【手続補正書】
【提出日】令和2年10月30日(2020.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の修飾された形態をコードするポリヌクレオチドであって、コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基３２および３３で修飾されており、さらにアミノ酸残基２５および２６で修飾されていてもよく；
アミノ酸残基３２、３３、２５および２６が、配列番号２のポリヌクレオチド配列のアミノ酸残基３２、３３、２５および２６に対応し；
各改変アミノ酸残基は、グリシン、セリン、およびグルタミン酸からなる群より選ばれるアミノ酸に独立して修飾されており、および
修飾されたチミジンキナーゼが野生型のチミジンキナーゼと比較して増大した細胞死滅活性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
コードされる改変されたＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基１６７で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に修飾されている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫのアミノ酸残基１６７が、ヒスチジン、リシン、システイン、セリンまたはフェニルアラニンに修飾されている、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基１６８で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に改変されている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫのアミノ酸残基１６８が、ヒスチジン、リシン、システイン、セリンまたはフェニルアラニンに修飾されている、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫ配列が、核外輸送シグナル配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
核外輸送シグナル配列が、コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫ配列の５’末端にまたはその付近に挿入される、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
核外輸送シグナル配列が、ＬＱＫＫＬＥＥＬＥＬＤＧ（配列番号２４）である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫが、核領域に排他的に局在しない、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫが、野生型ＨＳＶ−ＴＫと比較して、低下した量のチミジンキナーゼ活性を示す、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫの活性が、野生型ＨＳＶ−ＴＫのチミジンキナーゼ活性と比較して、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍または５０倍低下する、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫの活性が、１．５％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％低下する、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２、３３および１６８での修飾を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫが、変異Ｒ２５Ｇ、Ｒ２６Ｓ、Ｒ３２Ｇ、Ｒ３３ＳおよびＡ１６８Ｈを含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号１６〜２２のいずれか１つとして示される核酸配列を含む、請求項１に記載の修飾されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
ＨＳＶ−ＴＫ１６８ｄｍＮＥＳ（配列番号１８）を含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
修飾されたＨＳＶ−ＴＫポリペプチドをコードする請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクター。
【請求項１８】
第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記第２のポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、請求項１７に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１９】
治療用ポリペプチドが、自殺遺伝子または成長因子である、請求項１８に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２０】
成長因子が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βおよび線維芽細胞成長因子からなる群から選択される、請求項１９に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２１】
自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ、ＶＳＶ−ｔｋ、ＩＬ−２、ニトロレダクターゼ（ＮＲ）、カルボキシルエステラーゼ、β−グルクロニダーゼ、シトクロムｐ４５０、β−ガラクトシダーゼ、ジフテリア毒素Ａ−鎖（ＤＴ−Ａ）、カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）およびデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）からなる群から選択される、請求項１９に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２２】
ＰｉＴ−２またはＰｉＴ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１７に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２３】
ターゲッティングポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１７に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２４】
ターゲッティングポリペプチドが、細胞外タンパク質と結合する、請求項２３に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２５】
細胞外タンパク質が、コラーゲンである、請求項２４に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２６】
レトロウイルスベクターがレトロウイルスベクター粒子を形成する、がんの治療において使用するための、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２７】
静脈内に、筋肉内に、皮下に、動脈内に、肝動脈内に、髄腔内に、腹膜内におよび／または腫瘍内に投与される、請求項２６に記載のレトロウイルスベクター粒子。
【請求項２８】
レトロウイルス粒子が、腫瘍内にまたは静脈内に投与される、請求項２６に記載のレトロウイルスベクター粒子。
【請求項２９】
レトロウイルスベクター粒子が、動脈内に投与される、請求項２６に記載のレトロウイルスベクター粒子。
【請求項３０】
少なくとも１×１０15ＴＶＰのレトロウイルスベクター粒子が、それを必要とする対象に累積的に投与される、請求項２６に記載のレトロウイルスベクター粒子。
【請求項３１】
少なくとも１×１０9ＴＶＰのレトロウイルスベクター粒子が、それを必要とする対象に一度に投与される、請求項２６に記載のレトロウイルスベクター粒子。
【請求項３２】
レトロウイルスベクター粒子がヌクレオシドプロドラッグの投与と組み合わせて投与される、請求項２６に記載のレトロウイルスベクター粒子。
【請求項３３】
プロドラッグが、レトロウイルスベクター粒子の投与後、１〜２日の間投与される、請求項３２に記載のレトロウイルスベクター粒子。
【請求項３４】
プロドラッグが、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビルからなる群から選択される、請求項３２に記載のレトロウイルスベクター粒子。
【請求項３５】
プロドラッグが、ガンシクロビルである、請求項３２に記載のレトロウイルスベクター粒子。
【請求項３６】
動物又はヒトにおける新生物細胞を死滅させる方法に使用するための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであって、方法が：
ａ）新生物細胞に、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を導入すること、
ｂ）請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列にコードされたヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の修飾された形態を発現させること、
ｃ）細胞を、チミジンキナーゼによって細胞傷害性薬剤に変換される薬剤と接触させること
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
配列番号１６〜２２のいずれか１つの核酸配列を含む、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の突然変異した形態をコードするポリヌクレオチド配列であって、コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２、３３、１６７、１６８またはそれらの組合せで突然変異しており、ポリヌクレオチド配列が、配列番号３のポリヌクレオチド配列と比較して突然変異している、ポリヌクレオチド配列。一実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基１６７、１６８またはそれらの組合せで、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している。別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基１６７で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している。なお別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基１６８で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している。さらに別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基１６７および１６８の両方で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している。
本明細書の記載は以下の発明の開示を包含する。
［１］ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の突然変異した形態をコードするポリヌクレオチド配列であって、コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２、３３、１６７、１６８またはそれらの組合せで突然変異しており、ポリヌクレオチド配列が、配列番号３のポリヌクレオチド配列と比較して突然変異している、ポリヌクレオチド配列。
［２］コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基１６７、１６８またはそれらの組合せで、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している、［１］に記載のポリヌクレオチド。
［３］コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基１６７で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している、［１］または[２］に記載のポリヌクレオチド。
［４］コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基１６８で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している、［１］または[２］に記載のポリヌクレオチド。
［５］コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基１６７および１６８の両方で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している、［１］または［２］に記載のポリヌクレオチド。
［６］コードされるＨＳＶ−ＴＫのアミノ酸残基１６７が、セリンまたはフェニルアラニンに突然変異している、［１］または［２］に記載のポリヌクレオチド配列。
［７］コードされるＨＳＶ−ＴＫのアミノ酸残基１６８が、ヒスチジン、リシン、システイン、セリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸に突然変異している、［１］または［２］に記載のポリヌクレオチド配列。
［８］コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸２５および２６で突然変異している、［１］に記載のポリヌクレオチド。
［９］アミノ酸残基２５および２６が、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異している、［８］に記載のポリヌクレオチド。
［１０］コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基３２および３３で突然変異している、［１］に記載のポリヌクレオチド。
［１１］アミノ酸残基３２および３３が、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異している、［１０］に記載のポリヌクレオチド。
［１２］コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２および３３で突然変異している、［１］に記載のポリヌクレオチド。
［１３］アミノ酸残基２５、２６、３２および３３が、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異している、［１２］に記載のポリヌクレオチド。
［１４］コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２および３３からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異ならびにアミノ酸残基１６７および１６８からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む、［１］に記載のポリヌクレオチド。
［１５］コードされるＨＳＶ−ＴＫ配列が、核外輸送シグナルをさらに含む、［１］に記載のポリヌクレオチド。
［１６］核外輸送シグナル配列が、ＨＳＶ−ＴＫ配列の５'末端にまたはその付近に挿入される、［１５］に記載のポリヌクレオチド。
［１７］核外輸送シグナル配列が、ＬＱＫＫＬＥＥＬＥＬＤＧ（配列番号２４）である、［１５］に記載のポリヌクレオチド。
［１８］コードされる突然変異体ＨＳＶ−ＴＫが、核領域に排他的に局在しない、［１］から［１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
［１９］コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫが、野生型ＨＳＶ−ＴＫと比較して、低下した量のチミジンキナーゼ活性を示す、［１］から［１８］のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列。
［２０］コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫの活性が、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍または約５０倍低下する、［１９］に記載のポリヌクレオチド配列。
［２１］コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫの活性が、約１．５％、約２％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約１００％低下する、［１９］に記載のポリヌクレオチド配列。
［２２］コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２、３３および１６８での突然変異を含む、［１］に記載のポリヌクレオチド配列。
［２３］コードされるＨＳＶ−ＴＫが、突然変異Ｒ２５Ｇ、Ｒ２６Ｓ、Ｒ３２Ｇ、Ｒ３３ＳおよびＡ１６８Ｈを含む、［２２］に記載のポリヌクレオチド配列。
［２４］配列番号１２〜２２のいずれか１種として示される核酸配列を含む、［１］から［２３］のいずれかに記載の修飾されたポリヌクレオチド配列。
［２５］配列番号１６〜２２のいずれか１種として示される核酸配列を含む、［１］から［２４］のいずれかに記載の修飾されたポリヌクレオチド配列。
［２６］ＨＳＶ−ＴＫ１６８ｄｍＮＥＳ（配列番号１８）を含む、［１］から［２５］に記載のポリヌクレオチド配列。
［２７］修飾されたＨＳＶ−ＴＫポリペプチドをコードする［１］から［２６］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクター。
［２８］第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記第２のポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、［２７］に記載のレトロウイルスベクター。
［２９］第２の治療用ポリペプチドが、第２の自殺遺伝子または成長因子である、［２８］に記載のレトロウイルスベクター。
［３０］成長因子が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βおよび線維芽細胞成長因子からなる群から選択される、［２９］に記載のレトロウイルスベクター。
［３１］第２の自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ、ＶＳＶ−ｔｋ、ＩＬ−２、ニトロレダクターゼ（ＮＲ）、カルボキシルエステラーゼ、β−グルクロニダーゼ、シトクロムｐ４５０、β−ガラクトシダーゼ、ジフテリア毒素Ａ−鎖（ＤＴ−Ａ）、カルボキシペプチドＧ２（ＣＰＧ２）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）およびデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）からなる群から選択される、［２９］に記載のレトロウイルスベクター。
［３２］ＰｉＴ−２またはＰｉＴ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、［２７］に記載のレトロウイルスベクター。
［３３］ターゲッティングポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、［２７］に記載のレトロウイルスベクター。
［３４］ターゲッティングポリペプチドが、細胞外タンパク質と結合する、［３３］に記載のレトロウイルスベクター。
［３５］細胞外タンパク質が、コラーゲンである、［３４］に記載のレトロウイルスベクター。
［３６］それを必要とする対象に、［２７］から［３５］に記載のレトロウイルスベクターを含む治療有効量のレトロウイルス粒子を投与し、その後、ヌクレオシドプロドラッグを投与することを含む、それを必要とする対象において新生物細胞を死滅させる方法。
［３７］レトロウイルス粒子が、静脈内に、筋肉内に、皮下に、動脈内に、肝動脈内に、髄腔内に、腹膜内におよび／または腫瘍内に投与される、［３６］に記載の方法。
［３８］レトロウイルス粒子が、腫瘍内にまたは静脈内に投与される、［３６］に記載の方法。
［３９］レトロウイルスベクター粒子が、動脈内に投与される、［３６］に記載の方法。
［４０］少なくとも１×１０15ＴＶＰのレトロウイルスベクターが、それを必要とする対象に累積的に投与される、［３６］に記載の方法。
［４１］少なくとも１×１０9ＴＶＰのレトロウイルスベクターが、それを必要とする対象に一度に投与される、［３６］に記載の方法。
［４２］プロドラッグが、レトロウイルスベクター粒子の投与後、約１〜２日の間投与される、［３６］に記載の方法。
［４３］プロドラッグが、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビルからなる群から選択される、［３６］に記載の方法。
［４４］プロドラッグが、ガンシクロビルである、［３６］に記載の方法。
［４５］それを必要とする患者に、治療有効量の［２７］から［３５］に記載のレトロウイルスベクター粒子を送達し、その後、ヌクレオシドプロドラッグを投与することを含む、それを必要とする患者において癌を治療する方法。
［４６］レトロウイルス粒子が、静脈内に、筋肉内に、皮下に、動脈内に、肝動脈内に、髄腔内に、腹膜内におよび／または腫瘍内に投与される、［４０］に記載の方法。
［４７］レトロウイルス粒子が、腫瘍内にまたは静脈内に投与される、［４０］に記載の方法。
［４８］レトロウイルスベクター粒子が、動脈内に投与される、［４０］に記載の方法。
［４９］少なくとも１×１０15ＴＶＰのレトロウイルスベクターが、それを必要とする対象に累積的に投与される、［４０］に記載の方法。
［５０］少なくとも１×１０9ＴＶＰのレトロウイルスベクターが、それを必要とする対象に一度に投与される、［４０］に記載の方法。
［５１］プロドラッグが、レトロウイルスベクター粒子の投与後、約１〜２日の間投与される、［４０］に記載の方法。
［５２］プロドラッグが、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビルからなる群から選択される、［４０］に記載の方法。
［５３］プロドラッグが、ガンシクロビルである、［４０］に記載の方法。
［５４］ギャップ結合依存性細胞内情報伝達（ＧＪＩＣ）を増大する処理とともに、対象に治療有効量の、ＨＳＶ−ＴＫを含むレトロウイルスベクター粒子を送達することを含む、対象における新生物細胞のＨＳＶ−ＴＫガンシクロビル、バルガンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル媒介性死滅を増大する方法。
［５５］レトロウイルスベクター粒子が、［２７］から［３５］に記載のレトロウイルスベクターを含む、［５４］に記載の方法。
［５６］ＧＪＩＣを増大する処理が、少なくとも１種のギャップ結合サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を送達することを含む、［５４］に記載の方法。
［５７］ギャップ結合サブユニットが、コネキシン４３、コネキシン３０またはコネキシン２６である、［５６］に記載の方法。
［５８］ギャップ結合サブユニットが、翻訳後修飾を防ぐよう修飾されたギャップ結合サブユニットである、［５６］に記載の方法。
［５９］ＧＪＩＣを増大する処理が、Ｅ−カドヘリンをコードするポリヌクレオチド配列を送達することを含む、［５４］に記載の方法。
［６０］ＧＪＩＣを増大する処理が、対象に、ゲムシタビン、ｃＡＭＰ、レチノイン酸、カロテノイド、グルココルチコイド、フラバノイド、アピゲニンまたはロバスタチンからなる群からの化合物を送達することを含む、［５４］に記載の方法。
［６１］ＧＪＩＣを増大する処理が、プロテアソーム阻害を含む、［５４］に記載の方法。
［６２］プロテアソーム阻害が、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ（ＡＬＬＮ）および／またはクロロキンの投与を含む、［６１］に記載の方法。
［６３］ＧＪＩＣを増大する処理が、放射線処理を含む、［５４］に記載の方法。
［６４］ＧＪＩＣを増大する処理が、電気的処理を含む、［５４］に記載の方法。
［６５］レトロウイルス粒子が、ＴＫ１６８ｄｍＮＥＳ（配列番号１８）を含む、［５４］に記載の方法。
［６６］ａ）細胞に、［１］から［２６］のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を導入することと、
ｂ）細胞が、発現されるチミジンキナーゼまたはその変異体を発現するのを可能にするまたは開始させることと、
ｃ）細胞を、チミジンキナーゼによって細胞傷害性薬剤に変換される薬剤と接触させることと
を含む、細胞を死滅させる方法。
［６７］ＨＳＶ−ＴＫが、［１］から［２６］のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされる、［６６］に記載の方法。