(57)【要約】本発明は、特にウィルス感染症もしくは寄生虫感染症の治療、あるいは腫瘍の治療に使用するためのペプチドであって、サイズがアミノ酸３０未満、好ましくは２０未満、特に１５〜２０アミノ酸であり、in vitroでは、プロテインホスファターゼ２Ａ型ホロ酵素もしくはそのサブユニットと特異的に結合することを特徴とする、新規な合成ペプチドもしくは天然ペプチドに関するものである。本発明はまた、該ペプチドを同定する方法およびそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
in vitroで、プロテインホスファターゼ２Ａ型ホロ酵素またはそのサブユニットの一つと特異的に結合することを特徴とする、サイズが３０アミノ酸未満、好ましくは２０アミノ酸未満のペプチド。
【請求項２】
ウィルスタンパク質、寄生虫タンパク質もしくは細胞タンパク質のフラグメントであって、該タンパク質は、in vitroでプロテインホスファターゼ２Ａ型と結合するタンパク質であり、またはアミノ酸の置換もしくは欠失によって前記タンパク質フラグメントとは別異な配列でありながら、該別異な配列がプロテインホスファターゼ２Ａ型もしくはそのサブユニットの一つに結合する特性を保持する配列であることを特徴とする、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
該ウィルスタンパク質、寄生虫タンパク質または細胞タンパク質が、ＳＶ４０もしくはポリオーマのｔ抗原、ポリオーマのｍｉｄｄｌｅ  ｔ抗原、ＰＰ２ＡのＢ（Ｂ、Ｂ′、Ｂ″）型サブユニット、ＣＸＣＲ２（ケモカインレセプター）、ＣＫ２α、ＣａＭＩＶ、ｐ７０Ｓ６―キナーゼ、Ｐａｋ１／Ｐａｋ３、Ｔａｐ４２／ａｌｐｈａ  ４、ＰＴＰＡ、Ｓｅｔ／Ｉ１／Ｉ２−ＰＰ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ４、タウ、ＣＤ２８またはＶｐｒの各タンパク質から選択されることを特徴とする、請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
下記ペプチド配列：
ａ）ＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹ（SEQ ID No: 132）、または、
ｂ）アミノ酸の置換もしくは欠失によりａ）に記載の配列とは異なる配列でありながら、該配列がプロテインホスファターゼ２Ａ型もしくはそのサブユニットの一つに結合する特性を保持する配列
から選択されるＣＤ２８タンパク質のフラグメントであることを特徴とする、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
該ウィルスタンパク質、寄生虫タンパク質または細胞タンパク質が、ＨＩＶウィルスのＶｐｒタンパク質であることを特徴とする、請求項３記載のペプチド。
【請求項６】
該Ｖｐｒタンパク質が、ＨＩＶ―１またはＨＩＶ−２ウィルスに由来することを特徴とする、請求項５記載のペプチド。
【請求項７】
下記ペプチド配列：
ａ）ＲＲＲＲＲＲＲＳＲＧＲＲＲＲＴＹ（SEQ ID No: 140）、または、
ｂ）アミノ酸の置換もしくは欠失によってａ）に記載の配列とは異なる配列でありながら、該配列が、プロテインホスファターゼ２Ａ型もしくはそのサブユニットの一つに結合する特性を保持する配列
から選択されることを特徴とする、請求項６記載のペプチド。
【請求項８】
下記ペプチド配列：
ａ）ＶＥＡＬＩＲＩＬＱＱＬＬＦＩＨＦＲＩ（SEQ ID No: 1）、
ｂ）ＲＨＳＲＩＧＩＩＱＱＲＲＴＲＮＧ（SEQ ID No: 2）、または、
アミノ酸の置換もしくは欠失によってSEQ ID No:1もしくはSEQ ID No:2とは異なる配列でありながら、該異なる配列が、プロテインホスファターゼ２Ａ型もしくはそのサブユニットの一つに結合する特性を保持する配列
の一つに含まれることを特徴とする、請求項６記載のペプチド。
【請求項９】
配列ＲＨＳＲＩＧＶＴＲＱＲＲＡＲＮＧ（SEQ ID No: 139）
であることを特徴とする、請求項８記載のペプチド。
【請求項１０】
配列ＲＨＳＲＩＧ（SEQ ID No: 135）からなることを特徴とする、請求項８記載のペプチド。
【請求項１１】
その投与により、腫瘍細胞のアポトーシスが誘発されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１２】
ウィルスタンパク質、寄生虫タンパク質または細胞タンパク質が、ＣＫ２αタンパク質であることを特徴とする、請求項３記載のペプチド。
【請求項１３】
該ＣＫ２αタンパク質が、タイレリア・パルバ寄生虫に由来することを特徴とする、請求項１２記載のペプチド。
【請求項１４】
その投与により、寄生虫の発育が抑制されることを特徴とする、請求項１２または請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
下記配列：
ａ）ＲＫＩＧＲＧＫＦＳＥＶＦＥＧ（SEQ ID No: 3）、
ｂ）ＴＶＴＫＤＣＶＩＫＩＬＫＦＰＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩＬＱＮＬ（SEQ ID No: 4）、
ｃ）ＫＩＬＲＬＩＤＷＧＬＡＥＦＹＨＰ（SEQ ID No: 5）、もしくは、
ｄ）Ｐ．ファルシパラムもしくはリーシュマニア由来の、SEQ ID No: 3、SEQ ID No: 4もしくはSEQ ID No: 5の相同配列、または、
アミノ酸の置換もしくは欠失によって前記配列から由来した配列であって、該別異な配列が、プロテインホスファターゼ２Ａ型もしくはそのサブユニットの一つに結合する特性を保持し、特に、ＴＶＴＫＤＫＣＶＩＫＩＬＫＰＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩＬＱＮＬである配列
のひとつに含まれることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１６】
ペプチドＲＱＫＲＬＩ（SEQ ID No: 141）であることを特徴とする、請求項１５記載のペプチド。
【請求項１７】
由来元である天然タンパク質と、ＰＰ２Ａホロ酵素またはそのサブユニットの一つとの相互作用を競合的に阻害することを特徴する、請求項１〜１６のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１８】
真核細胞に該ペプチドを移行させすることのできるベクターに結合することを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか一項記載のペプチドの反復により構成されていることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２０】
下記配列：
ａ）（ＲＨＳＲＩＧ）2（SEQ ID No: 136）、
ｂ）（ＲＨＳＲＩＧ）3（SEQ ID No: 137）、または、
ｃ）（ＲＱＫＲＬＩ）3（SEQ ID No: 134）
から選択されることを特徴とする、請求項１９記載のポリペプチド。
【請求項２１】
配列が、請求項１〜２０のいずれか一項記載のペプチドをコードする配列からなることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列SEQ ID No: 26、配列SEQ ID No: 27、配列SEQ ID No: 28、配列SEQ IDNo:29、または配列SEQ ID No: 30からその配列が選択されることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２１または請求項２２に記載のポリヌクレオチドの多量体からなることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか一項記載のポリヌクレオチドと、請求項１〜２０のいずれか一項記載のペプチドの宿主細胞内における発現を可能にする調節配列を含むことを特徴とする、細胞発現ベクター。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか一項記載のペプチドのいずれか一つに特異的に結合できることを特徴とする、精製されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体。
【請求項２６】
請求項１〜２０のいずれか一項記載のペプチドを、薬学的に許容可能なビヒクルと共に含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２７】
請求項２１〜２３のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項２４に記載の発現ベクター、または請求項２５に記載の抗体から選択される成分を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
以下の配列：
・SEQ ID No: 137、
・SEQ ID No: 139、
・SEQ ID No: 140
から選択されていることを特徴とする、ペプチド。
【請求項２９】
配列SEQ ID No: 20を有することを特徴とする、ペプチド。
【請求項３０】
ウィルスまたは寄生虫感染症の治療用薬剤の調製における、請求項１〜２０、２８または２９のいずれか一項に定義されるペプチドまたはポリペプチドの使用。
【請求項３１】
ＨＩＶによる感染を防止することができる薬剤の調製における、請求項５〜１０、２８または２９のいずれか一項に定義されるペプチドもしくはポリペプチドの使用。
【請求項３２】
標的細胞、特に、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することができる薬剤の調製における、請求項５〜２０または請求項２８のいずれか一項に定義されるペプチドの使用。
【請求項３３】
寄生虫による感染を防止することができる薬剤の調製における、請求項１２〜１６のいずれか一項に定義されるペプチドの使用。
【請求項３４】
マラリアの治療に使用することを目的とした薬剤の調製における、請求項１２〜１６のいずれか一項に定義されるペプチドの使用。
【請求項３５】
寄生虫性疾患またはウィルス性疾患のin vitroでの診断における、請求項２１〜２３のいずれか一項記載のポリヌクレオチドまたは請求項２５記載の抗体の使用。
【請求項３６】
配列が、ウィルスタンパク質、寄生虫タンパク質、または細胞タンパク質に由来し、プロテインホスファターゼ２Ａ型ホロ酵素またはそのサブユニットの一つに特異的に結合するペプチドを同定するための方法であって、
ａ）その配列がウィルスタンパク質、寄生虫タンパク質、または細胞タンパク質に由来するペプチドを、スポットの形態で、支持体上にデポジットさせる工程であって、各スポットが、所定の配列を有するペプチドのデポジットに対応している工程、
ｂ）支持体上に存在するペプチドが、プロテインホスファターゼ２Ａホロ酵素またはそのサブユニットの一つと結合するのを可能にする条件の下で、該ホロ酵素またはそのサブユニットの一つを含有する溶液と固体支持体を接触させる工程、および、
ｃ）プロテインホスファターゼ２Ａまたはそのサブユニットの一つが結合しているペプチドを、固体支持体上で同定する工程
を含む方法。
【請求項３７】
スポットの形態でデポジットさせたペプチドのサイズが、２０アミノ酸未満、好ましくは１５アミノ酸未満であることを特徴とする、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ペプチドが、セルロース膜上にデポジットされていることを特徴とする、請求項３６または請求項３９のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
一連のデポジットされたペプチド配列が、それら配列が由来するウィルスタンパク質、寄生虫タンパク質、または細胞タンパク質の完全配列を包含することを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
請求項２４に定義される細胞発現ベクターを使用して宿主細胞を形質転換する工程、その後に、形質転換された宿主細胞を培養し、培地中のペプチドを回収する工程を含む、請求項１〜２０、２８または２９のいずれか一項に定義されるペプチドを調製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にウィルス感染症もしくは寄生虫感染症の治療、あるいは腫瘍の治療に使用するためのペプチドであって、サイズがアミノ酸３０未満、好ましくは２０未満、特に１５〜２０アミノ酸であり、in vitroでは、プロテインホスファターゼ２Ａ型ホロ酵素もしくはそのサブユニットと特異的に結合することを特徴とする、新規な合成ペプチドもしくは天然ペプチドに関するものである。本発明はまた、該ペプチドを同定する方法およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞プロテインホスファターゼ２Ａの活性を調節する際の、本発明によるペプチドの役割に関しては、まず、プロテインホスファターゼ２Ａおよびそれらの生理学的役割と、特定の細胞タンパク質、ウィルスタンパク質もしくは寄生虫タンパク質とそれらのとの相互作用に関する最近の知見に触れることが重要である。
【０００３】
細胞生理機能は、タンパク質のリン酸化反応を調節することによって一部制御される。細胞タンパク質のリン酸化状態は、それらタンパク質をリン酸化するプロテインキナーゼとそれらを脱リン酸化するプロテインホスファターゼの拮抗作用に依存する。
【０００４】
プロテインホスファターゼは、２種類の主なグループ、チロシンホスファターゼおよびセリン／スレオニンホスファターゼに分類される。セリン／スレオニンホスファターゼは、それらの基質の特異性および、特定の阻害剤すなわち１型ホスファターゼ（ＰＰ１）および２型ホスファターゼ（ＰＰ２）に対するそれらの感受性に従って決定される、２種類のカテゴリに分類される。２型ホスファターゼ自体は、ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）、ホスファターゼ２Ｂもしくは、その活性がカルシウムによって調節されるカルシニューリンおよびその活性がマグネシウムによって調節されるホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２Ｃ）など、各種クラスに分類される。
【０００５】
２Ａ型ホスファターゼは、進化段階で極めて良く保存されており、現在、数多くの生物学的プロセスの調節に潜在的に関与していることが明らかになっている。ＰＰ２Ａ型酵素が、転写の調節、細胞サイクルの制御もしくはウィルスの形質転換に関与していることは明らかである。さらに、ＰＰ２Ａは、各種ウィルスタンパク質もしくは寄生虫タンパク質の標的となるので、宿主−病原菌間における相互作用におけるＰＰ２Ａの役割が示唆されている。
【０００６】
ＰＰ２Ａは、それぞれ、触媒サブユニット（Ｃ）および、一つもしくはふたつの調節サブユニット（Ａ）および（Ｂ）を有するオリゴマー複合体（ホロ酵素）である。サブユニット（Ａ）の構造は、その一部がサブユニット（Ｂ）および（Ｃ）と相互作用する、３８〜４０のアミノ酸からなる保存されたアミノ酸配列の１５の不完全な反復で構成されている。進化において保存されたサブユニット（Ａ）およびサブユニット（Ｃ）は、酵素の基本構造を構成しており、恒常的に発現する。これに対して、サブユニット（Ｂ）は、共通の構造を有しない調節タンパク質ファミリを構成し、差次的に発現する（Cohen P. The structure and regulation of protein phosphatases. Annu Rev Biochem 1989;58:453-508）。プロテインホスファターゼ２Ａは、in vivoでは、二量体形式（ＡＣ）と三量体形式（ＡＢＣ）の２種類の形態で、２つのクラスが存在している。サブユニット（Ｂ）は、ホスファターゼの活性と基質に対するその特異性を調節する。複数の形態のＰＰ２Ａが存在することは、in vivoにおけるＰＰ２Ａの別個の多様な機能と関連付けられる。
【０００７】
近年、病原菌を用いて合成された各種タンパク質、特に、ウィルスタンパク質と寄生虫タンパク質が、プロテインホスファターゼ２Ａの特定の特異的活性を調節することが示唆されている。
【０００８】
宿主細胞におけるウィルスの複製と生存を容易にするために、ＰＰ２Ａに関与する様々な戦略がウィルスによって取られている。一例として、パラインフルエンザ（parainfluenza）ウィルスは、ＰＰ２Ａによって制御される、細胞由来のタンパク質であるＰＫＣζタンパク質を、ウィルス粒子内に取り込む。これにより、宿主細胞のリン酸化を撹乱させ、それ自身の複製を促進させることができる（De BP, Gupta S, Barnejee AK. Cellular protein kinase Cζ regulates human parainfluenza virus type 3 replication. Proc. Natl Aced Sci USA 1995;92:5204-8）。
【０００９】
ｐａｐｏｖａｅまたはアデノウィルスなどといった形質転換能を有するいくつかのＤＮＡウィルスや、１型ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）などといったある種のレトロウィルスは、特定の宿主ＰＰ２Ａと直接相互作用するタンパク質をコードする。これらウィルスのすべてが、構造的には異なっているにもかかわらず、特定のホロ酵素と相互作用し、ホスファターゼの活性を修飾するタンパク質を有している。
【００１０】
特に、アデノウィルスのＥ４ｏｒｆ４タンパク質は、ヘテロ三量体ＰＰ２Ａ、さらに詳しくは、調節サブユニット（Ｂ）に結合し、感染した細胞におけるＪｕｎＢの転写を抑制する。この作用は、感染した細胞のアポトーシス性反応を調節することによって、ウィルスに感染している間、重要な役割を果たすと考えられる。興味深いことに、ＰＰ２ＡとＥ４ｏｒｆ４との相互作用により、ｐ５３に依存することなく、形質転換された細胞でアポトーシスが誘発されるということが実証されている（Shtrichman R et al, Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J Virol 1998;72:2975-82）。
【００１１】
ＳＶ４０およびポリオーマウィルスをはじめとする、Papovae科の腫瘍発現ウィルスは、細胞の形質転換を誘発する。ＰＰ２Ａが、ＳＶ４０もしくはポリオーマの「small T」抗原および、ポリオーマのトランスフォーミング「middle T」タンパク質と相互作用することが実証されている。ウィルスタンパク質とＰＰ２Ａとのこのようの相互作用が、ウィルスによる形質転換に関与していることは明らかである。最後に、転写の調節、すなわち配列を調節するプロモータに特異的に結合する各種因子によって、細胞内で一般に行われているプロセスは、おそらく、ＰＰ２Ａによるウィルス発現の制御に関与する最も重要なメカニズムであると考えられる。ＰＰ２Ａは、ＡＰ１／ＳＲＥ、ＮＦ−κＢ、Ｓｐ１およびＣＲＥＢなど、特に細胞の成長と増殖プロセスに関与する多数の転写因子に対する負のレギュレーターであることが実証されている（Waszinski, B E, Wheat W H, Jaspers S, Peruski L F, J R Lickteig R L, Johnson G L, and Klemm D J,Nuclear protein phosphatase 2A dephosphorylates protein kinase A-phosphorylated CREB and regulates CREB transcriptional stimulation. Mol Cell Biol 1993 13, 2822-34）。これら転写因子のウィルスによる調節は、ウィルスの転写の調節を可能にする。
【００１２】
ＨＩＶ−１のウィルスタンパク質すなわちＶｐｒは、ＰＰ２Ａとin votroで相互作用し、ＰＰ２Ａの触媒活性を刺激する（Tung L et al, Direct activation of protein phosphatase 2A0 by HIV-1 encoded protein complex Ncp7:vpr.FEBS Lett 1997;401:197-201）。Ｖｐｒは、ｐ３４ｃｄｃ２−サイクリンＢ複合体の活性を阻害することによって、感染細胞のＧ２の休止期を誘発することができる。さらに、Ｖｐｒは、転写因子Ｓｐ１と相互作用し、Ｓｐ１依存性ＨＩＶ−１の転写における弱いトランス活性化因子として働く。したがって、ウィルス粒子に取り込まれたＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質は、Ｔａｔ転写因子（ＨＩＶ−１ウィルスによってコードされる転写の主要なレギュレーター）の発現の調節に明らかに不可欠と考えられるプロセスである、ウィルスの転写の開始にin vivoで関与しているはずである。
【００１３】
寄生虫感染におけるプロテインキナーゼの役割は確証されているが、それとは異なり、セリン／スレオニンホスファターゼについては寄生虫学の分野で重要な潜在的レギュレーターとして過去３年間で認識され始めたばかりである。
【００１４】
当初、２種類のセリン／スレオニンホスファターゼ、すなわちＰｐβとＰｆＰＰがプラスモディウム・ファルシパラムで同定された。寄生虫における１型および２Ａ型ホスファターゼの活性が、酵素学的研究によって実証された。最後に、寄生虫酵素のＰＰ２ＡとＰＰ２Ｂを精製した。
【００１５】
最近、ウシの寄生虫であるＰ．ファルシパラムによく似ているが、別の原虫であるタイレリア・パルバにおけるセリン／スレオニンホスファターゼの調査研究が行われた。この寄生虫が感染した単球宿主細胞と白血球宿主細胞は形質転換され、動物の体内で白血病が発症した。タイレリアに感染した細胞の精製した寄生虫は、プロテインキナーゼＣＫ２αを発現した。サブユニット  ＣＫ２αは、ＰＰ２Ａと相互作用し、その活性を促進的に調節している（Heriche H, et al, Regulation of protein phosphatase 2A by direct interaction with casein kinase 2α. Science 1997;276:952-5）。さらに、ＣＫ２αサブユニットの発現を介したＰＰ２Ａの調節は、寄生虫が感染した細胞内におけるふたつのシグナル伝送経路、すなわち、一つはＭＡＰキナーゼの経路（Chaussepied M et al. Theileria transformation of bovine leukocytes: a parasite model for the study of lymphoproliferation. Res Immunol 1996;147:127-38）、もう一つはプロテインキナーゼＢの経路（Ａｋｔ）（M Baumgartner, M Chaussepied, M F Moreau, A Garcia, G Langslay. Constitutive P13-K activity is essential for proliferation, but not survival, of Theileria parva-transformed B cells. Cellular Microbiol(2000) 2,329-339）を遮断する基盤を与え得る。
【００１６】
ＰＰ２Ａと相互作用する一連のタンパク質には共通のモチーフが欠落しているため、ＰＰ２Ａとそれらタンパク質との結合に直接関与するペプチドモチーフの情報による同定が阻まれれる。
【００１７】
上記のように、ウィルス‐宿主間における相互作用もしくは寄生虫‐宿主間における相互作用でのプロテインホスファターゼ２Ａの主要な役割を考えると、ＰＰ２Ａホロ酵素またはそれらのサブユニットのどれか一つとウィルスタンパク質もしくは寄生虫タンパク質との結合部位を同定し、これらウィルス病原菌もしくは寄生虫病原菌の新規な治療の目標を同定することが重要であると認識することができる。
【００１８】
特に、ＰＰ２Ａと相互作用するペプチドの同定により、ＰＰ２Ａとの相互作用を介して、ウィルスタンパク質もしくは寄生虫タンパク質によって誘発される細胞内メカニズム、特に、感染、病原菌の増殖ならびに細胞の形質転換などのメカニズムを競合的阻害によって遮断することができる、新規な医薬を開発することが可能となる。
【００１９】
本発明は、ＰＰ２Ａホロ酵素もしくはそのサブユニットの一つに結合する、サイズの小さいペプチドを同定するための手段に関するものである。天然タンパク質またはサイズの大きいポリペプチドドメインとは対照的に、サイズの小さいペプチドは、高い収率および低コストで、化学的にもしくは細胞系において容易に合成されるという利点を有している。
【００２０】
本発明のペプチドは、安定性にも非常に優れ、治療で使用することを考慮し、適切なベクターを使用して細胞の細胞膜や核に容易に移行させることができる。
【００２１】
本発明は、サイズがアミノ酸３０未満、特に、サイズがアミノ酸２０未満であり、ＰＰ２Ａホロ酵素もしくはそのサブユニットの一つと相互作用するペプチドを同定することが可能であるということが実証されたことから生まれたものである。
【００２２】
特に、発明者らは、FrankおよびOverwingに記載の「ＳＰＯＴ合成」技術の使用により（Method in Molecular Biology, 1996, vol 66:149-169, Epitope Mapping Protocols edited by: G E Morris Humana Press Inc, Totowa NJ）、ＰＰ２Ａホロ酵素もしくはそのサブユニットの一つと相互作用するタンパクの結合部位を同定できることを実証した。
【００２３】
一例として、発明者らは、精製したＰＰ２Ａホロ酵素もしくはそのサブユニットの一つとin vitroで相互作用する、サイズがアミノ酸２０未満のペプチドであって、ＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質もしくはＴ．パルバ寄生虫のＣＫ２αタンパク質由来のペプチドを同定した。これらペプチドに由来し、特定のＰＰ２Ａホロ酵素とウィルスタンパク質または寄生虫タンパク質との相互作用を阻害するという理由で選択される拮抗薬は、新規な抗腫瘍剤、抗ウィルス剤、もしくは抗寄生虫剤となりうる。
【００２４】
本発明は、配列が、ウィルスタンパク質、寄生虫タンパク質または細胞タンパク質に由来し、プロテインホスファターゼ２Ａ型ホロ酵素またはそのサブユニットの一つに特異的に結合するペプチドを同定するための方法であって、
ａ）その配列がウィルスタンパク質、寄生虫タンパク質、または細胞タンパク質に由来するペプチドを、スポットの形態で、支持体上にデポジットさせる工程であって、各スポットが、所定の配列を有するペプチドのデポジットに対応している工程、
ｂ）支持体上に存在するペプチドが、プロテインホスファターゼ２Ａホロ酵素またはそのサブユニットの一つと結合するのを可能にする条件の下で、該ホロ酵素またはそのサブユニットの一つを含有する溶液と固体支持体を接触させる工程、および、
ｃ）タンパクホスファターゼ２Ａまたはそのサブユニットの一つが結合するペプチドを、固体支持体上で同定する工程
を含む方法に関する。
【００２５】
工程ａ）では、各種ペプチドを、固体支持体上の、それぞれ特定のペプチド配列に対応する定められた位置（「スポット」）にデポジットさせ、一連のペプチドが二次元ペプチドアレイを形成するようにする。近年、このようなアレイを調製するための各種方法が報告されている（詳細については、Figeys and Pinto, Electrophoresis 22:208-216;Walter et al, 2000, Curr Opin Microbiol 3:298-302を参照されたい）。これら一連の方法では、一般に、支持体上へのペプチドの共有結合による固着、特に化学的リンカーを使用した共有結合固着が行われている。一例として、当業者であれば、「ＳＰＯＴ合成」技術を上げることができる（Frank and Overwing, Methods in Molecular Biology, 1996, vol 66:149-169, Epitope Mapping Protocols, edited by:G E Morris, Humana Press Inc, Totowa NJ）。
【００２６】
概して、デポジットしたペプチドと特定の化合物との間の特異的相互作用を検出するのに使用可能な、固体支持体上にデポジットしたペプチドアレイを産生できる方法であれば、どのような方法でも使用することができる。
【００２７】
特に好ましくは、一連のデポジットされたペプチド配列が、それらの配列の由来元であるウィルスタンパク質、寄生虫タンパク質もしくは細胞タンパク質の全配列を対象としていることが望まれる。そうすれば、この方法により、一般に配列同士が重複している有限数のペプチドに「区分化」された、所与のタンパク質の全配列を一回の工程で検査することができる。
【００２８】
好ましい態様では、スポットの形態でデポジットされたペプチドのサイズが、アミノ酸２０未満、特に、サイズがアミノ酸１５未満であることが好ましい。
【００２９】
さらに別の特定の態様では、ペプチドがセルロース膜上にデポジットされている。
【００３０】
得られたアレイは、工程ｂ）で、プロテインホスファターゼ２Ａホロ酵素もしくはそのサブユニットの一つと接触させる。
「タンパクホスファターゼ２Ａ型ホロ酵素」という用語は、細胞より精製された二量体（ＡＣ）またはヘテロ三量体（ＡＢＣ）複合体、もしくはプロテインホスファターゼ２Ａ型の二つのサブユニット（Ａ）と（Ｃ）、さらに必要に応じてサブユニット（Ｂ）を精製した後で再構成した抽出物を意味する。プロテインホスファターゼ２Ａ型は、哺乳動物由来であることが好ましい。
【００３１】
支持体は、例えば精製したプロテインホスファターゼまたはその精製したサブユニットの一つを含有する緩衝液内で培養する。好適な緩衝溶液は、５％のスキムミルクと３％のＢＳＡを含有するＴＢＳ（ＴＲＩＳ  ＢＯＲＡＴＥ）である。
【００３２】
プロテインホスファターゼ２Ａ型ホロ酵素が結合するペプチドは、一般に、プロテインホスファターゼに対する直接的ラベリングもしくは間接的ラベリングならびに、ラベルされたタンパクが結合しているスポットの特定によって同定される。ペプチドスポットの一つに対する、ＰＰ２Ａまたはそのサブユニットの一つの結合は、特にＰＰ２Ａのサブユニット（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に対する抗体あるいはＰＰ２Ａのサブユニット（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に対する抗体の混合物を、ペプチドアレイを有する支持体と培養した後で、ウエスタンブロット法もしくは固相ＥＬＩＳＡ検定に従来使用されている技術を使用すると、特に抗血清を用いて解明することができる。
【００３３】
本発明の方法は、特に、プロテインホスファターゼ２Ａ型ホロ酵素またはそのサブユニットの一つとin vitroで結合できる、サイズがアミノ酸３０未満またはアミノ酸２０未満のペプチドであって、特に特定のウィルス感染症または寄生虫感染症の治療に使用されるペプチドの同定に応用できる。
【００３４】
さらに、ペプチド合成分野における一般的知識を用いることにより、当業者は、上記有利な特性を有する、本発明の方法によって同定されるペプチドのフラグメントに由来するペプチドを産生することができる。
【００３５】
このように、本発明は、サイズがアミノ酸３０未満、好ましくはアミノ酸２０未満の天然ペプチドまたは合成ペプチドであって、in vitroで、プロテインホスファターゼ２Ａ型ホロ酵素またはそのサブユニット（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）の一つと特異的に結合することを特徴とする、天然ペプチドまたは合成ペプチドを提供する。「特異的に結合する」という用語は、ペプチドがウィルス由来もしくは寄生虫由来のタンパク質が、ＰＰ２Ａと結合するのを競合的に阻害することができることを意味する。
【００３６】
本発明の好ましい態様では、本発明のペプチドは、ウィルスタンパク質、寄生虫タンパク質もしくは細胞タンパク質のフラグメントであって、該タンパク質は、in vitroでプロテインホスファターゼ２Ａ型と結合するタンパク質であり、またはアミノ酸の置換もしくは欠失によって前記タンパク質フラグメントとは別異な配列でありながら、該別異な配列がプロテインホスファターゼ２Ａ型もしくはそのサブユニットの一つに結合する特性を保持する配列であるペプチドであることを特徴としている。初期配列に比べ、別異な配列から置換もしくは欠失されたアミノ酸の数は、初期配列を構成するアミノ酸の数の２０％以下、さらに好ましくは、１０％以下であることが好ましい。さらに、この欠失により、ＰＰ２Ａに対するペプチドのin vitroでの結合特性に影響がないアミノ酸のみが置換もしくは欠失されることが好ましい。
【００３７】
特に、一つの別異な配列は、それが由来する元の配列に比べ、プロテインホスファターゼ２Ａ型もしくはそのサブユニットの一つに対する結合親和性が向上したペプチド配列である。さらに、上記の別異な配列は、最初に同定されたペプチド配列と相同なペプチド配列である。本発明で使用されている「相同なペプチド」という用語は、最初に同定されたペプチド配列以外の種のタンパク質に由来し、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, GCG）などといった従来の最適アライメントプログラムを用いて最初に同定されたペプチド配列と、初期配列との配列比較が可能であるような配列を意味している。特に、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどの最適アライメントプログラムを用いて配列を比較した結果、配列Ａと配列Ｂが少なくとも５０％、好ましくは７５％の相同性を有している場合には、該配列Ａは、該配列Ｂと相同であるとみなされる。さらに、二つの配列は、配列全体の１０％〜２０％の可変性を示すいくつかの残基を除き、それら配列がほぼ同じである場合にも、相同であるとみなされる。
【００３８】
さらに、同じ化学的機能を有するアミノ酸（ＡｒｇおよびＬｙｓなど）は等価であるとみなされる。ＰＰ２Ａもしくはそのサブユニットの一つとの結合が分析されるペプチドは、概して、プロテインホスファターゼ２Ａ型とin vivoもしくはin vitroで相互作用することが実証されている、ウィルスタンパク質、寄生虫タンパク質もしくは細胞タンパク質のフラグメントから選択される。
【００３９】
特に、このようなウィルスタンパク質、寄生虫タンパク質または細胞タンパク質は、下記のタンパクの一つから選択されている。すなわち、ＳＶ４０またはポリオーマのｔ抗原、ポリオーマのｍｉｄｄｌｅ  ｔ抗原、ＰＰ２ＡのＢ型（Ｂ、Ｂ′、Ｂ″）サブユニット、ＣＫ２α、ＣａＭＩＶ、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｐａｋ１／Ｐａｋ３、Ｔａｐ４２／ａｌｐｈａ  ４、ＰＴＰＡ、Ｓｅｔ／Ｉ１／Ｉ２−ＰＰ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ４、タウ、ＶｐｒまたはＣＤ２８、ＣＣＸＲ２（ケモカインレセプター）の一つから選択される。
【００４０】
本発明の好ましいペプチドは、ＣＤ２８タンパク質のフラグメントであって、特にそれぞれＦＤ２およびＦＤ３と称するペプチドに対応する配列ＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹ（SEQ ID No: 132）および（ＰＲＲＰＧＰＴＲＫ）2（SEQ ID No: 133）によって構成されるペプチドで、その細胞間透過能および細胞生存度に対する影響については、以下の実施例の項に記載されている。本発明はまた、アミノ酸の置換もしくは欠失によって、前記のタンパク質とは別異なペプチド配列であるにもかかわらず、プロテインホスファターゼ２Ａ型もしくはそのサブユニットの一つに結合する特性を保持する配列に関する。
【００４１】
本発明の一つの好ましいペプチドは、ＨＩＶウィルスのＶｐｒタンパク質のフラグメントであって、特にＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２ウィルスのＶｐｒタンパク質のフラグメントあるいはアミノ酸の置換もしくは除去によって、前記のタンパク質フラグメントとは別異な配列でありながら、プロテインホスファターゼ２Ａ型もしくはそのサブユニットの一つに結合する特性を保持する配列である。本発明には、ＥＭＢＬデータベース内でアクセス番号Ｐ８９８２１で開示されている、配列ＬＦＩＨＦＲＩＧＣＱＨＳＲＩＧＩＴＲＲＲＲＶＲＤＧＳＳＲＰ＊を有するＶｐｒタンパク質のフラグメントであるペプチドは含まれない。しかし、以下に述べる状況で、該ペプチドを使用することは、本発明の範囲内である。
【００４２】
ここで引用するプロテインホスファターゼ２Ａ型と相互作用するプロタミン由来の、ペプチドの特別な例は、配列ＲＲＲＲＲＲＲＳＲＧＲＲＲＲＴＹ（SEQ ID No: 140，ＦＤ８と称する）あるいはアミノ酸の置換もしくは欠失によりSEQ ID No: 140とは別異な配列でありながらプロテインホスファターゼ２Ａ型またはそのサブユニットの一つに結合する特性を保持する配列を有するペプチドである。
【００４３】
さらに好ましくは、本発明のペプチドは、以下の配列の一つに含まれることを特徴とする。
ａ）ＶＥＡＬＩＲＩＬＱＱＬＬＦＩＨＦＲＩ（SEQ ID No: 1）もしくは、
ｂ）ＲＨＳＲＩＧＩＩＱＱＲＲＴＲＮＧ（SEQ ID No: 2）もしくは、
ｃ）アミノ酸の置換もしくは欠失によってSEQ ID No: 1またはSEQ ID No: 2とは別異な配列でありながらプロテインホスファターゼ２Ａ型またはそのサブユニットの一つに結合する特性を保持する配列。
【００４４】
本発明の特に好ましいペプチドは、ＦＤ９と称する配列ＲＨＳＲＩＧ（SEQ ID No: 135）を有するペプチドからなる、またはこのペプチドを有するフラグメントであるが、その細胞間透過能および細胞生存度に対する影響については、以下の実施例の項に記載がある。
【００４５】
本発明は、上記の本発明のペプチドを含むポリペプチドフレームワークを有する化合物であって、１０〜１５０  Ｋダルトンの範囲内の分子量を持ち、プロテインホスファターゼ２Ａと結合する能力を有している化合物にも関するものである。
【００４６】
本発明は、本発明のペプチドの反復によって構成されていることを特徴とするポリペプチドにも関するものである。
【００４７】
このようなポリペプチドの特定の例として、ペプチドＲＨＳＲＩＧポリマーであって、特に、それぞれＦＤ１０およびＦＤ１１と称する二量体（ＲＨＳＲＩＧ）2（SEQ ID No: 136）または三量体（ＲＨＳＲＩＧ）3（SEQ ID No: 137）が上げられるが、それらの細胞間透過能および細胞依存度に対する影響については、以下の実施例の項に記載がある。
【００４８】
アミノ酸の置換もしくは欠失によってSEQ ID No: 1またはSEQ ID No: 2とは別異な配列を有し、本発明の範囲に含まれるペプチドについてここに引用するが、そのペプチドの配列は、SEC ID No:1もしくはSEC ID No:2の変異体における相同配列に対応する、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶの各型の各種変異体のＶｐｒタンパク質の配列のいずれか一つに含まれている。
【００４９】
ＰＰ２ＡのサブユニットＡに結合すると特定されるドデカペプチドに対応するＶＥＡＬＩＲＩＬＱＱＬＬ（SEQ ID No: 6）、ＡＬＩＲＩＬＱＱＬＬＦＩ（SEQ ID No: 7）、ＩＲＩＬＱＱＬＬＦＩＨＦ（SEQ ID No: 8）、ＩＬＱＱＬＬＦＩＨＦＲ（SEQ ID No: 9）、ＲＨＳＲＩＧＩＩＱＱＲＲ（SEQ ID No: 10）、ＳＲＩＧＩＩＱＱＲＲＴＲ（SEQ ID No: 11）およびＩＧＩＩＱＱＲＲＴＲＮＧ（SEQ ID No: 12）の各配列を引用することができる。
【００５０】
アミノ酸の欠失もしくは置換によってSEQ ID No: 2とは別異な本発明の特定の配列は、配列ＲＨＳＲＩＧＶＴＲＱＲＲＡＲＮＧ（SEQ ID No: 139）であり、下記実施例においてＦＤ１３とも称せられる。
【００５１】
本発明の好ましいペプチドは、配列SEQ ID No: 1およびSEQ ID No: 2から選択されたペプチドであって、その投与により腫瘍細胞のアポトーシスが誘発されることを特徴とするペプチドである。
【００５２】
腫瘍細胞のアポトーシスを誘発可能なペプチドを選択する一つの方法は、例えば、実施例の項に記載のＭＴＴ生存度試験を用いて実施することができる。
【００５３】
本発明の別の好ましい態様では、ＣＫ２αタンパク質のフラグメントに由来することを特徴としたペプチドが提供される。特に、天然ペプチドもしくは合成ペプチドは、タイレリア・パルバ寄生虫のＣＫ２αタンパク質のフラグメントに由来していることを特徴とする。
【００５４】
さらに、本発明のペプチドは、下記の配列の一つに含まれていることを特徴とすることが好ましい。
ａ）ＲＫＩＧＲＧＫＦＳＥＶＦＥＧ（SEQ ID No: 3）、
ｂ）ＴＶＴＫＤＣＶＩＫＩＬＫＰＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩＬＱＮＬ（SEQ ID No: 4）、
ｃ）ＫＩＬＲＬＩＤＷＧＬＡＥＦＹＨＰ（SEQ ID No: 5）、
ｄ）Ｐ．ファルシパラムもしくはリーシュマニアに由来するSEQ ID No: 3、SEQ ID No: 4またはSEQ ID No: 5の相同配列、もしくは、
ｅ）アミノ酸の置換もしくは欠失によって上記配列から由来した配列であり、プロテインホスファターゼ２Ａまたはそのサブユニットの一つに結合する特性を保持する別異な配列であって、特に配列ＴＶＴＫＤＫＣＶＩＫＩＬＫＰＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩＬＱＮＬ（SEQ ID No: 142）。
【００５５】
配列SEQ ID No: 3、SEQ ID No: 4もしくはSEQ ID No: 5とは別異なペプチド間で引用することができるのは、部位１（ＲＫＩＧＲＧＫＦＳＥＶＦＥＧ）（SEQ ID No: 3）からの配列、特に、配列ＲＫＩＧＲＧＫＦＳＥＶＦを有するペプチドと配列ＩＧＲＧＫＦＳＥＶＦＥＧもしくは部位２（ＴＶＴＫＤＫＣＶＩＫＩＬＫＰＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩＬＱＮＬ）（SEQ ID No: 4）からの配列を有するペプチドであって、特に、
【００５６】
【表１】
2005522185.tif 000002
【００５７】
のペプチドであり、さらに、部位３  ＫＩＬＲＬＩＤＷＧＬＡＥＦＴＨＰ（SEQ ID No: 5）からの配列または配列ＫＩＬＲＬＩＤＷＧＬＡＥ（SEQ ID No: 23）を有するペプチド、配列ＬＲＬＩＤＷＧＬＡＥＦＹ（SEQ ID No: 24）を有するペプチドまたは配列ＬＩＤＷＧＬＡＥＦＹＨＰ（SEQ ID No: 25）を有するペプチドである。
【００５８】
Ｐ．ファルシパラムにおけるＣＫ２αタンパク質の部位３からの、Ｔ．パルバと相同な配列を有する本発明のペプチドの一例が、ペプチドＲＱＫＲＬＩ（SEQ ID No: 141）である。本発明は、ペプチドＲＱＫＲＬＩのポリマーであって、特に実施例の項でＦＤ７と称されている三量体（ＲＱＫＲＬＩ）3（SEQ ID No: 134）も含んでいる。
【００５９】
本発明は、その投与により寄生虫の発育が抑制されることを特徴とする、寄生虫タイレリア・パルバのＣＫ２αタンパク質に由来するペプチドに関していることが好ましい。
【００６０】
本発明のペプチド更なる態様は、タウタンパク質からペプチドが由来することを特徴としている。タウ配列には、Ｅ４ｏｒｆ４アデノウィルスタンパク質の結合部位に対応するモチーフがある。アルツハイマ病の場合、タウタンパク質は、プロテインホスファターゼ２Ａによって調節されている。したがって、このようなペプチドは、アルツハイマ病の治療に有効である。
【００６１】
本発明の方法によって同定されるペプチドは、特定の腫瘍、特定のウィルス感染症もしくは寄生虫感染症の治療に特に有効である。当業者は、結合競合テストにより、本発明の方法を使用して同定される配列に由来する新規なペプチドであって、それが由来する天然タンパク質の、ホロ酵素ＰＰ２Ａもしくはそのサブユニットの一つとの結合を競合的に阻害することを特徴とするペプチドを選択できる。
【００６２】
したがって、本発明は、それが由来する天然タンパク質と、ＰＰ２Ａホロ酵素またはそのサブユニットの一つとの相互作用を競合的に阻害することを特徴とする、上記の天然ペプチドもしくは合成ペプチドにも関するものである。
【００６３】
特定の腫瘍もしくは特定のウィルス性感染症もしくは寄生虫感染症の治療においてin vivoで効果を有するため、本発明のペプチドは、真核細胞内に該ペプチドを移行させることができるベクターに結合することができる。ただし、以下に述べるように、本発明のペプチドは、それ自身に、細胞内透過能を保持させることも可能であり、このことはベクターを追加する必要がないことを意味している。
【００６４】
当然のことながら、本発明は、本発明のペプチドを合成する手段にも関係している。特に、本発明は、本発明のペプチドをコードする配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドに関するものである。好ましいポリヌクレオチドは、その配列が
【００６５】
【表２】
2005522185.tif 000003
【００６６】
から選択される配列であり、それぞれがＮＯｓ：１〜５のペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００６７】
本発明は、配列SEQ ID No: 26-30の一つに相補的な配列、およびストリンジェントな条件下で該ポリヌクレオチドにハイブリタイズする配列を有する、ポリヌクレオチドにも関している。
【００６８】
「ストリンジェントな条件」という用語は、約６５℃で例えば、６  ｘ  ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、５X Denhardt溶液、および１００μgの非特異的キャリアＤＮＡの溶液中、もしくはこれと等価なイオン強度を有する他の溶液中で、更に例えば、最高で０．２  ｘ  ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ溶液もしくはこれと等価なイオン強度を有する他の溶液中で、６５℃で洗浄した後に、二つの一重鎖ＤＮＡ配列が特異的にハイブリタイズすることを可能にする条件を意味する。ストリンジェントな条件を定義するパラメータは、個々の対になる鎖の５０％が分離する（Ｔｍ）温度によって決まる。３０を越える塩基を有する配列の場合、Ｔｍは関係式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）＋１６．６ｌｏｇ（陽イオンの濃度）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／塩基数）によって定義される。長さが塩基３０未満の配列の場合には、Ｔｍは、関係式Ｔｍ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）によって定義される。ストリンジェントな条件は、２００１年のSambrookらに記載のプロトコルを用いても定義される（Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York）。
【００６９】
本発明の方法により同定されるペプチドモチーフの反復を有するポリペプチドを合成すると好都合であろう。したがって、本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの多量体からなることを特徴とする、ポリヌクレオチドに関するものである。本発明はまた、本発明のペプチドの反復によって構成されていることを特徴とするポリペプチドにも関するものである。
【００７０】
本発明は、上記のヌクレオチドと、宿主細胞における本発明のペプチドの発現を可能にする制御配列を有することを特徴とする細胞発現ベクターにも関するものである。
【００７１】
本発明は、上記のような細胞発現ベクターを用いて宿主細胞を基質転換する工程、その後に、基質転換された宿主細胞を培養し、培地中のペプチドを回収する工程からなることを特徴とする、本発明に記載のペプチドを調製するための方法にも関する。
【００７２】
本発明はさらに、抗血清、免疫血清もしくは精製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体にも関し、該抗体、抗血清または免疫血清が、本発明のペプチドに特異的に結合できることを特徴とする。
【００７３】
本発明の方法によって同定されるペプチドに対する特異的抗体は、例えば、本発明のペプチドを注入することにより動物を免疫し、産生された抗体を回収することによって取得することができる。モノクローナル抗体は、KohlerやMilstein(1975）に記載のハイブリドーマ方法など、当業者に知られた技術を用いて取得することができる。
【００７４】
プロテインホスファターゼ２Ａの標的に特異的な、取得された抗体は、免疫療法に特に有用である。一例として、これらは、ウィルスの発現もしくは寄生虫の発現を抑制するため、プロテインホスファターゼ２Ａに対するウィルスタンパク質もしくは寄生虫タンパク質の拮抗薬として作用することができる。
【００７５】
同様に、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、必要に応じて適切なベクターを用いて標的細胞の核に直接移入させ、対応するペプチドをin vivoでの発現させることができ、そのペプチドは、プロテインホスファターゼ２Ａと該ペプチドが由来するウィルスタンパク質もしくは寄生虫タンパク質との特異的相互作用を競合的阻害によって遮断することができる。
【００７６】
したがって本発明は、本発明のポリヌクレオチドもしくは本発明の抗体から選択される一つの要素を有する医薬組成物にも関するものである。
【００７７】
本発明は、薬理学的に許容可能なビヒクルと共に本発明のペプチドの一つを有する医薬組成物にも関するものである。
【００７８】
さらに本発明は、ウィルス感染症や寄生虫感染症の治療に使用するための医薬の調製における、上記の本発明のペプチドの使用にも関するものである。
【００７９】
好ましくは、本発明は、ＨＩＶによる感染を防止することのできる医薬の調製における、その配列が上記のＶｐｒタンパク質のフラグメントに由来するペプチドの使用にも関する。
【００８０】
本発明のペプチドは、細胞のプロテインホスファターゼ２Ａの活性化と関連するアポトーシスの誘発を刺激するために、有利に選択することができる。したがって本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞のアポトースを促進することができる医薬の調製における、上記の本発明のペプチドの使用にも関するものである。
【００８１】
さらに好ましい一つの態様では、本発明は、寄生虫感染症を防止することができる医薬の調製における、その配列がＣＫ２αタンパク質のフラグメントに由来するペプチドの使用に関するものである。さらに詳細には、本発明は、マラリヤの治療に使用することを目的とした医薬の調製における、ペプチドの使用に関するものである。
【００８２】
ウィルスに感染したり、寄生虫に感染すると、本発明のペプチドの配列を有するタンパク質が特異的に発現する。したがって、本発明のペプチドをコードする配列は、患者から採取した生体標本から抽出したＲＮＡから特定の方法により、ウィルス感染または寄生虫感染を検出するためのプローブとして使用することが可能である。
【００８３】
同様に、本発明の抗体は、感染中に発現するウィルスタンパク質や寄生虫タンパク質に含まれているペプチド配列を特異的に認識するために使用することができる。
【００８４】
このように本発明は、寄生虫疾患もしくはウィルス性疾患のin vitroでの診断における、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の抗体の使用に関するものである。
【００８５】
本発明は、プロテインホスファターゼ２Ａに結合し、細胞透過能を有するペプチドの選択および使用にも関するものである。
【００８６】
このようなペプチドの例が、Ｔ．パルバのＣＫ２αタンパクに由来するペプチドＦＤ６（SEQ ID No: 20）により示される。細胞にこのようなペプチドが存在していても、培養あるいは保存されている哺乳類の生きた細胞の生存度には影響を与えないということが、本発明で実証されている。
【００８７】
以下の実施例の項では、本発明のペプチドを同定するための方法を、ＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質からのペプチドおよび、タイレリア・パルバ寄生虫からのＣＫ２αタンパク質のペプチドの同定に適用することについて説明する。本発明は、プロテインホスファターゼ２Ａに結合し、細胞におそらく透過可能なペプチドであって、プロテインホスファターゼ２Ａの活性を調整することのできる分子のターゲッティングならびに細胞内プロテインホスファターゼ２Ａとの接触を可能にするペプチドの選択および使用にも関するものである。
【００８８】
実施例
Ａ．材料と方法
Ａ．１  精製ＰＰ２Ａタンパク質
ＰＰ２Ａ１タンパク質三量体をブタの脳から均一に精製した。
ＰＰ２Ａの構造的サブユニットの組換え体をE coliに発現させ、Cohenらに記載されているプロトコルを用いて（Cohen P, Alemany S, Hemmings B A, Resink T J, Stralfors P, Tung H Y, Protein phosphatase-1 and protein phosphatase 2A from rabbit skeletal muscle. Methods Enzymol 1988 159, 390-408）もしくはBoschらに記載されているプロトコルを用いて精製した（Bosch M, Cayla X, Van Hoof C, Hemmings B A, Ozen R, Merlevede W, Goris J, the PR55 and PR65 subunits of protein phosphatase 2A from Xenopus laevis. Molecular cloning and developmental regulation of expression. Eur J Biochem 1995, 230, 1037-45）。
【００８９】
Ａ．２  ＰＰ２ＡとのＨＩＶ  Ｖｐｒの結合部位ならびにタイレリア・パルバ(T parva)  ＣＫ２αの結合部位を同定するための方法
上記「スポットペプチド」技術（Frank and Overwing, 1996 Meth Mol Biol 66, 149-169）を用いて、ＰＰ２Ａと、（Ｔ．パルバ原虫によってコードされた）ＣＫ２αタンパク質もしくは（ＨＩＶ−１ウィルスによってコードされた）Ｖｐｒタンパク質由来のペプチドとの結合が同定された。
この方法は、対象となるタンパク質（ＶｐｒもしくはＣＫ２α）の配列全体がをその一連の配列によりカバーされていることを特徴とする、セルロース膜上の特定の位置において、in situでドデカペプチドを合成することからなる。膜上の２つの連続したスポットのペプチドは、２つのアミノ酸が重複している。
ＨＩＶ−１のＶｐｒタンパクの配列全体をカバーする６８個のドデカペプチドとタイレリアのＣＫ２αタンパクの配列をカバーする２０５個のドデカペプチドを合成し、セルロース膜に共有結合させた。
はじめに、準備した膜を、５％のスキムミルクと３％のＢＳＡを含有するＴＢＳで室温で１時間飽和させ、その後で、４μg/mlの精製タンパク質（ＰＰ２ＡのサブユニットＡまたはホロ酵素ＰＰ２Ａ１）の存在下で、同じ緩衝液中で一晩培養した。構造タンパクＡ（図１Ａと２Ａ）に対する抗体で、ならびにＰＰ２ＡのタンパクＡ、ＢおよびＣ（図１Ｂと２Ｂ）を認識する抗体の混合物で膜を培養した後、ウエスタンブロットにより、ペプチド配列と各精製したタンパク質（それぞれ構造サブユニットＡまたは三量体のホロ酵素ＰＰ２Ａ１）との特異的相互作用を明らかにした。
これらの膜を、培養に使用した通常のＴＢＳＴ緩衝液（ＴＢＳ＋ＴＷＥＥＮ）で１５分間５回洗浄し、その後で（ペロキシダーゼとカップルさせた）第二の抗体とともに室温でさらに１時間培養した。最後に膜を、ＴＢＳＴ緩衝液で１５分間５回洗浄し、分析に付した。
【００９０】
Ａ．３．細胞透過度テスト
１−細胞
ヒト頚ガン由来のヘラ細胞系を分析した。
２−吸収したペプチドの定量的判定
溶解緩衝液
０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８、０．５％  ＮＰ４０含有
ＯＰＤ緩衝液
２５．７mlの０．２Ｍ二塩基リン酸ナトリウム＋２４．３mlの０．１Ｍクエン酸＋５０mlの蒸留水をｐＨ５．０に調整。
ビオチン化アビジンペプチド複合体
４molのペプチドを１molのアビジンペロキシダーゼで培養した。室温で２０分間。
−各種ペプチドのヘラ細胞に対する細胞間透過度の分析
ヘラ細胞（１００ｌ中１０4個）を、２．５％のペニシリン／アンピシリンと１０％のウシの胎児血清の存在下で、完全ＤＭＥＭ培地が分注された９６ｌのプレート（フラットベース）とともに注入した。ＣＯ2オーブン（５％）内で３７℃の温度条件下で一晩培養した後に、さまざまに希釈した複合体（ビオチン化アビジンペロキシダーゼペプチド）を添加した。４時間培養した後に、上清を吸引し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン化したあとで、ＰＢＳ内でカウントするために採取した。カウントした後に、細胞を３００μlの溶解緩衝液内で回収した。
−ペルオキシダーゼ活性の測定
５０μlのＯＰＤ緩衝液を５０μlの溶解緩衝液もしくは５０μlの細胞溶解物（概して、何回かの連続希釈を行った（１／２まで））で９６ウェルのＥＬＩＳＡ内で培養した。分析のために、５０μlのＯＰＤ溶液を添加した（暗所で）。１００μlの１Ｎ  ＨＣｌにより反応（約１０分）が停止した。
−結果の分析
ペルオキシダーゼの活性は、ＥＬＩＳＡリーダー（６２０nmにおける基準フィルタ）内で４９０nmで読み取ることにより判定し、溶解物中におけるペルオキシダーゼの量を、較正曲線から計算し、次いで同数の細胞について推定した（１０3もしくは１０4）。
ペプチド分子＝（６＊１０23／ＭＷのペプチド）＊ＰＯのｎｇ＊１０-9。
【００９１】
Ａ．４．細胞生存度テスト
ヘラ細胞（１００μl中１０4個）を、２．５％のペニシリン／アンピシリンおよび１０％のウシの胎児の血清を含有する完全ＤＭＥＭ培地が分注された９６ウェルプレート（フラットベース）に播種した。ＣＯ2オーブン（５％）内で３７℃の温度条件下で一晩培養した後に、さまざまな濃度のペプチドの存在下で細胞を培養した。７２時間培養した後に、ペプチドを含有する培地を吸引し、０．５mg/ml（ＤＭＥＭ単独で希釈）のＭＴＴを各ウェルにつき１００μl添加した。３７℃の温度条件下で暗所で３０分間培養し、その後でＭＴＴを吸引して、取り出してから、５０μlのＤＭＳＯをすべてのウェルに添加した。細胞が完全に溶解するまで１０分間待ち、ウェル内の反応生成物の溶解を均質化するために溶解物ウェルを攪拌する必要があった。次に、プレートを６９０nmの基準フィルタを用いて５７０nmで読み取りをおこなった。
【００９２】
Ｂ．結果と考察
Ｂ．１．２種類の病原菌（ＨＩＶ−１とＴ．パルバ）によってコードされたタンパクのＰＰ２Ａ（ＰＰ２Ａ１とサブユニットＡ）との結合部位を含むペプチド配列の同定
生成した三量体ＰＰ２Ａホロ酵素と共にＨＩＶ−１のＶｐｒおよびＴ．パルバのＣＫ２αの配列をカバーするペプチドを含有する膜を培養した結果、ＶｐｒとＣＫ２αのペプチドの５つの配列が、ＰＰ２Ａに特異的に結合可能であると判断することができた。その結果を以下の表に示す。
【００９３】
【表３】
2005522185.tif 000004
【００９４】
さらに詳しくは、ＨＩＶ−１のＶｐｒでは、タンパク質ＰＰ２Ａ１（図１Ｂの「部位１」）およびサブユニットＡ（図１Ａの「部位１」と「部位２」）との結合部位を含有する２個のペプチド配列を同定した。Ｔ．パルバのＣＫ２αでは、タンパクＰＰ２Ａ１（図２Ｂの「部位３」）と構造的サブユニットＡとの結合部位を含む３個のペプチド配列も同定した（図２Ａの「部位１」、「部位２」および「部位３」）。
【００９５】
Ｂ．２．ＰＰ２Ａと結合するＨＩＶ−１  Ｖｐｒペプチドを用いることの意義
ＨＩＶ−１のＶｐｒの外因的発現またはプロウィルス感染による発現により、ヘラ細胞、Ｔリンパ系および一次リンパ球内でアポトーシスが誘発される（Stewart et al、1997 J Virol 71:5579-9）。Ｖｐｒミュータント使用したところ、この作用は、細胞サイクルのＧ２フェイズにおける停止と相関関係を持つことがまず明らかとなった。最近になりＶｐｒが、Ｇ２における停止とは関係なく、アポトーシスを誘発可能であるということも実証された（Nishizawa et al、2000、Virology 27、16-26）。
Ｅ４ｏｒｆ４アデノウィルスタンパク質との相互作用の結果、ＰＰ２Ａが活性化すると、形質転換した細胞でアポトーシスが誘発されるという報告がある（Shtrichman R et al、2000、Oncogene 19、3757-3765）。同様に、Ｖｐｒの発現も、形質転換した細胞でアポトーシスを誘発する（Stewart et al、1999、PNAS、96、12039-12043）。
さらに、当技術分野で周知のＶｐｒミュータントを分析したところ、本発明のプロセスによって同定され、ＰＰ２Ａタンパク質に特異的に結合するペプチドには、Ｖｐｒのアポトーシス促進効果に必要な配列に関連する配列が含有されていることが示唆される。
このように、ＰＰ２Ａと相互作用し、本発明のプロセスによって同定されるウィルスタンパク質ＶｐｒおよびＥ４ｏｒｆ４のフラグメントは、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発するのに効果的である。
同定されたペプチドは、ＨＩＶや他の関連するウィルスおよびレトロウィルスによる感染を防止する際にも、当然使用することができる。
【００９６】
Ｂ．３．ＰＰ２Ａと結合するＴ．パルバ  ＣＫ２α配列を用いることの意義
オカダ酸とＳＶ４０のsmall t抗原を使用したところ、ＰＩ３−キナーゼ、ＰＫＣζ（ＭＡＰ−キナーゼ−キナーゼ−キナーゼすなわちＭＥＫＫとして同定）、ＭＥＫタンパクおよび２個のＭＡＰキナーゼＥＲＫ−１およびＥＲｋ−２ならびに転写ファクタＮＦ−κＢおよびＳｐ１が関与する新規なリン酸化反応カスケードを介して、ＰＰ２Ａが細胞の増殖を制御することが実証された（Sontag E、Sontag J M、Garcia A(1997)、EMBO J、16、5662-5671;Ayllon V、Martinez A、C、Garcia A、Cayla XおよびRebollo A(2000)、EMBO J 19、1-10、A Garcia、S Cereghini、E Sontag(2000)、J Biol Chem 275、9385-9389）。さらに、ＭＡＰキナーゼのカスケードを調節する際のＰＰ２Ａの役割も、細胞ＣＫ２αサブユニットの過発現によりＭＥＫタンパク質が活性化され、ＰＰ２Ａを脱リン酸化することを実証した、Chambazのチーム（Heriche et al、(1997)、Science、276、952-955）による調査研究によって、示唆されている。
Ole-Moiら（Embo J、1993、12、1621-1631）による調査研究から、タイレリアによる形質転換が宿主タンパク質の過剰リン酸化を誘発することが明らかとなっている。この作用は特に、細胞ＣＫ２の恒常的な活性化に一部起因しており、その活性化自身は、寄生虫によってコードされ形質転換細胞の細胞質ゾルに分泌されるＣＫ２α型サブユニットの作用に、依存している。
以下に指摘するように、本発明のプロセスによって同定された、ＰＰ２Ａとの３つの結合部位に対応する配列の比較から、部位２で部分的に複写されているＫ−Ｉ−Ｇ／Ｌ−Ｒ／Ｋ型のモチーフの存在を同定することが可能である。
【００９７】
【表４】
2005522185.tif 000005
【００９８】
興味深いことに、ＣＫ２αのＡＴＰの結合部位が、部分的に部位１と部位２をカバーしており、それは、サブユニットＡとＣＫ２αとの相互作用の結果、キナーゼの活性を阻害することを示唆している。さらに、以下の表２からも明らかなように、Ｔ．パルバのＣＫ２αのＰＰ２Ａとの結合部位を含む３つの配列は、Ｐ．ファルシパラムおよびリーシュマニアの両寄生虫を含む多数の種において保存されている。
【００９９】
表２：ＰＰ２Ａとの結合部位を有するＴ．パルバからのペプチドと、ＣＫ２αの各種配列との比較（Ｐ．ファルシパラムの配列をＥＳＴから推定した。ほかは、「Swissprot」遺伝子バンクから得た）。Ｔ．パルバ配列とは異なる残基のみを示す。
【０１００】
【表５】
2005522185.tif 000006
【０１０１】
これらさまざまな種からのＣＫ２αが、ＰＰ２Ａと相互作用するということが、相互作用を注意深く分析することにより示唆される。例として、図２に記載され、部位３の最初の４個のアミノ酸が除去されているＴ．パルバのＣＫ２αからのペプチド１３１は、ＰＰ２Ａと結合することができる。このことは、最初の３個のアミノ酸が異なるリーシュマニア、Ｐ．ファルシパラムのＣＫ２αが、ＰＰ２Ａと結合するはずであるということを示唆している。これは、基本的に、ＰＰ２Ａの結合部位でありうる、Ｋ／Ｒ−ＩＩ／Ｌ−Ｉ／Ｌの複製をＫＩＬＲＬＩモチーフが所有しているという事実と一貫性がある。
これらペプチドの細胞内の存在は、タンパク質のＰＰ２Ａとのin vivoにおける結合部位に対応するため、これら寄生虫の成長を妨げることが可能である。
【０１０２】
Ｂ．４．細胞に対する本発明のペプチド化合物の生物学的作用
表３に列挙されている各種ペプチドをビオチン化形態で合成し、ＨＰＬＣ（Neosystem）によって精製し、細胞内透過度と細胞の生存度に対するそれらの作用をヘラ細胞で分析した。表１に示されている一連のペプチドに関する調査研究によって、ヘラ細胞内に透過する可能性がある６個のペプチドを同定することができた（図３）。
・ＦＤ６：Ｔ．パルバ  ＣＫ２αタンパク質とＰＰ２ＡのＡサブユニットが相互作用する部位由来の１２ＡＡペプチド
・ＦＤ７：６ＡＡヘキサモチーフの３回の反復に対応する１８ＡＡペプチド。Ｐ．ファルシパラム  ＣＫ２α由来のこの配列は、ＰＰ２Ａと結合するＴ．パルバ配列と相同性である
・ＦＤ８：プロタミン由来のペプチド（周知のＰＰ２Ａ活性化因子である）
・ＦＤ１１：ＦＤ１４の配列由来の６ＡＡヘキサモチーフの３回の反復に対応する１８ＡＡペプチド
・ＦＤ１４：ＨＩＶ−１  Ｖｐｒから特徴づけした、ＰＰ２Ａとの結合部位を再生するＦＤ１４
・ＦＤ１３：このペプチドは、ＦＤ１４ペプチド配列と相同であるＨＩＶ−１  Ｖｐｒ配列に相当し、別のＨＩＶ−１  ＶｐｒとＰＰ２Ａとの結合部位を表す。
さらに、表１に示されている一連のペプチドで実施した生存度に関する調査研究により、ヘラ細胞の生存度を阻害する３個のペプチドを同定することができた。
・ＦＤ８：ヘラ細胞の生存度に影響する（図４Ａ）
・ＦＤ１４：ヘラ細胞の生存度に明らかに影響する（図４Ｂ）
・ＦＤ１２：配列がＦＤ１１ペプチドの配列に由来する、１８ＡＡペプチド（ＲをＡに変異させている）。Chlamydia muridarumのグルコサミントランスフェラーゼタンパク質と相同なこのペプチドは、ヘラ細胞の生存度に影響を与える（図４Ｃ）。この生物学的作用は、原形質膜との相互作用によるものであると考えられる。
【０１０３】
【表６】
2005522185.tif 000007
【０１０４】
〔考察〕
ＰＰ２Ａと相互作用する特定のタンパク質由来のペプチドは、新規な抗腫瘍アプローチとなりうるか。
我々の研究により、ＰＰ２Ａと相互作用することが知られている２種類のタンパク質すなわちＶｐｒとプロタミン由来の２種類の透過性ペプチド（ＦＤ８／ＦＤ１４）を同定することができた。アルギニンとリシンリッチな共通配列を有するこれらのペプチドは、一般的吸収メカニズムを用いて細胞内へ透過することができる。アルギニンリッチな配列を有するペプチドの吸収で共通に使用されるこのようなメカニズムは、最近提案されたものである（Tomoki Suzuki et al、2002、Possible exstence of common interlization mechanisms among arginine-rich peptides、JBC 277、2437-2443）。概して、アルギニンもしくはリシンリッチな配列の存在により、ＰＰ２Ａと結合するタンパク質が特徴づけられ、他の透過性ペプチドをＰＰ２Ａファミリーで同定する可能性を示唆している。
【０１０５】
ＨＩＶ−１によりコードされるタンパク質であるＶｐｒは、高ウィルス負荷の保持およびＨＩＶの発症の確立に関与する。Ｖｐｒの発現は、外因性であれ、ＨＩＶ−１プロウィルス感染によるものであれ、ヘラ細胞、Ｔリンパ系細胞、一次リンパ球ならびに形質転換細胞においてアポトーシスを誘発する（Stewart et al、J Virol 1997、71、5579-9;Stewart et al 1999、PNAS、96、12039-12043）。さらなるウィルスタンパク質すなわちアデノウィルスＥ４ｏｒｆ４とＰＰ２Ａとの相互作用によって、腫瘍細胞のアポトーシスが誘発されることが報告されている（Marcellus et al、J Virol 2000、74、7869-7877）。全体として、これらの結果は、特定のＰＰ２Ａの活性化によって腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する新規な手段であるという仮説を示唆するものである。これに関して、図４Ｂに示した我々の実験結果は、ＨＩＶ−１  Ｖｐｒ由来のＦ１４ペプチドが抗腫瘍バイオペプチドとなりうることを示唆している。ペプチドＦＤ１３（ＦＤ１４と比較し、アミノ酸４個分異なる配列−表２を参照）では生物学的作用が存在しないことから、ＦＤ１４の構造がヘラ細胞の生存度を調節する際に不可欠であるということが示唆された。したがって、ＦＤ１４ペプチドの構造を模倣する化学分子の産生が、新規な抗腫瘍物質を生成するのを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ＰＰ２Ａ（Ａ）の構造的サブユニットＡおよびホロ酵素ＰＰ２Ａ１（Ｂ）による、ＨＩＶ−１のＶｐｒの配列を有するペプチドを含む膜のスクリーニング。４つのペプチド５４〜５７の配列により、部位２の配列ＶＥＡＬＩＲＩＬＱＱＬＬＦＩＨＦＲＩ（SEQ ID No: 1）を定義している。
【表７】
2005522185.tif 000008
３つのペプチド６４〜６６の配列により、部位１の配列ＲＨＳＲＩＧＩＩＱＱＲＲＴＲＮＧ（SEQ ID No: 2）を定義している。
【表８】
2005522185.tif 000009
【図２】ＰＰ２Ａ（Ａ）の構造的サブユニットＡと（Ｂ）ホロ酵素ＰＰ２Ａ１によるタイレリアのＣＫ２αの配列を有するペプチドを含む膜のスクリーニング。２つのペプチドの配列により、部位１の配列ＲＫＩＧＲＧＫＦＳＥＶＦＥＧ（SEQ ID No: 3）を定義している。
【表９】
2005522185.tif 000010
１０のペプチド７４〜８３の配列により、部位２の配列ＴＶＴＫＤＫＣＶＩＫＩＬＫＰＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩＬＱＮＬ（SEQ ID No: 4）を定義している。
【表１０】
2005522185.tif 000011
３つのペプチドの配列により、部位３の配列ＫＩＬＲＬＩＤＷＧＬＡＥＦＴＨＰ（SEQ ID No: 5）を定義している。
【表１１】
2005522185.tif 000012
【図３】図３は、表３に記載されているペプチドに関する細胞透過度テストを用いて取得した細胞内透過度値を表すヒストグラムである。
【図４Ａ】ＭＴＴ生存度テストを用いて評価したヘラ細胞の生存度に対する各種ペプチドの作用を表している。ヘラ細胞（初期集団に対するパーセンテージで表されている）の生存度は、ペプチドＦＤ８（４Ａ），ＦＤ１３／ＦＤ１４（４Ｂ）およびＦＤ１１／ＦＤ１２（４Ｃ）の存在下に濃度を上げて、ヘラ細胞の生存度を試験した。
【図４Ｂ】ＭＴＴ生存度テストを用いて評価したヘラ細胞の生存度に対する各種ペプチドの作用を表している。ヘラ細胞（初期集団に対するパーセンテージで表されている）の生存度は、ペプチドＦＤ８（４Ａ），ＦＤ１３／ＦＤ１４（４Ｂ）およびＦＤ１１／ＦＤ１２（４Ｃ）の存在下に濃度を上げて、ヘラ細胞の生存度を試験した。
【図４Ｃ】ＭＴＴ生存度テストを用いて評価したヘラ細胞の生存度に対する各種ペプチドの作用を表している。ヘラ細胞（初期集団に対するパーセンテージで表されている）の生存度は、ペプチドＦＤ８（４Ａ），ＦＤ１３／ＦＤ１４（４Ｂ）およびＦＤ１１／ＦＤ１２（４Ｃ）の存在下に濃度を上げて、ヘラ細胞の生存度を試験した。
【図１】
2005522185.tif 000013
【図２】
2005522185.tif 000014
【図３】
2005522185.tif 000015
【図４Ａ】
2005522185.tif 000016
【図４Ｂ】
2005522185.tif 000017
【図４Ｃ】
2005522185.tif 000018
【国際調査報告】
2005522185.tif 000019
2005522185.tif 000020
2005522185.tif 000021
2005522185.tif 000022
2005522185.tif 000023
2005522185.tif 000024
2005522185.tif 000025
2005522185.tif 000026
2005522185.tif 000027
2005522185.tif 000028