(57)【要約】本発明は、それぞれ、動物、ヒトまたは分裂した初代細胞に外来遺伝子および核酸を診断的、治療的および予防的に送達するためのベクターとしての動物ヘルペスウイルスなどの動物ウイルスに関する。前記ウイルスを使用することによって、感染性疾患、自己免疫疾患および腫瘍疾患並びにアレルギーおよび遺伝性疾患の予防および治療を治療することができる。本発明は、さらに、初代ヒト細胞に組換え動物ウイルスをインビトロおよびインビボにおいて効率的に形質導入する手法に関する。本発明は、さらに、（ｉ）先天性および養子免疫応答の診断およびモニタリング並びに（ii）遺伝子治療および（iii）免疫感作の目的のために有用なキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然ではヒトまたは他の動物種を宿主または最終宿主として使用しないウイルス由来の組換え動物ウイルスであって、自己複製能を有するまたは自己複製能を欠損しており、感染多重度１未満でインビトロにおいて天然宿主または最終宿主でない生物由来の初代細胞に形質導入する能力を有する組換え動物ウイルス。
【請求項２】
生物あたり１０6〜１０8未満の範囲の低粒子数でインビボにおいて細胞に効率的に形質導入する能力をさらに有する請求項１に記載の組換え動物ウイルス。
【請求項３】
形質導入により、処理された生物における、生物学的に測定可能な免疫応答の誘導、予防的、治療的または診断的な効果を誘導するのに十分な導入遺伝子産物の発現を生ずる請求項２に記載の組換え動物ウイルス。
【請求項４】
ウマヘルペスウイルスである請求項１〜３のいずれかに記載の組換え動物ウイルス。
【請求項５】
前記初代細胞が、ヒト、愛玩動物または家畜由来である請求項１〜４のいずれかに記載の組換え動物ウイルス。
【請求項６】
導入遺伝子を含む請求項１〜５のいずれかに記載の組換え動物ウイルス。
【請求項７】
天然宿主またはそれ由来の細胞もしくは細胞系統における複製に必須の遺伝子の少なくとも１つを欠失している請求項１〜６のいずれかに記載の組換え動物ウイルス。
【請求項８】
ＯＲＩSおよび／またはＯＲＩLならびにパッケージング（ｐａｃ）配列を含む請求項１〜７のいずれかに記載の組換え動物ウイルス。
【請求項９】
疾患を治療もしくは診断する、または疾患に対して免疫感作する薬剤または診断用剤を製造するための請求項１〜８のいずれかに記載の組換え動物ウイルスの使用であって、前記組換え動物ウイルスが、用量あたり１０6〜１０8未満の粒子範囲の低粒子数で治療対象に投与される使用。
【請求項１０】
前記組換え動物ウイルスが、用量あたり１０6〜１０8未満の粒子範囲の低粒子数で治療対象に投与される、遺伝子ターゲティングベクターとして使用するための請求項１〜８のいずれかに記載の組換え動物ウイルス。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の組換え動物ウイルスを形質導入した初代細胞。
【請求項１２】
ウイルスパッケージング配列、ＯＲＩSおよび／またはＯＲＩLを欠失するが、イントランスにおけるウイルスＤＮＡパッケージングのために必要で必須の、ベクターから除去された遺伝子を提供し、補完する、請求項１〜８のいずれかに記載の少なくとも１つの組換え動物ウイルスを有するパッケージング細胞系統。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それぞれ、動物、ヒトまたは分裂した初代細胞に外来遺伝子および核酸を診断的、治療的および予防的に送達するためのベクターとしての動物ヘルペスウイルスなどの動物ウイルスに関する。前記ウイルスを使用することによって、感染性疾患、自己免疫疾患および腫瘍疾患並びにアレルギーおよび遺伝性疾患の予防および治療を実施することができる。本発明は、さらに、インビトロおよびインビボにおいて初代ヒト細胞に組換え動物ウイルスを効率的に形質導入する手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワリセロウイルス属、アルファヘルペスウイルス亜科のメンバー（ＥＨＶ−１はアルファヘルペスウイルスである）である、ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）は、通常、ウマおよびウマ起源または齧歯類起源の細胞に感染し、複製する。通常、このウイルスによって誘導される疾患は軽度で、世界的にはウマの約９０％がこのウイルスを保有しており、動物中で長く生き残る。臨床症状は軽度の呼吸器疾患で、非常に稀に雌ロバの流産および神経疾患である1。
【０００３】
ＥＨＶ−１の１つの株、Ａｂ４ｐの全ＤＮＡ配列は決定されている。ＥＨＶ−１は、これまでに同定されている８つのウマヘルペスウイルスの１つである。ＥＨＶ−１およびその近親種、ＥＨＶ−４はワリセロウイルス属のメンバーであり、ＥＨＶ−３およびＥＨＶ−５〜ＥＨＶ−８としてアルファヘルペスウイルス亜科に属する。ＥＨＶ−２およびＥＨＶ−５はガンマヘルペスウイルス亜科であり、ウマ集団に広範に分布している1。ＥＨＶ−１、−４、−３、−５およびＥＨＶ−８は、組織特異性、ゲノム、組織化および遺伝子機能に関して密接に関連していると考えられている。ＥＨＶ−２およびＥＨＶ−８は、ガンマヘルペスウイルス亜科に属するが、ＥＨＶ−１、−４、−３、−５およびＥＨＶ−８と全体的なゲノム組織化および遺伝子機能の詳細な点の多くを共有している。
【０００４】
ヘルペスウイルスは、エンベロープを細胞膜に融合することによって標的細胞に侵入する。糖タンパク質は、このような感染の早期段階だけでなく、ビリオンの感染細胞からの流出および直接的な細胞間拡散（ｃｔｃｓ:cell-to-cell spread）に重要に関与する。これまでに、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）、原型アルファヘルペスウイルスの１１種の糖タンパク質（ｇ）が同定されており、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬおよびｇＭ3と命名されている。ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を比較すると、全ての既知のＨＳＶ−１糖タンパク質遺伝子がＥＨＶ−１に保存されていることが明らかになった。ＥＨＶ−１糖タンパク質は、ＨＳＶ−１糖タンパク質の命名法により命名されるが、ＥＨＶ−１は、ｇｐ２と呼ばれるさらに別のエンベロープタンパク質と、グリコシル化されていると報告されている、ＨＳＶ−１のＶＰ１３／１４相同物であるテグメントタンパク質とをコードする。アルファヘルペスウイルス亜科は遺伝子的には互いに密接に関連しており、同様の遺伝子を発現し、同様の機序で細胞に侵入するが、この過程並びに流出およびｃｔｃｓに関与するタンパク質はかなり異なる。例えば、ｇＤは、ＨＳＶ−１、ＥＨＶ−１およびウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）の侵入およびｃｔｃｓに絶対に必要とされているが、ワリセロウイルス属の原型メンバー、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ:varicella zoster virus）では欠失している4。ウイルス侵入の主要な段階は、（ｉ）ヘパリン−感受性および非感受性の結合、並びに（ii）ウイルスエンベロープと標的細胞の細胞膜との融合に分類することができる。ヘパリン感受性の結合、すなわち、ウイルスエンベロープと細胞表面のグリコサミノグリカンの相互作用によって媒介される一次結合は、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ:pseudorabies virus）、ＨＳＶ−１およびＥＨＶ−１のような数多くのアルファヘルペスウイルス亜科ではｇＣによって提供される。おそらく、ウイルスエンベロープおよび細胞膜の立体構造変化により、ｇＤと細胞受容体の相互作用によって提供される安定な結合が生じる。安定な結合後、ウイルスと宿主細胞の細胞膜の融合が生じる。この段階は、ＥＨＶ−１を含むアルファヘルペスウイルス亜科では、少なくともｇＢ、ｇＤ、およびｇＨ−ｇＬ複合体に関係する過程によって媒介される。しかし、正確な融合機序および融合細孔の形成は不明であり、「融合ペプチド」はまだ同定できていない。糖タンパク質はまた、少なくとも部分的に、アルファヘルペスウイルス亜科のインビボにおける制限された宿主指向性を、すなわち、動物ヘルペスウイルスが、共進化してきた宿主以外の種に感染できないことを決定すると思われる。
【０００５】
最近では、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローニングおよび突然変異の導入によって大型ヘルペスウイルスゲノムの操作が容易になった。この技法を使用して、ＥＨＶ−１を含む数種のヘルペスウイルスのゲノムが感染性ＢＡＣｓとしてクローニングされている7,8,9。ＢＡＣｓとしてクローニングされたヘルペスウイルスゲノムの標的突然変異およびランダム突然変異の迅速なプロトコールが使用されており、突然変異は、真核細胞におけるウイルスの増殖に依存せず、大腸菌(Escherichia coli)において実施することができる10。
【０００６】
ヒト遺伝子治療または免疫感作(immunization)に使用可能であると思われる数種のベクターが記載されてきた。これらにはＲＮＡおよびＤＮＡウイルスがある。最も一般的に使用されるベクターはレトロウイルス、ラブドウイルス(rhabodviruses)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）並びにＨＳＶ−１、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）を含むヒトヘルペスウイルスである。ＲＮＡウイルス、アデノウイルスまたはＡＡＶに関連する問題は、外来ＤＮＡをパッケージングする能力が限られていることであり、通常では鎖長＜５ｋｂｐのＤＮＡに制限される11。また、アデノ−またはＡＡウイルスの極めて高いウイルス価はヒト細胞の効率的な形質導入に必要であるが、患者におけるアレルギーまたは毒性反応のリスクを説明している12,13。ヒトヘルペスウイルスはサイズ＞１００ｋｂｐのＤＮＡをパッケージングすることができ、ＲＮＡ、アデノウイルスまたはＡＡＶ系に固有の低いパッケージング能力による限界は、ＨＳＶ−１、ＥＢＶまたはＨＣＭＶを使用することによって克服することができる。しかし、ヒトウイルスを使用する大きな欠点は、ほとんどの患者がそのようなウイルスによる感染および／またはワクチン化にすでに遭遇していることである14,15。
【発明の開示】
【０００７】
従って、本発明の課題は、遺伝子治療方法を成功させ、新規で、効果的な免疫感作スキームを確立する新規ベクター系を提供することである。
【０００８】
本発明の問題は、特許請求の範囲に規定する主題によって解決される。
【０００９】
本発明は、添付の図面を参照することによってより容易に理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において使用する「異種動物」という用語は、本発明によるベクターが感染可能であるが、当該ウイルスの天然宿主または最終宿主(dead-end host)ではない動物、またはその細胞集団をいう。
【００１１】
本明細書において使用する「ベクター」という用語は、動物およびヒトまたは単離したそれらの細胞集団に核酸を導入することができるウイルスまたはその誘導体をいう。
【００１２】
本明細書において使用する「複製能を欠損したＥＨＶ(replication-deficient EHV)」という用語は、例えば、ウイルスの複製に必須のゲノム配列の欠失によって、ウマまたは齧歯類起源などの通常は許容状態である細胞または細胞系統(permissive cells or cell lines)において複製しないという意味において遺伝的に改変されているＥＨＶ系ベクター(EHV based vector)をいう。
【００１３】
本明細書において使用する「複製能を有するＥＨＶ(replication-competent EHV」という用語は、許容細胞系統または初代細胞において複製能を有する組換えウイルスをいう。
【００１４】
本発明は、治療的、予防的または診断的遺伝子送達目的のための、ヒトを天然宿主または最終宿主として使用しない動物ウイルスの使用に関する。このようなウイルスは、ビルナウイルス科（例えば、ＩＢＤＶ、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス）、モノネガウイルス目（例えば、ニューカッスル病ウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、パラポックス、ヒツジ痘ウイルス、アビポックス）、コロナウイルス科（例えば、伝染性胃腸炎ウイルス、ＴＧＥＶ、鳥類伝染性気管支炎、ＡＩＢ）、アデノウイルス科（ウシ、ブタ、イヌアデノウイルス）およびヘルペスウイルス科（ウマヘルペスウイルス、ＥＨＶ）からなる限定するものではない群において見出される。従って、本発明は、ヒトを含む異種の種における普遍的なベクターとして使用するための、このような動物ウイルス、特に動物ヘルペスウイルス、さらに特にＥＨＶ−１などのウマヘルペスウイルスの可能性を調査する助けとなった。驚くべきことに、本発明者らは、インビトロおよびインビボにおいて、初代ヒト細胞を含む、多種多様の異種細胞において動物ヘルペスウイルスは、極めて低い粒子数で高い形質導入効率を示すことを見出した。注目すべきことに、（ｉ）ほとんどの動物ウイルスと同様にＥＨＶは、ヒト細胞のように天然の宿主でない異種生物中で複製しないこと、（ii）ＥＨＶは、本質的に、長時間持続する体液性免疫応答を誘導しないこと、さらに（iii）形質導入細胞または感染細胞において１つのＥＨＶタンパク質も発現しない組換えＥＨＶ由来ベクターを構築することができること、および（iv）最も関連のあるヒトヘルペスウイルスに対して高い抗体価を示すヒト血清はＥＨＶを中和しないことと合わせたこの特徴により、インビトロおよびインビボにおいて高い効率で、反復的な遺伝子送達を可能にするＥＨＶ由来ベクターおよび遺伝子送達方法を設計することができる。同時に、このような方法は、ベクターの免疫の誘導を回避する、さもなければ毒性、アレルギー性または自己免疫反応などの有害な副作用の誘導をレシピエントから回避する助けとなる。好ましいウイルス／細胞の組み合わせによると、ヘルペスウイルスはＥＨＶ−１であり、細胞は初代ヒト細胞である。さらに好ましくは、インビボにおいてヒトに遺伝子を送達するためのベクターとして組換えＥＨＶ−１を使用する。
【００１５】
本発明によると、異種動物およびヒトに遺伝子を送達することができるベクター系が提供される。
【００１６】
本発明の驚くべき態様は、インビトロおよびインビボにおいてＥＨＶは異なる種および初代組織由来の多種多様の細胞に侵入して、効率的に形質導入することができるということに関する。従って、種々の細胞系統の感染以外に、本発明者らは、ニワトリおよびウズラのような鳥類、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよびヒト細胞を含む脊椎動物起源の初代細胞の感染を証明することができた。
【００１７】
本発明の予想しなかった別の態様は、ＥＨＶはヒト細胞を含む試験した実質的に全ての細胞種に侵入し、細胞あたり約１００粒子に相当する１未満の感染単位(infectious unit)16,17が、変異型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）などのマーカー遺伝子の関心対象の細胞への導入に必要とされるということに関する。この態様は、最適な遺伝子送達の平衡を保つと同時に、ベクター免疫の誘導を低下するのに特に重要である。
【００１８】
本発明の予想しなかった別の所見は、例えば、ＥＧＦＰのＥＨＶ媒介性のＰＢＭＣｓへの遺伝子送達効率は、ＰＢＭＣｓを特異的に刺激することによってまたは例えば、ＣｏｎＡなどのマイトジェンを使用する非特異的な刺激によってかなり増加することができるということである。
【００１９】
本発明の別の態様は、マーカー導入遺伝子が、ＥＧＦＰを発現する組換えＥＨＶを感染させた後の刺激および未刺激の初代抹消血細胞中で効率的且つ長期間発現されるということに関する。
【００２０】
本発明の驚くべき別の態様は、感染細胞の上清において感染性子孫が存在しない場合におけるＥＧＦＰの長期発現によって証明されたように、マーカー導入遺伝子発現は、ヒトＣＤ４＋細胞系統ＭＴ４などの細胞において数継代にわたって比較的安定して維持されるということに関する。これらの細胞は、ＥＨＶにより溶解されないと思われ、いくつかの非許容細胞においてはＥＨＶゲノムのエピソームによる安定な維持によって生じる可能性が高い現象である、増殖性のウイルス複製を明らかに生じさせなかった。
【００２１】
予想しなかった別の所見は、そのウイルスに常に接触している実験室の職員を含むヒトにおいて中和作用のある抗ＥＨＶ−１抗体が存在しないこと、およびアルファヘルペスウイルス亜科グループの有名なメンバー、例えば、ＨＳＶ−１および２、ベータヘルペスウイルス亜科、例えば、ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）並びに例えば、エプスタイン−バーウイルスなどのガンマヘルペスウイルス亜科などの関連ヒトウイルスに対する高力価の抗血清による交差中和がないことであり、両所見は、免疫感作および遺伝子治療への適用のためのヒトの新規ベクターとして組換えＥＨＶを効率的に使用するために必要な要件を示している。別の所見は、ＥＨＶはインビボにおいてマウスの肺細胞に効率的に形質導入することができることである。ＥＧＦＰの発現は、低用量のＥＨＶの鼻腔内点滴後１２日より長い期間にわたって検出することができる。ＥＨＶのこのような特性により、系を、例えば、小型動物モデルにおけるインビボにおける治療適用の可能性の試験に利用することができる。
【００２２】
驚くべき別の態様は、ＥＨＶ系ベクターのインビボにおける投与は、中程度で、短時間の体液性応答を誘導するということにあり、これにより、形質導入または免疫感作の効率を大きく損失することなく反復適用が可能になる。
【００２３】
要約すると、ＥＨＶ系ベクターは、ヒトにおいて複製する、または少なくともヒトを最終宿主として使用するウイルス由来である現在使用されているベクターを上回る種々の利点を示す。これらの態様をＥＨＶの理論的なパッケージング能力と共に考慮し、外来遺伝子を発現するまたは外来核酸を含有する安全なベクターは、補完／パッケージング細胞系統でのみ増殖されうる条件付きで致死的な突然変異体を導入することによって構築することができることを考慮すると19、本発明によるＥＨＶベクター系をいくつかの異なる方法で調査することができる。
【００２４】
従って、本発明の一目的は、ヒトを宿主として使用せず、自己複製能を有するまたは欠損している、感染多重度１未満でインビトロにおいて天然宿主でない生物由来の初代細胞に形質導入する能力を有する組換え動物ウイルス、好ましくは、ビルナウイルス科（例えば、ＩＢＤＶ、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス）、モノネガウイルス目（例えば、ニューカッスル病ウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、パラポックス、ヒツジ痘ウイルス、アビポックス）、コロナウイルス科（例えば、伝染性胃腸炎ウイルス、ＴＧＥＶ、鳥類伝染性気管支炎、ＡＩＢ）、アデノウイルス科（ウシ、ブタ、イヌアデノウイルス）およびヘルペスウイルス科（ウマヘルペスウイルス、ＥＨＶ）に関する。好ましくは、本発明による組換え動物ウイルスは、約１０6〜１０8ｐｆｕの範囲の粒子数でインビボにおいて細胞に形質導入する能力をさらに有する。好ましくは、初代細胞はヒト由来である。本発明による組換え動物ウイルスは、好ましくは、導入遺伝子を含む。
【００２５】
本発明のさらに別の態様は、本発明による組換え動物ウイルスの薬剤または診断剤またはワクチンとしての、好ましくは遺伝子ターゲティングベクターとしての使用に関する。
【００２６】
本発明のさらに別の態様は、本発明による組換え動物ウイルスで形質導入した初代細胞に関する。
【００２７】
本発明によるこのような複製能力のあるまたは複製能力のない組換え動物ウイルスは、動物、例えば、細胞が由来する生物がそのウイルスの天然宿主でない、種々の起源の哺乳類細胞において組換えタンパク質を発現するために使用することができる。さらに、本発明によるこのような複製能力のあるまたは複製能力のない組換え動物ウイルスは、予防的または治療的目的で、例えば、ウイルス特異的または腫瘍特異的な免疫応答を誘導するために、または、抗原特異的な免疫寛容、アネルギーを形成するために、または、抗原特異的Ｂ細胞、Ｔ細胞もしくはその特異な(distinct)サブセットを枯渇させるために、動物、例えば、家畜もしくは愛玩動物またはヒトにおいてワクチンとして免疫感作方法に使用することができる。また、複製能力のあるまたは複製能力のない組換え動物ウイルス、例えば、ウマヘルペスウイルスは、細胞の、ウイルスのまたは任意の他の疾患に関連する遺伝子の発現を修復、代償または調節して、常染色体劣性遺伝的疾患、癌、自己免疫疾患または感染性疾患などの遺伝的疾患を治療するために、ヒトの体細胞遺伝子治療のためのベクターとして使用することができる。本発明によるこのような複製能力のあるまたは複製能力のない組換え動物ウイルスは、遺伝子組換え動物を作製するための遺伝子送達系としても使用することができる。さらに、本発明は、ワクチン化、感染性疾患、癌または自己免疫疾患により形成された抗原特異的Ｔ細胞応答を診断または追跡するために選択した抗原を発現する、本発明によるこのような複製能力のあるまたは複製能力のない組換え動物ウイルスの使用に関する。さらに、例えば、（ｉ）２つの既知のＥＨＶ  ＤＮＡ複製開始点であるＯＲＩsおよびＯＲＩLの一方と、（ii）上記適用のために、この場合では複製能力がない感染性のこのような組換えウマヘルペスウイルスを作製するために、パッケージング細胞系統からイントランスで提供される予め形成されたカプシドへ単位長さのウイルスＤＮＡを組込むために必要なパッケージング配列と、を含有する導入遺伝子構築物を少なくとも含有するキットを、本発明により構成することができる。さらに具体的には、このような試験キットにより、感染性および自己免疫疾患、癌並びにアレルギーの診断、予防、治療および治療モニタリングに関連するＢおよびＴ細胞エピトープである、異種または同系細胞において発現した、特異なポリペプチドを同定するために、導入遺伝子構築物への遺伝子ライブラリーのサブクローニングが可能になる。
【００２８】
複製能力のあるウイルスは、材料と方法に記載し、図１に例示するように構築することができる。簡単に説明すると、ＢＡＣクローニングおよび組換え技術を利用して、ウイルス増殖に影響を与えないで、またはウイルス増殖にわずかしか影響を与えないで、欠失されてもよい遺伝子内領域または非必須遺伝子に外来遺伝子またはＤＮＡ配列を完全または部分的に挿入またはそれと置換することができる。このような非必須遺伝子の例はｇｐ２、ｇＣ、ｇＥまたはｇＩ遺伝子である（１５）。
【００２９】
複製能力のないウイルスは、単独または組合せによりウイルス複製に必須である、例えば、ＥＨＶ−１遺伝子６４によってコードされる唯一の前初期遺伝子(immediate early gene)などの、いくつかのオープンリーディングフレームのＥＨＶゲノムからの欠失に基づくことができる。本質的には、ＥＨＶ−１は、それ自体並びに全ての非構造タンパク質および構造タンパク質の発現を調節する、１つだけの前初期（ＩＥ）トランス活性化因子を発現するので、このＩＥ遺伝子の欠失は、複製能力のないＥＨＶ−１を構築する非常に効率的な手段となる。この方法を使用すると、補完作用のある細胞系統にトランスフェクトし、そこで増殖することができる、最初は、ＩＥ遺伝子を除いた完全なＥＨＶ−１ゲノムを含有するＥＨＶ−１系ＢＡＣとして、ＥＨＶ−１由来ベクターを構築することができる。このような組換えＥＨＶ−１遺伝子ベクターは、例えば、ヒト起源の標的細胞に感染することができる。しかし、インビトロまたはインビボにおける標的細胞への侵入後は、ＥＨＶ−１由来でない異種プロモーター／エンハンサーの制御下にある導入遺伝子だけが発現され、抗ＥＨＶ−１免疫応答を完全に回避することができる。
【００３０】
遺伝子治療ベクターは、さらに、「無気力な(gut-less)」ＥＨＶの構築物によって開発することができる。このような無気力なＥＨＶ、好ましくはＥＨＶ−１由来ベクターは、本質的に、２つの既知のＥＨＶ  ＤＮＡ複製開始点であるＯＲＩSおよびＯＲＩLの一方２０−２２、並びに予め形成されたヌクレオカプシドへの単位長さのウイルスＤＮＡの組込みに必要なパッケージング（ｐａｃ）配列２２−２４を含有するＥＨＶ−１由来「レプリコン」ゲノムに基づいている。これらの突然変異体「レプリコン」ゲノムはまた、必須のヌクレオカプシド、テグメントまたはエンベロープ要素からなる遺伝子も含有し得る。このような「レプリコン」ゲノムは、ウイルスパッケージング配列、ＯＲＩSおよび／またはＯＲＩLを欠失するが、イントランスにおけるウイルスＤＮＡパッケージングのために必要で必須の、ベクターから除去された遺伝子を提供し、補完する突然変異体ＥＨＶ−１ゲノムを保有する細胞系統の助けによりパッケージングされ得る。これらの細胞系統はｐａｃ部位をコードしないので、「レプリコン」ゲノムだけがパッケージングされ、従って純粋な組換えウイルス集団を提供する。
【００３１】
パッケージング細胞系統はまた、種々の起源の安定な細胞系統の形態でも構築することができ、この場合には、複製能力を欠損するＥＨＶ−１由来の「レプリコン」ゲノムは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）由来のＯＲＩpを含有し、従って、ＥＢＶ由来のＥＢＮＡ−１タンパク質を発現するパッケージング娘細胞に分裂する。ＥＢＮＡ−１は、補完作用のある細胞系統によって、例えば、選択のためのＧ−４１８耐性を使用して、当該パッケージ細胞に遺伝子を導入後に安定に産生されうる。ＥＢＮＡ−１は、ＯＲＩpに結合することによって、ＥＨＶ−１由来の「レプリコン」ゲノムの分裂および子孫細胞への安定な維持を媒介する23。
【００３２】
標的細胞または標的組織における導入遺伝子情報の維持を延長するために、補完作用のあるパッケージングまたはプロデューサー細胞においてＥＨＶ、好ましくはＥＨＶ−１ベクター粒子にパッケージングされる「レプリコン」ゲノムにＥＨＶ「ＥＢＶ  ＯＲＩpおよびＥＢＮＡ−１  ＯＲＦを挿入することもできる。ＥＨＶベクターによる標的細胞または標的組織の形質導入が成功すると、導入遺伝子情報を含有するＥＨＶ由来の「レプリコン」ゲノムは、ＥＢＮＡ−１のＯＲＩpへの結合に媒介されて、有糸分裂中に娘細胞に分裂し、それによって形質導入された細胞の核にＥＨＶ由来の「レプリコン」ゲノムが長期間維持される。または、導入遺伝子情報の長期間の維持は、マトリックス結合部位（ＭＡＴ）をＥＨＶ由来レプリコンゲノムに挿入することによっても達成することができる。
【００３３】
本発明によるＥＨＶ由来ベクターの、ＥＨＶ糖タンパク質に関係のない特異的な細胞種への標的化が可能である。例えば、細胞へのＥＨＶ−１の結合は、ビリオンが細胞表面のグリコサミノグリカンにｇＣを介して結合することによって媒介される18。安定な結合および受容体結合は、これまで分析された全てのヘルペスウイルス科(Herpesvirinae)ではｇＤによって媒介されるが5、ウイルスエンベロープと細胞膜の融合は、ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ−ｇＬ複合体に関係するまだ未知の過程によって生ずる3,24。しかし、ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ−ｇＬが存在しない場合の、感染細胞からのウイルスの効率的な放出が証明されている25。
【００３４】
例として、シュードタイプＥＨＶベクターは数種の手段によって作製することができる。例えば、ウイルスゲノムからｇＢ、ｇＤおよびｇＨ−ｇＬそれぞれの単独または組み合わせを欠失させ、補完作用のあるそれぞれのパッケージング細胞系統を構築することによって、単一または多重欠失型のＥＨＶ−１を作製することができる。これらのウイルスは、「非感染性」ウイルスが放出される補完作用のない細胞に感染させるために使用することができる。表面に露出した膜受容体レベルで細胞種または組織特異性を媒介する、関心対象の受容体標的タンパク質、例えば、ｇｐ１２０／４１を、その細胞系統からのそれぞれの遺伝子の発現によって、このウイルスの子孫のエンベロープに挿入することができる。または、例えば、関心対象の受容体標的タンパク質によってＥＨＶ−１糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ−ｇＬの全てまたは一部を置換することによって、ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ−ｇＬコード領域を欠失するＥＨＶ−１系ＢＡＣゲノムを直接シュードタイプ化することもできる。次いで、受容体および共同受容体(coreseptor)と思われるものを発現する許容状態の産生細胞系統でこのようなウイルスを容易に産生することができる。ｇｐ１２０／４１シュードタイプウイルスの例では、受容体および共同受容体分子は、初代ヒトＣＤ４受容体およびヒト共同受容体、例えば、ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５である。必要に応じて、例えば、標的細胞におけるＥＨＶ由来の遺伝子産物の発現を回避するために、および／またはＥＨＶ由来ベクター（無気力なベクター）のパッケージングサイズを増加するために、ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ−ｇＬ以外に、ＩＥ遺伝子および／または他の遺伝子をウイルスゲノムから欠失させることができ、従って、上記パッケージングおよび産生細胞系統において補完される必要がある。
【００３５】
細胞種または組織特異性を媒介する受容体標的タンパク質は、種々の起源由来、例えば、（ｉ）ウイルス、例えば、シュードタイプレトロウイルスによるＣＤ４陽性細胞の特異的な形質導入を支持するＨＩＶ−１のｇｐ１２０／ｇｐ４１エンベロープタンパク質、（ii）密接な細胞間接触を天然に媒介することが既知の細胞受容体、（iii）異種の膜貫通ドメインを介してビリオン表面に固定されることによって、例えば、（例えば、選択されたケモカインの性質に応じて）抗原提示細胞、未処理のまたは記憶ＴまたはＢ細胞への接触を媒介することができる、補体成分またはケモカインなどの同族の細胞受容体を認識することが既知の可溶性リガンド、（iv）遺伝子工作した膜結合抗体、Ｆａｂ断片または１本鎖抗体などのそれらの代理物、ＰＳＴＩ（膵分泌性トリプシンインヒビター）の誘導体または例えば、ファージもしくはリボソームディスプレイ技術によって選択された任意の別の足場タンパク質、または（ｖ）受容体標的タンパク質もしくは膜融合媒介タンパク質の適当な部位に挿入された補完性決定領域または受容体相互作用決定因子を提示する部分などの由来であってもよい。さらに、例えば、ＥＨＶ−１ベクター粒子の標的細胞への効率的な融合および侵入は、独立して達成されてもよく、または、例えば、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質、ＭｏＭＬＶエンベロープタンパク質もしくはＧａＬＶエンベロープタンパク質など、完全もしくは部分的に非選択性の広宿主性(amphotropic)のウイルスエンベロープタンパク質の発現もしくは同時発現によって細胞種および組織特異的結合を助けてもよい。
【００３６】
例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターなどの非ＥＨＶベクターの送達にＥＨＶ由来ベクターを使用することができる。このようなハイブリッドＥＨＶベクターを構築するためには、ＥＨＶ由来ベクター粒子にパッケージングされるＥＨＶ由来の「レプリコン」ゲノムは、ＥＨＶ由来の「レプリコン」ゲノムの複製および補完作用のあるパッケージング細胞系統においてＥＨＶベクター粒子へのパッケージングに必要な最少情報以外に、導入遺伝子情報をコードするレトロまたはレンチウイルスの「レプリコン」ＤＮＡゲノムを少なくとも含有する必要がある。ＥＨＶ「レプリコン」ゲノムに挿入されるレトロまたはレンチウイルスの「レプリコン」ＤＮＡゲノムは、レトロまたはレンチウイルスＲＮＡレプリコンの作製、レトロまたはレンチウイルス粒子へのパッケージング、逆転写、レンチウイルス「レプリコン」ゲノムの核標的化および宿主細胞ゲノムへの導入並びに導入遺伝子の発現に必要な全てのシス作用型要素を少なくとも提供する必要が必ずある。感染性であるが、複製しないこのようなハイブリッドＥＨＶに基づいたベクター粒子は、ＧａｇＰｏｌなどのパッケージング機能および表面に露出した標的タンパク質、例えば、ＶＳＶ  Ｇタンパク質をイントランスで提供するレトロまたはレンチウイルスパッケージング細胞に感染させることによって、レトロまたはレンチウイルスベクター粒子を作製するために使用することができる。
【００３７】
または、レトロまたはレンチウイルスの「レプリコン」ＤＮＡゲノム以外に、ＥＨＶ由来のベクター粒子にパッケージングされるＥＨＶ由来の「レプリコン」ゲノムは、（ｉ）野生型またはコドン最適化したレトロまたはレンチウイルスｇａｇｐｏｌパッケージング遺伝子、および（ii）レトロまたはレンチウイルスベクターの細胞特異性を媒介する表面に露出した標的タンパク質をコードするオープンリーディングフレームも含有することができる。このような複合体ハイブリッドＥＨＶ系ベクター粒子も、レトロまたはレンチウイルスベクター粒子をインビトロにおいて作製するために使用することができる。このような複合体ハイブリッドＥＨＶ系ベクター粒子の好ましい使用は、インサイチューまたはインビボにおける使用であり、ハイブリッドＥＨＶ系ベクター粒子を細胞に感染させた結果、レトロまたはレンチウイルス粒子がインサイチューにおいて作製され、次いで導入遺伝子情報を宿主細胞ゲノムに組込むことによって標的細胞の安定な形質導入を可能にすると考えられる。
【００３８】
非ＥＨＶ−１由来ベクターを送達するための例えば、ＥＨＶ−１由来のベクターの使用の別の例は、アルファウイルス（例えば、セムリキ森林熱ウイルスＳＦＶ、シンドビスまたはベネズエラ脳炎ウイルスＶＥＥ）レプリコンの標的細胞への送達である。このようなアルファウイルス由来のレプリコンは、通常、アルファウイルスの非構造タンパク質をコードし、トランス活性化(transactivating)するアルファウイルスの非構造タンパク質によって制御される導入遺伝子の強力な細胞質転写に必要なアルファウイルスプロモーターとなる配列を含有する単位の核転写を誘導する、例えば、ウイルスの、細胞種−特異的または誘導性プロモーターによって調節される。転写単位におけるこれらの要素の順序の例は５’−ＣＭＶ−プロモーター／エンハンサー−アルファウイルス−非構造タンパク質−アルファウイルスプロモーター−導入遺伝子−３’である。このようなハイブリッドＥＨＶ−１ベクターを構築するためには、ＥＨＶ−１由来のベクター粒子にパッケージングされるＥＨＶ−１由来の「レプリコン」ゲノムは、ＥＨＶ−１由来の「レプリコン」ゲノムの複製および補完作用のあるパッケージング細胞系統におけるＥＨＶ−１ベクター粒子へのパッケージングに必要な最少情報以外に、導入遺伝子情報を含む上記アルファウイルスの「レプリコン」を少なくとも含有するべきである。
【００３９】
導入遺伝子情報の転写は、任意の異種の、例えば、ウイルス、細胞または任意の種類のハイブリッドプロモーター／エンハンサー単位によって誘導することができる。構成的な転写は、例えば、ウイルスのヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーター／エンハンサーもしくはアデノウイルス主要／後期プロモーター／エンハンサーなどの種々のウイルスプロモーター／エンハンサー要素またはアクチンプロモーターなどのハウスキーピング遺伝子の発現を誘導する細胞プロモーター／エンハンサー単位によって達成されうる。または、導入遺伝子発現の細胞種特異的標的化は、例えば、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ＭＨＣクラスＩまたはII分子、ＣＤ４受容体、インスリン、血液凝固カスケードの因子等などの発現を調節するものなどの細胞種または組織特異的なプロモーター／エンハンサー要素を使用することによって達成または支持されうる。または、例えば、ホルモン誘導性Ｐ／Ｅ要素などの誘導性プロモーター／エンハンサー要素または好ましくは、テトラサイクリンもしくはその類似物によって誘導されうるプロモーターエンハンサー単位を利用することができる。ＥＨＶ−１に基づいたベクターによって送達される転写単位は、例えば、診断的、予防的または治療的目的のためのポリペプチド、アプタマーもしくはイントラマー、リボザイム、アンチセンス構築物または短干渉性ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）などの種々の生物学的に活性な化合物をコードすることができる。このような組換えＥＨＶ−１由来のベクターによって単独または組み合わせて送達されるこのような生物学的に活性な分子は、免疫応答を誘導、増強および調節するため、免疫寛容を破壊もしくは誘導するため、アネルギーを誘導するためまたは特異的なＴもしくはＢ細胞またはそのサブセットを欠失させるために使用することができる。
【００４０】
従って、ＥＨＶ系ベクターは、診断的、予防的または治療的目的のために細胞培養物において任意の種類のポリペプチドを作製するために簡単に使用することができる。
【００４１】
または、ＥＨＶ由来のベクターは、ウマ以外の動物およびヒト起源の初代標的細胞またはウマ以外の動物およびヒト起源の細胞系統にインビトロおよびインビボにおいて感染または形質導入するために使用することができる。
【００４２】
半ビボにおいて選択し、作製し、操作し、培養することができるウマ以外の任意の動物およびヒト細胞系統または細胞集団がインビトロにおいて形質導入される対象の標的細胞となりえる。好ましくは、これらの細胞は、動物、例えば、家畜もしくはペットまたはヒトから単離した初代免疫細胞などの初代細胞であり、さらに好ましくは多能性前駆細胞、胚性幹細胞、骨髄系幹細胞、血液系幹細胞、造血幹細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはそれらの別個のサブセットもしくは誘導体である。最も好ましくは、これらの細胞は、それぞれ、Ｂ細胞、単球／マクロファージ系統の細胞、樹状細胞またはその誘導体などの抗原提示細胞である。または、これらの細胞は初代腫瘍細胞である。
【００４３】
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはネオマイシンなどの陽性もしくは陰性選択マーカーを使用して、または例えば、蛍光細胞分析法（ＦＡＣＳ）のためのＮＧＦＲなどの免疫学的マーカーまたはMilenyi BioTechもしくはDynal社製のような磁気ビーズ技術を使用する形質導入細胞の物理的濃縮を使用して、形質導入が成功した細胞を選択することができる。選択した細胞は自己増殖しても、またはさらに具体的には、抗原特異的Ｔ細胞などの免疫細胞を増殖するために使用することができる。形質導入した細胞は、例えば、細胞培養上清から分泌されるポリペプチドなどの成分を精製するために、培養でさらに増殖することができる。好ましくは、治療的または予防的目的のために、形質導入した細胞をヒト、愛玩動物、家畜または実験動物に再度導入することができる。
【００４４】
例えば、ＭＨＣクラス−Ｉおよびクラス−IIに制限されるＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞などの関連エピトープの免疫系への望ましい提示を実施するために、本発明による複製能力のあるまたは複製能力のない組換え動物ウイルスを使用した、好ましくは、細胞、好ましくは初代、最も好ましくは初代ヒト細胞の半ビボにおける形質導入を使用して、選択した疾患関連抗原、キメラまたはハイブリッドタンパク質、例えば、ウイルス抗原、腫瘍抗原を提示するエピトープまたはエピトープ列(strings)、自己免疫もしくはアレルギー反応の原因となる抗原またはエピトープを細胞、さらに具体的には抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞またはその誘導体にそれぞれ送達することができる。免疫応答の強度および種類の成果は、例えば、樹状細胞などの形質導入した細胞において、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに影響を与えるため、規定したサブユニットの免疫細胞を誘引するため、および免疫寛容を破壊するために、例えば、ＩＬ−２、ｇＩＦＮ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−６（単独または組み合わせて）などの選択したサイトカインおよび／または例えば、Ｒａｎｔｅｓ、ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１β、ＳＤＦ−１、ＳＬＣ、ＥＣＬ、ＢＣＡ−１、ＤＣ−ＣＫ１、ＩＰ−１０またはその誘導体（単独または組み合わせて）などのケモカインを、例えば、同時発現することによって影響され、調節されうる。別の方法としてまたは追加の方法として、免疫の誘導から例えば、アネルギーを誘導することによる末梢Ｔ細胞免疫寛容にスイッチするために、例えば、リーディングフレーム特異的リボザイム、アンチセンスＲＮＡｓまたはｓｉＲＮＡｓを同時転写することによって、同時刺激シグナル、例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ８０、ＣＤ８６などの細胞内シグナリングに関与する細胞表面受容体またはリガンドの発現レベルを形質導入した細胞において調節することができる。さらに、形質導入した細胞にｆａｓ／ｆａｓＬ系を使用することによって、抗原特異的Ｔ細胞を枯渇させ、表現型の上では免疫寛容を生じることができる。
【００４５】
または、本発明による複製能力のあるまたは複製能力のない組換え動物ウイルスを使用した細胞の半ビボにおける形質導入を、例えば、トランス優性ネガティブ突然変異体、分子デコイ、リボザイム、アンチセンス構築物またはｓｉＲＮＡｓを送達することによって、細胞、ウイルスまたは任意の他の疾患に関連する遺伝子の発現を修復、代償または調節して、常染色体劣性遺伝的疾患、癌、自己免疫疾患または感染性疾患などの遺伝的疾患を治療するために、ヒトの体細胞遺伝子治療のためのベクターとして使用することができる。さらに具体的には、例えば、マウスおよび家畜などの遺伝子組換え動物を作製するために、形質導入した胚性幹細胞を使用することができる。
【００４６】
初代ヒト細胞のインビトロにおける形質導入は、例えば、体液性、好ましくは細胞性の、例えば、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスII限定の、特にＣＤ４および／またはＣＤ８陽性Ｔ細胞応答を同定、具体化およびモニターするために、診断目的に使用することもできる。例えば、精製ＰＢＭＣｓ、好ましくは精製抗原提示細胞、最も好ましくは精製樹状細胞またはその誘導体は、免疫学的な標的タンパク質またはその誘導体を発現する複製能力のあるまたは複製能力のない組換えＥＨＶ−１に感染させることができる。または、全血試料に、関心対象の導入遺伝子を発現する組換えＥＨＶ−１による感受性細胞の感染を直接実施して、選択したエピトープの免疫細胞へのＭＨＣクラスIIおよび／またはＭＨＣクラスＩ限定提示を実施することができる。抗原特異的なＴ細胞のその後の刺激は、例えば、3Ｈチミジンもしくはブロモデソキシウリジンの取り込みによるＴ細胞増殖の測定、ELISPOTアッセイにおけるサイトカインおよびケモカイン産生細胞の定量などの種々の手段によって、または別の方法としてＦＡＣＳ分析によって、または標準的なクロム放出アッセイを構成することによってモニターすることができる。さらに、例えば、互いに異なる細胞集団からｃＤＮＡｓを取り出す結果として得られる遺伝子ライブラリーを複製能力のあるまたは複製能力のないＥＨＶ−１由来ベクターにクローニングしてベクター集団を作製し、次いでこれに上記に概略した手法による詳細な免疫学的分析を実施して、自己免疫疾患、腫瘍除去および感染性疾患の抑制に関与するＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスII制限Ｔ細胞を同定し、特徴づけることができる。
【００４７】
ヒト、ペットおよび家畜にＥＨＶ特異的な既存の免疫が存在しないことを利用し、例えば、初代ヒト細胞の低粒子数による効率的な感染を考慮することによって、本発明の別の好ましい実施態様は、予防的または治療的目的のために標的細胞に事前に半ビボ形質導入を行うことなく、ヒトまたは愛玩動物または家畜にインビボおよびインサイチューにおいてＥＨＶ−由来ベクターを直接投与することである。
【００４８】
特に、極めて低い感染多重度により、ＢおよびＴ細胞などの初代ヒト細胞の効率的な感染が可能になること並びにＭＯＩｓ＜１はインビトロにおいてヒト細胞系統に効果的に感染するのに十分であることを証明している本発明者らの所見は、ＥＨＶベクター粒子によるインビボにおける遺伝子送達は、アデノウイルス媒介性の遺伝子送達と比較して約１００〜５０００倍効率が良いことを強く示唆している。従って、ヒト、愛玩動物および家畜にインビボにおいて遺伝子を送達するためにこのような低粒子数（１０6〜１０8ｐｆｕ、アデノウイルスベクターと比較して、１００〜５０００倍低い）のＥＨＶ系ベクターを使用する利点は、例えば、アデノウイルスベクターと比較して、毒性の副作用、アレルギーまたは自己免疫疾患を誘導する可能性が低いことである。
【００４９】
このような比較的低い数のＥＨＶ−由来の複製能力のないベクター粒子は、そのウィルスベクターに対する免疫応答を少なくする。この事実を、それ自体が短命のＥＨＶ特異的体液性免疫応答と合わせて考慮すると、ベクターとして全く同じＥＨＶ株を使用して短い間隔で反復追加免疫投与を行うことができ、従って種々の抗原、遺伝子またはＤＮＡ配列を送達するための普遍的な搬送体としてＥＨＶ由来のベクターを使用することができる。
【００５０】
本発明による複製能力のない動物ウイルス由来のベクターの場合には、例えば、パッケージング後のＥＨＶレプリコンが、例えば、ＥＨＶがコードする全初期遺伝子を欠失する場合には、この効果はさらに拡大されうる６４。このようなＩＥ遺伝子を欠失するＥＨＶ由来ベクターは、ＥＨＶタンパク質を全く発現しないで標的細胞にインビボにおいて感染および形質導入することができるので、感染または形質導入が成功している細胞がＥＨＶ特異的な免疫応答により排除されない。
【００５１】
それ以外にも、ＥＨＶ由来のベクターは、ＰＢＭＣｓおよび腫瘍細胞などの分極していない細胞に主に形質導入する傾向を示す。
【００５２】
従って、半ビボにおける標的細胞の形質導入以外に、このような複製能力のあるまたは複製能力のない組換えウマヘルペスウイルスは、予防的または治療的な目的のために、例えば、ウイルスまたは腫瘍特異的な免疫応答を誘導するため、抗原特異的な免疫寛容を形成または破壊するため、抗原特異的なＢ細胞、Ｔ細胞または別個のサブセットを枯渇させるために、動物、例えば、愛玩動物および家畜のワクチンとして免疫感作方法においてインビボまたはインサイチューにおいて直接使用することもできる。
【００５３】
本発明によるこのような複製能力のあるまたは複製能力のない組換え動物ウイルスのインサイチューまたはインビボにおける直接投与は、例えば、ＭＨＣクラスＩおよびクラスII制限Ｔ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープなどの関連するエピトープを免疫系に好ましく提示するために、選択した疾患関連抗原、キメラまたはハイブリッドタンパク質、例えば、ウイルス抗原、腫瘍抗原を示すエピトープまたはエピトープ列(strings)、自己免疫またはアレルギー反応の原因となる抗原またはエピトープを免疫系、さらに具体的には抗原提示細胞、最も好ましくは樹状細胞またはその誘導体に送達することができる。免疫応答の強度および種類の成果は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに影響を与えるため、規定したサブユニットの免疫細胞を誘引するためおよび免疫寛容を破壊するために、例えば、ＩＬ−２、ｇＩＦＮ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−６（単独または組み合わせて）などの選択したサイトカインおよび／または例えば、Ｒａｎｔｅｓ、ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１β、ＳＤＦ−１、ＳＬＣ、ＥＣＬ、ＢＣＡ−１、ＤＣ−ＣＫ１、ＩＰ−１０またはその誘導体（単独または組み合わせて）などのケモカインを、例えば、同時発現することによって影響され、調節されうる。別の方法としてまたは追加の方法として、免疫の誘導から例えば、アネルギーを誘導することによる末梢Ｔ細胞免疫寛容にスイッチするために、例えば、リーディングフレーム特異的リボザイム、アンチセンスＲＮＡｓまたはｓｉＲＮＡｓを同時転写することによって、同時刺激シグナル、例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ８０、ＣＤ８６などの細胞内シグナリングに関与する細胞表面受容体またはリガンドの発現レベルを形質導入した細胞において調節することができる。さらに、形質導入した細胞にｆａｓ／ｆａｓＬ系を使用することによって、抗原特異的Ｔ細胞を枯渇させ、表現型の上では免疫寛容を生じることができる。
【００５４】
本発明による複製能力のあるまたは複製能力のない組換え動物ウイルスをヒトの体細胞遺伝子治療のベクターとしてインビボにおいて使用して、細胞、ウイルスまたは任意の他の疾患に関連する遺伝子の発現を修復、代償または調節して、常染色体劣性遺伝的疾患、癌、自己免疫疾患または感染性疾患などの遺伝的疾患を治療することができる。
【００５５】
望ましい抗原、トランス優性ネガティブ遺伝子突然変異体、リボザイム、アンチセンスＲＮＡｓまたはｓｉＲＮＡｓをレシピエントに送達するために異なる投与経路を使用することができる。送達経路の範囲は、（ｉ）例えば、肝細胞を形質導入するために複製能力のあるまたは複製能力のない組換えウマヘルペスウイルスを門脈に注射することによるインサイチュー投与、（ii）遺伝子を肺に送達するための吸入、（iii）例えば、粘膜応答を形成するための鼻腔内、直腸内または膣内投与、（iv）特異的な抗原提示細胞を標的とするための皮下または皮内注射、（ｖ）筋肉内投与、（vi）静脈内注射がある。
【００５６】
免疫系に抗原または核酸を送達する別の方法は、（ｉ）複製能力のあるまたは複製能力のない組換えウマヘルペスウイルスの感染後に細胞を封入化(encapsulate)すること、または（ii）封入化または別の方法で固定もしくは区画化した細胞に本発明による複製能力のあるまたは複製能力のない組換え動物ウイルスを感染させ、感染させた封入または固定したこのような細胞を、特定の器官に向けることによって全身的またはインサイチューにおいてレシピエントに投与することである。このような細胞は、（ｉ）本発明による感染性であるが、複製能力のない動物ウイルスの作製をサポートするパッケージング細胞であっても、または（ii）望ましい抗原の適当な発現および分泌を可能にする同質(syngenic)の遺伝子細胞、細胞集団または細胞系統であってもよい。
【００５７】
従って、例えば、導入遺伝子レポーターをコードするＤＮＡ配列をインビトロにおいてヒト以外の起源およびヒト起源の種々の細胞に送達するための普遍的なベクターとしてＥＨＶ−１が作用できるかどうかを分析することは本発明の目的の１つであった。さらに具体的には、本発明の一目的は、ＥＨＶ−１がインビトロおよびインビボにおける遺伝子の発現のための普遍的なベクターとして作用して、ヒト並びに最も重要な哺乳類および鳥類種の感染性疾患に対する免疫を形成することができるかどうかを分析することである。本発明の別の目的は、ＥＨＶ−１がヒトの抗腫瘍ワクチンとして使用できるかどうかを分析することである。さらに、ＥＨＶ−１由来ベクターが、遺伝子治療目的、遺伝子組換え動物の作製または診断目的のために大型のＤＮＡを用いて細胞を安定に形質導入するために使用できるかどうかを分析することは本発明の一目的であった。本発明の別の目的は、ＥＨＶ−１がインビトロにおける適用のためおよび種々の細胞種におけるマウス、ヒトまたは任意の他のゲノムのＢＡＣ／ＰＡＣライブラリーの機能的な試験のための普遍的なベクターとして使用できるかを分析することである23。
【００５８】
特に、高パッケージング能力、細胞あたり低いウイルス数においてのマーカー遺伝子の極めて効率的な送達、ヒト血清による中和がないこと、活発に複製する細胞において潜伏感染を樹立することができることおよびマウスモデルにおいてインビボにおいて効率的で、持続的な導入遺伝子発現を媒介することができることに関しては、ＥＨＶ−１は、診断的、予防的および治療的目的のために動物およびヒトにおいてベクターとして使用するための極めて有用な新規ツールであることを証明することができる。
【００５９】
体系的に使用し、適用すると、これまでは未知の特性を有する新規送達系を形成する、ヒト、愛玩動物および家畜のベクターとして使用されている他の系を上回るＥＨＶ−１の利点が数多くある。これらには、（１）極めて低い粒子数においてヒトなどの異種の種に非常に効率的に感染できること、（２）中和作用のある抗ＥＨＶ−１抗体がないことおよび（３）関連するヒトウイルスの交差−中和がないこと、（４）ＥＨＶ自体がごくわずかのベクター特異的免疫応答を誘導するが、（５）補完作用のある／パッケージング細胞系統において増殖することができ19、レシピエント細胞においてＥＨＶ由来タンパク質を１つも発現しない安全で、条件的致死性の突然変異体を作成することによってさらに低下することができること、（６）１００ｋｂｐをはるかに超えるＥＨＶ−１の理論的なパッケージング能力並びに外来核酸を発現または送達するＥＨＶ−１は小型の動物（齧歯類）モデルにおいて容易に試験することができること24が挙げられる。
【実施例】
【００６０】
本発明を実施するために、本発明者らは以下の材料と方法を使用した。
【００６１】
［材料］
〔ウイルスおよび細胞〕
非病原性ＥＨＶ−１ワクチン株ＲａｃＨ（継代２５６代、26）の誘導体を使用し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）で増殖したＲＫ１３細胞で増殖させた。全ての感染実験において、感染性ＢＡＣクローンｐＲａｃＨから再構成した非病原性ＲａｃＨウイルスを使用した（図１）。ｐＲａｃＨから再構成したウイルスは糖タンパク質ｇｐ２遺伝子（遺伝子７１）を欠失しており、ＨΔｇｐ２と名づけた7,8。対照ウイルスとして、ＧＦＰを発現するウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）、Schoenboeken株を使用した。ＢＨＶ−１の場合には、ウイルスは感染性ＢＡＣクローンｐＢＨＶ−１から再構成した。ｐＢＨＶ−１から再構成したＢＨＶ−１はＢＨＶ−１ΔｇＥと名づけ、ｇＥオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を欠失しており、その代わりにＧＦＰ発現カセットを含むミニＦプラスミドｐＨＡ２を挿入した。
【００６２】
ヒト細胞系統は、ＣＤ４＋Ｔ細胞系統ＭＴ４(MRC ARP017)、ヒト黒色腫細胞系統ＭｅＷｏ(ATCC HTB-65)、肝細胞癌細胞系統ＨｕＨ７(ATCC CCL-185)、腎臓癌細胞系統２９３(ATCC CRL-1573)、肺癌細胞系統Ｈ１２９９およびヒト子宮頚癌細胞系統ＨｅＬａ(ATCC CCL-2)であった。本発明者らはまた、ウシMadin Darbyウシ腎臓(MDBK、ATCC CCL-22)細胞、Madin Darbyイヌ腎臓(MDCK、ATCCCCL-34)、ネコ胚細胞（Insel Riemsの連邦動物ウイルス病研究センターの細胞系統コレクション、ＲＩＥ１３８）、ブタ腎臓細胞系統ＰＫ１５(ATCC CCL-33)並びに初代ニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）よびウズラ筋肉ＱＭ７を使用した27。細胞系統は、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭで維持した。初代ヒト、ブタ、ウシまたはウマ抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ:peripheral blood mononuclear cell）は以下のように調製した。１０ミリリッターの静脈血または臍帯血を、２％クエン酸ナトリウム溶液２ｍｌに採取した。ＰＢＭＣまたは臍帯幹細胞は、Ficoll（Histopaque（登録商標）、Sigma）を使用した密度勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣはリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＲＰＭＩ（Gibco-BRL）に懸濁させた。ＰＢＭＣは未処理のままか、またはＨΔｇｐ２もしくはＢＨＶ−１ΔｇＥウイルス接種の２４〜４８時間前に１ｍｌあたり５μｇの濃度のコンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）で刺激した。
【００６３】
［方法］
〔１段階増殖動態およびウイルス価測定〕
１段階増殖動態は、感染多重度(m.o.i.)３で２４ウェルプレートに接種した１×１０5細胞の感染後に測定した。ウイルスは氷上で２時間付着させ、次に３７℃において１時間の浸透期間をとった。時間シフト後示した時点において、感染体の上清を回収し、ＲＫ１３細胞（ＥＨＶ−１）またはＭＤＢＫ細胞（ＢＨＶ−１）で培養することによって両方の調製物のウイルス価を測定した。
【００６４】
〔間接的免疫蛍光およびフローサイトメトリー〕
間接的な免疫蛍光（ＩＦ）については、細胞を２４または６ウェルプレートで増殖し、その後ＧＦＰを発現するＨΔｇｐ２を種々のｍ．ｏ．ｉ．で感染させた。ＧＦＰの発現および種々の蛍光色素を結合させた二次抗体を用いて検出した抗体の結合は、倒立蛍光顕微鏡(Zeiss AxiovertおよびOlympus)によってまたはＦＡＣＳｃａｎ(Becton-Dickinson)を使用したフローサイトメトリーによって可視化した。ウイルス感染した細胞をＵ字型底の９６ウェルマイクロタイタープレートに移した（４×１０4細胞／ウェル）。種々のヒトＣＤマーカーに対するモノクローナル抗体（ｍａｂｓ）（抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ３１９、全ての抗体はDako社製）を添加して氷上で３０分間おき、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＡＬＥＸＡ５４３ヤギ抗マウスＩｇＧ結合物(Molecular Probes、米国)を添加して１５分間おいた。ＰＢＳでさらに２回洗浄してから、細胞を１００μｌのＰＢＳに懸濁させ、フローサイトメトリーで分析した（少なくとも５０００細胞／試料）28。
【００６５】
〔ウイルス中和アッセイ〕
１０〜１００ｐｆｕを含有するウイルス懸濁液を、高力価のＶＺＶ−、ＨＳＶ−１、ＨＣＭＶまたはＥＢＶ特異的抗体を含有するヒト抗血清を添加した１０％ＤＭＥＭ中で３７℃において１〜４時間インキュベーションした。対照は、ＥＨＶ−１抗体が陰性または陽性のウマまたはマウス血清を含んだ。ウイルス抗体混合物のトリプリケート試料をＲＫ１３細胞に添加し、３７℃において４８〜９６時間インキュベーションしてから、細胞変性効果を光学顕微鏡で分析した。
【００６６】
〔動物実験〕
エーテル麻酔後２×１０4感染単位のＥＨＶ−１（２０μｌ中）をＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７／ブラックに経鼻的に接種した18。点鼻後１〜１４日経過時に、マウスを犠牲にし、肺を切除し、ＧＦＰの発現についてインサイチューにおいて速やかに調査した。次いで、肺を液体窒素で急速冷凍し、薄片を調製した。ＧＦＰ蛍光信号の消光を回避するために固定しなかった。光学顕微鏡および蛍光結合部位によって肺切片を走査した。デジタルカメラ(Olympus)で写真を撮った。
【００６７】
［実施例１：ＥＨＶ−１は種々の起源の細胞系統に効率的に感染し、外来遺伝子を細胞に送達する］
ＥＨＶ−１はウマおよび齧歯類起源の細胞に効率的に感染し、複製することができることが以前に示されている。ＥＨＶ−１の増殖のための素材は、鼻上皮、肺、甲状腺および皮膚由来の初代ウマ細胞である18,26。また、ＥＨＶ−１株は、ウサギＲＫ１３細胞、マウスＬＭ細胞およびベビーハムスター腎臓ＢＨＫ−２１／Ｃ１３細胞において高力価まで増殖することが示されている1,26,29,30。外来遺伝子はこれらの細胞において種々のプロモーターの制御下で効率的に発現することも証明できた17,26,29,31。
【００６８】
本発明者らは、鳥類、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよび霊長類起源の細胞に感染させるために、ＨＣＭＶ前初期プロモーター／エンハンサーの制御下でＧＦＰを発現するｇｐ２−陰性ＥＨＶ−１  ＨΔｇｐ２の能力を調査することに関心を持った。本発明者らは、ＥＨＶ−１は鳥類、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよびヒト起源の細胞に効率的に侵入することを証明できた。蛍光顕微鏡によって分析するとき、ＣＥＣ、ＱＭ７、ＭＤＢＫ、ＰＫ１５、ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫ並びにヒト細胞系統ＭＴ４、ＨｅＬａ、ＨｕＨ７、２９３、Ｈ１２９９およびＭｅＷｏの場合には、２〜１００％の細胞は感染後２４時間からＧＦＰを発現することを示した（図２）。一方、感染性プラスミドｐＢＨＶ−１から回収したＢＨＶ−１ΔｇＥはウシ以外の起源の細胞に効率的に感染することができず、ＥＨＶ−１は、アルファヘルペスウイルス亜科のなかでも、ヒト細胞系統に感染するヒト以外の起源の独自の能力を有することを示している。
【００６９】
［実施例２：ＥＨＶ−１はブタおよびウシＰＢＭＣに効率的に感染する］
次の一連の実験では、本発明者らは、ＥＨＶ−１が重要な家畜種の抹消血から得られた初代細胞に侵入することができるかどうかを検討した。静脈血をウマ、ブタまたはウシから採取し、０．１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させた。ＥＨＶ−１の接種の結果、これらの種のＰＢＭＣの約０．５％がＧＦＰを発現していたが、ＣｏｎＡによる刺激の２４〜４８時間後に細胞に感染させた場合には、ＰＢＭＣの５〜２５％がＧＦＰを発現することが示された（図３）。他の種から単離したＰＢＭＣについて測定したとき、ウマにおけるＥＨＶ−１の溶菌感染部位および潜伏部位であることが記載されているウマＰＢＭＣはＨΔｇｐ２による感染に対して同様の感受性を示したことに注目することは興味深い。結果は、ＥＨＶ−１は家畜動物のＰＢＭＣに効率的に侵入することができることを証明した。一方、ＢＨＶ−１ΔｇＥは、刺激後または未刺激のＰＢＭＣにウイルスを添加後にＧＦＰを発現する細胞が存在しないことによって反映されるように、どちらの種のＰＢＭＣにも侵入できなかった。
【００７０】
［実施例３：ＥＨＶ−１はヒトＰＢＭＣおよび臍帯幹細胞に効率的に形質導入する］
他の種のＰＢＭＣがＥＨＶ−１によって形質導入されるかどうかに関する上記結果は非常に驚くべきである。従って、種々の男性および女性個体のＰＢＭＣ並びに男児および女児新生児の臍帯幹細胞をそれぞれ入手し、培養した。１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩまたはＣｏｎＡを含有する培地でＰＢＭＣまたは幹細胞を維持した。合計４人の個体のＰＢＭＣにＥＨＶ−１を感染させることができたことおよびＧＦＰの発現が生じたことを示すことができた。また、男児および女児胎児の幹細胞にＥＨＶ−１を使用して効率的に形質導入することができ、単離した幹細胞の１５％超がＧＦＰを発現した。ウマ、ブタおよびウシＰＢＭＣについて報告したように、ＣｏｎＡを使用してＰＢＭＣを２４時間刺激した場合には、感染およびＧＦＰ発現はより効果的であった（図４）。フローサイトメトリーで測定したとき、未刺激培養物ではＰＢＭＣの約１％がＥＨＶ−１で形質導入され、ＣｏｎＡ刺激した芽細胞の感染後２４時間経過時ではＰＢＭＣの最高２２％がＧＦＰ陽性であった。上記のように、ＢＨＶ−１ΔｇＥは刺激または未刺激ヒトＰＢＭＣに侵入できなかった。これらの結果および上記の結果は、ＥＨＶ−１は種々の起源の細胞系統に効率的に形質導入できることおよびＥＨＶ−１は高い効率でヒトＰＢＭＣに侵入できることを証明した。
【００７１】
［実施例４：ＥＨＶ−１は、ヒトＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ１１ｂ＋、およびＣＤ１９＋細胞への遺伝子導入を同様の効率で媒介する］
本発明者らは、次に、ＥＨＶ−１で形質導入したヒトＰＢＭＣの性質を同定しようとした。ＣｏｎＡで２４時間刺激したヒトＰＢＭＣまたは未刺激のヒトＰＢＭＣを１のｍ．ｏ．ｉ．で感染するためにＥＨＶ−１を使用した。細胞は、特異的なＣＤマーカーと共に感染後２４時間インキュベーションし、フローサイトメトリーを実施した。感染後２４時間経過時にＧＦＰを発現する細胞の表面でそれぞれの識別分子を検出することにより、二重標識細胞の出現によって証明するとき、ヒトＢリンパ球（ＣＤ１９＋）並びにＣＤ４＋およびＣＤ８＋ヒトＴリンパ球は、ＥＨＶ−１を使用して効率的に形質導入されたことを証明することができ、試験した表現型の各々の細胞の約１５〜２２％がマーカーＧＦＰ遺伝子を発現することが示された（図５）。また、ＧＦＰの発現は、懸濁培養で増殖させたＣＤ１１ｂ＋細胞（単球、顆粒球およびナチュラルキラー細胞）の約１０％において容易に検出された（図５）。さらに、ＣＤ４＋ＭＴ４細胞も高い効率で形質導入することができた（図６）。結果は、ＥＨＶ−１は、ＣｏｎＡで刺激した後の多種多様のヒトＰＢＭＣを、細胞あたり１００未満の粒子に等しい低いｍ．ｏ．ｉ．で形質導入することができたことを証明した1,18。
【００７２】
［実施例５：ＥＨＶ−１は、ヒトヘルペスウイルスに対して中和作用のある高力価の抗体を含有するヒト血清で中和されない］
ＥＨＶ−１をヒトワクチン化または遺伝子治療に使用するために、本発明者らは、アルファヘルペスウイルス亜科ＨＳＶ−１またはＶＺＶ並びにベータヘルペスウイルスＨＣＭＶおよびガンマヘルペスウイルスＥＢＶに対する高力価の抗体を含有する血清によってＥＨＶ−１が中和されるかどうかという疑問に対処した。また、通常ＥＨＶ−１を用いて研究している３人の研究者の血清を試験した。血清は５６℃において３０分間不活性化するかまたは未処理のままとし、１００μｌ中１００または１０ｐ．ｆ．ｕ．のＥＨＶ−１株ＲａｃＨまたはＨΔｇｐ２突然変異体ウイルスを、１００倍（ｌｏｇ２）希釈のヒト血清（１００μｌ）と共にＤＭＥＭ中で３７℃において４時間インキュベーションした。次いで、ウイルス抗血清混合物をＲＫ１３細胞と混合した。ヒト血清のどれにおいても、ＥＨＶ−１に対する中和活性は検出できず、最も低い血清希釈（１：４）およびわずか１０ｐ．ｆ．ｕ．のウイルスを使用した場合でも、完全な細胞変性効果が発生した（表１）。一方、ＲａｃＨ32で一旦免疫感作したマウスまたはウマ血清は、１０または１００ｐ．ｆ．ｕ．のＲａｃＨおよびＨΔｇｐ２を容易に中和し、１：１６〜１：２５６の力価を示した（表１）。ヒトヘルペスウイルスに対する高力価を含有しても、ＥＨＶ−１はヒト血清によって中和されないことをこれらの結果は証明した。また、実験条件下において両方の性別のヒトにＥＨＶ−１を持続的に接触させてもＥＨＶ−１特異的抗体力価を誘導しなかった。
【００７３】
［実施例６：ＥＨＶ−１によるインビボにおける効率的で、持続的な導入遺伝子発現］
新規に開発したベクターをワクチン化または遺伝子治療用途に適用するためには、インビボにおいてベクターが媒介して挿入した導入遺伝子の発現が必須である。従って、種々の遺伝的背景を有するマウスに２×１０4ＩＵのＥＨＶ−１を鼻腔内注入することによるＧＦＰのインビボにおける発現を評価した。鼻腔内適用後１日目から１２日目まで、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７／ブラックマウスの肺におけるＧＦＰ発現が容易に観察された。生体から切除直後に、肺を顕微鏡下でスクリーニングしたとき、高いレベルの自己蛍光を示した多数の領域を同定した（図５ａ）。薄片試料では、高いレベルのＧＦＰ発現が細気管支および肺胞の数多くの細胞において観察された。気道上皮における導入遺伝子の長期間の発現は、ベクターの適用後１２日目まで検出されたが、未処理の器官における上記に証明した観察を確認するものであった（図５ｂ）。非病原性で、遺伝的に弱毒化したウイルスを使用したので、ＧＦＰを発現するＥＨＶ−１ベクターを投与したマウスはどれも観察期間中疾患の徴候を全く示さなかったことを強調することは重要である。ＥＨＶ−１は、臨床症状を全く生じないで、ウマ以外の起源の細胞にインビボにおいて効率的に形質導入できることをこれらの結果は示した。上記の実施例を考慮すると、ウシ、ブタおよびヒトから単離した初代抹消血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）はＥＨＶ−１が効率的に感染できることを明確に証明している。ＥＨＶ−１のこの特性は、ＨＣＭＶ前初期プロモーター／エンハンサーの転写制御下において変異型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現する組換えウイルスを使用することによって示された。ヒトＰＢＭＣｓは、単離し、Ficoll濃度勾配で精製し、コンカナバリンＡで刺激した細胞の最高２５％の効率で感染されたが、未刺激の細胞は約０．５％〜２％が感染可能であった。種々の表現型マーカーを有する細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１１ｂ＋およびＣＤ１９＋）はほとんど同じ効率で感染された。また、１未満の感染多重度を使用すると、ＣＤ４＋ヒト細胞系統ＭＴ４、ヒト黒色細胞腫細胞系統ＭＥＷＯ、ヒト肝細胞癌細胞系統ＨｕＨ７、ヒト腎臓癌細胞２９３およびヒト子宮頚癌細胞系統ＨｅＬａの実質的に１００％はＥＨＶ−１で感染可能であった。感染細胞を感染後増殖させると、ＧＦＰ発現は連続する数継代で検出できた。しかし、細胞はウイルス感染後死滅せず、細胞培養上清への感染力の放出は観察されなかった。これらの結果は、非許容細胞における非溶菌性のＥＨＶ−１感染の樹立を示している。また、ＥＨＶ−１は、ブタ腎臓ＰＫ１５、ウシMadine Darby腎臓細胞（ＭＤＢＫ）、ネコ胚細胞（ＫＥ−Ｒ）、ニワトリ胚細胞およびウズラ筋肉細胞ＱＭ７に高い効率で侵入することができた。ＥＨＶ−１を含むヘルペスウイルスは高いパッケージング能力（＞１００ｋｂｐ）を示し、ＥＨＶ−１は複製中の細胞において潜伏感染を樹立することができるので、動物およびヒトにおける免疫感作、抗腫瘍治療、自己免疫疾患の治療および遺伝子治療に関して、外来核酸配列を予防的および治療的に送達するための普遍的なベクターとしてＥＨＶ−１を使用することが可能である。
【００７４】
［参照文献］
【表１Ａ】
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【表１Ｂ】
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【表１Ｃ】
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【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】ＥＨＶ−１  ＲａｃＨ  ＢＡＣ（ｐＲａｃＨ）の構築物を略図で例示する。約１５０ｋｂｐのＲａｃＨゲノムの編成を示す（Ａ）。ＢＡＣ配列が挿入されているおよび挿入されていないＲａｃＨゲノムの独自の短い領域のゲノムの編成を図示する（Ｂ）。ｂｐおよびｋｂｐのスケールおよび制限酵素部位を示す。Ｂ、ＢａｍＨＩ、Ｈ、ＨｉｎｄIII、Ｋ、ＫｐｎＩ、Ｐ、ＰａｃＩ、Ｓ、ＳｐｈＩ、Ｓｌ，ＳａｌＩ。
【図２】細胞あたり１の感染単位の付加後、ＨΔｇｐ２の感染後のヒト（ＭＴ４、ＭＥＷＯ、ＨｕＨ７）、ブタ（ＰＫ１５）およびウシ（ＭＤＢＫ）細胞系統の蛍光分析を示す。ＧＦＰ発現は、細胞種に関係なく、９０％を超える細胞において検出された。融合体の形成はＨΔｇｐ２−感染ＨｕＨ７およびＭＤＢＫ細胞において観察された。
【図３】形質導入した細胞のフローサイトメトリーデータを示す。ＥＨＶ−１  ＨΔｇｐ２を接種（細胞あたり０．５感染単位）した２４時間後のＣｏｎ  Ａ刺激したウシおよびブタＰＢＭＣのドットプロット分析を示す。ｍｏｃｋ接種細胞と比較すると、ＧＦＰの発現は、刺激したウシおよびブタＰＢＭＣの、それぞれ、８．１％および７．５％において検出できた。
【図４】同じく、形質導入した細胞のフローサイトメトリーデータを示す。細胞にＥＨＶ−１  ＨΔｇｐ２またはＢＨＶ−１ΔｇＥを接種した（細胞あたり０．５感染単位）２４時間経過時のＣｏｎＡ刺激したヒトＰＢＭＣのドットプロット分析を示す。ＨΔｇｐ２を使用した形質導入後では、１８．５％の細胞がＧＦＰ発現陽性であったが、ＢＨＶ−１ΔｇＥを接種したＰＢＭＣは０．５％未満が緑色蛍光を示した。
【図５】ＥＨＶ−１  ＨΔｇｐ２を接種した（細胞あたり０．５感染単位）２４時間経過時のＣｏｎＡ刺激したヒトＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析を示す。接種後、ＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ８−またはＣＤ１１ｂ−特異的モノクローナル抗体およびＡＬＥＸＡ５４６(Molecular Probes)二次ヤギ抗マウスＩｇＧ結合体を使用した間接的免疫蛍光法で細胞を染色した。赤色蛍光チャネルを使用して、ＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ８−またはＣＤ１１ｂが陽性の細胞クラスターをゲート化し、緑色蛍光チャネルのＧＦＰ発現について分析した。ヒストグラム分析によると、分析したＰＢＭＣ集団の１３．２％〜２２．９％がＧＦＰ発現陽性であった。緑色の蛍光を発するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、実質的に同じであった。
【図６】ＥＨＶ−１  ＨΔｇｐ２を接種した（細胞あたり０．５感染単位）２４時間経過時のヒトＣＤ４＋ＭＴ４細胞のフローサイトメトリーヒストグラム分析を図示する。ｍｏｃｋ形質導入した対照細胞と比較すると、ＨΔｇｐ２を接種したＭＴ４細胞の約７４％がＧＦＰ発現陽性であった。
【図６】マウスあたり１×１０4ＩＵを経鼻的に適用した２日経過時におけるマウス肺のＧＦＰ発現である。（Ａ）肺を切除し、速やかにＧＦＰ発現についてインサイチューにおいて走査した。倍率は１００倍である。（Ｂ）液体Ｎ2中で肺を急速冷凍した後のマウス肺の薄い切片である。肺は、ＧＦＰ発現を維持するために、固定および染色をしていない。上のパネルは、下のパネルに示す蛍光顕微鏡下の像の光学顕微鏡像を示す。細気管支（矢印の先端部）および肺胞（矢印）の細胞におけるＧＦＰの発現に注目されたい。倍率は２００倍である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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