(57)【要約】虹彩の色素沈着過剰を刺激する能力が減少しているかまたは該能力を有さない眼降圧活性を有する物質を同定する方法を開示する。該方法は、FP受容体と相互作用する被験化合物の能力を検出することを含んで成る。
2005522183.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
虹彩の色素沈着過剰を刺激する能力が減少しているかまたは該能力を有さない眼降圧活性を有する化合物を同定する方法であって、眼降圧活性を有する被験化合物とプロスタグランジンFP受容体とを接触させ、該受容体の生物学的活性を刺激する該化合物の能力を評価することを含んで成り、同じ降圧活性を有するラタノプロストと同程度かまたはそれより高い程度に、該受容体を刺激することができない化合物を、虹彩の色素沈着過剰を刺激する能力が減少しているかまたは該能力を有さない化合物として同定する方法。
【請求項２】
該FP受容体を、線維芽細胞または線維芽細胞由来細胞系において発現させる請求項1に記載の方法。
【請求項３】
被験化合物による受容体刺激の指標として、FP受容体を発現する細胞内におけるカルシウムシグナルを検出することによって、該評価を行う請求項1に記載の方法。
【請求項４】
該線維芽細胞または線維芽細胞由来細胞と共培養したメラニン合成細胞における、メラニンの形成を直接的または間接的に検出することによって、該評価を行う請求項2に記載の方法。
【請求項５】
該メラニン合成細胞と被験化合物との接触後に、該メラニン合成細胞の細胞溶解産物を含有する溶液の吸光度を、メラニンの存在に特徴的な波長において測定することによって、メラニン形成を検出する請求項4に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも1つの放射性メラニン先駆物質のメラニンへの取り込みを測定することによって、メラニン形成を検出する請求項4に記載の方法。
【請求項７】
メラニン先駆物質が放射性標識メラニンである請求項6に記載の方法。
【請求項８】
該被験化合物との接触後に、該メラニン合成細胞に含有されているチロシナーゼ活性の量を測定することによって、メラニン形成を検出する請求項4に記載の方法。
【請求項９】
眼降圧活性を有するプロスタグランジン類似体または誘導体を含んで成る被験化合物群から、ラタノプロストと比較して虹彩の色素沈着過剰活性を刺激する能力が減少しているかまたは該能力を有さない物質を選択する方法であって、生理的pHにおいて酸性である被験化合物を該被験化合物群から除去し、該被験化合物群から除去されなかった化合物だけを、同じ降圧活性を有するラタノプロストと比較して虹彩の色素沈着過剰を刺激する能力が減少しているかまたは該能力を有さない物質として同定することを含んで成る方法。
【請求項１０】
眼高圧を特徴とする病理学的状態を治療する方法であって、請求項9に記載の方法によって選択した物質の有効量を含んで成る医薬組成物を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含んで成る方法。
【請求項１１】
急性心筋梗塞、血栓症、高血圧症、肺高血圧症、虚血性心疾患、鬱血性心不全、狭心症および眼高圧症から成る群から選択される病理学的状態を治療する方法であって、請求項9に記載の方法によって選択した物質の有効量を含んで成る医薬組成物を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は主に、プロスタグランジン類似体または誘導体を含んで成る薬剤を使用する、緑内障に伴うような眼高圧症の治療であって、該薬剤での治療が最少限の眼の色素沈着過剰作用を生じるかまたは生じない治療に関する。さらに、本発明は、色素沈着過剰を生じる能力が低いプロスタグランジンF類似体を同定し、設計する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
特定のプロスタグランジンならびにそれらの類似体および誘導体、例えばXalatan（登録商標）として市販されているPGF2α誘導体ラタノプロストは、眼高圧症および緑内障の治療に有効な化合物として確認されている。しかし、この適応症に関して米国食品医薬品局によって承認されている最初のプロスタグランジン、ラタノプロストは、5〜15％のヒトの眼の虹彩に褐色色素の増加を生じる好ましくない副作用を有するプロスタグランジン誘導体である。色の変化は、虹彩メラノサイト内の増加した数のメラノソーム（色素顆粒）によって生じる。例えば、Watsonら、Ophthalmology 103:126(1996)参照（この文献およびそれに引用されている全ての文献は、参照として本明細書に組み入れられる）。この作用が付加的かつ有害な臨床的波及作用を有するかどうかはまだ明らかでないが、美容上の点だけから言えば、そのような副作用は好ましくない。
【０００３】
ラタノプロストのような合成眼高圧用プロスタグランジン誘導体と比較して、虹彩の色素沈着の増加を刺激する能力を有さないかまたはその能力が減少しているプロスタグランジン類似体またはプロスタグランジン誘導体を使用して、緑内障患者を治療する方法を考案することが望ましい。プロスタグランジン誘導体は、プロスタグランジンに類似した構造を有する化合物、好ましくはカルボン酸基を有するPGFプロスタグランジン、およびそのエステルを意味する。
【０００４】
この好ましくない副作用を有さない、眼高圧症の治療に有効な化合物を同定する方法を見出すことも望ましい。本発明は、眼圧を降下させるのに有効であり、この好ましくない副作用を実質的に有さないPGF2α類似体および／または誘導体を設計し同定する方法、ならびにそのような化合物による緑内障の治療法を提供する。
【０００５】
虹彩における色素沈着はメラニンの形成によること、およびメラニン生合成経路における最も重要な酵素はチロシナーゼであることは知られており、チロシンは、メラニン生成に絶対的に必要とされる。例えば、Hearing B. J.ら、FASEB J. (1991) 5：2902-2909参照。メラニンは一般にメラノサイトで合成され、メラノサイトでのメラニン生成における種々の要因の作用は、例えば、Morelli, J. G.ら、J. Invest Dermatol (1993) 100: 191S-195S によって研究されている。さらに、メラノサイト刺激ホルモン（MSH）はメラノサイトにおけるチロシナーゼの活性を刺激すると考えられるが、MSHはメラニン生合成経路に関与する他の酵素、特にTRP2およびTRP1と称される酵素の、発現または活性を増加させないことが示された。Aroca, P.ら、J. Biol. Chem. (1993) 268:25650-25655。
【０００６】
S91「クラウドマン」黒色腫細胞系におけるメラニン産生および細胞増殖への、プロスタグランジンおよびその類似体または誘導体の作用を研究することによって、色素沈着刺激のメカニズムを評価する試みがなされている。Kraussおよび共同研究者ら（Krauss, A.H.-P.ら、ARVO abstracts 39:S804(1998)）は、この細胞系を使用して、MSHは予想しうる仕方でメラニン産生を刺激しうるが、PGF2αおよび類似化合物は、この細胞系において極めて高い濃度でのみメラニン産生を刺激しうることを立証し、天然PGF2α受容体FP以外の受容体の関与を示した。ブタプロスト、およびFP以外のプロスタグランジン受容体のリガンドでの細胞の処置は、EP2およびIP受容体の関与を示した。これらの研究は、S91細胞がEP2およびIP受容体を含有するが、ラタノプロストに反応することが既知のFP受容体を含有しないことを示した。これは、Shi, L.ら、PASPCR abstracts 11:186(1998)によっても報告されている。
【０００７】
Krauss, A.H.-P.ら、Internat. Congress of Eye Res. Abstracts 14:S78(2000)によるその後の研究は、RT-PCRはFP受容体mRNAを増幅することができず、PGF2α（FP受容体の天然リガンド）での刺激はカルシウムシグナルを刺激することができなかったので、FP受容体がS91細胞に存在しないことを示した。これらの細胞がFP受容体で安定にトランスフェクションされ、タンパク質を過発現することを可能にされた場合、RT-PCRはFP受容体cDNAを産生し、該受容体が細胞表面に発現された。しかし、PGF2αは、これらのトランスフェクションされたS91細胞においてカルシウムシグナルを発生しなかった。カルシウムシグナルは一般に、他の細胞におけるFP受容体刺激に関連している。これらのFP受容体トランスフェクタントにおけるDOPAオキシダーゼ（チロシナーゼ）活性およびメラニン形成における、PGF2αの作用は、天然非トランスフェクションS91細胞に含有される反応と区別できなかった。Krauss, A.H.-P.ら、ARVO abstracts 41:S250(2000)；Krauss, A.H.-P.ら、IPCC abstracts Supp. 7, 68(1999)。従って、これらのデータは、メラノサイトは有意なFP受容体発現（PGF2αはそれを刺激することが既知である）が充分でないが、この受容体を生じるようにこれらの細胞を改質することは、このプロスタグランジンまたはその類似体に反応してメラノサイトがメラニンを合成することができないことを改善するのに充分でないことを示唆している。
【０００８】
PGF2αが細胞培養物におけるメラニンの産生を刺激するために、メラノサイトがそのように改質されている培地が、線維芽細胞を含有すべきであることを見出した。この認識に基づいて、色素沈着過剰の副作用を生じずに眼内圧を減少させる化合物を同定し設計することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、プロスタグランジン類似体での処置によって生じるメラニン産生のメカニズムが、メラノサイト（またはメラノサイト由来細胞）の存在下の、線維芽細胞または線維芽細胞直系の細胞のFP受容体における、類似体によるアゴニズムであると特に考えられる中間段階、おそらくそれに続く、メラノサイトによって検出可能な溶性シグナルの線維芽細胞合成（それは、次に、メラニン産生を刺激する作用をする）を含むという発見を利用するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の1つの態様において、線維芽細胞に存在するFP受容体群を刺激する能力について、化合物を評価する。FP受容体活性の検出は、直接的または間接的であってよい。線維芽細胞において発現されるFP受容体を刺激することはできないが、それにもかかわらず眼内圧を抑制できる化合物は、色素沈着過剰を示さないかまたは減少した色素沈着過剰を示す治療薬の設計に好適な候補である。
【００１１】
本発明の他の態様において、本願発明者らは、非酸性の、即ち、PGF2αに特徴的なカルボキシル基を有さないプロスタグランジン類似体は、FP受容体を刺激できないことを見出した。従って、生理的pHにおいて中性または塩基性である化合物は緑内障治療用に設計することができ、そのような化合物は、減少した色素沈着過剰を示すか、または色素沈着過剰を示さない。
【００１２】
従って、1つの局面において、本発明は、眼内圧を降下させることができるプロスタグランジン、プロスタグランジン誘導体またはプロスタグランジン類似体を含んで成る化合物であって、虹彩の色素沈着過剰を刺激する好ましくない特性を有さな化合物を同定する方法に関し、該方法は、FP受容体を発現する線維芽細胞に該化合物を接触させ、該FP受容体を刺激する該化合物の能力を直接的または間接的に評価することを含んで成り、FP受容体を刺激できないことは、該化合物が該特性を有さないことを示す。
【００１３】
前記のように、FP受容体活性の測定は、例えば細胞内Ca＋＋シグナルの刺激を検出するような直接的方法であってもよく、または間接的方法であってもよい。そのような間接的方法は、その存在または不存在がそれぞれFP受容体刺激の特徴を示す化合物または物理現象の存在または不存在を検出することを包含しうる。
【００１４】
本発明の好ましい態様において、線維芽細胞およびメラノサイト（または黒色腫細胞）を被験化合物の存在下に培養し、例えば、被験化合物の不存在下の同様の細胞共培養物中の同じ細胞型によるかまたは線維芽細胞の不存在下に培養した同じ細胞型および物質によって、メラノサイトによるメラニンの合成を対照培養物におけるメラニンの合成と比較する。メラニン産生は、直接的または間接的に検出できる。直接検出法は、培養メラノサイトからのメラニン（ユーメラニンまたはフェオメラニンのどちらかまたは両方を含む）の抽出および検出、メラノサイト溶解産物のHPLC分析、メラニン標準とのピーク（またはその不存在）の相関、メラニンに特徴的な波長での細胞溶解産物における吸光度の観測、ならびにメラニン先駆物質の放射性標識および刺激後の放射性標識メラニンの検出を包含するがそれらに限定されない。間接検出法は、メラノサイトにおけるチロシナーゼ活性の検出を包含するがそれに限定されない。現在、本願出願人は後者の方法を選択する。
【００１５】
本発明のアッセイに使用される線維芽細胞およびメラノサイトは、原細胞であってもよく、またはこれらの原細胞型に由来する不朽細胞系であってもよい。好ましくは、細胞は、2つの各細胞型に由来する不朽細胞系である。
【００１６】
他の態様において、本発明は、標準、好ましくはラタノプロスト遊離酸と比較した場合に、虹彩色素沈着を示さないかまたは減少した虹彩色素沈着を示す眼内圧降下PGF2α類似体または誘導体を選択する方法であって、酸性でなく中性または塩基性のプロスタグランジンF2α類似体または誘導体を設計することを含んで成る方法に関する。多くのプロスタグランジン類似体および誘導体が既知である。多くの該類似体および誘導体が、例えば国際特許出願公開第WO 94/06433号および米国特許第5688819号に記載されており、それらに開示されている内容は全て参照として本明細書に組み入れられる。ラタノプロストおよびフルプロステノール（両方ともカルボン酸官能基を含有し、従って、本発明によれば、虹彩の色素沈着過剰を刺激すると推測される）を包含する多くのそのような化合物が商業的に入手可能である。プロスタミドF2αおよび下記に示すがそれらに限定されない他の非酸性類似体のような他の類似体も合成用に入手可能である。最後に、アラキドン酸およびアナンダミドはそれぞれ、種々のプロスタグランジンおよびプロスタミドの生合成先駆物質である。
【化１】
2005522183.tif 000003
ラタノプロスト遊離酸
【化２】
2005522183.tif 000004
化合物A（LumiganTM）
【化３】
2005522183.tif 000005
フルプロステノール
【化４】
2005522183.tif 000006
化合物B（プロスタミドF2α）
【化５】
2005522183.tif 000007
化合物C
【化６】
2005522183.tif 000008
化合物D
【化７】
2005522183.tif 000009
化合物E
【化８】
2005522183.tif 000010
アナンダミド
【化９】
2005522183.tif 000011
アラキドン酸
【００１７】
本明細書に開示した発明を利用することによって、これらの類似体、およびあらゆる新たに合成された類似体または誘導体のどれが、減少した色素沈着過剰の刺激能力を有するかまたは有さないかを予測することができる。
【００１８】
図１は、サルに1年間にわたって毎日、片方の眼にラタノプロストまたは化合物A（LumiganTM）を局所投与した1年間の研究の結果を示すグラフである。結果を、虹彩の暗色化について、変化がない場合に0、および重度の虹彩暗色化を示す場合に3で評価する。
【００１９】
図２は、ラタノプロスト、フルプロステノール、化合物Aまたは化合物Bでの処置に反応した、ヒトプロスタグランジンFP受容体をコード化する発現プラスミドでトランスフェクションしたヒト胎児性腎細胞におけるカルシウムシグナルを示すプロットである。データは、前者の2つの物質はFP受容体を刺激し、後者の2つの物質はFP受容体を刺激しないことを示す。
【００２０】
図３Ａ〜３Ｆは、増加する濃度のアラキドン酸、アナンダミド、化合物C、化合物A、化合物Dおよび化合物Eのそれぞれの存在下の培養における、黒色腫細胞への作用を示す棒グラフである。グラフは、単独か、またはヒト皮膚線維芽細胞系とのトランスウェル培養で培養した、S91黒色腫細胞に関する結果を示す。
【００２１】
図４Ａ〜４Ｃは、S91線維芽細胞と黒色腫細胞とのトランスウェル共培養物中のチロシナーゼ活性における、ラタノプロスト、フルプロステノールおよびプロスタミドF2αのそれぞれの作用を示すグラフである。図に示されるように、ラタノプロストおよびフルプロステノールは、線維芽細胞の存在下に培養した場合に、これらの細胞におけるチロシナーゼの産生の増加を刺激する。共培養した線維芽細胞の存在または不存在下のプロスタミドF2αによって、有意な、チロシナーゼ活性の用量依存性刺激は示されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
虹彩の色素沈着過剰を刺激する能力を有さないかまたは減少した該能力を有する本発明に有用な眼降圧化合物は、好ましくは線維芽細胞において発現されるFP受容体を刺激する能力を評価することによって同定できる。この第一の局面において、好ましくは本発明の方法を適用する前に、化合物を単独に試験し、眼内圧（IOP）を降下しうる物質として確認する。そのような物質は、緑内障以外の眼高圧症、例えば手術後およびレーザートラベクレクトミー後の眼高圧エピソードの処置において、ならびに手術前補助剤としても、有効な場合がある。さらに、該物質は、急性心筋梗塞、血栓症、高血圧症、肺高血圧症、虚血性心疾患、鬱血性心不全および狭心症を包含する種々の病態生理学的疾患の治療にも有効な場合があり、その場合、該化合物は、血管を拡張し、それによって疾患の症状を軽減するあらゆる方法によって投与しうる。例えば、経口、経皮、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮または口腔経路によって投与しうる。
【００２３】
好ましくは線維芽細胞において、FP受容体を刺激することができる抗緑内障薬は、虹彩の色素沈着過剰を刺激し、該受容体を刺激することができない抗緑内障薬は、減少した色素沈着過剰を生じるか、または色素沈着過剰を生じない薬剤として同定される。この能力の評価は、多くの方法で行うことができる。例えば、被験化合物の存在下に線維芽細胞と共培養したメラノサイトにおいて、メラニン産生を検出することができ（例えば、メラニンに特徴的な波長における処置細胞と非処置細胞の溶解産物の吸光度を測定することによって）、またはこれらの細胞におけるチロシナーゼ活性を測定することができる。そのような細胞はトランスウェルにおいて共培養しうる。メラノサイトまたは黒色腫細胞を線維芽細胞と共培養する場合、前者は後者より過剰であるべきである。
【００２４】
または、培養した線維芽細胞が有するFP受容体の刺激は、例えば細胞内Ca＋＋シグナルを検出することによって検出することもできる。色素沈着過剰を刺激する標準プロスタグランジン誘導体、例えばラタノプロスト遊離酸またはフルプロスタノールより少なく受容体を刺激する化合物を、このようにして選択して、合成し、眼高圧症の治療用の医薬組成物用に配合する。
【００２５】
PGF2α類似体であるが酸性でない化合物は、メラニン合成を刺激しないか、または刺激する能力が低く、眼高圧症の治療用に配合しうることも見出された。従って、他の態様において、この酸性特性を有さないプロスタグランジン類似体である化合物を活性成分として含有する医薬組成物を製造することができる。
【００２６】
本発明の方法によって同定される医薬組成物は、緑内障の治療のために患者に投与するために、一般的な方法を使用して配合することができる。そのような配合物は、RemingtonのPharmaceutical Sciences、最新版、Mack Publishing Co., Easton, PAに記載されており、それに開示の内容は参照として本明細書に組み入れられる。好適な配合物は、全身性配合物および局所適用の両方を包含し、最も一般的には点眼剤である。投与水準および投与方法は、当業者によって理解される一般的な方法を使用して容易に最適化される。投与水準は、患者の症状の種類、医師の判断ならびに配合物および投与方法に依存して変化する。
【００２７】
下記の実施例は、本発明を例示するものであり、限定するものではない。
【実施例１】
【００２８】
物質および方法
2mM L−グルタミン、100mg/L ピルビン酸ナトリウム、100U/mL ペニシリンG、100U/mL ストレプトマイシンおよび250ng/mL アンホテリシンBを補充した10％ウシ胎児血清（FCS）を含有する低グルコースダルベッコ改質イーグル培地（DMEM）中、37℃、5％CO2において、ヒト皮膚線維芽細胞およびS91黒色腫細胞を培養する。チロシナーゼおよびメラニン産生アッセイのために、培養期間中にFCS濃度を1％に減少させる。
【００２９】
S91細胞を、6穴皿に105細胞／穴で培養し、一晩にわたって付着させる。トランスウェル試験のために、ヒト皮膚線維芽細胞系からの細胞を、103細胞／穴でトランスウェルインサートで培養し、一晩にわたって付着させる。黒色腫細胞を、線維芽細胞より初期過剰、好ましくは約1：30〜約1：1000、より好ましくは約1：50〜約1：300、最も好ましくは約1：100の比率で培養する。一次細胞については、線維芽細胞対メラノサイトの比率約1：2〜約1：50、好ましくは約1：5〜約1：20、さらに好ましくは約1：10の比率で細胞を培養する。添加試験物質は一般に、線維芽細胞増殖を刺激し、従って、トランスウェルの使用は、メラノサイトの分離計数を可能にする。
【００３０】
アッセイ期間中、試験物質を1日置きに添加し、培地は交換しない。
メラニンアッセイのために、細胞を5日間培養した。培養期間の最後に、S91細胞を採取し、振とう水浴において37℃で一晩培養することによって1M NaOHに溶解した。室温において16,000xgで30分間遠心分離した後、上澄みの光学密度を475nmで測定し、合成メラニンで得た標準曲線と比較した。
【００３１】
DOPAオキシダーゼ（チロシナーゼ）活性については、この場合、細胞を4日間培養し、S91細胞を溶解緩衝液に採集した。細胞懸濁液を、１回の凍結／解凍サイクル（−80℃）にかけ、渦を巻かせて細胞質ゾル含有物を抽出した。4℃において16,000xgで30分間遠心分離した後、上澄みの少量をブランドフォード・アッセイに使用してタンパク質濃度を測定するか、またはd-DOPAまたは1-DOPAを基質として使用して培養した。光学密度を490nmで6時間まで測定した。
【００３２】
細胞増殖アッセイについては、黒色腫細胞をハンクスBSSで洗浄し、トリプシン処理し、血球計で計数した。
【実施例２】
【００３３】
1つの実験において、1年間にわたって、サルの片方の眼を35μLの小滴の0.005％（w/v）ラタノプロストまたは0.03％化合物Aのどちらかで、1日に1回処置する。合計8匹の動物を各処置群において処理する。1年間の試験期間の最後に、処置した眼の暗色化を、処置前の同じ眼の写真と比較し、下記の測度で評価する：
0  変化なし
1  微かな、僅かにしか認知できない変化
2  中度の、容易に認知できる変化
3  重度の、顕著な変化
【００３４】
結果を図1に示す。図から分かるように、非処置眼は、各物質の不存在において、年齢に関係したいくらかの暗色化を示し、従って、実験の基準線は1であった。ラタノプロストで処置した眼は、顕著により暗く、評点2であった。これに対して、化合物Aで処置した眼は、有意により少ない暗さ（平均評点＝約1.1）であった。
【００３５】
従って、これらの結果は、ラタノプロストと比較して化合物Aで眼を処置した場合に、メラニン産生および虹彩の色素沈着過剰が有意に減少することを確認するものである。
【実施例３】
【００３６】
系HEK-293のヒト胎児性腎細胞を、ヒトFP受容体をコード化する発現プラスミドで安定にトランスフェクションする。10％ウシ胎児血清、2mM L−グルタミン、100mg/L ピルビン酸ナトリウム、100U/mL ペニシリンG、100U/mL ストレプトマイシン、250μg/mL G418、200μg/mL ヒグロマイシンおよび250ng/mL アンホテリシンBを含有する低グルコースダルベッコ改質イーグル培地中、37℃、5％CO2において、細胞を培養した。ポリ−D−リシン被覆96穴皿に、5000／穴で細胞を接種し、実験前に一晩培養した。ラタノプロスト遊離酸、フルプロステノール、化合物A、化合物Bのそれぞれの存在下に、細胞を培養し、遊離細胞内カルシウムの指示薬としてカルシウム活性化蛍光染料Fluo-4を使用して、FLIPR（蛍光画像プレートリーダー）で評価する。FP受容体の刺激は、遊離細胞内カルシウムの放出を増加させることが知られているので、この実験は、被験化合物がヒトFP受容体を刺激しうる場合に、測定するように設計される。
【００３７】
図2は、ラタノプロストおよびフルプロステノールが約10-11Mの濃度でFP受容体を刺激しうること、およびこの作用が約10-8Mで安定状態に達することを示す。これに対して、プロスタミドF2αおよび化合物Aは両方とも、これらの濃度においてヒトFP受容体を刺激しない。
【実施例４】
【００３８】
クラウドマンS91黒色腫細胞（ATCC CCL-53.1）を、前記のように、ヒト皮膚線維芽細胞（ATCC CRL-2097）の存在または不存在において培養した。添加した薬剤は、アラキドン酸、アナンダミド、化合物C、化合物A、化合物Dおよび化合物Eであった。
【００３９】
図3Aに示すように、10-9〜10-5Mのアラキドン酸（プロスタグランジン先駆物質）の存在下に培養した細胞は、増加用量の関数として、チロシナーゼ（DOPAオキシダーゼ）活性の有意な増加を示し；線維芽細胞を添加しなかった黒色腫細胞の培養物においては、より少ない増加が観察されるが、大部分の用量において、この増加は統計的に有意でない。
【００４０】
これに対して、図3Bは、アラキドン酸ではなくアナンダミド（プロスタミド先駆物質）に細胞を暴露する同じ実験の結果を示す。この実験は、増加量の薬剤への暴露の結果として、チロシナーゼ活性が顕著に増加しないことを示す。
【００４１】
図3Cは、別のプロスタミドである化合物Cの存在下に培養物を増殖させる同様の実験の結果を示す。チロシナーゼ活性は、10-9〜10-5Mの投与水準において有意に変化しない。10-5Mにおけるチロシナーゼ活性の少しの増加は、おそらく、比較的高い濃度の薬剤の存在による、目的とする細胞と薬剤との非特異的相互作用によるものと考えられる。
【００４２】
同様に、図3Dは、プロスタミドである化合物Aの存在下の培養物についての、チロシナーゼ活性データを示す。この実験において、試験したいずれの薬剤濃度においても、チロシナーゼ活性の有意な変化は見られない。
【００４３】
図3Eは、化合物Dについての同様のデータを示す。カルボン酸基を有さない薬剤は、このアッセイにおいて、チロシナーゼ活性の有意な刺激を生じない。
【００４４】
図3Fは、化合物Eについての同様のデータを示す。この場合、より高い濃度において細胞数が少し減少する（データを示さず）が、最も高い用量（10-5M）のみが、チロシナーゼ活性の増加を示し、これもおそらく、そのように高い被験化合物濃度における受容体の非特異的活性化によるものと考えられる。
【００４５】
チロシナーゼ活性の有意な増加が観測された実験（即ち、図3A）において、線維芽細胞と黒色腫細胞との共培養は、黒色腫細胞だけの存在において観測されるより有意に高いチロシナーゼ活性増加を生じた。
【００４６】
細胞増殖の評価を対照として使用した；線維芽細胞の存在は、細胞増殖における、これらの化合物（存在する場合）の影響に作用しなかった。
【実施例５】
【００４７】
実施例4と同様に行った実験において、被験化合物は、ラタノプロスト遊離酸、フルプロステノール、およびプロスタミドF2α（化合物B）であった。トランスウェル共培養物に線維芽細胞が含有されていてもいなくても、ラタノプロストは10-9〜10-6Mの濃度においてS91細胞の増殖にほとんど影響を与えなかった。10-5Mの濃度において、両方の場合に、減少が観測された。線維芽細胞共培養物が存在するかまたは存在しない10-9〜10-5Mにおいて、フルプロステノールまたはプロスタミドF2αによる細胞増殖における作用は観測されなかった。
【００４８】
しかし、図4Aおよび図4Bにそれぞれ示すように、チロシナーゼ活性をメラニン合成の測度として使用した場合、線維芽細胞の存在においてラタノプロストおよびフルプロステノールの用量依存性作用が観測された。カルボキシル基を有さず、FP受容体と相互作用しないプロスタミドは、線維芽細胞の存在または不存在において、チロシナーゼ産生を刺激することができなかった（図4C）。
【００４９】
ラタノプロストについては、10-6Mまでの濃度での、トランスウェル培養物でないS91細胞におけるDOPAオキシダーゼ活性およびメラニン形成の両方に関して、評価できる変化が生じないことが分かった。しかし、10-5Mにおいて、チロシナーゼ活性の増加およびメラニン形成の増加の両方が観測された。この高濃度において、FP受容体に対する特異性が失われる。
【００５０】
前記実施例において本発明を例示したが、本発明は請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】サルに1年間にわたって毎日、片方の眼にラタノプロストまたは化合物A（LumiganTM）を局所投与した1年間の研究の結果を示すグラフである。結果を、虹彩の暗色化について、変化がない場合に0、および重度の虹彩暗色化を示す場合に3で評価する。
【図２】ラタノプロスト、フルプロステノール、化合物Aまたは化合物Bでの処置に反応した、ヒトプロスタグランジンFP受容体をコード化する発現プラスミドでトランスフェクションしたヒト胎児性腎細胞におけるカルシウムシグナルを示すプロットである。データは、前者の2つの物質はFP受容体を刺激し、後者の2つの物質はFP受容体を刺激しないことを示す。
【図３Ａ】増加する濃度のアラキドン酸の存在下の培養における、黒色腫細胞への作用を示す棒グラフである。
【図３Ｂ】増加する濃度のアナンダミドの存在下の培養における、黒色腫細胞への作用を示す棒グラフである。
【図３Ｃ】増加する濃度の化合物Cの存在下の培養における、黒色腫細胞への作用を示す棒グラフである。
【図３Ｄ】増加する濃度の化合物Aの存在下の培養における、黒色腫細胞への作用を示す棒グラフである。
【図３Ｅ】増加する濃度の化合物Dの存在下の培養における、黒色腫細胞への作用を示す棒グラフである。
【図３Ｆ】増加する濃度の化合物Eの存在下の培養における、黒色腫細胞への作用を示す棒グラフである。
【図４Ａ】S91線維芽細胞と黒色腫細胞とのトランスウェル共培養物中のチロシナーゼ活性における、ラタノプロストの作用を示すグラフである。
【図４Ｂ】S91線維芽細胞と黒色腫細胞とのトランスウェル共培養物中のチロシナーゼ活性における、フルプロステノールの作用を示すグラフである。
【図４Ｃ】S91線維芽細胞と黒色腫細胞とのトランスウェル共培養物中のチロシナーゼ活性における、プロスタミドF2αの作用を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【国際調査報告】
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