(57)【要約】本発明は、患者が自己由来腫瘍に対する応答を生じるような、患者に結合剤を投与するための方法及び組成物に関する。本結合剤はアポトーシス性腫瘍細胞を標的とし、これらのアポトーシス性腫瘍細胞の樹状細胞又は他の抗原提示細胞による取り込みを促して、血中の腫瘍関連抗原を発現させることなく（又は、血中の腫瘍抗原の必要なく）免疫系によるプロセッシング及び提示させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者を処理して、抗原を発現する標的細胞の増殖を低下させる、及び／又は、致死させる方法であって、
（ａ）標的細胞のアポトーシスを起こさせる一種以上の薬剤を投与するステップと、
（ｂ）前記抗原に対して免疫反応性の抗体を投与するステップであって、前記抗体が、前記標的細胞に対して細胞傷害性であるステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記標的細胞が形質転換細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記形質転換細胞が腫瘍細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記処理が、患者における標的細胞数を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アポトーシスを起こさせる前記薬剤及び前記抗体が患者に組み合わせて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アポトーシスを起こさせる薬剤の後で、前記抗体が患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アポトーシスを起こさせる薬剤の前に、前記抗体が患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標的細胞のアポトーシスを起こさせる前記一種以上の薬剤が化学療法薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が異種型モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種型モノクローナル抗体が、Alt-1、Alt-2、Alt-3、Alt-4、及びAlt-5から成る群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アポトーシスを起こさせる前記一種以上の薬剤及び前記抗体が、患者に投与されたときに有効なB及び／又はT細胞応答を惹起する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記有効なT細胞応答が、Tヘルパ応答；CTL応答；並びにTヘルパ応答及びCTL応答から成る群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
患者を処理して、抗原を発現する標的細胞の増殖を低下させる、及び／又は、致死させる梱包された医薬であって、
（ａ）標的細胞上で到達可能である、前記抗原に対して免疫反応性の抗体調合物であって、抗原提示細胞による前記標的細胞のエンドサイトーシスを誘導し、前記標的細胞に対して細胞傷害性である、抗体調合物と、
（ｃ）標的細胞のアポトーシスを起こさせる処理と前記抗体調合物を併用するための指示と、
を含む、梱包された医薬。
【請求項１５】
標的細胞のアポトーシスを起こさせる一種以上の薬剤をさらに含む、請求項１４に記載の梱包された医薬。
【請求項１６】
標的細胞のアポトーシスを起こさせる前記一種以上の薬剤が化学療法薬である、請求項１５に記載の梱包された医薬。
【請求項１７】
アポトーシスを起こさせる前記一種以上の薬剤が、前記抗体調合物とは別に調合されている、請求項１５に記載の梱包された医薬。
【請求項１８】
アポトーシスを起こさせる前記一種以上の薬剤が、前記抗体調合物と一緒に調合されている、請求項１５に記載の梱包された医薬。
【請求項１９】
前記抗体調合物が異種型モノクローナル抗体調合物である、請求項１４に記載の梱包された医薬。
【請求項２０】
前記異種型モノクローナル抗体調合物が、Alt-1、Alt-2、Alt-3、Alt- 4、及びAlt-5 から成る群より選択される、請求項１９に記載の梱包された医薬。
【請求項２１】
前記標的細胞が形質転換細胞である、請求項１４に記載の梱包された医薬。
【請求項２２】
前記形質転換細胞が腫瘍細胞である、請求項２１に記載の梱包された医薬。
【請求項２３】
標的細胞のアポトーシスを起こさせる前記一種以上の薬剤及び前記抗体調合物が、患者において有効なB及び／又はT細胞応答を誘導する、請求項１４に記載の梱包された医薬。
【請求項２４】
前記有効なT細胞応答が、T ヘルパ応答、CTL応答、並びにTヘルパ応答及びCTL応答から成る群より選択される、請求項２３に記載の梱包された医薬。
【請求項２５】
前記抗体調合物が、約100μg／患者乃至約2mg／患者の投薬量で調合されている、請求項１４に記載の医薬梱包物。
【請求項２６】
前記抗体調合物が、約0.1μg／ml乃至約200μg／mlの投薬量で調合されている、請求項１４に記載の医薬梱包物。
【請求項２７】
前記抗体調合物が凍結乾燥している、請求項１４に記載の医薬梱包物。
【請求項２８】
患者を処理して、抗原を発現する標的細胞の増殖を低下させる、及び／又は、致死させるキットであって、
（ａ）標的細胞のアポトーシスをex vivoで起こさせる一種以上の薬剤と、
（ｂ）標的細胞上で到達可能な前記抗原に対して免疫反応性の抗体調合物であって、標的細胞の抗原提示細胞によるエンドサイトーシスを誘導し、前記標的細胞に対して細胞傷害性である、抗体調合物と、
（ｃ）前記一種以上のアポトーシス剤で標的細胞をex vivoで処理すると共に、処理された標的細胞を前記抗体調合物と組み合わせて投与するための指示と、
を含む、キット。
【請求項２９】
前記キットが、患者試料から標的細胞を単離するための手段を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
患者試料から標的細胞を単離するための前記手段が、抗体；レクチン；His-タグ配列；及びエンテロキナーゼ開裂タグから成る群より選択される親和性精製手段を含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記キットが、患者試料から樹状細胞を単離する手段を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３２】
前記キットがHLAを適合させた樹状細胞を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３３】
前記抗体が異種型モノクローナル抗体である、請求項２８に記載のキット。
【請求項３４】
前記異種型モノクローナル抗体がAlt-1; Alt-2; Alt-3; Alt-4; 及び Alt-5から成る群より選択される、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
標的細胞のアポトーシスをex vivoで起こさせる前記一種以上の薬剤が化学療法薬である、請求項２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
発明の背景
関連出願
本出願は、その全文を引用をもってここに援用することとする２００２年４月１１日出願の米国仮出願60/371,802号、２００２年１０月２２日出願の米国仮出願第60/420,269号、及び、２００２年１０月２２日出願の米国仮出願60/420,291号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本出願は、免疫学の分野に関し、より具体的には、自己由来腫瘍細胞に対して向上した免疫原性を促進する際の、血中腫瘍抗原又は腫瘍細胞及び樹状細胞との結合剤の併用に関する。
【０００３】
関連技術の概要
Tリンパ球（即ちT細胞）は、典型的には、Bリンパ球（即ちB細胞）とは異なり、抗原が主要組織適合性複合体（MHC）の関連で提示された場合にのみ、それらの標的抗原を認識する。従って、Tヘルパ細胞及び細胞傷害性T細胞を含むTリンパ球に抗原を提示するには、抗原は、MHC分子の関連で、抗原提示細胞の表面上に提示されねばならない。
【０００４】
具体的には、抗原提示細胞の一種である樹状細胞が、癌の免疫治療の分野で最近、注目を持たれ始めてきた。樹状細胞は骨髄を由来とする珍しい白血球であり、身体全体に分布して見つかり(Steinman, Annu. Rev. Immunol. 9 : 271-296 (1991) )、腫瘍ワクチンの生物学的アジュバントとして含有させられる可能性があるために、ますます関心を集めている(Bjork, Clinical Immunology 92 : 119-127 (1999))。樹状細胞は、免疫グロブリンIgGのFc受容体を発現するが、この受容体が、抗原-IgG複合体（IC）の内部移行を媒介する。こうした能力により、樹状細胞はT細胞への腫瘍抗原提示に用いられる。腫瘍ペプチドを成熟樹状細胞にパルシングする方法を含め、腫瘍抗原を樹状細胞に直接取り込ませるためにいくつかのアプローチが採られてきた(Avigan, Blood Reviews 13: 51-64 (1999))。ex vivoで腫瘍抗原で取り込ませると共に、細胞性ワクチンとして投与される単離樹状細胞が、防御的及び治療的抗腫瘍免疫性を誘導することが実験動物で見出されている(Timmerman et al., Annu. Rev. Med. 50: 507-529 (1999))。
【０００５】
ヨーロッパ特許第EP0553244号は、抗原に対する応答を刺激するための抗原／二重特異的結合剤の複合体を解説しており、この場合、前記結合剤は、抗原と、抗原提示細胞上の細胞表面受容体の両方に特異的に結合するが、細胞表面受容体へのこの結合剤の結合では、この受容体に対する天然リガンドは遮断されない。
【０００６】
抗原がFcγ受容体を介して樹状細胞に取り込まれると、抗原提示及びT細胞増殖が機能的に促進されることが、in vitroヒツジ系で見出されている(Coughlan et al.,  Veterinary Immunology and Immunopathology 49 : 321-330(1996))。さらに、マウス系では、Fcγ受容体は、樹状細胞の成熟を誘導し、外因性の免疫グロブリン（Ig）と複合体形成した抗原由来のペプチドの、効率的なMHCクラスＩ限定性提示を促進する(Regnault et al., J.Exp. Med. 189: 371-380 (1999))。
【０００７】
ex vivoの抗体／腫瘍細胞複合体が樹状細胞取り込みに及ぼす影響を研究するために、骨髄腫のex vivoヒトモデルを利用しようとする試みが最近なされているが、治療上の利点は立証されていない(Dhodpkar et al, J. Exp. Med. 195:125-133 (2002) )。
【０００８】
このように、ヒト疾患を治療するために樹状細胞を利用する方法を発見する必要が依然、ある。癌などの疾患を治療するという、樹状細胞ベースのアプローチの将来性は、このようなアプローチを有効な治療法として実際に開発することの必要性を強調するものである。
【０００９】
発明の概要
本発明は、腫瘍細胞に関連する疾患の治療のための有効な治療方法、組成物、及び医薬梱包物を提供するものである。
【００１０】
本発明に基づく組成物は、結合剤、樹状細胞、腫瘍細胞抗原、腫瘍細胞、アポトーシス性腫瘍細胞、結合剤−腫瘍細胞抗原複合体、及びアポトーシス誘導剤を包含するものである。本発明に基づく組成物は、ex vivoで作製して患者に投与したり、あるいは、in vivoでの治療効果に向けて患者に直接投与することができる。本発明の組成物の投与は、以下：アジュバント、免疫原性担体、及びアポトーシス誘導剤、の存在下又は非存在下で行うことができる。本発明に基づく組成物は、患者に対し、患者１人当たり約2mg未満の用量で投与されたときに有効である。
【００１１】
本発明の局面の一つは、多エピトープ性抗原を発現する標的細胞の増殖を低下させる、及び／又は、致死させるために、患者を処理する方法を提供するものであり、前記方法は、標的細胞のアポトーシスを起こさせる一種以上の薬剤を投与するステップと、前記多エピトープ性抗原に対して免疫反応性の抗体を投与するステップと、を含み、但しこの場合、前記抗体は、前記多エピトープ性抗原に対して抗イディオタイプ型応答を誘導でき、また前記抗体は、アポトーシス中の標的細胞上で到達可能な前記標的細胞にとって細胞傷害性であり、またさらに前記抗体は、アポトーシス標的細胞の抗原提示細胞によるエンドサイトーシスを誘導するものである。当該の標的細胞は形質転換細胞（例えば腫瘍細胞）である。本発明の方法は、患者体内の標的細胞数を減少させる。本発明の組成物を別々に投与することも、又は、組み合わせて投与することもできる。標的細胞のアポトーシスを起こさせる、前記本発明の一種以上の薬剤は化学療法薬である。本発明の抗体には、例えば、Alt-1、Alt-2、Alt-3、Alt-4、及びAlt-5などの異種型モノクローナル抗体がある。それを必要とする患者に投与されたとき、本発明の組成物は、患者に投与されたときに有効なB細胞及び／又はT細胞応答を惹起し、但しこの場合、前記有効なT細胞応答は、Tヘルパ応答；CTL応答；又はTヘルパ細胞応答及びCTL応答である。好ましくは、本発明の患者はヒトの患者であるとよい。
【００１２】
本発明の実施態様の一つは、多エピトープ性抗原を発現する標的細胞の増殖を低下させる、及び／又は、致死させるために患者を処理するための梱包された医薬であり、前記医薬は、アポトーシス中の標的細胞上で到達可能な、前記多エピトープ性抗原と免疫反応性の抗体調合物を含み、そして前記抗体は、抗原提示細胞によるアポトーシス性標的細胞のエンドサイトーシスを誘導して、前記多エピトープ性抗原に対する抗イディオタイプ型応答を誘導でき、そして前記抗体は前記標的細胞に対して細胞傷害性である。前記医薬は、さらに、標的細胞のアポトーシスを起こさせる処理と本抗体とを併用するための指示も含む。梱包された本医薬には、さらに、化学療法薬など、標的細胞のアポトーシスを起こさせる一種以上の薬剤を含めることができる。梱包された本医薬の組成物は、本抗体と別々に調合することも、又は一緒に調合することもできる。梱包された本医薬の抗体は、好ましくは、Alt-1、Alt-2、Alt-3、Alt-4、及びAlt-5などの異種型モノクローナル抗体であるとよい。梱包された本医薬の標的細胞は、腫瘍細胞などの形質転換細胞であってよい。標的細胞のアポトーシスを起こさせる一種以上の薬剤と、梱包された本医薬の抗体は、患者において有効なB細胞及び／又はT細胞応答を誘導するが、但しこの場合、前記有効なT細胞応答は、Tヘルパ応答；CTL応答；又はTヘルパ応答及びCTL応答である。本医薬梱包物の組成物は、患者が2mg以下の用量を受けるような低用量で調合することができる。低調合物の例には、例えば、約100μg／１人の患者から約2mg／１人の患者の投薬量；又は、約0.1μg／１人の患者から約200μg／１人の患者の投薬量、がある。
【００１３】
本発明の実施態様の一つは、多エピトープ性抗原を発現する標的細胞の増殖を低下させる、及び／又は、致死させるために、患者を処理するキットを提供するものであり、前記キットは、標的細胞のアポトーシスをex vivoで起こさせる一種以上の薬剤と、アポトーシス中の標的細胞上で到達可能な前記多エピトープ性抗原に対して免疫反応性の抗体調合物と、を含み、但しこの場合、前記抗体は、アポトーシス標的細胞の抗原提示細胞によるエンドサイトーシスを誘導して、前記多エピトープ性抗原に対するAb3'応答を誘導でき、そして前記抗体及びAb3'応答は、前記標的細胞に対して細胞傷害性である。前記キットは、さらに、前記アポトーシス剤で標的細胞をex vivoで処理すると共に、処理された標的細胞を前記抗体調合物と組み合わせて投与するための指示も含む。本発明のキットには、さらに、患者試料から標的細胞を単離するための手段を含めることもできる。このような手段には、抗体などの親和性精製手段；レクチン；His-タグ；及びエンテロキナーゼ開裂タグ、がある。本発明のキットには、さらに、患者試料から樹状細胞又は他の抗原提示細胞を単離する手段を含めることもできる。このような手段には、抗体又はレクチンなどの親和性精製手段；磁気ビーズ、接着表面又はエルトリエーション器、がある。本キットの抗体は、好ましくは、Alt-1；Alt-2；Alt-3；Alt-4；及びAlt-5などの異種型モノクローナル抗体であるとよい。本キット内に提供される、標的細胞のアポトーシスをex vivoで起こさせる一種以上の薬剤は化学療法薬であってもよい。
【００１４】
発明の開示
１．  概観
数多くの化学療法薬が細胞傷害性であり、癌治療におけるそれらの有効性は、癌細胞が、急速に代謝されたり、あるいは正常細胞が用いない生化学的経路を用いるために、正常細胞よりもこのような細胞傷害性治療に対する感受性が一般により高いという事実に基づく。多くの化学療法薬に関し、細胞傷害効果は、アポトーシスとも呼ばれるプログラムされた細胞死を誘導する結果だと考えられている。しかしながら、化学療法における大きな障壁は、多くの化学療法薬の有効性を低下又は無くすような化学療法耐性の発生であろう。このような耐性は、しばしば、化学療法薬で、アポトーシスを特定の癌細胞で誘導できなくなることにつながる。化学療法耐性に拮抗できれば、多くの化学療法薬の効験を維持でき、これらの薬剤の投薬量を低くする助けにもなり、従ってこれらの薬剤の望ましくない副作用を軽減したり、又は避けることができる。
【００１５】
しかしながら、化学療法は、腫瘍細胞に特異的でなく、血球などの他の増殖性細胞も破壊する。これらには、活性化B及びT細胞のような免疫系の細胞も含まれる。従って、化学療法は、ワクチン法とは相乗的でないと広く考えられている。
【００１６】
本発明は免疫療法に関する。より具体的には、本発明は、免疫療法における、結合剤と、抗原提示細胞、特に樹状細胞、の使用に関するものである。本発明は、治療上有効な腫瘍細胞ベースの方法を癌治療に提供する。ここで引用された特許及び公開文献を、それらの全文を引用をもってここに援用することとする。
【００１７】
本発明は、癌に罹患した患者を処理するための方法及び組成物を提供するものである。本発明に基づく方法及び組成物は、アポトーシス性腫瘍細胞上の抗原に特異的な結合剤と、前記アポトーシス性腫瘍細胞と樹状細胞とをex vivo又はin vivoで配合するステップを含み、この場合、当該の患者は治療上の利益を受ける。
【００１８】
ある一つの動物種由来の特定の抗体を免疫原として適した第二の種に注射する場合、注射される抗体は免疫応答を惹起するであろう（例えば注射された抗体に対する抗体又はT細胞に対して「抗-抗体」が産生されるなど）。従って、異種型抗体は、同じ種由来の抗体に比較して、より免疫原性が高く、他の方法では認識されない抗原に対して免疫応答を誘導する上で、より有益である。これらの抗-抗体のいくつかは、注射される抗体の可変ドメインの固有エピトープ（即ちイディオトープ）に対して特異的であろう。これらのエピトープは、一次抗体のイディオタイプであり、従って、これらのエピトープに結合する二次（抗）抗体は抗イディオタイプ抗体である。ある一個の抗体の可変部分に存在するイディオトープのすべての合計がそのイディオタイプである。Ab2は、最初の抗原の補体である結合部位を有し、従って、最初の抗原の「内側像」を再現して、サロゲート抗原として働く。
【００１９】
免疫応答中に最初に産生される抗体は、当該生物が寛容でない固有のエピトープを持つため、一次抗体（Ab1）のイディオタイプを狙う二次抗体（Ab2）の産生が惹起されることになる。こうして、このAb2は、三次抗体（Ab3）の誘導を誘導するイディオタイプを有する。
【００２０】
Ab1→Ab2→Ab3
【００２１】
本発明は、アポトーシス中の標的細胞上で到達可能な、多エピトープ性標的細胞間連抗原の所定のエピトープに対して免疫反応性の抗体に関するものであり、この場合、前記抗体は、抗原提示細胞によるアポトーシス性標的細胞のエンドサイトーシスを誘導する。これにより、標的細胞抗原の認識が変化して、ホストの免疫系が、以前は認識されなかった標的細胞を認識し、対する免疫応答を惹起できるようになる。このような免疫応答には、当該標的細胞抗原に特異的な、抗体、Tヘルパ細胞及び／又は細胞溶解性T細胞を含めることができる。本発明の顕著な特徴の一つは、多エピトープ性抗原上の第二エピトープを認識するAb3'抗体が産生され、その結果、抗原が変化すると露出する抗原上の第二エピトープに、このAb3'（抗イディオタイプ）抗体が結合することである。
【００２２】
ＩＩ．  定義の例
ここで用いる場合の用語「種」又は「動物」とは、哺乳動物、好ましくはヒトなどの哺乳動物を言う。同様に、本発明の方法により治療しようとする「患者」又は「対象」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれかを意味する場合がある。
【００２３】
ここで用いる「免疫原性複合体」は、腫瘍標的細胞上の腫瘍標的細胞抗原への、又は、血中腫瘍細胞抗原への、本結合剤のin vivo又はex vivoでの結合による連結前には、当該免疫系では認識されなかった結合剤／腫瘍標的細胞の複合体を意味する。
【００２４】
ここで用いる「結合剤」とは、例えば抗原に結合できる結合部分など、免疫原性の対を含め、一対の結合対のメンバーを言い、好ましくは、しかし限定はしないが、所定の腫瘍抗原など、抗原上に発現する単一のエピトープである。本発明のいくつかの実施態様では、本結合剤は、抗原に結合したときに、免疫原性の複合体を形成する。ある実施態様では、本結合剤とは抗体を包含するものである。
【００２５】
ここで用いる用語「抗体」とは、他に示唆しない限り、抗体分子や、多種の抗体由来分子の両方を言うために広く用いられている。このような抗体由来分子は、少なくとも一つの可変領域（重鎖又は軽鎖可変領域の）や、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖と他の分子との間のキメラ融合体等を包含するものである。本発明に基づく機能的免疫グロブリン・フラグメントは、Fvでも、scFvでも、ジスルフィドで連結したFvでも、Fabでも、そしてF (ab')2であってもよい。本発明による抗体又はそのフラグメントは、例えば、それらが抗体依存的細胞傷害性（ADCC）又は補体依存的細胞傷害性（CDC）を誘導するように、標的細胞にとって細胞傷害性であってよく、しかし必ずしもそうでなくともよい。
【００２６】
さらに用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（「MAb」）、好ましくはIgG1抗体；キメラモノクローナル抗体（「C-MAb」）；ヒト化抗体；遺伝子操作されたモノクローナル抗体（「G-MAb」）、も包含される。
【００２７】
本抗体は、２つの結合部位を有する「二重特異的抗体」であってもよく、この場合、一方の結合部位は本発明の（アポトーシス性）腫瘍細胞に特異的であり、他方は、樹状細胞表面上の受容体に、例えばそのリガンド結合部位でなど、特異的である。いくつかの好適な実施態様では、本発明の結合剤は、結合部位が標的細胞抗原に特異的であり、定常領域又は糖質部分が、リガンド部位などの受容体結合を担うような抗体である。好ましくは、本抗体は、患者１人当たり約1002mg又は1-100μg/kg  10pg/mlの濃度で提供されるとよい。
【００２８】
「抗体の活性部分」とは、腫瘍標的細胞抗原に特異的な腫瘍標的細胞結合部位を含有する分子である。あるいは、「抗体の活性部分」とは、樹状細胞上の受容体に、そのリガンド結合部位（例えば、重鎖定常領域又はヒンジ領域の糖質鎖を含む抗体のFc部分）に結合する受容体結合部位を含有する分子である。従って、本発明の抗体は、当該抗体が腫瘍細胞に特異的に結合できる限りにおいて、そして、標的細胞を結合させたままで、当該抗体が、樹状細胞上の受容体に、そのリガンド結合部位で結合する部分を含有する限りにおいて、例えばキメラ抗体、一本鎖抗体、変異抗体、又は抗体フラグメントなどであってよい。
【００２９】
本発明の好適な結合剤はモノクローナル抗体であり、そしてさらにより好ましくは異種型モノクローナル抗体である。患者がヒトである場合、これらの異種型モノクローナル抗体には、限定はしないが、マウスモノクローナル抗体が含まれる。特に好適なマウスモノクローナル抗体には、Alt-1 (MUC-1に特異的に結合するマウスIgG1；ATCC No. PTA-975；ヴァージニア州マナサス、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）、Alt-2(OvaRex(R)MAb B43.13、CAI CA125に特異的に結合するオレゴボ（原語：oregovo）mabマウスIgG1 ; ATCC No. PTA-1883)、Alt3 (CAICA19. 9に特異的に結合するマウスIgG3；ATCC No. PTA-2691)、Alt-4 (CA19. 9に特異的に結合するマウスIgM；ATCC No.PTA-2692)、及び Alt-5 (CAICA19. 9に特異的に結合するマウスIgG 1； ATCC No. PTA-2690); 及び Alt-6 (前立腺特異抗原(PSA)に特異的に結合するマウスIgG1；ATCC No. HB-12526)、がある。
【００３０】
本発明のある実施態様では、結合剤は、抗原結合ペプチド； 腫瘍結合ペプチド；受容体特異的タンパク質を含むタンパク質；受容体に結合したペプチド；受容体に結合した糖質；ポリペプチド；糖タンパク質；リポタンパク質（例えば成長因子）；リンホカイン及びサイトカイン；酵素、免疫調節物質；ホルモン（例えばソマトスタチン）；エフェクタ機能を媒介する分子に上述のいずれかを接合させたもの；及び上述のいずれかのミミック又はフラグメント、を包含する。本発明の結合剤を標識しても、又は標識しなくてもよい。本発明の結合剤をさらに操作して一個の融合タンパク質を作製し、該融合タンパクの第一部分が腫瘍標的細胞抗原に上記の通りに結合する部分を含有し、そして該融合タンパク質の第二部分が、樹状細胞上の受容体に結合できる、Fc部分、補体固定コンポーネント又は糖質を含有することもできる。
【００３１】
ここで用いる場合の「免疫反応性の」とは、腫瘍標的細胞抗原に特異的であるが、それでも尚他のタンパク質に対しても交差反応性である場合には、ヒトへの投与に向けた使用に調合されたレベルでは毒性でないような結合剤、その抗体又はフラグメントを言う。「特異的に結合する」とは、当該結合剤が、無関係の抗原に結合する場合よりも大きな親和性で標的細胞上の抗原に結合することを意味する。好ましくは、このような親和性が、無関係の抗原に対する当該結合剤の親和性よりも少なくとも１０倍大きい、より好ましくは少なくとも１００倍大きい、そして最も好ましくは少なくとも１０００倍大きいとよい。用語「免疫反応性の」及び「特異的に結合する」はここでは交換可能に用いられている。
【００３２】
「投与する」とは、ここでは、患者の身体内に組成物が至るような態様で患者に組成物を提供することを意味するものと、定義しておく。このような投与は、限定はしないが、皮下、皮内、静脈内、動脈内、腹腔内、及び筋肉内を含め、いずれの経路によってもよい。複数の本発明の組成物を組み合わせて（例えば同じ調合物にして、又は、別々の調合物を同時に投与して）投与することも、あるいは別々に投与することもできる。
【００３３】
当業で通常の技術を有する医師又は獣医であれば、本医薬組成物の必要な「有効量」（ED50）を容易に決定でき、また処方することができる。例えば、この医師又は獣医は、医薬組成物中で用いる本発明の化合物の量を、所望の治療効果を得るには少ない量から開始し、所望の効果が得られるまでこの投薬量を次第に増加させていってもよいであろう。
【００３４】
文言「治療上有効量」とは、ここで用いる場合、患者の腫瘍細胞の腫瘍特異的免疫応答を誘導し、ひいては、医学的処理に適用できる妥当な利益／リスク比で、処理された細胞の経路の生物学的結果を遮断して、腫瘍細胞を消失させたり、又はその増殖を妨げることにより、何らかの所望の治療効果を生むために有効な、本発明の化合物を含む化合物、物質又は組成物の量を意味する。
【００３５】
「有効な免疫応答」とは、患者が、疾患の兆候又は症状の部分的もしくは完全な軽減又は減少を経験するものとここで定義しておき、具体的にはその中には、限定はしないが、延命も含まれる。患者の症状は静的に留まり、腫瘍は大きくならない。さらに、有効な免疫応答は有効なB及び／又はT細胞応答である。T細胞応答は、Tヘルパ応答でも、CTL応答でも、あるいはTヘルパ及びCTL応答の両者でもよい。
【００３６】
「B細胞応答の誘導」とは、腫瘍細胞特異的抗体の産生を起こすものとここで定義しておく。
【００３７】
「CTLの誘導」とは、潜在的細胞傷害性Tリンパ球に、腫瘍細胞特異的細胞傷害性を示させることと、ここで定義しておく。
【００３８】
「腫瘍細胞特異的抗体」とは、抗体の、標的細胞への特異的結合能であるとここで定義しておく。ここで用いられる場合、ある腫瘍細胞に対する抗体の特異性を測定することができ、この場合、腫瘍細胞に対する抗体の親和性は、腫瘍に関連しない他の細胞に対するよりも大きい。
【００３９】
「腫瘍細胞特異的細胞傷害性」とは、細胞傷害性Tリンパ球の、標的細胞を特異的に致死させる能力であると、ここで定義しておく。ここで用いられる場合、ある腫瘍細胞に対するCTLの特異性を測定することができ、この場合、疾患に関連する腫瘍細胞に対する細胞傷害性は、腫瘍に関連しない細胞よりも大きい。
【００４０】
「Tヘルパ応答の誘導」とは、有効な抗体又は細胞溶解性応答が誘導されるように、Tヘルパ細胞に、B細胞又はCTLを支援させることであると、ここで定義しておく。
【００４１】
本発明の実施態様のそれぞれは、薬学的に許容可能な担体又は医薬品添加物と配合された場合には、組成物として用いることができる。「担体」及び「医薬品添加物」はここでは交換可能に用いられている。
【００４２】
文言「薬学的に許容可能な」は、ここでは、妥当な利益／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題又は合併症を起こすことなく、ヒト及び動物の組織に接触させて用いるのに適した、健全な医療上の判断の範囲内にある、化合物、物質、組成物、及び／又は剤形を言うために用いられている。
【００４３】
「薬学的に許容可能な担体」とは、投与された患者にとって生理学的に許容可能であると共に、一緒に投与された樹状細胞結合剤及びアポトーシス性腫瘍細胞（及び／又は樹状細胞）の治療的特性を保持した担体であると、ここで定義しておく。薬学的に許容可能な担体及びそれらの処方は広く公知であり、概略的には、例えば、Remington's pharmaceutical Science (18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990）に解説されている。薬学的に許容可能な担体の一例は生理食塩水である。ここで用いられる場合の文言「薬学的に許容可能な担体」とは、当該の結合剤又は処理済み樹状細胞を、身体の一臓器又は身体の一部分の投与部位から、身体の別の臓器又は一部分に運ぶ又は輸送することに関与する、例えば液体又は固体の充填剤、希釈剤、医薬品添加物、溶媒又は封入剤などの薬学的に許容可能な材料、組成物又は伝播体を意味する。各担体は、その調合物中のその他の成分に対して適合性があり、かつ、患者にとって有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。また薬学的に許容可能な担体は、処理された樹状細胞の本結合剤の特異的活性を変化させてはならない。薬学的に許容可能な担体として働かせることのできる材料のいくつかの例には、（１）ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類、（２）コーンスターチ及びいもでんぷんなどのでんぷん、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及びセルロースアセテートなど、セルロース及びその誘導体、（４）粉末トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）ココアバター及び座薬用ろうなどの医薬品添加物、（９）ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ごま油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油脂類、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチル及びラウリル酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）無発熱源水、（１７）等張の生理食塩水、（１８）リンガー液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、及び（２１）薬剤調合に用いられるその他の非毒性の適合性物質、が含まれる。
【００４４】
用語「腫瘍細胞抗原」とは、無関係の腫瘍細胞、正常細胞や、正常な体液中に存在するよりも、腫瘍細胞又は体液中により多量に存在する抗原であると、ここで定義しておく。この抗原の存在は、当業者に公知のいかなる数の検定法で検査してもよいが、その中には、限定はしないが、例えばELISA検定法など、抗体による正及び／又は負の選抜法、ラジオイムノアッセイ、又はウェスタン・ブロット法、がある。
【００４５】
ここで用いる用語「癌」は、患者の身体内の細胞が異常な、制御されていない増殖を起こしている状態を意味するために用いられている。癌の非限定的な例には、白血病、多発性骨髄腫、前立腺、卵巣、精巣、乳房、又は肺の腫瘍、黒色腫、リンパ腫等がある。ここで用いられる場合の用語「癌」とは、例えば腎細胞癌、カポシ肉腫、慢性白血病、乳癌、肉腫、卵巣癌、直腸癌、咽喉癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫、肺癌、乳腺腫、咽頭扁平細胞癌、胃腸管又は胃の癌、上皮癌、又は膵臓癌などの細胞の異常を含め、あらゆる新生物性の異常を言う。
【００４６】
ここで用いる「形質転換細胞」とは、抑制のない成長状態に自発的に変化した細胞を言い、即ちこれらが、培養において無限回数、分裂するような成長能を獲得していることを言う。形質転換細胞は、それらが成長の抑制を失ったことに関して、新形成性、退形成性及び／又は過形成性といった用語で特徴付けられよう。本発明の目的のためには、用語「悪性哺乳動物細胞の形質転換後の表現型」及び「形質転換後の表現型」とは、限定はしないが、哺乳動物細胞の細胞形質転換に関連する以下の表現型上の形質のいずれをも包含するものと、意図されている：細胞培地での成長期間延長、半固体培地での成長、又は免疫インコンピテントな、もしくは、同型の動物における腫瘍形成性の成長、によって検出される、不死化、形態学上又は成長上の変化、及び腫瘍形成性。
【００４７】
癌に罹患した患者を「治療する」とは、本発明に基づく処理後に、患者の症状が部分的又は完全に軽減するか、あるいは静的に留まることを意味する。治療を受けた患者は、症状及び／又は腫瘍の大きさの部分的又は完全な軽減を示すかも知れない。用語「治療」は、予防、治療及び治癒を包含するものと、意図されている。
【００４８】
用語「試料」とは、腫瘍細胞、又はその腫瘍細胞抗原及び樹状細胞を含有するであろう、癌患者から抽出可能な血液、血液生成物、生検組織、血清及びいずれかの他の種類の体液又は組織であると、ここで定義しておく。
【００４９】
ex vivoで「配合する」とは、身体の外側で物理的に近づけることを意味する。「配合する」及び「接触させる」は、ここでは交換可能に用いられており、同じように定義されることが意図されている。
【００５０】
「同種異系の」とは、患者以外のソースを由来とする細胞であり、例えば既存の細胞バンク（例えばNIH：OVCAR-3細胞株など）由来や、又はドナーや、患者由来ではない他のソースを由来とする細胞であると、ここで定義しておく。
【００５１】
「自己由来」とは、細胞がまったく同じMHC遺伝子座（クラスＩ及びクラスＩＩの両者とも）を有するような、ある１人の患者由来の細胞であると、ここで定義しておく。このように、両親が同じ兄弟は、ある患者に対して自己由来の樹状細胞を提供することができる。同様に、ある患者と、その近い血族がまったく同じMHC遺伝子座を有する限り、近い血族もその患者に対して自己由来樹状細胞を提供することができる。もちろん、実験動物の近交株（例えば近交したBALB/cマウス）のうちの２匹の個体は互いに自己由来である。
【００５２】
用語「アポトーシス」又は「プログラムされた細胞死」とは、発生及び他の正常な生物学的プロセスの間に、望ましくない、もしくは不用な細胞が除去される生理的プロセスを言う。アポトーシスは、正常な生理条件下で起きる細胞死の形態であり、当該細胞は、その消滅（「細胞の自殺」）の能動的な参加者である。それが最も多く見られるのは、正常細胞のターンオーバー及び組織の恒常性、胚の発生、免疫寛容の誘導及び維持、神経系の発生、及び内分泌依存的組織萎縮の間である。アポトーシスを起こしている細胞は特徴的な形態学上及び生化学上の特徴を示す。これらの特徴には、クロマチンの凝集、核及び細胞質の凝縮、リボゾーム、形態学的に無傷のミトコンドリア及び核物質を含有する膜結合小胞（アポトーシス体）への細胞質及び核の区画化、がある。in vivoでは、これらのアポトーシス体は、マクロファージ、樹状細胞又は隣接する上皮細胞のいずれかにより素早く認識され、貪食される。in vivoではアポトーシス性細胞の除去のためにこのような効率的な機序があるために、炎症性応答は惹起されない。in vitroでは、アポトーシス体や残りの細胞断片が最終的には膨らみ、最後には溶解してしまう。in vitroでの細胞死のこのような最終段階は、「二次ネクローシス」と呼ばれてきた。アポトーシスは、DNA断片化、アネキシンVの曝露、カスパーゼの活性化、チトクロームcの放出等、当業者に公知の方法により、測定することができる。致死するように誘導された腫瘍細胞は、ここでは「アポトーシス性腫瘍細胞」と呼ばれる。
【００５３】
ここで用いる「認識される」とは、免疫系が応答状態になく、不活性であった（例えば腫瘍細胞に対するBもしくはT細胞応答がない状態）ものが、投与後、B及び／又はT細胞免疫応答が惹起され、腫瘍細胞のアポトーシスが誘導されることを意味する。
【００５４】
「アポトーシス誘導剤」とは、アポトーシス／プログラムされた細胞死を誘導すること、とここで定義し、その中には、例えば、放射線、化学療法薬又は受容体連結剤が含まれ、この場合、腫瘍細胞はプログラムされた細胞死を起こすように誘導される。「化学療法薬」のいくつかの非限定的な例には、（リポソーム性）ルビシン（rubicin）、ドキソブシン（doxobucin）、タキサン（taxan）、トポイソメラーゼ阻害剤、カルボプラチン、及びシスプラチン、がある。ここで用いる場合の「放射線」は、標準的な放射線治療を用いて腫瘍細胞を処理することを意味し、その中には、限定はしないが、γ線がある。「受容体連結」とは、ここで用いる場合、例えばEGF受容体ファミリの受容体又はCD20など、アポトーシスの誘導を惹起する受容体に対する抗体又はリガンドを用いることにより、腫瘍細胞を処理することを意味する。
【００５５】
「樹状細胞」とは、抗原を内部移行させて、それ（又は腫瘍細胞の抗原由来のペプチド）がMHCクラスＩ複合体及びMHCクラスＩＩ複合体の両方の関係で提示されるように抗原をプロセッシングすることのできる骨髄由来細胞であると、ここで定義しておく。従って、本発明の樹状細胞は、（主に細胞傷害性Tリンパ球である） CD8+ T細胞及び（主にヘルパT細胞である）CD4+ T 細胞の両方を活性化することができる。内部移行した抗原を由来とするペプチドを、クラスＩ及びクラスＩＩMHCの両方の上で提示できれば、いずれの細胞も本発明の樹状細胞であると理解されたい。好ましくは、本発明の樹状細胞が、Steinman, Annu. Rev. Immunol. 9 : 271-296 (1991)に解説された樹状細胞の表現型及び特徴を有するとよい。
【００５６】
「未熟樹状細胞」とは、シュルテ氏らによりPCT出願WO01/85204号に解説されているように、示唆された発現レベルで細胞表面抗原のうちの一つ以上を好ましくは有するような樹状細胞集団であると、ここで定義しておく。
【００５７】
「前駆樹状細胞」とは、例えば単球など、集団のうちの80%を越えるものがCD64及びCD32抗原を提示し、集団のうちの約70%がCD14に対して陽性であり、そのそれぞれが樹状細胞になることができる細胞集団であると、ここで定義しておく。
【００５８】
ヒト樹状細胞は、好ましくは、その様々な成熟段階で、表１で下に解説した細胞表面分子を発現するとよい。典型的には、樹状細胞が成熟するにつれ、Fc受容体、特にCD64（FCγRI）、の発現が低下することに注目されたい。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
ＩＩＩ．  実施態様の例
Ａ．  化合物及び組成物
ある局面では、組成物は結合剤を含む。更なる実施態様では、前記結合剤は、抗体であるが、加えて、異種型モノクローナル抗体であってもよい。異種型モノクローナル抗体の具体的な例には、例えば、Alt-1 (マウスIgG1、MUC-1に特異的に結合する；ATCC No. PTA-975；ヴァージニア州マナサス、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）、Alt-2(OvaRex(R)； MAb B43.13、オレゴボ（原語：oregovo）mab、マウスIgG1、CAICA125に特異的に結合する；ATCC No.PTA-1883)、Alt3 (マウス IgG3、CAICA19. 9に特異的に結合する；ATCC No. PTA2691)、Alt-4 (マウス IgM、CA19. 9に特異的に結合する；ATCC No. PTA-2692)、及びAlt-5 (マウス IgG1、CAI CA19.9 に特異的に結合する；ATCC No. PTA-2690)、がある。
【００６１】
更なる実施態様では、本組成物は、患者由来の試料から得られる腫瘍細胞、又はその腫瘍細胞抗原をさらに含み、この場合、結合剤は、前記腫瘍細胞抗原に対して免疫原性である。当該腫瘍細胞は生存して（即ち非アポトーシス性）いてもよく、この腫瘍細胞を、ex vivoでアポトーシス誘導剤で処理することができる。代替的には、該腫瘍細胞はアポトーシス性であってもよく、この場合のアポトーシスは、放射線照射、化学療法又は受容体連結によってin vivoで誘導されたものである。更なる実施態様では、本結合剤及び腫瘍細胞、又はその腫瘍細胞抗原をex vivoで接触させ、患者に複合体として投与する。
【００６２】
更なる発明では、本抗体-アポトーシス性腫瘍細胞の複合体を、患者への投与前に親和性精製することができる。親和性精製は、Hisタグ配列、エンテロキナーゼ開裂タグ、又は磁気ビーズ系を使用することで、行うことができる。このように、濃縮された複合体を患者に投与することができる。
【００６３】
本発明による組成物は、癌患者に治療上の利益を提供するために有用である。形質転換細胞を増殖させて充実腫瘍を形成させてもよく、あるいは、増殖させて大量の細胞（例えば白血病）を形成させてもよい。好ましくは、本発明の癌が転移性であるとよい。癌は、患者の細胞の異常、かつ制御のない増殖であるため、この用語は、幹細胞又は精母細胞などの細胞の正常な増殖を包含するものでないことに留意されたい。
【００６４】
いくつかの実施態様では、本組成物を、結合剤、アポトーシス性腫瘍細胞、及び自己由来樹状細胞をex vivoで配合することにより、得てもよい。アポトーシス性腫瘍細胞は同種異系でも、又は自己由来でもよく、また化学療法薬、放射線照射、又は受容体連結による処理で不活化させてもよい。
【００６５】
更なる実施態様では、本組成物は樹状細胞をさらに含む。好ましくは、前記樹状細胞が、患者にとって自己由来であるとよい。好適な実施態様では、本組成物が少なくとも１つの樹状細胞を含有するとよく、より好ましくは本組成物が、１人の患者当たり、一回の処理当たり105乃至108個の樹状細胞濃度を含有するとよい。患者試料からの樹状細胞又は他の抗原提示細胞の単離は、抗体又はレクチンを用いた親和性精製手段；磁気ビーズ、接着表面又はエルトリエーション器具により、行うことができる。加えて、HLAを適合させたドナー由来樹状細胞を用い、組成物中に含めることもできる。
【００６６】
更なる実施態様では、本結合剤-腫瘍細胞の複合体を樹状細胞にex vivoで接触させて、この複合体を受容体媒介性エンドサイトーシスによりプロセッシングさせ、この樹状細胞製剤を患者に投与することもできる。
【００６７】
樹状細胞が、組成物に添加される時点で未熟樹状細胞であるか、又は、前駆樹状細胞であるような本発明の実施態様では、好ましくは本組成物を、該未熟もしくは前駆樹状細胞が患者への組成物投与前に成熟するような条件下で、ex vivoで（例えば細胞培養で）インキュベートするとよい。未熟もしくは前駆樹状細胞から成熟樹状細胞が形成可能なこのような条件は当業者に公知であり、例えば、シュルテ氏らによる公開済みのPCT出願WO 01/85204に解説されている。
【００６８】
従って、ある非限定的な方法では、アポトーシス性NIH: OVCAR-3細胞及びAlt-2をex vivoで接触させる。本組成物の変更例では、ヒト抗マウス抗体を当該混合物に加える。次に、この混合物を、当該疾患に罹患した患者由来の試料から単離された未熟樹状細胞に加える。本複合体、又は、サイトカイン混合物、をアポトーシス性腫瘍細胞に添加すると、未熟樹状細胞の成熟が促進される。次に、腫瘍細胞及びAlt-2を「取り込ませた」又は「載せた」成熟した樹状細胞を培養物から取り出し、選択に応じて精製し、そして本発明の結合剤と一緒に患者に投与する。本発明で用いる樹状細胞は、好ましくは、本発明の組成物が投与される患者にとって自己由来であるとよい。
【００６９】
本発明の局面の一つには、患者に投与可能な薬学的に許容可能な担体中に調合された組成物が含まれる。薬学的に許容可能な担体の一例は生理食塩水である。他の薬学的に許容可能な担体及びそれらの処方は公知であり、概略的には、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990)に解説されている。更なる実施態様では、本医薬製剤（例えば組成物）には、発熱因子が含まれない。
【００７０】
本発明の別の局面は、癌患者の治療用の医薬の調製における本結合剤の使用であり、この場合、有効なT細胞応答が、本医薬の投与に応答して惹起される。本発明の結合剤は、低用量の投与で有効である点において、独特である。具体的には、本発明の結合剤は、患者１人当たり2mg以下の用量で投与可能であり、治療上の利益を引き出すことができる。更なる実施態様では、本結合剤は、患者１人当たり約100μg乃至約2mgで患者に投与される。更なる実施態様では、本結合剤は、体重１kg当たり約0.1μg乃至約200μgの量で調合される。本発明の結合剤は、例えば、静脈内、腹腔内、又は皮下投与用に調合可能である。
【００７１】
本発明の結合剤は、ホスト抗異種型抗体（HAXA）応答を誘導することができる。ある実施態様では、本結合剤はHAXA応答を惹起する200U/mlを越える投薬量で投与される。ある実施態様では、本結合剤はHAXA応答を惹起する2000U/mlを越える投薬量で投与される。更なる実施態様では、本結合剤は、ホスト抗マウス抗体（HAMA）応答を誘導することができる。本発明のある実施態様では、本結合剤は、抗体媒介性傷害性を誘導しない、結合剤の最大量である投薬量で投与される。更なる実施態様では、本結合剤は、ADCC又はCDCを生じない、結合剤の最大量である投薬量で投与される。
【００７２】
本発明のある実施態様では、本結合剤を免疫原性担体に結合させる。更なる実施態様では、前記免疫原性担体はキーホール−リンペット・ヘモシアニンである。
【００７３】
本発明のある実施態様では、本結合剤は、免疫系を追加刺激するためのアジュバントの存在下で調合される。ヒト患者への投与に許容可能なアジュバントは当業において公知である。
【００７４】
本発明のある実施態様では、本結合剤は、アジュバントの非存在下で調合される。このような調合物において、外因性抗体は、レシピエントにとって異物であるために、結合剤及びアジュバントの両者として作用する。
【００７５】
本発明のある実施態様は、受容体を架橋する結合剤を提供するものである。本発明の結合剤は、受容体連結を通じて細胞表面受容体の架橋を誘導する。例えば、EGF受容体ファミリーの受容体やCD20など、アポトーシスの誘導を惹起する受容体に対する抗体又はリガンドを用いることにより、腫瘍細胞を処理する。ある好適な実施態様では、本組成物は、少なくとも１つの腫瘍細胞を含有するが、より好ましくは、当該腫瘍細胞が、処理１回当たり患者１人当たり105個乃至108個の濃度であるとよい。さらに、受容体の「リガンド結合部位」は、受容体上のうちで、この受容体の天然リガンドが結合する部位であると、ここで定義しておく。例えば受容体がFcγタイプＩＩ受容体である場合、この受容体の天然リガンドはIgG抗体である。本発明の結合剤は、受容体に結合したときに、この受容体にとっての天然リガンドがこの受容体に結合できないように、この受容体のリガンド結合部位を遮断する。ある非限定的な例では、当該の受容体がFcγタイプＩＩ受容体であり、そして本発明の結合剤がIgG抗体である場合、本発明の結合剤が当該受容体に結合すると、他のIgG抗体がこの受容体に結合することが妨げられる。
【００７６】
本発明の医薬調合物には、さらに、獣医学用の組成物、例えば、本結合剤、結合剤-腫瘍細胞複合体、結合剤-腫瘍細胞抗原、家畜やイヌなどのペットの治療用などの獣医学用途に適した樹状細胞、から成る医薬製剤など、を含めることができる。
【００７７】
これらの化合物を、治療対象のヒト及び他の動物に、注射（例えば静脈内、皮下、皮内、及び腹腔内）を含むいずれかの適した投与経路により、投与してよい。
【００７８】
選択した投与経路に関係なく、適した水和化形で用いてもよい本発明の化合物、及び／又は、本発明の医薬組成物は、下に解説したものや、又は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容可能な剤形に調合される。
【００７９】
本発明の医薬組成物中の実際の活性成分の投薬量は、患者にとって毒性となることなく、特定の患者、組成物、及び投与形態にとって所望の治療的応答を達成するのに有効な活性成分量が得られるように、変更してもよい。
【００８０】
選択される投薬量は、用いる本発明の特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排出速度、治療期間、用いる特定の組成物と組み合わせて用いる他の薬物、化合物及び／又は材料、治療しようとする患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康及び医療歴、及び、医業で公知の同様のファクタを含め、様々なファクタに依存するであろう。
【００８１】
Ｂ．  化学療法薬
本発明の化学療法薬には、市販の化学療法薬が含まれる。
【００８２】
単に描写すると、該化学療法薬は、クロマチン機能の阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害薬、DNA損傷性薬剤、抗代謝産物（例えば葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体、及び糖で修飾された類似体など）、DNA合成阻害剤、DNA相互作用薬剤（例えば内位添加剤）、及び／又はDNA修復阻害剤、であってよい。
【００８３】
化学療法薬を、それらの作用機序により、例えば以下のグループに分類してもよい：抗代謝産物／抗癌剤、例えばピリミジン類似体（5-フルオロウラシル、フロクスリジン、カペシタビン、ゲムシタビン及びシタラビン）及びプリン類似体、葉酸アンタゴニスト及び関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン及び2-クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））； 天然生成物、例えばビンカアルカロイド（ビンブラスチン）、ビンクリスチン、及びビンオレルビン）、微小管破壊薬、例えばタキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン及びナベルビン、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、DNA損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、ミトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテル、テニポシド、トリエチレンチオホスホールアミド及びエトポシド（VP16））を含む抗増殖性／抗有糸分裂剤；抗生物質、例えばダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びミトマイシン；酵素（L-アスパラギンを全身代謝して、自身のアスパラギンの合成能を持たない細胞から枯渇させるL-アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖性／抗有糸分裂性アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド及び類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン及びメチルメラミン（ヘキサメチルメラミン及びチオテパ）、アルキルスルホネート-ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（BCNU）及び類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン-ダカルバジニン（DTIC）； 抗増殖性／抗有糸分裂性抗代謝産物、例えば葉酸類似体（メトトレキセート）；プラチナ配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）及びアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩及びスロンビンの他の阻害剤）；線溶阻害剤（例えば組織プラスミノーゲンアクチベータ、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌剤（ブレベルジン）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリマス(FK-506)、シロリマス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノレート・モフェチル）；抗血管形成化合物（TNP-470、ゲニステイン）及び成長因子阻害剤（血管内皮細胞成長因子(VEGF)阻害剤、線維芽細胞成長因子（FGF）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断剤；酸化窒素供与剤；抗センスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ、リツキシマブ）；細胞周期阻害剤及び分化誘導剤（トレチノイン）；mTOR阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン（CPT-11)及びミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルペドニゾロン、プレドニゾン、及びプレニゾロン）；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導剤、コレラ毒素などの毒素、リシン、シュードモナスエキソトキシン、ボルデテラ-ペルツッシスアデニル酸シクラーゼ毒素、又はジフテリア毒素、及びカスパーゼ活性化剤；及びクロマチン破壊剤。該化学療法薬の好適な投薬量は、現在処方されている投薬量に一致するものである。
【００８４】
Ｃ．  治療の方法
本発明の実施態様の一つは、結合剤製剤を含有する医薬組成物を患者に投与するステップを含む、癌患者を処理する方法であり、この場合、前記結合剤は、患者において有効な免疫応答を惹起し、前記有効な免疫応答は、B及び／又はT細胞応答に分類され、そして前記患者が治療上の利益を受け取る。本発明の有効なB細胞応答は、有効な抗体応答であってもよい。本発明の有効なT細胞応答は、有効なTヘルパ応答、有効なCTL応答、又は有効なTヘルパ及びCTL応答であってよい。
【００８５】
ある非限定的な一例では、転移性の高い癌（例えば乳癌）に罹患した患者を処理するが、この場合、それ以上の転移は起きないか、あるいは、治療を受けない患者に比較して、数の上で減少している。別の非限定的な例では、患者を処理するが、この場合、患者の充実癌は部分的又は完全に大きさの上で減少するか、あるいは、治療を受けない患者に比較して大きさの上で上昇しない。さらに別の非限定的な例では、治療を受けた患者の癌細胞（例えば白血病細胞）の数は静的であるか、あるいは、治療を受けない患者における癌細胞の数に比較して、部分的又は完全に減少する。
【００８６】
ある実施態様では、当該患者はヒトである。別の実施態様では、当該患者は非ヒト哺乳動物、特に実験動物である。本発明の好適な非ヒト患者には、限定はしないが、マウス、ラット、ウサギ、ヒト以外の霊長類（例えばチンパンジー、ヒヒ、アカゲザル）、イヌ、ネコ、ブタ、及びアルマンジロ、がある。
【００８７】
更なる実施態様では、本方法は、インタクト腫瘍細胞もしくはアポトーシス性腫瘍細胞、あるいは腫瘍細胞抗原、のいずれかを有する患者から試料を取り出すステップと、結合剤製剤（例えば組成物）を前記試料に添加するステップであって、前記結合剤は、試料中に存在する腫瘍細胞抗原に対して免疫反応性であるため、前記結合剤と腫瘍細胞抗原との間でex vivoで複合体が形成されるために複合体を形成する、ステップと、前記複合体を患者に投与するステップであって、こうして前記患者が治療上の利益を受け取る、ステップと、を含む。
【００８８】
更なる実施態様では、該結合剤-腫瘍細胞抗原の複合体を、当該複合体を患者に投与する前に精製する。代替的には、患者の試料由来の腫瘍細胞がアポトーシス性でない場合、アポトーシス誘導剤を当該腫瘍細胞に添加することで、結合剤製剤中に混合する前に、アポトーシスを誘導することができる。
【００８９】
本発明の局面の一つは、患者から採取された試料から未熟もしくは前駆樹状細胞を単離することを規定する。このように、本発明の未熟もしくは前駆樹状細胞は、患者にとって自己由来である。加えて、インタクト腫瘍細胞又は、アポトーシス性腫瘍細胞、又は腫瘍細胞抗原を、同じ患者の試料から得、結合剤に接触させて、複合体を形成させる。次に、樹状細胞が当該複合体を、例えば受容体媒介性エンドサイトーシスによりプロセッシングして成熟するように、この複合体を、単離された未熟もしくは前駆樹状細胞にex vivoで接触させる。次に、この調製された樹状細胞を、結合剤を含む医薬組成物と患者に同時投与するが、このとき、この同時投与により、上述した通りのT細胞応答に分類される有効な免疫応答が患者において惹起される。
【００９０】
本発明のある好適な実施態様では、本結合剤及びアポトーシス性腫瘍細胞に、in vivoで（好ましくは未熟樹状細胞である）樹状細胞を狙わせる。このような結合は、これらの樹状細胞表面上にある樹状細胞受容体との相互作用を通じて起きる。アポトーシス性腫瘍細胞を好ましくは未熟樹状細胞の標的にし、これらの腫瘍細胞をMHCクラスＩ及びクラスＩＩ分子の両方の上で提示させることにより、樹状細胞結合剤／腫瘍細胞の免疫複合体は、樹状細胞を効率的に感作させて、CD4（＋）ヘルパ及びCD8（＋）細胞傷害性T細胞の両方の活性化をin vivoで誘導する。
【００９１】
本発明の結合剤は、樹状細胞表面上の受容体のリガンド結合部位に、樹状細胞の発生のいずれの段階で結合させてもよく、このとき、本抗体の活性部分は、樹状細胞上の受容体に、そのリガンド結合部位で結合する受容体結合部位を含有する。このように、本結合剤は、重鎖定常領域か、又はヒンジ領域の糖質鎖を含む抗体のFc部分を含有する。好ましくは、本結合剤が樹状細胞受容体のリガンド結合部位に結合した後は、その天然リガンドはこの受容体に、本結合剤が受容体に結合するのと同時には結合できないとよい。好ましくは、本結合剤がアポトーシス性腫瘍細胞に特異的に結合したときに、本結合剤が、樹状細胞表面上の受容体に結合するとよい。好ましくは、このような結合により、結合剤／アポトーシス性腫瘍細胞の複合体の内部移行が起きるとよい。さらに好ましくは、未熟もしくは前駆樹状細胞による結合剤-アポトーシス性腫瘍細胞の複合体が結合及び／又は内部移行すると、樹状細胞の成熟及び／又は活性化が起きるとよい。ある好適な実施態様では、本結合剤は、樹状細胞に、マンノース受容体又は他のC型レクチンを通じて結合するとよい。ある好適な実施態様では、本結合剤は、樹状細胞に、補体受容体を通じて結合する。より好ましくは、本発明の結合剤が好中球上では豊富でないCD64(FcγRI)又はCD32 (FcγRIIA)などの活性化Fcγ受容体に結合するとよい。本発明の結合剤は、当業で認識された方法により、容易に同定される。本結合剤がIgG抗体であるある非限定的な例では、前駆、未熟、もしくは成熟樹状細胞を、公知の、例えばシュルテ氏らによるWO01/85204で解説された方法で精製する。次に、この樹状細胞をFITC標識IgG抗体と（前記抗体が特異的に結合する相手である腫瘍細胞と一緒に、又はなしで）インキュベートする。同時に、又はその後、樹状細胞表面マーカに特異的なフィコエリトリン(PE)標識抗体を当該細胞に添加する。その後この細胞にフローサイトメトリによる分析を行って、本発明のFITC標識IgG抗体が当該樹状細胞に結合できるかどうかを判断する。結合した受容体は当業で公知の方法により識別することができる。本結合剤がIgG抗体であるある非限定的な例では、前駆、未熟、もしくは成熟樹状細胞を、公知の、例えばシュルテ氏らによるWO01/85204で解説された方法で精製する。次に、この樹状細胞を本発明のIgG抗体と（前記抗体が特異的に結合する相手である腫瘍細胞と一緒に、又はなしで）インキュベートする。同時に、ある受容体のリガンド結合部位に特異的なFITC又はフィコエリトリン（PE）標識天然リガンド又は抗体（即ち別のIgG抗体）をこの細胞に添加する。次にこの細胞にフローサイトメトリによる分析を行って、本発明のFITC標識IgG抗体が、樹状細胞上の受容体に対するPE標識受容体リガンド又は抗体の結合を遮断できるかどうかを判断する。
【００９２】
いくつかの好適な実施態様では、本発明の結合剤は二重特異的であり、腫瘍細胞と樹状細胞上のFcγタイプII又はタイプI受容体の両方に結合する。好ましくは、本結合剤がFcγタイプII又はタイプI受容体に結合すると、天然リガンドの、それぞれFcγタイプII又はタイプI受容体への結合が遮断されるとよい。従って、いくつかの実施態様では、本結合剤は、本組成物を投与された患者の腫瘍細胞と、樹状細胞上のFcγタイプI (CD64)受容体とに結合する。いくつかの実施態様では、本結合剤は、本組成物を投与された患者の当該抗原と、FcγタイプII(CD32) 受容体、例えば樹状細胞上のFcγタイプIIA(CD32A)受容体、とに結合する。いくつかの実施態様では、本結合剤は、本組成物を投与された患者の腫瘍細胞と、樹状細胞上のFcγタイプIII CD16(FcγRIII)受容体とに結合する。
【００９３】
本発明のある局面では、本方法は有効な免疫応答の誘導を包含し、このときT細胞応答が惹起され、また前記T細胞応答はTヘルパ応答、CTL応答、又は、Tヘルパ応答及びCTL応答の両方、である。本発明による方法のいくつかの実施態様では、本組成物を投与した患者において、CD8+IFN-γ産生性T細胞を活性化させて、細胞傷害性Tリンパ球(CTL）応答を誘導する。本発明による方法のいくつかの実施態様では、本組成物を投与した患者において、CD4+IFN-γ産生性T細胞を活性化させて、ヘルパT細胞免疫応答を誘導する。これらの活性化CD4+IFN-γ産生性T細胞（即ち、ヘルパT細胞）は、CTLだけでなく、B細胞により媒介される体液性免疫応答を誘導し、維持するために必要な免疫上の支援（例えばサイトカインを放出するなどにより）を提供する。このように、本発明による方法のいくつかの実施態様では、腫瘍細胞に対する体液性応答を、本組成物を投与された患者で活性化させる。CD8+ 及び／又はCD4+IFN-γ産生性T細胞の活性化は、IFN-γ産生能を有するT細胞に実際にIFN-γを産生させるか、又は、それらのIFN-γ産生を増加させることを意味する。好適な実施態様では、該T細胞応答は、腫瘍細胞上に存在する第二の別個の抗原に対して特異的である。本発明による方法のいくつかの実施態様では、本T細胞応答は、T ヘルパ応答及びCTL応答である。
【００９４】
好適な実施態様では, 本方法は、本組成物を患者に投与する前に、化学療法薬を投与するステップを含み、この場合、該化学療法薬が、前に定義したようにアポトーシスを誘導した結果アポトーシス性腫瘍細胞となっている。このように、化学療法薬治療を既に受けた患者が、本発明の候補である。好ましくは、本アポトーシス性腫瘍細胞が、患者の身体内を循環するとよい。好適な実施態様では、本組成物は、当該の化学療法薬後の７日以内に投与される。
【００９５】
好適な実施態様では、本結合剤組成物を患者に投与した後で、化学療法薬を患者に投与するが、このとき、当該の化学療法薬がアポトーシスを誘導する結果、上述したように本結合剤でオプソニン化してある腫瘍細胞がアポトーシス性になる。好ましくは、本アポトーシス性腫瘍細胞-結合剤の複合体が、患者の身体内を循環するとよい。
【００９６】
本発明のある局面では、患者から抽出された腫瘍細胞をアポトーシス誘導剤にex vivoで曝露して、腫瘍細胞にアポトーシスを起こさせる。次に、このアポトーシス性腫瘍細胞を本結合剤に接触させ、患者に投与可能な複合体を形成させる。
【００９７】
本発明のある局面では、本方法は、化学療法薬、放射線照射、及び受容体架橋剤など、アポトーシス誘導剤を包含する。ある好適な実施態様では、前記アポトーシス誘導剤は化学療法薬である。化学療法薬は、上述したように当業で公知であり、その中には、例えば、ゲニステイン及びシスプラチン、がある。ある好適な実施態様では、当該のアポトーシス誘導剤は放射線である。放射線物質には、例えば、ガンマ線がある。ある好適な実施態様では、当該のアポトーシス誘導剤は架橋剤である。
【００９８】
更なる実施態様では、本抗体-腫瘍細胞の複合体を、複合体が濃縮されるように患者への投与前に精製することができる。精製方法は当業で公知であり、その中には、例えば、親和性精製、エンテロキナーゼ開裂タグの開裂、Hisタグ配列、及び磁気ビーズ分離系、がある。
【００９９】
本発明の局面の一つでは、本方法は、癌患者に治療上許容可能なアジュバントを投与する付加的なステップを含む。前記アジュバントは、投与用の抗体又は複合体と一緒に調合することも、あるいは別に調合することもできる。
【０１００】
本発明の局面の一つでは、試料を患者から得ることができるが、その中には、例えば生検組織、血液、又は体液が含まれる。インタクト腫瘍細胞、アポトーシス性腫瘍細胞、腫瘍細胞抗原、及び樹状細胞は、前記試料から、当業で公知の技術を用いて単離することができる。
【０１０１】
本発明の局面の一つでは、患者に、化学療法薬と同時に、本結合剤-腫瘍細胞抗原の複合体を投与する。
【０１０２】
本発明の他の局面では、腫瘍細胞抗原は、インタクト腫瘍細胞又はアポトーシス性腫瘍細胞の表面上に存在するか、又は、患者の血中又は体液中を循環している。
【０１０３】
本発明のある実施態様では、腫瘍負荷を有する患者を処理するために用いられる抗体は異種型抗体である。ある好適な実施態様では、前記抗体は異種型モノクローナル抗体であるが、あるいはさらにより好ましくは、マウスモノクローナル抗体である。好適なマウスモノクローナル抗体の具体的な例には、Alt-1、Alt-2、Alt-3、Alt-4、及びAlt-5、がある。
【０１０４】
本発明の方法は、低用量で投与されたときに治療上有効である結合剤の投与を包含するものである。具体的には、本発明の結合剤は、患者１人当たり2mg以下の用量で投与されて、治療上の利益を示すことができる。更なる実施態様では、本結合剤は、患者１人に対し、約100μg乃至約2mg、投与される。更なる実施態様では、本結合剤は、体重1kg当たり約0.1μg乃至約200μgの量、調合される。本発明の結合剤を、例えば、癌患者への静脈内、腹腔内又は皮下投与用に調合することができる。
【０１０５】
患者に投与されたとき、本発明の結合剤は、ホストの抗異種型抗体（HAXA）応答を誘導することができる。本方法の実施態様の一つでは、本結合剤は、200ng/mlを越える、HAXA応答を惹起する投薬量で投与される。ある実施態様では、本結合剤は、5000ng/mlを越える、HAXA応答を惹起する投薬量で投与される。本方法の更なる実施態様では、本結合剤は、ホスト抗マウス抗体(HAMA）応答を誘導する。本発明のある実施態様では、本結合剤は、抗体媒介性傷害性を誘導しない、本結合剤の最大量である投薬量で投与される。更なる実施態様では、本結合剤は、抗体依存的細胞傷害性（ADCC）又は補体依存的細胞傷害性（CDC）を生じない、結合剤の最大量である投薬量で投与される。
【０１０６】
本発明の実施態様の一つでは、本結合剤を、患者への投与前に免疫原性担体に結合させる。更なる実施態様では、該免疫原性担体はキーホール-リンペット・ヘモシアニンである。
【０１０７】
本発明の実施態様の一つでは、本結合剤は、患者に投与されたときに免疫系を追加刺激するアジュバントの存在下で調合される。ヒトの患者への投与に許容可能なアジュバントは当業で公知であり、その中には、限定はしないが、オリゴヌクレオチド、サイトカイン、明礬、又はサポニン、がある。
【０１０８】
本発明の実施態様の一つでは、本結合剤は、患者に投与されたときにアジュバントの非存在下で調合される。このような調合物においては、例えば異種型抗体は、レシピエントにとって異物であるためにそれ自身のアジュバントとして作用する。
【０１０９】
本発明の実施態様の一つでは、治療を必要とする患者は、前立腺、卵巣、乳房、胃、肺、結腸、及び皮膚の癌に罹患している。本発明の実施態様の一つでは、治療を必要とする患者は寛解期にある。ある好適な実施態様では、治療を必要とする患者はヒトである。
【０１１０】
Ｄ．  医薬梱包物
本発明の実施態様の一つは、インタクト腫瘍細胞又はアポトーシス性腫瘍細胞上にある腫瘍細胞抗原に対して、又は、血中腫瘍抗原に対して、免疫反応性である結合剤又はそのフラグメントを含む医薬組成物と、癌患者に投与するための指示とを含む医薬梱包物である。以下の実施態様では、用語「腫瘍細胞抗原」は、インタクト腫瘍細胞又はアポトーシス性腫瘍細胞上にある腫瘍細胞抗原、及び、体液中を循環していても、又はしていなくてもよい血中腫瘍細胞抗原、と交換可能であることを意図されている。
【０１１１】
ある好適な実施態様では、本結合剤は抗体又はそのフラグメントである。本抗体を患者に投与し、アポトーシス性腫瘍細胞又は腫瘍細胞の表面上にある腫瘍細胞抗原に結合させることができ、その後これらの細胞をin vivoでアポトーシスするように誘導することができる。代替的には、腫瘍細胞抗原又は腫瘍細胞を含有する試料を患者から採取し、本抗体にex vivoで反応させて、抗体-腫瘍細胞抗原の複合体を形成させることができる。該腫瘍細胞は、本結合剤と配合する前にアポトーシス性であるか、あるいは、本結合剤を結合させた後にアポトーシスを起こすように誘導される。次に、当該の複合体を、癌治療のために患者に投与することができる。加えて、本抗体-腫瘍細胞抗原の複合体を精製／濃縮して、患者に投与される複合体の濃度を増しておくこともできる。
【０１１２】
本発明の医薬梱包物にアポトーシス誘導剤を付加的に含めてもよく、この場合、該アポトーシス誘導剤は、例えば、化学療法薬、放射線、又は受容体架橋剤である。化学療法薬、放射線、及び受容体架橋剤は上に論じられている。化学療法薬の例には、例えばゲニステイン及びシスプラチンがある。
【０１１３】
更なる実施態様では、本抗体を患者に単独で投与することも、あるいは、アポトーシス誘導剤と同時に投与して、有効なB及び／又はT細胞応答を惹起することもできる。惹起されるT細胞応答はT ヘルパ応答でも、CTL応答でも、又はTヘルパ及びCTL応答でもよい。
【０１１４】
本発明の医薬梱包物には、さらに、患者に投与しようとするアジュバントを含めてもよく、これにより、本抗体及び／又はアポトーシス誘導剤により惹起されるB及び／又はT細胞応答は高められる。
【０１１５】
代替的な実施態様では、当該医薬梱包物の抗体組成物を、アポトーシス誘導剤の投与から約１週間前に投与することができる。代替的には、本抗体を、惹起されるB及び／又はT細胞応答を高めるために、必要に応じてアポトーシス誘導剤後に付加的に投与することもできる。
【０１１６】
本発明の医薬梱包物の組成物は、治療上有益なB及び／又はT細胞応答を惹起するために必要なときに本組成物を患者に投与できるように、単回又は複数回の用量分に調合することができる。
【０１１７】
本発明の好適な実施態様では、本医薬梱包物の抗体組成物は異種型抗体である。更なる発明では、本異種型抗体は異種型モノクローナル抗体である。抗体の具体的な例には、例えば、Alt-1、Alt-2、Alt-3、Alt-4、及びAlt-5、がある。
【０１１８】
本発明の好適な実施態様では、本医薬梱包物は、さらに、治療しようとする患者にとって自己由来のHLA適合樹状細胞を含む。
【０１１９】
代替的には、本発明の好適な実施態様では、本医薬梱包物は、患者から樹状細胞を単離するために使用できる抗体を含む。このような抗体は、例えばファーミンジェン社（カリフォルニア州サンディエゴ）から得ることができる。
【０１２０】
代替的には、本発明の好適な実施態様では、本医薬梱包物は、患者から未熟DCを単離し、該細胞をex vivoで培養し、そして、該細胞を単離して、患者に成熟した樹状細胞を再投与する前に本抗体及び腫瘍細胞とそれらを配合できるようにするために使用できるカセットをさらに含む。このようなカセットは、例えばアーストロム・バイオサイエンセズ社から得ることができる。
【０１２１】
好適な実施態様では、本医薬梱包物の組成物は、ヒトの患者の治療のために認可されており、発熱因子を含まない。
【０１２２】
Ｅ．  投与
これらの物質を経口投与してもよく；あるいは静脈内注射；あるいは罹患組織への直接の注射、例えば腫瘍部位への注射や、又は腹腔内、皮内、もしくは皮下的に注射するなど、により、投与してもよい。
【０１２３】
本発明の組成物は、上述した通りの有効な免疫応答が惹起されるように、治療上有効量、投与される。
【０１２４】
Ｆ．  治療対象の腫瘍の例
本発明の抗体は：膵臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、脳腫瘍細胞、腎臓腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞及び卵巣腫瘍細胞、の増殖を阻害するか、又はアポトーシスを誘導するものであり、従って、扁平細胞癌、非扁平細胞癌、神経グリア芽細胞腫、肉腫、アデノカルシノーマ、黒色腫、乳頭腫、神経芽腫及び白血病細胞の成長を阻害するものである。
【０１２５】
本発明の方法は、限定はしないが、膵臓癌、腎細胞癌、カポシ肉腫、慢性白血病、乳癌、肉腫、卵巣癌、直腸癌、咽喉癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫、肺癌、乳腺アデノカルシノーマ、咽頭扁平細胞癌、胃腸管の癌、胃癌、又は前立腺癌を含め、様々な種類の癌の治療に有効である。
【０１２６】
ＩＶ．  均等物
当業者であれば、慣例的な実験によって、ここに解説した本発明の具体的な実施態様の均等物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。
【０１２７】
上で引用した参考文献及び公開文献の全ての全文を、引用をもってここに援用することとする。
【０１２８】
以下の実施例は、本発明のいくつかの特に好適な実施態様をさらに描出することを意図しており、本発明の範囲を限定することは意図していない。
【０１２９】
実施例１
材料及び方法
材料
マウスモノクローナル抗-CA125抗体 B43.13 （カナダ、アルバータ州エドモントン、アルタレックス・コーポレーション）をマウス腹水で産生させ、 プロテインＡ親和性及び陰イオン交換クロマトグラフィで精製した。このIgG1抗体はCA125と特異的かつ高親和で反応する。化学療法薬（パクリタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、カルボプラチン)はLKTラボから得られた。
【０１３０】
細胞及び細胞のソース
NIH: OVCAR-3卵巣癌細胞株はATCC (ヴァージニア州マナサス)から購入された。健康な正常ドナーからの末梢血白血球(PBL)をロイカフォレーシス（カリフォルニア州SeraCare社)で得、ヒストパック勾配（カナダ、ミシソーガ、シグマ社）で精製し、90% ヒトAb血清（カリフォルニア州ウッドランド、ジェミニ・バイオプロダクツ社）及び10% DMSO (ミズーリ州セントルイス、シグマ社）中で生存したまま凍結させ、使用するまで液体窒素の気相中に保存した。DNAをこれらの細胞の一部分から調製し、分子HLA型決定に用いた。
【０１３１】
細胞のソース
PBMCを正常なボランティアのフェレーシス生成物から、フィッコール・ハイパック（ミズーリ州セントルイス、シグマ社）勾配遠心分離により単離し、90% ヒトAb血清（カリフォルニア州ウッドランド、ジェミニ・バイオプロダクツ社）及び10% DMSO (ミズーリ州セントルイス、シグマ社）中に生存したまま凍結させ、使用するまで液体窒素の気相中に保存した。DNAをこれらの細胞の一部分から調製し、分子HLA型決定に用いた。
【０１３２】
負の選択によるDCの単離
DC前駆細胞を、解凍したばかりのPBMCから、系譜細胞の免疫磁気ビーズ枯渇を用いた負の選択により、調製した。PBMCを氷上で３０分間、マウス抗ヒトCD3、CD16及びCD19と一緒にインキュベートした。細胞をPBS/0.1% BSAで洗浄することで過剰な抗体を取り除き、この細胞をPanマウスIgG免疫時期ビーズと一緒に３０分間、氷上でインキュベートした（単球単離キット、ニューヨーク州レイク・サクセス、ダイナル社）。この試験管を磁石の近くにおいて細胞：ビーズの複合体を取り除き、系譜枯渇DC前駆細胞を含有する上清を採集した。
【０１３３】
DC培養株
系譜枯渇DC前駆細胞を洗浄し、GM-CSF (1000U/ml) 及びIL-4 (1000U/ml) (ミネソタ州ミネアポリス、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を含有するcRPMI (1% グルタミン及び10%熱不活化ヒトAb血清を添加したRPMI) 中に再懸濁させ、３７℃で5% CO2中、0.5×106個の細胞／ウェルにした２４ウェルプレートで培養した。培養４日目に細胞を抗原で刺激し、さらに８乃至２４時間、インキュベートした。次に、DCを成熟させることが知られているTNFα(10μg/ml) 及びIFNα(50μg/ml)をこの培養物に加えた。成熟したDCを培養７日目に採集し、表現型マーカをフローサイトメトリで分析し、機能研究に用いた。
【０１３４】
フローサイトメトリによるDCの表現型分析
DCを細胞表面マーカの発現についてフローサイトメトリで分析した。簡単に説明すると、細胞をポリスチレン製試験管内に分取し、表面マーカを蛍光色素標識済みマウス抗体で染色した。細胞表面マーカには、HLA-A、B、C、HLA-DR、CD14、CD11c、CD4、CD40、CD83、 CD86、CD80、CD16、CD32、CD64 (カリフォルニア州サンホセ、ベクトン・ディッキンソン社)がある。氷上で３０分間インキュベートした後、細胞をPBSで洗浄し、遠心分離でペレットにした。この細胞ペレットを250μlの固定液（2%のパラホルムアルデヒド）中に再懸濁させた。データをFACScan フローサイトメータ（カリフォルニア州サンホセ、ベクトン・ディッキンソン社）を用いて得、Cellquest ソフトウェア(カリフォルニア州サンホセ、ベクトン・ディッキンソン社)で解析した。
【０１３５】
T細胞の単離
応答細胞であるCD3+ Tリンパ球を解凍したPBMC から負の選択により単離した（T細胞単離キット、ニューヨーク州レイク・サクセス、ダイナル社）。簡単に説明すると、細胞を氷上で３０分間、抗CD14、CD16、CD56 及びHLA クラスII DR/DP抗体の混合物と一緒にインキュベートした。PBS/0.1% BSAで洗浄することで過剰な抗体を取り除いた。この細胞を３０分間、室温で、抗マウスIgG抗体で被覆した免疫磁気ビーズと一緒にインキュベートした。細胞を磁石に近づけて置き、Tリンパ球をその上清から単離した。
【０１３６】
腫瘍細胞の調製
マウスモノクローナル抗-CA125抗体 B43.13 (カナダ、アルバータ州エドモントン、アルタレックス・コーポレーション)をマウス腹水で産生させ、プロテインＡ親和性及び陰イオン交換クロマトグラフィで精製した。このIgG1抗体は、CA125と特異的かつ高親和で反応する。NIH: OVCAR-3腫瘍細胞にガンマ線照射（10,000ラド）するか化学療法薬によりアポトーシスを起こさせた。化学療法薬を腫瘍細胞と一緒にIC90（90%の細胞致死を誘導するために必要な濃度）で４乃至２４時間、インキュベートした後、細胞を洗浄した)。腫瘍細胞及びB43.13をcRPMI中にそれぞれ500 U/mL、5,000 細胞/mL 及び5μg/mlの濃度まで希釈し、樹状細胞に取り込ませた。
【０１３７】
T細胞のin vitro活性化
NIH: OVCAR-3腫瘍細胞を放射線照射（10,000ラド）するか、又は化学療法薬（４乃至２４時間のインキュベーション）によりアポトーシスを起こすよう誘導し、洗浄し、HLAを適合させた未熟DCに加えた。並行して、一組のアポトーシス性細胞をMAb-B43. 13と一緒に、未熟DCに取り込ませる前にインキュベートした。コントロールとして、ネクローシス性NIH: OVCAR-3 細胞（凍結−解凍サイクルを繰り返したもの）を未熟DCに、MAb-B43.13と一緒に、又はなしで、加えた。DC を２時間、DC一個当たり数腫瘍細胞の比で取り込ませ、成熟させ、３日間、インキュベートした。７日目にDCを採集し、洗浄し、精製済みの自己由来T細胞を10: 1 (T 細胞対DC)の比で加え、さらに７日間、培養した。７日目にT細胞を採集し、洗浄し、さらに７日間、20:1の比でIL-2 (10U/ml) 及びIL-7 (5 ng/ml)(ミネソタ州ミネアポリス、Ｒ＆Ｄシステムズ社)を添加したcRPMI中で上述したように取り込ませたDCと一緒に培養した。T細胞を２４時間、取り込ませたDC（結果の項で解説した組合せで）で再刺激し、CD4+ 及びCD8+ T リンパ球中の細胞内サイトカイン産生を測定するか、又は NIH: OVCAR-3細胞に対するクロム放出検定により、応答を評価した。
【０１３８】
クロム放出検定
NIH: OVCAR-3細胞を、 50-80% コンフルエントになったときにトリプシン処理により採集した。細胞を洗浄し、2×106個の細胞を100μL RPMI＋20μL FBS＋2 mCi 51Cr中に再懸濁させた。細胞を２時間、３７℃でインキュベートして、クロムを取り込ませた後、細胞を洗浄し、丸底微量定量プレートに104 細胞／ウェル/100μLになるようにプレートした。抗原を取り込ませたDCによる再刺激後２時間たったT細胞培養物を、標識済みの細胞に、エフェクター対標的細胞の比が20: 1 乃至0.625 : 1 (100μL／ウェル)になるように加え、そしてコントロールとして、100μLの培地（自発的な放出）又は0.1% Tween-20 (最大の放出）を加えた。プレートを４時間、３７℃でインキュベートした後、30×gで５分間、遠心分離した。上清のうち100μLのアリクォートを採集し、ガンマ・カウンタで計数した。特異的な溶解を、式：% 特異的放出＝特異的試料で得られたdpm −自発的放出のdpm）／（最大放出のdpm−自発的放出のdpm）×１００に従って計算した。
【０１３９】
薬物で誘導される細胞死の観察のためのWST
NIH: OVCAR-3細胞を９６ウェル・プレート（NUNC社）で成長させ、10,000 ラドで放射線照射するか、あるいはある範囲の濃度の化学療法薬で４時間、処理した後、洗浄した。細胞を３７℃で最高３日間、インキュベートした。WST-1基質（ドイツ、マンハイム、ベーリンガーマンハイム社）を処理から４時間、２４時間、４８時間、及び７２時間、加えた。プレートを650nmでELISAリーダで読み取り、細胞死のパーセンテージを式：処理された細胞のA650／未処理の細胞のA650×１００に従って計算した。
【０１４０】
アネキシンＶアポトーシス検定
NIH: OVCAR-3 細胞を６ウェル・プレート(NUNC社)で成長させ、放射線照射するか、あるいは化学療法薬で４乃至４８時間、処理し、洗浄し、アネキシンV-FITC(BD-ファーミンジェン社)で１時間、染色した。細胞をフローサイトメトリ(ベクトン・ディッキンソン社、CellQuest)で分析し、ヨウ化プロピジウムで対比染色し、フローサイトメトリで再度分析した。
【０１４１】
活性化したカスパーゼを調べる共焦点顕微鏡法
NIH: OVCAR-3細胞を組織チャンバ・スライド（NUNC社）で成長させ、化学療法薬で４乃至８時間、処理し、洗浄し、Phi-Phi-Lux で１時間、染色した。細胞を再度簡単に洗浄し、固定し、ヨウ化プロピジウムで対比染色してから、共焦点顕微鏡法（ドイツ、ツァイス社）で分析した。
【０１４２】
CA125 の発現
NIH: OVCAR-34細胞を、CA125の発現について、化学療法薬又は放射線照射によるアポトーシス誘導前及び誘導後２４時間目に分析した。細胞を氷上で5μg/mLのFITC標識MAb-B43.13 (FITCラベリング・キット、オレゴン州ユージーン、モラキュラー・プローブズ社)と一緒に１時間、インキュベートし、２回洗浄し、固定し、フローサイトメトリで分析した。
【０１４３】
共焦点顕微鏡法による腫瘍細胞の樹状細胞取り込み
未熟樹状細胞をチャンバ・スライドで成長させ４乃至７２時間、アポトーシス中のCFSE標識腫瘍細胞と一緒に、MAb-B43.13オプソニン化をして、又はせずに、インキュベートした。細胞を固定し、透過性にし、DAPI及び抗 toll様受容体2、3及び6抗体、続いて抗ウサギPE、で染色した。
【０１４４】
抗原刺激検定
Tリンパ球を２４ウェル・プレートに1×106個の細胞／ウェルの濃度になるようにプレートし、抗原で刺激していない、又は、MAb-B43.13、NIH: OVCAR-3細胞、又はNIH: OVCAR-3 細胞＋MAb-B43. 13に曝露してある5×104個のDCを加えた。７日目にこれらT細胞を採集し、洗浄し、IL-2 (10U/ml) 及びIL-7 (5ng/ml)(ミネソタ州ミネアポリス、Ｒ＆Ｄシステムズ社)を添加したcRPMI中で上述したように取り込ませたDCと一緒にさらに７日間、培養した。T細胞を２４時間、取り込ませたDC (結果の項で解説した組合せで)で再刺激し、応答を、CD4+ 及び CD8+ Tリンパ球内の細胞内サイトカイン産生を測定するか、又は、NIH: OVCAR-3細胞に対するクロム放出検定で評価した。
【０１４５】
フローサイトメトリによる細胞内サイトカイン発現の検出
CD4+ 及びCD8+ T細胞による細胞内サイトカイン産生をフローサイトメトリで測定した。ブレフェルディンＡ（10μg/ml）（カリフォルニア州サンディエゴ、ファーミンジェン社）を該T細胞培養株に、抗原を取り込ませたDCによる再刺激から２時間後に添加した。さらに１８時間培養した後、細胞を染色緩衝液 (1% ヒトAb血清を加えたPBS)と一緒に１５分間、４℃でインキュベートし、再度洗浄し、ペレットにし、蛍光色素で標識した抗CD3、CD4、又はCD8 抗体(カリフォルニア州サンホセ、ベクトン・ディッキンソン社)を加えた。この細胞を固定し、perm／フィックス固定溶液（カリフォルニア州サンディエゴ、ファーミンジェン社）と一緒に２０分間、氷上でインキュベートすることで透過性にし、洗浄し、抗IFNγ抗体又は適したアイソタイプ・コントロール（カリフォルニア州サンディエゴ、ファーミンジェン社）を加えた。氷上で３０分間、インキュベートした後、細胞を洗浄し、2%のパラホルムアルデヒドを含有する染色緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメトリで分析した。
【０１４６】
クロム放出検定
NIH: OVCAR-3細胞を、50-80%コンフルエントになったときにトリプシン処理により採集した。細胞を洗浄し、2×106個の細胞を100μL RPMI＋20μL FBS＋2mCi 51Cr中に再懸濁させた。細胞を２時間、３７℃でインキュベートしてクロムを取り込ませた後、細胞を洗浄し、丸底の微量定量プレートに104個の細胞/ウェル/100μLになるようにプレートした。抗原を取り込ませたDCによる再刺激から２時間後のT細胞培養物を、標識済みの細胞にエフェクター対標的細胞の比を20: 1乃至0.625 : 1 (100μL/ウェル) にして加え、コントロールとして、100μLの培地（自発的放出）又は0.1%Tween-20 （最大の放出）を加えた。プレートを４時間、３７℃でインキュベートした後、30×gで５分間、遠心分離した。上清のうちの100μLのアリクォートを採集し、ガンマ・カウンタで計数した。特異的溶解を式： % 特異的放出＝（特異的試料で得られるdpm−自発的放出のdpm）／（最大の放出のdpm−自発的放出のdpm）×１００に従って計算した。
【０１４７】
結果
放射線照射及び化学療法薬によるアポトーシスの誘導
薬物濃度を、３日以内に90%の致死（IC90）を達成するように、NIH: OVCAR-3細胞及びWST-1 検定液を用いて至適化した。至適濃度は各実施例で解説する。NIH: OVCAR-3 細胞を1μg/mL (IC90) のパクリタキセルでチャンバ・スライド内で処理し、洗浄し、蛍光カスパーゼ3基質Phi-Phi-Luxと一緒に0、4、24 及び48時間目にインキュベートした。細胞をヨウ化プロピジウムで対比染色し、再度洗浄し、共焦点顕微鏡法で分析した。パクリタキセルで誘導されたアポトーシスは処理後４時間目にピークを迎えた。この時点では、細胞の60%を越えるものが、活性化カスパーゼについて陽性染色されたが、PIについては僅かな細胞しか染色されなかった（処理のために致死した細胞）。対照的に、２４時間目の時点では、細胞の約半分が死んで見つかり、カスパーゼ活性について陽性染色された細胞も少なかった。４８時間目まではほとんどすべての細胞が死につつあり、ほんの僅かな細胞がアポトーシスの兆候を示した。同様な結果はアポトーシスを観察するためのアネキシンＶ染色及びフローサイトメトリ、そしてドキソルビシン（図１）及びパクリタキセルやトポテカン、カルボプラチン、及び放射線を用いた細胞死評価のためのWST-1検定でも得られた。これらのデータに基づき、４時間という薬物処理時間がすべての実験に選ばれた。
【０１４８】
生存及びアポトーシス性腫瘍細胞による抗原の発現
図２で示すように、アポトーシス性腫瘍細胞は、標的化された腫瘍関連抗原CA125について陽性である。これらの細胞はCA125抗原については90%を越えるものが陽性であり、アポトーシス中の細胞（アネキシンVについて陽性染色）も、CA125陽性である。
【０１４９】
腫瘍細胞のエンドサイトーシス
蛍光染料CFSEで標識された腫瘍細胞を樹状細胞に、結合剤MAb-B43. 13を添加して、又は添加せずに加えた。細胞を固定した後、樹状細胞をPEで標識した抗CD11c（樹状細胞に特異的なマーカ）を用いて視覚化した。細胞核をDAPIで染色した。結合剤MAb-B43.13でオプソニン化された腫瘍細胞は樹状細胞によりエンドサイトーシスされる。
【０１５０】
細胞溶解性T細胞の誘導
NIH: OVCAR-3腫瘍細胞に放射線によりアポトーシスを起こさせた(10,000 ラド)。細胞を培養皿からトリプシン消化により剥がし、遠心分離し、cRPMI中に再懸濁させた。細胞の一部分を5μg/ml のMAb- B43.13と一緒にインキュベートした。MAb-B43. 13抗体 (5μg/mL)、MAb-B43. 13(DC一個当たり1 腫瘍細胞)のある、又はないアポトーシス性腫瘍細胞、又はコントロール培地を未熟DCに加えると、DCは１時間後に成熟した。T細胞を７日目に加え（DC一個当たり20個のT細胞）、７日間培養し、上述したように取り込ませてあるDCで２回、再刺激した。最後の刺激から２４時間後のT細胞培養株をクロム標識済み標的細胞に、エフェクター対標的細胞比が４時間、20: 1乃至0.625 : 1になるように加えた。上清を計数し、特異的溶解を計算した。
【０１５１】
結果から、樹状細胞、腫瘍細胞、及び結合剤のex vivo投与は、樹状細胞単独か、又は、結合剤もしくは腫瘍細胞と組み合わせた場合よりも、腫瘍を溶解させる上で優れていることが実証された。結果を図３に示す。
【０１５２】
実施例ＩＩ
再発性卵巣癌と診断された２０人のヒト患者に、放射性標識していないマウスMAb-B43. 13を、標準的な化学療法薬と組み合わせた研究を行った。患者に2mgのMAb- B43.13を１週目、３週目、５週目、及び９週目に２０分間、輸注し、更に選択的用量を１２週目に輸注した。MAb-B43.13での処理後、患者に標準的な化学療法薬と選択的な用量を１２週目から２６週目の間に投与した。疾患の進行をCTスキャン、身体検査、CA125レベル、及び生存の長期追跡調査を用いて評価した。自己由来腫瘍に対するT細胞応答を８人の患者でELISPOT検定を用いて評価した。
【０１５３】
T細胞応答
患者の末梢血単核細胞 (PBMC) を標準的な技術を用いて解凍した。洗浄前にPBMCをDNAse解凍培地中に２分間、静置した。PBMCを、まず8 mL AIM V 培地 (カリフォルニア州カールスバッド、ギブコ／インヴィトロジェン・コーポレーションから市販のものを入手可能)を加えることで１回、洗浄した。PBMCを10mLのAIM V 培地中に再懸濁させた。3-8×106/mL PBMCの10ml AIM-V 溶液を１時間、３７℃、5% CO2下で、T75フラスコ・プレート内でインキュベートした。
【０１５４】
インキュベート後、暖かいAIM V培地を、接着細胞上に直接ではなく、フラスコの側面に加え、各洗浄後にデカントし、最後の洗浄液を吸引することで、フラスコを該培地で４回、洗浄した（各洗浄毎に10mL）。
【０１５５】
最後の洗浄後、イスコーブの改良ダルベッコ培地（カリフォルニア州カールスバッド、ギブコ／インヴィトロジェン・コーポレーションから市販の10 mL IMDM)、ウシ胎児血清 (カリフォルニア州カールスバッド、ギブコ／インヴィトロジェン・コーポレーションから市販の10% FBS ）、GM-CSF (1,000 U/ml)、及びIL-4 (1,000U/ml) (両者ともミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄシステムズ社から市販のものを入手できる）をフラスコに加え、３日間、３７℃で5% CO2下でインキュベートした。
【０１５６】
３日目に、IMDM (2 mL)、FBS (10%)、GM-CSF (12, 000, U)、及びIL-4 (12,000, U) をフラスコに加えることで (フラスコ内の最終的なサイトカイン濃度は1,000U/ml GM-CSF、及び1,000U/ml IL-4だった)、樹状細胞培養物を与えた。その後６日目に、抗体及び抗原を３７℃で１時間、5% CO2下のAIM-V中で複合体形成させた。複合体をインキュベート中、４℃で４℃のPBSと一緒に１５分間インキュベートした後にフラスコをタップすることにより、樹状細胞を採集した。次に樹状細胞を単純AIM-V 培地(2-4 mL)で洗浄し、計数した。合計25,000個乃至100,000個の樹状細胞を１２ウェル・プレートに加えた。次に、抗原／抗体複合体を各ウェルに加え、総体積1mLにして４時間、３７℃で5% CO2下でインキュベートした。
【０１５７】
上清を取り出し、AIM-V (1mL)、TNF-α(10ng/mL)、IL-1β（10ng/mL)、及びIL-6 (10 ng/mL) (Ｒ＆Ｄシステムズ社から市販のもの）を培養物に加え、３７℃で5% CO2下で一晩、インキュベートした。
【０１５８】
翌日に、様々な時点（即ち、化学療法から１２週前の試料と、化学療法から２６週後の試料）で得られた患者のT細胞を解凍することにより、in vitro刺激を開始した。細胞を計数し、RPMI-1640 (メリーランド州フレデリック、ライフ・テクノロジーズ社から市販の1-2×106 mL ）、FBS (10%)、L-グルタミン及びゲンタマイシン（ミネソタ州ミネアポリス、Ｒ＆Ｄシステムズ社から市販）、IL-2 (20 IU/mL) 及びIL-7 (10ng/mL)と一緒に再懸濁させた。
【０１５９】
培地を培養樹状細胞から吸引し、AIM-V培地で洗浄した。次に患者のT細胞を10-50: 1の比率で加え、１０日間、３７℃で5% CO2下でインキュベートした。
【０１６０】
１０日目に培養物にRPMI-1640 (0.5mL)、FBS(10%)、L-グルタミン及びゲンタマイシン、並びにIL-2 (80IU/mL)を与え、３日間、３７℃で5% CO2下でインキュベートした。
【０１６１】
結果を、T細胞のIFN-γ分泌に関するELISPOT検定を用いて解析した。放射性標識していないMAb-B43. 13を投与した患者は、図８に示すように、投与後腫瘍特異的T細胞を示した。図８に示すように、８週目の時点で採取されたT細胞試料 (化学療法前にMAb-B43.13を投与された ）の有する、自己由来腫瘍に対するT細胞応答は、２６週目時点で採取された患者試料 (放射性標識していないMAb-B43. 13を化学療法後に投与)よりも低かった。
【０１６２】
T細胞応答の有益な治療効果
統計学的解析法を用い、悪化までの時間及び生存上の利点を、自己由来腫瘍に対するT細胞応答と相関付けた。自己由来腫瘍及び／又はCA125に対するT細胞応答を示した患者では、図９Ｂのカプラン・マイヤー表に示すように、悪化までの時間に有意な上昇があった（６０週対１０．７週）。加えて、自己由来腫瘍及び／又はCA125に対するT細胞応答を示した患者では、さらに、図９Ａのカプラン・マイヤー表に示すように、生存率（１０８週目の時点でも中間値に達しない、対、３８週目の中間値）でも有意な上昇があった。
【０１６３】
実施例ＩＩＩ
以下の変更を行って、実施例Ｉで解説した通りに検定を行った。NIH: OVCAR-3腫瘍細胞をヴァージニア州マナサス、ATCCから購入した。マウスモノクローナル抗-CA125抗体 B43.13 (カナダ、アルバータ州、エドモントン、アルタレックス・コーポレーション)を、マウス腹水で産生させ、プロテインＡ親和性及び陰イオン交換クロマトグラフィで精製した。このIgG1抗体は、CA125と特異的かつ高親和で反応する。NIH: OVCAR-3 腫瘍細胞に、タキソール（1μg/mL）又はドキソルビシン（100μg/mL） で２４時間処理を行うことでアポトーシスを起こさせた。細胞を洗浄し、トリプシン消化で培養皿から剥がし、遠心分離し、cRPMI中に再懸濁させた。この細胞の一部分を5μg/ml のMAb-B43. 13と一緒に３０分間、氷上でインキュベートし、再度洗浄したが、残りの細胞は氷上で３０分間、抗体を添加せずにインキュベートした。NIH: OVCAR-3細胞には、それらに３回のサイクルの凍結−解凍を行うことで、ネクローシスも起こさせた。MAb-B43.13抗体 (5μg/mL)、アポトーシス性及びネクローシス性腫瘍細胞に、MAb-B43. 13(DC一個当たり腫瘍細胞１個)を加えたもの、又は加えないものを、未熟DCに与えた。１時間のインキュベート後、加えた成熟剤(TNF-α、10ng/mL ；及びIFN-γ、50U/mL) を用いてDCを成熟させ、この細胞をさらに３日間、インキュベートした。
【０１６４】
Tリンパ球を７日目に加え、実施例Ｉで解説した通りに取り込ませたDCと一緒に培養し、２４ウェル・プレートに1×106個の細胞/ウェルの濃度でプレートし、これに、抗原未刺激か、又は、 MAb-B43.13、アポトーシス性もしくはネクローシス性NIH: OVCAR-3細胞、又はアポトーシス性もしくはネクローシス性NIH: OVCAR3細胞＋MAb-B43. 13に曝露してある5×104個の成熟DCを加えた。７日目にT細胞を採集し、洗浄し、さらに７日間、IL-2 (10U/ml) 及びIL-7 (5 ng/ml) (ミネソタ州ミネアポリス、Ｒ＆Ｄシステムズ社)を添加したcRPMI中で上述したように取り込ませてあるDCと一緒に培養した。
【０１６５】
抗原を取り込ませたDCと一緒に最後の再刺激を行ってから２４時間後のT細胞培養物を、クロム標識した細胞（実施例Ｉを参照されたい）に、エフェクター対標的細胞比を25: 1 乃至2.5 : 1 (100μL/ウェル)にして、４時間、加え、そしてコントロールとして、100μLの培地（自発的放出）又は0.1% Tween-20 （最大の放出）を加えた。プレートを４時間、３７℃でインキュベートした後、30×gで５分間、遠心分離した。上清のうち100μLのアリクォートを採集し、ガンマ・カウンタで計数し、特異的溶解を式： % 特異的放出＝（特異的試料で得られるdpm−自発的放出のdpm）／（最大の放出のdpm−自発的放出のdpm）×１００に従って計算した。
【０１６６】
結果は、樹状細胞、タキソール又はドキソルビシンで処理されたアポトーシス性腫瘍細胞、及び結合剤を一緒に配合したex vivo投与の組合せは、腫瘍細胞を溶解させる上で、樹状細胞単独や、又は、結合剤単独、アポトーシス性腫瘍細胞単独、ネクローシス性腫瘍細胞単独、あるいは、ネクローシス性腫瘍細胞及び結合剤との組合せよりも優れていることを実証した。結果を図６に示す。
【０１６７】
実施例ＩＶ
検定を、以下の変更を行いつつ実施例Ｉで解説した通りに行った。NIH: OVCAR-3腫瘍細胞はヴァージニア州マナサス、ATCCから購入された。マウスモノクローナル抗CA125抗体 B43.13 (カナダ、アルバータ州エドモントン、アルタレックス・コーポレーション)をマウス腹水で産生させ、プロテインＡ親和性及び陰イオン交換クロマトグラフィで精製した。このIgG1抗体は、CA125と特異的かつ高親和で反応する。NIH : OVCAR-3腫瘍細胞に化学療法薬ドキソルビシン (100μg/mL、タキソール(1μg/mL)、トポテカン(2.5μg/mL) 及びカルボプラチン（100μg/mL） で２４時間、処理を行うか、又は、放射線照射 (10,000 ラド)を行って、アポトーシスを起こさせると共に、凍結−解凍を繰り返してネクローシスを起こさせた。細胞を洗浄し、トリプシン消化で培養皿から剥がし、遠心分離し、cRPMI中に再懸濁させた。この細胞の一部分を5μg/ml のMAb- B43.13と一緒に３０分間、氷上でインキュベートし、再度洗浄したが、残りの細胞は氷上で３０分間、抗体を加えずにインキュベートした。MAb-B43. 13抗体 (5μg/mL)、アポトーシス性及びネクローシス性腫瘍細胞に、MAb-B43. 13(DC一個当たり腫瘍細胞１個)を加えたもの、又は加えないものを、未熟DCに与えた。DCを成熟させ、１時間のインキュベーション後、成熟剤（TNF-α、10 ng/mL ; 及びIFN-γ、50U/mL）を加え、さらに３日間インキュベートしたこれらの細胞を、実施例Ｉ及びＩＩで解説したようにT細胞と一緒に培養した。
【０１６８】
Tリンパ球を２４ウェル・プレートに1×106個の細胞/ウェルの濃度になるようにプレートし、このプレートに、抗原未刺激か、又は、 MAb-B43.13、アポトーシス性もしくはネクローシス性NIH: OVCAR-3細胞、又はアポトーシス性もしくはネクローシス性NIH: OVCAR3細胞＋MAb-B43. 13に曝露してある5×104個の成熟DCを加えた。７日目にT細胞を採集し、洗浄し、さらに７日間、IL-2 (10U/ml) 及びIL-7 (5 ng/ml) (ミネソタ州ミネアポリス、Ｒ＆Ｄシステムズ社)を添加したcRPMI中で上述したように取り込ませてあるDCと一緒に培養した。
【０１６９】
抗原を取り込ませたDCで最後の再刺激を行ってから２４時間後のT細胞培養物を、クロム標識した細胞（実施例Ｉを参照されたい）に、エフェクター対標的細胞比を25: 1 乃至2.5 : 1 (100pL/ウェル)にして加え、そしてコントロールとして、100μLの培地（自発的放出）又は0.1% Tween-20 （最大の放出）を加えた。プレートを４時間、３７℃でインキュベートした後、30×gで５分間、遠心分離した。上清のうち100μLのアリクォートを採集し、ガンマ・カウンタで計数し、特異的溶解を式： % 特異的放出＝（特異的試料で得られるdpm−自発的放出のdpm）／（最大の放出のdpm−自発的放出のdpm）×１００に従って計算した。
【０１７０】
結果は、樹状細胞、ドキソルビシンで処理されたアポトーシス性腫瘍細胞、及び結合剤を一緒にしたex vivo投与の組合せは、腫瘍を溶解させる上で、樹状細胞単独や、又は、結合剤単独、アポトーシス性腫瘍細胞単独又はネクローシス性腫瘍細胞単独、あるいは、ネクローシス性腫瘍細胞及び結合剤との組合せよりも優れていることを実証した。４種類の検査された化学療法薬すべてでアポトーシス性になった腫瘍細胞は、放射線によりアポトーシス性になった腫瘍細胞よりも、CTLを誘導する上で、より有効だった。DCに取り込ませる前に結合剤MAb-B43.13で被覆したアポトーシス性腫瘍細胞は、アポトーシス性腫瘍細胞単独や、又は、結合剤単独よりも、検査したアポトーシス剤すべてに対してより強力なCTLの活性化剤だった。結果を図４に示す。
【０１７１】
実施例Ｖ
検定を、以下の変更を行いつつ実施例Ｉに関して解説した通りに行った。NIH:OVCAR-3 腫瘍細胞を、タキソール（1μg/ml）で２４時間処理してアポトーシス性にした。細胞を洗浄し、トリプシン消化で培養皿から剥がし、遠心分離し、cRPMI中に再懸濁させた。この細胞の一部分を5μg/ml のMAb- B43.13と一緒に３０分間、氷上でインキュベートし、再度洗浄したが、残りの細胞は氷上で３０分間、抗体を加えずにインキュベートした。MAb-B43. 13抗体 (5μg/mL)、アポトーシス性腫瘍細胞に、MAb-B43. 13(DC一個当たり腫瘍細胞１個)を加えたもの、又は加えないものを、未熟DCに与えた。１時間のインキュベート後、DCは成熟した。Tリンパ球を７日目に加え、実施例Ｉで解説したとおりに取り込ませたDCと一緒に培養した。
【０１７２】
抗原を取り込ませたDCで最後の刺激を行ってから２４時間後のT細胞培養物を、インターフェロン・ガンマ産生について分析した。CD4+ 及びCD8+ T 細胞による細胞内IFN-γ産生をフローサイトメトリで測定した。ブレフェルディンA (10μg/ml) (カリフォルニア州サンディエゴ、ファーミンジェン社)を、抗原を取り込ませたDCで再刺激を行ってから２時間後のT細胞培養物に加えた。さらに１８時間培養した後、細胞を染色緩衝剤(1% ヒトAb 血清を加えたPBS) と一緒に１５分間、４℃でインキュベートし、再度洗浄し、ペレットにし、蛍光標識した抗CD3、CD4、又はCD8抗体 (カリフォルニア州サンホセ、ベクトン・ディッキンソン社)を加えた。この細胞を固定し、perm/fix 溶液(カリフォルニア州サンディエゴ、ファーミンジェン社)と一緒に２０分間、氷上でインキュベートすることで透過性にし、洗浄し、抗IFNγ抗体又は適したアイソタイプ・コントロール（カリフォルニア州サンディエゴ、ファーミンジェン社）を加えた。３０分間氷上でインキュベートした後、細胞を洗浄し、2% パラホルムアルデヒドを含有する染色緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメトリで分析した。
【０１７３】
結果は、樹状細胞、タキソール誘導性アポトーシス性腫瘍細胞、及び結合剤を一緒にするex vivoでの組合せは、IFN-γを産生する上で、樹状細胞単独や、又は、結合剤単独、もしくはアポトーシス性腫瘍細胞単独との組合せよりも優れていることを実証した。タゾール処理でアポトーシス性にし、DCに取り込ませる前に結合剤に配合された腫瘍細胞は、CD+8 IFN-γ＋T細胞を誘導する上で、最も強力だった。検査された化学療法薬は４種ともすべてが、放射線によりアポトーシス性にした腫瘍細胞よりも、CTLを誘導する上でより有効だった。DCへ取り込ませる前に結合剤MAb-B43. 13で被覆したアポトーシス性腫瘍細胞は、検査したすべてのアポトーシス剤について、アポトーシス性腫瘍細胞単独又は結合剤単独よりも、CTLのより強力な活性化物質だった。結果を図６に示す。
【０１７４】
アポトーシス／CTL実験
実施例ＶＩ
再発性卵巣癌と診断された２０人のヒト患者に、放射性標識していないマウスMAb-B43. 13を、標準的な化学療法薬と組み合わせた研究を行った。患者に2mgのMAb- B43.13を１週目、３週目、５週目、及び９週目に２０分間、輸注し、更に選択的用量を１２週目に輸注した。MAb-B43.13での処理後、患者に標準的な化学療法薬と選択的な用量を、化学療法から４日間以内に１２週目から２６週目の間に投与した。疾患の進行をCTスキャン、身体検査、CA125レベル、及び生存の長期追跡調査を用いて評価した。自己由来腫瘍（n=8）及びCA125（n=18）に対するT細胞応答を、IFN-γに関するELISPOT検定を用いて評価した。
【０１７５】
T細胞応答
患者の末梢血単核細胞 (PBMC) を標準的な技術を用いて解凍した。洗浄前にPBMCをDNAse解凍培地中に２分間、静置した。PBMCを、まず8 mL AIM V 培地 (カリフォルニア州カールスバッド、ギブコ／インヴィトロジェン・コーポレーションから市販のものを入手可能)を加えることで１回、洗浄した。PBMCを10mLのAIM V 培地中に再懸濁させた。3-8×106/mL PBMCの10ml AIM-V 溶液を１時間、３７℃、5% CO2下で、T75フラスコ・プレート内でインキュベートした。
【０１７６】
インキュベート後、暖かいAIM V培地を、接着細胞上に直接ではなく、フラスコの側面に加え、各洗浄後にデカントし、最後の洗浄液を吸引することで、フラスコを該培地で４回、洗浄した（各洗浄毎に10mL）。
【０１７７】
最後の洗浄後、イスコーブの改良ダルベッコ培地（カリフォルニア州カールスバッド、ギブコ／インヴィトロジェン・コーポレーションから市販の10 mL IMDM)、ウシ胎児血清 (カリフォルニア州カールスバッド、ギブコ／インヴィトロジェン・コーポレーションから市販の10% FBS ）、GM-CSF (1,000 U/ml)、及びIL-4 (1,000U/ml) (両者ともミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄシステムズ社から市販のものを入手できる）をフラスコに加え、３日間、３７℃で5% CO2下でインキュベートした。
【０１７８】
３日目に、IMDM (2 mL)、FBS (10%)、GM-CSF (12, 000, U)、及びIL-4 (12,000, U) をフラスコに加えることで (フラスコ内の最終的なサイトカイン濃度は1,000U/ml GM-CSF、及び1,000U/ml IL-4だった)、樹状細胞培養物を与えた。その後６日目に、抗体及び抗原を３７℃で１時間、5% CO2下のAIM-V中で複合体形成させた。複合体をインキュベート中、４℃で４℃のPBSと一緒に１５分間、インキュベートした後にフラスコをタップすることにより、樹状細胞を採集した。次に樹状細胞を単純AIM-V 培地(2-4 mL)で洗浄し、計数した。合計25,000個乃至100,000個の樹状細胞を１２ウェル・プレートに加えた。次に、抗原、抗体、抗原／抗体複合体又はコントロールを各ウェルに加え、総体積1mLにして４時間、３７℃で5% CO2下でインキュベートした。
【０１７９】
上清を取り出し、AIM-V (1mL)、TNF-α(10ng/mL)、IL-1β（10ng/mL)、及びIL-6 (10 ng/mL) (Ｒ＆Ｄシステムズ社から市販のもの）を培養物に加え、３７℃、5% CO2下で一晩、インキュベートした。
【０１８０】
翌日に、様々な時点（即ち、化学療法から１２週前の試料と、化学療法から２６週後の試料）で得られた患者のT細胞を解凍することにより、in vitro刺激を開始した。細胞を計数し、RPMI-1640 (メリーランド州フレデリック、ライフ・テクノロジーズ社から市販の1-2×106 mL ）、FBS (10%)、L-グルタミン及びゲンタマイシン（ミネソタ州ミネアポリス、Ｒ＆Ｄシステムズ社から市販）、IL-2 (20 IU/mL) 及びIL-7 (10ng/mL)と一緒に再懸濁させた。
【０１８１】
培地を培養樹状細胞から吸引し、AIM-V培地で洗浄した。次に患者のT細胞を10-20: 1の比率で加え、１０日間、３７℃、5% CO2下でインキュベートした。
【０１８２】
１０日目に培養物にRPMI-1640 (0.5 mL)、FBS(10%)、L-グルタミン及びゲンタマイシン、並びにIL-2 (80IU/mL)を与え、３日間、３７℃、5% CO2下でインキュベートした。
【０１８３】
結果を、T細胞のIFN-γ分泌に関するELISPOT検定を用いて解析した。放射性標識していないMAb-B43. 13を投与した患者は、図７に示すように、抗体単独の投与（４回の注射、１２週目）後、腫瘍特異的T細胞の増加を示した。同様なT細胞応答はCA125に関しても見られた。図７に示すように、１２週目の時点で採取されたT細胞試料 (化学療法前に投与されたMAb-B43.13 ）の有する、自己由来腫瘍に対するT細胞応答は、２６週目時点で採取された患者試料 (化学療法と併用された放射性標識していないMAb-B43. 13投与)よりも低かった。
【０１８４】
T細胞応答の有益な治療効果
統計学的解析法を用い、悪化までの時間及び生存上の利点を、CA125及び／又は自己由来腫瘍に対するT細胞応答と相関付けた。自己由来腫瘍及び／又はCA125に対するT細胞応答を示した患者では、図９Ａのカプラン・マイヤー表に示すように、悪化までの時間に有意な上昇があった（１０８週目の時点でも中間値に達しない、対、１０．１週目の中間値、p＜0.0001）。加えて、自己由来腫瘍及び／又はCA125に対するT細胞応答を示した患者では、さらに、図９Ｂのカプラン・マイヤー表に示すように、生存率（１２０週目の時点でも中間値に達しない、対、５１．９週目の中間値、p=0.0019）でも有意な上昇があった。
【０１８５】
材料
MAb-B43. 13 はCA125に対するマウスモノクローナルIgG1抗体（アルタレックス・コーポレーション）である。化学療法薬 (パクリタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、カルボプラチン)はLKTラボから得られた。
【０１８６】
細胞
NIH: OVCAR-3卵巣癌細胞株はATCC (ヴァージニア州マナサス)から購入された。健康な正常ドナーからの末梢血白血球(PBL)をロイカフォレーシス（カリフォルニア州SeraCare社）で得、ヒストパック勾配（カナダ、ミシソーガ、シグマ社）で精製した。樹状細胞は、正常なヒトPBLから、抗CD3、CD7、CD16、CD19 及びCD56 による負の選択、続く磁気ビーズ結合抗マウスIgG及び磁石分離法（単球単離キット、ダイナル社）又は接着により、調製された。細胞をGM-CSF (1000U/mL)及びIL-4 (1000U/mL) 中で４日間、培養して、未熟DCを作製した。DCをTNF-α（50U/mL） 及びIFN-α(10ng/mL)を用いて成熟させた。T細胞を正常なヒトPBLからT細胞単離キット（ダイナル社）を用いた負の選択法により精製した。
【０１８７】
T細胞のin vitro活性化
NIH: OVCAR-3 腫瘍細胞を、放射線（10,000ラド）又は化学療法薬（4乃至24時間のインキュベーション）により、アポトーシスを起こすよう誘導し、洗浄し、HLAを適合させた未熟DCに与えた。並行して、一組のアポトーシス性細胞を、未熟DCに取り込ませる前にMAb-B43. 13と一緒にインキュベートした。コントロールとして、ネクローシス性NIH: OVCAR-3 細胞（凍結−解凍サイクルを反復）を未熟DCに、MAb-B43. 13と一緒に、又はなしで与えた。DCを２時間、DC一個当たり腫瘍細胞数個の比で取り込ませ、成熟させ、３日間、インキュベートした。７日目にDCを採集し、洗浄し、精製済み自己由来T細胞を10: 1 (T細胞対DC)の比率で加え、さらに７日間、培養した。DCでさらに一回刺激した後、このT細胞を、取り込ませたDC及びコントロールで、20:1の比率で２４時間、再刺激した後、T細胞活性化について分析した。
【０１８８】
細胞内IFN-γ染色
T細胞をブレフェルディン-Aと一緒に１６乃至２０時間、インキュベートした後、取り込ませたDCで最後の刺激を行った。細胞を抗CD3-FITC 及び抗CD8-CyChromeで染色し、透過性にした後、抗IFN-γ-PE で染色した後、フローサイトメトリ分析を行った。
【０１８９】
クロム放出検定
NIH: OVCAR-3細胞に51Cr (~100μCi/2×106個の細胞) で２時間、標識した後、活性化T細胞の連続希釈液に加えた。４時間のインキュベーション後、プレートを遠心分離して、上清のうちのアリクォートを放出された51Crについてガンマ・カウンタで分析した。特異的溶解のパーセンテージを、式：（活性化T細胞の存在下での放出−自発的放出）／（最大の放出−自発的放出）×１００に従って計算した。
【０１９０】
薬物誘導性細胞死を観察するためのWST-1
NIH: OVCAR-3細胞を96ウェル・プレート(NUNC社）で成長させ、10,000ラドで放射線照射するか、又は、ある範囲の濃度の化学療法薬で４時間処理した後に洗浄した。細胞を３７℃で最高３日間、インキュベートした。WST-1基質（ドイツ、マンハイム、ベーリンガー−マンハイム社 ）を処理後４時間、２４時間、４８時間、及び７２時間、加えた。プレートを650nmでELISAリーダで読み取り、細胞死のパーセンテージを、式：処理された細胞のA650／未処理の細胞のA650×１００に従って計算した。
【０１９１】
アネキシンＶアポトーシス検定
NIH: OVCAR-3細胞を6ウェル・プレート(NUNC社)で成長させ、放射線照射するか、又は、化学療法薬で４乃至４８時間、処理し、洗浄し、アネキシンＶ-FITC (BD-ファーミンジェン社)で１時間、染色した。細胞をフローサイトメトリ (ベクトン-ディッキンソン社、CellQuest)で分析し、ヨウ化プロピジウムで対比染色し、フローサイトメータで再度分析した。
【０１９２】
活性化カスパーゼに関する共焦点顕微鏡法
NIH : OVCAR-3 細胞を組織チャンバ・スライド(NUNC社)で成長させ、化学療法薬で４乃至４８時間、処理し、洗浄し、Phi-Phi-Luxで１時間、染色した。細胞を再度素早く洗浄し、固定し、ヨウ化プロピジウムで対比染色してから、共焦点顕微鏡法（ドイツ、ツァイス社）で分析した。
【０１９３】
CA125 発現
NIH: OVCAR-34細胞を、化学療法薬又は放射線照射によるアポトーシス誘導前及び誘導後２４時間目に、CA125発現について分析した。細胞を氷上で5μg/mLのFITC標識MAb-B43.13 (FITCラベリング・キット、オレゴン州ユージーン、モラキュラー・プローブズ社)と一緒に１時間、インキュベートし、２回、洗浄し、固定し、フローサイトメトリで分析した。
【０１９４】
共焦点顕微鏡法による、腫瘍細胞の樹状細胞取り込み
未熟樹状細胞をチャンバ・スライド中で成長させ、４乃至７２時間、アポトーシス中のCFSE標識腫瘍細胞と一緒に、MAbB43.13オプソニン化をした状態、又はしない状態でインキュベートした。細胞を固定し、透過性にし、DAPI及び抗toll様受容体2、3及び6、続いて抗ウサギPEで染色した。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】図１は、アポトーシスの時間経過を示す。  図１Ａは、化学療法薬で処理されたNIH: OVCAR-3細胞の細胞死の時間経過を示す。  図１Ｂは、アポトーシス関連アネキシンＶ増加の時間経過を示す。
【図２】図２は、タキソールで処理されていない又は処理された腫瘍細胞(NIH: OVCAR- 3)上の腫瘍細胞CA125の発現を示す。  図２Ａは、処理されていないCA125陽性細胞上のアネキシンＶ染色を示す。  図２Ｂは、タキソールで処理されたCA125陽性細胞上のアネキシンＶ染色を示す。  図２Ｃは、処理されていない、又は、多種の化学療法薬で処理されたCA125陽性細胞上のアネキシンＶ染色の比較を示す。
【図３】図３は、ex vivo法と、ガンマ線照射によりアポトーシス性にした腫瘍細胞、MAb-B43.13、又は、アポトーシス性腫瘍細胞とT細胞を刺激するためのB43.13との組合せ、で取り込ませた樹状細胞からの腫瘍溶解増加の図解を示す。活性化T細胞による腫瘍細胞溶解を、クロム放出検定で測定している。
【図４】図４は、ex vivo法と、アポトーシス性にした腫瘍細胞で取り込ませた樹状細胞からの腫瘍溶解増加の図解を示す。活性化T細胞による腫瘍細胞溶解を、クロム放出検定で測定している。  図４Ａは、ex vivo法と、タキソール又はコントロールによりアポトーシス性にした腫瘍細胞、MAb-B43.13、又は、アポトーシス性腫瘍細胞 とT細胞を刺激するためのB43.13との組合せ、で取り込ませた樹状細胞投与からの腫瘍溶解増加の図解を示す。  図４Ｂは、ex vivo法と、ドキソルビシン又はコントロールによりアポトーシス性にした腫瘍細胞、MAb-B43.13、又は、アポトーシス性腫瘍細胞 とT細胞を刺激するためのB43.13との組合せ、で取り込ませた樹状細胞投与からの腫瘍溶解増加の図解を示す。
【図５】図５は、アポトーシス性腫瘍細胞（化学療法又は放射線照射後４時間）又はネクローシス性腫瘍細胞（凍結−乾燥の反復）、あるいは、結合剤B43.13を加えた、又は加えない負のコントロールで取り込ませた樹状細胞（DC）で刺激したT細胞による腫瘍細胞溶解の図解を示す。
【図６】図６は、結合剤B43.13を加えた、又は加えない、アポトーシス性腫瘍細胞（タキソール又は放射線処理後４時間）で取り込ませた樹状細胞（DC）で刺激したT細胞によるインターフェロン-ガンマ産生の図解を示す。
【図７】図７は、in vivo法と、化学療法前にMAb-B43.13を投与された患者の自己由来腫瘍に対するT細胞活性の亢進を、ELISPOTで測定して、基線測定値及び１２週目で示す。
【図８】図８は、 in vivo法と、化学療法前（１２週目）及び化学療法後（２６週目）にMAb-B43.13を投与された患者の、CA125及び自己由来腫瘍に対するT細胞活性の亢進を、ELISPOTで測定して示す。  図８Ａは、自己由来樹状細胞をCA125で取り込ませ、培養の最後の２４時間を患者のT細胞と一緒にインキュベートした実験を示す。  図８Ｂは、自己由来樹状細胞を腫瘍細胞で取り込ませ、培養の最後の２４時間を患者のT細胞と一緒にインキュベートした実験を示す。
【図９】図９は、生存率及びT細胞活性で測定された処理効果間の相関をカプラン・マイヤー表を用いて表したin vivo法の図解である。  図９Ａは、悪化までの時間と、自己由来腫瘍及び／又はCA125に対するT細胞活性で測定された処理効果間の相関をカプラン・マイヤー表を用いて表したin vivo法の図解である。  図９Ｂは、生存率と、自己由来腫瘍及び／又はCA125に対するT細胞活性で測定された処理効果間の相関をカプラン・マイヤー表を用いて表したin vivo法の図解である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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