(57)【要約】本発明は、血液流体サンプル中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）関連コレステロールの濃度を決定する方法およびこの方法を行うための診断アッセイデバイスが記載される。このアッセイ設計は、ＨＤＬ定量反応または同じサンプルで行われる他のアッセイを用いたこのような除去のために使用される試薬による妨害を防止する。所望される場合、非ＨＤＬリポタンパク質の除去およびＨＤＬコレステロールのアッセイは、このアッセイを中断することなく行われ得る。
2005522681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）もまた含む血液流体サンプル中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と関連する血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイスであって、該デバイスは、以下：
（ｉ）複数の多孔性要素であって、該要素を通って、該血液流体サンプルが毛細管作用および／または重力によって順番に流れ得る、複数の多孔性要素、
であって、該複数は、以下：
サンプル分配マトリクス；
該マトリクスの下流にあるＨＤＬ試験パッドであって、ここでＨＤＬ濃度がアッセイされ得る、ＨＤＬ試験パッド；および
該ＨＤＬ試験パッドの上流に、該流体サンプルに由来する非ＨＤＬリポタンパク質を選択的に結合して除去するに有効な固定化試薬を含む要素、
を備える、複数の多孔性要素；ならびに
（ｉｉ）（ａ）該ＨＤＬ試験パッドが該サンプル分配マトリクスと流体連絡しない、サンプル分配位置と、（ｂ）該試験パッドおよび分配マトリクスが互いに流体連絡している、試験位置との間に該デバイスを合わせるために有効な取り付け手段、
を備える、アッセイデバイス。
【請求項２】
請求項１に記載のデバイスであって、前記固定化試薬は、前記サンプル分配マトリクス内の第１のサンプル収集領域に固定化され、該領域は、該デバイスが前記試験位置にある場合に、前記ＨＤＬ試験パッドと流体連絡して配置される、デバイス。
【請求項３】
請求項１に記載のデバイスであって、前記固定化試薬は、前記分配マトリクスの下流かつ前記ＨＤＬ試験パッドの上流に位置した多孔性試薬パッドに固定化され、該試薬パッドは、該デバイスが前記試験位置にある場合に、該ＨＤＬ試験パッドと流体連絡して配置される、デバイス。
【請求項４】
請求項３に記載のデバイスであって、前記試薬パッドは、前記ＨＤＬ試験パッドに取り付けられる、デバイス。
【請求項５】
請求項１に記載のデバイスであって、反応バーをさらに備え、該反応バーに前記ＨＤＬ試験パッドが取り付けられている、デバイス。
【請求項６】
請求項５に記載のデバイスであって、前記取り付け手段は、前記サンプル分配位置と前記試験位置との間に、前記反応バーおよびカセット本体の相対位置を合わせるに有効である、デバイス。
【請求項７】
請求項１に記載のデバイスであって、前記取り付け手段は、（ｃ）前記試験位置から、前記ＨＤＬ試験パッドが前記サンプル分配マトリクスと流体連絡していない位置へと該デバイスを移すためにさらに有効である、デバイス。
【請求項８】
請求項１に記載のデバイスであって、前記固定化試薬は、ポリアニオン試薬を含む、デバイス。
【請求項９】
請求項８に記載のデバイスであって、前記固定化ポリアニオン試薬は、スルホネート多糖を含む、デバイス。
【請求項１０】
請求項１に記載のデバイスであって、前記ＨＤＬアッセイパッドは、バイオセンサを備える、デバイス。
【請求項１１】
請求項１０に記載のデバイスであって、前記バイオセンサは、酸素もしくは過酸化水素の生成を電気化学的に測定するに有効であり、該生成は、前記アッセイパッド内のＨＤＬ関連コレステロール濃度に依存する、デバイス。
【請求項１２】
請求項１に記載のデバイスであって、前記試薬パッドは、多孔性ポリマー膜を備える、デバイス。
【請求項１３】
請求項１２に記載のデバイスであって、前記ポリマー膜は、カチオン性表面基を含む、デバイス。
【請求項１４】
請求項１に記載のデバイスであって、前記試薬パッドは、多層積み重ね膜を備え、該多層積み重ね膜のうちの少なくとも１層は、非ＨＤＬリポタンパク質を結合するに有効な固定化試薬を含む、デバイス。
【請求項１５】
請求項１に記載のデバイスであって、前記ＨＤＬ試験パッドおよび前記試薬パッドの各々は、多孔性ポリマー膜である、デバイス。
【請求項１６】
請求項４に記載のデバイスであって、前記ＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドは、ともに積層されている、デバイス。
【請求項１７】
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）もまた含む血液流体サンプル中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と関連する血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイスであって、該デバイスは、以下：
該血液流体サンプルを分配するためのサンプル分配マトリクス；
該流体サンプル由来の非ＨＤＬリポタンパク質を選択的に除去するに有効な固定化試薬を含む試薬パッド；および
該試薬パッドと流体連絡しているＨＤＬ試験パッドであって、該ＨＤＬ試験パッドにおいて、ＨＤＬ濃度がアッセイされ得るＨＤＬ試験パッド；
を備え、
ここで該試薬パッドは、該サンプルマトリクスと流体連絡した状態にされ得る、デバイス。
【請求項１８】
請求項１７に記載のデバイスであって、前記固定化試薬は、スルホネート多糖を含む、デバイス。
【請求項１９】
請求項１７に記載のデバイスであって、前記試薬パッドは、カチオン性表面基を有する多孔性ポリマー膜を備える、デバイス。
【請求項２０】
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）もまた含む血液流体サンプル中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と関連する血清コレステロールを測定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該サンプルと、吸収性サンプル分配マトリクスとを接触させる工程であって、ここで該サンプル分配マトリクスは、アッセイデバイス内に含まれる複数の多孔性要素のうちの１つであり、該要素を通って、該血液流体サンプルは、毛細管作用および／または重力によって順番に流れ得、該複数の要素は、
該サンプル分配マトリクスの下流にあるＨＤＬ試験パッドであって、このＨＤＬ試験パッドにおいて、ＨＤＬ濃度がアッセイされ得る、ＨＤＬ試験パッド；および
該ＨＤＬ試験パッドの上流に、流体サンプル由来の非ＨＤＬリポタンパク質を選択的に結合して除去するに有効な固定化試薬を含む要素、
をさらに備える、工程；
（ｂ）該サンプルと、該固定化試薬を含む該要素とを接触させる工程；
（ｃ）該マトリクスを、該ＨＤＬ試験パッドと流体連絡させ、それにより、該サンプルを、該要素から該ＨＤＬ試験パッドへと移す工程；ならびに
（ｄ）該血液流体サンプル中のＨＤＬリポタンパク質の含有量を決定する工程；
を包含し、ここで工程（ｃ）の前に、該マトリクスは、該ＨＤＬ試験パッドと流体連絡していない、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記要素は、前記分配マトリクスの下流かつ前記ＨＤＬ試験パッドの上流に位置する、多孔性試薬パッドであり、該多孔性試薬パッドは、工程（ｃ）において該ＨＤＬ試験パッドと流体連絡状態にされる、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、工程（ｂ）の前に、前記マトリクスは、前記試薬パッドと流体連絡していない、方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法であって、工程（ｂ）において、前記マトリクスと、前記試薬パッドとを接触させる際に、該試薬パッドは、前記ＨＤＬ試験パッドと同時に流体連絡している、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記試薬パッドは、前記ＨＤＬ試験パッドに取り付けられている、方法。
【請求項２５】
請求項２０に記載の方法であって、前記マトリクスは、前記固定化試薬を含み、その結果、工程（ａ）および工程（ｂ）の接触は、同時に起こる、方法。
【請求項２６】
請求項２０に記載の方法であって、前記固定化試薬は、前記マトリクスの上流の篩分けマトリクス内に含まれ、かつ該マトリクスと接触し、その結果、工程（ａ）および工程（ｂ）の接触は、逆の順番で起こる、方法。
【請求項２７】
請求項２０に記載の方法であって、該方法は、所望の量のサンプルが移される場合に、前記マトリクスと前記試験パッドとの間の前記流体連絡を中断する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２８】
請求項２０に記載の方法であって、前記固定化試薬は、スルホネート多糖を含む、方法。
【請求項２９】
請求項２１に記載の方法であって、前記試薬パッドは、カチオン性表面基を有する多孔性ポリマー膜を備える、方法。
【請求項３０】
請求項２１に記載の方法であって、前記試薬パッドは、多層積み重ね膜を備え、該多層積み重ね膜のうちの少なくとも１層は、非ＨＤＬリポタンパク質を結合するに有効な固定化試薬を含む、方法。
【請求項３１】
請求項２０に記載の方法であって、前記ＨＤＬ試験パッドは、バイオセンサを備える、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記バイオセンサは、酸素もしくは過酸化水素の生成を電気化学的に測定するに有効であり、該生成は、前記試験パッド内のＨＤＬ関連コレステロール濃度に依存する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、血液流体サンプル中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）関連コレステロールの濃度を決定する方法およびこの方法を行うための診断アッセイデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
血中に存在するコレステロールの量は、冠状動脈疾患の危険性に関連することが公知である。コレステロールは、主にタンパク質結合形態で血中を循環する。コレステロールを輸送するタンパク質は、リポタンパク質であり、このリポタンパク質は、それらの密度に基づいて、３つのクラスに下位分類される。超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）は、ヒトにおいて、肝臓において合成され、最終的には、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に変換され、血漿コレステロールの大部分を輸送する、トリグリセリドリッチリポタンパク質である。高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、トリグリセリドリッチリポタンパク質の異化、ならびに末梢組織からのコレステロールの除去および肝臓への輸送に関与する、リポタンパク質である。血清ＨＤＬレベルと冠状動脈疾患の危険性との間の逆の関係が確立された。特に、ＨＤＬと関連した血清コレステロールの割合が、低い場合、冠状動脈疾患の危険性は、増大する。
【０００３】
危険性の評価およびアテローム生成疾患の管理における相対的血清コレステロールレベルの重要性に鑑みて、かなりの取り組みが、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ならびに総コレステロールおよびトリグリセリドの血清レベルについて、正常な個体および危険性の高い個体両方の大きな集団をスクリーニングすることに費やされてきた。危険性の高い個体の処置の有効性は、種々のリポタンパク質区画におけるコレステロールの血清レベルの通常の試験によって、モニターされてきた。
【０００４】
特定のＨＤＬコレステロール試験の１つの方法は、代表的には、第二族カチオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣａ２＋）の存在下での、ポリアニオン化合物（例えば、硫酸デキストラン、ヘパリン、またはリンタングステン酸）による、血清中の非ＨＤＬリポタンパク質の選択的沈澱に基づく。沈澱の特異性および程度は、種々の要因（沈澱試薬の型および濃度が挙げられる）に依存する。一般に、漸増濃度のポリアニオンでの血清コレステロール粒子の沈澱の順番は、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬである。ＨＤＬは、通常、低密度粒子を完全に沈澱させるヘパリンまたは硫酸デキストランの濃度では可溶性のままであるが、ＨＤＬの微量のａｐｏＥ種は、低密度粒子と同時に沈澱され得る。低密度粒子の選択的沈澱によって、ＨＤＬ血清コレステロールレベルが決定され得る。
【０００５】
代表的脂質アッセイ手順において、少量の血液を採血し、遠心分離して、透明な血漿または血清のサンプル流体を生成する。次いで、このサンプル流体を、（ａ）総血清コレステロール、（ｂ）トリグリセリド、および（ｃ）ＨＤＬコレステロールの測定のために、いくつかのアッセイチューブへとアリコートに分ける。そのＨＤＬサンプルを上記のように沈澱させ、低密度粒子を、コレステロール検出の前に、濾過または遠心分離によって除去する。次いで、そのサンプルを、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼを含む酵素ミックス、およびＨ２Ｏ２の存在下で異なって呈色する産物に酸化され得る色素と反応させる。これらのチューブを、分光光度計により読み取り得、所望の総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、およびＬＤＬコレステロールの値を決定し得る。
【０００６】
ここで記載される液相コレステロールアッセイで達成され得る正確さおよび信頼性にも拘わらず、このアッセイは、広く行き渡ったスクリーニングにおける使用に関して多くの制限がある。第１に、この方法は、静脈血液サンプルを使用し、血液サンプルを採血および分画するための熟練した技術者が必要である。そして処理血液を個々のアッセイチューブへとアリコートに分けることが必要である。そのサンプルチューブのうちの少なくとも１つ（ＨＤＬ測定用）は、沈殿剤で処理されなければならず、さらに処理して、沈澱物質を除去しなければならない。これらの手順のいくつかが自動化され得るが、この目的で設計された分析機械は高価であり、大きな病院以外には、広く利用可能でない。
【０００７】
共有に係る米国特許第５，２１３，９６４号、同第５，２１３，９６５号、同第５，３１６，１９６号および同第５，４５１，３７０号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）は、血清コレステロールレベルを測定するための液体アッセイ手順に関連した上記問題の多くを実質的に克服する方法およびアッセイデバイスを開示する。一実施形態において、このデバイスは、ＬＤＬ粒子およびＶＬＤＬ粒子もまた含む血液サンプル中のＨＤＬ関連コレステロールの濃度を測定するために設計されている。このデバイスは、流体サンプルがマトリクスを通って移動するときに、可溶性リポタンパク質と沈澱したリポタンパク質とを分離し得る篩分けマトリクスを備える。このマトリクスと関連するレザバは、流体サンプルがマトリクスへと引き込まれて通るときに、ＬＤＬおよびＶＬＤＬを選択的に沈澱させるために可溶性沈殿剤を放出するように設計される。このことにより、篩分けマトリクスを通るより速いＨＤＬ移動に基づいて、この沈澱したリポタンパク質からＨＤＬを分離することが可能になる。このように除去された非ＨＤＬリポタンパク質の流体サンプルは、次いで、コレステロールについてアッセイされる試験表面に移動される。
【０００８】
上記のデバイスは、液相アッセイを超える進歩を示す一方で、沈殿試薬での流れ輸送経路の汚染の可能性がある。このような試薬は、ＨＤＬ定量、またはマルチアッセイデバイスの他の領域で起こる他のアッセイ化学を妨害し得る。本発明は、これらの問題に対処し、克服する。
【０００９】
血液サンプル中のＨＤＬコレステロールを測定するためのさらなる方法およびデバイスは、ＥＰ  ０４０８２２３およびＥＰ  ０４１５２９８（Ｒｉｔｔｅｒｓｄｏｒｆら）に開示され、これらは、試験ストリップ上で行われる連続アッセイ方法を記載し、この方法は、以下の工程および対応する要素を包含する。この血液サンプルは、細胞性血液構成要素を分離するための分離層に供される。毛管力または重力により駆動されて、そのサンプルは、可溶性沈殿剤を含むさらなるキャリアを通って流動し、この可溶性沈殿剤は、血清サンプル中に溶解した後、サンプル中に含まれる非ＨＤＬリポタンパク質を沈澱させる。さらなるキャリアにおいて、上記のこの沈澱された構成要素は、血清サンプルから濾過されて、後のＨＤＬ定量との干渉を妨害する。同じキャリアにおいて、このサンプルは、ＨＤＬ定量キャリアと隣接した位置に輸送され、ＨＤＬ定量工程が開始されるまで、保存される。最後に、そのサンプルは、ＨＤＬ定量層に移され、このＨＤＬ定量層において、血清サンプル中のＨＤＬコレステロールは、酵素反応によって定量される。
【００１０】
このアッセイ設計の欠点は、レザバとして機能しているキャリアが、ＨＤＬ定量を妨害し得る、沈澱された構成要素または可溶性試薬をサンプルへと移動させることである。さらに、血清サンプルの保存の間に、ＨＤＬは、キャリア繊維に接着することによって捕捉され得、沈澱試薬は、さらに所望でない反応を引き起こし得、そのキャリアは、血清サンプルを乾燥させることによって詰まった状態になり得る。
【００１１】
米国特許第５，１３５，７１６号（Ｔｈａｋｏｒｅ）は、血液流体サンプル中のＨＤＬ定量のためのさらなるデバイスおよび方法を開示する。これらのデバイスにおいて、この流体サンプルは、中断されていない経路を通り、内部ウェルからＨＤＬ定量のためのキャリアへと連続して流れる。従って、ＨＤＬ試験キャリアに入るサンプル容量を制御し、ＨＤＬアッセイのための環境条件を制御する能力は、制限される。このデバイスは、単一の流体サンプルに由来する種々の分析物の同時アッセイを提供することもない。
【００１２】
従って、本発明の目的は、上記の先行技術の欠点を克服するＨＤＬアッセイデバイスおよび方法を提供することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
一局面において、本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および／または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）もまた含む血液流体サンプル中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と関連する血清コレステロールを測定するアッセイデバイスを提供する。このデバイスは、以下を備える：
（ｉ）複数の多孔性要素（これを通って、このような血液流体サンプルは、順番に、毛細管作用および／または重力によって流動し得る）であって、
ここでこの複数の要素は、以下を備える：サンプル分配マトリクス；このマトリクスの下流にあるＨＤＬ試験パッドであって、この試験ＨＤＬパッドにおいてＨＤＬ濃度がアッセイされ得る、ＨＤＬ試験パッド；およびＨＤＬ試験パッドの上流にある、流体サンプルに由来する非ＨＤＬリポタンパク質を選択的に結合して、除去するために有効な固定化試薬を含む要素。
【００１４】
このデバイスは、さらに以下を備える：（ｉｉ）（ａ）サンプル分配位置（ここでこのＨＤＬ試験パッドは、サンプル分配マトリクスと流体連絡していない）と（ｂ）試験位置（ここでこのＨＤＬ試験パッドおよび分配マトリクスは、互いに流体連絡している）との間にデバイスを合わせるために有効な取り付け手段。
【００１５】
好ましくは、この固定化試薬は、ポリアニオン試薬、より好ましくは、スルホネート多糖を含む。一実施形態において、この固定化試薬は、サンプル分配マトリクス内の第１のサンプル収集領域に固定化される。この第１のサンプル収集領域は、デバイスが試験位置にある場合、ＨＤＬ試験パッドと流体連絡状態にされる。別の実施形態において、この固定化試薬は、その分配マトリクスの下流かつＨＤＬ試験パッドの上流に位置する多孔性試薬パッドに固定化される。この試薬パッドは、このデバイスが試験位置にある場合に、ＨＤＬ試験パッドと流体連絡状態にされる。この試薬パッドは、ＨＤＬ試験パッドに取り付けられ得る。
【００１６】
好ましくは、このデバイスは、さらに以下を備える：サンプル分配マトリクスの上流にありこのサンプル分配マトリクスと接触して、血液流体サンプルから細胞成分を除去するに有効な篩分けパッド、および篩分けパッドを備え、そして血液流体サンプルを含むためのウェルをさらに備えるカセット本体（このウェルは、篩分けパッドおよびサンプル分配マトリクスと流体連絡している）。
【００１７】
好ましくは、このデバイスはまた、反応バーを備え、この反応バーに対して、ＨＤＬ試験パッドが取り付けられ、上記の取り付け手段は、サンプル分配位置と試験位置との間に、反応バーおよびカセット本体の相対位置を合わせるために有効である。取り付け手段はまた、反応バーをカセット本体に取り付ける。好ましくは、この取り付け手段は、デバイスを、その試験位置からＨＤＬ試験パッドが、サンプル分配マトリクスと流体連絡しない位置へと移すためにさらに有効である。
【００１８】
一実施形態において、このサンプル分配マトリクスは、さらなるサンプル収集領域を備え、反応バーは、さらなる試験パッドを備える。その結果、さらなるパッドは、デバイスが試験位置に移された場合に、さらなるサンプル収集領域と流体連絡した状態になる。
【００１９】
代表的には、このＨＤＬ試験パッドは、ＨＤＬコレステロールの存在下で、試験パッドにおいて検出可能な変化を生じ、一実施経緯対においては、光学的に検出可能な変化を生じる試薬を含む。このＨＤＬアッセイパッドは、バイオセンサを備え得、このバイオセンサは、好ましくは、酸素または過酸化水素の生成を電気化学的に測定するために有効である。この酸素または過酸化水素の生成は、アッセイパッド内のＨＤＬ関連コレステロール濃度に依存する。
【００２０】
一実施形態において、この試薬パッドは、多孔性ポリマー膜を備える。好ましい実施形態において、固定化試薬がアニオン試薬（例えば、スルホネート多糖）である場合、このポリマー膜は、カチオン性表面基を含む。さらなる実施形態において、ＨＤＬ試験パッドおよび試薬パッドの各々は、多孔性ポリマー膜であり、この膜は、ともに積層されている。
【００２１】
別の局面において、本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および／または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）もまた含む血液流体サンプル中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と関連する血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイスを提供する。このデバイスは、以下を備える：血液流体サンプルを分配するためのサンプル分配マトリクス；流体サンプル由来の非ＨＤＬリポタンパク質を選択的に除去するに有効な固定化試薬を含む試薬パッド；およびＨＤＬ試験パッドであって、ＨＤＬ濃度がアッセイされ得、この試薬パッドと流体連絡状態にされ得るＨＤＬ試験パッド；ここでこの試薬パッドは、サンプルマトリクスと流体接触した状態にされ得る。好ましくは、この試薬パッドは、サンプルマトリクスと流体接触していない位置から、サンプルマトリクスとの流体接触へともたらされ得る。
【００２２】
この固定化試薬は、好ましくは、スルホネート多糖を含み、この試薬パッドは、好ましくは、カチオン性表面基を有する多孔性ポリマー膜を備える。
【００２３】
関連する局面において、本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および／または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）もまた含む血液流体サンプル中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と関連する血清コレステロールを測定する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）このようなサンプルと、吸収性サンプル分配マトリクスとを接触させる工程であって、ここでこのサンプル分配マトリクスは、アッセイデバイス内に含まれる複数の多孔性要素のうちの１つであり、この要素を通って、このサンプルは、毛細管作用および／または重力によって順番に流れ得、
ここでこの複数の要素は、このサンプル分配マトリクスの下流にあるＨＤＬ試験パッドであって、このＨＤＬ試験パッドにおいて、ＨＤＬ濃度がアッセイされ得；そして
ＨＤＬ試験パッドの上流に、流体サンプル由来の非ＨＤＬリポタンパク質を選択的に結合して除去するに有効な固定化試薬を含む要素、
をさらに備える、工程；
（ｂ）サンプルと、固定化試薬を含む要素とを接触させる工程；
（ｃ）マトリクスを、ＨＤＬ試験パッドと流体連絡させ、それにより、サンプルを、要素からＨＤＬ試験パッドへと移す工程；ならびに
（ｄ）血液流体サンプル中のＨＤＬリポタンパク質の含有量を決定する工程。
【００２４】
この方法に従って、工程（ｃ）の前に、このマトリクスは、ＨＤＬ試験パッドと流体連絡していない。
【００２５】
好ましくは、固定化試薬含有要素は、多孔性試薬パッドであり、分配マトリクスの下流かつＨＤＬ試験パッドの上流に位置し、この試薬パッドは、工程（ｃ）においてＨＤＬ試験パッドと流体連絡状態にされる。この方法の一実施形態において、このマトリクスは、工程（ｂ）の前に、試薬パッドと流体連絡していない。好ましくは、工程（ｂ）において、マトリクスと試薬パッドとを接触させる際に、試薬パッドは、ＨＤＬ試験パッドと同時に流体連絡している。この試薬パッドは、好ましくは、ＨＤＬ試験パッドに取り付けられ得る。
【００２６】
別の実施形態において、固定化試薬含有要素は、マトリクスであり、その結果、工程（ａ）および工程（ｂ）の接触は、同時に起こる。
【００２７】
なお別の実施形態において、この固定化試薬は、このサンプル分配マトリクスの上流の篩分けマトリクス内に含まれ、このマトリクスと接触し、その結果、工程（ａ）および工程（ｂ）の接触は、逆の順番で起こる。
【００２８】
好ましくは、この方法は、所望の量のサンプルが移される場合に、このマトリクスとこの試験パッドとの間の流体連絡を中断する工程をさらに包含する。
【００２９】
この方法の好ましい実施形態において、この固定化試薬は、スルホネート多糖を含み、そしてこの試薬パッドは、カチオン性表面基を有する多孔性ポリマー膜を備える。
【００３０】
この試薬パッドにおけるＨＤＬコレステロールの指標は、光学的に検出され得る。このＨＤＬ試験パッドはまた、バイオセンサを備え得る。このバイオセンサは、好ましくは、酸素もしくは過酸化水素の生成を電気化学的に測定するに有効であり、この生成は、この試験パッド内のＨＤＬ関連コレステロール濃度に依存する。
【００３１】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、本発明の以下の発明の詳細な説明を添付の図面とともに読めば、より十分に明らかになる。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
以下の用語は、別段示されなければ、以下の意味を有する。
【００３３】
第１の要素は、流体が第１の要素から第２の要素へと移動し得る場合に、連続固体要素の経路を介して、毛細管作用および／または重力の原動力（ｉｍｐｅｔｕｓ）下で第２の要素と「流体連絡」または「流体接触」する。第１の要素および第２の要素は、直接接触し得るか、またはそこを通って、流体が通過し得る要素は、第１の要素および第２の要素が固体要素の連続する経路によって接続される限り、中断され得る。
【００３４】
１つの要素は、流体が毛細管作用および／または重力を介して１つの要素から他の要素へと移動することができない場合、別の要素と「流体連絡していない」。代表的には、この要素は、物理的に分離している（すなわち、離れて間隔を空けられている）。
【００３５】
「パッド」（例えば、試薬パッドまたはアッセイパッド）は、本明細書中に使用される場合、任意の材料（例えば、多孔性膜または繊維状ストリップ）を含み得、このパッドは、浸漬された試薬または固定化試薬を含み得、このパッドを通って、流体が毛細管作用および／または重力を介して動き得る。
【００３６】
（ＩＩ．アッセイデバイス）
図１〜４は、本発明に従って構築されたマルチ分析物アッセイデバイス１４の種々の実施形態を示す。図４は、分解組み立て様式で示される。このデバイスは、少量の血液サンプル、代表的には、１０〜５０μｌの間の血液を用いて、特にＨＤＬと関連する血清コレステロール（ＨＤＬ関連コレステロールまたは単にＨＤＬコレステロールともいわれる）を決定するために設計される。他のアッセイ（例えば、総コレステロールまたはトリグリセリドレベル）は、同じサンプルから同時に決定され得る。ＨＤＬ関連コレステロールの決定はまた、単に、ＨＤＬの決定またはＨＤＬアッセイといわれ得る。
【００３７】
この装置は、主要本体または支持体１５を備え、これらは、一定量の血液サンプル、代表的には、約２５〜５０μｌの間の量を受容するような寸法およびサイズにされたウェル１６を規定する。このウェルは、篩分けパッド２２と流体接触し、支持体の上端に形成されたノッチ領域２０において保持され得る。この流体接触は、図１に示されるデバイスと同様に、そのウェルの基部においてプレート上に形成される毛細導管１８によって直接提供され得る。この支持体は、好ましくは、標準的な成型法または機械加工法によって形成されるウェル、ノッチ領域および／または毛細管を有するプラスチックプレートである。
【００３８】
領域２０において保持される篩分けパッド２２は、図に示されるように、サンプルが底から頂部の方向でパッドマトリクスを通って移動する場合に、大きな粒状物（血球を含む）を部分的に除去するように機能する。パッド２２は、好ましくは、血液サンプルがマトリクスを通して引き出される場合に、表面湿潤によって水性流体を引き出し、血球の動きを阻止するように設計された材料のガラス繊維状マトリクスから形成される。１つの例示的パッドは、ガラスファイバーフィルタ（例えば、Ｗｈａｔｍａｎによって供給されるＧＦ／ＤまたはＰＤ００８フィルタ）であり、このフィルタは、約０．１６ｇ／ｃｍ３のパッキング密度（ｐａｃｋｉｎｇ  ｄｅｎｓｉｔｙ）および約１ｍｍの厚みを有する。このパッドは、規定容量のサンプル流体、好ましくは、約１５〜２５μｌの間の容量を吸収するような寸法にされている。篩分けパッド２２は、さらに、赤血球捕捉試薬（例えば、レクチン、赤血球表面膜タンパク質（トロンビン）に特異的な抗体、またはイオン交換薬剤）を含み得る。一実施形態において、このパッドは、以下にさらに記載されるように、非ＨＤＬリポタンパク質の除去のための固定化試薬を含み得る。
【００３９】
次に、篩分けパッド２２は、細長ストリップまたはサンプル分配マトリクス２６と接触する。細長ストリップまたはサンプル分配マトリクス２６は、プレート１５の上側縁部に沿って延びる。このストリップはまた、図４に示されるように、発泡体緩衝材（ｆｏａｍ  ｃｕｓｈｉｏｎ）２７または他の支持体によって支持され得る。マトリクス２６は、サンプル流体を、中心サンプル付与領域２８（これは、パッド２２と流体接触している）からサンプル収集領域（例えば、マトリクス内の３０、３２）へと分配するように働く。このマトリクスは、好ましくは、ガラス繊維から形成される。このマトリクスのパッキング密度および厚みは、例えば、ストリップのサンプル付与領域からストリップのサンプル収集領域へと供給されるサンプル流体のある量（例えば、１０〜２５μｌ）を吸収し、分配するためのものである。このマトリクスは、約０．１６ｇ／ｃｍ３と４．０ｇ／ｃｍ３との間の好ましいパッキング密度を有する。１つの例示的なストリップ材料は、約０．２ｇｍ／ｃｍ３のパッキング密度および約０．１２ｍｍの厚みを有する、Ｗｈａｔｍａｎから入手可能なＦ−１６５−２５Ａガラス繊維フィルタである。
【００４０】
デバイス１４はまた、示されるように、細長支持体６２から構成される反応バー６０、ならびに支持体の下部表面に保持される複数のぬらすことができる吸収性反応試験パッド６４、６６、６８および７０を備える。支持体６２は、透明であるかまたはウィンドウ（例えば、ウィンドウ７６（図４））を有し、このウィンドウにより、支持体を通ってパッドが見えるようになる。これらのウィンドウは、透明な材料であり得るか、または単に、支持体における開口部であり得る。反応バーにおける反応試験パッドは、透明もしくは半透明の接着材料によって、または音波溶接（ｓｏｎｉｃ  ｗｅｌｄｉｎｇ）もしくは他の適切な接着法によって、支持体に取り付けられる。特定のアッセイにおいて使用される各試験パッドは、以下にさらに記載されるように、公知の様式で検出され得る、パッドにおける分析物依存性変化を生成するために有効な、分析物依存性試薬を含む。試験パッドの全てまたは任意の一体型サブセットは、特定のアッセイにおいて使用され得る。
【００４１】
望ましくは、この反応試験パッドは、多孔性ポリマー膜であり、好ましくは、約１００〜１５０μｍの厚みおよび約３ｍｍの側方寸法（ｓｉｄｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）を有する。各パッドの吸収容量は、好ましくは、約０．５〜１．０μｌの間である。一実施形態において、反応パッドのいくつかまたは全てが、非対称膜；すなわち、その膜の厚みを横切って間隙率勾配（ｐｏｒｏｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）を有する膜である。
【００４２】
その反応バーは、（ａ）サンプル分配位置（ここでこの試験パッド、および一実施形態においては、この試薬パッド（以下にさらに詳細に記載される）が、サンプル分配マトリクスから離れて間隔を空けられている）にデバイスを維持し、そして（ｂ）このデバイスを、試験位置（ここでこの試験パッド、存在するのであれば試薬パッド、およびサンプル分配マトリクスが全て流体連絡している）へと移すために有効な取り付け手段によって、支持体１５に対して取り付けられる。この取り付け手段はまた、所望の量のサンプルが、試験パッドに入った後、そして／または決定された接触時間の後に、その試験位置から、試験パッドがサンプル分配マトリクスと流体連絡していない位置（この位置は、「サンプル分配」位置と同じであり得る）へとそのデバイスを移すことにより、このような流体連絡を分断するために使用され得る。このような移動は、試験パッドの表面の頂部表面での反射率をモニタリングすることによって制御され得る。この頂部表面は、共有に係る米国特許第５，１１４，３５０号に記載されるように、湿潤の程度を反映する。あるいは、パッド材料の吸収能およびサンプル取り込み速度が既知である場合、そのサンプルの量は、単に所定の接触時環を使用することによって、十分正確に制御され得る。
【００４３】
取り付け手段は、例えば、１対の弾性部材（例えば、エラストマーブロック７１、７２）を備え得る。これらの弾性部材は、試験パッドを付勢するように作用し、一実施形態においては、試薬パッドを、非移動位置またはサンプル分配位置に向かって付勢するように作用する。この位置において、パッドは、サンプル分配マトリクスから離れて間隔が空けられ得る。弾性部材の圧縮または解放によって、サンプル分配マトリクス２６と、ＨＤＬ試験パッド６４と、そして／または試薬パッド７４（以下にさらに記載される）との間の流体連絡は、選択的に確立され、分離され得る。この流体連絡は、直接接触を介し得るかまたは中間要素を通じてであり得る。その支持体ブロックは、バネ様作用またはピストン様作用によって圧縮され得る。あるいは、外部機械的デバイスが、主要本体１５および／または支持体６２を係合し得、一方を他方に向かって動かし得る。このようなデバイスは、従来の構成要素（例えば、クランプ、ピストン、ステッパーモーター、ウォームギアなど）を備え得る。例示的なシステムは、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｃｈ  ＬＤＸ（登録商標）分析器であり、本明細書中に記載のようなアッセイデバイスと共に使用するために有利な内蔵式の自動化分析器である。
【００４４】
ＨＤＬアッセイ流れ経路中で、ＨＤＬ試験パッドの上流に提供されるのは、流体サンプル、非ＨＤＬリポタンパク質に結合し、これらから取り出すために有効な、ポリアニオン試薬がその上に固定化された要素である。この要素は、篩分けパッドまたはサンプル分配マトリクスであり得る。好ましくは、このような固定化試薬を有する別個の試薬パッド７４は、サンプル分配マトリクスとＨＤＬ試験パッドとの間に提供される。この試薬パッドは、図３に示されるように、サンプル分配マトリクスに固定され得るか、またはより好ましくは、図１および４に示されるように、ＨＤＬをアッセイするために使用される試験パッドに固定され得る。固定化結合試薬は、要素２２、２６、および７４の任意または全てに存在し得る；好ましくは、これらの試薬は、試薬パッド７４に制限される。
【００４５】
このような試薬パッド７４はまた、図２に示されるように、ＨＤＬ試験パッドとマトリクス２６のサンプル収集領域との間の実質的に同一平面位置に支持され得る。例えば、圧縮可能な支持体要素７３は、マトリクスの上に試薬パッド７４を支持し得、その結果、反応バーの主要本体に向かう動き（または逆も同様）は、これらの領域を流体連絡状態に、好ましくは、まず、試験パッド６４を、試薬パッド７４の上部表面と流体連絡状態にし、次いで、試薬パッドの下部表面を、サンプル分配マトリクスと流体連絡状態にする。上記のように、流体連絡は、図に例示されるように、直接接触によって、または中間要素を介してであり得る。
【００４６】
この試薬パッドは、好ましくは、約１００〜１５０μｍの厚み、約３×６ｍｍの側部寸法、および約０．５〜１．０μｌの吸収量を有する。この試験パッドは、ＬＤＬ粒子およびＶＬＤＬ粒子を流体サンプルから選択的に除去するために有効な固定化試薬を含む。この試薬は、例えば、抗体、または好ましくは、ポリアニオンＬＤＬ結合試薬およびＶＬＤＬ結合試薬であり得る。当該分野で公知のこのような試薬としては、第ＩＩ族カチオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣａ２＋）の存在下または非存在下での、スルホネート多糖、ヘパリン、およびリンタングステン酸が挙げられる。好ましい試薬は、必要に応じて、中性ｐＨを維持するように緩衝化された、酢酸マグネシウムまたは塩酸マグネシウムと組み合わせて、代表的には分子量５０，０００〜５００，０００ダルトンを有するスルホネート多糖（例えば、硫酸デキストラン）である。
【００４７】
この試薬パッドは、試薬パッド内の結合した非ＨＤＬリポタンパク質をトラップし、非ＨＤＬリポタンパク質がＨＤＬ試験パッド６４に入らないようにするために有効である。結合試薬は、キャリアに固定化され、流体サンプル中で可溶性ではないので、沈澱サンプル構成要素および沈澱試薬のＨＤＬ試験パッドへの移動が避けられる。
【００４８】
好ましい実施形態において、試薬パッド７４は、約１ミクロン以下の孔サイズを有する多孔性ポリマー膜から構成される。一実施形態において、このポリアニオン試薬（例えば、硫酸デキストラン）は、静電力および／または正に荷電した表面基を有する膜に共有結合することによって固定化され得る。この目的のための例示的材料は、表面の４級アンモニウム基を有するナイロン膜（例えば、Ｃｕｎｏ  Ｃｏｒｐ．（Ｍｅｒｉｄｉａｎ，ＣＴ）によって提供されるＡＭ０８０膜）である。カチオン表面を有する他の市販のポリマー膜としては、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｎｙ＋ＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、Ｚｅｔａｂｉｎｄ（登録商標）（これもまたＣｕｎｏ  Ｃｏｒｐ．製）、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ（登録商標）（ＮＥＮ／ＤｕＰｏｎｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＰｏｓｉｄｙｎｅ（登録商標）（ＰａｌｌＣｏｒｐ．，Ｇｌｅｎ  Ｃｏｖｅ，ＮＹ）が挙げられる。
【００４９】
米国特許第５，５４３，０５４号（Ｃｈａｒｋｏｕｄｉａｎら）は、負に荷電した炭水化物を、膜表面上に正に荷電した部分に近接した反応性部分を有する膜に共有結合するための方法を記載する。この膜は、例えば、多孔性ポリマー（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリメタクリレート、ポリスルホン、またはＨｅｒｃｕｌｅｓ  Ｒ−４３０８ＴＭをコーティングしたポリスチレン、ポリアミド−ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂）である。
【００５０】
正に荷電した膜の場合、上記のように、膜は、自動化分配プロセスを介してポリアニオンの溶液に浸漬され得、乾燥され得る。この膜はまた、二価カチオンに浸漬され得る。あるいは、この試薬は、小さな粒子に固定化され得、次いで、適切な膜に付与され得る。
【００５１】
試薬をガラス繊維上に固定化するために、結合試薬が篩分けマトリクスおよび／またはサンプル分配マトリクスに固定化される実施形態において、その繊維は、上記のように、まず、カチオンポリマーでコーティングされ得る。あるいは、そのガラス繊維は、シリカベースの表面の官能化について当該分野で公知のように、シロキサン基およびカチオン基を含む試薬（例えば、３−（トリエトキシシリル）プロピルトリメチルアンモニウムクロリドまたは同様の試薬）で官能化され得る。
【００５２】
ポリアニオン結合試薬はまた、膜または他の基材（例えば、線維性基材）に、共有結合によって固定化され得る。多糖を種々の基材に共有結合する種々の化学的方法は、当該分野で公知である（例えば、米国特許第４，７４４，８９９号（Ｔａｎｉら）、同第６，２８１，２０２号および同第６，００８，２０３号（Ｍａｇｎａｎｉら）、同第６，２０４，２５４号（Ｎｅｌｓｏｎら）、同第６，０６０，５２５号（Ｓｌｉｎｇｓｂｙら）、同第５，９１９，５２３号（Ｓｕｎｄｂｅｒｇら）、および同第５，８１１，５３２号（Ｈｏｕｓｅ）を参照のこと）。例えば、ヒドロキシル含有表面は、エピクロロヒドリンで改変されて、エポキシド化表面が生成され得、この表面は、多糖中のヒドロキシル基と反応する。あるいは、この多糖は、求電子基（例えば、エポキシド、エステル、またはアルデヒド）を含むように改変され得、次いで、この求電子基は、アミノ含有表面またはチオール含有表面と反応し得る。ガラス表面またはガラス繊維、ならびに他のヒドロキシ含有表面への結合のために、官能化シラン試薬（例えば、アミノアルキルトリアルコキシシランまたはヒドロキシアルキル−トリアルコキシシラン）は、特に有用である。
【００５３】
一実施形態において、試薬パッド７４は、単一の要素からなる。本発明はまた、多層（すなわち、約６までの）積み重ね膜の使用を企図し、ここで少なくとも１つの膜および好ましくは各々の膜は、非ＨＤＬリポタンパク質の結合のための（試薬パッド７４のための）試薬を含む。
【００５４】
一実施形態において、試験パッド６４はまた、ポリマー膜であり、この膜は、ＨＤＬレベルをアッセイするための試薬を含む。所望であれば、ＨＤＬアッセイ試薬（例えば、ペルオキシダーゼ）は、酵素固定化の周知の方法に従って、試験パッド膜に固定化され得る（例えば、米国特許第４，９９９，２８７号；米国特許第５，４１９，９０２号；Ｂｌｕｍ，Ｌ．Ｊ．ら，Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．２０（２）：３１７−２６（１９８７）；Ｋｉａｎｇ，Ｓ．Ｗ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２２（８）：１３７８−８２（１９７６）；Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ，Ｇ．Ｇ．編，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  ｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（１９８４）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１１：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９１）を参照のこと）。別の実施形態において、任意の生成された、試験パッド６４から下流に拡散し得る過酸化水素を分解するために有効な試薬（例えば、カタラーゼ）は、試薬パッド７４において含められ得る。
【００５５】
好ましい実施形態において、２つの結合されたポリマー膜が試験パッド６４および試薬パッド７４、それぞれに使用される場合、この適切な試薬は、浸漬されるかまたは固定化され、これらの膜は、製造の間に、アッセイデバイスに組み込むための２つの膜層として処理される。
【００５６】
さらなる実施形態において、このＨＤＬアッセイパッドは、記載されるように、バイオセンサ（例えば、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ公開番号ＷＯ９９５８９６６（Ｄｏｂｓｏｎら））を備える。この文書は、マイクロスケールのバイオセンサデバイスを開示し、このデバイスは、導電表面、この導電性表面に重層される誘電材料の層、および誘電層を通って延びる複数の孔を備える。この孔の各々は、この導電性表面と接触した生体ポリマーを含み、化学的応答を電気シグナルに変換するマイクロ電極として作用し得る。使用時に、アッセイされる分析物を含む流体は、生体ポリマーと接触するように、孔に適用される。本発明のＨＤＬアッセイデバイスにおいて、このことは、サンプル流体を含む試薬パッド７４が、ＨＤＬアッセイパッド；すなわち、このバイオセンサの孔含有表面と流体接触状態にされるかまたは流体接触が維持される場合に達成される。
【００５７】
そのマイクロ電極孔内の生体ポリマーは、代表的には、ＨＤＬ関連コレステロールの測定のための酵素（例えば、コレステロールオキシダーゼ）である。コレステロールは、コレステロールオキシダーゼによって、対応するケトンに酸化されて、過酸化水素を遊離する。この過酸化水素は、次いで、酵素ペルオキシダーゼによって水および酸素に変換され得る。酸素または過酸化水素のいずれかは、次いで、電気化学的に測定され得る。使用され得る電気化学的方法としては、Ｃｌａｒｋ酸素電極（この電極は、酸素の還元または過酸化水素の酸化によって発生した電流を測定する）におけるような電流測定法、またはボルタンメトリー法が挙げられる。マイクロ電極におけるサイクリックボルタンメトリー（ｃｙｃｌｉｃ  ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）の使用は、ドパミン（Ｐｉｈｅｌら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８（１３）２０８４−９（１９９６）およびフラーレン（Ｓｏｕｃａｚｅ−Ｇｕｉｌｌｏｕｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５（６）：６６９−７２（１９９３））ならびに過酸化水素（Ｈｏｒｒｏｃｋｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５（２４）：３６０５−１４（１９９３）；Ｎｏｗａｌｌら，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ  ９（２）：１０２−９（１９９７）；Ｄｅｑｕａｉｒｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４（２）：２４０−５３（２００２））のような種々の分析物（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２８９−２９７（１９９４）を参照のこと）の測定のために記載されている。
【００５８】
（ＩＩＩ．アッセイ法）
操作時に、血液サンプルは、ウェル１６に配置され、篩分けパッド２２を通して吸収され、ここで大きな粒子（赤血球を含む）が除去され、そこからサンプル分配マトリクス２６へと入る。これらの工程は、デバイスが「サンプル分配」ステージにある間に起こり、その結果、サンプル分配マトリクスは、試験パッドと流体連絡しておらず、特定の実施形態（例えば、図１〜２）においては、試薬パッド７４とも流体連絡していない。
【００５９】
試験パッドを接触させる前のある点において、サンプル血清は、固定化結合試薬と接触し、この試薬は、篩分けマトリクス、サンプル分配マトリクス、またはより好ましくは、別個の試薬パッドに含まれ得、その結果、非ＨＤＬリポタンパク質は、それぞれのキャリアに結合される。このデバイスは、従って、血清含有液相ＨＤＬのＨＤＬ試験パッド６４への通過を可能にする間に、血清から非ＨＤＬリポタンパク質を除去するために有効である。一実施形態において、この除去は、デバイスがサンプル分配位置にある間に；すなわち、その試薬が、篩分けパッド、サンプル分配マトリクス、または好ましくは、別個の試薬パッドに固定化され、これらは、これらの要素と流体連結される場合（例えば、図３）に起こる。
【００６０】
さらに好ましい実施形態において、この試薬は、試薬パッド７４に固定化され、この試薬パッド７４は、サンプル分配ステージの間（例えば、図１〜２および４に示されるように）に、篩分けマトリクスにも、サンプル分配マトリクスにも流体連絡されない。別個の試薬パッドを使用する図１〜４の実施形態の１つの利点は、サンプル分配マトリクスおよび上流の要素が、非ＨＤＬ結合試薬を含まないことである；このような試薬は、試薬パッド７４においてのみ存在する。従って、これらの試薬から妨げられる可能性は、ＨＤＬ以外の分析物のアッセイにおいては、排除される。
【００６１】
血清サンプルがサンプル収集部位（例えば、部位３０およびマトリクス２６の端部に隣接する部位３２）に達する場合、このデバイスは、好ましくは、反応バー６０を動かすことによって、試験位置に隣接されて、試験パッド６４、６６、６８、および／または７０を、図１〜２および４の実施形態においては、試薬パッド７４を、マトリクスと流体連絡状態にする。この位置において、マトリクス中のサンプル流体は、毛細管流によって試験パッドに引き出される。この反応バーは、試験パッドの湿潤の所望される程度が達成されるまで、この位置に保持される。次いで、このバーは、所望であれば、サンプル流体の所望される量が試験パッドに入ったとき、そして／または適切な接触時間の後に、サンプル分配マトリクスと試験パッドの間の流体連絡を分断するように動かされる。
【００６２】
試薬パッド７４が試験パッド６４とサンプル分配マトリクス２６との間に位置するが、いずれにも固定されない（例えば、図２）デバイスの実施形態において、反応バーおよび主要本体の互いへ向かうそれぞれの動きは、代表的には、反応バーを下向きに動かすことによって、好ましくは、まず、試験パッド６４を図１および４に示される要素の配置に近づくように、試薬パッド７４と流体連絡状態にし、次いで、さらなる動きによって、試薬パッドをサンプル分配マトリクスと流体連絡状態にすることによって、これらの３つの領域を流体連絡状態にする。接触は、上記のように、湿潤の所望される程度が達成されるまで維持される。
【００６３】
操作の間、図１〜２および４に例示される（結合試薬が要素７４に制限されることにおいてさらに特徴づけられる）ような実施形態において、サンプル流体が、パッド７４および６４を含むＨＤＬアッセイ経路を通過すると、その先導縁部（ｌｅａｄｉｎｇ  ｅｄｇｅ）は、パッド７４を通って上方向に通過し、ここで非ＨＤＬリポタンパク質が反応し、トラップされ、隣接するアッセイパッド６４に直接トラップされ、ここでＨＤＬは、ＨＤＬ関連コレステロールの測定のために、そのアッセイパッド６４においてアッセイ試薬と反応する。さらに、サンプルの一部は、この時間の間にパッド７４と接触し続け、類似の様式で、パッド６４の吸収能に達するまで、パッド７４からパッド６４へと進む。従って、試験パッド６４中のＨＤＬ関連コレステロールの定量は、試薬パッド７４中で生じる結合反応と同時に生じる。好ましくは、ＨＤＬアッセイ経路へと（パッド７４および６４を含む）サンプル分配マトリクスから移されるサンプル流体の容量は、試験パッド６４の吸収能以上であり、かつ試験パッド６４および試薬パッド７４の合わせた吸収能以下である。
【００６４】
これらの実施形態において、サンプル流体が固定化結合試薬を含む試薬パッド７４と接触する場合、固定化結合試薬は、ＨＤＬ試験パッド６４と直接接触しており、従って、ＨＤＬアッセイ反応の前に、血液サンプルと結合試薬との一時的な接触を、制限する。サンプル調製物およびＨＤＬ評価は、従って、別個の工程で行われ、ここでサンプル調製物は、例えば、細胞性血液成分の濾過、および必要に応じて、血液サンプルの一時的な貯蔵および血液サンプルの、温度、圧力および環境雰囲気のような試験要件または条件への適合を包含する。血液サンプルの異なる試薬との一時的接触が減少されるので、ＨＤＬ評価の任意の化学的妨害が、防止される。これらの試薬が固定化されるので、これらの試薬は、試薬パッドから隣接する要素へ移動しないようである。所望であれば、このアッセイは、サンプル付与および細胞成分の除去の後であるが、結合試薬との接触の前に、例えば、周辺の雰囲気に適合させるため、または環境温度を、試験を支持するために合わせるために所望の時間の間中断され得る。これは、デバイスを、サンプル分配位置に維持することによって達成される。この目的のために、このサンプル分配マトリクスは、必要な場合、さらにレザバとして働くように設計される。
【００６５】
このＨＤＬ試験パッドは、ＨＤＬ関連コレステロールの定量のための試薬を含む。好ましくは、これらは、遊離コレステロールをＨＤＬから遊離するためのコレステロールエステラーゼ、遊離コレステロールとの反応によってＨ２Ｏ２を生成するためのコレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ならびにペルオキシダーゼおよびＨ２Ｏ２の存在下で、異なって呈色するシグナル反応産物へ変換される、組み合わせられた色素系を含む。この試験パッドはまた、上記のように、Ｈ２Ｏ２および／またはＯ２を電気化学的に定量するために有効なバイオセンサを備え得る。
【００６６】
残りの試験パッドはまた、既知の様式で、目視または検出器のいずれかにより光学的に検出され得る、パッドにおいて変化を生じるアッセイ試薬を含む。本発明のデバイスおよび方法の好ましい実施形態において。この非ＨＤＬ結合試薬は、試薬パッド７４に位置し、サンプル分配マトリクスまたは篩分けマトリクスには位置しない。従って、ＨＤＬ以外の分析物のアッセイにおいて、これらの試薬から妨害する可能性は、排除される。
【００６７】
好ましくは、このアッセイパッドの各々は、分析物と酵素との反応を介してＨ２Ｏ２を生成するための試薬成分を含む；このＨ２Ｏ２は、その後、基質試薬を呈色したシグナル反応生成物に変換するか、または上記のように電気化学的に測定される。Ｈ２Ｏ２の酵素的生成およびその後の色素を酸化して、呈色反応生成物を形成するために種々の基質特異的オキシダーゼを使用する酵素的呈色反応は、周知である。
【００６８】
４つ以上の反応パッドを有するデバイスは、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ）、グルコース、総コレステロール（ＴＣｈ）、およびトリグリセリド脂質（ＴＧ）を同時に測定するために使用され得る。各パッドは、上記の共通経路要素（ペルオキシダーゼおよび組み合わされた色素系）を含み、その結果、生成されたＨ２Ｏ２が、異なって呈色するシグナル反応性生物を生成する。沈澱試薬または結合試薬に曝すことなく、血清に曝される総コレステロール試験パッド、およびＨＤＬ試験パッドは、各々、共通経路要素に加えて、遊離コレステロール形態で、血清リポタンパク質（ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬ粒子を含む）からエステル化コレステロールを放出するためのコレステロールエステラーゼ、ならびに上記のようにサンプル流体中の遊離コレステロールと反応することによってＨ２Ｏ２を生成するためのコレステロールオキシダーゼを含む。グルコースアッセイパッドは、共通経路要素に加えて、グルコースオキシダーゼを含む。トリグリセリドパッドは、共通経路要素に加えて、リパーゼ、Ｌ−グリセロールキナーゼ、および中間体Ｌ−グリセロール−３−リン酸を介してトリグリセリドからＨ２Ｏ２を生成するためのＬ−グリセロール−３−ホスフェートオキシダーゼを含む。ＴＧパッドへ引き出される血清サンプルは、沈澱試薬または結合試薬に曝されず、従って、血清リポタンパク質の全てを含むので、ＴＧシグナルは、総血清トリグリセリドを示す。
【００６９】
参照標準パッドもまた、使用され得る；例えば、共有に係る米国特許第５，１１４，３５０号（これは、本明細書中に参考として援用される）において記載されるシステム。
【００７０】
上記のように、本発明のデバイスおよび方法の１つの利点は、このサンプル分配マトリクスが非ＨＤＬ沈澱試薬または結合試薬を含まないことである；このような試薬は、試薬パッド７４中にのみ存在する。従って、総血清コレステロールおよび総トリグリセリドの様な分析物のアッセイにおいて、これらの試薬による妨害の可能性は、排除される。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例が例示されるが、如何様にも本発明を限定することを意図されるのではない。
【００７２】
（実施例１．固定化結合試薬を有する試薬膜の調製）
５〜２０ｍｇ／ｍｌの硫酸デキストラン（５００，０００ＭＷ）および（必要に応じて）１２．５ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２を含む水溶液は、上記のように、約１２５μｍの厚みを有するカチオン膜（例えば、表面四級アンモニウム基を有するナイロン膜）に分配される。この試薬溶液は、約１６μｌ／インチの速度で分配され、次いで、その膜は、連続ロールプロセスにおいて５０℃で２０分間乾燥される。例えば、１００フィートの長さは、このように調製され得、アッセイデバイスに適合するように切断され得る。
【００７３】
（実施例２．ＨＤＬ試験膜の調製）
ＨＤＬ反応膜を調製するために、ポリスルホン膜は、以下の水溶性処方物に浸漬される：コレステロールオキシダーゼ３６．５ユニット／ｍｌ、コレステロールエステラーゼ２１５ユニット／ｍｌ、ペルオキシダーゼ２００ユニット／ｍｌ、４−アミノアンチピリン１．８８ｍｇ／ｍｌ、およびＴＯＯＳ（３−［エチル（３−メチルフェニル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）１２．０５ｍｇ／ｍｌ。この試薬は、１６．６μｌ／インチの速度で分配され、その膜は、連続ロールプロセスにおいて５０℃で２０分間乾燥される。例えば、１００フィートの長さは、このように調製され得、アッセイデバイスに適合するように切断され得る。
【００７４】
図１に示されるような積層試薬／アッセイパッドを調製するために、上記のような試薬に浸漬されたこの２つの膜は、超音波溶接によって反応バーに別個に（連続して）取り付けられるか、またはこれらの膜は、１回の超音波溶接工程で同時に取り付けられ得る。これらの膜はまた、試薬の付与前にともに積層され得、次いで、それぞれの試薬は、まずその積層体の一方の側に付与され、次いで他方の側に付与される。
【００７５】
（実施例３．代表的アッセイ手順）
代表的アッセイは、本質的に実施例１〜２に記載されるように調製された試薬パッドおよびＨＤＬ試験パッドを使用して、ＬＤＸ（登録商標）分析器において行われる。図１に示されるようなアッセイデバイス構成について、サンプル（３５μｌの血清または全血）は、サンプルウェルに付与され、サンプル分配マトリクスを通して２分間分配させる。その反応バーは、次いで、マトリクスと３秒間（試薬パッドおよび試験パッド（約１．５μｌの合わせた収容能）を満たすに十分な血清を移動させるに十分な時間）接触させ、その後、そのバーを、その元の位置に戻す。反射率の読み取りを、３秒ごとに１５０秒間、ＨＤＬ試験パッドの上部表面から行って、ＨＤＬアッセイ反応の進行をモニターする。得られた最小の反射率値を、次いで、予め確立した較正曲線に従って、ＨＤＬコレステロールのｍｇ／ｄＬに変換する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、本発明の種々の実施形態に従って構築されたマルチ分析物アッセイデバイスの側面図である。
【図２】図２は、本発明の種々の実施形態に従って構築されたマルチ分析物アッセイデバイスの部分的図面を示す。
【図３】図３は、本発明の種々の実施形態に従って構築されたマルチ分析物アッセイデバイスの部分的図面を示す。
【図４】図４は、分解組み立て形態での、本発明の一実施形態に従って構築されたマルチ分析物アッセイデバイスの斜視図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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