(57)【要約】配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５および／または配列番号：６と命名されたＤＮＡ配列のうち少なくとも１つから選択されるオリゴヌクレオチド、またはそのアニーリング同等物を記載する。試料中のクリプトスポリジウム属のジェノタイピングおよびサブジェノタイピングのための方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５および／または配列番号：６と命名されたＤＮＡ配列、またはそれらのアニーリング同等物のうちの少なくとも１つから選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ジェノタイプおよびサブジェノタイプレベルにまでクリプトスポリジウム属を同定するためのＰＣＲプライマーのペアーを含む請求項１記載のオリゴヌクレオチドであって、１のプライマーが配列番号：３と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物を含み、第２のプライマーが配列番号：４と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物あるいは配列番号：５と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物を含み、第２のプライマーが配列番号：６と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物を含むものである、オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
該アニーリング同等物が少なくとも１５個のヌクレオチドを含む長さであり、１．５〜７ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するバッファー中４５ないし５５℃において、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６から選択されるプライマーの少なくとも１５個の連続した塩基に対して相補的である標的配列にアニールするように適合されている、請求項１または２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
下記工程を含む、試料中のクリプトスポリジウム属のジェノタイプおよびサブジェノタイプの同定方法：
（ａ）試験すべきゲノム鋳型ＤＮＡを含む試料を用意し；
（ｂ）下記のもの：
配列番号：３と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物および配列番号：４と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物、または配列番号：５と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物を含むプライマーならびに配列番号：６と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物を含む第２プライマー
からなる群より選択されるＰＣＲプライマーのペアーを用意し；
（ｃ）該プライマーペアーを用いて鋳型ＤＮＡの領域をＰＣＲにより増幅して１またはそれ以上のＰＣＲ生成物を得て、その後、ＰＣＲ生成物を増幅して試料中のクリプトスポリジウムのジェノタイプおよびサブジェノタイプを同定すること。
【請求項５】
該試料が糞便試料を含むものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
既知ジェノタイプであり、所望により既知サブジェノタイプである１またはそれ以上のクリプトスポリジウム標準のゲノム鋳型ＤＮＡも用意され増幅されて、クリプトスポリジウムのジェノタイプおよびサブジェノタイプの同定中に標準が提供される、請求項４記載の方法。
【請求項７】
ＰＣＲ生成物が電気泳動による分離に供される、請求項４記載の方法。
【請求項８】
該電気泳動による分離が変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＤＧＰＥ）または１本鎖コンホーメーション多型（ＳＳＣＰ）電気泳動を含むものである、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）およびこの属の他のメンバー中における遺伝学的変異の検出に関する。より詳細には、本発明は、核リボソームＲＮＡ遺伝子座に対して指向されたＰＣＲプライマーを用いる、クリプトスポリジウム単離体の高分解能同定およびジェノタイピング（genotyping）に関する。
【０００２】
発明の背景
本明細書にて言及される刊行物の詳細目録を明細書末尾に記載する。
【０００３】
通常に使用される略号は：
ＲＮＡ，リボ核酸；ＤＮＡ，デオキシリボ核酸；ＳＳＣＰ，１本鎖コンホーメーション多型分析；ＤＰＧＥ，変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動；Ｃ．ｐａｒｖｕｍ，クリプトスポリジウム・パルブム；ｐＳＳＵ，クリプトスポリジウムの小サブユニット遺伝子中のリボソームＲＮＡ遺伝子座；ｐＩＴＳ−２，クリプトスポリジウムの第２内部転写スペーサー中のリボソームＲＮＡ遺伝子座；ＰＣＲ，ポリメラーゼ連鎖反応。
【０００４】
少量の寄生体物質を特異的に増幅する能力ゆえに、種々の遺伝学的マーカーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法が、クリプトスポリジウム種の同定に用いられている。しかしながら、ＰＣＲに基づく制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）のごとき一定範囲の従来技術の方法は、クリプトスポリジウム単離体中および単離体間の遺伝学的変化を正確に検出あるいは示すことができない。
【０００５】
クリプトスポリジウムの伝染パターンを明かにし、クリプトスポリジウム症の制御の一助とするためにクリプトスポリジウム種および株を同定する必要性が有意にある。
【０００６】
発明の概要
本発明の主題は、その種々の態様において、ジェノタイプおよびサブジェノタイプのレベルでのクリプトスポリジウムの同定を可能にする。それゆえ、本発明は、クリプトスポリジウム集団の遺伝学的構成の分析のための基礎を提供し、それはクリプトスポリジウム症の制御の一助となる。
【０００７】
１の態様において、本発明は、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５および／または配列番号：６と命名されたＤＮＡは本発明分子配列のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ、またはそのアニーリング同等物を提供する。
【０００８】
本発明のもう１つの態様において、ＰＣＲプライマーのペアーが提供され、１のプライマーは配列番号：３と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物を含み、第２のプライマーは配列番号：４と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物、または配列番号：５と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物を含み、第２のプライマーは配列番号：６と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物を含む。
【０００９】
配列番号：１〜配列番号：４のオリゴヌクレオチド配列、より詳細には、上記のこれらのプライマーのそれぞれのペアーを適用して、クリプトスポリジウム、詳細にはクリプトスポリジウムのＩＴＳ−２の核ゲノム中のリボソームＤＮＡ領域を増幅する。
【００１０】
本発明のさらなる態様において、試料中のクリプトスポリジウムのジェノタイプおよびサブジェノタイプの同定方法が提供され、該方法は下記工程を含む：
（ａ）試験すべきゲノム鋳型ＤＮＡを含む試料を用意し；
（ｂ）下記のもの：
配列番号：３と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物および配列番号：４と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物、または配列番号：５と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物を含むプライマーならびに配列番号：６と命名されたＤＮＡ配列の少なくとも１５個の連続した塩基またはそのアニーリング同等物を含む第２プライマー
からなる群より選択されるＰＣＲプライマーのペアーを用意し；
（ｃ）該プライマーペアーを用いて鋳型ＤＮＡの領域をＰＣＲにより増幅して１またはそれ以上のＰＣＲ生成物を得て、その後、ＰＣＲ生成物を増幅して試料中のクリプトスポリジウムのジェノタイプおよびサブジェノタイプを同定すること。
【００１１】
好ましくは、ジェノタイプが知られた、所望によりサブジェノタイプが知られた１またはそれ以上のクリプトスポリジウム標準のゲノム鋳型ＤＮＡを用意し、増幅して、クリプトスポリジウムのジェノタイプおよびサブジェノタイプの同定の間の標準を提供する。
【００１２】
上記具体例において、「ＧＣ−タグ」である配列番号：３および配列番号：４の５’側のはじめの５個の塩基がプライマーに含められて、配列番号：５および配列番号：６のプライマーと比較した場合に改善されたＰＣＲ増幅ストリンジェンシーおよび効率が得られる。これらの塩基対を欠失させてもよく、本発明はかかるプライマーおよびそれらのアニーリング同等物を包含する。配列番号：５および配列番号：６はそれぞれ配列番号：３および配列番号：４から「ＧＣ−タグ」を除去したものである。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、本明細書記載のオリゴヌクレオチドのいずれかまたはそのアニーリング同等物の、クリプトスポリジウムのジェノタイプおよびサブジェノタイプの特徴付けのための使用を提供する。
【００１４】
種々の態様における本発明は、添付した実施例において添付図面を参照しつつ説明される。図面の説明は後で行う。
【００１５】
配列のリスト
ヌクレオチド配列番号１〜６は以下のとおりである：
AGTGACAAGAAATAACAATACAGG    配列番号：１
CCTGCTTTAAGCACTCTAATTTTC    配列番号：２
GGCGCTACTTCATATAATATAATGTTTTTT    配列番号：３
GGCGCTAATTTTAACTTAAATTGGTTAAGAAA    配列番号：４
TACTTCATATAATATAATGTTTTTT    配列番号：５
TAATTTTAACTTAAATTGGTTAAGAAA    配列番号：６
【００１６】
詳細な説明
以下は、本明細書記載の新規オリゴヌクレオチドをクリプトスポリジウムのジェノタイプおよびサブジェノタイプの同定に適用および使用することに関連して、一般的態様および特別な態様の両方において提供される本発明の好ましい形態に関する説明である。
【００１７】
本明細書記載の発明は、主に、広範なクリプトスポリジウム種由来のＰＣＲ増幅用のプライマーとしての使用に関するが、クリプトスポリジウム株の同定を目的として本明細書記載のいずれのオリゴヌクレオチドを異なったやり方で使用しうることは、容易に明らかとなろう。
【００１８】
本明細書全体において、特記しない限り、用語「含む（comprise）」ならびにその三人称単数形および現在進行形のごとき変形は、記述された数または工程あるいは数および工程の群を含むが、他の数または工程あるいは数および工程の群を排除するものではない。
【００１９】
本明細書の用語「属」は、分類学的ヒエラルキーにおける第１ランクをいい、科レベルの下位で種レベルの上位に位置し、クリプトスポリジウム属というように用いる。「種」は分類学的ヒエラルキーにおける基本的ランクをいい、属レベルの下位に位置し、相互交配可能な生物の限界を示す。「株」、ジェノタイプ（タイプ）またはサブジェノタイプは、種レベルの下位の操作上の分類学的単位をいい、種内の集団の変異を示すこともある。
【００２０】
本発明の好ましい形態において、試料は糞便に由来するものであり、詳細には、クリプトスポリジウム接合子嚢を含有するものであり、試料中に存在する生物のゲノムＤＮＡが単離されるように慣用的方法にて処理される。クリプトスポリジウムのゲノムＤＮＡの単離に適したいずれの方法を用いてもよいことが理解されるであろうし、好ましい方法が実施例に示されている。
【００２１】
先ず、上述の単離されたＤＮＡを、本発明の新規ＰＣＲプライマーペアー配列番号：３および配列番号：４ならびに配列番号：５および配列番号：６、あるいはそれらのアニーリング同等物を用いるＰＣＲの鋳型として引き続き本発明に使用する。これらのプライマーのそれぞれのヌクレオチド配列は実施例に示されており、上にも示してある。本発明のプライマーペアーは、クリプトスポリジウムおよびより詳細にはクリプトスポリジウム・パルブム（C. parvum）のジェノタイプおよびサブジェノタイプ（またはジェノタイプ中の株）の同定を可能にする。かくして、各ペアーは、クリプトスポリジウムの存在が疑われるいずれの試料についても、そしてクリプトスポリジウム属の異なる多くの種および株の同定に適用可能である。
【００２２】
本発明によれば、ＰＣＲプライマー（またはオリゴヌクレオチドプライマー）は、特定のＰＣＲ条件下において、プライマー配列に対して実質的に相補的でＰＣＲ中のＤＮＡの領域の伸長を開始させることのできる配列を有する鋳型ＤＮＡの一領域に特異的にハイブリダイゼーションしうる。相補的配列はその相補物とともに、アデニンがチミンと対合し、グアニンがシトシンと対合するワトソン−クリック結合を形成しうることが理解されよう。典型的には、各プライマーをプライマーペアーのメンバーとして使用され、増幅される鋳型ＤＮＡの５’末端にハイブリダイゼーションする５’上流プライマーおよび増幅される鋳型ＤＮＡの３’末端の相補配列にハイブリダイゼーションする３’下流プライマーを包含する。
【００２３】
本明細書の用語「実質的に相補的」とは、プライマーがその標的鋳型配列に対して１００％の相補性を有していなくてもよいが、適切なＰＣＲアニーリング条件下で特異的な様式でその標的鋳型配列にアニーリングしうることを意味するものであると、本発明が関連する分野の当業者は理解するであろう。
【００２４】
多くの慣用的なＤＮＡ合成法を用いて本発明のプライマーを調製することができる。本発明の場合、プライマーはGeneWorks Pty Ltd, PO Box 11, Rundle Mall, Adelaide, SA 5000, Australiaで製造されたものを購入した。
【００２５】
本発明の好ましい具体例によれば、上記配列番号：３および配列番号：４のプライマーと同じ長さおよび配列のプライマーを用いて最適結果が得られた。しかしながら、当業者は、ＰＣＲ増幅の属特異性および本発明の診断方法の有効性が維持されるならばプライマーを変更してもよいことを理解するであろう。これらの今まで未知であったプロセスおよびそれらに基づく配列は、クリプトスポリジウム属のジェノタイプおよびサブジェノタイプの同定に特に有用である。
【００２６】
第１に、プライマーの長さを変更してもよい。例えば、本発明において、これらのプライマーの少なくとも１５個の連続した塩基のヌクレオチド配列を含む比較的短いプライマーが適している可能性がある。同様に、プライマーを長くしてもよい。プライマー長の正確な上限は変化しうる。しかしながら、典型的には、プライマーは３２塩基未満または３２塩基であり、好ましくは１５塩基よりも長いか１５塩基である。例えば、本明細書で「言及されるプライマーを、それらの３’末端および／または５’末端において５〜１０個まであるいはそれ以上のヌクレオチドだけ伸長させてもよいと考えられる。さらに、非相補的ヌクレオチド配列鎖を各プライマーの５’末端に結合させ、かくして、それらの長さを伸長させてもよい。
【００２７】
第２に、本発明は、特異的な標的ＤＮＡにアニールし、その結果、ＰＣＲ中にそれらの延長を開始させる能力を実質的に変化させないプライマーの配列を企図する。例えば、いずれのヌクレオチドあるいはいすれのヌクレオチド数のプライマーを別のヌクレオチドに代えてもよく、それらはＰＣＲ中の鋳型ＤＮＡに対するプライマーのアニーリングに関して特定の変更部位においてワトソン−クリック塩基対を生じさせないものであるが、それにもかかわらずＰＣＲ中に伸長を開始させるプライマーの能力に実質的に影響しないものであってもよい。かかる別のプライマーは、本明細書記載の配列番号：３および配列番号：４のプライマーおよびそれらの変種の「アニーリング同等物」と呼ばれる。かかるアニーリング同等物は少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、適切なＰＣＲアニーリング条件下での標的配列に対するアニーリングに適合したものである。一般的には、かかるアニーリング同等物に関する適切なＰＣＲアニーリング条件は、１．５〜７ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＣＲ反応ミックスまたはバッファーの使用を包含する。４５℃ないし５５℃の間のアニーリング温度が大部分のアニーリング同等物に適切であると考えられる。さらに例えば、特定のプライマー配列中の５個のヌクレオチドがこの段落に記載されたように変化させられ、それらの変化がプライマー配列の中心にある場合、かかるプライマーの好ましいアニーリング温度は約５℃低下しうる。この段落で言及される標的配列は、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５および配列番号：６のプライマーの配列の少なくとも１５個の連続した塩基に対して相補的な配列を意味する。
【００２８】
適切なソフトウェアならびにｐＩＴＳ−２および隣接（flanking）ＤＮＡ配列の情報を用いて、本発明の配列番号：３および配列番号：４に基づいて設計された別のＰＣＲプライマーセットの有用性を少なくとも観念的に評価できることが理解されるであろう。かかるソフトウェアパッケジは、例えば、PC Oligo5（National Bioscience Inc）またはAmplify（University of Wisconsin）を包含する。
【００２９】
本明細書に開示された新規オリゴヌクレオチドまたはプライマーならびにそれらの変種は、クリプトスポリジウムのジェノタイプおよびサブジェノタイプの同定を可能にするために設計されたが、それらは別個にあるいは他のアプリケーションと組み合わせて使用できることが理解されるであろう。例えば、それらを別の診断法（ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）または定量的ＰＣＲのごとき）のための分子プローブまたはプライマーとして使用してもよい。当業者は、当該分野における標準的方法を用いてかかるアプリケーションを実行する手段を容易に理解するであろう。
【００３０】
ＰＣＲ生成物が結果的に検出されるように、好ましくは、プライマーは［ガンマγ−３３Ｐ］ＡＴＰで末端標識されたものである。あるいは、ＰＣＲ生成物を標識する他の手段を用いてもよく、例えば、ＰＣＲ増幅中に［ベータα３２Ｐ］ｄＮＴＰｓを取り込ませてもよい。より好ましくは、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ビオチン等の非放射性標識系を用いてもよい。また、未標識アンプリコンをその後のＳＥＡ２０００電気泳動装置（Elchrom, Switzerland）を用いるＳＳＣＰ分析に使用してもよい。かかる非放性標識系は当該分野においてよく知られており、したがって、当業者により容易に適用されうる。非放射性標識を用いて特定のプライマーを末端標識してもよく、あるいはプライマーおよび／またはＰＣＲ生成物中に取り込ませてもよいことが理解されよう。
【００３１】
一般的には、少なくとも１の対照試料または既知種の標準を併用して各ＰＣＲを行う。１種よりも多い既知種を含有する対照試料を用いてもよいことが理解されよう。クリプトスポリジウム鋳型ＤＮＡが存在しない陰性対照も試料に付けてもよい。当該分野において常套的に使用される他の標準的な対照を試料に付けてもよいことが理解されよう。
【００３２】
対照のクリプトスポリジウム種ゲノムＤＮＡまたは既知クリプトスポリジウム種もしくはジェノタイプの標準を、未知試料のゲノムＤＮＡに対するのと同様にして精製してもよい。
【００３３】
本発明に関連する分野における慣用的方法、例えば、米国特許第４６８３２０２号に記載の方法により増幅を行う。好ましくは、本発明による標準的なＰＣＲは０．１μＭ〜１μＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１．５〜７ｍＭのＭｇＣｌ２および１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）を用いる。典型的には、鉱油等を重層して各ＰＣＲを行ってサイクリング中の反応混合物の蒸発を防止する。好ましくは、下記条件下においてＰＣＲサイクリングを行う。最初の変性９４℃で５分、次いで、９４℃で約１５ないし３０秒の変性、４４℃ないし６０℃で１５ないし３０秒のアニーリング、そして７２℃で１５ないし３０秒の伸長を３０ないし２５サイクル、次いで、７２℃で５分の最終伸長。
【００３４】
本明細書に示されるＰＣＲ条件は単なる例示であり、例えば、別のＰＣＲサイクルまたはＤＮＡポリメラーゼを用いる場合、鋳型ＤＮＡの品質が異なる場合、あるいは本明細書において特に例示されないプライマーを用いる場合において条件を最適化するために、本発明の範囲から逸脱することなく変更されうることが当業者により理解されるであろう。例えば、反応物の種々の構成成分の濃度を変化させ、そして／あるいは反応物の構成成分を変更し、増幅サイクル数、変性、アニーリングまたは伸長時間または温度を変更する、あるいは鋳型ＤＮＡの品質を変更することによってＰＣＲ条件を変更あるいは最適化してもよい。当業者は、ＰＣＲ条件を最適化して反応間のばらつきを克服するために多くの他の方法があることを理解するであろう。当該分野において通常認識理解されている上記因子に基づく常套的な分析によりＰＣＲ条件を最適化してもよい。
【００３５】
本明細書において特記しない限り、本発明の範囲内のいずれのプライマーに関しても適切なＰＣＲアニーリング温度は当該プライマーの融解温度を計算して導出しうることが理解されよう。標準的方法を用いてかかる融解温度を計算してもよい。本発明に関する当業者が理解しているように、アニーリング温度は融解温度よりも高くても低くてもよいが、一般的には、計算されたプライマーの融解温度よりも約５℃高いまたは低い温度が適切でありうる。
【００３６】
同定用試料のＰＣＲ生成物および対応対照試料または既知性質の標準試料のＰＣＲ生成物を、電気泳動による分離によって検出してもよい。ＰＣＲ生成物のサイズおよび／または配列のわずかな相違に対して特に感度が高い電気泳動的方法が好ましい。例えば、ＳＳＣＰ（１本鎖コンホーメーション多型）および／またはＤＰＧＥ（変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の方法は、試料間における単一ヌクレオチドによる長さまたは配列の変化を検出する能力と有するように条件が最適化される場合に特に適する。さらに、これらの方法は多数の試料のスクリーニングに容易に適用可能である。
【００３７】
ＳＳＣＰ分析がすでに記載されている（Orita et al., 1989）。一般的に、どのようなＰＣＲ生成物でも（通常は５３０ｂｐ以下であるが）、未変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により１本鎖分子として分離可能である。該方法は、１本鎖ＤＮＡ分子が単一塩基またはそれ以上の塩基によって配列が異なる場合に別の１本鎖分子とは異なって折りたたまれるという事実に基づいている。２次構造および３次構造の相違は電気泳動中の移動度の相違を生じさせる。
【００３８】
本発明が関連する分野の当業者は、異なる物理的条件下、例えば異なる温度およびイオン環境において１本鎖ＤＮＡの３次構造が変化することを理解するであろう。結果として、ＳＳＣＰの感度はこれらの条件および他のかかる条件、例えばＰＣＲ生成物の長さに依存する。本発明の場合、下記の条件が好ましいことがわかったが、異なる研究室的条件および装置を考慮して条件を変更しうることが理解されよう：０．５ないし１．５ｘＴＢＥを含有する０．４ないし０．６ｘＭＤＥ(変異検出促進剤;FMC BioProducts)および７ないし４０ワットで約５ないし１７時間１８℃で電気泳動。より詳細には、下記条件を本発明に使用してもよい：
【表１】
2005536208.tif 000002
【００３９】
ＤＰＧＥはすでに記載されており、本発明が関連する分野においてよく知られている。ＤＰＧＥにおいて、各ＤＮＡ分子鎖はその相補鎖から分離され、変性条件下のポリアクリルアミドゲル上を泳動する。かかる条件下において、電気泳動中に特定ＤＮＡ分子の２本の鎖が互いに再ハイブリダイゼーションすることを防止されて、個々の鎖が別々にゲル中を移動する。ＤＰＧＥは、２つのＤＮＡの５’末端分子の長さの相違を単一ヌクレオチドまで確認しうる高感度な系である。
【００４０】
ＤＰＧＥの場合、下記範囲の条件が好ましいが、ＳＳＣＰ条件に関しては、本発明の範囲から逸脱せずに多くの他の研究室的変数を考慮して変更できる：ゲルの厚さ０．４ｍｍ、４２％尿素および１ｘＴＢＥを含有する４ないし６％ポリアクリルアミド、３０ないし６０ワットで３ないし４時間４０ないし４５℃で電気泳動に付す。より詳細には、下記条件を本発明に用いてもよい：
【表２】
2005536208.tif 000003
【００４１】
本発明は、特定の試料中のクリプトスポリジウム・パルブム株の同定に関してより良い理解を得るために並行して使用される両方の方法を企図する。同様に、本発明は、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ配列決定および変性高品質液体クロマトグラフィーのごとき他の既知オリゴヌクレオチドの検出法の使用も考慮する。
【００４２】
電気泳動によるＰＣＲ生成物の分離後標準的方法によりゲルを処理し（例えば、ポリアクリルアミドゲルの場合にはフィルターまたはブロッティング紙上で乾燥させる）、ゲル上のバンド位置を示すことができるような適当時間オートラジオグラフィーにかける。
【００４３】
本発明の方法は自動（蛍光ベースの）電気泳動システム、例えばサーモコントロールシステムならびに適切なコンピューターハードおよびソフトウェアとカップリングされたApplied BioSystems (ABI)の自動配列決定装置に適用可能である。このようにして、特異的な「指紋」を記録し、貯蔵し（プロトコルおよび報告目的に関して）、既知サブジェノタイプ標準試料と比較してもよい。かかる電気泳動法は当業者に通常使用され、理解されている標準的方法である。
【００４４】
本発明に自動化システムを用いる場合において、使用する個々の自動化システムに適合させるために、記載され、例示されているような手動ＳＳＣＰおよびＤＰＧＥに一般的に適用可能な標準的条件を変更する必要があるかもしれないということが理解されよう。製造者の説明書およびそれに従う常套的な最適化アッセイから適切な条件を容易に決定することができ、それらの条件は当該分野で通常使用されているものである。
【実施例】
【００４５】
以下の説明的で非限定的な実施例に本発明の態様を記載する。
【００４６】
１．材料および方法
１．１．単離体、ＤＮＡの単離および酵素による増幅
PHLS Cryptosporidium Reference Unit, Singleton Hospital, Swansea, Wales, UKのRachel Chalmers博士からクリプトスポリジウム接合子嚢単離体を得た。接合子嚢単離体は、最近英国において海外旅行中（ｎ＝１０３）または感染発生中（ｎ＝８３）にコントラクトされた（contracted）ことが報告された、臨床的にクリプトスポリジウム症を有する人からのものである（表１および２）。標準的方法（Chalmers et al., 2002参照）を用いて接合子嚢を精製し、ゲノムＤＮＡを単離した。オリゴヌクレオチドプライマー１８ＳｉＦ（フォワード, 5'-AGTGACAAGAAATAACAATACAGG-3'）および１８ＳｉＲ（リバース, 5'-CCTGCTTTAAGCACTCTAATTTTC-3'）（SSU rRNA遺伝子の約300bpの領域, pSSUと呼ばれる; Khramtsov et al., 1995; Morgan et al., 1997; Gasser et al., 2001a）、ならびにプライマーＹＡ５６Ｆ（フォワード: 5'-GGCGCTACTTCATATAATATAATGTTTTTT-3'       (SEQ ID NO: 3)）およびＹＡ５４Ｒ（リバース: 5'-GGCGCTAATTTTAACTTAAATTGGTTAAGAAA-3' (SEQ ID NO: 4)）（ITS-2の約230bpの領域, pITS-2と呼ばれる; Morgan et al., 1999bを参照のこと）を用いて核ゲノムの２つの領域を別々にＰＣＲ増幅した。「ＧＣ−タグ」（５’側の最初の５個の塩基）をＹＡ５６ＦおよびＹＡ５４Ｒ両方のプライマーに包含させて増幅のストリンジェンシーおよび効率を改善させた（未公表の結果）。Ｔ４キナーゼ（Promega）を用いて３３Ｐ−ＡＴＰ（NEN, DuPont）でプライマーを末端標識した。これらのＧＣ−タグを含まないプライマーはそれぞれ配列番号：５および配列番号：６である。
【００４７】
下記条件下にて２５ｐｍｏｌの各プライマー，２５０μＭの各ｄＮＴＰ，３ｍＭ ＭｇＣｌ２および１Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ (Promega, Madison, WI, USA)を用いて、５０μｌの体積中でＰＣＲ増幅を行った：480 thermocycler (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA)中で、９４℃で５分の最初の変性後、反応物を３０サイクルの下記工程に付した（９４℃で３０秒(変性)、５５℃(pSSU)または５０℃(pITS-2)で３０秒(アニーリング)そして７２℃で３０秒(伸長)）、次いで、７２℃で５分の最終伸長を行った。ＰＣＲ反応物に添加した鋳型の量は、通常は１ｐｇないし２０ｐｇであった。ＤＮＡの５’末端を含まない対照試料を各ＰＣＲ反応に付けた。ＰＣＲの特異性を試験するために、寄生体感染の証拠がない人の便または血液からの各ＤＮＡ、ならびに細菌（Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus および L. gasseri）、酵母（Saccharomyces cerevisiae, protozoan parasites, Giardia duodenalis および Entamoeba histolytica）および蠕虫（Schistosoma japonicum, S. mansoni, Hymenolepis nana, Taenia saginata, T. solium, Ascaris sp., Ancylostoma caninum, Necator americanus, Strongyloides stercoralis, Oesophagostomum bifurcum および Trichuris trichiura）由来のＤＮＡを含む２０個の「陰性」試料を同じ増幅手順に供した（両方のプライマーセットを用いて）。２個のC. parvum ＤＮＡ試料（ｃ１０７およびｃ２３２と命名、それぞれ以前１型および２型として分類されていたもの）を「陽性」対照として付けた。
【００４８】
サーモサイクリング後、個々のアンプリコンを同体積のローディングバッファー（１０ｍＭ ＮａＯＨ，９５％ホルムアミド，ともに０．０５％のブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール）と混合し、ＴＢＥ（６５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２７ｍＭホウ酸，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ９; Bio-Rad, Richmond, CA, USA）をバッファーとし、ＰｈｉＸ１７４−ＨａｅＩＩＩ（Promega, WI, USA）をサイズマーカーとして用いて臭化エチジウム染色２．５％アガロースゲル上で選択試料の強度を確認した。
【００４９】
１．２  電気泳動
放射性標識アンプリコンを９５℃で５分変性させ、フリーズブロック（−２０℃）で５分間急速冷凍し、その後、慣用的な配列決定リグ（rig）（S2, Life Technologies, USA）におけるＳＳＣＰまたは変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＤＰＧＥ）を行った（Zhu and Gasser, 1998; Woods et al., 2000参照）。製造者のプロトコルに従って０．４ｍｍ厚の０．６ｘ変異検出促進ゲル（MDE; FMC BioProducts, Rockland, ME, USA）中でＳＳＣＰ分析を行った。ゲルを注ぎ（60 tooth well-combを挿入; ウェル幅３ｍｍ）、２４℃で７０分ポリマー化させ、空調のある室内（１８℃一定）でバッファーとしてＴＢＥを用いて電気泳動を行った。ゲルを３０ワット（一定）で２０分プレランし（ゲルが約２４℃になるまで）、次いで、試料（１．７μｌ）をウェルに入れ、同じ条件下で５時間電気泳動した。４２％尿素を含む０．４ｍｍ厚の５％ポリアクリルアミドゲルにてＤＰＧＥを行った。試料（各３μｌ）をシャークトゥースコーム（shark-tooth comb）ウェル（４ｍｍ幅）中に入れ、ＴＢＥを用いて５０ワットで３時間、２４℃にて電気泳動した（ガラス板温度が約３９〜４０℃になった）。両方の電気泳動法において、ゲルを３ＭＭ濾紙（Whatman）上で乾燥させ、通常はCurix-Blueフィルム（Agfa）を用いてオートラジオグラフィーを２４時間行った。各電気泳動法を用いて得られた電気泳動プロファイルは、別の日に得られたアンプリコンを用いて別の日に再現性があることを示された（データ示さず）。
【００５０】
１．３  ＤＮＡ配列決定
選択したｐＳＳＵアンプリコンをWizard PCR Preps columns（Promega, WI, USA）にて精製し、３０μｌのＨ２Ｏで溶出し、次いで、ＰＣＲ用に用いたのと同じプライマーを用いる自動サイクル−配列決定（BigDye chemistry, ABI）に供した。選択したｐＩＴＳ−２アンプリコンを示すＳＳＣＰバンドを、すでに記載されているようにして（Gasser and Monti, 1997）豊富化させ、次いで、クローニングにより配列決定した。簡単に説明すると、ゲルをオートラジオグラムに露光した後、選択したＳＳＣＰバンドを外科用メスを用いて切り出し、５０μｌの水に懸濁し、４℃で２時間インキュベーションした。次いで、この懸濁液２μｌを９８μｌの水に添加し、その１〜２μｌをＰＣＲに供した（はじめの増幅と同じプライマーセットおよび条件を用いて）。次いで、カラム精製アンプリコンの一部（約１００ｎｇ）をpGEM Easy vector system I（Promega, WI, USA）中にクローン化した。クローンを単離し、インサートを増幅し、次いで、ベクタープライマーＳＰ６またはＴ７（Promega, WI, USA）を用いて配列決定した。ノン−リダンダントGenBank
データベースのＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＰ類似性サーチ（NCBI Basic BLAST; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）に核酸配列を供した。
【００５１】
３．結果および議論
C. parvum ｐＳＳＵおよびｐＩＴＳ−２を増幅するためのプライマーセット１８ＳｉＦ−１８ＳｉＲ（ｐＳＳＵ）およびＹＡ５６Ｆ−ＹＡ５４Ｒ（ｐＩＴＳ−２）ならびにＰＣＲ条件の特異性を、一定範囲の対照ＤＮＡ試料を用いて評価し、次いで、電気泳動分析およびオートラジオグラフィーを用いて評価した。ヒト血液または便から調製したＤＮＡ試料（寄生体感染の証拠のないヒト）および一定範囲の原核生物（細菌）または発達段階がヒトの腸管内で生じる真核生物（原虫、吸虫、条虫および線虫）から調製された１７個のさらなる試料もＰＣＦに供した。１のＰＣＲ反応につき約０．５ないし５ｎｇの鋳型を用いて、試料ｃ１０７およびｃ２３２（陽性対照）適当なサイズの生成物を増幅し、電気泳動により検出したが、試験した他の１９個の対照試料のいずれにもバンドは検出されなかった（示さず）。
【００５２】
試料ｃ１０７およびｃ２３２のゲノムＤＮＡの力価測定、次いで、ＳＳＣＰ分析（示さず）によりＰＣＲの感度を決定した。プライマーセット１８ＳｉＦ−１８ＳｉＲ（ｐＳＳＵ）またはＹＡ５６Ｆ−ＹＡ５４Ｒ（ｐＩＴＳ−２）を用いるＰＣＲ増幅により検出可能なC. parvum ＤＮＡの最小量は、その後の分析により１〜２ｐｇであると見積もられ、Eimeriidaeに属する他のメンバーについての以前の研究（Woods et al., 2000）に匹敵するものであった。
【００５３】
ＰＣＲおよび条件の特異性および感度が示されたので、最近海外旅行をした人でクリプトスポリジウム症の突発性のケースの人（ｎ＝１０３）または英国においてクリプトスポリジウム症の発生に関連したケースの人（ｎ＝８３）から得た１８６個のC. parvum試料をＰＣＲに供した。期待されたように、アンプリコンはアガロースゲル上で約３００ｂｐ（ｐＳＳＵ）または２３０ｂｐ（ｐＩＴＳ−２）のサイズであり、明らかなサイズのバリエーションは各ｒＤＮＡ遺伝子座を示すアンプリコンのいずれにおいても検出できなかった（示さず）。選択したｐＳＳＵおよびｐＩＴＳ−２アンプリコンの部分配列ならびに現行のデータベース中のエントリーと配列データとの比較によりそれらのアイデンティティーの確認を行った。次いで、１８６個すべての試料を高分解能電気泳動分析に供した。
【００５４】
ｐＳＳＵおよびｐＩＴＳ−２アンプリコンのＳＳＣＰ分析の結果を表１および表２に示し、典型的な電気泳動ゲルを図１に示す。ｐＳＳＵのＳＳＣＰ分析において、１０３個中８９個（８６．４％）の「外国旅行者」の試料が１型と同定でき、１４個の試料（１３．６％）が２型と同定された。ＳＳＣＰプロファイルのバリエーションは１型である試料のいずれにおいても検出されず、ただ１個の２型試料（ｃ３５）が当該ジェノタイプの他のすべての試料からわずかに異なっていた（微妙に上方にシフト）（図１参照）。典型的な試料（コードｃ１１、ｃ３２、ｃ３５、ｃ３９、ｃ４２、ｃ６５、ｃ１１８、ｃ１１９、ｃ１２２、ｃ１４５、ｃ１５９およびｃ２３２；図１参照）の配列決定により、試料ｃ３５とすべての他の２型試料との間でアラインメント位置２３０における１個のヌクレオチドの相違（Ａ＜−＞Ｔトランスバージョン）が明かとなった（図２参照）。ＢＬＡＳＴ分析により、ｃ３５配列（アラインメント位置１４２〜２６９において）と受託番号ＡＦ１３３８４２（Pieniazek et al.,未公表）に関連した配列とが完全に合致し、かくして、それは今日に至るまで報告された大多数の２型配列とは異なるものであった。対照的に、配列決定された１型試料（コードｃ２、ｃ４、ｃ１５、ｃ２０、ｃ２３、ｃ３１、ｃ４０、ｃ４１、ｃ６７、ｃ１２５、ｃ１２８、ｃ１２９、ｃ１３６、ｃ１４２、ｃ１４９、ｃ１５４、ｃ１５２、ｃ１６０およびｃ１６４）のいずれのｐＳＳＵにおいても固定されたヌクレオチドの相違は検出されず（図２）、それらの配列は現行のデータベース中の１型を示す配列一定範囲の配列（例えば、受託番号ＡＦ０９３４９１）と一致していた。ｐＳＳＵ遺伝子座のＳＳＣＰ分析により２型中に検出された変異（アラインメント位置２３０における）に関係なく、バンド位置に明確な相違があり（プライマーを除いて２６９ｂｐ中４〜５ｂｐ）、それにより１型C. parvumと２型C. parvumとの間の明確な同定および説明が可能となった（図１）。「発生」の試料に関しても（表２）、１型（ｎ＝２１；英国Middlesexの小児デイケア施設で発生）と２型（ｎ＝６２；英国ClitheroeおよびCleethorpeにおける水系伝染により発生）との明確な分別が達成された。
【００５５】
プロファイルのバリエーションがないかあるいは低レベルのプロファイルのバリエーションがｐＳＳＵのＳＳＣＰ分析において２つのジェノタイプのそれぞれにおいて検出可能であったが（図１）、合計１３個および１０個の異なるｐＩＴＳ−２プロファイル（１プロファイルにつき約４ないし１２個のバンド）が、それぞれC. parvum１型および２型である１８６個の試料すべてについて示された（表１および２）。これらのｐＩＴＳ−２プロファイルのいくつかを示す典型的なＳＳＣＰゲルを図１に示す。１型よりも２型においてより多くのバリエーションが示された。個々のＳＳＣＰプロファイル中のバンドが実際にC. parvumのＩＴＳ−２であったことを証明するために、４０個の異なるバンド（配列変異のスペクトルを示す）（図２に示す）を切り出し、次いで、ＰＣＲ豊富化および配列決定に供した。個々のバンドに由来する配列（１型である番号１〜１１；２型である番号１２〜４０）を、配列データベース中で利用可能な個々のＩＴＳ配列（受託番号ＡＦ０１５７７４、ＡＦ０９３００８、ＡＦ０９３０１２および／またはＡＦ０４０７２５）と比較した。１型に関して約７６〜９９％の配列同一性および２型に関して約７５〜９９％の配列同一性が記録され、かくして、ＩＴＳ−２としての個々のバンドの同一性に関する明確な支持が提供された。各ジェノタイプのバンドの配列をペアーにして比較する方法により、約６２〜９９％（１型）および約４５〜９９％（２型）の範囲の相違が明らかとなった。
【００５６】
「海外旅行者」試料（表１）に関し、ｐＩＴＳ−２ ＳＳＣＰプロファイル１Ａおよび１Ｂは、分析した８９個のC. parvum１型試料のうち３４個（３８．２％）および３５個（３９．３％）であったが、他の９個のプロファイル（１Ｃ〜１Ｋ）はそれらの試料のうち１〜６個（１．１〜６．７６％）であった。１型試料に関し、プロファイル１Ａおよび１Ｂは、プロファイル１Ｇ、１Ｃ、１Ｆおよび１Ｊに次いで最も広い地理的分布を示したが、プロファイル１Ｄ、１Ｅ、１Ｈ、１Ｉおよび１Ｋはそれぞれ特定の地理的領域に独特のものであった。２型を示す試料のサイズは１型を示す試料の約１６％であったが、ｐＩＴＳ−２アンプリコンのＳＳＣＰ分析により、９個の異なるプロファイルが明らかになった（２Ａ〜２Ｉ）（表１）。これらの試料に関し、プロファイルＤは最も広い地理的分布を有し、プロファイル２Ａ〜２Ｃはイベリア半島に生じ、プロファイル２Ｅ〜２Ｉはそれぞれ個々の場所に独特のものであった。ｐＳＳＵ遺伝子座のＳＳＣＰおよび配列分析によれば、プロファイル２Ｆ（試料ｃ３５）は他のすべての２型試料のうちで最も異なっていた。結局、「海外旅行者」試料に関するＳＳＣＰの結果は、個々の国または地理的領域からの試料のメンバーにおけるバイアスにもかかわらず、いくつかのＳＳＣＰプロファイルと地理的起源の間に何らかの関連性があることを示唆するものであろう。「発生」試料（表２）に関し、英国の水系流行病を示す６２個の試料（２型）において、プロファイルにおけるバリエーションは検出されなかったが、４個の異なるｐＩＴＳ−２ ＳＳＣＰプロファイル（１Ａ、１Ｂ、１Ｌおよび１Ｍ）がMiddlesexの施設での発生を示す２１個の試料において検出された。後者のこれらの知見は、少なくとも４個の異なるC. parvumのソースが施設での発生に関与していることを示唆するものであった。「海外旅行者」および「ストブレーク」試料群中において検出された「ジェノタイプ内（intragenotype）」プロファイルの変異に関わらず、C. parvumの当該２つのジェノタイプはｐＩＴＳ−２ ＳＳＣＰプロファイルに基づいて識別できるものであった（図１）。重要なことは、ｐＩＴＳ−２の分析に基づいて試料をジェノタイプにより１型または２型に分類することは、ｐＳＳＵ遺伝子座を用いて得られた結果と一致するものであった。
【００５７】
ジェノタイプ間（intergenotype）および／またはジェノタイプ内のｐＳＳＵおよびｐＩＴＳ−２両方の遺伝子座におけるＳＳＣＰ分析を行い、配列／長さのバリエーションを確認した後（図１〜３）、我々は、ルーチンの診断のためのアンプリコンの分析に必要な電気泳動の泳動時間を短縮することを目的とした。それゆえ、当該リボソーム遺伝子座のいずれかまたは両方を用いてC. parvumの１型および２型の間の信頼できる区別がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより達成できるかどうかを評価した。ｐＩＴＳ−２遺伝子座における検出可能なジェノタイプ間の変異がＳＳＣＰによって信頼できるように示されるかどうかも評価した（図３参照）。変異の全スペクトルを示す試料（１８６個の試料）のＤＰＧＥ分析により、ＳＳＣＰ分析と同じジェノタイプの同定結果および類似のサブジェノタイプ分類が示された（図３）。ＤＰＧＥによる２型試料のサブジェノタイプ分類はＳＳＣＰ分析に関するものと同じであったが、約３０％の小さなプロファイル変化（１３のプロファイルのうち９）がすべての１型試料において検出可能であった。これらの結果は、アンプリコン中の同じ長さの分子間の微妙な配列変異を検出するＳＳＣＰの優れた能力を支持するものであり（Gasser and Chilton, 2001; Woods et al., 2000）、１型と比較した場合の２型中および２型間におけるｐＩＴＳ−２の増加した配列変化度に関するＳＳＣＰの結果を反映するものであった。
【００５８】
２種のC. parvumジェノタイプのそれぞれにおいてｐＩＴＳ−２中の有意な集団の変異（すなわち、配列および／または長さの変化）を検出し、該変異は限定されたジェノタイプ中の変異度に関する以前からの確信（Gasser and O'Donoghue, 1999; Fayer et al., 2000中に引用された文献）と対照をなすものであり、より最近の多くの研究（例えば、Aiello et al., 1999; Caccio et al., 2000, 2001; Guyot et al., 2001; Ong et al., 2002）を支持するものである。例えば、ヒトおよび動物由来の９４種のC.parvum試料に関するマイクロサテライト分析を用いる最近の調査（Caccio et al., 2000）により、１型中に２つのサブジェノタイプおよび２型中に４つのサブジェノタイプが明らかとなった。サブジェノタイプのいくつかは広い地理的分布を有していたが、他のものは特定地域に限定されていた。９つのマイクロサテライト遺伝子座を用いる別の研究（Aiello et al., 1999）において１型および２型それぞれにおいて２つの異なるサブジェノタイプが同定された。集団の遺伝学的構造および可能ならばC. parvumの伝染パターンを調査することに関する重要性に加えて、ＩＴＳにおいて配列異種性を正確に示す能力がC. parvumにおける分子進化過程および遺伝を研究するにあたり基本的に重要でありうる。C. parvumに関する詳細な研究（Le Blancq et al., 1997参照）により、慣用的なhead-to-tailタンデムアレイにおいて組織化されない半数体のゲノム（少なくとも）５コピーのｒＤＮＡユニットがあることが示された。ｒＤＮＡユニットが少なくとも３つの異なる染色体に分散している（単一コピーとして）という証拠がある。２つの構造的に異なるｒＤＮＡユニットの変種、すなわち変種−Ａ（４コピー）および変種−Ｂ（１コピー）、ならびにＩＴＳに関連した２つの変種間における最も重要な配列の変化が検出された。C. parvumのＩＴＳ領域中の配列多様性の程度は関連アピコンプレキシアPlasmodium berghei（Dame et al., 1984参照）におけるそれと同様であるが、C. parvum中のｒＤＮＡの２つの変種の機能的重要性は現在不明であり、マラリア寄生体においては異なるセットのｒＲＮＡ遺伝子が異なる段階特異的なリボソームを生じさせる（Gunderson et al., 1987; McCutchan et al., 1995）。かかる不均一性が単離物中のC. parvumの個々の接合子嚢中または間の配列変異に関連しているのかどうかは不明である。マイクロマニピュレーション、ＰＣＲに基づくＳＳＣＰアプローチ（Sturbaum et al., 2001）が、単一のCryptosporidiumの接合子嚢を分析することによるこの問題の解決に有用でありうる。
【００５９】
ＩＴＳ−２における比較的高い程度の配列不均一性（低コピー数で示され、異なる染色体上の単一コピーとして示される）により、タンダムアレイに組織化された場合に高コピー数（単一遺伝子座上）の他のいくつかの生物（種）と比較して、染色体内交換プロセスにより配列均一性が維持される場合には、C. parvumにおいて（図１参照）配列均一化（「協奏的進化」;Elder and Turner, 1995による）があまり効果的でないことが示される（Schlotterer and Tautz; Gasser et al., 1998, 2001b参照）。いくつかのアピコンプレキシア寄生体のＩＴＳ中の配列不均一性は、異なるセットのｒＲＮＡ遺伝子を維持するための選択によって抑制されるように思われる（McCutchan et al., 1995; Woods et al., 2000参照）。単離体内（intraisolate）（または単離体間（interisolate））の変異は、いくつかのＰＣＲアプローチを用いる接合子嚢ＤＮＡ単離体の遺伝学的分析に関する実際的な問題を提示しうるが（Gasser, 1997参照）、それは、本明細書に明確に示されたような変異スキャンニングによるCryptosporidium中の集団の変化の検出のためのはっきりとした利点を提示するものである。ｐＩＴＳ−２におけるサブジェノタイプの変化の重要性は未知であるが、ＳＳＣＰプロファイル１Ａ、１Ｂ、１Ｇおよび２Ｄにより示されるいくつかのサブジェノタイプ（表１）は比較的広い地理的分布を示したが、他のものは特定の領域に限られていた。単離体の地理的起源に対して一定の関連性があるかどうかと確認するためにはさらなる研究が必要である。このことがあてはまるならば、このことは感染の起源を「探求する」ための重要な意味を持つであろう。
【００６０】
本研究の結果は、遺伝学的変異に関してC. parvum ＤＮＡ試料をスクリーニングし、それらをジェノタイプレベルおよびサブジェノタイプレベルの両方で分類することにおけるＳＳＣＰおよびＤＰＧＥの両方の適用可能性を示すものである。これらの電気泳動的方法は、クリプトスポリジウムに適用される他のいくつかの分子診断アプローチに優る有意な利点を有している。アガロースゲル上の特定サイズのバンドの検出にのみ基づくクリプトスポリジウムのジェノタイプの同定に依存するいくつかのＰＣＲベースのアプローチ（ジェノタイプの結果よりもむしろフェノタイプを提供する）とは対照的に、ＳＳＣＰは、長さおよび配列の変異度に関して詳細かつ定量的なアンプリコンの分析を可能にする。本発明のＳＳＣＰは２型のｐＳＳＵにおけるトランスバージョン（Ｔ＜−＞Ａ）（アラインメント位置２３０；図２）を検出することができ、その高い変異検出能が示された。この情報は、C. felis, C. serpentis and C. baileyi (see Gasser et al., 2001a)に関する知見と相俟って、ｐＳＳＵのＳＳＣＰ分析により現在認識されている１０種すべてのクリプトスポリジウム（Fayer et al., 2000参照）の特異的同定が可能になるはずであることが強調される（ただしこの提案は試験がやはり必要であるが）。ｐＳＳＵとｐＩＴＳ−２に関する結果、ならびにＩＴＳ−２領域におけるジェノタイプ内ヌクレオチド変異に関して直接「指紋を採る」能力を合わせると、クリプトスポリジウム種中の集団の変異を検出するための変異スキャンニングの価値が強調される。ＳＳＣＰおよびＤＰＧＥの両方を用いて、大きな試料サイズを直接スキャンして遺伝学的変異を検索し、ＤＮＡ配列分析の必要性を回避し（最初の例において）、そのことにより時間と労力を低減する。さらに本発明のアプローチは、例えば、リアルタイム−ＰＣＲよりもかなり費用がかからない。なぜなら本発明のアプローチはたいていの分子生物学の研究室において容易に利用可能な慣用的な装置を用いるものだからである。それゆえ、本発明のツールは、クリプトスポリジウム症の発生の診断およびモニタリングならびにクリプトスポリジウム集団の伝染病理学および遺伝学的構成の研究に特に価値を有するはずである。将来の研究は、電気泳動分析の自動化をはかって処理能力を増加させることを包含するであろうし、さらにプロファイルのデータの記録、貯蔵および比較を単純化すべきである。適切な遺伝子座を用いるならば、同様のアプローチが社会的−経済的に重要な広範な他の病原体に適用可能であろう。
【００６１】
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【００６２】
表１  他の国または大陸に旅行し、英国に戻った人の糞便試料に由来するCryptosporidium parvum(１型または２型)の接合子嚢ＤＮＡから得られたｐＩＴＳ−２アンプリコンのＳＳＣＰ分析の結果
【表３】
2005536208.tif 000004
表２  英国で２種の異なるクリプトスポリジウム症に関連した人の便試料に由来するCryptosporidium parvum (１型または２型)の接合子嚢ＤＮＡから得られたｐＩＴＳ−２アンプリコンのＳＳＣＰ分析の結果
【表４】
2005536208.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、外国旅行後間もないヒトから得られたクリプトスポリジウム・パルブム中および間の２つの遺伝子座ｐＳＳＵ（Ａ）およびｐＩＴＳ−２（Ｂ）における配列変異のＳＳＣＰ分析を示す。合計１０３個の試料を最初にＳＳＣＰによりスキャンし、試料サブセットをゲルイメージ上に示す。ｐＳＳＵに関しては、はじめの１９個の試料（ｃ２〜ｃ４）を１型と同定し、次の１１個の試料（ｃ３９〜ｃ４２）を２型と同定した。英国からのヒトから得た試料ｃ１０７およびｃ２３２を対照として含めた。ｐＩＴＳ−２に関しては、はじめの８個の試料（ｃ４０〜ｃ７４）を１型と同定し、次の１０個の試料を２型と同定した。同じ２個の対照試料をパネルＡに含ませた。１型および２型の両方において重要なｐＩＴＳ−２プロフィールの変化が検出された。示された配列変化のレベルは、１型と比較した場合、２型を示す試料中および間において大きかった。合計４０個の異なるバンド（白色ダッシュでマークした）をｐＩＴＳ−２ ＳＳＣＰゲルから切り出し（上から下へ、左から右の順に）、次いで、配列決定を行った。
【図２】図２は、２０個のC.parvum１型試料を示すｐＳＳＵコンセンサス配列（コード c2, c4, c15, c20, c23, c31, c40, c41, c67, c107, c125, c128, c129, c136, c142, c14-9, c152, c154, c160 および c164）および１２個の２型試料のそれら（コード c11, c32, c39, c42, c65, c118, c119, c122, c145, c159, c232 および c35）を並べたものである。２型試料のうち、１１個の試料は２．１型配列により示されるが、試料ｃ３５は２．２型配列を有していた。アラインメント位置２３０においてトランスバージョンにより異なっている２型配列はＳＳＣＰ分析に基づいて記載した（図１参照）。クリプトスポリジウム・パルブム１型および２型間のヌクレオチドの相違を（＊）により示す。ヌクレオチド相違のまとめ：１型対２．１型：５ヌクレオチド相違（３ヌクレオチド長相違）、１型対２．２型：４ヌクレオチド相違（３ヌクレオチド長相違）、２．１型対２．２型：１ヌクレオチド相違（長さ相違せず）。
【図３】図３は、ヒトから得たクリプトスポリジウム・パルブム中および間に２つの遺伝子座ｐＳＳＵ（Ａ）およびｐＩＴＳ−２（Ｂ）における配列変異のＤＰＧＥ分析を示す。ＳＳＣＰにより両方の遺伝子座においてスクリーニングされ、検出された配列の変異の全スペクトルを示す１８６個の試料が含まれた。ｐＳＳＵに関して、はじめの１９個の試料（ｃ２〜ｃ４）は１型と同定され、次の１１個の試料（ｃ３９〜ｃ４２）は２型と同定された（図１参照）。英国から帰国したヒトから得られた試料ｃ１０７およびｃ２３２を対照として含めた。ｐＩＴＳ−２については、英国Middlesexの施設で発生した感染者から得たはじめの４個の試料（ｃ７６〜ｃ１０７）および最近外国旅行をしたヒトから得た次の１１個の試料（ｃ４０〜ｃ６３）は１型と同定された。海外旅行後の患者から得た別の９個の試料（ｃ６５〜ｃ４２）および英国の水系伝染による感染者から得た２個の試料は２型と同定された。有意なｐＩＴＳ−２プロフィール変異が１型および２型の両方において検出された。ＳＳＣＰ分析によれば、２型である試料中および間において示された配列変異のレベルは１型である試料中および間において示されたよりも大きいように思われた（図１）。
【配列表】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月19日(2005.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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