(57)【要約】第一及び第二端を有する積層片、通気口、１マイクロリットル未満の流体サンプルを受容するための第一端から始まり通気口に通じる開放経路、開放経路内の第一端近辺で積層片に埋め込まれた作用電極、参照電極及び疑似作用電極、開放経路内において空間的に同一の広がりを持つ３つの電極を覆っている試薬マトリクス、及び積層片の第二端に位置する導電接触部を含む、流体サンプルを検査するための使い捨て電極片。
2005523444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の片端と、第二の片端と、前記第一の片端から離れた位置にある通気口とを有する積層片であって、上にスクライブ線が示され、少なくとも２つの電極経路を形成する導電層が上に置かれている基部層と、前記基部層上に置かれた経路形成層と、前記第一の片端にインレットノッチを有する被覆とを備えた積層片と、
前記第一の片端と前記通気口の間の、１マイクロリットル未満の体積の流体サンプルを収容するような大きさの閉鎖経路であって、前記少なくとも２つの電極経路の各部分を露出する閉鎖経路と、
前記閉鎖経路内の前記基部層上に置かれた、少なくとも１つの酵素、ポリアルキレングリコールである安定剤、及び１つのレドックス媒介物を含有する試薬マトリクスと、
前記第二の片端にあり、前記閉鎖経路から隔離された導電接触部とを備えた、
流体サンプル検査用の使い捨て電極片。
【請求項２】
前記酵素がグルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、及びクレアチニンアミドヒドロラーゼから成るグループから選択される、請求項１に記載の電極片。
【請求項３】
前記レドックス媒介物がフェリシアン化カリウム及び他の無機及び有機レドックス媒介物である、請求項１に記載の電極片。
【請求項４】
前記導電層が金、又は金及び酸化スズである、請求項１に記載の電極片。
【請求項５】
前記基部層、前記経路形成層及び前記被覆がプラスチック誘電性材料で作られている、請求項１に記載の電極片。
【請求項６】
前記閉鎖経路が約０．２マイクロリットルの容積を有する、請求項１に記載の電極片。
【請求項７】
前記被覆が少なくとも１つの面において親水性の被膜を有する、請求項１に記載の電極片。
【請求項８】
前記試薬マトリクスが更に、結合剤、界面活性剤及び緩衝剤のうちの少なくとも１つを含有している、請求項１に記載の電極片。
【請求項９】
前記安定剤がポリアルキレングリコールであり、前記結合剤がセルロース材料であり、前記界面活性剤がポリオキシエチレンエーテルである、請求項８に記載の電極片。
【請求項１０】
前記安定剤がポリエチレングリコールであり、前記結合剤がメチルセルロースであり、前記界面活性剤がｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールであり、前記緩衝剤がクエン酸塩緩衝剤である、請求項９に記載の電極片。
【請求項１１】
前記試薬マトリクスが、約１ｗｔ％から約６．５ｗｔ％の前記レドックス媒介物と、約２．５ｗｔ％の前記安定剤と、約１ｗｔ％の前記結合剤と、約０．０３ｗｔ％の前記界面活性剤と、前記クエン酸塩緩衝剤中の約１ｗｔ％の前記酵素とを含む出発成分を有する混合物から作られている、請求項１０に記載の電極片。
【請求項１２】
前記クエン酸塩緩衝剤が約０．０５Ｍである、求項１１に記載の電極片。
【請求項１３】
前記経路形成層が、前記開放経路に沿った前記流体サンプルの流量を最適化するのに十分な厚さを有する、請求項１に記載の電極片。
【請求項１４】
前記フェリシアン化カリウムが６．５ｗｔ％である、請求項１１に記載の電極片。
【請求項１５】
前記酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項１５に記載の電極片。
【請求項１６】
前記導電層が上に置かれている３つめの電極経路を有し、かつ、前記閉鎖経路が、作用電極、疑似作用電極及び参照電極を含む、請求項１に記載の電極片。
【請求項１７】
前記疑似作用電極が対極である、請求項１６に記載の電極片。
【請求項１８】
前記疑似作用電極がトリガー電極である、請求項１６に記載の電極片。
【請求項１９】
前記疑似作用電極及び前記参照電極の一対が抵抗測定電極対である、請求項１６に記載の電極片。
【請求項２０】
流体サンプル中の検体を検知するあるいはその濃度を測定するための、使い捨て電極片であって、
第一の基部層端及び第二の基部層端を有する絶縁基部層片と、
前記基部層片の１つの面に配置される導電層であって、それぞれ絶縁された３つの電気的に異なる導電経路を示すようスクライブされたパターンを有する導電層と、
前記絶縁基部層片より小さく、前記導電層のかなりの部分を覆う中間絶縁体であって、前記第一の基部層端から離れた位置にあり前記３つの導電経路の一定の部分を露出させている切取部を有する中間絶縁体と、
前記切取部内に配置され、酵素、レドックス媒介物、ポリアルキレングリコールである安定剤、結合剤、界面活性剤及び緩衝剤を含む電極材料と、
流体サンプル経路を形成する前記中間絶縁体を覆う大きさであり、該中間絶縁体と空間的に同一の広がりを持つ被覆層絶縁体であって、前記第一の基部層端と空間的に同一の広がりを持つ第一の被覆層絶縁体端部にインレットノッチと、前記第一の基部層端から離れた位置にあり、前記中間絶縁体の前記切取部の少なくとも一部分を露出させるよう構成された被覆層絶縁体開口とを有する被覆層絶縁体とを備えた電極片。
【請求項２１】
前記流体サンプル経路が約０．２２マイクロリットルの容積を有する、請求項２０に記載の電極片。
【請求項２２】
前記レドックス媒介物が、フェロセン、フェロセン誘導体及びフェリシアン化カリウムから成るグループから選択された少なくとも１つの金属錯体であり、前記安定剤がポリアルキレングリコールであり、前記結合剤がセルロース材料であり、前記界面活性剤がポリオキシエチレンエーテルであり、前記緩衝剤のｐＨが約５から約６である、請求項２０に記載の電極片。
【請求項２３】
前記媒介物がフェリシアン化カリウムであり、前記安定剤がポリエチレングリコールであり、前記結合剤がメチルセルロースであり、前記界面活性剤がｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールであり、前記緩衝剤がクエン酸塩緩衝剤である、請求項２２に記載の電極片。
【請求項２４】
前記電極材料が、約６．５ｗｔ％の前記フェリシアン化カリウムと、約２．５ｗｔ％の前記ポリエチレングリコールと、約１ｗｔ％の前記メチルセルロースと、約０．０３ｗｔ％の前記ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールと、前記クエン酸塩緩衝剤中の約１ｗｔ％の前記酵素とを含む出発成分を有する混合物から作られる、請求項２３に記載の電極片。
【請求項２５】
前記酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項３４に記載の電極片。
【請求項２６】
前記流体サンプル経路が、作用電極、疑似作用電極及び参照電極を収容している、請求項２０に記載の電極片。
【請求項２７】
前記疑似作用電極が対極である、請求項２６に記載の電極片。
【請求項２８】
前記疑似作用電極がトリガー電極である、請求項２６に記載の電極片。
【請求項２９】
前記疑似作用電極及び前記参照電極の対が抵抗測定電極対である、請求項２６に記載の電極片。
【請求項３０】
使い捨てバイオセンサの製造方法であって、
電極端と基部層の長さに沿って少なくとも２つの細長い導電性コンジットを形成する電気接触端とを備えた細長い基部層の１つの面に配置された導電性被膜に、複数のスクライブ線をスクライブにより形成し、前記複数のスクライブ線が、前記少なくとも２つの導電性コンジットのL字型の第一コンジットと、該第一コンジットに近接する第二コンジットとを示し、前記第一コンジットのL字型端部及び前記第二コンジット端部は、前記基部層の長さの中央軸と軸方向に整列されていて、前記電極端の近くに位置していることと、
前記基部層の前記導電性被膜上に経路形成層を配置し、該経路形成層は、前記第一コンジットのL字型の部分及び前記第二コンジットの部分を露出させるような大きさの中央の細長い経路を規定するU字型端部分を有し、かつ、前記少なくとも２つの細長いコンジットのそれぞれの部分が前記電気接触端で露出されるように、前記経路形成層が前記基部層より短くされていることと、
前記第一及び第二コンジットの露出部分を覆う前記中央経路に、混合試薬を加え、該混合試薬は、酵素の基質に関わる反応に対して触媒作用を及ぼすことができる酵素を含有することと、
試薬マトリクスを形成する前記混合試薬を乾燥させることと、
前記経路形成層上に最上層を配置し、該最上層は、前記電極端から離れた位置に通気口と前記電極端にインレットノッチとを有し、かつ、前記U字型端部分にインレット及び毛管空間を形成し、前記通気口は、前記インレットの反対側の前記毛管空間の端に前記中央経路の部分を露出させ、前記ノッチは、前記インレットに前記中央経路の部分を露出させることと、を含む方法。
【請求項３１】
前記最上層の前記電極端にノッチを形成し、該ノッチは前記インレットに位置することを更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
レドックス媒介物、安定剤、結合剤、界面活性剤、緩衝剤を混合することにより前記混合試薬を生成することを更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
各センサが少なくとも作用電極、参照電極、及び試薬マトリクスを有し、該試薬マトリクスは、酵素の基質に関わる反応に対して触媒作用を及ぼすことができる酵素を含有し、該作用電極及び該参照電極は、流体サンプルを測定するための流体サンプル経路内に配置されてなる複数の使い捨てセンサの製造方法であって、
導電材料の層が上に配置されている、第一端及び第二端を有する絶縁材料の基部層片を用意することと、
前記導電材料に反復パターン状の複数の線をスクライビングにより形成し、該複数の線は、各反復パターン内に少なくとも２つの導電経路を形成することができる反復パターンを含み、かつ、前記少なくとも２つの導電経路のうちL字型の第一コンジットと、該第一コンジットに近接する第二コンジットとを示し、前記第一コンジットのL字型端及び前記第二コンジット端は、前記基部層の長さの中央軸と軸方向に整列していて、前記電極端の近くに位置されていることと、
前記基部層片上に絶縁材料の中間層を配置し、該中間層は、細長い切取部の反復パターンを有し、該反復パターンのそれぞれの各切取部は、各反復パターンの少なくとも２つの導電経路のそれぞれの電極部を露出させ、前記細長い切取部の前記反復パターンは、前記基部層片の前記第一端から離れた位置にあり、前記中間層は、前記基部層片の前記第二端と距離を置いて、各反復パターンの前記２つの導電経路のそれぞれの接触部を露出させる大きさにすることと、
前記反復パターンの各細長い切取部内に試薬材料を置き、該試薬材料は、ポリアルキレングリコール安定剤を含むことと、
各前記細長い切取部内の前記試薬材料を凝固させるのに十分な温度及び時間で、該試薬材料を乾燥させることと、
前記中間層を覆い、該中間層と空間的に同一の広がりを持つように絶縁材料の最上層を配置し、該最上層は、反復パターンに複数の通気口及び穴を形成するノッチを有し、通気口のそれぞれは、前記中間層の前記細長い切取部の、前記基部層片の前記第一端から最も離れた部分に対応する反復パターンの一部分を露出させ、穴を形成するノッチのそれぞれは、前記細長い切取部の、前記基部層片の前記第一端に最も近い部分に対応する反復パターンの一部分を露出させ、前記基部層片、前記中間層、及び前記最上層が積層片を形成するようにすることと、
前記積層片の前記第一端に沿って、該第一端と平行に所定の距離を切り取って、前記反復パターンのそれぞれに対する前記最上層の前記細長い切取部及びインレットノッチのそれぞれにサンプル注入口を形成することと、
前記積層片の前記第二端に沿って、該第二端と平行に所定の距離を切り取って、前記反復パターンのそれぞれについて２つの別個の接触部を形成することと、
前記反復パターンのそれぞれを、前記積層片に沿って所定の間隔で分離することと、を含む方法。
【請求項３４】
レドックス媒介物、前記安定剤、結合剤、活性剤、緩衝材、及び前記酵素を混ぜて、試薬材料を形成する、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の技術分野
本願発明は、概して、液体サンプル中の特定の成分即ち検体を定量化するために使用することが可能な電気化学センサに関する。特に、本発明は、新しい改良型の電気化学センサ及び電気化学センサを製造する新しい改良型の方法に関する。より明確には、本発明は、製造が安価にできる使い捨て電気化学センサに関する。更に明確には、本発明は、正確な読み取り値を与え、わずか０．２マイクロリットル程度の流体サンプルを必要とするに過ぎない使い捨て電気化学センサに関する。更に、一層明確には、本発明は、生理的流体中の検体の正確な定量のための電気化学分析を行うために使用することが可能な使い捨て電気化学センサに関する。
２．先行技術の説明
流体中の種々の検体の濃度を定量するにあたり、バイオセンサが、３０年以上もの間使用されてきた。特に、関心の的となっているのは、血糖の測定である。血糖濃度が、恒常性を維持するために極めて重要であることは周知である。人の血糖値、即ちグルコースレベルの変動を測定する製品は、国内の何百万という糖尿病患者の多数にとって、日常的必需品となっている。この疾患は、血液化学における危険な異常を引き起こす可能性があり、失明や腎不全の一因になると考えられていることから、大多数の糖尿病患者は、自ら周期的に検査を行い、通常はインスリン注射によって、自らのグルコースレベルを適宜調整する必要がある。血糖濃度が正常範囲を下回れば、患者は意識不明や血圧の低下といった死につながる危険性さえある状態に陥るおそれがある。一方、血糖濃度が正常範囲を超えて高くなった場合には、失明、腎不全、血管疾患につながりうる。このため、血糖値の測定は、インスリン療法によって自らの血糖値をコントロールする糖尿病患者にとって、日々不可欠な事となっている。
【０００２】
インスリン依存性患者は、自らの血糖値を一日に４回程度チェックするよう医者から指示を受ける。通常の生活スタイルを頻繁なグルコースレベル測定の必要性に順応させるため、全血検査用試薬ストリップの開発に伴って、家での血糖値テストが可能となった。
【０００３】
血糖バイオセンサの一つのタイプは、グルコースが存在する際に酵素と電極との間で電子を往復させることによって測定可能な電流信号をもたらす媒介組成物と組み合わされた酵素電極である。最も一般的に使用される媒介物は、フェリシアン化カリウム、フェロセン及びその派生物と、その他の金属複合体である。この第二のタイプの電極に基づく多くのセンサが開示されて来た。
【０００４】
しかしながら、現存する先行技術による装置の大部分は、２マイクロリットルよりも多量の検査サンプルを必要とする。この量の検査サンプルは、例えば、針や注射器を使用して、又は有用なサンプル量を得るために、指先等の皮膚の一部を切開してその部位から“絞り出す”ことによってのみ、患者から採取することが可能である。これらの処置は、特に、頻繁なサンプル採取が必要とされる場合には、患者にとって不便なものであり、しばしば痛みを伴うものでもある。サンプルを得るためにより痛みの少ない方法として、腕や腿といった神経終末の密集度が少ない部位を切開するものが知られている。しかしながら、腕や腿といった体の部位を切開しても、通常はサブマイクロリットルのサンプル量の血液を得られるに過ぎない。なぜなら、これらの部位は、表面付近にたくさんの毛細血管を有していないからである。本発明は、わずか０．２マイクロリットルの血液を必要とするに過ぎないので、より少ない痛みで指先から採血できるだけでなく、代替の部位から適量の血液サンプルを採取することが可能となる。
【０００５】
先行技術装置の更なる欠点は、それらがより限定された、通常約６００ｍｇ／ｄＬまでの直線範囲を有するに過ぎないことである。更に、それらは、読取り値が得られるまでに、比較的長い待ち時間を必要とする。血液滴の源からサンプル室への血液サンプルの直接採血のための端部または側部インレットを有するバイオセンサの更なる欠点は、インレットが、血液によって不慮に部分的に閉塞されることである。ユーザは、バイオセンサを指や腕といった採血部分に強く押しつけがちである。バイオセンサの毛細血管への入口は小さいため、こうした行為は通常または部分的にインレットを閉塞する。その結果、（１）血液は毛管経路に全く入らない、（２）血液は部分的に経路に入るが、十分には充填されない、（３）血液は非常に緩慢に毛管経路を充填する。(１)の場合、メータは起動されず、読み取りが行われないかもしれない。（２）及び(３)の場合、メータは起動されないか、始動されても、サンプルが不十分または毛管充填動作が緩慢なため、不正確なテスト結果になるかもしれない。
【０００６】
正確なグルコース読取り値を得ることの重要性から、上述のような全ての欠点を伴わない、信頼性が高く、使用者にとって扱い易いバイオセンサを開発することは、大いに望ましいことであろう。
【０００７】
従って、必要とされる物は、先行技術によって従来必要とされてきた量よりも少ないサンプル量を必要とする電気化学センサである。更に、必要とされる物は、広範囲な直線測定範囲を有する電気化学センサ、即ち、より広範囲なグルコース濃度に対して使用可能なセンサである。その上必要とされる物は、定常応答が明らかになるまでの待ち時間が比較的短い電気化学センサである。また、必要とされる物は、電気化学センサのサンプル室へのサンプルの導入を容易にする改良型インレットポートを有する電気化学センサである。
発明の要約
本発明の一つの目的は、酵素と媒介物とを結み合わせた改良型電気化学センサを提供することである。本発明の更なる目的は、先行技術によって従来必要とされてきたよりも少量のサンプル量を必要とする電気化学センサを提供することである。本発明の更に別の目的は、サンプル経路における網状層を使用することなく、少量のサンプルを測定することが可能な電気化学センサを提供することである。本発明の更なる別の目的は、広範囲な直線測定範囲を有すると共に、定常応答が明らかになるまでの待ち時間が比較的短い電気化学センサを提供することである。本発明の更なる目的は、サンプルの採取を容易にする改良型インレットポートを有する電気化学センサを提供することである。
【０００８】
本発明は、これらの目的並びにその他の目的を、わずか約０．２マイクロリットルのサンプル量を必要とし、このサンプル量の減少を達成するための手段として、サンプル経路における網状層を使用しない電気化学センサを提供することにより達成する。更に、本発明は、流体サンプル中の検体濃度と非常に密接な相互関係を有する読取り値が、流体サンプルがサンプル経路に入ってから５秒で得られることを可能にする試薬組成物を用いる。
【０００９】
本発明は、長尺の積層体を備え、この積層体は、その一端に設けられた開口と該開口から離して配設された通気口との間で接続されたサンプル流体経路を有する。このサンプル流体経路は、全血等のサンプルのサンプル流体経路内への迅速な流入を最適化するようにその大きさが定められている。流体経路内には、少なくとも一つの作用電極と一つの参照電極とが設けられ、好ましくは、一つの作用電極と、一つの参照電極と、一つの擬似作用電極とを設けることが好ましい。作用電極と参照電極との配置は、電気化学センサから得られる結果の上で重要でない。作用電極、参照電極、及び擬似作用電極は、それぞれ個別の導電性コンジットと電気的に接触している。この個別の導電性コンジットは、積層体の開口経路端と対向する端部にその末端を有すると共に、そこで読取り装置と電気的に接続されるため露出した状態となっている。
【００１０】
積層体は、プラスチック材料から成る基部絶縁層を有する。この基部絶縁層は、その一面に導電層を有する。導電層は、スクリーン印刷によって、又は蒸着によって、又は基部絶縁層に付着し、その基部絶縁層の全体を実質的に覆う導電層を提供する何らかの方法によって、絶縁層上に設けられても良い。蒸着導電層は、当該導電層にエッチング／スクライビング処理を行うことにより、導電性コンジットに分離される。エッチング処理は、化学的に行われても良いし、導電層に機械的に線を刻み付けることによって行われても良いし、レーザーを使用して導電層に線を刻み付けることによって個別の導電性コンジットを形成することで成し遂げられても良いし、あるいは本発明で必要とされる個別の導電性コンジットの間に絶縁をもたらす何らかの手段によって成し遂げられても良い。好ましい導電被膜として、金被膜又は酸化スズ／金被膜組成物／層が挙げられる。
【００１１】
ここで、金被膜又は酸化スズ／金被膜それ自体は、参照電極として作用することは不可能であることが指摘されるべきである。参照電極を作用させるためには、電位が付与された際に、導電性材料側にレドックス反応（例えば、Ｆｅ（ＣＮ）63-＋ｅ-→Ｆｅ（ＣＮ）64-）が起こらなければならない。従って、参照電極として用いられる導電性材料に、レドックスカップルまたは媒介物が存在しなければならない。
【００１２】
本発明に特有の特徴は、測定のために必要とされるサンプル量を少なくするために、対向する作用電極及び参照電極や、それらの間に配設された吸着剤／網状層を使用することなく、わずか０．１０マイクロリットルのサンプル量で測定することが可能なことである。これは、U字型の切取部の幅及び長さを縮小し、薄い中間層を用いることにより実現される。
【００１３】
又、積層体は、基部層の上に中間絶縁層を有する。この中間層は、同じくプラスチック絶縁材料から成ると共に、積層体のサンプル流体経路を形成する。中間層は、その一端にＵ字形の切取部を有し、この切取部は、基部層上の導電性コンジットの電極部を、先に述べた積層体の開口端に対応する開口端でかぶせる役割を果たす。
【００１４】
中間層は、最適な血液流動特性を有する流体経路寸法を維持する一方で、電気化学センサとして用いるのに十分な量の化学試薬を充填するために十分な厚さでなければならない。Ｕ字形切取部は、化学試薬を含む。この化学試薬は、安定剤、結合剤、界面活性剤、及び緩衝剤のうちの少なくとも一つを備えたレドックス媒介物と、自らの基質を巻き込んだ反応に対して触媒作用を及ぼすことが可能な酵素とを有する。レドックス媒介物は、酵素触媒作用反応と作用電極との間で電子を運搬することが可能である。それは又、参照電極を機能させる。
【００１５】
本発明の積層体は、通気口とインレットノッチとを備えた最上層を有する。この通気口は、少なくともその一部が、中間絶縁層の化学試薬の一部を露出させているＵ字形切取部の底部上をかぶせるように配置されている。この通気口により、サンプル流体が積層体の開口端から入り込んだ時、サンプル流体経路内の空気が逃がされる。インレットノッチは、インレットの上層部にすき間を設けることにより、インレットを介したサンプル摂取を容易にする。そのすき間は、センサのインレット端部と連通する。サンプルインレットポートが指等の血液サンプル源によって偶発的にふさがれた場合、インレットノッチはサンプル流体を受けるために開いたままである。
【００１６】
サンプル流体は、通常、毛管現象によってサンプル流体経路を満たす。少量の状態では、毛管現象の程度は、毛管現象を起こしている流体と接触した表面の疎水性／親水性の性質に左右される。これは、物質のぬれ性としても知られている。毛管力は、親水性絶縁材料を用いて最上層を形成することによって、あるいは積層体の開口端と最上層の通気口との間のサンプル流体経路と向き合った最上層領域において、疎水性絶縁材料の一面の少なくとも一部を親水性の物質でコーティングすることによって、高めることができる。これは、最上層の一面全体を親水性物質でコートした後、第二中間層に接着しても良いと解釈されるべきである。
【００１７】
サンプル流体経路内に配置された電極部は、作用電極（Ｗ）と、参照電極（Ｒ）と、擬似作用電極（Ｗ0）とのための試薬材料を含む。試薬混合物は、流体経路内に配置され、そのため基部絶縁層及び導電性コンジットの電極部を覆う。十分な量の試薬混合物が、中間絶縁層のＵ字形切取部内に配設され、Ｕ字形切取部によって輪郭を形成された導電性表面全体を実質的に覆う。乾燥させることで作り出される試薬マトリクスが電気化学センサとして用いるのに十分であると共に、流体経路を介して迅速な血液の流動を許容するのに十分な空きスペースが試薬マトリクス上に提供されるように、使用される試薬混合物の量が決められる。試薬マトリクスは、安定剤、結合剤、界面活性剤、緩衝剤のうちの少なくとも一つを備えたレドックス媒介物と、自らの基質を巻き込んだ反応に対して触媒作用を及ぼすことが可能な酵素とを有する。
【００１８】
サンプル流体経路内の可能な電極配置は、積層体の開口端から通気口までの間に配置される電極配置順序として、Ｗ−Ｒ−Ｗ0、Ｗ−Ｗ0−Ｒ、Ｒ−Ｗ−Ｗ0、Ｒ−Ｗ0−Ｗ、Ｗ0−Ｗ−Ｒ、Ｗ0−Ｒ−Ｗで表される順序のいずれであっても良い。好ましい配置は、Ｗ−Ｒ−Ｗ0、つまり、サンプル流体が積層体の開口端から入り込んだ後、最初にＷを、その後Ｒを、更にその後Ｗ0を覆って行く配置であることが見い出されている。
【００１９】
擬似作用電極Ｗ0は、サンプル流体が最後にそこに到達するように配置される。このため、Ｗ0で結果的に生じた電流によって読取りメータが起動され、測定及び検体濃度定量工程を開始する。こうした配置によって、不十分なサンプル流体量のために引き起こされる信頼性及び精度に関する問題が取り除かれる。Ｗ0が又、対極としても使用可能であることが指摘されるべきである。結果として生じる三つの電極システム（即ち、作用電極、参照電極、及び対極）は、大きいＩＲ降下を有するサンプル流体の場合に使用される。また、いずれの二つの電極間の電気抵抗は、血液サンプルのヘマトクリットを算出し、それによってヘマトクリット干渉を補正するために用いることも可能であると指摘されるべきである。
【００２０】
本発明の全ての利点は、以下の詳細な説明、図面及び付随のクレームを検討することによって、より明確にされるであろう。
好ましい実施例の詳細な説明
本発明の好ましい実施例を、図１から４に示す。図１は、本発明のセンサ１０を示す。センサ１０は、積層体１００と、流体サンプル抽出端１１０と、電気接触端１２０と、通気口４２とを備える。流体サンプル抽出端１１０は、サンプル抽出端口１１４と通気口４２との間にサンプル流体経路１１２を備える。また、サンプル抽出端１１０は、インレットノッチ４４を備える。電気接触端１２０は、３つの目立たない導電接触部１２２、１２３、１２４を備える。
【００２１】
図２では、積層体１００が、基部絶縁層２０と、中間層３０と、最上層４０とから構成されている。全ての層は、誘電性材料、好ましくはプラスチックから作られる。好ましい誘電性材料の例としては、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ナイロン、ポリウレタン、硝酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、ポリエステル、アクリル、ポリスチレンである。基部絶縁層２０は、導電層２１を有し、その上に第一導電コンジット２２と第二導電コンジット２３と第三導電コンジット２４とが描かれている。導電コンジット２２、２３、２４は、図２にスクライブ線２７及び２８として示されるように導電層２１にスクライビングまたはスコアリングを行うことにより形成されてもよいし、あるいは、導電コンジット２２、２３、２４を基部層２０上にシルクスクリーン捺染することにより形成されてもよい。導電層２１のスクライビングまたはスコアリングは、導電層２１を機械的に十分にスクライビングすることにより、３つの独立した導電コンジット２２、２３、２４を生成するものであってもよい。本発明の好ましいスクライビングまたはスコアリング法は、炭酸ガス（ＣＯ２）レーザか、ＹＡＧレーザか、エキシマレーザを用いて行われる。雑音信号を発生させることがある潜在的な静電気の問題を回避するため、余分なスコアリング線２９（説明のためだけに拡大されていて実際の寸法にはなっていない）が基部層２０の外縁に沿って設けられていてもよい。なお、スコアリング線２９は、センサ１０を機能させるのに必要なものではない。導電層２１は、どんな導電材料からできていてもよいが、金または酸化スズ／金からなるのが好ましい。基部層２０に使用できる材料は、酸化スズ／金ポリエステルフィルム（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＦＭ−１）または金ポリエステルフィルム（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＦＭ−２）である。これらのフィルムは、カリフォルニア州カノガパークのコートールズパフォーマンスフィルムズ（Ｃｏｕｒｔａｕｌｄｓ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｆｉｌｍｓ）により販売されている。
【００２２】
中間層３０は、中間層センサ端３１に位置するＵ字型の経路切取部３２を有する。U字型の切取部は、レーザや型抜きによって形成される。経路切取部３２の長さは、中間層３０を基部層２０の上に重ねた時、電極領域Ｗ、Ｒ、Ｗ０が経路切取部３２により規定される空間内に収まる程のものにする。中間層３０の厚さは、毛管経路の量やサンプル流体経路１１２に流れ込むサンプル流体の速さにとって重要であることがわかった。サンプル流体経路１１２は、サンプル流体の毛管現象により満たされる。経路切取部３２は、作用電極と参照電極と擬似作用電極とを形成する試薬マトリクス５０を保持している。試薬マトリクス５０は、図３により明瞭に示されている。通常、試薬マトリクス５０には、参照電極を機能させるためにレドックス媒介物を供給しなければならない。Ｒにレドックス試薬又は媒介物が供給されていないと、作用電極Ｗ及びＷ０は機能しない。電極領域Ｗ、Ｗ０、Ｒには、同じ化学試薬が供給されるのが好ましい。試薬には、酸化型のレドックス媒介物、安定剤、結合剤、界面活性剤、緩衝剤、酵素が含まれるのが好ましい。通常、レドックス媒介物は、フェロセン、フェリシアン化カリウム、その他のフェロセン誘導体、その他の有機及び無機レドックス媒介物のうちの少なくとも１つである。好ましい安定剤は、ポリエチレングリコールであり、好ましい結合剤は、メチルセルロースであり、好ましい界面活性剤は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールであり、好ましい緩衝剤は、クエン酸塩緩衝剤である。酵素は、当該酵素の基質、或いは、酵素に対して触媒としての反応性を有する基質に関わる反応に対して触媒作用を及ぼすことができる。また、媒介物は、酵素触媒反応と作用電極との間で電子を運搬することができ、その結果、酵素または基質の活性及び混合物に対応した電流を生成させる。酵素は、ブドウ糖酸化酵素、乳酸酸化酵素、コレステロールオキシダーゼ、またはクレアチニンアミドヒドロラーゼであってもよい。
【００２３】
中間層３０の上に配置され、中間層３０と空間的に同一の広がりを持つ最上層４０は、流体経路１１２内のサンプル流体が完全に電極領域Ｗ、Ｒ、Ｗ０を覆うように、センサ１０の流体サンプル抽出端１１０から離れて配置される通気口４２を備える。通気口４２は、中間層３０の経路切取部３２の底部にある程度その位置が合うよう最上層４０に設けられる。ここで、底部とは、センサ端３１から最も離れた箇所に位置する経路切取部３２の部分を意味する。通気口４２は、中間層３０のＵ字型切取部３２の一部を露出させると共に、Ｕ字型切取部３２の底部と部分的に重なるのが好ましい。
【００２４】
最上層４０は、センサ１０の流体サンプル抽出端１１０にインレットノッチ４４を有する。インレットノッチ４４は、サンプル流体経路１１２でのサンプルの供給を容易にするために設けられている。サンプルノッチ４４がなければ、サンプル抽出端口１１４が偶発的にふさがれ、その結果サンプル流体の流体経路１１２への侵入が阻まれることがある。サンプルノッチ４４はどのような形状でもよく、図のような半円に限定されない。通気口及びインレットノッチは、レーザや型抜きによって形成することができる。
【００２５】
図３に、本発明の各種層の拡大断面図を示す。これらの層は、本発明の各構成要素の関係、特にはスクライブ線２７及び２８、が当業者によりよく理解されるようにするため、同一縮尺にはなっていない。
電極試薬マトリクスの調合
電極試薬マトリクスは、酸化型のレドックス媒介物、安定剤、結合剤、界面活性剤、緩衝剤、酵素を含む。酸化型のレドックス媒介物であるフェリシアン化カリウムは、マトリクスにおいて安定していることがわかった。適当なフェリシアン化カリウムは、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で購入できる（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ３６６７）。製剤に使われる量は、使用可能な直線範囲を得るのに十分でなければならない。酵素はまた、十分な活性、純度、安定性を有していなければならない。市販のグルコースオキシダーゼは、カリフォルニア州サンディエゴのバイオザイム（Ｂｉｏｚｙｍｅ）からＣａｔ．Ｎｏ．Ｇ０３Ａとして購入可能であり、およそ２７０Ｕ／ｍｇ必要である。安定剤は、水に十分に溶けかつ媒介物と酵素の両方を安定化できなければならない。好ましい安定剤は、ポリエチレングリコール（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４３３８、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））である。結合剤もまた、電極領域Ｗ、Ｒ、Ｗ０における試薬マトリクス中の他の全ての化学製品を基部層２０の導電面／層２１に結合できなければならない。好ましい結合剤は、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  ６０  ＨＧ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６４６５５、ウィスコンシン州ミルウォーキーのフルカケミカル（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ））である。緩衝剤溶液は、酵素による反応を最適化するために十分な緩衝力及びｐＨ値を有していなければならない。０．０５Ｍのクエン酸塩緩衝剤が好ましい。クエン酸塩緩衝剤を生成するのに使用されるクエン酸およびクエン酸ナトリウムは、シグマケミカルから購入できる。界面活性剤は、試薬マトリクスを形成するのに使用される乾燥した化学試薬を迅速に溶解させると共に、経路切取部３２への電極反応マトリクスの注入を促進するのに必要である。界面活性剤の量及び種類は、先に記載した機能を確実に果たし、酵素への変性効果を避けるものが選ばれる。好ましい界面活性剤は、ウィスコンシン州ミルウォーキーのフルカケミカル（Ｃａｔ．Ｎｏ．９４４４３）から購入可能なＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。試薬マトリクスは以下のように試薬配合を行うことにより得られる。
【００２６】
ステップ１：クエン酸０．１５１２グラムとクエン酸ナトリウム１．２５８０グラムとを純水１００ｍｌに溶かすことにより、５０ｍＭのクエン酸塩緩衝剤を調合する。
ステップ２：ｍｅｔｈｏｃｅｌ１グラムをステップ１のクエン酸塩緩衝剤１００ｍｌに入れて１２時間かき混ぜることにより１％のｍｅｔｈｏｃｅｌ  ６０ＨＧ溶液を調合する。
【００２７】
ステップ３：ｍｅｔｈｏｃｅｌ溶液に１０％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を０．３ｍｌ加える。
ステップ４：ポリエチレングリコール２．５グラムをステップ３の溶液に加える。
【００２８】
ステップ５：かき混ぜながら、フェリシアン化カリウム６．５グラムをステップ４の溶液に加える。
ステップ６：ステップ５の溶液にグルコースオキシダーゼ１．０グラムを加え、１０分間あるいは全ての固形物が完全に溶解するまでかき混ぜる。
電極の組み立て
コートールズパフォーマンスフィルムズから購入可能な金または酸化スズ／金ポリエステルフィルムの断片を、図２に示したような、センサ１０の基部層２０を形成するような形に切断する。金または酸化スズ／金ポリエステルフィルムのスコアリングを行うのにはＣＯ２レーザ（カリフォルニア州サンディエゴのシンラッド社（Ｓｙｎｒａｄ，Ｉｎｃ．）で購入可能な２５Ｗレーザ）が使われる。図２に示したように、流体サンプル抽出端１１０の２つの電極と、３つの接触点１２２、１２３、１２４とが電気接触端１２０に形成されるように、フィルムにはレーザによりスコアリングがなされ、スコアリング線２７及び２８が生成される。スコアリング線はとても細いが、２つの別個の導電体を形成するのに十分な太さである。余分なスコアリング線２９は、完成したセンサ１０から雑音信号を生じさせ得る潜在的な静電気の問題をなくすために基部層２０の外縁に沿って入れられるが、必ずしも必要ではない。
【００２９】
ペンシルバニア州グレンロックのアドヒーシブリサーチ（Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で購入可能な両面テープ（Ａｒｃａｒｅ（登録商標）７８４０）の断片をＵ字型経路３２を備えた中間層３０を形成する寸法及び形になるように切断する。その際、テープが、基部層２０の導電層２１の大部分を覆う一方で、図１に示した電気接触端１２０で小さな電気接触領域を露出させるようにする。Ｕ字型経路３２は、ＣＯ２レーザを使用して切断される。その後、中間層３０を基部層２０の上に重ねる。前述のように、この中間層３０はスペーサの役割を果たし、流体サンプル抽出経路１１２の大きさを規定する。また、中間層３０は、電極試薬マトリクス５０を保持する電極領域２６を規定する。その幅及び長さは、比較的すばやく動く流体サンプルに合わせて最適化される。Ｕ字型経路３２の大きさは、幅０．０３９インチ（１．０ｍｍ）程度、長さ０．１３４インチ（３．４ｍｍ）程度である。しかしながら、経路の幅及び長さは、サンプル量が０．１マイクロリットルほどまで短縮してもよい。
【００３０】
１．０マイクロリットルの混合試薬を経路３２に入れて電極Ｗ、Ｒ、Ｗ０を形成する。混合試薬は、レドックス媒介物、安定剤、結合剤、界面活性剤、緩衝剤、酵素の混合物である。好ましい混合試薬の構成は、以下の成分を以下の割合で混合することにより生成される：フェリシアン化カリウム約６．５％、ポリエチレングリコール約２．５％、ｍｅｔｈｏｃｅｌ  ６０  ＨＧ約１％、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００約０．０３％、クエン酸塩緩衝剤（ｐＨ５．７）約０．０５Ｍ、グルコースオキシダーゼ約１％。混合試薬を加えた後、装置を５５℃のオーブンで約２分間乾燥させた。
【００３１】
乾燥後、透明フィルム（３Ｍで購入可能なＣａｔ．ＮＯ．ＰＰ２２００またはＰＰ２５００）の断片で最上層４０を作成する。長方形の通気口４２及び半円形のノッチ４４を先に記載のＣＯ２レーザを使って形成する。通気口４２の好ましい大きさは、０．０３９インチ（１．０ｍｍ）×０．０５１インチ（１．３０ｍｍ）程度である。通気口４２は、センサ１０の流体端１１０からおよそ０．０８７インチ（２．２ｍｍ）の箇所に位置している。半円形ノッチ４４の半径は、約０．０３０インチ（０．７５ｍｍ）で、センサ１０の流体端１１０から陥凹している。最上層４０は、中間層３０上に位置を調整されて重ねられ、図１に示したセンサ１０の組み立てが完成される。
【００３２】
電極の組み立てについての上記の記述は、１つのセンサの組み立てについて記載しているが、その設計及び使用された材料は、図４Ａ−４Ｃに示したような各層の材料の一片から複数のセンサを製造する場合にも適用できるものである。この製造は、比較的大きな断片である基部層２０上に導電層２１を載せることから始められる。スコアリングを行うことで複数の線２７及び２８を導電層２１に入れるが、その際、図４Ａに示したような反復パターンが、前述した好ましいスクライビング法を用いて生成される。これにより、各パターンは、各センサの３つの導電パス２２、２３、２４を最終的に規定する。同様に、図４Ｂに示されている、反復パターンを示す複数の細長い切取部３２が設けられた中間層３０の大きな断片は、基部層２０上に重ねられる。中間層３０の大きな断片は、基部層２０に合う大きさに生成されるが、その際、複数の細長い切取部３２は、３つの異なる電極領域Ｗ、Ｒ、Ｗ０を露出させると共に細片の反対の端に位置する複数の導電接触部１２２、１２３、１２４を露出させるよう、スクライビング線２７及び２８が横断する領域上で位置合わせされる。各切取部の大きさ及び各経路３２に入れられた混合試薬の量は、先に開示したものと同様である。各切取部に混合試薬を入れた後、中間層３０の各細長い切取部３２が試薬マトリクスの薄い層を含むように混合試薬は乾燥される。図４Ｃに示したように、反復パターンの複数の通気口４２とノッチ形成口４４’とを有する、中間層３０に匹敵する大きさであると共に空間的に同一の広がりを有する最上層４０を中間層３０上に重ねる。図４Ｄは複合層の平面図である。３つの層２０、３０、４０によって作成された積層片は、積層片から切り出すことができる複数のセンサ１０を有している。積層片を流体サンプル抽出端２１０で線Ａ−Ａ'に沿って縦に切ると、複数のサンプル抽出孔１１４が形成され、電気接触端２２０で線Ｂ−Ｂ'に沿って縦に切ると、複数の導電接触部１２２、１２３、１２４が形成される。また、積層片を所定の間隔を置いて線Ｃ−Ｃ'に沿って切断すると、複数の個別のセンサ１０が形成される。図１に示したように、各センサ１０の流体サンプル抽出端１２０の成形は好みに応じて実行されてよい。積層片が切り出される順番が重要ではないことは当業者にとっては明らかであろう。例えば、積層片は、所定の間隔（Ｃ−Ｃ'）で切断されてからＡ−Ａ'及びＢ−Ｂ'に沿って切断されてもよい。
【００３３】
広範囲な直線範囲に関するより包括的な記述、すなわち、更なる試験パラメータや実施例とともに本発明の正確かつ最小限のサンプル量の特徴は、米国特許第６，２５８，２２９号に開示されおり、米国特許第６，２５８，２２９号は、全て引用によって本願の中に組み込まれている。
【００３４】
本発明の好ましい実施例を記載してきたが、上述の記載は一例に過ぎない。開示された発明の更なる修正が行われることは、当業者にとって自明であり、本発明の精神と範囲から逸脱することなく修正が行われることは、明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】積層体の開口端、通気口、電気接触点を示す本発明の透視図である。
【図２】積層体をなす種々の層を示す本発明の分解透視図である。
【図３】図１の本発明の断面図である。
【図４Ａ−４Ｃ】複数の本発明のセンサを形成するためのパターンを示す本発明の積層片の細片の断片の平面図である。
【図４Ｄ】複数の本発明のセンサを形成するパターンを示すための本発明の積層片の断片の平面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【国際調査報告】
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