(57)【要約】  本発明はＡβの特定のターン構造を有するＡβのみを標的とする治療方法を提供する。具体的には、本発明は、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβを特異的に認識する抗体を提供するものである。また、本発明は、アミロイドβの毒性コンホマーを特異的に認識する抗体を有効成分として含有する医薬組成物、又はアミロイドβの毒性コンホマーの測定キット若しくはアルツハイマー病の診断薬等に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβを特異的に認識する抗体。
【請求項２】
２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβに特異的に結合する物質を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３】
アルツハイマー病治療薬である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβと特異的に結合する物質を備える、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβの測定キット。
【請求項５】
２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβと特異的に結合する物質を備えるアルツハイマー病の診断薬。
【請求項６】
検体と２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβと特異的に結合する物質とを接触させる工程を備える、検体中における２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβレベルの測定方法。
【請求項７】
検体中の２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβを検出するステップを備える、アルツハイマー病の診断方法。
【請求項８】
以下のステップを備える、アルツハイマー病の診断方法：
ａ）被験者由来の試料を調製するステップ、
ｂ）少なくとも１つの２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβを特異的に認識する抗体に該試料を接触させるステップ、
ｃ）２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβへの該抗体の結合を検出して２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβのレベルを測定するステップ、並びに、
ｄ）２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβのレベルと被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップを含む方法。
【請求項９】
検体中における、全アミロイドβに対する２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβの割合を測定する方法であって、
検体中の全アミロイドβレベルを測定するステップ、
検体中の２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβレベルを測定するステップ、及び、
測定された全アミロイドβレベルに対する２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβレベルの割合を計算するステップを備える方法。
【請求項１０】
アルツハイマー病の診断方法であって、
検体中の全アミロイドβレベルを測定するステップ、
検体中の２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβレベルを測定するステップ、
測定された全アミロイドβレベルに対する２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβレベルの割合を計算するステップ、及び、
全アミロイドβレベルに対する２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβレベルの割合とアルツハイマー病の有無又は程度と関連付けを行うステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβの測定方法、並びに、アルツハイマー病の診断方法及び治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（以下、「ＡＤ」という）は、一般に老人斑におけるアミロイドの蓄積により特徴づけられる。アミロイドは、主に４０及び４２残基のアミロイドβタンパク質（以下、それぞれ、「Ａβ４０」及び「Ａβ４２」という）から構成される。これらのタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から、β−及びγ−セクレターゼの２つのプロテアーゼによる分解を受けて生成する。ＡＤの発症において、Ａβ４２は、その凝集傾向や神経毒性からＡβ４０よりも重要な役割を担っていると考えられている。最近の研究により、酸化ストレスがＡＤに関連する神経変性に寄与することが示されている。ラジカルの形成を介したＡβ４２の神経毒性は、活性酸素種の生成を伴う１０位のチロシン及び３５位のメチオニンにおけるラジカル化と緊密に関連している。一方で、Ａβのオリゴマーの集積がシナプス毒性を通じてＡＤを誘導する証拠が示されている。【０００３】
アルツハイマー病モデルマウスにＡβ凝集体をワクチンとして接種すると、脳内におけるＡβの沈着を減少させ、認識機能障害を抑制することから、Ａβによる免疫付与は、ＡＤ治療の有望な方法と考えられている。しかし、Ａβ４２によりＡＤ患者を免疫した臨床試験（ＡＮ１７９２）は、過剰な免疫活性化という深刻な副作用から中止されている。問題の理由の一つとして、生理的なＡβ４２の意図しない除去が考えられる。よって、生理的なＡβ４２と毒性のあるＡβ４２とを区別することは、ＡＤ患者におけるアミロイドプラークの形成や認識機能障害の進行を効果的に抑制する上で必須であると考えられる。【０００４】
系統的プロリン置換法と共に固体ＮＭＲ法を用いた研究により、Ａβ４２の２２位及び２３位にターン構造を有する毒性コンホマーと、Ａβ４２の２５位及び２６位にターン構造を有する生理的コンホマーが区別された（非特許文献１、特許文献１）。前者のコンホマーは、強力な凝集能と神経毒性を示すことが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２６５１８９
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：１５１６８−１５１７４
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、Ａβのターン構造の違いを効率的に識別し、または、特定のターン構造を有するＡβのみを標的とする治療方法を提供するため試行錯誤を行った。Ａβ４２の２２位及び２３位にターン構造を有する毒性コンホマーは、可逆的にＡβ４２の２５位及び２６位にターン構造を有する生理的コンホマーに変換され、その立体構造が固定されないことから、野生型Ａβ４２を用いてＡβ４２の２２位及び２３位にターン構造を有する毒性コンホマーを特異的に認識する抗体を作製することは困難であった。そこで、本発明者らは、上記構造の不安定性による問題を解決するため、２２位のグルタミン酸をプロリンに置換することにより、本部位におけるターン構造を固定した抗原を用いてＡβ４２の２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有する毒性コンホマーを特異的に認識する抗体の作製を試みた。一般には、抗体はアミノ酸の違いを厳密に認識し、区別することから、目的とする抗体が認識する部位（２２位及び２３位）にアミノ酸変異が入った変異体タンパク質（２２位がプロリンであるＡβ４２）を抗原として用いた場合、変異導入前の野生型タンパク質（２２位がグルタミン酸であるＡβ４２）を認識する抗体を得ることは困難である。しかし、本発明者らは、緻密なスクリーニング実験の結果、前記変異型の抗原を用いて得た抗体の中から、野生型であり、かつ、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβ４２の毒性コンホマーを特異的に認識する抗体を見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβの毒性コンホマーを特異的に認識する抗体及びその利用に関し、具体的には以下の発明に関する。
（１）  ２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβ（以下、「２２−２３ターンＡβ」という）を特異的に認識する抗体。
（２）  ２２−２３ターンＡβに特異的に結合する物質を有効成分として含有する医薬組成物。
（３）  アルツハイマー病治療薬である、（２）に記載の医薬組成物。
（４）  ２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質を備える、２２−２３ターンＡβの測定キット。
（５）  ２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質を備えるアルツハイマー病の診断薬。
（６）  検体と２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質とを接触させる工程を備える、検体中における２２−２３ターンＡβレベルの測定方法。
（７）  検体中の２２−２３ターンＡβを検出するステップを備える、アルツハイマー病の診断方法。
（８）  以下のステップを備える、アルツハイマー病の診断方法：
ａ）被験者由来の試料を調製するステップ、
ｂ）少なくとも１つの２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体に該試料を接触させるステップ、
ｃ）２２−２３ターンＡβへの該抗体の結合を検出して２２−２３ターンＡβのレベルを測定するステップ、並びに、
ｄ）２２−２３ターンＡβのレベルと被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップを含む方法。
（９）  検体中における、全アミロイドβに対する２２−２３ターンＡβの割合を測定する方法であって、
検体中の全アミロイドβレベルを測定するステップ、
検体中の２２−２３ターンＡβレベルを測定するステップ、及び、
測定された全アミロイドβレベルに対する２２−２３ターンＡβレベルの割合を計算するステップを備える方法。
（１０）  アルツハイマー病の診断方法であって、
検体中の全アミロイドβレベルを測定するステップ、
検体中の２２−２３ターンＡβレベルを測定するステップ、
測定された全アミロイドβレベルに対する２２−２３ターンＡβレベルの割合を計算するステップ、及び、
全アミロイドβレベルに対する２２−２３ターンＡβレベルの割合とアルツハイマー病の有無又は程度と関連付けを行うステップを含む方法。
【０００９】
本明細書において、ある抗体又は物質が「特異的に結合する」又は「特異的に認識する」とは、その抗体又は物質が他のアミノ酸配列や立体構造に対する親和性よりも、２２−２３ターンＡβに対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置または方法によって、その特定のアミノ酸配列や立体構造を他のアミノ酸配列や立体構造から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味する。実質的に高い親和性で結合する場合の結合定数（Ｋａ）としては、例えば、少なくとも１０７Ｍ−１であり、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１であり、より好ましくは、少なくとも１０９Ｍ−１である。このような結合定数として、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１又はそれより高い、例えば、１０１３Ｍ−１又はそれより高いものである。
【００１０】
本発明は、２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体に関する。また、本発明の２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体は、２２位及び２３位のアミノ酸においてターン構造を有するＡβを特異的に認識すれば、その認識部位が限定されるものではないが、好ましくは、Ａβの２２位及び／又は２３位のアミノ酸、並びに／あるいはその隣接した（好ましくは、２２位及び／又は２３位のアミノ酸から数残基以内の）アミノ酸を認識する抗体である。例えば、本発明の抗体は、２２−２３ターンＡβを特異的に認識し、かつ、Ａβの２２位及び２３位のアミノ酸のうち少なくとも１のアミノ酸を認識する抗体であってもよい。より好ましくは、本発明の抗体は、Ａβの２２位及び２３位のアミノ酸により作られるターン構造の立体構造を特異的に認識する抗体であり、例えば、本発明の抗体は、Ａβの２２位及び２３位のアミノ酸により作られるターン構造の立体構造を特異的に認識し、かつ、Ａβの２２位及び２３位のアミノ酸のうち少なくとも１のアミノ酸を認識する抗体であってもよい。
【００１１】
本発明の抗体等が認識する２２−２３ターンＡβとしては、「２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有する」限り、特に限定は無いが、好ましくは、２２−２３ターンＡβ４０又は２２−２３ターンＡβ４２であり、より好ましくは２２−２３ターンＡβ４２である。また、本発明の抗体等が認識する２２−２３ターンＡβは、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有し、野生型Ａβと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。本発明の抗体等が認識する２２−２３ターンＡβとしては、好ましくは２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有する野生型Ａβである。
【００１２】
本明細書において、特定のポリペプチド又はタンパク質と「実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はタンパク質」とは、２２−２３ターンＡβ当該特定のポリペプチド又はタンパク質と実質的に同等の生物学的性質を有するポリペプチド又はタンパク質であって、当該特定のポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは１〜数個（例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は修飾されているアミノ酸配列を有する変異ポリペプチド又はタンパク質、並びに、そのアミノ酸配列中に、複数個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは１〜数個（例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個）のアミノ酸が付加又は挿入されたアミノ酸配列を有する変異ポリペプチド又はタンパク質を意味する。また、実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はタンパク質は、前記の置換、欠失、修飾及び付加のうち、複数の変異を有する変異ポリペプチド又はタンパク質であってもよい。好ましくは、「実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はタンパク質」は、当該特定のポリペプチド又はタンパク質と同等の生物学的活性を有する。
【００１３】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、モノクローナル抗体である。本発明において、「モノクローナル抗体」は、抗原に対して高度に特異的であり、単一の抗原を認識するものである。更に、本発明の抗体は、非ヒト動物の抗体、非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体、及び、ヒト抗体を包含する。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ラビット、イヌ、サル、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル等の抗体を挙げることができ、好ましくは、ハイブリドーマを作製することができる動物の抗体であり、より好ましくはマウスの抗体である。非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体を挙げることができる。上記において、「キメラ抗体」とは、非ヒト動物由来であって２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変した抗体のことであり、好ましくは、ヒト・マウス・キメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）である。「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来であって２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体のことである。ここで、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）またはＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７）のいずれの定義によるものであってもよい。「ヒト抗体」とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体のことであり、例えば、ヒトの抗体産生に関与する遺伝子を導入したトランスゲニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）等を挙げることができる。例えば、本発明の抗体を治療、予防、又は体内に投与することにより用いる診断に使用する場合には、本発明の抗体として好ましくは、ヒト・非ヒト動物のキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。
【００１４】
本発明の抗体が認識するアミノ酸の数は、抗体が２２−２３ターンＡβに結合することができる数であれば、特に限定はない。抗体を治療薬として使用する場合には、２２−２３ターンＡβの機能を阻害することが可能な数のアミノ酸を認識することが好ましい。抗体またはその断片が認識するアミノ酸の数は、好ましくは、少なくとも１個であり、より好ましくは、少なくとも３個である。また、本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。
【００１５】
また、２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体の断片も、本発明の２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体に含まれる。ここで、「抗体の断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を保持するもののことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（以下、「Ｄｉａｂｏｄｙ」という）、またはＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ’は、該Ｆ（ａｂ’）のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｄＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬがペプチドリンカーで連結された抗原結合活性を有するポリペプチドである。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のシステイン残基に置換されたアミノ酸残基がジスルフィド結合を介して結合している抗原結合活性を有する断片である。Ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した断片である。本発明のＤｉａｂｏｄｙは、モノスペシフィックでもよいし、バイスペシフィック（多重特異性抗体）でもよい。二量体化しているｓｃＦｖは、同一であっても良いし、異なっていても良い。
【００１６】
更に、２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体の一部を含むペプチドも、本発明の２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体に含まれる。ここで、「抗体の一部を含むペプチド」とは、抗体を構成するアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を備えるペプチドであって、抗体の抗原への作用を保持するもののことである。本明細書において、「抗体の抗原への作用」とは、抗体の２２−２３ターンＡβへの結合作用を意味し、特に、本発明の２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体が治療薬又は予防薬として用いられる場合には、抗体のＡβの神経毒性を阻害する作用、及び／又はＡβの凝集を抑制する作用を意味する。抗体の一部を含むペプチドは、抗体に由来しないアミノ酸配列を含んでいてもよい。２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体の一部を含むペプチドとして、好ましくは、２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体のＣＤＲ配列を含むペプチドである。ここで、ＣＤＲ配列を含むペプチドとは、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３から選ばれる少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列を含むペプチドのことである。２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体の一部を含むペプチドとして、より好ましくは、重鎖可変領域のＣＤＲ３及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むペプチドである。
【００１７】
本明細書の全体に亘って「２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβ（２２−２３ターンＡβ）を特異的に認識する抗体」として、好ましくは、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）に寄託されたハイブリドーマＡｍｙｌｏｉｄβ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＩＢＬ−１０１（寄託微生物の受託日２００９年１０月１４日、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２９０）が産生するＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体である。例えば、本発明の抗体は、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ抗体の抗原への作用（例えば、結合作用、治療薬又は予防薬として用いる場合は好ましくは、抗体のＡβの神経毒性を阻害する作用、及び／又はＡβの凝集を抑制する作用）を保持するポリペプチド又は抗体、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体の可変領域とヒト由来の抗体の定常領域を有するキメラ抗体（以下、「ＩＢＬ−１０１キメラ抗体」という）、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）を有する抗体であってもよい（以下、「ＩＢＬ−１０１ヒト化抗体」という）（以下、これらの抗体を総称して、「ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体に基づいて作製される抗体」という）。ＩＢＬ−１０１ヒト化抗体としては、例えば、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体のＨ鎖のＣＤＲ１（以下、「ＣＤＲＨ１」という）、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３、並びに／あるいは、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体のＬ鎖のＣＤＲ１（以下、「ＣＤＲＬ１」という）、ＣＤＲＬ２及び／又はＣＤＲＬ３を有する抗体であり、好ましくは、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、並びに、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する抗体である。また、本発明の抗体は、前述のＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体又はこれに基づいて作製される抗体の断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ若しくはこれらの重合体、Ｄｉａｂｏｄｙ、またはＣＤＲを含むペプチド等）であってもよい。本段落、実施例、及び図面の説明を除き、本明細書において、「ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体」との言及は、前述のハイブリドーマＡｍｙｌｏｉｄβ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＩＢＬ−１０１により産生される抗体の他、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体に基づいて作製される抗体、及びそれらの断片をも含む。
【００１８】
また、別の態様において、本発明は、２２−２３ターンＡβに特異的に結合する物質を有効成分として含有する医薬組成物に関する。本明細書において、「２２−２３ターンＡβに特異的に結合する物質」とは、２２−２３ターンＡβに特異的に結合する物質であれば特に限定されず、好ましくは、Ａβの２２位及び２３位のアミノ酸により作られるターン構造の立体構造と特異的に結合する物質であり、より好ましくは、２２−２３ターンＡβの機能及び／又は凝集を阻害する物質である。そのような物質としては、例えば、アプタマー、２２−２３ターンＡβと結合するポリペプチド、又は、上述の２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体を挙げることができる。
【００１９】
「アプタマー」とはタンパク質等の物質と結合する核酸である。アプタマーはＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。核酸の形態は二本鎖であっても一本鎖であってもよい。アプタマーの長さは標的分子に特異的に結合することができれば特に限定されないが、例えば、１０〜２００ヌクレオチド、好ましくは、１０〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜８０ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドのものである。アプタマーは、当業者において周知の方法を用いて選択することができ、例えば、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５−５１０)を用いることができる。
【００２０】
「２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するＡβ（２２−２３ターンＡβ）と結合するポリペプチド」とは、２２−２３ターンＡβと結合するタンパク質と結合するポリペプチドであって、当該ポリペプチドと結合することにより、２２−２３ターンＡβが凝集することができず、及び／又は本来の機能（神経毒性等）を奏することができないポリペプチドのことである。本明細書における実験の結果から、２２−２３ターンＡβはたがいに結合し、三量体を形成することが示されていることから、２２−２３ターンＡβと結合するポリペプチドとしては、例えば、２２−２３ターンＡβの変異体やアナログ（例えば、Ｐ３−Ａβ４２、Ｅ２２Ｐ−Ａβ４２、及びＡβ−ラクタム）又はその部分ペプチドが挙げられる。例えば、このような変異体、アナログ又は部分ペプチドを作製し、２２−２３ターンＡβと結合する物質を選択することにより、２２−２３ターンＡβと結合するポリペプチドを得ることができる。また、これらのペプチドは、安定性の向上や阻害活性を促進させるため、適宜、修飾されていてもよい。
【００２１】
本発明の医薬組成物は、患者に投与することができる製剤であればいかなる製剤を採用してもよいが、非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、点鼻剤、坐剤、貼布剤、軟膏等を挙げることができる。好ましくは、注射剤である。本発明の薬剤の剤形は、例えば、液剤又は凍結乾燥製剤を挙げることができる。本発明の薬剤を注射剤として使用する場合、必要に応じて、プロピレングリコール、エチレンジアミン等の溶解補助剤、リン酸塩等の緩衝材、塩化ナトリウム、グリセリン等の等張化剤、亜硫酸塩等の安定剤、フェノール等の保存剤、リドカイン等の無痛化剤等の添加物（「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社参照）を加えることができる。また、本発明の治療薬又は予防薬を注射剤として使用する場合、保存容器としては、アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ、ペン型注射器用カートリッジ、及び、点滴用バッグ等を挙げることができる。
【００２２】
本発明の医薬組成物は、２２−２３ターンＡβにより発症し又は増悪する疾患の治療薬として使用することができる。このような疾患としては、例えば、アルツハイマー病を挙げることができる。
【００２３】
また、別の態様において、本発明は、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質を備える、２２−２３ターンＡβの測定キットに関する。例えば、本発明の測定キットは、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的方法、または、ウエスタンブロット等を挙げることができる。本測定キットの検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、本発明の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは組織（特には脳組織）又は血液である。本予測キットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００２４】
好ましくは、本発明の測定キットにおける２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質は、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体であり、より好ましくは、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体である。２２−２３ターンＡβと結合する限りその構造、大きさ、イムノグロブリンクラス、由来等を問わない。また、本発明の測定キットは、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、当該核酸を包含するベクター、当該ベクターを保有する細胞を包含するものであってもよい。
【００２５】
また、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質は、３２Ｐ、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ等の放射能標識；βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘム等の補酵素又は補欠分子族；フルオレセイン誘導体（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオフルバミル等）、ローダミン誘導体（テトラメチルローダミン、トリメチルローダミン（ＲＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン１１０等）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ｃｙ−クロム、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、プロピジウムイオダイド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）等の蛍光標識；ルシフェラーゼ等の生物発光標識；あるいは、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノースエステル等のルミノール誘導体、Ｎ−メチルアクリジニウムエステル、Ｎ−メチルアクリジニウムアシルスルホンアミドエステル等のアクリジニウム誘導体、ルシゲニン、アダマンチルジオキセタン、インドキシル誘導体、ルテニウム錯体等の化学発光標識；金コロイド等の金属等の検出可能な標識が結合していてもよい。
【００２６】
本発明の測定キットは、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質を含むものであれば特に限定はない。例えば、本発明の測定キットに含まれる試薬は、固体状、ゲル状又は液状であってもよい。また、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質は、樹脂、膜、フィルム、容器等に含まれ若しくは固定され、又は、溶媒に溶解されていてもよい。また、本発明のキットは、必要に応じて、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬、ブロッキング試薬等を含んでいてもよい。また、本発明のキットは、例えば、ニトロセルロース、セファロース、ナイロン、ビニロン、ポリエステル、アクリル、ポリオレフィン、ポリウレタン、レーヨン、ポリノジック、キュプラ、リヨセル、アセテート、ポリビニリデンジフルオリド、シリコンラバー、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素加工樹脂、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリマーアロイ、ガラス繊維、炭素繊維、ガラス、ゼラチン、ポリアミノ酸及び／又は磁気感応性素材等を含有する、プレート、チューブ、チップ（例えば、プロテインチップ、ラボチップ等）、ビーズ、膜、吸収体及び／又は粒子等を備えていてもよい。
【００２７】
例えば、本発明のキットとしては、例えば、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体が固相化されたプレート、ビオチン標識抗Ａβウサギポリクローナル抗体溶液、ストレプトアビジンＰＯＤ溶液、洗浄液、ＴＭＢ試薬、２Ｍ  ＨＣｌ、Ｅ２２Ｐ−Ａβ４２を備えるキット、あるいは、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体、抗Ａβマウスモノクローナル抗体結合金コロイド、ウサギ免疫グロブリン結合金コロイド、及び、テストプレートを備えるキットを挙げることができる。
【００２８】
また、本発明は、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質（好ましくは、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体、より好ましくは、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体）を備えるアルツハイマー病の診断薬に関する。例えば、生体外で使用する場合、本発明の診断薬は、上述の２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質を備える、２２−２３ターンＡβの測定キットに準じた構成とすることができる。また、本発明の診断薬は、画像診断用とすることもできる。本発明の診断薬を画像診断用として用いる場合、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質は、標識物質を含有し又は標識物質と結合している。標識物質としては、例えば、放射性同位元素等の当業者周知の物質を用いることができ、好ましくは陽電子放出放射性同位元素又はγ線放射性同位元素であり、これに限定されるものではないが、例えば１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、８６Ｙ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏおよび７５Ｂｒを挙げることができる。画像診断用として用いる場合、本発明の診断薬が含有する２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質は、好ましくは、２２−２３ターンＡβと結合するポリペプチド、又は、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体（より好ましくは、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体）であり、より好ましくは、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体である。画像診断用として用いる場合、本発明の診断薬は、ヒトへの投与に適した医薬上許容される形態であって、生理学的に許容し得る添加剤、例えば、薬学的に許容し得る希釈剤、緩衝剤、可溶化剤、無痛化剤、溶剤、安定化剤又は酸化防止剤を含んでいてもよい。本発明の診断薬の投与量は、対象部位、用いる画像診断方法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度により適宜選択することができる。
【００２９】
本明細書において、「ＸＮＹ」（Ｘ及びＹはアミノ酸一文字表記；Ｎは自然数）は、Ｎ位のアミノ酸Ｘがアミノ酸Ｙに置換されていることを示し、「Ａβｐ−ｑ」（ｐ及びｑは自然数）は、Ａβのｐ位のアミノ酸からｑ位のアミノ酸からなるペプチドを示す。例えば、Ｅ２２Ｐ−Ａβ４２は、２２位のグルタミン酸がプロリンに置換されたＡβ４２を示し、Ｇ９Ｃ、Ｅ２２Ｐ−Ａβ９−３５は、９位のグリシンがシステインに置換され、２２位のグルタミン酸がプロリンに置換されたＡβの９位−３５位までのアミノ酸からなるペプチドを示す。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の抗体は、２２−２３ターンＡβと特異的に結合することができることから、２２−２３ターンＡβを特異的に検出することができ、又は、２２−２３ターンＡβの作用を阻害することができる。従って、２２−２３ターンＡβの発現量を指標とした診断に利用できる他、２２−２３ターンＡβの発現が発症又は増悪に寄与する疾患の治療薬又は予防薬として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、Ａβ４２の立体構造（ターン構造）を模式的にあらわした図である。
【図２】図２は、２２位及び２３位にターンを有するＡβ４２の配座固定アナログＡβ−ラクタム（Ｋ２２−Ｅ２３）の構造、及び３か所のターン構造を取りうる部位をプロリン残基で置換したトリプルＡβ変異体（Ｐ３−Ａβ４２）の置換部位をあらわした図である。
【図３】図３は、モノクローナル抗体ＩＢＬ−１０１とモノクローナル抗体４Ｇ８のＡβ４２への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を表す図である。左図は、ＩＢＬ−１０１を、右図は４Ｇ８を示す。図中、縦軸はＯＤ４９２の吸光度を表し、横軸は固相化された各モノクローナル抗体の濃度を表す。図中、黒丸はＡβ４２を、白丸はＡβ４０を、黒三角はＥ２２Ｐ−Ａβ４２を、白三角はＥ２２Ｖ−Ａβ４２を、白四角は０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを示す。
【図４】図４は、モノクローナル抗体ＩＢＬ−１０１のＡβ４２、Ａβ−ラクタム（２２Ｋ−２３Ｅ）、及びＰ３−Ａβ４２への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を表す図である。図中、縦軸はＯＤ４９２の吸光度を表し、横軸は固相化されたＩＢＬ−１０１の濃度を表す。図中、黒丸はＡβ４２を、黒四角はＡβ−ラクタム（２２Ｋ−２３Ｅ）を、白逆三角はＰ３−Ａβ４２を示す。
【図５】図５は、ＰＣ１２細胞に対するＡβ４２及びＥ２２Ｐ−Ａβ４２の神経細胞毒性、並びに、ＩＢＬ−１０１の当該神経毒性の阻害効果を示すグラフである。図中、縦軸は細胞生存率（％）を示す。星印は、ｐ＜０．０５であることを示す。
【図６】図６は、ＡＤ患者（ケース１及びケース２）の海馬領域切片を、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体又は４Ｇ８モノクローナル抗体により染色した写真を示す。図中、アローヘッド印は、細胞内染色が認められた部位を示している。スケールバーは５０μｍを表す。
【図７】図７は、ＡＤ患者（ケース１及びケース２）及び非ＡＤ患者（ケース３及びケース４）の前頭葉領域切片を、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体により染色した写真を示す。
【図８】図８は、免疫原による前処理後にＡＤ患者脳切片を染色（阻害アッセイ）した写真を示す。図中、アローヘッド印は、細胞内染色が認められた部位を示している。スケールバーは５０μｍを表す。「＋Ｖｅｈｉｃｌｅ」は免疫原を含まない溶液で前処理した抗体（コントロール）を示し、「＋Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ」は免疫原で前処理した抗体を示す。
【図９】図９は、二種類のトランスジェニックマウス（Ｔｇ２５７６及びＪ２０）の脳をＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体により染色した写真を示す。右の写真は、左の写真において四角で囲った部分の拡大写真である。左の写真において、スケールバーは５００μｍを表し、右の写真において、スケールバーは５０μｍを表す。
【図１０】図１０Ａ，Ｂ及びＤは、ＡＤ患者の脳の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）（ＴＢＳ）可溶性フラクション（Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒ．）について、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｔｕｒｎ）、４Ｇ８モノクローナル抗体（４Ｇ８）、８２Ｅ１モノクローナル抗体（８２Ｅ１）、及び抗ＡＰＰ−Ｃ末抗体（Ａｎｔｉ−ＡＰＰ（Ｃ））を用いてウエスタンブロットを行った結果を表わす写真である。図１０Ｃは、リコンビナントヒトＡＰＰについて、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｔｕｒｎ）、及び抗ＡＰＰ−Ｎ末抗体（ＡＰＰ（Ｎ））を用いてウエスタンブロットを行った結果を表わす写真である。図１０ＣにおいてＣＢＢは、メンブレンをクーマシーブルー染色した結果を表わす。図１０Ｅは、ＡＤ患者の脳のＴＢＳ不溶性フラクション（Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒ．）について、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｔｕｒｎ）、及び４Ｇ８モノクローナル抗体（４Ｇ８）を用いてウエスタンブロットを行った結果を表わす写真である。図１０Ｅにおいて、「Ｈｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ」は、Ａβの高分子量の凝集物を示し、「Ｍｏｎｏｍｅｒ」は、Ａβの単量体を示す。図１０中の全ての図において、各写真の右の数値は分子質量（ｋＤａ）を表わす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
１．２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体の作製
本発明の抗体は、例えば、２２−２３ターンＡβを、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、または、フロインドの不完全アジュバント等）とともに、非ヒト哺乳動物または鳥類に免疫することにより作製することができる。【００３３】
免疫原としては、好ましくは、Ｅ２２Ｐ−Ａβ４２、Ａβ−ラクタム（２２Ｋ−２３Ｅ）及びＰ３−Ａβ４２であり、より好ましくはＥ２２Ｐ−Ａβ４２である。免疫原は、当該物質をコードする遺伝子ＤＮＡ、好ましくはｃＤＮＡを細菌、酵母、動物細胞等の細胞株に導入、発現させた組換えタンパク質、又は、合成タンパク質として得ることができる。【００３４】
例えば、本発明の抗体の作製に使用する免疫原は、免疫原をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより得ることができる。また、免疫原は、Ｆｍｏｃ法またはＢｏｃ法等を用いて化学合成により作製することができる。例えば、免疫原のＣ末端のアミノ酸をポリスチレン担体に固定化し、９-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）またはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護されたアミノ酸を、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の縮合剤を用いて反応させることにより結合させ、洗浄、脱保護の工程を繰り返すことにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。また、免疫原は、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。このようなペプチド合成機としては、例えば、ＰＳＳＭ−８（島津製作所）；モデル４３３Ａペプチドシンセサイザ（アプライドバイオシステムズ社）；ＡＣＴ３９６Ａｐｅｘ（アドバンストケムテック社）等が挙げられる。【００３５】
また、Ａβと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として使用する場合、例えば、合成オリゴヌクレオチド部位突然変異導入法（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法）、亜硝酸あるいは亜硫酸処理によってランダムに点突然変異を導入する方法、Ｂａ１３１酵素等により欠失変異体を作製する方法、カセット変異法、リンカースキャニング法、ミスインコーポレーション法、ミスマッチプライマー法、ＤＮＡセグメント合成法などを用いることができる。【００３６】
免疫原は、免疫される動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に単独であるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際しては、抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。免疫動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ラビット、イヌ、サル、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル等ハイブリドーマを作製することが可能な動物であれば特に限定はないが、好ましくは、マウスまたはラットであり、より好ましくは、マウスである。【００３７】
動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射または足蹠注射により行うことができるが、好ましくは、皮下注射または腹腔内注射である。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回または適当な間隔をあけて数回行うことができる。通常１〜６週毎に１回の免疫を合計２〜１０回程度行い、好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を合計２〜５回行い、より好ましくは、３週間に１回の免疫を合計３回行う。最後の免疫から１〜２週間後に、免疫した動物の眼窩または尾静脈から採血を行い、その血清を用いて抗体価の測定を行う。抗体価の測定は、当業者周知の方法で行うことができる。例えば、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法を挙げることができ、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法である。本発明の抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。【００３８】
モノクローナル抗体は、上記方法により免疫した免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３−４６）を挙げることができる。【００３９】
使用する抗体産生細胞は、上記方法により免疫し血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットの脾臓、膵臓、リンパ節、末梢血より採取することができ、好ましくは、脾臓より採取する。【００４０】
使用する骨髄腫系細胞は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラビット又はヒト等の哺乳動物に由来する細胞であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な細胞であれば特に限定はない。このような細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６,２９２,１９７６）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１，１９７８）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８，１９７９）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９，１９７８）、Ｓｐ２／Ｏ／ＦＯ−２（ＦＯ−２）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５，１，１９８０）等を挙げることができ、好ましくは、抗体産生細胞と同種動物由来の細胞であり、より好ましくは、抗体産生細胞と同系統の動物由来の細胞である。例えば、マウス由来の骨髄腫系細胞として、好ましくは、Ｐ３Ｕ１又はＰ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３である。ミエローマ細胞は凍結保存するか、ウマ、ウサギまたはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持することができる。また、細胞融合に用いられる骨髄腫系細胞としては、対数増殖期の細胞が好ましい。【００４１】
抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させる方法としては、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）等を用いる方法（ＰＥＧ法）、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などがあげられる。
例えば、ＰＥＧ法の場合、上述の方法に従って得られた抗体産生細胞及び骨髄腫細胞を、培地、ＰＢＳ等で洗浄後、３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１０００〜６０００）等の細胞凝集性媒体を含む適当な培地または緩衝液中で、脾細胞と骨髄腫細胞を１：２〜１０：１（好ましくは、５：１〜１０：１）の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させる。反応終了後、ＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、セルウェルプレート中に播種して培養を続ける。【００４２】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）を添加した動物細胞用培地で選択的に増殖させることにより、ハイブリドーマ細胞の選別を行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマ細胞が生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常、５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％ＣＯ2下で行なうことができる。
培養後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ等により、抗原タンパク質に特異的に結合し、非抗原タンパク質への結合が弱いクローンを選択する。このようなクローンから限界希釈法を１から５回、好適には２から４回繰り返すことにより単一細胞化を行い、安定して高い抗体価を示す細胞を選択することができる。本発明の２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体は、２２位及び２３位にβ−ターン構造をとる傾向にあるＡβ変異体（Ｅ２２Ｑ−Ａβ４２、Ｅ２２Ｇ−Ａβ４２、Ｅ２２Ｋ−Ａβ４２、Ｅ２２Ｐ−Ａβ４２、及びＤ２３Ｎ−Ａβ４２）（Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：４６１７９−４６１８７）（図１）への結合能を指標とし、全ての変異体への結合能の高いクローンを選択するスクリーニングを繰り返すことにより得ることができる。例えば、２２−２３ターンＡβを認識する抗体は、２２−２３ターンＡβと、前期方法により得られた抗体等との結合活性を測定し、結合活性の高い抗体等を選択することにより得ることができる。本発明の２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体と２２−２３ターンＡβとの結合における結合定数（Ｋａ）としては、例えば、少なくとも１０７Ｍ−１であり、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１であり、より好ましくは、少なくとも１０９Ｍ−１である。このような結合定数として、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１又はそれより高い、例えば、１０１３Ｍ−１又はそれより高いものである。２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体は、前記方法により得られた２２−２３ターンＡβを認識する抗体等の中から、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有しないＡβを認識しない抗体等を当業者周知の方法により選択することにより得ることができる。【００４３】
または、本発明の抗体を産生するハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター 中央第６）に寄託されたハイブリドーマＡｍｙｌｏｉｄβ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＩＢＬ−１０１（寄託微生物の受託日２００９年１０月１４日、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２９０）から入手することができる。【００４４】
本発明のモノクローナル抗体は、上述の方法により得られたハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、培養液を精製することによって得ることができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、予めプリスタンを腹腔内に投与した同系動物または免疫不全動物にハイブリドーマを移植した後、腹水化させ、採取した腹水を精製することによっても得ることができる。【００４５】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用することができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィ等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。アフィニティークロマトグラフィに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。例えば、プロテインＡカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を挙げることができる。また、ＩｇＹ及びＩｇＭの場合には、メルカプトピリジンをリガンドとしたカラムを用いることができる。更に、抗体のクラスによらず、Ｅ２２Ｐ−Ａβ４２固相化カラム、イオン交換クロマトグラフィ、疎水相互作用クロマトグラフィ等を用いることもできる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、遠心分離後、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラム等を用いてＩｇＧ画分を回収することにより行うことができる。【００４６】
２．ヒト型キメラ抗体・ヒト化抗体、ヒト抗体の作製
（１）ヒト型キメラ抗体
本発明のヒト型キメラ抗体は、２２−２３ターンＡβと結合し、２２−２３ターンＡβの機能を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを調製し、これをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５，１９８４）。【００４７】
非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡは、例えば、次の方法により得ることができる。当該モノクローナル抗体を産生する動物Ｂ細胞からｍＲＮＡを抽出する。ｍＲＮＡの抽出は、当業者周知の方法で行うことができ、例えば、グアニジン−超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４−５２９９，１９７９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６−１５９，１９８７）等によりＲＮＡを調製した後、ｍＲＮＡピュリフィケーションキット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ファルマシア社製、タカラバイオ社製）等により精製することにより行うことができる。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを使用することによりｃＤＮＡを作製してベクターに組み込む。ベクターに組み込んだｃＤＮＡの中から、非ヒト動物由来モノクローナル抗体の一部をプローブとして使用して、非ヒト動物由来モノクローナル抗体をコードしているｃＤＮＡを単離する。単離されたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、目的のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。【００４８】
また、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを得る別の方法として、次の方法が挙げられる。上述の方法で得られたｃＤＮＡを、ＶＨまたはＶＬを増幅可能なプライマー（例えば、非ヒト動物として、マウスを利用する場合、マウスＨ鎖定常領域（Ｃ領域）とハイブリダイズするプライマー及びマウスＬ鎖γ鎖定常領域の保存配列とハイブリダイズするプライマー等（Ｒ．Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３８３３）を用いてＰＣＲ法で増幅することにより、または、モノクローナル抗体を産生する動物Ｂ細胞からｍＲＮＡを抽出し、当該ＶＨまたはＶＬを増幅可能なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法で当該ＶＨまたはＶＬを増幅させる。得られたＰＣＲ産物から目的のＤＮＡ断片を抽出する。目的のＤＮＡ断片の抽出は、例えば、アガロースゲル電気泳動後に目的のＤＮＡのサイズを示すバンドを切り出し、当該ゲル切片よりＤＮＡを抽出することにより行うことができる。当該ベクター及び抽出したＤＮＡを制限酵素で処理した後、抽出したＤＮＡをベクターに組み込み、組み込まれたＤＮＡがコードするＤＮＡ配列を決定することにより、目的のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。【００４９】
ヒト型キメラ抗体のヒト抗体ＣＨ及びＣＬとしては、任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒトγ１、γ２のＣＨ及びヒトκのＣＬを挙げることができる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子としては、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いることができる。上述の方法により得られた非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡは、例えば、それぞれヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡと結合し、動物細胞用発現ベクターに組み込むことにより、本発明のキメラ抗体を発現するベクターを作製することができる。【００５０】
ヒト型キメラ抗体の発現に使用するエンハンサー及びプロモーターとしては、免疫グロブリン遺伝子自身のエンハンサー及びプロモーターまたは非免疫グロブリン用エンハンサー及びプロモーターを挙げることができる。例えば、非ヒト動物としてマウスを使用する場合、免疫グロブリン遺伝子の発現調節機構はマウスとヒトで共通であることから、Ｊ遺伝子とＣ遺伝子間に存在するマウスまたはヒトのエンハンサー配列を含む形で組換えＤＮＡを作製することもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶ２−ｇｐｔ（Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｂｅｒｇ（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４２２）を使用することができる。上述の方法により作製した本発明のヒト型キメラ抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子は、同一のベクターに組み込まれていても良いし、異なるベクターに組み込まれていても良い。【００５１】
（２）ヒト化抗体
本発明のヒト化抗体は、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｌ．Ｒｉｅｏｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，４，７７３−７８３；Ｃｌａｒｋ  Ｍ．，（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．，２１，３９７−４０２参照）。【００５２】
非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＣＤＲは、上述の方法によって得られた非ヒト動物由来モノクローナル抗体（例えば、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体）のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列と、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列とを比較し、各ＣＤＲのアミノ酸配列を得ることができる。既知の抗体のアミノ酸配列は、例えば、プロテイン・データ・バンク等のデータベースに登録されている抗体のアミノ酸配列より得ることができる。【００５３】
また、ヒト抗体のＦＲとしては、移植後の抗体が本発明の効果を奏するものであれば特に限定は無いが、好ましくは、ヒト化抗体のＶ領域が非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、または、使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲである。選択したヒト抗体のＦＲを有するヒト化抗体のＶ領域が、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるか否かは、例えば、選択したヒト抗体のＦＲ含むＶ領域のＤＮＡ配列情報を基にコンピューターモデリングにより立体構造を予測し、使用した非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域の立体構造との比較を行うことにより判断することができる。使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列は、上述の方法により得られたＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列及びＣＤＲのアミノ酸配列の情報より得ることができる。また、ヒト化抗体のＶ領域が非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、または、使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲとするため、得られたヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に適宜変異をいれることもできる。【００５４】
使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列として設計する。ヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、設計したＤＮＡ配列を基に、当業者周知の方法によって作製することができる。例えば、設計したＤＮＡを基に１００ｂｐ前後の長さのＤＮＡ断片を合成ＤＮＡとして化学合成し、当該ＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅することによって得ることができる。また、当該１００ｂｐ前後のＤＮＡ断片をリガーゼ等の酵素を用いて結合させ、設計されたヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列の両末端の配列をコードするプライマーを用いてＰＣＲを行い、所望の長さのＤＮＡ断片を抽出することによっても得ることができる。更に、ＰＣＲ使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、ＣＤＲグラフティングとして知られる方法によっても得ることができる。また、使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、部位特異的変異によりＣＤＲをコードするＤＮＡをヒト抗体のＶ領域のＤＮＡに組み込むことによっても得ることができる。部位特異的変異は、例えば、ジーンテイラーサイトダイレクティッドミュータジェネシスシステム（インビトロジェン社）、トランスフォーマー部位特異的突然変異誘発キット（クローンテック社）、サイトダイレクティッドミュータジェネシスシステム（タカラバイオ社）等を用いて、当該キットの説明に従うことにより行うことができる。【００５５】
ヒト化抗体のヒト抗体ＣＨ及びＣＬとしては、任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒトγ１、γ２のＣＨ及びヒトκのＣＬを挙げることができる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子としては、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いることができる。上述の方法により得られたヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、例えば、それぞれヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡと結合し、動物細胞用発現ベクターに組み込むことにより、本発明のヒト化抗体を発現するベクターを作製することができる。【００５６】
ヒト化抗体の発現に使用するエンハンサー及びプロモーターとしては、免疫グロブリン遺伝子自身のエンハンサー及びプロモーターまたは非免疫グロブリン用エンハンサー及びプロモーターを挙げることができる。例えば、非ヒト動物としてマウスを使用する場合、免疫グロブリン遺伝子の発現調節機構はマウスとヒトで共通であることから、Ｊ遺伝子とＣ遺伝子間に存在するマウスまたはヒトのエンハンサー配列を含む形で組換えＤＮＡを作製することもできる。【００５７】
動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶ２−ｇｐｔ（Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｂｅｒｇ（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ,２０９，１４２２）を使用することができる。上述の方法により作製した本発明のヒト化抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子は、同一のベクターに組み込まれていても良いし、異なるベクターに組み込まれていても良い。【００５８】
なお、上述のヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体の作製において使用される、非ヒト動物由来モノクローナル抗体は、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体であれば特に限定はないが、好ましくは、マウスモノクローナル抗体である。【００５９】
（３）ヒト抗体
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリーまたはヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら（（１９９７））ＮＡＴＵＲＥ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，１４６−１５６）。【００６０】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞由来の様々な配列をもつ抗体遺伝子プールからＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子をファージ遺伝子に導入することにより、ヒト抗体のＦａｂまたはｓｃＦｖ等を融合タンパク質として表面に提示させたファージのライブラリーである。このようなヒト抗体ファージライブラリーとしては、正常なヒトの持つ抗体のＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を末梢血リンパ球などからＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ライブラリー化することにより得られたナイーブ・非免疫ライブラリー（ケンブリッジアンチボディテクノロジー社；メディカルリサーチカウンセル；ダイアックス社等）、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片のＣＤＲ３領域などの抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドによって置換し、ライブラリー化した合成ライブラリー（バイオインベント社；クルーセル社；モルホシス社）、及び、癌、自己免疫疾患または感染症患者、あるいは、対象抗原をワクチンとして接種した人のリンパ球から作製したライブラリーである、免疫ライブラリーを挙げることができる。【００６１】
例えば、ナイーブヒト抗体ファージライブラリーは、以下の方法により作製することができる。人の末梢血からｍＲＮＡを調製し、イムノグロブリンのγ、μ、κ、λ鎖の定常領域に特異的なプライマーを用いて、Ｖ遺伝子のｃＤＮＡを合成し、各Ｖ遺伝子をＶ遺伝子ファミリーに特異的なＤＮＡプライマーのセットを用いて合成し、それらを（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３等のリンカーペプチドをコードするリンカーＤＮＡを用いてＰＣＲによって連結し、ｓｃＦｖ遺伝子を合成する。合成したｓｃＦｖ遺伝子を、両側にベクター導入用の制限酵素サイトを使って、ｐＣＡＮＴＡｂ５Ｅ等のファージミドベクターに挿入し、当該ベクターを大腸菌に形質転換し、ヘルパーファージによるレスキューを行う。【００６２】
ヒト抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、標的となるＥ２２Ｐ−Ａβ４２を固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる（パンニング）。また、得られたファージを増幅させ、増幅させたライブラリーについて更にパニングを繰り返し行うことにより、得られたクローンの精度を上げることができる。得られたクローンのＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を解析することにより、これらの遺伝子配列を有する完全なヒト抗体を作製することもできる。【００６３】
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウトしたマウスにヒト抗体のＩｇ遺伝子を導入したマウスである。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、例えば、以下の方法により得ることができる。ヒト−マウスハイブリッド細胞を４８時間コルセミド（紡錘糸形成阻害剤）処理することにより、１から数本の染色体が核膜に包まれた構造体である、ミクロセルを形成する。サイトカラシンＢ存在下で単離されたミクロセルを染色体受容細胞（マウスＥＳ細胞）とポリエチレングリコールにより融合し、ミクロセルハイブリッドＥＳ細胞を作製し、マウス胚へ注入する。【００６４】
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを免疫動物として、上述の抗体作製方法に準じて免疫原を免疫することにより、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体を得ることができる。【００６５】
３．抗体断片の作製
本発明の抗体の断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ若しくはこれらの重合体、Ｄｉａｂｏｄｙ、または、ＣＤＲを含むペプチド）は、以下の方法により作製することができる。【００６６】
本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、２２−２３ターンＡβと特異的に結合するＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理し、Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断することにより、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、後述のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合させることにより得ることができる。【００６７】
本発明のＦａｂ’断片は、上述の方法により得られた２２−２３ターンＡβと特異的に結合するＦ（ａｂ’）２を還元剤であるジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のＦａｂ’断片は、本発明の２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００６８】
本発明のＦａｂ断片は、本発明の２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理し、Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断することにより、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分の領域とＬ鎖の全領域がジスルフィド結合により結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦａｂ断片は、本発明の２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００６９】
本発明のｓｃＦｖは、本発明の２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、これらの遺伝子の間にリンカー配列をコードするＤＮＡを挿入し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。リンカーの長さは、ＶＨとＶＬが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは１０〜２０残基であり、より好ましくは１５残基である。また、リンカーの配列は、ＶＨとＶＬの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び／またはセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）またはその繰り返し配列である。【００７０】
本発明のｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基を部位特異的突然変異によりシステイン残基に置換し、ＶＨ及びＶＬを当該システイン残基間のジスルフィド結合で結合させることにより得ることができる。置換するアミノ酸は、立体構造に基づき抗原結合に影響の無いアミノ酸残基であれば特に限定はない。【００７１】
本発明のＤｉａｂｏｄｙは、上述のｓｃＦｖをコードするＤＮＡにおいて、リンカーのアミノ酸配列が８残基以下（好ましくは５残基）となるように構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。バイスペシフィックなＤｉａｂｏｄｙは、異なる２種類のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＤＮＡを組み合わせてｓｃＦｖを作製することにより得ることができる。【００７２】
本発明の、ＣＤＲを含むペプチドは、本発明の２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００７３】
４．医薬組成物
上記の方法により得られた抗体等は、必要により精製した後、常法に従って製剤化し、各種疾患等の予防および／または治療剤として用いることができる。例えば、注射剤は、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体等を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、その他の補助薬を含む等張液等が用いることができ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕等と併用することができる。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などを用いることができ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用することができる。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、バイアル、シリンジに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体を通常の点鼻薬用基剤、坐薬用基剤に混合することによって調製される。また、上記抗体を適当な賦形剤を添加することにより、凍結乾燥製剤を調製し、用時、注射用水、生理食塩水などで溶解して注射液とすることもできる。なお、一般的に抗体などのタンパク質の経口投与は消化器により分解されるため、困難とされるが、抗体断片や修飾した抗体断片と剤形の創意工夫により、経口投与の可能性もある。経口投与の製剤としては、例えば、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤等を挙げることができる。【００７４】
上記の非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好適である。このような投薬単位の剤形としては、注射剤（アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ）、点鼻剤、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、好ましくは、注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体等が含有されている。【００７５】
本発明の医薬組成物の投与方法は、所望の治療効果又は予防効果が得られる方法であれば特に限定はなく、例えば、投与部位としては、経口投与、口腔内投与、気道内投与、皮下投与、筋肉内投与、血管内（静脈内）投与等を挙げることができ、好ましくは、血管内（例えば、静脈内、冠動脈内）に投与することができる。本発明の薬剤の投与方法としては、注射又は静脈点滴注射による静脈内投与を挙げることができる。また、本発明の医薬組成物は、一時的に投与してもよいし、持続的又は断続的に投与してもよい。例えば、本発明の薬剤の投与は、１分間〜２週間の持続投与することもできる。本発明の医薬組成物の投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。本発明の治療薬又は予防薬の投与量は、例えば、ＡＤの治療効果又は予防効果を指標として決定することができる。例えば、ＡＤ患者の予防および／または治療のために使用する場合には、本発明の医薬組成物を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１月１〜１０回程度、好ましくは１月１〜５回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量または投与回数を増加させてもよい。【００７６】
５．測定キット・診断薬
本発明の抗体等は、２２−２３ターンＡβと特異的に結合することができるので、被検液中の２２−２３ターンＡβの測定に使用することができる。２２−２３ターンＡβは、ＡＤの発症及び増悪と関連することから、本発明の２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質は、ＡＤ病の診断薬として使用することができる。
生体外で測定又は診断する場合、測定方法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティークロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等を挙げることができる。
また、生体内に２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質を投与する場合、画像診断により診断することができる。【００７７】
ＥＩＡ法により測定する場合、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質と被験者のサンプル中の２２−２３ターンＡβとを反応させた後、標識した２２−２３ターンＡβと結合する物質を認識する抗体を結合させ、非結合抗体を除去後、標識物質に適した方法で測定することにより、複合体の形成を測定することができる。例えば、ＥＩＡ法として、ビオチン標識抗体を用いて２２−２３ターンＡβを検出する場合、被験者の体液を希釈することにより調製したサンプル又はＥ２２Ｐ−Ａβ４２、及び、ビオチン標識抗体溶液を、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する抗体を固相化した９６穴プレートの各ウェルに加えて室温で反応後、各ウェルを洗浄液で洗浄し、基質液（ＴＭＢ）を加えて室温で反応させた後、反応停止液（２Ｍ  ＨＣｌ）を加え、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定することにより測定することができる。サンプル中の２２−２３ターンＡβの濃度は、標準液で作成した検量線を利用して計算することができる。  イムノクロマト法により測定する場合、サンプルを標識抗体と結合させた後、ニトロセルロース膜の毛細管現象を利用したクロマトグラフィを行い、固相化された抗原特異的抗体と結合させることにより検出することができる。なお、イムノクロマト法において、標識として金コロイドを利用することにより、固相化抗体とサンプル／標識抗体複合体との結合を目視により確認することもできる。また、例えば、化学発光測定法としてＣＬＩＡ法を用いる場合、ルミノール誘導体又はアクリジニウム誘導体により標識された２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体と被験者のサンプル中の２２−２３ターンＡβとを反応させた後、非結合の抗体を分離した後、固相に吸着した化学発光性の標識体を発光させることにより検出することができる。【００７８】
画像診断により測定する場合、本発明の診断方法は、例えば、２２−２３ターンＡβと特異的に結合する物質を投与することと、前記物質を、画像診断装置（例えば、シンチグラフィー、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴモダリティー）を用いて前記物質の一部以上の画像を生成させることにより、生体内における２２−２３ターンＡβの存在の有無、局在、及び／又は存在量を測定することができる。本発明の診断薬の投与は、局所的であってもよく、全身的であってもよい。投与方法には特に制限はなく、経口的又は非経口的に投与される。非経口的投与経路としては、皮下、腹腔内、血中（静脈内、若しくは動脈内）又は脊髄液への注射又は点滴等が挙げられ、好ましくは血中への投与である。【００７９】
６．診断方法及び診断するための情報を収集する方法
２２−２３ターンＡβと結合する物質（特には、本発明の抗体）は、２２−２３ターンＡβに基づく疾患の診断方法、２２−２３ターンＡβに基づく疾患の診断ための情報を提供する方法、２２−２３ターンＡβに基づく疾患の状態又は進行をモニターする方法、及び、２２−２３ターンＡβに基づく疾患に対する治療薬の治療効果の判定方法（以下、総称して「２２−２３ターンＡβに基づく疾患の診断方法等」という）に使用することができる。２２−２３ターンＡβに基づく疾患は、好ましくは、アルツハイマー病である。【００８０】
本発明の２２−２３ターンＡβに基づく疾患の診断方法等は、検体中の２２−２３ターンＡβを検出するステップを備え、２２−２３ターンＡβの生成量を指標として診断を行うことができる【００８１】
より具体的には、本発明の２２−２３ターンＡβに基づく疾患の診断方法は、以下のステップ：
ａ）被験者由来の試料を調製するステップ、
ｂ）少なくとも１つの２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体に該試料を接触させるステップ、
ｃ）２２−２３ターンＡβへの該抗体又はその断片の結合を検出して２２−２３ターンＡβのレベルを測定するステップ、並びに、
ｄ）２２−２３ターンＡβのレベルと被験者における２２−２３ターンＡβに基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ、により行うことができる。
例えば、上記方法は、ＥＬＩＳＡ法、又は、イムノクロマト法により行うことができる。【００８２】
また、本発明の２２−２３ターンＡβに基づく疾患の診断方法は、以下のステップ：
ａ）被験者由来の試料を調製するステップ、
ｂ）２２−２３ターンＡβを分離するステップ、
ｃ）分離された２２−２３ターンＡβを検出するステップ、
ｄ）２２−２３ターンＡβのレベルと、被験者における２２−２３ターンＡβに基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ、により行うことができる。
例えば、上記方法は、クロマトグラフィとマススペクトルを組み合わせて使用することにより行うことができる。【００８３】
また、上述において、「２２−２３ターンＡβのレベルと、被験者における２２−２３ターンＡβに基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ」は、２２−２３ターンＡβの量が大きい被験者を２２−２３ターンＡβに基づく疾患に罹患している又は罹患の程度が高い患者として判定することを含むことができる。【００８４】
また、本発明の２２−２３ターンＡβに基づく疾患の診断方法等は、検体中の２２−２３ターンＡβを検出するステップを備え、２２−２３ターンＡβの生成量の比を指標として診断を行うことができる。このような比としては、例えば、全Ａβ量に対する、２２−２３ターンＡβの割合、又は、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有しないＡβに対する、２２−２３ターンＡβの割合を利用することができる。【００８５】
検体中における、２２−２３ターンＡβレベルの割合は、全Ａβに対する２２−２３ターンＡβの割合として、例えば、以下の方法により測定することができる：
検体中の全Ａβレベルを測定するステップ、
検体中の２２−２３ターンＡβレベルを測定するステップ、及び、
測定された全Ａβレベルに対する２２−２３ターンＡβレベルの割合を計算するステップを備える方法。【００８６】
よって、本発明の診断方法は、例えば、以下のステップを備えるアルツハイマー病の診断方法であってもよい：
検体中の全Ａβレベルを測定するステップ、
検体中の２２−２３ターンＡβレベルを測定するステップ、
測定された全Ａβレベルに対する２２−２３ターンＡβレベルの割合を計算するステップ、及び、
全Ａβレベルに対する２２−２３ターンＡβレベルの割合とアルツハイマー病の有無又は程度と関連付けを行うステップを含む方法。【００８７】
より具体的には、２２−２３ターンＡβに基づく疾患の診断方法は、以下のステップ：
ａ）被験者由来の試料を調製するステップ、
ｂ）２２−２３ターンＡβを特異的に認識する抗体に該試料を接触させるステップ、
ｃ）２２−２３ターンＡβのレベルを測定するステップ、
ｄ）２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有しないＡβを認識する抗体又はＡβを認識する抗体に該試料を接触させるステップ、
ｅ）２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有しないＡβ又はＡβのレベルを測定するステップ、
ｆ）  ２２−２３ターンＡβの量と２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有しないＡβ又はＡβの量との比を算出するステップ、並びに、
ｇ）算出された比と、被験者における２２−２３ターンＡβに基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ、により行うことができる。
上記において、Ａβを認識する抗体は好ましくは、ターン構造の有無に拘わらず全てのＡβと結合することができる抗体である。【００８８】
上述において、「算出された数値と被験者における２２−２３ターンＡβに基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ」は、２２−２３ターンＡβの量の２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有しないＡβを認識する抗体又はＡβの量に対する比が大きい被験者を２２−２３ターンＡβに基づく疾患に罹患している又は罹患の程度が高い患者として判定することにより行うことができる。【００８９】
本発明の２２−２３ターンＡβに基づく疾患の診断方法等は、既にアルツハイマー病の指標として用いられているその他の指標と組み合わせて行ってもよい。【００９０】
本発明の方法において使用する患者由来の検体としては、バイオマーカの発現を検出することができる検体であれば特に限定されず、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される検体は、本発明の測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液（例えば、脳脊髄液）、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは脳組織又は血液（血漿又は血清を含む）である。また、本発明の方法において使用する患者由来の試料は、測定試験に先立ち前処理されたものであってもよいし、患者から採取した検体をそのまま使用してもよい。また、本発明の診断方法による分析は、定性的、定量的又は半定量的に行うことができる。また、本発明の診断方法において、２２−２３ターンＡβに基づく疾患は、好ましくはアルツハイマー病である。上記において、２２−２３ターンＡβに基づく疾患の診断方法は、２２−２３ターンＡβに基づく疾患の診断ための情報を提供する方法、又は、２２−２３ターンＡβに基づく疾患の状態又は進行をモニターする方法であってもよい。【００９１】
本明細書において、２２−２３ターンＡβに基づく疾患を診断するために、測定された２２−２３ターンＡβと２２−２３ターンＡβに基づく疾患の有無又は程度との関係において用いられる「関連付けをする」という用語は、被験者における２２−２３ターンＡβの存在、レベル、又は、存在比を、２２−２３ターンＡβに基づく疾患患者又は２２−２３ターンＡβに基づく疾患であろうことが知られている患者、あるいは、２２−２３ターンＡβに基づく疾患ではなかった患者又は２２−２３ターンＡβに基づく疾患ではないと信じられている患者における２２−２３ターンＡβの存在、レベル、又は、存在比と比較することを意味する。比較対象となる患者における２２−２３ターンＡβのレベル又は比は、例えば、本発明の開示により、又は、既に２２−２３ターンＡβに基づく疾患又はその程度が判明している患者由来の検体における２２−２３ターンＡβのレベルを測定することにより、あるいは、他の２２−２３ターンＡβに基づく疾患の指標による評価と組み合わせて評価することにより知ることができる。２２−２３ターンＡβのレベル又は比を利用して、患者が２２−２３ターンＡβに基づく疾患に罹患している可能性又は罹患の程度を判定することができる。２２−２３ターンＡβのレベル又は比と２２−２３ターンＡβに基づく疾患との関連付けは、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｄ，１９８３）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。【００９２】
好ましくは、２２−２３ターンＡβは、その存在量又は存在比により２２−２３ターンＡβに基づく疾患又はその程度と関連付けることができる。例えば、２２−２３ターンＡβのレベルについて２２−２３ターンＡβに基づく疾患への罹患の指標としての閾値レベル又は当該疾患への罹患の程度の指標として各程度に対する閾値レベルを設定し、患者由来の試料における２２−２３ターンＡβのレベルを、閾値レベルと比較することにより関連付けてもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、２２−２３ターンＡβと、他のＡβ（例えば、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有しないＡβ、又は全Ａβ）との比率について、２２−２３ターンＡβに基づく疾患への罹患の指標としての閾値レベル又は当該疾患への罹患の程度の指標として各程度に対する閾値レベルを設定し、患者由来の試料における他のＡβに対する２２−２３ターンＡβの比を、閾値レベルと比較することにより関連付けてもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。【００９３】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本出願が優先権を主張する日本国特許出願２００９−２３９５４２は引用によりその全文がそのまま本出願に組み込まれる。【００９４】
（実施例１）Ａβ４２の２２位及び２３位にターン構造を有する毒性コンホマーに対する抗体の作製及びエンザイムイムノアッセイ
実施例１の実験において、マウスの維持及び実験は、免疫生物研究所の動物保護委員会の承認を受けたプロトコルに従って行った。Ｇ９Ｃ，Ｅ２２Ｐ−Ａβ９−３５及びＥ２２Ｐ−Ａβ９−３５の分子量はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて確認した（Ｋ．Ｉｒｉｅら（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０：９１５９−９１６７）。【００９５】
（１）Ａβ４２の毒性コンホマーに結合する抗体の取得
報告されている方法（Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２９４：５−１０；Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００７）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，８：２３０８−２３１４）に従って、Ｇ９Ｃ、Ｅ２２Ｐ−Ａβ９−３５ペプチド（ＣＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＰＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭ：配列番号１）を合成し、免疫原として使用した。Ｎ末には、９番目のグリシンの代わりにシステインを付加し、キャリアタンパク質であるウシサイログロブリンと結合させた（Ｙ．Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１９：７３３−７３７）。ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールスリバー株式会社、日本）を、５０ｍｇ／マウスのＧ９Ｃ、Ｅ２２Ｐ  Ａβ９−３５ペプチド融合体で週に１回、１月間免疫した。得られたクローンは、５０ｍｇ／ｍＬの様々な抗体変異体でコートされた９６穴のＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ社、デンマーク）中、室温で１時間培養後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）で処理し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｐｉｅｒｃｅ社、ロックフィールド、イリノイ州、米国）又はｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩基質（シグマ社）で定量した。得られた４５クローンを、２２位及び２３位にβ−ターン構造をとる傾向にあるＡβ変異体（Ｅ２２Ｑ−Ａβ４２、Ｅ２２Ｇ−Ａβ４２、Ｅ２２Ｋ−Ａβ４２、Ｅ２２Ｐ−Ａβ４２、及びＤ２３Ｎ−Ａβ４２）（Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：４６１７９−４６１８７）（図１）への結合能の高いクローンをスクリーニングし、選択された７つのクローンをサブクローニングした。スクリーニングを繰り返して、陽性度が低いか又は擬陽性のクローンを除いた。得られた７つのクローンについて、ウエスタンブロットによりさらにスクリーニングを行うことにより、クローンＩＢＬ−１０１を得た（非図示）。このハイブリドーマは、「Ａｍｙｌｏｉｄβ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＩＢＬ−１０１」として、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター 中央第６）に寄託した。寄託微生物の受託日は２００９年１０月１４日であり、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２９０である。【００９６】
（２）クローンＩＢＬ−１０１のＥ２２Ｐ−Ａβ４２、Ａβ４２、Ａβ４０、及びＥ２２Ｖ−Ａβ４２への結合能の測定
得られたモノクローナル抗体ＩＢＬ−１０１の、Ｅ２２Ｐ−Ａβ４２、Ａβ４２、Ａβ４０、及びＥ２２Ｖ−Ａβ４２への結合能をエンザイムイムノアッセイにより測定した。Ｅ２２Ｖ−Ａβ４２は、２２位にバリンを導入することによりターン構造をとりにくいことが報告されている（Ｐ．Ｙ．Ｃｈｏｕら（１９７７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１５：１３５−１７５）。コントロール抗体として、Ａβ配列の１８−２２残基（ターン構造部分ではない）にエピトープを有するモノクローナル抗体４Ｇ８（Ｈ．Ｍ．Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら（１９８９）Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，７８：２２−２７）を使用した。０．１２５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、又は１．０ｍｇ／ｍＬの各抗体（ＩＢＬ−１０１又は４Ｇ８）でコートした９６穴プレートに、Ｅ２２Ｐ−Ａβ４２、Ａβ４２、Ａβ４０、Ｅ２２Ｖ−Ａβ４２、又はコントロールとして０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加した。【００９７】
（３）クローンＩＢＬ−１０１の２２Ｋ−２３Ｅ、及びＰ３−Ａβ４２への結合能の測定
実施例１（２）と同様にして、２２位及び２３位の側鎖が共有結合することにより、２２位及び２３位にターンを有するＡβ４２の配座固定アナログＡβ−ラクタム（２２Ｋ−２３Ｅ）（Ｙ．Ｍａｓｕｄａら（２００９）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．，１０：２８７−２９５）、及び３か所のターン構造を取りうる部位をプロリン残基と置換したトリプルＡβ変異体（Ｐ３−Ａβ４２）（Ａ．Ｍｏｒｉｍｏｔｏら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：５２７８１−５２７８８）（図２）に対する、モノクローナル抗体ＩＢＬ−１０１の結合能を測定した。【００９８】
（４）結果
Ｅ２２Ｐ−Ａβ４２、Ａβ４２、Ａβ４０、及びＥ２２Ｖ−Ａβ４２への結合能を測定した結果を図３に示す。ＩＢＬ−１０１はＥ２２Ｐ−Ａβ４２、Ａβ４２及びＡβ４０に対して強い免疫反応性を示したが、Ｅ２２Ｖ−Ａβ４２に対しては低いアフィニティを示した。一方で、コントロール抗体４Ｇ８は、Ｅ２２Ｐ−Ａβ４２への反応が弱く、Ｅ２２Ｖ−Ａβ４２へはＡβ４２及びＡβ４０と同等に結合した。Ｅ２２Ｖ−Ａβ４２は、２２位及び２３位にターン構造を取りにくい（Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：４６１７９−４６１８７）ことから、これらの結果は、ＩＢＬ−１０１がターン構造を有するＡβ４２を特異的に認識していること、及び、４Ｇ８が２２位及び２３位にターン構造を有するＡβ４２を認識できないことを示唆している。また、ＩＢＬ−１０１は、Ｅ２２Ｐ−Ａβ４２のみならず、Ａβ４２とも結合していることから、認識部位であるターン構造を構成する２２位をプロリンに置換した変異体を免疫原として使用しているにもかかわらず、２２位のプロリン残基には特異的でないことが示された。
このように、ＩＢＬ−１０１がターン構造特異的であることから、ＩＢＬ−１０１のＡβ４２及びＡβ４０への結合は、Ａβ４２及びＡβ４０の中に２２位及び２３位にターン構造を有するものが存在することを示している。
また、２２Ｋ−２３Ｅ、及びＰ３−Ａβ４２への結合能を測定した結果を図４に示す。ＩＢＬ−１０１は、これらの変異体に対してもＡβ４２と同様に容量依存的な結合を示した。よって、これらの結果によっても、ＩＢＬ−１０１がＡβ４２のターン構造を特異的に認識していることが示された。【００９９】
（実施例２）モノクローナル抗体ＩＢＬ−１０１のＡβ４２誘導神経細胞毒性への効果
モノクローナル抗体ＩＢＬ−１０１がＡβ４２の細胞毒性を抑制できるか否かを決定するため、ＰＣ１２細胞でのＡβ４２誘導神経細胞毒性をＭＴＴアッセイにより評価した（Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：４６１７９−４６１８７）。１μＭのＡβ４２又はＥ２２Ｐ−Ａβ４２を単独で、又は、０．３６μＭのモノクローナル抗体ＩＢＬ−１０１と共に細胞に添加し、３７℃で４８時間培養した。使用したＡβの濃度は、野生型Ａβ４２のＩＣ５０値に近い１０−６Ｍとした。【０１００】
結果を図５に示す。１μＭのＡβ４２で処理したＰＣ１２細胞は、コントロール細胞と比較して低い生存能を示した。モノクローナル抗体ＩＢＬ−１０１を０．３６μＭ添加することにより、Ａβ４２の細胞毒性が阻害された。また、野生型Ａβ４２よりもＡβ４２の毒性コンホマーを形成する傾向が強いＥ２２Ｐ−Ａβ４２による神経毒性も同様にＩＢＬ−１０１により阻害された。よって、モノクローナル抗体ＩＢＬ−１０１がＡβ４２及びＡβ４２の毒性コンホマーによる細胞毒性を阻害することが示された。【０１０１】
（実施例３）ヒトＡＤ患者脳及びＡＰＰトランスジェニックマウスの脳の免疫組織化学染色
（１）ヒト脳の調製
患者の家族から紙面により得たインフォームドコンセントの下、７人のＡＤ患者、６人の非疾患コントロール個体、及び２人の他の疾患の患者（ケース１４：循環器疾患；ケース１５：ポリオ後症候群）の脳の海馬領域切片及び前頭葉領域切片を実験に使用した。該コンセント及び剖検は、東京都老人総合研究所及び東京都老人医療センター病院の倫理委員会により承認されている。各個体の神経病理学的診断結果は以下の表１に示す。本実験におけるＡＤの確定診断は、海馬体及び新皮質における神経原線維変化及び老人斑の存在に基づいて行った。【０１０２】
（２）トランスジェニックマウス脳の調製
２種類のＡＰＰトランスジェニックマウス、Ｔｇ２５７６（Ｋ．Ｈｓｉａｏら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：９９−１０２）及びＪ２０（Ｌ．Ｍｕｃｋｅら（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０：４０５０−４０５８）から得た脳を解剖し、４％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社、大阪、日本）中で３〜５日間固定化し、パラフィンに包埋し、常法に従ってミクロトーム上で５μｍ厚に切断した。本実験で使用したマウスは、東京都老人総合研究所の動物委員会に承認されたプロトコルに従って、維持及び実験を行った。
切片からパラフィンを除去し、水和させ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、ギ酸で短時間処理した。内因性の過酸化を防ぐため、３％過酸化水素含有メタノール中で静置後、１０％正常ヤギ血清含有ＰＢＳで切片をブロックし、第一抗体ＩＢＬ−１０１（１：５４０）又は４Ｇ８（１：１０００）（Ｓｉｇｎｅｔ社、デダム、マサチューセッツ州、米国）と共に４℃で一晩静置した。その後、ビオチン化第二抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）と共に室温で３０分間静置した。免疫反応性は、製造者のプロトコルに従い、ＡＢＣ  ｅｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて可視化した。３，３’−ジアミノベンジジン（シグマ社）を色原体として使用した。切片はヘマトキシリンで対比染色した。【０１０３】
（３）阻害アッセイ
ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体を、モル数で２００倍以上の免疫原（Ｇ９Ｃ、Ｅ２２Ｐ−Ａβ９−３５ペプチド）に接触させることで前処理を行い、ＡＤ患者（ケース５）の脳の染色に使用した。【０１０４】
（４）結果
ＡＤ患者（ケース１及びケース２）の海馬領域切片を、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体又は４Ｇ８モノクローナル抗体により染色した結果を図６に示し、ＡＤ患者（ケース１及びケース２）及び非ＡＤ患者（ケース３及びケース４）の前頭葉領域切片を、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体により染色した結果を図７に示す。図６に示された通り、両方の抗体が典型的なアミロイドプラークと反応している一方、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体を用いた場合にのみ、いくつかの細胞内染色が認められた（アローヘッド印）。図７に示す通り、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体によるこの染色は、非ＡＤ患者の脳ではあまり認められなかった。【０１０５】
実験を行ったすべてのケースにおける、ＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体による染色の結果を以下の表１に示す。「ＩＢＬ−１０１」のカラムの「ＳＰ」は老人斑の染色を、「ＩＡ」は細胞内アミロイドの染色を示す。ＩＢＬ−１０１の細胞内アミロイドへの反応性を調べた結果、７人中６人のＡＤ患者において中等度またはそれ以上の染色が認められ、コントロール個体においては、穏やか又は少ない染色が確認された。このことは、細胞内のアミロイド（特には、Ａβ４２の２２位及び２３位にターン構造を有するＡβ）がＡＤの発症に関与していることを示している。細胞内Ａβの蓄積は、細胞外Ａβの凝集よりも先んじて生じる（Ｙ．Ｏｈｙａｇｉら（２００８）Ｃｕｒｒ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓ．，５：５５５−５６１）ことから、本実験の結果より、細胞内Ａβの蓄積が、ＡＤの診断や評価に利用できることが示された。【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
また、阻害アッセイの結果を図８に示す。免疫原による前処理により、ＡＤ患者脳切片は染色されなくなった。コントロール実験では、４Ｇ８は、ＩＢＬ−１０１の免疫原には全く反応していなかった。これらの結果から、ＩＢＬ−１０１が細胞内及び老人斑のＡβ、特には２２位及び２３位にターン構造を有するＡβを特異的に認識していることが示された。【０１０８】
二種類のトランスジェニックマウスの脳をＩＢＬ−１０１モノクローナル抗体により染色した結果を図９に示す。トランスジェニックマウスの脳においては、ＩＢＬ−１０１による細胞内染色は確認できなかった。【０１０９】
（実施例４）ウェスタンブロッティング
ＩＢＬ−１０１抗体が、ヒトの脳におけるＡβのオリゴマーを認識するかを確認するため、ウェスタンブロッティングを行った。
（１）組織の調製
前頭葉組織は、０．７μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ（ペプチド研究所、大阪、日本）及び１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（シグマ社）を添加した、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤混合液（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、ロッシュ  ダイアグノスティックス、インディアナポリス、インディアナ州、米国）、及びホスファターゼ阻害剤混合液（Ｐｈｏｓ  ＳＴＯＰ、ロッシュ  ダイアグノスティックス）含有、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）（ＴＢＳ）の１０倍量（ｗ／ｖ）中に加え、ホモジナイズした。ホモジネートを、Ｏｐｔｉｍａ  ＴＬ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ及びＴＬＡ１００．４ロータ（ベックマン社、パロアロト、カリフォルニア州、米国）を用いて４℃、１８６，０００ｇで３０分間遠心し、上清及びペレットを採取した。得られた上清を溶解性フラクション（ｓｏｌｕｂｕｌｅ  ｆｒ．）として用いた。ペレットは、プロテアーゼ阻害剤含有７０％ギ酸中で超音波処理して溶解させた（Ｓａｉｄｏ，  Ｔ．  Ｃ．ら、（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ  １４，４５７−４６６）。可溶化したペレットを４℃、１８６，０００ｇで３０分間遠心し、得られた上清を１：２０（ｖ／ｖ）となる量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ１１）で中和して非溶解性フラクション（Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒ．）として用いた。また、ＩＢＬ−１０１抗体のＡＰＰに対する交差反応性を評価するため、プロテアーゼ  ネキシンＩＩを含むリコンビナントヒトＡＰＰ（Ｒ＆Ｄ、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）を用いた。【０１１０】
（２）ウエスタンブロット
２μｇ／μＬの溶解性フラクション、非溶解性フラクション、及びリコンビナントＡＰＰを、１０−２０％トリシンゲル（インビトロゲン、ゲイサーズバーグ、メリーランド州、米国）を用いたウエスタンブロットにかけ、ＰＶＤＦ膜（ポアサイズ０．２μｍ）（バイオラッド、ヘラクレス、カリフォルニア州、米国）に転写した。電子レンジを用いてＰＢＳ中で膜を１分間加熱し、ＴＢＳ−Ｔ（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、及び２．５％スキムミルク含有ＴＢＳ）でブロック後、第一抗体（ＩＢＬ−１０１：５μｇ／ｍＬ、４Ｇ８：１μフラム／ｍＬ、８２Ｅ１：１μｇ／ｍＬ、抗ＡＰＰ−Ｎ末抗体、及び抗ＡＰＰ−Ｃ末抗体：１μｇ／ｍＬ、抗アクチン抗体（シグマ）：１μｇ／ｍＬ、抗ラミン抗体（イムクエスト）：１μｇ）と４℃で一晩反応させた。抗原性の確認実験においては、第一抗体（ＩＢＬ−１０１）を予め２００倍モル過剰の抗原（Ｇ９Ｃ、Ｅ２２Ｐ−Ａβ９−３５ペプチド）で処理した。その後、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、第二抗体と室温で１時間反応させた。現像は、増強化学発光（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）ＥＣＬ試薬（ＧＥヘルスケア社、バッキンガムシャ、英国）を用いて行い、定量はＬＡＳ−３０００（富士フィルム株式会社、東京、日本）を用いて行った。また、タンパク質の存在を確認するため、クーマシーブリリアントブルーを用いた。【０１１１】
（３）結果
結果を図１０に示す。図１０Ａは、ＡＤ患者の脳から得られた溶解性フラクションについて、ＩＢＬ−１０１抗体、４Ｇ８抗体、及び８２Ｅ１抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。図１０Ｂは、ＡＤ患者の脳から得られた溶解性フラクションについて、抗ＡＰＰ−Ｃ末抗体、抗アクチン抗体、及び抗ラミン抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。抗アクチン抗体及び抗ラミン抗体は内部コントロールとして用いた。図中、（ａ）はラミン（７０ｋＤａ）を、（ｂ）はβ−アクチン（４２ｋＤａ）を示し、（ｃ）はＡＰＰのＣ末フラグメントを示す。
ＡＰＰには結合せずＡβにのみ結合する８２Ｅ１抗体（国際公開公報ＷＯ２００５／０８０４３５、図４、及びＨｏｒｉｋｏｓｈｉ，Ｙ．ら、（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１９，７３３−７３７参照）と、４Ｇ８抗体とは同じパターンの結果が得られたことから、染色されたタンパク質はＡβであると考えられる。また、実施例１の結果等から、Ａｎｔｉ−ｔｕｒｎ（ＩＢＬ−１０１）で染色されたタンパク質は、Ａβ４２の２２位及び２３位にターン構造を有するＡβであり、４Ｇ８で染色されたタンパク質は、ターン構造をとらないＡβであると考えられる。このことは、ＡＤ患者において特にターン構造を有するＡβが多く存在することを支持している。  ＩＢＬ−１０１抗体を用いた結果（図１０Ａ  Ａｎｔｉ−ｔｕｒｎ）、１２〜１７ｋＤａ付近のバンドとして確認されるＡβのオリゴマー（Ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｉｇｈｔ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ）（特には３量体）を認識することが示された。このバンドはＡβのＮ末をエピトープとする４Ｇ８抗体及び８２Ｅ１抗体（Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，Ｙ．ら、（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１９，７３３−７３７）で検出した場合（図１０Ａ  ４Ｇ８及び８２Ｅ１）には認められなかった。４Ｇ８抗体及び８２Ｅ１抗体は主にＡβのモノマー（図１０Ａ中矢印で示す）と強く反応していた。この結果は、Ａβのオリゴマーが、ターン構造を取ることによって形成されやすいことと合致していた。
更に、高分子量領域において、ＩＢＬ−１０１抗体は、４Ｇ８抗体と８２Ｅ１抗体のいずれとも明らかに異なるバンドパターンを示した（図１０Ａ）。抗ＡＰＰ−Ｃ末抗体のバンドパターンもＩＢＬ−１０１抗体のそれとは異なっていた（図１０Ｂ）。抗ＡＰＰ−Ｃ末抗体は、ＡＰＰの３つのアイソフォーム（ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０）と反応するが、それぞれα切断及びβ切断された分泌されたＡＰＰα及びＡＰＰβとは反応しない（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，４８９−５１７）。
ＩＢＬ−１０１抗体が、リコンビナントＡＰＰと反応するか確認した結果を図１０Ｃに示す。この結果から、抗ＡＰＰ−Ｎ末抗体は確かにＡＰＰと反応しているが、ＩＢＬ−１０１抗体はリコンビナントＡＰＰとは反応しないことが確認された。同実験においては、タンパク質（ＡＰＰ）の存在は、クーマシーブリリアントブルー染色においても確認された。これらの結果から、ＩＢＬ−１０１抗体により検出される高分子量のバンドは、Ａβの凝集物に由来するものであり、ＡＰＰではないことが確認された。【０１１２】
ＩＢＬ−１０１抗体の抗原性の確認のため抗原を用いた吸着実験を行った（図１０Ｄ）。その結果、図１０Ｄに示されるように、抗原との前処理により低分子量オリゴマーのバンドはほとんど得られなかった。一方で、高分子量には弱いバンドが認められた。これらの結果は、ＩＢＬ−１０１抗体が低分子量のオリゴマーにより好ましい免疫反応性を有することを示唆している。
図１０Ｅは、ＡＤ患者の脳から得られた非溶解性フラクションについて、ＩＢＬ−１０１抗体、及び４Ｇ８抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。ＩＢＬ−１０１抗体は、モノマー（図１０Ｅ中、矢印で示す）の他、様々な分子量を示す高分子の凝集物と反応していた。一方で、４Ｇ８抗体により、高分子量の凝集物と比較してモノマーがより明確に検出された。Ａβのモノマーはギ酸により高度に変性することから、本実験の結果は、ＩＢＬ−１０１抗体が変性していないＡβ、特にはＡβの凝集物に存在するＡβの構造に特異的であることを示している。【０１１３】
以上の結果から、ＩＢＬ−１０１抗体は、Ａβの凝集物に特徴的な構造を特異的に認識しており、特に、Ａβの２２位及び２３位のアミノ酸におけるターン構造を特異的に認識していることが示された。
また、４Ｇ８で検出されるＡβに対してＩＢＬ−１０１で検出されるＡβのオリゴマー量が多いことが確認された。このことは、ＡＤ患者の脳において、単にＡβ４２の２２位及び２３位にターン構造を有するＡβの量が増えているのみならず、ターン構造をもたないＡβ量に対するターン構造をもつＡβ量の比が大きいことを意味している。従って、ターン構造を持たないＡβ量とターン構造を持つＡβ量の比を測定することによって、ＡＤの診断を行えることが示された。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年8月10日(2011.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２９０のハイブリドーマにより産生される抗体、前記抗体と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ前記抗体の抗原への結合作用を保持するポリペプチド又は抗体、前記抗体の可変領域とヒト由来の抗体の定常領域を有するキメラ抗体、前記抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域を有する抗体、あるいはそれらの抗体の断片。
【請求項２】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２９０のハイブリドーマにより産生される抗体、前記抗体の可変領域とヒト由来の抗体の定常領域を有するキメラ抗体、あるいは、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２９０のハイブリドーマにより産生される抗体のＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに、該抗体のＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する抗体。
【請求項３】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２９０のハイブリドーマにより産生される抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項５】
アルツハイマー病治療薬である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体を備える、２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβの測定キット。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体を備えるアルツハイマー病の診断薬。
【請求項８】
検体と請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体とを接触させる工程を備える、検体中における２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβレベルの測定方法。
【請求項９】
検体と請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体とを接触させることにより、検体中の２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβを検出するステップを備える、アルツハイマー病の診断のための情報を提供する方法。
【請求項１０】
以下のステップを備える、アルツハイマー病の診断のための情報を提供する方法：
ａ）被験者由来の試料を調製するステップ、
ｂ）少なくとも１つの請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体に該試料を接触させるステップ、
ｃ）２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβへの該抗体の結合を検出して２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβのレベルを測定するステップ、並びに、
ｄ）２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβのレベルと被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップを含む方法。
【請求項１１】
検体中における、全アミロイドβに対する２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβの割合を測定する方法であって、
検体中の全アミロイドβレベルを測定するステップ、
検体と請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体とを接触させることにより、検体中の２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβレベルを測定するステップ、及び、
測定された全アミロイドβレベルに対する２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβレベルの割合を計算するステップを備える方法。
【請求項１２】
アルツハイマー病の診断のための情報を提供する方法であって、
検体中の全アミロイドβレベルを測定するステップ、
検体と請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体とを接触させることにより、検体中の２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβレベルを測定するステップ、
測定された全アミロイドβレベルに対する２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβレベルの割合を計算するステップ、及び、
全アミロイドβレベルに対する２２位及び２３位のアミノ酸にターン構造を有するアミロイドβレベルの割合とアルツハイマー病の有無又は程度と関連付けを行うステップを含む方法。
【国際調査報告】
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