(57)【要約】【課題】本発明は、高い細胞取り込み率と高い細胞生存率を有する細胞移植方法を提供することとと、その目的を達成するための、哺乳類(例えば、ヒト)心筋組織に移植するための細胞を生産する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、（ａ）不死化しない骨髄幹細胞を供給するステップと、（ｂ）前記細胞を心筋芽細胞に分化させるように誘導する条件下で前記骨髄幹細胞を培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞の分化状態をモニタリングするステップと、（ｄ）前記細胞の約１０％〜１００％が心筋芽細胞の時、ステップ(ｂ)の細胞を採収するステップを含む、哺乳類心筋組織に移植するための細胞の生産方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、哺乳類心筋組織に移植するための細胞の生産方法:
(ａ) 不死化しない骨髄幹細胞を供給するステップと、
(ｂ) 前記細胞を心筋芽細胞に分化させるように誘導する条件下で前記骨髄幹細胞を培養するステップと、
(ｃ) ステップ(ｂ)の細胞の分化状態をモニタリングするステップと、
(ｄ) 前記細胞の約１０％〜１００％が心筋芽細胞の時、ステップ(ｂ)の細胞を採収するステップ。
【請求項２】
前記哺乳類に前記心筋芽細胞を移植するステップ(ｅ) を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記骨髄幹細胞が前記哺乳類に由来するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳類がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記採収ステップ(ｄ)が、ステップ(ｂ)の前記細胞の約５０％〜８０％が心筋芽細胞のときに行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記培養ステップ(ｂ)が、培養液がＢＭＰ−２及びｂＦＧＦの少くとも一つを前記細胞の心筋芽細胞への分化を誘導するのに十分な量として含有する培養条件を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記モニタリングステップ(ｃ)が、ステップ(ｂ)の前記骨髄幹細胞と共存培養された自家骨髄幹細胞の分化状態を決定することを含み、該自家骨髄幹細胞の分化状態がステップ(ｂ)の前記骨髄幹細胞の分化状態と相関がある、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記モニタリングステップ(ｃ)が、ステップ(ｂ)の前記骨髄幹細胞と共存培養された同型又は異型骨髄幹細胞の分化を評価することを含み、該同型又は異型骨髄幹細胞の分化状態がステップ(ｂ)の前記骨髄幹細胞の分化状態と相関がある請求項１に記載の方法。
【請求項９】
以下のステップを含む、哺乳類に移植するための細胞の生産方法:
(ａ) 不死化しない骨髄幹細胞を供給するステップと、
(ｂ) 前記細胞を血管平滑筋細胞、内皮細胞、心外膜細胞、脂肪細胞、破骨細胞、骨芽細胞、心臓繊維芽細胞、マクロファージ、神経細胞前駆体、神経細胞、星状細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、膵臓細胞前駆体、膵臓β−細胞、又は肝細胞に分化させるよう誘導する条件下で前記骨髄幹細胞を培養するステップと、
(ｃ) ステップ(ｂ)の細胞の分化状態をモニタリングするステップと、
(ｄ) 前記細胞の約１０％〜１００％が、前記細胞タイプに特異的なタンパク質の検出可能な量を発現する際にステップ(ｂ)の細胞を採収するステップ。
【請求項１０】
ステップ(ｄ)からの前記細胞を前記哺乳類に移植するステップ(ｅ)を更に含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記骨髄幹細胞が前記哺乳類から由来されるものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記採収ステップ(ｄ)が、ステップ(ｂ)の前記細胞の約５０％〜８０％が前記細胞型に分化されるときに行なわれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記モニタリングステップ(ｃ)が、ステップ(ｂ)の前記骨髄幹細胞と共存培養された自家骨髄幹細胞の分化を評価することを含み、該自家骨髄幹細胞の分化状態がステップ(ｂ)の前記骨髄幹細胞の分化状態と相関がある、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記モニタリングステップ(ｃ)が、ステップ(ｂ)の前記骨髄幹細胞と共存培養された同種又は異種骨髄幹細胞の分化を評価することを含み、該同種又は異種骨髄幹細胞の分化状態がステップ(ｂ)の前記骨髄幹細胞の分化状態と相関がある請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳類において不完全な心臓機能による障害を治療する方法であって、以下のステップを含む方法:
(ａ) 前記哺乳類から骨髄幹細胞を分離するステップと、
(ｂ) 前記細胞を心筋芽細胞に分化させるよう誘導する条件下で前記骨髄幹細胞を培養するステップと、
(ｃ) ステップ(ｂ)の細胞の分化状態をモニタリングするステップと、
(ｄ) 前記細胞の約１０％〜１００％が心筋芽細胞のときにステップ(ｂ)の細胞を採収するステップと、
(ｅ) 前記心筋芽細胞を前記哺乳類に移植するステップ。
【請求項１７】
前記哺乳類がヒトである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記採収ステップ(ｄ)が、ステップ(ｂ)の前記細胞の約５０％〜８０％が前記細胞タイプに分化されるときに行なわれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記モニタリングステップ(ｃ)が、自家骨髄幹細胞の分化を評価することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記モニタリングステップ(ｃ)が、同種又は異種骨髄幹細胞の分化を評価することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳類に移植する際に内皮細胞に分化されるように誘導された細胞の生産方法であって、以下のステップを含む方法:
(ａ) 不死化しない幹細胞の集団を供給するステップと、
(ｂ) 前記細胞を内皮細胞前駆体に分化させるように誘導する条件下でステップ(ａ)の前記細胞を培養するステップと、
(ｃ) 細胞の約１０％〜１００％が内皮細胞前駆体のときにステップ(ｂ)の細胞を採収するステップであって、該細胞は哺乳類に移植したときに内皮細胞に分化されるように誘導されるものである。
【請求項２２】
ステップ(ｂ)と(ｃ)の間に、ステップ(ｂ)の細胞の分化状態をモニタリングするステップを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳類に移植する際に血管平滑筋細胞に分化されるように誘導された細胞の生産方法であって、以下のステップを含む方法:
(ａ) 不死化しない幹細胞の集団を供給するステップと、
(ｂ) 前記細胞を血管平滑筋細胞前駆体に分化されるように誘導する条件下でステップ(ａ)の前記細胞を培養するステップと、
(ｃ) 細胞の約１０％〜１００％が血管平滑筋細胞前駆体のときにステップ(ｂ)の細胞を採収するステップであって、該細胞は哺乳類に移植したときに血管平滑筋細胞に分化されるように誘導されるものである。
【請求項２４】
ステップ(ｂ)と(ｃ)との間に、ステップ(ｂ)の細胞の分化状態をモニタリングするステップを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
不完全な心臓機能により特徴付けられる疾患を有すると診断された哺乳類の治療方法であって、前記哺乳類の心筋組織に以下のものを導入することを含む方法:
(ａ) 心筋細胞又は心筋細胞前駆体と、
(ｂ) 内皮細胞又は内皮細胞前駆体と、
(ｃ) 血管平滑筋細胞又は血管平滑筋細胞前駆体
（但し、これらの細胞は心臓機能を向上させるのに十分な量が導入される。）
【請求項２６】
心筋細胞前駆体:内皮細胞前駆体:血管平滑筋細胞前駆体＝約１０:１:１の比率で、少くとも百万個の心筋細胞前駆体が別の二種の細胞型と共に前記心筋層に注入される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記心筋層にカスパーゼ阻害剤を導入することを更に含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳類はヒトである請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
以下のものを含んでなる医薬組成物:
(ａ) 心筋細胞又は心筋細胞前駆体と、
(ｂ) 内皮細胞又は内皮細胞前駆体と、
(ｃ) 血管平滑筋細胞又は血管平滑筋細胞前駆体
（但し、これらの細胞はヒトに導入する際、心臓機能を向上させるのに十分な量である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞移植分野に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨髄が、循環心筋細胞前駆体の生体内発生源という可能性が提示された。移植された骨髄由来細胞がジストロフィーのマウスの心臓に分布することが実験により観察された。たとえこれら細胞の分子的特徴を究明できなかったとしても、移植された細胞が心臓組織内に存在するということはこの細胞が心筋細胞であることを示している。５−アザシチジン(５−azacytidine)のような誘導物質を用いて誘導することにより搏動する心筋細胞として分化する能力を骨髄幹細胞(ＢＭＳＣｓ)が有することもまた知られている。これらの知見に基づき、ＢＭＳＣｓが心臓異常や心臓疾患治療のための細胞源として提案されている。
ＢＭＳＣｓの治療剤としての可能性にも拘わらず、現在心臓組織に細胞を移植する方法においては患者組織への移植物のとり込み率が低く、臨床的にまだ不向きである。その例として、ＢＭＳＣｓを移植したマウスのうち４０％についてのみ心筋組織が回復されたとＯｒｌｉｃらによって報告された(非特許文献１)。
従って、高い細胞とり込み率と高い細胞生存率を有する細胞移植方法が求められている。
【０００３】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：７０１〜７０５，２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、高い細胞とり込み率と高い細胞生存率を有する細胞移植方法を提供することを目的とする。また、本発明は、哺乳類(例えば、ヒト)心筋組織に移植するための細胞を生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らはin vitroにおいて幹細胞の分化誘導をモニタリングできる方法と移植のために幹細胞を採収する方法を見出した。
従って、本発明は哺乳類(例えば、ヒト)心筋組織に移植するための細胞を生産する方法を提供するものである。本方法は(ａ)不死化しない幹細胞を供給するステップと、(ｂ)心筋芽細胞(例えば、心筋細胞前駆体)に誘導する条件下で細胞を培養するステップと、(ｃ)ステップ(ｂ)の細胞の分化状態をモニタリングするステップと、(ｄ)採収された細胞の約１０％〜約１００％が心筋芽細胞の時、ステップ(ｂ)の細胞を採収するステップを含んでいる。細胞は、例えばヒト、ブタ、又はヒヒのＢＭＳＣｓであり得る。実施態様の一つとして、本発明の方法は哺乳類(例えば、ヒト)にステップ(ｄ)の細胞を移植するステップ(ｅ)を更に含む。移植は自家移植、即ち治療する哺乳類から細胞を得た後これを移植するものであり得る。採収した細胞のうち少くとも約１５％、２０％、３０％、４０％又は５０％が心筋芽細胞(例えば、心筋細胞前駆体)であることが望ましい。採収した細胞のうち多くは約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％が心筋芽細胞であることが望ましい。最も望ましくは、採収した細胞のうち約５０％〜約８０％が心筋芽細胞である。
【０００６】
また、本発明者らは心筋細胞を移植した心筋層局所で血管と心筋組織が共に再生される細胞移植治療方法を開発した。
心筋梗塞によって、梗塞した部位への血液供給が減少すれば、内因性心筋細胞が損傷される。移植された細胞の生存率を高めるためには細胞が移植された哺乳類が細胞生存に必要な栄養分と酸素を供給する血管網を創出ことが望ましい。
心外膜から心筋層に移動した血管平滑筋細胞前駆体と内皮細胞前駆体から心筋層の冠状血管構造が形成されるという点に基づき、心筋細胞前駆体又は心筋細胞と共に内皮細胞前駆体と血管平滑筋細胞前駆体を移植することが、治療学的に大事な心筋細胞の生存に求められる血管網形成を容易にすることと判断される。梗塞された心筋層は心筋細胞前駆体、内皮細胞前駆体と血管平滑筋細胞前駆体とを組み合わせて新たな血管を形成しつつ新たな心筋細胞を再生することによって治癒される。一例として、細胞前駆体は生体外（ex vivo）で幹細胞に由来するものである。
従って、第２の特徴として、本発明は、また、哺乳類(例えば、ヒト)の心筋組織に移植するために内皮細胞に分化されるように誘導された細胞を生産する方法を提供する。本方法は(ａ)不死化しない幹細胞の集団を供給するステップと、(ｂ)幹細胞が内皮細胞になる条件下で細胞を培養するステップと、(ｃ)細胞のうち約１０％〜約１００％が内皮細胞前駆体の時、ステップ(ｂ)の細胞を採収するステップとを含む。
【０００７】
第３の特徴として、本発明は哺乳類(例えば、ヒト)の心筋組織に移植するために血管平滑筋細胞に分化されるように誘導された細胞を生産する方法を提供する。本方法は(ａ)不死化しない幹細胞の集団を提供するステップと、(ｂ)幹細胞が血管平滑筋細胞になる条件下で細胞を培養するステップ、及び(ｃ)細胞のうち約１０％〜約１００％が血管平滑筋細胞前駆体の時、ステップ(ｂ)の細胞を採収するステップを含む。
【０００８】
第４の特徴として、本発明は不完全な心臓機能疾患がある哺乳類(例えば、ヒト)を治療する方法を提供する。本方法は以下の三種の形態の細胞を哺乳類の心筋組織に移植するステップを含む。即ち、心臓機能を向上させるための十分な量の(１)心筋細胞又は心筋細胞前駆体、(２)内皮細胞又は内皮細胞前駆体、及び(３)血管平滑筋細胞又は血管平滑筋細胞前駆体、がそれである。
一例としては、各注射毎に１×１０６個の心筋細胞前駆体を他の二つの細胞と共に約１０：１：１(心筋細胞前駆体:内皮細胞前駆体:血管平滑筋細胞前駆体)の比率で心筋層に注入する。また、他の比率でも使用できる。例えば、心筋細胞前駆体と内皮細胞前駆体又は血管平滑筋細胞前駆体の比率が１:１〜５０:１、又はそれ以上にすることが出来る(例えば、２:１、３:１、４:１、５:１、６:１、７:１、８:１、９:１、１０:１、１２:１、１５:１、２０:１、３０:１、４０:１、５０:１、又はそれ以上)。一例として、心筋細胞前駆体:内皮細胞前駆体:血管平滑筋細胞前駆体の比率が１０:２:１が挙げられる。注入の間に、各細胞型は、内皮細胞前駆体は心臓内膜に近く、血管平滑筋細胞前駆体は中間に、心筋細胞前駆体は心臓外膜に近くと言うように(横に又は垂直に)層状となる。他の方法としては、移植する前に三種の細胞を、例えば１０:１:１(心筋細胞前駆体:内皮細胞前駆体:血管平滑筋細胞前駆体)の細胞数比率で混合し、混合物として心筋層に注入することもできる。血管形成を向上させるために、例えばＶＥＧＦ(例えば１-１０μＭで)のような血管形成剤を注入した細胞と混合することができる。
【０００９】
心筋芽細胞になるように細胞を誘導する技術は数多い。例えばＢＭＳＣｓを心筋芽細胞に誘導する量のＢＭＰ２やｂＦＧＦを含有した培地で培養することができる。これら方法は本発明の実施例において取り上げられる。
分裂細胞は分裂後の細胞よりも心筋層によりとり込まれやすいので、ステップ(ｃ)の移植する細胞のうち少くとも約２５％、５０％、７５％、９０％、９５％或いはそれ以上が分裂細胞前駆体(例えば、心筋細胞前駆体、内皮細胞前駆体、又は血管平滑筋細胞前駆体)であることが望ましい。
【００１０】
もう一つの特徴として、本発明は、その約１０％〜１００％が内皮細胞前駆体である幹細胞由来細胞集団が薬剤学的に許容される担体や賦形剤に含有される医薬組成物を提供する。
更にもう一つの特徴として、本発明は、その約１０％〜１００％が血管平滑筋細胞前駆体である幹細胞由来細胞集団が薬剤学的に許容される担体や賦形剤に含有される医薬組成物を提供する。
【００１１】
もう一つの特徴として、本発明は以下の三種の型の細胞を含む医薬組成物を提供する。  即ち、心臓機能を向上させるための十分な量の(１)心筋細胞又は心筋細胞前駆体、(２)内皮細胞又は内皮細胞前駆体、及び(３)血管平滑筋細胞又は血管平滑筋細胞前駆体、がそれである。
細胞は幹細胞(例えば、ＢＭＳＣｓ)に由来するものであることが望ましい。血管形成を向上させるために、血管形成剤が含まれることが望ましい(例えば、１〜１０μＭのＶＥＧＦ)。更に、本発明の移植細胞の生存率を高めるために注入した細胞をカスパーゼ阻害剤(例えばzＶＡＤfmk)のような抗細胞壊死剤で処理することも出来る。
【００１２】
また、本発明は哺乳類(例えば、ヒト)に移植する細胞を生産する方法を提供する。本方法は(ａ)骨髄幹細胞集団を供給するステップ、(ｂ)血管平滑筋細胞、内皮細胞、心外膜細胞、脂肪細胞、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファージ、神経細胞前駆体、神経細胞、星状細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、膵臓細胞前駆体、膵臓β−細胞及び肝細胞で構成されるグループから選ばれた細胞型に細胞を誘導する条件で細胞を培養するステップ、(ｃ)ステップ(ｂ)で細胞の分化ステップをモニタリングするステップ、及び誘導された細胞に特異的なタンパク質を確認可能な量で発現する細胞が約１０％〜１００％の時、ステップ(ｂ)の細胞を採収するステップ(ｄ)を含む。適当なマーカーはここで述べられる。ＢＭＳＣｓは例えばヒト、豚、ヒヒのＢＭＳＣｓであり得る。実施態様の一つとして、本方法は哺乳類(例えば、ヒト)にステップ(ｄ)の細胞を移植するステップ(ｅ)を含む。移植は自家移植、即ち骨髄幹細胞を抽出した哺乳類に再び細胞を移植することが出来る。他の実施態様としては、ステップ(ｂ)及び(ｃ)の培養とモニタリングが、所望の分化系統における検出可能な量のマーカーを発現する細胞が少くとも約１５％、２０％、３０％、４０％又は５０％から多くは約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％のときまで行なわれる。望ましくは、培養とモニタリングステップ(ｂ)と(ｃ)は所望の分化系統で検出可能な量のマーカーを発現する細胞が約５０％〜８０％のときまで行う。
【００１３】
本発明は、また、不完全な心臓機能疾患がある哺乳類、望ましくはヒトを治療する方法を提供する。本方法は(ａ)治療される哺乳類から骨髄幹細胞を分離するステップ、(ｂ)骨髄幹細胞を心筋芽細胞に分化させる条件下で培養するステップ、(ｃ)ステップ(ｂ)の細胞が分化するステップをモニタリングするステップ、(ｄ)心筋芽細胞が約１０％〜約１００％のとき、ステップ(ｂ)の細胞を採収するステップ、及び(ｅ)心筋芽細胞を哺乳類に移植するステップ、を含む。
前述した方法のうちモニタリングステップ(ｃ)はレポータ遺伝子で形質移入されたカプセル化ＢＭＳＣｓの分化をモニタリングすることが望ましい。モニタリングに使用されるＢＭＳＣｓは培養したＢＭＳＣｓに対し、自己由来、同種、又は異種であり得る。
【００１４】
“幹細胞”は(ｉ)自家増殖でき、(ii)心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞から選ばれたグループの一つを含む、種々の型に分化できる細胞を意味する。
“ＢＭＳＣ”はＣＤ４５のない(ＣＤ４５−)骨髄間充織由来幹細胞を意味する。またＢＭＳＣｓは“骨髄幹細胞”及び"骨髄多潜在性細胞前駆体"とも呼ばれる。
ここで、“核酸”はＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。“核酸分子”はデオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖重合体である。特に言及しなければ、一本鎖核酸分子配列の左手方向は５'末端であり、二本鎖核酸分子の左手方向は５'方向とされる。
【００１５】
“Ｃsx/Ｎkx２.５”はマウスやヒトのＣsx／Ｎkx２.５ｃＤＮＡ又はＣsx／Ｎkx２.５ポリペプチドと実質的に同一な核酸やポリペプチドを意味し、ＢＭＳＣｓで発現されれば細胞が心筋芽細胞に誘導されることを意味する。核酸は５０個の連続的なヌクレオチドでマウスやヒトのＣsx／Ｎkx２.５と少くとも８０％同一なものが望ましく、８５％のものが更に望ましく、少くとも９０％又は９５％まで同一なことが更に望ましい。１０％までの差異は一方又は両側の配列に含める。ポリペプチドは２５個の連続的なアミノ酸でマウスやヒトのＣsx／Ｎkx２.５と少くとも８０％同一なことが望ましく、８５％であることが更に望ましく、少くとも９０％又は９５％まで同一なものが更に望ましい。１０％までの差異は一方又は両側の配列に含める。
【００１６】
“治療”は少くとも一つの異常反応や不完全な心臓機能を示す非正常的な症候を軽減させたり減少させることを意味する。異常反応や心臓機能異常症状は色々でありよく定義されている。異常反応や心臓機能異常症状の例としては呼吸困難、胸痛、心悸亢進、眩気症、気絶、浮腫、チアノーゼ、蒼白、疲労、及び死亡が含まれる。副作用や極めて多様な心臓疾患の更なる例は、Robbins、S．L．らの文献(Robbins，S．L．et al．，１９８４，Pathological Basis of Disease，p５４７-６０９，W．B．Saunders Company，Philadelphia)及びSchroeder，S．A．らの文献(Schroeder，S．A．et al．，１９９２，Current Medical Diagnosis & treatment，p２５７-３５６，Appleton & Lange，Connecticut)を参照されたい。
【００１７】
“不完全な心臓機能による異常疾患”は正常的な心臓機能の欠陥や障害又は異常な心臓機能の存在を意味する。異常な心臓機能は疾病、傷害及び/又は老化の結果でありうる。    ここで定義される異常な心臓機能は心筋細胞や心筋細胞集団の形態学的及び/又は機能的な異常を含む。形態学的及び機能的異常の例としては、心筋細胞の死滅及び/又は物理的低下、心筋細胞の異常な増殖形態、心筋細胞間の物理的結合の異常、心筋細胞による構成物質の過小又は過剰生産、正常的に生産する構成物質の生産欠如、電気的刺激伝達の異常形態や異常回数、及び前述した異常による結果の心臓圧の変化などを含むが、これらだけに限られない。異常心臓機能は虚血性心臓疾患、例えば狭心症、心筋梗塞、慢性虚血性心臓疾患、高血圧性心臓疾患、肺疾患性心臓疾患(肺疾患)、心臓瓣膜性心臓疾患、例えばリューマチス性発熱、僧帽弁逸脱、僧帽弁輪の石灰化、悪性腫瘍性心臓疾患、感染性心臓内膜炎、先天性心臓疾患、心筋疾患、例えば心筋炎、心筋症、欝血性心臓欠陥による心臓疾患、そして心臓癌、例えば一次肉腫及び２次腫瘍などを含む多くの欠陥と共に現われる。
【００１８】
“投与”、“導入”及び“移植”は混用され、所望の箇所に細胞がとり込まれる方法で、ヒト患者のような被実験者に本発明に係る心筋細胞を配置することを意味する。
“プロモータ”は解読開始コドンの上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼと転写を開始する他のタンパク質を認識し結合させる核酸領域を意味する。“ヒトプロモータ”はヒト細胞で転写を開始するプロモータであって、ヒト細胞に由来するものと由来しないものとがある。“Ｃsx/Ｎkx２.５プロモーター”はＣsx/Ｎkx２.５遺伝子のプロモータ部位から由来したもので、異種核酸分子と機能的に連結されている場合、心臓細胞内において該当分子の転写を開始できる(転写を支援できる転写培地中に存在する場合)。
【００１９】
“エンハンサー因子”又は"エンハンサー”はプロモータの隣接部位に位置し転写を支援できる転写培地中に存在する場合、エンハンサードメインがない状態においてプロモータによる転写活性よりも増加した転写活性を与える核酸塩基配列を意味する。“Ｃsx/Ｎkx２.５エンハンサー”はＣsx/Ｎkx２.５遺伝子のプロモータ領域から由来した遺伝子であり、他の核酸分子と機能的に連結されたとき、心筋細胞で該当分子の転写を開始することが出来る(転写を支援できる転写培地中に存在する場合)。“Ｔｉｅ-２エンハンサー”はＴｉｅ-２遺伝子のプロモータ領域から由来した遺伝子であり、他の核酸分子と機能的に連結されたときに内皮細胞で該当分子の転写を開始できる(転写を支援できる転写培地中に存在する場合)。“Ｂｖｅｓエンハンサー”はＢｖｅｓ遺伝子のプロモータ領域から由来した遺伝子であり、他の核酸分子と機能的に連結された時、血管平滑筋細胞で該当分子の転写を開始することができる(転写を支援できる転写培地中に存在する場合)。
“機能的に連結された”は、適した転写培地で核酸分子の転写を誘導するための方式で二つ以上の核酸分子(例えば、転写される核酸分子、プロモータ、及びエンハンサー因子)が連結されていることを意味する。
【００２０】
“由来した”は核酸分子が第２核酸分子から二次的に作られたり又は形成された場合を意味し、誘導体に作られたり形成された元の核酸分子の重要な機能の少くとも一つを維持している。
“発現コンストラクト（expression construct）”は転写を行なえる核酸分子を意味する。本発明における発現コンストラクトは少くとも心臓特異的エンハンサー因子とプロモータを含む。ここで述べた通り、転写終結信号のような付加的な因子が更に含められる。
“ベクター”又は“発現ベクター”は発現システム、核酸媒介体(vehicle)、核酸輸送に適した核酸分子、自律的な自家-複製原形ＤＮＡ(例えば、プラスミド)を意味する。ベクターが宿主細胞内に存する場合、ベクターは自律的な構造で細胞分裂周期の間安定的に細胞によって複製されたり、宿主細胞ゲノム内に統合されたり又は宿主細胞の核又は細胞質内に存在する場合もある。
【００２１】
“心臓細胞”は分化された心臓細胞(例えば、心筋細胞)又は心臓細胞を生成したり心臓細胞として産生又は分化されることを委ねられた細胞(例えば、心筋芽細胞又は心筋性細胞)を意味する。
“心筋細胞”は心臓で検出可能な量の心臓マーカー(例えば、α-ミオシン重鎖、ｃＴｎＩ、ＭＬＣ２ｖ、α-心臓アクチン、及びin vivoでのＣｘ４３)を発現し、収縮するが、増殖はしない筋肉細胞を意味する。
“心筋母細胞”は心臓で検出可能な量の心臓マーカーを発現し、収縮し増殖する細胞を意味する。
“心筋芽細胞”は検出可能な量のＣsx/Ｎkx２.５ＲＮＡ又はタンパク質を発現し、組織化された育種構造や収縮が見られず、検出可能な量のミオシン重鎖タンパク質を発現しない細胞を意味する。
“心外膜細胞”は検出可能な量のＦｌｋ−１及び/又はＩＣＡＭ−２を発現し、内皮細胞になれる細胞を意味する。
“心内膜細胞”は検出可能な量のＴｉｅ-２及び/又はフォンビルブランド因子を発現する心臓細胞を意味する。
“内皮細胞”は検出可能な量の、以下のＲＮＡ又はタンパク質を少くとも一つ以上発現する細胞を意味する。
ＭＵＣ１８、ＶＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、α-及びβ-カテニン、Ｆｌｋ-１、Ｔｉｅ-２、及びＣＤ３４。
【００２２】
“内皮細胞に分化するように誘導された細胞”は細胞が内皮細胞に誘導される条件下で培養された不死化しない幹細胞を意味し、その細胞中の少くとも約１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％までが内皮細胞である。
“血管平滑筋細胞に分化するように誘導された細胞”は細胞が血管平滑筋細胞に誘導される条件で培養された不死化しない幹細胞を意味し、その細胞中の少くとも約１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％までが血管平滑筋細胞である。
培養されたＢＭＳＣｓの分化に言及する際“一つの細胞型への特異的な誘導”は少くとも５０％のＢＭＳＣｓが所望の細胞型(例えば、心筋細胞)に分化される培養を意味する。
【００２３】
タンパク質の“検出可能な量”は、例えばここで提供された方法を使用した免疫細胞化学法によって検出されるタンパク質の量を意味する。細胞がＣsx/Ｎkx２.５又はミオシン重鎖で検出可能に標識されていることを確認する方法の一つが以下に提供される。
培養された細胞を氷上で２０分間４％ホルムアルデヒドで固定させ、引き続き０．２％トリトンＸ−１００の入っているリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で１５分間放置する。ＰＢＳで三回洗浄してから、細胞を１５分間ブロッティング溶液(ＰＢＳ中１％ＢＳＡ及び０．２％ツイーン２０)中でインキュベートする。この試料を以下の抗体のうちの一つで処理する。
抗体：抗ＣＳＸ(１:１００〜１:２００，from S．Izumo，Harvard Medical School，Boston MA)、ＭＦ−２０(１:５０〜２００，from Developmental Studies Hybridoma bank，University of Iowa，Iowa City Iowa)、抗デスミン (１:１００〜２００，from Sigma-Aldrich，Inc．，St．Louis MO)
そして、要すれば、同じ濃度の同種対照群(Ｃｓｘは正常ウサギ血清;ＭＦ-２０はマウスＩｇＧ２ｂ; デスミンはマウスＩｇＧ１)と共に４℃恒湿槽で一晩中反応させた。試料スライドを洗浄溶液(０．５％ツイーン２０含有ＰＢＳ)で三回洗浄した後、二次抗体と共に培養した(Ｃｓｘはロバ抗ウサギＩｇＧ、ＭＦ-２０と抗デスミンはロバ抗マウスＩｇＧ、これら全てはJackson Immuno  Research Laboratories、Inc．から入手)。三回洗浄した後、蛍光顕微鏡(例えば、蛍光付属品が装着されたＮｉｋｏｎ  ＴＳ１００顕微鏡)で観察して蛍光を呈する細胞数を肉眼で数えた。
【００２４】
“心臓特異的エンハンサー因子”はプロモータと機能的に連結され心臓細胞内で遺伝子発現を誘導するが、全ての組織や全ての細胞型で遺伝子発現を誘導しない因子を意味する。  例えば、Ｃsx/Ｎkx２.５からクローニングされたある種の心臓特異的エンハンサー因子は舌及び胚芽上でだけではなく心臓細胞で遺伝子を発現させる。本発明の心臓特異的エンハンサーは自然的に又は非自然的に生成させることができる。
“異種の”は核酸分子が外部ソースから由来する場合、又は同じソースなら元の形態から変形されることを意味する。従って、"異種プロモータ"は本発明の複製されたエンハンサードメインと正常的に連結されないプロモータである。同じく、異種核酸分子は元の形態から変形されたり、これと機能的に連結されたプロモータが由来するソースとは違うソースから誘導される。
【００２５】
“実質的に純粋な核酸”は本発明の核酸が誘導される有機体の天然ゲノム内において該核酸に隣接する、遺伝子のない核酸を意味する。従って、この用語は、ベクター内、自律複製プラスミド内、ウィルス内、又は原核細胞又は真核細胞のゲノム核酸内に組み込まれる組換え核酸や、他の塩基配列とは独立して分離された分子(例えば、ｃＤＮＡ、或いはＰＣＲや制限酵素切断によって生成されたゲノム断片又はｃＤＮＡ断片)として存在する組換え核酸を含んでいる。また、これは付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換え核酸をも含んでいる。
“導入遺伝子”は一時的又は永久的に細胞内に人工的に挿入され、ゲノム内に組み込まれたり染色体外に存在する場合、有機体の一部になる核酸分子(例えば、ＤＮＡ)の断片を意味する。このような形質転換遺伝子は形質転換有機体と部分的に又は全く異種の(即ち、外来の)遺伝子を含む場合があり、また、その有機体の内部遺伝子と同種の遺伝子を示す場合もある。
【００２６】
“形質転換細胞”は導入遺伝子を含む細胞を意味する。例えば、本発明において異種核酸分子と機能的に連結された発現ベクターを含むベクターに形質転換された幹細胞は形質的な特徴が変った細胞群を形成するのに利用できる。形質転換有機体から由来した細胞はその細胞が導入遺伝子を含む形質転換細胞である。
本発明の他の特徴と長所は、以下の、好ましい実施態様の記載及び特許請求の範囲の記載から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明者らは、発生学的に拘束された状態であるが、分化しない細胞の移植がターゲット組織内で移植細胞の生存と、とり込み、及び適応力を増加させるということを見出した。
脊椎動物の発生において初期心臓発生はＣsx/Ｎkx２.５の発現と定義される。このような発生段階でＣsx/Ｎkx２.５発現細胞は継続的な増殖時期にある。本発明者らは増殖時期にあるＣsx/Ｎkx２.５発現細胞を移植することによって心臓にとり込まれ機能を示す心筋細胞の数が増加することと確信している。
【００２８】
また、本発明者らは心筋層部位で新たな血管の形成と心筋組織が同時に再生される細胞移植治療法を見出した。このような方法は心筋細胞、内皮細胞、又は血管平滑筋細胞など三種の細胞形態のうちの一つになり始めた未分化細胞の移植を含む。
【００２９】
細胞移植のために十分な量の細胞を供給することが望ましい。従って、移植される細胞は幹細胞から由来するということが一種の特徴である。適切な幹細胞の内の一つは骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）であって、これは成人の骨髄から採取できる。一旦採取された骨髄幹細胞（ＢＭＳＣｓ）は後述するように成長因子で処理して(プライミングと呼ぶ。)心筋細胞系統に誘導することができる。一方、骨髄幹細胞（ＢＭＳＣｓ）は内皮細胞系統又は血管平滑筋細胞系統に誘導することもできる。  具体的に骨髄幹細胞の系統の転換を特定細胞認識インジケーターシステムを用いてモニタリングできる。このような内容は米国分割特許出願第６０/２８３、８３７号に記述されており、これを参照した。細胞種特異的インジケーターシステムを作り出すため、細胞系統特異的エンハンサー/プロモータ−誘導マーカーを含む遺伝子コンストラクトを用いて形質転換マウスラインが確立される。例えば、心筋細胞前駆体の変換はｈＣｓｘ-ｌａｃＺ形質転換マウスのカプセル化骨髄幹細胞を用いてモニタリングできる。適当なマーカー遺伝子発現が細胞集団から見出されれば、このような細胞を採収して宿主心筋層に注入する。
【００３０】
実施態様の一つとして、心筋細胞前駆体、内皮細胞前駆体、血管平滑筋細胞を同時に宿主心筋層に注入する。特定位置に各細胞型を適当な分布で注入するために多種の細胞を注入するよう考案されたマルチチャンネル注射器を使用することができる。各針の長さと針間の距離は心筋層に注入される各細胞の最適位置によって調節できる。
【００３１】
細胞移植成功のためには幹細胞と幹細胞誘導体の調製の最適化が極めて重要である。細胞移植の移植率を最大化するためには移植される細胞が拘束(commitment)と分化の適切な段階にあることが望ましい。現在種々の動物細胞に対する拘束と分化マーカーが知られているが、in vitro培養時適切な細胞採収時期を決定するためには分子生物学的な方法でマーカー発現を確認することに時間を費すしかない。本発明者らは、細胞培養時、細胞の分化段階を実時間的に決める生物学的に有用なインジケーターシステムを開発した。このようなインジケーターシステムを使って細胞成長又は細胞死滅過程の間、タンパク質の発現量を決定することができる。
【００３２】
殆んどの組織特異的遺伝子発現は転写段階でエンハンサーと抑制物質(repressor)によって調節される。一般に、発現を正確に調節するためには、エンハンサーは多様な転写因子の協力を求める混合調節メカニズムを採択すべきである。転写因子の結合部位は遺伝子プロモータから数キロベース(kb)離れており、互いに離れて分散している。
マウスで形質転換遺伝子の発現を誘導するために使用される際、ｈＣsx/Ｎkx２.５とｍＣsx/Ｎkx２.５の心臓エンハンサーは内因性のｍＣsx/Ｎkx２.５の発現パターンを反復する(米国特許出願公開第２００２/０２２２５９号参照、参考文献として提示。)。哺乳類の心臓エンハンサーと知られているものの一つであるこのエンハンサー(７．５ｋｂエンハンサー)は四つの心室と心房で発現される最初のエンハンサーである。更にこのエンハンサーは場所を外れたところからは発現されない。７．５ｋｂ内で二つの領域(Ａ１とＡ２と呼ばれるドメイン(domain))が共に同定された。これがhsp６８promoter-lacZカセットと連結されれば心臓特異的に遺伝子発現を向上させ得る。この二つの領域は本発明でレポータを構築する際に利用できる。
【００３３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
ＢＭＳＣｓからの心筋芽細胞の誘導
骨髄はマウスと犬の成体から分離した。 ＢＭＳＣｓを分離して１０％牛血清、１００μＭのＬ−アスコルビン酸−２−ＰＯ４、５−１５ｎｇ/ｍｌの白血病阻害因子（ＬＩＦ）（マウス細胞培養ではマウスＬＩＦを使用し、犬細胞培養ではヒトＬＩＦを使用した)及び２０ｎＭデキサメサゾンと共に培養した。このようなin vitro条件下で骨髄幹細胞は自家増殖性を維持し、成長因子のような分化試薬に反応性を失われず継代培養を通して増殖される。また、種々の継代培養を通して培養された幹細胞は間充織形態(mesenchymal morphology)と核型(karyotype)を維持する(図１)。成長因子(５０ｎｇ/ｍｌ ＢＭＰ２、１００ｎｇ/ｍｌ ｂＦＧＦ)と共に１４日間培養後約８０％の骨髄幹細胞がＣsx/Ｎkx２.５、ＭＦ−２０(筋節ミオシン特異モノクローナル抗体)とデスミン抗体によって染色されたが、これは細胞が心筋細胞に分化されたことを示している(図３及び図４)。
【００３５】
移植される骨髄幹細胞が露出される成体心筋層に似た環境を構成するために共存培養システムを用いた。このシステムにおいて骨髄幹細胞を同定するために蛍光タグ(ＶｙｂｒａｎｔＴＭ)で標識し、鶏胚芽心筋細胞と１:４０の比率で５ｎｇ/ｍｌのコラーゲンでコーティングされたガラススライド上で共存培養した。これらの共存培養は２５ｎｇ/ｍｌ ＢＭＰ２の存在下、又は２５ｎｇ/ｍｌ ｂＦＧＦの存在下に行った。その後、細胞は抗Ｃsx/Ｎkx２.５、ＭＦ−２０(筋節ミオシン特異モノクローナル抗体)及びデスミン抗体で染色した。開始５日後、少数(０．１〜１％)の細胞がＢＭＰ２又はｂＦＧＦ存在下の共存培養においてミオシン陽性反応を示した。しかし、成長因子なしに２週間共存培養した後にも多くの骨髄幹細胞がＭＦ-２０について陽性を示したが、これはこの細胞が筋肉芽細胞系統に変ったことを示している(図２)。従って、骨髄幹細胞はＢＭＰ２及びｂＦＧＦのような成長因子を使用したり、又は分化された心筋細胞と共存培養を行うことによって筋肉芽細胞系統に分化され得る。
【００３６】
前述した結果によれば、細胞が培養される環境を調節することによって骨髄幹細胞が心筋芽細胞に分化できる比率と量を調節することができる。本発明の移植方法により移植する細胞のうち少くとも１０％は心筋芽細胞であることが望ましい(即ち、類似分裂細胞はＣsx/Ｎkx２.５を発現するが筋節構造や筋収縮などが見られず、ミオシン重鎖ＲＮＡ又はタンパク質の発現を検出可能な量ほど発現しない)。心筋芽細胞が高含量に含有されていれば移植された細胞のとり込み率が高まる。少くとも１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％又は９５％或いはそれ以上の細胞が心筋芽細胞であることが望ましい。実時間拘束の測定は以下の実施例５で述べられた細胞インジケーターシステムを用いて実施される。
【実施例２】
【００３７】
ヒトと他の哺乳類からのＢＭＳＣｓ
前述した実施例は示範目的としてマウスＢＭＳＣｓを使用している。ヒトＢＭＳＣｓもまた心筋細胞を生成できることが知られている(Pittenger et al．，Science ２８４: １４３−１４７，１９９９)。他の哺乳類のＢＭＳＣｓ(例えば、humanized pig ＢＭＳＣｓ)もまた本発明の方法に用いることが出来る(Levy et al．，Transplantation ６９: ２７２−２８０，２０００)。
【実施例３】
【００３８】
ＢＭＳＣｓを心筋芽細胞に誘導する方法
前述したようにＢＭＰ２及び/又はｂＦＧＦ存在下で心筋細胞と骨髄幹細胞を共存培養すれば心筋細胞に分化できる心筋芽細胞を誘導する。骨髄幹細胞と誘導細胞の比率、及び成長因子の濃度を調節して心筋芽細胞分化の程度と量を調節することができる。例えば、骨髄幹細胞と誘導細胞の比率は１:１〜１:１０００、又はそれ以上も可能である。ＢＭＰ２の濃度範囲は約０．５ｎｇ/ｍｌ〜１μｇ/ｍｌが可能であり、ｂＦＧＦは１ｎｇ/ｍｌ〜５μｇ/ｍｌまで可能である。ＢＭＰ/ＴＧＦ及びＦＧＦファミリはＢＭＰ２及び/又はｂＦＧＦの代りに使用できる。
骨髄幹細胞を心筋芽細胞に誘導する公知の他の方法も本発明に使用できる。しかし、心筋細胞に誘導する方法は全て使用できない。例えば、５−アザシチジンは心筋細胞誘導物質として知られているが(Makino et al．，J．Clin．Invest．，１０３: ６９７−７０５，１９９９)、これは本特許の方法には不向きである。５−アザシチジンは任意に遺伝子配列をジメチル化させるため(非発現遺伝子の発現促進)、５−アザシチジンで骨髄幹細胞を処理すれば、心筋細胞(cardiac troponinＩ陽性)(Wakitani et al．，Muscle Nerve，１８: １４１７−１４２６，１９９５; Tomita et al．，Circulation，１００ suppl II: ２４７−２５６，１９９９)以外にも種々の細胞型(例えば筋細胞(ＭｙｏＤ陽性)、骨芽細胞(osteocalin陽性)、脂肪細胞(ＰＰＡＲ−γ陽性))に分化することが出来る。骨髄幹細胞を５−アザシチジンに暴露すれば、ｃ−ａｂｌとインターロイキン−６の発現が早く増加し、それによりコラーゲンＩのような主要マトリックス(matrix)タンパク質の発現が減少する(Andrews et al．，Mol．Cell．Biol．，９:２７４８−２７５１，１９８９)。本発明の方法においては、適切な因子又は条件は特異的にある種の細胞型(例えば、心筋細胞)に誘導する。
【実施例４】
【００３９】
他の細胞型への誘導
心筋層に移植するために血管筋肉細胞及び内皮細胞(又はそれらの前駆体)のような細胞を誘導することが望ましい。それは、このような細胞が移植された心筋芽細胞の周囲に新たな血管を形成するからである。細胞を一種だけ移植することもできるが、適当な心筋芽細胞と共に移植することが望ましい。
血管筋肉細胞の分化はＢｖｅｓ遺伝子エンハンサーを用いて決定することができる(Reese et al．，Dev．Biol．２０９:１５９−１７１，１９９９)。内皮細胞の分化はＴｉｅ−２又はクローニングされたフォンビルブランド因子エンハンサーを用いて決定することができる(Schnurch and  Risau，Development １１９: ９５７−９６８，１９９３; Coffin et al．，Dev．Biol．１４８:５１−６２，１９９１)。胚芽心筋外皮細胞(即ち、内皮細胞の前駆体)の分化はＦｌｋ−１又はＩＣＡＭ−２エンハンサーによって決定される(それぞれ、Shalaby et al．，Nature ３７６: ６２−６６，１９９５; Tevosian et al．，Cell １０１:７２９−７３９，２０００)。
骨髄幹細胞は前述した方法で分離し、胚芽発生時期に内皮細胞の発生因子として知られている生物学的因子と共に培養した(２％牛血清、２０ｎｇ/ｍｌ ＶＥＧＦ、１ｎｇ/ｍｌｂＦＧＦ、及び２ｎｇ/ｍｌ ＩＧＦ−Ｉ)。内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼであるＦｌｋ−１は培養１４日後、８０％近くの骨髄幹細胞で強く発現されたが、これは内皮細胞系統に変ったことを意味する(図５)。
【実施例５】
【００４０】
細胞インジケーターシステム
図１６Ａに示した通り、インジケーターシステムは三種で構成されている。インジケーター細胞２、細胞カプセル化システム（ＣＥＳ）４、及びインジケーター細胞をＣＥＳに残留できるようにし、インジケーター細胞２を移植される細胞８と区別してくれる透過性の外膜又はメッシュ６。
一例として、インジケーター システムは幹細胞(例えば骨髄幹細胞)の細胞の拘束と分化時期を決定するのに有用である。ここに記述された通り、ヒト骨髄幹細胞の約５〜１００％程度(望ましくは約８０％)が心筋芽細胞(Ｃsx/Ｎkx２.５発現、組織化された筋節構造又は筋収縮の欠乏、及び望ましくはミオシン重鎖ＲＮＡ又はタンパク質の欠乏により測定されたもの)になるようにヒト骨髄幹細胞を用意することが望ましい。かくして、分析のための細胞採収と移植のための細胞採収との間の時間的差異を短縮するために、分析を迅速にすることが望ましい。迅速な分析は、分析結果が最終的に移植される細胞がＣsx/Ｎkx２.５発現細胞であることを示すことを保障する。本発明はこのような分析方法を提供する。レポータ遺伝子と機能的に連結されたＣｓｘエンハンサーを含む形質転換マウスの骨髄幹細胞がインジケーター細胞として利用される。例えば、参考文献として記入した米国特許出願公開第２００２/０２２２５９号で適切なＣｓｘエンハンサーを説明している。インジケーター細胞は生物学的物質（例えば、アルギン酸塩、コラーゲン、ゼラチン又はキトサン)中にカプセル化させるか、又は生分解性の重合体［例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、又はポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体（ＰＬＧＡ）の非多孔性細粒］の上に付着させる。カプセル化された又は細粒に付着された細胞は酸素、栄養物質、及び他の生物学的分子透過性の膜によって取り囲まれている。適切な膜の例として多孔性透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）メンブラン、透明ナイロンメッシュ、透明多孔性ナイロンメンブラン、及び多孔性透明ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ／テフロン）などがある。
【００４１】
インジケーター細胞をカプセル内に保有することに加えて、外側の膜はシステムに物理的に完全な状態を提供する。ヒト骨髄幹細胞を心筋芽細胞に誘導する過程においてＣｓｘエンハンサーと機能的に連結されたレポータ遺伝子(即ち、ヒトＣｓｘエンハンサー)がインジケーター細胞で発現される。レポータ遺伝子発現の非毒性検査はヒト細胞の分化段階を指示する。適切なレポータ遺伝子には、これらに限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質やβ−ガラクトシダーゼやルシフェラーゼをコードする遺伝子が含まれる。細胞が所望の分化段階に至ったと決定された後、全てのインジケーターシステム(インジケーター細胞、カプセル化物質、透過性の膜を含む)は除去される。移植される細胞は移植のために採収され用意される。要すれば、細胞は凍結させて移植前まで保管することもできる。
【００４２】
本発明の細胞インジケーターシステムではインジケーター細胞として何れの種類の細胞でも使用可能であり、エンハンサー物質/レポータ遺伝子コンストラクトが、細胞が分化される際に操作できる何れかの形態の細胞であり得る。一例としては、レポータコンストラクトとしては形質転換された骨髄幹細胞が使用される。これらの細胞は何れかの動物の骨髄幹細胞、又はエンハンサー物質/レポータ遺伝子に形質転換された胚芽幹細胞やエンハンサー物質/レポータ遺伝子に形質転換された動物の骨髄幹細胞であっても良い。
【００４３】
本発明者らは前述したカプセル化細胞インジケーター システムの原理をｈＣｓｘ−ｌａｃＺ形質転換マウスから由来されたマウスの骨髄幹細胞を用いて証明した。本発明者らは心筋芽細胞系統に分化を誘導しない骨髄幹細胞はβ-ガラクトシダーゼアッセイで全く染色されないか微弱に染色されることを見い出した(図１５)。逆に前述した方法を用いて心筋芽細胞に分化を誘導した骨髄幹細胞は強力な陽性反応を示した(図１５)。従って、マウスｈＣｓｘ-ｌａｃＺ骨髄幹細胞は筋肉芽細胞分化の展開過程をモニタリングするのに使用できるシステムとしてのカプセル化のための優れた候補物質である(図１６Ａ及び図１６Ｂ)。このようなインジケーターシステムは以前に使用された細胞分化測定方法より幾つかの長所がある。特にカプセルは培養培地から容易に回収され、速やかに且つ正確に分析される。更に、カプセルは全ての培養管(vessel)に混和され、回収されてplate-by-plateでモニタリングできる。モニタリングするために以前の方法のように培養全体を破壊する必要がない。特に、ヒトの骨髄サンプルが得難く、培養し移植できる幹細胞の量も少量なので、これは骨髄幹細胞を用いる際に極めて重要な意味を有する。
【００４４】
マウスのｈＣｓｘ-ｌａｃＺ骨髄幹細胞は前述した特性を含む適当な物質にカプセル化できる。例えば、アルギン酸塩で細胞を包埋し、それから例えばミリポア社(マサチュセッツ州ベッドフォード)の１１μｍ又は３０μｍナイロンメッシュにアルギン酸塩包埋細胞を含有させることによってカプセルを作れるが、これは耐久性があり、且つ培養液や成長因子、酸素、β-ガラクトシダ-ゼアッセイに使用される化学物質に対して透過性が良い。  ここに記述された方法を使用すれば、カプセルは望ましくは１ｍｌ当たり少くとも約１０６個のｈＣｓｘ-ｌａｃＺ骨髄幹細胞を含有し得る。しかし、少くとも約１０７cell/ｍｌが更に望ましい。勿論、条件を変化させることにより、通常の技術を有する者がカプセルシステムのインジケーター細胞の適切な濃度を決定することもできる。
【００４５】
本発明においてカプセル化モニターシステムを作るのに使用される特異的インジケーター細胞がマウス細胞である必要はない。インジケーター細胞は移植受容体について異種であっても自家であっても良い。骨髄幹細胞が比較的に豊富な場合は、前述したようにレポータコンストラクトを有する宿主骨髄幹細胞を形質転換することが好ましい。このような自家骨髄幹細胞がカプセル化され、モニタリング目的として使用できる。骨髄幹細胞の供給に制約がある場合には、代案として非-自家(異種又は同種)インジケーター骨髄幹細胞を使用することもできる。
【実施例６】
【００４６】
移植方法
本発明は自家由来又は異種由来の心臓細胞を移植することによって不十分な心臓機能による被験者の障害を治療する方法に関する。本方法には本発明の幹細胞から由来された心臓細胞前駆体、内皮細胞前駆体、そして血管平滑筋細胞前駆体を被験者に投与する方法が含まれ、以下に詳述する。心臓疾患を有する被験者の心臓に本発明の細胞を移植することによって、機能できないか(hybernating)消失された心臓細胞と置き換えることが出来る。  機能できないか消失された心臓細胞の代りに、少くとも一種以上の心臓疾患の症状や副作用を緩和させたり少くとも部分的に軽減させ得る適当な量の細胞が、心臓疾患を有する患者に導入される。細胞は何れか適当なルートを通して患者に導入でき、患者の所望の領域に細胞を伝達した結果少くとも何れかの部位では細胞が生き残っている。少くとも約５％、望ましくは少くとも約１０％、より望ましくは少くとも約２０％、更に望ましくは少くとも約３０％、更に、より望ましくは少くとも約４０％、そして最も望ましくは少くとも約５０％又はそれ以上の細胞が患者に導入された後、生き残っていることが望ましい。  患者に導入された後細胞が生きている期間は短くは数時間、例えば、２４時間から数日、長くは数週から数ヵ月である。本発明の細胞を患者に伝達できる方法の一つは患者心室の心筋層に直接に細胞を注入することである(例えば、Soonpaa et al．，Science ２６４:９８-１０１，１９９４; Koh et al．，Am．J．Physiol.３３: Ｈ１７２７-１７３３，１９９３)。細胞は緩衝食塩水溶液のような生理的に適したキャリアーと共に投与できる。  ヒト患者の不完全な心臓機能による病気を治療するためには約１０４〜１０９個の細胞がヒトに、即ち、心筋層内に導入されるべきである。
【００４７】
このような投与方法を達成するため、本発明の細胞は患者内部への細胞移植や注入を容易にする運搬デバイス内に挿入されうる。移植対象患者の体内に細胞や体液を注入するための運搬デバイスにはチューブ、例えばカテ−テルが含まれる。好ましい実施態様としては、チューブはそれを通して患者の所望の部位に本発明の細胞を注入できるように一本の針や多数本の針を更に有している。注入の間中、相異なる状態の(他の培養液のような)それぞれの細胞形態は維持されることが望ましい。その場合、一本、二本又は三本の針を有する多-円筒形注射器が注入のために使用できる(図２０Ａ、図２０Ｂ、図２１Ａ、図２１Ｂ、図２２Ａ、及び図２２Ｂ)。もし３つの注射外筒と２つの注射針を持った注射器が使用される場合には、内皮細胞前駆体と平滑筋細胞前駆体は注入される間に混合されることが望ましい。
【００４８】
本発明において細胞は他の形態で運搬デバイス内に挿入できる。例えば、細胞は運搬デバイス内に含有させるとき、溶液中に懸濁させたり支持体マトリックス内に包埋させることができる。望ましくは、溶液が薬剤学的に許容し得るキャリアーや稀釈液を含み、その中に本発明の細胞が生存していることである。薬剤学的に許容し得るキャリアーや稀釈液としては、食塩水、水性緩衝液、溶媒及び/又は分散培養液が含まれる。キャリアーや稀釈液の使用は文献で公知である。溶液は望ましくは殺菌したものであり流動体である。望ましくは、溶液は製造及び保管時安定であるべきであり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールを使用してバクテリアやカビのような微生物に汚染されないよう貯蔵される。本発明の溶液はここで記述された細胞を薬剤学的に許容し得るキャリアーや稀釈液、及び、要すればその他の成分中に注入することによって製造できる。
【００４９】
本発明において支持体は細胞を内部に封入したり包埋できるようなものであって、被実験者に適合しており、分解されて被実験者に無害の物質を生じるマトリックスを含む。マトリックスは天然のもの及び/又は合成されたものであって生分解性のあるものである。  天然のもので且つ生分解性のあるものとしては、例えば、コラーゲンマトリックスとアルギン酸塩ビーズが含まれる。合成品で生分解性のあるものとしてはポリ酸無水物、ポリオルソエステル、ポリ乳酸のような重合体が含まれる。これらマトリックスはin vivoにおいて細胞の支持と保護のためのものである。
【００５０】
患者に導入する前に細胞は免疫拒否反応を抑制するために改変することができる。例えば、移植される細胞の拒否反応を抑制し移植被実験者の免疫非応答性を達成するため、本発明の方法は患者に導入する前に細胞表面の免疫性抗原の改変を含めることが出来る。細胞において一種又はそれ以上の免疫性抗原を改変する方法は、この方法を単独で行うか、或いは、患者へのＴ-細胞の活性を抑制する薬剤の投与とを並行して行うことにより達成される。他の方法として、移植される細胞の拒否反応抑制は移植される細胞表面に、先に免疫性抗原の改変なしに患者のＴ-細胞活性を抑制する薬剤を患者に投与することによって行うことが出来る。Ｔ−細胞活性を抑制する薬剤は、患者内部でＴ−細胞を除去(例えば、壊死巣分離)したり、破壊したり、或いは患者内部でＴ−細胞機能を抑制したりする物質と定義する。Ｔ-細胞は依然として患者内部に存在することもできるが、機能しない状態、即ち、増殖できないか、誘導できないか、エフェクター機能(例えば、サイトカイン産生、細胞障害作用)を行なえない状態になっている。Ｔ-細胞活性を抑える薬剤は、また、未熟なＴ-細胞(例えば胸線細胞)の成熟や活性化を抑制することもできる。移植される患者にとってＴ-細胞活性を抑えるために使用する好ましい薬剤は、正常な免疫作用を抑制したり妨害したりする免疫抑制薬物である。好まれる免疫抑制薬物としてはサイクロスポリンＡがある。他の免疫抑制薬物には、例えばＦＫ５０６やＲＳ-６１４４３が含まれる。
【００５１】
実施態様の一つとしては、免疫抑制薬物は少くとも一つの他の治療薬物と共に同時に投与される。追加的な治療薬物にはステロイド(例えば、プレドニゾン、メチルプレドニソロン、デキサメサゾンのようなグルココルチコイド)と化学療法剤(例えば、アザチオプリンやシクロホスファミド)が含まれる。他の実施態様としては、免疫抑制薬物はステロイド及び化学療法剤と共に投与できる。適当な免疫抑制薬物は商業的に入手可能である。
心臓と関連する病を治療すること以外にも細胞移植治療は広範囲の疾患に適用できる(例えば、パーキンソン氏病、糖尿病、脊髄損傷、多発性硬化症)。心筋層内部への移植において、望まれる細胞の運命を優先的に受け入れ、類似分裂を行なえる能力を有する細胞を移植することが、移植される細胞の調和を助けて宿主組織に望まれる細胞が更に多量にとり込まれ生き残れることにつながる。細胞系統の分化、拘束、又は能力の検出のために有用なエンハンサーは以下の表１に詳細に示される。
【００５２】
【表１】
2005522979.tif 000002
【００５３】
前記各参考文献は本発明の参考文献として組み入れる。
【実施例７】
【００５４】
犬の心筋梗塞モデル
In vitroにおいて心筋芽細胞系統に分化される骨髄幹細胞を梗塞された犬の心筋組織に移植した。犬心筋梗塞は左側冠状動脈を永久的に閉塞することによって作られた。梗塞は骨髄幹細胞移植前に少くとも二ヶ月間安定化させた。移植による免疫拒否反応を防止するため、骨髄は次のようにそれぞれ移植受容体である犬から分離して用意した。結紮後約４週後に、心エコー図を用いて心筋梗塞を確認した後、骨髄を抽出するために長骨に孔あけを施した。骨髄を直ちにヘパリンと混合し、冷凍してドライアイスに入れて組織培養室に運搬した。ここで骨髄は３７℃で解凍し、懸濁させ、通常使用されるＤＭＥＭ培地で１回洗浄して、培養液(１０％牛血清、１００μＭ Ｌ-アルコルビン酸-２-ＰＯ４、５〜１５ｎｇ/ｍｌ ＬＩＦ、２０ｎＭデキサメサゾン)が入っている組織培養フラスコに入れた。採収する際、移植後の細胞の生存と進行を追跡するため、赤色蛍光マーカーであるＤｉＩで骨髄幹細胞を標識した。標識された骨髄幹細胞は４〜７日間１００ｎｇ/ｍｌのｂＦＧＦを添加して培養した。１．５〜２５０×１０６個の細胞を採収し、心臓の梗塞部位に注入した。
【００５５】
移植後の骨髄幹細胞の生存は死後にＤｉＩ蛍光を視覚化することによって確認された。移植１５日後に心筋層でＤｉＩ陽性の大きな細胞集団が観察された。これは骨髄幹細胞が長期間生存していることを示唆している(図６)。特にＤｉＩで標識された幹細胞がＭＦ-２０陽性の心筋細胞を含んでいる心筋層内部部位と、ＭＦ-２０陽性の心筋細胞が欠如された梗塞部位で観察された(図６)。更に、心臓筋肉特異マーカーであるＭＨＣ α/βをも発現する、ＤｉＩ陽性の幹細胞が梗塞部位の境界付近でも観察された(図７〜図９)。これらのデータは、上記方法に従ってin vitroで調製された、移植された骨髄幹細胞が宿主心筋層にとり込まれ、組み入れられて、心臓に分化される特徴を示すマーカーを発現することを立証している。
【実施例８】
【００５６】
梗塞の大きさを減少させるＢＭＳＣ移植
実施例７に記載した心筋梗塞犬モデルを、心エコー図（ＥＣＧ)を用いて骨髄幹細胞移植の回復効果をin vivoで判断するために使用した。心エコー図は骨髄幹細胞移植後３．５、４．５、及び５週に行なって(それぞれ図１９、図１７、及び図１８)、移植前の心臓心エコー図と比較した。各動物において、梗塞部位の収縮力が改善され心筋層の隣接部位と調和をなすようになった。従って、心エコー図の結果は実施例７の組織免疫染色結果を確実にし、培養された骨髄幹細胞の移植が梗塞以後の心臓組織を部分的に回復させることを証明している。
【実施例９】
【００５７】
齧歯類の心筋梗塞モデル
移植された骨髄幹細胞の長期間生存能力を齧歯類の心筋梗塞モデルシステムを用いて検討した。免疫拒否反応を防止するため、骨髄幹細胞は移植に使用されるマウスと同種同形のマウスから採収した骨髄から分離した。前述したように、骨髄幹細胞は４〜７日間１００ｎｇ/ｍｌのｂＦＧＦ存在下で培養しＤｉＩで蛍光を呈するよう標識して再び採収した。  梗塞は左側心臓動脈を縛ることにより作製した。処理された骨髄幹細胞は次のように梗塞部位に注射した。骨髄幹細胞(１０μｌのＰＢＳ又はＨＢＳＳ中、１００、０００〜５００、０００個)を２９Ｇ又は３０Ｇハミルトン針を装着した５０μｌのハミルトン注射器を用いて斜めに前膈膜左心室心筋に注入した。手術中、マウスはフィードバック温度調節器を用いて３７℃が維持されるベッド上に置かれており、マウス人工呼吸器(設定容積:２００μｌ、速度:１１０μｌ／min)を用いて呼吸を助けた。移植後３６日に、ＤｉＩで標識された細胞の存在と心筋細胞生存能力を測定するため梗塞部位を分析した。犬モデルにおいて観察された通り、標識された骨髄幹細胞が齧歯類の心筋梗塞部位内にとり込まれた。また、心筋層に存在する、ＤｉＩで標識された細胞が、心筋細胞の形態学的特徴を示した。この部位をヘマトキシリンとエオシンで染色すれば、梗塞内部で心臓筋肉の特徴を示す縞模様、螺旋状の核、及び細長い繊維質が見える(図１０)。また、本発明者らは、心筋層の梗塞された部位に隣接している、ＤｉＩに陽性の細胞を観察した。心筋細胞を視覚化するためα-ＭＨＣ、ＭＦ-２０、及び心臓性トロポニン抗体を用いて染色した結果はＤｉＩで標識された細胞(移植された骨髄幹細胞)が心臓筋原繊維内に存在することを示している(図１１、図１２、及び図１４)。また、移植された骨髄幹細胞は心筋層の隣接部位にとり込まれた(図１３)。従って、移植され刺激された骨髄幹細胞は正常な心臓組織と梗塞された心臓組織の両方に完全にとり込まれ、続いて心筋細胞に分化された。分化は移植前にin vitroで刺激される間に始まった。
【実施例１０】
【００５８】
幹細胞を内皮細胞前駆体に誘導する方法
内皮細胞前駆体を産生させるためには、単離された幹細胞(例えば、ヒトの骨髄肝細胞)をＶＥＧＦ(１０ｎｇ/ｍｌ)、ｂＦＧＦ(１ｎｇ/ｍｌ)、ＩＧＦ-Ｉ(２ｎｇ/ｍｌ)を用いて４〜７日間前処理を施す(Shi et al．，Blood ９２:３６２-３６７，１９９８)。細胞インジケーターシステムにおける変換インジケーターとして、レポータ遺伝子に機能的に連結されたＴｉｅエンハンサーが内在された幹細胞を使用することができる(Schlaeger et al．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ９４: ３０５８-３０６３，１９９７)。
【実施例１１】
【００５９】
幹細胞を血管平滑筋細胞前駆体に誘導する方法
血管平滑筋細胞前駆体を産生させるためには、単離された幹細胞(例えば、ヒトの骨髄幹細胞)をＰＤＧＦ(１〜１０ｎｇ/ｍｌ)とＴＧＦ-β(１〜１０ｎｇ/ｍｌ)を用いて４〜７日間前処理を施す(Hirschi et al．，J．Cell Biol．１４１:８０５-８１４，２０００)。  細胞インジケーターシステムにおける変換インジケーターとして、レポータ遺伝子に機能的に連結されたＢｖｅｓエンハンサーが内在された幹細胞を使用することができる(Reese et al，Dev．Biol．２０９: １５９-１７１，１９９９)。
【００６０】
本明細書において引用された全ての刊行物と特許出願は、それぞれの刊行物や特許出願が特別に、また個々に示している内容と共に参考文献として本明細書に組み入れる。本発明の理解を明らかにするため実施例によって具体的に説明したが、当該分野において通常の知識を有する当業者にとって本発明の教示に照らして、添付した請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しない範囲において何らかの変更や修正が可能なことは自明であろう。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、高いとり込み率と高い細胞生存率を有する細胞移植方法と、哺乳類(例えば、ヒト)心筋組織に移植するための細胞を生産する方法を提供するものであり、細胞移植分野において貢献するところ大なるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】マウスと犬から得た骨髄幹細胞を分離、培養したものを位相差顕微鏡で観察した、図面に代る写真である。（実施例１）
【図２】マウス由来ＢＭＳＣｓを鶏心筋細胞と１４日間混合培養したものを顕微鏡で連続して観察した、図面に代る一連の写真である。（実施例１）
【図３】肉腫ミオシンに特異的なＭＦ−２０抗体又は抗デスミン抗体を使用した、マウス心筋細胞、未分化ＢＭＳＣｓ、及び分化したＢＭＳＣｓの染色と形態を示す、図面に代る一連の顕微鏡写真である。（実施例１）
【図４】犬ＢＭＳＣｓをin vitroで分化させた後の形態とＣsx/Ｎkx２.５発現を調べた、図面に代る一連の顕微鏡写真である。（実施例１）
【図５】in vitroでマウスＢＭＳＣｓからの内皮細胞分化を示す、図面に代る一連の顕微鏡写真である。（実施例４）
【図６】移植１５日後心筋梗塞犬の心筋層に移植されたＢＭＳＣｓの位置を示す、図面に代る一連の顕微鏡写真である。（実施例７）
【図７Ａ】注射された部位で、ＤｉＩ蛍光を示す移植されたＢＭＳＣｓと抗ＭＨＣα/β蛍光を示す心筋細胞の共存を示す、図面に代る一連の顕微鏡写真である。（実施例７）
【図７Ｂ】カスパーゼ阻害剤で処理したＢＭＳＣｓが処理しないＢＭＳＣｓと比べて生存率が増加することを示す、図面に代る顕微鏡写真である。（実施例７）
【図８】注射部位から離れた部位で、ＤｉＩ蛍光を示す移植されたＢＭＳＣｓと抗ＭＨＣα/β蛍光を示す心筋細胞の共存を示す、図面に代る一連の顕微鏡写真である。（実施例７）
【図９】注射部位から離れた部位で、ＤｉＩ蛍光を示す移植されたＢＭＳＣｓと抗ＭＨＣα/β蛍光を示す心筋細胞の共存を示す一連の顕微鏡写真である。（実施例７）
【図１０】マウスのＢＭＳＣｓを移植してから３６日後のマウス心筋壊死部位の組織病理を示す、図面に代る一連の顕微鏡写真である。（実施例９）
【図１１】移植３６日後のマウスの心筋組織にマウスＢＭＳＣｓがとり込まれたことを示す、図面に代る顕微鏡写真である（α−ＭＨＣで染色したもの）。（実施例９）
【図１２】移植３６日後マウスの心筋組織にマウスＢＭＳＣｓがとり込まれたことを示す、図面に代る顕微鏡写真である（ＭＦ−２０で染色したもの）。（実施例９）
【図１３】移植３６日後マウスの心筋組織にマウスＢＭＳＣｓがとり込まれたことを示す、図面に代る顕微鏡写真である（移植された骨髄幹細胞が心筋層の隣接部位にとり込まれたことを示す写真）。（実施例９）
【図１４】移植３６日後マウスの心筋組織にマウスＢＭＳＣｓがとり込まれたことを示す、図面に代る顕微鏡写真である（心臓性トロポニン抗体で染色したもの）。（実施例９）
【図１５】ｈＣｓｘ-ｌａｃＺマウスＢＭＳＣｓを心筋芽細胞に誘導する成長因子と共に(右側)、または成長因子なしに(左側)培養した時β-ガラクトシダーゼの活性を比較した一対の顕微鏡写真である。（実施例５）
【図１６Ａ】カプセル化細胞インジケーターシステムの例示であって、インジケーター細胞２はアルギン酸塩ビーズのようなカプセル化物質４にカプセル化されており、インジケーター細胞２とカプセル化物質４は透過性の膜又はメッシュ６中に含まれていて培養管１０で細胞８と同時培養される。（実施例５）
【図１６Ｂ】培養時心筋芽細胞分化をモニタリングするためにカプセル化インジケーター細胞が使用されていることを示したもので、細胞カプセル化に適した１１μｍと３０μｍナイロンメッシュの、図面に代る顕微鏡写真と、多様な細胞数を含むｈＣｓｘ−ｌａｃＺマウスＢＭＳＣｓインジケーターカプセルを使用して行なわれたβ−ガラクトシダーゼ反応の結果を示す、図面に代る顕微鏡写真である。（実施例５）
【図１７】心筋梗塞モデル犬に誘導された骨髄幹細胞を移植する前(左側)と移植した後(右側)の心エコー図（骨髄幹細胞移植後４．５週のもの）（図面に代る写真）である。（実施例８）
【図１８】心筋梗塞モデル犬に誘導された骨髄幹細胞を移植する前(左側)と移植した後(右側)の心エコー図（骨髄幹細胞移植後５週のもの）（図面に代る写真）である。（実施例８）
【図１９】心筋梗塞モデル犬に誘導された骨髄幹細胞を移植する前(左側)と移植した後(右側)の心エコー図（骨髄幹細胞移植後３．５週のもの）（図面に代る写真）である。（実施例８）
【図２０Ａ】典型的な、３バレル、１注射針の模式図である。本例において正確な部位に注射するために各バレルは一本の注射針に連結された液溜アダプタに同時にかつ均等に注入される。三つの注射器バレルは先端で連結されており、一つのプランジャーデプレッサによって調節される。（実施例６）
【図２０Ｂ】図２０Ａで示した、３バレル、１注射針の模式的断面図である。（実施例６）
【図２１Ａ】一つの細胞型を注入するための一つの大きいバレルを有する典型的な、３バレル、２注射針の模式図である。二つの小さいバレルは一本の針に連結されたリザーバーアダプタと連結されている。大きいバレルは注射用の別の針を持っている。大きいバレルに連結されている注射針の針穴は小さいバレルのバレル/針穴比率を維持するために増加させることが望ましい。それによって、三つのバレルの注入圧力が全て等しく維持される。また三つのバレルの三角形配置は二本の針が注入角度が平行に近接できるようにする。三つの注射器バレルは先端で連結されており、一つのプランジャーデプレッサによって調節され均一な圧力を維持させる。（実施例６）
【図２１Ｂ】図２１Ａの３バレル、１注射針の模式的断面図である。（実施例６）
【図２２Ａ】典型的な３バレル、３注射針の模式図である。それぞれの注射器バレルは注入のための１本の針を有している。必要に応じて、３バレルの三角形配置は、三本の針の注入角度が平行に近接できるようにする。三本の注射器バレルは先端で連結されており、一つのプランジャーデプレッサによって調節され均一な圧力を維持させる。（実施例６）
【図２２Ｂ】図２２ａの３バレル、３注射針の模式的断面図である。（実施例６）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図８ｄ】
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【図９】
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【図９ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【国際調査報告】
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