【手続補正書】
【提出日】令和1年11月29日(2019.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】送液装置およびそれを用いた細胞培養装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、送液装置およびそれを用いた細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞培養を自動化できる細胞培養装置が開発されてきた。細胞培養装置においては、培養容器の蓋を開閉する操作が不要な閉鎖系培養容器を用いることで、生物学的汚染リスクが低減できる。
【０００３】
培養細胞によっては、細胞の培養容器への接着性を高めるため、細胞培養を始める前に、足場材でコーティングする必要がある。自動培養装置では、足場材溶液の分注器を機械化し、手操作と同様に足場材溶液の分取と移送の動作を連動して足場材添加を行う方法がある（例えば、特許文献１参照）。また、分注操作にポンプを使用し、足場材溶液ボトルと培養皿を使い捨てのチューブで接続し、ポンプによって一定量の足場材溶液を送液する方法がある（例えば、特許文献２、３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−１４９２６８号公報
【特許文献２】特開２００７−２２２１２０号公報
【特許文献３】特開２０１２−５５２２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、新規な送液装置およびそれを用いた細胞培養装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一実施態様は、第１の液体を含む第１の容器と、第２の液体を含む第２の容器と、第１の液体及び第２の液体を入れるための第３の容器と、第１の液体及び第２の液体を排出するための第４の容器と、第３の液体を含む第５の容器と、第１の液体を送液するための第１の送液管と、第２の液体を送液するための第２の送液管と、第１の送液管及び第２の送液管に接続し、第１の送液管中の第１の液体及び第２の送液管中の第２の液体を第３の容器に送液するための第３の送液管と、第３の送液管に設けられ、第３の送液管での送液を制御するための第１の送液ポンプと、第３の容器中の第１の液体を排出し、第３の液体を第３の容器に送液するための第４の送液管と、第４の送液管に接続し、第５の容器中の第３の液体を第４の送液管を通じて第３の容器に送液する第５の送液管と、第４の送液管に接続し、第３の容器中の第１の液体を第４の送液管を通じて第４の容器に排出する第６の送液管と、第４の送液管に設けられ、第４の送液管での送液を制御するための第２の送液ポンプと、を備える、送液装置である。第１の送液管、第２の送液管、第５の送液管、および第６の送液管のそれぞれに弁が設けられていてもよい。
【０００７】
本発明の他の実施態様は、細胞培養用培地を含む第１の容器と、細胞懸濁液を含む第２の容器と、細胞を培養するための第３の容器と、培養後の廃液を捨てるための第４の容器と、細胞の足場材を含む足場材溶液を含む第５の容器と、第１の容器中の前記細胞培養用培地を送液するための第１の送液管と、第２の容器中の前記細胞懸濁液を送液するための第２の送液管と、第１の送液管及び第２の送液管に接続し、第１の送液管中の前記細胞培養用培地及び第２の送液管中の前記細胞懸濁液を第３の容器に送液するための第３の送液
管と、第３の送液管に設けられ、第３の送液管での送液を制御するための第１の送液ポンプと、第３の容器中の前記細胞培養用培地を排出し、前記足場材溶液を第３の容器に送液するための第４の送液管と、第４の送液管に接続し、第５の容器中の前記足場材溶液を第４の送液管を通じて第３の容器に送液する第５の送液管と、第４の送液管に接続し、第３の容器中の前記細胞培養用培地を第４の送液管を通じて第４の容器に排出する第６の送液管と、第４の送液管に設けられ、第４の送液管での送液を制御するための第２の送液ポンプと、を備える、送液装置である。第１の送液管、第２の送液管、第５の送液管、および第６の送液管のそれぞれに弁が設けられていてもよい。前記細胞が幹細胞であってもよい。前記足場材が、フィブロネクチン、コラーゲン、アルブミン、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチン、またはゼラチンを含んでもよい。
【０００８】
本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかの送液装置を１または複数備える、細胞培養装置である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、新規な送液装置およびそれを用いた細胞培養装置を提供できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態における送液装置Ｉの構成図である。
【図２】本発明の一実施形態における送液装置ＩＩの構成図である。
【図３】本発明の一実施形態における自動培養装置の制御フローである。
【図４】本発明の一実施形態における送液装置の制御タイムチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、添付図面を参照して本発明の種々の実施形態について説明する。ただし、これらの実施形態は本発明を実現するための例示に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。なお、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
【００１２】
＜送液装置  Ｉ＞
以下に、送液装置Ｉの構成例を示す。
【００１３】
送液装置１００は、第１の液体を含む第１の容器１０２と、第２の液体を含む第２の容器１１１と、第１の液体及び第２の液体を含む第３の容器１０８を有する。
【００１４】
第１の容器１０２、第２の容器１１１、第３の容器１０８は、その目的を考慮し、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。それぞれ、外気に開放している気圧調節管１０３を有し、容器内の気相に末端を有する。第３の容器１０８も、その目的を考慮し、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。第３の容器１０８は外気に開放している気圧調節管１３０を有し、容器内の気相に末端を有する。
【００１５】
送液装置１００は、第１の容器１０２中の第１の液体を送液するための第１の送液管１０５と、第２の容器１１１中の第２の液体を送液するための第２の送液管１１２と、第１の送液管１０５及び第２の送液管１１２に接続し、第１の送液管１０５中の第１の液体及び第２の送液管１１２中の第２の液体を第３の容器１０８に送液するための第３の送液管１０７を有する。第３の送液管１０７は、第１の送液ポンプ１０６を有し、第３の送液管１０７内の送液を調節する。それぞれの送液管は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。例えば、第１の送液管１０５と第３の送液管１０７、または第２の送液管１１２と第３の送液管１０７を１本の管とし、それぞれ第２の送液管１１２、または第１の送液管１０５を接続させるような構造であってもよい。第１の送液管１０５及び第２の送
液管１１２はそれぞれ第１の弁１１３及び第２の弁１１４を有し、それぞれ開閉を行うことにより、送液の有り・無しを切り替えることができる。
【００１６】
また、送液装置１００は、第３の容器１０８中の第１の液体を捨てるための第４の容器１２１と、第３の溶液を含む第５の容器１１７を有する。第４の容器１２１や第５の容器１１７は、目的を考慮し、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。それぞれ、外気に開放している気圧調節管１２３を有し、容器内の気相に末端を有する。第３の溶液は、粘性があるものが好ましい。それによって、第３の溶液が第１〜第３の送液管を汚すことがない。
【００１７】
送液装置１００は、さらに、第３の容器中１０８の第１の液体を排出し、第３の溶液を第３の容器１０８に送液するための第４の送液管１１６と、第４の送液管１１６に接続し、第５の容器１１７中の第３の溶液を第４の送液管１１６を通じて第３の容器１０８に送液する第５の送液管１１８と、第４の送液管１１６に接続し、第３の容器１０８中の第１の液体を第４の送液管１１６を通じて第４の容器１２１に排出する第６の送液管１２２と、を備える。第４の送液管１１６は、第２の送液ポンプ１１５を有し、第４の送液管１１６内の送液を制御する。それぞれの送液管は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。例えば、第４の送液管１１６と第５の送液管１１８、または第４の送液管１１６と第６の送液管１２２を１本の管とし、それぞれ第６の送液管１２２、または第５の送液管１１８を接続部１２０で接続させるような構造であってもよい。第５の送液管１１８及び第６の送液管１２２はそれぞれ第３の弁１１９及び第４の弁１２５を有し、それぞれ開閉を行うことにより、送液の有り・無しを切り替えることができる。
【００１８】
なお、制御部１２９を設け、ポンプの作動や弁の開閉などを自動的に制御できるようにすることが好ましい。
【００１９】
このように、第１〜第３の送液管と、第４および第５の送液管とを分けることによって、第３の容器１０８に必要な第３の溶液によって、第１〜第３の送液管が汚染することがない。しかも、第３の溶液の送液を、第１の液体を捨てることに使用されるのと同じポンプを用いることにより、装置構成が単純化される。
【００２０】
＜送液装置  ＩＩ＞
送液装置ＩＩを細胞培養に用いる場合について、図２の送液装置を参照しながら、以下に詳細を記載する。
【００２１】
送液装置２００は、細胞培養用培地を含む培地容器２０２と、細胞懸濁液を含む細胞容器２１１と、細胞を培養するための培養容器２０８を有する。
【００２２】
培地容器２０２や細胞容器２１１は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。それぞれ、外気に開放している気圧調節管２０３を有し、容器内の気相に末端を有する。気圧調節管２０３はフィルター２０４を有し、培地容器２０２や細胞容器２１１に流入する外気を滅菌する。従って、例えばフィルター２０４は、０．２２μｍサイズの孔径を有する滅菌用フィルターを用いることができる。細胞培養用培地は、培養する細胞にて適したものであれば、当業者が適切に選択することができる。細胞懸濁液は、培養目的の細胞を培地またはＰＢＳなどの緩衝液に適当な濃度で懸濁した液体である。
【００２３】
培養容器２０８は特に限定されないが、培養皿や培養ボトルであることが好ましい。培養容器２０８の底面は、コーティングされていないものが好ましく、例えば市販の細菌培養用プラスティックディッシュを用いることができる。培養容器２０８は外気に開放している気圧調節管２３０を有し、容器内の気相に末端を有する。気圧調節管２３０はフィル
ター２０９を有し、培養容器２０８に流入する外気を滅菌する。従って、例えばフィルター２０９は、０．２２μｍサイズの孔径を有する滅菌用フィルターを用いることができる。
【００２４】
送液装置２００は、培地容器２０２中の細胞培養用培地を送液するための培地送液管２０５と、細胞容器２１１中の細胞懸濁液を送液するための細胞懸濁液送液管２１２と、培地送液管２０５及び細胞懸濁液送液管２１２に接続部２１０において接続し、培地送液管２０５中の細胞培養用培地及び細胞懸濁液送液管２１２中の細胞懸濁液を培養容器２０８に送液するための培養物送液管２０７を有する。培養物送液管２０７は、第１の送液ポンプ２０６を有し、培養物送液管２０７内の送液を調節する。それぞれの送液管は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。例えば、培地送液管２０５と培養物送液管２０７、または細胞懸濁液送液管２１２と培養物送液管２０７を１本の管とし、それぞれ細胞懸濁液送液管２１２、または培地送液管２０５を接続部２１０で接続させるような構造であってもよい。培地送液管２０５及び細胞懸濁液送液管２１２はそれぞれ培地送液弁２１３及び細胞懸濁液送液弁２１４を有し、それぞれ開閉を行うことにより、送液の有り・無しを切り替えることができる。
【００２５】
送液装置２００は、さらに、外気と接続している２本の気体導入管２３１、２４１を有し、それぞれ接続部２２６、２３６で培養物送液管２０７または両方向送液管２１６に接続する。気体導入管２３１、２４１はフィルター２２７、２３７を有し、送液装置２００に導入する外気を滅菌する。従って、例えばフィルター２２７、２３７は、０．２２μｍサイズの孔径を有する滅菌用フィルターを用いることができる。また、気体導入管２３１、２４１は外気流入弁２２８、２３８を有し、外気の流入の有り・無しを調節する。これらの気体導入管２３１、２４１は、複数の培養容器２０８にそれぞれ培地容器２０２からの培地または足場材溶液容器２１７からの足場材を注入する場合、培養容器２０８の交換前に外気流入弁２２８、２３８を開け、一旦培養物送液管２０７または両方向送液管２１６中の培地または足場材を空にするために用いる。
【００２６】
また、送液装置２００は、培養後の廃液を捨てるための廃液容器２２１と、細胞の足場材を含む足場材溶液を含む足場材溶液容器２１７を有する。廃液容器２２１や足場材溶液容器２１７は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。それぞれ、外気に開放している気圧調節管２２３を有し、容器内の気相に末端を有する。気圧調節管２２３はフィルター２２４を有し、廃液容器２２１や足場材溶液容器２１７に流入する外気を滅菌する。従って、例えばフィルター２２４は、０．２２μｍサイズの孔径を有する滅菌用フィルターを用いることができる。足場材は、培養容器２０８の底面をコーティングし、培養細胞の接着を促進するものであって、培養する細胞に適合するものを選択すればよい。例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、アルブミン、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチン、またはゼラチンを含んでもよい。
【００２７】
送液装置２００は、さらに、培養容器２０８中の細胞培養用培地を排出し、足場材溶液を培養容器２０８に送液するための両方向送液管２１６と、両方向送液管２１６に接続し、足場材溶液容器２１７中の足場材溶液を両方向送液管２１６を通じて培養容器２０８に送液する足場材溶液送液管２１８と、両方向送液管２１６に接続し、培養容器２０８中の細胞培養用培地を両方向送液管２１６を通じて廃液容器２２１に排出する廃液送液管２２２と、を備える。両方向送液管２１６は、第２の送液ポンプ２１５を有し、両方向送液管２１６内の送液を制御する。それぞれの送液管は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。例えば、両方向送液管２１６と足場材溶液送液管２１８、または両方向送液管２１６と廃液送液管２２２を１本の管とし、それぞれ廃液送液管２２２、または足場材溶液送液管２１８を接続部２２０で接続させるような構造であってもよい。足場材溶液送液管２１８及び廃液送液管２２２はそれぞれ足場材溶液送液弁２１９及び廃液送液弁２２５を有し、それぞれ開閉を行うことにより、送液の有り・無しを切り替えることができる。
【００２８】
各容器及び各送液管はそれぞれ気密に保つことができるような構造とするのが好ましく、それによって、装置内部を滅菌状態に維持することができる。また、制御部２２９を設け、ポンプの作動や弁の開閉などを自動的に制御できるようにすることが好ましい。
【００２９】
このように、足場材溶液送液管２１８と細胞懸濁液送液管２１２を分けることによって、送液処理の間に、足場材溶液が通過した後を細胞懸濁液が通過することがなくなり、細胞懸濁液中の細胞が、装置内に付着した足場材溶液によって不適当な場所にトラップされることがなくなる。しかも、足場材溶液の送液を、廃液の送液と同じポンプで行うことによって、全体の装置構成が単純化される。
【００３０】
＜送液装置の作動方法＞
以下に、送液装置ＩＩを例にして送液装置２００の作動方法を詳述する。この送液装置２００の制御は、手で行ってもよく、制御部２２９に行わせてもよい。制御部２２９に行わせるときのフローチャートを図３に示す。また、図４には、各送液弁のオン（開放）とオフ（閉止）、各送液ポンプのオンとオフについて、時間軸に沿った制御方法を示す。なお、送液装置の作動開始時には、すべてオフとする。
【００３１】
（工程１）培養用細胞を細胞容器２１１に、培地を培地容器２０２に、足場材溶液を足場材溶液容器２１７に、それぞれ用意し、図１の構成になるように各流路に、細胞容器２１１、培地容器２０２、足場材溶液容器２１７、廃液容器２２１を装着する（図３Ｓ１）。
【００３２】
（工程２）足場材溶液容器２１７内の足場材溶液を培養容器２０８に送液し、培養容器２０８をコーティングする（図３Ｓ２）。以下に具体的に詳述する。
【００３３】
廃液送液弁２２５を閉止し、足場材溶液送液弁２１９を開放したのち、図１における反時計回りに第２の送液ポンプ２１５を稼働させると、足場材溶液容器２１７内の足場材溶液が足場材溶液送液管２１８及び両方向送液管２１６を通じて、培養容器２０８に送液される。所定の液量が足場材溶液送液管２１８より培養容器２０８に供給されたとき第２の送液ポンプ２１５を停止し、所定時間、培養容器２０８を静置する。足場材溶液が送液された分、足場材溶液容器２１７内部の空間体積は増加するが、同量の空気がフィルター２２７を介して外気から取り込まれるため、足場材溶液容器２１７内部の圧力は大気圧に維持される。また、培養容器２０８が気密である場合、足場材溶液が送液された分、培養容器２０８の空間体積は減少するが、同量の気体がフィルター２０９を介して外気に排気されるため、培養容器２０８内部の圧力は大気圧に維持される。静置時間は特に限定されないが、１０分から数時間まで、技術常識から適切な時間を選択できる。
【００３４】
（工程３）培養容器２０８内の足場材溶液を排出する（図３Ｓ３）。以下に具体的に詳述する。
【００３５】
足場材溶液送液弁２１９を閉止し、廃液送液弁２２５を開放したのち、第２の送液ポンプ２１５を図１における時計回りに回転すると、培養容器２０８内の足場材溶液が両方向送液管２１６及び廃液送液管２２２を通じ、廃液容器２２１に排液される。培養容器２０８内の足場材溶液がほぼ全量排出されたとき第２の送液ポンプ２１５を停止し、廃液送液弁２２５を閉止する。足場材溶液が送液された分、廃液容器２２１内部の空間体積は減少するが、同量の気体がフィルター２２４を介して外気に排気されるため、廃液容器２２１内部の圧力は大気圧に維持される。また、培養容器２０８が気密である場合、足場材溶液が排液された分、培養容器２０８の空間体積は増加するが、同量の気体がフィルター２０９を介して外気から取り込まれるため、培養容器２０８内部の圧力は大気圧に維持される
。
【００３６】
（工程４）培地容器２０２内の培地を培養容器２０８に送液する（図３Ｓ４）。以下に具体的に詳述する。
【００３７】
細胞懸濁液送液弁２１４と外気流入弁２２８を閉止し、培地送液弁２１３を開放したのち、第１の送液ポンプ２０６を図２における時計回りに稼働させると、第１の送液ポンプ２０６は培地送液管２０５及び培養物送液管２０７を通じて、培養容器２０８に培地を送液する。所定の液量の培地が培地容器２０２から培養容器２０８に供給されたとき、第１の送液ポンプ２０６を停止する。培地が送液された分、培地容器２０２内部の空間体積は増加するが、同量の気体がフィルター２０４を介して外気から取り入れられるため、培地容器２０２内部の圧力は大気圧に維持される。また、培養容器２０８が気密である場合、培地が送液された分、培養容器２０８の空間体積は減少するが、同量の気体がフィルター２０９を介して外気に排出されるため、培養容器２０８内部の圧力は大気圧に維持される。最後に外気流入弁２２８を開放すると、全体の圧力が微調整されて、ほぼ大気圧に等しくなる。
【００３８】
ここで、工程２０３で培養容器２０８から除去しきれなかった足場材溶液を洗浄するため、１回または複数回、洗浄工程を行ってもよい。その場合、足場材溶液送液弁２１９を閉止し、廃液送液弁２２５を開放したのち、第２の送液ポンプ２１５を図１における時計回りに回転すると、培養容器２０８内の培地が両方向送液管２１６及び廃液送液管２２２を通じ、廃液容器２２１に排液される。培養容器２０８内の足場材溶液がほぼ全量排出されたとき第２の送液ポンプ２１５を停止し、廃液送液弁２２５を閉止する。培地が送液された分、廃液容器２２１内部の空間体積は減少するが、同量の気体がフィルター２２４を介して外気に排気されるため、廃液容器２２１内部の圧力は大気圧に維持される。また、培養容器２０８が気密である場合、培地が排液された分、培養容器２０８の空間体積は増加するが、同量の気体がフィルター２０９を介して外気から取り込まれるため、培養容器２０８内部の圧力は大気圧に維持される。その後、上述のようにして、再度培地容器２０２内の培地を培養容器２０８に送液する。複数回の洗浄工程を行う時は、この部分工程を繰り返して行う。
【００３９】
（工程５）細胞容器２１１内の細胞懸濁液を培養容器２０８に送液する（図３Ｓ５）。以下に具体的に詳述する。
【００４０】
培地送液弁２１３と外気流入弁２２８を閉止し、細胞懸濁液送液弁２１４を開放したのち、第１の送液ポンプ２０６を図２における時計回りに稼働させると、第１の送液ポンプ２０６は細胞懸濁液送液管２１２及び培養物送液管２０７を通じて、培養容器２０８に細胞懸濁液を送液する。所定の液量が細胞容器２１１より供給されたとき第１の送液ポンプ２０６を停止する。細胞懸濁液が送液された分、細胞容器２１１内部の空間体積は増加するが、同量の気体がフィルター２０４を介して外気から取り入れられるため、細胞容器２１１内部の圧力は大気圧に維持される。また、培養容器２０８が気密である場合、細胞懸濁液が送液された分、培養容器２０８の空間体積は減少するが、同量の気体がフィルター２０９を介して外気に排出されるため、培養容器２０８内部の圧力は大気圧に維持される。最後に外気流入弁２２８を開放すると、全体の圧力が微調整されて、完全に大気圧と等しくなる。
【符号の説明】
【００４１】
１００…送液装置、１０２…第１の容器、１０３…気圧調節管、１０４…フィルター、１０５…第１の送液管、１０６…第１の送液ポンプ、１０７…第３の送液管、１０８…第３の容器、１０９…フィルター、１１０…接続部、１１１…第２の容器、１１２…第２の送
液管、１１３…第１の弁、１１４…第２の弁、１１５…第２の送液ポンプ、１１６…第４の送液管、１１７…第５の容器、１１８…第５の送液管、１１９…第３の弁、１２０…接続部、１２１…第４の容器、１２２…第６の送液管、１２３…気圧調節管、１２４…フィルター、１２５…第４の弁、１２９…制御部、１３０…気圧調節管、２０１…送液装置、２０２…培地容器、２０３…気圧調節管、２０４…フィルター、２０５…培地送液管５、２０６…第１の送液ポンプ、２０７…培養物送液管、２０８…培養容器、２０９…フィルター、２１０…接続部、２１１…細胞容器、２１２…細胞懸濁液送液管、２１３…培地送液弁、２１４…細胞懸濁液送液弁、２１５…第２の送液ポンプ、２１６…両方向送液管、２１７…足場材溶液容器、２１８…足場材溶液送液管、２１９…足場材溶液送液弁、２２０…接続部、２２１…廃液容器、２２２…廃液送液管、２２３…気圧調節管、２２４…フィルター、２２５…廃液送液弁、２２６…接続部、２２７…フィルター、２２８…外気流入弁、２２９…制御部、２３０…気圧調節管、２３１…外気流入管、２３６…接続部、２３７…フィルター、２３８…外気流入弁、２４１…外気流入管