(57)【要約】  本明細書の開示は、単球、マクロファージ及びこれらの細胞由来の微小胞から選択される１種又は２種以上のキャリアであって、ＲＮＡを内包するキャリアを含む組成物を提供する。この組成物中のＲＮＡ内包キャリアは、生体内においてＲＮＡを安定して維持することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球、マクロファージ及びこれらの細胞由来の微小胞から選択される１種又は２種以上のキャリアであって、ＲＮＡを内包するキャリアを含む組成物。
【請求項２】
前記ＲＮＡは外来性ＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記外来性ＲＮＡは、マイクロＲＮＡを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記外来性ＲＮＡは抗腫瘍活性を有する、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
ヒトを含む動物の生体内へのＲＮＡデリバリー用である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
ＲＮＡを内包するキャリアの製造方法であって、
単球又はマクロファージにＲＮＡ又は当該ＲＮＡを発現するＤＮＡコンストラクトを導入する工程、
を備える、製造方法。
【請求項７】
さらに、以下の工程：
（ａ）前記ＲＮＡが導入された単球を培養してマクロファージに分化させる工程を備える、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
さらに、（ｂ）前記単球及び／又は前記マクロファージから微小胞を放出させる工程、を備える、請求項６又は７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００９年１０月２２日に出願された日本国出願特願２００９−２４３４６６に基づく優先権を主張するものであって、その全ての内容は引用により本願に組み込まれるものとする。本明細書の開示は、マイクロＲＮＡ等のＲＮＡの生体内へのデリバリーに適した組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｓｉＲＮＡやマイクロＲＮＡ等、ＲＮＡは核酸医薬として期待されている。一方、ＲＮＡは標的部位へのデリバリーにおいて課題があると考えられている。すなわち、生体内にはＲＮＡを分解するヌクレアーゼが豊富に存在するからである。ここで、ヌクレアーゼからの攻撃を回避するための方法として、リポゾームやナノポリマーなどに核酸を包理して投与することが挙げられる（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】２００５−２８１１４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、リポゾームは５ｎｍ〜２００ｎｍ程度であり、ＲＮＡを包理したとしても、マクロファージに取り込まれて分解されてしまう。また、リポゾーム等はアレルギー反応を誘起するほか、肝臓や腎臓などへの障害が生じるおそれもある。こうしたことから、機能的ＲＮＡの実質的な投与量は制限されたものとなり、十分な効果を期待できないのが現状であった。【０００５】
そこで、本明細書の開示は、ＲＮＡの新規なデリバリーシステムを提供し、併せてその利用を図ることを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、白血球の一種である単球に着目した。すなわち、患者から採取した単球に目的のＲＮＡを導入し、導入後の単球や単球を分化させたマクロファージやこれらの培養上清に得られる微小胞（Shedding microvesicle（ＳＭＶ））を投与することで上記課題を解決できることを見出した。本明細書の開示によれば、以下の手段が提供される。【０００７】
本明細書の開示によれば、単球、マクロファージ及びこれらの細胞の微小胞から選択される１種又は２種以上のキャリアであって、ＲＮＡを内包するキャリアを含む組成物が提供される。前記ＲＮＡは外来性ＲＮＡであってもよく、当該外来性ＲＮＡは、マイクロＲＮＡを含んでいてもよい。前記外来ＲＮＡは抗腫瘍活性を有しているものであってもよく、こうした組成物は、抗腫瘍組成物として用いることができる。また、こうした組成物は、ヒトを含む動物の生体内へのＲＮＡデリバリー用である、組成物であってもよい。【０００８】
本明細書の開示によれば、単球又はマクロファージにＲＮＡ又は当該ＲＮＡを発現するＤＮＡコンストラクトを導入する工程、を備える、ＲＮＡ内包キャリアの製造方法が提供される。前記製造方法は、さらに、以下の工程：
（ａ）前記ＲＮＡが導入された単球を培養してマクロファージに分化させる工程を備えていてもよい。さらに、前記製造方法は、（ｂ）前記単球及び／又は前記マクロファージから微小胞を放出させる工程、を備えていてもよい。前記製造方法は、抗腫瘍組成物の製造方法であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本明細書の開示のＲＮＡ内包キャリアによるＲＮＡのデリバリーの概要を示す図である。
【図２】ヒト単球白血病細胞ＴＨＰ−１における導入ｍｉＲ−１４３量を比較する図である。
【図３】ｍｉＲ−１４３が導入された細胞を血清飢餓培養したときの培養上清から超遠心により微小胞を濃縮した沈殿物におけるｍｉＲ−１４３量の測定結果を示す図である。
【図４】ｍｉＲ−１４３が導入された細胞を血清飢餓培養したときの培養上清から超遠心により微小胞を濃縮した沈殿物におけるＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ及びＡＣＴＢ遺伝子のｍＲＮＡの測定結果を示す図である。
【図５】培養上清から超遠心で濃縮された微小胞の電子顕微鏡写真を示す図である。
【図６】担癌ヌードマウスの腫瘍部位におけるｍｉＲ−１４３量の測定結果を示す図である。
【図７】Ｋ５６２細胞に導入したｍｉＲＮＡ−１４３の濃度と微小胞におけるｍｉＲＮＡ−１４３の濃度との関係を示す図である。
【図８】Ｃｙ５でラベルしたｍｉＲＮＡ−１４３ＢＰを導入したＴＨＰ−１細胞の細胞内（ａ）ＴＨＰ−１細胞外（ｂ）の免疫電子顕微鏡写真を示す図である。
【図９】ｍｉＲＮＡ−１４３ＢＰを導入したＴＨＰ−１細胞を投与した担癌マウスにおけるｍｉＲＮＡ−１４３ＢＰの組織（腎臓）への蓄積を示す図である。
【図１０】ｍｉＲＮＡ−１４３ＢＰを導入したＴＨＰ−１細胞を投与した担癌マウスにおけるｍｉＲＮＡ−１４３ＢＰの血中濃度の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書の開示は、単球、マクロファージ及びこれらの細胞由来の微小胞から選択される１種又は２種以上のキャリアであって、ＲＮＡを内包するキャリアを含む組成物及びかかるＲＮＡ内包キャリアの製造方法に関する。本明細書に開示される組成物は、かかるＲＮＡ内包キャリアを含有していることにより、投与された生体内においてマクロファージやヌクレアーゼによる分解を免れる。このため、より高濃度でＲＮＡが生体内において存在されうる。また、これらのキャリアは、生体由来であるため、リポソーム等に生じうる副作用が回避される。さらに、これらのキャリアが取得源たる個体において単球が記憶している異物認識能を維持しうるとき、この個体に再度投与するときには、キャリアに内包されるＲＮＡが異物までデリバリーされうる。特に、微小胞は、ヌクレアーゼに対して安定で全身に血流によって分布される点において好ましいキャリアである。
【００１１】
本明細書において単球とは、マクロファージ系細胞のマクロファージに分化する前の段階にある細胞であって、生体においては主として血液中に存在しうる細胞を意味している。単核球ともいう。本明細書において単球というとき、単球に分化する前の単芽球及び前単球をその一部に含んでいてもよい。単球は、抗原提示作用、付着性及び食作用を有しうる。本明細書においてマクロファージとは、単球から分化して貪食能を有する食細胞を意味している。マクロファージは、抗原提示作用、付着性、運動性、誤って分化した腫瘍細胞などの細胞傷害作用を有しうる。また、本明細書において、単球及びマクロファージは、樹状細胞を包含しない。
【００１２】
図１に、本明細書に開示される組成物を用いたＲＮＡのデリバリーの概要について示す。本明細書に開示されるＲＮＡのデリバリーは、単球、マクロファージ及びこれらの細胞の膜に由来する微小胞をＲＮＡのパッケージングキャリアとして用いるものである。これらの細胞、特に、単球及びマクロファージは、それ自体生体内の免疫系で標的部位等にまでデリバリーするビヒクルでありＲＮＡを内胞するパッケージングするキャリアであるとともに、ＲＮＡを内包する微小胞を放出する機能を有していると推測される。また、特に、微小胞は、ＲＮＡを内包して標的に送達する機能を有していると推測される。
【００１３】
図１に示すように、ＲＮＡ内包キャリアは各種形態を採ることができる。ＲＮＡ等が導入された単球及び当該単球が分化誘導されて得られるマクロファージ、ＲＮＡ等が導入されたマクロファージ、並びに、こられの単球及びマクロファージから放出される微小胞が挙げられる。ＲＮＡ内包キャリア組成物は、これらの各種形態のＲＮＡ内包キャリアから選択される１種のみを含んでいてもよいし、２種以上を組み合わせて含んでいてもよい。
【００１４】
本明細書において微小胞とは、外来ＲＮＡを導入した単球又は当該単球を分化させて得られるマクロファージの培養上清に得られる小胞を意味している。これらの小胞は、単球やマクロファージの生体膜から生成されうる。こうした小胞は、shedding microvesicle（ＳＭＶ、分泌微小胞）のほかエクソゾーム（exosome）を包含しうる。ここで、ＳＭＶは、細胞膜から直接萌芽する小胞である。ＳＭＶは、単球やマクロファージなど各種細胞から萌芽すると考えられている。この粒子は、略球状の膜構構造を有していてもよい。
【００１５】
（ＲＮＡ内包キャリア含有組成物）
以下の説明において、単球、マクロファージ及びこれらの細胞由来の微小胞から選択される１種又は２種以上の粒子（キャリア）であって、外来性であってもよいＲＮＡを内包する粒子（キャリア）を、ＲＮＡ内包キャリアというものとする。
【００１６】
単球及びマクロファージは、生物個体から採取した細胞のほか、培養細胞であってもよく、また、ｉＰＳ細胞や幹細胞から分化させて取得したものであってもよい。単球は、生物個体、具体的には、ヒトなどの哺乳類の血液から公知の方法により採取することができる。マクロファージは、採取した単球を、公知の方法で分化させてマクロファージとして取得することができるほか、哺乳類などの組織から採取することができる。単球をマクロファージに分化させるには、例えば、ＴＰＡ及びある種のサイトカインで刺激するなどの方法が挙げられる。微小胞は、単球及び／又はマクロファージ培養した上清画分から取得することができる。微小胞は、培養上清の電子顕微鏡観察のほか、ｔｓｇ１０１タンパク質をウエスタンブロットで検出することなどにより確認することができる。
【００１７】
単球、マクロファージ及び微小胞の由来は特に問わないが、生物個体に投与することを考慮すると、拒絶反応を抑制する観点から、異種細胞よりも同種細胞であることが好ましく、他家細胞であるよりも自家細胞であることが好ましい。例えば、本組成物を、予防・治療用として用いる場合には、細胞取得源は、予防・治療対象個体（患者等）とすることが好ましい。
【００１８】
本明細書においてＲＮＡは、リボヌクレオチドがホスホジエステル結合で連結されたポリマーを意味している。なお、ＲＮＡは、公知のヌクレオチドアナログによって全体又は一部が構成されていてもよい。また、ヌクレアーゼ等による分解を回避又は抑制するために、何らかの修飾がなされていてもよい。キャリアに内包されるＲＮＡとしては、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡ以外のノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ等が挙げられる。ｎｃＲＮＡとしては、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡが挙げられる。また、これらのＲＮＡに相補的な塩基配列を有するＲＮＡも挙げられる。こうしたＲＮＡは、通常、公知の核酸合成法により人工的に取得できる。さらに、ＲＮＡとしては、こうしたＲＮＡを細胞内で発現可能に構成されたＤＮＡコンストラクトであってもよい。
【００１９】
本組成物は、こうしたＲＮＡをヒトを含む動物の体内へ導入用として用いることができる。また、特に、組織デリバリー用として用いるとができる。例えば、ＲＮＡとして、各種疾患の発症に関連するあるいはその可能性のあるマイクロＲＮＡを用いることで、例えば、こうしたＲＮＡ内包キャリアを含む組成物を動物等に投与することで、当該マイクロＲＮＡの機能研究や発症プロセスなどの研究や試験用の個体を得ることができる。また、疾患関連ＲＮＡの相補的な塩基配列を有するＲＮＡを内包するＲＮＡ内包キャリア組成物は、こうした疾患の予防・治療又はその試験研究に用いることができる。
【００２０】
疾患の予防又は治療に関連するあるいはその可能性のあるマイクロＲＮＡを用いることで、こうしたＲＮＡ内包キャリア含有組成物をヒトなど動物に投与することで、予防・治療又はその試験研究に用いることができる。この態様において、マイクロＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｌｅｔ−７等が好ましく用いられる。
【００２１】
生体に対して、本組成物を投与するには、静脈投与等の脈管経由の投与のほか、組織に対して経皮的に注入投与することもできるし、切開を伴って投与することもできる。
【００２２】
ＲＮＡ内包キャリアにおけるＲＮＡは、単球等の細胞の取得源である生物個体において本来的に存在するＲＮＡであってもよいし、当該生物個体において本来的に存在しえない異種ないし人工的なＲＮＡであってもよい。また、ＲＮＡは、取得源に本来的であるかどうかに関わらず、外部から導入した外来性のものであってもよい。
【００２３】
（ＲＮＡ内包キャリアの製造）
ＲＮＡ内包キャリアを取得するには、例えば、採取若しくは前駆細胞を分化させることで取得した単球又はマクロファージに公知の方法でＲＮＡあるいは転写産物としてＲＮＡを生成可能なＤＮＡコンストラクトを導入する。ＲＮＡやＤＮＡ等の核酸をこうした細胞に導入するには各種方法が挙げられる。例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。なお、ＲＮＡ内包キャリアとして、ＲＮＡを内包するマクロファージを得るには、単球にＲＮＡや当該ＲＮＡを発現するＤＮＡコンストラクトを導入し、その後、マクロファージに分化させてもよい。
【００２４】
ＲＮＡ内包キャリアとしてのＲＮＡを内包する微小胞は、ＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクトが導入された単球又はマクロファージを培養するとき、その培養上清に取得することができる。単球又はマクロファージを培養することで、微小胞が放出される。なお、微小胞は、単球やマクロファージを血清飢餓培養することにより、その放出が促進される。また、モネシン（カルシウムイオネート）処理も採用することもできる。
【００２５】
ＲＮＡ内包キャリアは、単球、マクロファージ及び微小胞から選択される１種又は２種以上のキャリアにＲＮＡを含み、これらのいずれかのキャリアに目的とするＲＮＡが含まれていればよい。また、ＲＮＡ内包キャリア含有組成物は、少なくとも１種のＲＮＡ内包キャリアを含んでいればよく、他のキャリアを含んでいる場合であっても、当該他のキャリアがＲＮＡを内包していなくてもよい。
【実施例】
【００２６】
以下、本明細書の開示を実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本明細書の開示を限定するものではない。
【実施例１】
【００２７】
本実施例では、ヒト単球白血病細胞ＴＨＰ−１の分化誘導前後の細胞Ｄ（−）及びＤ（＋）をそれぞれ準備した。なお、分化誘導にあたっては、２０〜１６０ｎＭの範囲のＴＰＡを培地に添加して用いた。これらの細胞に、ｍｉＲ−１４３をリポソーム（liofectamine、Invitrogen社）を用いて導入し、１８時間培養後、各培養液の細胞画分に見出されるｍｉＲ−１４３の量を確認した。具体的には、リポソーム中にｍｉＲ−１４３を４０ｎＭを包理させてして導入し、培養は、１０％仔牛血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地で行った。なお、ｍｉＲ−１４３の検出は、リアルタイムＰＲを用いて行った。結果を図２に示す。【００２８】
図２に示すように、ＴＨＰ−１ Ｄ（−）単球細胞に対して、リポソームを用いることでマイクロＲＮＡが細胞内に導入されること、また分化前の細胞に比べて分化後のＴＨＰ−１ Ｄ（＋）にマイクロＲＮＡを導入すると、より多くのｍｉＲ−１４３が細胞画分に導入保持されることがわかった。このことは、単球を分化させることにより、単球はマクロファージとなるが、マクロファージは単球よりも多くのＲＮＡを細胞内に保持することができることを支持した。【００２９】
さらに、培養後のＴＨＰ−１ Ｄ（＋）を血清なしの血清飢餓培養条件で２４時間培養後、培養上清を採取して、３０００ｒｐｍで３０分遠心後、その上清をさらに５〜１０万ｒｐｍで３時間超遠心を行い、チューブ壁に付着した微小胞を回収した。この小胞の浮遊液につき、ｍｉＲ−１４３、細胞質マーカータンパク質遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子及び細胞骨格タンパク質遺伝子であるＡＣＴＢ遺伝子を測定した。血清飢餓培養は、血清フリーのＲＰＭＩ １６４０培地を用いて２４〜２８時間行った。ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２２、ＧＡＰＤＨ遺伝子及びＡＣＴＢ遺伝子は、それぞれリアルタイムＰＣＲで測定した。結果を図３及び図４に示す。【００３０】
図３及び図４に示すように、ＴＨＰ−１ Ｄ（＋）にｍｉＲ−１４３を導入して飢餓条件で培養すると、培養上清に分泌された微小胞中のｍｉＲ−１４３がその導入濃度依存的に増大していることがわかった。ｍｉＲ−１４３は、ＴＨＰ−１ Ｄ（＋）細胞に本来的に内在するｍｉＲ−２２に対する相対量として増大しているため、微小胞中のｍｉＲ−１４３であると考えられた。また、同じ試料につき、Betha-Actin、GAPDHなどの内部標準になる遺伝子のｍＲＮＡ量につき測定した結果によれば、コントロールをはじめ、すべての試料にほぼ同量含有されており、ｍｉＲ−１４３以外のＲＮＡも存在していることが示された。このことは、超遠心後のサンプルには、細胞の死骸やその断片でなく、活性のある小胞が主成分であることを支持していた。【００３１】
また、培養上清を超遠心した取得した微小胞の電子顕微鏡写真を図５に示す。図５に示すように、ＳＭＶ様の微小胞が観察された。
【実施例２】
【００３２】
本実施例では、ヒト大腸癌を担癌させたヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ系、日本チャールズリバー社）に、ｍｉＲ−１４３がリポソームを介して導入された単球を静脈投与し、組織におけるｍｉＲ−１４３量を確認した。すなわち、ヒト大腸癌ＤＬＤ−１細胞を２００万〜３００万個／匹でヌードマウスの皮下に移植して担癌マウスを作製した。ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１（１０万個／ｍｌ）にｍｉＲ−１４３とコントロールｍｉＲ−Ｒ各２０ｎＭを、Lipofectamineを用いて導入した。担癌ヌードマウス１匹あたり５〜１０万個の導入処理されたＴＨＰ−１細胞を洗浄し、マウスの尾静脈により投与した。投与は１日１回で２回連日（２日間）とした。ｍｉＲ−１４３及びコントロールにつきそれぞれ５匹の担癌ヌードマウスを処理した。最終投与から２４時間後に、解剖し、臓器、腫瘍部を摘出した。摘出部位からＲＮＡをトリゾールにて抽出し、リアルタイムＰＣＲによりｍｉＲ−１４３の量を測定した。結果を図６に示す。【００３３】
図６に示すように、コントロールの腫瘍部で検出されたｍｉＲ−１４３量を１としたとき、ｍｉＲ−１４３導入マウスの腫瘍部では、約２倍量のｍｉＲ−１４３の蓄積が確認された。この結果から、ＲＮＡを導入した単球を静脈投与することにより、腫瘍細胞に対して選択的に単球あるいは単球から分化したマクロファージ若しくは微小胞が到達し、腫瘍組織にｍｉＲ−１４３が観察されたと考えられた
【実施例３】
【００３４】
本実施例では、実施例１に準じ、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞を分化誘導してＤ（＋）を準備した。なお、分化誘導にあたっては、２０〜１６０ｎＭの範囲のＴＰＡを培地に添加して用いた。これらの細胞に、ｍｉＲ−１４３をリポソーム（liofectamine、Invitrogen社）を用いて導入し、１８時間培養後、各培養液の細胞画分に見出されるｍｉＲ−１４３の量を確認した。具体的には、リポソーム中にｍｉＲ−１４３を１０〜６０ｎＭを包理させて導入し、培養は、１０％仔牛血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地で行った。【００３５】
さらに、培養後のＫ５６２・Ｄ（＋）を血清なしの血清飢餓培養条件で２４時間培養後、培養上清を採取して、３０００ｒｐｍで３０分遠心後、その上清をさらに５〜１０万ｒｐｍで３時間超遠心を行い、チューブ壁に付着した微小胞を回収した。この小胞の浮遊液につき、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１をリアルタイムＰＣＲで測定した。血清飢餓培養は、血清フリーのＲＰＭＩ １６４０培地を用いて２４〜２８時間行った。結果を図７に示す。【００３６】
図７に示すように、Ｋ５６２・Ｄ（＋）にｍｉＲ−１４３を導入して飢餓条件で培養すると、培養上清に分泌された微小胞中のｍｉＲ−１４３がその導入濃度依存的に増大していることがわかった。ｍｉＲ−１４３は、Ｋ５６２ Ｄ（＋）細胞に本来的に内在するｍｉＲ−２１に対する相対量として増大しているため、微小胞中のｍｉＲ−１４３であると考えられた。
【実施例４】
【００３７】
本実施例では、化学修飾ｍｉＲ-１４３ＢＰを、蛍光物質Ｃｙ５でラベルしたｍｉＲ-１４３ＢＰ／Ｃｙ５を、実施例１と同様にして分化誘導したＴＨＰ−１細胞に導入した。具体的には、ｍｉＲ−１４３ＢＰ／Ｃｙ５をリポソーム（liofectamine、Invitrogen社）中に40ｎＭを包理させて導入し、１８時間培養した。培養は、１０％仔牛血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地で行った。さらに、培養後のＴＨＰ−１細胞を血清なしの血清飢餓培養条件で２４時間培養後、細胞を抗Cy5イムノゴールドで反応後、電子顕微鏡で観察した。なお、血清飢餓培養は、血清フリーのＲＰＭＩ １６４０培地を用いて２４〜２８時間行った。結果を、図８に示す。【００３８】
図８（ａ）に示すように、細胞内の多小胞体には、Ｃｙ５を内包する微小胞（分泌膜小胞）を検出できた（図中の矢印参照）。また、図８（ｂ）に示すように、細胞外には、分泌された微小胞にmiR-143BP/Cy5を観察することができた（図中の矢印参照）。
【実施例５】
【００３９】
本実施例では、化学修飾ｍｉＲ-１４３ＢＰを、実施例１と同様にして分化誘導したＴＨＰ−１細胞に導入した。具体的には、ｍｉＲ−１４３ＢＰをリポソーム（liofectamine、Invitrogen社）中に40ｎＭを包理させて導入し、１８時間培養した。培養は、１０％仔牛血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地で行った。その後、血清フリーの培地で24時間培養後ＴＨＰ−１細胞を１〜５×１０5／マウスで、担癌マウスに静脈投与した。なお、担癌マウスは、ヒト大腸癌ＤＬＤ−１細胞を２００万〜３００万個／匹でヌードマウスの皮下に移植して作製した。投与は１日１回で２回連日（２日間）とした。最終投与から２４時間後に、解剖し、腎臓、腫瘍部を摘出した。摘出部位からＲＮＡをトリゾールにて抽出し、リアルタイムＰＣＲによりｍｉＲ−１４３の量を測定した。また、最終投与から、４時間、８時間及び２４時間後にマウスより採血して血清中のｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−２１をリアルタイムＰＣＲにより測定した。結果を図９及び１０に示す。【００４０】
図９に示すように、コントロールマウスの腎臓で検出されたｍｉＲ−１４３ＢＰ量を１としたとき、ｍｉＲ−１４３/BP導入TPH-1細胞が全身投与されたマウスの腎臓では、約２倍量のｍｉＲ−１４３の蓄積が確認された。この結果から、ＲＮＡを導入した単球を静脈投与することにより、腎臓に対して選択的にTHP-1細胞あるいはTHP-1細胞から分化したマクロファージ若しくは微小胞が到達し、腎臓においてｍｉＲ−１４３レベルの上昇が観察されたと考えられた。また、糸球体に蓄積した可能性があると考えられた。また、腫瘍部への分布を調べた結果、腫瘍部にも選択的な蓄積が認められた。【００４１】
図１０に示すように、血清中のｍｉＲ−１４３ＢＰは、最終投与から時間の経過とともに徐々に血中濃度が低下していることがわかった。すなわち、投与によって有効に血中濃度が上昇することがわかった。
【図１】
2011049059.tif 000002
【図６】
2011049059.tif 000003
【図９】
2011049059.tif 000004
【図１０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2011049059.tif 000009
【図７】
2011049059.tif 000010
【図８】
2011049059.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月5日(2011.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来性ＲＮＡが導入された単球又はマクロファージを血清飢餓培養して生成される前記外来性ＲＮＡを内包する小胞を細胞内に含む前記単球又はマクロファージを含む、
ヒトを含む動物における前記外来性ＲＮＡの前記外来性ＲＮＡの前記単球又はマクロファージによる前記異物認識部位へのデリバリーのための組成物。
【請求項２】
前記外来性ＲＮＡは、マイクロＲＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記外来性ＲＮＡは抗腫瘍活性を有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記外来性ＲＮＡは、ｍｉＲ−１４３である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記微小胞は、前記単球から分化したマクロファージ又は前記マクロファージの培養上清から得られる、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記単球又はマクロファージは、患者由来であり、前記患者の疾患部位への前記外来ＲＮＡのデリバリーのための組成物である、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
脈管経由による投与のための組成物である、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
ヒトを含む動物におけるＲＮＡデリバリーのための組成物の製造方法であって、
単球又はマクロファージに外来性ＲＮＡを導入する工程と、
前記外来性ＲＮＡを保持する単球又はマクロファージを血清飢餓培養して前記外来性ＲＮＡを内包する小胞をこれらの細胞内に形成させる工程と、
前記小胞を内包した前記単球又はマクロファージを用いて前記動物における前記外来性ＲＮＡの前記単球又はマクロファージによる前記異物認識部位へのデリバリーのための組成物を調製する工程と、
を備える、製造方法。
【請求項９】
前記導入工程は、前記外来性ＲＮＡを前記単球又はマクロファージにリポフェクションにより導入する工程である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記外来性ＲＮＡは、マイクロＲＮＡを含む、請求項８又は９に記載の製造方法。
【請求項１１】
ヒトを含む動物における標的部位へのＲＮＡのデリバリー方法であって、
外来性ＲＮＡトが導入された前記動物由来の単球又はマクロファージを血清飢餓培養して生成される前記外来性ＲＮＡを内包する小胞を含む前記単球又はマクロファージを含む組成物を準備する工程と、
前記組成物を前記動物に投与する工程と、
を備え、
ヒトを含む動物における前記外来性ＲＮＡを前記単球又はマクロファージによる前記異物認識部位へのデリバリーする、方法。
【請求項１２】
前記投与工程は、脈管経由による投与工程である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
外来性ＲＮＡが導入された単球又はマクロファージを血清飢餓培養して生成され細胞外に分泌される前記外来性ＲＮＡを内包する微小胞を含む、ヒトを含む動物における前記外来性ＲＮＡのデリバリーのための組成物。
【請求項１４】
ヒトを含む動物におけるＲＮＡデリバリーのための組成物の製造方法であって、
単球又はマクロファージに外来性ＲＮＡを導入する工程と、
前記外来性ＲＮＡを保持する単球又はマクロファージを血清飢餓培養して前記外来性ＲＮＡを内包する微小胞をこれらの細胞外に分泌させる工程と、
前記微小胞を含む前記組成物を準備する工程と、
を備える、製造方法。
【国際調査報告】
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