(57)【要約】バイオマス変換のための組成物および方法を提供する。この組成物は、リグノセルロース基質に対して直接使用可能な新規酵素混合物を含む。この方法は、リグノセルロースを分解する酵素によるリグノセルロースバイオマスから遊離糖および小さなオリゴ糖への変換を含む。植物バイオマスからの糖の相乗作用的な遊離を提供する新規の酵素の組み合わせを提供する。リグノセルロース物質を分解し糖を生成する酵素、この酵素を生成する株、またはその酵素をコードする遺伝子もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロースから糖に分解するための方法であって、該方法は、該糖を遊離するのに十分な時間、少なくとも１種の補助酵素および少なくとも１種のセルラー是と該リグノセルロースとを接触する工程を包含し、ここで少なくとも２０％の該糖が、高温および高圧の非存在下で遊離する、方法。
【請求項２】
前記補助酵素が、粗酵素混合物または半精製酵素混合物として添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記補助酵素が、該酵素を生産する少なくとも１種の生物体を基板上で培養することによって生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物体が、細菌、真菌および酵母からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記補助酵素が、植物細胞中で生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記リグノセルロースが、１種以上の補助酵素と接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記補助酵素がキシラナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リグノセルロースが、トウモロコシまぐさ、トウモロコシ繊維、トウモロコシ由来のＤｉｓｔｉｌｌｅｒの乾燥粒、イネのわら、乾草、サトウキビバカス、オオムギ、麦芽および他の農業バイオマス、スイッチグラス、森林廃棄物、ポプラのウッドチップ、パインのウッドチップ、おが屑ならびに庭廃棄物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記リグノセルロースがトウモロコシまぐさを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リグノセルロースがトウモロコシ繊維を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記リグノセルロースが、トウモロコシ由来のＤｉｓｔｉｌｌｅｒの乾燥粒を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記補助酵素が、前記セルラーゼの添加の前に、前記リグノセルロースと共にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
まぐさから糖に分解するための方法であって、該方法は、該糖が遊離するのに十分な時間、キシラナーゼおよびセルラーゼと該まぐさを接触する工程を包含し、ここで少なくとも２０％の該糖が、高温および高圧の非存在下で遊離される、方法。
【請求項１４】
前記キシラナーゼがエンドキシラナーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記セルラーゼがエンドセルラーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記セルラーゼがエキソセルラーゼである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
植物材料から遊離糖およびオリゴ糖を生産する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
炭水化物は、地球上で最も豊富な有機化合物である。しかし、この炭水化物の多くは、デンプン（種および種子中の主要な貯蔵炭水化物）ならびに炭水化物およびリグノセルロースとして知られるリグニンの組み合わせを含む複合ポリマー中に隔離される。リグノセルロースの主な炭水化物成分は、セルロース、ヘミセルロースおよびグルカンである。これらの複合ポリマーは、しばしば集団的にリグノセルロースと呼ばれる。
【０００３】
デンプンは、直鎖を形成するためのα−１，４連結、および直鎖の分枝を形成するためのα−１，６連結、によって結合される、α連結グルコース単位の高度に分枝した多糖類である。対照的に、セルロースは、β−１，４結合によって連結されたグルコース残基からなる直鎖多糖類である。セルロース繊維の直鎖性（ｌｉｎｅａｒ  ｎａｔｕｒｅ）ならびに（αに対する）β連結グルコースの化学量論は、デンプンの高度に分枝したα連結構造よりもストランド間で水素結合する傾向にある構造を生成する。従って、セルロースポリマーは、一般に、可溶性がほとんどなく、そしてデンプン中の繊維結合よりもより強固に結合された繊維を形成する。
【０００４】
ヘミセルロースは複合ポリマーであり、そしてその組成は、生物間および１つの組織型間で、しばしば、広範に変更する。一般に、ヘミセルロースの主な成分は、β−１，４連結キシロース（５つの炭素糖）である。しかし、このキシラナーゼは、しばしば、β−１，３連結として分枝され、そしてアラビノース、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸への連結または酢酸のエステル化によって置換され得る。ヘミセルロースはまた、グルカン（β連結された６つの炭素糖についての一般的用語である）を含み得る。
【０００５】
ヘミセルロースの組成、置換の性質および分枝の程度は、単子葉植物と比較して双子葉植物において非常に異なる。双子葉植物において、ヘミセルロースは、主に、１，６−β−連結キシロシル側鎖を有する１，４−β−連結グルコース鎖である、キシログリカンから構成される。単子葉植物（穀類を含む）において、ヘミセルロースの主要な成分は、ヘテトキシランである。これらは、主に、アラビノース、ガラクトースおよびマンノースへの１，３−β連結を有する１，４−β−連結キシロース骨格ポリマー、ならびにエステル連結酢酸によって改変されたキシロースから構成される。１，３−β−連結グルコシル鎖および１，４−β−連結グルコシル鎖からなる分枝したβグルカンもまた存在する。単子葉植物において、セルロース、ヘテロキシランおよびβグルカンが、ほぼ等しい量で存在する。
【０００６】
植物バイオマス中のこのような多量の炭水化物の隔離は、糖（多数の産業プロセスおよび農業プロセスに利用され得る五糖および六糖の両方）に形成における潜在的なエネルギーの豊富な供給原を提供する。しかし、これらの炭水化物の巨大な潜在エネルギーは、現在活用されていない。なぜなら、糖は、複合ポリマー中にロックされ、従って発酵のために容易にアクセス可能でないからである。植物バイオマスから糖を生産する方法は、化学物質、プラスチックおよび燃料への発酵のめに、豊富な、経済競争力のあるフィードストックを提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
リグノセルロースから可溶性糖を生産するための現在のプロセスは、複雑である。プロセスの重要な工程は、前処理と称されるものである。前処理の目的は、セルロース分解酵素に対するセルロースの接触性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を増大することである（例えば、真菌のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの発酵から誘導されたセルロース混合物）。現在の前処理プロセスは、高温および高圧下で強酸または強塩基中にトウモロコシまぐさのようなリグノセルロース物質を浸す工程を包含する。このような化学的前処理は、リグノセルロースのヘミセルロースおよび／またはリグニン成分を分解し、セルロースを露出するだけでなく、望ましくない副生成物（酢酸、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールおよび石膏）も生成する。これらの生成物は、引き続く酵素によるセルソースの分解または同時糖化および同時発酵（ＳＳＦ）として知られている共発酵プロセスによる分解を可能にするために、さらなる工程において除去されなければならない。
【０００８】
化学的前処理に使用される現在の条件は、高価な反応管を必要とし、そしてエネルギーを大量に消費する。高温および極度なｐＨ条件（例えば、１２ａｔｍ圧にて、１６０℃および１．１％硫酸）で起こる化学的前処理は、公知のセルロース分解酵素と適合性でない。さらに、発酵が進行し得る前に、これらの反応は、除去されなければならない化合物を生産する。結果として、現在の化学的前処理プロセスは、セルロース分解とは別の反応管において行われ、そしてセルロース分解の前に行われなければならない。
【０００９】
従って、高温および高圧を必要とせず、毒性の廃棄物を生産せず、そしてわずかなエネルギーしか必要としない、セルロース分解プロセルスとより適合性の方法が所望される。
【００１０】
これらの理由から、有効な方法がバイオマス転換（ｂｉｏｍａｓｓ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）に必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
リグノセルロースバイオマスから遊離糖およびオリゴ糖を生産する方法が提供される。これらの方法は、リグノセルロースを分解する酵素を用いてリグノセルロースバイオマスから遊離糖および小さいオリゴ糖に変換する工程を包含する。変換プロセスに使用される酵素は、リグノセルロースの任意の成分を分解し得、そしてこれらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：セルラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リピダーゼおよびグルクロニダーゼ。本発明の酵素は、種々の供給源によって提供される。すなわち、この酵素は、商業的な供給源から購入される。あるいは、この酵素は、例えば、微生物、真菌（すなわち、酵母）または植物のいずれか中での発現によって組換え的に生産され得る。
【００１２】
酵素の新規の組み合わせが提供される。この組み合わせは、植物バイオマスからの糖の相乗作用的な遊離を提供する。この酵素クラス間の相乗作用は、各クラスの酵素をわずかに必要とするのみであり、そして植物バイオマスからの糖のより完全な遊離を促進し、バイオマスから単糖へのより有効な変換を可能にする。有効なバイオマス変換は、生成物（特に、化学変換または発酵による化学物質、化学フィードストック、プラスチックス、溶媒および燃料を含む）を生産するのに有用な糖の費用を削減する。
【００１３】
リグノセルロース物質を分解し糖を生成し得る酵素、この酵素を生産する株、またはこの酵素をコードする遺伝子もまた提供する。これらの方法は、リグノセルロースバイオマスの分解および遊離した糖の量に基づくアッセイを伴う。さらに、微生物、酵素または遺伝子をスクリーニングし、そしてリグノセルロースを分解する酵素の能力を数量化するためのこのようなアッセイを利用する方法が提供される。これらの方法は、上記のバイオマス変換方法に組み込むのに最も有用であるタンパク質（酵素）を同定するのに有用である。
【００１４】
各リグノセルロース物質を分解するための酵素の最適な比および酵素組成を同定する方法もまた提供する。これらの方法は、任意のリグノセルロース基質からその構成糖への有効な変換のための最適な酵素組成および比を同定するための試験を含む。
【００１５】
新規な酵素、酵素組成物または酵素用途を同定するための方法をまた提供する。これらの方法は、上記のような酵素消化の後に残っている加水分解された物質を利用するアッセイにおいて酵素を試験する工程を包含する。この方法は、トウモロコシまぐさおよび他のリグノセルロース物質のさらなる加水分解を生じる酵素を同定し、さらなる糖の遊離を生じる。
【００１６】
（詳細な説明）
有用な生成物に発酵され得るか、または化学的に変換され得る糖およびオリゴ糖への植物バイオマスの変換のための方法および組成物が提供される。すなわち、酵素混合物を使用して基質を分解し糖を遊離するための方法を提供する。さらに、新規な酵素、または酵素を生産する株またはこの方法に有用な酵素をコードする遺伝子を同定するための方法が、記載される。本発明の組成物は、リグノセルロースを分解する相乗作用的な酵素組成物を含む。このような酵素組成物または混合物は、複合バイオマスから糖へと相乗的に分解し、そして一般的に少なくとも１種の補助酵素と共にセルラーゼを含む。
【００１７】
（酵素組成物）
「補助酵素（Ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ｅｎｚｙｍｅ）」、「補助酵素（ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ｅｎｚｙｍｅｓ）」、「補助酵素混合物（ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ）」、「触媒混合物（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｍｉｘｔｕｒｅ）」または「触媒混合物（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｍｉｘ）」は、バイオマスからの糖の遊離を増大するかまたは増強する任意の酵素として規定される。これは、反応においてバイオマスと接触される場合、引き続く酵素（例えば、セルラーゼ）の活性を増加する酵素を含み得る。あるいは、補助酵素は、他の酵素（例えば、セルラーゼ）と同じ管中で反応され得る。多くのクラスの酵素が補助酵素として機能し得ることが理解されるが、特に、補助酵素は、以下のクラスの酵素（限定されない）から構成され得る（しかし、これらに限定されない）：セルラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リピダーゼおよびグルクロニダーゼ。多くのこれらの酵素は、クラスＥＣ  ３．２．１の代表例であり、従って、このクラスにおける他の酵素は、本発明において有用であり得る。補助酵素混合物は、以下に由来する酵素から構成され得る：（１）業者；（２）酵素を生産するクローニング遺伝子；（３）複合ブロス（例えば、培地中にタンパク質および酵素を分泌する微生物株を培地中で増殖させることにより生じるブロス）；（４）（３）において増殖した株の細胞溶解物；および（５）リグノセルロースを分解し得る酵素を発現する植物物質。
【００１８】
補助酵素の任意の組み合わせが利用され得ることが認識される。酵素は、単独または混合物で使用され得、その混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：少なくとも１種のセルラーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼ；少なくとも１種のリグニナーゼ；少なくとも１種のアミラーゼ；少なくとも１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のリピダーゼ；少なくとも１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼと１種のキシラナーゼ；少なくとも１種のセルラーゼと１種のリグニナーゼ；少なくとも１種のセルラーゼと１種のアミラーゼ；少なくとも１種のセルラーゼと１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のセルラーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼと１種のリグニナーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼと１種のアミラーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼと１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のリグニナーゼと１種のアミラーゼ；少なくとも１種のリグニナーゼと１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のリグニナーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のリグニナーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のアミラーゼと１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のアミラーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のアミラーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のプロテアーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のプロテアーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼと１種のリグニナーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼと１種のアミラーゼ；少なくとも１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼと１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼと１種のアミラーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼと１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼと１種のアミラーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼと１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のアミラーゼと１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のアミラーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のアミラーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のプロテアーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のプロテアーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼと１種のアミラーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼと１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼと１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のアミラーゼと１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のアミラーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のアミラーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のプロテアーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のプロテアーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼと１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のプロテアーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のプロテアーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のアミラーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼと１種のプロテアーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のプロテアーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のプロテアーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼと１種のリピダーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼ、と１種のリピダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼ、と１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ；少なくとも１種のセルラーゼ、１種のキシラナーゼ、１種のリグニナーゼ、１種のアミラーゼ、１種のプロテアーゼ、１種のリピダーゼと１種のグルクロニダーゼ、など。上記のように、補助混合物は、これらの酵素のクラスの多数のメンバー、いくつかの数の１つの酵素のクラス（例えば、２つ以上のキシラナーゼ）、またはこれらの酵素のクラスのメンバーの任意の組み合わせ（例えば、プロテアーゼ、エキソセルラーゼと１種のエンドキシラナーゼ；またはリグニナーゼ、エキソキシラナーゼと１種のリピダーゼ）から構成されることが理解される。
【００１９】
補助酵素は、セルラーゼの添加の前に、前処理において基質またはバイオマスと反応され得るか、あるいは、セルラーゼは、任意の酵素混合物中に含まれ得る。すなわち、セルラーゼは、任意の酵素混合物に含まれえる。この酵素は、粗酵素混合物、半精製された酵素混合物または精製された酵素混合物として添加され得る。基質および酵素組み合わせの温度およびｐＨは、酵素の組み合わせの活性を増大するように変更され得る。同様に、温度およびｐＨは、酵素の活性を増大するように１つ以上の酵素の添加で変更され得る。しかし、ｐＨおよび温度の調節は、以下に議論される範囲内である。すなわち、反応は、全ての時間で穏やかな条件で行われる。
【００２０】
補助酵素が混合物として議論されるが、温度、ｐＨおよび他の条件が、各個々の酵素の活性を増大するように改変され得る場合、酵素は、連続的に添加され得ることが認識される。あるいは、最適ｐＨおよび最適温度は、酵素混合物について決定され得る。
【００２１】
酵素は、バイオリアクターを使用してバイオマス変換に現在利用してるような、極度な加熱または酸処理を含まない穏やかな条件下で、基質と反応される。例えば、酵素は、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃または約５５℃でインキュベートされ得る。すなわち、酵素は、低〜中程度のイオン強度および中性ｐＨの緩衝液中で、約２０℃〜約７０℃でインキュベートされ得る。「中程度のイオン強度」とは、緩衝液が任意の単一イオン成分について約２００ミリモーラー（ｍＭ）未満のイオン濃度を有することが意図される。ｐＨは、約ｐＨ５、約ｐＨ５．５、約ｐＨ６、約ｐＨ６．５、約ｐＨ７、約ｐＨ７．５、約ｐＨ８．０〜約０ｐＨ８．５の範囲であり得る。一般に、ｐＨは、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ９の範囲である。これらの条件下で、酵素の組み合わせのインキュベーションは、リグノセルロースからの糖の実質的な量の放出または遊離を生じる。実質的な量とは、少なくとも２０、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の利用可能な糖が意図される。
【００２２】
酵素または酵素混合物とのインキュベーション工程を包含する前処理工程が、利用され得る。前処理工程は、多くの異なる温度で行われ得るが、前処理工程は、試験される酵素に対して最も適切な温度（すなわち、試験される酵素の予測された酵素条件）で行われるのが好ましい。前処理の温度は、約１０℃〜約８０℃、約２０℃〜約８０℃、約３０℃〜約７０℃、約４０℃〜約６０℃、約３７℃〜約５０℃、好ましくは約３７℃〜約８０℃、より好ましくは約５０℃の範囲であり得る。温度最適条件についてのデータの非存在において、初めに３７℃で前処理反応、次いで、より高い温度（例えば５０℃）で行うことが好ましい。前処理混合物のｐＨは、約２．０〜約１０．０の範囲であるが、好ましくは約３．０〜約７．０、より好ましくは約４．０〜約６．０、なおより好ましくは約４．５〜約５の範囲である。再度、ｐＨは、酵素活性を最大にするように調節され得、そして酵素の添加で調節され得る。アッセイの結果の比較は、この試験が試験される酵素を最も適するように方法を改変することを可能にする。
【００２３】
前処理反応は、数分〜数時間（例えば、約６時間〜約１２０時間、好ましくは約６時間〜約４８時間、より好ましくは約６時間〜約２４時間、最も好ましくは約６時間）起こり得る。セルラーゼ処理は、数分〜数時間（例えば、約６時間〜約１２０時間、好ましくは約１２時間〜約７２時間、より好ましくは約２４時間〜約４８時間）起こり得る。
【００２４】
（バイオマス基質の定義）
「基質」または「バイオマス」とは、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、タンパク質および炭水化物（例えば、デンプンおよび糖）を含む物質が意図される。「バイオマス」は、バージンバイオマスおよび／または非バージンバイオマス（農業バイオマス、商業的な生物体、構成物および破壊片）、市営の固体廃棄物、古紙および庭廃棄物）を含む。バイオマスの一般的な形態としては、以下が挙げられる：木、低木および草、コムギ、コムギワラ、サトウキビバガス、トウモロコシ、トウモロコシのさや、トウモロコシの穀粒（穀粒由来の繊維を含む）、トウモロコシのような穀物の製粉（湿った製粉および乾燥製粉を含む）由来の産物および副産物、ならびに市営の固形廃棄物、古紙および庭廃棄物。「混合バイオマス」は、任意の混合物またはバージンバイオマスと非バージンバイオマスの混合物であり、好ましくは約５〜９５重量％の非バージンバイオマスを有する。「農業バイオマス」としては、枝、低木、サトウキビ、トウモロコシおよびトウモロコシのさや、エネルギー作物、森林、果物、花、穀物、草、草木作物、葉、樹皮、針、ログ（ｌｏｇ）、根、幼樹、短い回転の木作物（ｓｈｏｒｔ  ｒｏｔａｔｉｏｎ  ｗｏｏｄｙ  ｃｏｒｐ）、低木、スイッチグラス（ｓｗｉｔｃｈ  ｇｒａｓｓｅ）、木、野菜、蔓植物、および堅い木および軟らかい木（有毒な物質を含む木を含まない）。さらに、農業バイオマスとしては、農業プロセスから生成される有機廃棄物質（農業作業および森林活動（特に森林廃棄物を含む）を含む）が挙げられる。農業バイオマスは、任意の前述の単一か、またはその混合物の任意の組み合わせであり得る。
【００２５】
デンプン、糖またはタンパク質（例えば、トウモロコシ、穀物、果物および野菜）中に多いバイオマスは、食物として通常消費される。逆に、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニン中に多いバイオマスは、容易に消化可能でなく、そして木産物または紙産物、燃料に主に利用されるか、または代表的に廃棄される。一般的に、基質は、リグノセルロース含量（トウモロコシまぐさ、イネのワラ、乾草、サトウキビバガスおよび他の農業バイオマス（スイッチグラス、森林廃棄物、ポプラウッドチップ、パインウッドチップ、木屑、庭廃棄物など））（基質の任意の組み合わせを含む）が高い。
【００２６】
（代表的にバイオマスと称される物質の例）
【００２７】
【表１】
2005523720.tif 000002
「遊離」または「加水分解」とは、複合リグノセルロース基質またはバイオマスから単糖またはオリゴ糖の変換が意図される。
【００２８】
「変換」は、バイオマスおよび／または混合バイオマスからエタノール、またはエタノールと副産物を生成する、任意の生物学的活性、化学的活性および／または生化学的活性を含む。このような変換は、このようなバイオマスおよび／または混合バイオマスの加水分解、発酵および同時糖化と発酵（ＳＳＦ）を含む。好ましくは、変換は、本明細書中に記載されるような発酵物質および加水分解物質の使用を含む。
【００２９】
「トウモロコシまぐさ（ｃｏｎｅ  ｓｔｏｖｅｒ）」は、トウモロコシ植物の収穫によって生産された農業残渣を含む。まぐさは、トウモロコシ畑からのトウモロコシ粒の収穫によって（代表的に、刈取り脱穀機によって）生産される。トウモロコシまぐさは、トウモロコシの枝、さや、根、トウモロコシ粒および種々の物質（例えば、土壌）を様々な比で含む。
【００３０】
「トウモロコシの繊維」は、トウモロコシ粒の画分であり、湿った製粉、乾燥製粉または他のトウモロコシ粒プロセシングから生じる。トウモロコシ繊維画分は、デンプンおよびオイルの抽出後に残っている収穫された粒の繊維部分を含む。トウモロコシ繊維は、代表的に、ヘミセルロース、セルロース、残渣デンプン、タンパク質およびリグニンを含む。
【００３１】
「エタノール」は、エチルアルコールまたはエチルアルコールと水の混合物を含む。
【００３２】
「発酵産物」は、エタノール、クエン酸、ブタノールおよびイソプロパノールならびにその誘導体を含む。
【００３３】
（酵素の命名法および定義）
ＩＵＢＭＢの命名法の推奨は、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２  ［Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＩＳＢＮ  ０−１２−２２７１６４−５（ハードカバー），０−１２−２２７１６５−３（ペーパーカバー）］（補遺１（１９９３），補遺２（１９９４），補遺３（１９９５），補遺４（１９９７）および補遺５を含む）（それぞれＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９４）２２３：１−５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５）２３２：１−６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）２３７：１−５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２５０：１−６，およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２６４：６１０−６５０；）において公開されている。ＩＵＢＭＢによって推奨された分類は、広範に認識されそして当該分野において理解される。代表的に、酵素は、ＩＵＢＭＢ酵素分類またはＥＣ番号によって当該分野で言及される。各クラスにおける酵素のリストは、頻繁にアップデートされ、そして印刷物またはインターネットにおいてＩＵＢＭＢによって公開される。
【００３４】
ＩＵＢＭＢ分類に基づく酵素命名法の別の供給源は、ＥＮＺＹＭＥデータベースにおいて見出され得る。ＥＮＺＹＭＥは、酵素の命名法に関する情報の貯蔵庫である。ＥＮＺＹＭＥは、主にＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＩＵＢＭＢ）の推奨に基づき、そしてＥＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）番号が提供される特徴付けされた酵素の各タイプを記載する（Ｂａｉｒｏｃｈ  （２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：３０４−３０５）。ＥＮＺＹＭＥデータベースは、各項目について記載される：ＥＣ番号、推奨名前、別名（もしあれば）、触媒活性、補因子（もしあれば）、その酵素に対応するＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列項目に対する助言（もしあれば）、およびその酵素の欠損に関連するヒト疾患に対する助言。
【００３５】
「セルラーゼ」は、基質として、セルロースまたはセルロース分解から生じる産物を認識し得るエキソヒドロラーゼおよびエンドヒドロラーゼの両方を含む。セルラーゼは、エンドグルカナーゼ、セロビオイドロラーゼ、グルコシダーゼあるいはこれらの任意の酵素単独または他の活性剤との組み合わせを含む酵素の混合物を含む。セルロース分解活性を生成する生物体は、しばしば異なる基質特異性を有する多量の酵素を生産する。従って、実際に、いくつかの酵素型が活性に寄与され得る場合、セルロースを消化すると同定された株は、セルラーゼを有するとして記載され得る。例えば、「セルラーゼ」の市販の調製物は、しばしば、いくつかの酵素の混合物（例えば、エンドグルカナーゼ活性、エキソグルカナーゼ活性およびグルコシダーゼ活性）である。
【００３６】
従って、「セルラーゼ」は、このような酵素の混合物を含み、そして、セルロースを分解し得る市販の調製物、ならびにセルロースおよびセルロース分解活性を示すかまたはセルロース分解の分解産物（例えば、セロトリオースまたはセルビオース）に対して作用し得る培養上清もしくは細胞抽出物を含む。
【００３７】
「セロビオヒドロラーゼ」または「１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ」または「セルロース１，４−β−セロビオシダーゼ」または「セロビオシダーゼ」は、セルロースおよびセロテトラオース中の１，４−β−Ｄ−グルコシド連結を加水分解する酵素を含み、鎖の還元末端または非還元末端からセロビオースを生じる。グループＥＣ  ３．２．１．９１における酵素は、これらの酵素を含む。
【００３８】
「β−グルコシダーゼ」または「グルコシダーゼ」または「β−Ｄ−グコシドグルコヒドロラーゼ」または「セロビアーゼ」ＥＣ  ３．２．１．２１は、これらの触媒作用の産物としてグルコース分子を遊離する酵素を含む。これらの酵素は、基質としてのグルコースポリマー（例えば、セロビオース（β−１，４結合によって連結されるグルコースの二量体）、またはセロトリオース（β−１，４結合によって連結されるグルコースの三量体））を認識する。代表的に、これらは、末端の非還元β−Ｄ−グルコースを加水分解し、β−Ｄ−グルコースを遊離する。
【００３９】
「エンドグルカナーゼ」または「１，４−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ」または「β−１，４，エンドセルラーゼ」または「エンドセルラーゼ」または「セルラーゼ」ＥＣ  ３．２．１．４は、β−１，４連結によって結合されたグルコースのポリマーを切断する酵素を含む。これらの酵素によって作用される基質は、セルロースおよび改変されたセルロース基質（例えば、カルボキシセルロース、ＲＲＢ−セルロースなど）を含む。
【００４０】
セルラーゼとしては、酵素のクラスの以下のリストが挙げられるが、これらに限定されない：
【００４１】
【表２】
2005523720.tif 000003
2005523720.tif 000004
「キシラナーゼ」または「ヘミセルラーゼ」は、基質として、ヘミセルロースまたはヘミセルロース破壊から生じる産物を認識し、そして加水分解し得るエキソ型加水分解（ｅｘｏｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ）酵素およびエンド型加水分解（ｅｎｄｏｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ）酵素の両方を含む。ヘテロキシランは、ヘミセルロースの主な構成要素である単子葉植物において、エンド−１，４−β−キシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）およびβ−Ｄ−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）の組み合わせは、ヘミサルロースからキシロースへの分解壊のために使用され得る。さらなる脱分枝酵素は、ヘミセルロース構造中の分枝点に位置される他の糖成分（アラビノース、ガラクトース、マンノース）を加水分解し得る。さらなる酵素は、ヘミセルロースの糖（特に、アラビノース）とリグニンとの間に形成された結合を加水分解し得る。
【００４２】
「エンドキシラナーゼ」または「１，４−β−エンドキシラナーゼ」または「１，４−β−Ｄ−キシランキシラノヒドロラーゼ」または（ＥＣ  ３．２．１．８）は、β−１，４連結によって結合されたキシロースポリマーを加水分解する酵素を含む。エンドキシラナーゼは、リグノセルロースのヘミセルロース成分ならびに精製されたキシラン基質を加水分解するために使用され得る。
【００４３】
「エキソキシラナーゼ」または「β−キシロシダーゼ」または「キシラン１，４−β−キシロシダーゼ」または「１，４−β−Ｄ−キシランキシロヒドロラーゼ」または「キシロビアーゼ」または「エキソ−１，４−β−キシロシダーゼ」（ＥＣ  ３．２．１．３７）は、キシランポリマーの非還元末端からＤ−キシロース残基を首尾良く加水分解する酵素を含む。
【００４４】
「アラビノキシラナーゼ」または「グルクロノアラビノキシランエンド−１，４−β−キシラナーゼ」または「フラキサンエンドキシラナーゼ」は、いくつかのキシラン基質中のβ−１，４−キシロシル連結を加水分解する酵素を含む。
【００４５】
キシラナーゼとしては、酵素の以下のグループが挙げられるが、これらに限定されない：
【００４６】
【表３】
2005523720.tif 000005
「リグニナーゼ」は、リグニンポリマーの構造を加水分解し得るかまたは分解し得る酵素を含む。リグニンを分解し得る酵素は、リグニンペルオキシダーゼ、マンガナーゼペルオイキダーゼ、ラッカーゼおよびヘルロイル（ｆｅｒｕｌｏｙｌ）エステラーゼ、ならびにリグニンポリマーを脱重合または他の方法で分解することが当該分野で公知の記載される他の酵素を含む。ヘミセルロース糖（特に、アラビノース）とリグニンの間に形成された結合を加水分解し得る酵素もまた含まれる。
【００４７】
リグニナーゼとしては、酵素の以下のグループが挙げられるが、これらに限定されない：
【００４８】
【表４】
2005523720.tif 000006
「アミラーゼ」または「αグルコシダーゼ」は、オリゴ糖または多糖類における１，４−α−グルコシド結合を加水分解する酵素を含む。多くのアミラーゼは、以下のＥＣリストの下で特徴付けされる：
【００４９】
【表５】
2005523720.tif 000007
「プロテアーゼ」は、ペプチド結合を加水分解する酵素（ペプチダーゼ）ならびにペプチドと他の部分（例えば糖）との間の結合を加水分解する酵素（グリコペプチダーゼ）を含む。多くのプロテアーゼは、ＥＣ３．４の下で特徴付けられ、そして本明細書中の参考として援用される。いくつかの特定の型のプロテアーゼは、システインプロテアーゼ（ペプシン、パパインおよびセリンプロテアーゼ（キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼおよびメタロエンドペプチダーゼを含む）を含む）を含む。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＳＩＢ），Ｇｅｎｅｖａ，ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄおよびＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ），Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍによって管理されている）は、以下のクラスにプロテアーゼまたはペプチダーゼを分類する。
【００５０】
（セリン型ペプチダーゼ）
ファミリー：代表的な酵素
Ｓ１：キモトリプシン／トリプシン
Ｓ２：α型−溶解性エンドペプチダーゼ
Ｓ２：グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｖ８）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）
Ｓ２：プロテアーゼ  Ｄｏ（ｈｔｒＡ）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）
Ｓ３：トガビリン（Ｔｏｇａｖｉｒｉｎ）
Ｓ５：リジルエンドペプチダーゼ
Ｓ６：ＩｇＡ−特異的セリンエンドペプチダーゼ
Ｓ７：フラビビリン（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｎ）
Ｓ２９：Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３エンドペプチダーゼ
Ｓ３０：タバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ）３５ｋＤａエンドペプチダーゼ
Ｓ３１：ウシの下痢ウイルスｐ８０エンドペプチダーゼ
Ｓ３２：ウマ動脈炎ウイルス推定エンドペプチダーゼ
Ｓ３５：リンゴ茎溝ウイルス（Ａｐｐｌｅ  ｓｔｅｍ  ｇｒｏｏｖｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）セリンエンドペプチダーゼ
Ｓ４３：ポリンＤ２  
Ｓ４５：ペニシリンアミドヒドロラーゼ
Ｓ８：サブチラーゼ
Ｓ８：サブチリシン
Ｓ８：ケキシン（Ｋｅｘｉｎ）
Ｓ８：トリペプチジルペプチダーゼＩＩ
Ｓ５３：シュードモナペプシン
Ｓ９：プロリルオリゴペプチダーゼ
Ｓ９：ジペプチジルペプチダーゼＩＶ
Ｓ９：アシルアミノアシルペプチダーゼ
Ｓ１０：カルボキシペプチダーゼＣ
Ｓ１５：Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｘ−Ｐｒｏジペプチジルペプチダーゼ
Ｓ２８：リソソームＰｒｏ−Ｘ  カルボキシペプチダーゼ
Ｓ３３：プロリルアミノペプチダーゼ
Ｓ１ｌ：Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ  ペプチダーゼファミリー１（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｄａｃＡ）
Ｓ１２：Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ  ペプチダーゼｆファミリー２（Ｓｔｒｅｐｔ．Ｒ６１）
Ｓ１３：Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ  ペプチダーゼファミリー３（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｄａｃＢ）
Ｓ２４：ＬｅｘＡレプレッサー
Ｓ２６：細菌リーダーペプチダーゼＩ
Ｓ２７：真核生物シグナルペプチダーゼ
Ｓ２１：アセンブイリン（Ａｓｓｅｍｂｌｉｎ）（ヘルペスウイルスプロテアーゼ）
Ｓ１４：ＣｌｐＰエンドペプチダーゼ（Ｃｌｐ）
Ｓ４９：エンドペプチダーゼＩＶ（ｓｐｐＡ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｓ４１：テイル特異的プロテアーゼ（ｐｒｃ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｓ５１：ジペプチダーゼＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｓ１６：エンドペプチダーゼＬａ（Ｌｏｎ）
Ｓ１９：Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓエンドペプチダーゼ
Ｓ５４：ロンボイド（Ｒｈｏｍｂｏｉｄ）
（スレオニン型ペプチダーゼ）
ファミリー：代表的な酵素
Ｔ１：多触媒性エンドペプチダーゼ（プロテアソーム）
（システイン型ペプチダーゼ）
ファミリー：代表的な酵素
Ｃ１：パパイン
Ｃ２：カルパイン
Ｃ１０：ストレプトパイン
Ｃ３：ピコマイン（Ｐｉｃｏｍａｉｎ）
Ｃ４：ヤマノイモモザイクウイルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ）ＮＩ−ａ（４９  ｋＤａ）エンドペプチダーゼ
Ｃ５：アデノウイルスエンドペプチダーゼ
Ｃ１８：Ｃ型肝炎ウイルスエンドペプチダーゼ２
Ｃ２４：ＲＨＤＶ／ＦＣプロテアーゼＰ３Ｃ
Ｃ６：ヤマノイモモザイクウイルスヘルパーコンポーネント（ＨＣ）プロテイナーゼ
Ｃ７：クリ胴枯病ウイルスｐ２９エンドペプチダーゼ
Ｃ８：クリ胴枯病ウイルスｐ４８エンドペプチダーゼ
Ｃ９：トガウイルスｎｓＰ２エンドペプチダーゼ
Ｃ１ｌ：クロストリパイン（Ｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ）
Ｃ１２：ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼファミリー１
Ｃ１３：ヘモグロビナーゼ
Ｃ１４：カスパーゼ（ＩＣＥ）
Ｃ１５：ピログルタミル−ペプチダーゼＩ
Ｃ１６：マウス肝炎ウイルスエンドペプチダーゼ
Ｃ１９：ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼファミリー２
Ｃ２１：カブイエローモザイクウイルスエンドペプチダーゼ
Ｃ２５：ギンギパインＲ
Ｃ２６：γ−グルタミルヒドロラーゼ
Ｃ３７：サウザンプトンウイルスエンドペプチダーゼ
Ｃ４０：ジペプチジル−ペプチダーゼＶＩ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
Ｃ４８：ＳＵＭＯプロテアーゼ
Ｃ５２：ＣＡＡＸプレニルプロテアーゼ２
（アスパラギン酸型ペプチダーゼ）
ファミリー：代表的な酵素
Ａｌ：ペプシン
Ａ２：レトロペプシン  
Ａ３：カリフラワーモザイクウイルスペプチダーゼ
Ａ９：Ｓｐｕｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓエンドペプチダーゼ
Ａｌｌ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａトランスポゾンｃｏｐｉａエンドペプチダーゼ
Ａ６：ノダウイルスエンドペプチダーゼ
Ａ８：細菌リーダーペプチダーゼＩＩ
Ａ２４：ＩＶ型プレピリンリーダーペプチダーゼ
Ａ２６：オムプチン（Ｏｍｐｔｉｎ）
Ａ４：スチタリドペプシン（Ｓｃｙｔａｌｉｄｏｐｅｐｓｉｎ）
Ａ５：サーモプシン
（メタロペプチダーゼ）
ファミリー：代表的な酵素
Ｍ１：膜アラニルアミノペプチダーゼ
Ｍ２：ペプチジルジペプチダーゼＡ  
Ｍ３：チメット（Ｔｈｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ
Ｍ４：サーモリシン
Ｍ５：マイコリシン
Ｍ６：イムノインヒビターＡ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）  
Ｍ７：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ小型中性プロテアーゼ
Ｍ８：リーシュマノリシン（Ｌｅｉｓｈｍａｎｏｌｙｓｉｎ）
Ｍ９：微生物コラゲナーゼ
Ｍ１０：マトリキシン
Ｍ１０：セラリシン
Ｍ１０：フラギリシン
Ｍ１１：オートリシン（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）
Ｍ１２：アスタチン
Ｍ１２：リプロリシン
Ｍ１３：ネプリリシン
Ｍ２６：ＩｇＡ特異的メタロエンドペプチダーゼ
Ｍ２７：テントキシリシン（Ｔｅｎｔｏｘｉｌｙｓｉｎ）
Ｍ３０：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ中性プロテアーゼ
Ｍ３２：カルボキシペプチダーゼＴａｑ
Ｍ３４：炭疽致死因子
Ｍ３５：デューテロリシン（Ｄｅｕｔｅｒｏｌｙｓｉｎ）
Ｍ３６：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓエラスチン分解性メタロエンドペプチダーゼ
Ｍ３７：リソスタフィン
Ｍ４１：細胞分裂タンパク質ｆｔｓＨ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｍ４６：妊娠関連血漿タンパク質Ａ
Ｍ４８：ＣＡＡＸプレニルプロテアーゼ
Ｍ４９：ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ
（ＨＥＸＸＨモチーフを有さない他の酵素）
ファミリー：代表的な酵素
Ｍ１４：カルボキシペプチダーゼＡ
Ｍ１４：カルボキシペプチダーゼＨ
Ｍ１５：亜鉛Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼ
Ｍ４５：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａジペプチダーゼ
Ｍ１６：ピトリリシン（Ｐｉｔｒｉｌｙｓｉｎ）
Ｍ１６：ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ
Ｍ４４：ワクシニアウイルス型メタロエンドペプチダーゼ
Ｍ１７：ロイシルアミノペプチダーゼ
Ｍ２４：メチオニルアミノペプチダーゼ１型
Ｍ２４：Ｘ−Ｐｒｏジペプチダーゼ
Ｍ２４：メチオニルアミノペプチダーゼ２型
Ｍ１８：酵母アミノペプチダーゼＩ
Ｍ２０：グルタメートカルボキシペプチダーゼ
Ｍ２０：Ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ
Ｍ２５：Ｘ−Ｈｉｓジペプチダーゼ
Ｍ２８：Ｖｉｂｒｉｏロイシルアミノペプチダーゼ
Ｍ２８：アミノペプチダーゼＹ
Ｍ２８：アミノペプチダーゼｉａｐ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｍ４０：スルホロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）カルボキシペプチダーゼ
Ｍ４２：グルタミルアミノペプチダーゼ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）
Ｍ３８：Ｅ．ｃｏｌｉ  β−アスパルチルペプチダーゼ
Ｍ２２：Ｏ−シアログリコプロテインエンドペプチダーゼ
Ｍ５２：ヒドロゲナーゼ成熟ペプチダーゼ
Ｍ５０：ＳＲＥＢＰ部位２プロテアーゼ
Ｍ５０：胞子因子ＩＶＢ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
Ｍ１９：膜ジペプチダーゼ
Ｍ２３：β溶解エンドペプチダーゼ
Ｍ２９：好熱性アミノペプチダーゼ
（未知の触媒機構を有するペプチダーゼ）
ファミリー：代表的な酵素
Ｕ３：胞子エンド型ペプチダーゼｇｐｒ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
Ｕ４：胞子形成シグマＥ因子プロセシングペプチダーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
Ｕ６：ムレインエンドペプチダーゼ（ｍｅｐＡ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｕ８：バクテリオファージムレインエンドペプチダーゼ
Ｕ９：プロヘッドエンドペプチダーゼ（ファージＴ４）
Ｕ２２：Ｄｏｒｏｓｏｐｈｉｌａトランスポゾン２９７エンドペプチダーゼ
Ｕ２４：トウモロコシトランスポゾンｂｓ１エンドペプチダーゼ
Ｕ２６：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼ
Ｕ２９：脳脊髄炎ウイルスエンドペプチダーゼ２Ａ
Ｕ３０：Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｔｔｌｅウイルスプロテイナーゼ
Ｕ３１：ヒトコロナウイルスプロテアーゼ
Ｕ３２：Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓコラゲナーゼ
Ｕ３３：Ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍウイルスエンドペプチダーゼ
Ｕ３４：ＬａｃｔｏｃｏｃｃａｌジペプチダーゼＡ
「リピダーゼ」は、脂質、脂肪酸およびアシルグリセリド（ホスホグリセリド、リポタンパク質、ジアシルグリセロールなどを含む）を加水分解する酵素を含む。植物において、脂質は、水の損失および病原体感染を制限する構造成分として使用される。これらの脂質は、脂肪酸ならびにクチンおよびスベリンから誘導されるロウを含む。多くのリパーゼは、以下のＥＣリストの下で特徴付けされる：
【００５１】
【表６】
2005523720.tif 000008
2005523720.tif 000009
「グルクロニダーゼ」は、β−グルクロノシドを加水分解し、アルコールを得る酵素を含む。多くのグルクロニダーゼは、以下のＥＣリストの下で特徴付けされる：
【００５２】
【表７】
2005523720.tif 000010
（酵素混合物を使用して基質を遊離糖に分解する方法）
本発明の一つの局面において、この酵素は、リグノセルロース基質またはフィードストックとして役立つ植物バイオマスに作用し、そしてこの複雑な基質を、エタノールまたは他の有用産物の生成のために単糖およびオリゴ糖に変換する。本発明の別の局面は、他の酵素または物理的処理（例えば、温度またはｐＨ）と相乗作用的に作用する酵素の混合物を使用して、リグノセルロース植物バイオマスを糖およびオリゴ糖に変換する方法を包含する。酵素の組み合わせまたは物理的処理は、同時にまたは連続的に施され得る。この酵素は、微生物、酵母、真菌、細菌、または植物中のいずれかで外因的に生成され、次いで単離され、そしてリグノセルロースフィードストックに添加される。あるいは、この酵素は、生成された後単離せずに、粗細胞マス発酵ブロスまたは植物物質（例えば、トウモロコシのまぐさなどがフィードストックに添加される。あるいは、粗細胞マスまたは酵素生成培地または植物材料は、さらなる微生物の増殖を防止するために処理され（例えば、加熱により、または抗生物質を添加することにより）、次いで、フィードストックに添加され得る。これらの粗酵素混合物は、その酵素を生成する生物を含み得る。あるいは、この酵素は、フィードストック（例えば、トウモロコシまぐさ）を使用する発酵において生成され得、酵素を生成する生物に栄養を提供する。この様式で、この酵素を生成する植物は、リグノセルロースフィードストックとして作用し得、リグノセルロースフィードストックに添加される。
【００５３】
バイオマスから遊離する糖は、有用な発酵産物（アミノ酸、ビタミン、薬物、動物フィードサプリメント、特殊な化学物質、化学物質フィードストック、プラスチック、およびエタノール（燃料エタノールを含む）が挙げられるがこれらに限定されない）に変換され得る。
【００５４】
この酵素混合物は、微生物、酵母、真菌、または植物において発現され得る。この酵素を発現する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｅｉｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；米国特許第５，５６３，０５５号；同第４，９４５，０５０号；同第５，８８６，２４４号；同第５，７３６，３６９号；同第５，９８１，８３５号；ならびに当該分野で公知の他の文献（これら全ては、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。本発明の一つの局面において、この酵素は、トランスジェニック植物中で生成される。この方法において、植物は、バイオマスから単糖またはオリゴ糖への変換に使用される補助酵素のいくつかまたは全てを発現する。
【００５５】
（本発明の方法において使用するための酵素およびその酵素を生成する株の同定方法）
本発明の別の局面において、リグノセルロースバイオマスを分解する補助酵素として作用し得る酵素を同定する方法が提供される。リグノセルロース物質（例えば、トウモロコシまぐさ）の分解を容易にする能力を有する新規の酵素を同定するために、本明細書中に記載されるアッセイが用いられ得る。
【００５６】
第一に、補助酵素として作用する可能性のある遺伝子セットが同定およびクローニングされる。例えば、既知のリグノセルロース分解酵素のデータベースを選別し、次いでクローニングする遺伝子を同定することによってこのような遺伝子のプールが作成され得る。どの酵素生成遺伝子をクローニングするかの選択は、いくつかの要素に依存し得る。その産物が特定の特性を有することが知られているかまたはそうであると考えられる特定の遺伝子を同定することが望まれ得る。これらの特性としては、例えば、高ｐＨ値または低ｐＨ値での活性、高塩濃度、高温での活性、特定の大きさまたはアミノ酸組成のタンパク質をコードする能力、特定の基質に対する活性の保有、または特定のクラスのタンパク質のメンバーであることが挙げられる。次に、望ましい遺伝子セットが、当該分野で公知の方法（例えば、ＰＣＲ（これらの遺伝子を含む株からの））を用いて増幅される。あるいは、合成オリゴヌクレオチドをアニーリングおよび伸長することによって、その遺伝子が設計および合成され得る。このような遺伝子合成方法は、当該分野で公知である。続いて、得られたＤＮＡは、予測されたタンパク質が細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現され得る様式で、発現ベクター中にクローニングされる。
【００５７】
第二に、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてこれらのタンパク質が発現され、そして試験する活性を含む抽出物が調製される。このことは、これらの細胞から溶解物を生成することによって、活性を含む上清を収集することによって、または、例えば、カラムクロマトグラフィーによってその活性を精製することによって達成され得る。
【００５８】
第三に、この様式で調製された抽出物は、当該分野で公知のアッセイを用いて試験され、そして使用されるアッセイにおいて活性を生じたクローンが同定される。現行法とは対照的に、ポリマー炭水化物とリグニンの複雑な混合物、または実際のリグノセルロースは、バイオマス変換酵素により攻撃される基質として使用される。これらの複雑な基質からの糖およびオリゴ糖の遊離を測定するために使用され得る一つのアッセイは、ジニトロサリチル酸アッセイ（ＤＮＳ）であるあ。このアッセイにおいて、リグノセルロース物質（例えば、トウモロコシまぐさ）は、異なる時間、酵素と共にインキュベートされ、遊離した還元糖が測定される。このアッセイは、任意の複雑なリグノセルロース物質（トウモロコシまぐさ、ウッドチップなど）を使用する。
【００５９】
本発明の一つの局面において、リグノセルロース物質は、補助酵素混合物により前処理される。この混合物は、（１）業者；（２）酵素を発現するクローニング遺伝子；（３）複合ブロス（例えば、タンパク質および酵素を培地中に分泌する微生物株の培地中での増殖により得られるブロス）；（４）（３）のようにして増殖された株の細胞溶解物；および（５）リグノセルロースを分解し得る酵素を発現する植物物質、由来の酵素で構成される。
【００６０】
前処理後、リグノセルロース物質は、セルロース分解酵素（例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来の酵素混合物）で処理され得る。この混合物のアリコートは、アッセイ構成の前後の種々の時点で採取され得、そして糖の遊離がＤＮＳアッセイによって測定され得る。
【００６１】
本発明の別の局面において、補助酵素およびセルラーゼによる処理は、同じ反応容器中で行われる。この局面において、セルラーゼ処理および補助酵素処理が組み合わされることを除いて、上記のような工程が実施される。
【００６２】
これらのアッセイを用いて、試験される補助酵素混合物の、セルロースから糖を生成する能力が評価され得る。さらに、種々の酵素、酵素の組み合わせ、または物理的処理によるリグノセルロースから糖へおよびオリゴ糖への変換が測定され得る。
【００６３】
本発明において記載されたようなアッセイにおける複雑なリグノセルロース基質（例えば、トウモロコシまぐさおよびトウモロコシ繊維）の使用は、リグノセルロースの異なる成分（例えば、セルロース、ヘミセルロース、および／またはリグニン）を分解する酵素分類間の相乗作用性の試験および測定を可能にする。
【００６４】
（酵素の相乗作用的組み合わせを同定する方法）
各々リグノセルロース物質を分解する酵素の最適な比および組成を同定する方法もまた提供される。これらの方法は、任意のリグノセルロース基質からその構成糖への効率的な変換のための最適な酵素組成および比を同定する試験を伴う。
【００６５】
記載されるような試験において、リグノセルロース基質（例えば、トウモロコシまぐさ、乾草、サトウキビバガス、および他の農作物バイオマス、スイッチグラス、森林廃棄物、ポプラのウッドチップ、パインのウッドチップ、おが屑、庭廃棄物など）を使用し、そして遊離する糖およびオリゴ糖の量を測定することで、リグロセルロースの異なる成分を変換する酵素のクラス間の相乗作用性が測定され得る。例えば、トウモロコシまぐさに対して高い活性を与えるのに必要とされるエンドキシラナーゼとセルラーゼ（またはいくつかのセルラーゼおよび他の酵素の混合物で構成される調製物）の比が、測定され得る。その結果、異なるリグノセルロース基質（例えば、トウモロコシ繊維）の効果的な分解のために必要とされるこのような酵素の比は、本明細書中に提供される方法により決定され得る。
【００６６】
以下の実施例は、例示目的で提供され、限定ととられるべでない。
【実施例】
【００６７】
（実施例１：トウモロコシまぐさからの還元糖およびオリゴ糖の遊離のハイスループット定量）
少量の乾燥トウモロコシまぐさ（約３０ｇ）を、５分間隔でＷａｒｉｎｇ  ｂｌｅｎｄｅｒ中で粉末化し、ｃｏａｒｓｅ粉末混合物を生成する。この様式においてまぐさをプロセシングすることは、均一な粒子サイズを増加し、そして個々のトウモロコシの茎および植物残渣における不均質に起因するサンプルの不均質を減少する。この実施例において、０．２ｇの粉末のまぐさ物質を、各アッセイサンプルについて５０ｍｌの円錐管に配置する。まぐさを１５ｍｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄し、未結合の糖を除去する。このスラリーを、３０秒間ボルテックスし、５分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、そしてこの上清をピッペティングによって除去する。
【００６８】
このまぐさサンプルを、１０ｍｌの酵素溶液またはアッセイされる滅菌濾過した上清に再懸濁する。次いで、この混合物を空気振とう機（２５０〜３００ｒｐｍ）中で所望の温度でインキュベートする。適切な時点で、まぐさの上清を、振とう機から取り出し、そして４０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。少量の上清（約３００μｌ）を、管から取り出し、そして１．５ｍｌの遠心管に移し、ＤＮＳアッセイによってアッセイする。
【００６９】
（実施例２：可溶性糖の遊離を増強するセルラーゼ媒介分解の前のキシラナーゼによるトウモロコシまぐさの前処理）
トウモロコシまぐさのサンプル（０．２ｍｇ／試験管；上記の緩衝液で洗浄および調製した）を、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ由来のキシラナーゼ０、１０、または１００単位と共に、３７℃にて６時間、前処理反応においてインキュベートした。前処理の最後に、各サンプルを１００単位のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼで処理し、そして３７℃で１８時間インキュベートした。可溶性糖の遊離を、ＤＮＳ法を用いて還元糖の量を測定することによりモニタリングした。表１は、可溶性糖の遊離を経時的に示す（５４０ｎｍでのＤＮＳ吸光度により検出した）。表１の各時点は、４回の独立した測定の平均を反映している。前処理工程は、セルラーゼ添加後のまぐさから可溶性糖への変換を実質的に増加させることが観察された。
【００７０】
（表１）
キシラナーゼ前処理      還元糖の遊離
（活性単位）            （Ａ５４０）
０            ２．５７
１０            ３．８４
１００            ４．７３
（実施例３：可溶性糖の遊離を増強するための精製セルロースおよびキシラナーゼ酵素によるトウモロコシまぐさの同時処理）
トウモロコシまぐさのサンプル（０．２ｍｇ／試験管；上記の緩衝液で洗浄および調製した）を、Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ由来のキシラナーゼ１０、１００、または５００単位と共に、３７℃にて６時間インキュベートした。同時に、１００単位のＴ．ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼを含むサンプルを、Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ由来キシラナーゼ０、１０、１００、または５００単位と共に、３７℃にて６時間同時処理した。可溶性糖の遊離を、３００μｌのアリコートを採取し、ＤＮＡ法を用いて還元糖の量を測定することにより定量した。表２は、可溶性糖の遊離を示す（５４０ｎｍでのＤＮＳ吸光度により検出した）。表２の各時点は、４回の独立した測定の平均を反映している。同時処理は、いずれかの酵素単独、またはいずれかの酵素の活性の和よりも実質的に多くの糖を遊離することが観察された。
【００７１】
（表２）
セルラーゼ          キシラナーゼ          還元糖の遊離
（活性単位）        （活性単位）          （Ａ５４０）
０                １０                ０．１
０              １００                ０．３
０              ５００                ０．６
１００                  ０                ２．１
１００                １０                ２．４
１００              １００                ３．４
１００              ５００                ３．９
（実施例４：セルラーゼおよびキシラナーゼによるまぐさの同時処理は多量の糖を遊離させる）
トウモロコシまぐさのサンプル（０．２ｍｇ／試験管；上記緩衝液で洗浄および調製した）を、セルラーゼ酵素（５００単位、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）およびキシラナーゼ（５００単位、Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）で、０、２４、および４８時間同時処理した。未処理コントロールもまた調製した。３７℃で２４時間および１２０時間のインキュベーション後、可溶性糖の遊離を、５４０ｎｍでのＤＮＳ吸光度により検出した。表３の各データ点は、４回の独立した測定の平均を反映している。
【００７２】
（表３）
時点（時間）          まぐさの加水分解        葉の加水分解
（酵素なし）      （セルラーゼ＋キシラーゼ）
０              ０．３％                  ０．３％
２４              ０．４％                ３２．１％
１２０              ０．８％                ３７．６％
（実施例５：トウモロコシまぐさを分解し得る微生物株の同定）
微生物を、濃縮増殖培地（例えば、Ｌｕｒｉａブロス）中、培養フラスコ（代表的には２５０ｍＬ緩衝液フラスコ中に５０ｍＬ培養物）で増殖させる。中温性株を、代表的には、３０℃で４８時間増殖させ、好熱性株は、代表的には、６５℃で１８時間増殖させる。個々の株を増殖させた後、細胞を、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清をクリアにし、この上清をさらに、注射器濾過ユニットまたは減圧濾過滅菌ユニットを通過させることにより滅菌する。この滅菌した培養濾液をさらに、濃縮ユニットを用いて濃縮する。上清のタンパク質の濃縮の１つの方法は、回転濾過濃縮ユニット（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＭｉｃｒｏｎ／Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ／Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐユニット（）３０００分子量カットオフ）を使用するが、他の濃縮方法もまた適切である。この滅菌培養上清（または濃縮培養濾液）を、トウモロコシまぐさを分解する能力についてアッセイする。
【００７３】
クリアにした上清を、以下の様式でまぐさ基質と混合する：約３０ｇのトウモロコシまぐさを、「高」設定で、２×５分間隔で、Ｗａｒｉｎｇブレンダー中で挽く。スクリーニングする各抽出物について、４ｍｌの濃縮上清を、０．１ｇの挽いたまぐさおよび１ｍｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０（緩衝液として）を添加する。次いで、各試験管を、インキュベーターシェーカーのラックに入れ、そして振盪しながら５０℃で一晩（１６〜２０時間）インキュベートする。個々のサンプルを軽く濃縮し、出発バイオマス基質と、この基質から上清に遊離した任意の可溶性還元糖を分離する。個々の試験管を、ＤＮＳアッセイを用いて葉からの還元糖の遊離について試験する。
【００７４】
（実施例６：トウモロコシまぐさに作用する補助酵素を生成する株の同定）
補助酵素を生成する株は、上記の様にトウモロコシまぐさを分解し得る。補助酵素を生成する株を同定するために、その後のセルラーゼ分解を容易にする酵素を生成する株を試験し得る。実施例６のように調製および濃縮された培養濾液を、種々の時間（実施例６のように）、まぐさと共にインキュベートする。分泌タンパク質と共にまぐさをインキュベートした後、試験管を２０分間ボイルし、酵素およびプロテアーゼ活性を破壊する。ボイル後、試験管を５０℃まで冷まし、そして１００単位のセルラーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）を各試験管に添加する。この試験管を５０℃で１６〜２０時間インキュベートする。このインキュベーションの後、還元糖を、ＤＮＳアッセイによって定量する。
【００７５】
１００異常の微生物株を、この方法において記載されるようにしてスクリーニングした。株を増殖および滅菌し、そして濃縮培養上清を増殖培養物から調製した。これらの濾液を上記のようにトウモロコシまぐさを分解する能力についてアッセイし、遊離した還元糖の量を定量した。まぐさを分解しない１２株のアッセイは、０．１１３±０．２３のＡ５４０ｎｍでの平均ＤＮＳ値を生じた。いくつかの株は、コントロールよりもずっと良好であり、かつ基底レベル活性を示す株よりもずっと良好な（平均を超える３つの標準偏差よりも高い）糖遊離能力を示した。これらの活性を、表４に示す。
【００７６】
従って、本発明の方法は、植物バイオマス（トウモロコシまぐさを含む）の分解において有用な株を同定するのに有用である。
【００７７】
（表４）
株の番号          還元糖の遊離（Ａ５４０）
ＡＴＸ３６６１          １．００４
ＡＴＸ６０２４          ０．４５０
ＡＴＸ１４１０          ０．３９５
ＡＴＸ６０２７          ０．２４２
ＡＴＸ５９７５          ０．２２６
ＡＴＸ４２２１          ０．２０７
（実施例７：トウモロコシ繊維およびＤｉｓｔｉｌｌｅｒの乾燥粒を分解する能力を有する酵素の同定）
本明細書中に記載されるアッセイを、他のリグノセルロース基質とも使用について適合し得る。この実施例において、トウモロコシ繊維をこのアッセイに適合し、そして酵素を、トウモロコシ繊維およびＤｉｓｔｉｌｌｅｒの乾燥粒を分解するについて試験する。
【００７８】
トウモロコシ繊維およびＤｉｓｔｉｌｌｅｒの乾燥粒のサンプル（１．０ｇ／試験管；上記のような緩衝液で洗浄および調製した）を、セルラーゼ酵素（５００単位、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）またはキシラーゼ（５００単位、Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）で処理した。未処理のコントロールもまた同様にして調製した。０時間および２４時間の３７℃でのインキュベーション後、可溶性糖の遊離を、５４０ｎｍでのＤＮＳ吸光度により検出した。表５における各データ点は、４回の独立した測定の平均を反映している。
【００７９】
（表５）
時点（時間）                                ：      ０  ：      ２４
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−：−−−−−：−−−−−
トウモロコシ繊維の加水分解                    ：  ２．２  ：  １４．６
（５００単位のセルラーゼ＋キシラナーゼ）  ：          ：
トウモロコシ繊維の加水分解                    ：  ２．２  ：    ２．２
（酵素なし）                              ：          ：
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒの乾燥粒の加水分解          ：  ２．０  ：    ８．８
（５００単位のセルラーゼ＋キシラナーゼ）  ：          ：
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒの乾燥粒の加水分解          ：  １．９  ：    ２．０
（酵素なし）
本願において言及された全ての刊行物および特許は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示すものである。全ての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出願が詳細かつ個々に参考として援用されるように、本明細書中に参考として援用される。
【００８０】
前述の発明は、理解を明確にする目的で、例示および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、ある程度の変更および改良が添付の特許請求の範囲内で実施され得ることが明らかである。従って、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されず、改良および他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図していることが理解できるはずである。特定の用語が本明細書中で使用されているが、包括的かつ記述的な意味で使用され、限定の目的で使用されていない。
【国際調査報告】
2005523720.tif 000011