(57)【要約】単離、精製、又は組換え核酸配列を含む核酸配列は、（ａ）卵母細胞でカルシウム振動を引き起こすことが可能な本発明に包含されるポリペプチド、すなわちＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）アミノ酸配列をコードした核酸配列と、（ｂ）ストリンジェントな条件下で配列（ａ）にほぼ相同か、または配列（ａ）にハイブリダイズする配列と、（ｃ）遺伝子コードのｄｅｇｅｎｅｒａｃｙがない場合に前記配列（ａ）又は（ｂ）にほぼ相同か、またはこれにハイブリダイズする配列と、（ｄ）前記配列（ａ），（ｂ）又は（ｃ）のいずれかに特異的なオリゴヌクレオチドとを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵母細胞でカルシウム振動を引き起こすことが可能なＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）ポリペプチドをコードした核酸分子を含む単離、精製又は組換え核酸分子。
【請求項２】
前記配列はｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを含むＤＮＡ又はＲＮＡ配列である請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
配列番号３によって特定される配列であって、ヒトＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）又はこれに相同な配列又はストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズする配列を有する請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
配列番号４によって特定される配列であって、マウスＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）又はこれに相同な配列又はストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズする配列を有する請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項５】
配列番号１０によって特定される配列であって、ラットＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）又はこれに相同な配列又はストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズする配列を有する請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる単離、精製、又は組換えポリペプチド。
【請求項７】
ヒトＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）である配列番号１又はこれに相同な配列を有する単離、精製、又は組換えポリペプチド。
【請求項８】
マウスＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）である配列番号２又はこれに相同な配列を有する単離、精製、又は組換えポリペプチド。
【請求項９】
ラットＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）である配列番号１１又はこれに相同な配列を有する単離、精製、又は組換えポリペプチド。
【請求項１０】
以下の性質を示すことを特徴とするＰＬＣ−ゼータタンパク質：
（ａ）６００個〜７２０個、好ましくは６００個〜６９９個、より好ましくは６００個から６５０個の範囲のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、
（ｂ）ＥＦハンド、Ｘ、Ｙ、及びＣ２ドメインを有するが、ＰＨドメインは有さないドメイン配列、
（ｃ）下記から選ばれる保存領域からの少なくとも５個の連続したアミノ酸残基：
（ｉ）      ＱＤＤＦＲＧＧＫＩ  （１１−１９）；
（ｉｉ）    ＬＬＥＫＬＤ        （２７−３２）；及び
（ｉｉｉ）  ＱＧＲＩＴ          （５２−５６）（ＥＦ１ドメイン）；
（ｉｖ）    ＥＮＲＫＩＬ        （８２−８７）；及び
（ｖ）      ＦＬＴＱＥＱＹ      （９５−１０１）（ＥＦ２ドメイン）；
（ｖｉ）    ＹＱＱＦＮＥ        （４０３−４０８）（Ｙドメイン）；及び
（ｖｉｉ）  ＴＬＴＩＲ          （５１６−５２０）；
（ｖｉｉｉ）ＩＳＧＩＱＬＰ      （５２２−５２８）；及び
（ｉｘ）    ＬＣＭＮＫＧＹＲＲ  （６０９−６１７）（Ｃ２ドメイン）
（ただし残基は通常の一文字表記で表し、括弧内の数字はＡＢ０７０１０８（サルＡ）参照配列に関して示してある。）。
【請求項１１】
質量分析によって求められる分子量が７０〜７５ｋＤである請求項６乃至１０のいずれかに記載のポリペプチド又はタンパク質。
【請求項１２】
哺乳動物細胞に導入された際に細胞質カルシウム振動（ＣＣＯ）を発生させることが可能な哺乳動物の組換えＰＬＣ−ゼータタンパク質。
【請求項１３】
哺乳動物卵細胞に導入された際に細胞質カルシウム振動（ＣＣＯ）を発生させることが可能な、ＰＬＣ−ゼータタンパク質をコードした哺乳動物の組換えｍＲＮＡ。
【請求項１４】
非哺乳動物の細胞に導入された際に細胞質カルシウム振動（ＣＣＯ）を発生させることが可能な非哺乳動物の組換えＰＬＣ−ゼータタンパク質。
【請求項１５】
非哺乳動物の卵細胞に導入された際に細胞質カルシウム振動（ＣＣＯ）を発生させることが可能な、ＰＬＣ−ゼータタンパク質をコードした非哺乳動物の組換えｍＲＮＡ。
【請求項１６】
請求項６乃至１２及び１４のいずれかに記載のポリペプチド又はタンパク質を調製するための方法であって、
（ａ）哺乳動物精子からのそれの単離及び／又は精製、又は
（ｂ）該ポリペプチドをコードした核酸分子の発現、及び場合により得られた該ポリペプチドの単離及び／又は精製を含む方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチド又はタンパク質をコードした核酸分子の発現において下記のオリゴヌクレオチドの１以上を使用する請求項１６に記載の方法：
順方向ヒトプライマー：  ５’  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  Ｃ  ３’（２８量体）、
逆方向ＴｒｉｐｌＥｘプライマー：  ５’  ＣＴＣ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＴＴＧ  ＧＴ  ３’（２６量体）、
順方向マウスプライマー：  ５’  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  Ｃ  ３’（２８量体）、
逆方向Ｔ７プライマー：  ５’  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  Ｃ  ３’  （２２量体）、
順方向ヒトプライマー：  ５’  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  Ｃ  ３’  （２８量体）、
逆方向ヒトプライマー：  ５’  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＴＧＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ３’  （２４量体）、
順方向マウスプライマー：  ５’  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  Ｃ  ３’  （２８量体）、
逆方向マウスプライマー：  ５’  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＣＴＴ  Ｃ  ３’  （１９量体）。
【請求項１８】
請求項１乃至５のいずれかに記載の核酸分子を含む組換えコンストラクトからなるベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターによってトランスフォームまたはトランスフェクトした培養ホスト細胞。
【請求項２０】
請求項１乃至５のいずれかに記載の核酸分子が発現可能に組み込まれ、請求項６乃至１２及び１４のいずれかに記載のポリペプチド又はタンパク質を製造するために遺伝子操作又はタンパク質操作された細胞、プラスミド、ウイルス、生物、又は他のビークル。
【請求項２１】
遺伝子治療などの医療において使用するための薬剤の製造における請求項１乃至５のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドまたは該核酸分子自体の用途。
【請求項２２】
請求項６乃至１２及び１４のいずれかに記載のポリペプチド又はタンパク質、及び薬学的に許容されるそれ用の担体を含む医薬製剤。
【請求項２３】
請求項１乃至５に記載の核酸分子及び薬学的に許容されるそれ用の担体を含む医薬製剤。
【請求項２４】
哺乳動物の受精能を判定するための診断方法であって、哺乳動物から得た試験試料中に存在するかあるいは存在しない請求項６乃至１２のいずれかに記載のタンパク質又は請求項１乃至５のいずれかに記載の核酸配列の量を判定することを含む診断方法で、前記タンパク質又は核酸配列の量は前記哺乳動物が受精能を有することを示す濃度である方法。
【請求項２５】
診断又はスクリーニング方法であって、
（ａ）特定の個体から哺乳動物のＰＬＣζ遺伝子の核酸分子を有する試験試料を得てその遺伝子コードを決定し、
（ｂ）前記試験試料から得た前記コードのある領域を、配列番号３または４のような所定の野性型哺乳動物ＰＬＣζ配列の対応した領域と比較して変異があるかどうかを判定し、
これにより、前記所定配列に対する前記試料コード中の変異が、低下した受精能または不妊などの所定の状態であって、該状態に見られない正常な生物学的機能にとっての必要条件であるカルシウム振動パターンの阻害をともなう状態を示すものである方法。
【請求項２６】
受精能の問題が疑われる個体をスクリーニングするスクリーニング方法であって、
（ａ）ヒトＰＬＣζ遺伝子の核酸分子又はそれによってコードされるアミノ酸配列を含む試験試料を前記個体から得る工程と、
（ｂ）ヒトＰＬＣζ遺伝子若しくはそれによってコードされるアミノ酸配列の変異体の存在、又はヒトＰＬＣζ遺伝子若しくはそれによってコードされるアミノ酸配列の変異体の存在を示すかこれに関連した１以上の代用マーカーの存在について前記試験試料を分析する工程とからなり、
ヒトＰＬＣζ遺伝子又はこれによってコードされるアミノ酸配列の前記変異体は野性型ＰＬＣζ配列と比較した場合に少なくとも１個の変異を示すものである方法。
【請求項２７】
前記試験試料はゲノムＤＮＡを含む請求項２４乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
請求項６乃至１２及び１４のいずれかに記載のポリペプチドに対して作成された抗体。
【請求項２９】
請求項６乃至１２及び１４のいずれかに記載のポリペプチドに対して作成されたモノクローナル抗体である請求項２７に記載の抗体。
【請求項３０】
診断またはスクリーニングキットであって、
（ａ）ＰＬＣζ変異体のある領域に相当する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであって、該領域は対応する野性型ＰＬＣζ遺伝子配列から少なくとも１個の変異を含んでいるオリゴヌクレオチド、及び／又は、
（ｂ）野性型ＰＬＣζ遺伝子配列に対し、（ａ）で特定した前記領域において一致する核酸配列を有するオリゴヌクレオチド、及び／又は、
（ｃ）野性型ＰＬＣζ遺伝子配列の特定領域に一致する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記特定領域は前記哺乳動物のゲノムＤＮＡ中に存在しない配列を有するオリゴヌクレオチド、及び／又は
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに対して特異的なオリゴヌクレオチドに対して作成されたモノクローナル抗体などの抗体、及び、任意で、
（ｅ）前記個体のＤＮＡの所望の領域を増幅するためのＰＣＲを行ううえで適当な１以上の試薬からなるキット。
【請求項３１】
キットの構成要素（ａ）〜（ｃ）のいずれかが固体支持体上に固定された複数の前記オリゴヌクレオチドからなる請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内の遊離カルシウムイオン濃度の調節と制御に関し、より詳細には哺乳動物の卵母細胞（卵細胞）における細胞質カルシウム振動（ＣＣＯ）の制御に関する。詳細には本発明は、卵受精時に見られるＣＣＯと同様のＣＣＯを引き起こすホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼＣタンパク質及びこうしたタンパク質をコードした核酸配列、並びにバイオテクノロジー、診断又は医療におけるその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度の過渡的変化は、記憶形成、筋収縮、ホルモン分泌、受精、遺伝子転写、アポトーシスなど多くの生理学的プロセスの活性化を引き起こすことが知られている。心筋細胞、内皮細胞及び卵細胞など異なるタイプの細胞において観察される重要な現象に、細胞刺激に対するカルシウム濃度の一連の規則的な過渡変化、すなわち振動の発生がある。この現象の最も研究が進んでいる例は、哺乳動物の受精時のものであり、卵細胞内のカルシウム濃度が精子との融合後に規則的に振動し始めるというものである。受精時に発生するこうしたカルシウム振動は時に「カルシウム波」とも呼ばれ、卵細胞の活性化及びその結果である胚発生の誘因であると考えられている。研究目的また診断を含む多くの実際的用途における使用を目的としてこの現象の原因物質を発見、単離すべく永年にわたり研究が進められてきた。
【０００３】
哺乳動物の受精卵におけるこの重要なＣａ２＋シグナリング現象は、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）濃度の上昇から始まり、これによって卵細胞の細胞内貯蔵所からＩＰ３受容体を媒介としてＣａ２＋の放出が起こる。しかしながら、精子−卵相互作用後のホスホイノシチド代謝の刺激に関与する基本的な機構はいかなる生物種においても解明されていない。
【０００４】
受精時のシグナリングに関する「精子因子仮説」によれば、精子には、配偶子の膜が融合してＣａ２＋振動が発生した後に卵細胞に入る可溶性のＣａ２＋放出因子が含まれていると提唱されている。このことは、精子と卵子の細胞質融合がＣａ２＋放出の前兆現象であるという知見と一致する。この仮説を直接的に支持する証拠が、１個の精子または可溶性の精子抽出物を卵細胞内にマイクロインジェクションによって注入する実験によって得られ、哺乳動物及び哺乳動物以外のある種の生物の卵細胞の受精時に見られるのと同様なＣａ２＋振動が引き起こされることが示された。Ｃａ２＋振動を発生させる哺乳動物の精子因子はタンパク質に基づいたものであり、種間にまたがって作用し、体細胞ならびにウニ卵細胞ホモジェネートのような無細胞系でＣａ２＋放出を引き起こす。精子形成細胞から単離されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のマウス卵細胞へのマイクロインジェクションによって受精時と同様のＣａ２＋振動が引き起こされるのに対し、他の組織から得たｍＲＮＡではＣａ２＋振動が見られないことから、精子はＣａ２＋振動誘導タンパク質を特異的に発現していると考えられる。
【０００５】
哺乳動物の精子抽出物が、破砕しない卵細胞及び卵細胞のホモジェネートの双方においてＩＰ３生成を刺激することによってＣａ２＋放出を引き起こすことは、シグナルトランスダクション機構におけるホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ、通常はＰＬＣと略称される）の関与を示唆するものである。精子抽出物では高レベルのＰＬＣ酵素活性が生化学的に測定されることから、精子因子それ自体がＰＬＣであると唱える研究者もいる。しかしながら、精子中に存在するＰＬＣのベータ、ガンマ、及びデルタ（β、γ、及びδ）型のアイソフォームは、Ｃａ２＋振動を特異的に引き起こす精子抽出物のクロマトグラフによる画分からは検出されない。更に、精製した組換えＰＬＣβ２、γ１またはδ１タンパク質を卵細胞のホモジェネートに加えてもＣａ２＋放出を引き起こさない。精子で発現されるＰＬＣδ４スプライス変異体は、受精時における卵細胞内でのＣａ２＋放出ではなく、アクロソーム反応に関与していることが示されている。この分野における以前の研究が国際特許出願明細書第ＷＯ９６／２５４９５号に述べられているが、本出願を完全に理解し、本出願の背景を知るうえで参照すべきものである。そこでＷＯ９６／２５４９５の全容を参照し、ここに援用する。
【０００６】
国際特許出願明細書第ＷＯ９６／２５９４５号では、上述のカルシウム振動の原因を精子の赤道部に存在する物質（精子因子）であるとした。この物質は卵細胞との融合後に卵細胞内に拡散すると考えられている。この物質は特定のアミノ酸配列を有する３３ｋＤ（およそ）のタンパク質として同定された。このタンパク質をコードする核酸も特定された。しかしながら、遺伝子のクローニング及びその後の発現実験の結果、この精子因子の候補物質はカルシウム振動を再現し得ないことが示された。更に精子因子の候補物質としてｃ−ｋｉｔ受容体の短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）も先に検討された。しかしながら、これら２つのタンパク質及び他のあらゆる精子タンパク質のいずれも、哺乳動物の受精の唯一最大の特徴である卵細胞におけるＣａ２＋振動を引き起こさないことが示された。
【０００７】
これらの観察結果からこの分野の研究者の中には、「精子由来ＰＬＣは受精時のＣａ２＋放出を開始させる原因物質ではない」（Ｍｅｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２３６  ４９２−５０１  （２００１））と結論するものもあり、「このタンパク質の同定は次世紀の受精研究の課題である」（Ｒｕｎｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２４５  ２３７−５４  （２００２））と述べるものもあった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一方、本発明者等はこれらの観察結果から別の未確認の精子ＰＬＣアイソフォームが存在する可能性を検討した。すなわち本発明は哺乳動物の精子で特異的に発現される新規なＰＬＣアイソフォーム（以下、ＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）と呼称する）であって、精子因子の基本的な性質のすべてを固有の性質として備えたアイソフォームの存在に関するものである。本発明者等の研究結果は、精子ＰＬＣが卵細胞の活性化の生理学的誘因であり、したがって哺乳動物の受精及び胎児発生に不可欠なタンパク質であるとする考え方に一致するものである。
【０００９】
ヒト及びマウスにおけるこのタンパク質のアミノ酸配列を下記にそれぞれ配列番号１及び２として示し、それぞれの核酸コード配列を配列番号３及び４として示した。またラットのタンパク質を配列番号１１として、その核酸コード配列を配列番号１０として示した。
【００１０】
最近になって、Ｇｅｎｂａｎｋのデータベースが、ヒト及びマウス精巣の異なる核酸配列を開示した。これらの配列についてはなんらの機能も示されておらず、配列番号３及び４の開始位置から少なくともアミノ酸１００個の位置に相当する開始位置を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；タンパク質またはポリペプチド配列）を予測したものである。具体的には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＡＫ００６６７２（２００１年７月５日寄託）はマウス精巣配列の２２２７個の塩基対からなるが、マウス配列（配列番号４）の１１１番目のアミノ酸（ＭＥＩＤＨ）に相当する開始位置を有する（最初のアミノ酸（ａａ）１１０個を欠く）アミノ酸５３７個をコードしたＯＲＦを予測している。
【００１１】
Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＸＭ０２９８０２（２００１年１０月１６日寄託）はヒト精巣配列の２１１３個の塩基対からなり、ヒト配列（配列番号３）の１０５番目のアミノ酸（ＭＳＫＡＩ）の位置に相当する開始位置を有する（最初のアミノ酸１０４個を欠く）アミノ酸５０４個をコードしたＯＲＦと同一ではないがこれを予測した配列である。
【００１２】
Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＮＭ０３３１２３（２００１年８月２１日寄託）はデータベース内のヒト精巣配列の２１３２個の塩基対からなるが、ヒト配列（配列番号３）の１０５番目のアミノ酸（ＭＳＫＡＩ）に相当する開始位置を有する（最初のアミノ酸１０４個を欠く）５０４個のアミノ酸をコードしたＯＲＦを予測している。
【００１３】
Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＡＹ０３５８６６（２００１年６月２２日寄託）はデータベース内のヒト精巣配列の２１３２個の塩基対からなるが、ヒト配列（配列番号３）の１０５番目のアミノ酸（ＭＳＫＡＩ）に相当する開始位置を有する（最初のアミノ酸１０４個を欠く）５０４個のアミノ酸をコードしたＯＲＦを予測している。
【００１４】
Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＡＢ０７０１０８（２００１年８月１６日寄託）はサル精巣配列の２２１９個の塩基対からなり、６４１個のアミノ酸をコードした１９２３個の塩基対（２２０〜２１４２番目のヌクレオチド）からなるＯＲＦを含んでいる。これらの配列にはなんらの機能も示されておらず、推定される精子因子との関連も示されていない（それぞれ配列番号６及び７）。
【００１５】
同様にＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＡＢ０７０１０９（２００１年８月１６日寄託）は、サル精巣配列の２２１８個の塩基対からなり、６４０個のアミノ酸をコードした１９２０個の塩基対（２２０〜２１３９番目のヌクレオチド）からなるＯＲＦを含んでいる。これらの配列にはなんらの機能も示されておらず、推定される精子因子との関連も示されていない（それぞれ配列番号８及び９）。
【００１６】
ＡＢ０７０１０８とＡＢ０７０１０９のタンパク質配列の相違を下記に示す。
【００１７】
【数１】
2005522987.tif 000002
【００１８】
すなわち本発明は以下の性質の１以上を示すことを特徴とするＰＬＣ−ゼータタンパク質を提供するものである。
【００１９】
（ａ）６００個〜７２０個、好ましくは６００個〜６９９個、より好ましくは６００個から６５０個の範囲のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列。
【００２０】
（ｂ）ＥＦハンド、Ｘ、Ｙ、及びＣ２ドメインを有するが、ＰＨドメインは有さないドメイン配列。
【００２１】
（ｃ）下記から選ばれる保存領域からの少なくとも５個の連続したアミノ酸残基：
（ｉ）      ＱＤＤＦＲＧＧＫＩ  （１１−１９）；
（ｉｉ）    ＬＬＥＫＬＤ        （２７−３２）；及び
（ｉｉｉ）  ＱＧＲＩＴ          （５２−５６）（ＥＦ１ドメイン）；
（ｉｖ）    ＥＮＲＫＩＬ        （８２−８７）；及び
（ｖ）      ＦＬＴＱＥＱＹ      （９５−１０１）（ＥＦ２ドメイン）；
（ｖｉ）    ＹＱＱＦＮＥ        （４０３−４０８）（Ｙドメイン）；
（ｖｉｉ）  ＴＬＴＩＲ          （５１６−５２０）；
（ｖｉｉｉ）ＩＳＧＩＱＬＰ      （５２２−５２８）；及び
（ｉｘ）    ＬＣＭＮＫＧＹＲＲ  （６０９−６１７）（Ｃ２ドメイン）
ただし残基は通常の一文字表記で表し、括弧内の数字はサルＡＢ０７０１０８（サルＡ）配列の６４１個のアミノ酸からなるＯＲＦ内の配列座標を示す。
【００２２】
下記の表（表１）は異なるＰＬＣの長さの比較を示したものであり（基準（ａ））、図３は異なるＰＬＣ間のドメインの比較を示したものであり（基準（ｂ））、配列番号１２は他のＰＬＣと比較したＰＬＣ−ゼータの種間保存領域を示したものである。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐより入手可能なＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ解析プログラムでデフォルトの設定値を用いて異なるタイプのＰＬＣ間の比較を行った。
【００２３】
【表１】
2005522987.tif 000003
【課題を解決するための手段】
【００２４】
すなわち本発明は、卵母細胞においてカルシウム振動を引き起こすことが可能なＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）ポリペプチドをコードした核酸分子からなる単離、精製、又は組換え核酸分子を提供するものである。
【００２５】
本発明の核酸分子は本明細書中に開示される配列によって同定されるものであって、この配列に対してほぼ相同な配列またはストリンジェントな条件下でこの配列にハイブリダイズする配列を更に含むものである。
【００２６】
本発明の更なる局面では、上記の配列の一部に対して特異的な少なくとも１種のオリゴヌクレオチドが提供される。好ましくは前記オリゴヌクレオチドには本明細書中で述べるプライマー、より詳細には以下のものが含まれる。
【００２７】
順方向ヒトプライマー：  ５’  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  Ｃ  ３’（２８量体）、
【００２８】
逆方向ＴｒｉｐｌＥｘプライマー：  ５’  ＣＴＣ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＴＴＧ  ＧＴ  ３’（２６量体）、
【００２９】
順方向マウスプライマー：  ５’  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  Ｃ  ３’（２８量体）、
【００３０】
逆方向Ｔ７プライマー：  ５’  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  Ｃ  ３’  （２２量体）、
【００３１】
順方向ヒトプライマー：  ５’  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  Ｃ  ３’  （２８量体）、
【００３２】
逆方向ヒトプライマー：  ５’  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＴＧＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ３’  （２４量体）、
【００３３】
順方向マウスプライマー：  ５’  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  Ｃ  ３’  （２８量体）、
【００３４】
逆方向マウスプライマー：  ５’  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＣＴＴ  Ｃ  ３’  （１９量体）。
【００３５】
本明細書で云う「ほぼ相同」とは、前記の核酸配列が配列中の一致する位置において配列（ａ）のヌクレオチド塩基と少なくとも７０％一致するヌクレオチド塩基を有することを意味する。ヌクレオチド塩基の更なる１０％は（同様の塩基による）保存的置換からなっていてもよく、したがってその配列は少なくとも８０％の全体の相同性を有することとなる。より好ましいのは、配列（ａ）と少なくとも８０％のヌクレオチド塩基が一致し、約９０％の全体の相同性を有する配列である。このような相同配列は本発明のタンパク質とほぼ同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードするものである。
【００３６】
上記の核酸配列（ａ）〜（ｃ）のいずれかに対して「特異的な」オリゴヌクレオチドは、本発明の生物学的活性ペプチドを同定、単離するうえで有用であり、このペプチドのアミノ酸配列の固有のフラグメントをコードした固有の配列を含んでいる。
【００３７】
詳細には本発明は、前記配列がｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ又はｍＲＮＡなどのＤＮＡ又はＲＮＡ配列である上記に定義した核酸配列を提供する。
【００３８】
より詳細には本発明は以下のものを提供する：
本明細書中で配列番号３によって特定されるＤＮＡ配列であって、本明細書中で配列番号１として特定されるポリペプチドに相当する配列（ヒトＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）ヌクレオチド配列、１８２７ヌクレオチド）；
本明細書中で配列番号４によって特定されるＤＮＡ配列であって、本明細書中で配列番号２として特定されるポリペプチドに相当する配列（マウスＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）ヌクレオチド配列、１９４４ヌクレオチド）；及び
本明細書中で配列番号１０によって特定されるＤＮＡ配列であって、本明細書中で配列番号１１として特定されるポリペプチドに相当する配列（ラットＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）ヌクレオチド配列、１９３８ヌクレオチド）。
【００３９】
上記のマウス配列はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＡＦ４３５９５０として寄託されており、１９４１個のヌクレオチドからなるタンパク質コード領域と停止コドン（３ヌクレオチド）（これらを合わせると配列番号４となる）と非翻訳領域（全体で２１８７ヌクレオチド）とからなる。これは本明細書中で配列番号５として特定される。
【００４０】
したがって本発明は更に：
ヒトＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）アミノ酸配列（６０８残基）である配列番号１のポリペプチド；
マウスＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）アミノ酸配列（全体で６４７残基）である配列番号２のポリペプチド；及び
ラットＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）アミノ酸配列（全体で６４６残基）である配列番号１１のポリペプチドを提供する。配列中のアミノ酸は通常の一文字表記で表した。
【００４１】
更に本発明は、従来なんらの機能も割り当てられていなかった既知の配列のＰＬＣ−ｚｅｔａ（ＰＬＣζ）、または精子因子としての用途を提供する。詳細には、本発明はサルタンパク質（配列番号７及び９）のこうした用途を提供する。
【００４２】
推定されるヒト及びマウスのタンパク質である配列番号１と２とは、全長でアミノ酸３９個が異なり、これらのｃＤＮＡ配列もそれに応じて異なっている。同様の活性を有するタンパク質及びそれらをコードした対応する核酸配列が、ヒツジやブタなどの家畜を含む他の哺乳動物の精子、また魚類など他の動物種の精子中にも存在しているであろうことは了承されよう。こうしたタンパク質及び核酸配列はいずれも互いに高度の配列相同性を有し、上記の新たに発見されたＤＮＡ配列もしくはその部分を用いて他種の適当なｃＤＮＡライブラリをプローブすることによって容易に単離することが可能である。これらのタンパク質の分子量は、質量分析によって求めた場合に６５〜８０ｋＤの範囲、好ましくは７０〜７５ｋＤの範囲、特に約７０ｋＤであることが予想される。
【００４３】
実質上同様の生物学的活性を有する本明細書中に開示されるタンパク質（配列番号１，２及び１１及び相同配列）の誘導体も本発明の範囲に包含されるものである。例えばこれらの誘導体の１以上のものが、アスパラギン、セリン、又はスレオニンにおけるグリコシル化；及び／又はポリペプチドに普通に見られるようなチロシンの硫酸基やリン酸基；一塩基多型（ＳＮＰ）のような多型；及び更にリーダー／シグナル配列を有するものなどのような翻訳後修飾を受けていてもよい。
【００４４】
本発明は更に、診断テストや他のアッセイにおいてＰＬＣ−ゼータの同定に使用したり研究又は臨床用ツールとして使用するための配列番号１，２，７，９及び１１などの本明細書中で詳細に特定されるポリペプチド配列のいずれかのタグ付加誘導体を含むＰＬＣ−ゼータのタグ付加誘導体を提供する。ＰＬＣ−ゼータは、それに対する抗体が市販されている（例、サンタクルーズ・バイオテクノロジー）実施例６で後述するようなｃ−Ｍｙｃでタグ付加することが好ましい。
【００４５】
本発明に包含されるポリペプチドは、該ポリペプチドをコードしたＤＮＡ配列を含む発現ベクターでトランスフォームしたホストを、該ポリペプチドが発現するような条件下で提供もしくは培養し、必要に応じて得られたポリペプチドを単離することによって調製することも可能である。この手法は、発現させたいポリペプチドをコードしたヌクレオチド配列を得て、該ポリペプチドを組換え生物体内で発現させることに一般に基づいたものである。このように遺伝子改変された生物を培養することにより完全な生物学的活性を示す所望の産物が産生される。したがって本発明は更に、組換えＤＮＡ技術によって産生されるポリペプチドであって上記に含まれるようなポリペプチドをも包含するものである。本発明は更に合成又はタンパク質工学によって作成されるような上記に含まれるポリペプチドをも包含するものである。
【００４６】
したがって本発明は更に、本発明に基づく任意の核酸配列を含む組換えコンストラクト、そうしたコンストラクトを含むベクター、及びそうしたベクターによってトランスフォームまたはトランスフェクトしたホストを提供する。
【００４７】
したがって本発明は更に、本発明に基づくポリペプチドを産生するように遺伝子工学またはタンパク質工学によって改変された培養若しくは非ヒト細胞、プラスミド、ウイルス、生物又は他のビークルであって、本明細書中に開示されるような配列が発現可能に組み込まれた前記細胞、プラスミド、ウイルス、生物又は他のビークルを提供する。こうした細胞としては、本明細書中に述べられるような状態を治療または予防する遺伝子治療で用いるための、例えばヒトやヒト化細胞などの哺乳動物細胞を含む動物細胞が含まれる。具体的にはこうした細胞として、本発明に基づいた細胞核移植によって誘導される幹細胞が挙げられる。したがって本発明は更に、本発明のＰＬＣ−ゼータを用いることによって向上した核移植技術によって誘導される動物クローンをも提供するものである。
【００４８】
したがって本発明は更に、本発明に基づくポリペプチドを調製するための方法であって、
（ａ）哺乳動物の精子から単離及び／又は精製し、
（ｂ）前記ポリペプチドをコードした核酸配列を発現させ、必要に応じて得られたポリペプチドを単離及び／又は精製することからなる方法を提供するものである。
【００４９】
したがって本発明はとりわけヒト、マウス、ラット若しくは他の哺乳動物タンパク質としてのＰＬＣ−ゼータ、または非哺乳動物（例、魚類）のＰＬＣ−ゼータ、これらをコードした核酸配列、その核酸配列をトランスフェクトした細胞、及びトランスフェクト細胞の培養及び発現産物の回収によってＰＬＣ−ゼータを製造するための方法からなるものである。
【００５０】
上記の組換えタンパク質、特にマウス（ｃ−Ｍｙｃにてタグ付加したマウスなど）、サル（ＡＢ０７０１０８及びＡＢ０７０１０９）、及びヒトＰＬＣ−ゼータは、哺乳動物細胞に導入された際に細胞質カルシウム振動（ＣＣＯ）を発生させることが示されている。更にＰＬＣ−ゼータをコードした相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）のマウス卵細胞への注入によっても、卵細胞が精子によって受精した場合と同様のＣＣＯが発生する。更にＰＬＣ−ゼータは胎児発生を胚盤胞期（幹細胞が見出されるステージ）にまで進行させることも示されている。
【００５１】
したがって本発明は、下記のものを含め、本発明のタンパク質及び核酸配列の各種の応用及び／又は用途を更に提供するものである。
【００５２】
１．哺乳動物の不妊症治療
本発明者等が同定したヒトＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）タンパク質はヒトの男性不妊症の治療に用いることが可能である。このＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）タンパク質は精子と卵細胞の融合時に、卵細胞の活性化とその結果の胎児発生をもたらす生理学的プロセスであるカルシウム濃度の変化を引き起こす。精子中に活性ＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）が存在しなかったりまたその濃度が極めて低い場合には雄性不妊症を引き起こすと考えられる。哺乳動物の精巣でＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）タンパク質が高度に発現していることを支持する根拠として以下がある。
【００５３】
（ａ）精巣のｃＤＮＡライブラリ（ヒト精巣及びマウス精細胞）からｃＤＮＡが単離されている。
【００５４】
（ｂ）本発明者等のヒト及びマウスＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）配列を用いたＥＳＴデータベースの検索の結果、精巣から得たｃＤＮＡライブラリにおいて配列の一致をみた。
【００５５】
したがってヒト精子試料でのＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）タンパク質のアッセイを行うことにより、活性タンパク質（細胞カルシウム振動を引き起こすタンパク質）が正常レベルよりも少なく、そのために不妊症である男性を特定することが可能である。このアッセイは、当業者には周知の方法によって調製したこのタンパク質に対する抗体を用いることによって行うことができる。
【００５６】
こうした不全症を治療するため、臨床的なＩＶＦ（体外受精）法である細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）（Ｉｎｔｒａ−Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｓｐｅｒｍ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，１個の精子を卵子に直接導入する）と組み合わせて、活性ＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）の欠如した精子に活性ＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）を加えることが可能である。ＩＣＳＩ法は体外受精を行っている主な病院で行われており、幾千もの出産成功例がある。
【００５７】
２．幹細胞の作成における改良
最近、ヒト変性疾患の治療における「代用部品」としての胎児から得た幹細胞の倫理的使用が社会的に大きな論議の的となっている。患者から直接幹細胞を作成することによって提供胚を使用する必要がなくなる。細胞、組織及び動物（例、ヒツジの「ドリー」）のクローン化が体細胞と脱核卵細胞の融合によって行われている。融合卵細胞の活性化によってハイブリッド細胞の発生を引き起こして胚盤胞を形成し、これから幹細胞を得るというプロセスは極めて効率が低く成功率は１％未満である。したがって、体細胞と卵細胞との間で起こる融合過程の後に、卵細胞の活性化を引き起こすうえで生理理学的に有効な活性を有するネイティブなタンパク質を使用することによって、融合細胞の発生が更に進行する成功率が向上すると考えられる。
【００５８】
ＰＬＣ−ゼータを用いることによって改善された核移植法により得られる幹細胞は、パーキンソン病、アルツハイマー病、心不全や糖尿病など幹細胞治療が適用可能な各種のヒトの疾患や状態に対する使用が期待される。
【００５９】
３．動物のクローニング
上記の応用例２の拡張として、正常に発生している胚盤胞を妊娠中の雌をホストとして移植し、完全に発生させて１個の成体動物細胞に由来する複数のクローンを出産させることがある。この方法は現在、ヒツジやブタなど形質転換動物でバイオ医薬品を製造する目的及びヒトに移植するための動物細胞や臓器として使用する目的で開発中であるが、上述したように現段階でのこの方法の成功率は融合時に生存可能なハイブリッド細胞を得ることが困難であることから１％未満と極めて低い。
【００６０】
別の局面で本発明は、本明細書中で述べられる状態又は疾患の治療又は予防のための方法であって、前記ポリペプチドをコードした核酸配列が発現可能に取り込まれた患者の細胞内でポリペプチドを発現させることによって該ポリペプチドを投与する方法を提供する。遺伝子治療の代りに本発明のポリペプチドを医薬製剤として投与することも可能である。
【００６１】
すなわち本発明は本明細書中で述べられるポリペプチド又は該ポリペプチドをコードした核酸配列の、遺伝子治療を含む医療における用途、及び医薬品の製造におけるこうしたポリペプチドの用途を提供するものである。
【００６２】
したがって本発明の更なる一局面によれば、本発明に基づくポリペプチド（上述のもの）と薬学的に許容される該ポリペプチド用の担体とからなる医薬製剤が提供される。本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」なる用語は、有効成分や患者と不都合な反応を起こすことのない任意の不活性、無毒性の固体若しくは液体の充填剤、希釈剤、又は封入材料や他の添加剤を意味するものとして解釈されるべきである。
【００６３】
こうした製剤及び担体は当該技術分野では周知のものであり、例えば非経口的若しくは経口的又は局所的に患者に全身投与することが可能な医薬製剤が含まれる。
【００６４】
ここで云う「非経口」なる用語には、皮下、静脈内、筋内、動脈内、及び気管内注入、並びに輸液法が含まれる。非経口製剤はボーラス投与若しくは連続注入によって静脈内投与するか、又は公知の方法によって皮下投与することが好ましい。液体担体は非経口用途では周知のものであり、好ましくは滅菌水、生理食塩水、デキストロース水溶液、糖溶液、エタノール、グリコール及びオイルなどが挙げられる。
【００６５】
経口投与用の錠剤及びカプセル剤は、結合剤、充填剤、潤滑剤、湿潤剤などの通常の添加剤を含有してもよい。経口用液体製剤は、水性または油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ剤、エリキシル剤などとして用いられるか、水や他の適当な賦形剤で還元して使用する乾燥製品として与えられる。こうした液体製剤は、懸濁剤、乳濁剤、非水性賦形剤や保存剤などの通常の添加剤を含有してもよい。
【００６６】
局所塗布に適当な製剤は、水性または油性懸濁液、溶液、乳濁液、ゲル、好ましくは乳濁液ベースの軟膏として用いられる。
【００６７】
本発明に基づく医薬製剤の単位服用量は、一日所用量の前記ポリペプチドを含有するか、又はその等分量を含有させて所望の用量とすることが可能である。治療上許容される最適用量及び与えられた患者（例、ヒトなどの哺乳動物）に対する用量は、有効成分の効果；患者の年齢、体重、健康状態、性別及び食餌内容；投与の時間及び経路；クリアランス率；処置の目的（例、治療か予防か）；並びに治療する疾患の性質など各種の因子に応じて異なる。
【００６８】
０．００５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．００５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の全身用量が有効であると期待される。治療する疾患の性質に応じて、全身投与か局所投与かによらず、一回の用量は０．００５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分を含有することが可能である。
【００６９】
したがって本発明は更に、
（ａ）治療における本発明のポリペプチドの用途、
（ｂ）医薬品の製造における本発明のポリペプチドの用途、
（ｃ）患者における、ＣＣＯの発生の抑制、阻害、又は不活性化をともなう状態の治療又は予防のための方法であって、前記患者に本発明のポリペプチドの無毒性かつ阻害量を投与することを含む方法、
（ｄ）哺乳動物細胞におけるＣＣＯの発生における本発明のポリペプチドの用途、
（ｅ）哺乳動物における雄性不妊症を治療するための方法であって、本発明のポリペプチドを前記哺乳動物の精子に加えることを含む方法、
（ｆ）細胞クローニングにおける卵母細胞−体細胞核移植の効率を向上させるための方法であって、本発明に基づくポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードした核酸を、体細胞の内容物との融合よりも前または後に卵母細胞に加えることを含む方法を提供する。
【００７０】
更に、本発明に基づくタンパク質または該タンパク質をコードした核酸配列を、ヒトなどの哺乳動物の受精能の状態（例、妊娠可能か不妊か）を判定するための診断方法において使用することが可能である。
【００７１】
したがって本発明は更に、哺乳動物の受精能を判定するための診断方法であって、哺乳動物から得た試験試料中に存在するかあるいは存在しない本発明に基づくタンパク質もしくは該タンパク質をコードした核酸配列の量を求めることを含み、その量が前記哺乳動物の受精能のレベルを示す方法を提供する。
【００７２】
更なる診断又はスクリーニング方法は、
（ａ）特定の個体から哺乳動物のＰＬＣζ遺伝子のヌクレオチド配列を有する試験試料を得て、
（ｂ）前記試験試料から得た配列の領域を、配列番号３，４，５，６，８又は１０などの所定の野性型哺乳動物ＰＬＣζ配列の対応した領域と比較し、
その際、前記所定配列に対する前記試料配列中の変異が、低下した受精能または不妊などの所定の状態を示すものであることを特徴とし、この所定の状態とは、その状態に見られない正常な生物学的機能にとっての必要条件であるカルシウム振動パターンの阻害をともなうような状態である。
【００７３】
好ましくは試験試料はゲノムＤＮＡを含むものである。
【００７４】
特に好ましいスクリーニング法は、受精能の問題が疑われる個体をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ヒトＰＬＣζ遺伝子のヌクレオチド配列又はそれによってコードされるアミノ酸配列を含む試験試料を前記個体から得る工程と、
（ｂ）ヒトＰＬＣζ遺伝子またはそれによってコードされるアミノ酸配列の変異体の存在、あるいはヒトＰＬＣζ遺伝子またはそれによってコードされるアミノ酸配列の変異体の存在を示すかこれに関連した１以上の代用マーカーの存在について前記試験試料を分析する工程とからなり、
ヒトＰＬＣζ遺伝子またはこれによってコードされるアミノ酸配列の前記変異体は野性型ＰＬＣζ配列と比較した場合に少なくとも１個の変異を示すものであることを特徴とする方法である。
【００７５】
上記の方法はヒト以外の哺乳動物ならびに哺乳動物以外の動物にも同様に適用されることは当業者には明らかであろう。
【００７６】
分析工程（ｂ）は、従来のタンパク質配列決定法（質量分析法、マイクロアレイ解析、ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ等）、及び／又は抗体に基づいた検出法（例、ＥＬＩＳＡ）の１以上から選択することが可能である。本発明に基づく方法のいずれにおいても本タンパク質に対する抗体を作成することが可能である。
【００７７】
したがって精子試料中のタンパク質ＰＬＣζをアッセイすることを含む、雄性不妊症について試験するための方法に関し、当該方法は、前記タンパク質に対する抗体、特にタンパク質ＰＬＣζに対するモノクローナル抗体を用いて行うことが可能である。代わりに、ＰＬＣ−ゼータ遺伝子の配列は、ＰＣＲ増幅、制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定などの当業者には周知の方法を用い、ゲノムＤＮＡを含む試料で決定することも可能である。
【００７８】
したがって本発明は更に、本発明に基づくポリペプチドに対して作成された抗体、特に前記ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を提供するものである。
【００７９】
本スクリーニング法は、固体支持体上に固定された変異特異的オリゴヌクレオチドプローブのマイクロアレイにＤＮＡ（個体から得られたｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ）の標識試料をハイブリダイズさせることによって、複数の既知の変異について又はすべての可能な変異について同時スクリーニングを使用するものである。例えば、チップが小型の並列解析素子であるようなチップ技術を使用することができる。
【００８０】
本発明の方法はキットを使用して行うことが可能であり、当該キットは：
（ａ）ＰＬＣζ変異体のある領域に相当する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであって、該領域は対応する野性型ＰＬＣζ遺伝子配列から少なくとも１個の変異を含んでいるオリゴヌクレオチド；及び／又は
（ｂ）野性型ＰＬＣζ遺伝子配列に対し、（ａ）で特定した前記領域において一致する核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；及び／又は
（ｃ）野性型ＰＬＣζ遺伝子配列の特定領域に一致する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記特定領域は哺乳動物のゲノムＤＮＡ中に存在しない配列を有するオリゴヌクレオチド；及び／又は
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに対して特異的なオリゴヌクレオチドに相当する任意のペプチド配列に対して作成されたモノクローナル抗体などの抗体；及び、任意で、
（ｅ）前記個体のＤＮＡの所望の領域を増幅する（例えばＰＣＲを行うことにより）うえで適当な１以上の試薬、からなる。
【００８１】
キットの構成要素（ａ）〜（ｃ）のいずれかが固体支持体上に固定された複数の前記オリゴヌクレオチドからなることが好ましい。
【００８２】
本発明は更なる一局面において、卵母細胞における細胞質カルシウム振動を低下、抑制、若しくは防止する、及び／又は受精能を低下若しくは阻害する目的で使用するＰＬＣ−ゼータの阻害剤又は拮抗剤を提供する。このようなＰＬＣ−ゼータ阻害剤または拮抗剤は、既知の化合物、生体物質や他の物質であってもよく、あるいは新規な活性物質であってもよい。したがって本発明は更に、卵母細胞における細胞質カルシウム振動を低下、抑制、若しくは防止する、及び／又は受精能を低下若しくは阻害するうえで適当な活性物質であって、ＰＬＣ−ゼータの阻害剤または拮抗剤である活性物質を提供するものである。こうした活性物質は、医薬製剤と上記に述べたような薬学的に許容されるその担体との組合わせとして提供することが可能であり、男性避妊薬としての使用に適当である。
【００８３】
次に本発明を付属の図１〜５を参照しながら以下の非限定的実施例において更に説明する。
【実施例１】
【００８４】
ＰＣＲクローニングによる核酸／タンパク質の単離（ヒト）
ＮＣＢＩ（米国立衛生研究所内、米国立医学図書館、米国立バイオテクノロジー情報センター、アメリカ合衆国  メリーランド２０８９１州  ベセスダ所在）のヒトＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）データベースをＢＬＡＳＴアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用い、ラットホスホリパーゼＣのデルタ４型アイソフォームの公開されている配列（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｎｏ．Ｕ１６６５５−）を用いてホスホ−イノシチド特異的ホスホリパーゼＣの関連配列について検索した。得られた多数のポジティブな「ヒット」の内、ヒト精巣ｃＤＮＡに由来する新規なＥＳＴのクラスが見出された（例、アクセッション番号Ｎｏ．ＡＩ２１７８８８、ＡＡ７０７５８３、ＡＡ８６１０６４、ＡＡ６０９６２６）。
【００８５】
上記と同様のデータベース検索手法を用い、ＮＣＢＩのマウスＥＳＴデータベースからマウス精巣ｃＤＮＡに由来する新規なＥＳＴの関連するクラスを得た（例、アクセッション番号Ｎｏ．ＡＶ２５７２６０、ＡＶ２７７９０９、ＡＶ２７３３１６、ＡＶ２７７５６２）。
【００８６】
これらのＥＳＴのいずれにおいても完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は同定されなかったことから、これらのＥＳＴはいずれも部分的な精巣ｃＤＮＡ配列（４００塩基対未満からなる）を表すものである。
【００８７】
上記のＥＳＴの関連配列を増幅するように設計された特定のオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング法によって、ヒト及びマウスホスホリパーゼＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）の完全なタンパク質コード配列を下記の要領で得た。
【００８８】
ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック・ラボラトリーズ社、アメリカ合衆国  カリフォルニア９４３０３−４２３０  パロアルト  イースト・ミドウ・サークル  １０２０所在、＃ＨＬ５５０３ｕ）から得たＰＣＲで使用したプライマーは次のとおり。
【００８９】
順方向ヒトプライマー：５’  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  Ｃ  ３’  （２８量体）
【００９０】
逆方向ＴｒｉｐｌＥｘプライマー：  ５’  ＣＴＣ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＴＴＧ  ＧＴ  ３’  （２６量体）
【００９１】
上記の順方向プライマーはヒトＥＳＴ配列から得たものであり、下線で示した予想された停止コドンＴＧＡを含んでいた。逆方向プライマーはクロンテック社のラムダＴｒｉｐｌＥｘ２ベクター配列をコードしたものである。ＰＣＲは５０μＬの反応容量で、９６℃で３分間の初期変性の後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３分間のサイクルを３０サイクル行い、７２℃で５分間の最終伸長反応を行った。製造者の指示（プロメガ社カタログ番号第Ｍ７７４５号、プロメガ  ＵＫ  Ｌｔｄ．、イギリス国  サウサンプトンＳＯ１６  ７ＮＳ  チルワース・リサーチ・センター  デルタハウス所在）にしたがって、これらのプライマーをＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとともに用いて増幅した単一の約２ｋｂの産物を市販のベクターｐＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、製造者の指示（インビトロジェン社カタログ番号第Ｋ２８００−２０、イントロジェンＢＶ、オランダ国  グローニンゲン私書箱２３１２，９７０４ＣＨ所在）にしたがってこのプラスミドをコンピテントなＥ．Ｃｏｌｉに導入してプラスミドＤＮＡを調製した。製造者の指示（キアジェン社カタログ番号第１２１２５番、キアジェン  Ｌｔｄ．  ＵＫ、イギリス国  ウェスト・サセックスＲＨ１０  ９ＡＸ  クロウリー  ガトウィック・ロード  バウンダリー・コート所在）にしたがってＱｕｉａｇｅｎミニプレップ精製カラムを使用してＥ．ＣｏｌｉのカルチャーからプラスミドＤＮＡを単離した。
【００９２】
マウス精子ｃＤＮＡライブラリー（国立医学研究所（ロンドン）のポール・バーゴイン博士から提供されたラムダＺＡＰＩＩベクター（ストラタジーン社より入手可能、アメリカ合衆国  カリフォルニア９２０３７  ラ・ホヤ  ノース・トレイ・パインズ・ロード  １１０１１所在）を用いて作成）から得たＰＣＲで用いたプライマーは次のとおり。
【００９３】
順方向マウスプライマー：５’  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  Ｃ  ３’  （２８量体）
【００９４】
逆方向Ｔ７プライマー：  ５’  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  Ｃ  ３’  （２２量体）
【００９５】
上記の順方向プライマーはマウスＥＳＴ配列から得たものであり、下線を施した予想された停止コドンＴＣＡを含んでいた。逆方向プライマーはストラタジーン社のラムダＺＡＰＩＩベクター配列（Ｔ７配列）をコードしたものである。ＰＣＲは５０μＬの反応容量で、９６℃で３分間の初期変性の後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３分間のサイクルを３０サイクル行い、７２℃で５分間の最終伸長反応を行った。製造者の指示（プロメガ社）にしたがって、これらのプライマーをＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとともに用いて増幅した単一の約２ｋｂの産物を市販のベクターｐＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、製造者の指示（インビトロジェン社）にしたがってこのプラスミドをコンピテントなＥ．Ｃｏｌｉに導入してプラスミドＤＮＡを調製した。製造者の指示（キアジェン社）にしたがってＱｕｉａｇｅｎミニプレップ（商標）精製カラムを使用してＥ．ＣｏｌｉのカルチャーからプラスミドＤＮＡを単離した。
【００９６】
このようにして増幅及びクローン化したヒト及びマウスＤＮＡのヌクレオチド配列を、ｄローダミン・ダイ・ターミネーターキット（ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｋｉｔ）（ピー・イー・アプライドバイオシステムズ，イギリス国  ワーリントンＷＡ３  ７ＰＢ  バーチウッド・サイエンス・パーク・ノース  ケルビン・クローズ所在）を用いてアプライド・バイオシステムズ社のＡＢＩ３７７自動ＤＮＡシーケンサーで標準的なジデオキシ配列決定法を行って決定した。ＭａｃＶｅｃｔｏｒ配列解析ソフトウェア（オックスフォード・モレキュラー社、イギリス国  オックスフォードＯＸ４  ４ＧＡ  オックスフォード・サイエンス・パーク  メダワール・センター所在）を用いて完全なヒト及びマウスヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）解析を行って、ヒト及びマウスのＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣ  タンパク質）の完全なタンパク質コード配列を得た。ヒト配列は、６０８個のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする１８２４塩基対からなるＯＲＦであった。マウス配列は、６４７個のアミノ酸配列（配列番号２）をコードする１９４１塩基対からなるＯＲＦであった。
【００９７】
サルＰＬＣ−ゼータの同定及びクローニング
サイズで選別したカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）成体の精巣の１．５ｋｂよりも大きいｃＤＮＡからカニクイザルｃＤＮＡライブラリーを作成し、多くの新たな完全長インサートＤＮＡ配列を決定した。ｈＰＬＣ−ゼータ配列を用いたＢｌａｓｔ検索によって成体カニクイザル精巣ｃＤＮＡライブラリーから２個の相同なサル配列を得た（アクセッション番号Ｎｏ．ＡＢ０７０１０８及びＡＢ０７０１０９）。これら２個のカニクイザルｃＤＮＡクローン内のＯＲＦを上記のようにしてＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）（ｐｃＤＮＡゼータ）にクローニングし、上述のようにインサートＤＮＡを両鎖に沿って配列決定した。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ）及びＲＰＳ−Ｂｌａｓｔ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ）によるドメイン構造を用いて相同配列分析及びアラインメントを行った。
【実施例２】
【００９８】
哺乳動物細胞での発現用組換えベクターの調製
ヒト及びマウスＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζ）配列の完全なＯＲＦを哺乳動物の発現ベクターであるｐＴａｒｇｅＴ（プロメガ社、イギリス国  サウサンプトンＳＯ１６  ７ＮＳ  チルワース・リサーチ・センター  デルタハウス所在）にサブクローニングした。これらの完全長配列を、下記に示す開始及び停止コドンを有する特定のオリゴヌクレオチドを用いて、上述のようにＰｆｕポリメラーゼ（プロメガ社）によるＰＣＲを行って増幅した。
【００９９】
使用したヒトプライマーは次のとおり。
【０１００】
順方向ヒトプライマー：５’  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  Ｃ  ３’  （２８量体）
【０１０１】
逆方向ヒトプライマー：  ５’  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＴＧＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ３’  （２４量体）
【０１０２】
逆方向ヒトプライマーには下線で示した開始コドンＡＴＧが含まれており、順方向ヒトプライマーには上述した最初のＰＣＲクローニング段階で用いた停止コドンが含まれていた。上述の要領でＰＣＲを行った。得られた約１．８ｋｂの産物をｐＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、上述のようにＤＮＡインサートの配列を決定した。この約１．８ｋｂのヒトＤＮＡインサートを制限酵素ＥｃｏＲ１で消化してｐＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔベクターから切り出し、得られた制限フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離してＱｉａｇｅｎＤＮＡゲル抽出キットを用いて精製し、ＥｃｏＲ１で予め消化した哺乳動物用ベクターｐＴａｒｇｅｔにライゲートした。ライゲーションは１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社）の存在下、１２℃で一晩かけて行い、ライゲートしたプラスミドをコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社）に導入し、上述のようにＱｉａｇｅｎカラムを用いてプラスミドＤＮＡを精製した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素で消化してヒトＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣ  インサート）が正しい方向で組み込まれたクローンであることを確認した。
【０１０３】
使用したマウスプライマーは次のとおり。
【０１０４】
順方向マウスプライマー：５’  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  Ｃ  ３’  （２８量体）
【０１０５】
逆方向マウスプライマー：  ５’  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＣＴＴ  Ｃ  ３’  （１９量体）
【０１０６】
逆方向マウスプライマーには下線で示した開始コドンＡＴＧが含まれており、順方向マウスプライマーには上述の最初のＰＣＲクローニング段階で用いた停止コドンが含まれていた。上述の要領でＰＣＲを行った。得られた約１．９ｋｂの産物をｐＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、上述のようにＤＮＡインサートの配列を決定した。この約１．９ｋｂのマウスＤＮＡインサートを制限酵素ＥｃｏＲ１で消化してｐＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔベクターから切り出し、得られた制限フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離してＱｉａｇｅｎＤＮＡゲル抽出キットを用いて精製し、ＥｃｏＲ１で予め消化した哺乳動物用ベクターｐＴａｒｇｅｔにライゲートした。ライゲーションは１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社）の存在下、１２℃で一晩かけて行い、ライゲートしたプラスミドをコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社）に導入し、上述のようにＱｉａｇｅｎカラムを用いてプラスミドＤＮＡを精製した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素で消化してヒトＰＬＣ−ゼータ（ＰＬＣζインサート）が正しい方向で組み込まれたクローンであることを確認した。
【実施例３】
【０１０７】
ヒト及びマウス発現プラスミドのＣＨＯ細胞へのトランスフェクション
実施例２で述べたようにして調製したヒト及びマウスｐＴａｒｇｅＴ／ＰＬＣ  発現プラスミドＤＮＡを、組織培養中で培養したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系に脂質媒介トランスフェクション法によって別々に導入した。血清含有培地であるＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で培養皿当たり５００，０００個の細胞密度にまで培養したＣＨＯ細胞に、無血清ＤＭＥＭ中で４０μｇプラスミドＤＮＡと４０μＬリポフェクタミン２０００（ライフ・テクノロジーズ社、イギリス国  ペイズリー  インチナン・ビジネス・パーク  ファウンテン・ドライブ  ３所在）でトランスフェクションを行った。１５時間後にＣＨＯ細胞を血清含有ＤＭＥＭに戻した。
【０１０８】
これと平行してコントロール実験として、同一のＣＨＯ細胞をプラスミドＤＮＡの非存在下でリポフェクタミンで同様に処理した。
【実施例４】
【０１０９】
有効性の検証−ＣＨＯ細胞におけるＰＬＣ  
実施例３にしたがって調製したトランスフェクト細胞をトランスフェクションの３０分後に培地で洗い、カルシウム感受性蛍光指示薬であるｆｕｒａ−２−ＡＭと６０分間インキュベートした。細胞を更に培地で洗った後、顕微鏡のステージに載せてｆｕｒａ−２の蛍光によって検出される細胞のカルシウム濃度の変化を観察した。ＰＬＣζ発現ベクターをトランスフェクトした細胞においてのみ細胞のカルシウム濃度の周期的変化が観察された。この細胞カルシウムの特定の経時的挙動、すなわちカルシウム振動の発生は、受精時に精子と融合した際及び可溶性の精子タンパク質を卵細胞に直接注入した場合に卵細胞で見られるものと同様であった。図１はマウスＰＬＣζに関してこれを実証するものである。このことは、本発明者等がヒト及びマウス精巣で同定した新規なＰＬＣζタンパク質を使用することによって哺乳動物細胞の細胞カルシウム濃度を実際に制御することが可能であることを示すものである。
【実施例５】
【０１１０】
有効性の検証−卵母細胞におけるＰＬＣ  
実施例２で述べたようにしてｐＴａｒｇｅＴベクターにクローニングしたヒト及びマウスＰＬＣζのオープンリーディングフレームを制限酵素処理により直線化し、ＲｉｂｏｍａｘＲＮＡ合成キット（プロメガ社）を用いてＰＬＣζをコードした相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成して１２０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁した。ＭＩＩ期で停止したマウス卵母細胞を雌のマウスから採取して１０分間ｆｕｒａ２−ＡＭを取り込ませ、Ｈ−ＫＳＯＭ中で洗い、ニコン社製倒立顕微鏡（Ｄｉａｐｈｏｔ）のステージに載せた。スワン（Ｓｗａｎｎ，  Ｋ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１０  １２９５−１３０２  （１９９０））によって述べられるようにｃＲＮＡを卵細胞の容積の３〜５％までマイクロインジェクトし、カルシウム濃度を監視した。
【０１１１】
図２は、マウス卵細胞内でマウスＰＬＣζがカルシウム振動を引き起こすことを示したものである。実施例４及び５の実験から得られたデータより、ＰＬＣζがすべてのタイプの細胞でカルシウム振動を引き起こす効果を有することが明らかに示される。
【実施例６】
【０１１２】
ＰＬＣ−ゼータが精子因子であることの更なる根拠
相補的ＲＮＡ合成とｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳
マウスＰＬＣζの１９４１塩基対からなるオープンリーディングフレームをｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングし、配列決定した後サブクローニング（ｐＴａｒｇｅｔ，プロメガ社）してｐＴａｒｇｅｔ−ｍＰＬＣζを作成した。３ｍＭのｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの存在下、直線化したｐＴａｒｇｅｔ−ｍＰＬＣζから相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成し（ＲｉｂｏｍａｘＲＮＡ合成キット、プロメガ社）、イソプロパノール沈澱して、４Ｕ／μｌのＲＮａｓｉｎ（プロメガ社）を含んだＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位指向型突然変異誘発キット（ストラタジーン社）を用いてＰＬＣζに２１０Ａｓｐから２１０Ａｒｇへの突然変異を導入してＤ２１０ＲＰＬＣζを得た。上記と同様に、それぞれ完全長（アミノ酸７５６個）及びＰＨドメインを欠失させたＰＬＣδ１（Δ１−１３２）をコードした、ラットＰＬＣδ１及びΔＰＨＰＬＣδ１のコンストラクト及びｃＲＮＡ、並びにＤ２１０ＲＰＬＣζを、ｐＴａｒｇｅｔを用いて調製した。ｃＲＮＡ（２μｇ）を［３５Ｓ］メチオニン（アマシャム・ファーマシア社）の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｒｅｔｉｎｏｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ，  プロメガ社）で発現させた。放射性同位体標識したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにて分析し、ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウェア（バイオラド社）を用いてディスプレイした。
【０１１３】
ｃ−Ｍｙｃ−エピトープタグ付加、細菌での発現、及びＰＬＣζの定量化
１９４１塩基対からなるマウスＰＬＣζのオープンリーディングフレームを５’末端にインフレームなｃ−Ｍｙｃエピトープタグを付加して（Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６  ２７５８−２７６５  （２００１））、ｐＧＢＫ−Ｔ７（クロンテック社）にサブクローニングした。このｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζをｐｃＤＮＡ３．１に更にサブクローニングし、上述のように卵細胞にマイクロインジェクトするためのＴ７部位（リボマックス社）からのｃＲＮＡ合成に先立って配列を確認した。細菌での発現を行うため、ｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζをインフレームなヘキサヒスチジンを３’末端にタグ付加してｐＢＡＤ（インビトロジェン社）にサブクローニングした。このｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζ−Ｈｉｓｔａｇタンパク質は、５回の凍結−融解及び超音波処理のサイクルによって菌体ペレットの抽出を行った後、ニッケル親和性クロマトグラフィ（Ｐｒｏｂｏｎｄ、インビトロジェン社）によって精製することによって、０．２％ｗ／ｖアラビノースで誘導したＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生された。ＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアース社、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の定量化を行った。ＱｕａｎｔｉｆｙＯｎｅソフトウェア（バイオラド社）を用い、ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（１：２０００、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）及びウサギ抗ＰＬＣζ抗血清（１：１０００）を用いて、異なる濃度のｃＲＮＡをマイクロインジェクトした卵細胞で発現されたｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζバンド、Ｅ．ｃｏｌｉから単離したｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζ−Ｈｉｓｔａｇタンパク質、及び１０４〜１０６個のマウス精子から得たカリブレートした精子抽出ＰＬＣζのデンシトメトリーを行った。１００個のマイクロインジェクトした卵細胞の群において相対ｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζ含量を計算するため、ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いたイムノブロットデンシトメトリー（Ｍａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６  １１５０−１１５３  （１９９７））による分析から、Ｅ．Ｃｏｌｉから精製した所定量のｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζ−Ｈｉｓｔａｇタンパク質を用いて、カリブレーション基準プロットを構築した。定量分析を行ううえで、マウス卵細胞で発現されたマイクロインジェクトしたＥＧＦＰｃＲＮＡについて示されたのと同様に、ｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζタンパク質の発現量はｃＲＮＡのマイクロインジェクション後の時間に対して直線的であるものと仮定した。ｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζタンパク質はｃＲＮＡのマイクロインジェクションの３時間以内では検出限界以下であることからこの仮定が必要である。すなわち１個のマウス卵細胞について、０．０２ｍｇ／ｍｌのｃＲＮＡのマイクロインジェクションの５時間後に発現するｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζの計算値が４４０〜７５０ｆｇである場合、０．５時間後（最初のＣａ２＋濃度変化が通常観察される時間）に４４〜７５ｇが発現することと同等である。所定数のマウス精子中における相対ＰＬＣζ含量を推定するため、抗ＰＬＣζ抗体を用いた別のカリブレーションプロットを異なる濃度のｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζ−Ｈｉｓｔａｇタンパク質について構築した。
【０１１４】
下記セクション（ａ）〜（ｃ）に結果を示した。
精子抽出物からのＰＬＣζの免疫除去
ハムスター精子から調製した可溶性抽出物（Ｐａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３４１  １−４  （１９９９））を、タンパク質Ｇビーズ（１ｍｇ／ｍｌ，ＳｅｉｚｅＸキット、ピアース社）に共有結合させたコントロールとしてのＩｇＧまたは抗ＰＬＣζ抗体とともに１時間、４℃でインキュベートした。上清及び沈澱したビーズ中のＰＬＣζ含量を抗ＰＬＣζ抗体を用いたイムノブロット分析によって求めた。抗体処理した精子上清は更にウニ卵細胞のホモジェネートを用いたｆｌｕｏ−３蛍光測定法によってＣａ２＋放出活性についても分析を行い、パーキンエルマーＬＳ５０Ｂ蛍光計を用いて監視した（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ  ４３７  ２９７−３００  （１９９８））。これらの上清は、下記に述べるようにマウス卵細胞へのマイクロインジェクションによってＣＣＯを引き起こす能力についても分析した。精子ＰＬＣζタンパク質の免疫除去量は、各実験において（ｎ＝４）精子抽出物に対する抗体ビーズの最適な比を用いることによって最大となった。この最適比はコントロールとしてのＩｇＧビーズによる処理後にＣａ２＋放出活性を依然保持している精子抽出物の最低濃度（０．３〜０．８ｍｇ／ｍｌ）として各精子抽出物について経験的に求めた。
【０１１５】
下記セクション（ｄ）に結果を示した。
配偶子の調製及び取り扱い
ＨＥＰＥＳで緩衝したＫＳＯＭまたはアミノ酸を補ったＫＳＯＭのいずれかでマウス卵細胞処置を行った（Ｓｕｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  １５  １７９１−１８０１  （２０００））。５ＩＵのＰＭＳＧの注入４８時間後にＨＣＧ（インターベット社、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）を注入して雌ＭＦ１マウスを過剰排卵させた。ＨＣＧ注入の１３．５〜１４．５時間後に卵細胞を採取し、３７℃のミネラルオイル下Ｈ−ＫＳＯＭの１００μｌ液滴中に保存し、１時間以内にｃＲＮＡをマイクロインジェクトした。ｃＲＮＡのマイクロインジェクションの５時間後に、ＳＤＳサンプル用バッファをペレット化した卵細胞に加え、５分間９５℃でインキュベートした後、上述のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロット、次いでｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたデンシトメトリーによる分析を行って、卵細胞でのｃＭｙｃ−ＰＬＣζの発現量を調べた。カリブレートしたマウス精子のペレットを１５ｍＭのジチオトレイトールを加えた１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁し（Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６０  ７４７−７５５  （１９９９））、液体窒素中での凍結−融解サイクルを５回行ってから４℃で１０分間２０，０００ｘｇで遠心した後、上述のようにＰＬＣζ抗体を用いて可溶性抽出物のデンシトメトリーによる分析を行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精実験では、精子に２〜３時間受精能を獲得させてから卵細胞に加えた。卵細胞の活性化及び発生実験を２μＭのサイトカラシンＤを含んだＨ−ＫＳＯＭ中で４時間かけて行った。２細胞期、胞胚、及び胚盤胞への更なる発生は、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃のミネラルオイル下、ＫＳＯＭの５０μｌの液滴中で行った。
【０１１６】
ＭＩＩ期で発生停止したマウス卵細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度の測定
４μＭのＦｕｒａ  ｒｅｄ−ＡＭ（モレキュラープローブズ社）を１０分間取り込ませた卵細胞をＨ−ＫＳＯＭ中で洗い、ニコン社製倒立顕微鏡（Ｄｉａｐｈｏｔ）のステージに載せた。取り込ませた媒質にはスルフィンピラゾンを加えて色素による区画化及び押出しを防止した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４  ２２３−２４１  （１９９７））。１２０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）にｃＲＮＡを加えた溶液を上述したように卵細胞の容積の３〜５％までマイクロインジェクトした（Ｓｗａｎｎ  １９９０，  ｉｂｉｄ，  Ｅｘａｍｐｌｅ  ５）。ＰＬＣζのｃＲＮＡをマイクロインジェクトする（０．０２ｍｇ／ｍｌ；ｎ＝９）前に、卵細胞を１０μＭのシクロヘキシミドを含む溶液中で３０分プレインキュベートしたコントロール実験ではタンパク質の合成は阻害された。注入量はボーラス注入による排除量から予測した。Ｃａ２＋の測定は、上述したようなＣＣＤに基づいたイメージングシステム（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７；  ｉｂｉｄ）か、モノクロメーター（フォトニクス社）からの照射光をＭｅｔａＦｌｕｏｒ  ｖ．４．０（ユニバーサル・イメージング社）で制御したツァイス社製Ａｘｉｖｅｒｔ１００で行った。
【０１１７】
結果
（ａ）ＰＬＣζは卵細胞のＣａ２＋振動を引き起こす。
哺乳動物の精子因子の重要な特徴は、哺乳動物卵細胞に見られる受精に伴う過渡変化に類似したＣＣＯを引き起こす能力にある。精子のＰＬＣζがこうしたＣＣＯを引き起こすか否かを調べるため、本発明者等は上記に精原細胞ｍＲＮＡに関して述べたように、マイクロインジェクションによってＰＬＣζの相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）をＭＩＩ期で発生停止したマウス卵細胞に導入した。３〜５％の注入容積の注入後の卵細胞で０．１ｍｇ／ｍｌ未満の濃度に相当する２ｍｇ／ｍＬのＰＬＣζｃＲＮＡのピペット濃度をマイクロインジェクトした卵細胞では、図２に示されるＣＣＯと同様の、１５〜２０分以内に開始し、長時間にわたって持続するＣＣＯが見られた。高い振動数は高濃度の精子抽出物をマウス卵細胞に注入した際に見られる振動に類似していた。０．００２ｍｇ／ｍｌのＰＬＣζｃＲＮＡ濃度に１０００倍に希釈した場合では振幅は同様だが振動数の小さいＣＣＯが得られた（図６（ａ）の中央のトレース。卵細胞内の濃度０．００１ｍｇ／ｍｏｌ）。シクロヘキシミドで処理してタンパク質合成を阻害した卵細胞ではＰＬＣζｃＲＮＡのマイクロインジェクション（０．０２ｍｇ／ｍｏｌ、ｎ＝９、図６（ａ）、下段のトレース）後にＣａ２＋濃度の過渡変化を示したものはなかった。試験を行った０．００２〜２ｍｇ／ｍｌの範囲の４つの異なる濃度のＰＬＣζｃＲＮＡをマイクロインジェクトした卵細胞の１００％で著明なＣＣＯが観察された（図６（ｂ））。重要な点として、ＣＣＯの振幅ではなく振動数がＰＬＣζｃＲＮＡの濃度とともに変化し、異なる濃度の精子抽出物で見られる同様の現象とまったく一致した点である。使用したピペット濃度では最も高い２ｍｇ／ｍｌでは、７．３  ３．２分の平均スパイク間間隔を有するＣＣＯを生じた（図６（ｂ））。注入の２時間以内に信号を発生させた最も低いＰＬＣζｃＲＮＡのピペット濃度（０．００２ｍｏｌ／ｍｌ）では２０．１±５．４分の平均スパイク間間隔を示した（図６（ｂ））。これらの値はいずれもマウス卵細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）における平均スパイク間間隔（１２．１±５．８分）と大きく異なっている。これに対して、０．２及び０．０２ｍｇ／ｍｌのＰＬＣζｃＲＮＡ濃度におけるスパイク間間隔（それぞれ１３．６±３．２及び１２．７±６．０分）はＩＶＦと大きく異ならない。
【０１１８】
（ｂ）ＰＬＣζによる受精様Ｃａ２＋シグナル
受精時のＣＣＯには幾つかの固有の特徴が見られる。最初のＣａ２＋過渡変化は後続の振動よりも常に長時間持続し、主ピーク上に興味深い一群の小さな正弦状の増加が見られる。ＩＶＦと一致するスパイク間間隔を生ずるピペット濃度（０．０２ｍｇ／ｍｌ；図６（ｂ））のＰＬＣζｃＲＮＡのマイクロインジェクションによって、同様に長時間持続する最初のＣａ２＋の過渡変化が見られたばかりでなく、同様に小さな正弦状の増加パターンが見られた。０．０２ｍｇ／ｍｌのＰＬＣζｃＲＮＡのマイクロインジェクション後の最初のＣａ２＋の上昇は、平均間隔（ＰＬＣζ  ２．８±０．６分、ｎ＝３９に対し、ＩＶＦ  ３．０±０．７分、ｎ＝１６）ならびに、最初の過渡変化に重なるより小さなＣａ２＋の上昇のクラスターを再現可能に発生する点において最初のＩＶＦ過渡変化と一致している。以下のマイクロインジェクション実験では、受精に典型的な正確なＣａ２＋のシグナリング条件を与えるうえで特に断らない限り０．０２ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＬＣζｃＲＮＡを使用した。
【０１１９】
（ｃ）１個の精子中のＰＬＣζの生理学的濃度
マイクロインジェクトされた卵細胞内で発現するＰＬＣζを定量化するため、上述のようにｃ−ＭｙｃエピトープタグをＰＬＣζのＮ末端に導入した。異なる濃度でマイクロインジェクトされたｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζｃＲＮＡは、卵細胞でＣａ２＋振動を発生させるうえでタグ付加していないＰＬＣζと同様に効果的であり、このことはｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣについて示されるようにｃ−ＭｙｃタグのＮ−末端への付加がＰＬＣζの活性に悪影響を及ぼすものではないことを示している。更に卵細胞で発現するｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζタンパク質は抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたイムノブロットで、予測される重さが７８ｋＤａの単一のバンドとして容易に検出されたのに対して、注入を行っていない卵細胞では免疫反応は見られなかった。ネイティブなマウス精子のＰＬＣζ（７４ｋＤａ）と組換えによって得たｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζタンパク質（７８ｋＤａ［７４ｋＤａＰＬＣζと４ｋＤａのｃ−Ｍｙｃタグ］）の相対的な移動度の比較によって、ＰＬＣζのｃＤＮＡクローンの推定されるＯＲＦ配列（配列番号２；７４ｋＤａ）が完全な精子のＰＬＣζ配列を表していることが示された。卵細胞で発現する免疫反応性の７８ｋＤａのｃ−ＭｙｃＰＬＣζタンパク質のデンシトメーターによる分析結果を、細菌に生産させた精製組換えｃ−Ｍｙｃ−ＰＬＣζタンパク質のカリブレートした量と比較することによって、０．０２ｍｇ／ｍｌのｃＲＮＡを用いた場合にＣａ２＋振動を引き起こすＰＬＣζタンパク質の量として４４〜７５ｆｇ／卵細胞（ｎ＝４）が求められた。このｃＲＮＡ濃度がＩＶＦ応答を最もよく模倣するものであるが、１０倍低い濃度（０．００２ｍｇ／ｍｌのｃＲＮＡを用いた４〜８ｆｇのＰＬＣζタンパク質／卵細胞）であってもＣａ２＋振動を引き起こすことが可能である（図６）。
【０１２０】
更に精子のＰＬＣζ含量を、所定数のマウス精子を用いてＰＬＣζポリクローナル抗体によるデンシトメーター分析を行って求め、組換えＰＬＣζのカリブレートした量と比較した。１０４〜１０６個のマウス精子を含む試料から得た組換えＰＬＣζタンパク質のカリブレーションプロットにデンシトメーターによる測定値を用いることによって、１個のマウス精子が２０〜５０ｆｇのＰＬＣζタンパク質を含有すると算出された（ｎ＝４）。したがって１個の卵細胞において受精と同様のＣａ２＋振動を生じさせることが可能なＰＬＣζの濃度（０．００２〜０．０２ｍｇ／ｍｌのｃＲＮＡによる４〜７５ｆｇ）は１個の精子におけるＰＬＣζの含量（２０〜５０ｆｇ）と同じ範囲内にある。観察された定量的相関は、１個の精子からのＰＬＣζが精子と卵子の融合時に見られるようなＣａ２＋振動を生じさせるのに充分であることを示すものである。
【０１２１】
（ｄ）精子ＰＬＣζの除去によりＣａ２＋振動が消失する。
精子のＰＬＣζが卵細胞におけるＣａ２＋変動の固有の原因であるかどうかを確認するため、上述のように抗ＰＬＣζ抗体を用いて精子抽出物の含有ＰＬＣζを特異的に除去した。イムノブロット分析によれば、コントロール抗体による処理後では精子抽出物の上清にＰＬＣζタンパク質が残存するのに対して、ＰＬＣζ抗体で処理した上清にはＰＬＣζは存在しない。対応する沈降抗体試料の分析によって、精子のＰＬＣζはＰＬＣζ抗体によって効果的に除去されるがコントロール抗体によっては除去されないことが示された。ウニ卵のホモジェネートアッセイを用いた抗体処理精子抽出物におけるＣａ２＋放出活性の評価を行ったところ、ＰＬＣζを除去した試料ではＣａ２＋変動活性が見られなかったのに対して、コントロール抗体で処理した、ＰＬＣζタンパク質を含有する精子抽出物では著明なＣａ２＋放出が認められた。更に、抗体処理精子抽出物のマウス卵細胞へのマイクロインジェクションによって、未処理の試料がＩＶＦ様のＣａ２＋振動を発生させる能力は、コントロール抗体で処理した試料では完全に保存されているのに対して、Ｃａ２＋放出活性はＰＬＣζ除去によって効果的に消失することが説明された。
【０１２２】
これらのＰＬＣζ抗体除去実験（ｎ＝４）は、ＰＬＣζがマウス卵細胞においてＣａ２＋放出を引き起こす能力を有する精子抽出物の唯一の成分であることを示唆するものである。このことと、１個のマウス精子中のＰＬＣζの濃度は１個のマウスの卵細胞にＩＶＦ様Ｃａ２＋振動を引き起こすうえで充分であるという根拠を併せ考えると、免疫除去試験のデータによって従来哺乳動物精子因子として知られているものとＰＬＣζとは同じものであるという強力な証拠が与えられるものである。
【０１２３】
（ｅ）ＰＬＣζは正常な胚発生を活性化する。
ＰＬＣζｃＲＮＡ（０．０２ｍｇ／ｍｌ）をマイクロインジェクトされた卵細胞はＣａ２＋振動の性質のすべてを示し、これはＩＶＦによるものとまったく同じであり（上記の結果（ａ）及び（ｂ））、１個の精子のＰＬＣζ含量と同等である（上記（ｃ））ことから、卵細胞の発生過程をＰＬＣζのマイクロインジェクションの後数日間にわたって観察した。ＰＬＣζをマイクロインジェクトした卵細胞では、正常な発生が２４時間以内に２細胞期に進み（７８％、ｎ＝１４７）、４〜５日目までに多くが胞胚または胚盤胞期に達した（６２％、ｎ＝７６）ことからこれらの細胞では活性化が見られた（図４（ａ））。コントロールとしてバッファをマイクロインジェクトした卵細胞で２細胞期に達したものはなく、活性化がマイクロインジェクションを行ったことの結果として起こるものではないことが示された。ＰＬＣζで誘導した胚の内、２細胞期あるいは胞胚・胚盤胞期にまで発生したものの割合は、ストロンチウムイオンによって単為発生させた（ｎ＝７５）卵や、オスとの交尾によるｉｎ  ｖｉｖｏ受精（ｎ＝１０１）後にメスマウスから１細胞期の胚を採取した場合と同じであった（図４（ａ））。
【０１２４】
マウス卵細胞へのＰＬＣζのマイクロインジェクションの２４時間及び５日後に撮影した顕微鏡写真では、２細胞期及び胚盤胞期への正常な胚発生が見られた（それぞれ左及び右の写真、図４（ｂ））。精子による受精後に得られた胚との形態学的な差異は見られなかった。したがって卵細胞でのＣａ２＋振動の誘導後、精子ＰＬＣζのマイクロインジェクションによっても卵活性化及び胚発生に必要なイベントのカスケード全体が受精時の精子と同様に引き起こされた。
【０１２５】
例えば卵細胞中の別の分子とのタンパク質−タンパク質相互作用のように、ＰＩＰ２の加水分解以外のＰＬＣζの新規な作用が卵細胞の活性化を引き起こす原因となっている可能性が依然残る。卵細胞の活性化及び胚発生に酵素的に活性なＰＬＣζが必要とされるかどうかを試験するため、Ｃａ２＋振動を引き起こさないことが証明されているＤ２１０ＲＰＬＣζのｃＲＮＡ（０．０２ｍｇ／ｍｌ）をマイクロインジェクトし、卵細胞の活性化を２４時間後に評価した。Ｄ２１０ＲＰＬＣζのｃＲＮＡをマイクロインジェクトした卵細胞の内で前核期または２細胞期にまで進んだものは見られず（図５、ｎ＝２０）、精子ＰＬＣζの酵素機能が卵細胞の活性化には不可欠であることが示された。
ヒトＰＬＣ―ゼータはマウス卵母細胞でＣａ振動を引き起こす。
【０１２６】
ｈＰＬＣ−ゼータがＣａ２＋変化を引き起こす能力を調べるため、ｈＰＬＣ−ゼータのｃＲＮＡをＭＩＩ期で停止したマウス卵母細胞に２０μｇ／ｍｌのｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡのピペット濃度でマイクロインジェクトした。これは３〜５％の注入容積の注入後、卵母細胞内で０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度に相当する。図８（Ａ）は、マイクロインジェクトしたｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡの４つの異なる濃度のそれぞれについてＣａ２＋の代表的な記録例を示したものである。ｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡは２０μｇ／ｍｌでマイクロインジェクションから１０〜１５分以内に高振動数のＣａ２＋振動を引き起こした（平均スパイク間間隔：４．２１±１．７９分）。マウスＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡ及びハムスター精子抽出物のマイクロインジェクションで見られたように、低濃度の刺激では低振動数のＣａ２＋振動が得られた（Ｓｗａｎｎ，  １９９０；  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２）。ｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡは０．０２μｇ／ｍｌのピペット濃度であってもマイクロインジェクションから２時間以内にＣａ２＋振動を依然誘導し得たことは注目に値する。２０〜０．０２μｇ／ｍｌの広い範囲のｃＲＮＡ濃度を用いたが、各濃度で見られたＣａ２＋振動は３〜４時間の同様な長さで持続した（図８（Ａ））。ｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡの用量−応答の関係を示す平均スパイク間間隔のデータを図８（ｂ）のヒストグラムにまとめた。
【０１２７】
ｈＰＬＣ−ゼータによる胚発生
２０μｇ／ｍｌのｍＰＬＣ−ゼータをマウス卵母細胞にマイクロインジェクトすることによってＣａ２＋振動が誘導され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精におけるのと同等の発生率で胚盤胞期への発生が見られることが以前に証明されている。ｈＰＬＣ−ゼータによっても発生が助長されるか、また振動数が胚発生にどのような影響を与えるかについて調べるため、ＭＩＩ期で停止した卵母細胞に２０、２．０、及び０．２μｇ／ｍｌのｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡを注入して、２４時間及び９６時間観察した。３つの濃度はいずれも、卵母細胞を活性化し、２細胞期への発生を可能とするうえで有効であった（図９）。２．０及び０．２μｇ／ｍｌのｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡを用いた場合、それぞれ３３．３及び３８．９％のマウスの胚が胞胚／胚盤胞へと発生した（図９（Ａ））。これはｉｎ  ｖｉｖｏ受精における発生率と同等の値であり、異系交雑したマウス系を使用した本発明者等の条件下での５５〜６０％の単為生殖活性化率と同等の値である。しかしながら、２０μｇ／ｍｌで生ずる高いＣａ２＋振動数（低い平均スパイク間間隔）は、胞胚／胚盤胞期への発生を助長するうえで有効ではなく（胞胚／胚盤胞に到達した卵母細胞は１．８％）、これらの胚の多くが２細胞期で発生を停止した。
【０１２８】
ｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡのマイクロインジェクションによって得られたマウス胚の顕微鏡写真では、これらの胚がｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精後の胚に類似した形態を有することが分かり（図９Ｂ）、胚盤胞の細胞数は調べられていないがこれはｍＰＬＣ−ゼータにおける観察と類似している。これらのデータは、ｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡを未受精卵にマイクロインジェクトすることのみによってマウス胚において胚盤胞期への初期胚発生を引き起こすことが可能であることを示すものであるが、高用量のｈＰＬＣ−ゼータによって引き起こされる高振動数のＣａ２＋振動は２細胞期以降の発生にとって悪影響を与えるようである。
【０１２９】
サルＰＬＣ−ゼータはマウス卵母細胞でＣａ２＋振動を引き起こす。
【０１３０】
上記の観察結果（図８及び９）はヒト及びマウスＰＬＣ−ゼータが、マウス卵母細胞の活性化及び発生を開始させる受精時と同様のＣａ２＋振動を引き起こすことを示すものである。Ｍ．  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓから２個の関連した精巣に特異的な２．３ｋｂのｃＤＮＡ配列が特定されたこと、及びこれらの配列のＯＲＦとヒト及びマウスＰＬＣ−ゼータとが高い類似性を有することから、これらの配列がサルにおけるＰＬＣ−ゼータのホモログであると予測される。そこで本発明者等は、ｓ１ＰＬＣ−ゼータ及びｓ２ＰＬＣ−ゼータと呼ばれる（それぞれＡＢ０７０１０８及びＡＢ０７０１０９）これら２つの型のｓＰＬＣ−ゼータから調製したｃＲＮＡがマウス卵母細胞においてＣａ２＋振動を発生させる能力について比較を行った。その結果、いずれの型もＣａ２＋振動を引き起こす能力を有し、ｓ１ＰＬＣ−ゼータ及びｓ２ＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡのいずれをマイクロインジェクトした場合においても機能的な差は認められなかった（データは示されていない）。以下の実験ではすべてｓ１ＰＬＣ−ゼータ（ＡＢ０７０１０８）を使用した。図１０（Ａ）は、ｓ１ＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡが、マウス卵母細胞において、試験を行った３つの異なる用量のそれぞれ（０．２、０．０２、及び０．００２ｍｇ／ｍｌ）でヒト及びマウスＰＬＣ−ゼータで見られるのと同等の用量依存型Ｃａ２＋振動を引き起こしたことを示している。ヒトＰＬＣ−ゼータについて得られたデータ（図８（Ａ））と同様、Ｃａ２＋振動の発生時間は、マイクロインジェクトした３つの異なるｓ１ＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡの濃度のそれぞれで３〜４時間であった。これに対してＣａ２＋のスパイクの振動数は各ｃＲＮＡ濃度で異なっており、高レベルの刺激になるほど平均スパイク間間隔は小さくなった（図１０（Ｂ））。このデータは、各種の哺乳動物の精子／精巣から得られるＰＬＣ−ゼータには種特異性がなく、マイクロインジェクションで導入されると異種の哺乳動物卵母細胞でＣａ２＋振動を発生させることを示すものである。この発見は、哺乳動物以外の動物種も含めた異なるソースから得られた精子抽出物が、異なる哺乳動物の卵母細胞でＣａ２＋振動を引き起こすというこれまでの観察結果と完全に一致する。図１１は、ＰＬＣ−ゼータの３つの異なる哺乳動物型について、異なるｃＲＮＡのピペット濃度での平均スパイク間間隔を比較したものである。ｍＰＬＣ−ゼータ、ｈＰＬＣ−ゼータ、及びｓＰＬＣ−ゼータのｃＲＮＡのマイクロインジェクションのいずれによっても、２００〜２μｇ／ｍｌの濃度でＣａ２＋振動が引き起こされた。しかしながらｈＰＬＣ−ゼータは０．２〜０．０２μｇ／ｍｌの低濃度でＣａ２＋振動を引き起こした点で異なっていた（図１１）。これは同じ実験条件下ではＰＬＣ−ゼータのヒト型はマウス及びサルに由来するＰＬＣ−ゼータと比較してマウス卵母細胞でＣａ２＋振動をより効果的に発生させることを示すものである。
【０１３１】
本発明者等は、ｈＰＬＣ−ゼータ及びｓＰＬＣ−ゼータがマウス卵母細胞でＣａ２＋振動を引き起こすことを実証した（図８及び１０）ことに加え、ｈＰＬＣ−ゼータがｓＰＬＣ−ゼータ及びｍＰＬＣ−ゼータと比較してより効果的にＣａ２＋振動を引き起こすことの経験的な根拠を得た（図１１）。Ｃａ２＋振動を引き起こすのに必要なｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡの最小量は、マウスまたはサルＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡの最小有効量（２ ｇ／ｍｌ）と比較して１〜２桁低い値（０．２〜０．０２ ｇ／ｍｌ）であった。これらの相違はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現についてそれぞれ試験を行った異なるｃＲＮＡのバッチにおいて一致する所見として観察された（データは示さず）。したがってｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡの優れた効果は、ｈＰＬＣ−ゼータタンパク質の実際の性質を表していると考えられる。ここでマウス卵母細胞のｈＰＬＣ−ゼータに対する感受性には、ｍＰＬＣ−ゼータに対する感受性と比較して最低でも一桁の差があるという予測が可能である。ｈＰＬＣ−ゼータがｍＰＬＣ−ゼータやｓＰＬＣ−ゼータと比較してなぜ高い活性を示すかは明らかではない。ヒトＰＬＣ−ゼータは、マウス卵母細胞でＣａ２＋振動を刺激した後、胚盤胞期への胚発生を引き起こす能力も有している（図８）。このことは、ｈＰＬＣ−ゼータが卵細胞の活性化における通常のイベントのすべてを引き起こす能力を有することを示唆しているが、なかでもｈＰＬＣ−ゼータの高い効果の特徴は、高濃度のｃＲＮＡがマウス卵母細胞において極めて高い振動数のＣａ２＋振動を引き起こしたことである（図８（Ａ）、上段のトレース）。５分毎に約１スパイクの割合のＣａ２＋振動を生ずるｃＲＮＡの濃度では、ｈＰＬＣ−ゼータは卵母細胞の活性化を引き起こすものの、胚の発生は２細胞期で停止した（図９（Ａ））。これまでの研究によれば高振動数のＣａ２＋振動は卵母細胞のアポトーシスを引き起こすか、移植後の胚発生に変化をもたらす。本発明者等のデータは、高振動数のＣａ２＋振動によっても卵母細胞が活性化されるが、このような非生理学的な刺激は分裂初期での発生停止をもたらすことを初めて示したものである。
【０１３２】
結びになるが、本発明者等はホスホリパーゼＣのゼータ型アイソフォームをここに開示ならびにキャラクタライズしたものであり、以て受精プロセスにおける主要因を明らかにしたものである。
【０１３３】
【表２】
2005522987.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】ＣＨＯ細胞へのトランスフェクションによるマウスＰＬＣ−ゼータプラスミドＤＮＡの発現を示す、時間（秒；横座標）に対するカルシウム濃度（ｎＭ；縦座標）のプロット。
【図２】マウス卵細胞へのマイクロインジェクションによるマウスＰＬＣ−ゼータの相補的ＲＮＡの発現を示す、時間（秒；横座標）に対するカルシウム濃度（ｎＭ；縦座標）のプロット。
【図３】ＰＬＣ−ゼータと他のＰＬＣとの類似点及び相違点を示す、ＰＬＣ領域の概略的配列。
【図４】（ａ）ＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡのマイクロインジェクション（０．０２ｍｇ／ｍｌ）、またはストロンチウム（５ｍＭ、４時間）による病的活性化、またはｉｎ  ｖｉｖｏで精子で受精し、３７℃にて５％ＣＯ２インキュベータに入れた２４時間後に２細胞期に達したマウス卵細胞と、９６時間後に胞胚／胚盤胞期に達したマウス卵細胞の比率（％）を表したグラフ。（ｂ）図４（ａ）に示した処置後の、２細胞期及び胚盤胞期のマウス胚をそれぞれ示した２枚の顕微鏡写真。
【図５】２細胞期への発生が見られない、Ｄ２１０ＲＰＬＣ−ゼータのマイクロインジェクションの２４時間後のマウス卵細胞を示す顕微鏡写真。
【図６】（ａ）マウス精子ＰＬＣ−ゼータをコードしたｃＲＮＡのマイクロインジェクション（それぞれ２及び０．００２ｍｇ／ｍｌ、上及び中央のトレース）によって誘発した場合と、１０μＭのシクロヘキシミドとプレインキュベートした（０．０２ｍｇ、下のトレース）後の、ｆｕｒａ−ｒｅｄを取り込ませたマウス卵細胞における用量依存型カルシウム振動を示す図。（ｂ）異なる濃度のＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡのマイクロインジェクション後の卵細胞におけるカルシウム振動の平均スパイク間間隔を示す図。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）を行った際に観察される間隔と比較。＊は５％の有意水準でＩＶＦから統計的な有意差があったことを示す（スチューデントの対応のないｔ検定）。
【図７】ヒトｐｌｃ−ゼータ遺伝子の構造を示す図。１７９４５６ｂｐのコンティグ配列（アクセッション番号Ｎｏ．ＡＣ０２３９４０）内に特定された１５個のｐｌｃ−ゼータエクソンのゲノム上での編成が第１２染色体の５４．８ｋｂ領域（１２ｐ１２．３）に沿って示されている。エクソンはＥ１〜Ｅ１５まで番号付けしてある。ｈＰＬＣζの開始及び停止コドンはそれぞれＥ２及びＥ１５内に位置している。各エクソン間の実線はイントロンを示す（表２）。
【図８Ａ】ヒトＰＬＣ−ゼータのｃＲＮＡをマイクロインジェクトしたマウス卵母細胞におけるＣａ２＋振動を示す図で、ｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡのマイクロインジェクション後のＭＩＩ期で停止したマウス卵母細胞における用量依存型Ｃａ２＋振動。４つのトレースは２０〜０．０２μｇ／ｍｌの図に示したピペット濃度でｃＲＮＡをマイクロインジェクトした際に見られた細胞質Ｃａ２＋振動を示す。
【図８Ｂ】ヒトＰＬＣ−ゼータのｃＲＮＡをマイクロインジェクトしたマウス卵母細胞におけるＣａ２＋振動を示す図で、異なるｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡ濃度によって誘発されたマウス卵母細胞におけるＣａ２＋振動の平均スパイク間間隔。マイクロインジェクトした卵母細胞の数を各用量の上に示した。スチューデントの対応のあるｔ検定を行った（ｐ＝＜０．０００１）ところ、各用量における平均スパイク間間隔は互いに統計的に異なっていた（２０μｇ／ｍｌ、４．２１±１．７９；２．０μｇ／ｍｌ、９．２６±７．１４；０．２μｇ／ｍｌ、１６．０±６．４０、０．０２μｇ／ｍｌ、２４．３４±７．６８）。
【図９Ａ】ヒトＰＬＣ−ゼータのｃＲＮＡをマイクロインジェクトしたマウス卵母細胞の胚発生を示す図で、異なる濃度（２０〜０．２μｇ／ｍｌ）のｈＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡをマウス卵母細胞にマイクロインジェクトした。２４時間後に２細胞期に達した卵母細胞と９６時間後に胞胚／胚盤胞に達した卵母細胞のパーセンテージを記録した。
【図９Ｂ】ヒトＰＬＣ−ゼータのｃＲＮＡをマイクロインジェクトしたマウス卵母細胞の胚発生を示す図で、未受精卵にｈＰＬＣ−ゼータのｃＲＮＡ（０．２μｇ／ｍｌ）をマイクロインジェクトした後の２細胞期（左）及び胚盤胞期（右）のマウス胚の発生を示す顕微鏡写真。
【図１０Ａ】サルＰＬＣ−ゼータのｃＲＮＡを注入したマウス卵母細胞におけるＣａ２＋振動を示す図で、ｓＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡのマイクロインジェクション後のＭＩＩ期で停止したマウス卵母細胞における用量依存型Ｃａ２＋振動。３つのトレースは２００〜２μｇ／ｍｌの図に示したピペット濃度でｃＲＮＡをマイクロインジェクトした際に見られた細胞質Ｃａ２＋振動を示す。
【図１０Ｂ】サルＰＬＣ−ゼータのｃＲＮＡを注入したマウス卵母細胞におけるＣａ２＋振動を示す図で、異なるｓＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡ濃度によって誘発されたマウス卵母細胞におけるＣａ２＋振動の平均スパイク間間隔。マイクロインジェクトした卵母細胞の数を各用量の上に示した。スチューデントの対応のあるｔ検定を行った（ｐ＝＜０．０００１）ところ、各用量における平均スパイク間間隔は互いに統計的に異なっていた（２００μｇ／ｍｌ、３．１８±０．５５；２０μｇ／ｍｌ、７．３５±２．６９；２．０μｇ／ｍｌ、１５．７７±５．２０）。
【図１１】ヒト、サル、及びマウスＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡで見られた平均スパイク間間隔を示す図。これら３種類のＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡによって誘発されたマウス卵母細胞におけるＣａ２＋振動の平均スパイク間間隔の比較。ヒト、サル、及びマウスＰＬＣ−ゼータのｃＲＮＡは２００〜２．０μｇ／ｍｌのＰＬＣ−ゼータｃＲＮＡのマイクロインジェクションから２時間以内にＣａ２＋振動をそれぞれ誘発した。０．２及び０．０２μｇ／ｍｌの低用量ではｈＰＬＣ−ゼータのみが有効であった。マイクロインジェクトした卵母細胞の数を各用量の上に示した。スチューデントの対応のあるｔ検定を行った（ｐ＝＜０．００５）ところ、各用量における平均スパイク間間隔はヒト、サル、及びマウスで互いに統計的に異なっていた。
【０１３５】
配列表
【０１３６】
【表３】
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【０１３７】
【表４】
2005522987.tif 000006
【０１３８】
【表５】
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【０１３９】
【表６Ａ】
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【０１４０】
【表６Ｂ】
2005522987.tif 000009
【０１４１】
【表７】
2005522987.tif 000010
【０１４２】
【表８】
2005522987.tif 000011
【０１４３】
【表９】
2005522987.tif 000012
【０１４４】
【表１０】
2005522987.tif 000013
【０１４５】
【表１１】
2005522987.tif 000014
【０１４６】
【表１２】
2005522987.tif 000015
【０１４７】
【表１３】
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【０１４８】
【表１４】
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【０１４９】
【表１５】
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【０１５０】
【表１６】
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【０１５１】
【表１７】
2005522987.tif 000020
【０１５２】
【表１８】
2005522987.tif 000021
【０１５３】
【表１９】
2005522987.tif 000022
【０１５４】
【表２０】
2005522987.tif 000023
【０１５５】
【表２１】
2005522987.tif 000024
【０１５６】
【表２２】
2005522987.tif 000025
【０１５７】
【表２３】
2005522987.tif 000026
【０１５８】
【表２４】
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【０１５９】
【表２５】
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【０１６０】
【表２６】
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【０１６１】
【表２７】
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【０１６２】
【表２８】
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図５】
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【国際調査報告】
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