(57)【要約】MusTRDポリペプチドの機能を調節することによって筋肉の種類を調節する方法を提供する。同様にMusTRD遺伝子の新規イソ型も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物の筋原細胞においてMusTRDのレベルおよび／または活性を調節する段階を含む、ヒトまたは動物の筋組織において遅筋および速筋線維の相対的組成を調節する方法。
【請求項２】
ヒトまたは動物の筋原細胞においてMusTRDのレベルおよび／または活性を調節することができる化合物をヒトまたは動物に投与する段階を含む、ヒトまたは動物の筋組織において遅筋および速筋線維の相対的組成を調節する方法。
【請求項３】
化合物が、MusTRD1α1ポリペプチド、もしくはそのイソ型もしくは断片、または該化合物をコードする核酸である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
ヒトまたは動物の筋原細胞においてMusTRDのレベルおよび／または活性を調節する段階を含む、ヒトまたは動物の筋組織において遅筋および／または速筋線維の量を調節する方法。
【請求項５】
ヒトまたは動物の筋原細胞においてMusTRDのレベルおよび／または活性を調節することができる化合物をヒトまたは動物に投与する段階を含む、ヒトまたは動物の筋組織において遅筋および速筋線維の量を調節する方法。
【請求項６】
化合物が、MusTRD1α1ポリペプチド、もしくはそのイソ型もしくは断片、または該化合物をコードする核酸である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ヒトまたは動物の筋原細胞においてMusTRDのレベルおよび／または活性を調節する段階を含む、ヒトまたは動物における筋線維の特殊化を調節する方法。
【請求項８】
ヒトまたは動物の筋原細胞においてMusTRDのレベルおよび／または活性を調節することができる化合物をヒトまたは動物に投与する段階を含む、ヒトまたは動物における筋線維の特殊化を調節する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、MusTRDポリペプチドの機能を調節することによって、筋肉の種類を調節する方法に関する。本発明はまた、MusTRD遺伝子の新規イソ型にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
成人の骨格筋は二つの特殊化された細胞、すなわち収縮が遅く疲労に抵抗性であり酸化的な線維と、収縮が早く糖分解性の筋線維とからなる。発達中のマウス胚において、成体筋線維を生じる細胞である筋芽細胞は、分化および多様化という二つの相によって成体表現型へと分化する。第一の分化相（7〜8 dpc）は、原始筋管を生じ、これは遅筋線維の形成へと続く。第二の相（12.5 dpc）は、二次的な遅筋および推定される速筋線維に関与する筋管を生じる。特殊化された筋肉の種類への筋管の分離は、運動神経の接続が確立される15 dpcあたりで始まり、特殊な遺伝子発現プログラムの活性化によって駆動される。その結果、後期の胚および生後の発達の間に、太いおよび細いフィラメント収縮タンパク質の特殊なイソ型の発現は、将来の遅筋または速筋線維に限定されるようになる。周産期および生後の筋発達の最終段階において、筋線維は成熟および増殖過栄養を受ける。先天性のミオパシーおよび神経損傷では、異常な筋線維の成熟または筋線維の転換のいずれかによって骨格筋の筋線維組成が破壊される。したがって、本発明者らの研究は、筋線維の多様化と筋線維の種類に特異的な遺伝子発現を調節する転写因子を同定することである。
【０００３】
本発明者らはこれまでに、ヒト骨格筋cDNAライブラリからヒトの筋TFII-I反復ドメイン含有タンパク質1α1（hMusTRD1α1、これまでMusTRD1と呼ばれていた）をクローニングしている（O'Mahoneyら、1998）。ヒトMusTRD1α1 mRNAは、ヒトの骨格筋および心臓において顕著であり、当初アミノ酸458個のタンパク質をコードすると考えられた。配列決定のエラーがその後確認されたことによって、アミノ酸944個のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが明らかとなった。
【０００４】
hMusTRD1α1は、ヘリックス-ループ-ヘリックス（HLH）様式でそれぞれが整列した反復ドメイン（RD）5個を含み、これは転写因子TFII-Iと約70％のアミノ酸相同性を有する（Royら、1997）。肝臓および脾臓において顕著に発現されるTFII-Iは、アデノウイルスMLおよびc-fosプロモーターにおけるInr要素を特異的に標的とする。しかし、hMusTRD1α1は、TFII-I標的要素とは相互作用しない（O'Mahoneyら、1998）。hMusTRD1α1およびTFII-IはいずれもそのN末端最後部に、ヘテロ二量体形成に関係すると考えられているロイシンジッパーを有する。しかし、hMusTRD1α1はまた、アミノ酸458〜466位の間にmyc型のHLH二量体形成モチーフも含む。hMusTRDは、アミノ酸407〜413位（NLS1）および883〜889位（NLS2）の間に二つの核局在シグナル（NLS）モチーフを含む。その標的遺伝子におけるInr要素と直接相互作用する他に、TFII-Iは、バーキットチロシンキナーゼ（Btk）および血清反応因子（SRF）のような他のHLH位因子と相互作用して、c-SrcおよびERK1のようなマイトジェン活性化因子に反応する。したがって、hMusTRD1α1およびTFII-Iは、遺伝子発現を細胞特異的に調和させるために多数のシグナル伝達経路からのメッセージを統合する新たな転写調節物質ファミリーを示す可能性がある。
【０００５】
hMusTRD1α1をコードする遺伝子は、染色体7q11.23に存在し、かつ遺伝子18個に及ぶヘミ接合体微小欠失が原因で生じる多全身性障害であるウィリアムス-ビューレン症候群（WS）において欠失している。
【０００６】
WSは大動脈弁上部狭窄（SVAS）、独自の人格プロフィールを有する神経および認識欠損、幼児高カルシウム血症、歯の形成異常、骨格筋異常、および低身長を伴う成長遅滞を特徴とする。SVASは、エラスチン（ELN）遺伝子の欠損に帰因するが、シンタキシン1A（STX1A）およびLIM-キナーゼ1（LIMK）遺伝子の単不全が神経および認識欠損に関連する可能性がある。残りの表現型は、現在のところ、特定の遺伝子欠損に割付することができない。関節の拘縮、筋肉痛、および脊柱後側彎を含む筋骨格異常のために、WS患者はスタミナを欠き、容易に疲労する。基礎となるミオパシーが報告され、これが身体的制限の原因となる可能性があるが、疾患を引き起こす遺伝子／複数の遺伝子は同定されていない。さらに、成長遅滞は、基礎となる内分泌問題によると考えられている。WS患者はまた、変化した筋線維組成および分布を示すとも報告されている（Voitら、1991）。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明者らは、MusTRD遺伝子が、筋組織が異なれば異なるイソ型として異なるように発現されることを決定した。これらのイソ型は異なるスプライシングによって生じ、それによって、アミノ末端が高度に保存され、カルボキシ末端が、スプライシングされたエキソンを含めるまたは除外することによって非常に多様となるタンパク質が得られる。本発明者らは、ヒト筋肉からスプライス変種1個および異なるマウス骨格筋からスプライス変種11個を単離して、異なる骨格筋が異なる組み合わせのMusTRDイソ型を発現することを示した。
【０００８】
本発明者らはまた、hMusTRD1α1において二つのDNA結合ドメイン（DBD）を同定した：DBD1は、アミノ酸351〜458位に存在し、DBD2は、アミノ酸544〜944位に存在する。
【０００９】
骨格筋線維の発達におけるhMusTRD1α1および関連するイソ型の役割を調べるために、本発明者らは、hMusTRD1α1の正常ペプチドおよび全てのMusTRDイソ型に共通するΔhMusTRD1α1と呼ばれるアミノ酸458個の切断（Δ）型ペプチドの調節能を調べた。本発明者らは、hMusTRD1α1のアミノ酸1〜458個からなるポリペプチドが、DNA上のhMusTRD1α1結合モチーフを占有することができるものの転写を活性化することができず、このようにMusTRDイソ型の機能を阻害することを示した。本発明者らは、hMusTRD1α1およびΔhMusTRD1α1がいずれも遅筋特異的遺伝子であるMHCIslowおよびTnIslowのプロモーター／エンハンサー領域を抑制できるが、筋細胞培養において速筋線維遺伝子であるMHCIIbfastを抑制できないことを示す。
【００１０】
hMusTRD1α1遺伝子組換えマウスモデルを用いて、本発明者らは、MusTRD遺伝子からの産物が、筋発生における少なくとも三つのプロセスにとって必要であることを示した：1）遅筋線維表現型の確立、2）筋線維の成熟、および3）筋線維の増殖過栄養。本発明者らはまた、異なる筋肉および異なる発達段階において様々なMusTRDスプライス変種を同定した。さらに、hMusTRD1α1タンパク質の異なる領域が、異なる骨格筋において異なる線維特異的遺伝子調節プログラムを誘発する。
【００１１】
異なる筋肉において様々なMusTRDスプライス変種が同定されたことは、hMusTRD1α1の切断型（アミノ酸1〜458位）が完全長のhMusTRD1α1と比較して下腿ブロック筋における筋表現型に対して異なる作用を示すことと共に、異なるイソ型が異なる筋肉において筋肉の種類の決定に関して異なる機能を行うことを示している。最後に、MusTRD機能を破壊すると、WSにおいて認められる成長および筋骨格欠損が繰り返され、したがって、MusTRDは、WS表現型のこれらの成分に関する候補遺伝子である。
【００１２】
したがって、本発明は、ヒトまたは動物の筋原細胞においてMusTRD1のレベルおよび／または活性を調節する段階を含む、ヒトまたは動物の筋組織において遅筋および速筋線維の相対的組成を調節する方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、ヒトまたは動物の筋原細胞におけるMusTRD1のレベルおよび／または活性を調節することができる化合物をヒトまたは動物に投与する段階を含む、ヒトまたは動物の筋組織における遅筋および速筋線維の相対的組成を調節する方法も提供する。
【００１４】
本発明はさらに、ヒトまたは動物の筋原細胞において、MusTRD1のレベルおよび／または活性を調節する段階を含む、ヒトまたは動物の筋組織における遅筋および／または速筋線維の量を調節する方法を提供する。
【００１５】
もう一つの局面において、本発明は、ヒトまたは動物の筋原細胞においてMusTRDまたはそのイソ型のレベルおよび／または活性を調節することができる化合物をヒトまたは動物に投与する段階を含む、ヒトまたは動物の筋組織における遅筋および／または速筋線維の量を調節する方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ヒトまたは動物の筋原細胞において、MusTRDまたはそのイソ型もしくは断片のレベルおよび／もしくは活性を調節する段階を含む、ヒトまたは動物における筋線維の特殊化を調節する方法も提供する。
【００１７】
本発明はさらに、ヒトまたは動物の筋原細胞において、MusTRDポリペプチドのレベルおよび／または活性を調節することができる化合物をヒトまたは動物に投与する段階を含む、ヒトまたは動物における筋線維の特殊化を調節する方法を提供する。
【００１８】
上記の方法において、化合物は、MusTRDポリペプチドもしくはその断片、またはこの化合物をコードする核酸であることが好ましい。より好ましくは、化合物はhMusTRD1α1、そのオルソログまたはその断片である。
【００１９】
もう一つの局面において、本発明は、ヒトまたは動物の筋原細胞においてMusTRDポリペプチドのレベルおよび／または活性を調節することができる化合物をヒトまたは動物に投与する段階を含む、筋欠損を特徴とする疾患または病態を治療する方法を提供する。
【００２０】
筋欠損は、分化した筋管の異常な筋線維組成、異常な筋線維成熟、および／または異常な増殖過栄養であってもよい。
【００２１】
好ましくは、化合物は、MusTRDポリペプチドもしくはその断片、またはこの化合物をコードする核酸である。
【００２２】
本発明者らはまた、切断型MusTRDポリペプチドがミオシン軽鎖1 slowA（MLC1slowA）、α-トロポミオシンslow（α-Tmslow）、1型ミオシン重鎖（MHC 1）、およびトロポニンI slow（TnI slow）の発現のような、遅筋筋原細胞表現型に関係した遺伝子の発現を阻害することも示している。このように、hMusTRD1α1は、遅筋線維の産生にとって必要な多くの遺伝子の発現の調節に関係している。
【００２３】
したがって、本発明は、MusTRDポリペプチドまたはその断片を細胞に投与する／発現させる段階を含む、細胞におけるミオシン軽鎖1 slowA（MLC1slowA）、α-トロポミオシンslow（α-Tmslow）、I型ミオシン重鎖（MHC I）、およびトロポニンI slow（TnIslow）の発現を調節する方法を提供する。
【００２４】
さらに、本発明者らはまた、MusTRDが、MEF2C媒介転写活性化を阻害することによって遺伝子発現の抑制物質として機能することも示した。したがって、本発明はまた、MusTRDポリペプチドまたはその断片を細胞に投与する／発現させることによるような、細胞におけるMusTRDのレベルを調節することによって、細胞におけるMEF2C媒介遺伝子発現を阻害する方法も提供する。
【００２５】
本発明はさらに、（i）ヒトもしくは動物の筋組織における遅筋および速筋線維の相対的組成を調節するため；（ii）ヒトもしくは動物の筋組織における遅筋および／もしくは速筋線維の量を調節するため；（iii）ヒトもしくは動物の筋線維の特殊化を調節するため；ならびに／または（iv）筋欠損を治療するため、に用いるために、MusTRDポリペプチドもしくはその断片を含むポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２６】
本発明はまた、MusTRD遺伝子の新規イソ型、特にスプライス変種にも関する。したがって、もう一つの局面において、本発明は、オルソログがヒトオルソログである場合、完全長のヒトCREAM-1ポリペプチド（アミノ酸959個）、完全長のヒトWBSCR11ポリペプチド（アミノ酸944個）、完全長のヒトGTF2IRD1ポリペプチド（アミノ酸944個）、およびヒトGTF3ポリペプチドが特に除外されることを条件として、配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、および18のいずれか一つに示したアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのヒトオルソログを提供する。
【００２７】
好ましいオルソログは、ヒトオルソログである。ヒトオルソログには、上記のように除外される、本明細書に記述される対応するマウスイソ型と同じC末端エキソンスプライシングパターンを有するポリペプチドが含まれる。ヒトオルソログには、配列番号：24、25、および26のいずれか一つによってコードされるポリペプチドが含まれる。
【００２８】
本発明はまた、Box 5領域および／またはRD5領域を含むヒトMusTRDポリペプチドならびにBox 5領域および／またはRD5領域を含むその断片も提供する。
【００２９】
一つの態様において、上記の任意のポリペプチドのポリペプチド断片は、完全長のポリペプチドの転写活性化／抑制ドメインを含む。
【００３０】
一つの態様において、ポリペプチド断片は、DBD1 DNA結合ドメインおよび／またはDBD2 DNA結合ドメインを含む。
【００３１】
本発明はまた、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。さらに、本発明は、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドを提供する：
（a）配列番号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、および19のいずれか一つに示される配列を有するポリヌクレオチドおよびそのオルソログ；
（b）Box 5領域および／またはRD5領域をコードする配列を含む（a）のポリヌクレオチドの断片；
（c）DBD1ドメインおよび／またはDBD2ドメインをコードする配列を含む、（a）のポリヌクレオチドの断片；
（d）（a）、（b）、または（c）の任意のポリヌクレオチドに対する遺伝子コードの結果として縮重しているポリヌクレオチド；ならびに
（e）（a）、（b）、（c）、または（d）のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド。
但し、完全長のヒトCREAM-1ヌクレオチド配列、完全長のヒトWBSCR11ヌクレオチド配列、完全長のヒトGTF2IRD1ヌクレオチド配列、および完全長のヒトGTF3ヌクレオチド配列は特に除外される。
【００３２】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドを提供する：
（a）配列番号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、および19のいずれか一つに示される配列を有するポリヌクレオチドおよびそのオルソログ；
（b）Box 5領域および／またはRD5領域をコードする配列を含む（a）のポリヌクレオチドの断片；
（c）DBD1ドメインおよび／またはDBD2ドメインをコードする配列を含む、（a）のポリヌクレオチドの断片；
（d）（a）、（b）、または（c）の任意のポリヌクレオチドに対する遺伝子コードの結果として縮重しているポリヌクレオチド；ならびに
（e）（a）、（b）、（c）、または（d）のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド。
【００３３】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸ベクターと共に、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、この細胞において本ポリペプチドを発現させる条件で本発明の宿主細胞を培養する段階を含む、本発明のポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００３４】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むことによって遺伝子組換えである、ヒト以外の遺伝子組換え動物を提供する。
【００３５】
もう一つの局面において、本発明は、本発明のMusTRDポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を提供する。一つの態様において、この抗体は、Box 5領域もしくはRD5領域、またはDBD1領域もしくはDBD2領域を含む、本発明のMusTRDポリペプチドに特異的に結合する。
【００３６】
生体試料における異なるMusTRDイソ型を検出するために、異なるようにスプライシングされるMusTRDヌクレオチドの領域に基づくプローブ／プライマーを用いてもよい。
【００３７】
したがって、本発明は、マウスMusTRDイソ型のエキソン19、21、22、23、26、27、30、および31、またはそのオルソログの同等の領域から選択されるMusTRDポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチドプローブ／プライマーを提供する。好ましくは、オルソログはヒト配列である。
【００３８】
もう一つの態様において、本発明は、box 5領域およびRD5領域から選択されるMusTRDポリヌクレオチドに対して特異的にハイブリダイズするヌクレオチドプローブ／プライマーを提供する。
【００３９】
本発明はまた、マウスMusTRDイソ型のエキソン19、21、22、23、26、27、30、および31、またはそのオルソログの同等の領域から選択される一つまたは複数のヌクレオチド領域が試料中に存在するか否かを決定する段階を含む、試料中のMusTRDイソ型の有無を同定する方法も提供する。好ましくは、一つまたは複数のヌクレオチド領域の存在は、本発明の一つまたは複数のプライマーを用いるRT-PCRのようなヌクレオチド増幅手段によって決定される。
【００４０】
本発明はまた、以下を含む、試料中のMusTRDイソ型の有無を同定する方法も提供する：
（a）本発明の抗体を提供する段階；
（b）抗体-抗原複合体を形成させる条件で試料をこの抗体と共にインキュベートする段階；および
（c）上記抗体を含む抗体-抗原複合体が形成されたか否かを決定する段階。
【００４１】
好ましくは、抗体はMusTRDポリペプチドのbox5領域またはRD5領域に対して特異的に結合する。
【００４２】
発明の詳細な説明
特に定義していなければ、本明細書において用いた全ての科学技術用語は当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学）によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。分子、遺伝子、および生化学的方法（一般的に、参照として本明細書に組み入れられる、Sambrookら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第3版（2001）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールドスプリングハーバー、ニューヨークおよびAusubelら「Short Protocols in Molecular Biology」、（1999）第4版、John Wiley & Sons, Inc.、および「Current Protocols in Molecular Biology」と題する完全版を参照されたい）、ならびに化学的方法に関して、標準的な技術を用いる。
【００４３】
A．MusTRDポリペプチド
MusTRDポリペプチドには、hMusTRD1α1およびそのイソ型と共にそのオルソログが含まれる。MusTRDポリペプチドにはまた、上記の任意の対立遺伝子変種も含まれる。完全長のMusTRDポリペプチドは、典型的にDNA結合活性を有し（すなわち、下記のUSE B1モチーフ結合活性）TFII-I/MusTRD型反復ドメイン（RD）5または6個を含むポリペプチドである。
【００４４】
本明細書において用いられるイソ型という用語は、本来、対象となるポリペプチドと同じ遺伝子によってコードされる（この場合、イソ型は典型的に、スプライシングおよび／または翻訳後プロセシングのような異なるRNAプロセシングのために対象となるポリペプチドとは異なる）または異なる遺伝子によってコードされる、対象となるポリペプチドの天然に存在する変種を意味する。イソ型が異なる遺伝子によってコードされる場合、アミノ酸レベルでの相同性レベルは典型的には非常に高く、好ましくは全体的な同一性は少なくとも85、90、または95％であると考えられている。イソ型は、DNA結合ドメイン間（例えば、配列番号：31に示すhMusTRD1α1配列のアミノ酸351〜458位および／または544〜944位または他のMusTRDポリペプチドにおける同等の領域）に高いレベルの相同性を有すること、すなわち、DNA結合ドメインの間の全体的な同一性は少なくとも85、90、または95％であることが特に好ましい。
【００４５】
本明細書において言及した様々な特定のイソ型は、MusTRDXα/βYという書式を用いて命名される。イソ型の名称は、ペプチド配列に基づく。第一の数Xは、存在するC末端のRDの独自の組み合わせを示す。イソ型は、起こりうるC末端エキソン2個のうち1個を含み、これらを「α」（エキソン31）または「β」（エキソン30）と命名する。最後の数Yは、存在する独自のC末端エキソンの特異的組み合わせを示す。
【００４６】
オルソログは、その種において、対象となるポリペプチドまたはそのイソ型がヒトにおいて行う機能と同等の機能を有するもう一つの種からの相同なポリペプチドである。例として、マウスのポリペプチドBENは、hMusTRD1α1のオルソログであるが、配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、および20として示される本発明の新たに同定されたマウスポリペプチド配列10個は、BENのイソ型である。
【００４７】
好ましいオルソログはヒトオルソログである。ヒトオルソログには、本明細書に記述される対応するマウスイソ型と同じC末端エキソンスプライシングパターンを有するポリペプチドが含まれる。ヒトMusTRD遺伝子のゲノム配列は当技術分野で既知であり、その結果、本明細書に記述されるマウスイソ型と同じエキソンスプライシングパターンを有するヒトオルソログのポリペプチド配列は、ゲノム配列および／またはそのエキソン／イントロン境界を参照することによって決定することができる（GenBankアクセッション番号NT 007867−ヌクレオチド548538..697334としてMusTRDの位置を示すヒト第7染色体の配列；同様にGenBankアクセッション番号AC004851およびAC005231を参照されたい）。特に、ヒトCream-1を構成するエキソン27個のイントロン／エキソン境界はYanら、2000の表1に記述されている。しかし、Cream-1は、マウス配列のエキソン23、26、27、および30に対応するエキソンを欠失している。エキソン23および30のヒト同等物のヌクレオチド配列を配列番号：28および29に示す。
【００４８】
オルソログ間の相同性レベルは典型的に、イソ型間のレベルより低いと考えられる。その結果、アミノ酸レベルでの相同性のレベルは典型的に、全体的な同一性が少なくとも60、75、80、または85％であると考えられる。しかしこの場合も、オルソログは、DNA結合ドメイン間に高いレベルの相同性を有することが好ましく（例えば、配列番号：31に示されるヒトMusTRD配列のアミノ酸1〜458位または他のMusTRDポリペプチドにおける同等の領域）、すなわちDNA結合ドメイン間の全体的な同一性は少なくとも75、80、または85％であることが好ましい。
【００４９】
配列相同性（配列同一性のような）は、当技術分野で既知のコンピュータープログラムを用いて実行される多様なアルゴリズムを用いて計算することができる。これらのプログラムは典型的に、適当なギャップペナルティを考慮に入れ、概算した類似性スコア行列を用いて、まず最適なアラインメントを生成する。そのようなアラインメントを実行するために適したコンピュータープログラムは、GCGウィスコンシンBestfitパッケージ（ウィスコンシン大学、アメリカ；Devereuxら、1984、Nucleic Acids Research 12：387）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、BLASTパッケージ（Ausubelら、1999、同書第18章）、FASTA（Atschulら、1990、J. Mol. Biol. 403〜410）、およびGENEWORKS比較ツールセットが含まれるがこれらに限定されない。BLASTおよびFASTAは、いずれもオフラインおよびオンライン検索で入手可能である（Ausubelら、1999、同書、7-58〜7-60頁を参照されたい）。しかし、GCG Bestfitプログラム（ギャップに関して-12および各伸長に関して-4のアミノ酸配列デフォルトギャップペナルティならびに公共のデフォルト行列値を用いる）を用いることが好ましい。
【００５０】
ソフトウェアが最適なアラインメントを生成した後、相同性の割合（％）、好ましくは配列同一性の割合（％）を計算することが可能である。ソフトウェアは典型的に、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を生成する。
【００５１】
hMusTRD1α1のアミノ酸配列を配列番号：31に示す。マウスBENのアミノ酸配列を配列番号：20に示す。
【００５２】
本明細書に開示のMusTRDポリペプチドの特異的配列の他に、さらなるイソ型および／またはオルソログを、例えば配列番号：1〜26のいずれかにおけるアミノ酸／ヌクレオチド配列を用いて設計された核酸プローブを用いてcDNA／ゲノムライブラリをプロービングすることによって、または該アミノ酸／ヌクレオチド配列を用いて設計されたプライマーを用いるPCRによって同定してもよい。
【００５３】
好ましくは、オルソログは、ヒトを含む霊長類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等を含む家畜動物のような哺乳類の細胞に由来する。それらはまた、ニワトリ、アヒル、もしくはガチョウの細胞のような鳥類の細胞または魚類の細胞に由来してもよい。
【００５４】
上記のMusTRDポリペプチドの断片には、USE B1モチーフを含むポリヌクレオチドに結合することができる少なくとも一つのDNA結合ドメインを含む断片が含まれる。USE B1モチーフは
2005510545.tif 000002
からなるポリヌクレオチドとして定義される。USE B1モチーフおよびUSE B1モチーフを含むポリヌクレオチドに対するポリペプチドの結合を決定する方法は、O'Mahoneyら、1998にさらに記述される。結合を評価する方法には、電気泳動移動度シフトアッセイ法（EMSA）が含まれる。
【００５５】
適したDNA結合断片の例は、hMusTRD（配列番号：31）のアミノ酸351〜458位および544〜944位からなるポリペプチド、または他のMusTRDポリペプチドにおけるその同等物である。DNA結合活性にとって必要な最少の領域はアミノ酸458個より小さくてもよく、USE B1モチーフに対する結合が実質的に消失するまで、アミノ酸458個の領域のN末端および／またはC末端からアミノ酸配列を段階的に欠失させることによって、当業者によって決定することができる。MusTRD配列の分析から、DNA結合ドメインがアミノ酸408〜420位および738〜765位であることが示され、したがって好ましい断片は、hMusTRD（配列番号：31）のアミノ酸408〜420位および／または738〜765位、または他のMusTRDポリペプチドにおけるその同等物を含む。
【００５６】
他の断片には、本明細書においてトランス活性化ドメインと呼ばれる転写調節を行うために転写機構の成分と相互作用するMusTRDポリペプチドの領域が含まれるが、そのようなドメインは、状況に応じて転写を活性化または抑制する可能性がある。これらのトランス活性化ドメインは、異なるスプライシングのために本明細書に記載の様々なイソ型において異なる。例として、トランス活性化ドメインを含む適した断片は、ヒトMusTRD（配列番号：31）のアミノ酸459位〜C末端まで、または他のMusTRDポリペプチドにおけるその同等物である。
【００５７】
MusTRDポリペプチドのC末端に由来するMusTRD断片は、Box 5領域および／またはRD5領域を含むことが特に好ましい。Box 5領域は本明細書において、本質的に配列
2005510545.tif 000003
からなる配列（本明細書の配列表に示されるマウスイソ型5個のC末端の54個のアミノ酸）、または他のMusTRDポリペプチド（イソ型およびオルソログを含む）における同等の配列として定義される。好ましくは、box 5領域は、配列番号：32と少なくとも70、80、または90％の配列同一性を有する連続した領域を含む。
【００５８】
RD5領域は、本明細書において、本質的に配列
2005510545.tif 000004
からなる配列、または他のMusTRDポリペプチド（イソ型およびオルソログを含む）における同等の配列として定義される。好ましくは、RD5領域は、配列番号：33と少なくとも70、80、または90％の配列同一性を有する連続した領域を含む。
【００５９】
MusTRDポリペプチドの断片は、少なくとも6、8、10、12、または15連続アミノ酸、好ましくは少なくとも20、30、40、または50アミノ酸を含む。断片はまた、典型的に500、400、300、または200連続アミノ酸より少ない数を含む。好ましい断片には、エピトープを含む断片が含まれ、より好ましくは免疫原性である断片が含まれる。
【００６０】
MusTRDポリペプチド／断片の変種および誘導体には、配列からのまたは配列へのアミノ酸の任意の置換、変化、改変、交換、欠失、または付加も含まれる。一般的に、変種または誘導体のアミノ酸残基の20％、10％、または5％未満（例えば、2、3、または5から10個）が、配列表に示す対応する領域のように、当初の配列と比較して変化している。したがって、「変種または誘導体」という用語は、得られたポリペプチドがもはや当業者によってMusTRDポリペプチドでないと認識されるような、配列に対する変化を含まない。
【００６１】
一つの態様において、得られたアミノ酸配列は、当初の配列の生物活性（例えば、DNA結合活性または転写調節活性であってもよい）を保持することが好ましく、好ましくは配列表に示すポリペプチドの活性の少なくとも25〜50％を有する、より好ましくは少なくとも実質的に同じ活性を有する。
【００６２】
このように、例えば、アミノ酸置換は、改変された配列が活性の少なくとも約25〜50％、または実質的に同じ活性を保持する限り、1、2、または3個から10、20、または30個までのアミノ酸置換で構成されてもよい。
【００６３】
しかし、もう一つの態様において、MusTRDポリペプチドのアミノ酸配列に対する改変は、ポリペプチドの生物活性を意図的に減少するように作製してもよい。例えば、標的分子に対する結合能を保持するが機能的エフェクタードメインを欠損する切断型ポリペプチドは、完全長の分子の生物活性の阻害剤として有用となる可能性がある。
【００６４】
アミノ酸置換には、例えば治療的に投与されるポリペプチドの血漿中の半減期を増加させるために、天然に存在しない類似体を用いることが含まれてもよい（治療において用いられるペプチド誘導体の産生に関する詳細については下記を参照されたい）。
【００６５】
保存的置換は、例えば下記の表に従って作製してもよい。二列目の同じブロックにおけるアミノ酸、および好ましくは三列目の同じ行にあるアミノ酸は、互いに置換してもよい。
2005510545.tif 000005
【００６６】
本発明のMusTRDポリペプチドを含むMusTRDポリペプチドは典型的に、例えば下記のように組換え手段によって作製される。しかし、それらはまた、固相合成のような当業者に周知の技術を用いて合成手段によって作製してもよい。ペプチドを化学合成する様々な技術は、Borgia and Fields、2000、TibTech 18：243〜251によって論評され、その中に含まれる参考文献において詳細に記述される。
【００６７】
本発明のMusTRDポリペプチドを含むMusTRDポリペプチドはまた、例えば抽出および精製を補助するために融合タンパク質として産生してもよい。融合タンパク質のパートナーの例には、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、ヘキサヒスチジン、GAL4（DNA結合および／または転写活性化ドメイン）、およびβ-ガラクトシダーゼが含まれる。同様に、融合タンパク質配列を取り出すために、融合タンパク質パートナーと対象タンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を含めることが都合がよいと思われる。好ましくは、融合タンパク質は、それが結合するMusTRDポリペプチドの活性を妨害しない。
【００６８】
一つの態様において、DNA結合ドメインを含むMusTRDポリペプチドの断片を、転写活性化ドメインまたは転写リプレッサードメインのような異種転写調節ドメインに融合してもよい。もう一つの関連する態様において、MusTRD転写調節ドメインを含むMusTRDポリペプチドを、異種DNA結合ドメインに融合してもよい。
【００６９】
MusTRDポリペプチドは実質的に単離型であってもよい。タンパク質は、タンパク質の意図する目的を妨害しない担体または希釈剤と混合してもよく、それでもなお実質的に単離されたと見なしてもよいと理解される。MusTRDポリペプチドはまた、実質的に純粋型であってもよく、この場合これは一般的に調製物におけるタンパク質の90％を超える量、例えば95％、98％、または99％がMusTRDポリペプチドであるタンパク質を調製物において含むであろう。
【００７０】
治療ペプチド
MusTRDポリペプチドは、患者に治療的に投与してもよい。天然に存在するアミノ酸のみで構成されず、例えば免疫原性を減少させるため、患者の体内での循環中の半減期を増加させるため、生物学的利用率を増強するため、および／または有効性および／または特異性を増強するために改変されているペプチドを用いることが好ましい。
【００７１】
治療的応用のためにペプチドを改変する多数のアプローチが用いられている。一つのアプローチは、ポリエチレングリコール（PEG）およびポリプロピレングリコール（PPG）のような多様なポリマーにペプチドまたはタンパク質を結合させることである。例えば、米国特許第5,091,176号、第5,214,131号、および米国特許第5,264,209号を参照されたい。
【００７２】
天然に存在するアミノ酸を、D-アミノ酸およびN-メチルアミノ酸のような多様な非コードまたは改変アミノ酸に置換することもまた、ペプチドを改変するために用いてもよい。
【００７３】
もう一つのアプローチは、N-スクシニミジル3-(2-ピリジルチオ)プロピオネート、スクシニミジル6-[3-(2ピリジルチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート、およびスルホスクシニミジル6-[3-(2ピリジルチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート（米国特許第5,580,853号を参照されたい）のような双機能クロスリンク剤を用いることである。
【００７４】
配座が制限されているMusTRDポリペプチドの誘導体を用いることが望ましい可能性がある。配座による制限は、ペプチドがとる三次元形状の安定性および好ましい配座を意味する。配座による制限には、ペプチドにおける単一の残基の配座上の運動性を制限する段階を含む局所制限；残基がいくつかの二次構造単位を形成する可能性がある一群の残基の配座上の運動性を制限する段階を含む限局性制限；およびペプチド構造全体を巻き込む全体的な制限が含まれる。
【００７５】
B．MusTRDポリヌクレオチド
MusTRDポリヌクレオチドは、MusTRDポリペプチドをコードする核酸配列を含む。多数の異なるポリヌクレオチドが、遺伝子コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードしうることは当業者によって理解されると考えられる。さらに、当業者は、日常的な技術を用いて、MusTRDポリペプチドを発現するる任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するために、MusTRDポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を作製してもよいと理解される。
【００７６】
MusTRDポリヌクレオチドはDNAまたはRNSを含んでもよい。それらは一本鎖または二本鎖であってもよい。それらはまた、それらの中に合成または改変ヌクレオチドが含まれるポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なる種類の改変が当技術分野で既知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の3'および／または5'末端でのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的に関して、本明細書に記述したポリヌクレオチドは当技術分野で利用可能な任意の方法によって改変してもよいと理解される。そのような改変は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行ってもよい。
【００７７】
MusTRDポリヌクレオチドはまた、本明細書に示した配列または上記の任意の相補体と選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列は、好ましくは長さが少なくとも15ヌクレオチド、より好ましくは長さが少なくとも20、30、40、または50ヌクレオチドである。
【００７８】
本明細書において用いた「ハイブリダイゼーション」という用語には、「それによって核酸鎖が塩基対形成を通して相補鎖と結合するプロセス」と共に、ポリメラーゼ連鎖反応技術によって行われるような増幅プロセスが含まれるであろう。
【００７９】
MusTRDポリヌクレオチドにはまた、本明細書に示したヌクレオチド配列またはその相補体と選択的にハイブリダイズすることができるMusTRDポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。これらのポリヌクレオチドは一般的に、本明細書に示した対応するヌクレオチド配列の少なくとも20、好ましくは少なくとも25または30、例えば少なくとも40、60、または100もしくはそれ以上の連続ヌクレオチドの領域に対して、少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％または90％、およびより好ましくは少なくとも95％または98％相同であると考えられる。
【００８０】
「選択的にハイブリダイズ可能である」という用語は、標的MusTRDポリヌクレオチドがバックグラウンドより有意に高いレベルでプローブにハイブリダイズすることが判明した条件下で、プローブとして用いられるポリヌクレオチドが用いられることを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニングされるcDNAまたはゲノムDNAライブラリに存在する他のオリゴヌクレオチドのために起こる可能性がある。この場合、バックグラウンドは、プローブとライブラリの非特異的DNAメンバーとの相互作用によって生成したシグナルレベルを意味し、これは標的DNAについて認められる特異的相互作用の強度の10倍未満、好ましくは100倍未満である。相互作用の強度は、プローブを例えば32Pによって放射標識することによって測定してもよい。
【００８１】
ハイブリダイゼーション条件は、Berger and Kimmel（1987、「Guide to Molecular  Cloning Techniques」、Methods in Enzymology 152巻、Academic Press、サンジエゴ、カリフォルニア州）において教示されるように、核酸結合複合体の融解温度（Tm）に基づき、下記に説明するように、既定の「ストリンジェンシー」を与える。
【００８２】
最大のストリンジェンシーは、典型的に約Tm-5℃（プローブのTmより5℃低い）で起こる；高ストリンジェンシーは、Tmより約5℃〜10℃低い；中間のストリンジェンシーは、Tmより約10℃〜20℃低い；および低ストリンジェンシーは、Tmより約20℃〜25℃低い。当業者によって理解されるように、最大のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを用いて、同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出することができるが、中間（または低）ストリンジェンシーは類似または関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出するために用いることができる。
【００８３】
好ましい局面において、MusTRDポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件で（例えば、65℃および0.1×SSC{1×SSC＝0.15 M NaCl、0.015 M Na3クエン酸塩、pH 7.0}）任意の配列番号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、および19に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列である。
【００８４】
MusTRDポリヌクレオチドには、二本鎖の双方の鎖が個々にまたは組み合わせて含まれる。
【００８５】
本発明の配列と100％相同ではないが本発明の範囲内に入るポリヌクレオチドは多数の方法で得ることができる。本明細書に記述される配列の他の変種は、例えば広い範囲の個体、例えば異なる集団からの個体から作製したDNAライブラリをプロービングすることによって得てもよい。さらに、他のイソ型および／またはオルソログを得てもよく、そのようなイソ型および／またはオルソログは、一般的に任意の配列番号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、および19に示される配列と選択的にハイブリダイズすることができると考えられる。そのような配列は、他の動物種から生成されたcDNAライブラリまたはゲノムDNAライブラリをプロービングすることによって、およびそのようなライブラリを中等度から高ストリンジェンシー条件で上記の配列番号の全てまたは一部を含むプローブによってプロービングすることによって得てもよい。
【００８６】
変種、イソ型、およびオルソログはまた、縮重PCRのようなPCRを用いて得てもよい。縮重PCRにおいて用いられるプライマーは一つまたは複数の縮重位置を含み、既知の配列に対して単一の配列プライマーによって配列をクローニングするために用いられる条件より低いストリンジェンシー条件で用いられると考えられる。
【００８７】
または、そのようなポリヌクレオチドは、配列番号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、および19の任意の配列のような特徴が調べられた配列の部位特異的変異誘発によって得てもよい。これは、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主に関してコドン選択性を最適にするために、例えば配列においてサイレントなコドンの変化が必要である場合に有用となる可能性がある。他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するために、またはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性または機能を変化させるために望ましい可能性がある。
【００８８】
MusTRDポリヌクレオチドは、プライマー（例えばPCRプライマー、もう一つの増幅反応のためのプライマー）、プローブ（例えば、放射活性または非放射活性標識を用いた通常の手段により曝露標識によって標識した）を作製するために用いてもよく、またはポリヌクレオチドをベクターにクローニングしてもよい。そのようなプライマー、プローブ、および他の断片は、長さが少なくとも15、好ましくは少なくとも20、例えば少なくとも25、30、または40ヌクレオチドであると考えられる。好ましい断片は、長さが3000、2000、1000、500、または200ヌクレオチド未満である。
【００８９】
特に好ましいプローブ／プライマーは、異なるイソ型において異なるようにスプライシングされるMusTRD配列の領域に基づくプローブ／プライマーである。そのようなプローブ／プライマーを用いることによって、異なるイソ型を特異的に同定することができると考えられる（実施例において示されるように）。対象となる特定の領域は、マウスMusTRDイソ型のエキソン19、21、22、23、26、27、30、および31から選択されるMusTRDポリヌクレオチド配列またはそのオルソログの同等の領域に対して特異的にハイブリダイズするヌクレオチドプローブ／プライマーである。好ましくは、オルソログはヒト配列である。これらのプライマー／プローブは、マウスエキソン19、21、22、23、26、27、30、もしくは31の配列の断片またはその相補体であってもよい。
【００９０】
DNAポリヌクレオチドおよびプローブのようなMusTRDポリヌクレオチドは、組換え、合成、または当業者に利用可能な任意の手段によって産生してもよい。それらはまた、標準的な技術によってクローニングしてもよい。
【００９１】
一般的に、プライマーは、一度に一ヌクレオチドの、所望の核酸配列の段階的な製造を含む合成手段によって産生されると考えられる。自動化技術を用いてこれを行う技術は、当技術分野で容易に利用可能である。
【００９２】
より長いポリヌクレオチドは一般的に組換え手段、例えばPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて産生されると考えられる。クローニング技術は、望ましい配列の領域に隣接する一組のプライマー（例えば、約15〜30ヌクレオチド）を作製する段階、動物またはヒト細胞から得たmRNAもしくはcDNAにプライマーを接触させる段階、所望の領域の増幅を生じる条件でポリメラーゼ連鎖反応を行う段階、増幅された断片を単離する段階（例えば、反応混合物をアガロースゲル上で精製することによって）、および増幅されたDNAを回収する段階を含むと考えられる。プライマーは、増幅されたDNAを適したクローニングベクターにクローニングすることができるように、適した制限酵素認識部位を含むように設計してもよい。
【００９３】
C．ヌクレオチドベクター
本発明のMusTRDポリヌクレオチドを含むMusTRDポリヌクレオチドは、組換えベクター（典型的には複製可能なベクター）に組み入れることができる。ベクターは、適合性の宿主細胞において核酸を複製するために用いてもよい。適した宿主細胞には、大腸菌のような細菌、酵母、哺乳類細胞株、および他の真核細胞株、例えば昆虫のSf9細胞が含まれる。
【００９４】
好ましくは、ベクターに存在するMustRDポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を提供することができる制御配列に機能的に連結しており、すなわちベクターは発現ベクターである。「機能的に連結した」という用語は、記述される成分が意図するようにそれらを機能させる関係に存在することを意味する。コード配列に「機能的に連結した」調節配列は、コード配列の発現が制御配列と適合性の条件で得られるようにライゲーションされる。
【００９５】
制御配列は、例えば、転写レベルが、転写調節物質に対してより反応性の制御配列の指示を受けるように、さらなる転写調節要素の付加によって改変してもよい。
【００９６】
MusTRDポリヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドを含むベクターは、MusTRDポリペプチドの発現を提供するように、下記のように適した宿主細胞に形質転換または形質移入してもよい。このプロセスは、タンパク質をコードするコード配列のベクターによる発現を提供する条件で、上記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する段階、および選択的に発現されたタンパク質を回収する段階を含んでもよい。
【００９７】
ベクターは、例えば、複製開始点、選択的に上記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、および選択的にプロモーターの調節物質と共に提供されたプラスミドまたはウイルスベクターであってもよい。ベクターは、一つまたは複数の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン抵抗性遺伝子、または哺乳類ベクターの場合にはネオマイシン抵抗性遺伝子を含んでもよい。ベクターは、例えば、宿主細胞を形質移入または形質転換するために用いてもよい。
【００９８】
MusTRDポリペプチドをコードする配列に機能的に連結した制御配列には、プロモーター／エンハンサー、および他の発現調節シグナルが含まれる。これらの制御配列は、発現ベクターが中で用いられるように設計される宿主細胞と適合性となるように選択してもよい。「プロモーター」という用語は、当技術分野で周知であり、最小のプロモーターから上流の要素およびエンハンサーを含むプロモーターに至るまでその大きさおよび複雑度が多様な核酸領域を含む。
【００９９】
プロモーターは、典型的に、哺乳類細胞または他の動物細胞において機能的であるプロモーターから選択される。このように、プロモーターは、典型的にウイルスまたは真核細胞遺伝子のプロモーター配列に由来する。例えば、プロモーターは、発現が起こる細胞のゲノムに由来するプロモーターであってもよい。真核細胞のプロモーターに関して、それらは、偏在的に（β-アクチン、チューブリンのプロモーターのような）、または組織特異的に（α-骨格アクチンプロモーターのような）機能するプロモーターであってもよい。本発明の治療的方法の状況において、筋細胞に対して特異的な組織特異的プロモーター、例えば、速筋線維において発現するヒトα-骨格アクチンプロモーターおよび全ての筋線維において発現するヒトα-骨格アクチンプロモーターにTnslow上流エンハンサー（USE）を加えた組み合わせが特に好ましい。それらはまた、特異的刺激に反応するプロモーターであってもよい。ウイルスプロモーター、例えばモロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（MMLV LTR）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモーター、またはヒトサイトメガロウイルス（CMV）IEプロモーターを用いてもよい。
【０１００】
同様に、細胞の一生の間MusTRDポリペプチドの発現レベルを調節することができるようにプロモーターは誘導型であることが都合がよいと思われる。誘導型とは、プロモーターを用いて得られた発現レベルを調節することができることを意味する。
【０１０１】
さらに、任意のこれらのプロモーターも、さらなる調節配列、例えばエンハンサー配列を加えることによって改変してもよい。上記の二つまたはそれ以上の異なるプロモーターからの配列要素を含むキメラプロモーターも同様に用いてもよい。
【０１０２】
D．宿主細胞
MusTRDポリヌクレオチドおよびこれを含むベクターを、ベクター／ポリヌクレオチドを複製するおよび／またはMusTRDポリペプチドを発現する目的で宿主細胞に導入してもよい。MusTRDは、宿主細胞として原核細胞を用いて産生してもよいが、真核細胞、例えば酵母、昆虫、または哺乳類細胞を用いることが好ましい。特に、本発明の方法の状況において、治療することが望ましいヒトまたは動物の細胞（標的細胞）においてポリペプチドを産生してもよい。このように、典型的に宿主細胞は、哺乳類、鳥類、または魚類の細胞のような脊椎動物細胞であると考えられる。宿主細胞／標的細胞は、筋細胞、または筋衛星細胞および胚もしくは成体起源の幹細胞のような骨格筋を生じることができる細胞であることが特に好ましい。
【０１０３】
ベクター／ポリヌクレオチドは、形質移入、形質転換、および電気穿孔のような当技術分野で既知の多様な技術を用いて適した宿主細胞に導入してもよい。ベクター／ポリヌクレオチドを動物に投与する場合、いくつかの技術、例えばレトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびアデノウイルスのような組換え型ウイルスベクターによる感染、核酸の直接注入、ならびにバイオリスティック形質転換が当技術分野で既知である。
【０１０４】
E．タンパク質の発現と精製
MusTRDポリヌクレオチドを含む宿主細胞を用いてMusTRDポリペプチドを発現してもよい。宿主細胞は、MusTRDポリペプチドを発現させる適した条件で培養してもよい。MusTRDポリペプチドのタンパク質の発現は、それらが連続的に産生されるように構成的であってもよく、または発現を開始するために刺激を必要とする誘導型であってもよい。誘導型発現の場合、タンパク質産生は、例えば誘導物質、例えばデキサメタゾンまたはIPTGを培養培地に加える必要がある時期に開始することができる。
【０１０５】
望ましければ、MusTRDポリペプチドは、酵素、化学および／または浸透圧溶解ならびに物理的破壊を含む、当技術分野で既知の多様な技術によって宿主細胞から抽出することができる。
【０１０６】
F．抗体
本発明はまた、本発明のMusTRDポリペプチドまたはその断片に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を提供する。このように、本発明はさらに、本発明のMusTRDポリペプチドに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生のためのプロセスを提供する。さらに、MusTRDポリペプチド全般に対して特異的な抗体も本発明の方法において用いてもよい。好ましい態様において、抗体はBox 5領域またはRD5領域を欠損するMusTRDポリペプチドには交叉反応しない。好ましい抗体は、Box 5領域またはRD5領域に特異的に結合する抗体である。
【０１０７】
ポリクローナル抗体が望ましい場合、選択した哺乳類（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を、Box 5領域またはRD5領域を含む断片のような、MusTRDエピトープを有する免疫原性ポリペプチドによって免疫する。免疫した動物からの血清を採取して、既知の方法に従って処置する。MusTRDエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清が他の抗原に対する抗体を含む場合、ポリクローナル抗体を免疫アフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。ポリクローナル抗血清を産生および処理する技術は当技術分野で既知である。そのような抗体が産生されるように、本発明はまた、もう一つのポリペプチドに対してハプテン化された本発明のMusTRDポリペプチドまたはその断片および動物またはヒトにおける免疫原としての使用も提供する。
【０１０８】
MusTRDエピトープに対するモノクローナル抗体も同様に、当業者によって容易に産生することができる。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を産生する一般的な方法論は周知である。不死化抗体を産生する細胞株を細胞融合によって、および腫瘍発生DNAによるBリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン-バーウイルスによる形質移入のような他の技術によっても作製することができる。MusTRDエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルを、様々な特性；すなわちアイソタイプおよびエピトープ親和性に関してスクリーニングすることができる。
【０１０９】
もう一つの技術は、例えば、ファージがその外皮表面上に非常に多様な相補性決定領域（CDR）を有するscFv断片を発現するファージディスプレイライブラリをスクリーニングする段階を含む。この技術は当技術分野で周知である。
【０１１０】
MusTRDエピトープに対する抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれも、下記のように診断および／または治療的方法において有用となる可能性がある。
【０１１１】
特に、モノクローナル抗体は、抗イディオ型抗体を作製するために用いてもよい。抗イディオ型抗体は、対象となる抗原の「内部像」を有する免疫グロブリンである。抗イディオ型抗体を産生する技術は当技術分野で既知である。これらの抗イディオ型抗体も同様に治療において有用となる可能性がある。
【０１１２】
本発明の目的に関して、「抗体」という用語は、その逆であることを明記していない限り、標的抗原に対するその結合活性を保持する抗体全体の断片が含まれる。そのような断片には、Fv、F(ab')、およびF(ab')2断片と共に一本鎖抗体（scFv）および単ドメイン抗体が含まれる。さらに、抗体およびその断片は、例えば欧州特許第A239400号に記載されるように、ヒト化抗体であってもよい。
【０１１３】
MusTRD抗体は、固相支持体に結合、および／または適した試薬、対照、説明書等と共に適した容器においてキットに包装してもよい。
【０１１４】
G．MusTRDイソ型を同定する方法
本発明の抗体は、以下を含む方法によって生体試料中に存在するMusTRDポリペプチドを検出する方法において用いてもよい：（a）MusTRDに対して特異的な抗体を提供する段階；（b）抗体-抗原複合体を形成させる条件で生体試料を抗体と共にインキュベートする段階；および（c）抗体を含む抗体-抗原複合体が形成されるか否かを決定する段階。
【０１１５】
抗体-抗原複合体の有無を決定する方法は当技術分野で周知であり、ELISAのような技術が含まれる。典型的に、一次抗体を標識するか、または標識した、例えば酵素に結合させた二次抗体を用いる。
【０１１６】
適した試料には一般的に、筋組織および筋細胞を含む他の組織からの抽出物が含まれる。
【０１１７】
異なるようにスプライシングされるMusTRDヌクレオチドの領域に基づくプローブ／プライマーは、生体試料において異なるMusTRDヌクレオチドイソ型を検出するために用いてもよい。
【０１１８】
Musイソ型は異なるスプライシングによって生じることから、異なるイソ型を検出するために用いられる技術は一般的に、ノーザンブロッティングまたはRT-PCRのような方法を用いて試料中のRNAを検出することに基づくであろう。
【０１１９】
総RNAは、Trizol（商標）抽出のような当技術分野で既知の技術を用いて生体試料から抽出することができる。
【０１２０】
ノーザンブロッティングのようなプローブハイブリダイゼーション技術を用いる場合、実質的にプローブ配列全体が少なくとも一つのスプライス変種に存在しないヌクレオチド配列に対応するように、プローブを選択すべきである。図1は、同定されたイソ型11個のスプライスパターンを示す。本質的にエキソン23配列からなるプローブを用いて、マウスMusTRD 1α4、3α7、1β4、および3β7を検出してもよい。同様に、本質的にエキソン31配列からなるプローブを用いて、αイソ型を検出することができるが、本質的にエキソン30配列からなるプローブは、βイソ型を検出するために用いることができる。異なるヒトイソ型を検出するために役立つヒトエキソン30および31配列を配列番号：28および29として示す。
【０１２１】
典型的に、多数の異なるプローブは、異なるプローブにハイブリダイズする配列の有無に基づいて特定のイソ型を同定するために用いられると考えられる。試料中に存在するハイブリダイズする配列がMusTRD配列であることを確認するために、エキソン1〜18によってコードされる不変のN末端領域に対して特異的にハイブリダイズする対照プローブを含めることが望ましいかも知れない。
【０１２２】
しかし、RT-PCRのような増幅に基づく検出技術を用いることが好ましい。RT-PCRを行う場合、典型的に少なくとも一つのプライマーは、マウスMusTRDイソ型のエキソン19、21、22、23、26、27、30、および31のような異なるようにスプライシングされたエキソン、またはそのオルソログの同等の領域に対して特異的であると考えられる。適したプライマーの例を実施例に示し、これをマウス組織におけるマウスイソ型を同定するために用いた。そのような検出技術の結果は典型的に、増幅産物が存在するかまたは存在しないかであると考えられる。
【０１２３】
または、異なるようにスプライシングされる領域に隣接する適切に設計されたプライマーを用いると、検出は増幅産物の大きさに基づくことができる。PCRプライマーがハイブリダイズする二つの領域の間のスプライス変種にエキソンが存在しない場合、増幅産物はエキソンが存在する場合より小さくなるであろう。
【０１２４】
H．筋組織組成を調節する、筋障害を治療する、および運動成績を予測する方法
本発明者らは、MusTRDが遅筋 対 速筋筋原性表現型の調節と共に、筋線維の成熟および増殖過栄養において重要な役割を果たすことを示した。本発明者らはまた、マウス（m）MusTRDイソ型の異なる組み合わせが、ヒラメ筋、四頭筋、および長指伸筋（EDL）のような異なる筋肉ならびにC2C12骨格筋細胞株によって示される胚／胎児筋線維に存在することも示した。
【０１２５】
したがって、hMusTRD1α1およびそのイソ型の活性の調節を用いて、筋組織における遅筋および速筋線維の種類の増殖を調節してもよい。例えば、MusTRD活性の調節を用いて、個体の一つまたは複数の筋肉における遅筋線維の量を増強してもよい。または、MusTRD活性の調節を用いて、個体の一つまたは複数の筋肉における遅筋線維の量を減少させてもよい。筋細胞におけるMusTRD活性を調節する作用は一般的に、筋細胞の種類に依存する。さらに、特定のMusTRDイソ型を標的とする場合、作用は、特定のMusTRDイソ型に依存すると考えられる。
【０１２６】
同様の様式により、hMusTRD1α1およびそのイソ型の活性の調節を用いて、個体の筋組織における遅筋と速筋の型の相対的組成を調節してもよい。典型的に、これは、他の線維の種類の増殖を抑制しながら一つの線維の種類の増殖を刺激することによって得られる。同様に、一つの種類をもう一つに変換することによって得ることもできる。
【０１２７】
このように、一つの態様において、遅筋に対して特異的な一つまたは複数のミオシン重鎖イソ型および他の収縮性タンパク質遺伝子の発現の増加ならびに速筋に対して特異的な一つまたは複数のミオシン重鎖イソ型および他の収縮性タンパク質遺伝子の発現の減少が認められる。もう一つの態様において、速筋に対して特異的な一つまたは複数のミオシン重鎖イソ型および他の収縮性タンパク質遺伝子の発現の増加ならびに遅筋に対して特異的な一つまたは複数のミオシン重鎖イソ型および他の収縮性タンパク質遺伝子の発現の減少が認められる。
【０１２８】
hMusTRD1α1およびそのイソ型の活性の調節を用いて、筋線維の成熟を調節、典型的には増強してもよい。
【０１２９】
さらに、hMusTRD1α1およびそのイソ型の活性の調節も同様に用いて、筋増殖を調節（特に筋増殖を刺激）、例えば筋重量を増加させてもよい。これは、分化した筋管の増殖過栄養におけるその役割の結果である。特に、hMusTRD1α1およびそのイソ型の活性の調節を用いて、対象となる筋肉の断面積を増加または減少（好ましくは増加）および／または筋の直径を増加または減少（好ましくは増加）させてもよい。
【０１３０】
hMusTRD1α1およびそのイソ型による筋増殖ならびに遅筋／速筋の組成および量の調節は、治療応用を含む多くの適用を有する。例えば、速筋が多くなり、線維の萎縮が起こる神経損傷を経験した患者を、遅筋の増殖を刺激する、速筋を遅筋に変換する、および増殖過栄養を促進するように処置してもよい。同様に、遅筋の数の減少、速筋の数の増加、および筋萎縮筋によって生じた正常な加齢の有害な作用を経験する個体を、遅筋の数を増加させて萎縮を逆転させるように処置してもよい。もう一つの例において、速筋または遅筋が多く存在しておよび／または線維の萎縮が起こるヒトミオパシーのような、しかしこれらに限定されない疾患において、患者を、初回傾向を逆転させるおよび筋萎縮を逆転させるために速筋または遅筋の数を増加するように治療してもよい。MusTRD活性の調節はまた、筋変性を治療または予防するために用いてもよい。
【０１３１】
非治療的応用には、筋肉の品質を改善するためのウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ等を含む家畜動物における使用が含まれる。一つの態様において、これはMusTRDポリペプチドまたはその断片を発現する遺伝子組換え動物を作製することによって得てもよい。遺伝子組換え動物の作製は下記に記述する。もう一つの非治療的応用において、筋生検におけるMusTRD転写物またはタンパク質の量または分布を、筋疾患の有無、運動および競走馬の成績、ならびに肉牛、ヒツジ、およびブタにおける肉の品質の指標として用いることができる。そのような試験からの結果は、疾患を診断するため、および運動または動物の能力を評価するために用いられると思われる。そのような試験の結果は、最大の成績を得るために、そして一貫した所望の品質を有する食肉を産生する動物種畜を同定するために、訓練計画を設計するために用いられると思われる。MusTRD活性は、典型的に細胞におけるMusTRDポリペプチドの量を調節することによって、および／または細胞におけるMusTRDポリペプチドの活性を調節することによって調節してもよい。
【０１３２】
細胞におけるMusTRDポリペプチドの量は、その細胞におけるMusTRDポリペプチドの発現を指示するポリヌクレオチドを細胞に導入することによって増加させてもよい。細胞におけるMusTRDポリペプチドの量は、アンチセンスRNA、リボザイム、または他の阻害性RNA配列のようなMusTRDポリペプチドの発現を遮断するポリヌクレオチドを細胞に導入することによって減少させてもよい。適当な筋細胞特異的転写調節配列を用いることによって、ポリヌクレオチドの発現が筋細胞に限定されることが好ましい。同様に、被験者に化合物を投与することによって発現を誘導できるように、誘導型であって、被験生物において通常認められない化合物に対して反応する転写調節制御要素を含めることが望ましい可能性がある。
【０１３３】
細胞におけるMusTRDポリペプチドの量はまた、MusTRDポリペプチドの発現を調節する化合物、例えばMusTRD遺伝子からの転写を阻害する化合物を細胞に投与することによって調節してもよい。
【０１３４】
細胞におけるMusTRDポリペプチドの活性は多数の方法で調節してもよい。例えば、MusTRDに直接結合して、細胞転写機構の他の成分との相互作用を妨害する（抗体のような）化合物を投与してもよい。他の化合物は、MusTRDポリペプチドに結合しなくてもよいが、標的分子との結合に関してMusTRDと直接競合してもよい。例えば、転写活性化ドメインが欠損しているが機能的DNA結合ドメインを有する切断型MusTRDポリペプチドは、遺伝子プロモーターにおけるUSE-B1配列に結合する可能性があるが、転写を活性化／抑制することができないと考えられる（実施例に示すように）。
【０１３５】
抗体およびMusTRD変異体ポリペプチドの他に適した化合物が、例えば下記のアッセイ法を用いて同定される可能性がある。
【０１３６】
本発明者らはまた、切断型MusTRDポリペプチドが、特定の筋に応じて、ミオシン軽鎖1 slowA（MLC1slowA）、α-トロポミオシンslow（α-Tmslow）、I型ミオシン重鎖（MHC I）、およびトロポニンI slow（TnIslow）の発現のような遅筋筋原性表現型に関係する遺伝子の発現を阻害または活性化することができることも示した。このように、MusTRDイソ型は、遅筋線維の産生にとって必要な多数の遺伝子の発現の調節に関与している。
【０１３７】
本発明者らはまた、MusTRDがMEF2C媒介転写活性化を阻害することによって遺伝子発現の抑制物質として機能することも示した。したがって、MusTRDポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチドは、細胞におけるMusTRDポリペプチドのレベルを増加させることによるような、細胞におけるMEF2C媒介遺伝子発現を阻害する方法において用いることができる。好ましくは、MusTRDポリペプチドは、hMusTRD1α1またはそのオルソログである。
【０１３８】
I．アッセイ法
本発明は、MusTRD活性を調節する物質を同定するために適したアッセイ法を提供する。そのようなアッセイ法はインビトロまたはインビボであってもよい。
【０１３９】
候補物質
MusTRDポリペプチドとの相互作用の結果としてMusTRD活性を調節する物質は、いくつかの方法で調節を行ってもよい。これは、例えば、MusTRDポリペプチドに結合する、および他の成分との相互作用部位を遮蔽するまたは変化させることによって、細胞成分に対するMusTRDポリペプチドの結合を直接破壊してもよい。この種類の候補物質は、例えば下記のようにインビトロ結合アッセイ法によって予備的にスクリーニングしてから、例えば全細胞アッセイ法またはインビボアッセイ法において試験することが都合がよい可能性がある。候補物質の例には、MusTRDポリペプチドを認識する抗体が含まれる。
【０１４０】
MusTRDポリペプチドに直接結合することができる物質はまた、その細胞下局在を変化させそれによってMusTRDポリペプチドが細胞核に入ることを防止することによって、細胞の転写におけるその機能を阻害する可能性がある。これは、例えば下記の全細胞アッセイ法を用いて調べることができる。MusTRDポリペプチドの非機能的相同体も同様に、それらがプロモーターにおけるMusTRD認識部位に対する結合に関して、および／または転写機構の他の成分に対する結合に関してMusTRDポリペプチドと競合する可能性があるがMusTRDポリペプチドの正常な機能を行うことができないため調べてもよい。そのような非機能的相同体には、天然に存在するMusTRDポリペプチド変異体および改変MusTRDポリペプチド配列またはその断片が含まれてもよい。特に、DNA結合ドメインを含むが他の機能的ドメインが欠損しているMusTRDポリペプチドの断片を、プロモーター領域との結合に関して完全長のMusTRDポリペプチドと競合させるために用いてもよい。
【０１４１】
または、MusTRDと他の細胞成分との会合を直接調節する代わりに、物質は、MusTRDポリペプチドの生物学的に利用可能な量を調節、典型的には抑制してもよい。これは、転写、転写物の安定性、翻訳、または翻訳後の安定性のレベルでMusTRDの発現を阻害することによって行ってもよい。そのような物質の例は、MusTRDポリペプチドmRNA生合成の量を抑制するアンチセンスRNAまたは二本鎖干渉RNA配列であろう。
【０１４２】
適した候補物質には、特に、Aの章で記述したMusTRDポリペプチドの様々なドメインの配列に基づくペプチド、特に大きさがアミノ酸約5〜30個もしくは10〜25個のペプチド、または一つもしくは複数の残基が置換されているそのようなペプチドの変種が含まれる。ランダム配列、または最大限に多様なペプチドパネルを提供するために一貫して変化している配列を含むペプチドパネルからのペプチドを用いてもよい。
【０１４３】
適した候補物質にはまた、MusTRDポリペプチドに対して特異的である抗体産物（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ならびにCDR-移植抗体）が含まれる。さらに、組み合わせライブラリ、ペプチドおよびペプチド模倣体、既定の化学実体、オリゴヌクレオチド、ならびに天然物ライブラリを、MusTRD活性の調節物質としての活性に関してスクリーニングしてもよい。候補物質は、例えば反応あたり物質10個のバッチにおいて初回スクリーニングにおいて用いてもよく、阻害を示すそれらのバッチの物質を個々に調べてもよい。
【０１４４】
MusTRDポリペプチド結合アッセイ法
MusTRDポリペプチドに結合する物質を同定するためのある種の方法は、固相支持体に固定されたMusTRDポリペプチドに非固定候補物質を接触させる段階、MusTRDポリペプチドと候補物質とが互いに結合するか否かおよび／または結合する程度を決定する段階を含む。または、候補物質を固定してMusTRDポリペプチドを固定しなくてもよい。
【０１４５】
好ましいアッセイ法において、MusTRDポリペプチドをアガロースビーズのようなビーズに固定する。典型的に、これは細菌、酵母、または高等真核細胞株においてGST-融合タンパク質として成分を発現させること、およびグルタチオンアガロースビーズを用いて粗細胞抽出物からGST-融合タンパク質を精製することによって得られる。対照として、GST融合タンパク質ではない候補物質の固定MusTRDポリペプチドに対する結合を、MusTRDポリペプチドの非存在下で決定してもよい。次に、固定MusTRDポリペプチドに対する候補物質の結合を決定する。この種類のアッセイ法は、GSTプルダウンアッセイ法として当技術分野で既知である。この場合も、候補物質を固定して、MusTRDポリペプチドを固定しなくてもよい。
【０１４６】
同様に、成分の一つを固定するために異なるアフィニティ精製系、例えばNi-NTAアガロースおよびヒスチジンタグ成分を用いて、この種類のアッセイ法を行うことも可能である。
【０１４７】
候補物質に対するMusTRDポリペプチドの結合は、当技術分野で周知の様々な方法によって決定してもよい。例えば、非固定成分を標識してもよい（例えば、放射活性標識、エピトープタグ、または酵素-抗体結合物によって）。または結合を免疫学的検出技術によって決定してもよい。例えば、反応混合物にウェスタンブロットを行い、ブロットを、非固定成分を検出する抗体によってプロービングすることができる。ELISA技術も同様に用いてもよい。
【０１４８】
候補物質は典型的に、1〜1000 nmol/ml、より好ましくは1〜100 nmol/mlの最終濃度で加えられる。抗体の場合、用いる最終濃度は典型的に、100〜500 μg/ml、より好ましくは200〜300 μg/mlである。
【０１４９】
全細胞アッセイ法
候補物質はまた、MusTRD発現および／または活性に及ぼすその作用に関して全細胞について調べてもよい。候補物質は、上記のインビトロ法によって同定してもよい。または、MusTRD発現および／または活性を調節することができる物質に関する迅速な処理能のスクリーニングを、予備的なスクリーニングとして用いてもよい。
【０１５０】
候補物質、すなわち試験化合物はいくつかの方法で細胞に投与してもよい。例えば、これは細胞培養培地に直接加えてもよく、または細胞に注入してもよい。または、ポリペプチド候補物質の場合には、細胞においてポリペプチドの発現を指示する核酸構築物を細胞に移入させてもよい。ポリペプチドの発現は、調節可能なプロモーターの制御下であってもよい。
【０１５１】
典型的に、MusTRD発現に及ぼす候補物質の影響を決定するアッセイ法は、候補物質を細胞に投与する段階、ならびにウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、および／または定量的PCRのような技術を用いて、MusTRDポリペプチドおよび／またはmRNAレベルが影響を受けるか否かを決定する段階を含む。
【０１５２】
用いる候補物質の濃度は典型的に、細胞における最終濃度がインビトロアッセイ法のための上記の濃度と類似であるような濃度であると考えられる。
【０１５３】
インビボアッセイ法
候補物質は、MusTRD活性／発現に及ぼす作用によって、筋線維の種類／組成および／または増殖の調節に対する作用が起こるか否かを決定するために、最終的に動物モデルにおいて調べる必要があろう。
【０１５４】
候補物質は例えば、4週齢未満のマウスのような若い動物に投与してもよい。投与は、下記のHの章に記述するとおりに行ってもよい。次に動物を2〜12ヶ月間のような一定期間モニターし、動物の一つまたは複数の筋肉から筋組織の試料を採取して、存在する遅筋および速筋の量を決定する。
【０１５５】
実施例に記述するように、これは典型的に、遅筋線維の場合にはI型ミオシン重鎖（MHC）および速筋線維の場合にはMHC-IIA、MHC-IIX、またはMHC-IIBのような、異なる線維の種類に対して特異的なマーカーの発現を測定することによって行ってもよい。調べる筋肉には、ヒラメ筋（遅筋、45％MHC-Islowおよび55％MHC-IIAfast）、長指伸筋（EDL；主に速筋、80％MHC-IIBfast、15％MHC-IIAfast、および5％MHC-Islow）が含まれてもよい。好ましい候補物質は、一つの線維の種類に対して特異的な一つまたは複数のミオシン重鎖イソ型の発現において少なくとも20、30、40、または50％変化が起こる物質である。このように、一つまたは複数の態様において、遅筋線維に対して特異的な一つまたは複数のミオシン重鎖イソ型の発現の増加が起こり、速筋線維に対して特異的な一つまたは複数のミオシン重鎖イソ型の発現の減少が起こる。もう一つの態様において、速筋線維に対して特異的な一つまたは複数のミオシン重鎖イソ型の発現の増加が起こり、遅筋線維に対して特異的な一つまたは複数のミオシン重鎖イソ型の発現の減少が起こる。
【０１５６】
その他の試験には、筋断面積および／または線維の直径の測定が含まれる。
【０１５７】
J．投与
MusTRDポリペプチド、その断片、および上記のアッセイ法によって同定された物質を好ましくは様々な成分と組み合わせて組成物を産生する。好ましくは、組成物を薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて薬学的組成物を生成する（ヒトまたは動物で用いるためであってもよい）。適した担体および希釈剤には、等張生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。本発明の組成物は直接注射によって投与してもよい。組成物は、例えば非経口、筋肉内、静脈内、皮下、経口、または経皮投与のために調製してもよい。
【０１５８】
典型的に、ポリペプチドの場合、それぞれのポリペプチドは、0.01〜30 mg/kg体重、好ましくは0.1〜10 mg/kg、より好ましくは0.1〜1 mg/kg体重の用量で投与してもよい。
【０１５９】
本発明の方法において用いられるポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドまたは阻害性RNAを、裸の核酸構築物として直接投与してもよい。ポリヌクレオチド／ベクターを裸の核酸として投与する場合、投与する核酸の量は、典型的に1 μg〜10 mg、好ましくは100 μg〜1 mgの範囲であってもよい。
【０１６０】
哺乳類細胞のような真核細胞による裸の核酸構築物の取り込みは、いくつかの既知の形質移入技術、例えば形質移入剤を用いる段階を含む技術によって増強される。これらの物質の例には、陽イオン剤（例えば、リン酸カルシウムおよびDEAEデキストラン）およびリポフェクタント（lipofectant）（例えば、lipofectam（商標）およびtransfectam（商標））が含まれる。典型的に、核酸構築物を形質移入剤と混合して組成物を産生する。
【０１６１】
好ましくは、ポリヌクレオチドまたはベクターを薬学的に許容される担体または希釈剤と混合して、薬学的組成物を産生する。適した担体および希釈剤には、等張生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。組成物は、例えば、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、経口、または経皮投与のために調製してもよい。
【０１６２】
当業者は任意の特定の患者および病態に関して最適な投与経路および用量を容易に決定できると考えられることから、記述される投与経路および用量は、手引きに過ぎないことが意図される。
【０１６３】
K．遺伝子組換え動物の作製
遺伝子組換え動物を作製する技術は当技術分野で周知である。この主題に関する有用な一般的なテキストは、Houdebine、「Transgenic animals−Generation and Use」（Harwood Academic、1997）であり、これは魚からマウスおよびウシに至る遺伝子組換え動物を作製するために用いられる技術の詳細な論評である。
【０１６４】
胚の微小操作に関する技術の進歩によって、今では、例えば哺乳類の受精卵に異種DNAを導入することができる。例えば、全能性または多能性幹細胞をマイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染、または他の手段によって形質転換することができ、次に、形質転換した細胞を胚に導入すると、胚は遺伝子組換え動物に発達する。非常に好ましい方法において、発達途中の胚に、所望のDNAを含むレトロウイルスを感染させ、感染した胚から遺伝子組換え動物を産生する。しかし、最も好ましい方法において、適当なDNAを前核段階の卵に標準的な方法によってマイクロインジェクションする。注入した卵子を培養してから、仮親レシピエントの卵管に移植して、成熟遺伝子組換え動物を発達させる。これらの技術は周知である。Hoganら、「Manipulating the Mouse Embryo」（Cold Spring Harbor Press、1986）；Krimpenfortら、Bio/Technology 9：844（1991）；Palmiterら、Cell 41：343（1985）；Kraemerら、「Genetic manipulation of the Mammalian Embryo」（Cold Spring Harbor Laboratory Press、1985）；Hammerら、Nature 315：680（1985）；Wagnerら、米国特許第5,175,385号；Krimpenfortら、米国特許第5,175,384号を含む、異種DNAを哺乳類受精卵にマイクロインジェクションするための標準的な実験技法に関する論評を参照されたい（そのそれぞれの内容物が参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１６５】
遺伝子組換え動物はまた、Schnieke, A.E.ら、1997、Science 278：2130およびCibelli, J.B.ら、1998、Science 280：1256に記述される核移入技術によって産生してもよい。この方法を用いて、ドナー動物からの線維芽細胞を、調節配列の制御下で、対象となる結合ドメインまたは結合パートナーに関するコード配列を組み入れるプラスミドに安定に移入させる。徐核した卵母細胞に安定な形質移入体を融合させて、培養し、雌性レシピエントに移入する。
【０１６６】
遺伝子組換え配列を含む可能性がある動物の分析は典型的に、標準的な方法に従ってPCRまたはサザンブロット分析のいずれかによって行われると考えられる。
【０１６７】
ウシのような遺伝子組換え哺乳類を構築するための特定の例として、GFPに融合させた結合ドメインをコードする配列を含むヌクレオチド構築物を、例えば米国特許第4,873,191号に記述される技術を用いて、哺乳類から新たに採取した卵巣から得た卵母細胞にマイクロインジェクションする。卵母細胞を卵胞から吸引し、沈降させた後、これをヘパリンによって受精能を獲得させ、パーコール勾配によって予め分画し、運動性の分画を単離した凍結融解精子と受精させる。
【０１６８】
受精卵を、例えば、注入のために前核を可視化するために15,000 gで8分間遠心した後、卵管組織条件培地において受精卵を桑実胚または胚盤胞の段階まで培養する。この培地は、卵管から掻き取った管腔組織を用いて、培養培地において希釈することによって調製する。受精卵は、マイクロインジェクション後2時間以内に培養培地に入れなければならない。
【０１６９】
次に、コプロスタノールを投与することによって、ウシのような意図するレシピエント哺乳類において発情を同期させる。発情は2日以内に発生して、発情後5〜7日に胚をレシピエントに移植する。移入の成功は、子孫におけるサザンブロットによって評価することができる。
【０１７０】
または、導入遺伝子による改変を確実にするために、所望の構築物を胚幹細胞（ES細胞）に導入して細胞を培養することができる。次に、改変された細胞を胞胚段階に注入して、胞胚を偽妊娠宿主に移植した。得られた子孫は、ESおよび宿主細胞に関してキメラであり、ES子孫のみを含む非キメラ系統は、通常の交配を用いて得ることができる。この技術は例えば国際公開公報第91/10741号に記述されている。
【０１７１】
本発明の局面は、説明目的であって制限的でない以下の実施例を参照してさらに記述されるであろう。実施例は下に記載される図を参照する。
【０１７２】
実施例
緒言
ヒトMusTRD1α1（hMusTRD1α1）は、当初骨格筋ライブラリから単離された（O'Mahoneyら、1998）。hMusTRD1α1は、偏在する転写因子TFII-Iと相同性を有する。本発明者らは、カルボキシ末端において多様にスプライシングされたエキソンを有するスプライス変種11個を異なる骨格筋から単離した。骨格筋線維の発達におけるhMusTRD1α1および関連イソ型の役割を調べるために、本発明者らは、正常なhMusTRD1α1、および全てのMusTRDイソ型に対して共通のhMusTRD1α1のアミノ酸458個切断型（Δ）ペプチドの調節能を調べた。本発明者らはまた、hMusTRD1α1による転写抑制メカニズムも調べた。
【０１７３】
方法
cDNAクローンの単離と特徴付け
マウス骨格筋5'にストレッチラムダgt11を加えた cDNAライブラリ（Clonetech）からのプラーク形成単位（2.4×106個）を、開始コドンの28〜1364 bp下流で反復ドメイン1および2を含む、hMusTRD（アクセッション番号NM_005685）のランダムプライマー標識（ギガプライム標識キット(Giga Prime Labelling Kit)；Geneworks）1.3 kb AatII/PstI断片によってスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、CHURCH（0.5 M Na2HPO4、pH 7.2、1％BSA、7％SDS、1 mM EDTA、pH 8）において50℃で一晩行い、0.5×SSC/0.1％SDSを3回交換して60℃で30分間洗浄した。陽性プラークを選択して、同じハイブリダイゼーション条件を用いる二次および三次スクリーニングを行った。陽性クローンからのラムダDNAをキアゲンラムダシステムマキシキット(Qiagen Lamda System Maxi Kit)（Qiagen）を用いて製造元の説明書に従って精製した。cDNAは、ラムダgt11ベクターからEcoRI消化によって単離した。
【０１７４】
cDNA末端の迅速な増幅（RACE）
マウス骨格筋マラソンレディ(Marathon-Ready)cDNAライブラリ（Clontech）を用いて5' RACE PCRを行った。PCRは、RD2の下流に存在するcDNAクローンに対して特異的なリバースプライマー
2005510545.tif 000006
およびAP1フォワードプライマー（マラソンcDNAアダプタープライマー；Clonetech）を、アドバンテージHF PCRポリメラーゼミックス（Clonetech）およびマスターアンプPCR最適化緩衝液D(MasterAmp PCR Optimisation Buffer D)（Epicentre Technologies）と共に用いて、以下の条件：94℃で5秒、72℃で4分を5サイクル；94℃で5秒、70℃で4分を5サイクル；94℃で5秒、68℃で4分を30サイクル、で行った。
【０１７５】
サザンブロッティング
ブロットを、ランダムプライマー標識キット（ギガプライム標識キット；Geneworks）によって標識したhMusTRD 3000 bp BamHIプローブ（O'Mahoneyら、1998）またはマウスestクローン555547（アクセッション番号AA111609）（4〜103 bp）プローブと共にCHURCHにおいて65℃で一晩ハイブリダイズして、0.5×SSC/0.1％SDSを3回交換して65℃で30分間洗浄した。
【０１７６】
細胞および成体組織からのRNAの単離
総RNAを、Schmittら（1990）のプロトコールに従って、分化した筋管C2C12筋管から単離した。
【０１７７】
総RNAを製造元の説明書に従ってTrizol（登録商標）抽出によって交尾後（d.p.c）13.5日のB6D2胚20個から単離した。成体の外側広筋（VL）、ヒラメ筋および長指伸筋（EDL）を10週齢の雌性ARC 120匹から単離して、総RNAをTrizol（商標）抽出によって調製した。ポリ-A RNAをダイナビーズ(Dynabead)（DYNAL）によって製造元の説明書に従って精製した。
【０１７８】
実施例3において、Cos-7細胞、未分化C2C12筋芽細胞、および3日間分化させた筋管を含むC2C12培養物から総RNAをTrizol（登録商標）法（Invitrogen）によって抽出した。
【０１７９】
RT-PCR
ポリ-A RNA（1μg）を40 pmolオリゴd(T)10デカヌクレオチド（Roche）によってプライミングし、製造元の説明書に従ってスーパースクリプトII(Supercript II)逆転写酵素（Life Tehcnologies）によって逆転写した。PCRは、鋳型としてRT反応物の10％を用いて行った。完全なコード配列の増幅は、以下の条件；95℃で3分、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で3分間を35サイクルで、ATGの上流の5' RACE PCR産物から設計したフォワードプライマー
2005510545.tif 000007
および開始コドンの下流でポリ-Aテールの上流に存在するそれぞれのcDNAクローンに対して特異的なリバースプライマー
2005510545.tif 000008
により、Taq DNAポリメラーゼ（Roche）を用いて行った。PCR産物を1％アガロースゲル上で分析し、Qiaquickゲル抽出キット（Qiagen）を用いて精製し、pGEM-T Easyベクターにクローニングした。同じリバースプライマーを、エキソン19またはエキソン19に隣接するコード配列（エキソン18の3'領域およびエキソン20の5'領域）に対して設計した二つのフォワードプライマー
2005510545.tif 000009
と共に、3'領域のみを以下の条件；95℃で3分の後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を35サイクルによって増幅した。
【０１８０】
実施例3において、Impromptu（登録商標）逆転写酵素（Promega）と共に総RNA 2μgを用いて、製造元の説明に従って第一鎖cDNAを合成した。プライマーMusTRDF
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およびMusTRDR
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は、マウスとヒトの間で完全に配列が保存されたオープンリーディングフレーム領域に対して設計した。これらのプライマーを含むPCR増幅は、第一鎖cDNAの5％を鋳型として用い、マスターアンプ緩衝液D(Masteramp Buffer D)（Epicentre Technologies）およびサイクリングパラメータ：95℃で3分の後に35サイクルの95℃で30秒、60℃で1分、72℃で1分を用いた。
【０１８１】
イソ型のスクリーニング
分化したC2C12筋管、13.5 dpc胚、成体の四頭筋、ヒラメ筋、およびEDL筋からの総RNAのRT-PCR反応物を1.5％アガロースゲルにおいて分離し、得られたバンドをQiaquickゲル抽出キット（Qiagen）を用いて精製してpGEM-T Easyベクターにクローニングした。12個もの陽性クローンが増幅され、次いで95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を35サイクルの条件下で、エキソン30およびエキソン31に対して設計された二つのリバースプライマーと共に、エキソン19、エキソン19に隣接するコード配列、エキソン23、およびエキソン23に隣接するコード配列に対して特異的なフォワードプライマー
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を用いるPCR反応の鋳型として、精製したプラスミド100 ngを用いた。PCR産物を1.5％アガロースゲル上で分析した。
【０１８２】
MusTRD抗体
hMusTRD1α1（Mimotopes）、クレイトン、ビクトリア州）の最初のアミノ酸20個に対してヒツジ抗MusTRD血清を作製した。高度免疫血清をM-280ストレプトアビジンダイナビーズ（DYNAL（登録商標）、カールトン、ビクトリア州）にカップリングさせたビオシチンタグN末端ペプチドを用いてアフィニティ精製した。固定したMusTRD抗体を3 M MgCl2、pH 7.2によって溶出した。抗体調製物を、Slide-A-Lyzer（登録商標）Mini Dialysis Units（10,000 MWCO；Pierce、ロックフォード、イリノイ州）を用いて、25 mMトリス-HCl、pH 7.2、0.15 M NaCl、および0.1％BSA（TBS-BSA）を含む緩衝液において透析した。精製抗体は、0.1％Tween-20を含むTBS-BSAにおいて4℃で保存した。
【０１８３】
プラスミドの構築
ヒトTnIslow遺伝子および変異B1b含有型（O'Mahoneyら、1998）からの157 bp USE要素（nts-1031〜-874）をチミジンキナーゼ（tk）最小プロモーター（nts+81〜+52）およびルシフェラーゼレポーター遺伝子に結合させて、pTnIslowUSEB1tklucおよびpTnIslowUSEB1btklucレポーター構築物を生成した（図1）。p(B1)3xtklucおよびp(B1b)3xtklucレポーター構築物はB1要素
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のタンデムコピー3個と変異B1b型
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のタンデムコピー3個とをtk最小プロモーターおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子に結合させることによって作製した（図1）。CMVプロモーターによって駆動されるマウスMEF2C cDNAを含むpcDNAMEF2C発現構築物は、Richard Harvey博士からの寄贈であった。
【０１８４】
3'末端で段階的に切断されたhMusTRD1α1 cDNA 5個を、hMusTRD1α1（アクセッション番号AF118270）を鋳型として用いるPCRによって増幅した。
【０１８５】
hMusTRD1α1C末端切断変異体5個を増幅するために用いたヌクレオチド配列を下記に示す。hMusTRD1α1内の特異的アミノ酸部位に対するリバースプライマー5個
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を設計して、それぞれの反復ドメインまたは推定の機能的領域の前に切断が得られた。フォワードプライマー
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は、pcDNA3.1myc/hisベクター（Invitrogen）へのクローニングを容易にするために5' EcoRI部位（下線）を含むように操作した。この戦略によって、アミノ酸350個、アミノ酸458個、アミノ酸564個、アミノ酸689個、およびアミノ酸786個のエピトープタグMusTRDポリペプチドをコードする哺乳類発現プラスミド5個と共に完全長のアミノ酸944個の構築物（タグを含まない）が生成された。アミノ酸100〜544位の内部欠失を有する第七のプラスミドは、AoCI/BstEII消化および完全長のpcDNA3.1hMusTRD1α1944アミノ酸myc/hisの再ライゲーションによって作製して、それによって、pcDNA3.1hMusTRD1α1ΔN444myc/hisが得られた。
【０１８６】
CMVプロモーターによって駆動される完全なマウスNcoR cDNAを含むpCMXNCoR発現構築物は、Thorsten Heinzel博士からの寄贈であった。プラスミドpCMVGAL4hMusTRD1α1944アミノ酸およびpGAL4NCoR1-312は、酵母のGAL4 DBD（アミノ酸1〜147個）を、hMusTRD1α1944アミノ酸のcDNAまたは抑制ドメインを含むアミノ末端のアミノ酸312個をコードするNcoR cDNAの断片と融合させることによって構築した（Horleinら、1995）。哺乳類の1ハイブリッドアッセイ法において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、tkプロモーターに融合させたGAL4結合部位のタンデムコピー3個によって駆動され、p(GAL4)3xtkluc（Umesonoら、1991；Horleinら、1995）を生成した。pGST-NcoR1649-2453およびpGSTMusTRD1α1も同様に用いた。
【０１８７】
哺乳類の発現構築物
hMusTRD1α1458アミノ酸およびhMusTRD1α1944アミノ酸のcDNAの他に、大きさがアミノ酸350個、アミノ酸564個、アミノ酸689個、アミノ酸786個、およびアミノ酸859個のC末端欠失ヒトMusTRD1α１シリーズ5個を、インビトロ翻訳タンパク質を産生するためおよび形質移入アッセイ法において用いるために、CMVプロモーター駆動pcDNA3.1 myc/his発現ベクターにサブクローニングした。
【０１８８】
インビトロタンパク質翻訳
インビトロで翻訳されたhMusTRD1α1の350アミノ酸、458アミノ酸、564アミノ酸、689アミノ酸、786アミノ酸、859アミノ酸、および944アミノ酸のタンパク質は、供給元（Promega）によって推奨されるTNT（登録商標）ウサギ網赤血球を用いてそれぞれの発現プラスミドから生成した。[35S]標識インビトロ翻訳タンパク質は、10％SDS-ポリアクリルアミドゲルを通した電気泳動によって翻訳効率について慣例的にチェックした後、ゲルを乾燥させて、Molecular Dynamics ホスホイメージングスクリーンに露出して、ImageQuantソフトウェア（Molecular Dynamics、パロアルト、アメリカ）を用いるMolecular Dynamics Storm 860リーダー（Molecular Dynamics、パロアルト、アメリカ）を用いて定量した。
【０１８９】
ゲルシフトアッセイ法
インビトロで翻訳されたhMusTRD1α1の350アミノ酸、458アミノ酸、564アミノ酸、689アミノ酸、786アミノ酸、859アミノ酸、および944アミノ酸を、全量40μlの結合緩衝液（10 mM Hepes（pH 7.9）、1 mMジチオスレイトール、0.2 μg/μlポリ（dI-dC）、および10％グリセロール）において室温でインキュベートした。抗体ゲルシフトアッセイ法において、α-hMusTRD1α11-20アミノ酸抗体5 μlを、hMusTRD1α1タンパク質と共に室温で20分間予めインキュベートしてから、32P-標識した野生型エンハンサー(B1)3x要素または変異(B1b)3x要素約30,000 cpmを加えた。この反応物を室温でさらに20分間インキュベートした。DNA-タンパク質複合体を0.5×TBE（45 mMトリス、45 mMホウ酸、1 mM EDTA、pH 8.3）において4％（w/v）非変性ポリアクリルアミドゲルの中で分離して、X線フィルム（Kodak BioMax、ロチェスター、ニューヨーク、アメリカ）上でのオートラジオグラフィーによって可視化した。実験は少なくとも3回行い、代表的な結果を示す。
【０１９０】
プラスミドおよび導入遺伝子構築物
哺乳類および酵母細胞において完全長のhMusTRD1α1を発現させるために、pGAD10-hMusTRD1α1から単離したEcoR1 DNA断片をそれぞれ、pCI-neo（Promega、マディソン、ウィスコンシン州）およびpAS2-1（CLONTECH、パロアルト、カルフォルニア州）にサブクローニングした。哺乳類細胞においてΔhMusTRD1α1を発現させるために、EcoR1-BstEII（1597 bp）断片をpCI-neoのEcoRI-SmaI部位にサブクローニングした。TnIslowUSE（ヌクレオチド-1031〜-874）ルシフェラーゼレポーター構築物、pTK81Luc、pTnIslowUSE/TKLuc、pTnIslowΔB1USE/TKLucについては既に記述されている（O'Mahoneyら、1998）。pcDNA3.1-2000HSA:ΔhMusTRD1α1からのEcoR1-Pme1断片を、酵母細胞において分析するためにpAS2-1およびpACTII（CLONTECH）のEcoRI-SmaIにサブクローニングした。
【０１９１】
hMusTRD1α1導入遺伝子であるpcDNA3.1-2000HSA:hMusTRD1α1およびpcDNA3.1-2000HSA:hMusTRD1α1を作製するために、まずpcDNA3.1+（CLONTECH）のCMVプロモーターをヒト骨格アクチンプロモーター（HSA 2.2 kb HindIII断片；Brennan and Hardeman、1993）に置換した。hMusTRD1α1 EcoRIおよびEcoRI-BstEII（平滑末端）cDNA断片を、EcoR1およびEcoR1-EcoRV部位にクローニングしてそれぞれ、pcDNA3.1-2000HSA:野生型-hMusTRD1α1およびpcDNA3.1-2000HSA:ΔhMusTRD1α1を生成した。遺伝子組換え構築物TnIslowUSE-95X1nucZは既に記述されている（Corinら、1995）。
【０１９２】
細胞培養と形質移入
USE/USE-B1b異種レポーターアッセイ法に関してC2C12細胞を24ウェルプレートに播種して（5×104個/ウェル）、20％FBSおよび0.5％ニワトリ胚抽出物を含む低グルコースDMEM（Invitrogen）において、37℃で10％CO2を含む室内で一晩培養した。形質移入は、pcDNA3.1hMusTRD1α1切断型シリーズ、pMEF2C、または上記の組み合わせの100 ng量と共にpTnIslowUSB1tk/lucまたはpTnIslowUSB1btklucレポーター構築物250 ngを用い、Lipofectamine 2000（商標）（Invitrogen）を用いて製造元の説明書に従って行った。細胞を形質移入培地において5時間インキュベートしてから、2％ウマ血清（HS）を含むDMEMを含む分化培地に交換して、分化した筋管を含む得られた培養物を36時間後に回収した。
【０１９３】
B1.B1b異種レポーターアッセイ法および哺乳類1ハイブリッドアッセイ法に関して、Cos-7細胞1×105個を12ウェル組織培養プレートの各ウェルに播種して、10％FBSを含むDMEMにおいて一晩増殖させた。Cos-7細胞に、p(B1)3xtkluc、p(B1b)3xtkluc、またはp(GAL4)3xtklucレポーター構築物500 ngを、pcDNA3.1hMusTRD1α1944アミノ酸myc/his、pCMVGAL4hMusTRD1α1944アミノ酸、pCMVGAL4NcoR1-312、またはpGAL4DBD発現プラスミドの200 ng量と共に、無添加DMEM 1ml中でFugene6（商標）（Roche）1.5 μgを用いて移入させた。形質移入培地を10％FBSを含むDMEMに交換して、細胞を形質移入後40時間で回収した。
【０１９４】
免疫沈降実験およびウェスタンブロット上でのMusTRDタンパク質の抗体検出に関して、Cos-7細胞約1×107個に、Lipofectamine Plus（商標）（Invitrogen）を用いて製造元のプロトコールに従ってpCMXNCoR、pcDNA3.1hMusTRD1α1350myc/his、またはpcDNA3.1hMusTRD1α1944アミノ酸myc/his 20μgを移入させた。
【０１９５】
Cos-7細胞形質移入
10％仔ウシ胎児血清を添加したDMEMにおいてCOS-7細胞を増殖させ、形質移入のために4×106個／150 mm皿に播種した。一晩増殖させた後、プラスミドDNA pCl-neo、pCl-neo:ΔhMusTRD1α1、またはpCl-neo:hMusTRD1α1 10μgをFugene（商標）にカップリングさせ、製造元（Roche Diagnostics）の説明書に従って細胞単層に適用した。48時間後、細胞を回収し、RIPA緩衝液（150 mM NaCl、50 mMトリスHCl、pH 8、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、1％NP-40）において溶解して、ウェスタンブロッティングにおける陽性対照として用いた。
【０１９６】
C2C12形質移入のためのプラスミド構築
ヒトhMusTRD1α1944アミノ酸（FL）およびhMusTRD1α1458アミノ酸（TR）ならびにマウスイソ型MusTRD3α7、MusTRD1β1、およびMusTRD3β7を、CMVプロモーター駆動pcDNA3.1myc/his発現ベクター（Invitrogen、シドニー、オーストラリア）のAgeI部位にサブクローニングした。レポータープラスミドUSE-TK-ルシフェラーゼは、hTnIs上流エンハンサー（USE；-1031〜-875から157 bp）を含む。（-3500）βMHC-pGL3および（-2554〜+13）IIβMHC-pGL3レポーターは、di Masoら、2000；Wrightら、2001に記述されている。ルシフェラーゼレポーター構築物-800MLC2sはEsserら、1999に記述されている。
【０１９７】
C2C12の一過性の形質移入
マウス筋芽細胞（C2C12）細胞は、20％仔ウシ胎児血清、0.5％ニワトリ胚抽出物（全てGibco BRLから）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）において37℃、10％CO2において単層として増殖させた。形質移入のために、C2C12細胞を24ウェルプレートにおいて30〜50％の集密さでで一晩播種し、翌日、製造元（Gibco、BRL）のプロトコールに従って、Lipofectamine（登録商標）を用いて細胞にレポータープラスミド250 ng、およびpcDNA3.1またはヒトもしくはマウスイソ型発現プラスミドのcDNAを含むpcDNA3.1 100 ngを同時移入させた。37℃、10％CO2において6時間インキュベートした後、DNA-Lipofectamine（登録商標）ミックスを含む培地を除去して、2％ウマ血清（分化培地）を補充した新鮮な培地を加えた。分化培地において36時間インキュベートした後、細胞を溶解し、TopCountマイクロプレートシンチレーション&ルミネッセンスカウンター（Packard）においてルシフェラーゼ活性を決定した。それぞれの実験条件は、1試料あたり3本ずつ測定して、示した値は、3回の実験からの平均値±標準偏差を表す。
【０１９８】
MusTRDウェスタンブロット
成体マウスひ腹筋をつぶしてRIPA緩衝液に溶解した。組織をホモジナイズして氷中で1時間溶解した後、14,000 rpmで4℃で1時間遠心した。可溶性の筋タンパク質（200〜500 μg）およびCos-7細胞溶解物（50 μg）を10％SDS-PAGEゲル上で分析した。ゲルをニトロセルロース膜に電気的にブロッティングして、0.1％Tween-20を含むTBS（TBST）、5％スキムミルク粉末、および1％BSAによって4℃で16時間ブロッキングした。膜を精製ヒツジ抗MusTRD抗体（1:100）の1％BSAを含むTBST溶液によって22℃で2時間プロービングした後、ロバ抗ヒツジペルオキシダーゼ結合抗体（1/20,000、Sigma、キャッスルヒル、ニューサウスウェールズ州）によって22℃で1時間プロービングした。免疫反応性のバンドを化学発光によって検出した（Lumi-LightPLUS；Roche Diagnostics、キャッスルヒル、ニューサウスウェールズ州）。
【０１９９】
共焦点顕微鏡
マウスヒラメ筋の6 μm切片を2％パラホルムアルデヒド緩衝液において4℃で10分間固定した後、0.2％Tween20を含む氷冷TBSにおいて洗浄し、その後10％ロバ血清のTBST溶液において22℃で30分間洗浄した。切片は、10％ロバ血清を含むTBSTにおいて精製ヒツジ抗MusTRD抗体（1:5〜1:10）に4℃で一晩曝露した後、FITCに結合したロバ抗ヒツジIgG（1:50）（Sigma）に22℃で1時間曝露した。切片を洗浄して、マウス抗ジストロフィン（DYS2、Novocastra Laboratories、ベントンレーン、ニューキャッスル）とマウスI型ミオシン重鎖抗体（BAF8；Borrioneら、1988）の混合物によって4℃で一晩再標識した。ヤギ抗マウスローダミン赤-X結合抗体（Jackson ImmunoResearch、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）を22℃で90分間適用した。筋の核をヨウ化プロピジウムによって染色して、スライドガラスを2.5％DABCOの80％グリセロール溶液中に封入した。切片はLeica共焦点レーザー走査顕微鏡によって可視化した。
【０２００】
電気泳動移動度シフトアッセイ法
マウスEDLおよびヒラメ筋を用いて、先に記述された方法（O'Mahoneyら、1998）によって核抽出物を調製した。核タンパク質にオリゴヌクレオチドUSE-B1
2005510545.tif 000017
およびUSE-B1b
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による電気泳動移動度シフト分析を行った。
【０２０１】
hMusTRD1α1の350アミノ酸、458アミノ酸、500アミノ酸、564アミノ酸、689アミノ酸、786アミノ酸、および944アミノ酸のタンパク質ならびにMEF2Cタンパク質は、[35S]メチオニン（Amersham Pharmacia）の存在下でTNT（登録商標）ウサギ網状赤血球溶解物を用いてインビトロでカップリングした転写-翻訳反応によって産生した。反応のタンパク質の産生効率を、10％SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって調べた後、乾燥ゲルをホスホイメージングスクリーンに曝露して、Molecular Dynamics Storm 860アナライザおよびImageQuantソフトウェア（Molecular Dynamics）を用いて定量した。
【０２０２】
オリゴヌクレオチド（B13x、B1b3x、3'MEF2[TnIslow USEからnts-908〜-891]）またはmut3'MEF2を、Klenowを用いて標識して32PαdCTPの存在下で3'オーバーハングを塞いだ。30,000 cpmに対応する標識したオリゴヌクレオチドの量を、結合緩衝液（10 mM Hepes（pH 7.9）、1 mMジチオスレイトール、0.2 μg/μlポリ(dI-dC)、10％グリセロール）40 μlにおいて、インビトロで翻訳されたhMusTRD1α1またはMEF2Cポリペプチドに室温で20分間結合させた。抗体を含むアッセイ法において、ヒツジ抗hMusTRD1α11-20アミノ酸ポリクローナル抗体をhMusTRD1α1ポリペプチドと共に室温で20分間予めインキュベートしてからオリゴヌクレオチドを加え、競合シフトアッセイ法では、インビトロ翻訳hMusTRD1α1944アミノ酸 4μl、8μl、および12 μlをMEF2Cタンパク質と共に室温で20分間予めインキュベートした。DNA-タンパク質複合体を、0.5×TBE（45 mMトリス、45 mMホウ酸、1 mM EDTA、pH 8.3）において4％（w/v）非変性ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動し、オートラジオグラフィー（Kodak BioMax、ロチェスター、ニューヨーク、アメリカ）によって可視化した。実験は少なくとも3回行って、代表的な結果を示す。
【０２０３】
タンパク質の分析
NcoR-含有複合体は、1×NP40溶解緩衝液（20 mMトリス、pH 7.5、1 mM EDTA、1 mM EGTA、0.1 mM PMSF、150 mM NaCl、1％NonidetP-40含有Complete（商標）[Roche]プロテアーゼ阻害剤カクテル）においてプラスミド形質移入の24時間後にCos-7細胞を回収することによって分析した。溶解物を、C末端のアミノ酸2239〜2453位の領域に対する抗NCoR Rb88ポリクローナル抗体（Thorsten Heinzel博士からの寄贈、Georg Speyer Haus、フランクフルト、ドイツ）およびタンパク質A/Gアガロース（Santa Cruz）と混合して、4℃で30分間インキュベートした。アガロースビーズに結合した複合体を1×NP40溶解緩衝液において洗浄した後、SDSローディング緩衝液において沸騰させて、10％SDS-PAGEを行ってPVDFハイボンドP膜（Amersham Pharmacia）に転写した。フィルターを9E10抗-c-mycモノクローナル抗体（Santa Cruz）と共にインキュベートして、ECL Super Signal（商標）（Pierce）を用いて二次抗体の結合を検出した。
【０２０４】
異所発現されたhMusTRD1α1944アミノ酸タンパク質を、形質移入の24時間後に1×NP40溶解緩衝液においてCOs-7細胞を回収することによって可視化した。溶解物を10％SDS-ポリアクリルアミドゲルを通して分離して、ヒツジ抗hMusTRD1α11-20アミノ酸ポリクローナル抗体を用いてウェスタン転写ブロット上で分析した。
【０２０５】
レポーター遺伝子溶解緩衝液において培養細胞を溶解することによってルシフェラーゼアッセイ法を行い、一定の光シグナルのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ法を、製造元のプロトコール（Promega）に従ってTopCountマイクロプレートシンチレーション＆ルミネッセンスカウンター（Packard）を用いて行った。ルシフェラーゼ活性をタンパク質濃度に対して標準化し、空のベクターを移入させた細胞における活性と比較した比として表記した。実験は少なくとも3回行って代表的な結果を示す。
【０２０６】
GSTプルダウンアッセイ法
BL21(DE3)pLysSゴールド大腸菌株におけるGST-NcoR1649-2453、GST-MusTRD1α1944、およびGST単独の発現を、イソプロピル-b-D-チオ-ガラクトピラノシド（IPTG、1.25 mM）によって30℃で3時間誘導した。タンパク質の産生は、SDS-PAGEゲルのクーマシーブリリアントブルー染色によってチェックした。グルタチオンセファローススラリーを、ウシ血清アルブミン（1 μg/μl）を含むPPI緩衝液において使用前に予めブロックした。GSTプルダウンアッセイ法は、GST、またはインビトロで翻訳された[35S]-標識hMusTRD1α1350アミノ酸とのGST融合タンパク質、またはMEF2Cと共にPPI緩衝液（20 mM Hepes、pH 7.9、200 mM KCl、1 mM EDTA、4 mM MgCl2、1 mMジチオスレイトール、0.1％NP40、および10％グリセロール）において室温で40分間同時インキュベートすることによって行った。タンパク質結合グルタチオンセファローススラリーをPPI緩衝液において数回洗浄して、SDSローディング緩衝液において沸騰させ、10％SDS-PAGEを行った。ゲルを乾燥させて、ホスホイメージングスクリーンに曝露して、Molecular Dynamics Storm 860リーダーおよびImageQuantソフトウェア（Molecular Dynamics）を用いてバンドを定量した。
【０２０７】
ノーザンブロット分析
cDNAクローンを、hMusTRD1α1 cDNAプローブとのハイブリダイゼーション（5' 300 bp BamH1断片）によってマウス四頭筋cDNAライブラリ（CLONTECH）から単離した。ヒトhMusTRD1α1のRD1-RD2介在領域（ヌクレオチド675〜1066）に対応する配列をPCRによって増幅して、製造元の説明書に従ってギガプライム（商標）DNA標識キット（Geneworks、ザバートン、サウスオーストラリア）を用いるランダムプライミングによって標識したプローブを作製した。マウス胚ポリ-A+ RNAブロット（CLONTECH）をUltrahyb溶液（Ambion Inc.、オースチン、テキサス州）と予めハイブリダイズして、42℃でプローブとハイブリダイズさせて、製造元の説明書に従って洗浄した（Ultrahybプロトコール；Ambion）。CLONTECHブロットのポリ-A+ RNAローディングは、Ultrahyb条件（Ambion）を用いてβ-アクチンプローブ（CLONTECH）とのハイブリダイゼーションによってチェックした。収縮タンパク質遺伝子イソ型発現を分析するために、四つの遺伝子組換え子孫のヒラメ筋およびEDL筋をプールして総RNAを単離し、Trizol試薬（Sigma）または酸グアニジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出によって処理した。MLC1slowA、TnIslow、αTmslow、MLC2slowのcDNAプローブは既に記述されている（Sutherlandら、1991；Zhuら、1995）。
【０２０８】
酵母2ハイブリッドアッセイ法
USE-B1およびUSE-B1bタンデムリピートを含む二重レポーターYM4271酵母株は既に記述されている（O'Mahoneyら、1998）。2ハイブリッド接合アッセイ法を用いてhMusTRD1α1のトランス活性化および二量体化機能を調べた。酵母のレポーター株Y190（CLONTECH）を、アルカリ陽イオン法（BIO 101 Inc.、ラホヤ、カリフォルニア州）を用い、1 μgのpAS2-1、pAS2-1:hMusTRD1α1、またはpAS2-1:ΔhMusTRD1α1によって形質転換して、pACTII、pGAD:hMusTRD1α1、またはpACTII:ΔhMusTRD1α1のいずれかを有するY187細胞と接合させた。形質転換体は、トリプトファンおよびロイシン（BIO 101）を欠損する完全な合成培地プレートにおいて選択した。二倍体細胞を飽和まで増殖させて、これを用いて30℃でさらに24時間増殖させた試験培養物（OD600＝0.1）を接種した。細胞をブレーキング緩衝液（100 mMトリス-HCl、pH 8、20％グリセロール、5 mM PMSF、2 mM DTT）100 μl中に回収して、ガラスビーズと共にボルテックスによって溶解した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード法（Bio-Rad Laboratories、シドニー、ニューサウスウェールズ）によって決定した。タンパク質抽出物（20 μg）を、化学発光検出キット（CLONTECH）およびTurner Designs 20/20ルミノメーター（サニーベール、カリフォルニア州）によってβ-ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイした。
【０２０９】
hMusTRD1α1およびΔhMusTRD1α1遺伝子組換えマウスの作製と分析
遺伝子組換えマウスは、標準的な方法によって作製して遺伝子型を決定した（Brennan and Hardeman、1993）。-2000HSA:ΔhMusTRD1α1遺伝子組換え5系統、および-2000HSA:hMusTRD1α1 7系統をサザンブロッティングによって遺伝子型を決定し、それぞれが一つの遺伝子組換え座を有することを決定した。ΔhMusTRD1α1タンパク質発現レベルは、ひ腹筋抽出物（100 μg）のウェスタンブロッティングによって測定した。ウェスタンブロットは、コンピューディングデンシトメーターによって走査して、ImageQuant5.0（Molecular Dynamics、サニーベール、カルフォルニア州）を用いて分析した。ΔhMusTRD1α1免疫反応性バンドを総蛋白質に関して標準化した。総RNAを反対側のひ腹筋から単離して、ノーザンブロット分析によって処理した。試料（3 μg）をヒトhMusTRD1α1 cDNAプローブ（5' 300 bp BamHI断片）によってブロッティングし、Sutherlandら（1991）に記述されるプロトコールに従って18Sプローブによって再度ブロッティングした。ノーザンブロットを走査して、ウェスタンブロットと同様に分析した。ΔhMusTRD1α1 mRNA発現を18S発現に関して標準化した。野生型雄性マウス1匹（8週齢）および脊柱後側彎を示すΔhMusTRD1α1雄性マウス1匹を麻酔してX線撮影した。
【０２１０】
成長研究
二つの独立した-2000HSA:ΔhMusTRD1α1遺伝子組換え系統（10および11）の成長速度は、以下のようにマウスの体重を測定することによってモニターした：i）離乳時または生後21日、ii）2日ごとに2週間、iii）7週齢まで毎週、iv）12ヶ月齢まで2週間毎。
【０２１１】
組織化学およびMHC免疫化学
7週齢において、野生型および-2000HSA:ΔhMusTRD1α1マウス4〜6匹を屠殺してヒラメ筋およびEDL筋を採取し、凍結培地に封入して液体窒素下で保存した。ヘマトキシリン-エオジン（H＆E）染色を20 μm筋切片について行って、線維数を決定した。MHCの免疫組織化学染色は、既に記述されているように行い（Schiaffinoら、1989）。20 μm筋切片を、全てドイツ微生物細胞培養コレクション（German Collection of Microorganisms and Cell Culrures）から購入したI型MHC（BAF8；Borrioneら、1988）、IIA型およびIIB型（SC-71およびBF-F3；Schiaffinoら、1989）に対する抗体を分泌するハイブリドーマからの上清と共にインキュベートして、免疫ペルオキシダーゼ検出によって可視化した。EDL筋におけるマクロファージ浸潤は、製造元（Sigma Diagnostics、キャッスルヒル、ニューサウスウェールズ；Bhatiaら、1994）の説明書に従って8 μm切片に関するα-ナフトールアセテートエステラーゼ活性アッセイ法によって検出した。マクロファージ特異的酵素活性は1 mMフッ化ナトリウムによるブロッキングによって確認した。
【０２１２】
ホモ接合体TnlslowUSE-95X1nucZ遺伝子組換え動物（Corinら、1995）をF1世代-2000HSA:ΔhMusTRD1α1遺伝子組換え動物と異種交配させた。2および7週齢時にマウスを屠殺し、先に記述したように（O'Mahoneyら、1998）β-ガラクトシダーゼ活性の検出および組織学的分析のためにヒラメ筋およびEDL筋を採取した。8週齢時に大腿筋ブロックを野生型、-2000HSA:hMusTRD1α1、および-2000HSA:ΔhMusTRD1α1マウスから採取して凍結し、20 μm切片をBAF8上清と共にインキュベートした。筋組織学画像をオリンパスBX50顕微鏡によって可視化して、SPOT-アドバンスドデジタルカメラ（Diagnostic Instruments, Inc.、スターリングハイツ、ミシガン州）を用いて撮影して、Image-Pro（登録商標）Plus（バージョン4.0；Media Cybernetics、シルバースプリング、メリーランド州）を用いて分析した。
【０２１３】
MHCゲル電気泳動
反対側のヒラメ筋、EDL筋、および横隔膜を瞬間凍結し、破砕して、4容量の抽出緩衝液（0.3 M NaCl、150 mM NaPO4緩衝液、pH 6.5、100 mMピロリン酸ナトリウム、1 mM MgCl2、10 mM EDTA、1.4 mMβ-メルカプトエタノール）において溶解して処理し、先に記述されたとおり（Butler-Browneら、1984）にPAGEによって分離した。タンパク質ゲルを銀染色（Bio-Rad）によって可視化して、先に記述したようにMHCの新生児イソ型に対する抗体（NCL-MHCn；Novocastra）によるウェスタンブロッティングを行った。
【０２１４】
実施例1−mMusTRDイソ型の単離および特徴付け
cDNAライブラリスクリーニングによって、ラムダベクターから単離して配列決定のためにpGem7Zf（+）（Promega）にクローニングしたcDNAクローン7個が同定された。配列分析から、それぞれのクローンにおいて開始コドンを含むオープンリーディングフレームの5'領域が存在しないことが判明した。これは、EcoRI消化によってラムダgt11ベクターからcDNAを単離する場合に5'領域の切断が起こる、RD1（反復ドメイン1）内に存在する内部EcoRI認識部位の存在に起因した。この5'領域を得るために、5' RACE PCRを行った。PCR産物をサザンブロッティングして、hMusTRD 3000 bp BamHIプローブ（O'Mahoneyら、1998）、またはマウスestクローン555547（アクセッション番号AA111609）4〜103 bpによってハイブリダイズした。双方のプローブにハイブリダイズする二つの産物をpGEM-T Easy ベクター（Promega）にクローニングして配列決定したところ、その一つは、当初のマウス骨格筋ライブラリスクリーニングから単離されたcDNAクローンのそれぞれに対して100％の同一性で重なり合うことが判明した。BLAST検索により、PCR産物がマウスestクローン555547と完全に相同であることが判明した（結果は示していない）。
【０２１５】
5' RACE PCR産物に基づくフォワードプライマー
2005510545.tif 000019
と停止コドンの下流でポリA-テールの上流に存在するエキソン30または31のいずれかに対して設計されたリバースプライマーとを用いるRT-PCRを、ヒラメ筋、EDL、または13.5d.p.c.胚総RNAに由来するcDNA上で行ったところ、イソ型8個のオープンリーディングフレームを生じた。1〜1966 bpの間の5'領域の分析により、イソ型8個全ての間に完全な相同性があることが判明した。これらのイソ型の配列分析およびデータベース検索から、これらのイソ型をコードする一つの遺伝子、すなわちエキソン31個を含み、100 kbに及ぶGTF2IRD1遺伝子が第5染色体に存在することが示される（図1A）。この遺伝子は、染色体7q11.23上のヒトGTF2IRD1遺伝子の相同体である。この遺伝子の選択的スプライシングから生じたさらなるイソ型が存在する可能性を調べるために、同じリバースプライマーを用いて分化したC2C12筋管のRNAから合成したcDNAについてRT-PCRを行った。5'領域が全てのイソ型の間で保存されていると仮定して、エキソン19を標的とするフォワードプライマーおよびエキソン19に隣接するコード配列を用いると、次のように、mMusTRDの可変の3'領域のみが増幅された（図1B）。PCR産物をゲル抽出してpGEM-T Easy ベクター（Promega）にクローニングし、陽性クローンをPCRスクリーニングによってスクリーニングして、任意の新規イソ型も配列決定した。クローン3個（1α1、1α4、および3β3）が、新規イソ型の3'領域を含むことが示され、mMusTRDイソ型の数は11に増加した（図1C）。
【０２１６】
最初の18個のエキソンのコード配列は、変化することなく11個全てのイソ型に存在し、保存されたN末端を生じた。タンパク質のC末端の変化は、3'末端領域での二つの相互に排他的なエキソンの他に、四つのカセットの選択的スプライシングから生じる。エキソン19は独立したカセットを構成して、イソ型3α3および3β3では選択的にスプライシングされるが、エキソン23は、もう一つのカセットを構成し、イソ型1α1、1β1、3α3、3β3、3α5、および3β5では選択的にスプライシングされる。エキソン21、22、および23は、イソ型2α5において選択的にスプライシングされた多エキソンカセットを構成し、エキソン25、エキソン26、エキソン27の3'領域、およびエキソン28の5'領域は、もう一つのカセットを構成して、イソ型1α1、1β1、1α4、および1β4では選択的にスプライシングされる。二つの相互に排他的なエキソンはエキソン30および31であり、エキソン30を含むイソ型は「β」と呼び、エキソン31を含むイソ型を「α」と呼ぶ（図1C）。
【０２１７】
エキソン25、エキソン26、エキソン27の3'領域およびエキソン28の5'領域を含むカセットは、RD5の3'領域およびRD6の5'領域を構成する（図1D）。このカセットが選択的にスプライシングされると、得られたコード配列は、RD5の5'末端とRD6の3'末端を含み、このカセットを含むイソ型のRD6と完全に相同なRDを形成する（図1D）。
【０２１８】
選択的にスプライシングされた多エキソンカセットのいずれかを有するイソ型は、二つのhMusTRDイソ型と類似のRD 5個を有するが、選択的にスプライシングされていないカセットを有するイソ型は、TFII-Iにおいて認められたものと類似のように整列したRD 6個を有する（図2A）。これらのRDは、TFII-Iと約70％の相同性を有する（Royら、1997）。各タンパク質のRDは、ホモ二量体形成またはヘテロ二量体形成に関係する推定のbHLHモチーフを含み、双方のタンパク質は、同様にヘテロ二量体形成に関係すると考えられているロイシンジッパーモチーフをN末端最後部に含む。さらに、MusTRDは、ヘテロ二量体形成に関係するmyc型のHLHモチーフを含み、各RDも同様に、共活性化因子または共抑制因子とのヘテロ二量体形成に関与する可能性があるLxxILモチーフを含む。MusTRDは、RD2、RD5に推定の核局在配列（NLS）3個を含み、1個をRD6の後に含む。それぞれのイソ型は、NLSを少なくとも2個を含むが、RD5におけるNLSは選択的にスプライシングされ、イソ型3α3、3β3、3α5、3β5、3α7、および3β7に限って存在する。これらのNLSの存在は、核に存在する転写調節因子としてのMusTRDの役割と一致する（図2B）。
【０２１９】
実施例2−mMusTRDイソ型の発達的および空間的発現
これらのイソ型11個の発達的および空間的発現パターンを決定するために、分化したC2C12筋管、13.5 d.p.c.胚、ならびに成体VL、ヒラメ筋、およびEDL筋から単離したRNAについてRT-PCR分析を行った。PCRは、イソ型を区別することができるフォワードおよびリバースプライマーの組み合わせを用いて行った。エキソン19、エキソン19に隣接するコード配列、またはエキソン23を標的とするフォワードプライマーを、エキソン30または31のいずれかを標的とするリバースプライマーと組み合わせて選択した（図1B）。エキソン19に隣接するコード配列を標的とするフォワードプライマーと、エキソン30を標的とするリバースプライマーを用いるRT-PCRは、1.1 kb付近に単一の十分に明確なバンドを示し、これは調べた全ての起源にmMusTRD3β3が存在することを示しているが、エキソン31を標的とするリバースプライマーを用いた対応する反応は、約1 kbの単一の十分に明確なバンドを生じ、これは筋管および13.5 d.p.c.胚に限ってmMusTRD3α3が存在することを示している（データは示していない）。エキソン19を標的とするフォワードプライマーとエキソン31を標的とするリバースプライマーとを用いるRT-PCRによって、レーン2、3、4、および5では約1.2 kb付近に、そしてレーン7〜11では1.3 kb付近に密集したいくつかのバンドが出現した（データは示していない）。これらの反応は、既に同定されたイソ型に基づき、いくつかの異なるイソ型を、プライマー31を用いる反応では5個まで、およびプライマー30を用いる反応では4個までをおそらく増幅した可能性がある（図2A）。これらの不均一なバンドに存在するイソ型を同定するために、クローニングとPCRとを組み合わせた方法によってPCR産物をスクリーニングした。陽性クローンの同定によって、VLに3α5および3β5が存在すること、13.5 d.p.c.胚に3α5、3α7、および3β5が存在すること、ヒラメ筋およびEDLに1α1、1β4、3α5、3α7、および3β5が存在すること、ならびにC2C12筋管に1α1、1α4、2α5、3α5、3α7、および3β5が存在することが示された。他のイソ型の存在を検出するために、同じリバースプライマーとエキソン23を標的とするフォワードプライマーとを用いてRT-PCRを行った（データは示していない）。フォワードプライマー23とリバースプライマー31とを用いるPCRによって、レーン2〜5において880 bpのバンドが生成され、このことは、ヒラメ筋、EDL、13.5 d.p.c、および筋管に3α7が存在するが、VLには存在しないことを示している。エキソン31を標的とするリバースプライマーを用いた対応するPCRは、レーン7〜11において950 bp付近にバンドを生じ、全ての起源において3β7が存在することを示した。このバンドの他に、同様にレーン9では650 bpにもバンドを認め、EDLにイソ型1β4が存在することを示している（データは示していない）。イソ型2α5は、それがカセット2が除去されたためにRD4が欠損し、エキソン20がエキソン24に結合しているという点において、他のイソ型とは異なる（図1C、1D）。2α5に対して特異的で、エキソン20の3'領域およびエキソン24の5'領域を標的とするプライマー
2005510545.tif 000020
を設計した。このフォワードプライマーとエキソン31を標的とするリバースプライマーとを用いたRT-PCRは、レーン2〜6において850 bpでバンドを生じ、全ての起源に2α5が存在することを示しているが、発現はVLおよびC2C12筋管ではわずかに低いように思われる（データは示していない）。RT-PCRとイソ型スクリーニングとの組み合わせによってそれぞれの起源に認められた様々なイソ型の概要を表1に要約する。
【０２２０】
【表１】
2005510545.tif 000021
【０２２１】
実施例1と2の考察
mMusTRDファミリーの構造／機能
MusTRDは、bHLHモチーフを含む相同な反復ドメインの特徴的な整列を含む、TFII-I転写因子ファミリーの新規メンバーである。MusTRDにおいてmyc様HLHモチーフの他にこれらのbHLHモチーフ、ロイシンジッパー、DNA結合ドメインが存在することは、他のタンパク質との多数の相互作用の他に、DNA-タンパク質相互作用にこれらのタンパク質が関係していることを意味する。MusTRDとTFII-Iはいずれも第一のRDのbHLHモチーフの前に塩基性領域を有し、これはDNAの結合に関係していると考えられている。これは、DNAに結合して他の転写調節物質を動員することによって基礎転写機構の形成の調整に関係すると考えられている一般的転写因子としてのMusTRDの役割と一致する。二量体形成モチーフの数は、これらの相互作用と転写の調節におけるMusTRDの役割が多様かつ複雑であることを示唆している。
【０２２２】
現在のところ、既知のhMusTRDイソ型は二つ存在し、それらはアミノ酸が944個および959個であり、それらの違いはエキソン19の選択的スプライシングから生じる（Franckeら、1999およびYanら、2000）が、これはマウスにおいても同様に選択的にスプライシングされている（図1B）。高度に可変性のC末端を有するマウスMusTRDイソ型11個が同定されたことは、これが広範囲の機能を有する複雑な転写調節物質ファミリーであることを示唆している（図2A）。3α7イソ型は、脳cDNAライブラリから単離され、Hoxc8遺伝子の初期エンハンサー領域に結合することが示されているBEN（Bayarsaihan and Ruddle、2000）に対して完全に相同である。同様に、Cream-1のC末端は、Rbに結合することができることも示されている（Yanら、2000）。これは、MusTRDが、異なる11個のC末端を通して広範囲の共調節物質との相互作用によって、転写調節において多数の役割を果たすという仮説を支持する。
【０２２３】
他のタンパク質との相互作用の促進の他に、bHLHドメインは、同じタンパク質内での相互作用を促進することが示されており、それによってRD 5個を有するイソ型と6個を有するイソ型との間に三次構造の変化が起こる。それぞれのイソ型の他のタンパク質に対する親和性の起こりうる変化の他に、これらのmMusTRDイソ型は、互いに相互作用する可能性があり、多様な範囲のDNAモチーフの認識能を有する広範囲のホモダイマーおよび／またはヘテロダイマーを産生する。異なるC末端が11個存在することは、多数の転写共調節物質およびDNAモチーフに対する親和性を有する広範囲の三次および四次構造の可能性を示し、高レベルの機能的多様性を有するファミリーを生じる。
【０２２４】
mMusTRDファミリーの発現パターン
MusTRDの普遍的な発現を証明するためにこれまでノーザン分析が用いられていた。しかし、この技術は、本発明者らが同定したイソ型11個を区別することができなかった。したがって、RT-PCRを用いてこれらのイソ型11個を区別して、それらが時間的および空間的に多様なパターンで発現されることを示した。いくつかのイソ型の発現パターンは、異なる起源において様々な程度の発現を示した。VL筋は、ヒラメ筋およびEDLとはわずかに異なる発現パターンを示し、2α5のレベルはより低く、3α7は発現されなかった。イソ型3α3は、発達的分離を示し、筋管および13.5 dpcに限って発現されたが、1α1および1α4は、筋管に限って発現を示した。しかし、1α1および1α4は、成体の筋（ヒラメ筋およびEDL筋）に限って発現を示した。これらのイソ型は、発達を通しておよび異なる線維の種類において、特定の遺伝子の発現の調節において特定の役割を果たす可能性があるが、遺伝子発現に及ぼすそれぞれのMusTRDイソ型の影響に関するさらなる生化学的分析が必要である。
【０２２５】
これらの異なる発現パターンは、異なる遺伝子の発現を制御するために作用することができる、機能的に多様な転写因子ファミリーの考え方の根拠となる。hMusTRD1α1は、TnIslowの発現を調節することが示されている既知の転写調節物質である（O'Mahoneyら、1998）。これらのマウスイソ型11個のC末端の多様性および発現の多様性を考慮すると、本発明者らは、様々な筋特異的遺伝子の発現パターンの調節においてそれらが異なる役割を果たし、それによって筋肉の種類の決定に役割を有する可能性があると考えている。
【０２２６】
実施例3−hMusTRD1による転写の調節メカニズム
hMusTRD1α1の配列は、その生化学機能にとって重要となりうる多数の領域を含む。myc型のbHLHモチーフ、タンパク質キナーゼC（pKC）およびタンパク質キナーゼG（pKG）のリン酸化部位、DNA結合部位と共に、hMusTRD1α1分子のC末端領域最後部に存在するアルギニン-リジン（RK）に富むコンセンサス核局在シグナル（NLS）モチーフのような推定のタンパク質二量体形成部位が存在し、これらを略図で示す（図5）。長さがアミノ酸944個（hMusTRD1α1944アミノ酸）である完全長のhMusTRD1α1タンパク質の略図を、長さがアミノ酸458個である切断型hMusTRD1α1型（hMusTRD1α1458アミノ酸）と共に示す（O'Mahoneyら、1998）。長さがアミノ酸75〜93個の反復ドメイン（RD）は、TFII-Iに存在する構造的特徴である（Royら、1997）。これらのRDはまた、選択的にスプライシングされた一連のマウスMusTRDイソ型の特徴でもある。さらに、この新規MusTRDタンパク質ファミリーの命名は部分的に、各イソ型におけるこれらのRDの出現および順序に依存する（実施例1および2を参照されたい）。
【０２２７】
hTnIslow USEを通した、転写のMEF2Cによる活性化およびhMusTRD1α1による抑制
MEF2CおよびhMusTRD1α1によるhTnIslow上流エンハンサー要素（USE）の転写調節を、まずC2C12筋培養物において調べた。hMusTRD1α1およびMEF2Cをコードする発現ベクターを、B1領域内のhMusTRD1α1結合部位に変異を含む無傷のhTnIslow USEまたはUSE-B1bのいずれかによって駆動されるルシフェラーゼレポーター構築物と共にC2C12細胞に同時移入させた（図15A）。MEF2Cは、C2C12細胞においてhTnIslow USE転写活性の約2倍の増加を誘発した（図15B）。対照的に、hMusTRD1α1は、hTnIslow USEによって媒介される基礎活性を約2倍抑制した。MEF2C媒介トランス活性化に及ぼすhMusTRD1α1の転写効果を評価するために、hMusTRD1α1およびMEF2C発現構築物を野生型hTnIslow USEに同時移入させた。hMusTRD1α1は、hTnIslow USEのMEF2C媒介転写活性化を約3倍抑制した。この実験はまた、GATTAAコア配列の変異に基づいて活性が36倍低下することから、基礎転写活性がB1要素によって媒介されることも示した。さらに、このコア配列の変異によって、hTnIslow USEのMEF2C媒介誘導が68倍減少し、この部位が、MEF2C媒介転写活性化にとって必要であることを証明している。
【０２２８】
USEのhMusTRD1α1媒介抑制は、タンパク質の固有の特性、またはMEF2Cもしくは他のMusTRDイソ型のような筋原性転写増強因子の改変が原因となりうる。これらの可能性を区別するために、hMusTRD1α1のマウスオルソログを含む多数のMusTRDイソ型を発現するC2C12細胞とは対照的に、MusTRD転写物の発現が無視できるほどの量であるCos-7細胞において発現試験を行った（データは示していない）。さらに、Inr様要素を含むがMEF2C結合部位が欠損しているUSEのB1領域を用いた。B1領域は三量体を形成して、Cos-7細胞において十分な発現レベルを得るために異種プロモーター駆動ルシフェラーゼに結合した（図15A）。hMusTRD1α1を、B1またはB1b領域のいずれかを有する構築物と共に同時移入させた。hMusTRD1α1は、基礎転写活性を約3倍抑制した（データは示していない）。B1b型におけるコアGATTAA配列の変異によって、Cos-7細胞における基礎転写活性は4倍減少した。これらのデータは、hMusTRD1α1媒介抑制が、MEF2Cおよびその結合部位の非存在下で起こりうることを示している。これらの結果はまた、hMusTRD1α1によるMEF2C活性化および抑制にとって、B1に結合する同定されていない因子が必要であることも示唆している。
【０２２９】
二つのDNA結合ドメインを含むhMusTRD1α1
DNA結合および転写抑制に関与するhMusTRDの領域の位置を特定するために、本発明者らは、一連のhMusTRD1α1 cDNAの欠失の機能的能力を調べた。このプロセスの第一段階として、本発明者らは、インビトロで翻訳された完全長のhMusTRD1α1（hMusTRD1α1944アミノ酸）が、hTnIslow USEのB1領域内のInr様要素に結合することを証明した（データは示していない）。三量体形成B1またはB1b要素のいずれかを含むオリゴヌクレオチドを、インビトロで翻訳されたhMusTRD1α1944アミノ酸タンパク質と共にインキュベートした。B1要素をプローブとして用いた場合にはタンパク質-DNA複合体が形成されたが、hMusTRD1α1の同源の結合部位がB1b要素において変異している場合には形成されなかった。最も大きい複合体におけるhMusTRD1α1の存在は、hMusTRD1α1の最初のアミノ酸20個に対するα-MusTRD1α11-20アミノ酸抗体を用いて証明した（データは示していない）。抗体の特異性は、ウェスタンイムノブロッティングによって示した（データは示していない）。抗体の存在下で複合体が形成されなかったことは、それがB1要素に対するhMusTRD1α1の結合を妨害することを示している。
【０２３０】
hMusTRD1α1の切断型は、推定の調節領域を段階的にC末端から欠失させると共に、RD1およびRD2が欠損しているN末端欠失ペプチド（ΔN444アミノ酸）によって作製した（図6）。PCR産物を、長さがアミノ酸350個、アミノ酸458個、アミノ酸500個、アミノ酸564個、アミノ酸689個、およびアミノ酸786個であるタンパク質のインビトロ翻訳のためにpcDNA3.1myc/his発現ベクターにサブクローニングした。これらは、その後のEMSAおよび形質移入アッセイ法において用いた。RD1のみを含むhMusTRD1α1350アミノ酸は、B1要素に結合できなかった（データは示していない）。対照的に、hMusTRD1α1458アミノ酸は明らかにDNAに結合し、このことはDNA結合ドメイン（DBD1）がアミノ酸351〜458位のN末端に存在することを示している。アミノ酸544〜944位の間の第二のDNA結合ドメイン（DBD2）の存在は、DBD1が欠損しているhMusTRD1α1NΔ444アミノ酸の結合によって証明された。hMusTRD1α1786アミノ酸は、他の欠失と比較してより大きいバンド強度によって示されるように、B1要素に最も強力に結合する。このことは、hMusTRD1α1786アミノ酸が双方のDBDを含む可能性があり、DBD2がアミノ酸544〜786位に存在する可能性があることを示唆している。hMusTRD1α1458アミノ酸、hMusTRD1α1564アミノ酸、hMusTRD1α1786アミノ酸、およびhMusTRD1α1NΔ444アミノ酸の結合活性は、B1要素の変異によって失われ、GATTAA部位がDBD1およびDBD2の双方の相互作用にとってのコア領域であることをさらに示している。これらのデータは、hMusTRD1α1が二つのDBDを含むことを証明した。
【０２３１】
DNA結合の非存在下で抑制できるhMusTRD1α1
アミノ酸75〜93個からなるRDは、TFII-Iと共通の特徴である（Royら、1997）。それぞれのRDはLxxILモチーフを含み、これはホルモン依存的または非依存的な核ホルモン受容体相互作用にとって必要なほとんどの共活性化物質において認められる（Sauveら、2001；Liら、2001）。hMusTRD1α1の異なる領域が異なる転写活性を有するか否かを決定するため、および二つのDBDの機能的重要性を調べるために、hMusTRD1α1 C末端切断およびN末端欠失構築物を、三量体形成B1領域によって駆動されるルシフェラーゼ構築物と共にCos-7細胞に同時移入させた。hMusTRD1α1350アミノ酸を含むB1領域に結合することができない構築物は全て、活性を70％抑制した（図16）。これらのデータは、hMusTRD1α1が直接的なDNA結合とは無関係なメカニズムによって抑制できることを証明している。
【０２３２】
Cos-7細胞における哺乳類の1ハイブリッドアッセイ法を用いて、hMusTRD1α1がその同源のDNA結合部位に対する結合の非存在下で抑制できることを確認した。hMusTRD1α1944アミノ酸に結合したGAL4のDBDを含む融合タンパク質を、三量体形成GAL4 DNA結合部位によって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物と共にCos-7細胞において構成的に発現させた（図17A）。レポーター遺伝子の活性を決定して、基礎GAL4DBD活性に対する抑制倍数として表記した（図17B）。hMusTRD1α1944アミノ酸は、GAL4 DBDによってDNAに直接接触することなく基礎活性を約3.5倍抑制することができた。hMusTRD1α1944アミノ酸の抑制能は、強力な共抑制物質であるNcoRのN末端部分に存在する抑制ドメイン（RD）に対して調べた（Horleinら、1995）。抑制は双方の因子について類似であった。併せて考慮すると、これらの結果は、図16に示した同時形質移入結果を確認し、hMusTRD1α1944アミノ酸がその同源のDNA結合部位に結合することなく抑制できることを示している。さらに、それらは、hMusTRD1α1の抑制活性が、DNAに直接結合せずに機能する既知の抑制分子と同等であることを示している。
【０２３３】
インビボおよびインビトロで物理的に相互作用することができるhMusTRD1α1およびNcoR
インビボでhMusTRD1α1とNcoRとのタンパク質-タンパク質相互作用を調べるために、同時免疫沈降アッセイ法を行った。hMusTRD1α1350アミノ酸はDBDが欠損しているがDNA結合の非存在下で抑制できる最小のペプチドであることから、これを用いた。NcoRのC末端領域を認識する抗体を用いて、Cos-7細胞からの完全長のNcoRおよびhMusTRD1α1350アミノ酸を含むタンパク質複合体の共免疫沈殿に成功した（データは示していない）。GSTプルダウンアッセイ法を用いて、35S-標識hMusTRD1α1350アミノ酸と、他のタンパク質／転写因子との相互作用に関与する核受容体相互作用ドメイン（Id）を含むNcoRの一部、すなわちGST-NcoR1649-2453とのインビトロ相互作用を証明した。これらのタンパク質-タンパク質相互作用データは、hMusTRD1α1がDNA結合とは無関係なメカニズムによってNcoRと相互作用できることを確認した。併せて考慮すると、これらの知見は、NcoRとhMusTRD1α1とが協力してhTnIslow遺伝子の転写抑制を媒介できることを示唆している。
【０２３４】
直接相互作用によってTnIslow USE 3'MEF2部位に対するMEF2Cの結合を排除するhMusTRD1α1
EMSAを用いてhMusTRD1α1がMEF2C媒介トランス活性化をどのようにして抑制できるかを調べた。野生型またはUSEからの変異3'MEF2結合部位のいずれかを含むオリゴヌクレオチドを用いて、MEF2C結合を証明した。この結合は、hMusTRD1α1の濃度を増加させることによって徐々に競合された（データは示していない）。この結果は、同時形質移入分析においてMEF2C媒介トランス活性化がhMusTRD1α1によって遮断された理由を説明する。
【０２３５】
GSTプルダウンアッセイ法を用いて、MEF2Cトランス活性化のhMusTRD1α1媒介抑制がタンパク質間の直接相互作用を含みうるか否かを決定した。ホスホイメージャーによる検出によって、35S-標識MEF2Cと細菌によって発現されたGST-hMusTRD1α1944アミノ酸の直接結合が明らかとなった（データは示していない）。併せて考慮すると、EMSAおよびプルダウン実験は、MEF2CおよびhMusTRD1α1は、MEF2CがTnIslow USE内のその同源の結合部位と相互作用しないようにする不全複合体を形成するように相互作用することを示唆している。
【０２３６】
実施例3の考察
遺伝子抑制作用を得るためのいくつかのメカニズムが存在し、これらには1）核転写因子のDNAドッキング部位への直接的なDNA結合、2）活性化分子をそのエンハンサー部位から遠ざけるようにイントランスで作用する共抑制分子の競合的相互作用、および3）DNA-タンパク質-タンパク質複合体形成によって遺伝子活性化の直接ダウンレギュレーションを引き起こす、共抑制物質とDNA結合活性化物質との相互作用が含まれる。
【０２３７】
本実施例に示したデータは、hTnIslowおよびおそらく遅筋線維特異的遺伝子全般の転写調節に関する重要な局面に取り組む。hTnIslow USE内のInr様要素は、転写活性化および抑制の双方に関係する本質的な調節要素である。データは、MEF2媒介転写活性化がUSEの3'MEF2結合部位を通して起こり、未知の活性化因子によってInr様要素が占有される必要があるモデルと一致する。本発明者らは、Inr様要素の変異がUSEによるMEF2媒介活性化を防止することを証明する。この重要な知見は、USEの機能がInr様部位に結合するタンパク質とMEF2タンパク質との協調に依存することを示している。
【０２３８】
hMusTRD1α1がUSEの活性を抑制することが判明し、これはいくつかの手段によって得られる可能性がある。第一に、hMusTRD1α1は、その配列特異的DNA結合ドメイン2個によってInr様要素に結合し、したがって、結合部位の占有に関して活性化因子と競合しなければならない。第二に、本発明者らは、hMusTRD1α1と核受容体共抑制因子NcoRとの直接相互作用を証明した。さらに、hMusTRD1α1は、NcoRおよびMEF2Cとの直接相互作用能を利用するDNA非依存的メカニズムによって抑制を媒介することができる。これは、MEF2を封鎖するか、またはMEF2と活性化因子との相互作用を妨害することができる可能性がある。
【０２３９】
これらのデータは、3'MEF2結合部位と共に無傷のInr様要素に依存するhTnIslowの転写活性化および抑制のメカニズムの根拠となる。転写活性化は、B1要素が、3'MEF2C部位に結合したMEF2Cと相互作用する増強因子によって占有される場合に得られる（図18A）。抑制は、hMusTRD1α1によってDNA依存的または非依存的に得られる（図18B）。hMusTRD1α1は、NcoRと共にMEF2Cを封鎖することによって、またはInr様要素を占有して増強因子の結合を防止することによってMEF2Cの増強因子との適切な相互作用を防止することができる。
【０２４０】
数多くのシグナル伝達経路がMEF2タンパク質に収束し、それによって筋特異的遺伝子の転写制御におけるその本質的な役割を調節することが判明した。MEF2CおよびMEF2Aは、p38MAPキナーゼの基質であり、MEF2CはBMK1/ERK5の基質である。他の経路は、HDACによって課された抑制を緩和することによって、直接脱リン酸化およびCa2+カルモジュリン依存的タンパク質キナーゼCaMKによってMEF2を活性化するカルシニューリンを含むカルシウム感受性タンパク質を含む。Ca2+依存的経路によるシグナル伝達は、持続的な神経刺激パターンが細胞内カルシウムレベルを上昇させることから線維の種類の調節の潜在的な手段として最近提唱されており、マウスにおける最近の実験はこの仮説を支持している。さらに、転写共活性化因子PGC-1αは、MEF2との相互作用によってミトコンドリアの生合成と共に遅筋特異的遺伝子発現を誘発することが判明した。したがって、MEF2は、持続活性、および筋線維内の細胞内Ca2+レベルの筋遺伝子転写活性への電気活性媒介変化の翻訳に関係する重要な因子である。本研究において証明されたように、TnIslowのUSEにおけるMEF2Cの転写活性化能を破壊することによって、hMusTRD1α1は、遅筋特異的遺伝子の調節経路における節点として作用することは明らかである。
【０２４１】
hMusTRD1α1抑制様式は、いくつかの内在性の特性に依存する可能性がある。第一に、hMusTRD1α1は、二つのDBDによるB1要素と相互作用することが判明した。DBDの片方または双方を含むhMusTRD1α1の切断型は、O'Mahoneyら（1998）によって定義されるコア結合モチーフGATTAAを通してUSEのB1エンハンサー要素に特異的に結合する。全ての場合において、この配列のGATatcへの変異は結合を防止した。さらに、α-hMusTRD1α11-20アミノ酸抗体は、hMusTRD1α1 DNA結合活性を直接阻害することができ、このDNA-タンパク質複合体の特異性をさらに確認することができる。
【０２４２】
hMusTRD1α1とB1エンハンサー要素との相互作用は、分子のN末端およびC末端に独立して存在する二つの機能的DBDによって起こる。欠失分析によって、RD2におけるN末端DBD1、そして同様にRD4におけるC末端DBD2がそれぞれ、アミノ酸351〜458位およびアミノ酸544〜944位に存在することが示された。これらの領域は塩基性アミノ酸残基に富み、これらは典型的にDNAまたはタンパク質二量体形成のいずれかに関係する。推定のDNA結合ドメインに関するデータベース検索を再検討すると、本発明者らは、アミノ酸408〜420位および738〜765位における二つの塩基性アミノ酸に富む領域がそれぞれ、DBD1およびDBD2に対応する可能性があると提唱する。この知見は、ほとんどの転写因子ファミリーに関してDNA相互作用領域が典型的に、転写因子の核ホルモン受容体スーパーファミリーの場合と同様通常タンパク質のN末端部分である一つの既定の領域に分類されることから珍しい。
【０２４３】
hMusTRD1α1と核受容体共抑制因子N-CoRとの直接会合は、第二の抑制様式を証明する。N-CoRは、核ホルモン受容体のみならず、多数のクラスの転写因子に関しても共抑制剤として機能する。多数のアミノ末端抑制ドメインは、クラスIヒストンデアセチラーゼ（HDAC）を含む大きい複合体とのmSin3による相互作用を媒介するか、またはクラスII HDACとの直接会合によってヒストンの低アセチル化を通して染色質構造を改変する。共免疫沈殿研究によって、最近、hMusTRD1α1とクラスIヒストンデアセチラーゼHDAC3とが会合することが判明した。この相互作用は、N-CoR依存的メカニズムによって媒介される可能性がある。
【０２４４】
本発明者らは、一般的に異なる細胞環境に存在するタンパク質との異なる相互作用を提供することによって、これらの多様なメカニズムを通して、MusTRDイソ型に転写を調節させるのはC末端に存在する配列であると考えている。
【０２４５】
要約すると、hMusTRD1α1によって媒介される直接のDNA依存的抑制経路が示された。hMusTRD1α1とhTnIslow USEにおけるB1エンハンサー要素とのこのDNA依存的相互作用は、新規でありかつ分子の反対側の領域に存在する二つの機能的DBDを通して媒介され、直接的な転写抑制の例を示す。さらに、hMusTRD1α1による固有の機能的抑制能も同様に証明されており、間接的なメカニズムによって抑制作用を媒介するこの分子のさらなる特徴を強調する。
【０２４６】
実施例4−マウス筋におけるMusTRDの発現
本発明者らは、マウス筋におけるhMusTRD1α1様タンパク質の発現および機能を調べた。ヒトhMusTRD1α1のN末端ペプチド配列を標的とする抗体を作製したところ、COS-7細胞において異所発現された野生型hMusTRD1α1と特異的に相互作用することが判明した（図7A、レーン3）。hMusTRD1α1様タンパク質は、マウスヒラメ筋の遅筋筋核および速筋筋核の双方において発現された（図7B〜D）。細胞質膜成分であるジストロフィンの免疫染色によって、筋線維の核内におけるhMusTRD1α1様タンパク質の発現が確認されたが、静止状態の衛星細胞では確認されなかった。
【０２４７】
マウスヒラメ筋および長指伸筋（EDL）の核抽出物は、ラット筋におけるこれまでの記述と同様に、TnIslowUSE Inr様要素（TnIslow USE-B1）に関して親和性を有するhMusTRD1α1含有タンパク質複合体を有する（図7E、レーン1、2、5、および6；O'Mahoneyら、1998）。これらのタンパク質-DNA複合体は、hMusTRD1α1 Inr様相互作用部位における変異によって消失した（TnIslow USE-B1b；図7E、レーン3、4、7、および8）。
【０２４８】
発達中の胚におけるマウスhMusTRD1α1様mRNA転写物の発現をノーザンブロット分析によって評価した。ヒトhMusTRD1α1と高い相同性を有するcDNAクローンを、マウス四頭筋cDNAライブラリから同定した（未発表研究）。ヒトhMusTRD1α1（ヌクレオチド675〜1066位）のRD1-RD2介在領域に対応する配列を用いて、ノーザンブロット分析において用いるプローブを作製した。約3.6、4.4、および5.9の転写物3個が7 dpcもの早期に検出された（図7F）。三つの転写物の大きさは、最近記述されたマウスMusTRD-TFII-IファミリーメンバーであるBENの組織mRNA発現に関して認められた大きさと一致した（Bayarsaihanら、2000）。ヒトMusTRD mRNAのこれまでの分析から、3.3 kb転写物が最も豊富であることを示し（O'Mahoneyら、1998）、同様に、3.6 kb種はマウスにおいて支配的であることが示された。したがって、マウスはヒトMusTRD 1α1の相同体を発現し、マウス筋はTnIslow USE-B1結合タンパク質を含む。
【０２４９】
実施例5−hMusTRD1α1、ΔhMusTRD1α1、およびmMusTRDイソ型による速筋および遅筋の線維特異的プロモーター／エンハンサーの調節
MusTRDイソ型の遅筋および速筋の線維特異的遺伝子の潜在的調節能を決定するために、本発明者らは、代表的な遅筋および速筋の線維特異的収縮タンパク質の発現に及ぼすその作用を調べた。hMusTRD1α1、ΔhMusTRD1α1、およびmMusTRDイソ型3α7、1β1、および3β7を含む発現プラスミドを、速筋線維特異的MHCIIB遺伝子（di Masoら、2000）ならびに遅筋線維特異的MHCIslow（Wrightら、2001）、MLC2slow（Esserら、1999）およびTnIslow（O'Mahoneyら、1998）遺伝子からのプロモーター／エンハンサー要素を含むルシフェラーゼ発現プラスミドと共に、筋原細胞株C2C12細胞に同時移入させた。hMusTRD1α1およびΔhMusTRD1α1は、MHCIslowおよびTnIslowの転写活性の抑制に類似的に作用したが、MLC2slowおよびMHCIIB発現に対してはほとんどから全く影響を及ぼさなかった（図8A）。対照的に、mMusTRD3α7、1β1、および3β7は、このアッセイ法においてMHCIIB発現を増加させた1β1を例外として、如何なる調節要素に対してもほとんどから全く影響を及ぼさなかった（図8B）。これらの結果は、MusTRDイソ型が転写を抑制または活性化するために線維特異的遺伝子配列に対する作用能を有することを証明する。
【０２５０】
実施例6−ドミナントネガティブMusTRD（ΔMusTRD1α1）マウスモデルの作製
本発明者らは、アミノ酸458位で切断された変異体タンパク質（ΔhMusTRD1α1；図7A、レーン2）が、野生型hMusTRD1α1およびMusTRD遺伝子からの実際に全てのスプライス変種に関して、ドミナントネガティブとして機能するであろうと予測した。これを評価するために、本発明者らは、酵母の2ハイブリッドアッセイ法においてgal4 DNA結合ドメインに融合した場合、野生型hMusTRD1α1は自己トランス活性化を示したがΔhMusTRD1α1は示さなかったことを確認した（図9A）。野生型hMusTRD1α1およびΔhMusTRD1α1はいずれも、酵母1ハイブリッドアッセイ法においてTnIslow USE-B1要素と相互作用したが、TnIslow USE-B1b変異体とは相互作用しなかった（図9B）。ΔhMusTRD1α1は、野生型hMusTRD1α1ほど効率的に結合しなかった。さらに、野生型hMusTRD1α1およびΔhMusTRD1α1は、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成した（図9C）。野生型hMusTRD1α1は、求核タンパク質であり、ΔhMusTRD1α1は、COS-7細胞に移入させてもこの機能を保持した（データは示していない）。要約すると、ΔhMusTRD1α1は、DNA結合能を示すがトランス活性化機能が欠損しており、内因性のhMusTRD1α1のドミナントネガティブ競合物質としてその能力を示している。
【０２５１】
WBSのミオパシー特徴の媒介における機能的MusTRDレベルの低下の役割を調べるために、本発明者らは、ヒト骨格アクチン（HSA）プロモーターの制御下でΔhMusTRD1α1を発現する遺伝子組換えマウスを作製した（図10A；Muscat and Kedes、1987）。このプロモーターは、発達中の筋管において7.5dpcから導入遺伝子の発現を指示し（McLeod and Hardeman、未発表知見）、内因性のMusTRDの発現と一致し（図7Fを参照されたい）、出生前後および生後の発達の際に筋線維において活性である。独立した遺伝子組換え5系統を分析して、筋肉におけるΔhMusTRD1α1 mRNA転写物およびタンパク質レベルを検出した（図10B）。ΔhMusTRD1α1 mRNAとタンパク質レベルとの間に相関は認められなかった（図10C）。
【０２５２】
ΔhMusTRD1α1マウスにおける脊柱後側彎、関節拘縮、および成長遅滞
ΔhMusTRD1α1系統10、11、29、および70からの遺伝子組換え子孫は全て、4週齢もの早期から骨格筋欠損、すなわちX線分析によって脊柱の彎曲として認められる脊柱後側彎を発症した（図10D、E）。この奇形は、おそらく脊柱傍筋肉の虚弱により、頚椎-胸椎の圧迫から生じる。ΔhMusTRD1α1遺伝子組換え動物は、その野生型同腹子より動作が遅く活動度が低い傾向があり、異常なよろめき歩行を示した。さらに、それらは、散開する傾向がある後肢の虚弱を示した（図10F）。
【０２５３】
ΔhMusTRD1α1マウスは、全ての週齢でその野生型同腹子より有意に小さかった（図10G、H）。離乳時、系統10および系統11の遺伝子組換え子孫は、その野生型同腹子より21％および18％小さかった。指数的成長期間（3〜7週間）の成長速度は、遺伝子組換えマウスと野生型マウスで差がなく、ΔhMusTRD1α1マウスが栄養不良ではなかったことを示した（図10G）。ΔhMusTRD1α1マウスは、12ヶ月齢まで成長し続けたが、野生型同腹子より22％および30％（それぞれ、系統10および11）小さいままであった（図10H）。
【０２５４】
筋線維の特殊化、成熟、および増殖過栄養のΔhMusTRD1α1マウスにおける破壊
低体重と一致して、ΔhMusTRD1α1マウスの筋断面積は野生型と比較して減少した（図11A〜D）。ミオシン重鎖（MHC）イソ型発現によって定義される線維の組成は変化した。B6D2系統の野生型ヒラメ筋では、筋線維の約45％が、遅筋線維のマーカーであるI型MHC（MHCIslow）を発現し、線維の55％が酸化的速筋線維のマーカーであるIIA型MHC（MHCIIAfast）を発現する（図11A、B）。対照的に、ΔhMusTRD1α1のヒラメ筋では、MHC-Islowが減少または消失し、全ての線維が、MHC-IIAfastを発現するように思われた（図11A、C、D）。遺伝子組換えヒラメ筋断面積は、系統29、11、10、および70に関してそれぞれ、野生型同腹子より50％、51％、27％、および20％小さく、線維の直径はそれぞれ、33％、38％、19％、および23％小さかった（図11E、F）。タンパク質発現レベルが最も高かった系統29および11は、筋の面積および線維の直径の最も大きい減少を示し、遺伝子の用量依存的作用を示唆した。系統29、11、10、および70の子孫のヒラメ筋における筋線維の数はそれぞれ、野生型の87％、97％、82％、および98％であった；しかし、差は系統29および10に限って有意であるに過ぎなかった（図11G）。異なる系統における筋重量の減少は、ΔhMusTRD1α1タンパク質発現レベルと相関した（図11E；図10C）。
【０２５５】
主に速筋線維含有筋（80％糖分解MHC-IIBfast、15％MHC-IIAfast、5％MHCIslow）であるEDLも同様に、野生型より小さく、線維の直径は減少した（図11H、I）。遺伝子組換えEDL筋の全ての筋線維は、MHC-IIAfastとMHC-IIBfastを同時発現して、MHC-Islowの発現が欠損していた（データは示していない）。ΔhMusTRD1α1 EDL筋は、変性および再生を受ける筋の特徴的な特徴を示した。α-ナフチルアセテートエステラーゼ活性アッセイ法によって確認すると、線維の変性は、細胞の壊死（細胞質の濃縮）、血管形成、およびマクロファージ浸潤の増加に関連した（図11J、K；Yamら、1971；Bhatiaら、1994）。線維の変性は筋線維数のわずかな増加、および中心に核が存在する筋線維の割合の対応する増加と相関した（図11L、M）。線維の変性は、前脛骨筋、ひ腹筋、足底筋、および指屈線維筋のような主に速筋線維を含む筋において存在したが、ヒラメ筋および膝か筋のような遅筋優勢筋では存在しなかった。
【０２５６】
ΔhMusTRD1α1筋線維が発達的に遅れている可能性を調べるために、未成熟な筋線維に限って発現されるMHCの新生児／周産期イソ型（MHCneo）の発現を調べた。7週齢マウスからの横隔膜およびヒラメ筋のタンパク質抽出物に、高解像度ゲル電気泳動を行った後、銀染色またはウェスタンブロッティングを行った（図12A）。遺伝子組換え横隔膜およびヒラメ筋は、MHCIslow発現が欠損していた。生後1日（PND1）に脚筋において発現されるMHCneoは、ΔhMusTRD1α1には存在したが、野生型ヒラメ筋抽出物には存在しなかった。これは、MHCneoに対する抗体を用いるウェスタンブロッティングによって確認した。
【０２５７】
hMusTRD1α1およびΔhMusTRD1α1によるヒラメ筋およびEDL筋におけるほとんどの遅筋特異的遺伝子の抑制
ΔhMusTRD1α1筋にMHCIslow発現筋線維が存在しないことと一致して、他の筋線維遺伝子ファミリーの遅筋イソ型も同様にダウンレギュレートされた（図12B）。ミオシン軽鎖-1 slow A（MLC1slowA）、TnIslow、およびα-トロポミオシンslow（αTmslow）は、野生型ヒラメ筋において発現されたがEDL筋では発現されなかった。これらのイソ型の発現は、ΔhMusTRD1α1ヒラメ筋ではダウンレギュレートされたが、MLC2slowの発現は野生型筋と同じであった。
【０２５８】
TnIslow転写物の蓄積の抑制と一致して、ΔhMusTRD1α1は、インビボでのTnIslowUSE媒介発現を抑制した。半接合体-2000HSA:ΔhMusTRD1α1マウスを、TnIslowUSE-95X1nucZ導入遺伝子座に関してホモ接合である遺伝子組換えマウスと交配させた（図13A）。2週齢のTnIslowUSE-95X1nucZマウスからのヒラメ筋において、レポーターの発現は、これまでに記述されているようにMHC-Islow含有線維に限定された（図13B、C）。ΔhMusTRD1α1の存在によって、β-ガラクトシダーゼを含む筋核数と、個々の核内の発現レベルの双方が抑制された（図13D、E）。レポーター活性のレベルはヒラメ筋において減少したが、EDL筋抽出物では減少せず、MusTRDがTnIslowの遅筋特異的発現に必要であることを確認した（図13F、G）。
【０２５９】
hMusTRD1α1およびΔhMusTRD1α1により示される、大腿筋における遅筋遺伝子発現に対する異なる作用
大腿筋の全領域を調べると、遅筋に富むヒラメ筋および外側ひ腹筋に隣接する足底筋（PALG）のMHCslow陽性線維における顕著な減少によって証明されるように、hMusTRD1α1は全ての筋において遅筋遺伝子発現を抑制するように一貫して作用する（データは示していない）。ΔhMusTRD1α1は、ヒラメ筋において同様に作用する。しかし、完全に対照的に、これは大腿筋の残りにおいてMHCslow発現を誘発する（EDLは例外とする）（データは示していない）。最も劇的な作用は、野生型マウスでは発現しないのに対し、線維の40％がMHCIslowを発現する前脛骨筋において認められる。異なる筋におけるMHCslow発現に及ぼすΔhMusTRD1α1の作用が異なることは、遅筋および速筋における線維特異的遺伝子発現を調節する因子の組み合わせが筋において異なる可能性があること、そして因子のバランスの破壊がΔhMusTRD1α1によって得ることができることを示唆している。
【０２６０】
考察
遅筋または速筋筋線維における異なる遺伝子発現を媒介する転写因子の同定は、筋柔軟性の基礎となるメカニズム、特に先天的ミオパシーにおける筋線維の変換、神経または筋の損傷、運動、および加齢を理解する上で必須である。本発明者らは、これまでMusTRD1と呼ばれており、本研究においてhMusTRD1α1と再命名された転写因子MusTRDのイソ型が、骨格筋に存在してかつTnIslow遺伝子のエンハンサーにおける調節要素と直接相互作用することをこれまでに確立した（O'Mahoneyら、1998）。本明細書において、本発明者らは、MusTRD（WBSCR11、GTF2IRD1、GTF3）をコードする遺伝子が、タンパク質の3'カルボキシ末端に存在するイソ型の中でも、多様性を有する選択的スプライシング産物に由来する少なくとも11個のイソ型を生じることを示す。これらのイソ型は筋細胞株C2C12、ならびに胚および成体筋に存在するが、これらに限定されない。一般的に、hMusTRD1α1およびΔhMusTRD1α1はいずれも、細胞培養および古典的な遅筋マウス筋であるヒラメ筋において、MLC2slowを例外として、遅筋特異的遺伝子の抑制物質として作用する。しかし、かなり重要であるが、ドミナントネガティブΔhMusTRD1α1は、遅筋線維表現型を一貫して抑制したhMusTRD1α1とは対照的に、後肢の異なる筋において線維特異的遺伝子発現に対する異なる作用を有した。MusTRDはまた、筋線維の直径が双方の種類のMusTRD遺伝子組換えマウスにおいて有意に減少したことから、増殖過栄養にも影響を及ぼす。
【０２６１】
WBSにミオパシー特徴が存在することは、筋発生の重要な調節物質が染色体7q11.23上の欠失領域に局在することを示唆している。MusTRD（WBSCR11；GTF2IRD1、GTF3）をコードする遺伝子は、この領域に局在するがWBS表現型の様々な成分に対するその関与はわかっていない。ΔhMusTRD1α1マウスモデルの物理的特徴は、WBS表現型のミオパシー局面の媒介におけるMusTRDの関与を示している。ΔhMusTRD1α1遺伝子組換えマウスは脊柱後側彎および関節の拘縮を発症した。これらのマウスは、野生型同腹子より動作が遅く、活動度が低く、その後肢の虚弱のために異常なよろめき歩行を示した。同様に、WBS患者は、筋の疲労および緊張低下を示す。患者の約20％が脊柱後側彎を発症するが、患者の約50％に罹患する関節の拘縮はしばしば、運動および正常な活動を妨害するほど重度となりうる（Voitら、1991）。
【０２６２】
WBSの明確な臨床特徴は、百分順位10位未満の出生体重および身長、幼児期の成長遅滞、思春期の急成長、および成人期の極端な低身長を特徴とする成長遅滞である。比較すると、ΔhMusTRD1α1マウスは生後の成長期に成長が遅滞して、成体期でも野生型同腹子より30％小さいままであった。ΔhMusTRD1α1マウスモデルとWBSの臨床特徴とが類似であることは、WBSにおける物理的欠損および成長遅滞が、骨格筋の関与を有する可能性があること、およびMusTRD遺伝子の単不全がこれらの特徴のいくつかに関与する可能性があることを示唆する。
【０２６３】
筋重量は、マウスの体重の有意な比率を占める（約70％）。したがって、本発明者らは、筋増殖の欠損がΔhMusTRD1α1マウスにおける成長遅滞に関与する可能性があると仮定した。野生型マウスの生後の最初の2週間の間に、新たに形成された筋線維は成熟して、細胞質 対 核比の増加に至るプロセスである増殖過栄養を受け、最終的に筋重量が増加する。ΔhMusTRD1α1遺伝子組換え動物では、後肢の筋全ての筋重量および線維直径は減少した。組織形態学的分析により、筋線維の直径は、いくつかのΔhMusTRD1α1遺伝子組換え系統のヒラメ筋において減少するが、筋線維数は減少しないことが判明した。筋線維の栄養不良の程度は、ΔhMusTRD1α1のタンパク質発現レベルと相関し、このことは遺伝子の用量依存的作用を示唆する。したがって、筋線維数ではなくて筋線維増殖過栄養の欠損がΔhMusTRD1α1マウスにおける筋重量の減少の原因である。比較すると、WBS患者は線維の萎縮および過栄養の双方と共に筋線維の大きさにかなりの多様性を示すことが報告されている（Voitら、1991）。同様に、本発明者らは、ΔhMusTRD1α1マウスのいくつかの筋に、ジストロフィー筋の特徴である筋線維の萎縮と変性を観察した。興味深いことに、これは、主に速筋線維を含む筋の特徴であって、遅筋含有筋の特徴ではない。この筋特異的な差は、遅筋線維の機能とは異なる、hMusTRD1α1または関連タンパク質の速筋線維特異的機能を反映する可能性がある。
【０２６４】
筋線維増殖過栄養に対するその必要性の他に、hMusTRD1α1は、分化した筋管の成熟に影響を及ぼすように思われる。これは発達の遅延を反映するΔhMusTRD1α1筋の遺伝子発現プロフィールによって示される。野生型マウスでは、MHCneoイソ型の発現は、二次筋管が形成されつつある12.5 dpc以降に出現する。15dpcでは、MHCneo発現は、二次筋管および成体において速筋線維となるように運命が定められた一次筋管に限定されるようになる。MHCneoは、出生時に最も大量に存在し、生後約3〜5日で減少するMHCイソ型であり、これは筋管の特殊化の発現および成熟MHCイソ型の出現と一致する。対照的にMHCneo発現は、ΔhMusTRD1α1マウスの成体筋において持続した。さらに、単一の筋線維においてMHC-IIAfastとMHC-IIBfastが同時発現された。MHCイソ型の同時発現は、特異的線維の表現型が確立される前の未成熟筋管において、および変換を受ける筋管において認められる。したがって、MHCイソ型の変化した分布および量は、成体表現型への筋管の特殊化のプロセスが、ΔhMusTRD1α1筋において阻害または遅延しているように思われる。
【０２６５】
hMusTRD1α1およびそのタンパク質のドミナントネガティブ型であるΔhMusTRD1α1はいずれも、同時形質移入試験において少なくとも四つの遅筋線維特異的プロモーターを抑制したが、MLC2slowの発現には影響を及ぼさなかった。さらに、筋細線維遺伝子の遅筋イソ型は、MLC2slowを例外としてΔhMusTRD1α1遺伝子組換え筋のヒラメ筋において抑制された。MHCの発達型および速筋型の調節は異なる；MHCIIBは影響を受けないが、MHCIIAおよび新生児はアップレギュレートされる。ΔhMusTRD1α1筋においてMHC-Islow発現筋線維が存在しないことは、遅筋筋原性表現型の調節にも欠損を認めることを示唆している。この可能性と一致して、他の三つの筋細線維遺伝子の遅筋イソ型がダウンレギュレートされた。発達途中の一次および二次筋管の双方において発現され、成体において遅筋線維となるように拘束されるMLC1slowAも同様に、ΔhMusTRD1α1ヒラメ筋においてダウンレギュレートされた。その双方が発達途中および成体遅筋線維において発現されるTnIslowおよびαTmslowの発現も同様に、ΔhMusTRD1α1ヒラメ筋においてダウンレギュレートされた。したがって、遅筋筋原性表現型の成分は、ΔhMusTRD1α1マウスにおいて抑制されるように思われる。対照的に、神経支配状態に対して反応性である成体イソ型であるMLC2slowは、ΔhMusTRD1α1において野生型ヒラメ筋と同様に類似のレベルで発現され、このことは、遅筋線維表現型の遺伝子マーカーが協調して調節されないことを示唆している。遅筋線維の喪失が、遅筋表現型へと拘束された筋管における欠損が原因で起こるのか、または確立された遅筋線維の成熟の欠損が原因で起こるのかはわかっていない。mMusTRD1β1によるMHCIIbの活性化は、MusTRDの異なるイソ型が速筋および遅筋線維特異的遺伝子に対して異なる活性化または抑制能を有することを示している。併せて考慮すると、これらの結果は、hMusTRD1α1および関連タンパク質が、筋形成ならびに速筋および遅筋筋原プロフィールを確立するための重要な調節物質であることを示唆している。これらの結果は、遅筋表現型が単一の因子または複数の群の因子によって調節／確立されているのではないことを示唆している。
【０２６６】
hMusTRD1α1およびΔhMusTRD1α1は、Inr様要素との相互作用を通してインビボでTnIslow遺伝子の転写を調節する。これによって、hMusTRD1α1は、遅筋筋原遺伝子の一般的調節物質であるか否か、ならびにMusTRD結合要素はMHC-Islow、MLC1slowA、およびαTmslow遺伝子に存在するか否かに関する疑問が生じる。TnIslow USEはまた、MEF2結合部位およびE-ボックスコンセンサス配列を含む。MEF2およびカルシウム依存的カルシニューリン-NFAT経路は、遅筋線維の種類の誘導および／または維持に関係している。しかし、ラットTnIslowUSEにおけるMEF2および／またはNFAT結合部位のいずれかの欠失は、遅筋線維特異的遺伝子発現を消失させるには十分ではなかった（Calvoら、1999）。比較すると、hMusTRD1α1 Inr様結合要素の破壊は、遅筋線維におけるTnIslow USE媒介遺伝子発現を有意に減少させ（O'Mahoneyら、1998）、MusTRD機能の破壊はこの研究における遅筋筋原性遺伝子の発現を抑制した。しかし、TFII-Iは、セカンドメッセンジャーからのシグナルを統合して、血清反応因子およびHLH因子に結合して転写を調節することができるため、MusTRDがMEF2、NFAT、またはMyoDファミリーメンバーと協調して、または共に作用して遅筋筋原表現型を調節する可能性がある。
【０２６７】
ΔMusTRDの過剰発現が他のMusTRDイソ型または未知のTFII-I-MusTRDファミリーメンバーの機能を破壊する可能性も同様に検討する。最近、TFII-Iのイソ型変種間のホモおよびヘテロ二量体形成が、TFII-I標的遺伝子の調節に異なる作用を有することが示された。同様に、MusTRDは、ホモ二量体を形成することができ、他のMusTRDイソ型とおそらくヘテロ二量体を形成する可能性がある。したがって、ΔMusTRDは、部分的に、他のMusTRDイソ型との相互作用によってその作用を発揮する可能性がある。しかし、MusTRDイソ型が筋細胞に同時局在するか否かはなおも決定しなけれならない。
【０２６８】
マウスにおいてMusTRD機能を破壊すると、ミオパシー表現型を引き起こす。それによってミオパシーまたはジストロフィー特徴をマウスにおいて誘導することができるメカニズムが少なくとも4個ある：1）ジストロフィンによるウトロフィンのような細胞骨格遺伝子の破壊、2）コラーゲンVIまたはラミニンのような結合組織遺伝子の破壊、3）MRF4によるmyoDのような筋原性調節因子（MRF）の破壊、および4）神経欠損または損傷。したがって、エラスチン、LIM-キナーゼ1、frizzledおよび／またはシンタキシン1Aの単不全も同様に、WBSにおける筋骨格欠損に関与する可能性がある。LIM-キナーゼ1およびシンタキシンは、発達中の脳の細胞骨格構築および神経小胞輸送に関与しているが、frizzledは体計画の発達に関与している。しかし、LIMK-1およびSTXIAのいずれかの微小欠失を有する異型WBS患者は、筋骨格異常を示さなかったが、無傷のSTXIAおよびFZD3座を有する古典的なWBS患者は、筋骨格欠損を示す。同様に、エラスチン遺伝子座に限って欠失を有する患者は心血管欠損のみを示した。したがって、これらの遺伝子が筋骨格欠損を引き起こす可能性は低い。古典的なWBSの場合のように、組み合わせるとそれらまたは欠失点での如何なる座もMusTRDと協調して作用し、筋線維の完全性および神経依存的シグナル伝達に影響を及ぼす可能性がある。
【０２６９】
要約すると、本発明者らは、切断型MusTRDタンパク質によってマウスにおいて誘導されたミオパシー表現型を示した。認められた身体的および筋欠損は、MusTRDが少なくとも三つの異なるプロセスにおいて筋発生における重要な調節物質であるという主張を支持する。第一に、遅筋線維特異的遺伝子はΔMusTRD筋において抑制され、MusTRDが遅筋筋原性表現型の調節に関係することを示している。遅い疲労抵抗性の筋線維の喪失は、これらのマウスにおける姿勢および歩行の変化に関係する可能性があり、WBS患者における類似の特徴に関与する可能性がある。第二に、ΔMsuTRDは、MHCneoの発達的イソ型が保持されることによって示されるように、筋線維の成熟にとって重要である。第三に、MusTRD機能の破壊によって、筋重量の減少および成長遅滞が起こり、MusTRDが分化した筋管の増殖過栄養にとって必要であることを示唆している。これらの表現型は用量依存性であり、MusTRDコード遺伝子の半接合体欠失の影響を反映する可能性がある。さらに、これまで基礎となる内分泌疾患であると見なされているWBSにおける成長欠損は、現在では筋特異的転写因子MusTRD1の機能の破壊に一部帰因することができる。
【０２７０】
上記の明細書において言及した全ての出版物は、参照として本明細書に組み入れられる。本発明の上記の方法および系の様々な改変および変更が当業者に明らかであるが、それらも本発明の範囲に含まれる。本発明は、特定の好ましい態様に関連して記述してきたが、請求される本発明はそのような特定の態様に不当に限定されてはならないと理解すべきである。実際に、分子生物学または関連分野の当業者に明らかである、本発明を行うために記述される様式の様々な改変は、本発明の範囲内であると意図される。
【０２７１】
参考文献
2005510545.tif 000022
【０２７２】
説明の配列表部分
マウス配列（図3および4に示した通り）
1α1    配列番号：1 （ヌクレオチド）   配列番号：2（アミノ酸）
1α4    配列番号：3 （ヌクレオチド）   配列番号：4（アミノ酸）
1β1    配列番号：5 （ヌクレオチド）   配列番号：6（アミノ酸）
1β4    配列番号：7 （ヌクレオチド）   配列番号：8（アミノ酸）
2α5    配列番号：9 （ヌクレオチド）   配列番号：10（アミノ酸）
3α3    配列番号：11（ヌクレオチド）   配列番号：12（アミノ酸）
3β3    配列番号：13（ヌクレオチド）   配列番号：14（アミノ酸）
3α5    配列番号：15（ヌクレオチド）   配列番号：16（アミノ酸）
3β5    配列番号：17（ヌクレオチド）   配列番号：18（アミノ酸）
3β7    配列番号：19（ヌクレオチド）   配列番号：20（アミノ酸）
3α7    配列番号：21（ヌクレオチド）   配列番号：22（アミノ酸）
ヒト配列（図14を参照されたい）
1α1    配列番号：23（ヌクレオチド）
1α0    配列番号：24（ヌクレオチド）
1β1    配列番号：25（ヌクレオチド）
1β0    配列番号：26（ヌクレオチド）
配列番号：27−ヒトMusTRDのエキソン23配列
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配列番号：28−ヒトMusTRDのエキソン30配列
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配列番号：29−ヒトMusTRDのエキソン31配列
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配列番号：30−ヒトMusTRD−アミノ酸配列
GenBankアクセッション番号XM_034686
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配列番号：31ヒトMusTRD−アミノ酸配列
GenBankアクセッション番号XM_034686
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【図面の簡単な説明】
【０２７３】
【図１】（A）イントロンの相対的な位置を示す第5染色体上のmMusTRD遺伝子（GTF2IRD1）の略図である。（B）エキソン19、エキソン23、エキソン19に隣接するコード配列、エキソン23に隣接するコード配列を標的とするフォワードプライマー、ならびにエキソン30およびエキソン31を標的とするリバースプライマーを示す、mMusTRD遺伝子のエキソン18〜31の略図。同様に、選択的にスプライシングされた四つのカセット（1〜4）および*印で示す相互に排他的にスプライシングされたエキソン（30および31）も示す。（C）mMusTRDイソ型11個を生じるマウスGTF2IRD1遺伝子（エキソン18〜31）の3'領域における選択的スプライシング事象の略図である。（D）イソ型2α5、3α3、3β3、3α5、3α7、3β5、および3β7においてRD5の5'領域およびRD6の3'領域を構成するカセット4、ならびにこのカセットを選択的スプライシングによって除去した場合の、イソ型1α1、1α4、1β1、および1β4においてRD6を形成するエキソンの略図。
【図２】（A）mMusTRDイソ型11個の略図。完全に配列決定されたイソ型を*で示し、3'領域が配列決定されたイソ型を#で示す。反復ドメインを暗黄色で示し、その中でRD4、RD5の3'半分、およびRD6の5'半分は選択的にスプライシングされ、ポリセリン路を赤、および核局在配列を暗青色、エキソン19、23、31、およびエキソン30の3'領域の選択的スプライシングによって生じるシグナチャーボックスをそれぞれ、緑色、翡翠色、ピンク色、および紫色で示す。（B）起こりうる全てのコード配列から得られたMusTRDのアミノ酸配列。選択的にスプライシングされたカセットから生じたペプチド配列を斜線および太字で示し、さらに、エキソン30およびエキソン31の選択的にスプライシングされて相互に排他的な5'領域を括弧で示す。エキソン23によってコードされるアミノ酸配列を四角で囲んでより大きいカセットと区別する。同様に、核局在配列（下線）、ポリセリン管（四角）、および推定の同時調節LXXILモチーフ（四角）6個も示す。
【図３】マウスMusTRDイソ型11個のヌクレオチド配列のアラインメント。
【図４】マウスMusTRDイソ型11個のアミノ酸配列のアラインメント。
【図５】hMusTRD1α1のドメイン構築。hMusTRD1α1944アミノ酸およびhMusTRD1α1458アミノ酸は、長さがアミノ酸944個および458個であり、それぞれ、アミノ酸約86〜95個のTFII-I様反復ドメイン構造（暗黄色）5個および2個を含む。hMusTRD1α1のアミノ酸のアラインメントおよび構造モチーフ検索によって、核局在シグナル（NLS；翡翠色）、myc-ヘリックス-ループ-ヘリックス（HLH；赤色）、ポリセリン管（暗緑色）、および推定のDNA結合ドメイン2個（DBD；青色）が明らかとなった。
【図６】C末端およびN末端切断hMusTRD1α1シリーズ。（A）hMusTRD1α1のC末端およびN末端切断型は、RD1およびRD2を欠損するN末端欠失hMusTRD1α1の他に、分子のカルボキシ末端から始まるそれぞれの反復ドメイン（RD）を段階的に除去することによって作製した。C末端切断型cDNAの梯子をPCR（B）によって作製し、（C）その後の機能分析において用いられるhMusTRD1α1のC末端欠失型をインビトロで翻訳するために、pcDNA3.1 myc/his発現ベクターにサブクローニングした。
【図７】マウス骨格筋におけるMusTRDの発現。（A）COS-7細胞に異所発現させた完全長（レーン3）および切断型ヒトMusTRD1α1（アミノ酸1〜458個；ΔhMusTRD1α1；レーン2）のウェスタンブロット分析。非形質移入COS-7細胞溶解物をレーン1に示す。マウスヒラメ筋の免疫蛍光染色（FITC）から、MusTRDが遅筋および速筋線維（C）の双方の核（B）において発現されることが判明した。（C）抗ミオシン重鎖I型（MHC-Islow）染色は、遅筋（上部）を速筋（下部）筋線維と区別する。抗ジストロフィン免疫染色は、筋線維の細胞質膜を描写する（矢印）。（D）MusTRDを発現する核が筋線維の細胞質膜内に存在することを示す（B）および（C）の併合図。（E）マウス筋肉におけるTnIslow-USE-B1結合タンパク質の検出。マウスヒラメ筋（S）およびEDL（E）核タンパク質抽出物の電気泳動移動度シフト分析およびラット筋核抽出物との比較。B1オリゴヌクレオチドは、hMusTRD1α1の無傷のInr様結合部位を含む；B1bは、結合を防止する3 bpの変異を含む。（F）マウス胚発達の際のマウスMusTRD発現のノーザンブロット分析。5.9、4.4、および3.6 kbの三つのバンドが検出される（dpc＝交尾後の日数）。
【図８Ａ】C2C12細胞におけるhMusTRD1α1およびΔhMusTRD1α1による遅筋および速筋線維特異的プロモーターの調節。hMusTRD1α1またはΔhMusTRD1α1発現プラスミドを、ルシフェラーゼに結合させたMHIIB遺伝子の-2554〜+13、MHCIslow（MHCIB）遺伝子の-3500〜+462、MLC2slow遺伝子の-800〜+12、または157 bpのTnIslowエンハンサーのいずれかを含む発現プラスミドと共に同時移入させた。プラスミドの組み合わせあたりの3つの異なる形質移入培養物からの溶解物において、ルシフェラーゼ活性を決定した。転写活性のMusTRD媒介抑制または活性化は、1に設定した基礎／空の構築物活性に対する倍数変化として表記する。示した値は、3つの異なる実験からの平均値±標準偏差を表す。TR＝ΔhMusTRD1α1、FL＝hMusTRD1α1。
【図８Ｂ】C2C12細胞におけるmMusTRDイソ型による遅筋および速筋線維特異的プロモーターの調節。mMusTRD3α7、1β1、または3β7発現プラスミドを、ルシフェラーゼに結合させたMHIIB遺伝子の-2554〜+13、MHCIslow（MHCIB）遺伝子の-3500〜+462、MLC2slow遺伝子の-800〜+12、または157 bpのTnIslowエンハンサーのいずれかを含む発現プラスミドと共に同時移入させた。プラスミドの組み合わせあたりの3つの異なる形質移入培養物からの溶解物においてルシフェラーゼ活性を決定した。転写活性のMusTRD媒介抑制または活性化は、実際の光単位として表記する。値は、異なる3実験からの平均値±標準偏差を表す。
【図９】hMusTRD1α1およびΔhMusTRD1α1のトランス活性化および二量体形成機能。（A）gal4 DNA結合ドメイン（gal4DBD）に融合させると、hMusTRD1α1（黒いバー）は自己トランス活性化機能を示すが、ΔhMusTRD1α1は示さない（斜線のバー）。（B）YM4271酵母1ハイブリッド細胞において、野生型（wt）hMusTRD1α1（黒いバー）およびΔhMusTRD1α1（斜線のバー）は、TnIslowUSE-B1配列に結合したが、変異結合部位を含むUSE-B1b配列には結合しなかった。白いバーは、基礎β-ガラクトシダーゼレポーター活性を示す。（C）hMusTRD1α1（黒いバー）およびΔhMusTRD1α1（斜線のバー）はいずれも酵母においてホモ二量体を形成したが、二つのタンパク質の間のヘテロ二量体形成は効率的ではない（線状のバー）。これらのデータは、対照系統と比較して表記し、それぞれ1試料あたり3回行った独立した3実験のβ-ガラクトシダーゼ活性の平均誘導倍数を表す。
【図１０】ΔhMusTRD1α1遺伝子組換えマウスの作製。（A）-2000HSA：ΔhMusTRD1α1遺伝子組換え構築物は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（bgh）を有するhMusTRD1α1の1597 bp EcoR1-BstEII断片に結合させたHSAプロモーターの2.2 kb Hind III断片を含む。（B）導入遺伝子特異的プローブを用いた、独立した5系統のひ腹筋における導入遺伝子発現（ΔM1）のノーザンブロット（上のパネル）。遺伝子組換え系統におけるΔhMusTRD1α1タンパク質発現のウェスタンブロット（下のパネル）。（C）独立した5系統における導入遺伝子転写物（白色）およびタンパク質（黒色）レベルの定量的分析、n＝個々の子孫4〜5個。X軸表示は遺伝子組換え系統を指す。Y軸のデータは、相対的密度測定単位を表す。（D）左側の年齢および性別をマッチさせた対照と比較して、強い脊柱彎曲および脚拘縮を示すΔhMusTRD1α1遺伝子組換えマウスのマンモグラム。（E）ΔhMusTRD1α1遺伝子組換えマウス（右）は姿勢が悪く（左側に対照）、開いた後肢を示す。（F）MusTRD機能の破壊は成長遅滞を引き起こす。独立した二つの遺伝子組換え系統のF1子孫の体重を離乳直後から生後12ヶ月齢まで測定した。（G）その指数的成長期（生後3〜7週間）における、野生型同腹子（白印）と比較した系統10（黒四角）および11（黒丸）からのΔhMusTRD1α1雄性マウスの増殖速度。（H）遺伝子組換えマウスは12ヶ月齢まで成長が遅滞したままであった。データは、個々のマウス4〜14匹の平均体重（g±SD）を表す。差は、全ての時点で統計学的に有意であった（0.001＜P＜0.05）。雌性遺伝子組換えマウスの成長パターンは、雄性遺伝子組換えのパターンと類似であった。
【図１１】ΔhMusTRD1α1ヒラメ筋の組織形態学的分析。野生型のヒラメ筋断面の免疫染色は、MHC-Islow陽性（A）およびMHC-IIAfast陽性（B）筋線維を示す（茶色の沈殿物によって可視化される）。ΔhMusTRD1α1筋は、MHC-Islow発現が欠損しているが、（C）MHC-IIAfastは、全ての線維において発現される（D）。野生型マウスおよび独立した遺伝子組換え系統4個（70、10、11、29）からのヒラメ筋の定量的画像分析は、ΔhMusTRD1α1系統が、筋の断面積の減少（E）、筋直径の減少（F）、および筋の数のわずかな変化（G）を示すことを示す。データは各系統からの個々のマウス5〜6匹および野生型マウス11匹を表す。E〜Gに関して、*は、野生型と比較してP≦0.05の有意差を示し、***は、P≦0.01を示す。A〜Dにおける較正バーは、1 mmを示す。ΔhMusTRD1α1マウスの速筋線維における退化および再生。野生型（H）およびΔhMusTRD1α1（I）EDL筋切片のH＆E染色。マクロファージ活性化（黒い粒）に関するαナフトールアセテートエステラーゼアッセイ法は、ΔhMusTRD1α1（K）において線維の変性を示すが、野生型の筋（J）では示さない。（K）の挿入図は筋線維に浸潤するマクロファージ集団を示す。筋線維の数は、ΔhMusTRD1α1EDL筋（L）においてわずかに増加し、再生しつつある（核が中心に存在する）線維の数の増加（M）と一致する。分析した筋は、7週齢のマウスから得た。H、Iにおける較正バーは、25 μmを表し、J、Kにおけるバーは10 μmを表す。
【図１２】ΔhMusTRD1α1筋の線維特異的遺伝子発現プロフィール。（A）電気泳動分析後に、系統29（tg）および対照同腹子（wt）からの7週齢のΔhMusTRD1α1マウスの横隔膜筋（上のパネル）およびヒラメ筋（中央のパネル）のタンパク質溶解物の銀染色を行った。MHC-Islow（I）、MHC-IIAfast（IIA）、MHC-IIBfast（IIB）、MHC-IIX（IIX）、MHC胚（emb）、およびMHC新生児（neo）の電気泳動移動度を示す。ΔhMusTRD1α1筋は、MHCneoの存在によって示されるように未成熟な筋原表現型を示す。MHCneoに対する抗体を用いたヒラメ筋溶解物の対応するウェスタンブロット（下のパネル）を、生後1日目（PND1）にマウス筋において通常認められるMHCneoの発現と比較すると、ΔhMusTRD1α1筋においてMHCneoが発現されていることが確認される。（B）遅筋線維表現型はΔhMusTRD1α1マウスにおいて抑制される。7週齢での系統29および系統11のヒラメ筋（S）およびEDL筋（S）から抽出した総RNAのノーザンブロット分析は、野生型（wt）マウスと比較してΔhMusTRD1α1（tg）においてMLC1slowA、TnIslow、αTmslow、およびMLC2slowが発現されたことを示す。試料は18S rRNA発現に対してローディングした。
【図１３】ΔhMusTRD1α1は、遺伝子組換えマウスにおいてTnIslow上流エンハンサー（USE）の発現を抑制する。（A）TnIslowUSE-95X1nucZレポーター構築物は、TnIslow遺伝子のUSE（ヌクレオチド-1035〜-875）、および最小のプロモーター（-95〜+1）、チミジンキナーゼ5' UTRおよびAUG、ならびにβ-ガラクトシダーゼ遺伝子上流の核局在シグナル（nls）を含む。（B、C）TnIslowUSE-95X1nucZ+/+マウスのヒラメ筋におけるβ-ガラクトシダーゼ発現は、MHC-Islowを発現する線維（茶色の沈殿物として可視化される）に限定される。（D、E）遅筋線維特異的発現は、TnIslowUSE-95X1nucZ+/+×ΔhMusTRD1α1+/-筋ではダウンレギュレートされる。BおよびDにおける較正バーは1 mmを表し、CおよびEにおけるバーは50 μmを表すことに注意すること。グラフにしたデータは、TnIslowUSE-95X1nucZ+/+マウス（白いバー）およびTnIslowUSE-95X1nucZ+/+×ΔhMusTRD1α1+/-マウス（黒いバー）のヒラメ筋（F）およびEDL筋（G）からのタンパク質溶解物のβ-ガラクトシダーゼ活性を表す。それぞれの垂直のバーは、個々のマウスからの筋におけるβ-ガラクトシダーゼ活性を表す。（*）は、パネルB〜Eにおいて切片にした系統を示す。
【図１４】ヒトMusTRDイソ型4個のアミノ酸配列のアラインメント。
【図１５】hMusTRD1α1は、hTnIslowUSEにおけるB1要素を通してMEF2C活性化を抑制する。C1C12細胞の一過性の同時形質移入を、hMusTRD1α1（1α1944アミノ酸）およびMEF2Cに関する発現構築物、（A）ルシフェラーゼに結合させた無傷のhTnIslowUSE（nts-1031〜-874）および変異USE B1b部位を含むレポーター構築物を用いて行った。（B）C1C12細胞におけるhTnIslowUSEのMEF2C媒介トランス活性化およびMEF2Cトランス活性化のhMusTRD1α1媒介抑制を、1に設定した基礎（空の）発現ベクター活性の誘導倍数として表記する。Cos-7細胞の一過性の形質移入は、hMusTRD1α1（1α1944アミノ酸）および（A）ルシフェラーゼに結合させたhTnIslow USE（nts-977〜-960）からの三量体形成B1およびB1b要素を含むレポーター構築物を用いて行った。（B）Cos-7細胞におけるB1転写活性のhMusTRD1α1媒介抑制は、1に設定した基礎（空の）発現ベクター活性の誘導倍数として表記する。カラムは1試料あたり3回の実験の平均値を表す；バーは平均値の標準誤差（SEM）を表す。
【図１６】hMusTRD1α1は、その同源の結合部位への結合の非存在下で抑制することができる。hMusTRD1α1の一連のC末端欠失発現構築物および三量体形成B1要素を含むレポーター構築物を用いて、Cos-7細胞の一過性の形質移入を行った。それぞれの切断型構築物の転写活性は、1に設定した基礎（空の）発現ベクター活性の誘導倍数として表記する。カラムは1試料あたり3回の実験の平均値を表す；バーはSEMを表す。
【図１７】hMusTRD1α1およびNcoRは、hTnIslow USEを抑制する。（A）Cos-7細胞における哺乳類の1ハイブリッド同時形質移入アッセイ法を、表記の発現構築物について行った：GAL4 DNA結合ドメイン（GAL4 DBD）、GAL4DBD-hMusTRD1α1944アミノ酸mys/his（GAL4DBD-1α1944アミノ酸）、およびGALDBD-NcoR1-312融合構築物の他の、GAL4結合部位の3コピーによって駆動されるルシフェラーゼレポーター構築物。（B）抑制は、1に設定した基礎GAL4DBD転写活性の抑制倍数として表記する。カラムは1試料あたり3回の実験の平均値を表す；バーはSEMを表す。
【図１８】hTnIslowUSEのhMusTRD1α1媒介抑制のメカニズム。（A）B1要素が、3'MEF2C部位に結合したMEF2Cと相互作用する増強因子（X）によって占有されている場合、hTnIslowUSEによる転写のトランス活性化が得られる。（B）抑制は、NcoR：hMusTRD1α1（1α1）複合体によるMEF2Cの分離または増強因子の結合を防止するhMusTRD1α1によるB1要素の占有のいずれかによって起こる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2005510545.tif 000029
【図１Ｃ】
2005510545.tif 000030
【図１Ｄ】
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【図２】
2005510545.tif 000032
【図３−１】
2005510545.tif 000033
【図３−２】
2005510545.tif 000034
【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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