(57)【要約】  本発明は、シリカ粒子中に蛍光物質を内包した蛍光物質内包シリカナノ粒子において、該シリカナノ粒子の表面が、バルクの屈折率が１．６０以上４．００以下の物質で被覆されていることを特徴とし、長期保存性に優れた蛍光物質内包シリカナノ粒子、それを用いた生体物質標識剤が提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカ粒子中に蛍光物質を内包した蛍光物質内包シリカナノ粒子において、該シリカナノ粒子の表面が、バルクの屈折率が１．６０以上４．００以下の物質で被覆されていることを特徴とする蛍光物質内包シリカナノ粒子。
【請求項２】
前記バルクの屈折率が１．６０以上４．００以下の物質が、バルクの屈折率が１．７６以上２．５８以下の物質であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光物質内包シリカナノ粒子。
【請求項３】
前記バルクの屈折率が１．７６以上２．５８以下の物質が、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウムのうち少なくとも１種であることを特徴とする請求項２に記載の蛍光物質内包シリカナノ粒子。
【請求項４】
前記蛍光物質が有機色素であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の蛍光物質内包シリカナノ粒子。
【請求項５】
前記蛍光物質が量子ドットであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の蛍光物質内包シリカナノ粒子。
【請求項６】
分子標識物質を含有する生体物質標識剤であって、当該分子標識物質と請求項１から５のいずれか一項に記載の蛍光物質内包シリカナノ粒子とが、有機分子を介して結合されていることを特徴とする生体物質標識剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリカ粒子中に蛍光物質を内包した蛍光物質内包シリカナノ粒子及びそれを用いた生体物質標識剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
疾病の診断あるいは病態の把握を目的に、血液などに含まれる特定の生体分子（バイオマーカー）の検出が注目されている。【０００３】
現在生体分子の検出のために抗原抗体反応を利用した免疫分析（イムノアッセイ）が主に用いられている。酵素反応を利用した化学発光法が高感度とされ、現在主流である。しかしながら、生体物質である酵素を用いるため温度管理などを厳密にするなど煩雑な操作が要求され、より簡便なシステムが求められている。【０００４】
その一つとして予め蛍光物質標識された生体物質標識剤を用いる蛍光イムノアッセイ法が知られている。蛍光物質としては、有機色素や、量子ドットを使用することができる。化学発光法に比べ、簡便な操作で行えるものの、用いる蛍光物質の蛍光強度が非常に小さいため、検出感度が十分でなかった。【０００５】
近年より超早期での疾病の診断を行うため、すなわち極微量のバイオマーカーの検出を行うため、より高蛍光強度を有する蛍光物質で標識された生体物質標識剤が求められている。その一つとして蛍光物質を一つのシリカナノ粒子に内包させる技術が開示されている（例えば特許文献１および２参照）。【０００６】
特許文献３には、発光輝度の上昇を目的に、蛍光色素を内包するシリカ粒子をシリカ被覆することが開示されている。また、特許文献４には、連通孔に蛍光色素を内包するシリカ粒子を、シリカで被覆することが記載されている。【０００７】
ところが、本発明者らが特許文献３に開示されている方法によりシリカ被覆した有機色素内包シリカを作製したものを１ヶ月保存の後、蛍光イムノアッセイを行ったところ、検出したいバイオマーカーに結合した標識剤由来の蛍光強度（Ｓ）と検出したいバイオマーカーが存在しない条件で行った場合の蛍光強度（Ｎ）との比（Ｓ／Ｎ比）が小さかった。【０００８】
また、特許文献２に開示されている方法により本発明者らが量子ドット内包シリカを合成し、特許文献３に開示されている方法によりシリカ被覆を有する量子ドット内包シリカを用いた場合も同様であった。【０００９】
これらのことは、公知技術の蛍光物質内包シリカには体外診断薬への応用を考えた場合、長期保存性に課題があることを意味しており、さらなる改善が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０７／０７４７２２号パンフレット
【特許文献２】特開２００３−３２１２２６号公報
【特許文献３】特表２００６−５１４７０８号公報
【特許文献４】特開２００９−１９６８２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、その目的は、長期保存性に優れた蛍光物質内包シリカナノ粒子を提供することである。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の上記目的は、以下の構成により達成される。【００１３】
１．シリカ粒子中に蛍光物質を内包した蛍光物質内包シリカナノ粒子において、該シリカナノ粒子の表面が、バルクの屈折率が１．６０以上４．００以下の物質で被覆されていることを特徴とする蛍光物質内包シリカナノ粒子。【００１４】
２．前記バルクの屈折率が１．６０以上４．００以下の物質が、バルクの屈折率が１．７６以上２．５８以下の物質であることを特徴とする１に記載の蛍光物質内包シリカナノ粒子。【００１５】
３．前記バルクの屈折率が１．７６以上２．５８以下の物質が、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウムのうち少なくとも１種であることを特徴とする２に記載の蛍光物質内包シリカナノ粒子。【００１６】
４．前記蛍光物質が有機色素であることを特徴とする１から３のいずれか１項に記載の蛍光物質内包シリカナノ粒子。【００１７】
５．前記蛍光物質が量子ドットであることを特徴とする１から３のいずれか１項に記載の蛍光物質内包シリカナノ粒子。【００１８】
６．分子標識物質を含有する生体物質標識剤であって、当該分子標識物質と１から５のいずれか一項に記載の蛍光物質内包シリカナノ粒子とが、有機分子を介して結合されていることを特徴とする生体物質標識剤。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、長期保存性に優れた蛍光物質内包シリカナノ粒子を提供することができた。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することができた。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【００２１】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、屈折率が１．６０以上４．００以下の物質で被覆した蛍光物質内包シリカナノ粒子を用いた場合、長期保存の後にも蛍光イムノアッセイ時のＳ／Ｎ比の劣化が飛躍的に改善され、高感度検出が可能となることを見出した。従来法で得られるシリカ被覆した蛍光物質シリカナノ粒子において、内包された蛍光物質が徐々に漏洩しており、それが原因で長期保存後の蛍光イムノアッセイでの検出部位での蛍光強度の低下と、バックグラウンドにおけるノイズの増加により、Ｓ／Ｎ比の小ささにつながっていることがわかった。
【００２２】
詳細な原理は不明であるが、本発明では、被覆に用いたバルクの屈折率が１．６０以上４．００以下の物質は緻密であるため、漏洩した蛍光体が物理的に拡散するのを妨害・遮断し、外部への漏洩を防いだと考えられる。
【００２３】
すなわちバルクの屈折率が１．６０以上４．００以下の物質で被覆した蛍光物質内包シリカナノ粒子、及びそれを用いた生体物質標識剤を得ることができることを見出し、本発明に至った次第である。
【００２４】
本発明の蛍光物質内包シリカナノ粒子は、シリカ粒子中に蛍光物質を内包した蛍光物質内包シリカナノ粒子であって、当該シリカナノ粒子の表面が、バルクの屈折率が１．６０以上４．００以下の物質で被覆されていることを特徴とする。この特徴は、請求項１から請求項５に係る発明に共通する技術的特徴である。
【００２５】
本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、前記バルクの屈折率が１．６０以上４．００以下の物質が、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウムのうち少なくとも１種からなることが好ましい。
【００２６】
また前記蛍光物質が有機色素であることが好ましい。また前記蛍光物質が量子ドットであることが好ましい。
【００２７】
さらに、本発明の蛍光物質内包シリカナノ粒子は、当該シリカナノ粒子と分子標識物質とを有機分子を介して結合させて生体物質標識剤として好適に用いることができる。
【００２８】
以下、本発明とその構成要素、及び発明を実施するための最良の形態について詳細な説明をする。
【００２９】
〔シリカナノ粒子の製造方法〕
例えば、ジャーナルオブコロイドサイエンス  ２６巻、６２ページ（１９６８年）に記載されている、アンモニア水などを用いたアルカリ性条件下でテトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解を行う「ストーバー法」と呼ばれる方法により製造することが好ましい。粒径は、添加する水、エタノール、アルカリ量などについて公知の反応条件を適用することで自在に調整でき、平均粒径３０〜８００ｎｍ程度にできる。また粒径のばらつきを示す変動係数は２０％以下とすることができる。
【００３０】
本発明において、平均粒径とは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
【００３１】
〔蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法および生体物質標識剤の製造方法〕
本発明の蛍光体内包シリカナノ粒子は、公知の方法例えば、非特許文献（ラングミュア８巻、２９２１ページ（１９９２年））に記載されている方法を参考にすることができる。
【００３２】
工程（１）：テトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物と蛍光体を混合する。
【００３３】
工程（２）：エタノールなどの有機溶媒、水および塩基を混合する。
【００３４】
工程（３）：工程（２）で作製した混合液をかくはんしているところに、工程（１）で作製した蛍光物質含有液を添加し、反応を進行させる。
【００３５】
工程（４）：反応混合物から生成した蛍光色素内包シリカナノ粒子を、ろ過もしくは遠心分離により回収する。
【００３６】
工程（５）：工程（４）で得られた蛍光色素内包シリカナノ粒子分散液、に屈折率が１．６０以上４．００以下の物質を与える前駆体を添加し、反応を進行させ被覆する。
【００３７】
工程（６）：工程（５）で得られた屈折率が１．６０以上４．００以下の物質で被覆した蛍光物質内包シリカナノ粒子を分子標識物質と結合させ、生体物質標識剤を得る。
【００３８】
工程（１）で用いられる含ケイ素アルコキシド化合物として、テトラエトキシシラン、テトラメトキシシランといったテトラアルコキシドシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルエトキシシラン、フェニルトリエトキシシランなどのトリアルコキシシランなどをあげることができる。また有機官能基を有する含ケイ素アルコキシド化合物をあげることができる。具体的にはメルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどがあげられる。
【００３９】
含ケイ素アルコキシド化合物は上記の１種もしくは２種以上を併用することもできる。
【００４０】
本発明の蛍光物質内包シリカナノ粒子に用いられる蛍光物質としては、２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜９００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示す態様の蛍光物質であることが好ましい。
【００４１】
蛍光物質としては、有機色素を用いることができる。有機色素としてフルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
【００４２】
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，７，７′−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン  ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を挙げることができる。
【００４３】
上記の色素は、それぞれカルボン酸誘導体あるいは、その活性エステル誘導体として用いてもよい。この場合、含ケイ素アルコキシド化合物としてアミノ基を有するもの、例えばアミノプロピルトリエトキシシランを用いて、カルボン酸または活性エステル基と反応させることもできる。
【００４４】
また蛍光物質として量子ドットを挙げることができる。
【００４５】
本発明に係る量子ドットは、量子閉じ込め（ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）効果に由来する特異な光学特性をもつ、１００ｎｍ以下の粒子径を有する半導体結晶粒子のことを指す。通常は２−１０ｎｍ程度の粒子径で、粒子径を変化させることで、発光波長を制御することができる。
【００４６】
量子ドットとしては、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅに代表されるII−VI族化合物、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓに代表されるIII−Ｖ族化合物、又はＳｉ，Ｇｅに代表されるIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−Ｖ族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。
【００４７】
具体的には、ＣｄＳｅとしてＱｄｏｔ５２５、Ｑｄｏｔ５６５、Ｑｄｏｔ５８５、Ｑｄｏｔ６０５、Ｑｄｏｔ６２５、Ｑｄｏｔ６５５（以上インビトロジェン社製）、ｅＦｌｕｏｒ４９０ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ５２５ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ６０５ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ６２５ＮＣ（以上ノベルサイエンス社製）、ＩｎＧａＰとしてｅＦｌｕｏｒ７００ＮＣ（ノベルサイエンス社製）を挙げることができる。
【００４８】
それぞれ必要に応じて有機ポリマーなどにより表面処理が施されているものを用いてもよい。表面修飾基として例えばアミノ基、カルボキシル基、ポリエチレングリコール基、ペプチド基、ビオチン基、ストレプトアビジンなどがある。
【００４９】
含ケイ素アルコキシド化合物と蛍光体の混合比に制限はないが、充分な蛍光を得るためや、濃度消光をふせぐために、最終的に得られるシリカナノ粒子中に１Ｘ１０−６ｍｏｌ／ｌ以上１Ｘ１０−２ｍｏｌ／ｌ以下になるように混合することが好ましい。
【００５０】
工程（２）で用いられる有機溶媒としては、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で用いられるものであればよく、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが用いられる。１種もしくは２種以上の混合としてもよい。
【００５１】
また工程（２）で用いられる塩基としては、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で用いられるものであればよく、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを用いることができ、それぞれ水溶液として用いてもよい。
【００５２】
含ケイ素アルコキシド化合物としてテトラエトキシシラン、有機溶媒としてエタノール、塩基としてアンモニア水を用いた場合のそれぞれの仕込みモル比を以下にあげる。テトラエトキシシランを１ｍｏｌとした場合、エタノールをａ  ｍｏｌ、水をｒ  ｍｏｌ、アンモニアをｂ  ｍｏｌとすると、ａは２０以上４００以下、ｒは１０以上２００以下、ｂは１０以上４０以下で混合する。具体的には、ジャーナルオブコロイドサイエンス  ２６巻、６２ページ（１９６８年）に記載されている条件を適用することができる。
【００５３】
工程（３）において、反応温度は通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で適用される条件でよく、室温から５０℃の間で行うことができる。
【００５４】
蛍光色素含有液を添加する方法としては、限定されるものはなくシリンジポンプ、滴下ロートなど用いればよい。
【００５５】
工程（３）における反応時間は通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で適用される条件でよく、収率、不溶物形成防止などの面から、１時間以上５０時間以下であることが好ましい。
【００５６】
工程（４）における反応混合物から生成した蛍光物質内包シリカナノ粒子の回収方法は、通常ナノ粒子の回収で行われるろ過、もしくは遠心分離などを用いることができる。回収した蛍光色素内包シリカナノ粒子は必要に応じて、未反応原料などを除くため、有機溶媒もしくは水による洗浄をしてもよい。
【００５７】
〔バルクの屈折率が１．６０以上４．００以下の物質による被覆〕
本発明に係る蛍光物質内包シリカナノ粒子は、バルクの屈折率が１．６０以上４．００以下の物質で被覆されている。バルクの屈折率が１．６０より小さい無機物は、緻密性が低いためか本発明の効果が得られない。バルクの屈折率が４．００より大きいと粒子に内包された蛍光物質から発した蛍光の屈折が大きくなり、光検出器への集光が難しい。バルクの屈折率が１．６０以上３．００以下の範囲の物質で被覆されることが好ましい。
【００５８】
本発明におけるバルクの屈折率は、真空を１とした絶対屈折率をいい、アッベ測定法により測定した値とする。
【００５９】
具体的には、例えば化学大辞典（共立出版社  １９６０年）に記載されている値を適用することができる。
【００６０】
バルクの屈折率が１．６０以上４．００以下の物質としては、例えば、金属酸化物、金属硫酸塩、金属硫化物が好ましく、具体的には酸化アルミニウム（αアルミナ）（屈折率１．７６）、酸化ジルコニウム（屈折率２．２０）二酸化チタン（屈折率２．５８）、硫酸バリウム（屈折率１．６４）、硫化亜鉛（屈折率２．３７）、等が挙げられる。
【００６１】
なかでも低温で合成可能なゾル−ゲル法により作成でき、容易に前駆体が入手可能であることから、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウムが特に好ましい。
【００６２】
無機物による被覆の方法は、公知の方法例えば、シーエムシー出版ゾル−ゲル法のナノテクノロジーへの応用（２００５年）に記載されている方法を参考にすることができる。たとえば酸化アルミニウムの場合、アルミニウムトリｓｅｃ−ブトキシド、酸化チタンの場合、チタンテトライソプロポキシド、酸化ジルコニウムの場合、ジルコニウムテトラｎ−ブトキシドのそれぞれ加水分解反応を適用することができる。
【００６３】
被覆の厚みは特に制限はないが、イムノアッセイ時の沈降防止の観点から、５〜３０ｎｍであることが好ましい。
【００６４】
〔蛍光物質内包シリカナノ粒子と、分子標識物質とを結合する有機分子〕
本発明の生体物質標識剤は、蛍光物質内包シリカナノ粒子と、分子標識物質とが有機分子を介して結合されている。
【００６５】
蛍光物質内包シリカナノ粒子と、分子標識物質とを有機分子を介して結合させるには、例えば蛍光物質内包シリカナノ粒子の表面に結合し、かつ分子標識物質とも結合しうる有機分子を用い、ナノ粒子をこの有機分子で修飾し、修飾されたナノ粒子と分子標識物質を結合させることにより行われる。
【００６６】
上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
【００６７】
蛍光物質内包シリカナノ粒子の表面に結合し、分子標識物質とも結合しうる有機分子として、例えば無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。
【００６８】
このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどがあげられる。
【００６９】
また、生体物質との非特異的吸着を抑制するためポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ  ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）を用いることができる。
【００７０】
シランカップリング剤を用いる場合、２種以上を併用してもよい。
【００７１】
蛍光物質内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた蛍光色素内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離またはろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光物質内包シリカナノ粒子を得ることができる。
【００７２】
〔生体物質標識剤〕
本発明に係る生体物質標識剤は、上述した蛍光物質内包シリカナノ粒子と、分子標識物質とを有機分子を介して結合させて得られる。
【００７３】
本発明に係る生体物質標識剤は分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応することにより、生体物質の標識が可能となる。
【００７４】
当該分子標識物質としては例えば、ヌクレオチド鎖を有する化合物、タンパク質、抗体等が挙げられる。
【００７５】
具体例として、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光物質内包シリカナノ粒子のアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を量子ドット内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）のような縮合剤を用いることもできる。
【００７６】
また、有機分子修飾された蛍光物質内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例としてアミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光物質内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した蛍光物質内包シリカナノ粒子ができる。
【実施例】
【００７７】
以下、内包する蛍光物質として有機色素の場合テトラメチルローダミンを、量子ドットの場合ＣｄＳｅを用いた実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において「部」あるいは「％」の表示を用いるが、特に断りがない限り「質量部」あるいは「質量％」を表す。【００７８】
《蛍光物質内包シリカナノ粒子》
〔シリカナノ粒子１の調製〕
（シリカナノ粒子１：テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子）
特許文献１にならい下記工程（１）〜（４）の方法により、シリカナノ粒子１を作製した。【００７９】
工程（１）テトラメチルローダミン（インビトロジェン社製ＴＡＭＲＡ−ＳＥ）２ｍｇとテトラエトキシシラン４０μｌを混合した。【００８０】
工程（２）エタノール４ｍｌ、１４％アンモニア水１ｍｌを混合した。【００８１】
工程（３）工程２で作製した混合液を室温下かくはんしているところに、工程（１）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間かくはんを行った。【００８２】
工程（４）反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。【００８３】
得られたシリカナノ粒子１のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１１０ｎｍ、変動係数は１２％であった。【００８４】
〔シリカナノ粒子２の調製〕
（シリカナノ粒子２：ＣｄＳｅ内包シリカナノ粒子）
特許文献２にならい下記工程（１）〜（４）の方法により、シリカナノ粒子２を作製した。【００８５】
工程（１）ＣｄＳｅデカン分散液（インビトロジェン社Ｑｄｏｔ６５５）１０μｌとテトラエトキシシラン４０μｌを混合した。【００８６】
工程（２）エタノール４ｍｌ、１４％アンモニア水１ｍｌを混合した。【００８７】
工程（３）工程２で作製した混合液を室温下かくはんしているところに、工程（１）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間かくはんを行った。【００８８】
工程（４）反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。【００８９】
得られたシリカナノ粒子２のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１３０ｎｍ、変動係数は１３％であった。【００９０】
〔シリカナノ粒子３の調製〕
（シリカナノ粒子３：酸化チタン被覆したテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子）
シリカナノ粒子１の調製で得られたシリカナノ粒子１の水分散液１ｍｌを純水５ｍｌに分散させた。得られた分散液に、チタンテトライソプロポキシド１０μｌ、２８％アンモニア水１０μｌを混合し、室温で１２時間かくはんした。【００９１】
反応混合物を１００００ｇで１０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行い、シリカナノ粒子３を得た。【００９２】
〔シリカナノ粒子４の調製〕
（シリカナノ粒子４：酸化ジルコニウム被覆したテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子）
チタンテトライソプロポキシドの代わりにジルコニウムテトラｎ−ブトキシドを用いた他は、シリカナノ粒子３の調製と同様の手順により、シリカナノ粒子４を得た。【００９３】
〔シリカナノ粒子５の調製〕
（シリカナノ粒子５：酸化チタン被覆したＣｄＳｅ内包シリカナノ粒子）
シリカナノ粒子１の代わりに、シリカナノ粒子２の調製で得られたシリカナノ粒子２を用いた他はシリカナノ粒子３の調製と同様の手順により、シリカナノ粒子５を得た。【００９４】
〔シリカナノ粒子６の調製〕
（シリカナノ粒子６：酸化アルミニウム被覆したＣｄＳｅ内包シリカナノ粒子）
シリカナノ粒子１の代わりに、シリカナノ粒子２の調製で得られたシリカナノ粒子２を用い、及びチタンテトライソプロポキシドの代わりにアルミニウムトリｓｅｃ−ブトキシドを用いた他はシリカナノ粒子３の調製と同様の手順により、シリカナノ粒子６を得た。【００９５】
〔シリカナノ粒子７の調製〕
（シリカナノ粒子７：硫化亜鉛被覆したＣｄＳｅ内包シリカナノ粒子）
シリカナノ粒子２の調製で得られたシリカナノ粒子２の水分散液１ｍｌに対し、１モル／リットル酢酸亜鉛水溶液１００μＬおよび、１モル／リットル硫化ナトリウムエタノール分散液１００μｌを順に添加、室温で２４時間撹拌、反応させた。【００９６】
反応混合物を１００００ｇで１０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行い、シリカナノ粒子７を得た。【００９７】
〔シリカナノ粒子８の調製〕
（シリカナノ粒子８：シリカ被覆したテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子）
シリカナノ粒子１の調製で得られたシリカナノ粒子１に対し、特許文献４にならい、テトラエトキシシランを用いてシリカ被覆して、シリカナノ粒子８を得た。【００９８】
〔シリカナノ粒子９の調製〕
（シリカナノ粒子９：シリカ被覆したＣｄＳｅ内包シリカナノ粒子）
シリカナノ粒子２の調製で得られたシリカナノ粒子２の水分散を用い、シリカナノ粒子８の調製と同様の操作でシリカ被覆して、シリカナノ粒子９を得た。【００９９】
得られた無機物被覆された蛍光物質内包シリカの１ｎＭＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）分散液をそれぞれ調製し、１ヶ月室温にて保存した。分散液１ｍｌを容量１．５ｍｌのポリプロピレン製チューブにいれた。１２０００ｇで２０分遠心分離し、上澄み液０．９ｍｌを採取した。採取した上澄み液の蛍光強度を測定した。【０１００】
漏洩蛍光物質量は、テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子は、シリカナノ粒子１の蛍光強度を、ＣｄＳｅ内包シリカナノ粒子は、シリカナノ粒子２の蛍光強度をそれぞれ１．０としたときの、相対値として評価した。この値が低い場合、溶液への蛍光物質の漏洩が少なく、保存安定性が優れている。評価結果を表１〜２に示す。【０１０１】
【表１】
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【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
表１及び２から、バルクの屈折率が１．４５であるシリカで被覆した公知技術のものの１ヶ月保存後の漏洩蛍光物質量は、被覆なしと同等であったのに対し、本発明のバルクの屈折率が１．６０以上４．００以下の無機物で被覆した場合、大きく低減していることがわかる。このことは、屈折率１．６０以上４．００以下の無機物が蛍光物質を吸着して、漏洩を防いでいると考えられる。【０１０４】
《生体物質標識剤》
シリカナノ粒子３、８及び１を用い、分子修飾シリカナノ粒子Ａ、Ｂ及びＣを各々調製し、更にこれを用いて生体物質標識剤１、２及び３を調製して、生体物質標識剤の長期保存性を評価した。【０１０５】
〔分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製〕
（分子修飾シリカナノ粒子Ａ：アミノ基修飾した酸化チタン被覆したテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子）
シリカナノ粒子３の調製で得られた酸化チタン被覆したテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子３の１ｍｇを純水５ｍｌに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液１００μＬを添加し、室温で１２時間かくはんした。【０１０６】
反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を行った。【０１０７】
得られたアミノ基修飾した酸化チタン被覆テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。【０１０８】
〔分子修飾シリカナノ粒子Ｂの調製〕
（分子修飾シリカナノ粒子Ｂ：アミノ基修飾したシリカ被覆したテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子）
シリカナノ粒子８の調製で得られたシリカ被覆したテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子について、分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製と同様の手順で、アミノ基修飾を行った。【０１０９】
得られたアミノ基修飾したシリカ被覆テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。【０１１０】
〔分子修飾シリカナノ粒子Ｃの調製〕
（分子修飾シリカナノ粒子Ｃ：アミノ基修飾した被覆なしテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子）
シリカナノ粒子１の調製で得られた被覆前のテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子について、分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製と同様の手順で、アミノ基修飾を行った。【０１１１】
得られたアミノ基修飾した被覆なしテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。【０１１２】
〔生体物質標識剤１の調製〕
（生体物質標識剤１：アミノ基修飾酸化チタン被覆テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子への抗体結合体）
分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製で得られたアミノ基修飾酸化チタン被覆テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子０．５ｍｇを純水０．５ｍｌに分散させたもの０．１ｍｌをＤＭＳＯ２ｍｌに添加した。そこへ、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）をいれ１時間反応させた。過剰のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣなどを遠心分離により除去する、一方で、抗ｈＣＧ抗体を１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去した。【０１１３】
ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ処理したテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子と、ＤＴＴ処理した抗ｈＣＧ抗体を混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。ゲルろ過カラムにより未反応物を除去し、抗ｈＣＧ抗体が結合したスルホン酸基を有する酸化チタン被覆テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子（生体物質標識剤１）を得た。【０１１４】
〔生体物質標識剤２の調製〕
（生体物質標識剤２：アミノ基修飾シリカ被覆テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子への抗体結合体）
分子修飾シリカナノ粒子Ｂの調製で得られたアミノ基修飾シリカ被覆テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子について、生体物質標識剤１の調製と同様の手順で、抗ｈＣＧ抗体が結合したシリカ被覆テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子（生体物質標識剤２）を得た。【０１１５】
〔生体物質標識剤３の調製〕
（生体物質標識剤３：アミノ基修飾被覆なしテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子への抗体結合体）
分子修飾シリカナノ粒子Ｃの調製で得られたアミノ基修飾被覆なしテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子について、生体物質標識剤１の調製と同様の手順で、抗ｈＣＧ抗体が結合した被覆なしテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子（生体物質標識剤３）を得た。【０１１６】
生体物質標識剤１の調製で得られた抗ｈＣＧ抗体が結合した酸化チタン被覆テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子を０．１ｎＭの濃度でガラスバイアル瓶を用い、リン酸緩衝生理食塩水中、１ヶ月４℃にて保存した後にイムノアッセイを下記の手順で行った。
１）マイクロプレート上ウェル内にアンチ−ｈαサブニットを固定化する。
２）抗原であるｈＣＧを各ウェルに濃度を変えて入れる。
３）過剰のｈＣＧを洗浄により除去後、各ウェルに生体物質標識剤１分散液を入れる。
４）過剰の生体物質標識剤１を洗浄により除去する。
５）マイクロプレートリーダーにより各ウェルの蛍光強度を測定する。【０１１７】
抗原濃度に応じて蛍光強度が上昇した。すなわち、本発明で得られたテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子に結合した抗ｈＣＧ抗体は、抗原認識能を損なっていないことが言える。【０１１８】
同様のイムノアッセイを、抗ｈＣＧ抗体が結合したシリカ被覆テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子（生体物質標識剤２）および抗ｈＣＧ抗体が結合した被覆なしテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子（生体物質標識剤３）を、１ヶ月４℃にて保存後に用いて行った。保存前の蛍光強度は生体物質標識剤１と各々ほぼ同等であった。【０１１９】
長期保存性の評価はＳ／Ｎ比の測定で行った。Ｓ／Ｎ比が高い場合は長期保存性が優れていることを示す。【０１２０】
ｈＣＧ抗体が存在しない条件で行った場合の蛍光強度（Ｎ）と、ｈＣＧ抗体１ｎｇ／ｍｌ添加したときの蛍光強度（Ｓ）の比（Ｓ／Ｎ比）を、表３に示す。【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
表３から、本発明で得られた酸化チタン被覆テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子は、１ヶ月保存後に行った蛍光イムノアッセイ時のＳ／Ｎ比が、公知技術で得られたものと比べ格段に大きいことがわかる。すなわち、この結果により、本発明により長期保存後も高感度検出が可能で長期保存性にすぐれた生体物質標識剤を提供することができることが分かる。
【国際調査報告】
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