酸配列を含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
アッセイにより、Ｓｏｘ１８対立遺伝子によりコードされるタンパク質のトランス活性化またはＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を変更する突然変異が確認される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
該突然変異が、野生型ＳＯＸ１８による該遺伝子の転写の活性化と比べてＳＯＸ１８応答性遺伝子の転写活性化を低下させる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
遺伝性リンパ水腫の発症リスクをアッセイする方法であって、
（ａ）  ヒト被験者の少なくとも一つのＬＥＣ対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列が、また、そのＬＥＣ対立遺伝子によりコードされている接着ポリペプチドの結合親和性が、野生型対立遺伝子によりコードされている接着ポリペプチドの結合親和性と比べた場合に変更されている突然変異に関するヒト被験者の核酸をアッセイし、ここで、この野生型接着ポリペプチドは配列番号３１〜３４、４６、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり；かつ
（ｂ）  核酸における該突然変異の有無と、遺伝性リンパ水腫の発症リスクを相関させ、ここで、核酸に該突然変異が存在する場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがあることと関連づけ、核酸に該突然変異が不在である場合を遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがないことと関連づける
ことを含んでなる、方法。
【請求項５０】
アッセイにより突然変異の存在が確認され、相関工程によりその患者の遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクが確認される、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクがあるかどうかヒト被験者をスクリーニングする方法であって、表３のアミノ酸配列を含んでなる少なくとも一つのポリペプチドのコードされているアミノ酸配列を変更する突然変異に関してヒト被験者の核酸をアッセイすることを含んでなる、方法。
【請求項５２】
ポリペプチドが、遺伝性リンパ水腫の発症リスクと相関する様式で、配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２および５４、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ポリペプチドが配列番号５４に示されるＳＯＸ１８アミノ酸配列を含んでなる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
（ａ）  ヒト被験者の少なくとも一つのポリヌクレオチドの少なくとも一つのコドンのヌクレオチド配列を決定すること；
（ｂ）  ヒト被験者由来の核酸が１以上の参照配列と同じヌクレオチド配列を有するか、異なるヌクレオチド配列を有するかを決定するためにハイブリダイゼーションアッセイを行うこと；
（ｃ）  ヒト被験者由来の核酸が１以上の参照配列と同じヌクレオチド配列を有するか、異なるヌクレオチド配列を有するかを決定するためにポリヌクレオチド移動アッセイを行うこと；
（ｄ）  ヒト被験者由来の核酸が１以上の参照配列と同じヌクレオチド配列を有するか、異なるヌクレオチド配列を有するかを決定するために制限エンドヌクレアーゼ消化を行うこと
からなる群より選択される少なくとも一つの手順を含んでなる、請求項４３〜４９、５１、５２、または５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
該ＬＥＣポリヌクレオチドのコード配列を含んでなる核酸を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、および増幅された核酸のヌクレオチド配列を決定することを含んでなる、請求項４３〜４９、５１、５２、または５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
ヒト被験者において遺伝性リンパ水腫の遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  該被験者由来の核酸を含んでなる生体サンプルを準備し；かつ
（ｂ）  該核酸を、ヒト被験者において少なくとも一つの遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子のコードされているアミノ酸配列を、配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、５４、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヒト遺伝子と比べて変更する突然変異が存在するかどうか分析し、ここで、ヒト被験者に、コードされるアミノ酸配列を、ヒト被験者のリンパ水腫と相関する様式で変更する突然変異が存在していれば、遺伝性リンパ水腫の遺伝子型と確認される
ことを含んでなる、方法。
【請求項５７】
該生体サンプルが細胞サンプルである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
該分析が該核酸の一部を配列決定することを含んでなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
ヒト被験者が本スクリーニング方法により同定される遺伝性リンパ水腫の遺伝子型を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも一つの遺伝子が、配列番号５４で示されるアミノ酸配列をコードするヒトＳｏｘ１８遺伝子に相当する、請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
リンパ管形成を阻害する方法であって、被験体にＬＥＣトランスメンブランポリペプチドの阻害剤を投与することを含んでなり、ここで、このＬＥＣトランスメンブランポリペプチドが配列番号３１〜３４、４６、４８、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり、かつ、
この阻害剤が
（ａ）  ＬＥＣトランスメンブランポリペプチドの可溶性細胞外ドメイン断片；
（ｂ）  ＬＥＣトランスメンブランポリペプチドの細胞外ドメインと結合する抗体；
（ｃ）  （ｂ）の抗体の抗原結合ドメインを含んでなるポリペプチド；および
（ｄ）  ＬＥＣトランスメンブランポリペプチドまたはその相補体をコードする核酸と相補的なアンチセンス核酸
からなる群より選択される、方法。
【請求項６２】
阻害剤がＬＥＣポリペプチドの細胞外ドメイン断片を含んでなるポリペプチドであり、該細胞外ドメインの配列が配列番号３１のアミノ酸１〜１５２、配列番号３２のアミノ酸１〜６９５および配列番号３３のアミノ酸１〜２４８からなる群より選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
該被験体が腫瘍を含むヒトである、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
哺乳類被験体においてリンパ管形成を調節する方法であって、
リンパ管形成の調節を必要とする哺乳類被験体に、ＬＥＣポリヌクレオチド（このＬＥＣポリヌクレオチドは配列番号１４〜３０、４５、４７、４９および５１、２０８、６７７、８６０および８６２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでなる）に対するアンチセンス分子を、ＬＥＣポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドの転写または翻訳を阻害するのに有効な量で投与することを含んでなる、方法。
【請求項６５】
遺伝性リンパ水腫を治療する方法であって、
（ａ）  遺伝性リンパ水腫を有し、かつ、ヒト被験者の少なくとも一つのポリペプチドのコードされているアミノ酸配列を、配列番号３１〜４４、４６、４８、５０、５２、５４、２０７、６７６、８５９および８６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのアミノ酸配列と比べて変更する突然変異を有するヒト被験者を同定し；かつ
（ｂ）  該被験者に、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−ＤポリヌクレオチドおよびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドからなる群より選択されるリンパ増殖因子を投与する
ことを含んでなる、方法。
【請求項６６】
内皮細胞または内皮前駆細胞の増殖を調節する方法であって、内皮細胞または内皮前駆細胞を、細胞においてｐｒｏｘ−１の転写調節を調節する薬剤を含んでなる組成物と接触させることを含んでなり、その薬剤が
（ａ）  ｐｒｏｘ−１ポリペプチド；
（ｂ）  ｐｒｏｘ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）  ｐｒｏｘ−１に対するアンチセンス分子；
からなる群より選択される、方法。
【請求項６７】
細胞が培養内皮細胞または内皮前駆細胞を含み、接触がex vivoで行われる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
接触が培養培地に薬剤を含めることを含んでなる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
細胞が内皮前駆細胞を含む、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
細胞が、接触工程の後に哺乳類被験体に導入される、請求項６６〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
被験体がヒトである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ヒト被験者がＬＥＣ疾患を有する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ヒト被験者においてＬＥＣ機能を増強する方法であって、
ヒト被験者から内皮細胞または内皮前駆細胞を単離し；
内皮細胞を、ｐｒｏｘ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトしてＬＥＣの分化および増殖を促進し；かつ
形質転換またはトランスフェクション工程の後にそのＬＥＣ細胞をヒト被験者に投与する
ことを含んでなる、方法。
【請求項７４】
単離工程と投与工程のヒト被験者が同一である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ヒト被験者がリンパ水腫を有する、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
ベクターおよび形質転換またはトランスフェクション方法がｐｒｏｘ−１の一時的発現向けに選択される、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７７】
発現ベクターが複製欠陥アデノウイルスベクターを含んでなる、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７８】
配列番号３１のアミノ酸６１〜１２７と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項７９】
配列番号３１のアミノ酸３０〜１５２と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含んでなる、請求項７８に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
配列番号３１で示されるアミノ酸配列の断片を含んでなる可溶性ポリペプチドであって、該断片が配列番号３１のトランスメンブランおよび細胞内アミノ酸を欠いている、可溶性ポリペプチド。
【請求項８１】
配列番号３２の少なくとも一つのロイシン豊富な領域を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項８２】
配列番号３２のトランスメンブランアミノ酸を欠いている、請求項８１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８３】
配列番号３３の少なくとも一つのロイシン豊富な領域を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項８４】
配列番号３３のトランスメンブランアミノ酸を欠いている、請求項８１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８５】
配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、少なくとも一つのＩ型トロンボスポンジンリピート配列を含む断片と、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項８６】
該断片が配列番号１１１の６つのＩ型トロンボスポンジンリピート配列を含む、請求項８５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８７】
配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、少なくとも一つのＣ−２型免疫グロブリンドメインを含む断片と、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項８８】
該断片が配列番号１１１の３つのＣ−２型免疫グロブリンドメイン配列を含む、請求項８５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８９】
請求項７８〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチドと異種ポリペプチドを含んでなる、融合タンパク質。
【請求項９０】
請求項７８〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチドと特異的に結合する、抗体。
【請求項９１】
請求項７８〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項９２】
発現制御配列と機能的に連結された請求項９１に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項９３】
複製欠陥アデノウイルスベクターである、請求項９２に記載の発現ベクター。
【請求項９４】
ポリペプチドが表１または２に示されるものではない、請求項９に記載の方法または使用。
【請求項９５】
薬剤がアンチセンス分子を含んでなり、かつ、ポリペプチドが表１または２に示されるものではない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項９６】
アッセイにより突然変異の存在が確認され、相関工程によりその患者の遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクが確認され、かつ、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも一つの手順を含んでなる、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の方法：
（ａ）  ヒト被験者の少なくとも一つのポリヌクレオチドの少なくとも一つのコドンのヌクレオチド配列を決定すること；
（ｂ）  ヒト被験者由来の核酸が１以上の参照配列と同じヌクレオチド配列を有するか、異なるヌクレオチド配列を有するかを決定するためにハイブリダイゼーションアッセイを行うこと；
（ｃ）  ヒト被験者由来の核酸が１以上の参照配列と同じヌクレオチド配列を有するか、異なるヌクレオチド配列を有するかを決定するためにポリヌクレオチド移動アッセイを行うこと；
（ｄ）  ヒト被験者由来の核酸が１以上の参照配列と同じヌクレオチド配列を有するか、異なるヌクレオチド配列を有するかを決定するために制限エンドヌクレアーゼ消化を行うこと。
【請求項９７】
アッセイにより突然変異の存在が確認され、相関工程によりその患者の遺伝性リンパ水腫の発症の高いリスクが確認され、かつ、
該ＬＥＣポリヌクレオチドのコード配列を含んでなる核酸を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、および増幅された核酸のヌクレオチド配列を決定することを含んでなる、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
ヒト被験者がリンパ水腫を有し、かつ、
ベクターおよび形質転換またはトランスフェクション方法がｐｒｏｘ−１の一時的発現向けに選択される、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項９９】
ヒト被験者がリンパ水腫を有し、かつ
発現ベクターが複製欠陥アデノウイルスベクターを含んでなる、請求項７３または７４に記載の方法。
【国際調査報告】
2005536186.tif 000080
2005536186.tif 000081
2005536186.tif 000082