(57)【要約】本発明は、アッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）由来の新規ポリヌクレオチド、それにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する発現カセットおよびベクター、それらにより形質転換された微生物、該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、ならびに細胞壁または細胞骨格の構築をモジュレートするための、特にアッシビヤ（Ashbya）属の微生物におけるビタミンB2産生を改善するための、標的としての新規ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁および／または細胞骨格の構築に関連しているタンパク質をコードし、アッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）から単離されうるポリヌクレオチド。
【請求項２】
細胞壁および／または細胞骨格の構築に関連しており、表1に示す構造的および／または機能的特性を有する、請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
好ましくはアッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）から単離されうる、配列番号1、8、12、17、21、26、30または36に示す核酸配列、それに相補的なポリヌクレオチド、または遺伝暗号の縮重により該ポリヌクレオチドから誘導される配列を含んでなる、請求項1または2記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号4、10、15、19、23、28、34もしくは38に示す核酸配列またはその断片を含む、請求項3記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか1項記載のポリヌクレオチドに、特にストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項5記載のオリゴヌクレオチドに、特にストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズし、かつアッシビヤ（Ashbya）属微生物に由来する遺伝子産物またはこの遺伝子産物の機能的等価体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項1〜4のいずれか1項記載の核酸配列を含むポリヌクレオチドもしくはその断片により、または請求項6記載のポリヌクレオチドによりコードされるか、あるいは配列番号2、3、5、6、7、9、11、13、14、16、18、20、22、24、25、27、29、31、32、33、35、37または配列番号39に示す少なくとも10個の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその機能的等価体、特に請求項2に記載する特性を有する機能的等価体。
【請求項８】
少なくとも1つの調節核酸配列に機能しうる形で連結された請求項1〜6のいずれか1項記載の核酸配列を含んでなる発現カセット。
【請求項９】
請求項8記載の少なくとも1つの発現カセットを含んでなる組換えベクター。
【請求項１０】
請求項9記載の少なくとも1つのベクターで形質転換された原核または真核細胞宿主。
【請求項１１】
請求項7記載のポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子の機能的発現がモジュレートされているか、あるいは請求項7記載のポリペプチドの生物活性が低下または増加している原核または真核細胞宿主。
【請求項１２】
アッシビヤ（Ashbya）属由来である、請求項10または11記載の宿主。
【請求項１３】
ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の微生物による製造のための、請求項8記載の発現カセット、請求項9記載のベクターまたは請求項10〜12のいずれか1項記載の宿主の使用。
【請求項１４】
請求項7記載のポリペプチドの組換え製造のための、請求項8記載の発現カセット、請求項9記載のベクターまたは請求項10〜12のいずれか1項記載の宿主の使用。
【請求項１５】
ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の微生物による産生をモジュレートするエフェクター標的を検出するための方法であって、ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体を産生しうる微生物を、請求項7記載のポリペプチドまたはそれをコードする核酸配列から選ばれる標的と相互作用する、特に結合するエフェクターで処理し、微生物により産生されたビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の量に及ぼす該エフェクターの影響を確認し、適当な場合には、該標的を単離することを含んでなる方法。
【請求項１６】
ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の微生物による産生をモジュレートするための方法であって、ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体を産生しうる微生物を、請求項7記載のポリペプチドまたはそれをコードする核酸配列から選ばれる標的と相互作用するエフェクターで処理することを含んでなる方法。
【請求項１７】
請求項7記載のポリペプチドまたはそれをコードする核酸配列から選ばれる標的に対するエフェクターであって、
a）抗体またはその抗原結合性フラグメント、
b）請求項7記載のポリペプチドと相互作用する、a）とは異なるポリペプチドリガンド、
c）請求項7記載のポリペプチドの生物活性をモジュレートする低分子量エフェクター、
d）アンチセンス核酸配列、
から選ばれるエフェクター。
【請求項１８】
ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の微生物による製造方法であって、請求項10〜12のいずれか1項記載の宿主を、ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の産生に好適な条件下で培養し、1以上の所望の産物を培養混合物から単離することを含んでなる方法。
【請求項１９】
その培養の前および／または培養中に、請求項17記載のエフェクターで該宿主を処理する、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主がアッシビヤ（Ashbya）属の微生物から選ばれる、請求項18または19記載の方法。
【請求項２１】
前記微生物が請求項10〜12のいずれか1項記載の宿主である、請求項18〜20のいずれか1項記載の方法。
【請求項２２】
アッシビヤ（Ashbya）属の微生物におけるビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の産生をモジュレートするための標的としての、請求項1〜4および6のいずれか1項記載のポリヌクレオチドまたは請求項7記載のポリペプチドの使用。
【請求項２３】
ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の微生物による製造のための培養中のアッシビヤ（Ashbya）属の微生物における細胞壁および／または細胞骨格の構築をモジュレートするための標的としての、請求項1〜4および6のいずれか1項記載のポリヌクレオチドまたは請求項7記載のポリペプチドの使用。
【請求項２４】
改変された細胞壁および／または細胞骨格の構築を有する、請求項12記載の宿主。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）由来の新規ポリヌクレオチド、それにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含む発現カセットおよびベクター、それらにより形質転換された微生物、これらのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、ならびに細胞壁または細胞骨格の特性をモジュレートするための、特にアッシビヤ（Ashbya）属の微生物におけるビタミンB2産生を改善するための、標的としての該新規ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンB2（リボフラビン、ラクトフラビン）は、溶液中で黄緑色の蛍光を示すアルカリ感受性および光感受性のビタミンである。ビタミンB2の欠乏は、外胚葉損傷、特に白内障、角膜炎、角膜血管新生または自律神経および泌尿性器障害を引き起こしうる。ビタミンB2は、NAD+およびNADP+と共に水素転移に生物学上重要な分子であるFADおよびFMNの前駆体である。それらは、ビタミンB2からリン酸化（FMN）とそれに続くアデニル化（FAD）により形成される。
【０００３】
ビタミンB2は、植物、酵母および多数の微生物においてGTPとリブロース5-リン酸から合成される。その反応経路は、GTPのイミダゾール環の開裂およびリン酸残基の除去から始まる。脱アミノ化、還元および残存リン酸の除去により、5-アミノ-6-リビチルアミノ-2,4-ピリミジノンが生じる。この化合物と3,4-ジヒドロキシ-2-ブタノン 4リン酸との反応により、二環分子6,7-ジメチル-8-リビチルルマジンが生じる。この化合物は、4炭素単位が転移する不均化により、三環化合物であるリボフラビンに変換される。
【０００４】
ビタミンB2は、多くの野菜および肉類に含まれており、それより少量ではあるが穀物にも存在する。成人の1日ビタミンB2必要量は約1.4〜2 mgである。ヒトにおける補酵素FMNおよびFADの主要分解産物はリボフラビンであり、これはそのまま排泄される。
【０００５】
このように、ビタミンB2はヒトおよび動物にとって重要な食餌物質である。したがって、工業的規模でビタミンB2を入手可能にするための努力がなされている。こうして、微生物経路によりビタミンB2を合成することが提案されている。この目的に使用しうる微生物としては、例えば、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、子嚢菌エレモテシウム・アッシビー（Eremothecium ashbyii）、アッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）ならびに酵母カンジダ・フラレリ（Candida flareri）およびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。この目的に使用する栄養培地は、炭素源としての糖蜜または植物油、無機塩、アミノ酸、動物または植物ペプトンおよびタンパク質、ならびにビタミン添加物を含む。無菌好気的液内法においては、培養ブロス 1リットル当たり10gを超える収量のビタミンB2が数日のうちに得られる。必要条件としては、培養の際の良好な通気、注意深い撹拌および約30℃以下の温度設定が挙げられる。バイオマスの取り出し、蒸発、濃縮物の乾燥により、ビタミンB2が富化された産物が得られる。
【０００６】
ビタミンB2の微生物による製造は、例えば、WO-A-92/01060、EP-A-0 405 370およびEP-A-0 531 708に記載されている。
【０００７】
ビタミンB2の重要性、存在、製造、生合成および用途の概説は、例えば、Ullmann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry, volume A27, p.521以降に記載されている。
【０００８】
真核細胞の細胞壁と細胞骨格は、特に外部および内部構造を維持する働きをしている。これらの構成要素の機能はテントをおおう布やテント棒の役目に匹敵する。しかし、生存細胞の構造骨組は堅いものではなく、柔軟性があり、必要に応じて成長や環境条件に適応しうるため、その構築および組成は、温度やpHなどの外的要因だけでなく、細胞のATP含量やイオン濃度といった内的要因によっても影響される。
【０００９】
真菌の細胞壁は、真菌の成長、発達において、または環境もしくは他の細胞との相互作用において、極めて重要な役割を担っている。その主要な機能は、保護すること、すなわち、浸透圧、化学的または生物学的損傷から細胞を保護することである。しかし、細胞壁は形態的応答、抗原発現、接着および細胞-細胞相互作用にも関与している。真菌の細胞壁は種々の重合体の混合物で構成されている。これに関しては、2つのカテゴリーに分けられる。第一に、その構造体の堅さに関係している、いわゆる構造重合体と、第二に、埋め込まれていて、圧力に対する抵抗を保証しているマトリックス重合体である。ほとんどの真菌において、細胞壁の最も重要な構成成分はキチン、グルカン類およびマンノプロテイン類である。これらのうち、構造機能を有するものはキチンとグルカン類である。細胞壁の合成は、いろいろな段階で個々の構成成分を組み合わせることにより行われる。初期には、細胞内または原形質膜／壁境界層において個々の構成成分を合成する必要がある。全ての重合体が拡張しつつある壁の中に分泌された後で、それらは最初は、分子相互作用によりゆるい集合体を形成し、その後共有結合でしっかりと連結される。
【００１０】
これに対して、細胞骨格は、種々の分子を介して他の細胞構造体に連結している繊維状重合体の協調した網状構造体である。この網状構造体の構成および特性は、正確な発生依存的および機能的な制御を受けている。細胞骨格を構成している主な要素は、アクチンフィラメント（Fアクチン）、微小管および中間径フィラメントである。サイトゾルは、均一な溶液とよりも、高度に組織化されたゲルに匹敵するとされており、そのゲルの組成は細胞の異なる領域で著しい相違を示しうる。この構造化において、さらには、細胞分裂および細胞小器官の輸送においても、細胞骨格は重要な役割を果たしている。これに関して、それは比喩的な意味で鉄道線路の働きをしており、この線路に沿って様々な細胞成分がダイニンやキネシンなどの細胞モーターによって移動する。
【００１１】
細胞骨格の構築は、細胞壁の構造と違って、共有結合の形成を特徴とするものではない。細胞骨格は、相当に大きな柔軟性をもつ必要があるため、微小管の場合のように、「動的不安定性」により特徴づけられる。チューブリンサブユニットはGTPの助けをかりて重合する。しかし、GTPは細胞内の生理的条件下でGDP+Piに分解する性質があるので、微小管の構造も弱体化する。したがって、引き続き再度分解するためには、それらは絶えず合成されねばならない。微小管結合タンパク質（MAP）は、細胞が微小管のより大きなまたは制御可能な安定化を達成することを可能にする。リン酸化の程度に応じて、MAPは微小管に対して高いまたは低い親和性を有し、こうして、微小管に制御可能な安定化効果を与える。
【００１２】
アクチンからのミクロフィラメントの重合およびこれらの重合体の細胞内での安定性の調節は、チューブリンのそれと同様に生じる。一方、重合の過程はATPによってスピードアップされる。ミクロフィラメントの形成と分解にはアクチン結合タンパク質が影響しており、該タンパク質は、プロフィリンの場合と同様に、アクチン重合を妨げることさえある。
【００１３】
真菌の形態の発生特異的または環境関連的変化の際、例えば、出芽または子実体や仮性菌糸の発生の際には、細胞壁の合成と細胞骨格の構築の双方において、きわめて正確な時間的および空間的調節を受ける広範な再構成が生じる。細胞の基本的な構造骨組は、細胞の安定性および小胞輸送にとって本質的に重要であり、バイオマス生産のための基礎的な必要条件となっている。
【００１４】
細胞壁の構築および細胞骨格の構成のより詳細な説明に関しては、Wessels, J.G.H. (1990), Role of cell wall architecture in fungal tip growth generation. In: Heath I.B. (編) Tip growth in plant and fungal cells. Academic Press, San Diego, pp 1-29; Heath I.B. および Heath M.C. (1978), Microtubules and organelle movement in the rust fungus Uromyces phaseoli var. Vignae. Cytobiologie 16: 393-411; McConnel S.J., Yaffe M.P. (1993), Intermediate filament formation by a yeast protein essential for organelle inheritance. Science 260: 687-689; Esser K. および Lemke P.A. (編) The Mycota - A comprehensive Treatise on fungi as experimental systems for basic and applied research. Springer-Verlag, Berlin; Voet D. および Voet J.G. (編) Biochemie. VCH, Weinheim、ならびにこれらの引用文献のそれぞれに含まれる参考文献を参照されたい。
【００１５】
改変された細胞骨格または改変された細胞壁、例えば、それと関連して外的作用に対し改変された（より大きい）抵抗、を有する微生物（好ましくは、アッシビヤ（Ashbya）属、特にアッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）株の微生物）を作製するために細胞壁および／または細胞骨格の合成と関連した遺伝子を利用することは、これまでに記載されたことがない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の1つの目的は、アッシビヤ（Ashbya）属の微生物、特にアッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）における細胞壁および細胞骨格の特性に影響を及ぼす新規標的を提供することである。特に、この目的は、そのような微生物における細胞の安定性を改善することである。もう1つの目的は、そのような微生物によるビタミンB2の産生を改善することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、ビタミンB2の産生中にアッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）においてアップレギュレーションされるコード化核酸配列（特に、以下に列挙するもの）を提供することによりこの目的が達成されることを見出した（実験の部に詳しく記載されるMPSS分析法を用いて見出された結果に基づくものである）：
a）細胞壁前駆体タンパク質の機能を有するタンパク質をコードする、好ましくはアップレギュレーションされる核酸配列。
【００１８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、本発明の核酸配列の特徴的な部分配列をコードし、内部名称「オリゴ8」を有するDNAクローンが単離されている。
【００１９】
本発明のこの態様のもう1つの好ましい実施形態においては、本発明の核酸の完全配列をコードし、内部名称「オリゴ8v」を有するDNAクローンが本発明により単離されている。
【００２０】
本発明の1つの態様は、配列番号1に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。本発明のもう1つの態様は、配列番号4に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片に関する。該ポリヌクレオチドは、好ましくは、アッシビヤ（Ashbya）属の微生物、特にアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）から単離することができる。本発明はまた、それらに相補的なポリヌクレオチド、および遺伝暗号の縮重によりこれらのポリヌクレオチドから誘導される配列に関する。
【００２１】
「オリゴ8」および「オリゴ8v」のインサートは、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「Cwp1」との有意な相同性を有する。該インサートは、配列番号1または配列番号4に示す核酸配列を有する。配列番号1の相補鎖から又は配列番号4に示すコード鎖から誘導されるアミノ酸配列またはアミノ酸部分配列は、Shimoni Hら, J. Biochem. 118: 302-311 (1995)に記載されるサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来の細胞壁前駆体タンパク質Cwp1との有意な配列相同性を有する。
【００２２】
b）セリン-トレオニンキナーゼの機能を有するタンパク質をコードする、好ましくはアップレギュレーションされる核酸配列。
【００２３】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、本発明の核酸配列の特徴的な部分配列をコードし、内部名称「オリゴ25/39」を有するDNAクローンが単離されている。
【００２４】
もう1つの好ましい実施形態においては、本発明の核酸の完全配列をコードし、内部名称「オリゴ25/39v」を有するDNAクローンが本発明により単離されている。
【００２５】
本発明の1つの態様は、配列番号8に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。本発明のもう1つの態様は、配列番号10に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片に関する。該ポリヌクレオチドは、好ましくは、アッシビヤ（Ashbya）属の微生物、特にアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）から単離することができる。本発明はまた、それらに相補的なポリヌクレオチド、および遺伝暗号の縮重によりこれらのポリヌクレオチドから誘導される配列に関する。
【００２６】
「オリゴ25/39」および「オリゴ25/39v」のインサートは、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「ARK1」との有意な相同性を有する。該インサートは、配列番号8または配列番号10に示す核酸配列を有する。配列番号8の対応相補鎖から又は配列番号10に示すコード鎖から誘導されるアミノ酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のセリン-トレオニンプロテインキナーゼとの有意な配列相同性を有する。
【００２７】
c）GTPアーゼ活性化タンパク質の機能を有するタンパク質をコードする、好ましくはアップレギュレーションされる核酸配列。
【００２８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、本発明の核酸配列の特徴的な部分配列をコードし、内部名称「オリゴ46」を有するDNAクローンが単離されている。
【００２９】
もう1つの好ましい実施形態においては、本発明の核酸の完全配列をコードし、内部名称「オリゴ46v」を有するDNAクローンが本発明により単離されている。
【００３０】
本発明の1つの態様は、配列番号12に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。本発明のもう1つの態様は、配列番号15に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片に関する。該ポリヌクレオチドは、好ましくは、アッシビヤ（Ashbya）属の微生物、特にアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）から単離することができる。本発明はまた、それらに相補的なポリヌクレオチド、および遺伝暗号の縮重によりこれらのポリヌクレオチドから誘導される配列に関する。
【００３１】
「オリゴ46」および「オリゴ46v」のインサートは、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「BUD2/CLA2」との有意な相同性を有する。該インサートは、配列番号12または配列番号15に示す核酸配列を有する。配列番号12の対応相補鎖からまたは配列番号15に示すコード鎖から誘導されるアミノ酸配列またはアミノ酸部分配列は、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のGTPアーゼ活性化タンパク質との有意な配列相同性を有し、特に、Park H.-O.ら, Nature 365: 269-274 (1993)に記載されるBUD2/Rsr1に対するBUD2コード化GTPアーゼ活性化タンパク質との相同性を有する。
【００３２】
d）アクチンの過剰発現に対する耐性の機能を有するタンパク質をコードする、好ましくはアップレギュレーションされる核酸配列。
【００３３】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、本発明の核酸配列の特徴的な部分配列をコードし、内部名称「オリゴ103」を有するcDNAクローンが単離されている。
【００３４】
もう1つの好ましい実施形態においては、本発明の核酸の完全配列をコードし、内部名称「オリゴ103v」を有するcDNAクローンが本発明により単離されている。
【００３５】
本発明の1つの態様は、配列番号17に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。本発明のもう1つの態様は、配列番号19に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片に関する。該ポリヌクレオチドは、好ましくは、アッシビヤ（Ashbya）属の微生物、特にアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）から単離することができる。本発明はまた、それらに相補的なポリヌクレオチド、および遺伝暗号の縮重によりこれらのポリヌクレオチドから誘導される配列に関する。
【００３６】
「オリゴ103」および「オリゴ103v」のインサートは、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「Aor1」との有意な相同性を有する。該インサートは、配列番号17または配列番号19に示す核酸配列を有する。配列番号17の対応相補鎖からまたは配列番号19に示すコード鎖から誘導されるアミノ酸配列またはアミノ酸部分配列は、アクチンの過剰発現に対して耐性を有するまたはこの耐性に寄与するサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のタンパク質との有意な配列相同性を有する。
【００３７】
e）Nuf1p様タンパク質の機能を有するタンパク質をコードする、好ましくはダウンレギュレーションされる核酸配列。
【００３８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、本発明の核酸配列の特徴的な部分配列をコードし、内部名称「オリゴ128」を有するDNAクローンが単離されている。
【００３９】
もう1つの好ましい実施形態においては、本発明の核酸配列の完全配列をコードし、内部名称「オリゴ128v」を有するDNAクローンが本発明により単離されている。
【００４０】
本発明の1つの態様は、配列番号21に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。本発明のもう1つの態様は、配列番号23に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片に関する。該ポリヌクレオチドは、好ましくは、アッシビヤ（Ashbya）属の微生物、特にアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）から単離することができる。本発明はまた、それらに相補的なポリヌクレオチド、および遺伝暗号の縮重によりこれらのポリヌクレオチドから誘導される配列に関する。
【００４１】
「オリゴ128」および「オリゴ128v」のインサートは、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「Ykl179c」との有意な相同性を有する。該インサートは、配列番号21または配列番号23に示す核酸配列を有する。該コード鎖から誘導されるアミノ酸配列またはアミノ酸部分配列は、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のNuf1p様タンパク質との有意な配列相同性を有する(Wiemann Sら, Yeast 9: 1343-1348 (1993)を参照されたい)。
【００４２】
f）カルポニンまたはカルポニン相同タンパク質の機能を有するタンパク質をコードする、好ましくはアップレギュレーションされる核酸配列。
【００４３】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、本発明の核酸配列の特徴的な部分配列をコードし、内部名称「オリゴ150」を有するcDNAクローンが単離されている。
【００４４】
もう1つの好ましい実施形態においては、本発明の核酸の完全配列をコードし、内部名称「オリゴ150v」を有するDNAクローンが本発明により単離されている。
【００４５】
本発明の1つの態様は、配列番号26に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。本発明のもう1つの態様は、配列番号28に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片に関する。該ポリヌクレオチドは、好ましくは、アッシビヤ（Ashbya）属の微生物、特にアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）から単離することができる。本発明はまた、それらに相補的なポリヌクレオチド、および遺伝暗号の縮重によりこれらのポリヌクレオチドから誘導される配列に関する。
【００４６】
「オリゴ150」および「オリゴ150v」のインサートは、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「Scp1」との有意な相同性を有する。該インサートは、配列番号26または28に示す核酸配列を有する。それぞれの場合に該コード鎖から誘導されるアミノ酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のカルポニンまたはカルポニン相同タンパク質との有意な配列相同性を有する。
【００４７】
g）カンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）における仮性菌糸の発生に不可欠なタンパク質をコードする、好ましくはアップレギュレーションされる核酸配列。
【００４８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、本発明の核酸配列の特徴的な部分配列をコードし、内部名称「オリゴ177」を有するDNAクローンが単離されている。
【００４９】
もう1つの好ましい実施形態においては、本発明の核酸の完全配列をコードし、内部名称「オリゴ177v」を有するDNAクローンが本発明により単離されている。
【００５０】
本発明の1つの態様は、配列番号30に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。本発明のもう1つの態様は、配列番号34に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。該ポリヌクレオチドは、好ましくは、アッシビヤ（Ashbya）属の微生物、特にアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）から単離することができる。本発明はまた、それらに相補的なポリヌクレオチド、および遺伝暗号の縮重によりこれらのポリヌクレオチドから誘導される配列に関する。
【００５１】
「オリゴ177」および「オリゴ177v」のインサートは、カンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）由来のMIPSタグ「EPD1」との有意な相同性を有する。該インサートは、配列番号30または配列番号34に示す核酸配列を有する。配列番号30の対応相補鎖から又は配列番号34に示すコード鎖から誘導されうるアミノ酸配列は、カンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）由来のタンパク質との有意な配列相同性を有し、特に、カンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）における仮性菌糸の発生に不可欠なタンパク質との有意な配列相同性を有する（Nakazawa T.ら, J. Bacteriol., 180(8), 2079-2086, (1998)を参照されたい）。同様に、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来の対応タンパク質に対する相同性を確立することが可能であった。
【００５２】
h）アクチンと相互作用するタンパク質の機能を有するタンパク質をコードする、好ましくはダウンレギュレーションされる核酸配列。
【００５３】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、本発明の核酸配列の特徴的な部分配列をコードし、内部名称「オリゴ145」を有するDNAクローンが単離されている。
【００５４】
もう1つの好ましい実施形態においては、本発明の核酸の完全配列をコードし、内部名称「オリゴ145v」を有するDNAクローンが本発明により単離されている。
【００５５】
本発明の1つの態様は、配列番号36に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。本発明のもう1つの態様は、配列番号38に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片に関する。該ポリヌクレオチドは、好ましくは、アッシビヤ（Ashbya）属の微生物、特にアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）から単離することができる。本発明はまた、それらに相補的なポリヌクレオチド、および遺伝暗号の縮重によりこれらのポリヌクレオチドから誘導される配列に関する。
【００５６】
「オリゴ145」および「オリゴ145v」のインサートは、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「Aip2」との有意な相同性を有する。該インサートは、配列番号36または配列番号38に示す核酸配列を有する。該コード鎖から誘導されるアミノ酸配列またはアミノ酸部分配列は、アクチンと相互作用するサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のタンパク質との有意な配列相同性を有する（Chelstowska A.ら, Yeast 15(13), 1377-1391 (1999)を参照されたい）。
【００５７】
本発明のもう1つの態様は、前記ポリヌクレオチドの1つに、特にストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに関する。
【００５８】
本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドの1つにハイブリダイズし、かつアッシビヤ（Ashbya）属の微生物に由来する遺伝子産物またはこの遺伝子産物の機能的等価体をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００５９】
本発明は更に、前記のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドまたはタンパク質、および配列番号2、3、5、6、7、9、11、13、14、16、18、20、22、24、25、27、29、31、32、33、35、37または配列番号39に示す少なくとも10個の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するそれらのペプチド断片、および本発明のポリペプチドまたはタンパク質の機能的等価体に関する。
【００６０】
これに関して、機能的等価体は、他のタンパク質との配列比較により推定されうる元々認められたタンパク質機能を喪失することなく、少なくとも1個、例えば1〜30個、または1〜20個、または1〜10個の配列位置における付加、挿入、置換、欠失または逆位により、それらのアミノ酸配列において本発明で具体的に開示する産物と異なっている。したがって、等価体は、元のタンパク質と比較して、実質的に同じ、より高い又はより低い活性を有する可能性がある。
【００６１】
本発明の他の態様は、少なくとも1つの調節核酸配列に機能しうる形で連結された前記の核酸配列の1つを含む、本発明のタンパク質の組換え産生のための発現カセット、および本発明の少なくとも1つのそのような発現カセットを含む組換えベクターに関する。
【００６２】
また、本発明は、前記のタイプの少なくとも1つのベクターで形質転換された原核または真核細胞宿主を提供する。好ましい実施形態は、前記の本発明のポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子の機能発現がモジュレーション（例えば、抑制または過剰発現）されているか、あるい前記のポリペプチドの生物活性が低下または増加している原核または真核細胞宿主を提供する。好ましい宿主は、子嚢菌、特にアッシビヤ（Ashbya）属のもの、好ましくはアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）の株から選ばれる。
【００６３】
前記の意味における遺伝子発現のモジュレーションは、例えば、ある発現（特に、転写または翻訳）段階での遮断によるその抑制、または遺伝子の特異的過剰発現（例えば、調節配列の改変またはコード配列のコピー数の増加によるもの）を含む。
【００６４】
本発明のもう1つの態様は、ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の微生物による製造のための、本発明の発現カセット、本発明のベクターまたは本発明の宿主の使用に関する。
【００６５】
本発明のもう1つの態様は、前記の本発明のポリペプチドの組換え製造のための、本発明の発現カセット、本発明のベクターまたは本発明の宿主の使用に関する。
【００６６】
また、本発明は、ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の微生物による産生をモジュレートするためのエフェクター標的を検出または確認する方法を提供する。これは、ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体を産生しうる微生物を、前記の本発明のポリペプチドまたはそれをコードする核酸配列から選ばれる標的と相互作用する（例えば、非共有結合する）エフェクターで処理し、微生物により産生されたビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の量に対する該エフェクターの影響を確認し、適当な場合には、該標的を単離することを含む。この場合の確認は、好ましくは、エフェクターの非存在下である以外は同一の条件下での微生物によるビタミンB2産生との直接比較により行う。
【００６７】
本発明のもう1つの態様は、ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の微生物による産生を（該産生の量および／または速度に関して）モジュレートするための方法に関する。この場合、ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体を産生しうる微生物を、前記の本発明のポリペプチドまたはそれをコードする核酸配列から選ばれる標的と相互作用するエフェクターで処理する。
【００６８】
列挙すべき前記エフェクターの好ましい例としては、以下のものが挙げられる：
a）抗体またはその抗原結合性フラグメント、
b）本発明のポリペプチドと相互作用する、a）とは異なるポリペプチドリガンド、
c）本発明のポリペプチドの生物活性をモジュレートする低分子量エフェクター、
d）本発明の核酸配列と相互作用するアンチセンス核酸配列。
【００６９】
同様に、本発明は、前記の本発明の標的の少なくとも1つに対する特異性を有する前記エフェクターに関する。
【００７０】
本発明のもう1つの態様は、ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の微生物による製造方法に関する。該製造方法においては、前記宿主を、ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の産生に有利な条件下で培養し、所望の産物を該培養混合物から単離する。この場合、培養の前および／または間に該宿主を前記エフェクターで処理することが好ましい。この場合、好ましい宿主は、アッシビヤ（Ashbya）属の微生物、特に、前記のとおりに形質転換されたものから選ばれる。
【００７１】
本発明の最後の態様は、アッシビヤ（Ashbya）属の微生物におけるビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の産生をモジュレートするための標的としての本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
本発明の核酸分子は、本明細書においては細胞壁または細胞骨格構築タンパク質（例えば、細胞壁の合成または細胞骨格の構築に関連した活性を有するもの）または略して「CCタンパク質」と称されるポリペプチドまたはタンパク質をコードしている。これらのCCタンパク質は、例えば、発生に特異的なまたは環境と関係している細胞形態の変化に関連した、細胞壁または細胞骨格の合成または再構成における機能を有する。例えばWrightおよびPhilipsen (1991) Gene, 109, 99-105に開示されているとおり、アッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）において使用しうるクローニングベクターならびにアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）および関連酵母種の遺伝子操作のための技術が利用可能であるため、本発明の核酸分子を、これらの生物、特にアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）の遺伝子操作に使用して、それらを、ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の、より良好かつより効率的な生産体とすることが可能である。この改善された産生または効率は、本発明の遺伝子の操作の直接的な効果から、あるいはそのような操作の間接的な効果から生じうる。
【００７３】
本発明は、特にアッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）において、細胞壁および細胞骨格の構築（例えば、細胞壁および細胞骨格の合成または再構成）に関与しており、本明細書ではCC核酸およびCCタンパク質と称される新規分子の提供に基づくものである。アッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）における本発明のCC分子の活性は、この生物によるビタミンB2の産生に影響を及ぼす。好ましくは、本発明のCC分子の活性がモジュレートされ、その結果、本発明のCCタンパク質が関与するアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）の代謝および／またはエネルギー経路がビタミンB2産生の収率、生産量および／または効率に関してモジュレートされ、それにより、アッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）におけるビタミンB2産生の収率、生産量および／または効率が直接的または間接的にモジュレートされる。
【００７４】
本発明により提供される核酸配列は、例えば、American Type Culture CollectionからATCC 10895として自由に入手可能なアッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）株のゲノムから単離することができる。
【００７５】
ビタミンB2産生の改善：
本発明のCCタンパク質の量および／または活性を変化させることによりアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）株によるビタミンB2産生の収率、産生量および／または効率に直接的な影響を及ぼしうると考えられるメカニズムがいくつか存在する。
【００７６】
かくして、細胞壁および細胞骨格のより効率的な合成により細胞を外的影響に対してより強固にすることが可能となり、したがって、発酵槽内での生存能力ひいては生産性を高めることができる。
【００７７】
また、本発明の1以上のCCタンパク質の突然変異誘発は、アッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）からの必要産物の産生に間接的な影響を及ぼす改変（増強または減弱）された活性を有するCCタンパク質をもたらす可能性がある。例えば、CCタンパク質の助けにより、細胞の安定性および細胞における小胞輸送を特定の環境または培養条件に適応させること、それゆえに、不可欠な代謝過程の機能を維持することが可能である。こうした過程としては、該産物の生合成のほかに、細胞壁の構築、細胞の成長および分裂に必要な化合物（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、ビタミン、脂質など）の転写、翻訳、生合成が挙げられる（Lengelerら(1999)）。これらの改変された細胞の成長および増殖を改善することで、大規模培養での該細胞の生存能を増強し、また、比較的多数の産生細胞が発酵槽培養において生存できるように分裂速度を向上させることが可能である。少なくとも多数の生存細胞（各細胞が必要な産物を産生する）の存在のため生産の収率、生産量および効率が増加しうる。
【００７８】
ポリペプチド：
本発明は、前記アミノ酸配列またはその特徴的な部分配列を含み、かつ／または本明細書に記載の核酸配列によりコードされるポリペプチドに関する。
【００７９】
同様に、本発明は、具体的に開示された新規ポリペプチドの「機能的等価体」を含む。
【００８０】
具体的に開示されたポリペプチドの「機能的等価体」または類似体は、本発明の目的においては、該ポリペプチドとは異なるものの所望の生物活性（例えば、基質特異性）を尚も有するポリペプチドである。
【００８１】
「機能的等価体」は、本発明においては、特に、具体的に記載されたアミノ酸とは異なるアミノ酸を前記配列位置の少なくとも1つに有するが前記生物活性の1つを尚も有する突然変異体を意味する。したがって、「機能的等価体」は、1個以上のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位により得られる突然変異体を含み、こうした修飾が本発明の特性プロファイルを有する突然変異体を与える限り、かかる修飾はどのような配列位置に存在してもよい。機能的等価体は、特に、反応性パターンにおいて突然変異体と未修飾ポリペプチドとの間に定性的一致が認められる場合（すなわち、例えば、同一基質の変換速度に差がある場合）にも存在する。
【００８２】
また、前記の意味での「機能的等価体」としては、記載されたポリペプチドの前駆体ならびに該ポリペプチドの機能的誘導体および塩も挙げられる。「塩」なる語は、本発明のタンパク質分子中のカルボキシル基の塩とアミノ基の酸付加塩との両方を意味する。カルボキシル基の塩は、自体公知の方法で製造することが可能であり、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩のような無機塩、ならびに例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リシン、ピペリジンなどのアミンのような有機塩基との塩を含む。酸付加塩、例えば、塩酸または硫酸のような無機酸との塩ならびに酢酸およびシュウ酸のような有機酸との塩も、本発明の1つの態様である。
【００８３】
また、本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」は、アミノ酸側鎖官能基またはそのNもしくはC末端における誘導体として、公知技術により製造することが可能である。そのような誘導体には、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第1級もしくは第2級アミンとの反応により得られるカルボキシル基のアミド、アシル基との反応により製造される遊離アミノ基のN-アシル誘導体、あるいはアシル基との反応により製造される遊離ヒドロキシル基のO-アシル誘導体が含まれる。
【００８４】
また、「機能的等価体」は本来、他の生物から入手可能なポリペプチドおよび天然に存在する変異体を含む。例えば、配列比較により相同配列領域を見出すことが可能であり、本発明の特定の要件に基づいて同等の酵素を確認することができる。
【００８５】
同様に、「機能的等価体」には、例えば所望の生物学的機能を有する、本発明のポリペプチドの断片、好ましくは、単一のドメインまたは配列モチーフが含まれる。
【００８６】
「機能的等価体」としてはさらに、前記ポリペプチド配列またはそれに由来する機能的等価体の1つと、それとは機能的に異なる少なくとも1つの他の異種配列とを、機能的N末端またはC末端連結で（すなわち、該融合タンパク質の各部分の機能が互いにほとんど損なわれることなく）有する融合タンパク質が挙げられる。そのような異種配列の非限定的な例としては、例えば、シグナルペプチド、酵素、免疫グロブリン、表面抗原、受容体または受容体リガンドが挙げられる。
【００８７】
本発明における「機能的等価体」は、具体的に開示されたタンパク質のホモログを含む。これらは、PearsonおよびLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448のアルゴリズムによる計算で、具体的に開示された配列の1つに対して少なくとも60％、好ましくは、少なくとも75％、特に、少なくとも85％、例えば、90％、95％または99％の相同性を有する。
【００８８】
タンパク質のグリコシル化が可能である場合には、本発明の等価体は、前記タイプのタンパク質の脱グリコシル化またはグリコシル化形態、およびグリコシル化パターンの改変により入手可能な修飾形態を含む。
【００８９】
本発明のタンパク質またはポリペプチドのホモログは、該タンパク質の突然変異誘発、例えば点突然変異またはトランケーションにより作製することができる。本明細書中で用いる「ホモログ」なる語は、該タンパク質活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する、該タンパク質の変異体を意味する。
【００９０】
本発明のタンパク質のホモログは、突然変異体（例えば、トランケーション突然変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。例えば、核酸レベルでの組合せ突然変異誘発により、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的連結により、タンパク質変異体の雑多なライブラリーを作製することが可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のあるホモログのライブラリーを作製するために使用することができる方法は数多く存在する。縮重遺伝子配列の化学合成を自動DNA合成装置で行い、ついで該合成遺伝子を適当な発現ベクター内に連結することができる。遺伝子の縮重セットの使用は、所望セットの可能性のあるタンパク質配列をコードする全ての配列を1つの混合物で提供することを可能にする。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に公知である（例えば、Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakuraら (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraら, (1984) Science 198:1056; Ikeら (1983) Nucleic Acids Res. 11:477）。
【００９１】
さらに、本発明のタンパク質のホモログのスクリーニングとそれに続く選択のためのタンパク質断片の雑多な集団を作製するために、タンパク質コドンの断片のライブラリーを使用することができる。1つの実施形態においては、コード配列断片のライブラリーを作製するにあたって、コード配列の二本鎖PCR断片を、1分子当たり約1回だけニッキング（nicking）が生じる条件下に、ヌクレアーゼで処理し、該二本鎖DNAを変性させ、該DNAを再生させて二本鎖DNA（これは、異なるニック導入産物のセンス／アンチセンス対を含みうる）を形成させ、S1ヌクレアーゼでの処理により、新たに形成された二本鎖から一本鎖部分を除去し、得られた断片ライブラリーを発現ベクター内に連結する。この方法により、本発明のタンパク質の種々のサイズを有するN末端、C末端および内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導することが可能である。
【００９２】
点突然変異またはトランケーションにより作製されたコンビナトリアルライブラリーから遺伝子産物をスクリーニングするための技術、および選択された特性を有する遺伝子産物に関してcDNAライブラリーをスクリーニングするための技術が、先行技術においていくつか知られている。これらの技術は、本発明のホモログの組合せ突然変異誘発により作製された遺伝子ライブラリーの高速スクリーニングに応用することができる。ハイスループット分析を受ける大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も頻繁に用いられる技術は、複製可能な発現ベクター内への遺伝子ライブラリーのクローニング、得られたベクターライブラリーでの適当な細胞の形質転換、および該組合せ遺伝子の発現（これは、必要とされる活性の検出が、遺伝子産物が検出された該遺伝子をコードするベクターの単離を促進する条件下で行われる）を含む。ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を増加させる技術である反復アンサンブル突然変異誘発（recursive ensemble mutagenesis：REM）を、ホモログを同定するためのスクリーニング試験と組み合わせて用いることができる（ArkinおよびYourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgraveら (1993) Protein Engineering 6(3):327-331）。
【００９３】
本発明のポリペプチドの組換え的製造が可能であり（以下の節を参照されたい）、あるいは従来の生化学的手法を用いて微生物、特にアッシビヤ（Ashbya）属の微生物から天然形態でそれらを単離することが可能である（Cooper, T.G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New YorkまたはScopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinを参照されたい）。
【００９４】
核酸配列：
本発明はまた、前記ポリペプチドおよびそれらの機能的等価体（例えば、人工ヌクレオチド類似体を使用して入手可能なもの）の1つをコードする核酸配列（一本鎖および二本鎖のDNAおよびRNA配列、例えばcDNAおよびmRNA）に関する。
【００９５】
本発明は、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質をコードする単離された核酸分子または生物学的に活性なその断片に関する。本発明はまた、例えば、本発明のコード核酸を同定または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用しうる核酸断片に関する。
【００９６】
本発明の核酸分子はさらに、該遺伝子のコード領域の3'および／または5'末端からの非翻訳配列を含んでいてもよい。
【００９７】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものであり、さらに、それが組換え技術により製造された場合には、他の細胞性物質または培地を実質的に含有しないもの、あるいはそれが化学合成された場合には、化学前駆体または他の化学物質を含有しないものでありうる。
【００９８】
本発明の核酸分子は、分子生物学の標準的な技術と本発明により提供される配列情報とを用いて単離することができる。例えば、cDNAは、具体的に開示された完全配列の1つまたはその一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用し、標準的なハイブリダイゼーション技術（例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されているもの）を用いて、適当なcDNAライブラリーから単離することができる。さらに、開示された配列の1つまたはその一部を含む核酸分子は、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により単離することが可能である。このようにして増幅された核酸を適当なベクター内にクローニングし、DNA配列分析により特徴づけることができる。また、CCヌクレオチド配列に対応する本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成装置を使用する標準的な合成方法によっても製造することができる。
【００９９】
本発明はまた、具体的に記載されたヌクレオチド配列またはその一部に相補的である核酸分子を含む。
【０１００】
本発明のヌクレオチド配列は、他の細胞型および生物における相同配列を同定および／またはクローニングするために使用しうるプローブおよびプライマーを作製することを可能にする。そのようなプローブおよびプライマーは、通常、本発明の核酸配列のセンス鎖または対応アンチセンス鎖の少なくとも約12、好ましくは少なくとも約25、例えば約40、50または75個の連続したヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【０１０１】
本発明の更なる核酸配列は、配列番号1、4、8、10、12、15、17、19、21、23、26、28、30、34、36または配列番号38から誘導され、1個以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失によりそれとは異なっているが、所望の特性プロファイルを有するポリペプチドを尚もコードしている。
【０１０２】
本発明はまた、具体的に記載された配列と比較して、特定の起源または宿主生物のコドン使用頻度に従い修飾された又はいわゆるサイレント突然変異を含む核酸配列、および天然に存在するそれらの変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体を含む。同様に、本発明は、保存的ヌクレオチド置換（すなわち、関係のあるアミノ酸が同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度を有するアミノ酸で置換される）により入手可能な配列に関する。
【０１０３】
本発明はまた、配列多型を介して、具体的に開示された核酸から誘導された分子に関する。これらの遺伝的多型は、集団内の個体間の自然変異により生じうる。これらの自然変異は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列の1〜5％の変化をもたらす。
【０１０４】
本発明はまた、前記コード配列にハイブリダイズする又は相補的である核酸配列を含む。これらのポリヌクレオチドはゲノムまたはcDNAライブラリーのスクリーニングで見出すことができ、適宜、適当なプライマーを使用するPCRによりそれから増幅し、ついで、例えば、適当なプローブを用いて単離することが可能である。もう1つの可能性は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで適当な微生物を形質転換し、該微生物を増殖させることにより該ポリヌクレオチドを増幅し、それを単離することである。もう1つの可能性は、本発明のポリヌクレオチドを化学的経路により合成することである。
【０１０５】
ポリヌクレオチドに「ハイブリダイズ」しうるという特性は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがほとんど相補的な配列にはストリンジェントな条件下で結合できるが、これらの条件下、非相補的相手との非特異的結合は認められないことを意味する。この目的には、該配列は70〜100％、好ましくは90〜100％相補的であるべきである。互いに特異的に結合しうる相補的配列の特性は、例えば、ノーザンまたはサザンブロット法において、あるいはプライマー結合の場合にはPCRまたはRT-PCRにおいて利用されている。この目的には、通常、30塩基対以上の長さのオリゴヌクレオチドが使用される。ストリンジェントな条件は、例えばノーザンブロット法においては、非特異的にハイブリダイズしたcDNAプローブまたはオリゴヌクレオチドを溶出するため洗浄溶液、例えば、0.1％ SDSを含有する0.1×SSCバッファー（20×SSC: 3M NaCl, 0.3M クエン酸Na, pH 7.0）を50〜70℃、好ましくは60〜65℃で使用することを意味する。この場合、前記のとおり、高度の相補性を有する核酸だけが互いに結合したままとなる。ストリンジェントな条件の設定は当業者に公知であり、例えば、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
【０１０６】
本発明のもう1つの態様はアンチセンス核酸に関する。これは、コードセンス核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む。アンチセンス核酸は全コード鎖またはその一部のみに相補的でありうる。もう1つの実施形態においては、アンチセンス核酸分子は、ヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域に対してアンチセンスである。「非コード領域」なる語は、5'非翻訳領域および3'非翻訳領域と称される配列部分を意味する。
【０１０７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチド長でありうる。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野で公知の化学合成および酵素連結反応により構築することができる。アンチセンス核酸は、天然に存在するヌクレオチドまたは様々に修飾されたヌクレオチド（これらは、該分子の生物学的安定性を増加させるよう、またはアンチセンスおよびセンス核酸間で形成される二本鎖の物理的安定性を増加させるよう構成されている）を使用して化学合成することができる。使用しうる具体例としては、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが挙げられる。アンチセンス核酸を作製するために使用しうる修飾ヌクレオシドの具体例としては、とりわけ、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチル-アミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチル、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)wおよび2,6-ジアミノプリンが挙げられる。アンチセンス核酸はまた、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされている発現ベクターを使用することにより生物学的に製造することも可能である。
【０１０８】
本発明のアンチセンス核酸分子は、通常、細胞に投与されるか、またはin situで生成され、それにより、それらは細胞性mRNAおよび／またはコードDNAにハイブリダイズまたは結合して、例えば転写および／翻訳の阻害により該タンパク質の発現を阻害する。
【０１０９】
アンチセンス分子を修飾して、例えば、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体への該アンチセンス核酸分子の結合を介して、該アンチセンス分子が受容体と、または所定の細胞表面に発現された抗原と特異的に結合するようにすることが可能である。また、アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載のベクターを使用することにより細胞に投与することが可能である。アンチセンス分子の適当な細胞内濃度を得るのに好ましいベクター構築物は、該アンチセンス核酸分子が細菌、ウイルスまたは真核生物の強力なプロモーターの制御下にあるものである。
【０１１０】
もう1つの実施形態においては、本発明のアンチセンス核酸分子はαアノマー核酸分子である。αアノマー核酸分子は、相補的RNAと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これらの鎖は、通常のα単位とは対照的に、互いに平行になっている（Gaultierら, (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641）。アンチセンス核酸分子はさらに、2'-O-メチルリボヌクレオチド（Inoueら, (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148）またはキメラRNA-DNA類似体（Inoueら (1987) FEBS Lett. 215:327-330）を含みうる。
【０１１１】
また、本発明はリボザイムに関する。リボザイムは、mRNA（それらはmRNAに対する相補領域を有する）のような一本鎖核酸を切断しうるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNA分子である。したがって、本発明の転写産物を触媒的に切断して対応核酸の翻訳を阻害するために、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイム（HaselhoffおよびGerlach (1988) Nature 334:585-591に記載されている））を使用することが可能である。本発明のコード核酸に対する特異性を有するリボザイムは、例えば、本明細書に具体的に開示されているcDNAに基づいて構築することができる。例えば、テトラヒメナ-L-19 IVS RNAの誘導体を構築することができ、その活性部位のヌクレオチド配列は本発明のコードmRNA中の切断されるヌクレオチド配列に相補的である（例えば、US-A-4 987 071およびUS-A-5 116 742を比較されたい）。あるいは、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNAをRNA分子のプールから選択するために、mRNAを使用することができる（例えば、Bartel, D.およびSzostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい）。
【０１１２】
あるいは、本発明のヌクレオチド配列の調節領域（例えば、コード配列のプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列をターゲティングして、標的細胞内での対応遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造体を形成させることにより、本発明の配列の遺伝子発現を抑制することが可能である（Helene, C. (1991) Anticancer Drug Res. 6(6) 569-584; Helene, C.ら, (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36; およびMaher., L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-815）。
【０１１３】
発現構築物およびベクター：
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を調節核酸配列の遺伝的制御下に含む発現構築物、およびこれらの発現構築物の少なくとも1つを含むベクターに関する。本発明のそのような構築物は、好ましくは、特定のコード配列の5'上流のプロモーターおよび3'下流のターミネーター配列、ならびに適当な場合には他の通常の調節エレメント（特に、それぞれはコード配列に機能しうる形で連結されている）を含む。「機能しうる形で連結されている」は、調節エレメントのそれぞれがコード配列の発現のために意図されたその機能に従うように、プロモーター、コード配列、ターミネーター、および適当な場合には他の調節エレメントが連続的に配置されていることを意味する。機能しうる形で連結されうる配列の具体例としては、ターゲティング配列およびエンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどが挙げられる。他の調節エレメントは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などを含む。適当な調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【０１１４】
人工調節配列に加えて、天然調節配列が尚も、実際の構造遺伝子の前に存在することが可能である。この天然調節は、適当な場合には、遺伝的修飾によりスイッチオフにしておくことが可能であり、該遺伝子の発現が増強または減弱されうる。しかし、遺伝子構築物はより単純な構造をしていてもよく、すなわち、構造遺伝子の前に追加的な調節シグナルが挿入されておらず、それを調節する天然プロモーターが欠失されていなくてもよい。あるいは、もはや調節が行われず、遺伝子発現が増強または減弱されるように、天然調節配列が突然変異していることも可能である。核酸配列は遺伝子構築物中に1以上のコピー数で存在しうる。
【０１１５】
使用しうるプロモーターの具体例としては、グラム陰性菌において有利に使用されるcos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PRまたはλ-PLプロモーター、ならびにグラム陽性プロモーターamyおよびSPO2、酵母プロモーターADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDHまたは植物プロモーターCaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、notまたはユビキチンまたはファセオリンプロモーターが挙げられる。誘導プロモーター、例えば、光誘導性、特に温度誘導性プロモーター（PrPlプロモーター）の使用が特に好ましい。原則として、それらの調節配列を有するすべての天然プロモーターを使用することが可能である。また、合成プロモーターも有利に使用することができる。
【０１１６】
前記調節配列は核酸配列の特異的発現を可能にすることが意図される。このことは、例えば、宿主生物に応じて、遺伝子が誘導後にのみ発現または過剰発現されること、あるいはそれが直ちに発現および／または過剰発現されることを意味する。
【０１１７】
さらに、調節配列または因子は正の影響を及ぼし、それゆえ、発現を増強または減弱することが好ましい。したがって、プロモーターおよび／またはエンハンサーのような強力な転写シグナルを使用することにより、調節エレメントの増強が転写レベルで有利に生じうる。しかし、例えば、mRNAの安定性を向上させることにより、翻訳を増強することも可能である。
【０１１８】
発現カセットは、適当なプロモーターを、本発明の適当なヌクレオチド配列およびターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルに融合させることにより製造される。この目的には、従来の組換えおよびクローニング技術を、例えば、T. Maniatis, E.F. FritschおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)ならびにT.J. Silhavy, M.L. BermanおよびL.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)ならびにAusubel, F.M.ら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載されているとおりに用いる。
【０１１９】
適当な宿主生物における発現のためには、組換え核酸構築物または遺伝子構築物を、宿主内での遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的ベクター内に挿入するのが好都合である。ベクターは当業者によく知られており、例えば、“Cloning Vectors”（Pouwels P. H.ら編, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985）に記載されている。また、ベクターは、プラスミドだけではなく、当業者に公知の他のすべてのベクター（例えば、ファージ、ウイルス、例えば、SV40、CMV、バキュロウイルスおよびアデノウイルス、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、および直鎖状または環状DNA）をも意味する。これらのベクターは宿主生物内での自律複製または染色体複製を受けることができる。
【０１２０】
列挙しうる適当な発現ベクターの具体例としては以下のものが挙げられる：
通常の融合発現ベクター、例えば、pGEX（Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B.およびJohnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40）、pMAL（New England Biolabs, Beverly, MA）およびpRIT 5（Pharmacia, Piscataway, NJ）（それぞれ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質およびプロテインAが組換え標的タンパク質に融合される）。
【０１２１】
非融合タンパク質発現ベクター、例えば、pTrc（Amannら, (1988) Gene 69:301-315）およびpET 11d（Studierら, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89）。
【０１２２】
酵母サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）内での発現用の酵母発現ベクター、例えば、pYepSec1（Baldariら, (1987) Embo J. 6:229-234）、pMFα（KurjanおよびHerskowitz (1982) Cell 30:933-943）、pJRY88（Schultzら, (1987) Gene 54:113-123）およびpYES2（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）。糸状菌のような他の真菌での使用に適したベクター、および該ベクターの構築方法には、van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) “Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdyら編, pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridgeに記載されているものが含まれる。
【０１２３】
培養昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）内でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターは、pAcシリーズ（Smithら, (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）およびpVLシリーズ（LucklowおよびSummers (1989) Virology 170:31-39）を含む。
【０１２４】
植物発現ベクター、例えば、Becker, D., Kemper, E., Schell, J.およびMasterson, R. (1992) “New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197;ならびにBevan, M.W. (1984) “Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl. Acids Res. 12:8711-8721に詳しく記載されているもの。
【０１２５】
哺乳類発現ベクター、例えば、pCDM8（Seed, B. (1987) Nature 329:840）およびpMT2PC（Kaufmanら, (1987) EMBO J. 6:187-195）。
【０１２６】
原核および真核細胞用の適当な更なる発現系は、Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の第16章および第17章に記載されている。
【０１２７】
組換え微生物：
本発明のベクターは、例えば本発明の少なくとも1つのベクターで形質転換された組換え微生物を製造するために使用することが可能であり、本発明のポリペプチドを生産するために使用することができる。前記の本発明の組換え構築物は、適当な宿主系内に有利に導入されて、発現される。個々の発現系において核酸の発現を引き起こすためには、当業者によく知られたクローニングおよびトランスフェクション法、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどが好ましく用いられる。適当な系は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubelら編, Wiley Interscience, New York 1997またはSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
【０１２８】
また、本発明では、相同的に組換えられた微生物を製造することも可能である。これは、コード配列または本発明の遺伝子の少なくとも一部［適当な場合には、これには、本発明の配列を修飾するために、例えば機能的に破壊するために（ノックアウトベクター）、少なくとも1個のアミノ酸の欠失、付加または置換が導入されている］を含有するベクターの作製を伴う。また、導入される配列は、例えば、関連微生物由来のホモログであってもよく、あるいは哺乳類、酵母または昆虫に由来するものであってもよい。あるいは、内因性遺伝子が相同組換え中に突然変異したり修飾されるが、尚も機能的タンパク質をコードするように、相同組換えに使用するベクターを設計することが可能である（例えば、上流に位置する調節領域が内因性タンパク質の発現を改変するように、調節領域を修飾することが可能である）。CC遺伝子の修飾部分は相同組換えベクター内に存在する。相同組換えのための適当なベクターの構築は、例えば、Thomas, K.R.およびCapecchi, M.R. (1987) Cell 51:503に記載されている。
【０１２９】
適当な宿主生物は、原則として、本発明の核酸、その対立遺伝子変異体、その機能的等価体または誘導体の発現を可能にするすべての生物である。宿主生物は、例えば、細菌、真菌、酵母、植物または動物細胞を意味する。好ましい生物は、細菌、例えば、エシェリキア（Escherichia）属の細菌、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）、バシラス（Bacillus）またはシュードモナス（Pseudomonas）、真核微生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、アスペルギルス（Aspergillus）、動物または植物由来の高等真核細胞、例えば、Sf9またはCHO細胞である。好ましい生物は、アッシビヤ（Ashbya）属、好ましくはアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）株から選ばれる。
【０１３０】
首尾よく形質転換された生物は、ベクターまたは発現カセット中に同様に存在するマーカー遺伝子により選択することができる。そのようなマーカー遺伝子の具体例としては、抗生物質耐性遺伝子、および形質転換細胞の染色をもたらす発色反応を触媒する酵素の遺伝子が挙げられる。ついで、これらを自動セルソーティングにより選別することが可能である。ベクターで首尾よく形質転換され、適当な抗生物質耐性遺伝子（例えば、G418またはハイグロマイシン）を保持する微生物は、適当な抗生物質含有培地または栄養培地により選択することができる。細胞の表面上に存在するマーカータンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーによる選択に利用することが可能である。
【０１３１】
宿主生物と該生物に適したベクター（例えば、プラスミド、ウイルスまたはファージ、例えばRNAポリメラーゼ／プロモーター系を含有するプラスミド、ファージλもしくはμ、または他のテンペレートファージもしくはトランスポゾン、および／または他の有利な調節配列）との組合せが発現系を形成する。「発現系」なる語は、例えば、哺乳類細胞（例えば、CHO細胞）と、哺乳類細胞に適したベクター（例えば、pcDNA3neoベクター）との組合せを意味する。
【０１３２】
所望により、トランスジェニック生物、例えばトランスジェニック動物（例えば、特に、マウス、ヒツジ）またはトランスジェニック植物において該遺伝子産物を発現させることも可能である。
【０１３３】
ポリペプチドの組換え的製造：
本発明は更に、本発明のポリペプチドまたはその機能的な生物学的に活性な断片の組換え的製造方法に関する。該製造方法においては、ポリペプチド産生微生物を培養し、適当な場合には該ポリペプチドの発現を誘導し、それを培養物から単離する。所望により、このようにして工業的規模でもポリペプチドを製造することが可能である。
【０１３４】
組換え微生物は公知方法により培養し発酵することができる。例えば、TBまたはLB培地中、20〜40℃の温度および6〜9のpHで細菌を増殖させることができる。適当な培養条件の詳細は、例えば、T. Maniatis, E.F. FritschおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)に記載されている。
【０１３５】
ポリペプチドが培地に分泌されない場合には、ついで細胞を破壊し、公知のタンパク質単離方法によりライセートから産物を得る。あるいは、高周波超音波により、高圧（例えば、フレンチプレスセルで）により、浸透圧分解（osmolysis）により、界面活性剤、溶菌酵素もしくは有機溶媒の作用により、ホモジナイザーにより、または記載されている複数の方法の組合せにより、細胞を破壊することができる。
【０１３６】
ポリペプチドは、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、Q-セファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーのような公知クロマトグラフィー法、ならびに限外濾過、結晶化、塩析、透析および未変性ゲル電気泳動のような他の通常の方法により精製することができる。適当な方法は、例えば、Cooper, T.G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New YorkまたはScopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【０１３７】
組換えタンパク質の単離においては、特定のヌクレオチド配列によりcDNAを伸長させて、例えばより簡便な精製に役立つ修飾ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用するのが特に有利である。このタイプの適当な修飾体としては、アンカー（例えば、ヘキサヒスチジンアンカーとして知られている修飾体）として作用するいわゆるタグ、または抗体によって抗原として認識されうるエピトープ（例えば、Harlow, E.およびLane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載されている）が挙げられる。これらのアンカーは、例えばクロマトグラフィーカラムに充填されうるポリマーマトリックスのような固相支持体にタンパク質を結合させるために使用することが可能であり、あるいはマイクロタイタープレートまたは別の支持体上で使用することもできる。
【０１３８】
これらのアンカーは同時に、タンパク質の確認のためにも使用することができる。また、蛍光色素、酵素マーカー（基質との反応後に検出可能な反応産物を形成する）、または放射性標識のような通常のマーカーを、単独でまたはタンパク質を誘導体化するためのアンカーと組み合わせて、タンパク質の確認のために使用することも可能である。
【０１３９】
また、本発明は、ビタミンB2および／またはその前駆体および／または誘導体の微生物による製造方法に関する。
【０１４０】
前記変換を組換え微生物で行う場合には、まず、微生物を、適当な細胞密度に達するまで、好ましくは、酸素の存在下に複合培地内で例えば約20℃以上の温度および約6〜9のpHで培養する。反応をより良好に制御できるようにするためには、誘導プロモーターを使用することが好ましい。培養は、ビタミンB2産生の誘導後に12時間〜3日間にわたり酸素の存在下で継続する。  
以下の非限定的な実施例は本発明の具体的な実施形態を記載するものである。
【０１４１】
一般的な実験の詳細
a）一般的クローニング方法
本発明の目的のために行うクローニング工程、例えば、制限酵素切断、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、ニトロセルロースおよびナイロンメンブレンへの核酸の移行、DNA断片の連結、大腸菌（E. coli）細胞の形質転換、細菌の培養、ファージの複製および組換えDNAの配列分析は、Sambrookら, (1989)（前掲）に記載のとおりに行った。
【０１４２】
b）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
PCRは、以下の標準的な混合物を使用する標準的プロトコルに従って行った：
8μlのdNTP混合物（200μM）、MgCl2を含有しない10μlのTaqポリメラーゼバッファー（10×）、8μlのMgCl2（25mM）、1μlの各プライマー（0.1μM）、1μlの増幅されるDNA、2.5UのTaqポリメラーゼ（MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania）、脱イオン水（100μlに調整）。
【０１４３】
c）大腸菌の培養
組換え大腸菌（E. coli）DH5α株をLB-amp培地（トリプトン10.0g、NaCl 5.0g、酵母エキス5.0g、アンピシリン100g/ml、H2Oで1000 mlに調整）内で37℃にて培養した。この目的には、各場合において、接種ループを使用して、1個のコロニーを寒天プレートから5mlのLB-ampに移した。220rpmで振とうしながら約18時間培養した後、2Lフラスコ中の400mlの培地に4mlの培養物を接種した。OD578が0.8〜1.0の値に達した後、大腸菌（E. coli）内でのP450発現の誘導を3〜4時間、42℃での熱ショック誘導により行った。
【０１４４】
d）培養物からの必要産物の精製
当技術分野で公知の種々の方法により、微生物または培養上清から必要産物を単離することができる。必要産物が細胞により分泌されない場合には、低速遠心分離により培養物から細胞を回収し、機械的な力または超音波処理のような標準的な技術により細胞を溶解することができる。
【０１４５】
細胞残渣を遠心分離により除去し、可溶性タンパク質を含有する上清画分を必要化合物の更なる精製のために取得する。産物が細胞により分泌される場合には、低速遠心分離により細胞を培養物から除去し、上清画分を更なる精製のために保持する。
【０１４６】
それらの2つの精製方法からの上清画分を適当な樹脂でのクロマトグラフィーにかける。この場合、必要分子はクロマトグラフィー樹脂上に保持されるか、不純物よりも大きな選択性で樹脂を通過する。必要に応じて、同じ又は異なるクロマトグラフィー樹脂を使用して、これらのクロマトグラフィー工程を繰返すことができる。当業者であれば、精製すべき特定の分子に適するクロマトグラフィー樹脂の選択およびそれらの最も効果的な使用法を熟知していよう。精製された産物を濾過または限外濾過により濃縮し、産物の安定性が最大となる温度で保存することができる。
【０１４７】
多数の精製方法が当技術分野で公知である。これらの精製技術は、例えば、Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986)に記載されている。
【０１４８】
単離された化合物の正体（アイデンティティー）および純度は先行技術により確認することが可能である。これらは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、分光法、染色法、薄層クロマトグラフィー、NIRS、酵素アッセイまたは微生物学的アッセイを含む。これらの分析方法は、Patekら, (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhovaら, (1996) Biotekhnologiya 11 27-32およびSchmidtら, (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, pp. 575-581およびpp. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A.ら, (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17に要約されている。
【０１４９】
e）MPSS法、クローンの同定および相同性検索の一般的説明
MPSS技法（参照により本明細書に組み入れるBrennerら, Nat. Biotechnol. (2000) 18, 630-634に記載のMassive Parallel Signature Sequencing）をビタミンB2産生糸状菌アッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）に適用した。この技法を用いて、真核生物における多数の遺伝子の発現レベルに関する定量的情報を高精度で得ることが可能である。これは、該生物のmRNAをある特定の時点Xにおいて単離し、逆転写酵素によりcDNAに転写し、ついで、特異的タグ配列を有する特別なベクター内にクローニングすることを含む。異なるタグ配列を有するベクターの数は、統計的に、そのタグ配列のためユニークなものとなっているベクター内に各DNA分子をクローニングするのに十分多く（約1000倍多く）なるよう選択される。
【０１５０】
ついでベクターのインサートをタグと共に切り出す。ついで、このようにして得られたDNA分子を、前記タグの分子対応物を保有するマイクロビーズと共にインキュベートする。インキュベーション後、各マイクロビーズには特異的タグまたは対応物によりただ1つのタイプのDNAがローディングされると推定することができる。蛍光色素に基づく適合配列決定法により、また、カラーデジタルカメラにより、全てのビーズの大量配列決定を行うことが可能となるよう、ビーズを特別のフローセル内に移し、そこに固定する。この方法では数的には大規模な分析が可能であるが、それは、読取り幅が約16〜20塩基対であるという制約を受ける。しかし、この配列の長さは、ほとんどの生物において遺伝子と配列との間の明確な相関を可能にするのに十分なものである（20bpは約1×1012の配列頻度を有し、これに対して、ヒトゲノムはわずかに約3×109 bpのサイズを有するに過ぎない）。
【０１５１】
このようにして得られたデータは、同一配列の数を計数し、それらの頻度を互いに比較することにより分析される。頻繁に出現する配列は高レベルの発現を表し、1回しか出現しない配列は低レベルの発現を表す。mRNAが2つの異なる時点（XおよびY）で単離される場合には、個々の遺伝子の経時的発現パターンを作成することが可能である。
【実施例１】
【０１５２】
アッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）からのmRNAの単離
アッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）を、公知の方法（栄養培地: 27.5g/l 酵母エキス; 0.5g/l 硫酸マグネシウム; 50ml/l 大豆油; pH7）で培養した。アッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）菌糸サンプルを発酵の種々の時点（24時間、48時間および72時間）で採取し、Sambrookら, (1989)のプロトコルに従い該サンプルから対応RNAまたはmRNAを単離する。
【実施例２】
【０１５３】
MPSSの適用
アッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）から単離されたmRNAを、前記のMPSS分析に付す。  
得られた一連のデータを統計分析に付し、発現の差異の有意性に従い分類する。これは、発現レベルの増加および減少の両方について調べることを含む。発現の変化を、a）単調な変化、b）24時間後の変化、およびc）48時間後の変化に大別することにより、分類を行う。
【０１５４】
ついで、発現の変化を表す、MPSS分析により見出された20bpの配列をプローブとして使用し、約1kbの平均インサートサイズを有するアッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）由来の遺伝子ライブラリーにハイブリダイズさせる。この場合のハイブリダイゼーション温度は約30〜57℃の範囲とした。
【実施例３】
【０１５５】
アッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）由来のゲノム遺伝子ライブラリーの構築
ゲノムDNAライブラリーを構築するために、まず、染色体DNAをWrightおよびPhilippsen （Gene (1991) 109: 99-105）ならびにMohr（1995, PhD Thesis, Biozentrum Universitat Basel, Switzerland）の方法により単離する。
【０１５６】
該DNAをSau3Aで部分消化する。この目的には、6μgのゲノムDNAを、種々の量の酵素（0.1〜1U）によりSau3A消化に付す。生じる断片をショ糖密度勾配で分画する。1kbの領域を単離し、QiaEx抽出に付す。最大の断片を、BamHIで切断したベクターpRS416（SikorskiおよびHieter, Genetics (1988) 122; 19-27）（90ngのBamHI切断し脱リン酸化したベクター; 198ngのインサートDNA; 5mlの水; 2μlの10×連結バッファー; 1U リガーゼ）に連結する。この連結混合物を使用して大腸菌（E. coli）実験株XL-1ブルーを形質転換し、得られたクローンは該インサートの同定に使用する。
【実施例４】
【０１５７】
順序づけられた遺伝子ライブラリーの調製（CHIP技術）
アッシビヤ・ゴシッピー（Ashbya gossypii）遺伝子ライブラリーの約25,000個のコロニー（これは該ゲノムの約3倍の包含範囲に相当する）を順序づけてナイロンメンブレンにトランスファーし、ついで、Sambrookら, (1989)に記載のコロニーハイブリダイゼーションの方法により処理した。オリゴヌクレオチドを、MPSS分析により見出された20bpの配列から合成し、32Pで放射能標識した。それぞれの場合に、類似した融解温度を有する10個の標識オリゴヌクレオチドを合わせて、一緒にナイロンメンブレンにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の後、陽性クローンをオートラジオグラフィーにより同定し、PCRシークエンシングにより直接的に分析する。
【０１５８】
この方法で、内部名称「オリゴ8」を有するインサートを保持しかつサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「Cwp1」との有意な相同性を有するクローンを同定した。該インサートは、配列番号1に示す核酸配列を有する。
【０１５９】
この方法で、内部名称「オリゴ25/39」を有するインサートを保持しかつサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「ARK1」との有意な相同性を有するもう1つのクローンを同定した。該インサートは、配列番号8に示す核酸配列を有する。
【０１６０】
この方法で、内部名称「オリゴ46」を有するインサートを保持しかつサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「BUD2/CLA2」との有意な相同性を有するもう1つのクローンを同定した。該インサートは、配列番号12に示す核酸配列を有する。
【０１６１】
この方法で、内部名称「オリゴ103」を有するインサートを保持しかつサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「Aor1」との有意な相同性を有するもう1つのクローンを同定した。該インサートは、配列番号17に示す核酸配列を有する。
【０１６２】
この方法で、内部名称「オリゴ128」を有するインサートを保持しかつサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「Ykl179c」との有意な相同性を有するもう1つのクローンを同定した。該インサートは、配列番号21に示す核酸配列を有する。
【０１６３】
この方法で、内部名称「オリゴ150」を有するインサートを保持しかつサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「Scp1」との有意な相同性を有するもう1つのクローンを同定した。該インサートは、配列番号26に示す核酸配列を有する。
【０１６４】
この方法で、内部名称「オリゴ177」を有するインサートを保持しかつカンジダ・マルトーサ（C. maltosa）由来のMIPSタグ「EPD1」との有意な相同性を有する1つのクローンを同定した。該インサートは、配列番号30に示す核酸配列を有する。
【０１６５】
この方法で、内部名称「オリゴ145」を有するインサートを保持しかつサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「Aip2」との有意な相同性を有する1つのクローンを同定した。該インサートは、配列番号36に示す核酸配列を有する。
【実施例５】
【０１６６】
BLASTX検索による配列データの分析
得られた核酸配列の分析（すなわち、機能的アミノ酸配列へのそれらの機能的割り当て）を、配列データベースでのBLASTX検索により行った。見出されたアミノ酸配列相同性のほぼすべては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（パン酵母）に関連していた。この生物はすでに完全な配列決定がなされているため、この遺伝子に関するより詳細な情報は、http://www.mips.gsf.de/proj/yeast/search/code_search.htmのもとで確認することができる。
【０１６７】
このようにして、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のアミノ酸断片との以下の相同性が見出された。対応するアライメントを添付の図1〜8に示す。
【０１６８】
a）配列番号1のコード鎖から誘導されたアミノ酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来の細胞壁前駆体タンパク質との有意な配列相同性を有する。それから誘導された、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）タンパク質の部分配列を有するアミノ酸部分配列（配列番号1のヌクレオチド1092〜595に対応する）を、図1に示す。配列番号2および配列番号3はそれぞれN末端で伸長したアミノ酸部分配列を示す。
【０１６９】
したがって、見出されたアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）核酸配列は、細胞壁前駆体タンパク質の機能を割り当てることができる。
【０１７０】
b）配列番号8に対する対応相補鎖から誘導されたアミノ酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のセリン-トレオニンキナーゼとの有意な配列相同性を有する。それから誘導された、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）酵素の部分配列を有するアミノ酸部分配列（配列番号8のヌクレオチド1067〜84に対応する）を、図2に示す。配列番号9はN末端で伸長したアミノ酸部分配列を示す。
【０１７１】
したがって、見出されたアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）核酸配列は、セリン-トレオニンキナーゼの機能を割り当てることができる。
【０１７２】
c）配列番号12に対する相補鎖から誘導されたアミノ酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のGTPアーゼ活性化タンパク質との有意な配列相同性を有する。それから誘導された、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）タンパク質の部分配列を有するアミノ酸部分配列（配列番号12のヌクレオチド475〜353に対応する）を、図3Aに示す。それから誘導された、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）タンパク質の部分配列を有するもう1つのアミノ酸部分配列（配列番号12のヌクレオチド351〜1に対応する）を、図3Bに示す。配列番号13および配列番号14はそれぞれN末端で伸長したアミノ酸部分配列を示す。
【０１７３】
したがって、見出されたアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）核酸配列は、GTPアーゼ活性化タンパク質の機能を割り当てることができる。
【０１７４】
d）配列番号17に対する対応相補鎖から誘導されたアミノ酸配列は、アクチンの過剰発現に対する5r耐性と関連したサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のタンパク質との有意な配列相同性を有する。それから誘導された、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）タンパク質の部分配列を有するアミノ酸部分配列（配列番号17のヌクレオチド933〜157に対応する）を、図4に示す。配列番号18はN末端伸長アミノ酸部分配列を示す。
【０１７５】
したがって、見出されたアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）核酸配列は、アクチンの過剰発現に対する耐性を有するタンパク質の機能を割り当てることができる。
【０１７６】
e）配列番号21に対するコード鎖から誘導されたアミノ酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のNuf1p様タンパク質との有意な配列相同性を有する。それから誘導された、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）タンパク質の部分配列を有するアミノ酸部分配列（配列番号21のヌクレオチド117〜794に対応する）を、図5に示す。配列番号22はN末端伸長アミノ酸部分配列を示す。
【０１７７】
したがって、見出されたアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）核酸配列は、Nuf1p様タンパク質の機能を割り当てることができる。
【０１７８】
f）配列番号26に対するコード鎖から誘導されたアミノ酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のカルポニン相同タンパク質との有意な配列相同性を有する。それから誘導された、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）タンパク質の部分配列を有するアミノ酸部分配列（配列番号26のヌクレオチド438〜767に対応する）を、図6に示す。配列番号27はN末端伸長アミノ酸部分配列を示す。
【０１７９】
したがって、見出されたアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）核酸配列は、カルポニン相同タンパク質の機能を割り当てることができる。
【０１８０】
g）配列番号30に対する対応相補鎖から誘導されたアミノ酸配列は、カンジダ・マルトーサ（C. maltosa）における仮性菌糸の発生に不可欠なカンジダ・マルトーサ（C. maltosa）由来のタンパク質との有意な配列相同性を有する。それから誘導された、カンジダ・マルトーサ（C. maltosa）タンパク質の部分配列を有するアミノ酸部分配列（配列番号30のヌクレオチド983〜651に対応する）を、図7Aに示す。それから誘導された、カンジダ・マルトーサ（C. maltosa）タンパク質の部分配列を有するもう1つのアミノ酸部分配列（配列番号30のヌクレオチド661〜596に対応する）を、図7Bに示す。それから誘導された、カンジダ・マルトーサ（C. maltosa）タンパク質の部分配列を有する第3のアミノ酸部分配列（配列番号30のヌクレオチド591〜1に対応する）を、図7Cに示す。配列番号31、配列番号32および配列番号33はそれぞれ、N末端伸長アミノ酸部分配列を示す。
【０１８１】
したがって、見出されたアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）核酸配列は、カンジダ・マルトーサ（C. maltosa）における仮性菌糸の発生に不可欠なタンパク質の機能を割り当てることができる。
【０１８２】
h）配列番号36に対するコード鎖から誘導されたアミノ酸配列は、アクチンと相互作用するサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のタンパク質との有意な配列相同性を有する。それから誘導された、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）タンパク質の部分配列を有するアミノ酸部分配列（配列番号36のヌクレオチド2〜148に対応する）を、図8に示す。配列番号37はN末端伸長アミノ酸部分配列を示す。
【０１８３】
したがって、見出されたアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）核酸配列は、アクチンと相互作用するタンパク質の機能を割り当てることができる。
【実施例６】
【０１８４】
完全長DNAの単離
a）アッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）遺伝子ライブラリーの構築
液体MA2培地（10gのグルコース、10gのペプトン、1gの酵母エキス、0.3gのmyo-イノシトール、1000mlに調整）内で培養した2日齢の100mlの培養物から、アッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）由来の高分子量細胞性完全DNAを調製した。菌糸体を濾去し、蒸留水で2回洗浄し、20mgのザイモリアーゼ20Tを含有する10mlの1Mソルビトール、20mM EDTAに懸濁させ、穏やかに振とうしながら27℃で30〜60分間インキュベートした。該プロトプラスト懸濁液を50mM Tris-HCl（pH 7.5）、150mM NaCl、100mM EDTAおよび0.5％濃度のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に調節し、65℃で20分間インキュベートした。フェノール／クロロホルム（1:1 vol/vol）で2回抽出した後、該DNAをイソプロパノールで沈殿させ、TEバッファーに懸濁させ、RNアーゼで処理し、イソプロパノールで再沈殿させて、TEに懸濁させた。
【０１８５】
サイズに従って選択しかつSau3Aで部分消化したゲノムDNAを、コスミドベクターSuper-Cos1（Stratagene）の脱リン酸化アームに結合させることにより、アッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）コスミド遺伝子ライブラリーを作製した。2つのcos部位の間でのSuper-Cos1ベクターの開裂を、XbaIでの消化および子ウシ腸アルカリホスファターゼ（Boehringer）での脱リン酸化およびそれに続くBamHIでのクローニング部位の開裂により行った。連結反応は、2.5μgの部分消化染色体DNA、1μgのSuper-Cos1ベクターアーム、40mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、1mM ジチオトレイトール、0.5mM ATPおよび2ワイス単位のT4-DNAリガーゼ（Boehringer）を含有する20μl中、15℃で一晩行った。Stratagene（Gigapack II Packaging Extract）のプロトコルおよび抽出物を用いて、該連結産物をin vitroでパッケージングした。パッケージングされた物質を使用して大腸菌NM554（recA13, araD139, Δ(ara,leu)7696, Δ(lac)17A, galU, galK, hsrR, rps(strr), mcrA, mcrB）に感染させ、アンピシリン（50μg/ml）を含有するLBプレート上に播いた。30〜45kbの平均長を有するアッシビヤ・ゴシッピー（A. gossypii）インサートを含有する形質転換体が得られた。
【０１８６】
b）コスミド遺伝子ライブラリーの保存およびスクリーニング
合計4×104個の新鮮な単コロニーを、96ウェルマイクロタイタープレート（Falcon, No. 3072）のウェル内の、凍結用媒体（36mM K2HPO4/13.2mM KH2PO4, 1.7mM クエン酸ナトリウム, 0.4mM MgSO4, 6.8mM (NH4)2SO4, 4.4％(w/v) グリセロール）およびアンピシリン（50μg/ml）を添加した100μlのLB培地に1個ずつ接種し、振とうしながら37℃で一晩増殖させ、-70℃で凍結した。該プレートを急速融解し、ついで、エタノール浴中で滅菌し次いでホットプレート上でエタノールを蒸発させた96ウェルレプリケーターを使用して、新鮮な培地内に複製（duplicate）した。凍結前および融解後（他のいずれの処置よりも前）に、細胞の均一な懸濁液が保証されるよう該プレートをマイクロタイターシェーカー（Infors）で短時間振とうした。96ウェルのマイクロタイタープレートからナイロンメンブレン（GeneScreen Plus, New England Nuclear）に少量の液体を移すことを可能にするロボットシステム（Bio-Robotics）を使用して、単クローンをナイロンメンブレン上に配置した。培養物を96ウェルマイクロタイタープレートから移した後（1920個のクローン）、該メンブレンを22×22cm培養皿（Nunc）中のアンピシリン（50μg/ml）含有LB寒天の表面上に配置し、37℃で一晩インキュベートした。細胞がコンフルエントに達する前に、最初の変性工程後の追加的な処理として沸騰水浴上の変性溶液含浸パッド上の蒸気への該フィルターの5分間の曝露を含むHerrmann, B. G., Barlow, D. P.およびLehrach, H. (1987), Cell 48, pp. 813-825に記載の方法により、該メンブレンを処理した。
【０１８７】
ランダムヘキサマープライマー法（Feinberg, A. P.およびVogelstein, B. (1983), Anal. Biochem. 132, pp. 6-13）を用いて、高い比活性を有する［α-32P］dCTPの取り込みにより二本鎖プローブを標識した。サケ精子DNA（50μg/ml）を含有する50％（vol/vol）ホルムアミド、600mMリン酸ナトリウム（pH7.2）、1mM EDTA、10％ デキストラン硫酸、1％ SDSおよび10×デンハルト溶液中、42℃で6〜12時間、該メンブレンを32P標識プローブ（0.5〜1×106cpm/ml）とプレハイブリダイズおよびハイブリダイズさせた。典型的には、13〜30mM NaCl、1.5〜3mM クエン酸ナトリウム（pH6.3）、0.1％ SDS中、55〜65℃で約1時間にわたり洗浄工程を行い、Kodak増感スクリーンを使用して該フィルターを-70℃で12〜24時間にわたりオートラジオグラフィーに付した。これまで、個々のメンブレンは20回以上、成功裏に再利用されている。オートラジオグラフィーの間に、2mM Tris-HCl（pH8.0）、0.2mM EDTA、0.1％ SDS中、95℃で2×20分間のインキュベーションにより、該フィルターを剥がした。
【０１８８】
c）保存された遺伝子ライブラリーからの陽性コロニーの回収
無菌の使い捨てランセットを使用して、マイクロタイターウェル内の凍結細菌培養物を擦り取り、該物質をアンピシリン（50μg/ml）含有LB寒天ペトリ皿上にストリークした。ついで単コロニーを使用して液体培養物に接種して、アルカリ細胞溶解法（Birnboim, H. C.およびDoly, J. (1979), Nucleic Acids Res. 7, pp. 1513-1523）によりDNAを得た。
【０１８９】
d）完全長DNA
前記のとおり、適当な完全配列を有するインサートを保持するクローンを同定することが可能であった。これらのクローンは以下の内部名称を有する：
「オリゴ8v」：完全配列を有するインサートは、配列番号4に示す核酸配列を有する。これによりコードされるタンパク質は、好ましくは、配列番号5、6および7に示すアミノ酸配列の少なくとも1つを含む；
「オリゴ25/39v」：完全配列を有するインサートは、配列番号10に示す核酸配列を有する；
「オリゴ46v」：完全配列を有するインサートは、配列番号15に示す核酸配列を有する；
「オリゴ103v」：完全配列を有するインサートは、配列番号19に示す核酸配列を有する；
「オリゴ128v」：完全配列を有するインサートは、配列番号23に示す核酸配列を有する。これによりコードされるタンパク質は、好ましくは、配列番号24および25に示すアミノ酸配列の少なくとも1つを含む；
「オリゴ177v」：完全配列を有するインサートは、配列番号34に示す核酸配列を有する；
「オリゴ145v」：完全配列を有するインサートは、配列番号38に示す核酸配列を有する。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】本発明のアミノ酸部分配列（配列番号1の1092〜595位に対する相補鎖に対応する）（上側の配列）とサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグ「Cwp1」の部分配列（下側の配列）とのアライメントを示す。2つの配列間の同一の配列位置が示されている。類似の配列位置が「+」で示されている。
【図２】本発明のアミノ酸部分配列（配列番号8の1067〜84位に対する相補鎖に対応する）（上側の配列）とサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグARK1の部分配列（下側の配列）とのアライメントを示す。2つの配列間の同一の配列位置が示されている。類似の配列位置が「+」で示されている。
【図３】図3Aは、本発明のアミノ酸部分配列（配列番号12の475〜353位に対する相補鎖に対応する）（上側の配列）とサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグBUD2/CLA2の部分配列（下側の配列）とのアライメントを示す。図3Bは、本発明のアミノ酸部分配列（配列番号12の351〜1位に対する相補鎖に対応する）（上側の配列）とサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグBUD2/CLA2の部分配列（下側の配列）とのアライメントを示す。2つの配列間の同一の配列位置が示されている。類似の配列位置が「+」で示されている。
【図４】本発明のアミノ酸部分配列（配列番号17の933〜157位に対する相補鎖に対応する）（上側の配列）とサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグAor1の部分配列（下側の配列）とのアライメントを示す。2つの配列間の同一の配列位置が示されている。類似の配列位置が「+」で示されている。
【図５】本発明のアミノ酸部分配列（配列番号21の117〜794位の鎖に対応する）（上側の配列）とサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグYkl179cの部分配列（下側の配列）とのアライメントを示す。2つの配列間の同一の配列位置が示されている。類似の配列位置が「+」で示されている。
【図６】本発明のアミノ酸部分配列（配列番号26の438〜767位の鎖に対応する）（上側の配列）とサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグScp1の部分配列（下側の配列）とのアライメントを示す。2つの配列間の同一の配列位置が示されている。類似の配列位置が「+」で示されている。
【図７】図7Aは、本発明のアミノ酸部分配列（配列番号30の983〜651位に対する相補鎖に対応する）（上側の配列）とカンジダ・マルトーサ（C. maltosa）由来のMIPSタグEPD1の部分配列（下側の配列）とのアライメントを示す。図7Bは、本発明のアミノ酸部分配列（配列番号30の661〜596位に対する相補鎖に対応する）（上側の配列）とカンジダ・マルトーサ（C. maltosa）由来のMIPSタグEPD1の部分配列（下側の配列）とのアライメントを示す。図7Cは、本発明のアミノ酸部分配列（配列番号30の591〜1位に対する相補鎖に対応する）（上側の配列）とカンジダ・マルトーサ（C. maltosa）由来のMIPSタグEPD1の部分配列（下側の配列）とのアライメントを示す。それぞれの場合に、2つの配列間の同一の配列位置が示されている。類似の配列位置が「+」で示されている。
【図８】本発明のアミノ酸部分配列（配列番号36の2〜148位の鎖に対応する）（上側の配列）とサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のMIPSタグAip2の部分配列（下側の配列）とのアライメントを示す。2つの配列間の同一の配列位置が示されている。類似の配列位置が「+」で示されている。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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