(57)【要約】  本発明は核酸の処理方法に関する。より詳しくは、本発明は、先行する細胞溶解及び／又は沈殿反応から生じた沈殿物と染色体外DNAとを含む処理流から細胞残屑及び／又はRNAを除去することによる染色体外DNAの精製方法に関する。本発明はまた、本発明の方法により精製された核酸、特に染色体外DNA、それを含む又はそれよりなる医薬組成物、及び該方法のための装置に関する。該方法は、細胞溶解及び／又は沈殿反応を制御して、実質的に小粒子の形成を最小にし及び／又は大粒子の形成を最大にすること、ならびに75μmを超えるメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いに該処理流を通過させることにより該処理流を濾過して、相当な質量比率の該沈殿物を該処理流から除去することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体外DNA及び細胞残屑沈殿物及び／又はRNA沈殿物を含む処理流から細胞残屑及び／又はRNA沈殿物を除去することにより、染色体外DNAを精製する方法であって、
a．細胞溶解及び／又は沈殿反応を制御して、実質的に小粒子の形成を最小にし及び／又は大粒子の形成を最大にし、
b．75μmを超えるメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いに該処理流を通過させることにより該処理流を濾過して、相当な質量比率の該沈殿物を該処理流から除去することを含む前記方法。
【請求項２】
小粒子の形成を最小にし且つ大粒子の形成を最大にすることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
小粒子が、53μmのメッシュサイズによっては保持されるが150μmのメッシュサイズでは通過する粒子である、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項４】
処理流が15重量％以下の小粒子を含む、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
大粒子が、425μmのメッシュサイズにより保持される粒子である、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
処理流が少なくとも60重量％の大粒子を含む、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
処理流が更に中間サイズの粒子を含む、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
中間サイズの粒子が、150μmのメッシュサイズによっては保持されるが425μmのメッシュサイズのメッシュ又は篩いでは通過する粒子である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
処理流が20重量％未満の該中間粒子を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
粒子の少なくとも50重量％が、850μmのメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いにより保持される、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
粒子の少なくとも60重量％が、850μmのメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いにより保持される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
粒子の少なくとも65重量％が、850μmのメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いにより保持される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
処理流を、75μmを超えるメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いに通過させる、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４】
処理流を、200μm以上のメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いに通過させる、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１５】
処理流を、次第に減少するメッシュサイズの一連の篩いに通過させる、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１６】
メッシュ又は篩いが、処理流と実質的に完全に同じ平面上に位置する接触面を含む、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１７】
接触面が実質的に強固である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
篩い又はメッシュが金属である、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１９】
細胞溶解及び／又は沈殿反応において撹拌速度を制御して、小粒子の形成を最小にし大粒子の形成を最大にする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項２０】
撹拌速度を1.15m/s未満の先端速度に維持する、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
細胞溶解及び／又は沈殿反応において撹拌の持続時間を制御して、小粒子の形成を最小にし大粒子の形成を最大にする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項２２】
撹拌の持続時間が1時間未満である、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
細胞溶解及び／又は沈殿反応においてスタティック混合又はボルテックス混合を用いて、小粒子の形成を最小にし及び／又は大粒子の形成を最大にする、請求項1〜18のいずれか1項記載の方法。
【請求項２４】
メッシュ又は篩いへの処理流の通過を、せん断を最小にする条件下で行う、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項２５】
処理流をデプスフィルターに通過させることを更に含む、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項２６】
処理流を0.2μmフィルター膜に通過させることを更に含む、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項２７】
細胞残屑を除去するための遠心分離工程を行わない、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項２８】
染色体外DNAがプラスミドDNAである、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項２９】
大規模法である、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項３０】
大規模法が処理流中の少なくとも10リットルの液体を処理することを含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
重力供給方式によるものである、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項３２】
加圧下で運転する、請求項1〜30のいずれか1項記載の方法。
【請求項３３】
細胞溶解及び／又は沈殿反応を行う容器の高さの少なくとも40％を満たすよう長さ方向に伸長する大きなブレードを有するインペラを含む撹拌機を使用する、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項３４】
酸性酢酸塩溶液を使用する沈殿操作を含む清澄化工程からの固体を分離するために篩いを使用する、請求項1〜33のいずれか1項記載の方法。
【請求項３５】
RNAを沈殿させるために抗カオトロピック塩を使用する沈殿工程からの固体を分離するために篩いを使用する、請求項1〜33のいずれか1項記載の方法。
【請求項３６】
酸性酢酸塩溶液を使用する沈殿操作を含む清澄化工程と、抗カオトロピック塩を使用する沈殿工程との両方からの固体を、単一の沈殿物除去工程において分離するために篩いを使用する、請求項1〜33のいずれか1項記載の方法。
【請求項３７】
抗カオトロピック塩が塩化カルシウムである、請求項35又は36記載の方法。
【請求項３８】
前記請求項のいずれか1項記載の方法により精製された染色体外DNA。
【請求項３９】
前記請求項のいずれか1項記載の方法により精製された染色体外DNAを含む又はそれよりなる医薬組成物。
【請求項４０】
細胞溶解された細胞を含む処理流から染色体外DNAを精製する方法であって、
i）細胞溶解された細胞を含む処理流を、例えば酢酸ナトリウム又は酢酸カリウムで中和し、
ii）高濃度の抗カオトロピック塩、例えば塩化カルシウムを加えて、RNAを沈殿させ、
iii）75μMを超えるメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いに該処理流を通過させることにより、該処理流から固体を分離することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸の処理方法に関する。より詳しくは、本発明は、染色体外DNAと沈殿物とを含む処理流（process stream）から細胞残屑及び／又はRNAを除去することによる染色体外DNAの精製方法に関する。本発明はまた、本発明の方法により精製された核酸、特に染色体外DNA、それを含む又はそれよりなる医薬組成物、及び該方法のための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主細胞内への遺伝物質の組込みにより治療効果が誘導されうるヘルスケアの新たな領域に進出するために、プラスミドDNAの大規模製造方法が開発されつつある。
【０００３】
プラスミドDNAの製造においては、細胞を細胞溶解することによりプラスミドDNAを細胞から入手する。ついで該プラスミドDNAを細胞残屑から分離し精製する。この精製方法の第1段階は、細胞残屑を沈殿させる工程、及び処理流を濾過して固体を分離する工程を含むことが多い。
【０００４】
大量の混入物は、典型的には、化学的に細胞溶解された細菌細胞への酢酸カリウムの添加により、処理流から沈殿する。
【０００５】
プラスミドDNAの大規模製造においては、その工程の1つは、処理流の液体画分から沈殿物を除去することを伴う。この沈殿物は、典型的には、0.96M NaOH及び6％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）との混合により予め溶菌された大腸菌（E. coli）細胞と、冷却された典型的には3M 酢酸カリウムとの混合により形成される。この沈殿物は、せん断に感受性である。すなわち、それは、ある値を超えた速度又は割合でのポンプ又はパイプ内の通過のような機械的作用にさらされると、より小さな粒子に容易に断片化される。この製造段階では、処理流の固体含量は20％（w/v）にまでなることがあり、このため、他の生物的方法と比べて大量の固体の除去が必要となる。沈殿物は、酢酸カリウムを添加する混合工程の持続時間及び強度ならびに他の塩の存在に応じて、沈降又は浮遊しうる。それでもやはり、該プラスミドの更なる精製を可能にするためには、沈殿物を除去しなければならない。生物的方法における固体の除去は、通常は遠心分離、例えばバッチ遠心分離、濾過により、あるいはより通常は沈降により行う。
【０００６】
遠心分離工程は成功裏に沈殿物を除去するが、欠点もある。まず第1に、バッチ遠心分離は20分間の運転当たり6リットルしか処理できないため、いずれの装置の最大処理量も18リットル／時にしかならない。第2に、これらの装置の運転は労働集約的である。したがって、該方法のこの部分は容易には大規模化することができない。1000リットルのバッチは56個の遠心機（各遠心機は約£16,000もかかる）を要し、その体積分を同時に処理するためには、それに応じた大きな労働力を要する。第3に、該方法は一体化されず、処理流体が空気にさらされる段階があり、このため、製造施設の適当な部分における清潔さ及び気流の管理の強化が要求される。第4に、遠心分離工程は全ての粒子を常に除去するというわけではないため、処理流体の清澄性を保証し後続の下流操作を防護するためには処理流体を一連の濾過に付さなければならない。
【０００７】
プラスミドDNAを含有する処理流から沈殿物を除去するための大規模化可能で迅速で低せん断性で経済的な方法を設計することにより、これらの課題を克服することが、本発明の目的である。
【０００８】
本出願人は、沈殿物のサイズが、先行する処理工程、例えば細胞溶解及び／又は沈殿反応の持続時間及び撹拌速度に左右されること、そして更には、粒子のサイズが下流処理工程に有意な影響を及ぼしうることを確認した。沈殿物のサイズを制御することにより、後続の下流処理におけるその経済的な除去を最適化することが可能であり、また、（通常のフィルター装置、例えばバッグフィルター、膜又は繊維の代わりに）メッシュ又は篩いを使用することにより、沈殿物を非常に効果的に除去することが可能である。より詳しくは、それは、大量の沈殿物を迅速かつ簡便に除去することを可能にする。それはまた、沈殿物に対して行う機械的仕事を軽減する。また、沈殿物が液体中で沈降するか浮遊するかには無関係に沈殿物が除去されるよう、該系を構成することが可能である。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明の第1の態様においては、染色体外DNA及び細胞残屑沈殿物及び／又はRNA沈殿物を含む処理流から細胞残屑及び／又はRNA沈殿物を除去することにより染色体外DNAを精製する方法であって、
a．細胞溶解及び／又は沈殿反応を制御して、実質的に小粒子の形成を最小にし及び／又は大粒子の形成を最大にし、
b．75μmを超えるメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いに該処理流を通過させることにより該処理流を濾過して、相当な質量比率の該沈殿物を該処理流から除去することを含む方法を提供する。
【００１０】
好ましくは、該方法は、小粒子の形成を最小にすること及び大粒子の形成を最大にすることの両方を含む。 
小粒子及び大粒子なる語は相対的な用語であり、処理流の精製能に対する相対粒子径の効果を説明する際に用いられる。
【００１１】
より詳しくは、小粒子は、53μmのメッシュサイズによっては保持されるが150μmのメッシュサイズでは通過する粒子である。53μmのメッシュサイズで通過する粒子もあるが、これらはその計算には含まれず、本出願における小粒子とはみなされない。したがって、その計算においては、粒子の100重量％は、53μmのメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いにより捕捉される粒子であると仮定される。
【００１２】
好ましくは、小粒子は、全重量の15重量％以下、より好ましくは13重量％未満、最も好ましくは11重量％未満の量で含まれる。 
より詳しくは、大粒子は、425μmのメッシュサイズにより保持される粒子である。 
好ましくは、処理流は、少なくとも60重量％、より好ましくは少なくとも65重量％、より一層好ましくは少なくとも70重量％、最も好ましくは少なくとも75重量％の大粒子を含む。
【００１３】
好ましくは、処理流は更に中間サイズの粒子を含む。中間サイズの粒子は、150μmのメッシュサイズによっては保持されるが425μmのメッシュサイズのメッシュ又は篩いでは通過する粒子である。 
好ましくは、処理流は、20重量％未満、より好ましくは18％重量未満、最も好ましくは16％未満の該中間粒子を含む。
【００１４】
より好ましくは、処理流は、850μmのメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いにより保持される粒子を少なくとも50重量％、より好ましくは少なくとも60％、最も好ましくは少なくとも65重量％の量で含む。
【００１５】
好ましくは、処理流を、75μmを超える、より好ましくは150μmを超える、最も好ましくは約200μm以上のメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いに通過させる。 
1つの実施形態においては、処理流を単一の篩いに通過させ、もう1つの実施形態においては、処理流を、次第に減少するメッシュサイズの一連の篩いに通過させる。
【００１６】
好ましくは、メッシュ又は篩いは、処理流と実質的に完全に同じ平面上に位置する接触面を含む。 
好ましくは、該接触面は実質的に強固である。すなわち、それはバッグフィルターのようには柔軟でない。 
好ましくは、篩い又はメッシュは、金属、最も好ましくはステンレス鋼から構成されている。これは容易な清浄を助ける。
【００１７】
粒子のサイズを制御するための1つの方法は、小粒子の形成が最小となり大粒子の形成が最大となるよう、細胞溶解及び／又は沈殿反応において撹拌速度を制御することである。好ましい撹拌速度は、先端速度を1.15m/s未満、より好ましくは1m/s未満、より一層好ましくは0.5m/s未満、最適には約0.30m/sに維持することにより達成される。 
先端速度は撹拌機の円周に回転速度（rpm）を掛けたものに等しいという関係により、先端速度はrpmに関連づけられる。したがって、より小さな撹拌機と同じrpmで運転している、より大きな撹拌機は、より速い先端速度を有する。
【００１８】
撹拌速度に加えて、撹拌の持続時間も制御することが好ましい。小粒子の形成が最小となり大粒子の形成が最大となるよう、細胞溶解及び／又は沈殿反応において撹拌の持続時間を最小にするのが好ましい。好ましくは、該持続時間は1時間未満、より好ましくは30分未満、最も好ましくは数分である。実際、それは僅か数秒であってもよい。
【００１９】
せん断を減少させる他の方法、例えば、スタティック混合又はボルテックス混合を用いることも可能である。 
該方法は、例えば、処理流をデプスフィルター（例えば、0.2μmフィルター膜）に通過させるというような多数の更なる精製工程を含みうる。
【００２０】
記載している方法の利点として、細胞溶解及び沈殿反応に由来する粒子を除去するための遠心分離工程を必要としないことが挙げられる。 
好ましい染色体外DNAはプラスミドDNAである。
【００２１】
該方法は、大規模法（典型的には、少なくとも10リットルの出発液を一度に処理するもの）に特に適している。より好ましくは、該方法は50リットル以上を処理する。
【００２２】
該方法は、重力供給方式によるものであることが可能であり、あるいは加圧下で運転することが可能である。重力供給方式はせん断を減少させるため、これを用いることが好ましい。
【００２３】
撹拌機の設計も該方法に影響を及ぼすことがあり、大きなブレードを有するインペラを含む撹拌機を使用することが好ましい。ブレードの設計はプラスミドDNAに影響を及ぼすことがあり、インペラは、複数のブレード、好ましくは、それぞれが傾斜して互いに重なり合い正反対に対置された2対のブレードとして配置された4個のブレードを含むことが可能である。好ましくは、ブレードは水平面に対して40〜80度、より好ましくは50〜70度、最も好ましくは約60度の角度で固定されている。ブレードは、容器の高さの少なくとも40％を満たすよう長さ方向に伸長しているべきである。 
ブレードは、細胞溶解工程中、完全に覆われているべきではない。
【００２４】
もう1つの態様においては、本発明は、本発明の方法により精製された染色体外DNA、及び該方法により精製された染色体外DNAを含む又はそれよりなる医薬組成物を含む。
【００２５】
他の態様は、本発明の方法において使用する、75μmを超えるメッシュ又は篩いを含むフィルタープレート、及び大規模容器の少なくとも40％を満たすよう長さ方向に伸長するブレードを含む大規模容器用のインペラを含む撹拌機を含む。
【００２６】
メッシュ又は篩いは、好ましくは、フィルターメッシュ及びサポートメッシュを含む。フィルターメッシュは、好ましくは、75μm超、より好ましくは150μm超、最も好ましくは約200μm以上のメッシュサイズを有する。好ましくは、それはステンレス鋼から構成されており、最も好ましくは、ワイヤメッシュディスクである。ある程度の強固さを付与し、それを平坦に維持するのを助けるために、フィルターメッシュは、好ましくは、サポートメッシュ上に支持されている。サポートメッシュは、好ましくは、ステンレス鋼から構成され、例えば、口径1.6mmのワイヤメッシュディスクである。フィルタープレート上にフィルターメッシュ及びサポートメッシュを配置する問題を解決するのを助けるために、フィルターメッシュ及びサポートメッシュは、好ましくは、溶接されているか、さもなくば、1つに合体されている。メッシュ又は篩いは、好ましくは、その下面上に、配置を助け液体の迂回を（使用の際に）妨げるためのシールを備えている。このシールは、好ましくは、Oリングの形態である。好ましくは、メッシュ又は篩いは、0.50mを超える直径を有し、好ましくは、直径約1.0mであり、平面図において環状である。
【００２７】
使用の際は、メッシュ又は篩いは、GMP環境での使用に適合したフィルターホルダー中に支持される。該フィルターホルダーは、例えば、トロリーで取り付けられるプレートフィルター容器の形態でありうる。 
メッシュ又は篩い、及びフィルターホルダーの設計は、具体的な実施例において更に詳しく説明される。
【００２８】
本明細書に開示する篩いの配置は、プラスミドDNAの精製において特に有利である。なぜなら、それは、単一工程の清澄化／精製法において使用することが可能であり、この場合、相当量の細胞残屑及びRNAが、それよりは低度ではあるがタンパク質、内毒素及びゲノムDNAのような他の不純物と共に除去されうるからである。
【００２９】
説明すると、プラスミドDNAを精製する際には、細胞残屑を除去するために、細胞溶解された物質を遠心分離により清澄化するのが標準的な実施である。プラスミドDNAを抽出し精製するための典型的な方法として、Birnboim及びDolby (1979)の方法が挙げられる。この方法は、直鎖状DNAの変性は生じるが共有結合閉環DNAの変性は生じない狭いpH領域（12.0〜12.5）が存在するという観察を応用したものである。プラスミド含有細胞を、しばしば、リゾチームで処理して細胞壁を弱くし、ついでSDSで細胞溶解する。染色体DNAは高分子量形態のままであるが、変性している。酸性の酢酸ナトリウム又は酢酸カリウムで中和すると、該染色体DNAは再生し、凝集して不溶性の網目状構造体を形成する。同時に、高濃度の該酢酸塩はタンパク質-SDS複合体及び高分子量RNAの沈殿を引き起こす。該アルカリ性変性工程のpHを注意深く制御すれば、該cccプラスミドDNAは溶解したままとなり、一方、混入している巨大分子の大部分は沈殿する。 
遠心分離の代わりに、開示している篩い配置を用いることにより、この沈殿物を保持させることが可能である。
【００３０】
一方、典型的には、ついで、高レベルのRNAを除去するために、清澄化溶解物（遠心分離により得たもの）を更なる精製工程（例えば、塩化カルシウム沈殿）に付すことが可能である。本出願人は、塩化カルシウム沈殿工程を細胞溶解細胞の通常の清澄化と共に行うことが可能であり、単一の沈殿物収集工程（該沈殿物は細胞残屑及び高分子量RNAを含有する）を行うことが可能であることを確認した。
【００３１】
本発明の更にもう1つの態様においては、細胞溶解された細胞を含む処理流から染色体外DNAを精製する方法であって、
i）細胞溶解された細胞を含む処理流を、例えば酢酸ナトリウム又は酢酸カリウムで中和し、
ii）高濃度の抗カオトロピック塩、例えば塩化カルシウムを加えて、RNAを沈殿させ、
iii）75μMを超えるメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いに該処理流を通過させることにより、該処理流から固体を分離することを含む方法を提供する。
【００３２】
つぎに、単なる例示として以下の実施例、表及び図面を参照しながら、本発明の種々の態様を説明することとする。
【００３３】
発明の詳細な説明
沈殿物の性質：フルスケールと実験室スケールとの相違
一体化された沈殿除去工程の設計を促すための初期研究は、典型的には細胞溶解／沈殿反応において生じる沈殿物のサイズの評価に基づくものであった。実験室スケール及び実際の処理スケール（10又は50リットル）の装置からサンプルを採取した。粒子のサイズは、それが生じた位置によって有意に異なることが容易に認められた。結果を図1及び2に示す。図1は、1リットルの実験室スケールの反応から採取した沈殿物の写真である。この場合の撹拌速度は、細胞溶解反応及び沈殿反応のどちらにおいても100rpmであった（先端速度は0.3m/s）。図2は、50リットルの大規模反応から採取した沈殿物の写真である。この場合の撹拌速度は、細胞溶解では50rpm、沈殿では80rpmであった
明らかに、フルスケール反応からの物質は実験室スケール反応からの物質より小さい。そこで、特定のサイズの沈殿物の形成を支配するパラメーターを同定することにした。しかし、（目視検査による以外には）沈殿物のサイズの相違を定量するための容易に利用可能な方法はなかった。そこで、これを行うための方法を開発した。
【００３４】
沈殿物のサイズの相違の定量
サイズの相違を有する物質を評価するための1つの方法は、篩いのスタックを使用することによるものである。通常、これは、塵埃及び岩石などを処理する産業において利用されている。各篩いのメッシュサイズは該スタックの高さと共に逐次的に減少する。メッシュサイズ850μm、425μm、212μm、150μm、75μm及び53μmの篩いのスタックの最上部にサンプルを載せると、そのメッシュサイズより大きなサイズを有する粒子はその層で保持されるが、該メッシュサイズより小さな粒子は保持されない。沈降後に各篩いを秤量することにより、質量による該物質の粒径分布に関して該物質を評価することができる。粒径評価のためのこの方法を、小規模実験及びフルスケール実施から採取した沈殿物に応用した。そのデータを図3に示す。それらの2つのサンプル間の相違が、視覚的のみならず、定量的にも示されうる。
【００３５】
沈殿物のサイズに影響を及ぼす因子
実験室スケールの実験とフルスケールの実験との間の粒径分布における明白な相違を考慮して、観察された結果における相違を支配する因子を試験し決定するための一連の実験を行うことにした。スケール以外の、それらの2つの系における1つの相違は、細胞溶解容器の内容物を混合するために使用した撹拌機の先端速度であった。80RPMにおける大規模容器内の撹拌機の最大先端速度は1.15 m s-1であり、この先端速度との釣り合いを考慮して、これを、1リットルの実験室スケールの実施における220RPMと同等であるとみなした。一般には、1リットルのスケールの実験を行うためには100RPMが用いられていた。したがって、種々の先端速度及び種々の持続時間で一連の実験を行った。得られたデータを図4（表1）に示す。該データを操作して分布率（重量％）の数字を得、該データを、サイズ分布に基づき種々の実施に関してプロットした（図5〜10）。図5には、すべてのメッシュサイズにおける重量分布が比較されている。図6には、すべてのメッシュサイズにおける重量分布率（％）が比較されている。図7においては、それらの結果が大粒径、中間粒径及び小粒径にグループ分けされている。図8には、212μmのメッシュを使用した分離による結果が比較されている。図9には、大粒子と中間粒子とを同じグループに分けた場合の重量分布率（％）が小粒子のものと比較されている。図10には、150μmのメッシュを使用した分離による重量分布率（％）が比較されている。 
これらの実験を3回繰り返した。そして、粒子の分布における明らかな相違が示された。
【００３６】
図4に示す表及び図面における条件は以下のとおりであった。 
Set 1：細胞溶解220rpm、沈殿440rpm、持続時間30分間
Set 2：細胞溶解55rpm、沈殿55及び75rpm、持続時間30分間
Set 3：細胞溶解220rpm、沈殿440rpm、持続時間30秒間
Set 4：細胞溶解100rpm、沈殿100rpm、持続時間30分間
Set 5：細胞溶解125rpm、沈殿125rpm、持続時間30分間
【００３７】
前記データは、沈殿物のサイズがインペラの撹拌速度と撹拌の持続時間との両方により影響されることを示している。 
例えば、Set 1（この場合、撹拌速度は高く、時間は長い）は、主として425μmのメッシュ上に捕捉される粒子の形成を引き起こす。 
これはSet 2とは対照的である。すなわち、Set 2においては、ほとんどの粒子が850μmのメッシュ上で捕捉され、それより小さな等級の後続のメッシュは、比較的僅かな沈殿物しか捕捉しない。
【００３８】
Set 3（この場合、撹拌速度は高いが、時間は短い）においては、Set 2の場合と同様、ほとんどの粒子が850μmのメッシュ上で捕捉される。しかし、より小さなサイズのメッシュ（425、212及び150μm）においても、より多数の粒子が捕捉される。このことは、長時間に及ぶ高撹拌の効果が、850μmを超えるサイズの粒子を425〜212μmの範囲の粒子に断片化するものであることを示している。
【００３９】
Set 4及びSet 5は、100RPM及び125RPMの低撹拌速度では、概ね850μmを超えるサイズの粒子を生成しうることを証明している。 
小粒子が通常の膜を詰まらせる傾向にある点において、これらの知見は重要である。 
図11及び12は、プラスミドの収量が細胞溶解及び沈殿の持続時間によっては比較的影響を受けないことを示している。
【００４０】
混合工程及び後続のメッシュフィルターの設計
一般には、大粒子を溶液から除去することのほうが、小粒子を溶液から除去することより容易であり、経済的である。したがって、小規模系を真似て、前記データと関連づけて、プレートフィルター、撹拌機及び運転パラメーターを設計した。寸法均一性（dimensional homogeneity）を維持することによる1リットルの細胞溶解容器のスケールアップに基づき、撹拌機及び細胞溶解容器を設計した。 
これは以下の計算に基づいて行った。
【００４１】
撹拌型：単一の、4ブレード60度固定インペラ
撹拌機全径（ハブを含む）：
小規模装置（mm）：撹拌機径/容器径 = 58/120
= 0.4833
新混合容器の撹拌機径（m）：0.4833×容器径 = 撹拌機径
0.4833×0.46 = 0.2223m
【００４２】
ブレード幅：
小規模装置（mm）：ブレード幅/容器径 = 17/120
= 0.1417
新混合容器のブレード幅（m）：0.1417×容器径 = 撹拌機径
0.1417×0.46   = 0.0651m
【００４３】
ブレード長：
小規模装置（mm）：ブレード長/tan-tan長 = 68/150
= 0.4533
新混合容器のブレード長（m）：0.4533×tan-tan長 = ブレード長
0.4533×0.72       = 0.3264m
【００４４】
ブレードは45度で固定されるため、容器内の実際の高さは0.3264（sin60°） = 0.2826mとなる。 
細胞溶解バッファー（NaOH及びSDS）を加える前は、撹拌機のブレードの高さは液体の高さを超える。これは小規模系の場合にも当てはまる。
【００４５】
最小RPM：
理想的には、該容器は、小規模装置と同じ先端速度で運転する。 
小規模先端速度(m s-1) = (rpm/60)×撹拌機の円周
= (100/60)×58e10-3π
= 0.303 m s-1
新混合容器rpm         = 0.303×60/0.2223π
= 26.1rpm
【００４６】
このように、前記で大まかに示した原理を用いて、任意の大規模容器のための最適なインペラの設計を定めることが可能である。 
該メッシュは重力供給方式において沈殿物を非常に首尾よく捕捉して、固体含量が有意に減少した処理流を与えたため、実際の処理スケールでの除去のための可能な方法として、篩い系を更に検討した。重力のみで又は加圧により作動しうるスケールアップ装置を設計した。
【００４７】
該設計物が働くことの確認
望ましいサイズの沈殿物が大規模で生じうること、及び後続のプレートフィルターが重力供給方式において固体を除去しうることを確認するために、インペラの大規模な実験室模擬体を使用した。
【００４８】
図13には、大規模容器に由来する物質の粒径が示されており、それと小規模容器に由来するものとが比較されている。明らかに、大きな沈殿物が該粒径分布において優勢であり、このことは、新たに構成した混合工程において使用したインペラ及びプレートフィルターの設計物が所望のサイズの沈殿物を形成しうることを示している。
【００４９】
この物質を該プレートフィルターに適用したところ、該沈殿物は主として200μmのメッシュ上で保持された。350mm、200μmのメッシュは5リットルの沈殿溶解物を1分未満で処理することが可能であった。
【００５０】
篩い又はメッシュ10は、図16に、最も明らかに示されている。それは、相当な強固さを付与するサポートメッシュ14に点溶接されたフィルターメッシュ12を含む。該フィルターメッシュは、200μmの口径（非表示）を有するステンレス鋼ワイヤメッシュディスクである。これは、同様にステンレス鋼から構成された1.6mm口径のメッシュであるサポートメッシュ上に支持されている。それらは共に316等級のステンレス鋼である。メッシュシール16は、窪み部分46に収容されることにより、篩い又はメッシュがフィルタープレート20上に正しく整列し配置されるのを可能にする。
【００５１】
篩い又はメッシュは、濾過ユニット30（これは図14には断面図として、図15には上からの図として示されている）の一部を構成する。濾過ユニット30は、フィルタープレート20、カバー36、篩い又はメッシュ10を含み、所望により、スタンド32をも含む。
【００５２】
フィルタープレート20は、出口40、メッシュ接触面42（これは、中央に位置した出口40に向かって液体が排出するよう傾斜しているか又は皿状になっている）を含む。その周辺部44に向かって、2つの窪み部分46及び48がある。窪み部分46にはメッシュシール16が収容され、窪み部分48にはOリング50が収容され、それにより、該カバーが濾過ユニット30のフィルタープレート20に対して密封されるのが可能となる。あるいは、メッシュシール16はメッシュシールガスケットの形態をとることが可能である。皿状面42は約1:50の勾配を有し、互いに間隔を置いて配置された複数の突起52（これは、該メッシュ又は篩いを該皿状面から引き離すことにより廃液を促すものであり、例えば、リブ、ボタンなどが挙げられる）を備えている。
【００５３】
カバー36はその周辺部にフランジ部分62を含む。したがって、該カバーは複数のエッジクランプ70によりフィルタープレート20に対して締め付けられうる。該カバーの外周64上の上向きリップ66、及びフィルタープレート20の外周の下向きリップ54は、Oリング50と共に、強固な密封を確保するのを助ける。
【００５４】
カバー36は更に、2つの入口68及び72、ベント74、圧力計76及び破裂ディスク78、スペア80ならびに覗きガラス82を含む。複数の吊上げ用アイ84も該カバー上に互いに間隔を置いて配置されている。
【００５５】
該装置はフィルターメッシュ保持リング86をも含む。 
メッシュ又は篩いは、該カバーのフランジ62とフィルタープレート20との間に取り込まれるようフィルタープレート20上に伸張している。
【００５６】
該設計の重要な特徴には以下のものが含まれる。 
1．フィルタープレート上に突起52が設けられている。こうしてメッシュ又は篩いとフィルタープレートとの間の接触面積を減少させることで、プレートの滅菌における蒸気処理中の蒸気の流動が改善され、そして
2．メッシュフィルターの周辺付近にシール又はガスケット16が設けられており、フィルタープレートに窪み部分46が設けられていることにより、篩いの正しい配置及び収容が可能となる。その代わりに又はそれに加えて、篩いを適所に配置するために保持リング86を使用することが可能である。 
篩いは、染色体外DNA、例えばpDNAの精製での使用に特に有用である。
【００５７】
細胞溶解が、処理流を例えばSDSと混合することを含んでおり、混合を撹拌機中で行う場合には、撹拌機は、「大粒子」の生成を促進するよう設計される。そのような1つの設計を図17に示す。
【００５８】
図17に示すように、撹拌機90は、直径0.46mの容器94内に配置されたインペラ92を含む。該インペラは、軸98の周囲に放射状に配置された4つのブレード96を含む。該ブレードは該容器のベース100に対して約60度の角度で傾斜している。それらは互いに重なり合っており、長細い形状をしている。各ブレードは長さ0.326m、幅0.065m（長さ0.068m、幅0.017mである1リットル容器のブレードより大きい）である。該ブレードは、該容器の高さの少なくとも40％を満たすよう該容器の側面102に伸長している。このようにして、処理流は沈殿工程中には該ブレードを覆うが、細胞溶解中には部分的に覆うに過ぎない。
【００５９】
注意深く設計された撹拌機と、75μmを超えるメッシュサイズを有するプレートフィルターの使用と、粒径を制御するための細胞溶解及び／又は撹拌工程中の運転条件の制御との組合せは、経済的に実施可能なスケールアップ、処理速度、沈殿物に対する機械的応力の適用及び一体化された配管の欠如の問題を回避して、医薬用プラスミドDNAの製造における沈殿細胞溶解物をうまく除去する。
【００６０】
篩いは、pDNAの処理において用いた標準的な清澄化法（すなわち、高濃度の酸性酢酸塩溶液、例えば酢酸ナトリウム又は酢酸カリウム）において生成した沈殿反応由来生成物の分離に特に有効であることが判明した。
【００６１】
それは、抗カオトロピック塩、例えば、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化カルシウム、酢酸アンモニウム又は酢酸カリウムを使用する沈殿工程の生成物の分離にも有効であることが判明した。
【００６２】
実際、好ましい実施形態においては、例えば酸性酢酸塩溶液を使用する通常の清澄化法とRNA除去工程（例えば、塩化カルシウム沈殿）との両方により生成した固体を除去するために、単一工程で篩いを使用することが可能である。そのような工程は、RNアーゼを使用しない染色体外DNA精製方法であるという、処理上の利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図1は、1リットルの実験室スケールの反応から採取した沈殿溶解物の写真である。この場合の撹拌速度は、細胞溶解反応及び沈殿反応のどちらにおいても100RPMであった。
【図２】図2は、50リットルのフルスケール反応から採取した沈殿溶解物の写真である。
【図３】図3は、サイズに基づく粒子の分画に使用した種々のサイズの篩い上に保持された沈殿物の質量を示すグラフである。
【図４】図4は、種々の撹拌条件（インペラ先端速度及び持続時間）下で得たデータを示す表であり、質量、質量比率（％）によるデータ及び篩いサイズによるサブセットとしてのデータを含む。
【図５】図5は、850μm、425μm、212μm、150μm、75μm及び53μmの篩いサイズに対する質量分布を示すデータのプロットである。
【図６】図6は、850μm、425μm、212μm、150μm、75μm及び53μmの篩いサイズに対する質量比率（％）を示すデータのプロットである。
【図７】図7は、850μm + 425μm、212μm + 150μm、及び75μm + 53μmの篩いサイズに対する質量比率（％）を示すデータのプロットである。
【図８】図8は、850μm + 425μm + 212μm、及び150μm + 75μm + 53μmの篩いサイズに対する質量比率（％）を示すデータのプロットである。
【図９】図9は、850μm + 425μm + 212μm + 150μm、及び75μm + 53μmの篩いサイズに対する質量比率（％）を示すデータのプロットである。
【図１０】図10は、850μm + 425μm、212μm + 150μm + 75μm + 53μmの篩いサイズに対する質量比率（％）を示すデータのプロットである。
【図１１】図11は、細胞溶解時間（種々の撹拌速度）の相関因子としてのプラスミド収量を示すプロットである。
【図１２】図12は、沈殿操作時間（種々の撹拌速度）の相関因子としてのプラスミド収量を示すプロットである。
【図１３】図13は、大規模実験及び小規模実験からの物質の粒径を示すプロットである。
【図１４】図14は、本発明の1つの態様の濾過ユニットの側面図である。
【図１５】図15は、図14のユニットを上から見た図である。
【図１６】図16は、濾過ユニットのフィルタープレート、カバーアセンブリ及びメッシュ又は篩いの部分断面図である。
【図１７】図17は、本発明のもう1つの態様の撹拌機アセンブリの、一方の側及び上からの斜視図を示す。
【図１】
2005510239.tif 000002
【図２】
2005510239.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月17日(2003.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体外DNA及び細胞残屑沈殿物及び／又はRNA沈殿物を含む処理流から細胞残屑及び／又はRNA沈殿物を除去することにより、染色体外DNAを精製する方法であって、
a．細胞溶解及び／又は沈殿反応の速度を制御して、実質的に小粒子の形成を最小にし及び／又は大粒子の形成を最大にし、但し、該小粒子は、53μmのメッシュサイズによっては保持されるが150μmのメッシュサイズでは通過する粒子であり、かつ該大粒子は、425μmのメッシュサイズにより保持される粒子であり；
b．75μmを超えるメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いに該処理流を通過させることにより該処理流を濾過して、相当な質量比率の該沈殿物を該処理流から除去することを含む前記方法。
【請求項２】
処理流が15重量％以下の小粒子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
処理流が少なくとも60重量％の大粒子を含む、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項４】
処理流が更に中間サイズの粒子を含み、該中間サイズの粒子が、150μmのメッシュサイズによっては保持されるが425μmのメッシュサイズのメッシュ又は篩いでは通過する粒子である、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
処理流が20重量％未満の該中間粒子を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
粒子の少なくとも50重量％が、850μmのメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いにより保持される、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
粒子の少なくとも60重量％が、850μmのメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いにより保持される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
粒子の少なくとも65重量％が、850μmのメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いにより保持される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
処理流を、200μm以上のメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いに通過させる、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０】
処理流を、次第に減少するメッシュサイズの一連の篩いに通過させる、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
メッシュ又は篩いが、処理流と実質的に完全に同じ平面上に位置する接触面を含む、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１２】
接触面が実質的に強固である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
篩い又はメッシュが金属である、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４】
細胞溶解及び／又は沈殿反応において撹拌の持続時間を1時間未満に制御して、小粒子の形成を最小にし大粒子の形成を最大にする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１５】
染色体外DNA及び細胞残屑沈殿物及び／又はRNA沈殿物を含む処理流から細胞残屑及び／又はRNA沈殿物を除去することにより、染色体外DNAを精製する方法であって、
a．細胞溶解及び／又は沈殿反応をスタティック混合又はボルテックス混合を用いて制御して、実質的に小粒子の形成を最小にし及び／又は大粒子の形成を最大にし、但し、該小粒子は、53μmのメッシュサイズによっては保持されるが150μmのメッシュサイズでは通過する粒子であり、かつ該大粒子は、425μmのメッシュサイズにより保持される粒子であり；
b．75μmを超えるメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いに該処理流を通過させることにより該処理流を濾過して、相当な質量比率の該沈殿物を該処理流から除去することを含む前記方法。
【請求項１６】
メッシュ又は篩いへの処理流の通過を、せん断を最小にする条件下で行う、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１７】
処理流をデプスフィルターに通過させることを更に含む、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１８】
処理流を0.2μmフィルター膜に通過させることを更に含む、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１９】
細胞残屑を除去するための遠心分離工程を行わない、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項２０】
染色体外DNAがプラスミドDNAである、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項２１】
大規模法が処理流中の少なくとも10リットルの液体を処理することを含む、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項２２】
重力供給方式によるものである、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項２３】
加圧下で運転する、請求項1〜22のいずれか1項記載の方法。
【請求項２４】
酸性酢酸塩溶液を使用する沈殿操作を含む清澄化工程からの固体を分離するために篩いを使用する、請求項1〜23のいずれか1項記載の方法。
【請求項２５】
RNAを沈殿させるために抗カオトロピック塩を使用する沈殿工程からの固体を分離するために篩いを使用する、請求項1〜23のいずれか1項記載の方法。
【請求項２６】
酸性酢酸塩溶液を使用する沈殿操作を含む清澄化工程と、抗カオトロピック塩を使用する沈殿工程との両方からの固体を、単一の沈殿物除去工程において分離するために篩いを使用する、請求項1〜23のいずれか1項記載の方法。
【請求項２７】
抗カオトロピック塩が塩化カルシウムである、請求項25又は26記載の方法。
【請求項２８】
前記請求項のいずれか1項記載の方法により精製された染色体外DNA。
【請求項２９】
前記請求項のいずれか1項記載の方法により精製された染色体外DNAを含む又はそれよりなる医薬組成物。
【請求項３０】
細胞溶解された細胞を含む処理流から染色体外DNAを精製する方法であって、
i）細胞溶解された細胞を含む処理流を、例えば酢酸ナトリウム又は酢酸カリウムで中和し、
ii）高濃度の抗カオトロピック塩、例えば塩化カルシウムを加えて、RNAを沈殿させ、
iii）75μMを超えるメッシュサイズを有するメッシュ又は篩いに該処理流を通過させることにより、該処理流から固体を分離することを含む前記方法。
【国際調査報告】
2005510239.tif 000019
2005510239.tif 000020
2005510239.tif 000021
2005510239.tif 000022