(57)【要約】  ヌクレオチド配列データ調査技法の高められた使用が、原核細胞において組換えタンパク質を生成する効果的方法についての要求を拡大して来た。組換え宿主を生成する前、インビトロでの発現カセットからの翻訳を改良することによって、組換えアミノ酸配列の合成を増強するための手段が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の核酸配列：
A-B-C-D-E
[上記配列中、Aは、開始コドンであり；
Bは、13個の核酸のポリヌクレオチド配列であり、ここで前記ポリヌクレオチド配列は配列番号２に対する相同性を有し、前記13個の核酸の少なくとも５個は配列番号２におけるその対応する位置と同一であり、そして前記核酸配列は停止コドンをコードせず；
Cは、下記から成る群から選択されたポリヌクレオチド配列であり；
ａ）配列番号３の最初の10個の核酸を有するポリヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号３の最初の13個の核酸を有するポリヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号３の最初の16個の核酸を有するポリヌクレオチド配列；及び
ｄ）配列番号３の最初の19個の核酸を有するポリヌクレオチド配列；
Dは、配列番号４に示されるようなポリヌクレオチド配列であり；そして
Eは、下記から成る群から選択されたポリヌクレオチド配列であり：
ａ）配列番号５；
ｂ）配列番号６；
ｃ）配列番号７；
ｄ）配列番号８；
ｅ）配列番号９；
ｆ）配列番号10；
ｇ）配列番号11；
ｈ）配列番号12；及び
ｉ）配列番号13、
ここで少なくとも50％のヌクレオチドは、アデニン又はチミンのいずれかであり；そしてEのみが停止コドンをコードする］
を含んで成る精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
興味ある遺伝子に作用可能に連結される請求項１記載の単離された核酸分子を含んで成る発現カセット。
【請求項３】
転写プロモーター、請求項２記載の発現カセット、及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターが前記発現カセットにより作用可能に連結され、そして前記発現カセットが前記転写ターミネーターにより作用可能に連結される発現ベクター。
【請求項４】
複数の発現カセットを含んで成る請求項３記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記興味ある遺伝子が親和性標識をコードする請求項３記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項３記載の発現ベクターを含んで成る、細菌細胞である組換え宿主細胞。
【請求項７】
前記細菌細胞が、
ａ）E．コリ（E．coli）；
ｂ）バチルス（Bacillus）；及び
ｃ）ストレプトミセス（Streptomyces）
から成る群から選択される請求項６記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
前記細菌細胞がE．コリ（E．coli）である請求項７記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
興味ある遺伝子によりコードされるタンパク質を生成するためへの請求項３記載の発現ベクターの使用方法であって、前記発現ベクターを含んで成り、そして前記タンパク質を生成する組換え宿主細胞を培養することを含んで成る方法。
【請求項１０】
請求項１記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント。
【請求項１２】
生物学的サンプルにおける発現カップラー（EC）遺伝子発現の存在の検出方法であって、
（ａ）EC核酸プローブと、（ｉ）前記生物学的サンプルから単離された試験RNA分子、又は（ii）前記単離されたRNA分子から合成された核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイジング条件下で接触せしめ、ここで前記プローブは請求項１記載の核酸分子、又はその補体のヌクレオチド配列の一部を含んで成るヌクレオチド配列から成り；そして
（ｂ）前記核酸プローブ及び前記試験RNA分子又は合成された核酸分子のいずれかのハイブリッドの形成を検出し；ここで前記ハイブリッドの存在が前記生物学的サンプルにおけるEC RNAの存在を示し；又は
（a’）前記生物学的サンプルと、請求項11記載の抗体又は抗体フラグメントとを接触せしめ、ここで前記接触が前記生物学的サンプルへの前記抗体又は抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行なわれ；そして
（b’）前記結合された抗体又は結合された抗体フラグメントのいずれかを検出することを含んで成る方法。
【請求項１３】
興味あるアミノ酸配列の発現のための適切な核酸構造体の生成方法であって、発現ベクターのシャイン−ダルガルノ配列と、前記興味あるアミノ酸配列コードするヌクレオチド配列との間に、請求項１記載のポリヌクレオチドを挿入することを含んで成る方法。
【請求項１４】
前記核酸構造体が、前記ポリヌクレオチド及び前記興味あるアミノ酸配列の複数のコピーを含んで成る請求項13記載の方法。
【請求項１５】
次の核酸配列：
A-B-C-D-E
[上記配列中、Aは、開始コドンであり；
Bは、13個の核酸のポリヌクレオチド配列であり、ここで前記ポリヌクレオチド配列は配列番号２に対する相同性を有し、前記13個の核酸の少なくとも５個は配列番号２におけるその対応する位置と同一であり、そして前記核酸配列は停止コドンをコードせず；
Cは、下記から成る群から選択された核酸であり；
ａ）アデニン；
ｂ）チミン；
ｃ）シトシン；及び
ｄ）グアニン；
Dは、配列番号４に示されるようなポリヌクレオチド配列であり；そして
Eは、下記から成る群から選択されたポリヌクレオチド配列であり：
ａ）配列番号５；
ｂ）配列番号６；
ｃ）配列番号７；
ｄ）配列番号８；
ｅ）配列番号９；
ｆ）配列番号10；
ｇ）配列番号11；
ｈ）配列番号12；及び
ｉ）配列番号13、
ここで少なくとも50％のヌクレオチドは、アデニン又はチミンのいずれかであり；そしてEのみが停止コドンをコードする］
を含んで成る精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
Cがアデニンである請求項15記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１に示されるような核酸配列を有する請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号18に示されるような核酸配列を有する請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号19に示されるような核酸配列を有する請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
次の核酸配列：
A-B-C-D-E
[上記配列中、Aは、開始コドンであり；
Bは、13個の核酸のポリヌクレオチド配列であり、ここで前記ポリヌクレオチド配列は配列番号２に対する相同性を有し、前記13個の核酸の少なくとも５個は配列番号２におけるその対応する位置と同一であり、そして前記核酸配列は停止コドンをコードせず；
Cは、配列番号20の核酸配列を有するポリヌクレオチドであり；
Dは、配列番号４に示されるようなポリヌクレオチド配列であり；そして
Eは、下記から成る群から選択されたポリヌクレオチド配列であり：
ａ）配列番号５；
ｂ）配列番号６；
ｃ）配列番号７；
ｄ）配列番号８；
ｅ）配列番号９；
ｆ）配列番号10；
ｇ）配列番号11；
ｈ）配列番号12；及び
ｉ）配列番号13、
ここで少なくとも50％のヌクレオチドは、アデノシン又はチミンのいずれかであり；そしてEのみが停止コドンをコードする］
を含んで成る精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
次の核酸配列：
A-B-D-E
[上記配列中、Aは、開始コドンであり；
Bは、13個の核酸のポリヌクレオチド配列であり、ここで前記ポリヌクレオチド配列は配列番号２に対する相同性を有し、前記13個の核酸の少なくとも５個は配列番号２におけるその対応する位置と同一であり、そして前記核酸配列は停止コドンをコードせず；
Dは、配列番号４に示されるようなポリヌクレオチド配列であり；そして
Eは、下記から成る群から選択されたポリヌクレオチド配列であり：
ａ）配列番号５；
ｂ）配列番号６；
ｃ）配列番号７；
ｄ）配列番号８；
ｅ）配列番号９；
ｆ）配列番号10；
ｇ）配列番号11；
ｈ）配列番号12；及び
ｉ）配列番号13、
ここで少なくとも50％のヌクレオチドは、アデノシン又はチミンのいずれかであり；そしてEのみが停止コドンをコードする］
を含んで成る精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
ａ）配列番号21に示されるようなポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号22に示されるようなポリヌクレオチド；及び
ｃ）配列番号23に示されるようなポリヌクレオチド
から成る群から選択された、精製されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒト及び他のゲノムからの遺伝子の高められた利用性及び同定は、組換えタンパク質の効果的発現のための高められた必要性を導いて来た。細菌におけるタンパク質の発現は、クローン化された遺伝子の生成のための最も広く使用されるアプローチである。多くの理由のために、細菌における発現は、真核細胞における発現より好ましい。例えば、細菌は、真核細胞よりもより容易に増殖する。より特定には、多数の洗練された分子遺伝子学的用具及び多くの変異体の利用性は、発現宿主としてE．コリを、タンパク質生成のために非常に有用なものにする。しかしながら、E．コリにおける機能的タンパク質の高レベルの生成、特に真核細胞源からのそれらのタンパク質の生成は、しばしば困難であった。効率の悪い翻訳開始が、良好でない発現の最も共通する理由である（Schoner, B.E.,など., Methods Enzymol. 185: 94-103, 1990）。
【０００２】
翻訳開始は、リボソーム結合部位（RBS）のポリヌクレオチド配列、開始コドンからのその距離、及び開始コドンのすぐ上流の配列に依存する（Shine J. and Dalgrno L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71 (4) 1342-6, 1994; 及びThomas D. Y., など., Gene 19 (2): 211-9, 1982）。しかしながら、良好でない開始が、発現ベクターが高く発現されたタンパク質からの良好なRBSを含む事実にかかわらず存在する。適切に間隔を開けられた開始コドンと共に強いRBSの存在は、いずれの特定の遺伝子の効果的翻訳も確保しない。
【０００３】
組換え遺伝子が発現ベクターに移動するにつれて、連続的に変化する１つの変数は、開始コドンに続くヌクレオチド配列である。実際、コード配列のこの部分は翻訳に強く影響を及ぼす。翻訳の開始に対するコード配列の開始のこの影響についての最も許容できる説明は、RBS及び翻訳された配列の5’末端の周囲の二次ポリヌクレオチド構造体の不在又は存在を包含する（de Smit M. H., and Van Duin J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (19); 7668-72, 1990）。
【０００４】
最近、T7ファージ遺伝子0.3における開始コドンのすぐ下流に位置する下流ボックス（DB）ポリヌクレオチド配列が、クローン化された遺伝子の上流に配置される場合、発現の著しい刺激を引き起こし、そしてこの効果がたぶん、翻訳効率の刺激のためであることが報告されている（Sprengart, M. L., など., EMBO J. 15 (3): 665-74, 1996; 及びEtchegaray, J. P. and Inouye M., J. Biol. Chem. 274 (15); 10079-85, 1999）。これは、他の高く発現された遺伝子、例えばリボソームタンパク質、延長因子及びすべてのtRNAシンセターゼにまた見出されたDBコンセンサス配列（配列番号４）の同定を導き（Ito, k., など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1); 302-6, 1993）、これは、E．コリが遺伝子発現を調節するために、このコンセンサス配列を使用することを示唆する。
【０００５】
すべての同定されたDB要素は、E．コリの16S rRNAのヌクレオチド1467−1481（配列番号５）に対する部分的相補性を示す。突然変異誘発分析は、16S rRNAのこの領域に対する相補性のレベルの上昇が高められた発現を誘導したことを示唆した。この観察に基づけば、DB配列が、16S rRNAのヌクレオチド1467−1481に対する塩基対合によりリボソームとmRNAとの相互作用を増強し、そして安定化することが結論づけられた（Ito, 前記）。
【０００６】
２−シストロン発現システムが、翻訳開始問題を解決するために開発され、そしていくらかの成功に達している（Schoner, B. E., など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (22): 8506-10, 1986）。このシステムは、小さな十分に翻訳されたカップラー遺伝子、続いて停止コドン及び、次に、再開始工程により翻訳される興味ある遺伝子を含む。この２−シストロンアプローチは、RBSがそれらのmRNAの5’末端での阻害性二次構造体のために非常に不良であるプラスミドにおける標的遺伝子の発現を非常に改良することができる。しかしながら、それは、弱いRBS配列の効率を改良することはできない（Makoff, A. J., and Smallwood, A. E., Nucleic Acids Res. 18 (7): 1711-8, 1990）。
【０００７】
細菌宿主における組換えタンパク質の発現におけるそれらの利点にもかかわらず、高レベルの翻訳開始、及びタンパク質生成のためのより高い収率のための改良された方法についての必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、組換え宿主細胞によるペプチド、ポリペプチド及びタンパク質の改良された生成方法を提供する。本発明の１つの観点によれば、新規核酸配列、及び興味ある遺伝子は、相同組み合えにより、発現ベクター中に導入される。次に、新規核酸配列及び興味ある遺伝子を含む組換え発現ベクターが、原核宿主中に導入され、そして前記興味ある遺伝子によりコードされるタンパク質が生成される。タンパク質の生成レベルはは、新規核酸分子を伴なわない生成に比較して、増強される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．概観：
本明細書に記載されるように、本発明は、新規発現カップラーを組み込む、新規２−シストロン発現カセットにおけるリボソーム結合部位を改良することによってタンパク質生成を高めるための方法を提供する。前記発現カップラーは、希コドン及び可能性ある二次構造を欠いている。新規２−シストロン発現カセット配列は、E．コリにおける不良に発現された異種遺伝子の収率を高めることができる。さらに、本明細書においてECと呼ばれる新規発現カップラーは、細菌における異種タンパク質発現を最適化するためのユニークアプローチを提供する。
本発明のそれらの及び他の観点は、次の詳細な記載から明らかに成るであろう。さらに、種々の引例が下記において同定され、そして引用により組込まれる。
【００１０】
２．定義
次の記載においては、多くの用語が広範囲に使用される。次の定義は、本発明の理解を促進するために提供される。
本明細書において使用される場合、“核酸”又は“核酸分子”とは、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（DNA）又はリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）により生成されるフラグメント、及び連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成されるフラグメントを言及する。
【００１１】
核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（例えばDNA及びRNA）、又は天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば天然に存在するヌクレオチドのα−鏡像異性体形）、又は両者の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾されたヌクレオチドは、糖成分において、及び/又はピリミジン又はプリン塩基成分において変更を有することができる。糖修飾は、ハロゲン、アルキル基、アミン及びアジド基による１又は複数のヒドロキシル基の置換を包含し、又は糖はエーテル又はエステルとして機能され得る。さらに、全糖成分は、立体的に及び電子的に類似する構造体、例えばアザ−糖及びカルボン酸糖類似体により置換さえ得る。
【００１２】
塩基成分における修飾の例は、アルキル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン又はピリミジン、又は他の良く知られている複素環式置換基を包含する。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はそのような結合の類似体により結合さえ得る。ホスホジエステル結合の類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート、及び同様のものを包含する。用語“核酸分子”とはまた、いわゆる、ポリアミド主鎖に結合される天然に存在するか又は修飾された核酸塩基を含んで成る“ペプチド核酸”も包含する。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。
【００１３】
用語“核酸分子の相補体”とは、相補的ヌクレオチド配列、及び対照ヌクレオチド配列に比較して逆の配向を有する核酸分子である。例えば、配列5’ ATGCACGGG 3’ は、5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。
用語“contig ”とは、他の核酸分子に対する一連の連続した同一の又は相補的な配列を有する核酸分子を示す。連続した配列とは、核酸分子の全体において、又はその一部に沿って、一定の長さの核酸分子を“オーバーラップ”すると言われる。
用語“構造遺伝子”とは、特定のポリペプチドの特徴のアミノ酸の配列に翻訳されるメッセンジャーRNA（mRNC）に転写される核酸分子を言及する。“興味ある遺伝子”とは、構造遺伝子であり得る。
【００１４】
“相補的DNA（cDNA）”とは、逆転写酵素によりmRNA鋳型から形成される一本鎖DNA分子である。典型的には、mRNAの一部に対して相補的なプライマーは、逆転写の開始のために使用される。当業者はまた、そのような一本鎖DNA分子及びその相補的DNA鎖から成る二本鎖DNA分子を言及するために用語“cDNA”を用いる。用語“cDNA”はまた、RNA鋳型から生成されたcDNA分子のクローンも言及する。
【００１５】
“単離された核酸分子”とは、生物のゲノムDNAに組み込まれない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された成長因子をコードするDNA分子が、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子のもう１つの例は、生物のゲノムに組み込まれない、化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種からの染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
“核酸分子構造体”とは、天然においては存在しない配置で組み合わされ、そして並置された核酸のセグメントを含むようヒト介在を通して修飾された−本鎖又は二本鎖の核酸分子である。
【００１６】
“線状DNA”とは、遊離5’及び3’及び末端を有する非環状DNA分子を示す。線状DNAは、閉環DNA分子、例えばプラスミドから、酵素消化又は物理的な破壊により調製され得る。
“指向的連結”（derectioanl ligation）とは、固定された配向で配置されるモノマーを含んで成る核酸ポリマーを生成する方法に関する。例えば、指向的連結は、ヘッド−ツー−テイル配向でのモノマーのタンデム反復体を含んで成るポリマーを生成するために使用され得る。
【００１７】
“プロモーター”とは、構造遺伝子の転写を方向づけるヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に最も近い、遺伝子の5’非コードに領域位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴づけられる。それらのプロモーターは、例えばIPTG−誘発性プロモーター、バクテリオファージT7プロモーター及びバクテリオファージλPLを包含するが、但しそれらだけには限定されない。Sambrookなど., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001を参照のこと。
【００１８】
典型的なプロモーターは、−35及び−10でのコンセンサス配列、及びそれらの間の16〜19個のヌクレオチドの配列から成る３種の成分を有するであろう（Lisset, S. and Margalit, H., Nucleic Acids Res. 21: 1512, 1993）。この種類のプロモーターは、lac, trp, trp-lac (tac) 及びtrp-lac (trc) プロモーターを包含する。プロモーターが誘発プロモーターである場合、転写の速度は誘発剤に応答して上昇する。対照的に、転写の速度は、プロモーターが構成プロモーターである場合、誘発剤により調節されない。抑制できるプロモーターはまた知られている。
【００１９】
“コアプロモーター”は、転写の開始を包含するプロモーター機能のための必須ヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を増強し又は組織特異的活性を付与することができる特定の配列の不在下で検出できる活性を有しても又は有さなくても良い。
“調節要素”は、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節要素は、特定の細胞、組織又はオルガネラにおいて独占的に又は選択的に転写を可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含むことができる。それらのタイプの調節要素は通常、“細胞−特異的”、“組織−特異的”、又は“オルガネラ−特異的”態様で発現される遺伝子に結合されている。
“エンハンサー”は、転写の開始部位に対してエンハンサーの距離又は配向に関係なく、転写の効率を高めることができるタイプの調節要素である。
【００２０】
“異種DNA”とは、所定の宿主細胞内に天然において存在しない、DNA分子又はDNA分子の集団を言及する。特定宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA（すなわち、外来性DNA）と組み合わされる限り、宿主細胞種（すなわち、内因性DNA）に由来するDNAを含むことができる。例えば、転写プロモーターを含んで成る宿主DNAセグメントに作用可能に連結されるポリペプチドをコードする非宿主DNAセグメントを含むDNA分子は、異種DNA分子であると思われる。逆に言えば、異種DNA分子は、外来プロモーターと作用可能に連結される内因性遺伝子を含むことができる。もう１つの例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含んで成るDNA分子は、そのDNA分子が野生型遺伝子を欠いている突然変異細胞中に導入される場合、異種DNAであると思われる。
【００２１】
“ポリペプチド”とは、天然又は合成的に生成されても、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約10個よりも少ないアミノ酸残基のポリペプチドは通常、“ペプチド”として言及される。
“タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【００２２】
非宿主DNA分子によりコードされるペプチド又はポリペプチドは“異種”ペプチド又はポリペプチドである。
“組み込まれた遺伝子要素”とは、その要素がヒト操作を通して細胞中に導入された後、宿主細胞の染色体中に組み込まれているDNAのセグメントである。本発明においては、組み込まれた遺伝子要素は通常、エレクトロポレーション又は他の技法により細胞中に導入される線状化されたプラスミドに由来する。組み込まれた遺伝子要素は、元の宿主細胞からその子孫に通過される。
【００２３】
“クローニングベクター”は、宿主細胞において自律的に複製する能力を有する、核酸分子、例えばプラスミド、コスミド、又はバクテリオファージである。クローニングベクターは典型的には、ベクターの必須の生物学的機能を失わないで、決定できる態様で核酸分子の挿入を可能にする１又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、及びクローニングベクターにより形質転換された細胞の同定及び選択への使用のために適切であるマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は典型的には、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含む。
【００２４】
“発現ベクター”は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子及び転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に配置され、そしてそのような遺伝子はプロモーターに“作用可能に結合される”と言われる。同様に、調節要素及びコアプロモーターは、調節要素がコアプロモーターの活性を調節する場合、作用可能に連結される。
【００２５】
本明細書において使用される場合、用語“複数”又は“マルチマー”とは、興味ある遺伝子の複数のコピー、例えば２〜50のコピー、２〜30のコピー、２〜20のコピー、２〜15のコピー又は２〜10のコピーを言及する。さらなる典型的な範囲は、２〜20のコピー、３〜15のコピー又は３〜10のコピーを包含する。便利には、構造体は、３又はそれ以上のコピー（例えば、３〜７、又は５〜７）を含んで成ることができる。７又はそれ以上、例えば７〜30のコピー、７〜20のコピー、又は７〜15のコピーの範囲がまた有用である。
【００２６】
“ポリシストロニック転写単位”とは、１よりも多くの遺伝子が同じプロモーターの制御下にある核酸構造体を言及する。
“組換え宿主”とは、異種核酸分子、例えばクローニングベクター又は発現ベクターを含む細胞である。
“インテグレイティブ組換え体”は、異種DNAが細胞ゲノムDNA中に組み込まれるようになる組換え宿主細胞である。
用語“発現”とは、遺伝子生成物の生合成を言及する。例えば、構造遺伝子においては、発現はmRNAへの構造遺伝子の転写及び１又は複数のポリペプチドへのmRNAの翻訳を包含する。
【００２７】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向づけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００２８】
“単離されたポリペプチド”は、汚染性細胞成分、例えば炭水化物、脂質又は天然においてポリペプチドに関連している他のタンパク質性不純物を実質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高く精製された形で、すなわち少なくとも約80％の純度、少なくとも約90％の純度、少なくとも約95％の純度、95％以上の純度、又は99％以上の純度でポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示すための1つの手段は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルのクーマシーブルー染色によるシングルバンドの出現によるものである。しかしながら、用語“単離された”とは、他の物理形、例えばダイマー又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００２９】
用語“アミノ−末端” 及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対照配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
【００３０】
本明細書において使用される場合、用語“イムノモジュレータ−”とは、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンフォトキシン、同時−刺激分子、造血因子及びそれらの分子の合成類似体を包含する。イムノモジュレータ−の例は、腫瘍壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロン、幹細胞成長因子、エリトロポイエチン及びトロンボポイエチンを包含する。
“抗−イディオタイプ抗体”とは、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。
【００３１】
“抗体フラグメント”は、抗体の一部、例えばF(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Aab及び同様のものである。構造に関係なく、抗体フラグメントは、損なわれていない抗体により認識される同じ抗原と結合する。
用語“抗体フラグメント”はまた、特定の抗原に結合する、合成の又は遺伝的に構築されたポリペプチド、例えばL鎖可変領域から成るポリペプチド、H及びL鎖の可変領域から成る“Fv”フラグメント、L及びH鎖可変領域がペプチドリンガーにより連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（“svFvタンパク質”）、及び超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最少認識単位を包含する。
【００３２】
“キメラ抗体”は、囓歯動物抗体に由来する種々のドメイン及び相補的決定領域を含む組換えタンパク質であるが、ところが抗体分子の残りはヒト抗体に由来する。
“融合タンパク質”は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子により発現されるハイブリッドタンパク質である。
【００３３】
本明細書において使用される場合、用語“抗体融合タンパク質”は、抗体成分及び治療剤を含んで成る組換え分子を言及する。そのような融合タンパク質のために適切な治療剤の例は、イムノモジュレーター（“抗体−イムノモジュレーター融合タンパク質”）及び毒素（“抗体−毒素融合タンパク質”）を包含する。例示的な毒素成分は、プソイドモナス  外毒素成分、ジフテリア毒素成分、RNアーゼ成分、DAアーゼ成分、ゲロニン成分及びスタフィロコーカスエンテロトキシン−A成分を包含する。
【００３４】
“親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第2ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。
【００３５】
親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など.,  EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など.,  Methods  Enzymol. 198: 3, 1991), グルタチオンＳ  トランスフェラーゼ（Smits and Johnson, Gene 67; 31, 1988）, Glu-Glu親和性標識 （Grussenmeyerなど.,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985）, 物質Ｐ、すなわちFlagTM ペプチド（Hoppなど.,  Biotechnology 6: 1204-1210, 1988）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Protein  Expression  and  Purification 2:95-107, 1991を参照のこと。親和性標識をコードするDNAは、商品供給者（例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Eastman Kodak, New Heven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA）から入手できる。
【００３６】
“抗原性ペプチド”は、T細胞により認識されるMHC−ペプチド複合体を形成するために、主要組織適合複合体分子を結合し、それにより、T細胞への提供に基づいて細胞毒性リンパ球応答を誘発するペプチドである。従って、抗原性ペプチドは、適切な主要組織適合性複合体分子に結合し、そして細胞毒性T細胞応答、例えば抗原を結合するか又は発現する標的細胞に対する細胞溶解又は特異的サイトカイン開放を誘発することができる。抗原性ペプチドは、抗原提供細胞又は標的細胞上に、クラスI又はクラスII主要組織適合性複合体分子に関して結合され得る。
【００３７】
標準分析法の不正確さのために、ポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解される。そのような値が“約”X又は“およそ”Xとして表される場合、Xの言及された値は、±10％で正確であると理解されるであろう。
【００３８】
３．発現カップラー及び興味ある遺伝子を含む核酸分子の生成：
本発明は、増強されたタンパク質生成のために有用である新規核酸構造体を提供する。本発明の１つの観点は、タンパク質の改良された翻訳をもたらす発現ベクターにおける興味ある遺伝子の上流に遺伝子的に挿入され得る、発現カップラー（EC）と呼ばれる新規核酸を提供する。ECの挿入は、核酸構造体を、少なくとも２つのシストロンを有するRNA分子に転換する。
【００３９】
１つの観点においては、本発明は、次の式：
A-B-C-D-E
[上記配列中、Aは、開始コドンであり；
Bは、13個の核酸のポリヌクレオチド配列であり、ここで前記ポリヌクレオチド配列は配列番号２に対する相同性を有し、前記13個の核酸の少なくとも５個は配列番号２におけるその対応する位置と同一であり、そして前記核酸配列は停止コドンをコードせず；
Cは、下記から成る群から選択されたポリヌクレオチド配列であり；ａ）配列番号３の最初の10個の核酸を有するポリヌクレオチド配列；ｂ）配列番号３の最初の13個の核酸を有するポリヌクレオチド配列；ｃ）配列番号３の最初の16個の核酸を有するポリヌクレオチド配列；及びｄ）配列番号３の最初の19個の核酸を有するポリヌクレオチド配列；
【００４０】
Dは、配列番号４に示されるようなポリヌクレオチド配列であり；そしてEは、下記から成る群から選択されたポリヌクレオチド配列であり：ａ）配列番号５；ｂ）配列番号６；ｃ）配列番号７；ｄ）配列番号８；ｅ）配列番号９；ｆ）配列番号10；ｇ）配列番号11；ｈ）配列番号12；及びｉ）配列番号13、ここで少なくとも50％のヌクレオチドは、アデニン又はチミンのいずれかであり；そして
Eのみが停止コドンをコードする］
により記載されるようなECのポリヌクレオチド配列を提供する。１つの態様においては、本発明は、興味ある遺伝子に作用可能に連結される、上記ECの単離された核酸分子を含んで成る発現カセットを提供する。
【００４１】
もう1つの観点においては、転写プロモーター、発現カセット、及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターが前記発現カセットにより作用可能に連結され、そして前記発現カセットが前記転写ターミネーターにより作用可能に連結される発現ベクターが提供される。１つの態様においては、発現ベクターは、複数の発現カセットを含んで成る。もう1つの態様においては、興味ある遺伝子は親和性標識をコードする。もう１つの態様においては、発現ベクターを含んで成る、細菌細胞である組換え宿主細胞が提供される。もう１つの態様においては、細菌細胞は、E．コリ、バチルス及びストレプトミセスから成る群から選択される。さらにもう1つの態様においては、細菌細胞はE．コリである。
【００４２】
もう１つの観点においては、本発明は、発現ベクターを含んで成り、そして前記タンパク質を生成する組換え宿主細胞を培養することを含んで成る、興味ある遺伝子によりコードされるタンパク質を生成するためへの発現ベクターの使用方法を提供する。１つの態様においては、ECポリヌクレオチドによりコードされるECポリペプチドが提供される。
もう1つの観点においては、本発明は、ECポリペプチドと特異的に結合する、抗体又は抗体フラグメントを提供する。
【００４３】
もう１つの観点においては、（ａ）EC核酸プローブと、（ｉ）前記生物学的サンプルから単離された試験RNA分子、又は（ii）前記単離されたRNA分子から合成された核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイジング条件下で接触せしめ、ここで前記プローブはEC核酸分子、又はその相補体のヌクレオチド配列の一部を含んで成るヌクレオチド配列から成り；そして
【００４４】
（ｂ）前記核酸プローブと前記試験RNA分子又は合成された核酸分子のいずれかとのハイブリッドの形成を検出し；ここで前記ハイブリッドの存在が前記生物学的サンプルにおけるEC RNAの存在を示し；又は（a’）前記生物学的サンプルと、抗体又は抗体フラグメントとを接触せしめ、ここで前記接触が前記生物学的サンプルへの前記抗体又は抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行なわれ；そして（b’）前記結合された抗体又は結合された抗体フラグメントのいずれかを検出することを含んで成る、生物学的サンプルにおける発現カップラー（EC）遺伝子発現の存在の検出方法が提供される。
【００４５】
もう１つの観点においては、発現ベクターのシャイン−ダルガルノ配列と、興味あるアミノ酸配列コードするヌクレオチド配列との間に、ECポリヌクレオチドを挿入することを含んで成る、興味あるアミノ酸配列の発現のための適切な核酸構造体の生成方法が提供される。１つの態様においては、核酸構造体は、前記ポリヌクレオチド及び興味あるアミノ酸配列の複数コピーを含んで成る。
【００４６】
もう1つの観点においては、本発明は、次の核酸配列：
A-B-C-D-E
[上記配列中、Aは、開始コドンであり；
Bは、13個の核酸のポリヌクレオチド配列であり、ここで前記ポリヌクレオチド配列は配列番号２に対する相同性を有し、前記13個の核酸の少なくとも５個は配列番号２におけるその対応する位置と同一であり、そして前記核酸配列は停止コドンをコードせず；
Cは、下記から成る群から選択された核酸であり；ａ）アデニン；ｂ）チミン；ｃ）シトシン；及びｄ）グアニン；
Dは、配列番号４に示されるようなポリヌクレオチド配列であり；そして
【００４７】
Eは、下記から成る群から選択されたポリヌクレオチド配列であり：ａ）配列番号５；ｂ）配列番号６；ｃ）配列番号７；ｄ）配列番号８；ｅ）配列番号９；ｆ）配列番号10；ｇ）配列番号11；ｈ）配列番号12；及びｉ）配列番号13、ここで少なくとも50％のヌクレオチドは、アデニン又はチミンのいずれかであり；そしてEのみが停止コドンをコードする］
を含んで成る精製されたポリヌクレオチドを提供する。１つの態様においては、Cはアデニンである。
【００４８】
もう１つの観点においては、本発明は、次の核酸配列：
A-B-C-D-E
[上記配列中、Aは、開始コドンであり；
Bは、13個の核酸のポリヌクレオチド配列であり、ここで前記ポリヌクレオチド配列は配列番号２に対する相同性を有し、前記13個の核酸の少なくとも５個は配列番号２におけるその対応する位置と同一であり、そして前記核酸配列は停止コドンをコードせず；
Cは、配列番号20の核酸配列を有するポリヌクレオチドであり；
Dは、配列番号４に示されるようなポリヌクレオチド配列であり；そして
【００４９】
Eは、下記から成る群から選択されたポリヌクレオチド配列であり：ａ）配列番号５；ｂ）配列番号６；ｃ）配列番号７；ｄ）配列番号８；ｅ）配列番号９；ｆ）配列番号10；ｇ）配列番号11；ｈ）配列番号12；及びｉ）配列番号13、ここで少なくとも50％のヌクレオチドは、アデノシン又はチミンのいずれかであり；そしてEのみが停止コドンをコードする］
を含んで成る精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００５０】
もう１つの観点においては、本発明は、次の核酸配列：
A-B-D-E
[上記配列中、Aは、開始コドンであり；
Bは、13個の核酸のポリヌクレオチド配列であり、ここで前記ポリヌクレオチド配列は配列番号２に対する相同性を有し、前記13個の核酸の少なくとも５個は配列番号２におけるその対応する位置と同一であり、そして前記核酸配列は停止コドンをコードせず；
Dは、配列番号４に示されるようなポリヌクレオチド配列であり；そして
【００５１】
Eは、下記から成る群から選択されたポリヌクレオチド配列であり：ａ）配列番号５；ｂ）配列番号６；ｃ）配列番号７；ｄ）配列番号８；ｅ）配列番号９；ｆ）配列番号10；ｇ）配列番号11；ｈ）配列番号12；及びｉ）配列番号13、ここで少なくとも50％のヌクレオチドは、アデノシン又はチミンのいずれかであり；そしてEのみが停止コドンをコードする］を含んで成る精製されたポリヌクレオチドを提供する。
ECの核酸分子により包含される配列の例示的な例は、配列番号1, 18, 19, 21, 22及び23に示される。
【００５２】
A．発現カセットの企画：
本発明のために、発現カセットは、発現カップラー及び興味ある遺伝子を含んで成る。興味ある遺伝子は、いずれかの所望するアミノ酸配列をコードすることができる。典型的なアミノ酸配列は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び融合タンパク質を包含する。ポリペプチドは、約10〜約20個のアミノ酸、約20〜約40個のアミノ酸、約40〜約100個のアミノ酸、又は100個よりも多くのアミノ酸から成る。
【００５３】
例示的なタンパク質は、抗体及び抗体フラグメント、受容体、ホルモン及び可能性ある産業又は治療価値を有する他のタンパク質を包含する。例えば、発現カセットは、医薬的活性分子、例えば第VIIa因子、プロインスリン、インスリン、卵胞刺激ホルモン、組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子、インターロイキン（例えば、インターロイキン−（IL−1，IL−2，IL−3，IL−4，IL−5，IL−6，IL−7，IL−8，IL−9，IL−10，IL−11，IL−12，IL−13，IL−14，IL−15，IL−16及びIL−17）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球−コロニー刺激因子（G−CSF）及び顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（GM−CSF））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、−ω、−δ、−τ及び−ε）、幹細胞増殖因子、エリトロポエチン及びトロンボポエチンをコードする核酸分子を包含することができる。興味あるタンパク質の追加の例は、抗体、抗体フラグメント、抗イディオタイプ抗体（又はそのフラグメント）、キメラ抗体、ヒト型化抗体、抗体融合タンパク質、及び同様のものを包含する。
【００５４】
興味あるタンパク質は、そのタンパク質が宿主細胞内に保持されるか又は分泌されるよう生成され得る。タンパク質が分泌されないことが所望される場合、発現カセットは、プロモーター、ECヌクレオチド配列及び興味ある遺伝子から構成され得る。次に、発現カセットは、通常通りに組換え宿主中に導入される。他方では、所望するタンパク質を分泌する組換え宿主細胞が生成され得る。従って、本発明は、プロモーター、ECヌクレオチド配列、分泌シグナル配列（また、“シグナルペプチド”、“リーダー配列”、“プレプロ配列”、又は“プレ配列”としても知られている）をコードするヌクレオチド配列、及び興味ある遺伝子を含んで成る発現カセットを企画する。
【００５５】
分泌シグナル配列は、興味ある遺伝子に作用可能に連結され、その結果、２種の配列は、正しい読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中に興味ある新しい合成されたタンパク質を向けるよう配置される。分泌シグナル配列は、ある分泌シグナル配列が興味あるヌクレオチド配列における他の場所に位置することができるが、興味あるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の5’側に通常位置する（例えば、Welchなど., アメリカ特許第5,037,743号； Holland など., アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。
【００５６】
発現カセットはまた、所望するタンパク質の精製を助けるためにペプチド標識をコードするヌクレオチド配列を含んで成ることができる。組換えポリペプチドを単離するために有用であるペプチド標識は、例えばポリヒスチジン標識（ニッケル−キレート化樹脂に対する親和性を有する）、c-myc標識、カルモジュリン結合タンパク質（カルモジュリン親和性クロマトグラフィーにより単離される）、物質P, RYIRS 標識（抗−RYIRS抗体と結合する）、Gln−Gln標識及びFLAG標識（抗−FLG抗体と結合する）を包含する。例えば、Luoなど., Srch. Biochem. Biophys. 329: 215 (1996), Morganti など., Biotechnol. Appl. Biochem. 23: 67 (1996), 及びZhengなど., Gene 186: 55 (1997) を参照のこと。そのようなペプチド標識をコードする核酸分子は、例えばSigma−Aldrich Corporation (St. Louis, MO) から入手できる。
【００５７】
B．発現カセットを含んで成るベクターの企画：
原核細胞における所望するタンパク質の生成のために適切である発現ベクターは、典型的には、（１）細菌宿主における発現ベクターの増殖及び選択を提供するために細菌複製起点及び抗生物質耐性マーカーをコードする原核DNA要素；（２）転写の開始を制御するDNA要素、例えばプロモーター；（３）転写のプロセッシング、例えば転写終結を抑制するDNA要素；及び（４）原核細胞のための選択マーカー遺伝子を含んで成る。上記で論じられたように、発現ベクターはまた、宿主細胞の分泌経路中に異種ポリペプチドを向ける分泌配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【００５８】
さらに、本明細書に記載される方法への使用のために適切な発現ベクターは、少なくとも１つのEC及び興味ある１つの遺伝子を有する発現カセットを含むであろう。同様に、カセットは、１つよりも多くの興味ある遺伝子に連結される１つのECを含むことができる。また、同じか又は異なった興味ある遺伝子を含む複数のカセットは、発現ベクター中に組込まれ得る。例えば、本発明の１つの態様においては、１つのECが、ベクターのシャイン−デルガルノ配列と興味ある遺伝子の開始コドンとの間に挿入され得る。
【００５９】
もう１つの態様においては、興味ある第２遺伝子が、興味ある第１遺伝子に連結され得る。もう1つの態様においては、興味ある第１のEC−遺伝子対を有する第１カセット、続いて興味ある第２のEC−遺伝子対を有する第２カセットが存在する。興味ある１又は複数の遺伝子への１又は複数のECのカップリングの多くの組合せが本発明により包含される。従って、多数のEC/興味ある遺伝子のカセットが、発現カセット中に挿入され、その結果、発現カセットは、１〜10又はそれ以上の発現カセットを有することができる。従って、１又は複数の興味ある遺伝子への１又は複数のECのカップリングの多くの組合せが、本発明により包含される。
【００６０】
当業者は、発現カセットの調製のための多くの分子技法を良く知っている。例えば、ECポリヌクレオチドは、お互いプライムする長いオリゴヌクレオチド、及び本明細書に記載されるヌクレオチド配列を用いて、核酸分子を合成することによって得られる（例えば、Ausubel (1995) p.8-8〜8-9を参照のこと）。ポリメラーゼ鎖反応を用いての確立された技法は、少なくとも２kbの長さのDNA分子を合成する能力を提供する（Adang など., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993). Bambot など., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dilfon など., “Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Constrauction of Synthetic Genes,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications. White (ed.), Pages 263-268. (Humana Press. Inc. 1993), 及びHolowachukなど., PCR Methods Appl. 4: 299 (1995)。
【００６１】
本発明の核酸分子はまた、ホスホラミジット方法のようなプロトコールを用いて、“遺伝子機会”により合成され得る。化学的に合成される二本鎖DNAが遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のような用途のために必要とされる場合、個々の相補的鎖は別々に製造される。短い遺伝子（60〜80の塩基対）の生成は技術的に簡単であり、そして相補的鎖を合成し、そして次にそれらをアニーリングすることによって達成され得る。しかしながら、長い遺伝子（300以上の塩基対）の生成に関しては、化学的DNA合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに100％ではないので、特殊な手段が必要とされる。
【００６２】
この問題を克服するために、合成遺伝子（二本鎖）が、20〜100個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントからモジュラー形でアセンブルされる。ポリヌクレオチド合成の再考のためには、例えば、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura など., Annu. Rev. Biochem. 53: 323 (1984), などClimie など., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 87: 633 (1990) を参照のこと。
【００６３】
EC、興味ある遺伝子、発現カセット及び/又は発現ベクターを調製するために使用され得る他の技法の例は、例えば制限エンドヌクレアーゼ消化及び連結、及びポリメラーゼ鎖反応（それらはすべて、当業界において知られている）を包含する。さらに、酵母組換えが、ポリヌクレオチドを調製するために使用され得る。引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第6,207,442号（Plasmid Construction by Homologous Recombination）を参照のこと）。
【００６４】
広範囲の種類の選択マーカー遺伝子が入手できる（例えば、Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 487 (1990); Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 537 (1990)）。本発明においては、適切な選択マーカーは、“滴定可能”であり、この場合、高い用量の毒性薬物に対する細胞の耐性が細胞により生成される選択マーカータンパク質の数に関連するであろう。この特徴は、選択マーカーが、酵素当たり多数の毒性薬物分子を中和することができる酵素である場合、欠失する。
【００６５】
Ble遺伝子、例えばSh ble遺伝子は、現在記載される方法のための特に有用な選択マーカー遺伝子である。それらの遺伝子は、ブレオマイシン/フレオマイシン型薬剤の活性を阻害するタンパク質、例えばZEOCINを生成する（Gatignolなど., Mol. Gen. Genet. 207: 342 (1987); Drocourtなど., Nucl. Acids Res. 18: 4009 (1990)）。ブレオマイシン耐性遺伝子によりコードされるタンパク質は、ブレオマイシン型薬剤を１：１の比で結合し、毒性薬剤の分離をもたらす（例えば、Gatignolなど., FEBS Lett. 230: 171 (1988) を参照のこと）。化学量論的結合の他に、このシステムのもう１つの利点は、ZEOCINが広範囲の細胞型、例えば細菌、菌類、植物、鳥類、昆虫及び哺乳類細胞において毒性であることである。
【００６６】
当業者が知っているように、細菌発現のための選択マーカーは、耐抗生物質性を付与するマーカーを包含する。抗生物質、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール及びカナマイシンが通常使用される。発現ベクターは、１つより多くのそのような耐抗生物質性遺伝子を担持することができる。また、Sambrookなど., 前記を参照のこと。
【００６７】
他の選択マーカーも同様に使用され得、そしていくつかの場合、抗生物質の使用を必要としない選択マーカーを使用することが好ましい。この種類の選択マーカーの１つの例は、プラスミドR1からのhok/sokシステムを使用する。前記hok 遺伝子は52個のアミノ酸の毒性Hokタンパク質をコードし、そしてsok 遺伝子は、hok mRNAリーダー配列に対して相補的であるアンチセンスRNAをコードする。この選択マーカーは、当業者に知られており、そしてGerdes, K. など., Genetic Engineering, 19: 49-61, 1997により詳細に記載される。
【００６８】
C．発現ベクターの生成：
発現ベクターを構成した後、ベクターは、核酸ポリマーの生成のための核酸分子を合成するために、宿主細胞において増殖される。ベクター増殖は、原核宿主細胞、例えばE．コリ又はバチルス・サブチラス（Bacillus subtilus）において便利に行なわれる。E.コリの適切な株は、BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3)pLysE, DH1, DH4, DH5, DH51, DH51F, DH51MCR, DH 10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451及びER1647を包含する（例えば、Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991) を参照のこと）。
【００６９】
バチルス・スブチリスの適切な株は、BR151、YB886、MI119、MI120及びBI70を包含する（例えば、Hardy, “Bacillus Cloning Methods”, in DNA Cloning: A Practical Approach, Clover (ed.) (IRL Press 1985) を参照のこと。原核宿主におけるベクターの増殖のための標準技法は、当業者に良く知られている（例えば、Ausubelなど（eds.）、Short Protecols in Molecular Biology, 3rd Edition (John Wiley & Sons 1995) [“Ausubel 1995”]; Wuなど., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Inc. 1997) を参照のこと）。
【００７０】
本発明はまた、異なった遺伝子を含む発現ベクターを含んで成る異種ポリマーの生成を包含する。例示のように、興味あるタンパク質のための後−翻訳プロセッシング酵素をコードする遺伝子により細胞をトランスフェクトする必要がある。この場合、適切な酵素のための遺伝子を包含する線状化された発現ベクターが、異種ポリマーを生成するために連結され得る。プロセッシング遺伝子は、類似する調節要素により制御され得る。さらに、遺伝子の相対的量は、種々の発現ベクターの割合を変えることによって調節され得る。同様に、異種ポリマーは、マルチマータンパク質のサブユニットの発現を提供するか、又は宿主細胞の性質を修飾することができる多数の代謝経路を、組換え宿主細胞に提供するよう考案され得る。
【００７１】
４．宿主細胞による組換えタンパク質の生成：
核酸ポリマー、例えば発現ベクターは、種々の標準技術、例えばリポソーム介在性形質転換、熱ショック形質転換、マイクロプロジェクト介在性供給、エレクトロポレーション及び同様の技法を用いて、宿主細胞中に導入され得る。形質転換された細胞が、興味ある遺伝子を発現する組換え宿主細胞を供給するために、選択され、そして増殖され得る。
細菌細胞中に核酸分子を導入するための標準方法は、例えばAusubel（1995）により提供される。
【００７２】
広範囲の適切な組換え宿主細胞は、本発明により包含され、そしてグラム陰性原核宿主生物、例えばE．コリ、例えばE．コリK12, E. コリK12 RV308, E. コリK12 MM294, E. コリK12 C600, E. コリHB101, E. コリK12 C600 R. sub. K. M. sub. k-, E. コリK12 RR1, セラチア（Serratia）、プソイドモナス（Pseudomonas）、カウロバクター（Caulobacter）及び同様のもの、及びグラム陽性生成物、例えばバチルス、例えばB. サブチリス（B. subtilis）及びB．スリンギエンシス（B. thuringienesis）及びB．スリンギエンシスvar. イスラエレンシス（B. thuringienesis var. israelensis）、並びにストレプトミセス（Streptomyces）、例えばS．リビダンス（S．lividans）、S．アンボフェシエンス（S．ambofaciens）、S．ファラジアエ（S．fradiae）、及びS．グリセオフスカス（S．griseofuscus）を包含するが、但しそれだけには限定されない。
【００７３】
本発明は、組換え宿主に使用されるよう企画されるが、当業者はまた、このシステムがまた、細胞フリー発現システムにおいても使用され得ることを知っている。市販の細胞フリー翻訳システムは、例えばRoche Diagnostics (Rapid Translation System RTS E. coli Circular Template kit; Rapid Translation RTS 100 E. coli HY kit; Ruche Diagnostics, Indianapolis, IN) から入手できる。
【００７４】
本発明の発現ベクター及び方法は、適切な宿主細胞及び標準発酵技法、及び興味ある特定遺伝子を生成する条件を伴なって使用され、そして組換えタンパク質がさらに、発酵ブイヨンから通常の方法により精製される。一般的に、Sambrookなど., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, Volume three: Chapter 15, pages 15. 14-15.54を参照のこと。
【００７５】
さらに、ECタンパク質は、興味ある遺伝子の発現の量及びレベルをモニターすることにおいて有用であろう。標準の方法を用いて、当業者は、ECタンパク質の検出に基づいて、生成される興味ある遺伝子の量を決定することができるであろう。ECポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質のそのような検出は、ECタンパク質に対して生成される抗体を用いて行なわれ得る。
【００７６】
５．ECタンパク質に対する抗体の生成：
ECタンパク質に対する抗体はまた、興味あるタンパク質の生成をモニターするための手段として有用である。
ECに対する抗体は、例えば抗原として、EC発現ベクターの生成物を用いて得られる。特に有用な抗−EC抗体は、ECを、“特異的に結合する”。抗体は、その抗体が次の２つの性質の少なくとも１つを示す場合、特異的に結合すると思われる：（１）抗体が限界レベルの結合活性を伴って、ECに結合し、そして（２）抗体がECに関連するポリペプチドと有意に交差反応しない場合。
【００７７】
第１の特徴に関しては、抗体は、それらが、106M−1又はそれ以上、好ましくは107M−1又はそれ以上、より好ましくは108M−1又はそれ以上、及び最も好ましくは109M−1又はそれ以上の結合親和性（Ka）を伴なって、ECポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合する場合、特異的に結合する。抗体の結合親和性は、Scatchard 分析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660 (1949)）により、当業者により容易に決定され得る。第２の特徴に関しては、抗体は、それらが、標準のウェスターンブロット分析を用いて、ECを検出するが、しかし現在知られているポリペプチドを検出しない場合、関連するポリペプチドと有意に交差反応しない。
【００７８】
抗−EC抗体は、抗原性ECエピトープ−担持ペプチドを用いて生成され得る。本発明の抗原性エピトープ−担持ペプチド及びポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる、少なくとも９個、好ましくはそれ以上のアミノ酸の配列を含む。所望には、エピトープ担持ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒において実質的な溶解性を提供するよう選択される（すなわち、前記配列は、比較的親水性の残基を包含し、そして疎水性残基は好ましくは、回避される）。
【００７９】
組換えECタンパク質、又は天然源から単離されたECに対するポリクローナル抗体は、当業者に良く知られている方法を用いて調製され得る。例えば、Green など., “Production of polyclonal Antisera,” in Immunochemical Protecols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992), 及びWilliams など., “Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など., (eds.), page 15 (Oxford University press 1995を参照のこと。
【００８０】
ECポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えばみょうばん（水酸化アルミニウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用を通して高められ得る。免疫化のために有用なポリペプチドはまた、融合ポリペプチド、例えばEC又はその一部と、免疫グロブリンポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は好都合には、免疫化のために高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）又は破傷風トキソイド）に結合されるか又は連結され得る。
【００８１】
ポリクローナル抗体は典型的には、動物、例えば馬、牛、犬、鶏、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ又は羊において生ぜしめられるが、本発明の抗−EC抗体はまた、ヒトに近い霊長類抗体から誘導され得る。ヒヒにおいて診断的に及び治療的に有用な抗体を生ぜしめるための一般的な技法は、例えばGoldenbergなど., 国際特許出願番号WO91/11465号及びLosmanなど., Int. J. Cancer 46: 310, 1990に見出され得る。
【００８２】
他方では、モノクローナル抗−EC抗体が生成され得る。特定抗原に対する囓歯動物モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法により得られる（例えば、Kohler など., Nature 256: 495 (1975), Coliga など., (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, page 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Picksley など., “Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995を参照のこと)。
【００８３】
手短には、モノクローナル抗体は、EC遺伝子生成物を含んで成る組成物をマウスに注射し、血清サンプルを除去することにより抗体生成の存在を確かめ、B−リンパ球を得るために脾臓を除去し、ハイブリドーマを生成するために前記リンパ球を骨髄腫細胞により融合し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を生成する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を生成するクローンを培養し、そしてハイブリドーマ培養物から抗体を単離することに得られる。
【００８４】
さらに、本発明の抗−EC抗体は、ヒトモノクローナル抗体から誘導され得る。ヒトモノクローナル抗体は、抗原攻撃に応答して特定のヒト抗体を生成するよう構築されたトランスジェニックマウスから得られる。この技法においては、ヒトH鎖及びL鎖遺伝子座の要素が、内因性H鎖及びL鎖遺伝子座の標的化された破壊を含む胚幹細胞系に由来するマウス株中に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、そして前記マウスはヒト抗体−分泌性ハイブリドーマを生成するために使用され得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Greenなど., Nat. Genet. 7: 13, 1994, Lonberg など., Nature 368: 856, 1994, 及びTaylorなど., Inc. Immun. 6: 576, 1994により記載される。
【００８５】
モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技法により、ハイブリドーマ培養物から単離され、そして精製され得る。そのような単離技法は、プロテイン−Aセファロースによる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを包含する（例えば、Coligan, page 2.7.1-2.7.12及びpage 2.9.1^2.9.3; Bainesなど.,” Purification of Imunoglobulin G (IgG)”, Methods in Molecular Biology, vol, 10, p. 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992) を参照のこと）。
【００８６】
特定の用途に関しては、抗−EC抗体のフラグメントを調製することが所望される。そのような抗体フラグメントは、例えば抗体のタンパク質加水分解により得られる。抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン又はパパイン消化により得られる。例示のように、抗体フラグメントは、F(ab’)2として示される５Sフラグメントを供給するためにペプシンによる抗体の酵素分解により生成され得る。このフラグメントはさらに、3.5S Fab’ 単価フラグメントを生成するためにチオール還元剤を用いて分解され得る。
【００８７】
任意には、その分解反応は、ジスルフィド結合の分解に起因するスルフヒドリル基に関するブロッキング基を用いて行われ得る。他の手段としては、ペプシンを用いての酸素分解が２種の単位Fabフラグメント及びFcフラグメントを直接的に生成する。それらの方法は、例えば、Goldenberg, アメリカ特許第4,331,647号、Nisonoff など., Arcg Biochem. Biophys. 89: 230, 1960, Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959, Edelman など., in Methods in Enzymology vol. 1, p. 422 (Academic Press 1967), 及びColigan, p. 2.8.1-2.8.10及び2.10-2.10.4により記載される。
【００８８】
抗体を分解する他の方法、例えば単価L−H鎖フラグメントを形成するためへのH鎖の分解、フラグメントの追加の分解、又は他の酵素的、化学的又は遺伝的技法がまた、そのフラグメントが損なわれていない抗体により認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
例えば、Fvフラグメントは、VH及びVL鎖の会合を含んで成る。この会合は、Inbar など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659, 1972により記載のように、非共有的であり得る。他方では、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合により連結され、又は化学物質、例えばグルテルアルデヒドにより交差結合され得る（例えば、Sandhu, Crit. Rew. Biotech. 12: 437, 1992を参照のこと）。
【００８９】
Fvフラグメントは、ペプチドリンカーにより連結されるVH及びVL鎖を含んで成る。それらの一本鎖抗原結合タンパク質（scFv）は、オリゴヌクレオチドにより連結されるVH及びVLドメインをコードするDNA配列を含んで成る構造遺伝子を構成することによって調製される。構造遺伝子が、続いて、宿主細胞、例えばE.コリ中に導入される発現ベクター中に挿入される。組換え宿主細胞は、２種のVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単鎖ポリペプチドを合成する。ScFvを生成するための方法は、例えばWhitlow など., Methods: A Companion to Metheds in Enzymology 2:97, 1991により記載される。Bird など., Science 242:423, 1988, Ladner など., アメリカ特許第4,946,778号、Packなど., Bio/Technology 11: 1271, 1993及びSandhu, 前記も参照のこと。
【００９０】
例示のように、scFvは、インビトロで、ECポリペプチドにリンパ球を暴露し、そしてファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーを選択すること（例えば、固定された又はラベルされたECタンパク質又はペプチドの作用を通して）によって得られる。可能性あるECポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。
【００９１】
そのようなランダム  ペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ladner など., アメリカ特許第5,223,409 号; Ladner など., アメリカ特許第4,946,778 号；Ladner など., アメリカ特許第5,403,484 号及びLadner など., アメリカ特許第5,571,698 号、及びKayなど., Phage Display of Peputides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)）、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばClontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) 及びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piccataway, MJ) から市販されている。ランダムペプチド表示ライブラリーは、Zcytor 14に結合するタンパク質を同定するために、本明細書に開示されるEC配列を用いてスクリーンされ得る。
【００９２】
抗体フラグメントのもう１つの形は、単一の相補性−決定領域（CDR）をコードするペプチドである。CDRペプチド（“最小認識単位”）は、興味ある抗体のDCRをコードする遺伝子を構成することによって得られる。そのような遺伝子は、例えば抗体−生成細胞のRNAから可変領域を合成するためにポリメラーゼ鎖反応を用いることによって調製される（例えば、Larrick など., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991), Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter など., (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995), 及びWard など., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch など., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)を参照のこと）。
【００９３】
他方では、抗−EC抗体は、“ヒト型化”モノクローナル抗体から誘導され得る。ヒト型化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンH及びL可変鎖からのマウス相補的決定領域を、ヒト可変ドメイン中に移行することにより生成される。次に、ヒト抗体の典型的な残基がネズミ相対物の骨格領域において置換される。ヒト型化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、ネズミ不変領域の免疫原性に関連する可能性ある問題を回避する。
【００９４】
ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローン化するための一般的な技法は、例えば、Orlandiなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833, 1989により記載される。ヒト型化モノクローナル抗体を生成するための技法は、例えば、Jones など., Nature 321:522, 1986, Carter など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285, 1992, Sandhu, Crit. Rey. Biotech. 12: 437, 1992, Singer など., J. Tmmun. 150: 2844, 1993, Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, “Engineering Therapeutic Antibodies,” in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland など. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), 及びQueen など., アメリカ特許第5,693,762号（1997）により記載される。
【００９５】
ポリクローナル抗−イディオタイプ抗体は、標準技法を用いて、抗−EC抗体又は抗体フラグメントにより動物を免疫化することにより調製され得る。例えば、Greenなど., “Production of Ployclonal Antisera” in Methods in Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), P. 1-2 (Humana Press 1992) を参照のこと。また、Coligan, 前記、p.2.4.1-2.4.7も参照のこと。他方では、モノクローナル抗−イディオタイプ抗体は、上記の技法により、抗−EC抗体又は抗体フラグメントを免疫原として用いて調製され得る。
【００９６】
もう1つの方法として、ヒト型化抗−イディオタイプ抗体又は人間に近い霊長類抗−イディオタイプ抗体が、上記技法を用いて調製され得る。抗−イディオタイプ抗体を調製するための方法は、例えばIrie, アメリカ特許第5,208,146号, Greeneなど., アメリカ特許第5,637,677号、及びVarthakovi and Minocha, J. Gen. Virol 77: 1875, 1996により記載される。
一般的に記載されて来た本発明は、次ぎの例により容易に理解されるであろう。但し、それらの例は、本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００９７】
例1．EC及び興味ある遺伝子の構造体の調製
本明細書においてIL−20（zcyto10X１）と呼ばれる、ヒト遺伝子の一部をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを、次の通りにして酵母相同組換えを通してEC核酸配列の後方に挿入した：E．コリのためにコドン最適化されたIL−20（zcyto10X１）（配列番号14）のフラグメントを、センスプラマ−、ZC28,770（配列番号15）及びアンチセンスプライマー、ZC23,993（配列番号16）、及び鋳型としてのIL−20（zcyto10X１）挿入体を含むプラスミドを用いてPCRにより単離した。
【００９８】
センスプライマーを、EC配列に対応する41個の塩基、及び遺伝子のアミノ末端に対応する24個の塩基対を含むよう企画した。アンチセンスプライマーを、IL−20（zcyto10X１）挿入体を含むベクターの3’末端の38個の塩基対に対応するよう企画した。PCR反応条件は、次の通りであった：94℃で30秒、50℃で30秒及び72℃で１分（25サイクル）；続いての４℃でのソーキング。PCRサンプルの小サンプル（２〜４μl）を、分析のために１×TBE緩衝液により１％アガロースゲル上で展開し、そして約500bpのフラグメントの予測されるバンドが見出された。
【００９９】
100μlの反応の残りの体積を、200μlの無水アルコールにより沈殿せしめた。ペレットを、10μlのコンピテント酵母細胞（S．セレビシアエ）を、１μlのIL−20（zcyto10X１）遺伝子及び100ngのSmaI消化されたpTAP186ベクターを含む混合物10μlと共に組合し、そして0.2cmのエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母/DNA混合物を、0.75kV (5kV/cm)、無限オーム、25μFで電気パルスした。個々のキュベットに、600μlの1.2Mソルビトールを添加した。次に、酵母を、２種のURA Dプレート上の２種の300μlのアリコートでプレートし、そして30℃でインキュベートした。
【０１００】
約48時間後、単一のプレートからの陽性酵母形質転換体を、水1mlに再懸濁し、そして短時間、回転せしめ、酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを、1mlの溶解緩衝液（２％Tritonx-100, 100, 1%SDS, 100mMのNaCl、10mMのトリス、pH8.0、1mMのEDTA）に再懸濁した。500μlの溶解混合物を、300μlの酸により洗浄されたガラスビーズ及び500μlのフェノール−クロロホルムを含むEppendorf管に添加し、１分間かきまぜ、続いて、最大速度でEppendorf遠心分離機において５分間、回転せしめた。300μlの水性相を、新しい管に移し、そしてDNAを600μlのエタノール（EtOH）により沈殿せしめ、続いて４℃で10分間、遠心分離した。DNAペレットを、100μlの水に再懸濁した。
【０１０１】
例２．組換え宿主細胞における興味ある遺伝子の発現
エレクトロコンピテントE．コリ宿主細胞（Electromax DH10BTM 細胞；Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MDから得られた）の形質転換を、例１からの１μlの酵母DNA調製物及び40μlのDH12S細胞により行う。細胞を2.0kV, 25μF及び400オームで電気パルスする。エレクトロポレーションに続いて、0.6mlのSOC（２％のBactoTM Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0.5％の酵母抽出物（Ditco）、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコース）を、添加し、そして細胞を37℃で１時間、回収した。全形質転換体を、LB Kanプレート（LBブイヨン（Lennox）、1.8％ BactoTM 寒天（Difco）、25mg/lのカナマイシン）上に１アリコートでプレートした。
【０１０２】
正しい発現構造体を有する個々のクローンを、発現及びPCRにより同定した。細胞を、30μg/mlのカナマイシンを含むSuperbroth2において一晩、増殖せしめた。その一晩の培養物50μlを用いて、30μg/mlのカナマイシンを含む2mlの新鮮なSuperbroth2を接種した。培養物を、振盪しながら、37℃で２時間、増殖した。その培養物1mlを、1mMのIPTGにより誘発する。２〜４時間後、個々の培養物250μlを、酸により洗浄されたガラスビーズ250μ、及び5％βME及び色素を含むThomer緩衝液（８Mの尿酸、100mMトリス、pH7.0, 10％グリセロール、２mMのEDTA，５％SDS）250μlと共に混合する。サンプルを１分間、振盪し、そして65℃に10分間、加熱する。その20μlを、４％〜12％PAGEゲル（NOVEX）上のライン当たりに負荷する。
【０１０３】
スクリーンされたすべての８個のクローンは、約17kDのバンドを発現した。クローンをまた、プライマーZC28770（配列番号24）及びZC23993（配列番号25）によるPCRを通してスクリーンした。PCR反応条件は次の通りであった：94℃で30秒、50℃で30秒、及び72℃で１分（25サイクル）；続いての４℃でのソーキング。PCRサンプルの小サンプル（２〜４μl）を、分析のために１×TBE緩衝液により１％アガロースゲル上で展開し、そして約500bpのフラグメントの予測されるバンドを、スクリーンされたすべての８個のクローンに見出した。陽性クローンを配列分析にゆだね、そしてそれは、ECポリヌクレオチド配列が、配列番号17に示されるように、IL−20（zcyto10X１）配列の上流に正しく挿入されたことを示した。
【０１０４】
例３．核酸構造体からの酵母起源の複製の除去及びもう１つの組換え宿主における興味ある遺伝子の発現
例２からの陽性クローンを、Not1/Nco1（10μlのDNA、 5μlのBuffer3（New England BioLabs）、2μlのNot1, 2μlのNco1、31μlの水）により37℃で１時間、消化し、そしてTA DNAリガーゼ緩衝液（7μlの前での消化物、２μlの５×緩衝液、1μlのT4 DNAリガーゼ）により再連結し、酵母配列CEN−ARSを除去し、そしてベクターを簡素化した。酵母配列DNAの不在を、Pvu2及びPst1による消化により確かめた。次に、核酸構造体を、E．コリDH12Sについて列挙されるプロトコールを通して、E．コリW3110s中に形質転換した。
【０１０５】
細胞の誘発を次の通りに行なった：37.5mlのSuperbroth2＋30μg/mlのkanを、375μlの開始培養物により接種した。培養物を37℃で１時間50分、増殖した。次に、25mlを、１mMのIPTGにより誘発し、そしてそれぞれ12.5mlの２つのアリコートに分けた。それらのアリコートの１つを37℃で増殖し、そして他のアリコートを30℃で増殖した。12.5mlの負の誘発対照がまた包含される。培養物を、３時間の後−誘発で収穫した。250μlの培養物を、250μlのガラスビーズ及び250μlのThorner Buffer (５％の色素及び５％のβMEを含む)と共に混合した。サンプルをかきまぜ、そして次に、５分間、煮沸し、そしてPAGEゲル上で展開した。20μlを、４％〜12％PAGEゲル（NOVEX）上のレーン当たりに負荷した。ゲルを、１×MES緩衝液において展開した。30℃及び37℃の培養物は、約17kDのバンドを発現した。誘発されなかった培養物はそれぞれ発現しなかった。
【０１０６】
いくつかの他のタンパク質が、興味ある遺伝子の上流にECを挿入するこの態様で発現されている。
前述から、本発明の特定の態様が例示目的のために記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは理解されるであろう。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲を除いて、制限されない。
【配列表】
2005511000.tif 000002
2005511000.tif 000003
2005511000.tif 000004
2005511000.tif 000005
2005511000.tif 000006
2005511000.tif 000007
2005511000.tif 000008
2005511000.tif 000009
2005511000.tif 000010
【国際調査報告】
2005511000.tif 000011
2005511000.tif 000012