(57)【要約】  宿主細胞の内因性遺伝子由来の酵素の混入を防止することができる，組換え体ライソソーム酵素を製造するための新たな方法が開示されている。当該方法は，内因性のライソソーム酵素をコードする遺伝子を破壊した細胞を，ヒトライソソーム酵素をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターで形質転換し，当該形質転換細胞を用いて組換え体ライソソーム酵素を製造することを特徴とする。
2011108451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え体ヒトリソソーム酵素を製造する方法であって，以下の工程すなわち，
（ａ）ヒトリソソーム酵素をコードする遺伝子を，哺乳動物細胞中で発現するように発現ベクターに組み込む工程，
（ｂ）該発現ベクターを，１又は複数のリソソーム酵素をコードする内因性遺伝子を破壊した哺乳動物細胞に導入して，ヒトリソソーム酵素遺伝子発現用細胞を作成する工程，及び
（ｃ）該ヒトリソソーム酵素遺伝子発現用細胞を培養して，ヒトリソソーム酵素遺伝子を発現させる工程，
を含んでなる方法，
【請求項２】
該リソソーム酵素をコードする内因性遺伝子が，α−ガラクトシダーゼＡ，イズロン酸２−スルファターゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，ガルスルファーゼ，酸性グルコシダーゼ，グルコセレブロシダーゼ，サルファミダーゼから選択される，１又は複数の遺伝子である，請求項１の方法。
【請求項３】
該リソソーム酵素をコードする内因性遺伝子が，α−ガラクトシダーゼＡ，イズロン酸２−スルファターゼ，サルファミダーゼから選択される，１又は複数の遺伝子である，請求項１の方法。
【請求項４】
該ヒトリソソーム酵素をコードする遺伝子が，α−ガラクトシダーゼＡ，イズロン酸２−スルファターゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，ガルスルファーゼ，酸性グルコシダーゼ，グルコセレブロシダーゼから選択される，請求項１又は２の方法。
【請求項５】
破壊された該内因性遺伝子が，導入されるヒトリソソーム遺伝子と対応する同一種類のリソソーム酵素をコードする遺伝子である，請求項１の方法。
【請求項６】
導入されるヒトリソソーム遺伝子が，α−ガラクトシダーゼＡ又はイズロン酸２−スルファターゼである，請求項５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，組換え体リソソーム酵素を，遺伝子ノックアウト細胞を用いて製造する方法に関し，詳しくは，組換え体リソソーム酵素を，ガラクトシダーゼＡ，イズロン酸２−スルファターゼ等のリソソーム酵素をコードする内因性遺伝子を破壊した遺伝子ノックアウト細胞を用いて製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リソソーム酵素は，リソソームに局在する酸性領域に最適ｐＨを有する一群の加水分解酵素であり，α−Ｌ−イズロニダーゼ，イズロン酸２−スルファターゼ，ガルスルファーゼ（Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸スルファターゼ），酸性α−グルコシダーゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，グルコセレブロシダーゼ，サルファミダーゼ等の酵素がこの範疇に含まれる。【０００３】
リソソーム病は，リソソーム酵素の遺伝的欠損に起因する疾病の総称であり，脂質蓄積症，ムコ多糖症，糖タンパク質代謝異常症等の疾患がこの範疇に含まれる。例えば，α−Ｌ−イズロニダーゼの遺伝子欠損はハーラー症候群又はシャイエ症候群，イズロン酸２−スルファターゼの遺伝子欠損はハンター症候群，ガルスルファーゼの遺伝子欠損はマロトー・ラミー症候群，酸性α−グルコシダーゼの遺伝子欠損はポンペ病，α−ガラクトシダーゼＡの遺伝子欠損はファブリー病，グルコセレブロシダーゼの遺伝子欠損はゴーシェ病の原因となる（非特許文献１参照）。【０００４】
リソソーム病の患者では，遺伝子欠損により特定のリソソーム酵素の活性が欠失又は減少するために，その基質であるムコ多糖，脂質，グリコーゲンなどが細胞内に蓄積し，その結果，それぞれの疾患に特有の病理学的特徴が現れる。そこで，リソソーム病の治療法として，患者で欠失又は減少している酵素を，静脈注射等により体外から補充する酵素補充療法が実施されている。治療に用いられる組換え体酵素は，当該酵素をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターで形質転換したＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞を用いて製造されている。リソソーム酵素は本来リソソームに局在する酵素であるが，強制発現させるとにより細胞外に分泌されることから，形質転換した細胞を培養することにより，分泌された酵素を培養液中に得ることができる。組換え体リソソーム酵素を哺乳動物細胞中で発現させて製造する方法に関しては，例えば，組換え体α−Ｌ−イズロニダーゼをＣＨＯ細胞を用いて製造する方法が報告されている（特許文献１参照）。また，組換え体イズロン酸２−スルファターゼをＣＨＯ細胞を用いて製造する方法についても報告がある（特許文献２参照）。同様に，組換え体酸性α−グルコシダーゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，グルコセレブロシダーゼについてもＣＨＯ細胞を用いて製造する方法が報告されている（非特許文献２，特許文献３〜４参照）。また，組換え体ガルスルファーゼについては，繊維芽細胞を用いて製造する方法が報告されている（非特許文献３参照）。【０００５】
組換え体酵素を医薬品として用いるためには，発現させた酵素を高度に精製する必要がある。例えば，薬学的処方を得る目的で，組換え体ガルスルファーゼを高度に精製する方法が報告されている（特許文献５参照）。ここでは，組換え体ガルスルファーゼを純度が99.9％以上になるまで精製しているが，医薬品として用いるためには，有害な夾雑物の場合，極微量であってもその混入を排除する必要がある。特に，酵素補充療法で用いるリソソーム酵素の場合，患者への投与は継続して行われるので，異物，例えばＣＨＯ細胞の内因性遺伝子に由来するタンパク質の混入があると，抗原抗体反応が起こり，患者にアレルギー症状等の重篤な副作用が起こる可能性がある。【０００６】
組換え体リソソーム酵素を哺乳動物細胞を用いて製造した場合，当該宿主細胞の内因性遺伝子に由来するリソソーム酵素は能動的に細胞外に分泌されることなくリソソームに留まると予想される。従って，組換え体リソソーム酵素に，宿主細胞の内因性遺伝子に由来するリソソーム酵素が混入する可能性は低いと考えられる。このため，本発明者らの知る限りにおいて，特に宿主細胞の内因性遺伝子に由来するリソソーム酵素を除去するための工程を設けた，組換え体リソソーム酵素を製造する方法に関する報告はない。また，組換え体リソソーム酵素に，その製造過程で宿主細胞の内因性遺伝子に由来するリソソーム酵素が混入するか否かを分析した報告もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５０２４５６号公報
【特許文献２】米国特許公報６１５３１８８
【特許文献３】特表平８−５０３６１５号公報
【特許文献４】特表平３−５０３７２１号公報
【特許文献５】特表２００６−５１０３５６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Bou-Gharios G. et al., HistochemJ.(1993) 25, 593-605
【非特許文献２】Fuller M. et al., Eur J Biochem.(1995)15, 903-9
【非特許文献３】Anson DS. Et al., Biochem J.(1992)284, 789-94
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記背景の下で，本発明者らは，ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来の細胞）をそのまま用いて製造した組換え体リソソーム酵素に，該細胞の内因性遺伝子由来の微量のリソソーム酵素が混入すること見出した。従って，本発明の目的は，哺乳動物細胞を用いて製造した組換え体リソソーム酵素の製造方法であって，該哺乳動物細胞の内因性遺伝子由来の極微量のリソソーム酵素の混入も防止できるリソソーム酵素の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは，リソソーム酵素の遺伝子を破壊したノックアウト細胞を用いて組換え体リソソーム酵素を製造することを試み，それによって上記目的が達成されることを見出した。本発明は，この発見に基づいて完成されたものである。【００１１】
すなわち，本発明は以下を提供する。
（１）組換え体ヒトリソソーム酵素を製造する方法であって，以下の工程すなわち，
（ａ）ヒトリソソーム酵素をコードする遺伝子を，哺乳動物細胞中で発現するように発現ベクターに組み込む工程，
（ｂ）該発現ベクターを，１又は複数のリソソーム酵素をコードする内因性遺伝子を破壊した哺乳動物細胞に導入して，ヒトリソソーム酵素遺伝子発現用細胞を作成する工程，及び
（ｃ）該ヒトリソソーム酵素遺伝子発現用細胞を培養して，ヒトリソソーム酵素遺伝子を発現させる工程，
を含んでなる方法，
（２）該リソソーム酵素をコードする内因性遺伝子が，α−ガラクトシダーゼＡ，イズロン酸２−スルファターゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，ガルスルファーゼ，酸性グルコシダーゼ，グルコセレブロシダーゼ，サルファミダーゼから選択される，１又は複数の遺伝子である，上記（１）の方法。
（３）該リソソーム酵素をコードする内因性遺伝子が，α−ガラクトシダーゼＡ，イズロン酸２−スルファターゼ，サルファミダーゼから選択される，１又は複数の遺伝子である，上記（１）の方法。
（４）該ヒトリソソーム酵素をコードする遺伝子が，α−ガラクトシダーゼＡ，イズロン酸２−スルファターゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，ガルスルファーゼ，酸性グルコシダーゼ，グルコセレブロシダーゼから選択される，上記（１）又は（２）の方法。
（５）破壊された該内因性遺伝子が，導入されるヒトリソソーム遺伝子と対応する同一種類のリソソーム酵素をコードする遺伝子である，上記（１）の方法。
（６）導入されるヒトリソソーム遺伝子が，α−ガラクトシダーゼＡ又はイズロン酸２−スルファターゼである，上記（５）の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば，哺乳動物細胞で発現させて得られる組換え体ヒトリソソーム酵素に，哺乳動物細胞の内因性遺伝子由来のリソソーム酵素が混入するのを防止することができる（図２）。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】組換え体ヒトイズロン酸２−スルファターゼ精製品のRP-HPLC法による分析結果を示す。
【図２】遺伝子ノックアウト細胞を用いた組換え体ヒトイズロン酸２−スルファターゼの生産方法の特徴を模式的に示す。（Ａ）は遺伝子を破壊しない細胞を用いた場合，（Ｂ）は本発明に従い遺伝子ノックアウト細胞を用いた場合をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において，リソソーム酵素というときは，リソソームに存在する加水分解酵素，特に多糖類を加水分解する酵素のことをいい，α−ガラクトシダーゼＡ，イズロン酸２−スルファターゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，ガルスルファーゼ，酸性グルコシダーゼ，グルコセレブロシダーゼ，サルファミダーゼ等の酵素を含む。
【００１５】
本発明において，組換え体ヒトリソソーム酵素というときは，遺伝子組換え技術を用いて製造されるヒトリソソーム酵素のことをいう。一般的には，ヒトリソソーム酵素をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み，これを用いて哺乳動物細胞を形質転換し，形質転換細胞を培養することにより製造されるが，そのような技術は当業者にとって周知のものである。
【００１６】
本発明において，ヒトリソソーム酵素をコードする遺伝子としては，リーダーペプチド領域を含む天然型酵素をコードする遺伝子の翻訳全領域を含むｃＤＮＡが好適に用いられるが，これに限らず，リーダーペプチド領域を他の遺伝子，例えば，成長ホルモン，エリスロポエチンのもの，又は他のリソソーム酵素のものに置換したキメラ遺伝子を用いてもよく，更には，ｃＤＮＡの翻訳領域中に天然型酵素のアミノ酸配列に変化を与えないような塩基の置換を含む遺伝子，ｃＤＮＡの翻訳領域中に天然型酵素のアミノ酸配列の置換，欠失，重複をもたらすように塩基の置換，欠失，重複をさせた遺伝子を用いることもできる。
【００１７】
本発明において，発現ベクターは，哺乳動物細胞内でヒトリソソーム酵素をコードする遺伝子を発現させることができるものであれば特に限定はなく，一般的に，環状又は制限酵素で切断したプラスミドの形態で細胞に導入させる。発現ベクター内で，ヒトリソソーム酵素をコードする遺伝子は，哺乳動物細胞内で発現するように，一般に遺伝子の発現を制御するプロモーターの下流に組み込まれる。このときプロモーターとして，サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，伸長因子１（ＥＦ−１）プロモーター等が使用できる。
【００１８】
本発明において，哺乳動物細胞は，発現ベクターを導入してヒトリソソーム酵素を発現させることができるものであれば特に限定はないが，ＣＨＯ細胞，ＣＯＳ細胞が好適に使用できる。
【００１９】
本発明において，内因性遺伝子というときは，哺乳動物細胞がそのゲノム上に本来有している遺伝子のことをいい，哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞の場合，チャイニーズハムスターの遺伝子，ＣＯＳ細胞の場合はアフリカミドリサルの遺伝子である。リソソーム酵素をコードする内因性遺伝子には，α−ガラクトシダーゼＡ，イズロン酸２−スルファターゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，ガルスルファーゼ，酸性グルコシダーゼ，グルコセレブロシダーゼ，サルファミダーゼが含まれる。通常の細胞では，各種のリソソーム酵素をコードする遺伝子が発現し，リソソームに局在している。
【００２０】
本発明において，遺伝子ノックアウト細胞というときは，相同染色体上に存在する一対の遺伝子の双方が，それらの遺伝子によりコードされるタンパク質が全く発現しないように破壊された細胞のことを主にいう。遺伝子ノックアウト細胞は，相同組換え法により所望の細胞からin vitroで構築することができる（Huang DC. et. Al., Mol
Cancer Res.(2002） 1, 56-57)。遺伝子ノックアウト細胞作成用のアデノ随伴ウイルスベクターも開発されており，in vitroで遺伝子ノックアウト細胞を製造する方法は，当業者にとって周知な手法となっている（Porteus MH. Et. al., Mol Cell Biol.(2003) 23, 3558-65）。
【００２１】
破壊すべき遺伝子がＸ染色体上に存在する場合，雌の動物由来の細胞よりも雄由来の細胞を用いることにより，遺伝子ノックアウト細胞を構築することが容易となる。何故ならば、雄由来の細胞では，破壊すべき遺伝子が染色体上に１つしか存在せず、雌の動物由来の細胞と異なり，一対の遺伝子の両方を破壊する必要がなくなるからである。ヒトの場合，Ｘ染色体上に存在する遺伝子として，例えば，イズロン酸２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡの遺伝子が挙げられる。
【００２２】
また遺伝子ノックアウト細胞は，ノックアウト動物の細胞を株化することでも得ることができる。ライソソーム酵素をコードする遺伝子を破壊したノックアウト動物は，例えばイズロン酸２−スルファターゼ遺伝子のノックアウトマウス（Garcia AR. Et al., J Inherit Metab Dis.(2007) 30, 924-34），α−ガラクトシダーゼＡ遺伝子のノックアウトマウス（Ioannou YA. Et al., Am J Hum Genet.(2001) 68, 14-25）が知られており，これらの動物から細胞を株化することによりライソソーム酵素の遺伝子ノックアウト細胞を得ることができる。
【００２３】
また，本発明において，遺伝子ノックアウトマウス細胞というときは，特定のｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ，small interfering RNA）を細胞内に導入することにより，特定のｍＲＮＡを破壊して，当該ｍＲＮＡをコードするタンパク質の発現が抑制されるようにした細胞も含む。ｓｉＲＮＡは，ｓｉＲＮＡ発現ベクターにより細胞を形質転換することにより，細胞内に導入することができる。ｓｉＲＮＡ発現ベクターには，ｐＢＡｓｉシリーズ，ｐＳＩＮｓｉシリーズ，ｐＳＩＮｓｉ−ＤＫシリーズ（タカラバイオ）のように市販されたものがあることから，例えば，これら市販のものを用いることで，ｓｉＲＮＡ発現ベクターにより形質転換した遺伝子ノックアウトマウス細胞を容易に作成することができる。
【００２４】
本発明において，組換え体ヒトリソソーム酵素を製造するために用いられる遺伝子ノックアウト細胞は，１又は複数の内因性のリソソーム遺伝子を破壊した細胞であるが，特に，組換え体ヒトリソソーム酵素に対応する同一種類の酵素をコードする遺伝子を破壊した細胞が最も好適に用いられる。例えば，組換え体ヒトイズロン酸２−スルファターゼを製造する場合には，少なくとも内因性のヒトイズロン酸２−スルファターゼ遺伝子を破壊した細胞を使用することが好ましい。何故ならば，そのような対応する同一種類の内因性の酵素が，製造しようとする組換え体ヒトリソソーム酵素と最も性質が類似しており，精製工程で分離除去することが困難だからである。
【実施例】
【００２５】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。【００２６】
〔組換え体ヒトイズロン酸２−スルファターゼ発現用ベクターの構築〕
ヒトイズロン酸２−スルファターゼの翻訳領域の全長（ＤＮＡ配列を配列番号１に，それがコードするアミノ酸配列を配列番号２に示す。最初の２５アミノ酸よりなる部分はリーダーペプチドである。）を含むｃＤＮＡを，ヒト胎児肝臓由来のｃＤＮＡライブラリー (Clontech社) を鋳型としてＰＣＲ法により増幅し，これを発現ベクターpCI-neo (Promega社) のクローニングサイトにDNA ligation kit ver.2 (Takara社)を用いて結合させて，ヒトイズロン酸２−スルファターゼ発現用ベクターpCI-neo (I2S)とした。【００２７】
〔組換え体ヒトイズロン酸２−スルファターゼ発現用形質転換細胞の樹立〕
前記発現用ベクター（２μｇ）を，Lipofectamine2000 (Invitrogen社)を用いて，ＣＨＯ細胞(CHO-K1系：理化学研究所より購入)１×１０7個に慣用の方法でトランスフェクトして導入し，更に，１０％の牛胎仔血清(FBS)とG418 (SIGMA社)を０．８ｍｇ／ｍＬ含むHam-F12培地（Invitrogen社)で選択培養をし，ネオマイシン耐性能を獲得した形質転換細胞を得た後，細胞クローニングにより安定した高生産株を選択した。次に，細胞を無血清浮遊培養に馴化させるため，Ｌ−グルタミン４ｍＭ，ヒポキサンチン１０ｍｇ／Ｌ，チミジンを４ｍｇ／Ｌ，G418を１２０ｍｇ／Ｌ添加した市販の無血清培地EX-CELL302培地(JRH社)で細胞の増殖が安定するまで継代培養を行った。増殖が安定した細胞を，１０％のDMSOを含むHam-F12培地に懸濁させて液体窒素中に保存し，種細胞とした。【００２８】
〔組換え体ヒトイズロン酸２−スルファターゼ発現用形質転換細胞の前培養〕
前記種細胞を，２×１０５個／ｍＬの濃度に希釈してL-グルタミン４ｍＭ，ヒポキサンチン１０ｍｇ／Ｌ，チミジンを４ｍｇ／Ｌ，G418を１２０ｍｇ／Ｌ添加したEX-CELL302培地(JRH社)で３７℃で５％ＣＯ２存在下で培養し，４×１０１０個の細胞が得られるまで，３〜５日毎に継代した。【００２９】
〔本培養〕
前記の前培養で得られた細胞を，約２×１０５個／ｍＬの細胞濃度となるように２００Ｌのジャーファーメンター(Able社)に移し，１００ｒｐｍで攪拌しながら，３７℃で５％ＣＯ2存在下で培養した。通気は上面及び液内通気で行い，溶存酸素量を７０％と設定した。培養中，培地中のグルコース濃度をモニターし，グルコース濃度が９．５ｍｍｏｌ／Ｌ以下となった時点で，終濃度が１９ｍｍｏｌ／Ｌとなるように，０．３ｇ／Ｌグルコース溶液を添加した。また，培養開始から，７２時間，１２０時間，１６８時間後に，Ｌ−グルタミン４ｍＭ，インスリンを１０ｍｇ／Ｌ添加したEX-CELL302培地を２００ｍＬ添加した。培養開始９日後に本培養を終了した。【００３０】
〔組換え体ヒトイズロン酸２−スルファターゼの精製〕
細胞培養液を回収し，ゼータプラスＴＭフィルターカートリッジ90MZ03M（３Ｍ社）を用いて細胞を除去し，更に0.22μｍフィルターでろ過して，培養上清を得た。回収した培養上清に，６Ｎ
ＨＣｌを添加して，培養上清のｐＨを4.3に調整し，沈殿物をフィルターろ過して除去した。この培養上清を，カラム体積の４倍量の50ｍＭ酢酸ナトリウム／150ｍＭ ＮａＣｌ（pH4.3）溶液で平衡化した，疎水性相互作用及び水素結合に基づく選択性を併せ持つ陽イオン交換カラムであるCaptoMMCカラム（カラム体積；約6.3Ｌ）に，150ｃｍ／時の線流速で負荷し，吸着させた。引き続き同流速で，カラム体積の４倍量の50ｍＭ酢酸ナトリウム／150ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ4.3）溶液でカラムを洗浄した後，カラム体積の５倍量の50ｍＭ酢酸ナトリウム／150ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ5.1）溶液で吸着タンパク質を溶出した。【００３１】
次いで，ウイルス不活化工程として，上記のCaptoMMCカラム溶出画分に，最終濃度が各々0.3％(v/v)及び１％(w/v)となるようにトリ−ｎ−ブチルリン酸（TNBP）及び Tween80を添加して，室温で６時間静置した。上記のウイルス不活化処理をしたCaptoMMCカラム溶出画分に，６Ｎ ＮａＯＨを添加してｐＨを7.0に調整した。【００３２】
この溶出画分を，カラム体積の４倍量の20ｍＭリン酸ナトリウム／150ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ7.0）溶液で平衡化した，Q-Sepharoseカラム（カラム体積；約6.3Ｌ）に，150ｃｍ／時の線流速で負荷し，吸着させた。引き続き同流速で，カラム体積の４倍量の20ｍＭリン酸ナトリウム／150ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ7.0）溶液でカラムを洗浄した後，カラム体積の５倍量の20ｍＭリン酸ナトリウム／400ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ7.0）溶液で吸着タンパク質を溶出した。【００３３】
次に前記Q-SepharoseFFカラム溶出画分を限外ろ過膜濃縮（排除限界分子量8,000）で濃縮した。これを，20ｍＭリン酸ナトリウム／150ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ6.0）で平衡化したSuperdex 200ｐｇカラム（カラム体積；約19Ｌ，Amersham社）に適用してゲルろ過し，組換え体ヒトイズロン酸２−スルファターゼの精製品を得た。【００３４】
〔組換え体ヒトイズロン酸２−スルファターゼ精製品の分析〕
高速液体クロマトグラフィーはＬＣ-10ＡSystem,SPD-10AV UV/VIS Detector（島津製作所）を用いて実施した。CHEMCOSORB 300-7C4（4.6ｍｍ径Ｘ50ｍｍ長，ケムコ社）を，０．１％トリフルオロ酢酸を含む２５％アセトニトリル溶液で平衡化した。これにサンプルを負荷し，アセトニトリル濃度を段階的に２５％から８０％に上昇させて溶出した。検出は214ｎｍの吸光度を測定することにより行った。高速液体クロマトグラフィーの結果，ヒトイズロン酸２−スルファターゼの主要ピーク（図１中ピークＡ）の他に，複数のピーク（図１中ピーク１〜７）が出現した。これらを個別に分取し，Ｎ末端配列を分析したところ，ピーク４は，ＣＨＯ細胞に由来するチャイニーズハムスターのイズロン酸２−スルファターゼと考えられること，ピーク６の一部はチャイニーズハムスターのＮアセチルグルコサミン６スルファターゼ，ピーク７の一部はチャイニーズハムスターのアリルスルファターゼＡ及びチャイニーズハムスターのα−ガラクトシダーゼＡであることがわかった。ピーク１〜３は分析されなかった。これらの結果は，ＣＨＯ細胞中で組換え体ヒトリソソーム酵素を発現させることにより，本来リソソームに局在すべきチャイニーズハムスターのリソソーム酵素が，組換え体ヒトリソソーム酵素とともに培地中に分泌され，精製の過程で分離されずに，ヒトリソソーム酵素の精製品に混入することを示すものであった。このような現象が起こることは，従来知られておらず驚くべく結果であった。【００３５】
このように，ヒトリソソーム酵素の精製品に，微量であれヒトとは異種の哺乳動物細胞由来のタンパク質が混入することは，かかる精製品が医薬品として患者に静脈注射等により投与されることを考えると，免疫反応を引き起こし，重大な副作用の原因となることが予想され，排除すべきことである。【００３６】
しかしながら，リソソーム酵素の構造は哺乳動物細胞間で保存されており，その性質も近似する。従って，ヒトリソソーム酵素と異種のリソソーム酵素，例えばチャイニーズハムスターのリソソーム酵素を，完全に分離することは困難であると考えられた。【００３７】
〔イズロン酸２−スルファターゼ遺伝子ノックアウト細胞の作成〕
ＳＶ４０プロモーターの下流にネオマイシン耐性遺伝子を配置し，更にその下流にＳＶ４０ポリＡシグナル配列を配置させたネオマイシン耐性遺伝子カセット（約2.2ｋｂ）を，ＣＨＯ細胞の内因性のイズロン酸２−スルファターゼ遺伝子の翻訳領域の外側の5’側ゲノム配列(約1.4kb)と翻訳開始コドンの3’側のゲノム配列(約2.5kb)の間に挿入した全長約6.1ｋｂのDNA断片を用いて，相同組換え法により，内因性のイズロン酸２−スルファターゼ遺伝子を破壊することができる。遺伝子が破壊された細胞は，ネオマイシンを添加した培地で選択することができるので選択が容易である。遺伝子の破壊は，ノーザンブロッティング法により確認することができ，相同染色体に各々存在するイズロン酸２−スルファターゼ遺伝子が両方とも破壊された細胞を選択することができる。【００３８】
〔遺伝子ノックアウト細胞を用いた組換え体ヒトイズロン酸２−スルファターゼの作成〕
イズロン酸２−スルファターゼ遺伝子ノックアウトＣＨＯ細胞１×１０７個を，Lipofectamine2000 (Invitrogen社)を用いて，前記発現用ベクター(20μｇ)により慣用の方法でトランスフェクトし，更に，１０％の牛胎仔血清(FBS)とG418(SIGMA社)を０．８ｍｇ／ｍＬ含むHem-F12培地(Invitrogen社)でネオマイシン耐性による選択培養をし，安定した形質転換細胞を得ることができる。次に，細胞を無血清浮遊培養に馴化させるため，Ｌ−グルタミン４ｍＭ，ヒポキサンチン１０ｍｇ／Ｌ，チミジンを４ｍｇ／Ｌ，G418を１２０ｍｇ／Ｌ添加した市販の無血清培地EX-CELL302培地(JRH社)で細胞の増殖が安定するまで継代培養を行い，増殖が安定した細胞を，１０％のFBSと１０％のDMSOを含むHam-F12培地に懸濁させて液体窒素中に保存し，種細胞とすることができる。この種培養を用いて製造した組換え体ヒトイズロン酸２−スルファターゼには，ＣＨＯ細胞の内因性遺伝子由来のチャイニーズハムスターイズロン酸２−スルファターゼが混入することはない。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明によれば，宿主細胞の内因性遺伝子に由来するリソソーム酵素の混入のない組換え体ヒトリソソーム酵素，例えば組換え体ヒトイズロン酸２−スルファターゼを得ることができる。
【図１】
2011108451.tif 000003
【図２】
2011108451.tif 000004
【配列表】
2011108451000001.app
【国際調査報告】
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2011108451.tif 000006
2011108451.tif 000007