(57)【要約】金属で被覆したタンパク質ポリマーを提供する。貴金属触媒を用いて予め反応させておくことなく、無電界めっき法で、直径＜２０ｎｍの金粒子で被覆できるように、チュービュリンベースの微小管を調製するための新たな方法について説明する。金粒子の堆積については、懸濁液中または表面の微小管で起こり得る。金粒子コーティングおよびアニーリングのゴールドエンハンスメントによって、バルク金の抵抗率の数十倍のオーミック導電率が得られる。これらの方法は、他のタンパク質ポリマーにも適用できる可能性が高いものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーが単一の金属種でコーティングされている、単離された金属化タンパク質ポリマー。
【請求項２】
タンパク質ポリマーが、アクチン繊維、中間径フィラメント、フィブリン、コラーゲン繊維、シルクタンパク質、エラスチン、細菌のコートタンパク質、微小管、アビジン、ストレプトアビジン、免疫グロビン結合タンパク質、免疫グロビン、およびレセプタータンパク質よりなる群から選択される、請求項１に記載の単離された金属化タンパク質ポリマー。
【請求項３】
タンパク質ポリマーのアスペクト比が１０を超える、請求項２に記載の単離された金属化タンパク質ポリマー。
【請求項４】
タンパク質ポリマーの構造が管状である、請求項３に記載の単離された金属化タンパク質ポリマー。
【請求項５】
長さ１０ミクロン以下、外径約４ｎｍから約３０ｎｍ、そして内径約０ｎｍから約２０ｎｍである、請求項４に記載の単離された金属化タンパク質ポリマー。
【請求項６】
タンパク質ポリマーがチュービュリンを含んでなる、請求項５に記載の単離された金属化タンパク質ポリマー。
【請求項７】
タンパク質ポリマーのコーティングが断続的なものである、請求項１に記載の単離された金属化タンパク質ポリマー。
【請求項８】
タンパク質ポリマーのコーティングが連続したものである、請求項１に記載の単離された金属化タンパク質ポリマー。
【請求項９】
単一の金属種が、金、銀、白金、およびパラジウムよりなる群から選択される、請求項１に記載の単離された金属化タンパク質ポリマー。
【請求項１０】
微小管が金で連続的にコーティングされている、単離された微小管。
【請求項１１】
ａ）微小管の集団を提供し、
ｂ）固定剤が微小管に結合する固定剤で（ａ）の微小管を固定し、
ｃ）結合されなかった固定剤を除去し、
ｄ）（ｃ）の固定された微小管を還元剤の存在下で少なくとも１種の還元性金属塩と反応させ、金属塩の還元性金属で微小管をコーティングして金属化微小管を形成することを含んでなる、金属化微小管を合成するための方法。
【請求項１２】
ステップ（ｄ）の後に金属化微小管が任意に単離される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｄ）を１回以上繰り返し、同一または異なる金属で金属コーティングを強める、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
未結合の固定剤の除去が、希釈、洗浄、透析、遠心分離、および分離よりなる群から選択される方法によって達成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
微小管の集団が固体担体に固定化されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
微小管の集団が懸濁液中にある、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
固体担体が、ニッケルグリッド、ニッケルディスク、シリコンウェハ、炭素担体、アミノシラン処理シリカ、およびポリリジン被覆ガラスよりなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｄ）の金属化微小管が、任意に固体担体に固定化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
固体担体が、ニッケル、シリコン、炭素、置換ポリスチレン、アガロース、ニトロセルロース、ナイロン、アミノシラン処理シリカ、およびポリリジン被覆ガラスよりなる群から選択される材料を含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
固定剤が微小管を架橋するように作用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
固定剤が、ジアルデヒド、ケトアルデヒド、およびジケトンよりなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
未結合の固定剤が、希釈、洗浄、透析、遠心分離、分離、および急冷よりなる群から選択される方法によって除去される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
還元性金属塩が、金、銀、白金、およびパラジウムよりなる群から選択される金属塩よりなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
還元性金属塩が、ＨＡｕＣｌ４、ＡｇＮＯ３、Ｈ２ＰｔＣｌ６、およびＫ２ＰｄＣｌ４よりなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
還元剤が、ＮａＢＨ４およびアスコルビン酸ナトリウムよりなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
反応が完了する前に（ｄ）の反応を任意に終了させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の金属化タンパク質ポリマーを含んでなる導電性の相互接続部。
【請求項２８】
請求項１に記載の金属化タンパク質ポリマーを焼結させることを含んでなる方法によって製造される、金属ナノワイヤ。
【請求項２９】
請求項１に記載の金属化タンパク質を焼結させることを含んでなる、ナノワイヤを製造する方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の金属化タンパク質ポリマーを金増強することを含んでなる方法によって製造される、金属ナノワイヤ。
【請求項３１】
請求項１に記載の金属化タンパク質を金増強することを含んでなる、ナノワイヤを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本件出願は、２００２年８月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／４０４，８８７号の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明はナノテクノロジーの分野に関する。特に、ナノワイヤとして使用する目的で高アスペクト比の線状タンパク質ポリマーに金属をコーティングしている。
【背景技術】
【０００３】
集積回路密度を高めるために地道な努力がなされてきたが、電子デバイスや相互接続部の寸法の点で写真平板による手法の限界に達しており、可視光ならびにＵＶ光よりも波長を短くする試みがなされている（Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｏａｄｍａｐ  ｆｏｒ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒｓ、１９９９）。ＵＶ、Ｘ線、電子リソグラフの手法を極端に適用すれば分解能を改善できる可能性は高いが、これには相当なコストを伴うものと思われる。シリコンをベースにした従来の技術を補足する、あるいはこれに取って代わる新たな材料が提案されている。導電性の有機材料や、カーボンナノチューブまたは非シリコン半導体性材料で作られるナノワイヤが、これらの代替案の中で特に注目を集めている。フォトリソグラフィに代わる方法を模索する際にぶつかる大きな課題のひとつに、機能的な回路を得るにはデバイスおよび相互接続部を正確に配置できなければならない点がある。ひとつの手法として、この役割に生体分子を利用し、自然界における生物の細胞内で重要な分子の位置決めを担う自己組織化・自己決定手法を活用することがあげられる。モノマー単位を重合して高アスペクト比の構造体を形成できることから、本件出願にはＤＮＡや細胞骨格タンパク質などの分子が特によく適合する。また、これらの分子は他の分子が高い特異度で認識できるものでもある。こうした特徴はいずれも、分子をナノスケールの相互接続部にする上で望ましい条件である。
【０００４】
グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の存在下で重合されるα／β−チュービュリンヘテロ二量体から微小管が構成される。小管は一般に１３〜１５本の原繊維で構成され、α／βヘテロ二量体の線状ポリマーが頭−尾の形で配置されている（概要については、非特許文献１を参照のこと）。原繊維では、端と端、α−とα−、β−とβ−が会合し、外径２５ｎｍ、内径１４ｎｍ、長さは最大で数十ミクロンのチューブを形成する。チュービュリン（α−およびβ−が等モル）はウシの脳から大量に（グラム規模で）容易に単離および精製される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの重合は迅速であり、ポリマーの長さは懸濁媒体の組成、チュービュリン濃度、インキュベーション時間によって制御される。
【０００５】
酸化還元活性中心を含有する生体分子を除き、大半の生体分子では電子の移動が起こらない。この問題に対するひとつの解決策として、生体ポリマーを金属化し、ナノ電子デバイスを形成するか、あるいはナノ電子デバイスに連結できる可能性を秘めた二次元構造体および三次元構造体を形成できるようにするための方法を開発することがある。これらのポリマー分子は、元来または誘導体化後に、還元時に導電性の金属クラッドを形成する金属イオンに対する親和性を持つものである。このようにして金属化された生体分子には、脂質ミセル（非特許文献２）、（非特許文献３）、ラピドソーム（非特許文献４）、ＤＮＡ（非特許文献５）、微小管（非特許文献６）がある。
【０００６】
【非特許文献１】デサイ（Ｄｅｓａｉ），Ａ．およびミッチソン（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ），Ｔ（１９９７）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３、８３〜１１７
【非特許文献２】シュヌール（Ｓｃｈｎｕｒ），Ｊ．Ｍ．ら（１９８７）、Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ  １５２、１８１〜２０６
【非特許文献３】マルコウィッツ（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ），Ｍ．ら（１９９２）、Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ  ２２４、２４２〜７
【非特許文献４】パジランデフ（Ｐａｚｉｒａｎｄｅｈ），Ｍ．ら（１９９２）、Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  １、４１
【非特許文献５】ブラウン（Ｂｒａｕｎ），Ｅ．ら（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１、７７５〜８
【非特許文献６】キルシュ（Ｋｉｒｓｃｈ），Ｒ．ら（１９９７）、Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ  ３０５、２４８〜２５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
構造体を安定化させ、画像化するために、微小管などのナノスケールの構造体にそれぞれ金または白金などの金属をスパッタまたは堆積被覆することが従来技術において周知である。しかしながら、この方法では微小管を支持する表面を含む全体が金属で被覆されてしまう。導電性の経路を作るには、単離された微小管または他のナノスケールの構造体をその支持体とは独立に金属化する必要がある。
【０００８】
フリッチェ（Ｆｒｉｔｚｃｈｅ），Ｗ．ら（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９９、７５、２８５４〜２８５６）は、アルゴンイオンの光線によるエッチングから金表面を保護するマスクとして微小管を用いることについて説明している。ドライエッチング後、微小管があった場所にはゴールドメタルのバンドが残るのに対し、表面の残りは金のない状態になる。
【０００９】
それぞれＰｄ−Ｓｎコロイド溶液またはＰｄ（ＮＨ３）４Ｃｌ２を用いて細菌のラピドソーム（パジランデフ（Ｐａｚｉｒａｎｄｅｈ），Ｍ．ら、Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃｓ、１、第４１〜５０ページ、１９９２）および脂質ベースの小管微小構造体（シュヌール（Ｓｃｈｎｕｒ），Ｊ．Ｍ．ら、Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ、１５２、第１８１〜２０６ページ、１９８７、マルコウィッツ（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ），Ｍ．ら、Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ、第２４２〜７ページ、１９９３）を金属化し、まず表面に触媒部位のクラスターが形成された。次に、Ｎｉ、ＣｏまたはＣｕで小管を被覆して無電界金属めっき浴を形成した。ブラウン（Ｂｒａｕｎ）ら（Ｂｒａｕｎ、Ｅ．ら（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１、７７５〜８）は、２つの電極間にあるポリアニオンポリヌクレオチドにＡｇ＋イオンを結合させた後、ヒドロキノンで還元して導電性の銀ワイヤを得る、ＤＮＡの金属化について説明している。国際公開第９７／４８８３７号およびキルシュ（Ｋｉｒｓｃｈ），Ｒ．ら（Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ、１９９７、３０５、２４８〜２５３）は、Ｐｄ触媒を使用してＮｉまたはＣｏで微小管を金属化することについて説明しているが、この方法では金属の連続体を得るのに１０〜１５ｎｍの層を形成する必要がある。Ｎｉ被覆微小管は、あらかじめ構造化した金電極に微小管を接続する電子ビームリソグラフィ処理後に導電性であることが示された（フリッチェ（Ｆｒｉｔｚｃｈｅ）ら（１９９９）、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０、３３１〜３３５。
【００１０】
本願出願人らは、別の金属を用いる予備触媒ステップを伴うことなく、金属化したナノスケールの導電性タンパク質ポリマーを生成することによって、従来技術における問題を解決した。
【００１１】
発明の概要
本発明は、単一の金属種でポリマーをコーティングした、単離された金属化タンパク質ポリマーを提供するものである。好ましいタンパク質ポリマーはチュービュリンから得られる細胞骨格微小管であり、好ましい金属は金である。
【００１２】
もうひとつの実施形態において、本発明は、
ａ）微小管の集団を提供し、
ｂ）固定剤が微小管に結合する固定剤で（ａ）の微小管を固定し、
ｃ）結合されなかった固定剤を除去し、
ｄ）（ｃ）の固定された微小管を還元剤の存在下で少なくとも１種の還元性金属塩と反応させ、金属塩の還元性金属で微小管をコーティングして金属化微小管を形成することを含んでなる、金属化タンパク質ポリマーを合成するための方法を提供するものである。
【００１３】
もうひとつの実施形態では、本発明は、本発明の金属化タンパク質ポリマーを含んでなる導電性の相互接続部および金属ナノワイヤを提供するものである。
【００１４】
発明の詳細な記述
本発明は、主にナノワイヤを製造する目的でのタンパク質ポリマーの金属化に関する。また、タンパク質ポリマーを金属化するための新たな方法も開示する。
【００１５】
タンパク質ポリマーの金属化は、ナノスケールの電子デバイス、電界放射ディスプレイ、導電性コーティングの製造時に役立つものである。
【００１６】
本願明細書では以下の定義を使用し、特許請求の範囲を解釈するにあたって参照すべきものとする。
【００１７】
本願明細書において使用する場合、「タンパク質ポリマー」という用語は、アミノ酸で構成されるポリペプチドのポリマーを示す。本発明の典型なタンパク質ポリマーは微小管である。
【００１８】
「細胞骨格微小管」という用語は、真核生物細胞から単離されるチュービュリンベースのタンパク質ポリマーを示す。
【００１９】
「金属化される」という表現は、物質または材料を元素金属でコーティングすることを示す。本発明の文脈において、タンパク質ポリマーは連続的または間欠的のいずれかの方法で、さまざまな元素金属によって「金属化される」またはコーティングされる。
【００２０】
「単一の金属種」という用語は、単一の金属元素を意味する。
【００２１】
「アスペクト比」という用語は、タンパク質ポリマーの長さと幅の比を示す。
【００２２】
「固定剤」という用語は、タンパク質ポリマーのサブユニットを架橋させる機能を持つ物質を示す。
【００２３】
「導電性の相互接続部」という用語は二点間に導電性のブリッジを確立する材料を示す。
【００２４】
「ナノワイヤ」という用語は、少なくとも一寸法がナノメートル規模の導電性の相互接続部を意味する。
【００２５】
「ゴールドエンハンスメント（ｇｏｌｄ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」という用語は、すでに存在する金属表面に金の無電界めっきをほどこすことを示す。
【００２６】
金属化バイオポリマー
本発明は、単一の金属種をコーティングした金属化タンパク質ポリマーを提供するものである。本発明のタンパク質バイオポリマーには、金属を還元的な形で吸着するあらゆるタンパク質またはペプチドが含まれる。多数のタンパク質ポリマーが企図され、一例として、アクチン繊維、中間径フィラメント、フィブリン、コラーゲン繊維、シルクタンパク質、エラスチン、細菌のコートタンパク質および微小管などの構造タンパク質ならびに、アビジン、ストレプトアビジン、免疫グロビン結合タンパク質、免疫グロビン、レセプタータンパク質などの結合対のメンバとして機能し得るタンパク質があげられるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
特に好適なタンパク質ポリマーは、ロッド様または管状の形で高アスペクト比かつ線状の二次構造を有するものである。アスペクト比は少なくとも１０が好適であり、最大１０００までのアスペクト比が企図される。本願明細書において使用するのに好ましいタンパク質ポリマーは、チュービュリンで構成され、長さが約１０ミクロンの長さ以下であり、外径が約４ｎｍから約３０ｎｍ（約２５ｎｍが好ましい）、内径が約０ｎｍから約２０ｎｍ（約１４ｎｍが好ましい）のものである。
【００２８】
本発明の好ましいタンパク質バイオポリマーは微小管である。微小管は、直径約２５ナノメートル、長さがミクロン範囲の真核生物細胞の円筒形中空小管である。微小管は、α−およびβ−チュービュリンヘテロ二量体サブユニットが長手方向に会合した原繊維からなるものである。原繊維は端と端で会合して微小管となる。チュービュリンについては、多くの真核生物細胞から単離することが可能である。哺乳類の脳に見られるものなどの神経組織が、特に豊富なチュービュリン源である。ウシの脳組織から得られるチュービュリンは非常に豊富であり、容易に精製され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで微小管を形成するための重合も簡単である。しかしながら、微小管は容易に解重合し得るものであるため、その完全な状態を保つにはさまざまなキャッピング剤や安定化剤が必要である。チュービュリンを単離、精製、調製するための方法が、ミッチソン（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ）ら（基本方法を参照のこと）、シェランスキ（Ｓｈｅｌａｎｓｋｉ），Ｍ．Ｌ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７０、３、１９７３、７６５〜７６８）およびマーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ），Ｄ．Ｂ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１、６、１９８６、２３１９〜２３２４）によって説明されている。
【００２９】
本発明のタンパク質ポリマーは、貴金属または重金属金、白金、パラジウムおよび銀をはじめとする多種多様な金属で金属化できるものである。本発明の金属化タンパク質ポリマーについては単一種の元素金属でコーティングするのが普通であるが、複数の金属を組み合わせることも可能である点は当業者であれば理解できよう。コーティング方法に応じて、タンパク質を金属中で連続的にコーティングしてもよいし、間欠的な形でコーティングしてもよく、連続コーティングが好ましい。本発明の好ましい金属化タンパク質ポリマーは、金の連続コーティングを有するチュービュリンで構成される微小管である。
【００３０】
金属化タンパク質ポリマーの合成
本願出願人らは、金属化タンパク質ポリマーを合成するための新たな方法を提供する。一般的な反応では、従来技術において周知の方法（基本方法で説明するような、ミッチソン（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ），Ｔ．ら）で、単離されたチュービュリンから微小管を得る。続いて、微小管を架橋させる機能を果たす固定剤と得られた微小管とを接触させ、解重合に対する微小管の安定性を増すと同時に金属堆積のための表面の反応性を高める。好適な固定剤としては、グルタルアルデヒドなどのジアルデヒド、ケトアルデヒドおよびジケトンがあげられるが、これに限定されるものではなく、グルタルアルデヒドが好ましい。ここで、一方の端しか結合されていないグルタルアルデヒドは反応性の遊離アルデヒド基を含み、これがゆえにタンパク質ポリマー表面への還元による金属堆積を促進する穏やかな還元剤として機能することができる点に注意されたい。したがって、架橋官能性を有し、かつ反応性の遊離アルデヒド基を有する他の固定剤も好ましい固定剤になるであろうと思われる。一般に、微小管との反応後に未反応の余分な固定剤を除去するが、これは希釈や急冷、洗浄、透析、遠心分離、分離などの常法で行うことのできるものである。
【００３１】
タンパク質ポリマーのバルク（ｂｕｌｋ）金属化用の金属を、還元性金属塩の形で提供する。この金属塩を好適な還元剤の存在下で固定化タンパク質ポリマーと接触させ、タンパク質の表面に元素金属を堆積させる。好適な還元性金属塩としては、金、銀、白金およびパラジウムを含むがこれに限定されるものではない貴金属の金属のあらゆる塩が含まれるが、ＨＡｕＣｌ４、ＡｇＮＯ３、ＨＰｔＣｌ６、ＣｕＮＯ３およびＫ２ＰｄＣｌ４の各塩が好ましい。貴金属を還元するのに有用な還元剤は従来技術において周知であり、本発明に適する非限定的なリストにはＮａＢＨ４とアスコルビン酸ナトリウムが含まれる。
【００３２】
一般に、金属化反応を従来技術において周知の方法（希釈、急冷、洗浄、透析、遠心分離、分離、酸化剤の添加など）で終了させる。タンパク質ポリマーでの金属化レベルを高めると望ましい場合は、任意に、還元による金属化のステップを繰り返してさらに多くの金属をタンパク質に付加することが可能である。あるいは、他のゴールドエンハンスメント法によって別の金属を付加しても構わない。ゴールドエンハンスメントのプロトコールでは、すでに存在する金属表面に金属を無電界めっきする。ゴールドエンハンスメントの材料および方法は市販されており、たとえば、ゴールドエンハンス（ＧｏｌｄＥｎｈａｎｃｅ）のＥＭ溶液（カタログ番号２１１３、ナノプローブズ・インコーポレイテッド（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ヤップハンク（Ｙａｐｈａｎｋ）を参照のこと。
【００３３】
本発明のタンパク質ポリマーについては、懸濁液中で金属化してもよいし、固体担体への固定または固定化後に金属化しても構わない。固定化には、金属化工程の後で金属化タンパク質を容易に洗浄できる利点があり、懸濁液中で生成したものよりも数段線状でもつれの少ない金属化ポリマーを生成することができる。微小管の固定化に適した固体担体は従来技術において周知であり、ニッケルグリッドまたはディスク、シリコンウェハ、炭素担体、アミノシラン処理シリカ、ポリリジン被覆ガラスがあげられる。
【００３４】
あるいは、導電性の相互接続部などを構成するのであれば金属化しておいたポリマーをパターン状に担体に固定化してもよい。金属化ポリマーの固定化に適した担体としては、ニッケルグリッドまたはディスク、シリコンウェハ、炭素担体、合成ポリマー担体、置換ポリスチレン、ビーズ、アガロース、ニトロセルロース、ナイロンならびに、アミノシラン処理シリカおよびポリリジン被覆ガラスがあげられるが、これに限定されるものではない。好ましい実施形態では、Ｎｉディスク、ＴＥＭグリッドおよび電極などのニッケル表面に微小管を結合させる。
【００３５】
また、金属化タンパク質ポリマーをさらに修飾し、ナノ回路および他のナノデバイスに利用できるようにしてもよい。たとえば、金属化タンパク質を高温まで加熱（焼結）してタンパク質の足場を除去し、堆積した金属をなお一層完全に融合させて、それまでよりも強度が高く連続性のあるワイヤを形成してもよい。もうひとつの例に、ナノプローブズ・インコーポレイテッド（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）［ニューヨーク州ヤップハンク（Ｙａｐｈａｎｋ）］（ゴールドエンハンス（ＧｏｌｄＥｎｈａｎｃｅ）のＥＭおよびＨＱ  ＳｉｌｖｅｒおよびＬＩ  Ｓｉｌｖｅｒ）が提供しているものなどの金または銀補充（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）溶液を使用することがある。
【００３６】
導電性の相互接続部
本発明の金被覆微小管は金属質の（オーミック）挙動を呈することが分かっており、非線形のＩ−Ｖ特性を示すように適合させることができる。これらの挙動は、金属化微小管を相互接続部および実際の電子デバイス（スイッチ、ロジックゲートなど）の両方として使用するのに役立つものである。金属質の場合、微小管はナノメートル規模の電子デバイス同士を連結させ、高密度電子回路の製造を可能にし得るものと思われる。隣接する微小管間の距離を両者間の電位差によって制御可能な形で金属質の微小管をクロスに並べてアレイ化した後、このアレイをリーバー（Ｌｅｉｂｅｒ）ならびにその共同研究者ら（ルーキーズ（Ｒｕｅｃｋｅｓ）Ｔ．ら（２０００）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９、９４〜９７）がカーボンナノチューブで提案しているものに近い不揮発性メモリデバイスとして利用できるものと思われる。非線形の導電性微小管は、スイッチ、増幅器あるいはロジックゲートとしてそのまま利用可能な３端子ゲートデバイスでの用途が見込まれるものである。金属化微小管の金粒子を有機半導体と連結することで、たとえば、負性微分抵抗を呈する２端子スイッチングデバイス（ファン（Ｆａｎ）ら（２００２）ＪＡＣＳ  １２４、５５５０〜５５６０など）を開発することが可能になることがある。他の考え得る用途として、電界放出ディスプレイデバイスの放出点源ならびに、導電性コーティング中の導電性成分としての用途があげられる。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示目的であげたものにすぎない点を理解されたい。当業者であれば、上記の説明および以下の実施例から本発明に不可欠な特徴を把握することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を施してこれをさまざまな用途および条件に合わせることができる。
【００３８】
基本方法
特に明記しない限り、試薬はいずれもアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）から購入し、それ以上精製することなく使用した。
【００３９】
略号の意味は以下のとおりである。「ｈ」は時間（単数または複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数または複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（単数または複数）を意味し、「ｄ」は日（単数または複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。「ＰＩＰＥＳ」：ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス［２−エタンスルホン酸］。「ＥＧＴＡ」：エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸。「ＧＴＰ」：グアノシン三リン酸。「ＰＣ」：ホスホセルロース。「ＩＢ」：インジェクションバッファ。
詳細については後述する、ハーバード大学のＴ．ミッチソン（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ）の方法およびプロトコールに従って、再利用チュービュリンの調製と大規模チュービュリンの調製を行った。
【００４０】
チュービュリンの再利用
ホスホセルロース（ＰＣ）カラム後に再利用チュービュリン画分を−８０℃で保管し、日常的に使用できるように少量のアリコートで保管した。再利用チュービュリンは主に、遊離ＧＴＰのない状態でインジェクションバッファ（ＩＢ）内で保管した。
【００４１】
Ｉ．溶液＆備品
・５×ＢＲＢ８０：（１×＝８０ｍＭ  Ｋ−Ｐｉｐｅｓ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、ＫＯＨでｐＨ６．８；５×ＢＲＢ８０ストックを４℃で保管）
・１０×ＩＢ：５００ｍＭ  Ｋ−グルタミン酸塩、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、（１×のｐＨ  〜７．０、１０×ストックを−２０℃で保管、クッション：１×ＢＲＢ８０（温＝３７℃）中、６０％グリセロール
・１００ｍＭ  ＧＴＰ
・グリセロール
・Ｓｍａｌｌ  Ｄｏｕｎｃｅ（２ｍｌ）
・５０．２Ｔｉローター（温＝３７℃）
・ＴＬＡ１００．２または１００．３ローター（冷＝２〜４℃）
【００４２】
ＩＩ．再利用プロトコール
１．３−４  ３ｍｌのＰＣカラム画分を３７℃で解凍。氷上に移し、５０ｍｌ円錐（ｃｏｎｉｃａｌ）で混合。
２．チュービュリンのアリコートがＣＢ（５０ｍＭ  Ｋ−Ｐｉｐｅｓ、ｐＨ６．８；１ｍＭ  ＥＧＴＡ；０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中にある０．５×、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＧＴＰにＢＲＢ８０を加える。よって、緩衝液の最終組成は、９０ｍＭ  Ｋ−Ｐｉｐｅｓ、ｐＨ６．７、１．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、４．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＧＴＰ。かきまぜて混合し、氷上にて５分間保管。
３．３７℃に移す。２分後、グリセロールの半量を添加する。静かにボルテックスしてグリセロールを混合する。３７℃で４０分間インキュベートする。
４．５０．２Ｔｉ（または等価な）チューブ２本で温めたクッション（１０〜１４ｍｌ）上に層を形成する。５０．２ローターにて３５℃で４０Ｋ、４５分間スピンする。
５．試料を吸引し、温めたＩＸ  ＩＢで試料クッション界面を２〜３回洗浄する。チュービュリンペレットを完全に吸引し、温めた１×ＩＢで２×洗浄して、残留グリセロールをすべて除去する。これはペレットを３７℃の浴中に保持したまま行う。温めたＩＢをチューブのほぼ半分（洗浄側およびペレット壁）まで充填した後、吸引して繰り返す。
６．氷冷した１〜２ｍｌのＩＢ（厳密な容量はカラム画分中のチュービュリンの濃度と重合性とに左右される）にペレットを再懸濁させる。ＩＢ中のペレット塊を氷冷した加圧細胞破砕液（ｄｏｕｎｃｅ）２ｍｌに移す。氷上で静かに加圧細胞破砕し、塊を破壊する。氷上で３０分間インキュベートする。この冷却解重合の間、２分〜３分ごとに静かに加圧細胞破砕を続ける。緩徐な音波処理を用いてペレットを破壊することも可能である。
７．ＴＬＡ１００．２またはＴＬＡ１００．３ローターにて２℃で１０分〜１５分間９０Ｋでスピンし、解重合混合物を清澄化する。
８．上清を氷上にて回収し、ＩＢ中１／１００希釈液のＡ２８０を測定する。２８０ｎｍでの消散係数１１５，０００Ｍ−１ｃｍ−１を用いてチュービュリンの濃度を算出する。１０〜５０μｌのアリコートに入れて液体窒素中にて凍結させ、８０℃で保管する（注：１ｍｇ／ｍｌチュービュリン＝１０μＭ）。
【００４３】
チュービュリンの大規模調製
ウシ／ブタの脳から２サイクルの重合／解重合を行ってチュービュリンを精製した後、ホスホセルロース（ＰＣ）カラムで同時精製タンパク質を除去する。ここで説明する手順は、チュービュリン１〜４グラムが得られる大規模プレップ（１０メウシ脳）についてのものである。
【００４４】
Ｉ．チュービュリンプレップの概要
１．髄膜、脳幹、血塊を除去し、脳を秤量してブレンダーにて均質化する
２．ホモジネートを清澄化し、上清を１回目の重合サイクルに用いる
３．１回目のサイクルのポリマー画分を遠心分離により回収する
４．０〜４℃での均質化を行って１回目のサイクルのポリマーを解重合する
５．解重合混合物を清澄化し、上清を２回目の重合サイクルに用いる
６．２回目のサイクルのポリマー画分を遠心分離により回収する
７．０〜４℃での均質化を行って２回目のサイクルのポリマーを解重合する
１４．解重合混合物を清澄化し、上清をＰＣカラムに仕込む
１５．ＰＣカラムからの流出物（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）を回収し、等分し、−８０℃で冷凍する
【００４５】
ＩＩ．緩衝液＆ヌクレオチド
ＰＢ（Ｐｉｐｅｓ／重合緩衝液）：０．１Ｍ  Ｋ−Ｐｉｐｅｓ、ｐＨ６．８、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＡＴＰ。涼しい部屋で８リットル必要（プレップ開始直前にＡＴＰおよびＢＭＥを添加）ＣＢ（カラム緩衝液）：５０ｍＭ  Ｋ−Ｐｉｐｅｓ、ｐＨ６．８；１ｍＭ  ＥＧＴＡ；０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２。ＰＣカラムＣＢ＋１Ｍ  ＫＣｌの平衡、泳動、保管に２５リットル以内必要：ＰＣカラムの予備洗浄および溶出に１０リットル以内必要
【００４６】
１０×ＣＢ１Ｌを生成するには：
１５１．２グラムのＰＩＰＥＳ、遊離酸
３．８グラムのＥＧＴＡ
２ｍｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ２
ＫＯＨでｐＨをｐＨ６．７５にし、最大１リットルまで
１×でのｐＨが６．７であることを確認。１０〜１２の脳プレップ用に１０×ＣＢ３．５リットルを生成。
ＧＴＰ：シグマ（Ｓｉｇｍａ）タイプＩＩＳ−＃Ｇ−８７５２
ＡＴＰ：シグマ（Ｓｉｇｍａ）グレード１−＃Ａ−２３８３
グリセロール：あらかじめ３７℃まで温めて２〜３Ｌ（３７℃のインキュベータで一晩保管）
【００４７】
ＩＩＩ．１Ｌのホスホセルロース（ＰＣ）カラムを注ぐ
樹脂：ファットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）  Ｐ１１セルロースホスフェート−繊維状陽イオン交換体（ＰＣ１グラムが充填樹脂（ｐａｃｋｅｄ  ｒｅｓｉｎ）約４ｍｌまで増える）
概要：１Ｌのカラムを注ぐには、まず２２０グラムの乾燥樹脂を４４グラムずつ５つのアリコートに分けたものから始める。各アリコートを後述するようにして２Ｌ容のビーカーにて酸／塩基で処理する。この樹脂をプラスチック／ガラス棒で静かに攪拌し、樹脂を２Ｌ容のビーカー内に懸濁させた後、レジング（ｒｅｓｉｎｇ）を重量によって５分で硬化させる。標準の酸／塩基サイクリングプロトコールで樹脂を画定する。酸／塩基処理後、樹脂を十分に洗浄し、充填し、ＢＳＡで処理して不可逆的結合部位をブロックし、使用できるように平衡化させる。
【００４８】
溶液＆備品
ホスホセルロース２２０グラム
０．５Ｎ  ＮａＯＨ  ５Ｌ
０．５Ｎ  ＨＣｌ  ５Ｌ
０．５Ｍ  Ｋ−ホスフェート、ｐＨ６．８  １３Ｌ
ｄｄＨ２０  ５Ｌ
２Ｌ容のビーカー５つ
ＣＢ＋１Ｍ  ＫＣｌ  １２Ｌ
ＣＢ  ２０Ｌ
３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡをＣＢ（濾過）に入れたもの３００ｍｌ
１〜１．５Ｌの清潔なカラムハウジング
攪拌棒２本
大きなトラップのあるアスピレータ２台
蠕動ポンプ
蠕動ポンプの入口として１０ｍｌのプラスチックピペット
【００４９】
カラム調製手順
１．０．５Ｎ  ＮａＯＨを１Ｌ、５×２Ｌ容のビーカーに注ぐ。ＰＣが湿ってスラリーが出るまで棒で静かに攪拌しながらＰＣ４４グラムを各ビーカーに注ぐ。室温で５分間放置
２．細粒を含む上清を吸引して取り出し、０．５Ｍ  Ｋ−ホスフェート１Ｌをすみやかに加えて中和し、棒で静かに混合する。ｐＨが７以内であることを確認し、５分間放置する。
３．上清を吸引して取り出し、ｄｄＨ２０を１Ｌ加え、沈殿した樹脂を静かに攪拌して再懸濁させる。
４．樹脂を沈殿させる。
５．上清を吸引して取り出し、０．５Ｎ  ＨＣｌを１Ｌ加え、静かに攪拌して再懸濁させ、５分間待つ。
６．上清を吸引して取り出し、０．５Ｍ  Ｋ−ホスフェート１Ｌを加え、攪拌してｐＨが７であることを確認する。
７．樹脂が沈殿した後、上清を吸引し、すべての樹脂を４Ｌ容のビーカーに入れる。残りの０．５Ｍ  Ｋ−ホスフェートを使用し、再懸濁、沈殿、上清の吸引によって樹脂を洗浄する。
８．３×１ＬのＣＢ＋１Ｍ  ＫＣｌを７で行ったようにして洗浄する。
９．涼しい部屋で、再懸濁させた樹脂をカラムハウジング（内径５ｃｍのハウジングで約５０ｃｍの高さにマークのあるもの）に注ぎ、底からポンプ吸引によって充填する（すなわち蠕動ポンプが緩衝液をカラムの底から「吸い出し」、これを廃棄物用の壺（ｗａｓｔｅ  ｊｕｇ）にためていく）。充填については断面積４５ｍｌ／時間／ｃｍで行う。直径５ｃｍのカラムの場合、これは８８０ｍｌ／時間以内または１４．５ｍｌ／分以内となる。樹脂を充填した後、上からのポンプ吸引に切り替える。カラムに５〜１０ｍｌ／分でＣＢ＋１Ｍ  ＫＣｌを７Ｌ通す。
１０．ＣＢを１０Ｌで洗浄する。導電性を調べ、ＫＣｌがすべてなくなったことを確認する。塩の洗浄時に樹脂が膨張する場合があるため、樹脂床に大きな緩衝液ヘッドがあるかどうかを確認する。
１１．３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ３００ｍｌ（画分Ｖ；濾過済み）をＣＢに仕込み、続いてＣＢ７００ｍｌでカラムを停止させる。カラムを２時間攪拌したままにし、この間に樹脂上の不可逆的結合部位をＢＳＡでブロックする−これは、カラムを最初に使うときにチュービュリンの損失防止のため極めて重要である。
１２．ＣＢ＋１Ｍ  ＫＣｌを２Ｌでカラムを洗浄し、不可逆的に結合しなかったＢＳＡを溶出させる。
１３．ＣＢを１０Ｌでカラムを洗浄する。これでカラムが使用できる状態になる。
【００５０】
ＩＶ．脳
新鮮な脳を手に入れることが不可欠である。冷凍した脳ではチュービュリンの調製がうまくいかない。取り出したばかりの脳を、氷を充たしたクーラーに入れて取り出しから１〜２時間以内で実験室まで運んだものが好ましい。
【００５１】
Ｖ．遠心装置＆ローター
ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）  ＲＣ−５Ｃまたはこれと等価な低速遠心装置６台
ＧＳＡまたはこれと等価なローター（冷）６台
ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）超遠心装置４台
タイプ１９のローター（温）４台
タイプ３５のローター（温）２台
タイプ４５のＴｉローター（冷；冷たい状態で１回使用した後に温める必要がある）２台
タイプ５０．２のＴｉローター（冷）１台
冷＝４℃（涼しい部屋に一晩放置）
温＝３７℃（ローターを３７℃に設定した大きな細胞用振盪機に一晩入れておく）
【００５２】
ＶＩ．プロトコール
１．涼しい部屋で、髄膜（脳を囲んでいる膜；脳の表面を「拭う」のにペーパータオルを使用して行うのが最も良い）、血塊、脳幹を取り出す；脳を秤量し、同容量のＰＢを用いてウェアリング（Ｗａｒｉｎｇ）ブレンダーで３×１５均質化する。
２．ホモジネート（８〜９リットル以内）を回収し３６本のＧＳＡボトルに移し、ＧＳＡローターで４℃にて９０分間１２Ｋでスピンする。
３．上清を回収し、１リットルを３７℃のグリセロール５００ｍｌの入った１．８Ｌ容のガラス製のファーンバッハ（Ｆｅｒｎｂａｃｈ）フラスコに移す。０．１ｍＭ  ＧＴＰ、０．５ｍＭ  ＡＴＰ、３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加える（これにより、最終的に０．１ｍＭ  ＧＴＰ、１．５ｍＭ  ＡＴＰ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２が得られる）。ＡＴＰおよびＧＴＰは固体で加える。フラスコを温水を充填したシンク内に保持し、一定速度でかき回して固形分を溶解させ、グリセロールに混合させる。３７℃の浴に移し、清潔な温度計を使って混合物の温度を監視し、試料の温度が３２℃に達してから６０分重合させる。大きな湯（温度５０℃以内）タンク内でフラスコを回転させれば、３７℃に近付くのを加速することができる−この場合、熱を等しく分散させるために一定速度での回転が不可欠であり、混合物が加熱されすぎないように慎重に行う必要がある。
４．重合混合物をタイプ１９のボトルに移し、４台のタイプ１９のローターで３５℃にて１９Ｋで２．５時間スピンする。必要に応じて、さらにタイプ３５を１７．５Ｋで２．５時間使用する。スピンの最後で、遠心装置を４℃に設定する。
５．デカントし、上清を廃棄する。涼しい部屋で、ゼラチン状のペレットをＰＢに再懸濁させて最終容量が７００〜８００ｍｌ以内になるようにする。３本のチューブで４０〜５０ｍｌ以内の量を使用し、プラスチック製のスクレーパを使って各チューブからペレットを連続的に取り出し、ゼラチン状の大きなペレットの大半を取り出した後ですべてのチューブを必ず１回または２回洗浄するようにする。ペレット塊の再懸濁液を均質化するために、ヤマト（Ｙａｍａｔｏ）「ｐｏｕｒ−ｔｈｒｏｕｇｈ」連続流ホモジナイザを使用する−これは、モータ付きテフロン乳棒を漏斗形のガラス容器に送る装置である。一番上に注がれた混合物が容器の中程を移動する際に乳棒で均質化され、底から出てくる。再懸濁液が総容量７００〜８００ｍｌ以内の滑らかな黄色の液体になるまでペレット塊を「ヤマト（Ｙａｍａｔｏ）」する。すべてのペレットの均質化後、氷上にて３０分以内で解重合し、この間３〜５分に１回「ヤマト処理（Ｙａｍａｔｏｉｎｇ）」を続ける。あるいは、モータ付きの大きなテフロン加圧式細胞破砕装置または大きなチップソニケータ（ｔｉｐ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）をヤマト（Ｙａｍａｔｏ）の代わりに使ってペレット塊を再懸濁させることもできる。ＢＳＡを標準として用いてブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）でタンパク質濃度を調べる。＞２０ｍｇ／ｍｌの場合、２０ｍｇ／ｍｌまで希釈する。
６．タイプ４５のローター２つで４℃にて解重合混合物を３５Ｋで３０分スピンする。スピンの最後で遠心装置を３５℃に設定する。
７．涼しい部屋で上清を１Ｌ容のメスシリンダにデカントし、容量を測定する。１．８Ｌ容のファーンバッハ（Ｆｅｒｎｂａｃｈ）フラスコに注ぎ、３７℃のグリセロールの半量を加え、固化によってＧＴＰを最終の０．５ｍＭに、ＭｇＣｌ２を最終の４ｍＭにする（さらに３．５ｍＭ）。上記の３．で説明したようにして重合をセットアップする。混合物の温度が３２℃に達したら４０分間重合する。
８．タイプ３５を２台＋タイプ４５を１台で３５℃にて１時間、３５Ｋで重合混合物をスピンする。
９．上清を廃棄し、５．で上述したようにしてペレットをＣＢの最終容量１００〜１５０ｍｌ以内で再懸濁させる。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）でのタンパク質濃度が２５ｍｇ／ｍｌを超えないようにする。ペレットを最終容量１００〜１５０ｍｌ以内で再懸濁させる。氷上にて４０分間解重合させた後、解重合混合物を５０．２Ｔｉローターにて４℃で３０分間４０Ｋでスピンする。
１０．上清を回収し、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）で濃度を測定し、ＰＣカラム（高さ約５０ｃｍ×内径５ｃｍ＝〜１Ｌ；流量＝６ｍｌ／分）に仕込む。試料を仕込み、１５０ｍｌ以内の緩衝液を通した後、画分の回収を開始する。溶出されたチュービュリンは、わずかに黄色味を帯びているためすぐに分かる。ＢＳＡを標準として用いてブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）で濃度を測定し、最終濃度が５〜１０ｍｇ／ｍｌになるようにプールする。このプールを氷上にて混合し、５ｍｌのスナップキャップ付きポリプロピレンチューブで３ｍｌのアリコートを生成し、液体窒素中で冷凍する。冷凍アリコートを−８０℃で保管する。脳の到着時からチュービュリンの冷凍までの手順全体で１７〜１８時間程度の時間を要する。翌日、３容量のＣＢ＋１Ｍ  ＫＣｌを通してＰＣカラムからＭＡＰを溶出（これについては必要に応じて回収可能である）した後、保管用にカラムをＣＢ＋０．１％アジドに平衡させる。ホスホセルロースは湿った状態で保管しておくと機能が損なわれてしまう−これについては、０．１％アジドを含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭホスフェート、１ｍＭ  ＥＧＴＡおよび０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を用いてｐＨ７）中で保管すれば抑制可能である。
【００５３】
実施例１
微小管の調製
基本方法で説明したようなプロトコールに従って再利用ウシチュービュリンを調製し、ＢＲＢ８０緩衝液（８０ｍＭ  Ｋ＋−ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス［２−エタンスルホン酸］）＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋１ｍＭ  ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸）中１０ｍｇ／ｍｌの濃度で保管した。
【００５４】
簡単に説明すると、再利用チュービュリンの調製には、ウシ脳を均質化し、均質化後の材料に対して、ディファレンシャル遠心、重合および解重合、ホスホセルロースカラムを通して材料を精製して汚染タンパク質のない状態にする処理を連続して行う。チュービュリン（総量０．４２ｇ）の調製物を２ｍｌずつの画分（６．３５ｍｇ／ｍｌ）に等分し、冷凍保管した。次に、８ｍｌについてさらに２回の重合および解重合を繰り返し、１０ｕｌと５０ｕｌの画分に分けて冷凍し、実験時に個々に解凍できるようにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、この調製物がα−およびβ−チュービュリンで均質であることが分かった。再利用後のチュービュリンの回収率は２５％以内であった。
【００５５】
再利用チュービュリンを、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）を含有するＢＲＢ８０プラス２２％グリセロールに０℃で溶解させ、５分間放置した後、３７℃で１５分間のインキュベーションによって重合を誘導した。次に、パクリタキセル（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）中にて微小管懸濁液を５０μＭにし、室温にて５分間放置した。この時点で、１．１％グルタルアルデヒド（エレクトロン・マイクロソーピー・サプライズ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｏｐｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ）、ペンシルバニア州ウェスト・チェスター（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ）プラス１０μＭパクリタキセルを用いてＢＲＢ８０中にて微小管懸濁液を１：１０に希釈し、室温にて４分間放置して微小管を固定した。次に、１０μＭパクリタキセルを含有するＢＲＢ８０または５０ｍＭシステイン（または５０ｍＭグリシン）と１０μＭパクリタキセルとを含有するＢＲＢ８０を用いて、上記の懸濁液を２５倍に希釈した。この懸濁液を室温で数時間放置した。
【００５６】
１２ｍｍのカバーガラスをかぶせたルサイト（Ｌｕｃｉｔｅ）（登録商標）インサートを、ＳＷ４０スイングバケットローター（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）の遠心管の中に入れた。ＢＲＢ８０＋１０％グリセロール＋１０μＭパクリタキセル（１．５ｍｌ）を加え、微小管懸濁液６．５ｍｌと重ねた。次にＳＷ４０スイングバケットローターで１時間、２０，０００ｒｐｍにて２５℃で遠心管を遠心し、この時点で上層を吸引して界面をＢＲＢ８０で２回洗浄した。残りの液体をカバーガラスの２ｍｍ以内まで吸引し、この時点で管を揺らして微小管を静かに再懸濁させた。微小管を直接使用するか、あるいはシステインまたはグリシンで消光しない場合はＢＲＢ８０に対して一晩、室温にて１：１００に透析した。酢酸ウラニル染色微小管のＴＥＭ画像では、異なる調製物間でほとんど差がないことが分かった（図１ａおよび図１ｂ）。長期間の保管の場合、消光した微小管と消光していない微小管を容量５０μｌに等分し、液体Ｎ２で冷凍した。急速な冷凍・解凍はＴＥＭで観察した場合の微小管の元のままの状態にほとんど影響しなかった。
【００５７】
実施例２
懸濁液中の微小管の金属化−ＨＡｕＣｌ４プラスＮａＢＨ４中で金被覆した懸濁液中のシステイン消光微小管
微小管懸濁液（０．５ｍｇ／ｍｌ固定微小管およびシステイン消光微小管５０μｌ）を蒸留水５ｍｌに加えた。ＨＡｕＣｌ４（１ｍＭ）５ｍｌと、ＮａＢＨ４（２．７ｍＭ）５ｍｌとを１５〜３０分の時間をかけて同じ速度で滴下して加え、最終容量を１５ｍｌにした。得られた懸濁液の色はサーモンレッドから紫まであった。金属化微小管数μｌを、透過電子顕微鏡での検査用にＮｉ  ＴＥＭ（透過電子顕微鏡）グリッドにのせた（図２ａ）。
【００５８】
実施例３
懸濁液中の微小管の金属化−ＨＡｕＣｌ４プラスアスコルビン酸ナトリウム酸中で金被覆した懸濁液中のシステイン消光微小管
微小管懸濁液（０．５ｍｇ／ｍｌ固定微小管およびシステイン消光微小管５０μｌ）を蒸留水５ｍｌに加えた。ＨＡｕＣｌ４（１ｍＭ）５ｍｌと、アスコルビン酸ナトリウム（２．４ｍＭ）５ｍｌとを１５〜３０分の時間をかけて同じ速度で滴下して加え、最終容量を１５ｍｌにした。得られた懸濁液の色はサーモンレッドから紫まであった。金属化微小管数μｌを、透過電子顕微鏡での検査用にＮｉ  ＴＥＭグリッドにのせた（図２ｂ）。
【００５９】
実施例４（比較例）
懸濁液中の微小管の金属化−ＨＡｕＣｌ４プラスＮａジチオナイトで処理したシステイン消光微小管
微小管懸濁液（０．５ｍｇ／ｍｌ固定微小管およびシステイン消光微小管５０μｌ）を蒸留水５ｍｌに加えた。ＨＡｕＣｌ４（１ｍＭ）５ｍｌとＮａジチオナイト（２．６ｍＭ）５ｍｌとを１５〜３０分の時間をかけて同じ速度で滴下して加え、最終容量を１５ｍｌにした。得られた懸濁液の色はサーモンレッドから紫まであった。金属化微小管数μｌを、透過電子顕微鏡での検査用にＮｉ  ＴＥＭグリッドにのせた（図２ｃ）。
【００６０】
ＮａＢＨ４還元の場合、ＴＥＭでは微小管の外側に直径＜２０ｎｍの金粒子のコーティングの存在が明らかになり、これを図２ａに示す。金粒子が互いに融合しているように見えるアスコルビン酸ナトリウムの場合金のカバレッジはかなり厚く、これを図２ｂに示す。一方、金粒子がほとんど微小管表面に付着しないＮａジチオナイトでは金のカバレッジは粗く、これを図２ｃに示す。懸濁液中での金の堆積時に微小管が真っ直ぐから若干歪んだのが観察された。
【００６１】
実施例５
導電性の相互接続部の構築
ＨＡｕＣｌ４プラスＮａＢＨ４を用いてシステインおよび金被覆を用いて消光させた微小管を、金でパターンを形成したシリコンチップの上にＳＷ４０ローターにてスピンダウンした。このチップを、遠心管の底に配置したルサイト（Ｌｕｃｉｔｅ）（登録商標）インサートの頂面に上向きにのせた。次に、遠心管に金属化微小管懸濁液２０μｌを入れ、この遠心管をＳＷ４０ローターで１時間２０，０００ｒｐｍでスピンした。金属化微小管はパターンを形成したチップの表面に幾分不均質に分散し、このうちいくつかが金電極間のギャップをブリッジした。この作製物を電気測定に利用した。中央の金電極とシリコン上の２つの同心電極の内側との間のギャップをブリッジしている金粒子被覆微小管のＳＥＭ（走査電子顕微鏡写真）画像を図３ａに示す。内側と外側の同心電極間のギャップには微小管のブリッジはない。内側と外側のギャップに対応する電流−電圧測定値を図３ｂに示す。内側のギャップは導電性であり、ギガオーム範囲のオーミック抵抗を示したが、外側のギャップは開回路で、ＳＥＭ画像に一致している。
【００６２】
実施例６
表面での微小管の金属化−グルタルアルデヒド固定およびシステイン消光微小管
微小管はＮｉ  ＴＥＭグリッドまたはＮｉディスクでＮｉ表面に十分に結合して金属化されることが分かった。懸濁液（〜０．５ｍｇ／ｍｌグルタルアルデヒド固定、システイン消光微小管）５μｌの滴を表面に１０分間放置した後、毛管作用で除去（ｗｉｃｋｅｄ  ｏｆｆ）した。ＴＥＭによってＮｉグリッドで微小管を観察できた（図１）。鉗子を使ってグリッドとディスクを蒸留水５ｍｌ中に懸濁させた。ＨＡｕＣｌ４（１ｍＭ）５ｍｌとＮａＢＨ４（２．７ｍＭ）５ｍｌとを１５〜３０分の時間をかけて同じ速度で滴下して加え、最終容量を１５ｍｌにした。グリッド（図４上）およびディスク（図示せず）のＳＥＭ観察結果から、線状の微小管が＜２０ｎｍの金粒子で完全に被覆されていることが明らかになった。
【００６３】
懸濁液（〜０．５ｍｇ／ｍｌグルタルアルデヒド固定および透析微小管）５μｌの滴を表面に１０分間放置した後、毛管作用で除去した。ＴＥＭによってＮｉグリッドで微小管を観察できた（図１）。鉗子を使ってグリッドとディスクを蒸留水５ｍｌ中に懸濁させた。ＨＡｕＣｌ４（１ｍＭ）５ｍｌとＮａＢＨ４（２．７ｍＭ）５ｍｌとを１５〜３０分の時間をかけて同じ速度で滴下して加え、最終容量を１５ｍｌにした。グリッド（図４ｂ）およびディスク（図示せず）のＳＥＭ観察結果から、線状の微小管が＜２０ｎｍの金粒子で完全に被覆されていることが明らかになった。
【００６４】
金粒子が微小管に高い度合いで特異的に結合した。グルタルアルデヒド固定および透析微小管の金コーティングは、グルタルアルデヒド固定およびシステイン消光微小管で観察されたよりも平均でサイズの小さい金粒子をコーティングした場合の方が密であるように見えた。Ｎｉ表面での金による金属化（図４ａおよび図４ｂ）によって、おそらくはその表面への固定化がゆえに、懸濁液中のもの（図２および３）よりも線状度の高い金属化微小管が得られた。微小管の密着を強めるのにＮｉ表面の誘導体化は必要なかった。
【００６５】
実施例７
微小管金属化後のさらなる処理
Ｎｉ表面にある金粒子被覆微小管を焼結し、金の連続体を得ることができる。＜２０ｎｍの金粒子でコーティングしたＮｉ  ＴＥＭグリッドの横棒上の微小管（図４）をＮ２雰囲気下にて１時間４００℃で加熱した。ＳＥＭ（図５ａ）から、金粒子が融合して金の連続体が形成されていることが明らかになった。懸濁させた微小管は、連続した金のカバレッジのあるワイヤのような構造体を形成していた。Ｎｉ表面の微小管は、連続した金のカバレッジのあるものを示していたが、断続的なギャップによって分離された金の長さ部分のあるものも示していた。これらは表面の濡れと金粒子同士の融合との若干の競合を反映している。この競合は、原理的には融合が起こる雰囲気を変えるか、あるいは表面の性質の改変時に、制御可能なもののはずである。
【００６６】
すでに存在する金粒子にさらに金を堆積させ、互いに融合させる（図５ｂ）ゴールドエンハンスＥＭ溶液（カタログ番号２１１３、ナノプローブズ・インコーポレイテッド（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ヤップハンク（Ｙａｐｈａｎｋ）でも金粒子被覆微小管を処理した。
【００６７】
実施例８
表面の金被覆した微小管の電子特性
冷凍グルタルアルデヒド固定非消光・透析微小管を解凍し、ＢＲＢ−８０で４倍に希釈した。この微小管の懸濁液１０マイクロリットルを、予めグロー放電で清浄化しておいたニッケルパターンチップにのせた。空気の入ったペトリ皿で相対湿度の高い状態で滴を１０分間室温にてチップ上に放置した。このチップを毛管作用により乾燥させ、さらにチップを周囲相対湿度で空気乾燥させた。このチップを自己ロック式（ｓｅｌｆ−ｌｏｃｋｉｎｇ）の鉗子で保持し、脱イオン水５ｍｌの入ったシンチレーションバイアル中で懸濁させた。ＨＡｕＣｌ４（１ｍＭ）とＮａＢＨ４（２．４ｍＭ）とを、攪拌せずにバイアルにそれぞれ５ｍｌが入るまで３０分かけて同じ速度で滴下して加えた。チップを脱イオン水に浸し、空気乾燥させた。
【００６８】
図６ｂおよび図６ｃに示す一対の電極間の０．５μｍのギャップでの図６ａの微小管の電流−電圧測定（Ｉ−Ｖ）を実施した。電圧掃引は−０．５Ｖから＋０．５Ｖ（図７ａ）で、抵抗値＞１０１０オームであることが分かる。
【００６９】
ゴールドエンハンス（ナノプローブズ・インコーポレイテッド（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）２０マイクロリットルをチップにのせて１０分間放置した後、チップを水洗して毛管作用により乾燥させた（図６ｂ）。
【００７０】
上記と同じギャップについて別のＩ−Ｖ測定を実施した（図７ｂ）ところ、抵抗値が３．２×１０６オームであることが分かった。Ａｒ雰囲気下３５０℃で１時間チップをアニーリングした（図６ｃ）。上記と同じギャップで別のＩ−Ｖ測定を実施した（図７ｃ）ところ、抵抗値が２９０オームであることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１ａ】酢酸ウラニルで染色した、グルタルアルデヒド固定システイン消光微小管のＴＥＭ画像である。
【図１ｂ】酢酸ウラニルで染色した、グルタルアルデヒド固定・透析微小管のＴＥＭ画像である。
【図２ａ】ＨＡｕＣｌ４プラスＮａＢＨ４で金被覆した懸濁液中のシステイン消光微小管ＴＥＭ画像である。
【図２ｂ】ＨＡｕＣｌ４プラスアスコルビン酸ナトリウムで金被覆した、懸濁液中のシステイン消光微小管のＴＥＭ画像である。
【図２ｃ】ＨＡｕＣｌ４プラスＮａジチオナイト中のシステイン消光微小管のＴＥＭ画像である。
【図３ａ】懸濁液中で金被覆し、中央の電極と２つの同心電極の内側とをブリッジしているギャップに遠心処理したシステイン消光微小管のＳＥＭ画像である。
【図３ｂ】中央の電極と２つの同心電極の内側との間、内側と外側の同心電極間の電流−電圧測定値を示すグラフである。
【図４ａ】ニッケルＴＥＭグリッドにおいたままＨＡｕＣｌ４およびＮａＢＨ４を用いて金粒子被覆したグルタルアルデヒド固定およびシステイン消光微小管のＳＥＭ画像である。
【図４ｂ】ニッケルＴＥＭグリッド（ｇｉｒｄ）の横棒の上においたままＨＡｕＣｌ４およびＮａＢＨ４を用いて金粒子被覆したグルタルアルデヒド固定・透析微小管のＳＥＭ画像である。
【図５ａ】Ｎ２雰囲気下にて１時間４００℃で焼結させた金被覆システイン消光微小管のＳＥＭ画像である。
【図５ｂ】ＨＡｕＣｌ４プラスＮａＢＨ４での金コーティング後にゴールドエンハンス溶液を用いて８分間ニッケルＴＥＭグリッドで処理したシステイン消光微小管のＴＥＭ画像である。
【図６ａ】図６ｂおよび図６ｃと同じパターンを形成したチップのニッケル電極上のコールド被覆微小管のＳＥＭ画像である。
【図６ｂ】ゴールドエンハンスでの金増強後、０．５μｍのギャップでの２つのニッケル電極をブリッジしている同じニッケルパターンチップの図６ａの微小管のＳＥＭ画像である。
【図６ｃ】Ａｒ雰囲気下３５０℃にて１時間のアニーリング後の同じ０．５μｍのギャップでの図６ｂの微小管のＳＥＭ画像である。
【図７ａ】ゴールドエンハンスメント前の図６ｂおよび図６ｃに示すギャップでの微小管の電流−電圧測定値のグラフである。
【図７ｂ】この図に示す（ゴールドエンハンスメント後の）０．５μｍのギャップをブリッジしている図６ｂの微小管の電流−電圧測定値のグラフである。
【図７ｃ】この図に示す（Ａｒ雰囲気３５０℃にて１時間のアニーリング後の）０．５μｍのギャップをブリッジしている図６ｃの微小管の電流−電圧測定値のグラフである。
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【図３ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【国際調査報告】
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