(57)【要約】本発明は、ｓｒｃチロシンキナーゼと相互作用しそして阻害する化合物を用いる処置に対する細胞（例えば、大腸セルライン）の相対的な内因的感受性または耐性と、相関することが発見されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを記載する。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、加重投票クロスバリデーションプログラムによって、これらの化合物に対する内因的耐性および感受性を予測する際に有用性を有することが分かった。発現レベルが薬物感受性または耐性と高く相関する該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、薬物応答を予測する方法において、並びに疾患の管理（特に、ｓｒｃチロシンキナーゼ経路のｓｒｃチロシンキナーゼによるシグナル伝達が疾患プロセスに関与する疾患領域）における予後的または診断学的な指示物質として、有用であるポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターまたはマーカーのセットを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現パターンが、タンパク質チロシンキナーゼ活性、またはタンパク質チロシンキナーゼ経路の要素をモジュレートする化合物を用いる処置に対する細胞の応答の予測である、複数のポリヌクレオチドを含有するプレディクターセット。
【請求項２】
ポリヌクレオチドは、
ａ）表３中で提供するポリヌクレオチド；
ｂ）表３中で提供する感受性プレディクターポリヌクレオチド；
ｃ）表３中で提供する耐性プレディクターポリヌクレオチド；
ｄ）表４中で提供するポリヌクレオチド；
ｅ）表４中で提供する感受性プレディクターポリヌクレオチド；
ｆ）表４中で提供する耐性プレディクターポリヌクレオチド；
ｇ）表５中で提供するポリヌクレオチド；
ｈ）表５中で提供する感受性プレディクターポリヌクレオチド；
ｉ）表５中で提供する耐性プレディクターポリヌクレオチド；
ｊ）表６中で提供するポリヌクレオチド；
ｋ）表６中で提供する感受性プレディクターポリヌクレオチド；および
ｌ）表６中で提供する耐性プレディクターポリヌクレオチド、
からなる群から選ばれる、請求項１記載のプレディクターセット。
【請求項３】
複数のポリヌクレオチドは、
ａ）少なくとも約５個のポリヌクレオチド；
ｂ）少なくとも約１０個のポリヌクレオチド；
ｃ）少なくとも約１５個のポリヌクレオチド；
ｄ）少なくとも約２０個のポリヌクレオチド；
ｅ）少なくとも約２５個のポリヌクレオチド；および
ｆ）少なくとも約３０個のポリヌクレオチド、
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドの数を含む、請求項２記載のプレディクターセット。
【請求項４】
複数のポリヌクレオチドは、
ａ）表１０中で提供するポリヌクレオチド；
ｂ）表１０中で提供する感受性プレディクターポリヌクレオチド；
ｃ）表１０中で提供する耐性プレディクターポリヌクレオチド；
ｄ）表１１中で提供するポリヌクレオチド；
ｅ）表１１中で提供する感受性プレディクターポリヌクレオチド；
ｆ）表１１中で提供する耐性プレディクターポリヌクレオチド；
ｇ）表１２中で提供するポリヌクレオチド；
ｈ）表１２中で提供する感受性プレディクターポリヌクレオチド；
ｉ）表１２中で提供する耐性プレディクターポリヌクレオチド、
からなる群の要素を含む、請求項３記載のプレディクターセット。
【請求項５】
タンパク質チロシンキナーゼは、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、Ｌｃｋ、Ｌｙｎ、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒからなる群から選ばれる、請求項４記載のプレディクターセット。
【請求項６】
化合物は、
ａ）該ポリヌクレオチドに向けられるアンチセンス試薬；
ｂ）該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに対する抗体；
ｃ）小分子化合物、
からなる群から選ばれる、請求項５記載のプレディクターセット。
【請求項７】
化合物は、
ａ）ＢＭＳ−Ａ；
ｂ）ＢＭＳ−Ｂ；
ｃ）ＢＭＳ−Ｃ；および
ｄ）ＢＭＳ−Ｄ、
からなる群から選ばれる、請求項５記載のプレディクターセット。
【請求項８】
細胞は大腸癌細胞である、請求項１記載のプレディクターセット。
【請求項９】
発現パターンは、タンパク質チロシンキナーゼ活性、またはタンパク質チロシンキナーゼ経路の要素をモジュレートする化合物を用いる処置に対する細胞の応答の予測である、複数のポリペプチドを含有するプレディクターセット。
【請求項１０】
ポリペプチドは、
ａ）表３中で提供するポリペプチド；
ｂ）表３中で提供する感受性プレディクターポリペプチド；
ｃ）表３中で提供する耐性プレディクターポリペプチド；
ｄ）表４中で提供するポリペプチド；
ｅ）表４中で提供する感受性プレディクターポリペプチド；
ｆ）表４中で提供する耐性プレディクターポリペプチド；
ｇ）表５中で提供するポリペプチド；
ｈ）表５中で提供する感受性プレディクターポリペプチド；
ｉ）表５中で提供する耐性プレディクターポリペプチド；
ｊ）表６中で提供するポリペプチド；
ｋ）表６中で提供する感受性プレディクターポリペプチド；
ｌ）表６中で提供する耐性プレディクターポポリペプチド、
からなる群から選ばれる、請求項９記載のプレディクターセット。
【請求項１１】
複数のポリペプチドは、
ａ）少なくとも約５個のポリペプチド；
ｂ）少なくとも約１０個のポリペプチド；
ｃ）少なくとも約１５個のポリペプチド；
ｄ）少なくとも約２０個のポリペプチド；
ｅ）少なくとも約２５個のポリペプチド；および
ｆ）少なくとも約３０個のポリペプチド、
からなる群から選ばれるポリペチドの要素を含む、請求項１０記載のプレディクターセット。
【請求項１２】
複数のポリペプチドは、
ａ）表１０中で提供するポリペプチド；
ｂ）表１０中で提供する感受性プレディクターポリペプチド；
ｃ）表１０中で提供する耐性プレディクターポリペプチド；
ｄ）表１１中で提供するポリペプチド；
ｅ）表１１中で提供する感受性プレディクターポリペプチド；
ｆ）表１１中で提供する耐性プレディクターポリペプチド；
ｇ）表１２中で提供するポリペプチド；
ｈ）表１２中で提供する感受性プレディクターポリペプチド；および
ｉ）表１２中で提供する耐性プレディクターポリペプチド、
からなる群の要素を含む、請求項１１記載のプレディクターセット。
【請求項１３】
タンパク質チロシンキナーゼは、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、Ｌｃｋ、Ｌｙｎ、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒからなる群から選ばれる、請求項１２記載のプレディクターセット。
【請求項１４】
化合物は、
ａ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに向けられるアンチセンス試薬；
ｂ）該ポリペプチドに対する抗体；および
ｃ）小分子化合物、
からなる群から選ばれる、請求項１３記載のプレディクターセット。
【請求項１５】
化合物は、
ａ）ＢＭＳ−Ａ；
ｂ）ＢＭＳ−Ｂ；
ｃ）ＢＭＳ−Ｃ；および
ｄ）ＢＭＳ−Ｄ、
からなる群から選ばれる、請求項１３記載のプレディクターセット。
【請求項１６】
細胞は大腸癌細胞である、請求項９記載のプレディクターセット。
【請求項１７】
化合物が細胞の活性をモジュレートすることができるかどうかを予測する方法であって、
ａ）細胞の標本を得て；
ｂ）該細胞が複数のマーカーを発現するかどうかを測定し；そして、
ｃ）該マーカーの発現と、該細胞の活性をモジュレートする化合物の能力とを相関する、
工程を含む、該方法。
【請求項１８】
複数のマーカーはポリヌクレオチドである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ポリヌクレオチドは、
ａ）請求項１記載のポリヌクレオチド；
ｂ）請求項２記載のポリヌクレオチド；
ｃ）請求項３記載のポリヌクレオチド；および
ｄ）請求項４記載のポリヌクレオチド、
からなる群から選ばれる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
化合物は、
ａ）請求項５記載の化合物；
ｂ）請求項６記載の化合物；および
ｃ）請求項７記載の化合物、
からなる群の要素である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
細胞は大腸癌細胞である、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
複数のマーカーはポリペプチドである、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドは、
ａ）請求項９記載のポリペプチド；
ｂ）請求項１０記載のポリペプチド；
ｃ）請求項１１記載のポリペプチド；および
ｄ）請求項１２記載のポリペプチド、
からなる群から選ばれる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
化合物は、
ｄ）請求項１３記載の化合物；
ｅ）請求項１４記載の化合物；および
ｆ）請求項１５記載の化合物、
からなる群の要素である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
細胞は大腸癌細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
発現レベルは疾患状態と関係する細胞の化合物感受性または耐性と相関する、ポリヌクレオチドおよびポリペチドを同定するための、複数のセルライン。
【請求項２７】
セルラインは大腸癌セルラインである、請求項２６記載の複数のセルライン。
【請求項２８】
セルラインは表１中に提供される１つ以上のセルラインを含む、請求項２７記載の複数のセルライン。
【請求項２９】
疾患状態に関係する細胞の化合物感受性および耐性を予測する、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを同定する方法であって、
ａ）請求項２８記載の複数のセルラインを１つ以上の化合物と反応させ；
ｂ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのマイクロアレイの発現パターンを分析し；そして、
ｃ）該マイクロアレイの発現パターンを用いることによって、疾患状態に関係する細胞の感受性または耐性を予測するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを選択する、
工程を含む、該方法。
【請求項３０】
化合物は、
ａ）請求項５記載の化合物；
ｂ）請求項６記載の化合物；
ｃ）請求項７記載の化合物；
ｄ）請求項１３記載の化合物；
ｅ）請求項１４記載の化合物；および
ｆ）請求項１５記載の化合物、
からなる群の要素である、請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
疾患は大腸癌である、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
疾患状態に対する処置を必要とする個体が該処置に対して十分に応答するかまたは応答しないかを予測する方法であって、該処置は、
ａ）該個体から細胞の標本を得て；
ｂ）該細胞が複数のマーカーを発現するかどうかを測定し；そして
ｃ）該マーカーの発現を、該処置に対して応答する個体の能力に相関させる、
工程を含む、該方法。
【請求項３３】
複数のマーカーがポリヌクレオチドである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ポリヌクレオチドは、
ａ）請求項１記載のポリヌクレオチド；
ｂ）請求項２記載のポリヌクレオチド；
ｃ）請求項３記載のポリヌクレオチド；および
ｄ）請求項４記載のポリヌクレオチド、
からなる群から選ばれる、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
化合物は、
ａ）請求項５記載の化合物；
ｂ）請求項６記載の化合物；および
ｃ）請求項７記載の化合物、
からなる群の要素である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
疾患状態は大腸癌である、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
複数のマーカーはポリペプチドである、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
ポリペプチドは、
ａ）請求項９記載のポリペプチド；
ｂ）請求項１０記載のポリペプチド；
ｃ）請求項１１記載のポリペプチド；および
ｄ）請求項１２記載のポリペプチド、
からなる群から選ばれる、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
化合物は、
ａ）請求項５記載の化合物；
ｂ）請求項６記載の化合物；および
ｃ）請求項７記載の化合物、
からなる群の要素である、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
疾患状態は大腸癌である、請求項３７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国仮出願番号60/350,061（2002年1月18日出願）の利益を主張する。該引用出願の完全な教示は、本明細書の一部を構成する。
【０００２】
(技術分野)
本発明は、一般的に薬理ゲノミクスの分野に関し、そしてより具体的には患者における薬物の感受性を測定するための新規で且つ別の方法および操作に関し、このものは分子レベルでの患者の応答に基づいて疾患および障害を処置する際に役立つ個別化された遺伝子プロファイルの開発を可能とする。
【０００３】
（背景技術）
薬理ゲノミクス研究の主要な目標は、臨床における薬物に対するある患者の応答を正確に予測する（predict）遺伝子マーカーを同定することであり；それら個別化された遺伝子評価は、テーラーメイド（personalized）処置を大きく促進するであろう。この性質の研究は、通常使用される薬剤が多数の患者において無効でありそして副作用が多い癌の処置および療法において特に必要とされる。
【０００４】
患者の標本の分類は、癌の診断および処置の重要な面である。薬物処置に対する患者の応答と、分子マーカーおよび遺伝子マーカーとの関連は、非応答性患者における薬物の開発についての新たな機会を開くことができ、あるいは効力についてのより高い信頼度のために他の処置の選択とは薬物の指標を区別することができる。更に、医薬、薬物または組み合わせ療法に対してよく応答するであろう患者を予め選択することは、臨床研究において必要とされる患者の数を減少することができ、あるいは臨床開発プログラムを完成させるのに必要とされる時間を加速することができる（M. Cockettらによる2000, Current Opinion in Biotechnology, 11: 602-609）。
【０００５】
薬物応答は標的細胞に内因的な性質だけでなく宿主の代謝的性質にも影響を及ぼすという理由で、患者における薬物感受性を予測する能力は、特に魅力的である。当該分野における当業者による薬物感受性を予測するために遺伝子情報を使用する努力は、広い効果を有する個々のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（例えば、多剤耐性のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ｍｄｒ１およびｍｒｐｌ）に主に集中している（P. Sonneveldによる2000, J. Intern. Med., 247: 521-534）。マイクロアレイ技術はまた、何千ものポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現パターンを同時にモニターし、複数のマーカーを分析し、そして癌をサブグループに分類することをより端的とする（J. Khanらによる1998, CancerRes., 58: 5009-5013; A. A. Alizadehらによる2000, Nature, 403: 503-511; M. Bittnerらによる2000, Nature, 406: 536-540; J. Khanらによる2001, Nature Medicine, 7(6): 673-679; およびT. R. Golubらによる1999, Science, 286: 531-537）。
【０００６】
それら技術および分子ツールは、いかなる時にも細胞内の多数の転写物の発現レベルをモニターすることを可能とする（例えば、Schenaらによる1995, Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA micro-array, Science, 270: 467-470; Lockhartらによる1996, Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays, Nature Biotechnology, 14: 1675-1680; Blanchardらによる1996, Sequence to array: Probing the genome's secrets, Nature Biotechnology, 14: 1649; 米国特許第5,569, 588号（Ashbyらによる1996年10月29日発行）を参照）。完全なゲノムが知られる生物（例えば、ヒトを含む）において、細胞内の全てのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの転写物を分析することが可能となる。
【０００７】
どれほどに差次的な遺伝子発現が健康および疾患と関係するかは、機能ゲノミクスの基本であり、これは、特定の細胞または細胞群によって発現されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの全ての研究、並びに発生、疾患または環境曝露の間でのそれらの発現パターンの変化として定義される。遺伝子発現を研究するために使用されるハイブリダイセーションアレイは、一度に文字通り何千ものポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現の変化の調査を可能とすることによってゲノムスケールでの遺伝子発現分析を可能とする。通常、ハイブリダイゼーションアレイの場合、遺伝子に特異的な配列（プローブ）を固体状態のマトリックス上に固定化する。次いで、これら配列を、生物学的な標本（標的）からの核酸の標識コピーを用いてクエリーする。根底にある理論は、遺伝子の発現の増大、標識標的の量の増大、従ってシグナルの出力の増大である（W. M. Freemanらによる2000, BioTechniques, 29: 1042-1055）。
【０００８】
最近の研究により、ヒト腫瘍のマイクロアレイ分析によって得られる遺伝子発現情報が臨床的な結果を予測することができることが実証されている（L. J. van't Veerらによる2002, Nature, 415: 530-536; M. Westらによる2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 11462-11467; T. Sorlieらによる2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 10869-10874; M. Shippらによる2002, Nature Medicine, 8(1): 68-74）。これらの発見は、療法に対する個々の腫瘍の応答をより予測することによって、癌の処置が大きく改善されるであろうという希望をもたらす。
【０００９】
当該分野において、患者における薬物感受性を測定するための新規で且つ別の方法および操作法が必要とされており、これにより、分子レベルでの患者の応答に基づいて疾患および障害を処置する際に役立つ個別化された遺伝子プロファイルの開発が可能となる。インビボ効果のモデルとして培養細胞を使用することによって、本発明は、細胞培養物中で曝露される細胞内因性の性質に有利に焦点を当て、そして薬物感受性と相関する同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。インビトロでアッセイするセルライン中でのポリヌクレオチドおよびポリペプチド／マーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチド（プレディクター（predictor）ポリヌクレオチド、プレディクターポリペプチド、プレディクターポリヌクレオチドサブセット、およびプレディクターポリペプチドサブセット）についての本発明が記載する発見および同定を用いてインビボでの薬物応答と相関させることができ、従って、そのものは、同じポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いて患者による薬物および／または化学療法剤に対する応答を予測するという臨床的な状況にまで拡張することができる。
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、発現レベルがタンパク質チロシンキナーゼインヒビター化合物に対して感受性または耐性のいずれかである大腸セルラインにおける薬物感受性と高く相関する、マーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同定を記載する。より具体的には、本発明に従って阻害される該タンパク質チロシンキナーゼとしては、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む）を含む。これらおよび他のタンパク質チロシンキナーゼについての総説は、例えばP. Blume-JensenおよびT. Hunterによる2001, 「Oncogene Kinase Signaling」, Nature, 411: 355-365を参照。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドのいくつかはまた、タンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路におけるそれらの関与を示すチロシンキナーゼインヒビター化合物、特にｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物によってモジュレートされる。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、または「マーカー」は、薬物および／または薬物処置に対する宿主の応答を予測する際に有用性を示す。
【００１１】
本発明の目的は、発現レベルが疾患状態または疾患を有する宿主に関係する細胞の薬物感受性と相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを同定するための細胞培養モデルを提供することである。本発明によれば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを、非処置のセルライン、特に大腸セルラインのパネルにおける多数のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現レベルを測定するために使用し、そしてこれにより、４個のｓｒｃキナーゼインヒビター化合物に対する薬物感受性を測定した。予め処置していない細胞における遺伝子発現プロファイルの測定により、発現レベルがｓｒｃキナーゼもしくはｓｒｃファミリーキナーゼ、またはｓｒｃもしくはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼが関与する経路をモジュレートする（阻害することが好ましい）薬物または化合物に対する感受性と高く相関する、マーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチドの化学感受性および同定の予測が可能となる。従って、該マーカーまたはプレディクターのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ活性に直接的にまたは間接的に影響を及ぼす薬物または薬物処置に対する患者の応答を予測するのに有用である。
【００１２】
本発明の別目的は、疾患状態（例えば、大腸疾患、またはあるタイプの癌もしくは腫瘍（大腸の癌または腫瘍が好ましい））についての薬物または化学療法剤の処置または療法を必要とする患者が、該個体に該処置または化学療法を行なう前に、該薬物または化学療法剤の処置または療法（これは、例えばｓｒｃキナーゼ活性のインヒビターなどのｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼモジュレート剤を含む処置または療法が好ましい）に対して十分に応答するかまたは応答しないことを測定しまたは予測する方法を提供することである。該処置または療法は、タンパク質チロシンキナーゼモジュレート剤（例えば、タンパク質チロシンキナーゼ活性のインヒビター）を含むことが好ましい。活性が本発明に記載のインヒビター化合物によって阻害され得るタンパク質チロシンキナーゼとしては、例えばチロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む）を含む。本発明によれば、患者の組織標本（例えば、腫瘍もしくは癌のバイオプシー（大腸癌もしくは腫瘍の標本であることが好ましい））または脱落した大腸細胞由来の細胞をアッセイして、ｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼモジュレート化合物または薬物（ｓｒｃキナーゼインヒビターが好ましい）を用いる処置前のそれらの遺伝子発現パターンを測定する。その結果得られる該化合物または薬物への曝露前の該試験細胞の遺伝子発現プロファイルを、該薬物または化合物に対して耐性または感受性のいずれかである非処置細胞のコントロールパネルにおける、本明細書中に記載しおよび示すポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセットの遺伝子発現パターンと比較する（すなわち、図１〜３）。
【００１３】
加えて、該方法において、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０以上のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含有するプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドのサブセットの遺伝子発現パターンを使用することができる。本明細書中の用語「約」とは、各プレディクターサブセット内で１、２、３、４または５個だけ多いかまたは少ないポリヌクレオチドおよびポリペプチドを意味すると解釈することができる。該方法において、表１０〜１２にそれぞれ記載する２５、１５および１０個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのセットを含有するプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドのサブセットの遺伝子発現パターンもまた使用することができることが好ましい。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本明細書中に示す薬物または化合物に対して耐性または感受性のいずれかであると測定された非処置細胞のコントロールパネルから導く。
【００１４】
薬物を用いる処置の成功または不成功は、試験組織（例えば、腫瘍または癌のバイオプシー）由来の試験細胞の遺伝子発現パターンに基づいて測定することができる。その理由は、細胞の耐性または感受性コントロールパネルにおけるポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセットの遺伝子発現パターンとはかなり同じかまたは異なるので、そのためにｓｒｃキナーゼインヒビター化合物に対する薬物感受性を測定することができる。従って、該試験細胞が、該薬物または化合物に対して感受性である細胞のコントロールパネルにおけるポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセットの遺伝子発現プロファイルに対応する遺伝子発現プロファイルを示す場合には、該個体の癌または腫瘍は該薬物または化合物を用いる処置に対して有利に応答する可能性は高く、あるいはそのように予測される。それに対して、該試験細胞が該薬物または化合物に対して耐性である細胞のコントロールパネルのポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセットの遺伝子発現パターンに対応する遺伝子発現パターンを示す場合には、該個体の癌または腫瘍は該薬物または化合物を用いる処置に対して応答しない可能性は高く、あるいはそのように予測される。
【００１５】
本発明の態様は、癌患者が、薬物または化合物、特にタンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路に直接的にまたは間接的に関与する薬物または化合物を用いる処置に対して感受性であるかまたは耐性であるかを測定するためのスクリーニングアッセイを提供することである。該タンパク質チロシンキナーゼとしては例えば、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む）を含むが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明の更なる目的は、患者の癌腫瘍が、薬物または化合物、特にｓｒｃもしくはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ活性またはｓｒｃもしくはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ経路に直接的にまたは間接的に関与する薬物または化合物を用いる処置に対して感受性であるかまたは耐性であるかを測定するためのスクリーニングアッセイを提供することである。
【００１７】
本発明の別目的は、ｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ活性を阻害する薬物または化合物を用いる処置前および再び該薬物または化合物を用いる処置後に、患者の組織標本（例えば、腫瘍または癌のバイオプシー（大腸の癌または腫瘍の標本であることが好ましい））由来の細胞の耐性または感受性の遺伝子発現プロファイルを比較することによって、ｓｒｃチロシンキナーゼをモジュレートする化合物または薬物によって処置可能な疾患を有する患者の処置をモニタリングする方法を提供することである。該患者由来の単離細胞をアッセイして、化合物または薬物（ｓｒｃキナーゼインヒビターが好ましい）への曝露前後のそれらの遺伝子発現パターンを測定して、更なる薬物もしくは剤を用いる処置を保証するかまたは現行の処置を中断するために、該遺伝子発現プロファイルの変化が生じるかどうかを測定する。その結果得られる処置の前後に試験した細胞の遺伝子発現プロファイルを、該薬物または化合物に対して耐性または感受性のいずれかである細胞中で高く発現することが本明細書中に記載されおよび示されているポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセットの遺伝子発現パターンと比較する。
【００１８】
該モニタリングプロセスは、患者の標本（例えば、腫瘍または癌のバイオプシー）から単離された細胞の遺伝子発現パターンに基づいて薬物または化合物を用いる患者の処置の成功または不成功を示すことができる。その理由は、薬物または化合物に曝露させてそして曝露後のそれらの遺伝子発現プロファイルを評価する細胞の耐性または感受性コントロールパネルのプレディクター遺伝子セットの遺伝子発現パターンとかなり同じかまたは異なるからである。従って、薬物または化合物を用いる処置後に、該試験細胞が、処置前に見られる発現プロファイルから、該薬物または化合物に対して耐性である細胞のコントロールパネルの発現プロファイルに対応する発現プロファイルまで、それらの該遺伝子発現プロファイルの変化を示す場合には、現行の処置は改変され、変えられまたは中断されるべきであるとの指示物質として機能することができる。また、プレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現プロファイルの相関に基づいて、患者の応答がｓｒｃキナーゼインヒビター化合物による処置に対して感受性となる場合には、該患者の処置予後は好ましいと認定することができて、そして処置を続けることができる。該モニタリングプロセスは、必要ならばまたは所望するならば繰り返すことができる。ある薬物処置に対する患者の応答のモニタリングはまた、薬物または活性化合物を用いる処置の前後よりもむしろ、処置後のみ記載するアッセイにおいて患者の細胞を試験することを含むことができる。
【００１９】
本発明の更なる目的は、タンパク質チロシンキナーゼまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路によるシグナル伝達が重要である疾患領域（例えば、癌および腫瘍、または免疫学的な疾患、病気もしくは機能不全）において、あるいは細胞シグナル伝達および／または増殖コントロールが異常であるかまたは迷入(aberrat)である疾患状態において、診断値および予後値の両方を有するツールとして、プレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチド、並びにポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセットを提供することである。直接的なまたは間接的なモジュレートが疾患状態または病気と関連し得る該タンパク質チロシンキナーゼとしては、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む）を含む。本発明によれば、プレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはプレディクター遺伝子セットの使用は、生物学的システムまたは細胞応答についてのいかなる知識をも有する前に結果を予想しまたは予告することである。本発明によればまた、該プレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはプレディクター遺伝子セットは、生物学的システムまたは応答を分類するのに使用する表現型を予測する際に有用である。例えば、セルラインの「耐性」または「感受性」としての分類は、予め化合物に曝露させ、そして１つ以上の化合物へ曝露後の耐性または感受性に相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現レベルについて統計学的に評価したセルラインのパネル（例えば、本明細書中に記載する３１個の大腸セルラインパネル）の平均ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）値に相対的な、１つ以上の化合物（例えば、ｓｒｃキナーゼインヒビター化合物）に対する各セルラインのｌｏｇ１０値（ＩＣ５０）値に基づく。
【００２０】
本発明の更なる別の目的は、例えば表３〜５に例示するポリヌクレオチドおよびポリペプチド、または本明細書中の表６に示す通常のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供して、ｓｒｃチロシンインヒビター化合物または異なる生物学的システム中でもしくは細胞応答におけるｓｒｃチロシンキナーゼシグナル伝達経路に影響を及ぼす化合物のいずれかのあり得る影響を予測しまたは合理的に予想することができるプレディクター遺伝子サブセット（例えば、表１０〜１２）を構築することである。該プレディクター遺伝子セットを、試験細胞による薬物応答のインビトロアッセイにおいて使用して、インビボ結果を予測することができる。本発明によれば、本明細書中に記載の様々なプレディクター遺伝子セット、あるいはこれらプレディクターセットと、他のポリヌクレオチドおよびポリペプチドまたはこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの他の共変異体との組み合わせを用いて、例えば癌または腫瘍を有するどれほどの患者がｓｒｃチロシンキナーゼファミリーをモジュレートする化合物を用いた治療学的インターベンションに対して応答し得るかを予測することができる。加えて、該プレディクターセットを用いて、どれほどの患者が完全なｓｒｃチロシンキナーゼ制御経路によるシグナル伝達をモジュレートする治療学的インターベンションに対して応答し得るかを予測することができる。ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはこれらポリヌクレオチドおよびポリペプチドの共変異体のプレディクターセットを用いて、癌または腫瘍を有するどれほどの患者がチロシンキナーゼをモジュレートする化合物を用いた療法に応答するかを、あるいはチロシンキナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーのタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む））の活性を、予測することができる。
【００２１】
本発明の更なる目的は、ｓｒｃチロシンキナーゼまたはｓｒｃチロシンキナーゼシグナル伝達経路のモジュレートに直接的にまたは間接的に関与する薬物または化合物に対する耐性または感受性に最も高く相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの１つ以上のプレディクターセットを含有するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供することである。本発明によれば、ｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物に対する耐性または感受性に関係するプレディクター遺伝子セットは、本明細書中の図１〜３および表３〜６に提示するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む。また、本発明によれば、表３〜６のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、４つの異なるｓｒｃキナーゼインヒビター化合物に対して感受性または耐性である細胞によって発現されることが発見された。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはこれらの組み合わせの発現は、該異なるｓｒｃキナーゼインヒビターに対する細胞の感受性と非常に高く相関することを見出した。ｓｒｃキナーゼインヒビター化合物に対する３１個の大腸細胞の感受性と相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの３セットの発現パターンを、図１〜３に提示する。
【００２２】
本発明の更なる別の目的は、プレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはｓｒｃチロシンキナーゼもしくはｓｒｃチロシンキナーゼ経路によるシグナル伝達が関与する疾患領域（例えば、癌または腫瘍）、もしくは細胞シグナル伝達および／または細胞増殖コントロールは異常または迷入である疾患状態において診断学的な値および予後的な値の両方を有するプレディクター遺伝子セット、を提供することである。本発明は、発現レベルが該ｓｒｃキナーゼインヒビター化合物の全４つに対する感受性または耐性のいずれかと強く相関する、通常のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する（表６）。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、細胞中での該ｓｒｃキナーゼインヒビター化合物の全４つに関連する薬物感受性および耐性の分類と相関するので、それらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いて、ｓｒｃキナーゼ活性、ｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼシグナル伝達経路が関与する他の生物学的システムについてのプレディクターまたはマーカーを構築することができる。
【００２３】
本発明の別の目的は、１つ以上のｓｒｃキナーゼインヒビター化合物に対する感受性または耐性のいずれかと相関する発現プロファイルを示す、本明細書に記載する該ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはその組み合わせを含有する１つ以上の特殊化マイクロアレイ（例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ）を提供することである。該マイクロアレイは、例えば腫瘍バイオプシー由来の試験細胞中でのマイクロアレイにおける該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現レベルを評価し、そしてこれらの試験細胞がｓｒｃキナーゼインヒビター化合物に対して耐性または感受性であるかを測定するためインビトロアッセイにおいて使用することができる。例えば、１つ以上のマイクロアレイは、本明細書中に記載し並びに図１〜３および表３〜６に示す、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの各々またはそれらの組み合わせを用いて製造することができる。組織または器官バイオプシー由来の細胞は単離して、そして１つ以上のインヒビター化合物に曝露することができる。
【００２４】
非処置および処置の両方の細胞から単離した核酸を１つ以上の特殊化マイクロアレイに適用後に、該試験細胞の遺伝子発現のパターンを測定し、そして使用する細胞パネル由来のプレディクター遺伝子パターンのパターンと比較して、該マイクロアレイ上にプレディクター遺伝子セットを作り上げることができる。試験を受けている細胞からの遺伝子発現パターン結果に基づいて、該細胞が遺伝子発現の耐性または感受性のプロファイルを示すかどうかを測定することができる。次いで、組織または器官のバイオプシー由来の試験細胞が１つ以上のインヒビター化合物に対して応答するかどうかを、および処置または療法の経過を、特殊化マイクロアレイ分析の結果から集めた(glean)情報に基づいて測定し、または評価することができる。
【００２５】
本発明の更なる目的は、疾患（特に、癌または腫瘍、すなわち大腸の癌または腫瘍に関する）を有する患者による薬物感受性または耐性を測定しまたは予測するためのキットを提供することである。該キットは、患者の腫瘍または癌がｓｒｃチロシンキナーゼ活性またはｓｒｃチロシンキナーゼ活性に関与する細胞シグナル伝達経路のモジュレート（阻害が好ましい）に直接的にまたは間接的に関与する薬物、化合物、化学療法剤または生物学的な剤を用いるある処置または療法に対して耐性または感受性であるかを測定しまたは予測するために、患者のバイオプシー腫瘍または癌の標本を試験する際の使用のための臨床的な設定において有用であろう。該キット中には、１つ以上のプレディクター遺伝子セットを供し、このものは、タンパク質チロシンキナーゼのＳｒｃファミリー（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）に対する耐性および感受性と相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチド、並びに他のＢｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒタンパク質チロシンキナーゼのインヒビターを含有するマイクロアレイ（例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ）を含有することが好ましく；そして、適当な容器中には、ｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物に対する耐性／感受性について患者の組織検体または患者の標本由来の細胞を試験する際に使用するための該モジュレート剤／化合物を供し；および、使用のための指示を供する。加えて、本発明によって企図するキットはまた、当該分野において実施される他の技術およびシステム（例えば、本明細書に記載する１つ以上のプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドに基づいて設計したプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲアッセイ；イムノアッセイ法（例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）；イムノブロット法（例えば、ウェスタンブロット）；インシチュハイブリダイゼーション；または本明細書中に更に記載するもの）を用いて、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで本発明のプレディクターまたはマーカーのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現をモニタリングするための試薬または物質をも含む。
【００２６】
本発明の別の目的は、疾患の処置における薬物療法の開発のための標的として機能し得る本明細書中で同定したプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドの内の１つ以上のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供することである。該標的は、大腸疾患（例えば、大腸の癌または腫瘍）の処置に特に使用することができる。これらのプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドは感受性および耐性の細胞中で差次的に発現するので、それらの発現パターンは、タンパク質チロシンキナーゼ（例えば、タンパク質チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びにＢｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒタンパク質チロシンキナーゼを含む）と相互作用しおよび／または阻害する化合物を用いる処置に対する、細胞の相対的な内因的感受性と相関する。従って、耐性細胞中で高く発現するポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、タンパク質チロシンキナーゼインヒビター化合物に対して耐性である腫瘍についての新規な薬物療法の開発のための標的として機能することができる。
【００２７】
本発明の更に別の目的は、プレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドによってコードされるｓｒｃバイオマーカーポリペプチドまたはそのペプチドに関するポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかである抗体を提供することである。該抗体は、例えば本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドを精製し、検出し、そして標的とするための様々な方法（これは、インビトロおよびインビボの両方の診断方法、検出方法、スクリーニング方法および／または治療方法などを含む）において使用することができる。本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド内に、タンパク質チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びにＢｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒタンパク質チロシンキナーゼを含む。
【００２８】
本発明の更なる目的、特徴、および利点は、付随する図または図面と合わせて考えると、本発明の詳細な説明の記載に基づいてより理解される。
【００２９】
（表の説明）
表１は、３１個の大腸セルラインの各々についての４つのｓｒｃキナーゼインヒビターの平均ＩＣ５０平均を示す。３１個の大腸セルラインを、４つのｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物、すなわち、ＢＭＳ−Ａ、ＢＭＳ−Ｂ、ＢＭＳ−ＣおよびＢＭＳ−Ｄの各々を用いて処理し、そして該ＩＣ５０を実施例１に記載するＭＴＳアッセイ（方法）によって細胞中で評価した。標準偏差（ＳＤ）と共に平均ＩＣ５０を、示された結果について各セルラインについての２〜５個の個々の測定値から算出した。該ＩＣ５０単位はμＭである。
【００３０】
表２は、４つのｓｒｃキナーゼインヒビター化合物、ＢＭＳ−Ａ、ＢＭＳ−Ｂ、ＢＭＳ−ＣおよびＢＭＳ−Ｄについての３１個の大腸セルラインの耐性／感受性の分類を示す。各化合物について、各セルラインのＩＣ５０をｌｏｇ１０（ＩＣ５０）にｌｏｇ変換して、次いで、該ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）値を、３１個の大腸セルラインについてのｌｏｇ１０（ＩＣ５０）平均値にまで規格化した。全ての３１個のセルラインの平均ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）より低いｌｏｇ１０（ＩＣ５０）を有するセルラインは、該化合物に対して感受性であると定義され、一方で平均ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）を超えるｌｏｇ１０（ＩＣ５０）を有するセルラインは耐性であると定義される。
【００３１】
表３は、発現パターンと、ＢＭＳ−ＡまたはＢＭＳ−Ｄに対する耐性／感受性の分類との間の高い相関を示す遺伝子リストを示す。遺伝子番号、相対的な発現パターン（すなわち、感受性または耐性）、遺伝子寄託番号、遺伝子の説明（ユニジーンクラスター（unigene cluster））、遺伝子のＤＮＡ配列についての配列番号、および（入手可能な場合）遺伝子のアミノ酸配列についての配列番号を、該表中に提示する。各遺伝子について、該表中に配列番号によって示されるＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列を、配列表中に記載する。
【００３２】
表４は、発現パターンと、ＢＭＳ−Ｂに対する耐性／感受性の分類との間の高い相関を示す遺伝子リストを提示する。遺伝子番号、相対的な発現パターン（すなわち、感受性および耐性）、遺伝子寄託番号、遺伝子の説明（ユニジーンクラスター）、遺伝子のＤＮＡ配列についての配列番号、および（入手可能な場合）遺伝子のアミノ酸配列についての配列番号を、該表中に提示する。各遺伝子について、該表中に配列番号によって示されるＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列を、該配列表中に記載する。
【００３３】
表５は、発現パターンと、ＢＭＳ−Ｃに対する耐性／感受性の分類との間の高い相関を示す遺伝子リストを提示する。遺伝子番号、相対的な発現パターン（すなわち、感受性または耐性）、遺伝子寄託番号、遺伝子の説明（ユニジーンクラスター）、遺伝子のＤＮＡ配列についての配列番号、および（入手可能な場合）遺伝子のアミノ酸配列についての配列番号を、該表中に提示する。各遺伝子について、該表中に配列番号によって示されるＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列を、該配列表中に記載する。
【００３４】
表６は、発現パターンと、４つのｓｒｃキナーゼインヒビター化合物、ＢＭＳ−Ａ／ＢＭＳ−Ｄ、ＢＭＳ−ＢおよびＢＭＳ−Ｃについての細胞の耐性／感受性との間の最も高い相関を示す表３〜５からの共通の遺伝子リストを提示する。該遺伝子の説明、寄託番号、ＤＮＡ配列、アミノ酸配列（入手可能な場合）、および対応する核酸とアミノ酸の配列番号を、提示する。各遺伝子の相対的な発現パターン（すなわち、感受性または耐性）を、示す。
【００３５】
表７は、表１０中に示すプレディクターセットとして１０マーカーを用いる、ＢＭＳ−ＡまたはＢＭＳ−Ｄ、ＢＭＳ-ＢおよびＢＭＳ−Ｃについての３１個の大腸セルラインの感受性／耐性の予測を示す。ＩＣ５０の結果に基づいて、真のクラスを表２の通り割り当てる。該予測されるクラスは、プレディクターセットとして最適な１０個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いることによって決定して、耐性または感受性のクラスを予測する。「Ｓ」は感受性を意味し、「Ｒ」は耐性を意味する。信頼度のスコアは、該プレディクターセットによるセルラインについて行なわれる各予測についての予測の強さを意味する。該信頼度のスコアは０〜１の範囲であり、すなわち、これは該予測を行なう際の低いから高いの信頼度に対応する。誤り予測は、星印（＊）によって示す。
【００３６】
表８は、表１１中に示すプレディクターセットとして１５個のマーカーを用いる、ＢＭＳ−Ｄ、ＢＭＳ−ＢおよびＢＭＳ−Ｃについての３１個の大腸セルラインの耐性／感受性の予測を示す。ＩＣ５０の結果に基づいて、真のクラスを表２の通り割り当てる。該予測されたクラスは、プレディクターセットとして最適な１５個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いることによって決定されて、該耐性または感受性のクラスを予測する。「Ｓ」は感受性を意味し；「Ｒ」は耐性を意味する。信頼度のスコアは、該プレディクターセットによるセルラインについて行なわれる各予測についての予測の強さを意味する。該信頼度のスコアは０〜１の範囲であり、すなわち、これは、該予測を行なう際の低いから高いの信頼度に相当する。誤り予測は、星印（＊）によって示す。
【００３７】
表９は、表１２中に示すプレディクターセットとして２５個のマーカーを用いる、ＢＭＳ−ＡまたはＢＭＳ−Ｄ、ＢＭＳ−ＢおよびＢＭＳ−Ｃについての３１個の大腸セルラインの耐性／感受性の予測を提示する。ＩＣ５０の結果に基づいて、真のクラスを表２の通り割り当てる。該予測されたクラスは、該プレディクターセットとして最適な２５個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いることによって決定して、耐性または感受性のクラスを予測する。「Ｓ」は感受性を意味し；「Ｒ」は耐性を意味する。信頼度のスコアは、プレディクターセットによるセルラインについて行なわれる各予測についての予測の強さを意味する。該信頼度のスコアは０〜１の範囲であり、すなわち、これは該予測を行なう際の低いから高いの信頼度に相当する。該誤り予測は、星印（＊）によって示す。
【００３８】
表１０は、表７中に示す予測に使用される１０個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセットを例示する。これら１０個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、７３個の共通のもの（表６に示す通り）から選択した。この１０遺伝子プレディクターセットについての遺伝子寄託番号、遺伝子の説明（ユニジーンクラスター）、および相対的な発現パターン（すなわち、感受性または耐性）を示す。
【００３９】
表１１は、表８中に示す予測において使用される１５個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセットを例示する。これら１５個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、７３個の共通のもの（表６に示す通り）から選択した。この１５遺伝子プレディクターセットについての遺伝子寄託番号、遺伝子の説明（ユニジーンクラスター）、および相対的な発現パターン（すなわち、感受性または耐性）を示す。
【００４０】
表１２は、表９中に示す予測において使用される２５個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセットを例示する。これら２５個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、７３個の共通のもの（表６に示す通り）から選択した。この２５遺伝子プレディクターセットについての遺伝子寄託番号、遺伝子の説明（ユニジーンクラスター）および相対的な発現パターン（すなわち、感受性または耐性）を示す。
【００４１】
表１３は、表３〜５中の配列番号および寄託番号によって同定される、本発明のＳｒｃバイオマーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチドの各々についての代表的なフォワードおよびリバースＲＴ−ＰＣＲプライマーを示す。
【００４２】
（発明の詳細な記載）
本発明は、薬物、化合物または生物剤に対する細胞の感受性を測定するために、薬物で予め処置していないセルラインを使用する、薬物の感受性または耐性と相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同定を記載する。本明細書中でマーカーまたはプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドと呼ばれるこれらポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、薬物応答を予測するために使用することができる。該マーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、予め処置していない細胞中での何千もの別個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現パターンを同時にモニターするために、マイクロアレイ技術を用いるインビトロアッセイにおいて測定した。化合物または薬物、特にタンパク質チロシンキナーゼまたはタンパク質チロシンキナーゼ活性（特に、ｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ）を阻害する化合物、に対する感受性を試験する。薬物、化合物または生物剤に対する応答に関係する該タンパク質チロシンキナーゼ、またはその活性としては例えば、タンパク質チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びにＢｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒタンパク質チロシンキナーゼの要素を含む（例えば、P. Blume-JensenおよびT. Hunterによる2001,「Oncogene Kinase Signaling」, Nature, 411: 355-365）。
【００４３】
このアッセイにより、細胞中での発現レベルを有する、本明細書中でｓｒｃバイオマーカーと呼ばれる、マーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチド（このものは、該細胞によって示される薬物感受性と高く相関する）の同定が可能となった。該マーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、タンパク質チロシンキナーゼ機能（特に、ｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼの機能または活性）の直接的なまたは間接的な阻害または拮抗によって、薬物、化合物、生物剤、化学治療剤など（タンパク質チロシンキナーゼ活性（特に、ｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ活性）に影響を及ぼす薬物および化合物などが好ましい）に対する応答を予測するための有用な分子ツールとして機能する。
【００４４】
好ましい態様において、本発明は、タンパク質チロシンキナーゼインヒビター化合物（特に、本明細書に記載するｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物）を用いる処置に対する大腸セルラインの感受性または耐性と相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを記載する。４個のｓｒｃキナーゼインヒビター化合物の各々に対して３１個の大腸セルラインを曝露することにより、該インヒビター化合物に対する３１個の大腸セルラインの耐性または感受性の分類と最も高く相関する各化合物についてのポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセットを与えた（図１〜３、および表３〜５）。本発明の遺伝子プレディクターセットを同定するために使用されるｓｒｃキナーゼインヒビター化合物は、WO00/62778（2000年10月26日公開）中に記載されている。具体的には、分析された４個のｓｒｃキナーゼインヒビター化合物、すなわちＢＭＳ−Ａ、ＢＭＳ−Ｂ、ＢＭＳ−ＣおよびＢＭＳ−Ｄについて、３１個の大腸セルラインについての薬物感受性の分類はＢＭＳ−ＡおよびＢＭＳ−Ｄにおいて同様であって；そして、３１個の大腸セルラインのうちの２６個は、表２に示す通り、全ての４個のｓｒｃキナーゼインヒビター化合物について同じ感受性の分類を有する。これらの４個の化合物の１つ以上は、多数のタンパク質チロシンキナーゼ（例えば、タンパク質チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎを含む）、並びにＢｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒタンパク質チロシンキナーゼの要素についての強力な阻害活性を有する。該プレディクター遺伝子セットはＳｒｃキナーゼ機能および活性を特異的に阻害する際のこれら化合物の１つ以上の効力を予測する際に最も有用であるが、該プレディクター遺伝子セットはまた、タンパク質チロシンキナーゼ、一般的には特にＳｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ、並びにＢｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒタンパク質チロシンキナーゼ、を阻害する際のこれら化合物の効力を予測するのに有用でもある。
【００４５】
１２３、１１９および１３７プレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現は、ＢＭＳ−Ａ／ＢＭＳ−Ｄ、ＢＭＳ−ＢおよびＢＭＳ−Ｃのそれぞれに対する大腸セルラインの耐性／感受性と相関することが分かった。共通のプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドをまた、ｓｒｃキナーゼインヒビターに対する細胞の耐性／感受性の分類を予測するために測定した。それらの発現パターンと、ｓｒｃキナーゼインヒビター化合物に対する該セルライン中での耐性または感受性の分類との間で最も高い相関を示す共通のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、表６中に提示する。
【００４６】
本発明によれば、セルラインのサブセット中の発現パターンが相関し、そして、細胞増殖、外部の刺激（例えば、リガンドの結合）に対する細胞応答、またはシグナル伝達に直接的にもしくは間接的に関与するタンパク質、酵素もしくは分子（例えば、レセプター）の機能、を阻害しまたは活性化することが知られる１化合物または化合物群の組み合わせを用いる処置または療法に対する、細胞応答のインビトロプレディクターとして使用することができる、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、並びにポリヌクレオチドおよびポリペプチドの組み合わせを同定する方法を見出した。あるタンパク質（例えば、チロシンキナーゼ）の機能のアンタゴニストまたはインヒビターが好ましい。
【００４７】
好ましい態様において、あるｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物、ＢＭＳ−Ａ、ＢＭＳ−Ｂ、ＢＭＳ−ＣおよびＢＭＳ−Ｄを用いて、細胞を該化合物に曝露後に大腸セルラインのパネルにおける薬物感受性を測定する。該セルラインのいくつかはインヒビター化合物を用いる処置に対して耐性であると測定され、一方でそれ以外は該インヒビターに対して感受性であると測定された（表１および２）。調べた該セルラインのサブセットは、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、並びにポリヌクレオチドおよびポリペプチドの組み合わせ、の発現パターンまたはプロファイルを供し、このものはこれらインヒビター化合物、並びに作用および／または構造が似た様式を有する化合物、に対する該細胞による応答と相関し、そして該応答のプレディクターとして機能する（図１〜３、および表７〜１２）。
【００４８】
薬物または薬物の組み合わせに該細胞を曝露後の細胞の感受性または耐性と相関する細胞の遺伝子発現パターンの該プレディクターセットは、薬物、類似薬物または薬物の組み合わせを用いる処置前に腫瘍標本をスクリーニングするための有用なツールを提供する。該スクリーニング法により、プレディクターセットの遺伝子発現結果に基づいて、腫瘍が、故に該腫瘍を有する患者が該薬物または薬物の組み合わせを用いる処置に対して応答するかまたは応答しないことについて、薬物または薬物の組み合わせに曝露された腫瘍標本の細胞腫瘍における予測が可能となる。
【００４９】
加えて、プレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはプレディクター遺伝子セットはまた、ｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼインヒビター化合物または化学療法薬を含む疾患の処置を受けているこれら患者における疾患の処置または療法の進行をモニタリングするために、本明細書に記載する通り使用することもできる。
【００５０】
本発明のある態様によれば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて、３１個の非処置大腸セルラインのパネルにおける１２,０００を超えるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現レベルを測定し、それにより、４個のｓｒｃキナーゼインヒビター化合物に対する薬物感受性を測定した。この分析を行なって、非処置細胞の遺伝子発現サインが、化学感受性の予測に十分であるかどうかを測定した。データ分析により、発現レベルが薬物感受性と高く相関することが見出されたマーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同定が可能となった。加えて、薬物を用いる非処置細胞の処理はまた、該化合物に対する耐性を予測する遺伝子発現サインを提供した。続くデータ分析により、発現レベルが薬物耐性と高く相関することが見出されたマーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同定が可能となった。従って、その態様の１つにおいて、本発明は、薬物に対する細胞の処理または曝露時での薬物応答を予測する際に有用性を示す、これらポリヌクレオチドおよびポリペプチド、または「マーカー」もしくはプレディクターを提供する。特に、該マーカーまたはプレディクターのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ｓｒｃバイオマーカータンパク質／ポリペプチドをコードするｓｒｃバイオマーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチドである。
【００５１】
本発明によって包含される遺伝子発現およびマーカー遺伝子の同定分析を行なうための手法を、更に詳細に且つ本明細書中の以下に限定されることなく、記載する。
【００５２】
ＩＣ５０の測定、およびｓｒｃキナーゼインヒビター化合物に対する３１個の大腸セルラインの感受性に基づく表現型の分類
３１個の大腸セルラインは、各セルラインについてのＩＣ５０値を測定するために、４個のｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物（ＢＭＳ−Ａ、ＢＭＳ−Ｂ、ＢＭＳ−ＣおよびＢＭＳ−Ｄ）の各々を用いて処理した。標準偏差と共に平均ＩＣ５０は、各セルラインについての２〜５個の個々の測定から算出した。表１に示す通り、ＩＣ５０値の大きさの変化（＞１０００倍）が、該３１個のセルラインにおけるこれら化合物について観察された。
【００５３】
各セルラインについてのＩＣ５０値を、ｌｏｇ１０変換した。該３１個のセルラインについての平均ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）は、各化合物について算出した。各セルラインについてのｌｏｇ１０（ＩＣ５０）の値を、各薬物についての３１個の大腸セルラインについての平均ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）と比較した。平均ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）よりも低いｌｏｇ１０（ＩＣ５０）を有するセルラインは化合物に対して感受性であると分類し、そして平均ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）よりも高いｌｏｇ１０（ＩＣ５０）を有するものは耐性であると分類した。表２は、ＢＭＳ−Ａ、ＢＭＳ−Ｂ、ＢＭＳ−ＣおよびＢＭＳ−Ｄのそれぞれについての３１個の大腸セルラインの耐性／感受性の分類を示す。
【００５４】
表２中に示す通り、３１個の大腸セルラインについての薬物感受性の分類は、たとえこれらの２個の化合物についてのＩＣ５０が各セルラインにおいて同一でなくても、ＢＭＳ−ＡおよびＢＭＳ−Ｄについて同じであった。該セルラインの大部分（３１個のうち２６個）は試験した該ｓｒｃキナーゼインヒビター化合物の４つ全てについて同じ耐性／感受性を有することをも示した。５個のセルラインは、表２中に示す４個のｓｒｃキナーゼインヒビター化合物に対して異なる分類を有することを示した。
【００５５】
薬物の耐性／感受性の分類と有意に相関する遺伝子の同定
３１個の非処置大腸セルラインについてのＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２アレイ上に示された１２,５５８ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現プロフィリングデータを得て、そして実施例１の方法に記載する通りプレプロセスした。該プロプロセスデータを、K-mean Nearest Neighborhood（ＫＮＮ）アルゴリズムを用いて分析して、発現パターンが薬物耐性／感受性の分類と強く相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを同定した（表２）。「理想の発現パターン」とは、あるクラスにおいて一律に高く（例えば、感受性）、そして他のクラスにおいては一律に低い（例えば、耐性）遺伝子に相当する。最初に、ＫＮＮ分析を行なって、各遺伝子についての相関係数を得た。相対的な分類分けの手段である該相関係数は、以下の式：
Ｐ（ｇ，ｃ）＝（μ１−μ２）／（σ１＋σ２）
を用いて得る。
【００５６】
上記式中、Ｐ（ｇ，ｃ）について、Ｐは相関係数を示し；ｇは遺伝子発現を示し；そしてｃは分類を示す。
μ１は、クラス１の標本の平均遺伝子発現レベルを示し；
μ２は、クラス２の標本の平均遺伝子発現レベルを示し；
σ１は、クラス１の標本についての遺伝子発現の標準偏差を示し；そして、
σ２は、クラス２の標本についての遺伝子発現の標準偏差を示す。
【００５７】
Ｐ（ｇ，ｃ）の大きな値は、遺伝子発現および耐性／感受性の分類の間の強い相関を示す。該相関をランダム並び替え検定（random permutation test）（ランダムに割り当てた分類）と比較して、有意な測定値を得る。次いで、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを本分析から得た相関係数に従って順位を付けることができ、最も高い値は、遺伝子発現レベルと、３１個の大腸セルライン内のｓｒｃキナーゼインヒビター化合物に対する耐性／感受性の分類との最も良い相関を示す。
【００５８】
該ＫＮＮ分析は、多数のポリヌクレオチドおよびポリペプチドが試験化合物の４つ全てについて薬物耐性／感受性の分類と相関することを示した。従って、より大きな厳密性のために、２個の異なる方法を適用して、該化合物の全てについて薬物耐性／感受性の分類と相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドのより小さなサブセットを選択した。
【００５９】
第１に、並べ替え検定を行なって、上位２００のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについて上記ＫＮＮ分析において得た相関係数の有意性を算出した。「ｐ」値が０．０５以下であるポリヌクレオチドおよびポリペプチドを選択した。第２に、Ｔ−検定を行なって、そして「ｐ」値が０．０５以下であるポリヌクレオチドおよびポリペプチドを選択した。
【００６０】
該２個の分析方法からの遺伝子リストを、各化合物について得た。これらの分析を行なった際に、図１に示す通り、化合物ＢＭＳ−ＡまたはＢＭＳ−Ｄについての薬物耐性／感受性の分類と相関する、表３中に例示する１２３個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドが存在することが観察された。該１２３個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの内、６０個はＢＭＳ−ＡまたはＢＭＳ−Ｄに対して感受性であると分類されたセルライン中で高く発現し、そして６３個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ＢＭＳ−ＡまたはＢＭＳ−Ｄに対して耐性であると分類されたセルライン中で高く発現した。同じ方法を使用して、それぞれＢＭＳ−ＢおよびＢＭＳ−Ｃについての薬物耐性／感受性の分類と相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチド（表４および５中に例示する）を選択した。表３〜５中に例示するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現パターンを図１〜３中に提示する。これらは、それぞれ化合物ＢＭＳ−Ａ／ＢＭＳ−Ｄ、ＢＭＳ−ＢおよびＢＭＳ−Ｃについての薬物耐性／感受性の分類との相関を示した。
【００６１】
表３〜５はまた、上記の分析から選ばれる７３個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドが該４個の試験化合物の全てにおいて共通である（共通のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを表６中に示す）ことを示す。該共通のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの３１個は、感受性と分類されるセルライン中で高く発現し、そして該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの４２個は、耐性と分類されるセルライン中で高く発現する。これらの共通のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは薬物感受性および耐性の分類と相関するので、それらを用いて以下に示す通り、他の生物学的なシステムについてのプレディクターを構築することができる。
【００６２】
本明細書に使用する用語「薬物」または「化合物」とは、本発明のタンパク質チロシンキナーゼ（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎを含む）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼ（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む）を直接的にまたは間接的にモジュレートすることができるいずれかの組成物を包含することを意味し、そして小分子化合物、アンチセンス試薬、抗体などを含む。
【００６３】
本明細書中で使用する用語「モジュレートする」とは、ある活性、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の量、質または効果の増大または低減を意味する。本明細書中で使用する定義「モジュレートする」とは、ある活性、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを包含することを意味する。用語「モジュレートする」とはまた、細胞活性（これは、必然的に細胞が分化し、増殖し、動態化し、転移する能力を含む）および／またはいずれかの他の活性（これは、増殖性状態および／または発癌性状態への細胞の形質転換と関係し得る）の増大または低減を包含することをも意味する。
【００６４】
予測するための、高く相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの有用性
生物学的なシステムの特異的な性質と相関する遺伝子を用いて、生物学的なシステムおよび他の生物学的なシステムについて予測することができる。該ジーンクラスターソフトウェア（Genecluster software）を用いて、「加重投票クロス−バリデーションアルゴリズム（weighted-voting cross-validation algorithm）」（T. R. Golubらによる1999, Science, 286: 531-537）を用いて性質を予測することができるポリヌクレオチドおよびポリペプチド、並びにポリヌクレオチドおよびポリペプチドの組み合わせを選択することができる。特に、該ジーンクラスターソフトウェアを用いて、薬物感受性および耐性と相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの有用性を示すプレディクターを構築することができた。
【００６５】
本明細書中で使用する用語「プレディクター」または「プレディクターセット」は、以下の通り使用する：プレディクターとは、発現パターンまたは性質を用いていずれかのある生物学的なシステムの性質または特性について異なる誤り率で予測することができる、単一の遺伝子、またはポリヌクレオチドおよびポリペプチドの組み合わせを意味する。
【００６６】
耐性／感受性の分類を予測する遺伝子発現パターンの能力は更に、加重投票アルゴリズム（これは、T. R. Golubらによる1999, Science, 286:531-537によって記載されるクロス−バリデーション方法を使用する）を用いて研究した。該プログラムをフォーマットして、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（該発現パターンを用いて、ｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物（例えば、ＢＭＳ−Ａ、ＢＭＳ−Ｂ、ＢＭＳ−ＣまたはＢＭＳ−Ｄ）に対する耐性または感受性に基づいてセルラインの分類を最適な正確さで予測することができる）の最適な数を選択した。該プログラムの該クロス−バリデーション方法の簡単な説明を記載する。
【００６７】
１つ除外（leave one out）クロス−バリデーション方法に基づいて、３１個の予測分析の総計（すなわち、データセット中のセルラインの数）を反復様式で行ない、そして全ての３１個の予測分析の結果を合わせて、最適な予測の正確さを有するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの最適な数を選択した。各別個の予測分析において、１つのセルラインはデータセットから保留し（withheld）、そして最適な数の遺伝子プレディクターを残りの３０個のセルラインに基づいて構築し、続いてこれを用いて、該保留した標本のクラスを予測した。
【００６８】
図４は、大腸セルライン中でのＢＭＳ−Ａ、ＢＭＳ−Ｂ、ＢＭＳ−ＣおよびＢＭＳ−Ｄに対する耐性および感受性のクラスを予測するためのプレディクターセット中の異なる数のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いた真の誤り率（real error rate）を示す。該真の誤り率を、大腸セルラインについての分類をランダムに割り当てた２０事例におけるプレディクターセットと同数のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いる真の誤り率と比較した。例えば、各プレディクターセットが２０個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む場合には、ＢＭＳ−ＡまたはＢＭＳ−Ｄについての真の誤り率は１５．７％であって；ＢＭＳ−ＢおよびＢＭＳ−Ｃについては、真の誤り率はそれぞれ１９％および１６．２％であった。この結果は、これら誤り率の値は、ランダムな表現型分類をセルラインについて使用する場合に得られる真の誤り率よりも有意に低いことを示した（すなわち、３０％〜７０％の範囲である）。
【００６９】
表７は、プレディクターセットとして１０マーカー（表１０に例示する）を用いて、ＢＭＳ−ＡまたはＢＭＳ−Ｄ、ＢＭＳ−ＢおよびＢＭＳ−Ｃについての３１個の大腸セルラインの真の耐性／感受性の予測を提示する。ＢＭＳ−ＡまたはＢＭＳ−Ｄの場合には、３１個のセルラインのうち２８個が、該最適な１０遺伝子プレディクターセットを用いて正確に予測された。２個の耐性セルライン、ＣＸ−１およびＳＷ−４０３はＢＭＳ−ＡまたはＢＭＳ−Ｄに対して感受性であると予測されたが、一方で、感受性セルライン、ＨＣＴ−１５は、ＢＭＳ−ＡまたはＢＭＳ−Ｄに対して耐性であると予測された。このことより、１０％の真の誤り率（該真の誤り率は、各クラスの誤り率の平均をとることによって算出される）が得られ、これは下式：
【化１】
2005523688.tif 000002
の通り算出される。
【００７０】
ＢＭＳ−ＢおよびＢＭＳ−Ｃについての異なる真の誤り率を得た。ＢＭＳ−Ｂの場合には、最適な１０遺伝子プレディクターは、２８個のセルラインの感受性または耐性を正確に予測した。該プレディクターは、３個の誤りを生じた。２つの間違った予測が、感受性クラスにおいて生じた（それらは、耐性と呼ぶ）。このことにより、１１．６％の真の誤り率を生じ、これは下式：
【化２】
2005523688.tif 000003
の通り算出した。
【００７１】
ＢＭＳ−Ｃの場合には、該最適な１０遺伝子プレディクターセットは、２９個のセルラインを正しく予測した。該プレディクターは、感受性クラスにおいて２個の誤りのみを生じた。このことにより、８．３％の真の誤り率を生じ、これは、下式：
【化３】
2005523688.tif 000004
の通り算出した。
【００７２】
加えて、プレディクターセットによってセルラインについて行なう各予測についての信頼度スコアは、ジーンクラスターソフトウェアから得ることができる。該信頼度スコアは０〜１の範囲であり、これは加重投票アルゴリズム（T. R. Golubらによる1999, Science, 286: 531-537を参照）を用いて各予測の勝利のマージン（the margin of victory）を測定する。記載する通り得られた最適な１０遺伝子プレディクターセットを用いる各セルラインについての信頼度スコア値を、表７中に示す。
【００７３】
最適なプレディクターセットを含むであろうポリヌクレオチドおよびポリペプチドの正確な数は明確に確立されないしまたは決められないことは、認められるであろう。いずれかのプレディクターセットが１００％の正確さで得ることができることは、現実の世界ではありえない。これは、より多くのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを加えることによって得る更なる情報の量および頑強さ（robustness）と、同時に加えられるノイズの量との間にトレードオフが存在するという事実による。本発明によれば、異なる数のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを該プレディクターセット中で試験し；データを得て、分析し、そして１０、１５もしくは２５のプレディクターまたはマーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含有するプレディクターセットを提示する（表７〜９に示す）。該プレディクターセットにおける使用のためのマーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチドの選択は、感受性クラスの差違と強く相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの総数内で十分であった（表３〜６）。表８に示す通り、マーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチドの１５を含有するプレディクターセット（表１１中に例示）の場合には、ＢＭＳ−Ａ／ＢＭＡ−Ｄ、ＢＭＳ−ＢおよびＢＭＳ−Ｃの予測感受性の誤り率は、それぞれ１２．４％、７％および４％であった。また、表９および表１２に示すマーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチドの２５を含有するプレディクターセットの場合には、異なる誤り率を得た。
【００７４】
従って、本発明によれば、セルラインのサブセットにおける発現パターンがｓｒｃチロシンキナーゼの機能を阻害する化合物群を用いる処置に対するインビトロ応答と相関し、そして該応答のプレディクターとして使用することができる、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、並びにポリヌクレオチドおよびポリペプチドの組み合わせを発見する方法を開発した。
【００７５】
有用性を実証するために使用するプレディクターセット、誤り率およびアルゴリズム
いずれかのあるプレディクター中のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの数は、クロス−バリデーション実験および他の数学的アルゴリズムを用いる場合における該プレディクターセットの誤り率に影響を及ぼし得る。該データは、プレディクターの誤り率が該プレディクターセットにおけるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの数、あるプレディクターセット中の各個々の遺伝子の寄与、並びにクロス−バリデーション実験において試験するセルラインの数にいくらか依存することを示す。例えば、あるプレディクターセットにおいて、ある遺伝子は他のポリヌクレオチドおよびポリペプチドよりも予測に対してより有意に寄与し得る。
【００７６】
遺伝子がプレディクターセットに有意に寄与する場合に、異なるプレディクターセット中で異なる誤り率を得る（例えば、遺伝子Ａ単独は３０％の誤り率を示す）ために、他のポリヌクレオチドおよびポリペプチドとの異なる組み合わせで使用することができることは非常によくある。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドＢ、ＣおよびＤとの組み合わせの場合には、誤り率は１０％であり；ポリヌクレオチドおよびポリペプチドＢ、ＤおよびＥとの組み合わせの場合には、誤り率は１２％であり；一方で、遺伝子Ａと、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドＥ−Ｘとの組み合わせは８％の誤り率を与えることなどである。本明細書中に記載する誤り率は、クロス−バリデーション実験において使用するセルラインのセットに適用する。異なるセットを使用したり、あるいはより多くのセルラインを試験する独創的な(original）セットに加える場合には、異なる誤り率を記載の通り得ることができ、このことは当該分野の当業者によって理解される。重要なことに、薬物感受性と相関する異なる組み合わせのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使用して、異なる予測の正確さを有するプレディクターを構築することができる。
【００７７】
プレディクターセットの使用法
異なる誤り率を有するプレディクターセットを、異なる使用法において使用することができる。プレディクターセットは、表３〜６中に例示するポリヌクレオチドおよびポリペプチドのいずれかの組み合わせ、または２５、１５および７のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクター遺伝子サブセット（これは、それぞれ表７、８、９、１０、１１および１２中に提示する）から構築することができて、ｓｒｃチロシンインヒビター化合物、または異なる生物学的なシステム中でｓｒｃチロシンキナーゼシグナル伝達経路に影響を及ぼす化合物のいずれか、のあり得る影響について予測することができる。本明細書中に記載する様々なプレディクターセット、またはこれらプレディクターセットと、他のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、もしくはこれらポリヌクレオチドおよびポリペプチドの他の共変異体との組み合わせは、広い有用性を有するであろう。例えば、それらは、疾病管理における診断学的なまたは予後的な指示物質として使用することができ；それらを用いて、癌を有する患者のどれほどがｓｒｃチロシンキナーゼファミリーをモジュレートする化合物を用いる治療学的インターべンションに応答し得るかを予測することができ；そして、それらを用いて、どれほどの患者が完全なｓｒｃチロシンキナーゼ制御経路によるシグナル伝達をモジュレートする治療学的インターベンションに応答し得るかを予測することができる。
【００７８】
本明細書中に記載するデータは、癌療法における潜在的な有用性を有する化合物をスクリーニングしそして同定するのにルーチン的に使用されるセルライン中で得られるが、該プレディクターは、タンパク質チロシンキナーゼ（特に、ｓｒｃチロシンキナーゼまたはｓｒｃチロシンキナーゼ経路）によるシグナル伝達が重要である他の疾患領域（例えば、免疫学）、あるいは細胞シグナル伝達および／または増殖の制御が予想外である（gone awry）癌または腫瘍において、診断値および予後値の両方を有し得る。該タンパク質チロシンキナーゼおよびそれらの経路は、例えばチロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む）を含む。
【００７９】
更に、本明細書中に記載するデータは特に例示されるｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物（すなわち、ＢＭＳ−Ａ、ＢＭＳ−Ｂ、ＢＭＳ−ＣおよびＢＭＳ−Ｄ）を用いて得られるが、該プレディクターは、ｓｒｃチロシンキナーゼまたはｓｒｃチロシンキナーゼシグナル伝達経路に影響を及ぼすいずれかの分子または治療学的インターベンション、に関連する診断値および予後値の両方を有し得る。
【００８０】
関連分野における当業者は、タンパク質チロシンキナーゼ経路（例えば、Ｓｒｃチロシンキナーゼ経路）を使用し、そしてこのものは大腸組織のセルライン以外の細胞タイプにおいて機能的であることを認めるであろう。従って、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの上記プレディクターセット、または該プレディクターセット内でのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの組み合わせは、疾患状態と関係する他の組織もしくは器官、または他の組織タイプ由来の癌もしくは腫瘍、からの細胞中でｓｒｃチロシンキナーゼ活性と相互作用しまたは阻害する化合物、に対する薬物感受性または耐性を予測するための有用性を示し得る。それらの細胞、組織および器官としては例えば、大腸、乳房、肺、前立腺、精巣、卵巣、頚部、食道、膵臓、脾臓、肝臓、腎臓、胃、リンパ器官および脳を含むが、これらに限定されるものではなく、従って、本明細書中に記載するプレディクター遺伝子セットに対する広範で且つ有利な利用可能性を提供する。分析のための細胞は、当該分野において知られる通常の方法（例えば、組織バイオプシー、吸引法、細胞（例えば、大腸細胞）の脱落、臨床上または医学上の組織または細胞のサンプリング方法）によって得ることができる。
【００８１】
プレディクターセットを構成するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの機能性
プレディクターまたはプレディクターセット（例えば、プレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセット）の使用は、生物学的なシステムについてのいずれかの知識を有する前に結果を予測するのに簡便である。本質的に、プレディクターは統計学的なツールであると見なすことができる。該プレディクターは、生物学的なシステムを分類するのに使用する表現型を予測するのに第１に有用である。本発明によって提示される具体的な態様において、「耐性」または「感受性」との分類は、セルラインパネル（例えば、本明細書中に例示する３１個の大腸セルラインパネル）の平均ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）に相対的な、化合物（例えば、本明細書に例示するｓｒｃキナーゼインヒビター化合物、ＢＭＳ−Ａ、ＢＭＳ−Ｂ、ＢＭＳ−ＣまたはＢＭＳ−Ｄ）に対する各セルラインのｌｏｇ１０（ＩＣ５０）値に基づく。
【００８２】
多数の本明細書中に記載するポリヌクレオチドおよびポリペプチド（表３〜６）は、ｓｒｃチロシンキナーゼファミリー（例えば、カベオリン−１、カベオリン−２、ホスホイノシチド３−キナーゼなど）（M. T. BrownおよびJ. A. Cooperによる1996, Biochemica et Biophysica Acta, 1287: 121-149）についての基質であることが知られる。プレディクターの高い正確さに寄与するポリヌクレオチドおよびポリペプチドはモジュレートする経路において機能的な役割を果たしているであろうという理由で、このものは期待される。例えば、ヘルセプチン（Herceptin）療法（すなわち、Ｈｅｒ２レセプターと結合し、そしてインターナリゼーションによって機能を防止する抗体）は、Ｈｅｒ２遺伝子が過剰発現される場合に示される。標的酵素が発現しない場合に、療法がいずれかの治療学的な効果を有するであろうことはありえない。
【００８３】
しかしながら、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、並びにプレディクターセットを構成するそれらの機能的産物（タンパク質およびｍＲＮＡ）の全ての完全な機能は現在知られていないが、いくつかのポリヌクレオチドおよびポリペプチドはおそらくｓｒｃチロシンシグナル伝達経路に直接的に関与しているであろう。加えて、該プレディクターセットにおけるいくつかのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ｓｒｃシグナル伝達経路に間接的に関連し得る。加えて、該プレディクターセットにおけるいくつかのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、試験する化合物にとって特有の代謝的経路または他の耐性経路において機能し得る。それにもかかわらず、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの機能についての知識は、本発明の実施によれば、プレディクターの正確さを測定するために必須ではない。
【００８４】
異なるプレディクターセットが本明細書中で試験する異なる化合物についての最も低い誤り率を得るのに必要であることが示された。このことは、異なる化合物に対して異なる応答を示すセルラインのサブセットによる。従って、プレディクターを構築するプロセスの発見において、ある化合物または化合物群に対して耐性または感受性のいずれかとしての細胞の分類は、最も良いプレディクター／プレディクターセットを含むポリヌクレオチドおよびポリペプチドの最終的なセットに影響を与えるであろう。耐性および感受性の細胞の異なる組み合わせを各化合物について使用する理由で、異なるプレディクターを得た。加えて、異なる化合物についての異なるプレディクターを得ることは、遺伝子マーカー発現における共通の耐性または感受性の分類を有するセルライン（例えば、表２中に提示する２６セルラインを参照）を使用するかどうかを避けることができる。
【００８５】
本明細書中に提示するデータはまた、４個の異なる化合物についての共通のポリヌクレオチドおよびポリペプチドが存在することをも示す（例えば、表６を参照）。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ｓｒｃチロシンキナーゼ経路において直接的かまたは間接的かについていくつかの規則を有するであろう。あるいは、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ｓｒｃシグナル伝達または阻害に対する細胞の感受性を内因的に測定する際に重要であり得る。
【００８６】
本明細書に記載する通り、ｓｒｃチロシンキナーゼと相互作用しそして阻害する化合物を用いた処置に対する大腸セルラインの相対的な内因性の感受性または耐性に相関する、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを発見した。加重投票クロス・バリデーションプログラムによって、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、これらの化合物に対する大腸セルラインの内因的な耐性および感受性を予測する際に有用性を有することを示した。
【００８７】
本発明の態様は、疾患（例えば、あるタイプの癌または腫瘍）についての薬物または化学療法薬の処置または療法を必要とする個体は、該個体がそれら処置または化学療法を受ける前に該薬物または化学療法薬に対して十分に応答するかまたは応答しないかを測定しまたは予測する方法に関する。該薬物または化学治療薬は、タンパク質チロシンキナーゼ（特に、ｓｒｃ活性もしくはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ活性、またはシグナル伝達に関与するｓｒｃもしくはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ）をモジュレートするものが好ましい。本発明の方法によれば、疾患に関係する組織または器官由来の細胞（例えば、腫瘍または癌の患者のバイオプシー（大腸の癌または腫瘍のバイオプシーが好ましい））を本明細書中に記載するインビトロアッセイに受けさせ、化合物または薬物（特に、タンパク質チロシンキナーゼインヒビター（ｓｒｃキナーゼインヒビターが好ましい））を用いるそれらの処置前に、それらのマーカー遺伝子発現パターン（表３〜６からのポリヌクレオチドおよびポリペプチド）を測定する。その結果得られる薬物処置前の該細胞の遺伝子発現プロファイルを、本発明によって提示される薬物または化合物に対して耐性または感受性のいずれかである細胞中の同一ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの遺伝子発現パターンと比較する（すなわち、図１〜３）。
【００８８】
薬物を用いる患者の癌または腫瘍の処置の成功または非成功は、試験する患者の細胞の遺伝子発現パターンに基づいて測定し、薬物または化合物に曝露させた耐性または感受性のパネルにおけるプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドの遺伝子発現パターンと比較し、そして本明細書中に詳述するプレディクター遺伝子分析を受けさせることで可能である。従って、薬物へ曝露後に、試験細胞が、薬物または化合物に対して感受性である細胞のコントロールパネルのプレディクター遺伝子セットのものに相当する遺伝子発現パターンを示す場合には、個体の癌または腫瘍は該薬物または化合物を用いる処置に対して有利に反応する可能性は高くあるいはそう予測される。それに対して、薬物の曝露後に、該試験細胞が、薬物または化合物に対して耐性である細胞のコントロールパネルのプレディクター遺伝子セットのものに相当する遺伝子発現パターンを示す場合には、個体の癌または腫瘍は該薬物または化合物を用いる処置に対して反応しない可能性は高くあるいはそう予測される。
【００８９】
関連し且つより具体的な態様として、本発明は、疾患（例えば、乳がんまたは乳の腫瘍）に対する薬物または化学療法薬の処置または療法を必要とする個体が、該個体が該処置または化学療法を受ける前に該薬物または化学療法薬に十分に応答するかまたは応答しないことを測定しまたは予測する方法に関する。本態様において、該薬物または化学療法薬物は、ｓｒｃチロシンキナーゼ活性またはシグナル伝達に関与するｓｒｃチロシンキナーゼをモジュレートするものであることが好ましい。本発明の方法によれば、疾患に関係する組織または器官由来の細胞（例えば、腫瘍または癌の患者のバイオプシー（大腸癌または腫瘍のバイオプシーが好ましい））を、本明細書中に記載するインビトロアッセイに受けさせ、ｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物または薬物を用いるそれらの処置前のマーカー遺伝子発現パターン（表３〜６からのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、および／または表１０〜１２のプレディクター遺伝子サブセット）を測定する。その結果得られる薬物処置前の該細胞の遺伝子発現プロファイルを、本発明によって提示される薬物または化合物に対して耐性または感受性のいずれかである細胞中の同一ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの遺伝子発現パターンと比較する。
【００９０】
別の関連態様において、本発明は、疾患状態に対する薬物療法または癌（例えば、大腸癌）に対する化学療法を必要とする個体が処置の投与前に処置に応答するかまたはしないかを予測し、予後し、診断し、および／または測定する方法を含む。該処置または療法は、タンパク質チロシンキナーゼモジュレート剤、化合物または薬物（例えば、タンパク質チロシンキナーゼ活性のインヒビター）を含むことが好ましい。タンパク質チロシンキナーゼとしては、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む）を含むが、これらに限定されない。ｓｒｃチロシンキナーゼおよびそのインヒビターが好ましい。本態様によれば、患者の組織標本（例えば、大腸の腫瘍または大腸のバイオプシー）由来の細胞をアッセイして、該タンパク質チロシンキナーゼモジュレート剤、化合物または薬物を用いる処置前のそれら遺伝子発現パターンを測定する。その結果得られる該化合物または薬物へ曝露前の該試験細胞の遺伝子発現プロファイルを、２５、１５または１０のいずれかのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含有するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの１つ以上のプレディクターサブセット（これは、本明細書中に記載し、そしてそれぞれ表１０〜１２中に示す）と比較する。
【００９１】
関連態様において、患者の癌または腫瘍が薬物または化合物（特に、ｓｒｃもしくはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ活性、またはｓｒｃキナーゼ経路に直接的にまたは間接的に関与する薬物または化合物）を用いる処置に対して感受性または耐性であるかを測定するためのスクリーニングアッセイを提供する。
【００９２】
タンパク質チロシンキナーゼ、特にｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ活性と相互作用しまたは阻害する薬物または化合物が関与する薬物処置の進行をモニターするためのモニタリングアッセイをも提供する。これらのモニタリングアッセイによって包含されるタンパク質チロシンキナーゼとしては、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む）を含む。それらインビトロアッセイは、ｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ活性を阻害する薬物または化合物を用いる処置前、および該薬物もしくは化合物を用いる処置後再び、患者の組織標本（例えば、腫瘍または癌のバイオプシー（大腸癌または腫瘍の標本が好ましい））からの細胞の耐性または感受性の遺伝子発現パターンを、記載する１つ以上のプレディクター遺伝子セットまたはそれらの組み合わせの発現パターンと比較することによって、ｓｒｃチロシンキナーゼをモジュレートしまたは相互作用する化合物または薬物によって処置可能な疾患を有する患者の処置をモニタリングすることができる。患者からの単離細胞をアッセイして、化合物または薬物（ｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼインヒビターが好ましい）への曝露前後のそれらの遺伝子発現パターンを測定し、別の薬物または薬剤を用いる処置を保証しあるいは現在の処置を中断するために、遺伝子発現プロファイルの変化が起こるかどうかを測定する。その結果得られた処置前後に試験した細胞の遺伝子発現プロファイルを、薬物または化合物に対して耐性または感受性のいずれかである細胞中で高く発現することが本明細書中に記載されそして示されているポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセットの遺伝子発現パターンと比較する。あるいは、薬物処置または療法に関連する患者の進行は、患者がある薬物または治療学的化合物を用いる処置を受けた後にだけ上記の遺伝子発現プロファイルを得ることによってモニターすることができる。この方法においては、該薬物または化合物を用いる処置前の患者の標本を試験する必要はない。
【００９３】
該モニタリングのプロセスは、患者の標本（例えば、腫瘍または癌のバイオプシー）から単離した細胞の遺伝子発現パターンに基づいて薬物または化合物を用いる患者の処置の成功または不成功を示すことができる。その理由は、薬物または化合物へ曝露させそして曝露後にそれらの遺伝子発現プロファイルについて評価した、細胞の耐性または感受性のコントロールパネルのプレディクター遺伝子セットの遺伝子発現パターンとはかなり同じかまたは異なるからである。従って、薬物または化合物を用いる処置後に、該試験細胞が、処置前に見られるものから、薬物または化合物に対して耐性である細胞のコントロールパネルのプレディクター遺伝子セットのものに相当するものまでのそれらの遺伝子発現プロファイルの変化を示す場合には、それは現行の処置を改変すべき、変えるべき、または中断さえすべきであるという指示物質として機能することができる。また、薬物感受性を示す細胞のプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現プロファイルと、処置を受けている患者由来の細胞からの遺伝子発現プロファイルとの相関に基づくと、患者の応答がｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼインヒビター化合物による処置に対する感受性を示す応答であるならば、患者の処置の予後は有利なものとして認定することができ、そして処置を続けることができる。更に、患者を薬物処置前に試験しない場合には、処置後に得られる結果を用いて、該プレディクター遺伝子セットと比較した遺伝子発現プロファイルに基づいて、該薬物に対する細胞の耐性または感受性を測定することができる。
【００９４】
関連態様において、本発明はタンパク質チロシンキナーゼをモジュレートする化合物または薬剤によって処置可能な疾患（すなわち、大腸癌）を有する患者の処置をモニタリングする方法を包含する。それらの処置のモニタリングアッセイによって包含されるタンパク質チロシンキナーゼとしては、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む）を含む。これらのアッセイの場合、患者からの試験細胞をアッセイして、タンパク質チロシンキナーゼインヒビター化合物または薬物への曝露前後のそれらの遺伝子発現パターンを測定する。その結果得られる処置の前後に試験した細胞の遺伝子発現プロファイルを、該薬物または化合物に対して耐性または感受性のいずれかである細胞中で高く発現することを本明細書中に記載され且つ示されているポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセットの遺伝子発現パターンと比較する。従って、該プレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現プロファイルの相関に基づいて、患者の応答がタンパク質チロシンキナーゼインヒビター化合物による処置に対して感受性である応答でありまたはそうなる場合には、該患者の処置予後は有利と認定され、そして処置は続けることができる。また、薬物または化合物を用いる処置後に、該試験細胞が、薬物または化合物に対して感受性である細胞のコントロールパネルのものに相当するプロファイルにまでそれらの遺伝子発現プロファイルの変化を示さない場合には、このことは、現行の処置が改変されるべき、変えるべき、あるいは中断さえされるべきであるという指示物質として機能する。それらモニタリングのプロセスは必要ならばまたは所望するならば繰り返すことができ、そして患者の標本から単離される細胞の遺伝子発現パターンに基づいて、薬物または化合物を用いる患者の処置の成功または不成功を示すことができる。ある薬物処置に対する患者の応答のモニタリングはまた、薬物または活性化合物を用いる処置の前後よりもむしろ処置後だけを記載するアッセイにおいて患者の細胞を試験することを含み得る。
【００９５】
好ましい態様において、本発明はｓｒｃチロシンキナーゼをモジュレートする化合物または薬物によって処置可能な疾患（すなわち、大腸癌）を有する患者の処置をモニタリングする方法を包含する。該患者からの試験細胞をアッセイして、ｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物または薬物へ曝露前後のそれらの遺伝子発現パターンを測定する。その結果得られた処置前後に試験した細胞の遺伝子発現プロファイルを、薬物または化合物に対して耐性または感受性のいずれかである細胞中で高く発現すると本明細書中に記載されそして示されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドのプレディクターセットの遺伝子発現パターンと比較する。従って、プレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現プロファイルの相関に基づいて、患者の応答がｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物による処置に対して感受性の応答でありまたはそうなる場合には、該患者の処置予後は有利なものと認定され、そして処置は続けることができる。また、薬物または化合物を用いる処置後に、該試験細胞が、該薬物または化合物に対して感受性である細胞のコントロールパネルのものに相当するプロファイルにまでそれらの遺伝子発現プロファイルの変化を示さない場合には、このものは、現行の処置を改変すべき、変えるべきまたは中断さえすべきという指示物質として機能する。それらモニタリングプロセスは必要ならばまたは所望するならば繰り返すことができ、そしてこのものは、患者の標本から単離した細胞の遺伝子発現パターンに基づいて、薬物または化合物を用いる患者の処置の成功または不成功を示すことができる。ある薬物処置に対する患者の応答のモニタリングはまた、薬物または活性化合物を用いる処置の前後よりもむしろ処置後だけに記載されるアッセイにおいて患者の細胞を試験することをも含むことができる。
【００９６】
別の態様において、本発明は、生物学的なシステム（苦しんでいる個体の組織、器官、腫瘍または癌由来の細胞であることが好ましい）が該システムをモジュレートする化合物に対して耐性または感受性であるかを分類する方法を包含する。本発明の好ましい態様において、細胞（例えば、腫瘍または癌から得られる細胞）のｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物または化合物群に対する感受性または耐性を測定する。該方法によれば、ｓｒｃキナーゼインヒビター薬物または化合物に曝露後の細胞の耐性／感受性のプロファイルを、本明細書中に記載の遺伝子発現プロファイリングプロトコールによって測定することができる。細胞の該耐性／感受性のプロファイルは、適当なアッセイ（例えば、実施例１に記載のインビトロ細胞毒性アッセイ）を用いて測定される通り、該化合物に対する細胞のＩＣ５０値に影響を及ぼす。この分類（sort）方法は、様々な細胞タイプ、およびｓｒｃチロシンキナーゼと相互作用したりまたはｓｒｃもしくはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼシグナル伝達経路においてその活性に影響を及ぼす化合物を用いて実施することができる。
【００９７】
その別態様において、本発明は、ｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼモジュレーター（特に、ｓｒｃチロシンキナーゼのインヒビター）に対する感受性（または耐性）と最も高く相関することが実証されている、本明細書中に記載のプレディクター遺伝子セットの１つ以上の特殊化（specialized）マイクロアレイ（例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ）（これは、表３〜５中のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの全てを含有する）またはそれらの組み合わせの製造を企図する。該プレディクター遺伝子セットは、本明細書中で実証する通り、１つ以上のｓｒｃキナーゼモジュレーター（例えば、ｓｒｃキナーゼインヒビター）中の感受性を予測するために共通であることが好ましい。本発明の本態様によれば、オリゴヌクレオチド配列またはｃＤＮＡ配列は、本明細書中に記載のプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドまたは遺伝子組み合わせのいずれかを含み、これらは、耐性または感受性の細胞中で高く発現し、そして、いずれかの担体物質（例えば、ガラススライド、ナイロン膜フィルター、ガラスもしくはポリマーベッド、または他のタイプの適当な基質物質）と一緒にマイクロアレイ（例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ）上に含まれ、あるいは該担体物質中に導入される。
【００９８】
細胞性核酸（例えば、ＲＮＡ）は、ｓｒｃチロシンキナーゼもしくはそのシグナル伝達経路と相互作用する薬物または化合物に曝露後に試験を受けている細胞、または薬物もしくは化合物に対する細胞の感受性の最初の測定もしくは予測（最終的には、該薬物または化合物を用いる処置の結果の予測）を得るために試験する細胞のいずれかから単離する。該単離した核酸を適当に標識し、そしてこれを１つ以上の該特殊化マイクロアレイに適用する。その結果得られる該特殊化マイクロアレイ上の遺伝子発現のパターンを、本明細書中に記載しそして当該分野において知られる通り分析する。該薬物または化合物に対する感受性または耐性のいずれかと相関する遺伝子発現のパターンはまた、例えば本明細書中でアッセイするｓｒｃキナーゼインヒビターに曝露された細胞のパネルについて図１〜３中に示す遺伝子発現パターンとの比較によって測定することもできる。
【００９９】
本発明の該特殊化マイクロアレイの態様によれば、該マイクロアレイは、１つ以上の該プレディクター遺伝子セット、もしくはそれらの組み合わせ、または細胞タイプによって薬物感受性もしくは耐性と高く相関する表３〜５中の遺伝子の全てのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む（例えば、大腸細胞について表１を参照）。試験細胞（例えば、腫瘍または癌細胞（大腸の癌または腫瘍細胞が好ましい））から単離した核酸標的が、コントロールと比べて、薬物感受性の該プレディクターセットのポリヌクレオチドおよびポリペプチドとの検出可能な結合の高レベルを示す場合には、患者の細胞が薬物または薬物群に対して応答するであろうこと、および該薬物または薬物群に対する患者の応答が好ましいであろうことを予測することができる。
【０１００】
該結果は、腫瘍または癌の細胞が、該薬物または薬物群を使用する成功処置または療法のよい候補物であることを予測する。あるいは、試験細胞から単離した核酸標的がコントロールと比べて、薬物耐性の該プレディクターセットのポリヌクレオチドおよびポリペプチドとの検出可能な結合の高レベルを示す場合には、患者は薬物または薬物群に対して応答しないであろうこと、および薬物または薬物群に対する患者の応答が有利でないだろうことを予測することができる。該結果は、腫瘍または癌の細胞が薬物または薬物群を使用する処置または療法にとっての良い候補物ではないと予測する。
【０１０１】
マイクロアレイ技術の利用は、当該分野の当業者に知られる。要するに、マイクロアレイ技術を使用する遺伝子発現を測定するために、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ（ＲＮＡが好ましい））を、生物学的な標本（例えば、大腸細胞として本明細書中に記載する細胞）から単離する。該単離核酸を、検出可能に標識し（例えば、蛍光、酵素、または化学発光標識）、そしてこのものをマイクロアレイ（例えば、本発明によって提供される特殊化マイクロアレイ）に適用する。次いで、該アレイを洗浄して非結合物質を除去し、そして染色もしくは蛍光、または使用する標識のタイプに応じて当該分野において知られる他の方法によって視覚化する。
【０１０２】
本発明の別の態様において、該プレディクター遺伝子セット、または該プレディクター遺伝子セットを含有するポリヌクレオチドおよびポリペプチドのサブセットは、ｓｒｃキナーゼインヒビター化合物に対して耐性または感受性である細胞についてのバイオマーカーとして使用することができる。手元のプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドの場合に、スクリーニングアッセイおよび検出アッセイを行なって、細胞（例えば、腫瘍または癌のバイオプシー標本（例えば、大腸癌細胞標本））をある化合物（ｓｒｃキナーゼインヒビター化合物が好ましい）に曝露後に、該化合物が感受性または耐性の表現型を誘発するかどうかを測定することができる。従って、ｓｒｃチロシンキナーゼまたはｓｒｃキナーゼ経路と相互作用する薬物または化合物（インヒビター化合物が好ましい）、および該細胞を曝露させるもの、に対する細胞の耐性または感受性を測定するためのスクリーニング方法、モニタリング方法、検出方法および／または診断方法を、本発明に包含する。
【０１０３】
該方法は、タンパク質チロシンキナーゼまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路と相互作用しまたは影響を及ぼす薬物または化合物に曝露させた細胞中での、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（特に、本明細書（表３〜６）中に記載のプレディクターまたはｓｒｃバイオマーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチド）の発現を測定しおよび評価するための様々な方法およびアッセイを包含する。ここで、該タンパク質チロシンキナーゼとしてはチロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む）を含む。適当な方法としては、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）レベルでの遺伝子の活性化または発現の検出および評価、並びにコードされるタンパク質の検出および評価を含む。例えば、当該分野において知られそして実施されているＰＣＲアッセイを用いて、薬物処置（例えば、ｓｒｃキナーゼインヒビター）に対する感受性についてアッセイするために、細胞中でのＲＮＡを定量化することができる（実施例２、ＲＴ−ＰＣＲを参照）。
【０１０４】
別の態様において、本発明は、タンパク質チロシンインヒビター化合物、もしくはタンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路（例えば、Ｓｒｃチロシンキナーゼ）に影響を及ぼす化合物のいずれかに耐性であると予測されるか、あるいはそれら化合物に対する異なる生物学的なシステムにおいて耐性である、細胞、組織および／または患者を同定する方法に関する。該方法は、（ｉ）該化合物に対する耐性応答の予測に相関することが分かった、表３〜６中に例示するポリヌクレオチドおよびポリペプチドまたはそれらのいずれかの組み合わせのみの発現を分析する工程；（ｉｉ）該試験細胞、組織および／または患者中の相関する耐性ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの観察される発現レベルを、該化合物に対して耐性であると知られるセルライン中の同一ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現レベルを比較する工程；および、（ｉｉｉ）該細胞、組織および／または患者が、工程（ｉｉ）において観察されるそれらポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現の全体的類似度に基づいて、該化合物に対して耐性であるかどうかを予測する工程、を含む。
【０１０５】
別の態様において、本発明は、タンパク質チロシンインヒビター化合物、もしくはタンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路（例えば、Ｓｒｃチロシンキナーゼ）に影響を及ぼす化合物のいずれかに感受性であると予測されるか、あるいはそれら化合物に対する異なる生物学的なシステムにおいて感受性である、細胞、組織および／または患者を同定する方法に関する。該方法は、（ｉ）該化合物に対する感受性応答の予測に相関することが分かった、表３〜６中に例示するポリヌクレオチドおよびポリペプチドまたはそれらのいずれかの組み合わせのみの発現を分析する工程；（ｉｉ）該試験細胞、組織および／または患者中での相関する感受性ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの観察される発現レベルを、該化合物に対して感受性であると知られるセルライン中の同一ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現レベルを比較する工程；および、（ｉｉｉ）該細胞、組織および／または患者が、工程（ｉｉ）において観察されるそれらポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現の全体的類似度に基づいて、該化合物に対して感受性であるかどうかを予測する工程、を含む。
【０１０６】
本発明は更に、抗体ベースアッセイ（例えば、イムノアッセイ）および／または検出システムを用いて、本発明の１つ以上のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質の検出および／または定量化を包含する。本明細書中に記載する通り、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーは、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む）を含む。該アッセイは、本明細書中更に記載する通り、以下の実施例、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット法などを含むがこれらに限定されない。
【０１０７】
別の態様において、本発明のヒトタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドおよび／またはペプチド、またはそれらの免疫原性フラグメントもしくはオリゴペプチドを、様々な薬物スクリーニング技術において治療学的な薬物または化合物をスクリーニングするのに使用することができる。それらスクリーニングアッセイにおいて使用するフラグメントは、溶液中遊離であり、固体担体に付着し、細胞表面に運ばれ（bear）、または細胞内に置くことができる。該バイオマーカーと試験する薬剤との間の結合複合体の形成についての活性の低下または消滅を、測定することができる。従って、本発明は、本発明のタンパク質キナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはその結合可能なペプチドフラグメントとの特有な結合アフィニティーについて複数の化合物をスクリーニングしまたは評価する方法を提供する。本発明は、複数の化合物を提供し；タンパク質キナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはその結合可能なペプチドフラグメントを、該複数の化合物の各々と、適当な条件下、結合できる十分な時間で混合し；該バイオマーカーポリペプチドまたはペプチドと該複数の試験化合物の各々との結合を測定し、それによって、該バイオマーカーポリペプチドまたはペプチドに特異的に結合する化合物を同定する、工程を含む。より具体的には、該バイオマーカーポリペプチドまたはペプチドは、Ｓｒｃチロシンキナーゼのものである。
【０１０８】
ヒトタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドおよび／またはペプチドの活性をモジュレートする化合物を同定する方法を本発明によって提示し、そして該方法はタンパク質キナーゼ生物学的活性の潜在的なまたは候補の化合物または薬物モジュレーターを、タンパク質キナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはペプチド（例えば、表２中に記載するＳｒｃチロシンキナーゼバイオマーカーアミノ酸配列）と一緒に混合し、そして該候補化合物または薬物モジュレーターが該タンパク質キナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはペプチドの生物学的活性に及ぼす影響を測定することを含む。該測定可能な効果としては、例えば物理学的な結合相互作用；適当なタンパク質キナーゼ基質を切断する能力；未変性（native）のクローン化タンパク質キナーゼバイオマーカー−発現セルラインに及ぼす影響；および、モジュレーターまたは他のタンパク質キナーゼ媒介性の生理学的な測定の効果を含む。
【０１０９】
本発明の新規なタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの生物学的活性をモジュレートする化合物を同定する別方法は、タンパク質チロシンキナーゼの生物学的活性（例えば、Ｓｒｃチロシンキナーゼ）の潜在的なまたは候補の化合物または薬物のモジュレーターを、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドを発現する宿主細胞と一緒に混合し、そして該候補の化合物または薬物のモジュレーターが該タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの生物学的活性に及ぼす影響を測定することを含む。該宿主細胞はまた、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドを、例えば誘発性発現によって発現するように誘発することができる。あるモジュレーター候補物が該タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに及ぼす生理学的な影響もまた測定することができる。従って、あるタンパク質チロシンキナーゼモジュレーター（例えば、ｓｒｃキナーゼモジュレーター）についての細胞アッセイは、該タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの物理学的な生物学的活性の直接的な測定または定量化のいずれかであり得て、あるいはそれらは生理学的な効果の測定または定量化であり得る。該方法は、本明細書に記載するタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド、または過剰発現する組み換えタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドを、本明細書に記載する発現ベクターを含有する適当な宿主細胞（該タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドが、発現し、過剰発現し、または下方調節された発現を受ける）中で使用することが好ましい。
【０１１０】
本発明の別の態様は、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド（例えば、Ｓｒｃキナーゼバイオマーカーポリペプチド）の生物学的活性をモジュレートすることができる化合物をスクリーニングする方法を包含する。該方法は、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド、またはそれらの機能性ペプチドもしくは部分（例えば、本明細書の表３〜１２または配列表に記載の、ｓｒｃポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはフラグメント配列）をコードする核酸配列を有する(harboring)発現ベクターを含有する宿主細胞を提供し；モジュレーター化合物の非存在下で、該発現タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの生物学的活性を測定し；該細胞を該モジュレーター化合物と接触して、該モジュレーター化合物の存在下で該発現タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの生物学的な活性を測定することを含む。該方法において、該モジュレーター化合物の存在下および該モジュレーター化合物の非存在下での該タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの活性の間の差違は、該化合物のモジュレート効果を示す。
【０１１１】
本質的に、いずれかの化学的化合物を、本発明に記載のアッセイにおいて潜在的なモジュレーターまたはリガンドとして使用することができる。タンパク質チロシンキナーゼモジュレーターとして試験する化合物は、いずれかの小化学的化合物または生物学的な実体（例えば、タンパク質、糖類、核酸または脂質）であり得る。試験化合物は、典型的に小化学分子およびペプチドである。一般的に、潜在的なモジュレーターとして使用する化合物は、水溶液または有機（例えば、ＤＭＳＯ−ベース）溶液中に溶解することができる。該アッセイは、該アッセイ工程を自動化し、そしていずれかの便利な供給源から化合物を得ることによって、大きな化学ライブラリをスクリーニングするように設計する。アッセイは典型的に、例えばロボットアッセイ中でのマイクロタイタープレート上のマイクロタイターフォーマット中で平行して行なう。化学的化合物の多数の供給源（例えば、シグマ（St. Louis, MO）、アルドリッチ（St. Louis, MO）、シグマ−アルドリッチ（St. Louis, MO）、フルカ・ケミカ−バイオケミカ・アナリティカ(Fluka Chemika-Biochemica Analytika)（Buchs, スイス国）を含む）が存在する。また、化合物は当該分野において知られる方法によって製造することができる。
【０１１２】
ハイスループットスクリーニング方法論が、新規なタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカー（例えば、本明細書中に記載のｓｒｃバイオマーカー、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド）のモジュレーターの検出について特に想定される。該ハイスループットスクリーニング方法は典型的に、多数の潜在的な治療学的化合物（例えば、リガンドまたはモジュレーター化合物）を含有するコンビナトリアルな化学またはペプチドのライブラリを提供することを含む。次いで、該コンビナトリアルな化学ライブラリまたはリガンドライブラリを１つ以上のアッセイ中でスクリーニングして、所望する特有の活性を示すそれらライブラリ要素（例えば、ある化学種またはサブクラス）を同定する。そうして同定した化合物は、通常のリード化合物として機能することができたり、あるいはそれ自身、潜在的なまたは実際の治療薬として使用することができる。
【０１１３】
コンビナトリアル化学ライブラリは、多数の化学ビルディングブロック（すなわち、アミノ酸などの試薬）を組み合わせることによって製造される、化学的合成または生物学的合成のいずれかによって生成する多様な化学的化合物の収集物である。例えば、線形（linear）コンビナトリアルライブラリ（例えば、ポリペプチドまたはペプチドライブラリ）は、ある化合物の長さ（すなわち、ポリペプチドまたはペプチド化合物内のアミノ酸の数）についてのあらゆる可能な方法で化学的なビルディングブロックのセットを組み合わせることによって生成される。何百万の化学的化合物を、化学的なビルディングブロックのそれらコンビナトリアルなミックスによって製造することができる。
【０１１４】
コンビナトリアルな化学ライブラリの製造およびスクリーニングは、当該分野の当業者にとってよく知られる。コンビナトリアルライブラリとしては、ペプチドライブラリ（例えば、米国特許第5,010, 175号; Furka, 1991, Int. J. Pept. Prot. Res., 37: 487-493; およびHoughtonらによる1991, Nature, 354: 84-88）を含むが、これらに限定されない。化学的な多様性ライブラリを得るための他の化学をまた、使用することができる。化学的な多様性ライブラリの非限定的な例としては、ペプチド（PCT公開番号WO 91/019735）、コードされたペプチド（PCT公開番号WO 93/20242）、ランダムなバイオ−オリゴマー（PCT公開番号WO 92/00091）、ベンゾジアゼピン（米国特許第5,288,514号）、ダイバーソマー（diversomer）（例えば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド）（Hobbsらによる1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6909-6913）、ビニル性（vinylogous）ポリペプチド（Hagiharaらによる1992, J. Amer. Chena. Soc., 114: 6568）、グルコーススカホールドを有する非ペプチド性ペプチド擬態（Hirschmannらによる1992, J. Amer. Chenu. Soc., 114: 9217-9218）、小化合物ライブラリの有機合成アナログ（Chenらによる1994, J. Amer. Chen. Soc., 116: 2661）、オリゴカルバメート（Choらによる1993, Science, 261: 1303）および／またはペプチジルホスホネート（Campbellらによる1994, J. Org. Chez., 59: 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, BergerおよびSambrookによる上記の全てを参照）、ペプチド核酸ライブラリ（米国特許第5,539,083号）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughnらによる1996, Nature Biotechnology, 14(3): 309-314、およびPCT/US96/10287）、炭水化物ライブラリ（例えば、Liangらによる1996, Science, 274-1520-1522、および米国特許第5,593,853号）、小有機分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C & EN, Jan. 18, 1993, 33頁；および米国特許第5,288,514号）；イソプレノイド（米国特許第5,569,588号）；チアゾリジノンおよびメタチアザノン（米国特許第5,549,974号）；ピロリジン（米国特許第5,525,735号、および第5,519,134号）；モルホリノ化合物（米国特許第5,506,337号）などを含む。
【０１１５】
コンビナトリアルライブラリの製造のためのデバイスは、商業的に使用可能である（例えば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA）。加えて、多数のコンビナトリアルライブラリを、商業的に入手可能である（例えば、ComGenex, Princeton, NJ; Asinex, Moscow, Russia; Tripos, Inc., St. Louis, MO; ChemStar, Ltd., Moscow, Russia; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MDなど）。
【０１１６】
１態様において、本発明は、チロシンキナーゼタンパク質／ポリペプチド／ペプチドを発現する細胞または組織を固相基質と結合する、ハイスループットフォーマットにおける固相ベースのインビトロアッセイを提供する。該ハイスループットアッセイにおいて、１日に数千までの異なるモジュレーターまたはリガンドをスクリーニングアップすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルを用いて、選択した潜在的なモジュレーターに対する別々のアッセイを行なったり、あるいは、濃度またはインキュベーション時間の効果を観察する予定の場合には、各５〜１０ウェルを用いて１個のモジュレーターを試験することができる。従って、１個の標準的なマイクロタイタープレートを用いて、約９６個のモジュレーターをアッセイすることができる。１５３６ウェルプレートを使用する場合には、１個のプレートは、約１００〜約１５００個の異なる化合物について容易にアッセイすることができる。１日に数個の異なるプレートをアッセイすることが可能であり；従って、例えば約６，０００〜２０，０００個までの異なる化合物についてのアッセイスクリーニングが、記載された統合システムを用いて可能である。
【０１１７】
別の該態様において、本発明は、あるタンパク質（すなわち、チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはペプチド）（例えば、Ｓｒｃチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはペプチド）と結合することができる小分子の検出または同定を含む、スクリーニングアッセイおよび小分子（例えば、薬物）検出アッセイを包含する。ハイスループットスクリーニング方法論について適当なアッセイが、特に好ましい。
【０１１８】
該結合ベースの検出、同定、またはスクリーニングアッセイにおいては、機能的なアッセイは典型的に必要とされない。通常、必要とされるものは、標的タンパク質（このものは実質的に精製されることが好ましい）、および化合物（例えば、リガンド、薬物または小分子）のライブラリもしくはパネル、または該タンパク質標的との結合についてスクリーニングしもしくはアッセイする生物学的な実体が全てである。該標的タンパク質と結合するほとんどの小分子は、該タンパク質上の機能性領域または部位との優先的でより高いアフィニティー結合に起因するいくつかの様式で該標的活性をモジュレートすることが好ましい。 
【０１１９】
該アッセイは例えば、Pantolianoらによる米国特許第6,020,141号および第6,036,920号に記載されている通り、蛍光ベースの熱シフトアッセイ（3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc., 3DP, Exton, PA）を挙げられる（例えば、J. Zimmermanらによる2000, Gen Eng, News, 20(8)を参照）。該アッセイにより、タンパク質と薬物またはリガンドとの複合体の熱アンフォールディング曲線を分析することによる結合測定のアフィニティーに基づいて、発現するために結合する小分子（例えば、薬物、リガンド）、およびチロシンキナーゼバイオマーカータンパク質／ポリペプチド／ペプチド（例えば、Ｓｒｃチロシンキナーゼ）（これは、精製されているものが好ましい）の検出が可能となる。本技術によって測定される薬物または結合分子は更に、所望するならば、本明細書に記載の方法によってアッセイして、該分子が該標的タンパク質の機能または活性に影響を及ぼしたりあるいはモジュレートするかどうかを測定することができる。
【０１２０】
チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはペプチド（例えば、Ｓｒｃチロシンキナーゼ）を精製するために、および生物学的結合またはリガンド結合アッセイを測定するために、該供給源は、標準的なプロテアーゼインヒビターの存在下、連続した冷凍−解糖サイクル（例えば、１〜３回）によって調製することができるホールセルライセートであり得る。該チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドは、標準的なタンパク質精製方法（例えば、本明細書中に記載する特異的抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー法）、または組み換えチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド分子中に操作されたエピトープタグに特異的なリガンド（本明細書中にも記載する）によって部分的にまたは完全に精製することができる。次いで、結合活性を記載する通り測定することができる。
【０１２１】
本明細書中で提示する方法に従って同定され、そして本発明に係わるチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの生物学的な活性または生理学をモジュレートしまたは制御する化合物が、本発明の好ましい態様である。該モジュレート化合物は、該処置を必要とする個体に本明細書中に記載する方法によって同定される化合物の治療学的に有用な量を投与することによって、チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド（例えば、Ｓｒｃチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド）によって媒介される疾患を処置するための処置方法および治療方法において使用することができると企図する。
【０１２２】
加えて、本発明は、本発明のチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドによって媒介される疾患、障害または病気のための処置が必要な個体の処置方法を提供し、該方法は該個体に本明細書中に提示する方法によって同定されたチロシンキナーゼバイオマーカーモジュレート化合物を投与することを含む。本発明によれば、該方法によって包含される該チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはタンパク質としては、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む）を含む。
【０１２３】
本発明は特に、本発明のＳｒｃバイオマーカーポリペプチドによって媒介される疾患、障害または病気についての処置の必要な個体の処置方法を提供し、該方法は該個体に、本明細書中に提示する方法によって同定されるＳｒｃバイオマーカーモジュレート化合物の治療学的に有効な量を投与することを含む。
【０１２４】
本発明のｓｒｃバイオマーカータンパク質に対する抗体、またはその抗原性もしくは免疫原性エピトープは例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ、１本鎖およびヒト化抗体、並びにＦａｂ、Ｆ(ａｂ)’２もしくはＦｖフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラリの産物をも含む。当該分野において知られる様々な方法を、該抗体および抗体フラグメントの産生に使用することができる。
【０１２５】
本発明のｓｒｃバイオマーカー配列の１つ以上に対応するポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して生成する抗体は、該動物中に該ポリペプチドまたはペプチドを直接的に注入することによって、または動物（非ヒト動物が好ましい）に該ポリヌクレオチドまたはペプチドを投与することによって得ることができる。次いで、そうして得られた抗体を、該ポリペプチドまたはペプチドと結合する。この様式において、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも用いて、全ての未変性（whole native）ポリペプチドと結合する抗体を得ることができる。該抗体を用いて、例えばポリペプチドを発現する組織から該ポリペプチドを単離することができる。
【０１２６】
モノクローナル抗体の製造の場合には、連続的なセルライン培養によって産生する抗体を与えるいずれかの技術を使用することができる。例えば、ハイブリドーマ技術（KohlerおよびMilsteinによる1975, Nature, 256: 495-497）、トリオマ(trioma)技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Kozborらによる1983, Immunol. Today, 4: 72）、およびヒトモノクローナル抗体を得るためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Coleらによる1985. In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 77-96頁）を含む。
【０１２７】
１本鎖抗体の産生について記載する技術（米国特許第4,946,778号）は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する１本鎖抗体を得るために適合することができる。また、トランスジェニックマウスを用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現することができる。
【０１２８】
ＥＬＩＳＡアッセイは、最初にｓｒｃバイオマーカータンパク質またはポリペプチドの抗原に特異的な抗体（モノクローナル抗体が好ましい）を製造することを含む。加えて、該モノクローナル抗体を認識しそしてそれと結合するレポーター抗体を用いる。該レポーター抗体に、検出可能な試薬（例えば、放射性同位元素、蛍光分子、または本実施例においては酵素（例えば、ホースラッディシュペルオキシダーゼ））を結合する。
【０１２９】
ＥＬＩＳＡアッセイを実施するために、標本（例えば、患者の標本）を宿主から取り出し、そしてこのものを、該標本中のタンパク質が結合することができる固体担体（例えば、マイクロタイタープレートまたはポリスチレンディッシュのウェル）上でインキュベートする。次いで、該ディッシュ上のいずれかの遊離タンパク質結合部位を、非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）と一緒にインキュベートすることによってブロックする。次いで、該モノクローナル抗体を該固体担体（例えば、ウェルまたはディッシュ）に加え、そしてインキュベートする。インキュベート時間の間、該モノクローナル抗体を、該ポリスチレンディッシュと結合するいずれかのｓｒｃバイオマーカータンパク質またはポリスチレンと結合する。全ての非結合性モノクローナル抗体を、適当な緩衝溶液を用いて洗浄する。レポーター抗体（例えば、ホースラッディシュペルオキシダーゼと結合したもの）を該支持体に加え、その結果、該レポーター抗体といずれかのモノクローナル抗体（これは、標本中に存在するｓｒｃバイオマーカータンパク質またはポリペプチドと結合する）との結合を生じる。次いで、非結合性レポーター抗体を洗浄する。ペルオキシダーゼ基質を該担体に加え、そしてある期間内で顕色した（developed）色の量は、標準的な曲線と比較して、ある容量の患者の標本中に存在するｓｒｃバイオマーカータンパク質またはポリペプチドの量の基準を与える。
【０１３０】
本発明は、表３〜６中に記載する１つ以上のｓｒｃバイオマーカーアミノ酸配列のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープを含むか、あるいは別にそれから構成されるポリペプチドを包含する。本発明は更に、本発明のｓｒｃバイオマーカーのポリペプチドの配列のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列を包含する。
【０１３１】
本明細書中に記載する用語「エピトープ」とは、動物（哺乳動物が好ましく、ヒトが最も好ましい）中の抗原性または免疫原性の活性を有するポリペプチドの部分を意味する。好ましい態様において、本発明は、エピトープを含有するポリペプチド、並びに本ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。本明細書中に使用する「免疫原性エピトープ」とは、当該分野において知られるいずれかの方法、または上記の抗体を得るための方法によって測定される、動物中での抗体応答を誘発するタンパク質の部分を意味する（例えば、Geysenらによる1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3998-4002を参照）。本明細書中で使用する用語「抗原エピトープ」とは、当該分野においてよく知られるいずれかの方法（例えば、本明細書中に記載するイムノアッセイ）によって測定される通り、その抗原と免疫特異的に結合することができるタンパク質の部分を意味する。免疫特異的な結合は非特異的な結合を除くが、このものは必ずしも他の抗原との交叉反応性を除外するものではない。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。全長タンパク質または抗原性ペプチドフラグメントのいずれかを使用することができる。抗体は、エピトープを含有するｓｒｃバイオマーカー核酸およびタンパク質配列の領域内のこれらの領域からまたは該領域内の別個のフラグメントから、製造されることが好ましい。
【０１３２】
その上、抗体はまた、本明細書中で記載するｓｒｃバイオマーカーのポリペプチドおよびペプチドのいずれかの領域から製造することもできる。好ましいフラグメントは、リガンドとの結合を減少させるかまたは完全に防止する抗体の産生を与える。加えて、抗体は、レセプター全体または該レセプターの部分（例えば、細胞内カルボキシ末端ドメイン、アミノ末端細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン全体、特異的な膜貫通セグメント、細胞内または細胞外ループスのいずれか、またはこれらの領域のいずれかの部分）に対して発生することができる。抗体はまた、特異的な機能性部位（例えば、リガンド結合の部位）、またはグリコシル化、ホスホリル化、ミリスチル化、もしくはアミド化された部位に対して発生することもできる。
【０１３３】
エピトープとして機能するポリペプチドまたはペプチドのフラグメントを、いずれかの通常の方法によって産生することができる（例えば、Houghten, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5131-5135を参照; および米国特許第4,631,211号に記載）。
【０１３４】
本発明において、抗原エピトープは、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。免疫原性エピトープまたは抗原エピトープを含有する好ましいポリペプチドは、鎖中、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のアミノ酸残基である。更なる非排他的な好ましい抗原エピトープとしては、本明細書中に開示する抗原エピトープ、それらの部分、並びにこれら抗原エピトープの２、３、４、５もしくはそれ以上のいずれかの組み合わせを含む。抗原エピトープは、例えば、抗体（例えば、該エピトープと特異的に結合するモノクローナル抗体を含む）を産生するのに有用である。加えて、抗原エピトープは、イムノアッセイにおいて標的分子として使用することができる（例えば、Wilsonらによる1984, Cell, 37: 767-778; およびSutcliffeらによる1983, Science, 219: 660-666）。しかしながら、本明細書中に記載するそれらフラグメントは、本発明以前に開示されているかもしれないいずれかのフラグメントを包含するので、構築すべきでない。
【０１３５】
同様に、免疫原性エピトープは、例えば当該分野においてよく知られる方法に従って、抗体を誘発するために使用することができる（例えば、Sutcliffeらによる上記; Wilsonらによる上記; Chowらによる1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 910-914; およびBittleらによる1985, J. Gen. Viril, 66: 2347-2354）。好ましい免疫原性エピトープとしては、本明細書中に開示する免疫原性エピトープ、並びにこれらの免疫原性エピトープの２、３、４、５またはそれ以上のいずれかの組み合わせを含む。
【０１３６】
抗体応答を誘発する１つ以上の免疫原性エピトープを含有するＳｒｃバイオマーカーポリペプチドは、動物システム（例えば、ウサギまたはマウス）中にキャリヤータンパク質（例えば、アルブミン）と一緒に導入することができる。別に、該ポリペプチドが十分に長い（例えば、少なくとも約２５個のアミノ酸）場合には、該ポリペプチドは、キャリヤーなしで提供することができる。しかしながら、５〜１０個程のアミノ酸を含有する免疫原性エピトープが、変性ポリペプチド中のごくわずかの鎖状エピトープと結合することができる抗体を産生するのに十分であることが分かった（例えば、ウェスタンブロット法）。
【０１３７】
本発明のエピトープ含有ポリペプチドを用いて、当該分野において良く知られる方法に従って抗体を誘発することができ、該方法としては例えば、インビボ免疫化、インビトロ免疫化およびファージディスプレイ法を含むが、これらに限定されない。例えば、Sutcliffeらによる上記; Wilsonらによる上記; およびBittleらによる上記を参照。インビボ免疫化を使用する場合には、動物は遊離ペプチドを用いて免疫化することができるが；しかしながら、該抗−ペプチド抗体価は、該ペプチドを巨大分子キャリヤー（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド（ＴＴ））にペプチドをカップリングさせることによって追加免疫することができる。例えば、システイン残基を含有するペプチドは、リンカー（例えば、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ））を用いてキャリヤーとカップリングすることができ、一方で、他のペプチドはより一般的な連結剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリヤーとカップリングすることができる。
【０１３８】
最初にJ. P. Tamらによる1995, Biomed. Pept., Proteins, Nucleic Acids, 199, 1(3): 123-32; およびCalvoらによる1993, J. Immunol., 150 (4): 1403-12（このものは本明細書の一部を構成する）によって記載されている通り、本発明のエピトープ含有ペプチドをまた、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）として製造することができる。ＭＡＰは、非免疫原性リシンコアと結合した特異的ペプチドの多数のコピーを含む。ＭＡＰペプチドは通常、該ペプチドの４または８個のコピーを含み、これらはＭＡＰ４またはＭＡＰ８ペプチドと呼ばれることが多い。ＭＡＰは、ポリエチレングリコール−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）担体と結合したリシンのコア・マトリックス上に製造することができるが、これは非限定的な例である。関心あるペプチドは、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を用いてリシン残基上に製造される。例えば、アプライドバイオシステム（Applied Biosystems (Foster City, CA)）は、商業的に入手可能なＭＡＰ樹脂（例えば、Ｆｍｏｃレシン４ブランチ（Branch）およびＦｍｏｃレシン８ブランチ）（これらは、ＭＡＰを製造するために使用することができる）を提供する。ＭＡＰの該樹脂からの切断は、当該分野において知られる標準的なトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）ベースのカクテルを用いて行なう。ＭＡＰの精製（脱塩の場合を除く）は通常、必要とされない。ＭＡＰペプチドは、該ペプチドが誘導されるＭＡＰおよび天然タンパク質の両方を認識する抗体を誘発するワクチンを免疫化する際に使用することができる。
【０１３９】
本発明のエピトープ含有ペプチドはまた、ウイルスのコートタンパク質中に取り込むことができ、次いでこのものは動物（ヒトを含む）を免疫化するために免疫原またはワクチンとして使用することができ、順に抗−エピトープ抗体の産生を刺激する。例えば、ヒト免疫不全症ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）のｇｐ１２０糖タンパク質のＶ３ループは、ライノウイルスの表面上で発現するように操作した。Ｖ３ループペプチドをディスプレイするライノウイルスを用いる免疫化は、ＨＩＶ−１免疫原の見かけ上有効な擬態を与えた（このことは、抗−ＨＩＶ−１抗体によって中和されるそれらの能力によって、並びに細胞培養物中でＨＩＶ−１を中和することができる抗体の産生を誘発するそれらの能力によって測定される）。操作したウイルス粒子を免疫原として使用するこの技術は、Smithらによる1997, Behring Inst Mitt Feb, (98): 229-39; Smithらによる1998, J. Vol., 72: 651-659; およびZhangらによる1999, Biol. Chem., 380: 365-74）（このものは、本明細書の一部を構成する）中でより詳細に記載されている。
【０１４０】
本発明のエピトープ含有ポリペプチドは、例えば該ペプチドのアミノ−および／またはカルボキシ−末端上にアミノ酸を付加することによって改変することができる。該改変は、例えばエピトープ含有ポリペプチドの立体配座を改変して、その結果該エピトープが天然タンパク質内の該エピトープの構造により密接に関連する立体配座を有するように、行なう。本発明の改変されたエピトープ含有ポリペプチドの例としては、１つ以上のシステイン残基が該ポリペプチドに加えられて、２個のシステイン間のジスルフィド結合の形成が可能であり、従って非還元性条件下で該エピトープ含有ポリペプチドの安定なループ構造を与えることが可能である、ポリペプチドが挙げられる。ジスルフィド結合は、該ポリペプチドに加えられたシステイン残基と該天然エピトープのシステイン残基の間で、または該天然のエピトープ含有ポリペプチドに共に加えられた２個のシステインの間で、形成することができる。
【０１４１】
加えて、ジスルフィド結合したループ構造の形成を促進するためにシステインによる置換によって、該天然エピトープポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基を改変することが可能である。合成ペプチドの環状チオエーテル分子は、例えば、PCT国際公開WO 97/46251（このものは本明細書の一部を構成する）に記載されている通り当該分野において知られる技術を用いてルーチン的に生成することができる。本発明によって企図されるエピトープ含有ポリペプチドの他の改変としては、ビオチニル化を含む。
【０１４２】
インビボでの抗体の産生のために、宿主動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ヒツジまたはヤギ）を、遊離なまたはキャリヤーとカップリングさせた、ペプチドまたはＭＡＰペプチドのいずれかを用いて、腹腔内および／または皮内の注入によって免疫化する。注入物質は典型的に、ペプチドまたはキャリヤータンパク質（約１００μｇ）と、フロイントのアジュバントまたは免疫応答を刺激することが知られるいずれかの他のアジュバントとを含有する乳濁液を挙げられる。いくつかの追加免疫注入は、例えば固体の表面に吸着された遊離ペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイによって検出することができる抗−ペプチド抗体の有用な力価を得るために、例えば約２週間間隔で必要とされ得る。免疫化した動物からの血清中の抗−ペプチド抗体の力価は、抗−ペプチド抗体を選択することによって、例えば当該分野においてよく知られる方法に従って固体担体上へ該ペプチドを吸着させそして該選択した抗体を溶出することによって、増大することができる。
【０１４３】
当該分野の当業者が認めるであろうし且つ上に記載する通り、本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドは、他のポリペプチド配列と融合することができる。ここで、本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドは、例えばチロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおｙびＥｐｈｒを含む）を含み、このものは免疫原性または抗原エピトープを含有する。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリンの定常部（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＤまたはＩｇＭ）もしくはその部分（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）またはそれらとその部分とのいずれかの組み合わせと、あるいはアルブミン（このものは、組み換えヒトアルブミンまたはそのフラグメントもしくは変異体を含むが、それらに限定されない）（例えば、米国特許第5,876,969号; ＥＰ特許第0 413 622号; および米国特許第5,766 883号（これらは本明細書の一部を構成する））と、融合して、その結果キメラポリペプチドを得ることができる。該融合タンパク質は、精製を促進することができ、そしてインビボでの半減期を増大することができる。このことは、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの第１の２個のドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンのＨ鎖もしくはＬ鎖の定常部の様々なドメインを含有するキメラタンパク質について見られる。例えば、Trauneckerらによる1988, Nature, 331: 84-86。
【０１４４】
上皮性関門を通過する免疫システムへの抗原の運搬の増大は、ＦｃＲｎ結合パートナー（例えば、ＩｇＧまたはＦｃのフラグメント）と接合した抗原（例えば、インスリン）について実証されている（例えば、PCT公開WO96/22024およびWO 99/04813を参照）。ＩｇＧ部のジスルフィド結合に起因するジスルフィド−連結の二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドまたはそのフラグメントの単独よりも、他の分子と結合しそして中和する際により効率が良いことが分かっている。例えば、Fountoulakisらによる1995, J. Biochem., 270: 3958-3964を参照。
【０１４５】
エピトープをコードする核酸はまた、該発現するポリペプチドの検出および精製を助けるために、エピトープタグ（例えば、赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグ（flag）タグ）として関心ある遺伝子を用いて組み換えることもできる。例えば、ヒトセルライン中で発現する非変性融合タンパク質の準備（ready）精製のためのシステムが、Janknechtら（1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8972-897）によって記載されている。このシステムにおいて、関心ある遺伝子をワクシニア組み換えプラスミド中にサブクローニングし、その結果該遺伝子のオープンリーディングフレームを６個のヒスチジン残基を有するアミノ−末端タグと翻訳的に融合する。該タグは、融合タンパク質のマトリックス結合ドメインとして機能する。組み換えワクシニアウイルスを用いて感染した細胞からのエキスを、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラム上にロードし、そしてヒスチジン−タグしたタンパク質を、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出する。
【０１４６】
本発明の更なる融合タンパク質は、遺伝子−シャッフリング、モチーフ−シャッフリング、エキソン−シャッフリングおよび／またはコドン−シャッフリング（これらはまとめて、「ＤＮＡ」シャッフリングと呼ぶ）の技術を使用することによって生成することができる。ＤＮＡシャッフリングを用いて、本発明のポリペプチドの活性をモジュレートすることができ、該方法を用いて、活性を改変したポリペプチド、並びに該ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを得ることができる。一般的には、米国特許第5,605,793号; 第5,811,238号; 第5,830,721号; 第5,834,252号; および第5,837,458号, 並びにPattenらによる1997, Curr. Opinion Biotechnol., 8: 724-33; Harayamaによる1998, Trends Biotechnol., 16 (2): 76-82; Hanssonらによる1999, J. Mol. Biol., 287: 265-76; 並びにLorenzoおよびBlascoによる1998, Biotechniques, 24 (2): 308-313（これらは各々本明細書の一部を構成する）を参照。
【０１４７】
本発明の１態様において、表３〜６中に記載するｓｒｃバイオマーカーポリヌクレオチド配列およびこれらポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの１つ以上に対応するポリヌクレオチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングによって達成することができる。ＤＮＡシャッフリングは、ポリヌクレオチド配列内の変化を得るために、相同または部位特異的な組み換えによる２つ以上のＤＮＡセグメントの構築を含む。別の態様において、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらのコードされたポリペプチドは、組み換え前に、エラープローンＰＣＲ法、ランダムヌクレオチド挿入法、または他の方法によってランダムな突然変異ポリヌクレオチド（mutapolynucleotide）およびポリペプチドに供することによって改変することができる。別態様において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどを、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどを用いて組み換えることができる。
【０１４８】
本発明の別の態様は、表３〜６中に記載の１つ以上のｓｒｃバイオマーカーアミノ酸配列のポリペプチド、ポリペプチドフラグメントもしくは変異体、および／または本発明のそのエピトープと免疫特異的に結合する、抗体およびＴ−細胞抗原レセプター（ＴＣＲｓ）（これは、特異的な抗体−抗原結合をアッセイするための当該分野においてよく知られるイムノアッセイによって測定される）に関する。
【０１４９】
抗体または免疫グロブリンの基本的な抗体の構造単位は、四量体を含むことが知られる。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は１つの「Ｌ」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「Ｈ」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含み；該可変領域は、主に抗原認識に関与する。各鎖のカルボキシ末端部分は、免疫グロブリンエフェクター機能に主に関与する定常部を画定する。免疫グロブリンＬ鎖（これは、ヒトＬ鎖を含む）は、カッパタイプおよびラムダタイプがある。免疫グロブリンＨ鎖イソ型は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む（一般的には、Fundamental Immunology, Ch. 7, Paul, W., Ed., 2版. Raven Press, N. Y. (1989)（このものは本明細書の一部を構成する）を参照）。各Ｌ／Ｈ鎖対の可変領域は、抗体または免疫グロブリン結合部位を形成する。従って、例えば無傷のＩｇＧ抗体は、２個の結合部位を有する。二機能性および二重特異性の抗体を除いて、２個の結合部位は同一である。
【０１５０】
免疫グロブリン分子の鎖は、３個の超可変領域（これはまた、相補性決定領域またはＣＤＲｓとも呼ばれる）によって結合されたよく保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的な構造を示す。各対のＨ鎖およびＬ鎖のＣＤＲｓはフレームワーク領域によってアラインされ、従って特異的エピトープと結合することができる。Ｎ−末端からＣ−末端まで、両方のＬ鎖およびＨ鎖は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の帰属は、カバト・シークエンシーズ・オフ・プロテインズ・オフ・イムノロジカル・インタレスト（Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest）（National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987および1991)）; Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196: 901-917; またはChothiaらによる1989, Nature, 342: 878-883の定義に従う。
【０１５１】
二重特異性または二機能性の抗体は、２個の異なるＨ／Ｌ鎖対および２個の異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、様々な方法（これはハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントのリンキングを含む）によって産生することができる（例えば、Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321; Kostelnyらによる1992, J. Immunol., 148: 1547 1553を参照）。加えて、二重特異性抗体は、「ダイアボディー（diabodies）」（Holligerらによる1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448を参照）または「ヤヌシン（Janusins）」（Trauneckerらによる1991, EMBO J., 10: 3655-3659およびTrauneckerらによる1992, Int. J. Cancer 7章: 51-52-127を参照）として生成することができる。
【０１５２】
本発明の抗体は、例えばポリクローナル、モノクローナル、多重特異性（multispecific）、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生されるフラグメント、抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）、細胞内で産生される抗体（すなわち、細胞内発現抗体（intrabodies））、および上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントを含むが、これらに限定されない。本明細書中で使用する用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分またはフラグメント（すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）を意味する。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれかのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラスもしくはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２）であり得る。好ましい態様においては、免疫グロブリンはＩｇＧ１イソ型である。別の好ましい態様においては、免疫グロブリンはＩｇＧ２イソ型である。別の好ましい態様においては、免疫グロブリンはＩｇＧ４イソ型である。
【０１５３】
免疫グロブリンは、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方を有し得る。ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹのＨ鎖のアレイは、カッパタイプまたはラムダタイプのＬ鎖と対になることができる。本発明の抗体はヒト抗原結合性の抗体および抗体フラグメントであることが最も好ましく、そしてこのものは例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合性Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含有するフラグメントを含むが、これらに限定されない。抗原結合性抗体フラグメント（１本鎖抗体を含む）は、可変領域を単独でまたは以下のもの（ヒンジ領域、並びにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）の全てまたは一部と組み合わせて含むことができる。また、本発明と連関して、ヒンジ領域並びにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインと可変領域とのいずれかの組み合わせをも含有する、抗原結合性フラグメントをも含む。本発明の抗体は、いずれかの動物起源（例えば、トリおよび哺乳動物を含む）由来であり得る。ヒト、マウス（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたは鶏起源の抗体が好ましい。本明細書中に使用する「ヒト」抗体としては、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、また本明細書中上記する通り（例えば、米国特許第5,939,598号）、ヒト免疫グロブリンライブラリまたは１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物から単離されそして内因性免疫グロブリンを発現しない、抗体を含む。
【０１５４】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはそれ以上の多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープについて特異的であり得て、あるいは本発明のポリペプチドおよび異種エピトープ（例えば、異種ポリペプチドまたは固体の担体物質）の両方について特異的であり得る（例えば、PCT公開WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tuttらによる1991, J. Immunol., 147: 60-69; 米国特許第4,474,893号; 第4,714,681号; 第4,925,648号; 第5,573,920号; 第5,601,819号; 並びにKostelnyらによる1992, J. Immunol., 148: 1547-1553を参照）。
【０１５５】
本発明の抗体は、それらが認識したりまたは特異的に結合する本発明のポリペプチドのエピトープまたは部分の観点で記載しあるいは明記することができる。該エピトープまたはポリペプチド部分は、例えばＮ−末端およびＣ−末端位によって、近接するアミノ酸残基の大きさによって、または本明細書中の表３〜６において定義する配列中に提示する通り、明記することができる。更に本発明によれば、本明細書中に記載する通りストリンジェントなまたは弱いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと結合する抗体を含む。
【０１５６】
本発明の抗体（例えば、その抗体フラグメントまたは変異体を含有しあるいはそれから構成される、分子を含む）は、表３〜６中に記載するヒトｓｒｃバイオマーカータンパク質および／またはサルｓｒｃバイオマーカータンパク質の、ポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメントもしくは変異体と免疫特異的に結合することができる。
【０１５７】
非限定的な例として、抗体が第２抗原に対する抗体のＫｄよりも低い解離定数（Ｋｄ）で第１抗原と結合する場合には、該抗体は第１抗原と優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な態様において、抗体が第２抗原に対する抗体のＫａよりも大きさが少なくとも１低い次数であるアフィニティーで第１抗原と結合する場合には、該抗体は第１抗原と優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な態様において、抗体が第２抗原に対する抗体のＫｄよりも大きさが少なくとも２低い次数であるアフィニティーで第１抗原と結合する場合には、該抗体は第１抗原と優先的に結合するとみなすことができる。 
【０１５８】
別の非限定的な態様において、抗体が第２抗原に対する抗体のｋｏｆｆよりも低いオフ速度（ｋｏｆｆ）で第１抗原と結合する場合には、該抗体は第１抗原と優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な態様において、抗体が第２の抗原に対する抗体のｋｏｆｆよりも大きさが少なくとも１低い次数であるアフィニティーで第１抗原と結合する場合には、該抗体は該１抗原と優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な態様において、抗体が第２抗原に対する抗体ｋｏｆｆよりも大きさが少なくとも２低い次数であるアフィニティーで第１抗原と結合する場合には、該抗体は該第１抗原と優先的に結合するとみなすことができる。
【０１５９】
本発明の抗体はまた、本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチド（例えば、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む））に対する結合アフィニティーの観点で記載しあるいは明記することもできる。好ましい結合アフィニティーは、解離定数またはＫｄが５×１０−２Ｍ、１×１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１×１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍまたは１×１０−４Ｍよりも低いものを含む。より好ましい結合アフィニティーは、解離定数またはＫｄが５×１０−５Ｍ、１×１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１×１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１×１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍまたは１×１０−８Ｍよりも低いものを含む。より一層好ましい抗体結合アフィニティーは、解離定数またはＫｄが、５×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１×１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１×１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１×１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１×１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１×１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍまたは１×１０−１５Ｍよりも低いものを含む。
【０１６０】
具体的な態様において、本発明の抗体は、オフ速度（ｋｏｆｆ）が約５×１０−２ｓｅｃ−１、１×１０−２ｓｅｃ−１、５×１０−３ｓｅｃ−１または１×１０−３ｓｅｃ−１以下で、ｓｒｃバイオマーカーポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変異体と結合する。より好ましくは、本発明の抗体は、オフ速度（ｋｏｆｆ））が約５×１０−４ｓｅｃ−１、１×１０−４ｓｅｃ−１、５×１０−５ｓｅｃ−１、１×１０−５ｓｅｃ−１、５×１０−６ｓｅｃ−１、１×１０−６ｓｅｃ−１、５×１０−７ｓｅｃ−１または１×１０−７ｓｅｃ−１以下で、ｓｒｃバイオマーカータンパク質ポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変異体と結合する。
【０１６１】
他の態様において、本発明の抗体は、オン速度（ｋｏｎ）が１×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、１×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１または５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上でｓｒｃバイオマーカーポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変異体と結合する。より好ましくは、本発明の抗体は、オン速度が１×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０−６Ｍ−１ｓｅｃ−１または１×１０−７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上でｓｒｃバイオマーカーポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変異体と結合する。
【０１６２】
本発明はまた、競合的な結合を測定するための当該分野において知られるいずれかの方法（例えば、本明細書中に記載するイムノアッセイ）によって測定される、本発明のエピトープに対する抗体の結合を競争的に阻害する抗体をも提供する。好ましい態様において、該抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％だけエピトープとの結合を競合的に阻害する。
【０１６３】
本発明の抗体は、本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして機能し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンドの相互作用を一部または完全に妨害する抗体を含む。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方を含む。本発明はまた、リガンドとの結合を防止しないが、レセプターの活性化も防止しない、レセプター特異的抗体をも含む。レセプターの活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載されるかまたはそれ以外に当該分野において知られる技術によって測定することができる。例えば、レセプターの活性化は、免疫沈降法、続いてウェスタンブロット分析によって、該レセプターまたはその基質のホスホリル化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン上で）を検出することによって測定することができる。具体的な態様において、リガンド活性またはレセプター活性を、該抗体の非存在下での活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％または少なくとも５０％だけ阻害する抗体を提供する。
【０１６４】
本発明の別の態様において、ｓｒｃバイオマーカータンパク質またはそのフラグメントもしくは変異体と免疫特異的に結合する抗体は、本発明の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現するＨ鎖のいずれか１つ、および／または本発明の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現するＬ鎖のいずれか１つ、のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明の別の態様において、ｓｒｃバイオマーカータンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは変異体と免疫特異的に結合する抗体は、抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現するＨ鎖のＶＨドメインのいずれか１つ、および／または抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現するＬ鎖のＶＬドメインのいずれか１つ、のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。好ましい態様において、本発明の抗体は、単一の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現される、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を含む。別の態様において、本発明の抗体は、２個の異なる抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現するＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を含む。
【０１６５】
ｓｒｃバイオマーカータンパク質と免疫特異的に結合する抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現するＶＨおよび／またはＶＬドメインの抗体フラグメントまたは変異体を含むかあるいはそれらから構成される分子もまた、これらのＶＨおよびＶＬドメイン、分子、フラグメントおよび／または変異体をコードする核酸分子として、本発明によって包含される。
【０１６６】
本発明はまた、ｓｒｃバイオマーカータンパク質のポリペプチド、またはそのポリペプチドフラグメントもしくは変異体と免疫特異的に結合する抗体であって、１つ以上の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現されるＨ鎖内に含まれるいずれかの１、２、３またはそれ以上のＶＨ  ＣＤＲｓのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかあるいはそれから構成される、抗体を提供する。特に、本発明は、ｓｒｃバイオマーカータンパク質と免疫特異的に結合する抗体であって、１つ以上の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現するＨ鎖内に含まれるＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかあるいはそれから構成される、抗体を提供する。別の態様において、ｓｒｃバイオマーカータンパク質と免疫特異的に結合する抗体は、１つ以上の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現するＨ鎖内に含まれるＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはそれから構成される。好ましい態様において、ｓｒｃバイオマーカータンパク質と免疫特異的に結合する抗体は、本発明の１つ以上の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現するＨ鎖内に含まれるＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはそれから構成される。ｓｒｃバイオマーカータンパク質またはそれらのＳｒｃバイオマーカータンパク質フラグメントもしくは変異体と免疫特異的に結合する、これらの抗体、またはそれらの抗体フラグメントもしくは変異体を含むかあるいはそれから構成される分子もまた、これらの抗体、分子、フラグメントおよび／または変異体をコードする核酸分子として本発明によって包含される。
【０１６７】
本発明はまた、ｓｒｃバイオマーカータンパク質のポリペプチド、またはポリペプチドフラグメントもしくは変異体と免疫特異的に結合する抗体であって、本発明の１つ以上の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現されるＨ鎖内に含まれるいずれかの１、２、３またはそれ以上のＶＬ  ＣＤＲｓのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかあるいはそれから構成される、抗体を提供する。特に、本発明は、ｓｒｃバイオマーカータンパク質と免疫特異的に結合する抗体であって、本発明の１つ以上の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現されるＨ鎖内に含まれるＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかあるいはそれから構成される、抗体を提供する。別の態様において、ｓｒｃバイオマーカータンパク質と免疫特異的に結合する抗体は、本発明の１つ以上の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現されるＨ鎖内に含まれるＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかあるいはそれから構成される。好ましい態様において、ｓｒｃバイオマーカータンパク質と免疫特異的に結合する抗体は、本発明の１つ以上の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現されるＨ鎖内に含まれるＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはそれから構成される。ｓｒｃバイオマーカータンパク質またはそれらのｓｒｃバイオマーカータンパク質フラグメントもしくは変異体と免疫特異的に結合する、これらの抗体またはそれらの抗体フラグメントもしくは変異体を含むかあるいはそれから構成される分子もまた、これらの抗体、分子、フラグメントおよび／または変異体をコードする核酸分子として本発明によって包含される。
【０１６８】
本発明はまた、ｓｒｃバイオマーカータンパク質ポリペプチド、またはｓｒｃバイオマーカータンパク質のポリペプチドフラグメントもしくは変異体と免疫特異的に結合する抗体（これは、抗体フラグメントまたは変異体を含むかあるいはそれから構成される、分子を含む）であって、本発明の１つ以上の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現されるＨ鎖またはＬ鎖に含まれる、１、２、３もしくはそれ以上のＶＨ  ＣＤＲｓおよび１、２、３もしくはそれ以上のＶＬ  ＣＤＲｓを含むかあるいはそれから構成される、抗体を提供する。特に、本発明は、ｓｒｃバイオーマーカータンパク質のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントもしくは変異体と免疫特異的に結合する抗体であって、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３、または本発明の１つ以上の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現されるＨ鎖もしくはＬ鎖免疫グロブリン分子内に含まれるＶＨ  ＣＤＲｓおよびＶＬ  ＣＤＲｓのいずれかの組み合わせを含むかあるいはそれから構成される、抗体を提供する。好ましい態様において、１つ以上のこれらの組み合わせは、本発明の１個の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルライン由来である。ｓｒｃバイオマーカータンパク質と免疫特異的に結合するこれらの抗体のフラグメントまたは変異体を含むかあるいはそれから構成される分子はまた、これらの抗体、分子、フラグメントまたは変異体をコードする核酸分子として、本発明によって包含される。
【０１６９】
本発明はまた、本発明の抗体をコードする核酸分子（通常、単離される）（例えば、その抗体フラグメントまたは変異体を含むかあるいはそれから構成される、分子を含む）をも提供する。具体的な態様において、本発明の核酸分子は、本発明の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現されるＨ鎖のＶＨドメインのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、および本発明の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現されるＬ鎖のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含むかあるいはそれから構成される抗体（例えば、抗体フラグメントまたはその変異体を含むかあるいはそれから構成される、分子を含む）をコードする。別の態様において、本発明の核酸分子は、本発明の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現されるＨ鎖のＶＨドメインのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、および本発明の抗−Ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現されるＬ鎖のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含むかあるいはそれから構成される抗体（例えば、抗体フラグメントまたはその変異体を含むかあるいはそれから構成される、分子を含む）をコードする。
【０１７０】
本発明はまた、本明細書中に記載の抗体分子（例えば、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを）の変異体（誘導体を含む）を含むかあるいはそれから構成される抗体であって、ｓｒｃバイオマーカータンパク質またはそれらのフラグメントもしくは変異体と免疫特異的に結合する、抗体をも提供する。
【０１７１】
当該分野における当業者にとって知られる標準方法を用いて、本発明の分子をコードするヌクレオチド配列中に突然変異を導入することができる。該方法は、例えば部位特異的変異ポリヌクレオチドおよびポリペプチド導入法（sited-directed mutapolynucleotides and polypeptidesis）、並びにＰＣＲ−媒介性変異ポリヌクレオチドおよびポリペプチド導入法を含み、これによりアミノ酸置換が生じる。該分子は、免疫グロブリン分子であることが好ましい。また、該変異体（誘導体を含む）は、基準ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２またはＶＬ  ＣＤＲ３と比べて、５０よりも少ないアミノ酸置換、４０よりも少ないアミノ酸置換、２５よりも少ないアミノ酸置換、２０よりも少ないアミノ酸置換、１５よりも少ないアミノ酸置換、１０よりも少ないアミノ酸置換、５よりも少ないアミノ酸置換、４よりも少ないアミノ酸置換、３よりも少ないアミノ酸置換、または２よりも少ないアミノ酸置換をコードすることが好ましい。
【０１７２】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を同様な電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基で置き変えたものである。同様な電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。あるいは、突然変異は、コード配列の全てまたは一部に沿って、例えば飽和変異ポリヌクレオチドおよびポリペプチド導入法によって、ランダムに導入することができる。得られた変異体は、活性を保持する変異体を同定するために、生物学的活性についてスクリーニングすることができる。
【０１７３】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域のみまたはＣＤＲ領域のみに突然変異を導入することが可能である。導入された突然変異は、サイレント変異または中立（neutral）ミスセンス変異であり得て、すなわち、このものは、抗体が抗原と結合する能力に及ぼす影響が全くないかまたはほとんどない。これらのタイプの突然変異は、コドンの利用を最適とするのに、またはハイブリドーマ抗体産生を改善するのに、有用であり得る。あるいは、非中立ミスセンス変異は、抗原と結合する抗体の能力を変えることができる。ほとんどのサイレント変異および中立ミスセンス変異の位置はフレームワーク領域中であり、一方でほとんどの非中立ミスセンス変異の位置はＣＤＲｓ中であるが、このことは絶対的な要件ではない。当該分野の当業者は、所望の性質（例えば、抗原結合活性の非改変または結合活性の改変（例えば、抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化））を有する突然変異分子を設計しそして試験することができる。変異ポリヌクレオチドおよびポリペプチド導入法後に、該コードされたタンパク質をルーチンに発現することができ、そして該コードされたタンパク質の機能的および／または生物学的な活性を本明細書中に記載の技術を用いて、または当該分野において知られ且つ実施されているルーチン的に改変した技術によって、測定することができる。
【０１７４】
具体的な態様において、ｓｒｃバイオマーカーポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体と免疫特異的に結合する本発明の抗体（抗体フラグメントまたはその変異体を含むかあるいはそれから構成される、分子を含む）は、本発明の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体発現−セルラインの１つ以上によって発現されるＶＨまたはＶＬドメインの１つのコードするものに相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれによって構成される。ここで、該ハイブリダイズは、ストリンジェント条件下（例えば、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でフィルターと結合したＤＮＡとハイブリダイズし、続いて０．２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中、約５０〜６５℃で１回以上洗浄する）が好ましく、高いストリンジェントな条件下（例えば６×ＳＳＣ中、約４５℃でフィルターと結合した核酸とハイブリダイズし、続いて０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中、約６８℃で１回以上洗浄する）、または当該分野の当業者にとって知られる他のストリンジェントな条件下（例えば、Ausubel, F.M.ら編, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York, 6.3.1-6.3.6および2.10.3頁を参照）で行なう。これらの抗体をコードする核酸はまた、本発明に包含される。
【０１７５】
似たアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体が、似た構造および多数の同じ生物学的活性を有することが多いことは、当該分野においてよく知られる。従って、１態様において、ｓｒｃバイオマーカーポリペプチドまたはｓｒｃバイオマーカーポリペプチドのフラグメントもしくは変異体と免疫特異的に結合する抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含むかあるいはそれから構成される、分子を含む）は、本発明の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現されるＨ鎖のＶＨドメインのアミノ酸配列と、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含むかあるいはそれから構成される。
【０１７６】
別の態様において、ｓｒｃバイオマーカーポリペプチドまたはｓｒｃバイオマーカータンパク質ポリペプチドのフラグメントもしくは変異体と免疫特異的に結合する抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含むかあるいはそれから構成される、分子を含む）は、本発明の抗−ｓｒｃバイオマーカータンパク質抗体−発現セルラインによって発現されるＬ鎖のＶＬドメインのアミノ酸配列と、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含むかあるいはそれから構成される。
【０１７７】
本発明はまた、当該分野において知られるいずれかの方法（例えば、ＦＡＣＳ分析または免疫沈降アッセイ）によって測定される、ｓｒｃバイオマーカータンパク質の細胞表面発現を下方調節する抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含むかあるいはそれから構成される、分子を含む）をも提供する。非限定的な仮説として、該下方調節は、ｓｒｃバイオマーカータンパク質の抗体誘発性インターナリゼーションの結果であり得る。該抗体は、本発明の抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体のアミノ酸配列を有するＶＨまたはＶＬドメインの部分（例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２またはＶＬ  ＣＤＲ３）を含むかあるいはそれから構成され得る。
【０１７８】
別の態様において、ｓｒｃバイオマーカータンパク質の細胞表面発現を下方調節する抗体は、本発明の抗体またはそれらのフラグメントもしくは変異体のＶＨドメイン、および本発明の抗体またはそれらのフラグメントもしくは変異体のＶＬドメイン、のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかあるいはそれから構成される。別の態様において、ｓｒｃバイオマーカータンパク質の細胞表面発現を下方調節する抗体は、本発明の単一抗体（または、ｓｃＦｖもしくはＦａｂフラグメント）またはそのフラグメントもしくは変異体由来のＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはそれから構成される。別の態様において、ｓｒｃバイオマーカータンパク質の細胞表面発現を下方調節する抗体は、本発明の抗体またはそのフラグメントもしくは変異体のＶＨドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはそれから構成される。別の態様において、ｓｒｃバイオマーカータンパク質の細胞表面発現を下方調節する抗体は、本発明の抗体またはそのフラグメントもしくは変異体のＶＬドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはそれから構成される。
【０１７９】
好ましい態様において、ｓｒｃバイオマーカータンパク質の細胞表面発現を下方調節する抗体は、本発明の抗体またはそのフラグメントもしくは変異体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはそれから構成される。別の好ましい態様において、ｓｒｃバイオマーカータンパク質の細胞表面発現を下方調節する抗体は、本発明の抗体またはそのフラグメントもしくは変異体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはそれから構成される。これらの抗体をコードする核酸分子はまた、本発明によって包含される。
【０１８０】
別の好ましい態様において、ｓｒｃバイオマーカータンパク質の活性を増大する抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体は、本発明の抗体またはそのフラグメントもしくは変異体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはそれから構成される。これらの抗体をコードする核酸分子はまた、本発明によって包含される。
【０１８１】
非限定的な例として、本発明の抗体を用いて、本発明のポリペプチドを精製し、検出し、そして標的とすることができ、これはインビトロおよびインビボの両方での診断方法、検出方法、スクリーニング方法および／または治療方法を含む。例えば、抗体は、生物学的な標本における本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドのレベルを定性的におよび定量的に測定するためのイムノアッセイにおける使用を有する（例えば、HarlowらによるAntibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2版 1988（このものは本明細書の一部を構成する）を参照）。
【０１８２】
別の非限定的な例として、本発明の抗体は、受動免疫の形態として個体に投与することができる。あるいは、本発明の抗体は、抗体によって結合されるエピトープを同定するためのエピトープマップとして使用することができる。この方法で同定されたエピトープは、例えばワクチン候補物として、すなわち、１つ以上のｓｒｃバイオマーカータンパク質の天然形態に対する抗体を誘発するために個体を免疫化するために、使用することができる。
【０１８３】
以下により詳細に記載する通り、本発明の抗体は、単独でまたは他の組成物と組み合わせていずれかで使用することができる。該抗体は、更にＮ−もしくはＣ−末端で異種ポリペプチドに組み換え的に融合したり、あるいはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に接合（例えば、共有および非共有の接合を含む）することができる。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおいてラベルとして有用である分子、およびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または毒素）と融合したりまたは接合することができる。例えば、PCT公開WO 92/08495; WO 91/14438; WO89/12624; 米国特許第5,314,995号およびEP第396,387号を参照。
【０１８４】
本発明の抗体は、すなわち、いずれかのタイプの分子を該抗体と共有結合することによって改変した誘導体を含む。例えば、該抗体誘導体としては、グリコシル化、アセチル化、ペジル化（pegylation）、ホスホリル化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導化、タンパク質分解性の切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質との結合などによって改変された抗体を含むが、これらに限定されない。多数の化学的な改変法のいずれかを、公知の技術（例えば、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシン（tunicamycin）の代謝合成などを含むが、これらに限定されない）によって行なうことができる。加えて、該誘導体は１つ以上の非典型的なアミノ酸を含み得る。
【０１８５】
本発明の抗体は、当該分野におけるいずれかの適当な方法によって得ることができる。関心ある抗原または免疫原に対するポリクローナル抗体は、当該分野においてよく知られる様々な方法によって産生することができる。例えば、本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドまたはペプチドは、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の製造を誘発するために、上で解明した通り、様々な宿主動物に投与することができる。様々なアジュバントを使用して、宿主の種類に応じて、免疫学的な応答を増大することができる；アジュバントとしては例えば、フロイント（完全および非完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性剤（例えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール（pluronic polyol）、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（corynebacterium parvum））を含むが、これらに限定されない。それらのアジュバントはまた、当該分野においてよく知られる。
【０１８６】
モノクローナル抗体は、当該分野において知られる広範囲な様々な技術（例えば、ハイブリドーマ、組み換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む）を用いて製造することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野において知られ且つ実施されており、そして例えばHarlowらによるAntibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2版. 1988; HammerlingらによるIn: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., 563-681頁, 1981（これらは本明細書の一部を構成する）中に教示されている、ハイブリドーマ技術を用いて産生することができる。本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体には限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、単一クローン（例えば、真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む）から誘導される抗体を意味するが、それらを産生する方法を意味するものではない。
【０１８７】
ハイブリドーマ技術を用いるある抗体についての産生方法およびスクリーニング方法は、ルーチンであってそして当該分野においてよく知られる。非限定的な例において、マウスは本発明のポリペプチドもしくはペプチド、または該ポリペプチドもしくはペプチドを、用いて免疫化することができる。免疫応答を検出後（例えば、該抗原に特異的な抗体を免疫化マウスの血清中で検出後）、該脾臓を収集し、そして脾細胞を単離する。次いで、該脾細胞を、よく知られる技術によっていずれかの適当なミエローマ細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能なセルラインＳＰ２／０またはＰ３Ｘ６３−ＡＧ８．６５３からの細胞）に融合する。ハイブリドーマを選択し、そして限定希釈法によってクローニングする。次いで、該ハイブリドーマクローンを、当該分野において知られる方法によってアッセイして、本発明のポリペプチドと結合することができる抗体を分泌する細胞を選別する。通常では高レベルの抗体を含む腹水は、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫化することによって得ることができる。
【０１８８】
従って、本発明は、モノクローナル抗体の製造方法、並びにこれらの方法によって産生する抗体を包含し、該方法は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養し（ここで、該ハイブリドーマは、本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドまたはペプチド抗原を用いて免疫化されるマウスから単離される脾細胞と、ミエローマ細胞とを融合することによって得ることが好ましい）、次いで本発明のポリペプチドと結合する抗体を分泌するハイブリドーマクローンのための融合から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることを含む。
【０１８９】
ポリクローナルおよびモノクローナルの両方のヒトＢセルラインを産生するための別のよく知られる方法は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）を用いる形質転換である。ＥＢＶ−形質転換Ｂセルラインを得るプロトコール（例えば、Current Protocols in Immunology, Coliganらによる編, 1994, John Wiley & Sons, NY（これは本明細書の一部を構成する）の7.22章に概説されているプロトコール）は、当該分野において通常知られる。形質転換のためのＢ細胞の供給源は通常ヒト末梢血であるが、しかし、形質転換のためのＢ細胞はまた、他の供給源（例えば、リンパ節、扁桃腺、脾臓、腫瘍組織、および感染組織を含むが、これらに限定されない）からも得ることができる。組織は、通常ＥＳＢ形質転換前に単一細胞懸濁液として調製する。加えて、Ｂ細胞標本中に存在し得るＴ細胞は、物理的に除去または失活（例えば、シクロスポリンＡを用いる処理によって）のいずれかを行なうことができる。抗−ＥＢＶ抗体にとって血清陽性である個体由来のＴ細胞はＥＢＶによってＢ細胞の不死化を抑圧することができるので、Ｔ細胞の除去が有利であることが多い。通常、ヒトＢ細胞を含有する標本は、ＥＢＶを用いて接種（innoculate）し、そして３〜４週間培養する。ＥＢＶの典型的な供給源は、Ｂ９５−８セルライン（ＡＴＣＣ；ＶＲ−１４９２）の培養懸濁液である。ＥＢＶ形質転換の物理的な兆候は通常、３〜４週間の培養期間の最後の方に見ることができる。
【０１９０】
位相差顕微鏡によって、形質転換された細胞は大きく、清澄に、且つ「毛様に」見られ；それらは、細胞の密なクラスター中で凝集する傾向がある。最初、ＥＢＶラインは、通常ポリクローナルである。しかしながら、長期間の細胞培養中、ＥＢＶラインは、あるＢ細胞クローンの選択的な所産（outgrowth）の結果としてモノクローナルとなることができる。あるいは、ポリクローナルなＥＢＶ形質転換ラインをサブクローングし（例えば、限定希釈によって）、あるいは適当な融合パートナーと共に融合してそして限定的希釈で培養してモノクローナルＢセルラインを得ることができる。ＥＢＶ形質転換セルラインのための適当な融合パートナーとしては、ミエローマセルライン（例えば、ＳＰ２／０、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）、ヘテロミエローマセルライン（ヒトｘマウス；例えば、ＳＰＡＭ−８、ＳＢＣ−Ｈ２０およびＣＢ−Ｆ７）およびヒトセルライン（例えば、ＧＭ  １５００、ＳＫＯ−００７、ＲＰＭＩ  ８２２６およびＫＲ−４）を含む。従って、本発明はまた、ヒトＢ細胞のＥＢＶ−形質転換を含む、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに対するポリクローナルまたはモノクローナルのヒト抗体を得る方法をも含む。
【０１９１】
特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって得ることができる。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ(ａｂ')２フラグメントは、酵素、例えばパパイン（これは、Ｆａｂフラグメントを産生する）またはペプシン（これは、Ｆ(ａｂ')２フラグメントを与える）を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質加水分解によって産生することができる。Ｆ(ａｂ')２フラグメントは、可変領域、Ｌ鎖定常領域およびＨ鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１９２】
本発明によって包含される抗体はまた、当該分野において知られる様々なファージディスプレイ方法を用いて生成することができる。ファージディスプレイ方法において、機能性の抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面上にディスプレイされる。ある態様において、該ファージを用いて、レパートリー（repertoire）またはコンビナトリアルの抗体ライブラリ（例えば、ヒトまたはマウス）から発現する抗原結合ドメインをディスプレイすることができる。本発明の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは例えば、標識化抗原、または固体表面もしくはベッド上に結合しもしくは捕獲した抗原を用いて選別することができ、あるいは抗原と一緒に同定することができる。これらの方法において使用するファージは典型的に、繊維状ファージ（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはファージ遺伝子ＩＩＩもしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかと組み換え的に融合したジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む）である。本発明の抗体を製造するために使用することができるファージディスプレー方法の例としては、以下の刊行物に開示されているものを含む：Brinkmanらによる1995, J. Immunol. Methods, 182: 41-50; Amesらによる1995, J. Immunol. Methods, 184: 177-186; Kettleboroughらによる1994, Eur. J. Immunol., 24: 952-958; Persicらによる1997, Gene, 187: 9-18; Burtonらによる1994, Advances in Immunology, 57: 191-280; PCT公開番号PCT/GB91/01134; PCT国際公開WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO95/15982 ; WO 95/20401; 並びに米国特許第5,698,426号; 第5,223,409号; 第5,403,484号; 第5,580,717号; 第5,427,908号; 第5,750,753号; 第5,821,047号; 第5,571,698号; 第5,427,908号; 第5,516,637号; 第5,780,225号; 第5,658,727号; 第5,733,743号および第5,969,108号（これらは、各々本明細書の一部を構成する）。
【０１９３】
上記の刊行物に記載されている通り、ファージ選択後に、該ファージ由来の抗体コード領域を単離しそしてこのものを用いて全抗体（例えば、ヒト抗体、またはいずれか他の所望する抗原結合フラグメントを含む）を得て、そしていずれかの所望する宿主（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌、および細菌を含む）中で発現することができる（例えば、以下に詳細に記載する）。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ(ａｂ’)２フラグメントを組み換え的に産生するための技術はまた、当該分野において知られる方法（例えば、PCT公開WO 92/22324; Mullinaxらによる1992, BioTechniques, 12 (6): 864-869 ; Sawaiらによる1995, AJRI, 34: 2634; およびBetterらによる1988, Science, 240: 1041-1043（これらは本明細書の一部を構成する）中に開示されている方法）を用いて使用することもできる。
【０１９４】
１本鎖Ｆｖｓおよび抗体を産生するために使用することができる技術の例としては、米国特許第4,946,778号および第5,258,498号; Hustonらによる1991, Methods in Enzyzology, 203: 46-88; Shuらによる1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999; およびSkerraらによる1988, Science, 240: 1038-1040中に記載されているものを含む。例えばヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの使用のために、キメラ、ヒト化またはヒトの抗体を使用することが好ましいこともある。キメラ抗体とは、抗体の異なる部分が異なる動物種から誘導される分子であり、例えばマウスモノクローナル抗体由来の可変部およびヒト免疫グロブリン定常部を有する抗体である。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野において知られる（例えば、Morrisonによる1985, Science, 229: 1202; Oiらによる1986, BioTechniques, 4: 214; Gilliesらによる1989, J. Immunol. Methods, 125: 191-202; および米国特許第5,807,715号; 第4,816,567号; および第4,816,397号（これらは本明細書の一部を構成する））。
【０１９５】
ヒト化抗体は、所望する抗原と結合し、そして非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する、非ヒト種の抗体からの抗体分子である。ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換されて、抗原結合を改変（改善が好ましい）することが多い。これらのフレームワーク置換は、当該分野においてよく知られる方法によって同定される。例えば、ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって、抗原との結合に重要なフレームワーク残基を同定し、そして配列の比較によって、ある位置での異常なフレームワーク残基を同定する（例えば、Queenらによる米国特許第5,585,089号; およびRiechmannらによる1988, Nature, 332: 323（これらは本明細書の一部を構成する））。抗体は、当該分野において知られる様々な技術を用いてヒト化することができる。該技術としては、例えばＣＤＲ−グラフティング（EP第239,400号; PCT公開WO 91/09967; 米国特許第5,225,539号; 第5,530,101号; および第5,585,089号）；ベニヤリング（veneering）法およびリサーフェイシング（resurfacing）法（EP第592,106号; EP第519,596号; Padlanによる1991, Molecular Immunology, 28(4/5): 489-498; Studnickaらによる1994, Protein Engineering, 7 (6): 805-814; Roguskaらによる1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 969-973）；およびチェーンシャッフリング法（米国特許第5,565,332号）を含む。
【０１９６】
完全なヒト抗体は、当該分野において知られる様々な方法によって製造することができる。該方法は例えば、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリを用いる上記のファージディスプレイ方法を含む。例えば、米国特許第4,444,887号および第4,716,111号; 並びにPCT公開WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO98/16654, WO 96/34096, WO96/33735, およびWO 91/10741（これらは本明細書の一部を構成する）をも参照。
【０１９７】
完全なヒト抗体は、外来性タンパク質に対する免疫反応を避けたりまたは軽減するために、ヒト患者の治療学的な処置にとって特に所望し得る。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリを用いる、当該分野において知られる様々な方法（例えば、上記のファージディスプレイ法を含む）によって製造することができる。米国特許第4,444,887号および第4,716,111号; 並びにPCT公開WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735、およびWO 91/10741（これらは本明細書の一部を構成する）をも参照。
【０１９８】
ヒト抗体はまた、機能性の内因性免疫グロブリンを発現することができるが、ヒト免疫グロブリンポリヌクレオチドおよびポリペプチドを発現することができる、トランスジェニックマウスを用いて産生することができる。例えば、該ヒトＨ鎖およびＬ鎖の免疫グロブリン遺伝子複合体は、マウス肺幹細胞中にランダムにまたは相同的組み換えによって導入することができる。あるいは、該ヒト可変領域、定常部、および多様性領域（diversity region）は、ヒトＨ鎖およびＬ鎖のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに加えて、マウス肺幹細胞中に導入することができる。該マウスＨ鎖およびＬ鎖の免疫グロブリンポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、相同的組み換えによるヒト免疫グロブリン座位の導入を用いて別々にまたは同時に、非機能的とすることができる。特に、ＪＨ領域のホモ結合性欠失は、内因性抗体の産生を防止する。該改変された肺幹細胞は拡張され、そして胚盤胞中に微量注入されて、キメラマウスを与える。次いで、該キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を得る。該トランスジェニックなマウスを、選択した抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全てまたは部分）を用いる通常の様式中で免疫化する。
【０１９９】
該抗原に対するモノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ技術を用いて免疫化したトランスジェニックマウスから得ることができる。該トランスジェニックマウスによって宿された（harbored）ヒト免疫グロブリントランスポリヌクレオチド（transpolynucleotides）およびポリペプチドは、Ｂ細胞の分化の間に再構成され、そして続いてクラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。
【０２００】
従って、該技術を用いて、有用なヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するための技術の概要については、LonbergおよびHuszarによる, 1995, Intl. Rev. Immunol., 13: 65-93を参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するための技術、並びにそれらの抗体を産生するためのプロトコールの詳細な記載については、例えばPCT公開WO98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096 ; WO 96/33735; 欧州特許第0 598877号; 米国特許第5,413,923号; 第5,625,126号; 第5,633,425号; 第5,569,825号; 第5,661,016号; 第5,545,806号; 第5,814,318号; 第5,885,793号; 第5,916,771号; 第5,939,598号; 第6,075,181号; および第6,114,598号（これらは本明細書の一部を構成する）を参照。加えて、例えばアブゲニックス社（Abgenix, Inc. (Fremont, CA)）およびゲンファーム社（Genpharm）（San Jose, CA）などの会社は、上記の技術に似た技術を用いて選択した抗原に対するヒト抗体を提供することに従事することができる。
【０２０１】
選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド選択（guided selection）」と呼ばれる技術を用いて生成することができる。この方法において、選択した非−ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）を用いて、同一のエピトープを認識するための完全なヒト抗体の選択をガイドする（Jespersらによる1988, BioTechnology, 12: 899-903）。
【０２０２】
更に、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当該分野における当業者にとってよく知られる技術を用いて、本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドを「模倣する」抗−イディオタイプの抗体を得ることができる（例えば、GreenspanおよびBonaによる1989, FASEB J., 7(5): 437-444、並びにNissinoffによる1991, J. Immunol., 147(8): 2429-2438を参照）。例えば、結合しそしてポリペプチドの多量体化および／または本発明のポリペプチドとリガンドとの結合を完全に阻害する抗体を用いて、ポリペプチドの多量体化および／または結合ドメインを「模倣する」抗−イディオタイプを得ることができ、その結果、例えば治療学的な療法においてポリペプチドおよび／またはそのリガンドと結合することができる。該中和される抗−イディオタイプまたは該抗−イディオタイプのＦａｂフラグメントを用いて、ポリペプチドリガンドを中和することができる。例えば、該抗−イディオタイプ抗体を用いて、本発明のポリペプチドと結合し、および／またはそのリガンド／レセプターと結合し、そしてその結果その生物学的活性を活性化したりまたは遮断することができる。
【０２０３】
細胞内発現抗体とは、組み換え核酸分子から発現しそして細胞内に保持される（例えば、宿主細胞の細胞質、小胞体または周辺質内に保持される）ように操作される抗体（ｓｃＦｖｓ）である。例えば、細胞内発現抗体を用いて、該細胞内発現抗体が結合するタンパク質の機能を切断することができる。細胞内発現抗体の発現はまた、該細胞内発現抗体をコードする核酸を含有する核酸発現ベクター内で誘導プロモーターの使用によって制御することもできる。本発明の細胞内発現抗体は、当該分野において知られる方法（例えば、刊行物：Chenらによる1994, Hum. Gene Ther., 5: 595-601; Marasco, W. A.による1997, Gene Ther., 4: 11-15; RondonおよびMarascoによる1997, Annu. Rev. Microbiol., 51: 257-283; Probaらによる1998, J. Mol. Biol., 275: 245-253; Cohenらによる1998, Oncogene, 17: 2445-2456; OhageおよびSteipeによる1999, J. Mol. Biol., 291: 1119-1128; Ohageらによる1999, J. Mol. Biol., 291: 1129-1134; WirtzおよびSteipeによる1999, Protein Sci., 8: 2245-2250; Zhuらによる1999, J. Immunol. Methods, 231: 207-222中に開示されおよび概説されている方法）を用いて産生することができる。
【０２０４】
本発明によれば、ゼノマウス（XenoMouse）テクノロジー抗体は、インサートされるゲノムを産生するヒト抗体の実質的な部分を有するが、しかし外来性マウス抗体（例えば、アブジェニクス社（Fremont, CA）から入手可能なマウス系統）の産生において欠点を与えるトランスジェニックマウスの使用によって製造することが好ましい。該マウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生することができ、そしてマウス免疫グロブリン分子および抗体の産生において実質的に欠失している。同じことを達成するために使用される技術は、本明細書中に開示する特許、特許出願、および刊行物中に開示されている。
【０２０５】
ＹＡＣｓにおけるメガベースサイズのヒト座位をクローニングしそして再構築し、およびマウス生殖系列中にそれを導入する能力は、非常に大きいかまたは粗雑にマッピングした座位の機能成分を解明し並びにヒト疾患の有用なモデルを与える、強力な方法を提供する。更に、マウスの座位をそれらのヒト等価物を用いて置換するためのそれら技術の使用は、発生中のヒト遺伝子産物の発現および制御への特異な洞察、他のシステムとのそれらの情報交換、並びに疾患の誘発および進行におけるそれらの関与を提供することができる。それらの方法の重要な実用的利用法は、マウス体液性免疫システムの「ヒト化」である。ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）座位のマウス（内因性Ｉｇポリヌクレオチドおよびポリペプチドが失活されている）への導入は、抗体のプログラムされた発現および構築の根底にある機構、並びにＢ細胞の発生におけるそれらの役割、を研究する機会を与える。その上、該方法は、十分なヒトモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）を産生するための理想的な供給源、ヒト疾患における抗体療法の見込みを満たす方向の重要な一里塚（milestone）を与えることができる。
【０２０６】
十分なヒト抗体は、マウスまたはマウス誘導化モノクローナル抗体に内因的な免疫原性およびアレルギー性の応答を最小とし、従って、投与する抗体の有効性および安全性を増大すると予想される。十分なヒト抗体の使用は、抗体投与の繰り返しを必要とする慢性および再発性のヒト疾患（例えば、癌）の処置において実質的な利点を与えると予想され得る。
【０２０７】
この目標への１方法は、該マウスはマウス抗体の非存在下でヒト抗体の大きなレパートリーを産生するであろうことを見越して、ヒトＩｇ座位の大きなフラグメントを宿すためにマウス抗体の産生が欠失するマウス系統を操作することである。大きなヒトＩｇフラグメントは、大きな可変遺伝子の多様性、並びに抗体産生および発現の適当な制御を保存するであろう。抗体の多様化および選択のためのマウスの機構、並びにヒトタンパク質に対する免疫寛容の不足を開拓することによって、これらのマウス系統における再生されたヒト抗体レパートリーは、関心あるいずれかの抗原（例えば、ヒト抗原を含む）に対する高アフィニティー抗体を得る。ハイブリドーマ技術を用いて、所望する特異性を有する抗原特異的なヒトモノクローナル抗体を容易に産生し、そして選択することができる。
【０２０８】
この一般的な方法は、１９９４年に公開されている通り、最初の「ゼノマウスＴ」系統の生成と関連して実証された。例えば、Greenらによる1994, Nature Genetics, 7: 13-21を参照。該ゼノマウス系統は、酵母人口染色体（ＹＡＣＳ）（これは、それぞれヒトＨ鎖座位およびカッパＬ鎖座位の２４５ｋｂおよび１０１９０ｋｂサイズの生殖系列の立体配置フラグメントを含有し、そしてコアの可変領域および定常部の配列（同上）を含む）を用いて操作した。ＹＡＣｓを含有するヒトＩｇは、抗体の再構成および発現の両方のためのマウスシステムと適合し得ることが分かり、そして失活したマウスＩｇポリヌクレオチドおよびポリペプチドに代わって置換することができた。このことは、十分なヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生するために、および抗原特異的なヒトモノクローナル抗体を生成するために、Ｂ−細胞の発生を誘発するそれらの能力によって実証された。これらの結果はまた、より多数のＶポリヌクレオチドおよびポリペプチド、更なる制御要素、並びにヒトＩｇ定常部を含有するヒトＩｇ座位のより大きな部分の導入は、感染および免疫化に対するヒト体液性応答の特徴である十分なレパートリーを実質的に再利用（recapitulate）し得ることをも示唆した。グリーン（Green）らによる研究は最近、それぞれヒトＨ鎖座位およびカッパＬ鎖座位のメガベースサイズの生殖系列立体配置のＹＡＣフラグメントの使用によって、ヒト抗体レパートリーの約８０％以上の導入にまで拡張されて、ゼノマウス・マウス（XenoMouse mice）を与えることを示唆した。Mendezらによる1997, Nature Genetics, 15: 146-156; GreenおよびJakobovitsによる1998, J. Exp. Med., 188: 483-495; 並びにGreenによる1999, Journal of Immunological Methods, 231: 11-23（これらは本明細書の一部を構成する）を参照。
【０２０９】
ヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答は、キメラまたはそれ以外にはヒト化抗体を製造する産業を導く。キメラ抗体は典型的にヒト定常部およびマウス可変領域から構成されるが、あるヒト抗−キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が、特に該抗体の慢性的なまたは多数回投与の利用を含む処置において観察されるであろうと予想される。従って、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡ応答の関心および／または効果を低下させるためにｓｒｃバイオマーカーポリペプチドに対する十分なヒト抗体を提供する。
【０２１０】
本発明のポリペプチド抗体は、組み換え発現系の使用によって化学的に合成されるかあるいは産生され得る。従って、本発明は更に、本発明の抗体およびそれらのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、ストリンジェントな条件下またはより低いストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例えば、上で定義する通り）、抗体（本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体が好ましく；表３〜６中に記載する１つ以上のｓｒｃバイオマーカー配列のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する抗体が好ましい）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ポリヌクレオチドをも包含する。
【０２１１】
該ポリヌクレオチドを得て、そして該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を当該分野において知られるいずれかの方法によって測定することができる。例えば、該抗体のヌクレオチド配列が知られている場合には、該抗体をコードするポリヌクレオチドを化学的に合成したポリヌクレオチドから構築することができ（例えば、Kutmeierらによる1994, BioTechniques, 17: 242に記載されている通り）、このことは要するに、該抗体をコードする配列の部分を含有する重なりオリゴヌクレオチドの合成、これらオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲート、並びに次いでＰＣＲによる該ライゲートしたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
【０２１２】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適当な供給源由来の核酸から生成することができる。ある抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できないが、該抗体分子の配列が知られている場合には、該免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成するかあるいは適当な供給源から得ることができる。該適当な供給源とは、例えば抗体ｃＤＮＡライブラリ、または該抗体を発現するいずれかの組織もしくは細胞（例えば、該配列の３’および５’末端とハイブリダイズすることができる合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅によって本発明の抗体を発現するように選択されるハイブリドーマ細胞）から得られるｃＤＮＡライブラリ（または、核酸（それから単離されるポリＡ+ＲＮＡが好ましい）である。あるいは、例えば該抗体をコードするｃＤＮＡライブラリからｃＤＮＡクローンを同定するために、ある遺伝子配列にとって特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングを使用することができる。次いで、ＰＣＲによって得られた増幅核酸を、当該分野において良く知られるいずれかの方法を用いて複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることができる。
【０２１３】
該抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を測定した後に、該抗体のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列のマニピュレーションについて当該分野においてよく知られる方法（例えば、組み換えＤＮＡ技術、部位特異的な突然変異ポリヌクレオチドおよびポリペプチド導入法、ＰＣＲなど）（例えば、Sambrookらによる1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2版 , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; およびAusubelらによる編, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY（これらは本明細書の一部を構成する）に記載の技術を参照）を用いてマニピュレートして、例えばアミノ酸置換、欠失および／または挿入を生じるために、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成することができる。
【０２１４】
具体的な態様において、該Ｈ鎖および／またはＬ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は視察されて、当該分野においてよく知られる方法によって（例えば、他のＨ鎖およびＬ鎖の可変領域の公知のアミノ酸配列と比較することによって）ＣＤＲｓの配列を同定し、配列超可変性（sequence hypervariability）の領域を測定することができる。ルーチンな組み換えＤＮＡ技術を用いて、上記の通り、１つ以上のＣＤＲｓをフレームワーク領域（例えば、ヒトフレームワーク領域）内に挿入して、非ヒト抗体をヒト化することができる。該フレームワーク領域は、天然またはコンセンサスのフレームワーク領域であり得て、ヒトフレームワーク領域であることが好ましい（例えば、ヒトフレームワーク領域の例示について、Chothiaらによる1998, J. Mol. Biol., 278: 457-479）。
【０２１５】
該フレームワーク領域およびＣＤＲｓの組み合わせによって得られるポリヌクレオチドは、本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドと特異的に結合する抗体をコードする。また、上記の通り、１つ以上のアミノ酸置換がフレームワーク領域内で行なわれ得ることが好ましく；該アミノ酸置換は、該抗体とその抗原との結合を改善するという目標で実施する。加えて、該方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を行なって、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠いた抗体分子を得ることができる。ポリヌクレオチドに対する他の改変は、本発明のよって包含され、そして当該分野の通常の知識の範囲内である。
【０２１６】
いくつかの使用（例えば、本発明の抗体のインビトロアフィニティ増強（maturation））のために、上記のファージディスプレイ方法を用いるファージディスプレイライブラリにおいて、１本鎖抗体またはＦａｂフラグメントとして本発明の１つ以上の抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＶＨおよびＶＬドメインを発現するのに有用である。例えば、本発明の１つ以上の抗体のＶＨおよびＶＬドメインを発現するｃＤＮＡを、ファージディスプレイライブラリを用いて全ての可能な組み合わせにおいて発現することができ、従って、例えばアフィニティーの改善またはオフ速度の改善などの好ましい結合性質を有する、本発明に記載のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドと結合するＶＨ／ＶＬの組み合わせの選択が可能となる。加えて、ＶＨおよびＶＬセグメント、特に本発明の１つ以上の抗体のＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲ領域を、インビトロで変異することができる。ファージディスプレイライブラリにおける「変異体」ＣＤＲｓを有するＶＨおよびＶＬドメインの発現は、例えばアフィニティーの改善またはオフ速度の改善などの好ましい結合性質を有するレセプターポリペプチドである、ｓｒｃバイオマーカータンパク質と結合するＶＨ／ＶＬの組み合わせの選択が可能となる。
【０２１７】
ファージディスプレイ方法において、機能性抗体ドメインはそれらをコードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特に、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリ（例えば、リンパ様組織のヒトまたはマウスのｃＤＮＡライブラリ）または合成ｃＤＮＡライブラリから増幅する。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡは、ＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーにより一緒に結合し、そしてファージミドベクター（例えば、ｐ  ＣＡＮＴＡＢ  ６またはｐＣｏｍｂ  ３  ＨＳＳ）中にクローニングした。該ベクターをエレクトロポレーションによって大腸菌中に導入し、そして該大腸菌をヘルパーファージを用いて感染する。これらの方法において使用するファージは、典型的に線維状ファージ（例えば、ｆｄおよびＭ１３を含む）であり、そして該ＶＨおよびＶＬドメインは通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたはファージ遺伝子ＶＩＩＩのいずれかと組み換え的に融合する。関心ある抗原と結合する抗原結合ドメイン（すなわち、ｓｒｃバイオマーカーポリペプチドまたはそのフラグメント）を発現するファージは、抗原（例えば、標識抗原、または固体表面もしくはベッド上に結合されもしくは捕獲された抗原）を用いて選択しまたは同定することができる。
【０２１８】
本発明に記載の抗体は、抗体の製造について分野において知られるいずれかの方法によって、特に化学的な合成、細胞内免疫化（すなわち、細胞内発現抗体技術）、または好ましくは組み換え発現技術によって、産生することができる。抗体を産生する方法としては例えば、ハイブリドーマ技術、ＥＢＶ形質転換法、および本明細書に中に記載されている他の方法、並びに以下に記載する組み換えＤＮＡ技術を含むが、これらに限定されない。
【０２１９】
本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体、変異体もしくはアナログ（例えば、本発明の抗体または本発明の１本鎖抗体、のＨ鎖またはＬ鎖）の組み換え発現は、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。本発明の抗体分子、抗体のＨ鎖もしくはＬ鎖、またはその一部（Ｈ鎖またはＬ鎖可変領域ドメインを含有することが好ましい）をコードするポリヌクレオチドを得た後に、該抗体分子の産生のためのベクターを、当該分野において知られる技術を用いる組み換えＤＮＡ技術によって産生することができる。抗体をコードするポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を製造するための方法は、本明細書中に記載する。当該分野の当業者にとってよく知られる方法を用いて、抗体コード配列および適当な転写および翻訳の制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組み換えを含む。従って、本発明は、本発明の抗体分子をコードするヌクレオチド配列、そのＨ鎖もしくはＬ鎖、またはプロモーターと操作可能に連結したＨ鎖もしくはＬ鎖可変ドメイン、を含有する複製可能なベクターを包含する。該ベクターは、該抗体分子の定常部をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、PCT公開WO 86/05807; PCT公開WO 89/01036; および米国特許第5,122,464号を参照）、そして、該抗体の可変ドメインは完全なＨ鎖またはＬ鎖の発現のためのベクター中にクローニングすることができる。
【０２２０】
該発現ベクターは通常の技術によって宿主細胞に運ばれ、そして次いで該形質移入された細胞は通常の技術によって培養されて、本発明の抗体を産生する。従って、本発明は、
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、そのＨ鎖もしくはＬ鎖、または非相同性プロモーターと操作可能に連結した本発明の１本鎖抗体、を含有する宿主細胞を含む。以下に記載する通り、二本鎖抗体の発現のための好ましい態様において、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方をコードするベクターを、完全な免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞中で共発現することができる。
【０２２１】
様々な宿主発現ベクターシステムを利用して、本発明の抗体分子を発現することができる。該発現システムとは、関心あるコード配列を発現することができるビヒクル、産生され続いて精製されるそれらのコードされた産物である。これらのシステムはまた、適当なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換しまたは形質移入する場合に、本発明の抗体分子をインシチュで発現することができる細胞でもある。細胞発現システムは例えば、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくは抗体コード配列を含有するコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換した細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）；抗体コード配列を含有する組み換え酵母菌発現ベクターを用いて形質転換した酵母菌（例えば、サッカロミセスまたはピヒア）；抗体コード配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いて感染した昆虫細胞システム；抗体コード配列を含有する組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換した、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を用いて感染した、植物細胞システム；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されるプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスから誘導されるプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーターまたはワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組み換え発現構築物を有する哺乳動物細胞システム（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３、ＮＳＯ細胞）、などの微生物を含むが、これらに限定されない。特に、全組み換え抗体分子の発現においては、好ましくは細菌細胞（例えば、大腸菌）が、そしてより好ましくは真核生物細胞が、組み換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）とベクター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間の早期遺伝子プロモーター要素）との組み合わせは、抗体にとって有効な発現システムである（Foeckingらによる1986, Gene, 45: 101; Cockettらによる1990, BioTechnology, 8: 2）。
【０２２２】
細菌システムにおいて、多数の発現ベクターを、発現する抗体分子に意図される使用に応じて、有利に選択することができる。例えば、多量の該タンパク質を抗体分子の医薬組成物の製造のために産生する場合に、例えば容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指向するベクターが所望され得ることが多い。該ベクターとしては例えば、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Rutherらによる1983, EMBOJ., 2: 1791）（ここで、該抗体コード配列は、ｌａｃＺコード領域と一緒にインフレーム中でベクターに個別にライゲートし、その結果、融合タンパク質を産生することができる）；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouyeによる1985, Nucleic Acids Res., 13: 3101-3109; Van Heeke & Schusterによる1989, J. Biol. Chem., 24: 5503-5509；など）を含むが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターもまた用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質としての外来性ポリペプチドを発現することができる。通常、該融合タンパク質は可溶であり、そしてこのものは、マトリックスグルタチオン−アガロースベッドに吸着しおよび結合し、続いて遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって、溶解した細胞から容易に精製することができる。該ＧＥＸベクターは、トロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果該クローニングされた標的遺伝子産物は該ＧＳＴ分子から放出され得る。
【０２２３】
昆虫システムにおいて、オートグラファ・カリフォルニア・核多角体病ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）（ＡｃＮＰＶ）は、外来性ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを発現するためにベクターとして使用される。該ウイルスは、スポドプテラ・フィグリペルダ（Spodoptera figuriperda）細胞中で増殖する。該抗体コード配列は、該ウイルスの非本質的な領域（例えば、該ポリへドリン（polyhedrin）遺伝子）中に個別にクローニングし、そしてこのものをＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリへドリンプロモーター）のコントロール下に置いた。
【０２２４】
哺乳動物宿主細胞中、多数のウイルスベースの発現システムを使用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合には、関心ある抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳コントロール複合体（例えば、後期プロモーターと三部分リーダー配列）にライゲートすることができる。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組み換えによってアデノウイルスゲノム中にインサートすることができる。該ウイルスゲノムの非本質的な領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）中のインサートにより、生存可能であって且つ感染宿主中で抗体分子を発現可能な組み換えウイルスを生じる（例えば、LoganおよびShenkによる1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 355-359）。特定の開始シグナルはまた、インサートされた抗体コード配列の効率の良い翻訳を必要とし得る。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび近接配列を含む。更に、該開始コドンは、全インサートの翻訳を確実にするために所望するコード配列の読み枠とインフェース（in-phase）でなければいけない。これらの外因性翻訳コントロールシグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源であり得る。発現の効率は、適当な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどの包含によって増大され得る（Bittnerらによる1987, Methods in Enzymol., 153: 51-544を参照）。
【０２２５】
加えて、該インサート配列の発現をモジュレートしたりあるいは所望する特定の様式に該遺伝子産物を改変しそしてプロセスする宿主細胞系統を、選択することができる。タンパク質産物のそれら改変（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は、該タンパク質の機能にとって重要であり得る。
【０２２６】
異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび改変のついての特有で且つ特異的な機構を有する。適当なセルラインまたは宿主系は、発現する該外来性タンパク質の正確な改変およびプロセッシングを確実にするために選択することができる。この最後に、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化およびホスホリル化の適当なプロセッシングのための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を使用することができる。該哺乳動物宿主細胞としては例えば、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、特に乳癌セルライン（例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ）および正常な乳腺セルライン（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔ）を含むが、これらに限定されない。
【０２２７】
組み換えタンパク質の長期間で高収率な産生のためには、安定な発現が好ましい。例えば、該抗体分子を安定に発現するセルラインは、操作することができる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、宿主細胞を、適当な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって制御されたＤＮＡを用いて形質転換することができる。外来性ＤＮＡの導入後に、該遺伝子操作した細胞を、エンリッチナな媒質中で１〜２日間増殖することができ、次いで典型的には選択培地中で繰り返す。組み換えプラスミド中の選択マーカーは選択物に対する耐性を与え、そして細胞がそれらの染色体中に該プラスミドを安定に取り込み、増殖して病巣（このものは、次いでクローニングされてそしてセルライン中に拡がり得る）を形成することを許容する。この方法は、該抗体分子を発現するセルラインを操作するために有利に使用することができる。該操作したセルラインは、該抗体分子と直接的にまたは間接的に相互作用する化合物をスクリーニングしそして評価する際に特に有用である。
【０２２８】
多数の選択システムを使用することができ、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ  ＴＫ）（Wiglerらによる1977, Cell, 11: 223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴ）（SzybalskおよびSzybalskiによる1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 202）、並びにアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyらによる1980, Cell, 22: 817）ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これらは、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞（ＡＰＲＴ）中で使用することができる）を含むが、これらに限定されない。
【０２２９】
加えて、代謝拮抗耐性は、以下のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての選択の基礎として使用することができる；ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を与える）（Wiglerらによる1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 357; およびO' Hareらによる1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527）；ｇｐｔ（これは、マイコフェノール酸に対する耐性を与える）（MulliganおよびBergによる1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072）；ｎｅｏ（これは、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を与える）（Clinical Pharmacy, 12: 488-505; WuおよびWuによる1991, Biotherapy, 3: 87-95; Tolstoshevによる1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 573-596; Mulliganによる1993, Science, 260: 926-932; Andersonによる1993, Ann. Rev. Biocchem, 62: 191-21; May, 1993, TIB TECH, 11(5): 155-215）；およびｈｙｇｒｏ（これは、ハイグロマイシンに対する耐性を与える）（Santerreらによる1984, Gene, 30: 147）。組み換えＤＮＡ技術の分野において通常知られる方法が、所望する組み換えクローンを選択するためにルーチン的に適用することができ、そして該方法は、例えばAusubelら（編）によるCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；Krieglerによる1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; 12および13章；Dracopoliら（編）によるCurrent Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)；Colberre-Garapinらによる1981. J. Mol. Biol., 150: 1（これらは本明細書の一部を構成する）中に記載されている。
【０２３０】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大することができる（総説として、BebbingtonおよびHentschelによるThe use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned polynucleotides and polypeptides in mammalian cells in DNA cloning, 3巻（Academic Press, New York, 1987）を参照）。抗体を発現するベクターシステム中のマーカーが増幅可能である場合には、宿主細胞培養物中に存在するインヒビターのレベルの増大は、マーカー遺伝子のコピーの数を増大するであろう。該増幅領域は抗体遺伝子と関係するので、抗体の産生もまた増大するであろう（Crouseらによる1983, Mol. Cell. Biol., 3: 257）。
【０２３１】
グルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを選択マーカーとして使用するベクターは、それぞれ薬物メチオニンスルホキシイミン（sulphoximine）またはメトトレキセートの存在下で増幅することができる。グルタミンシンターゼベースのベクターの利点は、グルタミンシンターゼ陰性であるセルライン（例えば、マウスミエローマセルライン、ＮＢＯ）の利用可能性である。グルタミンシンターゼ発現システムはまた、別のインヒビターを供することによってグルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）中で機能して、内因性遺伝子の機能化を防止することができる。
【０２３２】
選択マーカーとしてグルタミンシンターゼを発現するベクターとしては例えば、StephensおよびCockettによる1989, Nucl. Acids. Res., 17: 7110中に記載されるｐＥＥ６発現ベクターを含むが、これに限定されない。グルタミンシンターゼ発現システムおよびその構成成分は、PCT公報: W087/04462; W086/05807; W089/01036; W089/10404; およびW091/06657（これらは本明細書の一部を構成する）中に詳述されている。加えて、本発明に従って使用することができるグルタミンシンターゼ発現ベクターは、供給者（例えば、Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH)を含む）から商業的に入手可能である。マウスミエローマ細胞中でのＧＳ発現システムを使用するモノクローナル抗体の発現および産生は、Bebbingtonらによる1992, BioTechnology, 10: 169、並びにBibliaおよびRobinsonによる1995, Biotechnol. Prog., 11: 1（これらは本明細書の一部を構成する）中に記載されている。
【０２３３】
宿主細胞は、本発明の２個の発現ベクター、Ｈ鎖誘導ポリペプチドをコードする第１ベクター、およびＬ鎖誘導ポリペプチドをコードする第２ベクターと一緒に同時形質移入することができる。該２つのベクターは、Ｈ鎖およびＬ鎖のポリペプチドの等しい発現を可能とする同一の選択マーカーを含むことができる。あるいは、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方のポリペプチドをコードしそして発現することができる、単一のベクターを使用することができる。そのような状況下では、該Ｌ鎖は、毒性のないＨ鎖の過剰を避けるためにＨ鎖の前に置かれるべきである（Proudfootによる1986, Nature, 322: 52; Kohlerによる1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 2197）。該Ｈ鎖およびＬ鎖についてのコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。
【０２３４】
本発明の抗体分子が動物によって産生されるか、化学的に合成されるか、あるいは組み換え的に発現された後に、そのものは免疫グロブリンまたはポリペプチド分子の精製について当該分野において知られるいずれかの方法、例えばクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換、アフィニティー（特に、特定の抗原およびプロテインＡに対するアフィニティー）、およびサイズカラムのクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の差違、またはタンパク質の精製のためのいずれか他の標準的な技術によって精製することができる。加えて、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載するかまたはそれ以外に当該分野において知られる異種ポリペプチド配列と融合させて、精製を容易にすることができる。
【０２３５】
本発明は、本発明のポリペプチド（またはその部分、該ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個のアミノ酸が好ましい）と組み換え的に融合させたりまたは化学的に接合させて（例えば、共有的におよび非共有的に接合された両方の場合を含む）融合タンパク質を与える、抗体を包含する。該融合は、直接であることは必ずしも必要としないが、リンカー配列によって生じることができる。該抗体は、本発明のポリペプチド（または、該ポリペプチドの一部、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個のアミノ酸であることが好ましい）以外の抗原にとって特異的であり得る。例えば、抗体を用いて、インビトロまたはインビボのいずれかで本発明のポリペプチドをある細胞表面レセプターにとって特異的である抗体に融合させたりまたは接合させることによって、本発明のポリペプチドをある細胞タイプに標的化することができる。
【０２３６】
本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは変異体を含む）は、異種タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃポリペプチド、またはヒト血清アルブミンポリペプチド）のＮ−末端またはＣ−末端のいずれかと融合することができる。本発明の抗体はまたアルブミンと融合して、キメラポリペプチドを与えることができる。該アルブミンとしては例えば、組み換えヒト血清アルブミン（例えば、米国特許第5,876,969号（1999年3月2日発行）; EP特許第0 413 622号; および米国特許第5,766,883号（1998年6月16日発行）（これらは本明細書の一部を構成する））を含むが、これに限定されない。好ましい態様において、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは変異体を含む）は、ヒト血清アルブミンの成熟形態（すなわち、EP特許第0 322 094号（これは本明細書の一部を構成する）の図１および２に示すヒト血清アルブミンのアミノ酸１〜５８５）と一緒に融合する。別の好ましい態様において、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは変異体を含む）は、米国特許第5,766,883号（これは本明細書の一部を構成する）に記載されているヒト血清アルブミンのアミノ酸残基１〜ｚ（ここで、ｚは３６９〜４１９の整数である）を含有するかまたは別にそれから構成される、ポリペプチドフラグメントと一緒に融合する。
【０２３７】
ｓｒｃバイオマーカー融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその抗体もまた、本発明に包含する。該融合タンパク質は、例えば精製を容易にして、そしてインビボでの半減期を増大することができる。本発明のポリペプチドと融合したりまたは接合する抗体はまた、当該分野において知られる方法を用いるインビトロイムノアッセイ法および精製方法においても使用することができる。例えば、Harborらによる上記, およびPCT公報WO 93/21232; EP第439,095号; Naramuraらによる1994, Immunol. Lett., 39: 91-99; 米国特許第5,474,981号; Gilliesらによる1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1428-1432; Fellらによる1991, J. ImmunoL, 146: 2446-2452（これらは本明細書の一部を構成する）を参照。
【０２３８】
本発明は更に、可変領域ドメイン以外の抗体ドメインと融合したりまたは接合する本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドを含有する組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域またはその一部と融合したりまたは接合することができる。本発明のポリペプチドと融合する抗体部分は、定常部、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたは全ドメインもしくはその一部のいずれかの組み合わせを含み得る。該ポリペプチドはまた、上記の抗体部分と融合したりまたは接合して、多量体を形成することができる。例えば、本発明のポリペプチドと融合するＦｃ部分は、Ｆｃ部分の間で結合するジスルフィドによって二量体を形成することができる。より高度な多量体形態は、該ポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分へ融合させることによって製造することができる。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合したりまたは接合する方法が、当該分野において知られる（例えば、米国特許第5,336,603号; 第5,622,929号; 第5,359,046号; 第5,349,053号; 第5,447,851号; 第5,112,946号; EP第307,434号; EP第367,166号; PCT公報WO96/04388; WO 91/06570; Ashkenaziらによる1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539; Zhengらによる1995, J. Immunol., 154: 5590-5600; およびVilらによるProc. Call. Acad. Sci. USA, 89: 11337-11341（これらは本明細書の一部を構成する）を参照）。
【０２３９】
上記の通り、表３〜６中に記載する１つ以上のｓｒｃバイオマーカーアミノ酸配列の、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、または変異体に対応するポリペプチドは、該ポリペプチドのインビボ半減期を増大するために、または当該分野において知られる方法を用いるイムノアッセイにおける使用のために、上記の抗体部分に融合したりまたは接合することができる。更に、表３〜６中に記載の１つ以上のｓｒｃバイオマーカー配列に対応するポリペプチドは、精製を容易にするために、上記の抗体部分に融合したりまたは接合することができる。指針として、ヒトＣＤ４ポリペプチドの第１の２個のドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンのＨ鎖またはＬ鎖の定常部の様々なドメインを有するキメラタンパク質が記載されている（EP第394,827号; Trauneckerらによる1988, Nature, 331: 84-86）。ジスルフィド結合した二量体構造（ＩｇＧに起因）を有する抗体またはその部分と融合したりまたは接合する本発明のポリペプチドはまた、例えばまた単量体分泌型タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも他の分子と結合したりおよび中和する際により効率的であり得る（Fountoulakisらによる1995, J. Biochem., 270: 3958-3964）。多くの場合において、融合タンパク質におけるＦｃ部分は、療法、診断法および／またはスクリーニング法において有利であり、従って例えば、薬物動態学的な性質の改善を与え得る（EP A 232,262）。薬物発見において、例えばヒトタンパク質（例えば、ｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するために、ハイスループットスクリーニングアッセイの目的でＦｃ部分と一緒に融合される（Bennettらによる1995, J. Molecular Recognition, 8: 52-58; およびJohansonらによる1995, J. Biol. Chem., 270: 9459-9471を参照）。あるいは、融合タンパク質を発現し、検出し、そして精製した後に、該Ｆｃ部分を検出することが、所望され得る。例えば、該融合タンパク質を免疫化のための抗原として使用する場合に、該Ｆｃ部分は療法および診断を妨げ得る。
【０２４０】
その上、本発明の抗体またはそのフラグメントは、マーカー配列（例えば、ペプチド）と融合して、それらの精製を容易にすることができる。好ましい態様において、特に多数が商業的に入手可能であるが、該マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（QIAGEN, Inc. , Chatsworth, CA）中で供されるタグ）である。Gentzらによる1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 821-824中に記載されている通り、例えばヘキサヒスチジンは、該融合タンパク質の簡便な精製のために供される。精製のために有用な他のペプチドタグとしては例えば、「ＨＡ」タグ（このものは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質から融合されるエピトープに相当する）（Wilsonらによる1984, Cell, 37: 767）および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これらに限定されない。
【０２４１】
本発明は更に、診断用薬剤または治療用薬剤と接合した抗体またはそのフラグメントを包含する。該抗体は、例えば臨床的な試験方法の一部として腫瘍の発生または進行をモニターするために、および例えばある処置様式の有効性を測定するために、診断学的に使用することができる。検出は、該抗体を検出可能な物質とカップリングさせることによって容易にすることができる。検出可能な物質の非限定的な例としては、様々な酵素、接合団（prosthetic groups）、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、様々な陽電子放射型断層撮影法を用いる陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンを含む。該検出可能な物質は、当該分野において知られる技術を用いて、抗体に直接的にか、または中間体（例えば、当該分野において知られるリンカー）によって間接的にかのいずれかでカップリングしたりまたは接合することができる（例えば、本発明に記載の診断学として使用するために抗体と接合することができる金属イオンについては、米国特許第4,741,900号を参照）。
【０２４２】
適当な酵素の非限定的な例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み；適当な接合団の非限定的な例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適当な蛍光物質の非限定的な例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イシチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（dichlorotriazinylamine）・フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンを含み；発光物質の非限定的な例としては、ルミノールを含み；生物発光物質の非限定的な例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含み；そして、適当な放射性物質の非限定的な例としては、ヨウ素（１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３ｓｕｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎおよびインジウムの他の放射性同位元素）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ)、タリウム（２０Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（ｌ０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１９Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、Ｇｄ、放射性Ｐｍ、放射性Ｌａ、放射性Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、放射性Ｓｃ、放射性Ｒｅ、放射性Ｒｅ、ｌ４２Ｐｒ、ｌ０５Ｒｈおよび９７Ｒｕを含む。
【０２４３】
具体的な態様において、本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドは、放射性金属イオン（radiometal）と接合するのに有用な大環状キレート因子と結合し、例えば、ポリペプチドとの１１１Ｉｎ、ｌ７７Ｌｕ、９０Ｙ、１６６Ｈｏおよび１５３Ｓｍを含むが、これらに限定されない。好ましい態様において、本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドと結合する大環状キレート因子と会合する該放射性金属イオンは、１１１Ｉｎである。別の好ましい態様において、本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドと結合する大環状キレート因子と会合する該放射性金属イオンは、９０Ｙである。具体的な実施態様において、該大環状キレート因子は、１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ,Ｎ',Ｎ'',Ｎ'''−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。他の具体的な実施態様において、該ＤＯＴＡは、リンカー分子によって本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドと結合する。
【０２４４】
ＤＯＴＡをポリペプチドと接合するために有用なリンカー分子の例は、当該分野において通常知られる（例えば、DeNardoらによる1998, Clin. Cancer Res., 4(10): 2483-90; Petersonらによる1999, Bioconjug. Chem., 10(4): 553-557; およびZimmermanらによる1999, Nucl. Med. Biol., 26(8): 943-950（これらは本明細書の一部を構成する）を参照）。加えて、米国特許第5,652,361号および第5,756,065号（これは、抗体と接合することができるキレート化剤、並びにそれの製造法および使用方法を開示する）は、本明細書の一部を構成する。米国特許第5,652,361号および第5,756,065号はキレート化剤と抗体との接合に焦点を当てているが、当該分野の当業者は、キレート化剤と接合するために該文献中に開示されている方法を他のポリペプチドに容易に適用することができる。
【０２４５】
抗体はまた、標的抗原のイムノアッセイまたは精製のために特に有用な固体担体と結合することができる。該固体担体としては例えば、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンを含むが、これらに限定されない。
【０２４６】
治療学的な分子を抗体と接合するための技術はよく知られており、例えば、Arnonらによる「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, In: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら（編）, 243-56頁, Alan R. Liss社, 1985; Hellstromらによる「Antibodies For Drug Delivery」, In: Controlled Drug Delivery (2版), Robinsonらによる（編）, 623-53頁, Marcel Deldcer社, 1987; Thorpeによる「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」, In: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら（編）, 475-506頁, 1985; 「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」, In: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら（編）, 303-316頁, Academic Press, 1985; およびThorpeらによる1982, 「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」, Immunol. Rev., 62: 119-158を参照。あるいは、抗体を２次抗体と接合させて、抗体へテロ接合体（heteroconjugate）を得ることができる（例えば、Segalによる米国特許第4,676,980号（これは本明細書の一部を構成する）において記載）。抗体、すなわち本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドに特異的な抗体は、それと接合する治療学的な分子の存在あるいは不存在で、並びに単独であるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与する場合に、治療薬として使用することができる。
【０２４７】
本発明の抗体は、セルラインおよび生物学的な標本のイムノフェノタイピングに使用することができる。本発明のｓｒｃバイオマーカーコードポリヌクレオチドおよびポリペプチドの翻訳産物は、細胞特異的なマーカー、またはより具体的には、ある細胞タイプの分化および／または成熟の様々な段階で差次的に発現する細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープに対するモノクローナル抗体、またはエピトープの組み合わせは、該マーカーを発現する細胞個体群のスクリーニングを可能とする。モノクローナル抗体を使用するための様々な技術を用いて、該マーカーを発現する細胞個体群をスクリーニングすることができ、該技術としては例えば、抗体でコーティングした磁気ベッドを用いる磁気的分離（magnetic separation）、固体マトリックス（すなわち、組織培養プレート）と結合した抗体を用いる「パニング（panning）」、およびフローサイトメトリーを含む（例えば、米国特許第5,985,660号; およびMorrisonらによる1999, Cell, 96: 737-749を参照）。
【０２４８】
これらの技術により、血液学的な悪性（すなわち、急性白血病患者における微小残存病変（ＭＲＤ））について見られ得るある個体群の細胞、および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するための移植における「非自己」細胞、をスクリーニングすることが可能である。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見られ得る、増殖および／または分化を行なうことができる造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングが可能となる。
【０２４９】
本発明に記載する抗体は、当該分野において知られるいずれかの方法によって、免疫特異的な結合についてアッセイすることができる。使用することができるイムノアッセイとしては例えば、ＢＩＡコア分析、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）分析、免疫蛍光法、免疫細胞化学、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル内沈降反応（gel diffusion precipitin reaction）、免疫拡散法、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法（immunoradiometric assay）、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ（２、３だけを示す）などの技術を用いる競合的および非競合的なアッセイシステムを含むが、これらに限定されない。該アッセイはルーチンであり、そして当該分野においてよく知られ且つ実施される（例えば、Ausubelら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, 1巻, John Wiley & Sons, Inc., New York（これは本明細書の一部を構成する）を参照）。非限定的で典型的なイムノアッセイを、以下に記載する。
【０２５０】
免疫沈降プロトコールは通常、溶解緩衝液（例えば、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を用いて補足したＲＩＰＡ緩衝液（すなわち、１％  ＮＰ−４０またはトリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．２、１％トラシロール（Trasylol））中に細胞の個体群を溶解し；該関心ある抗体を細胞ライセート中に加え；一定の期間（例えば、１〜４時間）４℃でインキュベートし；該細胞ライセートにプロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースベッドを加え；４℃で約６０分間以上インキュベートし；溶解緩衝液中で該ベッドを洗浄し；そして、該ベッドをＳＤＳ／標本緩衝液中に再懸濁する、ことを含む。関心ある抗体のある抗原を免疫沈降させる能力は、例えばウェスタンブロット分析によって評価することができる。当該分野の当業者は、改変して、該抗体と抗原との結合を増大させ、そして該バックグラウンド（例えば、セファロースベッドを用いて該細胞ライセートを前清澄する）を低減することができるパラメータについてよく知っているであろう。免疫沈降プロトコールに関する更なる詳細な記載は、例えばAusubelら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, 1巻, John Wiley & Sons, Inc., New York, at10.16.1.を参照。
【０２５１】
ウェスタンブロット分析は通常、タンパク質標本を調製し；ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて８％〜２０％のＳＤＳ  ＰＡＧＥ）中、該タンパク質標本を電気泳動し；ポリアクリアミドゲルから膜（例えば、ニトロセルロース、ＰＤＶＦまたはナイロン）へタンパク質標本を移動し；ブロック用溶液（例えば、３％ＢＳＡまたは脱脂乳と一緒のＰＢＳ）中で該膜をブロックし；該膜を洗浄用緩衝液（例えば、ＰＢＳ−ツイーン２０）中で洗浄し；該膜をブロック用緩衝液中に希釈した１次抗体（関心ある抗体）を用いてブロックし；該膜を洗浄用緩衝液中で洗浄し；該膜を、ブロック用緩衝液中に希釈した酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）と接合させた２次抗体（このものは、１次抗体を認識する、例えば抗ヒト抗体）を用いてブロックし；該膜を洗浄用緩衝液中で洗浄し；そして、抗原の存在下で検出する、ことを含む。当該分野の当業者は、検出するシグナルを増大し、そしてバックグラウンドのノイズを低減するために改変することができるパラメーターについてよく知っているであろう。ウェスタンブロットプロトコールに関する更なる記載は、例えばAusubelら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, 1巻, John Wiley & Sons, Inc., New York, at10.8.1.を参照。
【０２５２】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製し；９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングし；検出可能な化合物（例えば、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）と接合した関心ある抗体を、該ウェルに加え；一定の期間インキュベートし；そして、抗原の存在下で検出する、ことを含む。ＥＬＩＳＡにおいて、関心ある抗体は、検出可能な化合物とは接合する必要はなく；その代わりに検出可能な化合物と接合した２次抗体（このものは、関心ある抗体を認識する）を該ウェルに加えることができる。更に、該ウェルを抗原を用いてコーティングする代わりに、該抗体を第１に該ウェル上にコーティングすることができる。この場合に、検出可能な化合物と接合した２次抗体は、関心ある抗原の添加後に、該抗体でコーティングしたウェルに加えることができる。当該分野の当業者は、改変して検出するシグナルを増大することができるパラメーター、並びに当該分野において知られるＥＬＩＳＡの他の改変法についてよく知っているであろう。ＥＬＩＳＡに関する更なる記載は、例えばAusubelら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, 1巻, John Wiley & Sons, Inc., New York, at 11.2.1を参照。
【０２５３】
抗体と抗原との結合アフィニティー、および抗体−抗原相互作用のオフ速度は、競合的な結合アッセイによって測定することができる。競合的な結合アッセイの１例としては、標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）またはそのフラグメントもしくは変異体を、標識抗原の量を増大させながらその存在下で関心ある抗体と一緒にインキュベートすること、および該標識抗原と結合した抗体を検出すること、を含むラジオイムノアッセイである。ｓｒｃバイオマーカータンパク質に対する関心ある抗体のアフィニティー、および該結合オフ速度は、スキャッチャードプロット分析によるデータから測定することができる。２次抗体による競合はまた、ラジオイムノアッセイを用いて測定することができる。この場合に、該ｓｒｃバイオマーカータンパク質は、非標識２次抗体の量を増大させながらその存在下で標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉで標識した化合物）と接合した関心ある抗体とインキュベートする。この種類の２つの抗体の間の競合的なアッセイをも用いて、２つの抗体が同じかまたは異なるエピトープと結合しているかを測定することができる。
【０２５４】
好ましい態様において、ＢＩＡコア動力学的な分析を用いて、抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む）と、ｓｒｃバイオマーカータンパク質またはｓｒｃバイオマーカータンパク質のフラグメントとの結合のオンおよびオフ速度を測定する。動力学的な分析は、チップ表面上に固定化されたｓｒｃバイオマーカータンパク質を有する該チップからの該抗体の結合および解離を分析することを含む。
【０２５５】
例えば、分子生物学を含む組み換え技術、並びにポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびタンパク質の分析に関する他の技術による、抗体分子の産生、発現、単離およびマニピュレーションのための上記技術は、本発明の様々な態様に従って利用可能であったりまたは保証されるので、本明細書に記載する本発明の他のポリペプチドまたはペプチド分子、特にｓｒｃバイオマーカーポリペプチドまたはペプチドそのものに適用可能であることを、更に理解されるべきである。
【０２５６】
本発明はまた、疾患、特に癌または腫瘍（大腸の癌または腫瘍が好ましい）を有する患者によって薬物の感受性または耐性を測定したりまたは予測するためのキットをも包含する。該キットは、例えば患者の腫瘍または癌が薬物、化合物、化学療法剤または生物学的治療剤を用いるある処置または療法に対して耐性または感受性であるかどうかを測定しまたは予測するために、患者のバイオプシーの腫瘍または癌の標本を試験する際の使用のための臨床的なセットにおいて有用である。ある生物学的システムにおけるｓｒｃまたはｓｒｃファミリーチロシンキナーゼモジュレーター（特に、ｓｒｃキナーゼインヒビター）に対する耐性または感受性と相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含有する（マイクロアレイを含有することが好ましい）プレディクターセット；適当な容器中の患者の組織または患者の標本からの細胞を耐性／感受性について試験する際に使用するためのモジュレーター化合物；並びに、使用のための指示、を該キット中に提供する。該キットは、タンパク質チロシンキナーゼ（例えば、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの要素（例えば、Ｓｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＬｙｎ）、並びに他のタンパク質チロシンキナーゼの要素（例えば、ｃｒ−ａｂｌ、Ｊａｋ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔおよびＥｐｈｒを含む）のモジュレーターに対する耐性および感受性と相関する、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含有するプレディクターセットを包含する。
【０２５７】
また、上で説明する通り、該キットは、マイクロアレイに限定されないが、しかし該プレディクター／マーカーのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現をｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルについてアッセイしおよび／またはモニターすることができる様々な方法およびシステム（例えば、ＰＣＲアッセイ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）およびイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ））を包含することもできる。ＰＣＲまたはインシチュハイブリダイゼーションを行なうためのキット中、例えば１つ以上のプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列からの核酸プライマーまたはプローブ（例えば、表３〜６および１３中に記載するもの）を、該方法を実施するために必要な緩衝液および試薬、並びに使用のための指示に加えて、供する。イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、イムノブロットアッセイなど）を行なうためのキットにおいて、抗体、あるいは本発明のｓｒｃバイオマーカーポリペプチドまたはその抗原性もしくは免疫原性ペプチドと結合可能な部分を、該方法を行なうために必要な緩衝液および試薬、並びに使用のための指示に加えて、供する。
【０２５８】
別の態様において、本発明は、疾患処置のための薬物療法の開発において標的として機能することができる、本明細書中で同定するプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドのうち、１つ以上のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用を包含する。該標的は、大腸の疾患（例えば、大腸の癌または腫瘍）の処置に特に利用可能であり得る。実際、これらのプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドは感受性および耐性の細胞中で差次的に発現するので、それらの発現パターンは、ｓｒｃチロシンキナーゼと相互作用しそしてそれを阻害する化合物を用いる処置に対する細胞の相対的な内因的感受性と相関する。従って、耐性細胞中で高く発現するポリヌクレオチドおよびポリペプチドはｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物に対して耐性である腫瘍の薬物療法の開発における標的として機能し得る。
【０２５９】
実施例
本明細書中の実施例は、本発明を実施するための様々な態様を例示することを意図するものであり、そしていかなる形で本発明の範囲を限定することを意図するものでない。該実施例は、使用する通常の方法についての詳細な記載（例えば、ベクターの構築、該ベクター中へのｃＤＮＡのインサート、または得られたベクターの適当な宿主中への導入）を含まない。該方法は、当該分野における当業者にとってよく知られており、そしてこれは、多数の刊行物中に記載されている（例えば、Sambrook, FritschおよびManiatisによるMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, (1989)を参照）。
【０２６０】
実施例−方法
ＩＣ５０測定−インビトロ細胞毒性アッセイ
Ｓｒｃチロシンキナーゼインヒビター化合物（WO 00/62778（2000年10月26日公開）に記載）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ＡＴＣＣから入手可能な（学術的な研究者から得るＣＸ−１およびＭＩＰを除く）３１個のヒト大腸セルラインのパネルに対するインビトロでの細胞毒性について試験した。細胞毒性は、ＭＴＳ（３−(４,５−ジメチルチアゾール−２−イル)−５−(３−カルボキシメトキシフェニル)−２−(４−スルフェニル)−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩）アッセイ（T. L. Rissらによる1992, Mol. Biol. Cell, 3(補遺): 184a）によって細胞中で評価した。
【０２６１】
該アッセイを行なうために、大腸細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート中に４,０００細胞／ウェルで置き、そして２４時間後に、連続的に希釈した薬物を加えた。該細胞毒性アッセイにおいて使用するｓｒｃ化合物についての濃縮範囲は、５μｇ／ｍＬ〜０．００１６μｇ／ｍＬ（約１０μＭ〜０．００３２μＭ）とした。該細胞を、３７℃で７２時間インキュベートし、その後に、テトラゾリウム色素、ＭＴＳ（最終濃度は３３３ｇ／ｍＬである）を、電気カップリング剤であるフェナジンメトスルフェート（henazine methosulfate）（最終濃度は２５μＭである）と組み合わせて加えた。肝臓細胞中のデヒドロゲナーゼ酵素は、ＭＴＳを４９２ｎＭでの光（これは、分光光度的に定量化することができる）を吸収する形態に還元する。吸光度（absorbency）が大きければ大きいほど、肝臓細胞の数は多い。該結果はＩＣ５０として表し、これは、非処置コントロール細胞の場合の５０％まで細胞増殖を抑制するのに必要とされる薬物濃度（すなわち、４５０ｎＭでの吸光度）である。各セルラインについての複数回試験からの平均ＩＣ５０および標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【０２６２】
耐性／感受性の分類
各化合物について、各セルラインについてのＩＣ５０をｌｏｇ変換してｌｏｇ１０（ＩＣ５０）とし、次いで該ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）値を３１個の大腸セルラインについて規格化した。全３１個のセルラインの平均ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）値よりも低いｌｏｇ１０（ＩＣ５０）を有するセルラインは、化合物に対して感受性であると定義し、一方で平均ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）を超えるｌｏｇ１０（ＩＣ５０）を有するものは、化合物に対して耐性であると見なした。該３１個の大腸セルラインの分類を、ｓｒｃキナーゼインヒビター化合物の全４個について行なった（表２）。
【０２６３】
遺伝子発現プロファイリング
大腸細胞を５０〜７０％集密まで増殖させ、そしてＲＮＡをRNeasy（登録商標）キット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて単離した。該ＲＮＡの質を、アジレント（Agilent）２１００バイオアナライザー（Agilent Technologies, Rockville, MD）を用いることによって、２８：１８リボソームＲＮＡ比率を測定することによって評価した。総ＲＮＡの濃度を、分光光度的に測定した。各セルラインからの総ＲＮＡ（１０μｇ）を用いて、Affymetrixマニュアル（Affymetrix Genechip（登録商標）Technical Manual, 2000）に従って、ビオチン化プローブを調製した。プローブを、AffymetrixヒトゲノムＵ９５Ａｖ２高密度オリゴヌクレオチドアレイ（Affymetrix, Santa Clara, CA）にハイブリダイズした。次いで、該アレイを洗浄し、そして商業主の指示（Affymetrix Genechip（登録商標）技術マニュアル, 2000）に従って、Genechip（登録商標）フルイディックスステーション（Fluidics station）を用いて染色した。該ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２アレイは、約１２,０００ヒト遺伝子配列およびＥＳＴｓである約１２,０００プローブセットを含む。
【０２６４】
マイクロアレイデータのプレプロセッシング
スキャンイメージファイルを人工産物について視覚的に検査し、そしてＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現分析ソフトウェア（Affymetrix, Santa Clara, CA）を用いて分析した。「アブソルート・コール（Absolute Call）」（Affymetrix Genechip（登録商標）Technical Manual, 2000）（これは、転写物が１標本中に検出されるかどうかを測定するのに使用する）、並びに「差違の平均値（Average Difference）」（Affymetrix Genechip（登録商標）Technical Manual, 2000）（これは、転写産物の発現レベルの相対的な指示物質として機能する）を、算出した。全体のチィップ強度におけるいずれかのモニター差違について説明する目的で、各標本についてのハイブリダイゼーション強度を１，５００（Affymetrix Genechip（登録商標）Technical Manual,2000）にまでスケールし、その結果、各セルラインについての総発現レベルを比較可能となった。Affymetrixコントロール配列は、分析前に除去した。
【０２６５】
ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２アレイにおける総計１２，５５８個の示すポリヌクレオチドおよびポリペプチド中の２０７９個の示すポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、Affymetrix Gene Chip（登録商標）発現分析アルゴリズムを用いる３１個の大腸セルラインの全てにおいて検出されず（Absent Call）；これらの非検出ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、更なる分析から除外した。残りのデータを、ジーンクラスターソフトウェア（Whitehead Institute; T. R. Golubらによる1999, Science, 286: 531-537）に移した。閾値フィルターを残りの１０，４７９個の示すポリヌクレオチドおよびポリペプチドの遺伝子発現値に適用して、負の遺伝子発現値を除去し、そしておそらくAffymetrix蛍光スキャナーの線形範囲内ではないであろう高い遺伝子発現値を制限した。該閾値フィルターは、負または１００単位より低い全ての遺伝子発現値を１００単位に、および４０，０００単位を超える全ての遺伝子発現値を４０，０００単位に変換した。遺伝子発現値が１００〜４０，０００の間である全ての示すポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、変えなかった。
【０２６６】
次いで、第２の「変動フィルター」をデータセットに適用して、３１個のセルラインのパネルの異なる性質および特徴と相関するであろうポリヌクレオチドおよびポリペプチドを見つけた。該第２フィルターの目的は、発現パターンがデータセットについて変わるポリヌクレオチドおよびポリペプチドを選択することであり；変わらない遺伝子は、該３１個のセルラインパネルの異なる性質についての情報を与え得ない。例えば、該データセット内に２つの個体群の細胞、すなわち速く増殖する細胞および遅く増殖する細胞が存在する場合に、発現が一定であるかまたは発現が実質的に変わらない遺伝子は、速いまたは遅い細胞増殖と相関する情報を与え得ない。
【０２６７】
該第２の変動フィルターを公式化して、該３１個のセルラインについての各遺伝子の発現パターンを測定し、以下の基準に合格するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを見つけた：
１．遺伝子は、絶対的な発現において３倍の変化を示さなければいけないこと、すなわち、下式：
いずれかのあるセルラインにおける発現値      ＞３または＜０．３３
いずれかの他のセルラインにおける発現値  
に示す通りであること；
２．１に加えて、該３倍の変化は１０００発現単位の絶対的な差違でなければいけないこと；
３．加えて、上記の１番および２番の基準は、データセット内の３個の別個の機会、すなわちセルラインＡ／Ｂ、セルラインＥ／ＦおよびセルラインＴ／Ｇにおいて満たさなければいけないこと（該アルゴリズムは、多くの機会において、すなわちセルラインＡ／Ｂ、セルラインＡ／ＦおよびセルラインＢ／Ｆにおいて１セルラインに対して１個の発現値を使用しない）。
【０２６８】
該第２の変動フィルターは、データセットを、３００８個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドにまで低減した。
【０２６９】
第２の変動フィルターを適用した後に、各遺伝子を、以下の式を用いて、全３１個の大腸細胞標本についての平均値（平均値のセットは０まで、および標準偏差のセットは１まで）にまで規格化した：
遺伝子「Ｚ」の発現値−３１セルラインにおける遺伝子「Ｚ」の平均発現値
３１個のセルラインにおける遺伝子「Ｚ」の発現値の標準偏差
。
【０２７０】
この規格化したデータセットを用いて、本明細書に記載する通り、薬物クラスに対する感受性の性質と有意に相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを選択した。
【０２７１】
実施例２−ＰＣＲ発現プロファイリング
ＲＮＡ定量化は、タックマン（Taqman）（登録商標）リアル−タイム−ＰＣＲ蛍光発生アッセイを用いて実施する。該タックマン（登録商標）アッセイは、核酸鋳型の濃度をアッセイするための最も正確な方法の１つである。
【０２７２】
全てのセルラインを、標準的な細胞培養条件を用いて増殖する：１０％  ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍＬ  ペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０ｍＭ  ヘペス（これらは全て、GibcoBRL, Rockville, MD製である）を含むように捕捉したＲＰＭＩ１６４０。８０％集密の細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（GibcoBRL）を用いて２回洗浄し、そして０．２５％トリプシン（GibcoBRL）を用いて収集した。ＲＮＡを、標準的な方法（Qiagen（Valencia, CA）から商業的に入手可能なRNeasyキットを用いることが好ましい）を用いて製造する。
【０２７３】
リアルタイムＰＣＲのためのｃＤＮＡ鋳型は、ＲＴ−ＰＣＲのためのスーパースクリプト（登録商標）第１鎖合成システムを用いて得ることができる。本発明のｓｒｃバイオマーカーポリヌクレオチドおよびポリペプチドの各々についての代表的なフォワードおよびリバースのＲＴ−ＰＣＲプライマーを、本明細書中の表１３に提示する。
【０２７４】
ＳＹＢＲグリーン（Green）リアル−タイムＰＣＲ反応物は、以下の通り調製する：該反応混合物は、第１鎖ｃＤＮＡ（２０ｎｇ）；５０ｎＭ  フォワードプライマー（配列番号３９１〜５９１から選ばれる１つ以上のプライマー）；５０ｎＭ  リバースプライマー（配列番号５９２〜７９２から選ばれる１つ以上のプライマー）；０．７５Ｘ  ＳＹＢＲグリーンＩ（Sigma製）；１Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．３、７５ｍＭ  ＫＣｌ）；１０％  ＤＭＳＯ；３ｍＭ  ＭｇＣｌ２；３００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ；１Ｕ  プラチナム（Platinum）（登録商標）タックＤＮＡポリメラーゼ・ハイ・フィデリティー（High Fidelity）（カタログ番号; 11304-029; Life Technologies; Rockville, MD）、１：５０の希釈物；ＲＯＸ（Life Technologies）を含む。
【０２７５】
リアルタイムＰＣＲは、Applied Biosystems 5700配列検出システム（Sequence Detection System）を用いて行なう。条件は、９５℃で１０分間（プラチナム（商標登録）タックＤＮＡポリメラーゼの変性および活性化）、ＰＣＲの４０サイクル（９５℃で１５秒間、６０℃で１分間）とする。ＰＣＲ産物を、５７００配列検出システム中に構築された分析アルゴリズムを用いてユニフォームなメルティング（uniform melting）について分析した。
【０２７６】
鋳型の量の規格化において使用するｃＤＮＡ定量化は、タックマン（登録商標）技術を用いて行なう。タックマン（登録商標）反応物は、以下の通り調製する：該反応混合物は、第１鎖  ｃＤＮＡ（２０ｎｇ）；２５ｎＭ  ＧＡＰＤＨ−Ｆ３、フォワードプライマー；２５０ｎＭ  ＧＡＰＤＨ−Ｒ１、リバースプライマー；２００ｎＭ  ＧＡＰＤＨ−ＰＶＩＣタックマン（登録商標）プローブ（蛍光色素標識のオリゴヌクレオチドプライマー）；１×緩衝液Ａ（Applied Biosystems）；５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；３００μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ；１Ｕ  アンプリタック・ゴールド（Amplitaq Gold）（Applied Biosystems）を含む。ＧＡＰＤＨ、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼは、ｍＲＮＡレベルを規格化するためのコントロールとして使用する。
【０２７７】
リアルタイムＰＣＲは、Applied Biosystems 7700配列検出システムを用いて行なう。条件は、９５℃で１０分間（アンプリタック・ゴールドの変性および活性化）、ＰＣＲの４０サイクル（９５℃で１５秒間、６０℃で１分間）である。
【０２７８】
タックマン（登録商標）反応物において使用するＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである：
ＧＡＰＤＨ−Ｆ３：5'-AGCCGAGCCACATCGCT-3'（配列番号７９３）
ＧＡＰＤＨ−Ｒ１: 5'-GTGACCAGGCGCCCAATAC-3'（配列番号７９４）
ＧＡＰＤＨ−ＰＶＩＣ  Taqman（登録商標）プローブ-VIC-5'-CAAATCCGTTGACTCCGACCTTCACCTT-3'TAMRA（配列番号７９５）。
【０２７９】
該配列検出システムは、各インプットｃＤＮＡ鋳型の濃度を算出するために使用する、Ｃｔ（閾値サイクル）値を与える。関心のある各遺伝子についてのｃＤＮＡレベルを、インプット標本中の総ｃＤＮＡ量の変動について補償する（compensate）ためにＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡレベルにまで規格化する。これは、各セルラインについてＧＡＰＤＨ  Ｃｔ値を得ることによって行なう。関心ある遺伝子およびＧＡＰＤＨについてのＣｔ値を、δδＣｔ式の修正バージョン（Applied Biosystems Prism（登録商標）7700 Sequence Detection System User Bulletin 2番）中に挿入し、これを用いて、各特異的なｃＤＮＡについてのＧＡＰＤＨ規格化した相対的なｃＤＮＡレベルを算出する。δδＣｔ式は以下の通りである：
核酸テンプレートの相対量＝２δδＣｔ＝２（δＣｔａ−δＣｔｂ）
（式中、
δＣｔａ＝Ｃｔ  標的−Ｃｔ  ＧＡＰＤＨであり、そして、
δＣｔｂ＝Ｃｔ  参照−Ｃｔ  ＧＡＰＤＨである）
（参照セルラインを用いずに、相対的な量を算出し；δＣｔｂを、２１と定義する）。
【０２８０】
実施例３−Ｓｒｃバイオマーカーポリペプチドに対する抗体の産生
本発明の抗−ｓｒｃバイオマーカーポリペプチド抗体は、様々な方法によって製造することができる。抗体産生方法の１例として、本発明のポリペプチドを発現する細胞を動物に投与して、該発現するポリペプチドに対するポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘発する。好ましい方法において、該発現タンパク質は、当該分野において通常行なわれている技術を用いて製造され、好ましくは単離精製されて、天然の混入物が実質的にはない。次いで、該製造物を動物中に導入されて、該発現しそして単離したポリペプチドについてのより大きな比活性のポリクローナル抗血清を産生する。
【０２８１】
最も好ましい方法において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（または、そのタンパク質結合フラグメント）であり、そしてこのものは本明細書中に上で詳述するハイブリドーマ技術を用いて製造することができる。該ポリペプチドを発現する細胞は、いずれかの適当な組織培地中で培養することができるが；しかしながら、アール（Earle's）改変アール培地（このものは、１０％ウシ胎児血清（約５６℃で失活させた）を含むように補足し、そして約１０ｇ／Ｌの非必須アミノ酸、約１,０００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび約１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むように補足する）中で細胞を培養することが好ましい。
【０２８２】
免疫化した（および、追加免疫した）マウスの脾細胞を抽出し、そしてこのものを適当なミエローマセルラインと一緒に融合する。いずれかの適当なミエローマセルラインを本発明に従って使用することができるが；しかしながら、親ミエローマセルライン（ＳＰ２／０）（ＡＴＣＣから入手可能）を使用することが好ましい。融合後に、得られたハイブリドーマ細胞は、ＨＡＴ培地中に選択的に維持され、そして次いで、Wandsら（1981, Gastroenterology, 80: 225-232）によって記載されている限界希釈によってクローニングする。次いで、該選択によって得られるハイブリドーマ細胞をアッセイして、ポリペプチド免疫原またはその一部と結合することができる抗体を分泌する細胞クローンを同定する。
【０２８３】
あるいは、該ポリペプチドと結合することができる別の抗体を、抗−イディオタイプ抗体を用いる２段階の操作で産生することができる。該方法は、抗体が抗原自身であるとの事実を使用し、従って２次抗体と結合する抗体を得ることが可能である。本方法に従って、タンパク特異的な抗体を用いて、動物（マウスが好ましい）を免疫化する。次いで、該免疫化動物の脾細胞を用いてハイブリドーマ細胞を産生し、そして該ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、タンパク−特異的抗体と結合する能力を該ポリペプチドによってブロックすることができる、抗体を産生するクローンを同定する。該抗体は、抗−イディオタイプ抗体からタンパク−特異的抗体を含み、そしてこのものを用いて動物を免疫化して更なるタンパク−特異的抗体の生成を誘発することができる。
【０２８４】
ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましいことがある。該抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞から誘導される遺伝的な構築物を用いて産生することができる。キメラ抗体を産生する方法は、当該分野において知られ且つ行なわれている（総説として、例えばMorrisonによる1985, Science, 229: 1202; Oiらによる1986, BioTechniques, 4: 214; Cabillyらによる米国特許第4,816,567号; TaniguchiらによるEP第171496号; MorrisonらによるEP第173494号; NeubergerらによるWO 8601533; RobinsonらによるWO 8702671; Boulianneらによる1984, Nature, 312: 643; およびNeubergerらによる1985, Nature, 314: 268を参照）。
【０２８５】
実施例４−免疫蛍光アッセイ
以下の免疫蛍光プロトコールを用いて、例えば細胞上のｓｒｃバイオマーカータンパク質の発現を立証したり、あるいは例えば、細胞の表面で発現するｓｒｃバイオマーカータンパク質と結合する１つ以上の抗体の存在を調べることができる。要するに、Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩチャンバースライドを、カルシウムおよびマグネシウムを含有するＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ＋＋）中のウシコラーゲンタイプＩＩ（１０マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍＬ））を用いて４℃で終夜コーティングする。次いで、該スライドを、冷ＤＰＢＳ＋＋を用いて２回洗浄し、そして８０００  ＣＨＯ−ＣＣＲ５またはＣＨＯ  ｐＣ４形質移入細胞を用いて総容量１２５μＬで播種し、そして９５％酸素／５％二酸化炭素の存在下、３７℃でインキュベートする。
【０２８６】
該培地を吸引によって静かに取り出し、そして接着細胞をＤＰＢＳ＋＋を用いて２回、周囲温度で洗浄する。該スライドを、０．２％ＢＳＡ（ブロッカー）を含有するＤＰＢＳ＋＋を用いて０〜４℃で１時間ブロックする。該ブロック溶液を吸引によって静かに取り出し、抗体含有の溶液（１２５μＬ）を得る。該抗体含有の溶液は、例えばハイブリドーマ培養上清（このものは通常希釈せずに使用する）、または血清／血漿（このものは通常希釈して、約１／１００の希釈の希釈物である）であり得る。該スライドを、０〜４℃で１時間インキュベートする。次いで、抗体溶液を吸引によって静かに取り出し、そして該細胞を氷冷ブロック用溶液（４００μＬ）を用いて５回洗浄する。次いで、ブロック用溶液（１２５μＬ）中のローダミン標識２次抗体（例えば、抗−ヒトＩｇＧ）（１μｇ／ｍＬ）を、該細胞に加える。再び、細胞を０〜４℃で１時間インキュベートする。
【０２８７】
次いで、２次抗体溶液を吸引によって静かに取り出し、そして該細胞を氷冷ブロック用溶液（４００μＬ）を用いて３回、およびＤＰＢＳ＋＋を用いて５回洗浄する。次いで、該細胞を、３．７％ホルムアルデヒドのＤＰＢＳ＋＋溶液（１２５μＬ）を用いて周囲温度で１５分間固定化する。その後、該細胞を、ＤＰＢＳ＋＋（４００μＬ）を用いて周囲温度で５回洗浄する。最後に、該細胞を、５０％グリセリン水溶液中にマウントし、そしてローダミンフルターを用いて蛍光顕微鏡中で視察する。
【０２８８】
（配列表の簡単な説明）
配列番号１〜配列番号３９０を含む配列表は本明細書の一部を構成し、このものは本明細書中の表３〜６中に提示するｓｒｃバイオマーカーの核酸配列およびアミノ酸配列を含む。該配列表はまた、本発明のプレディクターポリヌクレオチドおよびポリペプチドのいずれか（これは、配列番号３９１〜配列番号７９２を含む）についてのＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて使用することができる代表的なプライマー対をも含む。
【０２８９】
本特許出願のファイルは、カラーで仕上げられた少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を有する本特許出願のコピーは、必要な手数料の要求および支払いで特許庁によって供されるであろう。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【０２９０】
本明細書中に引用する、全ての特許、特許出願、公開されたＰＣＴ出願および論説、書籍、刊行物、参照マニュアル、抄録およびインターネットウェーブサイトは、本発明が属する分野の状況をより十分に記載するために、本明細書の一部を構成する。
【０２９１】
様々な変化が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく上記の内容内で行なうことができるので、上記の記載に含まれたりまたは本特許請求の範囲中に含まれる全ての内容が本発明の記述および例示として解釈されるものと意図する。本発明の多数の改変および変化が、上記の教示に照らて可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】図１は、本発明に記載の遺伝子発現パターンを例示する図面である。ＢＭＳ−ＡまたはＢＭＳ−Ｄについての３１個の大腸セルラインの耐性／感受性の表現型分類に最も高く相関する１２３個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを示す。各列は遺伝子に相当し、そして段は異なるセルライン中での発現レベルに相当する。各遺伝子の発現レベルは、３１個のセルラインの全ての発現レベルの平均値について規格化する。該平均値より大きい発現レベルを有するポリヌクレオチドおよびポリペプチドは赤色で影を付け、そして該平均値より低いものは緑色で影を付ける。図１のｓｒｃバイオマーカーをコードする個々のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、順に表３中に例示する。
【図２】図２は、本発明に記載の遺伝子発現パターンを例示する図面である。ＢＭＳ−Ｂについての３１個の大腸セルラインの耐性／感受性の表現型分類に最も高く相関する１１９個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを示す。各列は遺伝子に相当し、そして段は異なるセルライン中での発現レベルに相当する。各遺伝子の発現レベルは、３１個のセルラインの全ての発現レベルの平均値について規格化する。該平均値より大きい発現レベルを有するポリヌクレオチドおよびポリペプチドは赤色で影を付け、そして該平均値より低いものは緑色で影を付ける。図２のｓｒｃバイオマーカーをコードする個々のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、順に表４中に例示する。
【図３】図３は、本発明に記載の遺伝子発現パターンを例示する図面である。ＢＭＳ−Ｃについての３１個の大腸セルラインの耐性／感受性の表現型分類に最も高く相関する１３７個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを示す。各列は遺伝子に相当し、そして段は異なるセルライン中での発現レベルに相当する。各遺伝子の発現レベルを、３１個のセルライン全ての発現レベルの平均値について規格化する。該平均値より大きい発現レベルを有するポリヌクレオチドおよびポリペプチドは赤色で影を付け、そして該平均値よりも低いものは緑色で影を付ける。図３のｓｒｃバイオマーカーをコードする個々のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、順に表５中に例示する。
【図４】図４は、クロスバリデーション試験およびランダム並び替え試験における４個のｓｒｃキナーゼインヒビター、ＢＭＳ−Ａ、ＢＭＳ−Ｂ、ＢＭＳ−Ｃ、およびＢＭＳ−Ｄについての予測の誤り率（error rates）を示す図面である。本明細書中に記載する通り、ジーンクラスター・ソフトウェアを用いて、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを選択し、そして「加重投票（１つ除外（leave one out））クロスバリデーション・アルゴリズム」を用いて分類を予測した。異なる数のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、大腸セルライン中でのＢＭＳ−Ａ、ＢＭＳ−Ｂ、ＢＭＳ−ＣおよびＢＭＳ−Ｄに対する耐性および感受性のクラスを予測するためのプレディクターセットにおいて使用した。該真の（real）誤り率を、大腸セルラインについての分類をランダムに割り当てた２０個のケースにおいて同数のポリヌクレオチドおよびポリペプチドをプレディクターセットとして用いた真の誤り率と比較した。例えば、各プレディクターセットが２０個のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む場合には、ＢＭＳ−ＡまたはＢＭＳ−Ｄについての予測の真の誤り率は１５．７％であり；ＢＭＳ−ＢおよびＢＭＳ−Ｃについては、該誤り率はそれぞれ１９％および１６．２％であった。これらの誤り率の値は、ランダムな表現型分類を該セルラインについて使用する場合に得る真の誤り率よりも有意に低い（すなわち、３０％〜７０％の範囲）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年9月9日(2004.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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