(57)【要約】  本発明は、患者試料において虚血事象をインビトロ検知するための電気化学的方法およびデバイスを含む。既知量の遷移金属イオンを患者試料に添加した後、電極（２、４、６）を用いて、試料中の封鎖されていない遷移金属イオンの電流または電位差を測定する。試料中の封鎖されていない遷移金属イオンの量は、虚血事象の結果であるアルブミンに対する修飾度を反映する。
2005510712.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血事象の診断となりうる、アルブミン誘導体のインビトロ検出または測定のための方法であって、
ａ）アルブミンおよび／またはその誘導体を含む患者試料を、電気化学装置に接続した容器に供給し；
ｂ）電気化学的手法を用いるために電気化学装置を作動させ；
ｃ）所望により試料のバックグラウンド特有の電気化学的出力信号を測定し；
ｄ）既知量の遷移金属イオンを試料に添加し、これにより少なくとも若干のイオンがアルブミンの金属封鎖部位に結合し、残りのイオンは封鎖されず；
ｅ）所望により指示薬または増幅剤を試料に添加して、封鎖されていないイオンに結合させ；
ｆ）封鎖されていないイオンに関連する特有の電気化学的出力信号を測定し；
ｇ）所望により標準曲線を用いて出力信号の測定値を換算値に換算する
ことを含み、これにより、電気化学的出力信号の測定値またはその換算値が予め定めた値を超えた場合は虚血事象の診断とすることができる方法。
【請求項２】
既知量の金属イオンが過剰量である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特有の電気化学的出力信号が電流および電圧よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
虚血事象の診断となりうる、アルブミン誘導体のインビトロ検出または測定のための方法であって、
ａ）アルブミンおよび／またはその誘導体を含む患者試料を、参照電極および作用電極を備えた容器に供給し、それらの電極は作動可能な状態でポテンショスタットに接続しており；
ｂ）ポテンショスタットを作動させて試料に電位を印加し；
ｃ）所望により試料におけるレドックス反応からバックグラウンド電流を相殺してゼロにし；
ｄ）既知量の遷移金属イオンを試料に添加し、これにより少なくとも若干のイオンがアルブミンの金属封鎖部位に結合し、残りのイオンはアルブミンにより封鎖されず；
ｅ）所望により指示薬または増幅剤を試料に供給して、封鎖されていない金属イオンに結合させ；
ｆ）イオンとアルブミンの反応を平衡状態または予め定めた処理時間に到達させ；
ｇ）封鎖されていないイオンに関連する電流を測定し；
ｈ）所望により標準曲線を用いて電流測定値を換算値に換算する；
ことを含み、これにより、電流測定値またはその換算値が予め定めた値を超えた場合は虚血事象の診断とすることができる方法。
【請求項５】
既知量の金属イオンが過剰量である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
容器がさらに、作動可能な状態でポテンショスタットに接続した補助電極を容器内に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
作用電極がさらに、封鎖されていない金属イオンに結合させる指示薬または増幅剤を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
虚血事象の診断となりうる、アルブミン誘導体のインビトロ検出または測定のための方法であって、
ａ）アルブミンおよび／またはその誘導体を含む患者試料を、イオン選択電極および参照電極を備えた容器に供給し、それらの電極は作動可能な状態でエレクトロスタットまたは電圧計に接続しており、イオン選択電極は遷移金属イオンに対して選択透過性であるバリヤーを含み；
ｂ）エレクトロスタットまたは電圧計を作動させて、試料に接触した参照電極とイオン選択電極の電位差を測定し；
ｃ）所望により試料のバックグラウンド電位差を相殺し；
ｄ）既知量の遷移金属イオンを試料に添加し、これにより少なくとも若干のイオンがアルブミンの金属封鎖部位に結合し、残りのイオンは封鎖されず；
ｅ）所望により指示薬または増幅剤を試料に供給して、封鎖されていない金属イオンと結合させ；
ｆ）封鎖されていない金属イオンにイオン選択電極の膜を通過させ；
ｇ）イオン選択電極のバリヤーを介したイオン活性差に関連する電圧を測定し；
ｈ）所望により標準曲線を用いて電圧測定値を換算値に換算する；
ことを含み、これにより、電圧測定値またはその換算値が予め定めた値を超えた場合は虚血事象の診断とすることができる方法。
【請求項９】
既知量の金属イオンが過剰量である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
診断された虚血事象が心虚血である、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
診断された虚血事象が無症候性虚血である、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
診断された虚血事象が狭心症である、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
診断された虚血事象が心筋梗塞である、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
診断された虚血事象が一時性虚血である、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
診断された虚血事象が腸虚血である、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
診断された虚血事象が脳虚血である、請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
診断された虚血事象が胎盤不全症である、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
診断された虚血事象が心虚血である、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
診断された虚血事象が無症候性虚血である、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
診断された虚血事象が狭心症である、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
診断された虚血事象が心筋梗塞である、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
診断された虚血事象が一時性虚血である、請求項８に記載の方法。
【請求項２３】
診断された虚血事象が腸虚血である、請求項８に記載の方法。
【請求項２４】
診断された虚血事象が脳虚血である、請求項８に記載の方法。
【請求項２５】
診断された虚血事象が胎盤不全症である、請求項８に記載の方法。
【請求項２６】
虚血事象の診断をｉｎ  ｓｉｔｕ冠血管ステントの効果の評価に使用する、請求項４に記載の方法。
【請求項２７】
虚血事象の診断を経皮心臓介入の効果の評価に使用する、請求項４に記載の方法。
【請求項２８】
虚血事象の診断を薬物療法の効果の評価に使用する、請求項４に記載の方法。
【請求項２９】
虚血事象の診断をｉｎ  ｓｉｔｕ冠血管ステントの効果の評価に使用する、請求項８に記載の方法。
【請求項３０】
虚血事象の診断を経皮心臓介入の効果の評価に使用する、請求項８に記載の方法。
【請求項３１】
虚血事象の診断を薬物療法の効果の評価に使用する、請求項８に記載の方法。
【請求項３２】
運動中、および運動前、運動後または両方において患者の虚血レベルを測定してそれらのレベルを比較することにより運動誘発虚血を検知または測定する方法であって、その際請求項４に記載の方法を用いて虚血事象を検知または測定する、前記方法。
【請求項３３】
運動中、および運動前、運動後または両方において患者の虚血レベルを測定してそれらのレベルを比較することにより運動誘発虚血を検知または測定する方法であって、その際請求項８に記載の方法を用いて虚血事象を検知または測定する、前記方法。
【請求項３４】
虚血事象の診断となりうる、アルブミン誘導体のインビトロ電気化学的検出または測定のためのデバイスであって、
ディスプレー手段、データ入力および制御手段、開口、ディスプレー手段と電気的に連続した開口内部接点、電源、ならびに所望により検査室情報システムへのリンクを含む、エレクトロニクスモジュールハウジング；ならびに
試料ウェルおよび複数の電極を含み、各電極が試料ウェル内に配置され、対応するトレースによりストリップ上の対応する接点に接続した、試料分析ストリップ；
を含み、該ストリップをモジュールハウジングに挿入すると各ストリップ接点がモジュール開口内の対応する接点とかみ合い、これによりディスプレー手段との電気的連続性が得られ、こうしてアルブミン誘導体を検出または測定できるデバイス。
【請求項３５】
検査室情報システムへのリンクが、直接電気接続、赤外線リンクおよび／または無線リンクよりなる群から選択される、請求項３４に記載のデバイス。
【請求項３６】
虚血事象の診断となりうる、試料中のアルブミン誘導体のインビトロ電気化学的検出または測定のためのデバイスであって、
試料分析ストリップを受け入れるための開口が形成されたハウジング；試料分析ストリップは試料ウェル、試料ウェル内に配置された複数の電極、および電極に接続した同様に複数の第１接点を備えている；
ハウジング内にある制御手段；ならびに
該制御手段と電気的に結合しており、試料分析ストリップが開口に挿入されると複数の第１接点と接続するための、開口内の複数の第２接点；
を含み、試料分析ストリップを開口に挿入すると、第１接点がそれぞれ対応する第２接点とかみ合い、こうして制御手段によりアルブミン誘導体を検出または測定できるデバイス。
【請求項３７】
さらに、検査室情報システムへのリンクを含む、請求項３６に記載のデバイス。
【請求項３８】
検査室情報システムへのリンクが、直接電気接続、赤外線リンクおよび／または無線リンクよりなる群から選択される、請求項３７に記載のデバイス。
【請求項３９】
さらに、制御手段と電気的に結合されたディスプレー手段をハウジング内に含み、該ディスプレー手段はアルブミン誘導体の検出を指示する情報を表示するように作動できる、請求項３６に記載のデバイス。
【請求項４０】
さらに、制御手段に電気的に結合されたデータ入力手段を含む、請求項３６に記載のデバイス。
【請求項４１】
制御手段が、
試料分析ストリップ中の試料に関連する特有の電気化学的出力信号を測定する手段；および
その電気化学的出力信号が予め定めた値を超えているかを判定し、これにより虚血事象を指示する手段
を含む、請求項３６に記載のデバイス。
【請求項４２】
電気化学的出力信号が、既知量の遷移金属イオンを添加したアルブミンおよび／またはその誘導体を含む試料中の封鎖されていない金属イオンに関連する電流である、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項４３】
電極の１つが、遷移金属イオンに対して選択透過性であるバリヤーを含むイオン選択電極を含み；
電気化学的出力信号が、既知量の遷移金属イオンを添加したアルブミンおよび／またはその誘導体を含む試料中のイオン選択電極のバリヤーを介したイオン活性差に関連する電圧である、
請求項４１に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、被検体の電気化学的検出を用いたインビトロ診断デバイスに関する。本発明は特に、あらゆる形の電流測定および電圧測定（クーロメトリー、ボルタンメトリー、イオン選択電極、クロノアンペロメトリーなど）を用いて解明されるレドックス反応を、アルブミンに対するすべての修飾を検出することによる虚血事象の指標として用いる。
【０００２】
発明の背景
虚血は、身体の一部における酸素の供給と需要の不均衡状態であり、その部分へ供給する血管の狭窄または閉塞により起きる場合が多い。最も一般的な２形態の虚血は、心臓血管性および脳血管性のものである。
【０００３】
心臓血管性虚血は一般に冠動脈疾患の直接的な結果であり、冠動脈のアテローム斑が断裂して血栓（凝血塊）が形成され、これが冠動脈を遮断または閉塞し、これによって下流の心筋の酸素が枯渇することにより起きる。長期間の虚血は細胞死または壊死をもたらす可能性があり、死組織の領域は一般に梗塞と呼ばれる。急性心虚血事象を伴う患者は、胸痛や他の症状および徴候、たとえば心電図（ＥＣＧ）の変化などを伴って病院の救急室に運ばれる場合が多い。このタイプの症状は急性冠症候群（ＡＣＳ）と呼ばれる。ＡＣＳと診断された患者は、心筋に対する不可逆的な損傷を避けるために直ちに処置する必要がある。
【０００４】
脳虚血は脳へ通じる動脈の狭窄によるものが多い。
頭痛、めまい、感覚変化、および一時的な特定の運動機能の喪失を含めた虚血の初期症状は、一過性脳虚血発作（ＴＬＡ）と呼ばれる。ＴＬＡは脳血管発作（ＣＶＡまたは脳卒中）の前駆症状である。
【０００５】
連続した虚血性疾患には５つの状態が含まれる：（１）コレステロールその他の脂質の血中濃度上昇；（２）アテローム斑の形成とそれに続く動脈狭窄；（３）臓器への血流低下（動脈狭窄または斑断裂とそれに続く血栓形成の結果として）；（４）酸素不足により起きる臓器の細胞損傷；（５）持続的な酸素枯渇により起きる臓器組織の死。段階３〜５は”虚血性疾患”と総称され、段階１および２はその前駆症状とみなされる。
【０００６】
虚血状態とそれをもたらす疾患を識別することが重要である。たとえば、冠動脈疾患を伴う患者が必ずしも心虚血状態にあるわけではないが、心虚血状態の者はほとんど例外なく冠動脈疾患を伴う。
【０００７】
心臓血管疾患と脳血管疾患を合わせると、１９９８年に米国で７７８，０００人の死亡に達した（２００２  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｕｐｄａｔｅ，２００２  米国心臓学会）。さらに、３〜４百万人もの米国人がいわゆる”無症候性虚血”を伴う。これは、胸痛や狭心症といった通常の古典的な症状を伴わない虚血性心疾患がある状態である。
【０００８】
心筋や冠動脈に対する損傷を推定できる血液検査法の開発および利用が、緊急に求められている。心臓事象の処置の成功は、損傷を最小限に抑えるために早期に心虚血の存在を検知してそれに対処することに大きく依存する。心臓性酵素、特にクレアチンキナーゼイソ酵素（ＣＫ−ＭＢ）、ならびに他の心臓壊死マーカー、特にミオグロビンならびにトロポニンＩおよびトロポニンＴなどの生化学的マーカーが、心筋傷害の診断に利用される。しかし、これらの酵素およびマーカーは細胞死または壊死の存在を検知できるにすぎないので、壊死を伴わない虚血の患者、たとえば心筋梗塞前の虚血状態にある患者においては有用性が限定されるか、または有用性がない。さらに、これらの酵素およびマーカーは、壊死開始の数時間後まで測定可能な上昇を示さない。たとえば心臓性トロポニンは、心臓発作開始の約４〜６時間後までヒトの血液検査で正常値を超える測定可能な上昇を示さず、そのような事象の約１８時間後まで血中ピークレベルに達しない。したがって、虚血状態の診断に心臓壊死マーカーを利用することの主な欠点は、心臓が不可逆的な損傷を受けた後にようやくこれらのマーカーが検出可能になることである。
【０００９】
心虚血の診断には、特に救急室で利用できる一連の検査法がある（たとえばＳｅｌｋｅｒ，ＨＰ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎｎａｌｓ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２９：１３−８７参照）。認められている治療基準は１２誘導心電図（ＥＣＧまたはＥＫＧ）であるが、その臨床感度は５０％未満である（たとえばＳｅｌｋｅｒ，ＨＰ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎｎａｌｓ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２９：１３−８７；およびＳｅｌｋｅｒ，ＨＰ  ｅｔ  ａｌ．，心虚血の救急診断試験法，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＩＳＢＮ  ０−６３２−０４３０４−０（１９９７）参照）。他の診断試験法には、心エコー検査法および放射性核種心筋血流イメージングが含まれる。
【００１０】
冠動脈疾患の診断は、イメージング（たとえば冠動脈造影法）により、または誘発試験法により行われ、その目的は、意図的に心虚血を誘発してその影響を観察することである。たとえばＥＣＧ運動負荷試験法では、患者の運動速度を次第に高めて、虚血症状が誘発されるか、または虚血の指標となる変化がＥＣＧにみられるかを観察する。負荷ＥＣＧは一般に冠動脈疾患の初期スクリーニングとして用いられるが、わずか２５〜５０％というその精度によって制限される（たとえばＦｒｏｅｌｉｃｈｅｒ，ＶＦ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２８（１２）：９６５−９７４参照）。一般に用いられる他の診断試験法は心筋血流イメージングであり、この場合は負荷試験中に放射性標識薬品を注入する。正常に代謝している心臓組織は放射性標識薬品を取り込むことができ、一般的なイメージング技術（ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ走査）を用いて視覚化することにより生存する心臓組織と損傷を受けた心臓組織を識別できる。
【００１１】
しかし本発明は、簡単な血液検査であって、はるかに低い経費で、かつ患者に対するリスクや不便さを減らして、匹敵する精度をもつという点で、既知の診断方法より有利であると考えられる。本発明は、精度において現在の診断基準に匹敵するレベルの特異性および感度を備えていると考えられる。
【００１２】
心筋壊死については、ＡＣＢ（商標）検査法に関して後記に述べる以外に、十分に確立された生化学的マーカーがあり、これらは血液試料中にポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）計測器を用いて検出できるが、虚血については十分に確立された生化学的マーカーがなく、現在のところ虚血の検知のためのＰＯＣ計測器はない。理想的な検査法は、好ましくは迅速に正確な結果を与える小型の簡単なデバイス、たとえば患者のベッドサイドにおいて最小程度の不快感で疾患検査に使用できるデバイスを用いて実施できる血液検査であろう。
【００１３】
血液成分のひとつはヒト血清アルブミンである（ＨＳＡ）。ＨＳＡが虚血組織に暴露されると、アルブミン分子のＮ末端修飾体が生成し（Ｂａｒ−Ｏｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．１９：３１１−３１５；ＰＣＴ／ＵＳ９９／２２９０５）、場合により他の部位の修飾体も生成するであろう。アルブミンのＮ末端がコバルト、ニッケルおよび銅など数種類の遷移金属一次結合部位であることは十分に解明されている（Ｓａｄｌｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２０：１９３−２００；Ｌａｋｕｓｔａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：３０３−３１５；Ｇａｓｍｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．４９：５００−５０９；Ｐｒｅｄｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８７：２１１−２１５；Ｌｕｓｓａｃ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３：２８３２−３８；Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１５３３−３７）。Ｎ末端および場合により他の封鎖結合部位が虚血事象への暴露により修飾されると、それらは金属を結合できなくなる。この変化したアルブミンを、本明細書において虚血修飾アルブミン（Ｉｓｃｈｅｍｉａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｌｂｕｍｉｎ，ＩＭＡ）と呼ぶ。したがって、既知量の遷移金属を生体試料（全血、血清または血漿、尿、脳席髄液、唾液などを含む患者試料）に添加すると、結合していない金属の量をモニターすることにより、正常なアルブミンとＩＭＡを識別できる。試料に添加した金属は、非虚血試料では、アルブミンがもはや金属を結合できない状態に修飾されている虚血試料より高い頻度でアルブミンのＮ末端および場合により他の部位において封鎖されるであろう。次いで、試料中のアルブミンのＮ末端および場合により他の部位において封鎖されていない金属を、アルブミンコバルト結合（ＡＣＢ）検査法（Ｉｓｃｈｅｍｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，コロラド州デンバー）により検出および定量できる。これは、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２２９０５（１９９９年１０月１日出願）およびＵ．Ｓ．５，２２７，３０７に記載されるように、比色法を用いて試料中に存在するＩＭＡの量を測定する。ＰＣＴ／ＵＳ９９／２２９０５には、虚血事象に際してのアルブミンに対するＮ末端修飾の詳細な記載も提示されている。患者の診断およびリスク層別化におけるＩＭＡの臨床有用性を証明する研究が、ＡＣＢ検査法により行われた。
【００１４】
ＡＣＢ検査法では検査室用化学分析装置を用いてＩＭＡを定量するが、現在のところ虚血用のＰＯＣ検査法はない。理想的な検査法は、好ましくは品質管理システムによる標準曲線を参照した正確な結果を迅速に与える、小型の簡単なデバイス、たとえば患者のベッドサイドにおいて最小程度の不快感で疾患検査に使用できるデバイスを用いて実施できる血液検査であろう。
【００１５】
本発明の目的は、生体分子の変化により発生または変化した信号を検知することによって生体分子の変化を検知する診断試験法を提供することであり、この変化は生体分子のある部分に金属が結合することに関連する。
【００１６】
他の目的は、虚血患者と非虚血個体から得た体液における電流または電位の測定値の差を測定する診断試験法を提供することであり、その際、試料をまずコバルトその他の遷移金属と結合させる。
【００１７】
本発明の他の目的は、金属と生体試料の結合を検知することにより生体の状態を検知するための電気化学的アッセイ法を提供することであり、その際、生体試料に添加した金属、錯化剤その他の試薬などの添加剤の量に対する信号に差があり、その信号が検量および品質管理システムにより標準化される。
【００１８】
本発明の他の目的は、データ処理技術を用いて、虚血個体と非虚血個体の相異を判定するための電気化学的アッセイから得た電気化学的出力データの特色を同定することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、患者の状態を患者のベッドサイドでアッセイする装置を提供することである。
発明の概要
本発明は、既知量の遷移金属を添加した生体試料中の封鎖されていない遷移金属イオンの電気化学的検出に関する。封鎖されていない金属イオンは、虚血により修飾されたアルブミンの程度を反映し、これを利用して虚血事象の発症または非発症を判定できる。
【００２０】
１態様において本発明は、虚血事象の診断となりうる、アルブミン誘導体のインビトロ検出または測定のための方法に関する。この方法は、下記の工程を含む：アルブミンおよび／またはその誘導体を含む患者試料を、電気化学装置に接続した容器に供給し；電気化学的手法を用いるために電気化学装置を作動させ；所望により試料のバックグラウンド特有の電気化学的出力信号を相殺し；既知（所望により、過剰）量の遷移金属を試料に添加し、これにより少なくとも若干のイオンがアルブミンの金属封鎖部位に結合し、残りのイオンは封鎖されず；所望により指示薬または増幅剤を試料に添加して、封鎖されていないイオンに結合させ；封鎖されていないイオンに関連する特有の電気化学的出力信号を測定し；所望により標準曲線を用いて出力信号をある値に換算し；これにより、電気化学的出力信号の測定値またはその換算値が予め定めたを超えた場合は虚血事象の診断とすることができる。この態様において、特有の電気化学的出力信号は電流または電圧であってよい。
【００２１】
他の態様において本発明は、虚血事象の診断となりうる、アルブミン誘導体のインビトロ検出または測定のための、下記を含む方法を含む：アルブミンおよび／またはその誘導体もしくは修飾体を含む患者試料を、参照電極、作用電極、および所望により補助電極を備えた容器に供給し、それらの電極は作動可能な状態でポテンショスタットに接続しており；ポテンショスタットを作動させて試料に電位を印加し；所望により試料におけるレドックス反応からバックグラウンド電流を相殺してゼロにし；既知（所望により、過剰）量の遷移金属イオンを試料に添加し、これにより少なくとも若干のイオンがアルブミンのＮ末端および場合により他の金属封鎖部位に結合し、残りのイオンは封鎖されず；所望により指示薬または増幅剤を試料に供給して、封鎖されていない金属イオンに結合させ；イオンとアルブミンの反応を平衡状態または予め定めた処理時間に到達させ；封鎖されていないイオンに関連する電流を測定する。次いで、標準曲線を参照して電流測定値をある値に換算できる。電流測定値または換算値は封鎖されていない金属イオンの濃度に関連するものであり、したがってＩＭＡの量に関連する。したがって、予め定めた値を確立し、それより低い場合はその試料は虚血性でないということができ、予め定めた値を超えた場合はその試料は虚血性であるということができる。
【００２２】
封鎖されていない金属イオンの測定に際しては、遊離金属、すなわちアルブミンに結合していない金属だけでなく、アルブミンに結合してはいるが検出からみて封鎖されていないままである様式で結合している金属イオンも測定される可能性がある。本明細書中で用いる”封鎖されていない”イオンは、アルブミンに結合していない遊離イオンだけでなく、アルブミンとゆるく会合してはいるが封鎖されないままであるイオンをも表わす。封鎖されていない金属イオンは、電気化学的方法で直接測定してもよく、あるいは指示薬または増幅剤、たとえばジメチルグリオキシム（ＤＭＧ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）または一般的な共有結合キレート化剤、たとえばＥＤＴＡなどの錯体を、当技術分野で既知の方法に従って測定してもよい。指示薬または増幅剤を電極アマルガム中に取り込ませてもよく、あるいは金属イオン添加の前、途中または後に試料容器に添加してもよい。指示薬および増幅剤を、金属イオンが結合可能な状態を維持した様式で固相に付着させてもよく、これにより指示薬／増幅剤の信号を反応混合物から相分離できる。指示薬／増幅剤は封鎖されていない金属イオンに結合し、本発明の電流態様での金属イオン測定を可能にする。封鎖されていない金属イオンに関連する電流の検知は指示薬または増幅剤の使用によって向上させることができるが、指示薬または増幅剤を用いずに、封鎖されていない金属イオンに関連する電流を検知することもできる。
【００２３】
他の態様において本発明は、虚血事象の診断となりうる、アルブミン誘導体のインビトロ検出または測定のための、下記を含む方法を含む：アルブミンおよび／またはその誘導体もしくは修飾体を含む患者試料を、イオン選択電極および参照電極を備えた容器に供給し、それら２電極はエレクトロスタットまたは電圧計に接続しており、イオン選択電極は遷移金属イオンに対して選択透過性であるバリヤーを含み；エレクトロスタット／電圧計を作動させて、試料に接触した参照電極とイオン選択電極の電位差を測定し；所望により試料のバックグラウンド電位差を相殺し；既知（所望により、過剰）量の遷移金属イオンを試料に添加し、これにより少なくとも若干のイオンがアルブミンのＮ末端および場合により他の金属封鎖部位に結合し、残りのイオンは封鎖されず；所望により指示薬または増幅剤を試料に供給して、封鎖されていない金属イオンと結合させ；封鎖されていない金属イオンにイオン選択電極の膜を通過させ；そしてイオン選択電極のバリヤーを介したイオン活性差に関連する電圧を測定する。この電圧変化を標準検量曲線と対比して、ある値に換算することができる。電圧測定値または換算値は封鎖されていない金属イオンの濃度と関連し、したがってＩＭＡの量と関連する。したがって、予め定めた値を確立し、それより低い場合はその試料は虚血性でないということができ、予め定めた値を超えた場合はその試料は虚血性であるということができる。
【００２４】
本発明は、虚血事象の診断となりうる、アルブミン誘導体のインビトロ電気化学的検出または測定のための、下記のものを含むデバイスをも含む：ディスプレー手段、データ入力および制御手段、開口、ディスプレー手段と電気的に連続した開口内部接点、電源、ならびに所望により検査室情報システムへのリンクを含む、エレクトロニクスモジュールハウジング；ならびに試料ウェルおよび複数の電極を含み、各電極が試料ウェル内に配置され、対応するトレースによりストリップ上の対応する接点に接続した、試料分析ストリップ；該ストリップをモジュールハウジングに挿入すると各ストリップ接点がモジュール開口内の対応する接点とかみ合い、これによりディスプレー手段との電気的連続性が得られ、こうしてアルブミン誘導体を検出および／または測定できる。検査室情報システムへのリンクは、直接電気接続、赤外線リンクおよび／または無線リンクを含めた幾つかの手段により行うことができる。このデバイスを電流または電位差の態様で、生体試料における虚血事象の検知に使用できる。
【００２５】
他の態様において本発明は、虚血事象の診断となりうる、試料中のアルブミン誘導体のインビトロ電気化学的検出または測定のためのデバイスを提供する。このデバイスは、下記のものを含む：試料分析ストリップを受け入れるための開口が形成されたハウジングであって、試料分析ストリップは試料ウェル、試料ウェル内に配置された複数の電極、および電極に接続した同様に複数の第１接点を備えている；ハウジング内にある制御手段；ならびに該制御手段と電気的に結合しており、試料分析ストリップが開口に挿入されると複数の第１接点と接続するための、開口内の複数の第２接点。試料分析ストリップを開口に挿入すると、第１接点がそれぞれ対応する第２接点とかみ合い、こうして制御手段によりアルブミン誘導体を検出または測定できる。このデバイスは、検査室情報システムへのリンクを含むことができ、これは直接電気接続、赤外線リンクまたは無線リンクであってよい。このデバイスは、制御手段と電気的に結合されたディスプレー手段をハウジング内に含むこともできる；このディスプレー手段は、検出されたアルブミン誘導体を指示する情報を表示する。このデバイスは、制御手段と電気的に結合されたデータ入力手段を含むこともできる。制御手段は、試料分析ストリップ中の試料に関連する特有の電気化学的出力信号を測定する手段；およびその電気化学的出力信号が予め定めた値を超えているかを判定することにより虚血事象を指示する手段を含む。電気化学的出力信号は、既知量の遷移金属イオンを添加したアルブミンおよび／またはその誘導体を含む試料中の封鎖されていない金属イオンに関連する電流であってもよい。あるいは、電気化学的出力信号は、遷移金属イオンに対して選択透過性であるバリヤーを含むイオン選択電極により測定される電位差であってもよく、この場合、電位差は、既知量の遷移金属イオンを添加した試料中において測定される。
【００２６】
本明細書に引用した参考文献の全体を援用する。
発明の詳細な説明
本発明を理解しやすくするために以下の定義を示す。
【００２７】
”ＩＭＡ”は、虚血によりアルブミンに誘発される、分子の遷移金属結合能に影響を与える修飾体を表わす。ＩＭＡには、アルブミンＮ末端誘導体、Ｎ末端以外の金属結合部位であって修飾されていない場合は検出物からの金属を封鎖できる部位を修飾されたアルブミンもの、および銅がＮ末端を占有した全長アルブミンが含まれる。
【００２８】
”アルブミンＮ末端誘導体”は、虚血事象の結果としてＮ末端が変化またはトランケートしたアルブミン種を表わす。具体的には、これらの誘導体には４、３、２および１個のＮ末端アミノ酸を欠如するアルブミン、ならびにそのＮ末端Ａｓｐ残基がアセチル化または他の形で誘導体化された全長アルブミンが含まれる。アルブミン末端誘導体はアルブミン−金属錯体を形成できず、虚血患者の血液中にみられる可能性がある。
【００２９】
”過剰量”の金属イオンまたは”過剰の金属イオン”は、アルブミンの化学量論的に利用できる金属イオン結合部位より実質的に多い量の金属イオンを添加し、したがって実質的にすべての全長アルブミンのＮ末端が金属イオンに結合し、かつ実質的にすべてのアルブミンの他の金属結合／封鎖部位が（あるとすれば）金属イオンに結合することを表わす。
【００３０】
”指示薬”、”増幅剤”または”錯化剤”は、非特異的に、たとえばアルブミンのＮ末端以外の官能性部位（チオール基を含む）に結合している遷移金属と、錯体を形成する化合物である。指示薬または増幅剤の例は、ＤＭＧ、ＤＴＴおよび一般的な二価キレート化剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などである。これらの化合物は、本発明の各態様において、アルブミンとゆるく会合した封鎖されていない金属イオンが電流または電圧に関与するのを測定可能にし、または測定を向上させる。たとえばＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４６（１２）：８５３−７；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２（１４）：３２１８−２２参照。
【００３１】
前記に述べた”封鎖されていない”イオンは、アルブミンに結合していない遊離イオン、およびアルブミンとゆるく会合してはいるが封鎖されないままのイオン、すなわち直接または間接的な電気化学的方法で測定される可能性のあるイオンを意味する。間接的な電気化学的方法は、錯化剤の使用を伴う。
【００３２】
”患者試料”は、アルブミン（全長および／または誘導体）を含有するいずれかの患者試料を意味し、これには全血、血清、血漿、他の血液画分、尿、唾液、脳席髄液、乳汁などを含めることができる。”予め定めた処理時間”は、遷移金属添加後の選択された時間を表わし、一貫してその時点で測定を行う。予め定めた処理時間は、平衡状態の達成に必要な時間より短かくてもよい。
【００３３】
”予め定めた値”は、正常な個体および虚血患者についての臨床試験により、それを超えると虚血事象を指示するカットオフ値であると判定した、電流値、電位差値、標準曲線から求めた数値などを表わす。
【００３４】
”封鎖された”イオンは、錯化剤と反応できないようにする様式で、または錯化剤がアルブミンから結合金属をストリッピングするのを阻害する様式で、アルブミンに配位した（結合した）金属イオンである。
【００３５】
”遷移金属”は、周期表のいずれかの遷移金属を表わす。好ましい遷移金属はコバルトである。
本発明によれば、遷移金属のレドックス反応から生じる電流のモニタリングにより、またはイオン選択電極を用いる電位差測定により、Ｎ末端および場合により他の金属封鎖部位が修飾されたアルブミンを、修飾されていないアルブミンから識別できる。両方式の唯一の要件は、アルブミンのＮ末端および場合により他の金属封鎖部位に結合した金属被検体を電気化学的に検出できないことである。
【００３６】
レドックス反応から生じる電流の測定は、当該被検体に固有の電位をその系に印加することにより実施できる。より具体的な例では、既知濃度の金属を試料に導入する。金属がＮ末端またはその他の部位で封鎖されるのに伴って、その金属は電気化学的に検出できる反応にもはや関与できなくなり、したがってもはや検出できない。電流安定化のための期間は、アルブミン上の金属封鎖部位への金属の結合反応速度に依存するであろう。ＩＭＡは非ＩＭＡアルブミンと同程度に金属を封鎖することはできないので、比較的大量の修飾アルブミンを含む試料（虚血試料のように）において生じる電流は、修飾アルブミンの量がきわめて少ない試料（正常試料）とは異なるであろう。起きる反応のタイプが電流のタイプを決定するであろう。たとえば酸化電位を印加すると、反応物中に存在する被検体はＭ+からＭ2+＋ｅ-になり、電子を遊離させて電流を発生する。逆の場合もあり、還元電位を印加した場合は反応はＭ+＋ｅ-からＭになり、その際、系は電子を供給しなければならない。したがって、遊離金属が増加すると、系内にマイナスの電流が流れる。作用電極は、電流の流れる方向に関係なく正味電流を測定する。この系は、被検体のごくわずかな変動で有意の正味電流変化を生じるのに十分な感度をもつ。感度を高めるためにこの系に本明細書に記載する増幅系を取り込ませてもよく、取り込ませなくてもよい。
【００３７】
電位差測定も、試料中のＩＭＡ量の測定に利用できる。測定は、参照電極とイオン選択電極（測定される被検体に特異的）の両方、または組合わせ電極（同様に、測定される被検体に特異的）を試料中に配置することにより実施できる。イオン選択電極と参照電極により測定できる被検体の量に基づいて、試料の電位測定を行う。次いで、アルブミンに対して適正な比率の被検体を添加する。イオン選択電極と参照電極の電位差は、被検体がアルブミンにより封鎖され、イオン選択電極への被検体の泳動が十分に行われた後に残る被検体の量に応じて、変化するであろう。
【００３８】
電流検出法
被検体の電気化学的検出には多様な方法があるが、電流態様では電気化学的システムにより電流の変化を測定する。図１に示すように、一般的な電気化学的システムには、容器８内の溶液を介して互いに接した２または３つの電極、すなわち作用電極２、参照電極４および任意の補助電極６が必要である。これらの電極は、電位を印加しかつ電流を測定するポテンショスタット１０に接続され、この電流は適切な出力デバイス、たとえばコンピューター１２またはストリップチャート記録計へ信号として伝達される。
【００３９】
概念的に、ポテンショスタットは溶液中の２つの電極からなる。その１つは参照電極であり、これに対してすべての電圧測定値が参照される。しかし一般に参照電極は、それに電流が流れないときは基準として適正に作動するだけである。したがって、発生する電流の量に応じて、追加電極である補助電極が必要となる場合がある；これは電流を流すことができるが、参照電極と同じ電圧に維持される。機能性ポテンショスタットの基本的構成要素を図２に示す。３つの電極、すなわち参照電極４、作用電極２および補助電極６を、測定すべきイオン種を含有する溶液中に配置する。補助電極６と作用電極２の間に電流を流す。電流が変化する（増減または極性の変化）のに伴い、作用電極２と参照電極４の間の電圧を測定し、電圧がゼロになるまで電流を調整する。この時点で作用電極２の電圧は参照電極４の電圧とちょうど同じであるが、参照電極４には電流が流れていない。作動ポテンショスタットの詳細は当業者に周知である。
【００４０】
レドックス反応は電子の伝達を伴う。被酸化種は他の種へ電子を供与した種である。その際、電子を受容する種を被還元種という。これらの電子が流れる方向は、標準レドックス電位（Ｅ0により表示）により誘導される。コバルトのレドックス半反応は下記のとおりである：
Ｃｏ3+＋ｅ-    →  Ｃｏ2+        Ｅ0＝−１．９２Ｖ
Ｃｏ2+＋２ｅ-  →  Ｃｏ（ｓ）    Ｅ0＝−０．２８２Ｖ
Ｅ0は、標準水素参照電極に対比して設定され（標準の温度、ｐＨおよび活性で）、したがって用いる参照電極のタイプに基づいて調整されなければならない。たとえばＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極は、Ｅ0を０．１９７Ｖシフトさせる必要がある。したがって、この場合、反応を誘導するためにＣｏ3+＋ｅ-  →  Ｃｏ2+には−２．１１７Ｖが必要であろう。Ｅ0よりプラスの電位はその種を酸化形にし、これに対しＥ0より低い電位はその種を還元形にするであろう。これは半反応に関する下記のネルンスト（Ｎｅｒｎｓｔ）方程式に従う：
Ｅ＝Ｅ0−（ＲＴ／ｎＦ）ｌｎ（［Ｒｅｄ］／［Ｏｘ］）
式中：
Ｅ＝印加電位
Ｅ0＝その反応の標準レドックス電位（用いる参照電極のタイプに合わせて調整）
Ｒ＝定数８．３１４Ｊ／Ｋ・ｍｏｌ
Ｔ＝温度（Ｋ）
ｎ＝反応中に伝達された電子数
Ｆ＝ファラデー定数（９．６４８×１０4Ｃ／ｍｏｌ）
［Ｒｅｄ］＝被還元種の濃度
［Ｏｘ］＝被酸化種の濃度
電子がある種から他の種へ伝達されるのに伴って、それらを電流として検知し、定量することができる。
【００４１】
複雑なマトリックス、すなわち多数の物質の混合物または溶液においてレドックス反応を測定することができる。これらの反応を測定するためのは、その系に参照電極と対比した電位を印加できることが必要である。その系は、適切な電位を印加して作用範囲内で電流を測定できるポテンショスタット、およびバックグラウンド電流を除くことができるオフセット；作用電極；参照電極；ならびに場合により補助電極の使用を必要とする。
【００４２】
作用電極は目的とする反応（すなわち電子の伝達）が起きる場所である。作用電極はいずれかの固体状態の電極であってよく、白金、炭素、黒鉛、金および水銀／金属アマルガムが含まれるが、これらに限定されない。これらの固体状態の電極は、電極表面にタンパク質が蓄積するのを防ぐためにマトリックスタンパク質から隔離されていることが要求される場合もあり、されない場合もある。ポリマーコーティングまたは他のいずれかのフィルターもしくはバリヤー隔離を採用できる。ポリマーコーティングにはペルフルオロスルホナート（Ｎａｆｉｏｎ、商標）および酢酸セルロースが含まれるが、これらに限定されない。作用電極は半固体状態または液体の電極であってもよく、カーボンペースト電極、水銀フィルム電極および水銀滴電極が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
参照電極は、作用電極が目的電位を維持するための相対点を与える。参照電極は、銀線、銀／塩化銀、白金、炭素、黒鉛、金、ならびに他のいずれかの固体状態、半固体状態および液体の電極から作成できる。
【００４４】
補助電極は、測定する唯一の電流が被検体から生じるものとなるように、参照電極と作用電極の間にゼロ電流を維持する（電流の蓄積を防ぐ）作用をする。補助電極は前記の固体状態電極のいずれであってもよい。
【００４５】
作用電極は、支持体として使用でき、これにレドックス反応により分析種を吸着し、次いで第２レドックス反応により離脱させて測定する（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｗａｎｇ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００２参照）。そのような方法を一般に吸着式またはストリッピング式ボルタンメトリーと呼ぶ。そのような方法の結果を実施例１に記載し、図３に示す。試料に添加するコバルトの濃度を高めるとそれに応じて電流測定値が増大することが見いだされた。これは、発生する電流がコバルト依存性であることを証明する。
【００４６】
封鎖されていない被検体の信号応答を増強するために錯化剤（すなわち指示薬または増幅剤）を系に添加することができる。漸増濃度のコバルトを含有する試料に過剰量の錯化剤を添加すると封鎖されていない金属イオンに関連する電流測定値を増大させうることを実施例２に記載し、図４に示す。錯化剤は金属イオンと錯体を形成し、この錯体を電流の形で測定できる。Ｃｏイオンまたは錯化剤のみを添加した対照実験では、同じ電位で電流が発生しなかった。金属イオンと錯化剤の錯体を検出するために印加する電流発生電位は、一般に試料中の遊離金属イオンを検出するために印加する電流発生電位と異なる。
【００４７】
封鎖されていないコバルトイオンの検出に錯化剤法を用いると、ＡＣＢ（商標）検査により虚血陽性と判定された個体は、電流測定値が指示するように、非虚血試料についての電流測定値との有意差を示す非封鎖コバルト錯体濃度を伴うことが見いだされた。
【００４８】
生体試料中のコバルトの直接測定は、実施例３および４に記載し、図５および６に示すアンペロメトリー法または走査ボルタンメトリー法により実施できる。そのような方法を用いて、臨床試料の診断に有用な標準曲線を作成できる。
【００４９】
アルブミンへのコバルト結合の特異性は、ＡＣＢ検査法に関して記載されており（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  ｏｎ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｍａｒｋｅｒｓ、２００２年夏、発表のために受理）、各実施例に記載する電気化学的試験によりさらに支持される。本明細書に記載するように、試料中の一定のＣｏイオン濃度については、コバルト電流ピークは試料中に存在するアルブミンの濃度に逆依存する。
【００５０】
アルブミンに対する修飾は、虚血組織に暴露された結果起きると考えられる（ＰＣＴ／ＵＳ９９／２２９０５、１９９９年１０月１日出願）。提唱されたそのような修飾の１つは、アルブミンの金属封鎖部位（そのうちＮ末端が主要部位）への銅の結合である。実施例に記載するように、漸増濃度の銅と錯化したアルブミンを含有する試料は、反応可能なコバルトイオンによる電流増大を示す。
【００５１】
実施例にさらに記載するように、本発明の電気化学的方法による虚血事象の診断と確立されたＡＣＢ検査法による診断との間に強い相関性があることが認められた。
電位差法
２つの”コンパートメント”に関して分析種の活性に変化がある場合、電位差を測定できる。これらのタイプの電位差を測定するためには、一般にイオン選択電極が用いられる。イオン選択電極は、外側コンパートメント（膜の外側、またはバルク溶液）と対比した電極の内側コンパートメント（膜の一方側）の分析種の活性を選択的に測定する。膜の両側の活性の差は、膜を介した電位差を生じる。膜が選択性であるイオン（１以上）は、それらの濃度勾配に基づいて膜を通って拡散する。膜の低活性側に最終的に泳動イオンと共通の電荷（＋／−）が蓄積してそれ以上のイオン泳動が阻止され、この時点で２つのコンパートメント間の一定の電位に到達する。
【００５２】
自由エネルギー方程式から誘導される、２つのコンパートメント間の電位差は、下記のとおりである：
Ｅ＝（ＲＴ／ｎＦ）ｌｎ（Ａ1／Ａ2）
すなわち２５℃ではＥ＝（０．０５９１６／ｎ）ｌｎ（Ａ1／Ａ2）
Ｅ＝生じた電位差
Ｒ＝定数（８．３１４Ｊ／ｍｏｌ・Ｋ）
Ｔ＝温度（Ｋ）
ｎ＝イオンの電荷
Ａ1＝第１コンパートメント内のイオンの活性
Ａ2＝第２コンパートメント内のイオンの活性
活性はイオン濃度を推定するためにしばしば用いられる。
【００５３】
４つの基本的なタイプのイオン選択電極がある：ガラス膜電極、固体状態の電極、液体ベースの電極、および化合物電極。
ガラス膜電極は一般に一価カチオンに用いられる。異なるガラス組成物は異なる一価カチオンに対して選択的であるが、最も一般的な例はＨ+に対して選択的なｐＨメーターである。
【００５４】
固体状態の電極は無機塩を膜として用い、その際、目的イオンを結晶格子のポケット内に捕捉できる。次いでイオンは、隣接ポケットの１つから次ぎのポケットへ移動することにより、結晶格子を通って泳動できる。一般的な例はフッ化物電極である。
【００５５】
液体ベースの電極は、疎水性液状イオン交換体で飽和した疎水性ポリマー膜を用いる。この場合、疎水性ポリマー膜はそれに溶解したイオン”輸送体”を含むことができる。一例は、有機溶剤に溶解したアポ−シアノコバラミンであり、これは疎水膜中においてコバルトに対する選択的イオン交換体となる。
【００５６】
イオン選択電極を尖端直径１０μｍという小さなマイクロ電極に縮小して、きわめて小容量の測定を行うことができる。イオン選択電極は錯化していないイオンに対してのみ応答し、前記で考察したパラメーターを変化させることにより、他の（妨害する可能性のある）イオンと対比した選択性に関して”微小調整”できる。測定中に溶液のイオン強度が一定のままであれば活性係数も一定のままであり、イオンの活性測定値はそのイオンの濃度と等しい。
【００５７】
装置
図１０に示したデバイスは、本発明の電流態様または電位差態様のいずれにも使用できる。このデバイスは、手で持つのに適したサイズのエレクトロニクスモジュールを含む。これは、病院での使用に適した丈夫な耐水性プラスチック材料内に収容されている。病院では血液などの体液と接触する可能性があるため、清浄処理しやすいものでなければならない。ハウジング１４には、読取りエレクトロニクス、電源（たとえば電池）、および測定操作の実施に必要な他の構成要素が収容されている。
【００５８】
ハウジング上に１以上の機能キー１６および２０があり、オペレーターがこれらを用いて測定操作を開始し、パラメーターを変更し、患者ＩＤなどのデータを入力できる。分かりやすくするために図１０には３つの機能キーを示すが、テキスト入力できるようにゼロから全キーボードまで任意数があってよい。
【００５９】
同様にハウジング上に設けることができるものは、検査室情報システムとの連絡のための機構（図示されていない機構）である。これは、たとえば直接電気接続（たとえばＲＳ２３２系列、および１００ＢａｓｅＴ  Ｅｔｈｅｍｅｔ通信）、赤外線リンク（赤外線パルスによる伝達）または無線リンク（無線送信機／受信機）であってよい。
【００６０】
オペレーターからみてハウジング前面に、電位差または電流の測定結果を表示するのに用いられるディスプレー１８、および他の通信手段、たとえばシステム状態、故障状態、電池低下の指示器などがあってもよい。
【００６１】
ハウジングの一端に開口３０があり、ここへ試料ストリップを挿入して結果を読取ることができる。
試料ストリップも図１０に示されている。ストリップ２２は使い捨てであってよく、好ましくは絶縁性かつ耐水性の材料で作成される。これには試料ウェルまたは容器２６が含まれる。前記のように、このウェル内に電極２４がある。各電極２４は、それに対応する導線またはトレース３２（プリント導線または電線であってよい）を介してそれに対応するストリップ接点２８と接続し、電気的に連続している。
【００６２】
使用する際には、体液（たとえば血液、尿、唾液）の試料を試料ウェルに導入する。適切な時間の後、この検査デバイスをハウジング１４の開口３０に導入する（注意：オペレーターが”装填済み”ストリップを取扱うことによりバイオハザードと接触するのを最小限に抑えるために、開口に既に挿入したストリップに生体試料を添加する方が良い）。ストリップ接点２８とモジュール開口内の接点（図示していない）が電気的に接触し、これらがエレクトロニクスと電気的に連続し、かつ場合によりディスプレー１８とも接続する。電極２４により、試料について電気的測定が行われる。ディスプレー１８が測定順序および／または検査結果を指示した後、使い捨て検査デバイスをモジュールから取り外して廃棄することができる。
【００６３】
当業者に自明のとおり、図１０のデバイスの別形態、たとえば卓上型デバイスを用いて本発明を実施することもできる。さらに、本発明方法を自動化して、分析に伴う操作時間および経費を節減することができる。
【００６４】
用途
本明細書に記載した虚血事象の診断方法は多数の臨床用途をもつ。１態様においては、本発明方法を用いて運動負荷誘発虚血を検知できる。虚血状態であることが分かっているかまたはその疑いのある患者の安静時と運動中の虚血レベルを比較して評価することができる。まず患者試料を入手して分析する；次いで患者にトレッドミル（踏み板）テストまたは他の運動を行わせる；次いでもう一度患者試料を入手して分析する；そして検査結果を比較する。追加評価するために、これらの段階をさらに数回繰り返してもよい（たとえば３カ月後、６カ月後または１年後）。この用途は、ｉｎ  ｓｉｔｕ冠血管ステントの開存性または経皮心臓介入（たとえば血管形成処置）の有効性を評価するのに有用である。
【００６５】
本発明方法は、普段は無症状の患者（無症候性虚血）において、運動により誘発される虚血の存在を検知するのにも利用できる。この場合も、患者から試料を採取し、患者にトレッドミルテストなどを行わせ、そして２回目の試料を得る。普段は無症状の患者における虚血の検知により、冠動脈疾患その他の虚血状態の重症度を軽減できる。無症候性虚血は、単一試料、すなわち運動誘発テストのものではない試料について検知することもできる。
【００６６】
他の態様では、患者、特に１以上の心臓リスク因子をもつ患者において、虚血の存在を除外する（虚血がないことを確認する）ための方法として本発明方法を利用できる。そのようなリスク因子には、５０歳以上の年齢、喫煙歴、糖尿病、肥満症、高血圧、高コレステロール、および強い心臓疾患家族歴が含まれる。虚血事象の除外は、医療資源の適正な配分に重要である：虚血事象の状態ではないことが分かった患者には、実際に急性冠血管症候群の状態にある患者に行うための全域の検査および処置を施す必要がない。この用途の１態様においては、患者から初期試料を入手し、次いで患者にトレッドミルテストまたは他の運動を行わせた後に第２試料を採取する。これらの検査結果を比較すると、運動によって亢進した代謝条件下でのみ虚血事象が誘発されるのかが明らかになる。さらに、虚血事象の除外は、単一の患者試料、すなわち運動誘発テストのものではない試料について行うこともできる。
【００６７】
本発明方法は、狭心症または狭心症様症状を伴う患者の評価に使用して、心筋梗塞の発症を検知することができる。虚血および心筋梗塞の指示において、本発明方法の結果とＥＣＧの結果が一致するか比較する。
【００６８】
さらに本発明方法は、経皮心臓介入、たとえば血管形成処置の有効性を評価するのに使用できる。処置前および処置後の予め定めた時点で患者試料を採取して、患者の虚血状態を評価する。
【００６９】
本発明方法は、ＥＣＧ結果の補足として用いることにより虚血事象の発症または非発症を判定できる。この用途は、外科処置を受けつつある患者に特に有用であろう。
本発明方法は、患者において一時性（ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ−ｌｉｍｉｔｅｄ）虚血事象の発症を検知するためにも使用できる。一時性虚血事象には、たとえば運動または薬物使用に関連する虚血事象が含まれる。
【００７０】
本発明方法は、発作様徴候を伴う患者において虚血事象を検知するためにも使用できる。この状況で本発明方法を用いると、虚血性発作と出血性発作を識別できる。
さらに本発明方法は、血栓溶解薬または虚血心筋の改善により虚血事象を軽減するための薬物など他の薬物による療法の有効性を評価するのに使用できる。薬物療法前および療法後の予め定めた時点で患者試料を入手して、療法による虚血事象軽減を検知する。
【００７１】
さらに本発明方法は、妊娠女性において胎盤不全症の検知に使用できる。一般に母親から試料を採取する；ＩＭＡの存在は胎盤における虚血状態の指標となりうる。
実施例
実施例１−コバルト濃度と電流測定値の相関性
吸着式またはストリッピング式ボルタンメトリーを用いて、試料中の漸増濃度のコバルトと発生電流の相関性を調べた。コバルトを体液に添加し、非修飾アルブミンに結合する時間をおく。アルブミンへのコバルトの結合反応速度を予め調べ、この結合反応は１分より速いことが示された。循環ボルタンモグラム形式のこの例では一連の電位を印加したが、電位を段階的に印加することもでき、これにより反応可能なコバルトをレドックス反応させてコバルトを作用電極に吸着させた。２回目のコバルトレドックス反応で、電極に吸着したコバルトの量を、ある範囲の電位を走査するのに伴う電流の形で測定した。こうして発生したコバルト依存性電流ピークを、５６〜１７４ｍＭのコバルト濃度範囲にわたって図３に示す。コバルト濃度変化に一致した電流変化がみられ、発生した電流が実際にコバルト依存性であることが証明された。
【００７２】
実施例２−封鎖されていない金属イオンに関連する電流を増強するための錯化剤の使用
コバルトイオンの信号応答を増強するために、錯化剤ＤＭＧを試料に添加した。漸増濃度のコバルトを生体試料に添加し、非修飾アルブミンに結合させた。次いでコバルト濃度より過剰の一定濃度のＤＭＧを試料に添加し、ボルタンメトリー法を用いてＣｏ（ＤＭＧ）2錯体を電流の形で検出した。この場合、コバルト濃度範囲０．０９４〜１．７８０ｍＭが用いられ、コバルト濃度変化に対する適切な電流値変化が示された。対照実験ではコバルトおよびＤＭＧを別個に添加し、適切な電位で電流応答が示されなかった。これは、発生した信号がＣｏ（ＤＭＧ）2錯体の形成に依存し、したがって系内に存在する反応可能なコバルトの量に比例することを示す。
【００７３】
虚血個体と非虚血個体の集団差を調べる際の臨床有用性を証明するために、錯化法を用いてさらに実験を行った。ＡＣＢ（商標）検査法（Ｉｓｃｈｅｍｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，コロラド州デンバー）により正常値上限の第９５パーセンタイルを規定カットオフとして用いて、虚血陽性試料を決定した（臨床検査室基準に関する国際委員会、臨床検査室において標準間隔を決定および測定する方法；承認された指針，ＮＣＣＬＳ，１９９５；Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｃ２８−Ａ，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．４）。これより高い数値をいずれも”虚血”とみなし、これより低い数値をいずれも”非虚血”とみなす。両側ｔ−検定は、コバルト錯化剤を用いる電気化学的方法が虚血試料と非虚血試料を有意に識別することを示した（ｐ値＝０．０１）。
【００７４】
実施例３−アンペロメトリーによるコバルトイオンの測定
生体試料に添加した反応可能なコバルトを、アンペロメトリー法で直接測定できる。これらの実験では、時間をかけてコバルトを試料に逐次添加し、その間にレドックス反応を誘導する電位を系に印加した。図５に示すように、試料のコバルト濃度変化が出力電流の変化として検知され、高濃度でコバルトとの飽和関係が証明された。
【００７５】
実施例４−走査ボルタンメトリーによるコバルトイオンの測定
生体試料中の反応可能なコバルトを、循環ボルタンメトリーまたはこれに類する走査電位法、たとえばステップボルタンメトリーにより直接測定できる。試料中に存在するアルブミンの量に対して過剰のコバルトを添加し、非修飾アルブミンに結合させた。次いで、コバルト依存性電流を測定するのに適した範囲の電位を走査した。図６に、漸増範囲のコバルト濃度（０〜１２００μＭ）にわたって得られたコバルト電流応答増大のプロットを示す。これは、電流応答がコバルト依存性であり、相対濃度範囲を容易に検出できることを示す。
【００７６】
実施例５−電流により測定したアルブミンへのコバルト結合の特異性
アルブミンへのコバルト結合の特異性は、コバルト電流ピークが試料中に存在するアルブミンの濃度に依存することを示すことにより支持される。生体試料に漸増濃度のアルブミンを装入した。次いで各試料に一定濃度のコバルトを添加し、非修飾アルブミンに結合させた。次いで、コバルト電流ピークを生じるのに適した範囲の電位を走査した。図７は、予想どおり漸増濃度のアルブミンに対するコバルト電流応答の低下を示す。これは、アルブミンがコバルトを電気化学的方法による検出から封鎖することを示す。
【００７７】
実施例６−銅の増加に伴う電流およびコバルトイオンの増加
提唱された虚血機序のひとつは、虚血事象に際して銅がアルブミンのＮ末端に結合するというものである。漸増濃度の銅を正常試料に添加することにより、虚血試料を模倣した。この方法は、１ｍＭの銅でＡＣＢ値の平均上昇６０％を示した。次いでコバルトを試料に添加し、コバルトのレドックス反応から得られるコバルト依存性電流ピークを生じるのに適した範囲の電位を走査した。図８は、これらの条件下での電気化学的システムにおける応答を示す。銅濃度が増大して銅がアルブミン上の封鎖部位に結合するのに伴って、コバルトを封鎖する部位が減少するので、コバルト電流応答は増大する。１ｍＭの銅で、電気化学的出力信号（電流）の増大は約３０％である。銅はアルブミンに対してコバルトより高い親和性をもつため（それぞれ１０16および１０4）一次部位への結合において競合はないので、電流の増大はコバルトによるものである。さらに、銅のレドックス電位はコバルトのレドックス電位と重ならない。
【００７８】
実施例７−電流検出法による診断とＡＣＢ検査法による診断の相関性
銅を添加した正常試料はＡＣＢが増大して正常範囲から虚血範囲へ移行する。ＡＣＢ検査法で虚血範囲にあると判定された銅添加試料およびＡＣＢ検査法で非虚血と判定された試料を用いて、２つの試料集団を作成した。これらの試料を、一定濃度のコバルトの添加およびコバルト電流ピークを生じるのに適した電位の走査により試験した。これらの集団から得られた電流応答を用いて、これらの集団をこの方法で統計的に識別できるか判定した。両側ｔ−検定を用いて、図９に示すように有意の集団差が示された（ｐ値＝０．００４０）。
【００７９】
実施例８−虚血検知のための電位差法
イオン選択電極（ＩＳＥ）は、生体試料中の電解質（たとえばＮａ+およびＫ+）を測定する臨床試験に一般に用いられる。バリノマイシンは膜をカリウム選択性にするためにしばしば用いられる（Ｃａｔｔｒａｌｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４６（１４）：２２２３−６）。ＩＳＥは血清アルブミンへの銅の結合を測定するのにも有用であることが示され（Ｍｏｈａｎａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７１（１０）：１１８０−２）、したがってＩＳＥは複雑な試料マトリックス中の遊離金属イオンを測定できることが証明された。Ａｌｔｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．２２４：２１１−３４は、マグネシウム濃度を測定した際、血漿試料と血清試料から得たＩＳＥ信号間に認めうるほどの差がないことを証明した。
【００８０】
本明細書およびＰＣＴ／ＵＳ９９／２２９０５に考察されるように、アルブミン−コバルト結合を検知するための既存の方法（ＡＣＢ）は、比色法による患者試料中の遊離コバルト検出を伴う。この実施例は、選択電極を使用し、次いでその結果を現在のＡＣＢ検査方式と相関させることにより、生体試料中の遊離コバルトを検出できることを証明する。
【００８１】
イオン選択電極の設計
１．下記によりコバルト選択膜を作成する。非水性溶剤、たとえば３−ニトロ−ｏ−オキシレン中におけるアポ−コバラミンの飽和溶液を調製する。溶剤をガラス管に入れ、アポ−コバラミンの全濃度が高すぎて非水性溶剤に完全には溶解しないようにアポ−コバラミンを添加する。この混合物をコバルト選択膜として用いる。
【００８２】
２．フィラメントを含み、または含まず、前延伸内径１．０〜１．５ｍｍのガラス毛管を電極本体として用いる。
３．ガラス毛管にアセトンを流すことにより、毛管の内側を洗浄する。この洗浄により、製造中に導入された石油製品が除去されるであろう。
【００８３】
４．毛管に脱イオン水を流すことによりアセトン残留物をすすぎ去り、オーブン内で３０分間ベーキングして乾燥させる。
５．毛管を電極延伸機で延伸して、尖端外径が１０〜７０ｕｍになるように尖端開口を調整する。尖端開口は尖端にガラス棒を”打ち当てる”ことにより調整することができ、あるいはカミソリの刃または解剖はさみで尖端を切ってもよい。
【００８４】
６．次いで、電極の尖端にマイクロハミルトン注射器で１滴のクロロジメチルシランを付与することにより、電極をシラン処理する。
７．次いで、クロロジメチルシランからの蒸発ヒュームが細い尖端を通り抜けるように、尖端を上に向けて電極を８０℃のオーブンに１時間入れておく。
【００８５】
８．次いで尖端にコバルト選択膜をマイクロハミルトン注射器で充填する。電極尖端に気泡を導入しないように注意しなければならない。
９．次いで、マイクロハミルトン注射器を用いて２５ｍＭ塩化コバルト溶液を後方充填する。その際、コバルト選択膜と塩化コバルト溶液が”混和”しないように注意する。塩化コバルト溶液は、膜上に膜と接して直接積層すべきであるが、２層が混和すべきではない。
【００８６】
１０．次いで銀線を電極の太い末端から塩化コバルト溶液中へ挿入する。この線は作用電極接点として機能する。この線を適所に保持するために、電極尖端をシールしてもよい。この線がコバルト選択膜と接触しないことが確実となるように注意しなければならない。
【００８７】
１１．銀／塩化銀線を参照電極として用いる（塩橋を含む銀／塩化銀参照電極を用いて信号を改善することができる）。
作用電極線および参照電極線を記録用エレクトロスタットに接続する。エレクトロスタットは高い入力インピーダンスをもち、これにより、確実に作用電極と参照電極の間の電位差が測定される唯一のものになる。エレクトロスタットの代わりに、十分な入力インピーダンスをもつ電圧計を用いてもよい。標準電圧計と共に、十分な入力インピーダンス条件をもつコネクターも使用できる。
【００８８】
標準曲線の作成
作用電極と参照電極の間に生じる電位差を遊離コバルト濃度に換算できるように、標準曲線を作成する。０．９％ＮａＣｌ中６ｇ／ｄＬのＩｇＧからなる試料を用いて、添加コバルトを封鎖する容量のない想定試料マトリックス条件を模倣する。作用電極と参照電極を両方とも試料と接触させて配置する。種々の濃度（５、１０、１５、２０および２５ｍＭ）の塩化コバルト溶液を試料に添加し、生じる電位を記録する。電位をコバルト濃度に対してプロットした結果は理想的には直線になるはずであり、あるいは非直線関数を用いて曲線をあてはめることができる。その後の遊離コバルト実験測定値を定量できるように、プロットに対する直線または曲線あてはめ方程式を記録する。
【００８９】
作用電極を２４時間使用していない場合、または試薬を変更した場合、装置および試薬を試料検査前に再検量すべきである。
コバルトに対するＩＳＥの選択性の試験
イオン選択電極の選択性は、選択係数により決まる。
【００９０】
ＫX,Y＝Ｙに対する応答／Ｘに対する応答
この場合：
Ｘ＝Ｃｏ2+
Ｙ＝コバルトに類似したサイズ、電荷または特性をもち、ＩＳＥが応答する可能性のある、他のいずれかの分析種；
Ｙには、高濃度で被験試料タイプ中に存在する遊離金属イオンも含まれる。理想的には、選択係数はきわめて小さくなければならない（Ｋ＜＜１）。これは、その電極がコバルトに対して高選択性であることを示す。
【００９１】
生体試料中の妨害の可能性をもつ３種の金属はＦｅ2+、Ｎｉ2+およびＣｕ2+である。これらの金属が遊離状態で試料中にみられる可能性はないであろうが、イオン選択電極を用いてコバルトに対する選択性を試験し、適切であることを示すべきである。
【００９２】
Ｆｅ2+、Ｎｉ2+およびＣｕ2+を被検体として用いて各標準曲線を作成する。
０．９％ＮａＣｌ中６ｇ／ｄＬのＩｇＧからなる試料を用いて、生体マトリックスを模倣する。種々の濃度（５、１０、１５、２０および２５ｍＭ）のＦｅＣｌ2を試料に添加し、各濃度で作用電極と参照電極の間に生じる電位を記録する。５ｍＭ  Ｆｅ2+からの電位応答を調べ、５ｍＭ  Ｃｏ2+からの電位応答で割ることにより、Ｆｅ2+と対比したＣｏ2+に対する選択係数を計算する。試験したすべてのＦｅ2+濃度についてこの計算を続行する。すべての選択係数がきわめて小さくなければならない。
【００９３】
この操作を同濃度のＮｉ2+およびＣｕ2+について繰り返す。
患者試料の検査
作用電極と参照電極を生体試料（たとえば血漿、血清、全血）に装入する。この場合、電位差が測定されないか、またはきわめてわずかな電位差が測定されるべきである。この作用電極は遊離コバルトのみを測定でき、試料中には遊離コバルトはきわめてわずか存在するか、または全く存在しないはずだからである。信号が測定された場合、それをバックグラウンドノイズとし、最終測定値から差し引くことができる。２５ｍＭの塩化コバルト溶液を試料に添加し、作用電極と参照電極の間の安定化した電位差を測定する。信号が安定化した時点で、コバルトを結合および封鎖できるすべてのアルブミン部位が占有されており、試料中の反応可能な封鎖されていないコバルトから信号（ミリボルト、ｍＶ）が発せられる。
【００９４】
次いで、安定化した電位測定値を用い、適切な検量曲線を参照して、試料中の反応可能な封鎖されていないコバルトを定量できる。
ＩＳＥとＡＣＢの相関性
ＰＣＴ／ＵＳ９９／２２９０５に示された既存のアルブミン−コバルト結合（ＡＣＢ）検査法は、試料中の反応可能な封鎖されていないコバルトを比色測定することにより、ＩＭＡを測定する。ＡＣＢ法とＩＳＥ法の相関性は、両方法で試料を試験することにより確認できる。ＩＳＥ法からのｍＶ結果をｙ軸にプロットし、ＡＣＢ（Ｕ／ｍｌ）結果をｘ軸にプロットしたプロットを作成する。得られた線に関する相関係数は、ＡＣＢ検査法に対するＩＳＥ法の相対的性能の指標である。
【００９５】
新規方法の精度を判定するために、両方法で測定した対応する個々の試料間の相異％を計算することにより、バイアスプロットを作成すべきである。
ＡＣＢ検査法について確立した臨床データを用いて、本明細書に記載した電位差プロトコルにより測定した反応可能な封鎖されていないコバルト濃度を、虚血事象の診断となると認められた予め定めたコバルト値と比較することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】電気化学的測定デバイスに必要な構成要素を示す。
【図２】機能性ポテンショスタットの基本的構成要素を示す。
【図３】吸着法により測定したコバルト依存性電流ピークのグラフを示す。
【図４】錯形成配位子によりボルタンメトリー法で測定したコバルト依存性電流ピークのグラフを示す。
【図５】アンペロメトリーにより測定したコバルト電流応答のデータ出力プロフィールを示す。
【図６】循環ボルタンメトリーにより測定したコバルト依存性電流応答のデータ出力プロフィールを示す。
【図７】漸増濃度のアルブミンの存在下でのコバルト依存性応答を示す。
【図８】漸増濃度の銅の存在下でのコバルト依存性応答を示す。
【図９】循環ボルタンメトリーにより測定した体液中に存在する正常アルブミンと修飾アルブミンの有意集団差を示す。
【図１０】本発明方法の実施に適したハンドヘルド型ポイント・オブ・ケアデバイスを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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