(57)【要約】本発明は、（凝固）血漿マトリックス、１つもしくはそれ以上の増殖因子、少なくとも１つのリン脂質および組織の生成のためのタンパク質足場（もしくは第ＶＩＩ凝固因子）を含んでなるシーラントもしくは組織生成製品に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（凝固）血漿マトリックス、１つもしくはそれ以上の増殖因子、少なくとも１つのリン脂質および組織の生成のためのタンパク質足場（もしくは第ＶＩＩ凝固因子）を含んでなるシーラントもしくは組織生成製品。
【請求項２】
該血漿マトリックスが多血小板血漿の凝固マトリックスもしくは乏血小板血漿の凝固マトリックスである請求項１に記載のシーラントもしくは組織生成製品。
【請求項３】
増殖因子がヒト（組み換え）組織因子（ｒｈＴＦ）、ヒト（組み換え）血小板由来増殖因子（ｒｈＰＤＧＦ）、ヒト（組み換え）トランスフォ−ミング増殖因子（ｒｈＴＧＦ）、ヒト（組み換え）インシュリン様増殖因子（ｒｈＩＧＦ）、ヒト（組み換え）上皮増殖因子（ｒｈＥＧＦ）もしくはヒト（組み換え）肝細胞増殖因子（ｒｈＨＧＦ）、．．．よりなる群から選択される請求項１もしくは２に記載のシーラントもしくは組織生成製品。
【請求項４】
凝固血漿マトリックスが、マトリックス形成剤のマイクロリットル当たり１，５００，０００個の血小板より高い、好ましくはマイクロリットル当たり１，５００，０００個の血小板〜マイクロリットル当たり８，０００，０００個の血小板の間を含んでなる血小板濃度を有する多血小板血漿である前記の請求項のいずれかに記載の組織生成製品。
【請求項５】
少なくとも１つのバッファーおよび少なくとも１つの抗生物質をさらに含んでなる前記の請求項のいずれかに記載の組織生成製品。
【請求項６】
抗生物質が抗破骨細胞効果を有する請求項５に記載のシーラントもしくは組織生成製品。
【請求項７】
組織の生成のためのタンパク質足場が、骨もしくは軟骨のような硬組織、または皮膚もしくは胃の上皮組織のような軟組織の生成に適当なタンパク質足場である前記の請求項１〜６のいずれかに記載の組織生成製品。
【請求項８】
組織の生成のためのタンパク質足場が骨誘導性代用骨である請求項７に記載の組織生成製品。
【請求項９】
骨誘導性代用骨が化合物ＰＥＰＧＥＮ  Ｐ−１５もしくは化合物ＰＥＰＧＥＮ  Ｐ１５  ｆｌｏｗ、ＰＥＰＧＥＮ  ＯＳＩＧＲＡＦＴ、化合物ＯＳＩＧＥＬもしくは化合物ＩＮＦＵＳＥよりなる群から選択される請求項８に記載の組織生成製品。
【請求項１０】
該マトリックスに分散した有効量のカルシウム含有化合物（骨組織の形成を誘導するための）をさらに含んでなる骨生成製品である前記の請求項のいずれかに記載の組織生成製品。
【請求項１１】
該有効量のカルシウム含有化合物が、リン酸カルシウムを含有しそして７５０μｍより低い平均粒径、好ましくは１５０μｍ〜５００μｍの間を含んでなる平均粒径を有する無機粒子である請求項１０の骨生成製品。
【請求項１２】
該リン酸カルシウム含有化合物が、合成ヒドロキシアパタイト、ＣａＣｌ２、β−リン酸三カルシウム、骨片（変性骨もしくはそうでない）、アパタイト、アスピジン、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト（サンゴ礁から）、グルコノ乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルトン酸カルシウムおよびその混合物よりなる群から選択される請求項１０もしくは１１に記載の骨生成製品。
【請求項１３】
ヒト増殖因子、タンパク質足場要素もしくは第ＶＩＩ凝固因子および場合により骨である組織の形成を誘導するための有効量のカルシウム化合物を含有するバイアル、または第一のものが１つもしくはそれ以上の増殖因子を含有し、一方、第二のバイアルがタンパク質足場要素もしくは第ＶＩＩ凝固因子および場合により骨である組織の形成を誘導するための有効量のカルシウム含有化合物を含有する２つの別個のバイアル、ならびに場合により少なくとも１つの緩衝化剤および少なくとも１つの抗生物質を含有することができる最後のバイアルを含んでなる、前記の請求項のいずれかに記載のシーラントもしくは組織生成製品の製造用キット。
【請求項１４】
−混合物に１つもしくはそれ以上の増殖因子および少なくとも１つのリン脂質を加えるとき、血漿マトリックスを有効量のタンパク質足場要素もしくは第ＶＩＩ凝固因子、および場合により骨である組織の形成を誘導するためのカルシウム含有化合物と混合することにより実質的に均質な混合物を形成し、
−タンパク質足場要素および第ＶＩＩ凝固因子、血漿マトリックスならびに場合によりカルシウム含有化合物の混合物に増殖因子および少なくとも１つのリン脂質を加えて混合し、そして
−該混合物を血漿マトリックスの凝固およびシーラントもしくは組織生成製品の形成を保証する条件下で保つ
前記の請求項１〜１２のいずれかに記載のシーラントもしくは組織生成製品の製造方法。
【請求項１５】
マトリックスの凝固を酸素の存在下でそして実質的に攪拌することなしに実施する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
凝固を３５〜４０℃の間を含んでなる温度で、より好ましくは約３７℃の温度で実施する請求項１４もしくは１５に記載の方法。
【請求項１７】
組織が生成されなければならない場所で前記の請求項１〜１２のいずれかに記載のシーラントおよび／もしくは生成製品を使用する段階を含んでなる、必要とする哺乳類患者（ヒトを包含する）における組織を生成する方法。
【請求項１８】
哺乳類患者（ヒトを包含する）における組織損傷の処置における薬剤の製造のための前記の請求項１〜１２のいずれかに記載のシーラントもしくは組織生成製品の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（凝固）血漿マトリックス、１つもしくはそれ以上の増殖因子、少なくとも１つのリン脂質および組織の生成のためのタンパク質足場（もしくは第ＶＩＩ凝固因子）を含んでなるシーラントもしくは組織（骨もしくは軟骨のような硬組織、または皮膚もしくは胃の上皮組織のような軟組織）生成製品（ｔｉｓｓｕｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｏｄｕｃｔ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
代用組織もしくはインプラントの製造のために多くの研究が行われている。
【０００３】
例えば、代用骨もしくはインプラントの製造のために、プリオンを破壊する化学物質により人骨を処理することが知られている。そのように処理された人骨は、その埋め込み後に細胞の増殖に適当な多孔質マトリックスとして働く。
【０００４】
コラーゲン含有材料から人工マトリックスもしくはスポンジを製造することおよび該マトリックスもしくはスポンジを代用骨として使用することもまた提示されている。
【０００５】
特許文献１の実施例４は、血漿−軟膜濃縮物および粉砕した乾燥骨を含有する混合物からのもしくは血漿−軟膜濃縮物およびＣａＣｌ２からの凝血塊の製造を開示し、該後者の化合物は、混合物の凝固を保証するために用いられている。該実施例４において、粉砕した乾燥骨を含有する血漿−軟膜濃縮物のキレート化は、おそらく、固体の骨からのカルシウムの存在のためであると記載されている。該実施例において、トロンビンの使用は患者の合併症の原因であることがはっきりと明記されている。
【０００６】
しかしながら、血漿−軟膜濃縮物および粉砕した乾燥骨を混合することにより得られる代用骨は、骨生成に適していなかった。
【０００７】
骨修復を誘導するために、Ｆｒｉａｄｅｎｔは、式ＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶ（ＰＥＰＧＥＮ１５）の合成アミノ酸ペプチドを含有する合成の再吸収可能なマトリックス、およびリン酸カルシウムを含有しそして７５０μｍより低い平均粒径を有する無機粒子からなる製品「ＰＥＰＧＥＮ  １５」および「ｐｅｐｇｅｎ  １５  Ｆｌｏｗ」を商品化している。
【０００８】
下記の表は、アミノ酸、その１文字コードおよびその３文字コード間の相関関係を示す。
【０００９】
【表１】
2005536244.tif 000002
【００１０】
この製品は、評価した２／４の場合において優れた組織再生を可能にする。
【特許文献１】ＵＳ  ５，７３３，５４５明細書
【発明の開示】
【００１１】
［発明の要約］
本発明は、（凝固）血漿マトリックス、（好ましくは多血小板血漿の（凝固）マトリックスもしくは乏血小板血漿の（凝固）マトリックス）、１つもしくはそれ以上の増殖因子、好ましくはトロンビンを生成するための組み換え化合物、少なくとも１つのリン脂質および組織の生成のためのタンパク質足場を含んでなる組織生成製品に関する。
【００１２】
本発明の組織生成製品に存在するタンパク質足場は、再生されるべき組織のタイプに従って選択される。この組織は、硬組織（骨もしくは軟骨のような）または軟組織（皮膚もしくは胃の上皮組織のような）であることができる。好ましくは、本発明の組織生成製品は、該組織の生成のためのタンパク質足場として化合物ＰＥＰＧＥＮ  Ｐ１５ＴＭもしくはＰＥＰＧＥＮ  Ｐ１５  Ｆｌｏｗ（ＣＥＲＡＭＥＤ社により販売される）のようなバイオ設計された（ｂｉｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒａｔｅｄ）骨誘導性（ｏｓｔｅｏ  ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）代用骨を含んでなりそして無機ウシ骨材料（該骨組織の生成のための該タンパク質足場として）および修復細胞の接着に関与するＩ型コラーゲンから得られそして式ＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶを有する１５個のアミノ酸のペプチドを含んでなる骨生成製品である。
【００１３】
そのようなバイオ設計された骨誘導性代用骨の別の例は、ＣＨＯ細胞において生産される骨形成タンパク質７でありそして間葉細胞における細胞分化の誘導によって骨形成を開始する、Ｈｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ  α（組み換え骨形成タンパク質１（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １））を含んでなるウシコラーゲンから得られる純粋な再吸収可能なタンパク質足場である化合物ＯＳＩＧＲＡＦＴＴＭ（ＳＴＲＩＫＥＲ社により販売される）である。
【００１４】
そのようなバイオ設計された骨誘導性代用骨の別の例は、都合よくマイトジェンおよび強力な血管新生因子である組織因子ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）の活性の粘弾性ポリマー補足物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）である化合物ヒアルロン酸を含んでなる化合物ＯｓｓｉｇｅｌＴＭ（ＯＲＱＵＥＳＴ社により販売される）である。
【００１５】
そのようなバイオ設計された骨誘導性代用骨のさらなる例は、コラーゲンスポンジでありそして新生骨形成の刺激に用いることができる組み換えヒト骨形成タンパク質２（ｒｈＢＭＰ２）を含んでなる化合物ＩｎｆｕｓｅＴＭ（ＭＥＤＴＲＯＮＩＣ社により販売される）である。
【００１６】
該タンパク質足場の最後の例は、コラーゲン、レチクリンおよび／もしくはエラスチン繊維またはそれらの前駆体（トロポコラーゲン、トロポエラスチン、．．．）のマトリックスである。
【００１７】
本発明の組織生成製品に用いる骨組織生成のためのタンパク質足場は、１つもしくはそれ以上の組織因子、ならびに骨組織の再生に使用する有効量のカルシウム含有化合物のような、組織再生を促進する他の要素をさらに含んでなる人工マトリックスもしくはスポンジである。
【００１８】
本発明の組織生成製品は、都合よく、高濃度の血小板を有する凝固多血小板血漿のマトリックスを含んでなる（ＧＥＲＮＯＴ  ＷＥＩＢＲＩＣＨ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｏｔａｌ．Ｉｍｐｌ．Ｒｅｓ．１３，ｐ．４３７−４４３，２００２；ＧＥＲＮＯＴ  ＷＥＩＢＲＩＣＨ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｏｔａｌ．Ｉｍｐｌ．Ｒｅｓ．１４，ｐ．３５７−３６２，２００３）。血小板濃度（異なる増殖因子を含んでなる）は、都合よく、組織の再生に改善された影響を与える。
【００１９】
多血小板血漿の凝固マトリックスは、都合よく、マトリックス形成剤のマイクロリットル当たり１，５００，０００個の血小板より高い血小板濃度を有する。
【００２０】
好ましくは、該多血小板血漿は、マトリックス形成剤のマイクロリットル当たり１，５００，０００個の血小板〜２０，０００，０００個の血小板の間を含んでなる血小板濃度を有する。
【００２１】
好ましくは、該濃度は、マトリックス形成剤のマイクロリットル当たり２，０００，０００個の血小板〜マイクロリットル当たり８，０００，０００個の血小板の間を含んでなり、より好ましくはマイクロリットル当たり約５，０００，０００個の血小板である。
【００２２】
組織生成製品はまた、血小板濃度が都合よくマトリックス形成剤のマイクロリットル当たり１，５００，０００個の血小板より低い、好ましくは、血小板濃度がマトリックス形成剤のマイクロリットル当たり５００，０００、１００，０００もしくは５０，０００個の血小板より低いことを意味する乏血小板血漿の凝固マトリックスを含んでなることもできる。
【００２３】
組織生成製品の製造のために、本発明の組織生成製品の第一の使用に適当な自己多血小板血漿マトリックスを好ましくは患者の血液から得られる単一の血液サンプルからそして第二の使用に適当な自己乏血小板血漿マトリックスを残りの材料サンプルから得ることが可能である。
【００２４】
使用のタイプに従って、組織製品はまた、該マトリックスに分散した有効量のカルシウム含有化合物（骨のような硬組織の形成を誘導するための）のような他の要素を含んでなることもできる。
【００２５】
該リン酸カルシウム含有化合物は、合成ヒドロキシアパタイト、ＣａＣｌ２、β−リン酸三カルシウム、骨片（変性骨）、骨片（変性骨ではない）、アパタイト、アスピジン、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、（サンゴ礁から）、グルコノ乳酸（ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔａｔｅ）カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルトン酸（ｇｌｕｔｏｎａｔｅ）カルシウムおよびその混合物よりなる群から選択される。（好ましくは、該化合物は鋭いもしくは先の尖ったエッジを有さない）。
【００２６】
該有効量のカルシウム含有化合物は、リン酸カルシウムを含有しそして７５０μｍより低い平均粒径を有する無機粒子であることができる。
【００２７】
組織骨生成製品において、リン酸カルシウムを含有する無機粒子は、好ましくは、１５０μｍ〜５００μｍの間を含んでなる平均サイズを有する。
【００２８】
本発明の骨生成製品に含まれる骨片は、好ましくは、頭蓋顔面骨片、腸骨片およびその混合物よりなる群から選択される。該骨片は、好ましくは、非変性骨から得られ、そしてリン酸カルシウム含有粒子は、鋭いおよび先の尖ったエッジを実質的に有さない。
【００２９】
骨片は、都合よく、０．５ｍｍ〜５ｍｍの間を含んでなる、好ましくは０．５〜３ｍｍの間を含んでなる、最も好ましくは約１ｍｍの平均粒径を有する（重量における平均）。例えば、骨片は、０．５ｍｍ〜５ｍｍの間を含んでなる、好ましくは０．５〜３ｍｍの間を含んでなる、最も好ましくは約１ｍｍの平均粒径を有する（重量における平均）チップもしくはフレークの形態を有する。可能な態様によれば、骨片は変性骨片（例えば、それをプリオンフリーにするために化学物質（１つもしくは複数）、放射線照射などにより処理されている骨を粉砕することにより製造される骨片）および非変性骨片の混合物からなる。いくらかの変性骨片を使用する時、該変性骨片が製品にいくらかのカルシウムを加えるために使用される場合、変性骨の該粒子は０．５ｍｍより低い粒径を有することができる。
【００３０】
本発明の組織生成製品は、例えば骨片の５〜５０容積％、都合よく１０〜４０％、好ましくは骨片の２０〜３０容積％を含んでなる。骨片は、好ましくは、本発明の組織生成製品に存在するカルシウム含有化合物の９０重量％より多くを成す。
【００３１】
さらに、本発明の組織生成製品はまた、緩衝化剤、抗生物質、添加剤（増殖因子、増殖因子をコードする遺伝子、薬剤、脂肪酸、殺菌剤もしくは殺ウイルス剤よりなる群から選択される）およびマトリックスの形成を誘導するための化合物ならびにその混合物のようなさらなる要素を含んでなることもできる。
【００３２】
好ましくは、該抗生物質は抗破骨細胞効果（ａｎｔｉ−ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｅｆｆｅｃｔ）を有する。
【００３３】
該さらなる要素は、好ましくは、増殖因子（ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＡＢ、ＰＤＧＦＢＢ、スーパーファミリーＢＴＧＦおよびＢＭＰ−１のようなＢＭＰのファミリーなど）、ＢＭＰおよび／もしくはＢＴＧＦをコードする遺伝子、立体因子、カルシウム含有化合物、薬剤、脂肪酸、抗生物質もしくは抗生物質の混合物（好ましくは、テトラサイクリン群の抗生物質、ビブラマイシンＲ、ドキシサイクリンＲ、ミノサイクリン、ミノシンＲ（Ｗｙｅｔｈ−Ｌｅｄｅｒｌｅｅ）のような抗破骨細胞効果を有する化合物（１つもしくは複数）、およびマクロライド、ペニシリンに基づく化合物などのような別の抗生物質（１つもしくは複数）と抗破骨細胞効果を有する化合物（１つもしくは複数）との混合物）、殺菌剤、殺ウイルス剤、フィブリノーゲン、マトリックスの形成を誘導する化合物、バッファー、生理的ｐＨでの両性イオンバッファー系など、ならびに該化合物もしくは添加剤の混合物である。
【００３４】
好ましい態様の詳細によれば、組織生成製品は０．００１〜１０重量％、都合よく０．０１〜５重量％、好ましくは０．０２〜１％、例えば０．０５〜０．４重量％の抗生物質もしくは複数の抗生物質（その乾燥形態で計算する）を含有する。抗生物質は、抗破骨細胞効果を有する抗生物質（さらに特に、テトラサイクリン群の抗生物質、ビブラマイシンＲ、ドキシサイクリンＲ、ミノサイクリン、ミノシンＲ（Ｗｙｅｔｈ−Ｌｅｄｅｒｌｅｅ））、抗破骨細胞効果を有する抗生物質の混合物、および１つもしくはそれ以上の他の抗生物質（好ましくは、マクロライド、ペニシリンに基づく化合物などおよびその混合物）と抗破骨細胞効果を有する１つもしくはそれ以上の抗生物質との混合物よりなる群から都合よく選択される。
【００３５】
組織生成製品は、そのゲル化の前に、生理的ｐＨに実質的に等しいｐＨ、例えば６．５〜８の間を含んでなるｐＨ、好ましくは約７〜７．５の３７℃で測定されるｐＨを都合よく有する。
【００３６】
本発明の組成物に存在する組み換え増殖因子の中に、膜結合配列を有さないもしくは細胞外ドメインのみを有する（組み換え体、これは該増殖因子が混入物質を与えないことを意味する）組織因子を選択することができる。
【００３７】
好ましくは、該増殖因子はヒト（組み換え）組織因子（ｒｈＴＦ）、ヒト（組み換え）血小板由来増殖因子（ｒｈＰＤＧＦ）、ヒト（組み換え）トランスフォ−ミング増殖因子（ｒｈＴＧＦ）、ヒト（組み換え）インシュリン様増殖因子（ｒｈＩＧＦ）、ヒト（組み換え）上皮増殖因子（ｒｈＥＧＦ）、ヒト（組み換え）肝細胞増殖因子（ｒｈＨＧＦ）、．．．よりなる群から選択される。
【００３８】
好ましい態様によれば、トロンビンを生成するための組み換え化合物（もしくは組織因子）は、ホスファチジルセリン、その誘導体、少なくとも１つの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、その誘導体、少なくとも１つの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルコリン、およびその混合物よりなる群から選択される少なくとも１つのリン脂質と組み合わされ、好ましくは混合される。好ましくは、トロンビンを生成するための組み換え化合物（もしくは組織因子）は、ホスファチジルセリン、その誘導体、少なくとも１つの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、その誘導体、少なくとも１つの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルコリン、およびその混合物よりなる群から選択される少なくとも１つのリン脂質と組み合わされ、該脂肪酸側鎖は、少なくとも１つの二重結合を有しそして６〜２４個の炭素原子を有する、最も好ましくは１６〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸鎖よりなる群から選択される。
【００３９】
本発明の組織生成製品はまた、少なくとも１つの該記載のリン脂質、好ましくは２つの異なるリン脂質およびシーラント特性を向上する第ＶＩＩ凝固因子（ＦＶＩＩ）であるタンパク質足場の存在下で該記載の血漿マトリックス、１つもしくはそれ以上の該記載の組み換え因子、（好ましくはトロンビンを生成するための組み換え化合物）を含んでなるシーラントであることもできる。
【００４０】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つのリン脂質（好ましくは少なくとも２つの異なるリン脂質）、該組織の再生のためのタンパク質足場もしくは第ＶＩＩ凝固因子および場合により骨である組織の形成を誘導するための該マトリックスに分散した有効量のカルシウム含有化合物（好ましくは、該化合物は７５０μｍより低い平均粒径を有するリン酸カルシウムを含有する無機粒子である）の存在下で、該血漿マトリックスをトロンビンを生成するための組み換え化合物（もしくは増殖因子）と接触させることにより製造されるシーラントもしくは組織生成製品の製造用キットに関する。該キットは、トロンビンを生成するための組み換え化合物（もしくは増殖因子）、タンパク質足場要素もしくは第ＶＩＩ凝固因子、および場合により骨である組織の形成を誘導するための有効量のカルシウム含有化合物（好ましくは、リン酸カルシウムを含有しそして７５０μｍより低い平均粒径を有する無機粒子）を含有するバイアル；第一のものがトロンビンを生成するための組み換え化合物（もしくは増殖因子）を含有し、一方、第二のバイアルがタンパク質足場要素もしくは第ＶＩＩ凝固因子および場合により骨である組織の形成を誘導するための該有効量のカルシウム含有化合物（好ましくは、リン酸カルシウムを含有しそして７５０μｍより低い平均粒径を有する無機粒子）を含有する２つの別個のバイアルよりなる群から選択される少なくとも１つの系を含んでなる。バイアルはまた、少なくとも１つの緩衝化剤および少なくとも１つの抗生物質および１つもしくはそれ以上の上記の他の添加剤を含有するバイアルのような、本発明の製品に存在する他の要素を含んでなることもできる。
【００４１】
抗生物質製剤は、経口用抗生物質製剤、注入可能な抗生物質製剤、局所用抗生物質製剤、スプレー用抗生物質製剤および吸入用抗生物質製剤であることができ、該製剤は、組織が再生されなければならない場所で有効用量の抗生物質を患者に投与するのに適している。経口用製剤および注入可能な製剤が好ましい。
【００４２】
好ましい態様の詳細によれば、シーラントもしくは組織生成製品に加えるかまたはマトリックス血漿組織生成製品の凝固中に使用するかまたは患者へのシーラントもしくは組織生成製品の使用の前に、間におよび／もしくは後に投与する抗生物質もしくは複数の抗生物質の量は、組織生成製品が０．００１〜１０重量％、都合よく０．０１〜５重量％、好ましくは０．０２〜１％、例えば０．０５〜０．４重量％、さらに特に０．２〜０．３％の抗生物質もしくは複数の抗生物質（その乾燥形態で計算する）を含有するようにである。抗生物質は、抗破骨細胞効果を有する抗生物質（さらに特に、テトラサイクリン群の抗生物質、ビブラマイシンＲ、ドキシサイクリンＲ、ミノサイクリン、ミノシンＲ（Ｗｙｅｔｈ−Ｌｅｄｅｒｌｅｅ））、抗破骨細胞効果を有する抗生物質の混合物、および１つもしくはそれ以上の他の抗生物質（好ましくは、マクロライド、ペニシリンに基づく化合物などおよびその混合物）と抗破骨細胞効果を有する１つもしくはそれ以上の抗生物質との混合物よりなる群から都合よく選択される。
【００４３】
最も好ましくは、少なくとも１つの抗生物質は、トロンビンを生成する組み換え化合物を加える前に、しかしまたトロンビンを生成する組み換え化合物を加える時にも都合よく、少なくとも多血小板血漿およびリン酸カルシウム含有化合物を含有する混合物に加えられる。
【００４４】
抗生物質を混合物に加えない場合もしくは少量の抗生物質を混合物に加える場合、抗生物質（１つもしくは複数）は、患者への骨生成製品の使用の前にそして／もしくは間にそして／もしくは後に、経口投与により、注射により、局所使用により、吸入により、好ましくは経口投与によりそして／もしくは注射（最も好ましくは血液中注射もしくは経皮注射）により患者に都合よく与えられる。
【００４５】
好ましくは、患者は少なくとも１つの抗生物質での少なくとも１つの処置に付され、該処置は：
−患者へのシーラントもしくは組織生成製品の使用の少なくとも後の有効用量もしくは有効量の少なくとも１つの抗生物質の経口投与；
−患者へのシーラントもしくは組織生成製品の使用の少なくとも前の有効用量もしくは有効量の少なくとも１つの抗生物質の経口投与；
−患者へのシーラントもしくは組織生成製品の使用の少なくとも後の有効用量もしくは有効量の少なくとも１つの抗生物質の注射；
−患者へのシーラントもしくは組織生成製品の使用の少なくとも前の有効用量の少なくとも１つの抗生物質の注射；
−骨生成製品の使用の前の少なくとも１日間のそして患者へのシーラントもしくは組織生成製品の使用の後の少なくとも１日間の有効用量もしくは有効量の少なくとも１つの抗生物質の投与；
よりなる群から選択される。
【００４６】
特定の態様によれば、有効量の抗生物質は、本発明のシーラントもしくは組織生成製品の使用の前に、ならびに該使用の後に患者に投与される（最も好ましくは経口的にもしくは注射により）。
【００４７】
本発明はまた：
−組み換えトロンビン生成化合物のような増殖因子および少なくとも１つのリン脂質の混合物に加える場合に血漿マトリックス（好ましくは多血小板血漿もしくは乏血小板血漿）を有効量のタンパク質足場もしくは第ＶＩＩ凝固因子および場合により組織生成を誘導するためのカルシウム含有化合物と混合することにより実質的に均質な混合物を形成し、
−タンパク質足場および第ＶＩＩ凝固因子ならびに場合によりカルシウム含有化合物（骨片もしくはヒドロキシアパタイトのような）ならびに血漿マトリックス（好ましくは多血小板血漿もしくは乏血小板血漿）の混合物に組織因子もしくは組み換えトロンビン生成化合物および少なくとも１つのリン脂質を加えて混合し、そして
−該混合物を血漿マトリックスの凝固およびシーラントもしくは組織生成製品の形成を保証する条件下で保つ
本発明のシーラントもしくは組織生成製品の製造方法にも関する。
【００４８】
好ましくは、マトリックスの凝固は、酸素の存在下でそして実質的に攪拌することなしに実施する。該凝固は、最も好ましくは３５〜４０℃の間を含んでなる温度で、さらに特に約３７℃の温度で実施する。
【００４９】
都合よく、少なくとも２つの異なるリン脂質を混合物に加え、該添加は、好ましくは、組み換えトロンビン生成化合物（もしくは組織因子）を加える時に実施する。
【００５０】
本発明の方法において、組み換えトロンビン生成化合物（もしくは組織因子）は、リン脂質（上記）と、好ましくは２つのリン脂質と都合よく組み合わされ、リン脂質（１つもしくは複数）と組み合わせる該化合物は、都合よく、凍結乾燥ケーク、粉末もしくは顆粒のような凍結乾燥製品の形態を有する。
【００５１】
本発明の好ましい方法の詳細によれば、血漿マトリックスの凝固は、少なくとも１つの抗生物質の存在下で実施するかもしくはマトリックスの凝固後に少なくとも１つの抗生物質を混合物に加える。抗生物質もしくは抗生物質の混合物は、場合により、他の要素（骨片および／もしくは骨にその粉砕する前にそして／またはトロンビンを生成する組み換え化合物もしくは組織因子にそして／またはリン脂質に）に加えることができる。
【００５２】
本発明の好ましい方法において、少なくとも１つのリン脂質およびタンパク質足場もしくは第ＶＩＩ凝固因子および場合により無機粒子の存在下でトロンビンを生成するための組み換え化合物（もしくは組織因子）と血漿マトリックスとの接触（好ましくは混合）によりゲル（最も好ましくはヒドロゲル）が都合よく形成され、それにより、ゲル形成の間、血漿マトリックスのｐＨは６〜８の間に保たれる。
【００５３】
ゲルはまた、少なくとも１つの緩衝化剤の存在下で形成することもできる。可能なバッファーは、例えば、トリスバッファー、リンガー溶液、重炭酸ナトリウム、およびその混合物である。
【００５４】
本発明の最後の態様は、必要とする哺乳類患者（ヒトを包含する）における組織（骨のような）を生成する方法に関し、該方法は、組織（骨）が生成されなければならない場所で本発明のシーラントおよび／もしくは組織生成製品を使用する段階を含んでなる。
【００５５】
本発明の最後の態様はまた、哺乳類患者（ヒトを包含する）における組織損傷の処置における薬剤の製造のための本発明のシーラントおよび／もしくは組織生成製品の使用にも関する。
【００５６】
本発明の様々な態様の好ましい特徴は、同封の実施例に詳細に記述する。
【実施例】
【００５７】
該実施例の準備のために、下記の製品が使用されている：
ＰＲＰ：骨移植片が配置されなければならない患者の多血小板血漿。該血漿の血小板濃度は、血漿のマイクロリットル当たり１，８００，０００個の血小板であった（血小板のさらに高い濃度もまた用いることができる）。ＰＲＰを白血球の除去のための、最大割合の生きている血小板を得るための、細菌制御のための既知の通常の処理に供し、該ＰＲＰは少なくとも５日間有効であった。ＰＲＰをその使用の前に３７℃の温度で振盪し、該振盪は、ＰＲＰを含有する容器を振盪することにより行った。
トロンボプラスチン：使用するトロンボプラスチンは、ＤＡＤＥ  ＡＧ社（Ｄｕｄｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により商標Ｉｎｎｏｖｉｎで販売されるトロンボプラスチンであった。該トロンボプラスチンは、合成リン脂質、すなわち、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンと組み合わせて凍結乾燥した組み換えヒト組織因子であり、該リン脂質は少なくとも１つの脂肪酸側鎖を有し、該脂肪酸側鎖は、少なくとも１つの二重結合を有しそして１６〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸鎖よりなる群から選択される。Ｉｎｎｏｖｉｎは、プロトロンビンを含まず、ＦＶＩＩ因子を含まず、そしてＦＸ因子を含まない。カルシウムは、Ｉｎｎｏｖｉｎに存在する。Ｉｎｎｏｖｉｎは、診断目的のための既知の製品である。Ｉｎｎｏｖｉｎはまた、いくらかのカルシウム、生理的ｐＨでの両性イオンバッファー系も含有する。Ｉｎｎｏｖｉｎトロンボプラスチンは、約１／３００の組織因子／リン脂質重量比（約１／１０，０００のＴＦ／リン脂質モル比）で、組織因子とリン脂質の混合物を含んでなる。
【００５８】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａにより販売されるトロンボプラスチンもしくはＨｅｎｏｇｅｎ  ＳＡにより開発されたトロンボプラスチンのような他のトロンボプラスチンもまた用いることができる。Ｈｅｎｏｇｅｎ  ＳＡにより開発されたトロンボプラスチンは、膜結合配列のないそして細胞内ドメインのない組織因子を含んでなる。従って、Ｈｅｎｏｇｅｎ組織因子は、細胞外ドメインのみを含んでなる。Ｈｅｎｏｇｅｎ組織因子は、酵母により発現され、そして培養培地中に可溶性でグリコシル化された形態として回収された。該組織因子は、クロマトグラフィー（１もしくは２段階で、例えば２段階で）により精製された。Ｈｅｎｏｇｅｎのトロンボプラスチン製剤はまた、３：７のホスファチジルセリン／ホスファチジルコリン重量比でリン脂質、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンも含んでなる。ＴＦ／リン脂質モル比は、約１／１０００である。組み換え組織因子は、該リン脂質と混合される。
骨片：骨片は、骨移植片が必要とされる患者の腸骨もしくは頭蓋顔面骨から製造されている。患者のフレッシュな骨を１ｍｍの平均直径を有する骨フレーク（骨粉）に粉砕した。骨片は、それらの製造直後にＰＲＰに加えられる。
水：使用する水は、蒸留し、滅菌した、パイロジェンフリーの水である。
ＰｅｐＧｅｎ  Ｐ−１５Ｒ：Ｆｒｉａｄｅｎｔ，Ｇｅｒｍａｎｙにより販売されるこの製品は、天然のヒドロキシアパタイトにより増強されたペプチドである。該ペプチドは、式ＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶを有する。該ペプチドは、２５０μｍ〜４２０μｍの間を含んでなるサイズを有する天然のリン酸カルシウム粒子（ヒドロキシアパタイト）に結合している。該粒子は、１１００℃より高い温度で加熱した無機質（ａｎｏｒｇａｎｉｃ）骨塩である。該粒子は、鋭いそして先の尖ったエッジを取り除くためにローリングに付されている。式ＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶのペプチド／リン酸カルシウム粒子重量比は、約２５０／１，０００，０００、すなわち０．０００２５である。該粒子は、該ペプチドで少なくとも部分的に被覆されている。
【００５９】
ＰｅｐＧｅｎ  Ｐ−１５  ＦｌｏｗＲ：この製品は、それが再吸収可能なゲルマトリックス（セルロースのポリカルボキシメチルエーテルのナトリウム塩、グリセロールおよびヒドロゲルでできている）を含有することを除いて、上記の本明細書に開示する製品と同様である。
［実施例１］
【００６０】
該実施例では、５０ｍｌのＰＲＰを滅菌された容器に入れた。５０ｍｌの容量のＰｅｐＧｅｎ  Ｐ−１５もしくは上記の別のタンパク質足場をＰＲＰに加え、混合した。次に、レシピエントを酸素含有雰囲気において、３７．５℃で（例えば、３７．５℃の温度を有する水浴を用いることにより、該浴は水および０．９％のＮａＣｌを含有する）無菌状態で加熱する。
【００６１】
１０ｍｇのＩｎｎｏｖｉｎを２ｍｌの蒸留し、滅菌したそしてパイロジェンフリーの水と混合した。３７．５℃の温度で保ったＰＲＰ＋ＰｅｐＧｅｎ  Ｐ−１５混合物に水＋Ｉｎｎｏｖｉｎ混合物を加えた。
【００６２】
攪拌することなしに、約１０分後に、レシピエントにおいてゲルが形成され、該ゲルは、患者へのインプラントに適当な骨精製製品である。
［実施例２］
【００６３】
２０ｍｇのＩｎｎｏｖｉｎを２ｍｌの蒸留し、滅菌したそしてパイロジェンフリーの水と混合し、そしてＰＲＰ＋ＰｅｐＧｅｎ  Ｐ−１５混合物に加えたことを除いて、実施例１を繰り返した。
［実施例３〜９］
【００６４】
該実施例では、使用する試薬の量が異なったことを除いて、実施例１を繰り返した。
【００６５】
【表２】
2005536244.tif 000003
［実施例１０〜１９］
【００６６】
該実施例では、使用する試薬の量が異なったことを除いて、実施例１を繰り返した。
【００６７】
【表３】
2005536244.tif 000004
【００６８】
ゲルの形態を有する該実施例１〜１９の骨生成製品は、患者に、例えば重大な（ｍａｊｏｒ）顎顔面萎縮を患っているヒト患者に容易に埋め込むことができる。本発明の骨生成製品は、骨の陥凹に容易に詰めることができ、そして容易に成形することができる。
【００６９】
本発明の骨生成製品を重大な顎顔面萎縮を患っている志願者に使用した。サイナスリフト移植および顎顔面骨上の上のせ移植を実施した。これらの試験は、本発明の骨生成製品を使用した場所で骨成長もしくは骨の生成を示している。
［実施例２０］
【００７０】
人骨をプリオンフリーになるように変性させそしてγ線照射した。該骨を０．２ｍｍの平均（重量による）を有する粒子に粉砕した。乾燥した後、トロンビンを生成するための組み換え化合物、リン脂質および高レベルのカルシウム含有化合物の混合物を得るために、１０ｇの骨片を１０ｍｇの乾式Ｉｎｎｏｖｉｎと乾式混合した。
【００７１】
次に、そのようにして調製した混合物を本発明の骨生成製品の製造に使用した。
【００７２】
１０ｍｇのＩｎｎｏｖｉｎ＋１０ｇの変性骨片混合物を１０ｍｇのＩｎｎｏｖｉｎのみの代わりに使用したことを除いて、そしてより多量の滅菌水を使用した（５〜１０ｍｌ）（ペーストを製造するために調整する水の量）ことを除いて、実施例１の方法を繰り返した。
［実施例２１］
【００７３】
組み換えトロンボプラスチンを加える前に、ＰＲＰのｍｌ混合物当たり２００μｇのビブラマイシンＲを加えたことを除いて、実施例１を繰り返した。
［実施例２２］
【００７４】
組み換えトロンボプラスチンを加える前に、ＰＲＰのｍｌ混合物当たり１００μｇのミノサイクリンＲ（ミノシンＲ）を加えたことを除いて、実施例１を繰り返した。
［実施例２３］
【００７５】
組み換えトロンボプラスチンを加える前に、ＰＲＰのｍｌ混合物当たり５０μｇのミノサイクリン（ミノシンＲ）を加えたことを除いて、実施例１を繰り返した。
［実施例２４］
【００７６】
組み換えトロンボプラスチンを加える前に、ＰＲＰのｍｌ混合物当たり２０μｇのミノサイクリン（ミノシンＲ）を加えたことを除いて、実施例１を繰り返した。
［実施例２５］
【００７７】
ＰｅｐＧｅｎ  Ｐ−１５の代わりにＰｅｐＧｅｎ  Ｐ−１５  Ｆｌｏｗを使用したことを除いて、実施例１〜２４を繰り返した。
［実施例２６］
【００７８】
リン脂質と混合した別の組み換え組織因子でＩｎｎｏｖｉｎを置き換えたことを除いて、実施例１〜２４を繰り返した。例えば、組み換え組織因子をホスファチジルセリン、その誘導体、少なくとも１つの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、その誘導体、少なくとも１つの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルコリン、およびその混合物よりなる群から選択される少なくとも１つのリン脂質と組み合わせる。好ましくは、トロンビンを生成するための組み換え化合物をホスファチジルセリン、その誘導体、少なくとも１つの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、その誘導体、少なくとも１つの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルコリン、およびその混合物よりなる群から選択される少なくとも１つのリン脂質と組み合わせ、該脂肪酸側鎖は、少なくとも１つの二重結合を有しそして６〜２４個の炭素原子を有する、最も好ましくは１６〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸鎖よりなる群から選択される。
【００７９】
最も好ましい態様によれば、トロンビンを生成するための組み換え化合物を少なくとも２つのリン脂質の混合物と組み合わせ、第一のリン脂質は、ホスファチジルセリン、その誘導体、少なくとも１つの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルセリン、およびその混合物よりなる群から選択され、少なくとも１つの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルセリンの脂肪酸側鎖は、少なくとも１つの二重結合を有しそして６〜２４個、好ましくは１６〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸鎖よりなる群から選択され、一方、第二のリン脂質は、ホスファチジルコリン、その誘導体、少なくとも１つの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルコリン、およびその混合物よりなる群から選択され、少なくとも１つの脂肪酸側鎖を有するホスファチジルコリンの脂肪酸側鎖は、少なくとも１つの二重結合を有しそして６〜２４個の炭素原子を有する脂肪酸鎖よりなる群から選択される。
【００８０】
組み換え組織因子／リン脂質重量比は、本実施例における１：３００〜１：２００の間、すなわち、約１：２５０のような、例えば１：５００〜１：５０の間を含んでなる。
【００８１】
該実施例では、実施例１〜２４において使用する１０ｍｇのＩｎｎｏｖｉｎにつき１．５ｍｇの組み換え組織因子＋リン脂質の割合でＩｎｎｏｖｉｎを置き換えた。
【００８２】
シーラントもまた、抗生物質の有無で、ＰＲＰ、Ｈｅｎｏｇｅｎ  ＳＡの組み換え組織因子およびリン脂質を混合することにより製造した。
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月18日(2004.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿マトリックス、１つもしくはそれ以上の増殖因子、少なくとも１つのリン脂質および組織の生成のためのタンパク質足場（ここで、該タンパク質足場は、コラーゲン、レチクリンおよび／もしくはエラスチン繊維またはそれらの前駆体のマトリックスである）を含んでなる組織生成製品。
【請求項２】
前駆体がトロポコラーゲンもしくはトロポエラスチンである請求項１に記載の組織生成製品。
【請求項３】
該血漿マトリックスが、マトリックス形成剤のマイクロリットル当たり５００，０００、１００，０００もしくは５０，０００個の血小板より低い血小板濃度を含んでなる乏血小板血漿の凝固マトリックスである請求項１もしくは２に記載の組織生成製品。
【請求項４】
増殖因子がヒト（組み換え）組織因子（ｒｈＴＦ）、ヒト（組み換え）血小板由来増殖因子（ｒｈＰＤＧＦ）、ヒト（組み換え）トランスフォ−ミング増殖因子（ｒｈＴＧＦ）、ヒト（組み換え）インシュリン様増殖因子（ｒｈＩＧＦ）、ヒト（組み換え）上皮増殖因子（ｒｈＥＧＦ）もしくはヒト（組み換え）肝細胞増殖因子（ｒｈＨＧＦ）よりなる群から選択される前記の請求項のいずれかに記載の組織生成製品。
【請求項５】
少なくとも１つのバッファーおよび少なくとも１つの抗生物質をさらに含んでなる前記の請求項のいずれかに記載の組織生成製品。
【請求項６】
組織が皮膚もしくは胃の上皮組織である前記の請求項のいずれかに記載の組織生成製品。
【請求項７】
ヒト増殖因子、タンパク質足場要素（これは、コラーゲン、レチクリンおよび／もしくはエラスチン繊維またはそれらの前駆体よりなる群から選択される）を含有するバイアル、または第一のものが１つもしくはそれ以上の増殖因子を含有し、一方、第二のバイアルがコラーゲン、レチクリンおよび／もしくはエラスチン繊維またはそれらの前駆体よりなる群から選択されるタンパク質足場要素を含有する２つの別個のバイアル、ならびに場合により少なくとも１つの緩衝化剤および少なくとも１つの抗生物質を含有することができる最後のバイアルを含有する前記の請求項のいずれかに記載の組織生成製品の製造用キット。
【請求項８】
−コラーゲン、レチクリンおよび／もしくはエラスチン繊維またはそれらの前駆体よりなる群から選択される有効量のタンパク質足場要素と血漿マトリックスとを混合することにより実質的に均質な混合物を形成し、
−タンパク質足場要素および血漿マトリックスの混合物に増殖因子および少なくとも１つのリン脂質を加えて混合し、そして
−該混合物を血漿マトリックスの凝固および組織生成製品の形成を保証する条件下で保つ
請求項１〜６のいずれかに記載の組織生成製品の製造方法。
【請求項９】
マトリックスの凝固を酸素の存在下でそして実質的に攪拌することなしに実施する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
凝固を３５〜４０℃の間を含んでなる温度で、より好ましくは約３７℃の温度で実施する請求項８もしくは９に記載の方法。
【請求項１１】
ヒトを包含する哺乳類患者における組織損傷の処置における薬剤の製造のための請求項１〜６のいずれかに記載の組織生成製品の使用。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載の生成製品を組織が生成されなければならない場所で使用する段階を含んでなる、組織生成を必要とするヒトを包含する哺乳類患者において組織を生成する方法。
【国際調査報告】
2005536244.tif 000005
2005536244.tif 000006
2005536244.tif 000007
2005536244.tif 000008