(57)【要約】  本発明は、血液由来または関節由来の液体サンプル中のmiRNAの発現量を測定し、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患への罹患または病勢を判定するための検査方法を提供する。  前記発明は、経時的に採取された血液由来の液体サンプルを準備する準備工程と、前記サンプルから配列番号１〜５に示される少なくとも一つのmiRNAの発現量を測定する測定工程と、異なる採取時期の間で前記発現量を比較する比較工程とを含む免疫系の異常疾患及び／または関節異常疾患の病勢の判定を行う検査方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液または関節由来の液体サンプル中に含まれる配列番号１〜５からなる群から選択される少なくとも１つのmiRNAを指標とする、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の検出方法。
【請求項２】
経時的に採取された血液由来の液体サンプルまたは関節由来の液体サンプルを準備する準備工程と、
前記サンプルから配列番号１〜５に示される少なくとも一つのmiRNAの発現量を測定する測定工程と、
異なる採取時期の間で前記発現量を比較する比較工程とを含む、
免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の病勢の判定を行う検査方法。
【請求項３】
経時的に採取された血液由来の液体サンプルおよび関節由来の液体サンプルを準備する準備工程と、
それぞれのサンプルから配列番号１〜５に示される少なくとも一つのmiRNAの発現量を測定する測定工程と、
関節由来サンプルから得られた前記miRNAの発現量（Ea）と血液由来サンプルから得られた前記miRNAの発現量（Eb）との比（Ea/Eb）を異なる採取時期の間で比較する工程とを含む、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の病勢の判定を行う検査方法。
【請求項４】
血液由来の液体サンプル中、配列番号２に示されるmiRNAの発現量を測定する、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の罹患の判定を行う検査方法。
【請求項５】
関節由来の液体サンプル中、配列番号１、３、４および５からなる群から選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量を測定する、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の判別を行う検査方法。
【請求項６】
血液由来の液体サンプルが血漿であり、かつ、関節由来の液体サンプルが、関節液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
配列番号１〜５からなる群から選択されるmiRNAの発現量を分析することのできるプライマーまたはプローブの、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の検出用キットの製造への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液由来または関節由来の液体サンプル中のmiRNAの発現量を測定し、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患への罹患またはこれらの疾患の病勢を判定するための検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロRNA（以下miRNA）は約２２塩基長のタンパク質に翻訳されない小さなRNAである（非特許文献１）。miRNAはメッセンジャーRNAの3’UTRに結合することにより転写を制御し、細胞の代謝、臓器形成、悪性腫瘍などの多岐にわたって関連している。
血液中にはRNaseが存在し、RNAを付加しても即座に分解されるため、細胞成分を除去した血清または血漿中にRNAは存在しないと長年考えられていた。しかし近年、血清や血漿中で、miRNA-141が膀胱癌に特異的なマーカーとして示された（非特許文献２）。
一方で、一般に細胞中のmiRNAと細胞から放出されるmiRNAとは一致しないことが知られている（非特許文献３）。このため、細胞内や組織内で増加または低下しているmiRNAの血清または血漿中での変動量は不確実であるため、予測性に欠ける。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ambros V: microRNAs: tiny regulators with great potential. Cell 2001, 107:823-826.
【非特許文献２】Mitchell PS, et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A 2008, 105:10513-10518.
【非特許文献３】Valadi H, et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol 2007, 9:654-659.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の罹患を検出する方法（in vitro診断方法）を提供することにあり、更には、サンプルの採取管理が簡便であるだけでなく、高い精度で疾患の検査をすることができる検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、（１）血液由来の液体サンプル中の特定のmiRNAをマーカーとして免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の有無を検査できることを見出し、また、（２）関節由来の液体サンプル中においても特定のmiRNA群が存在していることを見出すとともに、これらのmiRNA群をマーカーとして免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患を判別できることを見出し、更に（３）血液由来の液体サンプル中の特定のmiRNA群によって、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の病勢を検査できることを見出し、特に（４）特定のmiRNA群について、関節由来液体サンプル中の濃度を血液由来液体サンプル中の濃度で除した比により、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の病勢を検査できることを見出し、本発明を完成した。本発明は以下を包括する。【０００６】
（１）血液または関節由来の液体サンプル中に含まれる配列番号１〜５からなる群から選択される少なくとも１つのmiRNAを指標とする、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の検出方法。
（２）経時的に採取された血液由来の液体サンプルまたは関節由来の液体サンプルを準備する準備工程と、前記サンプルから配列番号１〜５に示される少なくとも一つのmiRNAの発現量を測定する測定工程と、異なる採取時期の間で前記発現量を比較する比較工程とを含む免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の病勢の判定を行う検査方法。
（３）経時的に採取された血液由来の液体サンプルおよび関節由来の液体サンプルを準備する準備工程と、それぞれのサンプルから配列番号１〜５に示される少なくとも一つのmiRNAの発現量を測定する測定工程と、関節由来サンプルから得られた前記miRNAの発現量（Ea）と血液由来サンプルから得られた前記miRNAの発現量（Eb）との比（Ea/Eb）を異なる採取時期の間で比較する工程とを含む、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の病勢の判定を行う検査方法。
（４）血液由来の液体サンプル中、配列番号２に示されるmiRNAの発現量を測定する、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の罹患の判定を行う検査方法。
（５）関節由来の液体サンプル中、配列番号１、３、４および５からなる群から選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量を測定する、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の判別を行う検査方法。
（６）血液由来の液体サンプルが血漿であり、かつ、関節由来の液体サンプルが、関節液である、（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７）配列番号１〜５からなる群から選択されるmiRNAの発現量を分析することのできるプライマーまたはプローブの、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の検出用キットの製造への使用。
なお、本発明において、「液体サンプル」とは、採取物より細胞成分を取り除いた状態の液体を意味する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、細胞成分を除去したサンプルであっても高い精度で検査できるため、従来、細胞活性を保つために必要であった温度・時間管理を省略することができる。
また、滑膜組織や骨組織などの関節関連組織を採取せずに検査できるため、患者の苦痛および合併症の可能性を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】関節リウマチ患者（RA）および変形性関節症患者（OA）から採取した関節液中の配列番号１〜５のmiRNA濃度を示す。サンプル数はそれぞれの患者で３０ずつである。
【図２】血漿中の配列番号２のmiRNAを用いた関節リウマチ患者の判定または変形性関節症患者の判定のためのROC曲線とROC曲線下面積（AUC）を示す。サンプル数はそれぞれの群で３０ずつである。
【図３】関節リウマチ患者から採取した検体中の配列番号１〜５のmiRNAの血漿中発現量とTJC/DAS28との相関を示す。
【図４】関節リウマチ患者から採取した検体中の配列番号１〜５のmiRNAに関し、関節液/血漿miRNA比とTJCとの相関を示す。P値が0.1以下のものに対しては近似直線を示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明方法における、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の検出（in vitro診断）には、以下に限定されるものではないが、例えば、当該疾患の罹患の判定、当該疾患の判別、当該疾患の病勢の判定等が含まれる。
本発明では、下記表１に示す配列番号１〜５で表される配列からなるmiRNAから選択した少なくとも１つのmiRNAの、血液または関節由来の液体サンプル中での発現量を指標として、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患を検出する。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
血液由来の液体サンプルとしては、例えば、血清、血漿、血液由来細胞の培養上清（血液由来細胞を培養液中で培養して得られた上清）などが挙げられ、特に血漿からのサンプルが簡便性の観点から好ましい。これらの液体サンプルは、公知または慣用の方法で採取することができる。
【００１２】
関節由来の液体サンプルとしては、関節液上清、関節と関連する各種組織細胞（例えば、関節軟骨組織、滑膜組織、骨組織、靭帯組織、およびそれら由来の細胞）の培養上清（関節と関連する細胞を培養液中で培養して得られた上清）などを挙げることができ、特に、関節液上清が簡便性の観点から好ましい。これらの液体サンプルは、公知または慣用の方法で採取することができる。
【００１３】
検査可能な免疫系の異常疾患としては、例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、リウマチ熱、バゼドー病、橋本病、全身性エリテマトーデス、結節性動脈周囲炎、結節性多発動脈炎、混合性結合組織病、多発筋炎、皮膚筋炎、サルコイドーシス、強皮症、乾癬性関節炎、ベーチェット病、血清反応陰性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、リウマチ性多発筋痛症、自己免疫性肝炎、再発性多発軟骨炎、多発性硬化症、ウイルス感染、敗血症、シェーグレン症候群、抗リン脂質抗体症候群、成人still病、アミロイドーシスなどを挙げることができる。好ましくは関節リウマチ、若年性関節リウマチ、リウマチ熱が挙げられ、これらのうち、特に関節リウマチにおいて高い精度で検査することが可能である。なお、関節リウマチ、若年性関節リウマチは、関節の破壊を伴うことから、関節系異常疾患にも属する。
また、上記以外の検査可能な関節系異常疾患としては、例えば、変形性関節症、軟骨損傷、痛風、偽痛風、関節感染（化膿性関節炎）、骨系統疾患、骨折、関節内靭帯損傷、半月板損傷、捻挫、骨壊死、骨粗鬆症、シャルコー関節炎、骨軟骨腫瘍、軟部腫瘍などを挙げることができる。好ましくは変形性関節症、軟骨損傷、骨折、関節内靭帯損傷、半月板損傷、捻挫、骨壊死が挙げられ、これらのうち、特に変形性関節症において高い精度で検査することが可能である。
【００１４】
なお、本発明方法は、哺乳類全般に対して有用であり、哺乳類としては、例えば、ヒト、類人猿、げっ歯類、犬、猫、兎が挙げられ、特にヒトが望ましい。
【００１５】
本発明方法では、例えば、まず患者から得られた血液由来液体サンプルまたは関節由来液体サンプルからRNAを抽出する。RNAの抽出方法としてはグアニジン−塩化セシウム超遠心法や酸性フェノール法およびスピンカラム法などが挙げられる。
次いで血液由来液体サンプルまたは関節由来液体サンプルから得られたRNA中のmiRNAを検出する。検出方法は、miRNAの発現量を測定できるものである限り特に限定されないが、例えば、リアルタイムRT-PCR法、マイクロアレイ法などが挙げられる。これらの方法は、例えば、microRNA実験プロトコール 著  河府 和義  羊土社にその詳細が記載されている。
前記配列番号１〜５からなる群から選択されるmiRNAの発現量を分析することができるプライマーまたはプローブは、当業者であれば、これらの塩基配列に基づいて容易に設計し合成して使用することができる。
本発明のmiRNAの発現量の分析キットとしては、前記配列番号１〜５からなる群から選択されるmiRNAの発現量を分析することができるプライマーまたはプローブを少なくとも一つ以上含む。その他、測定系に合わせて、適宜、緩衝液や酵素などを含むことができる。
【００１６】
以下、本発明の具体的態様に沿って、本発明を更に説明する。
本発明では、第一の態様として、経時的に採取された血液または関節由来の液体サンプルを準備する準備工程と、前記サンプルから配列番号１〜５に示される少なくとも一つのmiRNAの発現量を測定する測定工程と、異なる採取時期間で前記発現量を比較する比較工程とを含む、免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の病勢の判定を行う検査方法が含まれる。
【００１７】
免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患を患っている患者においては、前記液体サンプル中の配列番号１〜５に示される少なくとも一つのmiRNAの発現量を経時的に測定し、異なる採取時期間で比較すると、その病勢と有意な相関関係が見出され、例えば、前記miRNAの発現量が減少するにつれて病勢が進行すると判断できる。なお、ここで「病勢」とは、その疾患の進行する勢いを意味しており、前記miRNAの発現量が経時的に減少するとその疾患はより悪化傾向にあることを示している。また、経時的なサンプル採取の間隔は、患者の病勢を判断する上で適宜設定することが可能であるが、例えば、採取間隔としては、例えば、７日〜１年間隔、好ましくは３０日〜１８０日間隔であってもよい。
【００１８】
本発明では、第二の態様として、前記配列番号１〜５に示される少なくとも一つのmiRNA（好ましくは配列番号１〜３）を利用した免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の病勢の判定を行う検査方法を包含する。この検査方法は、経時的に採取された血液由来の液体サンプルおよび関節由来の液体サンプルを準備する準備工程と、それぞれのサンプルから配列番号１〜５に示される少なくとも一つのmiRNAの発現量を測定する測定工程と、関節由来の液体サンプルから得られた前記miRNAの発現量（Ea）と血液由来の液体サンプルから得られた前記miRNAの発現量（Eb）との比（Ea/Eb）を採取時期間で比較する工程とを含んでいる。
【００１９】
第二の態様に係る検査方法では、前記発現量の比（Ea/Eb）を得るための各液体サンプルは、例えば７日以内、好ましくは１日以内に同じ患者から採取され、前記サンプル採取を経時的に（例えば、７日〜１年間隔、好ましくは３０日〜１８０日間隔）で行うことにより、その病勢と有意な相関関係が見出され、例えば、前記比（Ea/Eb）が高くなるにつれて病勢が進行すると判断できる。
第二の態様に係る検査方法においては、好ましくはmiRNAの発現量の比（Eb/Ea）は、前記miRNAの関節液中濃度と血漿中濃度との比であるのが好ましい。
【００２０】
本発明では、第三の態様として、被検者から採取した血液由来の液体サンプルにおいて、配列番号２に示されるmiRNAの発現量を測定して、免疫系の異常疾患（例えば関節リウマチ）及び／または関節系の異常疾患（例えば変形性関節症）の罹患の判定を行う検査方法を包含する。
この検査方法によれば、患者から採取した配列番号２のmiRNAの発現量と、健常者から採取した前記miRNAの発現量とを比較すると、後述する統計手法に従って閾値を決定することにより、患者の免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患の罹患の有無について有意な相関が示される。
より詳細には、例えば、被検者について、血漿中配列番号２のmiRNA濃度が閾値67pmol/L以下であった場合に、約84%の感度と約80%の特異度をもって、免疫系の異常疾患（例えば関節リウマチ）及び／または関節系の異常疾患（例えば変形性関節症）を有する状態であると判定することができる。なお、この閾値は例示であり、統計処理により適宜変動してもよい。
【００２１】
本発明では、第四の態様として、関節由来の液体サンプルにおいて、配列番号１、３、４および５からなる群から選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量を測定して、免疫系の異常疾患（例えば関節リウマチ）及び／または関節系の異常疾患（例えば変形性関節症）の判別を行う検査方法を包含する。
この検査方法によれば、被検者から採取した関節由来の液体サンプル中に存在する前記miRNAの発現量を測定し、後述する統計手法に従って閾値を決定することにより、被検者が免疫系の異常疾患及び／または関節系の異常疾患のいずれに罹患しているのかについて、有意な相関が示される。
例えば、関節リウマチに罹患している場合は、変形性関節症より前記miRNAの発現量が高くなる。従って、配列番号１、３、４および５のmiRNAは、それぞれ閾値が40pmol/L、11pmol/L、0.04pmol/L、2.5pmol/L以下で感度75%特異度78%、感度73%特異度72%、感度77%特異度70%、感度56%特異度80%で変形性関節症であると判別することができる。あるいは、関節リウマチの陽性値を、配列番号１、３、４および５のmiRNAに関して、それぞれ40pmol/L、11pmol/L、0.04pmol/L、2.5pmol/L以上とすると、それぞれ感度75%特異度78%、感度73%特異度72%、感度77%特異度70%、感度56%特異度80%で関節リウマチと判断することができる。なお、これらの閾値は例示であり、統計処理により適宜変動してもよい。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。【００２３】
[材料および方法]
（実験対象集団）
関節リウマチ患者および変形性関節症患者より末梢血および関節液を、健常人より末梢血をそれぞれ３０検体ずつ、京都大学大学院医学研究科医の倫理委員会の承認のもと取得した。末梢血はEDTA-2Kを含む試験管に採取した。【００２４】
（液体サンプルの調整）
細胞成分を取り除くため、末梢血および関節液は400gで7分間遠心分離し上清を解析まで-20℃で凍結保存した。【００２５】
（全RNAの抽出）
100μLの血漿または関節液上清に、酸性フェノール法を用いた試薬であるIsogen LS（日本ジーン社）を750μL加えてRNaseの活性を失活させた後、25fmolの合成したcel-miR-39を外部標準として加え懸濁液を得た。ついで、この懸濁液に更に200μLのクロロホルムを加えた後、12,000gで15分間遠心分離して300μLの液相を採取した。この液相よりHigh Pure miRNA Isolation Kit（ロッシュ社）を用いて全RNAを抽出した。【００２６】
（リアルタイムRT-PCR）
NCode VILO miRNA cDNA Synthesis Kit（Invitrogen社）にてcDNAを合成した後に、リアルタイムRT-PCRをABI Prism 7300 Sequence Detection System（Applied Biosystems社）、EXPRESS SYBR GreenER qPCR SuperMix（Invitrogen社）を用いて実施した。
使用したプライマーは以下の通りである：
hsa-miR-16, 5’-TAG-CAG-CAC-GTA-AAT-ATT-GGC-G-3’（配列番号６）
hsa-miR-132, 5’-TAA-CAG-TCT-ACA-GCC-ATG-GTC-G-3’（配列番号７）
hsa-miR-146a, 5’-TGA-GAA-CTG-AAT-TCC-ATG-GGT-T-3’（配列番号８）
hsa-miR-155, 5’-TTA-ATG-CTA-ATC-GTG-ATA-GGG-GTA-3’（配列番号９）
hsa-miR-223, 5’-TGT-CAG-TTT-GTC-AAA-TAC-CCC-A-3’（配列番号１０）
cel-miR-39, 5’-CGT-CAC-CGG-GTG-TAA-ATC-AGC-TTG-3’（配列番号１１）
リバースプライマーはNCode VILO miRNA cDNA Synthesis Kitの添付品を用いた。
各miRNAの発現レベルを定量するために、PCR産物をpTAC-1 vector（(株)バイオダイナミック研究所）に挿入したものを予め作成し、連続希釈物で標準曲線を作成した。各サンプルに既知の濃度で添加してあるcel-miR-39をもとに各サンプルのmiRNAの絶対濃度を計算した。【００２７】
（統計処理）
（１）関節リウマチ患者と変形性関節症患者の関節液中miRNAの濃度を両側t検定を用いて検定した。
（２）関節リウマチ患者と変形性関節症患者の血漿中miRNA濃度の両疾患間の違いを両側t検定を用いて検定した。
（３）関節リウマチ患者において、関節リウマチの病勢を示すTJC（疼痛関節数）、DAS28スコアに関し、（ａ）血漿中miRNA濃度、（ｂ）関節液中miRNA濃度、（ｃ）関節液中miRNA濃度を血漿中miRNA濃度で除した値（Ea/Eb）の相関について、それぞれピアソンの積率相関係数を用いて統計的に解析した。【００２８】
[結果]
図1に示すように、関節液中miR-16、miR-146a、miR-155およびmiR-223の濃度はp≦0.05で関節リウマチ患者が変形性関節症患者より高かった。関節リウマチの陽性値をそれぞれ40pmol/L、11pmol/L、0.04pmol/L、2.5pmol/L以上とすると、それぞれ感度75%特異度78%、感度73%特異度72%、感度77%特異度70%、感度56%特異度80%で関節リウマチと判断することができる。
図２に示すように、正常人由来の血漿中miR-132は関節リウマチ患者または変形性関節症患者より有意に高かった。また、陽性値を67pmol/L以下とした場合に、関節リウマチおよび変形性関節症それぞれに対して約84%の感度と約80%の特異度をもって、疾患を有する状態であると判定することができる。また、ROC曲線のAUCはそれぞれ0.90、0.91と高値であることからも優れた検査であることが示される。
図３に示すように、miR-16血漿中濃度は現在最もよく使われている関節リウマチの疾患活動性評価基準であるDAS28と相関した。miR-16、miR-132、miR-146a、miR-155、miR-223血漿中濃度はTJC（疼痛関節数）と相関が認められた。
図４に示すようにmiR-16、miR-132、miR-146aの関節液/血漿濃度比は、TJC（疼痛関節数）と相関が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明に係るmiRNAの血液由来または関節由来の液体サンプル中濃度を測定すると、免疫系及び／または関節系の異常疾患の有無の判定または病勢の判定を容易に行うことができる。そのため、スクリーニングとして本発明の検査を行い、陽性であった者に対して放射線被曝をともなうレントゲン撮影や追加の採血などの検査を行うことも考えられる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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