(57)【要約】腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡＥＣ）中の新規タンパク質およびその対応するヌクレオチド配列が提供される。特に、ＡａｐおよびＥＡＥＣ  ０４２のｐＡＡプラスミドのＡＡプローブ領域の５つの遺伝子のクラスター（ａａｔ）が同定され、配列決定され、そしてさらに特徴づけられる。これらの新規タンパク質およびその対応するヌクレオチド配列の、ＥＡＥＣ感染の診断、治療および予防のための使用もまた、提供される。配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択されるタンパク質のうち少なくとも１つコードする核酸を含む、発現ベクター。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択されるタンパク質のうち少なくとも１つコードする核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２】
請求項１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３】
配列番号１、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択される遺伝子のうち少なくとも１つコードする核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５】
配列番号１または配列番号１の縮重改変体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を有する配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を有する配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を調製する方法であって、該方法は、該タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項２に記載の宿主細胞を培養する工程、および該細胞培養物から該タンパク質を回収する工程、を包含する、方法。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列または保存的アミノ酸置換を有する配列番号２のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド分子。
【請求項９】
Ａａｐに特異的に結合する抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖およびＦａｂフラグメントからなる群から選択される、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、検出可能に標識される、請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
前記標識が、放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素からなる群から選択される、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
サンプル中のＡａｐの存在を検出する方法であって、
請求項９に記載の抗体と該サンプルとを接触させる工程；および
該抗体のＡａｐへの結合を検出する工程；
を包含し、ここで、該結合が、該サンプル中のＡａｐの存在を示す、方法。
【請求項１４】
前記Ａａｐの存在が、腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉの存在を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが、髪、皮膚、組織、培養細胞、培養細胞培地および生物学的流体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が標識される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識が、放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項９に記載の抗体を含む容器、およびタンパク質Ａａｐを検出するために該抗体を使用するための指示書を備える、キット。
【請求項１９】
腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するためのキットであって、以下：
容器、該容器上のラベル、該容器内の請求項９に記載の抗体を含む組成物、該抗体とＡａｐとの結合を検出するための視覚化手段；および腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するために該組成物を使用するための指示書を備え、ここで、該容器上の該ラベルは、該組成物が腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するために使用され得ることを示す、キット。
【請求項２０】
配列番号９または配列番号９の縮重改変体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２１】
配列番号４のアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２２】
配列番号４のアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質を調製する方法であって、該方法は、該タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項２に記載の宿主細胞を培養する工程、および該細胞培養物から該タンパク質を回収する工程、を包含する、方法。
【請求項２３】
配列番号４のアミノ酸配列または保存的アミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド分子。
【請求項２４】
ＡａｔＰに特異的に結合する抗体。
【請求項２５】
前記抗体が、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖およびＦａｂフラグメントからなる群から選択される、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
前記抗体が、検出可能に標識される、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２７】
前記標識が、放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素からなる群から選択される、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
サンプル中のタンパク質ＡａｔＰの存在を検出する方法であって、
請求項２４に記載の抗体と該サンプルとを接触させる工程；および
該抗体のＡａｔＰへの結合を検出する工程；
を包含し、ここで、該結合が、該サンプル中のＡａｔＰの存在を示す、方法。
【請求項２９】
前記ＡａｔＰの存在が、腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉの存在を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルが、髪、皮膚、組織、培養細胞、培養細胞培地および生物学的流体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体が標識される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記標識が、放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２４に記載の抗体を含む容器、およびタンパク質ＡａｔＰを検出するために該抗体を使用するための指示書を備える、キット。
【請求項３４】
腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するためのキットであって、
容器、該容器上のラベル、該容器内の請求項２４に記載の抗体を含む組成物、該抗体とＡａｔＰとの結合を検出するための視覚化手段；および腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するために該組成物を使用するための指示書を備え、ここで、該容器上の該ラベルは、該組成物が腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するために使用され得ることを示す、キット。
【請求項３５】
配列番号１０または配列番号１０の縮重改変体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３６】
配列番号５のアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を有する配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３７】
配列番号５のアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を有する配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質を調製する方法であって、該方法は、該タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項２に記載の宿主細胞を培養する工程、および該細胞培養物から該タンパク質を回収する工程、を包含する、方法。
【請求項３８】
配列番号５のアミノ酸配列または保存的アミノ酸置換を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド分子。
【請求項３９】
ＡａｔＡに特異的に結合する抗体。
【請求項４０】
前記抗体が、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖およびＦａｂフラグメントからなる群から選択される、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４１】
前記抗体が、検出可能に標識される、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４２】
前記標識が、放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素からなる群から選択される、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
サンプル中のＡａｔＡの存在を検出する方法であって、
請求項３９に記載の抗体と該サンプルとを接触させる工程；および
該抗体のＡａｔＡへの結合を検出する工程；
を包含し、ここで、該結合が、該サンプル中のＡａｔＡの存在を示す、方法。
【請求項４４】
前記ＡａｔＡの存在が、腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉの存在を示す、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記サンプルが、髪、皮膚、組織、培養細胞、培養細胞培地および生物学的流体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体が標識される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記標識が、放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項３９に記載の抗体を含む容器、およびタンパク質ＡａｔＡを検出するために該抗体を使用するための指示書を備える、キット。
【請求項４９】
腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するためのキットであって、
容器、該容器上のラベル、該容器内の請求項３９に記載の抗体を含む組成物、該抗体とＡａｔＡとの結合を検出するための視覚化手段；および腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するために該組成物を使用するための指示書、を備え、ここで、該容器上の該ラベルは、該組成物が腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するために使用され得ることを示す、キット。
【請求項５０】
配列番号１１または配列番号１１の縮重改変体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項５１】
配列番号６のアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を有する配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項５２】
配列番号６のアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を有する配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質を調製する方法であって、該方法は、該タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項２に記載の宿主細胞を培養する工程、および該細胞培養物から該タンパク質を回収する工程、を包含する、方法。
【請求項５３】
配列番号６のアミノ酸配列または保存的アミノ酸置換を有する配列番号６のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド分子。
【請求項５４】
ＡａｔＢに特異的に結合する抗体。
【請求項５５】
前記抗体が、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖およびＦａｂフラグメントからなる群から選択される、請求項５４に記載の抗体。
【請求項５６】
前記抗体が、検出可能に標識される、請求項５４に記載の抗体。
【請求項５７】
前記標識が、放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素からなる群から選択される、請求項５６に記載の抗体。
【請求項５８】
サンプル中のタンパク質ＡａｔＢの存在を検出する方法であって、
請求項５４に記載の抗体と該サンプルとを接触させる工程；および
該抗体のＡａｔＢへの結合を検出する工程；
を包含し、ここで、該結合が、該サンプル中のＡａｔＢの存在を示す、方法。
【請求項５９】
前記ＡａｔＢの存在が、腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉの存在を示す、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記サンプルが、髪、皮膚、組織、培養細胞、培養細胞培地および生物学的流体である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗体が標識される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記標識が、放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項５４に記載の抗体を含む容器およびＡａｔＢを検出するために該抗体を使用するための指示書を備える、キット。
【請求項６４】
腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するためのキットであって、
容器、該容器上のラベル、該容器内の請求項５４に記載の抗体を含む組成物、該抗体とＡａｔＢとの結合を検出するための視覚化手段；および腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するために該組成物を使用するための指示書を備え、ここで、該容器上の該ラベルは、該組成物が腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するために使用され得ることを示す、キット。
【請求項６５】
配列番号１２または配列番号１２の縮重改変体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６６】
配列番号７のアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を有する配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６７】
配列番号７のアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を有する配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質を調製する方法であって、該方法は、該タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項２に記載の宿主細胞を培養する工程、および該細胞培養物から該タンパク質を回収する工程、を包含する、方法。
【請求項６８】
配列番号７のアミノ酸配列または保存的アミノ酸置換を有する配列番号７のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド分子。
【請求項６９】
ＡａｔＣに特異的に結合する抗体。
【請求項７０】
前記抗体が、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖およびＦａｂフラグメントからなる群から選択される、請求項６９に記載の抗体。
【請求項７１】
前記抗体が、検出可能に標識される、請求項６９に記載の抗体。
【請求項７２】
前記標識が、放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素からなる群から選択される、請求項７１に記載の抗体。
【請求項７３】
サンプル中のＡａｔＣの存在を検出する方法であって：
請求項６９に記載の抗体と該サンプルとを接触させる工程；および
該抗体のＡａｔＣへの結合を検出する工程；
を包含し、ここで、該結合が、該サンプル中のＡａｔＣの存在を示す、方法。
【請求項７４】
前記ＡａｔＣの存在が、腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉの存在を示す、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記サンプルが、髪、皮膚、組織、培養細胞、培養細胞培地および生物学的流体である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗体が標識される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記標識が、放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
請求項６９に記載の抗体を含む容器、およびＡａｔＣを検出するために該抗体を使用するための指示書を備える、キット。
【請求項７９】
腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するためのキットであって、
容器、該容器上のラベル、該容器内の請求項６９に記載の抗体を含む組成物、該抗体とＡａｔＣとの結合を検出するための視覚化手段；および腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するために該組成物を使用するための指示書を備え、ここで、該容器上の該ラベルは、該組成物が腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するために使用され得ることを示す、キット。
【請求項８０】
配列番号１３または配列番号１３の縮重改変体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項８１】
配列番号８のアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を有する配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項８２】
配列番号８のアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を有する配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質を調製する方法であって、該方法は、該タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項２に記載の宿主細胞を培養する工程、および該細胞培養物から該タンパク質を回収する工程、を包含する、方法。
【請求項８３】
配列番号８のアミノ酸配列または保存的アミノ酸置換を有する配列番号８のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド分子。
【請求項８４】
ＡａｔＤに特異的に結合する抗体。
【請求項８５】
前記抗体が、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖およびＦａｂフラグメントからなる群から選択される、請求項８４に記載の抗体。
【請求項８６】
前記抗体が、検出可能に標識される、請求項８４に記載の抗体。
【請求項８７】
前記標識が、放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素からなる群から選択される、請求項８６に記載の抗体。
【請求項８８】
サンプル中のＡａｔＤの存在を検出する方法であって、
請求項８４に記載の抗体と該サンプルとを接触させる工程；および
該抗体のＡａｔＤへの結合を検出する工程；
を包含し、ここで、該結合が、該サンプル中のＡａｔＤの存在を示す、方法。
【請求項８９】
前記ＡａｔＤの存在が、腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉの存在を示す、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記サンプルが、髪、皮膚、組織、培養細胞、培養細胞培地および生物学的流体である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記抗体が標識される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記標識が、放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素からなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
請求項８４に記載の抗体を含む容器、およびＡａｔＤを検出するために該抗体を使用するための指示書を備える、キット。
【請求項９４】
腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するためのキットであって、
容器、該容器上のラベル、該容器内の請求項８４に記載の抗体を含む組成物、該抗体とＡａｔＤとの結合を検出するための視覚化手段；および腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するために該組成物を使用するための指示書を備え、ここで、該容器上の該ラベルは、該組成物が腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染を検出するために使用され得ることを示す、キット。
【請求項９５】
動物において腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉに対する免疫応答を刺激し得る免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、ならびにＡａｔ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、およびＡａｔＤまたはそれらのフラグメントからなる群から選択される、１種以上の単離され精製されたタンパク質を含む、免疫原性組成物。
【請求項９６】
前記免疫原性組成物が、経口投与、経鼻投与、吸入、眼投与、直腸投与または膣投与からなる群から選択される経路によって投与される、請求項９５に記載の免疫原性組成物。
【請求項９７】
動物において腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉに対する免疫応答を生じさせる方法であって、該動物に対して請求項９５に記載の免疫原性組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項９８】
動物において腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉに対する免疫応答を刺激し得る免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、ならびに配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８、または保存的アミノ酸置換を有するこれらの配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、１種以上の単離され精製された核酸分子を含む、免疫原性組成物。
【請求項９９】
前記免疫原性組成物が、経口投与、経鼻投与、吸入、眼投与、直腸投与または膣投与からなる群から選択される経路によって投与される、請求項９８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１００】
動物において腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉに対する免疫応答を生じさせる方法であって、該動物に対して請求項９８に記載の免疫原性組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１０１】
キットであって、以下：
容器、該容器上のラベル、ならびに該容器内に含まれる、請求項９５に記載の免疫原性組成物および腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉに対する免疫応答を誘発するために該免疫原性組成物を使用するための指示書を備え、ここで、該容器上の該ラベルは、該免疫原性組成物が動物において腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉに対する免疫応答を誘発するために使用され得ることを示す、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
本非仮特許出願は、米国特許法１２０条下において、米国仮特許出願第６０／３３４，４２５号および同第６０／３９８，７７５号（それぞれ２００１年１１月３０日および２００２年７月２６日出願）の利益を主張し、この内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府の利益の声明）
本発明は、国立衛生院（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によるＮＩＡＤＡ許可番号第ＡＩ３３０９６号下において、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般に、腸凝集性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＥＡＥＣ）における新規タンパク質および遺伝子に関し、より具体的には、ＥＡＥＣ感染の診断、治療、および予防のための、これらのタンパク質およびそれに対応するヌクレオチド配列の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
腸凝集性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＡＥＣ）は、開発途上国および先進国の両方における、全年齢の個々において、散発性、地方性、および流行性の下痢疾病に伴う、発現腸性病原体である。（Ｎａｔａｒｏら，Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ４：２５１−２６１（１９９８）；Ｎａｔａｒｏら，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．１１：１４２−２０１（１９９８）；Ｏｋｅｋｅら，Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １：３０４−３１３（２００１））。ＥＡＥＣ感染の病因としては、腸粘膜（最も可能性が高くは、小腸および大腸の両方）への強力な粘着が挙げられる。これは、引き続き腸上皮細胞における細胞変性効果を誘発する１つ以上のエンテロトキシンの分泌を起こす。（Ｎａｔａｒｏら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６４：４７６１−４７６８（１９９６）；Ｅｓｌａｖａら，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６６：３１５５−３１６３（１９９８）；Ｃｚｅｃｚｕｌｉｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６７：２６９２−２６９９（１９９９））。ＥＡＥＣの腸粘膜への粘着は、濃く凝集したバイオフィルムの存在によって特徴付けられ、これは、この生物がヒトの腸内に粘り強く留まることを助け得る。（Ｎａｔａｒｏら，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．１１：４２−２０１（１９９８）；Ｔｚｉｐｏｒｉら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６０：５３０２−５３０６（１９９２））。加えて、ＥＡＥＣは、腸の炎症を誘発し得、これは、下痢がなくとも、成長不全に陥れ得る。（Ｓｔｅｉｎｅｒら，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １７７：８８−９６（１９９８））。
【０００５】
ＥＡＥＣの定義となる特徴は、培養におけるＨＥｐ−２細胞への、その際立って特徴的な凝集粘着（ＡＡ）パターンである。（Ｎａｔａｒｏら，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ  ６：８２９−８３１（１９８７））。特に、ＥＡＥＣは、ＨＥｐ−２細胞の表面へ、ガラス基層へ、およびＥＡＥＣ同士で、特徴的なレンガを積んだ（ｓｔａｃｋｅｄ−ｂｒｉｃｋ）形状で粘着する。よく特徴付けられた細胞株におけるＨＥｐ−２細胞への凝集粘着は、プラスミドが有する凝集粘着綿毛（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  Ｆｉｍｂｒｉａｅ）（ＡＡＦ）ファミリーの、１つ以上のメンバーの発現を必要とする。（Ｎａｔａｒｏら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６０：２２９７−２３０４（１９９２）；Ｃｚｅｃｚｕｌｉｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６５：４１３５−４１４５（１９９７））。ＡＡＦファミリーの２つのメンバー、ＡＡＦ／ＩおよびＡＡＦ／ＩＩは、遺伝子レベルで特徴付けられており、この各々は大型のプラスミド（ｐＡＡと称される）にコードされている。（Ｓａｖａｒｉｎｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７６：４９４９−５７（１９９４）；Ｅｌｉａｓら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８１：１７７９−８５（１９９９））。ヒト病原性株０４２は、結腸粘膜への細菌の粘着のために、ＡＡＦ／ＩＩ綿毛状抗原を必要とすることが示されており、これにより、この粘着因子は、ヒト感染のビルレンス因子であることが示唆される。（Ｃｚｅｃｚｕｌｉｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６５：４１３５−４１４５（１９９７））。
【０００６】
ＥＡＥＣ株の大部分は、ＡＡＦ／ＩおよびＡＡＦ／ＩＩを欠いていることが示されている。（Ｃｚｅｃｚｕｌｉｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６７：２６９２−２６９９（１９９９））。にも関わらず、殆どのＥＡＥＣ株は、幾つかの保存された遺伝子座の存在により認識される、およそ１００ｋｂのｐＡＡプラスミドを有する。これらの遺伝子座の中で最も重要なものは、ＡｇｇＲと呼ばれるＡｒａＣクラスの転写アクチベーターで、これは、ＡＡＦ／ＩおよびＡＡＦ／ＩＩ両方の発現に必要である。ＡｇｇＲはまた、確認されているどのＡＡＦも発現しないＥＡＥＣ株の大部分において存在している。（Ｎａｔａｒｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７６：４６９１−４６９９（１９９４））。最近、ＥＡＥＣ０４２においてＡｇｇＲのすぐ上流に存在する新規のＡｇｇＲ依存性遺伝子が、同定され、特徴づけられた。（Ｓｈｅｉｋｈら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（印刷中）（２００２））。このＡｇｇＲ依存性遺伝子は、細菌表面を被膜し、腸粘膜上におけるＥＡＥＣの分散を促進するようである、Ａａｐと呼ばれる、１０．２ｋＤの分泌性タンパク質をコードする。また、Ａａｐは、ジスペルジン（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎ）とも呼ばれる。Ａａｐの変異型は、野生型より、より大きく凝集し、個々の細菌数はよりまばらで、そしてより激しく凝集することが示された。加えて、Ａａｐは、ＡＡＦ仲介凝集を部分的に相殺し、そしてＥＡＥＣの病因における基本的な役割を果たし得る。さらに、データは、Ａａｐが、細菌細胞表面へ、非共有結合的に結合することを示唆する。しかし、Ａａｐが外膜を横切って転位される機構は、まだ知られていない。
【０００７】
プラスミド上における、もう１つの重要な遺伝子座は、ＤＮＡプローブの結合部位、ＣＶＤ４３２である。ＣＶＤ４３２プローブは、ＥＡＥＣの同定を簡潔にするために開発され、ＡＡプローブとして使用された。（Ｂａｕｄｒｙら，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １６１：１２４９−１２５１（１９９０））。その独自の評価において、このプローブは、ＥＡＥＣに対して８９％の感受性および９９％の特異性であることが見出された。ＡＡプローブのヌクレオチド配列は、プラスミドのレプリコンに隣接して位置する、潜在の開放読み取り枠（ＯＲＦ）を表した。（Ｎａｔａｒｏら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６４：４７６１−４７６８（１９９６））。ＡＡプローブ領域のさらなる配列分析により、５つのＯＲＦが、明らかになった。そのうち１つのＯＲＦより予測されるタンパク質は、ＡＢＣ輸送体のＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）ドメインに類似した。このことは、この遺伝子クラスターが、未同定のＥＡＥＣ分子の移送に関係することを示唆する。さらに、この遺伝子クラスターは、Ａａｐのトランスロケーション、およびＥＡＥＣのビルレンス因子の新しい輸送系の構成に関連すると見られる。この５つの遺伝子クラスターは、ａａｔと呼ばれた。
【０００８】
ＥＡＥＣ感染は、世界人口において医学的に重要である。例えば、開発途上国においては、児童は、しばしばＥＡＥＣに感染し、そして長期にわたる下痢を発症し得、しばしば深刻な栄養失調を起こす。先進国においては、ＥＡＥＣは、旅行者の下痢の新たな原因である。腸毒性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅ．Ｃｏｌｉ）から防御するのに効果的なワクチンは、旅行者の下痢の症例の少なくとも２分の１を防御する。しかし、過去、ＥＡＥＣ誘発性疾病の効果的な処置または予防は、なかった。
【０００９】
従って、ＡａｐおよびＥＡＥＣ０４２のｐＡＡプラスミドのＡＡプローブ領域の５つの遺伝子クラスター（ａａｔ）を同定し、特徴づけること、ならびにこれらのタンパク質およびその対応ヌクレオチド配列をＥＡＥＣ感染の診断、治療、および予防のために使用することが、望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
従って、ＥＡＥＣ感染の診断、治療、および予防のための、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、およびＡａｔＤ、ならびにこれらのタンパク質のフラグメントの同定および特徴づけが、本発明の目的である。ＥＡＥＣ感染の診断、治療、および予防のための、ａａｐ、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、およびａａｔＤ（ａａｔ遺伝子クラスターまたはａａｔクラスター）およびこれら遺伝子のフラグメントの同定および特徴づけも、本発明の目的である。
【００１１】
本発明の一実施形態は、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、またはＡａｔＤの組換え産物およびキャリアを含む、免疫原性組成物に関する。この実施形態の種々の局面は、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、またはＡａｔＤの組換え産物が、それぞれＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、もしくはＡａｔＤのフラグメント、それぞれＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、もしくはＡａｔＤの全長、またはそれぞれＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、もしくはＡａｔＤと少なくとも９５％相同であるような産物である、組成物に関する。Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、またはＡａｔＤの組換え産物は、それぞれＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、またはＡａｔＤそのものを、含み得る。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、ａａｐ、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、もしくはａａｔＤを含む単離されたヌクレオチド配列、またはこれらの機能フラグメントに関する。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態は、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、もしくはＡａｔＤ、またはＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、もしくはＡａｔＤの機能的等価物をコードする精製されたポリペプチド配列に関する。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、ａａｐ、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、またはａａｔＤをコードする遺伝子、これらの産物、およびこれらのフラグメントを使用する方法に関する。本明細書中で開示されるある特定の実施形態は、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、もしくはＡａｔＤ、これらの機能フラグメント、またはそれらの産物を含む免疫原性組成物を被験体に提供する工程、および免疫原性組成物を被験体に接触させる工程であって、この免疫原性組成物が被験体において免疫反応を生じる、工程を包含する、免疫反応の発生方法を教示する。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、ａａｐ、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、もしくはａａｔＤ、またはこれらの機能フラグメントをコードするポリヌクレオチドからポリペプチド産物を産生する方法に関し、これは、発現ベクターにおいてａａｐ、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、またはａａｔＤを提供する工程、組換え体宿主細胞が産生されるように発現ベクターを宿主細胞へ導入する工程、およびａａｐ、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、またはａａｔＤからのタンパク質が発現するような条件に組換え体宿主細胞を晒す工程を包含する。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、組換え型のａａｐ、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、もしくはａａｔＤ、またはこれらのフラグメントを含む細胞、およびａａｐ、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、もしくはａａｔＤ、またはこれらのフラグメントを含む発現ベクターに関する。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態は、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、もしくはＡａｔＤ、またはＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、もしくはＡａｔＤのフラグメントに結合し、これらを認識する抗体および抗体フラグメントに関する。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態は、腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡＥＣ）によって引き起こされる疾患の診断に関する。ＥＡＥＣにより引き起こされる疾患の診断はＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、もしくはＡａｔＤ、またはＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、もしくはＡａｔＤのフラグメントに結合し、これらを認識する抗体または抗体フラグメントの使用により行う。ＥＡＥＣによって引き起こされる疾患の診断に関する本発明の代替の実施形態は、ＥＡＥＣによって引き起こされる疾患を診断するための、ａａｐ、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、もしくはａａｔＤ、またはａａｐ、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、もしくはａａｔＤの部分に相補的なポリヌクレオチドの使用に関する。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態は、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、もしくはＡａｔＤ、またはＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、もしくはＡａｔＤのフラグメントに結合し、これらを認識する抗体または抗体フラグメントを利用するキット、抗体または他のタンパク質（すなわち、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、もしくはＡａｔＤ）を利用するキット、およびａａｐ、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、もしくはａａｔＤ、またはａａｐ、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、もしくはａａｔＤのフラグメントに結合し、これらを認識するポリヌクレオチドを利用するキットを含む。これらのキットは、ＥＡＥＣによって引き起こされる疾患の診断およびＥＡＥＣ感染の診断に使用し得る。
【００２０】
Ａａｐタンパク質をコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド分子が、中程度からストリンジェントまでの条件下で、配列番号１またはその相補鎖の１５またはそれ以上の隣接したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得ることは、本発明の特徴である。
【００２１】
本発明の別の特徴は、ＡａｔＰタンパク質をコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド分子が、中程度からストリンジェントまでの条件下で、配列番号９またはその相補鎖の１５またはそれ以上の隣接したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得ることである。
【００２２】
本発明のまた別の特徴は、ＡａｔＡタンパク質をコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド分子が、中程度からストリンジェントまでの条件下で、配列番号１０またはその相補鎖の１５またはそれ以上の隣接したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得ることである。
【００２３】
本発明のさらなる特徴は、ＡａｔＢタンパク質をコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド分子が、中程度からストリンジェントまでの条件下で、配列番号１１またはその相補鎖の１５またはそれ以上の隣接したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得ることである。
【００２４】
ＡａｔＣタンパク質をコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド分子が、中程度からストリンジェントまでの条件下で、配列番号１２またはその相補鎖の１５またはそれ以上の隣接したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得ることも、本発明の特徴である。
【００２５】
本発明のさらなる特徴は、ＡａｔＤタンパク質をコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド分子が、中程度からストリンジェントまでの条件下で、配列番号１３またはその相補鎖の１５またはそれ以上の隣接したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得ることである。
【００２６】
本発明の前述のおよび他の目的、特徴、ならびに利点は、添付の図面と共に、以下の詳細な記載の考察より、以降で完全に明らかにされる。しかし、これらの図面は例示する目的のものであり、本発明の限界を定義するものとして解釈されないことが、はっきりと理解されるべきである。
【００２７】
本発明の利点は、特に、添付の図面と共に考察される場合、以下の本発明の詳細な開示の考察の上に明らかである。
【００２８】
（発明の詳細な記載）
本発明は、Ａａｐ（Ａｎｔｉ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔａｉｎ（抗凝集タンパク質）、ジスペルジンとも呼ばれる）、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、およびＡａｔＤを含む。これらは、全て腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡＥＣ）において見出されたタンパク質である。本発明は、これらのタンパク質の遺伝子（ａａｐ、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、およびａａｔＤ）ならびに遺伝子フラグメントおよびタンパク質フラグメント、かつこれらのタンパク質、遺伝子、およびそれらのフラグメントの、ＥＡＥＣ感染の診断および治療のための使用も含む。以下の遺伝子は、ａａｔ遺伝子クラスターとも呼ばれる：ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、およびａａｔＤ。
【００２９】
Ａａｐは、腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡＥＣ）から分泌され、そして腸粘膜においてＥＡＥＣの強い凝集表現型を調節する。Ａａｐの分泌は、ＥＡＥＣ綿毛状発現（ｆｉｍｂｒｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）または綿毛状生物発生（ｆｉｍｂｒｉａｌ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に、否定的な影響を及ぼさない。Ａａｐは、１１６アミノ酸のタンパク質で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから判断すると約１０．２キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有し、ｐＩはおよそ９．２５、そしてアミノ酸配列は図２（配列番号２）において図示される。ＳＩＧＮＡＬＰ分析は、２１位の後ろでの切断を伴う、シグナル配列を強く予測する。細菌培養上清からのＡａｐのＮ末端アミノ酸配列により、この切断が確証される。
【００３０】
ａａｐは、３４８塩基対（ｂｐ）長で、図１（配列番号１）に図示するポリヌクレオチド配列を有する。ａａｐは、原型ＥＡＥＣ株０４２（ＥＡＥＣ０４２）のｐＡＡプラスミド（およそ１００ｋｂ）上の、ａｇｇＲ遺伝子（綿毛サブユニット（ｆｉｍｂｒｉａｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ）（ａａｆＡ）の下流に位置する）の上流に位置する。ａｇｇＲの上流のｐＡＡプラスミドＤＮＡの配列決定は、ａｇｇＲ開始コドンから上流の開放読み取り枠の８４３ヌクレオチドを明らかにした。この開放読み取り枠は、３４８ヌクレオチド長で、１１６アミノ酸の推定タンパク産物をコードした。ＳＩＧＮＡＬＰ（シグナル配列プロセシングの部位を予測するウェブベースのアルゴリズム）を用いた分析は、２１位の後ろでの切断を伴う、シグナル配列を強く予測した。細菌培養上清からのＡａｐのＮ末端アミノ酸配列により、切断シグナル配列が確証された。この配列を図２に示す。
【００３１】
ｐＡＡプラスミドは、推定上のビルレンス因子ＡＡＦ、Ａａｐ（ジスペルジン）、Ｐｅｔ、ＥＡＳＴ１、およびＡｇｇＲを含むだけでなく、ＥＡＥＣ株に感受性の経験的に誘導されたプローブ（「ＡＡプローブ」）と相同な配列をも含む。（Ｂａｕｄｒｅｙら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １６１：１２４９−１２５１（１９９０））。ＡＡプローブを含む領域（すなわち、プラスミドｐＣＶＤ４３２の挿入部分）は、病原性ＥＡＥＣ株に関連し、そしてビルエンス因子らしき存在と連動することが示された。（Ｏｋｅｋｅら，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ８１：２５２−６０（２０００）；Ｃｏｈｅｎ，Ｍ．およびＮａｔａｒｏ，Ｊ．Ｐ．，未発表）。プローブの７６５ｂｐ配列自体は以前に報告されているが（Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３３：７０１−５（１９９５））、この配列は、可能性のある１つの読み取り枠において終止コドンを含まないと言及された。ｐＡＡ２プラスミドの７ｋｂ配列は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔライブラリーのショットガン配列決定法（ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により決定された（図９（配列番号３）参照）。不一致な部分は、所望の領域を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの定方向配列決定法（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により解明された。
【００３２】
このプローブのこの領域のＤＮＡ配列の分析は、同じ右側方向の非常に近接な場所における５つの開放読み取り枠（ＯＲＦ）のクラスターを明らかにする（図３参照）。このＯＲＦのクラスターは、ａａｔ遺伝子クラスターまたはａａｔクラスターとして知られる。何故なら、このクラスターにおける遺伝子のうちの２つが、細菌ＡＢＣ輸送タンパク質と有意の相同性を示すがゆえに、ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（腸凝集性ＡＢＣ輸送体）の略語としたからである。ａａｔ遺伝子クラスターの特徴は、Ｇ＋Ｃ比率が非常に低く、２９．６から３４．３の範囲であることである。ａａｔ遺伝子クラスターは、ａａｔＰ、ａａｔＡ、ａａｔＢ、ａａｔＣ、およびａａｔＤを含む。ＩＳ配列の残りの部分が、各々の側で５００ｂｐ以上の距離でａａｔ遺伝子クラスターに隣接する。
【００３３】
ａａｐのヌクレオチド配列を、図１５（配列番号９）に示す。ＡａｔＰのアミノ酸配列を、（配列番号４）に示す。ＡａｔＰは、３７７アミノ酸（４２．７ｋＤａ）の推定タンパク質で、図９で示されるｐＡＡ由来７ｋｂフラグメントのヌクレオチド１４２５位からヌクレオチド２５５５位までにわたる。ＡａｔＰは、その全長にわたって、リポタンパク質放出に関わるＡＢＣ型輸送系の透過酵素成分と、アミノ酸レベルで２０％の同一性がある。このタンパク質は５つの膜貫通領域を有し、コンピューター分析に基づき、内膜タンパク質であると信じられる。
【００３４】
ａａｔＡのヌクレオチド配列を、図１６（配列番号１０）に示す。ＡａｔＡのアミノ酸配列を、図１１（配列番号５）に示す。ＡａｔＡは、４１３アミノ酸（４８．５ｋＤａ）の推定タンパク質で、図９（配列番号３）で示されるｐＡＡ由来７ｋｂフラグメントのヌクレオチド２５５２位からヌクレオチド３７９０位までにわたる。ＳｉｇｎａｌＰ分析は、２３位の後ろでの切断を伴う、シグナル配列を強く予測する。３９１アミノ酸の推定成熟タンパク質は、４５．９ｋＤａの大きさである。ａａｔＡのヌクレオチド配列も、その推定アミノ酸配列も、任意の他の公知の遺伝子またはタンパク質と、有意の同一性を示さない。Ａａｐは、超コイル（ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ）領域を有し、外膜タンパク質またはペリプラズムタンパク質であると信じられる。
【００３５】
ａａｔＢのヌクレオチド配列を、図１７（配列番号１１）に示す。ＡａｔＢのアミノ酸配列を、図１２（配列番号６）に示す。ＡａｔＢは、２７４アミノ酸（３１．１ｋＤａ）の推定タンパク質で、図９（配列番号３）で示されるｐＡＡ由来７ｋｂフラグメントのヌクレオチド３６８７位からヌクレオチド４５０８位までにわたる。ＡａｔＢは、ＧｅｎＢａｎｋライブラリーにおける任意の公知のタンパク質配列と、有意な相同性を有しない。このタンパク質は、Ｎ末端の領域に１つの膜貫通領域を有し、内膜タンパク質であると信じられる。
【００３６】
ａａｔＣのヌクレオチド配列を、図１８（配列番号１２）に示す。ＡａｔＣのアミノ酸配列を、図１３（配列番号７）に示す。ＡａｔＣは、２１０アミノ酸（２３．３ｋＤａ）の推定タンパク質で、図９（配列番号３）で示されるｐＡＡ由来７ｋｂフラグメントのヌクレオチド４５０１位からヌクレオチド５１３０位までにわたる。ＡａｔＣは、その全長にわたって、ＡＢＣ輸送ＡＴＰ結合タンパク質と、アミノ酸レベルで４５％同一である。Ｅ．ｃｏｌｉのＡＢＣドメインは、４つの短いモチーフを有し、これらは常に保存される：Ｗａｌｋｅｒ  Ａ、Ｗａｌｋｅｒ  Ｂ、ＡＢＣシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）、およびヒスチジンモチーフ（Ｌｉｎｔｏｎ  １９９８）。これらの全てのモチーフは、ＡａｔＣにおいて保存された。
【００３７】
ａａｔＤのヌクレオチド配列を、図１９（配列番号１３）に示す。ＡａｔＤのアミノ酸配列を、図１４（配列番号８）に示す。ＡａｔＤは、４０５アミノ酸（４７．２ｋＤａ）の推定タンパク質で、図９（配列番号３）で示されるｐＡＡ由来７ｋｂフラグメントのヌクレオチド５１４２位からヌクレオチド６３５６位までにわたる。ＡａｔＤは、その３４％の長さにわたって、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのサブユニット２と、アミノ酸レベルで２９％同一である。ＡａｔＤは、Ｎ末端の領域に５つの膜貫通領域を有し、内膜タンパク質であると信じられる。
【００３８】
上で議論したそれぞれの遺伝子のために、上で議論したタンパク質をコードする追加のポリヌクレオチド分子は、マイナーな遺伝子多型、株間の相違、縮重改変体、ならびにアミノ酸置換、付加および／または欠失を含むタンパク質のコードを生じるポリヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
ａａｐおよび／またはａａｔ遺伝子クラスターをコードするヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡライブラリーまたは他の生物（原核または真核生物）からのＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、Ａａｐおよび／またはａａｔ遺伝子クラスターのタンパク質と同様の生物学的機能を持つ他のタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を同定するために使用され得る。これらの新規のＤＮＡ分子は、標準的ハイブリダイゼーション技術を用いて、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用した配列の増幅により、本明細書中で開示されるポリヌクレオチド配列を使用して、このようなライブラリーから単離され得る。タンパク質ホモログ配列を同定するのに使用するための適切なプローブは、遺伝子特異的配列から得られ得る。あるいは、これらの遺伝子のコード領域由来の特異的ＤＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドは、関連クローンの同定に使用し得る。当業者は、遺伝子およびその相同遺伝子の調節領域が、同様の方法を使用して得られ得ることを認識する。
【００４０】
相同のポリヌクレオチド分子は、少なくとも約７ヌクレオチド長、より好ましくは１５ヌクレオチド長（しかしコード配列全長と同じ長さにもし得る）のプローブを用いた標準的ハイブリダイゼーション技術を使用して、単離され得る。相同ポリヌクレオチド配列は、中程度またはより高いストリンジェンシーの条件でのハイブリダイゼーションが可能である、本明細書中に開示される配列に基づく縮重オリゴヌクレオチドの使用により同定され得る。用語「ハイブリダイゼーションが可能である」は、本明細書中で使用されるように、被験核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでも）が、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列の１つの１５以上の隣接したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドとアニールすることを意味する。
【００４１】
ハイブリダイゼーション条件の選択は、当業者に明白であり、一般に、ハイブリダイゼーションの目的、ハイブリダイゼーションの様式（ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ）、および配列間の望ましい関連性の程度により導かれる。ハイブリダイゼーションの方法は、文献においてよく確立されている。当業者は、核酸二重鎖の安定性が、不一致塩基の数および位置が増加するに応じて減少することを理解する。結果として、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、このような二本鎖の安定性を最大化または最小化するように使用され得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、ハイブリダイゼーション温度の調節、ハイブリダイゼーション混合物における螺旋不安定化剤（例えば、ホルムアミド）の比率の調節、および洗浄溶液の温度および塩濃度の調節により、変化させ得る。一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、塩濃度および／または温度を変えること（この結果、進行的にストリンジェンシーが上がる条件となる）により、ハイブリダイゼーション後の洗浄の間に調節される。
【００４２】
進行的にストリンジェンシーが上がる条件の例は、以下である：およそ室温で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；およそ室温で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェンシー条件）；約４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中程度ストリンジェンシー条件）；および約６８℃で０．１×ＳＳＣ（高ストリンジェンシー条件）。洗浄は、これらの条件のうち１つだけ（例えば高ストリンジェンシー条件）を使用して行い得るか、またはそれぞれの条件が使用され得る（例えば、それぞれ１０〜１５分、上に列挙した順序で、列挙した任意のまたは全ての工程を繰り返して）。最適な条件は、関与する特定のハイブリダイゼーション反応に依存して変化し、そして経験的に決定され得る。高ストリンジェンシー条件は、対象となるプローブのハイブリダイゼーションに、好ましく使用される。
【００４３】
あるいは、ａａｐまたはａａｔ遺伝子クラスターのポリヌクレオチド配列の１つと、実質的に同じであるヌクレオチド配列を有するか、または、実質的に同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ａａｐ様またはａａｔクラスター様の遺伝子を代表する。機能的にＡａｐと同等なタンパク質もしくはＡａｐ機能フラグメントまたはａａｔ遺伝子クラスターのタンパク質をコードするポリヌクレオチドも、本発明に含まれる。「実質的に同じ」または「実質的に同一」は、核酸、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドが、参照の核酸、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相同性を示すことを意味する。ヌクレオチド配列に関しては、比較配列の長さが、一般に少なくとも１０から５００ヌクレオチド長である。好ましくは、比較の長さが、少なくとも５０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも１１０ヌクレオチド長である。
【００４４】
「単離された」核酸は、その構造が、任意の天然に存在する核酸の構造にも、３つより多い別個の遺伝子にわたる、天然に存在するゲノム核酸の任意のフラグメントの構造にも同一ではない、核酸である。従って、この用語は、例えば、以下を包含する：（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、それが天然に存在する生物のゲノム中の分子のこの部分に隣接する両方のコード配列によって隣接されない、ＤＮＡ；（ｂ）得られた分子が、天然に存在する発現ベクターまたはゲノムＤＮＡと同一ではないような様式で、発現ベクターまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた、核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されたフラグメントまたは制限フラグメントのような、別個の分子；ならびに（ｄ）ハイブリッド遺伝子（すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子）。この定義から特に除外されるのは、以下の混合物中に存在する核酸である：（ｉ）ＤＮＡ分子、（ｉｉ）トランスフェクトされた細胞、および（ｉｉｉ）細胞クローン（例えば、これらは、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーのようなＤＮＡライブラリーを生じるので）。
【００４５】
本発明のＤＮＡ配列は、いくつかの方法によって獲得され得る。例えば、ＤＮＡは、当該分野で周知のハイブリダイゼーション技術またはコンピュータベースの技術を使用して、単離され得る。このような技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：相同なヌクレオチド配列を検出するための、プローブを用いた、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーション；共有される構造的特徴を有する、クローニングされたＤＮＡフラグメントを検出するための、発現ライブラリーの抗体スクリーニング；目的のＤＮＡ配列にアニーリングし得るプライマーを使用した、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに対する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；類似の配列についての配列データベースのコンピュータ検索；ならびにサブトラクティドＤＮＡライブラリーの差示的スクリーニング。
【００４６】
核酸ハイブリダイゼーションに基づくスクリーニング手順は、適切なオリゴヌクレオチドプローブが入手可能である場合、任意の生物から任意の遺伝子配列を単離することを可能にする。本明細書中に提供されるａａｐ遺伝子クラスターまたはａａｔ遺伝子クラスターの配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、化学的に合成され得る。他のオリゴヌクレオチドプローブの合成は、アミノ酸配列の短いオリゴペプチドストレッチが既知であることを必要とし得る。なぜなら、特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、遺伝子コードを使用して推論され得るからであるが；コードの縮重が考慮されなければならない。配列が縮重していると、変性した二本鎖ＤＮＡの異種混合物を含む混合付加反応を実施することが可能である。このようなスクリーニングのために、ハイブリダイゼーションは、好ましくは、一本鎖ＤＮＡまたは変性した二本鎖ＤＮＡのいずれかに対して実施される。ハイブリダイゼーションは、目的のポリペプチドに関する極度に少ない量のｍＲＮＡ配列が存在する供給源に由来するｃＤＮＡクローンの検出において、特に有用である。非特異的結合を回避するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用することによって、例えば、標的ＤＮＡの完全な相補体である混合物中の単一のプローブへの標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションによって、特異的なｃＤＮＡクローンまたはＤＮＡクローンの、オートラジオグラフィーによる可視化を可能にすることができる（Ｗａｌｌａｃｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．９：８７９（１９８１））。あるいは、サブトラクティブライブラリーは、非特異的ｃＤＮＡクローンの排除のために有用である。
【００４７】
目的のＤＮＡ配列を単離するための別の標準的手順は、目的の生物由来の総ＤＮＡを含む、プラスミドまたはファージが運搬するゲノムライブラリーの形成である。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組み合わせて使用される場合、稀な発現産物でさえ、クローニングされ得る。ポリペプチドのアミノ酸配列の有意な部分が既知である場合、標的ＤＮＡ中におそらく存在する配列を複製する、標識された一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのプローブ配列の作製は、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション手順において使用され得、この手順は、一本鎖形態に変性されたＤＮＡのクローニングされたコピーに対して実施される（Ｊａｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１１：２３２５（１９８３））。
【００４８】
ａａｐ遺伝子クラスターおよびａａｔ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列は、無数の適用を有する。これらのヌクレオチド配列の代表的な用途としては、ノザン、サザン、イムノ−ＰＣＲ、ドットブロット、ならびにＥＡＥＣを検出するため、細胞中のＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣまたはＡａｔＤの発現レベルを定量するため、あるいはこのヌクレオチド配列によってコードされる特定のタンパク質またはポリペプチドを生成するための他のアッセイにおいて有用な、ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドプローブの構築が挙げられる。ａａｐ遺伝子クラスターおよびａａｔ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列は、組換え細胞株、組換え生物、発現ベクターなどの構築のために使用され得る。このような組換え構築物は、組換えＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣおよび／またはＡａｔＤを発現するために使用され得、そしてワクチンとして（生の弱毒化ベクターワクチンまたは他の型の侵襲性ベクターワクチンを介して）使用され得るか、または１つ以上のこれらのタンパク質を発現する生物の病理を変更し得る候補治療剤についてスクリーニングするために使用され得る。
【００４９】
これらのタンパク質がＥＡＥＣの凝集、粘膜粘液表層の貫通、接着および集落形成において果たす重要な役割を考慮すると、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、（例えば、サブユニットワクチンを介して）被験体における免疫応答を生成するために使用され得る免疫原性組成物の生成において、そしてＥＡＥＣの検出のためのキットにおいて、非常に有用である。サブユニットワクチンについて、本発明の１つ以上のタンパク質が、発現され、精製され、そして免疫原性組成物を調製するために使用され得る。生の弱毒化ベクターワクチンについて、本発明の１つ以上のタンパク質はまた、弱毒化された侵襲性の細菌またはウイルスにおいて発現され得、そして生物全体が、免疫原性組成物へと処方され得る。別の型のワクチンにおいて、本発明の１つ以上の遺伝子は、真核生物プロモーターのシグナル配列の下流で、プラスミド上に配置され得る。このプラスミドは、１つ以上の選択マーカーを含み得、そして原核生物（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．または他の適切な細菌）中にトランスフェクトされる。次いで、この細菌は、ＥＡＥＣに対する免疫応答が所望される、真核生物被験体に投与される。例えば、Ｈｏｎｅらに対する米国特許第５，８８７，１５９号を参照のこと。さらに、本発明のタンパク質のうちの１つをコードするポリヌクレオチドが、被験体の粘膜組織に投与されて、免疫応答を生じさせ得る。例えば、Ｍａｌｏｎｅらに対する米国特許第６，１１０，８９８号を参照のこと。また、本発明のタンパク質のうちの１つをコードする裸のポリヌクレオチドが、Ｄｒａｂｉｃｋ，Ｊ．Ｊ．ら；Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｒｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｖｏｌ３（２）；ｐｐ．２４９−５５（２００１）に記載される方法を使用して、被験体にエレクトロポレーションされて、免疫応答を生じさせ得る。
【００５０】
本発明の遺伝子はまた、以下により完全に考察される発現ベクター中に配置され得る。
【００５１】
（アンチセンス）
本発明の遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチド配列は、本発明のタンパク質の発現をブロックするために使用され得る。適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１１ヌクレオチド長であり、そして非翻訳（上流）および関連のコード配列を含み得る。当業者に公知なように、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最適な長さは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的ｍＲＮＡとの間の相互作用の強度、翻訳が生じる温度およびイオン環境、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列、ならびにｍＲＮＡおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチド中の二次構造および三次構造の存在に依存する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの適切な標的配列としては、プロモーター領域、リボソーム結合部位、およびリボソームの進行を妨害する部位が挙げられる。
【００５２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を、適切な発現ベクターに挿入して、このＤＮＡ分子が、本発明の特定の遺伝子と比較して逆の方向でプロモーターの下流に挿入されるようにすることによって、調製され得る。次いで、この発現ベクターは、このアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現するために適切な細胞（原核生物および／または真核生物）に、形質導入、形質転換またはトランスフェクトされ得る。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標準的な、手動または自動の合成技術を使用して合成され得る。これらの合成オリゴヌクレオチドは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿およびマイクロインジェクションを含む種々の手段によって、適切な細胞中に導入される。適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与方法の選択は、当業者に明らかである。
【００５３】
合成オリゴヌクレオチドに関して、アンチセンスオリゴヌクレオチド−ｍＲＮＡハイブリッドの安定性は、オリゴヌクレオチドへの安定剤の付加によって、有利に増大される。安定剤の一例としては、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両方の末端に共有結合したインターカレート剤が挙げられる。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホトリエステル、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホラミデート、ホスホロジチオエートまたはモルホリノ環の導入による、ホスホジエステル骨格の改変によって、ヌクレアーゼに対して耐性にされる。
【００５４】
（アミノ酸）
本明細書中に記載される場合、「Ａａｐ」、「ＡａｔＰ」、「ＡａｔＡ」、「ＡａｔＢ」、「ＡａｔＣ」および「ＡａｔＤ」とは、タンパク質全体（それぞれ、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣおよびＡａｔＤ）、機能的に活性なタンパク質のフラグメント（それぞれ、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣおよびＡａｔＤ）、ならびに置換（別の塩基性アミノ酸による、ある塩基性アミノ酸の置換、または別の酸性アミノ酸による、ある酸性アミノ酸の置換、または別の中性アミノ酸による、ある中世アミノ酸の置換）を含むポリペプチド、を包含する。「Ａａｐ」、「ＡａｔＰ」、「ＡａｔＡ」、「ＡａｔＢ」、「ＡａｔＣ」および「ＡａｔＤ」はまた、それぞれ、天然に存在する材料、および特定のタンパク質に特異的な抗血清によって検索された、密接に関連する機能的に類似のタンパク質から精製された、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣおよびＡａｔＤを包含する。特定の遺伝子配列中の領域に対する類似性に基づいて検索された遺伝物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ）によってコードされる、組換え的に発現されるタンパク質もまた、本記述に包含される。
【００５５】
Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣおよびＡａｔＤをコードするポリヌクレオチド分子としては、それぞれ、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣおよびＡａｔＤ、またはそれぞれ、配列番号２（図２）；配列番号４（図１０）；配列番号５（図１１）；配列番号６（図１２）；配列番号７（図１３）および配列番号８（図１４）に示される配列と同一性を共有するペプチドをコードする分子が挙げられる。これらの分子は、好ましくは、開示されたタンパク質と、アミノ酸レベルで３０％より高い同一性を共有する。好ましい実施形態において、これらのポリヌクレオチド分子は、高度に保存された領域にわたって、アミノ酸レベルでより高い同一性を共有する。特定の遺伝子によりコードされるタンパク質の改変体としては、軽微な遺伝的多型、株間の差異から生じるアミノ酸配列、ならびにアミノ酸の置換、付加および／または欠失、および保存的アミノ酸置換を含む改変体が挙げられる。保存的アミノ酸置換としては、１つのアミノ酸残基の、類似の生物学的特徴（例えば、大きさ、電荷および極性  対  非極性）を有する異なる残基による置換が挙げられる。
【００５６】
配列番号２；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７および配列番号８に示される配列と実質的に同じアミノ酸配列が、本発明によって包含される。好ましい実施形態としては、本明細書中に記載される配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチド、その機能的フラグメント、または本明細書中に記載される配列と実質的に同一なアミノ酸配列が挙げられる。上記のように、「実質的に同じ」または「実質的に同一」とは、ポリペプチドが、参照アミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％〜１００％の相同性を示すことを意味する。ポリペプチドについて、比較配列の長さは、一般に、少なくとも１６アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも２５アミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも３５アミノ酸であり得る。
【００５７】
配列の相同性は、しばしば、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７０５またはＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴプログラム）を使用して測定される。このようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、置換および他の改変に対して相同性の程度を割り当てることによって、類似の配列を一致させる。
【００５８】
用語「実質的に同一」はまた、保存的アミノ酸置換（例えば、同じクラスの別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換（例えば、グリシンによるバリン、リジンによるアルギニンなど））のみが異なるか、またはアッセイされるタンパク質（例えば、本明細書中に記載されるような）の機能を破壊しないアミノ酸配列の位置に位置する、１つ以上の非保存的置換、欠失もしくは挿入により異なる、アミノ酸配列を意味する。好ましくは、このような配列は、本明細書中に記載される配列に対して、アミノ酸レベルで、少なくとも８５％、そしてより好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％〜１００％相同である。
【００５９】
用語「機能的フラグメント」は、類似のアミノ酸配列を有し、そして特定のタンパク質の機能または活性を保持する、本明細書中に記載されるタンパク質のフラグメントを含む。全長タンパク質が記載される場合、当業者は、本明細書中に提供される実施例を使用することによって、フラグメントの機能性についてスクリーニングし得る。
【００６０】
用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、このポリペプチドに天然に付随する成分から分離されたポリペプチドを意味する。代表的には、このポリペプチドは、このポリペプチドが代表的に関連するタンパク質および他の天然に存在する分子を、少なくとも６０重量％を含まない場合、実質的に純粋である。好ましくは、この調製物は、少なくとも７５重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９９重量％である。実質的に純粋なタンパク質は、例えば、天然の供給源からの抽出、特定のタンパク質をコードする組換え核酸の発現、またはタンパク質の化学的合成によって、獲得され得る。純度は、任意の適切な方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＨＰＬＣ分析）によって測定され得る。
【００６１】
タンパク質は、その天然の状態において付随する混入物から分離された場合に、天然の関連する成分を実質的に含まない。従って、化学的に合成されたタンパク質、またはこのタンパク質が天然に起源する細胞または宿主とは異なる細胞系において産生されたタンパク質は、それが天然に関連する成分を実質的に含まない。従って、実質的に純粋なポリペプチドとしては、原核生物に由来するが、真核生物において合成されたポリペプチドが挙げられる。精製ポリペプチドは、その天然の状態でこのポリペプチドに付随する混入物から分離された場合に、天然に関連する成分を実質的に含まないポリペプチドである。当業者に明らかなように、本開示に従うポリヌクレオチド分子は、調節配列、発現ベクター、および精製され得るポリペプチドまたはタンパク質を生成するための、文献中に十分確立された方法を使用して、種々の原核生物および真核生物において発現され得る。
【００６２】
本発明のタンパク質の精製は、多数の確立された方法（例えば、固体支持体に結合された特定のタンパク質に特異的な抗体を使用するアフィニティクロマトグラフィー）を使用して実施され得る。抗原タグと目的のタンパク質との融合タンパク質は、このタグに対する抗体を使用して精製され得る。必要に応じて、さらなる精製が、従来の精製手段（例えば、液体クロマトグラフィー、勾配遠心分離またはゲル電気泳動）を使用して達成される。タンパク質の精製方法は、当該分野で周知であり、そして本明細書中に記載される組換えタンパク質の精製に適用され得る。本発明のタンパク質の精製は、以下により詳細に考察される。
【００６３】
融合タンパク質は、代表的に、ネイティブのタンパク質の１つ以上連続するアミノ酸の、適切な融合タンパク質パートナー由来のアミノ酸による、付加、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含む。このような融合タンパク質は、当業者によって容易に同定されかつ周知の組換えＤＮＡ技術を使用して獲得される。例えば、目的のハイブリッドＡａｐ融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子は、一般に利用可能な方法（例えば、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発ならびに／または制限消化および連結）を使用して調製される。次いで、ハイブリッドＤＮＡは、発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主細胞に導入される。
【００６４】
本発明の１実施形態は、本明細書中に記載されるタンパク質と相互作用するか、または本明細書中に記載されるタンパク質のレセプターであるタンパク質の単離を含む。Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣおよび／またはＡａｔＤは、相互作用因子を単離するため、またはツーハイブリッドスクリーニングの異なる方法を使用する相互作用因子のスクリーニングのために、免疫沈降において使用され得る。これらのタンパク質の単離された相互作用因子は、宿主またはＥＡＥＣ間の特定のタンパク質の活性を調節またはブロックするために使用され得る。
【００６５】
合成ペプチド、組換え的に誘導されたペプチド、融合タンパク質、キラルタンパク質（立体化学異性体、ラセミ体、鏡像異性体およびＤ−異性体）などが提供され、これらは、本明細書中に記載されるタンパク質のうち１つの一部またはタンパク質全体を含む。本発明のペプチドは、配列番号１、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３の、１５以上連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を有する。本発明のペプチドの代表的なアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に開示されている。本発明のペプチドは、種々の用途（特異的抗体の調製および本明細書中に記載されるタンパク質の活性のアンタゴニストの調製を含む）を見出す。
【００６６】
（Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣまたはＡａｔＤに結合する抗体）
抗血清またはモノクローナル抗体（例えば、マウス、ウサギ、ブタ、ウマまたはヒト）の産生は周知であり、そして当業者によって容易に同定される方法（例えば、本明細書中に記載されるタンパク質の１つまたはタンパク質の１つに由来するペプチドを用いた動物の免疫）によって達成され得る。モノクローナル抗体の産生について、抗体産生細胞を、免疫した動物から獲得し、不死化し、そしてスクリーニングする。あるいは、抗体産生細胞は、特定のタンパク質または特定の誘導ペプチドに結合する抗体の産生について最初にスクリーニングされ、次いで不死化される。非ヒト抗体の抗原結合領域（例えば、Ｆ（ａｂ’）２領域または超可変領域）を、組換えＤＮＡ技術によってヒト抗体のフレームワークに移して、実質的にヒトの分子を生成することが所望され得る。
【００６７】
特定のタンパク質またはその一部の合成または発現、および単離または精製の後、単離または精製されたタンパク質は、特定のタンパク質および目的のフラグメントと相互作用する因子を同定するための抗体およびツールを作製するために使用され得る。文脈に依存して、用語「抗体」は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂライブラリーよって生成されるフラグメントを包含し得る。Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣおよび／またはＡａｔＤならびにこれらのフラグメントを認識する抗体は、多数の用途を有し、その用途としては、バイオテクノロジー適用、治療適用／予防適用、および診断適用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
抗体産生について、種々の宿主（ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどが挙げられるが、これらに限定されない）は、特定のタンパク質、または免疫学的特性を保持する任意の部分、フラグメントもしくはオリゴペプチドを注射することによって、免疫され得る。宿主の種に依存して、種々のアジュバントが、免疫学的応答を増大するために使用され得る。このようなアジュバントとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の無毒化熱不安定性毒素、フロイント、金属ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）および界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノール）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍもまた、潜在的に有用なアジュバントである。
【００６９】
特異的抗体を誘導するために使用されるペプチドは、少なくとも３アミノ酸のアミノ酸配列、そして好ましくは少なくとも１０〜１５アミノ酸のアミノ酸配列を有する。好ましくは、特定のタンパク質のフラグメントをコードするアミノ酸の短いストレッチは、別のタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）のものと融合され、その結果、このキメラ分子に対する抗体が産生される。本発明の特定のタンパク質を特異的に認識し得る抗体は、特定のタンパク質のアミノ酸配列に対応する３マー、１０マーおよび１５マーの合成ペプチドを、宿主（例えば、マウス）に注射することによって生成され得るが、より多様なセットの抗体が、特定の組換えタンパク質、特定の精製タンパク質または特定のタンパク質のフラグメントを使用することによって生成され得る。
【００７０】
Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、ＡａｔＤおよび／またはこれらのフラグメントに対する抗体を生成するために、実質的に純粋なＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、ＡａｔＤまたはこれらのフラグメントを、トランスフェクトもしくは形質転換された細胞、または野生型ＥＡＥＣから単離する。最終調製物中のポリペプチドの濃度は、例えば、Ａｍｉｃｏｎフィルタデバイスで濃縮することによって、数マイクログラム／ｍｌのレベルにまで調節される。
【００７１】
Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、ＡａｔＤまたはこれらのフラグメントに対するモノクローナル抗体は、培養物中の継続する細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して、調製され得る。このような技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））に元々記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ８０：２０２６−２０３０（１９８３））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．、ｐｐ  ７７−９６（１９８５））。「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（すなわち、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るための、マウス抗体遺伝子の、ヒト抗体遺伝子へのスプライシング）もまた、使用され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））。あるいは、単鎖抗体の産生のために記載された技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されるような技術）が、Ａａｐ特異的単鎖抗体を産生するために適合され得る。さらに、抗体は、リンパ球集団においてインビボ産生を誘導することによって、または組換え免疫グロブリンライブラリーもしくは高度に特異的な結合試薬（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ８６：３８３３−３８３７（１９８９）；ならびにＷｉｎｔｅｒ  Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９（１９９１）に開示される）のパネルをスクリーニングすることによって、産生され得る。
【００７２】
本発明の特定のタンパク質に対する特異的結合部位を含む抗体フラグメントもまた、生成され得る。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合の還元によって生成されるＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするように構築され得る（Ｈｕｓｅ  Ｗ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２７５−１２８１（１９８９））。
【００７３】
Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、ＡａｔＤまたはこれらのフラグメントに対するモノクローナル抗体を作製する１つの方法は、数週間にわたって、数μｇの選択されたタンパク質またはペプチドで、マウスを繰り返し接種する工程を包含する。次いで、このマウスは屠殺され、そして脾臓の抗体産生細胞が単離される。これらの脾臓細胞は、ポリエチレングリコールの存在下で、マウス骨髄腫細胞と融合される。過剰の非融合細胞を、アミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）で、系の増殖によって破壊する。次いで、首尾よく融合した細胞を希釈し、そして希釈物のアリコートを、マイクロタイタープレートのウェル中に配置し、ここで、培養物の増殖を続ける。抗体産生クローンを、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：４１９（１９８０）に元々記載された）およびその派生方法のようなイムノアッセイ手順によって、ウェルの上清流体中の抗体を検出することによって同定する。選択されたポジティブクローンを増殖させ得、そしてそのモノクローナル抗体産物を、使用のために収集する。モノクローナル抗体産生の詳細な手順の例は、Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、セクション２１−２に見出され得る。
【００７４】
単一タンパク質の異種エピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は、発現されたタンパク質またはそれらに由来するペプチドで適切な動物を免疫することによって調製され得、そのタンパク質またはペプチドは、免疫原性を増強するために非改変または改変され得る。効果的なポリクローナル抗体の生成は、抗原および宿主種の両方に関する多くの因子によって影響される。例えば、低分子は、より大きい分子より抗原性が低い傾向にあり、キャリアおよびアジュバントの使用を要求し得る。また、宿主動物は、接種部位および用量に応じて変化し、不十分または過剰の用量の抗原の両方が、低力価抗血清を生じる。複数の皮内部位に投与される少用量（例えば、ｎｇレベル）の抗原は、最も信頼性があるようである。ウサギに対する効果的な免疫のプロトコルの例は、Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３３：９８８−９９１（１９７１）に見出され得る。
【００７５】
追加免疫は、規則的な間隔で与えられ得、そして抗血清の抗体力価が低下し始める場合、抗血清は収集され得る。この抗体力価の低下は、半定量的に、例えば、既知濃度の抗原に対する寒天中における二重免疫拡散法によって決定され得る（例えば、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ，Ｏ．ら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄ．Ｗｉｅｒ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（１９７３）の１９章を参照のこと）。抗体のプラトー濃度は、通常、血清（約１２μＭ）の０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌの範囲である。抗原に対する抗血清の親和性は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．らによってＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版（ＲｏｓｅおよびＦｒｉｅｄｍａｎ編）Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８０）の中の４２章に記載されたような競合的結合曲線を作成することによって決定される。いずれかのプロトコルによって調製される抗体調製物は、生物学的サンプル中の抗原保有物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイに有用である。これらの抗体調製物はまた、（例えば、生物学的サンプル中のＡａｐの存在を同定する診断的実施形態において）半定量的または定量的に使用される。分子モデリングおよび合理的な薬物設計の種々の方法は、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、ＡａｔＤ、それらのフラグメントまたは誘導体に類似の化合物ならびにＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣおよび／またはＡａｔＤと相互作用し、それによって特定のタンパク質の機能を調節する分子を同定するために適用され得ることもまた企図される。
【００７６】
Ａａｐタンパク質またはＡａｔタンパク質に対する抗体の非治療的使用は、細菌の検出を含む。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、迅速に細菌を検出するためのスライド凝集反応アッセイにおいて使用され得る。便由来のＥ．ｃｏｌｉは、栄養寒天上に継代され、３７℃で一晩培養される。次いで、コロニーは、爪楊枝で選び出され、顕微鏡スライドガラス上の１滴のリン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁される。１滴の抗体再懸濁液は、次いで、細菌懸濁液に添加され、混合され、そして１分間振とうされる。この時点で、この懸濁液は、細菌の凝集反応について試験される。凝集反応は、抗体と細菌との正の相互作用を示し、そして細菌がＡａｐタンパク質またはＡａｔタンパク質を発現したことを示す。この技術の改変として、抗体は、視覚化を改善するためにラテックスビーズに添付され得る。
【００７７】
（発現ベクター）
本発明の遺伝子またはそれらの一部のいずれかを含む組換え遺伝子発現ベクターは、当該分野で周知の種々の形態で構築され得る。好ましい発現ベクターとしては、プラスミドまたはコスミドが挙げられる。発現ベクターは、特定の遺伝子の１つ以上のフラグメントを含み、好ましくは、全長遺伝子を含む。本発明の遺伝子の１つ以上を含む発現ベクターは、そのタンパク質を生成するためにか、もしくは免疫応答を生成するため、または他のいくつかの目的のために、適切な細胞（原核細胞または真核細胞）をトランスフェクトまたは形質転換するために使用され得る。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、句「動作可能にコードする」は、コード領域によってコードされるポリペプチドの発現に必要とされる調節配列を伴う、１つ以上のタンパク質コード領域をいう。このような調節領域の例としては、プロモーター結合部位、エンハンサーエレメント、リボソーム結合部位などが挙げられる。当業者は、調節配列を選択し得、そして過度の実験なしに本明細書中に記載される組換え発現ベクターにそれらを組み込み得る。例えば、種々の真核細胞系または原核細胞系における使用のために適切な調節配列は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７に記載されており、これは、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【００７９】
ａａｐ遺伝子クラスターまたはａａｔ遺伝子クラスターと使用のための発現ベクターは、代表的に、所望の宿主細胞内での発現のために適合性のある種由来の調節配列を含む。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉが宿主細胞である場合、宿主細胞集団は、代表的に、アンピシリン耐性（ＡＭＰＲ）およびテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ  ２：９５（１９７７））。従って、ｐＢＲ３２２は、形質転換された細胞を同定するための簡便な手段を提供する。Ｇａｌｅｎ、ＷＯ００／３２０４７に記載されるプラスミドはまた、いくつかの細菌における発現ベクターについて有用である。
【００８０】
原核生物の宿主との使用に適切なプロモーターとしては、例として、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１７（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４（１９７９））、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０））、ｏｍｐＣ、ｎｉｒＢ、およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｑプロモーター）（ｄｅ  Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５（１９８３））が挙げられる。他の機能的細菌プロモーターもまた、適切であり、そして当業者によって容易に同定可能である。これら機能的細菌プロモーターのヌクレオチド配列はまた、一般的に当該分野に公知であり、それによって熟練者が、任意の必要な制限部位を提供するリンカーまたはアダプターを使用して、目的のペプチドをコードするポリヌクレオチドにこれらのプロモーターを連結することが可能になる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌ  ２０：２６９（１９８０））。
【００８１】
真核生物微生物（例えば、酵母培養物）もまた、調節配列のための供給源として使用され得る。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般的に使用される真核生物宿主微生物である。酵母宿主と使用するのに、適切なプロモーター配列としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０７３（１９８０））または他の解糖酵素（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼおよびグルコキナーゼ（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４９００（１９７８））のプロモーターが挙げられる。
【００８２】
増殖条件によって制御される転写の利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関する分解された酵素、メタチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素のプロモーター領域が挙げられる。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターによって有利に使用される。
【００８３】
組換えウイルスはまた、発現ベクターとして使用され得る。例示的なウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、ＣＭＶ、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、バキュロウイルス、あるいはレトロウイルスまたはαウイルスのようなＲＮＡウイルスが挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスまたは鳥類レトロウイルスの誘導体である。αウイルスベクターは好ましくは、ＳｉｎｄｂｉｓウイルスまたはＳｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔウイルスに由来する。これらの発現ベクターのすべては選択可能なマーカーに関する遺伝子を運搬または組み込み得るので、形質転換された細胞が同定および生成され得る。
【００８４】
ウイルスのベクターは、特定の標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする他の遺伝子とともに、ウイルスベクター目的の一つ以上の配列を挿入することによって標的特異性を生じさせ得る。例えば、レトロウイルスベクターは、糖、糖脂質またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって標的特異性を生じさせ得る。好ましい標的は、ＭＡＬＴ−特異抗体を使用しての粘膜誘導性部位の周辺のように、レトロウイルスベクターを標的とする抗体を使用することによって達成される。当業者にとって、目的のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするためにレトロウイルスゲノム内に挿入し得る、特異的ポリヌクレオチド配列は公知であるか、あるいは過度の実験なしでも容易に確認し得る。
【００８５】
いくつかの場合、発現ベクターおよび目的のＤＮＡを含む細胞および生物を同定するために、選択マーカーを使用することが好ましくあり得る。選択マーカーは、通常クローン化されたＤＮＡ分子と共に細胞または生物に導入され、そしてアンピシリン、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物に対して耐性を与える遺伝子を含む。選択マーカーはまた、宿主細胞の栄養要求性を補足し得るか、あるいはクローン化したＤＮＡ分子を含む細胞または生物を同定するために、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、または黄色蛍光タンパク質のような検出可能なシグナルを提供し得る。
【００８６】
ａａｐおよび／またはａａｔ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列、および必要に応じて他の免疫賦活性のポリヌクレオチドをウイルス遺伝子発現ベクターに組み込むために活用される同じ技術では、免疫原性の組成物として使用するための生きたウイルスおよび活性を弱めた生きたウイルスが組み込むために使用され得ることが理解される。
【００８７】
粘膜組織の標的化を、標的化されるリンパ球床（ｂｅｄ）の固有の、生物学的な特性を利用することによって実行し得る。これらの特性は扁桃体柱の陰窩構築を含み、それは粒子を捕らえるために使用され得、そしてまた、脂質粒子および他の小粒子を含む広い範囲の粒子を特異的にエンドサイトーシスする腸の、パイアー斑のＭ細胞を含む。従って、当業者は広い範囲の分子粒子の調製物を調製し得、腸に供給される場合、腸のパイアー斑の陰窩部位内にとどまり、そしてＭ細胞によってエンドサイトーシスする。このような粒子が、生物学的に活性なポリヌクレオチドのＭ細胞への送達を提供する場合、粒子はＭ細胞を行き来するパイアー斑のリンパ組織によって、粘膜の免疫応答誘導の刺激または調節を可能とする。
【００８８】
所望するコード配列、非コード配列および制御配列を含む適切な発現ベクターの構築は、標準的な連結技術を使用する。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを切断し、編成し、そして必要なプラスミドを構築するために所望される形態において再連結する。プラスミドにおいて正しい配列が構築されたことを確認するために、例えば、宿主細胞を形質転換するために連結混合物を使用し得る適切な場合、抗生物質耐性によって成功した形質転換体が選択され得る。形質転換体からプラスミドを調製し、制限によって分析されそして／または配列決定される（例えば、Ｍｅｓｓｉｎｇら、（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，９：３０９（１９８１））、Ｍａｘａｍら、（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５：４９９（１９８０））に記載の方法、あるいは当業者に公知の他の適切な方法によって）。切断フラグメントのサイズ分離は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｐ．１３３〜１３４（１９８２））によって記載されるような従来のゲル電気泳動を使用することで実行され得る。
【００８９】
宿主細胞を、前記本明細書中に記載の発現ベクターで形質転換し得、そしてプロモーター誘導に適切なように、形質転換体を選択するためにまたは遺伝子を選択するために、改変された従来の栄養培地で培養し得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現に関して選択した宿主細胞で以前に使用したものであり、そして当業者に明らかである。
【００９０】
（精製）
本発明の一つ以上のタンパク質の精製に含まれる工程は、（１）所望のタンパク質の可溶化、（２）一以上の分離手順および濃縮手順の発達、（３）精製に続くタンパク質の安定化、および（４）所望のタンパク質の存在を決定するために適するアッセイの発達、を含む。タンパク質単離およびタンパク質精製のさまざまな局面は、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｔ．Ｇ．，「Ｔｈｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７７に詳細に議論されており、これはその全体が本明細書によって参考として援用される。タンパク質単離および精製の技術は、当該分野で一般に周知であり、本開始は、それらを詳細に議論することを控える。それにもかかわらず、参考文献の要素を以下で要約し、そして議論する。
【００９１】
一般的に使用される大部分の単離手順は、水溶液中で操作を行うので、精製されるほとんどのタンパク質に可溶化が必要である。幾つかの場合において、可溶化は、所望のタンパク質が発現される宿主細胞を単に溶解させることによって達成され得る。他の状況において、さらなる工程（例えば、所望のタンパク質を非細胞小器官から抽出する工程）は、必要であり得る。浸透溶解、粉砕、混合機の使用、超音波、プレス、および他の周知のタンパク質可溶化の技術は、本明細書に開示される方法とともに使用され得る。
【００９２】
本発明のタンパク質の単離および濃縮について当該分野で周知である、種々の利用可能な技術が存在する。これらの技術としては、（１）示差的可溶化、（２）イオン交換クロマトグラフィー、（３）吸着クロマトグラフィー、（４）モレキュラーシーブ技術、（５）アフィニティークロマトグラフィー、（６）電気泳動、および（７）焦点電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。これらの技術の各々はまた、本発明のタンパク質の精製において有用であり得る。Ａａｐの精製の例は、以下に見出され得る。
【００９３】
精製されたタンパク質産物を機能的な状態で可溶化および維持することは、多数の異なる条件（例えば、（１）ｐＨ、（２）酸化の程度、（３）重金属濃度、（４）媒体極性、（５）プロテアーゼ濃度、および（６）温度）に対する注意を保証する。当業者は、過度の実験をすることなく、活性な形態の精製されたタンパク質を維持するために、どの利用可能な技術を使用すればよいかが容易に分かる。
【００９４】
（組成物）
ａａｐ遺伝子クラスターおよびａａｔ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質を使用して、免疫応答を促進する免疫原性組成物を処方し得る。ＥＡＥＣ感染に対する代表的な免疫応答の例としては、粘膜免疫応答および全身性免疫応答が挙げられる。
【００９５】
本発明の１つの局面にしたがって、本発明のタンパク質のより小さなフラグメントを使用して、免疫原性組成物を提供する。特に、これらのフラグメントは、代表的に、約５、６、８、１０または１２アミノ酸から約２０、２２，２４、３０以上のアミノ酸までの発現産物の免疫原性領域を含む。適切なフラグメントまたは免疫原性領域は、スクリーニング手順として以下に示される技術を使用して、容易に確認され得る。適切なスクリーニング手順の１つの例において、多数の候補フラグメントは、多かれ少なかれ、無作為に産生され、そしてそれらを使用して、モルモットまたは他の適切なモデルを免疫する。あるいは、本発明において活性であると示される全長ポリペプチドは、短縮され得、そして反復プロセスにおいてスクリーニングされ、最小フラグメントに対する免疫原性活性および保護活性を単離し得る。このようなスクリーニングは、過度の実験をすることなく、容易に実施され得、そして活性なフラグメントは、本発明の企図内にある。第３の実施例は、疎水性および／または他のアミノ酸特性を用いて、表面曝露エピトープおよび免疫原性エピトープを予測することである。予測された表面曝露残基は、オリゴペプチドとして合成され、そして抗体は、例えば、ウサギまたはマウスにおいて、これらのペプチドに対して惹起される。次いで、この抗体は、インタクトなタンパク質に対しての反応について試験される。タンパク質への結合は、予測されたエピトープが、実際に表面曝露されており、それゆえに、ＥＡＥＣワクチンについての潜在的保護エピトープに相当し得ることを示唆する。
【００９６】
（組換え生物）
本発明の１つの実施形態において、ａａｐ遺伝子もしくはその機能的フラグメントまたはａａｔ遺伝子クラスターの１つ以上の遺伝子もしくはそのフラグメントを含むヌクレオチド配列は、当業者に周知の標準的分子生物学的技術を用いて、外因性生物に導入される。例示的な分子生物学的技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」に記載される。次いで、得られる組換え生物は、免疫応答が発生し得る免疫原として使用され得る。好ましい実施形態において、弱毒化された病原性生物は、外因性生物として機能する。さらに、組換え生物全体またはその機能的フラグメント（例えば、単離された膜画分、リポソームなど）を使用して、免疫原性組成物を生成し得ることが企図される。１つのこの企図された実施形態では、ａａｐ遺伝子は、親生物、ＥＡＥＣ  ０４２由来の案内役（ｕｓｈｅｒ）およびシャペロンを用いて同時発現され、細菌外側膜を介するＡａｐタンパク質の分泌を保証する。案内役（ａａｆＣ）およびシャペロン遺伝子（ａａｆＤ）は、キメラクローンとして入手可能である。別の実施形態において、ａａｔ遺伝子クラスター全体は、生物内で発現される。
【００９７】
（サブユニット免疫原性組成物）
本発明の別の実施形態は、目的の生物の別個の免疫原性タンパク質（もしくはそのフラグメント）または機能的フラグメントを含む、免疫原性組成物の作製に関する。このような免疫原性組成物は、本明細書でサブユニット免疫原性組成物として参照される。なぜなら、組成物の少なくとも１つの成分は、生物全体ではなく、生物のサブユニットであるからである。代表的に、このような免疫原性組成物は、１つ以上の免疫原性成分を含む。
【００９８】
好ましい実施形態において、サブユニット免疫原性組成物は、キャリア成分および免疫原性成分を含む。代表的に、キャリア成分は、発生する生物が、宿主生物に結合し、そして宿主生物への入口を得るために使用する結合部分として機能する。別の好ましい実施形態において、ＥＡＥＣ由来のＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、および／またはＡａｔＤは、キャリア成分として機能する。免疫応答を誘発する任意のタンパク質、ペプチド、またはアミノ酸配列は、サブユニット免疫原性組成物において、免疫原性成分として使用され得る。
【００９９】
サブユニット免疫原性成分のキャリア成分は、それら自体の免疫原性特性を保有し得る。代表的に、アジュバントが、免疫原性組成物において使用され、免疫原性組成物の免疫原性成分に対して指向する免疫応答を増強する。粘膜結合特性および免疫原性特性の両方を保有するキャリア成分が、使用され得る。例えば、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、および／またはＡａｔＤは、キャリア成分としてかつ免疫原性成分として機能し得る。
【０１００】
上記のキャリア成分について、分子全体が、キャリア成分として使用され得るか、または分子の機能的に活性なフラグメントが、使用され得る。これらの分子の変異誘発された形態もまた、キャリア成分として使用され得る。
【０１０１】
理論に束縛されることを望まないが、サブユニット免疫原性組成物は、粘膜およびそこに存在する種々の免疫系成分にこのサブユニット免疫原性組成物の免疫原性成分を曝すことにより機能するという仮説が立てられる。１つの理論によれば、サブユニット免疫原性組成物による所望される免疫応答の発生が、標的組織へのこの免疫原性組成物の曝露を増加させることにより生じる。キャリア成分および免疫原性成分の両方の存在が、この目的を達成するよう理論付けられる。
【０１０２】
本発明の１つの実施形態において、Ａａｐが、単離され、精製され、そして１つ以上の免疫原性化合物またはアジュバント化合物と混合または組み合わせられる。例えば、Ａａｐが、発現され、精製され、そしてサブユニット免疫原性組成物における使用のために毒素、トキソイド（弱毒化された毒素）またはいくつかの他の免疫原性化合物に架橋され得る。別の実施形態において、ＡａｔＡが、発現され、精製され、そしてサブユニット免疫原性組成物における使用のために毒素、トキソイド（弱毒化された毒素）またはいくつかの他の免疫原性化合物に架橋され得る。
【０１０３】
別の実施形態において、発現されたＡａｐもしくはそのフラグメントまたはＡａｔＡもしくはそのフラグメントが、免疫原性成分に架橋され得、この免疫原性成分は、単離されたタンパク質、その機能性フラグメント、生物全体（例えば、細菌またはウイルス）、または一部分が単離されるかもしくは全体として病原性生物として用いられるかのいずれかのその機能性フラグメントであり得る。ＡａｐおよびＡａｔＡが、細菌自体から単離され得るか、または当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術を用いて産生され得る。組換え生物全体またはその機能的フラグメント（例えば、単離された膜画分、リポソームなど）が用いられて免疫原性組成物を生成することが企図されかつ本発明の範囲内である。
【０１０４】
サブユニット免疫原性組成物を形成するために用いられる本発明のタンパク質は、タンパク質全体、その免疫原性フラグメント、タンパク質の変異形態、または特定のタンパク質もしくはそのフラグメントと適切な融合パートナー（例えば、当該分野において公知の組換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質および融合パートナーの発現および／または精製を容易にする任意のタンパク質、ペプチド、またはアミノ酸配列）とを有する含む融合タンパク質であり得る。あるいは、１つ以上の追加の免疫原が、融合タンパク質における融合パートナーとしての役割を果たし得る。
【０１０５】
（ヌクレオチド免疫原性組成物）
免疫応答がまた、ヌクレオチド含有組成物を用いて誘発され得る。例えば、本発明中により包含される１つの実施形態において、宿主に、抗原性エピトープをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む抗原コードポリヌクレオチド調製物を投与することにより、宿主において粘膜性免疫応答または全身性免疫応答が誘発される。好ましくは、このヌクレオチド含有組成物が、宿主の粘膜組織における粘膜性誘導因子部位に投与される。裸のＤＮＡが、粘膜に直接か（例えば、生理食塩水の液滴中で）、または組換え遺伝子発現ベクター中で投与され得る。好ましくは、組み換え遺伝子発現ベクターは、複製も播種もし得ない。
【０１０６】
ヌクレオチド含有免疫原性組成物はまた、生きたウイルス性免疫原性組成物を含む。ウイルス性免疫原性組成物における使用のためのウイルスは、免疫刺激性ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、標的タンパク質抗原が、組換え遺伝子発現ベクターによるその発現を介して投与される。
【０１０７】
「ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ  ａ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」と題された、Ｍａｌｏｎｅらに対する米国特許第６，１１０，８９８号（その全体が、本明細書中に参考として援用される）は、そのような免疫原性組成物の作製についての詳細な教示を提供する。特に、Ｍａｌｏｎｅは、Ｍａｌｏｎｅ，Ｊ．Ｇ．ら、「Ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ」、Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ  Ｍｉｔｔ  ９８：６３−７２（１９９７年２月）に記載されるような組換えアルファウイルスベクター系を得ることを教示する。（例えば）ＡａｐをコードするＤＮＡが、ベクターにおいてｌａｃＺ遺伝子で置換される。複製欠損アルファウイルス粒子が、１／２０容量のキモトリプシン１０ｍｇ／ｍｌ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を有するＰＢＳ中）および１／５０容量のＣａＣｌ２（５０ｍＭ）に１容量のウイルスストックを合わせることにより活性化される。この混合物を、室温での３０分のインキュベーションに供し、次いで氷上に置く。次に、１／２容量のアプロチニン２ｍｇ／ｍｌを添加する。この溶液を氷上で１時間まで保持し、そして用いられない場合、廃棄する。
【０１０８】
Ｂａｌｂ−Ｃマウス（ＳＰＦ雌、６週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に、１０６のウイルス粒子（１０７／ｍｌ）を、気管内経路、鼻腔内経路、または静脈内経路を介して、接種する。接種の前に、動物を、ケタミン（２２ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（２．５ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン（０．７５ｍｇ／ｋｇ）のカクテルを用いて麻酔する。気管内接種を、頸部の腹側部位で皮膚に沿って小さい医学的切開を作製することにより実施する。唾液腺を、平担切開（ｂｌｕｎｔ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）を用いて取り出して、気管を露出させた。気管を可視化し、１ｃｃのツベルクリンシリンジを取り付けた３０．５ゲージの針を、気管の環を通して気管支まで入れた。１００μｌの上記のウイルス粒子を、肺に注射する。鼻腔内点滴注入は、外鼻腔のうち１つへの５０μｌのウイルス粒子の注入から構成される。一旦、吸入によりこれが鼻腔経路へと取りこまれると、他方の側に、同じ様式で接種される。静脈内接種が、３０．５ゲージの針を用いて、１００μｌの上記のウイルス粒子を尻静脈（ｔａｉｌ  ｖｅｉｎ）に挿入することによって実施される。
【０１０９】
血液を、マイクロキャピラリーチューブを用いて、０日目、１４日目、および２８日目に後眼窩静脈叢（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｖｅｎｏｕｓ  ｐｌｅｘｕｓ）から回収する。血液を、２〜４時間室温に置いて血塊にし、次いで、それを、ＩＥＣ  Ｃｅｎｔｒａ  ＭＰ４Ｒ遠心分離機において、６，０００ＲＰＭで６分間、回転させる。上清（血清）を取り出し、そしてＥＬＩＳＡアッセイを実施するまで−２０℃で貯蔵する。
【０１１０】
４週間目での肺の洗浄を、以下の方法により実施する。マウスを二酸化炭素での窒息により殺傷する。腹部（ｖｅｎｔｒｕｍ）の皮膚をむき、そして腸間膜を取り出し、肝臓を露出させる。肝臓を、横に移動して、横隔膜を可視化する。横隔膜を開き、そして胸骨を通して両側から胸郭を切断する。この切断部を、マウスを頭部の上に吊り上げ、気管を露出したままにする。気管の逆側の切開を、気管支の約２ｃｍ上で作製する。平担な２４ゲージの針を、気管内に０．５ｃｍ挿入し、そして外科用糸を用いて適所に固定する。１ｍｌのＢＢＳ（８９ｍＭ  ホウ酸、９０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３［ＮａＯＨ］）を、平担な針を取り付けられた１ｍｌのツベルクリンシリンジを用いて肺に徐々に導入し、次いで、その容量を、徐々に引き出す。この溶液を、遠心分離して細胞（粒子）成分および上清成分を生成する。回収される容量は、通常０．８５〜０．９５ｍｌの範囲内である。この細胞性成分および上清成分を、使用するまで−２０℃で貯蔵する。
【０１１１】
組織学的切片標本が取り出される動物を、２日目に二酸化炭素により殺傷する。これらの動物の肺をパラホルムアルデヒド中に３０分間、固定し、次いで、その組織を、ＰＢＳ＋２ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋３０％スクロースの混合物中で４℃で一晩インキュベートする。肺組織を、低温で切開し（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ）、そしてゼラチンスライド上に置く。次いで、これらのスライドを、固定し、ビオチン化標識した抗Ａａｐ抗体を用いてＡａｐについて染色する。
【０１１２】
ＥＬＩＳＡアッセイを、Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：４１９（１９８０）によって記載されたと同じ基本的なプロトコール、およびその派生した方法を用い、９６ウェルマイクロタイタープレートを用いて、試料について実施する。手短に言えば、Ａａｐを、５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを補充したＰＢＳで、１ｍｇ／ｍｌの濃度に懸濁する。マイクロタイタープレートのウェルを、５ｍｇ  Ａａｐ（その溶液中）／ｍｌ  ＢＢＳ（８９ｍＭホウ酸、９０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３［ＮａＯＨ］）でコーティングする。このプレートを、４℃で一晩インキュベートする。このプレートを、重ねたペーパータオルに連打して乾燥させ、１５０μｌ  ＢＢ（上記のように１％ウシ血清アルブミンを添加したＢＢＳ）でブロッキングする。このプレートを室温で２時間静置後、サンプル血清をＢＢで８回２倍希釈した希釈物をマイクロタイタープレートにピペットで入れる（１ウェルあたり５０μｌ）。以下のように希釈を行う：血清ＩｇＧおよび血清ＩｇＡ−１：１０〜１：５１２０、洗浄（ｌａｖａｇｅ）ＩｇＧおよび洗浄ＩｇＡ−１：１〜１：１２８。このプレートを、４℃で一晩インキュベートする。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで５〜６回洗浄し、乾燥させる。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２０００希釈）またはヤギ抗マウスＩｇＡ（ＢＢで１：１０００希釈）のいずれかを添加する（１ウェルあたり５０μｌ）。プレートを、室温で２時間インキュベートする。これらを上記のように洗浄および乾燥させ、そして基質緩衝液（１ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェノールリン酸、５０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．８、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を添加する。プレートを、室温で１時間、再度インキュベートする。ｉＭａｃ（適切なソフトウェアを有する）に接続したＤｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲ５０００  ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）が、４０５ｎｍ波長で、これらのプレートを読み取る。バックグラウンド信号を、バックグラウンドの２．５倍より大で確認されるポジティブな力価を有するコントロール血清を用いて規定する。洗浄（ｌａｖａｇｅ）サンプルのために、バックグラウンドの２．５倍として規定されるポジティブな信号を有する１：２希釈を用いて、ＯＤ４０５を記録する。
【０１１３】
肺洗浄研究の結果から、鼻腔内の接種によって、結果としてＩｇＧおよびＩｇＡの両方が高レベルになる（粘膜免疫を示す）ことが実証される。気管内および血管内の接種は、全身性の免疫応答を引き起こす。
【０１１４】
あるいは、ａａｔクラスターの１つ以上の遺伝子が、弱毒化した（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）ＥＡＥＣ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、または粘膜組織に侵襲性の他の弱毒化した細菌に導入され得、従って、この遺伝子にコードされる特定のＡａｔタンパク質を発現する。この細菌を、コード化された特定のＡａｔタンパク質に対する免疫応答を引き起こすために、動物に投与する。
【０１１５】
（処方物および投与）
本明細書中に記載される免疫原性組成物は、種々の経路による投与に関して、種々の有用な様式で処方され得る。上記の処方物中の免疫原性組成物の濃度は、これらの免疫原性成分の有効用量が処方物中に含まれるような濃度である。このような濃度の決定は、当業者に容易に明らかである。
【０１１６】
これらの免疫原性組成物の投与は、鼻適用によって、吸入によって、眼的、経口的、直腸的、膣的な適用によって、または免疫原性組成物が粘膜組織に接触する結果となる任意の他の様式によって、なされ得る。
【０１１７】
これらの組成物の経口投与のための固体処方物は、適切なキャリアまたは賦形剤（例えば、コーンスターチ、ゼラチン、乳糖、アラビアゴム、ショ糖、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、またはアルギン酸）を含み得る。使用され得る崩壊薬（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）としては、制限無く、微晶質セルロース、コーンスターチ、デンプングリコレートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、およびアルギン酸が挙げられる。使用され得る錠剤結合剤としては、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ショ糖、デンプン、およびエチルセルロースが挙げられる。使用され得る潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、アイリコン流体（ａｉｌｉｃｏｎｅ  ｆｌｕｉｄ）、滑石、ワックス、油、およびコロイド状シリカ（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｓｉｌｉｃａ）が挙げられる。
【０１１８】
本発明の１つの実施形態において、これらの免疫原性組成物は、吸入による送達のために、微粒化分散として存在する。これらの免疫原性成分の微粒化分散は、代表的に、微粒化分散またはエアロゾル化分散のための一般的なキャリア（例えば、緩衝化生理食塩水および／または当業者に周知の他の化合物）を含む。免疫原性組成物の吸入を介した送達は、免疫原性成分を粘膜組織の広い面積に迅速に分散化する効果および免疫原性成分の循環のための血液による迅速な吸収の効果を有する。微粒化分散を調製する方法の１つの例は、米国特許第６，１８７，３４４号に「Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ」という題名で記載され、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１１９】
本明細書中に記載される免疫原性組成物はまた、直腸座薬または膣座薬の形態でも処方され得る。座薬の不活性な部分の処方物に使用される代表的なキャリアとしては、ポリエチレングリコール、グリセリン、カカオバター、および／または当業者に周知の他の化合物が挙げられる。理論によって結合されることを希望しないが、座薬を介する免疫原性組成物の送達は、近位粘膜組織に放出するために、粘膜表面を免疫原性組成物と接触する効果を有すると仮定される。遠位粘膜組織は、拡散によっても免疫原性組成物を受容する。本発明に含まれる免疫原性組成物の送達に適切な他の座薬処方物もまた、企図される。
【０１２０】
さらに、免疫原性組成物もまた、液体形態で存在する。液体は、経口投薬のためか、滴下剤として眼投薬もしくは鼻投薬のためかまたは浣腸もしく灌注器としての使用のためであり得る。免疫原性組成物が液体として処方される場合、この液体は、免疫原性組成物の液剤または懸濁剤のいずれかであり得る。その意図する用途に依存して、免疫原性組成物の液剤または懸濁剤について、当業者に周知の種々の適切な処方が存在する。水中、または他の水性ビヒクル中で調製される経口投与用の液体処方は、種々の懸濁剤（例えば、メチルセルロース、アルギン酸、トラガカント、ペクチン、ケルギン（ｋｅｌｇｉｎ）、カラゲナン、アカシア、ポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコール）を含み得る。液体処方としてはまた、活性化合物、湿潤剤、甘味剤、ならびに着色剤および矯味剤を一緒に含む、液剤、乳剤、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられ得る。種々の液体処方および粉末処方が、処置すべき哺乳動物の肺への吸入のための従来の方法によって調製され得る。
【０１２１】
経口投薬による液体形態の、記載される免疫原性組成物の送達は、胃腸管および尿生殖器管の粘膜を免疫原性組成物に曝露する。胃の極端なｐＨに抵抗して安定化される適切な用量が、免疫原性組成物を胃腸管の全ての部分、特にその上位部分に送達する。組成物の効果的な送達が胃腸管に沿って分布するように、液体経口投薬において免疫原性組成物を安定化するための任意の方法は、本明細書中で記載される免疫原性組成物用いる使用が企図される。
【０１２２】
点眼剤による液体形態の、記載される免疫原性組成物の送達は、眼および関連組織の粘膜を免疫原性組成物に曝露する。点眼剤のための代表的な液体キャリアは、緩衝され、そして、当業者にとって周知であり、当業者が容易に同定可能な他の化合物を含む。
【０１２３】
点鼻薬による液体形態の、記載される免疫原性組成物の送達は、鼻および洞ならびに関連組織の粘膜を免疫原性組成物に曝露する。点鼻薬のための液体キャリアは、代表的には種々の形態の緩衝化生理食塩水である。
【０１２４】
コロイド分散系が、免疫原性組成物を含む核酸の標的送達のために使用され得る。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む、脂質ベースの系が挙げられる。好ましいコロイド系は、単層リポソームおよび多層リポソームを含む脂質調製物である。
【０１２５】
本組成物の注入可能な処方は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａａｍｉｄｅ）、エチルラクテート、エチルカーボネート、イソプロピルミリステート（ｍｒｉｓｔａｔｅ）、エタノール、ポリオール（グリセロ−ル、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコール）などのような種々のキャリアを含み得る。静脈内注入について、本化合物の水溶性の種類が、点眼注で投与され得、それにより、抗真菌剤を含む薬学的処方物と生理学的に受容可能な賦形剤が注入される。生理学的に受容可能な賦形剤としては、例えば、５％ブドウ糖、０．９％生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液または他の適切な賦形物が挙げられ得る。筋肉内用調製物（例えば、本組成物の適切な可溶性塩の形態の無菌処方）が注射用水、０．９％生理食塩水または５％グルコース溶液のような薬学的賦形剤に溶解され、投与され得る。本組成物の適切な不溶性の形態は、水溶性基剤または、長鎖脂肪酸のエステル（例えば、オレイン酸エチル）のような薬学的に受容可能な油性基剤中の懸濁剤として調製され、そして投与され得る。
【０１２６】
リポソームは、インビトロおよびインビボにおいて送達ビヒクルとして有用な、人工膜ビヒクルである。０．２〜４．０μｍのサイズの範囲の大きな単層ビヒクル（ＬＵＶ）が、大きな高分子を含む水性緩衝液の実質的な割合をカプセル化し得ることが示された。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオン粒子が、水性内部にカプセル化され得、そして生物学的に活性な形態で細胞へと送達され得る（Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．６：７７（１９８１））。哺乳動物細胞に加え、リポソームは、植物細胞、酵母細胞および細菌細胞においてポリヌクレオチドの送達のために使用された。リポソームが十分な遺伝子伝達ビヒクルであるためには、以下の特性が存在すべきである：（１）高い効率でポリヌクレオチドをコードする遺伝子をカプセル化する一方で、それらの生物学的な活性は損なっていない；（２）非標的細胞と比較して、優先的かつ実質的に標的細胞に結合する；（３）ビヒクルの水性内容物の標的細胞細胞質への高い効率での送達；および（４）遺伝情報の急速かつ効率的な発現（Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２（１９８８））。このようなＬＵＶ構造に加え、種々のカチオン性脂質両親媒性物質を組み込む多層状脂質調製物および小さな単層脂質調製物もまた、アニオン性ポリヌクレオチドと混合され、しばしばリポソームとも呼ばれる核脂質粒子を形成し得る（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４（２１）：７４１３（１９８７））。これらの核脂質粒子は、核酸を細胞内に送達するのに使用され得る。
【０１２７】
リポソームの組成は、通常、リン脂質（好ましくは高い相転移温度のリン脂質）の組み合わせであり、通常はステロイド（好ましくはコレステロール）の組み合わせである。しかし、他のリン脂質または他の脂質もまた、使用され得る。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価のカチオンの存在に依存する。カチオン性脂質両親媒性物質：ポリヌクレオチド処方の適切な組成物および調製物は当業者に公知であり、この情報を提供する多くの参考文献が入手可能である（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．６（３）：５４５）。
【０１２８】
リポソーム産生に有用な脂質の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ホスファチジルグリセロ−ル、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドのようなホスファチジル化合物。特に、有用なのは、ジアシルホスファチジルグリセロ−ルであり、この脂質部分は１４〜１８個の炭素原子、好ましくは１６〜１８個の炭素原子を含み、そして飽和している。例示的なリン脂質としては、卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。ポリヌクレオチド送達のための核脂質粒子の処方に有用な、カチオン性両親媒性脂質の例としては、一価の脂質（ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡおよびＤＣ−Ｃｈｏｌ）、多価の脂質（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ、ＤＯＧＳ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍおよび他の両親媒性ポリアミン）が挙げられる。これらの試薬は、ヘルパー脂質（例えば、Ｄｉｏｌｅｏｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）または、種々のキャリア組成物（種々のアジュバント（例えば、コレラ毒を含むコレラ由来分子）を含む）を用いて調製され得る。
【０１２９】
リポソームの標的化は、解剖学的因子および機械的因子に基づいて分類され得る。解剖学的分類は、例えば、臓器特異的、細胞特異的およびオルガネラ特異的のような選択性のレベルに基づく。機械的標的化は、標的化が受動的かまたは能動的かで区別され得る。受動的標的化は、洞様毛細血管を含む臓器における細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布するというリポソームの本来の傾向を利用する。一方で、能動的標的化は、特定のリガンド（例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質）へのリポソームの結合によるか、または自然に生じる局在化部位以外の臓器および細胞型への標的化を達成するために、リポソームの組成またはサイズを変更することによる、リポソームの改変を含む。
【０１３０】
標的化送達系の表面は、多様な方法で改変され得る。リポソームの標的化送達系の場合、標的リガンドをリポソームの脂質二重層との安定な会合に維持するために、脂質基がリポソームの脂質二重層に組み込まれ得る。種々の連結基が、脂質鎖を標的リガンドに連結するのに使用され得る。
【０１３１】
上で検討した化合物の投与は、インビトロまたはインビボで実施され得る。インビトロで実施される場合、任意の滅菌、かつ無毒性の投与経路が使用され得る。インビボで実施される場合、上で検討した化合物の投与は、皮下、静脈内、筋肉内、眼内、経口、経粘膜または経皮の経路で、例えば、注射によってかまたは制御放出機構によって、有利に達成され得る。制御放出機構の例としては、ポリマー、ゲル、ミクロスフェア、リポソーム、錠剤、カプセル、坐剤、ポンプ、シリンジ、眼挿入物（ｏｃｕｌａｒ  ｉｎｓｅｒｔ）、経皮処方、ローション、クリーム、経鼻スプレー、親水性ガム、ミクロカプセル、吸入剤およびコロイド薬物送達系が挙げられる。
【０１３２】
免疫原性組成物は、薬学的に受容可能な形態で、そして実質的に無毒性の量で投与される。特に、免疫原性組成物は、免疫応答を生じる個々の化合物に適当な組成物の量で投与され得る。適切な用量は、過度の実験を必要とせず、容易に当業者に周知の技術によって決定され得る。このような決定は、適切な化学療法用量を決定するのに使用される技術に類似した技術を使用する、特定の用量の許容性および有効性に部分的に基づく。さらに、この化合物は、界面活性剤を伴うかまたは伴わない水中で投与され得る。
【０１３３】
注射用調製物としては、滅菌水性溶液または使用前に滅菌環境下で希釈または懸濁され得る懸濁剤および散剤が挙げられる。水、エタノールポリオ−ル、植物油などを含有する液剤または分散媒体のようなキャリアもまた、本明細書に記載される組成物に添加され得る。レクチンおよび界面活性剤のようなコーティング剤が、組成物の適切な流動性を維持するために使用され得る。糖または塩化ナトリウムのような等張剤ならびに活性化合物の吸収を遅らせることを意図される生成物（例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチン）が添加され得る。滅菌注射溶液は、当業者に周知の方法に従って調製され、保存および／または使用の前に濾過され得る。滅菌散剤は、液剤または懸濁剤から減圧乾燥されるか凍結乾燥され得る。徐放性調製物および処方物もまた企図される。本明細書中に記載される組成物に使用される任意の物質は、薬学的に受容可能であり、かつ使用される量において実質的に無毒性であるべきである。抗菌化合物が、必要に応じて調製物に添加され得る。
【０１３４】
以下のいくつかの実験において、化合物は単一用量で投与されるが、臨床設定においては、化合物は、長期の時間にわたって多用量で投与され得ることが理解されるべきである。特に、化合物は、約１週間までの期間で、そしてさらに１ヶ月または１年より長い、長期間にわたって投与され得る。いくつかの例において、化合物の投与は、中止され、そして後に再開され得る。
【０１３５】
全ての化合物調製物は、均一な投薬量および投与の容易さのために投薬単位形態で提供され得る。各投薬単位形態は、薬学的に受容可能なキャリアと関連して所望の効果を生じるように計算された所定の量の活性成分を含む。それゆえ、このような投薬量は、特定の化合物の有効量を規定する。
【０１３６】
選択された免疫原性成分に対する免疫応答を誘発する免疫原性組成物の必須の成分を含むキットもまた、本発明の範囲内である。
【０１３７】
（診断）
本発明はまた、サンプル中のＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、および／またはＡａｔＤを検出する方法を提供し、この方法は、被験体からのサンプルとこれらのタンパク質の１つ以上に対する抗体を接触させ、そしてこの抗体と特定のタンパク質（この抗体が認識する）との結合を検出する工程を包含する。抗体結合は、サンプルにおける特定のタンパク質の存在を示す。本発明の１つの実施形態において、サンプルにおけるＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、および／またはＡａｔＤの存在は、ＥＡＥＣによる感染を示す。ＡａｐおよびＡａｔは、ＥＡＥＣに高度に特異的であるので、臨床サンプルにおける細菌に関するこれらのタンパク質の検出は、患者がＥＡＥＣ細菌に感染していることを示唆する。
【０１３８】
用語「サンプル」は、動物（例えば、魚、鳥、哺乳動物、ヒト、など）由来の物質を含む。そのようなサンプルとしては、髪、皮膚、組織、培養細胞、培養細胞培地、および生物学的流体が挙げられるが、これらに限定されない。用語「組織」とは、ヒトまたは他の動物由来の結合細胞塊（例えば、ＣＮＳ組織、神経組織、または眼組織）をいい、そしてこの細胞と関連する結合性物質および液体物質を含む。本明細書で使用される場合、用語「生物学的流体」とは、ヒトまたは他の動物由来の液体物質をいう。そのような生物学的流体としては、血液、血漿、尿、精液、排泄物、血清、血清誘導体、胆汁、粘液、唾液、汗、羊水、胸膜液、および脳脊髄液（ＣＳＦ）（例えば、腰部ＣＳＦまたは心室ＣＳＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
用語「サンプル」としてはまた、単離されたＡａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、および／またはＡａｔＤポリペプチドを含む溶液、これらのタンパク質が分泌された培地、およびこれらのタンパク質を産生する宿主細胞を含む培地が挙げられる。例えば、サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分けられ、そしてウエスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜に移されるタンパク質サンプルであり得る。反応物を得るために必要なサンプル量は、標準的な実験室技術により、当業者によって難なく決定され得る。サンプルの最適量は、連続希釈によって決定され得る。
【０１４０】
動物におけるＥＡＥＣの存在を診断するかまたは決定するためのキットは、本発明の範囲内の実施形態である。本発明の１つの実施形態において、キットは、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、および／もしくはＡａｔＤまたはこれらのタンパク質の１つ以上のフラグメントを認識する１つ以上の抗体（例えば、上述される）を含む。このキットは、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、および／またはＡａｔＤの検出のために有用であり、抗体（Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、および／またはＡａｔＤと結合する）を含む容器を閉鎖性の制限体で受けいれることが可能な区画化されたキャリアを有する。本明細書で使用される場合、「容器」は、バイアル、チューブ、などを含み、各容器は、使用される別々の要素の１つを含む。好ましい実施形態において、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、および／またはＡａｔＤと結合する抗体は、検出可能に標識される。さらにより好ましい実施形態において、標識は放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、または酵素である。このキットは、あるいは、抗Ａａｐ抗体、または抗ＡａｔＰ抗体、または抗ＡａｔＡ抗体、または抗ＡａｔＢ抗体、または抗ＡａｔＣ抗体、または抗ＡａｔＤ抗体を認識する抗体を含み得、そのためこのキットは、これらのタンパク質の１つ以上に対する抗体がサンプル中または組織中に存在するか否かを決定するために使用され得る。
【０１４１】
キット様式において、抗体は、商業上ラテックスビーズと結合され得る。ビーズは、生理食塩水中のＥ．ｃｏｌｉ細菌の懸濁液と混合される。この懸濁液は、１分間室温で激しく揺さぶられ得、そして懸濁液の凝集の存在が、陽性試験として読みとられる。
【０１４２】
さらに別の実施形態では、キットは、ａａｐポリヌクレオチドおよび／またはａａｔ遺伝子クラスターの１つ以上の遺伝子に関するポリヌクレオチドの検出のために有用である。キットは、ａａｐ、および／またはａａｔ遺伝子クラスターの１つ以上の遺伝子に関するポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸プローブを含む容器を、閉鎖性の制限形態で受け入れるための区画化されたキャリアである。好ましくは、サンプルからのポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸プローブは、検出可能に標識される。この標識は、放射性同位体、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、または酵素であることが好ましい。
【０１４３】
（ＥＡＥＣの間のａａｔクラスターの有病率）
ａａｔの配列は、ＡＡＦ／Ｉ−コード株１７−２とＡＡＦ／ＩＩ−コード株０４２との間で明らかに保存されている。それらは、ヌクレオチドレベルで９６％同一であり、そしてアミノ酸レベルで９５％同一である。臨床ＥＡＥＣ分離物間のａａｔクラスターの保存性を評定するために、ａａｔＡおよびａａｔＢＣＤ（ａａｔＢ、ａａｔＣ、ａａｔＤとも称される）に関して世界中のいくつかの地区の子供から単離された３１株を、ＰＣＲによって試験する。図４は、典型的なＰＣＲの結果を示す。さらに、ａｇｇＲの存在は、ａａｔおよびａｇｇＲの有病率を比較するために、ＰＣＲによって調査される。３１ＥＡＥＣ分離物におけるａａｔＡ、ａａｔＢＣＤ、およびａｇｇＲの有病率は、以下で示される表１の下方で示される。ａａｔＡおよびａａｔＢＣＤの発生率は、それぞれ７１．０％（２２／３１）および７４．２％（２３／３１）である。１つの株を除いて、ａａｔＡは、ａａｔＢＣＤによって必ず随伴されることに留意のこと。この観察は、ａａｔクラスターは、ＥＡＥＣ臨床分離物間で高度に保存されることを示唆する。２２ａａｔ陽性株のうち１９株は、ａｇｇＲ陽性であり、一方９ａａｔ陰性株のうちの５株は、ａｇｇＲ陰性である。ａｇｇＲの存在は、ａａｔクラスターの存在と有意に関係がある。
【０１４４】
【表１】
2005536235.tif 000003
（ａａｔクラスターの転写およびそのＡｇｇＲに対する依存性）
初め、０４２株のａａｔＡ変異体、ａａｔＣ変異体、およびａａｔＤ変異体が構築される。各遺伝子は、自殺プラスミド、ｐＪＰ５６０３の組み込みによって不活性化される。各転写物は、野生型において観察されるが、変異体においては観察されない（データは示されない）。
【０１４５】
５つの遺伝子間での転写における連鎖を評価するために、ＲＴ−ＰＣＲが、ａａｔクラスターにおけるそれらの遺伝子とプライマーとの多数の組み合わせを使用することで実行される。プライマー、ａａｔＰｉｎｔ−ＦおよびａａｔＡｉｎｔ−Ｒを使用するＲＴ−ＰＣＲアッセイは、予想されるサイズの産物を生じるが、ａａｔＡ遺伝子、ａａｔＢ遺伝子、ａａｔＣ遺伝子、およびａａｔＤ遺伝子に由来するプライマーとの組み合わせを使用するアッセイは、産物を生じない（データは示されない）。これらの結果は、ａａｔＰ遺伝子およびａａｔＡ遺伝子がポリシストロン的に転写される。データはまた、ａａｔクラスターにおける他の遺伝子の転写における連鎖を示す。
【０１４６】
【表２】
2005536235.tif 000004
ａａｔクラスターの転写に関するＡｇｇＲの影響を試験するために、０４２株および０４２ａｇｇＲ株におけるａａｔＡ転写についてのＲＴ−ＰＣＲが実行される。予測されたサイズの産物が０４２において観察されるが、０４２ａｇｇＲにおいては観察されない。ＡｇｇＲがａａｔクラスター転写のために必要とされることを確認するために、相補性の株におけるａａｔＡの転写がアラビノース依存性プロモーター、０４２ａｇｇＲ（ｐＢＡＤａｇｇＲ）の制御下にあることが見出される（図６、レーン４および５を参照のこと）。細胞が、アラビノースの存在下では増加するが（ａｒａ誘導状態）、グルコース存在下では増加しない（抑制状態）場合に、ａａｔＡの転写が、０４２ａｇｇＲ（ｐＢＡＤａｇｇＲ）において回復される。ａａｔ転写は、陰性対照株０４２ａｇｇＲ（ｐＢＡＤ３０）においては観察されなかった（図６、レーン３を参照のこと）。同様の方法を使用して、ＡｇｇＲはまた、ａａｔＰ、ａａｔＣ、およびａａｔＤの転写に不可欠であることが示される（データは示されない）。
【０１４７】
（ＡａｔＡタンパク質の局在）
ＡａｔＡ−Ｈｉｓ融合タンパク質は、発現されそして精製される（以下を参照のこと）。このタンパク質は、高度に特異的なＡａｔＡ抗血清を生成するために使用される。ＡａｔＡ特異的抗体は、この精製タンパク質に対する親和性精製によって濃縮される（以下を参照のこと）。ウエスタン免疫ブロット法は、全細胞、ペリプラズマ、および外膜から調製される。予想されるサイズのバンドが、０．４５％グルコースを追加したダルベッコ最小限必須培地（ＤＭＥＭ）（高グルコースＤＭＥＭ）中で培養された０４２の全細胞溶解産物において観察されるが、０４２ａａｔＡにおいては観察されない（データは示されない）。同じサイズのバンドが、外膜において観察されるが、ペリプラズマ分画においては観察されない。ＡａｔＡは、培地中に観察されない（データは示されない）。従って、ＡａｔＡは、主に外膜に存在する。ＡａｔＡが、ＡａｔＣのＡＢＣトランスポータージャンクションによって生成されるエネルギーを使用することで外膜へ転位されるか否かを決定するために、０４２ａａｔＣおよび０４２ａａｔＤが、ウエスタン免疫ブロット法によってＡａｔＡに関して試験される。ＡａｔＡは、０４２ａａｔＣおよび０４２ａａｔＤの両方の外膜において観察される（データは示されない）。
【０１４８】
（ａａｔクラスターは、Ｄｉｓｐｅｒｓｉｎ、Ａａｐの分泌と関連する）
原核生物のＡＢＣトランスポーター間の輸送体（ｉｍｐｏｒｔｅｒ）の膜貫通ドメインは、Ｃ末端における保存されたモチーフである、ＥＡＡをを保持する（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：３８１〜３９９（１９９９））。このモチーフが、ａａｔクラスターのアミノ酸配列中に観察されないので、ａａｔクラスターが、内膜および／または外膜を介して未同定のタンパク質を輸送することが仮説立てられる。この仮説を証明するために、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿された培地のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で、野生型と変異体との間での分泌性タンパク質における違いが、調査される。０４２株および０４２ａａｔＡ株は、一晩高グルコースＤＭＥＭ中で培養された。この培地は、ＴＣＡで沈殿され、５分間煮沸され、そして１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用することで分離された。Ｌ−ブロス培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンにおける有意な違いは観察されない。しかし、高グルコースＤＭＥＭ（ＡｇｇＲを発現することが公知である）におけるわずかな違い（図４Ａ）が、観察される。
【０１４９】
このゲルの銀染色は、野生型ＥＡＥＣにおける１０ｋＤのバンドを示すが、０４２ａａｔＡにおいてそのバンドを示さない。成熟Ａａｐの分子量は、１０．２ｋＤであることが公知であるので、この分泌性タンパク質は、Ａａｐであることが予測される。Ａａｐは、細菌の細胞表面に非共有結合することが公知であり、そして最終濃度０．１％で培地中にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加することによって、培地中に容易に放出されることが公知である。培地上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥが、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で実行される（図４Ｂを参照のこと）。０４２、０４２ａａｔＡ、０４２ａａｔＣ、０４２ａａｔＤ、および０４２ｐｅｔの培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。これらの株は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む高グルコースＤＭＥＭ中で６時間培養された。この培地は、ＴＣＡで沈殿され、５分間煮沸され、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離され、そしてクマシーブルーで染色された。野生型におけるバンドは、クマシーブルー染色によって容易に観察される。他方、このバンドは、０４２ａａｔＡ、０４２ａａｔＣ、および０４２ａａｔＤにおいて観察されない。ｐＪＰ５６０３の効果の可能性を除去するために、変異体０４２ｐｅｔ（ＥＡＥＣの毒素、ｐｅｔの遺伝子内に統合されるｐＪＰ５６０３を保有する）が、コントロールとして試験される。この０４２ｐｅｔは野生型と同じバンドを示す。
【０１５０】
この１０ｋＤａの分泌性タンパク質は、ウエスタン免疫ブロット法によってＡａｐであることが確認される（図５を参照のこと）。各株は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎを有する高グルコースＤＭＥＭ中および０．１％Ｔｒｉｔｏｎを有さない高グルコースＤＭＥＭ中で６時間培養され、そしてこの上清がＴＣＡで沈殿された。次いで、サンプルは、煮沸され、そして１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離された。ウエスタン免疫ブロット法が、Ａａｐに対する特異的ポリクローナル抗体を使用する標準的な方法によって実行された。
【０１５１】
図５において示されるように、Ａａｐは、高グルコースＤＭＥＮ中の野生型ＥＡＥＣの上清において観察されるが、０４２ａａｔＡにおいては観察されない。分泌性Ａａｐの量は、野生型および０４２ａａｔＡの両方において０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加後に増加する。しかし、野生型におけるＡａｐの分泌のレベルは、０４２ａａｔＡにおけるものよりもより高い。細胞ペレットに残るＡａｐのレベルは、野生型よりも０４２ａａｔＡにおけるもののほうが高い。
【０１５２】
分泌性Ａａｐのレベルはまた、０４２ａａｔＣおよび０４２ａａｔＤにおいて縮小されるが、０４２ｐｅｔにおいては縮小されない（図６Ａを参照のこと）。ウエスタン免疫ブロット分析が、（上清およびペレットにおける）０４２、０４２ａａｔＡ、０４２ａａｔＣ、０４２ａａｔＤ、および０４２ｐｅｔに関して行われた。各株は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有する高グルコースＤＭＥＭ中で６時間培養された。次いで、この上清は、ＴＣＡで沈殿され、煮沸され、そして１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離された。ウエスタン免疫ブロットは、Ａａｐに対する特異的ポリクローナル抗体を使用する標準的な方法によって実行された。減少の程度は、１０倍以下であることが算定される。
【０１５３】
さらに、ウエスタン免疫ブロット分析は、０４２、０４２ａａｔＡ、０４２ａａｔＣ、および０４２ａａｔＤのペリプラズムにおけるＡａｐに関して行われた。各株は、一晩高グルコースＤＭＥＭ中で培養された。ペリプラズムは、「細胞性分画の調製および分析」と題される部分の下方に記載されるように、抽出された。
【０１５４】
０４２ａａｔＡ、０４２ａａｔＣおよび０４２ａａｔＤにおけるペレットならびにペリプラズムのＡａｐレベルは、野生型におけるものよりも高く、これは、非分泌性Ａａｐが外膜の中、多分ペリプラズム中に残存することを示唆する（図６Ａおよび６Ｂを参照のこと）。
【０１５５】
ａａｔＡがＡａｐの分泌と関連することを証明するために、０４２ａａｔＡが補われる。初め、ｐＪＮＡＤ（図３を参照のこと）（単一コピー発現ベクターｐＺＣ３２０内にクローン化されるａａｔＡＢＣＤをコードする４．５ｋｂフラグメントを有する）が、０４２ａａｔＡ内に導入される。しかし、この補足物０４２ａａｔＡ（ｐＪＮＡＤ）は、Ａａｐ分泌を完全には回復しない（データは示されない）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、０４２ａａｔＡ（ｐＪＮＡＤ）におけるａａｔＡの転写レベルは、野生型と比較して非常に低いことを示す（データは示されない）。それゆえ、ａａｔＡのプロモーターは、ａａｔＰの上流領域中に存在することが考えられる。
【０１５６】
６．５ｋｂの全ａａｔクラスター（ｐＺＣ３２０（図３を参照のこと）内にクローン化されるａａｔＰの上流領域を含む）を含むｐＪＮＷが、０４２ａａｔＡ内に導入される。この補足物は、０４２ａａｔＡ（ｐＪＮＷ）として定義される。ＡａｔＡは、ウエスタン免疫ブロット法によって、全細胞および０４２ａａｔＡ（ｐＪＮＷ）の外膜において検出される（図７Ａを参照のこと）。ウエスタン免疫ブロット法分析は、０４２、０４２ａａｔＡ、および０４２ａａｔＡ（ｐＪＮＷ）の全細胞、外膜、および上清中のＡａｔＡに関して行われた。各株は、一晩高グルコースＤＭＥＭ中で培養された。外膜分画は、「細胞性分画の調製および分析」と題される以下の節に記載されるように調製された。外膜分画および全細胞サンプルは、煮沸後１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離された。上清は、ＴＣＡで沈殿され、煮沸され、そして１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離された。ウエスタン免疫ブロットは、ＡａｔＡに対して特異的なポリクローナル抗体を使用する標準的な方法によって実行された。Ａａｐの分泌レベルは、０４２ａａｔＡ（ｐＪＮＷ）において、野生型とほとんど同じレベルまでに回復される（図７Ｂを参照のこと）。
【０１５７】
補足物０４２ａａｔＣ（ｐＪＮＷ）および０４２ａａｔＤ（ｐＪＮＷ）はまた、Ａａｐ分泌を回復させる（図８を参照のこと）。図８に例示される結果は、０４２、０４２ａａｔＣ、０４２ａａｔＣ（ｐＪＮＷ）、０４２ａａｔＤ、および０４２ａａｔＤ（ｐＪＮＷ）の上清中のＡａｐのウエスタン免疫ブロット分析の結果である。特に各株は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎを有する高グルコースＤＭＥＭ中で６時間培養された。この上清は、ＴＣＡで沈殿化され、煮沸され、そして１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用することで分離された。ウエスタン免疫ブロットは、Ａａｐタンパク質に対する特異的ポリクローナル抗体を使用する標準的な方法によって実行された；
翻訳の極性効果の可能性を決定するために、ｐＪＮＡＰ（ｐＺＣ３２０内にクローン化されるａａｔＰＡをコードする３．９ｋｂのフラグメント（図３））が、０４２ａａｔＡ内へ導入される。この補足物０４２ａａｔＡ（ｐＪＮＰＡ）は、０４２ａａｔＡ（ｐＪＮＷ）とほとんど同じレベルまでＡａｐの分泌を回復し、これは、変異誘発の極性効果がないことを示唆する。
【０１５８】
（実験手順）
（細菌株、プラスミド、および増殖条件）
本明細書で使用される株およびプラスミドは、以下で示される表３中で列挙される。
【０１５９】
【表３】
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2005536235.tif 000006
株０４２は、１９８３年に、ペルーのリマにおける疫学研究中に下痢を有する子供から分離された（Ｎａｔａｒｏら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １５２：５６０〜５６５（１９８５））。この株はまた、成人ボランティアにおいて下痢を引き起こすことが示される（Ｎａｔａｒｏら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １７１：４６５〜４６８（１９９５））。追想的な（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ）ＰＣＲ分析において使用されるＥＡＥＣ株は、ワクチン開発センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）由来であり、そして疫学研究の間に世界中の種々の地域から分離された。全株は、１５％グリセロールを有するトリプチカーゼ大豆ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ）中で−７０℃で保管される。他の点で言及されない限り、全Ｅ．ｃｏｌｉ株は、ルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地中で３７℃で好気的に増殖される。抗生物質が、以下の濃度（適切な場合：アンピシリン、１００μｇ／ｍｌ；カナマイシン、５０μｇ／ｍｌ；およびナリジクス酸、５０μｇ／ｍｌ）で添加される。
【０１６０】
（分子クローニングおよび配列決定手順）
プラスミドＤＮＡ精製、制限、ライゲーション、形質転換、およびアガロースゲル電気泳動が、標準方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１））によって実行される。ｐＡＡ２を除く、プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫｉｔまたはＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用することで抽出される。アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの抽出は、Ｃｏｎｃｅｒｔ  Ｒａｐｉｄ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用することで実行される。プラスミドＤＮＡは、Ｈａｎａｈａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７〜５８０（１９８３）の方法によるコンピテント細胞の熱ショック形質転換によってＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α、ＤＨ５αλｐｉｒ、およびＳ１７−１λｐｉｒ内へ、またはＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用するエレクトロポレーションによって０４２ａａｔＡ、０４２ａａｔＣ、および０４２ａａｔＤ内へ導入される。ＤＮＡ配列分析は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  ＦａｃｉｌｉｔｙでＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３７３Ａシーケンサーで実行される；鋳型ＤＮＡは、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｈｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）からのミニカラムを使用することによって精製された。
【０１６１】
（ＰＣＲ手順）
増幅は、５０μｌの反応混合物（２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、０．５μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオシドトリホスフェート、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５μｌのメーカーの緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む）において、鋳型として５００ｎｇの精製されたゲノムＤＮＡを用いて実行される。増幅反応は、他の点で言及されない限り、ＭＪ  Ｍｉｎｉｃｙｃｌｅｒで、９４℃で５分間、引き続いて９４℃で３０秒間、５０℃で４０秒間、および１ｋｂあたり７２℃で１分間を３０サイクル、そして７２℃で１０分間での伸長で終了する。この産物は、０．７〜１．０％アガロースゲルによって分離され、臭化エチジウムで染色され、そしてＵＶトランスイルミネーションで可視化される。この研究で使用されるプライマー配列は、上の表２中で示される。
【０１６２】
（ＲＴ−ＰＣＲ分析）
総ＲＮＡは、対数相の中間まで振とうされたＬＢ培地から、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で抽出される。混在したＤＮＡを除去するために、調製物は、ＲＮａｓｅの存在しないＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で処理される。ＲＮＡ調製物中のゲノムＤＮＡの混在の無さは、染色体クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子に関するＰＣＲの実行によって証明される。ｃＤＮＡを合成するために、総ＲＮＡ（２μｇ）は、メーカーの指示に従って、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および遺伝子特異的逆方向プライマーを使用する逆転写酵素（ＲＴ）反応を受ける。ＲＴ−ＰＣＲのために使用されるプライマーは、表２中に示される。増幅反応は、他の点で言及されない限り、ＭＪ  Ｍｉｎｉｃｙｃｌｅｒで９４℃で５分間、引き続いて９４℃で３０秒間、５０℃で４０秒間、および１ｋｂあたり７２℃で１分間を３０サイクル、そしてこれは７２℃で１０分間の伸長で終了する。この産物は、０．７〜１．０％アガロースゲルによって分離され、臭化エチジウムで染色され、そしてＵＶトランスイルミネーションで可視化される。
【０１６３】
（Ａａｐの単離）
Ａａｐを単離するための単離技術は、以下に記載されるが、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、およびＡａｔＤの単離が、同じ手段で行われる。
【０１６４】
Ａａｐが、ＥＡＥＣ細菌の表面と非共有結合する優性タンパク質である場合、それは容易に単離される。細菌は、最小必須培地またはＬ培地中（Ａａｐ発現を最大にするために０．０５％グルコースを含むいずれか）で３７℃で一晩培養される。培養後、細菌は、２０，０００×ｇでの２０分間の遠心によってペレット化される。次いで、この細菌ペレットは、０．１％Ｔｒｉｔｏｎを有するＰＢＳ中に再懸濁され、そして１時間３７℃で培養される。次いで、細菌は、以前のようにペレット化される。上清は、実質的に純粋なＡａｐタンパク質（約９５％）を含む。
【０１６５】
（ＡａｔＡ発現および精製）
ＡａｔＡの発現および精製は、以下に記載されるが、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、およびＡａｔＤの発現および精製は、同じ手段で行われる。
【０１６６】
ａａｔＡ遺伝子産物は、発現ベクターｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位内への１０６４ｂｐフラグメント（ＰＣＲによって生成された）のクローニングによって発現される。増幅のためのａａｔＡ−ＦおよびａａｔＡ−Ｒのプライマー配列は、表２に示される。このタンパク質は、そのカルボキシ末端およびＴ７−ｔａｇに６Ｈｉｓタグを伴う融合体として合成される。タンパク質発現は、光学密度が６００ｎｍで０．５〜０．６に到達するまで、構築物のＬＢ培地を３７℃での振とうを伴うインキュベーションによって達成される。細胞は、最終濃度０．４ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）で３時間培養される。融合タンパク質は、Ｔａｌｏｎ  ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を供給する標準的プロトコルによる金属アフィニティーマトリクスの通過による変性条件において精製される。カラム溶出液は、８Ｍ尿素（ｐＨ７．４）を含むＰＢＳで一晩透析される。ヒスチジン標識融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、そしてクマシーブリリアントブルーＲ２５０での染色によって検出される。関心のタンパク質の正体を決定するために、バンドはゲルから切り出され、そしてタンパク質核酸研究施設（スタンフォード大学医学部，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で質量分光法によって分析される。
【０１６７】
（ＡａｔＡ特異的抗体の調製）
ＡａｔＡ特異的抗体の調製は以下に記載されるが、Ａａｐ、ＡａｔＰ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、およびＡａｔＤに対する抗体が同じ手段で調製される。
【０１６８】
ＡａｔＡに特異的なウサギ抗血清抗体は、フロインドアジュバンド中のＡａｔＡ調製物（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、１９９８に記載される）の皮下注射によって産生される。抗血清のアフィニティー精製は、ＡａｔＡ特異的抗体を精製するために実行される。ヒスチジン標識ＡａｔＡ融合タンパク質（１０ｍｇ）は、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に結合させられる。ウサギ抗血清は、Ｈｉｓ−ＡａｔＡタンパク質結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと２時間室温で混合することで吸収される。洗浄後、結合した抗体は、０．２Ｍグリシン（ｐＨ１．８５）で溶出され、そして直ちに１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で中和される。溶出液は、ＰＢＳで透析され、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、５０，０００ＭＷＣＯ（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することで濃縮され、そして続いてウエスタン免疫ブロットのために使用される。
【０１６９】
モノクローナル抗体は、精製したタンパク質をマウスへ注射することによって、Ａａｐに対して産生され得る。５０ｍｃｇの精製されたＡａｐタンパク質は、０日目、１４日目、２８日目および４３日目に、フロインドアジュバンドとともにそれぞれ３頭のマウスに注射される。最終ブーストから３日後、マウスリンパ球は、標準的な手順によって単離され、そして骨髄腫細胞と融合される。融合から２４日後、細胞株は、ウエスタンブロットによるＡａｐに対する抗体の存在に関して、個々のコロニーの培地を試験することで抗体産生についてスクリーニングされる。高レベルの特異的抗体産生を有するコロニーは、細胞培養フラスコを満たすために増大され、そして将来的な使用のために保存される。
【０１７０】
ポリクローナル抗体は、ニュージランドホワイトウサギにゲル薄片を注射することで産生される。２０ｍｃｇの純粋Ａａｐタンパク質を含む調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄから市販されている）に添加され、そして４時間ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１５％ゲル）上で分離される。次いで、このゲルは、クマシーブリリアントブルー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で染色され、そして可視化される。Ａａｐに対応するバンドは、サイズによって容易に同定される。このバンドは、かみそり刃を使用することでゲルから切り出され、そしてこのバンドは、かみそり刃で非常に小さい薄片に切り刻まれる。この薄片は、等容量のＰＢＳと混合され、そしてＰＢＳ中でこのゲル薄片をさらにホモジネートするために、２０ゲージ皮下針を通して出し入れされる。小さな（約１ｍｍ）塊のみが残される場合、スラリーは、１．５ｋｇニュージランドホワイトウサギの背中で、その皮下領域内へ皮下的に注射される。代表的には、注射物は、３〜４回の注射に分けられる。この手順は、２週間後、次いで、２回目の注射から４週間後に再度繰り返される。３回目の注射から１週間後、ウサギは抗血清のために採血される。この血液は、室温で３時間凝固させられ、次いでこの血液は、１５，０００×ｇで１０分間遠心される。上清が除去され、そして−２０℃で保管される。
【０１７１】
（細胞性分画の調製および分析）
培養上清分画を調製するために、株は、一晩または６時間３７℃で５ｍｌの高グルコースＤＭＥＭ中で増殖される。変異体の増殖率は、野生型とほとんど同じである（データは示されない）。１３，０００×ｇでの５分間の遠心後、上清中のタンパク質は、三塩化酢酸（ＴＣＡ）で沈殿化される。０．４％（ｗｔ／ｖｏｌ）デオキシコレートを含むＴＣＡの１／４容量が、エッペンドルフチューブ内の上清に添加され、そしてボルテックス後、氷上で３０分間インキュベートされる。ペレットは、１４，０００×ｇで１５分間遠心され、そして１．５ｍｌのアセトンで１５分間室温で洗浄される。ペレットは、再度１４，０００×ｇでの１５分間の遠心によって集められ、乾燥され、そして５０μｌのＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で懸濁される。外膜に非共有結合したＡａｐを検出するために、株は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有する培地中で増殖される。この上清は、ＴＣＡで沈殿化される。
【０１７２】
外膜タンパク質は、２０ｍｌの高グルコースＤＭＥＭ中で３７℃で一晩増殖された培養物から抽出される。細菌は、６，０００×ｇで１０分間４℃での遠心によって回収され、そして３．０ｍｌの１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）で再懸濁される。細胞はフレンチプレスで溶解され、そして３０分間１３，０００×ｇで４℃で遠心される。ペレットは、２４０μｌの１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、６０μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１．５μｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ２（Ｓｋａｒｅ，ら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７８：４９０９〜４９１８（１９９６））または３５μｌの蒸留Ｈ２Ｏおよび２６５μｌのサルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）（Ａｍａｋｏ，ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４０：７４９〜７５４（１９９６））中で再懸濁される。それは、室温で２０分間インキュベートされ、そしてペレットは、５０μｌのＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で再懸濁される。
【０１７３】
ペリプラズムは、５ｍｌの高グルコースＤＭＥＭ中で３７℃で一晩増殖された培養物から抽出される。細菌は、３，８００×ｇで１０分間の遠心によって回収され、そして５００μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で再懸濁される（Ｔｈｏｒｓｔｅｎｓｏｎ，ら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７９：５３３３〜５３３９（１９９７））。懸濁液は、氷上で３０分間保持され、そして１５分間３，８００×ｇで遠心される。上清は、保存され、そしてペレットは、５００μｌの溶解緩衝液中で再懸濁される。懸濁液は、１５分間３，８００×ｇで遠心される。上清は、集められそして上述されるようにＴＣＡで沈殿化される。ペレットは、１００μｌ中のＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で再懸濁される。
【０１７４】
１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．第４７巻（１）：６９〜８５（１９７０））が、１０〜１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のアクリルアミド分離ゲルおよび４．０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のアクリルアミドスタッキングゲルを使用することで実行される。サンプルは、充填前に慣用的にＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中（Ｌａｅｍｍｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０〜６８５（１９７０））で５分間１００℃で加熱される。タンパク質は、クマシーブリリアントブルーまたは銀染色キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）での染色によって検出される。
【０１７５】
（ウエスタン免疫ブロット分析）
調製タンパク質サンプルは、５分間煮沸され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０．５％、１２．５％、または１５％）によって分離され、そしてＩｍｍｏｂｉｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に転移された。乾燥脱脂乳（５％［ｗｔ／ｖｏｌ］）が、ブロッキング試薬として使用される。ＡａｔＡおよびＡａｐの検出のために、抗ＡａｔＡ特異的抗体および抗Ａａｐ抗血清が、それぞれ１：１，０００および１：８，０００の希釈倍率で使用される。抗原抗体複合体が、１；４０，０００の希釈倍率で西洋ワサビペルオキダーゼ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧと反応され、そして化学発光ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して可視化される。
【０１７６】
（変異誘発および相補性）
ａａｔＡ変異体を構築するために、ａａｔＡ遺伝子（ヌクレオチド２８９３〜３４１２）の内部部分は、ＰＣＲによって生成され、そして自殺ベクターｐＪＰ５６０３のＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ部位内でクローン化され、その複製は、トランスで供給されるＲ６Ｋｐｉｒをコードするπタンパク質の１コピーを必要とする（Ｐｅｎｆｏｌｄら，Ｇｅｎｅ  １１８：１４５〜１４６（１９９２））。この内部フラグメントを増幅するために使用されるプライマーの配列は、表２中に示される。結果として生じるプラスミド、ｐＩＮＴＡは、Ｓ１７−１λｐｉｒにおけるドナーＥ．ｃｏｌｉ株への形質転換前にＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αλｐｉｒにおいて増加される。次いで、変異体株は、野生型の親株０４２（ナリジクス酸耐性である）とＳ１７−１λｐｉｒにおけるＥ．ｃｏｌｉ株との間で接合交配によって得られる。接合交配体は、カナマイシンおよびナリジクス酸を補充されたＬＢ寒天培地上で選択される。このプロセスは、ａａｔＡ遺伝子内の相同性部位（そして部分的に二倍体の状態であるので）でのｐＩＮＴＡの組み込みを生じる。結果として生じる株は、０４２ａａｔＡとして表される。天然のａａｔＡ遺伝子への自殺プラスミドの挿入は、ＭｌｕＩおよびＢａｍＨＩを使用するｐＡＡ２プラスミドの制限分析によって確認される。ａａｔＡ転写物およびＡａｔＡタンパク質の欠乏は、それぞれＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタン免疫ブロットによって確認される。
【０１７７】
ａａｔＣおよびａａｔＤ変異体（それぞれ０４２ａａｔＣおよび０４２ａａｔＤ）の構築のために、各遺伝子（それぞれヌクレオチド４６１０〜４９０９およびヌクレオチド５３６１〜５８６０）の内部部分は、ＰＣＲによって生成され、そしてｐＪＰ５６０３（それぞれ、ｐＩＮＴＣおよびｐＩＮＴＤ）内にクローン化される。この内部フラグメントを増幅するために使用されるプライマーの配列は、表２中で示される。０４２ａａｔＣおよび０４２ａａｔＤは、上述されるように生成される。ａａｔＣおよびａａｔＤの転写物の欠失は、ＲＴ−ＰＣＲによって確認される。
【０１７８】
変異体のトランス相補体を構築するために、全ａａｔクラスターは、ＰＣＲによって増幅され、そして単一コピーベクターｐＺＣ３２０内にクローン化される。増幅のために使用されるａａｔＷ−ＦおよびａａｔＷ−Ｒのプライマー配列は、表２中に示される。増幅は、５０μｌの反応混合物（２．５ＵのプラチナｐｆｘＤＮＡポリメラーゼ、０．５μＭの各プライマー、０．３ｍＭの各デオキシヌクレオシドトリホスフェート、２ｍＭのＭｇＣｌ２および５μｌのメーカーの緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む）中で、鋳型として５００ｎｇの精製されたゲノムＤＮＡを用いて実行される。増幅反応は、ＭＪ  Ｍｉｎｉｃｙｃｌｅｒで、９４℃で５分間、引き続いて９４℃で３０秒間、５４℃で４０秒間、そして６８℃で６．５分間を３０サイクルで実行され、そしてこれは６８℃での１０分間の伸長で終了される。６．５ｋｂのＰＣＲ産物を、ベクターｐＺＣ３２０のＢａｍＨＩ部位およびＮｏｔＩ部位にクローン化する。このプラスミドは、ｐＪＮＷと称される。ｐＪＮＷは、０４２ａａｔＡ、０４２ａａｔＣ、０４２ａａｔＤ中に、エレクトロポレーションによって導入される。
【０１７９】
ｐＪＮＰＡ（ｐＺＣ３２０内でクローン化されたａａｔＰおよびａａｔＡをコードする３．９ｋｂのフラグメント）は、プライマーａａｔＷ−ＦおよびａａｔＰＷ−Ｒを使用する上述される手段と同じ手段で構築される。ｐＪＮＰＡは、エレクトロポレーションによって０４２ａａｔＡに導入される。ｐＪＮＡＤ（ｐＺＣ３２０内にクローン化されたａａｔＡＢＣＤをコードする４．５ｋｂのフラグメント）もまた構築され、０４２ａａｔＡに導入される。
【０１８０】
（コンピューター分析および統計分析）
ＤＮＡおよびタンパク質配列の分析は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）およびＳｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ）のＥｘＰＡＳｙサーバーを介して利用可能なプログラムを使用して実行される。統計学的試験は、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔを使用して実行される。０．０５未満の確率値は、有意とみなされる。
【０１８１】
（ａａｐ遺伝子の同定）
上で言及されるように、ａａｐは、ａｇｇＲ開始コドンからおおよそ８４３ヌクレオチド上流のｐＡＡに位置する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥが、Ｌａｅｍｍｌｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４７（１）：６９〜８５（１９７０）（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌらに記載される）の標準方法によって実行された。このゲルの全ては、１ｍｍのスペーサーを使用してＢｉｏ−ＲａｄのＭｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩＩ電気泳動システムで泳動される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの全試薬は、ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて使用されるゲルは、他の点で言及されない限り、１０％ポリアクリルアミドである。全てのサンプルは、ＢｉｏＲａｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動緩衝液中で調製され、そしてゲル充填前に１０分間煮沸される。ゲルは、メーカーのプロトコルに従い、ＢｉｏＲａｄからのゲル染色試薬を使用してクマシーブルー中で染色された。
【０１８２】
ａｇｇＲ遺伝子は、基本型ＥＡＥＣ株０４２のｐＡＡプラスミド上において線毛サブユニット（ａａｆＡ）の下流に位置される。この領域は、株１７−２のＡＡＦ／Ｉをコードするプラスミドの配列中で完全に保存される（９７％の配列相同性および全オープンリーディングフレームの保存性を有する）。
【０１８３】
さらに、Ａａｐ配列は、ジスルフィドループを形成し得る２つのシステイン残基を特色としたが、他の特徴的なアミノ酸配列モチーフまたは特性はないことが決定された。
【０１８４】
（株０４２におけるａａｐノックアウト変異体の構築）
ａａｐ変異体が、以下の方法を使用して自殺プラスミドｐＪＰ５６０３の単一交差挿入によって、Ｅ．ｃｏｌｉ株０４２において構築される：
ａａｐに対して内部のＤＮＡフラグメントは、以下のプライマーを使用するＰＣＲによって合成される：
【０１８５】
【化１】
2005536235.tif 000007
ＰＣＲは、メーカーの使用説明書にしたがって、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からのＯｐｔｉｐｒｉｍｅ  ｋｉｔ（緩衝液８）を使用して実行される。
【０１８６】
このＰＣＲ反応は、以下のプログラムを使用してＭＪ  Ｒｅｓｅａｃｈ，Ｉｎｃ．，（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＤ）からのＰＴＣ−１５０  Ｍｉｎｉｃｙｃｌｅｒで実行される：９４℃で１分間、５８℃で９０秒間、７２℃で２分間を４０サイクル；引き続く、７２℃で１０分間の一回の伸長反応。
【０１８７】
次に、反応産物は、制限酵素ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で３時間消化され、次いで標準的な方法を使用してアガロースゲル電気泳動で分離される。このフラグメントは、ゲルから切り出され、そして自殺ベクターｐＪＰ５６０３（Ｄｒ．ＪＭ．Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎから得られ、そしてＰｅｎｆｏｌｄ  ＲＪ  ａｎｄ  Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ  ＪＭ，Ｇｅｎｅ  １１８：１４５；１９９２中で言及される）（前もって同じ制限酵素で３時間消化されている）中にクローン化される。Ｅ．ｃｏｌｉ自殺ベクターｐＪＰ５６０３は、カナマイシン耐性であり、そして自殺Ｐ６Ｋレプリコンを有する。
【０１８８】
ライゲーションは、Ａｕｓｕｂｅｌらに開示される標準プロトコルによって、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬから得られるＤＮＡリガーゼで１８時間室温で、その製造業者によって提供される緩衝液およびＧｉｂｃｏ／ＢＲＬから得られるＡＴＰを使用して実行される。ライゲーション反応の容量は、２０μｌである。５μｌは、標準的なプロトコルに従う標準的な塩化カルシウム形質転換条件を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（λｐｉｒ）を形質転換するために使用される。次いで、組み換えプラスミドは、製造業者の指示書（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＱＡ）に従いＱｉａｇｅｎ  ｍｉｄｉ−ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔを使用して精製される。１μｇの精製されたプラスミドＤＮＡが、標準的な塩化カルシウム技術に従い、株Ｓ１７−１（λｐｉｒ）に形質転換される。
【０１８９】
株Ｓ１７−１（λｐｉｒ）が、株０４２中にプラスミドを動員するために使用される。ｐＪＰ５６０３ａａｐ構築物を保持するＳ１７−１（λｐｉｒ）およびレシピエント株０４２（ナリジクス酸耐性）は、それぞれルリア培地中で対数期（３時間）まで３７℃で増殖される。次いで、１００μｌの各ブロス培養物は、抗生物質なしのルリア寒天プレートに適用される硝酸セルロースディスク（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｋｅｅｎｅ，Ｎ．Ｈ．から得られる）上で混合される。このプレートは、一晩３７℃でインキュベートされる。翌日、細菌増殖物は、Ｌブロス中で再懸濁され、そしてアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびナリジクス酸（１００μｇ／ｍｌ）を有するＬ寒天上にプレートされる。一晩のインキュベーション後、個々のコロニーが突かれ、そして天然のａａｐ遺伝子への自殺プラスミドの挿入は、１００ｋｂ  ｐＡＡ２プラスミドを抽出し、そしてそれをＢａｍＨＩ制限酵素およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化することによって確認される。この天然プラスミドの消化のパターンは、公知であるので、挿入の部位は、容易に決定される。
【０１９０】
生じたＥ．ｃｏｌｉ株は、０４２ａａｐと称される。この構築物は、天然プラスミドｐＡＡ２上でａａｐ遺伝子に組み込まれたｐＪＰ５６０３プラスミドを含んだ。不活性化の方法は、ｐＪＰ５６０３中にクローン化されたａａｐフラグメントについて部分的に二倍体の複製物を生じる。Ａａｐ発現の欠失を、以下のようにウエスタンブロットによって確認した。０４２ａａｐは、振とうしながら３７℃で３時間Ｌ培地中で増殖される。細菌は、遠心（１０，０００×ｇ）でペレット化され、そして２０μｌの培養物上清は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡから得られる）と混合され、次いで、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離される。次いで、このゲルは電気ブロットによってニトロセルロース紙に転移される。電気ブロットは、６０Ｖで４時間４℃で、２０％メタノールを有するＴｏｗｂｉｎ  Ｔｒｉｓ／グリシン緩衝液中でＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｙｔｅｍを使用して実行される。
【０１９１】
ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，Ｎ．Ｈ．）への転移後、このブロットは、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）、０．５％脱脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ，Ｎｅｓｔｌｅ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ）を有するリン酸緩衝化生理食塩水中で一晩４℃でブロッキングされる。次いで、このブロットは、抗Ａａｐ抗体（以下で記載されるように惹起される）と、ＰＢＳ  ０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）中での１：２０００の希釈で、１８時間インキュベートされる。次に、このブロットは、０．５％脱脂乳と共に２時間室温でインキュベートされ、次いで０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄される。次いで、このブロットは、室温で１時間、二次抗体（１：４０，０００の希釈（ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ中）のヤギ抗ウサギ西洋ワサビぺルオキシダーゼ結合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）であった）と反応させされる。次いで、ブロットはＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄される。次いで、ブロットは、製造業者の指示書に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａからの化学発光キットで現像される。次いで、このブロットは風乾され、そしてＸ線フィルム（Ｘ−ｏｍａｔ  ｆｉｌｍ，Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に露光される。
【０１９２】
全ＰＣＲ反応を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からの緩衝液およびこの製造業者からのプロトコルを使用して実行した。各ＰＣＲ反応に特異的な詳細は、以下で提供される。
【０１９３】
（Ａａｐタンパク質の単離および精製ならびに抗体産生）
Ａａｐタンパク質の精製のために、ａａｐポリヌクレオチドが、プラスミドｐＱＥ７０（結果として生じるプラスミドは、ｐＡａｐと称される）中に、ｌａｃプロモーターの上流および６つのヒスチジン残基の上流に連結される。さらなる６つのヒスチジン残基（タンパク質のＣ末端に融合される）を保持する天然のＡａｐタンパク質が、生成される。
ａａｐ遺伝子は、以下の配列を有するプライマーを使用するＰＣＲによって増幅される：
【０１９４】
【化２】
2005536235.tif 000008
増幅は、製造業者のプロトコルに従い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からのＯｐｔｉ−Ｐｒｉｍｅ  ｋｉｔ中の緩衝液８番および他の試薬を使用して実行される。ＰＣＲ反応は、以下の順番の工程をプログラムされたＰＴＣ−１５０  Ｍｉｎｉｃｙｃｌｅｒ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）で実行される：９４℃で３分間；引き続いて９４℃で１分間、４３℃で３分間、７２℃で２分間を３５サイクル；引き続いて７２℃で１０分間の最終伸長。この反応は、ＳｐｈＩ制限部位およびＢａｍＨＩ制限部位を、それぞれａａｐの上流端部および下流端部に有する、ポリヌクレオチドフラグメントを生じる。
【０１９５】
増幅後、ＰＣＲ産物は、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩ（製造業者の指示書；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤに従い）で消化され、そして発現ベクターｐＱＥ７０（同じ酵素で消化された）に連結される。このライゲーション反応は、塩化カルシウム技術によってＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αを形質転換するために使用される。生じるプラスミドは、ｐＡａｐと称される。
【０１９６】
プラスミドｐＡａｐ  ＤＮＡは、製造業者の指示書に従い、Ｑｉａｇｅｎプラスミド抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してＤＨ５αｐＡａｐから単離される。このプラスミドＤＮＡは、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩを使用する制限消化によって所望の構築物であることが確認される。ＰＣＲは、クローニングのために使用されるフラグメントを生成するために使用されたのと同じプライマーおよび条件を使用して実行される。この構築物は、所望のサイズの産物を生じる。
【０１９７】
ｐＡａｐプラスミドは、上述されるように抽出され、次いでＥ．ｃｏｌｉ  ０４２ａａｐ内にエレクトロポレーションされる。０４２ａａｐは、以下のように、Ａｕｓｕｂｅｌらに記載される方法によってコンピテントにされる：０４２ａａｐは、５００ｍｌのＬブロス中で一晩振とうしながら、ＯＤ６００が０．６になるまで増殖される。次いで、この培養物は、氷上で冷やされ、そして遠心分離によって回収される。ペレットは、５００ｍｌの氷冷された水に再懸濁され、そして再度遠心分離される。このプロセスは、繰り返される。最終的なペレットは、５ｍｌの氷水中で再懸濁される。
【０１９８】
エレクトロポレーションは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｉｎｃ．からのＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを使用して実行される。蒸留水中で再懸濁された０．５μｇの精製されたプラスミドＤＮＡは、Ｂｉｏ−Ｒａｄからの０．２ｃｍキュベットにおいて、０．５ｍｌの細胞懸濁液中に添加される。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒは、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωに設定され、そして一回のパルスが適用される。次いで、１ｍｌのＳＯＣ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）が添加され、そして培養物は、１００ｍｃｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）を有するＬ寒天培地上でプレートする前に、振とうしながら３７℃で３０分間インキュベートされる。
【０１９９】
抗Ａａｐ抗体を使用するＥ．ｃｏｌｉ  ０４２ａａｐ（ｐＡａｐ）のウエスタン免疫ブロット分析は、Ａａｐ発現の回復を示す。ＩＰＴＧ誘導欠如下でのＥ．ｃｏｌｉ  ０４２ａａｐ（ｐＡａｐ）におけるＡａｐの発現レベルは、天然のレベルよりわずかに高い。
【０２００】
Ａａｐ−６Ｈｉｓ融合タンパク質は、ＯＤが０．６に到達するまで、Ｌブロス中で振とうしながら３７℃で増殖された、１００ｍｌの培養容量から精製される。この時点で、ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ；Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が、１ｍＭの濃度まで添加され、そして３７℃でのインキュベーションが、さらに４時間続けられる。次いで、細菌細胞は、４，０００×ｇでの２０分間の遠心分離でペレット化される。タンパク質の抽出は、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔマニュアル（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３／９９；Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中のプロトコル１０（「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」）で記載されるように実行される。特に、細胞ペレットは、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、２０％ショ糖（ｐＨ８．０）中でペレット１グラム湿重量（ｗｅｔ  ｗｅｉｇｈｔ）当たり８０ｍｌで再懸濁される。次いで、ＥＤＴＡが、１ｍＭの濃度に到達するまで添加され、そして細胞は、穏やかに１０分間攪拌される。次いで、細胞懸濁液は、８０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離され、そしてペレットは、同じ容量の冷５ｍＭ  ＭｇＳＯ４中に再懸濁される。次に、懸濁液は、穏やかに１０分間攪拌され、次いで、８０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離される。次いで、懸濁液は、３回（少なくともそれぞれ６時間）、１Ｌの溶解緩衝液（８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）を含む）に対して透析される。透析は、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ５，０００  Ｄａ  ＭＷカットオフ透析チュービング（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）を使用して、本明細書中および本願の他の箇所で実施されることに留意すべきである。
【０２０１】
次いで、上で得られた清浄化された溶解産物は、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔマニュアル（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３／９９）からのプロトコル１４を使用して、Ｎｉ−ＮＴＡ精製に供される。簡単には、精製は以下のように実行される：１ｍｌの５０％Ｎｉ−ＮＴＡスラリー（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）が、４ｍｌの清浄化された溶解産物に添加され、そして穏やかに回転式振とう器で６０分間混合される。次いで、混合物は、５ｍｌのクロマトグラフィーカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に充填され、そしてフロースルーが集められる。カラムは、４ｍｌの「緩衝液Ｃ」［８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．３）］で２回洗浄される。次いで、カラムは、０．５ｍｌの「緩衝液Ｄ」［８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ５．９）］を用いた４回の洗浄で溶出され、その後「緩衝液Ｅ」［８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ４．５）］を用いた４回の同様の洗浄が行われる。Ａａｐ−６Ｈｉｓタンパク質のほとんどは、緩衝液Ｅ洗浄液中に見出される。これらの分画は、プールされ、そして５，０００Ｄａ  ＭＷ透析チュービング（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を使用して、リン酸緩衝化生理食塩水を３回交換（それぞれ１８時間）して、透析される。
【０２０２】
高品質のポリクローナル抗血清は、精製されたＡａｐ−６Ｈｉｓタンパク質融合体に対して、ウサギの皮下注射によって（以下に示されるように）惹起される。ヒスチジンタグを含むＡａｐタンパク質は、製造業者の指示書に従い、Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，によって提供されるニッケルを基にしたカラムを通すクロマトグラフィーによって精製される。
【０２０３】
カラムからの溶出後、タンパク質は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、そしてかみそり刃を使用してゲルから切り出される。タンパク質の正体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅにおいて、自動Ｅｄｍａｎ分解を使用するＮ末端配列分析によって確認される。次いで、ゲル薄片内に含まれるおおよそ１ｍｇのタンパク質は、浸軟され、そして１．５ｋｇのニュージーランドホワイトウサギに皮下注射された。２週間後、タンパク質を含む第２の複製ゲル薄片が、同一の形式でウサギに注射される。第２の注射から３週間後、このウサギは、採血される。血液を、室温で一晩凝固させ、次いで赤血球が、３，０００×ｇで遠心され、そして血清が集められる。血清は、−２０℃で保存される。血清の一アリコートは、１ｍｌの抗血清（ＰＢＳで最終容量１０ｍｌに希釈される）を一晩、製造業者の指示書に従ってＥ．ｃｏｌｉアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と反応させることによって、交差反応する抗体について吸収される。生じる吸収された抗血清は、上述されるように実行されるウエスタンブロット分析によってＡａｐ−６Ｈｉｓタンパク質とのみ反応することが見出される。
【０２０４】
（Ａａｐの機能）
株０４２のＬブロス中での３７℃での一晩の増殖は、培養チューブの底に沈殿される細菌の凝集塊（「綿状沈降物」）を生じる。０４２ａａｐは、一晩の増殖後、大容量の沈殿物質（肉眼まで）を産生する。さらに、０４２ａａｐ（ｐＡａｐ）は、株０４２と比較して、類似の量の培養沈殿物を産生する。
【０２０５】
（ＡＡＦ／ＩＩ線毛の発現）
ＡＡＦ／ＩＩ線毛の発現は、走査型電子顕微鏡検査法によって観察される。試験されるべき株は、Ｌブロス中で振とうしながら一晩３７℃で増殖される。細菌培養物は、前もってポリリジンで５分間コートされたシリカチップ（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）上にスポットされる。このポリリジンストックは、蒸留水中の０．１％ポリリジン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から成った。３０μｌの一晩細菌培養物がチップ上にスポットされ、そして室温で５分間インキュベートされた。水は、パスツールピペットを使用して抜かれ、次いでＣａＣｏ緩衝液（０．１Ｍ  Ｃａ  カコジレート、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、全試薬はＥ．Ｍ．Ｓ．，Ｉｎｃ．から）中２％のグルタルアルデヒド（Ｅ．Ｍ．Ｓ．，Ｉｎｃ，Ｆｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）が１時間適用され、室温でインキュベートされた。液体は、抜かれ、そして０．１Ｍ  ＣａＣｏ緩衝液がそれぞれの洗浄で５分間３回適用される。次いで、標本は、ＣａＣｏ緩衝液中２％の四酸化オスミウム（Ｅ．Ｍ．Ｓ．，Ｉｎｃ）で１時間氷上で後固定される。次いで、標本は、それぞれ５分間蒸留水で２回洗浄される。次いで、標本は、２％ウラニルアセテート（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）で３０分間室温で染色され、５０％エタノールですすがれ、次いで、それぞれ５分間一連のエタノール浴槽（５０％、７０％、９０％、１００％）で脱水される。１００％エタノールでの洗浄工程は、それぞれ５分間３回実行される。次いで、標本は、乾燥するまで臨界点乾燥器（モデルＣＰＤ−０３０，Ｂａｌ−Ｔｅｅ  ＡＧ，Ｂａｌｚｅｒ，Ｓｗｉｔｚｅｅｒｌａｎｄ）に差し込まれ、その後、製造業者のプロトコル（Ｄｅｎｔｏｎ  Ｖａｃｕｕｍ，Ｉｎｃ，Ｍｏｏｒｅｓｔｏｗｎ，ＮＪ）に従い、９０秒間プラチナ／パラジウム（ｐａｌａｄｉｕｍ）を使用して、９０秒間のＤｅｓｋ  ＩＩ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｕｔｔｅｒｃｏａｔｅｒにおけるスピュッター（Ｓｐｕｔｔｅｒ）コーティングを行う。次いで、標本は、Ｌｅｏ  １５５０電界放出型走査型電子顕微鏡（Ｌｅｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｉｎｃ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）での走査型電子顕微鏡検査法によって試験される。
【０２０６】
（Ａａｐタンパク質の局在）
野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  ０４２におけるＡａｐを位置づけるために、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  ０４２および０４２ａａｐの細胞分画実験が、実行される。試験細菌の培養は、５ｍｌのＬブロス培養物に接種され、そして３７℃で振とうしながら一晩培養される。それぞれの分画について、サンプルが、以下のように調製される：
１）上清：１００μｌの培養が抜かれ、そしてこの細菌は、遠心分離によってペレット化される。２０μｌの残存上清が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用される。
【０２０７】
２）ペリプラズム：遠心分離された５ｍｌの培養物からのペレットは、１ｍｌの３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、２０％ショ糖（ｐＨ８．０）に再懸濁される。氷上で、ＥＤＴＡ（０．５Ｍのストック溶液、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）が、最終濃度を１ｍＭにするために添加される。氷上で５分間おいた後、細胞は、遠心分離によってペレット化され、次いで１ｍｌの冷５ｍＭ  Ｍｇ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁される。懸濁液は、１０分間攪拌される。次いで、細胞は、遠心分離によってペレット化され、そして２０μｌの上清が、ぺリプラズム分画としてＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動される。
【０２０８】
３）全細胞：遠心分離後、残存ペレットは吸引され、そして細胞ペレットは等容量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動緩衝液中で再懸濁される。上清は１０分間煮沸される。この調製物の１０μｌが、ゲル上で泳動される。
【０２０９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを泳動し、そして元の培養物中の細胞の数に戻って外挿することによって、株０４２によって産生されるＡａｐの少なくとも５０％が、培養上清に局在し、そして細菌細胞から遊離していると概算される。培養ペレットの全細胞溶解産物は、Ａａｐと関連する細胞の大部分が、１２ｋＤａのプロセシングされていない細胞質形態にあることを示す。また、Ａａｐタンパク質は、配列番号１の残基２１と２２との間に、優れたシグナル配列を有することが決定される。
【０２１０】
（腸管接着におけるＡａｐの役割）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ０４２ａａｐ（ｐＡａｐ）の凝集における減少に起因して、ａａｐ変異体が、インビトロ器官培養（ＩＶＯＣ）においてヒトの粘膜に接着する能力が試験される。結腸サンプルは、起こりうる炎症性腸疾患について、結腸鏡検査法を経験する小児患者（その親に十分にインフォームドコンセントが与えられる）から得られる。これらの実験に使用される全組織は、実験前に病理学試験によって正常と決定される。
【０２１１】
内視鏡検査法は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＰＣＦ小児内視鏡を使用することで実行される。２〜３ｍｍ２の生検標本は、６人の小児患者（５人の雄性：１人の雌性；年齢４１〜１７４ヶ月、中間年齢１０７ヶ月）由来の横行結腸から取り出される。組織は、３７℃で９５％Ｏ２および５％ＣＯ２ガス雰囲気において、ペトリ皿（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄｏｒｓｅｔ，Ｅｎｇｌａｎｄ）における発泡支持体（ｆｏａｍ  ｓｕｐｐｏｒｔ）（廃棄されたパッキング材料から取り出されるポリエチレンパッキング発泡体）上に乗せられる（粘膜表面を上にして）。この組織は、ＮＣＴＣ−１３５培地と０．５％ｄ−マンノースを含み、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）新生仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）を有するＤＭＥＭとの、１：１の混合物を含む培地中に、部分的に浸水される。培地は、ｐＨおよび栄養素供給を維持するために２時間ごとに交換される。細菌は、脳−心臓注入ブロス（Ｄｉｆｃｏ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中で１８時間３７℃で振とうせずに増殖される。２５μｌの一晩細菌培養物は、組織に塗布され、そして８時間培養される。この組織標本は、任意の非接着性の細菌を除去するために、新鮮なＮＣＴＣ−１３５／ＤＭＥＭ培地で３回洗浄される。次いで、標本は、３％リン酸緩衝化生理食塩水グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）で固定され、そしてその後１％水性四酸化オスミウム（ｍｇｆ）で固定される。次いで、標本は、段階分けした一連のエタノールおよびＰｏｌａｒｏｎ  Ｅ３０００臨界点乾燥器を使用する液体ＣＯ２での臨界点乾燥から得られる。サンプルは、Ｐｏｌａｒｏｎ  Ｅ５１００シリーズＩＩコーティングシステムにおいて金  パラジウムでスピュッターコートされ、そしてＪＥＯＬ  ＪＳＭ走査型電子顕微鏡検査法（ＪＥＯＬ  Ｉｎｃ．，Ｐｅａｂｏｄｙ，ＭＡ）で試験される。８時間の小児腸ＩＶＯＣが、接種されないコントロールおよび野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  ０４２と比較される。
【０２１２】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ０４２野生型は、細菌の厚い凝集塊および単一細菌で、粘膜と接着する。対照的に、ａａｐ変異体（Ｅ．ｃｏｌｉ  ０４２ａａｐ）は、粘膜表面上で実質的には単一の細菌のない「過剰凝集塊」で接着した。従って、ＩＶＯＣ実験は、ＡａｐがＥＡＥＣの分散または非凝集において助成することを示す。
【０２１３】
（ａａｐの発現条件）
Ａａｐは、対数増殖期の間に最大限に発現される。Ｅ．ｃｏｌｉ  ０４２は、Ｌブロス培地中で３７℃で振とうしながら培養され、そして２ｍｌのサンプルが２時間ごとにサンプルから抜かれる。この細菌細胞は、１０，０００×ｇでの遠心分離でペレット化され、そして５０μｌの上清が等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液（ＢｉｏＲａｄ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）と混合される。次いで、サンプルは、１０分間煮沸され、そして１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動される。次いで、ゲルはナイロン膜に電気ブロットされ、そして抗Ａａｐ抗血清を使用する免疫ブロットに供される。Ａａｐ発現は、対数期中期の間で最も高いことが示される。
【０２１４】
（アッシャーシャペロン経路）
Ａａｐは、細菌のピリンサブユニットに特徴的ないくつかの特性（小さいサイズ、切断可能なシグナル配列、ジスルフィドループを形成することが可能な２つのシステイン残基、およびＰａｐＤ様のシャペロンタンパク質との関連を示し得るＣ末端のグリシン残基を含む）を有する。
【０２１５】
ＡＡＦ／ＩＩ発現は、ＰａｐＤ様のシャペロンＡａｆＤおよびＰａｐＣアッシャーホモログＡａｆＣに依存することが示されている（Ｅｌｉａｓ，ら，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｒｉｏｌ  １８１：１７７９〜８５（１９９９））。Ａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  Ｆｉｍｂｒｉａ  ＩＩに関する生物発生遺伝子の組織化は、腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉにおける毒性遺伝子クラスターを規定する（Ｉｄ）。
【０２１６】
ｐＪＰ５６０３の挿入を有する株０４２の変異体は、細胞内空間へＡａｐを分泌する能力に関して試験される（Ｉｄ）。ｐＪＰ５６０３の挿入方法は、上述される。
【０２１７】
Ａａｐは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ０４２ならびにａａｆＤ、ａａｆＣ、およびａａｆＡ遺伝子内に挿入変異を有するＥ．ｃｏｌｉ  ０４２の上清において検出された。Ａａｐは、ａａｆＤ変異体およびａａｆＣ変異体において検出不可能である。しかし、Ａａｐは、ａａｆＡ変異体（すなわち、ＡＡＦ／ＩＩ主要線毛サブユニットの発現が欠損している）において野生型より多く分泌される。
【０２１８】
この点をさらに証明するために、以下の実験が、プラスミドｐＡＡ２ならびにａａｆＣ、ａａｆＤおよびａａｆＡにおいて変異を有するｐＡＡ２を保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＳの培養物中のＡａｐのタンパク質の存在を決定するために行なわれる。野生型株と比較される場合、同一の結果が観察され、そしてこれは、Ａａｐ発現が、Ｅ．ｃｏｌｉ株０４２のアッシャーシャペロンシステムに依存するが、ＡＡＦ／ＩＩ線毛自身の発現に依存しないことを示す。
【０２１９】
（ＥＡＥＣ感染の診断）
ＥＡＥＣ感染の診断は、Ａａｐに特異的な抗体を使用して以下に記載されるが、ＡａｔＰ、ＡａｔＡ、ＡａｔＢ、ＡａｔＣ、およびＡａｔＤに対する抗体が、同様の方法で診断のために使用され得る。
【０２２０】
ＥＡＥＣに罹患した個体は、便中に、Ａａｐタンパク質を細菌表面上で発現させるＥＡＥＣを排泄する可能性が最も高い。それゆえ、Ａａｐを発現するＥ．ｃｏｌｉの検出（免疫学的方法または遺伝学的方法による）は、ＥＡＥＣ感染を診断する。免疫学的検出は、Ａａｐに対する抗体を使用して、スライド凝集方法によって実行され得る。抗体は、単独で使用され得るか、またはラテックスビーズと結合体化され得る。
【０２２１】
Ａａｐ遺伝子が、ＥＡＥＣ株においてのみ存在することに起因して、ａａｐ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉの存在が、ＥＡＥＣ感染を診断する。Ｅ．ｃｏｌｉコロニーにおいてａａｐ遺伝子を見出す１つの有用な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲを介する。ＰＣＲは、下痢を伴う患者の便から単離されたＥ．ｃｏｌｉで実行され得る。陽性反応は、感染を診断する。患者の便は、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ培地でプレートされ、そして一晩３７℃でインキュベートされる。そのようなインキュベーション後、このプレートは試験され、そして乳糖陽性コロニーが、つま楊枝で突かれ、そして５００ｍｃｌの蒸留水中に再懸濁され、次いで、１０分間煮沸される。次いで、２ｍｃｌのこの調製物が、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．３］、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、それぞれ１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、２．５ＵのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ［Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．］、２５ｐｍｏｌの各ａａｐプライマーを含む水性緩衝液に添加される。ＰＣＲプライマーの配列は、
【０２２２】
【化３】
2005536235.tif 000009
である。
【０２２３】
反応混合物は、ＤＮＡサーマルサイクラーで５分間９４℃に加熱され、次いで、３５サイクル（９４℃で３０秒間、５０℃で１分間、および７２℃で４５秒間）の増幅を受け、次いで、７２℃で７分間の最終的な伸長を受ける。次いで、増幅されたＰＣＲ産物のそれぞれ１０μｌが、１−ｋｂのＤＮＡ分子量マーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と共に、１％アガロース電気泳動ゲルに添加される。陽性反応は、０．４ｋｂの予想されるサイズのＰＣＲ産物の存在として規定される。
【０２２４】
コロニーブロットハイブリダイゼーションは、標準方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１；１．１２６〜１．１４２頁）によって実施される。一枚のニトロセルロース紙（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＨＡＷＰ）が、Ｌ寒天プレート上に層状に重ねられる。試験されるべき細菌コロニーは、つま楊枝を使用してニトロセルロース上に植え付けられる。この植え付けられたプレートは、３７℃で一晩インキュベートされる。一晩のインキュベーション後、ニトロセルロース紙は、水中１０％ＳＤＳで３分間飽和され、次いで、変性溶液［０．４Ｍ  ＮａＯＨ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ］で５分間飽和される。この工程後、このフィルタは、中和溶液［１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、１．５Ｍ  ＮａＣｌ］で２回、それぞれ５分間濡らされる。これらの処理後、このフィルタは、２×ＳＳＰＥ［０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）］で５分間濡らされる。次いで、このフィルタは、真空下で８０℃でベーキングする前に乾燥される。
【０２２５】
ハイブリダイゼーション反応のために、フィルタは最初、２×ＳＳＣ［０．３Ｍ  ＮａＣｌ／０．０３Ｍクエン酸三ナトリウム］中で５分間濡らされ、次いで５０℃で６０分間、３×ＳＳＣ［０．４５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０４５Ｍクエン酸三ナトリウム］／１％ＳＤＳ（４×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液［１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液は、２％Ｆｉｃｏｌｌ  ４００、２％ポリビニルピロリドン、および２０ｇ／Ｌウシ血清アルブミンを含む］が添加されている）中でインキュベートされる。１００μｇ／ｍｌの変性サーモン精子ＤＮＡが、添加される。ハイブリダイゼーションのために、２５ｎｇのプローブフラグメント（このセクションにおいて上述されるＰＣＲ産物）が、低融点アガロースを使用するアガロースゲル電気泳動によって、そしてゲル薄片を７０°で１時間溶解することによるゲルからの抽出によって、精製される；次いで、このＤＮＡは、市販の標識キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用することにより、３２Ｐｄ−ＣＴＰを用いるランダムプライミングによって標識される。組み込まれていないヌクレオチドは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０  マイクロカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を通り抜けさせることによって除去される。次いで、放射性標識されたプローブフラグメントは、上のハイブリダイゼーション混合物中に既にあるブロットに直接添加される。ブロットは、ハイブリダイズするために６５℃で一晩放置され、その後、このブロットは、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６５℃で３回洗浄され、そして−８０℃で一晩Ｘ線フィルムに露光される。以前の研究において特徴付けられた株が、コントロールとして使用された。Ｅ．ｃｏｌｉコロニーの領域においてフィルムが暗くなることは、陽性試験として解釈され、それゆえ、Ｅ．ｃｏｌｉが単離された患者におけるＥＡＥＣ感染を診断する。
【０２２６】
（免疫原性組成物）
免疫原性組成物は、Ａａｐに関して以下に記載されるが、本明細書で記載される任意の他のタンパク質を使用する免疫原性組成物が、類似の方法で行われる。
【０２２７】
免疫原性組成物は、アジュバントと共に注射によって精製されたタンパク質を投与することにより、Ａａｐを使用して作製され得る。動物およびヒトに使用されるそのようなアジュバントの１つは、水酸化アルミニウム（ミョウバン）である。１ミリグラムの水酸化アルミニウムは、１ｍｌの０．９％生理食塩水中で５０ｍｃｇのタンパク質抗原と混合され、そして混合物はボルテックスされ、次いで室温で２０分間インキュベートされる。混合物は、１０，０００×ｇで１０分間遠心される。上清が回収され、そして４℃で貯蔵される。免疫原性を試験するために、混合物は、２回０．５ｍｌの注射でウサギに皮下注射され得る。ヒトへの注射のために、調製物は、正確に同じ方法で作られるが、優良製造規則の条件下においてである。抗原は、サブユニットワクチンとしてヒトに筋肉内注射され得る。
【０２２８】
（ヌクレオチド免疫原性組成物）
免疫原性組成物は、ａａｐに関して以下に記載されるが、本明細書で記載される任意の他の遺伝子を使用する免疫原性組成物が、同様にして作製される。
【０２２９】
ａａｐ遺伝子が、Ａａｐタンパク質に対する抗体を誘導するために、ＤＮＡワクチンとして送達され得る。ａａｐ遺伝子は、このプライマーを使用することで増幅される
【０２３０】
【化４】
2005536235.tif 000010
これらのプライマーの使用が、ＤＮＡフラグメントへのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＢａｍＨＩ部位の組み込みを生じる。ＰＣＲ産物は、メーカーのプロトコル（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によりこれらの２つの酵素で消化され、そしてこのフラグメントは、ベクターｐｃＤＮＡ２（前もって同じ酵素で消化した）に連結される。この反応は、またＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓからのＤＮＡリガーゼを使用してメーカーが提唱するプロトコルを使用することで起こる。この実験は、このようにして、このベクターのＣＭＶプロモーターの下流へのａａｐ遺伝子の配置を生じる。ライゲーション混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換され、アンピシリン耐性に関して選択される。次いで、プラスミドは、標準的なアルカリ溶解技術によって精製され得、そしてＤＮＡワクチンとして注射するために用意される。ＤＮＡは、内毒素の無いＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解される。この懸濁液の５０μｌは、免疫原性を試験するためにマウス大腿筋肉に注射され得る。おおよそ１ｍｌが、ヒト用量として作用する。
【０２３１】
（ＥＡＥＣワクチン）
Ａａｐタンパク質はまた、ＥＡＥＣ感染のための効果的なワクチンとして作用し得る。Ａａｐタンパク質は、細菌細胞の外側に分泌されること、ならびにタンパク質の機能の阻害（遺伝子の変異誘発により）が、細菌が粘膜層に浸透する能力を変化させること、そしてまた、腸管粘膜との相互作用の形態を変化させることが示される。この理由のために、Ａａｐは、ビルレンス因子であること、ならびにこのタンパク質に対する抗体の存在が、病理学的なプロセスを妨げることが推論される。従って、Ａａｐタンパク質の発現が、ＥＡＥＣワクチンの有用な成分として作用し得る。
【０２３２】
Ａａｐタンパク質は、ワクチン送達ベクターにおけるタンパク質の発現を操作することによって、ワクチンの一部とて発現され得る。おそらく、大部分のグラム陰性ワクチンベクターが、これを成し遂げるために首尾よく操作され得る。この技術の１つの例は、ベクターワクチン株ＣＶＤ１２０４にｐＡａｐプラスミドを導入することである（１９９８年７月２１日Ｎｏｒｅｉｇａらに対して発行された、米国特許第５，７８３，１９６号）。ＣＶＤ１２０４は、結腸粘膜でコロニーを作り、そして赤痢菌表面抗原および細菌細胞表面上で発現される異物タンパク質（腸毒素産生性のＥ．ｃｏｌｉ線毛タンパク質を含む）の両方に対する抗体応答を誘導する弱毒化赤痢菌ベクターワクチンである（Ａｌｔｂｏｕｍら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６９：３１５０〜８（２００１））。ｐＡａｐプラスミドは、セクション「Ａａｐタンパク質の単離および精製ならびに抗体産生」において上述される方法を使用するエレクトロポレーションによって導入され得る。次いで、ワクチンは、文献（Ｋｏｔｌｏｆｆら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８：１０３４〜９（２０００））中で記載されるように経口で投与され、そして抗体応答は、上述される方法を使用するウエスタン免疫ブロットによって検出され得る。
【０２３３】
この技術の別の例は、ＢａｍＨＩ部位（上流プライマー）およびＮｈｅＩ部位（下流プライマー）を組み込む上流および下流プライマーを使用して、株０４２からａａｐ遺伝子をＰＣＲ増幅することである。ＰＣＲ後、フラグメントは、アガロースゲルから精製され、そしてＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化される。発現ベクターｐＳＥＣ１０は、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化され、２つのフラグメントを生成する。より大きいフラグメントは、アガロースゲルから単離され、そして前もってＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化されたａａｐＰＣＲフラグメントと連結される。消化プロトコルおよびライゲーションプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されるものである。次いで、このライゲーション混合物は、コンピテントＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉワクチンベクター株ＣＶＤ１２０４にエレクトロポレーションされる。形質転換株は、カナマイシンを含む寒天上で選択され、そしてプラスミドはＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩでの消化によって証明される。
【０２３４】
ＣＶＤ１２０４におけるａａｐ発現プラスミドは、ａａｐを発現する弱毒化赤痢菌株（その表面でＡａｐを発現することが予測される）を含む。これは、上述される方法を使用するウエスタンブロットによって証明される。１０ｍｌのＬブロスは、Ａａｐを発現するｐＳＥＣ１０クローンを植え付けられ、そして一晩増殖させられる。この期間後、細胞は、遠心によって沈殿化され、そして表面に局在するＡａｐタンパク質を除去するために５００ｍｃｌの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤で１０分間洗浄される。２０ｍｃｌのこの洗浄された洗浄剤は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用され、そして電気泳動を被る。ゲルは、ニトロセルロースに転移され、そして上記のように抗Ａａｐ抗血清を使用するウエスタン免疫ブロットを受ける。
【０２３５】
増幅されたａａｐは、そのシグナル配列（ペリプラズマへの分泌を媒介する）を含む。Ａａｐは、専用の分泌システム（Ａａｔ）を有するようだが、Ａａｔが無いときにおいてでさえ、細菌細胞表面への残存のトランスロケーションがあることが示されている。それゆえ、Ａａｐ単独発現は、輸出を確立するために十分であり得る。
【０２３６】
（ａａｔワクチン）
ＡａｔＡタンパク質はまた、ＥＡＥＣ感染のための効果的なワクチンとして作用し得る。我々は、ＡａｔＡタンパク質が細菌細胞の外膜に分泌され、そして他の遺伝子が無いときにおいてそうできるようであることを示してきた。それゆえ、ＡａｔＡタンパク質が、さらなるタンパク質を加えることなくワクチン送達ベクターにおいてタンパク質の発現を操作することによって、ワクチンの一部として発現し得た。ａａｔは、弱毒化ＥＡＥＣ、サルモネラ菌、赤痢菌、乳酸杵菌、または他の細菌に導入され得る。次いで、この細菌は、Ａａｔに対する免疫応答を生成するために動物に投与される。
【０２３７】
ａａｔＡ遺伝子は、ＢａｍＨＩ部位（上流プライマー）およびＮｈｅＩ部位（下流プライマー）を組み込む上流および下流プライマーを使用して、株０４２からＰＣＲ増幅される。ＰＣＲ後、フラグメントは、アガロースゲルから精製され、そしてＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化される。発現ベクターｐＳＥＣ１０は、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化され、２つのフラグメントを生成する。より大きいフラグメントは、アガロースゲルから単離され、前もってＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化されたａａｔＡ  ＰＣＲフラグメントと連結される。消化プロトコル、ライゲーションプロトコルおよび形質転換／エレクトロポレーションプロトコルは、記載されるとおりである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。次いで、ライゲーション混合物は、コンピテントＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉワクチンベクター株ＣＶＤ１２０４にエレクトロポレーションされる。形質転換株は、カナマイシンを含む寒天上で選択され、そしてプラスミドはＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩでの消化によって証明される。
【０２３８】
ＣＶＤ１２０４におけるａａｔＡ発現プラスミドは、ａａｔＡを発現している弱毒化Ｓｈｉｇｅｌｌａ株（その表面（外膜に挿入された）上でＡａｔＡを発現することが予測される）を含む。これは、標準的な方法（Ｈａｒｌｏｗｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）を使用されるウエスタンブロットによって証明される。１０ｍｌのＬブロスが、ＡａｔＡを発現しているｐＳＥＣ１０クローンに植え付けされ、そして一晩増殖させられる。この期間後、細胞は、遠心によって沈殿化され、そしてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が最終濃度２％まで上清に添加される。この調製物は、２０，０００×ｇで１５分間遠心され、そしてペレットはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用され、次いで電気泳動に供される。このゲルは、ニトロセルロースに転移され、そして抗ＡａｔＡ抗血清を使用するウエスタン免疫ブロットに供される。
【０２３９】
上記で記載されるような弱毒化赤痢菌株において発現される場合、モルモット（ケタマインＨＣＬ（４０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）で皮下麻酔した）に、２回、０日目および１４日目に、鼻腔内投与によって、約２×１０９（０．１ｍｌの４０ＯＤ６００ｎｍ）の赤痢菌ＡａｔＡ株（ＴＳＡ／コンゴーレッド／グアニンを含む平板上で増殖され、そしてＰＢＳ中に回収された）細菌が植え付けられる。血清を、麻酔をかけられた動物の前方大静脈への穿刺によって、０日目、１４日目および３０日目に得た。この免疫された動物を、細菌凝集、免疫ブロット、および血球凝集およびＡａｔを発現する株のＣａｃｏ−２細胞への接着の阻害について試験した。動物は、上述されるようにウエスタンブロットによってＡａｔＡに対する免疫応答に関して試験される。次いで、この群の動物は、１０９ｃｆｕの株０４２で経口的にチャレンジされる；免疫されない対照動物の第２の群もまた、０４２でチャレンジされる。全動物からの便サンプルは、上述されるようにａａｐに関するコロニーハイブリダイゼーションにより、ＥＡＥＣの脱粒（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）についてスクリーニングされる。ａａｐを含む細菌の存在は、ＥＡＥＣ感染を示した。
【０２４０】
（作用機構および重要性）
腸病原体は、有効なコロニー化をもたらすために上皮表面に接着しなければならないことが示されている（Ｎａｔａｒｏら，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｊａｎ；１１（１）：１４２〜２０１（１９９８））。しかし、上皮表面を横断する広がりの改善を可能にするようにその接着を調節することが重要であり得る。Ｋｎｕｔｔｏｎ，ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３３：４９９〜５０９（１９９９）は、ＥＰＥＣの束形成ピリ線毛（ｂｕｎｄｌｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｉｌｕｓ）（ＢＦＰ）が凝集形成の役割および剥離の役割（これらは、引き続いて生じる）の両方を提供する。このようにして、ＥＰＥＣは接着し、そして病原性の連鎖反応における初期に繁殖して、上皮上で足場を確立し得るが、次いで、遊離している個々の子孫を「自由に振り落として（ｓｈａｋｅ  ｌｏｏｓｅ）」、粘膜上でいくらか距離をおいて感染の新たな中心を確立し得る。この範例は、細菌にとって直観的に有益であり、そしてそれゆえ、多くの他の粘膜病原体の特性であり得る。確かに、Ｂｅｎｉｔｅｚらは、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅのＨａｐムチナーゼが、酵素の「剥離酵素（ｄｅｔａｃｈａｓｅ）」として作用し得、その変異が、細菌のコロニー化の増加された密度を生じるが、毒性の弱毒化もまた生じることを示唆した（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６９：６５４９〜５３（２００１））。同様に、ＥＡＥＣの高度に保存されたＡａｐタンパク質は、ＥＡＥＣにおける接着およびコロニー化の調節因子として作用し得る。
【０２４１】
Ａａｐは、細菌細胞から分泌され、そして細胞外環境において細胞から遊離して存在する。この証拠は、Ａａｐが単一様式で作用することを示唆する。Ａａｐは、ＡＡＦ／ＩＩよりもより親水性であり、したがって細胞外でのその存在は、ＡＡＦ線毛の発現によって与えられる高表面親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｃｉｔｙ）を緩和する。Ａａｐもまた、酵素活性を同様に所有するが、この場合、Ａａｐ効果が細胞非含有インビトロシステムにおいてのみ例示されることに起因して、基質は細菌起源である必要がある。代替の実施形態は、Ａａｐが細菌外膜またはＡＡＦ線毛自身に結合することであり、それにより細菌細胞の生物物理学的特徴を調整する。しかし、Ａａｐは、細胞性成分のいずれにも結合しない。別の実施形態において、Ａａｐは、翻訳後のレベルでＡＡＦ線毛の発現を抑制する。
【０２４２】
Ａａｐは、粘膜の粘液表層の穿通（多分、粒子サイズを減少させながら）において役割を担う。確かに、精製されたムチンゲルカラムアッセイにおいて論証されるように、Ａａｐ変異体は、野生型の親株よりもよりゆっくり浸透した（上記を参照のこと）。したがって、ＥＡＥＣ凝集体の軽減は、粘液表層への浸透を促進し、かつ／または粘膜表面を横断する生物の播種を促進するように作用し得る。
【０２４３】
本出願の発明は、一般的実施形態および特異的な実施形態の両方に関して上述される。本発明は、好ましい実施形態と考えられることを示すが、当業者に公知の広く多様な代替が、一般的な開示以内で選択され得る。本発明は、以下に示される特許請求の範囲の公開を除いて、他の点で限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０２４４】
【図１】図１は、ａａｐのヌクレオチド配列を示す（配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１））。
【図２】図２は、Ａａｐのアミノ酸配列を示す（配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２））。
【図３】図３は、ａａｔ遺伝子クラスターの位置を示す、ＥＡＥＣ０４２のｐＡＡプラスミドの７ｋｂフラグメントの地図である。
【図４】図４Ａは、野生型および変異体ａａｔを、三塩化酢酸で沈殿させた培養液の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。図４Ｂは、野生型および変異体ａａｔの、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えた培養液の上清の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図５】図５は、上清および細胞ペレットにおける、０４２および０４２ａａｔの、ウェスタン免疫ブロットの写真である。
【図６】図６Ａは、上清および細胞ペレットにおける、分泌されたＡａｔのウェスタン免疫ブロットの写真で、以下における種々のレベルの発現を図示する：野生型、０４２ａａｔＣおよび０４２ａａｔＤ、だが０４２ｐｅｔはなし。図６Ｂは、ペリプラズムにおける、Ａａｔ野生型、０４２ａａｔＣ、０４２ａａｔＤおよび０４２ｐｅｔのレベルのウェスタン免疫ブロットの写真である。
【図７】図７Ａは、０４２ａａｔＡ（ｐＪＮＷ）の全細胞および外膜のウェスタン免疫ブロットの写真である。図７Ｂは、０４２、０４２ａａｔＡ、および０４２ａａｔＡ（ｐＪＮＷ）の上清におけるＡａｐのウェスタン免疫ブロット分析の写真である。
【図８】図８は、相補の０４２ａａｔＣ（ｐＪＮＷ）および０４２ａａｔＤ（ｐＪＮＷ）が、Ａａｐ分泌を元に戻すことを図示する、ウェスタン免疫ブロットの写真である。
【図９】図９は、ＥＡＥＣ０４２のｐＡＡの７ｋｂフラグメントのヌクレオチド配列を示す（配列番号３）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３）。
【図１０】図１０は、ＡａｔＰのアミノ酸配列を示す（配列番号４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４））。
【図１１】図１１は、ＡａｔＡのアミノ酸配列を示す（配列番号５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５））。
【図１２】図１２は、ＡａｔＢのアミノ酸配列を示す（配列番号６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６））。
【図１３】図１３は、ＡａｔＣのアミノ酸配列を示す（配列番号７（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７））。
【図１４】図１４は、ＡａｔＤのアミノ酸配列を示す（配列番号８（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８））。
【図１５】図１５は、ａａｔＰのヌクレオチド配列を示す（配列番号９（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９））。
【図１６】図１６は、ａａｔＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号１０（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０））。
【図１７】図１７は、ａａｔＢのヌクレオチド配列を示す（配列番号１１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１））。
【図１８】図１８は、ａａｔＣのヌクレオチド配列を示す（配列番号１２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２））。
【図１９】図１９は、ａａｔＤのヌクレオチド配列を示す（配列番号１３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３））。
【配列表】
2005536235.tif 000011
2005536235.tif 000012
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【図１】
2005536235.tif 000027
【図２】
2005536235.tif 000028
【図３】
2005536235.tif 000029
【図４】
2005536235.tif 000030
【図５】
2005536235.tif 000031
【図６】
2005536235.tif 000032
【図７】
2005536235.tif 000033
【図８】
2005536235.tif 000034
2005536235.tif 000035
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【図１２】
2005536235.tif 000042
【図１３】
2005536235.tif 000043
2005536235.tif 000044
2005536235.tif 000045
【図１５】
2005536235.tif 000046
【図１６】
2005536235.tif 000047
【図１７】
2005536235.tif 000048
【図１８】
2005536235.tif 000049
【図１９】
2005536235.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月29日(2004.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005536235000001.app
【国際調査報告】
2005536235.tif 000051
2005536235.tif 000052
2005536235.tif 000053