(57)【要約】本発明は、オボムコイド遺伝子発現制御領域を含むトリ核酸配列を含む新規単離核酸を提供する。本発明のオボムコイドプロモーター領域は、例えば、卵管細胞の様なトランスフェクショントリ細胞での異種核酸インサートの発現を可能とする。本発明の単離トリオボムコイドは、選択された核酸インサートに作動可能に結合してもよく、該核酸インサートはトランスフェクション細胞で発現することが望まれるポリペプチドをコード化する。本発明の組み換えＤＮＡは、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含んでいてもよい。本発明は、本発明の単離トリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む発現ベクター、および該発現ベクターを含むトランスフェクション細胞および遺伝子導入トリをさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２６の核酸配列を含むトリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む単離核酸。
【請求項２】
トリが、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、走鳥類、観賞用のトリ、または野生のトリからなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
トリがニワトリである、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
配列番号：２６と少なくとも７５％同一の配列を含み、作動可能に結合したヌクレオチド配列のトリ細胞での発現を指揮する単離核酸。
【請求項５】
配列番号：２６と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
配列番号：２６と少なくとも９９％同一の配列を含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項７】
異種ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列に作動可能に結合するトリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む核酸。
【請求項８】
トリが、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、走鳥類、観賞用のトリ、または野生のトリからなる群から選択される、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
トリがニワトリである、請求項７に記載の核酸。
【請求項１０】
オボムコイド遺伝子発現制御領域が配列番号：２６の核酸配列を含む、請求項７に記載の核酸。
【請求項１１】
ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、請求項７に記載の核酸。
【請求項１２】
ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０ウイルス由来である、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
ヌクレオチド配列が、トリでのタンパク質発現に最適化されたコドン相補体を有する、請求項７に記載の核酸。
【請求項１４】
該ポリペプチドがインターフェロンα２ｂポリペプチドである、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
核酸インサートが免疫グロブリンサブユニットをコード化する、請求項７に記載の核酸。
【請求項１６】
細菌の複製起点またはウイルスの複製起点から選択される複製起点を含む、請求項７に記載の核酸。
【請求項１７】
プラスミドである、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
真核細胞のウイルスベクターである、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１９】
宿主細胞へ組み込まれる発現ベクターである、請求項７に記載の核酸。
【請求項２０】
異種ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列に作動可能に結合するトリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む核酸分子でトランスフェクションされた真核細胞、または該真核細胞の子孫を、該異種ポリペプチドの発現に適当な培地で培養すること、これにより該異種ポリペプチドを発現させることを含む、宿主細胞で該異種ポリペプチドを発現させる方法。
【請求項２１】
真核細胞がトリ由来である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
真核細胞がニワトリ由来である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
異種ポリペプチドを発現する、請求項１９に記載の発現ベクターでトランスフェクションされた真核細胞、または該細胞の子孫。
【請求項２４】
細胞がトリ細胞である、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項２５】
細胞がニワトリ細胞である、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項２６】
細胞がニワトリの卵管細胞である、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項２７】
細胞がウズラの卵管細胞である、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項２８】
細胞が培養細胞である、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項２９】
該異種ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列がトリでのタンパク質発現に最適化されたコドン相補体を有する、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項３０】
ヌクレオチド配列がインターフェロンα２ｂポリペプチドをコード化する、請求項２９に記載の真核細胞。
【請求項３１】
ヌクレオチド配列が免疫グロブリンまたはそのサブユニットをコード化する、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項３２】
異種ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列に作動可能に結合するトリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む核酸を含む、遺伝子導入トリ。
【請求項３３】
トリが、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、走鳥類、観賞用のトリ、または野生のトリである、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項３４】
トリがニワトリである、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項３５】
オボムコイド遺伝子発現制御領域が配列番号：２６の核酸配列を含む、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項３６】
核酸がポリアデニル化シグナル配列を含む、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項３７】
ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０ウイルス由来である、請求項３６に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項３８】
ヌクレオチド配列が、トリでのタンパク質発現に最適化されたコドン相補体を有する、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項３９】
核酸インサートがインターフェロンα２ｂポリペプチドをコード化する、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項４０】
血清または卵白に異種ポリペプチドを産生する、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項４１】
卵白に異種ポリペプチドを産生する、請求項４０に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項４２】
ヌクレオチド配列が免疫グロブリンまたはそのサブユニットをコード化する、請求項４１に記載の遺伝子導入トリ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、全体として引用により本明細書に取り込まれる２００１年１１月３０日出願の出願番号０９／９９８，７１６の部分継続出願である。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、一般に、特にニワトリ由来のトリオボムコイド遺伝子発現制御領域の同定に関する。より具体的には、本発明は、組換え核酸および発現ベクター、異種ポリペプチドコード化核酸に作動可能に結合するトリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含むトランスフェクション細胞および遺伝子導入動物、特にニワトリに関する。
【０００３】
２．背景
遺伝子導入（transgenics）の分野は、当初、全動物および遺伝子活性化、発現、および相互作用の現象に関係する単一遺伝子の作用を理解すために発展した。該技術を用いて、ヒトおよび他の動物の様々な疾病モデルが作られ、これは遺伝学研究、および遺伝子メカニズムおよび機能の理解に利用可能な最も強力なツールである。経済上の観点から、医薬品として興味のある特定のタンパク質または別の物質（Gordon et al., Biotechnology 5: 1183 1187 (1987); Wilmut et al., Theriogenology 33: 113 123 (1990)）を産生するための遺伝子導入技術の使用は、通常の方法である遺伝子発現によるタンパク質産生より優位な利点を提供する。
【０００４】
異種核酸は、発現したタンパク質がミルクまたは尿への遺伝子導入発現産物が分泌されるようにタンパクまたはペプチドと結合させ、続いてその結合体から該タンパク質の回収を可能とするように操作された。該方法はある程度成功したが、ウシ、ヒツジ、またはヤギを含む巨大種動物の個体または群れを維持するのに付随するコストと、授乳動物を必要とし得る。
【０００５】
歴史的には、遺伝子導入動物は受精卵のマイクロインジェクションにより、専ら作られてきた。受精卵の前核は、生体外で、異質、すなわち、異種間ＤＮＡ分子または同種間ＤＮＡ分子、異種ＤＮＡ分子、またはハイブリッドＤＮＡ分子を、マイクロインジェクションされる。続いて、マイクロインジェクションされた受精卵は、偽妊娠させたメスの生殖系に移植される（例えば、Krimpenfortらの米国特許番号第５，１７５，３８４号を参照）。
【０００６】
可能性のある１つのシステムは、トリ生殖システムである。トリ卵の生成は、メスのトリの卵巣での巨大な卵黄形成で始まる。未受精の卵母細胞または卵細胞は、卵黄嚢の上部に位置する。排卵後、卵細胞は、受精場所である卵管の漏斗を通り、続いて、尿細管腺細胞と並ぶ卵管の筒部（magnum）に移動する。該細胞は、筒部管腔に、卵白アルブミン、オボムコイド、オボインヒビター、コンアルブミン、オボムチン、およびリゾチームを含む卵白タンパク質を分泌し、それらはトリ胚および卵黄に貯蔵される。
【０００７】
高レベルのタンパク質を産生し、適切な折りたたみが見込まれ、および標的タンパク質を翻訳後修飾し、産生物の回収が容易であり、そして可能性のある別の動物種と比較してニワトリの発生期間は短いため、メスのトリの卵管は、タンパク質バイオリアクターとしての優れた可能性を提供する。結果的に、努力して、卵管で異種タンパク質を発現する遺伝子導入ニワトリが作られた。
【０００８】
ニワトリの卵管細胞は、産卵の間にステロイドホルモンで刺激されると、３つの主要なポリペプチドである卵白アルブミン、オボムコイドおよびリゾチームを分泌する（Tsai et al., Biochemistry 17: 5773 5779 (1978)）。卵白アルブミンをコード化するｍＲＮＡ転写物は、該細胞の全ｍＲＮＡのうち約５０％を構成する。オボムコイドおよびリゾチームｍＲＮＡは、それぞれ、ステロイドで刺激された細胞の全ｍＲＮＡの約６．６％、および３．４％に対応する（Hynes et al., Cell 11:923 932 (1977)）。
【０００９】
ニワトリのゲノムＤＮＡフラグメントの詳細な制限酵素分析は、オボムコイドコード化配列が７つの介在配列を含むことを示す（Lindenmaier et al., Nuc. Acid Res. 7;1221 1232 (1979); Catterall et al., Nature 278: 323 327 (1979); Lai et al., Cell 18:829 842 (1979)）。オボムコイド遺伝子の５’フランキング領域のうち短い部分は配列決定されたが（Lai et al., Cell 18: 829 842 (1979)；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｊ００，８９７）、これは認められている転写開始部位の上流の５７９塩基部分だけであった。オボムコイド遺伝子の５’フランキング領域が単離されたが（Catterall et al., Nature 278: 323 327 (1979); Lai et al., Cell 18: 829 842 (1979)）、低分解の制限部位のマッピング以外、一般的には特徴付けられなかった。Scottらは、Biochemistry 26: 6831 6840 (1987)において、オボインヒビターコード化領域と下流のオボムコイド遺伝子との間に位置する１０ｋｂのニワトリゲノムＤＮＡのＣＲ１様領域を同定した。１０ｋｂのオボインヒビターオボムコイド領域に伸長されるオボインヒビターコード化ｃＤＮＡおよび付随する３’非翻訳領域も配列決定された（Scott et al. J. Biol. Chem. 262: 5899 5907 (1987)）。
【００１０】
それゆえ、ニワトリオボムコイド遺伝子は、成熟したメスのトリ卵管の尿細管腺において高発現し、遺伝子導入動物、特に動物での異種タンパク質産生に有効なプロモーターの適当な候補を意味する。オボムコイド遺伝子座の制御領域は、転写開始部位の５’上流ＤＮＡのうち約１０ｋｂの核酸領域で伸長され、そして認識エレメントであるＣＲ１を少なくとも１つ含む。
【００１１】
３．発明の要約
本発明は、例えば、卵管細胞の様なトランスフェクショントリ細胞における興味あるポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の発現に有用である、トリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む核酸に関する。好ましい実施態様において、ポリペプチドは異種、すなわち、オボムコイドタンパク質産物でなく、そしてより好ましくは、哺乳類ポリペプチドであり、最も好ましくは、ヒトポリペプチドである。
【００１２】
本発明の１つの態様は、ニワトリ（または別のトリ）オボムコイド遺伝子座の転写開始部位の５’上流すぐの領域から単離された核酸を提供する。核酸は、少なくとも１つのトリＣＲ１反復エレメント、および隣接のオボムコイドプロモーターを含むオボムコイド遺伝子発現制御領域を含むトリ核酸配列を含む。該構成エレメントの間に組みいれられて、ポリペプチドコード化領域と関連する定められた配列の遺伝子制御領域を少なくとも認識するために働く核酸の伸張配列であり得る。本発明の１つの実施態様において、オボムコイド遺伝子発現制御領域は、ニワトリから単離される。特定の実施態様において、オボムコイド遺伝子発現制御領域は、配列番号：２６のヌクレオチド配列を有する。別の実施態様において、オボムコイド遺伝子発現制御領域は、配列番号：２６に対して少なくとも７５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であり、そしてトリ卵管細胞でポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の発現を指揮する。
【００１３】
本発明のトリオボムコイド遺伝子発現制御領域は、ポリペプチドコード化核酸の組織特異的な発現を指揮するのに有用である。トリオボムコイド遺伝子発現制御領域は、選択された核酸インサートと作動可能に結合され得る。ここで、該核酸インサートは、トランスフェクション細胞で発現することが望まれるポリペプチド、好ましくは、異種ポリペプチドをコード化する。該核酸インサートは、シグナルペプチドコード化ヌクレオチド配列とインフレームで位置し得る。翻訳の開始はシグナルペプチドで始まり、該核酸インサートを通って続き、これにより、所望のアミノ酸配列を有する発現ポリペプチドを産生し得る。
【００１４】
本発明の組換えＤＮＡは、本発明のオボムコイド遺伝子発現制御領域により指揮される転写が、異種ポリペプチド（すなわち、オボムコイド遺伝子発現制御領域を含む内在遺伝子から発現するオボムコイドタンパク質ではない）コード化核酸インサートを超えて続くことを可能とし、そして転写物が３’非翻訳領域およびポリアデニル化末端をさらに含むことを可能とするポリアデニル化シグナル配列をさらに含め得る。任意の機能的ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモンアデニル化配列などを含む核酸インサートの３’末端に結合し得る。必要に応じて、本発明の核酸は、遺伝子発現制御エレメント、例えば、オボムコイド遺伝子以外のもの由来のプロモーター、エンハンサー、ＩＲＥＳも含み、そしてそれは、非トリ遺伝子由来であってもよい。
【００１５】
発現した核酸インサートの配列は、宿主細胞によるコドンの使用に最適化される。これは、ニワトリ細胞で発現した、少なくとも１つ、そして好ましくは、１より多くのタンパク質のコドン使用より決定され得る。例えば、コドン使用は、ニワトリの卵白アルブミンタンパク質、オボムコイドタンパク質、オボムチンタンパク質、およびオボトランスフェリンタンパク質コード化核酸配列より決定され得る。
【００１６】
本発明のなお別の態様は、ベクターの異種タンパク質コード配列の発現のためのレシピエント細胞への送達に適当な発現ベクターである。本発明の発現ベクターは、非オボムコイドポリペプチドコード化核酸インサートに作動可能に結合するトリオボムコイド遺伝子発現制御領域、および必要に応じて、ポリアデニル化シグナル配列を含み得る。発現ベクターは、適当な宿主でのベクターの複製を可能する細菌プラスミド配列、ウイルス核酸配列、またはフラグメントまたはその変異体をさらに含み得る。本発明において考えられるように、核酸は、ＹＡＣ、ＢＡＣ、細菌ファージ由来人工染色体（ＢＢＰＡＣ）、コスミド、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）である。
【００１７】
本発明は、核酸ベクターおよび複数のポリペプチドコード化領域を組み込まれた、挿入された導入遺伝子にさらに関する。ここで、第１のポリペプチドコード化領域が転写プロモーターに作動可能に結合し、そして第２のポリペプチドコード化領域が配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）に作動可能に結合する。例えば、ベクターは、２つの異なる異種タンパク質（例えば、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖）のコード配列を含有し得る。
【００１８】
かかる核酸構造物は、トリのゲノムに挿入されてそこで発現すると、例えば、グリコシル化の様に翻訳後修飾されるか、またはある実施態様においては、相互にヘテロ２量体のような複合体として存在し得る個々のポリペプチドを産生する。
【００１９】
本発明の別の態様は、異種ポリペプチドコード化核酸インサートに作動可能に結合するトリオボムコイド遺伝子発現制御領域、および必要に応じて、ポリアデニル化シグナル配列を含む組換えＤＮＡでの細胞のトランスフェクションによる、真核細胞で異種ポリペプチドを発現させる方法、およびトリオボムコイド遺伝子発現制御領域の制御下で、異種ポリペプチド発現に適当な培地においてトランスフェクション細胞を培養する方法である。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、サイトカイン、成長因子、酵素、構造タンパク質であり、そしてより好ましくは、免疫グロブリンまたはそのサブユニットである。別の好ましい実施態様において、ポリペプチドは、哺乳類ポリペプチドであり、好ましくは、ヒトポリペプチド、またはヒトもしくは哺乳類由来のポリペプチドである。
【００２０】
本発明の範囲にはまた、本発明に記載のおよび上記の組換え核酸分子を含む組換え細胞、組織および動物、特にトリおよびトリの卵があり、最も好ましくは、ニワトリである。好ましい実施態様において、異種タンパク質の発現レベルは、本発明の遺伝子導入トリにより産生される1個の卵（好ましくは、卵白）において、５μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、または７５０μｇより高く、より好ましくは、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、または５ｇより高い。本発明の１つの実施態様において、形質転換細胞はニワトリ卵管細胞であり、そして核酸は、ニワトリオボムコイド遺伝子発現制御領域、必要に応じて、トリ細胞での発現に最適化されたコドンである、興味ある異種ポリペプチド（例えば、ヒトインターフェロンα２）コード化核酸インサート、およびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。
【００２１】
３．１定義
本発明で用いられる用語「動物」は、ヒトを含む全ての脊椎動物を含む。それは、胚および胎児期を含む発生の全ステージの個々の動物も含む。
【００２２】
本明細書において用いられる様に、用語「トリ」は、分類学上の任意の種、亜種、または類の生物を意味し、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、およびダチョウ、エミューおよびヒクイドリを含む走鳥類の様な生物であるが、これらに制限されない。用語は、様々な既知の系統のGallus gallus、またはニワトリ（例えば、White Leghorn、Brown Leghorn、Barred Rock、Sussex、New Hampshire、Rhode Island、Ausstralorp、Minorca、Amrox、California Gray、Italian Partidge colored）、ならびに、シチメンチョウ、キジ、ウズラ、カモ、ダチョウの系統、および通常商業的な数で育てられる他の家禽を含む。
【００２３】
本明細書で用いられる、用語「核酸」は、任意の天然および合成の直鎖および一連の配列であるヌクレオチドおよびヌクレオシド、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、およびその誘導体を意味する。本発明の核酸の代表的な例は、ｐＢＲ３２２（これに制限されない）のような発現ベクター、クローニングベクター、コスミドベクター、および形質導入ベクターを含む細菌プラスミドベクター、修飾型アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルスなど（これらに制限されない）の様な動物ウイルスベクター、バクテリオファージ核酸由来のベクター、例えば、プラスミドおよびコスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）および細菌人工染色体（ＢＡＣ）（これらに制限されない）の様な人工染色体、および合成オリゴヌクレオチド様化学合成ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。用語「核酸」は、５−ブロモウラシル（これだけではない）の様なハロゲン化されたヌクレオチド、およびビオチン標識ヌクレオチドの様な誘導体化されたヌクレオチドの様な、修飾されたまたは誘導体化されたヌクレオチドおよびヌクレオシドをさらに含むが、これらに制限されない。
【００２４】
本明細書において用いられる、用語「単離核酸」は、核酸を含有する細胞の他の成分、または核酸を生成するために用いられる化学反応／合成反応の他の成分を取り除かれた核酸を意味する。特定の実施態様において、核酸は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％純粋である。「単離核酸」は、ライブラリーの他のメンバーから同定、および区別されない限り、例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーの様なライブラリーのメンバーである核酸は含まない。本発明の核酸およびタンパク質を単離し、そして特徴付けるために用いられる技術は、当該技術分野の技術者によく知られており、そして、標準的な分子生物学および生化学マニュアルを調べて、実験を行わないで適当なプロトコールが選択され得る。例えば、Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Pressを参照されたい。この内容は、全体として引用により本明細書に取り込まれる。
【００２５】
核酸に関連しての用語「濃縮された」の使用は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、正常または異常細胞、または配列が採取された細胞においてより、細胞に存在する全ＤＮＡまたはＲＮＡ、または該溶液の有意に大きな分画を構成することを意味する。濃縮は、他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを示唆するのではなく、該配列の相対量が、例えば、１倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍、または１，０００，０００倍で有意に増加したことを意味する。他のＤＮＡは、例えば、酵母または細菌ゲノム由来、またはプラスミドまたはウイルスベクターの様なクローニングベクターであってもよい。
【００２６】
ヌクレオチド配列が精製された形であることは、ある目的に好都合である。核酸に関連する用語「精製された」は、配列が天然の環境と比べて増加した純度、好ましくは、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％純粋であることを表す。
【００２７】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸配列」は、本明細書において交換可能に用いられ、そしてコード配列（適切な制御配列またはコントロール配列の制御下に位置する場合、試験管内または生体内で転写され、そしてポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチドまたは核酸配列）；コントロール配列（例えば、翻訳開始および停止コドン、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写因子結合部位、転写終結配列、上流および下流の制御ドメイン、エンハンサー、サイレンサーなど）；および制御配列（転写因子が結合し、遺伝子プロモーターの活性を陽性（誘導）または陰性（抑制）に変えるＤＮＡ配列）を含むが、これらに制限されない。上記の用語により、長さまたは合成起源についての制限がないことが示される。
【００２８】
本明細書において用いられる、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合を介して結合する、連続配列中の３以上のアミノ酸であるアミノ酸ポリマーを意味する。用語「ポリペプチド」は、タンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク質類似体、オリゴペプチドなどを含む。用語「ポリペプチド」は、核酸によりコード化され、組換え技術を通じて産生され（適切な供給源、例えば、トリから単離され）、または合成される、上で定義された様なポリペプチドを考慮する。用語「ポリペプチド」は、化学的に修飾されたアミノ酸、または標識リガンドに共有結合または非共有結合するアミノ酸を含む、上で定義された様なポリペプチドをさらに考慮する。
【００２９】
本明細書において用いられる、用語「フラグメント」は、人工的に（例えば、化学合成により）、または制限酵素または機械的せん断を用いて天然産物を複数の断片に切断することにより、または、ＰＣＲまたは当該技術分野で既知の任意の他のポリメラーゼ技術のように酵素的に構築された核酸（例えば、ｃＤＮＡ）のうち１０、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００、２０００、または５０００ヌクレオチド長部分を意味する。本明細書において用いられる、用語「フラグメント」は、少なくとも１つのプロテアーゼによるタンパク質分解切断により、天然に生じるポリペプチドから切断される部分か、または化学的方法により、または当該技術分野の技術者に既知の組換えＤＮＡ技術（例えば、天然に生じるポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列の一部から発現させる）を用いて合成される天然に生じるポリペプチドのうち少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４５０、５００、１０００、２０００、または５０００アミノ酸部分を意味する。
【００３０】
本明細書において用いられる、用語「遺伝子」（複数の「遺伝子」を含めて）は、全ＲＮＡ、全タンパク質、または該全ＲＮＡまたは全タンパク質のいずれかの部分を合成するため、遺伝子情報をコード化する核酸配列（ＲＮＡおよびＤＮＡを共に含む）を意味する。特定の生物のゲノムのうち天然部分でない遺伝子は「外来遺伝子」、「異種遺伝子」、または「外因性遺伝子」として言及され、そして特定の生物のゲノムのうち天然部分である遺伝子は「内在性遺伝子」として言及される。用語「遺伝子産物」は、遺伝子によりコード化されるＲＮＡまたはタンパク質を意味する。「外来遺伝子産物」は「外来遺伝子」によりコード化されるＲＮＡまたはタンパク質であり、そして「内在性遺伝子産物」は内在性遺伝子によりコード化されるＲＮＡまたはタンパク質である。「異種遺伝子産物」は「外来、異種、または外因性遺伝子」によりコード化されるＲＮＡまたはタンパク質であり、従って、細胞で天然に発現するものではない。
【００３１】
本明細書において用いられる、用語「発現させる」または「発現」は、遺伝子の２本鎖核酸のうち１本鎖領域の少なくとも一部に相補的であるＲＮＡ核酸分子を与えるための遺伝子の転写を意味する。本明細書において用いられる、用語「発現させる」または「発現」は、タンパク質、ポリペプチドまたはその一部を与えるための該ＲＮＡ核酸分子の翻訳も意味する。
【００３２】
本明細書で用いる、用語「遺伝子座」（複数の「遺伝子座」を含めて）は、染色体上の遺伝子の位置を意味する。１対の遺伝子は、１対の染色体上のそれぞれ同じ位置にある遺伝形質を制御する。該遺伝子対または対立遺伝子は、該形質の発現において優性または劣性であり得る。それぞれの場合で、個体は該遺伝子対により制御される形質のホモ接合であることを示す。該遺伝子対（対立遺伝子）がある優性形質および劣性形質からなるとき、個体は遺伝子対により制御される形質のホモ接合体となる。例えば、組換えまたは結果として起こる変異により生じる遺伝子または核酸分子の天然バリエーションは、類似だが同一ではないヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体を生じる。天然のセレクションは、典型的には機能を変える変異に対して選択されるので、該対立遺伝子の変異体は、典型的には、それらが比較される遺伝子によりコード化されるタンパク質のものと類似の活性を有するタンパク質をコード化する。対立遺伝子変異体は、遺伝子の非翻訳領域、例えば、３’または５’非翻訳領域の変化も含むか、または隣接して位置する選択的エキソンを与える、新生転写物の別のスプライシングを含み得る。
【００３３】
用語「作動可能に結合される」または「作動可能なように結合される」は、所望の機能を果たすためのコード配列とコントロール配列との立体的配置を意味する。従って、コード配列に作動可能に結合する制御配列は、コード配列の発現に作用し、どの発生時間ポイントの組織においてまたはシグナルに応答して、遺伝子の発現を制御できる。コード配列が細胞の転写制御領域に作動可能に結合するか、または制御下である場合、ＤＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合して、コード化タンパク質に翻訳され得るｍＲＮＡにコード配列を転写する。コントロール配列は、その発現を指揮するために働く限りは、コード配列と隣接している必要はない。従って、例えば、転写されたが翻訳されていない配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し、そしてプロモーター配列は依然コード配列に「作動可能に結合する」とみなされる。かかる中間の配列は、転写されない、またはポリメラーゼにより結合されないエンハンサー配列を含むが、これに限らない。
【００３４】
本明細書において用いられる、用語「転写制御配列」および「遺伝子発現制御領域」は、遺伝子核酸配列と関連するヌクレオチド配列を意味し、遺伝子の転写発現を制御する。例えば、転写制御配列は、エンハンサーエレメント、ホルモン応答エレメント、ステロイド応答エレメント、ネガティブ制御エレメントなどを含む。「転写制御配列」は、単離され、核酸ベクターに取り込まれて適切な細胞でのベクターＤＮＡ部分の制御された転写を可能とされていてもよい。「転写制御配列」は、ｍＲＮＡに翻訳されるタンパク質コード配列の５’末端領域の核酸配列より前にあってもよいが、この位置に限らない。転写制御配列は、「イントロン」領域として同定される遺伝子領域のタンパク質コード領域に位置していてもよいし、あるいは、核酸領域の核酸配列の領域にあってもよい。
【００３５】
本明細書において用いられる、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始部位を決定するＤＮＡ配列を意味する。「プロモーター−隣接エレメント」は、約２００塩基対の転写開始部位内の制御配列であってもよい。本明細書において用いられる、「筒部特異的」プロモーターは、トリ筒部の尿細管腺細胞の主要または独占的な活性のあるプロモーターである。有用なプロモーターは、外因性に誘導可能なプロモーターも含む。これらは、一般的に内在性の代謝産物またはサイトカインではない、外因性に添加される物質または刺激に応答して「オンにされ」得るプロモーターである。例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーターの様な、抗生物質−誘導性プロモーター、熱−誘導性プロモーター、光−誘導性プロモーター、またはレーザー誘導性プロモーターを含む（例えば、Halloran et al., 2000, Development 127: 1953-1960; Gemer et al., 2000, Int. J. Hyperthermia 16: 171-81; Rang and Will, 2000,  Nucleic Acids Res. 28: 1120-5; Hagihara et al., 1999, Cell Transplant 8:  4314; Huang et al., 1999, Mol. Med. 5: 129-37; Forster et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 708-10; Liu et al., 1998, Biotechniques 24: 624-8, 630-2を参照されたい；この内容は、全体として引用により本明細書に取り込まれる）。
【００３６】
本明細書において用いられる、用語「コード領域」は、タンパク質に翻訳される、連続する線状配列のヌクレオチドを意味する。全長コード領域は、全長コードタンパク質；つまり、翻訳後修飾も全くない天然の状態で翻訳される完全タンパク質に翻訳され得る。全長コード領域は、任意のリーダータンパク質配列、または翻訳タンパク質由来の天然に存在するタンパク質の別の領域を含んでいてもよい。
【００３７】
本明細書において用いられる、用語「相補的」は、互いに特異的に相互作用可能な２つの核酸分子を意味する。特異的な相互作用において、２つの核酸鎖が相対する位置にある場合、核酸の第１の鎖のアデニン塩基が、核酸の第２の鎖のチミジンと２個の水素結合を形成する。特異的な相互作用においてまた、２つの核酸鎖が相対する位置にある場合、核酸の第１の鎖のグアニン塩基が、核酸の第２の鎖のシトシン塩基と３個の水素結合を形成できる。本明細書において用いられる、相補的核酸は、修飾された塩基をさらに含んでいてもよく、修飾されたアデニンは、チミジンまたは修飾されたチミジンと水素結合するか、または修飾されたシトシンはグアニンまたは修飾されたグアニンと水素結合する。
【００３８】
本明細書において用いられる、用語「プローブ」は、核酸を意味する場合、それとハイブリダイズして、これにより相補的な配列の存在を同定するために用いられるヌクレオチド配列、または用いられたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下ではハイブリダイゼーションを妨げない程度にプローブ配列と異なる相補配列を意味する。プローブは、当該技術分野でよく知られている放射性グループ、ビオチンなど（これらに制限されない）のような標識で修飾されていてもよい。
【００３９】
本明細書において用いられる、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能である」は、以下で定義されるストリンジェントな条件下で、第１の核酸の第２の核酸へのアニーリングを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、ハイブリダイゼーション反応でプローブとして用いられる核酸分子と少なくとも７０％同一の核酸配列を有する核酸分子のハイブリダイゼーションを可能とする。例えば、第１の核酸は試験試料またはプローブであってもよく、第２の核酸はオボムコイド遺伝子発現制御領域またはそのフラグメントのセンスまたはアンチセンス鎖であってもよい。第１と第２の核酸のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件、例えば、異なるヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを嫌う傾向にある高温および／または低塩含有量下で行われてもよい。または、第１と第２の核酸のハイブリダイゼーションは、ストリンジェント性を減少した条件、例えば、異なるヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを好む傾向にある低温および／または高塩含有量下で行われてもよい。低くストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、高くストリンジェントな条件または中程度にストリンジェントな条件に続いて、第１と第２の核酸の結合の選択性を増加する。ハイブリダイゼーション条件は、異なるヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションをなおさらに嫌うために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはホルムアミド（これらに制限されない）の様な試薬をさらに含んでいてもよい。適当なハイブリダイゼーションプロトコールは、例えば、６５℃の６×ＳＳＣ（ここで、１×ＳＳＣは、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムおよび０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む）水溶液中でのハイブリダイゼーション、続いて、６５℃での１×ＳＳＣでの洗浄を含む。２つの核酸分子間の３０％以下のミスマッチは許容するハイブリダイゼーションを達成するために、適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を予測するための式は、例えば、Meinkoth et al. (1984) Anal. Biochem. 138: 267 284（この内容は、全体として引用により本明細書に取り込まれる）に記載されている。ハイブリダイゼーション技術のプロトコールは、当該技術分野の技術者によく知られており、そして標準的な分子生物学マニュアルを調べて、実験を行わないで適当なハイブリダイゼーションプロトコールが選択され得る。例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Pressを参照されたい。この内容は、全体として引用により本明細書に取り込まれる。
【００４０】
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度は約１．５Ｍのナトリウムイオンより低く、典型的にはｐＨ約７．０〜約８．３の約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または別の塩）であり、温度は短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドの様な不安定化物質の添加でも達成される。例えば、低くストリンジェントな条件は、３７℃、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃、１×〜２×ＳＳＣ中での洗浄を含む。例えば、中程度にストリンジェントな条件は、３７℃、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃、０．５×〜１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。例えば、高くストリンジェントな条件は、３７℃、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃、０．１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。
【００４１】
本明細書において用いられる、用語「唯一の核酸領域」および「唯一のタンパク質（ポリペプチド）領域」は、ある核酸またはタンパク質（ポリペプチド）には存在するが、それ以外の核酸またはタンパク質配列には存在しない配列を意味する。本明細書で言及される様に、用語「保存核酸領域」は、特定の核酸配列が低く、中程度に、または高くストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な、２以上の核酸配列に存在するヌクレオチド配列である。２以上の核酸配列の保存領域間の保存の程度が高くなるにつれ、保存領域と特定の核酸配列とのハイブリダイゼーションを可能とするハイブリダイゼーション条件も高くなる。
【００４２】
本明細書において用いられる、用語「％配列同一性」または「％配列類似性」は、Karlin & Attschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2264 2268のアルゴリズムを用いて決定され、Karlin & Attschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 5873 5877のように修飾された２つの核酸配列または２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を意味する。該アルゴリズムは、Attschul et al. (1990) T. Mol. Biol. Q15: 403 410のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれている。本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るためのＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行われる。関連ポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得るためのＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行われる。比較の目的でギャップ配列を得るたに、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Attschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25: 3389 3402に記載される様に利用する。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメーターが用いられる。他のアルゴリズム、プログラム、および初期設定は、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の比較のためのプログラムを含むU.K. Human Genome Mapping Project Resource CentreのGCG Sequence Analysis Package（これに制限されない）に適当であってもよい。
【００４３】
本明細書において用いられる、用語「センス鎖」は、ＲＮＡに転写され、遺伝子の天然ポリペプチド産物に翻訳され得るゲノムＤＮＡ由来の一本鎖ＤＮＡ分子を意味する。本明細書において用いられる、用語「アンチセンス鎖」は、遺伝子のセンス鎖と相補的であるゲノムＤＮＡの１本鎖ＤＮＡ分子を意味する。
【００４４】
本明細書において用いられる様に、用語「アンチセンスＤＮＡ」は、逆向き、すなわち、ＤＮＡが５’から３’方向よりむしろ３’から５’方向でＲＮＡへと読まれる場合の、遺伝子の「センス鎖」に相補的なヌクレオチド配列を有する遺伝子配列ＤＮＡを意味する。用語「アンチセンスＲＮＡ」を用いる場合は、ＲＮＡヌクレオチド配列（例えば、アンチセンスＤＮＡによりコード化されるか、またはアンチセンスＤＮＡと相補的に合成される）を意味する。アンチセンスＲＮＡは、アンチセンスＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能である。本発明のアンチセンスＲＮＡは、転写レベルまたは翻訳レベルのいずれかで、「標的遺伝子」の発現の制御に有用である。例えば、目的の核酸の転写は、転写開始の阻害、または転写因子の抑制のための競合により転写を阻害することができる、アンチセンス転写物を産生する；アンチセンス転写物は「標的ＲＮＡ」の輸送を阻害するか、または「標的ＲＮＡ」の翻訳を阻害する。
【００４５】
本明細書において用いられる、用語「核酸ベクター」は、天然または合成の１または２本鎖プラスミドまたはウイルス核酸分子、または細胞内へトランスフェクションまたは形質導入され、独立して、または宿主細胞のゲノム内で複製され得る、ＹＡＣ、ＢＡＣ、細菌ファージ由来人工染色体（ＢＢＰＡＣ）、コスミドまたはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）（これらに制限されない）の様な他の核酸分子を意味する。環状２本鎖ベクターは、ベクターのヌクレオチド配列に基づき、適切な制限酵素での処理により直線化され得る。核酸は、ベクターを制限酵素で切断し、断片と共にライゲーションされることにより、ベクターに挿入され得る。核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。
【００４６】
本明細書において用いられる、用語「発現ベクター」は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合するオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む核酸ベクターを意味する。本明細書において用いられる、用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、および遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。Sambrook et al. eds "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 3rd ed., Cold Spring Harbor Press (2001)の様な標準的な分子生物学の教科書を調べて、複製起点および選択可能な遺伝子マーカーをさらに含む適当な発現ベクターを設計してもよい。しかしながら、適当な発現ベクターの選択および機能的エレメントの組合せが、形質導入されるべき宿主細胞の選択および／または発現させるべきタンパク質の種類を含む複数の因子に依存することが理解される。
【００４７】
本明細書において用いられる、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、宿主への核酸の挿入過程を意味する。原核または真核生物への核酸の形質転換またはトランスフェクションを促進するための多くの技術は、当該技術分野の技術者によく知られている。該方法は、宿主細胞を核酸分子取り込ができるようにするための、カルシウム塩またはマグネシウム塩（これらに制限されない）の様な高濃度の塩、電場、界面活性剤、リポソーム仲介トランスフェクション法での細胞処理の様な様々な技術、および精子介在性および制限酵素介在性の組込みのような方法を含む。
【００４８】
本明細書において用いられる、用語「トランスフェクション剤」は、真核細胞、好ましくはトリ細胞への異種ＤＮＡセグメントの取り込みを増強するため、遺伝子原料に加えられる組成物を意味する。増強度は、トランスフェクション剤なしの取り込みと比べて測定される。トランスフェクション剤の例としては、アデノウイルス−トランスフェリン−ポリリジン−ＤＮＡ複合体を含む。該複合体は、一般に、細胞へのＤＮＡの取り込みを増し、細胞質から核への通過の間の分解を減らす。該複合体は、例えば、ｃ−ｋｉｔリガンドまたはその修飾物のような、生殖細胞表面の受容体により認識される特定のリガンドを用いて、オスの生殖細胞を標的とすることができる。
【００４９】
別の好ましいトランスフェクション剤は、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＩＭＲＩＥ  Ｃ、SupeffectおよびEffectin（Qiagen）、ユニフェクチン（unifectin）、マキシフェクチン（maxifectin）、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ（Transfectam；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム プロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチル ジオクタデシトアンモニウム臭化物)、ＤＨＤＥＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、ＨＤＥＡＢ（Ｎ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、ポリブレン、またはポリ（エチルアミン）（ＰＥＩ）を含むが、これらに制限されない。これらの非ウイルス性物質は、ウイルス由来のトランスフェクション剤に通常付随するサイズの制限はなく、脊椎動物のゲノムに異種間ＤＮＡ配列の安定的組込みを促進するという利点がある。
【００５０】
用語「組換え細胞」は、事実上、特定の形態（configuration）で互いに共有結合する、新たな組合せの核酸セグメントを有する細胞を意味する。核酸セグメントの新たな形態は、当該技術分野の技術者にとって利用可能な、広範な配列の核酸操作技術を用いて生物に導入される。組換え細胞は、哺乳類細胞またはトリ細胞（遺伝子導入哺乳類またはトリの細胞を含む）の様な１個の真核細胞、または１個の原核細胞であってもよい。組換え細胞は、ゲノム外（extragenomic）遺伝子であるベクターを宿す。ゲノム外核酸ベクターは細胞のゲノムに挿入されない。組換え細胞は、ゲノム内（intragenomic）であるベクターまたはその一部（例えば、制御配列およびコード配列を含有する部分）をさらに宿す。用語「ゲノム内」は、組換え細胞ゲノムに取り込まれる核酸構造物を定義する。
【００５１】
本明細書において用いられる様に、用語「組換え核酸」および「組換えＤＮＡ」は、真核細胞または原核細胞で天然には見つけられない、特定の立体配置にある少なくとも２つの核酸の組合せを意味する。核酸は、核酸ベクター、遺伝子発現制御エレメント、複製起点、発現した場合に抗生物質抵抗性を有する適当な遺伝子配列、タンパク質コード化配列などを含んでいてもよいが、これらに制限されない。用語「組換えポリペプチド」は、それが、位置、純度、または構造のいずれかで天然に生じるポリペプチドと異なるように、組換えＤＮＡ技術により産生されるポリペプチドを含むことを意味する。一般的に、該組換えポリペプチドは、天然で普通に観察されるものとは異なる量で細胞に存在する。
【００５２】
オボムコイド遺伝子発現制御領域に作動可能に結合するポリペプチドコード化核酸の発現の制御を調節する物質を含む医薬組成物は、レシピエント動物の年齢、性別、体重、種、および状態といった因子、および投与経路を考慮して、適用量で、かつ医学または獣医学の分野の技術者によく知られた技術により投与され得る。投与経路は、粘膜投与経由（例えば、経口、経鼻、経肛、経膣）または非経腸経路経由（皮内、筋内、皮下、静脈内、または腹膜内）の経皮投与であってもよい。医薬組成物は単独で投与されるか、または他の処置または治療と同時投与、または連続投与され得る。投与製剤は、懸濁剤、シロップ剤またはエリキシル剤、および滅菌懸濁剤または乳濁剤の様な、非経腸、皮下、皮内、筋内または静脈内投与のための製剤（例えば、注射剤投与）を含んでいてもよい。医薬組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコースの様な適当な担体、希釈剤、または添加剤との混合物として投与されてもよい。組成物は、所望の投与経路および製剤に依存して、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、補助剤、ゲルまたは粘性増強添加剤、保存剤、香味剤、着色剤の様な補助物質を含有できる。Remmington's Pharmaceutical Science, 17th edition, 1985の様な標準的な医薬の教科書を調べて、実験を行わないで適切な製剤を製造できる。適用量は、一般に、数百ミリグラムから数グラムの範囲である。
【００５３】
本明細書において用いられる様に、「遺伝子導入動物」は、動物の１以上の細胞が、当該技術分野においてよく知られた遺伝子導入技術のようなヒト介入方法により誘導される異種核酸を含有する、ニワトリを含むトリといった任意の非ヒト動物である。核酸は、マイクロインジェクションまたは組換えウイルス感染の様な計画的な遺伝子操作により、細胞の前駆体への直接または非直接的導入により、導入される。用語「遺伝子操作」は、古典的な交雑育種または試験管内受精は含まないが、むしろ組換えＤＮＡ分子の導入を指示する。該分子は染色体に取り込まれてもよいし、あるいは、染色体以外でＤＮＡを複製してもよい。典型的な遺伝子導入動物においては、導入遺伝子により、細胞が組換え形、例えば、作用形または拮抗形の目的のポリペプチドを発現するか、または該遺伝子が分解されているかである。ある実施態様において、動物のゲノムは、異種遺伝子発現エレメントが外因性コード配列に作動可能に結合するために挿入されるように修飾されている。本明細書において用いられる様に、用語「キメラ動物」または「モザイク動物」は、組換え遺伝子が見られるか、または組換え遺伝子が動物の全細胞でなくある細胞で発現している動物を意味する。用語「組織特異的キメラ動物」は、組換え遺伝子がある組織では存在するが別の組織では存在しない、および／または、ある組織では発現するが別の組織では発現しないことを示す。
【００５４】
本明細書で用いる様に、用語「導入遺伝子」は、それが導入される遺伝子導入動物または細胞にとって、部分的または全体的に異種、すなわち、外来遺伝子であるか、またはそれが導入される遺伝子導入動物または細胞の外因性遺伝子に相同であるが、挿入細胞のゲノムを変化する（例えば、それが天然遺伝子のものとは異なる位置で挿入されるか、またはその挿入がノックアウトを生じる）様に、動物のゲノムに挿入されるために設計されるかまたは挿入される、核酸配列（例えば、ヒトインターフェロンポリペプチドをコード化する）を意味する。導入遺伝子は、それが外因性コード配列の発現を制御、例えば、発現を増加させるか、および／または、タイミングおよび／または発現の組織特異性を変える（例えば、「遺伝子活性化」を行うこと）、ゲノムに挿入されるために設計される制御配列も含む。
【００５５】
本明細書において用いられる、用語「サイトカイン」は、細胞の機能に作用し、かつ免疫での細胞間の相互作用、および炎症および造血応答を調節する分子である任意の分泌ポリペプチドを意味する。サイトカインは、それを産生する細胞に関わらずモノカインおよびリンホカインを含むが、これらに制限されない。例えば、モノカインは、一般に、マクロファージおよび／または単球のような単核細胞により産生されて分泌されるものとして言及される。しかしながら、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、好塩基球、好中球、内皮細胞、脳アストロサイト、骨髄間質細胞、上皮性ケラチノサイトおよびＢリンパ球の様な多くの他の細胞も、モノカインを産生する。リンホカインは、一般に、リンパ球細胞により産生されるものとして言及される。サイトカインの例としては、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）および腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）を含むが、これらに制限されない。
【００５６】
本明細書において用いられる、用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、およびそのフラグメント、および免疫学的に結合する均等物を意味する。用語「抗体」は、同種の化合物、または多数の別の化合物からなるポリクローナル血清産物のような混合物を意味し、エピトープ特異的結合能を保持している、任意の修飾または誘導された変異体をさらに含む。モノクローナル抗体は、標的抗原またはエピトープに選択的に結合できる。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、キャメライズ（camelized）抗体、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）フラグメント、例えば、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるような、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、細胞内発現抗体、合成抗体、および上記のうちいずれかのエピトープ−結合フラグメントを含むが、これらに制限されない。
【００５７】
本明細書において用いられる、用語「免疫グロブリンポリペプチド」は、免疫グロブリンの構成ポリペプチドからもたらされるポリペプチドを意味する。「免疫グロブリンポリペプチド」は、免疫グロブリン（好ましくは、抗体）の重鎖および軽鎖であってもよいが、これらに制限されず、可変領域、多様性領域、結合部領域および定常領域、またはいずれかの組合せ、変異体または切断形を含む。用語「免疫グロブリンポリペプチド」は、免疫グロブリン重鎖可変領域、免疫グロブリン軽鎖可変領域、および必要に応じて、ペプチドリンカー（これらに制限されない）からなる１本鎖抗体をさらに含む。
【００５８】
本発明の核酸およびタンパク質を単離し、特徴付けるために用いられる技術は、当該技術分野の技術者によく知られており、標準的な分子生物学および生化学マニュアルを調べて、実験を行わないで適当なプロトコールを選択できる。例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Pressを参照されたい。この内容は、全体として引用により本明細書に取り込まれる。
【００５９】
本明細書は、Cucurbit Genetics Cooperative Report 18:85 (1995)（全体として引用により本明細書に取り込まれる）で明らかな様に、Cucurbit Genetics Cooperativeにより認められる遺伝子命名法を用いる。この遺伝子命名法を用いて、遺伝子はイタリック体のローマ字で表されている。変異遺伝子が正常タイプに対して劣性であるとき、変異遺伝子の表記および名前はイタリック体の小文字で表される。
【００６０】
略語
本明細書において用いられる略語は、以下：ａａ、アミノ酸；ｂｐ、塩基対；ｃＤＮＡ、ＲＮＡに相補的なＤＮＡ；ｎｔ、ヌクレオチド：ＳＳＣ、塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシドを含む。
【００６１】
本発明のさらなる目的および態様は、以下の様に簡単に説明している添付図面と組み合わせると、以下で説明する詳細な説明を見ればさらに明らかになる。
【００６２】
４．図面の簡単な説明
図１は、プライマーＯＶＩＮｓ２（配列番号：１）およびＯＶＭＵａ２（配列番号：２）を用いて、ニワトリゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析を示す。
【００６３】
図２は、ニワトリオボムコイド転写開始部位の５’上流にある約１０ｋｂの核酸領域、および該領域を配列決定するために用いられるプライマーの位置および向きを示す。
【００６４】
図３は、ニワトリオボムコイド転写開始部位の５’上流にある約１０ｋｂの核酸領域をＰＣＲ増幅および／または配列決定するために用いられる配列番号：１〜２５のＰＣＲプライマーを示す。
【００６５】
図４は、ニワトリオボムコイド転写開始部位の５’上流にある約１０ｋｂの核酸領域の配列番号：２６の核酸配列を示す。
【００６６】
図５は、ルシフェラーゼまたはヒトＩＦＮα−２ｂコード配列に結合する１０ｋｂのオボムコイドプロモーターを示す。
【００６７】
図６Ａは、ニワトリ骨髄細胞株であるＨＤ１１細胞への、ルシフェラーゼ遺伝子に結合するオボムコイドプロモーターまたはＣＭＶプロモーターを含むプラスミドのトランスフェクション結果を示す。図６Ｂは、ウズラのメスにある卵管の筒部分から単離された初代ウズラ尿細管腺細胞への、ルシフェラーゼ遺伝子に結合するオボムコイドプロモーターまたはＣＭＶプロモーターを含むプラスミドのトランスフェクション結果を示す。
【００６８】
図７は、ウズラのメスにある卵管の筒部分から単離された初代ウズラ尿細管腺細胞への、ルシフェラーゼ遺伝子に結合するオボムコイドプロモーターまたはＣＭＶプロモーターを含むプラスミドのトランスフェクション結果を示す。
【００６９】
５．本発明の詳細な説明
５．１  ニワトリオボムコイド遺伝子発現制御領域の核酸配列
ニワトリゲノムＤＮＡを鋳型とする一連のＰＣＲ増幅を用いて、ニワトリオボムコイド遺伝子座の遺伝子発現制御領域が単離された。オボインヒビター遺伝子の３’末端とオボムコイド遺伝子の５’転写開始部位との間にあるニワトリゲノムの領域が、以下の実施例および図１で詳細に記載される様に、プライマーＯＶＩＮｓ２、５’−ＴＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＧＡＣＴＣＴＣＡＡＣＣＴＣＧＴ−３’（配列番号：１）およびＯＶＭＵａ２、５’−ＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＡＧＴＴＡＣＴＣＡ−３’（配列番号：２）を用いて、ＰＣＲ増幅された。約１０ｋｂｐのフラグメントは平滑末端化され、制限酵素ＢａｍＨＩで切断された。生じた約４．７ｋｂと５．５ｋｂのフラグメントは、直線化されたプラスミドベクターpBluescript  ＫＳ  ＩＩ(+/-)（Stratagene, La Jolla, CA）にサブクローニングされた。それぞれのインサートは、図２および図３、および以下の実施例３で記載される配列番号：５〜２５のプライマーを用いて配列決定された。ニワトリオボムコイド転写開始部位の５’上流である、約１０ｋｂの核酸領域の核酸配列が、図４において示される。
【００７０】
配列番号：２６は、Scott et al. (J. Biol. Chem. 262: 5899  5909 (1987))により記載される様に、図４で示される塩基位置１〜２５５のオボインヒビター遺伝子３’非翻訳領域を含む。ＣＲ１様エレメント（Scott et al., Biochemistry 26: 6831 6840 (1987)；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｍ１７９６６）は、図４で示される様に塩基位置２７６１〜３０２４に位置している。図４で示される塩基位置９４０３〜９９２０の配列番号：２６の領域は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｊ００８９７およびLai et al., Cell 18: 829 842 (1979)で記載され、そしてオボムコイド遺伝子の５’非翻訳領域の一部を含む。
【００７１】
任意のポリペプチドコード化核酸配列は、トランスフェクショントリ細胞で発現するように、本発明のトリオボムコイド遺伝子発現制御領域が作動可能に結合するようにされている。例えば、クローン化オボムコイドプロモーター領域および所望のポリペプチドコード化核酸配列を含むプラスミド構造物が、培養ウズラまたはニワトリ卵管細胞にトランスフェクションされ、続いてインキュベートされて、所望のポリペプチドに対する抗体で検出可能なポリペプチドを合成し得る。
【００７２】
本発明を用いて、ヒトおよび動物の医薬品、診断薬、および家畜の飼料添加物として用いられるものを含む広範囲の所望タンパク質を、巨大産生量かつ低コストで発現させ得る。ヒト成長ホルモン、インターフェロン、リゾチーム、およびβ−カゼインを含む、成長ホルモン、サイトカイン、構造タンパク質、および酵素のようなタンパク質が卵管で望ましく発現されて、本発明に記載の卵に蓄積されるタンパク質の例である。産生されるべき可能性のある他のタンパク質は、アルブミン、α−１アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、コラーゲン、因子VIII、ＩＸ、Ｘ（など）、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、インスリン、ラクトフェリン、プロテインＣ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、飼料添加酵素、ソマトトロピン、およびキモトリプシンを含むが、これらに制限されない。ヒト腫瘍細胞の表面抗原に結合して、破壊する免疫毒素を含む免疫グロブリンおよび一般的に操作された抗体はまた、医薬品または診断薬としての使用のため、発現される。本発明の方法によるトランスフェクションに続いてトリ細胞で発現される免疫グロブリンポリペプチドは、単量体の重鎖および軽鎖、重鎖および軽鎖の可変領域、すなわち、抗原結合ドメインを含む１本鎖抗体または多量体の免疫グロブリン、または完全な免疫グロブリン重鎖および軽鎖を含んでいてもよいと考えられる。
【００７３】
本発明のニワトリオボムコイド遺伝子発現制御領域は、未変性のニワトリオボムコイド遺伝子座の転写開始部位の５’上流に位置し、下流のポリペプチドコード化核酸の発現を制御するのに必要であるヌクレオチドエレメントを含む。該領域が、例えば、ステロイドホルモンなどを含むホルモンにより制御可能な転写コントロール領域を含むと考えられる。
【００７４】
従って、本発明の１つの態様は、図４で示される配列番号：２６のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＦ４５３７４７）、およびその誘導体および変異体を含み、ニワトリオボムコイド遺伝子座の転写開始部位のすぐ５’上流に位置する新規単離核酸を提供する。
【００７５】
本発明の１つの実施態様において、単離核酸は、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、走鳥類、観賞用のトリ、または野生のトリからなる群から選択されるトリから単離される。
【００７６】
本発明の別の実施態様において、単離核酸はニワトリから得られる。該実施態様において、単離核酸は、図４に示される配列番号：２６の配列、またはその変異体を有する。配列番号：２６は、実施例２で記載される様に、pBluescript  ＫＳ  ＩＩ(+/-)ベクターにクローン化され、ｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ−１０と名付けられた。ｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ−１０は、ブタベスト条約の規定に基づき、２００２年１１月２６日にＡＴＣＣ番号 として、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）に預けられた。
【００７７】
本発明の別の態様は、図４で示される配列番号：２６の核酸配列全て、その変異体、またはその一部を有するニワトリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む単離核酸に、高く、中程度に、または低くストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、トリ卵管細胞でポリペプチドコード配列の発現を指揮できる核酸を提供する。ニワトリからオボムコイド遺伝子発現制御領域(配列番号：２６)を単離することにより決定されるヌクレオチド配列は、別のトリ生物中のオボムコイド遺伝子発現制御領域、またはその相同体の同定に使用するために設計されるプローブの生成を可能とする。
【００７８】
目的のオボムコイド遺伝子発現制御領域の一部を含む核酸のフラグメントも、本発明の範囲内である。本明細書で用いられる様に、オボムコイド遺伝子発現制御領域の活性部分を含む核酸のフラグメントは、オボムコイド遺伝子発現制御領域の完全な核酸配列を含むヌクレオチド配列より少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を意味する。
【００７９】
オボムコイド遺伝子発現制御領域のフラグメントは、１以上の以下のエレメント：図４で示される様に、塩基位置１〜２５５のオボインヒビター遺伝子３’非翻訳領域、図４で示される様に、オボムコイド遺伝子の５’非翻訳領域の一部を含む塩基位置９４０３〜９９２０の領域を含んでいてもよい。または、該フラグメントは、１０、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００、２０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、または９０００ヌクレオチド長であってもよく、特にトリ卵管細胞においては、作動可能結合される異種遺伝子配列の発現を指揮することが可能である。
【００８０】
本発明の１つの実施態様において、本発明の単離ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列が、オボムコイド遺伝子発現制御領域を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイのプローブとして用いられる。本発明のヌクレオチド配列は、全体として引用により本明細書に取り込まれる、サザンブロット（Southern, E.M. J. Mol. Biol. 98: 508 (1975)）、ノーザンブロット（Thomas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 5201 05 (1980)）、およびコロニーブロット（Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 72: 3961 65 (1975)）（これらに制限されない）を含む、当該技術分野で既知の核酸ハイブリダイゼーションアッセイシステムのいずれかで用いられる。または、本発明の単離ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ連鎖反応法（Erlich et al., Science 252: 1643 51 (1991)、これは全体として、引用により本明細書に取り込まれる）、または全体として引用により本明細書において取り込まれるWatson et al., (2d ed. 1992), Recombinant DNA, Scientific American Books, 519 522, 545 547に記載の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）診断技術のような遺伝子増幅検出方法で用いられ得る。
【００８１】
本発明に従って構築された核酸は、検出手段としてのシグナルを提供するため標識される。例えば、３２Ｐ、３Ｈ、および３５Ｓなどの様な放射性元素が、放射性標識として有用である十分な半減期を提供する。合成ヌクレオチドを標識するのに有用な別の物質は、蛍光化合物、酵素および化学発光部分を含む。適切な標識の選択で有用な方法、および合成ヌクレオチドに標識を結合する結合プロトコールは、当該技術分野の技術者によく知られている。Promega: Protocol and Applications Guide, 2nd Edition, 1991 (Promega Corp., Madison, WI、この内容は、全体として本明細書に取り込まれる）の様な標準的な免疫マニュアルを調べて、実験を行わないで適切な標識プロトコールを選択し得る。
【００８２】
本発明の別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：２６で示される様に、核酸分子を含むニワトリ由来オボムコイド遺伝子発現制御領域と、少なくとも約７５％、好ましくは、少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約８５％、なおより好ましくは、少なくとも約９０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９５％、そしてもなおより好ましくは、少なくとも約９９％同一である核酸を含み、ポリペプチドコード化配列に作動可能に結合する場合は、トリ卵管細胞でのポリペプチドコード化配列の発現を指揮する。
【００８３】
本発明の別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：２６またはその相補鎖、またはｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ−１０のインサートに、高く、中程度または低くストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含む。
【００８４】
本発明の別の実施態様において、トリオボムコイド遺伝子発現制御領域の遺伝子または核酸分子が、配列番号２６、または別のトリ、例えば、ウズラ、カモ由来の相同体の対立遺伝子変異体であってもよい。
【００８５】
本発明は、核酸のコード鎖に対して相補的である（すなわち、ｍＲＮＡ配列に対して相補的である）か、またはｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域に対して相補的であるように設計されるアンチセンス核酸分子の使用も考慮する。合成ヌクレオチドの別の使用は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）などのプライマー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）としてである。
【００８６】
合成されるヌクレオチドは、変化できる長さで産生される。合成される塩基数は、プローブまたはプライマーとしての所望の使用を含む、様々な因子に依存する。または、センスまたはアンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチドを修飾されたヌクレオチドを用いて化学合成し、分子、またはアンチセンスとセンス核酸間で形成される結合複合体の生物学的安定性を増加させる。例えば、アクリジンで変えられたヌクレオチドが合成される。単離ヌクレオチド、ヌクレオチドプローブ、および／またはヌクレオチドプライマーを設計するプロトコールは、当該技術分野の技術者によく知られており、様々な製造元（例えば、Sigma Genosys, The Woodlands, TX or  The Great American Gene Co., Ramona, CA）から市販されている。
【００８７】
本発明のニワトリオボムコイド遺伝子発現制御領域の核酸分子（配列番号：２６）の核酸配列は、当該技術分野の技術者が、例えば、（ａ）細胞による複製のための細胞への挿入（これに制限されない）のような方法により、化学合成により、またはＰＣＲまたはＬＣＲの様な方法により、核酸分子のコピーを作成すること、（ｂ）全長遺伝子、全長コード領域、制御コントロール領域、切断されたコード領域などを含む、該核酸分子の少なくとも一部を含む核酸分子を得ること、（ｃ）シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、ダチョウ、エミューおよびヒクイドリを含む走鳥類（これらに制限されない）の様な別のトリのオボムコイド遺伝子発現制御領域の核酸相同体を得ること、および（ｄ）トリオボムコイド遺伝子発現制御領域の核酸にハイブリダイズできる単離核酸を得ることを可能とし、そしてそれを用いて、プローブと標的核酸との間の相補性により核酸関連配列の存在を検出する。
【００８８】
該核酸相同体は、適当なライブラリーをスクリーニングするための伝統的なクローニング技術を用いて、本発明の抗体で適当な発現ライブラリーをスクリーニングすること、ポリメラーゼ連鎖反応法または別の増幅方法において本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、適当なライブラリーまたはＤＮＡを増幅すること、および標的を同定するために本発明の核酸分子を用いて、遺伝子配列を含む公開および／または私的データベースをスクリーニングすることを含む、様々な方法で得られる。スクリーニング、またはそれから核酸分子を増幅するための好ましいライブラリーの例は、哺乳類ＢＡＣライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー、およびｃＤＮＡライブラリー（これらに制限されない）を含む。同様に、他の種のニワトリオボムコイド遺伝子発現制御領域に相同な配列を同定するためのスクリーニングに有用な好ましい配列データベースは、ＧｅｎＢａｎｋ、およびInstitute of Genomics Research（ＴＩＧＲ)の哺乳類Gene Indexデータベースを含むが、これに限らない。
【００８９】
コドン最適化タンパク質
本発明の別の態様は、選択されたポリペプチドコード化核酸インサートに作動可能に結合する本発明の新規単離トリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む、組換えＤＮＡ分子であり、適当な宿主細胞、好ましくは、トリ細胞にトランスフェクションされると、核酸インサートを発現できる。核酸インサートは、シグナルペプチド配列とインフレームで位置し、これにより、転写物の翻訳がシグナルペプチドで開始し、核酸インサートを通って続けられ、所望のアミノ酸配列を有する発現ポリペプチドを産生する。
【００９０】
組換えＤＮＡは、新規オボムコイド遺伝子発現制御領域により指揮される転写が、ポリペプチドコード化核酸インサートを超えて続けられることを可能とし、転写が、３’非翻訳領域およびポリアデニル化末端をさらに含むことを可能とするポリアデニル化シグナル配列をさらに含んでいてもよい。任意の機能的ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモンアデニル化配列などを含む核酸インサートの３’末端、またはその誘導体に結合する。
【００９１】
本発明の別の態様は、トリ細胞での発現のために最適化されたタンパク質の核酸配列、およびその誘導体およびフラグメントを提供する。
【００９２】
本発明の１つの実施態様は、ポリペプチドコード化核酸インサートに作動可能に結合する本発明の単離トリオボムコイド遺伝子発現制御領域、および必要に応じて、作動可能に結合するポリアデニル化シグナル配列を含む組換えＤＮＡ分子である。組換えＤＮＡが発現のためにレシピエント細胞に運ばれる場合、核酸の配列はコドンがレシピエント種のコドン使用に最適化される様に修飾されることが考慮される。異種核酸が発現のためにレシピエント細胞に運ばれる場合、核酸の配列は、レシピエント種のコドン使用に最適化される様に修飾される。例えば、異種核酸がレシピエントのニワトリ細胞にトランスフェクションされると、発現核酸インサートの配列は、ニワトリコドン使用に最適化される。このことは、ニワトリ細胞で発現される、少なくとも１つの、そして好ましくは１以上のタンパク質のコドン使用から決定される。例えば、コドン使用は、ニワトリの卵白アルブミン、リゾチーム、オボムチン、およびオボトランスフェリンタンパク質をコード化する核酸配列から決定されてもよい。簡単に行うには、標的タンパク質のＤＮＡ配列は、ニワトリ（Gallus gallus）卵白アルブミン、リゾチーム、オボムコイド、およびオボトランスフェリンタンパク質からなるコドン使用の表とWisconsin Package, version 9.1（Genetics Computer Group, Inc., Madison, WI）のBACKTRANSLATE［登録商標］プログラムを用いて最適化される。次に、鋳型およびプライマーオリゴヌクレオチドが、Ｐｆｕポリメラーゼ（STRATAGENE［登録商標］, La Jolla CA）でのＰＣＲ（これに制限されない）を含む、当該技術分野において既知の方法のいずれかにより、増幅される。
【００９３】
本発明の方法で使用される異種核酸の１つの例示的な実施態様においては、ニワトリによるコドン使用に最適化されたヒトインターフェロンα２ｂポリペプチドコード化核酸インサートが用いられる。コドン使用ための配列の最適化は、トリ卵での翻訳レベルを上昇させる際に有用である。
【００９４】
トリ細胞での発現に最適化されるべき任意のポリペプチドコード化核酸が本発明の範囲内であることが考慮される。さらに、コドン使用が宿主細胞の供給源として用いられる特定のトリに最適化されることが考慮される。本発明の１つの実施態様において、異種ポリペプチドはニワトリのコドン使用を用いてコード化される。
【００９５】
本発明のなお別の実施態様において、組換えＤＮＡは、ヒトインターフェロンα２ｂコード化核酸に作動可能に結合する単離トリオボムコイド遺伝子発現制御領域、およびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。
【００９６】
本発明のタンパク質は、既知の通常の技術のいずれかにより精製された形で産生されてもよい。好ましい実施態様において、該タンパク質は、ニワトリの卵、好ましくは、卵白から精製される。例えば、ニワトリ細胞が、ホモジェナイズされ、遠心分離される。続いて、上清が硫安塩析および熱処理される。本発明のタンパク質を含有する分画が、タンパク質を分けるために適当なサイズのデキストランまたはポリアクリルアミドカラムでのゲル濾過される。必要なら、タンパク質分画がＨＰＬＣによりさらに精製されてもよい。
【００９７】
多量体タンパク質
好ましい実施態様において、本発明は、多量体タンパク質、好ましくは、抗体のような免疫グロブリン、およびその抗原結合フラグメントを産生する方法を提供する。
【００９８】
本発明の１つの実施態様において、第１および第２の異種ポリペプチドがそれぞれ免疫グロブリンの重鎖および軽鎖である、多量体タンパク質免疫グロブリンである。この態様および別の態様、およびトリ細胞で異種多量体ポリペプチドを産生する本発明の実施態様の例示的な例は、Rappにより２００１年６月８日付けで出願された米国特許出願番号第０９／８７７，３７４号（これは２００２年８月８日にUS-2002-0108132-A1として公開された）、およびRappにより２００２年９月１８日付けで出願された米国特許出願番号第１０／２５１，３６４号（共に、全体として、引用により本明細書に取り込まれる）で十分に記載されている。従って、本発明の１つの実施態様において、多量体タンパク質は、第１および第２の異種ポリペプチドがそれぞれ免疫グロブリンの重鎖および軽鎖である、免疫グロブリンである。または、本発明は、本発明の遺伝子導入トリにより産生された免疫グロブリンおよび他の多量体タンパク質を提供する。
【００９９】
本発明の該態様の様々な実施態様において、少なくとも１つの発現ベクターの転写ユニットによりコード化される免疫グロブリンポリペプチドは、可変領域またはその変異体を含む免疫グロブリン重鎖ポリペプチドであってもよく、Ｄ領域、Ｊ領域、Ｃ領域、またはその組合せをさらに含んでいてもよい。発現ベクターの転写ユニットによりコード化される免疫グロブリンポリペプチドは、可変領域およびその変異体を含む免疫グロブリンの軽鎖であってもよく、Ｊ領域およびＣ領域をさらに含んでいてもよい。同じ動物種、またはヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびニワトリ（これらに制限されない）を含む種の混合からもたらされる免疫グロブリン領域が、本発明の範囲内であることが考慮される。好ましい実施態様において、抗体はヒトまたはヒト化抗体である。
【０１００】
本発明の別の実施態様において、少なくとも１つの発現ベクターの転写ユニットによりコード化される免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の可変領域、免疫グロブリン軽鎖の可変領域、およびリンカーペプチドを含み、これにより、抗原に選択的に結合可能な１本鎖抗体を形成する。
【０１０１】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの導入遺伝子を取り込んでいる遺伝子導入トリを作る工程を含む、抗原に選択的に結合可能な抗体を形成できる異種タンパク質のトリでの産生方法を提供し、ここで、導入遺伝子は、免疫グロブリン重鎖の可変領域、可変領域および定常領域を含む免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖の可変領域、可変領域および定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖、および２つのペプチド結合免疫グロブリン可変領域を含む１本鎖抗体からなる群から選択される、少なくとも１つの異種ポリペプチドをコード化する。
【０１０２】
本発明の該方法の実施態様において、単離異種タンパク質は、抗原に選択的に結合できる抗体である。１つの実施態様において、抗体は、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖の可変領域と少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖の可変領域との結合、好ましくは、少なくとも１つのジスルフィド結合による架橋結合により、生成される。２つの可変領域の組合せは、当該技術分野においてよく知られている抗体再構成法を用いて、抗原結合可能な結合部位を生成する。
【０１０３】
しかしながら、別の遺伝子導入トリで発現され、そしてそれゆえ、単一種の免疫グロブリンポリペプチドを含む各単離物が血清または卵を含む異なる媒体から単離される、免疫グロブリン重鎖および軽鎖、またはその変異体または誘導体が、本発明の範囲内であることが考慮される。該方法は、多数の単離異種免疫グロブリンポリペプチドを結合し、これにより、抗原に選択的に結合できる抗体を産生する工程をさらに含んでいてもよい。該実施態様において、２つの個々の遺伝子導入トリが作られ、ここで、遺伝子導入体が、そこで発現される免疫グロブリン重鎖の可変領域、またはこれを含むポリペプチドを有する血清または卵を産生する。第２の導入遺伝子を有する第２の遺伝子導入動物は、そこで発現される免疫グロブリン軽鎖の可変領域、またはこれを含むポリペプチドを有する血清または卵を産生する。ポリペプチドは、それぞれの血清および卵から単離され、そして試験管内で結合させられて、抗原を結合できる結合部位が作られる。
【０１０４】
本発明の方法で用いられ得る治療抗体の例としては、転移性乳癌患者の処置のための、ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるＨＥＲＣＥＰＴＩＮ［登録商標］（トラスツズマブ）(Genentech, CA)；凝血塊形成を予防するための、血小板の抗−糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体であるＲＥＯＰＲＯ［登録商標］（アブシキシマブ）(Centocor)；急性腎臓同種移植拒絶反応の予防のための、免疫抑制剤ヒト化抗−ＣＤ２５モノクローナル抗体であるＺＥＮＡＰＡＸ［登録商標］（ダクリズマブ）(Roche Pharmaceuticals, Switzerland)；マウス抗−１７−ＩＡ細胞表面抗原ＩｇＧ２ａ抗体（Glaxo Wellcome/Centocor）であるＰＡＮＯＲＥＸ［登録商標］；マウス抗−イディオタイプ（ＧＤ３エピトープ）ＩｇＧ抗体（ImClone System）であるＢＥＣ２；キメラ抗−ＥＧＦＲ  ＩｇＧ抗体（ImClone System）であるＩＭＣ−Ｃ２２５；ヒト化抗−αＶβ３インテグリン抗体（Applied Molecular Evolution/MedImmune）であるＶＩＴＡＸＩＮ［登録商標］；ヒト化抗ＣＤ５２  ＩｇＧ１抗体（Leukosite）であるキャンパス（Campath）１Ｈ／ＬＤＰ−０３；ヒト化抗−ＣＤ３３  ＩｇＧ抗体（Protein Design Lab/Kanebo）であるスマート（Smart）Ｍ１９５；キメラ抗−ＣＤ２０  ＩｇＧ１抗体（IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku）であるＲＩＴＵＸＡＮ［登録商標］；ヒト化抗−ＣＤ２２  ＩｇＧ抗体（Immunomedics）であるＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ［登録商標］；ヒト化抗−ＩＣＡＭ３抗体（ICOS Pharm）であるＩＣＭ３；霊長類化（primatied）抗−ＣＤ８０抗体（IDEC Pharm/Mitsubishi）であるＩＤＥＣ−１１４；放射性標識されたマウス抗−ＣＤ２０抗体（IDEC/Schering AG）であるＺＥＶＡＬＩＮ［登録商標］；ヒト化抗−ＣＤ４０Ｌ抗体（IDEC/Eisai）であるＩＤＥＣ−１３１；霊長類化抗−ＣＤ４抗体（IDEC）であるＩＤＥＣ−１５１；霊長類化抗−ＣＤ２３抗体（IDEC/Seikagaku）であるＩＤＥＣ−１５２；ヒト化抗−ＣＤ３  ＩｇＧ（Protein Design Lab）であるスマート抗−ＣＤ３；ヒト化抗−補体因子５（Ｃ５）抗体（Alexion Pharm）である５Ｇ１．１；ヒトか抗−ＴＮＦ−α抗体（CAT/BASF）であるＤ２Ｅ７；ヒト化抗−ＴＮＦ−α  Ｆａｂフラグメント（Celltech）であるＣＤＰ８７０；霊長類化抗−ＣＤ４  ＩｇＧ１抗体（IDEC Pharm/SmithKline Beecham）であるＩＤＥＣ−１５１；ヒト抗−ＣＤ４  ＩｇＧ抗体（Medarex/Eisai/Genmab）であるＭＤＸ−ＣＤ４；ヒト化抗−ＴＮＦ−α  ＩｇＧ４抗体（Celltech）であるＣＤＰ５７１；ヒト化抗−α４β７抗体（LeukoSite/Genentech）であるＬＤＰ−０２；ヒト化抗−ＣＤ４  ＩｇＧ抗体（Ortho Biotech）であるオルトクローン（OrthoClone）ＯＫＴ４Ａ；ヒト化抗−ＣＤ４０Ｌ  ＩｇＧ抗体（Biogen）であるＡＮＴＯＶＡ［登録商標］；ヒト化抗−ＶＬＡ−４  ＩｇＧ抗体（Elan）であるＡＮＴＥＧＲＥＮ［登録商標］；およびヒト抗−ＴＧＦ−β２抗体（Cambridge Ab Tech）であるＣＡＴ−１５２を含むが、これらに制限されない。
【０１０５】
組換え核酸、およびトリオボムコイドプロモーターの制御下でのその発現
本発明の新規単離オボムコイド遺伝子発現制御領域の可能性のある別の有用な応用は、遺伝子移入によりトリ（特にニワトリ）に存在する異種タンパク質の量を増加することである。多くの場合で、レシピエント動物に遺伝子移入された異種ポリペプチドコード化核酸インサートは、オボムコイド遺伝子発現制御領域に作動可能に結合し、細胞が遺伝子産物タンパク質の産生を開始し、続けることを可能とする。本発明の組換えＤＮＡ分子は、宿主の外−染色体またはゲノムＤＮＡに遺伝子移入される。
【０１０６】
本発明の組換えＤＮＡ核酸分子は、通常の組換えＤＮＡ技術を用いて細胞に運ばれる。組換えＤＮＡ分子のポリペプチドコード化核酸インサートが異種（すなわち、天然には存在しない）である組換えＤＮＡ分子が、細胞に挿入されてもよい。または、以下でより詳細に記載される様に、組換えＤＮＡ分子は、例えば、ポリペプチドが発現しないことを改善するために、組換えＤＮＡ分子のポリペプチドコード化核酸インサートを天然に含有するか、またはポリペプチドの過剰発現が望まれる細胞に挿入される。
【０１０７】
異種システムでの発現のため、異種ＤＮＡ分子は、適切なセンス起点および正しいリーディングフレームで、発現システムまたは本発明のベクターに挿入される。ベクターは、新規単離オボムコイド遺伝子発現制御領域を含む、挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含有する。
【０１０８】
全体として、引用により本明細書に取り込まれる、Cohen & Boyerの米国特許番号第４，２３７，２２４号では、制限酵素切断およびＤＮＡリガーゼライゲーションを用いた組換えプラスミドの形での発現システムの構築について記載している。続いて、該組換えプラスミドは、形質転換方法により細胞に導入され、組織培養での真核細胞増殖を含む培養において複製される。
【０１０９】
従って、本発明の１つの態様は、ベクターのポリペプチドコード化核酸のＯＲ発現の複製のため、レシピエント細胞への送達に適当な発現ベクターである。ポリペプチドコード化核酸インサートに作動可能に結合する単離トリオボムコイド遺伝子発現制御領域、および必要に応じて、ポリアデニル化シグナル配列を含む発現ベクターが、本発明の範囲内であることが考慮される。本発明の発現ベクターは、適当な宿主でのベクターの複製を可能とする細菌性プラスミド配列、ウイルスの核酸配列、またはそのフラグメントまたは変異体をさらに含んでいてもよい。
【０１１０】
本発明の新規単離トリオボムコイド遺伝子発現制御領域（配列番号：２６）、およびそれにおよび必要に応じて、ポリアデニル化シグナル配列に作動可能に結合するポリペプチドコード化核酸が、ワクシニアウイルスの様なウイルスに挿入される。オボムコイドプロモーターの制御下で、タンパク質を発現するのに有用なウイルス組換えベクターを作成する方法は、米国特許番号第４，６０３，１１２；４，７６９，３３０；５，１７４，９９３；５，５０５，９４１；５，３３８，６８３；５，４９４，８０７；４，７２２，８４８号；Paoletti, E. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11349 11353 (1996)；Moss Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11341 11348 (1996)；Roizman Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11307 11302 (1996)；Frolov et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11371 11377 (1996)；Grunhaus et al. Seminars in Virology 3: 237 252 (1993)；および特にＤＮＡ発現ベクターに関連して米国特許番号第５，５９１，６３９；５，５８９，４６６；および５，５８０，８５９号（これらの内容は、全体として引用により本明細書に取り込まれる）で記載される方法に類似のものである。
【０１１１】
組換えウイルスは、ウイルス感染させた細胞へのプラスミドのトランスフェクションによっても作成される。適当なベクターは、λベクターシステムであるλｇｔ１１、λｇｔＷＥＳ．ｔＢ、シャロン４の様なウイルスベクター、およびｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ＳＶ４０、pBluescript  ＩＩ  ＳＫ+/−またはＫＳ+/−（Stratagene, La Jolla, Calif の「Stratagene Cloning Systems」カタログ(1993)を参照。これは引用により、本明細書に取り込まれる）、ｐＱＥ、ｐＩＨ８２１、ｐＧＥＸ、ｐＥＴシリーズ（Studier, F.W. et. al. (1990) 填se of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes  Gene Expression Technology, vol. 185を参照。これは、全体として引用により本明細書に取り込まれる）、およびそのいずれかの変異体の様なプラスミドベクター、コスミドベクターを含むが、これらに制限されず、好ましい実施態様において、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＢＢＰＡＣ、またはＰＡＣ（これらに制限されない）の様な人工染色体を含む。該人工染色体は、巨大核酸インサートが増幅されて、トリ細胞に導入される際に有用である。組換え分子は、形質転換、特に、形質導入、接合、可動化、またはエレクトロポレーションを介して細胞へ導入される。ＤＮＡ配列は、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, N.Y. (2001)（全体として、引用により本明細書に取り込まれる）に記載の様に、当該技術分野において標準的なクローニング方法を用いて、ベクターにクローン化される。
【０１１２】
本発明のベクターは、遺伝子導入トリで発現されることが望まれる、１以上の異種タンパク質コード化ヌクレオチド配列、ならびに、プロモーター、エンハンサー、マトリックス結合領域、ＩＲＥＳ、および他の翻訳制御エレメント、転写終結エレメント、ポリアデニル化配列などといった制御エレメントを含む。特定の実施態様において、本発明のベクターは、少なくとも２つの異種タンパク質コードヌクレオチド配列、例えば、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖（これに制限されない）を含有する。
【０１１３】
本発明は、複数のポリペプチド-コード化領域を組み込む、本発明のトリオボムコイド遺伝子発現制御領域を有する挿入核酸ベクターおよび導入遺伝子にさらに関し、ここで、第１のポリペプチド-コード化領域が、転写プロモーターに作動可能なように結合し、第２のポリペプチド-コード化領域が、ＩＲＥＳに作動可能なように結合する。例えば、ベクターは、２つの別の異種タンパク質（例えば、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖）のコード配列を含有していてもよい。
【０１１４】
トリゲノムに挿入されてそこで発現される該核酸構造物は、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化される個々のポリペプチドを生成するか、またはある実施態様においては、互いに結合してヘテロ２量体のような複合体を、トリ卵の卵白で形成する。または、発現されたポリペプチドは、トリ卵から単離され、試験管内で結合させられて、血清の様な非生殖性組織で発現される。別の実施態様においては、例えば、抗体の重鎖と軽鎖両方の発現が必要である場合（これに限らない）、それぞれが本発明のオボムコイド遺伝子発現制御領域に作動可能に結合する異種タンパク質のうち１つのコード配列を含有している２つの別の構造物が、トリ細胞に導入される。または、それぞれが２つの異種タンパク質のうち１つを含有している２羽の遺伝子導入トリ（例えば、第１の遺伝子導入トリが、抗体の軽鎖をコード化する導入遺伝子を有し、第２の遺伝子導入トリが、抗体の重鎖をコード化する導入遺伝子を有している）が、生殖系列に両導入遺伝子を含有してタンパク質コード化導入遺伝子の両方を好ましくは卵で発現するトリを得るためにかけあわされる。
【０１１５】
本発明のオボムコイド遺伝子発現制御領域がベクターシステムにクローン化されると、宿主細胞に取り込まれることが容易となる。該取り込みは、ベクター／宿主細胞システムに依存して、上記の様々な形の形質転換で行われる。適当な宿主細胞は、細菌、ウイルス、酵母、哺乳類またはトリ細胞などを含むが、これらに制限されない。または、レシピエント細胞への本発明のＤＮＡの取り込みが、ウイルストランスファー、エレクトロポレーション、遺伝子銃挿入法、トリへの精子仲介輸送、マイクロインジェクション、細胞質インジェクション、前核のインジェクションなど（これらに制限されない）の様な任意の適当な方法によることが考慮される。
【０１１６】
従って、本発明の別の態様は、ポリペプチドコード化核酸インサートに作動可能に結合するトリオボムコイド遺伝子発現制御領域、および必要に応じて、ポリアデニル化シグナル配列を含む組換えＤＮＡで細胞をトランスフェクションし、トリオボムコイド遺伝子発現制御領域の制御下での異種ポリペプチドの発現に適当な培養液中で、トランスフェクション細胞を培養することにより、真核細胞で異種ポリペプチドを発現させる方法である。
【０１１７】
好ましい実施態様において、オボムコイド遺伝子発現制御領域は、トリ卵での異種タンパク質の、卵１個当たり５μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、または７５０μｇより高い、より好ましくは、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、または５ｇより高い発現レベルを指揮する。発現の該レベルは、本発明の発現制御領域を用いて得られる。
【０１１８】
本発明の方法の１つの実施態様において、レシピエント真核細胞はトリ由来である。１つの実施態様においては、トリはニワトリである。
【０１１９】
本発明のなお別の態様は、本発明および上記の発現ベクターで形質転換された真核細胞である。本発明の１つの実施態様において、形質転換細胞はニワトリ卵管細胞であり、核酸インサートは、ニワトリオボムコイド遺伝子発現制御領域、トリ細胞での発現のためにコドン最適化されたヒトインターフェロンα２ｄコード化核酸インサート、およびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。
【０１２０】
本発明に記載のトランスフェクション細胞は一過性にトランスフェクションされ、これにより、形質転換された組換えＤＮＡまたは発現ベクターはゲノム核酸に取り込まれないことが考慮される。トランスフェクションされた組換えＤＮＡまたは発現ベクターが、レシピエント細胞のゲノムＤＮＡへ安定的に取り込まれ、これにより、それぞれの娘細胞がトランスフェクションされた核酸のコピーを受け継ぐ様に細胞で複製されることも考慮される。本発明の範囲内に、本発明に記載のトランスフェクションされた核酸から発現する異種タンパク質を産生する遺伝子導入動物を含むことが、さらに考慮される。
【０１２１】
本発明の１つの実施態様において、遺伝子導入動物は、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、平胸類のトリ、観賞用のトリ、または野生のトリから選択されるトリである。別の実施態様において、トリはニワトリであり、本発明に記載の単離トリオボムコイド遺伝子発現制御領域の転写制御下で産生される異種タンパク質は、卵の卵白に産生される。
【０１２２】
ウイルスベクターでの細胞形質転換
目的の新規単離オボムコイド遺伝子発現制御領域に作動可能に結合する、ポリペプチドコード化核酸の細胞への生体内導入の例示的な方法は、遺伝子産物をコード化する核酸、例えば、ｃＤＮＡを含有するウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターでの細胞感染は、巨大集団の標的細胞が核酸を受け取ることができるという点で利点がある。または、ウイルスベクター内にコード化される分子、例えば、ウイルスベクターに含有されるｃＤＮＡは、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞で十分に発現される。
【０１２３】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、細胞への遺伝子の十分な運搬を提供し、そして運ばれた核酸は、宿主の染色体ＤＮＡへ安定的に取り込まれる。組換えウイルスベクターは、オボムコイド遺伝子発現制御領域を含む核酸に置き換えられたレトロウイルスのコード配列（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）の一部として構築され、これにより、レトロウイルス複製を不完全にする。組換えレトロウイルス産生方法および試験管内または生体内の該ウイルスでの細胞感染方法は、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (1989) (eds.) Greene Publishing Associates, Sections 9.10 9.14および他の標準的な実験室マニュアルで示されている。適当なレトロウイルスベクターの例としては、当該技術分野の技術者によく知られている、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭを含む。エコトロピックおよびアンホトロピックなレトロウイルスシステム作成のため、適当なパッケージングウイルスラインの例としては、ｐｓｉＣｒｉｐ、ｐｓｉＣｒｅ、ｐｓｉ２、およびｐｓｉＡｍを含む。
【０１２４】
さらに、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージングタンパク質を修飾することにより、レトロウイルス、結果としてレトロウイルスに基づいたベクターの感染範囲を制限することが可能である（例えば、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９４／０６９２０、およびＷＯ９４／１１５２４号を参照）。例えば、レトロウイルスベクターの感染範囲の修飾ストラテジーは、ウイルスのｅｎｖタンパク質への細胞表面抗原特異的抗体のカップリング（Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 9079 9083 (1989); Julan et al., J. Gen. Virol. 73: 3251 3255 (1992);およびGoud et al., Virology 163: 251 254 (1983)）、またはウイルスｅｎｖタンパク質への細胞表面リガンドのカップリング（Neda et al., J. Biol. Chem. 266: 14143 14146 (1991)）（これらは、全体として、引用により本明細書に取り込まれる）を含む。カップリングは、タンパク質または他の部分（例えば、アシアロ糖タンパク質へとｅｎｖタンパク質を変えるラクトース）との化学的な架橋結合の形、ならびに、融合タンパク質の生成（例えば、１本鎖抗体／ｅｎｖ融合タンパク質）による。ある組織型への感染を制限するか、あるいは反対に指揮するのに有用な該技術を用いて、エコトロピックベクターをアンホトロピックベクターに変えることができる。
【０１２５】
本発明で有用な別のウイルス遺伝子送達システムは、アデノウイルス由来ベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムは、興味ある遺伝子産物をコード化するが、正常な溶菌ウイルスライフサイクルで複製する能力を不活性化されるように、操作されてもよい（例えば、Berkner et al., BioTechniques 6: 616 (1988); Rosenfeld et al., Science 252: 43 1434 (1991);およびRosenfeld et al., Cell 68: 143 155 (1992)を参照。これは全て、全体として引用により本明細書に取り込まれる）。アデノウイルス菌株Ａｄ型５ｄｌ３２４またはアデノウイルスの別の菌株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）由来の適当なアデノウイルスベクターは、当該技術分野の技術者によく知られている。ウイルス粒子は比較的安定であり、精製および濃縮し易く、上記の様に、感染範囲を改変するように修飾される。または、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（および、その中に含有される外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムには取り込まれないが、エピソームを保持し、これにより、挿入ＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ分子）に取り込まれる状況での挿入による変異誘発の結果として生じる可能性のある問題を回避する。一般に使用され、従って本発明に好ましい複製−欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３の全てまたは一部を欠いているが、アデノウイルスの遺伝子物質の８０％も保持している（例えば、Jones et al., Cell 16:683 (1979); Berkner et al., supra；およびGraham et al., in Methods in Molecular Biology, E. J. Murray, (1991) Ed. (Humana, Clifton, N.J.) vol. 7. pp. 109 127を参照）（これら全てが、全体として本明細書に取り込まれる）。例えば、ヒトインターフェロンα２ｂの様な挿入遺伝子の発現は、外因性に加えられたオボムコイド遺伝子発現制御領域配列の制御下であってもよい。
【０１２６】
例えば、ポリペプチドコード化核酸に作動可能に結合する目的のトリオボムコイド遺伝子発現制御領域の送達に有用な、あらに別のウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶの３００塩基対を含有するベクターがパッケージされて、取り込まれる。異種間ＤＮＡのスペースは約４．５ｋｂに制限される。Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 3260 (1985)に記載されるようなＡＡＶベクターを用いて、細胞へＤＮＡを導入する。様々な核酸が、ＡＡＶベクターを用いて、異なる細胞種に導入された（例えば、Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6466 6470 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 2081 (1985); Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32 39 (1988); Tratschin et al., J. Virol. 51:611 619 (1984);およびFlotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781 3790 (1993)を参照）（これら全てが、全体として引用により本明細書に取り込まれる）。
【０１２７】
非ウイルス発現ベクター
巨大分子の取り込み、そして細胞内への移動の非ウイルス性の遺伝子移入方法の多くが、真核細胞により用いられる正常機序による。好ましい実施態様において、本発明の非ウイルス性遺伝子送達システムは、目的のオボムコイド遺伝子発現制御領域の取り込み、そして標的細胞により作動可能に結合されるポリペプチドコード化核酸のエンドサイトーシス経路にある。例えば、この種類の遺伝子送達システムは、リポソーム輸送システム、ポリリジン接合、および人工ウイルスエンベロープを含む。
【０１２８】
代表的な実施態様において、本発明の新規単離オボムコイド遺伝子発現制御領域を含む核酸は、リポソームの表面を正に荷電させ（例えば、リポフェクチン）、そしてこれは、（必要に応じて）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体で標識される（Mizuno et al., NO Shinkei Geka 20:547 551 (1992)；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９１／０６３０９号；日本特許出願番号第１０４７３８１号；およびヨーロッパ特許公開番号ＥＰ  Ａ  ４３０７５号を参照）これら全てが、全体として、引用により本明細書に取り込まれる。
【０１２９】
同様の方法では、遺伝子送達システムは、ポリリジンのような遺伝子結合物質と架橋結合する抗体または細胞表面リガンドを含む（例えば、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９３／０４７０１、ＷＯ９２／２２６３５、ＷＯ９２／２０３１６、ＷＯ９２／１９７４９、およびＷＯ９２／０６１８０号を参照）これら全てが、全体として、引用により本明細書に取り込まれる。受容体仲介エンドサイトーシスを介しての目的の核酸構造物の有効な輸送が、エンドソーム構造物由来の遺伝子を回避する物質を用いて改善されることも認められる。例えば、アデノウイルスまたはＨＡ遺伝子産物の膜融合ペプチドは、送達システムの一部として用いられて、エンドソームを含有するＤＮＡの有効な分裂を誘導する（Mulligan et al., Science 260: 926 (1993); Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:7934 (1992);およびChristiano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:2122 (1993)を参照。これら全てが、全体として、引用により本明細書に取り込まれる）。本発明の新規単離オボムコイド遺伝子発現制御領域を含む組換えＤＮＡ分子が、遺伝子銃、マイクロインジェクション、２００２年９月２３日付けて出願されたＰＣＴ／ＵＳ０２／３０１５６（全体として、引用により本明細書に取り込まれる）に記載の精子仲介輸送、核輸送などによる方法を含む別の非ウイルス性の方法により、レシピエント細胞に運ばれることがさらに考慮される。
【０１３０】
遺伝子導入動物
本発明の別の態様は、本発明の新規単離オボムコイド遺伝子発現制御領域を含む導入遺伝子を含有し、好ましくは（必要に応じてだが）、動物の１以上の細胞で異種遺伝子を発現するニワトリのような遺伝子導入動物に関する。取り込まれた異種ＤＮＡを有する遺伝子導入トリの作成に適当な方法、例えば、細胞質インジェクションおよび前核インジェクションが、例えば、Rappらにより２００２年９月１８日付けで出願された、「Methods of Generating Transgenic Avians Using Microinjection into the Cytoplasm of an Avian Egg or Embryo」と名付けられた米国特許番号第１０／２５１，３６４号（これは全体として引用により本明細書に取り込まれる）に記載されている。
【０１３１】
本発明の様々な実施態様において、導入遺伝子の発現は、例えば、本発明のオボムコイド遺伝子発現制御領域に作用して、所望のパターンでの遺伝子発現を制御するシス作動性配列を利用して、特定のサブセットの細胞、組織、または発生期に制限される。組織特異的制御および条件付きの制御配列を用いて、ある空間的パターンで導入遺伝子の発現を制御できる。さらに、遺伝子発現の時間的パターンが、例えば、条件付きの組換えシステムまたは原核細胞の転写制御配列により提供される。
【０１３２】
それゆえ、本発明の１つの実施態様は、異種ポリペプチドをコード化し、そして必要に応じて、新規単離トリオボムコイド遺伝子発現制御領域に作動可能に結合する核酸インサートを含む、異種ポリヌクレオチド配列を有する遺伝子導入トリである。本発明の実施態様において、遺伝子導入トリは、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、走鳥類、観賞用のトリ、または野生のトリから選択される。本発明の別の実施態様において、遺伝子導入トリはニワトリである。
【０１３３】
本発明の遺伝子導入トリのさらに別の実施態様では、遺伝子導入トリは、配列番号：２６の核酸配列、またはその変性変異体を含むトリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む。
【０１３４】
本発明の遺伝子導入トリのさらに別の実施態様では、遺伝子導入トリは、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む。
【０１３５】
本発明の遺伝子導入トリのなおさらに別の実施態様では、ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ウイルス由来である。
【０１３６】
本発明の遺伝子導入トリの別の実施態様では、ポリペプチドコード化核酸インサートは、トリでのタンパク質発現に最適化されたコドン相補体を有する。
【０１３７】
本発明の遺伝子導入トリの別の実施態様において、遺伝子導入トリは、血清または卵白に異種ポリペプチドを産生する。本発明の遺伝子導入トリの別の実施態様において、遺伝子導入トリは、卵白に異種ポリペプチドを産生する。
【０１３８】
本発明は、例示の目的で提供され、制限されることを意図しない以下の実施例によりさらに例示される。本発明により引用される全引例、公開特許出願、および特許の内容は、全体として、引用により本明細書に取り込まれる。
【０１３９】
実施例１：オボムコイドプロモーターのＰＣＲ増幅
センスプライマー、ＯＶＩＮｓ２、５’−ＴＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＧＡＣＴＣＴＣＡＡＣＣＴＣＧＴ−３’（配列番号：１）およびアンチセンスプライマー、ＯＶＭＵａ２、５’−ＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＡＧＴＴＡＣＴＣＡ−３’（配列番号：２）を、ニワトリオボインヒビターエクソン１６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｍ１６１４１）の配列、およびニワトリオボムコイドプロモーター領域（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｊ００８９７）のフラグメントよりそれぞれ設計した。オボムコイドプロモーター領域のＰＣＲ増幅のための鋳型ＤＮＡを、White Leghornの血液から分離した。
【０１４０】
一連の異なるＰＣＲ条件を実施して、約１０．０ｋｂの産物の合成を最適化した。結果を図２に示す。該試験での鋳型ＤＮＡの濃度は、５００ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、または１０ｎｇであった。図３で示す２組のプライマー、ＯＶＩＮｓ１（配列番号：３）とＯＶＭＵａ１（配列番号：４）、またはＯＶＩＮｓ２（配列番号：１）とＯＶＭＵａ２（配列番号：２）、Ｍｇ２＋濃度（１．０ｍＭ、１．５ｍＭおよび２．０ｍＭ）、および５０℃〜７０℃のアニーリング温度を用いた。
【０１４１】
試験の結果を図２に示す。レーン１ないし８で示す様に、ＤＮＡ鋳型５００ｎｇ、ＯＶＩＮｓ１（配列番号：３）およびＯＶＭＵａ１（配列番号：４）プライマー、６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ９．１、１８ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｍＭ  Ｍｇ２＋、および５０℃〜５８℃の間のアニーリング温度での試験反応は、特異的ＤＮＡ産物を生じなかった。また、図２のレーン１７ないし２４で示す様に、ＤＮＡ鋳型１００ｎｇ、ＯＶＩＮｓ１およびＯＶＭＵａ１プライマー、６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ９．１、１８ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｍＭ  Ｍｇ２＋、および５０℃〜５８℃の間のアニーリング温度での試験反応では、特異的なバンドは見られなかった。しかしながら、図２のレーン９ないし１６で示す様に、ＤＮＡ鋳型５００ｎｇ、ＯＶＩＮｓ２（配列番号：１）およびＯＶＭＵａ２（配列番号：２）プライマー、６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ９．１、１８ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  Ｍｇ２＋、および６０℃〜６８℃の間のアニーリング温度での試験反応は、所望の長さである約１０ｋｂのバンドを生じた。レーン２５ないし３２で示す様に、ＤＮＡ鋳型１００ｎｇ、ＯＶＩＮｓ２（配列番号：１）およびＯＶＭＵａ２（配列番号：２）プライマー、６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ９．１、１８ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  Ｍｇ２＋、および６０℃〜６８℃の間のアニーリング温度である反応条件は、所望の産物の増加を生じた。
【０１４２】
従って、約１０ｋｂの産物を、以下の条件：最適ＤＮＡ鋳型濃度、約５０ｎｇ〜５００ｎｇ；プライマー、ＯＶＩＮｓ２（配列番号：１）およびＯＶＭＵａ２（配列番号：２）；Ｍｇ２＋濃度、２ｍＭ；アニーリング温度、約６０℃〜６８℃、またはその間を用いた場合に検出した。５０μｌのＰＣＲ反応液は、それぞれ、鋳型ＤＮＡ５０ｎｇまたは１００ｎｇ、各プライマー０．１μｇ、バッファーＢ（Elongase Enzyme Mix kit, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）５μｌ、１０μＭ  ｄＮＴＰ溶液１ｍｌ、および脱イオン蒸留水からなるものであった。ＰＣＲプロトコールは、９４℃３０秒、１サイクル；９４℃３０秒、６０℃３０秒、３０サイクル、そして６８℃１０分、であった。６８℃１０分、３５℃３０分を１サイクル行い、最終的に４℃で保った。ＰＣＲ産物を約０．６５％のアガロースゲル分析で調べた。
【０１４３】
実施例２：ＰＣＲ産物のクローニング
ＰＣＲ産物を標準的な方法で精製した。簡単に言うと、ＰＣＩ（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール、２４：２５：１）抽出、およびクロロホルム抽出を１回行った。２．５当量１００％エタノールと共に、３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を最終濃度０．３Ｍになるように加え、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡペレットを乾燥させて、脱イオン蒸留水に溶解し、続いてプライマーＯＶＩＮｓ２（配列番号：１）およびＯＶＭＵａ２（配列番号：２）を用いて、ＡＢＩ３７００自動シークエンサー（Applied Biosystems, Foster City, CA）で配列決定し、各ＰＣＲ産物の同一性を確かめた。同一性の確認後、約１０ｋｂのＰＣＲ産物を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、５’末端をリン酸化した。マングビーンヌクレアーゼにより、ＰＣＲ産物の末端から任意のオーバーハングアデニンを取り除き、それにより平滑末端を生じさせた。ＰＣＲ産物を、ＰＣＩ抽出およびクロロホルム抽出で精製し、そして標準的な方法で沈殿させた。続いて、該１０ｋｂの産物をＢａｍＨＩで切断し、それぞれ約４．７と約５．５ｋｂの２つのフラグメントとした。
【０１４４】
ベクタープラスミドpBluescript  ＩＩ  ＫＳ(+/-)を、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで切断し、ウシ腸由来アルカリホスファターゼで処理した。ベクターに結合されるべきＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法により分析し、ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ核酸精製キット（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）を用いて、アガロースゲルスライスから精製した。４．７ｋｂと５．５ｋｂのフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ処理したpBluescriptに挿入し、構造物ｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ４．７およびｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ５．５をそれぞれ得た。
【０１４５】
陽性クローンを、ＸｂａＩ／ＸｈｏＩ切断によりスクリーニングした。クローンｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ４．７は、約４．７ｋｂと２．９６ｋｂのフラグメントを生じた。クローンｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ５．５は、約５．５ｋｂと２．９６ｋｂのフラグメントを生じた。４．７ｋｂのインサートを有する明らかな陽性クローンを、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断し、０．５ｋｂ、４．２ｋｂ、および２．９ｋｂの３つのフラグメントとなるかをさらに確認した。約５．５ｋｂのインサートを有する明らかな陽性クローンを、ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ切断し、２ｋｂ、３．５ｋｂ、および２．９６ｋｂの３つのフラグメントとなるかをさらに確認した。
【０１４６】
pBluescript  ＫＳ  ＩＩ(+/-)ベクターにクローン化した１０ｋｂのＰＣＲ産物全長を含む、構造物ｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ−１０を、ｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ４．７プラスミドから、４．７ｋｂのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメントを採取し、ｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ５．５のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ切断部位に挿入することで、作成した。ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ切断末端を、２５℃で１５分間クレノー酵素およびｄＮＴＰ処理し、ＢａｍＨＩで切断した。
【０１４７】
実施例３：配列決定
プラスミドｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ４．７およびｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ５．５を、図１で示すように、各インサートの両末端から配列決定した。開始プライマーは、核酸配列５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：５）および５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ−３’（配列番号：６）をそれぞれ有するＴ７およびＴ３であった。図３に示す様に、次のプライマー（配列番号：７〜２５）を、利用可能となった配列の結果に従い設計した。約１０ｋｂの配列を編集し、Vector NTI SuiteのContigExpressソフトウエア、バージョン６．０（InforMax, Inc.）によりアセンブルした。ＢａｍＨＩ結合部を含む、上記実施例１で記載の約１０ｋｂのＰＣＲ産物領域を、プライマーＯＶＭＵａ９（配列番号：２７）およびＯＶＩＮｓ９（配列番号：２８）（図３で示す）を用いて配列決定した。
【０１４８】
それぞれの配列のクロマトグラムを配列の正確性について目視でチェックし、不明確な塩基の位置を決定した。不明確な塩基を含有する領域を、同じプライマーで、あるいは依然不明確なら、相補鎖の配列について設計した新たなプライマーで、再び配列決定した。プライマーＯＶＭＵａ９（配列番号：２７）およびＯＶＩＮｓ９（配列番号：２８）を用いての元々の１０ｋｂＰＣＲフラグメントの配列決定により、親フラグメントでかつＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントが介在しない核酸配列の全部を含む、プラスミドｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ４．７およびｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ５．５のサブクローン化インサートを、最終的配列である配列番号：２６に含むことが分かった。オボインヒビター遺伝子の３’末端とオボムコイドコード化領域の転写開始部位との間の領域配列（配列番号：２６）を、図４に示す。
【０１４９】
実施例４：１０ｋｂのオボムコイドプロモーターにより制御される、トランスフェクション培養トリ骨髄細胞および卵管細胞でのルシフェラーゼ発現
ｐ１０−ＯＭ−ｌｕｃ構造物
オボムコイドプロモーターの後で、かつオボムコイドコード配列の第２のＡＴＧとインフレームのコード配列の挿入を促進するため、２番目のＡＴＧと重なるＮｃｏＩ部位を、以下の様にＰｃｉＩ部位に換えた。上段は、翻訳開始部位の野生型オボムコイド配列である。下段は、２番目のＮｃｏＩ部位をＰｃｉＩ部位に換えたものである。
【０１５０】
【表１】
2005536984.tif 000002
【０１５１】
ｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ−１０のBluescript骨格のＰｃｉＩ部位を、ＰｃｉＩで切断し、クレノーポリメラーゼで平滑末端化し、再結合させることにより破壊した。隣接のプロモーター領域を、プライマーＯＭ−５（配列番号：２９）およびＯＭ−６（配列番号：３０）、および鋳型ｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ−１０でＰＣＲ増幅した。生じたＰＣＲ産物（配列番号：３１）をＮｏｔＩおよびＴｔｈ１１１Ｉで切断し、１２０５９ｂｐのｐＯＭ−１０−αのＮｏｔＩ−Ｔｔｈ１１１Ｉフラグメントにクローン化し、これによりｐＯＭ−１０−Ｐｃｉを作成した。ｇＷｉｚ−ルシフェラーゼ（Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, California）の１９６４ｂｐのＮｃｏＩ−Ｓ１−処理ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＯＭ−１０−Ｐｃｉの１２８２４ｂｐのＰｃｉＩ−ＳｍａＩフラグメントにクローン化し、ｐ１０−ＯＭ−ｌｕｃを作成した。
【０１５２】
プライマー配列
ＯＭ−５  ５’−ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＡＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＡＧＴＡＣＴＧＣＣＣ−３’（配列番号：２９）
ＯＭ−６  ５’−ＧＧＣＣＣＧＧＧＡＴＴＣＧＣＴＴＡＡＣＴＧＴＧＡＣＴＡＧＧ−３’（配列番号：３０）
【０１５３】
ＰＣＲ産物
ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＡＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＡＧＴＡＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＡＡＴＡＴＡＴＡＣＡＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＣＣＧＡＡＣＴＧＴＴＧＧＡＣＴＧＧＡＡＣＡＣＧＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＡＴＣＴＧＴＣＡＧＣＧＧＣＡＣＡＡＴＧＡＧＧＣＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＴＧＧＴＣＴＧＣＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧＣＡＡＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＧＣＴＴＧＡＧＡＣＡＡＧＴＧＴＣＡＣＡＴＧＣＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＧＡＣＴＴＴＴＧＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＣＴＴＡＡＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＧＡＡＣＣＣＴＡＡＡＴＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＧＣＴＧＡＧＧＧＧＡＧＴＡＡＧＧＧＡＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＡＴＴＣＧＴＣＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＡＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣＡＴＧＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＴＣＡＣＣＴＣＴＡＧＧＴＡＡＡＡＧＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＴＧＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＴＡＴＣＴＡＡＣＣＴＡＴＧＡＡＧＴＴＡＡＴＧＧＴＡＴＴＴＡＧＣＡＣＴＡＧＣＴＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＧＧＴＴＴＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＧＴＡＴＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧＴＡＧＡＡＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＣＡＡＧＧＴＡＡＡＴＧＣＴＧＴＣＡＡＡＴＡＣＣＡＣＴＡＡＡＡＡＴＧＴＣＡＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＴＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＣＣＴＡＧＴＣＡＣＡＧＴＴＡＡＧＣＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣ（配列番号：３１）
【０１５４】
オボムコイド配列の第１と第２のＡＴＧを下線で示す。オボムコイドコード配列は逆方きであることに注意されたい。下線のＡは野生型配列にはないが、オリゴＯＭ−５のエラーにより、ｐＯＭ−１０−Ｐｃｉに取り込まれた。
【０１５５】
ルシフェラーゼの発現
筒部由来でないトリ細胞での発現のためには、ニワトリ骨髄細胞株ＨＤ１１を用いた。細胞を、Beug, H., et al. (Chicken hematopoietic cells transformed by seven strains of defective avian leukemia viruses display three distinct phenotypes of differentiation. (1979) Cell, 18: 375-90、該細胞はＨＢＣＩ細胞として言及されている。これは、全体として引用により本明細書に取り込まれる。）に記載のように培養した。プラスミドＤＮＡを、製造元の指示に従い、リポフェクタミン２０００（Invitrogen Corporation, Carlsbad, California）でＨＤ１１細胞にトランスフェクションした。
【０１５６】
トランスフェクションの４８時間後、細胞を回収し、ペレットにした。上清を取り除き、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥ）２０ｍｌを加えた。細胞を−８０℃で凍結し、解凍した。細胞上清５ｍｌを、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ［登録商標］試薬（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ［登録商標］Luciferase Assay System, Promega, Madison, WI）２５ｍｌと混合し、１秒当たりの相対発光量をＢｅｒｔｈｏｌｄ検出システム（Oak Ridge, TN）ＦＢ１２ルミノメーターで測定した。
【０１５７】
結果を図６Ａに示す。ＨＤ１１細胞はＣＭＶプロモーターを許容し、オボムコイドプロモーターを若干活性化することができる。１０ｋｂのオボムコイドに結合するルシフェラーゼ遺伝子の発現が明らかである。
【０１５８】
トリ卵管細胞での発現のため、初代尿細管腺細胞を以下の様に単離した。ニホンウズラ（Coturnix coturnix japonica）の卵管を取り出し、筒部を細かく切り、３７℃で３０分間、振とうし、磨砕（titurating）することにより、０．８ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）および１．０ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN）で酵素的に分解した。続いて、細胞懸濁液を、滅菌した外科用ガーゼを通して濾過し、２００×ｇで遠心によりＦ−１２培地（Life Technologies, Grand Island, NY）で３回洗浄し、ＯＤ６００が約２となる様にＯＰＴＩＭＥＭ［登録商標］（Life Technologies）に再溶解した。細胞懸濁液８００μｌを、６ウェルディッシュの各ウェルにまいた。それぞれのトランスフェクションに対して、ＤＭＲＩＥ−Ｃリポソーム（Life Technologies）４．０μｌおよびプラスミドＤＮＡ２．０μｇを、室温で１５分間、ＯＰＴＩＭＥＭ［登録商標］２００μｌ中でインキュベートし、卵管細胞に加えた。ＤＮＡ／リポソームと共に細胞を、３７℃、５％ＣＯ２中で、約５時間インキュベートした。次に、１５％ウシ血清（ＦＢＳ）（Atlanta Biologicals, Atlanta, GA）、２×ペニシリン／ストレプトマイシン（Life Technologies）、５０ｎｇ／ｍｌインスリン（Sigma）、１０−７Ｍ  α−エストラジオール（Sigma）、１０−６Ｍ  コルチコステロン（Sigma）を添加した、ＤＭＥＭ（Life Technologies）２．０ｍｌを、各ウェルに加え、約４０時間インキュベートした。続いて、培養液を回収し、１１０×ｇで５分間遠心した。
【０１５９】
定量のため、細胞をラバーポリースマンで培地に移した。１ｍｌを、エッペンドルフチューブに移し、細胞をペレットにした。上清を取り除き、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥ）２０ｍｌを加えた。細胞を−８０℃で凍結して解凍した。細胞懸濁液５ｍｌを、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ［登録商標］試薬（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ［登録商標］Luciferase Assay System, Promega, Madison, WI）２５ｍｌと混合し、１秒当たりの相対発光量をBerthold検出システム（Oak Ridge, TN）ＦＢ１２ルミノメーターで測定した。
【０１６０】
結果を図６Ｂに示す。ルシフェラーゼの発現は、ＣＭＶおよび１０ｋｂのオボムコイドプロモーターより明らかである。オボムコイドプロモーターは、ＨＤ１１細胞（オボムコイドに対するＣＭＶの割合は２２２１である）中より、尿細管腺細胞（オボムコイドに対するＣＭＶの割合は１５２である）中のＣＭＶプロモーターと相関する活性を有する。
【０１６１】
実施例５：１０ｋｂのオボムコイドプロモーターにより制御される、トランスフェクション培養トリ骨髄細胞でのヒトインターフェロンα２ｂの発現
ｐ１０−ＯＭ−ＩＦＮ構造物
ＮｃｏＩ部位（ｐＣＭＶ−ヒトＩＦＮ−α−２ｂ−ＭａｇＭａｘ）にフランクするｐＡＶＩＪＣＲ−Ａ１３７．９１．１．２のＣＭＶプロモーター領域を、ｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ−４．４由来の１０５１ｂｐのＮｃｏＩ−ＮｃｏＩフラグメントで再び置き換え、これにより、ＩＦＮコード配列およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの前に１ｋｂのオボムコイドプロモーターを挿入し、ｐ１ｋｂ−ＯＭ−ＩＦＮＭＭを作成した。ｐ１ｋｂ−ＯＭ−ＩＦＮＭＭの１８１６ｂｐのＣｌａＩ−ＳａｃＩフラグメントを、ｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ−４．４の６２４５ｂｐのＣｌａＩ−ＳａｃＩフラグメントに挿入し、これにより、４．４ｋｂのオボムコイドフラグメントをＩＦＮコード配列と融合させ、ｐ４．４ＯＭ−ＩＦＮＭＭを作成した。ｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ−１０の８５１１ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐ４．４ＯＭ−ＩＦＮの５１４８ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントに結合し、これにより、ＩＦＮコード配列の前に１０ｋｂオボムコイドプロモーターを置き、ｐ１０−ＯＭ−ＩＦＮを作成した。
【０１６２】
インターフェロンの発現
ウズラ初代尿細管腺細胞を単離し、実施例４に記載の様に処理した。上清１００ｍｌを、ヒトインターフェロンα２ｂ量について、ＥＬＩＳＡ（PBL Biomedical Laboratories, Flanders, NJ）で分析した。結果を図７に示す。インターフェロンの発現は、ＣＭＶおよび１０ｋｂオボムコイドプロモーターより明らかである。
【０１６３】
本明細書で引用された引例は全て、全体として、引用により本明細書に取り込まれ、これは個々の刊行物、特許または特許出願が全体として引用により取り込まれるべきであると特別にかつ個々に示されたのと同程度の意図である。
【０１６４】
刊行物の引例は出願日より前に開示されたものであるが、本発明が先発明によりかかる公開に先行することができないと言うことを自認するものと解釈されてはならない。
【０１６５】
本発明の修飾およびバリエーションの多くが、本発明の精神と範囲から逸脱することなくなされ、このことは当該技術分野の技術者に明らかである。本明細書に記載の特定の実施例は例示のためだけに提示され、本発明は、添付の請求項の記載によってのみ、該請求項が権利化されるのと等しい範囲で制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】図１は、ＰＣＲ増幅ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析を示す。
【図２】図２は、プライマーの位置および向きを示す。
【図３】図３は、配列番号：１〜２５のＰＣＲプライマーを示す。
【図４ａ】図４は、配列番号：２６の核酸配列を示す。
【図４ｂ】図４は、配列番号：２６の核酸配列を示す。
【図４ｃ】図４は、配列番号：２６の核酸配列を示す。
【図４ｄ】図４は、配列番号：２６の核酸配列を示す。
【図５】図５は、１０ｋｂのオボムコイドプロモーターを示す。
【図６】図６は、プラスミドのトランスフェクション結果を示す。
【図７】図７は、プラスミドのトランスフェクション結果を示す。
【配列表】
2005536984.tif 000003
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2005536984.tif 000019
【図１】
2005536984.tif 000020
【図２】
2005536984.tif 000021
【図３】
2005536984.tif 000022
【図４ａ】
2005536984.tif 000023
【図４ｂ】
2005536984.tif 000024
【図４ｃ】
2005536984.tif 000025
【図４ｄ】
2005536984.tif 000026
【図５】
2005536984.tif 000027
【図６】
2005536984.tif 000028
【図７】
2005536984.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月27日(2004.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005536984000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月16日(2004.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２６の核酸配列を含むトリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む単離核酸。
【請求項２】
トリが、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、走鳥類、観賞用のトリ、または野生のトリからなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
トリがニワトリである、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
配列番号：２６と少なくとも７５％同一の配列を含み、作動可能に結合したヌクレオチド配列のトリ卵管細胞での発現を指揮する単離核酸。
【請求項５】
配列番号：２６と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
配列番号：２６と少なくとも９９％同一の配列を含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項７】
異種ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列に作動可能に結合するトリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む核酸。
【請求項８】
トリが、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、走鳥類、観賞用のトリ、または野生のトリからなる群から選択される、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
トリがニワトリである、請求項７に記載の核酸。
【請求項１０】
オボムコイド遺伝子発現制御領域が配列番号：２６の核酸配列を含む、請求項７に記載の核酸。
【請求項１１】
ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、請求項７に記載の核酸。
【請求項１２】
ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０ウイルス由来である、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
ヌクレオチド配列が、トリでのタンパク質発現に最適化されたコドン相補体を有する、請求項７に記載の核酸。
【請求項１４】
該ポリペプチドがインターフェロンα２ｂポリペプチドである、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
核酸インサートが免疫グロブリンサブユニットをコード化する、請求項７に記載の核酸。
【請求項１６】
細菌の複製起点またはウイルスの複製起点から選択される複製起点を含む、請求項７に記載の核酸。
【請求項１７】
プラスミドである、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
真核細胞のウイルスベクターである、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１９】
宿主細胞へ組み込まれる発現ベクターである、請求項７に記載の核酸。
【請求項２０】
異種ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列に作動可能に結合するトリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む核酸分子でトランスフェクションされた真核細胞、または該真核細胞の子孫を、該異種ポリペプチドの発現に適当な培地で培養すること、これにより該異種ポリペプチドを発現させることを含む、宿主細胞で該異種ポリペプチドを発現させる方法。
【請求項２１】
真核細胞がトリ由来である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
真核細胞がニワトリ由来である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
異種ポリペプチドを発現する、請求項１９に記載の発現ベクターでトランスフェクションされた真核細胞、または該細胞の子孫。
【請求項２４】
細胞がトリ細胞である、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項２５】
細胞がニワトリ細胞である、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項２６】
細胞がニワトリの卵管細胞である、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項２７】
細胞がウズラの卵管細胞である、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項２８】
細胞が培養細胞である、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項２９】
該異種ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列がトリでのタンパク質発現に最適化されたコドン相補体を有する、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項３０】
ヌクレオチド配列がインターフェロンα２ｂポリペプチドをコード化する、請求項２９に記載の真核細胞。
【請求項３１】
ヌクレオチド配列が免疫グロブリンまたはそのサブユニットをコード化する、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項３２】
異種ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列に作動可能に結合するトリオボムコイド遺伝子発現制御領域を含む核酸を含む、遺伝子導入トリ。
【請求項３３】
トリが、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、走鳥類、観賞用のトリ、または野生のトリである、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項３４】
トリがニワトリである、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項３５】
オボムコイド遺伝子発現制御領域が配列番号：２６の核酸配列を含む、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項３６】
核酸がポリアデニル化シグナル配列を含む、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項３７】
ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０ウイルス由来である、請求項３６に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項３８】
ヌクレオチド配列が、トリでのタンパク質発現に最適化されたコドン相補体を有する、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項３９】
核酸インサートがインターフェロンα２ｂポリペプチドをコード化する、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項４０】
血清または卵白に異種ポリペプチドを産生する、請求項３２に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項４１】
卵白に異種ポリペプチドを産生する、請求項４０に記載の遺伝子導入トリ。
【請求項４２】
ヌクレオチド配列が免疫グロブリンまたはそのサブユニットをコード化する、請求項４１に記載の遺伝子導入トリ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
本発明の別の実施態様において、単離核酸はニワトリから得られる。該実施態様において、単離核酸は、図４に示される配列番号：２６の配列、またはその変異体を有する。配列番号：２６は、実施例２で記載される様に、pBluescript  ＫＳ  ＩＩ(+/-)ベクターにクローン化され、ｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ−１０と名付けられた。ｐＢＳ−ＯＶＭＵＰ−１０は、ブタベスト条約の規定に基づき、２００２年１１月２６日にＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８２１として、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）に預けられた。
【国際調査報告】
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