(57)【要約】  本発明は、新規なグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素を提供することを目的とし、グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素、それをコードするポリヌクレオチド等に関する。本発明は、例えば、配列番号1又は4の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含有する発現ベクター及び形質転換体、該形質転換体を用いる食品等の製造方法、又はそのような製法によって製造された食品等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）〜（e）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（a）配列番号1又は4の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2のアミノ酸配列において、1〜100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、85％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（e）配列番号1又は4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の（f）又は（g）のいずれかに記載の請求項1に記載のポリヌクレオチド：
（f）配列番号2のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（g）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号1又は4の塩基配列を含有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
【請求項９】
請求項7に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
【請求項１０】
前記形質転換体が脂質生産菌である、請求項8又は9に記載の形質転換体。
【請求項１１】
前記脂質生産菌が、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella  alpina）である、請求項10に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項8〜11のいずれかに記載の形質転換体の培養物から、脂質又は脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、脂質又は脂肪酸組成物の製造方法。
【請求項１３】
請求項12に記載の製造方法により採取された脂質又は脂肪酸組成物を含有する食品、医薬品、化粧品又は石鹸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素をコードするポリヌクレオチド及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は、リン脂質やトリアシルグリセロール等脂質を構成する重要な成分である。不飽和結合を2箇所以上含有する脂肪酸は、高度不飽和脂肪酸（PUFA）と総称され、具体例としては、アラキドン酸やジホモγリノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等が知られている。この高度不飽和脂肪酸のうち、いくつかの種類は、動物が体内で合成することができない。従って、このような高度不飽和脂肪酸については、必須脂肪酸として食物から摂取する必要がある。【０００３】
動物体内において、高度不飽和脂肪酸は多種多様な臓器及び組織に含まれている。例えば、アラキドン酸は動物の副腎腺や肝臓から抽出した脂質から分離される。しかしながら、動物臓器には高度不飽和脂肪酸は少量しか含まれていないため、動物臓器から抽出・分離される高度不飽和脂肪酸だけでは、十分な供給量を得ることができない。そのため、種々の微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を獲得する方法が開発されてきた。中でもモルティエレラ（Mortierella）属微生物は、アラキドン酸等の高度不飽和脂肪酸含有脂質を効率的に生産する微生物として知られている。また、植物で高度不飽和脂肪酸を生産させる試みもなされている。高度不飽和脂肪酸は、トリアシルグリセロール等の貯蔵脂質を構成し、微生物の菌体内若しくは植物種子中に蓄積されることが知られている。【０００４】
貯蔵脂質であるトリアシルグリセロールは、生体内で以下のように生成される。グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素によりグリセロール-3-リン酸にアシル基が転移されてリゾホスファチジン酸が生じる。次に、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素によりリゾホスファチジン酸にアシル基が転移されてホスファチジン酸が生じる。そして、ホスファチジン酸が、ホスファチジン酸ホスファターゼにより脱リン酸化されることによってジアシルグリセロールが生じる。最後に、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素によりジアシルグリセロールにアシル基が転移されてトリアシルグリセロールが生じる。【０００５】
上記のトリアシルグリセロール生合成経路やリン脂質生合成経路において、グリセロール-3-リン酸のアシル化によりリゾホスファチジン酸（lysophosphatidic acid）が生成する反応には、グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素（以下、「GPAT」と記載する場合もある。：EC 2.3.1.15）が介在することが知られている。【０００６】
GPAT遺伝子の存在はこれまでにいくつかの生物で報告されている。哺乳動物由来のGPAT遺伝子として、小胞体型（膜結合型）とミトコンドリア型（膜結合型）の2種類がクローン化されている（非特許文献2）。また、植物由来のGPAT遺伝子として小胞体型（膜結合型）、ミトコンドリア型（膜結合型）及び葉緑体型（遊離型）の3種類がクローン化されている（非特許文献3）。【０００７】
真菌であるSaccharomyces cerevisiae 由来のGPAT遺伝子として、小胞体型（膜結合型）のGPT2/GAT1(YKR067w)とSCT1/GAT2(YBL011w)の2種類がクローン化されており、これらを同時に欠失させると致死であることが知られている。（非特許文献4）。ここで、GPT2はパルミチン酸（16:0）からオレイン酸（18:1)に至るまで、幅広い範囲の脂肪酸を基質とする活性を有するのに対し、SCT1はパルミチン酸（16:0）、パルミトレイン酸（16:1）といった炭素数16の脂肪酸を基質とすることに強い選択性を有することが示されている（非特許文献4）。【０００８】
上記の他にも多くの生物種からGPAT遺伝子はクローン化されている。特に、脂質生産菌であるモルティエレラ（Mortierella）属微生物由来のGPATについても以下のような報告がある。【０００９】
Mortierella ramanniana由来のGPATについては、小胞体型GPATが単離され、これがパルミチン酸（16:0）よりもオレイン酸（18:1）を5.4倍高い選択性をもってアシルドナーとして利用することが示されている（非特許文献5）。Mortierella alpina（以下、「M. alpina」と記載する場合もある。）由来のGPATについては、ミクロソーム画分にグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性があることが報告されている（非特許文献6）。【００１０】
M. alpinaのミクロソームに存在するGPAT（膜に結合している状態）と種々のアシルCoAをインビトロで反応させると、GPATは、高い活性を維持したまま、オレイン酸（18:1）、リノール酸（18:2）、ジホモγリノレン酸（DGLA）（20:3）、アラキドン酸（20:4）といった高度不飽和脂肪酸を広く基質として用いることが示されている（特許文献1）。【００１１】
M. alpina (ATCC #16266）からクローニングされたGPAT（以下、本明細書ではMaGPAT1（ATCC＃16266）と記載する）を、エイコサペンタエン酸（EPA）まで生合成できるように形質転換されたYarrowia lipolytica内で発現させたところ、総脂肪酸の内、ジホモγリノレン酸（DGLA）（20:3）の組成が増加し、オレイン酸（18:1）の組成が減少することが示された。この結果は、より長鎖で不飽和度の高い高度不飽和脂肪酸が選択的に取り込まれていることを示すものである（特許文献2）。【００１２】
近年、M. alpina（1S-4）からGPATホモログであるMaGPAT2が単離され、MaGPAT1とは異なる基質特異性を示すことが報告されている（特許文献3）。即ち、MaGPAT1は、パルミチン酸に対する特異性が高く、MaGPAT2は、オレイン酸に対する特異性が高いことが示唆されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第WO2004／087902号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第2006／0094091号明細書
【特許文献３】国際公開第WO2008／156026号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Lipids, 39, 1147 (2004)
【非特許文献２】Biochimica et Biophysica Acta, 1348, 17-26, 1997
【非特許文献３】Biochimica et Biophysica Acta, 1348, 10-16, 1997
【非特許文献４】The Journal of Biological Chemistry, 276 (45), 41710-41716, 2001
【非特許文献５】The Biochemical Journal, 355, 315-322, 2001
【非特許文献６】Biochemical Society Transactions, 28, 707-709, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述のような状況下で、リゾホスファチジン酸、及びこれを基に生成されるトリアシルグリセロールを効率的に生産することにより、脂肪酸生産経路の更なる活性化及び効率化に寄与する新たなGPATホモログが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、脂質生産菌であるM.alpinaの第3のGPATホモログ（MaGPAT3）をコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下のポリヌクレオチド、タンパク質、発現ベクター、形質転換体、該形質転換体を用いる食品等の製造方法、並びにそのような製法によって製造された食品等を提供する。【００１７】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
[1]  以下の（a）〜（e）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（a）配列番号1又は4の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2のアミノ酸配列において、1〜100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、85%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（e）配列番号1又は4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[2]  以下の（f）又は（g）のいずれかに記載の前記[1]に記載のポリヌクレオチド：
（f）配列番号2のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（g）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[3]  配列番号1又は4の塩基配列を含有する、前記[1]に記載のポリヌクレオチド。
[4]  配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、前記[1]に記載のポリヌクレオチド。
[5]  DNAである、前記[1]〜[4]のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
[6]   前記[1]〜[5]のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
[7]   前記[1]〜[5]のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
[8]   前記[1]〜[5]のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
[9]   前記[7]に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
[10]  前記形質転換体が脂質生産菌である、前記[8]又は[9]に記載の形質転換体。
[11]  前記脂質生産菌が、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella  alpina）である、前記[10]に記載の形質転換体。
[12]   前記[8]〜[11]のいずれかに記載の形質転換体の培養物から、脂質又は脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、脂質又は脂肪酸組成物の製造方法。
[13]   前記[12]に記載の製造方法により採取された脂質又は脂肪酸組成物を含有する食品、医薬品、化粧品又は石鹸。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、脂質生産菌（例えば、M．alpina）、酵母、植物等の形質転換に利用することができ、そのようにして得られる形質転換脂質生産菌、形質転換酵母又は形質転換植物等は脂肪酸組成物、食品、化粧料、医薬、石鹸等の製造に利用することができる。【００１９】
より具体的には、本発明の形質転換体は、トリグリセリドの生産効率が極めて高く、形質転換体においてみられる脂肪酸増加の大部分は、トリグリセリド中の脂肪酸が増加したことに因るものである。したがって、本発明は、大量のトリグリセリドや脂肪酸を必要とする医薬品あるいは健康食品の製造に有効に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】MaGPAT3のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。
【図１−２】図１-１の続き
【図１−３】図１-２の続き
【図２−１】MaGPAT3（1S-4）のCDS配列と推定アミノ酸配列を示す図である。
【図２−２】図２-１の続き
【図３】MaGPAT1（(1S-4)及び（ACTT#16266））とMaGPAT3（1S-4）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図４】各種GPATホモログタンパク質（MaGPAT1、MaGPAT3、ScSCT1及びScGPT2）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。GPATホモログで保存されている4つのドメインとそのドメイン中の、GPAT活性に重要であるとされるアミノ酸残基（＊印）及びグリセロール-3-リン酸との結合に重要なアミノ酸残基（＋印）が、GPAT3においても保存されていた。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2009年9月18日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願2009-217646号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００２２】
本発明者らは、後述の実施例において詳細に記載するように、脂質生産菌であるM．alpina由来の第3番目のグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素ホモログの遺伝子（MaGPAT3）の全長cDNAのクローニングに初めて成功した。また、本発明者らは、M．alpina由来のMaGPAT3のゲノムDNAの塩基配列、及び推定アミノ酸配列も同定した。MaGPAT3のORF配列、MaGPAT3の推定アミノ酸配列、MaGPAT3のCDS配列及びMaGPAT3のゲノム配列は、それぞれ配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4である。また、M．alpina由来のMaGPAT1のゲノム配列を配列番号5に示す。これらのポリヌクレオチド及び酵素は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。
【００２３】
1．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、以下の（a）〜（e）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチドを提供する。
（a）配列番号1又は4の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2のアミノ酸配列において、1〜100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、85%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（e）配列番号1又は4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００２４】
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、DNA又はRNAを意味する。
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号1又は4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号2のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook ＆ Russell，  Molecular Cloning： A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
【００２５】
本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0．5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２６】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling and Detection System（GE Healthcare）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1％（w/v）SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
【００２７】
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLAST等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1又は4のDNA、又は配列番号2のアミノ酸配列をコードするDNAと74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
【００２８】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、FASTA(Science 227 (4693): 1435-1441, (1985))や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTN、BLASTXやBLASTPと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTPを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２９】
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。
【００３０】
2．本発明のタンパク質
本発明は、次に示すタンパク質を提供する。
（i）上記（a）〜（e）のいずれかのポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（ii）配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（iii）配列番号2のアミノ酸配列における1若しくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質。
（iv）配列番号2のアミノ酸配列に対して85％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質。
【００３１】
上記（iii）又は（iv）に記載のタンパク質は、代表的には、天然に存在する配列番号2のタンパク質の変異体であるが、例えば、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"、"Nuc. Acids. Res., 10, 6487（1982）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409（1982）"、"Gene, 34, 315 （1985）"、"Nuc.  Acids.  Res., 13, 4431（1985）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488（1985）"等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
【００３２】
本明細書中、「配列番号2のアミノ酸配列における1若しくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる、グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質」としては、配列番号2のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
【００３３】
また、このようなタンパク質としては、配列番号2のアミノ酸配列と85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。  なお、グリセロール-3-リン酸アシル基転移活性は、例えば、J.B.C. 276(45), 41710-41716(2001)に記載の方法に従って測定することができる。また、GPAT活性を確認する方法としては、酵母のΔgpt2，Δsct1株を用いた相補実験が挙げられる。当該酵素をコードするポリヌクレオチドをΔgpt2，Δsct1株中（GPT2及びSCT1は、同時に欠失させると致死である）で発現させた場合に、Δgpt2，Δsct1株が増殖することができれば、そのポリヌクレオチドにコードされるタンパク質又はペプチドはGPAT活性を有するということができる。
【００３４】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ1若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸；C群：アスパラギン、グルタミン；D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2，4−ジアミノブタン酸、2，3−ジアミノプロピオン酸；E群：プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン；F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００３５】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Advanced Automation Peptide Protein Technologies社製、Perkin Elmer社製、、Protein Technologies社製、PerSeptive社製、Applied Biosystems社製、SHIMADZU社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００３６】
3．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換体
本発明はまた、別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供する。
本発明のベクターは、通常、（i）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；（ii）該プロモーターに結合した、上記（a）〜（g）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
（iii）RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。このように構築されるベクターは、宿主細胞に導入される。本発明において使用される適切な宿主細胞の例としては、脂質生産菌、酵母等が挙げられる。
【００３７】
脂質生産菌としては、例えば、MYCOTAXON, Vol. XLIV, No. 2, pp. 257-265（1992）に記載されている菌株を使用することができ、具体的には、モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等のモルティエレラ亜属（subgenus  Mortierella）に属する微生物、又はモルティエレラ・イザベリナ（Mortierella  isabellina）CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、モルティエレラ・ナナ（Mortierella nana）IFO8190、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、モルティエレラ・ヴィナセア（Mortierella vinacea）CBS236.82等のマイクロムコール亜属（subgenus Micromucor）に属する微生物等を挙げることができる。とりわけ、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）が好ましい。
【００３８】
また、酵母の例としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces  cerevisiae）NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が挙げられる。
【００３９】
なお、酵母内に本発明のベクターを導入して、該ベクターがコードするGPAT3タンパク質のグリセロール-3-リン酸アシル基転移活性を調べる場合、宿主細胞として用いる酵母のGPAT遺伝子（Gpt2p及びSct1p）が欠損していると、該GPAT3タンパク質の酵素活性のみを評価することが可能になる。従って、本発明の一態様においては、宿主細胞としての酵母は、Gpt2p遺伝子及びSct1p遺伝子が欠損していることが好ましい。
【００４０】
本発明のベクターで形質転換されたこれらの宿主細胞は、本発明のベクターで形質転換されていない宿主細胞に比べて、より多くの量のトリグリセリドを生成する。本発明のベクターの導入により増加する脂肪酸の大部分はトリグリセリドを構成する脂肪酸である。
脂質生産菌に導入する際に用いるベクターとしては、例えば、pDura5(Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425, (2004))が利用可能であるが、これに限定されない。
【００４１】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、酵母細胞内でインサートを発現する活性を有するベクターであれば特に限定されないが、例としては、pYE22m（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）が挙げられる。
【００４２】
宿主細胞中での遺伝子発現を調節するためのプロモーター/ターミネーターとしては、宿主細胞中で機能する限り、任意の組み合わせでよい。例えば、脂質生産菌で利用する場合はhiston H4.1遺伝子のプロモーター、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター等を利用可能である。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、栄養要求性マーカー（ura5、niaD）、薬剤耐性マーカー（hygromycine、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992； Hussain et et al., gene, 101, 149, 1991）等が利用可能である。
【００４３】
宿主細胞の形質転換方法としては、一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、脂質生産菌の場合、エレクトロポレーション法（Mackenxie D. A. et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000）やパーティクルデリバリー法（特開2005−287403「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）が利用できる。また、酵母の場合は、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929（1978））、酢酸リチウム法（J.Bacteriology, 153, p163（1983））、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 （1978）、Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等に記載の方法で実施可能であるが、これらに限定されない。
【００４４】
その他、一般的なクローニング技術に関しては、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genitics、A laboratory manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY）"等を参照することができる。
【００４５】
4．本発明の脂質又は脂肪酸組成物の製造方法
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換脂質生産菌又は酵母を用いる脂質又は脂肪酸組成物の製造方法を提供する。
本明細書中、「脂質」とは、脂肪酸とアルコールとがエステル結合した化合物（例えば、グリセリド）又はその類似体（例えば、コレステロールエステル）等を含む単純脂質、単純脂質の一部にさらにリン酸、アミノ酸、糖等が結合した複合脂質、及び脂質の加水分解物で水に溶けない誘導脂質をいうものとする。
本明細書中、「油脂」とは、グリセロールと脂肪酸のエステル（グリセリド）のことをいう。
本明細書中、「脂肪酸」とは、一般式RCOOH（Rはアルキル基）で表される脂肪族モノカルボン酸（カルボキシル基を一個有し、炭素原子が鎖状に連結したカルボン酸）のことをいう。脂肪酸には、炭化水素鎖中に二重結合を有さない飽和脂肪酸と、二重結合を含む不飽和脂肪酸とが含まれる。
【００４６】
本発明の脂質又は脂肪酸組成物は、本発明に従って形質転換した細胞から以下のようにして抽出することができる。生物（例えば、脂質生産菌又は酵母）の形質転換株について、培養終了後、遠心分離法、ろ過等の常法に従って培養細胞を得る。細胞を十分水洗し、好ましくは乾燥する。乾燥は、凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。乾燥細胞を、必要に応じて、ダイノミルや超音波等により破砕した後、好ましくは窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用いることができ、又はメタノール及び石油エーテルの交互抽出又はクロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、脂肪酸を含有する脂質を得ることができる。抽出した脂肪酸は、塩酸メタノール法等によってメチルエステル化してもよい。
【００４７】
さらに、上記脂肪酸を含有する脂質からの脂肪酸の分離は、混合脂肪酸又は混合脂肪酸エステルの状態で、常法（例えば、尿素付加法、冷却分離法、カラムクロマトグラフィー法等）により濃縮分離することにより行うことができる。
本発明の製造方法によって得られた脂質又は脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。
【００４８】
本発明はまた、別の実施形態において、本発明の形質転換脂質生産菌又は形質転換酵母を用いる食品、化粧料、医薬、石鹸等の製造方法を提供する。この方法は、本発明の形質転換脂質生産菌又は形質転換酵母を用いて脂質又は脂肪酸を生成する工程を包含する。生成された脂質又は脂肪酸を含有する食品、化粧料、医薬、石鹸等の調製は、常法による。このように、本発明の製造方法によって製造された食品、化粧料、医薬、石鹸等は、本発明の形質転換脂質生産菌又は形質転換酵母を用いて生成された脂質又は脂肪酸を含有する。本発明はさらに、そのような方法によって製造された食品、化粧料、医薬、石鹸等を提供する。
【００４９】
本発明の化粧品（組成物）又は医薬品（組成物）の剤型は、特に限定されず、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をとることができる。また、本発明の化粧料組成物又は医薬組成物は、オイル、ローション、クリーム、乳液、ゲル、シャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、エナメル、ファンデーション、リップスティック、おしろい、パック、軟膏、香水、パウダー、オーデコロン、歯磨、石鹸、エアロゾル、クレンジングフォーム等の化粧料若しくは皮膚外用薬の他、皮膚老化防止改善剤、皮膚炎症防止改善剤、浴用剤、養毛剤、皮膚美容液、日焼け防止剤あるいは、外傷、あかぎれ、ひびわれ等による肌荒れの防止改善剤等に用いることができる。
【００５０】
本発明の化粧料組成物は、必要に応じてさらに、その他の油脂、及び／又は色素、香料、防腐剤、界面活性剤、顔料、酸化防止剤等を適宜配合することができる。これらの配合比率は、目的に応じて当業者が適宜決定し得る（例えば、油脂は、組成物中に、1〜99.99重量％、好ましくは、5〜99.99重量％、より好ましくは、10〜99.95重量％含有され得る）。また、本発明の医薬組成物は、必要に応じてさらに、その他の医薬活性成分（例えば、消炎成分）又は補助成分（例えば、潤滑成分、担体成分）を含んでいても良い。例えば、化粧料あるいは皮膚外用薬におけるその他の常用成分としては、にきび用薬剤、ふけ・かゆみ防止剤、制汗防臭剤、熱傷用薬剤、抗ダニ・シラミ剤、角質軟化剤、乾皮症用薬剤、抗ウイルス剤、経皮吸収促進剤等が挙げられる。
【００５１】
本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品等が挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等を含む。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約6歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約1歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約6ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
【００５２】
これらの食品の形態の例としては、肉、魚、ナッツ等の天然食品（油脂で処理したもの）、中華料理、ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加える食品、天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油脂を用いた食品、バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品、おかき、ハードビスケット、あんパン等の加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品等を挙げることができる。しかしながら、油脂を含む食品に限定されるわけではなく、例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品、清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等であってもよい。
【００５３】
本発明の食品はまた、カプセル等の医薬製剤の形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の油脂が配合された自然流動食、半消化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤等の加工形態であってもよい。
【００５４】
以上に記載するように、本発明のGPAT3遺伝子を宿主細胞内で発現させることにより、効率的に脂肪酸を生成させることが可能である。
さらに、当該遺伝子の発現量を指標にして、脂肪酸生産を効率よく行うための培養条件の検討、培養管理、等にも利用できる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。【００５６】
[実施例1]M.alpinaのゲノム解析
M.alpina 1S-4株を100 mlのGY2：1培地（2％グルコース、1％酵母エキス  pH6.0）に植菌し、28℃で2日間振とう培養した。濾過により菌体を集菌し、DNeasy（QIAGEN）を用いてゲノムDNAを調製した。
上記ゲノムDNAの塩基配列を、 Roche 454 Genome Sequencer FLX Standard を用いて決定した。その際、フラグメントライブラリーの塩基配列決定を2ラン分、メイトペアライブラリーの塩基配列決定を3ラン分行った。得られた塩基配列をアッセンブリすることにより、300個のSuper Contigを得た。【００５７】
M.alpina 1S-4株のcDNAの合成
M.alpina 1S-4株を4 mlの培地（2％グルコース、1％酵母エキス、pH6.0）に植菌し、4日間28℃で培養した。菌体をろ過により回収し、RNeasy plant kit（QIAGEN）を用いてRNAを抽出した。SuperScript First Strand System for RT-PCR（Invitrogen）を用いてcDNAを合成した。【００５８】
GPATホモログの探索
MaGPAT1（ATCC＃16266）のアミノ酸配列をM.alpina 1S-4株のゲノム塩基配列に対し、tblastn検索した結果、配列番号4、配列番号5に示す配列を含むSuper contigがヒットした。配列番号5は、M.alpina 1S-4株由来のGPAT1（以下、本明細書ではMaGPAT1と記載する）のゲノム配列であると考えられた。一方、配列番号4は、開始コドン、終止コドンの出現やMaGPAT1との比較から、新たなGPATホモログをコードする配列であると考えられた。更に、配列番号4の1-3番目の残基がこのホモログの開始コドンであり、そして3278-3280番目の残基が終止コドンであると推定された。この遺伝子をMaGPAT3と命名した。【００５９】
MaGPAT3遺伝子のクローニング
MaGPAT3遺伝子のCDSをクローン化するために、以下のプライマーを作製した。
Eco-MaGPAT3-F：5’-GAATTCATGGGTCTCCAGATCTATGACTTCGTCTC-3’（配列番号6）
Sal-MaGPAT3-R：5’-GTCGACTTATGCCTCCTTAGACTTGACTGCATCC-3’（配列番号7）
上記のcDNAを鋳型として、プライマーEco-MaGPAT3-FとプライマーSal-MaGPAT3-Rを用いて、KOD-Plus（TOYOBO）によりPCR増幅を行ったところ、約2.2kbのDNA断片が増幅された。これをZero Blunt  TOPO PCRクローニングキット（Invitrogen）を用いてクローン化し、得られたプラスミドをpCR-MAGPAT3とした。このプラスミドのインサートの配列、すなわち、MaGPAT3遺伝子のCDS配列を配列番号3に示す。さらに、MaGPAT3遺伝子のORF配列を配列番号1に示す。【００６０】
配列解析
MaGPAT3遺伝子のゲノム配列（配列番号4）とCDS配列（配列番号3）を比較したところ、本遺伝子のゲノム配列は、エクソン7つ、イントロン6つからなり、753個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコードしていると推定される（図1及び図2）。MaGPAT3と、M.alpina由来の公知のGPATホモログの配列を比較した。MaGPAT3のCDS配列は、GPAT1（ATCC#16266）と73.7％、GPAT1（1S-4）と73.2％の同一性を示した。また、MaGPAT3タンパク質のアミノ酸配列は、GPAT1（ATCC#16266）と82.9％、GPAT1(1S-4) と83.7％の同一性を示した（図3）。なお、MaGPAT3タンパク質のアミノ酸配列は、GPAT2（1S-4）のアミノ酸配列とは、14.4％の同一性を示した。【００６１】
MaGPAT3の推定アミノ酸配列（配列番号2）をGENEBANK nrに登録されているアミノ酸配列に対してBLASTpにて相同性解析を行った。その結果、この配列に対して最もE-valueの低かったアミノ酸配列、すなわち同一性の高かったアミノ酸配列は、担子菌Cryptococcus neoformans var. neoformans JEC21由来のGPATホモログ（GENEBANK accession No.XP_569487）であり、そのアミノ酸配列の同一性は40.3％であった。また、MaGPAT3の推定アミノ酸配列は、酵母S. cerevisiae由来のGPATであるSct1pのアミノ酸配列とは33.3％、Gpt2pのアミノ酸配列とは31.5％の同一性を示した。M.alpina 1S-4株由来のGPAT3及びGPAT1、並びにS．cerevisiae由来のGPATであるSct1とGpt2のアミノ酸配列を比較した（図4）。GPATホモログで保存されている4つのドメインとそのドメイン中の、GPAT活性に重要であると考えられるアミノ酸残基（図4の＊印）及びグリセロール-3-リン酸との結合に重要なアミノ酸残基（図4の＋印）は、GPAT3においても保存されていた。【００６２】
[実施例2]酵母S.cerevisiae（Δsct1、Δgpt2）の相補実験
酵母S.cerevisiaeでは、GPAT活性を担う遺伝子としてSCT1とGPT2が知られており、これらを同時に欠失させると致死であることが知られている。M.alpina由来のMaGPAT1、MaGPAT3にコードされるタンパク質がGPAT活性を有するかどうかを確認するため、Δsct1、Δgpt2の相補実験をおこなった。表1に、本実験で作製した株の遺伝子型をまとめた。【００６３】
【表１】
2011034199.tif 000002
【００６４】
GP-1株の作製
yeast knock out strain collection（Open Biosystems）のΔgpt2ホモ接合2倍体酵母（カタログNo.YSC1021-663938）のSCT1遺伝子を以下の方法で破壊した。最初に、S.cerevisiae S288C株の菌体から、Genとるくん（酵母用）（TAKARA BIO）を用いてDNAを抽出した。これを鋳型として、プライマーXba1-Des-SCT1-F：5’-TCTAGAATGCCTGCACCAAAACTCAC-3（配列番号8）とプライマーXba1-Des-SCT1-R：5’-TCTAGACCACAAGGTGATCAGGAAGA-3’（配列番号9）を用いて、KOD-Plus（TOYOBO）によってSCT1遺伝子の部分配列をPCR増幅した。増幅された約1.3kbpのDNA断片を、Zero Blunt TOPO PCRクローニングキット（Invitrogen）を用いてクローン化し、得られたプラスミドをpCR-SCT1Pとした。続いて、プラスミドYEp13を制限酵素SalI及びXhoIで消化して得られたLEU2遺伝子のCDSを含む約2.2kbpのDNA断片と、プラスミドpCR-SCT1PをSalIで消化して得られた約4.4kbpのDNA断片を、ligation high（TOYOBO）を用いて連結し、SCT1遺伝子に対してLEU2遺伝子が逆方向に挿入されたプラスミドを作製し、このプラスミドをpCR-Δsct1：LEU2とした。pCR-Δsct1：LEU2を制限酵素XbaIで消化し、上記Δgpt2ホモ接合2倍体酵母を酢酸リチウム法により形質転換して、SD-Leu（1Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)6．7g、グルコース20g、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩1．25g、アルギニン0．6g、アスパラギン酸3g、グルタミン酸3g、ヒスチジン0．6g、リジン0．9g、メチオニン0．6g、フェニルアラニン1．5g、セリン11．25g、チロシン0．9g、バリン4．5g、スレオニン6g、トリプトファン1．2g、ウラシル0.6gを混合したもの）1．3g））寒天培地（2％アガー）で生育できるものを形質転換体として選抜した。得られた形質転換株の菌体から上述の方法でDNAを抽出した。（1）プライマーSCT1outORF−F：5’-AGTGTAGGAAGCCCGGAATT-3（配列番号10）及びプライマーSCT1inORF−R：5’-GCGTAGATCCAACAGACTAC-3’（配列番号11）の組み合わせ（0.5kbp）、及び （2）プライマーSCT1outORF−F1とプライマーLEU2 in ORF-F: 5’-TTGCCTCTTCCAAGAGCACA-3’(配列番号12)の組み合わせ（1.2kbp）を用いてPCR増幅を行うことで遺伝子型、すなわち、SCT1/Δsct1：LEU2であることを確認し、この遺伝子型を有する形質転換酵母細胞をGP-1株とした。【００６５】
MaGPAT1-D株とMaGPAT3-D株の作製
M.alpinaのGPAT遺伝子であるMaGPAT1及びMaGPAT3を、酵母の染色体上に挿入するために、プラスミドpUC-URA3-MAGPAT1と、プラスミドpUC-URA3-MAGPAT3を以下のように作製した。【００６６】
プラスミドpUC-URA3-MAGPAT1
プラスミドpUC18マルチクローニングサイトをHindIIIサイトのみを含むようにに改変し、そのHindIIIサイトに、pURA34（WO0131000）をHindIIIで消化して得られた約1.2kbpのDNA断片を挿入し、プラスミドpUC-URA3を作製した。pYE-MAGPAT1（WO2008156026）を制限酵素HindIIIで消化した後に、Blunting  Kit（TAKARA BIO）を用いて末端部分を平滑化して得られた約3.5kbpのDNA断片を、プラスミドpUC-URA3のSmaIサイトに挿入し、GPAT1遺伝子とURA3遺伝子が同じ向きに挿入されたプラスミドを作製し、このプラスミドをpUC-URA3-MAGPAT1とした。【００６７】
プラスミドpUC-URA3-MAGPAT3
プラスミドpCR-MAGPAT3を制限酵素EcoRIとSalIで消化して得られた約2.3kbpのDNA断片を、酵母発現用ベクターpYE22m（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）のEcoRI、SalIサイトに挿入し、プラスミドpYE−MAGPAT3を構築した。続いて、プラスミドpYE−MAGPAT3を制限酵素HindIIIで消化した後に、Blunting  Kit（TAKARA BIO）を用いて末端部分を平滑化して得られた約3.6kbpのDNA断片を、プラスミドpUC-URA3のSmaIサイトに挿入し、GPAT3遺伝子とURA3遺伝子が同じ向きに挿入されたプラスミドを作製し、このプラスミドをpUC-URA3-MAGPAT3とした。【００６８】
それぞれ制限酵素HindIIIで消化したプラスミドpUC-URA3-MAGPAT1及びプラスミドpUC-URA3-MAGPAT3で、上述のGP-1株を酢酸リチウム法により形質転換し、SD-Ura（1Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)6．7g、グルコース20g、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩1．25g、アルギニン0．6g、アスパラギン酸3g、グルタミン酸3g、ヒスチジン0．6g、リジン0．9g、メチオニン0．6g、フェニルアラニン1．5g、セリン11．25g、チロシン0．9g、バリン4．5g、スレオニン6g、トリプトファン1．2g、ロイシン1.8gを混合したもの）1．3g））寒天培地（2％アガー）で生育できるクローンを形質転換体として選抜した。得られた株のうち、任意の株からGenとるくん（酵母用）を使ってDNAを抽出した。URA3-MAGPAT1を導入した株については、（3）プライマーGPAT1-f1：5’-GTCAAGAAGGAATTCAAGGAGCTCAAG-3’（配列番号13）及びプライマーGPAT1-r2：5’-CCTGGGATGATGGACAAGAACAATG-3’（配列番号14）の組み合わせ（1.1kbp）を用いてゲノムDNAをPCR増幅し、URA3-MAGPAT3を導入した株は、（4）プライマーMaGPAT3-2F：5’-TTTTGAACGCTTAAATGCTGGC-3’（配列番号15）及びプライマーMaGPAT3-3R：5’-GGTCTTTTGAAGCTCTGCACGCGAC-3’（配列番号16）の組み合わせ（1.1kbp）を用いてゲノムDNAをPCR増幅した。MaGPAT1の発現カセット又はMaGPAT3の発現カセットのゲノムへの挿入が確認できた株をそれぞれMaGPAT1-D株又はMaGPAT3-D株とした。【００６９】
胞子形成と四分子分析
MaGPAT1-D株とMaGPAT3-D株をそれぞれYPD寒天培地に塗布し、30℃で2日間培養した。生育した菌体を、胞子形成用寒天培地（0.5％酢酸カリウム、2％アガー）に塗布し、25℃で4日間培養した。得られた菌体を適当量掻きとって、100μlのザイモリアーゼ溶液（0.125mg/ml  ザイモリアーゼ100T、1M  ソルビトール、40mM  リン酸カリウムバッファー（pH6.8））に懸濁し、室温で30分間インキュベートした後に、ザイモリアーゼ溶液及び菌体を含むチューブを氷中に移した。顕微鏡下で、子嚢胞子が形成されていることを確認した後、YPD寒天培地上でマイクロマニピュレーションにより4個の子嚢胞子を分離し、30℃で2日間インキュベートし、それぞれの胞子に由来するコロニーを得た。得られた胞子クローンを、SD−Ura寒天培地、SD−Leu寒天培地にレプリカし、30℃で3日間インキュベートして、ウラシル要求性とロイシン要求性を調べた。各プレートでの生育の可否とクローン数を表2に示す。【００７０】
【表２】
2011034199.tif 000003
【００７１】
どちらの株由来の胞子クローンにおいても、ウラシル非要求性かつロイシン非要求性の株：ウラシル非要求性かつロイシン要求性の株：ウラシル要求性かつロイシン要求性の株の比率はおよそ1：1：1であった。また、ウラシル要求性かつロイシン非要求性の株は得られなかった。続いて、MaGPAT1-D株とMaGPAT3-D株それぞれから得られたウラシル非要求性かつロイシン非要求性の株と、ウラシル要求性かつロイシン要求性の株の遺伝子型を調べるために、上記と同様に菌体からDNAを抽出し、（1）プライマーSCT1outORF−F及びプライマーSCT1inORF−Rの組み合わせ、（2）プライマーSCT1outORF−F1及びプライマーLEU2in ORF-Fの組み合わせ、及びMaGPAT1-D株由来の株は、（3）プライマーGPAT1-f1及びプライマーGPAT1-r2の組み合わせ、MaGPAT3-D株由来の株は、（4）プライマーMaGPAT3-2F及びプライマーMaGPAT3-3Rの組み合わせでPCRを行った。【００７２】
ウラシル非要求性かつロイシン非要求性の株では、（1）の組み合わせではPCRによる増幅がみられず、（2）の組み合わせでは増幅がみられたことから、これらの株はΔsct1：LEU2であることが示された。また、それぞれ（3）又は（4）の組み合わせでも増幅がみられたことから、これらの株はMaGPAT1又はMaGPAT3が挿入されていることが示された。【００７３】
上述の結果より、S．cerevisiaeにおいてΔgpt2、Δsct1株は致死であるが、M．alpina由来のMaGPAT1又はMaGPAT3を発現させることで生育可能となることが明らかになった。すなわち、M．alpina由来のMaGPAT1又はMaGPAT3は、酵母のΔgpt2、Δsct1を相補できた。このことから、M．alpina由来のMaGPAT1及びMaGPAT3にコードされるタンパク質は、GPAT活性を有することが示唆された。【００７４】
一方、ウラシル要求性かつロイシン要求性の株では、（1）ではPCRによる増幅がみられ、（2）では増幅がみられなかったことから、これらの株はSCT1であることが示された。また（3）又は（4）では増幅がみられなかったことから、M.alpina由来のMaGPAT1又はMaGPAT3は挿入されていないことが示された。【００７５】
さらに、これらの株をSD-Met（1Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)6.7g、グルコース20g、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩1.25g、アルギニン0.6g、アスパラギン酸3g、グルタミン酸3g、ヒスチジン0.6g、リジン0.9g、フェニルアラニン1.5g、セリン11.25g、チロシン0.9g、バリン4.5g、スレオニン6g、トリプトファン1.2g、ロイシン1.8g、ウラシル0.6gを混合したもの）1.3g）寒天培地（2％アガー）とSD-Lys（1Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)6.7g、グルコース20g、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩1.25g、アルギニン0.6g、アスパラギン酸3g、グルタミン酸3g、ヒスチジン0.6g、メチオニン0.6g、フェニルアラニン1.5g、セリン11.25g、チロシン0.9g、バリン4.5g、スレオニン6g、トリプトファン1.2g、ロイシン1.8g、ウラシル0.6gを混合したもの）1.3g）寒天培地（2％アガー）にレプリカし、30℃で3日間インキュベートして、メチオニン要求性とリジン要求性を調べた。その結果に基づき、表１に示した各遺伝子型の株のうち、GP-11（＃SC-1）、MaGPAT1-11（＃3b、＃4a、＃8a）、MaGPAT3-11（＃2d、＃19a、＃32a）、GP-21、（＃SC-2）、MaGPAT1-21（＃1a、＃2d、＃13a）、MaGPAT3-21（＃10a、＃20c、＃26b）を、以下の実験に供した。【００７６】
GPAT遺伝子として、酵母由来のSCT1のみを持つ株、M.alpina由来のGPAT1のみを持つ株、M.alpina由来のGPAT3のみを持つ株の脂肪酸生産性を比較した。上述の四分子分析で得られた酵母由来のSCT1のみを持つ株であるGP-11及びGP-21は、ともにura3, leu2であるため、ウラシルとロイシンを要求する。そこで、ウラシルとロイシンの要求性を相補するために、GP-11及びGP-21をそれぞれ、プラスミドpESC-URA3とプラスミドpESC-LEU2で同時に形質転換し、SD-Ura、Leu（1Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids（DIFCO）6.7g、グルコース20g、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩1.25g、アルギニン0.6g、アスパラギン酸3g、グルタミン酸3g、ヒスチジン0.6g、リジン0.9g、メチオニン0.6g、フェニルアラニン1.5g、セリン11.25g、チロシン0.9g、バリン4.5g、スレオニン6g、トリプトファン1.2gを混合したもの）1.3g））寒天培地（2％アガー）で生育できる株を形質転換体として選抜し、選抜された任意の株GP-12（＃1、2、3）及びGP-22（＃1、＃2、＃3）を以下の実験に供した。【００７７】
[実施例3]酵母の脂肪酸分析
上述のようにして得られた株、GP-12（＃1、2、3）、MaGPAT1-11（＃3b、＃4a、＃8a）、MaGPAT3-11（＃2d、＃19a、＃32a）、GP-22（＃1、＃2、＃3）、MaGPAT1-21（＃1a、＃2d、＃13a）、MaGPAT3-21（＃10a、＃20c、＃26b）を以下のように培養した。
SD-Ura、Leu液体培地10mlに各株を1白金耳植菌し、30℃で1日間振とう培養した。得られた培養液100μlを、SD-Ura、Leu液体培地10mlに植菌し、30℃で2日間振とう培養した。酵母の培養液を遠心分離することにより、菌体を回収した。菌体を10mlの滅菌水で洗浄し、再度遠心分離を行って菌体を回収し、凍結乾燥した。塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去して、ガスクロマトグラフィーにより分析を行った。脂肪酸組成分析の結果を表3〜8に示す。【００７８】
表3は、met15,lys2酵母の菌体脂肪酸組成（％）を示す。数値は、平均±標準偏差（SD）で表す。
【表３】
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【００７９】
表4は、met15,lys2酵母の培養後の菌体濃度を示す。数値は、平均±SDで表す。
【表４】
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【００８０】
表5は、met15,lys2酵母の脂肪酸生産量を示す。数値は、平均±SDで表す。
【表５】
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【００８１】
表6は、MET15,LYS2酵母の菌体脂肪酸組成（％）を示す。数値は、平均±SDで表す。
【表６】
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【００８２】
表7は、MET15,LYS2酵母の培養後の菌体濃度を示す。数値は、平均±SDで表す。
【表７】
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【００８３】
表8は、MET15,LYS2酵母の脂肪酸生産量を示す。数値は、平均±SDで表す。
【表８】
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【００８４】
各菌体において、菌体濃度は、栄養要求性に依存していた。MET15,LYS2酵母の菌体濃度は、met15,lys2酵母の菌体濃度と比べて5倍程高かったが、その脂肪酸組成に対するGPAT遺伝子の影響は認められなかった（表3及び6）。また、MET15,LYS2酵母の場合、脂肪酸生産性についても、GPAT遺伝子の違いによる顕著な差が認められなかった。【００８５】
一方、met15,lys2酵母の場合、脂肪酸の生産量は、GPAT遺伝子としてSCT1のみを持つGP-12株と比べて、M.alpina由来のGPAT遺伝子を持つMaGPAT1-11株では、約1.5倍、MaGPAT3-11株では、約2.2倍多いものであった。さらに、MaGPAT3-11株はMaGPAT1-11株に比べて、約1.4倍も脂肪酸生産量が多かった。met15,lys2酵母はMET15,LYS2酵母に比べて増殖は抑えられるが、M.alpina由来のGPAT1遺伝子やGPAT3遺伝子を発現させることにより、脂肪酸の生産性が顕著に向上することが判明した（表4及び5）。脂肪酸組成を比較すると、GP-12株やMaGPAT1-11株に比べてMaGPAT3-11株では、飽和脂肪酸であるパルミチン酸（16：0）やステアリン酸（18：0）の比率が上昇していた（表3）。【００８６】
[実施例4]酵母の脂質分析
脂肪酸生産量に差のあったmet15,lys2酵母であるGP-12（＃1、2、3）、MaGPAT1-11（＃3b、＃4a、＃8a）、MaGPAT3-11（＃2d、＃19a、＃32a）で、各脂質の量や脂肪酸組成を調べた。
SD-Ura、Leu液体培地  10mlに各株を1白金耳植菌し、30℃で1日間振とう培養した。得られた培養液1mlを、SD-Ura、Leu液体培地  10 mlに、各株2本ずつ植菌し、30℃で1日間振とう培養した。酵母の培養液を遠心分離することにより、菌体を回収した。10 mlの滅菌水で洗浄し、遠心分離により再び菌体を回収し、凍結乾燥した。各株1本ずつを塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去して、ガスクロマトグラフィーにより分析を行った。
また、各株1本ずつから以下の通り、脂質を抽出した。すなわち、1 mlのクロロホルム：メタノール（2：1）とガラスビーズを加え、ビーズビーターにて菌体を破砕したあと、遠心分離して上清を回収した。残った菌体にさらに1 mlのクロロホルム：メタノール（2：1）を加え、同様にして、上清を回収することを繰り返し、総量4 mlのクロロホルム：メタノール（2：1）で脂質を回収した。スピードバックを使って、溶媒を留去し、残渣を少量のクロロホルムに溶かした。シリカゲル60プレート（Merck）、展開溶媒ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸70：30：1の条件で薄層クロマトグラフィーを行い、脂質を分画した。プリムリン溶液を噴霧し、紫外線を照射することにより脂質を検出した。トリグリセリド画分とリン脂質画分をそれぞれかきとって試験管に集め、塩酸メタノール法により脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにより、脂肪酸分析を行った。
結果を以下の表に示す。【００８７】
【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【００８８】
菌体濃度は、GPAT遺伝子により、影響を受けなかった。培地あたりの脂肪酸生産量は、GPAT遺伝子としてSCT1のみを持つGP-12株と比べて、モルティエレラ  アルピナ由来のGPAT遺伝子を持つMaGPAT1-11株で約1.5倍、MaGPAT3-11株で約2倍であった。
リン脂質の脂肪酸量と脂肪酸組成は、GPAT遺伝子により、影響を受けなかった。一方、トリグリセリドの量は、GPAT遺伝子としてSCT1のみを持つGP-12株と比べて、モルティエレラ  アルピナ由来のGPAT遺伝子を持つMaGPAT1-11株で約1.6倍、MaGPAT3-11株で約2倍であった。
総脂肪酸の生産量が、MaGPAT1-11株やMaGPAT3-11株で増加しているのは、主に、トリグリセリドの生産量が増加しているためであることが判明した。また、トリグリセリド中の脂肪酸組成を比較すると、MaGPAT3-11株では、GP-12株と比べて、飽和脂肪酸の比率が高まっていた。
MaGPAT3遺伝子を発現させることで、特にトリグリセリドの生産性を向上させることができることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内で発現させることにより、宿主細胞の増殖率に関わらず、効率良くトリグリセリドを生成させることができる。また、トリグリセリドの増加によって、トリグリセリドを構成する脂肪酸も増加する。本発明によって宿主細胞内で生成されるトリグリセリドや脂肪酸は、食品、化粧料、医薬、石鹸等の製造に利用することができる。
【図２−１】
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【図２−２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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