(57)【要約】試験物質の細胞毒性を同定する方法及び対応するキットを開示する。この方法は、所定量の試験物質を、細胞培養用培地中に細胞を含有するベッセルに加えるステップを有する。その後、この細胞を所定時間インキュベートする。その後、この細胞及び細胞培養用培地に対して、生細胞に対して毒性を有さない試薬混合物を加える。好適実施例において、この試薬混合物は、溶媒、色素、電子伝達剤、２時間以上の半減期を有する細胞質酵素のための基質及びＮＡＤ＋を含有する。その後、上記の色素の還元状態の生成に関して、上記のベッセルの内容物を測定する。なお、上記の色素の還元状態の生成は、上記の試薬混合物中の基質に特異的な細胞質酵素により生じる。好適実施例において、上記の色素の還元状態の生成は、上記ベッセル内の死細胞から放出された乳酸デヒドロゲナーゼにより惹起される。上記のキットは、上述の方法を実行するために必要な成分を含有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験物質の細胞毒性を同定する方法であって：
（ａ）細胞培養用培地中に存在する生細胞を有するベッセルに、所定量の前記試験物質を前記細胞に曝露するステップ；
（ｂ）細胞培養用培地中の前記細胞を前記ステップ（ａ）から所定時間インキュベートするステップ；
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の前記細胞及び前記細胞培養用培地に対して、生細胞に対して毒性を有しない試薬混合物を加えるステップであって、該試薬混合物は、溶媒、酸化状態と還元状態とを有し前記還元状態は前記酸化状態と区別可能であり初期的に前記酸化状態として存在する色素、電子伝達剤、２時間以上の半減期を有する細胞質酵素用基質及び前記細胞質基質用補酵素を有する、ステップ；並びに
（ｄ）前記色素の前記還元状態の生成に関して、前記ステップ（ｃ）に由来した前記細胞培養用培地を測定するステップであって、前記色素の前記還元状態の前記生成は、前記ステップ（ｃ）で加えられた前記試薬混合物における前記基質に特異的な細胞質酵素により生じ、前記細胞質酵素は、前記ベッセルに含まれる死細胞から遊離され、これにより、前記試験物質により生じた細胞死が同定される、ステップ；
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｃ）において、前記色素の前記還元状態は、蛍光光度的に前記色素の前記酸化状態を区別可能であり、且つ
前記ステップ（ｄ）において、蛍光分光光度法にて前記色素の前記還元状態の生成に関して前記細胞培養用培地を測定する、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｃ）において、前記色素の前記還元状態は、分光光度的に前記色素の前記酸化状態と区別可能であり、且つ
前記ステップ（ｄ）において、可視分光法にて前記色素の前記還元状態の生成に関して前記細胞培養用培地を測定する、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｃ）において、前記色素は、レサズリン又は３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボニルメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（ｃ）において、前記電子伝達剤は、酵素であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（ｃ）において、前記電子伝達剤は、ジアホラーゼであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｃ）において、前記基質は乳酸であり、前記補酵素はＮＡＤ＋であり、且つ、
前記ステップ（ｄ）において、前記色素の前記還元状態の生成は、乳酸デヒドロゲナーゼにより生じる、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（ａ）において、前記ベッセルは、原核生物の生細胞を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（ａ）において、前記ベッセルは、真核生物の生細胞を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ａ）において、前記ベッセルは、培養された真核生物細胞の生細胞を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ａ）において、前記試験物質は、既知又は推定上の抗菌剤であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試験物質は、既知又は推定上の医薬剤又は治療剤であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ステップ（ｂ）において、前記細胞をインキュベートし、
前記ステップ（ｃ）において、前記試薬混合物を添加し、且つ
前記ステップ（ｄ）において、前記色素の前記還元状態の生成に関し前記細胞培養用培地を測定し、
且つ、これら全てを前記ステップ（ａ）の前記ベッセルで行う、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップ（ｄ）において、前記ステップ（ｃ）の前記細胞から前記細胞培養用培地を分離することなく、前記色素の前記還元状態の生成に関して、前記細胞培養用培地を測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ステップ（ｃ）において、前記溶媒は水性溶媒であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステップ（ｃ）において、前記溶媒は、緩衝状態の溶媒であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試薬混合物は、水性溶媒、乳酸、ＮＡＤ＋、ジアホラーゼ、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ及びレサズリンを有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記試薬混合物は：
約５０ｍＭ以上２５０ｍＭ以下の乳酸；
約０．１Ｕ／ｍＬ以上約１０Ｕ／ｍＬ以下のジアホラーゼ；
約０．５ｍＭ以上約１０ｍＭ以下のＮＡＤ＋；
約１ｍＭ以上約１０ｍＭ以下のＴｒｉｓ緩衝液：
約１０ｍＭ以上約１００ｍＭ以下のＨＥＰＥＳ；
約１ｍＭ以上約１００ｍＭ以下のＮａＣｌ；及び
約５０μＭ以上約５００μＭ以下のレサズリン；
を有することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試薬混合物は：
約１０９ｍＭの乳酸；
約３．３ｍＭのＮＡＤ＋；
約２．２Ｕ／ｍＬのジアホラーゼ；
約３．０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液；
約３０ｍＭのＨＥＰＥＳ；
約１０ｍＭのＮａＣｌ；及び
約３５０μＭのレサズリン；
を有することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記試薬混合物は、約７．０以上約８．０以下のｐＨであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記試薬混合物は、約７．２５以上約７．６０以下のｐＨであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステップ（ｃ）の後で前記ステップ（ｄ）の前に、前記ベッセルにストップ溶液を加えるステップをさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ストップ溶液は、石鹸又は界面活性剤を有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ストップ溶液は、ドデシル硫酸ナトリウムを有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ストップ溶液は、水酸化ナトリウムを有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップ（ｃ）において、前記試薬混合物は、３７℃にて細胞溶解又は細胞死を行った後、２時間以上の半減期を有する細胞質酵素のための基質を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップ（ｃ）において、前記試薬混合物は、３７℃にて細胞溶解又は細胞死を行った後、４時間以上の半減期を有する細胞質酵素のための基質を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップ（ｃ）において、前記試薬混合物は、３７℃にて細胞溶解又は細胞死を行った後、６時間以上の半減期を有する細胞質酵素のための基質を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（ｃ）において、前記試薬混合物は、３７℃にて細胞溶解又は細胞死を行った後、８時間以上の半減期を有する細胞質酵素のための基質を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
試験物質の細胞毒性を同定する方法であって：
（ａ）細胞培養用培地中に存在する生細胞を含有するベッセルに、所定量の前記試験物質を前記細胞に曝露するステップ；
（ｂ）細胞培養用培地中の前記細胞を前記ステップ（ａ）から所定時間インキュベートするステップ；
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の前記細胞及び前記細胞培養用培地に対して、生細胞に対して毒性を有しない試薬混合物を加えるステップであって、該試薬混合物は、水性溶媒、レサズリン、電子伝達剤、ＮＡＤ＋及び乳酸を有する、ステップ；
（ｄ）前記ベッセルから前記培地を除去することなくレゾルフィンの生成に関して、前記ステップ（ｃ）に由来した前記細胞培養用培地を測定するステップであって、前記のレゾルフィンの生成は、前記ベッセルに含有する死細胞から放出された乳酸デヒドロゲナーゼにより生じ、これにより、前記試験物質により生じる細胞死を同定する、ステップ；
を有することを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記ステップ（ｃ）において、前記電子伝達剤は、ジアホラーゼであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ステップ（ｃ）において、前記電子伝達剤は、Ｍｅｌｄｏｌａ’ｓ  Ｂｌｕｅであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ステップ（ａ）において、前記ベッセルは、原核生物の生細胞を有することを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ステップ（ａ）において、前記ベッセルは、真核生物の生細胞を有することを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ステップ（ａ）において、前記ベッセルは、培養された真核生物細胞の生細胞を有することを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ステップ（ａ）において、前記試験物質は、既知又は推定上の毒性化合物であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記試験物質は、既知又は推定上の医薬剤又は治療剤であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記ステップ（ｄ）において、前記のレゾルフィンの生成は、蛍光分光的に測定されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記ステップ（ｄ）において、前記のレゾルフィンの生成は、分光分光的に測定されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記試薬混合物は、水性溶媒、乳酸、ＮＡＤ＋、ジアホラーゼ、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ及びレサズリンを有することを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
前記試薬混合物は：
約５０ｍＭ以上２５０ｍＭ以下の乳酸；
約０．１Ｕ／ｍＬ以上約１０Ｕ／ｍＬ以下のジアホラーゼ；
約０．５ｍＭ以上約１０ｍＭ以下のＮＡＤ＋；
約１ｍＭ以上約１０ｍＭ以下のＴｒｉｓ緩衝液：
約１０ｍＭ以上約１００ｍＭ以下のＨＥＰＥＳ；
約１ｍＭ以上約１００ｍＭ以下のＮａＣｌ；及び
約５０μＭ以上約５００μＭ以下のレサズリン；
を有することを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
前記試薬混合物は：
約１０９ｍＭの乳酸；
約３．３ｍＭのＮＡＤ＋；
約２．２Ｕ／ｍＬのジアホラーゼ；
約３．０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液；
約３０ｍＭのＨＥＰＥＳ；
約１０ｍＭのＮａＣｌ；及び
約３５０μＭのレサズリン；
を有することを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
前記試薬混合物は、約７．０以上約８．０以下のｐＨであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項４４】
前記試薬混合物は、約７．２５以上約７．６０以下のｐＨであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
前記ステップ（ｃ）の後で前記ステップ（ｄ）の前に、前記ベッセルにストップ溶液を加えるステップをさらに有することを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項４６】
前記ストップ溶液は、石鹸又は界面活性剤を有することを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ストップ溶液は、ドデシル硫酸ナトリウムを有することを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ストップ溶液は、水酸化ナトリウムを有することを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
試験物質の細胞毒性を測定するキットであって：
第１容器に配置された色素であって、該色素は、酸化状態と還元状態とを有し、前記還元状態は、前記酸化状態と区別可能であり、且つ、前記酸化状態で存在する前記色素；
第２容器に配置された凍結乾燥基質混合物であって、該基質混合物は、電子伝達剤、２時間以上の半減期を有する細胞質酵素のための基質及び前記細胞質酵素用補酵素を有する、凍結乾燥基質混合物；並びに
当該キットの取扱説明書；
を組み合わせて有することを特徴とするキット。
【請求項５０】
前記色素は、水性緩衝溶液を有する前もって混合された使用の準備が整った試薬混合物中に含有されていることを特徴とする請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記色素の前記還元状態は、蛍光光度的に前記色素の前記酸化状態と区別可能であることを特徴とする請求項４９に記載のキット。
【請求項５２】
前記色素の前記還元状態は、分光光度的に前記色素の前記酸化状態と区別可能であることを特徴とする請求項４９に記載のキット。
【請求項５３】
前記色素は、レサズリン又は３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボニルメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、塩（ＭＴＳ）であることを特徴とする請求項４９に記載のキット。
【請求項５４】
前記電子伝達剤は、酵素であることを特徴とする請求項４９に記載のキット。
【請求項５５】
前記電子伝達剤は、ジアホラーゼであることを特徴とする請求項４９に記載のキット。
【請求項５６】
前記電子伝達剤は、Ｍｅｌｄｏｌａ’ｓ  Ｂｌｕｅであることを特徴とする請求項４９に記載のキット。
【請求項５７】
前記基質は、乳酸であり、前記補酵素はＮＡＤ＋であることを特徴とする請求項４９に記載のキット。
【請求項５８】
前記色素は、レサズリンであり、該レサズリンは、乳酸、ＮＡＤ＋、ジアホラーゼ、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ及びＮａＣｌと共に水性緩衝溶液を含有する前もって混合された使用の準備の整った試薬混合物中に含有されていることを特徴とする請求項４９に記載のキット。
【請求項５９】
前記試薬混合物は：
約５０ｍＭ以上２５０ｍＭ以下の乳酸；
約０．１Ｕ／ｍＬ以上約１０Ｕ／ｍＬ以下のジアホラーゼ；
約０．５ｍＭ以上約１０ｍＭ以下のＮＡＤ＋；
約１ｍＭ以上約１０ｍＭ以下のＴｒｉｓ緩衝液：
約１０ｍＭ以上約１００ｍＭ以下のＨＥＰＥＳ；
約１ｍＭ以上約１００ｍＭ以下のＮａＣｌ；及び
約５０μＭ以上約５００μＭ以下のレサズリン；
を有する水性緩衝溶液を含有することを特徴とする請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
前記試薬混合物は：
約１０９ｍＭの乳酸；
約３．３ｍＭのＮＡＤ＋；
約２．２Ｕ／ｍＬのジアホラーゼ；
約３．０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液；
約３０ｍＭのＨＥＰＥＳ；
約１０ｍＭのＮａＣｌ；及び
約３５０μＭのレサズリン；
を有する水性溶液を含有することを特徴とする請求項５８に記載のキット。
【請求項６１】
前記試薬混合物は、約７．０以上約８．０以下のｐＨであることを特徴とする請求項５８に記載のキット。
【請求項６２】
前記試薬混合物は、約７．２５以上約７．６０以下のｐＨであることを特徴とする請求項５８に記載のキット。
【請求項６３】
第３容器に配置されたストップ溶液をさらに有することを特徴とする請求項４９に記載のキット。
【請求項６４】
前記ストップ溶液は、石鹸又は界面活性剤を有することを特徴とする請求項６３に記載のキット。
【請求項６５】
前記ストップ溶液は、ドデシル硫酸ナトリウムを有することを特徴とする請求項６３に記載のキット。
【請求項６６】
前記ストップ溶液は、水酸化ナトリウムを有することを特徴とする請求項６３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（本発明の技術分野）
本発明は、所定の試験化合物又は所定の試験状態のセットにおける細胞毒性効果を同定するアッセイに関する。本発明の方法は、細胞培養用培地中において２時間以上の半減期を有する、死細胞からの細胞質成分の放出を測定する。上記の細胞質成分は、好ましくは、３７℃において４時間以上の半減期を有する。この細胞質成分は、指示色素の変換により測定される。測定されるべき好適な細胞質成分は、乳酸からピルビン酸への酸化を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）である。つまり、好適実施例において、ＬＤＨにて触媒される乳酸の酸化は、蛍光色素を生成するように、非蛍光物質のジアホラーゼの触媒による還元にリンクされている。また、本発明を実施するためのキットも本願において開示する。
【０００２】
（背景技術）
所定の試験物質への曝露に反応した細胞バイアビリティー又は細胞毒性を同定する方法は、製薬的及び環境的な試験、殺虫剤や除草剤における試験、薬物創製等へのキーとなっている。つまり、所定の細胞に曝露する際所定の化学物質が真の或いは可能性のあるリスクを示すかどうかを同定することは、この試験物質を曝露した後、信頼性が高く、精密で正確な細胞毒性及び／又はバイアビリティーを測定する方法を必要とする。
【０００３】
細胞のバイアビリティーを同定する一般的な方法は、トリパンブルーやプロピジウムヨーダイドなどの色素を生細胞の細胞膜が排除する能力を有するかどうかを基礎とする。生細胞は、かかる色素を排除し、染色されることはない。逆に、細胞膜のインテグリティーを消失した死細胞は、これら色素が細胞質へと進入可能であり、そこでは、この色素は、細胞内における種々の化合物又は細胞内小器官を染色する。
【０００４】
細胞膜のインテグリティーを欠除した非生存細胞は、周囲の培地に細胞質成分を漏出する。従って、周囲の培地におけるこれら細胞質成分の濃度をモニターすることにより細胞死を測定し得る。かかる一つの方法として述べられている文献には、Ｃｏｒｅｙらによる（１９９７）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．  ２０７：４３−５１がある。このアッセイにおいて、死細胞からのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）の放出は、ＡＴＰの生成とカップリングした放出されたＧ３ＰＤＨの活性により測定される。
【０００５】
細胞のバイアビリティー又は細胞死に関するその他の試験方法は、色素の一つの状態から別の状態への変換に依拠する。例えば、典型的な形式において、反応に先だって、色素は、第１の蛍光波長において吸収性を示す。この色素は、その後、第２（又は異なる）光波長において吸収性を示す産物に変換される。色素の一つの状態から他の状態への変換をモニターすることにより、細胞のバイアビリティー又は細胞死の程度を測定し得る。本技術分野において、この目的に関する適当な複数の色素が知られている。これら指示薬に最も汎用的に使用されるのは、テトラゾリウム塩などの電子受容色素である。本技術分野において知られているテトラゾリウム塩には、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール）−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）、ＸＴＴ（３’−｛１−（フェニルアミノ−カルボニル）−３，４−テトラゾリウム｝−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼン−スルフォン酸無水物ナトリウム）及びＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボニルメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、塩）が挙げられる。
【０００６】
Ｂｕｔｔｋｅら、（１９９３）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １５７：  ２３３−２４０には、ＭＴＳを用いた典型的な細胞のバイアビリティー及び細胞増殖アッセイについて述べる。Ｄｕｎｉｇａｎらは、以下の文献（１９９５，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １９：  ６４０−６４９）において顕著な代謝物の一つは、有機分子の複合酸化還元反応を介したエネルギーの生成である、と続けて述べている。これら反応の大部分は、水素供与体として、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を利用する。実用的な観点から、分光光度的に直接ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの濃度をモニターすることは理論上可能であるが、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの最大吸収（λｍａｘ２５９ｎｍにおいてε＝１６，９００）の近傍の光を吸収する複数の成分が存在するので、直接分光光度的に分析することは制限される。例えば、約２６０ｎｍには、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び多くのタンパクの吸収極大が存在する。
【０００７】
Ｂｕｔｔｋｅらは、ＭＴＳを用いて、生細胞、増殖細胞により生じる上記の還元を間接的に測定することについて述べており、このＭＴＳは、還元状態において、可視領域に吸収を有する。還元型であるＭＴＳのフォルマザンは、水溶性であって、４５０〜５８０ｎｍを中心とした広範な最大吸収を示す。Ｄｕｎｉｇａｎらが述べている実験は、完全に細胞フリーの条件で行っている。ストック溶液としてＭＴＳ及びＭＴＳ／フェナジンメタスフロネート（ＰＭＳ）溶液を調製し、このストック溶液の一部に酵素及び還元剤の種々の組み合わせを加え、経時的に分光光度を分析している。ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、マレイン酸、イソクエン酸、マレイン酸デヒドロゲナーゼ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼの種々の組み合わせを検討している。この文献の著者は、ＭＴＳ単独では、非常に緩徐に還元型のフォルマザンへと変換するのみであることを見出した。しかしながら、ＭＴＳの反応性は、反応溶液に電子伝達剤であるＰＭＳを５％添加することにより極度に促進された。従って、この著者は、ＭＴＳ／ＰＭＳは、細胞フリーの水性溶媒システムにおけるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの生成をモニターするのに有用であると結論付けた。
【０００８】
Ｌａｎｃａｓｔｅｒらによる１９９６年３月２６日登録の米国特許第５，５０１，９５９号明細書では、微生物、組織細胞又はこれに類似する生物をレサズリン及び試験化合物の存在下成長培地中でインキュベートして行う細胞のバイアビリティー及び増殖アッセイについて述べている。多くの細胞培養用培地に見出される成分に起因したレサズリンの非特異的な自動還元を阻害するように、反応混合物中にいわゆる毒物質である還元安定化剤を加える。このアッセイにおいて、レサズリン色素は、生細胞の活性により還元される。従って、Ｌａｎｃａｓｔｅｒらのアッセイにおいて、レサズリンは、細菌の死ではなく細菌の増殖を検出するための酸化還元試薬として使用される。レゾルフィンとして自明な還元型のレサズリンは、蛍光光度的又は比色的に検出され得る。上記の色素酸化型であるレサズリンは、青色を呈し、還元型のレゾルフィンは赤色を呈する。
【０００９】
複数の細胞毒性アッセイは、市販で購入し得る。例えば、ＯｒｅｇｏｎのＥｕｇｅｎｅにあるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅは、登録商標“Ｖｙｂｒａｎｔ”で、細胞毒性アッセイを市販している。
【００１０】
“Ｖｙｂｒａｎｔ”ブランドのアッセイでは、死細胞から放出された細胞質酵素であるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）を検出する。このアッセイでは、レサズリンをレゾルフィンへと還元する２ステッププロセスを介してＧ６ＰＤＨを検出する。
【００１１】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅの製品の文書には、２４時間以上インキュベートすると、Ｇ６ＰＤＨの有意な分解が起こり、測定結果が悪化することが示されている。１０月２０日に改訂されたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製品の情報ファイル番号Ｖ−２３１１１を参照されたい。
【００１２】
ＷｉｓｃｏｎｓｉｎのＭａｄｉｓｏｎにあるＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎでは、細胞のバイアビリティー、細胞毒性及び細胞増殖アッセイを、登録商標”ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６”、”ＣｅｌｌｔｉｔｅｒＧｌｏ”及び”ＣｙｔｏＴｏｘ９６”として販売している。Ｐｒｏｍｅｇａの技術情報番号１１２、１６９、２４５及び２８８を参照されたい。Ｐｒｏｍｅｇａ社の非放射性細胞毒性アッセイである”Ｃｙｔｏｔｏｘ９６”は、例えば、試験物質の細胞毒性を同定するための比色アッセイに基づいている。このアッセイは、ＩＮＴの酵素にリンクした還元反応を用いて、ＭＴＳに類似したテトラゾリウム色素（米国特許第５，１８５，４５０号明細書にて、ＭＴＳ色素の詳細な記述を参照されたい）にて、死細胞からのＬＤＨの遊離を定量的に測定する。このアッセイは、２ステップのプロトコールであって（つまり、非均一である）、ＩＮＴ色素は、比色的に検知される。このアッセイが用いる条件は、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の存在下ｐＨ８．５で行うので、生細胞に適合しない。
【００１３】
ＭｉｓｓｏｕｒｉのＳｔ．ＬｏｕｉｓのＧｅｎｏｔｅｃｈは、登録商標”ＣｙｔｏＳｃａｎ”にて、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をベースとした細胞毒性アッセイを販売している。この”ＣｙｔｏＳｃａｎ”ブランドのアッセイは、死細胞から放出されたＬＤＨを測定する比色方法である。死細胞により放出されたＬＤＨは、テトラゾリウム塩を赤色のフォルマゼンへと還元させるカップリングされた酵素反応を介して測定される。このＬＤＨ活性は、所定の経時的時間とともに、ＮＡＤＨ酸化の機能又はテトラゾリウム還元の機能として同定される。Ｇｅｎｏｔｅｃｈのカタログ番号７８６−２１０を参照されたい。本質的に同一のアッセイキットは、Ｗｉｓｏｃｏｎｓｉｎ、ＭａｄｉｓｏｎのＰａｎｖｅｒａ社（ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｐａｎｖｅｒａ製品番号ＴＡＫ  ＭＫ４０１）、Ｍｉｃｈｉｃｇａｎ、ＯｘｆｏｒｄのＯｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｏｘｆｏｒｄ製品番号ＬＫ１００）及びＩｎｄｉａｎａ、ＩｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓのＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅカタログ番号１６４４７９３）より販売されている。これら全てのキットは、細胞培養用培地を異なる容器へと移動させるので、２ステップ工程を必要とし、このため、非均一である。
【００１４】
Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、Ｓｔ．ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ社は、製品名”Ｔｏｘ−７”及び”Ｔｏｘ−８”にて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの２つの毒性アッセイキットを販売している。”Ｔｏｘ−７”キットは、ＬＤＨをベースとしており、上述したＧｅｎｏｔｅｃｈ社製”ＣｙｔｏＳｃａｎ”ブランドのアッセイと本質的に同一である。”Ｔｏｘ−７”アッセイは、２ステップの工程であって、上清又は細胞ライゼートを別のベッセルに移す必要があり、そこで、上清又はライゼートを分析する。２ステップの工程は、材料を取り扱う必要性が増加させるので、高出力のスクリーニングには好適ではない。Ｓｉｇｍａ社製の”Ｔｏｘ−７”に使用されている特定のテトラゾリウム色素は、特別な物質ではないが、その製品に関する文献で示すように、その反応は、フォルマザンの典型的な最大吸収である（上記のＧｅｎｏｔｅｃｈ社製で用いられているのと同様の波長である）４９０ｎｍにて分光光度的に測定される。
【００１５】
これら市販で購入可能なキットの全ては、ＬＤＨ活性の酵素学的測定に関して細胞上清を別のベッセルに移動させることが必要であり、従って、非均一的である。
【００１６】
Ｓｉｇｍａ社製の”Ｔｏｘ−８”アッセイでは、生細胞（死細胞ではない）によるレサズリンの生物学的還元反応によりレゾルフィンを生成させる。還元された色素の量は、蛍光光度的又は分光光度的に測定し得る。
【００１７】
Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ）は、登録商標”ａｌａｍａｒＢｌｕｅ”にて細胞増殖及びバイアビリティーを測定するキットを販売している（カタログ番号Ｄａｌ１０２５及びＤａｌ１１００を参照されたい）。レサズリンと同様、”ａｌａｍａｒＢｌｕｅ”ブランドの色素は、生細胞の還元環境をモニターするのに用いられる。この市販品の技術は、米国特許番号第５，５０１，９５９号明細書にてＬａｎｃａｓｔｅｒらにより述べられている。
【００１８】
ＢａｋｅｒらによるＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６：２４８−２５３（１９８０）及びカナダ国特許第１，１１２，１４０号明細書では、レサズリン及び抗菌可能性試験のため、抗生物質を含浸された吸収パッドを用いることが述べられている。脳心臓潅流ブロスにおいて、細菌単離物を上記のパッドに適用する。しかしながら、これら文献にて述べられているプロトコールは、最小阻害濃度（ＭＩＣ）を同定するには適さない。ＫａｎａｚａｗａらによるＪ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、１９：２２９−２３３（１９９６）でも、可能性試験において使用するためレサズリン及び抗菌剤を含浸された吸収パッドの使用について述べている。ＢｒｏｗｎらによるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．，５：１０−１３（１９６１）及び米国特許第３，１０７，２０４号明細書で述べているのは、テトラゾリウムをベースとした酸化還元指示薬及び抗菌剤を含浸された吸収パッドの使用であって、可能性試験に使用している。
【００１９】
しかしながら、急速で成分が毒性を有さず（従って、検討される細胞の存在した状態で試験し得る）、測定される細胞質成分が約２時間以上の半減期を有するような、（バイアビリティーではなく）細胞死を測定する細胞毒性アッセイに関して、長い間、切実で満足されていない要求がある。
【００２０】
（本発明の概略）
上述の欠点を認識しつつ、本発明の第１実施例は、試験物質の細胞毒性を同定する方法を開示している。この方法は、第１に、所定量の試験物質を細胞培養用培地中に存在する生細胞を有するベッセルへと加えるステップを有する。その後、所定時間、細胞培養用培地中でこの細胞をインキュベートする。インキュベートされた細胞及び細胞培養用培地に、細胞培養用培地中に存在する生細胞に対して毒性を有さない試薬混合物を添加する。この試薬混合物は、溶媒と、酸化状態及び還元状態を有し初期的には酸化状態で存在している色素と、電子伝達剤と、２時間以上の半減期を有する細胞質酵素用の基質と、この細胞質酵素用の補酵素とを有する。その後、ベッセルの内容物に関して、還元状態の上記の色素の生成を測定する。還元状態の上記色素は、上記の試薬混合物に含有されている基質を所望の産物へと変換する細胞質酵素により生成される。この細胞質酵素は、上記ベッセル中に含まれる死細胞から放出されるが、血清などの細胞培地に存在する成分として存在していてもよい。従って、間接的に（上記の還元状態の色素を検出することにより）この酵素の量を定量し且つ試験物質により惹起される細胞死が行われる前のバックグラウンドの量を差分することにより同定される。
【００２１】
また、本発明は、上述の方法を実行するキットをも包含する。上記の方法に使用される試薬混合物は、アッセイの反応時間に関する細胞のバイアビリティーに逆行的に影響を及ぼすことなく、（細胞が存在する）上記の細胞培養用培地に直接加えてもよい。好適実施例において、上記の方法及び対応するキットは、一般的に、本質的に急速に約１０分で結果を得る。比色的又は蛍光的にデータを取得し得る。蛍光的測定は、より高感度であり、レゾルフィンの検出には好適な手段である。他の実施例では、上記の試薬混合物を添加した後直ちに収集可能であって、このデータ収集工程は、一般的に、秒又は分のオーダーが可能である。
【００２２】
上記方法の全体が単一のベッセル実行されることがより好適である。つまり、上記の細胞は、適切な培地を含有するベッセルに載置される。試験物質をこのベッセルに加える。細胞及び試験物質を有するベッセルをインキュベートする。（細胞を含有しないアリコートを採取しこれに試薬混合物を添加するのではなく）その後、同一のベッセルに、インキュベートされた細胞の存在下、試薬混合物を添加する。この細胞培地をその後（比色的又は蛍光的に）測定する。従って、本発明の好適実施例は、”均一的”であり、この均一性は、単一のベッセルにて上記反応の全体を実行することであって、異なるベッセルに移動され試験されるアリコートが必要ない。このことは、本発明による方法が高出力の自動化方法に高度に適させることができ、材料の取扱及び操作の必要性が絶対的な最小限度に低減されることが望ましい。
【００２３】
上述したように、本発明の方法からの出力は、インキュベートされた細胞への試薬混合物の添加の後本質的に即座に起こることで開始する。従って、データの取得は、試薬混合物の添加の後即座に開始可能である。本発明の方法により発生する信号は、数秒、１０分、３０分又はこれ以上のいずれの時間において測定してもよい。好適実施例において、この信号は、一般的に１０分のオーダーにおいて測定される。
【００２４】
本発明の方法の好適実施例において、２時間以上の半減期を有する細胞質酵素用の基質は、乳酸であって、細胞毒性測定の基礎を形成する細胞質酵素は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）である。ＬＤＨは、細胞溶解の後、細胞培養用培地中で、３７℃で約９時間以上の半減期を有する。本発明に使用する好適な色素は、レサズリンである。ＭＴＳを用いてもよい。好適な電子伝達剤は、酵素ジアホラーゼであって、Ｍｅｌｄｏｌａ’ｓ  Ｂｌｕｅを用いてもよい。
【００２５】
また、還元状態の上記の色素の生成を測定する前に、反応系にストップ溶液（好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の溶液）を加えることも好適である。
【００２６】
本発明の方法は、死細胞から放出された後、長い半減期を有する細胞質成分に依拠する。従って、上述したように、好適実施例において、ＬＤＨは、測定される細胞質成分である。本発明の方法は相対的に長い半減期を有する細胞質成分を利用するので、１２又は２４時間（或いはそれ以上）のインキュベート時間を包含し得る試験時間に関して上記の成分の最小限の分解が発生してもよい。放出される長い半減期の細胞質成分活性は、放出される短い半減期の成分と比較してより安定的に測定し得るし、特に、試薬混合物をベッセルに添加する前、試験物質による細胞のインキュベートにより数時間細胞質成分を放出される場合顕著である。
【００２７】
さらに好適なのは、必須ではないが、本発明の方法は、”均一”な方法にて実行され、つまり、本発明の方法の全てのステップは、本発明において使用される細胞の存在下、同一のベッセル内で実施されるのが好適である。このことは、例えば、試験管、マルチウェルプレート又は種々の適切なベッセルにて行い得る。
【００２８】
本発明の第２の実施例は、上述の方法を実行するためのキットに関する。本発明によるキットは、第１容器に配置された酸化状態及び還元状態を有する色素であって、酸化状態の色素は還元状態の色素と区別可能であって、酸化状態にて存在する色素と；第２容器に配置された凍結基質混合物であって、電子伝達剤、２時間以上の半減期を有する細胞質酵素用基質及び細胞質酵素用の補酵素を有する基質混合物と：（任意で）キットの取扱説明書と；を組み合わせて有する。
【００２９】
本発明によるキットの好適実施例において、試薬混合物は、水溶液であって：約１０９ｍＭの乳酸；３．３ｍＭのＮＡＤ＋；約２．２Ｕ／ｍＬのジアホラーゼ；約３．０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液；約３０ｍＭのＨＥＰＥＳ；約１０ｍＭのＮａＣｌ；及び約３５０μＭのレサズリン；を含有する。他の成分の濃度は、適切な反応速度となるように過剰に存在する基質、補酵素及び電子伝達剤の程度と、試薬混合物の浸透圧が細胞にダメージを与える状態の細胞培養用培地の全体的な浸透圧に逆行的に影響を与えない程度とに応じて使用し得る。
【００３０】
任意で、ストップ溶液を第３容器に配置してもよい。ストップ溶液は、一般的に、石鹸、界面活性剤又は強塩基を含有する。好適なストップ溶液は、ＳＤＳ又は水酸化ナトリウムを包含する。
【００３１】
また、任意で、追加の（第４）容器に（ポジティブコントロールとして）溶解溶液を配置してもよい。好適な溶解溶液は、９％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００水溶液である。
【００３２】
本発明によるキットのその他の実施例は、単一の容器に試薬混合物を含有してもよい。かかるキットは、緩衝液、色素、細胞質成分用の基質、細胞質成分用の適切な補酵素及び電子伝達剤を組み合わせて第１容器に配置して備える。例えば、かかる第１容器には、レサズリン、乳酸、ＮＡＤ＋、ジアホラーゼ、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ及びＮａＣｌを含有する。また、キットは、このキットの取扱説明書を有し、任意でストップ溶液を配置されてもよい。
【００３３】
本発明の好適実施例の当初の利点は、向上された媒体を提供し且つ細胞死の指示薬としてレサズリン又はＭＴＳを使用する方法を提供する点にある。特に、本発明の方法は、試験される細胞のバイアビリティーに悪影響を及ぼさない試薬混合物を利用する。従って、本発明の方法は”均一的”であって、細胞がインキュベートされる同一のベッセルにて行い得るし、細胞培養用培地から細胞を含まないアリコートを採取する必要がない。つまり、本発明の方法を用いると、細胞培養用培地の細胞を含まないアリコートを採取して試験を実行する必要が無い。本発明の方法は、インキュベートされる細胞が存在したまま、細胞がインキュベートされる同一のベッセルにて、細胞培養用培地に直接適用して行い得る。
【００３４】
本発明の他の利点は、好適実施例において、細胞死を同定するため、ＬＤＨの活性を測定する点である。ＬＤＨは、長い半減期（３７℃にて８時間以上）を有するので、本発明において、長時間の試験期間において、細胞死の程度を同定するため使用し得るし、先行技術の方法に比してより正確に精密に測定可能である。
【００３５】
本発明の他の利点は、このアッセイ条件が試験される細胞に悪影響を及ぼさないので、アッセイが実行される際培養系に存在する生細胞は、上述のバックグラウンドに対して有意でない信号量をもはや発生しない点である。このことの理由は、生細胞の細胞膜は本発明の方法に使用される試薬溶液により障害されないためであって、従って、これら生細胞はそれぞれに細胞質ＬＤＨを保持するためである。従って、血清などの培地に由来する培地中に存在するＬＤＨのみ或いは細胞膜を保有する細胞から放出されるＬＤＨのみ測定される。従って、生細胞を含有するベッセルにおいて直接アッセイを実行し得る。
【００３６】
このアッセイを利用することにより明示される点は、所定の化合物又は成分の細胞毒性を同定することが薬物創製工程における情報の臨界的試験片である、ということである。例えば、望ましい細胞毒性は、所定の癌のタイプ、感染性のタイプ、疾患を惹起する細菌のタイプ又は寄生生物のタイプに対して特別に毒性を示す場合である。もちろん、細胞毒性が望ましくない場合もあって、例えば、推定上の新規薬物が正常細胞に対して細胞毒性を惹起することが発見される場合などである。本発明は、これら両方の場合であっても、所定の細胞タイプに対する所定の試験物質の細胞毒性を測定するのに使用され得る。
【００３７】
（本発明の詳細な説明）
以下の略語は、本願明細書及び特許請求の範囲を通じて使用する。ここに表現して規定されていない用語は、本技術分野において通じる通常の表記方法にて示す。
【００３８】
”Ｌ９２９細胞”は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｖｉｒｇｉｎｉａ、Ｍａｎａｓｓａｓ）においてアクセッション番号ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１にて購入可能な、Ｃ３Ｈ／Ａｎマウス皮下乳輪及び脂肪細胞由来の線維芽細胞系接着細胞株である。
【００３９】
”Ｊｕｒｋａｔ細胞”は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２にて購入可能な、ヒト白血球Ｔ細胞株である。
【００４０】
”ＨＥＰＥＳ”は、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタン硫酸である。
【００４１】
”公知又は推定上の医薬的又は治療薬”は、化学物質又は公知で薬物として使用される構造物又は薬物として使用するため検討される化学物質又は構造物である。
【００４２】
”ＬＤＨ”は、乳酸デヒドロゲナーゼである。
【００４３】
”ＭＴＳ”は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＭａｄｉｓｏｎのＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐにて購入可能な３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である。
【００４４】
”ＭＴＴ”は、Ａｌｄｒｉｃｈから購入可能な、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイドである。
【００４５】
”ＮＡＤＨ”は、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（水素型）であって、”ＮＡＤ＋”は、酸化型を示す。
【００４６】
”ＮＡＤＰＨ”は、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（水素型）であって、”ＮＡＤＰ＋”は、酸化型を示す。
【００４７】
”レサズリン”は、Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号１９，９３０−３）から購入可能な、７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン  １０−オキサイド（ナトリウム塩）である。
【００４８】
”レゾルフィン”は、Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号４２，４４５−５）から購入可能な、７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン（レサズリンの還元型）である。
【００４９】
”ＳＤＳ”は、ドデシル硫酸ナトリウムである。
【００５０】
”Ｔｒｉｓ”は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである。
【００５１】
”ベッセル”は、種々の容器又はホルダーであって、本発明の方法を実行し得る部材を示す。これには、試験管などの単一のウェル容器、種々の形態のマイクロタイタープレートなどのマルチウェル容器を含む。また、”ベッセル”は、本発明の方法を実行するのに必要な細胞や試薬を保持するのに十分な吸着性を有する、種々の材料構造のパッド、パッチ、テープ、バンデージ及びこれらに類する部材をも包含する。
【００５２】
”ＸＴＴ”は、３’−｛（１−フェニルアミノ−カルボニル）−３，４−テトラゾリウム｝−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルフォン酸ナトリウム、無水物である。
【００５３】
本発明による好適な方法に関する概略図である図１を参照すると、この方法は、成長培地中で細胞及び試験される薬剤（以下、試験薬物と略す）をインキュベートするステップを有する。その後、試薬混合物及び試験薬剤の存在下、細胞を経時的にインキュベートする。図１には示さないが試薬混合物を少なくとも部分的に細胞毒性を有すると推定することは、いくらかの細胞死が発生することであって、”漏洩的”となり、これにより、例えばＬＤＨなどの細胞質成分の細胞培養用培地中への放出が起こる。
【００５４】
本発明の方法に使用される試薬混合物は、生細胞に対して毒性を有さない。従って、本発明の方法の結果に逆行的な影響を与えることなく、インキュベートされる細胞に直接添加され得る。試薬混合物は、溶媒（好ましくは、水及び緩衝液）、酸化状態と還元状態とを有し還元状態が酸化状態と区別可能で初期的に酸化状態で存在する色素、電子伝達剤、細胞質成分用の基質（例えば乳酸、ＬＤＨに特異的な基質）及び（ＮＡＤ＋などの）適切な補酵素を含有する。図１に示すように、色素は好ましくはレサズリンであるが、ＭＴＳなどのテトラゾリウム系色素も首尾よく使用し得る。他の酸化還元指示薬を使用してもよい。好適な電子伝達剤は、酵素ジアホラーゼであるが、Ｍｅｌｄｏｌａ社製Ｂｌｕｅ（ナフトールブルー（カラーインデックスＣ．Ｉ．５１１７５）（ドイツ、ＤａｒｍｓｔａｄｔのＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡの支社であるＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｈａｒｌｅｃｏ）を使用してもよい。
【００５５】
好適実施例において、試験物質の存在下、所定時間細胞をインキュベートし、その後、インキュベートされた細胞に試薬混合物を添加する。図１に示すように、基質として乳酸を使用する場合は、測定される細胞質成分はＬＤＨであって、死細胞から放出されるＬＤＨは、酵素触媒反応を開始させる。この第１反応において、（試薬溶液に含有される原料の一つである）乳酸は酸化され乳酸を生成する。この反応には、ＮＡＤ＋が必要であって、従って、好適実施例において、上記の試薬混合物にＮＡＤ＋が含有される。
【００５６】
乳酸のピルビン酸への酸化によりＮＡＤＨを生成する。第２反応において、（図１においてレサズリンとして示される）色素は、第１反応により生成されたＮＡＤＨによる反応にて電子伝達剤にて触媒されて還元される（図１において、好適な電子伝達剤としてジアホラーゼを示す）。従って、図１に示すように、好適な電子伝達剤であるジアホラーゼは、ＮＡＤＨによる還元力により、レサズリンからレゾルフィンへの還元を触媒する。
【００５７】
最終的に、死細胞から細胞質成分（図１ではＬＤＨと図示）の放出は、色素の還元を測定することにより間接的に測定され、この還元は、放出された細胞質成分に特異的な基質の酸化にリンクした反応を介して駆動される（例えば、この反応は、図１に示すように、放出されたＬＤＨにより惹起される乳酸からピルビン酸への転換反応である）。生成された還元型の色素の量は、溶解された細胞の数に比例する（以下の記述に関する以下の例を参照されたい）。
【００５８】
上記の色素の還元型の生成は、色素に応じて、比色的、蛍光的又はその他の電磁気的スペクトル測定装置により定量し得る。レサズリンは、比色的又は蛍光的のいずれの方法にても測定し得るが、ＭＴＳは、比色的にしか測定可能ではない。適切な測定装置は、本技術分野において公知であって、市販の供給元から購入可能である。
【００５９】
特に、色素としてレサズリンを使用する場合、比色的な吸収又は蛍光的に還元を測定し得る。レサズリンは、純度に応じて、深青色であって且つ本質的に非蛍光である。レサズリンの還元型であるレゾルフィンは、赤色であり、高度に蛍光的である。比色測定を使用する場合、この反応は、レサズリンの最大吸収として当業者公知の波長（約５７０ｎｍ）でモニターされる。レサズリンの蛍光的測定は、当業者公知の波長（約５３０〜５６０ｎｍ）にて励起され且つ放射スペクトル（当業者公知の約５９０ｎｍ）にて測定される。蛍光光度的検出は、分光光度的検出よりも高感度であるので、本発明の方法の好適実施例においては、レサズリンが色素として使用され、レゾルフィンの生成が蛍光光度的に検出される。
【００６０】
細胞を成長又は保持させる培地は、本発明の機能を限定しないが、色素の非特異的な還元を最小限にすべく非還元的な培地が好ましい。細菌の培養に関して、適切な培地として、限定されないが、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス及びトリプチカーゼ・ソイ・ブロスが挙げられる。哺乳類の細胞培養に関して適切な培地は、限定されないが、ＲＰＭＩ１６４０、仔牛血清含有ＲＰＭＩ１６４０、Ｄｕｌｂａｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地、Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ溶液及びリン酸緩衝液が挙げられる。本来的にピルビン酸ナトリウムを含有するこれら培地は緩徐にＬＤＨ反応を示し、従ってレゾルフィンの生成が起こる。所望の感度に応じて、より長い反応時間を所望してもよい。
【００６１】
本発明の方法の一つの適用例において、試験物質は、抗生物質や細胞毒性を示す薬剤などの推定的に成長を阻害する物質であってもよい。しかしながら、これら試験物質の性質は、実質的に限定されない。例えば、これら試験物質は、種々の要素、化合物、混合物、薬物又は推定的な薬物の種々の形態（例えば固体、液体又は気体）又はその細胞毒性効果に関して試験される所望の環境的条件のセット（熱、湿度、光、酸素レベル及びこれらに類する種々の組み合わせ）であってもよい。また、本発明の方法は、所定の感染状態や細胞のタイプに対して最も効果的な化学療法剤を同定する目的で公知の抗菌剤や細胞毒性を有する薬物を試験するのに使用されてもよい。また、本発明の方法は、所定の細菌又は細胞型に対する潜在的な活性を同定する目的で、公知でないか或いは疑いのある抗菌剤に使用されてもよく、例えば、薬物スクリーニング又はその他の活動の一部として生物学的活性のため物質の高出力なスクリーニングに使用されてもよい。
【００６２】
本発明の方法に使用される細胞は、種々のソースから取得可能であり、原核細胞又は真核細胞であってもよい。例えば、ヒト由来の細胞を病院内にて医師により収集され本発明の方法を使用して試験するため中央研究所に送付されてもよく、或いは、細胞の試験片を病院内にて患者から収集してもよい。細菌の試験片は、ヒト又は動物の一部から採取されてもよく、例えば、これら一部には、脳脊髄液、膿瘍、感染創傷、生殖器感染等が挙げられる。これら細胞は、腫瘍の生検又は他の試験片に由来してもよい。試験されるこれら細胞は、植物サンプル、土壌のサンプル等に由来してもよい。つまり、試験される細胞の性質及びそのソースは、本発明に対して限定的ではない。
【００６３】
収集された試験片は、上述の通り、従来の実験的な応用例に従って、適切な培地上又は培地中で培養される。細菌のコロニー又は初代培養プレート上の細胞クローンから接種して前持って設定された濃度の細菌又は細胞懸濁液を得る、確立された手法に従って調製される。これら懸濁液のさらなる処理は、疑いのある試験に使用される特定の装置及び方法に依存する。
【００６４】
細菌の試験に関する一つの好適な成果は、選択した抗菌剤にて所定の密度で可能な限り連続して処理して情報を得る点である。本発明のその他の使用例には、混合液、溶液又はこれらを含まないと考えられる表面上に細菌が存在することを試験することである。細胞毒性試験の目的には、特定の化学療法剤又は試験物質に対する疑いのある腫瘍細胞を同定することであり、或いは、潜在能力を有する候補薬物をスクリーニングすることであり、或いは、所定の候補薬物が正常細胞又は種々の指示的な細胞型に対する所望しない細胞毒性を示すかどうかを同定することであってもよい。
【００６５】
本願に述べた方法は、生成される還元型の色素の量が溶解された細胞数に比例するという本質的に定量的な測定である。しかしながら、本発明の方法は、定量的な試験及び定性的な試験のいずれに使用されてもよい。定性的な試験という用語が参照するのは、生物又は細胞試験片が特定の抗菌剤又は細胞毒性試験物質に対して感受的か耐性を有するかどうかを一般的に示す試験結果をもたらす試験装置及び方法である。感受的又は耐性の相対的な程度は、定性的な試験においては得られない。定量的な試験という用語が参照するのは、細菌又はその他の細胞型の成長を実質的に阻害する抗菌的又は細胞毒性産物の濃度に関するデータを提供する試験結果をもたらす試験装置及び方法である。典型的には、細菌の試験片に関して、試験物質の治療範囲濃度の全てを包含する、試験物質の６又はそれ以上の希釈系列を利用する。最小阻止濃度（ＭＩＣ）という用語は、しばしば、試験物質の定量的な試験により得られる試験について参照するのに用いられ、且つ、本発明の方法に使用される細胞の生長を阻害する試験物質の最小濃度として規定される。
【００６６】
本発明の方法の一般的なプロトコールは、以下の通りである：
第一に、緩衝液中に凍結乾燥基質混合物を再構築し、アッセイ温度（通常室温）に平衡化させる。これにより、本発明の方法を実行するのに必要な全ての成分を含有する試薬混合物を得る。
【００６７】
試薬混合物は、その後、測定されるサンプルに添加され、このサンプルは、既知濃度の試験物質の存在下、所定の時間前もってインキュベートされたサンプルである。このサンプルは、その後、均一になるようにゆっくり撹拌される。その後、サンプルは、蛍光的又は比色的データを取得する前に所定時間、好ましくは約１０分間、インキュベートされる。
【００６８】
適切なストップ試薬、好ましくは、３ｗ／ｖ％のＳＤＳ水溶液又は水酸化ナトリウム（１Ｎ）水溶液を添加してこの反応を停止する。
【００６９】
その後、還元型の指示色素、好ましくはレゾルフィン、の蛍光を記録する。この蛍光量は、サンプルに存在する細胞質成分（例えばＬＤＨ）の量を示す。蛍光を記録する好適なフィルターのセットは、５６０ｎｍの励起波長で５９０ｎｍの蛍光波長で測定する。これら波長とは異なる若干の改変も可能である。
【００７０】
色素としてレサズリンを使用し蛍光強度をエンドポイントで測定する場合、マイクロタイターアッセイプレートなどの反応が起こるベッセルは、マイクロウェルフルオロメーターに適合されなければならない。指示薬としてＭＴＳを使用する場合、反応を実行するベッセルは、４９０ｎｍの吸収測定に適合されなければならない。
【００７１】
また、本発明は、上述の本発明の方法を実行するのに必要な試薬及び説明書を有するキットにも関する。最も好適な態様において、このキットが含むのは、第１容器に配置された色素（再び記するが、この色素は酸化状態と還元状態とを有し、還元状態は酸化状態と区別可能であり、色素は、初期的には酸化状態で混合物中に存在する）を含有するアッセイバッファーである。また、このキットは、電子伝達剤、細胞質成分用の基質（例えば乳酸）及び細胞質酵素用の補酵素（例えばＬＤＨの場合にはＮＡＤ＋）を含有する凍結乾燥基質混合物を第２容器中に含有する。任意の第３容器には、ストップ溶液を含有していてもよい。任意で追加の容器には、溶解溶液を含有していてもよい。このキットには、キットの取扱説明書を同封する。
【００７２】
好適なのは、上記の基質混合物は、凍結乾燥粉末の形態で存在し、その後バッファーにて再構築され細胞に対して毒性を示さない試薬混合物を生成する、本発明の方法を実施するのに必要な成分を含有する、ことである。この実施例が好適であるのは、凍結乾燥基質混合物は、保存及び移動が容易であるためである。しかしながら、このキットは、上述の通り必要な成分が、使用可能状態にある前もって製造された試薬混合物の形態にて梱包されるように設定されてもよい。
【００７３】
本発明のキットに関する好適実施例において、色素は、レサズリン又は３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）である。また、上記の細胞質酵素用基質には乳酸が好適である。上記の電子伝達剤が酵素、最も好適にはジアホラーゼであることが好ましい。ＬＤＨが測定される細胞質成分である場合、上記の試薬混合物には、さらに補酵素としてＮＡＤ＋を含有することが好ましい。
【００７４】
従って、上記の基質混合物が試薬溶液に再構築される場合、上記の試薬溶液は、水性溶媒、乳酸（例えば乳酸リチウム）、ＮＡＤ＋、ジアホラーゼ、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ及びレサズリン又はＭＴＳを含有することが好ましい。特に、基質混合物が再構築される際、上記の試薬溶液が以下の成分を含有することが好ましい、つまり：約５０〜２５０ｍＭの乳酸リチウム；約０．１〜１０Ｕ／ｍＬのジアホラーゼ；約０．５〜１０ｍＭのＮＡＤ＋；約１〜１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液；約１０〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ；約１〜１００ｍＭのＮａＣｌ；及び約５０〜５００μＭのレサズリン；である。これら成分は、検討中細胞に必要とされる浸透圧（最も一般的な哺乳類細胞で約３１０ｍＯｓｍ）と一致して含有する。反応速度の最適化を必要としてもよく、このことは当業者に公知である。
【００７５】
本発明の最も好適な実施例において、再構築される際上記の基質混合物は、以下の成分を有する試薬溶液を得る：約１０９ｍＭの乳酸リチウム；約３．３ｍＭのＮＡＤ＋；約２．２Ｕ／ｍＬのジアホラーゼ；約３．０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液；約３０ｍＭのＨＥＰＥＳ；約１０ｍＭのＮａＣｌ；及び約３５０μＭのレサズリン；である。
【００７６】
上記の基質混合物を再構築する際（或いは上記成分が使用の準備が整った溶液で存在する場合）、この溶液は、約７．０〜８．０、好ましくは約７．２５〜７．６０のｐＨを有することが好ましい。
【００７７】
本発明のキットのストップ溶液は、好ましくは、石鹸、界面活性剤又は水酸化ナトリウムなどの強塩基の水溶液であることが好ましい。好適なストップ溶液は１〜５％のＳＤＳ水溶液又は（好ましくは１Ｎの）水酸化ナトリウム水溶液である。３％のＳＤＳ水溶液が好ましい。
【００７８】
（例）
以下の例は、示すことをのみを目的として提供する。この例は、上述の本発明及び請求項のより完全な理解を補助することのみを含んでいる。これら例は、種々の様式における本発明の範囲を限定するものではない。
【００７９】
（例１：バックグラウンド及び線形性）
試薬溶液は、レサズリンを含有するアッセイバッファーを有する凍結乾燥基質混合物と死細胞から遊離するＬＤＨの測定に必要な原料の全てとを組み合わせて調製される。この凍結乾燥基質混合物の再構築に使用されるバッファー溶媒は、混合物の再構築に使用される際得られる溶液が生細胞に適合可能な浸透圧を有するように設計される。凍結乾燥基質混合物の再構築に使用する際、上記の試薬溶液は以下の原料を含有する：
乳酸：            １０９ｍＭ
ＮＡＤ＋：        ３．３４ｍＭ
ジアホラーゼ：    ２．１７Ｕ／ｍＬ
Ｔｒｉｓ緩衝液：  ３．０５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ：      ３０ｍＭ
ＮａＣｌ：        １０ｍＭ
レサズリン：      ３５０μＭ
１０％ＦＢＳ含有Ｆ１２／ＤＭＥ培地中でＬ９２９細胞を培養し、９０μＬの全量にて、単位ウェル当たり約０、１５６２、３１２５、６２５０、１２，５００、２５，０００及び５０，０００個細胞を含有するｎ＝２のウェルを生成するようにマイクロタイタープレート中で希釈系列を作成した。接着可能となるのに十分な時間（約１．５時間）、３７℃にて細胞をインキュベートした。細胞を有するマイクロタイタープレートをインキュベーターから取り出し、ウェルの一つのセットに１０μＬのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（溶解剤）を添加し、細胞を室温に平衡化しつつ溶解が完全に完了するまで処理した（約３０分）。ウェルのその他のセットは溶解させず、１０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を容量コントロールとしてウェルに添加した。アッセイ試薬混合物を上述の通り調製し、室温で平衡化した。溶解が完了した後、１００μＬの試薬混合物を各ウェルに添加した。ウェルの２つのセットを１０分間インキュベートした。１０分後、５０μＬのストップ溶液（３％ＳＤＳ）を各ウェルに添加した。その後、各ウェルの蛍光強度を測定した（励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍ）。結果を図２に示す。
【００８０】
図２に示すように、溶解剤が存在しないウェルにおいて、蛍光強度に関して最小限のバックグラウンドが検出された。溶解剤を添加してウェルでは、蛍光強度は線形的に増加し、各ウェル中の細胞数に比例的であった。図２に示すように、本発明の方法は、単位ウェル当たり０から少なくとも５００個において線形性が得られた。その他の細胞株を検討し、同様に結果を示す。
【００８１】
この例で示すのは、本発明の方法は、試験物質の細胞毒性を算定するのに使用し得ることであって、その理由は、検知された蛍光強度は、溶解された細胞数に比例することが知られているからである。
【００８２】
（例２：Ｇ６ＰＤＨの安定性と比較した細胞培養用培地中でのＬＤＨの安定性）
図３及び図４は、２つの異なる細胞株、Ｌ９２９細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞に関する同一のアッセイ条件での細胞培養用培地中でのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）（図３）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（図４）の活性を示す。使用したアッセイ条件は、上述の例１で示したのと同様の条件である。乳酸及びＮＡＤ＋に代えて、Ｇ６ＰＤＨの測定に関しては、グルコース−６−リン酸及びＮＡＤＰ＋を使用し、レサズリンの発色速度の増加を補助するため、レサズリンは２５０μＭとした。このＧ６ＰＤＨ試薬を用いた従来の検討が示すのは、その蛍光強度は、溶解された細胞数に比例するということである。試験されるＬ９２９細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞のサンプルを収集し、溶解剤を添加した。放出された細胞質酵素の安定性をモニターするため、溶解性界面活性剤を添加した後３７℃にて細胞をインキュベートした。蛍光強度は、溶解剤を添加した後１、２、４、及び６時間後にそれぞれ測定した。図３及び図４は、同様の条件下で、Ｇ６ＰＤＨの安定性と比較した、細胞培養用培地中でのＬＤＨの安定性を示す。図４に示すように、溶解剤を添加後６時間においてでも、Ｌ９２９細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞の両方から放出されたＬＤＨは、開始時点の活性の５０％以上を保持している。逆に、図３に示すように、同一の条件下においてＧ６ＰＤＨは、溶解剤を添加後２時間以内に開始時点の活性の５０％以下に活性が低下した。
【００８３】
この例では、本発明の好適実施例において、この方法が、細胞培養用培地中で８時間以上の半減期を有する酵素であるＬＤＨに依拠するということを示す。従って、本発明は、先行技術において公知のアッセイと比較して、より長い細胞毒性の測定に使用し得る。
【００８４】
（例３：本発明を用いたＴＮＦαの細胞毒性の測定）
１０％馬血清含有Ｆ−１２／ＤＭＥ培地で３８４ウェル組織培養プレートを用いてＬ９２９細胞（２０００個／ウェル）を調製した。この細胞を接着させ、５％ＣＯ２、３７℃にて２４時間成長させた。最終濃度１μｇ／ｍＬのアンチマイシンＤの存在下種々の濃度のＴＮＦα（ｎ＝４）を各ウェルに添加し、プレートを２０時間インキュベートした。同一容量の試薬（２５μＬ／ウェル）をその後添加し、プレートを３０秒間撹拌した。プレートを２２℃で１０分間インキュベートした後、１２．５μＬ／ウェルにて３％ＳＤＳ溶液を添加し反応を停止させた。その後、５６０ｎｍｎ励起波長、５９０ｎｍの蛍光波長にて蛍光強度を同定した。
【００８５】
この例の結果を図５に示す。図５に示すように、観察された蛍光強度は、ＴＮＦα濃度が０から約０．１２５ｎｇ／ｍＬＴＮＦαの範囲でＴＮＦαの投与量依存的に増加した。約０．１２５ｎｇ／ｍＬ以上では、観察された蛍光強度は本質的に一定となり、このことは、ウェル中の全ての細胞が上記の濃度又はそれ以上の濃度のＴＮＦαで溶解されることを示している。これらの結果は、本発明が、公知の細胞毒性剤により相対的に溶解される細胞溶解の後に蛍光強度を測定することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】本発明による好適実施例の概略図である。
【図２】本発明の方法を例示的に行った際の細胞数（ｘ軸）と蛍光強度（励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍ）（ｙ軸）を示すグラフである。Ｌ９２９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１）を用いて試験を行い、生細胞は（黒四角）にて、溶解細胞は（白丸）にて示す。
【図３】Ｌ９２９細胞（黒四角）Ｊｕｒｋａｔ細胞（白四角）から放出されたＧ６ＰＤＨの活性を測定するアッセイにおいて、溶解経過時間（ｘ軸）と蛍光強度（励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍ）（ｙ軸）との関係を示すグラフである。
【図４】溶解されたＬ９２９細胞（黒丸）及びＪｕｒｋａｔ細胞（白丸）から放出されたＬＤＨの活性を測定するアッセイにおいて、溶解経過時間（ｘ軸）と蛍光強度（励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍ）（ｙ軸）との関係を示すグラフである。
【図５】本発明による方法を用いて測定したＴＮＦαの細胞毒性を示すグラフである。ＴＮＦαの濃度をｘ軸に示し、ｙ軸には図２乃至４と同様に蛍光強度を示す。例３を参照されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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