(57)【要約】再狭窄を治療又は予防する方法であって、血液単球又はマクロファージを枯渇させるか、且つ／或いは抑制し、それによって再狭窄を治療する活性化合物を、有効量個体に投与することによる方法。血管再狭窄に関連するサイトカイン又は成長因子の活性又は生成を抑制する方法であって、血液単球又はマクロファージを枯渇させるか、且つ／或いは抑制し、それによって再狭窄を治療する活性化合物を、有効量個体に投与することによる方法。サイトカイン及び成長因子には、インターロイキン１−β、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２、及び血小板由来成長因子β（ＰＤＧＦβ）が含まれるが、これらに限定されない。活性化合物は直接投与することができ、担体粒子、又は粒子剤形に被包することができる。この化合物は粒子中に被包、包埋、又は吸着させ、ポリマーマトリクス中に均一に分散させ、粒子表面に吸着させ、或いは任意のこれらの形と組み合わせることができる。粒子には、リポソーム又は不活性ポリマー粒子、例えばミクロカプセル、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、又はミクロ粒子などがある。粒子には、ポリマー粒子中に被包、捕捉、又は吸着されていない化合物の、任意の懸濁又は分散形が含まれる。粒子には、活性化合物の懸濁又は分散コロイド、集合体、凝集体、不溶塩及び不溶複合体が含まれる。この化合物は、血液単球又はマクロファージを枯渇させるか、且つ／或いは抑制する、任意の細胞内毒素、例えばビスホスホネートなどを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
再狭窄を治療又は予防する方法であって、
個体に有効量の化合物を投与することを含み、該化合物が血液単球又は組織マクロファージを抑制するか、或いは枯渇させ、それによって再狭窄を抑制する方法。
【請求項２】
再狭窄を治療又は予防するために、マクロファージ又は単球を抑制するか或いは枯渇させる方法であって、
被包した化合物を含む製剤を個体に有効量投与し、それによって再狭窄を抑制することを含む方法。
【請求項３】
再狭窄を治療又は予防するために、マクロファージ又は単球を抑制するか或いは枯渇させる方法であって、
粒子状化合物を含む製剤を個体に有効量投与し、それによって再狭窄を抑制することを含む方法。
【請求項４】
血管再狭窄に関連するサイトカイン又は成長因子の活性又は生成を抑制する方法であって、
被包した化合物を含む製剤を個体に有効量投与することを含み、該化合物が血液単球又は組織マクロファージを抑制するか、或いは枯渇させ、それによって再狭窄を抑制する方法。
【請求項５】
血管再狭窄に関連するサイトカイン又は成長因子の活性又は生成を抑制する方法であって、
粒子状化合物を含む製剤を個体に有効量投与することを含み、該化合物が血液単球又は組織マクロファージを抑制するか、或いは枯渇させ、それによって再狭窄を抑制する方法。
【請求項６】
投与が静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、或いは「スウェッティングバルーン(sweating balloon)」、コーティングバルーン、又はコーティングステントによる送達である、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
製剤を全身に投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
製剤の大きさの範囲が０．１〜１．０ミクロンである、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項９】
化合物が細胞内毒素である、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
化合物がビスホスホネートである、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
化合物がガリウムである、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
ビスホスホネートが、クロドロネート、エチドロネート、チルドロネート、パミドロネート、アレンドロネート、リゼンドロネートからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
化合物を、リポソーム、ポリマー粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、及びナノスフェアからなる群から選択される粒子中に被包する、請求項２又は４に記載の方法。
【請求項１４】
粒子が、集合体、凝集体、コロイド、ポリマー鎖、不溶塩及び不溶複合体からなる群から選択される、請求項３又は５に記載の方法。
【請求項１５】
前記単球及びマクロファージの枯渇が、製剤の食作用によって起こる、請求項２〜５のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
サイトカイン及び成長因子が、インターロイキン１−β、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）、及び血小板由来成長因子β（ＰＤＧＦβ）からなる群から選択される、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項１７】
サイトカイン及び成長因子が、再狭窄のカスケードに関与する細胞型に関連する、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項１８】
細胞型がマクロファージ、単球、平滑筋細胞、及び線維芽細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、以下の式（Ｉ）であって：
【化１】
2005523327.tif 000009
上式でＲ１はＨ、ＯＨ又はハロゲン原子であり、且つ
Ｒ２はハロゲン；場合によってはヘテロアリール又はヘテロシクリルＣ１〜Ｃ１０アルキルアミノ又はＣ３〜Ｃ８シクロアルキルアミノで置換されていてもよい（アミノが第一級、第二級又は第三級であってよい）、直鎖或いは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル；Ｙが水素、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールである−ＮＨＹ；Ｚがクロロ置換フェニル又はピリジニルである−ＳＺである、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
血管形成術を行う前に化合物を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
血管形成術を行う日に化合物を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
血管形成術の後に化合物を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
血管形成術を行う前に製剤を投与する、請求項２〜５のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
血管形成術を行う日に製剤を投与する、請求項２〜５のいずれか記載の方法。
【請求項２５】
血管形成術の後に製剤を投与する、請求項２〜５のいずれか記載の方法。
【請求項２６】
血管再狭窄に関連するサイトカイン又は成長因子の活性又は生成を抑制する方法であって、
被包したビスホスホネートを個体に有効量投与することを含み、それによって再狭窄を抑制する方法。
【請求項２７】
血管再狭窄に関連するサイトカイン又は成長因子の活性又は生成を抑制する方法であって、
粒子状ビスホスホネートを個体に有効量投与することを含み、それによって再狭窄を抑制する方法。
【請求項２８】
再狭窄を治療又は予防するための医薬組成物であって、化合物、被包した化合物、及び粒子状化合物からなる群から選択される製剤を、薬剤として許容可能な担体と共に含み、該化合物が血液単球又は組織マクロファージを抑制する、医薬組成物。
【請求項２９】
静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、又は腹腔内送達に適した剤形である、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
製剤が希釈剤と共に存在する、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
製剤が安定剤と共に存在する、請求項２８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再狭窄（当分野では「促進型動脈硬化症」及び「血管形成後狭窄」と呼ばれることもある）を予防する、抑制する（inhibit）、或いは軽減することができる組成物に関する。詳細には本発明は、マクロファージ及び単球を選択的に抑制する（inhibit）且つ／或いは枯渇させ（deplete）、それによって再狭窄（restenosis）を予防又は軽減することができる化合物の使用に関する。好ましい化合物の一種はビスホスホネートである。
【背景技術】
【０００２】
閉塞性動脈硬化症の血管の血管再生を行う機械的手段は、過去１０年間で、大幅に改善されてきている。経皮経管冠動脈拡張術（ＰＴＣＡ）には、バルーン拡張、アテローム切除、管腔内ステント挿入、ローター処理及びレーザー切除があるが、これらに限定されない。しかしながら、血管再生によって血栓症、及び新血管過形成が誘導され、次いでこれによって、バルーン血管形成が成功した後、並びに冠状動脈伏在静脈バイパス移植及び他の冠状動脈移植において、冠状動脈の大部分において再狭窄が引き起こされる。さらに、血管過形成によって、多くの大腿表面血管形成術、頚動脈内膜切除、及び大腿末端静脈バイパス術において、再狭窄が引き起こされる。再狭窄とは、血管形成術、又はステント配置、又はバイパスの吻合の部位で、新しい閉塞が形成されることである。結果として患者は、心臓発作、又は他の虚血性疾患、肺塞栓症及び脳卒中を含む、様々な合併症の危険にさらされる。したがって、この方法は、まさにそうした問題の危険を伴う可能性があり、その使用を改善することが目的であった。血管内ステントを導入することによって、再狭窄の発生率が低下してきているが、この問題は依然として重大である。なぜなら、再狭窄又は「過剰増殖性」組織の治癒が、ステント配置の部位で起こる可能性があるからである（Waller, B. F．et al, 1997, Clin-Cardiol., 20 (2）:153-60; Anderson,W.D et al., 1996, Curr-Opin-Cardiol., 11 (6):583-90; Moorman, D.L. et al., 1996, Aviat-Space-Environ-Med., 67(10):990-6; Laurent, S. et al., 1996, Fundam. Clin. Pharmacol., 10 （3）:243-57; Walsh, K. et al., 1996, Semin-Interv-Cardiol., 1 (3):173-9; Schwartz, R.S., 1997, Semin-Interv-Cardiol.,2 （2）:83-8; Allaire, E. et al., 1997, Ann.Thorac.Surg., 63:582-591; Hamon, M. et al., 1995, Eur. Heart J., 16: 33s〜48s; Gottsauner-Wolf, M. et al., 1996, Clin.Cardiol., 19:347-356）。
【０００３】
今日まで、ヒト及び動物モデルにおいて、発生率、タイミング、メカニズム及び薬理学的介入に関して広範囲に調査が行われたが、冠状動脈再狭窄を一貫して予防する療法は存在しない（Herrman、J.P.R. et al., 1993, Drugs, 46:18-52; Leclerc, G. et al., 1995, Elsevier Science, 722-724, Topol, E., 1997, The NY  Academy of Sciences, 225-227）。再狭窄を低下させる、或いは予防するための、組成物及び方法が依然として非常に望まれる。したがって、再狭窄を治療しその再発を防止する際に有効である、新規な組成物及び方法を開発することが望ましいと思われる。
【非特許文献１】Waller, B. F．et al, 1997, Clin-Cardiol., 20 (2）:153-60
【非特許文献２】Anderson,W.D et al., 1996, Curr-Opin-Cardiol., 11 (6):583-90
【非特許文献３】Moorman, D.L. et al., 1996, Aviat-Space-Environ-Med., 67(10):990-6
【非特許文献４】Laurent, S. et al., 1996, Fundam. Clin. Pharmacol., 10 （3）:243-57
【非特許文献５】Walsh, K. et al., 1996, Semin-Interv-Cardiol., 1 (3):173-9
【非特許文献６】Schwartz, R.S., 1997, Semin-Interv-Cardiol., 2 （2）:83-8
【非特許文献７】Allaire, E. et al., 1997, Ann.Thorac.Surg., 63:582-591
【非特許文献８】Hamon, M. et al., 1995, Eur. Heart J., 16: 33s〜48s
【非特許文献９】Gottsauner-Wolf, M. et al., 1996, Clin.Cardiol., 19:347-356
【非特許文献１０】Ｈｅｒｒｍａｎ、Ｊ．Ｐ．Ｒ．他、１９９３、Ｄｒｕｇｓ、４６：１８〜５２
【非特許文献１１】Leclerc, G. et al., 1995, Elsevier Science, 722-724, Topol, E., 1997, The NY  Academy of Sciences, 225-227）
【非特許文献１２】M.Donbrow in: Microencapsulation and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy, CRC Press, Boca Raton, FL, 347, 1991
【非特許文献１３】Fishbein、I., et al., 2000,Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 20:667-676
【非特許文献１４】Jawien, A., et al., 1992, J. Clin. Invest., 507-511
【非特許文献１５】Ross, R., 1993, Nature, 362:801〜809
【非特許文献１６】Panek, R.L., et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17:1283〜1288
【非特許文献１７】Waltenberger, J, 1997, Circulation, 96:4083〜4094
【非特許文献１８】Deguchi, J., et al., 1999, Gene Ther., 6:956〜965
【非特許文献１９】Fleisch, H., 1997, in: Bisphosphonates in bone disease. Parthenon Publishing Group Inc., 184-186
【非特許文献２０】Braunwald, E., 1997, Heart Disease in: A textbook of cardiovascular medicine; 5th Ed., W. B. Saunders Company: Philadelphia
【非特許文献２１】Alfonso, G. et al., 1995, in: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing, Easton PA, 19th ed.
【非特許文献２２】Monkkonen, J. et al., 1994, J. Drug Target, 2:299〜308；
【非特許文献２３】Monkkonen, J．et al., 1993, Calcif. Tissue Int., 53:139〜145）
【非特許文献２４】Cohen, H．et al., 1999, Pharm. Res., 16:1399-406
【非特許文献２５】Cohen H, Alferiev IS, Monkkonen J, Seibel MJ, Pinto T, Ezra A, Solomon V, Stepensky D, Sagi H, Ornoy A, Patlas N, Hagele G、Hoffinan A, Breuer E、Golomb G, 1999, “Synthesis  and  preclinical  pharmacology of 2-(2-aminopyrimidinio) ethylidene-1,1-bisphosphonic acid betaine (ISA-13-1)-a novel bisphosphonate.” Pharm Res.;16:1399-406３９９〜４０６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、再狭窄を治療又は予防する方法に関するものであり、この方法は、血液単球及び組織マクロファージを抑制するか、且つ／或いは枯渇させ、それによって再狭窄を治療又は予防する化合物を、個体に投与することによる。この活性化合物は細胞内毒素であり、これが標的マクロファージ／単球に直接侵入するか、或いはその中に放出され、マクロファージ及び単球を抑制及び／又は破壊する。
【０００５】
一実施態様では、本発明は、再狭窄を治療又は予防する方法に関し、この方法は、単球及びマクロファージを特異的に標的化し、単球及びマクロファージの活性を抑制し、且つ／或いはそれらを破壊することができる化合物を有効量、個体に直接投与することによる方法である。
【０００６】
他の実施態様では、本発明は、再狭窄を治療又は予防する方法に関し、この方法は、被包した化合物を含む製剤を有効量、個体に投与することによる方法である。「被包した化合物」なる用語には、粒子中に被包され、包埋され、及び／又は吸着され、粒子マトリクス中に分散され、粒子表面に吸着又は結合された化合物、或いはこれらの形のいずれかとの組合せである、化合物が含まれる。これらの粒子には、ミクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、ミクロスフェア、ナノ粒子、ミクロ粒子、又はリポソームなどの不活性ポリマー粒子が含まれるが、これらだけには限られない。
【０００７】
他の実施態様では、本発明は、再狭窄を治療又は予防する方法に関するものであり、この方法は、粒子状化合物を含む製剤を有効量、個体に投与することによる。これらの粒子には、化合物の集合体、凝集体、コロイド、ポリマー鎖、不溶塩及び不溶複合体が含まれるが、これらだけには限られない。
【０００８】
本発明の活性化合物は、任意の細胞内毒素を含み、これはマクロファージ／単球に一端侵入するか、或いはその中に放出されると、マクロファージ又は単球の活性を抑制し、且つ／或いはそれらを死滅させる。好ましい化合物の一種、ビスホスホネートである。他の有効な化合物には、セレン、ガリウム、ガドリニウム及び金が含まれるが、これらだけには限られない。
【０００９】
単球／マクロファージによる、被包した化合物及び粒子状化合物の有効な食作用は、このような食細胞の活性に影響を与える可能性がある。この化合物は、再狭窄のカスケード(restenotic cascade)に関わる食細胞、例えばマクロファージ／単球、線維芽細胞などを抑制することにより、再狭窄に影響を与える。送達系は、移動及び／又は増殖を誘発する細胞を抑制することにより間接的に、平滑筋細胞（ＳＭＣ）及び細胞外マトリクスの生成に影響を与える。しかし、ＳＭＣに対する直接的な影響を生じる可能性もある。活性化合物を望ましい作用部位へ効果的に輸送する任意の経路によって、製剤を投与することができる。好ましい実施態様では、投与の態様には動脈内、静脈内、又は皮下投与が含まれる。
【００１０】
他の実施態様では、本発明は、血管再狭窄を予防又は治療するための医薬組成物であって、化合物、被包した化合物、及び粒子状化合物からなる群から選択される製剤と、薬学的に許容される担体、安定剤又は希釈剤とを共に含む、医薬組成物を含む。
【００１１】
他の実施態様では、本発明は、血管再狭窄に関連するサイトカイン及び成長因子の活性及び／又は生成を抑制する方法であって、被包した化合物を含む製剤を個体に有効量投与することを含み、それによって再狭窄を抑制する方法を含む。
【００１２】
さらに他の実施態様では、本発明は、血管再狭窄に関連するサイトカイン及び成長因子の活性及び／又は生成を抑制する方法であって、粒子状化合物を含む製剤を個体に有効量投与することを含み、それによって再狭窄を抑制する方法を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、再狭窄を低下させる、遅延させる、或いは排除するための、組成物及び方法に関する。再狭窄の低下には内側血管の内層の肥大を含まれるが、これは、様々な血管形成術後に、平滑筋細胞の刺激及び増殖、及び他の細胞移動及び増殖から、並びに細胞外マトリクスの蓄積から生じる。再狭窄の遅延は、血管造影法による血管の再狭窄が現れるまでの時間、又はこの血管の狭窄の原因である臨床症状が発症するまでの時間を遅らせることを含む。血管形成術後の再狭窄の排除は、再狭窄の臨床症状なしで、血管腔の５０％未満である程度に過形成を低下させることを含む。介入法は、例えば繰り返しの血管形成術及び／又はステント配置、又は冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）などの方法によって、血管中の適切な血液流を再建することを含む。
【００１４】
本発明は、再狭窄を治療又は予防する方法を含み、この方法は、血液単球及び組織マクロファージを不活性化又は抑制することが知られている、任意の化合物又は製剤を有効量、個体に投与することによる。マクロファージ及び単球を選択的に標的化し、それらを抑制及び／又は枯渇させる、任意の化合物又は製剤が、再狭窄を治療又は予防する際に有効であると思われる。かかる化合物は直接投与することができ、粒子中、又は粒子形に被包することができる。化合物が単球及びマクロファージを選択的に標的化し、それらの活性を抑制することができる場合は、化合物を直接投与することができる。しかしながら、化合物が単球及びマクロファージを選択的に標的化することができない場合、即ち、化合物がマクロファージ／単球の細胞膜を通過することができない場合、或いは化合物が、多くの異なる型の細胞を標的化することができる場合は、化合物を粒子担体中に被包するか、或いは特異的なサイズの寸法を有する粒子形に配合することができる。化合物は、特定のサイズのリポソーム、ミクロ粒子又はナノ粒子に被包されると、或いは例えば特定のサイズの集合体などの粒子形に被包されると、マクロファージ及び単球を特異的に標的化し、マクロファージ及び単球による食作用によって効率よく取り込まれる。対照的に非食細胞は、それらの特異的なサイズの寸法のために被包した化合物及び粒子状化合物を取り込むことができない。
【００１５】
一実施態様では、製剤は、異なる物質の粒子中に被包された活性化合物を含み、これは本明細書では以後、「被包した化合物」と称する。用語「被包した化合物」は、粒子中に被包、包埋、及び／又は吸着された、粒子マトリクス中に分散した、粒子表面に吸着又は結合した、或いは任意のこれらの形と組み合わさった活性化合物を含む。粒子は、当分野で知られる任意のリポソーム、ミクロ粒子、ナノ粒子、ナノスフェア、ミクロスフェア、ミクロカプセル、又はナノカプセルを含む(M. Donbrow in:Microencapsulation and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy, CRC Press, Boca Raton, FL, 347, 1991）。
【００１６】
粒子なる用語は、活性化合物のポリマー調製物と非ポリマー調製物の両方を含む。さらに、懸濁剤及び安定剤を、被包した化合物の製剤と共に使用することもできる。
【００１７】
他の実施態様では、製剤は粒子形の活性化合物を含み、これは本明細書では以後、「粒子状化合物」と称す。「粒子状化合物」の製剤には、例えば活性化合物の不溶塩、不溶エステル、又は不溶複合体がある。典型的には「不溶」は、１０，０００部を超える溶媒中の、化合物の１部の溶解度を指す。「粒子状化合物」の剤形には、ポリマー粒子中に被包、捕捉、又は吸着されていない、活性化合物の任意の不溶懸濁又は分散粒子形がある。粒子状化合物には、活性化合物の懸濁又は分散コロイド、集合体、凝集体、不溶塩、不溶複合体、及びポリマー鎖が含まれるが、これらだけに限定されない。さらに、懸濁剤及び安定剤を、粒子状化合物の製剤と共に使用することができる。
【００１８】
本発明の製剤、例えば被包した化合物又は粒子状化合物は、再狭窄のカスケードの重要な誘発因子である細胞、即ちマクロファージ及び／又は単球を、一時的に枯渇及び／又は不活性化させることによって、平滑筋細胞の移動及び増殖を阻害する。活性化合物は、リポソーム又はナノ粒子に被包されると、或いは例えば特定のサイズの集合体などの粒子剤形に被包されると、食作用によって、マクロファージ及び単球によって非常に効率よく、線維芽細胞などの食作用活性を有する他の細胞によってある程度取り込まれる。一端マクロファージ内で、担体粒子（例えば、リポソーム、ミクロ粒子、ナノ粒子）の構造が破壊されると、活性化合物が放出され、それによって活性が阻害され、且つ／或いはマクロファージが死滅する。マクロファージは、その正常状態で、血管形成術又は他の侵入的介入により外傷を受けた領域に入り、平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖を開始させ、マクロファージの活性を阻害し、ＳＭＣの移動及び増殖を阻害する。マクロファージにより取り込まれた後、活性化合物は、マクロファージ上で持続的な阻害活性を有する。したがって、活性化合物の長期の徐放は、阻害を維持するためには必要とされない。したがって、被包した化合物として、或いは粒子状化合物として活性化合物を投与することにより、再狭窄を抑制するか、或いは低下させる方法は、被包した化合物及び粒子状化合物が、循環する単球及びマクロファージを標的化する、全身療法であることが好ましい。
【００１９】
しかしながら、いくつかの被包した化合物及び粒子状化合物は、ＳＭＣ活性に対して直接的な影響を有する可能性があることに留意しなければならない。さらに、いくつかの被包した化合物及び粒子状化合物は、身体中の他の食細胞及び白血球細胞系統の細胞、例えば肝臓及び脾臓マクロファージ、及び動脈壁中のマクロファージなどを不活性化する可能性もある。
【００２０】
さらに、本発明の送達系は、活性化合物が体液中に放出されない充分な時間、活性化合物を保持するだけでなく、標的細胞中に薬剤を効果的に排出もする。活性化合物は、「被包した化合物」又は「粒子状化合物」に配合する。なぜなら、大抵の場合、遊離活性化合物は、食細胞によって取り込まれないために無効であるからである。活性化合物を特定のサイズの担体粒子中に被包すること、又は活性化合物を特定のサイズの粒子に配合することによって、マクロファージ及び単球によって効果的かつ効率的に製剤を取り込ませることができる。製剤のサイズの範囲は０．１〜１．０ミクロンであることが好ましい。しかしながら、これは単なる一例であり、他の範囲のサイズを、本発明の精神又は範囲から逸脱せずに使用することができる。
【００２１】
本発明はまた、再狭窄又は再狭窄のカスケードに関連する細胞型に関連する、いくつかのサイトカイン及び成長因子の活性、生成、及び／又は転写を、化合物、被包した化合物、又は粒子状化合物を投与することによって抑制する方法を提供する。再狭窄又は再狭窄のカスケードに関わる細胞型に関連する、選択サイトカイン及び成長因子には、インターロイキン１（ＩＬ−１）、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、及び血小板由来成長因子β（ＰＤＧＦβ）が含まれるが、これらだけには限定されない。例えば、ＩＬ−１β及びＭＭＰ−２は、活性化マクロファージの主要な生成物であり、これは動脈損傷後に分泌され、新しい血管増殖の過程を引き起こす一因となる。さらにＰＤＧＦ−ＢＢは、血管平滑筋細胞の強力な化学的誘因物質であり、血管損傷に付随する新血管形成に関わる（Fishbein、I., et al., 2000,Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.,20:667-676; Jawien, A., et al., 1992, J. Clin. Invest., 507-511; Ross, R., 1993, Nature, 362:801〜809; Panek, R.L., et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17:1283〜1288; Waltenberger, J, 1997, Circulation, 96:4083〜4094; Deguchi, J., et al., 1999, Gene Ther., 6:956〜965）。
【００２２】
活性化合物は、標的マクロファージ／単球に直接入るか、或いはその中に放出され、マクロファージ及び単球を抑制及び／又は破壊する、任意の物質を含む。本発明に従い、活性化合物は細胞内毒素を含むことができる。「活性化合物」なる用語はその範囲内に、化合物のモノマーだけでなく、ポリマー鎖も含む。化合物の１つの好ましいクラスは、ビスホスホネートである。遊離ビスホスホネートは、骨とのその親和性のため、及び細胞膜を通過できないために、炎症応答に対する影響がほとんどない。対照的にビスホスホネートは、特定の寸法のリポソーム、ミクロ粒子又はナノ粒子中に、被包ビスホスホネート形で被包されると、或いは粒子状ビスホスホネート剤形、例えば特定のサイズの集合体などであると、特異的に標的化され、食細胞によって、マクロファージ及び単球によって効率よく取り込まれる。対照的に、非食細胞は、被包したビスホスホネート及び粒子状ビスホスホネートを取り込むことができない。
【００２３】
前述の及び以下の詳細な説明は、本発明の好ましい実施態様、即ち活性化合物、ビスホスホネート、詳細には被包したビスホスホネート又はビスホスホネート粒子の使用に関するものであることが多いが、単球／マクロファージを効果的に枯渇及び／又は不活性化させることができる、任意の化合物又は細胞内毒素を、本発明の精神又は範囲から逸脱せずに使用することができることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、ガリウム及び金は、単球及びマクロファージの不活性化物質であり、これらを使用して再狭窄を治療することができる。他の有効な化合物には、セレン、ガドリニウム、シリカ、ミスラマイシン、パクリタクソール、シロリムス、及びエベロリムスが含まれるが、これらだけには限定されない。さらに細胞内毒素を、被包した細胞内毒素又は粒子状細胞内毒素として配合することができる。
【００２４】
本発明によると、好ましい活性化合物の一種は、ビスホスホネートである。ビスホスホネート（「ＢＰ」）（以前はジホスホネート(diphosphonate）と呼ばれた）は、２つのＣ−Ｐ結合によって特徴付けられる化合物である。その２つの結合が同じ炭素原子上に位置する場合（Ｐ−Ｃ−Ｐ）、それらはジェミナルビスホスホネートと呼ばれる。ＢＰは、骨の形成及び再吸収の調節に関わる、内在性の無機ピロリン酸の類似体である。ビスホスホネートなる用語は、ジェミナル及び非ジェミナルビスホスホネートに関して一般に使用される。ＢＰはポリマー鎖を形成する場合がある。骨のミネラルに対して親和性があることから、さらに、骨の再吸収及び異所性石灰化の強力な阻害剤であることから、ＢＰは骨に作用する。ＢＰは、臨床上は主に（ａ）著しく骨が破壊された、特にパジェット病、骨腫瘍疾患、及び骨粗しょう症の患者の骨溶解防止剤；（ｂ）診断目的の骨用マーカー（９９ｍＴｃに連結）；（ｃ）異所性石灰化及び軟骨性骨化がある患者における石灰化の阻害剤、及び（ｄ）歯磨き粉に加えられる抗歯石剤として使用されてきている（Fleisch, H., 1997, in: Bisphosphonates in bone disease. Parthenon Publishing Group Inc., 184-186）。さらに、親水性が高く負に帯電しているため、ＢＰはその遊離形では、細胞膜を通過することがほとんどできない。
【００２５】
ビスホスホネートは、特定の寸法のポリマー粒子に被包されると、或いは粒子剤形、例えば特定のサイズの集合体などに被包されると、血管再狭窄を治療又は予防するために使用される。本明細書で使用する、ビスホスホネートなる用語は、ジェミナル及び非ジェミナルビスホスホネートの両方を示す。好ましい活性化合物は、以下の式（Ｉ）であって：
【００２６】
【化１】
2005523327.tif 000002
【００２７】
上式でＲ１はＨ、ＯＨ又はハロゲン原子を表し、且つ
Ｒ２はハロゲン；場合によってはヘテロアリール又はヘテロシクリルＣ１〜Ｃ１０アルキルアミノ又はＣ３〜Ｃ８シクロアルキルアミノで置換されていてもよい（アミノが第一級、第二級又は第三級であってよい）、直鎖或いは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル；Ｙが水素、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールである−ＮＨＹ；Ｚがクロロ置換フェニル又はピリジニルである−ＳＺを表す。
【００２８】
したがって本発明は、血管再狭窄を予防又は治療するための組成物を調製するための、前記活性化合物、活性化合物の複合体、活性化合物の製剤、又は薬理学的に許容されるその塩又はエステルの使用を提供する。
【００２９】
さらに本発明は、再狭窄を予防又は治療するための医薬組成物であって、有効量の活性化合物、活性化合物の製剤、詳細には被包した化合物又は粒子状化合物、場合によっては薬理学的に許容される担体又は希釈剤も含む、医薬組成物を提供する。
【００３０】
「有効量」なる用語は、望ましい治療結果、即ち血管再狭窄の予防、低下、又は排除を得る際に有効な、化合物又は製剤の量を示す。有効量は、治療する個体の体重及び性別；医学的手順の型、例えば、抑制される血管再狭窄がバルーン血管形成術の後であるか、バルーン血管形成術がステント配置より先であるかどうか；製剤の投与態様（即ち、それが全身、或いは部位に直接投与されるかどうか）；使用される担体の型（例えば、それが活性化合物を迅速に放出する担体であるか、又は活性化合物を長期で放出する担体であるかどうか）；治療計画（例えば、製剤を１日１回、１日数回、数日毎に１回、或いは１回用量投与するかどうか）；炎症の臨床的兆候；再狭窄の進行速度に影響を与える臨床要因、例えば糖尿病、喫煙、高コレステロール血症、腎臓病など；解剖学的要因、例えば、重度の血管形成術前の狭窄、全体的な閉塞、左前脚下の冠状動脈位置、伏在静脈移植病巣、長い病巣、多血管又は多病巣ＰＴＣＡが存在するかどうかなど；及び組成物の剤形を含む、いくつかの要因によって変わる可能性がある。さらに、ＰＴＣＡ、危険な解剖(severe dissection)、脈管内膜断裂の後の多大な残留性狭窄、バルーンの適切なサイズ、及び血栓の存在などの手順の変数も、投与に関連すると考えられる。当業者であれば、通常の型の実験によって、それぞれの場合の有効量を決定する際に、実質的な困難はないはずである。
【００３１】
本発明は、血管形成術後の血管再狭窄、冠状動脈再狭窄に限定されないが、主にこれらの予防、低下、又は治療のために適用することができる。血管再狭窄は主に、バルーン血管形成術、静脈内ステント配置、又は経皮血管形成術の他の方法（冠状動脈、頚動脈、及び血管形成術が可能な他の血管の血管形成術を含む）を含めた様々な血管形成術、並びに血管移植による狭窄から生じる再狭窄（例えば、バイパス手術後）から生じる(Braunwald, E., 1997, Heart Disease in: A textbook of cardiovascular medicine; 5th Ed., W. B. Saunders Company: Philadelphia）。
【００３２】
さらに本発明は、末梢動脈及び静脈の、血管再狭窄の予防、低下、又は治療の際の使用にも適用可能である。
【００３３】
本発明の１つの例示的な適用例は、ステント内再狭窄の予防及び治療である。血管形成術の構成内で血管中にステントを配置して、血管の壁を支えることは、広く認められている医学的手順である。しかしながら、血管中にステントが存在するにもかかわらず、再狭窄が起こることが非常に多い。本発明による、前述の活性化合物又は製剤を、全身或いは部位に直接投与して、このような再狭窄を予防又は抑制することができる。活性化合物は、ステントへのその取り込みを可能にする方法で配合することができ、実際これによって、前記活性化合物が部位に直接投与される。製剤は、例えばそれをステントのコーティングに含ませることによる方法で、考案することができる。コーティングの例は、ポリマーコーティング（例えばポリウレタンでできたもの）、ゲル、フィブリンゲル、ヒドロゲル、炭水化物、ゼラチン、又は任意の他の生体適合性ゲルである。
【００３４】
本発明に従って使用する製剤は、当分野で知られている任意の従来の技法によって、医薬組成物中に調製することができる（例えばAlfonso, G. et al., 1995, in: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing, Easton PA, 19th ed.を参照のこと）。組成物は、身体中の注射、点滴、又は移植に適した様々な形、例えばナノ粒子の懸濁液、ステントなどの医療用具のコーティングなどに調製することができる（上記を参照のこと）。さらに、本発明の医薬組成物は、非経口剤形用の適切な薬剤添加剤を用いて配合することができる。好ましい投与形は、それぞれの場合、所望の送達態様によって決まり、その送達態様は通常、患者の状態、及びその患者が現在受けている他の療法的治療と、最も生理学的に適合する。
【００３５】
前述のように、本発明の好ましい実施態様では、活性化合物はビスホスホネートの群から選択される。この群の活性化合物の１つは、以下の式（ＩＩ）を有する、化合物クロドロネート、（ジクロロメチレン）ジホスホン酸である(Fleisch, H., 1997, in: Bisphosphonates in bone disease. Parthenon Publishing Group Inc., 184-186)。
【００３６】
【化２】
2005523327.tif 000003
【００３７】
クロドロネートは、悪性腫瘍から生じる高カルシウム血症の治療、腫瘍関連骨溶解の治療における使用に関して、以前に記載された(Fleisch, H., 1997, in: Bisphosphonates in bone disease. Parthenon Publishing Group Inc., 184-186)。クロドロネートは、インビトロでマクロファージを阻害し、マウスの脾臓及び肝臓組織中のマクロファージ活性を抑制することも見出された(Monkkonen, J. et al., 1994, J. Drug Target, 2:299〜308； Monkkonen, J．et al., 1993, Calcif. Tissue Int., 53:139〜145）。
【００３８】
この群の他の好ましい活性化合物は、以下の式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）をそれぞれ有する、エチドロネート及びチルドロネートである：
【００３９】
【化３】
2005523327.tif 000004
【００４０】
【化４】
2005523327.tif 000005
【００４１】
本発明によると、クロドロネートの活性と類似の活性を有する他のＢＰも好ましい。このようなＢＰは、クロドロネートの生物学的活性を模倣する、それらの能力に基づいて選択することができる。これは例えば、食細胞、例えばマクロファージ及び線維芽細胞の食作用活性を阻害する際のインビトロでの活性；マクロファージからのＩＬ−１及び／又はＩＬ−６及び／又はＴＮＦ−αの分泌の阻害；ＭＭＰ活性、例えばＭＭＰ−２活性の低下；ＰＤＧＦβＲ活性の阻害及び／又はＰＤＧＦ−Ｂタンパク質レベルの低下；及びインビボでの活性、例えば試験する製剤が、実験動物モデル、例えば以下の実施例１に記載するラット又はウサギ頚動脈カテーテル損傷モデル、又はブタの再狭窄モデルなどにおいて、再狭窄を予防するか或いは低下させる能力を含む。
【００４２】
本発明の活性化合物の最も好ましい群は、以下の一般式（Ｖ）を有する、アミノＢＰ及び任意の他の窒素含有ＢＰである：
【００４３】
【化５】
2005523327.tif 000006
【００４４】
上式でＸがＣ１〜Ｃ１０アルキルアミノ又はＣ３〜Ｃ８シクロアルキルアミノを表し、アミノが第一級、第二級又は第三級であってよく；或いはＸが、Ｙが水素、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであるＮＨＹを表す。
【００４５】
この群に属するＢＰは代謝されないと考えられており、比較的低い濃度でインターロイキンＩＬ−１の分泌を誘導し、比較的高い濃度でマクロファージのアポトーシスを引き起こすことが示されてきている(Monkkonen, J. et al., 1994, J. Drug Target, 2:299〜308； Monkkonen, J．et al., 1993, Calcif. Tissue Int., 53:139〜145）。この群に属する好ましいＢＰは、例えば以下の式（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）をそれぞれ有する、パミドロネート及びアレンドロネートである。
【００４６】
【化６】
2005523327.tif 000007
【００４７】
【化７】
2005523327.tif 000008
【００４８】
ジェミナルＢＰは本発明の好ましいＢＰであるが、非ジェミナルＢＰ、一般にホスホネートと呼ばれる、ＢＰのモノホスホネートも、本発明の活性化合物として使用することができる。
【００４９】
他のビスホスホネートには、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ジホスホン酸、例えばジメチル−ＡＰＤ；１−ヒドロキシ−エチリデン−１，１−ビスホスホン酸、例えばエチドロネート；１−ヒドロキシ−３−（メチルペンチルアミノ）−プロピリデン−ビスホスホン酸、（イバンドロン酸）、例えばイバンドロネート；６−アミノ−１−ヒドロキシヘキサン−１，１−ジホスホン酸、例えばアミノ−ヘキシルＢＰ；３−（Ｎ−メチル−Ｎ−ペンチルアミノ）−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ジホスホン酸、例えばメチル−ペンチル−ＡＰＤ；１−ヒドロキシ−２−（イミダゾール−１−イル）エタン−１，１−ジホスホン酸、例えばゾレドロン酸；１−ヒドロキシ−２−（３−ピリジル）エタン−１，１−ジホスホン酸（リセドロン酸）、例えばリセドロネート；３−［Ｎ−（２−フェニルチオエチル）−Ｎ−メチルアミノ］−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ビスホスホン酸；１−ヒドロキシ−３−（ピロリジン−１−イル）プロパン−１，１−ビスホスホン酸、１−（Ｎ−フェニルアミノチオカルボニル）メタン−１，１−ジホスホン酸、例えばＦＲ７８８４４（Ｆｕｊｉｓａｗａ）；５−ベンゾイル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラゾール−３，３−ジホスホン酸テトラエチルエステル、例えばＵ８１５８１（Ｕｐｊｏｈｎ）；及び１−ヒドロキシ−２−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル）エタン−１，１−ジホスホン酸、例えばＹＭ５２９が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
したがって、本発明における使用に適したビスホスホネートには、前述の酸化合物、任意の許容可能なその塩、並びに結晶及び非晶質ＢＰがある。さらに、好ましいビスホスホネートは、アレンドロネート、ゾレンドロネート、及びリゼンドロネートなどの、アミノ−ビスホスホネートである。
【００５１】
本発明の製剤は前記活性化合物を含むことができ、活性化合物は担体粒子内に被包されているか、粒子表面に吸着しているか、カルシウム、マグネシウム又は有機塩基などの金属カチオンと複合体形成しているか、不溶塩又は複合体に形成されているか、或いは重合して４０モノマーまでのポリマーになっている。これらの塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、ガリウム、又はカルシウム塩、又は任意の他の適切なカチオン（例えば、有機アミノ化合物）と共に形成された塩であってよい。塩又はポリマーは、約０．０１〜１．０μｍの範囲内、好ましくは約０．１〜０．５μｍの範囲内の直径を有する微粉状の粒子形であってよい。活性化合物は、その塩の形で、結晶化した水（含水及び無水）と共に、或いはそれ無しで存在してよい。さらに、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、プルロニクス、及び他の表面活性剤などの添加剤を使用して、塩及び又は複合体を安定化させ、コロイド又はナノ−サイズ懸濁液を確立することができる。一実施態様では、例えば組成物は、Ｃａ−ＢＰ塩及び又は複合体を含むことができる。
【００５２】
本発明の一実施態様では、活性化合物はリポソームに被包されている。当分野で知られている任意の方法によって、リポソームを調製することができる（リポソームの調製法に関する、Monkkonen, J. et al., 1994, J.Drug Target, 2:299-308, 及びMonkkonen, J. et al., 1993, Calcif.Tissue Int., 53:139-145を参照のこと）。リポソームは正に帯電しているか、中性であるか、或いは負に帯電しており（負に帯電しているリポソームが現在は好ましい）、単層又は多層であってよい。本発明の適切なリポソームは、例えば以下に記載したように、非毒性リポソーム、例えばホスファチジル−コリンホスホグリセロール、及びコレステロールから調製したリポソームなどであることが好ましい。多くの場合、リポソーム送達を使用することによって、食作用を介して細胞により、活性化合物の充分な取り込みがもたらされる。好ましいリポソームの直径は、０．１５〜３００ｎｍの範囲であってよい。しかしながら、これは単なる非制限的な例であり、他のサイズの範囲のリポソームも使用することができる。
【００５３】
他の好ましい実施態様では、活性化合物、例えばビスホスホネートは、不活性粒子に被包又は包埋することができる。他の実施態様では、活性化合物を、空の粒子の表面に吸着させ、或いは空の粒子中に吸着させることができる。空の粒子は、その中に被包又は包埋された薬剤を有していない粒子である。或いは活性化合物は、コロイド、集合体、凝集体、又は薬剤粒子の調製に関して当分野で知られている他のこのような構造を含む、粒子を形成することができる。さらに、このような粒子は、重合した活性化合物の集合体であってよい。
【００５４】
活性化合物の粒子は、インサイチュで得ることができる不溶塩又は複合体を使用することによって、即ち可溶性薬剤で始め、例えば適切な濃度及びｐＨにおいてＣａを加えることにより、その薬剤を「塩析」させることによって、得ることができる。分散又は遊離粒子を形成させ、表面活性剤、懸濁液、解こう剤によって、或いはゲル中で使用する増粘剤などの増粘剤によって安定化させる。活性化合物は、三価カチオン、例えばガリウムを加えることによってさらに沈殿させ、それによってガリウム−ＢＰ塩／複合体の沈殿物を形成することができる。
【００５５】
活性化合物は、例えば改変型ナノ沈殿法を使用することによって、粒子、例えばナノ粒子中に被包するか、或いはその上に吸着させることができる。本発明のこの実施態様では、活性化合物を含むポリマーナノ粒子を、水と薬剤及びポリマー（ＰＬＧＡ又は他のポリマー）それぞれの有機溶液を混合することによって形成する。したがって、形成された薬剤を含むナノ粒子は水に懸濁されており、凍結乾燥することができる。さらに活性化合物は、空のポリマーナノ粒子中に捕捉するか、或いは吸着させることができ、且つ／或いは空のポリマーナノ粒子の表面に吸着させることができる（空のナノ粒子は、その中に被包、包埋、及び／又は吸着された薬剤を有していない粒子である）。
【００５６】
活性化合物自体の粒子剤形、又はポリマー粒子剤形（例えばナノ粒子）の１つの利点は、凍結乾燥法、及び濾過滅菌以外の滅菌法が可能であることである。したがって、これらの形の活性化合物は、貯蔵寿命が長期で、且つ取り扱いやすい。
【００５７】
他の実施態様では、活性化合物、例えばビスホスホネートは、ナノ粒子（「ＮＰ」）中に被包することができる。ナノ粒子は、直径３０〜１０００ｎｍの球形又は非球形ポリマー粒子である。薬剤をナノ粒子中に被包する、ポリマーマトリクス（モノリシック）中に均一又は不均一に分散させる、表面に吸着させる、或いは任意のこれらの形と組み合わせることができる。治療用途において薬剤をさらに有効にするのは、この組成物形のサブミクロン的性質である。このサブミクロンのサイズによって、単球及びマクロファージなどの食細胞による取り込みが容易になり、肺中での取り込みが回避される。好ましい実施態様では、ナノ粒子を製造するために使用するポリマーは、生体適合性及び生分解性、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）ポリマー（ＰＬＧＡ）である。しかしながら、生体適合性及び生分解性である任意のポリマーを、使用することができる。したがって、ＮＰを製造するために使用することができる他のポリマーには、ポリ無水物、ポリアルキル−シアノアクリレート（ポリイソブチルシアノアクリレートなど）、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド及びその誘導体、キトサン、アルブミン、ゼラチンなどがあるが、これらには限定されない。活性化合物即ちビスホスホネートを被包するために使用する、ナノ粒子のサイズは、調製の方法、及び投与の態様（例えばＩＶ、ＩＡなど）に依存する。ナノ粒子は、７０〜５００ｎｍの範囲のサイズであることが好ましい。しかしながら、調製技法及び滅菌技法に応じて、より好ましい範囲には、１００〜３００ｎｍ、及び１００〜２２０ｎｍが含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
小さな、親水性の、帯電した活性化合物、例えばビスホスホネートをナノ粒子中に被包することは、本明細書に記載する。ナノ粒子の調製中に、水相へ薬剤が迅速に分散し、これによって低い捕捉効率がもたらされる。したがって、この低い被包効率を克服するための、製剤が開発された。以下の製剤のパラメータ：緩衝液、乳濁液、ＰＶＡなどの安定剤、ＰＬＧＡポリマーの量及び分子量、ＢＰの型、非溶媒の型、タイミング、成分の混合速度及び蒸発、真空圧、及び温度は、薬剤の捕捉効率及び放出性に影響を与える可能性がある。Ｃａ＋２などのカチオン、非溶媒、又は他の化合物を、ナノ粒子によって被包する前に、ＢＰと共に取り込ませて、親水性薬剤の溶解度を低下させ、その捕捉効率を高めることができる。「非溶媒」は、ポリマー又は薬剤とは非混和性であるが、存在する他の溶媒などとは混和性であり、ポリマー又は薬剤をその溶媒に残す。当分野で知られているいくつかのナノ粒子調製方法を使用することができ；その一般的な方法には乳濁液又は二重乳濁液溶媒−蒸発沈殿法、ナノ沈殿法、コアセルベーション法、及び固体−液体リポソーム法が含まれるが、これらには限定されない。
【００５９】
ナノ粒子の表面は、ポリマー及び／又はＢＰの酸性官能基によって、負に帯電していることが好ましいので、食細胞による充分な取り込みが予想され、それによって再狭窄に対する高い活性がもたらされる。電荷が中性である粒子を使用して、ＢＰを被包することもできるが、単球／マクロファージによる最も有効な取り込みは帯電粒子によって起こり、負に帯電した粒子が好ましい。
【００６０】
本発明の組成物中に使用する薬理学的担体又は希釈剤は、当分野で知られている従来の固体、液体、又は半固形担体の任意の１つであってよい。固形担体は例えば、ラクトース、スクロース、ゼラチン、及び他の炭水化物であってよい。液状担体は例えば、ピーナッツ油などの注射に適した生体適合性の油、水、又は生体適合性の液体の混合物、或いはポリエチレン又はゼラチンゲルなどの生体適合性の粘性担体であってよい。
【００６１】
注射用に使用する活性化合物の製剤は、適切な添加剤を含む乳濁液、懸濁液、コロイド溶液、及び当業者に知られている他の適切な組成物から選択することができる。
【００６２】
活性化合物の製剤は、活性化合物を適切又は所望の作用部位に効果的に運ぶ、任意の経路によって投与することができる。本発明の好ましい実施態様により、投与の態様は静脈内（ＩＶ）及び動脈内（ＩＡ）（オンライン投与に特に適する）である。他の適切な投与の態様には、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、又は腹腔内（ＩＰ）がある。このような投与は、大量注射又は注入であってよい。組成物は、例えば活性化合物でコーティングされた医療用具によって、動脈の疾患部位に局所的に投与することもできる。他の投与の態様は、血管周囲への送達によるものであってよい。任意の前述の投与経路の組合せも、本発明に従って使用することができる。
【００６３】
使用する活性化合物の用量は、選択した活性化合物の特異的活性、投与の態様（例えば、全身投与又は局所送達）、活性化合物の形（例えば、リポソーム、ナノ粒子などの粒子に被包されたポリマーなど）、粒子のサイズ、ビスホスホネートの型、投与経路、注射の回数、注射のタイミング、必要な患者の生物学的性質／病状、及びそれ自体が知られている他の要因によって変わる。
【００６４】
一実施態様では、ヒト中のクロドロネート含有リポソーム（リポソームクロドロネート（「ＬＣ」））に関する用量は、０．０１５ｍｇ／ｋｇ（体重１ｋｇ当たり）から１５０ｍｇ／ｋｇの範囲であることが好ましいが、より好ましくは、用量は０．１５〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。当業者により容易に決定することができるように、これらの好ましい範囲外の用量を使用することもできる。ＩＶ／ＩＡ注射又は局所送達法を使用する、即ちバルーンカテーテルによる場合は、用量はその範囲の下限である。しかし、ＩＭ又はＳＣ投与態様を使用する場合は、その用量は、ＩＶ投与に使用する用量の約１０倍である。
【００６５】
本発明の好ましい実施態様に従い、製剤を用いる個体の治療は、その発生前に再狭窄を予防する目的のものであってよい。予防のために、活性化合物は、血管形成術前、血管形成術中、又は血管形成後、並びに血管形成術投与の前、最中、後を組み合わせて、個体に投与することができる。さらに活性化合物は、ＩＶ、ＩＡ、ＩＭ、ＳＣ、ＩＰ、又は任意の他の適切な投与型によって投与することができる。例えば、活性化合物は、血管形成術の日（第０日）にＩＡによって、血管形成術前の日（−１）にＩＶによって、且つ／或いは第０日に、ＩＶによって、血管形成術前の日（−１）及び血管形成術投与の後、例えば第６日に投与することもできる。
【００６６】
本発明の他の実施態様に従い、活性化合物を、再狭窄を低下させる、或いは治療する目的で、再狭窄に罹患している個体に投与する。このような場合、活性化合物は、再狭窄が発見された後の異なる時間地点で、単独或いは他種の治療剤と組み合わせて、個体に投与することもできる。
【００６７】
さらに活性化合物は、促進性動脈硬化症をもたらす可能性がある任意の他の状態の前に、並びに方法がその状態のさらなる進行を阻害し始めた直後に、投与することができる。
【００６８】
ここで本発明を、添付の図面を参照しながら、非制限的な実施例によって示す。以下の実施例で使用する動物モデルは、バルーン損傷ラット頚動脈モデル、及びバルーン損傷高コレステロール血症ウサギ頚動脈モデルを含む。ラットは、薬剤及び複合物の抗再狭窄効果を評価する際の、許容可能なモデルであるが、ウサギがより好ましい。なぜならウサギは、ラットと異なり、アテローム性動脈硬化症であり、しかも動脈壁中に相当数のマクロファージを含むからである。
【実施例１】
【００６９】
クロドロネートのリポソーム
クロドロネートのストック溶液を、０．１１Ｍの濃度、ｐＨ＝７で、薬剤を脱イオン水に溶解することによって調製した。
【００７０】
リポソームの調製
３８．９ｍｇのジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、１１８．５ｍｇのジステアロイル−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及び３８．７ｍｇのコレステロールを、正確に計量し、丸底バイアルにおいて２０ｍｌのクロロホルム：メタノール（９：１）に溶解した。バイアルを徐々に温め、次いで溶媒を回転式装置中で蒸発させた。次いで２０ｍｌの水和ジイソプロピルエーテルを加え、中身が溶解するまでバイアルを水浴中に置いた。前に記載したのと同様に調製した８ｍｌのクロドロネート溶液を次いで加え、４５分間の間５５℃で、溶液を超音波処理した。次いで有機相を回転式装置中で蒸発させた（５５℃、１００ｒｐｍ）。同様にして、他の薬剤含有リポソームを調製することができる。
【００７１】
調製したリポソームの精製
２．６グラムのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を４０ｍｌの水に溶解し、一晩安定化させることによって、Ｓｅｐｈａｄｅｘゲルを調製した。１００ｍｌの緩衝液（５０ｍＭのＭｅｓ＋５０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋７５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）でカラムをすすいだ。リポソームをカラムに広げ、カラムをこの緩衝液ですすいだ。リポソームはバンドとして見られ、これらはカラム中においてその色を伴うことができた。約２０滴を、カラムからそれぞれのチューブに回収した。
【００７２】
動物
Faculty of Medicine, The Hebrew University of Jerusalemの動物施設で動物を得、同施設に収容し、Hebrew University of Jerusalemの実験動物の管理及び使用に関する規格に従った。３５０〜４２０ｇの重量の、イスラエル系統のオスのラットを使用した。これらの動物には、標準的な実験用固形飼料及び水道水を自由に与えた。インビボでの実験はすべて、一般的な麻酔下で行い、８０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び５ｍｇ／ｋｇキシラジンをＩＰ投与した。
【００７３】
ラット頚動脈カテーテル損傷モデル
遠位の左側共通及び外側頚動脈を、頚部の正中線切開によって露出させた。左側共通の頚動脈は、外側頚動脈を介して導入する、２Ｆバルーンカテーテルを腔内に通すことによって内皮を剥ぎ取った。カテーテルを、生理食塩水で充分に膨張させたバルーンと共に３回通過させると、わずかな抵抗が生じた。次いでカテーテルを除去し、外側頚動脈を連結して、創傷を手術用ステープルで閉じた。
【００７４】
７匹のラットを対照群として、６匹のラットを治療群として（ランダムに選択した）用いた。リポソームクロドロネートを、動脈損傷の１日前に「治療群」にＩＶ注射し（ラット当たりクロドロネート６ｍｇ）、第６日目にこれをもう一度行った。対照群には、同様ではあるが、「空の」即ちブランクリポソーム（クロドロネートなし）の注射を投与した。
【００７５】
動物はすべて、過剰用量のペントバルビタールによって、損傷後１４日で死滅した。１００ｍｍＨｇにおいて１５０ｍｌの４％ホルムアルデヒド溶液ｐＨ７．４で、動脈を潅流固定した。右心房を切開し、潅流系と結合した１８Ｇカテーテルを、左心房に挿入した。動脈部分を切開し、切断し、ポリマーと徐々に分離し、同じ固定溶液中で少なくとも４８時間、後固定した。その動脈部分をパラフィンに包埋し、８〜１０の部位で６００μｍ隔てて切断した。次いで６μｍの切片を固定し、組織を調べるためにベルホエフのエラスチン染色液で染色した。
【００７６】
形態計測解析
実験群の型を全く知らない研究者によって、顕微鏡によりスライドを調べた。それぞれのスライド中の６〜８の切片を、コンピュータによる形態計測解析によって評価し、群間を比較するために、平均切片データをスライド全体の指標としてさらに使用した。残留腔、内側弾性膜によって結合した領域（元の腔）、及び外側弾性膜によって囲まれた領域（「動脈領域全体」）を直接測定した。新内膜肥大の程度は、新内膜領域と元の腔の間の比（狭窄の％）として、また新内膜領域と内側領域の間の比（Ｎ／Ｍ）として表した。内側領域、ＳＭＣの生存能力の間接的指標は、動脈領域全体と元の腔領域の間の差として決定した。
【００７７】
外科手術手順及び治療によって、動物の死亡又は明らかな罹患が引き起こされることはなかった。
【００７８】
図１中に見られるように、新内膜領域と内側領域の間の比（Ｎ／Ｍ）は、リポソーム中に被包されたクロドロネートを用いた治療後に、有意に低下した。クロドロネート治療したラットのＮ／Ｍ比は、対照群の１．４２±０．２６と比較して、０．２８±０．２３であった（平均値±ＳＤ、ｐ＜０．０１）。同様に、図２中に見られるように、狭窄の％の有意な阻害が治療群で得られ：治療群と対照群で、それぞれ９．８±７．７６対４１．５３±７．９であった（平均値±ＳＤ、ｐ＜０．０１）。図３に示すように、明らかな全身性の副作用も、体細胞増殖に対するいかなる影響も存在しなかった。
【００７９】
したがって、これらの実験の結果によって、クロドロネート含有リポソームを用いてラットを治療することにより、冠状動脈のバルーン損傷の後に新内膜形成として観察される再狭窄が、有意に低下することが示される。
【実施例２】
【００８０】
リポソームクロドロネート注射の抗再狭窄効果を、バルーン損傷ラット及び高コレステロール血症ウサギ頚動脈モデルにおいて試験した。ラットは、クロドロネート含有リポソーム、空のリポソーム（対照）、及びクロドロネート溶液（他の対照）によって治療した。注射したクロドロネートの用量は１．５ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇであり、手順の１日前（−１）及び／又は損傷の６日後（＋６）に投与した。ウサギ（アテローム性動脈硬化症用治療食の３０日後のもの）を、リポソームクロドロネート（１０ｍｇ／ｋｇ）によって、バルーン血管形成術の１日前に治療した。腔、新内膜、内側及び血管の領域及び体積を、それぞれラット及びウサギモデルで損傷後１４日及び３０日に、組織切片をデジタル式に面積測定することにより、治療及び対照動物群で測定した。
【００８１】
リポソームクロドロネートの抗再狭窄効果の結果は、図４に示す。示したように、空のリポソームと溶液中の遊離クロドロネートの治療の間に有意な差異は見られず、これらはいずれも顕著な新内膜形成を示した。平均的な新内膜形成、平均的な新内膜領域と内側領域の間の比（Ｎ／Ｍ）、クロドロネート含有リポソームを用いた治療の後の狭窄の％の程度は、有意に低下した。しかしながら、内側領域は様々な治療によって影響を受けず、休止期細胞に対する有害な影響は示されなかった。さらに、明らかな全身性の副作用も、骨及び体細胞増殖に対するいかなる影響も存在しなかった。有意なことに、さらに強力な治療が、詳細には１×１５ｍｇ／ｋｇ（−１）及び２×１５ｍｇ／ｋｇ（−１、及び＋６）の注射で認められ、これらの間に有意な差異はなかった。悪影響がないという同様の知見が、ウサギの試験においても見られた。リポソームクロドロネートは、新内膜形成及び狭窄の％を低下させる上で、著しく有効であった。
【００８２】
さらに、シリカ粒子の注射によっても、新内膜形成が低下する（図４）。この観察結果は、シリカのマクロファージに対する知られている抑制効果に起因する可能性がある。
【００８３】
この実験の結果によって、クロドロネート含有リポソームによる治療は、ラット及びウサギモデルにおいてバルーン損傷後の、新内膜形成を有意に低下させることが示された。明らかな全身性及び局所性の副作用も、体細胞増殖に対するいかなる影響も存在しなかった。ＢＰは骨に影響を与えるものとして知られているが、骨、又は骨及び血液中のカルシウム及びリン酸レベルに対しては影響を与えず、クロドロネートのリポソーム調製物を用いた治療の後に観察されたことに注目されたい。
【実施例３】
【００８４】
ＩＳＡ組成物のＲＡＷ２６４増殖に対する影響
ナノ粒子に被包されたＩＳＡ
二重乳濁系を使用する、新規な溶媒蒸発ポリマー沈殿技法によって、ナノ粒子（ＮＰ）を調製した。２０ｍｇのＩＳＡ酸(Cohen, H．et al., 1999, Pharm. Res., 16:1399-406)及び８．９ｍｇのＮａＨＣＯ３を０．５ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液に溶かし、９０ｍｇのＰＬＧＡを３ｍｌのジクロロメタンに溶解した。水性ナトリウムＩＳＡ溶液をＰＬＧＡ有機溶液に加えて、油中水型（Ｗ／Ｏ）乳濁液を、プローブ型超音波装置を使用した、氷浴での超音波処理によって形成した。このＷ／Ｏ乳濁液を、次いで２％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（２０ｍｌ）フィルタ滅菌溶液に加え、ＣａＣｌ２をＩＳＡに対して２：１のモル比で含むＮａＯＨ溶液を用いて、ｐＨを７．４に調整した。この混合物を氷浴で混合させ、二重乳濁液（Ｗ／Ｏ／Ｗ）を形成した。乳濁液は４℃で一晩攪拌して、有機溶媒を蒸発させた。
【００８５】
いかなる薬剤もその中に被包していなかったナノ粒子（空のＮＰと呼ぶ）を、薬剤を削除することによる同じ手順に従い調製した。Ｃａ＋２−ＩＳＡ塩とＰＶＡ、及びＣａ＋２−ＩＳＡ塩を、それぞれポリマーを削除することにより、或いはポリマーとＰＶＡとを削除することにより、同じ手順に従い調製した。Ｃａ＋２−ＩＳＡを、ナノ粒子を緩衝液中に分散させ、前に使用したものと同じ成分と共にＩＳＡ−カルシウムを沈殿させることによって、空のナノ粒子（前述と同様に調製したもの）に吸着させた。ＮＰ中に捕捉された薬剤の量は、連続して超遠心分離法を行った後に、分光光度計により決定した。
【００８６】
薬剤捕捉効率、放出性、及びサイズに対する、様々な製剤のパラメータの影響が調べられている。例えば、以下のパラメータ：緩衝液、乳化剤、様々な量のＩＳＡ、ＣａＣｌ２（存在しない場合も含めて）、ＰＶＡの量（存在しない場合も含めて）、異なる量及び分子量のＰＬＧＡ／ＰＬＡポリマー、温度、収率及び捕捉効率が評価された。様々な配合ステップによって、ＩＳＡを含む球状ナノ粒子の進展がもたらされた。さらに、ＮＰ製剤の再現性は実証されている。高収率、高捕捉効率、及び高凍結乾燥性は、任意のナノ粒子担体の重要な特徴である。
【００８７】
図５は、ＩＳＡ充填ナノ粒子及び空のナノ粒子の、典型的製剤を示す。図５は典型的製剤を示すが、他の製剤も有効である可能性があることは理解されるであろう。示した製剤のパラメータには、凍結乾燥前後のナノ粒子のサイズ、回収率、ＩＳＡ捕捉（開始時の％として測定）、最終ＩＳＡ含量、ＮＰ中のＩＳＡ、上清中のＩＳＡ、最初のＩＳＡ含量、Ｃａ＋２回収率、上清中のＣａ＋２、ＮＰ中のＣａ＋２、Ｃａ＋２とＩＳＡの比、及びゼータ電位が含まれる。凍結乾燥前のナノ粒子のサイズは３７６ｎｍであり、凍結乾燥後には３９６ｎｍに増大した。典型的には、ナノ粒子のサイズは１００〜５００ｎｍの範囲であり、これは調製及び滅菌技法だけでなく、投与の態様によっても変わる。凍結乾燥はナノ粒子の貯蔵寿命を増大させるだけでなく、γ線照射によってＮＰを滅菌することも可能にする。回収率は、６８．７％として図５に示す。ビスホスホネートＮＰの抗再狭窄効果に重要なのは、ナノ粒子中のビスホスホネート含量及び捕捉効率である。これらのパラメータは、ＩＳＡ捕捉、５９．６％として図５に示される；最終ＩＳＡ含量、ＩＳＡ重量とＮＰ総重量の比として測定され、１６．５％として示されるが、２５〜４０％の範囲であってよい；ＮＰ中のＩＳＡの量、１１．９ｍｇとして示されるが、状況に応じて変わる可能性がある；上清中のＩＳＡの量、１．１ｍｇとして示されるが、前述の捕捉効率の関数として変わる可能性がある；及び初期ＩＳＡ含量、１８．１％として示されるが、ポリマー量と適切な比で任意の割合であってよい、によって測定される。親水性薬剤の溶解度を低下させ、その捕捉効率を増大させるために、Ｃａ＋２などのカチオンを複合体に加える。Ｃａ＋２に関連するパラメータには：Ｃａ＋２回収率、７２．３％として示される；上清中のＣａ＋２、３８％として示される；ＮＰ中のＣａ＋２、３４％として示される；及びＣａ＋２／ＩＳＡ、１．２ｍｏｌとして示される；がある。しかしながら、これらのパラメータは、カルシウムとＩＳＡの比、添加剤の型、溶液のｐＨ、及び他の同様の要因の関数として変動してもよい。さらに、ゼータ電位は−５．７として示される。ナノ粒子のゼータ電位に関する負の値は、食細胞（例えばマクロファージ）による効率の良い取り込みのために重要である。
【００８８】
さらに凍結乾燥ＮＰは、インビトロ及びインビボの実験で、非凍結乾燥ＮＰと類似の性質を有することが示された。実際、このことは非常に重要である。なぜならＮＰの滅菌は、乾燥ＮＰのγ線照射、エチレンオキシド滅菌、蒸気滅菌（他のポリマーを使用するとき）、又は濾過滅菌によって行うことが可能であるからである。
【００８９】
それぞれの粒子担体（例えば、ポリマーミクロ／ナノ粒子）は、ビスホスホネート薬剤に関してある程度の捕捉効率を示した。ＮＰ中のＩＳＡ捕捉効率は６０％に達し、ＰＬＧＡナノ粒子又はリポソーム中の任意の所与の親水性薬剤に関して、文献中で報告されている任意の効率より大幅に高い。
【００９０】
ビスホスホネート、ＩＳＡは、モデルのビスホスホネートとして働く。他のＢＰの物理化学的性質は、ＩＳＡのそれと類似している。さらにＩＳＡは、低分子量、親水性、帯電分子のモデル薬剤として働くので、本明細書中の実験でモデルのビスホスホネートとして使用した。ＩＳＡの諸性質に関しては、Cohen H, Alferiev IS, Monkkonen J, Seibel MJ, Pinto T, Ezra A, Solomon V, Stepensky D, Sagi H, Ornoy A, Patlas N, Hagele G、Hoffinan A, Breuer E、Golomb G, 1999, “Synthesis  and  preclinical  pharmacology of 2-(2-aminopyrimidinio) ethylidene-1,1-bisphosphonic acid betaine (ISA-13-1)-a novel bisphosphonate.” Pharm Res.;16:1399-406を参照のこと。
【００９１】
インビトロでの生物活性
ＲＡＷ２６４細胞の増殖に対するＩＳＡの影響を測定した。ネズミのマクロファージ細胞系に由来するＲＡＷ２６４細胞を、２４ウエルプレート中にウエル当たり細胞２×１０４個で平板培養し、約２４時間ＤＭＥＭ中で増殖させた。次いで細胞を、ＩＳＡ薬剤の様々な組成物、詳細には遊離ＩＳＡ、ＩＳＡ−Ｃａ＋２塩、及びナノ粒子中に被包されたＩＳＡ（「ＩＳＡ  ＮＰ」）で処理した。前述のように、ＩＳＡ  ＮＰは、ビスホスホネートの溶解度を低下させ、その捕捉効率を増大させるためにＣａ＋２を含む。比較目的用に、ＲＡＷ２６４細胞を空のＮＰ、即ち薬剤がその中に埋め込まれていないナノ粒子でも処理した。次いで細胞を、処理後４８時間で分析した。分析はＣｏｕｌｔｅｒ計数器による細胞計数、及びトリパンブルーの排除アッセイによる細胞生存率測定を含んでいた。
【００９２】
インビトロでのＲＡＷ２６４細胞の増殖に対する、ＩＳＡ組成物の影響を図６に示す。緩衝液のみの中での細胞増殖を、１００％として定義した。示されるデータは、平均値±ＳＤ（６＜Ｎ＜２７）である。汎例が示すように、緩衝液と比較した＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及びＩＳＡ＋Ｃａ＋２と比較した＄Ｐ＜０．０１によって、これらの差異が統計学的に有意であることが示される。
【００９３】
図６に示すように、遊離ＩＳＡは、ＲＡＷ２６４細胞（マクロファージ）の増殖に対して、ごくわずかしか影響を及ぼさなかった。しかしながら、塩を形成させるために、等しいＣａ＋２濃度をＩＳＡに加えることによって、ビスホスホネート活性が増大し、用量応答式にＲＡＷ２６４細胞の増殖を有意に抑制した。実際に、ＩＳＡ−Ｃａ＋２塩の使用は、ＩＳＡ  ＮＰ活性の適切な対照群として働いた。なぜなら両方の組成物が、等モル量のＣａ＋２及びＩＳＡを含んでいたからである。ナノ粒子中に被包されたＩＳＡ（「ＩＳＡ  ＮＰ」）は、ＲＡＷ２６４細胞の増殖の、強力な阻害剤であることが見出された。図６に示すように、ＩＳＡ  ＮＰは、ＩＳＡ及びＩＳＡ＋Ｃａ＋２の両方より、はるかに強力であった。空のＮＰは、１００μＭまでＲＡＷ２６４細胞の増殖に対して全く影響がなく、ＩＳＡ  ＮＰの増殖阻害効果が、ポリマーによってではなく、ＩＳＡによって引き起こされたことが示される。
【００９４】
さらに、Ｃａ＋２−ＩＳＡ塩製剤の、ＲＡＷ２６４増殖に対する影響を図７に示す。以下の製剤を評価した：Ｃａ＋２−ＩＳＡ塩、Ｃａ＋２−ＩＳＡ塩＋ＰＶＡ、及び空のＮＰの表面に吸着したＣａ＋２−ＩＳＡ。緩衝液のみの中での細胞増殖を、１００％として定義した。Ｎ．Ｂ．、低い列は高い強度を表す。
【００９５】
図７に示すように、Ｃａ＋２−ＩＳＡ塩は、５０μＭでＲＡＷ２６４細胞の増殖を強く阻害し、ＰＶＡをＣａ＋２−ＩＳＡ塩に加えることによって、その活性がさらに増大した。前述のように、ＰＶＡは、ＢＰ−塩／複合体を安定化させるために使用される添加剤である。しかしながら、空のＮＰの表面に吸着したＣａ＋２−ＩＳＡは、ＲＡＷ２６４細胞の増殖を有意に抑制した。図６及び７に示すように、空のＮＰに吸着したＣａ＋２−ＩＳＡ塩（５０μＭ）、及びＮＰ中に被包されたＩＳＡ（５０μＭ）は、ＲＡＷ２６４増殖の類似した阻害剤であった。要約すると、実験の結果から、Ｃａ＋２−ＩＳＡ塩粒子は、マクロファージを排除又は抑制することによって再狭窄を抑制する際に、有用であることが示される。
【００９６】
しかしながら、マクロファージを排除するための、Ｃａ＋２−ＩＳＡ塩粒子のインビボでの使用には、組成物をナノメートルのサイズに維持して、ＩＶ使用に適したものにすることが必要となる。塩複合体をナノメートルのサイズに維持することは、Ｃａ＋２−ＩＳＡ塩調製中に適切な界面活性剤を用いて行うことができる。実際、Ｃａ＋２−ＩＳＡ塩複合体を使用して、再狭窄を治療することの利点は、その簡潔性、及びＰＬＧＡの使用が避けられることである。しかし、この手法の欠点は、その高い希釈率によって、投与の数秒後にはＣａ＋２−ＩＳＡ塩が早急に溶解することであると考えられる。
【００９７】
同様の実験を行って、成体であるオスのイスラエル産ラットの大動脈から抽出した平滑筋細胞、及び３Ｔ３線維芽細胞の増殖に対する、ＩＳＡ  ＮＰの影響を測定した。実験の結果（示さず）から、ＩＳＡ  ＮＰがラットのＳＭＣ及び３Ｔ３細胞（線維芽細胞）の増殖を有意に阻害したことが示される。
【００９８】
要約すると、ＮＰ中に被包されたＩＳＡは、再狭窄のカスケードに関連する３つの主要な細胞型、即ちマクロファージ（ＲＡＷ２６４細胞）、線維芽細胞（３Ｔ３細胞）及び平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖を阻害することが見出された。
【実施例４】
【００９９】
ＩＳＡナノ粒子の、再狭窄のラット頚動脈モデルにおける影響
インビボでの生物活性
以下の実験によって、ＮＰ中、特にＰＬＧＡ系ＮＰ中に被包されたＩＳＡの、新内膜形成に対する影響を調べた。ＩＳＡ  ＮＰは、実施例３に前述したのと同様に調製した。さらに、オスのイスラエル産ラットを、実施例１に前述したラット頚動脈カテーテル損傷モデルに従って、使用し調製した。ＩＳＡ  ＮＰを、動脈損傷の１日前（−１ｄ）に、１５ｍｇ／ｋｇの用量で「治療群」にＩＶ注射した。対照群では、同様の注射ではあるが、空のＮＰ、即ちその中にＩＳＡが被包又は吸着されていないナノ粒子を含む注射を行った。
【０１００】
次いで動物を損傷１４日で犠牲にし、それらの動脈部分を切開し、組織を調べるために調製した（詳細に関しては、上記の実施例１を参照のこと）。動脈部分は、コンピュータによる形態計測解析によって評価した。残留腔、内側弾性膜によって結合した領域（元の腔）、及び外側弾性膜によって囲まれた領域（「動脈領域全体」）を直接測定した。新内膜肥大の程度は、新内膜領域と元の腔の間の比（狭窄の％）として、及び新内膜領域と内側領域の間の比（Ｎ／Ｍ）として表した。内側領域、ＳＭＣの生存能力の間接的指標は、動脈領域全体と元の腔領域の間の差として決定した。
【０１０１】
実験の結果により、ＩＳＡ  ＮＰを投与することよって、空のＮＰ治療と比較して、血管の新内膜形成を有意に阻害したことが示される。図８Ａに示すように、狭窄の有意な阻害％が、ＩＳＡ  ＮＰ治療群（ｎ＝１２）で得られた。同様に、図８Ｂに示すように、ＩＳＡ  ＮＰによる治療後の、平均新内膜領域と平均内側領域の間の比（Ｎ／Ｍ）は、有意に低下した。したがって、これらの実験結果により、ＩＶ投与によりＩＳＡ被包ナノ粒子を用いて、ラットを治療することによって、頚動脈のバルーン損傷後の新内膜形成として観察される再狭窄が、有意に低下することが示される。
【０１０２】
さらに、ナノ粒子に被包されたＩＳＡのＳＣ投与が評価され、血管損傷後１４日で新内膜形成を有意に阻害したことが見出された。しかしながら、ＳＣ投与によって、ＩＳＡ  ＮＰのＩＶ送達から得られる効果より、弱い再狭窄抑制効果がもたらされた。
【０１０３】
要約すると、前の実験によって、ＮＰ中に被包されたＩＳＡ又はＮＰに吸着したＩＳＡの、改善された安定性、高い薬剤捕捉効率、及び高い生物活性には、臨床用途に対する新規で重要な利点があることが示される。さらに、Ｃａ−ＢＰ塩粒子が、単球の増殖を抑制する際に、生物活性があり有効であることも見出された。
【実施例５】
【０１０４】
再狭窄のウサギモデルにおける、アレンドロネート−ナノ粒子の影響
アレンドロネートＮＰ
ナノ粒子中に被包されたアレンドロネート（「アレンドロネートＮＰ」）を、二重乳濁系を使用する、新規な溶媒蒸発ポリマー沈殿技法によって調製した。２０ｍｇのアレンドロネートを、２．８％のＰＶＡを含む０．５ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液に溶解し、９０ｍｇのＰＬＧＡを３ｍｌのジクロロメタンに溶解した。水性アレンドロネート溶液をＰＬＧＡ有機溶液に加えて、油中水型（Ｗ／Ｏ）乳濁液を、プローブ型超音波装置を、１４Ｗで９０秒間使用して、氷浴での超音波処理によって形成した。このＷ／Ｏ乳濁液を、１０．５ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（２％ＰＶＡ及びＣａＣｌ２溶液をアレンドロネートに対して２：１のモル比で含む）にさらに加え、氷浴で９０秒間超音波処理し、二重乳濁液（Ｗ／Ｏ／Ｗ）を形成した。乳濁液は４℃で３時間攪拌して、有機溶媒を蒸発させた。
【０１０５】
図９は、形成されたアレンドロネートＮＰに関する、製剤のパラメータを示す。図９は典型的なアレンドロネートＮＰを示すものであるが、様々な製剤も有効である可能性があることは理解されるであろう。製剤のパラメータには、サイズ、アレンドロネートの捕捉、ＮＰ中のアレンドロネートの量、上清中のアレンドロネート、アレンドロネートの開始量、ＰＬＧＡ量、及び０．２４６Ｍ塩化カルシウム溶液の体積が含まれる。ナノ粒子のサイズは、２１９ｎｍであった。前に論じたように、典型的には、ナノ粒子のサイズは１００〜５００ｎｍの範囲であるが、これは調製及び滅菌技法だけでなく、投与の形式によっても変わる。ビスホスホネートＮＰの抗再狭窄効果に重要であるのは、ナノ粒子中のビスホスホネート含量及び捕捉効率である。これらのパラメータは、アレンドロネート捕捉、５５．１％として図９に示される；ＮＰ中のアレンドロネート、１．００２ｍｇ／ｍｌとして示される；上清中のアレンドロネート、０．２３２ｍｇ／ｍｌとして示される；アレンドロネートの初期量、２０ｍｇとして示される；ＰＬＧＡの量、９０ｍｇとして示される；及び塩化カルシウムの体積、０．５ｍｌとして示される、によって測定される。しかし、これらのパラメータを改良して、他の製剤を提供することができる。この実験では、アレンドロネートＮＰのＲＡＷ２６４増殖に対する影響を評価した。ＲＡＷ２６４細胞の増殖、及びその後のＮＰによる処理を記載する手順に関しては、前述の実施例３を参照のこと。図１０に示すように、アレンドロネートＮＰは、マクロファージの強力な阻害剤であり、その活性は濃度と共に増大する。
【０１０６】
バルーン損傷高コレステロール血症ウサギ頚動脈モデル
アレンドロネートＮＰの抗再狭窄効果を、バルーン損傷ラット及びバルーン損傷高コレステロール血症ウサギ頚動脈モデルの両方で評価した。アレンドロネートＮＰは、両方のモデルの再狭窄を低下させる際に成功したが、特に重要なのは、バルーン損傷したウサギの高コレステロール血症モデルで発見された顕著な有効性である。ウサギは、ＳＣ及びＩＶ投与によって、アレンドロネートＮＰ及び空のＮＰ（対照）により治療して、２つの投与形式間の差異を比較した。１つの群のウサギは、ＳＣ投与によって１．５ｍｇ／ｋｇのアレンドロネートＮＰで、バルーン血管形成術の１日前に治療した。比較目的で、他の２つの群も、ＳＣ及びＩＶ投与によって、０．１５ｍｇ／ｋｇのアレンドロネートＮＰで、手順の１日前（−１ｄ）に治療した。腔、新内膜、内側及び血管の領域を、損傷後３０日に組織切片をデジタル式に面積測定することにより、治療及び対照ウサギ群で測定した。
【０１０７】
バルーン損傷高コレステロール血症ウサギモデルにおける、アレンドロネートＮＰの抗再狭窄効果の結果を、図１１、１２ａ及び１２ｂに示す。
【０１０８】
図１１は、ＳＣ投与によるアレンドロネートＮＰを用いた治療後に、再狭窄の％が有意に低下したことを示す。
【０１０９】
図１２ａ及び１２ｂは、ＳＣ投与による２つの用量、詳細には１．５ｍｇ／ｋｇと０．１５ｍｇ／ｋｇのアレンドロネートＮＰの影響、及び２つの投与形式、ＩＶ及びＳＣの影響も比較する。これらの図に示すように、平均新内膜と平均内側の比（Ｎ／Ｍ）、及び狭窄の％は、用量応答式に低下した。詳細には１．５ｍｇ／ｋｇの用量が、Ｎ／Ｍ及び再狭窄の％を低下させる際に、０．１５ｍｇ／ｋｇと比較してより有効であった。さらに、ＳＣ投与によるアレンドロネートＮＰによって、新内膜形成の阻害及び再狭窄の％が、ＩＶ送達により得られたものよりわずかに増大したが、実験の標準偏差に照らして有意ではなかった。さらに、明らかな全身性副作用、或いは骨又は体細胞増殖に対するいかなる影響も存在しなかった。
【０１１０】
結論として、アレンドロネートＮＰは、ＳＣ及びＩＶ投与による動物モデルにおいて、再狭窄の非常に強力な阻害剤である。さらに、０．１５〜１．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量は、再狭窄を予防する際の最も強力な送達系であることが見出された。
【実施例６】
【０１１１】
ヒト血液における、アレンドロネート−ナノ粒子の影響
この実施例では、ヒト血液中の単球の数を低下させる、アレンドロネートＮＰの能力を試験した。ヒト血液をＥＤＴＡ含有試験管に取り出し、２００μｌを２４時間３７℃で攪拌器において、５０のＰＢＳに希釈した指定用量のアレンドロネート−ナノ粒子５０μｌと共にインキュベートした。対照サンプルは、５０μｌと共にインキュベートした。次いでこれらのサンプルを、ＲＰＥ結合抗ＣＤ１４Ａｂ（単球に特異的）と共に、３０分間インキュベートした（３０分間、４℃、暗所中）。ＲＢＣ（赤血球細胞）を、ＦＡＣＳ溶解溶液（Becton-Dickinson社製, San-Jose, Ca）及び蒸留水によって溶解させ、次にＦＡＣＳ（蛍光活性細胞選別）溶液中で洗浄し、フローサイトメトリー分析を行った。側面散乱及び蛍光によって、単球を検出した。
【０１１２】
アレンドロネート−ナノ粒子の抗増殖効果の、ヒト血液中の単球に対する影響の結果を図１３に示す。アレンドロネートＮＰが、ヒト血液中の単球の量を用量応答式に、大幅に低下させることは明らかである。単球は、その正常状態で、血管形成術又は他の侵入的介入により外傷を受けた領域に入り、平滑筋細胞の増殖を開始させ、これによって再狭窄をもたらすことから、単球の数を抑制すると再狭窄が抑制されると考えられる。
【実施例７】
【０１１３】
リポソームのクロドロネートの、ＩＬ−１β生成及び転写、並びにＭＭＰ−２活性に対する影響
リポソームのクロドロネートの、インターロイキン１−β（ＩＬ−１β）生成、及び転写、並びにマトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）活性に対する影響を、バルーン損傷ラット及び高コレステロール血症ウサギ頚動脈モデルにおいて試験した。１つの群のオスのイスラエル産ラットを、実施例１に前述したラット頚動脈カテーテル損傷モデルに従って調製した。高コレステロール血症ウサギモデルは、重量２．５〜３．５ｋｇのニュージーランド産白ウサギから形成された。これらのウサギには、コレステロール２％及びピーナッツ油６％のアテローム性動脈硬化症用の飼料を与え、これは血管形成及び高コレステロール血症が確定する（血漿コレステロール＞１，２００ｍｇ／ｄＬ）３０日前に開始した。次いでウサギに、キシラジン（７ｍｇ／ｋｇ）及びケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）によって麻酔をかけた。ヘパリン（２００単位／ｋｇ）、アトロピン（０．０５ｍｇ）及びノルフロキサシンニコチネート（７０ｍｇ）も、ウサギに投与した。その後、バルーン損傷を、３ｍｍの血管形成術用バルーンカテーテル（Cordis社製、Miami, ＦＬ、 ＵＳＡ、２×１分膨張、８ａｔｍ）を用いて、左の共通の大動脈に行った。ウサギモデルとラットモデルの両方で、リポソームのクロドロネート（ＬＣ）を、動脈損傷の１日前（−１ｄ）と１５ｍｇ／ｋｇの投与の６日後（＋６）の両方で、「治療群」にＩＶ注射した。対照動物は、空のリポソーム、即ちビスホスホネートがその中に被包されていないリポソームで治療した。
【０１１４】
ＩＬ−１β生成及び転写
動脈及び肝臓を、コラゲナーゼ緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．０２％のＢｒｉｊ３５、０．２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６）中で、均質状態にした。ＩＬ−１βは、市販のＥＬＩＳＡキット（R＆d Systems社製、Minneapolis、ＭＮ、ＵＳＡ）を使用して測定した。ＲＴ−ＰＣＲ分析用に、頚動脈からのＲＮＡを、ＲＮＡ単離キット（Life Technologies社製、ＵＳＡ）を使用して抽出した。ＲＮＡの量、サイズ及び質を、従来の１．０％アガロースゲル電気泳動（Ｓｉｇｍａ社製）及び分光光度法によって調べた。合計ＲＮＡ（２μｇ）を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、及びオリゴ（ｄＴ）とランダムなヘキサヌクレオチドとの混合物（１：１）を２０ｍｌの反応体積で使用する、第１鎖ｃＤＮＡの合成用に使用した。第１鎖ｃＤＮＡは、ＰＣＲによって増幅させた。ＲＮＡ調製の質を保証し、ＲＴ−ＰＣＲプロトコルを標準化するために、β−アクチンＲＴ−ＰＣＲ産物も、すべてのサンプルに関して生成させた。ｃＤＮＡ（２μｌ）を、５μｌの１０＊ＰＣＲ反応緩衝液、２．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのそれぞれのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、２００ｎＭのそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマー、及び１．０単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、５０ｍｌの反応混合物に加えた。ウサギＩＬ−１β及びβ−アクチン用のオリゴヌクレオチドプライマーは、以下のヌクレオチド配列に基づいて合成した：ＩＬ−１βのセンスプライマー５’−ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＡＡＧＡＧＣ  ＴＴＣ  ＣＧＧ  ＣＡ（配列番号１）；ＩＬ−１βのアンチセンスプライマー５’−ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＴＡＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴ（配列番号２）；β−アクチンのセンスプライマー５’−ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＡＣＧ  ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＡＴ（配列番号３）；β−アクチンのアンチセンスプライマー５’−ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＣＣＡ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＴＣ（配列番号４）。３７サイクルのＤＮＡ熱サイクルを使用して増幅を行い、サイクルの概略は、１分間９４℃での変性、１分間５５℃でのアニーリング、及び１分間７２℃での伸長からなっていた。増幅した断片のサイズは、ＩＬ−１β及びβ−アクチンそれぞれに関して、３５４ｂｐ及び４９３ｂｐであった。臭化エチジウムを含む１．５％アガロースゲル上で、１０μｌの反応混合物の電気泳動を行って、生成した断片の増幅及びサイズを評価した。ＰＣＲ用マーカー（Promega社製、ＵＳＡ）を、標準サイズのマーカーとして使用した。バンドの強度は濃度測定によって定量化し、これらのバンドの値を、β−アクチンのｍＲＮＡ発現に正規化した。
【０１１５】
ＭＭＰ−２活性
コラゲナーゼ緩衝液（上記を参照）に懸濁させた動脈ホモジェネートの上清を、コラゲナーゼ活性に関して分析した。動脈のサンプルを、非還元状態下において、ゼラチン含浸（１ｍｇ／ｍｌ：Difco社製、Detroit、ＭＩ、ＵＳＡ）ＳＤＳ８％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次に２．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＢＤＨ社製、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）中で３０分間攪拌した。ゲルをコラゲナーゼ緩衝液中において１６時間３７℃でインキュベートし、０．５％クーマシーＧ−２５０（BioRad社製、Richmond、ＣＡ）をメタノール／酢酸／Ｈ２Ｏ（３０：１０：６０）に溶解したもので染色した。バンドの強度は、コンピュータによる濃度測定によって測定した（Molecular Dynamics type ３００Ａ）。
【０１１６】
図１４Ａに示すように、バルーン損傷後に、ラット動脈組織（対照動物）中のＩＬ−１βのレベルを分析することによって、損傷後第６日にピークとなるベル型のパターンが明らかになり（３７．３±９．６ｐｇ／タンパク質１ｍｇ）、３０日後に基底レベルに戻った。しかしながら、ＩＬ−１βレベルの有意な低下が、ＬＣ治療後、損傷後第３日及び第６日に見られた。図１４Ｂに示すように、同様の応答をウサギの動脈で観察し、ＬＣ治療後、損傷後第２、４及び６日に、ＩＬ−１βレベルの有意な低下が見られた。
【０１１７】
ＬＣ治療後の動脈のＩＬ−１βレベルの低下は、ＩＬ−１β転写の顕著な低下に関係していた。ウサギの動脈中のＩＬ−１β  ｍＲＮＡ転写を、バルーン損傷前の日（−１）に施したＬＣ治療後に分析した。ＲＴ−ＰＣＲ分析後の、生成した反応混合物のゲル電気泳動を、図１５に示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、対照動物（ＬＣ治療せず）において、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡ転写は、損傷後第１日（＋１）よりも、損傷後第３日（＋３）で強烈であったことが示される。しかしながら、損傷後第１日（＋１）及び第３日（＋３）のＩＬ−１β転写は、ＬＣ治療によって有意に低下した。図１５では、レーン１はＰＣＲマーカー（５０、１５０、３００、５００、７５０、１０００ｂｐ）を表し；レーン２及び３は、＋１日のＬＣ治療及び未治療（対照）をそれぞれ表し；レーン４及び５は、＋３日のＬＣ治療及び未治療（対照）をそれぞれ表す。ＬＣ治療（レーン３及び５）によって抑制された、未治療（対照）動物（レーン２及び４）における、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡ発現の（３５４ｂｐにおける）強烈なシグナルに注目されたい。β−アクチン  ｍＲＮＡ発現の発現産物（４９３ｂｐ）を、同じサンプルの充填用の対照として使用した（下側パネル）。ＩＬ−１β  ｍＲＮＡのレベル（β−アクチン  ｍＲＮＡに対して濃度測定分析したもの）がＬＣ治療及び未治療動物においてそれぞれ、第１日に０．４５±０．２４及び０．３７±０．４４、第３日に０．５９±０．２及び０．１２±０．１であったことが、見い出された（３つの独立したＲＴ−ＰＣＲ反応）。
【０１１８】
さらに、肝臓中のＩＬ−１βレベルも調べた。有意な低下が、第１日にＬＣの１回注射の後に示され、第３０日で基底レベルになった（データは示さず）。
【０１１９】
図１４ｃに示すように、損傷後に、ラットの動脈組織中のＭＭＰ−２活性が増大し、第１４日にベル型のパターンのピークが示され（第６日に２５２±１２及び第１４日に４０２±４４）、第３０日に基底レベルに戻った。しかしながら、ＬＣによる治療によって、第６日及び第１４日に、ＭＭＰ−２活性の有意な低下がもたらされた（それぞれ１５２±２３及び２８４±１７）。同様に、ウサギの動脈では、ＭＭＰ−２活性の急激な増大はラットの動脈のそれより低かったが、ＬＣ治療の影響はさらに顕著であった（図１４ｄを参照）。図１４ｄに示すように、第６日のＭＭＰ−２活性は、対照及びＬＣ治療ウサギでそれぞれ、２４８±４２及び５２±５であり、損傷後約１４日で基底レベルに戻った。
【実施例８】
【０１２０】
リポソームのクロドロネートの、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦβＲ及びＰＤＧＦβＲチロシンリン酸化に対する影響
リポソームのクロドロネートの、ＰＤＧＦ−ＢＢ、血小板由来成長因子β受容体（ＰＤＧＦβＲ）、及びＰＤＧＦβＲチロシンリン酸化に対する影響を、バルーン損傷ラット動脈モデルにおいて試験した。１つの群のオスのイスラエル産ラットを、実施例１に前述したラット頚動脈カテーテル損傷モデルに従って調製した。頚動脈を損傷前に早急に回収し、第１４日に冷たいＰＢＳ中ですすぎ、さらに処理するまで早急に充分に凍結させた（−７０℃）。凍結断片を、ドライアイス上で機械的に細分した。各群の動物は合計１２匹で、４つの動脈をそれぞれの試験用に集めた。リポソームのクロドロネート（ＬＣ）を、動脈損傷の１日前（−１ｄ）及び投与の６日後（＋６）に、１５ｍｇ／ｋｇの用量で「治療群」にＩＶ注射した。溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎのＸ−１００、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１００μＭのオルトバナジン酸ナトリウム、及び１％アプロチニン）を使用して、タンパク質を抽出し、それぞれの群で４匹の動物用に集めた。タンパク質含量を改変型ローリー法のプロトコルを使用して決定し、１００μｇのサンプルにＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％又は１２％）を施し、それぞれＰＤＧＦβＲ又はＰＤＧＦ−Ｂ鎖の分析用に、ＰＶＤＦ膜（Ｒｏｔｈ）のニトロセルロース膜（Hybond C extra、Amersham社製）上にブロッティングした。ＰＤＧＦβＲタンパク質は、ポリクローナル抗体（ＳＣ−４３１、Santa Cruz社製、ＵＳＡ）及びポリクローナルアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ抗血清（Tropix社製、ＵＳＡ）を使用して検出し、チロシンリン酸化タンパク質は、モノクローナル抗体ＰＹ２０（Transduction Laboratories社製、ＵＳＡ）と４Ｇ１０（UBI社製、ＵＳＡ）の混合物を使用し、次にポリクローナルアルカリホスファターゼ結合抗マウス抗血清（CDP Star、TROPIX社製）を含む、化学発光系検出システムを施して検出した。ＰＤＧＦ−ＢＢタンパク質は、モノクローナル抗体ＰＧＦ００７（Mochida社製）、西洋ワサビ結合ウサギ抗マウス抗血清（DAKO社製）、及び検出システムSuper Signal Ultra（Pierce社製、Germany）を使用して検出した。データの定量化は、ＬＡＳ−１０００  Imager（Fuji社製、Japan）によって行った。
【０１２１】
図１６ａに示すように、ＰＤＧＦβＲの活性化（即ちチロシンリン酸化）によって、バルーン損傷させた未治療ラットでは基底レベルの１３５％まで著しく増大したが、ＬＣ治療ラットではほとんど検出不能、即ち基底活性未満であった。注目すべきは、１９０ｋＤａの活性化ＰＤＧＦβＲを表すバンドである。さらに図１６ｂに示すように、血管損傷によって、未治療群（１２１％）とＬＣ治療群（２３３％）の両方で、ＰＤＧＦβＲタンパク質のアップレギュレーションがもたらされた。損傷によって、損傷後第１日及び第３日で、血管壁内においてＰＤＧＦ−Ｂタンパク質の充分な蓄積がもたらされ（４６ｋＤａ）、それぞれ基底レベルの３３３％及び２１９％に達した（図１６ｃ）。さらに図１６ｃにからは、ＬＣ治療ラットでは、このＰＤＧＦ−Ｂの蓄積が、強烈に低下し（第１日及び第３日でそれぞれ１８１％及び１６８％）、これらの時間地点におけるＰＤＧＦβＲの低い活性と相関関係があったことが示される。
【０１２２】
ラット及びウサギをリポソームのクロドロネートで治療することにより、インターロイキン１−βの転写及び生成、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２の活性、血小板由来成長因子β受容体（ＰＤＧＦβＲ）の活性化、及びＰＤＧＦ−Ｂタンパク質のレベルが有意に低下することが、前述の実験の結果から明らかに示される。
【０１２３】
本明細書に引用した、すべての特許、刊行物、書物、参照マニュアル、及び要約の内容は、それらの全容を参照によりここに組み込み、本発明に関する現況技術をさらに完全に記載する。
【０１２４】
前に記載した主題において、本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、様々な変形を作製することができるので、上記に含まれるか、或いは添付の特許請求の範囲で定義するすべての主題は、本発明を説明し例示するものとして解釈すべきであると考えられる。本発明の多くの変更態様及び変形態様が、前の教示に照らして考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】実験用ラット、頚動脈カテーテル損傷モデルにおける、リポソーム中に被包されたクロドロネートの再狭窄の低下に対する影響を、クロドロネートを含まない対照リポソームの同じラットに対する影響と比較した結果を示す、棒グラフであり、対照リポソームで治療したラットと比較した、クロドロネート含有リポソームで治療したラットの、内側領域に対する平均新内膜領域を示す図である。内側領域は、動脈領域全体と元の腔領域の間との差である。
【図２】実験用ラット、頚動脈カテーテル損傷モデルにおける、リポソーム中に被包されたクロドロネートの再狭窄の低下に対する影響を、クロドロネートを含まない対照リポソームの同じラットに対する影響と比較した結果を示す、棒グラフであり、対照リポソームで治療したラットの狭窄の％と比較した、クロドロネート含有リポソームで治療したラットにおける、狭窄の％を示す図である。
【図３】実験用ラット、頚動脈カテーテル損傷モデルにおける、リポソーム中に被包されたクロドロネートの再狭窄の低下に対する影響を、クロドロネートを含まない対照リポソームの同じラットに対する影響と比較した結果を示す、棒グラフであり、平滑筋細胞の生存能力の間接的指標としての、内側領域の範囲を示す図である。これらを、対照リポソームのみで治療したラットと比較した、クロドロネート含有リポソームで治療したラットにおける、動脈領域全体と元の腔領域の間との差として決定した（外側弾性膜結合領域−内側弾性膜結合領域）。
【図４】バルーン損傷ラット及びアテローム性動脈硬化症ウサギ頚動脈モデルの、リポソームのクロドロネートの抗再狭窄効果を示す図である。
【図５】ＩＳＡ被包ナノ粒子の典型的製剤の特性を示す図である。
【図６】ＩＳＡ、特に遊離ＩＳＡ、Ｃａ＋２−ＩＳＡ塩、及びナノ粒子に被包されたＩＳＡの、インビトロでのＲＡＷ２６４細胞の増殖に対する影響を示す図である。
【図７】５０μＭのＣａ＋２−ＩＳＡ塩製剤、特に空のＮＰに吸着したＣａ＋２−ＩＳＡ、Ｃａ＋２−ＩＳＡ塩、及びポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びＣａ＋２−ＩＳＡ塩の、インビトロでのＲＡＷ２６４細胞の増殖に対する影響を示す図である。
【図８ａ】実験用ラット、頚動脈カテーテル損傷モデルにおける、ナノ粒子中に被包されたＩＳＡの再狭窄の低下に対する影響を、ＩＳＡを含まなかった対照ナノ粒子（即ち空のＮＰ）の同じラットに対する影響と比較した結果を示す、棒グラフであり、対照ナノ粒子で治療したラットの狭窄の％と比較した、ＩＳＡ被包ナノ粒子で治療したラットにおける、狭窄の％を示す図である；及び
【図８ｂ】実験用ラット、頚動脈カテーテル損傷モデルにおける、ナノ粒子中に被包されたＩＳＡの再狭窄の低下に対する影響を、ＩＳＡを含まなかった対照ナノ粒子（即ち空のＮＰ）の同じラットに対する影響と比較した結果を示す、棒グラフであり、対照ナノ粒子で治療したラットと比較した、ナノ粒子中に被包されたＩＳＡで治療したラットの、平均新内膜領域と内側領域の比を示す図である。内側領域は、動脈領域全体と元の腔領域の間の差である。
【図９】ナノ粒子中に被包されたアレンドロネートの、典型的製剤の特性を示す図である。
【図１０】アレンドロネート充填ナノ粒子の、ＲＡＷ２６４細胞の増殖に対する影響を示す図である。
【図１１】高コレステロール血症バルーン損傷ウサギモデルにおける、ナノ粒子中に被包されたアレンドロネートの再狭窄の低下に対する影響を、皮下投与により、アレンドロネートを含まなかった対照ナノ粒子の同じラットに対する影響と比較した結果を示す、棒グラフである。これらのグラフは、再狭窄の低下における、皮下（ＳＣ）及び静脈内（ＩＶ）投与の影響も比較する。対照ナノ粒子で治療したラットの狭窄の％と比較した、アレンドロネート充填ナノ粒子で治療したラットにおける、狭窄の％を示す図である。粒子は皮下に投与した；
【図１２ａ】高コレステロール血症バルーン損傷ウサギモデルにおける、ナノ粒子中に被包されたアレンドロネートの再狭窄の低下に対する影響を、皮下投与により、アレンドロネートを含まなかった対照ナノ粒子の同じラットに対する影響と比較した結果を示す、棒グラフである。これらのグラフは、再狭窄の低下における、皮下（ＳＣ）及び静脈内（ＩＶ）投与の影響も比較する。ＳＣ投与による１．５ｍｇ／ｋｇのアレンドロネート充填ナノ粒子、ＳＣ投与による０．１５ｍｇ／ｋｇのアレンドロネート充填ナノ粒子、及びＩＶ投与による０．１５ｍｇ／ｋｇのアレンドロネート充填ナノ粒子で治療したラットの狭窄の％を比較する図である；及び
【図１２ｂ】高コレステロール血症バルーン損傷ウサギモデルにおける、ナノ粒子中に被包されたアレンドロネートの再狭窄の低下に対する影響を、皮下投与により、アレンドロネートを含まなかった対照ナノ粒子の同じラットに対する影響と比較した結果を示す、棒グラフである。これらのグラフは、再狭窄の低下における、皮下（ＳＣ）及び静脈内（ＩＶ）投与の影響も比較する。対照ナノ粒子で治療したラットと比較した、ＩＳＡ充填ナノ粒子で治療したラットの、平均新内膜領域と内側領域の比（Ｎ／Ｍ）を示す図である。ＳＣ投与による１．５ｍｇ／ｋｇのアレンドロネート充填ナノ粒子、ＳＣ投与による０．１５ｍｇ／ｋｇのアレンドロネート充填ナノ粒子、及びＩＶ投与による０．１５ｍｇ／ｋｇのアレンドロネート充填ナノ粒子で治療したラットの、平均新内膜領域と内側領域の比（Ｎ／Ｍ）も比較する。内側領域は、動脈領域全体と元の腔領域の間の差である。
【図１３】２４時間のインキュベーション後の、ナノ粒子中に被包されたアレンドロネートの、ヒト血液中の単球数に対する影響を示す図である。
【図１４ａ】バルーン損傷後のラット及びウサギの動脈中の、リポソームのクロドロネート治療の、インターロイキン１−β（ＩＬ−１β）濃度、及びマトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）活性に対する影響を示す図である。詳細には、図１４ａ及び１４ｂは、それぞれラット及びウサギモデルの、リポソームのクロドロネート治療のＩＬ−１β濃度に対する影響を示す。
【図１４ｂ】バルーン損傷後のラット及びウサギの動脈中の、リポソームのクロドロネート治療の、インターロイキン１−β（ＩＬ−１β）濃度、及びマトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）活性に対する影響を示す図である。詳細には、図１４ａ及び１４ｂは、それぞれラット及びウサギモデルの、リポソームのクロドロネート治療のＩＬ−１β濃度に対する影響を示す。
【図１４ｃ】バルーン損傷後のラット及びウサギの動脈中の、リポソームのクロドロネート治療の、インターロイキン１−β（ＩＬ−１β）濃度、及びマトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）活性に対する影響を示す図である。詳細には、図１４ｃ及び１４ｄは、それぞれラット及びウサギモデルの、リポソームのクロドロネート治療のＭＭＰ−２活性に対する影響を示す。
【図１４ｄ】バルーン損傷後のラット及びウサギの動脈中の、リポソームのクロドロネート治療の、インターロイキン１−β（ＩＬ−１β）濃度、及びマトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）活性に対する影響を示す図である。詳細には、図１４ｃ及び１４ｄは、それぞれラット及びウサギモデルの、リポソームのクロドロネート治療のＭＭＰ−２活性に対する影響を示す。
【図１５】バルーン損傷後のウサギの動脈中の、リポソームのクロドロネートのＩＬ−１β転写に対する影響を示す図である。
【図１６ａ】バルーン損傷後の、ラットの動脈壁におけるリポソームのクロドロネート治療の、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）系に対する影響を示す図である。詳細には、図１６ａは、血小板由来成長因子β受容体（ＰＤＧＦβＲ）の活性（即ち、チロシンリン酸化）に対する影響を示す。
【図１６ｂ】バルーン損傷後の、ラットの動脈壁におけるリポソームのクロドロネート治療の、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）系に対する影響を示す図である。詳細には、図１６ｂは、ＰＤＧＦβＲタンパク質に対する影響を示し、図１６ｃは、ＰＤＧＦ−Ｂタンパク質に対する影響を示す。
【図１６ｃ】バルーン損傷後の、ラットの動脈壁におけるリポソームのクロドロネート治療の、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）系に対する影響を示す図である。詳細には、図１６ｃは、ＰＤＧＦ−Ｂタンパク質に対する影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2005523327.tif 000034