(57)【要約】  生物変換によってα−ケトブチレートを得る方法を開示する。この分子は培地中に蓄積され、最良級の芳香の香味料などの食品成分に後で加工しやすい。適切な菌株は、発酵培地中にα−ケトブチレートを蓄積させることができる、天然のｉｌｖ−３突然変異菌株である。特定の培地のパラメーターを調節することによって、８ｇ／ｌ培地までのα−ケトブチレートを蓄積させた。
2005510245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵培地で培養した微生物によるトレオニンからの生物変換によって、α−ケトブチレートを蓄積させるための方法。
【請求項２】
微生物の酵素抽出によるトレオニンからの生物変換によって、α−ケトブチレートを蓄積させるための方法。
【請求項３】
微生物が食品等級の微生物である、請求項１及び２に記載の方法。
【請求項４】
微生物がニューロスポラ  クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）株である、請求項１から３までのいずれかに記載の方法。
【請求項５】
微生物が天然の突然変異微生物である、請求項１から４までのいずれかに記載の方法。
【請求項６】
微生物が非常に低いアセトヒドロキシ酸合成酵素活性を示すか、或いはまったく示さない、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
微生物のバイオマスの生成を促進する第１の培地中で微生物を培養し、その後、α−ケトブチレートの蓄積及び／又は排出を促進する異なる培地中で前記バイオマスを培養することを含む、請求項１から６までのいずれかに記載の方法。
【請求項８】
α−ケトブチレートの蓄積及び／又は排出を促進する前記培地が、０．１〜１０重量％のトレオニン、０〜１重量％のバリン、及び／又は７〜１１に調節されたｐＨを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
発酵培地からα−ケトブチレートを抽出、単離及び／又は精製することをさらに含む、請求項１から７までのいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
トレオニンからの生物変換によって、天然のα−ケトブチレートを生成するための微生物の使用。
【請求項１１】
５−エチル−３−ヒドロキシ−４−メチル−２（５Ｈ）−フラノン（エモキシフロン）を生成するための方法であって、前駆物質として使用するα−ケトブチレートが、請求項１から１０までのいずれかに記載の方法のα−ケトブチレートである上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−ケトブチレートを蓄積させるための方法に関する。本発明は、天然の突然変異微生物及び／又は抽出した酵素を使用して、天然のα−ケトブチレートを生成することにも関する。本発明は、エモキシフロンを得る方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
α−ケト−酪酸、２−オキソ−ブチレート、２−オキソ−酪酸の同義語であるα−ケトブチレートは、様々な生物によって蓄積された。しかしながら反対の報告によれば、この分子が釣り合いの取れた濃度範囲で生成され、したがって、蓄積するのに適していないことも示された。
【０００３】
ＪＰ０３１８３４７６では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物は、２，３−ジヒドロキシ酪酸をα−ケト酪酸に変換することができることが示されている。しかしながら、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは食品等級の微生物ではなく、したがって、この微生物の発酵によって得られるα−ケト酪酸は、食品に容易に適用できない。このことは、このプロセスによって得られたα−ケト酪酸の、さらなる処理によって得られる誘導体にも当てはまる。
【０００４】
Ｎａｋａｈａｒａ、Ｎｋａｊｉｍａ−Ｋａｍｂｅ及びＳａｔｏ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９４）、１６（３）、２６３〜８）は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ菌株によって、α−ケト酪酸を蓄積させることができることを示している。しかしながら、この生物変換では、１，２−プロパンジオールを、食品成分を得るのに好ましくない培地に加えなければならない。さらに、食品成分の合成中における食品成分又は反応物の生成に関して、この微生物が無害であることが正当化されるわけではない。
【０００５】
組み換え微生物中にα−ケト酪酸が蓄積するという、他の報告が存在する（Ｋｉｓｕｍｉ、Ｓｕｇｉｕｒａ、Ｔａｋａｇｉ及びＣｈｉｂａｔａ、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ）１９７７Ｊａｎ；３０（１）、１１１〜７）。しかしながら、香味料（食品成分）をさらに合成するために、遺伝学的に改変されていない生物からα−ケト酪酸を得ることが望まれる。
【０００６】
Ｓｌｕｉｓ他（Ｓｌｕｉｓ、Ｗｏｌｋｅｎ、Ｇｉｕｓｅｐｐｉｎ、Ｔｒａｍｐｅｒ  Ｗｉｊｆｆｅｌｓ、「トレオニン、シスチオニン、及び分岐鎖アミノ酸のＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉの代謝に対する影響（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、ｃｙｓｔｈｉｏｎｉｎｅ、ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉ）」、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、２０００Ｆｅｂ１；２６（２〜４）：２９２〜３００）は、真菌菌株中ではα−ケトブチレートは蓄積しないことを発見した。なぜなら、この微生物中のα−ケトブチレートの蓄積量は、常時釣り合いが取れていたからである。
【０００７】
高レベルのα−ケトブチレートは、微生物に対して毒性である可能性があることは既に示されている（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ、「ｉｌｖＡの突然変異を同定するための有効な手法によって、大腸菌由来の生合成トレオニンデアミナーゼの、アミノ末端カタラーゼドメインが明らかになる（Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｉｌｖＡ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃａｔａｌｉｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ）」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９９３  Ｏｃｔ；１７５（２０）６６０５〜１３）。結論として、α−ケトブチレートの蓄積を、生物変換によって得ることは困難である可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来技術に照らせば、バイオテクノロジーによる方法においてα−ケト酪酸を得ることが目的である。特に、遺伝子工学によって処理した微生物と対照的な天然の突然変異体から、α−ケト酪酸を得ることが目的である。さらに、α−ケト酪酸を蓄積又は生成させるのに適した微生物は、食品における異議の無い無害の使用を正当化するために、食品等級の微生物でなければならない。
【０００９】
特に、α−ケトブチレートは、非常に強力であるが特異的な香気を有し、低濃度で「最良級の芳香」として使用される、特定のフラノン、例えば「マギーラクトン」（５−エチル−３−ヒドロキシ−４−メチル−２（５Ｈ）−フラノン）を得るための出発地点である。本発明の目的は、香味料をさらに合成するための中間物質としてこれまで使用されている、化学合成されたα−ケトブチレートの代替物を発見することである。
【００１０】
培養することが容易な微生物を有することも目的である。
【００１１】
栄養学的に問題のある反応物を含まない生物変換によって、菌株からα−ケト酪酸を得ることは他の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
意外なことに、天然の突然変異体であり、充分な量のα−ケト酪酸を蓄積及び／又は分泌させる、食品等級の微生物を使用することができる。
【００１３】
したがって、第１の態様では本発明は、発酵培地で培養した微生物によるトレオニンからの生物変換によって、α−ケトブチレートを蓄積させるための方法を提供する。
【００１４】
第２の態様では本発明は、微生物の酵素抽出によるトレオニンからの生物変換によって、α−ケトブチレートを蓄積させるための方法を提供する。
【００１５】
第３の態様では本発明は、トレオニンからの生物変換によって、α−ケトブチレートを生成するための微生物の使用を提供する。
【００１６】
第４の態様では本発明は、５−エチル−３−ヒドロキシ−４−メチル−２（５Ｈ）−フラノン（エモキシフロン，ｅｍｏｘｙｆｕｒｏｎｅ）を生成するための方法であって、前駆物質として使用するα−ケトブチレートが、本発明の方法によって得ることができるα−ケトブチレートである上記方法を提供する。
【００１７】
本発明の利点は、本発明によって、容易かつ安価にα−ケトブチレートを得るための方法が提供されることである。
【００１８】
本発明の他の利点は、本発明によって、α−ケト酪酸を得るバイオテクノロジーによる方法が提供されることである。
【００１９】
本発明の他の利点は、本発明によって、食品中に容易かつ安全に使用することができ、或いは食品に添加するのに適した物質にさらに加工することができる、α−ケトブチレートが提供されることである。
【００２０】
１つの利点は、本発明に従って生成されるα−ケトブチレートは、食品等級の微生物によって生成することができることである。
【００２１】
本発明の他の特徴及び利点は、本発明の好ましい実施形態の記載中に記載し、そこから明らかであり、図面を参照しながらこれらを以下に述べる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本明細書の文脈で、「含む」という語は、「数ある中で〜を含む」ことを意味すると解される。この語は、「のみからなる」として解釈されることを意図するものではない。
【００２３】
用語α−ケトブチレートは、同義の名称２−オキソ−ブチレートによって、或いは対応する共役酸の名称によって置換可能である。
【００２４】
「天然の突然変異体」という表現は、遺伝子工学による手段以外の手段により得られた、突然変異した微生物を指すと考えられる。言い換えると、この表現は非ＧＭＯ（遺伝子改変生物）を指す。
【００２５】
本発明の文脈では、突然変異は、点突然変異、又は特定の遺伝子のコード領域のみに存在する突然変異として解釈されるべきではない。非常に対照的に、突然変異は、突然変異の文脈で述べる特定の遺伝子産物の活性に影響を与える任意の遺伝子座における、任意の種類のＤＮＡの変化であると考えられる。例えば、ｉｌｖ−３突然変異（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ中の遺伝子座）は、ｉｌｖ−３遺伝子のコード領域に限られた突然変異としてのみ、みなすべきではない。
【００２６】
用語「連鎖群」は、「連鎖群ＩＶ」で使用されるように、遺伝学において使用される用語であり、一緒に遺伝する傾向がある異なる遺伝子座を有する、染色体上の領域を指す。
【００２７】
用語「連鎖群ＩＶ」は、ｉｌｖ−３遺伝子座が取り込まれている、Ｎ．ｃｒａｓｓａ中の染色体領域を指す。さらなる詳細に関しては：Ｋｕｗａｎａ  Ｈ及びＷａｇｎｅｒ  ＲＰ、「Ｎ．ｃｒａｓｓａ、Ｉ．のｉｌｖ−３突然変異体、遺伝的及び生化学的特性（Ｔｈｅ  ｉｌｖ−３  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｎ．ｃｒａｓｓａ、Ｉ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）」、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６２：４７９〜４８５、１９６９中を参照のこと。
【００２８】
本発明の文脈では、ｉｌｖ−３遺伝子は、ＥＣ４．１．３．１８（酵素番号）をコードする遺伝子を意味するものとする。Ｉｌｖ−３は、Ｎ．ｃｒａｓｓａ中の遺伝子の名称である。しかしながら、この用語は、他の生物の同一機能体、例えば略称ＩＬＶ−２で知られているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の同一機能体も含むと、本明細書ではみなす。
【００２９】
本明細書で使用する酵素番号は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＵＢＭ）によって確立された、酵素分類システムを指す。
【００３０】
本発明の文脈内では、「異なる」培地という表現は、完全に異なるか或いは新しい培地に限られるものではないとする。しかしながら、前の培地の１つの機能とは異なる特定の機能に調節された、培地を使用することを意味するものとする。例えば栄養物の添加、ｐＨの変更又は完全な培地交換によって、この調節を行うことができる。したがって、用語「異なる」培地は、文脈に応じて、用語「改変」又は「第２の」培地によって置換可能である。
【００３１】
好ましくは、本発明の方法の一実施形態では、微生物は食品等級の微生物である。より好ましくは、微生物は細菌、真菌又は酵母菌である。
【００３２】
好ましくは、微生物は細菌又は真菌である。微生物が真菌である場合、それはＡｓｃｏｍｙｃｏｔａ門、より好ましくはＳｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ亜綱、さらに好ましくはＳｏｒｄａｒｉａｌｅｓ目に属する。好ましい実施形態では、微生物はＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ属に属する。
【００３３】
好ましい実施形態では、微生物はＮ．ｃｒａｓｓａ菌株である。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、微生物は天然の突然変異微生物である。
【００３５】
好ましくは、本発明の微生物は、イソロイシン、ロイシン又はバリンの生合成経路に影響を与える突然変異を有する。
【００３６】
好ましくは、それはＮ．ｃｒａｓｓａの連鎖群ＩＶの突然変異である。例えば、天然の突然変異はｉｖ−３突然変異である。
【００３７】
天然の突然変異菌株は、Ｋｕｗａｎａ  Ｈ及びＷａｇｎｅｒ  ＲＰ、「Ｎ．ｃｒａｓｓａ、Ｉ．のｉｌｖ−３突然変異体、遺伝的及び生化学的特性（Ｔｈｅ  ｉｌｖ−３  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｎ．ｃｒａｓｓａ、Ｉ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）」、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６２：４７９〜４８５、１９６９中に引用された菌株から選択されることが好ましい。
【００３８】
好ましくは、天然の突然変異菌株は、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋａｎｓａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋｓ  Ｃｅｎｔｒｅ）から商業的に入手可能なＮ．ｃｒａｓｓａ菌株、カタログ番号ＦＧＳＣ５７５であり、これは以下の特性を有する：交配型Ａ、遺伝子型ｉｌｖ−３、対立遺伝子Ｙ７１１０、連鎖群ＩＶＲ、遺伝的背景Ｌ、Ｍｕｔａｇｅｎ  Ｍ．、マーカー：イソロイシン及びバリン−３。参照文献：Ｂａｒｒａｔ他、１９５４、Ａｄｖ  Ｇｅｎｅｔ６：１〜９３．Ｐｅｒｋｉｎｓ他、１９６９、Ｇｅｎｅｔｉｃａ４０：２４７〜２７８．この菌株は、ｉｌｖ−３遺伝子上に突然変異を有する。
【００３９】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、天然の突然変異体は、機能不全、欠陥又は阻害型ｉｌｖ−３遺伝子産物、及び／又はｉｌｖ−３遺伝子の突然変異を含む。
【００４０】
好ましい実施形態では、微生物が非常に低いアセトヒドロキシ酸合成酵素活性を示すか、或いはまったく示さない。
【００４１】
好ましい実施形態では、微生物は欠陥又は阻害型デヒドロキシ酸脱水酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素を有する。
【００４２】
本発明の方法は、１つ、２つ又はそれより多くの段階を含むことが好ましい。それが２つ以上の段階を含む場合、微生物のバイオマスを生成する少なくとも１つの段階、及びα−ケトブチレートが蓄積する少なくとも１つの他の段階が存在する。
【００４３】
本発明の方法は、２段階以上の連続又は不連続発酵であることが好ましい。
【００４４】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、微生物のバイオマスの生成及び酵素の活性化を促進する第１の培地中で微生物を培養し、α−ケトブチレートの蓄積及び／又は排出を促進する異なる培地中でそのバイオマスを後に培養することを含む。
【００４５】
好ましくは、バイオマスの生成後に、第１の培地を濾過し、残留物（微生物）を回収し、異なる培地に移す。
【００４６】
或いは、微生物の存在下、即ち濾過段階なしで、培地を改変して異なる培地を形成することができる。
【００４７】
好ましい実施形態では、α−ケトブチレートの蓄積を促進する培地（例えば第２の培地）は、０〜１重量％のバリン、０．２〜１０重量％のトレオニン、及び／又は７〜１４に調節されたｐＨを含む。培地は、０．２〜５重量％のトレオニンを含むことが好ましい。
【００４８】
第１の培地は、バイオマスの増加及び適切な酵素の活性化を促進する、化学的に定義された培地であってよい。
【００４９】
第２の、即ち異なる培地は、追加のバリン（酵素誘導物質）及び／又はトレオニン（前駆物質）を含む。
【００５０】
第１の培地と第２の培地は、異なるｐＨを有することが好ましい。
【００５１】
例えば、第２の培地は、追加のバリン及び／又はトレオニンを含む。
【００５２】
本発明の方法は、発酵培地からα−ケトブチレートを抽出、単離及び／又は精製することをさらに含むことが好ましい。
【００５３】
例えばα−ケトブチレートは、適切な樹脂を有するカラムの培地から単離することができ、或いはＨＰＬＣによって単離することができる。
【００５４】
他の実施形態では、α−ケトブチレートに予備精製のみを行い、これはα−ケトブチレートを含む培地を、単なる不完全な、部分的単離後の他の処理用に、直接使用することを意味する。例えば、培地を単に濾過して微生物を除去し、さらに処理するために直接使用することができる。エモキシフロン又はソトロン（ｓｏｔｏｌｏｎ）（最良級の芳香の香味料）が最終産物である場合、この手法は成功する可能性がある。エモキシフロン又はソトロンは、その合成が終了した後に、容易に単離することができる。
【００５５】
本発明を実施するためには、適切な菌株を決定しなければならない。このような菌株は、その代謝の特徴に従って選択することができる。通常、トレオニンからα−ケトブチレートへの生物変換は、動物、高等植物及び単細胞生物を含めた、大部分の生物において一般的である。したがって、適切な菌株は、莫大な数の生物から選択することができる。野生型の場合、α−ケトブチレートを２−アセト−２−ヒドロキシ−ブチレートに変換する能力を有する、微生物又は細胞系を選択することが好ましい。言い換えれば、野生型として存在する場合、イソロイシン及び／又はバリン及びロイシンを合成することができる微生物。この要件は、高等植物及び多くの単細胞生物に当てはまる。バリン又はイソロイシン経路がいくらか悪影響を受ける場合、任意の種類のこれらの生物が、α−ケトブチレートを蓄積させるのに適している可能性がある。
【００５６】
例えば、欠陥、機能不全又は阻害型アセトヒドロキシ酸合成酵素（この酵素は酵素番号ＥＣ４．１．３．１８で与えられる）であって、前述のように野生型生物においてα−ケトブチレートを２−アセト−２−ヒドロキシ−ブチレートに変換することができる酵素のために、α−ケトブチレートを蓄積又は排出する菌株を選択する。この酵素は、アセト乳酸合成酵素とも呼ばれ、この後者の名称は、ピルビン酸塩をα−アセト乳酸塩に変換するその並行的能力によるものである。したがって、この酵素が阻害されるか、欠陥があるか、機能不全であるか、或いは単に発現されない、菌株を選択することができる。例えば、この酵素をコードする遺伝子、又はその発現と関係がある転写因子の突然変異によって、対応する酵素の正常な機能が防止される、天然の突然変異体を使用することができる。
【００５７】
当然ながら、他の突然変異体もα−ケトブチレートを蓄積させることができるであろう。特に、アミノ酸バリン、イソロイシン及びロイシンの生合成経路に影響を与える、１個又は複数個の突然変異を含む菌株が有用である可能性がある。例えば、欠陥型アセトヒドロキシ酸リダクトイソメラーゼ（ＥＣ１．１．１．８６）、ジヒドロキシ酸脱水素酵素（ＥＣ４．２．１．９）、又は分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素（ＥＣ２．６．１．４２）などを有する菌株を、α−ケトブチレートを蓄積させる能力に関して選択することができ、したがって、これらは本発明に適した菌株である可能性がある。しかしながら、他の突然変異体もα−ケトブチレートを蓄積させることができる。
【００５８】
例えば、好ましくはａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａの亜門から選択される、真菌菌株を使用する。しかしながら、特定の細菌も適切である可能性がある。例えば、酵母菌を使用することができる。しかしながら、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属から、特にＮ．ｃｒａｓｓａ種からの菌株も使用することができる。本発明の一実施形態では、前述のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋａｎｓａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒからのＮ．ｃｒａｓｓａ菌株を、使用することができる。この特異的な菌株は、Ｋｕｗａｎａ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ、「Ｎ．ｃｒａｓｓａ、Ｉ．のｉｌｖ−３突然変異体、遺伝的及び生化学的特性（Ｔｈｅ  ｉｌｖ−３  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｎ．ｃｒａｓｓａ、Ｉ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）」、ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６２：４７９〜４８５、１９６９中にＹ７１１０−菌株として既に記載された。
【００５９】
一般に、食品等級の微生物が好ましい。
【００６０】
α−ケトブチレートを得るためには、適切な培地を選択しなければならない。選択する菌株に応じて、前培養物も調製することができる。一般に、前培養又は主な発酵、及びあらゆる発酵のパラメーターに関する、最適培地の選択は、選択する菌株に非常に依存する。当業者は、特異的な菌株の最適な増殖又は培養条件を理解している。
【００６１】
例えば、Ｎ．ｃｒａｓｓａとして真菌を使用する場合、出発物質として胞子の懸濁液を得ることが適切である可能性があり、これによって、このプロセスの後期に同時の迅速なバイオマス生成が可能になるであろう。大部分の真菌菌株に関して、胞子形成を促進する、特定の発酵のパラメーター（温度、ｐＨ、光、栄養供給）が知られている。例えば、Ｎ．ｃｒａｓｓａ菌株では、いわゆるホロビッツ培地（寒天）を使用することができる「実験：Ｓｃｈｌａｕｃｈｐｉｌｚ  Ｎ．ｃｒａｓｓａによる胞子形成」、ドイツ語（Ｄｅｕｔｓｃｈ、“Ｄａｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ：Ｓｐｏｒｅｎｍｕｓｔｅｒｂｉｌｄｕｎｇ  ｂｅｉｍ  Ｓｃｈｌａｕｃｈｐｉｌｚ  Ｎ．ｃｒａｓｓａ”、Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  ｉｎ  ｕｎｓｅｒｅｒ  Ｚｅｉｔ、１９９３、２３（４）：２５９〜２６４を参照のこと）。Ｎ．ｃｒａｓｓａ菌株をエルレンマイヤー寒天上に筋状に並べ、２５℃において１２０時間、光の下で増殖させる。一般に、有性又は無性生殖によって生じる胞子の胞子形成を促進することが知られている、条件を選択する。充分なバイオマスが増加するや否や、滅菌水を寒天プレートに加えることができ、軽く振とうさせた場合これによって胞子が懸濁される。このようにして得られた胞子の懸濁液は、出発培養物として使用することができる。細菌又は細胞系を選択して本発明を実施する場合、特異的な細菌菌株又は細胞系の特殊性を考慮して、出発物質は異なる調製をしなければならない。
【００６２】
培地に接種するために出発培養物を使用することができ、これによって、胞子形成を低下させずに、或いは低下させて、栄養生殖、バイオマス生成及び／又はα−ケトブチレートの蓄積が促進される。Ｎ．ｃｒａｓｓａを選択して本発明を実施する場合、以前に記載されたように「実験：Ｓｃｈｌａｕｃｈｐｉｌｚ  Ｎ．ｃｒａｓｓａによる胞子形成」、ドイツ語（Ｄｅｕｔｓｃｈ、“Ｄａｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ：Ｓｐｏｒｅｎｍｕｓｔｅｒｂｉｌｄｕｎｇ  ｂｅｉｍ  Ｓｃｈｌａｕｃｈｐｉｌｚ  Ｎ．ｃｒａｓｓａ”、Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  ｉｎ  ｕｎｓｅｒｅｒ  Ｚｅｉｔ、１９９３、２３（４）：２５９〜２６４）、出発物質を液体培地、例えばフォーゲル−スクロース培地に加えることができる。研究室規模では、胞子をエルレンマイヤー寒天の液体培地に加えることができ、これを２５℃に置き、１００〜２００ｒｐｍで振とうさせる。
【００６３】
発酵の開始後、例えば接種後８〜４０時間、好ましくは接種後８〜３０時間で、トレオニンを培地に加えて、培地１リットル当たり、０．１〜５重量％トレオニン、好ましくは０．２〜４重量％、より好ましくは０．５〜３重量％トレオニンの濃度を得ることができる。
【００６４】
欠陥型アセト乳酸合成酵素を有する菌株を使用する場合、イソロイシン及びバリンも培地に加えることができる。なぜなら、この菌株は、これらのアミノ酸を合成することができないからである。当然ながら、イソロイシン／バリン経路に影響を与える任意の突然変異又は欠陥を有する任意の菌株に関して、同じことが当てはまる。しかしながら、負又は正のフィードバック調節機構のために、これらのアミノ酸は非常に正確な量で加えなければならない。特に、高レベルのイソロイシンは、トレオニン脱水素酵素（Ｎ．ｃｒａｓｓａ中のｉｌｖ−１遺伝子産物）の活性を阻害又は下方制御し、したがってα−ケトブチレートの蓄積を低下させる。興味深いことに、Ｎ．ｃｒａｓｓａのｉｌｖ−１遺伝子産物の活性化物質であるバリンを、充分な量加えることもできない。したがって、培地全体の０．００５〜１．５重量％の開始量で、バリンを培地に加える。０．０１〜１重量％、より好ましくは０．０１〜０．５重量％の量で、バリンを培地に加えることが好ましい。
【００６５】
しかしながら発酵の時間は、実施する発酵の型に依存する。
【００６６】
前に記載したＮ．ｃｒａｓｓａによって発酵された培地におけるαケトブチレートの蓄積は、発酵の最適時間後に、多量に達する可能性がある。発酵の開始後、２０〜２００時間、好ましくは４０〜１５０時間で、最大量を得ることができる。
【００６７】
前に示したα−ケトブチレートを得るためのバイオマスの培養は、通常は連続発酵プロセスと呼ばれる。例えば、発酵が開始された後には、いかなる物質も培地に加えることができない。同系では、トレオニン、又は栄養物を、ある時間の後、例えば培地の接種後１０〜４０時間後のみに、加えることができる。他の変更形態に従って、発酵の開始後、例えば８、１６、２４、４８及び７２時間後に、トレオニンを異なる間隔で加える。さらに、他の代謝産物又は栄養物を、このようなパターンに従って加えることができる。
【００６８】
前に記載した一過性の連続的又はバッチプロセスは、バイオマスの形成が、主要な代謝産物の蓄積と実質的に同時になされることを一般的に特徴とする。これに付随して、発酵中の通常のｐＨの低下以外に、極端なｐＨの変化が起こる可能性はない。
【００６９】
或いは、より精巧な連続２段階（或いはそれより多段階）のプロセスを、適用することができる。この種の発酵によって、見出されたように驚くべきことに、非常に高濃度のα−ケトブチレートが生じる。なぜなら、培地の組成が、特定の段階の特定の効果のために最適化されるからである。例えば、バイオマスを増加させることを目的とする第１の段階、及び次の段階、例えば実質的に生物変換が起こる、第２の段階を企図することができる。
【００７０】
２段階（或いはそれより多段階）の発酵プロセスは、驚くべきことに、α−ケトブチレートを蓄積させるのに非常に適していることが証明された。２つの手法を続けることができる。最初に、連続２段階発酵プロセスを、行うことができる。したがって、特定のｐＨにおいてバイオマスを生成させることができる。充分なバイオマスが増加するや否や（０．０１ｇ湿潤重量／ｍｌ、例えば）、ｐＨ（又は他の、菌株特異的なパラメーター）を変え、さらに場合によっては、元の培地を捨てずに他の培地成分を加える。
【００７１】
当然ながら、選択した使用する微生物に応じて、ｐＨ及び他のパラメーターが、極端に異なる可能性がある。特に、バイオマス形成及びα−ケトブチレート合成に関する最適ｐＨは、以下に与える値と異なる可能性がある。両方の段階、バイオマス形成及びα−ケトブチレート合成に関して、菌株が同一又は類似の最適ｐＨを有することも考えられる。
【００７２】
前に記載したようにＮ．ｃｒａｓｓａ菌株に関してα−ケトブチレートが生成される場合、バイオマスを蓄積させるための出発ｐＨは７未満、好ましくは４〜６、より好ましくは４．５〜６であってよい。このｐＨ及び２０〜３０℃の温度において、発酵を開始させ、１〜１０日間、好ましくは２〜５日間、例えば前に示したフォーゲル−スクロース培地を用いて、かきまぜ又は攪拌の下で行う。
【００７３】
充分なバイオマスが蓄積すると、ＮａＯＨを加えることによって、ｐＨを７〜１４、好ましくは９〜１１に変えることができ、したがって生物変換プロセスが開始される。さらに、トレオニン、バリン及び／又はイソロイシンを、この段階で加えることができる。
【００７４】
このプロセスに従って、Ｌ培地当たり２〜１０ｇのα−ケトブチレートを、前に同定したＮ．ｃｒａｓｓａ菌株によって生成することができる。さらに、このプロセスは単純で迅速である。なぜなら、本質的にｐＨの変化は、高いα−ケトブチレート合成を開始させるほど充分なものであるからである。
【００７５】
他方で、不連続２段階法も、本発明の文脈において考えられる。したがって、バイオマスが増加した後に、例えば濾過によって、それを培地から分離する。その後バイオマスを新しい培地に移し、それを調節してα−ケトブチレートの蓄積を促進させる。
【００７６】
真菌のＮ．ｃｒａｓｓａ菌株を使用してα−ケトブチレートを蓄積させる場合、その６４の蓄積を促進するための培地のｐＨは、７〜１４、好ましくは９〜１１のｐＨを有する。連続２段階法と同様に、このプロセスによって、多量のα−ケトブチレート（３〜１０ｇ／Ｌ）が生じる。培地の他の特異的な調節によって、さらに高濃度が得られることが考えられる。
【００７７】
例えば、バイオマスの形成は、連続２段階法用にも使用される、フォーゲル−スクロース培地において行うことができる。バイオマスの増加は、例えば１０℃〜４５℃、好ましくは２２℃〜３０℃において、１〜７日間、好ましくは１〜４２日間、わずかなかきまぜ又は攪拌の下で行うことができる。
【００７８】
生物変換用に、例えば濾過によって、バイオマスを生成するのに適した第１の培地から、バイオマスを分離することができ、例えば生物変換に適した緩衝液に移すことができる。このような緩衝液又は培地は、標的分子の蓄積を促進するｐＨ及びアミノ酸濃度によって一般的に特徴付けられる。当業者は、培地に加えられる因子、及びこの目的のために調節されるパラメーターを理解している。これらの因子は一般に、所望の生物変換に含まれる酵素が活性化されるように選択される。
【００７９】
例えば、前に定義したＮ．ｃｒａｓｓａ菌株を使用する場合、ｐＨ７〜１４、好ましくは９〜１１の、リン酸緩衝液（０．１Ｍ）又はグリシン緩衝液（０．１Ｍ）を使用することができる。緩衝液にトレオニン、例えば０．１〜１０％、好ましくは０．１〜５％、より好ましくは０．２〜４％、及びバリン、例えば０．００５〜１．５％、好ましくは０．０１〜０．５％を補って、トレオニンをα−ケトブチレートに変換することができる。生物変換のためのリン酸緩衝液における発酵は、１２時間〜３日間、好ましくは１８時間〜４８時間、１０℃〜４５℃、好ましくは２３℃〜３０℃の温度で行うことができる。
【００８０】
一般に、前述の連続１段階プロセスに関して記載したものと、同一の出発物質及び液体培地、並びに特定のアミノ酸の同一の追加的補充物を、使用することができる。
【００８１】
当然ながら、完全な微生物を用いた発酵を行う代わりに、このような酵素の抽出物、又は市販の酵素単離体を使用して、トレオニンからα−ケトブチレートへの生物変換を行うこともできる。例えば、本明細書で述べるＮ．ｃｒａｓｓａ菌株から、酵素を抽出することができる。最適ｐＨ、酵素活性化物質、及び圧力を含む培地を次いで調製して、α−ケトブチレートを蓄積させる。
【００８２】
α−ケトブチレートをさらに利用することに応じて、α−ケトブチレートは、例えば適切な樹脂を有するカラム上、或いはＨＰＬＣによって、培地から単離することができる。
【００８３】
しかしながら、α−ケトブチレートを中間物質として使用して、他の最終産物、例えばエモキシフロン（５−エチル−３−ヒドロキシ−４−メチル−２（５Ｈ）−フラノン）、又はソトロン（３−ヒドロキシ−４，５−ジメチル−２（５Ｈ）−フラノン）などの香味料を合成する場合、例えば、ある種の精製及び単離法で十分かもしれない。この２つの香味料は、一般に「最良級の芳香」であり、これらは非常に低い濃度で使用される。
【００８４】
例えば、培地からの真菌菌糸を濾過し、場合によっては培地をさらに精製することによって、及び条件を変えてラクトン化反応を促進させることによって、エモキシフロンを生成させることができる。
【００８５】
第１段階では、培地中のα−ケトブチレートの濃度を決定することが、適切である可能性がある。α−ケトブチレートの濃度が同じ培地にＫ２ＣＯ３を加えることによって、α−ケトブチレートのエノール互変異性体の形成が促進される。その後、ｐＨを８に調節することができ、リン酸緩衝液を加えることができる。次いで培地を、例えば１２０℃で４時間加熱する。場合によっては、沸騰石をこの段階で加えて、沸騰を防止することができる。この段階では、エモキシフオン（５−エチル−３−４−メチル−２（５Ｈ９−フラノン）が形成され、これは本来α−ケトブチレートの２分子からなり、その１つはエノール形である。その後、培地を１０℃未満に冷却することができ、１０％のＨＣｌを加える（α−ケトブチレート１部当たり１０％のＨＣｌを１０部）。その後、培地を再び１／２〜３時間加熱して、ケトンの加水分解を和らげることができる。環の形成は、４０〜９０℃で真空（１０〜１００ｍｂａｒ）を施すことによって最終的に行うことができ、これによって分子から水と（１／２）ＣＯ２が分かれ、エモキシフランが生じる。
【００８６】
エモキシフロン（ラクトン）は、例えばＨ２Ｏ系において３サイクルでメチルテトラブチルエーテルを使用し、硫酸ナトリウムを加えることによって、エーテル抽出により、培地から容易に単離することができる。
【００８７】
以下の実施例は例示のみによって与え、決して本出願の主題を制限するものとして解釈すべきではない。パーセンテージ及び部は、他に示さない限りは重量によるものである。
【実施例１】
【００８８】
Ｎ．ｃｒａｓｓａにおける、トレオニンの生物変換によるα−ケトブチレートの蓄積
物質及び方法
ｔｈｅ  Ｋａｎｓａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒからカタログ番号ＦＧＳＣ５７５で購入した、交配型Ａの、ｉｌｖ−３（−）遺伝子型を有するＮ．ｃｒａｓｓａ菌株の胞子を、出発物質を調製するためにエルレンマイヤーの寒天上に平板培養する。この目的のために使用する、「ホロビッツ」培地の組成は、以下の表１に与える。
【００８９】
【表１】
2005510245.tif 000003
【００９０】
この菌株を、２５℃において１２０時間、光の下で増殖させる。
【００９１】
その後、１０ｍｌの蒸留水をエルレンマイヤー寒天に加えて、胞子を懸濁させる。４ｍｌの懸濁液を採取し、以下の表２に与える、液体「フォーゲル−スクロース」培地を含む、エルレンマイヤー寒天に加える。この培地を、Ｌ−バリン及びＬ−イソロイシンを用いて、最初から富化させる。さらに、「フォーゲル−スクロース」培地は、改質型「フォーゲル−塩溶液」を含み、その成分は以下の表３に与える。発酵は、２５℃において１００ｒｐｍで１６８時間（７日間）行う。Ｌ−トレオニンを、発酵の開始後２４時間で加える（１０ｇ／ｌ）。
【００９２】
【表２】
2005510245.tif 000004
【００９３】
【表３】
2005510245.tif 000005
【００９４】
培地のサンプルを２４、４８、７２時間後に採取し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって分析する。
【００９５】
結果
培地中には、α−ケトブチレートが４００ｍｇ／ｌまで蓄積した（ＨＰＬＣ分析）。
【００９６】
結論として、天然の突然変異微生物の発酵によって、培地中でのα−ケトブチレートの蓄積を得ることができる。本発明における実施例では、天然のｉｌｖ−３突然変異ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎｅ菌（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）が、有効であることが証明された。
【実施例２】
【００９７】
２段階発酵プロセスにおける、α−ケトブチレートの増大した蓄積
物質及び方法
実施例１で述べたものと同じ菌株、培地及び装置を使用する。
【００９８】
最初の発酵では、実施例１のデータに従って、富化させたフォーゲル−塩溶液、Ｌ−バリン及びＬ−イソロイシンを含む培地（トレオニンは後で加える）を接種することによって、バイオマスを生成させる。発酵の最初は、ｐＨは５．８であり、わずかな振動（２００ｒｐｍ）の下で２６℃において、７２時間後に４．４に下降する。
【００９９】
次いで菌糸細胞を濾過し（０．２２μｍ）、それを異なる培地、即ちトレオニン（２％）及びバリン（０．０３％）をさらに含む、リン酸緩衝液（０．１Ｍ）に移す。ＮａＯＨ（１０Ｎ）を用いて、ｐＨを１０に調節する。
【０１００】
合計１１０時間後、２５℃及び２００ｒｐｍにおいて、培地を濾過してバイオマスを除去し、さらに分析するまで４℃において浸透液を保存することによって、生物変換を中断させる。
【０１０１】
結果
多量のα−ケトブチレート（＞８ｇ／ｌ）を、Ｎ．ｃｒａｓｓａを用いた２段階発酵を行った後に、培地中に得た。図１は、発酵プロセス全体の時間行程中の、α−ケトブチレートの蓄積を示す。トレオニンからα−ケトブチレートへの生物変換は、９０％に及んだ。
【０１０２】
結論として、天然の突然変異食品等級微生物を用いた、適切な培地の２段階発酵によって、トレオニンから変換された充分な量のα−ケトブチレートが生成して、工業生産が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】時間行程（時間）中の発酵培地の、α−ケトブチレート（ＯＢＡ＝オキソブチレート）の蓄積ｍｇ／Ｌを示す図である。２本の曲線は、２段階発酵プロセスであって、微生物のバイオマスを、第１の培地中での発酵の７２時間後に、ＯＢＡを蓄積させるのに適した第２の培地に移す上記プロセスを示す。２つのうちの低いほうが対照として働く（トレオニンは存在せず、培地に加えなかった）。
【図１】
2005510245.tif 000006
【国際調査報告】
2005510245.tif 000007
2005510245.tif 000008
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