(57)【要約】アミノ末端〜カルボキシル末端、第一PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチド、リンカーポリペプチド、及び第二PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドからなる融合タンパク質、並びに当該タンパク質を作製するための方法が開示されている。前記第一及び第二PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドの各々は、配列番号：２又は配列番号：４に示すようなアミノ酸x〜アミノ酸yのアミノ酸残基の配列からなり、ここで、xは２４６〜２５８の整数であり、そしてyは３６５〜３７０の整数である。前記リンカーポリペプチドは１１〜４０アミノ酸残基からなる。タンパク質は、ヒト及びヒト以外の動物における骨及び/又は結合組織の生産を刺激するために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端〜カルボキシル末端、
第一PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチド；
リンカーポリペプチド；及び
第二PDGF-D増殖因子ドメインペプチド、
からなる融合タンパク質であって：
ここで、前記第一及び第二PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドの各々は、配列番号：２又は配列番号：４に示すようなアミノ酸x〜アミノ酸yのアミノ酸残基の配列からなり、ここで、xは２４６〜２５８の整数（２４６と２５８を含む）であり、そしてyは３６５〜３７０の整数（３６５と３７０を含む）であり；ここで前記リンカーポリペプチドは１１〜４０のアミノ酸残基からなり；そして前記融合タンパク質が任意にグリコシル化されている、融合タンパク質。
【請求項２】
yが３７０である請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
xが２４６、２４８、又は２５０である請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
xが２５０でありそしてyが３７０である請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記リンカーポリペプチドが１２〜２０のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記リンカーポリペプチドが１４〜１６のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記リンカーポリペプチドがLys又はArgを含まない、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記リンカーポリペプチドがCysを含まない、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記リンカーポリペプチドがProを含まない、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記リンカーポリペプチドがタンパク質分解解裂部位を含んで成る、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記解裂部位がプラスミン解裂部位、トロンビン解裂部位、又は因子Xa解裂部位である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記リンカーポリペプチドがアミノ酸配列Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser(配列番号：３３)及びタンパク質分解解裂部位を含んで成る、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記第一及び第二PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドが１以上の鎖間ジスルフィド結合によって連結されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが更に、前記融合タンパク質に対して作用可能式に連結する分泌ペプチドをコードする、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
DNAである請求項１４又は１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
以下の作用可能式に連結する要素：
転写プロモーター；
請求項１６に記載のポリヌクレオチド；及び
転写ターミネーター、
を含んで成る発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターが導入されている培養細胞。
【請求項１９】
培養培地において請求項１８に記載の細胞を培養し、それによってDNAセグメントを発現せしめて融合タンパク質を生産させ；そして
当該融合タンパク質を回収する：
段階を含んで成る、タンパク質を作製する方法。
【請求項２０】
前記細胞が真核細胞であり、前記DNAセグメントが、前記融合タンパク質に対して作用可能式に連結する分泌ペプチドをコードし、そして当該融合タンパク質が当該細胞から分泌され且つ培養培地から回収されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２１】
前記回収された融合タンパク質が、第一PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドを第二増殖因子ドメインポリペプチドに対して連結するジスルフィド結合を１以上含んで成る、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
前記リンカーポリペプチドが、タンパク質分解解裂部位を含んで成り、回収段階の後に、前記融合タンパク質が当該解裂部位でタンパク質分解解裂される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リンカーポリペプチドがタンパク質分解解裂部位を含んで成り、そして当該細胞が前記解裂部位で解裂をするプロテアーゼを生産し、そして前記融合タンパク質は、細胞が分泌をする間にプロテアーゼによって解裂されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が原核細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法により生産されたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
多細胞生物において、細胞の増殖、分化、及び移動はペプチド増殖因子によって調節されている。これらの増殖因子は、正常な発達及び病原性の、例えば固形腫瘍の発達の両方において役割を果たす。ペプチド増殖因子は、その多くがチロシンキナーゼである細胞表層レセプターに対して結合することによって細胞事象に影響を及ぼす。結合は、最終的に形態的変化、例えば、細胞分裂、プロテアーゼ生産、及び細胞移動をもたらす細胞内でのシグナル伝達の鎖を起動する。
【０００２】
増殖因子は構造の類似性に基づきファミリーに分類できる。かかるファミリーの一つ、PDGF(血小板に由来する増殖因子)ファミリーはジスルフィド結合によって安定化された二量体構造を特徴とする。このファミリーとしてはPDGF、胎盤増殖因子(PlGF)、及び血管内皮増殖因子(VEGF)が挙げられる。このPDFGはジスルフィド結合した二量体タンパク質の群である。４つのPDFGポリペプチド鎖が同定されており、そしてA、B、C及びDと命名されている。A及びB鎖はそれら自身及びお互いに二量体を形成し、AA、BB及びAB二量体をもたらす。一般に、例えば、Rossら、Cell vol.46：pp.155〜169、1986及びHartら、Biochem.vol.29:pp.166〜172、1990を参照のこと。これらのタンパク質の組換え形態、例えば、トランケーション及び置換型変異体は、米国特許第4,801,542号；4,845,075号；4,849,407号；4,889,919号；及び5,895,755号に開示されている。C及びDと命名されている２つの更なるPDGFポリペプチドが開示されている。WIPO刊行物WO00/34474；WIPO刊行物WO00/66736；BergstenらNature Cell Biol.vol.3：pp.512〜516、2001；LaRochelleら、Nature cell Biol.vol.3：pp.517〜521、2001；及びUutelaら、Circulation vol.103：pp.2242〜2247、2001を参照のこと。PDGF-Cは「zvegf3」(WO00/34474)としても知られており、そしてPDGF-Dは「zvegf4」(WO00/66736)としても知られている。
【０００３】
PDGF-C及びPDGF-Dは、およそ70アミノ酸残基のインタードメイン領域によって連結されたアミノ末端CUBドメイン及びカルボキシル末端増殖因子ドメインを含んで成るマルチドメイン構造を有する。ヒトPDGF-D(配列番号：2)のおよそ250〜370番目の残基を含んで成るPDGF-Dの増殖因子ドメインは、PDGFファミリーの「システインノット」構造の特徴であるシステイン残基とβストランドの配置を特徴とする。
【０００４】
CUBドメインは、ニューロピリン(Takagiら、Neuron vol.7：pp.295〜307、1991；Sokerら、Cell vol.92：pp.735〜745、1988)、ヒト骨形成タンパク質-1(Wonzneyら、Science vol.242：pp.1528〜1534、1988)、ブタ精漿タンパク質及びウシ酸性流体タンパク質(Romeroら、Nat.Struct.Biol.vol.4：pp.738〜788、1997)、及びアフリカツメガエルトロイド様タンパク質(Linら、Dev.Growth Differ.vol.39：pp.43〜51、1997)に対する配列の相同性を示す。
【０００５】
PDGF-C及びPDGF-Dはホモ二量体タンパク質(PDGF-CC及びPDGF-DD)を形成し、それらはタンパク質分解解裂され、活性物質を生み出し、それは各場合、増殖因子ドメイン二量体である。活性PDGF-DDタンパク質はPDGFレセプターのα/α、β/β及びα/βイソ型に対して結合して活性化する。PDGF-DD二量体は、様々な間葉細胞のための分裂因子である(Bergstenら、ibid.：LaRochelleら、ibid)。加えて、PDGF-Dアデノウィルス構築体でインフェクトされたマウスは内骨の増殖を示す(米国特許出願第09/540,224号)。
【０００６】
生物学的に活性のある、組換えPDGF-DDの生産には問題があることが発見されている。例えば、Bergstenら、ibidを参照のこと。経済的に実行可能な量で組換えPDGFを生産するための材料と方法に対する要請がある。
【発明の開示】
【０００７】
発明の説明
本発明の１つの観点において、アミノ末端〜カルボキシル末端、第一PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチド、リンカーポリペプチド、及び第二PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドからなる融合タンパク質が提供されており、ここで当該各第一及び第二PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドは、配列番号：２又は配列番号：４に示されたアミノ酸X〜アミノ酸yのアミノ酸残基の配列からなり、ここでxは２４６〜２５８の整数（２４６と２５８を含む）であり、そしてyは３６５〜３７０の整数（３６５と３７０を含む）であり；ここで当該リンカーポリペプチドは１１〜４０のアミノ酸残基からなり；そしてここで当該融合タンパク質は任意にグリコシル化されている。本発明の１つの実施態様において、yは３７０である。本発明の他の実施態様において、xは２４６、２４８、又は２５０である。本発明の他の実施態様において、xは２５０であり、そしてyは３７０である。本発明の更なる実施態様において、リンカーポリペプチドは１２〜２０のアミノ酸残基又は１４〜１６のアミノ酸残基からなる。本発明の尚も他の実施態様において、前記リンカーポリペプチドはLys又はArgを含まず、当該リンカーポリペプチドはCysを含まず、又は当該リンカーポリペプチドはProを含まない。本発明の更なる実施態様において、前記リンカーポリペプチドはタンパク質分解解裂部位を含んで成る。本発明の他の実施態様において、前記第一及び第二PDGF-増殖因子ドメインポリペプチドは１以上の鎖間ジスルフィド結合によって連結されている。
【０００８】
本発明の第二の観点において、上に開示した融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供されている。本発明の１つの実施態様において、前記ポリヌクレオチドは、更に、前記融合タンパク質に対して作用可能式に結合する分泌ペプチドをコードする。他の実施態様において、前記ポリヌクレオチドはDNAである。
【０００９】
本発明の第三の観点において、作用可能式に結合する以下の要素：転写プロモーター；上に開示したような融合タンパク質をコードするDNAセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターが提供されている。
【００１０】
本発明の第四の観点において、上に開示した発現ベクターが導入されている培養細胞が提供されている。
【００１１】
本発明の第五の観点において、上に開示したような細胞を培養培地中で培養し、それによってDNAセグメントが発現し、そして融合タンパク質が生産され、そして当該融合タンパク質を回収する段階を含んで成る、タンパク質を作製する方法が供されている。１つの実施態様において、前記細胞は真核細胞であり、そして前記DNAセグメントは、融合タンパク質に対して作用可能式に結合する分泌ペプチドをコードし、そして当該融合タンパク質は細胞から分泌され、そして培養培地から回収されている。関連した実施態様において、回収された融合タンパク質は、第一PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドを第二PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドに対して連結するジスルフィド結合を１以上含んで成る。他の実施態様において、前記リンカーポリペプチドはタンパク質分解解裂部位を含んで成り、そして回収段階の後に、前記融合タンパク質はこの解裂部位でタンパク質分解解裂される。更なる実施態様において、前記リンカーポリペプチドはタンパク質分解解裂部位を含んで成り、前記細胞は、当該解裂部位で解裂を行うプロテアーゼを生産し、そして当該融合タンパク質はプロテアーゼによって細胞内で分泌中に解裂されている。更なる実施態様において、前記細胞は原核細胞である。
【００１２】
本発明の第六の観点において、上に開示された方法により生産されたタンパク質が提供されている。
【００１３】
本発明のこれら及び他の観点は、本発明の以下の詳細な説明を参照することにより明らかになるだろう。
【００１４】
本明細書中で使用されている場合、「生物学的活性を有する」PDGF-DDタンパク質とは、細胞表層PDGFレセプター(α/α、α/β、又はβ/βレセプター)に対して結合し、それによって移動、分化又は有糸分裂などの細胞反応を刺激するPDGF-DDタンパク質である。
【００１５】
用語「発現ベクターが導入されている培養細胞」とは、ベクターを含むように物理的に操作された細胞、並びに操作された細胞の子孫(当該子孫も当該ベクターを含む場合は)を含む。
【００１６】
用語「発現ベクター」とは、環状又は直線状のDNA分子であって、その転写を担う更なるセグメントに対して作用可能式に連結する注目のポリペプチドをコードするセグメント含んで成るDNA分子を規定するために使用されている。かかる更なるセグメントはプロモーター及びターミネーター配列を含み、そして１以上の複製の開始点、１以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどをも含んでも良い。発現ベクターは一般に、プラスミド又はウィルスDNAに由来し、又は両方の要素を含みうる。
【００１７】
用語「単離」とは、ポリヌクレオチドに対して適用された場合、ポリペプチドがその天然遺伝的環境から取り出されており、従って他の余分又は不都合なコーディング配列を伴わず、そして遺伝子操作されたタンパク質生産系(genetically engineered protein production system)内で使用するのに適した形態にあることを規定する。かかる単離された分子は、それらの天然環境から分離されたものであり、そしてcDNA及び遺伝的クローンが挙げられる。本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は本来結合していた他の遺伝子を伴わず、しかしプロモーター及びターミネーターなどの天然に生じる５’及び３’非翻訳領域を含みうる。関連した領域を同定することは当業者に周知であろう(例えば、Dyan及びTijan、Nature vol.316：pp.774〜778、1985を参照のこと)。
【００１８】
「単離された」ポリペプチド又はタンパク質とは、それらの天然の環境ではない、例えば、血液及び動物組織とは別のある環境中で発見されるポリペプチド又はタンパク質である。本発明の１つの実施態様において、単離されたポリペプチド又はタンパク質は他のポリペプチド又はタンパク質、特に動物由来の特定の他のポリペプチド又はタンパク質を実質上含まない。単離されたポリペプチド又はタンパク質は、高純度形態、即ち；９５％超の純度又は９９％超の純度において提供されて良い。この背景において使用された場合、用語「単離」は、代わりの物理形態、例えば、二量体又は代わりのグリコシル化もしくは誘導形態における同ポリペプチド又はタンパク質の存在を除かない。
【００１９】
「作用可能式に連結する」とは、２以上の実体がそれらの目的のために協力して機能するように一緒に連結することを意味する。DNAのセグメントに言及する場合、当該用語は、例えば、コーディング配列が正しいリーディングフレームにおいて連結しており、そして転写がプロモーターで始まり、そして１又は複数のコーディングセグメントを通りターミネーターまで進むことを意味する。ポリペプチドに言及する場合、「作用可能式に連結する」とは、共有結合(例えば、ジスルフィド結合によって)及び非共有結合(例えば、水素結合、疎水性相互作用、又は塩架橋相互作用)により結合した配列の両方を含み、ここで当該配列の所望の１又は複数の機能は維持されている。
【００２０】
用語「PDGF-Dポリペプチド」とは、本明細書中、PDGF-D(例えば、ヒトzvegf4(配列番号：２)又はマウスzvegf4(配列番号：４)の残基２５８〜３６５)のコア増殖因子ドメインを含んで成るポリペプチドを規定するために使用されている。PDGF-Gポリペプチドは更に、完全長PDGF-Gポリペプチド鎖に由来するかあるいは相同的なポリペプチドに由来する１又は数個の更なるアミノ酸を含んで成る。当業界で公知の方法を使用することで、PDGF-Dポリペプチドは様々な形態、例えば、最初のメチオニン残基有無の、グリコシル化された又はグリコシル化されていない形態、ペグ化された又はペグ化されていない形態において、そして融合ポリペプチドとして調製できうる。PDGF-Dポリペプチドは、単量体又はジスルフィド結合した二量体の形態でありうる。
【００２１】
「ポリヌクレオチド」とは、５’から３’末端へと読まれるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドとしては、RNA及びDNAが挙げられ、そして天然資源から単離される、in vitroで合成されるかあるいは天然及び合成分子の組み合わせから調製されても良い。ポリヌクレオチドのサイズはベースペア(略記「bp」)、ヌクレオチド(「nt」)、又はキロベース(kb)として表される。背景によれば、後者の用語２つは一本鎖又は二本鎖であるポリヌクレオチドを記載する。この用語が二本鎖分子に対して適用されている場合、それは全体の長さを規定するために使用されており、そして用語「ベースペア」と同等であることが理解されるだろう。当業者は、二本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖は長さが僅かに異なりそしてその末端は、酵素解裂の結果、捩れており；従って二本鎖ポリヌクレオチド分子内で全てのヌクレオチドがペアになりえないことに気づくだろう。かかるペアになっていない末端は一般に長さで２０ntを超えないだろう。
【００２２】
「ポリペプチド」は、天然又は合成により生産された、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約１０アミノ酸残基未満のポリペプチドが通常「ペプチド」に言及されている。
【００２３】
用語「プロモーター」とは本明細書中で使用されている場合、RNAポリメラーゼの結合及び転写の開始を担うDNA配列を含む遺伝子の部分を規定する当業界で認識されている意味である。プロモーター配列は通常、いつもではないが、遺伝子の５’非コーディング領域において発見される。
【００２４】
「タンパク質」は、１又は数個のポリペプチド鎖を含んで成るマクロ分子である。あるタンパク質は、炭水化物基など非ペプチド成分をも含んで成る。炭水化物及び他の非ペプチド置換基もタンパク質に対して細胞(ここでタンパク質が生産される)により加えられて良く、そして細胞の種類により多彩であるだろう。タンパク質は本明細書中で、それらのアミノ酸骨格構造の観点から規定されており；炭化水素基などの置換基は一般に特定されていないが、それでも尚存在していて良い。
【００２５】
「分泌シグナル配列」とは、より大きなポリペプチドの成分として、より大きなポリペプチドをそれが合成される細胞の分泌経路を通じて導くポリペプチド(「分泌ペプチド」)をコードするDNA配列である。より大きなポリペプチドは分泌経路を通過する間に分泌ペプチドを取り除くために通常は解裂される。
【００２６】
「セグメント」とは、特定の性質を有するより大きな分子(例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド)の部分である。例えば、特定のポリペプチドをコードするDNAセグメントは、より長いDNA分子、例えばプラスミド又はプラスミド断片の部分であり、５’から３’方向に読まれた場合、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。
【００２７】
本発明は、二量体PDGFタンパク質及びそれらを作製するための材料と方法を供する。本発明は、本明細書中、代表的なPDGF-DD二量体の観点から記載されている。しかし、当業者は本発明の材料と方法が、他のPDGFタンパク質、例えば、PDGF AA、AB、BB及びCC二量体の生産に対して等しく適用可能であること、そしてこれら二量体、及びこれらを作製するための材料と方法は本発明の範囲内であることを理解するだろう。更に、当業者は、本発明がPDGFポリペプチドの野生型配列に限定されることはなく、様々な変異配列の使用も包含することを理解するだろう。PDGFポリペプチド及びそれらの変異体、例えば置換及びトランケーションされた変異体は、当業者に公知である。例えば、米国特許第4,801,542号；4,845,075号、4,849,407号；4,889,919号；及び5,895,755号；WIPO刊行物WO00/34474；Betsholzら、Nature vol.302:pp.695〜699、1986；Tongら、Nature、vol.328：pp.319〜621、1987；及びCollinsら、Nature、vol.302：pp.621〜624、1987を参照のこと。
【００２８】
代表的なヒトPDGF-Dポリペプチド配列(一次翻訳産物)は配列番号：２に示されており；そして代表的なマウスPDGF-Dポリペプチド配列は配列番号：４に示されている。これらのポリペプチドをコードするDNAは配列番号：１及び３にそれぞれ示されている。当業者は、これらの配列が代表的なヒト及びマウス遺伝子の単一アレルを示し、そしてこのアレルの変異体の存在が期待されていることを理解するだろう。配列番号：２に示されるアミノ酸配列の分析は、残基１〜１８が分泌ペプチドを形成することを示すだろう。一次翻訳産物は、およそ残基５２〜およそ残基１７９に延びるCUBドメイン；およそ残基１８０〜残基２４５、残基２４９又は残基２５７のいずれかに４つの潜在的な解裂部位(例えば、残基２４５及び残基２４９における一塩基部位、残基２５４〜２５５における二塩基部位、フリン又はフリン様プロテアーゼのための残基２５４〜２５７における標的部位)を伴い広がるプロペプチド様配列；及び上に開示されたカルボキシル末端増殖因子ドメインをも含む。バキュロウィルス発現系において完全長DNAを発現させることによって生産されたタンパク質は、残基２４５〜２５０での解裂、並びに残基１９及び３５におけるアミノ末端を伴うより長い物質を示した。プラスミンによる完全長PDGF-DDダイマーの解裂はタンパク質の活性化をもたらした。ウェスタン分析により、増殖因子ドメインとおよそ同じサイズで移動するバンドが確認された。対応させた、解裂してない、完全長PDGF-DD試料は活性を示さなかった。
【００２９】
任意の理論にとらわれることなく、前記PDGF-D増殖因子ドメインは、PDGF A及びBポリペプチドと同様にアンチパラレルダイマーを形成する。２つのPDGF-Dポリペプチドは、１以上の鎖間ジスルフィド結合によって連結されているとも考えられている。
【００３０】
本発明の材料と方法は、PDGF-D増殖因子ドメイン二量体の生産増強をもたらした。完全長PDGF-D及び単離された増殖因子ドメインのバキュロウィルス系における発現は低い量の生物活性を有するタンパク質をもたらした。選択圧を増加させることでは満足できる発現量を生み出さなかった。配列番号：２のArg-250で始まるトランケーション型PDGF-Dポリペプチドを、培養された昆虫細胞及びほ乳類細胞中で生産した場合、実部(substantial portion)の分泌された産物は不活性な一量体形態であった。しかし、本発明者は生物学的に活性を有するPDFG-DDの割合を融合タンパク質を使用することにより高めた。この増加は、少なくともある部分において、二量体化が向上したことによると考えられた。
【００３１】
本発明において、２つのPDGF-Dポリペプチドを含んで成る生物学的に活性を有するPDGF-DDタンパク質は、培養宿主細胞中、アミノ〜カルボキシル末端、第一PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチド、リンカーポリペプチド、及び第二PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドからなる融合ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって生産されている。宿主細胞のタイプにより、タンパク質はジスルフィド結合を欠く直鎖状ポリペプチドとしてかあるいは１以上のジスルフィド結合によって連結された第一及び第二PDGF-D増殖因子ドメインを伴い生産されている。もしタンパク質が直鎖状ポリペプチドとして生産されれば、所望のジスルフィド結合を、以下に一層詳細に開示したような機械的な方法により、形成できうる。
【００３２】
本発明のタンパク質において、PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドは、配列番号：２又は配列番号：４に示されるようにアミノ酸x〜アミノ酸yのアミノ酸残基の配列からなり、ここでxは２４６〜２５８の整数（２４６と２５８を含む）であり、そしてyは３６５〜３７０の整数（３６５と３７０を含む）である。従って、前記PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドは、例えば、配列番号：２の残基２４６〜３７０、配列番号：２の残基２４７〜３７０、配列番号：２の残基２４８〜３７０、配列番号：２の残基２４９〜３７０、配列番号：２の残基２５０〜３７０、配列番号：２の残基２５１〜３７０、配列番号：２の残基２５２〜３７０、配列番号：２の残基２５３〜３７０、配列番号：２の残基２５４〜３７０、配列番号：２の残基２５５〜３７０、配列番号：２の残基２５６〜３７０、配列番号：２の残基２５７〜３７０、又は配列番号：２の残基２５８〜３７０からなりうる。本発明の他の実施態様において、前記PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドは、上に開示したポリペプチドの１つのアミノ末端、及び配列番号：２の残基３６５、配列番号：２の残基３６６、配列番号：２の残基３６７、配列番号：２の残基３６８、又は配列番号：２の残基３６９におけるカルボキシル末端を有する。他の実施態様において、PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドは、配列番号：４の対応する残基からなる。
【００３３】
PDGF A鎖増殖因子ドメインは、成熟A鎖配列のアミノ酸残基１〜９（１と９を含む）内のアミノ酸残基内でアミノ末端を有する(米国特許第4,849,407号)。本発明の所定の実施態様において、アミノ末端は残基１〜５（１と５を含む）内である。PDGF A鎖増殖因子ドメインは、成熟配列のアミノ酸残基９６〜１０４内のアミノ酸残基でカルボキシル末端を有する。
【００３４】
PDGF B鎖増殖因子ドメインは、成熟B鎖配列のアミノ酸残基１〜１５（１と１５を含む）内のアミノ酸残基でアミノ末端を有する(米国特許第4,849,407号)。本発明の所定の実施態様において、アミノ末端は残基１〜１１（１と１１を含む）内である。PDGF B鎖増殖因子ドメインは、成熟配列のアミノ酸残基１０２〜１０９内のアミノ酸残基でカルボキシル末端を有する。
【００３５】
PDGF C鎖増殖因子ドメインは、配列番号：３４のアミノ酸残基２２６〜２３６（２２６と２３６を含む）内のアミノ酸残基でアミノ末端、及び配列番号：３４のアミノ酸残基３４０〜３４５（３４０と３４５を含む）内のアミノ酸残基でカルボキシル末端を有する。
【００３６】
一般に、リンカーポリペプチドは、融合ポリペプチド鎖の折りたたみによって、第一PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドのカルボキシル末端と第二PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドのアミノ末端の間での距離を３５Å以上供するように設計されている。実際に、リンカーポリペプチドは本来、当該分子の三次構造をより一層容易に収容するために３５Å超の長さであろう。従って、４０Å以上、例えば４５Å又は５０Åの長さのリンカーが好適である。溶液中でのポリペプチドの有効な長さの計算は当業界で慣用のことである。例えば、Creighton、Proteins: Structures and Molecular Properities、第二版、W.H.Freeman and Company、1993、第5章を参照のこと。リンカーポリペプチドは１１以上のアミノ酸残基からなり、そして長さは４０残基程度、通常は２５残基以下、そして通常は２０残基以下でありうる。従って、本発明は、限定されることはないが、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０残基のリンカーポリペプチドの使用、そして１４〜１６残基のリンカーの使用が特に好適である。
【００３７】
リンカーポリペプドは、全体的に親水性の特徴を有し且つ非免疫原性及び柔軟性であるべきだ。本明細書中で使用されている場合、「柔軟な」リンカーとは、溶液中で高次構造の実質的な安定性を欠くものである。局所電荷の領域は避けられるべきである。一般に、小さな、極性、及び親水性残基が好適であり、そして大きく、そして疎水性の残基は望ましくない。もし、リンカーポリペプチドが帯電した残基を含めば、それらは通常、ポリペプチドの小領域内での正味天然電荷(net natural charge)を供するように配置されるだろう。従って、帯電した残基を逆の電荷を帯びた残基の近くに配置することが好適である。一般に、リンカーポリペプチド内に含ませるために好適な残基としては、Gly、Ser、Ala、Thr、Asn及びGlnが挙げられ；一層好適な残基としてはGly、Ser、Ala及びThrが挙げられ；そして最も好適な残基としてはGly及びSerが挙げられる。一般に、Phe、Tyr、Trp、Cys、Pro、Leu、Ile、Lys及びArg残基は避けされるだろうし、Cys残基は不都合なジスルフィド結合を形成するそれらの可能性により、Pro残基はそれらの疎水性及び柔軟性の欠如により、そしてLys及びArg残基は免疫原性の可能性による。しかし、これら所望さが少ない残基は以下に記載するように、特異的タンパク質分解解裂部位を供するために含まれて良い。本発明の所定の実施態様において、リンカーポリペプチドは、第一PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドと第二第一PDGF-D増殖因子ドメインポリペプチドとの間でのペプチド結合を取り除くことを促すためにタンパク質分解解裂部位を含んで成る。タンパク質分解解裂部位の例としては、プラスミン、トロンビン、因子Xa、エンテロキナーゼ、フリン、及びライノウィルス3Cプロテアーゼによって解裂される配列が挙げられる。これら及び他のプロテアーゼを、融合タンパク質を分解するために使用することは当業界で公知である。例えば、Rubisteinら、をWO00/616768；Van de Venら、米国特許第5,935,815号；及びFischerら米国特許第6,010,844号を参照のこと。トロンビンはジペプチド配列Arg-Pro又はPrp-Argを解裂する。エンテロキナーゼはペンタペプチド配列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(配列番号：５)を解裂する。因子Xaは配列Ile-Gle-Gly-Arg(配列番号：６)を解裂する。プラスミンは配列Arg-Proを解裂する。ヒトライノウィルス3Cプロテアーゼは、例えば、配列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro(配列番号：７)におけるGln-Glyペプチド結合を解裂する。フリンはArg-Xaa-Lys/Arg-Arg(配列番号：８)を解裂する。リンカーの例は、タンパク質分解解裂部位との組み合わせにおいて構造Ser-Gly-Ser-Gly-Ser(配列番号：９)の２回リピートを有するもの、例えば、トロンビン解裂部位を含む、Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(配列番号：１０)である。
【００３８】
本発明は、ポリヌクレオチド分子、例えば、上に開示されたPDGF-DポリペプチドをコードするDNA及びRNA分子をも提供する。本発明のポリヌクレオチドは一本鎖分子及び二本鎖分子の両方を含む。ヒトPDGF-Dをコードする代表的なDNA配列は配列番号：１に開示されており、そしてマウスPDGF-Dをコードする代表的なDNA配列は配列番号：３に開示されている。PDGF-Dポリペプチドをコードする更なるDNA配列は当業者に公知の方法により遺伝暗号に基づいて容易に生じさせることができうる。対応するRNA配列はTをUに置換することによって生じさせることができる。当業者には、遺伝暗号の縮重の観点において、多くの配列の変化が、PDGF-Dポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子の中で可能であることに容易に気付くだろう。
【００３９】
DNA及びRNAを調製するための方法は当業界で公知である。相補的DNA(cDNA)クローンは、多量のPDFG-D RNAを生産する組織又は細胞から単離されたRNAから調製される。かかる組織及び細胞はノーザンブロッティング(Thomas、Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.77：p.5210、1982)によって同定され、そして心臓、すい臓、胃及び副腎が挙げられる。全長RNAは、グアニジンHCl抽出、しかる後のCsCl勾配中での遠心による単離によって調製できうる(Chrigwinら、Biochemistry vol.18：pp.52〜94、1979)。ポリ(A)+RNAは全長RNAからAvivとLederの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.69：pp.1408〜1412、1972)を使用することで調製される。相補的DNAは公知方法を使用することでポリ(A)+RNAから調製される。代わりに、ゲノムDNAが単離されて良い。いくつかの用途(トランスジェニック動物中での発現)に関してゲノムクローンを使用すること、又は１以上のゲノムイントロンを含むようにcDNAクローンを修飾することが好適である。cDNA及びゲノムクローンを同定及び単離するための方法は、当業者に周知であり、そして当業界のレベルの範囲内であり、そして本明細書中で開示された配列、もしくはその一部の、ライブラリーを標識もしくはプライミングするための使用を含む。PDGF-Dポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」、Mullis、米国特許第4,683,202号)によって同定及び単離されている。発現ライブラリーはPDGF-D、レセプター断片、又は他の特異的結合パートナーに対する抗体により標識されて良い。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは自動合成によっても調製できうる。短い二本鎖セグメント(６０〜８０bp)の生産は技術的に容易であり、そして相補鎖を合成してそれらをアニーリングすることによって達成されうる。より長いセグメント(典型的に＞３００bp)は、長さ２０〜１００ヌクレオチドである一本鎖断片からモジュラー形態において集成されている。ポリヌクレオチドの自動合成は、当業者のレベルの範囲内であり、そして適切な装置と試薬は商業的な供給者から入手可能である。一般に、GlickとPastenak、Molecular Biotechnology、Principles ＆ Applications of Recombinant DNA、ASM出版、Washington、D.C.、1994；Itakuraら、Ann.Rev.Biochem.vol.53：pp.323〜356、1984；及びClimieら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.87：pp.633〜637、1990を参照のこと。
【００４１】
本発明のタンパク質は、常用の方法により遺伝子操作された宿主細胞から生産されて良い。適切な宿主細胞は、外来DNAにより形質転換又はトランスフェクションされて培地中で増殖できるタイプの細胞であり、例えば、細菌、真菌細胞、及び培養された高等真核生物細胞(多細胞生物の培養細胞など)である。クローン化されたDNA分子を操作して外来DNAを様々な宿主細胞中へと入れるための技術は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.1989及びAusubelら著、Current Protocols in Molecular Biology、Green and Wiley and Sons、N.Y.1993を参照のこと。
【００４２】
一般に、PDGF-DポリペプチドをコードするDNA配列は、その発現のために必要となる他の遺伝的要素、例えば、発現ベクター内の、転写プロモーター及びターミネーターに対して作用可能式に連結している。ベクターは通常１もしくは複数の選択可能マーカー及び１もしくは複数の複製開始点を含んで成るが、当業者は所定の系において、選択可能マーカーは、個々のベクター上で供されて良く、そして外来DNAの複製は宿主細胞ゲノム中への組み込みによって司られることに気付くだろう。プロモーター、ターミネーター、選択可能マーカー、ベクター及び他の要素の選択は、当業者のレベルにおける慣用の設計の事項である。多くの要素が刊行物中に開示されており、それらは商業的な供給者から入手可能である。
【００４３】
PDGF-Dポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へと向けるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている)が発現ベクター中に供されている。前記分泌シグナル配列はPDGF-Dものであって良い、又は他の分泌されたタンパク質(例えば、t-PA；米国特許第5,641,655を参照のこと)もしくはde novo合成されたタンパク質に由来するものであって良い。前記分泌シグナル配列はPDGF-D DNA配列に対して作用可能式に連結されており、それは即ち、２つの配列は正確なリーディングフレームにて連結されており、そして新たに合成されたペプチドを宿主細胞の分泌経路へと向けるように配置されている。分泌シグナル配列は、通常、PDGF-DポリペプチドをコードするDNA配列に対して５’側に位置するが、所定のシグナル配列は注目のDNA配列の何処かに配置されていても良い(Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照のこと)。
【００４４】
PDGF-Dポリペプチド(本発明の融合タンパク質など)の宿主細胞分泌経路を介する発現により二量体タンパク質の生産がもたらされることが予測される。二量体は、適切な条件下でのPDGF-Dポリペプチドのインキュベーションによってin vitroでも集成されうる。一般に、in vitro集成は、ポリペプチドを変性及び還元条件下でインキュベートし、しかる後に当該ポリペプチドの再折りたたみ及び再酸化をし二量体を形成することをと伴うだろう。細菌細胞中で発現したタンパク質の回収及び集成は以下に開示されている。
【００４５】
培養されたほ乳類細胞は本発明において使用するために適切な宿主である。外来DNAをほ乳類宿主細胞へ導入するための方法としては、リン酸カルシウム介在トランスフェクション(Wiglerら、Cell vol.14：p.725、1978；CorsaroとPearson、Somatic Cell Genetics vol.7:p.603、1981：GrahamとVan der Eb、Virology vol.52：p.456、1973)、エレクトロポレーション(Neumannら、EMBO J.vol.1:pp.841〜845、1982)、DEAEデキストラン介在トランスフェクション(Ausubelら、ibid)、及びリポソーム介在トランスフェクション(Hawley-Nelsonら、Focus vol.15：p.73、1993、Ciccaroneら、Focus vol.15：p.80、1993)が挙げられる。培養されたほ乳類細胞中での組換えポリペプチドの生産は、例えば、Levinsonら、米国特許第4,713,339号；Hagenら、米国特許第4,784,950号；Palmiterら、米国特許第4,579,821号；Ringoldら、米国特許第4,656,134号によって開示されている。培養された適切なほ乳類細胞としては、COS-1(ATCC No.CRL1650)、COS-7(ATCC No.CRL1651)、BHK(ATCC No.CRL1632)、BHK570(ATCC No.CRL10314)、293(ATCC No.CRL1573；Grahamら、J.Gen.Viorol.vol.36：pp.59〜72、1977)及びチャイニーズハムスターオバレイ(例えば、CHO-K1；ATCC No.CCL61)細胞系統が挙げられる。更なる適切な細胞系統が当業界で公知であり、American Type Culture Collection、Manassas、Virginiaなどの公共寄託機関から入手可能である。強力な転写プロモーター、例えば、SV-40又はサイトメガロウィルスに由来するプロモーターが使用されて良い。例えば、米国特許第4,956,288号を参照のこと。他の適切なプロモーターとしては、メタロチオネイン遺伝子(米国特許第4,956,288号)に由来するもの及びアデノウィルス主要後期プロモーターが挙げられる。ほ乳類細胞中で使用するための発現ベクターとしてはpZP-1及びpZP-9（それらはAmerican Type Culture Collection、Manassas、VirginiaにアクセスNo.98669及び98668の下それぞれ寄託されている）及びこれらのベクターの誘導体が挙げられる。
【００４６】
外来DNAが挿入された培養ほ乳類細胞を選択するためには一般に薬物選択が使用されている。かかる細胞は一般に「トランスフェクション体」に言及される。選択剤の存在下で培養された細胞は、注目の遺伝子をそれらの子孫に対して受け継ぐことができ、それらは「安定なトランスフェクション体」に言及される。選択マーカーの例は、抗生物質ネオマイシン対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシンタイプの薬剤、例えば、G-418などの存在下でも行われて良い。選択系は、注目の遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用することができ、ある方法は「増幅」に言及される。増幅は、トランスフェクション体を低レベルの選択剤の存在下で培養し、そして導入された遺伝子の産物を高レベルで生産する細胞を選択するために、選択剤の量を増加することによって行われている。増幅可能な選択マーカーの例は、ジヒドロホレートレダクターゼ(メトトキセレートに対する耐性を付与する）である。他の薬物耐性(例えば、ヒグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)遺伝子も使用できる。
【００４７】
他の高等真核生物細胞、例えば、昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞も宿主として使用することができうる。植物細胞中で遺伝子を発現せしめるためのベクターとしてアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を使用することは、Sinkarら、J.Biosci.(Bangalore)vol.11：pp.47〜58、1987によって確認されいている。昆虫細胞の形質転換及び外来細胞のその中への導入は、Guarinoら、米国特許第5,162,222号及びWIPO刊行物WO94/06463に開示されている。
【００４８】
昆虫細胞は、通常、アウトグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウィルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)(AcNPV)に由来する、組換えバキュロウィルスによりインフェクトされていて良い。例えば、KigとPossee、The Baculovirus Expression System：Laboratory Guide、London、Champman ＆ Hall；O’Reillyら、Baculovirus Expression Vectors：Laboratory Manual、New York、Oxford University Press、1994；及びRichardson著、Baculovirus Expression Protocols.Methods in Molecular Biology、Humana出版、Totowa、NJ、1995を参照のこと。組換えバキュロウィルスは、Luckowらにより記載された(J.Virol.vol.67：pp.4566〜4579、1993)トランスポゾンベースの系を使用することにより生産することもできる。輸送ベクターを使用するこのような系は、通常キット形態(Bac-to Bac(登録商標)キット；Life Technologies、Gaithesburg、MD)で入手可能である。輸送ベクター(例えば、pFastBacI(登録商標）、Life Technologies)は、注目のタンパク質をコードするDNAを大腸菌(E.coli)中で維持される「バクミド(bacmid)」と呼ばれる巨大プラスミドとしてのバキュロウィルスゲノム中へと移動させるためにTn7トランスポゾンを含む。例えば、Hill-PerkinsとPossee、J.Gen.Virol.vol.71:pp.971〜976、1990；Bonningら、J.Gen.Virol.vol.75:pp.1551〜1556、1994；及びChazanbalkとRapoport、J.Gen.Biol.Chem.vol.270:pp.1543〜1549、1995を参照のこと。加えて、輸送ベクターは、上に開示したようなポリペプチドエクステンション又はアフィニティー標識をコードするDNAとのインフレーム融合を含むことができる。当業界で公知の方法を使用することで、PDFG-Dポリペプチドコーディング配列を含む輸送ベクターは、大腸菌宿主細胞中へと形質転換させられ、そして当該細胞は、組換えバキュロウィルスを示す遮断されたlacZ遺伝子を含むバクミドのためにスクリーニングされる。通常の技術を使用することで、組換えバキュロウィルスゲノムを含むバクミドDNAが単離され、そしてスポドプテラ・フルジペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞、例えば、Sf9細胞をトランスフェクトするために使用される。PDGF-Dタンパク質を発現する組換えウィルスがその後生産されている。組換えウィルスストックは当業界で通常の方法によって作製されている。
【００４９】
タンパク質生産のために、宿主細胞、典型的には秋アワヨウトウの幼虫、スポドプテラ・フルジペルダ(例えば、Sf9又はSf21細胞)又はトリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni）(例えば、High Five(登録商標)細胞；Invitrogen、Carsbad、CA)に由来する細胞系統にインフェクションするために組換えウィルスが使用されている。一般に、GlickとPasternak、Molecular Biotechnology、Principles ＆ Applications of Recombinant DNA、ASM出版、Washington、D.C.、1994；米国特許第5,300,435号を参照のこと。無血清培地は、細胞を増殖させて維持するために使用されている。適切な培地製剤は当業者に公知であり、そして商業的供給者から入手可能である。細胞は、およそ２〜５×１０5細胞の密度〜およそ１〜２×１０6細胞の密度で増殖し、この場合、組換えウィルスストックは０.１〜１０、一層典型的にはおよそ３の感染多重度(MOI)で加えられる。使用された手順は一般に、入手可能なラボラトリーマニュアル(例えば、KingとPossee、ibid.；O’Reillyら、ibid.；Richardson、Ibid.)に記載されている。
【００５０】
真菌細胞、例えば酵母細胞も本発明の範囲内で使用することができる。これについて特に注目の酵母種としては、サッカロミセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピチア・パストリス(Pchia pastoris)及びピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)が挙げられる。S.セレビジアエ細胞を外来DNAで形質転換させてそれらから組換えポリペプチドを生産するための方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Kawasakiら、米国特許第4,931,373号；Brake、米国特許第4,870,008号；Welchら、米国特許第5,037,743号；及びMurryら、米国特許第4,845,075号に開示されている。形質転換された細胞は、選択マーカーによって決定される表現形、通常は薬剤耐性又は特定の栄養(ロイシンなど)の不在下で増殖する能力によって選択されている。サッカロミセス・セレベジアエにおいて使用するための例となるベクター系は、Kawasakiら(米国特許第4,931,373号)によって開示されたPOT1発現系であり、それは形質転換細胞をグルコース含有培地中で増殖させることによって選択されるように形質転換せしめる。酵母中で使用するための適切なプロモーター及びターミネーターは糖分解酵素遺伝子(Kawasakiら、米国特許第4,599,311号；Kingsamら、米国特許第4,615,974号；及びBitter、米国特許第4,977,092号；を参照のこと)及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に由来するものである。米国特許第4,990,466号；第5,063,154号；第5,139,936号；及び4,661,454号をも参照のこと。他の酵母、例えば、ハンセニュラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、シゾサッカロミシス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluiyveromyces lactis)、クルイベロミセス・フラジリス(Kluiyveromyces fragilis)、ウスチラゴ・マイジス(Ustilago maydis)、ピチア・パトリス(Pichia pastris)、ピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピチア・グイレルモンジ(Pichia guillermondii)及びカンジダ・マルトーザ(Candida maltosa)に関する形質転換系も当業界で公知である。例えば、GLeesonら、J.Gen.Microbiol.vol.132：pp.3459〜3465、1986；Cregg、米国特許第4,882,279号；及びRaymondら、Yeast、vol.14：pp.11〜23、1988を参照のこと。アスペルジルス細胞はMcKnightら米国特許第4,935,349号の方法により使用されても良い。アクレモニウム・クリソゲナン(Acremonium chrysogenum)を形質転換するための方法はSuminoら、米国特許第5,162,288号に開示されている。ニューロスポラを形質転換するための方法はLambowitz、米国特許第4,486,533号に開示されている。ピチア・メタノリカにおける形質転換細胞の生産は、米国特許第5,716,808号；5,736,383号；5,854,039号及び第5,888,768号に開示されている。
【００５１】
原核宿主細胞、例えば、大腸菌、バチルス(Bacillus)及び他の属の細菌の系統も本発明の範囲内における有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換して外来DNA配列を発現させるための方法は、当業者に周知である(Sambrookら、ibid.などを参照のこと)。大腸菌などの細菌中でzvegf4ポリペプチドを発現せしめる場合、当該ポリペプチドは細胞質に、典型的には不溶性顆粒として維持されているかあるいは、細菌の分泌配列によってペリプラズム空間に向けられうる。前者の場合、細胞が溶解され、そして顆粒は回収され、そして例えば、グアニジンイソチオシアネート又は尿素を使用することで変性される。変性されたポリペプチドは、次いで、再度折りたたまれ、変性体を希釈すること（例えば、尿素の溶液及び還元と酸化されたグルタチオンの組み合わせに対する透析、しかる後の緩衝化された塩類溶液に対する透析）によって二量体化される。代りの方法においてタンパク質は、細胞質から、可溶性形態において回収され、そして変性剤を使用せずに単離されている。タンパク質は例えば、リン酸緩衝塩類溶液中の水性抽出物として細胞から回収されている。注目のタンパク質を回収するために、抽出物がクロマトグラフィー媒体、例えば固定化された抗体又はヘパリン-セルロースカラムに対して直接適用されている。分泌されたポリペプチドは、細胞を破壊(例えば、超音波処理又は浸透性ショック)しペリプラズム空間の含有物を放出させてタンパク質を回収し、それによって変性及び再折りたたみの必要性を防ぎ、ペリプラズム空間から、可溶性及び機能性形態において回収することができる。
【００５２】
形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞は、選定の宿主細胞が増殖するために必要な栄養及び他の成分を含む培養培地中で常用の手順により培養されている。様々な適切な培地、例えば、規定の培地及び複合培地は当業者に公知であり且つ一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含む。培地は必要に応じ、増殖因子又は血清などの成分をも含んで良い。増殖培地は、一般に、外的に加えられたDNAを含む細胞を、例えば、薬剤選択又は必須栄養素を欠いた培地(発現ベクター又は共トランスフェクション体上で担持され宿主細胞に入る選択マーカーを補足されている)によって選択するためであろう。
【００５３】
リンカーポリペプチドがタンパク質分解解裂部位を含む場合、前記PDGF-DDポリペプチドは、宿主細胞が、当該タンパク質解裂分解部位での解裂をするプロテアーゼを生産するならば、当該宿主細胞内で解裂されうる。もしも宿主細胞が天然にプロテアーゼを生産しなければ、それはプロテアーゼとPDGF-DDポリペプチドを共に発現させるためにトランスフェクションされて良い。例えば、米国特許第5,648,254号及び5,935,815号を参照のこと。PDGF-DDのかかる細胞内解裂はジスルフィド結合した二量体タンパク質の分泌を促すだろう。
【００５４】
リンカーポリペプチド内に解裂部位を含む本発明のPDGF-DDタンパク質は、常用の方法によりin vitroで解裂されても良い。組換えタンパク質のプロセシングをするためのプロテアーゼの使用は、当業界で慣用であり、そして固定化されたプロテアーゼの使用を含む。例えば、米国特許第6,010,844号を参照のこと。特異的反応条件は、使用されるプロテアーゼに基づいており、そして第一ポリペプチドセグメントによる不都合なタンパク質分解を最小にとどめるために使用されて調整されるだろう。一般に、反応時間及び基質に対するプロテアーゼの比などのパラメーターは、所望の結果を獲得するために調節されるだろう。
【００５５】
本発明のPDGF-DDタンパク質は、常用のタンパク質精製法、典型的にはクロマトグラフィー技術の組み合わせによって精製されている。例えば、一般に、Affinity Chromatography：Principals and Method Pharmacia KLB Biothechnology、Uppsala、Sweden、1988；及びScopes、Protein Purification：Principles and Practice、Springer-Verlag、New York、1994を参照のこと。適切なクロマトグラフィー技術としては、限定ではないが、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【００５６】
PDFG-DDタンパク質は、ヒト及びヒト以外の動物両方において骨組織及び/又は結合組織の生産を刺激することが望まれている場合に使用できうる。獣医学的な使用としては、家畜動物、例えば、家畜及びペットにおける使用を含む。特異的な用途としては、限定ではないが、骨折、例えば癒着不能骨折及び治癒力が損なわれている患者、例えば、糖尿病、アルコール中毒、及び老人の患者の骨折；骨移植；放射線が誘導した骨壊死後の骨の治癒；移植、例えば関節置換及び歯科的な移植；手術により生じる骨の欠損の修復、例えば、腫瘍除去の後の頭蓋マキシロホシアル(maxilofocial)修復、外傷性傷害後の外科的な再構築、遺伝的又は他の生理的な異常の修復、及び形成外科における骨治癒の促進；歯周病の治療及び他の歯科的欠陥の修復；骨ガンの治療処置後の骨欠損の治療；仮骨延長術中の骨形成の増加：関節傷害の治療、例えば、軟骨及び靭帯の修復；変形性関節症に侵されてきた関節の治療；腱の修復及び再接着；骨粗鬆症(例えば、加齢性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、グルココルチコイド誘導骨粗鬆症、及び非活動性骨粗鬆症)及び骨損失の増加又は骨形成の低下を特徴とする他の症状の治療；前更年期における女性の最大骨密度の上昇；硬膜に連結した結合組織の治癒における使用が挙げられる。
【００５７】
医薬的な使用のために、PDGF-DDタンパク質は常用の方法による局所又は全身(特に静脈又は皮下)デリバリーのために処方されている。一般に、医薬製剤は、医薬的に許容できるデリバリービヒクルとの組み合わせにおけるPDGF-DDタンパク質が挙げられるだろう。デリバリービヒクルとしては、生物適合性の固体状又は半固体状マトリクス、例えば、粉末状骨、セラミックス、生分解性及び生物非分解性合成ポリマー、及び天然ポリマー；組織粘着質(例えばフィブリンベースの)；水性ポリマーゲル；水溶液；リポソーム；軟膏などが挙げられる。これら及び他の適切なビヒクルは当業界で公知である。製剤は更に１又は複数の更なる増殖因子、賦形剤、防腐剤、流動促進剤、緩衝剤、ウィルス表層上でのタンパク質の損失を防ぐためのアルブミンなどを含んでも良い。処方の方法は、当業者に周知であり、例えば、Remoington：The Science and Practice of Farmacy 第20版、Gennaroら著、Lippoincott、Williams ＆ Wilkins、Baltimore、2000に開示されている。正確な用量は、医者によって、許容された標準に従い、治療される患者の特性、症状の性質及び症度を考慮して決定されるだろう。用量の決定は当業者に周知のレベルである。投与の経路及び方法に依存し、タンパク質は、単一投与において、延長注入として又は長期に渡り断続的に投与されうる。静脈投与はボラス注射又は典型的な１〜数時間に渡る注入によって投与されるだろう。持続放出製剤も使用されて良い。一般に、zvegf4の治療上有効な量とは、治療される症状における臨床的に有意な変化、例えば、骨折の修復において必要となる時間の臨床的に有意な減少、空隙の体積又は他の欠損の臨床的に有意な減少、骨密度の有意な増加、疾病率の有意な減少、又は組織学的スコアの有意な増加を生み出す量である。
【００５８】
PDGF-DDは本来約１０〜１００μg/mlの合計体積の濃度で使用されているが、１ng/ml〜１０００μg/mlの範囲の濃度において使用されても良い。局所適用、例えば、骨折又は他の骨欠損の再生のための適用について、タンパク質は０.１〜１００μg/cm2の傷害領域の範囲で使用されるだろう。
【００５９】
本発明のPDGF-DDタンパク質は、他の増殖因子及び骨の増殖又は結合組織の増殖に対して正の効果を有する他の治療剤との組み合わせにおいて使用されて良い。かかる増殖因子としては、インスリン様増殖因子１(IGF-1)、PDGF、α及びβ形質転換増殖因子(TGF-α及びTGF-β)、上皮増殖因子(EGF)、骨形成タンパク質、白血病阻害因子、及び繊維芽細胞増殖因子が挙げられる。他の治療剤としては、ビタミンD、ビスホスホン酸塩、カルシトニン、エストロゲン、パラチロイドホルモン、オステオゲニン、NaF、オステオプロテグリン、及びステインが挙げられる。
【００６０】
本発明は更に以下の限定ではない例によって説明されている。
【実施例】
【００６１】
実施例１
PDGF-DDタンパク質を昆虫細胞中で発現させるために昆虫細胞中で発現ベクターのzVegf4[GFD]-FL2-TCS-zVegf4[GFD]/pZBV37Lを調製した。このベクターを、１０アミノ酸Ser-Gly-リッチ配列と６アミノ酸トロンビン解裂部位（TCS）（配列番号：１０）によって連結された２つのPDGF-D増殖因子ドメインポリペプチド（zvegf4 GFD）を発現するように設計した。このタンパク質を「zvegf4-sc-GFD」と命名した。
【００６２】
BspEI及びEcoRI制限部位をそれぞれ５’及び３’末端に含む、８３０bpの断片(zvegf[GFD]-FL2-TCS-zvegf4[GFD])を、２つのPCR増幅断片をライゲーションさせることによって生じさせた。第一の断片はBspEI及びBamHI部位をそれぞれ５’及び３’末端に含み、そして第二の断片はBamHI及びEcoRI部位をそれぞれ５’及び３’末端に含んだ。最初の断片を、PCR増幅によって、PDGF-D cDNAを含むプラスミドからプライマーzc38,995(配列番号：１１)及びzc38,602(配列番号：１２)を使用することで生じさせた。第二断片は、PDGF-D cDNAを含むプラスミドからプライマーzc38,950(配列番号：１３)及びzc38,953(配列番号：１４)を使用するPCR増幅により生じさせた。PCR反応混合物を９４℃で５分に渡りインキュベートし、しかる後に９４℃で６０秒、５８℃で１２０秒、及び７２℃で１８０秒に渡る３５サイクル；７２℃で１０分に渡り維持し；しかる後に４℃で浸した。前記最初の断片をBpsEI及びBamHIで消化し、そして第二の断片をBamHI及びEcoRIで消化した。断片をアガロースゲル上で移動させ、切り出して、そしてシリカゲル膜を含むスピンカラム(QIAquick(登録商標)Gel Extraction Kit；Quiagen、Inc)を使用して精製した。生じる精製された第一及び第二断片をライゲーションしてアガロースゲル上での電気泳動に掛けた。組み合わせた断片のサイズに対応するバンドを切り出してスピンカラムを使用して精製した。精製した断片をベクターpZBV37L(pFastBack1(登録商標)発現ベクター(Life Technologies、Gaithersburg、MD)の修飾体、多面体プロモーターは取り除かれておりそして遅発活性化塩基性タンパク質プロモーターで置換されている)へとライゲーションした。およそ２３ngの制限消化されたzVegf4[GFD]-FL2-TCS-zVegf4[GFD]挿入体及び約５０ngのpZBV37Lベクターを１６℃で一晩ライゲーションした。このライゲーション混合物を、大腸菌宿主細胞(ElectoMAX(登録商標)DH12S(登録商標)；Life Technologies)中にエレクトロポレーション(２mmギャップエレクトロポレーションキュベット(BTX、Model No.620)中４００Ω、２V、及び２５μF)によって形質転換させるために入れた。形質転換した細胞を４５０μlのSOC培地(２％Bacto(登録商標)トリプトン(Difco Laboratories、Detroit、MI)０.５％Bacto(登録商標)イーストエクストラクト(Difco Laboratories)、０.０１M NaCl、１.５mM KCl、１０mM MgCl2、１０mM MgSO4、及び２０mM グルコース)中で希釈して、１００μlのこの希釈物を１００μg/mlのアンピシリン含有LBプレート上に置いた。クローンをPCRによって分析し、そして３つのポジティブクローンを増殖により選択し、そしてスピンカラム(QIAprep(登録商標)Spin Miniprep Kit；Quiagen、Inc.)を使用することで精製した。ポジティブクローンを配列決定によっても確認した。２μlの各ポジディブクローンを２０μlの大腸菌細胞(MAX Efficiency(登録商標)DH10Bac(登録商標)Competent Cell；Life Technologies)中へと形質転換させるために４２℃のヒートブロック中４５秒に渡る熱ショックによって入れた。形質転換した細胞を９８０μlのSOC培地中で希釈し、そしてその１００μlをLuria Agarプレート(５０μg/mlのカナマイシン、7μg/mlのゲンタマイシン、１０μg/mlのテトラサイクリン、４０μg/mlのIPTG及び２００μg/mlのハロゲン化インドリル-β-D-ガラクトシド(blou-gal)を含む)上に塗布した。このプレートを３７℃で４８時間に渡りインキュベートした。カラーセレクションを使用し、輸送されたウィルスDNA(「バクミド」に言及する)を有する細胞を同定した。白色のコロニーを分析のために採取し、そしてPCRによって分析して、そしてポジティブコロニー(所望のバクミドを含む)を増殖により選択してスピンカラムを使用することで精製した。クローンを、バクミド中の転移エレメントに対するプライマー(プライマーzc447(配列番号：１５)及びzc976(配列番号：１６))を使用するPCRによりこのDNAを増幅することによって適切な挿入体についてスクリーニングした。このPCR混合物を９４℃で５分に渡りインキュベートし、しかる後に９４℃で６０秒、５０℃で１２０秒、及び７２℃で１８０秒に渡る３０サイクル；７２℃で１０分に渡り維持し；しかる後に４℃で浸した。PCR産物を１％アガロースゲル上で流して挿入体のサイズを調べた。
【００６３】
適切なサイズを有するクローンを使用しスポドプテラ・フルジペルダ(Sf9)細胞にトランスフェクションさせた。このSf9細胞を６ウェルプレート中１×１０6/ウェルで播き、そして２７℃で１時間に渡り接着せしめた。１０μlバクミドDNAを１００μlのSf-900IISFM(Life Technologies)で希釈した。膜ろ過水中のポリカチオン脂質２，３-ジオレイルオキシ-N-[２(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパニミニウム-トリフルオロアセテートと天然脂質ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミンの３：１(w/w)リポソーム製剤２０μl(LipofectAMINE(登録商標)試薬；Life Technologoes)を１００μlのSf-900IISFMで希釈した。バシミドDNA及び脂質溶液を穏和に混合して室温で３０〜４５分インキュベートした。細胞の１つのウェルから培地を吸引し、そして細胞を２mlの新鮮Sf-900IISFM培地で一回洗浄した。８００μlのSf-900IISMFを脂質-DNA混合物に対して加えた。洗浄培地を吸引し、そしてDNA-脂質混合物を細胞に対して加えた。細胞を２７℃で１晩インキュベートした。このDNA-脂質混合物を吸引し、そして２mlのSf-900II培地を各プレートに対して加えた。プレートを２７℃、湿度９０％で９６時間に渡りインキュベートし、その後ウィルスを収穫した。
【００６４】
一次ウィルス増幅のために、Sf9細胞を、１２５ml振とうフラスコ中５０mlのSf-900IISFM中、およそ１×１０6細胞/mlの密度に増殖させた。次いで、それらを、トランスフェクションさせた６ウェルプレートに由来するウィルスストック５００μlでインフェクションし、そして２７℃で３日に渡りインキュベートし、その後ウィルスを収穫して滴定した。
【００６５】
実施例２
１２５mlの振とうフラスコ中２７℃において２×１０6細胞/mlにおけるSf9細胞の50ml培養物を５mlのヒトzvegf4-sc-GFDをコードする一次増幅したウィルスでインフクションした。培養物を４８時間で収穫した。上清及び全細胞溶出物をウェスタンブロッティングによって分析した。およそ適切なサイズの３６kDaのバンドを上清及び溶出物の試料の両方に対応するレーンで確認した。
【００６６】
ウィルスストックを大量に増幅した。２７℃における１×１０6細胞/mlを伴う１L振とうフラスコにウィルスを０.１の標的MOIでインフェクションし、そして９６時間(この時間で上清を回収して滴定した)に渡りインキュベートした。
【００６７】
多量の増幅したウィルスを使用し、２×１０6細胞/mlでのSf9細胞の複数の１L培養物をおよそ１〜２のMOIでインフェクションした。上清を４８時間で収穫した。
【００６８】
実施例３
組換えzvegf4-sc-GFDタンパク質を、バキュロウィルスインフェクションした昆虫細胞の条件培地から回収した。１１Lの培養物を回収し、そして培地を０．２０μmフィルターを使用してろ過した。
【００６９】
タンパク質を条件培地から、陽イオン交換、疎水性相互作用、及びサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによって部分的に精製した。ろ過した培養培地(pH６．３、導電性９mS)を直接、５０ml用イオン交換カラム(Poros(登録商標)５０−HS；Applied Biosystems、Framingham、MA)上にロードした。カラムを１０カラム体積(cv)の９６％スターティングバッファーA(５０mMの２-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)、pH６．５)及び４％のバッファーB(５０mMのMES、２M NaCl、pH６．６)で洗浄し、そして結合したタンパク質を１００％バッファーBに対する１５cv、しかる後に５cvの１００％バッファーB直線勾配により１２ml/分で溶出させた。４mlの画分を回収した。カラムからの試料を、zvegf4-sc-GFDタンパク質の存在に関し銀染色を伴うSDS-PAGE及びウェスタンブロッティングによって分析した。タンパク質含有画分をプールし、硫酸アンモニウムペレットと混合し最終濃度を２Mにし、０．２０μmのろ過ユニット(Nalgene(登録商標))によりろ過し、そして２０mlの誘導体化アガロースカラム(Phenyl Sepharose(登録商標)、Amersham Pharmacia Biotech)上にロードした。タンパク質を、３cv直線勾配、１００％バッファーC(５０mMのリン酸ナトリウム、２Mの硫酸アンモニウム、pH７．０)〜４０％、しかる後の１０cv直線勾配、４０％バッファーC(５０mMリン酸ナトリウム、pH７．０)により溶出させた。１２mlの画分を回収した。ウェスタンブロッティング陽性シグナル画分をプールし、Millipore濃縮器80(Millipore)を使用して１mlに濃縮し、そして１６×４５０mm架橋デキストランゲルろ過カラム(Superdex-75；Amersham Pharmacia Biotech)に１ml/分でロードした。精製されたzvegf4-sc-GFDを含む全２画分をプールし、そしてアッセイのために濃縮した。
【００７０】
組換えzvegf4-sc-GFDタンパク質を銀染色(Fast Silver；Geno Tech、St.Louis、MO)を伴うSDS-PAGE(Bis-Tris Nupage(登録商標）ゲル、４〜１２％；Invitorgen、Calsbad、CA)及びPDGF-Dタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析した。条件付けされた培地又は精製されたタンパク質を、商業的に入手可能なブロッティング装置(Novex(登録商標)XcellII(登録商標)mini-cell；Invitrogen)を使用することで電気泳動し、そして説明マニュアルに記載されている指示に従い撹拌しながらブロットモジュール(XcellII(登録商標)；Invitrogen)を使用することで、室温においてニトロセルロース膜(０．２μm；Invitrogen)に移した。この移しをバッファー(２５mMのトリス塩基、２００mMのグリシン、及び２０％メタノール含む)中で１時間に渡り５００mAで行った。次いで、ブロットをPBS中１０％無脂肪乾燥乳で１０分に渡り室温で遮断した。ブロットを迅速に洗浄し、次いでマウス一次抗体(２．５％無脂肪乳を含むPBS中１：２０００に希釈した)を加えた。ブロットを室温で２時間に渡るかあるいは４℃で一晩穏和な振とうをしながらインキュベートした。インキュベーション後、ブロットを１０分に渡りそれぞれPBSで洗浄し、二次抗体(西洋ワサビペルオキシダーゼに接合したヒツジ抗マウスIgG；Pierce Chemical Co.Rockford、IL)(２．５％無脂肪乳を含むPBS中１：２０００に希釈した)で標識し、そしてブロットを室温で２時間に渡り穏和に振とうしながらインキュベートした。次いで、ブロットを３回、１０分ごと、PBS中で洗浄して、次いでH2Oで迅速にリンスした。ブロットを、商業上入手可能な化学発光基質試薬(SuperSignal(登録商標)ULTRA試薬１及び２、混合１：１、Pierce Chemical Co.、Lockford、ILから入手可能)で顕色し、そしてシグナルを商業上入手可能なソフトウェア(Lumi-Imager(登録商標)LumiAnalyst3.0；Boehringer Mannheim GmbH、Germany)を使用することで、必要に応じ１０秒〜５分の時間範囲でとらえた。
【００７１】
部分的に精製したzvegf4-sc-GFDタンパク質は、銀染色ゲル上およそ３２kDa及び２０kDaの２つのバンドとして非還元及び還元条件下で現われた。この結果は、zvegf4-sc-GFD及びzvegf4-GFD単量体の２つのタンデムリピート形態が２つのzvegf4-GFDリピートのリンカー領域の周辺で解裂された可能性があることを示唆している。部分的に精製されたタンパク質は、カルシウムベースのルシフェラーゼアッセイにおいて非常に活性があった。
【００７２】
実施例４
ラット星細胞を９６ウェル組織クラスター(FALCON；BD、Franklin Lakes、NJ)においてDMEM(Laife Technologies、Geithersberg、MD)(１０％のウシ胎児血清(Hyclone Laboratories、Inc、Logan、UT)を補足した)中で増殖させた。翌日、培地を０.１％BSA(Fraction V、Sigma、St.Louis、MO)で血清を置換することによって無血清培地に代えた。この培地は、SRE及びSTATエレメントによって誘導されるルシフェラーゼレポーターミニ遺伝子をコードするアデノウィルス構築体KZ136を感染の多重度(m.o.i.)1000：1でも含んでいた。アデノウィルス構築体を細胞中へ導入した２４時間後、培地を交換し、そして無血清培地+０.１％BSA(zvegf4-sc-GFDを発現する昆虫細胞又はコントロール細胞に由来する条件付けされた培地(CM)を指示された最終濃度(下表)で含んでいた)で置換した。４時間後、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ活性、レポーター遺伝子の活性標識化を、商業上入手可能なアッセイキット(Promega Corp.、Madison、WI)及び発光リーダー(MICROLUMAT PLUS、Berthold Thechnologies、WI)使用することで溶出物において測定した。結果(表に示した)を溶出物における比ルシフェラーゼユニット(RLU)として獲得し、そして値１をBSAコントロール (条件付けした培地を細胞に対して与えていない)に割り当てた。
【表１】
2005523001.tif 000002
【００７３】
zvegf4-sc-GFDを発現するバキュロウィルスをトランスフェクションした昆虫細胞に由来する条件培地は、抗PDGF-D抗体と反応し且つSDSタンパク質ゲル上の適切な位置に移動したタンパク質(約３５kDa、還元されていない)を含んでいた。この方法によって、タンパク質濃度をおよそ０.４μg/mlであると見積もった。トランスフェクションしなかった細胞に由来する条件培地は、抗PDGF-D抗体によって認識される成分をなんら含んでいなかった。
【００７４】
精製した組換えPDGF-D-GFDタンパク質(増殖因子ドメインのみをコードするDNAを発現させることによって生産される)を使用する標準曲線に基づいて、zvegf4-sc-GFD CMの活性は大まかに０．３μg/mlのPDGF-D-GFDに同等であった。このことは、ウェスタンブロッティングによって特定した場合の、CMにおけるこのタンパク質の濃度に相関関係があった。単鎖GFD二量体は生物学的に活性があり且つその活性(重量/重量)はPDGF-D-GFDに匹敵していた。
【００７５】
実施例５
ヒトzvegf4-sc-GFDのポリヌクレオチド配列を調製した。２つのzvegf4 cDNA断片をPCRによって鋳型zVegf4[GFD]-FL2-TCS-zVegf[GFD]/pZBV37L（実施例１）から単離した。第一断片について、２つのプライマーを使用し単鎖分子の最初の半分：（１）プライマーzc40,105（配列番号：１７）（zvegf4配列のアミノ末端に対応する４１bp及び２５bpのベクターフランキング配列を含む）；及び（２）プライマーzc40,369（配列番号：１８）（zvegf4鋳型に対して１００％の内部相同性を含み、断片２に対して３０bpの相同性を有する）を使用した。第二の断片をプライマーzc40,368（配列番号：１９）（zvegf4鋳型に対して１００％の相同性を含み、断片１に対して３０bpの相同性を有する）及びプライマーzc40,106（配列番号：２０）（zvegf4配列のカルボキシル末端に対応する４０bp及び２５bpのベクターフランキング配列を有する）を使用した。PCR反応を９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で１分の２５サイクルに渡り行い、しかる後に４℃で浸潤させた。１００μl PCR反応混合物の各２μlを、分析のための１×TBEバッファーを伴う１．０％アガロースゲル上で泳動し、そしておよそ４００bpの予測されたバンドを確認した。各PCR反応混合物の残り９８μlを、zvegf4-sc-GFDをコードする発現ベクター（pTAP339）の構築において使用するために２００μlの無水エタノールで沈殿させた。
【００７６】
pTAP168を、PCRにより生じたリンカー断片を酵母（サッカロミセス・セレビジアエ）の相同的組換えによりpCZR239のSmaＩ部位に挿入することよって生じさせた。プラスミドpCZR239は、プラスミドpRS316（サッカロミセス・セレビジアエシャトルベクター；Hieter及びSikorski、Genetics、vol.122：pp.19〜27）及びpMAL-c2（New England Biolabs 、Beverly、MA）、MalE（マルトース結合タンパク質をコードする）を駆るtacプロモーターを含んで成る大腸菌発現プラスミドに由来し、その後His標識、トロンビン解裂部位、クローニング部位、及びrrnBターミネーターが続く。プラスミドpCZR239はカナマイシン耐性遺伝子を含み、SmaI部位が破壊されており、そして酵母CEN-ARS及びURA3配列に隣接し、NotIによる消化によってプラスミドからのそれらの除去を促すNotI及びSfiI部位を有する。pCZR239は更に固有のpMAL-c2のマルチクローニング部位を有含む。リンカーを、各１００pmolのオリゴヌクレオチドzc26,109（配列番号：２１）及びzc26,110（配列番号：２２）及びおよそ各５pmolのオリゴヌクレオチドzc26,106（配列番号：２３）及びzc26,113（配列番号：２４）から調製した。これらのオリゴヌクレオチドを、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、そして７２℃で３０秒の１０サイクルに渡るPCR、しかる後の４℃での浸潤によって組み合わせた。このPCR産物を２倍の体積の１００％エタノールによる沈殿によって濃縮させた。沈殿した産物を１０μlの水中で懸濁させ、そして１μlのSmaI-cut pCZR239と、本質的に以下に記載した相同組換えによって組み換えた。プレートを室温で約９６時間に渡り放置し、次いで１つのプレートからのUra+形質転換体を１mlのH2O中で再懸濁させ、そして手早く酵母細胞をペレット化するために回転させた。この細胞ペレットを１mlの溶解バッファー（２％トリトンX-100、１％SDS、１００mM NaCl、１０mMトリス、pH８．０、１mMのEDTA）中で再懸濁させた。５００μlの溶解混合物を、３００μlの酸洗浄済みガラスビーズが入っている遠心管に移し、５００μlのフェノール-クロロホルムを加えた。この管を１分間隔で２又は３回、ボルテックスに掛け、しかる後に、最大速度でマイクロ遠心において回転させた。３００μlの水相を新鮮な管に移し、そしてDNAを６００μlのエタノール（EtOH）で沈澱させ、しかる後に４℃で１０分に渡り遠心した。このDNAペレットを１００μlのH2O中で再懸濁させた。この１μlのDNA懸濁を以下のようにして大腸菌MC1061（Casadbanら、J.Mol.Biol.vol.138：pp.197〜207、1980）中へ形質転換させた。クローンを、各２０pmolのオリゴヌクレオチドzc26,110（配列番号：２２）及びzc26,109（配列番号：２１）及び鋳型として１０μlのLBコロニー混合物を使用するコロニーPCRによってスクリーニングした。この反応を、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、そして７２℃で３０秒の２５サイクルに渡るPCR、しかる後の４℃での浸潤によって行なった。アガロースゲル上で適切なサイズのバンドを示すクローンを配列解析に委ねた。適切な構築体をpTAP168と命名した。
【００７７】
プラスミドpTAP168を、PCRにより生じたリンカー断片を相同的組換えによってpTAP168のSmaI部位へと挿入することによって生じさせた。リンカーを、各１００pmolのオリゴヌクレオチドzc26,110（配列番号：２２）及びzc26,547（配列番号：２５）及びおよそ各５pmolのオリゴヌクレオチドzc27,864（配列番号：２６）及びzc27,865（配列番号：２７）から調製した。これらのオリゴヌクレオチドを、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、そして７２℃で３０秒の１０サイクルに渡るPCR、しかる後の４℃での浸潤によって組み合わせた。PCR産物を２倍の体積の１００％EtOHによる沈殿によって濃縮した。沈殿した産物を１０μlの水中で懸濁させて１μlのSmaI-cut pTAP168と、本質的に以下に記載した相同組換えによって組み換えた。プレートを室温で約９６時間に渡り放置し、次いで１つのプレートからのUra+形質転換体を１mlのH2O中で再懸濁させ、そして手早く酵母細胞をペレット化するために回転させた。この細胞ペレットを１mlの溶解バッファー中で再懸濁させ、そしてDNAを回収して本質的に上記のように大腸菌MC1061中へと形質転換させた。１つのクローンを、各２０pmolのオリゴヌクレオチドzc26,547（配列番号：２５）及びzc26,110（配列番号：２２）を使用する上に開示したPCRによってスクリーニングした。アガロースゲル上で適切なサイズのバンドを示すクローンを配列解析に委ねた。適切な構築体をpTAP168と命名した。
【００７８】
プラスミドpTAP238を、PCRにより生じたリンカーを相同的組換えによってpTAP186のSmaI部位へと挿入することによって生じさせた。リンカーは、各１００pmolのオリゴヌクレオチドzc29,740（配列番号：２８）及びzc29,741（配列番号：２９）及びおよそ各５pmolのオリゴヌクレオチドzc29,737（配列番号：３０）及びzc29,735（配列番号：３１）から調製した。これらのオリゴヌクレオチドを、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、そして７２℃で３０秒の１０サイクルに渡るPCR、しかる後の４℃での浸潤によって組み合わせた。生じるPCR産物を２倍の体積の１００％エタノールによる沈殿によって濃縮した。沈殿した産物を１０μlの水中で再懸濁させて１μlのSmaI-cut pTAP168と、本質的に以下に記載した相同組換えによって組み換えた。酵母細胞を塗布して室温で約７２時間に渡り放置し、次いで１つのプレートからのUra+形質転換体を１mlのH2O中で再懸濁させ、そして手早く酵母細胞をペレット化するために回転させた。この細胞ペレットを０．５mlの溶解バッファー中で再懸濁させた。そしてDNAを回収して本質的に上記のように大腸菌MC1061中へと形質転換させた。クローンを、各２０pmolのオリゴヌクレオチドzc29,740（配列番号：２８）及びzc29,741（配列番号：２９）を使用する上記コロニーPCRによってスクリーニングした。アガロースゲル上で適切なサイズのバンドを示すクローンを配列解析に委ねた。適切な構築体をpTAP238と命名した。
【００７９】
１００μlのコンピテント酵母細胞（S.セレビジアエ）をそれぞれおよそ１μgのヒトzvegf4断片（PCR産物）及び１００ｎgのSmaI-消化pTAP238ベクターを含む混合物１０μlと組み合わせ、そして０．２cmのエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母/DNA混合物を装置（０．７５kV（５kV/cm）、無限Ω、２５μFに設定する）を使用することでエレクトロポレーションし、次いで、６００μlの１．２Mソルビトールをこのキュベットに対して加えた。次いで、酵母を３００μlアリコートで２つのURAD（ウラシルを欠くグルコース含有培地）プレート上に置いて３０℃でインキュベートした。４８時間後、次いで１つのプレートからのUra+形質転換体を１mlのH2O中で再懸濁させ、そして手早く酵母細胞をペレット化するために回転させた。細胞のペレットを１mlの溶解バッファー中で懸濁させた。DNAを上のようにして回収した。DNAペレットを１００μlのH2O中で再懸濁させた。
【００８０】
４０μlのエレクトロコンピテント大腸菌MC1061細胞を１μlの酵母DNAで形質転換させた。この細胞を２．０kV、２５μF及び４００Ωでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、０．６mlのSOC（２％Bacto（登録商標）トリプトン（Difco、Detroit、MI）、０．５％イーストエクストラクト（Difco）、１０mMのNaCl、２．５mMのKCl、１０mMのMgCl2、１０mMのMgSO4、２０mMのグルコース）をこの細胞に対して加えた。細胞を３７℃で１時間に渡り回収し、次いでそれを１アリコートでLB+カナマイシンプレート（LBブロス（Lennox）、１．８％Bacto（登録商標）、Agar（Difco）、３０mg/Lカナマイシン）上に塗布した。
【００８１】
ヒトzvegf4-sc-GFDに関する適切な発現構築体を有する個々のクローンをプラスミドDNAの検査的消化によって同定した。細胞を３０μg/mlのカナマイシンを伴うSuper BrothII（Becton Dickison）中で１晩増殖させた。翌日、細胞を収穫して、そしてプラスミドDNAをスピンカラム（QIAprep（登録商標）Spin Miniprep Kit；Quiagen Inc.,Valencia、CA）を使用することで調製した。次いで、このDNAをNotI及びXbaIで切断した。適切な制限パターンを伴うクローンは消化されたpTAP339であり、そして配列決定した。pTAP339における単鎖zvegf4のポリヌクレオチド配列を配列番号：３２で示している。
【００８２】
１０μlのpTAP339を、３μlの商業上入手可能なバッファー（バッファー３；New EnglandBiolabs）及び１５μlのH2O中３７℃で１時間に渡り２μlのNotIで切断した。７μlの反応混合物を２μlの５×T4DNAリガーゼバッファー（Life Technorogies、Gethersbur、MD）及び１μlのT4DNAリガーゼと組み合わせて、室温で１時間に渡りインキュベートした。１μlのライゲーション混合物を使用して大腸菌系統W3110（ATCC27325）を形質転換させた。細胞を２．０kV、２５μF及び４００Ωでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、０．６mlのSOCをこの細胞に対して加えた。細胞を３７℃で１時間に渡り増殖させ、次いでそれを１アリコートでLB+カナマイシンプレート上に塗布した。
【００８３】
個々のコロニーを回収して増殖させた。プラスミドDNAをスピンカラムを使用して調製した。DNAをPvuII及びHindIII により酵母URA3及びCEN/ARSエレメントの欠如を確認するために検査的に切断した。次いで、このDNAを大腸菌Rosetta（登録商標）コンピテント細胞（pRAREを伴うBL21誘導体；Novagen、Inc.、Madison、WIから入手）へと形質転換させるために入れた。この細胞を３０μg/mlのカナマイシン及び３５μg/mlクロラムフェニコール上に、pRAREの存在が理由で塗布した。
【００８４】
個々のコロニーを採取した。細胞を３０μg/mlのカナマイシン及び３５μg/mlのクロラムフェニコール含むSuper BrothII（Becton Dickison）中で一晩増殖させた。１００μlの一晩培養物を使用して２mlの３０μg/mlのカナマイシン及び３５μg/mlのクロラムフェニコールを含む新鮮Super Broth IIに接種した。培養物を３７℃でおよそ２時間に渡り１５mlコニカルチューブ中で振とうしながら増殖させた。１mlの培養物を１mMのIPTGで誘導した。２.２５時間後、当体積の培養物を、５％βME及び色素伴う２５０μlのThonerバッファー（８M尿素、１００mMのトリスpH７.０、１０％のグリセロール、２mMのEDTA、５％のSDS）と混合した。試料を５分に渡り沸騰させた。２０μlの試料を４％〜１２％PAGEゲル（NOVEX）上にロードした。ゲルを１×MESバッファー中で泳動した。発現をウェスタンブロッティングによって分析した。
【００８５】
NuPAGE４〜１２％ビストリスゲル(Invitrogen)を１×MESバッファーを使用し泳動した。１つのレーン（５μlの培養物及びバッファー）につき２.５μlの培養物をロードした。zvegf4標準（「A447F」と命名した）を２５ng及び５０ngとしてロードした。ゲルを泳動に掛けた後、DNAを、Novex transfer box及びプロトコルによりニトロセルロース膜に移した。次いで、膜を５％ミルク及びTTBS（１６０mMのNaCl、０.１％Tween20、２０mMトリス、pH７.４）中で３０分に渡り遮断した。次いでそれを室温で抗zvegf4モノクローナル抗体（E3501と命名した）（１：５０００希釈物として）とインキュベートした。次いで、ブロットを各５〜１０分に渡り２度TTBS中で洗浄した。洗浄したブロットを室温で１時間に渡りヒツジ抗マウス抗体（Bio-Rad Laboratoies、Hercules、CA）の１：５０００希釈物中でインキュベートした。次いで、ブロットを再度、同条件下でTTBS中で洗浄した。次いで、洗浄したブロットをELC試薬（Amersharm）に曝してフィルムに露出させた。発現は、誘導及び誘導しなかった試料の両方において確認され、おそらくそれはtacプロモーターの、公知になっている漏出（leakiness）によるものだろう。
【配列表】
2005523001000001.app
【国際調査報告】
2005523001.tif 000003
2005523001.tif 000004
2005523001.tif 000005