(57)【要約】本発明は、固相微量採取法を使用して液体サンプルのサンプル準備を実施する際に使用される方法と装置に関するもので、試料を含む液体サンプルを固相材料が用意されたシリンジ胴部を有するシリンジ内に吸引し、前記液体サンプル内の試料が前記固相材料に吸収されるよう前記固相材料を通過して前記液体サンプルを流し、前記試料を液体溶媒により分析装置のインジェクタ内に直接抽出する各ステップから構成される。固相微量採取法を使用して液体サンプルのサンプル準備をするための装置は、内部でスライド移動可能なプランジャを備えたシリンジ胴部と、前記シリンジ胴部内に吸引される前記液体サンプルが通過するための前記胴部から延びる中空針とを有する。前記シリンジ胴部内には前記シリンジ内に吸引された液体サンプルと接触するよう固相材料が供給され、前記液体サンプルは前記針を通して前記シリンジ内に吸引される。
2005522670.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相微量採取法を利用して液体サンプルのサンプル準備を行うための方法であって、
−試料を含む液体サンプルを、固相材料（１０）を備えたシリンジ胴部（４）を有するシリンジ（２）内に吸引し、
−前記サンプル中の試料が前記固相材料に吸収されるよう、前記固相材料を通過させて前記液体サンプルを通し、
−液体溶媒により前記試料を分析装置（２０）のインジェクタ（２２）内に直接抽出すること、
の各ステップからなる方法。
【請求項２】
自動試料採取器（１２）を使用して前記サンプルが前記シリンジ（２）内に吸引される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固相材料（１０）が前記抽出ステップの前に洗浄される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が有機溶媒により抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
固相微量採取法を利用して液体サンプルのサンプル準備を行うための装置であって、
スライド移動可能なプランジャ（６）を内部に備えたシリンジ胴部（４）と、
前記シリンジ胴部内に吸引される前記液体サンプルが通過可能な、前記胴部から延びる中空針（８）と、を有し、
前記シリンジ（２）内に吸引された液体サンプルに接触するよう、固相材料（１０、１１、１３）が前記シリンジ胴部（４）内に提供されていることを特徴とする装置。
【請求項６】
前記固相材料が、前記シリンジ胴部（４）内の多孔性プラグ（１０）として提供されている、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記固相材料が、前記シリンジ胴部の壁内側のコーティング（１１）として提供されている、請求項５に記載の装置。
【請求項８】
前記固相材料が、前記シリンジ胴部（４）内部に供給されたフィルタのコーティング（１３）として提供されている、請求項５に記載の装置。
【請求項９】
前記固相材料（１０、１１、１３）が固体ポリマで作られている、請求項５から請求項８のいずれか一に記載の装置。
【請求項１０】
前記固相材料（１０、１１、１３）が液体ポリマで作られている、請求項５から請求項８のいずれか一に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相微量採取法（ＳＰＭＥ）を利用してシリンジ内の固相材料でオンラインのサンプル準備をするための方法に関する。本発明はさらに、固相微量採取法を利用してサンプル準備を行う装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
より高速でより効率的なサンプル事前処理方法の重要性はますます現実のものとなっている。ある研究により、実際のサンプル成分測定が分析時間の僅か７％であるのに対し、６０％以上をサンプル準備に費やされていることが分かった。固相採取法（ＳＰＥ：solid phase extraction）及び固相微量採取法（ＳＰＭＥ：solid phase microextraction）は、化学廃材がほとんど出ないことから目標となる試料（analyte）の分離と事前濃縮に対して特に魅力的な技術である。ＳＰＥとＳＰＭＥは、旧式の化学分析である液体−液体採取法（ＬＬＥ）と急激に置き換わりつつある。
【０００３】
ＳＰＥとＳＰＭＥの間の最も主要な差は、ＳＰＥが徹底採取、すなわちサンプルから限りなく１００％に近い試料を採取するのがゴールであるのに対し、ＳＰＭＥは平衡採取である。平衡が得られるに十分な採取時間が経過すると、さらなる採取時間の増加は採取される試料の量に影響しない。採取時間が結果に影響しなければ、採取技術は簡略化され、正確度が増す。
【０００４】
H. LordとJ. Pawliszynによる参照文献「Evolution of solid-phase microextraction technology」には、ＳＰＭＥの幾つかの実施例が示されている。ＳＰＭＥの伝統的なアプローチは、例えばシリンジの中空針内に搭載された繊維などの被覆繊維が使用される。例えば、吸収材又は安定相で被覆された融合シリカ繊維などの繊維は、サンプルを吸収し、有機試料を表面に濃縮する「スポンジ」として作用し、分析のためにガスクロマトグラフィの加熱されたインジェクタ上に移送することを可能にする。しかしながら、被覆繊維を使用するＳＰＭＥでは、例えば繊維がプラズマや尿などの複合体基質内で不安定になるなどの幾つかの不利な点がある。さらに、有機物溶媒中のサンプルは、繊維上のコーティングが有機溶媒に融ける虞があることから使用することができない。また、ＳＰＭＥのコーティングは高い熱安定性を有していなければならず、さもなければ安定相として使用することができない。繊維固相微量採取法による他の不利な点は、回収率が非常に低く、僅か約０．５−１０％の間であり、したがって感度が低い。加えて、６０分又はそれ以上の長い吸収時間と、５分にもなる長い取り除き時間が採取された溶質に対して必要であり、これは合計サンプル分析時間を長くしている。
【０００５】
米国特許第6,164,144号公報にＳＰＭＥ技術の他の実施例が開示されており、ここではＳＰＭＥを実施するための安定相がシリンジ針の内部表面に被覆されている。この方法は、まず中空針の前記被覆内部表面を、微量採取が可能となるに十分な時間だけ試料を含んだサンプルに接触させ、その後、前記針をクロマトグラフィ装置のインジェクションポートへ置き、流体流通手段を介してキャリアガスを流し、試料を前記被覆表面からインジェクションポートへ排出する助けをしている。米国特許第6,164,144号公報に開示された技術の不利な点は、前記コーティングが高い熱安定性を持つ必要があることであり、さもなければ安定相として使用することができない。また、安定相でメモリ効果を得るリスクがあり、これは定量分析を困難にし得る。さらにこの技術は、吸収された試料を流し出すのに加熱ガスが使用されるため、液体クロマトグラフ（ＬＣ）への適用はできず、これによって分析装置の使用はガスクロマトグラフ（ＧＣ）に制限されている。
【０００６】
前記試料が、例えばプラズマ、尿、環境起源のサンプルなどの複合基質内に存在する場合、このサンプル準備は分析にとって極めて重要である。サンプル準備の目的は、障害となるいかなる物質をも取り除き、試料を濃厚にすることである。前記手順は、目標となる試料の高い回収率を備えた再現性の高いものでなければならない。さらに、理想的なサンプル準備の方法は、最少の作業ステップ数からなり、これによって完全に自動化されなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、固相微量採取法を利用するサンプル準備のための改善された方法と装置を提供することにあり、ここでは前記固相材料はシリンジ胴部内に提供されており、いわゆるパックシリンジ（packed syringe）となる。この構造により、被覆繊維の固相材料内の不安定性問題と、被覆繊維が容易に障害をうける問題とが解消される。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、従来の方法及び装置よりも採取回収率が高いサンプル準備の方法と装置を提供することである。これにより、僅かなサンプル量であっても処理が可能となる。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、キャピラリ電気クロマトグラフィ（ＣＥＣ）を使用したサンプル分析に使用することができる方法と装置を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、各サンプル処理に対して非常に短い時間、すなわち１〜２分でサンプル準備を行う完全自動化された方法と装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様によれば、固相微量採取法を利用して液体サンプルのサンプル準備を行う方法が提供され、この方法は：
−試料を含んだ液体サンプルを、固体支持相を備えたシリンジ胴部を有するシリンジ内に吸引し、
−試料が前記固体支持相に吸収されるよう前記固体支持相に前記液体サンプルを通過させ、
−溶媒により前記試料を分析装置のインジェクタ内に直接抽出すること、
の各ステップを含んでいる。
【００１２】
好ましくは、前記サンプルは自動試料採取器を使用してシリンジ内に吸引される。
【００１３】
通常、吸収された試料は直接分析装置内に抽出されるが、もし必要であれば、前記固体支持相は前記抽出ステップの前に洗浄することができる。通常、サンプルがプラズマなどの複合基質から吸引されるときには洗浄ステップが必要である。前記洗浄ステップは、水を洗浄液として使用し、実施される。
【００１４】
好ましくは、前記試料はメタノールなどの有機溶媒によって抽出される。
【００１５】
本発明はまた、固相微量採取法を利用して液体サンプルのサンプル準備を実施するための装置を提供しており、この装置は、スライド移動可能なプランジャを内部に備えたシリンジ胴部と、液体サンプルが吸引されるよう前記胴部から延びる中空針とを有しており、ここで固相材料は、前記シリンジ内に吸引される液体サンプルと接触するよう前記シリンジ胴部内に提供されている。
【００１６】
前記固定相材料は、前記シリンジ胴部内の多孔性プラグとして提供されることが好ましい。
他の実施の形態では、前記固相材料は、前記シリンジ胴部の壁内側のコーティングとして提供される。
さらに他の実施の形態では、前記固相材料は、前記シリンジ胴部内に備えられるフィルタ上のコーティングとして具現化される。
さらに他の実施の形態では、固相材料で作られた薄い膜が前記シリンジ胴部内に提供される。
【００１７】
好ましくは、前記固相材料は、固体ポリマで作られている。
好ましくは、前記固相材料は、液体ポリマで作られている。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、目標となる試料の高い回収率での高速サンプル準備を可能とする。さらに、サンプル準備のための本方法と装置は、最少の作業ステップからなり、完全自動化される。
【００１９】
本発明の主たる利点は、高い回収率での高速サンプル準備が可能となり、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、キャピラリ電気クロマトグラフィ（ＣＥＣ）のいずれにも適用可能なことである。
【００２０】
本発明のさらなる利点は、パックシリンジ、すなわち固相材料を備えているシリンジが、百回にも及ぶ繰り返し使用が可能となることである。これは、シリンジ胴部内に配置される固相材料が容易且つ効果的に洗浄可能であることによる。
【００２１】
本発明にかかる上述した、並びに他の特性と利点は、請求の範囲に定義され、好ましい実施の形態を示す添付図面を参照して以下に詳細に説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
図１は、試料を含む液体サンプルからサンプル準備をするために使用される、固相材料１０を備えたシリンジ２を示す。前記シリンジは、胴部４と、プランジャ６と、針８とを備えている。前記針は、ゲルやコロイドなどの半固形サンプルの取り扱いも可能となるよう大きな内径を持つよう定められている。好ましい実施の形態では、前記固相材料は、多孔性のプラグ１０として前記シリンジ内に提供される。通常、前記シリンジは１００〜２５０μｌシリンジである。２５０μｌシリンジに対して好ましくは長さ約３ｍｍのプラグを形成するよう１〜２ｍｇの固相材料が使用され、シリンジ胴部内に導入される。前記固相材料は、好ましくはシリカベース材料、分子刷込みポリマ（molecular imprinting polymer）、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン・ジビニルベンゼンから構成される。
【００２３】
図２ａに示す他の実施の形態では、多孔性プラグとして設けられる代わりに、シリンジ胴部の内壁を固相材料のコーティング１１で被覆している。この胴部内側のコーティング１１は、シリンジ針から始まって１〜２ｃｍの幅に延びている。
【００２４】
図２ｂに示すさらに他の実施の形態では、固相材料がフィルタ材料上のコーティングとして提供されている。被覆されたフィルタ材料１３は、薄いディスク状にシリンジ胴部内に供給される。この実施の形態は、僅かなサンプル量しか得られない場合に有用であることが分かっている。フィルタを被覆する代わりに、固相材料の薄い膜を形成し、前記被覆フィルタと同様に使用されてもよい。
【００２５】
次に、図３、図４は、サンプル準備を実施するため自動試料採取器１２に配置されたシリンジ２を示す。図３において、前記自動試料採取器でサンプルがシリンジ針８によりサンプルトレイ１６にあるボトル又は容器１８からシリンジの胴部４へ吸引される。シリンジ内には１０〜２５０μｌの範囲で吸引可能であるが、５０μｌがシリンジ内に吸引する好ましい量である。液体サンプルが固相材料１０を通過すると、試料は当該固相に吸収される。通常、固相材料に液体サンプルを一回通過させるだけで十分である。しかしながらもし必要であれば、試料が固相に吸収されるまで液体サンプルを数回通過させてもよい。
【００２６】
抽出ステップの前に、サンプルから蛋白質や他の障害物質を取り除く必要があるかもしれない。特に、サンプルが水溶液中になければ、試料は抽出ステップ前に洗浄されなければならない。固相材料はその後、約５０〜１００μｌの水で一度洗浄され、全ての吸収された障害物質を除去する。
【００２７】
図４において、自動試料採取器１２のアーム１４は、シリンジ２をガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、キャピラリ電気クロマトグラフィ（ＣＥＣ）などの分析装置２０の入口ポート２２近傍へ移動させている。シリンジ２が分析装置２０の入口ポート２２に移動する直前に、メタノールなどの有機溶媒約５０μｌが試料を抽出するために使用される。もし多数のサンプル、すなわち１００以上の準備が必要であれば、幾つかのシリンジが自動試料採取器のアーム１４に搭載可能である。このため、２〜５個のシリンジを搬送するカセットが前記アームに搭載可能である。
【００２８】
本発明にかかるサンプル準備の技術を使用すれば、１０００μｌまでの多量のサンプルはもとより、１０μｌからの少ないサンプル量までをも処理することができる。さらに、９９〜１００％の高い採取回収率を得ることができる。通常、繊維ＳＰＭＥを使用したときの採取回収率は、大抵１〜１０％ほどである。
【００２９】
サンプルが抽出されると、シリンジ胴部内に供給された固相材料は、メタノールやアセトンなどの有機相を前記固相材料内に数回（５−７回）吸引することによって容易に且つ効果的に洗浄され得る。
【００３０】
本発明にかかるパックシリンジを使用したサンプル準備方法を、液体−液体採取法（ＬＬＥ）、固相採取法（ＳＰＥ）、繊維固相微量採取（繊維ＳＰＭＥ）などの他のサンプル準備方法と比較する調査を行った。調査結果を以下のテーブルに示す。
【００３１】
方法                  ロピバカイン    正確度      精度（ＲＳＤ％）  参考
Ropivacaine     Accuracy    Precision
（μＭ）        ％        （日中)                  
パックシリンジ／ＧＣ／ＭＳ    0.15          105          7.0
パックシリンジ／ＧＣ／ＭＳ    0.75          101          3.0
ＬＬＥ／ＧＣ−ＮＰＤ          0.10           96          5.7            (1)
ＬＬＥ／ＧＣ−ＭＳ            0.04          101          3.8
ＳＰＥ／ＬＣ−ＵＶ            1.90          101          3.0            (2)
繊維ＳＰＭＥ／ＧＣ−ＮＰＤ    0.16           98         17.1            (3)
繊維ＳＰＭＥ／ＧＣ−ＭＳ      0.08          110          6.3
(1) M.Engman、P.Neidnstorm、C.Norsten-Hoog、S-J.Winklund、U.Bondesson、T.Arvidsson、J. Chromatogr. B 709 (1998) 57-67
(2) T.Arvidsson、Y.Askemark、M.Halldin、Biomed. Chromatogr. 13 (1999) 286-292
(3) M.Abdel-Rehim、M.Andersson、E.Prtelius、C.Norsten-Hoog、L.G.Biomberg、J.Pharm. Biomed. Anal.、 Submitted.
ＧＣ−ガスクロマトグラフィ
ＬＣ−液体クロマトグラフィ
ＵＶ−紫外線検出
ＭＳ−マス分光計
ＮＰＤ−窒素燐検出器
【００３２】
上術した内容は、本発明を実施するための好ましい実施の形態の開示である。しかしながら、当業者には改造や変形を含んだ方策は明らかである。上術の開示は当業者が本発明を実施可能にするためになされたものであり、これによって限定されると解釈してはならず、このような改造や変形は本願発明の精神と範疇に含まれるものと解釈するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明にかかるサンプル準備を行うための固相材料を備えたシリンジを示す。
【図２ａ−２ｂ】図１に示すシリンジの他の実施の形態を示す。
【図３】図１に示すシリンジを、液体サンプル吸引のため自動試料採取器に接続した状態を示す。
【図４】図１に示すシリンジを、試料を分析装置内に抽出するため自動試料採取器に接続した状態を示す。
【符号の説明】
【００３４】
２．シリンジ、  ４．胴部、  ６．プランジャ、  ８．針、  １０．固相材料（多孔性プラグ）、  １１．固相材料コーティング、  １２．自動試料採取器、  １３．フィルタ材料、  １４．アーム、  １６．サンプルトレイ、  １８．ボトル（容器）、  ２０．分析装置、  ２２．入口ポート。
【図１】
2005522670.tif 000003
【図２ａ】
2005522670.tif 000004
【図２ｂ】
2005522670.tif 000005
【図３】
2005522670.tif 000006
【図４】
2005522670.tif 000007
【国際調査報告】
2005522670.tif 000008
2005522670.tif 000009