【手続補正書】
【提出日】令和2年6月5日(2020.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】パイエル板活性化剤
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゴマ種子の原体及びゴマ種子ゴマ油搾り粕の水性溶媒抽出物、並びにゴマ種子水性溶媒抽出物のタンパク分解酵素消化液から得られる多糖体を有効成分とする小腸パイエル板活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
パイエル板は上部腸管に存在する高度に機能化されたリンパ濾胞組織であり、抗原特異的・非特異的分泌型ＩｇＡ産生形質芽細胞、抗原特異的・非特異的エフェクター及び制御性のＴ及びＢリンパ球、抗原特異的Ｔｈ１７リンパ球などの誘導のための重要な出発点である誘導組織の１つとなっている。パイエル板は、腸管免疫系と呼ばれる局所粘膜免疫系や全身免疫系での生体防御に関わる免疫機構、及び、食物抗原や自己抗原などの無害な抗原に対する免疫寛容に関わる免疫機構において重要な働きを担っていることが知られている。例えば、パイエル板のリンパ球は常時ホーミング現象により他の局所粘膜免疫系及び全身免疫系付属組織や造血組織にリクルートされ、免疫情報を伝搬させ、これらの生体機構を調節する機能を有する。
【０００３】
パイエル板免疫機能調節活性の一つとして、骨髄細胞増殖促進因子（例えば、サイトカイン）のパイエル板での産生が挙げられる。このような骨髄細胞増殖促進因子として、例えば、パイエル板で産生されるサイトカインであるＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１０が知られている（非特許文献１及び非特許文献２）。
【０００４】
一方、これまでに、キク科ホソバオケラ（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ  ｌａｎｃｅａ  ＤＣ．）の根茎から得られた多糖、及びマメ科ナイモウオウギ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ  Ｂｕｎｇｅ）の地上部から得られた多糖やユリ科チモ（Ａｎｅｍａｒｒｈｅｎａ  ａｓｐｈｏｄｅｌｏｉｄｅｓ  Ｂｕｎｇｅ）の根茎から得られた多糖にパイエル板免疫機能調節活性があることが報告されている（非特許文献２及び非特許文献３）。
【０００５】
ゴマ科ゴマ属の一年草であるゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ）の種子に由来する機能性成分はセサミンを主としてこれまでにいくつか知られているものの、パイエル板免疫機能調節活性を有する成分、例えば、骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカインのパイエル板での産生の亢進作用（以下、本作用を「パイエル板活性化作用」ともいう。）を有する成分、はこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔ．Ｈｏｎｇ、Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｈ．Ｋｉｙｏｈａｒａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｙａｍａｄａ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈｅｓ  ｂｙ  ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋａｍｐｏ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｈｅｒｂａｌ）  ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ、‘Ｊｕｚｅｎ−ｔａｉｈｏ−ｔｏ’、Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、５巻、３５３〜３６０頁（１９９８年）
【非特許文献２】Ｈｉｒｏａｋｉ  Ｋｉｙｏｈａｒａ、  Ｔｏｓｈｉａｋｅ  Ｍａｔｓｕｚａｋｉ、  Ｈａｒｕｋｉ  Ｙａｍａｄａ：Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈ−ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｍａｎｎａｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｈｉｚｏｍｅｓ  ｏｆ  Ａｎｅｍａｒｒｈｅｎａ  ａｓｐｈｏｄｅｌｏｉｄｅｓ  Ｂｕｎｇｅ、  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、  ９６巻、３３７−３４６  （２０１３年）
【非特許文献３】Ｈｉｒｏａｋｉ  Ｋｉｙｏｈａｒａ、Ｔｏｓｈｉａｋｅ  Ｍａｔｓｕｚａｋｉ、Ｔｓｕｋａｓａ  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｔａｋａｙｕｋｉ  Ｎａｇａｉ、Ｈａｒｕｋｉ  Ｙａｍａｄａ：Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ、１２８巻、５号、７０９〜７１９頁（２００８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
パイエル板免疫機能調節を人為的に可能とすれば、腸管免疫系を通じて全身での生体防御や免疫寛容に関わる免疫機構の調節が可能となり有益である。上述の通り、パイエル板免疫機能調節活性を有する物質がこれまでにいくつか知られている。しかし、需要者の多様なニーズに応えるためには未だ充分なレパートリーがあるとは言えない。本発明は、上記事情に鑑み、パイエル板における骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカインなどの産生亢進作用を有する新規なパイエル板活性化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ゴマ種子の原体及びゴマ種子ゴマ油搾り粕の水性溶媒抽出物、並びにゴマ種子水性溶媒抽出物のタンパク分解酵素消化液から精製されたヘテログリカンが、パイエル板において、骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカイン産生を亢進させる作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、ゴマ種子から得られる多糖を含有する多糖組成物、及び当該多糖組成物を有効成分として含有するパイエル板活性化剤を提供する。本発明の多糖組成物は、パイエル板での骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５）産生の亢進作用を少なくとも有する。したがって、パイエル板での上記サイトカイン産生の調節により、パイエル板免疫機能調節活性を発揮することができる。また、ゴマは古来より食品として使用されているものの一つであるため、より安全性の高いパイエル板活性化剤の提供が可能となる。
【００１０】
よって、本発明は、ゴマ種子から得られる多糖を含有する多糖組成物に関し、また当該多糖組成物を有効成分として含有するパイエル板活性化剤に関する。
【００１１】
本明細書において、「ゴマ種子」は食用に付されるゴマであれば特に限定されるものではなく、焙煎処理を行ったもの（焙煎ゴマ種子）と非焙煎（非焙煎ゴマ種子）のいずれであってもよい。ゴマ種子としては、例えば、白ゴマ（薄口ゴマ、濃口ゴマ）、茶胡麻、金ゴマ及び黒ゴマを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の多糖はゴマ種子の代わりに、ゴマ種子からゴマ油を搾った後に残る搾り粕（本明細書において、「ゴマ油搾り粕」という）を用いて、得られる多糖であってもよい。ゴマ油搾り粕は、焙煎処理を行ったゴマからゴマ油を搾り取った粕（焙煎ゴマ油搾り粕）と非焙煎のゴマからゴマ油を搾り取った粕（非焙煎ゴマ油搾り粕）のいずれであってもよい。
【００１２】
本発明における多糖は、ヘテログリカンを主成分とする。焙煎処理ゴマ種子由来の多糖は、ピーク分子量が１０，０００〜１００，０００の範囲内であり、好ましくは、１２，０００〜９０，０００、１４，０００〜８０，０００、又は１６，０００〜６１，０００の範囲内である。非焙煎処理ゴマ種子由来の多糖は、ピーク分子量が５００，０００〜１，６００，０００の範囲内である。
【００１３】
好ましくは、本発明における多糖は、全構成糖に占めるアラビノースの割合が１０〜５０％、１１〜４８％、１２〜４５％、又は１３〜４４％であり、ラムノースの割合が５〜２０％、６〜１８％、７〜１５％、又は９〜１３％であり、キシロースの割合が５〜２５％、６〜２０％、又は７〜１９％であり、マンノースの割合が０．５〜１５％、１〜１３％、又は２〜１１％であり、ガラクトースの割合が１〜２５％、２〜２３％、３〜２０％、又は５〜１７％であり、ガラクツロン酸の割合が１〜６０％、１．５〜５５％、又は２〜５３％であり、かつ、グルクロン酸の割合が０．５〜８％、１〜５％、又は１〜４％である。
【００１４】
また、好ましくは、本発明における多糖は、非還元末端アラビノースの割合が１〜２０％、１．５〜１８％、又は２〜１４％であり、４もしくは５結合のアラビノースの割合が５〜３０％、７〜２８％、又は９〜２５％である。
【００１５】
また、本発明における多糖は、アラビノガラクタンプロテイン（ＡＧＰ）に結合する糖鎖を含有していても良い。すなわち、本発明における多糖は、エキソ−β−Ｄ−（１→３）−ガラクタナーゼ（例えば、ドリセラーゼ由来）、及び／又は、エンド−β−Ｄ−（１→４）−ガラクタナーゼ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来）を用いた酵素消化により、オリゴ糖を遊離し、β−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原との反応性が低下する多糖であってもよい。本明細書において、「ガラクタナーゼによる酵素消化によりβ−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原との反応性が低下する」とは、ガラクタナーゼによる酵素消化前の多糖のβ−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原との反応性と比較して、ガラクタナーゼによる酵素消化後の多糖のβ−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原との反応性が低いことを意味する。反応性の低下の程度は特に限定されるものではないが、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％低下してもよい。また、エキソ−β−Ｄ−（１→３）−ガラクタナーゼによる反応性の低下の程度と、エンド−β−Ｄ−（１→４）−ガラクタナーゼによる反応性の低下の程度は同じである必要は無く、例えば、片方の酵素消化によってのみ反応性の低下が認められる多糖も、本発明における、酵素消化によってβ−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原との反応性が低下する多糖に含まれる。
【００１６】
好ましくは、本発明のゴマ種子から得られる多糖としては、焙煎処理ゴマ種子由来のヘテログリカンを主成分とし、ピーク分子量が６１，０００〜１６，０００の範囲内にあり、全構成糖に占めるアラビノースの割合が１３〜４４％、ラムノースの割合が９〜１３％、キシロースの割合が７〜１９％、マンノースの割合が１〜１１％、ガラクトースの割合が５〜１７％、ガラクツロン酸の割合が２〜５３％、及びグルクロン酸の割合が１〜４％であり、かつ非還元末端アラビノースの割合が２〜１４％、４もしくは５結合のアラビノースの割合が９〜２５％で、Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ由来のエキソ−β−Ｄ−（１→３）−ガラクタナーゼ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のエンド−β−Ｄ−（１→４）−ガラクタナーゼを用いた酵素消化により、オリゴ糖を遊離し、各酵素消化によりβ−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原との反応性が低下する多糖；並びに、非焙煎処理のゴマ種子由来のヘテログリカンを主成分とし、ピーク分子量が６００，０００〜１，６００，０００の範囲内を示す多糖が挙げられる。
【００１７】
本明細書において「分子量分布曲線」とは、被験試料（例えば、ゴマ抽出物のゴマ多糖画分）の分子量を、高速ゲルろ過クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）で分析したときに得られる分布曲線を意味する。分子量は、例えば、標準多糖（ｐｕｌｌｕｌａｎ  Ｐ−８００、４００、２００、１００、５０、２０、１０及び５；昭和電工）のＨＰＳＥＣでの保持時間より分子量対保持時間係数（Ｋａｖ）の検量線を作成し、被験試料の保持時間から算出することができる。また、ＨＰＳＥＣの条件は、例えば、以下のように設定することができる。
カラム：Ａｓａｈｉ−ｐａｋ  ＧＳ５２０ＨＱ及びＡｓａｈｉ−ｐａｋ  ＧＳ３２０ＨＱ（各０．７５ｉ．ｄ．×３０ｃｍ）（昭和電工）の連結カラム
送液装置：ＪＡＳＣＯ  ＰＶ−９８０（日本分光）
検出器：Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ  ＳＥ−６２（昭和電工）（感度：×２）
溶出液：０．２Ｍ  ＮａＣｌ（０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
【００１８】
本明細書において「ピーク分子量」とは、上述の「分子量分布曲線」におけるピークのピークトップに対応する分子量を意味する。
【００１９】
一態様において、本発明の多糖組成物は、ゴマ種子又はゴマ油搾り粕からの水性溶媒抽出物を含む。また、本発明の多糖組成物は、ゴマ種子又はゴマ油搾り粕の水性溶媒抽出物のタンパク質分解酵素による酵素消化物を含んでいてもよい。
【００２０】
また、別の態様において、本発明の多糖組成物は、ゴマ種子又はゴマ油搾り粕のエタノール沈殿画分を含む。該エタノール沈殿画分は、好ましくは、ゴマ種子又はゴマ油搾り粕からの水性溶媒抽出物のエタノール沈殿画分、又は、ゴマ種子又はゴマ油搾り粕からの水性溶媒抽出物のタンパク分解酵素による酵素消化物のエタノール沈殿画分である。また、本発明の多糖組成物は、ゴマ種子又はゴマ油搾り粕の水性溶媒抽出物のエタノール沈殿画分のタンパク質分解酵素による酵素消化物を含んでいてもよい。
【００２１】
更に別の態様において、本発明の多糖組成物は、ゴマ種子又はゴマ油搾り粕の水性溶媒抽出物、該水性溶媒抽出物のエタノール沈殿画分、又はそれらタンパク質分解酵素による酵素消化物を、透析及び／又は膜処理することにより低分子量の物質やタンパク質を除去して得られる画分を含む。あるいは、本発明の多糖組成物は、前記画分から中性多糖が除去されたものを含んでいてもよい。透析及び／又は膜処理することにより低分子量の物質やタンパク質を除去して得られる画分としては、担体として陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、上記陰イオン交換樹脂に対し吸着した成分を低〜高イオン強度の溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分、又は、それを更にゲルろ過して得られる画分が好ましい。
【００２２】
例えば、本発明の多糖組成物は、焙煎処理ゴマ種子由来の多糖画分については、前記エタノール沈殿画分を、担体として水で平衡化した陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、上記陰イオン交換樹脂に吸着された成分を、０．０８Ｍ  ＮａＣｌで溶出した後に、０．２１Ｍ  ＮａＣｌ、次いで０．３０Ｍ  ＮａＣｌで溶出して得られる各溶出画分、又は、得られた溶出画分を更に分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムに通液して得られる溶出液であって、該ゲルろ過ＨＰＬＣによる分析において、上述のピーク分子量の範囲の多糖成分が溶出する溶出容積に相当する画分を含むことが好ましい。本発明の多糖組成物は、非焙煎処理ゴマ種子由来の多糖画分については、前記エタノール沈殿画分を、担体として水で平衡化した陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、上記陰イオン交換樹脂に吸着された成分を、０．１５２Ｍ  ＮａＣｌで溶出して得た画分、又は、得られた溶出画分を更に分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムに通液し、得られた溶出液についての上記ゲルろ過ＨＰＬＣによる分析において、上述のピーク分子量の多糖成分が溶出する溶出容積に相当する画分を含むことが好ましい。
【００２３】
好ましくは、本発明の多糖組成物は、ゴマ種子及び／若しくはゴマ種子のゴマ油搾り粕からの水性溶媒抽出物、又は、ゴマ種子原体の水性溶媒抽出物のタンパク分解酵素消化液を含む原料をエタノール沈殿し、得られた沈殿から透析及び／又は膜処理により低分子量の物質を除去して得られる画分を含む組成物である。ゴマ種子について焙煎処理を行ったものを用いても良いし、焙煎処理を行っていないものを用いても良い。また、本発明の多糖組成物は、エタノール沈殿後に追加のタンパク分解酵素による消化を行い、その後、透析及び／又は限外ろ過を行い、よりタンパク含量を低下させたものを含んでいても良い。
【００２４】
本発明の多糖組成物は、パイエル板活性化作用を有することから、医薬組成物、特には、パイエル板活性化剤、腸管免疫亢進剤、又はパイエル板の活性化により治療又は予防される疾患又は障害の治療薬又は予防薬として使用することができる。すなわち、一態様において、本発明は、本発明の多糖組成物を有効成分として含有する医薬組成物又はパイエル板活性化剤に関する。本発明のパイエル板活性化剤はゴマ種子もしくはゴマ油搾り粕自体を有効成分として含有していても良い。また、腸管免疫亢進作用を通じて、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２やＩＬ−５が関与する疾患の予防や治療に用いることができる。また、本発明のパイエル板活性化剤は、パイエル板活性化用の食品組成物、食品添加物、飼料として使用することもできる。パイエル板の活性化により治療又は予防される疾患又は障害としては、感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、又はアレルギーを挙げることができる。ある疾患又は障害が、パイエル板の活性化により治療又は予防される疾患又は障害であるかどうかは、例えば、Ｓｐｉ−Ｂ遺伝子の発現抑制により増悪化するか、あるいは、ＲＡＮＫＬの投与により改善する疾患又は障害（Ｋａｎａｙａ  Ｔら，  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１２  Ｊｕｎ  １７；１３（８）：７２９−３６．）であれば、パイエル板の活性化により治療又は予防される疾患又は障害であるとして確認することができる。
【００２５】
本明細書において、「パイエル板活性化」とは、パイエル板における免疫調節機能を高めることを意味し、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（キラーＴ細胞）やＣＤ４陽性Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）の増殖及び活性化、ＮＫ細胞の増殖、分化、及び活性化、単球・マクロファージの活性化、抗ウイルス効果、ＮＫ細胞、ＣＴＬ及びマクロファージの細胞障害活性の増強、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の促進、Ｔｈ２細胞の抑制によるＩｇＥ抗体産生抑制、並びに／又は、Ｂ細胞の発生・分化促進作用を含む。
【００２６】
本発明の医薬組成物は，例えば，静脈内投与用，点滴剤などの形態の非経口投与用医薬組成物、又は経口投与用医薬組成物として調製することができる。本発明の医薬組成物は，薬理学的に許容される担体（製剤用添加物）を含有していてもよい。医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類，有効成分に対する製剤用添加物の割合，又は医薬組成物の製造方法は，組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、パイエル板活性化作用を有することから、例えば、腸管免疫亢進剤、腸管免疫調節剤、腸管感染症改善剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、ウイルス感染症改善剤、細菌感染症改善剤、糖尿病改善剤、肥満症改善剤、気分障害改善剤又はそれらの疾患の予防剤等として使用することもできる。
【００２８】
また、本発明の多糖組成物は、パイエル板活性化作用を有することから、食品組成物又は飼料として用いることができる。本発明の医薬組成物・パイエル板活性化剤・食品組成物・飼料の形状は特に限定されないが、液状又は粉末状でもよく、又は通常用いられる製剤用担体を使用し固形製剤若しくは液体製剤としてもよい。このようにして得られたパイエル板活性化剤は、液状又は粉末状で保存することができる。保存は、特に液状の場合、冷蔵保存が好ましい。
【００２９】
また、本発明の医薬組成物において、本発明のゴマ多糖は唯一の有効成分として含有されていても良いし、他の有効成分と共に含まれていても良い。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、新規なパイエル板活性化剤が提供される。本発明によれば、ゴマ種子から得られる多糖を有効成分として含有する剤を哺乳動物に投与（例えば、経口投与）することにより、例えば、パイエル板でのサイトカイン（例えば、骨随細胞増殖促進因子としてのＩＬ−２など）産生の亢進作用を奏することができる。これにより、例えば、腸管免疫亢進を通じて、生体防御や免疫寛容に関わる免疫機構を亢進させることが可能である。
【００３１】
また、本発明のパイエル板活性化剤は、古来よりヒトが食してきたゴマ種子に由来するものであるため、ヒト又はヒトが食用とする家畜若しくは家禽などの産業動物の健康を害することもなく、安全である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】試験例１におけるパイエル板活性化作用試験の結果を示すグラフである。
【図２】試験例１におけるパイエル板活性化作用試験の結果を示すグラフである。
【図３】試験例１におけるパイエル板活性化作用試験の結果を示すグラフである。
【図４】製造例１で行ったヘテログリカン（画分Ａ１）のカラムクロマトグラフィーにおける溶出パターンを示すグラフである。
【図５】製造例１で行ったヘテログリカン（画分Ｂ１）のカラムクロマトグラフィーにおける溶出パターンを示すグラフである。
【図６】製造例１で行ったヘテログリカン（画分Ｃ１）のカラムクロマトグラフィーにおける溶出パターンを示すグラフである。
【図７】製造例２で行ったヘテログリカン（画分Ｄ１）のカラムクロマトグラフィーにおける溶出パターンを示すグラフである。
【図８】試験例２におけるヘテログリカン画分の分子量分布を示すＨＰＳＥＣチャートである。
【図９】試験例２における非焙煎処理ゴマ種子ゴマ油搾り粕から得たヘテログリカン画分（画分Ｄ１）の分子量分布を示すＨＰＳＥＣチャートである。
【図１０】実施例１におけるヘテログリカン画分のパイエル板活性化作用試験の結果を示すグラフである。
【図１１】実施例１におけるヘテログリカン画分のパイエル板活性化作用試験の結果を示すグラフである。
【図１２】実施例２におけるＢＡＬＢ／ｃマウスへの経口投与によるパイエル板活性化作用試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
〔多糖の製造方法〕
【００３４】
＜ゴマ種子＞
ゴマは種子の外皮の色により、白ゴマ、茶胡麻、黒ゴマ、金ゴマの４種類に大きく分けられているが、本発明にはいずれの種類のゴマも用いることができる。また、ゴマの原産地はアフリカであるが、現在では世界中で栽培されている。主要産地はアフリカ以外にミャンマー、インド、中国、メキシコ、パラグアイ、ボリビアなどで、本発明にはいずれの産地のゴマ種子も用いることができる。
【００３５】
＜焙煎＞
ゴマ油特有の色、香りを醸し出し、風味を向上させることを目的にゴマ種子を加熱することを焙煎という。加熱する種子の温度としては一般に品温１６０〜２１０℃で行うが、これに限定されるものではない。
【００３６】
＜ゴマ油搾り粕＞
ゴマ種子からゴマ油を搾った後に残る搾り粕（ゴマ油搾り粕）は、次の方法により得られる。ゴマ油の製造法には圧搾法と抽出法が用いられている。前者は生のゴマもしくは焙煎したゴマ種子を圧搾してゴマ油を製造する方法である。一方、抽出法はヘキサンなどの有機溶剤を用い、ゴマ種子を処理することにより種子の油分を抽出する方法である。これらのいずれの方法により得られたゴマ油搾り粕にもパイエル板活性化多糖体が含まれることから、本明細書におけるゴマ油搾り粕は、いずれの製造法を用いても製造することができる。
【００３７】
＜水性溶媒抽出物＞
焙煎処理若しくは非焙煎のゴマ若しくはゴマ油搾り粕の水性溶媒抽出物は、室温や冷温の水で抽出できる。好ましいのは、焙煎処理若しくは非焙煎のゴマ若しくはゴマ油搾り粕を水中で約半量になるまで直火で煎出することにより、より効率的に得ることができる。よって、本明細書における水性溶媒抽出物は、冷水もしくは熱水抽出物である。煎出液は、必要に応じてろ紙等を用いてろ過することにより、不溶性の固形成分を除去することができる。また、必要に応じて更に、減圧濃縮して用いてもよい。
【００３８】
＜タンパク質分解酵素処理＞
本明細書の水性溶媒抽出物又はエタノール沈殿画分のタンパク質分解酵素処理は、緩衝液（ｐＨ８．０）中、タンパク分解酵素（例えば、アクチナーゼＥ）を添加して３７°Ｃで１〜７日間インキュベートすることにより行うことができる。必要に応じて、更に、タンパク質分解酵素処理後のサンプルを沸騰水浴中で５分間加熱後、氷水中で急冷し、精製水を用いて透析（３〜１７日間）を行って精製してもよい。
【００３９】
＜エタノール沈殿画分＞
本発明のエタノール沈殿画分は、焙煎処理若しくは非焙煎のゴマ種子若しくはゴマ油搾り粕の水性溶媒抽出物、又はそのタンパク分解酵素処理液を、エタノール沈殿することにより得ることができる。得られた沈殿は、必要に応じて、更に透析及び／又は膜処理により低分子量の物質を除去して精製してもよい。エタノール沈殿画分について、上述のタンパク分解酵素による処理を行い、必要に応じて、透析及び／又は膜処理による精製を行うことで、よりタンパク含量を低下させることもできる。エタノール沈殿画分の収率は、例えばゴマ種子のゴマ油搾り粕を用いた場合、ゴマ油搾り粕を基準として通常約５質量％程度である。エタノール沈殿画分には、多糖に加え、リグニンなどのポリフェノール、塩類などの成分が含まれる。
【００４０】
＜透析／膜処理＞
透析には、一般に脱塩に用いられる透析膜を用いることができる。また、膜処理には、脱塩及び単糖類除去などに用いられるＵＦ膜を用いることができる。
【００４１】
＜焙煎処理若しくは非焙煎のゴマ種子若しくはゴマ油搾り粕から得られる多糖＞
焙煎処理若しくは非焙煎のゴマ種子若しくはゴマ油搾り粕から得られる多糖（以下、「ゴマ多糖」という）は、以下の方法により製造（精製）することにより得られる。
ゴマ多糖の製造には、ゴマ種子若しくはゴマ油搾り粕の水性溶媒抽出液、そのタンパク質分解処理液、若しくはそれらのエタノール沈殿画分を用いることができるが、エタノール沈殿画分を用いることが好ましい。よって、以下、エタノール沈殿画分を用いる場合を例にとり、ゴマ多糖の精製方法を説明する。
【００４２】
上述の方法により得られたエタノール沈殿画分を、担体として陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、成分を吸着させる。陰イオン交換樹脂としては弱イオン交換樹脂が好ましい。例えば、ＤＥＡＥ基を有する樹脂を用いることができる。このような担体を備えるカラムの具体例としては、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＦＦ）等を挙げることができる。これらの樹脂担体は、水で平衡化しておくことが好ましい。例えば、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの場合、２Ｍの塩化ナトリウムに浸漬することによりＤＥＡＥ基を活性化させ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに共有結合させた３級アミノ基にカウンターイオンの塩素イオンを結合させる、すなわちＣｌ−型にする）、次いで水で洗浄することにより残存する塩化ナトリウムを除去した後、水での懸濁状態（水で平衡化）にする。
【００４３】
次に、上記担体に吸着された成分を段階的にイオン強度が高くなるように溶出溶媒を通液し、溶出する。溶出溶媒としては、ＮａＣｌ、ＮＨ４ＨＣＯ３又はＨＣＯＯＮＨ４など、陰イオンの塩を溶解した水溶液を用いることが好ましい。
【００４４】
ゴマ多糖は、低〜高イオン強度の溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分からヘテログリカン画分として得ることができる。低イオン強度の溶出溶媒としては、例えば、陰イオンとしてＣｌ−を用いた場合、当該陰イオンの濃度が５０〜１００ｍＭである溶出溶媒を用いることができ、７０ｍＭ〜８０ｍＭである溶出溶媒がより好ましい。また、中イオン強度の溶出溶媒としては、当該陰イオンの濃度が１５０ｍＭから２５０ｍＭである溶出溶媒を用いることができ、１５０ｍＭ〜２１０ｍＭである溶出溶媒がより好ましい。さらに、高イオン強度の溶出溶媒としては、当該陰イオンの濃度が２５０ｍＭから３５０ｍＭである溶出溶媒を用いることができ、２９０ｍＭ〜３１０ｍＭである溶出溶媒がより好ましい。例えば焙煎処理ゴマ種子由来のゴマ多糖を含有するヘテログリカン画分は、７０ｍＭ〜８０ｍＭの溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分（画分Ａ）と、１９０ｍＭ〜２１０ｍＭである溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分（画分Ｂ）と、２９０ｍＭ〜３１０ｍＭである溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分（画分Ｃ）とに分けて精製した後、これらを組み合わせて用いることもできる。また、非焙煎ゴマ種子由来のゴマ多糖画分は１４０〜１６０ｍＭの溶出溶媒での溶出法にて得られる画分（画分Ｄ）を用いることができる。
【００４５】
あるいは、陰イオン交換体を用いて、まず、水を用いて溶出させることで中性成分を除去後、３１０ｍＭ以上のイオン強度の溶出溶媒を用いて溶出させることで、酸性画分として一括したゴマ多糖を含有するヘテログリカン画分を調製することもできる。
【００４６】
得られた溶出画分は、必要に応じて、透析膜（例えば、Ｖｉｓｋｉｎｇ  ｔｕｂｅ、ＭＷＣＯ  １２，０００〜１４，０００）を用いて透析した後、透析内液を凍結乾燥してから次の工程に用いてもよい。
【００４７】
また、本発明のゴマ多糖は、必要に応じて、上記溶出画分をゲルろ過カラムを用いて分子量により分画したヘテログリカン画分として得てもよい。例えば、画分Ａについて、分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムを用い、ゲルろ過ＨＰＬＣによる分析でピーク分子量が６１，０００から２６，０００を示すピークが流出する画分（画分Ａ１）を得てもよい。また、画分Ｂについて、分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムを用い、ゲルろ過ＨＰＬＣによる分析でピーク分子量が３３，０００を示すピークが流出する画分（画分Ｂ１）を回収してもよい。また、画分Ｃについて、例えば、分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムを用い、ゲルろ過ＨＰＬＣによる分析でピーク分子量が２２０，０００を示すピークが流出する画分を除去し、ピーク分子量が１６，０００を示すピークが溶出する画分（画分Ｃ１）を回収してもよい。あるいは、ゲルろ過の際の溶出画分について、糖、ウロン酸及び２８０ｎｍでのＵＶ吸収に基づいて溶出パターンを作成し、上記画分Ａ及び画分Ｂの当該分子量画分（画分Ａ１及び画分Ｂ１）を回収しても良い。また、同様の操作により上記画分Ｃの当該分子量画分（画分Ｃ１）を回収してもよい。また、画分Ｄについて、例えば、分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムを用い、ゲルろ過ＨＰＬＣによる分析でピーク分子量が２，０００，０００から３００，０００を示すピークが流出する画分（排斥限界溶出画分、画分Ｄ１）を回収してもよい。
【００４８】
分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムとしては、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２等を用いることができる。
【００４９】
本発明のゴマ多糖としては、画分Ａ、画分Ｂ、画分Ｃ、及び画分Ｄからゲルろ過して得られたそれぞれの画分（画分Ａ１、画分Ｂ１、画分Ｃ１、及び画分Ｄ１）を個々に用いることができ、または、これらを組み合わせて用いることもできる。得られたヘテログリカン画分は更に常法に従い透析した後、凍結乾燥してもよい。
【００５０】
〔医薬組成物・パイエル板活性化剤・食品組成物・飼料〕
本発明の医薬組成物・パイエル板活性化剤・食品組成物・飼料が固形製剤である場合、例えば有効成分である本発明のゴマ多糖、又はゴマ種子もしくはゴマ油搾り粕にデキストリン、コーンスターチ又は脱脂米糠を混和し調製してもよい。これらの製剤化の方法は公知である。
【００５１】
本発明の医薬組成物・パイエル板活性化剤の投与時期は、特に限定されない。本発明のパイエル板活性化剤の投与量は、製剤形態、対象とするヒトや非ヒト動物の種類、健康状態、年齢や成長の度合いなどにより異なるため、特に限定されない。例えば、有効成分である上記多糖に換算して体重１ｋｇ当たり１日に１〜１，０００ｍｇを投与することができる。
【００５２】
本発明の医薬組成物・パイエル板活性化剤の投与形態は特に限定されないが、例えば経口、経腸及び経鼻の方法で投与することができる。また、口腔内に貯留しやすい形状（チューインガムなども含む）にて投与することもできる。
【００５３】
投与される対象は、哺乳動物であれば特に限定されないが、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマを含み、好ましくは、ヒトである。
【００５４】
一態様において、本発明は、パイエル板活性化剤、又は、パイエル板の活性化により治療若しくは予防される疾患の治療薬若しくは予防薬の製造のための、本発明のゴマ多糖の使用に関する。別の態様において本発明は、パイエル板の活性化のための本発明のゴマ多糖、あるいは、医薬（好ましくは、パイエル板の活性化により治療若しくは予防される疾患の治療薬若しくは予防薬）として使用するための本発明のゴマ多糖に関する。更に別の態様において、本発明は、有効量の本発明のゴマ多糖をそれを必要とする対象に投与することを含む、パイエル板の活性化方法又はパイエル板の活性化により治療若しくは予防される疾患の治療方法若しくは予防方法に関する。あるいは、本発明は、本発明のゴマ多糖のパイエル板を活性化するための使用に関する。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００５６】
＜統計学的検定＞
実施例における全ての結果はｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では平均値±Ｓ．Ｄ．、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では平均値±Ｓ．Ｅ．で示した。対照及び被験試料間の統計学的有意差は、ＡＮＯＶＡの検定後、ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤにより検定した。
【００５７】
〔試験例１：ゴマ種子由来の水性溶媒エキスのエタノール沈殿画分によるパイエル板活性化作用試験〕
（１）焙煎処理ゴマ種子からのエタノール沈殿画分の調製
異なる焙煎条件で処理した白ゴマ種子（薄口ゴマ、濃口ゴマ）及び黒ゴマ種子のゴマ油搾り粕（各１０ｇ）を１００ｍＬの精製水を用いて約半量になるまで直火で煎出した。煎出液をガラス繊維ろ紙を用いて吸引ろ過後、５０ｍＬにまで減圧濃縮し、撹拌しながら４倍量のエタノール（２００ｍＬ）を加え、ひと晩室温にて撹拌した。得られた沈殿を遠心分離（６、０００ｒｐｍ、４°Ｃ、３０分間）により分取後、精製水を用いて７日間透析した。得られた透析内液について不溶物を遠心分離（６、０００ｒｐｍ、４°Ｃ、３０分間）により除去後、凍結乾燥することによりエタノール沈殿画分を得た。薄口ゴマからは０．４２ｇ（収率：４．２％）、濃口ゴマからは０．３８ｇ（収率：３．８％）、及び、黒ゴマからは０．４ｇ（収率：４．０％）のエタノール沈殿画分が得られた。
【００５８】
（２）非焙煎処理ゴマ種子からのエタノール沈殿画分の調製
非焙煎処理の白ゴマ種子ゴマ油搾り粕（１００ｇ）に精製水（２Ｌ）を加えて、半量になるまで直火で煎出し、吸引ろ過により残渣を除去した。残渣について精製水（１Ｌ）を用いて同様の方法により再度煎出液を調製後、先の煎出液と併せて５００ｍＬになるまで減圧濃縮した。本煎出液に４倍量のエタノールを撹拌しながら加え、室温にて一晩撹拌した。生じた沈殿を遠心分離（６、０００ｒｐｍ、４℃、３０分間）により分取し、得られた沈殿を流水及び精製水にて透析後（７日間）、非透析性画分について不溶物を遠心分離（６、０００ｒｐｍ、４°Ｃ、３０分間）により除去して、凍結乾燥することによりエタノール沈殿画分（収量：２．８２ｇ、収率：２．８％）を得た。
【００５９】
（３）非焙煎処理ゴマ種子からのエタノール沈殿画分のタンパク分解酵素消化
上記（２）で得た非焙煎処理ゴマ種子ゴマ油搾り粕からのエタノール沈殿画分（１０３ｍｇ）を１０ｍＭ塩化カリウム及び０．０５％アジ化ナトリウム含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解後、タンパク分解酵素（アクチナーゼＥ、科研製薬製）５ｍｇを加えて３７°Ｃにて３日間インキュベートすることにより酵素消化を行った。消化液を沸騰水浴中で５分間加熱後、氷水中で急冷し、精製水を用いて透析（７日間）を行った。非透析性画分を凍結乾燥することによりアクチナーゼＥ処理エタノール沈殿画分（収量：３２．７ｍｇ、収率：３１．５％）を得た。
【００６０】
（４）糖鎖分解エタノール沈殿画分の調製
上記（１）で得られた焙煎処理ゴマ種子（薄口ゴマ）のゴマ油搾り粕から調製したエタノール沈殿画分（２０ｍｇ）を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５、１２ｍＬ）に溶解後、１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムを含む前記酢酸緩衝液（４ｍＬ）を加え、４°Ｃ、暗所で９６時間撹拌し過ヨウ素酸酸化を行った。反応溶液にエチレングリコール（０．４ｍＬ）を加えて室温で１時間撹拌し、過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを分解させた。次いで、反応混合物について精製水を用いて２日間透析し、透析内液を約半量まで減圧濃縮した。さらに、水素化ホウ素ナトリウム（２５０ｍｇ）を加えて室内で１２時間撹拌後、酢酸を滴下することで中和した。さらに精製水を用いて本反応液を７日間透析後、透析内液を凍結乾燥することにより糖鎖分解エタノール沈殿画分を得た。（収量：１１．４ｍｇ、収率：５６．５％）。
【００６１】
（５）脱リグニン化エタノール沈殿画分の調製
上記（１）で得られた焙煎処理ゴマ種子（薄口ゴマ）のゴマ油搾り粕から調製したエタノール沈殿画分（２０ｍｇ）を４％酢酸水溶液（２０ｍＬ）に溶解後、亜塩素酸（１００ｍｇ）を加えて、７０°Ｃの水浴中で溶液の色調が変化するまで（約１０分間程度）撹拌した。反応液を氷冷下３Ｍ水酸化ナトリウムを用いて中和した後、精製水を用いて本反応液を４日間透析し、非透析性画分を凍結乾燥することにより脱リグニン化エタノール沈殿画分を得た（収量：１２．７ｍｇ、収率：６３．５％）。
【００６２】
（６）マウスパイエル板細胞の調製及び培養
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスをイソフルラン（エスカイン吸入麻酔薬、マイラン製薬）を用いて安楽死後、眼科用ハサミを用いて小腸よりパイエル板を切り出した。このパイエル板を氷冷した５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２ｍＬ）を加えた滅菌シャーレにとり、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）上で５ｍＬのディスポーサブル注射器の内筒のゴムラバー部を用いて圧砕することでパイエル板細胞を遊離させた。遊離細胞の懸濁液を５０ｍＬファルコンチューブに移し、ボルテックスミキサーで短時間撹拌した。その後、細胞懸濁液をステンレスメッシュ（１５０ｍｅｓｈ）によりろ過後、遠心分離（１、５００ｒｐｍ、４℃、７分間）し、培地をデカンテーションすることによりパイエル板細胞を得た。得られた細胞についてＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｍＬ）を用いて計４回同様の操作を繰り返すことにより細胞を洗浄後、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）によりろ過した。この細胞懸濁液（２０μＬ）を用いてセルカウンターで細胞数を計数後、ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて１〜２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのパイエル板細胞懸濁液を調製した。
【００６３】
得られたパイエル板細胞懸濁液（１８０μＬ／ｗｅｌｌ）及びエタノール沈殿画分溶液等（多糖試料溶液）（２０μＬ／ｗｅｌｌ、エタノール沈殿画分終濃度：〜１００μｇ／ｍＬ）を９６穴培養プレート（３０７２、ＦＡＬＣＯＮ）に添加し、５％ＣＯ２−９５％空気下、３７℃で２〜６日間培養した。培養上清を別の９６穴培養プレートに移し、−２０℃にて使用まで保存した。エタノール沈殿画分溶液等の代わりに注射用水（２０μＬ／ｗｅｌｌ）を加えて培養することにより得た培養上清を対照として用いた。
【００６４】
（７）マウス骨髄細胞の調製
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（７週齢、雌）はイソフルランを用いて安楽死後、大腿骨を摘出し、２３Ｇ注射針を装着した５ｍＬ注射器を用いてＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（５ｍＬ）により骨髄細胞を大腿骨から押しだすことにより採取した。得られた骨髄細胞をボルテックスミキサーにより分散後、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）でろ過し、次いで遠心分離（１、２００ｒｐｍ、４℃、７分間）を行うことにより骨髄細胞を回収した。同様の操作を３回繰り返し細胞を洗浄後、骨髄細胞をＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｍＬ）に懸濁し、セルカウンターで細胞数を計数後、ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて骨髄細胞懸濁液（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を調製した。
【００６５】
（８）パイエル板活性化作用試験
９６穴培養プレートにパイエル板細胞培養上清（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、骨髄細胞懸濁液（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１００μＬ／ｗｅｌｌ）、及びＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加えて、５％ＣＯ２−９５％空気下、３７℃にて６日間培養した。培養した骨髄細胞培養懸濁液にＡｌａｍｅｒ  Ｂｌｕｅ（２０μＬ／ｗｅｌｌ、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を添加し、５％ＣＯ２−９５％空気下、３７℃で６〜２４時間培養後、生じた蛍光物質量を蛍光プレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００、Ｔｅｃａｎ、励起波長：５４４ｎｍ、測定波長：５９０ｎｍ）にて測定し、得られた相対蛍光強度としての増殖骨髄細胞数を骨髄細胞増殖促進因子量とした。
【００６６】
（９）結果
図１に、焙煎処理ゴマ種子のゴマ油搾り粕から調製したエタノール沈殿画分のパイエル板活性化作用試験の結果を示す。骨髄細胞増殖促進因子量をパイエル板活性化作用として示した。異なる焙煎条件で処置した白ゴマ種子（薄口ゴマ、濃口ゴマ）のゴマ油搾り粕由来のエタノール沈殿画分には、いずれもパイエル板活性化作用が認められた。また、非焙煎処理の黒ゴマ種子のゴマ油搾り粕から調製したエタノール沈殿画分についても上記の焙煎処理白ゴマ由来のエタノール沈殿画分と同等のパイエル板活性化作用が認められた（図１）。
【００６７】
さらに、焙煎処理を行っていない白ゴマのゴマ油搾り粕から調製したエタノール沈殿画分は、タンパク分解酵素（アクチナーゼＥ）によりタンパク含量を低下させることによりパイエル板活性化作用が認められたが、アクチナーゼＥ未処理のエタノール沈殿画分では有意なパイエル板活性化作用は認められなかった（図２）。
【００６８】
一方、焙煎処理薄口ゴマのゴマ油搾り粕から調製したエタノール沈殿画分について、過ヨウ素酸酸化によりその糖鎖を分解したもの（図３中、「糖鎖分解」）では糖鎖分解前のエタノール画分と比較し、対照と有意差がないレベルまで活性が激減した（図３）。また、同エタノール沈殿画分を亜塩素酸処理により脱リグニン化したものでは未処理エタノール沈殿画分に比べ活性は低下したが、有意な活性が認められた（図３中、「脱リグニン化」）。この結果、ゴマ種子由来エキス中のエタノール沈殿画分の多糖含有成分にパイエル板活性化作用を示す物質が含まれることが示唆された。
【００６９】
〔製造例１：焙煎処理ゴマ種子からのヘテログリカン画分の調製〕
（１）エタノール沈殿画分の調製
焙煎処理ゴマ種子（薄口ゴマ）のゴマ油搾り粕２００ｇを精製水（４Ｌ）を用いて液量が約半量になるまで煎出した。残渣は再び同量の精製水を用いて煎出し、抽出液を合わせて遠心分離（６、０００ｒｐｍ、４℃、３０分間）により分取し吸引ろ過後、ろ液を合わせて５００ｍＬまで減圧濃縮した。本抽出液に撹拌しながら４倍量のエタノールを加え、室温にて一晩撹拌した。生じた沈殿を遠心分離（６、０００ｒｐｍ、４°Ｃ、３０分間）により分取し、水に再溶解後、水道水を用いて４日間、次いで精製水を用いて７日間透析を行った。得られた透析内液を遠心分離（６、０００ｒｐｍ、４°Ｃ、３０分間）することにより、不溶解物を除去後、凍結乾燥することによりエタノール沈殿画分を得た（収量：１０．５２ｇ、収率：５．３％）。
【００７０】
（２）ヘテログリカン画分の調製
薄口ゴマエタノール沈殿画分（２．０ｇ）を精製水３００ｍＬに溶解後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｃｌ−型）カラム（５．０×３８．５ｃｍ）に添加し、精製水を用いて洗浄し中性多糖画分を除去した。吸着画分は、０．０７７６Ｍ食塩水（１．７Ｌ、画分Ａ）、０．２０６７Ｍ食塩水（１．４Ｌ、画分Ｂ）、次いで０．３０３５Ｍ食塩水（０．９Ｌ、画分Ｃ）で順次溶出し、吸着画分を得た。各画分は透析膜（排斥限界：１２、０００−１４、０００）を用いて透析後、透析内液を凍結乾燥し、画分Ａ（収量：１３５．８ｍｇ、収率：６．７９％）、画分Ｂ（収量：４３７．２３ｍｇ、収率：２１．９％）、及び画分Ｃ（収量：１７４．７５ｍｇ、収率：８．７％）を得た。
【００７１】
（３）ヘテログリカンの精製
得られた画分Ａを０．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００（２．６ｉ．ｄ．×９０ｃｍ）により分画し、図４において「画分Ａ１」で示される画分を主要画分として回収した（収量：０．１１ｇ、収率：０．５％）。また、（２）で得られた画分Ｂを０．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００（２．６ｉ．ｄ．×９０ｃｍ）により分画し、図５において「画分Ｂ１」で示される画分を主要画分として回収した（収量：０．１４ｇ、収率：６．９％）。同様に、（２）で得られた画分Ｃを０．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００（２．６ｉ．ｄ．×９０ｃｍ）により分画し、図６において「画分Ｃ１」で示される画分を、Ｖｏ溶出画分を除く主要画分として回収した（収量：０．１３ｇ、収率：６．６％）。
【００７２】
〔製造例２：非焙煎処理ゴマ種子からのヘテログリカン画分の調製〕
（１）エタノール沈殿画分の調製
非焙煎処理白ゴマ種子のゴマ油搾り粕（１００ｇ）を精製水（２Ｌ）を用いて液量が約半量になるまで煎出し、抽出液を５００ｍＬまで減圧濃縮後、本抽出液を撹拌しながら４倍量のエタノール（２Ｌ）を加え、室温にて一晩撹拌した。生じた沈殿を遠心分離（６、０００ｒｐｍ、４℃、３０分間）により分取し、精製水を用いて７日間透析を行った。得られた透析内液を濃縮し、凍結乾燥することにより非焙煎処理白ゴマ種子ゴマ油搾り粕由来のエタノール沈殿画分（収量：２．８ｇ、収率：２．８％）を得た。
【００７３】
非焙煎処理白ゴマ種子ゴマ油搾り粕由来のエタノール沈殿画分（２．８２ｇ）を０．０５％ＮａＮ３／１０ｍＭ  ＣａＣｌ２含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（２８２ｍＬ）にて溶解後、Ａｃｔｉｎａｓｅ  Ｅ（１４１ｍｇ、科研製薬）を加え、３７℃にて３日間酵素消化を行った。酵素反応液について濃塩酸を用いて中和後、沸騰水浴中で５分間加熱し、酵素を失活させた。さらに精製水を用いて７日間透析、凍結乾燥することにより除タンパクエタノール沈殿画分を得た（収量：７５１．１ｍｇ、収率：２６．６％）。
【００７４】
（２）ヘテログリカン画分の調製
得られた非焙煎処理白ゴマ種子ゴマ油搾り粕由来の除タンパク質エタノール沈殿画分（１３３．５２ｍｇ）を精製水５０ｍＬで溶解後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｃｌ−型）カラム（２．４×２７ｃｍ）に添加し、未吸着画分（収量：１９．０ｍｇ、収率：１４．３％）を得た後、吸着画分を０．１５２２Ｍ  ＮａＣｌ（２Ｌ）を用いて溶出させ、透析後、透析内液を凍結乾燥し画分Ｄを得た（収量：８２．９ｍｇ、収率：６２．１％）。
【００７５】
（３）ヘテログリカンの精製
非焙煎処理白ゴマ種子由来の除タンパク質エタノール沈殿画分より得た画分Ｄ（８２．９ｍｇ）を０．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００（２．６ｉ．ｄ．×９０ｃｍ）により分画し、図７において「画分Ｄ１」で示される画分を、主要画分であるＶｏ溶出画分として得た（収量：４０．２ｍｇ、収率：５５．４％）。
【００７６】
〔試験例２：ヘテログリカンの分析〕
（１）分子量分布の測定
製造例１及び製造例２において得られたヘテログリカン画分の分子量分布を、Ａｓａｈｉ−ｐａｋ  ＧＳ５２０ＨＱ及びＡｓａｈｉ−ｐａｋ  ＧＳ３２０ＨＱ（各０．７５  ｉ．ｄ．×３０ｃｍ）（昭和電工）の連結カラム、又は、Ａｓａｈｉ−ｐａｋ  ＧＳ６２０ＨＱ（０．７５  ｉ．ｄ．×３０ｃｍ）を用いた高速ゲルろ過クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により分析した。分子量は、標準多糖（ｐｕｌｌｕｌａｎ  Ｐ−１６００、Ｐ−８００、４００、２００、１００、５０、２０、１０及び５、昭和電工）のＨＰＳＥＣでの保持時間より分子量対保持時間係数（Ｋａｖ）の検量線を作成し、被験試料の保持時間から算出した。
ＨＰＳＥＣの条件は以下の通りである。
送液装置；ＪＡＳＣＯ  ＰＶ−９８０（日本分光）
検出器；Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ  ＳＥ−６２（昭和電工）（感度：×２）
溶出液；０．２Ｍ  ＮａＣｌ（０．８−１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
【００７７】
（２）比色定量
全糖量はフェノール−Ｈ２ＳＯ４法、ウロン酸量はｍ−ヒドロキシビフェニル法、タンパク質量はブラッドフォード法を用いて測定した。標品としては、フェノール−Ｈ２ＳＯ４法にはガラクトースを、ｍ−ヒドロキシビフェニル法にはガラクツロン酸を、ブラッドフォード法はウシガンマグロブリン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。
【００７８】
（３）β−Ｄ−（１→３、６）−ｇａｌａｃｔａｎ含量の測定
ヘテログリカン（画分Ａ１、Ｂ１及びＣ１）中のβ−Ｄ−（１→３、６）−ガラクタン含量はＨｏｌｓｔ及びＣｌａｒｋｅにより報告されたβ−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原を用いた一元ゲル拡散法を用いて測定した。
１％アガロース、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、及び１０μｇ／ｍＬのβ−グルコシル−ヤリブ抗原（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を含むアガロースゲル（７ｍＬ）を７．６×５．１ｃｍのスライドグラス上に重層後、モイスチャーチャンバー内で冷却し、固化させた。ゲルに直径約２ｍｍの穴を作成後、ヘテグリカン試料水溶液（１ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ）を加え、モイスチャーチャンバー内で室温にて１晩インキュベーションした。ゲルをろ紙を用いて乾固させ、生じた赤色沈降リングの直径を計測した。標準β−Ｄ−（１→３、６）−ガラクタンとしてアカシアアラビノガラクタン（１０μｇ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を用いて同様の操作を行い、β−Ｄ−（１→３、６）−ガラクタン（１０μｇ）にて形成される赤色沈降リングの直径を計測した。検量線は標準β−Ｄ−（１→３、６）−ガラクタンにより形成された赤色沈降リング直径の２乗値とβ−Ｄ−（１→３、６）−ガラクタン量（１０μｇ）から作成し、被検ヘテログリカン中のβ−Ｄ−（１→３、６）−ガラクタン量を算出した。
【００７９】
（４）糖鎖分解酵素消化
（エキソ−β−Ｄ−（１→３）−ガラクタナーゼ消化）
ヘテログリカン（画分Ａ１、Ｂ１又はＣ１）（３００μｇ）の２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）溶液（３００μＬ）にエキソ−α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（２μＬ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ）とともに、Ｔｒｕｍｕｒａｙａらの方法（Ｔｓｕｍｕｒａｙａ，  Ｙ．，  Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，  Ｎ．，  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｙ．，  Ｋｏｖａｋ，  Ｐ．，  １９９０．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｏ−β−（１→３）−Ｄ−ｇａｌａｃｔａｎａｓｅ  ｏｆ  Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ  （Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｔｕｌｉｐｉｆｅｒａｅ）  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５）によりドリセラーゼ（協和発酵バイオ）から精製したエキソ−β−Ｄ−（１→３）−ガラクタナーゼ（２μＬ）を加え、３７°Ｃ、２４時間の条件で酵素反応を行った。消化物について沸騰水浴中３０秒間加熱処理し、酵素を失活させ、使用まで−２０°Ｃにて保存した。
【００８０】
（エンド−β−Ｄ−（１→４）−ガラクタナーゼ消化）
ヘテログリカン（３００μｇ）の２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）溶液（３００μＬ）にエンド−β−Ｄ−（１→４）−ガラクタナーゼ（２μＬ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を加え、３７°Ｃ、２４時間の条件で酵素反応を行った。消化物について沸騰水浴中３０秒間加熱処理し、酵素を失活させ、使用まで−２０°Ｃにて保存した。
【００８１】
（５）構成糖分析
構成糖分析は、ＴＭＳメチルグリコシド法により行った。
単糖の標準品混合物（Ｇｌｃ、Ｇａｌ、ＧｌｃＡ、ＧａｌＡ、Ａｒａ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎ、Ｒｈａ、各５μｇ）及び被験試料（各５０〜１００μｇ）を１３ｍｍネジ口試験管に分取し、さらにｍｙｏ−イノシトール（内部標準：２０μｇ）を加えた。各試験管に１Ｍ  ＨＣｌ−ＭｅＯＨ溶液（１００〜３００μＬ、和光純薬）を加え、密封下メタノリシス（８０℃、１５時間）を行った。反応溶液にｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ（５μＬ）を加え窒素気流下（４０℃）で溶媒を留去した後、Ｔｒｉ−Ｓｉｌ試薬（１００μＬ、Ｐｉｅｒｃｅ）を加えて密封下反応（８０℃、２０分間）させた。試薬を窒素気流下（４０℃）で留去した後、反応生成物にヘキサン（２ｍＬ）を加え数秒間超音波処理することによりＴＭＳ誘導体を抽出した。抽出物中の不溶物を遠心分離（２、０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により除去後、溶媒を窒素気流下（４０℃）で留去し、得られたＴＭＳ誘導体のヘキサン溶液をガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）により分析した。各単糖誘導体の同定は標準品の誘導体の保持時間との比較から行い、含有率比（ｍｏｌ．％）はピーク面積と各実験毎に得られる各単糖誘導体のＦＩＤ検出器に対する応答係数から算出した。
ＧＬＣの条件は以下の通りである。
機器：ＨＰ５８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）
カラム：ＤＢ−１  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎ（０．２５ｍｍ  ｉ．ｄ．×３０ｍ、液膜厚０．２５μｍ、Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）
キャリアガス：Ｈｅ（総流量：８０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム入口圧：２１ｐｓｉ、ガス純度：９９．９９９９％）
注入口温度：２５０℃
検出器温度：２８０℃
オーブン温度プログラム：６０℃（１分間）、６０℃→１７０℃（３０℃／ｍｉｎ）、１７０℃→１９０℃（１℃／ｍｉｎ）、１９０℃→３００℃（３０℃／ｍｉｎ）、３００℃（５分間）
【００８２】
（６）メチル化分析
糖結合様式解析のためのメチル化分析は以下に示すように箱守法とＷａｅｇｈｅ等の方法を改変した方法に従って行った。
【００８３】
（メチルスルフィニルカルバニオンナトリウムを用いる多糖のメチル化）
被験試料（５００μｇ）をネジ口試験管（１５ｉ．ｄ．×１００ｍｍ）にとり、一晩デシケーター中で減圧乾燥させた後、無水ジメチルスルホキシド（ｄｒｙ  ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）を加え、窒素気流下密封条件で１５分間超音波処理し、試料が完全に溶解するまで（数時間〜一昼夜）５０〜６０℃で加温した。試料溶液に常法にて自製調製したメチルスルフィニルカルバニオンナトリウム（５００μＬ）を加え、窒素気流下１時間超音波処理を行った後、３時間室温で反応させた。反応後、少量の反応液（５〜１０μＬ）を用い、トリフェニルメタン試薬（和光純薬）により、過剰のメチルスルフィニルカルバニオンナトリウムの残存を確認した。メチルスルフィニルカルバニオンナトリウムが不十分の場合、さらにメチルスルフィニルカルバニオンナトリウムを追加し、上記操作をメチルスルフィニルカルバニオンナトリウムの過剰量が残存するまで繰り返した。反応混合液を凍結後に、ＣＨ３Ｉ（ヨードメタン、柳島製薬株式会社、特級、１ｍＬ）を加え、窒素気流下で密封条件にて１５分間超音波処理を行い、室温で４時間以上反応させた。反応終了後、反応液中のＣＨ３Ｉを減圧留去し、氷冷下凍結させ、使用したジメチルスルホキシド及びメチルスルフィニルカルバニオンの総容量と等容量の精製水を加え、残存するメチルスルフィニルカルバニオンを分解し、反応を停止させた。さらに、反応液にその黄色が消えるまで飽和チオ硫酸ナトリウム（約２５０μＬ〜）を加えた。
【００８４】
（完全メチル化多糖の回収）
Ｓｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（１ｍＬ、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅ  Ｉｎｃ．）を蒸留エタノール（１０ｍＬ×４回）、次いで水（２ｍＬ×３回）を用いて洗浄後、上記メチル化反応混合液を本カートリッジへ通過させ、メチル化多糖をカートリッジに吸着させた。カートリッジを５０％ジメチルスルホキシド（２ｍＬ×５回）、次いで水（２ｍＬ×５回）により洗浄後、蒸留エタノール（２ｍＬ×３回）を用いてメチル化多糖を溶出後、減圧乾固することにより完全メチル化多糖を得た。
【００８５】
（メチル化多糖中のウロン酸のカルボキシル基の還元）
完全メチル化多糖中のウロン酸残基のカルボキシルメチルエステル基は以下に示した方法により、重水素化一級アルコールに還元した。すなわち、完全メチル化多糖試料を９５％エタノール（０．２１ｍＬ）及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、０．５１ｍＬ）で溶解後、重水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＤ４、１．８ｍｇ）を加えて混和した後１８時間以上室温で反応させ、さらに７０°Ｃで１時間加温させることによりカルボキシメチルエステル基を還元した。反応液を酢酸を用いて中和し、さらに７〜８滴の酢酸を加えて反応を停止させた。反応溶液を減圧乾固後、生成したホウ酸を除去するため、反応生成物に蒸留メタノール（１ｍＬ）を加えて減圧乾固する操作を少なくとも４回繰り返した。本反応混合物の５０％ジメチルスルホキシド溶液について、（完全メチル化多糖の回収）欄に記載した方法と同様の操作によりカルボキシル還元完全メチル化多糖を回収した。
【００８６】
（完全メチル化多糖から部分メチル化アルジトールアセテート体への誘導体化と分析）
得られたカルボキシル還元完全メチル化多糖をネジ口試験管（１５ｉ．ｄ．×１００ｍｍ）中、２Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１ｍＬ）を用いて密封下１２１℃で１時間加熱することにより加水分解を行った。反応終了後、室温に冷却した反応溶液を減圧乾固し、さらにデシケーターで３０分間減圧乾燥することにより残存するトリフルオロ酢酸を除去した。得られた加水分解物を９５％エタノール（蒸留、１ｍＬ）に溶解させ、２５％アンモニア水を７〜８滴添加しアンモニアアルカリ性にした後、過剰の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を加え室温で４時間以上反応させた。反応液に酢酸溶液を滴加し、残存する水素化ホウ素ナトリウムを分解した後、さらに７〜８滴加え、溶媒を減圧乾固により留去した。反応生成物にメタノール（１ｍＬ）を加え、減圧乾固する操作を４回繰り返すことにより生成したホウ酸を除去した。反応生成物をデシケーター中１時間減圧乾燥後、無水酢酸を加え、密封下１２１℃、３時間加熱反応させることによりアセチル化を行った。反応溶液を室温になるまで放置した後、トルエン（１ｍＬ）を加えて混和し、４０℃で空気気流下、無水酢酸を除去した。反応生成物に水（１ｍＬ）及びクロロホルム（ＣＨＣｌ３、２ｍＬ）を加え液−液分配し、遠心分離（４℃、２、５００ｒｐｍ、５分）した後、上層の水層を吸引除去した。さらにクロロホルム層は水（１ｍＬ）を用いて４〜５回程洗浄後、クロロホルムを減圧留去し、部分メチル化アルジトールアセテート誘導体を得た。本誘導体は以下に示す条件によりガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）及びガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＬＣ−ＭＳ）を用いて分析した。メチル化アルジトールアセテートの同定は標品のフラグメントイオンとの比較及び２、３、４、６−ｔｅｔｒａ−ＯＭｅ−１、５−ｄｉ−ＯＡｃ−ガラクチトールに対する相対保持時間との比較により行った。メチル化糖の構成モル比（ｍｏｌ．％）はピーク面積と水素炎イオン検出器（ＦＩＤ）に対する応答係数により求めた。
【００８７】
ＧＬＣ：
装置：ＨＰ５８９０  ＳｅｒｉｅｓＩＩ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｇｈ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）
キャピラリカラム：ＳＰ−２３８０  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎ（０．２５ｍｍｉ．ｄ．×３０ｍ、液膜厚０．２５μｍ、ＳＰＥＬＣＯ／ＡＬＤＲＩＣＨ）
キャリアガス：Ｈｅ（総流量：８０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム入口圧：１０ｐｓｉ、ガス純度：９９．９９９９％）
注入口温度：２５０℃
検出器：２５０℃
オーブン温度：６０℃（１ｍｉｎ）、６０℃→１５０℃（３０℃／ｍｉｎ）、１５０℃→２５０℃（１．５℃／ｍｉｎ）、２５０℃（１ｍｉｎ）
【００８８】
ＭＳ：
Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ＨＰ５９７０Ｂ  Ｍａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（７０ｅＶ、２８０℃）
【００８９】
（７）結果
得られたヘテログリカンの化学的性状を表１に、ヘテログリカンの糖結合様式を表２に示す。表２において、ｆはフラノース型、ｐはピラノース型を示す。また、ヘテログリカンの分子量分布の測定結果を図８（画分Ａ１、Ｂ１、及びＣ１）及び図９（画分Ｄ１）に示す。
【００９０】
【表１】
2018162217.tif 000001
【００９１】
【表２】
2018162217.tif 000002
【００９２】
表１及び図８に示すように、画分Ａ１は、ピーク分子量が４１，０００であり、分子量が１０，０００〜３００，０００の範囲に分布していた。画分Ｂ１ピーク分子量が３３，０００であり、分子量が１０，０００〜３００，０００の範囲に分布していた。画分Ｃ１はピーク分子量が１６，０００であり、分子量が１０，０００〜１００，０００の範囲に分布していた。画分Ａ１は、構成糖に占めるアラビノース、ラムノース、キシロース、マンノース、及びガラクトースの割合は、それぞれ約４４％、１３％、７％、１０％、及び１６％であった。画分Ｂ１では、構成糖に占めるアラビノース、ラムノース、キシロース、ガラクツロン酸、及びガラクトースの割合は、それぞれ約３７％、９％、１９％、１５％、及び１０％であった。また、画分Ｃ１の構成糖に占めるアラビノース、ラムノース、キシロース、ガラクツロン酸、及びガラクトースの割合は、それぞれ約１３％、１０％、１０％、５２％、及び５％であった。これらのヘテログリカンのうち画分Ｂ１及びＣ１は中性糖とウロン酸からなる糖を主成分として含有する多糖画分で、画分Ａ１は中性糖からなる糖を主成分とする多糖画分であった。図８及び図９に示すように、非焙煎処理白ゴマ種子ゴマ油搾り粕から得た多糖画分（画分Ｄ１、図７）は焙煎処理白ゴマ種子ゴマ油搾り粕から得た多糖画分（画分Ａ１、Ｂ１及びＣ１）に比べ分子量は大きく、ピーク分子量が５００，０００〜１，６００，０００の範囲に分布し、分子量が３００，０００〜２，０００，０００の範囲に分布していた。
【００９３】
表２に示すように、ヘテログリカン（画分Ａ１）は、非還元末端のアラビノフラノースを約１３％、４もしくは５結合のアラビノースを約２４％、４結合のマンノースを約２１％と多く含むという特徴があった。また、ヘテログリカン（画分Ｂ１）は非還元末端のアラビノフラノースを約１４％、非還元末端のアラビノピラノースを約１１％、４もしくは５結合アラビノースを約２０％、３、４もしくは３、５分岐アラビノースを約１１％と多く含むという特徴があった。さらにヘテログリカン（画分Ｃ１）は、４もしくは５結合のアラビノースを約９％、２結合のラムノースを約１０％、４結合のマンノースを約９％、非還元末端のガラクトースを約１１％、４結合のガラクトースを約１８％、４結合ガラクツロン酸を約１８％と多く含むという特徴があった。加えて、表１に示すように、β−Ｄ−グルコシル−ヤリブ抗原で検出可能で、且つドリセラーゼ由来のエキソ−β−Ｄ−（１→３）−ガラクタナーゼもしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のエンド−β−Ｄ−（１→４）−ガラクタナーゼにより、前記ヤリブ抗原と反応しなくなる構造に変換されるβ−Ｄ−（１→３、６）−ガラクタン構造は、画分Ａ１及び画分Ｂ１にそれぞれ約２９％及び１２％含まれる特徴を有していた。一方、画分Ｃ１には本構造は含まれていなかった。
【００９４】
〔実施例１：パイエル板活性化作用試験〕
製造例１及び製造例２で調製したヘテログリカン画分（画分Ａ１、Ｂ１、Ｃ１及びＤ）を用い、試験例１と同様にパイエル板活性化作用試験を行った。陽性コントロールとして、ナイモウオウギ多糖画分（Ｋｉｙｏｈａｒａ，  Ｈ．ら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７１，  ２８０−２９３．）、及び試験例１（５）で得られた脱リグニン化エタノール沈殿画分を用いた。
【００９５】
図１０に示されるとおり、骨髄細胞増殖促進因子量をパイエル板活性化作用として示した。焙煎処理白ゴマ種子（薄口ゴマ）ゴマ油搾り粕から得たヘテログリカン画分（画分Ａ１、Ｂ１及びＣ１）はいずれもリグニンを除去した焙煎処理白ゴマ種子（薄口ゴマ）ゴマ油搾り粕エタノール沈殿画分と比較して同程度もしくは有意に強いパイエル板活性化作用を示した。また、図１１に、非焙煎処理白ゴマ種子ゴマ油搾り粕エタノール沈殿画分由来の画分Ｄのパイエル板活性化作用試験結果を示す。非焙煎処理白ゴマ種子ゴマ油搾り粕から得たヘテログリカン画分（画分Ｄ）も有意なパイエル板活性化作用を示した。
【００９６】
〔実施例２：ゴマ種子ヘテログリカン画分の経口投与によるパイエル板活性化作用〕
（１）マウスへの焙煎処理白ゴマ種子ゴマ油搾り粕由来のエタノール沈殿画分の投与
ＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢、雌、日本ＳＬＣ）にＦＴＹ７２０水溶液（１．２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を３日間経口投与し、パイエル板からのリンパ球の遊出を阻害した。上記処置マウスにＦＴＹ７２０投与３時間以上後に、製造例１（１）で得られた焙煎処理白ゴマ種子（薄口ゴマ）のゴマ油搾り粕由来のエタノール沈殿画分（５０もしくは１００ｍｇ／ｋｇ／ｓｄａｙ）を３日間経口投与した。対照群としては、ＦＴＹ７２０処置マウスに水を同期間経口投与した。投与開始４日目にマウスをイソフルラン（マイラン製薬）麻酔下、安楽死後、眼科用ハサミを用いて小腸からパイエル板を採取した。
【００９７】
（２）マウスパイエル板細胞の調製及び培養
得られたパイエル板を氷冷した５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２ｍＬ）を加えた滅菌シャーレにとり、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）上で５ｍＬのディスポーサブル注射器の内筒のゴムラバー部を用いて圧砕することでパイエル板細胞を遊離させた。本細胞懸濁液を５０ｍＬファルコンチューブに移し、ボルテックスミキサーで短時間撹拌した。本細胞懸濁液をステンレスメッシュ（１５０ｍｅｓｈ）によりろ過後、遠心分離（１、５００ｒｐｍ、４℃、７分間）し、培地をデカンテーションすることによりパイエル板細胞を得た。本細胞についてＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｍＬ）を用いて計４回同様の操作を繰り返すことにより細胞を洗浄後、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）によりろ過した。この細胞懸濁液（２０μＬ）を用いてセルカウンターで細胞数を計数後、ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのパイエル板細胞懸濁液を調製した。
【００９８】
２４穴培養プレート（３０４７、ＦＡＬＣＯＮ）に上記で得たパイエル板細胞懸濁液（５００μＬ／ｗｅｌｌ）及びコンカナバリンＡ（５０μｇ／ｍＬ、５０μＬ、終濃度：５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＴリンパ球刺激条件下で、５％ＣＯ２−９５％空気下、３７℃にて３日間培養した。培養上清を別の２４穴培養プレートに移し、−２０℃にて使用まで保存した。
【００９９】
（３）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）に５０ｍＭ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍＬに希釈した抗マウスサイトカイン一次抗体（抗ＩＬ−２、ＩＬ−５もしくはＩＦＮ−γ抗体、１００μＬ／ｗｅｌｌ）を分注し、４℃で一昼夜インキュベーションした。本プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＴ）（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄後、１％スキムミルク（ＳＭ）含有ＰＢＳＴ（ＳＭ−ＰＢＳＴ）（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を用いて３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で４回洗浄後、１％ＳＭ−ＰＢＳＴ（５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加えて１０分間室温にてプレインキュベーションし、次いで、パイエル板培養上清（５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、４℃で１晩インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄し、１％ＳＭ−ＰＢＳＴ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を用いて１０分間室温にてプレインキュベーションした。さらにプレートに１％ＳＭ−ＰＢＳＴで希釈した一次抗体に対応するビオチン標識抗サイトカイン二次抗体（１：１０００、５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加え３７℃で１時間インキュベーション後、ＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄した。プレートを１％ＳＭ−ＰＢＳＴ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を用いて１０分間室温にてプレインキュベーション後、１％ＳＭ−ＰＢＳＴで希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（１：１０００、１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で５回洗浄後、基質溶液［ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムの１０％ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）溶液（１ｍｇ／ｍＬ、１５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、室温でインキュベーションした。発色した黄色をマイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＪＸ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いて測定した（測定波長：４０５ｎｍ、ブランク波長：４９２ｎｍ）。
【０１００】
（４）結果
図１２に、ＦＴＹ７２０処置したＢＡＬＢ／ｃマウスへの薄口ゴマのゴマ油搾り粕由来のヘテログリカン含有画分であるエタノール沈殿画分の経口投与によるパイエル板Ｔリンパ球からのＩＬ−２、ＩＬ−５及びＩＦＮ−γの産生変化についての試験結果を示す。５０もしくは１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量のエタノール沈殿画分の経口投与により、パイエル板Ｔリンパ球からのＩｌ−２、ＩＬ−５及びＩＦＮ−γの産生は用量依存的に顕著に増強されていた。ＩＬ−２はＴリンパ球の増殖や制御性Ｔリンパ球の維持に関与すること、ＩＬ−５は造血系での好中球などの顆粒球の分化に関与すること、ＩＦＮ−γは抗原提示細胞の機能増強、Ｔｈ１リンパ球反応の増強、抗ウイルス作用やマクロファージの活性化に関与することが知られている。このことから、ゴマ種子由来のヘテログリカンがパイエル板でのこれらのサイトカイン産生に関与するＴリンパ球を誘導し、これらのサイトカインの関与する病態の改善につながると考えられる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
2018162217.tif 000003
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
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