(57)【要約】cAMP結合能およびコリネバクテリウム・グルタミキュム（C. glutamicum）のaceB遺伝子の発現抑制能を有する配列番号１の配列またはその変異を有し、アミノ酸の20％以下の挿入、欠失または置換によって配列番号１より取得可能である単離されたポリペプチド配列。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列を有するか、またはcAMP結合能およびコリネバクテリウム・グルタミキュム（C. glutamicum）のaceB遺伝子の発現抑制能を有する、配列番号１のアミノ酸の20％以下の挿入、欠失または置換によって得られる配列番号１の変異型の配列を有する、単離されたポリペプチド配列。
【請求項２】
cAMP結合ドメインおよびへリックス-ターン-へリックスDNA結合モチーフを有する、請求項１記載の単離されたポリペプチド配列。
【請求項３】
請求項１または２記載のポリペプチド配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。    
【請求項４】
少なくともコリネバクテリウムのaceB発現をモジュレートするための、請求項３記載のポリヌクレオチド配列の使用。
【請求項５】
アミノ酸生合成に影響を与えるための、請求項４記載の使用。
【請求項６】
アミノ酸生合成を増加させるための、請求項５記載の使用。
【請求項７】
アミノ酸がリジンである、請求項６記載の使用。
【請求項８】
コリネバクテリウムの天然のゲノム構成とは異なる方法で、宿主内で請求項３記載のポリヌクレオチド配列を発現させることにより、少なくともaceB遺伝子の遺伝子発現に影響を与えることによる、コリネバクテリウム属の宿主内でリジンを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
コリネバクテリウム・グルタミキュム（Corynebacterium glutamicum）はグラム陽性微生物であり、例えば、グルタミン酸およびリジン（Kinoshita, 1995）等のアミノ酸の工業的製造の宿主微生物としてよく知られてきた。アミノ酸製造における微生物の役割のために、工業的に重要なアミノ酸を生じる異化および同化経路が過去10年の間に詳細に研究されてきた（Sahmら, 1995、MalumbresおよびMartin, 1996参照）。しかし、代謝経路の深い理解の必要性にも関わらず、微生物における遺伝子発現の調節メカニズムにおける情報は非常に限られている。
【０００２】
C. glutamicumのグリオキシル酸バイパスが、遺伝子発現の調節メカニズムを研究する上で良い候補であるのは、該バイパスを触媒するイソクエン酸リアーゼおよびリンゴ酸合成酵素（図１）の発現が、炭素源の利用可能性によって厳密に調節されているためである（Wendischら, 1997）。aceA遺伝子にコードされるイソクエン酸リアーゼは、TCA中間体、イソクエン酸のグリオキシル酸およびコハク酸への転換を触媒する（Reinscheidら, 1994a）。aceB遺伝子にコードされるリンゴ酸合成酵素は、引き続いてグリオキシル酸とアセチル-CoAの縮合を触媒して、TCA回路に順番に入るリンゴ酸を製造する（LeeおよびSinskey, 1994、Reinscheidら, 1994b）。aceAおよびaceB遺伝子は、炭素の唯一の原料として供給される酢酸塩等の２炭素化合物によって抑制解除され、TCA回路の二酸化炭素産生ステップを迂回することによって、細胞材料の生合成のためのアセテートカーボン（acetate carbon）の保存を行っている。炭素源として供給されるグルコースは、aceAおよびaceB遺伝子を抑制する。グリオキシル酸バイパス酵素の発現は、利用可能な炭素源によって転写レベルにおいて調節される（Wendischら, 1997）が、Wendischらがアセチル-CoAのシグナル分子としての関与を示唆しているにも関わらず（Wendischら, 1997）、その転写調節のメカニズムの大半は未知である。大腸菌（Escherichia coli）において、iclRリプレッサーがaceBAKオペロン調節の要因であることが知られている（Chungら, 1988、Sunnarborgら, 1990）。iclRの発現は、脂肪酸代謝に関与する遺伝子の発現を調節することが知られているFadRによって調節される。C. glutamicumのaceAおよびaceB遺伝子の構造的構成は大腸菌のそれと異なるにも関わらず、利用可能な炭素源による遺伝子発現の調節は共通の性質を有すると考えられる。
【０００３】
発明の概要
本発明は、少なくともCorynebacterium glutamicumのaceB遺伝子の遺伝子発現を抑制する能力を有する新規のポリペプチド分子を提供する。これらの分子はglxR分子（グリオキシル酸バイパス調節因子）と呼ぶ。本発明の別の態様は、上記のglxR分子をコードするポリヌクレオチド配列に関する。本発明の別の態様は、コリネバクテリウム（Corynebacteria）等の宿主におけるアミノ酸合成に影響を与えるglxR分子の使用に関する。
【０００４】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくともコリネバクテリウム・グルタミキュムのaceB遺伝子の遺伝子発現を抑制する能力を有する新規のポリペプチド分子を提供する。配列番号１に表されるポリペプチド配列を有するglxR分子の単離は、実施例の節に記載する。
【０００５】
cAMP結合能およびC. glutamicumにおけるリンゴ酸合成酵素をコードするaceB遺伝子の転写抑制能を有するglxR変異体の調製は、実施例の節に記載する。
【０００６】
glxR分子およびglxR変異体をコードするポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードについて個々のポリペプチド配列を逆翻訳することおよびこのポリヌクレオチド配列の化学合成により調製され得る。配列番号１に関するglxR分子をコードするポリヌクレオチド配列の単離は、実施例の節に記載する。
【０００７】
本発明の別の態様は、glxR分子および少なくともコリネバクテリウム・グルタミキュム（C. glutamicum）のaceB遺伝子の発現をモジュレートする個々のポリヌクレオチド配列の使用である。１つの実施形態において、glxR分子をコードするポリヌクレオチド配列は、機能的なaceB遺伝子を有するコリネバクテリウム属の宿主微生物に組換え導入される。少なくともこのaceB遺伝子の遺伝子発現は、コリネバクテリウムの天然のゲノム構成と比較して、転写レベルでモジュレートされる。glxR分子を天然の量と同じくらい明確に高い量で発現させることで、より効果的なaceBの遺伝子抑制がもたらされる。
【０００８】
本発明の別の実施形態において、glxR分子をコードするポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子を宿主微生物に導入する。このアンチセンス分子は、glxR遺伝子の発現を減少させ、宿主におけるglxR分子の量に影響を与えて天然の量より低減させる。これは結果としてaceBの遺伝子の転写速度を向上させる。
【０００９】
本発明の別の実施形態において、glxR分子をコードするポリヌクレオチド配列は宿主生物内において部分的または完全に欠失する。これはaceB遺伝子の高い転写速度をもたらす。
【００１０】
aceBの遺伝子発現のモジュレートによって、グリオキシル酸バイパスは直接的に影響を受ける。モジュレートは例えば上方制御および下方制御の両方向であり得る。グリオキシル酸バイパスに影響を与えることで、コリネバクテリウムにおけるアミノ酸およびその中間体の代謝流動が効果的に影響を受け得る。
【００１１】
コリネバクテリウムが、アミノ酸、好適にはリジン、グルタミン酸およびメチオニンの製造のための生物として使用される時、glxR分子を介したグリオキシル酸バイパスにおける影響は、コリネバクテリウムにおけるアミノ酸製造を変化させるのに使用され得る。場合によっては、所望のアミノ酸の製造を変化させて量を増やすために有利となり得る一方、例えば不必要な中間体の合成を阻止するためには反対方向への変化が望まれる場合もある。
【００１２】
glxR分子によってグリオキシル酸バイパスへ影響を与えることは、コリネバクテリウムの代謝能力を設計するために効果的な方法である。
【実施例】
【００１３】
glxRの単離。タンパク質産物がコリネバクテリウム・グルタミキュムaceB遺伝子の発現において調節的効果を及ぼす遺伝子を単離するために、本出願人らは、コリネバクテリウムaceBの下流に融合した腸内細菌lacオペロンを有するpSL145（Kimら, 2001）をレポータープラスミドとして用いた。該プラスミドを用いた、プロモーター領域におけるaceB発現のモジュレートは、β-ガラクトシダーゼ活性の変化に反映される。pSL145を有する大腸菌DH5αF’細胞（大腸菌DH5αF’-145）は、X-galを含むLBプレート上で青色コロニーを形成し、それらをコリネバクテリウムライブラリーのスクリーニングのための宿主として用いた。タンパク質産物がaceBのプロモーター領域に調節的効果を持ち、ゆえにlacZの発現に影響を及ぼすクローンを担持する宿主細胞はプレート上で白色コロニーを形成すると予想された。スクリーニングされた合計20,000個のコロニーの中で、4個の白色コロニーが同定された。クローニングされたDNAは、重複したインサートを含むことが判明した。クローンの中から、7.8 kbのインサートを有するプラスミドpSL329（図２）が選択され、それをさらに解析した。β-ガラクトシダーゼ活性を変化させるDNA領域は、X-galを含むLB培地上にサブクローンを有する細胞（図２）をパッチング（patching）することにより同定した。呈色試験データに従い、プラスミドpSL329を有する大腸菌DH5αF’-145は2.5 mUのβ-ガラクトシダーゼ活性を示し、27 mUのβ-ガラクトシダーゼ活性を示す親株と比較して90％の減少であった（表３）。このデータは、クローニングされたDNAが有する遺伝子（glxR、下記参照）が、aceB遺伝子のプロモーター領域に結合し得ることでlacZの発現を妨害することを示唆する。
【００１４】
glxR遺伝子の配列解析。pSL329-5を配列決定テンプレート（sequencing template）として用い、クローンの完全なヌクレオチド配列を決定した。684 bpから構成されるORFが該クローンの中央領域で見つかった。他のタンパク質（下記参照）との類似性に基づいて、GTGが開始コドンとして選択された（図３）。リボソーム結合部位である可能性のあるAGGAは、GTGより9 bp上流に位置していた（図３）。ORFのGC含有率は59％であって、これはC. glutamicum遺伝子に典型的である。コドン優先度もまた、これまでに報告されたコリネバクテリウム遺伝子と非常に類似しており、興味深いことに、このことはまたこのORFが低いレベルで発現するタンパク質をコードし得ることを示唆した（Malumbresら, 1993）。
【００１５】
推定上の遺伝子産物は、228アミノ酸（配列番号１）から構成され、予測される等電点が7.0である24,957 Daのタンパク質をコードする。このORFの翻訳されたアミノ酸配列をタンパク質データベースの配列と比較した。既知のタンパク質の中で、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の推定転写調節タンパク質（E70790）および放線菌（Streptomyces coelicolor）の推定転写調節タンパク質（T36556）が、それぞれ78および53％のアミノ酸同一性で最も高いスコアを得た。役割が既知であるタンパク質の中で、コレラ菌（Vibrio cholerae）（NP232242）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）（A26049）および大腸菌（J01598）のサイクリックAMP受容体タンパク質（CRP）がおよそ27％の同一性で最も高いスコアを得た。アミノ酸配列の綿密な解析により、酵素の触媒活性に含まれ得る２つの保存されたモチーフが明らかになった（図３）。13〜102番目のアミノ酸は、cAMP結合ドメインと予測される保存された残基のパターンを示し、cAMP結合ドメインの保存配列と31％の同一性を示した（図４）。さらに、CRP/FNRファミリーのヘリックス-ターン-へリックスDNA結合モチーフが、コードされたタンパク質の炭素末端領域（170〜218番目のアミノ酸）で同定された。それは、CRPのヘリックス-ターン-へリックスモチーフと41％の同一性を示した（図４）。クローニングされた遺伝子（下記参照）の特徴に基づき、本出願人らはこのコリネバクテリウム遺伝子をglxR（glyoxylate bypass regulator）と命名した。
【００１６】
コードされたタンパク質の解析。pKK223-3ベクターへのRBSを含むglxRコード領域のクローニング、および得られたベクターの大腸菌への導入は、SDS-PAGEにおいて25,000 Mrであるタンパク質発現をもたらした（図５A）。検出された分子量は、該タンパク質の推定Mwと一致した。GlxRタンパク質は、MBP融合技術を用いて精製した。予想通り、精製されたタンパク質はSDS-PAGEにおいて25,000 Mrを示した（図５B）。精製されたタンパク質の本来のMwは、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーによって決定されたように44,000 Daであった（データは示さない）。このことは、該タンパク質が他の多くのDNA結合タンパク質のように二量体を形成しているらしいことを示唆する。
【００１７】
cAMPの関与。glxRの役割を研究するための初めのステップとして、glxRクローンであるプラスミドpSL329-5をC. glutamicumに導入し（AS019E12）、その効果をモニタリングした。図６ABに示すように、多コピーでのglxRクローンの存在は、炭素源としてグルコースまたは酢酸で生育させた宿主細胞の増殖に著しい影響を及ぼした。表２に示すように、酢酸最小培地で観察された増殖障害は、明らかにリンゴ酸合成酵素およびイソクエン酸リアーゼ等のグリオキシル酸バイパス酵素の減少によるものであった。イソクエン酸脱水素酵素、TCA回路酵素の酵素活性は影響を受けなかった。活性の減少はSDS-PAGEにより判断されるように、発現酵素量減少によるものであった（データは示さない）。しかし、増殖実験をcAMP存在下で行うと、興味深い結果が観察された。グルコース最小培地中での増殖（図６A）と異なり、酢酸最小培地におけるglxRクローンを有する細胞の増殖は、cAMPによって激しく影響を受けた（図６B）。ウェスタンブロット解析によって証明されたように、炭素源としてグルコースまたは酢酸を用いた両増殖条件下において発現したGlxRの量は影響を受けなかった（データは示さない）。このデータと一致して、表３に示すように、コリネバクテリウムaceBプロモーターにおけるglxRクローンの活性のモジュレートは、大腸菌のcya変異株には観察されなかった。さらに、精製したGlxRタンパク質は、cAMP存在下でのトリプシンによる消化に対してより耐性があった（データは示さない）。これらのデータは、cAMPがGlxR活性のモジュレートに関与することを示唆する。また、cAMPが様々な炭素源の利用に関与する遺伝子の発現を調節するシグナル分子であり得ることを示唆する。
【００１８】
GlxRのDNA結合活性。GlxRがaceBの発現調節に関与することを知るために、本発明者らは精製したGlxRのaceB遺伝子のプロモーター領域への結合を試験した。目的のために、aceB遺伝子のプロモーター領域を有するDNA断片を使用した（図７A）。cAMPの存在下において、プローブに対する精製したGlxRタンパク質の量をさらに増加させることで、２本の異なるシフト（shifted）バンドが生じた（図７C）。上のバンドは下のバンドより後に現れ、このことは上のバンドがGlxRタンパク質のオリゴマー化（oligormerization）によるものであり得ることを示唆する。cAMPをグリオキシル酸バイパス酵素のモジュレーターとして示唆されてきた（Wendischら, 1997）アセチル-CoAに代えると、該プローブではいかなるDNAシフトも生じなかった（データは示さない）。ゲル移動（mobility）アッセイにより証明されたように、GlxRタンパク質がオリゴマー（oligomers）を形成し得ることを知るために、本出願人らは架橋剤であるEDACを用いて精製したGlxRのオリゴマー化を試験した。cAMPの存在とは無関係に、二量体および三量体の架橋構造が観察された。
【００１９】
glxRタンパク質の変異体。本来のglxRポリペプチド配列（配列番号１）より始めることで、多くの機能的に等価なglxR変異体は、配列番号１の１つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって調製し得る。機能的に等価な変異体とは、配列番号１を有するglxRと同じ程度のcAMPへの結合能およびC. glutamicumのaceB遺伝子の発現、特に転写への抑制能を維持しているような変異体を意味する。glxR変異体の調製は、好適には個々にコードしているポリヌクレオチドの部位特異的変異誘発等の公知の遺伝子操作技術によって行われる。
【００２０】
glxR変異体は、配列番号１の配列とアミノ酸配列が20％以下、好適には15％以下、最も好適には10％以下および非常に最も好適には5％以下異なる。
【００２１】
例えば図４に示すように、glxR変異体が完全なcAMP結合ドメインおよび完全なヘリックス-ターン-ヘリックスDNA結合モチーフを有することが重要である。
【００２２】
材料および方法
細菌株、プラスミドおよび増殖条件。本研究で用いた全ての株およびプラスミドを表１に列挙する。大腸菌DH5αF’を用いてプラスミドの構築および増殖を行った。大腸菌JM105を用いてpKK-glxR由来のGlxRを発現させた。プラスミドpRS415において構築したPaceB-lacZのオペロン融合体を、Simonsらによって記載されているようにλRS415ラムダファージを用いて大腸菌の染色体に導入した（Simonsら, 1987）。他に定めがない場合は、大腸菌およびC. glutamicum細胞をそれぞれLB中で37℃（Sambrookら, 1989）およびMB中で30℃で培養した（Follettieら, 1993）。大腸菌およびC. glutamicumの最小培地はそれぞれM9（Sambrook, 1989）およびMCGC（von der Osten, 1989）であった。炭素源を以下の量で最小培地に添加した：グルコース、1％；酢酸、2％。抗生物質を以下の量で添加した：アンピシリン50 μg/ml、テトラサイクリン20 μg/ml、カナマイシン20 μg/ml。X-galおよびcAMPをそれぞれ40 μg/ml、8 mMとなるよう培地に添加した。タンパク質の発現のために、IPTGを最終濃度が1 mMまたは0.3 mMとなるよう添加した。
【００２３】
DNA技術。標準的な分子クローニング、形質転換および電気泳動法を用いた（Sambrookら, 1989）。エレクトロポレーションによってプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミキュム（C. glutamicum）細胞に導入した（Follettieら, 1993）。コリネバクテリウム・グルタミキュム（C. glutamicum）細胞の少量プラスミド調製は記載されているように行った（Yoshihamaら, 1985）。コリネバクテリウム・グルタミキュムAS019由来の染色体DNAを記載されているように調製した（Tomiokaら, 1981）。制限酵素およびDNA修飾酵素は宝酒造（株）（滋賀、日本）およびNew England Biolabs（Beverly, USA）より購入し、製造者により推奨されているように使用した。
【００２４】
クローニングおよび配列決定。コリネバクテリウム・グルタミキュムAS019のゲノムライブラリーをこれまでの記載に従って構築した（LeeおよびSinskey, 1994）。それは、大腸菌-コリネバクテリウムシャトルベクターpMT1の中にクローニングされた4〜13 kbのMboI断片から作製された。大腸菌DH5αF’細胞をpSL145で形質転換し（Kimら, 2001）、生じた大腸菌DH5αF’-145株をライブラリーのスクリーニングのための宿主として用いた。lacZYAを有するプラスミドpSL145をaceBプロモーター領域の下流に融合した。
【００２５】
glxRのヌクレオチド配列解析のために、プラスミドpSL329-5を鋳型として用いた。glxRの完全なヌクレオチド配列は、the Korea Research Center for Basic Sciences（Taejon, Korea）において、一般的なおよび合成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて商業的に決定した。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の配列類似性検索は、the National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）においてBLASTを用いて実施した（Altschulら, 1990、Altschulら, 1997）。２つの配列の比較はExPASy Proteomics toolsのウェブサイト（http://www.expasy.ch/tools/）においてClustalW配列比較法を用いて実施した（Thompsonら, 1994）。
【００２６】
プラスミドの構築。プラスミドpSL329-1、pSL329-2、pSL329-3およびpSL329-5は、SmaI-XbaI、XhoIおよびKpnIでそれぞれ消化したpMT1ベクターに、pSL329の5.1 kbのEcoRI-XbaI断片、5.2 kbのXhoI断片、2.7 kbのSmaI-EcoRI断片および1.8 kbのKpnI断片を連結することで作製した。プラスミドpSL329-4は、pSL329-3の0.2 kbのSalI断片を欠失させることによって作製した。プラスミドpSL08-glxRは、pSL329-5の1.8 kbのKpnI-BamHI断片を、XbaIで消化およびKlenow酵素で平滑末端化したpSL08内に挿入することにより構築した。クローニングしたglxR遺伝子の転写方向は、aceB遺伝子のそれとは逆であった。プラスミドpKK-glxRは、C1およびC2プライマーでpSL329-5の828 bp断片を増幅し、かつ生じた断片をpKK223-3のEcoRI部位に挿入することによって構築された。828 bp断片はglxR遺伝子およびそのリボソーム結合部位を有する。プラスミドpMAL-glxRは以下のように構築した。glxRコード領域を、プラスミドpSL329-5を鋳型として用いてD1およびD2のプライマーで増幅した。0.89 kbのPCR産物をEcoRIおよびSalIで処理し、EcoRI-SalIで消化および脱リン酸化したpMAL-c2内に連結した。
【００２７】
GlxRの精製。プラスミドpMAL-glxRを用いてGlxRを発現させた。glxRを有するベクターをmalEに融合し、MBP-GlxR融合タンパク質を発現させる。ファクターXaを用いた融合タンパク質の切断は、該タンパク質のN末端に一連のアミノ酸（Ile-Ser-Val-Phe）を有する遊離のGlxRタンパク質を放出する。該融合タンパク質を発現させ、ベクターpMAL-c2（New England Biolabs, Beverly, USA）の製造者による指示に従って精製した。GlxRは、Q-Sepharose Fast Flow column chromatography（Amersham Pharmacia Biotech、2.8 cm×11 cm）により、25〜500 mMの直線的NaCl勾配を用いてMBPから分離された。GlxRを含む画分をプールし、かつ該タンパク質をPEG8,000に対する透析によって濃縮した。
【００２８】
ゲル移動度シフトアッセイ。プローブDNAは以下のように調製した。aceB遺伝子の上流領域（ATG開始コドンから120〜320 bp上流）を含む200 bpのDNA断片を、E1およびE2プライマーを用いて増幅し、次にT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ-32P］dATPによって標識した。10 μlの結合反応混合液は、標識したDNA断片、様々な量の精製したGlxR、10 mMリン酸バッファー、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、3 μgのウシ血清アルブミンおよび1 μgのポリ（dI-dC）・ポリ（dI-dC）を含む。GlxRのプローブDNAへの結合は室温で15分間行い、記載されているように該混合液を6％の未変性ポリアクリルアミドゲル中で解析した（Sambrookら, 1989）。必要な場合は、0.2 mMのcAMPを結合バッファー、ゲルおよび泳動バッファー中に含ませた。
【００２９】
生化学的解析および抗体の調製。コリネバクテリウム細胞抽出物を記載されているように調製した（Follettieら, 1993）。β-ガラクトシダーゼ、リンゴ酸合成酵素、イソクエン酸リアーゼ、イソクエン酸脱水素酵素および酢酸キナーゼの酵素活性を、これまでに記載されているように測定した（Miller, 1972、Gublerら, 1993、DixonおよびKornberg, 1959、 GarnakおよびReeves, 1979、van DykおよびLaRossa, 1987）。タンパク質はBradford法（Bradford, 1976）によりウシ血清アルブミンをスタンダードとして用いて測定した。SDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析はこれまでに記載されているように行った（Laemmli, 1970）。抗GlxR抗血清は、マウスを宿主としてKoma Biotech（Seoul, Korea）において商業的に調製した。
【００３０】
GenBank受託番号。glxRのヌクレオチド配列は、受託番号AF293334としてGenBankに受託した。
【００３１】
考察
本研究において、本出願人らは、炭素源としての酢酸の利用に関与するaceB遺伝子の調節におけるGlxRの関与を示した。その証拠は、１）レポーターを有する大腸菌におけるβ-ガラクトシダーゼ活性のモジュレート、２）コードされたタンパク質配列における推定DNA結合ドメインの存在、３）導入したglxRクローンの存在下でのグリオキシル酸バイパス酵素の発現の減少、および４）aceBプロモーター領域上への精製したGlxRのDNA結合である。さらに、他のDNA結合タンパク質のように、該タンパク質が相対的に塩基性のpIを有する二量体として存在する研究成果もまた、該タンパク質の調節的役割を支持する。しかし、本出願人らのデータはglxR遺伝子が主としてaceAおよびaceB等のグリオキシル酸バイパス遺伝子の調節に関与し得ることを示唆するが、本出願人らは、該遺伝子がまた他の遺伝子の発現に関与し得る可能性を除外することは出来ない。グルコース最小培地中のglxRによる増殖遅延は、他のプロモーターとGlxRとの相互作用を示唆し得るが、このことはCRPにおいて観察されたような配列非依存的なDNAへの親和性による可能性がある。多くの試みにも関わらず、クローニングしたDNAを用いたglxR変異株構築の失敗は、該遺伝子の必須性を示唆し得（データは示さない）、他の遺伝子の発現へのglxR遺伝子の関与を示唆している。この観点において、大腸菌のCRPのように、GlxRタンパク質は該遺伝子を必須としている他の遺伝子の活性因子として機能し得る。
【００３２】
glxR遺伝子のコードされたタンパク質配列が腸内細菌のCRPと相同性を示すことを知ることは興味深い。CRPは炭素異化産物抑制において役割を果たし、大腸菌等の腸内細菌のcAMPによって支配される。GlxRおよびCRPの間の大きな類似性は、１）アミノ酸配列類似性、２）cAMP結合モチーフの存在、３）DNA結合活性のモジュレートへのcAMPの関与、および４）cAMP存在下におけるタンパク質のプロテアーゼに対する異なる感受性を含む。これらの類似性にも関わらず、GlxRの役割はCRPのそれとは異なる形式であると考えられる。例えば、glxR遺伝子は大腸菌のcrp変異体を相補出来なかった（データは示さない）。
【００３３】
サイクリックAMPは、多くの遺伝子の発現を制御する重要なシグナル分子である。ｃAMPが関与することは、腸内細菌、バチルス（Bacillus）種およびストレプトマイセス（Streptomyces）種等の多くの細菌において報告されている（BotsfordおよびHarman, 1992）。大腸菌において、該分子はラクトースおよびアラビノースオペロン等の炭素異化遺伝子に対して重要な役割を果たしている（Epsteinら, 1975）。炭素飢餓条件下においてcAMPの細胞内濃度は上昇する。これは一般的な現象であるが、また例外もある。例えば、Brevibacterium種はグルコース最小培地上で増殖する際、明らかにcAMP濃度を低く保つ（Peterら, 1991）。このことは本発明者らがコリネバクテリウム・グルタミキュムにおいて発見したことと類似している。増殖実験において証明されるように（図６）、cAMPの細胞内濃度は酢酸で増殖する際に低く保たれ得る。cAMP存在下におけるglxRクローンを有する細胞の増殖の低下は、この仮説を支持し得る。このことはさらに、cAMPによる明白な影響を全く示さないグルコース最小培地で得られたデータによって支持される。このことは、大腸菌、ストレプトマイセス種において確立されている定説（dogma）と逆であるが、cAMPがグルコース制限条件よりもむしろ急速増殖期の間に高レベルで存在し、従って炭素源の欠乏よりもむしろ利用可能性のシグナルを伝達するということが主張されてきている（Dobrovaら, 1984）。バチルス種等の低GC含有率であるGm+細菌における異化抑制のcAMP非依存的メカニズムが詳細に研究されてきているが、コリネバクテリウム種等の高GC含有率であるGm+細菌における情報は全体的に不足している（BotsfordおよびHarman, 1992、Saier Jr., 1996の総説参照）。この観点において、本研究は炭素利用に関与する遺伝子の発現におけるcAMPの関与に対する最初の証拠を示す。
【００３４】
結論として、本出願人らはコリネバクテリウムaceBプロモーターおよびlacオペロンを有するレポータープラスミドを用いて、C. glutamicumより調節遺伝子を単離することに成功した。glxR遺伝子はaceAおよびaceB遺伝子に対するリプレッサー様タンパク質をコードしていると考えられるが、遺伝子がまた他の遺伝子の発現に関与し得る可能性もある。
【表１】
2005536194.tif 000002
【表２】
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【表３】
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【００３５】
引用文献
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【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】コリネバクテリウム・グルタミキュムのグリオキシル酸バイパスおよび関連経路を示す。グリオキシル酸バイパスはイソクエン酸リアーゼおよびリンゴ酸合成酵素により行われる。略語：ACK＝酢酸キナーゼ、ICDH＝イソクエン酸脱水素酵素、ICL＝イソクエン酸リアーゼ、MS＝リンゴ酸合成酵素、OAA＝オキサロ酢酸、PTA＝ホスホトランスアセチラーゼ。破線矢印は複数のステップを表す。
【図２】クローンおよびサブクローンの模式図を示す。プラスミドpSL329はコリネバクテリウムライブラリーより単離した。クローニングベクターpMT1は示さない。それぞれのクローンを有する大腸菌DH5αF’-145のコロニーの色（青色または白色）をX-gal、テトラサイクリンおよびアンピシリンを含むLBプレート上で試験した。略語：B＝BamHI、E＝EcoRI、K＝KpnI、Sa＝SalI、Sc＝ScaI、Sp＝SphI、X＝XhoI、Xb＝XbaI。
【図３】GlxRタンパク質の模式図（パネルA）を示す。
【図４】コリネバクテリウム・グルタミキュムのGlxRタンパク質の他の相同配列との複数配列アライメントを示す。保存されたおよび機能的に類似したアミノ酸は、それぞれ黒および影付きの囲いで示す。サイクリックヌクレオチド１リン酸結合モチーフおよびヘリックス-ターン-ヘリックスDNA結合モチーフは実線で示す。略語：CG＝C. glutamicumのGlxR（AF220150）、MT＝結核菌H37RVの推定転写調節因子Rv3676（E70790）、SC＝Streptomyces coelicolorの推定転写調節因子（T36556）、VC＝コレラ菌のCRP（NP232242）、EC＝大腸菌のCRP（J01598）。
【図５】大腸菌でのGlxRの発現を示す。（A）GlxRタンパク質は、材料および方法に記載するようにpKK-glxRベクターより発現させた。レーン：1＝大腸菌JM105/pKK223-3、2＝大腸菌JM105/pKK-glxR（非誘導）、3＝大腸菌JM105/pKK-glxR（誘導）。（B）GlxRの精製。タンパク質をpMAL-glxRより発現させた。レーン：4＝全タンパク質、5＝可溶画分、6＝精製したMBP-GlxR融合タンパク質、7＝ファクターXa（Factor X）処理後、8＝精製したGlxRタンパク質。Mは分子量スタンダードを示す。
【図６】コリネバクテリウム・グルタミキュムにおけるglxRの発現および増殖におけるcAMPの影響を示す。グルコース（パネルA）または酢酸（パネルB）を唯一の炭素源として使用した。必要ならば、cAMPを最終濃度8 mMとなるよう添加した。記号：●＝pMT1（空のベクター）、○＝pMT1およびcAMP、■＝pSL329-5（glxR）、□＝pSL329-5（glxR）およびcAMP。
【図７】精製したGlxRを用いたゲルシフトアッセイの結果を示す。精製したGlxRタンパク質をプローブと伴にインキュベートし、この混合物を6％PAGEで解析した。パネル：A＝aceBプロモーター領域の模式図、B＝cAMP非存在下におけるゲルシフト、C＝cAMP存在下におけるゲルシフト。アッセイ混合物、ゲルおよびPAGEバッファーにサイクリックAMPを添加した（0.2 mMまで）。レーン：1＝タンパク質なし、2＝0.03 μg、3＝0.06 μg、4＝0.13 μg、5＝0.25 μg、6＝0.5 μg、7＝1.0 μg、8＝2.0 μgの精製したGlxRタンパク質。矢印はシフトしたバンドを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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