(57)【要約】本発明は、リュードコッカス  エリトロポリスからのアルコールデヒドロゲナーゼに関する。このような補因子−依存型ＡＤＨｓを用いた場合には、有機合成において使用することができるキラルアルコールは、有利には補因子−再生酵素と一緒に、組み合わされた酵素系中で得ることができる。核酸配列、これを含有するビヒクル、ポリペプチド配列および突然変異の方法および配列の使用をクレームする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸配列が、
ａ）配列番号１の配列を有する核酸配列、
ｂ）配列番号１による核酸配列またはそれと相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、
ｃ）配列番号１と少なくとも９１％の相同性を有する核酸配列、
ｄ）アミノ酸レベルで、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８４％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、この場合、これらの配列は、配列番号２のポリペプチドと比較した場合に、ポリペプチドの活性および／または選択性および／または安定性を本質的に減少させるものではなく、
ｅ）配列番号２のポリペプチドと比較した場合に、改善された活性および／または選択性および／または安定性を有するポリペプチドをコードする核酸配列
から成る群から選択され、この場合、これらの配列が、
ｉ）配列番号１の突然変異
ｉｉ）ｉ）で得られた核酸配列を適したベクター中でをクローニングし、その後に適した発現系中に形質転換させ、かつ
ｉｉｉ）改善された活性および／または選択性および／または安定性を有するクリティカルなポリペプチドを検出することによって製造されることを特徴とする、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列。
【請求項２】
ａ）請求項１に記載の核酸配列によってコードされるポリペプチド、
ｂ）配列番号２による配列を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号２のポリペプチドと少なくとも８４％の相同性を有するポリペプチド、この場合、これらのポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドと比較した場合に、ポリペプチドの活性および／または選択性および／または安定性を本質的に減少させるものではない、の群から選択されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の１種またはそれ以上の核酸を有する、プラスミド、ベクター、微生物。
【請求項４】
ＰＣＲによって請求項１に記載の核酸配列を製造するためのプライマー。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸配列から出発して、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する改善されたｒｅｃ−ポリペプチドを製造するための方法において、
ａ）核酸配列に突然変異を生じさせ、
ｂ）ａ）から得ることが可能な核酸配列を、適したベクター中にクローニングし、かつこれらを適した発現系に移し、かつ、
ｃ）改善された活性および／または選択性および／または安定性を有する形成されたポリペプチドを検出し、かつ単離することを特徴とする、請求項１に記載の核酸配列から出発して、アルコールデヒドロゲナーゼを有する改善されたｒｅｃ−ポリペプチドを製造するための方法。
【請求項６】
請求項５によって得ることが可能な、ｒｅｃ−ポリぺチドまたはこれらをコードする核酸配列。
【請求項７】
キラルのエナンチオマー濃縮された有機化合物、たとえばアミノ酸またはアルコールを製造するための、請求項２または６に記載のポリペプチドの使用。
【請求項８】
全細胞触媒を製造するための、請求項１から６までのいずれか１項に記載の核酸配列の使用。
【請求項９】
ＮＡＤＨ依存型アルコールデヒドロゲナーゼのためのクローニングされた遺伝子およびホルメートデヒドロゲナーゼまたはＮＡＤＨオキシダーゼのためのクローニングされた遺伝子を有する、全細胞触媒。
【請求項１０】
Ｒ．エリトロポリス、特にＤＳＭ４３２９７からのアルコールデヒドロゲナーゼである、請求項９に記載の全細胞触媒。
【請求項１１】
ホルメートデヒドロゲナーゼが、カンジダ  ボイジニイからのホルメートデヒドロゲナーゼから誘導され、かつＮＡＤＨオキシダーゼが、ラクトバチルス  ブレビスからのＮＡＤＨオキシダーゼから誘導される、請求項９に記載の全細胞触媒。
【請求項１２】
請求項２または６に記載のポリペプチドでの有機化合物の補因子依存型酵素的変換および補因子の酵素的再生を有する、組み合わされた酵素反応系。
【請求項１３】
酵素的再生を、カンジダ  ボイジニイからのホルメートデヒドロゲナーゼから誘導されたホルメートデヒドロゲナーゼ、またはラクトバチルス  ブレビスからのＮＡＤＨオキシダーゼから誘導されたＮＡＤＨオキシダーゼを用いて実施する、請求項１２に記載の反応系。
【請求項１４】
ケトンの不斉還元のための方法における、請求項９に記載の全細胞触媒の使用。
【請求項１５】
ベクターｐＫＡ１。
【請求項１６】
封入体を形成しうる組換えタンパク質を製造するための、「高いコピー数」ベクター（Ａ）および「中程度のコピー数」ベクター（Ｂ）から製造されるベクターの使用において、少なくとも複製源がベクター（Ｂ）から取り出され、かつ少なくともクローニングエレメントおよび発現エレメントがベクター（Ａ）から取り出されることを特徴とする、ベクターの使用。
【請求項１７】
ｐＥＴ１１ａをベクター（Ａ）として、かつｐＡＣＹＣ１８４をベクター（Ｂ）として使用する、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物リュードコッカス・エリトロポリス（Rhodococcus erythropolis）からのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ、ＲＥ−ＡＤＨ）に関する。さらに本発明は、特に、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法、さらにはこれらの使用に関する。特異的な全細胞触媒または組み合わされた酵素反応系は、さらに本発明の対象である。
【０００２】
光学的活性の有機化合物、たとえばアルコールおよびα−アミノ酸の、生物触媒的経路を用いての製造は、ますまず重要になってきている。補因子再生における２種のデヒドロゲナーゼを組み合わせての使用は、これら化合物の工業的規模における合成の経路として試みられている（ＤＥ１９７５３３５０）。
【０００３】
【化１】
2005523702.tif 000002
【０００４】
ＮＡＤ−依存型ホルメートデヒドロゲナーゼを用いての、ＮＡＤＨのｉｎ  ｓｉｔｕ再生は、トリメチルピルベートの還元的アミノ化において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを提供する（Bommarius et al. Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 2851-2888）。
【０００５】
これに関して、同様に重要なアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨｓ）は、平行しての組み合わされた酵素系、特に、ケトンまたはラセミ体アルコールから出発してのエナンチオマー濃縮されたアルコールの製造を可能にする（DE10037101、 W. Hummel, Adv. Biochem. Engineering/Biotechnology 1997, 58, 145-184.）。
【０００６】
【化２】
2005523702.tif 000003
【０００７】
ＡＤＨｓは、Ｅ．Ｃ．１．１．１．１クラスに分類されており、したがっていわゆるオキシドレダクターゼに属する。これらは、多くの微生物中で見出されている（Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Ed.: K, Drauz and H. Waldmann, 1995, VCH, Vol. II, 595ff）。いわゆる、立体選択的に広範囲の基質上で反応する「ブロードバンド」酵素が重要である。
【０００８】
３種の異なるＡＤＨｓは、酵母（ＹＡＤＨ）、ウマの肝臓（ＨＬＡＤＨ）およびテルモアナエロビウム  ブロッキイ（Thermoanaerobium brockii；ＴＢＡＤＨ）からのものであり、この場合、これらは、アルコールを製造するために使用されるものであり、すでに実験室規模における使用のために、商業的に入手可能なものである。さらに、他のＡＤＨｓも商業的に入手可能であるが、しかしながら、これらはおそらくは、その名称を挙げるとすれば特定の基質と反応するものであって、たとえば、ステロイド構造中で好ましくはアルコール群と反応するいくつかのステロイドデヒドロゲナーゼであるか、あるいは、グリセリンと反応するグリセロールデヒドロゲナーゼ、あるいは最終的には、たとえばグリコースＤＨのような糖反応性酵素である。
【０００９】
これに関して、文献中で最も開示されているＡＤＨｓは、「Ｓ−特異的」なものである（ＳおよびＲの用語は、時に技術的理由から命名において可逆的である）。
【００１０】
しかしながら、我々の認識によれば、ラクトバチルス菌株からのＡＤＨｓは、Ｒ−特異的であり（C. W. Bradshaw, W. Hummel, C.-H. Wong, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532.）、同様に文献中において開示されている他のＡＤＨは、シュードモナスからのものであり、この場合、これらは、最近になってAltenbucherおよびBronscheuerの研究グループによって報告されている。（P. Hildebrandt, T. Riermier, J. Alrenbuchner, U. T. Bornscheuer, Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 1207）。KeinanおよびLamedを含む研究グループは、テルモアナエロビウム  ブロッキイ（Thermoanaerobium brockii）からのＡＤＨにおいて報告されており、この場合、これらは、小さい基質に関しては（Ｒ）−特異的であるが、大きい基質に関しては（Ｓ）−特異的であるものを示している。
【００１１】
（Ｓ）−特異的アルコールデヒドロゲナーゼの大多数の典型例は公知であるが、その工業的適性は一般には極めて制限されている。これは、公知のＡＤＨｓの多くの数に比べて、これらが、特にほんのいくつかの工業的方法で試みられているにすぎないからである。酵母からの（Ｓ）−ＡＤＨは、ＮＡＤ−依存型酵素である。これは極めて安価であるが、しかしながら本質的には第１アルコールのみを変換し（またはアルデヒド）、したがってこのような酵素は、キラルアルコールの製造に関してはあまり有用ではない。さらに、この酵素は特に感受性であり、かつ特に有機溶剤に対しての高い不安定性によって特徴付けられる。ウマ肝臓（ＨＬＡＤＨ）からのＮＡＤ−依存型（Ｓ）−ＡＤＨは、間違いなく、これに関しての、最も頻繁に使用されるアルコールデヒドロゲナーゼであり、特に学術的分野においては、この酵素を用いて、多くの文献において試験されている（たとえば、K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 4th edition, Springer- Verlag, 2000, p. 184以降）。
【００１２】
不運なことに、この酵素は、その入手可能性の低さから工業的使用に関してはあまり適切ではない。さらに、ウマ肝臓からの（Ｓ）−ＡＤＨは極めて高価であり（１Ｕ当たり約０．５ユーロのコスト）、最近では組換え体の形では入手されない。さらに、基質スペクトルは、好ましくは環状ケトンを含むものであって；芳香族側鎖を有するケトン（アセトフェノン型）は変換されない。しかしながら、芳香族ケトンを含有する基質のこの群は、工業的観点から特に有用であり、この場合、これらは、製薬学的領域における鍵となる中間産物としての、多く適用されうる（たとえば、ａ）R. A. Holdt, S. R. Rigby （Zeneca Limited）、ＵＳ５５８０７６４、１９９６；ｂ）T. J. Blacklock, P. Sohar, J. W. Butcher, T. Lamanec, E. J. J. Grabpwski, J. Org. Chem. 1993, 58, 1672-1679；ｃ） R. A. Holdt, Chimica Oggi-Chemistry Today 1996, 9, 17-20； ｄ） F. Bracher, T. Litz, Arch. Pharm. 1994, 327, 591-593；ｅ） S.Y. Sit. R. A. Parker, I. Motoc, W. Han, N. Balasubramanian, J. Med. Chem. 1990, 33, 2982-2999;；ｆ）A. zaks, D. R. Dodds, Drug Discovery Today 1997, 2, 513-530）。テルモアナエロビウム  ブロッキイ(Thermoanaerobium brockii）細菌（ＴＢＡＤＨ）からのＮＡＤＰ−依存型ＡＤＨ（ＮＡＤＰは、ＮＡＤよりも５〜１０倍高価である）は、また組換え型で入手可能である。しかしながら、その基質スペクトルは、脂肪族ケトンに関して制限される。たとえば、芳香族側鎖を有するケトン（アセトフェノン型）は変換されない。
【００１３】
単離された酵素の使用とは別に、アルコールデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒の使用は公知であるが、原則として、単離された酵素の使用と比較して不利である。これらの欠点としては、特に、K. Faber, Biotransformation in Organic Chemistry, 4th edition, springer-verlag, 2000, p. 193以降において記載されているように、単離された酵素と比較して微生物−触媒反応における低い生産性および低い収率を有することである。たとえば、パン酵母を使用した場合の反応率は、使用される最も一般的な全細胞触媒であるが、数日間に亘っての反応においては稀である。他の欠点は、困難な生成物の後処理工程（添加された炭素源、細胞材料および副生成物の分離）、さらにはいくつかのＡＤＨｓが、通常細胞中に存在するといった事実により生じる問題であり、この場合これらは同時に生じ、かつしばしば、好ましくない副次的反応および減少した収率および好ましい産物のエナンチオ異性選択性の減少を生じうる。それにもかかわらず、いくつかの例においては、天然の全細胞触媒が、工業的規模で使用される場合には、一般に工業的規模（＝トンの規模）に達するようなプロセスではないことが文献から公知である。たとえば、Ｚｅｎａｃａ  Ｌｉｆｅ−Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．（R.H. Holdt, S.R. Rigby (Zeneca Ltd.), US 5580764, 1996）では、ジヒドロ−６−メチル−４−チエノ−チオピラン−４−オン−７，７−ジオキシドの、相当する４−ヒドロキシ化合物への、ニューロスポラ  クラッサ（nerospora crassa 糸状真菌）からのＡＤＨを用いての変換が記載されており、その際、酵素は単離されておらず、前記に示すように全細胞が使用されている。ブリストル−マイヤー−スクイブは、エチル６−ベンジルオキシ−３，５−ジオキソ−ヘキサノエートを、相当する３，５−ジヒドトキシ化合物に、アシネトバクター  カルコアセチッカス（Acinetobacter calcoaceticus）（細菌）からの細胞抽出物中に存在する酵素を用いて変換した（R.N. Ratel, C.G. McNamee, A. Banerjee, L. J. Szaeka (E.R. Squibb & Sons), EP569998, 1993）。さらに、メチル−４−クロロ−３−オキソ−ブチレートを相当する３−ヒドロキシ化合物に、ゲオトリチウム  カンジジウム（Geotrichum candidum）（酵母菌）からのＡＤＨを用いての変換が記載されている（Patel, R. N., McNamee, C. G., Banerjee, A., Howell, J. M., Robinson, R. S., Szaeka, L.J., Enzyme Microb. Technol. 1992, 14, 731）。
【００１４】
イーライリリーでは、３，４−メチレン−ジオキシアセトフェノンの相当するアルコールへの変換においてサイゴサッカロミセス  ロキシイ（Zygosaccharomyces rouxii 酵母)からのＡＤＨを用いておこなうことが報告されている（J.T. Vicenzi, M. J. Zmijewski, M. R. Reinhard, B. E. Landen, W. L. Muth, P.G. Marler, Enzyme Microb. Technolol. 1997, 20, 494）。
【００１５】
メルクでは、ピリジン誘導体を、カンジタ  ソルボフィア（Chartrain, M., Chung, J., Roberge, C. (Merck & Co., Inc.)  酵母）を用いて変換している（Chartrain, M., Chung, J., Roberge, C. (Merk & Co., Inc. US 5846791, 1998)）。
【００１６】
日本の刊行物では、メチル−４−クロロ−３−オキソ−ブチレートをＡＤＨを用いて、組換え全細胞触媒中で還元することが記載されている。適したＡＤＨ（市販されていない「ケトレダクターゼ」）および補酵素−再生酵素を、Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞と一緒にクローニングした（Kataoka, M., et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997, 48, 699; Kataoka, M., et al., Biosci., Biotechnol., Biochem. 1998, 62, 167）。
【００１７】
（Ｓ）−特異的酵素に関しては、微生物リュードコッカス  エリトロポリス（Rhodococcus erthropolis）からの（Ｓ）−ＡＤＨが、すでに特許出願ＤＥ４２０９０２２から公知である。しかしながら、これは明らかに、わずかに熱的安定性を有し、かつ１０時間に亘ってのインキュベーションの後に最適温度４５℃を有する酵素系である。熱的安定性は、直接的に操作的安定性および溶剤中での安定性に結びつくが（Suzuki, Y., K. Oishi, H. Nakano and R. Nagayama. Appl. Microbiol. Biotechnol. 26: 546）、工業的プロセスに関しては中程度の安定性のみが、この刊行物中に記載された中温性酵素に関して期待されるうる。
【００１８】
したがって、さらに改善された、工業的合成において使用することのできるＡＤＨｓが要求される。以上より、本発明の対象は、公知の酵素と比較した場合に、改善された特性を有する、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨｓ）またはこれらをコードする核酸を提供することである。特に、ＡＤＨｓは、エナンチオマー濃縮アルコールを製造するための工業的規模において、効果的に使用することができ、その結果、製造プロセスのこれらの型を、有利には経済的および環境的観点から、商業的規模において実施することが可能であり、その際、選択率、安定性および／または活性の点で前記にしめされた平均的なＡＤＨを要求するものである。
【００１９】
本発明の対象は特許請求の範囲に示す通りである。請求項１は特定の核酸に関し、請求項２はそれに付随するポリペプチドに関する。請求項３および４は、本発明による核酸のためのプライマーおよびビヒクルに関する。請求項５は、改善されたポリペプチドを得ることが可能な手段を用いての突然変異方法を保護するものである。請求項６は、ポリペプチドおよびそれから導かれる核酸配列自体に関する。請求項７および８は、製造されたポリペプチドおよび核酸の使用に関し、その一方で請求項９〜１１は、特異的な全細胞触媒に関する。最終的に請求項１２および１３では、本発明による酵素で改質化された反応系を提供する。請求項１４は、本発明による全細胞触媒の使用に関し、その一方で、請求項１５は本発明によるベクターを保護するものである。請求項１６および１７は再び、特定のベクターの使用に関する。
【００２０】
以下の群から選択される、アルコールデヒドロゲナーゼを有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列、
ａ）配列番号１で示された配列を有する核酸配列、
ｂ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１による核酸配列またはこれと相補的な配列と一緒にハイブリダイズする核酸配列、
ｃ）配列番号１と少なくとも９１％の相同性を有する核酸配列、
ｄ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８４％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、その際、配列番号２のポリペプチドと比較して、ポリペプチドの活性および／または選択性および／または安定性について本質的に減少することはないものであって、
ｅ）配列番号２のポリペプチドと比較して改善された活性および／または選択性および／または安定性を有するポリペプチドをコードする核酸配列
を得ることが可能であり、この場合、これらは、
ｉ）配列番号１を突然変異させ、
ｉｉ）適したベクター中で、ｉ）から得られた核酸配列をクローニングし、その後に適した発現系に移し、
ｉｉｉ）改善された活性および／または選択性および／または安定性を有するクリティカルなポリペプチドを検出することによって製造されたものであり、好ましい場合には、適した量で、かつ組み換え技術を用いて製造され、この場合、酵素は、エナンチオマー濃縮化合物を製造するための酵素的工業プロセスに関して必要とされる。核酸配列を用いた場合には、急速に成長したホスト微生物から高い収率でポリペプチドを得ることが可能である。通常ではない広い範囲の基質スペクトルに加えて、本発明によるポリペプチドは予測とは対照的に熱耐性である。
【００２１】
これらは、特に、脂肪族および芳香族ケトン、アルデヒドおよび２−または３−ケトンエステルを変換する。通常ではなくかつ予測しえない、前記に示したようなことは、本発明による核酸配列によってコードされたポリペプチドが、実際に１５分に亘って６５℃の温度で不活性化されない事実に基づくものであるが、それというのも、これらのポリペプチドは、３７℃ではもはや成長しない細菌から得られるものであって、好熱性ではないためである。この極めて高い熱安定性に加えて、この場合、これらは有利には高い操作安定性および溶剤耐性に付随するものであり（Suzuki, Y. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 26: 546 (上記参照)）、本発明のポリペプチド、さらにはこの酵素に関してコードする核酸配列は、ＤＥ４２０９０２２に挙げられた酵素とは、構造および大きさにおいて異なっている。本発明によるポリペプチドにおける４個のサブユニットが、それぞれ３９ｋＤａ（±２ｋＤａ）のモル質量を有する一方で、ＤＥ４２０９０２２に記載の２個のサブユニットは、７２ｋＤａ（±５ｋＤａ）のモル質量を有する。
【００２２】
したがって、本発明においては、核酸配列に加えて、ストリンジェントな条件下で、本発明による核酸配列またはそれと相補的な配列とハイブリダイズする核酸配列、さらに、変異のための適した方法によって開発されたその他の配列を請求する。
【００２３】
本発明による核酸配列またはそれによりコードされるポリペプチドを製造するための方法において、突然変異方法を用いることは当業者に公知である。突然変異のための適した方法は、この目的のために当業者に公知の方法すべてである。特にこれらは、飽和突然変異、ランダム突然変異、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え方法および部位指定突然変異法である（Eigen, M. and Gardiner, W., Evolutionary molecular engineering based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 1984, 56, 967-978; Chen, K. and Aenold, F., Enzyme engineering for non-aqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of substilisin E in polar organic media. Bio/technology 1991, 9, 1073-1077; Horwitz, M. nad Loeb, L., Promoters Selected From Random DNA- Sequences, Proc Natl Acad Sci USA 83, 1986, 7405-7409; Dube, D. nad L. Loeb, Mutants Generated By The Insertion of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta- Lactamase Gene, Biochemistry 1989, 28, 5703-5707; Stemmer, P.C., Rapid evolution of protein in vitro by DNA shuffling, Nature 1994, 370, 389-391 and Stemmer, P.C., DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA 91, 1994, 10747-10751）。
【００２４】
得られた新規核酸配列は、ホスト微生物中で、示された方法（以下の文献参照のこと）を用いてクローニングし、かつこの方法で発現されたポリペプチドを検出し、その後に適したスクリーニング方法によって単離した。検出の目的のために、このポリペプチドで形成された分子に関するすべての可能な検出反応が基本的には適している。特に、形成されるかまたは消費されたＮＡＤＨを介しての側光試験、ＨＰＬＣまたはＧＣ方法は、ここで、この酵素を用いて形成されたアルコールを検出するために使用することができる。さらに、遺伝子工学的技術を用いて改質化された新規ポリペプチドを検出するために、ゲル電気泳動による検出法または抗体を用いての検出法が適している。
【００２５】
前記に示したように、さらに本発明は、ストリンジェントな条件下で、本発明による一本鎖核酸配列あるいはこれと相補的な一本鎖核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を包含する。たとえば、配列番号１３による遺伝子プローブまたは配列番号３〜１２に示されたプライマーによる遺伝子プローブはこのような配列に関する。
【００２６】
「ストリンジェントな条件下」の用語は、ここでは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって記載されたものと同様の意味であると解される（Sambrool, J. ; Fritsch, E. F. nd Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。本発明によるストリンゲントなハイブリダイゼーションは、好ましくは、１ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）および０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で、１時間に亘って５０℃で、より好ましくは６２℃で、最も好ましくは６８℃で成長させた後に、かつさらに好ましくは０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで、５０℃で、好ましくは５５℃で、より好ましくは６２℃で、さらに好ましくは６８℃で１時間に亘って成長された後に、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナルがさらに観察された。
【００２７】
さらに、本発明による適用は、以下の群から選択されるポリペプチド（酵素）を提供する：
ａ）本発明による核酸配列によってコードされたポリペプチド、
ｂ）配列番号２による配列を含有するポリペプチド、
ｃ）配列番号２のポリペプチドに対して＞８２％の相同性を有するポリペプチド、その際、ポリペプチドの活性および／または選択性および／または安定性が、配列番号２のポリペプチドと比較した場合に本質的に減少していることはない。
【００２８】
本発明によるポリペプチドは、前記に示された安定性および広範囲の基質スペクトルによって、工業的プロセスにおいて極めて簡単に使用される。
【００２９】
次の改良点において、本発明は、本発明による１個またはそれ以上の核酸配列を含有するプラスミドまたはベクターを提供する。
【００３０】
適したプラスミドまたはベクターは、原則としてこの目的に関して当業者に公知のすべてのものである。プラスミドおよびベクターのこれらの型は、たとえば、Ｓｔｕｄｉｅｒら（Studier, w. F.; Posenberg A.. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.;, Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Mothods Enzymol. 1990, 185, 61-89）であるか、あるいはＮｏｖａｇｅｎ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｏｒ  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ等の会社のカタログにおいて見い出すことができる。他の好ましいプラスミドおよびベクターは、以下において見出すことができる：Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（１９８５），ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ：Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄＤｅｎｈａｒｄｔ，Ｄ．Ｔ（ｅｄｓ）（１９８８）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：  ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，１７９−２０４、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ；  Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｍｏｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０，１８５，３−７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．；Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉｓｔｉｓ，Ｔ．（１９８９），ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
本発明による核酸を含有する遺伝子コンストラクトを包含するプラスミドを、極めて好ましい方法でホスト微生物中でクローニングすることができるプラスミドは、以下のものである。ｐＵＣ１８（Roche Biochemicals）、ｐＫＫ−１７７−３Ｈ（Roche Biochemicals）、ｐＢＴａｃ２（Roche Biochemicals）、ｐＫＫ２２３−３（Amersham Pharmacia Biotech）、ｐＫＫ−２３３−３（Stratagene）またはｐＥＴ（Novagen）、またはｐＫＡ１（図１）である。
【００３１】
同様に本発明は、１種またはそれ以上の本発明による核酸配列を含有する微生物を提供する。
【００３２】
本発明による核酸配列を含有するプラスミドをクローニングする微生物は、増殖させて使用し、かつ十分な量の組換え酵素を得られる。この目的のために使用される方法は当業者には公知である（Sambrook, J.,; Fritch, E.F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory m,anual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。これに関連する微生物としては、原則として当業者に公知ものであり、この場合、これらの目的のために適しているのは、たとえば酵母、Hamsenula polymotpha, Pichia 種, Saccharomyces cerevisiae, prokaryotes, E. coli, Bacillus subtilis ot eukatyontes, たとえば哺乳類細胞、昆虫細胞である。Ｅ．Ｃｏｌｉの系がこの目的のために好ましい。以下は特に好ましいものである：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ，ＮＭ５２２，ＪＭ１０１，ＪＭ１０９，ＪＭ１０５，ＲＲ１，ＤＨ５α，ＴＯＰ１０−またはＨＢ１０１である。本発明による核酸配列を含有する遺伝子コンストラクトを含むプラスミドは、好ましくは、前記ホスト微生物中でクローニングされた。
【００３３】
本発明の他の態様は、本発明による遺伝子配列を、すべての型のＰＣＲを用いて製造するためのプライマーを提供することである。相当するアミノ酸配列をコードするためのセンスおよびアンチセンスプライマー、または相補的ＤＮＡ配列が含まれる。適したプライマーは、原則として当業者に公知の方法で得ることができる。本発明によるプライマーの開発は、公知のＤＮＡ配列との比較によってか、あるいは微生物の好ましいコドンを検討しながら視覚的に検出されたアミノ酸配列を翻訳することによっておこなわれる（たとえば、ストレプトマイセスに関して：Wright F. and Bibb m.J. (1992), Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome, Gene 113, 55-65）。いわゆるスーパーファミリーからのタンパク質のアミノ酸の共通の特徴は、さらにこれに関して使用される（Firestine, S. M.; Nixon, A. E.; Benkovic, S. J. (1996), Threading your way to protein function, chem. Biol. 3, 779-783）。これに関する他の刊行物としては、Gait, M. J. (1984), Oligonucleotide synthesis: a practical approach, IRL Press Ltd., Oxford; Innis, M. A.; Gelfound, D.H.; Sninsky, J.J. and White, T.J. (1990), PCR Protocols: A guide to method and applications, Academic Press Inc., San Diego.が挙げられてもよい。以下のプライマーが特に好ましい：
【００３４】
【化３】
2005523702.tif 000004
【００３５】
さらに本発明は、本発明による核酸配列から出発して、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する改善されたｒｅｃ−ポリペプチドを製造するための方法を提供し、その際、以下のプロトコールが適用される：
ａ）核酸配列を突然変異させ、
ｂ）ａ）により得られた核酸配列を適したベクター中でクローニングし、その後に、これを適した発現系に移し、かつ、
ｃ）改善された活性および／または選択性および／または安定性を有するポリペプチドの形成を検出し、かつ単離する。
【００３６】
さらに本発明は、ｒｅｃ−ポリペプチドまたはこれらをコードする核酸配列を提供し、この場合、これらは前記と同様の方法により得ることが可能である。
【００３７】
改善されたｒｅｃ−ポリペプチドを製造させるために必要な核酸配列の製造およびそのホスト中での発現は以下に記載されており、相応して本明細書中で適用される。
【００３８】
本発明によるポリペプチドおよびｒｅｃ−ポリペプチドは、好ましくはキラルエナンチオマー濃縮された有機化合物、たとえば立体的中心を有する第２アルコールを製造するために使用される。
【００３９】
驚くべきことに、アルコールデヒドロゲナーゼの新規の型および従来公知のアルコールデヒドロゲナーゼ、たとえばＲ．エリトロポリスからのＡＤＨｓは、特に、これは基質パターンさらには製造されるエナンチオ選択性に関して、極めて種々の生物化学的特性を示す。新規ＡＤＨは、特に芳香族第２アルコールを製造するのに適していることが示され、この場合、これらは、新規のＡＤＨに関する工業的適用性を高いレベルに導くものであり、これはこのクラスの基質の商業的有用性の理由からである。
【００４０】
以下においては、特にＲ．エリトロポリスからの従来のＡＤＨｓと比較した場合に、相違しかつ有利であることが記載されている。
【００４１】
ここで請求されているＲ．エリトロポリスからのアルコールデヒドロゲナーゼは、従来のＡＤＨｓと比較した場合において、かなり相違するものであり（たとえば、ＤＥ４２０９０２２、１９９９，Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４，３３，２８３およびＪ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｄｉｓｓｅｒａｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖ．Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｅｆ，１９９３）、この場合、これらは、粗製のエキストラクトから直接的にかまたは部分的に精製されて使用されている。これらの相違点については、前記に示すように、物理的特性、たとえば構造、熱的安定性および有機媒体中での安定性さらには生物化学的特性の双方に関するものであり、特に基質の受容性に関する。
【００４２】
従来公知のＡＤＨｓと比較した場合における、Ｒ．エリトロポリスから新規ＡＤＨの生物化学的特徴における著しい相違（基質受容性）は以下に示すとおりである。特に表に示すように、これは、実施例および図面によって例証されている。この場合において、通常は、一つの化合物に対する尺度となる活性は１００％に調整され、かつ他の化合物の活性をそれに対して測定する。他の基質と比較した場合の相対的活性から、もう一方の基質が大きいまたは小さい程度に受容されるかどうかについて認識される。
【００４３】
第１の顕著な例は第１表に示されている。この場合において、それぞれのｐ−メチルアセトフェノンに対して測定される活性は１００％に調整される。驚くべきことに、これらは、新規のＡＤＨが基質ｐ−クロロアセトフェノンに対して著しく改善された受容性を導くことを示しており、その際、相対的活性は１８９％である。対照的に、ｐ−メチルアセトフェノンとの比較において減少した活性は、８１％のみであり、この場合、これは従来のＡＤＨに関して測定したものである（ＤＥ４２０９０２２、１９９１に記載）。
【００４４】
【表１】
2005523702.tif 000005
【００４５】
他の重要な比較は、第２表に示されている。ここで相対活性は、ｐ−フルオロアセトフェノンに対して得られたものである。この場合において、新規のＡＤＨは好ましくは、基質ｐ−メトキシアセロフェノンを受け入れるものであって（相対活性：１９５％）、その一方で対抗する作用は、従来公知のＡＤＨに関して観察される（ＤＥ４２０９０２２、１９９１参照）（ｐ−フルオロアセトフェノン１００％と比較してのｐ−メトキシアセトフェノン９０％のみの相対活性）。
【００４６】
【表２】
2005523702.tif 000006
【００４７】
しかしながら、著しい相違は、種々の置換された芳香族ケトンの領域に対して制限されるわけではなく、脂肪族β−ケトエステルとの一般的比較においてのみ検出される（第３表）。これによればβ−ケトエチルエステルは、ＡＤＨのすでに公知の形によって（J, Perters, Dissertation, 1993）、芳香族ケトンの例としてのｐ−クロロアセトフェノンよりもより簡単に受容されない（２５０％対１００％）。さらに簡単には受容されないケトエステル基質であっても、メチルアセトアセテートは、ｐ−クロロアセトフェノンと同様の活性を有する。対照的な動向は、新規のＡＤＨの形によって示される：ここで、メチルエステルと比較した場合には、ｐ−クロロアセトフェノンは、９倍を上廻る活性を有する（９０９％対１００％）。さらにβ−ケトエチルエステルとの比較において、ｐ−クロロアセトフェノンは、新規ＡＤＨを使用した場合により高い活性を有する（９０９％対７７３％）。したがって、この例はさらに、新規ＡＤＨと従来の公知ＡＤＨｓとをＪ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，１９９３にしたがって比較した場合に、基質受容性における著しい定量的変更を証明するものである。
【００４８】
【表３】
2005523702.tif 000007
【００４９】
最終的に、基質受容性に対する著しい定量的相違が、さらに異なる方法において官能化されたケトンに関して見出されるものであることが挙げられてもよい。これは、純粋な長鎖アルキルケトンとフェノキシアセトンとを比較した例によって示され、この場合、典型的にはヘテロ原子−置換されたジアルキルケトンである（第４表）。
【００５０】
【表４】
2005523702.tif 000008
【００５１】
したがって、Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，１９９３からのＡＤＨの公知の型に関する基質パターンは、明らかに、好ましい長鎖アルキルケトンに関して試験される。２−ヘプタノン（１００％）および２−デカノン（７９％）の双方に関して、フェノキシアセトン（７１％）よりも高い活性が見出された。しかしながら新規ＡＤＨは、完全に異なる基質パターンを示すものである。ここで、１２６％を大きく上廻る高い活性は、フェノキシアセトンに関して測定され、その一方でアルキルケトンは、より低い活性を有する（１００％および７６％）。２−アルキルケトンの範囲内で、Ｃ７−ケトンがＣ１０−ケトンよりも好ましいが、しかしながら、これらはすべてのＡＤＨｓに関して同様であり、２−デカノンと比較した場合には、２−ヘプタノンの一般的に高い活性によって証明されるものである。
【００５２】
したがって重要であるのは、生物触媒がこの新規ＡＤＨにおいて見出されることであり、この場合、これらは、たとえばＲ．エリトロポリスからの従来のＡＤＨｓと比較して改質されたか、あるいはさらに相補的な特性を示すものであり、この場合、これらは、粗製抽出物からであるか、あるいは、部分的に精製されたものから直接的に使用される。これらの著しい相違点は、適用における新規かつ重要な分野を見出し、かつ同時に、この新規生物触媒の新規性について報告するものである。したがって、Ｒ．エリトロポリスからの従来のＡＤＨｓを含有するＡＤＨｓは、粗製抽出物または部分的に精製された形から生じるものであって、新規かつ改善された生物触媒である新規のＡＤＨｓと比較した場合に、その生物化学的性質に関して極めて、異なる性質を有するものである。特に、明らかな利点は、光学的活性芳香族アルコールを含む基質の工業的に極めて重要な群の製造に関して見出される。
【００５３】
さらに本発明による核酸配列は、この場合、これらはさらに改善されたものであって、必要とするポリペプチドをコードし、好ましくは、全細胞触媒の製造に関して適している。このような生物触媒の製造は、原則として以下のように記載し、かつ当業者に十分公知のものである。
【００５４】
さらに本発明は、ＮＡＤＨ−依存型アルコールデヒドロゲナーゼのためのクローニングされた遺伝子を含有し、かつＮＡＤＨの再生に適した酵素、ホルメートデヒドロゲナーゼ、またはＮＡＤ−再生酵素、たとえばＮＡＤＨオキシダーゼのためのクローニングされた遺伝子を含有する全細胞触媒を提供する。
【００５５】
他の好ましい全細胞触媒は、他方では、アルコールデヒドロゲナーゼが、Ｒ．エリトロポリスからのものであり、特に、本発明によるものであって、ＤＳＭ４３２９７からのものであることによって特徴付けられる。
【００５６】
全細胞触媒中でホルメートデヒドロゲナーゼの存在する場合において、これは、カンジダ  ボイジニイ（Candida boidinii）から誘導されたホルメートデヒドロゲナーゼであるべきであり、かつＮＡＤＨオキシダーゼが存在する場合には、これは、ラクトバチルス  ブレビス（Lactobacillus brevis）から誘導されたＮＡＤＨオキシダーゼであるべきである。ＤＥ１０１５５９２８において挙げられたような微生物は、好ましくはホスト微生物として使用されるものである。
【００５７】
この型の微生物の有利な点は、双方のポリペプチド系の同時の発現であり、その際、１種のみのｒｅｃ−微生物が本発明において包含されるべきである。ポリペプチドの発現のための反応割合を適合させるために、相当するコードされた核酸配列は、異なるプラスミド上で、異なるコピー数および／または異なる強度のプロモーターで、核酸配列の異なる強度の発現のために使用することができる。適合された酵素系のこの型において、場合により抑制された中間体化合物の堆積が有利には生じることなく、かつ必要とされる反応は、適切な全割合でおこなうことができる。しかしながら、これは当業者に極めてよく知られたものである。
【００５８】
【化４】
2005523702.tif 000009
【００５９】
これに加えて、本発明は、本発明によるポリペプチドでの有機化合物の補因子−依存型酵素的変換および補因子の酵素的再生を含む組み合わされた酵素反応系を提供する。
【００６０】
補因子の酵素的再生は、有利には、カンジタ  ボイジニイ（Candida boidinii）からのホルメートデヒドロゲナーゼから誘導されたホルメートデヒドロゲナーゼであるか、あるいはラクトバチルス  ブレビス（Lactobacillus brevis）からのＮＡＤＨオキシダーゼから誘導されたＮＡＤＨオキシダーゼを用いて実施することができる。反応系は、本発明による反応を実施することができる任意の容器であると解され、この場合、これは、任意の型の反応器（環状反応器、撹拌槽、酵素膜型反応器等）であるか、あるいはすべての任意の形の診断キットである。
【００６１】
ホルメートデヒドロゲナーゼを使用する場合には、補因子再生は、蟻酸またはその塩を還元剤として用いて実施される。しかしながら二者択一的に、他の酵素または基質をベースとする補因子再生系が使用されてもよい。
【００６２】
本発明によるアルコールデヒドロゲナーゼまたは本発明による全細胞触媒の最終的使用は、ケトンの不斉反応に関する方法での使用に関する。水性緩衝溶液は、ケトン変換のために適している。
【００６３】
反応は、酵素反応のために典型的なｐＨ範囲で実施され、その際、４〜９のｐＨ値、特に５．５〜７．５の範囲のｐＨ値は特に適していると解される。
【００６４】
還元変換のための反応温度は、好ましくは１５〜６５℃、特に２０〜４０℃である。
【００６５】
したがって、本発明による核酸配列は、有利にはｒｅｃ−ポリペプチドを製造するために使用されてもよい。当業者に公知の組換え技術を用いて、微生物は工業的方法に関して十分な量で包含されるポリペプチドを提供する能力が得られる。本発明によるｒｅｃ−ポリペプチドは、当業者に公知の遺伝子工学技術を用いて製造される。
【００６６】
【化５】
2005523702.tif 000010
【００６７】
一般的なプロトコール（ＰＣＲ、クローニング、発現等）に関しては、以下の文献等に示されている：Universal GenomeWalker ＴＭ  kit user Manual, Clontech, 3/2000 and the literature cited therein; Triglis T.; Peterson, M. G. and Kemp, D.J. (1988), A produre for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2ｎｄ ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Rodriguez, R. L. and Denhardt, D. T (eds) theirt uses, Butterworth, Stoneham.
適用に関して、包含されるポリペプチドは、均一に精製された化合物または組換えにより製造された酵素としての遊離系の形で使用することができる。さらに、ポリペプチドは構成成分として、昆虫寄生微生物または消化され、かつ任意に高度に精製された、ホスト微生物からのすべての細胞材料との組合せで使用することができる。固定化された形で酵素を使用することも可能である（Sharma B.P.; Bailey L. F. and Messing R. A. (1982), Immobilisierte Biometerialien- Techniken und Anwendungen, Agew. Chem. 94, 836-852）。有利には、固定化は凍結乾燥によって達成される。
【００６８】
【化６】
2005523702.tif 000011
【００６９】
表面活性物質、たとえばアエロゾルＯＴまたはポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＢｒｉｊ５２（ジエチレングリコールモノ−セチルエーテル）の存在下での凍結乾燥は特に好ましい（Kamiya, N.; Okazaki, S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375-378）。Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（Ｒ）、特にＥｕｐｅｒｇｉｔＣ（Ｒ）およびＥｕｐｅｒｇｉｔ２５０Ｌ（Ｒ）（Roehm）上での固定化は特に好ましい（E. Katchalski-Katzir, D. M, Kraemer, J. Mol.  Catal. B: Enzym. 2000, 10, 157）。同様に好ましくは、Ｎｉ−ＮＴＡ上での、Ｈｉｓ−Ｔａｇ（ヘキサ−ヒスチジン）を付着させることによって改質化されたポリペプチドとの組合せでの固定化である（Petty, K. J. (1996), Metak-Chelate affinity chromatogeraphy In: Ausubel, F. M. et al. eds. Current Proticols in Molecular Biology, Vol. 2, New York: John Wiley and Sons）。ＣＬＥＣｓとしての使用も可能である（St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angrew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383）。これらの尺度を使用することによって、有機溶剤中で不安定なポリペプチドから、水性溶剤および有機溶剤との混合物中、あるいは完全に有機媒体中で実施可能なものを製造することが可能である。
【００７０】
最終的な開発において、本発明は、「高コピー数の」ベクター（Ａ）および「中程度のコピー数の」ベクター（Ｂ）から製造されたベクターを使用して、封入体を形成することが可能な組換えタンパク質を製造し、その際、少なくとも複製源は、ベクター（Ｂ）から導かれたものであり、かつ少なくともクローニングおよび発現エレメントはベクター（Ａ）から導かれたものである。
【００７１】
好ましくはｐＥＴ１１ａをベクター（Ａ）として使用し、かつｐＡＣＹＣ１８４を好ましくはベクター（Ｂ）として使用する。ベクターｐＡＫ１はこのような構造のプロトタイプである。このベクターは、前記に示したように、複製源ＣｏｌＥ１を有する「高コピー数」のベクターｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖｏｇｅｎ社）および複製源ｐ１５Ａを有する「中程度のコピー数の」ベクターｐＡＣＹＣ１８４からのセグメントから構成される。ｐＥＴ１１ａは、アンピシリン（ＡＭＰ）遺伝子を選択マーカーとして含有し、ｐＡＣＹＣ１８４は２個の選択マーカー、クロラムフェニコール（ＣＡＭ）およびテトラサイクリン（ＴＥＴ）を含有する。ｐＡＣＹＣ１８４中のｐＥＴ１１ａのライゲーションの結果として、選択マーカーに加えて、これらのＴ７プロモーター、ｌａｃＩ遺伝子およびＭＣＳ（マルチプルクローニングサイト；ポリリンカー）が、ｐＡＣＹＣ１８４に導入される。
【００７２】
Ｅ．Ｃｏｌｉからの本発明によるＡＤＨの組換え製造のために、本発明によって製造されたベクターｐＫＡ１を用いた場合には、約７０Ｕ／ｍｇのＡＤＨ活性が粗生成物中で得られ、それにもかかわらわず、約６Ｕ／ｍｇに過ぎない活性および溶解不可能な封入体の高い割合が、「高コピー数」のプラスミドｐＫＫ２２３−３（Amersharm社）を用いた場合に得られる。
【００７３】
本発明による天然のポリペプチドを製造するために、Ｒ．エリトロポリスのハーベストされた細胞を、ガラスビーズミル中での粉砕によって分解され、かつ固体成分を遠心分離した。遠心分離からの細胞不含の上清液体を、アニオン交換クロマトグラフィーおよびフェニルセファロース上で精製した後に、この間に画分の活性が連続的に試験され、アミノ酸配列分析に使用可能なポリペプチド画分が得られた。決定された出発配列および公知のＡＤＨｓとの比較による保存的モチーフは、変性されたプライマーを構築するために使用され（配列番号３および４）、その際、５００ｂｐの長さのフラグメントを用いて、ＰＣＲによって得ることができる。このフラグメントを使用して、遺伝子プローブ（配列番号１３）が、相同なプライマーで製造される（配列番号５および６）。
【００７４】
【化７】
2005523702.tif 000012
【００７５】
Ｒ．エリトロポリスからのゲノムＤＮＡはその後に、ＥｃｏＲＩを用いて切断し、かつ、フラグメントをゲル電気泳動およびブロットを用いて分離した後に、プローブを用いてハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの検出を、５．２ｋｂでの極めて特異的なシグナルを介しておこなった。これは、遺伝子が５．２kｂの長さのＥｃｏＲＩ上に存在するとみられることを示した。
【００７６】
完全な遺伝子配列を得るために、Ｒ．エリトロポリスからのゲノムＤＮＡを再度ＥｃｏＲＩで消化し、５〜６ｋｂの長さを有するＤＮＡフラグメントを単離し、かつｐＵＣ１８クローニングベクター中でクローニングした。製造されたプラスミドｐＲＥ−ＡＤＨを、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１  Ｂｌｕｅ中に形質転換し、かつクローンをＰＣＲによって、相同なプライマーを用いてスクリーニングした。
【００７７】
ＡＤＨに関する完全な遺伝子配列は、その後に相同なプライマーを用いて定めることができる。
【００７８】
Ｒ．エリトロポリスからの天然のポリペプチドは、四量体構造を有しており、かつサブユニット当たり３６．２０６ｋＤａの分子量を有している。アミノ酸配列に基づいて、Ｒ．エリトロポリスからのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＲＥ−ＡＤＨ）は、明らかに中鎖のデヒドロゲナーゼの群に属する。この群および典型的な亜鉛結合部位の存在（zinc-finger）を含む酵素との相同性の高い割合は、これに関して重要である。デヒドロゲナーゼのこの群の典型的な性質は、ウマの肝臓からのＡＤＨに対して定義されており、これは、最も多く研究されているものである。種々の触媒的性質を有する多くの酵素はこの群の範囲内で公知である。
【００７９】
データーベース「遺伝子ライブラリー」中でのサーチは、サーチアルゴリズムＢｌａｓｔＮＴおよびＥＭＢＬを用いて、インターネットを介してＲＥ−ＡＤＨと、他の亜鉛含有アルコールデヒドロゲナーゼ、長鎖および中鎖のＡＤＨｓの双方との高い相同性について試験した。最も高い相同性は、コリネバクテリウム種（Corynebacterium sp.）ＳＴ−１０からのフェニルアセトアルデヒドレダクターゼを用いた場合に生じた。一致性に関する２個の遺伝子の比較は、図３において示される。
【００８０】
【化８】
2005523702.tif 000013
【００８１】
Ｒ．エリトロポリスからのアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子配列と、コリネバクテリウム種ＳＴ−１０からのフェニルアセトアルデヒドレダクターゼの高い相同性を有する遺伝子配列との比較（図３）は、上段でＲＥ−ＡＤＨの塩基配列および下段でコリネバクテリウムの塩基配列を示した。マッチングした塩基は線を標した。２個のポリペプチド中のタンパク質配列は、完全な遺伝子上の３１６アミノ酸を上廻って一致した（８２％）。一致は、特異的な領域を比較した場合にはさらに高いものであった。Ｎ−末端からは、アミノ酸配列中の１００％の一致が、コドン９４６〜９４８で定められたアミノ酸で存在した。その後に、コリネバクテリウム配列から出発して、この位置からフレームシフトを導くリュードコッカス中での欠失がみられ、これによって異なるアミノ酸配列が導かれた。その後に遺伝子配列が相当するアミノ酸配列に変換される場合には、Ｎ−末端から出発して、アミノ酸１〜３１６は絶対的に２個のポリペプチド中で同一であり、その後に遺伝子フレームシフトに依存して、完全に異なった。これに関連して、例４で示した。
【００８２】
Ｅ．ｃｏｌｉ中での本発明による核酸配列の形質転換および発現は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈからのベクターｐＫＫ２２３−２中でＡＤＨ遺伝子をクローニングすることによって実施される。発現の割合を改善するために、位置８におけるアミノ酸アルギニンに関するコドンＡＧＡを、同様にアルギニンをコードするＣＧＴに変更している。同時に、新規ベクター（ｐＡＫ１−図１）が製造され、かつこれは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）中で、ベクター中でのＡＤＨ遺伝子のライゲーションの後に変換される。細胞不含の粗抽出物中で、７０Ｕ／ｍｇの活性が、ｐ−Ｃｌ−アセトフェノンの変換に関して示された。これと比較して、Ｒ．エリトロポリスからの粗製抽出物中での活性は、ｐ−Ｃｌ−アセトフェノンで、約２．５Ｕ／ｍｇであった。
【００８３】
Ｒ．エリトロポリスからの従来公知のアルコールデヒドロゲナーゼと比較しての、安定性の改善における前記に示された有利な態様および相違は、第５表および図４中に示された。良好な比較に関して、測定された相当する酵素活性は、４５℃で１００％に設定された。
【００８４】
ここで、極めて純粋な新規アルコールデヒドロゲナーゼに関しては、高い熱的安定性が、６５℃までの広い温度範囲において生じた。この場合における安定性の値は１００〜１０５℃であった。これとは対照的に、著しい温度感受性が、Ｒ．エリトロポリスからの従来公知のアルコールデヒドロゲナーゼに関して観察され、その際、４５〜６０℃の温度範囲において、１００％の相対的活性からわずかに３８％に著しく減少した。
【００８５】
【表５】
2005523702.tif 000014
【００８６】
Ｒ．エリトロポリスからの公知のアルコールデヒドロゲナーゼとの他の著しい相違に関しては、エナンチオ選択性における著しい改善に関するものであり、この場合、これは、Ｒ．エリトロポリス細胞、文献中で開示されている粗抽出物およびＲ．エリトロポリスからの新規ＡＤＨを用いての反応中におけるエナンチオ選択性における変化と比較した場合にみられた。
【００８７】
Ｒ．エリトロポリスの全細胞を用いた場合の結果から、この菌株がいくつかのＡＤＨｓを含有し、その際、少なくとの一種の対抗するエナンチオ選択性を有するものを含むことが示された。アルギネートで固定化された全細胞が、連続的にｐ−クロロアセトフェノンと反応する場合には（１．５ｍＭ；２ｍｌ／ｈ）、カラム中において（５ｃｍの充填カラム、１．２ｃｍ直径；５．７ｍｌの充填容量）、エナンチオ的に純粋な（Ｓ）−ｐ−クロロ−２−フェニルエタノールは最初に、ほぼ完全な変換で搬出物中で得られた。しかしながら、この高いｅｅ値は約１０時間（約３倍）のみ保持され、その後にｅｅ値は劇的に減少し、その一方で同様の高いレベルでの変換率が保持された。２５時間の後に（約９倍の変化）、（Ｓ）−ｐ−クロロ−２−フェニルエタノールが７０％のｅｅで得られ、かつ５０時間後に（約１８倍の変化）、アルコールは約５％ｅｅを示すのみであった。
【００８８】
本明細書中における「新規」アルコールデヒドロゲナーゼは、ｐ−クロロアセトフェノンを完全に、エナンチオ的に純粋な形に変換する。数倍または高い濃度で使用される場合であっても、（Ｒ）−ｐ−クロロ−２−フェニルエタノールの形成は観察されなかった。したがって、酵素は、固定化された形で、１１回に亘って反復して使用され（例８参照）、その際、生成物は常にエナンチオ的に純粋な（Ｓ）−アルコールであった。
【００８９】
光学的に濃縮された（エナンチオ濃縮、エナンチオマー濃縮の）化合物は、本発明の範囲内において、他のものと混合された一つの鏡像異性体が＞５０モル％存在することを意味するものと解される。
【００９０】
発現核酸配列は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよびさらにはＲＮＡまたはこれらの混合物のすべての型を含むものと解される。
【００９１】
活性および／または選択性および／または安定性の改善は、本発明によれば、ポリペプチドがより活性化および／またはより選択的であり、かつ使用された反応条件下でより安定であることを意味する。その一方で、工業的適用に関しての酵素の活性および安定性は、当然のことながら可能なかぎり高く、選択性に関しては、基質が選択的に減少するか、酵素がエナンチオ選択的に増加する場合に改善されるものである。発現に関しては、本質的に減少せず、これに関連して、同様の定義が、変更を加えて適用されることが使用される。
【００９２】
請求されたタンパク質配列および核酸配列はさらに、本発明によれば、これらの配列の一つに対して、９１％を上廻って、好ましくは９２％を上廻って、９３％または９４％であり、より好ましくは９５％または９６％を上廻って、かつ特に好ましくは９７％、９８％または９９％を上廻る相同性を有するこれらの配列を含み、その際、このような配列の作用様式または目的は保持される。「相同性（または同一性）」の用語は、本明細書中で、等式Ｈ（％）＝［１−Ｖ／Ｘｘ１００］［式中、Ｈは相同性を意味し、Ｘは比較配列中の核酸塩基／アミノ酸の総数を示し、かつＶは比較配列に対して検討されるべき配列中の異なる核酸塩基／アミノ酸の数を示す］によって定義することができる。これはさらに、図３中で塩基１〜９４８を有する遺伝子配列の部分領域に対して適用されるものである。それぞれの場合において、ポリペプチドをコードする発現核酸配列の用語は、遺伝子コードの縮重にしたがって可能なすべての配列を含む。
【００９３】
本明細書中で挙げられた引用文献は、本発明の開示に含まれるものとする。
【００９４】
【化９】
2005523702.tif 000015
【００９５】
【化１０】
2005523702.tif 000016
【００９６】
【化１１】
2005523702.tif 000017
【００９７】
【化１２】
2005523702.tif 000018
【００９８】
【化１３】
2005523702.tif 000019
【００９９】
【化１４】
2005523702.tif 000020
【０１００】
【化１５】
2005523702.tif 000021
【０１０１】
例１
アルコールデヒドロゲナーゼの精製および得られる部分的配列データ
Ｒ．エリトロポリスを、ＤＳＭ６５培地（１ｌ当たりグルコース４ｇ、イーストエクストラクト４ｇ、マルトエクストラクト  １０ｇ；ｐＨ７．２）中で、３日間に亘って３０℃で好気性条件下で培養した。細胞をハーベストした後に、これらをバッファー（細胞１ｇ当たりトリス−ＨＣｌバッファーｐＨ７．４  １．５ｍｌを添加したもの）を用いて懸濁し、ガラスビーズで粉砕することによって分解した。固体構成成分および細胞フラグメントを遠心分離によって除去し、かつ細胞不含の上清液体をさらなる精製のための粗抽出物として使用した。
【０１０２】
第一の精製は、アニオン交換クロマトグラフィー（MonoQ-Material, Pharmacia）（移動バッファー：５０ｍＭ  ＴＥＡバッファー、ｐＨ７．０、０〜１ＮのＮａＣｌ勾配での溶出した）によって達成することができた。ｐ−Ｃｌ−アセトフェノン（１．５ｍＭ  ｐ−Ｃｌ−アセトフェノン、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＨ、０．１Ｍ  Ｋｐｉバッファー、ｐＨ６．０）を用いての測光試験（３４０ｎｍでの測定）は、好ましい酵素が約０．８Ｍ  ＮａＣｌで溶出することを示した。最も高い活性を有する画分を、硫酸アンモニウムで処理し（１．８Ｍ最終濃度）、かつフェニルセファロース  ＣＬ−４Ｂカラム（Pharmacia）に適用した。溶離に関しては、硫酸アンモニウム勾配（１〜０Ｍ）の流下を使用し、これによって好ましい酵素をほぼ０Ｍの硫酸アンモニウムで溶出した。ここで再度、最も活性の高い画分を、さらに硫酸アンモニウム（１Ｍ最終濃度）で処理し、かつブチルセファロースＦＦで充填された他のカラムに入れた。好ましいタンパク質は、約０．１Ｍ硫酸アンモニウムで、硫酸アンモニウム勾配（１〜０Ｍ）の流下の適用上で溶離した。
【０１０３】
この工程で得られたタンパク質材料は、アミノ酸配列分析に使用されうる十分に精製されたものであった（Automated Sequencer 4774 (Applied Biosystems) を用いてオンラインＨＰＬＣ１２０Ａでの自動化されたEdman  Biosystems）。シークエンスはＭＫＡＩＱＹＴＲＩと読んだ。
【０１０４】
例２：
遺伝子配列の決定
データベースサーチは、アルコールデヒドロゲナーゼの群に属する酵素が、特徴的な保存領域を有することを示した。これらの領域は、たとえば：
【０１０５】
【化１６】
2005523702.tif 000022
であった。
【０１０６】
下線によって示された区分は、機能的であるとして分類されうるモチーフである：配列番号１、２および３において、これらのモチーフは、亜鉛結合に関連するものであり（「Zinc-finger」）、配列番号４においては、ＮＡＤとの結合に関連するいくつかのアミノ酸である。
【０１０７】
これらの保存的領域からの配列は、Ｎ−末端配列と一緒に、アルコールデヒドロゲナーゼのための遺伝子を単離するために使用することができる。Ｒ．エリトロポリスからの好ましい酵素は、Ｎ−末端配列ＭＫＡＩＱＹＴＲＩ（５’−プライマー）および配列ＹＡＶＶＩＧＴＧ（３’−プライマー）からのプライマーを縮重するものであって、この場合これは、データベース情報から得られたものである。
【０１０８】
【化１７】
2005523702.tif 000023
【０１０９】
ＰＣＲ反応はこれらのプライマーで、約５００ｂｐ長のフラグメントが増幅されうるよう実施した。配列分析およびデータベースサーチは、コリネバクテリウム種からのフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ、および他の亜鉛含有アルコールデヒドロゲナーゼとの高い程度での相同性を示した（上記参照のこと）。
【０１１０】
完全な遺伝子を単離するために、プローブを５００ｂｐ長のフラグメントから製造し、かつこれは、サザンブロットハイブリダイゼーションを実施するのに使用した。ハイブリダイゼーション反応の特異性を確実にするために、５００ｂｐフラグメントの内在配列からの相同なプライマーを、プローブを製造するために構築した。
【０１１１】
【化１８】
2005523702.tif 000024
【０１１２】
ゲノムＤＮＡを種々の制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、遺伝子ライブラリーを編集し、かつ５．２Ｋｂの特異的シグナルがサザンブロットハイブリダイゼーションによって得られた。これは、欠損した遺伝子が５．２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント上に配置していることを示した。
【０１１３】
制限酵素の切断部位および５００ｂｐフラグメントからの配列から誘導された、特異的プライマーを用いて、他のフラグメントをＰＣＲによって得て、その際、重複するＤＮＡ配列および停止コドンを用いて、完全な配列を定義することができた。
【０１１４】
一次構造から、ＲＥ−ＡＤＨの分子量が測定され、この場合、これは３６．２０６ｋＤであった。約１５００００の分子量がゲル濾過によって測定され（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ−２００，Pharmacia）、天然の形でのＲＥ−ＡＤＨは、四量体構造を有する酵素であった。
【０１１５】
例３：ＲＥ−ＡＤＨのクローニングおよび異種発現
ａ）ＲＥ−ＡＤＨ遺伝子（野生型）のベクターｐＫＫ２２３−３中でのクローニング
ＲＥ−ＡＤＨ遺伝子の発現のために、プラスミドｐＫＫ２２３−３を最初に選択した（Amersham Pharmacia Biotech）.
ＡＤＨ遺伝子を以下の条件下で、ＰＣＲを用いて増幅させた：
ＤＮＡの変性のために、これを９４℃で３分に亘ってインキュベートした。その後に、以下を３０サイクルに亘っておこなった。
変性：      ４５秒；９４℃
アニーリング：      ３０秒；６４℃
伸長：      １１０秒；６８℃
終結工程（concluding step）：      １０分；６８℃
冷却：６℃
反応容量は５０μｌであった。
ＡｄｖａｎＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（CLONTECH）を反応のためのポリメラーゼとして使用した。
【０１１６】
Ｒ．エリトロポリスＧＣからのゲノムＤＮＡはリッチ（６３％）であり、ＤＭＳＯの５％を混合物に添加して、ＰＣＲ反応の効率を高めた。制限エンドヌクアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに関しての制限切断部位を有する以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した（Ｍｉｔａｂｉｏｎ）：
【０１１７】
【化１９】
2005523702.tif 000025
【０１１８】
遺伝子をクローニングするために、ＰＣＲ産物およびプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３（１〜２μｇ）を制限ヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（１０Ｕ）で消化した（３７℃、２ｈ）。エンドヌクアーゼを反応末端で、６５℃で２０分に亘って加熱することによって不活性化した。
【０１１９】
反応混合物を、アガロースゲル上で分子量によって分離し、かつＤＮＡをゲルから単離した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）。ベクターｐＫＫ２２３−３を脱リン酸化することで（６Ｕ  エビアルカリホスファターゼ）、直線化したベクターＤＮＡの再度のライゲーションを回避した。この反応を３７℃で１時間に亘って実施し、その後に酵素を６５℃で１５分に亘って加熱することによって不活性化した。
【０１２０】
ＰＣＲ産物（インサート）をベクターでライゲーションした（等モル量）。ライゲーション混合物は５ＵのＴ４リガーゼを含有し、かつライゲーションを２５℃で実施した。
【０１２１】
ＲＥ−ＡＤＨを発現させるために、製造されたプラスミドｐＲＥ−ＡＤＨ１をコンピテントＥ．ＣｏｌｉＪＭ１０５細胞中で形質転換した。組換えＥ．Ｃｏｌｉ細胞を、ＬＢａｍｐ培地でのアガープレート上で（選択マーカーとしてアンピシリン１００μｇ／ｍｌを有するＬＢ培地）、３７℃で１６時間に亘って成長させた。
【０１２２】
アガープレート上のクローニングを、５ｍｌ  ＬＢａｍｐ液体培地  ５ｍｌ中で発現のために３０℃で１６時間に亘って培養した。この培地をメインカルチャーのためのプレカルチャーとして使用した（１：１００の播種）。遺伝子発現を、１ｍＭ  ＩＲＴＧを添加することによって、０．３の光学的密度（ＯＤ６００ｎｍ）でインキュベートし、誘発した細胞をその後に、円筒状のシェーカー（１３０ｒｐｍ）上で３０℃でさらに１６時間に亘って成長させた。
【０１２３】
活性化試験のために、細胞をハーベストし（１４０００ｒｐｍで１５分間に亘って、４℃で遠心分離した）、かつ１００ｍＭ  ＫＰｉバッファーで、ｐＨ６．０で再度懸濁した後に崩壊させた（細胞１ｇあたり１．５ｍｌのバッファー）。崩壊目的のために、懸濁液を超音波で処理し（２ｘ３０秒、出力１００％、パルス５０）、その後に細胞ブロスを遠心分離した。
【０１２４】
上清液は溶解可能な粗抽出物であり、かつ沈殿は溶解不能な画分であった。双方の画分をアルコールデヒドロゲナーゼの活性に関して、測光的に試験した（ｐ−Ｃｌ−アセトフェノンおよびＮＡＤＨでの標準試験）。溶解画分において、６Ｕ／ｍｇの特異的酵素活性を測定した（１Ｕ＝１分あたり１μＭ  ＮＡＤＨの減少）。
ｂ）ＲＥ−ＡＤＨ遺伝子（突然変異体）のベクターｐＫＡ１中でのクローニング
Ｅ．Ｃｏｌｉ中の良好な発現割合を達成するために、コドン中位置８においてアミノ酸であるアルギニンをコードするコドンが、さらにアルギニンをコードするＣＧＴに変更された突然変異を導入した（「マイナーコドン」への置換（Chen, G.T., Inouye, M., Nucleic Acids Res. Vol. 18 (1990), 1465; Chen, G. T., Inouye, M., Genes Dev. Vol. 8 (1994), 2641））。
【０１２５】
改質化したコドンを有する突然変異の製造
遺伝子を、ＰＣＲを用いて増幅させ、その際、以下のＰＣＲ条件を使用した：
ＤＮＡを変性させるために、これを９４℃で３分に亘ってインキュベートした。その後に以下のような３０サイクルをおこなった：
変性：      ４５秒；９４℃
アニーリング：      ３０秒；６４℃
伸長：１１０秒；６８℃
終結工程：１０分；６８℃
冷却：６℃
反応溶液は５０μｌであった。
【０１２６】
ＡｄｖａｎＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（CLONTECH）は、反応のためのポリメラーゼとして使用した。制限切断部位ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを含む以下のヌクレオチドプライマーを使用した：
【０１２７】
【化２０】
2005523702.tif 000026
【０１２８】
プラスミドｐＫＡ１の構築
このプラスミドをプラスミドベクターｐＥＴ１１ａ、複製源ＣｏｌＥ１（Novagen）および中程度のコピー数を有するプラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４、複製源ｐ１５Ａ（Biolabs）から構築した。ｐＥＴ１１ａは、選択マーカー、アンピシリン（Ａｍｐ）−耐性遺伝子を選択マーカーとして、クロラムフェニコール（Ｃａｍ）−耐性およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）−耐性のための遺伝子を含有している。
【０１２９】
プラスミドｐＥＴ１１ａは、制限ヌクレターゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｒｕＩで制限した。２５００ｂｐの長さのフラグメントは、発現要素ｌａｃＩ、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネータを含有していた。このフラグメントを、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４中で、制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｒｕＩを介してライゲートした。この場合において、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４を２個の制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｒｕＩで消化した。これは、テトラサイクリン−耐性遺伝子（Ｔｅｔ）を不活性化した。製造されたプラスミドｐＫＡ１（５５５９ｂｐ長） を、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＸＬ１Ｂｌｕｅ中で形質転換し、かつ、クロラムフェニコール４０μｇ／ｍｌを含むＬＢアガープレート上にプレーティングした。
【０１３０】
試験的に、プラスミドの長さをチェックするために、２個のクローンをＬＢｃａｍアガープレートからピックアップし、かつ５ｍｌ  ＬＢｃａｍ中で１６時間に亘って培養した。プラスミドを単離し、かつ制限分析のために使用した：プラスミドをＥＣｏＲＩで消化し、かつアガロース（０．８％）上で長さを測定した。５５５９ｂｐの長さをこの方法で測定した。このプラスミドをクローニングに使用し、かつＲＥ−ＡＤＨを発現させた。
【０１３１】
ｐＫＡ１ベクター中で、ＲＥ−ＡＤＨをクローニングし、かつ発現するために、突然変異変異部位（前記参照）およびベクターｐＫＡ１を含有する遺伝子フラグメントを、制限ヌクレターゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化させ、フラグメントをアガロース０．８％ゲル上に適用し、かつゲルから精製させた（QIAquick Gel 抽出キット、Quiagen）。ベクターおよびインサートをライゲートした（等モル量）。ライゲーションを２５℃で、Ｔ４リガーゼ５Uを用いて実施した。コンストラクトｐＲＥ−ＡＤＨ４を最初に、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞中で形質転換し、かつＬＢｃａｍアガープレート上で、１６時間に亘って３７℃でインキュベートした。クローニングの成功を、制限酵素分析を用いてチェックした。ここで、５個のコロニーをアガープレートからピックアップし、かつプラスミドを単離し（QIAprep Spin Miniprep kit, Qiagen）、かつシークエンシングした。
【０１３２】
発現のために、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）をホストとして使用した。
組換え細胞を、培地ＬＢｃａｍ中で３７℃で増殖させた。ＯＤ６００で０．５であり、発現を２５μＭ  ＩＰＴＧで導入し、その後に細胞を１２時間に亘って３０℃で増殖させた。細胞を５０００ｒｐｍで１５分に亘って遠心分離した後にハーベストし、沈殿を１００ｍＭ  Ｋｐｉバッファー（細胞１ｇあたり１．５ｍｌ）中で再懸濁し、かつ超音波を用いて分解した。
【０１３３】
細胞不含の粗抽出物は、７０Ｕ／ｍｇの酵素活性を示した（ｐ−Ｃｌ−アセトフェノンおよびＮＡＤＨで測定した）。
【０１３４】
例４：
Ｒ．エリトロポリスからのアルコールデヒドロゲナーゼと、コリネバクテリウム種からのアルコールデヒドロゲナーゼとの生物化学的比較
Ｒ．エリトロポリスからのＡＤＨのための遺伝子配列を、データベースにおける遺伝子配列と比較した場合に、ＲＥ−ＡＤＨが、コリネバクテリウム種からのアルデヒドレダクターゼとの高い程度の相同性を有することが示された。アルデヒドレダクターゼに関する刊行物において、この酵素の多くの生物化学的性質が記載されている（Itoh, N. R. Morihama, J. Wang, K. Okada and N. Mizuguchi (1997), Purification and characterisation of phenylacetaldehyde reductase from a styrene- assimilating Corynebacterium strain, St-10, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3783-378）。刊行物において記載されている（アルデヒド）基質のいくつかはＲＥ−ＡＤＨを用いて変換され、かつレダクターゼの相対的活性を使用して比較された。第６表は、アルデヒドを含むこれらの結果を示し、さらにアセトフェノンとの反応に対する２個の酵素の活性を示した。刊行されたデータ材料を用いての２個の酵素の他の比較は意味のあることではなく、それというのもコリネバクテリウムからの酵素は、基質としてのフェニルアセトアルデヒドと一緒に排他的に試験されるが、しかしながら、従来ｐ−Ｃｌ−アセトフェノンを用いて特徴付けられていない。
【０１３５】
第６表：
コリネバクテリウム種からのアルデヒドレダクターゼを含むＲＥ−ＡＤＨと、アセトフェノン還元およびいくつかのアルデヒドに関する活性に対する比較
コリネバクテリウムからの酵素データを、Ｉｔｏｈら（前記参照）による刊行物から得て、ＲＥ−ＡＤＨ上のデータは我々の尺度であった（相同性＝極めて純粋な相同的な酵素）。相対的活性を用いての比較に関しては、２個の酵素の活性が、フェニルアルデヒドに関して＝１００％を示した。
【０１３６】
【表６】
2005523702.tif 000027
【０１３７】
結果は、２個の酵素におけるＣ−末端配列の相違を示し、この場合、これらは異なる生物化学的特性を生じるものである。２個のかなり純粋な酵素の活性は著しく異なっており；リュードコッカス  ＡＤＨは、コリネバクテリウム酵素よりもアセトフェノンに対して約１５倍の活性を有する。さらに、相対的基質スペクトルは相違を示す：カプリル酸アルデヒドに対するコリネバクテリム酵素の高い活性（アセトフェノンに対しての１２倍）は、ＲＥ−ＡＤＨ酵素で生じるものではなく、ここで、カプリル酸アルデヒドに対する活性はアセトフェノンに対して約５倍にすぎない。さらに、ｐ−Ｃｌ−アセトフェノン／アセトフェノンの比は異なっている：コリネバクテリウムに関しては、約１０：１であるが、しかしながらＲＥ−ＡＤＨに関しては３：１であった。
【０１３８】
これらの例は、２個の酵素が互いに著しく異なっており、かつこれらの相違点は、Ｃ−末端領域における配列の相違に寄与するものである。
【０１３９】
例５：
Ｒ．エリトロポリスからのアルコールデヒドロゲナーゼの生物化学的特徴
ａ）基質スペクトル
第７表：ケトンおよびケトエステルに関するＲ．エリトロポリスからの新規ＡＤＨの基質特異性
第７表は以下に、Ｒ．エリトロポリスからのアルコールデヒドロゲナーゼが、多くのケトンおよびケトエステルを受容し、これによって芳香族および脂肪族の第２アルコールの製造に適している。この場合において、相対的活性は、アセトフェノンに関して測定された活性に対するものである。
【０１４０】
【表７】
2005523702.tif 000028
ｂ）Ｋｍ値
還元反応に関して、ＲＥ−ＡＤＨは、基質ｐ−Ｃｌ−アセトフェノンに対して０．５ｍＭおよび補酵素ＮＡＤＨに対して０．０２５ｍＭのＫｍ値を示す。酸化反応に関しては、（Ｓ）−ｐ−Ｃｌ−フェニルエタノールのための値は０．２８ｍＭであり、かつＮＡＤに関する値は０．０８２ｍＭである。
ｃ）活性および安定性に関するｐＨ最適値
ＲＥ−ＡＤＨに関するｐＨ最適値は、還元反応に関してｐＨ６．０である（ｐ−Ｃｌ−アセトフェノンを用いて測定した）。
【０１４１】
酵素を４℃および室温で、１日および２日に亘って保存した場合に、７．５〜８．５の範囲で不活性化はみられなかった（トリス−ＨＣｌ緩衝液、０．１Ｍ）。
【０１４２】
例６：
Ｒ．エリトロポリスからのＡＤＨの製造方法
酵素の製造ポテンシャルは、いくつかのケト−化合物を反応させることによって示されてもよい。
ａ）還元反応
還元は、補酵素ＮＡＤＨに関する再生反応と一緒に結合させなければならず、たとえばホルメートデヒドロゲナーゼおよびホルメートとの反応である。しかしながら、すべての他のＮＡＤＨ−製造反応もさらに使用されてよい。生成物は、ガスクロマトグラフィーを用いて分析し、その際、固定相はＧＣカラム中で、エナンチオマーのアルコールを分離する能力を有し、これによって、酵素的に製造された生成物のｅｅ値の情報を得ることができる。
【０１４３】
還元条件のためのこのような混合物は以下のものを包含する：
１０ｍＭ  ケト−化合物
０．５ｍＭ  ＮＡＤ
１００ｍＭ  Ｎａ  ホルメート
１Ｕ／ｍｌ  ホルメートデヒドロゲナーゼ
０．５Ｕ／ｍｌ  アルコールデヒドロゲナーゼ（イオン交換クロマトグラフィーによって部分的に精製されたもの；単位はｐ−Ｃｌ−アセトフェノンおよびＮＡＤＨを用いての標準試験で光学的に測定された）
０分、５分および１０分の時点で、試料（１００μｌ）を取り出し、クロロホルム１００μｌで抽出し、かつクロロホルム相をガスクロマトグラフィーを用いて分析した。
ＧＣ分析：
カラム：ＣＰ−Ｃｈｉｒａｓｉｌ−ＤＥＸ  ＣＢ  長さ：２５ｍ、直径：２５μｍ（Chrompack）。温度プログラム：６０℃で５分、その後に１９０℃まで５℃／分（ヘキサノン／ヘキサノールに関して：３０分に亘って６０℃、その後に１０℃／分で１９５℃まで）。カラム流は１．３ｍｌ／分；ガス：ヘリウム。
【０１４４】
以下を、ケト−化合物として使用した：
ｐ−Ｃｌ−アセトフェノン、アセトフェノン、エチル２−オキソブチレート、２−ヘキサノンおよび２−ヘプタノン。第８表は、生成物純度上でのデータを示す。すべての化合物は十分に１０分後に変換され；ガスクロマトグラフィーによる分析は、１個のエナンチオマーのみがそれぞれの反応体と一緒に形成されたことを示す。したがって酵素は、ケト−化合物を高くエナンチオ選択的な方法で還元した。
【０１４５】
【表８】
2005523702.tif 000029
ｂ）酸化反応
アルコールのエナンチオ選択的酸化によって、たとえばエナンチオマー濃縮またはエナンチオマー的に純粋なアルコールは、ラセミ体から得ることができる。たとえば、これは、（Ｒ）−フェニルエタノールの製造をおこなった：
以下のものを使用した：１０ｍＭ（Ｒ，Ｓ）−フェニルエタノール、０．５ｍＭ  ＮＡＤＨ、２ｍＭ  ＤＴＴを含む５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファーｐＨ７．５、Ｒ．エリトロポリスからの１Ｕ  ＡＤＨおよび２Ｕ  ＮＡＤＨオキシダーゼ（ＤＥ１０１４００８８によるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＤＳＭ２００５４からのもの）
試料は０、１および２時間後に取り出し、かつガスクロマトグラフィーにより分離した（カラム：ＣＰ−Ｃｈｉｒａｓｉｌ−ＤＥＸ  ＣＢ  長さ：２５ｍ、直径：２５μｍ（Chrompack））、温度プログラム：５分６０℃、その後に５℃／分で１９０℃まで上昇；カラム流速１．３ｍｌ／分；ガス：ヘリウムであった。この場合において、双方のアセトフェノンピーク（生成物；保持時間＝１６．９分）、更にはフェニルエタノールのエナンチオマー（反応体；保持時間  Ｒ−フェニルエタノール＝２０．８分およびＳ−フェニルエタノール＝２１．１分）が記録された。
【０１４６】
分析は（Ｓ）−フェニルエタノールを完全に２時間後に酸化し、かつ酸化生成物アセトフェノンの相当量が、ガスクロマトグラフィーによって得ることができた。（Ｒ）−フェニルエタノールに関しては依然として言及されず、＞９９％のｅｅ値がこのエナンチオマーに対して得られた。
【０１４７】
例７：
酵素の固定化
ＲＥ−ＡＤＨは、種々の結合方法および支持材料を用いて固定化することができる。たとえば、酵素は、支持材料、たとえばＥｕｐｅｒｇｉｔ（Ｒ）と、共有結合を介して結合させることができる。
ａ）Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（Ｒ）上の固定化（商標；Roehm/Desussa）
Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ（Ｒ）およびＥｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ２５０Ｌ（Ｒ）を、平衡バッチで使用し、この場合、これらは部分的に精製されたＲＥ−ＡＤＨで充填したものである（Literature reference relationg to Eupergit immobilisation: E. Katchalski-Katzie, D. M. Kraemer, J. Mol. Catal. B: Enzym. 2000, 10, 157）。以下のものを試験のために使用した。
【０１４８】
１．５ｍＭ  ｐ−Ｃｌ−アセトフェノン（０．１Ｍ  Ｎａホルメートバッファー、０．０５Ｍ  ＫＰｉバッファー中に溶解した、ｐＨ６．０）
０．５ｍＭ  ＮＡＤ
３０ｍｇ  固定化物
１Ｕ／ｍｌ  ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）
これらの試験材料を３０℃でインキュベートし、試料（１００μｌ）をそれぞれの混合物から０、５、１０および１５分後に取り出し、これをクロロホルム１００μｌで抽出し、かつクロロホルム相をガスクロマトグラフィーを用いて、形成された任意のフェニルエタノールに関して分析した。固定化された酵素活性は、フェニルエタノール形成のキネティックスより算定され、かつＥｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ（Ｒ）に関しては１１．８Ｕ／ｇおよびＥｕｐｅｒｇｉｔＣ２５０Ｌ（Ｒ）に関しては８Ｕ／ｇの値が得られた。使用された酵素量に対して、これは、１％（ＥｕｐｅｒｇｉｔＣ（Ｒ））および０．８％の結合収率（ＥｕｐｅｒｇｉｔＣ２５０Ｌ（Ｒ））に相当する。
ｂ）Ｎｉ−ＮＴＡ上の固定化
Ｎｉ−ＮＴＡ上の固定化のために、酵素をＨｉｓ−Ｔａｇ（ヘキサ−ヒスチジン）と一緒にＣ−末端に提供し、遺伝子工学的技術を用いておこなった。
−ＲＥ−ＡＤＨ遺伝子の改質化：
以下のヌクレオチドプライマーは、ヘキサ−ヒスチジン基をＣ−末端で製造するために構築した：
【０１４９】
【化２１】
2005523702.tif 000030
【０１５０】
５’−プライマーを用いての位置８（アルギニンコドンＡＧＡをＣＧＴによって置換したもの）でのアミノ酸のサイレント突然変異
【０１５１】
【化２２】
2005523702.tif 000031
【０１５２】
ヒスチジンに関して６個のコドンを有するこのプライマーは、ＲＥ−ＡＤＨのＣ−末端で６個のヒスチジン基の導入を促進するものである。
【０１５３】
遺伝子をこれらのプライマーを用いて、以前に記載された条件下でＰＣＲを用いて増幅させた。
【０１５４】
ｐＫＫ２２３−３プラスミドベクターおよびＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩと一緒に消化した。２個のフラグメントのライゲーション（５Ｕ  Ｔ４リガーゼでの２５℃の反応）の後に、製造されたプラスミドｐＲＥ−ＡＤＨ５を最初にＥ．Ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ中で最初に形質転換し、かつＬＢａｍｐ培地で３７℃で１６時間に亘って、アガープレート上でインキュベートした。クローニングの成功は、制限分析を用いてモニタリングすることができる。発現に関して、ベクターｐＲＥ−ＡＤＨ５をＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０５中で形質転換し、かつ１６時間に亘って、ＬＢａｍｐ培地中で、３７℃で算定した。ＯＤ６００で０．５を達成した時点で、遺伝子発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することによって誘発した。さらに１２時間に亘って成長させた後に、細胞をハーベストし、かつＲＥ−ＡＤＨの活性を試験した。
【０１５５】
７Ｕ／ｍｇの酵素活性を測定した。この活性値は、Ｃ−末端に対してヘキサ−ヒスチジン基を結合させることによる遺伝子の改質は、酵素活性上で影響のないものであった。
【０１５６】
固定化の実施：
組換え体  Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５／ｐＲＥ−ＡＤＨ５細胞を、イミダゾール含有バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；３００ｍＭ  ＮａＣｌ；１０ｍＭイミダゾール、
ｐＨ８．０）中で粉砕し、かつ粗抽出物を、従来記載された方法中で製造した。固定化のために、酵素溶液１ｍｌ（１３Ｕ／ｍｌ  ＲＥ−ＡＤＨ、カルチャーＥ．Ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５／ｐＲＥ−ＡＤＨ５からの粗抽出物；タンパク質８ｍｇ／ｍｌ）を、Ｎｉ−ＮＴＡ担体３００ｍｇに添加し（Quiagen）、かつ、０℃で１０分に亘ってインキュベートした（氷浴）。懸濁液を遠心分離した後に、３Ｕ／ｍｌは、なおも残留活性として、上清中に非結合酵素として検出することができた。固定化物をｐ−Ｃｌ−アセトフェノンと一緒に反応させ、結合活性を検出した。
【０１５７】
この目的のために、以下のものを全量１ｍｌに対して使用した：
３０ｍｇ  固定化物
３ｍＭ  ｐ−Ｃｌ−アセトフェノン（基質；１００ｍＭ  Ｎａ  ホルメート、５０ｍＭ  Ｋｐｉバッファー  ｐＨ６．０）
０．５ｍＭ  ＮＡＤ
１Ｕ  ホルメート  デヒドロゲナーゼ
試験バッチを同様の方法で、前記に示したようにしてインキュベートし（Eupergit （Ｒ）上での固定化）、試料を取り出し、かつこれらをガスクロマトグラフィーを用いて分析した。図２は、反応のカイネティクスを示し；ｐ−Ｃｌ−フェニルエタノールの形成のカイネティクスに基づいて、０．２１Ｕの活性を算定した。この試験が３０ｍｇの固定化物を用いておこなわれ、かつ１０Ｕ  ＲＥ−ＡＤＨが担体３００ｍｇに結合するといった事実に考慮して、１Ｕを、３０ｍｇの試験バッチ中に導入した。０．２１Ｕの活性が報告されてはいるが、２１％の固定化収率が得られた。固定化物で形成されたアルコールのエナンチオマーの純度（ｅｅ値）は＞９９％であった。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】プラスミドｐＫＡ１を示す図
【図２】本発明による反応のカイネティクスを示す図
【図３】ＲＥ−ＡＤＨとコリネバクテリウム種ＳＴ−１０からのフェニルアセトアルデヒドレダクターゼとの核酸配列の比較を示す図
【図４】本発明による新規ＡＤＨと公知ＡＤＨとの安定性における比較を示す図
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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