(57)【要約】部分的なペプチド擬似物並びに製造方法及び使用方法であって、ここで部分的なペプチド擬似物は、ANIKLSVQMKL(配列番号8)、そのホモログ、又は配列番号8又はそのホモログの断片を含む第一のアミノ酸配列、或いはIIVKLND(配列番号2)、そのホモログ或いは配列番号2又はそのホモログの断片を含む第二のアミノ酸配列、及び第一及び第二のアミノ酸配列の間に結合されたβターン誘導骨格を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ANIKLSVQMKL(配列番号8)、そのホモログ、或いは配列番号8又はそのホモログの断片を含む第一アミノ酸配列；IIVKLND(配列番号2)、そのホモログ、或いは配列番号2又はそのホモログの断片を含む第二アミノ酸配列；そして上記第一アミノ酸配列と上記第二アミノ酸配列の間に結合されたβターン誘導骨格を含む、部分的なペプチド擬似物であって、ここで上記ホモログ又は断片が、以下の活性：80μM未満のIC50レベルで、in vitroにおいて内皮細胞の増殖を阻害する活性；コラーゲン・ゲルに基づくアッセイにおいて、85％未満の出芽レベルでin vitroにおける血管新生を阻害する活性；又は投与期間の終わりにおいて対照に比較して少なくとも25％でin vivoにおける腫瘍体積を減少させる活性；の内の少なくとも1を上記部分的なペプチド擬似物に提供する、前記部分的なペプチド擬似物。
【請求項２】
前記第一アミノ酸配列が、配列番号8又はそのホモログの少なくとも3のアミノ酸を含む、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物。
【請求項３】
前記第一アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、又は8残基N末端において欠失がされた配列番号8又はそのホモログを含む、請求項2に記載の部分的なペプチド擬似物。
【請求項４】
前記第一アミノ酸配列が、MKL、QMKL(配列番号4)、SVQMKL(配列番号5)、IKLSVQMKL(配列番号6)、及びNIKLSVQMKL(配列番号7)から成る群から選ばれる少なくとも1の配列を含む、請求項3に記載の部分的なペプチド擬似物。
【請求項５】
前記第一アミノ酸配列が、ANIKLSVQMKL(配列番号8)又はそのホモログを含み、かつ前記第二アミノ酸配列がIIVKLND(配列番号2)又はそのホモログを含む、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物。
【請求項６】
前記第二アミノ酸配列が、配列番号2又はそのホモログの少なくとも1のアミノ酸を含む、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物。
【請求項７】
前記第二アミノ酸配列は、1，2，3，4，5、又は6残基C末端において欠失がされた配列番号2又はそのホモログを含む、請求項6に記載の部分的なペプチド擬似物。
【請求項８】
前記第二アミノ酸配列が、I、IIVK(配列番号3)、及びIIVKLN(配列番号9)から成る群から選ばれる少なくとも1の配列を含む、請求項7に記載の部分的なペプチド擬似物。
【請求項９】
前記第一アミノ酸配列が、MKL、QMKL(配列番号4)、SVQMKL(配列番号5)、IKLSVQMKL(配列番号6)、及びNIKLSVQMKL(配列番号7)から成る群から選ばれる少なくとも1の配列を含む、請求項8に記載の部分的なペプチド擬似物。
【請求項１０】
前記βターン誘導骨格が、ジベンゾフランを含む骨格である、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物。
【請求項１１】
ANIKLSVQMKL(配列番号8)又はその断片から成る第一アミノ酸配列、IIVKLND(配列番号2)またはその断片から成る第二アミノ酸配列、及び第一アミノ酸配列と第二アミノ酸配列の間に結合されたβターン誘導骨格を含む部分的なペプチド擬似物であって、ここで配列番号8の断片は、1、2、3、4、5、6、7又は8残基N末端において欠失された配列であり、かつ配列番号2の断片は、1、2、3、4、5,又は6残基C末端において欠失された配列である、前記部分的なペプチド擬似物。
【請求項１２】
第一アミノ酸配列が、少なくとも4のアミノ酸の配列QMKL(配列番号4)を有し、第二配列が、少なくともアミノ酸Iを有し、そしてその間で結合するβターン誘導骨格を含む部分的なペプチド擬似物であって、ここで上記部分的なペプチド擬似物が、少なくとも1の以下の活性：80μM未満のIC50レベルでin vitroにおける内皮細胞増殖を阻害する活性；コラーゲン・ゲルに基づくアッセイにおける85％未満の出芽レベルでin vitroの血管新生を阻害する活性；又は投与期間の終わりで対照と比較して少なくとも25％でin vivoの腫瘍体積を減少する活性を有する、前記部分的なペプチド擬似物。
【請求項１３】
第一アミノ酸配列が、少なくとも1の以下：
配列SVQMKL(配列番号5)の6のアミノ酸；
配列IKLSVQMKL(配列番号6)の9のアミノ酸；
配列NIKLSVQMKL(配列番号7)の10のアミノ酸；又は
配列ANIKLSVQMKL(配列番号8)の11のアミノ酸
を有する、請求項12に記載の部分的なペプチド擬似物。
【請求項１４】
前記第二アミノ酸配列が、少なくとも1の以下：
配列IIVK(配列番号3)の4のアミノ酸；
配列IIVKLN(配列番号9)の6のアミノ酸；又は、
配列IIVKLND(配列番号2)の9のアミノ酸
を有する、請求項12に記載の部分的なペプチド擬似物。
【請求項１５】
以下：
ANIKLSVQMKL-[DBF]-IIVKLND；
NIKLSVQMKL-[DBF]-IIVKLND；
IKLSVQMKL-[DBF]-IIVKLND；
SVQMKL-[DBF]-IIVKLND；
QMKL-[DBF]-IIVKLND；
MKL-[DBF]-IIVKLND；
L-[DBF]-IIVKLND；
ANIKLSVQMKL-[DBF]-IIVKLN；
ANIKLSVQMKL-[DBF]-IIVK；
ANIKLSVQMKL-[DBF]-I；
SVQMKL-[DBF]-IIVKLN；
SVQMKL-[DBF]-IIVK；
SVQMKL-[DBF]-IIV；
SVQMKL-[DBF]-II；及び
SVQMKL-[DBF]-I； 
から成る群から選ばれる部分的なペプチド擬似物であって、ここで、DBFはジベンゾフランβターン擬似物である、前記部分的なペプチド擬似物。
【請求項１６】
細菌感染及び/又は内毒血症の阻害方法であって、上記方法が、細胞を、上記細菌感染を阻害するために、及び/又は上記内毒血症を中和するために効果的な量の組成物と接触させることを含み、ここで上記組成物が、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記接触ステップが、in vitroで起こる、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記接触ステップが、in vivoで起こる、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、細胞培養、組織、器官、又は生物体内に存在する、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項16に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞がヒト細胞である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記部分的なペプチド擬似物が、内毒素を中和するか、殺菌剤であるか、又は殺菌剤でありかつ内毒素を中和する、請求項16に記載の方法。
【請求項２３】
TNF-αの量を低減する方法であって、上記方法が、細胞を、TNF-αを低減するために効果的な量の組成物と接触させることを含み、ここで上記組成物が、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物を含む、前記方法。
【請求項２４】
前記接触ステップが、in vitroで起こる、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記接触ステップが、in vivoで起こる、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、細胞培養、組織、器官、又は生物体内に存在する、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項23に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
内皮細胞増殖の阻害方法であって、上記方法が、細胞を、内皮細胞の増殖を阻害するために効果的な量の組成物と接触させることを含み、ここで上記組成物が、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物を含む、前記方法。
【請求項３０】
前記接触ステップが、in vitroで起こる、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記接触ステップが、in vivoで起こる、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、細胞培養、組織、器官、又は生物体内に存在する、請求項29に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項29に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項29に記載の方法。
【請求項３５】
血管新生因子が引き起こす細胞間接着分子の発現の発現低下を阻害する方法であって、上記方法が、細胞を、血管新生因子が引き起こす細胞間接着分子の発現の発現低下を阻害するために効果的な量の組成物と接触させることを含み、ここで上記組成物が、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物を含む、前記方法。
【請求項３６】
前記接触ステップが、in vitroで起こる、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記接触ステップが、in vivoで起こる、請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が、細胞培養、組織、器官、又は生物体内に存在する、請求項35に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項35に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞がヒト細胞である、請求項35に記載の方法。
【請求項４１】
血管新生因子が引き起こす細胞間接着分子の発現を促進する方法であって、上記方法が、細胞を、血管新生因子が引き起こす細胞間接着分子の発現を促進するために効果的な量の組成物と接触させることを含み、ここで上記組成物が、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物を含む、前記方法。
【請求項４２】
前記接触ステップが、in vitroで起こる、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記接触ステップが、in vivoで起こる、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が、細胞培養、組織、器官、又は生物体内に存在する、請求項41に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項41に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞がヒト細胞である、請求項41に記載の方法。
【請求項４７】
血管新生の阻害方法であって、上記方法が、細胞を、血管新生を阻害するために効果的な量の組成物と接触させることを含み、ここで上記組成物が、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物を含む、前記方法。
【請求項４８】
前記接触ステップが、in vitroで起こる、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
前記接触ステップが、in vivoで起こる、請求項47に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が、細胞培養、組織、器官、又は生物体内に存在する、請求項47に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項47に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項47に記載の方法。
【請求項５３】
患者における腫瘍形成の阻害方法であって、上記方法が、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物を含む組成物の治療上効果的な量を、患者に対して投与することを含む、前記方法。
【請求項５４】
患者におけるアテローム性動脈硬化症の阻害方法であって、上記方法が、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物を含む組成物の治療上効果的な量を、患者に対して投与することを含む、前記方法。
【請求項５５】
患者における再狭窄の阻害方法であって、上記方法が、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物を含む組成物の治療上効果的な量を、患者に対して投与することを含む、前記方法。
【請求項５６】
患者における糖尿病性網膜症の阻害方法であって、上記方法が、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物を含む組成物の治療上効果的な量を、患者に対して投与することを含む、前記方法。
【請求項５７】
患者における血管新生緑内障の阻害方法であって、上記方法が、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物を含む組成物の治療上効果的な量を、患者に対して投与することを含む、前記方法。
【請求項５８】
患者におけるリュウマチ様関節症の阻害方法であって、上記方法が、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物を含む組成物の治療上効果的な量を、患者に対して投与することを含む、前記方法。
【請求項５９】
患者における子宮内膜症の阻害方法であって、上記方法が、請求項1に記載の部分的なペプチド擬似物を含む組成物の治療上効果的な量を、患者に対して投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
血管新生、つまり血管形成の過程は、通常の組織の発達に対し、並びに様々な病理学疾患、例えばガン、関節炎、糖尿病性網膜症及び再狭窄に対しカギとなる(A.W. Griffioen et al., Biochem. J., 354,233-242(2001)。設計されたサイトカイン様のβシート形成ペプチド33mer、配列ANIKLSVQMKLFKRHLKWKIIVKLNDGRELSLD(配列番号1)を有するβpep-25は、抗-血管新生化合物であり、これらの病理学疾患と戦うために開発された(K.H. Mayo et al., Angiogenesis, 4, 45-51(2001);及びS. Liekens et al., J.Biochem.Pharm., 61, 253-270(2001)。
【０００２】
特に、抗-腫瘍研究(例えば、M.S. O'reilly et al., Cell, 88, 277-285(1997);及び T. Boehm et al., Nature, 390, 404-407(1997))において、血管新生を阻止できる薬剤の使用は、近い将来において抗-血管新生治療が、有望な治療様式になるということを示した。今日までに、血管新生阻害剤の捜索は、血管新生を促進する2つの過程：内皮細胞(EC)の成長と接着を制御することに焦点が当てられてきた(G. Molema et al., Immunol. Today, 19, 392-394(1998);及びJ. Folkman et al., Nature Med., 1,27-31(1995)。ECが他の細胞に比べて血液を通して由来する薬剤に到達されやすいこと、並びに、ECが遺伝的に安定でありかつ薬剤耐性変異体へと容易に突然変異しないことから、最初は、抗-腫瘍治療としてECを標的とすることは、魅力があった。
【０００３】
多くの抗-血管新生薬剤は、EC成長を阻害する内在性の分子、主にタンパク質を同定することにより発見された。この伝統的なアプローチは、多くの抗-血管新生薬、例えば血小板因子-4(PF4)、トロンボスポジン、腫瘍壊死因子-α(TNF-α、その濃度に依存して)、インターフェロン-γ誘導性タンパク質-10、アンジオスタチン、エンドスタチン、及びバソスタチン及び殺菌性-透過性上昇(BPI)タンパク質、を産生してきた。例えば、M.S. O'Reilly et al., Cell, 88, 277-285(1997); S.K. Gupta et al., J. Cell Biol., 127, 1121-1127(1994); S.S. Tolsma et al., J. Cell Biol., 122, 497-511(1993); N. Sato et al., Japan Natl. Cancer Inst., 76, 1113-1121(1986); V.J. Palombella et al., J. Biol. Chem., 264, 18128-18136(1989); B. Robaye et al., Am. J. Pathol., 138, 447-453(1991); A.D. Luster et al., J. Exp. Med., 182, 219-231(1995); M.S. O'Reilly et al., Cell, 79, 315-328(1994); S.E. Pike et al., J. Exp. Med., 188,2349-2356(1998);及び D.W.J. Van der Schaft et al., Blood, 96, 176-181(2000)参照のこと。約40の抗-血管新生薬剤が、現在知られている。
【０００４】
多くの抗-血管新生タンパク質は、組成上は類似であり、比較的高頻度の疎水性かつ正に荷電した残基を有し、そして、主にβ-シートとして折りたたまれる(A.R. Mire Sluis et al., J. Immunol. Methods, 200, 1-16(1997)): インターロイキン-1(IL-1),腫瘍壊死因子(TNF),リンフォトキシン(LT又はTNF-β)、癌化促進因子(TGF-β)、エンドスタチン。例えば、J.P. Priestle te al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9667-9671(1989); E.Y. Jones et al., Nature, 338, 225-228(1989); M.J. Eck et al., J. Biol. Chem., 267, 2119-2122(1992); S. Daopsin et al., Science, 257, 369-373(1992); 及び E. Hohenester et al, EMBO J., 17, 1656-1664(1998)参照のこと。
【０００５】
最近、設計された両親媒性βシート-形成ペプチド33merであるβpep-25は、EC成長及び血管新生の強力な阻害剤であることが示された。βpep-25は、PF4及び他のよく知られた血管新生阻害剤、例えばアンジオスタチン、エンドスタチン、AGM-1470、及びトロンボスポンジン-1に比べ、より効果的にEC成長を阻害する。βpep-25は、血管新生を活性化されたECの接着及び移動を特異的にブロックすることによって作用すると信じられて、アポトーシス及び究極的にはin vitro及びin vivoにおける血管新生の阻害を導き、そして様々なモデルにおいて、腫瘍成長を80％まで阻害する。例えばD.W.J. Van der Schaft et al., Faseb J., 16, 1991-1993(2002); 及び R.P.Dings et al., Cancer Res., 63, 382-385(2003)を参照のこと。
【０００６】
より小さい化合物をうまく設計するため、特異的アミノ酸残基の同定及びその空間的関係が使われる。構造生物学者及び医薬品化学者のあいだにおける、主な目標の一つは、低分子かつ潜在的により効果のある抗-腫瘍薬剤を開発することである。抗-血管新生タンパク質にとって、そういった構造-活性関係(SAR)、つまり、活性を与える特定の残基及びコンフォメーションは、強く必要とされているにもかかわらず、多くの抗-血管新生タンパク質、例えばエンドスタチン、PF4、及びBPIの高分解能の分子構造を解析することは、この情報をまだ提供していない。例えば、E. Hohenester et al., EMBO J., 17, 1656-1664(1998); K.H. Mayo et al., Biochemistry, 34, 11399-11409(1995)及び L.J. Beamer et al., Science, 276, 1861-1864(1997)参照のこと。
【発明の開示】
【０００７】
要約
知られている血管新生阻害剤の構造から、多くの抗-血管新生タンパク質は、組成上類似であるというように思える。血管新生阻害剤は、比較的高頻度の疎水性かつ正に荷電した残基を示し、そしてβシートを示す。βpep-25は、両親媒性βシートを形成するペプチド33merとして、このカテゴリーに分類される。βシート高次構造は、33merのβpep-25の生理活性に必要であると信じられる。本発明は、活性の原因となる特定の残基及び高次構造を同定することに向けられて、βpep-25の部分的なペプチド擬似物のデザインを導く。
【０００８】
本明細書中に使われるとき、ペプチド擬似物は、ペプチドを真似する化合物である。形容詞「部分的な」の使用は、ペプチド擬似物が完全な真似ではないことを指す。なぜなら、ペプチド擬似物は、いくつかのペプチド区分、つまりアミノ酸を配列中に含むからである。
【０００９】
本発明は、部分的なペプチド擬似物及びβpep-25配列の断片(つまり成分)を含むそういった化合物の使用方法に関し、そのβpep-25は、ANIKLSVQMKLFKRHLKWKIIVKLNDGRELSLD(配列番号1)、又はこのホモログである。
【００１０】
特に、本発明の部分的なペプチド擬似物は、ANIKLSVQMKL(配列番号8)又はそのホモログ、及びIIVKLND(配列番号2)又はそのホモログ配列の全て又は断片を含むように設計され、それらの間に結合(例えば共有結合)するβ-ターン誘導骨格を有する。それらの配列(配列番号8及び配列番号2又はそれらのホモログ)の断片は、1以上のアミノ酸を含む。配列番号8及び配列暗号2並びにそれらのホモログの断片及び全長配列は、部分的なペプチド擬似物に、少なくとも1の以下の活性：in vitroで、コラーゲンゲルに基づくアッセイにおいて発芽する血管新生を、少なくとも85％未満のレベルで阻害する活性；又は、in vivoにおいて、投与期間の終わりにおいて、コントロールと比較して、少なくとも25％で腫瘍体積を減少する活性、を与える。
【００１１】
ある態様では、配列番号8又はそのホモログの断片は、配列番号8又はそのホモログ(好ましくは、近接したアミノ酸)の少なくとも3のアミノ酸、及びより好ましくは、配列番号8又はそのホモログ(好ましくは近接したアミノ酸)の少なくとも6のアミノ酸を含む。ある態様では、配列番号8又はそのホモログの断片は、N末端で、好ましくは1,2,3,4,5,6,7,又は8の残基に、より好ましくは1,2,3,4,又は5の残基に欠失がおこるところの配列を含む。本発明の断片的なペプチド擬似物を作る際に使われうる配列番号8の断片例は、MKL、QMKL(配列番号4)、SVQMKL(配列番号5)、IKLSVQMKL(配列番号6)、及びNIKLSVQMKL(配列番号7)を含む。特に、好ましいそういった断片は、例えば、SVQMKL(配列番号5)、IKLSVQMKL(配列番号6)、及びNIKLSVQMKL(配列番号7)を含む。
【００１２】
ある態様では、配列番号2又はそのホモログの断片は、配列番号2又はそのホモログの少なくとも1のアミノ酸、並びに好ましくは、配列番号2又はそのホモログの少なくとも4のアミノ酸(好ましくは、近接したアミノ酸)を含む。ある好ましい態様では、配列番号2又はそのホモログの断片は、C末端において、1,2,3,4,5,又は6の残基に欠失が起こるところの配列を含む。本発明の部分的なペプチド擬似物を形成する際に使われうる特に好ましい配列番号2の断片は、I、IIVK(配列番号3)、及びIIVKLN(配列番号9)を含む。
【００１３】
βターン誘導骨格は、化学骨格、例えばジベンゾフランを含む骨格でありうる。
【００１４】
本発明の特に好ましい部分的なペプチド擬似物は、その間に結合しβターン誘導骨格、例えば化学骨格、例えばジベンゾフランを含む骨格を有する少なくとも4のアミノ酸配列QMKL(配列番号4)と組み合わせた、少なくとも7のアミノ酸IIVKLND(配列番号2)を含む。別の好ましい部分的なペプチド擬似物は、その間に結合しβターン誘導骨格を有する少なくとも配列番号2及び少なくとも6のアミノ酸SVQMKL(配列番号5)を含む。別の好ましい部分的なペプチド擬似物は、その間に結合しβターン誘導骨格を有する少なくとも配列番号2及び少なくとも9のアミノ酸IKLSVQMKL(配列番号6)を含む。別の好ましい部分的なペプチド擬似物は、その間に結合しβターン誘導骨格を有する少なくとも配列番号2及び少なくとも11のアミノ酸ANIKLSVQMKL(配列番号8)を含む。
【００１５】
別の好ましい部分的なペプチド擬似物は、その間に結合しβターン誘導骨格を有する少なくともANIKLSVQMKL(配列番号8)及び少なくともアミノ酸Iを含む。別の好ましい部分的なペプチド擬似物は、その間に結合しβターン誘導骨格を有する少なくとも配列番号8及び少なくとも4のアミノ酸IIVK(配列番号3)を含む。別の好ましい部分的なペプチド擬似物は、その間に結合しβターン誘導骨格を有する少なくとも配列番号8及び少なくとも6のアミノ酸IIVKLN(配列番号9)を有する。
【００１６】
別の好ましい部分的なペプチド擬似物は、その間に結合しβターン誘導骨格を有する少なくともSVQMKL(配列番号5)及び少なくともアミノ酸Iを含む。別の好ましい部分的なペプチド擬似物は、その間に結合しβターン誘導骨格を有する少なくとも配列番号5及び少なくとも6のアミノ酸IIVKLN(配列番号9)を含む。
【００１７】
本発明は、本明細書中で開示される少なくとも1の部分的なペプチド擬似物の使用方法にも関する。好ましくは、本方法は、in vivoの様々な症状の治療目的であるが、in vitroの方法も望ましい。典型的には、そういった方法は、少なくとも1の部分的なペプチド擬似物及び場合により担体、好ましくは、医薬として許容される担体を含む組成物の使用を含む。
【００１８】
そういった方法は、例えば、細菌感染又は内毒素ショックの治療を含む。ある態様では、部分的なペプチド擬似物は、内毒素を中和し、別の態様では、部分的なペプチド擬似物は殺菌性であり、及び別の態様では、部分的なペプチド擬似物は、殺菌性であり、かつ内毒素を中和する。そういった部分的なペプチド擬似物は、細胞培養において、細菌感染又は内毒素ショックを阻止するために使われうる。
【００１９】
本発明は、TNF-αレベルの阻害方法に関し、内皮細胞の増殖を阻害し、細胞接着分子(ICAM)の発現を促進し、細胞接着分子(ICAM)発現の発現低下を阻害し、腫瘍形成を阻害し、そして血管新生を阻害する。そういった方法は、in vivo(例えば哺乳動物を治療するため)又はin vitro(たとえば細胞培養において)行われうる。同様に、そういった部分的なペプチド擬似物は、病理学的障害、例えばアテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病性網膜症、新生血管緑内障、リュウマチ様関節炎、及び子宮内膜症を阻止するために使われうる。
【００２０】
本明細書中で使われるとき、「1の」、「1の」、「その」、「少なくとも1の」及び「一以上の」は、互換的に使われる。
【００２１】
「アミノ酸」は、一般式：NH2---CRH---COOHを有する化学的化合物を指すために本明細書中で使われ、ここで側鎖RはH又は有機性基である。Rが有機性である場合、Rは変わりうるし、及び極性又は非極性である(つまり疎水性)。本発明のアミノ酸は、天然又は合成(非タンパク質構成アミノ酸のことを指すことが多い)でありうる。本明細書中で使われるとき、有機性基は、脂肪性基、環状基、または脂肪性基および環状基の組み合わせとして分類される炭化水素基である。「脂肪性基」という用語は、飽和または不飽和の直鎖又は分枝状の炭化水素基を意味する。「脂肪性基」という用語は、例えば、アルキル、アルケニル、及びアルキニル基を含むために使われる。「環状基」という用語は、脂環式の基、芳香環の基、又は複素環式の基として分類される閉環炭化水素基を意味する。「脂環式の基」という用語は、脂肪性の基と似ている性質を有する環状炭化水素基のことを意味する。「芳香族の基」という用語は、単環式又は多環式の芳香族炭化水素基のことを指す。本明細書中で使われるとき、有機性基は、置換型又は非置換型でありうる。本明細書中で、天然アミノ酸を指摘するために、1文字表記又は3文字表記が使われる。そういった命名は、R又はArgがアルギニン、K又はLysがリジン、G又はGlyがグリシン、及びXが決定されていないアミノ酸、並びにそのようなものを含み、当業者によく知られている。
【００２２】
「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、本明細書中で使われるとき、互換性をもって使われ、そして2以上のアミノ酸を含む化合物のことを指す。これらの用語は、アミノ酸の特定の長さを指さない(例えば、本明細書中で、「アミノ酸配列」は、1のアミノ酸を含みうる)。
【００２３】
「部分的なペプチド擬似物」という用語は、本明細書中で使われるとき、ペプチドを真似る化合物のことを指し、いくつかのペプチド断片、つまりアミノ酸を配列中に含む。時折、それらの化合物は、単純に「ペプチド」又は「ポリペプチド」のことを指す。
【００２４】
【表１】
2005536453.tif 000002
【００２５】
本明細書中で使われる別の略語は以下：DBF、ジベンゾフラン；EC、内皮細胞；EAM、内皮接着分子；HUVEC、ヒト臍帯静脈EC；PBS、リン酸緩衝溶液；HPLC、高速液体クロマトグラフィー；bFGF、塩基性線維芽細胞成長因子；VEGF、血管内皮増殖因子；PF4、血小板因子-4；BPI、殺菌性-膜透過性亢進タンパク質；NMR、核磁気共鳴；GC-LRMS、ガスクロマトグラフィー-液体クロマトグラフィー質量分析；IR、赤外線分光法；SPPS、固相ペプチド合成；BOP/HOBT、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウム・ヘキサフルオロフォスフェート/1-ヒドロキシベンゾトリアゾール；DPC、ドデシルホスホコリン、を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の実例的な態様の詳細な記述
本発明は、部分的なペプチド擬似物及びそういった部分的なペプチド擬似物の使用方法を提供する。これらの部分的なペプチド擬似物は、βpep-25配列の断片を含み、βpep-25配列は、ANIKLSVQMKLFKRHLKWKIIVKLNDGRELSLD(配列番号1)又はそのホモログである。これらの部分的なペプチド擬似物は、好ましくは少なくとも7のアミノ酸残基を含む。しかしながら、アミノ酸の数には上限は無いが、部分的なペプチド擬似物は小さく、そして慣用的な治療上の有機低分子の大きさに近いことが望ましい。
【００２７】
特に、本発明の部分的なペプチド擬似物は、ANIKLSVQMKL(配列番号8)又はそのホモログの配列の全て又は断片、及びIIVKLND(配列番号2)又はそのホモログを含み、その間に結合(例えば共有結合)しβターン誘導骨格を有するように設計される。これらの配列の断片(配列番号8及び配列番号2、又はそれらのホモログ)は、1以上のアミノ酸を含む。
【００２８】
配列番号8及び配列番号2の断片、並びに断片及び全長配列のホモログは、好ましくは、以下の活性：実施例の部分で記述されるアッセイを用いて決定したとき、in vitroにおいて内皮細胞の増殖を、80μM未満(より好ましくは50μM未満、及びさらに好ましくは25μM未満)のIC50のレベルで阻害する活性；実施例の部分で記述されるコラーゲンゲルに基づくアッセイを用いて決定されるとき、in vitroにおいて85％未満の出芽(より好ましくは75％未満の出芽、さらに好ましくは50％未満の出芽、及びさらに好ましくは35％未満の出芽)レベルで血管新生を阻害する活性；又は、実施例の部分で記述される動物モデルに関するアッセイを用いて決定したとき、in vivoにおける腫瘍体積を少なくとも25％(より好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは70％)で減少する活性、を部分的なペプチド擬似物に提供する。これらの値は、当業者によって決定され、典型的には平均値である。
【００２９】
ある態様では、配列番号8又はそのホモログの断片は、配列番号8又はそのホモログの少なくとも3のアミノ酸(好ましくは連続のアミノ酸)を含み、より好ましくは、配列番号8又はそのホモログの少なくとも6のアミノ酸(好ましくは、連続のアミノ酸)を含む。ある態様では、配列番号8の断片又はそのホモログは、好ましくは1,2,3,4,5,6,7,又は8の残基、より好ましくは1,2,3,4,又は5の残基及びさらに好ましくは5の残基にN-末端で欠失がされるところの配列を含む。本発明の部分的なペプチド擬似物を形成する際に使われうる配列番号8の断片の例は、MKL、QMKL(配列番号4)、SVQMKL(配列番号5)、IKLSVQMKL(配列番号6)、及びNIKLSVQMKL(配列番号7)を含む。特に、好ましいそういった断片は、例えばSVQMKL(配列番号5)、IKLSVQMKL(配列番号6)、及びNIKLSVQMKL(配列番号7)を含む。
【００３０】
ある態様では、配列番号2又はそのホモログの断片は、配列番号2又はそのホモログの少なくとも1のアミノ酸を含み、そして、好ましくは配列番号2又はそのホモログの少なくとも4のアミノ酸(このマシックは連続アミノ酸)を含む。ある好ましい態様において、配列番号2の断片は、1,2,3,4,5,又は6残基に欠失がC末端でされる配列を含む。特に、本発明の部分的なペプチド擬似物を形成する際使われうる配列番号2の好ましい断片は、I,IIVK(配列番号3)、及びIIVKLN(配列番号9)を含む。
【００３１】
βターン誘導骨格は、化学的な骨格、例えばジベンゾフランを含む骨格又はビフェニルを含む骨格でありうる。好ましくは、ジベンゾフランを含む骨格である。より好ましくは、ジベンゾフランを含む骨格は、実施例(スキーム1)において示され、そして本明細書中で「DBF」として示される骨格である。骨格における及びペプチドに結合するフェニル環の炭化水素鎖の長さは、長さの点で変わりうるということを理解されるべきである。
【００３２】
そういった部分的なペプチド擬似物は、多くの生物学的活性に関して活性がある。このことは、本明細書中で示されるデータによって、βシートを引き起こすビフェニルフラン骨格及びβpep-25由来の2つの短いアミノ酸配列から構成される特異的な部分的ペプチド擬似物に関して、例証される。それらの部分的ペプチド擬似物は、in vitroにおいて内皮細胞の増殖及び血管新生を阻害する点において、βpep-25と同程度に効果的でありうる。例えば、マウスの卵巣ガンの異種移植片モデルにおいては、部分的な擬似物の2つの変異体は、βpep-25より腫瘍の体積を85％まで減らすことによって、かなり効果的であるということが観測される。抗腫瘍活性が、血管密度及び細胞増殖の有意な減少並びに細胞のアポトーシスの有意な増大により引き起こされるということを免疫組織化学的染色は示す。それ以上に、部分的なペプチド擬似物は、βpep-25の改良された生物利用度、及び血管新生阻害タンパク質の経口活性低分子を獲得するための可能性を示す。この抗血管新生の振る舞いから、病理的疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病性網膜症、新生血管緑内障、リュウマチ様関節炎、及び子宮内膜症を阻害するために使われうるということが、信じられた。病理的疾患の阻害は、当業者が適切なin vitro及びin vivoのモデルを用いることにより、容易に評価されうる。
【００３３】
特に、好ましい部分的なペプチド擬似物は、6DBF1、6DBF7、及び11DBF7を含み、この中で、さらにより好ましいのは6DBF7及び11DBF7である。これらのDBFアナログ(部分的なペプチド擬似物である)は、表1に示される。
【００３４】
そういった部分的なペプチド擬似物は、遊離酸の形態でありうるし、C末端のカルボキシル基でアミド化されうる。本発明は、本明細書中に掲載したペプチド配列のホモログを含み、このホモログは、典型的にそういったペプチドと構造的な類似性を有する。ポリペプチドの「ホモログ」は、1以上の保存されたアミノ酸置換を含み、このアミノ酸置換は、アミノ酸が属するクラスの別のメンバーから選ばれる。例えば、特定のサイズ又は性質(例えば、電荷、疎水性、及び親水性)を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸は、通常ポリペプチドの構造を実質的に変えることなく、別のアミノ酸へと置換されうるということは、タンパク質生物化学の技術分野においてよく知られている。
【００３５】
本発明の目的のために、保存的なアミノ酸置換は、以下の残基のクラス：クラス1：Ala、Gly、Ser、Thr、及びPro(小さい脂肪族の側鎖及び水酸基の側鎖を示す)；クラス2：Cys、Ser、Thr、及びTyr(-OH、又は-SHを含む側鎖を示す)；クラス3：Glu、Asp、Asn、及びGln(カルボキシル機を含む側鎖を示す)；クラス4(His、Arg、及びLys(塩基性側鎖を示す)；及びクラス5：Ile、Val、Leu、Phe、Met、Phe、Trp、Tyr、及びHis(疎水性側鎖を示す)の1のうちからアミノ酸を交換することに起因するために定義される。クラスは、関連するアミノ酸、例えば3Hyp及び4Hypをクラス1に；ホモシステインをクラス2に；2-アミノアジピン酸、2-アミノピメリン酸、γ-カルボキシグルタミン酸、β-カルボキシアスパラギン酸、及び対応するアミノ酸アミドをクラス3に；オルニチン、ホモアルギニン、N-メチル・リジン、ジメチル・リジン、トリメチル・リジン、2,3-ジアミノプロピオン酸、2,4-ジアミノブチル酸、ホモアルギニン、サルコシン、及びヒドロキシリジンをクラス4に；置換されたフェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、2-アミノオクタン酸、2-アミノヘプタン酸、スタチン、及びβ-バリンをクラス5に；及び、ナフチルアラニン、置換されたフェニルアラニン、テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、及びハロゲン化チロシンをクラス5に含む。
【００３６】
ポリペプチドホモログ、この用語は本明細書中で使われるとき、修飾されたポリペプチドも含む。本発明のポリペプチドの修飾は、1以上のアミノ酸構成成分において、化学及び/又は酵素的誘導体化を含み、このアミノ酸は、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、及び炭水化物又は脂質部分、コファクター、及びそのようなものの結合を含む側鎖修飾、基幹修飾、並びにN-及びC-末端修飾を含む。
【００３７】
そういったホモログは、本明細書中に記載される1以上の生物学的活性有する部分的なペプチド擬似物を提供する。
【００３８】
部分的なペプチド擬似物、特に本発明の部分的なペプチド擬似物のペプチド部分は、t-ブチルオキシカルボニル(BOC)又は9-フルオレニルメトキシ-カルボニル(FMOC)保護基に基づく基本方法を用いる固相方法によって合成されうる。この方法論は、G.B.Fields et al., によりSynthetic Peptides: A User's Guide, W.M. Freeman & Company, New York, NY,pp. 77-183 (1992)において記述される。
【００３９】
好ましい部分的なペプチド擬似物は、本明細書中に記述される少なくとも1の生物学的活性を有することによって特徴付けられる。ポリペプチドの生物学的活性は、例えば、本明細書中で記述されるとき、当該技術分野の当業者によく知られた方法によって記述されうる。
【００４０】
本発明の1以上の部分的なペプチド擬似物を含む組成物で付加的な担体(例えば、医薬として許容される担体)を有する組成物は、培養している細胞へと加えられ、又は患者、例えば哺乳動物を治療するために使われうる。部分的なペプチド擬似物が、患者を治療するために使われる場合、部分的なペプチド擬似物は、好ましくは、安定性を増すために医薬として許容される担体、例えばより巨大な分子と混ぜらるか、又は担体として役に立つ医薬として許容される緩衝液と混ぜられる。
【００４１】
治療は、予防的でありうるし、又は治療的でありうる。このように、治療は、症状(例えば細菌感染又は内毒血症)の発達前、中、後において、始められうる。それゆえ、症状、例えば細菌感染及び/又は内毒血症の「阻害」又は「阻害するのに効果的な」という用語は、予防的及び治療的な治療(つまり、予防及び/又は症状の回復)を含む。
【００４２】
本発明の部分的なペプチド擬似物は、単独で又は医薬として許容される緩衝液中で、別のタンパク質、例えば免疫賦活性のタンパク質と関連するか、又はタンパク質担体、例えば非限定的に鍵穴カサガイヘモシアニン(KLH)、ウシ胎児血清(BSA)、卵白アルブミン、又はそのようなものと関連した抗原として投与されうる。
【００４３】
部分的なペプチド擬似物は、基本的な方法、例えば異なる2の機能性のスルフォスシイミドイル・4-(n-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート薬剤で担体分子を活性化することを用いて、別のタンパク質と結合しうる。活性化された担体をペプチドへとクロスリンクすることは、担体のマレイミド基を、システイン残基を含むペプチド基のスルフィドリル基と反応させることにより起こりうる。複合体は、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー又は別の当該技術分野で知られる方法により、非複合体から分けられうる。
【００４４】
部分的なペプチド擬似物は、患者へ運搬するために様々な生理的に受け入れられる担体と混ぜられ、この担体は当業者に知られる様々な希釈液又は賦形剤を含みうる。例えば、非経口投与では、等張の生理食塩水が好ましい。局所的な投与では、担体、例えばジメチルスルフォキシド(DMSO)又は、局所的クリームにおいて典型的に見られる別の薬剤であって、ペプチドの活性をブロック又は阻害しない薬剤を含むクリームが使われうる。別の適切な担体は、非限定的にアルコール、リン酸緩衝生理食塩水、及び別の平衡塩類溶液を含む。
【００４５】
生物学的活性を示す本発明の部分的なペプチド擬似物は、ヒト、マウス、ウサギを含む様々な哺乳動物に静脈内、局所的、経口、及び筋肉内、の投与を含む様々な方法において投与されうる。部分的なペプチド擬似物は、単位投与量として又は複数の投与量で投与されうる。好ましくは、投与量は、本明細書中に記述される基本的な方法によって決定されるとおりの効果的な量であり、約1μg〜約1000μgの前処置、より好ましくは約50〜約250μgの前処置を含む。臨床試験の当業者は、基本的な試験研究をとおして、特定の部分的なペプチド擬似物投与量を最適化することができるだろう。
【００４６】
好ましい部分的なペプチド擬似物は、抗-血管新生性である。血管新生は、通常過程、例えば胚形成及び創傷治癒から、異常過程、例えば腫瘍成長、関節炎、再狭窄、アテローム性動脈硬化、糖尿病性網膜症、新生血管緑内障、及び子宮内膜症まで、体における多数の生物学的機能に決定的である。in vitro及びin vivoにおいて、特に抗腫瘍研究において、血管新生を阻害できる薬剤の使用は、抗血管新生治療が、未来において治療の様式を約束するだろうということを指し示す。血管新生の阻害剤の探索は、血管新生を促進する2つの過程：主に内皮細胞(EC)の成長及び接着を制御することに着目した。なぜなら、ECsは、他の細胞と比較して、血液を通して運ばれる医薬薬剤を利用しやすく、そしてECsは、遺伝的に安定であり、簡単に薬剤耐性変異体へと突然変異しないからである。多くの抗-血管新生薬剤は、ECの成長を阻害する内在性の分子、特にタンパク質を同定することにより発見されてきた。この伝統的な試みは、多くの抗-血管新生物質、例えば血小板因子-4(PF4)、トロンボスポンジン、腫瘍壊死因子(TNF)、インターフェロンγ誘導性タンパク質-10、アンギオスタチン、エンドスタチン、バソスタチン、及び殺菌性-膜透過性亢進(BPI)タンパク質を産生した。全体では、様々な試みを用いて同定された、約40の抗-血管新生薬剤が現在知られている。
【００４７】
腫瘍成長は、血管新生を欠乏させることにより制御されうるということが仮説されてきている(Folkman J. Natl. Cancer. Inst., 82, 4-6(1990); Folkman et al., J. Biol. Chem., 267, 10931-10934(1992))。多くの内在性血管新生阻害剤、例えば血小板因子-4(PF4)、インターフェロン-γ誘導性タンパク質-10(IP-10)、トロンボスポジン-1(TSP-1)、アンギオスタチン、並びに合成薬剤、例えばサリドマイド、TNP-470、及びメタロプロテイナーゼ阻害剤が、記述されてきた。それらの薬剤のいくつかは、現在フェーズ1/2の臨床試験において試験されている。Griffioen et al., Blood, 88, 667-673 (1996),及び Griffioen et al., Cancer Res., 56, 1111-1117 (1996)に記述される以前の研究は、腫瘍における血管新生誘導因子は、腫瘍の脈管構造における内皮細胞上の接着分子の発現低下を引き起こし、そして炎症性シグナル、例えば腫瘍壊死因子α(TNF-α)、インターロイキン-1、及びインターフェロン-γに対する免疫反応不顕性を引き起こすことを示した。血管内皮増殖因子(VEGF)(Griffioen et al., Blood, 88, 667-673 (1996))及び塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)(Griffioen et al., Blood, 88, 667-673 (1996))は、細胞間接着分子-1(ICAM-1)の発現増加、並びに血管細胞接着分子(VCAM-1)及びE-セレクチンの導入を重度に妨害する。腫瘍誘導性EC免疫反応不顕性と名づけられたこの現象は、血管新生性の表現形を有する腫瘍が、細胞障害性リンパ球による浸潤を逃れうる方法の一つである。
【００４８】
血管新生に引き起こされる内皮接着分子(EAM)の発現低下が、免疫反応を避けることによって腫瘍成長を促進しうるので(Griffioen et al., Blood, 88, 667-673(1996); Kitayama et al., Cancer. Res., 54 4729- 4733(1994); 及び Piali et al., J. Exp. Med., 181, 811-816(1996)、血管新生を阻害することが、接着分子の発現低下及び炎症性シグナルに対する不反応性に打ち勝つことができると信じられている。この仮説を支持する際には、E-セレクチン発現増加と血管新生性の薬剤AGM-1470との関係が、報告された(Budson et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 225, 141-145(1996))。PF-4による血管新生の阻害が、bFGF刺激されたEC上でICAM-1の発現増加をするということが示された。付け加えて、PF4による血管新生の阻害は、血管新生に関するECの炎症性シグナルに対する免疫反応不顕性に打ち勝つ。
【００４９】
このように、本発明は、患者(例えば、哺乳動物、例えばヒト)における内皮細胞の増殖を阻害する方法を提供する。このことは、内皮細胞の成長を阻害するために効果的な量の組成物(典型的には、医薬組成物)を患者に対し投与することを含み、ここで、組成物は、本明細書中に記述される1以上の部分的なペプチド擬似物を含む。類似して、本発明は、in vitro(例えば、細胞培養において)における内皮細胞の増殖を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞を、内皮細胞の成長を防ぎ及び/又は低減するために効果的な量の組成物と接触させることを含み、ここで組成物は、1以上の本発明に記述される部分的なペプチド擬似物を含む。
【００５０】
in vivoにおける内皮細胞の量を決定するために、当業者に知られている様々な方法が使われうる。例えば、腫瘍において内皮細胞の成長評価するために、組織切片は、血管密度を定量するために適切に染色されうる。in vitroにおいて内皮細胞の増殖の量を決定するため、EC増殖アッセイが使われ、このアッセイは、細胞培養において細胞によるトリチウム標識されたチミジンの取り込みを含む。内皮細胞増殖の阻害に対し「活性」である部分的なペプチド擬似物は、好ましくは10-4M未満の濃度で内皮細胞の増殖の少なくとも10％の減少を引き起こす物質である。代わりに、in vitroにおける「活性」のある部分的なペプチド擬似物による内皮細胞の増殖の阻害は、実施例において記述されるアッセイを用いて記述されるとき、80μM未満のIC50レベル(より好ましくは、50μM未満、さらに好ましくは25μM未満)である。
【００５１】
本発明はまた、患者における(例えば哺乳動物、例えばヒト)血管新生因子に引き起こされる細胞間接着分子(ICAM)の発現の発現低下(及び/又はICAM発現の促進)の阻害方法を提供する。本発明は、ICAM発現の発現低下の量を阻害するか及び/又は低減するために効果的な量の組成物を患者に投与することを含み、ここで、この組成物は、本発明中で記述される1以上の部分的なペプチド擬似物を含む。類似して、本発明は、in vitro(例えば細胞培養)における血管新生因子が引き起こす細胞間接着分子の発現の発現低下(及び/又はICAMの発現促進)を阻害するための方法を提供する。この方法は、細胞を、ICAM発現の発現低下の量を阻害し及び/又は低減するために効果的な量の組成物と接触させることを含み、ここで組成物は、本明細書に記載される1以上の部分的なペプチド擬似物を含む。
【００５２】
本発明は、患者(例えば、哺乳動物、例えばヒト)における血管新生(つまり新しい血管の形成)を阻害する方法を提供する。本発明は、血管新生を阻害し及び/又は低減するために効果的な量の組成物を患者に対し投与することを含み、ここで、この組成物は、本明細書中に記述される1以上の部分的なペプチド擬似物を含む。類似して、本発明は、in vitroにおける(例えば、細胞培養における)血管新生を阻害するための方法を提供する。この方法は、細胞の血管新生を阻害し及び/又は低減するために効果的な量の組成物と接触することを含み、ここで、組成物は、本明細書中に記載される1以上の部分的なペプチド擬似物を含む。
【００５３】
in vivoにおける血管新生の量を決定するために、当業者に知られる様々な方法が使われうる。例えば、腫瘍における血管新生の評価では、組織切片は、血管濃度を定量するために適切に染色されうる。in vitroにおける血管新生の量を決定するために、血管新生アッセイが使われ、このアッセイは細胞培養におけるECの発芽の消失を含む。血管新生の阻害に対して「活性」であるポリペプチドは、好ましくは、10-4Mより低い濃度で出芽する内皮細胞において、少なくとも10％の現象を引き起こすものである。代わりに、in vitroにおける部分的なペプチド擬似物の血管新生の阻害は、実施例において記述されるコラーゲンゲルに基づいたアッセイを用いて決定するとき、好ましくは少なくとも85％未満の出芽レベル(より好ましくは、75％未満の出芽であり、さらにより好ましくは50％未満の出芽であり、そしてさらに好ましくは、35％未満である)である。
【００５４】
同様に、そういった抗血管新生組成物は、病理学疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病性網膜症、新生血管緑内障、リュウマチ様関節炎、及び子宮内膜症を制御するために使われうる。この組成物は、当業者に知られる基本的な技術及びモデルを用いることで、示されうる。
【００５５】
本発明は、患者(たとえば、哺乳動物、例えばヒト)における腫瘍形成を阻害するための方法を提供する。本発明は、腫瘍の成長を阻害し及び/又は低減するために効果的な量の組成物を患者に対して投与することを含み、ここで、この組成物は、本明細書中に記載される1以上の部分的なペプチド擬似物を含む。腫瘍形成の阻害を決定する方法は、当業者によく知られており、腫瘍の減縮、残存を評価することを含む。
【００５６】
本発明は、患者(例えば哺乳動物、例えばヒト)における細菌感染及び/又は内毒血症を治療するための方法提供する。本発明は、細菌感染を阻害し及び/又は内毒血症を中和するために効果的な量の組成物を患者に対し投与することを含み、ここで、医薬組成物は、本明細書中に記述される1以上の部分的なペプチド擬似物を含む。類似して、本発明は、in vitroにおける(例えば、細胞培養における)細菌感染及び/又は内毒血症を阻害するための方法を提供する。この方法は、細胞を、細菌感染を阻害し及び/又は内毒血症を中和するために効果的な量の組成物と接触することを含み、ここで、組成物は、本明細書中に記述される1以上の部分的なペプチド擬似物を含む。
【００５７】
in vivo及びin vitroにおける方法の両者において、細菌感染を「阻害する」ことは、患者又は細胞サンプルにおいて、細菌の成長を阻害し並びに回復又は低減することを含む。内毒素を「中和する」ことは、LPSに結合し、それにより患者又は細胞サンプルのシステムから内毒素を取り除くことを含む。細菌感染のレベルは、知られている殺菌アッセイに従って決定されうる。内毒血症のレベルは、知られているLPS中和アッセイに従って決定されうる。これらのアッセイは、in vivo又はin vitroのどちらにおいて使われるにしろ、ポリペプチドの有効性を決定するために使われる。細菌感染を有する患者の治療の有効性を決定するために、血液サンプルが採られ、培養を成長させ、そして、生存している細菌の量が決定された。内毒血症を有する患者の治療の有効性を決定するため、血液サンプルが採られ、培養を成長させ、そしてサイトカイン(例えばTNF-α、IL-1)の量が、当業者に知られる方法を用いて決定されうる。例えば、WEHIアッセイは、TNF-α(Battafarano et al., Sugery 118, 318-324(1995))の検出のために使われうる。
【００５８】
本発明の部分的なペプチド擬似物の有効量は、治療される症状及び望まれる結果に依存するだろう。例えば、細菌感染の治療は、細菌感染、感染部位、及び部分的なペプチド擬似物に依存するだろう。細菌感染を治療するための部分的なペプチド擬似物の有効量は、動物中の細菌数を減じる量であるし、及び細菌感染に関連する兆候、例えば熱、痛み、及びその他の関連する細菌感染の兆候を減じる量である。ペプチドの有効量は、基本的な用量反応方法により決定されうる。
【００５９】
代わりに、細菌感染を治療するための部分的なペプチド擬似物の有効量は、動物システム、例えばマウスにおいて決定されうる。急性腹膜炎は、Dunn et al., (Surgery,98:283, 1985)；Cody et al., (Int. Surg. Res., 52:315, 1992) によって記述されるとおりに、細菌、例えばピー・アエルギノーサ(P. aeruginosa）を腹腔内投与することによって、マウス、例えば非近交系のスイス・ウェブスター・マウスにおいて引き起こされうる。殺菌剤活性は、様々な細菌、好ましくはグラム陰性細菌に対して評価されうるが、細菌のタイプは、ピー・アエルギノーサ(P. aeruginosa)及びピー・セパシア(P. cepacia)を含むシュードモナス spp(Psudomonas spp)、イー・コリ・ビー(E. Coli B)を含むイー・コリ(E. coli)種、サルモネラ、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)及びスタフィロコッカス種、例えばスタフィロコッカス アウレウスを含みうる。内毒素を中和する性質を有する部分的なペプチド擬似物は、内毒素ショックの兆候、例えば熱、ショック、及びTNF-αの放出を示すグラム陰性の細菌で全身感染された哺乳動物を治療するために使われうる。
【００６０】
内毒素中和活性は、ペプチドが完全に、アッセイ、例えばカブトガニ変形細胞ライセートアッセイ(LAL、Sigma Chemicals, St. Louis, MO)又は色素産生性LAL1000回試験(Biowhittacker Walkersville, MD)において、リポ多糖の活性を完全に阻害するモル濃度を決定することによって測定されうる。内毒素を中和する活性は、基本的な用量作用方法を用いて、阻害濃度50(LD50)を計算することにより計測されうる。阻害濃度50は、内毒素の活性の50％を阻害することができるペプチドの量である。
【００６１】
本発明はまた、患者(例えば、哺乳動物、例えばヒト)におけるTNF-αの量を阻害するための方法を提供する。本発明は、血清TNF-αレベルを評価することにより決定されるとき、患者のシステムにおけるTNF-αの量を阻害するために効果的な量の組成物を患者に対し投与することを含み、ここで、組成物は、本明細書中に記述される1以上の部分的なペプチド擬似物を含む。類似して、本発明は、in vitroにおける(例えば、細胞培養における)TNF-αの量を阻害するための方法を提供する。この方法は、細胞を、細胞培養においてTNF-αを低減するために効果的な量の組成物とインキュベーションする事を含み、ここで、組成物は、本明細書中に記述される1以上の部分的なペプチド擬似物を含む。in vivo及びin vitro両方の方法のため、細胞培養において又は患者の血清においてWEHIアッセイがTNF-αの検出のために使われうる(Batafarano et al., Surgery, 118,318-324(1995))。代わりに、サンプルにおけるTNF-αの量は、抗TNF-α抗体を用いることでアッセイされうる。TNF-αを減少するために「活性のある」部分的なペプチド擬似物は、in vitroの試験を用いることで評価されうるし、そしてTNF-αの量の少なくとも10％の減少を示す。
【００６２】
本発明は、さらに以下の詳細な実施例を参照することにより、さらに記述されるだろう。これらの実施例は、種々の特異的な及び好ましい態様及び技術をさらに例示するために提供される。しかしながら、本発明の範囲にとどまる限りにおいて、多くの変化及び修飾が行われうるということは理解されるべきである。
【実施例】
【００６３】
実験プロトコル
ペプチド合成
ペプチドは、フルオレニルメトキシカルボニル・化学を用いてMilligen/biosearch 9600ペプチド固相合成機を用いて合成される。凍結乾燥された未精製のペプチドは、C18カラムを有する調製用逆層HPLCにより、水中における0.1％トリフルオロ酢酸、0〜60％のアセトニトリルの溶出勾配で精製された。ペプチドの純度及び組成物は、アルゴン存在下で6規定(6N)のHClで110℃24時間ペプチドを処理することにより調製される加水分解産物のアミノ酸組成を、HPLC(Beckman Model 6300)分析により検証された。ペプチドのアミノ酸配列は、N-末端の配列決定及びマス・スペクトロメトリーにより確認された。
【００６４】
DBFアナログの合成
通常の固相ペプチド合成(SPPS)は、Milligen/Biiosearch 9600ペプチド合成機上で、フルオレニルメトキシ-カルボニル(Fmoc)方法論及びBOP/HOBTをカップリング試薬として用いることにより、行われた。Fmoc-DBF-CO2H(1)は、報告された方法(H.Bekeleet al., J. Org. Chem., 62, 2259-2262(1997))を少し修飾することにより行われた。この9段階の合成において、中間産物及び最終産物は、TLC及び1H NMR、GC-LRMS、13C NMR、融点(mp)、及びIRにより特徴付けられ、適切なものとして使われる。1〜I20(βpep-25配列の20番目残基のイソロイシン)並びにL11(βpep-25配列の11番目残基のロイシン)〜ペプチド-DBF-NH2は、合成機上で行われた。FMOC-K10-CO2H(ここで、K10は、βpep-25配列の10番目残基のリジンを指す)とペプチド-DBF-L11-NH2配列とのカップリングは難しく、より反応性の高いHATU試薬(L.A. Carpino, J. Am. Chem. Soc., 115, 4397-4398(1993))を用いる手動のSPPSを必要する。
【００６５】
表1に載せられたDBFアナログを産生するため使われる残存の化学カップリングは、ペプチド合成機上でBOP/HOBT条件を用いることで行われた。最終Fmoc脱保護の後、各DBFペプチド・アナログ(部分的なペプチド擬似物)は、同時に試薬Kを用いて全ての酸分解性のトリチル及びtert-ブチル側鎖保護基を同時に取り除かれて、レジンから放出される(D.S. king et al., Int. J. Pept. Protein. Res., 36, 255-266(1990)。リンクアミド又は同様のレジンは、C末端D24ユニットの主なアミド形態を提供するために使われた。凍結乾燥された未精製ペプチドは、Hewlett-Packard 1090システムを用いて、C18カラムを有する調製逆層HPLCによって精製された。水中における0〜60％アセトニトリルの溶出勾配(0.1％トリフルオロ酢酸)が使われた。ペプチドの純度および組成物は、分析用HPLC、Hewlett-PackardのG2025Aシステムを用いて及びシナピン酸をマトリックスとして用いたマトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI)マス・スペクトロメトリー、及び加水分解産物(6N HCl、110℃、24時間、アルゴン存在下)のアミノ酸組成の分析によって検証された。
【００６６】
NMR分光法
NMR計測のために、凍結乾燥されたDBFアナログは、水-DMSO-DPC混合物に溶解された。ペプチド濃度は、3mMであった。pHは、μl量のNaOD又はHClを、ペプチド・サンプルへと添加することによりpH5.7に調節された。NMRスペクトルは、Varian UNITY Plus-600NMR分光器で獲得された。
【００６７】
DIPSIを有する2D-ホモ核 TOCSY(M.Piotto et al., J. Biomol. NMR, 2, 661-665(1992))スピンロック(混合時間80ミリ秒(ms))は、スピンシステムを同定するために使われた。2D NOESY実験(G.Wider et al., J. Magn Reson., 56, 207-234(1985))は、配列的な割り当て及び高次構造分析のために行われた。WATERGATE(A.J. Shaka et al., J. Magn. Reson., 77, 274-293(1998); 及びS.P. Rucker et al., Mol. Phys., 68, 509-517(1989))は、水共鳴を低減するために使われた。全てのスペクトルは、256〜512t1実験として25℃で集められ、水共鳴上に置かれた単体を有する両方の次元において、６ｋHzのスペクトル幅にわたって2048の複合体データポイントをそれぞれ有した。16のスキャンは、t1実験ごとの平均された時間であった。データは、SGIワークステーション上のVNMR(Varian, Inc., Palo Alto)又はNMRPipe(F.Delaglio et al., J. Biomol. NMR, 6, 277-293(1995))を用いて直接スペクトロメーター上で加工された。
【００６８】
構造モデリング
NOE増殖曲線の分析は、バックボーンからバックボーンのプロトン間のNOEｓは通常約200msで最大であることを示した。プロトン間の距離の束縛は、100msの混合時間で獲得される1H NOSEYスペクトルにおいて割り当てられるNOEｓ由来であった。NOEｓは、距離の上限束縛、2.8、3.3、4.0、及び4.5Åそれぞれに対応する、強、中、弱、又はとても弱として分類された。非結合性プロトンの間における下限の束縛は、1.8Åにセットされた。偽原子の補正が、適切であるところの距離の上限束縛に加えられ、0.5Åの補正が、メチルプロトンを含むNOEｓに対する上限に加えられた。水素結合束縛が、ゆっくりしたアミド・プロトン-溶媒との交換の証拠を伴って、NH及びCaHプロトンを含む配列的及び鎖間のNOEｓのパターンから同定された。同定された各水素結合は、2つの距離束縛；ｒNH-0＝1.8〜2.5Å、及びｒN-O＝1.8〜2.5Åをもちいて決定された。
【００６９】
もたらされた核間の距離束縛は、X-PLOR(A.T. Brunger, X-plor Manual, Yale University Press, New Haven (1992))を用いて、6DBF7の構造を計算する際に使われた。分子は、Parallhdg.pro 力場を用いて作られた。テンプレートの配位セットは、テンプレートルーチンを用いて作られた。最初からの模擬アニール(SA)プロトコルは、次に使われた。SA手順は、高温の動態(3000K120ピコ秒(ps))で行われ、そして各ステップで1.5psの分子動態を有する50Kのステップにおいて、100Kまで冷やされた。パウエルの最小化が、100Kで1000ステップ行われた。構造の洗練は、1000Kで始まり100Kで終わる模擬アニールに基づいて行われた。最終構造は、0.5ÅのNOEｓ及び5°の二面角の違反閾値に関して、X-PLORアクセプトルーチンが行われた。角度、結合長、又は不適当は、それぞれ5°、0.05Å、及び5°以上の理想的な幾何学を逸脱してはならない。構造は、BIOSYM INSIGHT viewer(Molcular Simulations, Inc)を用いて、上書きされ、X-PLOR分析ルーチンを用いて分析された。
【００７０】
細胞、細胞培養、及び試薬
ヒト臍帯静脈由来のEC(HUVEC)は、0.125％トリプシン/EDTAで還流することにより、通常のヒト臍帯から回収された。回収されたHUVECsは、ゼラチンコートされた組織培養フラスコ内で培養され、そして週に一度培養液 (2mMグルタミン及び100U/mlペニシリン及び0.1mg/mlのストレプトマイシンを添加した、20％のヒト血清を有する、RPMI-1640)中に1:3で継代された。ウシ毛細血管EC(BCE)は、Dr.M.Furie(State University New York, Stony Brook, USA)により好意により提供され、フィブロネクチンコートされる組織培養フラスコにおいて、10％FCS、グルタミン、及び抗生物質を含むRPMI-1640メディウム内で培養された。
【００７１】
EC増殖速度の計測
ECの増殖は、[3H]-チミジン取り込みアッセイを用いて計測された。bFGFで刺激された(10ng/ml)ヒト臍帯静脈EC(HUVEC)培養の増殖は、3H-チミジン取り込みを定量することによって計測された。増殖は、3回の独立実験における4通りの培養の平均のカウント毎分(cpm)で表される(±SEM)。ECを平底組織培養プレート内に5000細胞/ウェルで撒き、培養液中に制御因子の非存在下又は存在下において、3日間成長させた。アッセイの最後の6時間において、細胞培養は、0.5μCi[メチル-3H]-チミジン/ウェルでパルス標識された。ヒト臍帯血由来EC(HUVEC)は、0.125％トリプシン/EDTAで還流することにより、通常ヒト臍帯から回収された。回収されたHUVECsは、ゼラチンコートされた組織培養フラスコ内で培養され、そして週に一度培養液 (2mMグルタミン及び100U/mlペニシリン及び0.1mg/mlのストレプトマイシンを添加した、20％のヒト血清を有するRPMI-1640)中に1:3で継代された。
【００７２】
in vitroの血管新生アッセイ
ウシEC(BCE)の出芽及び管形成は、D. Van der Scaft et al., Blood, 96, 176-181(2000)に記述されるとおりに、3-次元コラーゲンゲル(Vitrogen-100, Collagen Crop., Fremont, CA, USA)におけるBCEで、過成長されたcytodex-3ビーズを用いて、研究された。ゲル化に続き、βpep-25又はDBFアナログを有する又は有しない、20ng/ml bFGFを含む培養液は、ゲルの上部に注ぎ込んだ。37℃、24時間後の細胞培養において、撮影が行われた(示さず)。各ウェルにおける出芽量(つまり、出芽の全長)は、コンピュータープログラムNIHイメージにより定量された。出芽及び管形成における違いを定量するために、統計的分析は、マンホイットニーのUテストを用いて行われた。このデータを用いて、EC増殖及び管形成に関するIC50は、定量され、表1に記載される。
【００７３】
腫瘍モデル研究
全ての研究において、メスの胸腺欠損ヌードマウス(nu/nu、5〜6週齢)が用いられた。これらのマウスを国立ガン研究所から購入し、少なくとも1週間地域の状況に環境適応させた。動物は、水及び基本的な飼料を自由に与えられ、12時間の明/暗サイクルを継続された。全ての実験は、ミネソタ大学研究動物始原倫理委員会により承認された。マウスは、ランダム化され、そして3つの群へと分けられた。1)ヒト血清アルブミン(10mg/kg/日)、2)βpep-25(10mg/kg/日)、及び3)DBFアナログ(10mg/kg/日)である。化合物は、100mM SDSに希釈され、浸透圧ミニポンプ(Durect, Cupertino, CA)を用いて投与された。Ramakrishnan教授(R.P. Dings et al., Cancer Res., 63, 382-385(2003))により提供された指数関数的に増殖するMA148ヒト卵巣ガン細胞は、RPMI1640倍溶液(Life Techonologies, Grand Island,NY)において培養された。この培養液は、10％のウシ胎児血清及び1％のペニシリン/ストレプトマイシン(Cellgro, Mediatech, Washington, DC)を37℃、5％CO2存在下で添加された。100μlの腫瘍細胞懸濁液(2×107細胞/ml)は、次に、各マウスの右の脇腹に皮下注射された。28日の治療期間のあいだ化合物を皮下投与するため、ポンプは、マウスの左脇腹に移植された。
【００７４】
本モデルの2つの変種が用いられた：予防と介入である。予防の変種では、治療は、MA148細胞の接種時間に始められた。介入の変種では、腫瘍を治療が始まる前まで、平均サイズ50mm3(通常接種後7日)まで成長させた。どちらの変種でも、動物は、治療の開始前にランダム化された。治療は、マウスの左脇腹の皮下に移植された浸透圧性のミニポンプ(Durect、Cupertino、CA)を通して投与された。28日の治療期間が、一つのポンプの移植によってカバーされうるように、βpep-25又はDBFアナログの濃縮された溶液が処方された。各研究では、動物のコントロールの群は、PBSか又はヒト血清アルブミンを含むPBSのいずれかが投与された。腫瘍成長曲線は、これらのコントロールの場合と実質的に同一である。
【００７５】
腫瘍の体積は、キャピラリー(Scienceware, Pequannock, NJ)を用いて、腫瘍の直径を計測して、球状体に対する体積の式：(a2×b×π)/6により決定され、ここでaは幅、及びbは組織の長さであった。計測は、週につき2回又は3回行われた。実験の結論では、腫瘍重量は、安楽死させた動物から腫瘍を切除したのちに計測された。腫瘍重量は、このように計算された腫瘍体積とよく相関した。
【００７６】
免疫組織化学
免疫組織化学を毛細血管の密度及び全細胞のアポトーシスの程度を評価するために使った。腫瘍組織を組織凍結メディウム(Miles Inc, Elkart, IN)に封入し、そして液体窒素で急激に凍結した。10mmの厚さの組織切片を免疫組織化学分析に準備した。免疫組織化学分析のために、組織切片を、室温まで温度を上げ、一晩風乾し、そして次にアセトン中で10分間固定した。スライドを少なくとも30分間風乾させ、各5分づつリン酸緩衝食塩水(PBS、pH7.4)で3回洗浄した。次にサンプルを0.1％ウシ胎児血清、及び3％ヒト血清アルブミンで少なくとも30分間かけて、湿箱中室温でブロッキングした。毛細血管の密度を染色するために、サンプルを次にフィコエリチン(PE)が結合するCD31に対するモノクローナル抗体(PECAM-1)の1:50の希釈でインキュベーションした。室温での1時間のインキュベーション後、スライドをPBSで洗い、そして即座に、オリンパスBX-60経口顕微鏡の200倍の倍率を用いて写真をとった。
【００７７】
全細胞のアポトーシスの程度を評価するために、組織切片を、TUNEL(末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼによるdUTP-ニック-末端標識)アッセイを用いて、染色し、このTUNELアッセイは、製品説明書に従って行われた(in situ細胞死検出キット、フルオレセイン；TUNEL、Roche)。デジタル画像をAdebe Photoshop(Adbe Inc., Mountain View CA)を用いて保存され加工した。
【００７８】
毛細血管密度の定量、増殖割合及び全細胞アポトーシス割合の定量は、以前に記述されたとおりに決定された(R. Wild et al., Microvasc. Res, 59, 368-376 (2000)）。統計分析は、スチューデントのt検定を用いて行われた。
【００７９】
毒性アッセイ
全身毒性の間接的な計測として、マウスの体重をデジタル秤(Ohaus Florham, NJ)を用いて週に2回モニターした。血球用量及びクレアチン・レベルを決定するために、血液サンプルを治療が終わった1日後に、尻尾静脈出血により抽出し、血液は、ヘパリン処理されたマイクロ-血球容量キャピラリーチューブ(Fisher;Pittsburgh,PA)に集められた。血球容量レベルのため、サンプルをマイクロ血球用量遠心(Clay-Adams; NY)において10分間遠心し、血球容量は、国際微小キャピラリーリーダー(IEC；Needham, Mass)を用いて、決定された。クレアチン・レベルを獲得するために、キットをシグマ(Sigma Diagnostics; St Louis, MO)から購入し、及び製品説明書に従って使った。
【００８０】
結果と考察
詳細な構造-活性評価
本発明の部分的なペプチド擬似物の設計を入力するために、βpep-25に関する完全な構造活性分析が行われた。比較的小さいペプチドに関して実験を行うことは、アラニンスキャンニング及び、歩き回るバリアントを用いて、望ましい残基を徹底的に評価することを可能にした。
【００８１】
βpep-25配列を歩き回り、各ペプチドにおいて3残基シフトする、ドデカペプチドの歩き回るバリアントは、調製されかつ図1Aに記載される。EC増殖に関するそれらの効果は、図1AにIC50値で示される。歩き回るペプチドのうち３つだけが、βpep-25に比較して有意な抗増殖活性を示し、アラニンスキャンニングからの結果では、これらのペプチドは、β-ストランド１及び２を含む。これらの結果に基づいて、活性は、βストランド1及び2の中に局在するということが結論付けられる。位置を確かめるために、βストランドのβpep-25に対する配列比較を図1bに記述し、重要な配列を囲った。
【００８２】
EC増殖を阻害するβpep-25の活性が最も有意な減少を示した残基は、1番目の2つのβストランドにおける疎水性残基：I3、L5、V7,L11、及びI20(これらは、βpep-25における添え字によってしめされた位置の特定のアミノ酸残基のことを指す)である。立体構造的に、これらの疎水性残基は、両親媒性の抗-平行βシートの同じ表面上に横たわる。
【００８３】
これらの構造活性の関係を使うことで、一連の新しい分子は設計された。ここでは、βpep-25のβストランド3及びターン2は、省略され、そしてジベンゾフラン(DBF)βターン擬似物(H.Diaz et al., J. Am. Chem. Soc., 115, 3790-3791(1993); 及びK.Y. Tsang et al., J. Am. Chem. Soc., 116, 3988-4005(1994))は、ターン1の場所およびβストランド1(βpep-25又は配列番号1の残基1〜11)及びβストランド2(βpep-25又は配列番号1の残基20〜26)の残部で使われた。DBFのβターン擬似物は、βpep-25の生理活性のあるβシート立体構造を維持するために使われた。
【００８４】
βターンを引き起こす多くの骨格が知られている。Kelly et al.(H. Diaz et al., J. Am. Chem. Soc., 115, 3790-3791(1993);及びK.Y. Tsang et al., J. Am. Chem. Soc., 116, 3988-4005(1994))によって開発されたジベンゾフランの骨格は、Kellyのグループ及び別のグループによって、様々な長さのペプチドへと取り込まれたα、ω-アミノ酸である。注意すべきことに、タンパク質シラトキシン(scyllatoxin)(31mer)におけるβターンを引き起こす2つの天然アミノ酸を、DBF骨格に置換することは、その2次構造及び活性が元の毒素から区別できないアナログを提供する。Kellyは、DBFユニットが、親油性のアミノ酸残基のペアの間に挿入されるとき、「疎水性クラスター」が作られ、ここで、これらの残基の側鎖は、傾けられたDBFサブユニットの芳香環によって作られる疎水性ポケットの中に入れ込まれる。比較的小さなサイズのペプチドアナログが設計することの望みから、DBFは、βpep-25のI20残基とL11残基との間に挿入されうるので、DBFは最良の選択である。残基20における親油性イソロイシンは、βpep-25抗血管新生活性と関連する重要な疎水性残基の一つである。
【００８５】
KellyのDBFのFmoc-に保護されるバージョンは、下のスキーム1において示され、いくつかの微妙な改良が、合成(大胆な条件)においてなされる。
【００８６】
【表２】
2005536453.tif 000003
【００８７】
図1Cに記載される親DBFに基づく化合物は、11DBF7と呼ばれ、ここでDBFの左及び右における数字は、βpep-25由来のN末端における及びC末端におけるアミノ酸残基の数のことをそれぞれ指し、DBFのターンの擬似物は、βpep-25、配列番号1のアミノ酸残基12〜19を置換する。生理活性を必要とされる短い配列を同定することは、11DBF7のN末端及びC末端を欠失したバリアントの系列は、表1に記載されるように作られた。本出願が優先権を主張する仮出願では、バリアントのいくつかは、CF-1からCF-8として記された。さらに、本出願が優先権を主張する仮特許出願において、配列番号1の断片は、反対の順序(つまり、C末端からN末端)で書かれ、このことは、仮特許出願の脈絡を読む際に、当業者にとって明らかでありうる。例えば、CF-1は、DN25LKVII[DBF]Lとして書かれ、ここでN25は、そのアスパラギンがβpep-25又は配列番号1の残基25であることを示す。
【００８８】
【表３】
2005536453.tif 000004
【表４】
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【００８９】
βシート構造は、DBFアナログにおいては保存される。
NMR分光法は、βシート立体構造が、DBFアナログにおいて保存されるかどうかを調査するために使われた。等価なβストランドの長さを有するアナログ、11DBF7及び6DBF7は、この構造研究の焦点である。水溶性の制限のため、及び膜様の環境を真似する望みのため、これらの化合物は、ドデシルホスフォコリン(DPC)ミセルにおいて調査された。NMRの仕事に必要とされるミリモル濃度において、11DBF7は、スペクトル分析をあいまいなものとする重なり共鳴を与えた。6DBF7は、完全な構造分析を可能にする良好なNMRスペクトルを与えた。抗-平行βシート立体構造の診断のNOEs及び結合定数は、容易に特定され、そしてコンピューターによるモデリングに使われた。結果の28の構造を重ね合わせたものが、図2Aに示され、図2Bにおける単純化したこの折りたたみパターンの図が示され、この図2Bは、βシートの疎水性及び親水性残基の表面上の残基を目立たせる。この構造中で、6DBF7における2つの脂肪性の疎水性残基ロイシン及びイソロイシンは、DBF基のフェニル基に閉じ込められることに気づく。効果として、このことは、βシートの折りたたみを組み立て、そして安定化の手助けをする。6DBF7の構造情報に基づいて、別のDBFアナログが、例え、2つの差の長さに依存して様々な長さであったとしても、つまり同じ長さの鎖は、βシートをよりよく形成できると予期されたとしても、同様に折りたたまれることが結論されうる。
【００９０】
DBFアナログは、EC増殖を阻害し、そして抗−血管新生活性を保持する。
内皮細胞(EC)増殖アッセイにおいて、11DBF7、並びに多くの短いアナログは、EC成長の阻害において効果的であると示された。全てのxDBF7のアナログに対する用量反応曲線は、図3に例示され、そして全てのDBFアナログ(つまり、部分的なペプチド擬似物)に対するIC50値及び25μmにおけるEC成長の阻害％は、表1に与えられる。親βpep-25(IC50、3μM)と比較して、多くのDBFアナログは、わずかに活性が低い(IC50、約10μm)が、このアッセイにおいて比較的に良好に行う。このことは、部分的には、そのサイズの減少によって説明されうる。付け加えて、アナログのいくつかは、アラニンスキャンニングによって、機能的に重要であると同定される残基(例えばL5及びI3)を欠いている。それにもかかわらず、多くのそれらの短いアナログは、適度に活性を残し、そしてN−末端のヘキサペプチドSVQMKL(配列番号5)及びC末端テトラペプチドIIVK(配列番号3)は、抗血管新生活性を高めるように思える。
【００９１】
血管新生抑制能は、さらにin vitroのコラーゲンゲルに基づく出芽形成アッセイ(R.P. Dings et al., Cancer Res., 63, 382-385(2003))でさらに示された。コントロールが多くの出芽を示した一方で、βpep-25、11DBF7、及び6DBF7での処理は全て、高い低減された出芽を示した(データ未掲載)。全てのアナログに対する定量的な結果は、表1に与えられる。通常、βストランドにおけるアミノ酸残基の数を減少することは、増殖アッセイで比較できる出芽形成阻害の低減をもたらした。しかしながら、いくつかのアナログは活性があり、最も短いアナログの一つである6DBF7でさえ、管形成における有意な阻害効果を有した。その上、DBFアナログをもちいた阻害の動態は、βpep-25の動態と同じであった(データ未掲載)。
【００９２】
DBFアナログが、マウスにおける腫瘍成長を阻害する。
抗-血管新生薬剤の特定の使用が、腫瘍生物学の分野であるので、in vitroにおいて最も活性の高いDBFアナログのうちの2つ、11DBF7及び6DBF7のin vivoにおける有効性は、βpep-25をポジティブコントロールとして、以前R.P. Dings et al., Cancer Res., 63, 382-385(2003)に記述される胸腺欠損マウスにおけるMA148卵巣ガン細胞異種移植モデルにおいて評価された。このモデルをもちいた最初の実験は、DBFアナログの11DBF7を、腫瘍細胞系列を摂取したときに移植されたミニポンプをとおして皮下に投与した。この予防モデルは、11DBF7での腫瘍形成動物の治療が、腫瘍成長の阻害をもたらすということを示した(図4A)。驚くべきことに、11DBF7は、平均して、コントロール動物と比較して90％まで腫瘍体積を減少することで、βpep-25よりわずかに良好に機能した。
【００９３】
さらなる実験において、治療は、治療開始前の小さい腫瘍の確立を可能にするため、腫瘍細胞の接種後7日から始められた。このプロトコルを用いて、βpep-25、11DBF7、及び6DBF7は試験され、そして治療の過程の間に70％まで、及び4週の投与期間の終わり(35日)に50％まで、腫瘍の成長を阻害することが分かった(図４B)。腫瘍成長の割合は、増加し始めるが、動物が腫瘍組織分析のために屠殺された治療後10日では、約50％のままであった。興味深いことに、小さいDBFアナログの6DBF7は、βpep-25又は11DBF7よりも少し効果的に腫瘍成長を阻害すると観察された。例えば35日において、6DBF7は、コントロール動物からの腫瘍に比較して、70％以上の腫瘍成長阻害を維持した(図4B)。
【００９４】
in vivoにおける抗血管新生能は、治療された動物由来の組織の断片を、血管を同定するために免疫組織化学で使われる蛍光標識された抗CD31抗体で染色することによって行われた。血管密度は、コントロールと比較して、βpep-25、11DBF7、又は6DBF7で治療されることにより有意に減少された。さらに、抗血管新生の化合物は、血管構造に関して、同様に有意な効果を有して、末端の数、枝分かれした点の数、及び血管の長さの減少を示した(表2)。さらに、抗-血管新生治療は、腫瘍の凍結切片におけるPCNAの免疫組織化学染色によって決定されるとき、腫瘍細胞の増殖割合を低減した(表２)。血管新生阻害の結果として、アポトーシスした腫瘍細胞の数は、コントロールにおける311±103からβpep-25及び6DBF7で治療される動物におけるそれぞれ620±146及び851±162まで増加した。
【００９５】
【表５】
2005536453.tif 000006
【００９６】
a  PCNA-染色の画像の二値化後、増殖は、範囲あたりの白いピクセルの総量を数えることにより評価された。
b  CD31-染色の画像を二値化後、毛細血管の密度は、範囲あたりの白いピクセルの総量を数えることにより評価された。
c  画像の削減後、決定される血管末端の平均数(R.Wild et al., Microvasc. Res., 59, 368-376(2000))。
d  画像あたりの血管分岐点/節の平均数。
e  画像あたりの全血管長の平均値。
全ての結果は、画像あたりの平均ピクセル数として表される(±標準誤差)。
【００９７】
全てのin vivo実験において、βpep-25、11DBF7、及び6DBF7での治療は、行動の変化及び通常の体重増加により評価されるとき、毒性の兆候を示さなかった(データ未掲載)。それ以上に、治療動物における血球容量及びクレアチニンレベルは、コントロールに比較して通常であり、骨髄及び腎臓に対する毒性が無いことを指し示す。解剖の際に、巨視的及び顕微的な内部器官の形態学は、全ての実験群の動物内で通常であると観測された。
【００９８】
結果
要約すると、βpep-25の血管新生活性を促進するアミノ酸残基が同定され、そしてβpep-25の部分的なペプチド擬似物が、設計されそして合成された。より効果的な擬似物は、33アミノ酸残基のうちの13のみを持ち、部分的なペプチド擬似物がin vitro及びin vivoにおいて効果的な抗-血管新生薬剤であるということを示した。さらに、in vitro活性がβpep-25の活性よりいくらか低いので、in vivoにおける活性は改良されているように思え、DBFアナログの生体利用度増加を示した。血管新生阻害活性にを促進するために必要とされる残基数の有意な減少及びβシートを含む有機骨格の使用は、抗-血管新生タンパク質の経口で活性のある低分子擬似物の開発を可能にする。
【００９９】
この分析において試験されないDBFアナログは、当業者によって予測されて、その構造の同一性のために少なくとも1のアッセイにおけるいくつかの活性を提供する。示されていないことだが、本明細書中に記述される型のDBFアナログは、いくらかの殺菌性活性及びない毒素中和活性を示す。さらに、本明細書中に示される結果のため、本明細書中に記載される型のDBFアナログは、TNF-αレベルを阻害し、細胞間接着分子(ICAM)の発現を促進し、そして細胞間接着分子(ICAM)の発現の発現低下を阻害すると当業者によって予想される。また、特に血管新生の阻害に関する結果のために、本明細書中に記述されるDBFアナログのタイプは、病理学疾患、例えばアテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病性網膜症、新生血管緑内障、リュウマチ様関節炎、及び子宮内膜症を阻害すると当業者によって予想される。
【０１００】
本明細書中で引用される全ての参考文献は、その全てを本明細書中に援用される。本発明は、部分的な態様の脈絡内で記述されているが、本特許の範囲は、以下の特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】[図１Ａ]βpep-25のアミノ酸配列下のドデカペプチドが歩き回る配列。bFGF-刺激(10ng/ml)されたヒト臍帯静脈EC(HUVEC)細胞培養の増殖は、3H-チミジン取り込みの定量により計測された。増殖は、3回の独立実験における細胞培養の4通りのカウント毎分(cpm)の平均値として表される(±SEM)。アラニンスキャンニングからのEC増殖の結果(25μM投与量で試験される)は、コントロールの細胞培養に比較する増殖ECのパーセント(算術的なカウント毎分(cpm)の3回の培養の平均値)として棒グラフの形式で示される。歩き回るペプチドでは、結果は、容量反応曲線からのIC50値として与えられ；βpep-25に比べ有意な活性を有するドデカペプチドにたいするIC50値のみが、与えられる。  [図１Ｂ]βpep-25の全体の折りたたみ(2つのターンを有する3のβストランド)は、四角に囲まれた機能的に重要な残基を伴って示す。  [図１Ｃ]骨格の導入した親DBFアナログ(11DBF7又はCF-8)を示す。
【０１０２】
【図２】NMR分析から得られた6DBF7の重なりが、図2Aに示され、化学的3D構造が、図2Bに例示される。
【０１０３】
【図３】DBFアナログの、bFGFに活性化されるECにおける抗-増殖効果が、容量反応曲線としてプロットされる。
【０１０４】
【図４】MA148腫瘍を有するマウスは、最適化されたβpep-25投与量(10mg/kg/日)、或いは等量の11DBF7又は6DBF7投与量で治療された。図4Aでは、治療は、MA148細胞を接種されたときから始められた。図4Bでは、介入時期の研究が示され、ここで腫瘍は、治療が始まる前に触診できる大きさを確立することを可能にされた。どちらの研究でも、動物のコントロール群は、タンパク質濃度を制御する為にヒト血清アルブミンを含むPBSで処理された。腫瘍の体積(全ての群で、n＝11、±SEM)は、mm3対接種後の日にちでプロットされる。挿入されたグラフは、全体の毒性の試験として、研究の間におけるマウスの体重の増加を示す。
【０１０５】
配列表
ペプチドのアミノ酸配列
βpep-25(配列番号1)
ANIKLSVQMKLFKRHLKWKIIVKLNDGRELSLD
(配列番号2)
IIVKLND
(配列番号3)
IIVK
(配列番号4)
QMKL
(配列番号5)
SVQMKL
(配列番号6)
IKLSVQMKL
(配列番号7)
NIKLSVQMKL
(配列番号8)
ANIKLSVQMKL
(配列番号9)
IIVKLN
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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