(57)【要約】例えば、小分子または抗体派生物によるＰＥＣＡＭ−１（血小板内皮細胞接着分子−１）の賦活は、血栓症、発作、血管閉塞のような心臓血管疾患の処置または予防ならびに安定性疾患の処置または予防において有用な血小板賦活、血栓形成を緩和する新たな治療法を提供する。これは、それが賦活組織の一方の腕を単に遮断することよりはむしろ一般的な抑制機構を賦活するので、既存の薬物よりもこれらの状態の処置に対して良好な解決法を与える。ＰＥＣＡＭ−１の賦活体用スクリーンは、ＰＥＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１の外部領域、ＰＥＣＡＭ−１の細胞形質尾部、ＰＥＣＡＭ−１のＩＴＩＭ、ＰＥＣＡＭ−１の活性部位、ＰＥＣＡＭ−１の組換型細胞外部領域、もしくはその派生物もしくはその一部、ならびに、ＰＥＣＡＭ−１の賦活用スクリーンは、ＰＥＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１の外部領域、ＰＥＣＡＭ−１の細胞形質尾部、ＰＥＣＡＭ−１のＩＴＩＭ、ＰＥＣＡＭ−１の活性部位、ＰＥＣＡＭ−１の組換型細胞外部領域、もしくはその派生物もしくはその一部の賦活、架橋、リン酸化反応またはチロシン・リン酸化反応を検出する手段からなる。
2005523886.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板賦活、血小板凝集、または血小板分泌を緩和、軽減、または抑制するＰＥＣＡＭ−１の賦活。
【請求項２】
前記賦活は架橋ＰＥＣＡＭ−１からなる、請求項１に記載の賦活。
【請求項３】
前記賦活は抗体仲介架橋からなる、請求項１または２に記載の賦活。
【請求項４】
前記抗体はＰＥＣＡＭ−１の外部領域に対して特異性がある、請求項３に記載の賦活。
【請求項５】
二次抗体からさらになる、先行請求項に記載の賦活。
【請求項６】
前記賦活はＰＥＣＡＭ−１のリン酸化反応からなる、請求項１−５の任意の一項に記載の賦活。
【請求項７】
前記リン酸化反応はＰＥＣＡＭ−１の細胞形質尾部において起こる、請求項６に記載の賦活。
【請求項８】
前記リン酸化反応はＰＥＣＡＭ−１のＩＴＩＭ内で起こる、請求項６または７に記載の賦活。
【請求項９】
ＰＥＣＡＭ−１はチロシン残留物においてリン酸化反応される、請求項６−８の任意の一項に記載の賦活。
【請求項１０】
血栓症、血管閉塞、または発作のような心臓血管疾患の発症を処置もしくは軽減する、または血行停止疾患の発症を処置もしくは軽減する、請求項１−９の任意の一項に記載のＰＥＣＡＭ−１の賦活、架橋、またはリン酸化反応。
【請求項１１】
ＰＥＣＡＭ−１の賦活、架橋、またはリン酸化反応は、総合チロシン・リン酸化反応、血小板タンパク質リン酸化反応、密顆粒剤からの血小板分泌、細胞内蓄積からのカルシウムの可動化、イノシトール・リン酸塩の生成、インテグリン連鎖キナーゼの調整からなる群から選択された任意の１つを緩和、抑制、または軽減する、請求項１−１０の任意の一項に記載のＰＥＣＡＭ−１の賦活。
【請求項１２】
受容体または受容体作動薬を含有するＩＴＡＭまたは非ＩＴＡＭによって刺激された血小板を抑制、緩和、または軽減するための、請求項１−１１の任意の一項に記載のＰＥＣＡＭ−１の賦活、架橋、またはリン酸化反応。
【請求項１３】
コラーゲン、コラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）、コンバラクシン、トロンビン、ＡＤＰ、トロンボキサン擬態、Ｕ４６６１９、免疫グロブリン  Ｇ  ＦｃγＲＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩＡ）、免疫グロブリン  Ｅ  ＦｃεＲＩ（ＦｃεＲＩ）、チロシン・キナーゼ、ＧＰＶＩ仲介徴候、およびトロンビン受容体仲介徴候からなる群から選択された任意の１つに応答して、血小板の賦活、凝集、または分泌を抑制、軽減、緩和をするための、請求項１２に記載のＰＥＣＡＭ−１の賦活、架橋、またはリン酸化反応。
【請求項１４】
先行請求項にもとづいて使用するためのＰＥＣＡＭ−１賦活体。
【請求項１５】
前記賦活体は、小分子、抗体、抗体派生物、作動薬、拮抗薬、リガンド、ＤＮＡ配列、相補ＤＮＡ配列、プローブ、タンパク質配列、ＰＥＣＡＭ−１の組換型細胞外部領域、触媒、ずれ、酸化性応力、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩ用高結合性受容体、高結合性受容体ＦｃεＲＩの賦活化形体、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ用低結合性受容体、および低結合性受容体ＦｃγＲＩＩＡの賦活化形体からなる群から選択される、請求項１４に記載の賦活体。
【請求項１６】
血栓症、血管閉塞、または発作のような心臓血管疾患の発症を処置もしくは軽減する、または血行停止疾患の発症を処置もしくは軽減する、請求項１４または１５に記載の賦活体。
【請求項１７】
血栓症、血管閉塞、または発作のような心臓血管疾患の発症を処置もしくは軽減するための、または血行停止疾患の発症を処置もしくは軽減するための医薬の製造に用いる、請求項１４−１６の任意の一項に記載の賦活体。
【請求項１８】
ＰＥＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１の外部領域、ＰＥＣＡＭ−１の細胞形質尾部、ＰＥＣＡＭ−１のＩＴＩＭ、ＰＥＣＡＭ−１の活性部位、ＰＥＣＡＭ−１の組換型細胞外部領域、もしくはその派生物もしくはその一部、ならびに、ＰＥＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１の外部領域、ＰＥＣＡＭ−１の細胞形質尾部、ＰＥＣＡＭ−１のＩＴＩＭ、ＰＥＣＡＭ−１の活性部位、ＰＥＣＡＭ−１の組換型細胞外部領域、もしくはその派生物もしくはその一部の賦活、架橋、リン酸化反応またはチロシン・リン酸化反応を検出する手段からなる、ＰＥＣＡＭ−１の賦活体用スクリーン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓症、血管閉塞、発作のような心臓血管状態の発症を処置または軽減しかつ血行停止疾患の発症を処置または軽減する血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ３１）の活性度の変調に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓症、細胞要素のエントラプメントが血管閉塞症をその生成点においてしばしば生じる状態にした、主に血小板およびフィブリンの血液因子の凝縮が、顕著な主要問題である。それは、心臓血管疾患から最も多くの死の底流をなしている（別の底流原因があろうがなかろうが）。２００１心臓および発作統計最新情報（アメリカ心臓協会）は、心臓疾患の罹患率が、冠状動脈心臓疾患（心筋層の亀裂および狭心症）を最近患った１２４０万人について、５人に１人であり、４７０万人が発作作用を受けていることを報告している。１９９８年においては、心臓血管疾患（高血圧および鬱血心不全の作用を含む）で、アメリカにおいて９１５，６１９人（死者２．５人について１人に相当する）が死亡した。
【０００３】
血小板は血液凝固を開始し、凝固および／またはトロンビンの生成を制御し、組織損傷部位における血小板の迅速かつ完全な賦活が、多数の正帰還経路をかいして、主として、賦活された血小板から解除されたトロンボキサンＡ２およびＡＤＰのような仲介物の作用をかいして保証される。このような迅速反応系統の存在は、血栓症、出血のような疾患を予防するために血小板機能の有効な調整の必要性を強調している。血小板反応度は、正負調整因子と徴候機構との間の制御された均衡である。
【０００４】
賦活血小板細胞表面受容体を標的としかつ遮断する試薬の使用は公知であり、抗血栓症薬物の開発において成功対策を提供した。しかし、定常性系統の複雑な特性およびそれが賦活される多くの方法のために、これらの薬物のいずれも血栓症関連状態のすべてに治癒または完全な解決をもたらさなかった。せいぜい、いくつかの試みにおいては、死亡率が２５％まで軽減されたと報告されている。しかし、多くの側の作用は既存の処置に関連されている。その結果、これらの薬物のほとんどすべてが、臨床状況にもとづいて組み合わせて使用される。これは、血栓症および関連した心臓血管状態の安全有効処置の必要性を強調する働きをする。
【０００５】
多くの注意が、血小板賦活、特にコラーゲン、トロンビン、ＡＤＰへの露出を招く受容体の確認および徴候経路に最近焦点を合わせてきた。
【０００６】
この徹底的な研究活動にもかかわらず、血小板賦活を緩和または抑制するように天然の抑制性受容体を賦活し、それによって血栓症生成を軽減する薬剤の使用が従来は示唆も試行もされてこなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、細胞表面ＩＴＩＭ支持接着受容体、ＰＥＣＡＭ−１をかいして実現される負の調整システムを確認した。ＰＥＣＡＭ−１徴候は、血小板賦活経路に負帰還を生じ、それにより傷害なしに血栓症を予防する血小板賦活に対して限界刺激レベルを設定する。
【０００８】
本発明者は、例えば、小分子または抗体派生物を伴うＰＥＣＡＭ−１の賦活が血栓症、発作、血管閉塞のような心臓血管疾患の処置または予防においてならびに血行停止疾患の処置または予防において有用である血小板賦活および血栓生成を緩和する新規な治療方法を提供することを突き止めた。
【０００９】
本発明は、賦活システムの一方の腕を単に遮断するよりもむしろ一般的な抑制機構を賦活するとき、既存の薬剤よりもこれらの状態の処置により良い対策を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
最も広い観点においては、本発明は、血小板賦活、血小板凝集、または血小板分泌を緩和、軽減、または抑制するＰＥＣＡＭ−１を賦活する方法を提供する。
【００１１】
好適観点において、本発明は、血栓症、血管閉塞、または発作のような心臓血管疾患の発症を処置もしくは軽減するための、または血行停止疾患の発症を処置もしくは軽減するためのＰＥＣＡＭ−１の賦活、架橋、またはリン酸化反応を行う方法を提供する。
【００１２】
別の観点においては、本発明は、この方法に用いる賦活体を提供する。
【００１３】
別の観点においては、本発明は、血栓症、血管閉塞、または発作のような心臓血管疾患の発症を処置もしくは軽減するための、または血行停止疾患の発症を処置もしくは軽減するための賦活体を提供する。
【００１４】
別の観点においては、本発明は、血栓症、血管閉塞、または発作のような心臓血管疾患の発症を処置もしくは軽減するための、または血行停止疾患の発症を処置もしくは軽減するための薬物の製造に使用する賦活体を提供する。
【００１５】
別の観点においては、本発明は、ＰＥＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１の外部領域、ＰＥＣＡＭ−１の細胞形質尾部、ＰＥＣＡＭ−１のＩＴＩＭ、ＰＥＣＡＭ−１の活性部位、ＰＥＣＡＭ−１の組換型細胞外部領域、もしくはその派生物もしくはその一部、ならびに、ＰＥＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１の外部領域、ＰＥＣＡＭ−１の細胞形質尾部、ＰＥＣＡＭ−１のＩＴＩＭ、ＰＥＣＡＭ−１の活性部位、ＰＥＣＡＭ−１の組換型細胞外部領域、もしくはその派生物もしくはその一部のための賦活体用スクリーンを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、添付実験データおよび図面を参照して例示として記載される。
【００１７】
図１は、ＰＥＣＡＭ−１の架橋がコラーゲン刺激血小板凝集を抑制することを示す。
（Ａ）血小板表面上のＰＥＣＡＭ−１架橋がそのチロシン・リン酸化反応を生じ、血小板凝集を刺激しない。（ｉ）ＰＥＣＡＭ−１は休眠状態または下記のＰＥＣＡＭ−１架橋の下で洗浄されたヒトの血小板から免疫沈降された。タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、リン酸化反応残留物を検出するように免疫吸取りされた（上方パネル）。免疫沈降は、ＰＥＣＡＭ−１を再検査することによって検証された（下方パネル）。（ｉｉ）ＰＥＣＡＭ−１が洗浄血小板上で架橋され、凝集が光学凝集測定法を用いて監視された。（Ｂ）（ｉ）９０秒間Ｆ（ａｂ’）２架橋体の追加前に５分間アイソタイプ整合制御ＩｇＧによって培養され、その後コラーゲン（１００ｍＭ（ｍｇ／ｍＬ））によって刺激された。凝集が光学凝集測定法を用いて監視された。（ｉｉ）ＰＥＣＡＭ−１の架橋がコラーゲン刺激血小板凝集を抑制する。血小板は、第１架橋ＰＥＣＡＭ−１有りおよび無しで、９０秒間コラーゲン（１００ｍＭ（ｍｇ／ｍＬ））によって刺激され、血小板凝集が光学凝集測定法によって監視された。データは３つの別個の実験を表す。Ｔｙｒ（Ｐ）、チロシン・リン酸化反応、ＰＥＣＡＭ−１  ＸＬ、ＰＥＣＡＭ−１架橋。
【００１８】
図２は、ＰＥＣＡＭ−１架橋がＧＰＶＩおよびトロンビン受容体刺激血小板凝集を抑制することを示す。
（Ａ）血小板は、（ｉ）１５ｎＭ（ｎｇ／ｍＬ）および（ｉｉ）６２．５ｎＭ（ｎｇ／ｍＬ）において、第１架橋ＰＥＣＡＭ−１有りおよび無しでＣｖｘによって刺激され、凝集応答が光学凝集測定法によって監視された（矢印はＣｖｘの追加を表す）。（Ｂ）血小板は、（ｉ）０．０５Ｕ／ｍＬおよび（ｉｉ）０．１Ｕ／ｍＬにおいて、ＰＥＣＡＭ−１の事前架橋有りおよび無しでトロンビンによって刺激された。血小板凝集が光学凝集測定法によって監視された（矢印はトロンビンの追加を表す）。Ｃｖｘ（１５ｎＭ（ｎｇ／ｍＬ））およびトロンビン（０．０５Ｕ／ｍＬ）による刺激前のアイソタイプ整合制御ＩｇＧによる血小板の処置が、Ａ（ｉ）およびＢ（ｉ）にそれぞれ示される。データは３つの別個の実験を表す。ＰＥＣＡＭ−１  ＸＬ、ＰＥＣＡＭ−１架橋。
【００１９】
図３は、血小板密顆粒分泌がＰＥＣＡＭ−１徴候によって抑制されることを示す。
血小板は、Ｃｖｘ（６２．５ｎＭ［ｎｇ／ｍＬ］）またはトロンビン（０．１Ｕ／ｍＬ）による刺激前に［３Ｈ］５−ＨＴによって装填された。必用に応じて、ＰＥＣＡＭ−１は作動薬の追加前に架橋された。細胞媒体への［３Ｈ］５−ＨＴの分泌がシンチレーション・スペクトロメータを用いて測定された。［３Ｈ］５−ＨＴ解除は、基底の分泌値の減算後に総合組織内容の百分率として表された。結果は、平均＋／−ＳＥ（ｎ＝３）を表す。学生のｔ−試験は、統計上の重みに対してＰＥＣＡＭ−１架橋サンプルと非架橋サンプルとを比較するために用いられた。（＊ｐ値＜０．０５、ＰＥＣＡＭ−１  ＸＬ、ＰＥＣＡＭ−１架橋）
【００２０】
図４は、ＰＥＣＡＭ−１徴候が血小板タンパク質チロシン・リン酸化反応を抑制することを示す。
血小板溶解産物は、非刺激血小板（バッファのみによって攪拌された）および９０秒間Ｃｖｘ（１５ｎＭ［ｎｇ／ｍＬ］）またはトロンビン（０．０５Ｕ／ｍＬ）により刺激された血小板からＬａｅｍｍｌｉバッファ中に準備された。刺激前に、ＰＥＣＡＭ−１が同じサンプル（Ａ）に架橋されるか、またはアイソタイプ整合制御ＩｇＧおよびＦ（ａｂ’）２（Ｂ）によって培養された。タンパク質は、軽減条件の下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、タンパク質チロシン・リン酸化反応を検出するために免疫吸取りをされた。ＰＥＣＡＭ−１  ＸＬ、ＰＥＣＡＭ−１架橋。
【００２１】
図５は、架橋が細胞内蓄積からカルシウムの可動化を抑制することを示す。
Ｆｕｒａ−２  ＡＭ装填ヒトの血小板がＣｖｘまたはトロンビンによって刺激され、カルシウムの可動化が蛍光測定で計測された（矢印は作動薬の追加を表す）。パネル（Ａ）：制御ＩｇＧおよびＦ（ａｂ’）２による血小板の処置は、Ｃｖｘ−およびトロンビン刺激カルシウム可動化に効果を有していない。
【００２２】
図６は、刺激に対する代表的なカルシウム応答を示す。パネルＢ（ｉ）および（ｉｉ）は、第１架橋ＰＥＣＡＭ−１有りおよび無しによるそれぞれ６２．５ｎＭ［ｎｇ／ｍＬ］および１５ｎＭ［ｎｇ／ｍＬ］による刺激に対する代表的なカルシウム応答を示す。痕跡は、３つの別個の実験を表す。パネル（ｉｉｉ）は、６２．５、３１．２５、１５ｎＭ（ｎｇ／ｍＬ）Ｃｖｘによって刺激された細胞内カルシウムのピーク・レベルにおけるＰＥＣＡＭ−１誘導百分率軽減を示す。データは、平均＋／−ＳＥ（ｎ＝３）を表す。
【００２３】
図７は、刺激に対する代表的なカルシウム応答を示す。
パネルＣ（ｉ）および（ｉｉ）は、第１架橋ＰＥＣＡＭ−１有りおよび無しによるそれぞれ０．１Ｕ／ｍＬおよび０．０５Ｕ／ｍＬにおけるトロンビンによる刺激に対する代表的なカルシウム応答を示す。痕跡は、３つの別個の実験を表す。パネル（ｉｉｉ）は、０．５Ｕ／ｍＬ、０．１Ｕ／ｍＬおよび０．０５Ｕ／ｍＬによって刺激された細胞内カルシウムのピーク・レベルにおけるＰＥＣＡＭ−１誘導百分率軽減を示す。データは、平均＋／−ＳＥ（ｎ＝３）を表す。ＰＥＣＡＭ−１  ＸＬ、ＰＥＣＡＭ−１架橋。
【００２４】
血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１）は、１３０ｋＤａ膜架橋糖タンパク質である。その表現は、血小板、単細胞、好中球、特定のＴ−リンパ球、および血管内皮細胞を含むいくつかの造血薬細胞形式に限定される。ＰＥＣＡＭ−１の機能は多様であり、血小板のこの分子の役割は現在不明ではあるが、血管形成、脈管形成、インテグリン調整、白血球のトランス内皮細胞遊走、ＴおよびＢ細胞抗原受容体機能を含む。ＰＥＣＡＭ−１が複製されたとき、それは構造上の類似性にもとづいて細胞接着分子の系統群に割り当てられた。ＰＥＣＡＭ−１は、多くの注意が信号（徴候）導入に関与するようにその能力を研究する方向に最近向けられてきた。ＰＥＣＡＭ−１の細胞形質尾部は、免疫受容体チロシン基礎抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）と呼ばれている保存されたモチーフを含有する。ＩＴＩＭは、徴候特性を根底とし、抑制受容体の成長系統群によって割り当てられる。これらは、ＰＥＣＡＭ−１が血小板において表現されるべきであることを報告されたＩＴＩＭ支持受容体のみであるが、免疫グロブリンＧ受容体ＦｃγＲＩＩＢ、同様な抑制受容体（ＫＩＲ）、および徴候調整タンパク質（ＳＩＲＰ）を含む。したがって、ＰＥＣＡＭ−１は受容体のＩｇ−ＩＴＩＭ系統群に割り当てられるべきであることが提案された。
【００２５】
ＰＥＣＡＭ−１の受容体結束特性は複雑である。それは、同種親和相互作用のための能力を有し、また、インテグリンανβ３およびＣＤ３８を含む多数の分子との異種親和相互作用が、免疫グロビンＥ（ＦｃεＲＩ）、ずれ、酸化応力に対するＰＥＣＡＭ−１架橋および高親和性受容体の賦活を含む種々の刺激に応答して、チロシン残留物にリン酸化反応をすることになる。本発明者は、チロシン・リン酸化反応は凝集によって強化されるが、コラーゲン受容体糖タンパク質ＧＰＶＩ（ＧＰＶＩ）およびトロンビン受容体をかいした血小板賦活が、血小板凝集および分泌に依存しないＰＥＣＡＭ−１チロシン・リン酸化反応を生じることを最近発見した。ＰＥＣＡＭ−１においてリン酸化反応したチロシン残留物は、ＩＴＩＭ内に描かれ、落ちた。リン酸化反応ＩＴＩＭは、Ｓｒｃホモロジー２領域相互作用をかいしてモチーフに結合するチロシン・リン酸化反応ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２のような徴候分子を補充する。実際に、両ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２はチロシン・リン酸化反応ＰＥＣＡＭ−１に関連して示され、ＰＥＣＡＭ−１  ＩＴＩＭリン酸ペプチドが試験管内でこれらリン酸化反応物を賦活する。一般に、ＳＨＰ−２は成長因子受容体徴候を確実に調整するように示されているが、これらのタンパク質チロシン・リン酸化反応物はチロシン・キナーゼ依存経路に反作用することによって抑制効果を抑制する。
【００２６】
免疫受容体チロシン系賦活モチーフ（ＩＴＡＭ）支持受容体は、血小板機能の調整において臨界位置を占めるように示されていた。実際に、ＩＴＡＭを通るコラーゲン受容体ＧＰＶＩ−ＦｃＲγ鎖複雑信号（徴候）が、ＧＰＶＩ−ＦｃＲγ鎖の細胞形質尾部に現れる。他細胞系統内のいくつかの研究は、ＩＴＡＭと、同じ細胞で表現されたとき、受容体を含むＩＴＩＭとの間の拮抗作用関係の証拠を提供した。この実例は、ＦｃγＲＩＩＡ（ＩＴＡＭ）によって刺激された細胞賦活を負に調整するＩｇＧ  ＦｃγＲＩＩＢ（ＩＴＩＭ）用受容体である。
【００２７】
ＰＥＣＡＭ−１は、受容体の細胞外部領域に向けられた抗体を用いて架橋をかいして刺激される。この計画は、ＰＥＣＡＭ−１を賦活するために最も特殊な方法として選択されたものである。架橋がそのチロシン・リン酸化反応を刺激したので、賦活は確認された。ＰＥＣＡＭ−１架橋はチロシン・リン酸化反応（図１）およびＳＨＰ−２（図示せず）を刺激するが、それ自体は血小板賦活を生じない。架橋上のＰＥＣＡＭ−１のチロシン・リン酸化反応は、インテグリンαｉｉｂβ３係合に依存していないことを示した。コラーゲンによる刺激前に９０秒間架橋ＰＥＣＡＭ−１が血小板凝集の抑制を生じた。コラーゲンの低濃度において、凝集は完全に抑制されたが、コラーゲンの非常に高い濃度（１００μｇ／ｍｌ）においてさえもＰＥＣＡＭ−１賦活は、凝集の相当な抑制を生じた。コラーゲンは他の受容体を血小板上に結合できるので、インテグリンα２β１を含めて、特別な作動薬Ｃｖｘを用いたＧＰＶＩ仲介血小板凝集のＰＥＣＡＭ−１架橋効果が試験された。同様な結果は、作動薬の低濃度（１５ｎｇ／ｍｌ）において凝集の完全抑制を伴って得られ、高濃度（６２．５ｎｇ／ｍｌ）における部分的効果はＰＥＣＡＭ−１がＧＰＶＩ仲介（ＩＴＡＭ）血小板凝集能力のある抑止体であることを示す。
【００２８】
ＰＥＣＡＭ−１の抑制効果が、受容体を含むＩＴＡＭをかいして徴候に制限されるか否かを決定するために、実験が行われた。一方、ＰＥＣＡＭ−１架橋がトロンビン刺激血小板凝集を抑制するように見出された。ＰＥＣＡＭ−１の抑制効果はトロンビンの適度な濃度（０．５および１Ｕ／ｍｌ結果が現在示された）において観測されなかったが、抑制の劇的なレベルがコラーゲンの非常に高い濃度（１００μｇ／ｍｌ）において観測された。トロンビン刺激血小板凝集のＰＥＣＡＭ−１仲介抑制は、低いトロンビン濃度でのみ観測された（０．０５Ｕ／ｍｌでは完全抑制、０．１Ｕ／ｍｌでは若干の抑制）。ＰＥＣＡＭ−１賦活がコラーゲン刺激凝集よりも少ない効率でトロンビン刺激血小板凝集を抑制することを示す。
【００２９】
他のＧタンパク質結合受容体作動薬によって刺激された血小板凝集のＰＥＣＡＭ−１架橋効果が試験された。トロボキサン疑態Ｕ４６６１９の低濃度に応答した凝集は、ＰＥＣＡＭ−１徴候によって軽減された。さらに、予備作業は、低作動薬濃度におけるＡＤＰ誘導血小板凝集が影響を受けることもあることを示唆している。
【００３０】
本発明者は、抗体仲介架橋によるＰＥＣＡＭ−１徴候賦活がコラーゲン仲介賦活の抑制を生じることを証明した。本発明者は、ＧＰＶＩ選択的作動子痙攣の効果がＰＥＣＡＭ−１徴候の賦活によって抑制されることをも示した。トロンビン刺激賦活は、ＰＥＣＡＭ−１徴候の賦活によって抑制されるように示され、ＰＥＣＡＭ−１の抑制効果がＩＴＡＭ含有受容体徴候経路の抑制に制限されないことを示す。
【００３１】
これは、ＰＥＣＡＭ−１と両立し、ＩＴＡＭおよび非ＩＴＡＭ含有受容体作動薬によって刺激された血小板賦活の制御において負の調整を行う。
【００３２】
例えば、Ｄｕｎｃａｎ  Ｇ  Ｓ、Ａｎｄｒｅｗ  Ｄ  Ｐ、Ｔａｋｉｍｏｔｏ  Ｈ等による先の研究でさえも、血小板／内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１）の機能過剰についての総括証明：ＣＤ３１欠損マウスがＰＥＣＡＭ−１依存機能およびＰＥＣＡＭ−１独立機能を明らかにしている。Ｊ．Ｉｍｍｕｎ  １９９９；１６２：３０２２−３０３０およびＰａｔｉｌ  Ｓ、Ｎｅｗｍａｎ  Ｄ  Ｋ、Ｎｅｗｍａｎ  Ｐ  Ｊ：ＰＥＣＡＭ−１がコラーゲンに応答する血小板を変調する抑制受容体として働く。血液２００１；９７：１７２７−１７３２は、ＰＥＣＡＭ−１欠損マウス血小板におけるトロンビンおよびＡＤＰ刺激血小板凝集は正常であることを報告した。
【００３３】
ＩＴＡＭ仲介徴候が非ＩＴＡＭ仲介徴候よりも高度に抑制されるという観察は、ＰＥＣＡＭ−１がＦｃγＲＩＩＡ（ＩＴＡＭ含有免疫グロブリンＧ受容体）によって共縛された場合に、血小板の実験によってさらに支持される。共縛は、受容体架橋によって刺激されたＦｃγＲＩＩＡ仲介凝集および細胞内カルシウム可動化の抑制を生じる。
【００３４】
コラーゲン、Ｃｖｘ、トロンビン、トロンボキサン擬態Ｕ４６６１９のような作動薬による刺激に関するＰＥＣＡＭ−１の抑制効果は、ＰＥＣＡＭ−１が一次徴候事態および賦活血小板によって解除された因子による二次刺激を抑制することを示唆する。したがって、ＧＰＶＩ仲介徴候と混信する受容体の抑制がコラーゲンおよびコンバルキシン刺激賦活にＰＥＣＡＭ−１の抑制作用を貢献させることが可能である。このことは、なぜＧＰＶＩ仲介賦活にＰＥＣＡＭ−１の抑制機能がトロンビン仲介賦活よりも有効であるかを説明している。
【００３５】
ＰＥＣＡＭ−１架橋が血小板機能を抑制することを確立したので、信号（徴候）導入のいくつかの観点についてこの効果が試験された。血小板賦活は、血小板タンパク質チロシン・リン酸化反応に付随する抑制および細胞内蓄積からのカルシウム可動化の軽減されたレベルによって達成されることが見出された。コラーゲン受容体ＧＰＶＩによる血小板賦活は、チロシン・キナーゼに依存し、その結果、広い範囲の血小板タンパク質の迅速チロシン・リン酸化反応に関連される。トロンビンによる刺激はタンパク質チロシン・リン酸化反応を生じるが、それは少ない。タンパク質チロシン・リン酸化反応レベルを変えない架橋ＰＥＣＡＭ−１は、Ｃｖｘまたはトロンビンによる引き続く刺激によって誘導されるチロシン・リン酸化反応のレベルを実質的に抑制する。これは、観察された凝集および分泌における軽減と両立する。リン酸化反応がＰＥＣＡＭ−１架橋上で軽減されるリン酸タンパク質の確認が最近調査中である。
【００３６】
血小板賦活のＰＥＣＡＭ−１仲介抑制を根底とすることは、細胞内蓄積から解除されるカルシウムの抑制の著しいレベルになる。凝集分析からわかるように、Ｃｖｘおよびトロンビンの低濃度（それぞれ、１５ｎｇ／ｍｌおよび０．０５Ｕ／ｍｌ）においては、ＰＥＣＡＭ−１徴候はほとんど完全に解除を抑制し、その場合、部分的効果が高作動薬濃度において観察される。カルシウム可動化は、ホスホリパーゼＣによってイノシトール・リン脂質  ４、５−ビスホスヘートからイノシトール  １、４、５−リン酸塩（ＩＰ３）の細胞内発生をかいして刺激される。血小板においてコラーゲンによる刺激がリン酸化反応およびＰＬＣγ２イソフォームへ導き、トロンビン徴候がＰＬＣβを調整することが良好に確立された。これは、ＰＥＣＡＭ−１がコラーゲンおよびトロンビン刺激徴候にＰＬＣイソフォームの上流でまたはこれらの酵素自体にその効果を発生することを示唆している。
【００３７】
［方法］
材料  Ｈｏｒｍ−Ｃｈｅｍｉｅコラーゲン（ウマの腱からのコラーゲン繊維）がＮｙｃｏｍｅｄ（ドイツ、ミュンヘン）から購入された。コンバルキシンが上述したようにガラガラヘビ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｄｕｒｉｓｓｕｓ  ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ）の毒液から精製された。トロンボキサン擬態Ｕ４６６１９およびＡＤＰがＳｉｇｍａ（英国、プール）から購入された。抗ホスホチロシン単一クローン系抗体（４Ｇ１０）がＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＴＣＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  英国、バッキンガムシャー）から購入された。抗ＰＥＣＡＭ−１抗体：単一クローン抗体ＨＣ１／６がＳｅｒｏｔｅｃ（英国、オックスフォード）から購入された。多クローン抗ＰＥＣＡＭ−１（Ｃ−２０）および単一クローン抗体ＡＢ４６８がＡｕｔｏｇｅｎ  Ｂｉｏｃｌｅａｒ  Ｌｔｄ．（英国、ウイルシャー）から購入された。単一クローン抗体ＰＥＣＡＭ１．３がＰｅｔｅｒ  Ｎｅｗｍａｎ教授（米国  ＷＩ、ミルオーキ、Ｗｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの血液センタ）によって親切にも提供された。制御マウスＩｇＧがＳｉｇｍａ（英国、プール）から購入された。単一クローン抗体ＩＶ．３がＰｉｅｒｃｅ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国、チェスタ）から購入された試薬を用いてタンパク質消化によって発生されたハイブリッドマー細胞培養媒体およびＦ（ａｂ’）２破片から精製された。ワサビダイコン・ペルオキシダーゼ活用二次抗体および強化化学発光検出システムが、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（英国、バッキンガムシャー）から購入された。Ｆｕｒａ−２ＡＭがＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、英国、ケンブリッジ）から購入された。
【００３８】
血小板の準備および刺激：薬物を使用していないボランチアからのヒトの血小板が、差動遠心によって実験の日に準備され、また、緩和されたＴｙｒｏｄｅｓ−Ｈｅｐｅｓバッファ（１３４ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２．９ｍＭ  ＫＣｌ、１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３）に２×１０８ｃｅｌｌ／ｍｌの密度まで懸濁された。タンパク質沈降反応実験のために、血小板が凝集を防止するために１ｍＭ  ＥＧＴＡを含有するバッファにおいて８×１０８ｃｅｌｌ／ｍｌで再懸濁された。コラーゲン、コンバルキシン（Ｃｖｘ）およびトロンビン（５０μｌに導出された）が連続攪拌（１２００ｒｐｍ）によって光学血小板凝集測定機（Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ社）において３７℃で実施された。ＰＥＣＡＭ−１賦活が抗ＰＥＣＡＭ−１抗体（ＡＢ４６８、１μ／ｍｌまたはＰＥＣＡＭ１．３、１０μｇ／ｍｌ）により５分間保温によって刺激され、次いで架橋するために抗ＩｇＧ二次抗体（３０μ／ｍｌ）のＦ（ａｂ’）２破片によって９０秒間培養された。ｍＡｂ  ＡＢ４６８が全長ＰＥＣＡＭ−１外部領域に抗して発生された。制御実験がＡＢ４６８またはＰＥＣＡＭ−１．３に代えて関連のないアイソタイプ整合抗体を用いて実施され、同じ濃度で使用された。いくつかの実験においては、ＩｇＧに対する低親和力受容体が、５分間ｍＡｂＩＶ．３のＦ（ａｂ’）２破片の飽和濃度（１μｇ／ｍｌ）で保温によって遮断された。ｍＡｂＩＶ．３抗体の飽和濃度が、全ＩｇＧ仲介ＦｃγＲＩＩＡ架橋および血小板賦活に続いて完全に抑制されたＦ（ａｂ’）２破片の濃度を決定することによって確立された。血小板凝集は光学凝集測定法によって決定された。
【００３９】
免疫沈降反応研究：血小板刺激は、氷冷溶解バッファ（２％［ｖ／ｖ］Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルフォニル・フッ化物、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌペプスタンＡ、ｐＨ７．３）の等量の追加によって決定された。洗剤不溶解破片が除去され、溶解産物が１時間４℃でタンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと混合することによって事前に清浄にされた（Ｔｒｉｓ緩衝サリンＴｗｅｅｎ（［ＴＢＳ−Ｔ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％［ｖ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．６）のタンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａａｒｏｓｅの５０％［ｗ／ｖ］懸濁液の２０μｌ］）。タンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体（ＨＣｌ／６、１μｇ）の追加前に溶解産物から除去された。４℃１時間の回転に続いて、０．５μｌ二次抗血清（ラビット抗マウスＩｇＧ）が加えられ、さらに３０分間混合された。２５μｌタンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ懸濁液が各サンプルに加えられ、ＴＢＳ−Ｔによる洗浄に続く溶解バッファ中でＳｅｐｈａｒｏｓｅを洗浄しかつＬａｅｍｍｌｉサンプル処置バッファの追加前に１時間混合が継続された。タンパク質は１０％ゲルを使用して軽減条件の下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、半乾燥ウエスタンブロット法によってビニリデン・２フッ化物膜まで移送された。
【００４０】
免疫ブロット法：ＴＢＳ−Ｔで溶解された１０％（ｗ／ｖ）ウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）中で培養によって、膜が遮断された。一次および二次抗体が２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＴＢＳ−Ｔ中で希釈され、１時間常温で膜と共に培養された。１時間常温で抗体と共に各培養後、斑点がＴＢＳ−Ｔ中で２時間洗浄された。次いで、強化された化学発光検出システムを用いて展開された。一次抗体は、１μｇ／ｍｌ（抗ホスホチロシン、４Ｇ１０；抗ＰＥＣＡＭ−１、Ｃ−２０）の濃度で使用され、ワサビダイコン・ペルオキシターゼ共役二次抗体が１：１００００に希釈された。
【００４１】
５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）分泌検定：血小板が血小板豊富プラズマの０．５μＣｉ／ｍｌにより３７℃１時間培養によって［３Ｈ］５−ＨＴと共に装填された。血小板は、上述したように、血小板豊富プラズマから準備された。血小板の刺激が、６％グルタルアルデヒドの等量の追加およびマイクロ遠心によって決定され、上澄みに解除された［３Ｈ］５−ＨＴのレベルがシンチレーション・スペクトル法によって決定された。［３Ｈ］５−ＨＴ解除は、基部状態の下での解除の減算後に全体の組織容量の百分率として表現された。
【００４２】
分光蛍光測定法による［Ｃａ２＋］１の測定：洗浄されたヒトの血小板（上述のように準備された）が、３μＭ  Ｆｕｒａ−２  ＡＭと共にカルシウム無しＴｙｒｏｄｅｓ−ｈｅｐｅｓにおいて４５分間２×１０９ｃｅｌｌ／ｍｌにおいて培養された。血小板は一度洗浄され、修正Ｔｙｒｏｄｅｓ−ｈｅｐｅｓにおいて２×１０８ｃｅｌｌ／ｍｌで懸濁された。２ｍＭ  ＥＧＴＡの存在でＣｖｘおよびトロンビン（５０μｌに導出された）による血小板の刺激が、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの励起波長で発光分光光度計（ＬＳ−５０Ｂ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において３７℃における一定攪拌によって実行された。発光量は、５１０ｎｍの波長で測定された。必要に応じて、ＰＥＣＡＭ−１は、上述したように、作動薬による刺激前に架橋された。式［Ｃａ２＋］１＝Ｋｄ×（Ｒ−Ｒｍｉｎ）／（Ｒｍａｘ−Ｒ）×ＳＦＢ（Ｒは発生比（３４０／３８０ｎｍ））を用いて、ＦＬＷｉｎＬａｂソフトウエア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使って、発光値の比（３４０／３８０ｎｍで励起）が計算され、カルシウム濃度に変換された。Ｒｍａｘ最大３４０／３８０比が、１ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在の下で２５μＭジギトニンによる血小板を溶解することによって決定された。Ｒｍｉｎ３４０／３８０比は、２ｍＭ  ＥＧＴＡの追加によって得られた。Ｋｄは、Ｆｕｒａ−２／Ｃａ２＋複合（２２４ｎＭ）の解離定数であり、ＳＦＢはＲｍｉｎおよびＲｍａｘの３４０／３８０ｎＭにおける発光比である。
【００４３】
統計分析：統計的測定が学生の組にしたＴ試験を用いて実施された。その結果は、平均の平均＋／−標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表現される。
【００４４】
［実験データ］
架橋ＰＥＣＡＭ−１がコラーゲン刺激血小板凝集を抑制する。
拮抗関係が、同じ細胞で表現されたとき、ＩＴＩＭ受容体とＩＴＡＭ含有受容体との間で報告された。ＩＴＡＭをかいして血小板コラーゲン受容体ＧＰＶＩ信号（徴候）が関連されたＦｃＲγ鎖に現れるので、本発明者はコラーゲンによる血小板賦活へのＰＥＣＡＭ−１徴候の効果を調査した。ＰＥＣＡＭ−１は、ＰＥＣＡＭ−１（ＡＢ４６８［図１］またはＰＥＣＡＭ１．３（図示せず））の外部領域に対する抗体種による培養によって賦活され、二次抗体［Ｆ（ａｂ’）２破片］によって架橋された。これは、タンパク質の増加されたチロシン・リン酸化反応を生じたが、しかし血小板凝集の刺激を生じない（図１Ａ）。ＰＥＣＡＭ−１のチロシン・リン酸化反応は、ＥＧＴＡ（１ｍＭ）、ＲＧＤＳペプチド（０．５ｍＭ）、別個にまたは一緒に（図示せず）に加えられたフィブリノーゲン（１００μＭ）のγ鎖ペプチド存在下で架橋に維持された。このことは、これらの実験が洗浄血小板で実施されたという事実と共に、架橋上のＰＥＣＡＭ−１のチロシン・リン酸化反応がインテグリンα１１ｂβ３係合に依存していないことを示す。コラーゲン刺激前９０秒間、ＰＥＣＡＭ−１架橋効果は、コラーゲン刺激血小板凝集に顕著な効果を有することがわかった。コラーゲンの低濃度（例えば、１０μｇ／ｍｌ）においては、作動薬追加前のＰＥＣＡＭ−１の架橋は、完全に凝集を破壊した（データは図示されていない）。図１Ｂ（ｉｉ）は、コラーゲンの非常に高濃度（１０μｇ／ｍｌ）におけるＰＥＣＡＭ−１架橋の顕著な抑制効果を示す。アイソタイプ整合ＩｇＧ制御および架橋Ｆ（ａｂ’）２の使用は、ＰＥＣＡＭ−１チロシン・リン酸化反応（図示せず）およびコラーゲン刺激血小板凝集［図１Ｂ（ｉ）］の効果を有していなかった。その結果は、３つの別個の実験が現す。類似の結果は、別のＰＥＣＡＭ−１抗体ＰＥＣＡＭ１．３を用いて得られた。いくつかの実験においては、ＩｇＧ  ＦｃγＲＩＩＡに対する低い親和力受容体は、ｍＡｂＩＶ．３のＦ（ａｂ’）２破片の飽和濃度を用いてＰＥＣＡＭ−１架橋および作動薬刺激前に遮断された。ＰＥＣＡＭ−１架橋の抑制効果は、これらの条件の下で、変えられなかった。これは、抗体を用いたＰＥＣＡＭ−１の抑制効果がＦｃγＲＩＩＡの賦活によらないことを明らかに示している。
【００４５】
ＰＥＣＡＭ−１架橋はＧＰＶＩおよびトロンビン受容体仲介血小板凝集を抑制する。
コラーゲン仲介血小板凝集にＰＥＣＡＭ−１徴候の顕著な効果を与えられるので、本発明者はこの効果がＧＰＶＩ仲介徴候のみに制限されたか否かを調査した。ＧＰＶＩが、選択的作動薬Ｃｖｘ、ガラガラヘビ（Ｃｒｏｔａｌｉｓ  ｄｕｒｉｓｓｕｓ  ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ）の毒液から精製されたタンパク質を用いて刺激された。１５ｎｇ／ｍｌＣｖｘによる刺激は、ＰＥＣＡＭ−１の事前の賦活によって完全に抑制された（図２Ａ（ｉ））。部分的な抑制効果は、Ｃｖｘの高濃度［それぞれ、３１．２５および６２．５ｎｇ／ｍｌ（図示せず）および図２Ａ（ｉｉ）］において観察された。同様な結果は、Ｇタンパク質結合受容体作動薬トロンビンによる血小板刺激において観察された。９０秒刺激における凝集の完全抑制は、０．０５Ｕ／ｍｌ［それぞれ、図２Ｂ（ｉ）および０．１Ｕ／ｍｌ図２Ｂ（ｉｉ）における部分効果］のトロンビン濃度において観察された。アイソタイプ整合ＩｇＧ制御および架橋Ｆ（ａｂ’）２の使用は、Ｃｖｘまたはトロンビン刺激血小板凝集［図２Ａ（ｉ）および２Ｂ（ｉｉ）］に効果をもたらさなかった。ＰＥＣＡＭ−１賦活の抑制効果は、トロンビンの高濃度（例えば、０．５および１Ｕ／ｍｌ、データは図示されていない）において観察されなかった。その結果は、５つの別個の実験を代表している。類似の実験が、別の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体ＰＥＣＡＭ１．３を用いて、そして、ＦｃγＲＩＩＡがＰＥＣＡＭ−１架橋前に遮断されたとき、に観察された。
【００４６】
血小板刺激はＰＥＣＡＭ−１徴候によって抑制される。
血小板刺激は、密顆粒からの分泌によって達成される。密顆粒分泌は、事前装填洗浄血小板から［３Ｈ］５−ＨＴの解除の測定によって査定された。図３は、［３Ｈ］５−ＨＴ分泌のＰＥＣＡＭ−１架橋効果を決定するために実験結果を示す。分泌における顕著な軽減は、Ｃｖｘ（８１．９％＋／−２．９％から３９．８％＋／−４．１％、ｐ＝０．０２、ｎ＝３）またはトロンビン（７０．９％＋／−４．６％から３７．０％＋／−８．０％、ｐ＝０．０１、ｎ＝３）による刺激前に賦活された場合に、血小板に観察された。アイソタイプ整合ＩｇＧ制御および架橋Ｆ（ａｂ’）２の使用は、Ｃｖｘまたはトロンビン刺激密顆粒分泌（図示せず）に効果をもたらさなかった。Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＡを遮断するためにｍＡｂＩＶ．３の存在の下で行った実験は、類似の結果を発生した。
【００４７】
ＰＥＣＡＭ−１は血小板タンパク質チロシン・リン酸化反応を抑制する。
ＧＰＶＩおよびトロンビン受容体刺激徴候におけるＰＥＣＡＭ−１架橋効果が、調査された。血小板は、９０秒間ＰＥＣＡＭ−１の事前架橋有りまたは無しで、Ｃｖｘ（１５ｎｇ／ｍｌ）またはトロンビン（０．０５Ｕ／ｍｌ）によって刺激された。全細胞タンパク質チロシン・リン酸化反応レベルは、免疫ブロット法によって決定された。架橋ＰＥＣＡＭ−１単独は、基底血小板チロシン・リン酸化反応レベルに効果をもたらさなかった（図４）。Ｃｖｘ（１５ｎｇ／ｍｌ）またはトロンビン（０．０５Ｕ／ｍｌ）による刺激は、広範囲タンパク質のチロシン・リン酸化反応のレベルに増加を生じた。ＰＥＣＡＭ−１徴候がＣｖｘまたはトロンビンによる培養前に架橋によって刺激されたそれらのサンプルにおいて、総合チロシン・リン酸化反応は軽減された（図４）。アイソタイプ整合ＩｇＧ制御および架橋Ｆ（ａｂ’）２の使用は、Ｃｖｘまたはトロンビン刺激総合チロシン・リン酸化反応レベルに検出可能効果をもたらさなかった。
【００４８】
ＰＥＣＡＭ−１は細胞内蓄積からカルシウムの可動化を抑制する。
コラーゲン受容体ＧＰＶＩおよびトロンビン受容体の刺激は、カルシウムの急激な細胞内可動化を導入し、分泌および凝集に必須である効果をもたらす。細胞内カルシウムレベルは、カルシウム感応ダイＦｕｒａ−２ＡＭを用いて蛍光分析的に測定された。実験は、細胞外カルシウムの侵入を防止するために２ｍＭ  ＥＧＴＡの存在の下で実行された。Ｃｖｘおよびトロンビンによる血小板の刺激は、約５分間を超えて減衰した細胞内カルシウムのレベルに急激な増加を生じた。制御抗体および架橋Ｆ（ａｂ’）２による血小板の培養は、Ｃｖｘおよびトロンビン刺激細胞内カルシウム可動化に変化を生じなかった（図５）。Ｃｖｘ（６２．５ｎｇ／ｍｌ）またはトロンビン（０．１Ｕ／ｍｌ）による培養前に９０秒間ＰＥＣＡＭ−１の架橋は、カルシウム可動化の著しく軽減したレベルを生じた［図６Ｂ（ｉ）および図７Ｃ（ｉ）］。使用した作動薬の低濃度（Ｃｖｘ、１５ｎｇ／ｍｌ、トロンビン０．０５Ｕ／ｍｌ）において、カルシウム可動化はほとんど破壊された［図６Ｂ（ｉｉ）および図７Ｃ（ｉｉ）］。作動薬濃度の範囲に対するピーク細胞内カルシウムのレベルの軽減におけるＰＥＣＡＭ−１架橋効果は、図６Ｂ（ｉｉｉ）および図７Ｃ（ｉｉｉ）に示されている。カルシウム可動化における少なくとも５０％の軽減は、試験されたＣｖｘおよびトロンビンのすべての濃度において観察された。類似の結果は、別の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体ＰＥＣＡＭ−１．３を用いて得られた。さらに、細胞外ＥＧＴＡの不在の下で実施された実験は、ＰＥＣＡＭ−１架橋はカルシウムの作動薬誘導流入を抑制しないことを示す（データは図示されていない）。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＰＥＣＡＭ−１の架橋がコラーゲン刺激血小板凝集を抑制することを示す。
【図２】ＰＥＣＡＭ−１架橋がＧＰＶＩおよびトロンビン受容体刺激血小板凝集を抑制することを示す。
【図３】血小板密顆粒分泌がＰＥＣＡＭ−１徴候によって抑制されることを示す。
【図４】ＰＥＣＡＭ−１徴候が血小板タンパク質チロシン・リン酸化反応を抑制することを示す。
【図５】架橋が細胞内蓄積からカルシウムの可動化を抑制することを示す。
【図６】刺激に対する代表的なカルシウム応答を示す。
【図７】刺激に対する代表的なカルシウム応答を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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