(57)【要約】  本発明の発明者らは、α−アミノアジピン酸レダクターゼおよびホモクエン酸シンターゼが、各々、真菌病原性に必須であることを発見した。具体的には、真菌においてα−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼ遺伝子発現を阻害すると、感染成功または病変のいかなる徴候も生じない。したがって、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼを、抗生物質、好ましくは抗真菌剤を同定するための標的として使用可能である。したがって、本発明は、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼ発現または活性を阻害する化合物の同定法を提供する。本発明の方法は、抗生物質、好ましくは抗真菌剤を同定するのに有用である。
2005510230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）α−アミノアジピン酸レダクターゼポリペプチドと前記試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記α−アミノアジピン酸レダクターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み；
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項２】
前記α−アミノアジピン酸レダクターゼポリペプチドが、真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼポリペプチドである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記α−アミノアジピン酸レダクターゼポリペプチドが、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）α−アミノアジピン酸レダクターゼポリペプチドである、請求項１の方法。
【請求項４】
前記α−アミノアジピン酸レダクターゼポリペプチドが配列番号３である、請求項１の方法。
【請求項５】
請求項１の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：
真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出する
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項６】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）前記試験化合物と：真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド、真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、および真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み；
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項７】
請求項６の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：
真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出する
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項８】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−２−アミノアジペートおよびＮＡＤＰＨおよびＡＴＰと、α−アミノアジピン酸レダクターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−２−アミノアジペートおよびＮＡＤＰＨおよびＡＴＰと、α−アミノアジピン酸レダクターゼおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−２−アミノアジペート、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、ＡＭＰ、ＡＴＰ、Ｈ２Ｏおよび／またはピロホスフェート；
ことを含み；
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項９】
前記α−アミノアジピン酸レダクターゼが真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼである、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記α−アミノアジピン酸レダクターゼが、マグナポルテ属α−アミノアジピン酸レダクターゼである、請求項８の方法。
【請求項１１】
前記α−アミノアジピン酸レダクターゼが配列番号３である、請求項８の方法。
【請求項１２】
請求項８の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：
真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出する
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項１３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェート、およびＨ２Ｏと、α−アミノアジピン酸レダクターゼを接触させ； 
ｂ）Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェート、およびＨ２Ｏと、α−アミノアジピン酸レダクターゼおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−２−アミノアジペート、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、ＡＭＰ、ＡＴＰ、Ｈ２Ｏおよび／またはピロホスフェート；
ことを含み；
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１４】
前記α−アミノアジピン酸レダクターゼが真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼである、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記α−アミノアジピン酸レダクターゼが、マグナポルテ属α−アミノアジピン酸レダクターゼである、請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記α−アミノアジピン酸レダクターゼが配列番号３である、請求項１３の方法。
【請求項１７】
請求項１３の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：
真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出する
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項１８】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−２−アミノアジペートおよびＮＡＤＰＨおよびＡＴＰと：α−アミノアジピン酸レダクターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、α−アミノアジピン酸レダクターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびα−アミノアジピン酸レダクターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含んでなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−２−アミノアジペートおよびＮＡＤＰＨおよびＡＴＰと、前記ポリペプチドおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−２−アミノアジペート、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、ＡＭＰ、ＡＴＰ、Ｈ２Ｏおよび／またはピロホスフェート；
ことを含み；
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１９】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェート、およびＨ２Ｏと：α−アミノアジピン酸レダクターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、α−アミノアジピン酸レダクターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびα−アミノアジピン酸レダクターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含んでなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェート、およびＨ２Ｏと、前記ポリペプチドおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−２−アミノアジペート、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、ＡＭＰ、ＡＴＰ、Ｈ２Ｏおよび／またはピロホスフェート；
ことを含み；
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項２０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）一の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記化合物の非存在下で、α−アミノアジピン酸レダクターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞において、前記α−アミノアジピン酸レダクターゼの発現を測定し；
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、α−アミノアジピン酸レダクターゼの発現を比較する
ことを含み；
前記試験化合物の存在下での発現がより低いことが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項２１】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物が真菌であるか、または真菌由来である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物がマグナポルテ属真菌または該真菌細胞であるか、あるいはマグナポルテ属真菌または該真菌細胞由来である、請求項２０の方法。
【請求項２３】
前記α−アミノアジピン酸レダクターゼが配列番号３である、請求項２０の方法。
【請求項２４】
ＡＡＲ１  ｍＲＮＡを検出することによって、α−アミノアジピン酸レダクターゼ発現を測定する、請求項２０の方法。
【請求項２５】
α−アミノアジピン酸レダクターゼポリペプチドを検出することによって、α−アミノアジピン酸レダクターゼ発現を測定する、請求項２０の方法。
【請求項２６】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）α−アミノアジピン酸レダクターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を準備し、そしてα−アミノアジピン酸レダクターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を準備し、
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み；
前記化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項２７】
細胞が真菌細胞である、請求項２６の方法。
【請求項２８】
細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項２６の方法。
【請求項２９】
α−アミノアジピン酸レダクターゼの前記型および前記比較型が、真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼである、請求項２６の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属α−アミノアジピン酸レダクターゼである、請求項２６の方法。
【請求項３１】
α−アミノアジピン酸レダクターゼの前記型および前記比較型が、非真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼである、請求項２６の方法。
【請求項３２】
α−アミノアジピン酸レダクターゼの一方の型が真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼであり、そしてもう一方の型が非真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼである、請求項２６の方法。
【請求項３３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）リジン生化学経路および／またはリジン遺伝子経路において遺伝子の１つの型を有する細胞を準備し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を準備し、
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、前記試験化合物を接触させ、
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み；
前記化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項３４】
細胞が真菌細胞である、請求項３３の方法。
【請求項３５】
細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項３３の方法。
【請求項３６】
リジン生合成遺伝子の前記型および前記比較型が、真菌リジン生合成遺伝子である、請求項３３の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属リジン生合成遺伝子である、請求項３３の方法。
【請求項３８】
リジン生合成遺伝子の前記型および前記比較型が、非真菌リジン生合成遺伝子である、請求項３３の方法。
【請求項３９】
リジン生合成遺伝子の一方の型が真菌リジン生合成遺伝子であり、そしてもう一方の型が非真菌リジン生合成遺伝子である、請求項３３の方法。
【請求項４０】
請求項３３の方法によって抗生物質候補と同定された試験化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：
真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出する
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項４１】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
（ａ）対の増殖培地を準備し；該増殖培地は第一の培地および第二の培地を含み、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのリジンを含有し；
（ｂ）生物と前記試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み；
前記の第一の培地および第二の培地の間で、生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項４２】
前記生物が真菌である、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記生物がマグナポルテ属である、請求項４１の方法。
【請求項４４】
配列番号３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項４５】
配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項４４のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
請求項４５のポリヌクレオチドを含んでなる、発現カセット。
【請求項４７】
配列番号１と少なくとも５０％〜少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる、請求項４４の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
配列番号３のアミノ酸配列から本質的になる、ポリペプチド。
【請求項４９】
配列番号３のアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチド。
【請求項５０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）ホモクエン酸シンターゼポリペプチドと前記試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ホモクエン酸シンターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み；
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項５１】
前記ホモクエン酸シンターゼポリペプチドが真菌ホモクエン酸シンターゼポリペプチドである、請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記ホモクエン酸シンターゼポリペプチドがマグナポルテ属ホモクエン酸シンターゼポリペプチドである、請求項５０の方法。
【請求項５３】
前記ホモクエン酸シンターゼポリペプチドが配列番号６である、請求項５０の方法。
【請求項５４】
請求項５０の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：
真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出する
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項５５】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）前記試験化合物と：真菌ホモクエン酸シンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド、真菌ホモクエン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、および真菌ホモクエン酸シンターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み；
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項５６】
請求項５５の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：
真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出する
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項５７】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）アセチルＣｏＡおよびＨ２Ｏおよび２−オキソグルタレートと、ホモクエン酸シンターゼを接触させ；
ｂ）アセチルＣｏＡおよびＨ２Ｏおよび２−オキソグルタレートと、ホモクエン酸シンターゼおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレート、２−オキソグルタレート、アセチルＣｏＡ、ＣｏＡ、および／またはＨ２Ｏ；
ことを含み；
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項５８】
前記ホモクエン酸シンターゼが真菌ホモクエン酸シンターゼである、請求項５７の方法。
【請求項５９】
前記ホモクエン酸シンターゼが、マグナポルテ属ホモクエン酸シンターゼである、請求項５７の方法。
【請求項６０】
前記ホモクエン酸シンターゼが配列番号６である、請求項５７の方法。
【請求項６１】
請求項５７の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：
真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出する
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項６２】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレートおよびＣｏＡと、ホモクエン酸シンターゼを接触させ；
ｂ）２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレートおよびＣｏＡと、ホモクエン酸シンターゼおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレート、２−オキソグルタレート、アセチルＣｏＡ、ＣｏＡ、および／またはＨ２Ｏ；
ことを含み；
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項６３】
前記ホモクエン酸シンターゼが真菌ホモクエン酸シンターゼである、請求項６２の方法。
【請求項６４】
前記ホモクエン酸シンターゼが、マグナポルテ属ホモクエン酸シンターゼである、請求項６２の方法。
【請求項６５】
前記ホモクエン酸シンターゼが配列番号６である、請求項６２の方法。
【請求項６６】
請求項６２の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：
真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出する
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項６７】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）アセチルＣｏＡおよびＨ２Ｏおよび２−オキソグルタレートと：ホモクエン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、ホモクエン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびホモクエン酸シンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含んでなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）アセチルＣｏＡおよびＨ２Ｏおよび２−オキソグルタレートと、前記ポリペプチドおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレート、２−オキソグルタレート、アセチルＣｏＡ、ＣｏＡ、および／またはＨ２Ｏ；
ことを含み；
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項６８】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレートおよびＣｏＡと：ホモクエン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、ホモクエン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびホモクエン酸シンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含んでなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレートおよびＣｏＡと、前記ポリペプチドおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレート、２−オキソグルタレート、アセチルＣｏＡ、ＣｏＡ、および／またはＨ２Ｏ；
ことを含み；
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項６９】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）一の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記化合物の非存在下で、ホモクエン酸シンターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞において、前記ホモクエン酸シンターゼの発現を測定し；ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、ホモクエン酸シンターゼの発現を比較する
ことを含み；
前記試験化合物の存在下での発現がより低いことが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項７０】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物が真菌であるか、または真菌由来である、請求項６９の方法。
【請求項７１】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物がマグナポルテ属真菌または該真菌細胞であるか、あるいはマグナポルテ属真菌または該真菌細胞由来である、請求項６９の方法。
【請求項７２】
前記ホモクエン酸シンターゼが配列番号３である、請求項６９の方法。
【請求項７３】
ＨＣＳ１  ｍＲＮＡを検出することによって、ホモクエン酸シンターゼ発現を測定する、請求項６９の方法。
【請求項７４】
ホモクエン酸シンターゼポリペプチドを検出することによって、ホモクエン酸シンターゼ発現を測定する、請求項６９の方法。
【請求項７５】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）ホモクエン酸シンターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を準備し、そしてホモクエン酸シンターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を準備し、
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み；前記化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項７６】
細胞が真菌細胞である、請求項７５の方法。
【請求項７７】
細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項７５の方法。
【請求項７８】
ホモクエン酸シンターゼの前記型および前記比較型が、真菌ホモクエン酸シンターゼである、請求項７５の方法。
【請求項７９】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属ホモクエン酸シンターゼである、請求項７５の方法。
【請求項８０】
ホモクエン酸シンターゼの前記型および前記比較型が、非真菌ホモクエン酸シンターゼである、請求項７５の方法。
【請求項８１】
ホモクエン酸シンターゼの一方の型が真菌ホモクエン酸シンターゼであり、そしてもう一方の型が非真菌ホモクエン酸シンターゼである、請求項７５の方法。
【請求項８２】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）リジン生化学経路および／またはリジン遺伝子経路において遺伝子の１つの型を有する細胞を準備し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を準備し、
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、前記試験化合物を接触させ、
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み；前記化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項８３】
細胞が真菌細胞である、請求項８２の方法。
【請求項８４】
細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項８２の方法。
【請求項８５】
リジン生合成遺伝子の前記型および前記比較型が、真菌リジン生合成遺伝子である、請求項８２の方法。
【請求項８６】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属リジン生合成遺伝子である、請求項８２の方法。
【請求項８７】
リジン生合成遺伝子の前記型および前記比較型が、非真菌リジン生合成遺伝子である、請求項８２の方法。
【請求項８８】
リジン生合成遺伝子の一方の型が真菌リジン生合成遺伝子であり、そしてもう一方の型が非真菌リジン生合成遺伝子である、請求項８２の方法。
【請求項８９】
請求項８２の方法によって抗生物質候補と同定された試験化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：
真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出する
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項９０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
（ａ）対の増殖培地を準備し；該増殖培地は第一の培地および第二の培地を含み、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのリジンを含有し；
（ｂ）生物と前記試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み；
前記の第一の培地および第二の培地の間で、生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項９１】
前記生物が真菌である、請求項９０の方法。
【請求項９２】
前記生物がマグナポルテ属である、請求項９０の方法。
【請求項９３】
配列番号６のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項９４】
配列番号４のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項９３のポリヌクレオチド。
【請求項９５】
請求項９４のポリヌクレオチドを含んでなる、発現カセット。
【請求項９６】
配列番号４と少なくとも５０％〜少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる、請求項９３の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９７】
配列番号６のアミノ酸配列から本質的になる、ポリペプチド。
【請求項９８】
配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、米国特許出願第１０／０１１，１４６号、２００１年１１月９日出願、および米国特許出願第１０／０１１，２００号、２００１年１１月９日出願に基づく優先権の利益を主張し、これらの内容は本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、一般的に、抗生物質、好ましくはリジン生合成に効果を及ぼす抗真菌剤の同定法に関する。
【背景技術】
【０００３】
繊維状真菌は、植物および動物の多くの深刻な病原性感染に関与する原因病原体である。真菌は真核生物であるため、そしてしたがって、例えば細菌よりも、宿主生物により似ているため、真菌による感染の治療は、他の種類の感染には起こらない特別のリスクおよび難問をもたらす。１つのこうした真菌は、イネ（ｒｉｃｅ）いもち病を引き起こす真菌、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。該真菌は、世界の食料供給に深刻な脅威をもたらす生物である。経済的に重要な植物病原体の他の例には、Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ、Ａｎｉｓｏｇｒａｍｍａ、Ａｎｔｈｒａｃｏｉｄｅａ、Ａｎｔｒｏｄｉａ、Ａｐｉｏｇｎｏｍｏｎｉａ、Ａｐｉｏｓｐｏｒｉｎａ、Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ、Ａｓｃｏｃｈｙｔａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｃｅｒａｔｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｃｅｒｏｔｅｌｉｕｍ、Ｃｅｒｒｅｎａ、Ｃｈｏｎｄｒｏｓｔｅｒｅｕｍ、Ｃｈｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｈｒｙｓｏｍｙｘａ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｌｅｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｉｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ、Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｃｙａｔｈｕｓ、Ｃｙｍａｄｏｔｈｅａ、Ｃｙｔｏｓｐｏｒａ、Ｄａｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ、Ｄｉｄｙｍｅｌｌａ、Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｄｉｓｃｏｈａｉｎｅｓｉａ、Ｄｉｓｃｕｌａ、Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ、Ｅｃｈｉｎｏｄｏｎｔｉｕｍ、Ｅｌｓｉｎｏｅ、Ｅｎｄｏｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ、Ｅｎｄｏｔｈｉａ、Ｅｎｔｙｌｏｍａ、Ｅｐｉｃｈｌｏｅ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ、Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ、Ｆｏｍｅｓ、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｏｅｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ、Ｇｎｏｍｏｎｉｅｌｌａ、Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ、Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ、Ｈｉｒｓｃｈｉｏｐｏｒｕｓ、Ｈｙｐｏｄｅｒｍｅｌｌａ、Ｉｎｏｎｏｔｕｓ、Ｉｒｐｅｘ、Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ、Ｋａｂａｔｉｎａ、Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ、Ｌａｅｔｉｓａｒｉａ、Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｌａｘｉｔｅｘｔｕｍ、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ、Ｌｅｕｃｙｔｏｓｐｏｒａ、Ｌｉｎｏｓｐｏｒａ、Ｌｏｐｈｏｄｅｒｍｅｌｌａ、Ｌｏｐｈｏｄｅｒｍｉｕｍ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ、Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ、Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ、Ｍｅｌａｍｐｓｏｒｅｌｌａ、Ｍｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｏ���ｉｌｉｎｉａ、Ｍｏｎｏｃｈａｅｔｉａ、Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｎｅｃｔｒｉａ、Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ、Ｏｐｈｉｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｅｒｅｎｎｉｐｏｒｉａ、Ｐｅｒｉｄｅｒｍｉｕｍ、Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ、Ｐｈａｅｏｃｒｙｐｔｏｐｕｓ、Ｐｈａｅｏｌｕｓ、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ、Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ、Ｐｈｏｍａ、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍ、Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ、Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ、Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｏｐｓｉｓ、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｅｚｉｚａ、Ｐｓｅｕｄｏｓｅｐｔｏｒｉａ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｓｔｒｕｍ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈａｂｄｏｃｌｉｎｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａ、Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｒｈｙｔｉｓｍａ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｐｏｒａ、Ｓｃｉｒｒｈｉａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｓｃｙｔｉｎｏｓｔｒｏｍａ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ、Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒａ、Ｓｉｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｐａｅｒｏｔｈｅｃａ、Ｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ、Ｓｐｏｒｉｓｏｒｉｕｍ、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ、Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ、Ｓｔｅｒｅｕｍ、Ｔａｐｈｒｉｎａ、Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｔｒａｎｚｓｃｈｅｌｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｕｂａｋｉａ、Ｔｙｐｈｕｌａ、Ｕｎｃｉｎｕｌａ、Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｕｒｏｍｙｃｅｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ、Ｖａｌｓａ、Ｖｅｎｔｕｒｉａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｘｙｌａｒｉａ、および他の属の病原体が含まれる。Ａｌｂｕｇｏ、Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｒｅｍｉａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｐｈｔｈｏｒａ、および他の属を含む、卵菌類に分類される関連生物もまた、重要な植物病原体であり、そしてときに、真の真菌と一緒に分類される。繊維状真菌に引き起こされるヒト疾患には、生命を脅かす肺疾患および播種性疾患が含まれ、これはしばしばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ感染の結果である。動物における他の真菌疾患は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｍｓａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、他のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉ、および他の属に引き起こされる。植物および動物における真菌疾患の制御は、通常、真菌生物の成長、増殖、および／または病原性を阻害する化学薬品によって仲介される。今日まで、植物防御殺真菌剤およびヒト抗真菌化合物の作用様式には２０未満しか知られていない。
【０００４】
病原性生物は、疾患を引き起こすかまたは疾患を引き起こすことが可能な生物と定義されてきている。病原性生物は、組織上または組織中で増殖し、そして栄養素および他の必須物質を宿主から得ることが可能である。繊維状真菌病原体に関わるかなりな量の研究が、ヒト病原体、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓを用いて、行われてきている。Ｓｈｉｂｕｙａら（Ｓｈｉｂｕｙａ，  Ｋ．，  Ｍ．  Ｔａｋａｏｋａら（１９９９）  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ  ２７：１２３−３１（ＰＭＩＤ：  １０４５５００３））は、それぞれ、アルカリプロテアーゼまたはハイドロフォビン（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ）（ロッドレット（ｒｏｄｌｅｔ））をコードする、病原性関連と推測される２つの遺伝子のいずれかを欠失させても、これらの突然変異株に感染させたマウスの死亡率が減少しないことを示した。Ｓｍｉｔｈら（Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｃ．  Ｍ．  Ｔａｎｇら（１９９４）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６２：  ５２４７−５４（ＰＭＩＤ：  ７９６０１０１））は、アルカリプロテアーゼおよびリボトキシン、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）で同様の結果を示した；これらの遺伝子のいずれかに関して突然変異させたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ株は、マウスに対して、完全に病原性であった。Ｒｅｉｃｈａｒｄら（Ｒｅｉｃｈａｒｄ，  Ｕ．，  Ｍ．  Ｍｏｎｏｄら（１９９７）  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｅｔ  Ｍｙｃｏｌ  ３５：  １８９−９６（ＰＭＩＤ：  ９２２９３３５））は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓにおいて、アスペルギロペプシン（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｐｅｐｓｉｎ）（ＰＥＰ）をコードする、病原性と推測される遺伝子を欠失させても、モルモット（ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ）モデル系において、死亡率にまったく効果がないことを示し、そしてＡｕｆａｕｖｒｅ−Ｂｒｏｗｎら（Ａｕｆａｕｖｒｅ−Ｂｒｏｗｎ，  Ａ．，  Ｅ．  Ｍｅｌｌａｄｏら（１９９７）  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｂｉｏｌ  ２１：１４１-５２（ＰＭＩＤ：  ９０７３４８８））は、キチンシンターゼの突然変異が、病原性にまったく効果がないことを示した。しかし、すべての実験が陰性結果を生じたわけではない。エルゴステロールは、真菌生物に見られる、重要な膜構成要素である。植物宿主も、また動物宿主も、この特定のステロールを含有しないため、この生化学経路中の重要な酵素を欠く病原性真菌は、非病原性であると予期しうる。この生化学経路に効果を及ぼす多くの抗真菌化合物が記載されてきている（Ｏｎｉｓｈｉ，  Ｊ．  Ｃ．およびＡ．  Ａ．  Ｐａｔｃｈｅｔｔ（１９９０ａ，  ｂ，  ｃ，  ｄ，  およびｅ）米国特許４，９２０，１０９；４，９２０，１１１；４，９２０，１１２；４，９２０，１１３；および４，９２１，８４４、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．  Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ラーウェイ））および（Ｈｅｗｉｔｔ，  Ｈ．  Ｇ．（１９９８）  Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。Ｄ’Ｅｎｆｅｒｔら（Ｄ’Ｅｎｆｅｒｔ，  Ｃ．，  Ｍ．  Ｄｉａｑｕｉｎら（１９９６）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６４：４４０１−５（ＰＭＩＤ：  ８９２６１２��））は、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を突然変異させたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ株が、マウスにおいて、完全に非病原性であることを示し、そしてＢｒｏｗｎら（Ｂｒｏｗｎ，  Ｊ．  Ｓ．，  Ａ．  Ａｕｆａｕｖｒｅ−Ｂｒｏｗｎら（２０００）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３６：１３７１−８０（ＰＭＩＤ：  １０９３１２８７））は、パラ−アミノ安息香酸の合成に関与する遺伝子を突然変異させた結果、非病原性になることを観察した。いくつかの特定の標的遺伝子が、植物病原性真菌の阻害剤をスクリーニングするのに有用性を有すると記載されてきている。Ｂａｃｏｔら（Ｂａｃｏｔ，  Ｋ．  Ｏ．，  Ｄ．  Ｂ．  Ｊｏｒｄａｎら（２０００）  米国特許６，０７４，８３０、Ｅ．  Ｉ．  ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ（デラウェア州ウィルミントン））は、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼの使用を記載し、そしてＤａｖｉｓら（Ｄａｖｉｓ，  Ｇ．  Ｅ．，  Ｇ．  Ｄ．  Ｇｕｓｔａｆｓｏｎら（１９９９）  米国特許５，９７６，８４８、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ（インディアナ州インディアナポリス））は、潜在的なスクリーニング目的のためのジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼの使用を記載する。
【０００５】
突然変異体が、完全な病原性も、また非病原性も示さない、より明確でない結果を報告するいくつかの論文もある。Ｈｅｎｓｅｌら（Ｈｅｎｓｅｌ，  Ｍ．，  Ｈ．  Ｎ．  Ａｒｓｔ，  Ｊｒ．ら（１９９８）  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２５８：５５３−７（ＰＭＩＤ：  ９６６９３３８））は、ａｒｅＡ転写活性化因子を欠失させても、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓの病原性には、中程度の効果しかなかったことを示した。Ｔａｎｇら（Ｔａｎｇ，  Ｃ．  Ｍ．，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｍｉｔｈら（１９９４）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６２：  ５２５５−６０（ＰＭＩＤ：  ７９６０１０２））は、関連真菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓを用いて、パラ−アミノ安息香酸合成における突然変異が、マウスにおいて死亡を防いだが、リジン生合成における突然変異が、感染マウスの死亡率に有意な効果を及ぼさないことを観察した。
【０００６】
したがって、現在、病原体が、どの特定の増殖物質を宿主から容易に得ることが可能であり、そしてどの物質を得ることが不能であるのか決定することは、不可能である。特に、繊維状真菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓにおけるリジン生合成突然変異が、マウスモデル系において、病原性に有意な効果を及ぼさなかったことを示す結果（Ｔａｎｇ，  Ｃ．  Ｍ．，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｍｉｔｈら（１９９４）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６２：  ５２５５−６０（ＰＭＩＤ：  ７９６０１０２））に照らすと、驚くべきことに、我々は、それ自体のリジンを合成不能であるＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａが、宿主生物に対して、完全に非病原性であることを見出した。現在まで、繊維状真菌において、リジン生合成に関与する遺伝子または遺伝子産物のノックアウト、過剰発現、アンチセンス発現、または阻害の抗病原性効果を立証する刊行物は現れていない。したがって、リジンのｄｅ  ｎｏｖｏ生合成が真菌病原性に必須であることは示されていない。リジン経路中のホモクエン酸シンターゼを用いた我々の研究は、酵素活性、ホモクエン酸シンターゼをコードする遺伝子を破壊した結果のリジン生合成の破壊もまた、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａの非病原性表現型を生じることを示す。したがって、抗生物質化合物、特に殺真菌剤を評価するため、リジン生合成に関与する酵素の有用性を決定することが望ましいであろう。真菌生化学経路またはこの経路の特定の遺伝子産物が、真菌病原性に必要であることが示されたなら、多様な形式のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニングアッセイを設置して、有効な標的遺伝子、遺伝子産物、または生化学経路と反応し、そしてしたがって抗真菌剤、殺生剤、および生物静力学（ｂｉｏｓｔａｔｉｃ）物質の候補である化学的化合物種を発見することが可能である。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要：
驚くべきことに、本発明の発明者らは、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａにおいて、α−アミノアジピン酸レダクターゼをコードする遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ破壊、およびそれとは別個に、ホモクエン酸シンターゼをコードする遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ破壊が、各々、この真菌の病原性を防御するか、または阻害することを発見した。これらの酵素はどちらも、リジン生合成に関与する。したがって、本発明の発明者らは、α−アミノアジピン酸レダクターゼおよびホモクエン酸シンターゼが、各々、正常イネいもち病病原性に必須であり、そして抗生物質、好ましくは殺真菌剤を同定するための標的として使用可能であることを発見した。したがって、本発明は、α−アミノアジピン酸レダクターゼ、または別個にホモクエン酸シンターゼの発現または活性を阻害する化合物を同定する方法を提供する。本発明の方法は、抗生物質、好ましくは殺真菌剤の同定に有用である。
【０００８】
発明の詳細な説明：
別に示さない限り、以下の用語は、本発明を解釈する際に、以下の意味を有すると意図する。
【０００９】
抗生の活性を有する化合物、剤または組成物の文脈中の用語「〜に対して活性」は、該化合物が、特定の単数または複数の標的に対して、単数または複数のその標的を有する生物のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏの増殖に有害な効果を発揮することを示す。特に、遺伝子に対して活性である化合物は、その遺伝子の発現産物に影響を及ぼす標的に対して作用を発揮する。これは、必ずしも、その化合物が、遺伝子の発現産物に直接作用することを意味せず、化合物が、有害な方式で、発現産物に影響を及ぼすことを示す。したがって、化合物の直接標的は、例えば、遺伝子からの転写を減少させ、より低い発現レベルを生じる上流のコンポーネントであることが可能である。同様に、化合物は、ポリペプチド発現産物の翻訳レベルに影響を及ぼすことが可能であるし、または遺伝子の発現産物が主要な生物学的役割を果たす生化学経路の、下流のコンポーネントに作用することが可能である。その結果、こうした化合物は、遺伝子に対して、遺伝子産物に対して、あるいはその遺伝子または発現産物の上流または下流いずれかの関連コンポーネントに対して、活性であると言うことが可能である。用語「〜に対して活性」は、広い範囲の潜在的な活性を含むが、ある程度の標的特異性も示す。したがって、例えば、一般的なプロテアーゼは、ポリペプチド産物を生じる特定の遺伝子「に対して活性」ではない。対照的に、特定の酵素を阻害する化合物は、その酵素に対して活性であり、そしてその酵素をコードする遺伝子に対して活性である。
【００１０】
本明細書において、用語「アレル」は、既定の遺伝子座に生じることが可能な遺伝子の代替型のいずれかを指す。
本明細書において、用語「α−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．３１）、α−アミノアジピン酸レダクターゼポリペプチド、α−アミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、またはアルファ−アミノアジピン酸レダクターゼ」は、「ＡＡＲ１遺伝子産物」または「ＡＳＤ１遺伝子産物」と同義であり、そしてＬ−２−アミノアジペート、ＮＡＤＰＨ、およびＡＴＰと、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェート、Ｈ２Ｏの相互変換を触媒する酵素を指す。
【００１１】
用語「抗生物質」は、生存細胞、生物、ウイルス、または複製可能な他の実体と接触した際、その実体の増殖、生存度、または病原性の減少を生じる物質または化合物いずれかを指す。
【００１２】
用語「結合」は、２つの分子をともに保持する、非共有または共有相互作用、好ましくは非共有相互作用を指す。例えば、２つのこうした分子は、酵素とその酵素の阻害剤とであることが可能である。非共有相互作用には、水素結合、荷電基の間のイオン相互作用、ファンデルワールス相互作用および非極性基間の疎水性相互作用が含まれる。１以上のこれらの相互作用が２つの分子の互いの結合を仲介しうる。
【００１３】
用語「生化学経路」または「経路」は、細胞で通常生じる、一連の連結した生化学反応、またはより広い意味では、細胞分裂またはＤＮＡ複製などの細胞事象を指す。典型的には、こうした生化学経路の工程は、協調した方式で作用して、特定の単数または複数の産物を生じるか、あるいはいくつかの他の特定の生化学作用を生じる。遺伝子の発現産物が存在しないと、生化学経路の１以上の工程の完了が、直接または間接的に妨げられ、それによってその経路の通常の産物または効果の１以上の産生が妨げられるかまたは有意に減少する場合、こうした生化学経路はその遺伝子の発現産物を必要とする。したがって、ある剤が存在すると、特定の遺伝子の発現産物を必要とする生化学経路の一連の工程の完了が停止するかまたは実質的に減少する場合、その剤は、生化学経路を特異的に阻害する。こうした剤は、その特定の遺伝子の発現産物に直接作用する可能性があるが、必ずしもそうではない。
【００１４】
本明細書において、用語「ｃＤＮＡ」は、相補的デオキシリボ核酸を意味する。
本明細書において、用語「ＣｏＡ」は補酵素Ａを意味する。
本明細書において、用語「条件致死」は、特定の増殖または環境条件下でのみ、増殖および／または生存を可能にする突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を指す。
【００１５】
本明細書において、用語「コスミド」は、遺伝子クローニングに用いられ、ｃｏｓ部位（ラムダバクテリオファージ由来）を含むハイブリッドベクターを指す。該ベクターはまた、薬剤耐性マーカー遺伝子および他のプラスミド遺伝子も含有する。コスミドは、大きい遺伝子または多遺伝子断片をクローニングするのに特に適している。
【００１６】
本明細書において、用語「優性アレル」は、この突然変異が、野生型（非突然変異体）、劣性アレル、または他の優性アレルも含有する生物に存在した場合、識別しうる突然変異体表現型を検出可能な優性突然変異体アレルを指す。
【００１７】
本明細書において、用語「ＤＮＡ」はデオキシリボ核酸を意味する。
本明細書において、用語「ＥＬＩＳＡ」は、酵素連結免疫吸着アッセイを意味する。
「真菌（ｆｕｎｇｉ、単数形：ｆｕｎｇｕｓ）」は、全真菌、真菌器官および組織（例えば子嚢、菌糸、仮性菌糸、仮根、菌核、梗子、胞子、分生子座、胞子嚢、分生子柄束、分生子、子嚢子座、閉子嚢殻、菌糸体、子嚢殻、担子器等）、胞子、真菌細胞およびその子孫を指す。真菌は、限定されるわけではないが、真菌界を含んでなる、キノコ、うどん粉病菌（ｍｉｌｄｅｗ）、カビ（ｍｏｕｌｄ）、酵母などを含む生物群（約５０，０００種が知られる）である。これらは、単細胞として存在するか、または菌糸として知られる繊維からなる菌糸体と呼ばれる多細胞体を構成する可能性がある。大部分の真菌細胞は多核であり、そして主にキチンで構成される細胞壁を有する。真菌は、主に地上の湿った状況で存在し、そしてクロロフィルが存在しておらず、そしてしたがって光合成によって自身の食物を製造することが不能であるため、他の生物の寄生生物であるか、または死んだ生物物質を食料とする腐生生物であるか、いずれかである。分類に用いられる基本的な基準は、産生される胞子の性質および菌糸内の横断壁の存在または非存在である。真菌は、陸地、淡水、および海洋生育環境で、世界中に分布する。あるものは地中に住む。多くの病原性真菌は、動物およびヒトまたは植物において疾患を引き起こし、一方、材木、織物および他の物質に破壊的である腐生生物もある。他の生物と関連を形成する真菌もあり、とりわけ藻類とともに地衣類を形成する。
【００１８】
本明細書において、用語「殺真菌剤（ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ）」、「抗真菌剤（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ）」、または「抗真菌（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）」は、真菌、真菌細胞、真菌組織または胞子の少なくとも１つを殺すか、あるいはその増殖、生存度、または病原性を抑制する抗生物質または化合物を指す。
【００１９】
本開示の背景において、「遺伝子」は、遺伝の単位を指すと理解すべきである。各遺伝子は、鎖を形成するヌクレオチドの配列によって称することが可能な、デオキシリボヌクレオチドの直鎖で構成される。したがって、「配列」は、鎖を形成するヌクレオチドの順序だった列挙、およびヌクレオチドの配列を有する鎖そのものの両方を示すように用いられる（「配列」は、リボヌクレオチドで作られる直鎖である、ＲＮＡ鎖を指す際も、同様な方式で用いられる）。遺伝子は、制御配列および調節配列、ＲＮＡ分子に転写可能な配列を含むことが可能であり、そして未知の機能を持つ配列を含有することが可能である。ＲＮＡ転写産物の大部分はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり、該ＲＮＡは、ポリペプチドに翻訳される配列を含み、そして翻訳されない配列を含むことも可能である。異なる真菌株間で、または特定の真菌株内にさえ、遺伝子の同一性を改変しない、同一遺伝子のヌクレオチド配列における小さい相異が存在しうることを認識すべきである。
【００２０】
本開示において、用語、生物の「増殖」または「細胞増殖」は、前記生物の細胞の質量、密度、または数の増加を指す。増殖を測定する一般的ないくつかの方法には、細胞懸濁物の光学密度の測定、一定の体積中の細胞数の計数、細胞分裂の測定による細胞数の計数、細胞質量または細胞体積の測定等が含まれる。
【００２１】
本開示において、用語「増殖条件表現型」は、こうした表現型を有する真菌株が、増殖条件表現型を持たない以外は同様である株よりも、１以上の培養パラメーターの変化に反応して、増殖速度に、有意により大きい相異を示すことを示す。典型的には、増殖条件表現型は、単一の増殖培養パラメーター、例えば温度に関して記載される。したがって、温度（または熱感受性）突然変異体（すなわち熱感受性表現型を有する真菌株）は、許容条件下での増殖に比較した際、非許容温度条件下で、有意に異なる増殖を示し、そして好ましくはまったく増殖を示さない。さらに、こうした突然変異体はまた、好ましくは、中程度の温度または半許容温度で、中程度の増殖速度を示す。また、他の種類の増殖条件表現型の適切な増殖変化からも同様の反応が生じる。
【００２２】
本明細書において、用語「Ｈ２Ｏ」は水を意味する。
本明細書において、用語「ＡＡＲ１」は、α−アミノアジピン酸レダクターゼ活性をコードする遺伝子を意味し、Ｌ−２−アミノアジペート、ＮＡＤＰＨ、およびＡＴＰと、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェート、およびＨ２Ｏの相互変換を触媒する酵素を指す。
【００２３】
本明細書において、用語「異種ＡＡＲ１遺伝子」は、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来ではなく、そして：配列番号１または配列番号２と、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の配列同一性、および昇順に５０〜１００％からの各整数単位の配列同一性を有するか；あるいはＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  α−アミノアジピン酸レダクターゼ活性の少なくとも１０％、好ましくは２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％、および昇順に１０〜１００％の各整数単位の活性を有する遺伝子を意味する。
【００２４】
本明細書において、用語「ＨＣＳ１」は、ホモクエン酸シンターゼ活性をコードする遺伝子を意味し、アセチルＣｏＡ、Ｈ２Ｏ、および２−オキソグルタレートと、２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレートおよびＣｏＡの相互変換を触媒する酵素を指す。
【００２５】
本明細書において、用語「異種ＨＣＳ１遺伝子」は、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来ではなく、そして：配列番号１または配列番号２と、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の配列同一性、および昇順に５０〜１００％の各整数単位の配列同一性を有するか；あるいはＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａホモクエン酸シンターゼ活性の少なくとも１０％、好ましくは２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％、および昇順に１０〜１００％の各整数単位の活性を有する遺伝子を意味する。
【００２６】
本明細書において、用語「ホモクエン酸シンターゼ（ＥＣ  ４．１．３．２１）またはホモクエン酸シンターゼポリペプチド」は、「ＨＣＳ１遺伝子産物」と同義であり、そしてアセチルＣｏＡ、Ｈ２Ｏおよび２−オキソグルタレートと、２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレートおよびＣｏＡの相互変換を触媒する酵素を指す。
【００２７】
本明細書において、用語「Ｈｉｓタグ」は、多数の連続ヒスチジンアミノ酸からなる、コードされるポリペプチドを指す。
本明細書において、用語「ＨＰＬＣ」は、高圧液体クロマトグラフィーを指す。
【００２８】
本明細書において、用語「ｈｐｈ」、「ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ」、および「ハイグロマイシン耐性遺伝子」は、大腸菌ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子または遺伝子産物を指す。
【００２９】
本明細書において、用語「ハイグロマイシンＢ」は、大腸菌ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する真核細胞の選択および維持に用いる、アミノグリコシド性抗生物質を指す。
「過敏性」は、同様のまたは同一の遺伝子背景を持つ野生型細胞よりも、抗生物質化合物に、細胞がより感受性である表現型を指す。
【００３０】
「感受性低下」は、同様のまたは同一の遺伝子背景を持つ野生型細胞よりも、抗生物質化合物に、細胞がより感受性でない表現型を指す。
本明細書において、用語「不完全状態」は、立証しうる有性生活段階を持たない真菌生物の分類を指す。
【００３１】
用語「阻害剤」は、本明細書において、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼの酵素活性を不活性化するか、または酵素活性レベルを実質的に減少させる化学物質を指し、「実質的に」は、少なくとも測定の標準偏差と同じ程度に大きい減少、好ましくは５０％の減少、より好ましくは少なくとも１桁、すなわち１０％への減少を意味する。阻害剤は、酵素、酵素の補因子、酵素の基質、またはその組み合わせいずれかと直接相互作用することによって、機能することが可能である。
【００３２】
ポリヌクレオチドは、トランスフェクション、形質転換または形質導入、転位因子、エレクトロポレーション、微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、感染等を含む、当業者に知られる手段いずれかによって、真菌細胞に「導入」可能である。導入されたポリヌクレオチドは、非染色体自律レプリコンに取り込まれるか、または真菌染色体に組み込まれている場合、安定に細胞内に維持されうる。あるいは、導入されたポリヌクレオチドは、染色体外非複製ベクター上に存在して、そして一過性に発現するか、または一過性に活性であることが可能である。
【００３３】
本明細書において、用語「ノックアウト」または「遺伝子破壊」は、ヌル突然変異（活性遺伝子産物がない突然変異）、単数または複数の部分的ヌル突然変異、あるいはＤＮＡの外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）片の挿入を通じたＤＮＡ配列の中断による、遺伝子制御の単数または複数の改変を所持する生物の生成を指す。通常、外来ＤＮＡは選択可能マーカーをコードする。
【００３４】
本明細書において、用語「ＬＢアガー」は、ルリアのブロス・アガーを意味する。
用語「スクリーニング方法」は、該方法が、多数の化合物における、特定の特性または効果に関して試験するために、適しており、典型的に用いられることを意味する。典型的には１より多い化合物を同時に試験し（９６ウェルマイクロタイタープレートにおけるように）、そして好ましくは、方法のかなりの部分は自動化可能である。「スクリーニング方法」はまた、１つの化合物の異なる特性または効果のセットを測定することも指す。
【００３５】
本明細書において、用語「ｍＲＮＡ」は、メッセンジャーリボ核酸を意味する。
本明細書において、用語、遺伝子の「突然変異型（ｍｕｔａｎｔ  ｆｏｒｍ）」は、天然または人工的に改変され、遺伝子の塩基配列が変化している遺伝子を指す。塩基配列の変化は、いくつかの異なる種類のものであることが可能であり、１以上の塩基の異なる塩基への変化、欠失、および／またはトランスポゾンによるなどの挿入が含まれる。対照的に、遺伝子の正常型（野生型）は、生物の天然集団に一般的に見られる型である。一般的に、天然集団には、遺伝子の単一の型が優勢であろう。一般的に、こうした遺伝子は、遺伝子の正常型として適切であるが、同様の機能的特性を提供する他の型もまた、正常遺伝子として使用可能である。特に、正常型遺伝子は、その遺伝子を有する株に増殖条件表現型を与えないが、これらの方法に使用するのに適した突然変異型遺伝子は、こうした増殖条件表現型を提供する。
【００３６】
本明細書において、用語「Ｎｉ」は、ニッケルを指す。
本明細書において、用語「Ｎｉ−ＮＴＡ」はニッケルセファロースを指す。
本明細書において、用語、遺伝子の「１つの型」は、用語「遺伝子」と同義であり、そして遺伝子の「異なる型」は、前記の第一の型と、４９％の配列同一性より大きく、そして１００％の配列同一性より小さい配列同一性を有する遺伝子を指す。
【００３７】
本明細書において、用語「病原性」は、疾患を引き起こす能力を指す。該用語は、その宿主に関連して寄生微生物に適用される。
本明細書において、用語「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００３８】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列間の「配列同一性パーセント（％）」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．，  Ｗ．  Ｇｉｓｈら（１９９０）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０（ＰＭＩＤ：  ２２３１７１２））にしたがって、またはＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ  ＰｌｕｓＴＭに取り込まれているような、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ並列（Ｓｍｉｔｈ，  Ｔ．  Ｆ．およびＭ．  Ｓ．  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４７：１９５−７（ＰＭＩＤ：  ７２６５２３８））を用いて決定される。ＤＮＡ配列をＲＮＡ配列に比較する際に、配列同一性を決定する目的のため、チミンヌクレオチドがウラシルヌクレオチドと同等であると理解される。
【００３９】
「ポリペプチド」によって、ペプチド結合によって連結される、少なくとも２つのアミノ酸の鎖を意味する。鎖は、直鎖、分岐鎖、環状またはその組み合わせであることが可能である。好ましくは、ポリペプチドは、長さ約１０〜約１０００アミノ酸であり、より好ましくは長さ１０〜５０アミノ酸である。ポリペプチドは、アミノ酸類似体、および限定されるわけではないが、グリコシル化残基またはリン酸化残基を含む、他の修飾を含有することが可能である。
【００４０】
本明細書において、用語「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」は、用語「増殖（ｇｒｏｗｔｈ）」と同義である。
本明細書において、用語「逆転写酵素ＰＣＲ」は、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００４１】
本明細書において、用語「ＲＮＡ」はリボ核酸を意味する。
本明細書において、「半許容条件」は、特定の増殖条件表現型の相当する培養パラメーターが、許容条件および非許容条件の間の中間である条件である。その結果、半許容条件において、増殖条件表現型を有する生物は、許容条件および非許容条件において示されるものの中間の増殖速度を示すであろう。一般的に、こうした中間の増殖速度は、半許容条件下で部分的に機能し、許容条件下で本質的に完全に機能し、そして非許容条件下で機能しないか、または非常に低い機能しか持たない、突然変異細胞構成要素による可能性があり、この場合、この構成要素の機能レベルが、生物の増殖速度に関連する。中間の増殖速度はまた、最適な増殖速度が達成されるには不十分な量で存在する、単数または複数の栄養物質の結果である可能性もある。
【００４２】
「感受性表現型」は、過敏性または感受性低下のいずれかを示す表現型を指す。
用語「特異的結合」は、α−アミノアジピン酸レダクターゼおよび分子または化合物間の相互作用であって、α−アミノアジピン酸レダクターゼの一次アミノ酸配列および／またはコンホメーションに依存する相互作用をさす。
【００４３】
本明細書において、用語「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィーを意味する。
「形質転換」は、本明細書において、いずれかの手段による、生存細胞へのポリヌクレオチド（一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組み合わせ）の導入を指す。形質転換は、限定されるわけではないが、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコールが仲介する取り込み、微粒子銃、アグロトランスフォーメーション（ａｇｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等を含む、多様な方法によって達成可能である。このプロセスは、形質転換したポリヌクレオチドの一過性または安定発現を生じる可能性がある。「安定形質転換」によって、細胞中のレプリコン、例えば染色体またはエピソームに、目的の配列が組み込まれることを意味する。形質転換細胞は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、目的のポリヌクレオチドを保持する、その子孫も含む。
【００４４】
本発明の目的のため、「トランスジェニック」は、少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドをすべてまたは部分的に含有する、細胞、胞子、組織または部分いずれかを指す。多くの場合、組換えポリヌクレオチドはすべてまたは部分的に、代々の世代に渡されるように、染色体に、または安定な染色体外要素に、安定して組み込まれる。
【００４５】
本明細書において、用語「トランスポザーゼ」は、転位を触媒する酵素を指す。好ましいトランスポゾンは、ＷＯ  ００／５５３４６、ＰＣＴ／ＵＳ００／０７３１７、およびＵＳ  ０９／６５８８５９に記載される。
【００４６】
本明細書において、用語「転位」は、しばしば単数のゲノムまたは複数のゲノム、あるいはプラスミド、バクミド、およびコスミドなどのＤＮＡ構築物内またはそれらの間で、ポリヌクレオチド（トランスポゾン）が１つの位置から移動するか、またはコピーされて、別の位置に挿入されることを伴う、複雑な遺伝子再編成プロセスを指す。
【００４７】
本明細書において、用語「トランスポゾン」（または「転位要素」、「転位遺伝子要素」、「可動要素」、または「ジャンプ遺伝子」としても知られる）は、例えばＷＯ  ００／５５３４６、ＰＣＴ／ＵＳ００／０７３１７、およびＵＳ  ０９／６５８８５９に記載されるものなどの、可動ＤＮＡ要素を指す。トランスポゾンは、遺伝子発現を破壊するか、または欠失および逆位を引き起こすことが可能であり、そしてしたがって、関与する生物の遺伝子型および表現型両方に影響を及ぼしうる。転位因子の可動性は、長く、遺伝子操作に用いられてきており、特定のモデル系のゲノムに遺伝子または他の情報を導入してきた。
【００４８】
本明細書において、用語「Ｔｗｅｅｎ２０」は、ソルビタン・モノ−９−オクタデカノエート・ポリ（オキシ−１，１−エタンジイル）を意味する。
本開示において、用語、生物の「生存度」は、生物が、前記生物に適した条件下で増殖を示すか、または活性細胞機能を示す能力を指す。活性細胞機能のいくつかの例には、ガス発展によって測定されるような呼吸、タンパク質および／または他の化合物の分泌、色素排除、可動性、色素酸化、色素減少、ピグメント産生、培地酸性度の変化等が含まれる。
【００４９】
本発明の発明者らは、ＡＡＲ１遺伝子またはＨＣＳ１遺伝子および／または遺伝子産物の破壊が、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの病原性を阻害することを発見した。したがって、本発明の発明者らは、初めて、α−アミノアジピン酸レダクターゼおよびホモクエン酸シンターゼが抗生物質、好ましくは抗真菌剤の標的であることを立証した。
【００５０】
したがって、本発明は、ＡＡＲ１遺伝子またはＨＣＳ１遺伝子発現またはその遺伝子産物（類）の生物学的活性を阻害する化合物を同定する方法を提供する。こうした方法には、リガンド結合アッセイ、酵素活性アッセイ、細胞に基づくアッセイ、およびＡＡＲ１またはＨＳＣ１遺伝子発現に関するアッセイが含まれる。α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼのリガンドであるいかなる化合物も、抗生活性を有しうる。本発明の目的のため、「リガンド」は、ポリペプチド上の部位に結合するであろう分子を指す。本発明の方法によって同定される化合物は、抗生物質として有用である。
【００５１】
したがって、１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）
ｉ）α−アミノアジピン酸レダクターゼポリペプチド；および
ｉｉ）ホモクエン酸シンターゼ
からなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドと、前記試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み；結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００５２】
α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼタンパク質は、真菌、動物、植物、または微生物に見られる、天然存在α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼのアミノ酸配列を有することが可能であるし、また、天然存在配列由来のアミノ酸配列を有することが可能である。好ましくは、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼは、真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼである。α−アミノアジピン酸レダクターゼタンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列番号１）、該タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号２）、およびポリペプチド（配列番号３）を本明細書に見出しうる。ホモクエン酸シンターゼタンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列番号４）、該タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号５）、およびポリペプチド（配列番号６）もまた、本明細書に見出しうる。
【００５３】
「真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼ」は、少なくとも１つの真菌に見出すことが可能であり、そしてＬ−２−アミノアジペートおよびＮＡＤＰＨおよびＡＴＰと、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェート、およびＨ２Ｏの相互変換を触媒する酵素を意味する。α−アミノアジピン酸レダクターゼは、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、ツボカビ類、および地衣類を含む、真菌いずれかに由来することが可能である。
【００５４】
「真菌ホモクエン酸シンターゼ」は、少なくとも１つの真菌に見出すことが可能であり、そしてアセチルＣｏＡおよびＨ２Ｏおよび２−オキソグルタレートと、２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレートおよびＣｏＡの相互変換を触媒する酵素を意味する。ホモクエン酸シンターゼは、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、ツボカビ類、および地衣類を含む、真菌いずれかに由来することが可能である。
【００５５】
１つの態様において、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼはマグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼである。マグナポルテ属種には、限定されるわけではないが、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｓａｌｖｉｎｉｉ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａおよびＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ、並びにＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属のＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ不完全状態が含まれる。好ましくは、マグナポルテ属α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼは、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来である。
【００５６】
多様な態様において、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼは、粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、灰色カビ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、白腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）、心材腐れ病真菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｄｓｐｅｒｓｕｍ）、茶腐れ病菌（Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ  ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ）、トウモロコシ黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、心材腐れ病菌（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓ）、黒斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、ハチミツ真菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）、根腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｌｕｔｅｏｂｕｂａｌｉｎａ）、靴紐腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ）、バナナ炭疽病真菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｕｓａｅ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ジャガイモ胴枯れ病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、根病原体（Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ａｎｎｏｓｕｍ）、立ち枯れ病真菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オランダニレ病菌（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉ）、マメさび病菌（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、北方斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、ミロ病菌（Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、南方トウモロコシ胴枯れ病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、葉斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａ）、褐条病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｔｅｎｏｓｐｉｌｕｓ）、パナマ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、コムギ赤カビ病真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、穀類根腐れ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ジャガイモ黒痂皮病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、コムギ黒さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、白カビ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）等由来であることが可能である。
【００５７】
α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼポリペプチドの断片は、好ましくは、断片が生物学的に活性である野生型α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼに生じる、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）エピトープまたはほぼ損なわれていないエピトープを含むならば、本発明の方法に使用可能である。該断片は、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を含んでなる。好ましくは、断片は、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼの１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１１００、１１１０、１１２０、１１３０、１１４０、１１５０、１１６０、１１７０、または少なくとも１１８０の連続アミノ酸残基を含んでなる。１つの態様において、断片は、マグナポルテ属α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼ由来である。好ましくは、断片は、真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼ間で保存されるアミノ酸配列を含有する。
【００５８】
真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼと少なくとも５０％配列同一性を有するポリペプチドもまた、本発明の方法に有用である。好ましくは、配列同一性は、少なくとも６０％、より好ましくは、配列同一性は、少なくとも７０％、最も好ましくは、配列同一性は、少なくとも８０％または９０％または９５％または９９％、あるいは昇順に、６０〜１００％の整数いずれかの配列同一性である。
【００５９】
さらに、ポリペプチドが、真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼ活性の少なくとも１０％を有することが好ましい。より好ましくは、ポリペプチドは、真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼ活性の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％を有する。最も好ましくは、ポリペプチドは、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼタンパク質活性の少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％を有する。
【００６０】
したがって、別の態様において、本発明は、試験化合物を殺真菌剤の候補と同定する方法であって：
ａ）前記試験化合物と：真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド、真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、および真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み；
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００６１】
さらに別の態様において、本発明は、試験化合物を殺真菌剤の候補と同定する方法であって：
ａ）前記試験化合物と：真菌ホモクエン酸シンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド、真菌ホモクエン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、および真菌ホモクエン酸シンターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み；
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００６２】
標的へのリガンドの結合を検出するいかなる技術も、本発明の方法に使用可能である。例えば、リガンドおよび標的を緩衝液中で合わせる。標的へのリガンドの結合を検出する多くの方法が当該技術分野に知られ、そして限定されるわけではないが、固定リガンド−標的複合体の検出、または標的がリガンドに結合した際の標的の特性変化の検出が含まれる。例えば、１つの態様において、固定した候補リガンドのアレイを提供する。固定リガンドを、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼタンパク質、あるいはその断片または変異体と接触させ、未結合タンパク質を取り除き、そして結合したα−アミノアジピン酸レダクターゼを検出する。好ましい態様において、標識抗体などの標識結合パートナーを用いて、結合したα−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼを検出する。このアッセイの変型において、固定した候補リガンドに接触させる前に、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼを標識する。好ましい標識には、蛍光部分または放射性部分が含まれる。好ましい検出法には、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）およびＦＣＳ関連共焦点ナノ蛍光測定法が含まれる。
【００６３】
ひとたび化合物が抗生物質の候補と同定されたら、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼ酵素活性を阻害する能力に関して、該化合物を試験することが可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたは細胞に基づくアッセイいずれかを用いて、化合物を試験可能である。あるいは、真菌または真菌細胞に化合物を直接適用するか、あるいは真菌または真菌細胞中で発現させ、そして増殖、発生、生存度、病原性の変化または減少、あるいは遺伝子発現改変を監視することによって、化合物を試験可能である。したがって、１つの態様において、本発明は、上述の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：真菌または真菌細胞と前記真菌剤候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出することをさらに含んでなる、前記方法を提供する。
【００６４】
増殖の減少によって、抗真菌剤候補が、抗真菌剤候補の非存在下における真菌または真菌細胞の増殖と比較した際、真菌または真菌細胞の増殖に、少なくとも１０％の減少を引き起こすことを意味する。生存度の減少によって、抗真菌剤候補と接触させた真菌細胞、または真菌部分の少なくとも２０％が生存不能であることを意味する。好ましくは、増殖または生存度は、少なくとも４０％減少するであろう。より好ましくは、増殖または生存度は、少なくとも５０％、７５％または少なくとも９０％以上、減少するであろう。真菌増殖および細胞生存度を測定する方法が当業者に知られる。病原性の減少によって、抗真菌剤候補が、抗真菌剤候補の非存在下で引き起こされる疾患と比較した際、真菌病原体とその宿主の接触によって引き起こされる疾患に、少なくとも１０％の減少を引き起こすことを意味する。好ましくは、疾患は、少なくとも４０％減少するであろう。より好ましくは、疾患は、少なくとも５０％、７５％または少なくとも９０％以上、減少するであろう。真菌疾患を測定する方法が当業者に周知であり、そしてこれには、病変形成、病変サイズ、胞子形成、呼吸不全、および／または死などの測定基準が含まれる。
【００６５】
化合物が、α−アミノアジピン酸レダクターゼ活性を阻害する能力は、基質の消失または産物の出現を直接または間接的に検出する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイを用いて、検出可能である。α−アミノアジピン酸レダクターゼは、不可逆反応または可逆反応Ｌ−２−アミノアジペートおよびＮＡＤＰＨおよびＡＴＰ＝Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェート、およびＨ２Ｏを触媒する（図１を参照されたい）。Ｌ−２−アミノアジペート、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、ＡＭＰ、ＡＴＰ、Ｈ２Ｏおよび／またはピロホスフェートを検出する方法には、分光光度測定、質量分析、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および逆相ＨＰＬＣが含まれる。
【００６６】
したがって、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−２−アミノアジペートおよびＮＡＤＰＨおよびＡＴＰと、α−アミノアジピン酸レダクターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−２−アミノアジペートおよびＮＡＤＰＨおよびＡＴＰと、α−アミノアジピン酸レダクターゼおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−２−アミノアジペート、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、ＡＭＰ、ＡＴＰ、Ｈ２Ｏおよび／またはピロホスフェート；
ことを含み；
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示すか
または、
ａ）Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェート、およびＨ２Ｏと、α−アミノアジピン酸レダクターゼを接触させ；そして
ｂ）Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェート、およびＨ２Ｏと、α−アミノアジピン酸レダクターゼおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−２−アミノアジペート、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、ＡＭＰ、ＡＴＰ、Ｈ２Ｏおよび／またはピロホスフェート；
ことを含み；
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００６７】
化合物が、ホモクエン酸シンターゼ活性を阻害する能力は、基質の消失または産物の出現を直接または間接的に検出する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイを用いて、検出可能である。ホモクエン酸シンターゼは、不可逆反応または可逆反応アセチルＣｏＡおよびＨ２Ｏおよび２−オキソグルタレート＝２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレートおよびＣｏＡを触媒する（図４を参照されたい）。２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレート、ＣｏＡ、アセチルＣｏＡ、および／または２−オキソグルタレートを検出する方法には、分光光度測定、質量分析、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および逆相ＨＰＬＣが含まれる。
【００６８】
したがって、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）アセチルＣｏＡおよびＨ２Ｏおよび２−オキソグルタレートと、ホモクエン酸シンターゼを接触させ；
ｂ）アセチルＣｏＡおよびＨ２Ｏおよび２−オキソグルタレートと、ホモクエン酸シンターゼおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレート、２−オキソグルタレート、アセチルＣｏＡ、ＣｏＡ、および／またはＨ２Ｏ；
ことを含み；
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示すか
または、
ａ）２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレートおよびＣｏＡと、ホモクエン酸シンターゼを接触させ；
ｂ）２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレートおよびＣｏＡと、ホモクエン酸シンターゼおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレート、２−オキソグルタレート、アセチルＣｏＡ、ＣｏＡ、および／またはＨ２Ｏ；
ことを含み；
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００６９】
真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼの酵素的に活性である断片もまた、本発明の方法に有用である。例えば、真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸残基を含んでなるポリペプチドを、本発明の方法で使用可能である。さらに、真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または少なくとも９８％の配列同一性を有するポリペプチドを、本発明の方法で使用可能である。最も好ましくは、ポリペプチドは、真菌α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼと、少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％、２５％、７５％、または少なくとも９０％を有する。
【００７０】
したがって、本発明は、試験化合物を殺真菌剤の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−２−アミノアジペートおよびＮＡＤＰＨおよびＡＴＰと：α−アミノアジピン酸レダクターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、α−アミノアジピン酸レダクターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびα−アミノアジピン酸レダクターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含んでなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−２−アミノアジペートおよびＮＡＤＰＨおよびＡＴＰと、前記ポリペプチドおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−２−アミノアジペート、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、ＡＭＰ、ＡＴＰ、Ｈ２Ｏおよび／またはピロホスフェート；
ことを含み；
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示すか
または、
ａ）Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェートおよびＨ２Ｏと：α−アミノアジピン酸レダクターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、α−アミノアジピン酸レダクターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびα−アミノアジピン酸レダクターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含んでなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェートおよびＨ２Ｏと、前記ポリペプチドおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−２−アミノアジペート、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、ＡＭＰ、ＡＴＰ、Ｈ２Ｏおよび／またはピロホスフェート；
ことを含み；
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００７１】
さらに、本発明は、試験化合物を殺真菌剤の候補と同定する方法であって：
ａ）アセチルＣｏＡおよびＨ２Ｏおよび２−オキソグルタレートと：ホモクエン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、ホモクエン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびホモクエン酸シンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含んでなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）アセチルＣｏＡおよびＨ２Ｏおよび２−オキソグルタレートと、前記ポリペプチドおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレート、２−オキソグルタレート、アセチルＣｏＡ、ＣｏＡ、および／またはＨ２Ｏ；
ことを含み；
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示すか
または、
ａ）２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレートおよびＣｏＡと：ホモクエン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、ホモクエン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびホモクエン酸シンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含んでなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレートおよびＣｏＡと、前記ポリペプチドおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレート、２−オキソグルタレート、アセチルＣｏＡ、ＣｏＡ、および／またはＨ２Ｏ；
ことを含み；
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００７２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイのため、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼタンパク質およびその誘導体は、真菌から精製可能であるし、または古細菌、細菌、真菌、または他の真核生物細胞培養中で組換え的に産生し、そしてこれらの培養から精製することが可能である。好ましくは、これらのタンパク質は、大腸菌、酵母、または繊維状真菌発現系を用いて産生される。α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼを精製する方法は、ＪａｋｌｉｔｓｃｈおよびＫｕｂｉｃｅｋ（Ｊａｋｌｉｔｓｃｈ，  Ｗ．  Ｍ．およびＣ．  Ｐ．  Ｋｕｂｉｃｅｋ（１９９０）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２６９：２４７−５３（ＰＭＩＤ：  ２１１５７７１））に記載されるものであることが可能である。α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼタンパク質およびポリペプチドを精製する他の方法が、当業者に知られる。
【００７３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの代替法として、本発明はまた、細胞に基づく方法も提供する。１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）一の細胞（ａ  ｃｅｌｌ）、複数の細胞（ｃｅｌｌｓ）、組織（ｔｉｓｓｕｅ）、または生物（ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）において、前記化合物の非存在下で、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼの発現を測定し；
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼの発現を比較する
ことを含み；前記試験化合物の存在下で、発現がより低いことが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００７４】
α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼの発現は、ＡＡＲ１またはＨＣＳ１一次転写物またはｍＲＮＡ、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼポリペプチド、あるいはα−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼ酵素活性を検出することによって、測定可能である。ＲＮＡおよびタンパク質の発現を検出する方法が、当業者に知られる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ニューヨーク，  １９９５を参照されたい。検出法は、本発明には重要でない。ＡＡＲ１  ＲＮＡを検出する方法には、限定されるわけではないが、定量的逆転写酵素ＰＣＲなどの増幅アッセイ、および／またはノーザン解析、ドットブロット、スロットブロット、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションアッセイ、レポーター遺伝子に融合させたＡＡＲ１またはＨＣＳ１プロモーターを用いた転写融合、ＤＮＡアッセイ、並びにマイクロアレイアッセイが含まれる。
【００７５】
タンパク質発現を検出する方法には、限定されるわけではないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析、および酵素アッセイなどの免疫検出法が含まれる。また、レポーター遺伝子系いずれかを用いて、ＡＡＲ１またはＨＣＳ１タンパク質発現を検出することも可能である。遺伝子レポーター系を用いた検出には、キメラポリペプチドを産生するように、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドを、インフレームでＡＡＲ１またはＨＣＳ１に融合させる。レポーター系を用いた方法は当業者に知られる。
【００７６】
その後、上述の方法によって、ＡＡＲ１またはＨＣＳ１発現または活性の調節因子、好ましくは阻害剤と同定された、化学薬品、化合物または組成物を用いて、真菌増殖を制御することが可能である。さび病、うどん粉病、および胴枯れ病などの疾患は、ひとたび確立されると迅速に広まる。したがって、成長中の作物および貯蔵作物に、防御手段として、日常的に、一般的には葉面散布または種子ドレッシングとして、殺真菌剤を適用する。例えば、真菌増殖を防御するため、真菌増殖を阻害する化合物を、真菌に適用するか、または真菌において発現させることが可能である。したがって、本発明は、真菌増殖を阻害する方法であって、本発明の方法によって、抗真菌活性を有すると同定された化合物と真菌を接触させることを含んでなる、前記方法を提供する。
【００７７】
本発明の方法によって同定された抗真菌剤および抗真菌阻害剤候補を用いて、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、ツボカビ類、および地衣類を含む、望ましくない真菌の増殖を制御することが可能である。
【００７８】
望ましくない真菌の例には、限定されるわけではないが、粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、灰色カビ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、白腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）、心材腐れ病真菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｄｓｐｅｒｓｕｍ）、茶腐れ病菌（Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ  ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ）、トウモロコシ黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、心材腐れ病菌（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓ）、黒斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、ハチミツ真菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）、根腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｌｕｔｅｏｂｕｂａｌｉｎａ）、靴紐腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ）、バナナ炭疽病真菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｕｓａｅ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ジャガイモ胴枯れ病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、根病原体（Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ａｎｎｏｓｕｍ）、立ち枯れ病真菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オランダニレ病菌（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉ）、マメさび病菌（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、北方斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、ミロ病菌（Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、南方トウモロコシ胴枯れ病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、葉斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａ）、褐条病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｔｅｎｏｓｐｉｌｕｓ）、パナマ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、コムギ赤カビ病真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、穀類根腐れ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ジャガイモ黒痂皮病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、コムギ黒さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、白カビ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、肺、血液、脳、皮膚、頭皮、爪または他の組織の感染などの動物疾患（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｆｕｓｒａｉｕｍ種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ種、およびＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ種等）が含まれる。
【００７９】
やはり提供するのは、同定された遺伝子（ＡＡＲ１の配列番号１および配列番号２、またはＨＣＳ１の配列番号４および配列番号５）、その遺伝子産物（ＡＡＲ１の配列番号３またはＨＣＳ１の配列番号６）、あるいは機能する単数または複数の生化学経路に対して、試験化合物が活性であるかどうか決定することによる、抗生物質のスクリーニング方法である。
【００８０】
１つの特定の態様において、正常型、突然変異型、相同体、あるいはそれぞれＡＡＲ１またはＨＣＳ１と同様の機能を行う異種ＡＡＲ１遺伝子またはＨＣＳ１遺伝子いずれかの、ＡＡＲ１の配列番号１および配列番号２、またはＨＣＳ１の配列番号４および配列番号５いずれかに対応する遺伝子の第一の型を有する生物を提供することによって、該方法を行う。ＡＡＲ１またはＨＣＳ１の第一の型は、増殖条件表現型、すなわちリジン要求表現型、および／または改変型を有する生物の過敏性または感受性低下表現型を与えても、または与えなくてもよい。１つの特定の態様において、突然変異型は、トランスポゾン挿入を含有する。遺伝子の第一の型と異なるＡＡＲ１またはＨＣＳ１の第二の型を有する比較生物もまた提供し、そして２つの生物を別個に試験化合物と接触させる。その後、試験化合物の存在下で、２つのＡＡＲ１生物または２つのＨＣＳ１生物の増殖を比較する。
【００８１】
したがって、１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）α−アミノアジピン酸レダクターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を準備し、そしてα−アミノアジピン酸レダクターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を準備し、
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み；
前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００８２】
別の態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）ホモクエン酸シンターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を準備し、そしてホモクエン酸シンターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を準備し、
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み；
前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００８３】
場合によって、すべての試験化合物の非存在下で、前記の第一の生物および前記の第二の比較生物の増殖の測定を行って、遺伝子が異なる結果の増殖の固有な相異をいずれも管理することが可能であることが認識される。正常遺伝子、突然変異遺伝子、相同体、および機能的相同体を含む、ＡＡＲ１遺伝子またはＨＣＳ１遺伝子の２つの異なる型のいかなる組み合わせも、本方法で使用可能であることも認識される。光学密度測定等の当該技術分野に周知の方法によって、生物の成長および／または増殖を測定する。好ましい態様において、生物はＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。
【００８４】
条件致死突然変異体は、少なくとも１つの同定される標的遺伝子がその経路に存在するならば、特定の生化学経路および／または遺伝子経路を同定することが可能である。これらの経路の知識は、経路の基質、産物および酵素の阻害剤としての、抗生物質候補として、試験化合物をスクリーニングすることを可能にする。当該技術分野に知られる経路は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓおよび標準的な生化学教科書（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．，  Ｄ．  Ｎｅｌｓｏｎら（１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ニューヨーク，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に見出すことが可能である。
【００８５】
したがって、１つの態様において、本発明は、ＡＡＲ１またはＨＣＳ１が機能する、単数または複数の生化学経路および／または遺伝子経路に対して作用する試験化合物に関してスクリーニングする方法であって：
ａ）リジン生化学経路および／またはリジン遺伝子経路において遺伝子の１つの型を有する細胞を準備し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を準備し、
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み；前記化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００８６】
スクリーニングのためのマルチウェルプレートの使用は、多様な組み合わせおよび形式で、多様な化合物、化合物濃度、および真菌株を性質決定する、多数の異なるアッセイに容易に対応する形式である。スクリーニング方法の特定の試験パラメーターが、増殖阻害剤の同定に有意に影響を及ぼす可能性があり、そしてしたがって、こうしたパラメーターを操作して、スクリーニング効率および／または信頼性を最適化することが可能である。これらの要因のうち注目すべきものは、異なる突然変異体の多様な感受性、条件がより許容性でなくなるのに連れて増加する過敏性、化合物濃度の増加に連れて見かけ上増加する過敏性、および当業者に知られる他の要因である。
【００８７】
条件致死突然変異体は、少なくとも１つの同定される標的遺伝子がその経路に存在するならば、特定の生化学経路および／または遺伝子経路を同定することが可能である。これらの経路の知識は、抗生物質候補として試験化合物をスクリーニングすることを可能にする。当該技術分野に知られる経路は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓおよび標準的な生化学教科書（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．，  Ｄ．  Ｎｅｌｓｏｎら（１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ニューヨーク，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に見出すことが可能である。したがって、１つの態様において、本発明は、ＡＡＲ１またはＨＣＳ１が機能する、単数または複数の生化学経路および／または遺伝子経路に対して作用する試験化合物に関してスクリーニングする方法であって：
（ａ）対の増殖培地を準備し；該増殖培地は第一の培地および第二の培地を含み、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのリジンを含有し；
（ｂ）生物と前記試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み；前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で、生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００８８】
場合によって、すべての試験化合物の非存在下で、対の培地中の前記生物の増殖の測定を行って、培地が異なる結果の増殖の固有な相異をいずれも管理することが可能である。光学密度測定等の当該技術分野に周知の方法によって、生物の成長および／または増殖を測定する。好ましい態様において、生物はＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。
【実施例１】
【００８９】
選択可能マーカーを含有するトランスポゾンを用いたプラスミドの構築：
Ｓｉｆトランスポゾンの構築：主鎖として、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ビバリー）のＧＰＳ−Ｍ突然変異誘発系のＧＰＳ３ベクターを用いて、Ｓｉｆを構築した。この系は、細菌トランスポゾンＴｎ７に基づく。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓにしたがって、ＧＰＳ３に以下の操作を行った。ＥｃｏＲＶ消化によって、Ｔｎ７アームの間に含有されるカナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔ）を除去した。ＧＰＳ３ベクターのＴｎ７アームにＨｐａＩ／ＥｃｏＲＶ平滑連結することによって、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｔｒｐＣプロモーターおよびターミネーター（Ｍｕｌｌａｎｅｙら（１９８５）  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９９：３７-４５（ＰＭＩＤ：  ３１５８７９６））の調節下の細菌ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）遺伝子（ＧｒｉｔｚおよびＤａｖｉｅｓ  （１９８３）  Ｇｅｎｅ  ２５：１７９-８８（ＰＭＩＤ：  ６３１９２３５））をクローニングして、ｐＳｉｆ１を得た。ＸｍｎＩおよびＢｇｌＩでｐＳｉｆ１を切断し、その後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理してＢｇｌＩ消化によって残された３’オーバーハングを除去し、そしてプラスミドに再連結してｐＳｉｆを得ることによって、ｐＳｉｆ１からのアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）切除を達成した。Ｔｏｐ１０Ｆ’のエレクトロコンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の推奨にしたがって、連結混合物で形質転換した。Ｓｉｆトランスポゾンを含有する形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）を含有するＬＢアガー上で選択した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【実施例２】
【００９０】
真菌遺伝子および選択可能マーカーを含有するコスミドライブラリーの構築：
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されるように、ｐｃｏｓＫＡ５ベクター（Ｈａｍｅｒら（２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：５１１０-１５（ＰＭＩＤ：  １１２９６２６５））中にコスミドライブラリーを構築した。パルスフィールドゲル電気泳動、制限消化解析、および単一遺伝子のＰＣＲ同定によって、コスミドライブラリーの品質をチェックした。
【実施例３】
【００９１】
真菌遺伝子に挿入されたトランスポゾンを用いたコスミドの構築：
コスミドへのＳｉｆ転位：ＧＰＳ−Ｍ突然変異誘発系（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．）に記載されるように、コスミドフレームワークへのＳｉｆの転位を行った。簡潔には、２μｌの１０Ｘ  ＧＰＳ緩衝液、７０ｎｇのスーパーコイルｐＳＩＦ、８〜１２μｇの標的コスミドＤＮＡを混合し、そして水で最終体積２０μｌにした。１μｌのトランスポザーゼ（ＴｎｓＡＢＣ）を反応物に添加し、そして３７℃で１０分間インキュベーションして、組み立て反応が起こるのを可能にした。組み立て反応後、１μｌの開始溶液を試験管に添加し、よく混合し、そして３７℃で１時間インキュベーションした後、タンパク質を７５℃で１０分間、熱不活性化した。３７℃で２時間ＰＩＳｃｅＩ消化した後、該タンパク質を７５℃で１０分間インキュベーションして不活性化することによって、残った非転位ｐＳｉｆの破壊を行った。製造者の推奨にしたがって、Ｔｏｐ１０Ｆ’エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の形質転換を行った。５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．）および１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．）を含有するＬＢアガープレート上での増殖によって、Ｓｉｆ含有コスミド形質転換体を選択した。
【実施例４】
【００９２】
真菌遺伝子へのトランスポゾンの挿入の高処理調製および検証：
トランスポゾン挿入を含むコスミドを含有する大腸菌株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した１．５ｍｌのＴＢ（テリフィック・ブロス、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を含有する９６ウェル増殖ブロック（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏ．）に摘み取った。ブロックを震蘯しながら、３７℃で一晩インキュベーションした。遠心分離によって、大腸菌細胞をペレット化し、そして修飾アルカリ溶解法（Ｍａｒｒａら（１９９７）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ７：１０７２-８４（ＰＭＩＤ：  ９３７１７４３））によって、コスミドを単離した。アガロースゲル上の電気泳動によって、ＤＮＡ品質をチェックした。各トランスポゾンの末端由来のプライマーおよび商業的なジデオキシ配列決定キット（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）を用いて、コスミドの配列を決定した。ＡＢＩ３７７  ＤＮＡ配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）上で、配列決定反応を解析した。
【００９３】
挿入部位に隣接するＤＮＡ配列を収集し、そしてＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９-３４０２（ＰＭＩＤ：  ９２５４６９４））を用いて、ＤＮＡデータベースおよびタンパク質データベースを検索するのに用いた。さらなる解析のため、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  ＡＡＲ１遺伝子へのＳＩＦの単一挿入を選択した。この構築物はｃｐｇｍｒａ００１５０１９ｇ１２と称され、そしてＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ相同体（全長１１７４アミノ酸、ＧＥＮＢＡＮＫ：寄託番号ＡＬ３８９８９０の９３６７２４８）に比較して、ほぼアミノ酸６７８および６７９の間にＳＩＦトランスポゾンを含有する。
【００９４】
上記のＡＡＲ１に関しては、挿入部位に隣接するＤＮＡ配列を収集し、そしてＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９-３４０２（ＰＭＩＤ：  ９２５４６９４））を用いて、ＤＮＡデータベースおよびタンパク質データベースを検索するのに用いた。さらなる解析のため、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  ＨＣＳ１遺伝子へのＳＩＦの単一挿入を選択した。この構築物はｃｐｇｍｒａ００２３００８ｈ０４と称され、そしてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ相同体（全長４７４アミノ酸、ＧＥＮＢＡＮＫ：寄託番号ＡＪ２２３６３０のＰＣＡＪ３６３０）に比較して、アミノ酸３３４および３３５の間にＳＩＦトランスポゾンを含有する。
【実施例５】
【００９５】
コスミドＤＮＡの調製および真菌Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの形質転換：
ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＡＡＲ１トランスポゾンでタグ付けしたコスミドクローンから、コスミドＤＮＡを調製し、そしてＰＩ−ＰｓｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．）によって消化した。本質的に記載されるように（Ｗｕら（１９９７）  ＭＰＭＩ  １０：７００−７０８）、真菌エレクトロ形質転換を行った。簡潔には、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ株Ｇｕｙ１１を完全液体培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中で、１２０ｒｐｍで震蘯しながら、暗所中、２５℃で３日間増殖させた。菌糸体を採取し、そして無菌Ｈ２Ｏで洗浄し、そして４ｍｇ／ｍｌベータ−グルカナーゼ（ＩｎｔｅｒＳｐｅｘ）で４〜６時間消化して、プロトプラストを生成した。遠心分離によってプロトプラストを収集し、そして２ｘ１０８プロトプラスト／ｍｌの濃度で、２０％スクロース中に再懸濁した。５０μｌプロトプラスト懸濁物を、１０〜２０μｇのコスミドＤＮＡと混合し、そして以下のパラメーターに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてパルス処理した：抵抗２００オーム、電気容量２５μＦ、電圧０．６ｋＶ。２０％スクロースを添加した完全アガー培地（ＣＭ、Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中で１日、形質転換プロトプラストを再生し、その後、ハイグロマイシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ）を含有するＣＭアガー培地を上層して、形質転換体を選択した。標的遺伝子における相同組換え事象に関して、ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングした（Ｈａｍｅｒら（２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：５１１０-１５（ＰＭＩＤ：  １１２９６２６５））。ＡＡＲ１に関して、２つの独立株が同定され、そしてこれらをそれぞれ、ＫＯ１−１およびＫＯ１−１１と称する。ＨＣＳ１に関しても、２つの独立株が同定され、そしてこれらをそれぞれ、ＨＣＳ１  ＫＯ１−１およびＫＯ１−２と称する。
【実施例６】
【００９６】
マグナポルテ属病原性に対するＡＡＲ１トランスポゾン挿入の効果：
実施例５で得た標的真菌株、ＡＡＲ１  ＫＯ１−１およびＫＯ１−１１、並びに野生型株Ｇｕｙ１１を病原性アッセイに供して、１週間の期間に渡って感染を観察した。本質的にＶａｌｅｎｔら（（１９９１）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２７：８７−１０１（ＰＭＩＤ：  ２０１６０４８））に記載されるように、マコモ（Ｉｎｄｉａｎ  ｒｉｃｅ）品種ＣＯ３９を用いて、イネ感染アッセイを行った。３つの株すべてを、完全アガー培地上で胞子産生のために増殖させた。胞子を採取し、そして完全体植物への接種のため、胞子濃度を調整した。品種ＣＯ３９の２週齢の実生に１２ｍｌの分生子懸濁物（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）溶液１ｍｌあたり５ｘ１０４分生子）をスプレーした。接種植物を加湿チャンバー（ｄｅｗ  ｃｈａｍｂｅｒ）中、２７℃、暗所で３６時間インキュベーションし、そして成長チャンバー（２７℃１２時間／２１℃１２時間、７０％湿度）に、さらに５．５日間移した。接種３、５、および７日後、葉の試料を採取し、そして感染成功の徴候（すなわち病変）に関して調べた。図２は、接種５日後、マグナポルテ属感染に対するＡＡＲ１遺伝子破壊の効果を示す。
【実施例７】
【００９７】
栄養要求の解析によるＡＡＲ１遺伝子機能の検証：
Ｂｉｏｌｏｇ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ヘイワード）のＰＭ５表現型マイクロアレイを用いて、リジンに対する栄養要求に関して、実施例５で得たＡＡＲ１破壊遺伝子を含有する真菌株ＫＯ１−１およびＫＯ１−１１を解析した。ＰＭ５プレートは、９４の異なる代謝産物に関する栄養要求に関して試験する。接種液は、０．０５％Ｐｈｙｔａｇｅｌ、０．０３％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、１％グルコース、２３．５ｍＭ  ＮａＮＯ３、６．７ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、１１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０１％  ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２および微量元素からなる。微量元素の最終濃度は：７．６μＭ  ＺｎＣｌ２、２．５μＭ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１．８μＭ  ＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、０．７１μＭ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．６４μＭ  ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．６２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４、１８μＭ  Ｈ３ＢＯ３である。ＮａＯＨで、ｐＨを６．０に調整した。各株の胞子を接種液中に採取した。胞子濃度を２ｘ１０５胞子／ｍｌに調整した。マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌの胞子懸濁物を入れた。プレートを２５℃で７日間インキュベーションした。４９０ｎｍおよび７５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）測定を毎日行った。ＯＤ４９０は、テトラゾリウム色素減少の度合いおよび増殖レベルを測定し、そしてＯＤ７５０は増殖のみを測定する。濁度＝ＯＤ４９０＋ＯＤ７５０である。Ｌ−リジンの非存在下（図３Ａ）および存在下（図３Ｂ）、突然変異体真菌および野生型対照両方を示す、濁度対時間のグラフとして、注釈をつけた遺伝子機能を確認するデータを示す。
【実施例８】
【００９８】
マグナポルテ属病原性に対するＨＣＳ１トランスポゾン挿入の効果：
実施例５で得た標的真菌株、ＨＳＣ１  ＫＯ１−１およびＫＯ１−２、並びに野生型株Ｇｕｙ１１を病原性アッセイに供して、１週間の期間に渡って感染を観察した。本質的にＶａｌｅｎｔら（（１９９１）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２７：８７−１０１（ＰＭＩＤ：  ２０１６０４８））に記載されるように、マコモ品種ＣＯ３９を用いて、イネ感染アッセイを行った。３つの株すべてを、完全アガー培地上で胞子産生のために増殖させた。胞子を採取し、そして完全体植物への接種のため、胞子濃度を調整した。品種ＣＯ３９の２週齢の実生に１２ｍｌの分生子懸濁物（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）溶液１ｍｌあたり５ｘ１０４分生子）をスプレーした。接種植物を加湿チャンバー中、２７℃、暗所で３６時間インキュベーションし、そして成長チャンバー（２７℃１２時間／２１℃１２時間、７０％湿度）に、さらに５．５日間移した。接種３、５、および７日後、葉の試料を採取し、そして感染成功の徴候（すなわち病変）に関して調べた。図５は、接種５日後、マグナポルテ属感染に対するＨＣＳ１遺伝子破壊の効果を示す。
【実施例９】
【００９９】
栄養要求の解析によるＨＣＳ１遺伝子機能の検証：
Ｂｉｏｌｏｇ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ヘイワード）のＰＭ５表現型マイクロアレイを用いて、リジンに対する栄養要求に関して、実施例５で得たＨＣＳ１破壊遺伝子を含有する真菌株ＫＯ１−１およびＫＯ１−２を解析した。ＰＭ５プレートは、９４の異なる代謝産物に関する栄養要求に関して試験する。接種液は、０．０５％Ｐｈｙｔａｇｅｌ、０．０３％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、１％グルコース、２３．５ｍＭ  ＮａＮＯ３、６．７ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、１１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０１％  ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２および微量元素からなる。微量元素の最終濃度は：７．６μＭ  ＺｎＣｌ２、２．５μＭ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１．８μＭ  ＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、０．７１μＭ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．６４μＭ  ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．６２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４、１８μＭ  Ｈ３ＢＯ３である。ＮａＯＨで、ｐＨを６．０に調整した。各株の胞子を接種液中に採取した。胞子濃度を２ｘ１０５胞子／ｍｌに調整した。マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌの胞子懸濁物を入れた。プレートを２５℃で７日間インキュベーションした。４９０ｎｍおよび７５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）測定を毎日行った。ＯＤ４９０は、テトラゾリウム色素減少の度合いおよび増殖レベルを測定し、そしてＯＤ７５０は増殖のみを測定する。濁度＝ＯＤ４９０＋ＯＤ７５０である。Ｌ−リジンの非存在下（図６Ａ）および存在下（図６Ｂ）、突然変異体真菌および野生型対照両方を示す、濁度対時間のグラフとして、注釈をつけた遺伝子機能を確認するデータを示す。
【実施例１０】
【０１００】
α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼタンパク質のクローニングおよび発現戦略、抽出および精製：
以下のプロトコルを使用して、精製α−アミノアジピン酸レダクターゼタンパク質を得ることが可能である。
【０１０１】
クローニングおよび発現戦略：
ＡＡＲ１またはＨＣＳ１  ｃＤＮＡ遺伝子を、Ｈｉｓ／融合タンパク質タグを含有する大腸菌（ｐＥＴベクター、Ｎｏｖａｇｅｎ）、バキュロウイルス（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および酵母（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）発現ベクターにクローニングすることが可能である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析によって、組換えタンパク質の発現を評価する。
【０１０２】
抽出：
４℃、６秒パルスで、６回、超音波処理することによって、２５０ｍｌ細胞ペレットから３ｍｌ抽出緩衝液に組換えタンパク質を抽出する。抽出物を１５０００ｘｇで１０分間遠心分離し、そして上清を収集する。活性アッセイによって、組換えタンパク質の生物学的活性を評価する。
【０１０３】
精製：
Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）によって組換えタンパク質を精製する。
【０１０４】
精製プロトコル：すべての工程を４℃で行う：
・３ｍｌ  Ｎｉビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる
・緩衝液でカラムを平衡化する
・タンパク質抽出物を装填する
・平衡化緩衝液で洗浄する
・結合したタンパク質を０．５Ｍイミダゾールで溶出する
【実施例１１】
【０１０５】
α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼに対する試験化合物の結合を試験するアッセイ：
以下のプロトコルを使用して、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼタンパク質に結合する試験化合物を同定することが可能である。
・Ｈｉｓ／融合タンパク質タグ（実施例１０）を含む、精製した全長α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼポリペプチドを、製造者の指示にしたがって、ＨｉｓＧｒａｂＴＭニッケルコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）に結合させる。
・結合したＡＡＲ１への放射標識１４Ｃ−α−アミノアジピン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）の結合に関して、または結合したＨＣＳ１への放射標識（アセチル−１−１４Ｃ）−補酵素Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）の結合に関して、緩衝液条件を最適化する（例えばイオン強度またはｐＨ、Ｊａｋｌｉｔｓｃｈ，  Ｗ．  Ｍ．およびＣ．  Ｐ．  Ｋｕｂｉｃｅｋ  （１９９０）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２６９：２４７-５３（ＰＭＩＤ：  ２１１５７７１））。
・結合したＡＡＲ１を含有するＨｉｓＧｒａｂＴＭプレートのウェルに、試験化合物および１４Ｃ−α−アミノアジピン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を添加することによって、または結合したＨＣＳ１を含有するＨｉｓＧｒａｂＴＭプレートのウェルに、試験化合物および（アセチル−１−１４Ｃ）−補酵素Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を添加することによって、試験化合物のスクリーニングを行う。
・ウェルを洗浄して、過剰な標識リガンドを取り除き、そして各ウェルにシンチレーション液（Ｓｃｉｎｔｉｖｅｒｓｅ（登録商標）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加する。
・マイクロプレートシンチレーションカウンター中で、プレートを読み取る。
・試験化合物を添加していない対照ウェルに比較して、より低い放射活性を有するウェルとして、候補化合物を同定する。
【０１０６】
さらに、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼ由来の１０〜５０アミノ酸を含んでなる精製ポリペプチドを同じ方式でスクリーニングする。発現した際に、Ｈｉｓタグを付加するタンパク質発現ベクターに、ＡＡＲ１遺伝子またはＨＣＳ１遺伝子の一部をサブクローニングすることによって、１０〜５０アミノ酸を含んでなるポリペプチドを生成する（実施例８を参照されたい）。ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、ＡＡＲ１遺伝子またはＨＣＳ１遺伝子の一部を増幅するように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。上記実施例１０に記載するように、１０〜５０アミノ酸のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングし、宿主生物において発現させて、そして精製する。
【０１０７】
ＡＡＲ１またはＨＣＳ１に結合する試験化合物を、抗生活性に関してさらに試験する。オートミールアガー培地上で胞子産生するため、記載されるように（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａを増殖させる。最少培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中、２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度まで、胞子を採取して、そして培養を分割する。１つの培養に最終濃度２０〜１００μｇ／ｍｌまで試験化合物を添加する。第二の培養には溶媒のみ添加する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。溶媒対照試料および試験化合物試料の増殖曲線を比較する。試験化合物を含有する培養の増殖が、対照培養の増殖より劣っているならば、試験化合物は抗生物質候補である。
【実施例１２】
【０１０８】
α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼ活性の阻害剤または阻害剤候補を試験するアッセイ：
ＧｒａｙおよびＢｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ（Ｇｒａｙ，  ＧＳおよびＢｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ，  ＪＫ  （１９７６）  Ｃａｎ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２２：１６６４−７（ＰＭＩＤ：  １００６６））、またはＪａｋｌｉｔｓｃｈ，  Ｗ．  Ｍ．およびＣ．  Ｐ．  Ｋｕｂｉｃｅｋ  （１９９０）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２６９：２４７-５３（ＰＭＩＤ：  ２１１５７７１）に記載されるように、適切な反応混合物中、候補化合物の存在下および非存在下で、α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼの酵素活性を測定する。どちらかの方向に進行する反応で、産物の減少または基質の減少の欠如が検出された場合に、候補化合物が同定される。
【０１０９】
さらに、ＧｒａｙおよびＢｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ（Ｇｒａｙ，  ＧＳおよびＢｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ，  ＪＫ  （１９７６）  Ｃａｎ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２２：１６６４−７（ＰＭＩＤ：  １００６６））、またはＪａｋｌｉｔｓｃｈ，  Ｗ．  Ｍ．およびＣ．  Ｐ．  Ｋｕｂｉｃｅｋ  （１９９０）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２６９：２４７-５３（ＰＭＩＤ：  ２１１５７７１）に記載されるように、適切な反応混合物中、候補化合物の存在下および非存在下で、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼ由来の１０〜５０アミノ酸を含んでなるポリペプチドの酵素活性を測定する。発現した際に、Ｈｉｓタグを付加するタンパク質発現ベクターに、ＡＡＲ１遺伝子またはＨＣＳ１遺伝子の一部をサブクローニングすることによって、１０〜５０アミノ酸を含んでなるポリペプチドを生成する（実施例１０を参照されたい）。ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、ＡＡＲ１遺伝子またはＨＣＳ１遺伝子の一部を増幅するように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。上記実施例１０に記載するように、１０〜５０アミノ酸のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングし、発現させて、そして精製する。
【０１１０】
ＡＡＲ１活性またはＨＣＳ１活性の阻害剤と同定された試験化合物を、抗生活性に関してさらに試験する。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を増殖させる。オートミールアガー培地上で胞子産生するため、記載されるように（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａを増殖させる。最少培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中、２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度まで、胞子を採取して、そして培養を分割する。１つの培養に最終濃度２０〜１００μｇ／ｍｌまで試験化合物を添加する。第二の培養には溶媒のみ添加する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。溶媒対照試料および試験化合物試料の増殖曲線を比較する。試験化合物を含有する培養の増殖が、対照培養の増殖より劣っているならば、試験化合物は抗生物質候補である。
【実施例１３】
【０１１１】
α−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼ遺伝子の発現を改変する化合物または化合物候補を試験するアッセイ：
当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、完全アガーまたはオートミールアガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、野生型Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。２５ｍｌの培養を調製して、これに試験化合物を多様な濃度で添加する。試験化合物が存在しない培養を対照として含める。培養を２５℃で３日間インキュベーションした後、試験化合物または対照には溶媒のみを添加する。培養をさらに１８時間インキュベーションする。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（登録商標）、カリフォルニア州ラホヤ）でろ過して真菌菌糸体を採取し、水で洗浄し、そして液体窒素中で凍結する。製造者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）に提供される方法を用い、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬で、総ＲＮＡを抽出する。プローブとしてＡＡＲ１遺伝子またはＨＣＳ１遺伝子の放射標識断片を用いて、記載されるように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ＲＮＡ試料のノーザンブロット解析によって、発現を解析する。未処理対照試料に比較して、ＡＡＲ１  ｍＲＮＡまたはＨＣＳ１  ｍＲＮＡレベルの減少を生じる試験化合物を、候補抗生物質化合物と同定する。
【実施例１４】
【０１１２】
活性がないα−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼの突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
トランスポゾン挿入（実施例４および５を参照されたい）を含有する遺伝子などの、酵素活性を無効にするＡＡＲ１遺伝子またはＨＣＳ１遺伝子の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、１００μＭ  Ｌ−リジンを含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。９６ウェルプレートの各ウェルにおよそ４ｘ１０４胞子を添加し、これに試験化合物（多様な濃度）を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル（増殖対照）、および細胞を含まないウェルを、対照として含める（陰性対照）。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果の増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例１５】
【０１１３】
活性が減少したα−アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモクエン酸シンターゼの突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
発現を減少させるプロモーター一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）などの、ＡＡＲ１遺伝子またはＨＣＳ１遺伝子の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、転写開始部位上流のプロモーターの一部を欠失させることによって、プロモーター一部切除を行う。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。９６ウェルプレートの各ウェルにおよそ４ｘ１０４胞子を添加し、これに試験化合物（多様な濃度）を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル（増殖対照）、および細胞を含まないウェルを、対照として含める（陰性対照）。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果の増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例１６】
【０１１４】
活性がないリジン生合成遺伝子の突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
リジン生合成経路の遺伝子（例えばＨＣＳ１（Ｅ．Ｃ．  ４．１．３．２１））の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、１００μＭ  Ｌ−リジンを含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果の増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例１７】
【０１１５】
活性が減少したリジン生合成遺伝子の突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
発現を減少させるプロモーター一部切除など、リジン生合成経路の遺伝子（例えばＨＣＳ１（Ｅ．Ｃ．  ４．１．３．２１））の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、転写開始部位上流のプロモーターの一部を欠失させることによって、プロモーター一部切除を行う。突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果の増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例１８】
【０１１６】
真菌ＡＡＲ１遺伝子を含有する真菌株および異種ＡＡＲ１遺伝子を含有する第二の真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
野生型Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞および機能するＡＡＲ１遺伝子を欠き、そしてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｙ１３９６７、５６％配列同一性）由来のＡＡＲ１遺伝子を含有するＭ．  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。異種ＡＡＲ１遺伝子を所持するＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を以下のように作成する：
・天然遺伝子中にトランスポゾン挿入を含有するものなど、非機能性ＡＡＲ１遺伝子を持つＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を作成する（実施例４および５を参照されたい）。
・当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、ｔｒｐＣプロモーターおよびターミネーターを含有する真菌発現ベクター（例えばｐＣＢ１００３、Ｃａｒｒｏｌｌら（１９９４）  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎ  Ｎｅｗｓ  Ｌｅｔｔ  ４１：２２）に、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のＡＡＲ１遺伝子をクローニングすることによって、異種ＡＡＲ１遺伝子を含有する構築物を作成する。
・前記構築物を用いて、機能するＡＡＲ１遺伝子を欠くＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を形質転換する（実施例５を参照されたい）。Ｌ−リジンを欠く最少アガー培地上で形質転換体を選択する。機能するＡＡＲ１遺伝子を所持する形質転換体のみが増殖するであろう。
【０１１７】
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの野生型株およびＡＡＲ１の異種型を含有する株を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。野生型および異種真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。野生型および異種真菌株に対する試験化合物の結果の増殖阻害パーセントを比較する。野生型および異種株間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、天然または異種ＡＡＲ１遺伝子産物に特異性を持つ潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例１９】
【０１１８】
真菌ＨＣＳ１遺伝子を含有する真菌株および異種ＨＣＳ１遺伝子を含有する第二の真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
野生型Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞および機能するＨＣＳ１遺伝子を欠き、そしてＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｏ８７１９８、５６％配列同一性）由来のＨＣＳ１遺伝子を含有するＭ．  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。異種ＨＣＳ１遺伝子を所持するＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を以下のように作成する：
・天然遺伝子中にトランスポゾン挿入を含有するものなど、非機能性ＨＣＳ１遺伝子を持つＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を作成する（実施例４および５を参照されたい）。
・当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、ｔｒｐＣプロモーターおよびターミネーターを含有する真菌発現ベクター（例えばｐＣＢ１００３、Ｃａｒｒｏｌｌら（１９９４）  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎ  Ｎｅｗｓ  Ｌｅｔｔ  ４１：２２）に、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＨＣＳ１遺伝子をクローニングすることによって、異種ＨＣＳ１遺伝子を含有する構築物を作成する。
・前記構築物を用いて、機能するＨＣＳ１遺伝子を欠くＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を形質転換する（実施例５を参照されたい）。Ｌ−リジンを欠く最少アガー培地上で形質転換体を選択する。機能するＨＣＳ１遺伝子を所持する形質転換体のみが増殖するであろう。
【０１１９】
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの野生型株およびＨＣＳ１の異種型を含有する株を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。野生型および異種真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。野生型および異種真菌株に対する試験化合物の結果の増殖阻害パーセントを比較する。野生型および異種株間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、天然または異種ＨＣＳ１遺伝子産物に特異性を持つ潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例２０】
【０１２０】
経路特異的ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイスクリーニングプロトコル：
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、オートミールアガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、野生型Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地および４ｍＭ  Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。最少増殖培地は、炭素、窒素、ホスフェート、およびサルフェート供給源、およびマグネシウム、カルシウムおよび微量元素を含有する（例えば実施例７の接種液を参照されたい）。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに胞子懸濁物を添加する（およそ４ｘ１０４胞子／ウェル）。最少培地中の胞子懸濁物を含有する各ウェルに対して、４ｍＭ  Ｌ−リジンを含有する最少培地中の胞子懸濁物を含有する、さらなるウェルが存在する。最少培地中に胞子を含有するウェルおよびＬ−リジンを含有する最少培地中に胞子を含有するウェルに、試験化合物を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物を含まない、最少培地ウェルおよびＬ−リジン含有培地ウェル両方を、対照として提供する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。試験化合物を添加した結果、最少培地を含有するウェル中で観察される増殖が、Ｌ−リジンを含有するウェルで観察される増殖より劣る場合、化合物を、リジン生合成経路に対して作用する抗生物質の候補と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【０１２１】
上記は、本発明の特定の態様を記載するが、当業者は、変動および修飾を行って、そしてなお、本発明の範囲内に属することが可能であることを理解するであろう。上記例は、本発明の多様な特定の態様を例示すると意図され、そしていかなる方式でもその範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１は、α−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＡＡＲ１）反応が行う反応を示す。基質／産物はＬ−２アミノアジペート＋ＮＡＤＰＨ＋ＡＴＰであり、そして産物／基質はＬ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド＋ＮＡＤＰ＋  ＋ＡＭＰ＋ピロホスフェート＋Ｈ２Ｏである。α−アミノアジピン酸レダクターゼ酵素の機能は、Ｌ−２−アミノアジペート、ＮＡＤＰＨ、およびＡＴＰから、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェート、およびＨ２Ｏへの相互変換である。この反応は、リジン生合成経路の一部である。
【図２】図２は、完全体植物（ｗｈｏｌｅ  ｐｌａｎｔ）への感染アッセイを用いた、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ病原性に対するＡＡＲ１遺伝子破壊の効果を示す、デジタル画像を示す。イネ品種ＣＯ３９に野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−１およびＫＯ１−１１を接種した。接種５日後、葉の部分を画像化した。
【図３】栄養要求の解析による遺伝子機能の検証。野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−１およびＫＯ１−１１を、それぞれ、（Ａ）最少培地および（Ｂ）Ｌ−リジンを添加した最少培地中で増殖させた。ｘ軸は時間を日数で示し、そしてｙ軸は４９０ナノメートルおよび７５０ナノメートルで測定した濁度を示す。記号は、野生型（−−◆−−）、トランスポゾン株ＫＯ１−１（−−■−−）、およびトランスポゾン株ＫＯ１−１１（−−黒三角−−）を示す。
【図４】図４は、ホモクエン酸シンターゼ（ＨＣＳ１）反応が行う反応を示す。基質／産物はアセチルＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ＋２−オキソグルタレートであり、そして産物／基質は２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレート＋ＣｏＡである。ホモクエン酸シンターゼ酵素の機能は、アセチルＣｏＡ、２−オキソグルタレート、およびＨ２Ｏから、２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボキシレートおよびＣｏＡへの相互変換である。この反応は、リジン生合成経路の一部である。
【図５】図５は、完全体植物への感染アッセイを用いた、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ病原性に対するＨＣＳ１遺伝子破壊の効果を示す、デジタル画像である。イネ品種ＣＯ３９に野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−１およびＫＯ１−２を接種した。接種５日後、葉の部分を画像化した。
【図６】栄養要求の解析による遺伝子機能の検証。野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−１およびＫＯ１−２を、それぞれ、（Ａ）最少培地および（Ｂ）Ｌ−リジンを添加した最少培地中で増殖させた。ｘ軸は時間を日数で示し、そしてｙ軸は４９０ナノメートルおよび７５０ナノメートルで測定した濁度を示す。記号は、野生型（−−◆−−）、トランスポゾン株ＫＯ１−１（−−■−−）、およびトランスポゾン株ＫＯ１−２（−−黒三角−−）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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