(57)【要約】本発明は、マルチマー化ポリペプチドが、分子（例えば、異種ポリペプチド配列）に連結した場合、マルチマーの形成を与え得るマルチマー化ポリペプチドを提供する。本発明は、ポリペプチド配列に結合される分子の間でのオリゴマー（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、およびより高い次元のオリゴマー形態）の形成を媒介する操作されたポリペプチド配列に関連する。１つの局面において、マルチマーの形成を与える、１つ以上の７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを作製する方法であって、該方法が、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むポリペプチドを改変する工程を包含し、ここで、位置ａまたはｄの１つ以上が、ロイシンまたはイソロイシンで置換され、それによって、マルチマー形成を与えるマルチマー化ポリペプチドを作製する、方法が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜７；配列番号９〜３７；および配列番号１５４〜１６３に記載のアミノ酸配列から選択される、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して７０％以上の同一性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、マルチマー化可能である、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して７５％以上の同一性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、マルチマー化可能である、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して８０％以上の同一性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、マルチマー化可能である、ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して８５％以上の同一性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、マルチマー化可能である、ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して９０％以上の同一性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、マルチマー化可能である、ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して９５％以上の同一性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、マルチマー化可能である、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドのポリペプチド部分配列であって、該ポリペプチド部分配列が、マルチマー化可能である、ポリペプチド部分配列。
【請求項９】
請求項２に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、１つ以上のアミノ酸置換を有し、但し、７残基ジッパー反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）の位置ａまたはｄの全てが、ロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかであり、該置換されたポリペプチドが、マルチマー化を与え得る、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項２に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、１つ以上のアミノ酸置換を有し、但し、７残基ジッパー反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）の位置ａまたはｄの１つ以上が、ロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかであり、該置換されたポリペプチドが、マルチマー化を与え得る、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、７残基ジッパー反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）の位置ａまたはｄの少なくとも１つが、ロイシン、イソロイシンまたはバリン以外のアミノ酸である、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１０に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、１〜５個のアミノ酸置換を有する、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項２に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆまたはｇの位置に、１つ以上のアミノ酸置換を有し、但し、該置換されたポリペプチドが、マルチマー化を与え得る、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、１〜５個のアミノ酸置換を有する、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくとも１１アミノ酸長の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくとも１５アミノ酸長の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくとも１８アミノ酸長の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくとも２２アミノ酸長の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくとも２７アミノ酸長の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくとも３１アミノ酸長の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、約１２５アミノ酸長未満の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、約１００アミノ酸長未満の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、約７５アミノ酸長未満の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、約５０アミノ酸長未満の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
【請求項２５】
異種ポリペプチドに融合された、請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドを含む、キメラポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２５に記載のキメラポリペプチドであって、前記マルチマー化ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドのアミノ末端に融合される、キメラポリペプチド。
【請求項２７】
請求項２５に記載のキメラポリペプチドであって、前記マルチマー化ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドのカルボキシ末端に融合される、キメラポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２５に記載のキメラポリペプチドであって、前記マルチマー化ポリペプチドが、請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して５０％以上の同一性を有し、該キメラポリペプチドが、マルチマー化を与え得る、キメラポリペプチド。
【請求項２９】
請求項２５に記載のキメラポリペプチドであって、前記マルチマー化ポリペプチドが、請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドの部分配列であり、該キメラポリペプチドが、マルチマー化を与え得る、キメラポリペプチド。
【請求項３０】
請求項２５に記載のキメラポリペプチドであって、前記マルチマー化ポリペプチドが、１つ以上のアミノ酸置換を有し、但し、７残基ジッパー反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）の位置ａおよびｄの１つ以上が、ロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかであり、該キメラポリペプチドが、マルチマー化を与え得る、キメラポリペプチド。
【請求項３１】
請求項２５に記載のキメラポリペプチドであって、前記キメラポリペプチドが、約１８〜３０、３０〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜５００または５００〜１０００のアミノ酸の配列長を有する、キメラポリペプチド。
【請求項３２】
請求項２５に記載のキメラポリペプチドであって、前記異種ポリペプチドが、結合タンパク質、酵素、レセプター、リガンド、核酸結合タンパク質、成長調節因子、分化因子、および走化性因子から選択される、キメラポリペプチド。
【請求項３３】
請求項３２に記載のキメラポリペプチドであって、前記結合タンパク質が、抗原結合ポリペプチドを含む、キメラポリペプチド。
【請求項３４】
請求項３３に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗原結合ポリペプチドが、少なくとも１つの抗体可変ドメインを含む、キメラポリペプチド。
【請求項３５】
請求項３４に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗体可変ドメインが、ヒトまたはヒト化されている、キメラポリペプチド。
【請求項３６】
請求項３３に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗原結合ポリペプチドが、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、またはＦｖ抗体の部分配列を含む、キメラポリペプチド。
【請求項３７】
請求項３３に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗原結合ポリペプチドが、多特異的または多機能性の抗体を含む、キメラポリペプチド。
【請求項３８】
請求項３３に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗原結合ポリペプチドが、ＩＣＡＭ−１またはそのエピトープに結合する、キメラポリペプチド。
【請求項３９】
請求項３３に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗原結合ポリペプチドが、ＩＣＡＭ−１を発現するヒトライノウイルス感染を阻害する、キメラポリペプチド。
【請求項４０】
請求項３３に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗原結合ポリペプチドが、ヘテロまたはホモのダイマー、トリマー、テトラマーまたはより高次のオリゴマーを形成する、キメラポリペプチド。
【請求項４１】
請求項４０に記載のキメラポリペプチドであって、前記ホモダイマー、ホモトリマー、ホモテトラマー、またはより高次のホモオリゴマーを構成するモノマーのＫＤが、１×１０−７以下である、キメラポリペプチド。
【請求項４２】
請求項４０に記載のキメラポリペプチドであって、前記ホモダイマー、ホモトリマー、ホモテトラマー、またはより高次のホモオリゴマーを構成するモノマーのＫＤが、１×１０−８以下である、キメラポリペプチド。
【請求項４３】
請求項２５に記載の少なくとも１つのキメラポリペプチドを含む、ホモまたはヘテロのダイマー、トリマー、テトラマーまたはより高次のポリペプチドのオリゴマー。
【請求項４４】
請求項２５に記載のキメラポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、前記マルチマー化ポリペプチドと前記異種ポリペプチドとの間にリンカーを含む、キメラポリペプチド。
【請求項４５】
請求項４４に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、ヒトアミノ酸配列またはヒト化アミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
【請求項４６】
請求項４４に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、約５〜２０アミノ酸のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
【請求項４７】
請求項４４に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、約１０〜３０アミノ酸のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
【請求項４８】
請求項４４に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、約２５〜５０アミノ酸のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
【請求項４９】
請求項４４に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、約３０〜６０アミノ酸のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
【請求項５０】
請求項４４に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、約５０〜７５アミノ酸のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
【請求項５１】
請求項４４に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、配列番号４３（Ｄ３０）、配列番号４４（Ｄ３５）、配列番号４５（ＥＤ）、配列番号４６（ＥＤＣ）、または配列番号４７（Ｄ６３）のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
【請求項５２】
異種ポリペプチドに融合された、配列番号４３（Ｄ３０）、配列番号４４（Ｄ３５）、配列番号４５（ＥＤ）、配列番号４６（ＥＤＣ）、または配列番号４７（Ｄ６３）のいずれかに記載のリンカーポリペプチド配列を含む、キメラポリペプチド。
【請求項５３】
請求項５２に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーポリペプチド配列が、配列番号４３（Ｄ３０）、配列番号４４（Ｄ３５）、配列番号４５（ＥＤ）、配列番号４６（ＥＤＣ）、または配列番号４７（Ｄ６３）のいずれかに記載の部分配列である、キメラポリペプチド。
【請求項５４】
請求項２３に記載のキメラポリペプチドを含む、薬学的処方物。
【請求項５５】
請求項２５または５２に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項５６】
発現制御エレメントに作動可能に連結された、請求項５５に記載の核酸を含む、発現カセット。
【請求項５７】
請求項５６に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項５８】
請求項５６に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項５９】
請求項５８に記載の細胞であって、該細胞が、細菌細胞、真菌細胞、動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞からなる群より選択される、細胞。
【請求項６０】
請求項５７に記載の細胞であって、前記動物細胞が、哺乳類である、細胞。
【請求項６１】
請求項１に記載のマルチマー化ポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
【請求項６２】
発現制御エレメントに作動可能に連結された、請求項６１に記載の核酸。
【請求項６３】
異種ポリペプチドをコードする核酸にインフレームで融合した、請求項６１に記載の核酸。
【請求項６４】
請求項６３に記載の核酸であって、リンカー配列をコードする核酸が、請求項６１に記載の核酸と異種ポリペプチドをコードする核酸との間に位置する、核酸。
【請求項６５】
請求項６１に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項６６】
請求項６５に記載のベクターであって、前記ベクターが、発現ベクターである、ベクター。
【請求項６７】
請求項６１に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項６８】
請求項６７に記載の細胞であって、前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞からなる群より選択される、細胞。
【請求項６９】
請求項６８に記載の細胞であって、前記動物細胞が、哺乳類である、細胞。
【請求項７０】
マルチマーの形成を与える、１つ以上の７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを作製する方法であって、該方法が、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むポリペプチドを改変する工程を包含し、ここで、位置ａまたはｄの１つ以上が、ロイシンまたはイソロイシンで置換され、それによって、マルチマー形成を与えるマルチマー化ポリペプチドを作製する、方法。
【請求項７１】
請求項７０に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、トリマー、テトラマー、またはペンタマーを形成するが、未改変ポリペプチドが、ダイマーを形成する、方法。
【請求項７２】
請求項７０に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、未改変ポリペプチドと比較して、マルチマーにおける増加または減少した安定性を有する、方法。
【請求項７３】
請求項７０に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、テトラマーまたはペンタマーを形成するが、未改変ポリペプチドが、ダイマーまたはトリマーを形成する、方法。
【請求項７４】
ダイマーの形成を与える、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを作製する方法であって、該方法が、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を改変する工程を包含し、ここで、位置ａまたはｄが、バリンとロイシンまたはイソロイシンのいずれかとで置換され、それによって、ダイマー形成を与えるマルチマー化ポリペプチドを作製する、方法。
【請求項７５】
請求項７４に記載の方法であって、前記未改変ポリペプチドが、トリマーまたはテトラマーまたはペンタマーを形成する、方法。
【請求項７６】
請求項７４に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、未改変ポリペプチドと比較して、マルチマーにおける増加または減少した安定性を有する、方法。
【請求項７７】
トリマーを形成するキメラポリペプチドを作製する方法であって、該方法が、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを作製する工程を包含し、ここで、位置ａおよびｄの１つ以上が、ロイシンまたはイソロイシンのいずれかであり、異種ポリペプチドに融合され、それによって、トリマーを形成するキメラポリペプチドを作製する、方法。
【請求項７８】
請求項７７に記載の方法であって、前記未改変ポリペプチドが、ダイマーまたはテトラマーまたはペンタマーを形成する、方法。
【請求項７９】
請求項７７に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、未改変ポリペプチドと比較して、マルチマーにおける増加または減少した安定性を有する、方法。
【請求項８０】
テトラマーを形成するキメラポリペプチドを作製する方法であって、該方法が、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを作製する工程を包含し、ここで、位置ａおよびｄの１つ以上が、ロイシンまたはイソロイシンのいずれかであり、異種ポリペプチドに融合され、それによって、テトラマーを形成するキメラポリペプチドを作製する、方法。
【請求項８１】
請求項８０に記載の方法であって、前記未改変ポリペプチドが、ダイマーまたはトリマーまたはペンタマーを形成する、方法。
【請求項８２】
請求項８０に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、未改変ポリペプチドと比較して、マルチマーにおける増加または減少した安定性を有する、方法。
【請求項８３】
ペンタマーを形成するキメラポリペプチドを作製する方法であって、該方法が、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを作製する工程を包含し、ここで、位置ａおよびｄの１つ以上が、ロイシンまたはイソロイシンのいずれかであり、異種ポリペプチドに融合され、それによって、ペンタマーを形成するキメラポリペプチドを作製する、方法。
【請求項８４】
請求項８３に記載の方法であって、前記未改変ポリペプチドが、ダイマーまたはトリマーまたはテトラマーを形成する、方法。
【請求項８５】
請求項８３に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、未改変ポリペプチドと比較して、マルチマーにおける増加または減少した安定性を有する、方法。
【請求項８６】
マルチマーを形成する分子を作製する方法であって、該方法が、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを含む分子を作製する工程を包含し、ここで、位置ａまたはｄが、バリンと、ロイシンまたはイソロイシンのいずれかとであり、該分子に融合され、それによって、マルチマーを形成する分子を作製する、方法。
【請求項８７】
請求項８６に記載の方法であって、前記分子が、ポリペプチドである、方法。
【請求項８８】
トリマーまたはテトラマーまたはペンタマーを形成する分子を作製する方法であって、該方法が、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを分子に連結し、これによって、トリマーまたはテトラマーまたはペンタマーを形成する分子を作製する工程を包含し、ここで、位置ａおよびｄの１つ以上が、ロイシンまたはイソロイシンのいずれかである、方法。
【請求項８９】
請求項８８に記載の方法であって、前記分子が、ポリペプチドである、方法。
【請求項９０】
７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを同定する方法であって、該方法が、以下：
ａ）ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーの形成を可能にする条件下で、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むポリペプチドをインキュベートする工程であって、ここで、位置ａおよびｄの１つ以上が、ロイシン、イソロイシン、またはバリンのいずれかである、工程；および
ｂ）該ポリペプチドのホモマルチマーまたはヘテロマルチマーの存在をアッセイする工程であって、ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーの形成が、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを同定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項９１】
請求項９０に記載の方法であって、工程ａ）の前記ポリペプチドが、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むポリペプチドに融合された異種ポリペプチドを含む、方法。
【請求項９２】
請求項９１に記載の方法であって、前記ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドと前記７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むポリペプチドとの間にリンカーを含む、方法。
【請求項９３】
細胞のＲＳＶ感染を阻害する方法であって、該方法が、ＲＳＶを含む細胞またはＲＳＶ感染に感受性の細胞を、細胞のＲＳＶ感染を阻害するのに有効な量の、請求項３６に記載の抗体のヘテロまたはホモのダイマー、トリマー、テトラマーまたはより高次のオリゴマーと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項９４】
請求項８７に記載の方法であって、前記細胞が、被験体に存在する、方法。
【請求項９５】
請求項８８に記載の方法であって、前記被験体が、喘息を有するかまたは喘息の危険にある、方法。
【請求項９６】
請求項８７に記載の方法であって、前記細胞が、上皮細胞である、方法。
【請求項９７】
請求項８７に記載の方法であって、前記抗体が、ヒト化されている、方法。
【請求項９８】
請求項８７に記載の方法であって、前記抗体が、局所的に投与される、方法。
【請求項９９】
請求項８７に記載の方法であって、前記抗体が、吸入または鼻腔内によって投与される、方法。
【請求項１００】
ＲＳＶ感染の阻害、ＲＳＶ進行の阻害、または被験体のＲＳＶ感染の処置の方法であって、該方法が、ＲＳＶ感染を有するかまたはＲＳＶ感染を有する危険がある被験体に、被験体のＲＳＶ感染の阻害、ＲＳＶ進行の阻害、または被験体のＲＳＶ感染の処置に有効な量の、請求項３８に記載の抗体、あるいは請求項３８に記載の抗体のヘテロまたはホモのダイマー、トリマー、テトラマーまたはより高次のオリゴマーを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１０１】
請求項１００に記載の方法であって、前記抗体が、ヒト化されている、方法。
【請求項１０２】
請求項１００に記載の方法であって、前記抗体が、局所的に投与される、方法。
【請求項１０３】
請求項１００に記載の方法であって、前記抗体が、吸入または鼻腔内によって投与される、方法。
【請求項１０４】
請求項１００に記載の方法であって、前記被験体が、喘息を有するかまたは喘息の危険にある、方法。
【請求項１０５】
請求項１００に記載の方法であって、前記被験体が、新生児あるいは１〜５歳、５〜１０歳または１０〜１８歳の間である、方法。
【請求項１０６】
感冒を処置する方法であって、該方法が、感冒を有するかまたは感冒を有する危険にある被験体に、被験体における感冒を処置するのに有効な量の、請求項３８に記載の抗体、あるいは請求項３８に記載の抗体のヘテロまたはホモのダイマー、トリマー、テトラマーまたはより高次のオリゴマーを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１０７】
請求項１０６に記載の方法であって、前記処置が、ＨＲＶによる感染、ＨＲＶ感染の進行、またはＨＲＶ感染の症状を阻害する工程を包含する、方法。
【請求項１０８】
請求項１０６に記載の方法であって、前記抗体が、ヒト化されている、方法。
【請求項１０９】
請求項１０６に記載の方法であって、前記抗体が、局所的に投与される、方法。
【請求項１１０】
請求項１０６に記載の方法であって、前記抗体が、吸入または鼻腔内によって投与される、方法。
【請求項１１１】
請求項１０６に記載の方法であって、前記被験体が、喘息を有するかまたは喘息の危険にある、方法。
【請求項１１２】
請求項１０６に記載の方法であって、前記被験体が、新生児あるいは１〜５歳、５〜１０歳または１０〜１８歳の間である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、出願番号６０／３０６，７４６（２００１年７月１９日出願）および出願番号６０／３３５，４２５（２００１年１１月３０日出願）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、ポリペプチド配列に結合される分子の間でのオリゴマー（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、およびより高い次元のオリゴマー形態）の形成を媒介する操作されたポリペプチド配列に関連する。
【０００３】
（背景）
マルチマー組換え抗体を作製するいくつかの方法が、報告されており、それらの方法としては、ミニ抗体（Ｐａｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１２７１（１９９３）；Ｐａｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：１５７９（１９９２）；Ｐａｃｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４６：２８（１９９５）；Ｒｈｅｉｎｎｅｃｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２９８９（１９９６）；およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎおよびＰａｃｋ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：８３（１９９７））、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、−トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、−テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ（Ｈｕｄｓｏｎ  ＰＪ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：３９５（１９９８）；Ｈｉａｄｅｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０９：４３７（１９９７）；Ｋｏｒｔｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：４２３（１９９７）；およびＧａｌｌら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５３：１６４（１９９９））、プロテインＡ融合タンパク質（ＩｔｏおよびＫｕｒｏｓａｗａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２０６６８（１９９３））、ストレプトアビジン−融合タンパク質（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９：２０３（１９９６））、ジスルフィド結合フラグメント（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３（１９９２））、化学的に結合したスペーサーと連結したフラグメント（ＣｏｏｋおよびＷｏｏｄ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７１：２２７（１９９４））または変性および再生によるｓｃＦｖマルチマーの精製後アセンブリ（Ｗｈｉｔｌｏｗら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：１０１７（１９９４）および米国特許第５，８６９，６２０号）が挙げられる。
【０００４】
プロテインＡおよびストレプトアビジンが、ヒトにおいて高度に免疫原性であるので、プロテインＡまたはストレプトアビジンとの融合により作製されるマルチマー抗体は、ヒトへの使用に適さないようである。ジスルフィド結合による抗体フラグメントの連結は、ダイマー組換え抗体を導き得る。単鎖抗体ｓｃＦｖ−ベースの分子は、しばしば、ｓｃＦｖにおけるＶＨドメインとＶＬドメインとの間のリンカーの長さを変化させることによってマルチマー形態で作製され得る。リンカーが、３アミノ酸残基より長いが、１２アミノ酸残基より短い場合、ｓｃＦｖは、「ダイアボディー」と呼ばれるダイマーを形成し、このリンカーが、２残基より短いか、またはリンカーの残基が用いられない場合、ｓｃＦｖは、「トリアボティー」および「テトラボディー」と呼ばれるトリマーまたはテトラマーを形成する。これらのマルチマーｓｃＦｖ分子が、構造的に固定されているので、親和性の改善は、より高い原子価からほとんど生じなかった。トリアボディーは、ダイアボディと同一であるかまたはダイアボディーより低い親和性を有し、そしてテトラボディーは、ダイアボディーの１倍未満の強さの親和性を有する（Ｋｏｒｔｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：４２３（１９９７）；およびＧａｌｌら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５３：１６４（１９９９））。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本発明は、マルチマー形成をもたらし得るポリペプチド配列を含む。１つの実施形態において、マルチマー化ポリペプチドは、配列番号１〜７；配列番号９〜３７；および配列番号１５４〜１６３に示されるアミノ酸配列から選択される。マルチマー化ポリペプチドはまた、このポリペプチドがマルチマー化しうる限りで、本明細書中で開示される配列と種々の量の配列同一性を有する配列を含む。種々の実施形態において、ポリペプチドは、例えば、配列番号１〜７；配列番号９〜３７；配列番号１５４〜１６３に示されるマルチマー化ポリペプチドに対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の同一性を有する。
【０００６】
マルチマー化し得るマルチマー化ポリペプチドの部分配列、改変形態（例えば、アミノ酸の置換、付加または欠失を有する配列）もまた含まれる。１つの実施形態において、改変形態は、１つ以上のアミノ酸の置換を有し、但し、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）の全てのａ位またはｄ位は、ロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかであり、この置換されたポリペプチドは、マルチマー化をもたらし得る。別の実施形態において、改変形態は、１つ以上のアミノ酸置換を有し、但し、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）のうち１つ以上のａ位またはｄ位は、ロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかであり、この置換されたポリペプチドは、マルチマー化をもたらし得る。別の局面において、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）のうちの少なくとも１つのａ位またはｄ位は、ロイシン、イソロイシンまたはバリン以外のアミノ酸である。別の局面において、このポリペプチドは、１〜５のアミノ酸置換を有する。
【０００７】
なお別の実施形態において、改変形態は、ｂ位、ｃ位、ｅ位、ｆ位またはｇ位に１つ以上のアミノ酸置換を有し、但し、この置換されたポリペプチドは、マルチマー化をもたらし得る。１つの局面において、このポリペプチドは、１〜５のアミノ酸置換を有する。
【０００８】
マルチマー化ポリペプチドは、種々の長さのマルチマー化ポリペプチドである。種々の実施形態において、このポリペプチドは、少なくとも１１アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも１８アミノ酸長、少なくとも２２アミノ酸長、少なくとも２７アミノ酸長、少なくとも３１アミノ酸長の配列を有する。さらなる実施形態において、このポリペプチドは、ほぼ１２５アミノ酸長より短い配列、ほぼ１００アミノ酸長より短い配列、ほぼ７５アミノ酸長より短い配列、ほぼ５０アミノ酸長より短い配列を有する。
【０００９】
部分配列およびその改変形態を含むマルチマー化ポリペプチドは、任意の分子に融合され、それによりマルチマー形成をもたらす。１つの実施形態において、この分子は、ポリペプチド配列（例えば、異種ポリペプチド）を含む。種々の局面において、マルチマー化ポリペプチドは、異種ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合されて、キメラポリペプチドを形成する。キメラポリペプチドは、代表的には、ほぼ１８〜３０アミノ酸、ほぼ３０〜５０アミノ酸、ほぼ５０〜７５アミノ酸、ほぼ７５〜１００アミノ酸、ほぼ１００〜１５０アミノ酸、ほぼ１５０〜２００アミノ酸、ほぼ２００〜２５０アミノ酸、ほぼ２５０〜５００アミノ酸またはほぼ５００〜１０００アミノ酸の配列の長さを有するが、それより短くても長くてもよい。特定の異種ポリペプチドは、例えば、以下：結合タンパク質（例えば、抗原結合ポリペプチド）、酵素、レセプター、リガンド、核酸結合タンパク質、成長調節因子、分化因子、および走化因子からなる群より選択される。種々の局面において、この抗原結合ポリペプチドは、少なくとも１つの抗体可変ドメイン（例えば、ヒト可変ドメインまたはヒト化可変ドメイン）を含む。さらなる局面において、抗原結合ポリペプチドとしては、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、またはＦｖ抗体の部分配列が挙げられる。さらなる局面において、この抗原結合ポリペプチドは、多重特異的抗体または多機能抗体を含む。１つの特定の局面において、抗原結合ポリペプチドは、ＩＣＡＭ−１またはそのエピトープに結合する（例えば、抗原結合ポリペプチドは、ＩＣＡＭ−１を発現する細胞のヒトライノウイルス感染を阻害する）。
【００１０】
マルチマーは、ヘテロダイマーもしくはホモダイマー、ヘテロトリマーもしくはホモトリマー、ヘテロテトラマーもしくはホモテトラマー、ヘテロペンタマーもしくはホモペンタマー、またはより高次のオリゴマーを形成する。マルチマーのうちのモノマー置換基の間の結合は、モノマーの解離（すなわちＫＤ）によって測定される。種々の例示的なＫＤが、１×１０−７以下、１×１０−８以下または１×１０−９である。
【００１１】
さらなる実施形態において、リンカーは、マルチマーポリペプチドとそれが結合する分子との間に含まれる。１つの実施形態において、リンカーは、ポリペプチド配列（例えば、ヒトアミノ酸配列またはヒト化アミノ酸配列）を含む。リンカーは、任意のサイズであり得る。例えば、ポリペプチドリンカーは、ほぼ５〜２０アミノ酸、ほぼ１０〜３０アミノ酸、ほぼ２５〜５０アミノ酸、ほぼ３０〜６０アミノ酸、ほぼ５０〜７５アミノ酸、またはこれらより長いかもしくは短いアミノ酸配列であり得る。特定の局面において、リンカーは、配列番号４３（Ｄ３０）、配列番号４４（Ｄ３５）、配列番号４５（ＥＤ）、配列番号４６（ＥＤＣ）もしくは配列番号４７（Ｄ６３）に示されるアミノ酸配列またはそれらの部分配列を含む。
【００１２】
本発明はまた、これらのマルチマーを含む薬学的処方物を提供する。１つの実施形態において、薬学的処方物は、１つの分子に融合されたマルチマーを含む。１つの局面において、この分子は、異種ポリペプチド配列を含む。
【００１３】
本発明は、単独および異種ポリペプチドと組み合わせたマルチマーポリペプチドならびに連結された配列をコードする核酸をさらに提供する。この核酸を含む発現カセット、発現ベクター、および発現細胞（例えば、細菌、真菌、動物、植物、および昆虫）が含まれる。
【００１４】
本発明は、マルチマーの形成をもたらす、１つ以上の７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを産生する方法をさらに提供する。１つの実施形態において、特定の方法は、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むポリペプチドを改変する工程を包含し、ここで、１つ以上の位置のａまたはｄは、ロイシンまたはイソロイシンのいずれかで置換され、それによりマルチマー形成をもたらすマルチマー化ポリペプチドを産生する。別の実施形態において、特定の方法は、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を改変する工程を包含し、ここで、位置ａまたは位置ｄは、バリンおよびロイシンまたはイソロイシンのいずれかで置換され、それによりマルチマー形成をもたらすマルチマー化ポリペプチドを産生する。
【００１５】
種々の局面において、改変ポリペプチドは、トリマー、テトラマー、またはペンタマーを形成し、一方で、非改変ポリペプチドは、ダイマーを形成する；改変ポリペプチドは、テトラマーまたはペンタマーを形成し、一方で、非改変ポリペプチドは、ダイマーまたはトリマーを形成する；非改変ポリペプチドは、トリマーまたはテトラマーまたはペンタマーを形成する。別の局面において、改変ポリペプチドは、非改変ポリペプチドと比較して増加または減少したマルチマー安定性を有する。
【００１６】
本発明は、マルチマーを形成するキメラポリペプチドを産生する方法をさらに提供する。１つの実施形態において、特定の方法は、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを産生する工程を包含し、ここで、１つ以上の位置のａおよびｄは、ロイシンまたはイソロイシンのいずれかであり、これらａおよびｄは、異種ポリペプチドに融合されており、それによりトリマー、テトラマー、またはペンタマーを産生する。
【００１７】
本発明は、マルチマーを形成する分子を産生する方法をさらに提供する。１つの実施形態において、特定の方法は、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを含む分子を産生する工程を包含し、ここで、ａ位またはｄ位は、バリンおよびロイシンまたはイソロイシンのいずれかであり、これらのａ位またはｄ位は、この分子に融合されており、それによりマルチマー（例えば、ダイマーまたはトリマーまたはペンタマー）を形成する。
【００１８】
７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを同定する方法が、さらに提供される。１つの実施形態において、特定の方法は、以下の工程：ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーの形成を可能にする条件下で、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むポリペプチド（ここで、ａ位およびｄ位のうちの１つ位上が、ロイシン、イソロイシン、またはバリンのいずれかである）をインキュベートする工程；このポリペプチドのホモマルチマーまたはヘテロマルチマーの存在についてアッセイする工程であって、ここで、同種マルチマーまたは異種マルチマーの形成により、７残基反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを同定する工程、を包含する。
【００１９】
（例えば、被験体における）細胞のＲＳＶ感染を阻害する方法もまた提供される。１つの実施形態において、特定の方法は、ＲＳＶまたはＲＳＶ感染に対して感受性の細胞を、この細胞のＲＳＶ感染を阻害するのに有効なマルチマーを有する量のヘテロダイマーもしくはホモダイマー、ヘテロトリマーもしくはホモトリマー、ヘテロテトラマーもしくはホモテトラマー、ヘテロペンタマーもしくはホモペンタマー、またはより高次のオリゴマーと接触させる工程を包含する。被験体のＲＳＶ感染を阻害する方法、ＲＳＶの進行を阻害する方法、およびＲＳＶ感染を処置する方法がさらに提供される。別の実施形態において、特定の方法は、ＲＳＶ感染を有するか、またはその危険性のある被験体に、その被験体のＲＳＶ感染の阻害、ＲＳＶ感染の進行の阻害、またはＲＳＶ感染の処置に有効な量のマルチマー抗体（例えば、抗体のヘテロダイマーもしくはホモダイマー、ヘテロトリマーもしくはホモトリマー、ヘテロテトラマーもしくはホモテトラマー、またはより高次のオリゴマー）を投与する工程を包含する。種々の局面において、この被験体は、喘息を有するか、または喘息を有する危険性があり；新生児または１〜５歳、５〜１０歳、もしくは１０〜１８歳の間であり；この細胞は、上皮細胞であり；このマルチマーは、キメラポリペプチド（例えば、ヒト化抗体のような抗体）を含む。さらなる局面において、この抗体は、吸入または鼻腔を介して局所的に投与される。
【００２０】
感冒を処置する方法が、さらに提供される。１つの実施形態において、特定の方法は、感冒を有するか、またはその危険性のある被験体に、その被験体の感冒の処置に有効な量の抗体（あるいは、抗体のヘテロダイマーもしくはホモダイマー、ヘテロトリマーもしくはホモトリマー、ヘテロテトラマーもしくはホモテトラマー、またはより高次のオリゴマー）を投与する工程を包含する。種々の局面において、この処置としては、ＨＲＶによる感染、ＨＲＶ感染の進行、もしくはＨＲＶ感染の症状を阻害する工程を包含し；この抗体は、ヒト化され；この抗体は、局所的に投与され；この抗体は、吸入または鼻腔を介して投与され；被験体は、喘息を有するか、または喘息を有する危険性を有し；そしてこの被験体は、新生児であるかまたは１〜５歳、５〜１０歳、または１０〜１８歳の間である。
【００２１】
（詳細な説明）
本発明は、少なくとも一部、本明細書中で「マルチマー化ポリペプチド」、「マルチマー化ドメイン」または「マルチマー化デバイス」として参照されるマルチマー化をもたらすペプチド配列の同定に基づく。本発明のマルチマー化ポリペプチドは、オリゴマー形成をもたらす。例えば、第二の分子（例えば、異種ポリペプチド配列）に融合される場合、マルチマー化ポリペプチドは、そのポリペプチドの中でのダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、もしくはそれより高次のオリゴマーまたはそれらの混合物の形成を容易にする。そのような本発明のマルチマー化ポリペプチドは、種々の診断用途または治療用途において有用である。例えば、結合タンパク質（例えば、抗体のような抗原結合タンパク質）に、マルチマー化ポリペプチドを融合することは、オリゴマー形成を介する抗原結合部位の数を増加させるために用いられ得る。抗原結合部位の数を増加させることは、次いで、抗原に対する抗体のアビディティを増加させ、このことは、任意の治療的または診断的抗体適用において、特に、抗体アビディティを増加させることが望まれるかまたはそれが有利である適用において有用である。完全なヒトマルチマー化抗体またはヒト化マルチマー化した抗体は、非ヒト化抗体と比較して減少したヒトにおける免疫原性を減少するか、または免疫原性が存在しない。
【００２２】
分子に結合したマルチマー化ポリペプチドは、任意の分子間でマルチマーが形成されることを可能にする。言い換えると、このオリゴマーは、例えば、２つ以上の分子の同じタンパク質の（例えば、ホモダイマー、ホモトリマー、ホモテトラマー、またはそれ以上に高次のオリゴマー）または２つ以上の異なる（すなわち、非同一の）タンパク質の混合物（例えば、ヘテロダイマー、ヘテロトリマー、ヘテロテトラマーまたはそれ以上に多いオリゴマー）を含み得る。例えば、オリゴマー抗体は、同じ抗体を含んでも、２つ以上の異なる抗体（これらの各々は、２つ以上の（例えば、２つ以上のエピトープに結合する）機能または活性を有する）を含んでもよい。そのようなヘテロオリゴマーはまた、このオリゴマーを含むタンパク質の多機能に起因して、多機能性オリゴマー（例えば、適切な、二機能性、三機能性、四機能性など）として参照され、そして種々の診断適用および治療的適用において有用である。例えば、２つ以上の異なる抗体を含む多機能オリゴマーは、多機能抗体を使用することが所望される適用において有用である。特に、多機能抗体は、細胞表面レセプターに結合する抗体およびこのレセプターを保有する細胞が殺傷のための標的化されるように補体カスケードを媒介する抗体を含み得る。このオリゴマーの特異的な機能は、本願に基づき、当業者により決定される。
【００２３】
従って、本発明によれば、マルチマー形成をもたらすマルチマー化ポリペプチドが提供される。１つの実施形態において、マルチマー化ポリペプチドは、配列番号１〜７；配列番号９〜３７；配列番号１５４〜１６３に示されるアミノ酸配列のいずれかより選択される。他の実施形態において、マルチマー化ポリペプチドは、配列番号１〜７；配列番号９〜３７；配列番号１５４〜１６３に示されるアミノ酸配列に対して３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を有し、ただし、このマルチマー化ポリペプチドは、マルチマー化をもたらす。さらなる実施形態において、マルチマー化ポリペプチドは、ヘテロダイマーもしくはホモダイマー、ヘテロトリマーもしくはホモトリマー、ヘテロテトラマーもしくはホモテトラマー、ヘテロペンタマーもしくはホモペンタマー、ヘテロヘキサマーもしくはホモヘキサマー、またはより高次のオリゴマーおよびこれらの混合物の形成をもたらす。なおさらなる実施形態において、マルチマー化ポリペプチドは、ヘテロダイマーもしくはホモダイマー、ヘテロトリマーもしくはホモトリマー、ヘテロテトラマーもしくはホモテトラマーまたはより高次のオリゴマーを形成し得るヒトペプチドの配列に基づく、完全なヒトポリペプチドまたはヒト化ポリペプチドから作製される配列である。
【００２４】
マルチマー化ポリペプチドおよびマルチマー化ポリペプチドをコードする核酸は、異種ポリペプチドに融合されない場合、既知の野生型ロイシンジッパー配列とは別個である。従って、本発明のマルチマー化ポリペプチドは、当該分野において公知である野生型ロイシンジッパードメイン配列（例えば、天然に存在するＧＣＮ４、ＡＴＦａ、ＡＴＦ−７（ＡＴＦαにおけるコイルド−コイルドメインと１００％同一である）、ＡＴＦ−２、環状ＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質Ｐａ（ＣＲＥＢ−Ｐａ）、ＪＵＮ−ＤおよびＣ−ＪＵＮ）を含まない。本発明のマルチマー化ポリペプチドはまた、ＷＯ  ９６／３７６２１に記載されるマルチマー化デバイス（ヒトｐ５３、ＰＦ４、ＴＳＰ−４、ＣＯＭＰ、トロンボスポンジン、ｄＴＡＦＩＩ４２、ｄＴＡＦＩＩ３１、ｄＴＡＦＩＩ６２、ｄＴＡＦＩＩ８０、ヒストン３およびヒストン４由来の野生型配列）とは異なる。
【００２５】
本発明のマルチマー化ポリペプチドは、任意の長さのものであり得るが、ただし、これらは、マルチマー化をもたらし得る。特定の実施形態において、マルチマー化ポリペプチドは、少なくとも１１アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも１８アミノ酸長、少なくとも２２アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも２９アミノ酸長、少なくとも３１アミノ酸長の配列を有する。さらなる特定の実施形態において、マルチマー化ポリペプチドは、ほぼ１００アミノ酸長より短い配列、ほぼ７５アミノ酸長より短い配列、およびほぼ５０アミノ酸長より短い配列を有する。
【００２６】
本発明はまた、異種ポリペプチドに融合されたマルチマー化ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを提供する。そのようなキメラポリペプチドは、マルチマー化ポリペプチドを介してオリゴマー（マルチマー）を形成する。１つの実施形態において、キメラポリペプチドは、配列番号１〜７；配列番号９〜３７；配列番号１５４〜１６３に示されるアミノ酸配列のいずれかより選択されるマルチマー化ポリペプチドを含む。他の実施形態において、キメラポリペプチドは、配列番号１〜７；配列番号９〜３７；配列番号１５４〜１６３に示されるアミノ酸配列に対して３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を有するマルチマー化ポリペプチドを含み、ただし、このキメラポリペプチドは、マルチマーを形成する。さらなる実施形態において、キメラポリペプチドは、ヘテロダイマーもしくはホモダイマー、ヘテロトリマーもしくはホモトリマー、ヘテロテトラマーもしくはホモテトラマー、ヘテロペンタマーもしくはホモペンタマー、ヘテロヘキサマーもしくはホモヘキサマー、またはより高次のオリゴマーおよびこれらの混合物を形成する。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、用語「マルチマー」およびその文法的バリエーションは、２つ以上の別個の分子間でのオリゴマー複合体の形成を示す。ポリペプチドの参照において用いられる場合（例えば、「ポリペプチドマルチマー」）、これは、それ自体を用いて（ホモマルチマー）または他の分子を用いて（ヘテロマルチマー）より高次のオリゴマーを形成することを意味する。マルチマー化をもたらすポリペプチドとは、適切な条件下で、それ自体を用いる（ホモオリゴマー）かまたは１つ以上の他の異なるタンパク質を用いる（へテロオリゴマー）、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマーまたは任意のより高次のオリゴマーの形成をもたらし得るアミノ酸配列を意味する。例えば、異種ポリペプチドに融合されたマルチマー化ポリペプチドを含むキメラポリペプチドはまた、マルチマー化ポリペプチド部分と相互作用し得るドメインを有する、それ自体または異なるタンパク質を用いて、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマーまたは任意のより高次のオリゴマーを形成し得る。従って、マルチマーは、さらに、共有結合または非共有結合を介して直接的または間接的のいずれかで結合された一価またはオリゴマー（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなど）キメラポリペプチドを含む。
【００２８】
このマルチマー化ポリペプチドは、共有結合（例えば、化学的架橋剤）を介して異種ポリペプチドに直接的に連結され得る。あるいは、マルチマー化ポリペプチドは、リンカー配列（例えば、抗体ヒンジ配列のようなペプチド配列）を介して異種ポリペプチドに結合され得る。任意ではあるが、必要に応じたリンカーの包含は、このマルチマー化ポリペプチドが、異種ポリペプチドの機能をブロックしないことおよびこの異種ポリペプチドが、マルチマー化機能をブロックしないことを確かにする。従って、リンカーにより、マルチマー中の各々の抗原結合ドメインが、抗原に結合するに十分に可撓性になる。
【００２９】
リンカーの１つの特定の例は、免疫グロブリンヒンジ配列（例えば、ＩｇＧまたＩｇＤ）である。マルチマー化ドメイン同様に、リンカーアミノ酸配列は、本明細書中で示されるような、改変されていないかまたは改変された、完全なヒトアミノ酸配列、ヒト化アミノ酸配列、または非ヒトアミノ酸配列であり得る。完全なヒトリンカー配列またはヒト化リンカー配列は、特に治療目的において有用であり得る。
【００３０】
異種ポリペプチドに融合されたマルチマー化ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを含む本発明の組成物は、既知のネイティブの（すなわち、天然に存在する）タンパク質およびマルチマー化ポリペプチド配列を含む組換えタンパク質とは異なる。例えば、酵母ベースのタンパク質ＧＣＮ４−ＬＩドメインに融合されたｓｃＦｖ（これは、四価ｓｃＦｖを形成する（Ｐａｃｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４６：２８（１９９５））およびｊｕｎおよびｆｏｓ由来の野生型ロイシンジッパードメインに融合されたｓｃＦｖ（米国特許第５，９１０，５７３号）は、異種ポリペプチドに融合されたマルチマー化ポリペプチドを含むキメラポリペプチドと異なる。本発明のキメラポリペプチドは、当該分野で公知のマルチマー化配列を含み得るが、ただし、これらのキメラポリペプチドは、マルチマーを形成し、そして当該分野において公知のマルチマー化配列を含む公知のタンパク質とは異なる。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「異種」とは、ポリペプチドに対する参照において用いられる場合、このポリペプチドが、天然の環境において他のポリペプチドと通常にないように連続していることを意味する。従って、異種ポリペプチドに融合されたマルチマー化ポリペプチドを含む本発明のキメラポリペプチドとは、そのマルチマー化ポリペプチドが、正常な細胞において、その異種ポリペプチドと融合して存在しないことを意味する。言い換えると、異種ポリペプチドに融合されたマルチマー化ポリペプチドを含むキメラポリペプチドは、通常、天然には存在しない分子である。すなわち、そのような分子は、例えば、人工的に産生される（例えば、組換えＤＮＡ技術を介して人工的に産生される）。
【００３２】
用語「融合」とは、２つ以上の分子（例えば、ポリペプチド）に関して使用される場合、これらの分子が共有結合で結合されるかまたは連結されることを意味する。分子を結合する任意の方法が、企図される。従って、このマルチマーと、これが結合される分子との間の連結の化学的性質は、限定されない。２つのタンパク質配列の連結についての特定の例は、アミド結合またはその等価物である。
【００３３】
用語「キメラ」およびその文法的バリエーションは、タンパク質に関して使用される場合、そのタンパク質が２つ以上の異なるタンパク質（すなわち、非同一タンパク質）由来の、１つ以上のアミノ酸残基を含むことを意味する。２つ以上の異なるタンパク質由来のアミノ酸を含むキメラの特定の例は、マルチマー化ポリペプチド、および異種性ポリペプチドを含む。３つ以上の異なるタンパク質由来のアミノ酸残基を含むキメラの特定の例は、マルチマー化ポリペプチド、リンカー（例えば、ヒンジ）、および異種性ポリペプチドを含むポリペプチドである。
【００３４】
理論により束縛されることを所望しないが、マルチマー化をもたらすアミノ酸配列は、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、水素結合または電荷−電荷結合を介したタンパク質−タンパク質結合を媒介する。分子が互いに共有結合で連結される場合、これら分子はまた、オリゴマーを形成し得る。例えば、化学的に合成されるか、インビトロで翻訳されるか、または細胞もしくはサンプルから単離もしくは精製される、２つの異なるタンパク質は、非アミド結合を介して一緒に化学的に架橋されて、オリゴマーを形成し得る。従って、別個の実体として存在し、そして非共有結合性相互作用を介してはオリゴマーを形成しないが共有結合を介して一緒に合わせられた２つの分子もまた、マルチマーであるとみなされる。従って、本発明のオリゴマーまたはマルチマー（例えば、ヘテロダイマーもしくはホモダイマー、ヘテロトリマーもしくはホモトリマー、ヘテロテトラマーもしくはホモテトラマー、ヘテロペンタマーもしくはホモペンタマー、ヘテロヘキサマーもしくはホモヘキサマーなど）は、共有結合、非共有結合、またはそれらの混在を介して形成され得る。
【００３５】
コイルドコイルドメインは、７残基反復配列（ヘプタッド（ｈｅｐｔａｄ）反復）（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）によって特徴付けられる、両親媒性αヘリックスと、位置ａおよび位置ｄ（位置１および位置４）での優勢な疎水性残基、ならびに一般的に他のいずれかの極性残基との相互作用から構成される（Ｈａｒｂｕｒｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１（１９９３））。ロイシンジッパードメインは、代表的にヘプタッド反復のうちのｄ位置にロイシンを有する、コイルドコイルドメインである。天然に存在するコイルドコイルドメインは、代表的に、複数のヘプタッド反復、例えば、３つ以上の配列（（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）１−（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）２−（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）３など）から構成される。略号「（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）ｎ」とは、単に、半分の長さ（３〜４アミノ酸）または全長（７アミノ酸）の、２つ以上のさらなるヘプタッド反復配列をいい、ここで、各々の半分の長さの反復または全長（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ．）の反復は、同一のアミノ酸配列を有する必要はない（例えば、表３Ａおよび３Ｂを参照のこと）。
【００３６】
一般的に、反復配列のａ位置およびｄ位置での疎水性残基の性質は、その特定のマルチマー性状態を決定する。さらに、ａ残基およびｄ残基の所定の対で、このマルチマー化状態は変動し得、そしてｂ位置、ｃ位置、ｅ位置、ｆ位置およびｇ位置での配列によって影響され得る。これらの規則は、酵母タンパク質ＧＣＮ４中のコイルドコイルドメインと、ほんの２９％から５０％のみの同一性を有するコイルドコイル配列にすら、あてはまる。
【００３７】
ロイシンおよびイソロイシンが、本明細書中で開示されるような位置ａおよび位置ｄにある場合、ダイマーまたはトリマーまたはテトラマーまたはペンタマーが生じる。具体的には、テトラマーは、ＡＴＦα−ＬＩドメイン、ＡＴＦ１−ＬＩドメイン、ＡＴＦ２−ＬＩドメイン、ＣＪＵＮ−ＬＩドメイン、ＪＵＮＤ−ＬＩドメインおよびＣＲＥＢ−ＬＩドメインによって示されるように、位置ａにロイシンそして位置ｄにイソロイシンを有するコイルドコイル配列から生じるようである。位置ａにイソロイシン、そして位置ｄにロイシンを有するコイルドコイル配列は、ダイマー（例えば、ＣＲＥＢ−ＩＬ、ＣＪＵＮ−ＩＬおよびＡＴＦ２−ＩＬ）、ＡＴＦα−ＩＬのようなテトラマー、またはＡＴＦ１−ＩＬのようなダイマーを形成し得る。位置ａおよび位置ｄの両方にロイシンを有する場合、トリマーまたはテトラマーのいずれかが生じる。例えば、ＡＴＦα−ＬＬ、ＡＴＦ１−ＬＬおよびＣＪＵＮ−ＬＬはトリマーを形成し、そしてＡＴＦ２−ＬＬおよびＣＲＥＢ−ＬＬの両方はテトラマーを形成する。位置ａおよび位置ｄの両方にイソロイシンを有するコイルドコイルは、トリマーを形成する傾向を有する；例えば、ＡＴＦα−ＩＩおよびＡＴＦ１−ＩＩはトリマーを形成する。疎水性コア（位置ｂ、位置ｃ、位置ｅ、位置ｆおよび位置ｇ）の外側のアミノ酸が、ヘリックス内水素結合およびヘリックス間水素結合、ならびに塩橋の網（ｎｅｔｗｏｒｋ）を作製することによって、コイルドコイルのマルチマー化状態を調節し得るので、これらのマルチマー形態が存在する。この親水性結合の網は、これが最適な相対位置（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）に向かう傾向にあるように、ヘリックスの相対的な方向を変更し、結果的にマルチマー化状態に対して観察される作用を生じる。従って、マルチマー化状態を調節するために、個々のｂ位置、ｃ位置、ｅ位置、ｆ位置およびｇ位置での１つまたは２〜３の残基を変更することは、文脈に依存性の様式において可能である。
【００３８】
バリンがａ位置およびｄ位置でイソロイシンまたはロイシンのいずれかと対合される場合、得られるマルチマー化ポリペプチドは、不安定である傾向にあるが、ダイマーおよびトリマーの混合物形成を与え得る。例えば、ＪＵＮ−Ｄのコイルドコイルドメイン（アミノ酸２４９〜２８０）は、ＡＴＦαドメインと４８％の同一性を有し（表３Ｂ）、これを本発明に従って改変した。ＪＵＮＤ−ＬＩはトリマーを形成し、そしてＪＵＮＤ−ＬＬはダイマーを形成する（表８）。同様に、Ｃ−ＪＵＮのコイルドコイルドメイン（アミノ酸２７７〜３０８）はＡＴＦαドメインと３９％の同一性を有する。Ｃ−ＪＵＮ−ＬＩは、テトラマーを形成し、Ｃ−ＪＵＮ−ＬＬはトリマーを形成し、そしてＣ−ＪＵＮ−ＩＬはダイマーを形成する（表８）。
【００３９】
一般的に、２つ以上の（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ．）ヘプタッド反復配列を有するマルチマー化ドメインは、ａ位置およびｄ位置に、ロイシン、イソロイシンまたはバリン以外のアミノ酸を許容する。例えば、４つのヘプタッド反復配列において、ａ位置およびｄ位置のうちの１つ以上は、ロイシン、イソロイシンまたはバリン以外のアミノ酸であり得る。例えば、１つの親水性残基が、少なくとも３つのヘプタッド反復を含む配列におけるａ位置またはｄ位置に挿入されて、マルチマー化状態を調節し得る。従って、本発明は所定のヘプタッド反復配列中のａ位置およびｄ位置が、ロイシン、イソロイシンまたはバリン以外のアミノ酸であり得る。マルチマー化ポリペプチドを含む。さらに、マルチマーを構成するモノマーの間の結合強度（または、本明細書中で安定性または緊密さ（ｔｉｇｈｔｎｅｓｓ）とも言われる）は、（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ．）ヘプタッド反復配列を改変することによって変更され得る。例えば、ａ残基およびｄ残基の全体の相互作用層を、水素結合を介して相互作用し得る残基で置き換えることであり、例えば、ａおよびｄはグルタミンによって置きかえられ得る：ＣＦＹ１９６Ｑ：
【００４０】
【化１】
2005522192.tif 000003
。従って、本発明は、ａ位置、ｂ位置、ｃ位置、ｄ位置、ｅ位置、ｆ位置およびｇ位置がマルチマー化状態を変更するように、そしてマルチマー間の結合強度を増加または低下するように改変され得る、マルチマー化ポリペプチドを含む。
【００４１】
コイルドコイル配列に由来するマルチマードメインの各々は、モノマー、ダイマー、トリマー、テトラマーまたはそれより高いマルチマーの混合物として存在し得る。主要なマルチマー形態（その質量の５０％以上を構成する）は、設計されたマルチマー形態である。例えば、マルチマーが設計されたテトラマーである場合、少なくとも５０％の質量がテトラマー形態をとる。
【００４２】
本発明のマルチマー化ポリペプチドの特定の例としては、例えば、配列番号１〜７；配列番号９〜３７；および配列番号１５４〜１６３に挙げられる。さらなるマルチマー化ポリペプチドは、推定のコイルドコイル配列をアッセイすることによって同定され得、この配列は、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で公知のような、慣用的な検出アッセイを使用して、オリゴマー形成のために１つ以上のヘプタッド反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）からなる（実施例６を参照のこと）。ヘプタッド反復（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含む配列（ここで、１つ以上の位置ａおよび位置ｄはロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかである）は、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーの形成を可能にする条件下でインキュベートされ得る。
【００４３】
例えば、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質−Ｐａのロイシンジッパードメイン（ＣＲＥＢ−Ｐａ、アミノ酸３９３〜４２４）は、ＡＴＦαロイシンジッパードメイン配列と７４％の配列同一性を有する（表３Ｃ）。ＣＲＥＢ−Ｐａロイシンジッパードメインの改変体のＣＲＥＢ−ＬＬおよびＣＲＥＢ−ＬＩは、テトラマーを形成し、そしてＣＲＥＢ−ＩＬはダイマーを形成した（表８）。ＡＴＦ−１ロイシンジッパードメイン（アミノ酸２３８〜２６９）は、ＡＴＦαロイシンジッパードメイン配列と２９％の同一性を有する。ＡＴＦ−Ｉロイシンジッパードメインの改変体のＡＴＦ１−ＬＩはテトラマーを形成し；ＡＴＦ１−ＩＬ、ＡＴＦ１−ＬＬおよびＡＴＦ１−ＩＩはトリマーを形成する（表８）。
【００４４】
さらなるマルチマー化ドメインは、野生型コイルドコイルドメインを最初に同定することによって作製され得る。例えば、５つのロイシンジッパードメインを、公的データベースを検索することによって同定した（表３Ｂ）。これらのドメインは、ＡＴＦαロイシンジッパードメインに対して３２％〜７７％の同一性を示し、そしてＧＣＮ４ロイシンジッパードメインに対しては５０％未満の同一性を示した（表３Ｃ）。位置ａおよび位置ｄでの野生型残基を、ロイシンまたはイソロイシンで置き換えた（表３Ｄ）。本発明に従って改変され得る、さらなるコイルドコイルドメインとしては、例えば、肺表面活性物質（ｌｕｎｇ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）Ｄタンパク質、テトラネクチンおよびマンノース結合タンパク質のような３つおよび４つのヘリックスの束（ｂｕｎｄｌｅ）；ならびにそれぞれ、ＲＯＰ、シトクロムＢ５６２、およびテトラブラキオンストーク（ｔｅｔｒａｂｒａｃｈｉｏｎ  ｓｔａｌｋ）が挙げられる。
【００４５】
従って、他のマルチマー化ドメインは、配列データベースとの比較によって同定され得、そして本明細書中に記載されるように配列を変異誘発し得る。例えば、１つ以上のコイルドコイルを形成する配列は、タンパク質データベースから選択され得る（例えば、ＧＥＮ−ＢＡＮＫ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）およびイソロイシン、ロイシンまたはバリンを、その配列のマルチマー化状態を変更するために、ヘプタッド反復配列のうちの1つ以上のａ位置またはｄ位置に導入され得る。マルチマー化状態は、本明細書中に記載されるアッセイを使用して決定され得る（実施例６）。必要に応じて、このヘプタッド反復配列は、位置ｂ、位置ｃ、位置ｅ、位置ｆおよび位置ｇでの１つ以上の点変異、付加または欠失で置換され得、この場合、付加変異は、形成されるマルチマーの状態を調節または安定化するように、すなわち形成されるマルチマーの型（例えば、トリマー  対  テトラマー）を変更するようにか、またはマルチマーを形成するモノマーの間の結合強度を調節するように、選択される。従って、１つ以上の位置ｂ、位置ｃ、位置ｅ、位置ｆおよび位置ｇは、単独で改変され得るか、または１つ以上のａ位置またはｄ位置での改変と組み合わせて改変され得る。
【００４６】
このような変異の特定の例としては、（例えば、４つのヘリックスの束のうちのｅ位置とｇ位置との間での）さらなるヘリックス内水素結合またはヘリックス内塩橋を作製する改変が挙げられる。これらの変異はまた、このドメイン表面上の親水性結合網に対する変更の効果を考慮することにより選択され得る。親水性結合網の調査は、一般的に予想可能であるが、マルチマー状態は、本明細書中に記載されるマルチマー化アッセイを使用して確認され得る（実施例６）。
【００４７】
マルチマー化状態が改変によって増大する場合、例えば、改変された配列がダイマーの代わりにトリマーもしくはテトラマー、またはより高い数のオリゴマーを形成する場合、位置ｂ、位置ｃ、位置ｅ、位置ｆおよび位置ｇでの１つ以上の疎水性残基が、適切な疎水性境界（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）の形成を促進するように置換されて（実施例１２）、マルチマーの緊密さまたは安定性を増大することが、所望され得る。ヘリックス形成は、そのヘリックスの直前および直後の残基に少なくとも部分的に依存するので、マルチマーの安定性または緊密さを改善するために、１つ以上の残基がヘリックスのＮ末端もしくはＣ末端に追加され得るか、またはヘプタッド反復配列の組のＮ末端もしくはＣ末端に追加され得る。「緊密さ」または「安定性」を増大または改善することの句は、形成されるマルチマーがその構成物質のモノマーへと解離する可能性がより少ないことを意味する。マルチマーの緊密さまたは安定性一般的な概算は、沈降速度研究において作成されたピークの幅の狭さまたは広さによって評価され得る。緊密さまたは安定性はまた、例えば、形成されたマルチマーを、同時に円偏光二色性をモニタリングしながら解離することによって、アッセイされ得る。このような改変の特定の例は、末端セリンの追加である（実施例１１）。
【００４８】
従って、本発明は、１つ以上の７残基コイルドコイル、またはロイシンジッパー反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含む、マルチマー化ポリペプチドを作製する方法を提供する。１つの実施形態において、１つの方法は、コイルドコイル配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むポリペプチドを作製する工程を包含し、ここで、位置ａおよび位置ｄはロイシンまたはイソロイシンのいずれかで置き換えられ、これによってダイマー形成、トリマー形成、テトラマー形成またはペンタマー形成を与えるマルチマー化ポリペプチドを作製する。別の実施形態において、１つの方法は、コイルドコイル配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を作製する工程を包含し、ここで、位置ａまたは位置ｄは、バリンおよび、ロイシンまたはイソロイシンまたはバリンのいずれかで置き換えられ、これによってダイマー形成およびテトラマー形成を与えるマルチマー化ポリペプチドを作製する。なお別の実施形態において、１つの方法は、コイルドコイル配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を合成する工程を包含し、ここで、位置ａおよび位置ｄはロイシンまたはイソロイシンまたはバリンのいずれかであって、ダイマー形成、トリマー形成またはテトラマー形成を与えるマルチマー化ポリペプチドを作製する。さらに別の実施形態において、１つの方法は、コイルドコイル配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を合成する工程を包含し、ここで、位置ａまたは位置ｄは、バリンおよび、ロイシンまたはイソロイシンのいずれかであって、ダイマー形成およびテトラマー形成を与えるマルチマー化ポリペプチドを作製する。さらなる実施形態において、複数の（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）の反復がある場合、位置ａまたは位置ｄは、ロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかが優勢であるように（例えば、５０％より多い）置き換えられる。さらなる実施形態において、１つ以上の位置ｂ、位置ｃ、位置ｅ、位置ｆおよび位置ｇは、例えば１つ以上の疎水性残基が親水性残基で置換される。なおさらなる実施形態において、１つ以上のアミノ酸が、マルチマー化ドメインのＮ末端またはＣ末端に追加されるか、またはそのドメイン内のヘプタッド反復に隣接して追加される。
【００４９】
本発明はまた、コイルドコイル配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むマルチマー化ポリペプチドを同定する方法を提供し、ここで、位置ａまたは位置ｄは、ロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかである。１つの実施形態において、１つの方法は、コイルドコイル配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）（ここで、位置ａまたは位置ｄは、ロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかである）を含むポリペプチドを、ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーの形成を可能にする条件下でインキュベートする工程、およびこのポリペプチドのホモマルチマーまたはヘテロマルチマーの存在についてアッセイする工程を包含する。ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーの形成は、このポリペプチドを、マルチマー化ポリペプチドとして識別する。種々の局面において、複数の（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）の反復がある場合、位置ａまたは位置ｄは、ロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかが優勢である。別の局面において、ポリペプチドはコイルドコイル配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むポリペプチドと融合された異種性ポリペプチドを含む。別の局面において、ポリペプチドは、異種性ポリペプチドと、コイルドコイル配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）を含むポリペプチドとの間に、リンカーを含む。なお別の局面において、検出されるホモマルチマーまたはヘテロマルチマーは、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマーまたはより高い数のオリゴマーである。
【００５０】
用語「タンパク質」「ポリペプチド」および「ペプチド」は、アミド結合またはその等価物を介して共有結合で連結された、２つ以上の連続するアミノ酸（または「残基」ともいわれる）を言及するために本明細書中で交換可能に使用される。タンパク質は、無制限の長さであり、そしてＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸、およびその混合物からなり得る。アミノ酸は、非天然化学結合および非アミド化学結合によって連結され、これら結合は、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、またはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて形成される結合を含む。非アミド結合としては、例えば、ケトメチレン、アミノメチレン、オレフィン、エステル、チオエステルなどが挙げられる（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ（１９８３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、７巻、２６７−３５７頁「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ、ＮＹを参照のこと）。
【００５１】
ポリペプチドは、分子のアミノ末端とカルボキシ末端との間の末端対末端のアミド結合、または分子間ジスルフィド結合もしくは分子内ジスルフィド結合のような、１つ以上の環構造を有し得る。ポリペプチドは、インビトロまたはインビボで改変され得、例えば、糖残基、リン酸基、ユビキチン、脂肪酸または脂質を含むように、例えば翻訳後修飾され得る。ポリペプチドはさらに、アミノ酸構造アナログおよびアミノ酸機能アナログ、例えば、合成または非天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログを含む、ペプチド模倣物を含む。
【００５２】
用語「抗体」は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）を介して、他の分子（抗原）に結合するタンパク質をいう。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む。これらの抗体は、インタクトな免疫グロブリン分子（２つの全長重鎖が、２つの全長の軽鎖にジスルフィド結合によって連結されている）、および抗原のエピトープに結合する免疫グロブリン分子の（定常領域を有するかまたは有さない）部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）（すなわち、フラグメント）、または抗原のエピトープに結合する免疫グロブリン分子の（定常領域を有するかまたは有さない）その部分配列（すなわち、フラグメント）であり得る。抗体は、全長の重鎖可変ドメインおよび全長の軽鎖可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）を、個々にまたは任意の組み合わせで含み得る。
【００５３】
ポリペプチド配列は、細胞発現またはインビトロ翻訳を介した、ポリペプチドをコードする核酸の組換えＤＮＡ技術、または当該分野で公知の方法を使用した、ポリペプチド鎖の化学合成を使用して作製され得る。抗体および部分配列は、組換え産生された、抗体をコードする核酸（例えば、ハイブリドーマ細胞から単離されたポリヌクレオチドまたは天然に存在する抗体遺伝子もしくは合成抗体遺伝子のライブラリーから選択されたポリヌクレオチド）から発現され得る（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９９９；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら、Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．１１７：１１０７５（１９９５）；Ｇｒａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６（１９９２）を参照のこと）。ポリペプチド配列はまた、化学合成機によって作製され得る（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡを参照のこと）。
【００５４】
用語「多機能性」とは、２つ以上の活性または機能（例えば、二機能性、三機能性、四機能性など）を有することが言及される組成を意味する。例えば、多機能性ポリペプチドは、２つ以上の抗原結合部位、酵素活性、リガンドまたはレセプター結合、毒性などを有する。同様に、多機能性オリゴマーは、各々が少なくとも１つの機能または活性（例えば、抗原結合および酵素活性、リガンド結合またはレセプター結合、毒性など）を有する２つ以上のポリペプチドの混合物を含む。
【００５５】
特定の抗原に結合し、かつ酵素活性（例えば、ルシフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼなど）と結合されたポリペプチドを有する抗体は、二機能性抗体の１つの具体的な例である。抗原を結合する以外、そして酵素活性に加えた多機能性オリゴマーの候補機能としては、例えば、以下が挙げられる：検出可能なドメイン（例えば、免疫グロブリン、Ｔ７配列およびポリヒスチジンアミノ酸配列）、毒性（例えば、リシン、コレラ、百日咳）、細胞表面タンパク質（例えば、レセプター）、リガンド（基質、アゴニストおよびアンタゴニスト）、接着タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、アビジン、レクチン）、増殖因子、分化因子、走化性因子、および酵素前駆体（ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）。
【００５６】
多機能性マルチマーはさらに、多重特異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）構成（例えば、二重特異的構成、三重特異的構成、四重特異的構成など）を含み得る。用語「多重特異的」とは、異なる抗原性エピトープに結合する抗原結合性ポリペプチド（例えば、抗体）を意味する。これら異なるエピトープは、同一の抗原上または異なる抗原上に存在し得る。例えば、多重特異的抗体オリゴマーは、各々が異なるエピトープの結合特異性を有する、２つ以上の抗体の混合物を含む。多重特異的オリゴマーは、個々の抗原結合性ポリペプチドから構成され得、その各々のポリペプチドが異なる可変領域を有する。例えば、抗原結合性ポリペプチドのうちの１つのオリゴマーは、２つの可変領域を有し得、その各々の可変領域が異なるエピトープを認識する。
【００５７】
多機能性ポリペプチドは、選択された分子（これらは、合成手段によってかまたはそのポリペプチドをコードする核酸の発現によって作製されている）の化学的架橋を介して作製され得るか、あるいはポリペプチドのインビトロ発現または細胞内発現と、それに続くオリゴマー化を組み合せた組換えＤＮＡ技術を介して、作製され得る。多重特異的抗体は、同様に、組換え技術および発現（異なるエピトープ特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマの融合、または単一細胞中で異なるエピトープを有する抗体可変鎖をコードする複合的な核酸の発現）を介して作製され得る。
【００５８】
二重特異的抗体の特定の例を、図６Ａおよび６Ｂに例示する。ＣＲＥＢ−ＩＬ多重化ポリペプチドを、２つの異なる抗体由来のＦａｂを連結する分子の中央に配置して、４価結合性抗体を作製する。トリマー形成またはテトラマー形成を与えるマルチマー化ポリペプチドを使用して、それぞれ６価分子または８価分子を作製する。二重特異的タンパク質中のＦａｂ部分は、異なる特異性を有し得る。可撓性リンカー（例えば、ヒンジ）の配列を使用して、各々のタンパク質のＦａｂ部分を併せ得る。この例示の二重特異的抗体ポリペプチドは、１つのトリシストロン性（ｔｒｉｓｉｓｔｒｏｎｉｃ）ＲＮＡ分子から作製され得る（図６Ｂ）。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「部分配列」または「フラグメント」とは、全長の分子の一部を意味する。例えば、多重化ポリペプチドの部分配列は、１以上のアミノ酸であり全長のポリペプチド未満の長さ（例えば、１つ以上の内部アミノ酸またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかからの末端アミノ酸の欠失）である。従って、部分配列は、全長までの任意の長さの分子であり得る。
【００６０】
抗体部分配列の特定の例としては、例えば、異種性ドメインがＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントまたは単鎖抗体（ＳＣＡ）フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）を含む、キメラポリペプチドである。部分配列は、その全長配列の機能または活性の少なくとも一部を保持する部分を含む。例えば、抗体部分配列は、この抗体部分配列の結合親和性がその全長抗体の結合親和性よりも高くてもまたは低くても、抗原に選択的に結合する能力を保持する。
【００６１】
抗体部分配列のために、抗体全体のペプシン消化またはパパイン消化を使用して、抗体フラグメントを調製し得る。特に、Ｆａｂフラグメントは抗体分子の１価の抗原結合性フラグメントからなり、そして酵素パパインを用いた抗体分子全体の消化によって作製されて、インタクトな軽鎖および重鎖の一部分からなるフラグメントを生じ得る。抗体の（Ｆａｂ’）２フラグメントは、酵素ペプシンを用いて抗体分子全体を処理することによって（その後の還元なしに）取得され得る。抗体分子のＦａｂ’フラグメントは、チオール還元剤を用いる還元によって、（Ｆａｂ’）２フラグメントから取得され得、これはインタクトな軽鎖および重鎖の一部分からなる分子を生じる。この様式で処理された１つの抗体あたり２つのＦａｂ’フラグメントが取得される。
【００６２】
Ｆｖフラグメントは、２つの鎖として発現される、軽鎖ＶＬの可変領域および重鎖ＶＨの可変領域を含む、１つのフラグメントである。この会合は、例えば、化学的架橋剤または分子内ジスルフィド結合のような、非共有結合であっても、共有結合であっても良い（Ｉｎｂａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９（１９７２）；Ｓａｎｄｈｕ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｘ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２））。
【００６３】
単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、軽鎖ＶＬの可変領域および重鎖ＶＨの可変領域を含む、遺伝子的に操作された抗体、または酵素的に消化された抗体であり、可撓性リンカー（例えば、ポリペプチド配列）によってＶＬ−リンカー−ＶＨ方向、またはＶＨ−リンカー−ＶＬ方向のいずれかで連結される。あるいは、単鎖Ｆｖフラグメントは、２つのシステイン残基の間のジスルフィド連結を介して２つの可変ドメインを連結することによって作製され得る。ｓｃＦｖ抗体を作製するための方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７（１９９１）；米国特許第４，９４６，７７８号；およびＰａｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１（１９９３）によって記載される。抗体部分配列を作製する他の方法（例えば、重鎖を分離して１価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成すること、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的技術、化学的技術もしくは遺伝子的技術）もまた、この部分配列が、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する条件で、使用され得る。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、用語「結合」または「結合する」とは、組成物が互いに対して親和性を有するように言及されたことを意味する。「特異的な結合」は、その結合が２つの分子間で選択的である場合である。特異的な結合の具体例は、抗体と抗原との間に生じる結合である。代表的に、特異的な結合は、その解離定数（ＫＤ）が約１×１０−５Ｍ未満または約１×１０−６Ｍ未満または約１×１０−７Ｍである場合、非特異的な結合と区別され得る。特異的な結合は、例えばＥＬＩＳＡ、免疫沈降、共沈（化学的架橋を有するかまたは有さない）、ツーハイブリッドアッセイなどによって、検出され得る。適切なコントロールを使用して、「特異的」結合と「非特異的」結合との間を区別し得る。
【００６５】
全長の抗体、部分配列抗体（例えば、単鎖形態抗体）または改変形態抗体、完全ヒト抗体、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体または非ヒト抗体はモノマーの抗原結合活性の少なくとも一部を保持する、ヘテロマーもしくはホモマーの、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマーまたは任意のより高い数のオリゴマーとして、存在し得る。抗体マルチマーは、異なる抗体のオリゴマー性（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなど）の組み合せを含み、これらは多重特異的（二重特異的、三重特異的、四重特異的など）または多機能性（例えば、二機能性、三機能性、四機能性など）である、
本発明はさらに、リンカーポリペプチド配列を提供する。本発明のリンカー配列を、異種性ポリペプチドに融合してキメラポリペプチドを形成し得る。１つの実施形態において、リンカーは、免疫グロブリン由来のヒンジ領域の一部分を含み得る。１つの局面において、リンカーは、ヒト免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンに由来するか、またはこれらを基に模られる（ｍｏｄｅｌ）。特定の局面において、リンカー配列は、以下のいずれかに記載されるアミノ酸配列から選択される、免疫グロブリンのヒンジ領域の一部分を含む：配列番号４３（Ｄ３０）、配列番号４４（Ｄ３５）、配列番号４５（ＥＤ）、配列番号４６（ＥＤＣ）、または配列番号４７（Ｄ６３）。さらに特定の局面において、リンカー配列は、約２〜２０アミノ酸、約５〜１０アミノ酸、約１０〜３０アミノ酸、約２５〜５０アミノ酸、約３０〜６０アミノ酸、約５０〜７５アミノ酸のアミノ酸配列を含む。さらに特定の局面において、リンカー配列は、２〜２０アミノ酸、約５〜１０アミノ酸、約１０〜３０アミノ酸、約２５〜５０アミノ酸、約３０〜６０アミノ酸、約５０〜７５アミノ酸、約７５〜１００アミノ酸のアミノ酸配列を含み、そしてこれらは以下のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含む：配列番号４３（Ｄ３０）、配列番号４４（Ｄ３５）、配列番号４５（ＥＤ）、配列番号４６（ＥＤＣ）、または配列番号４７（Ｄ６３）。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「リンカー」または「スペーサー」は、２つ以上の分子を互いに連結する分子または分子の群をいう。互いに連結された２つの分子の間の可撓性のリンカーは、１つ以上の分子の十分な自由回転を可能にし、その結果、分子は、互いの機能をブロックしない。例えば、リンカー（例えば、マルチマー化ポリペプチドとキメラポリペプチド（例えば、ヒト化抗体）の異種ポリペプチドとの間に位置するアミノ酸配列）によって、抗体は、オリゴマー中のほかのマルチマーからの有意な立体的干渉なく抗原に結合し得る。
【００６７】
従って、本発明はまた、マルチマー化ポリペプチドと異種ポリペプチドとの間にリンカーポリペプチドをさらに含む異種ポリペプチドに融合されたマルチマー化ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを提供する。異種配列に融合されたリンカー配列を含むキメラポリペプチドもまた提供される。
【００６８】
本発明のポリペプチド（マルチマー化ポリペプチド、キメラポリペプチドオリゴマーおよびリンカー）は、１つ以上のアミノ酸置換を有する配列、付加を有する配列または欠失を有する配列（すなわち、部分配列）のような改変型を含み、但し、この改変は、機能を破壊しない。従って、用語「改変」は、改変された分子の活性または機能を破壊しない分子の変更を示す。従って、形成されたオリゴマーは、親和性の減少に起因して安定性がより低く、例えば、トリマーではなくダイマー、テトラマーではなくトリマーを形成する、などの場合でさえも、改変されたマルチマー化ポリペプチドは、例えば、少なくとも部分的にオリゴマーを形成する能力を保持する。改変された異種ポリペプチドは、ポリペプチドに関連する１つ以上の機能または活性（例えば、タンパク質結合活性、酵素活性、リガンド活性、核酸結合活性、増殖制御活性、細胞分化活性、または走化性活性）の少なくとも一部を保持する。例えば、改変された抗体配列（例えば、１つ以上のアミノ酸付加または挿入を有する抗体部分配列または抗体）を含むキメラポリペプチドは、抗原結合能力を少なくとも一部保持する。
【００６９】
従って、改変は、例えば、アミノ酸の付加、挿入、欠失および置換を含む。付加の例は、１つ以上のアミノ酸が、マルチマー化ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加される場合である。挿入の例としては、アミノ酸が配列に挿入される場合である。欠失の例は、１つ以上のアミノ酸が、Ｎ末端またはＣ末端、あるいは配列内の内側から除去される場合である。
【００７０】
改変は、改変された分子の活性または機能を改善し得るかまたは異なる機能を提供し得る。例えば、マルチマー化ポリペプチドの親和性は、ヘプタッド反復配列の全て、または一部（例えば、ハーフターン）の付加によって増加され得る。ヘプタッド反復配列またはヘプタッド反復配列の一部の付加はまた、オリゴマーをダイマー形成からトリマー形成またはテトラマー形成に変化し得る。
【００７１】
例示的なマルチマー化ポリペプチドは、例えば、配列番号１〜７；配列番号９〜３７；および配列番号１５４〜１６３に示され、各々は、ヘプタッド反復配列の４個半を含む（表３Ａを参照のこと）。従って、これらおよび他のヘプタッド含有配列が、改変され得る。例えば、全長ヘプタッド反復配列（７アミノ酸）または半分のヘプタッド反復配列（モチーフの３〜４アミノ酸）が、追加され得る。
【００７２】
あるいは、マルチマー化ポリペプチドを短くすることが所望され得、この場合、１つ以上のアミノ酸残基が、マルチマー化機能を破壊することなくマルチマー化ポリペプチドから除去され得る。従って、本発明のマルチマー化ポリペプチドは、配列番号１〜７；配列番号９〜３７；および配列番号１５４〜１６３に示される例示的マルチマー化ポリペプチドを含み、例えば、半分のヘプタッド反復（３〜４アミノ酸）または全長ヘプタッド反復（７アミノ酸）を除去するように改変され得る。
【００７３】
例示的アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。用語「保存的置換」は、生物学的または化学的に類似する残基による１つのアミノ酸の置換を意味する。生物学的に類似とは、置換が、生物学的活性（例えば、マルチマー化ポリペプチド、オリゴマー形成）に影響を及ぼさないことを意味する。保存的置換の特定の例としては、別の残基を１つの疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）で置換すること、別の残基を１つの極性残基で置換すること（例えば、リジンをアルギニンで置換すること、アスパラギン酸をグルタミン酸で置換すること、またはアスパラギンをグルタミンで置換すること、トレオニンをセリンで置換することなど）が挙げられる。
【００７４】
１つの実施形態において、マルチマー化ポリペプチドは、１〜３、３〜５または５〜１０のアミノ酸置換を有し、但し、コイルドコイルヘプタッド反復配列（ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ）の位置ａ（１）またはｄ（４）は、ロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかであり、そして置換ポリペプチドは、マルチマー化し得る。１つの局面において、複数のヘプタッド反復配列が存在する場合、位置ａおよびｄは、優先的にロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかである。別の局面において、マルチマー化ポリペプチドは、例えば、位置ｂ，ｃ，ｅ，ｆ，またはｇで、１〜３、３〜５または５〜１０のアミノ酸置換を有し、形成するマルチマーの型を調節するかまたは、形成されたマルチマーの安定性または剛性を維持する。なお別の局面において、１つ以上のアミノ酸置換は、保存性アミノ酸置換である。なお別の局面において、置換は、ヒトアミノ酸を有する。
【００７５】
改変はまた、誘導体化された配列（例えば、遊離アミノ基が、アミン塩酸塩、アミンｐ−トルエンスルホニル基、アミンカルボベンゾキシ基を形成し；遊離カルボキシル基が、塩、メチルエステルおよびエチルエステルを形成し；遊離ヒドロキシル基が、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を形成するアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸誘導体（例えば、プロリンに対する４−ヒドロキシプロリン、リジンに対する５−ヒドロキシリジン、セリンに対するホモセリン、リジンに対するオルニチン、など）を含む。共有結合（例えば、それによって環状ポリペプチドを生成する、２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合）を付与する改変もまた含まれる。改変は、当該分野で周知の種々の方法のいずれかを使用して生成され得る（例えば、ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発、欠失変異誘発および挿入突然変異誘発、化学的改変および突然変異誘発、化学的架橋など）。
【００７６】
改変はまた、タグ（例えば、ポリヒスチジン、Ｔ７、免疫グロブリンなど）、金粒子（マルチマー化ペプチド、キメラポリペプチドまたはオリゴマーに共有結合または非共有結合される）のような機能性実体の追加を含む。従って、本発明は、改変されないポリペプチドの１つ以上の活性（例えば、マルチマー活性、抗原結合活性などの少なくとも一部を保持する）を有する改変されたポリペプチドを提供する。改変は、分子に結合されるかまたは分子に組込まれた、放射性および非放射性の検出可能な標識を含む。
【００７７】
用語「同一」または「同一性」は、２つ以上の参照された実体が同じであることを意味する。従って、２つのポリペプチドが同一である場合、これらは、同じアミノ酸配列を有する。「同一の領域」は、２つ以上の参照された実体の一部が同一であることを意味する。従って、２つのポリペプチド配列は、これらの配列の１つ以上の部分にわたって同一である場合、これらは、これらの領域において同一性を共有する。用語「実質的に同一」は、同一性が構造的または機能的に有意であることを意味する。すなわち、同一性は、たとえ分子が異なっていても分子が構造的に同一であるかまたは同じ機能（例えば、生物学的機能）を行うようなものである。構造的および機能的に関連するタンパク質の間の配列保存の量の変化に起因して、実質的な同一性を有する分子に対する配列同一性の量は、領域／ドメインの型およびその機能に依存する。核酸配列に対して、５０％以上の配列相同性は、実質的な同一性を構成し得る。タンパク質についての実質的相同性は、有意により低くあってもよく、例えば、３０％配列相同性程度に小さくてもよいが、代表的には例えば、５０％、６０％、７５％、８５％以上である。
【００７８】
２つの配列間の同一性の程度は、当該分野で公知の種々のコンピュータープログラムおよび数学的アルゴリズムを使用して確認され得る。％配列同一性（相同性）を計算するこのようなアルゴリズムは、一般的に、比較領域にわたる配列ギャップおよびミスマッチを説明する。例えば、ＢＬＡＳＴ（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）検索アルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）を参照のこと、ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮＣＢＩを介して公的に入手可能）は、以下のような例示的検索パラメーターを有する：Ｍｉｓｍａｔｃｈ  −２；ギャップ開放５；ギャップ伸長２。ポリペプチド配列比較について、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、代表的にスコア付けマトリクス（例えば、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ２５０、ＢＬＯＳＵＭ６２など）と共に使用される。
【００７９】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、本発明の組成物（例えば、マルチマー化ポリペプチド、キメラ、リンカー、抗体、部分配列、改変形態、これらをコードする核酸、細胞、ベクターなど）の改変因子として使用される場合、この組成物が、人の手によって作製され、天然に存在するインビボ環境から分離されることを意味する。一般的に、そのように分離された組成物は、例えば１つ以上のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜と、本来通常に関連する、実質的に１つ以上の物質を含まない。「単離された」ポリペプチドはまた、本来通常に関連する物質のほとんどまたは全てを含まない場合、「実質的に純粋」であり得る。従って、実質的に純粋でもある単離されたポリペプチドは、何百万もの他の配列（例えば、抗体ライブラリーの抗体またはゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー中の核酸）の中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含まない。純度は、少なくとも約６０重量％以上であり得る。純度はまた、約７０％または８０％以上であり得、そしてより大きく、例えば、９０％以上であり得る。純度は、任意の適切な方法（例えば、ＵＶ分光法、質量分光法、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、気相）、ゲル電気泳動（例えば、銀染色またはクマシー染色）および配列分析（核酸およびペプチド））によって決定され得る。
【００８０】
本発明はまた、本発明のポリペプチド（マルチマー化ポリペプチド、キメラ、リンカー、部分配列、改変形態およびこれらのマルチマーを含む）をコードする核酸を提供する。種々の実施形態において、核酸は、配列番号１〜７；配列番号９〜３７；または配列番号１５４〜１６３に示されるポリペプチドをコードする。さらなる実施形態において、核酸は、（配列番号１〜３６；および配列番号１５４〜１６３）のいずれかに示される配列を含むキメラポリペプチド、異種度面に融合されたキメラポリペプチドをコードする。別の実施形態において、核酸配列は、（配列番号４３（Ｄ３０）、配列番号４４（Ｄ３５）、配列番号４５（ＥＤ）、配列番号４６（ＥＤＣ）、または配列番号４７（Ｄ６３））をコードする。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「核酸」は、リン酸ジエステル結合または等価物によって結合される、少なくとも２つ以上のリボ核酸塩基対またはデオキシリボ核酸塩基対をいう。核酸は、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオシドを含む。核酸は、一本鎖、二本鎖または三本鎖の環状または線型分子を含む。核酸分子は、ヌクレオチド含有分子のいずれかの群に、排他的に属しても、またはこれらの混合物中に属してもよく、これらは、核酸分子の以下の群によって例示されるが、これらに限定されない：ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノム核酸、非ゲノム核酸、天然に存在する核酸および天然に存在しない核酸ならびに合成核酸。これは、例として、任意の細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）に関連する核酸、リボソームＲＮＡ、および天然に存在する成分と共に天然に存在しない１つ以上の成分から化学的に構成される核酸分子が挙げられる。
【００８２】
さらに、「核酸分子」は、アミノ酸および糖によって例示されるがこれらに限定されない、１つ以上の非ヌクレオチドベースの成分を、一部含み得る。従って、例として、一部ヌクレオチドベースであり、一部タンパク質ベースであるリボザイムは、「核酸分子」と考えられるが、これらに限定されない。
【００８３】
核酸は、任意の長さであり得る。核酸の長さは、代表的に、約２０〜１０Ｋｂ長、１０〜５Ｋｂ長、１〜５Ｋｂ以下長、１０００〜約５００塩基対長以下の範囲にある。核酸はまた、より短くあり得、例えば、１００〜約５００塩基対長、または約１２〜２５塩基対長、２５〜５０塩基対長、５０〜１００塩基対長、１００〜２５０塩基対長、または約２５０〜５００塩基対長であり得る。
【００８４】
遺伝コードの縮重の結果として、核酸は、（配列番号１〜７、配列番号９〜３７、配列番号１５４〜１６３、配列番号４３（Ｄ３０）、配列番号４４（Ｄ３５）、配列番号４５（ＥＤ）、配列番号４６（ＥＤＣ）、または配列番号４７（Ｄ６３））をコードする核酸に関する配列および部分配列縮重を含む。核酸はまた、表１、２および４に示される配列、これらに相補的である配列およびこれらの部分配列を含む。このような核酸は、サンプル（インビトロ、細胞、培養培地、組織または器官、血清、被験体において、など）中のキメラポリペプチドの存在または量を検出するためのハイブリダイゼーションに有用である。
【００８５】
本発明の核酸は、種々の標準的クローニング技術および化学的合成技術を使用して産生される。このような技術としては、１）ゲノムＤＮＡ標的またはｃＤＮＡ標的を用い、抗体配列にアニーリング可能なプライマー（例えば、縮重プライマー混合物）を使用する核酸増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；２）その核酸配列が、次いで、プラスミドにクローニングされ得、増殖され増幅され得、そして精製され得る核酸配列の化学合成および；３）関連配列に対するデータベースのコンピューター検索、が挙げられるがこれらに限定されない。核酸の純度は、配列決定、ゲル電気泳動などによって決定され得る。
【００８６】
本発明は、さらに、発現制御エレメントに作動可能に連結される、キメラポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結される」は、意図された様式で作動することを可能にするようにいわれるエレメント間の物理的関係または機能的関係をいう。従って、核酸に「作動可能に連結される」発現制御エレメントは、制御エレメントが転写を、そして適切な場合、転写物の翻訳を、調節することを意味する。
【００８７】
発現を制御するために、核酸に物理的に連結される必要はない。従って、物理的結合は、作動可能に連結されるエレメントに必要とされない。例えば、最小エレメントは、キメラのポリペプチドをコードする核酸に連結され得る。最小エレメントに「イントランス」で結合するように機能する、タンパク質をコードする、作動可能に連結された核酸の発現を制御する第２のエレメントは、キメラのポリペプチドの発現に影響し得る。第２のエレメントが、キメラのポリペプチドの発現を調節するので、この第２のエレメントは、キメラのポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結される。
【００８８】
用語「発現制御エレメント」は、作動可能に連結された核酸の発現に影響する核酸をいう。プロモーターおよびエンハンサーは、発現制御エレメントの特に非限定的な例である。「プロモーター配列」は、コード配列の下流（３’方向）の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列は、転写を開始するのに必要な最少数の塩基を含む。エンハンサーは、遺伝子発現を制御するが、作動可能に連結された遺伝子の転写開始部位から離れて機能し得る。エンハンサーはまた、遺伝子の５’末端または３’末端のいずれかで、そして遺伝子の内（例えば、イントロンまたはコード配列）で機能する。
【００８９】
発現制御エレメントは、「構成性」である様式で発現を付与し、その結果、作動可能に連結された核酸の転写は、シグナルまたは刺激の存在なしに生じる。発現制御エレメントは、「制御可能」である様式（つまりシグナルまたは刺激が、作動可能に連結された核酸の発現を上昇するかまたは減少する）で発現を付与し得る。シグナルまたは刺激に応じて、作動可能に連結された核酸の発現を増加する制御可能なエレメントはまた、「誘導性エレメント」といわれる。シグナルまたは刺激に応じて、作動可能に連結された核酸の発現を減少する制御可能なエレメントはまた、「抑制性エレメント」といわれる（すなわち、シグナルが、発現を減少し、その結果、シグナルが除去されるか存在しない場合、発現が増加する）。
【００９０】
発現制御エレメントは、特定の組織型または細胞型において活性なエレメントを含み、本明細書中では、「組織特異的発現制御エレメント」といわれる。組織特異的発現制御エレメントは、代表的に、特定の細胞または組織において活性である。なぜなら、これらは、特定の細胞型または組織型に特有である、転写活性化因子タンパク質または他の転写制御因子によって認識されるからである。
【００９１】
発現制御エレメントは、さらに、細胞周期または細胞分化の特定の段階で発現を付与するエレメントを含む。従って、本発明は、さらに、構成的、制御可能、組織特異的、細胞周期特異的、そして分化段階特異的発現を付与する、発現制御エレメントを含む。
【００９２】
発現制御エレメントは、全長核酸配列（例えば、ネイティブなプロモーターおよびエンハンサーエレメント）およびその部分配列またはヌクレオチド改変体（例えば、ネイティブ配列と異なる置換形態／変異形態または他の形態）を含み、この発現エレメントは、全長配列の全てもしくは一部を保持するか、または非改変体制御エレメントの機能（調節を付与する、例えば、シグナルまたは刺激に応じていくらかの誘導性を保持する）を保持する。
【００９３】
細菌系について、構成性プロモーター（例えば、Ｔ７など）および誘導性プロモーター（例えば、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター））が、使用され得る。昆虫細胞系において、構成性または誘導性プロモーター（例えば、エクジソン）が、使用され得る。酵母において、構成性または誘導性プロモーターが、使用され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，第１３章，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ編（１９８８）；Ｇｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，５１６−５４４（１９８７），Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ編，３１９８７，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第ＩＩ巻，第３章，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．（１９８６）；Ｂｉｔｔｅｒ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２，６７３−６８４（１９８７），Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ編，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；ならびにＳｔｒａｔｈｅｒｎら、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（１９８２）を参照のこと）。構成性酵母プロモーター（ＡＤＨまたはＬＵＥ２）または誘導性プロモーター（例えば、ＧＡＬ）が、使用され得る（Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ：ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第ｌｌ巻，第３章，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．（１９８６））。
【００９４】
哺乳動物細胞について、ウイルスまたは他の起源の構成性プロモーターが、使用され得る。例えば、ＳＶ４０、またはウイルス長い末端反復（ＬＴＲ）など、あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来する誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネインＩＩＡプロモーター；熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント）あるいは哺乳動物のウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；誘導性マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲ）が、発現のために使用され得る。
【００９５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸が、インビトロ、エキソビボまたはインビボでの組換えＤＮＡ技術によって導入された、形質転換細胞およびその子孫を提供する。形質転換細胞およびその子孫は、増殖され、導入された核酸は、転写されるか、またはコードされるタンパク質が、発現される。子孫細胞が、親細胞と同一ではなくてもよいことが理解される。なぜなら、複製の間に生じる変異が存在し得るからである。形質転換細胞としては、原核生物細胞および真核生物細胞（例えば、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞（例えば、ヒトを含む哺乳動物細胞））が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、培地、細胞、組織または器官に、エキソビボで存在してもよいし、あるいは被験体に存在してもよい。
【００９６】
用語「形質転換された」は、細胞に対して外来性である核酸（例えば、導入遺伝子）の組み込みの後での、細胞中の遺伝子的変化を意味する。従って、「形質転換細胞」は、核酸分子が、組換えＤＮＡ技術によって導入された細胞または子孫である。細胞形質転換は、本明細書中に記載されるように実施されても、当該分野で公知の技術を使用して実施されてもよい。従って、核酸を含む細胞および本発明のキメラのポリペプチドを発現する細胞を産生する方法もまた、提供される。
【００９７】
代表的な細胞形質転換は、ベクターを使用する。用語「ベクター」は、例えば、プラスミド、ウイルス（例えば、ウイルスベクター）、または当該分野で公知の他のビヒクルをいい、これらは、遺伝子操作のための、核酸の挿入または組込みによって操作され得る（「クローニングベクター」）か、あるいは挿入された核酸を転写または翻訳するために使用され得る（「発現ベクター」）。このようなベクターは、核酸（発現制御エレメントに作動可能に連結されたキメラのポリペプチドをコードし、そのコードされたタンパク質をインビトロ（例えば、溶液中または固相中）、細胞中またはインビボで発現する核酸を含む）を導入するために有用である。
【００９８】
ベクターは、一般的に、細胞での増殖のための複製起点を少なくとも含む。ベクター内に存在する制御エレメント（本明細書中に示されるような発現制御エレメントを含む）が、転写および翻訳を容易にするために含まれる。用語「発現制御エレメント」は、存在が発現に影響し得る１つ以上の成分を最低限含むことを意図され、そしてプロモーターまたはエンハンサー以外にまたはそれに加えて、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列、多重遺伝子の作製のための内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメント、ポリシストロン性、メッセージ、イントロンに対するスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にする、遺伝子の正しいリーティングフレームの維持、目的の遺伝子の転写物の適切なポリアデニル化を提供するためのポリアデニル化シグナル、ストップコドンなどの成分を含み得る。
【００９９】
ベクターは、選択マーカーを含み得る。当該分野で公知であるように、「選択マーカー」は、遺伝子を含む細胞の選択を可能にする遺伝子を意味する。「ポジティブな選択」は、それによって、ポジティブな選択への曝露の際に、選択マーカーを含む細胞のみが、生存するプロセスをいう。薬物耐性は、ポジティブな選択マーカーの１つの例であり；このマーカーを含む細胞は、選択薬物を含む培養培地中で生存し、一方このマーカーを含まない細胞は、死滅する。このようなマーカーとしては、特に、薬物耐性遺伝子（例えば、ｎｅｏ（これは、Ｇ４１８に対する耐性を付与する）、ｈｙｇｒ（ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）、またはｐｕｒｏ（ピューロマイシンに対する耐性を付与する）が挙げられる。他のポジティグな選択マーカー遺伝子は、マーカーを含む細胞の同定またはスクリーニングを可能にする遺伝子を含む。これらの遺伝子としては、特に、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対する遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、および表面マーカー（例えば、ＣＤ８）が挙げられる。
【０１００】
ベクターは、ネガティブな選択マーカーを含み得る。「ネガティブな選択」は、それによって、適切なネガティブな選択薬剤への曝露の際に、ネガティブな選択マーカーを含む細胞が、死滅するプロセスをいう。例えば、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））を含む細胞は、薬物ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）に対して感受性である。同様に、ｇｐｔ遺伝子は、細胞を６−チオキサンチンに対して感受性にする。
【０１０１】
さらなる選択系が、使用され得、これらとしては、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２６（１９６２））およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる選択可能な遺伝子（すなわち、ｔｒｐＢ（これは、細胞が、トリプトファンの代わりにインドールを使用することを可能にする）；ｈｉｓＤ（これは、細胞が、ヒスチジンの代わりにヒスチノールを使用することを可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８０４７（１９８８））；およびＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（オルニチンデカルボキシラーゼインヒビター（２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ））に対する耐性を付与する））（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ（１９８７）：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，編）が、記載されている。
【０１０２】
細胞中での核酸の導入および発現のために改変されたウイルスベクターに基づくベクターとしては、レトロウイルスゲノム、アデノ随伴ウイルスゲノム、アデノウイルスゲノム、レオウイルスゲノム、レンチウイルスゲノム、ロータウイルスゲノム、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルスなどのようなベクターが挙げられる（Ｃｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９（１９８４）；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｌｕｚｍａｎ編，１９８２；Ｓａｒｖｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：４８６（１９８１））。発現に有用なさらなるウイルスベクターとしては、パルボウイルス、ロータウイルス、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルスおよびラブドウイルス、トガウイルス（例えば、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス）ならびに水疱性口内炎ウイルスが挙げられる。
【０１０３】
哺乳動物発現系は、さらに、インビボ発現およびエキソビボ発現のために特に設計されたベクターを含む。このような系としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（米国特許第５，６０４，０９０号）（これは、ヒトおよびマウスにおいて、治療の利益に十分なレベルで、第ＩＸ因子の発現を提供することが示された）（Ｋａｙら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２５７（２０００）；Ｎａｋａｉら、Ｂｌｏｏｄ  ９１：４６００（１９９８））。アデノウイルスベクター（米国特許第５，７００，４７０号、同第５，７３１，１７２号および同第５，９２８，９４４号）、単純疱疹ウイルス（米国特許第５，５０１，９７９号）およびレトロウイルス（例えば、レンチウイルスベクターは、分裂性および非分裂性の細胞および泡沫状ウイルスに感染するために有用である）ベクター（米国特許第５，６２４，８２０号、同第５，６９３，５０８号、同第５，６６５，５７７号、同第６，０１３，５１６号および同第５，６７４，７０３号ならびにＷＩＰＯ公報ＷＯ９２／０５２６６およびＷＯ９２／１４８２９）およびパピローマウイルスベクター（例えば、ヒトおよびウシパピローマウイルス）は全て、遺伝子治療において使用されてきた（米国特許第５，７１９，０５４号）。ベクターはまた、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベースのベクター（米国特許第５，５６１，０６３号）を含む。胃腸管の細胞に対して遺伝子を効率的に送達するベクターが、開発されており、これらもまた、使用され得る（例えば、米国特許第５，８２１，２３５号、同第５，７８６，３４０号および同第６，１１０，４５６号を参照のこと）。
【０１０４】
酵母では、染色体への外来核酸配列の組込みを促進するべクター（例えば、相同組換えを介して）は、当該分野で公知であり、そして使用され得る。挿入される核酸が、より従来式のベクターに対して長すぎる（例えば、約１２ｋｂより長い）場合、酵母人工染色体（ＹＡＣ）が代表的に使用される。
【０１０５】
ヒト化抗体をコードする核酸およびヒト化抗体の標的細胞中への導入はまた、当該分野で公知の従来法（例えば、浸透圧ショック（例えば、リン酸カルシウム）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合など）によって実施され得る。インビトロ、エキソビソおよびインビボでの核酸およびポリペプチドの導入はまた、他の技術を用いて達成され得る。例えば、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、エチレン−ビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、あるいはラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、またはエチレンビニルアセテートコポリマーのようなポリマー物質。核酸は、コアセルベーション技術によってか、または界面重合によって（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル、またはポリ（メチルメタクロレート（ｍｅｔｈａｃｒｏｌａｔｅ））マイクロカプセルの使用によって）調製されるマイクロカプセル中にか、あるいはコロイド薬物送達系中に取り込まれ得る。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、および脂質ベースの系（水中油乳濁液、ミセル、混合ミセル、およびリポソーム）が挙げられる。
【０１０６】
種々の組成物（核酸を含む）の細胞中への導入のためのリポソームの使用は、当業者に公知である（例えば、米国特許第４，８４４，９０４号、同第５，０００，９５９号、同第４，８６３，７４０号、および同第４，９７５，２８２号を参照のこと）。ＷＯ  ９４／２００７８および米国特許第６，０９６，２９１号に記載される天然ポリマーあるいは天然ポリマーの誘導体または加水分解物を含むキャリアは、分子（例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の粘膜送達に適切である。遺伝子治療に有用なピペラジンベースの両親媒性（ａｍｐｈｉｌｉｃ）カチオン性脂質もまた、公知である（例えば、米国特許第５，８６１，３９７号を参照のこと）。カチオン性脂質系もまた、公知である（例えば、米国特許第５，４５９，１２７号を参照のこと）。従って、インビトロ、インビボおよびエキソビソでの、細胞または組織への送達のウイルスベクター手段および非ウイルスベクター手段が包含される。
【０１０７】
本発明はさらに、適切な包装材料中に梱包された本発明の１つ以上の組成物（薬学的処方物を含む）を含むキットを提供する。１つの実施形態において、キットは、キメラポリペプチドあるいはそのヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーを含む。別の実施形態において、キットは、キメラポリペプチドをコードする核酸を含む。さらなる実施形態において、この核酸は、細胞内での発現をもたらす発現制御エレメントをさらに含む；発現ベクター；ウイルス発現ベクター；アデノ随伴ウイルス発現ベクター；アデノウイルス発現ベクター；およびレトルウイルス発現ベクター。
【０１０８】
さらなる実施形態において、キットは、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで、細胞内でキメラポリペプチド（例えば、ヒト化抗体）またはキメラポリペプチドをコードする核酸を発現させるための指示書を含む標識または包装挿入物を備える。なおさらなる実施形態において、キットは、被験体（例えば、喘息を有するか、または喘息を有する危険性のある被験体）をキメラポリペプチド（例えば、ヒト化抗体）またはキメラポリペプチドをコードする核酸を用いてインビボまたはエキソビボで処置するための指示書を含む標識または装挿入物を備える。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、用語「包装材料」は、キットの成分を収容する物理的構造物をいう。包装材料は、これらの成分を無菌的に維持し、そしてこのような目的のために一般的に使用される材料（例えば、紙、段ボール繊維、ガラス、プラスチック、箔、アンプルなど）で製造され得る。標識または装挿入物は、適切な指示書（例えば、本発明の方法（例えば、ＨＲＶ感染またはＲＳＶ感染あるいは風邪を処置する工程）を実施する工程）を含み得る。従って、本発明のキットは、本発明の方法においてキットの成分を使用するための指示書をさらに含み得る。
【０１１０】
指示書は、本明細書中に記載される本発明の任意の方法を実施するための指示書を含み得る。従って、本発明の薬学的組成物は、被験体への投与のための指示書とともに容器、パック、またはディスペンサー中に含まれ得る。指示書はさらに、満足できる臨床終末点または起こり得る任意の有害な症状、あるいはヒト被験体における使用について食品医薬品局により求められるさらなる情報の指示を含み得る。
【０１１１】
この指示書は、「印刷物」上（例えば、キット内の紙もしくは厚紙上、キットもしくは包装材料に貼られた標識上、またはキットの成分を含むバイアルもしくはチューブに貼られた標識上）に存在し得る。指示書は、音声録音またはビデオテープを含み得、そしてさらにコンピュータ読み取り可能媒体（例えば、ディスク（フロッピー（登録商標）ディスクまたはハードディスク）、光学的ＣＤ（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭまたはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ）、磁気テープ、電気的記録媒体（例えば、ＲＯＭおよびＲＡＭ）ならびにこれらのハイブリッド（例えば、磁気／光学記録媒体）上に含まれ得る。
【０１１２】
本発明のキットはさらに、緩衝剤、保存剤、またはタンパク質／核酸安定化剤を含み得る。このキットはまた、活性についてアッセイするためのコントロール成分（例えば、コントロールサンプルまたは標準）を含み得る。このキットの各成分は、別個の容器内にか、または混合物で封入され得、そして種々の容器は全て、単一の包装または複数の包装中に存在し得る。例えば、本発明の組成物は、被験体の喉、鼻腔または副鼻腔へこの組成物をスプレーするためにハードポンプ容器または加圧（例えば、エアロゾル）容器中に梱包され得る。
【０１１３】
本発明の分子（マルチマー化ポリペプチド、キメラ、マルチマー形態、改変形態、およびポリペプチドをコードする核酸を含む）は、薬学的組成物中に組み込まれ得る。このような薬学的組成物は、インビボまたはエキソビボでの被験体への投与のため、および本発明のポリペプチドを用いて処置可能な生理学的障害または状態に対する治療を提供するために有用である。
【０１１４】
薬学的組成物は、「薬学的に受容可能」かつ「生理学的に受容可能」なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能」および「生理学的に受容可能」は、薬学的投与に適合性の、溶媒（水性または非水性）、溶液、乳濁液、分散媒体、コーティング、等張剤および吸収促進剤または吸収遅延剤を含む。このような処方物は、液体；乳濁液、懸濁液、シロップまたはエリキシル、あるいは固体形態；錠剤（コーティングされるかまたはコーティングされない）、カプセル（硬質または軟質）、粉末、顆粒、結晶、またはマイクロビーズ中に含まれ得る。補助的な活性化合物（例えば、保存剤、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤）もまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０１１５】
薬学的組成物は、特定の局所的または全身的な投与経路に適合性であるように処方され得る。従って、薬学的組成物は、特定の経路による投与に適切なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む。
【０１１６】
本発明の組成物のための投与経路の特定の非限定的例は、吸入または鼻腔内送達である。さらなる経路としては、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与および直腸投与）が挙げられる。
【０１１７】
非経口、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用の水、生理食塩水溶液、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート）および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調整され得る。
【０１１８】
注射用の薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤、および滅菌注射可能溶液または分散剤の即席調製のための滅菌散剤を含む。静脈内投与について、滅菌キャリアとしては、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。このキャリアは、溶媒または分散媒体であり得、例えば、以下が挙げられる：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適切な混合物。例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、流動性が維持され得る。抗菌剤および抗真菌剤としては、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールが挙げられる。等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウム）が、この組成物中に含まれ得る。吸収を遅延する薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含むことは、注射可能組成物の吸収を延長し得る。
【０１１９】
滅菌注射可能溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物を上記成分の１つまたは組み合わせて取り込み、次いで濾過滅菌することによって、調製され得る。一般に、分散剤は、ベースの分散媒体および上記のような他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を取り込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌散剤の場合、調製方法としては、例えば、以前に滅菌濾過されたその溶液から、活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥が挙げられる。
【０１２０】
経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるべき障壁に適切な浸透剤が、処方物中に使用される。このような浸透剤は、当該分野で一般に公知であり、経粘膜投与について、例えば、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレー、吸入デバイス（例えば、吸入器）または坐剤の使用を介して達成され得る。経皮投与について、活性化合物は、当該分野で一般に公知の軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリーム中に処方される。
【０１２１】
本発明のポリペプチドおよびこれらをコードする核酸は、身体からの迅速な排出に対して防御するキャリア（例えば、制御放出処方物または時間遅延物質（例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルステアレート））を用いて調製され得る。これらの組成物はまた、局所的または全身的な持続送達または制御放出を達成するために、移植物およびマイクロカプセル化送達システムを使用して、送達され得る。
【０１２２】
生物分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸）が使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者に明らかである。これらの物質はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入され得る。リポソーム懸濁物（抗体またはウイルス被覆タンパク質を使用して細胞または組織に標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、当業者に公知の方法（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載される）に従って調製され得る。
【０１２３】
本発明の方法における投与のための組成物に適切なさらなる薬学的処方物が、当該分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ；Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（１９９６）第１２版，Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，ＮＪ；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．，（１９９３）を参照のこと）。
【０１２４】
薬学的処方物は、投与の容易さおよび投薬の均一性のために、投薬単位形態にパッケージされ得る。「投薬単位形態」は、本明細書中で使用する場合、処置されるべき被験体についての単一投薬として適切な物理的に別個の単位をいい；各々の単位が、薬学的なキャリアまたは賦形剤と合わせて、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。
【０１２５】
本発明のマルチマー抗体は、細胞のウイルス感染に対して防御する抗体を含む。例えば、マルチマー化ポリペプチドと融合された、ＩＣＡＭ−１を結合する抗体は、ＨＲＶ感染から細胞を防御し得るマルチマーを形成する（図６および図７）。特に、ＣＦＹ１９６（Ｆａｂ−ＡＴＦα（１）ＬＩ＋Ｓ），ＣＦＹ１９７（Ｆａｂ−ＡＴＦα（３）ＩＬ）およびＣＦＹ１９３Ｂ（Ｆａｂ−ＡＴＦα（２）ＬＬ）は、ＨＲＶ感染に対して、最も高い防御効力を示した。
【０１２６】
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）はまた、ＩＣＡＭ−１を細胞感染のためのコレセプターとして利用するので、ＩＣＡＭ−１を結合し、そしてマルチマー化ポリペプチドと融合されてマルチマーを形成した抗体またはリガンドはまた、ＲＳＶ感染から細胞を防御し得る。従って、別の実施形態において、本発明は、細胞のＲＳＶ感染に対して防御する抗体マルチマーおよびリガンドマルチマーを提供する。
【０１２７】
本明細書中で使用される場合、用語「防御効力」は、実験条件（例えば、実施例６を参照のこと）下で、感受性細胞の５０％を感染から防御し得る抗体の量（すなわち、ＥＣ５０）である。例えば、ＲＳＶについて、ＥＣ５０での防御効力は、ＲＳＶ感染から、５０％の細胞を防御する抗体の量である。従って、別の抗体（例えば、非ヒト化抗体）よりも５倍高い防御効力を有する抗体は、感染からの同じ程度の防御をなお提供しつつ、他の抗体の５分の１の量で使用され得る。
【０１２８】
マルチマー抗体は、代表的には、モノマー対照物より強い防御効力を示す。１つの実施形態において、抗体マルチマーは、抗体モノマーより少なくとも２〜５倍強い防御効力を有する。別の実施形態において、抗体マルチマーは、抗体モノマーより少なくとも５〜１０倍強い防御効力を有する。なお別の実施形態において、抗体マルチマーは、抗体モノマーより少なくとも１０〜２０倍強い防御効力を有する。さらに別の実施形態において、抗体は、抗体モノマーより少なくとも２０〜３０倍（例えば、３０〜５０倍、５０〜１００倍、または１００〜１０００倍あるいはそれ以上）強い防御効力を有する。
【０１２９】
本発明のキメラポリペプチドは、ＩＣＡＭ−１に結合する抗体に融合されたマルチマー化ポリペプチドを含む。理論に束縛されることを望まないが、ＩＣＡＭ−１に結合する抗体は、ウイルスの結合または細胞に感染する能力もしくは細胞に侵入する能力を阻害し、それによって、ウイルスの感染もしくは増殖を阻害すると考えられる。従って、このような抗体は、ＩＣＡＭ−１に結合する病原体（例えば、ＲＳウイルスおよび他のウイルス（例えば、ＨＲＶおよびコクサッキー（ｃｏｘａｃｋｉｅ）Ａウイルス）、細菌、真菌および原生動物（例えば、マラリア）を阻害するために有用である。従って、マルチマー化抗体は、ＨＲＶ感染およびＲＳＶ感染を阻害するため、ならびにＩＣＡＭ−１レセプターが関与する任意の微生物および他の病原体を阻害するために、有用である。従って、本発明は、細胞の病原体感染を阻害するマルチマー化抗体（完全にかまたは部分的にヒト化された形態を含む）（ここで、感染は、少なくとも一部、ＩＣＡＭ−１に結合することによって媒介される）および細胞の病原体感染を阻害するための方法（ここで、感染は、少なくとも一部、ＩＣＡＭ−１に結合することによって媒介される）を提供する。
【０１３０】
１つの実施形態において、方法は、細胞のウイルス感染を阻害するのに充分な量の、ＩＣＡＭ−１に結合するマルチマー化抗体と、ウイルスまたは細胞とを接触させる工程を包含する。１つの局面において、マルチマー化抗体は、ヒト化されている。別の実施形態において、方法は、被験体のウイルス感染を阻害するのに充分な量の、ＩＣＡＭ−１に結合するマルチマー化抗体を被験体に投与する工程を包含する。種々の局面において、このウイルスは、ＲＳＶ、コクサッキーＡウイルスおよびＨＲＶである。なお別の実施形態において、方法は、病原体による被験体の感染を阻害するのに充分な量の、ＩＣＡＭ−１に結合するマルチマー化抗体を被験体に投与する工程を包含する。さらに別の実施形態において、方法は、感染の症状（例えば、風邪の症状）を回復させるのに充分な量の、ＩＣＡＭ−１に結合するマルチマー化抗体を被験体に投与する工程を包含する。
【０１３１】
本明細書中で使用される場合、用語「回復させる」は、状態（例えば、疾患の症状）に関して使用される場合、その状態の１つ以上の症状を低減することを意味する。例えば、風邪に伴う症状としては、発熱、頭痛、悪寒、くしゃみ、咳き、鬱血、咽頭痛、鼻水、筋肉痛、全身倦怠などが挙げられる。従って、風邪または風邪に関与する病原体（例えば、ＨＲＶ）を回復させることは、発熱、頭痛、悪寒、くしゃみ、咳き、鬱血、咽頭痛、鼻水、筋肉痛、全身倦怠などのうちの１つ以上を低減することを意味する。
【０１３２】
直接機能するかまたはＩＣＡＭ−１を介して間接的に機能する病原体の症状、複製または進行を阻害することに加えて、本発明のマルチマー化抗体は、所望されない状態（例えば、ＩＣＡＭ−１が役割を果たす疾患または障害）を処置するために使用され得る。例えば、ＩＣＡＭ−１とのＬＦＡ−１の相互作用は、炎症に関与する。本発明の抗体は、この相互作用を阻害し、それによって局所的炎症または全身的炎症を調節（例えば、低減）するために使用され得る。従って、別の実施形態において、方法は、炎症を低減または予防するのに十分なマルチマー化抗体を被験体に投与する工程を包含する。
【０１３３】
さらに、ＩＣＡＭ−１は、他の免疫応答経路、癌および転移において役割を果たす。従って、本発明の抗体は、臓器移植拒絶または自己免疫疾患あるいは癌または転移を、低減または予防するために、免疫応答を調整するために使用され得る。従って、本発明は、免疫応答性（例えば、炎症）およびＩＣＡＭ−１が関与する他の細胞プロセスを調節するマルチマー化抗体、ならびに免疫応答経路およびＩＣＡＭ−１が関与する他の細胞プロセスを調節するための方法を提供する。
【０１３４】
本発明はまた、感染を阻害するための方法（例えば、予防）、進行を阻害するための方法、または被験体の病原性感染を処置する方法を提供する。例えば、上気道からＲＳＶをブロックすることは、ＲＳＶの侵入を妨ぎ、従って、ＲＳＶが、下気道に侵入することを妨げる。ＩＣＡＭ−１結合分子は、被験体に、スプレーまたは滴剤（ｄｒｏｐ）として鼻腔内または口腔内に送達され得る。
【０１３５】
従って、１つの実施形態において、方法は、ＲＳＶ感染を有するかまたはＨＲＶ感染を有する危険性のある被験体に、被験体のＲＳＶ感染を阻害するか、その進行を阻害するか、またはＲＳＶ感染を処置するために充分な量のマルチマー化抗体を投与する工程を包含する。別の実施形態において、方法は、コクサッキーＡウイルス感染もしくはＨＲＶウイルス感染を有するかまたはそれを有する危険性のある被験体に、被験体のコクサッキーＡウイルス感染もしくはＨＲＶ感染を阻害するか、その進行を阻害するか、またはこれらを処置するために充分な量のマルチマー化抗体を投与する工程を包含する。なお別の実施形態において、方法は、マラリアを有するかまたはマラリアを有する危険性のある被験体に、被験体の感染を阻害するか、その進行を阻害するか、またはそれを処置するのに充分な量のマルチマー化抗体を投与する工程を包含する。
【０１３６】
本発明はさらに、（例えば、ＲＳＶ、コクサッキーＡウイルス、ＨＲＶまたはマラリアによって引き起こされる）病原体感染の１つ以上の症状を低減または阻害する（すなわち、回復させる）方法を提供する。１つの実施形態において、方法は、ＲＳＶ、コクサッキーＡウイルス、ＨＳＶまたはマラリアに関連する１つ以上の症状を有する被験体に、被験体におけるＲＳＶ、コクサッキーＡウイルス、ＨＲＶまたはマラリアに関連する１つ以上の症状を低減または阻害するのに充分な量のマルチマー化抗体を投与する工程を包含する。低減または阻害される症状としては、例えば、ＲＳＶについて、肺炎、発熱、気管支炎、および上気道感染のうち１つ以上；コクサッキーＡウイルスについて、発熱、頭痛、悪寒、くしゃみ、咳き、鬱血、咽頭痛などのうちの１つ以上；マラリアについて、発熱、悪寒、肝臓の肥大、貧血のうちの１つ以上が挙げられる。
【０１３７】
別の実施形態において、方法は、肺炎、発熱、気管支炎、または上気道感染を有する被験体に、被験体における肺炎、発熱、気管支炎、または上気道感染の１つ以上の症状を低減または阻害するのに充分な量のマルチマー化抗体を投与する工程を包含する。１つの局面において、ヒト化抗体は、局所的に投与される。別の局面において、マルチマー化抗体は、吸入を介してか、または鼻腔内に投与される。なお別の局面において、被験体は、喘息を有するかまたは喘息を有する危険性がある。
【０１３８】
本発明の方法は、感染前（すなわち、予防）または感染後、感染の急性の症状または慢性的な症状、もしくは生理学的状態もしくは疾患の進行の前または後に実施され得る（例えば、器官移植前）。症状の進行の前または直後に組成物を投与することは、被験体における症状の重篤度を低減する。被験体における症状の進行の前に組成物を投与することは、被験体の感染性を減少させ得、それによって、感染した被験体から他の被験体が感染する可能性を減少させる。
【０１３９】
用語「被験体」は、動物のことをいい、代表的には哺乳動物である（例えば、非ヒト霊長類（サル、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、マカク）、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）（イヌおよびネコ）、家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）（ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）およびヒト）。ヒト被験体としては、成人、および小児（例えば、新生児およびそれより上の（例えば、１歳〜５歳の間、５歳〜１０歳の間および１０歳〜１８歳の間））が挙げられる。ヒト被験体は、ウイルス（例えば、ＨＲＶまたはＲＳＶ）感染を有しているか、または有する危険性のあるヒト被験体および１種類以上の感染症状を発症するヒト被験体を含み得る。ヒト被験体としては、喘息を有しているか、または有する危険性のあるヒト被験体が挙げられ、急性喘息発作が起きる前または受けた後に、慢性的な喘息に罹患している喘息患者が含まれる。被験体は、本発明のヒト化抗体のインビボでの効果の試験ための疾患モデル動物（例えば、マウスおよび非ヒト霊長類）を含む（例えば、ＨＲＶ動物モデルまたはＲＳＶ動物モデル、喘息動物モデル、器官移植モデル、自己免疫疾患モデル、癌モデルなど）。
【０１４０】
他に指定しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中において記載される方法および物質と類似または等価な方法および物質が、本発明の実施または試験において用いられ得るが、適切な方法および物質が、本明細書中に記載される。
【０１４１】
全ての刊行物、特許および本明細書中に引用した他の参考文献は、参考としてその全体が援用される。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が支配する。
【０１４２】
本明細書で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明らかに示さない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」の参照は、複数のポリペプチド（例えば、マルチマー化、キメラ、異種のポリペプチド）を含み、そして「細胞」の参照は、１つ以上のそのような細胞を含む、など。
【０１４３】
多くの本発明の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々な改変がなされ得ることが理解される。従って、以下の実施例は、例証を示すが、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１４４】
（実施例１）
本実施例は、マルチマー化ドメイン、リンカー配列およびキメラポリペプチドの設計を記載する。
【０１４５】
ＡＴＦαのアミノ酸１８１〜２１１は、４．５回の７価リピート（ｈｅｐｔｅｄ−ｒｅｐａｅｒ）（３１アミノ酸）を構成する。各反復のｄ位（位置４）の残基は、全て、ロイシンであり、この７アミノ酸繰返しはまた、ロイシンジッパードメインともいわれる。ＡＴＦαのアミノ酸１８１〜２１１は、ＧＣＮ４ロイシンジッパードメインに対して４５％の同一性を有する。
【０１４６】
ＡＴＦαのアミノ酸１８１〜２１１の変異体を、位置ａおよび位置ｄの３つの疎水性非極性残基（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）を各々での（表３）置換（各７価リピートにおける位置１および位置４）によって作製された。ａ位またはｄ位のいずれかにロイシンおよびイソロイシンを有するＡＴＦα変異体は、トリマーまたはテトラマーを形成する；テトラマー形成配列としては、ＡＴＦα−ＬＩおよびＡＴＦα−ＩＬが挙げられる；トリマー形成配列としては、ＡＴＦα−ＬＬおよびＡＴＦα−ＩＩが挙げられる。ＡＴＦα−ＶＬは、ダイマーおよびテトラマーの混合物を形成する；ａ位またはｄ位にバリンを有する変異体は、全て、高いダイマー比率を示した。
【０１４７】
ＡＴＦα−ＬＩドメインは、抗体Ｆａｂフラグメントまたはレポータータンパク質（チオレドキシン）と融合する場合、テトラマーを形成する。
【０１４８】
例示的なリンカー配列は、ヒト免疫グロブリンＤヒンジ配列に基き、これは、ヒト免疫グロブリン中にある最も長い公知の可撓性のヒンジである。ヒトＩｇＤヒンジは、全体で６３アミノ酸残基を有し、そして５７番目の残基は、システインである（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９（１９９４））。
【０１４９】
ＩｇＤヒンジの５つの変異体を、表５に列挙する：Ｄ３０、Ｄ３５、ＥＤ、ＥＤＣおよびＤ６３。Ｄ３０は、ＩｇＤヒンジの始めの３０残基を含み、Ｄ３５は、始めの３５残基を含み、ＥＤは、システインの前の５６アミノ酸の全てを含み、ＥＤＣは、ＥＤ中の５６アミノ酸の全てとシステインを含み、そしてＤ６３は、完全なヒンジの６３アミノ酸を含む。
【０１５０】
ＡＴＦα−ＬＩを用いて調製した精製テトラマーを比較すると、Ｄ３５を有するタンパク質は、長時間にわたってテトラマー状態で維持されるＤ３０およびＥＤによって形成されるテトラマーよりも安定性が低い。Ｄ３５のＣ末端は、２つのグリシン（ＧＲＧＧ）で終結する。Ｄ３５を、マルチマー化ドメインのＮ末端と融合する場合、２つのグリシンは、マルチマー化ドメインのαヘリックスを不安定化し得、なぜＤ３５テトラマーの安定性が低いのかを説明する。
【０１５１】
（実施例２）
本実施例は、Ｍａｂ  １Ａ６由来の抗原結合部位を有する抗ＩＣＡＭヒト化Ｆａｂフラグメントのクローニングを記載する。
【０１５２】
発現ベクターを構築し、ジシストロンオペロンからＦａｂ１９およびマルチマーＦａｂ１９を作製した。ジシストロンオペロンは、Ｃａｒｔｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３（１９９２）で記載される（図１）。
【０１５３】
簡単にいうと、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、エンテロトキシン  ＩＩ（ｓｔＩＩ）シグナル配列をコードする遺伝子セグメントに、５’末端で正確に融合する。ジシストロン遺伝子中の介在性配列（ＩＶＳ）は、リボソーム挿入部位を含み、一方で、その遺伝子の３’末端は、バクテリオファージλｔ０転写終結因子（ＴＥＲ）を含む。唯一のＳａｃＩ部位を、ＣＨ１ドメイン中の停止コドンの直前に挿入し、そして唯一のＥｃｏＲＩ部位を、停止コドンの直後に挿入し、ヒンジおよび重合化ドメインをコードする配列の付加を容易にした。このイソプロピル−１−チオβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導可能なｐｔａｃプロモーターを用いて、このジシストロンメッセージの発現を駆動した。
【０１５４】
軽鎖フラグメントについての遺伝子セグメント（ＳｐｅＩ〜ＸｂａＩ）を、ＰＣＲを用いて合成した。ＰＣＲ産物は、２つのテンプレート（ヒト化抗ＩＣＡＭ抗体の可変ドメインをコードするＶＬフラグメント、およびＣＬテンプレート）の融合物であり、その配列は、ヒトκ１軽鎖定常領域由来である（ＰａｌｍおよびＨｉｌｓｃｈｍａｎｎ，Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５６：１６７（１９７５））。
【０１５５】
ＶＬテンプレートを、一連の重複オリゴヌクレオチド（表１）を用いて合成した。始めに、オリゴヌクレオチドを、以下の２つのグループにおいてアニーリングした：オリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２およびオリゴヌクレオチド３；ならびにオリゴヌクレオチド４、オリゴヌクレオチド５およびオリゴヌクレオチド６。アニーリングしたグループの各々を、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて伸長した。アニーリングおよび伸長した生成物を、Ｐ１オリゴヌクレオチドおよびＰ２オリゴヌクレオチド（表２）を用いたＰＣＲを介して融合させた重複テンプレートとしてプールした。このＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローニングし、そして配列決定した。ＣＬテンプレートを、４つのグループ（表１：Ｆａｂ４、Ｆａｂ５およびＦａｂ６；Ｆａｂ７およびＦａｂ８；Ｆａｂ９およびＦａｂ１０；Ｆａｂ１１およびＦａｂ２８）においてアニーリングしそしてＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ロット番号０８００１７６）を用いて伸長したオリゴヌクレオチドから得た。次いで、このＤＮＡプールを、ハイフィデリティーポリメラーゼ混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ，ロット番号８５６１０２２８）、および隣接するＤＮＡプライマー（Ｆａｂ２９およびＦａｂ３Ｓ）を用いて増幅した。このＰＣＲ産物を、ＰＣＲ２．１ＴＯＰＯクローニングベクターにクローニングした。このＶＬドメインおよびＣＬドメインを、オリゴヌクレオチドＦａｂ１およびオリゴヌクレオチドＦａｂ１１を用いて融合し、そして５’ＳｐｅＩ部位を、オリゴヌクレオチドＦａｂ２６およびオリゴヌクレオチドＰ３を用いて付加した。最終的な軽鎖クローンを、その全体について配列決定した。
【０１５６】
類似のアプローチを用いて、重鎖およびＸｂａ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントとしての終結因子を含む遺伝子セグメントをクローニングした。ヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメインの配列に基くＣＨテンプレート（Ｅｌｌｉｓｏｎら  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１（１９８２））を、ＣＬを使用して４つのグループのオリゴヌクレオチド（表１、Ｆａｂ１６およびＦａｂ１７、Ｆａｂ１８およびＦａｂ１９、Ｆａｂ２５およびＦａｂ２１、Ｆａｂ２０、Ｆａｂ２２およびＦａｂ２３）のアニーリングおよび伸長によって作製した。ヒト化抗ＩＣＡＭ抗体の重鎖可変領域をコードするＶＨドメインは、始めに以下オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって作製した：オリゴヌクレオチド７、オリゴヌクレオチド８およびオリゴヌクレオチド９；オリゴヌクレオチド１０、オリゴヌクレオチド１１およびオリゴヌクレオチド１２；ならびにオリゴヌクレオチド１３およびオリゴヌクレオチドｐ４。アニーリングしたグループを、各々、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて伸長した。アニーリングおよび伸長した生成物を、Ｎ末端をＦａｂ１オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドＦａｂ１３、オリゴヌクレオチドＦａｂ１２Ａ、オリゴヌクレオチドＦａｂ１２Ｓ）に融合させた重複テンプレートおよびＣ末端を（プライマーとして、オリゴヌクレオチドＦａｂ１２ｓおよびオリゴヌクレオチドＦａｂ２４を用いた）ＰＣＲを用いてＣＨ１ドメインに融合させた重複テンプレートとしてプールした。また、このフラグメントを完全に配列決定した。ヒト化した抗ＩＣＡＭＦａｂタンパク質（Ｆａｂ１９という）のための発現プラスミドを、ＳｐｅＩ／Ｘｂａ軽鎖フラグメントおよびＸｂａＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ重鎖フラグメントをＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐｔａｃ／Ｔｅｔにライゲーションすることによって作製し、ｐＦａｂ１９／Ｔｅｔを（図１）を産生した。
【０１５７】
（表１：オリゴヌクレオチド配列）
【０１５８】
【表１】
2005522192.tif 000004
2005522192.tif 000005
2005522192.tif 000006
（実施例３）
本実施例は、ヒトＡＴＦαロイシンジッパードメイン改変体のクローニングを記載する。本実施例はまた、結合したリンカー（ヒンジ）配列を有するヒトＡＴＦαロイシンジッパードメイン改変体のクローニングを記載する。
【０１５９】
このＡＴＦαロイシンジッパードメイン改変体（表３Ａ）を、テンプレートとして、３’末端が相補的である２つのＤＮＡオリゴヌクレオチド「Ａ」および「Ｂ」（表２）を用いたＰＣＲ増幅により作製した。このオリゴヌクレオチド対をアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて伸長し、そしてプライマーとしてオリゴヌクレオチドＰ１およびオリゴヌクレオチドＰ２を用いたＰＣＲにより増幅した。生じたＰＣＲ産物を精製し、ＰＣＲクローニングベクター（ＴＯＰＯ  ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした。クローニングした挿入物を有するプラスミドＤＮＡを、単離および配列決定した。
【０１６０】
クローニングしたＡＴＦαドメイン変異体を、各々、特定のヒンジ配列に融合させるために、ＰＣＲ反応において、ＡＴＦαドメイン変異体テンプレートとして、５’末端が、適切なヒンジの３’末端と相補的である連結オリゴヌクレオチドを用いた。次いで、このＰＣＲ産物を、別のＰＣＲ反応におけるヒンジテンプレートとの組合せに用い、ヒンジＡＴＦαドメインフラグメントを作製した。設計により、このヒンジＡＴＦαドメインフラグメントは、Ｎ末端にＳａｃＩ部位そしてＣ末端にＥｃｏＲＩ部位を有する。配列決定の後、ヒンジＡＴＦαドメインフラグメントを、Ｆａｂフラグメントを保有し、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩを用いて前もって消化されたベクターにクローニングし、ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端とインフレームで融合した（図１）。
【０１６１】
（表２：ＡＴＦロイシンジッパー変異体についてのオリゴヌクレオチド）
【０１６２】
【表２】
2005522192.tif 000007
2005522192.tif 000008
（表３Ａ：ＡＴＦαロイシンジッパードメイン変異体）
【０１６３】
【表３Ａ】
2005522192.tif 000009
（表３Ｂ：ＡＴＦαに相同なロイシンジッパードメイン）
【０１６４】
【表３Ｂ】
2005522192.tif 000010
（表３Ｃ：野生型ロイシンジッパードメインの配列比較（同一％））
【０１６５】
【表３Ｃ】
2005522192.tif 000011
（表３Ｄ：コイルドコイルドメインベースのマルチマー化ドメインのアミノ酸配列）
【０１６６】
【表３Ｄ】
2005522192.tif 000012
2005522192.tif 000013
（表４Ａ：ＡＴＦαロイシンジッパードメイン変異体をコードするヌクレオチド配列）
【０１６７】
【表４Ａ】
2005522192.tif 000014
（表４Ｂ：コイルドコイルドメインベースのテトラマー化ドメインのヌクレオチド配列）
【０１６８】
【表４Ｂ】
2005522192.tif 000015
2005522192.tif 000016
（表５：設計したヒンジ配列）
【０１６９】
【表５】
2005522192.tif 000017
（実施例４）
本実施例は、位置ａおよび位置ｄ以外の位置の残基が、本発明のキメラタンパク質のマルチマーの状態に影響し得ることを示す。本実施例はまた、他の配列が、本発明に従って、どのようにして生成され得るのかを示す。
【０１７０】
公共のデータベースの検索に基いて、５つの候補ロイシンジッパードメインを選択した（表３Ｂ）。次いで、マルチマー化ドメインを、位置ａおよび位置ｄの野生型の残基をロイシンまたはイソロイシンに置換することによって設計した（表３Ｄ）；それらを、表４Ｂのヌクレオチド配列に従って、ＰＣＲにより合成した。各変異体を発現させ、キメラマルチマー化融合タンパク質の成分として精製した。
【０１７１】
位置ａのＬおよび位置ｄのＩを用いて、５つのマルチマー化ドメインメインのうち４つは、テトラマーを形成したが、５つ目（ＪＵＮＤ−ＬＩ）は、トリマーを形成した。位置ａのＩおよび位置ｄのＬを用いて、ＡＴＦ−１は、トリマーを形成したが、ＡＴＦ−２、ＣＪＵＮ、およびＣＲＥＢは、ダイマーを形成した。位置ａおよび位置ｄの両位置にＬを置いた場合、ＡＴＦ−２およびＣＲＥＢは、テトラマーを形成し、ＡＴＦ−１およびＣＪＵＮはトリマーを形成し、そしてＪＵＮＤは、ダイマー形成した。位置ａおよび位置ｄの両位置にイソロイシンを置いた場合、トリマーまたはダイマーのいずれかを形成した。これらの結果は、ＡＴＦαを用いて得られる結果（実施例１）と対照的であり得、実施例１では位置ａおよび位置ｄ、ＩＬおよびＬＩの組合せはテトラマーを形成し、一方で、ＩＩおよびＬＬの組合せはトリマーを形成した。従って、このデータは、位置ａおよび位置ｄの外側の配列が、形成されるマルチマーの型を調節し得ることを示す。
【０１７２】
位置ｂ、位置ｃ、位置ｅ、位置ｆおよび位置ｇの残基は、ヘリックスの束の相対位置に影響を及ぼすヘリックス間相互作用およびヘリックス内相互作用の相互関連ネットワークを形成する。このヘリックス間相互作用およびヘリックス内相互作用のネットワークを、三次元モデルから分析し得る。そのようになされるように、マルチマー化ドメインのモデルを、所望のマルチマー化状態のコイルドコイルをテンプレートとして用い、相同性によって構築する。７価リピートに関連して、適切なレジスターで分析されるドメインの配列を置換した後、この構造は、エネルギーが最小化される。代替の側鎖回転異性体の可能性との兼ね合いで、次いで、表面の残基を、検査によって分析する。置換が企図される場合、ネットワーク全体に対する増強された効力が考えられる。例えば、隣接するヘリックスの位置ｇに塩橋形成し得る残基に位置ｅを変えることにより、以前に位置ｇと相互作用していた第３の残基にまた、その相互作用のパートナーを変更させる。
【０１７３】
置換の効果は、この方法により、常に首尾よく予測され得る。この予測される効果を確認するために、置換したマルチマー化ドメインを、そのマルチマー化または他の性質（例えば、安定性および密接性）についてスクリーニングし得る。例えば、マルチマー形態を、本明細書中（実施例６）に記載されるようにＨＰＬＣおよび／または超遠心アッセイ法によって決定し得る；密接性のマルチマー化に対する効果を、マルチマー化ドメインを有するポリペプチドの溶解プロファイルを決定することによってアッセイし得る。
【０１７４】
（実施例５）
本実施例は、マルチマーＦａｂタンパク質の発現および精製を記載する。マルチマーＦａｂを作製するために、ＥＤヒンジをコードするＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメント（表５）は、ＩｇＤおよび改変ＡＴＦαコイルドコイルドメイン（ＡＴＦα（１）−ＬＩ＋Ｓ）由来であり、Ｆａｂ１９のＣＨ１コード配列の３１末端で、Ｆａｂ１９／Ｔｅｔプラスミド（図１）にクローニングされる。このプラスミドを、企ＣＦＹ１９６と名付けた。
【０１７５】
Ｆａｂ１９およびテトラマーＣＦＹ１９６タンパク質を作製するために、Ｆａｂ１９／ＴｅｔプラスミドまたはＣＦＹ１９６プラスミドを発現するＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ８３の培養物を、選択ＴＢ培地内で、ＯＤ６００が２．０になるまで増殖させた。最終濃度（０．２ｍＭ）にＩＰＴＧを添加して誘導した後、室温にて８時間インキュベーションし、４℃で１５分間の、４，０００ｇでの遠心分離によって細胞を回収した。この細胞ペレットを、培養液１リットル当り５０ｍｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０μＭ  ＰＭＳＦおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に懸濁し、４℃で１５分間の、４，０００ｇでの遠心分離によって細胞を再ペレット化し、冷凍した。凍結細胞ペレットを、ペレットの湿重量１ｇ当り２０ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，５ｍＭ  ＥＧＴＡ，５０μＭ  ＰＭＳＦおよび０．１ｍｇ／ｍｌ  リソゾーム）中に再懸濁し、氷上にて３０分間インキュベートした後、ペレットを超音波処理し、そして溶解物を、３０分間の２３，０００ｇでの遠心分離によって透明化した。この上清（可溶性タンパク質を含む）を、１Ｍ  ＮａＣｌに調整し、そそてＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。次いで、このカラムを、２Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて頻繁に大規模に洗浄し、そして０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ２．５）を用いて溶出した。溶出物のｐＨを、１／１０量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ９．０）を用いて中和した。
【０１７６】
一価のＦａｂタンパク質の精製のために、タンパク質含有画分をプールし、ＴＢＳに対して透析し、そして４℃で保存した。マルチマーＦａｂ融合タンパク質の精製のために、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムからの画分を、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中の２００ｍＭ  ＫＣｌに対して透析し、次いで、ヒドロキシアパタイトカラム（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ＴｙｐｅＩＩ，Ｂｉｏｒａｄ）によりさらに精製した。透析緩衝液中でこのタンパク質を結合させた後、このカラムを結合緩衝液で洗浄し、次いで、２００ｍＭ  ＫＣｌ／１０ｍＭ  Ｋホスフェート／５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）で洗浄した。マルチマーＦａｂタンパク質を、リン酸勾配（５００ｍＭ  ＫＣｌ／５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．０））で溶出した。陽性分画をプールし、ＴＢＳに対して透析した。
【０１７７】
収量は、振盪フラスコ中の培養液１リットル当り１〜２ｍｇであった。タンパク質調製物の純度を、サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより決定した（図２）。
【０１７８】
（実施例６）
本実施例は、Ｆａｂ−ＡＴＦαドメイン融合タンパク質のマルチマー状態の特徴付けを記載する。
【０１７９】
以下の２つのアッセイを示す：マルチマー化状態を決定し得、かつ、マルチマー間の異なる密接性を区別し得る、沈降速度アッセイ；および、沈降速度データで相関させた後のマルチマー化状態を区別し得る、ＨＰＬＣアッセイ。沈降速度は、遠心力の影響下で溶質が溶媒を通って移動する場合、溶質境界の移動を測定する。このデータは、長時間にわたって記録された一連の境界の位置である。次いで、その生データを処理し、沈降係数の分布（図３）を得る。大きなピークは、サンプル中の主要な種についての沈降係数を表す。ピークの数は、純度の指標であり、主要なピークの幅の広さは、主要な種の均一性を示す。
【０１８０】
精製したマルチマーＦａｂ融合タンパク質のオリゴマー状態を、光分散データ（Ｗｅｎ，ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２４０：１５５（１９９６））との組合せで分析超遠心分離（Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ，ＴＭ  ＳｃｈｕｓｔｅｒおよびＴＭ  Ｌａｕｅ（編）（１９９４）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ）を用い、沈降速度によって決定した。トリマーＦａｂ−ＡＴＦαドメイン融合タンパク質は約５．５Ｓで沈降し、そしてテトラマータンパク質は６．５Ｓで沈降する。Ｆａｂ−ＡＴＦαドメイン融合タンパク質についての沈降実験の結果を、表６にまとめる。
【０１８１】
沈降速度データの相関により、さらなるＡＴＦαベースのドメインのマルチマー化状態を、サイズ排除ＨＰＬＣにより決定した。ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーを、ダイマーからペンタマーまでの範囲のキメラマルチマー種を分離するために選択したカラムで実施した。この選択したカラムはまた、キメラのＦａｂ部分を含む種を分離した：テトラマー（超遠心分離で６．５Ｓ）は、常に１３．７±０．１分にカラムから溶出した；トリマー（５．５Ｓ）は、１４．０±０．１分に溶出した；そして、ダイマーは、（４．５Ｓ）は、１５．０±０．１分に溶出した。さらなるドメインについてのデータを、沈降によって決定されるデータと共に、表７に列挙する。ＡＴＦ１ロイシンジッパー、ＡＴＦ２ロイシンジッパー、ＣＪＵＮロイシンジッパー、ＪＵＮＤロイシンジッパーおよびＣＲＥＢロイシンジッパー由来のドメインのマルチマー状態を、表８にまとめる。
【０１８２】
（表６：マルチマーの形成）
【０１８３】
【表６】
2005522192.tif 000018
（表７：ＡＴＦα変異体によるマルチマーの形成）
【０１８４】
【表７】
2005522192.tif 000019
沈降データはまた、テトラマー間の区別を可能にする。例えば、ＣＦＹ  １９２Ｂ、ＣＦＹ  １９６およびＣＦＹ４８４は、同じａアミノ酸およびｄアミノ酸を有し、そして全てが主にテトラマーを形成する。しかし、これらのタンパク質は、配列の他の場所においてバリエーションを生じる。ＣＦＹ１９６およびＣＦＹ１９２Ｂについてのｃ（ｓ）  対  Ｓのプロットの調査は、前者が優勢であることを示す。ＣＦＹ１９６について当てはめた沈降係数の分布は、ＣＦＹ１９２Ｂについて当てはめた沈降係数の分布よりも狭く、このことは、ＣＦＹ１９６について、より均一なテトラマー集団であることを示す（図５）。
【０１８５】
Ｆａｂ１９  ＥＤは、ＡＴＦ（１）α−ＩＬ（配列番号１６２）と融合される場合、テトラマーを形成し、その沈降速度分析は、幅の広いピークを示した（図７Ａ）。新しい潜在的なヘリックス間の塩橋を形成する第３の反復の位置ｅでのセリンからアルギニンへの変更（配列番号１６３）では、わずかな改善しか得られなかった（図７Ｂ）。これらの変化を第３の反復の位置ｂでのイソロイシンからグルタミンへのさらなる変異（配列番号５）と合わせることによって、非常に狭い沈降分布が得られた（図７Ｃ）。ＡＴＦα−ＩＬ変異体の配列は：
【０１８６】
【化２】
2005522192.tif 000020
である。
【０１８７】
（表８：他のマルチマー化ポリペプチドによるマルチマー形成）
【０１８８】
【表８】
2005522192.tif 000021
沈降データは、細胞ベースの機能アッセイの結果と十分に相関する（例えば、実施例７を参照のこと）。これらのアッセイは、細胞保護能力において、テトラマー化タンパク質が、トリマーより優れていること、そしてトリマー化タンパク質およびテトラマー化タンパク質が、一価のＦａｂよりも高い保護性を提供することを示す。最も均一なテトラマーは、最高の保護性を提供する（図４）。
【０１８９】
（実施例７）
本実施例は、一価のＦａｂ１９抗ヒトＩＣＡＭ−１タンパク質および多価のＦａｂ１９−ＥＤＡＴＦαドメイン融合タンパク質の生物学的活性を示す。本実施例はまた、トリマー化Ｆａｂ１９−ＥＤＡＴＦαタンパク質およびテトラマー化Ｆａｂ１９−ＥＤＡＴＦαタンパク質が、一価のＦａｂ１９および二価のモノクローナル抗体よりも、ＨＲＶ感染からのより高い細胞の保護を提供することを示すデータを記載する。
【０１９０】
ＨＲＶ保護アッセイを実施し、一価のＦａｂ１９タンパク質と多価のＦａｂ１９ベースのタンパク質の、感染から細胞を保護する能力を比較した。ＨｅＬａ細胞を、アッセイの２４時間前に４８ウェル組織培養皿に、１ウェル当り１×１０５でプレートした。成長培地を除去し、示した濃度に希釈した１００μｌの多価タンパク質または一価タンパク質を、各ウェルに添加した。このプレートを、３７℃のインキュベーター中で１時間インキュベートし、溶液を除去し、そして２００μｌのＨＲＶ１５を（１のＭＯＩで）添加し、次いで、３３℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、そして１ウェル当り１ｍｌの成長培地を添加した。感染させた細胞を、３３℃で４８時間インキュベートし、培地を除去し、そして残った生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。結合したクリスタルバイオレットを、１ウェル当り３ｍｌのメタノールで抽出し、次いで、細胞染色の量を、Ａ５７０を測定することによって定量した。
【０１９１】
保護アッセイの結果を、図４に示す。保護％は、以下の式を使用して三連で、各データ点について計算する：
【０１９２】
【化３】
2005522192.tif 000022
保護効力は、ＥＣ５０（５０％保護を与える抗体の用量）として定量化される。データに基づいて、Ｆａｂ１９のＥＣ５０は、７６ｎＭである。テトラマータンパク質ＣＦＹ１９２ＢおよびＣＦＹ１９６は、トリマーＣＦＹ１９２ＢおよびＣＦＹ１９５よりも有効である。ＡＴＦαに基づくこの群のマルチマーにおいて、ＣＦＹ１９６（Ｆａｂ１９−ＥＤＡＴＦα（１）−ＬＩ＋Ｓ）は、最も高い保護（０．７３ｎＭのＥＣ５０）を示し、これは、一価Ｆａｂ１９タンパク質よりも１０４倍高い保護である。
【０１９３】
別の研究において、一価Ｆａｂ１９、二価抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体ＲＲ／１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、二価ＣＦＹ２０２、トリマーＣＦＹ１９３ＢおよびテトラマーＣＦＹ１９６の保護効力を、比較した（図５）。一価Ｆａｂ１９が２００ｎＭより高いＥＣ５０を有し、そして二価ＲＲ／１が１０ｎＭより高いＥＣ５０を有するが、ＣＦＹ２０２のＥＣ５０は、４．５ｎＭであり、ＣＦＹ１９３ＢのＥＣ５０は、１．３５ｎＭであり、そしてＣＦＹ１９６のＥＣ５０は０．９７ｎＭであった。これらのデータは、テトラマーが、最も高い保護効力を提供し、続いて、トリマー、ダイマー、およびモノマーであったことを示す。
【０１９４】
（実施例８）
この実施例は、本発明の非Ｆａｂキメラポリペプチド（チオレドキシン−ＡＴＦαＬＩ融合タンパク質）の構成およびマルチマーの特徴を記載する。
【０１９５】
ＡＴＦαロイシンジッパードメイン改変体が、Ｆａｂ以外のタンパク質と融合した場合に、テトラマー複合体を誘導し得ることを実証するために、ヒンジ−ＡＴＦα（１）−ＬＩ−＋ＳＧ３Ｈ６フラグメントを、発現ベクターｐＢＡＤ−チオ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のチオレドキシンのＣ末端に融合した。発現構築物（ｐＢＡＤ−チオ−ヒンジ−ＡＴＦα（１）−ＬＩ−＋ＳＧ３Ｈ６）を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＯＰ−１０に移入し、そして０．８のＯＤ６００まで選択ＴＢ培地中で増殖させた。０．０２％の最終濃度までのアラビノースの添加による誘導および室温で一晩のインキュベーション後に、４℃で１５分間、４，０００ｇでの遠心分離によって細胞を収集した。細胞ペレットを溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５００ｍＭ  ＮＡＣｌ、４０ｍＭ  イミダゾール、１ｍＭ  β−メルカプトエタノール）、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム中に懸濁させ、そして２０分間、氷上でインキュベートした。細胞を超音波処理し、そしてＰＭＳＦの別のアリコートを添加した。２３，０００ｇでの遠心分離によって細胞細片をペレット化し、そして清澄化された超音波処理物を濾過し、そして金属アフィニティークロマトグラフィーによって分画した。
【０１９６】
誘導されたヒスチジンタグ化タンパク質を、製造業者の指示に従って、Ｎｉ２＋で平衡化されたＨｉ  Ｔｒａｐ金属キレート化カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合した。次いで、カラムを、４カラム容量の緩衝液（１００ｍＭ  イミダゾール、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌからなる）で洗浄した。タンパク質を、カラムから、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、１Ｍ  イミダゾールを用いて溶出し、画分で収集した。タンパク質画分をプールし、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して、４℃で透析した。
【０１９７】
チオレドキシン−ＡＴＦα（１）−ＬＩ融合タンパク質の分子量を、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（７．５ｍｍ×２５ｃｍ）を、０．４ｍｌ／分の流速で、ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で平衡化させた。カラムを、標準タンパク質（リボヌクレアーゼＡ、１３．７：キモトリプシノーゲンＡ、２５ｋＤａ；オボアルブミン、４３ｋＤａ；ウシ血清アルブミン、６６ｋＤａ；アルコールデヒドロゲナーゼ、１５０ｋＤａ；およびβ−アミラーゼ、２００ｋＤａ）を用いて較正した。精製されたチオレドキシン−ＡＴＦαＬＩ１融合タンパク質を、標準タンパク質と同じ条件下で別々に分析した。
【０１９８】
モノマーチオレドキシン−ＡＴＦα（１）−ＬＩ−＋ＳＧ３Ｈ６融合タンパク質の計算された分子量は、１９．６ｋＤａである。しかし、精製された融合タンパク質の計算された分子量は、約７８ｋＤａである。この結果は、チオレドキシン−ＡＴＦα（１）ＬＩ＋ＳＧ３Ｈ６融合タンパク質が、テトラマーとして存在することを実証する。
【０１９９】
（実施例９）
この実施例は、本発明の多価ＩＣＡＭ−１結合タンパク質により、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）感染を阻害または処置することを記載する。
【０２００】
ＲＳＶは、ＲＳＶの表面上のＦタンパク質を介してＩＣＡＭ−１に結合するようであり；Ｆタンパク質はまた、ＲＳＶに対する中和抗体の標的である。最近公開された文献は、主張によると、ヒト上皮細胞のヒトＲＳウイルス（ＲＳＶ）感染が、可溶性ＩＣＡＭ−１でのＲＳＶの前処理、または抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体での細胞の前処理のいずれかによって、阻害され得たことが見出された（Ｂｅｈｅｒａら、ＢＢＲＣ  ２８０：１８８（２００１））。しかし、ＲＳＶ感染の明らかな阻害を達成するために、非常に高い濃度の抗体（２００〜４００μｇ／ｍｌ、＞１ｍＭ）が必要とされ、これは、モノクローナル抗体が、ＲＳＶに対して有効な治療法でないようであることを示す。
【０２０１】
インビトロでのＲＳＶ感染の阻害のために必要とされるモノクローナル抗体の高い濃度を考えると、ＲＳＶは、ＩＣＡＭ−１に対して比較的高い結合親和性またはアビディティを有し得る。そうである場合、マルチマー（ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマーまたはさらに高次のオリゴマー）のＩＣＡＭ−１結合タンパク質が、ＲＳＶ感染に対して、一価のＩＣＡＭ−１抗体より、より良い効率を有する。さらに、本格的なＲＳＶ感染が全身的な疾患であるものの、ウイルスは、最初に、身体の上気道（特に、鼻咽頭領域）を侵襲する。上気道からのＲＳＶのブロックは、ＲＳＶの侵入を妨げ、従って、ＲＳＶの下気道の侵襲を妨げる。
【０２０２】
理論に束縛されることを望まないが、多価ＩＣＡＭ−１結合タンパク質は、上気道の細胞へのＲＳＶの足場または通路をブロックするようである。結果として、浮動性ＲＳＶ粒子は、通常の粘膜毛様体洗浄系によって胃腸管へと方向を変え、無害になる。
【０２０３】
（実施例１０）
この実施例は、２つの異なる結合特異性を含むポリペプチドの構成および発現を記載する。
【０２０４】
ダイマー化ドメインからテトラマー化結合能力を有する分子を作製するために、マルチマー化ドメインは、２つの異なる抗体分子からのＦａｂを連結する分子の中心であり得る（例えば、図６Ａを参照のこと）。あるいは、トリマー化ドメインまたはテトラマー化ドメインは、６価および８価分子をそれぞれ作製するために使用され得る。
【０２０５】
二重特異的マルチマータンパク質において、異なる陰影（ｈａｔｃｈｉｎｇ）を用いて示されたＦａｂ部分が、異なる特異性（例えば、抗ＣＤ−３および抗ＣＤ−１９）を有し得る。それぞれのタンパク質のＦａｂ部分（重鎖および軽鎖からなる）は、リンカー配列によって、図６Ａにおける六角形として示される、ダイマー化ドメインに連結される。このポリペプチドは、１つのトリシストロンＲＮＡ分子から作製される。あるいは、３つのプロモーターは、３つの異なるポリペプチドの発現を駆動し得る。このメッセージから翻訳される第１のポリペプチド鎖に対するコード配列を、抗ＣＤ−３軽鎖（ＬＣ−１）を表す、図６Ｂの陰影を付けた囲みによって示す。第２のＤＮＡフラグメントは、中心キメラポリペプチド（ＩｇＤから誘導される長いヒンジに連結された抗ＣＤ−３重鎖（ＨＣ−１）からなる）、続いて、ダイマー化ドメイン、第２のヒンジ、続いて、抗ＣＤ−１９軽鎖（ＬＣ−２）をコードする。図６Ｂの白い囲みによって示される第３のＲＮＡは、抗ＣＤ−１９重鎖（ＨＣ−２）をコードする。
【０２０６】
ＨＣ−２配列およびＬＣ−２配列がｓｃＦｖをコードする配列に切換えられた代替的な発現構築物はまた、ｓｃＦｖの親和性が所望なほどに高い場合、可能である。
【０２０７】
トリシストロンメッセージから二重特異的な四価分子を発現させるために、３つのＤＮＡフラグメントを調製する。第１は、Ｎｄｅ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉフラグメントであり、これは、抗ＣＤ−３Ｆａｂ由来の軽鎖および介在配列（ＩＶＳ１）のバルク（リボソーム結合部位を含む）からなる。このフラグメントから下流に、ＰＣＲを使用して、一緒に融合された６片からなるＸｂａＩ／ＳｐｅＩ制限フラグメントが連結される：ＩＶＳ１の残り、Ｆａｂの重鎖、ＩｇＤ由来のヒンジ、ＣＲＥＢ−ＩＬダイマー化ドメイン、ＩｇＤ由来の第２のヒンジ、抗ＣＤ−１９の軽鎖、および第２の介在配列（ＩＶＳ２）のバルク。第３のＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントは、ＩＶＳ２の残り、抗ＣＤ−１９の重鎖、およびターミネーター配列を含む。各ＩＶＳは、リボソーム結合部位を含み、そして構築物の３’末端は、バクテリオファージλｔ０ターミネーター（ＴＥＲ）を含む。翻訳された場合、３つのポリペプチドは、各々、エンテロキシンＩＩシグナル配列（ｓｔＩＩ）によって先行される。
【０２０８】
他の二重特異的分子について、塗りつぶされた囲みによって示されるマルチマー化ドメインは、代替的なマルチマー化配列によって置換されて、４価、６価、８価またはより高次の結合アームを形成する。これらの３つのＤＮＡコード配列は、複数のプロモーターによって駆動され得るか、または異なるベクターにコードされる。異なる特異性の２つのＦａｂ分子が共通の軽鎖を共有する場合、類似の構築物がまた、二重特異的抗体のために使用され得る。この場合、図６ＢにおいてＨＣ−２をコードする配列は、ＬＣ−２をコードする配列に置換され、そしてＴＥＲ配列は、ＩＶＳ２を置換する。次いで、この発現ベクターは、ビスシトロンメッセージにおける２つのポリペプチド鎖を生成する。
【０２０９】
（実施例１１）
この実施例は、本発明のマルチマー化ドメインに隣接するアミノ酸が、形成するマルチマーの安定性または緊密性（ｔｉｇｈｔｎｅｓｓ）を調整するために、どのように改変され得るかを示す。
【０２１０】
Ｃ末端におけるコイルドコイルドメインを有する本発明のキメラタンパク質において、マルチマー化ドメインのＣ末端は、溶媒に曝露される。外部アミノ酸を、Ｃ末端に付加して、タンパク質に対して、より安定な疎水性の端部を作製し得る。一般的に、コイルドコイルドメインにおける少なくとも２つのアミン素案を考慮することによって、末端アミノ酸は、これらの残基が関係する相互作用を妨害しないＣ末端に付加されるように選択され得る。ＡＴＦα（１）−ＬＩについて、セリンは、これらの基準を満たす。この位置におけるセリンは、コイルドコイルのＣ末端に親水性末端を提供する、一連の水媒介性水素結合の形成を可能にすることによって、マルチマー化ドメインの折り畳みを安定化し得る。
【０２１１】
ＡＴＦα（１）−ＬＩ（配列番号１）は、Ｃ末端セリンの付加によって改変された（配列番号１５４）。このマルチマー化ドメインが抗ＩＣＡＭ抗体キメラ（ＣＦＹ１９６）において使用された場合、精製されたタンパク質マルチマー（テトラマー）は、例外的に狭い分布の沈降係数を与える（図３Ｃ、実施例６）ことが見出され、これは、マルチマーを含むサブユニットに対するより緊密なマルチマー化を示す（すなわち、ＫＤが減少する）。ＡＴＦ（１）α−ＬＩ＋Ｓの配列：
【０２１２】
【化４】
2005522192.tif 000023
（実施例１２）
この実施例は、本発明の方法を用いるペンタマーの構築を記載する。
【０２１３】
ペンタマーを構築するために、マルチマー化ドメインＡＴＦα−ＩＩ（配列番号６）（キメラ抗ＩＣＡＭ抗体において使用される場合、トリマーを形成し、ＣＦＹ１９５と呼ばれる）を、選択した。この配列は、β分枝イソロイシン残基が、ペンタマーの疎水性コア中に効率的にパッキングされ得るので、選択された。疎水性コアとドメインの外部に曝される溶媒との間の界面における残基は、トリマーをペンタマーに変更するために、より疎水性になるように変更されなければならない。従って、ｅおよびｇの位置の４つの残基を、ロイシンに変更した。ペンタマー形成を支持するために、螺旋間および螺旋内相互作用のネットワークを調節するために、１つのｂの位置および１つのｃの位置において、２つのさらなる変更を行った。これらの変異（疎水性残基を親水性残基に変更する）の両方ともが、相互作用する螺旋間表面の適切な配向を提供する。この配列は、ＡＴＦα−ＩＩ−ｇ（配列番号１５９）と指定された。
【０２１４】
重複するオリゴヌクレオチドを使用して、ＡＴＦα−ＩＩ−ｇといくつかの改変体（ＡＴＦα−ＩＩ−ｇにサブセットの変異を含む）の両方（表９）がＰＣＲによって作製され、サブクローニングされ、そしてその全体が、配列決定された。これらの全てが、ａの位置およびｄの位置でイソロイシンを有するが、表９において下線で示される６個のアミノ酸が異なる。これらのドメインは、それぞれ、Ｆａｂ１９およびＥＤヒンジに融合され、そして実施例６に記載されるように、サイズ排除クロマトグラフィーによって、それらのマルチマー化状態を評価された。
【０２１５】
Ｆａｂ  １９、ＥＤヒンジおよびマルチマー化ドメインＡＴＦα−ＩＩ−ａ〜ＡＴＦα−ＩＩ−ｇ（配列番号１５５〜１５９）から構成されるマルチマー化ドメインは、トリマーＣＦＹ１９５よりも長い保持時間を示したが、ａ、ｂ、およびｃは、ブロードなピークとしてＨＰＬＣカラムから溶出され、実質的な不均質性を示す。ＡＴＦα−ＩＩ−ｆのマルチマーおよびＡＴＦα−ＩＩ−ｇのマルチマーのみが、均質な種を生成し、ペンタマーについての予期される保持時間で、テトラマーの前に溶出した。ＡＴＦα−ＩＩ−ｇマルチマーの活性を、実施例７に記載されるように、細胞保護アッセイにおいて測定した。テトラマーＣＦＹ１９６に対する類似の保護能力およびトリマーＣＦＹ１９５に対する優れた能力を有することが見出された。
【０２１６】
【表９】
2005522192.tif 000024
疎水性コアを拡大することによって、トリマーをより高次のマルチマーに変更し得ることをさらに実証するために、別のコイルドコイルドメインＡＴＦ−１の文脈でペンタマーを作製した。表１０において、ペンタマーを形成するために、ＡＴＦ１−ＩＩおよび改変体ＡＴＦ１−ＩＩａの配列を設計する。２つの配列は、下線を付したアミノ酸によって示される位置で異なる。これらのドメインから調製される２つのキメラタンパク質のＨＰＬＣによる比較は、このアミノ酸の変更が、ＡＴＦ１−ＩＩから調製されたトリマータンパク質をより高次のマルチマーに変更したことを示す。
【０２１７】
【表１０】
2005522192.tif 000025
（実施例１３）
この実施例は、モノマーＦａｂ抗体およびマルチマーＦａｂ抗体の結合親和性の評価のための競合ＥＬＩＳＡアッセイを記載する。
【０２１８】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したテトラマーＦａｂ１９（１９６ＴＧＣと呼ばれる）を、トレーサーとして使用するために開発した。ＡＴＦ（１）α−ＬＩマルチマー化ドメインを含むキメラＦａｂ１９−ＥＤのＣ末端に配列ＴＧＣを付加する（１９６ＴＧＣ）ことによって、テトラマー抗ＩＣＡＭ抗体に１つのシステイン導入した。ＨＲＰを、ＥＺ−Ｌｉｎｋマレイミド活性化ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、１９６ＴＧＣに化学的に結合した。１９６ＴＧＣマルチマー化ドメインの配列：
【０２１９】
【化５】
2005522192.tif 000026
９６ウェルＥＩＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中で、０．１μｇ／ｍｌで、１００μｌ／ウェルの可溶性ＩＣＡＭ−１（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ）を用いてコーティングした。ＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて洗浄した後、プレートを、１時間、室温で、ＴＢＳＴ中の３％無脂肪乳を用いてブロッキングした。ＴＢＳＴを用いて洗浄した後に、１％無脂肪乳／ＴＢＳＴ溶液中に連続的に希釈した抗ＩＣＡＭ−１  Ｆａｂサンプル（モノマーまたはマルチマー）を添加し、そして室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴ用いて洗浄した後に、プレートを、２時間、室温で、１％無脂肪乳／ＴＢＳＴ中で、１：５０，０００に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ＩＣＡＭ−１テトラマー抗体（１９６ＴＧＣ−ＨＲＰ）とともにインキュベートした。プレートをＴＢＳＴを用いて徹底的に洗浄し、そして１００μｌ／ウェルの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。１５分のインキュベーション後、１００ｍｌ／ウェルの０．１２Ｎ  ＨＣｌを添加することによって、色の発色を停止させ、そして４５０ｎｍでウェルの吸光度を、プレートリーダー（ＩＣＮ）によって測定した。
【０２２０】
トレーサー抗体（１９６ＴＧＣ−ＨＲＰ）結合の阻害％は、以下のように計算された：
阻害％＝１００×（Ａ０−Ａｓ）／Ａ０
ここで、Ａ０は、サンプルのない参照ウェル（１９６ＴＧＣ−ＨＲＰのみ）のＯＤ４５０であり；Ａｓは、希釈されたサンプルからのＯＤ４５０の読み取り値である。抗ＩＣＡＭ−１抗体の相対的な結合親和性は、トレーサー抗体（ＴＧＣ−ＨＲＰ）を５０％でブロックするタンパク質の濃度（ＩＣ５０）によって表された。
【０２２１】
図８は、モノマーＦａｂ（Ｆａｂ１９）のみが、試験された最も高い濃度で、２５％トレーサー抗体（ＴＧＣ−ＨＲＰ）結合を阻害することを示す。しかし、そのトリマー（Ｆａｂ１９−ＥＤＡＴＦα−ＩＩ）またはそのテトラマー（Ｆａｂ１９−ＥＤＡＴＦα−ＬＩ）は、ずっと高い阻害％を与えた。これら３つの分子についてのＩＣ５０は、以下の通りである：
【０２２２】
【化６】
2005522192.tif 000027
（実施例１４）
この実施例は、本発明のマルチマーポリペプチドのさらなる適用を記載する。
【０２２３】
マルチマーは、より大きな結合親和性または多価の結合が所望される任意の状況において使用され得る。唯一の要件は、本発明のキメラタンパク質の構築における使用に適合され得る部分の有効性である。この部分は、結合タンパク質または任意の合成分子もしくは天然の分子であり得、キメラ抗体を形成するために化学結合によって結合され得る。このような部分の例としては、キレーター、結合ペプチド、結合タンパク質などが挙げられる。
【０２２４】
本発明のマルチマー分子は、種々の環境的適用について使用され得る。例えば、重金属または毒素に結合した本発明のマルチマーは、バイオレメディエーションにおいて使用され得る。病原体の表面上のタンパク質に結合するマルチマーは、環境（例えば、ウシを放牧する場所）において、その病原体を中和するために使用され得る。本発明のマルチマーはまた、多くの小分子の意図しない毒性のない殺虫剤または除草剤として作用すると解釈され得る。
【０２２５】
本発明のマルチマー分子はまた、工業的適用を有し得る。例えば、マルチマーは、反応の生成物を除き、従って、反応を加速するかまたは反応を完了に駆動するか、あるいは反応物または触媒を除き、従って、反応を停止させるかのいずれかのために、工業化学において使用され得る。さらに、マルチマー分子は、希釈溶液から物質を回収するために使用され得る。さらに、二重特異的分子は、組み合わせた工程について反応速度を増加させるために、合成経路において２つの連続した酵素から構築され得る。
【０２２６】
（実施例１５）
この実施例は、本発明に従ってなされ得るさらなる種類のマルチマーペプチドベースの薬物を記載する。
【０２２７】
結合分子（例えば、標的に対する抗体）は、当該分野において公知の任意の手段によって同定され得る。例えば、目的の標的に結合する抗体のＣＤＲ領域は、当該分野において公知の方法を使用して、ヒト化フレームワークに移され得る。ヒト化抗体は、必要に応じて、キメラマルチマータンパク質の一部としてＳｃＦｖまたはＦａｂフラグメントのいずれかとして発現され得る。目的の標的タンパク質の特定の非制限的な例（標的に対するマルチマータンパク質の結合によって処置され得る医学的状態の徴候とともに）：
＊βトリプターゼ（アレルギー、炎症）
＊ＬＦＡ−１（移植片拒絶）
＊ＣＤ１０５、ＶＥＧＦ（黄斑変性、癌）
＊ＩｇＥ（喘息）
＊ＣＤ１５４（狼瘡、移植片拒絶）
＊ＣＤ１４（敗血症）
＊葉酸レセプターα（フィロウイルス感染、例えば、ＥｂｏｌａウイルスおよびＭａｒｂｕｒｇウイルス）
＊ネクチン−１（ＣＤ１１１としても公知）−（ヒトヘルペスウイルス）
＊ｇｐ１２０（ＨＩＶ−１／ＡＩＤＳ）
＊ＩＬ−６（関節炎）
＊ＩＬ−５（喘息）
＊ＩＬ−８（一般的な炎症）
＊または任意の他のインターロイキン（一般的な炎症）
＊任意の成長因子レセプター（癌）
さらに、すでに開発された治療抗体は、本発明の適用によって増強され得る。例えば、以下が挙げられる：
＊抗ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（冠状動脈血栓症）
＊抗ＴＮＦα（クローン病）
＊抗Ｈｅｒ−２（乳癌）
＊抗ＣＤ−３（移植片拒絶）
＊抗ＣＤ−２０（非ホジキンリンパ腫）。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】図１は、実施例１〜３に記載されるようなマルチマー化ドメイン（ＡＴＦα）、リンカー（ＥＤ）、および抗体配列（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ）を含む例示的なキメラポリペプチドを発現するための発現ベクター（「Ｆａｂベクター」）を示す。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、精製されたＣＦＹ１９６の特徴付けを示す。図２Ａ）ＨＰＬＣサイズ排除カラム上の単一のピークとしての、精製されたＣＦＹ１９６の電気泳動；図２Ｂ）ＣＦＹ１９６のクマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（これは、２つの成分（軽鎖（ＬＣ）のバンドおよび複合体重鎖（ＣＨＣ）バンド（レーン１））として示される）。分子量マーカーが、レーン２に示される。
【図３】図３Ａ〜図３Ｃは、図３Ａ）ＣＦＹ１９５（５．５秒でのピーク）；図３Ｂ）ＣＦＹ１９２Ｂ；および図３Ｃ）ＣＦＹ１９６（６．５５秒でのピーク）からの加工された沈降速度を示す。ＣＦＹ１９６についてのより狭いピークに注意のこと。
【図４】図４は、一価Ｆａｂおよび多価Ｆａｂ−ＡＴＦαドメインキメラタンパク質を用いた、ＨＲＶ１４による感染からのＨｅＬａ細胞の保護を示す。キメラタンパク質は、以下のように示される：ＣＦＹ１９８Ｂ、Ｆａｂ−ＥＤ−ＡＴＦαＬＬ；ＣＦＹ１９６、Ｆａｂ−ＥＤ−ＡＴＦα（１）ＬＩ＋Ｓ；ＣＦＹ１９２Ｂ、Ｆａｂ−ＥＤ−ＡＴＦα（２）ＬＩ；およびＣＦＹ１９５、Ｆａｂ−ＥＤ−ＡＴＦαＩＩ。
【図５】図５は、一価Ｆａｂ１９、二価モノクローナル抗体ＲＲ／１、二価ＣＦＹ２０２、トリマーＣＦＹ１９３Ｂ、およびテトラマーＣＦＹ１９６を用いた、ＨＲＶ１５感染からのＨｅＬａ細胞の保護を示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｂは、二重特異性マルチマータンパク質を示す。図６Ａ）異なるハッチング（ｈａｔｃｈｉｎｇ）で示されるＦａｂ部分は、異なる特異性または機能を有する。リンカー配列は、六角形で示される。図６Ｂ）このポリペプチドは、１つのトリシストロンＲＮＡ分子から産生される。このメッセージから翻訳される第一のポリペプチド鎖についてのコード配列は、ハッチングされた囲みにより示され、抗ＣＤ３軽鎖（ＬＣ−１）を表す。第二のＤＮＡフラグメントは、ＩｇＤから誘導されたヒンジに連結された抗ＣＤ−３重鎖（ＨＣ−１）、引き続くダイマー化ドメイン、第二のヒンジ、および抗ＣＤ−１９軽鎖（ＬＣ−２）から構成される中央のキメラポリペプチドをコードする。第三のＲＮＡ（空の囲み）は、抗ＣＤ１９重鎖（ＨＣ−２）をコードする。制限部位は、示されるとおりである。
【図７】図７Ａ〜図７Ｂは、溶媒に曝された位置でのアミノ酸の置換によるＡＴＦαＩＬのテトラマー化の改善を示す；図７Ａ）ＣＦＹ１９７１；図７Ｂ）ＣＦＹ１９７２；およびＣ）ＣＦＹ１９７。
【図８】図８は、競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。このデータは、ＩＣＡＭ−１へのトレーサー抗体結合の阻害の％として表される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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