(57)【要約】本発明は、標的細胞中または染色体外配列中のあらかじめ選択された標的配列への外因性ポリヌクレオチドのターゲティングを増強する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体外配列中のあらかじめ選択された標的核酸配列を、相同的組換えによりターゲティングおよび改変する方法であって：
ａ）リコンビナーゼと、２つの核酸分子を含む組換え用の少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質との混合物であって、ここで、第１および第２の核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、２つの核酸分子は、互いに部分的２本鎖分子を形成することができ、および、第１の核酸分子の少なくとも５’末端または３’末端はヌクレオチド配列を含み、その実質的な相補体は第２の核酸分子のそれぞれ３’末端または５’末端には存在せず、このヌクレオチド配列はリコンビナーゼと結合することができる、混合物を提供し；
ｂ）混合物を染色体外配列と接触させて組換え中間体を形成させ、そして
ｃ）組換え中間体を細胞に導入して、標的配列の変化を含む遺伝子改変した染色体外配列を含む改変細胞を与える、
ことを含む上記方法。
【請求項２】
染色体外配列中のあらかじめ選択された標的核酸配列を、相同的組換えによりターゲティングおよび改変する方法であって：
ａ）リコンビナーゼと、１本鎖５’末端と３’末端を有する実質的に２本鎖分子を形成する２つの核酸分子を含む組換え用の核酸基質とを含む混合物であって、第１および第２の核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つの１本鎖末端はリコンビナーゼに結合することができる、混合物を提供し；
ｂ）混合物を染色体外配列と接触させて組換え中間体を形成させ、そして
ｃ）組換え中間体を細胞に導入して、標的配列の変化を含む遺伝子改変した染色体外配列を含む改変細胞を与える、
ことを含む上記方法。
【請求項３】
細胞中のあらかじめ選択された標的核酸配列を、相同的組換えによりターゲティングおよび改変する方法であって：
ａ）リコンビナーゼと、２つの核酸分子を含む組換え用の少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質とを含む混合物であって、第１および第２の核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、２つの核酸分子は互いに部分的に２本鎖の分子を形成することができ、第１の核酸分子の少なくとも５’末端または３’末端はヌクレオチド配列を含み、その実質的な相補体は第２の核酸分子の３’末端または５’末端には存在せず、ヌクレオチド配列はリコンビナーゼに結合することができる、混合物を提供し；そして
ｂ）細胞を混合物と接触させて、標的配列の変化を含む改変細胞を与える、
ことを含む上記方法。
【請求項４】
細胞中のあらかじめ選択された標的核酸配列を、相同的組換えによりターゲティングおよび改変する方法であって：
ａ）リコンビナーゼと、１本鎖５’末端と３’末端とを有する実質的に２本鎖の分子を一緒に形成する２つの核酸分子を含む組換え用の少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質とを含む混合物であって、第１および第２の核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つの１本鎖末端はリコンビナーゼに結合することができる、混合物を提供し；そして
ｂ）細胞を混合物と接触させて、標的配列の変化を含む改変細胞を与える、
ことを含む上記方法。
【請求項５】
第１の核酸分子の５’末端はヌクレオチド配列を含み、その実質的な相補体は第２の核酸分子の３’末端には存在しない、請求項１または３の方法であって、第２の核酸分子の５’末端はヌクレオチド配列を含み、その実質的な相補体は第１の核酸分子の３’末端には存在せず、このヌクレオチド配列はリコンビナーゼに結合することができる、上記方法。
【請求項６】
第１の核酸分子の３’末端はヌクレオチド配列を含み、その実質的な相補体は第２の核酸分子の５’末端には存在しない、請求項１または３の方法であって、第２の核酸分子の３’末端はヌクレオチド配列を含み、その実質的な相補体は第１の核酸分子の５’末端には存在せず、このヌクレオチド配列はリコンビナーゼに結合することができる、上記方法。
【請求項７】
部分的に１本鎖の核酸基質はまた部分的に２本鎖である、請求項１または３の方法。
【請求項８】
１本鎖末端はヘリカーゼを使用して形成される、請求項２または４の方法。
【請求項９】
あらかじめ選択された標的核酸配列は、改変される細胞中に存在する染色体外配列である、請求項３または４の方法。
【請求項１０】
あらかじめ選択された標的核酸配列は細胞の染色体配列である、請求項３または４の方法。
【請求項１１】
核酸基質は２つの１本鎖核酸分子を含む、請求項１または３の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの核酸分子は細胞取り込み成分に結合している、請求項１、２、３または４の方法。
【請求項１３】
細胞取り込み成分は、非共有結合により少なくとも１つの核酸分子に結合している、請求項１２の方法。
【請求項１４】
細胞取り込み成分はタンパク質−脂質複合体を含む、請求項１２の方法。
【請求項１５】
混合物は、リポフェクション、トランスフェクション、微量注入法、電気穿孔法、レーザー穿孔法、バイオリスティクス、またはカルシウム介在形質転換により細胞に導入される。請求項１、２、３または４の方法。
【請求項１６】
各ターゲティングポリヌクレオチドは２０ヌクレオチドより長い、請求項１、２、３または４の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの核酸分子は、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して、複数の欠失、複数の付加、複数の置換、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１、２、３または４の方法。
【請求項１８】
ヌクレオチド配列はターゲティングポリヌクレオチドを含む、請求項１、２、３または４の方法。
【請求項１９】
染色体外配列中にあらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列を含む組換え中間体のライブラリーを作成する方法であって、染色体外配列に、リコンビナーゼと組換え用の複数の少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質とを付加し、ここで各基質は２つの変種核酸分子を含み、第１および第２の変種核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、２つの変種核酸分子は、互いに部分的に２本鎖の分子を形成することができ、第１の変種核酸分子の少なくとも５’末端または３’末端はヌクレオチド配列を含み、その実質的な相補体は第２の変種核酸分子の３’末端または５’末端には存在せず、このヌクレオチド配列はリコンビナーゼに結合することができ、複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む、上記方法。
【請求項２０】
染色体外配列中のあらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列を含む組換え中間体のライブラリーを作成する方法であって、染色体外配列に、リコンビナーゼと組換え用の複数の核酸基質とを付加して、組換え中間体のライブラリーを形成し、ここで各基質は２つの変種核酸分子を含み、これらは一緒に、１本鎖５’末端および３’末端を有する実質的に２本鎖の分子を形成し、第１および第２の変種核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つの１本鎖末端はリコンビナーゼに結合することができ、複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む、上記方法。
【請求項２１】
細胞中のあらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列のライブラリーを作成する方法であって、標的細胞集団に、リコンビナーゼと組換え用の複数の少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質とを付加して、変種核酸配列のライブラリーを形成し、ここで各基質は２つの核酸分子を含み、第１および第２の核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、２つの核酸分子は、互いに部分的に２本鎖の分子を形成することができ、第１の核酸分子の少なくとも５’末端または３’末端はヌクレオチド配列を含み、その実質的な相補体は第２の核酸分子の３’末端または５’末端には存在せず、このヌクレオチド配列はリコンビナーゼに結合することができ、複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む、上記方法。
【請求項２２】
細胞中のあらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列のライブラリーを作成する方法であって、標的細胞集団に、リコンビナーゼと組換え用の複数の核酸基質とを付加して、変種核酸配列のライブラリーを形成し、ここで各基質は２つの核酸分子を含み、これらは一緒に、１本鎖５’末端および３’末端を有する実質的に２本鎖の分子を形成し、第１および第２の核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つの１本鎖末端はリコンビナーゼに結合することができ、複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む、上記方法。
【請求項２３】
染色体外配列中のあらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを作成する方法であって：
ａ）染色体外配列に、リコンビナーゼと組換え用の複数の少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質とを付加して、複数の組換え中間体を形成し、ここで各基質は２つの核酸分子を含み、第１および第２の核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、２つの核酸分子は、互いに部分的に２本鎖の分子を形成することができ、第１の核酸分子の少なくとも５’末端または３’末端はヌクレオチド配列を含み、その実質的な相補体は第２の核酸分子の３’末端または５’末端には存在せず、このヌクレオチド配列はリコンビナーゼに結合することができ、複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む；そして
ｂ）複数の組換え中間体を細胞集団に導入して、変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを形成させる、
ことを含む上記方法。
【請求項２４】
染色体外配列中のあらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを作成する方法であって：
ａ）染色体外配列に、リコンビナーゼと組換え用の複数の核酸基質とを付加して、複数の組換え中間体を形成し、ここで各基質は２つの核酸分子を含み、これらは一緒に、１本鎖の５’末端および３’末端を有する実質的に２本鎖の分子を形成し、第１および第２の核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つの１本鎖末端はリコンビナーゼに結合することができ、複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む；そして
ｂ）複数の組換え中間体を細胞集団に導入して、変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを形成させる、
ことを含む上記方法。
【請求項２５】
あらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを作成する方法であって：
あらかじめ選択された標的核酸配列を含む細胞の集団に、リコンビナーゼと組換え用の複数の少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質とを付加して、変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを形成し、ここで各基質は２つの核酸分子を含み、第１および第２の核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、２つの核酸分子は、互いに部分的に２本鎖の分子を形成することができ、第１の核酸分子の少なくとも５’末端または３’末端はヌクレオチド配列を含み、その実質的な相補体は第２の核酸分子の３’末端または５’末端には存在せず、このヌクレオチド配列はリコンビナーゼに結合することができ、複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む、上記方法。
【請求項２６】
あらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを作成する方法であって：
あらかじめ選択された標的核酸配列を含む細胞の集団に、リコンビナーゼと組換え用の複数の核酸基質とを付加して、変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを形成し、ここで各基質は２つの核酸分子を含み、これらは一緒に、１本鎖の５’末端および３’末端を有する実質的に２本鎖の分子を形成し、第１および第２の核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つの１本鎖末端はリコンビナーゼに結合することができ、複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む、上記方法。
【請求項２７】
標的細胞は原核細胞である、請求項２３、２４、２５または２６の方法。
【請求項２８】
標的細胞は真核細胞である、請求項２３、２４、２５または２６の方法。
【請求項２９】
遺伝子改変細胞のライブラリーを所望の表現型についてスクリーニングすることをさらに含む、請求項２３、２４、２５または２６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の米国特許出願第６０／３７３，１００（２００２年４月１６日出願）の出願日の利益を請求する（本出願の開示内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）
【背景技術】
【０００２】
相同的組換え（homologous recombination）（または一般的組換え）は、２つのＤＮＡ分子の長さに沿ったどこかの相同的セグメントの交換として定義される。相同的組換えの基本的な特徴は、この組換え事象に関与する酵素が、任意の対の配列を基質として使用するが、他の種類の配列より好ましいいくつかの種類の配列があることである。遺伝的および細胞学的研究は、高等動物の減数分裂中に相同的染色体対の間でそのようなクロスオーバープロセスが起きることを示した。
【０００３】
相同的組換えの主要な工程は、ＤＮＡ鎖の交換であり、これは、あるＤＮＡ２本鎖が相補的配列を含有する少なくとも１つのＤＮＡ鎖と対合して、ヘテロ２本鎖ＤＮＡを含有する中間組換え構造を形成する（ラヂング（Radding）、1982；米国特許第４，８８８，２７４号を参照）。ヘテロ２本鎖ＤＮＡは、トリプレックス（triplex）型（１つの相補鎖がＤＮＡ２本鎖に進入している）を含む３ＤＮＡ鎖を含むいくつかの型を取り（フシエ（Hsieh）ら、1990；ラオ（Rao）ら、1991）、２つの相補的ＤＮＡ鎖がＤＮＡ２本鎖と対合すると、古典的ホリデー組換え結合構造またはカイ構造（ホリデー（Holliday）、1964）、すなわち２重Ｄループ（米国特許第５，９４８，６５３号を参照）を形成する。いったん形成されると、ヘテロ２本鎖構造は鎖の破壊と交換により分離し、進入するすべてまたは一部のＤＮＡ鎖はスプライシングされて受容体ＤＮＡ２本鎖にされ、受容体ＤＮＡ２本鎖のセグメントを付加または置換する。あるいはヘテロ２本鎖構造は、遺伝子変換を起こし、進入する鎖の配列は、進入する鎖を鋳型として使用して、ミスマッチした塩基の修復により受容体ＤＮＡ２本鎖に輸送される（レウィン（Lewin）、1987；ロペス（Lopez）ら、1987）。破壊と再結合の機構であっても、遺伝子変換の機構であっても、相同的に対合した結合部分のヘテロ２本鎖ＤＮＡの形成は、遺伝子配列情報を１つのＤＮＡ分子から別のＤＮＡ分子に伝達する役目をすることができる。相同的組換え（遺伝子変換と古典的な鎖破壊／再結合）がＤＮＡ分子の間で遺伝子配列情報を伝達する能力は、ターゲティング相同的組換えを、遺伝子工学と遺伝子操作における強力な方法としている。
【０００４】
例えばターゲティング組換え事象は、既知の部位の変異を修正し、遺伝子または遺伝子セグメントを欠陥遺伝子で置換し、または細胞に外来遺伝子を導入するのに使用することができる。そのような遺伝子ターゲティング法の効率は、いくつかのパラメータに関連している：細胞にＤＮＡを送る効率、ＤＮＡパッケージング（あれば）の種類、および入っているＤＮＡのサイズとコンフォメーション、標的部位に相同的な領域の長さと位置（これらのすべてのパラメータはまた、入ってくる相同的ＤＮＡ配列が細胞内のヌクレアーゼ攻撃に耐える能力に影響を与える可能性がある）、ハイブリダイゼーションと組換えの効率、および組換え事象が相同的であるかまたは非相同的であるか。ターゲティング相同的組換えは、２本鎖ＤＮＡ分子中の基本的に任意の所望の配列をターゲティングおよび改変する一般的な基礎となるが、ターゲティング相同的組換えはまれな事象であり、正しくターゲティングされた組み換え体を同定し単離する複雑な細胞選択スキームを必要とする。
【０００５】
相同的組換えを促進する性質（すなわちリコンビナーゼ活性）を有するいくつかのタンパク質または精製抽出物が、原核生物または真核生物で同定されている（コックス（Cox）とレーマン（Lehman）、1987；ラヂング（Radding）、1982；マカーシー（MacCarthy）ら、1988；ロペス（Lopez）ら、1987）。これらの一般的リコンビナーゼはおそらく、相同的組換えプロセス中の相同的対合した中間体の形成、鎖交換、遺伝子変換、および／または他の工程の１つ以上の工程を促進するであろう。特に、原核生物中の相同的組換えの頻度は、リコンビナーゼ活性の存在により有意に増強される。いくつかの精製タンパク質は、インビトロで相同的対合および／または鎖交換を触媒し、例えば特に限定されないが、大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４ＵｖｓＸタンパク質、トウモロコシ黒穂菌（Ustilago maydis）のＲｅｃ１タンパク質、ラムダバクテリオファージからのＲｅｄβ（コワルクジコウスキー（Kowalczykowski）ら、1994）、大腸菌（E. coli）の潜在Ｒａｃプロファージ（コワルクジコウスキー（Kowalczykowski）ら、1994）、エス・セレビッシェ（S. cerevisiae）のＲａｄ５１タンパク質（スング（Sung）ら、1994）、アーキオプロブス・フルギヅス（Archaeoplobus fulgidus）のｒａｄＡ（マキルライス（McIlwraith）ら、2001）、およびヒト細胞（ボーマン（Baumann）ら、1996）がある。
【０００６】
リコンビナーゼは大腸菌（E. coli）のＲｅｃＡタンパク質のように、鎖対合と交換を促進するタンパク質である。今日まで最もよく研究されているリコンビナーゼは、大腸菌（E. coli）のＲｅｃＡリコンビナーゼであり、これは、相同性検索と交換反応に関与している（コックス（Cox）とレーマン（Lehman）、1987）。ＲｅｃＡは、大腸菌（E. coli）のＳＯＳ修復応答、ＤＮＡ修復、および効率的な遺伝子組み換えの誘導に必要である。ＲｅｃＡは、線状の２本鎖ＤＮＡと相同的な以下ＤＮＡのインビトロでの相同的対合と鎖交換とを触媒することができる。部位特異的リコンビナーゼと比較して、いくつかのインビトロの実験で証明されているように、一般的組換えに関与するＲｅｃＡのようなタンパク質は相同性の共有に基づきＤＮＡ構造の対合を認識し促進する（フシエ（Hsieh）とカメリニ−オテロ（Camerini-Otero）、1989；ハワード−フランダース（Howard-Flanders）ら、1984；レジスター（Register）ら、1987）。何人かの研究者はＲｅｃＡをインビトロで使用して、相同的対合したトリプレックスＤＮＡを促進させ（チェング（Cheng）ら、1988；フェリン（Ferrin）とカメリニ−オテロ（Camerini-Otero）、1991；ラムダス（Ramdas）ら、1989；ストローベル（Strobel）ら、1991；フシエ（Hsieh）ら、1990；リガス（Rigas）ら、1986）、パチ（Pati）ら（米国特許第５，９４８，６５３号）は、原核生物と真核生物中のターゲティング相同的組換え用において、精製ＲｅｃＡを使用した。
【０００７】
しかしまだ、ターゲティング相同的組換えの効率を上昇させるニーズが当該分野には存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
本発明は、組換えのための少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質を、あらかじめ選択された標的核酸配列にターゲティングする方法を提供する。本発明の少なくとも部分的に１本鎖の基質は、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含む２つの外因性核酸分子を含み、この２つの核酸分子は、互いに部分的に２本鎖の分子を形成することができる。リコンビナーゼの存在下ではターゲティングポリヌクレオチドは、相同的対合（例えば、インビトロで染色体外配列と、またはインビボで染色体外配列もしくは染色体ＤＮＡと）により１つ以上のあらかじめ選択された標的核酸配列を局在化（ターゲティング）して、組換え中間体を形成する。組換え中間体のインビボでの分離により、高効率かつ配列特異性で、標的配列の改変（例えば、挿入、欠失、置換、またはこれらの組合せ）が得られる。
【０００９】
本発明のある実施態様において、基質の核酸分子はターゲティングポリヌクレオチドのみを含む。すなわち、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドは、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して、１つ以上のヌクレオチド変化、例えば１つ以上の挿入、欠失、置換、またはこれらの任意の組合せを含む。ある実施態様において基質の核酸分子は、ターゲティングポリヌクレオチド以外に無数のヌクレオチド、例えばあらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応もせずまた実質的に相補的でもない目的の核酸断片を含む。
【００１０】
基質の少なくとも一部の１本鎖性は、基質の他の核酸分子のそれぞれ３’末端または５’末端にその実質的な相補体が存在しないヌクレオチド配列を含む核酸分子の１つの、少なくとも５’末端または３’末端の結果である。すなわちもし２つの核酸分子が塩基対合していたなら、基質は５’末または３’のずれ末端（staggered ends）（突出オーバーハング）を含む。好適な基質は２つのずれ末端を有し、例えば２つの５’ずれ末端を含む基質、５’と３’ずれ末端を含む基質、または２つの３’ずれ末端を含む基質を有する。リコンビナーゼは、完全に１本鎖の本発明の基質を混合してもよく、すなわち２つの核酸分子は変性しており、部分的に１本鎖であり、かつ部分的に２本鎖である。基質の部分的１本鎖性は、例えばヘリカーゼを使用して２本鎖ＤＮＡの少なくとも１つの遊離末端をほどいて、部分的に１本鎖かつ部分的に２本鎖の分子を与えた結果かも知れない。この実施態様においてリコンビナーゼは、１本鎖末端を形成後、基質と混合される。
【００１１】
後述のように、大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡまたはサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）ＲｅｃＡ（プラスミド標的と部分的１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）基質）との大腸菌（E. coli）中のターゲティング相同的組換えの効率は、対応する変性２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）基質との効率より大きかった（すなわち、ｄｓＤＮＡの核酸分子は完全に相補的である）。３’ずれ末端を有する部分的ｓｓＤＮＡ基質とのターゲティング相同的組換えの効率は、対応する変性ｓｓＤＮＡ基質の効率と同様であった。３’ずれ末端を有する部分的１本鎖基質との組換えの効率は増強できると企図される。例えば中間体形成後、ポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、またはクレノウ断片）をｄＮＴＰとともに、基質と標的ＤＮＡ（すなわち、dut ung宿主中で増殖させたプラスミド）の混合物に加えることにより。基質の３’末端は、標的ＤＮＡを鋳型として使用して、ポリメラーゼにより伸長することができる。生じる生成物は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼで消化して、これはＤＮＡからウラシル塩基を除去し、非塩基性部位を除去し、次に細菌に形質転換されるか、またはＤＮＡグリコシラーゼによる前処理無しで単にDut+ Ung+ 宿主細菌中に形質転換する。すなわち、ＤＮＡポリメラーゼの鋳型として機能した標的の親株は細菌中で分解され、改変標的配列が形成される（クンケル（Kunkel）、1985を参照）。あるいは標的ＤＮＡは、新に合成されたＤＮＡをメチル化する宿主中で増殖され、基質の３’末端は非メチル化ヌクレオチドの存在下で伸長される。場合により、伸長した生成物はリガーゼで処理される。伸長した生成物は、メチル化残基を切断するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＤｐｎＩ）で消化され、標的ＤＮＡ中で１本鎖ニックを形成する。次にＤＮＡは細菌宿主中に形質転換され、ＤＮＡポリメラーゼの鋳型として機能した標的の親株は細菌中で分解され、改変ターゲティング配列が形成される（米国特許第５，７８９，１６６号、およびパプワース（Papworth）ら、1996）。
【００１２】
すなわち本発明は、相同的組換えにより、染色体外配列中または細胞中、すなわち細胞中に存在する染色体または染色体外配列の、あらかじめ選択された標的核酸配列をターゲティングおよび改変する方法を提供する。この方法は、リコンビナーゼと、２つの核酸分子を含む組換え用の少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質との混合物を提供することを含む。第１および第２の核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含む。２つの核酸分子は、互いに部分的２本鎖分子を形成することができ、ある実施態様において、第１の核酸分子の少なくとも５’末端または３’末端はヌクレオチド配列を含み、その実質的な相補体は第２の核酸分子のそれぞれ３’末端と５’末端には存在せず、このヌクレオチド配列はリコンビナーゼと結合することができる。ある実施態様において、核酸基質の１本鎖部分はリコンビナーゼで被覆される。ある実施態様において、リコンビナーゼは原核生物種のリコンビナーゼである。ある実施態様において原核生物リコンビナーゼは、原核生物ＲｅｃＡタンパク質の種類であり、例えば大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡまたはサーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡ、Ｒｅｄβ、ＲｅｃＴまたはＲａｄＡである。別の実施態様においてリコンビナーゼは真核生物リコンビナーゼの種類であり、例えばリコンビナーゼはＲａｄ５１リコンビナーゼ、またはリコンビナーゼタンパク質の複合体である。
【００１３】
ある実施態様において少なくとも１つの核酸分子は、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応せずまた実質的に相補的でもない目的の核酸断片をさらに含む。ある実施態様において少なくとも１つの核酸分子は、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して少なくとも１つのヌクレオチドの欠失を含む。別の実施態様において少なくとも１つの核酸分子は、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含む。別の実施態様において少なくとも１つの核酸分子は、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して少なくとも１つのヌクレオチドの付加を含む。さらに別の実施態様において少なくとも１つの核酸分子は、化学置換基、例えば核酸分子に共有結合したものをさらに含む。ある実施態様において少なくとも１つの核酸分子の配列は、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して、遺伝子、プロモーター、イントロン、エンハンサー、読みとり枠、またはエキソンに欠失を含む。さらなる実施態様において少なくとも１つの核酸分子の配列は、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して、遺伝子、プロモーター、イントロン、エンハンサー、読みとり枠、またはエキソンに挿入を含む。さらなる実施態様において少なくとも１つの核酸分子の配列は、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して、遺伝子、プロモーター、イントロン、エンハンサー、読みとり枠、またはエキソンに置換を含む。
【００１４】
本発明はさらに、相同的組換えにより、染色体外配列中のあらかじめ選択された標的核酸配列をターゲティングおよび改変する方法を提供する。この方法は、リコンビナーゼと、１本鎖５’末端と３’末端を有する実質的に２本鎖分子を形成する２つの核酸分子を含む組換え用の核酸基質とを含む混合物であって、第１および第２の核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つの１本鎖末端はリコンビナーゼに結合することができる、混合物を提供する。混合物は、染色体外配列と接触されて組換え中間体を形成し、組換え中間体は細胞に導入されて、標的配列の変化を含む遺伝子改変染色体外配列を含む改変細胞を与える。ある実施態様において核酸基質の１本鎖部分はリコンビナーゼで被覆される。ある実施態様においてリコンビナーゼは、原核生物リコンビナーゼの種類である。ある実施態様において原核生物リコンビナーゼは、原核生物ＲｅｃＡタンパク質の種類であり、ＲｅｃＡタンパク質は大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡまたはサーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡ、Ｒｅｄβ、ＲｅｃＴまたはＲａｄＡである。別の実施態様においてリコンビナーゼは真核生物リコンビナーゼの種類であり、例えばリコンビナーゼはＲａｄ５１リコンビナーゼ、またはリコンビナーゼタンパク質の複合体である。
【００１５】
ある実施態様において少なくとも１つの核酸分子は、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応せずまた実質的に相補的でもない、目的の核酸断片をさらに含む。ある実施態様において少なくとも１つの核酸分子は、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して少なくとも１つのヌクレオチドの欠失を含む。別の実施態様において少なくとも１つの核酸分子は、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含む。さらなる実施態様において少なくとも１つの核酸分子は、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して少なくとも１つのヌクレオチドの付加を含む。さらなる実施態様において少なくとも１つの核酸分子は、化学置換基、例えば核酸分子に共有結合したものをさらに含む。ある実施態様において少なくとも１つの核酸分子の配列は、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して、遺伝子、プロモーター、イントロン、エンハンサー、読みとり枠、またはエキソンに欠失を含む。さらなる実施態様において少なくとも１つの核酸分子の配列は、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して、遺伝子、プロモーター、イントロン、エンハンサー、読みとり枠、またはエキソンに挿入を含む。さらなる実施態様において少なくとも１つの核酸分子の配列は、あらかじめ選択された標的核酸配列に対して、遺伝子、プロモーター、イントロン、エンハンサー、読みとり枠、またはエキソンに置換を含む。
【００１６】
本発明の好適な実施態様において、この方法は、あらかじめ選択された標的核酸配列を含む染色体外配列に、少なくとも１つのリコンビナーゼと、ターゲティングポリヌクレオチドを含む核酸分子を含む組換え用の少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質とを加えて、染色体外配列と核酸分子とを含む組換え中間体を形成させることを含む。インビトロで形成された組換え中間体は次に、適切な宿主細胞（原核細胞または真核細胞、例えば変異体大腸菌（E. coli）宿主）に導入され、これは、少なくとも１つの核酸分子中のターゲティングポリヌクレオチドと、染色体外配列中のあらかじめ選択された標的核酸配列との組換え中間体を分離する。上記したようにこの変化は、ヌクレオチドの１つ以上の挿入、欠失または置換でもよい。別の実施態様において、少なくとも１つのリコンビナーゼと少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質とを、そのゲノムがあらかじめ選択された標的核酸配列を含む（すなわち標的核酸配列が染色体外配列または細胞の染色体である）宿主細胞に加える。この実施態様において組換え中間体が形成され、インビボで分離されて、標的配列の変化を与える。基質は細胞に、１つ以上のリコンビナーゼ種と同時にまたは連続的に導入され、あらかじめ選択された標的核酸配列を含む染色体外配列も随時導入される。好ましくは、次に標的配列の変化を含む宿主細胞は、随時選択無しで投与されるかおよび／または単離される。同定は、標的配列の変化についての配列特異的スクリーニングにより、例えば制限エンドヌクレアーゼ部位の獲得もしくは喪失、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＳＳＣＶ、ＰＣＲまたは配列分析により行われる。ある実施態様において宿主細胞は原核細胞である。別の実施態様において宿主細胞は真核細胞である。ある実施態様において少なくとも１つの核酸分子は、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応せずまた実質的に相補的でもない目的の核酸断片をさらに含む。例えば、目的の核酸断片は、1000ヌクレオチドの長さより長い。ある実施態様において目的の核酸断片は、あらかじめ選択された標的核酸配列中に存在しない遺伝子、プロモーター、イントロン、エンハンサー、読みとり枠、またはエキソンを含む。本発明はまた、標的配列の変化を有する改変細胞の同定をさらに含む。
【００１７】
ターゲティング相同的組換えは、以下のために使用される：(1) 例えば原核生物中でのクローニングを促進するために、(2) 配列特異的に化学的置換をターゲティングするために、(3) 相同的組換えおよび／または遺伝子変換［例えば、非機能的な、機能不全の、および／または末端切断型ポリペプチドをコードする変異ＤＮＡ配列を、機能性ポリペプチド（例えば、酵素活性、ホルモン機能、または他の生物学的性質のような生物学的性質を有する）をコードする修正ＤＮＡ配列に変換する］により、遺伝された遺伝病（例えば嚢胞性繊維症）および新生物［例えば、癌遺伝子もしくは腫瘍抑制遺伝子の体細胞変異（例えば、p53、新生物に関連するウイルス遺伝子、例えばHBV）により誘導される新生物］に関与する疾患対立遺伝子を修正する方法を含む、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子変異（例えば、塩基置換、負荷、および／または欠失）を修正または作成するために、非コード配列中で遺伝的病変を除去または作成するために、(4) 相同的にターゲティングされたトランスジェニック（組換え）動物（細菌、動物および植物を含む）を高率に産生するために、(5) インビボの相同的対合に基づく他の応用において、(6) ドメイン交換、および(7) 遺伝子融合（例えば、レポーター構築）のために。
【００１８】
本発明の方法の使用は、相同的組換えによるＤＮＡ操作の一般的利点（例えば配向およびクロスオーバー制御を含む遺伝情報の正確かつ特異的な交換、および基質ＤＮＡのサイズに無関係に単一の塩基対レベルでの正確な改変、目的の任意の位置での修飾）を与える。さらに本発明の方法は、特に限定されないが原核細胞中でＤＮＡをクローン化するのに使用される時、この方法は、現在当該分野で公知の方法に必要なプロセスまたは酵素（すなわち、制限酵素、リガーゼ、ホスファターゼ、およびクローニングと遺伝子修飾のための部位特異的リコンビナーゼ）の使用を避けるという利点を有する。この方法はまた、ゲル精製無しで迅速な指向性クローニング、選択無しで高収率の所望の組換えＤＮＡ（例えば、１０〜２０％）、および、部位特異的組換え部位もしくは制限エンドヌクレアーゼ部位を使用することなく、あらかじめ選択された標的ＤＮＡへのターゲティングポリヌクレオチド中の配列の融合の単一塩基制御という利点を有する。さらに本発明の方法を使用して、従来報告されているものより大きなＤＮＡが挿入され、例えばこの方法により１００kb以上の挿入が達成される。特にターゲティングポリヌクレオチドの合成サイズより大きなサイズ（ポリヌクレオチド長さ）である挿入が達成できる。
【００１９】
ターゲティングヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む本発明の複数の基質は、あらかじめ選択された標的核酸配列、例えば染色体外配列中の、インビトロまたはインビボの、または染色体中の標的核酸配列の変種核酸配列のライブラリーを作成するのに有用である。本明細書において「ミスマッチ」は、配列中の１つ以上の置換、挿入および／または欠失を含み、すなわちミスマッチ配列は、参照配列（例えば標的配列）に対して変種配列である。本明細書においてライブラリーは、互いに１つ以上のミスマッチを有する核酸配列を有する核酸分子または細胞を含む。ある実施態様においてこの方法は、インビトロのあらかじめ選択された標的核酸配列、リコンビナーゼ、および組換えのための複数の核酸基質とを含む染色体外配列に加えて、変種核酸配列のライブラリーを形成する。別の実施態様においてこの方法は、あらかじめ選択された標的核酸配列を含む細胞集団に、リコンビナーゼと組換えのための複数の核酸基質を導入して、変種核酸配列の細胞ライブラリーを形成することを含む。各基質は、２つの核酸分子を含み、各分子は、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、基質の２つの分子は、互いに少なくとも一部は２本鎖である分子を形成することができる。少なくとも１つの核酸分子は、リコンビナーゼに結合することができる１本鎖ヌクレオチド配列を含む。例えばミスマッチライブラリーを含む複数の基質を調製するために、１つ以上のミスマッチを有する２つ以上の構造および／または機能が関連するポリヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼ（例えばＤＮａｓｅＩ）による限定処理にランダムにニックされる。エンドヌクレアーゼ処理した分子は混合、変性およびゆっくり冷却されて、リコンビナーゼに結合することができる少なくとも１つの１本鎖末端を含む、組換え用の複数の基質を含む集団を与える。すなわち、遺伝子の読みとり枠の一部もしくは完全な遺伝子、またはマルチ遺伝子家族の遺伝子の一部もしくは完全な遺伝子中にミスマッチを含む核酸のライブラリーは、本発明の方法において基質を調製するのに使用することができる。生じる配列ライブラリーは細胞に導入されて、変種核酸配列を含む遺伝的改変細胞のライブラリーを形成し、この変種配列は、増幅反応によりもしくは機能的な差（例えば、陽性もしくは陰性選択）に基づきクローン化されるかまたは単離される。ある実施態様において細胞は原核細胞である。別の実施態様において細胞は真核細胞である。
【００２０】
ある実施態様において本発明は、染色体外配列中にあらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列を含む組換え中間体のライブラリーを作成する方法を提供する。この方法は、染色体外配列にリコンビナーゼと組換えのための複数の核酸基質とを加えて、組換え中間体のライブラリーを形成することを含む。各基質は、１本鎖５’末端と３’末端を有する実質的に２本鎖分子を一緒に形成する２つの変種核酸分子を含み、ここで第１と第２の変種核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含む。少なくとも１つの１本鎖末端は、リコンビナーゼに結合することができる。複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む。ある実施態様において細胞は原核細胞である。別の実施態様において細胞は真核細胞である。
【００２１】
さらに、細胞中であらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列のライブラリーを作成する方法が提供される。この方法は、標的細胞の集団中に、リコンビナーゼと、組換えのための複数の少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質とを導入して、変種核酸配列のライブラリーを形成することを含む。各基質は、２つの核酸分子を含み、第１と第２の変種核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、ここで、第１の核酸分子の少なくとも５’末端または３’末端はヌクレオチド配列を含み、その実質的な相補体は第２の核酸分子の３’末端または５’末端に存在せず、このヌクレオチド配列はリコンビナーゼに結合することができる。複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む。ある実施態様において細胞は原核細胞である。別の実施態様において細胞は真核細胞である。
【００２２】
また、細胞中であらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列のライブラリーを作成する方法が提供され、ここでリコンビナーゼと、組換えのための複数の核酸基質は標的細胞集団中に導入されて導入して、変種核酸配列のライブラリーを形成する。各基質は、２つの核酸分子を含み、１本鎖５’末端と３’末端を有する実質的に２本鎖分子を一緒に形成する２つの核酸分子を含み、ここで第１と第２の変種核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、およびここで、少なくとも１つの１本鎖末端はリコンビナーゼに結合することができる。複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む。ある実施態様において細胞は原核細胞である。別の実施態様において細胞は真核細胞である。
【００２３】
別の実施態様において本発明は、染色体外配列中のあらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを作成する方法を提供する。この方法は、標的細胞の集団中に、リコンビナーゼと、組換えのための複数の少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質とを導入して、複数の組換え中間体を形成することを含む。各基質は、２つの核酸分子を含み、第１と第２の変種核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、ここで、２つの核酸分子は互いに部分的に２本鎖の分子を形成することができ、ここで第１の核酸分子の少なくとも５’末端または３’末端はヌクレオチド配列を含み、その実質的な相補体は第２の核酸分子の３’末端または５’末端に存在せず、このヌクレオチド配列はリコンビナーゼに結合することができ、ここで、複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む。複数の組換え中間体は細胞集団中に導入されて、変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを形成する。ある実施態様において細胞は原核細胞である。別の実施態様において細胞は真核細胞である。
【００２４】
さらに別の実施態様において本発明は、染色体外配列中のあらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを作成する方法が提供される。この方法は、染色体外配列に、リコンビナーゼと、組換えのための複数の核酸基質とを導入して、複数の組換え中間体を形成することを含みここで各基質は、２つの核酸分子を含み、これらは、１本鎖５’末端と３’末端を有する実質的に２本鎖分子を形成し、ここで第１と第２の変種核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの１本鎖末端はリコンビナーゼに結合することができ、複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む。複数の組換え中間体は細胞集団中に導入されて、変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを形成する。ある実施態様において細胞は原核細胞である。別の実施態様において細胞は真核細胞である。
【００２５】
また、あらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを作成する方法が提供される。この方法は、あらかじめ選択された標的核酸配列を含む細胞集団中に、リコンビナーゼと、組換えのための複数の少なくとも部分的に１本鎖の核酸基質とを導入して、変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを形成することを含む。各基質は、２つの核酸分子を含み、第１と第２の変種核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、ここで、２つの核酸分子は互いに部分的に２本鎖の分子を形成することができ、ここで第１の核酸分子の少なくとも５’末端または３’末端はヌクレオチド配列を含み、その相補体は第２の核酸分子の３’末端または５’末端に存在せず、このヌクレオチド配列はリコンビナーゼに結合することができ、ここで、複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む。ある実施態様において細胞は原核細胞である。別の実施態様において細胞は真核細胞である。
【００２６】
さらに、あらかじめ選択された標的核酸配列の変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを作成する方法が提供される。この方法は、あらかじめ選択された標的核酸配列を含む細胞集団中に、リコンビナーゼと、組換えのための複数の核酸基質とを導入して、変種核酸配列を含む遺伝子改変細胞のライブラリーを形成することを含む。各基質は、２つの核酸分子を含み、１本鎖５’末端と３’末端を有する実質的に２本鎖分子を形成し、ここで第１と第２の変種核酸分子はそれぞれ、あらかじめ選択された標的核酸配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの１本鎖末端はリコンビナーゼに結合することができ、複数の基質は、ターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列とのミスマッチのライブラリーを含む。ある実施態様において細胞は原核細胞である。別の実施態様において細胞は真核細胞である。
【００２７】
さらに別の実施態様において、ある生物（例えば細菌）からのゲノムＤＮＡは、リコンビナーゼに結合することができる少なくとも１つの１本鎖末端を有する複数の基質を与えるように処理され、例えばゲノムＤＮＡを制限ＤＮａｓｅＩ処理でランダムにニックし、処理したＤＮＡを加熱し、次にＤＮＡをゆっくり冷却して、基質が形成される。次に、部分的に１本鎖の核酸基質のライブラリーは、別の生物（例えば、異なる種の細菌）の細胞に導入されて、細胞ライブラリーを形成する次にライブラリーは、対応そして非遺伝子改変細胞とは異なる性質を有する遺伝子改変細胞について、随時スクリーニングされる。
【００２８】
定義
特に明記しない場合は、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的文献は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様の方法と材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法と材料が記載される。本発明の目的のために以下の用語が定義される。
【００２９】
「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」または本明細書の文法的相当物は、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般に、ホスホジエステル結合を有するが、ある場合には、例えばホスホラミド（ボケージ（Beaucaage）ら、1993；レチンガー（Letsinger）、1970；スプリンズル（Sprinzl）ら、1977；レチンガー（Letsinger）、1984；レチンガー（Letsinger）、1988；およびパウウェルズ（Pauwels）ら、1986）、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホスホラミダイト結合、およびペプチド核酸骨格と結合（エグホルム（Egholm）、1992；メイアー（Meier）ら、1992；ニールセン（Neilsen）、1993；カールソン（Carlsson）ら、1996）を含む選択可能な骨格を有する核酸類似体が含まれる。リボース−ホスフェート骨格または塩基のこれらの修飾は、他の残基（例えば、２’Ｏ−メチルと５’修飾置換基を含む）の付加を促進するために、またはそのような分子の生理学的環境での安定性と半減期を上昇させるために行われる。
【００３０】
核酸は、記載したように１本鎖でも２本鎖でもよく、または２本鎖もしくは以下の配列の一部を含有してもよい。核酸はＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ）、ＲＮＡまたはハイブリッドでもよく、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せ、および塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニンおよびヒポキサンチンの任意の組合せ）などを含む。すなわち例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡ分子は、コール−ストラウス（Cole-Strauss）ら（1996）とユーン（Yoon）ら（1996）が記載したように使用してもよい。
【００３１】
一般にターゲティングポリヌクレオチドを含む核酸分子は、その構造が、ターゲティングポリヌクレオチドが相同的組換えを引き起こす機能的能力に実質的に影響を与えない限りは、任意の数の構造を含む。
【００３２】
本明細書において用語「あらかじめ決められた」または「あらかじめ選択された」標的ＤＮＡ配列は、単離された染色体外配列中のまたは標的細胞中に含有されるポリヌクレオチド配列を意味し、これは例えば、染色体配列（例えば、構造遺伝子、プロモーターやエンハンサーを含む制御配列、リコンビナトリアルホットスポット、繰り返し配列、組み込みプロウイルス配列、ヘアピンおよびパリンドローム）、またはクロロプラストやミトコンドリアＤＮＡ配列を含む染色体外配列（例えば、複製可能なプラスミドまたはウイルス複製中間体）を含む。「あらかじめ決められた」または「あらかじめ選択された」とは、標的配列が実施者の考えにより公知のまたは予測される配列情報に基づき選択されることを意味し、ある部位特異的リコンビナーゼ（例えば、ＦＬＰリコンビナーゼまたはＣＲＥリコンビナーゼ）により認識される特異的部位に限定されない。ある実施態様においてあらかじめ選択されたＤＮＡ標的配列は、天然に存在するＤＮＡ配列以外のものである（例えば、トランス遺伝子、寄生体、マイコプラズマまたはウイルス配列）。外因性核酸分子は、標的細胞中に移送されるが宿主細胞中では複製されないポリヌクレオチドである：しかし、細胞中で連続的に作成されたポリヌクレオチドの複製コピーは内因性配列である（および、例えば細胞染色体中に組み込まれる）。同様に細胞に微量注入されるかまたはトランスフェクトされるトランス遺伝子は外因性ポリヌクレオチドであるが、トランス遺伝子の組み込まれたかおよび／または複製されたコピーは内因性配列である。
【００３３】
用語「に対応する」は本明細書において、参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部に対して、ポリヌクレオチド配列が相同的（すなわち、同様であるかまたは同一であり、必ずしも進化的に関連するものではない）であることを意味する。これに対して用語「に相補的」は本明細書において、相補的ポリヌクレオチド配列が他の鎖にハイブリダイズすることができることを意味する。以下に概略を説明するように、２つの配列の間の相同性は、少なくとも７０％、好ましくは８５％、およびさらに好ましくは９５％同一である。すなわちターゲティングポリヌクレオチドを含む２つの１本鎖核酸分子の間の相補性およびターゲティングポリヌクレオチドと標的核酸配列の間の相補性は、完全である必要は無い。例えばヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に完全に相補的である。
【００３４】
用語「に実質的に対応する」または「実質的同一性」または「相同的」は本明細書において、核酸配列が参照配列と比較して少なくとも約７０％の配列同一性、典型的には少なくとも約８５％の配列同一性、および好ましくは参照配列と比較して少なくとも約９５％の配列同一性を有する、核酸配列の特徴を示す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば遺伝子またはフランキング配列の一部、または染色体の繰り返し部分でもよい。しかし参照配列は少なくとも２０ヌクレオチドの長さであり、典型的には少なくとも約３０ヌクレオチドの長さ、および好ましくは少なくとも約５０〜１００ヌクレオチドの長さである。本明細書において「実質的に相補的」とは、参照配列に実質的に対応する配列に相補的である配列を意味する。一般にターゲティング効率は、標的ＤＮＡ中に存在する参照配列に実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチド部分の長さとともに上昇する。
【００３５】
本明細書において「特異的ハイブリダイゼーション」とは、ターゲティングポリヌクレオチド（例えば、あらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列と比較して、置換、形エス、および／または付加を含む本発明のポリヌクレオチド）と、選択された標的ＤＮＡ配列とのハイブリッドの形成として定義され、ここで例えば、少なくとも１つの別個のバンドが、標的ＤＮＡ配列を含有する標的細胞から調製されたＤＮＡのサザンブロットで同定することができるように、および／または完全な細胞または核中のターゲティングポリヌクレオチドが別個の位置に局在化するように、ターゲティングポリヌクレオチドはあらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列に優先的にハイブリダイズする。完全なゲノム配列が既知の生物について、ユニークな標的ＤＮＡ配列とターゲティングポリヌクレオチドは、コンピューターソフトウェアを使用してモデル化することができる。ある例では、２つ以上のターゲティングポリヌクレオチド種中に標的配列が存在する（例えば特定の標的配列が、遺伝子ファミリーの複数のメンバー中に存在するかまたは既知の繰り返し配列中に存在する）。最適なハイブリダイゼーション条件は、配列組成とターゲティングポリヌクレオチドおよび標的の長さ、および実施者が選択する実験法により変わることが明らかである。適切なハイブリダイゼーション条件を選択するのに種々のガイドラインを使用することができる（例えば、マニアティス（Maniatis）ら、1989とバーガー（Berger）とキメル（Kimmel）、1987を参照）。
【００３６】
本明細書においてある対象に適用される用語「天然に存在する」は、対象が天然に存在する事実を意味する。例えば天然の供給源から単離することができる生物（ウイルスを含む）中に存在し、ヒトにより故意に修飾（例えば実験室で）されていないポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００３７】
本明細書において用語「疾患対立遺伝子」は、認識可能な疾患を生成することができる遺伝子の対立遺伝子を意味する。疾患対立遺伝子は優性でも劣性でもよく、直接、または特異的な遺伝子バックグランドもしくはすでに存在する病理的条件と組合せて存在する時、疾患を引き起こす。疾患対立遺伝子は、遺伝子プール中に存在するか、または体細胞変異により個体で新規に生成される。例えば疾患対立遺伝子には以下がある：鎌状赤血球貧血対立遺伝子、テイ・サックス病対立遺伝子、嚢胞性繊維症対立遺伝子、レッシュ‐ナイハン症候群対立遺伝子、網膜芽細胞腫対立遺伝子、ファブリ病対立遺伝子、ハンチントン舞踏病対立遺伝子。本明細書において疾患対立遺伝子は、ヒトの疾患に関連する対立遺伝子および認識されている動物の疾患に関連する対立遺伝子を包含する。
【００３８】
本明細書において用語「細胞取り込み成分」とは、直接または間接に核酸分子に結合すると、例えば少なくとも１つの種類の細胞への例えば核酸分子の細胞内取り込みを増強する物質を意味する。細胞取り込み成分には、特に限定されないが以下がある：肝細胞アシアロ糖タンパク質受容体を介して肝細胞にインターナライズされることが可能なガラクトース−末端（アシアロ−）糖タンパク質のような特異的細胞表面受容体、ポリ陽イオン（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）、および／または核酸分子と形成されるタンパク質−脂質複合体。当業者は、上記の種々の組合せ、ならびに別の細胞取り込み成分を周知している。
【００３９】
一般に、以下で使用されかつ細胞培養、分子遺伝学、および核酸化学および後述のハイブリダイゼーションで使用される命名法は、当該分野で公知であり、一般的に使用されている。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、細胞培養、およびトランス遺伝子には、標準的方法が使用される。一般的な酵素反応、オリゴヌクレオチド合成、オリゴヌクレオチド修飾、および精製工程は、製造業者の説明書に従って行われる。方法と操作は一般的に、当該分野の従来法および本文書を通して提供される種々の一般的文献に従って行われる。そこに記載の操作は当該分野で公知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。そこに記載のすべての情報は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００４０】
ターゲティングポリヌクレオチドを含む核酸分子
ターゲティングポリヌクレオチドを含む核酸分子は、オリゴヌクレオチドの化学合成、配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅（またはリガーゼ連鎖反応増幅）、目的の配列を有する原核生物もしくは標的クローニングベクター（例えば、クローン化ｃＤＮＡもしくはゲノムクローン、またはこれらの一部）の精製、例えばプラスミド、ファジミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、コスミド、バクテリオファージＤＮＡ、他のウイルスＤＮＡもしくは複製中間体、またはこれらの精製制限断片、ならびに所望のヌクレオチド配列を有する１本鎖および２本鎖ポリヌクレオチドの他の供給源により産生される。
【００４１】
ターゲティングポリヌクレオチドは一般に、すなわち約２〜１００ヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約５〜約１００ヌクレオチドの長さ、さらに好ましくは少なくとも約２０〜約２００ヌクレオチドの長さ、少なくとも約５０〜約５００ヌクレオチドの長さ、または２０００ヌクレオチド、またはそれ以上である；しかし核酸分子の長さが約２０，０００〜５０，０００〜４００，０００ヌクレオチドを超えると、完全な核酸分子を細胞中に移行させる効率は低下する。ターゲティングポリヌクレオチドの長さは、配列組成とあらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列の複雑さ、および当該分野で提供される指針（ヘースティ（Hasty）ら、1991、およびシュルマン（Shulman）ら、1990）に記載の指針に基づき、実施者の考えにより選択される。好適な実施態様において核酸分子に対するターゲティングポリヌクレオチドの長さは、約０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１または０．１〜１００％であるが、約１〜約２０％、または約１〜約１０％でもよい。
【００４２】
ターゲティングポリヌクレオチドは、あらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的な少なくとも１つの配列を有する［すなわち、標的細胞中に存在するポリヌクレオチド（ウェーハー、染色体、ミトコンドリア、葉緑体、ウイルス、エピソーム、またはマイコプラズマポリヌクレオチド）のＤＮＡ配列、または外因性（単離された）染色体外配列中のＤＮＡ配列］。そのようなターゲティングポリヌクレオチドは、あらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列との相同的対合の基質として作用する。ターゲティングポリヌクレオチドは、典型的には本発明の核酸分子の５’末端、３’末端にまたはその近傍に、内部に、５’と３’末端に、またはこれらの任意の組合せに存在し、および好ましくはがターゲティングポリヌクレオチドは、組換えのための基質の１本鎖部分の少なくとも一部（この部分はリコンビナーゼに結合することができる）に含まれる。実質的に相補的な配列をターゲティングするレベルまたはターゲティングするのに有用な量のリコンビナーゼに結合することができる１本鎖領域は、好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド、および好ましくは２０ヌクレオチドの長さより大きい。ターゲティングポリヌクレオチドを含む組換えのための基質の１本鎖領域へのリコンビナーゼの付加は、相同的配列間の相同的組換えの効率を上昇させる可能性がある。リコンビナーゼの付加はまた、短い（約２０ヌクレオチドの長さ）セグメントの相同性を有するターゲティングポリヌクレオチドを用いる、またはより長い相同性のセグメントを有するターゲティングポリヌクレオチドを用いる効率的な遺伝子ターゲティングを可能にする可能性がある。
【００４３】
ターゲティングポリヌクレオチドは、あらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列に相同性の高い配列を有することが好ましい。典型的には本発明のターゲティングポリヌクレオチドは、少なくとも約１２〜３５ヌクレオチドの長さの少なくとも１つの相同性の領域を有し、相同性は約１２〜３５ヌクレオチドの長さであることが好ましく、さらに好ましくは少なくとも５０〜５００ヌクレオチドの長さであるが、ターゲティングポリヌクレオチドと標的配列との配列相同性の程度および標的配列の塩基組成が、最適かつ最小の相同性長さを決定する（例えば、Ｇ−Ｃリッチな配列は典型的には、熱力学的に安定であり、一般により短い長さを必要とする）。従って相同性長さと配列相同性の程度の両方とも、特定のあらかじめ選択された標的配列を参照してのみ決定することができるが、相同性は一般に少なくとも１２ヌクレオチドの長さであり、およびあらかじめ選択された標的配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的でなければならない。好ましくは相同性は少なくとも１２ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約２２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの長さであり、あらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列と同一であるかまたは相補的である。
【００４４】
ヘテロ２本鎖結合部の形成は厳密なプロセスではない：遺伝学的証拠は、減数分裂的遺伝子変換と異常な減数分裂的分離の古典的現象が、一部は、ヘテロ２本鎖結合部中のミスマッチ塩基対の存在と、複製前のこれらのミスマッチ塩基対の一部の以後の補正により生じるという見解を支持する。ＲｅｃＡタンパク質についての観察は、完全なまたはほとんど完全な相同性からの関連性の区別に影響を与え、かつヘテロ２本鎖結合部中のミスマッチ塩基対の存在に影響を与えるパラメータについての情報を与えた。ＲｅｃＡタンパク質が、すべての単一の塩基対ミスマッチを超えて鎖交換を行い、超らせんＤＮＡの浩瀚なミスマッチ結合部を形成する能力は、組換えと遺伝子変換におけるその役割を反映する。この修復ミスの多いプロセスはまた、突然変異誘発におけるその役割に関連している。ｐｈｉＸ１７４とＧ４（これらは約７０パーセント相同的である）を含むＲｅｃＡ介在対合反応は、相同的な組み換え体を与え（カニンガム（Cunningham）ら、1981）たが、ＲｅｃＡは、相同性の高い配列の間で優先的に相同的結合部を形成し、侵入するＤＮＡ鎖と受容体ＤＮＡ鎖との相同性検索プロセスを仲介して、高相同性領域で比較的安定なヘテロ２本鎖を産生する可能性が高い。従ってリコンビナーゼは、かなり（しかし完全ではない）相同性の高い鎖の間の相同的組換え反応を進めることができ、これは標的配列の遺伝子変換と修飾を可能にする。すなわちターゲティングポリヌクレオチドを含む核酸分子を含む本発明の基質は、あらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列に１つ以上のヌクレオチド置換、挿入および／または欠失を導入し、改変（ターゲティング）されたＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質に対応するアミノ酸置換、挿入および欠失を導入するのに使用される。
【００４５】
好適な実施態様において本方法は、２つの核酸分子を含む基質を使用し、各分子は、あらかじめ選択された標的配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、各核酸分子は５’末端または３’末端を有し、その配列は、他の核酸分子のそれぞれ３’末端または５’末端に相補的配列を持たない。好ましくは、リコンビナーゼに接触または細胞に導入前に、基質は部分的に２本鎖である（少なくともターゲティングポリヌクレオチドの相補性により）。基質は、核蛋白質複合体を形成するように、ＲｅｃＡ、他のリコンビナーゼまたは複数のリコンビナーゼとインキュベートされる。この複合体は染色体外配列と混合されて、組換え中間体を形成した後、標的細胞に導入されるか、または直接細胞に導入される。ある実施態様において細胞は原核細胞、例えば大腸菌（E. coli）細胞である。
【００４６】
あるいは、各分子があらかじめ選択された標的配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含み、核酸分子の少なくとも１つは５’末端または３’末端を有し、その配列は他の核酸分子の各３’末端または５’末端に相補的配列を持たない、２つの核酸分子を含む基質の変性型が、不１つのリコンビナーゼとインキュベートされて、核蛋白質複合体を形成する。上記したようにこの複合体は染色体外配列と混合して、組換え中間体を形成した後、標的細胞に導入されるか、または直接細胞に導入される。
【００４７】
基質およびリコンビナーゼは、個々に、順に、または連続して細胞に導入されるか、または染色体外配列と混合されて細胞に導入される。基質の１本鎖部分は、リコンビナーゼのローディングプロセスを増強する配列を含有し、例えばＲｅｃＡローディング配列はリコンビナーゼ性核形成配列のポリ［ｄ（Ａ−Ｃ）］であり、その相補的はポリ［ｄ（Ｇ−Ｔ）］である。２本鎖配列はポリ［ｄ（Ａ−Ｃ）−ｄ（Ｇ−Ｔ）［ｎ］であり、ここでｎは５〜２５である。
【００４８】
緩和または線状化２本鎖ＤＮＡ標的と比較して陰性のスーパーコイルＤＮＡ標的とハイブリダイズした１つの１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）プローブの間で形成されるＲｅｃＡタンパク質介在Ｄ−ループの安定性に基本的な差があるようである。ｓｓＤＮＡにハイブリダイズした緩和または線状化２本鎖ＤＮＡ標的上の、内部に位置する２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的配列は、単一のＤ−ループを産生し、これはＲｅｃＡタンパク質を除去後は不安定である（アズマ（Adzuma）、1992；フシエ（Hsieh）ら、1992；およびチュー（Chiu）ら、1993）。
【００４９】
線状２本鎖ＤＮＡ標的と形成されたハイブリッドのＤＮＡ不安定性はおそらく、入ってくるｓｓＤＮＡプローブＷ−Ｃが２本鎖標的の相補的ＤＮＡ鎖と塩基対合して、他のＤＮＡ鎖中で塩基対合を破壊することが原因であろう。タンパク質を含まない単一のＤ−ループ中で対合していないｓｓＤＮＡコンフォメーション中の置換されたＤＮＡ鎖を維持するのに必要な高いフリーエネルギーは、陰性のスーパーコイルＤＮＡ標的に固有の保存されたフリーエネルギーにより、第２の相補的ｓｓＤＮＡの添加により、または結合部ＤＮＡ分子の遠い末端で開始される塩基対合により補償されて、交換された鎖が自由に絡み合うことを可能にする。単一のＤ−ループを含有する３鎖への第２のＲｅｃＡ被覆相補的ｓｓＤＮＡの付加は、２重Ｄ−ループの形成を介して２本鎖標的ＤＮＡの遊離の末端から遠くに位置するハイブリッド結合部を安定化される（パチ（Pati）ら、1997）。しかし後述の例に記載するように、組換え中間体の構造は、プロテアーゼ消化後に不安定であった。すなわち２重Ｄ−ループは、本発明の中間体に存在する構造ではない。
【００５０】
リコンビナーゼタンパク質
リコンビナーゼは、ターゲティングポリヌクレオチドを含む核酸分子に含まれると、ＤＮＡに機能できる形で結合し、相同的対合と相同的ＤＮＡ分子間のＤＮＡ鎖交換とを促進することにより、ターゲティングポリヌクレオチドとあらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列との組換え頻度および／または局在化頻度の、測定可能な上昇を与える。
【００５１】
本発明においてリコンビナーゼは、同じ機能（特に：（ｉ）ターゲティングポリヌクレオチドをその相同的標的上に正しく結合しかつ位置させるリコンビナーゼの能力、および（ii）相補的標的配列を効率的に見つけかつからの結合するリコンビナーゼ／ターゲティングポリヌクレオチド複合体の能力）の基本的にすべてまたはほとんどを有するＲｅｃＡ様組換えタンパク質のファミリーを意味する。本発明の範囲内のリコンビナーゼは、天然の起源から得られるものであり、例えば野生型リコンビナーゼを有する細胞、または組換え産生したリコンビナーゼ、例えば変異体もしくはキメラリコンビナーゼ（対応する天然に存在するリコンビナーゼに対して活性が上昇したリコンビナーゼを含む）を含む。
【００５２】
最も解析されているＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（E. coli）由来であり、野生型タンパク質以外に、多くの変異体ＲｅｃＡ様タンパク質が同定されている（例えば、ＲｅｃＡ８０３；マジラジュ（Madiraju）ら、1988；マジラジュ（Madiraju）ら、1992；ラベリー（Lavery）ら、1992；およびコワルクジコウスキー（Kowalczykowski）ら、1994）。さらに、多くの生物が、鎖移送活性を有するＲｅｃＡ様リコンビナーゼを有する（例えば、フギサワ（Fugisawa）ら、1985；フシエ（Hsieh）ら、1986；フシエ（Hsieh）ら、1989；フィシェル（Fishel）ら、1988；カッスト（Cassuto）ら、1987；ガネア（Ganea）ら、1987；ムーア（Moore）ら、1990；キーネ（Keene）ら、1984；キメイック（Kimeic）、1984；クメイック（Kmeic）、1986；コロドナー（Kolodner）ら、1987；スギノ（Sugino）ら、1985；ハルブルーク（Halbrook）ら、1989；エイセン（Eisen）ら、1988；マカーシー（McCarthy）ら、1988；ローウェンハウプト（Lowenhaupt）ら、1989）。そのようなリコンビナーゼタンパク質の例には、特に限定されないが、ＲｅｃＡ、ＲｅｃＡ８０３、ＵｖｓＸ、および他のＲｅｃＡ変異体、およびＲｅｃＡ様リコンビナーゼ（ロカ（Roca）、1990）、Ｓｅｐ１（コロドナー（Kolodner）ら、1987；チシュコフ（Tishkoff）ら）、ＤＳＴ２、ＫＥＭ１、ＸＲＮ１（ディクストラ（Dykstra）ら、1991）、ＳＴＰアルファ／ＤＳＴ１（クラーク（Clark）ら、1991）、ＨＰＰ−１（ムーア（Moore）ら、1991）、他の標的リコンビナーゼ（ビショップ（Bishop）ら、1992、およびシノハラ（Shinohara）ら、1992）、およびＲａｄＡ、例えばアルカエグロブス・フルギヅス(Archaeoglobus fulgidus）（コワルクジコウスキー（Kowalczykowski）ら、1994）由来のものがある。他の例には、ＲｅｃＴ（コワルクジコウスキー（Kowalczykowski）ら、1994）、およびＲｅｄβ（コワルクジコウスキー（Kowalczykowski）ら、1994）がある。ＲｅｃＡは、大腸菌（E. coli）、他の細菌株、例えばサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、または真核細胞から精製される。ある株は、細胞当たりのコピー数の大きい「ランアウェイ」複製プラスミドベクター上にＲｅｃＡコード配列を含有する。ＲｅｃＡ８０３タンパク質は、野生型ＲｅｃＡの高活性変異体である。当該分野は、リコンビナーゼタンパク質のいくつかの例、例えばキイロショウジョウバエ（Drosophila）、酵母、植物、ヒト、および非ヒト哺乳動物細胞からのタンパク質、ＲｅｃＡと同様の生物学的性質を有するタンパク質（すなわち、ＲｅｃＡ様リコンビナーゼ）、例えば哺乳動物や酵母からのＲａｄ５１、およびＰｋ−ｒｅｃ（ラシド（Rashid）ら、1997）があることを教示する。さらにリコンビナーゼは実際は、タンパク質、すなわち「リコンビノソーム」の複合体でもよい。さらにリコンビナーゼの定義に含まれるのは、リコンビナーゼ生物活性を保持するリコンビナーゼの一部もしくは断片、ならびに生物活性を保持する野生型リコンビナーゼの変種もしくは変異体、例えばリコンビナーゼ活性が増強されている大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡ８０３変異体、および非リコンビナーゼ配列にもしくは異なる供給源からのリコンビナーゼ配列に機能できる形で結合したリコンビナーゼ配列を含むキメラ配列がある。
【００５３】
好適な実施態様においてＲｅｃＡまたはＲａｄ５１が使用される。例えばＲｅｃＡタンパク質は典型的には、タンパク質を過剰産生する細菌株から得られる：野生型大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡタンパク質および変異体ＲｅｃＡ８０３タンパク質はそのような株から精製してもよい。あるいはＲｅｃＡタンパク質はまた、例えばアマシャム・バイオサイエンシーズ（Amersham Biosciences）（ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）から購入してもよい。
【００５４】
ＲｅｃＡタンパク質とその同族体は、ｓｓＤＮＡを被覆する時、核蛋白質複合体を形成する。この核蛋白質複合体では、ＲｅｃＡタンパク質の１つのモノマーが約２．５〜３つのヌクレオチドに結合している。ＲｅｃＡがｓｓＤＮＡを被覆するこの性質は基本的に配列に依存しないが、特定の配列はポリヌクレオチド（例えば、核形成配列）へのＲｅｃＡの初期の付加を促進する。核蛋白質複合体は、基本的に任意のＤＮＡ分子上で形成され、細胞中で形成することができる。
【００５５】
本発明の基質のリコンビナーゼ被覆
核酸基質をＲｅｃＡタンパク質やＡＴＰγＳのようなリコンビナーゼで被覆するのに使用した条件は、例えば米国特許第５，２７３，８８１号、米国特許第５，２２３，４１４号または米国特許第５，９４８，６５３号、ならびに後述の例に記載されている。後述の例は、大腸菌（E. coli）またはサーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡの使用に関するが、当業者により理解されるように、他のリコンビナーゼを使用してもよい。核酸基質は、ＧＴＰγＳ、ＡＴＰγＳとｒＡＴＰとの混合物、ｒＧＴＰおよび／またはｄＡＴＰ、またはｄＡＴＰもしくはｒＡＴＰ単独を使用して、ｒＡＴＰ生成系（シグマ（Sigma））の存在下で被覆される。ＧＴＰγＳ、ＡＴＰγＳ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ｄＡＴＰおよび／またはｒＡＴＰまたは他のヌクレオチドの種々の混合物も使用でき、特にＡＴＰγＳとｄＡＴＰとの混合物が好ましい。
【００５６】
核酸基質のＲｅｃＡタンパク質被覆は、典型的には後述のように、または米国特許第５，２７３，８８１号または米国特許第５，９４８，６５３号に記載のように行われる。簡単に説明すると基質（完全に１本鎖かまたは部分的に１本鎖）が、ＡＴＰγＳとｄＡＴＰとを含有する標準的ＲｅｃＡ被覆反応緩衝液に、４２℃（大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡ）または６５℃〜７５℃（サーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡ）で加えられ、ここにＲｅｃＡタンパク質が加えられる。あるいは被覆反応は、他の温度、例えば３０℃もしくは３７℃で行ってもよい。あるいはＲｅｃＡタンパク質は、基質を加える前に、緩衝液成分およびＡＴＰγＳやｄＡＴＰとともに含めてもよい。
【００５７】
基質のＲｅｃＡタンパク質被覆は通常、標準的１×ＲｅｃＡ被覆反応緩衝液で行われる。被覆反応中のＲｅｃＡタンパク質濃度は、基質の大きさと量により変化する。
【００５８】
ＲｅｃＡタンパク質による基質の被覆は、多くの方法で評価することができる。まず、ＤＮＡへのタンパク質の結合は、バンドシフトゲル測定法（メンテ（Menthe）ら、1981、および実施例１を参照）を使用して調べることができる。標識ポリヌクレオチドは、ＡＴＰγＳの存在下でＲｅｃＡタンパク質により被覆することができ、被覆反応の生成物はゲル電気泳動により分離される。ＲｅｃＡタンパク質と基質をインキュベート後、ＲｅｃＡタンパク質は１本鎖領域を有効に被覆する。基質中のヌクレオチドに対するＲｅｃＡタンパク質モノマーの比が増加すると、基質の電気泳動移動度が、ＲｅｃＡ結合のために遅延する。被覆基質の移動度の遅延は、ＲｅｃＡタンパク質による基質の飽和の程度を反映する。短い基質の効率的なＲｅｃＡ被覆のためには、ＤＮＡヌクレオチドに対して過剰のＲｅｃＡモノマーが必要である（レーイ（Leahy）ら、1986）。
【００５９】
ＤＮＡへのタンパク質結合を評価するための第２の方法は、ニトロセルロースフィルター結合測定法の使用である（レーイ（Leahy）ら、1986、およびウッドベリー（Woodbury）ら、1983）。ニトロセルロースフィルター結合法は、標識ＤＮＡを使用してタンパク質：ＤＮＡ複合体の解離速度を測定するのに特に有用である。フィルター結合測定法では、フィルター上にＤＮＡ：タンパク質複合体が保持され、遊離のＤＮＡはフィルターを通過する。この測定法は、遊離のターゲティングポリヌクレオチドからのＤＮＡ：タンパク質複合体の分離が非常に迅速であるため、解離速度測定についてより定量的である。
【００６０】
細胞取り込み成分
本発明の核酸分子は、典型的には共有結合または好ましくは非共有結合により、細胞取り込み成分に随時結合される。具体的な細胞の種類へのＤＮＡのターゲティングについて、当該分野で種々の方法が記載されている。本発明の核酸分子は、当該分野で公知のいくつかの細胞取り込み成分の基本的にすべてに結合することができる。本発明のある態様において、少なくとも１つの関連リコンビナーゼを有する基質は、受容体介在取り込み機構、例えばアシアロ糖タンパク質受容体介在取り込みプロセスの利点を利用して、インビトロで培養細胞に、またはインビボで真核細胞に（すなわち、無傷の動物中）ターゲティングされる。この変種態様では、ターゲティングポリヌクレオチドを含む核酸分子は、リコンビナーゼと細胞取り込み成分とに結合され、これは、無傷の個体中の少なくとも１つの種類の細胞への核酸分子の取り込みを増強する。例えば、細胞取り込み成分は典型的には以下がある：（１）インビボで肝細胞上の特殊な受容体（アシアロ糖タンパク質受容体）により認識されインターナライズされることが可能なガラクトース−末端（アシアロ−）糖タンパク質（例えば、アシアロオロソムコイド）、および（２）通常静電相互作用により核酸分子に結合する、ポリ陽イオン、例えばポリエチルイミン（ＰＥＩ）上のポリ−Ｌ−リジン。
【００６１】
肝細胞へのターゲティングのために、当該分野で開示され参照することにより本明細書に組み込まれる方法により、核酸分子をアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）−ポリ−Ｌ−リジン結合体に結合することができる（ウー（Wu）とウー（Wu）、1987；ウー（Wu）とウー（Wu）、1988a；ウー（Wu）とウー（Wu）、1988b；ウー（Wu）とウー（Wu）、1992；ウー（Wu）ら、1991；ウィルソン（Wilson）ら、1992；ＷＯ９２／０６１８０；ＷＯ９２／０５２５０；およびＷＯ９１／１７７６１）。
【００６２】
あるいは、核酸分子を少なくとも１つの脂質種および少なくとも１つのタンパク質種とインキュベートして、基本的に核酸分子と脂質−タンパク質細胞取り込み成分からなるタンパク質−脂質−ポリヌクレオチド複合体を形成して、細胞取り込み成分を形成することができる。脂質小胞はフェルグナー（felgner）（ＷＯ９１／１７４２４）、および／または陽イオン性脂質化（ＷＯ９１／１６０２４）、またはポリヌクレオチド投与のための他の型（ＥＰ４６５，５２９）を、細胞取り込み成分として使用してもよい。ヌクレアーゼを使用してもよい。
【００６３】
典型的には、リコンビナーゼと細胞取り込み成分の両方が基質に結合するように、基質はリコンビナーゼと細胞取り込み成分で同時に被覆される；あるいは基質は、リコンビナーゼで被覆した後に、細胞取り込み成分とインキュベートされる；あるいは基質は、細胞取り込み成分で被覆され、別に供給されたリコンビナーゼ（例えば、１つ以上のリコンビナーゼを含有するターゲティングされたリポソーム）と同時に細胞に導入される。本発明の基質は細胞取り込み成分に結合され、少なくとも１つのリコンビナーゼで被覆され、生じる細胞ターゲティング複合体は、基質とリコンビナーゼが標的細胞中にインターナライズされるように、取り込み条件（生理学的条件）下で接触させられる。最も好ましくはリコンビナーゼと細胞取り込み成分の被覆は、基質上のすべての利用可能な結合部位を飽和させる。基質は、生じるターゲティング複合体がモルベースでリコンビナーゼより多くの細胞取り込み成分を含有するように、細胞取り込み成分で優先的に被覆される。あるいは基質は、生じるターゲティング複合体がモルベースで細胞取り込み成分より多くのリコンビナーゼを含有するように、細胞取り込み成分で優先的に被覆される。
【００６４】
特に、例えば遺伝子疾患（新生物を含む）を治療するための遺伝子治療のようなインビボ遺伝子ターゲティング応用、およびウイルス感染症を治療するためのターゲティング相同的組換えのために、細胞取り込み成分は、本発明のリコンビナーゼ被覆ターゲティングポリヌクレオチドとともに含有されて、細胞へのリコンビナーゼ被覆ターゲティングポリヌクレオチドの取り込みを増強させ、ここでウイルス配列（例えば、組み込まれたＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムまたはゲノム断片）は、相同的配列ターゲティングによりターゲティングされて不活性化される。あるいは、基質は細胞取り込み成分で被覆され、リコンビナーゼ投与と同時に細胞にターゲティングされる（例えば、リコンビナーゼを含有するリポソームもしくは免疫リポソーム、およびリコンビナーゼをコードし発現するベクター）。
【００６５】
細胞取り込み成分以外に、当該分野で公知のように核局在化シグナルのようなターゲティング成分を使用してもよい。
【００６６】
化学置換基を有する核酸分子の相同的対合
化学置換基を含有する少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドはまた、無傷の生きた標的細胞中のあらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列にターゲティングされて、化学置換基、例えば架橋剤、金属キレート剤（例えば、鉄触媒切断のための鉄／ＥＤＴＡキレート）、トポイソメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、リガーゼ、ホスホジエステラーゼ、光感作ポルフィリン、フリーラジカル生成剤、化学療法剤（例えば、アドリアマイシンまたはドキソルビシン）、挿入物質、塩基修飾剤、塩基類似体、および修飾塩基（例えば、蛍光色素、またはビオチンやジゴキシゲニンのような親和性タグを含有する）、免疫グロブリン鎖、オリゴヌクレオチド、および他の置換基の配列特異的ターゲティングを可能にする。本発明の方法は、種々の応用［例えば、配列特異的鎖切断の発生、配列特異的化学修飾の作成（例えば、塩基メチル化または鎖架橋）、ポリペプチド配列特異的局在化の作成（例えば、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、またはプロテアーゼ）、ポリヌクレオチド配列特異的局在化の作成（例えば、転写因子および／またはＲＮＡポリメラーゼのローディング部位）および他の応用］のために、相同的対合によりあらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列に、そのような化学置換基をターゲティングするのに使用することができる。
【００６７】
すなわちリコンビナーゼおよび随時細胞取り込み成分以外に、核酸分子は化学置換基を含んでもよい。付加された化学置換基で修飾された外因性核酸分子を含む基質は、代謝活性のある標的細胞中にリコンビナーゼ（例えば、ＲｅｃＡ）とともに導入されて、あらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列と相同的対合をする。好適な実施態様において核酸分子は誘導体化され、ポリヌクレオチド合成中または後に追加の化学置換基が結合され、こうして特異的外因性標的配列に局在化され、ここでこれらは、局所ＤＮＡ配列に変化や化学修飾を加える。好適な結合される化学置換基には、特に限定されないが、架橋剤、金属キレート剤（例えば、鉄触媒切断のための鉄／ＥＤＴＡキレート）、トポイソメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、リガーゼ、ホスホジエステラーゼ、光感作ポルフィリン、化学療法剤（例えば、アドリアマイシン、ドキソルビシン）、挿入物質、標識物、塩基修飾剤、標識物のような核酸に通常結合する物質（例えば、アフォニナ（Afonina）ら、1996参照）、免疫グロブリン鎖、およびオリゴヌクレオチドがある。ＤＮＡ配列の局所的切断が所望の場合、鉄／ＥＤＴＡキレートは特に好ましい化学置換基である（ヘルツバーグ（Hertzberg）ら、1982；ヘルツバーグ（Hertzberg）とダーバン（Dervan）、1984；テイラー（Taylor）ら、1984；ダーバン（Dervan）、1986）。さらに好適なものは、相補的１本鎖核酸が互いにハイブリダイズすることを妨害するが非修飾核酸へのハイブリダイゼーションは妨害しない基である；例えばクトリアビン（Kutryavin）ら、1996、とウー（Woo）ら、1996を参照）。２’−Ｏ−メチル基もまた好ましい（コール−ストラウス（Cole-Strauss）ら、1996；ユーン（Yoon）ら、1996）。さらに好適な化学置換基には、標識残基（蛍光標識物を含む）がある。好適な結合化学物質には、例えば付加された反応性アミノ基（コーレイ（Corey）とシュルツ（Schultz）、1988）を介する直接結合、および他の直接結合化学物質があるが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン抗体結合法も使用される。化学置換基を連結する方法は、米国特許第５，１３５，７２０号、５，０９３，２４５号および５，０５５，５５６号に記載されている（これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）。他の結合化学物質は、実施者の考えにより使用してもよい。
【００６８】
細胞への導入
リコンビナーゼ−基質組成物（標的ＤＮＡを含む単離された染色体外配列を随時含む）がいったん調製されると、これらは標的細胞中に導入または投与される。投与は典型的には、細胞への核酸の投与について公知のように行われ、当業者には理解されるように、その方法は標的細胞の選択に依存する。適当な方法には、特に限定されないが、Ｃａ2+介在形質転換、微量注入法、エリスロポエチン、リポフェクションなどがある。本明細書において「標的細胞」とは、原核細胞または真核細胞を意味する。適当な原核細胞には、特に限定されないが、細菌、例えば大腸菌（E. coli）、バチルス（Bacillus）種、サルモネラ（Salmonella）種、ストレプトミセス（Streptomyces）種、および極限環境微生物（extremophile）、例えば好熱性細菌、古細菌などがある。好ましくは原核生物の標的細胞は組換えコンピタントである。適当な真核細胞には、特に限定されないが、真菌、例えば酵母および糸状菌、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）、例えばエス・セレビッシェ（S. cerevisiae）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、例えばエス・ポンベ（S. pombe）、ピチア（Picchia）、アスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、およびノイロスポラ（Neurospora）；植物細胞、例えばトウモロコシ、モロコシ、タバコ、カノーラ、ダイズ、綿、トマト、ジャバイモ、アルファルファ、ヒマワリ、アラビドプシス（Arabidopsis）、コムギなど；および動物細胞、例えば昆虫（例えば、キイロショウジョウバエ（Drosophila））、ウオ（例えば、フグ・ルブリペス（Fugu rubripes））、鳥および哺乳動物の細胞がある。適当なウオ細胞には、特に限定されないが、サケ、マス、テラピア、マグロ、コイ、ヒラメ、カレイ、メカジキ、タラ、ゼブラダニオ、およびフグの細胞がある。適当な鳥細胞には、特に限定されないが、ニワトリ、アヒル、ウズラ、キジおよび七面鳥、および他のジャングルの鳥、猟鳥の細胞がある。適当な哺乳動物細胞には、特に限定されないが、ウマ、ウシ、バッファロー、ブタ、シカ、ヒツジ、ウサギ、げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスターおよびモルモット、ヤギ、ブタ、霊長類、海洋性哺乳動物（イルカやクジラを含む）、ならびに細胞株、例えば任意の組織または幹細胞のヒト細胞株、および幹細胞（多能性および非多能性を含む）および非ヒト受精体の細胞がある。
【００６９】
好適な実施態様において、原核細胞が使用される。この実施態様において、改変のためにあらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列が選択される。好ましくはあらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列は染色体外配列中に含有される。本明細書において「染色体外配列」とは、染色体配列から分かれた配列を意味する。好適な染色体外配列には、プラスミド（特に原核生物性プラスミド、例えば細菌プラスミド）、コスミド、ファジミド、Ｐ１ベクター、ウイルスゲノム、酵母、細菌および哺乳動物人口染色体（それぞれＹＡＣ、ＢＡＣおよびＭＡＣ）、および他の自立的自己複製配列があるが、これが必要ではない。本明細書に記載のように、リコンビナーゼと、染色体外配列上に含有される標的配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含む一対の核酸分子を含む基質（この基質は少なくとも１つの１本鎖末端を含む）が、インビトロで染色体外配列に加えられる。ある実施態様において核酸分子の少なくとも１つは、標的ＤＮＡ配列に対して少なくとも１つのヌクレオチド置換、挿入または欠失を含む。核酸分子中のターゲティングポリヌクレオチドは、染色体外配列中の標的ＤＮＡ配列に結合して、相同的組換えを行い、組換え中間体を形成する。中間体は次に、当該分野で公知の方法を使用して原核細胞中に導入される。これらの方法はまた、真核細胞についても使用される。ある具体的な実施態様において、核酸分子は目的の核酸断片を含み、その配列は標的配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的であり、この断片はターゲティングポリヌクレオチドの間に置かれる。この実施態様においてターゲティング相同的組換えにより、染色体外配列中に断片が挿入される。
【００７０】
あるいはあらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列は、細胞中の染色体配列であるかまたは染色体外配列である。この実施態様において、リコンビナーゼと基質とを含む核蛋白質複合体は標的細胞中に導入される。基質とリコンビナーゼは相同的組換えを行うように機能して、改変したゲノム染色体配列または染色体外配列を与える。すなわち基質中に存在する配列は、染色体外配列または染色体中に挿入され、ならびに染色体外配列もしくは染色体から配列を欠失するのに、または染色体外配列もしくは染色体から配列を置換するのに使用される。
【００７１】
ある実施態様において、トランスジェニック非ヒト動物を調製するのに有用な真核細胞が使用される、トランスジェニック動物は、他の遺伝子（例えばレポーター遺伝子）で遺伝子またはその一部（例えば、遺伝子のコード配列またはその一部）を置換する、別の種（「ノックイン」）か、または内因性遺伝子またはその一部の欠失を含む別の種（「ノックアウト」）からの遺伝子またはその一部からしばしば得られる、染色体中の遺伝子または遺伝子構築体の安定に組み込まれたコピーを含有する生物である。外来遺伝子のクローン化ＤＮＡ構築体を、種々の方法（相同的組換えを含む）により全能性細胞に導入することにより、これらの動物を作成することができる。遺伝的改変した全能性細胞から発生する動物は、すべての体細胞中の内因性遺伝子に外来遺伝子または欠失を有し、また最初の細胞分裂前に受容体細胞のゲノムに外来遺伝子が組み込まれるなら、生殖細胞系細胞中に外来遺伝子または欠失を有する。トランスジェニック体を作成するための現在の方法は、全能性の胚幹細胞（ＥＣ）についてかつ受精した接合体で行われている。ＥＣ細胞は、多数の細胞をインビトロで相同的組換えにより容易に操作でき、その後トランスジェニック体を作成するのに使用できるという利点を有する。あるいはＤＮＡはまた、前核への微量注入法により受精卵母細胞中に導入することができ、次に擬妊娠受容体動物の子宮に移して満期まで成長させる。トランスジェニック非ヒト動物（相同的にターゲティングされた非ヒト動物を含む）を作成するために、胚幹細胞（ＥＳ細胞）と充分な誠意した接合体が好ましい。
【００７２】
好適な実施態様において、例えばトランスジェニック動物を作成するために、当該分野で公知の技術を使用して非ヒト接合体が使用される（米国特許第４，８７３，１９１号を参照）。好適な接合体には、特に限定されないが、動物接合体があり、例えばキイロショウジョウバエ（Drosophila）、ウオ、トリおよび哺乳動物接合体を含む。適当なウオの接合体には、特に限定されないが、サケ、マス、マグロ、コイ、ヒラメ、カレイ、メカジキ、タラ、ティラピア、ゼブラダニオ、およびフグの接合体がある。適当なトリの接合体には、特に限定されないが、ニワトリ、アヒル、ウズラ、キジ、七面鳥、および他のジャングルの鳥、猟鳥の接合体がある。適当な哺乳動物細胞の接合体には、特に限定されないが、ウマ、ウシ、バッファロー、シカ、ブタ、シカ、ヒツジ、ウサギ、げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスターおよびモルモット、ヤギ、ブタ、霊長類、海洋性哺乳動物（イルカやクジラを含む）の細胞がある。
【００７３】
目的のＤＮＡセグメントを含有するベクターは、公知の方法により細胞宿主の種類に依存して、宿主細胞中に移すことができる。例えば、標的細胞について微量注入法が一般に使用されるが、リン酸カルシウム処理、電気穿孔法、リポフェクション、バイオリスティクス、またはウイルスベースのトランスフェクションも使用される。哺乳動物細胞を形質転換するのに使用される他の方法には、ポリブレン、プロトプラスト融合などがある（一般的にはサムブルーク（Sambrook）ら、1989を参照）。ＤＮＡとリコンビナーゼおよび／またはリコンビナーゼ被覆基質の標的細胞（例えば、骨格細胞または筋肉細胞）への直接注入もまた使用される（ウルフ（Wolff）ら、1990）。
【００７４】
ＤＮＡ配列のターゲティング
本発明の方法は多くの応用で使用され、例えば染色体外配列の部位特異的突然変異誘発、例えばクローニング、または標的細胞内の内因性配列、および、動物（特に哺乳動物）の遺伝疾患の診断、治療および予防、およびトランスジェニック植物と動物を含むトランスジェニック生物の作成で使用される［例えば、非ヒト動物（特にマウスのような非ヒト動物）中の標的配列修飾を作成するためで、これは、非ヒト動物（そのような疾患対立遺伝子を有する配列修飾非ヒト動物は、ヒトと動物の新生物および他の病原性疾患の有用なモデルとなるため）で疾患対立遺伝子（例えば、ヒト疾患対立遺伝子）を作成する］。
【００７５】
一般に、遺伝子配列のようなあらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列は、本発明の基質を用いて相同的組換え（遺伝子変換を含む）により改変することができる。ある実施態様において組換えのための基質は、単一のミスマッチヌクレオチド、いくつかのミスマッチのように小さいか、または約数キロ塩基もしくはそれ以上の非相同配列までの長さでもよい、あらかじめ選択された標的配列上に存在しない配列（すなわち、非相同的部分またはミスマッチ）を含む核酸分子を含む。一般にそのような非相同的部分は、両側にターゲティングポリヌクレオチドが隣接する。非相同的部分は、あらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列中に挿入、欠失および／または置換を作成して、例えばあらかじめ選択された標的ＤＮＡ配列中に単一のもしくは複数のヌクレオチド置換を作成して、生じる組換え配列（すなわち、標的配列または組換え配列）が、核酸分子の非相同的部分の配列情報の一部もしくはすべてを取り込むようにする。すなわち非相同的領域を使用して、変種配列、すなわち標的配列修飾が作成される。付加および欠失は、１ヌクレオチドまたは１〜４キロ塩基もしくはそれ以上でもよい。こうして、種々の目的のために種々の系で部位特異的突然変異誘発が行われる。
【００７６】
ある実施態様においてターゲティングポリヌクレオチドを含む核酸分子は、構造遺伝子の変異配列を置換するかまたはこれを野生型配列（例えば、野生型の生物活性を有するタンパク質をコードする配列）に変換することにより修復するのに使用される。例えばそのような応用を使用して、ヘモグロビンのベータサブユニットをコードするヌクレオチド配列を改変して、ベータサブユニットの６位のコドンをＶａｌからＧｌｕに変換することにより、ヘモグロビン遺伝子の鎌状赤血球形質の対立遺伝子を、鎌状赤血球化の影響を受けないヘモグロビン分子をコードする対立遺伝子に変換することができるであろう（シェセリー（Shesely）ら、1991）。適切に選択された核酸分子を使用して疾患対立遺伝子中の配列情報を置換、挿入および／または欠失することは、他の遺伝疾患を部分的または全体に修正することができる。例えば特に限定されないが、ＣＦＴＲ遺伝子の欠失は、本発明のＲｅｃＡ被覆基質を使用してターゲティング相同的組換えにより修正することができる。
【００７７】
多くの種類のインビボ遺伝子治療が有効であるためには、間違ってターゲティングされた組換え事象を有する細胞の数を最小にして、多くの細胞を正しくターゲティングしなければならない。この目的を達成するためには、（１）基質、（２）リコンビナーゼ（正しい相同配列ターゲティングの効率と特異性を増強するために）、および（３）細胞取り込み成分（核酸分子の細胞取り込みを増強するために）の組合せが、インビボでの細胞の効率的かつ特異的ターゲティングの手段となり、インビボの相同配列ターゲティングおよび遺伝子治療を現実のものとする。
【００７８】
いくつかの疾患は、相同的遺伝子ターゲティングによりインビボの肝細胞ターゲティング改変により治療または予防できるかも知れない。例えば特に限定されないが、特に以下の疾患がターゲティング遺伝子治療に応答すると予測される：肝細胞癌、ＨＢＶ感染、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠陥）、アルコール感受性（アルコール脱水素酵素および／またはアルデヒド脱水素酵素不全）、肝芽細胞腫、ウィルソン病、先天性肝ポルフィリン症、肝代謝の遺伝的障害、オルニチトランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）対立遺伝子、レッシュ‐ナイハン症候群に関連するＨＰＲＴ対立遺伝子など。インビボでの肝細胞のターゲティングが所望の場合、基本的にアシアロ糖タンパク質−ポリ−Ｌ−リジン結合体からなる細胞取り込み成分が好ましい。インビボで肝細胞をターゲティングするのに使用される本発明のターゲティング複合体は、基質をリコンビナーゼの組合せによる有意に上昇したターゲティング効率を利用し、これは、ＷＯ９２／０５２５０および／またはウィルソン（Wilson）ら（1992）の方法のような細胞ターゲティング法と組合せると、肝細胞のような細胞中のインビボの相同配列ターゲティングを行うための非常に効率的な方法を提供する。
【００７９】
別の実施態様において本発明の方法と組成物は、遺伝子不活性化に使用される。すなわち、疾患対立遺伝子を修正する以外に、外因性核酸分子を使用して、細胞（またはトランスジェニック非ヒト動物）中の１つ以上の遺伝子の生物活性を不活性化、低下または改変することができる。これは、疾患の動物モデルの作成、または遺伝子機能と活性の解明（「ノックアウト」実験に似ている）に特に有用である。これらの方法を使用して生物学的機能を排除することができる：例えば、ヒトでの動物組織の異種反応性（xenoreactivity）に関連するｇａｌＴ遺伝子（アルファガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子）は破壊されてトランスジェニック動物（例えばブタ）を生成し、超急性拒絶応答に関連しない臓器移植源となるか、または例えば原核生物での病原性に関連する遺伝子を排除する。あるいは野生型遺伝子の生物活性を低下させるか、または野生型活性を改変して、疾患状態を模倣するかまたは例えば有用なタンパク質（例えばインスリン）を過剰発現させてもよい。これは、遺伝子の転写に影響を与える非コード配列（プロモーター、リプレッサー、エンハンサーおよび転写活性化配列を含む）の遺伝子操作を含む。
【００８０】
修飾すべき具体的な標的遺伝子が選択されたら、これらの配列を可能な破壊部位（例えば便利な制限部位）についてスキャンする。目的の遺伝子に欠失または挿入を有する適切なサイズの遺伝子配列を含有するプラスミドを作成し、少なくとも１つのフランキング領域は、標的ＤＮＡ配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含む。ターゲティングポリヌクレオチド配列を含むベクターは、典型的には大腸菌（E. coli）で増殖させ、次に標準的な分子生物学的方法を使用して単離するか、またはオリゴヌクレオチドとして合成される。ベクターを必要としない直接のターゲティング不活性化を行ってもよい。微量注入法を使用する時は、修飾した標的遺伝子配列のみを含有しベクターまたは選択配列の無い線状化配列を用いて、トランスフェクション法を使用することが好ましいであろう。修飾された遺伝子部位は、外因性核酸分子と内因性ＤＮＡ標的配列との相同的組換え体が、プライマーとポリメラーゼ連鎖反応を注意深く選択し、次に所望のターゲティング事象に特異的なＰＣＲ産物が存在するかどうかを検出する分析により、同定できるようなものである。
【００８１】
さらに、本発明の方法は、外因性ＤＮＡ配列、例えば外因性遺伝子または外因性遺伝子の追加のコピーを生物に付加するのに有用である。上記法については、多くの理由により行われる：例えば１つ以上の野生型遺伝子または治療遺伝子の１つ以上のコピーを付加することにより、疾患を改善するために；癌遺伝子または変異遺伝子または野生型遺伝子の余分のコピーを付加することにより、疾患モデルを作成するために；例えば腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐ５３、Ｒｂ１、Ｗｔ１、ＮＦ１、ＮＦ２およびＡＰＣ）または他の治療遺伝子を付加することにより、治療遺伝子およびタンパク質を付加するために；優れたトランスジェニック動物、例えば優れた家畜を作成するために；任意の数の宿主細胞中で、タンパク質（例えばタンパク質産生）のような遺伝子産物を産生するために。適当な遺伝子産物には、特に限定されないが、Ｒａｄ５１、アルファアンチトリプシン、アンチトロンビンIII、アルファグルコシダーゼ、コラーゲン、プロテアーゼ、ウイルスワクチン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、モノクローナル抗体、第VIII、IX、およびＸ因子、グルタミン酸脱炭酸酵素、ヘモグロビン、プロスタグランジン受容体、ラクトフェリン、子ウシ小腸アルカリホスファターゼ、ＣＦＴＲ、ヒトプロテインＣ，ブタ肝エステラーゼ、ウロキナーゼおよびヒト血清アルブミンがある。
【００８２】
すなわちある好適な実施態様において、ターゲティング配列修飾により、生物活性を有するかまたは生物活性を有するポリペプチドをコードする新規配列が作成される。好適な実施態様においてポリペプチドは、酵素活性を有する酵素である。
【００８３】
好適な実施態様において本発明の組成物と方法は、古典的な部位特異的突然変異誘発法(例えば、カセット突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発）に似た、標的配列内の任意の数の部位もしくは領域で任意の数の特異的もしくはランダムな変化を作成するための部位特異的突然変異誘発法に有用である。すなわち例えば、本発明の方法と組成物は、任意の数の系において部位特異的変種を作成するのに使用され、例えば変種を作成するのに古典的に使用される大腸菌（E. coli）、バチルス（Bacillus）、サームス（Thermus）、酵母（サッカロミセス（Saccharomyces）およびピキア（Pichia））、昆虫細胞（スポドプテラ（Spodoptera）、トリコプルシア（Trichoplusia）、キイロショウジョウバエ（Drosophila））、アフリカツメガエル（Xenopus）、げっ歯類細胞株（ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３を含む）および霊長類細胞株（ＣＯＳを含む）、またはヒト細胞（ＨＴ１０８０およびＢＴ４７４を含む）がある。これらの方法は、特定の部位、特定の配列の領域内、または全配列にわたって、特異的変化またはランダム変化を作成するのに使用することができる。
【００８４】
このおよび他の実施態様において適当な標的配列は、治療的または商業的に関連するタンパク質をコードする核酸配列を含み、特に限定されないが、酵素（プロテアーゼ、リコンビナーゼ、リパーゼ、キナーゼ、炭水化物分解酵素、イソメラーゼ、互変異性酵素、ヌクレアーゼなど）、ホルモン、受容体、転写因子、増殖因子、サイトカイン、グロビン遺伝子、免疫抑制遺伝子、腫瘍サプレッサー、癌遺伝子、補体活性化遺伝子、ミルクタンパク質（カゼイン、アルファラクトアルブミン、ベータラクトグロブリン、ウシ血清アルブミンおよびヒト血清アルブミン）、免疫グロブリン、ミルクタンパク質、薬剤学的タンパク質およびウイルス、ならびに他の所望の標的がある。
【００８５】
遺伝的多様性のライブラリー
好適な実施態様は、本発明の方法を利用して新規遺伝子と遺伝子産物を作成する。すなわち完全にまたは部分的にランダムな変化を遺伝子中に取り込んで、新規遺伝子および遺伝子産物を形成し、多くの新しい生成物を迅速かつ効率的に産生し、これらは次に、当業者に理解されているようにスクリーニングされる。
【００８６】
すなわち本発明の方法は、変種核酸配列のプールまたはライブラリー、および変種ライブラリーを含む細胞ライブラリーを作成するのに有用である。この実施態様において本発明の複数の基質が使用される。各基質は、標的配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的なターゲティングポリヌクレオチドを含む一つの核酸分子を含む。対の他のメンバーに対して、対の少なくとも１つのメンバーは、リコンビナーゼに結合できる少なくとも１つの１本鎖末端を有し、標的配列に対してターゲティングポリヌクレオチドは、少なくとも１つのミスマッチを含む。基質は、ＤＮＡ分子（例えば、１つの種からのゲノムＤＮＡ、または構造が関連する配列、例えば遺伝子ファミリー）の集団のエンドヌクレアーゼ（例えばＤＮａｓｅＩ）処理により作成される。構造はまた、当該分野で公知のＤＮＡオリゴヌクレオチド合成法を使用して合成的に作成される。
【００８７】
複数の基質は、好ましくは全標的配列の一部の領域またはすべてにわたってミスマッチのプールもしくはライブラリーを含む。しかし変種核酸分子はそれぞれ、標的配列中に１つのみまたは数個のミスマッチ（１０以下）を含む。すなわち、例えば縮重変種核酸分子のプールが作成され、そのそれぞれの変種核酸分子は、参照配列の配列に対してターゲティングポリヌクレオチド中に１つ以上のミスマッチを有し、例えばプールは、参照配列の位置の０．０１％、０．１％、１％、１０％、３０％またはそれ以上、例えば４０％〜１００％までにミスマッチを有する。さらにプール中の特定の変種核酸分子は１つのみのミスマッチ、または２つ以上の位置にミスマッチ、例えば位置の０．０１％、０．１％、１％、１０％、３０％またはそれ以上（例えば４０％〜１００％を含む）にミスマッチを含有してもよい。すなわち複数の基質は、ランダムかつ好ましくは縮重ミスマッチのプールを含む。
【００８８】
当業者には明らかなように、標的配列への変種核酸分子のプールの導入（インビトロで染色体外配列へ、またはインビボで染色体配列または染色体外配列へ）は、時間をかけて多くの相同的組換え反応を引き起こす。すなわち、単一の標的配列上で任意の数の相同的組換え反応が起きて、単一の標的配列内に広範囲の単一のおよび複数のミスマッチとそのような変種標的配列のライブラリーが作成され、これらのほとんどは、ミスマッチを含有し、ライブラリーの他のメンバーとは異なるであろう。これは、ミスマッチのライブラリーを作成するように作用する。
【００８９】
ある実施態様において変種核酸分子は、配列の特定の領域またはドメインに作成される（すなわち、特定のタンパク質またはタンパク質ドメインをコードするヌクレオチド配列）。例えば、異なる生物学的機能ドメインに影響を与えることなく、タンパク質の結合ドメインのすべての可能な変種のライブラリーを作成することが好ましいであろう。すなわち本発明の方法は、カセット突然変異誘発に似ているが配列長さに限定されない、配列の特定の領域内で多数の異なる変種を作成するのに特に有用である。さらにこれらの方法を使用して、２つ以上の領域を同時に改変してもよい。適当なドメインには、特に限定されないが、受容体結合ドメイン、転写活性化領域、プロモーター、起源、リーダー配列、ターミネーター、局在化シグナルドメイン、および免疫グロブリン遺伝子において相補性決定領域（ＣＤＲ）、Ｆc、ＶH およびＶL がある。
【００９０】
すなわち、例えば本発明の方法は、ｌａｃＺや緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような優れた組換えレポーター遺伝子；優れた抗生物質および薬剤耐性遺伝子；優れたリコンビナーゼ遺伝子；優れた組換えベクター；および他の優れた組換え遺伝子やタンパク質（免疫グロブリンを含む）、ワクチンまたは治療的価値のある他のタンパク質を作成するのに使用される。例えば、任意の数の改変を含むターゲティングポリヌクレオチドを、タンパク質の１つ以上の機能的もしくは構造ドメインに作成し、次に相同的組換えの生成物を評価してもよい。
【００９１】
いったん作成され標的細胞に投与されると、標的細胞をスクリーニングして、標的配列修飾を含有する細胞を同定する。これは多くの方法で行われ、当業者により理解されるように、標的遺伝子と核酸分子に依存するであろう。スクリーニングは、標的配列により、表現型、生化学的、遺伝子型、または他の機能的変化に基づく。さらなる実施態様において、当業者により理解されるように、後の同定を促進するために選択マーカーもしくはマーカー配列を核酸分子に含めてもよい。あるいは、陰性（または対）選択マーカー（例えばｇａｌＫ、サプレッサー、ＨＳＶｔＫ、ｇｐｔ、ＵＲＡ３、ｓａｃＢ、ｃｃｄＢ、ｔｅｔR 、または５ＦＯＡ遺伝子）を使用して、いくつかの事象（例えば非標的組み換え体）を選択してもよい。選択が行われるなら、相同的組換えによる選択遺伝子の以後のターゲティングは、遺伝子を除去、置換または破壊するのに使用される。
【００９２】
好適な実施態様において、相同的組換えのための試薬および随時本発明の基質を含有するキットが提供される。キットは、リコンビナーゼ、他の酵素、例えばエキソヌクレアーゼIII、ポリメラーゼ（例えばＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ）、ヘリカーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｔ７遺伝子６、ＤＮａｓｅＩ、緩衝液、ｄＡＴＰおよび／またはＡＴＰγＳなどを含有してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９３】
本発明を以下の非限定例によりさらに説明する。
【実施例１】
【００９４】
大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡとサーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡ被覆反応
ＲｅｃＡは、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）と２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に協同的に結合するＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅであり、相同的対合と相同的ＤＮＡ分子間の交換とを促進する。サーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡを精製するために、ＡＴＣＣからサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）ＤＮＡを得て、ＮＣＢＩ（ナショナルセンター・フォー・バイオテクノロジーインフォメーション（National Center for Biotechnology Information））から入手できるゲノム配列を使用して、ＲｅｃＡの遺伝子をクローン化した。細網内皮細胞サーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡクローンを含有する大腸菌（E. coli）を６５℃に加熱し、次に加熱混合物を、ＰＥＩ（ポリエチルイミン）と硫酸アンモニウムにより連続的に沈殿させた。沈殿物をハイドロキシアパタイトカラム、ヘパリンセファロースカラム、ホスホセルロースカラムおよびＱ濃縮カラムに通した。最初の加熱変性工程以外は、大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡは同様に精製される。精製したリコンビナーゼ調製物を性状解析するために、標準的活性測定法（例えば、鎖交換、核蛋白質集合（後述）、またはＡＴＰａｓｅ活性、ならびに標準的混入物質測定法、例えばＤＮａｓｅ測定法）を使用することができる。
【００９５】
基質のリコンビナーゼ被覆（核蛋白質集合）を検出するために、標識ｓｓＤＮＡを用いるゲルシフト測定法を使用してもよい。例えば０．１μMのフルオレセイン標識９１量体オリゴヌクレオチド（F-ACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCTAATCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGAT；配列番号１）を、ＲｅｃＡによる被覆のための基質として使用した。大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡの被覆緩衝液は、２５mMトリス酢酸（ｐＨ７．８５）、１５mMグルタミン酸カリウム（Ｋ−Ｇｌｕ）、５mM 酢酸マグネシウム、および２．５mM ＤＴＴであった。サーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡの緩衝液は、２５mMトリス酢酸（ｐＨ８．０）、１５mM Ｋ−Ｇｌｕ、２mM 酢酸マグネシウム、２．５mM ＤＴＴおよび０．１％トリトンであった。被覆緩衝液はまた、ＡＴＰγＳ（３mM）、またはｄＡＴＰとＡＴＰγＳを１０：１（それぞれ３mMと０．３mM）の比で含有した。次にＲｅｃＡを、１０μMの塩基について４μMのＲｅｃＡの比で基質を含有する被覆緩衝液に加えた。大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡ被覆反応物を４２℃で６０分までインキュベートし、サーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡ被覆反応物を７５℃（または６５℃）で６０分までインキュベートしたが、他の温度を使用してもよい。図１Ａに示すように、試料を０、１５、３０および４５分に取った。標識されたオリゴヌクレオチドを視覚化し、FluorImager-SIとImageQuantソフトウェアを使用して定量した。
【００９６】
濃度１０μM塩基の長さの異なる３つの標識基質（５１量体、３５量体、および９１量体オリゴヌクレオチド基質）（それぞれ、F-CAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCTAATCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCG；配列番号２、F-GCTGATTGGCGTTGCCTAATCCAGTCTGGCCCTGC；配列番号３，F-ACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGC  GTTGCCTAATCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGAT；配列番号１）をそれぞれ、サーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡ被覆緩衝液中の４μMのサーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡ、または大腸菌（E. coli）被覆緩衝液中の４μMの大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡと混合した。混合物を７５℃（サーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡ用）または４２℃（大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡ用）で最大６０分インキュベートした。図１Ｂに示すように、試料を０、１５、３０および４５分に取った。結果は、より短いオリゴヌクレオチド（例えば３５量体と５１量体）の核蛋白質集合は、より長いオリゴヌクレオチドの集合より遅いことを示した（図１Ｂ）。またサーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡは、大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡに対して、すべての基質で集合が効率的であった（図１Ｂ）。
【実施例２】
【００９７】
５’ずれ末端を有する部分的ｓｓＤＮＡ基質と３’ずれ末端を有する部分的ｓｓＤＮＡ基質による組換え効率
ｔｅｔR 遺伝子を、標的ｐＧＥＭ１１ｏ（ｐＧＥＭ１１zf+の誘導体、プロメガ社（Promega Corporation））との組換え用の基質として選択した。基質調製のためのＰＣＲで使用したプライマーを、表Ｉに示す。
【００９８】
【表１】
2005523014.tif 000002
【００９９】
種々のビオチン化プライマー対との鋳型としてｔｅｔR 遺伝子を使用して予測されるＰＣＲ産物を表IIに示す。ＰＣＲ条件は９５℃で２分、４２サイクル（９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で１．２分）、そして次に７２℃で１０分であった。ＰＣＲ反応混合物は、１×ＰＣＲ緩衝液中にプライマー（２pmol）、０．２mM ｄＮＴＰ、０．１Ｕ Ｐｆｕクローン化ポリメラーゼ（ストラタジーン（Stratagene））、および０．２μlの鋳型を含有した。ＰＣＲ反応は、ウイザード（Wizard）直接精製により追跡した（プロメガ社（Promega Corporation））。
【０１００】
【表２】
2005523014.tif 000003
【０１０１】
５’または３’ずれ末端を有するＤＮＡ分子を含む基質（図２Ａ）を調製するために、等モル量の精製ＰＣＲ断片（表II参照、３’ずれ末端を有する基質について断片１と２、および５’ずれ末端を有する基質について断片３と４）を混合し、次に５分沸騰させた。次に混合物を徐々に室温まで冷却して、５’末端または３’末端に１４３０ヌクレオチドのｄｓ領域および６０ヌクレオチドのｓｓ領域を有する部分的ｓｓＤＮＡ基質を得た。磁気分離（図２Ｂを参照）のために、ストレプトアビジン−磁性ビーズを再懸濁し、３０μlのビーズを新鮮な試験管に入れ、磁性スタンドを使用して保存緩衝液を除去した。ビーズを１００μlの結合緩衝液（１mM ＥＤＴＡ、１０mMトリス−塩酸、ｐＨ７．５、および１Ｍ ＮａＣｌ）で静かにボルテックス混合し、磁性スタンドを用いて上清を除去することによりビーズを３回洗浄した。次にビーズを、各１５μlのビーズについて３０μlの結合緩衝液に再懸濁した。ビーズ上の非特異結合部位を、５μgのニシン精子ＤＮＡを加えて飽和させ、この混合物を、室温で１０分時々攪拌してインキュベートした。磁性スタンドを用いて上清を除去し、ビーズを同量の結合緩衝液で再懸濁した。
【０１０２】
ビオチン化分子を捕捉するために、ビーズを反応試験管に移し、静かに混合し、室温で３０分回転しながらインキュベートさせた。次に非結合ＤＮＡを新鮮なビーズを有する新しい試験管に移し、さらに３０分室温でインキュベートした。非結合ＤＮＡ（ずれ末端を有する部分的ｓｓＤＮＡ基質）を新鮮な試験管に移し、エタノールを沈殿させた。
【０１０３】
分子の構造を証明するために、５’ずれ末端または３’ずれ末端を有する部分的ｓｓＤＮＡ断片と、フルオレセイン標識オリゴヌクレオチド（３’オーバーハングのオリゴヌクレオチド１５１８２と１５１８１，および５’オーバーハングのオリゴヌクレオチド１５９９７と１５９９５）とのアニーリング反応を使用した。標識構造を５％アクリルアミドゲルに流し、蛍光スキャナーで視覚化した。
【０１０４】
被覆反応（４μM ＲｅｃＡ：１０μM塩基）を、上記の緩衝液中の変性ｄｓＤＮＡ基質（２３３．４μM塩基）、または部分的ｓｓＤＮＡ基質（１１６．７μM塩基）、および４mM ｄＡＴＰ、０．０８mM ＡＴＰγＳ、および大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡもしくはサーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡと、それぞれ４２℃と７５℃で３０分行った。ローディング緩衝液にＳＤＳを随時加えてもよい。
【０１０５】
相同的組換えによるターゲティング用の組換え中間体を調製するために、Ｍｇ濃度を１２mMに上げ、標的（０．０１９９pmol/μl）を加え（基質：標的比は８：１）、反応物を４２℃（大腸菌（E. coli））、または６５℃〜７５℃（サーモトガ（Thermotoga））で６０分インキュベートした。０．５％のアガロースゲル上の分析は、中間体の安定性が：５’ずれ末端を有する部分的ｓｓＤＮＡ＞変性ｄｓＤＮＡ＞３’ずれ末端を有する部分的ｓｓＤＮＡであることを示した。ＲｅｃＡのタンパク質分解的除去のために、プロテイナーゼＫを反応物に同時に加えた。ＲｅｃＡの非存在下で中間体は不安定なため、２重Ｄ−ループが組換え中間体の重要な成分である可能性は低い。
【０１０６】
組換え中間体のインビボ分解のために電気穿孔法または塩化Ｃａ2+介在形質転換により、中間体を大腸菌（E. coli）ＪＣ８６７９株（ＲｅｃＥ組換え成分）に導入した。中間体の安定性は、ｔｅｔR 組み換え体のパーセントに相関することがわかった。サーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡで被覆した５’ずれ末端を有する部分的ｓｓＤＮＡ基質を用いて得られた組換え頻度は、１７％であった（図３）。さらに、試験した各ＲｅｃＡについて、５’ずれ末端を有する部分的ｓｓＤＮＡ基質を用いて得られた組換え頻度は、変性ｄｓＤＮＡ基質を用いて得られた組換え頻度より少なくとも２倍大きかった。さらに、サーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡによる中間体は、大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡに対してより高いパーセントの組み換え体を与えた。例えば５’ずれ末端を有する部分的ｓｓＤＮＡ基質を用いて得られた組み換え体のパーセントは、組み換え体についての陽性選択が容易に省略できるほど充分であった（図４）。ＲｅｃＡの非存在下では、ｔｅｔR 組み換え体のパーセントは非常に低かった（＜０．０１％）。
【実施例３】
【０１０７】
５’ずれ末端を有するｔｅｔR またはｎｅｏR 基質または変性ｄｓＤＮＡを用いる組換え効率
プラスミド標的ｐＧＥＭ１１ｏを用いる組換え用の２つの異なる基質の効率を測定した。基質は、ｔｅｔR 遺伝子またはｎｅｏR 遺伝子（それぞれ１５５２塩基と１８３塩基）を含む変性ｄｓＤＮＡ基質、またはｔｅｔR 遺伝子またはｎｅｏR 遺伝子と５’ずれ末端とを含む部分的ｓｓＤＮＡ基質を含んだ。部分的ｓｓＤＮＡを調製するために、それぞれの断片が一端にビオチン親和性標識を有する等モルの２つのｄｓＤＮＡ断片を、５分沸騰させ、静かに冷却し、ストレプトアビジン被覆磁性粒子と混合し、次に磁気分離を行った。非標識ＤＮＡの構造は、蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用して確認した。ｄｓＤＮＡ基質を９５℃で５分加熱し、次に氷上に５分置いた。
【０１０８】
４mM ｄＡＴＰと０．０８mM ＡＴＰγＳとを含む被覆緩衝液中で変性ｄｓＤＮＡ基質と大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡまたはサーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡ（４μM ＲｅｃＡ：１０μM塩基；ｔｅｔR 遺伝子について９２３μM、およびｎｅｏR 遺伝子について９０４μM）を有する被覆反応物（４０μl）を、４２℃（大腸菌（E. coli））または７５℃（サーモトガ（Thermotoga））で３０分インキュベートした。４mM ｄＡＴＰと０．０８mM ＡＴＰγＳとを含む被覆緩衝液中で部分的ｓｓＤＮＡ基質と大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡまたはサーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡ（４μM ＲｅｃＡ：１０μM塩基、ここでμM塩基は、ｔｅｔR 遺伝子についてｓｓＤＮＡ２２７．７μM、およびｎｅｏR 遺伝子について２４５μMとして計算される）を有する被覆反応物（４０μl）を、４２℃（大腸菌（E. coli））または７５℃（サーモトガ（Thermotoga））で３０分インキュベートした。
【０１０９】
中間体形成のために、酢酸Ｍｇを使用してＭｇ濃度を１２mMに上げ、２．５μlの標的（０．０１４pmol/μl；基質対標的比は６：１）を加え、反応物を４２℃（大腸菌（E. coli））、または６５℃〜７５℃（サーモトガ（Thermotoga））で６０分インキュベートした。６０分後、反応物の一部をプロテイナーゼＫ処理（２％ ＳＤＳ中２００μg/ml）処理した。サーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡによる中間体の形成は、大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡより効率的であり、変性ｄｓＤＮＡ基質で形成した中間体は、プロテイナーゼＫ処理後には安定ではなかった（分解して元々の分子になった）（図５）。２重Ｄ−ループが形成されたら、これは予測できなかったであろう。中間体形成結果は、形質転換結果により支持された。形質転換前のＲｅｃＡの除去は、組み換え体のパーセントを３〜７倍低下させた（図６Ａ）。サーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡは、大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡと比較して、約２倍多い数のｔｅｔR とｎｅｏR 組み換え体を与えた（図６）。また部分的ｓｓＤＮＡ基質による組み換え体のパーセントは、変性ｄｓＤＮＡ基質と比較して（４倍）高かった（すなわち、大きな挿入体について２重Ｄ−ループは形成されず、不安定な中間体となった）。
【０１１０】
文献
Adzuma. Genes Devel., 6: 1679 (1992) 
Afonina ら, PNAS USA 93: 3199 (1996) 
Ausubel ら "Short Protocols m Molecular Brology," 第２版 (John Wiley and Sons, New York), pp. 9-14 と 9-15 (1992). 
Bardwell, Mutagenesis 4: 245 (1989). 
Baumann ら, Cell, 87: 757 (1996) 
Beaucage ら, Tetrahedron, 49(1O): 1925 (1993) 
Behr ら, Proc. Natl. Acad. Scu. USA, 86:6982 (1989) 
Berger と Kimmel, Methods in Enzymology. Volume 1 52. Guide to 
Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., サンジエゴ、カリホルニア州. 
Berinstein ら, Molec. Cell. Biol., 12: 360 (1992) 
Bertling, Bioscience Reports, 7:l07 (1987) 
Bertolotti, Newsletter of BioTechnology, Health and Environmental 
Scrences, Nl4 (1 996) 
Bixhop ら, Cell 69: 439 (1992)
Brinsterら, PNAS, 86: 7087 (1989)
Camerini-Otero ら, Annu. Rev. Genetics, 29:509 (1995) 
Capecchi, Science, 244: 1288 (1989) 
Carlsson ら, Nature, 380: 207 (1996) 
Cassuto ら, Mol. Gen. Genet., 208: 10 (1987) 
Cavard ら, Nucleic Acids Res., 16: 2099 (1988) 
Cheng ら, J. Biol. Chem., 263: 15110 (1988). 
Cheng, ら, NATO ASI Ser.. Ser C., Photochemical Probes in Biochemistry, 272: 169-177, P.E. Nielsen (編), (1989). 
Chiu ら, Biochemistry, 32: 13146 (1993) 
Clark ら, Molec. Cell. Blol., I I : 2576 (1991) 
Cole-Strauss ら, Scrence, 273:1386 (1996) 
Corey と Schultz, Science, 238: 1401 (1988) 
Cox ら, Ann. Rev. Biochem, 56:229 (1987) 
Cox と Lehman, Ann. Rev. Biochem., 56:229 (1987) 
Crameri ら, Nature BioTech., 14:315 (1996) 
Crameri ら, Nature Medicine, 2: 100-l02 (1996) 
Cunningham ら, Cell, 24: 213 (1981) 
Dervan, PB, Sclence, 232: 464 (1986). 
Doetschman ら, J. Embryol Exp. Morph., 87: 21 (1985) 
Doetschman ら. Proc. Natl. Acad. Sci. S.A., 85: 8583 (1988) 
Dorini ら. Science, 243: 1357 (1989). 
Drumm ら. Cell, 62: 1227 (1990). 
Dykstra ら, Molec. Cell. Biol., 11: 2583 (1991) 
Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, オックスフォード大学出版 (Oxford University Press)）. 
Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992). 
Eisen ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 7481 (1988). 
Erlich ら, Science 252: 1643 (1991). 
Felgner ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413 (1987). 
FelTin と Camerini-Otero, Science 354: 1494 (199l).
Frelds と Jang, Science, 249: 1046 (1990).
Frshel ら, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 85: 3683 (1988) 
Friedmann, Science, 224: 1275 (1989) 
Fu ら, Nucleic Acids Res., 25(3):677 (1997). 
Fugisawa ら, Nucl. Acids Res., 13: 7473 (1985). 
Ganea ら, Mol. Cell Biol., 7: 3124 (1987). 
Gareis ら, Cell. Molec. Biol., 37:191 (1991). 
Gates ら, J. Mol. Biol., 255:373 (1996). 
Genes, 第３版. (1987) Lewin, B., John Wiley, New York, N.Y. 
Haensler と Szoka, Abstract V211 in J. Cell. Biochem. Supplement 16F 
(1992). 
Halbrook ら. J. Biol. Chem., 264: 21403 (1989).
Hasty ら, Molec. Cell. Biol., 11: 5586 (1991).
Hasty ら, Nature, 350:243 (1991). 
Herzing ら, Gene, 137: 163 (1993).
Hertzberg と Dervan, Biochemist, 23: 3934 (1984).
Hertzberg ら, J. Am. Chem. Soc., 104: 313 (1982).
Hogan, ら, "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1988). 
Holliday, Genetic Res., 5:282 (1964).
Hooper ら, Nature, 326: 292 (1987).
Howard-Flanders ら, Nature, 309:215 (1984).
Hsieh ら, Cell 44: 885 (1986). 
Hsieh ら, J. Biol. Chem., 264: 5089 (1989).
Hsieh ら, Genes and Development, 4:195 1 (1990).
Hsieh ら, PNAS USA, 89: 6492 (1992).
Hunger-Bertling ら, Mol. and Cellular Biochem., 92: 107 (1990).Immunology-A Synthesis, 第２版, E. S. Golub と D. R. Green, 編, 
Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991). 
Itzhaki と Porter, Nucl. Acids Res,, 19:3835 (1991).
Jasin ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:8804 (1996).
Jasin と Berg, Genes と Development, 2:1353 (1988).
Jayasena ら, J. Mol. Biol., 230: 1015 (1993).
Joyner ら, Nature, 338: 153 (1989).
Keene ら, Nucl. Acids Res., 12: 3057 (1984). 
Kido ら, Exper. Cell Res., 198:l07 (1992). 
Kim ら, Gene, 103:227 (1991).
Kim と Smithies, Nucleic Acids Res., 16:8887 (1988).
Kmeic ら, Cold S rin Harbor Symp., 48: 675 (1984).
Kmeic と Hollaman, Cell, 44: 545 (1986). 
Koller ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:10730 (1991).
Koller と Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:8932 (1989).
Kolodner ら, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 84: 5560 (1987).
Kowalczykowski ら, Microbiol. Rev., 58:401 (1994). 
Kowalczykowski ら, Gene Targeting, CRC Press: Boca Raton, ed. 
Manuel A. Vega, Chap. 7: 167 (1995). 
Kucherlapati ら, Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3153 (1984).
Kucherlapati ら, Mol. Cell. Biol., 5:714 (1985).
Kunkel, PNAS USA, 82:488 (1985).
Kunzelmann ら, Gene Thera, 3:859 (1996).
Langer ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(1l):6633 (1981).
Lavery ら, J. Biol. Chem. 267: 20648 (1992). 
Leahy ら, J. Biol. Chem. 26: 954 (1986).
Leahy ら, J. Biol. Chem. 261: 6954 (1986).
Letsinger ら, J. Am. Chem. Soc., 1lO: 4470 (1988).
Letsinger, J. Or . Chem., 35: 3800 (1970).
Letsinger ら, Nucl. Acids Res., 14: 3487 (1986).
Lewin (編), Genes, 第３版, John Wiley, New York, NY (1987). 
Lopez ら, Nucleic Acids Res., 15:5643 (1987). 
Loweuhaupt ら, J. Biol. Chem., 264: 20568 (1989). 
Ludwig ら, Soma. Cell and Molecular Genetics, 20(1): 11 (1994).
Lukhtanov ら, Nucleic Acids Research, 24(4):683 (1996).
Madiraju ら, Biochem., 31: 10529 (1992).
Madiraju ら, PNAS USA, 85(18): 6592 (1988).
Maniatis ら. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd 
Ed., Cold Spring Harbor, N.Y. 
Mansour ら, Nature 336:348 (1988).
Matsumura ら, Nature Bio Tech., 14:366 (1996). 
McCarthy ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5854 (1988).
McEntee ら, J. Biol. Chem., 256: 8835 (1981).
McMahon と Bradley, Cell, 62: 1073 (1990).
Mcllwraith ら, Nucleic Acids Research 29 (22): 4509 (2001).
Meier ら, Chem. Int. Ed. Engl., 31: 1008 (1992).
Meyer, Jr. ら, J. of the Amer. Chem. Soc., 111 (22):8517 (1989).
Moore ら, J Biol. Chem., 19: 11108 (1990).
Moore ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 9067 (1991).
Mortensen ら, Proc, Natl. Acad. Scl. USA, 88: 7036 (1991).
Mouellic ら, Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 87: 4712 (1990).
Nielsen, Nature, 365: 566 (1993).
O'Gorman ら, Scaence, 25 1: 135 1 (1991).
Onouchi ら, Nucleic Acids Res., 19: 6373 (・1991).
Oppliger ら, Mut. Res., 291:181 (1993).
Orkin ら, National Institutes of Health, Dec. 7, 1995. 
Papworth ら, Strategies, 9:3 (1996).
Pati ら, Encycl. of Cancer, vol. 111: 1601-1625 (1997).
Pauwels ら, Chemica Scripta, 26: 141 (1986).
Podymnogin ら, Blochem,, 34: 13098 (1995).
Podymmogin ら, Biochem., 35: 7267 (1996).
Radding, C. M., Ann. Rev. Genet., 16:405 (1982).
Ramdas ら, J. Biol Chem., 264: 11395 (1989).
Rao ら, PNAS, 88:2984 (1991).
Rashid ら, Nuclerc Acids Research, 25:7 19 (1997).
Rawls, C&EN, p. 11 (1996). 
Register ら, J. Biol. Chem., 262: 12812 (1987).
Rerd ら, Molec. Cellular Biol. 11: 2769 (1991).
Reiss ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3094 (1996).
Revet ら, J. Mol. Biol., 232:779 (1993). 
Rigas ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83: 9591 (1986).
Robertson ら, Nature, 323: 445 (1986).
Robertson, E. J. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A 
Practical Approach. E. J. Robertson, 編 (oxford: IRL Press), p. 71-112 (1987). 
Roca, A. I., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 25: 415 (1990). 
Rose ら, BioTechniques, 10:520 (1991).
Rosenfeld ら, Cell, 68: 143 (1992).
Sambrook ら, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989). 
Samulski ら, EMBO J. lO:2941 (1991).
Sauer と Henderson, New Biologist, 2:441 (1990). 
Sawai ら, Chem. Lett., 805 (1984).
Schwartzberg ら, Science, 246: 799 (1989).
Sena ら, Nature Genetics 3:365-372 (1993). 
Shesely ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:4294 (1991).
Shinohara ら, Cell, 6: 457 (1992).
Shulman ら, Molec. Cell. Biol., lO: 4466 (1990). 
Smithies ら, Nature, 3 17:230 (1985).
Snouwaert ら, Science, 257: 1083 (1992).
Song ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:6820 (1987).
Sprinzl ら, Eur. J. Biochem., 81: 579 (1977).
Stasiak ら, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 49:561 (1984).
Stemmer, Nature, 370:389 (1994).
Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10747-l0751 (1994).
Sterumer ら, Gene, 164:49 (1995).
Strobel ら, Science, 254:1639 (1991). 
Sugino ら, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 85: 3683 (1985).
Sung ら, Science, 265: 1241 (1994).
Susulic ら, J. Biol. Chem., 49: 29483 (1995).
Tabone ら, Biochemist, 33(1):375 (1994).
Taylor ら, Tetrahedron, 40: 457 (1984).
Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, E. J. 
Robertson, 編, IRL Press, Washington, D.C., 1987. 
Thomas ら, Cell, 44:419 (1986).
Thomas と Capecchi, Cell 51:503 (1987). 
Tisnkoffら, Molec. Cell. Blol. 11 : 2593 
Valancius と Smithies, Molecular と Cellular Biolo, 11 (3):1402 
(1991). 
Voloshin ら, Science, 272:868 (1996).
Wilson ら, J. Biol. Chem., 267: 963 (1992).
Wolffら, Science 247: 1465 (1990).
Woo, ら, Nucleic Acids Res., 24(13):2470 (1996). 
Woodbury ら, Biochemist, 2(20): 4730 (1983). 
Wu ら, The Journal of Biological Chemist, 264(29):16985 (1989).
Wu ら, J. Biol. Chem., 266: 14338 (1991). 
Wu と Wu, Biochemist, 27: 887 (1988). 
Wu と Wu, J. Biol. Chem., 262: 4429 (1987). 
Wu と Wu. J. Biol. Chem . 263: 14621 (1988). 
Wu と Wu, J. Biol. Chem., 267: 12436 (1992) 
Yoon ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2071 (1996).
Zimmer と Gruss, Nature. 338: 150 (1989).
Zjilstra ら, Nature, 342: 435 (1989).
【０１１１】
すべての刊行物、特許および特許出願は参照することにより本明細書に組み込まれる。前記明細書において本発明をいくつかの好適な実施態様について説明し、多くの詳細が例示目的に記載されたが、本発明には追加の実施態様が可能であり、本発明の基本的な原理を逸脱することなく、本明細書に記載のいくつかの詳細を相当変更できることは当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１Ａ】フルオレセイン標識９１量体およびサーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡまたは大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡとの核蛋白質の経時的集合。
【図１Ｂ】フルオレセイン標識３５量体、５１量体、または９１量体およびサーモトガ（Thermotoga）ＲｅｃＡまたは大腸菌（E. coli）ＲｅｃＡとの核蛋白質の経時的集合のグラフ。
【図２Ａ】本発明の基質の例の略図。
【図２Ｂ】３’ずれ末端を有する本発明の部分的ｓｓＤＮＡ基質の調製の略図。
【図２Ｃ】５’ずれ末端を有する本発明の部分的ｓｓＤＮＡ基質の調製の略図。
【図３】２つの異なるＲｅｃＡと変性ｄｓＤＮＡ基質の１つ、５’末端を用いる部分的ｓｓＤＮＡ基質、および３’ずれ末端を有するｓｓＤＮＡ基質を含む核蛋白質複合体を用いて、大腸菌（E. coli）を形質転換した後に得られた組み換え体のパーセント。
【図４】図３に示す３つの異なる基質を用いて得られた組換え頻度の要約。
【図５】ＲｅｃＡを含まない中間体の安定性の解析。
【図６Ａ】２つの異なるＲｅｃＡとｔｅｔR またはｎｅｏR 遺伝子挿入を含む変性ｄｓＤＮＡ基質の１つを含む組換え中間体を用いて大腸菌（E. coli）を形質転換した後に得られた組み換え体のパーセント。
【図６Ｂ】２つの異なるＲｅｃＡとｔｅｔR またはｎｅｏR 遺伝子挿入を含む変性ｄｓＤＮＡ基質、および５’ずれ末端を有する部分的ｓｓＤＮＡ基質および標的ｄｓＤＮＡプラスミドの１つを含む、組換え中間体を用いて、大腸菌（E. coli）を形質転換した後に得られた組み換え体のパーセント。
【図１Ａ】
2005523014.tif 000004
【図１Ｂ】
2005523014.tif 000005
【図２Ａ】
2005523014.tif 000006
【図２Ｂ】
2005523014.tif 000007
【図２Ｃ】
2005523014.tif 000008
【図３】
2005523014.tif 000009
【図４】
2005523014.tif 000010
【図５】
2005523014.tif 000011
【図６Ａ】
2005523014.tif 000012
【図６Ｂ】
2005523014.tif 000013
【国際調査報告】
2005523014.tif 000014
2005523014.tif 000015
2005523014.tif 000016