(57)【要約】白血病を有する患者を処理するための方法は、前記患者がファメシルトランスフェラーゼインヒビター（FTI）及び任意には、他の治療剤による処理に対して応答するかどうかを決定するために患者の遺伝子発現プロフィールを分析することを包含する。前記方法はまた、患者の治療をモニターし、そして治療の進路を選択するためにも有用である。FTI処理に応答して調整された遺伝子が提供され、そしてそれは、そのプロフィールを配合するために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者がファメシルトランスフェラーゼインヒビター（FTI）による処理に対して応答するかどうかを、FTIの存在下で分別的に調整される遺伝子の発現を分析することによって決定するための方法。
【請求項２】
前記分別的調整が少なくとも1.5倍である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記分別的調整が少なくとも1.7倍である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記分析が１つよりも多くの遺伝子の発現の分析である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子が、第Ｉ表〜第III表において同定される１又は複数の核酸配列と相互関係する請求項１記載の方法。
【請求項６】
患者の治療をモニターするために使用される請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記FTIが、（B）−６−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（1H）−キノリノン）である請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記分析が、第Ｉ表〜第III表において同定される核酸配列と相互作用する遺伝子群の発現の分析であり、そして前記FTIが、（B）−６−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（1H）−キノリノン）である請求項１記載の方法。
【請求項９】
患者の処理方法であって、
ａ）患者がFTIによる処理に対して応答するかどうかを決定するために前記患者の遺伝子発現プロフィールを分析し、そして
ｂ）前記分析が、患者が応答するであろうことを示す場合、前記FTIにより、患者を処理することを含んで成る方法。
【請求項１０】
前記分析が１つよりも多くの遺伝子の発現の分析である請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記FTIが、キノリン又はキノリン誘導体から成る群から選択される請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記FTIが、
７−（３−クロロフェニル）−９−[（４−クロロフェニル）−1H−イミダゾール−１−イルメチル]−２，３−ジヒドロ−1H, 5H−ベンゾ[ij]キノリジン−５−オン；
７−（３−クロロフェニル）−９−[（４−クロロフェニル）−1H−イミダゾール−１−イルメチル]−１，２−ジヒドロ−4H−ピロロ[3,2,1−ij]キノリジン−４−オン；
８−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−６−（３−クロロフェニル）−１，２−ジヒドロ−4H−ピロロ[3,2,1−ij]キノリジン−４−オン；
８−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−６−（３−クロロフェニル）−２，３−ジヒドロ−1H, 5H−ベンゾ[ij]キノリジン−５−オン；及び
（B）−６−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（1H）−キノリノン）から成る群から選択される請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記FTIが、（B）−６−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（1H）−キノリノン）である請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子が、第Ｉ表〜第III表において同定される１又は複数の核酸配列と相互関係する請求項10記載の方法。
【請求項１５】
前記処理が、FTI及びもう１つの治療組成物の投与を含んで成る請求項９記載の方法。
【請求項１６】
前記もう１つの治療組成物が、MAPK/ERKシグナル化経路、TGFβ、WNT又はアポプトシス経路を変調する請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記もう１つの組成物が、チロシンキナーゼインヒビター、MEKキナーゼインヒビター、PI3キナーゼインヒビター、MAPキナーゼインヒビター、アポプトシスモジュレーター及びそれらの組合わせから成る群から選択される請求項16記載の方法。
【請求項１８】
FTI応答を示す患者の遺伝子発現プロフィールが決定される媒体を含んで成る、FTIにより患者の処理の効力を評価するための製品。
【請求項１９】
前記遺伝子発現プロフィールが、第Ｉ表〜第III表において同定される１つよりも多くの核酸配列に関連する遺伝子群から選択される請求項18記載の製品。
【請求項２０】
前記核酸配列が第III表において見出される請求項19記載の製品。
【請求項２１】
媒体に固定される遺伝子発現プロフィールの表示を含んで成る請求項18記載の製品。
【請求項２２】
前記媒体がコンピューター読み取りできる請求項18記載の製品。
【請求項２３】
FTI処理に対応する応答を決定するための遺伝子発現プロフィールを得るための製品を含んで成るキット。
【請求項２４】
説明書をさらに含んで成る請求項23記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【背景技術】
【０００２】
本出願は、次のアメリカ仮出願の利益を主張する：60/340,938号；60/338,997号；60/340,081号及び60/341,012号。本発明は、白血病細胞の遺伝子発現プロフィールに基づいての白血病の診断、予後及び処理に関する。
【０００３】
癌に関係するいくつかの分子群、例えばRasは、細胞の原形質膜の内側のリーフレットと相互作用し、そして種々のシグナリング経路にかかわるようになるようにファルネシルトランスフェラーゼ酵素によりファルネシル化されるべきである。 Rasはプレニル化されたCAAXボックスを有する癌に関係した唯一のタンパク質ではない。 ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター(FTI)は種々のタンパク質のC末端CAAXモチーフへの炭素ファルネシル成分の共有結合を阻害する治療剤である。 それらは、癌及び増殖性疾患、例えば白血病に利用される。急性骨髄性白血病(AML)は、FTIにより最も有益に取り組まれ得る疾病である。
【０００４】
多くの治療管理の場合に当てはまるように、何人かの患者はFTIによる治療に応答するが、他のものは応答しない。 それに応じそうにない患者の治療を処方することは望ましくない。従って、非応答者は必ずしも処理される必要がなく、そして薬物からの恩恵の最良の機会を有するそれらの応答者は適切に処理され、そしてモニターされるので、薬物が投与される前、患者がそのような処理に対する応答をいかにして予測されるかを知ることは有用である。さらに、処理に応答する人々の中では、種々の程度の応答が存在する。FTI以外の治療剤による処理、又はFTIの他に治療剤による処理は、FTIに対して応答しないか、又はFTIのみに対する応答が所望されないそれらの患者のために有益であり得る。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、白血病を有する患者のFTIによる処理方法である。１つのそのような方法においては、患者の遺伝子発現プロフィールが、患者がFTIに対して応答するかどうかを決定するために分析され、そして患者が応答する場合、患者はFTIにより処理される。
本発明のもう１つの観点においては、白血病を有する患者は、FTIによる処理についてモニターされ、ここで患者の遺伝子発現プロフィールが、患者がFTIに対して応答するかどうかを決定するために分析され、そしてそれが所望する態様で応答する場合、FTIにより患者は処理される。
【０００６】
本発明のさらにもう１つの観点においては、患者は、遺伝子発現プロフィールがFTI応答を示す１又は複数の特定遺伝子のアップレギュレーションを示す場合、処理される。
本発明のもう１つの観点においては、FTI応答を示す遺伝子発現プロフィールは、FTI非応答に対して少なくとも1.5, 1.7又は２倍の差異で示すそれらのプロフィールである。
本発明のさらにもう１つの観点においては、遺伝子発現プロフィールがFTI応答を示す１又は複数の特定遺伝子のダウンレギュレーションを示す場合、患者は処理される。
本発明のさらにもう１つの観点においては、遺伝子発現プロフィールが、第Ｉ表〜第III表において同定される遺伝子群から選択された遺伝子の変調を示す場合、患者は処理される。
【０００７】
本発明のさらにもう１つの観点においては、FTIはキノリン又はキノリン誘導体である。
本発明のさらにもう１つの観点においては、FTIは、（B）−６−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（1H）−キノリノン）である。
前記方法の実施において使用される製品はまた、本発明の観点である。そのような製品は、遺伝子発現プロフィール、又はコンピューター読み取り可能媒体に固定されるそれらの表示を包含する。本発明の他の製品は、本発明の遺伝子発現プロフィールを決定するために使用される核酸アレイを包含する。
【０００８】
本発明のもう１つの観点においては、白血病を有する患者の処理の方法は、FTIを投与すること、及びMAPK/ERKシグナル化経路、TGFβ、WNT又はアポプトシス経路を変調する治療組成物を包含する。
本発明のもう１つの観点においては、患者は、FTI、及びチロシンキナーゼインヒビター、MEKキナーゼインヒビター、PI3キナーゼインヒビター、MAPキナーゼインヒビター、アポプトシスモジュレーター及びそれらの組合わせから成る群から選択された治療組成物により処理される。
【０００９】
本発明のさらにもう１つの観点においては、白血病を有する患者の遺伝子発現プロフィールは、患者がFTIに対して応答するかどうか、又は患者がFTI及びもう１つの薬物の組合わせから利益を得るかどうかを決定するために分析される。次に、患者が、そのような組合わせにより処理されるか、又は患者がFTIに対して応答しそうでない場合、患者は、チロシンキナーゼインヒビター、MEKキナーゼインヒビター、PI3キナーゼインヒビター、MAPキナーゼインヒビター、アポプトシスモジュレーター及びそれらの組合わせから成る群から選択された薬物により処理される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書に言及される治療剤は、FTIである。それらは、多形を獲得するが、しかし癌及び増殖性疾患に関連するタンパク質のファルネシル化を妨げるか又は低める必須阻害機能を共有する。好ましくは、FTIは、白血病、例えばAMLの処理のために示されるそれらのFTIである。FTIに対して応答する患者は、50％以上の幼若な細胞の低下がFTIによる処理に続いて、骨髄に見出される患者である。
【００１１】
多くのFTIは本発明の範囲内にあり、そして次のアメリカ特許に記載されるそれらを包含する（それらの特許は引用により本明細書に組み込まれる）：第5, 976, 851号 （ Brown など）; 第5,972, 984 号（ Anthony など）; 第5,972, 966 号 （deSolms ）; 第5,968, 965 号（ Dinsmore など）; 第5, 968, 952 号（ Venet など）;第 6, 187, 786号 （Venet など）; 第6,169, 096 号（ Venet など）;第 6,037, 350 号（Venet など）; 第6,177, 432 号（ Angibaud など）;第 5,965, 578号（Graham など）;第 5,965, 539 号（ Sebtiなど）; 第5,958, 939号（ Afonso など）;第 5,939, 557 号（Anthony など） ; 第5,936, 097 号（Commercon など）; 第5,891, 889 号（Anthony など） ;第 5,889, 053 号（Baudin など）; 第5, 880, 140 号（Anthony）;第 5,872, 135 号（ deSolms） ; 第5,869, 682 号（ deSolms ）;
【００１２】
第5,861, 529 号（ Baudoin）;第 5,859, 015 号（Graham など）;第 5,856, 439 号（Clerc）; 第5,856, 326号（Anthony など）;第 5,852, 010 号（ Grahamなど）; 第5,843, 941 号（ Marsters など）; 第5,807, 852 号（ Doll）;第 5,780, 492 号（ Dinsmoreなど） ; 第5,773, 455 号（ Dong など） ; 第5,767, 274号（ Kim など）; 第5,756, 528 号（Anthony など） ;第 5,750, 567 号（Baudoin など） ; 第5,721, 236 号（ Bishopなど）; 第5,700, 806 号（Doll など）;第 5,661, 161 号（ Anthony など）; 第5,602, 098 号（ Sebti など）;第 5,585, 359 号（ Breslin など）; 第5,578, 629号（Ciccarone など）; 第5,534, 537 号（ Ciccarone など）; 第5,532, 359 号（Marsters など）; 第5,523, 430 号（ Patel など）;第 5,504, 212 号（ de Solmsなど） ;第 5,491, 164 号（deSolms など）; 第5,420, 245号（ Brownなど）; 及び第5,238, 922 号（ Graham など）。非ペプチド、いわゆる“小分子”の治療剤が好ましい。
【００１３】
より好ましいFTIは、キノリン又はキノリン誘導体、例えば、
７−（３−クロロフェニル）−９−[（４−クロロフェニル）−1H−イミダゾール−１−イルメチル]−２，３−ジヒドロ−1H, 5H−ベンゾ[ij]キノリジン−５−オン；
７−（３−クロロフェニル）−９−[（４−クロロフェニル）−1H−イミダゾール−１−イルメチル]−１，２−ジヒドロ−4H−ピロロ[3,2,1−ij]キノリジン−４−オン；
８−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−６−（３−クロロフェニル）−１，２−ジヒドロ−4H−ピロロ[3,2,1−ij]キノリジン−４−オン；及び
８−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−６−（３−クロロフェニル）−２，３−ジヒドロ−1H, 5H−ベンゾ[ij]キノリジン−５−オンである。最も好ましいFTIは、（B）−６−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（1H）−キノリノン）である。
【００１４】
FTI及び他の治療剤により白血病を処理することを含んで成る本発明の観点においては、本明細書において言及される治療剤は、キノリン基剤のFTIによる処理にゆだねられる白血病細胞の遺伝子発現分析を通して解明される生物学的経路に対する効果を有するそれらの剤である。
【００１５】
ゲノム内でタンパク質又はペプチド（“遺伝子”）を発現する能力を有する核酸配列の単なる存在は、タンパク質又はペプチドが所定の細胞において発現されるかどうかの決定因子ではない。タンパク質又はペプチドを発現できる所定の遺伝子がそのように行おうと、又は行わずとも、及びそのような発現がどの程度、生じるかは、種々の複雑な因子により決定される。それらの因子を理解し、そして評価することにおける困難性にかかわらず、遺伝子発現の検定は、所定の刺激、例えば薬物又は他の治療剤の導入に対する細胞応答についての有用な情報を提供することができる。遺伝子が活性であるか又は不活性である程度の相対的表示が遺伝子発現プロフィールに見出され得る。本発明の遺伝子発現プロフィールは、所定の治療から利益を得る患者を同定し、そして処理するために、又は患者が薬物又は治療に対してほとんどか又はまったく有益な応答を経験しない所定の治療から患者を排除するために使用される。
【００１６】
遺伝子発現プロフィール（適切な生物学的経路の解明に達するために使用されるそれらのプロフィールを包含する）を確立するための好ましい方法は、タンパク質又はペプチドをコードすることができる遺伝子により生成されるRNAの量を決定することを包含する。これは、逆転写酵素PCR（RT−PCR）、競争RT−PCR、同時RT−PCR、示差表示RT−PCR、ノザンブロット分析及び他の関連する試験により達成される。個々のPCR反応を用いて、それらの技法を行うことが可能であるが、mRNAから生成されるコピーDNA（cRNA）を増幅し、そしてマイクロアレイを通してそれを分析することが最良である。多くの異なったアレイ配置及びそれらの生成方法は、当業者に知られており、そして次のアメリカ特許（それらは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている：アメリカ特許第5,445,934号；第5,532,128号；第5,556,752号；第5,242,974号；第5,384,261号；第5,405,783号；第5,412,087号；第5,424,186号；第5,429,807号；第5,436,327号；第5,472,672号；第5,527,681号；第5,529,756号；第5,545,531号；第5,554,501号；第5,561,071号；第5,571,639号；第5,593,839号；第5,599,695号；第5,624,711号；第5,658,734号及び第5,700,637号。
【００１７】
マイクロアレイ技法は、数千の遺伝子の定常状態mRNAレベルの同時測定を可能にし、それにより、細胞生物学に対するFTIの効果、及びそのような効果の分析に基づいての処理の効果を同定するための強力な手段を提供する。２種のマイクロアレイ技法が現在、広く使用されている。第１の技法はcDNAアレイであり、そして第２の技法はオリゴヌクレオチドアレイである。それらのチップの構成には、差異が存在するが、実質的にすべての下流のデータ分析及び出力は同じである。それらの分析の結果は、典型的には、マイクロアレイに基づいて既知の位置での核酸配列に対してハイブリダイズする、サンプルからのcDNA配列を検出するために使用されるラベルされたプローブから受動するシグナルの強度の測定である。典型的には、シグナルの強度は、サンプル細胞において発現されるcDNA及び従って、mRNAの量に比例する。
【００１８】
多数のそのような技法は入手でき且つ有用である。遺伝子発現を決定するための好ましい方法は、アメリカ特許第6,271,002号（Linsleyなど.）; 第6,218,122号（Friendなど.）;第6,218,114号（Peckなど.）及び第6,004,755号（Wandなど.）（それらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
発現レベルの分析は、そのような強度の比較によって行われる。これは、試験サンプルにおける遺伝子の発現強度−対−対照サンプルにおけるそれらの強度の比率マトリックスを生成することによって最良に行われる。例えば、薬物により処理された組織からの遺伝子発現強度が、薬物により処理されていない同じ組織から生成される発現強度と比較され得る。それらの発現強度の比は、試験サンプルと対照サンプルとの間の遺伝子発現における倍率−変化を示す。
【００１９】
遺伝子発現プロフィールはまた、多くの手段で示され得る。最も通常の方法は、縦列が試験サンプルを示し、そして横列が遺伝子を示すグラフ樹状図中に、比率マトリックスを配置することである。データは、類似する発現プロフィールを有する遺伝子がお互い、隣接するよう配置される（例えば、図1を参照のこと）。個々の遺伝子についての発現比率は、色として可視化される。例えば、１未満の比率（ダウン−レギュレーションを示す）は、スペクトルの青色部分において出現し、そして１以上の比率（アップ−レギュレーションを示す）は、スペクトルの赤色部分における色として出現する。市販のコンピューターソフトウェアプログラム、例えばBatelleからの“OMNIVIZ PRO”及びStanfordからの“TREE VIEW”ソフトウェアが、そのようなデータを示すために利用できる。
【００２０】
分別的に発現される遺伝子は、FTIによる処理につづいて、疾病細胞においてアップレギュレートされるか、又はダウンレギュレートされる。アップレギュレーション及びダウンレギュレーションとは、検出できる差異（ノイズを測定するための使用されるシステムにおけるノイズの寄与を越えて）が、基線に対する遺伝子の発現の量として見出されることを意味する相対的用語である。この場合、基線は正常細胞の測定された遺伝子発現である。次に、非正常細胞における興味ある遺伝子が、同じ測定方法を用いて、基線レベルに対してアップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされる。
【００２１】
好ましくは、アップ及びダウンレギュレーションのレベルは、ハイブリダイズされるマイクロアレイプローブの強度側定値の倍率変化に基づいて区別される。1.5倍の差異が、そのような識別を行うために好ましい。すなわち、１つの遺伝子が処理された疾病細胞−対−処理されていない疾病細胞において示差的に発現されるといわれる前、その処理された細胞は、処理されていない細胞よりも少なくとも1.5倍高いか又は1.5倍低い強度を生むことが見出される。1.7倍の差異がより好ましく、そして遺伝子発現測定における２又はそれ以上の倍率変化が好ましい。第III表は、すべての細胞系を通して及び応答サンプルにおいて通常調整された遺伝子を列挙する。
【００２２】
遺伝子のポートフォリオは、グループ分けされた一連の遺伝子群であり、その結果、それについて得られた情報は、臨床学的に適切な判断、例えば診断、予後又は処理選択を行うための基礎を提供する。この場合、そのポートフォリオにより支持される判断は、FTIによる白血病の処理を包含する。遺伝子発現プロフィールのポートフォリオは、第Ｉ表〜第III表に示される遺伝子の組み合わせから成ることができる。
【００２３】
本発明の１つの方法は、個人が治療剤の使用に対して応答するかどうかを決定するために種々の遺伝子について遺伝子発現プロフィールを比較することを包含する。応答者と非応答者とを区別する遺伝子発現プロフィールを確立した後、個々の遺伝子発現プロフィールが、媒体、例えば下記に記載されるようなコンピューター読み取り可能媒体に固定される。疾病細胞（例えば、AMLの場合、造血幼芽な細胞）を含む患者サンプルが得られる。次に、サンプルRNAが疾病患者の細胞から得られ、そして増幅され、そして遺伝子発現プロフィールが、適切なポートフォリオにおける遺伝子のために、マイクロアレイを通して得られる。
【００２４】
次に、サンプルの発現プロフィールが、応答者及び非応答者として前もって決定されたそれらのプロフィールに比較される。サンプル発現パターンがFTI応答者発現パターンと一致する場合、FTIによる処理が示され得る（相等の医学的考慮の不在下で）。サンプル発現パターンがFTI非応答者発現パターンと一致する場合、FTIによる処理が示され得ない。好ましくは、発現パターンとの一致性は、上記に記載されるように、マイクロアレイ読み取りの強度測定に基づかれて決定される。
【００２５】
類似する態様で、遺伝子発現プロフィール分析は、処理応答をモニターにするために行われ得る。この方法の１つの観点においては、上記に記載されるような遺伝子発現分析は、処理の間、種々の期間でFTIにより処理される患者に対して行われる。遺伝子発現パターンが応答者と一致する場合、その患者の治療は続けられる。そうでない場合、患者の治療は追加の治療剤、例えばチロシンキナーゼインヒビター、その用量の変更、又はFTIの処理の排除に関して変更される。そのような分析は、検出できる臨床学的徴候の前、又は他の不明瞭な臨床学的徴候にもかかわらず、介入及び治療判断を可能にする。
【００２６】
応答者を示すいくつかの観点において、及び非応答者を示す他の観点において存在するいくつかの遺伝子発現プロフィールが記録される不明瞭な結果を獲得することが可能である。例えば、前記プロフィールは、応答者と一致する３種の遺伝子がアップ−レギュレートされるが、しかしもう１つの遺伝子は、応答者に関して通常であるが、アップ−レギュレートされないことを示すことができる。そのような場合、統計学的アルゴリズムが、患者が薬物に対して応答するか又は応答しないかの確立を決定するために適用され得る。この目的のために適切な統計学的アルゴリズムはまた良く知られており、そして入手できる。
【００２７】
本発明の製品は、コンピューター読み取り可能媒体（磁気、光学及び同様のもの）により自動的に読み取られ得る媒体に変換される、疾病を処理し、診断し、予後し、ステージングし、そして他方では、評価するために有用な遺伝子発現プロフィールの表示を包含する。前記製品はまた、そのような媒体において遺伝子発現プロフィールを評価するための使用説明書を包含することができる。例えば、製品は、上記遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現プロフィールを比較するためのコンピューター使用説明書を有するCD ROMを包含することができる。
【００２８】
製品はまた、そこにおいてデジタル記録される遺伝子発現プロフィールを有することができ、その結果、それらは患者サンプルからの遺伝子発現データと比較され得る。他方では、前記プロフィールは異なった表示フォーマットで記録され得る。グラフの記録が１つのそのようなフォーマットである。図１は、そのような記録のグラフ表示の例を示す。クラスターリングアルゴリズム、例えば上記に言及される“OMNIVIZ”及び“TREE VIEW”コンピュータープログラムに組み込まれるそれらは、そのようなデータの可視化において最良に助けることができる。
【００２９】
本発明の追加の製品は、上記に記載されるように、本発明の遺伝子発現プロフィールを識別するために形状化される核酸アレイ（例えば、cDNA又はオリゴヌクレオチドアレイ）である。
【００３０】
クラスター分析（上記に言及されたアルゴリズムを包含する）を用いて、一定の統計学的信頼性を伴って遺伝子間の調節関係を確立するために患者サンプルの発現レベルを比較することができる。力学的地図が、そのような発現データに基づいて構成された。そのような遺伝的ネットワーク地図は、薬物発見のために有用である。例えば、興味ある基本的遺伝子が同定されると、可能性ある上流の調節遺伝子の列挙が、そのような遺伝子ネットワーク地図を用いて見出された。次に、そのようにして同定された遺伝子又はそれらの発現生成物は、薬物標的物としてのそれらの使用のために分析された。いくつかの態様においては、同定された特定遺伝子の調節機能は、白血病の処理に使用するための治療剤を同定するために使用された。
【００３１】
転写の調節、RNAプロセッシング及びRNA修正はすべて、それら自体の遺伝子によりコードされるタンパク質により達成される。さらに、DNA配列は、位置効果により他の遺伝子の発現に対して長い範囲の制御を発揮することができる。従って、遺伝子の発現は、しばしば、他の遺伝子の発現により調節される。それらの調節遺伝子は、調節されたか又は下流の遺伝子に対して、上流の遺伝子と呼ばれる。単純な調節経路においては、下記の通りである：
A＋＋＞B−＞C＋＋＞D
【００３２】
ここで、A, B, C, Dは遺伝子であり、＋＋はアップ−レギュレートし、−はダウン−レギュレートする。遺伝子Aは遺伝子Bの上流の遺伝子であり、そしてBはCの上流の遺伝子である。当業者は、そのネットワークが時々、ループ化され、そしてそれらの間で連結されることを理解するであろう。いくつかの場合、遺伝子の発現は、陽性又は陰性フィードバックのいずれかとして、それ自体の生成物により調節される。
【００３３】
クラスター分析方法は、その発現レベルが相互関係する遺伝子を分類するために使用された。クラスター分析のための方法は、引用により本明細書に組み込まれるHarfian（1975） Clustering Algorithms, NY, John Wile and Sons, Inc. and Everritt, (1980) Cluster analysis 2nd. Ed. London Heineman Educational book, Ltd. に詳細に記載される。進路分析が、変数間の関係を分析するために、及び遺伝子ネットワークについての原因モデルを試験するために使用された。白血病細胞における薬物の複数の一次標的物は、そのような細胞の処理において有用な薬物種類として同定された。現方法によれば、薬物は、生物学的システムを混乱させるいずれかの程度の複雑性のいずれかの化合物である。
【００３４】
薬物の生物学的効果は、１又は複数の種々のRNAの転写又は複数のポリペプチドの翻訳又は後−翻訳プロセッシングの速度又は程度、１又は複数のタンパク質の分解の速度又は程度、１又は複数のタンパク質の作用又は活性の阻害又は刺激、及び同様のものの薬物−介在性変化の結果であり得る。好ましいFTIの他に、本発明の好ましい薬物は、MAPK/ERKシグナル化経路、TGFβ、WNT又はアポプトシス経路を変調するそれらのものである。それらは、チロシンキナーゼインヒビター、MEKキナーゼインヒビター、PI3キナーゼインヒビター、MAPキナーゼインヒビター、アポプトシスモジュレーター及びそれらの組合わせを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００３５】
それらの中で最も好ましい典型的な薬物は、Novartisの“GLEEVEC”チロシンキナーゼインヒビター、U−0126MAPキナーゼ、PD−098059MAPキナーゼインヒビター、SB−203580MAPキナーゼインヒビター及びアンチセンス、リボザイム、及びDNAzyme Bcl-XL抗−アポプトシスである。他の有用な薬物の例は、アメリカ特許第6,306,897号のカロノリド；アメリカ特許第6,284,764号の置換された二環状物；アメリカ特許第6,133,305号のインドリン；及びアメリカ特許第6,271,210号のアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００３６】
示されるように、本発明の薬物は遺伝子治療又はアンチセンス治療に向けられる治療剤であり得る。mRNA配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳を阻止するために細胞中に導入され、従って、mRNAをコードする遺伝子の機能を阻止する。遺伝子発現を阻止するためへのオリゴヌクレオチドの使用は、例えばStrachan and Read, Human Molecular Genetics, 1996 (引用により本明細書に組み込まれる)に記載される。
【００３７】
それらのアンチセンス分子は、DNA、DNAの安定誘導体、例えばホスホロチオエート又はメチルホスホネート、RNA, RNAの安定誘導体、例えば2’−0−アルキルRNA、又は他のアンチセンスオリゴヌクレオチド擬似体であり得る。アンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソーム封入、又はアンチセンス配列を有するベクターからの発現により細胞中に導入され得る。
【００３８】
遺伝子治療の場合、興味ある遺伝子は、受容体宿主細胞の感染により、治療DNAのトランスファーを仲介するウィルスベクター中に連結され得る。適切なウィルスベクターは、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス、ポリオウィルス及び同様のものを包含する。他方では、治療DNAは、リガンド−DNA接合体又はアデノウィルス−リガンド−DNA接合体を用いての受容体−介在性標的化されたDNAトランスファー、リポフェクチン膜融合又は直接的なマイクロインジェクションを包含する非ウィルス技法により、遺伝子療法のための細胞中にトランスファーされ得る。それらの方法及びその変法は、エクスビボ及びインビボ遺伝子療法のために適切である。遺伝子と共に使用するために適切な遺伝子療法の分子方法論のためのプロトコールが、Gene Therapy Protocals, Paul D. Robbins, Human Press, Totawa NJ. 1996に記載されている。
【００３９】
本発明の薬物を含んで成る医薬的に有用な組成物は、既知の方法に従って、例えば医薬的に許容できるキャリヤーの混合により配合され得る。そのようなキャリヤー及び配合方法の例は、Remington's Pharmaceutical Sciencesに見出され得る。効果的な投与のために適切な医薬的に許容できる組成物を形成するために、そのような組成物は有効量の薬物を含むであろう。前記薬物の有効量は、種々の因子、例えば個人の状態、体重、性別及び年齢に従って変化することができる。
【００４０】
他の因子は、投与の形式を包含する。医薬組成物は、種々の経路、例えば皮下、局部、経口及び筋肉内投与により個人に供給され得る。
本発明の薬物は、薬物の基本分子の化学的誘導体を包含する。すなわち、それらは、通常、基本分子の一部でない追加の化学的成分を含むことができる。そのような成分は、基本分子の溶解性、半減期、吸収性、等を改良することができる。他方では、その成分は、基本分子の所望しない副作用を弱めるか、又は基本分子の毒性を低めることができる。そのような成分の例は、種々のテキスト、例えばRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載される。
【００４１】
本明細書に開示される方法に従って同定される化合物は、いずれかの可能性ある毒性を最少にしながら、最適な阻害又は活性を得るために、通常の試験により定義される適切な用量で、単独で使用され得る。さらに、他の剤の同時投与又は連続的投与が所望される。
【００４２】
本発明の薬物は、投与のための従来のビークル中、広範囲の種類の治療用量形で投与され得る。例えば、薬物は、錠剤、カプセル（一定時間後に作用する配合物及び持効性配合物をそれぞれ含む）、ピル、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップ及びエマルジョンのような経口用量形で、又は注射により投与され得る。同様に、それらはまた、静脈内（ボーラス及び注入の両者）、腹腔内、皮下、局部（吸蔵を伴ってか又はそれを伴わないで）、又は筋肉内形で投与され得、それらのすべては、当業者に良く知られている形を用いる。効果的であるが、しかし非毒性の量の所望する化合物が、変調剤として使用される。
【００４３】
製品の毎日の用量は、0.01〜1,000mg/患者・日の広範囲で変化することができる。経口投与に関しては、組成物は、好ましくは、処理される患者への用量の徴候調節のための活性成分0.01, 0.05, 0.1, 0.4, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0及び50.0mgを含む、切れ目を付けられているか又は付けられていない錠剤の形で供給される。有効量の薬物は通常、約0.0001〜約100mg/kg体重・日の用量レベルで供給される。前記範囲は、より特定には、約0.001〜10mg/kg体重・日である。前記用量は、所望する効果を達成するために組み合わされる場合、調節される。他方では、それらの種々の剤の用量は、独立的に最適化され、そして病理学が、いずれかの剤が単独で使用される場合よりも低められる相乗結果を達成するために組み合わされ得る。
【００４４】
好都合には、本発明において使用される化合物又はモジュレーターは、１回の毎日の用量で投与され得、又は合計の毎日の用量は、２，３又は４回に分けた用量で毎日投与され得る。さらに、本発明のための化合物又はモジュレーターは、適切な鼻腔内ビークルの局部使用を通して鼻腔内形で、又は経皮路を通して、当業者に良く知られている皮下用皮膚パッチの形で投与され得る。経皮供給システムの形で投与されるためには、もちろんその用量投与は、用量レジメを通して断続的であるようりもむしろ連続的であろう。
１つよりも多くの活性剤による組合わせ処理に関しては、活性剤が別々の用量配合物に存在する場合、活性剤は同時に投与されるか、又はそれらはそれぞれ、別々に時差的に投与され得る。
【００４５】
本発明の化合物又はモジュレーターを用いる用量レジメは、種々の因子、例えば患者の型、種類、年齢、体重、性別及び医学的状態；処理されるべき病状の重症度；患者の腎及び肝機能；及び使用される特定の薬物に従って選択される。当業者（医者又は獣医）は、病状の進行を妨げるか、又は阻止するために必要とされる薬物の有効量を容易に決定し、そして処方することができる。毒性を伴わないで効能をもたらす広範囲の薬物の濃度を達成することにおける最適な決定は、標的部位への薬物の利用能の動力学に基づいてのレジメを必要とする。これは、薬物の分布、平衡及び排除の考慮を包含する。
【００４６】
本発明の薬物は、活性成分を形成することができ、そして典型的には、投与の意図された形、すなわち経口錠剤、カプセル、エリキシル、シロップ及び同様のものに関して適切に選択され、そして従来の医薬的実施と一致する、適切な医薬的希釈剤、賦形剤又はキャリヤー（集合的には、“キャリヤー”材料として本明細書において言及される）と混合して投与される。
【００４７】
例えば、錠剤又はカプセルの形での経口投与に関しては、活性薬物成分は、非毒性の医薬的に許容できる経口不活性キャリヤー、例えばエタノール、グリセロール、水及び同様のものと組み合わされ得る。さらに、所望されるか又は必要な場合、適切な結合剤、滑剤、砕解剤及び着色剤がまた、前記混合物に導入され得る。適切な結合剤は、スターチ、ゼラチン、天然糖、例えばグルコース又はβ−ラクトース、トウモロコシ甘味剤、天然及び合成ガム、例えばアカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。それらの投与形に使用される滑剤は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。砕解剤は、スターチ、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンガム同様のものを包含するが、但し、それらだけには限定されない。
【００４８】
液体形に関しては、活性薬物成分は、適切に調味された沈殿防止剤又は分散剤、例えば合成及び天然ゴム、例えば、トラガサント、アカシア、メチルセルロース及び同様のものと組み合わされ得る。使用され得る他の分散剤は、グリセリン及び同様のものを包含する。非経口投与に関しては、無菌懸濁液及び溶液が所望される。一般的に適切な保存剤を含む等張製剤が、静脈内投与が所望される場合、使用される。
本発明の薬物はまた、リポソーム供給システム、例えば小単層状小胞、大単層状小胞及び多層状小胞の形で投与され得る。リポソームは、種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンから形成され得る。
【００４９】
本発明の薬物はまた、化合物分子が結合される個々のキャリヤーとして、モノクローナル抗体の使用により供給され得る。本発明の薬物はまた、標的化できる薬物キャリヤーとして適切なポリマーと共に結合され得る。そのようなポリマーは、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルタミドフェノール、又はパルミトイル残基により置換されたポリエチル−エネオキシドポリリシンを包含することができる。さらに、本発明の薬物は、薬物の調節された放出の達成において有用な種々の生分解性ポリマー、例えばポリ酢酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレート、及びヒドロゲルの架橋された又は両親媒性ブロックコポリマーに結合され得る。
【００５０】
経口投与に関しては、薬物はカプセルに、錠剤又はボーラス形で投与され得るか、又は他方では、それらは食料と共に混合され得る。カプセル、錠剤及びボーラスは、適切なキャリヤービークル、例えばスターチ、タルク、ステアリン酸マグネシウム又はリン酸二カルシウムと組合して活性成分から構成される。それらの単位用量形は、適切に細かく粉砕された不活性成分、例えば希釈剤、充填剤、砕解剤、及び/又は均等な混合物が得られる結合剤と共に活性成分を均等に混合することによって調製される。
【００５１】
不活性成分は、薬物と反応せず、そして処理される動物に対して非毒性である成分である。適切な不活性成分は、スターチ、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物ガム及び油、及び同様のものを包含する。それらの配合物は、多くの因子、例えば処理される動物種のサイズ及び型、及び感染の型及び重症度に依存して、広範囲の種々の量の活性及び不活性成分を含むことができる。活性成分はまた、食物と共に化合物を単純に混合することによって、又は食物の表面に化合物を適用することによって投与され得る。
【００５２】
他方では、化合物又はモジュレーターは、不活性液体キャリヤーに溶解された活性成分から成る配合物の注射を通して非経口的に投与され得る。注射は、筋肉内、気管内、管腔内又は皮下のいずれかであり得る。注射用配合物は、適切な不活性液体キャリヤーと共に混合された活性成分から成る。許容できる液体キャリヤーは、植物油、例えばピーナッツ油、綿種子油、ゴマ油及び同様のもの、及び有機溶媒、例えばソルケタール、グリセロールホルマール及び同様のものを包含する。他方では、水性非経口配合物もまた使用され得る。植物油は、好ましい液体キャリヤーである。配合物は、最終配合物が0.005〜10重量％の活性成分を含むよう液体キャリヤーにおいて活性成分を溶解するか又は懸濁することによって調製される。
【実施例】
【００５３】
本発明はさらに、次の非制限的例により例示される。
例１：細胞培養物：
AML−様細胞系HL−60（前骨髄細胞）及びU−937（前単球）は、ATCCから入手された。AML−193（単球）及びTHP−１（単球）細胞は、RW Johnson Pharmaceutical Research Center, San Diegoから入手された。細胞は、20％ウシ胎児血清（FBS）を含むRoswell Park Memorial Institute培地（RPMI）において増殖された。AML−193は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）（10ng/ml）、インスリン(0.005mg/ml)及びトランスフェリン（0.005mg/ml）により補充された。
【００５４】
例２：毒性用量アッセイ：
例１の細胞を、１×105個の細胞/mlの初期濃度で６−ウェルプレート中に接種した。３μlのDMSO中、（B）−６−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（1H）−キノリノン）を、0.5〜500nMの濃度で、培養培地に直接的に添加した。例１からの対照細胞を、培地のみにおいて、又はビークル（0.1％DMSO）により補充された培地において増殖した。
【００５５】
細胞数を、血球数を、血球計により４及び７日目に計数し、そして細胞生存性を、トリパンブルー排除アッセイにより決定した。IC50は、処理されたサンプルにおける生存細胞の数が７日目で対照における生存細胞の50％である用量として定義された。計算は、二重反復実験に基づいて行われた。４種の細胞系のIC50 は、FTIによる処理の７日後に計算された。AML−193は134nMのIC50、 HL-60は24nMのIC50、THP−１は19nMのIC50、そしてU−937は44nMのIC50を有した。これは、４種のAML−様細胞系がFTI処理に対して敏感であることを示した。
【００５６】
例３：時間進行アッセイ：
例１の細胞の二重反復培養物を、１×105個の細胞/mlの初期濃度で６−ウェルプレート中に接種した。（B）−６−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（1H）−キノリノン）を、３μlのDMSO中、100mMの濃度で培養物に直接的に補充した。100nMの濃度が、例２の結果に一部、基づいて処理プロトコールを標準化するために、続く時間進行実験のために選択された。
【００５７】
二重反復対照培養物を、0.1％のDMSOを含む培地において増殖した。二重反復培養物を、合計６日間、毎日収穫した。細胞を計数し、生存性についてアッセイし、そして全RNAを製造業者のプロトコール（Qiagen RNeasy）に従って単離した。その分析は、異なった細胞系からの細胞が異なった時間でもたらされたことを示した。RNAをDNアーゼ１（Qiagen DNase1キット）により処理し、残留ゲノムDNAを除去した。RNAの直線的増幅を、アメリカ特許第5,542,522号（Van Gelderなど.）に記載される方法に従って行った。次に、５μgのaRNAのアリコートを、cDNAアレイへのハイブリダイゼーションのために調製した。
【００５８】
例４：骨髄処理：
骨髄吸引物を、FTLにより処理された、AMLを有すると診断された２人の患者から得た。それらのAML患者に、600mgの（B）−６−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（1H）−キノリノン）を、21日間、１日２度、投与した。骨髄吸引物を、３週間の処理の間、基線で及び週１度、採取した。それらの患者の１人は、応答せず（RH）、そして他はFTIに対しいて再応答した（BS）。
【００５９】
応答を、骨髄吸引物における幼若な細胞の50％以上の低下として決定した。その吸引物を、PBSにより15mlに希釈し、そしてFicoll-密度遠心分離した。白血病細胞をPBSにより２度、洗浄し、10％DMSOを含むFBSにより再懸濁し、そしてすぐに、−80℃で凍結した。細胞を、細胞生存率を維持するために、凍結保存した。サンプルを37℃で融解し、そして20％FBSと共に10倍体積のRPMIを５分間にわたって、滴下した。細胞を1600rpmで10分間、遠心分離し、そして2mMのEDTA及び0.5％BSAを含むPBS10mlに再懸濁した。
【００６０】
次に、サンプルを、70μMのフィルターに通し、細胞凝集物を除去した。細胞生存率を、トリパンブルーアッセイにより決定した。サンプル生存率が50％以下である場合、Miltenyi Dead Cell Removal Kitを用いて、生存細胞画分を富化した。次に、２×105個の生存細胞を、CD33−FITC及びCD24−PE抗体（Pharminigen）により二重ラベルし、そしてFACS分析を行った。後（B）−６−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（1H）−キノリノン）−処理された骨髄サンプルを、CD33又はCD34抗体（Miltenyi）のいずれかを用いて、磁気ビーズ細胞分離により白血球細胞について富化した。抽出された細胞は、例３に記載のようにして抽出されたRNAを有した。
【００６１】
例５：プローブ調製：
例３及び４において得られたRNAサンプルを、次の方法に従って、cDNAマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションのために調製した。１〜２回の線状増幅を、出発材料の量に依存して、全RNAに対して行った。最初に、１〜10μgの全RNAを、Superscript cDNA転写キット（Gibco BRL）を用いて転写した。10μlの全RNAをまず、１μlの0.5mg/mlのT7−oligodTプライマーと共に混合し、70℃で10分間インキュベートし、そして次に、氷上で冷却した。次に、8μlの５×第１鎖反応緩衝液、0.1MのDTT、10mMのdNTP及び１μlのRnase Blockを添加し、そしてその溶液を42℃で５分間インキュベートした。
【００６２】
次に、１μlのSuperscript IIを添加し、そしてその反応を42℃で２時間インキュベートした。反応を70℃で10分間、不活性化し、そして1μlをPCRのために除去した。次に、92μlのRnaseを含まない水、30μlの５×第２鎖反応緩衝液、３μlの10mMのdNTP, 4μlのDNAポリメラーゼ１、1μlのE. コリRnase H、1μlのE. コリDNAリガーゼを添加し、そしてその混合物を16℃で２時間インキュベートした。cDNAを、Ampliscribe T7−転写キット（Epicenter）を用いて、線状増幅した。
【００６３】
必要とされる場合、第２回目のRNA増幅を、ランダムヘキサマーアプローチにより行った。蛍光ラベルされたcDNAプローブを、ランダムヘキサマーによりRNAをプライミングし、そしてヌクレオチド混合物にCy3−dCTPを包含することによって合成した。反応を、QIAquick PCR精製キット（Qiagen）を用いて精製し、プローブの体積を相対的蛍光（Cytofluor）を用いて標準化し、そして50％ホルムアミド及びヒトCot１ DNA (Life Technologies) を含むVersion 2ハイブリダイゼーション緩衝液（Amersham Pharmacia Biotech, Pistcataway, NJ）50μlに再懸濁した。
【００６４】
例６：アレイハイブリダイゼーション及び分析：
アレイは、IMAGE協会（Integrated Molecular Analysis of Genome and Their Expression: Research Genetics, Huntsville, AL）及びIncyteライブラリーからの7452のcDNAを含んだ。マイクロアレイを、次の通りにして生成し、そしてプローブを、例５に記載のようにしてハイブリダイズした。cDNAを、Generation III  Micro-away Spotter (Molecular Dynamics) によりアミノシラン−被覆されたスライド（Corning）上にプリントした。cDNAをPCR増幅し、精製し（Qiagen PCR精製キット）、そして10MのNaSCNプリント用緩衝液と共に１：１の比で混合した。
【００６５】
ハイブリダイゼーションの前、マイクロアレイを、イソプロパノールにおいて室温で10分間インキュベートした。プローブを、95℃で２分間、室温で５分間インキュベートし、そして次に、３個の複製スライド適用した。カバースライドを、DPX（Fluka）によりスライド上に密封し、そして42℃で一晩インキュベートした。次に、スライドを、１×SSC/0.2％SDS及び0.1×SSC/0.2％SDSにより55℃で５分間、洗浄し、0.1×SSCに含浸し、そして乾燥せしめ、その後、Gen III  Array Scanner (Molecular Dynamics) により走査した。個々のスポットについての蛍光強度を、AUTOGENEソフトウェア（Biodiscovery, Las Angeles） により分析した。
【００６６】
個々のマイクロアレイの強度レベルを標準化し、その結果、発現レベルの75％目がマイクロ−アレイの全域で等しい。平均の50％以上の分散係数（CV）を示すクローンを、分析から排除した。バックグランド強度はすべての実験に関して最大32単位であるので、32の限界値を、これよりも低い発現レベルを示すすべてのクローンに割り当てた。次に、比率マトリックスを、処理された及び対照のサンプルの対−様分析に基づいて生成し、そしてHierarchicalクラスターリングを、ユークリッドマトリックス及び平均連鎖（Omniviz ProTM）を用いて行った。
【００６７】
個々のサンプルを、３種の同一のアレイにハイブリダイズし、そして平均シグナル強度を、分散−ブロット分析により比較した。対照サンプルが同じ日からの処理されたサンプルに比較される場合、高い相関係数がまた観察された。これは、（B）−６−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（1H）−キノリノン）による処理のために、遺伝子発現に著しい変化が存在しなかったことを示した。さらに、異なった日からの対照サンプル間の変化を試験した。細胞を擬似−処理し、そしてRNAを、１，２，３，４，５及び６日後に単離した。ラベリング及びハイブリダイゼーションに続いて、二重反復サンプルの平均強度及び個々のクローンの分散係数（CV）（クローン当たり３スポット）を計算した。50％以上のCVを示すデータ点を、さらに分析から除外した。
【００６８】
例７：処理された細胞系サンプルにおける分別的遺伝子発現：
Hierarchicalクラスターリングを、Omnivia ProTMソフトウェア（Battelle）を用いて、時間−進行データ組に基づいて行った。最初に、1.5, 1.7及び2.0の倍率−変化を、時間−進行の個々の日、対照強度に対する処理された強度の比較についてフィルターとして使用した。それらの限界を越えて調整された遺伝子発現プロフィールを分析し、３種のデータ組間で通常調整されたそれらの遺伝子を試験し、そして類似する発現プロフィールを共有した遺伝子のクラスターを同定した。結果は、下記第Ｉ表〜第III表に示される。
【００６９】
本発明に従って分析された遺伝子は、そのような遺伝子がGenbankデータベースに入力されているGenbankデータベースにおける遺伝子ID番号（内部的に付けられた）及び受託番号により下記表において同定される。引用により本明細書に組み込まれる、付随する配列の列挙は、遺伝子ID番号に対応し、そしてそれらの遺伝子ID番号により命名された配列を示す。いくつかの場合、列挙される配列は、タンパク質又はペプチドの生成をコードする十分な長さの核酸配列である。
【００７０】
当業者は、十分な長さの配列の同定が分析点の観点から必要でないことを理解するであろう。すなわち、配列又はESTの一部が、プローブがその対応する遺伝子に関する遺伝子発現を評価するよう企画され得る良く知られた原理に従って選択され得る。さらに、列挙におけるいくつかの配列は、ヌクレオチド表示の代わりに文字“N”を含むことが注目されるべきである。当業者は、“N”が配列のその部分におけるいずれかのヌクレオチドの位置を示すことを理解するであろう。
【００７１】
例８：遺伝子ネットワークの同定：
薬物処理された細胞系における複数の細胞系において少なくとも1.5倍、調節された遺伝子（表１）を、上記のようにして同定した。それらの遺伝子の列挙を用いて、最も好ましいFTI、すなわち（B）−６−[アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−1H−イミダゾール−５−イル）メチル]−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（1H）−キノリノン）により調整された一次遺伝子経路を同定した。クローンが好ましくは適合しない場合、クローン配列の最良のBLAST結果からの既知の遺伝子注解が使用された。それらの遺伝子の調節のレベルは細胞系の処理の間、変化するので、このFTIに応答した一次AML組織からの遺伝子発現プロフィールを決定した。
【００７２】
MAPK/ERK（図２）シグナル化経路における多くの遺伝子がダウン−レギュレートされ、そしてTGFβ（図３）及びWNT（図３）シグナル化経路における遺伝子が一般的にアップ−レギュレートされ、そしてアポプトシス経路がまた、活性化された（図４）ことが見出された。これは、既知又は新規薬物化合物による処理に対して敏感な他の遺伝子標的物の同定を可能にした。例えば、有益な処理は、より有能な効果を得るためにチロシンキナーゼ、PI3K及び/又はMAPキナーゼインヒビターと共に使用されるFTIに起因することができる。
【００７３】
さらに、アポプトシス経路がFTI処理された細胞において活性化される発見を得たので、アポプトシスを調整する薬物は、FTIと共に使用される場合、有益な効果を有することが予測される。それらのタイプの化合物の例は、チロシンキナーゼインヒビター（例えば、Gleevec, Novartis）、MAPキナーゼインヒビター（例えば、U−0126、PD−098059, SB-203580）、及び抗−アポプトシス遺伝子のインヒビター、例えばBcl-XL（例えば、アンチセンス、リボザイム）DNAzymes)を包含する。
【００７４】
【表１】
2005522990.tif 000002
【００７５】
【表２】
2005522990.tif 000003
【００７６】
【表３】
2005522990.tif 000004
【００７７】
【表４】
2005522990.tif 000005
【００７８】
【表５】
2005522990.tif 000006
【００７９】
【表６】
2005522990.tif 000007
【００８０】
【表７】
2005522990.tif 000008
【００８１】
【表８】
2005522990.tif 000009
【００８２】
【表９】
2005522990.tif 000010
【００８３】
【表１０】
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【００８４】
【表１１】
2005522990.tif 000012
【００８５】
【表１２】
2005522990.tif 000013
【００８６】
【表１３】
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【００８７】
【表１４】
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【００８８】
【表１５】
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【００８９】
【表１６】
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【００９０】
【表１７】
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【００９１】
【表１８】
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【００９２】
【表１９】
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【００９３】
【表２０】
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【００９４】
【表２１】
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【００９５】
【表２２】
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【００９６】
【表２３】
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【００９７】
【表２４】
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【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、本発明の遺伝子発現プロフィールを分析するために使用される遺伝子発現パターンのグラフ表示の例である。
【図２】図２は、MAPK/ERK経路の図示である。
【図３】図３は、TGFβ及びWnt経路の図示である。
【図４】図４は、アポプトシス経路の図示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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