【手続補正書】
【提出日】令和2年3月9日(2020.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットであって、
（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むターゲティング領域ならびに当該ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド；および、
（ｉｉ）前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域における配列と相補的な配列を含む活性化領域を含む第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ここで、前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域と前記第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域は、互いにハイブリダイズして活性化二重鎖領域を形成することが可能であり、ここで、当該活性化二重鎖領域は、ＤＮＡとステムとバルジを含み、そして、ここで、当該活性化二重鎖領域はＣａｓ９と結合することが可能である；
を含む、セット。
【請求項２】
前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該ターゲティング領域は、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む、請求項１に記載の二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセット。
【請求項３】
当該活性化二重鎖領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセット。
【請求項４】
当該活性化二重鎖領域は、下方ステム、バルジ、および上方ステムを含む、請求項１に
記載の二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセット。
【請求項５】
（ｉ）二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットであって、
（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むターゲティング領域ならびに当該ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド；および、
（ｂ）前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域における配列と相補的な配列を含む活性化領域を含む第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ここで、前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域と前記第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域は、互いにハイブリダイズして活性化二重鎖領域を形成することが可能であり、ここで、当該活性化二重鎖領域は、ＤＮＡとステムとバルジを含み、そして、ここで、当該活性化二重鎖領域はＣａｓ９と結合することが可能である；
を含む、セット、および、
（ｉｉ）Ｃａｓ９
を含む、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項６】
当該活性化二重鎖領域は、下方ステム、バルジ、および上方ステムを含む、請求項５に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項７】
前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該ターゲティング領域は、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む、請求項５に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項８】
当該活性化二重鎖領域は、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む、請求項５に記載のクラス２
ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項９】
当該活性化二重鎖領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項５に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項１０】
ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項５に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項１１】
生物、分離された細胞、またはインビトロでの標的核酸分子を修飾する方法であって、前記方法は：
細胞に、
（ｉ）二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットであって、
（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むターゲティング領域、ここで当該ターゲティング領域は標的核酸内の標的配列にハイブリダイズするように構成されている、ならびに当該ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド；および、
（ｂ）前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域における配列と相補的な配列を含む活性化領域を含む第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ここで、前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域と前記第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域は、互いにハイブリダイズして活性化二重鎖領域を形成することが可能であり、ここで、当該活性化二重鎖領域は、ＤＮＡとステムとバルジを含む；
を含む、セット、および、
（ｉｉ）Ｃａｓ９であって、ここでＣａｓ９は前記二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化二重鎖領域と結合し、前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該ターゲティング領域は、当該標的配列とハイブリダイズし、そして当該標的核酸が切断される、前記Ｃａｓ９；
を導入することを含む、前記方法。
【請求項１２】
Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９のコーデイング配列を含む発現ベクターによりコードされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットおよびＣａｓ９は、細胞内に導入する前に核タンパク質複合体を形成する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃａｓ９は、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットおよびＣａｓ９は、リポフェクション、エレクトロポーレーション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート、またはそれらの組み合わせにより細胞内に導入される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
活性化二重鎖領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
活性化二重鎖領域は、下方ステム、バルジ、および上方ステムを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
ドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
生物、分離された細胞、またはインビトロでの標的核酸分子内の少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する方法であって、前記方法は：
細胞に、
（ｉ）二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットであって、
（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むターゲティング領域、ここで当該ターゲティング領域は少なくとも一つの遺伝子のオープンリーディングフレーム内の標的配列または少なくとも一つの遺伝子のプロモーター配列内の標的配列にハイブリダイズするように構成されている、ならびに当該ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド；および、
（ｂ）前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域における配列と相補的な配列を含む活性化領域を含む第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ここで、前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域と前記第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域は、互いにハイブリダイズして活性化二重鎖領域を形成することが可能であり、ここで、当該活性化二重鎖領域は、ＤＮＡとステムとバルジを含む；
を含む、セット、および、
（ｉｉ）Ｃａｓ９であって、ここで当該Ｃａｓ９はヌクレアーゼ活性を有さず、ここでＣａｓ９は前記二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化二重鎖領域と結合し、前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該ターゲティング領域は、当該標的配列とハイブリダイズし、そして標的核酸分子内の少なくとも一つの遺伝子の転写が調節される、前記Ｃａｓ９；
を導入することを含む、前記方法。
【請求項２２】
Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９のコーデイング配列を含む発現ベクターによりコードされる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットおよびＣａｓ９は、細胞内に導入する前に核タンパク質複合体を形成する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｃａｓ９は、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットおよびＣａｓ９は、リポフェクション、エレクトロポーレーション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート、またはそれらの組み合わせにより細胞内に導入される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
活性化二重鎖領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
活性化二重鎖領域は、下方ステム、バルジ、および上方ステムを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
単一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドであって、
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むターゲッティング領域と；
当該ターゲッティング領域に隣接した、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む活性化領域と；
を含み、
ここで、当該活性化領域は、ステムループ構造を含み、そして、Ｃｐｆ１と結合するこ
とが可能である、
前記単一ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項３０に記載の単一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド。
【請求項３２】
活性化領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項３０に記載の単一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド。
【請求項３３】
（ｉ）単一のポリヌクレオチドであって、
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むターゲッティング領域と、当該ターゲッティング領域に隣接した、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む活性化領域とを含み、
ここで、当該活性化領域は、ステムループ構造を含み、そして、Ｃｐｆ１と結合することが可能である、
前記単一ポリヌクレオチド；および、
（ｉｉ）Ｃｐｆ１
を含む、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項３４】
当該ターゲティング領域は、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む、請求項３３に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項３５】
ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３３に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項３６】
当該活性化領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項３３に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項３７】
標的核酸分子を修飾する方法であって：
標的配列を有する前記標的核酸分子を、
（ｉ）単一のポリヌクレオチドであって、
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むターゲッティング領域と、当該ターゲッティング領域に隣接した、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む活性化領域とを含み、
ここで、当該ターゲティング領域は標的配列にハイブリダイズするように構成され、そして、当該活性化領域はステムループ構造を含む、
前記単一ポリヌクレオチド；および、
（ｉｉ）Ｃｐｆ１であって、ここでＣｐｆ１は単一ポリヌクレオチドの活性化領域と結合し、前記標的核酸分子と前記単一ポリヌクレオチドおよび前記Ｃｐｆ１との、（Ａ）インビトロ、（Ｂ）細胞、または（Ｃ）分離された細胞での接触が起き、そして前記標的核酸分子が切断される、前記Ｃｐｆ１；
と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３８】
前記標的核酸分子は、ＤＮＡを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的核酸分子は、ＲＮＡを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
標的核酸分子と、単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１との接触が、インビトロで起こる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
標的核酸分子と、単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１との接触が、細胞内で起こる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
標的核酸分子と、単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１との接触が、分離された細胞内で起こる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
ドナーポリヌクレオチドを供給することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１のコーデイング配列を含む発現ベクターによりコードされる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１は、細胞内に導入する前に複合体を形成する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
Ｃｐｆ１は、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１は、リポフェクション、エレクトロポーレーション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート、またはそれらの組み合わせにより細胞内に導入される、請求項３７に記載の方法。
【請求項５０】
活性化領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５１】
標的核酸分子内の少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する方法であって、前記方法は：
標的配列を有する前記標的核酸分子を、
（ｉ）単一のポリヌクレオチドであって、
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むターゲッティング領域と、当該ターゲッティング領域
に隣接した、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む活性化領域とを含み、
ここで、当該ターゲティング領域は少なくとも一つの遺伝子のオープンリーディングフレーム配列内、または少なくとも一つの遺伝子のプロモーター配列内の標的配列にハイブリダイズするように構成されており、そして、当該活性化領域はステムループ構造を含む、
前記単一ポリヌクレオチド；および、
（ｉｉ）Ｃｐｆ１であって、ここで当該Ｃｐｆ１はヌクレアーゼ活性を有さず、ここでＣｐｆ１は単一ポリヌクレオチドの活性化領域と結合し、前記単一ポリヌクレオチドの前記ターゲティング領域は、前記標的配列とハイブリダイズし、前記標的核酸分子と前記単一ポリヌクレオチドおよび前記Ｃｐｆ１との、（Ａ）インビトロ、（Ｂ）細胞、または（Ｃ）分離された細胞での接触が起き、そして標的核酸分子内の少なくとも一つの遺伝子の転写が調節される、前記Ｃｐｆ１；
と接触させることを含む、前記方法。
【請求項５２】
前記標的核酸分子は、ＤＮＡを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的核酸分子は、ＲＮＡを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
標的核酸分子と、単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１との接触が、インビトロで起こる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
標的核酸分子と、単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１との接触が、細胞内で起こる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
標的核酸分子と、単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１との接触が、分離された細胞内で起こる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１のコーデイング配列を含む発現ベクターによりコードされる、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１は、細胞内に導入する前に複合体を形成する、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
Ｃｐｆ１は、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１は、リポフェクション、エレクトロポーレーション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート、またはそれらの組み合わせにより細胞内に導入される、請求項５１に記載の方法。
【請求項６３】
活性化領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート
、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
（ｉ）ターゲティング領域および当該ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第一のポリヌクレオチド；および、
（ｉｉ）前記第一のポリヌクレオチドの当該活性化領域における配列と相補的な配列を含む活性化領域を含む第二のポリヌクレオチド、ここで、前記第一のポリヌクレオチドの当該活性化領域と前記第二のポリヌクレオチドの当該活性化領域は、互いにハイブリダイズして活性化二重鎖領域を形成することが可能であり、ここで、当該活性化二重鎖領域は、ＤＮＡとステムとバルジを含み、そして、ここで、当該活性化二重鎖領域は、Ｃａｓ９、低減されたヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９、ヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ９、およびＣａｓ９ドメインを含む融合タンパク質からなる群から選択される部位特異的ポリペプチドと結合することが可能であり、ここで、当該Ｃａｓ９ドメインは、前記活性化二重鎖領域と結合することが可能であり、そして、ここで、前記融合タンパク質はＣａｓ９以外のポリペプチドに由来するドメインさらに含む；を含む、細胞。
【請求項６５】
Ｃａｓ９、低減されたヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９、ヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ９、およびＣａｓ９ドメインを含む融合タンパク質からなる群から選択される部位特異的ポリペプチド、ここで、当該Ｃａｓ９ドメインは、前記活性化二重鎖領域と結合することが可能であり、そして、ここで、前記融合タンパク質はＣａｓ９以外のポリペプチドに由来するドメインさらに含む、
をさらに含む、請求項６４に記載の細胞。
【請求項６６】
前記部位特異的ポリペプチドは、前記部位特異的ポリペプチドのコーデイング配列を含む発現ベクターによりコードされる、請求項６４に記載の細胞。
【請求項６７】
前記部位特異的ポリペプチドは、前記細胞により構成的に発現される、請求項６４に記載の細胞。
【請求項６８】
前記部位特異的ポリペプチドは、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項６４に記載の細胞。
【請求項６９】
前記部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ９である、請求項６４に記載の細胞。
【請求項７０】
前記部位特異的ポリペプチドは、低減されたヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９である、請求項６４に記載の細胞。
【請求項７１】
前記部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９ドメインを含む融合タンパク質であり、ここで前記Ｃａｓ９ドメインは前記活性化二重鎖領域と結合することが可能であり、そして、ここで、前記融合タンパク質は、Ｃａｓ９以外のポリペプチドに由来するドメインをさらに含み、そしてそれは前記部位特異的ポリペプチドに対し、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、グリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ
活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性および脱ミリストイル化活性からなる群から選択される、さらなる活性を付与する、請求項６４に記載の細胞。
【請求項７２】
第一および第二のポリヌクレオチドは、リポフェクション、エレクトロポーレーション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート、またはそれらの組み合わせにより細胞内に導入される、請求項６４に記載の細胞。
【請求項７３】
細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、請求項６４に記載の細胞。
【請求項７４】
活性化二重鎖領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項６４に記載の細胞。
【請求項７５】
ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６４に記載の細胞。
【請求項７６】
二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットであって、
（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むターゲティング領域ならびに当該ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド；および、
（ｉｉ）前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域における配列と相補的な配列を含む活性化領域を含む第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ここで、前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域と前記第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域は、互いにハイブリダイズして活性化二重鎖領域を形成することが可能であり、ここで、当該活性化二重鎖領域は、ステム構造を含み、そして、ここで、当該活性化二重鎖領域はＣｐｆ１と結合することが可能である、
を含む、セット。
【請求項７７】
前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該ターゲティング領域は、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む、請求項７６に記載の二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセット。
【請求項７８】
当該活性化二重鎖領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項７６に記載の二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセット。
【請求項７９】
当該活性化二重鎖領域は、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む、請求項７６に記載の二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセット。
【請求項８０】
（ｉ）二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットであって、
（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むターゲティング領域ならびに当該ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド；および、
（ｂ）前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域における配列と相補的な配列を含む活性化領域を含む第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ここで、前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域と前記第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域は、互いにハイブリダイズして活性化二重鎖領域を形成することが可能であり、ここで、当該活性化二重鎖領域は、ステム構造を含み、そして、ここで、当該活性化二重鎖領域はＣｐｆ１と結合することが可能である；
を含む、セット、および、
（ｉｉ）Ｃｐｆ１
を含む、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項８１】
前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該ターゲティング領域は、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む、請求項８０に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項８２】
当該活性化二重鎖領域は、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む、請求項８０に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項８３】
当該活性化二重鎖領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項８０に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項８４】
ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項８０に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項８５】
生物、分離された細胞、またはインビトロでの標的核酸分子を修飾する方法であって、前記方法は：
細胞に、
（ｉ）二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットであって、
（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むターゲティング領域、ここで当該ターゲティング領域は標的核酸内の標的配列にハイブリダイズするように構成されている、ならびに当該ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド；および、
（ｂ）前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域における配列と相補的な配列を含む活性化領域を含む第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ここで、前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域と前記第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域は、互いにハイブリダイズして活性化二重鎖領域を形成することが可能であり、ここで、当該活性化二重鎖領域は、ステム構造を含む；
を含む、セット、および、
（ｉｉ）Ｃｐｆ１であって、ここでＣｐｆ１は前記二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化二重鎖領域と結合し、前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該ターゲティング領域は、当該標的配列とハイブリダイズし、そして当該標的核酸が切断される、前記Ｃｐｆ１；
を導入することを含む、前記方法。
【請求項８６】
Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１のコーデイング配列を含む発現ベクターによりコードされる、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットおよびＣｐｆ１は、細胞内に導入する前に核タンパク質複合体を形成する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
Ｃｐｆ１は、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットおよびＣｐｆ１は、リポフェクション、エレクトロポーレーション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート、またはそれらの組み合わせにより細胞内に導入される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
活性化二重鎖領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
ドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入する工程をさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９４】
生物、分離された細胞、またはインビトロでの標的核酸分子内の少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する方法であって、前記方法は：
細胞に、
（ｉ）二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットであって、
（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むターゲティング領域、ここで当該ターゲティング領域は少なくとも一つの遺伝子のオープンリーディングフレーム内の標的配列または少なくとも一つの遺伝子のプロモーター配列内の標的配列にハイブリダイズするように構成されている、ならびに当該ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド；および、
（ｂ）前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域における配列と相補的な配列を含む活性化領域を含む第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ここで、前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域と前記第二のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化領域は、互いにハイブリ
ダイズして活性化二重鎖領域を形成することが可能であり、ここで、当該活性化二重鎖領域は、ステム構造を含む；
を含む、セット、および、
（ｉｉ）Ｃｐｆ１であって、ここで当該Ｃｐｆ１はヌクレアーゼ活性を有さず、ここでＣｐｆ１は前記二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該活性化二重鎖領域と結合し、前記第一のクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの当該ターゲティング領域は、当該標的配列とハイブリダイズし、そして標的核酸分子内の少なくとも一つの遺伝子の転写が調節される、前記Ｃｐｆ１；
を導入することを含む、前記方法。
【請求項９５】
Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１のコーデイング配列を含む発現ベクターによりコードされる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットおよびＣｐｆ１は、細胞内に導入する前に核タンパク質複合体を形成する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
Ｃｐｆ１は、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
二つのクラス２  ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのセットおよびＣｐｆ１は、リポフェクション、エレクトロポーレーション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート、またはそれらの組み合わせにより細胞内に導入される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
活性化二重鎖領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項１００】
細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０１】
ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む、請求項９４に記載の方法。