(57)【要約】高沸点ペルフルオロケミカル物質から作られるナノパーティクルを含むエマルジョンは、当該パーティクルが脂質／界面活性剤被膜で被覆されているが、前記ナノパーティクルをターゲティングリガンドに直接カップリングすることにより標的特異になる。ナノパーティクルは、更に生理活性剤、放射性核種、及び／又は他の造影剤を含んでもよく、ヒト被験者における血餅を画像化及び／又は溶解させるために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体、高沸点ペルフルオロカーボンベースのナノパーティクル系エマルジョンの使用において、前記ナノパーティクルは、更に脂質／界面活性剤の被膜を含み、血餅を特徴づける少なくとも１つの成分に対して特異的である少なくとも１つのターゲティングリガンドと直接結合することを特徴とする、ヒト被験者における血餅を画像化及び治療する方法において使用する診断用及び／又は治療用組成物の製造のための、液体、高沸点ペルフルオロカーボンベースのナノパーティクル系エマルジョンの使用。
【請求項２】
前記方法は、前記組成物を前記ヒト被験者に対して全身投与することを含む請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記全身投与は、静脈内投与によるものである請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記方法は、前記組成物を前記血餅に対して局所投与することを含む請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記方法は、超音波、ＭＲＩ又は放射性核種を用いて前記血餅の画像化をすることを含む請求項１〜４の何れか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記方法は、更に前記血餅の溶解又は前記血餅の広がりを抑制することを含む請求項１〜５の何れか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記ターゲティングリガンドは、脂質／界面活性剤被膜の成分と共有結合的にカップリングされる請求項１〜６の何れか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記リガンドは、フィブリンと特異的に結合する請求項１〜７の何れか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記ナノパーティクルは、更に少なくとも１つの磁気共鳴画像化造影剤を含む請求項１〜８の何れか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記磁気共鳴画像化造影剤は、キレート化した常磁性イオンである請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記キレート化剤は、ＤＯＴＡであり、常磁性イオンは、ガドリニウムイオンである請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記ナノパーティクルは、更に少なくとも１つの放射性核種を含む請求項１〜８の何れか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記放射性核種は、９９Ｔｃである請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
更に少なくとも１つの生物活性剤を含む請求項１〜１３の何れか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記生物活性剤は、血栓溶解剤である請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記ターゲティングリガンドは、抗体、抗体のフラグメント、ペプチド、アプタマー、ペプチド擬似物の又はレセプターのリガンドである請求項１〜１５の何れか一項に記載の使用。
【請求項１７】
ターゲティングリガンドは、抗体又は抗体のフラグメントである請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記抗体又はフラグメントは、ヒト型である請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本願は、２００２年８月２０日に出願された米国特許出願第１０／２２５，０２４号の一部継続出願である。この先の出願の内容は、参照により本書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、凝血塊ないし血餅（blood clot）に誘導し、かつ、これらの標的に診断又は治療に有用な物質を運ぶナノパーティクル（nanoparticle）を用いてヒト患者における血餅（blood clot）を画像化及び治療する方法に関する。より詳細には、本発明はナノパーティクルの使用を含むが、当該ナノパーティクルには血栓（thrombosis）に対して特異的なリガンドが直接結合され、当該ナノパーティクルは、更に造影剤（imaging agent）及び／又は生理活性材料を含んでもよい。
【背景技術】
【０００３】
米国特許第５６９０９０７号、５７８００１０号及び５９５８３７１号は、その開示が参照により本願に組み込まれるが、ビオチン−アビジン系によって、放射性核種（radionuclide）、及び磁気共鳴画像化（造影）剤（magnetic resonance imaging agent）の特異的な部位への送達に有用であるビオチン標識（ビオチン化）された脂質被包性ペルフルオロカーボンナノパーティクル（biotynilated lipid-encapsulated perfluorocarbon nanoparticle）を記載する。生理活性剤も含まれてもよい。このアプローチにおいて、標的（ターゲット）部位は、ビオチンと結合する標的特異性のリガンドと結合される。次いで、アビジンは、エマルジョン中に含まれるビオチン誘導体化されたナノパーティクルと、現にビオチン標識された標的とを架橋するために用いられる。例示される標的には血餅が含まれる；しかしながら、これらの血餅はまず、抗フィブリン抗体（antifibrin antibody）で標識され、次にビオチンがこれに結合する。血餅に対して特異的なリガンドを用いて血餅を直接標的にすることは開示されていない。
【０００４】
本発明において、血栓に対して特異的なリガンドは、最初は、エマルジョン中のナノパーティクルに直接結合される。したがって、エマルジョンは、投与されると、その表面で標的特異性のリガンドを生ずるために標的特異的である。
【０００５】
特異的な結合成分をもつフルオロケミカルエマルジョン（perfluorochemical emulsion）は、生体外(in vitro)分析方法における標識用途として、米国特許５４０１６３４号に記載されている。しかしながら、例えば、音響画像化（acoustic imaging）、薬剤送達、又は造影剤若しくは核種の送達のための生体内(in vivo)使用を意図していない。そのうえ、生体内での使用を意図していないため、血栓に結びつけるためのこれらパーティクル（粒子）の修飾は言及されていない。
【０００６】
本発明のナノパーティクルとは異なる粒子担体を用いる薬剤送達について記載している他の報告がある。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９５／０３８２９号は、薬剤が油滴内部に分散又は溶解化され、この油滴がリガンドによって特異的な部位を標的にする油エマルジョンを記載する。米国特許５５４２９３５号は、気体充填ペルフルオロカーボン微粒子（gas-filled perfluorocarbon microsphere）を用いる部位特異的な薬剤送達を記載する。この薬剤送達は、微粒子が標的に誘導できるようにし、そのときそれらの微粒子の崩壊をもたらすことにより成し遂げられる。低沸点ペルフルオロ化合物は、気泡が生じうるよう粒子を形成するために使用される。
【０００７】
前記記載した組成物とは異なり、本発明において有用な組成物は、高沸点ペルフルオロカーボン液体をベースとした、リガンド含有液体エマルジョン（ligand-bearing liquid emulsion）である。本発明の組成物は、それらの表面に含まれる材料を血餅に送達する容易な手段を与える。
【０００８】
本発明者の論文報告研究、Flacke, S., et al., Circulation (2001) 104: 1280-1285は、２００１年９月に出され、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡで処方されたナノパーティクルを用いるイヌにおける人為的に誘発した血栓の分子画像を記載した。そのパーティクルは、抗フィブリンモノクローナル抗体と共有結合的に結合され、循環している血餅の磁気共鳴画像を得るために使用された。しかしながら、この論文に記載された方法は、ヒトに応用できない。この記載された方法は、必要以上に侵襲的であり、二重結紮、血液の除去、及びカニューレ挿入を含む。更に、血流停止の状態において、ナノパーティクルとの長いインキュベーションが要求される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、血餅を標的にするナノパーティクルを使用してヒト被験者の画像化処理及び治療の方法を記載する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ヒト生体内での血栓ないし血餅の溶解を画像化する及び／又は血餅の溶解をもたらす方法に関する。一つの側面において、本発明は、それゆえ、そのような方法（処置）において使用するための組成物を調製する方法に関する。結果として生ずる薬剤／診断用組成物は、液体エマルジョンである。この液体エマルジョンは、液体の、脂質及び／又は界面活性剤からなる被膜で覆われた比較的高沸点のペルフルオロカーボンで構成されるナノパーティクルを含む。ナノパーティクルを覆っている被膜は、血餅を標的とする成分と直接結合することができ、又は任意にリンカーを介して前記血餅を標的とする成分と共有結合的に結合する中間体成分を封入する(entrap)ことも可能である。あるいは、被膜は、一般には核酸、特にアプタマー等の負の荷電をもつ血餅ターゲティング剤が、その表面に吸着されうるようにカチオン性にしてもよい。
【００１１】
ターゲティング剤又はリガンドに加えて、ナノパーティクルは、その表面で放射性核種、磁気共鳴画像化（magnetic resonance imaging；MRI）の造影剤（contrast agent）及び／又は生物活性化合物を含んでもよい。ナノパーティクル自体は、超音波画像法のための造影剤又はＸ線造影剤として役立ちうる。
【００１２】
本発明のエマルジョンは、生体内での血餅又は血栓を標的とすることを意図しているので、血餅の成分は標的として使用される。これらのマーカー又は標的としては、フィブリン、組織因子、ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、組織因子／ＶＩＩＡ複合体、活性化した凝固因子Ｘａ、活性化した凝固因子ＩＸａ、フィブリン凝集産物（fibrin condensation product）、ｄ−ダイマー及び血小板である。組織因子は、比較的非特異性であるので好ましくないが、存在する。
【００１３】
したがって、一つの側面において、本発明は、ヒト被験者における血餅の溶解を画像化する及び／又は血餅の溶解をもたらす、生体内での方法において使用するための薬剤或いは診断用組成物を調製するための、液体、高沸点ペルフルオロカーボンベースのナノパーティクル系エマルジョンの使用、並びに当該画像化又は当該治療を施す方法に関する。その組成物自体に関し、ナノパーティクルは更に血餅を標的にする少なくとも１種のリガンド、並びに任意に少なくとも１種の生物活性化合物、少なくとも１種の放射性核種、及び／又は少なくとも１種のＭＲＩ画像化剤が組み込まれ或いはこれらと直接共有結合的に結合される脂質／界面活性剤の被膜を含む。
【００１４】
本発明の方法により調製された組成物は、心臓内及び血管内の血栓を検出することにおいて有用である。この検出は、脳卒中、心筋梗塞、又は循環系内での血液凝固の他の後遺症を防ぐために重要である。この組成物は、血栓溶解剤をも含んでもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の組成物は、循環系における血液凝固ないし血餅に付随したコンディションのヒト被験者を診断及び／又は治療する方法に使用するため調製される。いかなる心臓内及び血管内の血栓の検出も、脳卒中、心筋梗塞、及び該当する症状を示す患者における動脈性又は静脈性由来の閉塞性の血餅に二次的なものである他の組織虚血の予防のために重要である。血餅は、冠状動脈、頚動脈、肺、腎臓、鎖骨下及び腸間膜等の種々の動脈並びに静脈内で発生するかもしれない。例えば、心臓内の血餅には、心室内壁在性血栓、及び動脈外肢血栓が含まれる。血管内の血栓には、破裂したアテローム硬化型のプラーク、並びに血管損傷、血流の停滞（うっ血）、凝血促進性の段階（例えば癌）により形成される他の血栓が含まれる。特殊な腫瘍学的使用には、癌、及びフィブリン沈着に付随した血管形成ベッド（bed）の検出、又は他の血餅成分の検出が含まれる。
【００１６】
さらに、血栓溶解剤又は血栓阻害剤は、いくつかの血餅を溶解すべくナノパーティクル表面上に組み込まれてもよい。そのような薬剤には、例えば、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ｔＰＡ等が含まれる。血餅標的ナノパーティクル上へのこれら薬剤の組み込みにより、一般には、効果のある薬剤循環時間が延長され、血管性血餅に対する特異性が増加されるであろう。しかも、ナノパーティクル表面上におけるｔＰＡ等のいくつかの治療薬の組み込みにより、溶解のため血餅が標的にされるであろう。本発明の組成物を用いる血栓溶解剤の送達は、これらの溶解剤が循環から外れて血餅が保持される必要のある奥まったところにある複数の部位へ漏出することを防ぐ。急性心筋梗塞にかかる脳卒中患者に与えられた血栓溶解剤の主な副作用は、脈管構造から外れて溶解剤が血管外遊出されること及び奥まったところにある複数の血餅が溶解することによる、脳内及び胃腸内出血である。本発明の組成物のナノパーティクルでは、その大きさの特長により、これらの部位に達することが立体的に妨げられるであろう。
【００１７】
血栓溶解剤の他に、他の治療薬がエマルジョンに含まれてもよい。さらに、ナノパーティクル自体が血餅形成を妨げてもよい。
【００１８】
組成物は、ヒト患者において使用されることを意図しているので、比較的に非侵襲的な投与方法が使用される。組成物は、多くの場合静脈注射又は注入（点滴）により導入されるであろう。他の非侵襲的な経路も、使用目的に依存するが、実行可能な選択肢である。例えば、動脈内、リンパ内、腹膜内、尿道内、膣内、又は頚椎内投与が用いられてもよい。本発明の組成物は、標的部位に近い身体の部位中へのカテーテル、又は直接注射による局所投与によって投与されてもよい。
【００１９】
一般に、画像を得るという本発明の一側面は、緊急でない状況において問題の性質が明らかでない場合に用いられるであろう。最も代表的には、本発明のエマルジョンの投与が、静脈経路によるものである。一般的には、投与量は、ナノパーティクル中のペルフルオロカーボンの量に換算して、０．５ｇ／ｋｇ以下である。エマルジョン自体の投与量は、一般的には、ペルフルオロカーボンがおよそ４０％ｗ／ｖであるとき０．５ｃｃ／ｋｇ以下である。しかしながら、エマルジョンは、一般的には希釈され、１０分以下の時間（期間）にわたって注入される。しかしながら、適当なモニタリング（監視）をしてより長期間なされてもよい。
【００２０】
心臓への送達がより一層早いとはいえ、冠状動脈等の離れた部位を通過するには血液全体について約２時間かかると判断されるので、組成物が注入された後では、注入後約１時間で得られる画像が、最もよい。実際の問題として、画像化の検討は、全ての事象において、３０分間又は１時間の間隔で予定されるので、注入後の画像化のための典型的な時間は、６０〜１２０分であり、最も典型的には注入後６０〜９０分であろう。
【００２１】
本発明の組成物の主成分である担体系は、核として高沸点ペルフルオロカーボンと、ナノパーティクルに対して１種又は２種以上の目的とする成分の多数の複製を結合させる媒体を与える脂質／界面活性剤混合物である外膜とを含むナノパーティクル系である。基本的なパーティクル（粒子）の構成及びこれらのパーティクルを含むエマルジョンの形態は、外表面と結合される複数の成分にかかわらず、参照により本出願に組み込まれる米国特許第５６９０９０７号；同第５７８００１０号；同第５９８９５２０号；同第５９５８３７１号及び同第６５４８０４６号に記載されている。
【００２２】
高沸点フルオロケミカル液体は、その沸点が体温、即ち３７℃よりも高いものである。したがって、少なくとも３０℃の沸点を有するフルオロケミカル液体が好ましく、より好ましくは３７℃、更に好ましくは５０℃より上、最も好ましくは約９０℃より上である。本発明において有用な「フルオロケミカル液体」には、他の官能基を有するフッ素置換した化合物を含む直鎖、分岐鎖及び環状のペルフルオロカーボンが含まれる。フッ素置換した化合物が好ましい。特に好ましい化合物は、その化合物が被験者においてその機能を果たすとき；例えば、音響画像を得るために使用されるときに、液体状態で残存するであろう化合物である。
【００２３】
有用なペルフルオロカーボンエマルジョンは、米国特許第４９２７６２３号、同第５０７７０３６号、同第５１１４７０３号、同第５１７１７５５号、同第５３０４３２５号、同第５３５０５７１号、同第５３９３５２４号、及び同第５４０３５７５号に開示され、ペルフルオロカーボンカーボン化合物が、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロジクロロオクタン、ペルフルオロ−ｎ−オクチルブロマイド、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロデカン、ペルフルオロシクロヘキサン、ペルフルオロモルフォリン、ペルフルオロトリプロピルアミン、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロヂメチルシクロヘキサン、ペルフルオロトリメチルシクロヘキサン、ペルフルオロジシクロヘキシルエーテル、ペルフルオロ−ｎ−ブチルテトラヒドロフラン、及びこれらの化合物との構造類似化合物、並びに部分的に又は完全にハロゲン化（少なくともいくつかのフッ素置換基を含む）化合物、或いはペルフルオロアルキル化エーテル、ポリエーテル又はクラウンエーテル（大環状ポリエーテル化合物）を含む部分的に又は完全にフッ素置換した化合物であるようなペルフルオロカーボンエマルジョンを含む。
【００２４】
結合（カップリング）したリガンドを含むか又は目的とする化合物を表面に結合させる試薬を取り込むであろうナノパーティクル上に外膜を形成するために脂質／界面活性剤を含む被膜は、天然又は合成のリン脂質、脂肪酸、コレステロール、リゾ脂質（lysolipids）、スフィンゴミエリン等を含み、それらの中には脂質複合ポリエチレングリコールも含まれる。Ｔｗｅｅｎ系、Ｓｐａｎ系、Ｔｒｉｔｏｎ系等を含む各種市販のアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、及び非イオン界面活性剤も用いることができる。いくつかの界面活性剤は、ペルフルオロヘキサン酸及びペルフルオロオクタン酸等のフッ素置換したアルカン酸、フッ素置換したアルキルスルホンアミド、アルキレン四級アンモニウム塩等のように、それ自体フッ素化される。更に、フッ素置換したアルコールリン酸エステルを用いることができる。外層に含まれるカチオン性脂質は、核酸等のリガンド、特にアプタマーを取り込むことにおいて有利であろう。典型的なカチオン性脂質は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA；N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,M-trimethylammonium chloride）、１，２−ジオレオイロキシ−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（DOTAP；1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propane）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニウム）ブタノイル−ｓｎ-グリセロール（DOTB；1,2-dioleoyl-3-(4'-trimethylammonio)butanoyl-sn-glycerol）、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（1,2-diacyl-3-trimethylammonium-propane）、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（1,2-diacyl-3-dimethylammoniumu-propane）、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール−３−エチルホスフォコリン（1,2-diacyl-sn-glycerol-3-ethyl phosphocholine）、及び３β−［Ｎ’，Ｎ’，−ジメチルアミノエタン］−カルバモル）コレステロール］−ＨＣｌ（3-[N',N',β-dimethylaminoethane)-carbamol]cholesterol-HCl）を含むであろう。
【００２５】
脂質／界面活性剤被覆ナノパーティクルは、典型的には、核を形成するフルホロカーボン液体と外層を形成する脂質／界面活性剤混合物との混合物を、水性媒体に懸濁した状態でエマルジョンを形成するように微流体化することによって形成される。水媒体中で脂質／界面活性剤を懸濁させるため、超音波処理又は他の技術が必要とされるかもしれない。典型的には、脂質／界面活性剤外層の少なくとも１つの成分は、ターゲティングリガンドを結合させるために有用であるリンカー又は官能基を含む。あるいはこのターゲティングリガンドは、エマルジョンが調製される時にすでに前記少なくとも１つの成分と結合（カップリング）されていてもよい。外層の成分はまた画像化剤又は放射性核種とカップリングされてもよい。外層の成分はまた生物活性材料を含んでもよい。
【００２６】
ターゲティングリガンド又は他の有機成分（常磁性金属のためのキレート化剤等）を外層の成分に対して共有結合的に結合させてカップリングさせるために、各種タイプの結合剤（bond）及びリンキング剤（linking agent）が用いられてもよい。そのようなカップリングを形成するための典型的な方法には、カルボジアミドの使用によるアミド形成、或いはマレイミド等の不飽和化合物の使用によるスルフィドリンケージ（結合）の形成が含まれる。他のカップリング剤には、例えば、グルタルアルデヒド；プロパンジアール（propanedial）又はブタンジアール（butanedial）；２−イミノチオランヒドロクロライド；ジスクシンイミジルサブストレート、ジスクシンイミジルタートレート、ビス［２-（スクシンイミドオキシカルボニロキシ）エチル］スルホン等の二官能性のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；Ｎ−（５−アジド−２−ニトロベンゾイロキシ）スクシンイミド、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、及びスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート等のヘテロ二官能性試薬；１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロジフェニルスルホン、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−ジスルホン酸スチルベン、ｐ−フェニレンジイソチオシアネート、カルボニルビス（Ｌ−メチオニン  ｐ−ニトロフェニルエステル）、４，４’−ジチオビスフェニルアジド、エリスリトールビスカーボネート等のホモ二官能性試薬；及びジメチルアジピミデートヒドロクロライド、ジメチルスベリミデート、ジメチル  ３，３’−ジチオビスプロピオンイミデートヒドロクロライド等の二官能性イミドエステル等が含まれる。目的とするリガンドを１又はそれ以上の成分と共有結合的にカップリングさせる多数の方法が、技術としてよく知られている。リガンド自体は、その特性が適している場合には、界面活性剤層に含まれてもよい。例えば、リガンドが高親油性部分を含む場合には、それ自体脂質／界面活性剤被膜中に組み込まれてもよい。更に、リガンドが被膜に直接吸着可能である場合にも、やはりそのカップリングをもたらすであろう。例えば、核酸は、その負の電荷のため、カチオン界面活性剤に直接吸着する。
【００２７】
ナノパーティクルに対するリガンドの「直接結合する」とは、血餅の特徴づける成分に対して特異的なリガンドが、ビオチン／アビジンによりもたらされる間接的な結合と反対に、ナノパーティクル自体と結合されることを意味する。従来技術のビオチン／アビジン媒介ターゲティング法において血餅特異性リガンドは、エマルジョンとカップリングされずに、むしろ標的組織に対してビオチン標識された形態でカップリングされる。血餅の「特徴的な」成分は、組織因子を含まない。
【００２８】
ターゲティングリガンドは、血餅の構成成分に結合する一定範囲の好適な成分を包含する。一般に、１つの構成成分は、それ自体、抗体を産生するように又はその構成成分に特異的な結合相手であるアプタマーを選択するように、その構成成分を使用することによってリガンドを産生するために使用してもよい。一方、適当なリガンドは、従来技術として公知であるかもしれない。しかしながら、より一般には、抗体は、慣用技術により目的とする成分に対して産生されうるが、好ましくはモノクローナル抗体若しくはそのフラグメント（断片）として、又は組換え型で生ずる単鎖抗体として与えられうる。本発明の組成物が投与されるべき被験者はヒトであるので、従来技術として一般に公知の技術を用いて抗体型リガンドをヒト型に適応させる（ヒト化する）ことが望ましいであろう。更に、標的に結合する適当な蛋白質又はペプチド類を、ファージディスプレイ技術を通じて又は他の適当な方法を用いるペプチドライブラリの調製を通じて見つけることができる。目的とする標的を選択的に結合することができる選択的なアプタマーも、ＳＥＬＥＸ（登録商標）等の公知の技術を用いて調製することができる。（アプタマーは、選択した標的を結合する能力のためランダムなプールから選択されるオリゴヌクレオチドである。）
【００２９】
前述の他に、公知の親和性のペプチド類を模倣するように意図された小さい有機分子であるペプチド擬似物（peptidomimetics）も、ターゲティング剤として使用されうる。特に好ましいターゲティング剤は、フィブリンは血餅中に含まれる特に特徴的な要素であるので、フィブリンに結合するターゲティング剤である。抗フィブリン抗体が特に好ましいが、この際、抗フィブリン抗体は、そのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等の断片、単鎖抗体（ＦＶ）等を含む。一つの好ましい形態として、エマルジョンがキレート遷移金属等のＭＲＩ画像化剤を含むとき、ターゲティング剤はｇｐIIｂ／IIIａ、凝固因子Ｘａ及びＩＸａ等のフィブリン以外の血餅の成分を標的とする。
【００３０】
血餅に対してエマルジョンを結合させるようにデザインしたリガンドの他に、エマルジョンの添加成分が、リガンドを結合するために使用されるそれと類似の方法でナノパーティクルに結合されうる。
【００３１】
被覆層における取り込みを通じてナノパーティクルとカップリングされてもよい他の成分には、放射性核種が含まれる。これらの放射性核種には、例えば、９９Ｔｃが含まれる。放射性イオンを、様々な方法で、前もって形成されたエマルジョンに与えることができる。例えば、９９Ｔｃペルテクナート（99Tc-pertechnate）を、過剰の塩化第一スズと混合させ、前もって形成されたナノパーティクルのエマルジョンに配合させ、次いで遠心分離及び洗浄により未結合の９９Ｔｃペルテクナートを除去してもよい。オキシ酸スズ（stannous oxinate）が塩化第一スズに対して置換されうる。更に、Nikomed Amersham社によりＣｅｒｅｔｅｋ（登録商標）として市販されているＨＭ−ＰＡＯ（exametazine）キット等の市販のキットを使用することができる。ナノパーティクルに各種放射性リガンドを付着させる手段は、技術常識として理解される。
【００３２】
放射性各種の配合に加え、磁気共鳴画像化において使用するための常磁性金属を含むキレート化剤をも使用することができる。典型的には、常磁性金属を含むキレート化剤は、ナノパーティクル上の被膜の脂質／界面活性剤と結合され、超音波処理される初混合物中へ配合される。キレート化剤は、１又はそれ以上の被覆層の成分に対して直接カップリングされうる。適当なキレート化剤には、ＥＤＴＡ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ等の各種の多座配位化合物が含まれる。これらのキレート化剤は、例えば、ホスファチジルエタノールアミン（phosphatidyl ethanolamine）、ビスオレアート（bis-oleate）等中に含まれる官能基に対して直接カップリングされる。ヒトについて使用するためには、本願発明によれば、ＤＯＴＡが好ましい。好ましいキレートは、下記式の化合物中に含まれるキレートである：
【００３３】
【化１】
2005536537.tif 000002
但し、Ｃｈは、キレート部分（成分）を示し；
ｍは、０〜３であり；
Ｒ１は、非干渉性置換基（non-interfering substituent）であり；
ｌは、０〜２であり；
Ｚは、Ｓ又はＯであり；
Ｒ２は、Ｈ又はアルキル（1-4Ｃ）であり、
ｎは、０又は１であり；及び
それぞれのＲ３は、独立して、少なくとも１０Ｃを含む任意に置換した飽和又は不飽和炭化水素基であり、キレート化剤と関連して、少なくとも１種の常磁性金属イオン又は放射性核種と結合したものを含んでもよい。
【００３４】
典型的には、Ｃｈで示されるキレート化剤は、少なくとも２種の、好ましくは、アルキレン基で間隔をとられ、かつカルボン酸関連成分（carboxylic acid-bearing moiety）がカップリングされる多数の窒素を含む。キレート化剤は、目的とする金属イオンを封鎖する役割を果たす多数の非共有電子対又は潜在負電荷（potential negative charge）を含むことに特徴がある。通常用いられるキレート化剤には、ポルフィリン、エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタアセテート酸（diethylenetriamine-N,N,N',N'',N''-pentaacetate；DTPA）、１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロドデカン−７，１６−ジアセテート（1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazacyclooctadecane-7（ODDA）,16-diacetate）、Ｎ−２−（アゾール−１（２）−イル）エチルイミノ二酢酸（N-2-(azol-1(2)-yl)ethyliminodiacetic acid）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ'''−テトラ酢酸（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid；DOTA）、１，７，１３−トリアザ−４，１０，１６−トリオキサシクロ−オクタデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリアセテート（1,7,13-triaza-4,10,16-trioxacyclo-octadecan-N,N',N''-triacetate；TTTA）、テトラエチレングリコール、１，５，９−トリアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，−トリス（メチレンホスホン酸（1,5,9-triazacyclododecane-N,N',N'',-tris(methylenephosphonic acid；DOTRP）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリメチルアンモニウムクロライド（N',N',N''-trimethylammonium chloride；DOTMA）及びこれらの類似物が含まれる。本発明の化合物において特に好ましいキレート化剤は、ＤＯＴＡである。
【００３５】
本発明のＭＲＩ造影剤において有用な常磁性金属には、希土類金属、代表的には、ランタン、イッテルビウム、ガドリニウム、ユーロピウム等、が含まれる。鉄イオンを使用してもよい。
【００３６】
本発明のいくつかの形態において、ナノパーティクルの表面には生物活性剤も含有される。これらの生物活性剤は、蛋白質、核酸、薬等を含み、多種多様でありうる。したがって、適当な薬の中には、抗腫瘍剤、ホルモン、鎮痛薬、麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌又は抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、インターフェロン、抗糖尿病薬、抗ヒスタミン剤、鎮咳薬、抗凝血剤等が含まれる。特に関連したものは、ｔＰＡ、ウロキナーゼ及びストレプトキナーゼ等の血栓溶解化合物である。
【００３７】
本発明のエマルジョンを調製するための典型的な手順（方法）については、フルオロケミカル液体及び脂質／界面活性剤被膜の成分を水媒体中で流動化させて、水系エマルジョンを形成させる。表面層の機能成分が元のエマルジョンに含まれていてもよく、又はナノパーティクルエマルジョン形成以後、もっと後に、表面層に対して共有結合的に結合させてもよい。一つの特殊な例として、例えば、核酸ターゲティング剤又は薬が含まれるような場合には、被膜は、カチオン界面活性剤及びパーティクル（粒子）が形成された後表面に対して吸着した核酸を利用してもよい。
【００３８】
適当に調製されたときには、パーティクルは、多数の官能性試薬をその外表面に含み、典型的には、ナノパーティクルは、何千もの分子のＭＲＩ造影剤を含む。好ましくは、ナノパーティクルに対してカップリングされるべき成分の複製数は、パーティクル（粒子）に対して１０００コピーより多く、より好ましくはパーティクルに対して５０００コピーより多く、更に好ましくは１００００、更に好ましくは５００００コピーより多い。
【００３９】
どの生物活性剤又は放射性核種の濃度も、使用される特定の剤又は核種の性質により決定される。ターゲティング剤の観点からいえば、典型的には、抗体型ターゲティング剤（antibody-based targeting agent）は、パーティクルに対して約２０〜５０コピーでナノパーティクルに結合される。ターゲティングのために使用されるより小さいペプチド及びペプチド擬似物又は他の小さい分子として、より大きなコピー数のものが使用されうる。
【００４０】
パーティクルは、乳化する前に脂質表面層中の補助成分の全てを含むように調製されてもよく、又はパーティクルには、エマルジョンの調製後、ＭＲＩ造影剤、生物剤、放射性核種、ターゲティング剤等の補助成分と反応する反応基が付いていてもよい。一方、これらの成分のうちあるものは、ナノパーティクルエマルジョンの調製の間中含まれ、またあるものは、後に脂質層中に含まれる反応基と反応するかもしれない。抗体等の大きなターゲティング剤が用いられる場合には、そのような大きなターゲティング剤は、その大きさによって、エマルジョン自体の形成を妨げるかもしれないので、エマルジョンの調製後に、エマルジョンにこれを加えることが好ましいであろう。パーティクルを調製するための各種の方法を、以下に記載する。
【００４１】
一般に、直接標的特異性リガンドと結合される標的パーティクルは、超音波造影剤（ultrasound contrast agent）としてそれ自体有用である。しかしながら、複数のコピー数で他の成分を含有させると、それらパーティクルは他の点で有用なものとなる。例えば、常磁性イオンを含むキレート化剤を含有させると、エマルジョンは磁気共鳴画像化造影剤として有用なものとなる。パーティクルは多量のフッ素を含むので、これらのパーティクルをＭＲＩに対して有用なものとするために、常磁性イオンを添加する必要はない。生物活性材料を含有させると、それらのパーティクルは薬物送達システムとして有用なものとなる。放射性核種を含有させると、それらのパーティクルは、放射線治療のための療法として又は画像化のための診断用薬として或いはその両方として有用なものとなる。多数のそのような活性が含まれてもよい；したがって、標的組織の画像を、それらの組織に活性物質が送達されると同時に、得ることができる。最後に、パーティクルはフルオロカーボン核を有しているので、１９Ｆ磁気共鳴画像化を、前記した補助的な機能に付随してパーティクルの位置を追跡するために使用することができる。
【００４２】
エマルジョンを、被膜中に含まれるべき成分の性質に左右される方法の範囲内で調製することができる。典型的な手順については、詳細に説明する目的のためだけに使用されるが、下記手順が示される：ペルオクチルブロマイド（４０％  ｗ／ｖ、perfluorooctylbromide（PFOB）、3M）、及び界面活性剤共混合物（２．０％、ｗ／ｖ）、及びグリセリン（１．７％、ｗ／ｖ）を調製する。界面活性剤共混合物は、６４モル％レシチン（Pharmacia Inc）、３５モル％コレステロール（Sigma Chemical Co.）及びクロロホルム中に溶解した１モル％ジパルミトイル−Ｌ−アルファ−ホスファチジル−エタノールアミン（Pierce Inc.）を含む。薬剤を、メタノール（〜２５μｇ／２０μｌ）中に懸濁させ、２％界面活性剤層の０．０１から５．０モル％、好ましくは０．２から２．０モル％の間の滴定量で加える。クロロホルム−脂質混合物を、減圧蒸発させ、５０℃真空乾燥器で一晩乾燥させ、超音波処理により水中へ分散させる。懸濁液を、蒸留水又は脱イオン水とペルフルオロオクチルブロマイドと共にブレンダーカップ（Dynamics Corporation of America）中へ移し、３０〜６０秒間乳化処理する。乳化混合物を、Microfluidics emulsidier（乳化機）（Microfluidics Co.）に移し、３分間、２００００  ＰＳＩで、連続的に処理する。でき上がったエマルジョンを、ガラス瓶に入れ、窒素を充填し、使用するまで圧着密閉栓（stopper crimp seal）で密閉する。パーティクルの大きさ（径）を、レーザ光散乱微小粒子径分析機（laser light scattering submicron particle size analyzer）（Malvern Zetasizer 4、Malvern Instruments Ltd.、Southborough、MA）を用いて、３７℃で３回測定する。そしてこの分析機では、パーティクルの大きさは、平均粒子径４００ｎｍ未満であり、径分布も密で、その再現性も高い。ターゲティングリガンドを提供するために、Ｆ（ａｂ）フラグメント（断片）は、前記記載の手順で二官能性のリンカーにより共有結合的にホスファチジルエタノールアミンと結合される。
【００４３】
下記実施例は、本発明を詳細に説明することを目的とするものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４４】
［実施例１］  ナノパーティクルの調製−１
ペルフルオロオクチルブロマイド（４０％ｗ／ｖ、ＰＦＯＢ）、界面活性剤共混合物（２．０％、ｗ／ｖ）、及びグリセリン（１．７％、ｗ／ｖ）及び任意に「油」（２〜１０％  ｗ／ｖ、ＰＦＯＢの代わりに用いる）を含むナノパーティクルを調製する。
【００４５】
各種の適用のため、界面活性剤共混合物には、治療薬、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ホスフォエタノールアミン−Ｎ−４  ＰＥＧ（２０００）−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド（ＭＰＢ−ＰＥＧ−ＰＥ）又はホスフォエタノールアミン−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド、ホスファチジルエタノールアミン、及びスフィンゴミエリンが、モル比を変えて含まれる。それらは、クロロホルム／メタノール中に溶解され、５０℃真空乾燥器で一晩乾燥され、水中へ分散される。常磁性の剤形のため、界面活性剤共混合物には、変動量の、メトキシフェニル含有リンケージによりホスファチジルエタノールアミンと結合したガドリニウム１，４，７，１０−テトラアザシクロデカンテトラ酢酸（Ｇｄ−Ｍｅｏ−ＤＯＴＡ）等のガドリニウム脂質キレートが、総濃度２．５〜５０モル％で含まれる。
【００４６】
油（即ち、植物油、ビタミンＥ又は他の生体適合性油）は、単独で加えられてもよく、又は治療薬を組み込んでもよい。親油性及び疎水性の治療薬を、全薬剤有効配合量（total drug payload）を増加させて濃度が飽和になるまで、油成分中に溶解させてもよい。
【００４７】
前記懸濁液は、ＰＦＯＢ及び蒸留、脱イオン水と組み合わされ、配合され、その後３分間、１００００〜２００００  ＰＳＩで乳化される。
【００４８】
硫黄置換リガンド（thiolated ligand）を、５０ｍＭ  リン酸塩、１０ｍＭ  ＥＤＴＡバッファ中、ｐＨ６．６５、一晩、非酸化雰囲気（即ち、窒素、アルゴン）下で、マレイミド誘導体化したリン脂質（又は親油性の代用品）と結合させる。小さいペプチド分子及び非ペプチド分子を、乳化前に、脂質成分に結合させる。
【００４９】
フィブリン又は血餅中に含まれる他の標的に対する抗体を、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（N-succinimidyl S-acetylthioacetate；SATA）と３０分間反応させ、無酸素バッファ（oxygen free buffer）中で透析し、その後室温でナノパーティクルと結合させる。一方、抗体を、パパイン又はペプシンで酵素消化し、通常のアフィニティークロマトグラフィーで単離したＦ（ａｂ）フラグメントを産生する。
【００５０】
パーティクルの大きさ（径）を、レーザ光散乱微小粒子径分析機（Malvern Zetasizer 4、Malvern Instruments Ltd.、Southborough、MA）を用いて、室温で３回測定する。この分析の結果、パーティクルの大きさは、一般に平均粒子径およそ２５０ｎｍであり、径分布の再現性も高い。
【００５１】
［実施例２］  ナノパーティクルの調製−２
この実施例において、キレート化リガンド及びターゲティングリガンドは、乳化する前に、ナノパーティクルと結合される。
【００５２】
この実施例においてナノパーティクルエマルジョンは、２０％（ｗ／ｖ）フルオロケミカル、２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤共混合物、１．７％（ｗ／ｖ）グリセリン及び残余の水で構成される。コントロール（対照）の界面活性剤、即ち、非標的ナノエマルジョンには、７０モル％レシチン（Avanti Polar Lipid, Inc.）、２８モル％コレステロール（Sigma Chemical Co.）、２モル％ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine；DPPE）（Avanti Polar Lipid, Inc.）が含まれる。フィブリン標的ナノパーティクルを、以下の界面活性剤共混合物を用いて調製する：７０モル％レシチン、抗体フラグメント又はペプチド擬似物等の抗フィブリンペプチドと共有結合した０．０５モル％Ｎ−［｛ｗ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブタノイル］アミノ｝ポリ（エチレングリコール）２０００］１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン（N-[{w-[4-(p-maleimidophenyl)butanoyl]amino}poly(ethylene glycol)2000]1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine；MPB-PEG-DSPE）、２８モル％コレルテロール、及び１．９５モル％ＤＰＰＥ。各ナノパーティクルの処方の成分を、Ｍ１１０Ｓ  Microfluidics emulsidier（Microfluidics）中、４分間、２００００  ＰＳＩで乳化する。でき上がったエマルジョンを、圧着密閉ガラス瓶（crimp sealed vial）に入れ、窒素を充填する。パーティクルの大きさを、レーザ光散乱微小粒子径分析機（Malvern Instruments Ltd.、Southborough、MA）を用いて、３７℃で測定する。
【００５３】
一方、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）マレイミドメルカプト酢酸付加体；
【００５４】
【化２】
2005536537.tif 000003
を、ＤＭＦ中に１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレン  グリコール）２０００］を溶解させ、窒素又はアルゴンを散布して脱ガスすることにより、調製する。無酸素溶液を、ＤＩＥＡを用いて、ｐＨ７〜８に調整し、メルカプト酢酸で処理する。分析により出発原料が完全に消費されたことを示すまで、室温で撹拌を続ける。この溶液は、ペプチド擬似物又は小さいペプチドとの反応において直接使用される。誘導体化したＰＥＧ−ＤＳＰＥは、３ｍｌのＮ２除去した、６ｍＭ  ＥＤＴＡにおける擬似又は小さいペプチドと、１：１のモル比で組み合わされる。丸底フラスコは、そのとき、水浴中、３０分間、遅い流れのＮ２の下、３７〜４０℃で、穏やかに超音波処理される。混合物は、脂質膜の全てを再懸濁させるために、時折かきまぜる。この予混合物を、残存界面活性剤成分、ＰＦＣ及び乳化のための水に添加する。
【００５５】
［実施例３］  ナノパーティクルの調製−３
この実施例では、画像化及びターゲティングするためのリガンドを、乳化後、ナノパーティクルと結合させる。
【００５６】
この実施例におけるナノパーティクルエマルジョンは、２０％（ｗ／ｖ）フルオロカーボン、２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤共混合物、１．７％（ｗ／ｖ）グリセリン及び残余の水で構成される。コントロール（対照）の界面活性剤、即ち、非標的エマルジョン、には、７０モル％レシチン（Avanti Polar Lipid, Inc.）、２８モル％コレステロール（Sigma Chemical Co.）、２モル％ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine；DPPE）（Avanti Polar Lipid, Inc.）が含まれた。標的ナノパーティクルは以下の界面活性剤共混合物を用いて調製する：７０モル％レシチン、０．０５モル％Ｎ−［｛ｗ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブタノイル］アミノ｝ポリ（エチレングリコール）２０００］１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン（N-[{w-[4-(p-maleimidophenyl)butanoyl]amino}poly(ethylene glycol)2000]1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine；MPB-PEG-DSPE）、２８モル％コレルテロール、及び１．９５モル％ＤＰＰＥ。各ナノパーティクルの処方の成分を、Ｍ１１０Ｓ  Microfluidics emulsidier（Microfluidics）中、４分間、２００００  ＰＳＩで乳化する。でき上がったエマルジョンを、圧着密閉ガラス瓶（crimp sealed vial）に入れ、結合するまで窒素を充填する。パーティクルの大きさを、レーザ光散乱微小粒子径分析機（Malvern Instruments Ltd.、Southborough、MA）を用いて、３７℃で測定する。
【００５７】
遊離のチオールを含むリガンド（例えば、抗体、小さいペプチド、擬似物又は抗体フラグメント）を、脱酸素化した５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ  ｐＨ６．６５バッファ中に約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させる。この溶液を、窒素存在下、界面活性剤中に含まれるＭＰＢ−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥの割合をリガンドに対して等モル比でナノパーティクルに添加する。ガラス瓶を、窒素（又は他の不活性ガス）下、密閉し、室温で、４〜１６時間の間、静かにかき混ぜて反応させておく。過剰（即ち、未結合）のリガンドを、必要ならば、Spectra/Por「Dispodialyzer」、300000  MWCO（Spectrum Laboratories、Rancho Dominguez、CA）を用いて、リン酸塩／ＥＤＴＡバッファに対して透析してもよい。
【００５８】
ＭＲＩ画像化のため、硫黄置換スペーサー（thiolated spacer）と結合した実施例５のＤＯＴＡ−ＮＣＳ試薬が添加される。
【００５９】
［実施例４］  ペルフルオロカーボンエマルジョンパーティクルへの抗フィブリン抗体のカップリング
（エマルジョンの調製）：ペルフルオロカーボンナノパーティクル造影剤は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミン（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-4-(p-maleimidophenyl)butyramine；MPB-PE）をエマルジョンの外脂質単層中に組み込むことにより製造した。エマルジョンは、ペルフルオロジクロロオクタン、サフラワー油、界面活性剤共混合物及びグリセリンで構成される。当該界面活性剤共混合物には、レシチン、コレステロール及びクロロホルム中に溶解させたＭＰＢ−ＰＥが含有される。クロロホルム−脂質混合物を、減圧蒸発させ、５０℃真空乾燥器で一晩乾燥させ、超音波処理により水中へ分散させる。懸濁液を、ペルフルオロジクロロオクタン、サフラワー油及び蒸留、脱イオン水と共にブレンダーカップ（Dynamics Corporation of America）中へ移し、３０〜６０秒間乳化処理する。予乳化混合物を、微乳化機（microemulsidier）に移し、３分間、１００００  ＰＳＩで、連続的に処理する。でき上がったエマルジョンを、ガラス瓶に入れ、窒素を充填し、使用するまで圧着密閉栓で密閉する。ネガティブコントロールエマルジョンも、非誘導体化したホスファチジルエタノールアミンが界面活性剤共混合物に代用されることを除いて、同様に調製される。パーティクルの大きさ（径）を、レーザ光散乱微小粒子径分析機を用いて、３０℃で３回測定する。
【００６０】
（抗フィブリンＦ（ａｂ）’のＭＰＢ−ＰＥ誘導体化したエマルジョンとの結合）：抗フィブリンＦ（ａｂ）’フラクション（画分）を、プールし、ＭＰＢ−ＰＥ誘導体化したエマルジョンと結合させる（０.０１〜５.０ｍｇ  Ｆ（ａｂ）’／ｍｌのエマルジョン、好ましくは１〜２ｍｇ  Ｆ（ａｂ）’／ｍｌのエマルジョン）。その混合物を、ｐＨ６.７に調整し、窒素存在下密閉し、静かに、連続的に混合して、一晩周囲温度で反応させておく。その混合物は、その後、300000  MWCO  Spectra/Por  Dispodialyzer（Laguna Hills、CA）を用いて、１０ｍＭリン酸塩バッファ（ｐＨ７．２）に対して透析し、未結合のＦ（ａｂ）’フラグメントを取り除いてもよい。最終的なエマルジョンを、窒素の存在下ガラス瓶に入れ、使用するまで４℃で保存する。結果として生ずるパーティクルは、パーティクルにあたり約５０ターゲティングリガンドを含む。
【００６１】
［実施例５］  ＭＲＩ用の標的エマルジョン
エマルジョンを、実施例４において記載されたように調製するが、脂質混合物には、下記記載されたようなＤＯＴＡと結合されているホスフォエタノールアミンが含まれる。混合物中におけるパーティクルに対する結合したＤＯＴＡの比は、およそ５０００：１以上である。ホスファチジルエタノールアミンをパーティクル表面に組み込んで、ナノパーティクルを含むエマルジョンを与えるが、このナノパーティクルは、そのとき抗フィブリンリガンド及びキレート化剤の両方を含むであろう。キレート剤は、その後、ガドリニウムイオンの溶液と接触されて、完全なエマルジョンが与えられる。
【００６２】
ホスフォエタノールアミン（phosphoethanolamine；PE）を、ｔ−ｂｏｃ保護トリグリシン（t-boc protected triglycine）とまず結合させる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxy succinimide；NHS）又はヒドロキシベンゾトリアゾール（hydroxybenzotriazole；HBT）の何れかと共に、ジイソプロピルカルボジイミド（又はこれに相当するもの）を用いてｔ−ｂｏｃ−トリグリシンの遊離酸の活性化エステルを形成すること等標準のカップリング技術が用いられ、ｔ−ｂｏｃ−トリグリシン−ＰＥが精製される。
【００６３】
ｔ−ｂｏｃ−トリグリシン−ＰＥのトリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid）処理により、トリグリシン−ＰＥが産生され、このトリグリシン−ＰＥは、５０℃でＤＭＦ／ＣＨＣｌ３中で過剰なＤＯＴＡ−ＮＣＳとその後反応する。最終的な産物は、溶媒を除去することにより単離され、次いで過剰の水を用いて残存固体を生じさせて、過剰の溶媒及び全ての未反応又は加水分解したＤＯＴＡ−ＮＣＳを除去する。
【００６４】
【化３】
2005536537.tif 000004
【００６５】
結果として生ずる、ＰＥと結合したキレートは、実施例４の標的ナノパーティクルを調製するために使用される界面活性剤混合物中に含まれる。
【００６６】
［実施例６］  フィブリン標的音響造影システムを用いたフィブリンに富む血漿血栓の生体外でのターゲティング
新鮮な全血を取得し、滅菌クエン酸ナトリウムを用いて血液凝固を阻止した（９：１、ｖ／ｖ）。一連の試験では、血漿凝塊（plasma clot）（９）を、ニトロセルロース膜の上に重ねたプラスチック管中で、５単位のトロンビン（Sigma Chemical Company、St Louis、MO）と血漿及び１００ｍＭ塩化カルシウム（３：１、ｖ／ｖ）を組み合わせて製造した。血漿を、室温でゆっくりと凝固させた。
【００６７】
血漿凝塊を、抗フィブリンモノクローナル抗体（ＮＩＢ−５Ｆ３又はＮＩＢ−１Ｈ１０）を用いて抗フィブリン（Ｆ（ａｂ））結合又は非結合コントロールエマルジョン造影剤と共にインキュベートした（Tymkewycz, et al.(1992)；Tymkewycz, et al.(1993)）。凝塊（血餅）の半分（５）を、個別に２時間、１％ウシ血清アルブミン（結晶、Sigma Chemical Company、St.Louis、MO）を含む１０ｍｌＰＢＳ中で、１５０μｇビオチン標識した抗フィブリンモノクローナル抗体と共にインキュベートした；残りの凝塊（４）は、１％ウシ血清アルブミンを含む１０ｍｌＰＢＳ中において、維持された。抗体インキュベーション中、ウシ血清アルブミンを加えて、ポリスチレンペトリ皿壁に付く非特異性蛋白質を最小にした。抗フィブリン標的エマルジョンを、３０分間、凝塊（０.２ｍｌ）と共にインキュベートした。コントロールの凝塊を、３０分間、非標的コントロールペルフルオロカーボンエマルジョン（０.２ｍｌ）と共に、同様に処理した。音響顕微鏡（acoustic microscope）を用いて、ニトロセルロース上の血漿凝塊に高周波をあてて音響ホログラムを作り、コントロール及び標的エマルジョンに起因する超音波後方散乱力（ultrasonic backscattered power）における変化を評価した。
【００６８】
顕微鏡は、パルス−エコーモードで稼動する５０ＭＨｚ広帯域、集束（focused）、圧電、遅延ライントランスジュース（delay-line transduce）（直径1/4インチ、焦点距離1/2インチ、Model V390、Panametrics Co.、Waltham、MA）で構成された。Tektronix DSA 601デジタイジング（デジタル化）オシロスコープ（digitizing oscilloscope）（Beaverton、OR）を使用して、８ビットの解像度、毎秒５００メガサンプル（megasample）で、後方散乱高周波データ（backscattered radiofrequency data）をデジタル化した。各部位から集められた高周波データについては、３２回平均をとった。平均した高周波データは、５０ミクロン側方ステップ解像度（lateral step resolution）で、約４００の独立部位から取得した。高周波データを、低解像度ラスタースキャンフォーマット（raster scan format）で保存し、カスタムソフトウェア（custom software）を用いて解析した。持続時間５００ナノ秒の、表面反射を含む高周波線の線分（セグメント）を、解析のためにゲート制御した。ゲート制御したデータを、ハミングウィンドウ（Hamming window）により、及び高速フーリエ変換により測定されたそれらのパワースペクトルにより増大させる。
【００６９】
各試料からのパワースペクトルを、完全に近いステンレス鋼プレート反射から後方散乱したパワースペクトルに照合して、見掛け周波数依存性後方散乱伝達関数（apparent frequency-dependent backscatter transfer function）を算出した。平滑細胞（smooth cell）、Ｂ(f)、の音響反射率の後方散乱伝達関数は、ステンレス鋼プレートから反射されるパワーに比例した音量で表された：
Ｂ(f)２＝１０log[Ｖ(f)２組織]/[Ｖ(f)２ステンレス鋼プレート]
但し、Ｖ(f)２組織は、細胞からのゲート制御したｒｆ後方散乱の選択周波数でのパワーであり、Ｖ(f)２ステンレス鋼プレートは、ステンレス鋼プレートからのゲート制御したｒｆ後方散乱の同一周波数でのパワーである。積分後方散乱（integrated backscatter）を、トランスジューサーの有用な帯域幅にわたる周波数依存性後方散乱伝達関数の平均から計算した。
【００７０】
［実施例７］  生体内におけるイヌ原位置フィブリンのターゲティング
ペルフルオロカーボンナノパーティクル造影剤により、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミン（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-4-(p-maleimidophenyl)butylamide；MPB-PE；Avanti Polar Lipids、Alabaster、AL）をエマルジョンの外脂質単層に組み込んで、後のリガンド結合に対処する。Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ホスファチジルエタノールアミン（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ）を、前記記載したように０又は２０モル％で界面活性剤混合物に添加した。
【００７１】
抗フィブリンモノクローナル抗体（ＮＩＢ  １Ｈ１０、ＮＩＢ５Ｆ３）は、慣用の方法により製造され、精製される。フィブリン標的ナノパーティクル造影剤は、外脂質膜表面と抗フィブリンＦ（ａｂ）’フラグメントの共有結合により作り出される。抗フィブリンＦ（ａｂ）’フラグメントは産生され（Pierce、Rockford、IL）、一晩窒素存在下、ｐＨ６.７でＭＰＢ−ＰＥ誘導体化エマルジョン（１〜２ｍｇＦ（ａｂ）’/ｍｌの４０％ペルフルオロカーボンエマルジョン）と組み合わされる。結合したナノパーティクルは、透析され、ガラス瓶に入れられ、４℃で保存される。非特異性コントロールエマルジョンは、無関連ＩｇＧＦ（ａｂ）’フラグメントを用いて調製される。
【００７２】
流動している静脈内環境での凝塊の検出をイヌにより行った。血栓を開循環内部で形成させ、この血栓を、隔離血管セグメント内部で生体内原位置でのシステム（系）を用いて標的にし、そのとき、この血栓を磁気共鳴画像化のため体循環にさらす。動物プロトコルは、ワシントン大学動物研究委員会（Animal Studies Committee）により承認されている。
【００７３】
二匹のイヌ（〜２０ｋｇ）を、内因性血栓溶解を抑制するため、トラネキサム酸（０．２５ｇ／ｈｒ）で前処理した。各動物に、麻酔（ペントタールナトリウム（チオペンタールのナトリウム塩）／イソフルラン）をかけ、手術の準備処置を施し、外頚静脈を露出させた。１０、０．５ｃｍストランドのトロンビン浸漬した綿繊維と共にナイロン単繊維（４−０）を、超音波（Acuson Sequoia、Mountain View、CA）のそばの適当な位置に置いた。凝塊（血餅）の形成に続いて、血栓（複数）を、封止係蹄（snare closure）の中間で捕捉し、１ｍｌのフィブリン標的ガドリニウム又はコントロールナノパーティクルを、単離したセグメント中に浸出させた。コントラストインキュベーション（contrast incubation）（１ｈｒ）の後、血栓（複数）を、体循環中に再導入し、画像化した。その急性の手法の終了時に、動物を安楽死させ、血管を血栓内部でのフィブリンの通常の免疫組織学のため回収した。
【００７４】
外頚静脈内部で生じたイヌ血栓を、三次元（３−Ｄ）、脂肪抑制、Ｔ１加重急勾配エコー（T1-weighted fast gradient echo）（ＴＥ／ＴＲ／ａ：８．１／２４／３５ｆ、ＦＯＶ１８０ｍｍ、マトリックス２０５×２５６）で画像化した。血管内部での流動及び血栓を、（流動障害として）３−Ｄ位相差、Ｔ１加重急勾配エコー血管写（ＴＥ／ＴＲ／ａ：５．３／１５／１５ｆ、ＦＯＶ２００ｍｍ、マトリックス１９２×２５６）で画像化した。
【００７５】
イヌにおいて、開循環状態で生体内で予想されるコントラスト増強の大きさを測定した。コントロール又は２０モル％（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ）抗フィブリンナノパーティクルを、外頚静脈内部で生成した血栓に対して投与した。血栓を、３−Ｄ  Ｔ１加重、脂肪抑制、、急勾配エコーシーケンスを用いて画像化した。標的凝塊の検出性は、コントロールの血栓に比べてフィブリン特異性常磁性ナノパーティクルにより著しく増強された（図１Ａ及び１Ｂ）。位相差血管造影法では、血栓は双方の外頚静脈において流動障害として示された。対応する勾配エコー画像では、鮮やかな脂肪（bright fat）の信号（１３６０±１４０）より高い信号（シグナル）強度（１７８０±３２７）を与える処理凝塊の選択的な増強が示されたのに対して、コントロール凝塊は、その近傍の筋肉の信号強度（７６８±４７）とほぼ同等の信号強度（８１５±４１）であった。脂肪抑制した状態でのＴ１加重勾配リコールエコー画像（T1-weighted gradient recalled echo image）において、標的凝塊は、最も明るい画像信号を示した（図１Ｃ）。このシーケンスで測定された、２０モル％Ｇｄ−ＤＴＰＡと共にナノパーティクルを用いる、標的凝塊と血液間のコントラスト−ノイズ比（contrast-to-noise ratio；CNR）は、約１１８±２１であった。標的凝塊とコントロール凝塊間のＣＮＲは、１３１±３７であった。切除した血管及び凝塊のフィブリン免疫染色により、生体内でのコントラスト増強に対応するフィブリンの存在量及び局在性が確認された。
【００７６】
［実施例８］  イヌの循環フィブリンのターゲティング
生体内で使用される（循環する）ペルフルオロカーボンナノパーティクル造影剤を、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミン（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-4-(p-maleimidophenyl)butylamide；MPB-PE；Avanti Polar Lipids、Alabaster、AL）をエマルジョンの外脂質単層に組み込むことにより製造し、後のリガンド結合２０に対処した。Ｇｄ−ＤＴＰＡホスファチジルエタノールアミン（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ）を、前記記載したように２０モル％で界面活性剤混合物に添加した。
【００７７】
抗フィブリンモノクローナル抗体（ＮＩＢ  １Ｈ１０、ＮＩＢ５Ｆ３）を、製造し、精製した。フィブリン標的ナノパーティクル造影剤を、外脂質膜表面と抗フィブリンＦ（ａｂ）’フラグメントの共有結合により作り出した。抗フィブリンＦ（ａｂ）’フラグメントを産生し（Pierce、Rockford、IL）、一晩窒素存在下、ｐＨ６.７でＭＰＢ−ＰＥ誘導体化エマルジョン（１〜２ｍｇＦ（ａｂ）’/ｍｌの４０％ペルフルオロカーボンエマルジョン）と組み合わせた。結合したナノパーティクルを、透析し、ガラス瓶に入れ、４℃で保存した。
【００７８】
二匹のイヌ（〜２０ｋｇ）を、内因性血栓溶解を抑制するため、トラネキサム酸（０．２５ｇ／ｈｒ）で前処理した。各動物に、麻酔（ペントタールナトリウム（チオペンタールのナトリウム塩）／イソフルラン）をかけ、手術の準備処置を施し、外頚静脈を露出させた。１０、０．５ｃｍストランドのトロンビン浸漬した綿繊維と共にナイロン単繊維（４−０）を、超音波（Acuson Sequoia、Mountain View、CA）のそばの適当な位置に置いた。凝塊（血餅）の形成に続いて、血栓（複数）を、封止係蹄（snare closure）の中間で捕捉し、１ｍｌのフィブリン標的ガドリニウム又はコントロールナノパーティクルを、単離したセグメント中に浸出させた。コントラストインキュベーション（contrast incubation）（１ｈｒ）の後、血栓（複数）を、体循環中に再導入し、画像化した。その急性の手法の終了時に、動物を安楽死させ、血管を血栓内部でのフィブリンの通常の免疫組織学のため回収した。外頚静脈内部でのイヌ血栓を、３−Ｄ、脂肪抑制、Ｔ１加重急勾配エコーを用いて画像化した（ＴＥ／ＴＲ／ａ：８．１／２４／３５ｆ、ＦＯＶ  １８０ｍｍ、マトリックス２０５×２５６）。フィブリン標的常磁性ナノパーティクル（複数）を、抹消アクセスにより静脈注入した。３０分後、凝塊のＴ１加重コントラストが示された。コントラストシングルレベル（contrast single level）は、６０分まで増加しつづけた。
【００７９】
［実施例９］  ヒト生体内における画像化−ＭＲＩ
患者Ａ．Ｃ．は、３５歳男性であり、胸苦しさ、及び適度な運動をしてもしなくても断続的に生ずる息切れを示す。この患者の父親は、突発性心臓発作で４０歳で死亡した。Ａ．Ｃ．は医師を訪ね、ＥＫＧ、心エコー図及びトレッドミルストレステスト（tredmill stress test）を受ける。全て目立ったところはない。この患者の過去の病歴からして、彼の医師は、彼の心臓の非侵襲的なＭＲＩ検査を決める。この患者の心臓機能は正常であり、ＭＲＩ血管造影図は、病巣の狭窄症でない軽い広汎性の冠状動脈疾患を示唆する。
【００８０】
患者には、抗フィブリン抗体のＦ（ａｂ）’領域を含み、かつ更にキレート化合物としてＤＰＴＡの代わりにＤＯＴＡを用いることを除いて本願に参照により組み込まれるＰＣＴ公報ＰＣＴ／ＵＳ０３／０９２７７号に記載されたのと同一のキレート化ガドリニウムを組み込むように変更された実施例２に記載されたフィブリン標的ナノパーティクルが投与される。
【００８１】
エマルジョンが、１０分間にわたり０．５ｃｃ／ｋｇの投与量で静脈内注入（点滴）される。患者は約１時間待合室で待ち、その後ＭＲＩ画像化場に戻る。冠状動脈及び心臓のＭＲＩ画像は、中央右冠状動脈における一連の密接に集合した破裂の存在を示す。患者は医学的抗血栓治療を受け、そして心臓カテーテルラボに移されて、この患者が破裂している血管壁を補強するため抗フィブリンナノパーティクルコントラストの特定の部位にステント（stent）配置（移植）を受け、次いで起こる冠動脈閉塞症及び心筋梗塞を伴うより深刻な破裂を防いだ。
【００８２】
［実施例１０］  ヒト生体内における画像化−音響
患者Ｂ．Ｌ．は６５歳男性であり、高コレステロール血症、高血圧症で、年３０箱の喫煙歴であることがわかっている。Ｂ．Ｌ．は、ある朝起きて、左足のしびれと脱力感に気づくが、以後２時間にわたって徐々に回復していく。心配になって、Ｂ．Ｌ．は、標準限度内の簡単な理学的検査を行なう医師を訪ねる。患者は心配したままであり、医師は、高度の血管閉塞の可能性を排除するためにこの患者の左頸動脈の二重超音波診断（duplex ultrasound）検査を指示することに同意する。その検査では、血行力学的に重大な狭窄症は示されない。超音波診断検査について判断がなされる一方で、実施例４において記載される音響反射ナノパーティクルの表面に結合される抗フィブリン抗体の各種領域で構成される、フィブリン標的ナノパーティクルを投与する判断がなされる。１０分間にわたり０．５ｃｃ／ｋｇの投薬量での静脈内注入により薬剤が投与され、患者は２Ｄ及び３Ｄ超音波診断法を用いて再検査される。
【００８３】
［実施例１１］  血栓溶解剤の投与
患者Ｄ．Ｓ．は４０歳男性であり、介入心臓病学（interventional cardiology）の手腕が無い地方の病院で病歴、検査、及びＥＫＧにより診断された急性心筋梗塞の徴候を示す。患者は、自身が約１年前一過性脳虚血発作を患っていたかもしれないこと、及び自身の血圧が現在１８０／１１０であることを提言する。患者には、潜在的な脳内出血の危険性を最小限にするため、実施例４におけるものと同様に調製されるフィブリン標的ナノパーティクルであって、その表面上に組換えヒト組織プラスミノゲン活性化因子（recombinant tissue plasminogen activator）を持つフィブリン標的ナノパーティクルが投与される。静脈内注入（点滴）が、１０分間にわたって、１００ｍｇのｒＴＰＡ（組換えヒト組織プラスミノゲン活性化因子）を含む０．５ｃｃ／ｋｇの投与量で、なされる。患者の胸苦しさは１０分間経てば正常に近くなって鎮まり、患者は更なる心臓血管検査のため安定したコンディション（容態）で航空救難（air rescue）により三次医療センターに送られる。
【００８４】
［実施例１２］
Ｇ．氏は、６０歳男性であり、健常であったが、この２ヶ月間に庭で働いている間、５分間続く胸の重苦しさを２回経験した。二つの発症は、軽い頭のくらくら及び発汗の増大を伴っていた。患者は、「暑」中で働きすぎたこと及び簡単に日陰で小休止する必要があったことと指摘する。今日、Ｇ．氏は、仕事をするため電車に間に合うように走っている間、短時間ではあるが同様の胸苦しさの症状に気づいて、医師に電話する。患者は、少し減量し、タバコを止める必要があることは知っているが、何か他に起こっていることはないかと述べる。医師は運動ストレステストを提案する。
【００８５】
Ｇ．氏は、核運動ストレステスト（nuclear exercise stress test）を受ける。彼の運動に対する許容度は、まずまずのものにすぎず、その検査では、正常と解釈される。臨床歴からして、医師は、患者には重大な冠状動脈疾患があるかもしれないと信じる。医師は、その徴候により侵襲性の心臓病試験が正当化され、病巣の高度の狭窄症を検出する可能性が疑われると感じる。医師は、患者に、非侵襲的なＭＲ血管写（造影図）を受けさせるが、このＭＲ血管写は高度の狭窄症ではなく軽い広汎性の冠状動脈疾患を裏付ける。Ｇ．氏には、実施例４において調製されるフィブリン標的常磁性ナノパーティクルがＩＶ（静脈内）注入により投与され、このパーティクルは、基部左前下行動脈（proximal left anterior descending artery）の壁上の破裂したアテローム硬化型プラークの二つの小領域を明らかにする。これらの結果に基づいて、患者は、弱まっている血管壁を構造的に支持するため及び管腔の血栓形成又は塞栓形成の進行を妨げるためプラーク不安定の部位にステントを配置する心臓カテーテルラボ（cardiac cath lab）に送られる。患者は、自らのアテローム硬化型の疾病の安定化を促進するため及び将来の心臓の諸現象の可能性を最小限にするため、集中的な医学療法を受け、そして生活習慣を変える。
【００８６】
［実施例１３］
Ｃ．夫人は、５５歳女性であり、瞬間的な左視覚障害及び４時間未満で回復する右手の脱力感の症状を示す。頚動脈の二重超音波診断は、左右に、５０％以下の広汎性の疾病をと共に、そこなわれていない順行性の流動を示す。患者は、自分の左手を襲う３ヶ月前同様の症状が発現したことを思い出す。
【００８７】
内科医は、一過性脳虚血発作を除外することに決める。患者は、頚動脈のＭＲ血管写を受けるが、このＭＲ血管写は、流動が良好かつ左右順行性であることを裏付ける。実施例４において調製されるフィブリン標的ナノパーティクルが、破裂したアテローム硬化型プラークを一過性脳虚血発作（transient ischemic attack；TIA）の塞栓源と決定して、投与される。薬剤の投与のあとで、患者は、左総頚動脈においてｔ１ｗ  ＭＲＩ画像化により同定されたコントラストの多様であるが限局的な集積（focal accumulation）があることに気づかされる。これらの知見に基づいて、頚動脈血管内膜切除によりプラークを外科手術で取り除く判断がなされる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、フィブリン特異的及びフィブリン非特異的常磁性ナノパーティクルで得られた音響画像をそれぞれ示す。図１Ｃは、脂肪抑制したことを除いて同様の画像を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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