(57)【要約】本発明は、各種癌の治療効果の診断、予後及び監視に有用なバイオマーカーの発見方法を提供する。また本発明は、本発明に従って確認されたバイオマーカーを用いて各種形態の癌を診断する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物中の癌の存在について診断するバイオマーカーを確認する方法であって、
ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドを発現する細胞から分泌されたポリペプチドをコード化することを予測するかどうかを測定するアルゴリズムを用いて、１つ以上のポリヌクレオチド配列を分析する工程、及び
該分泌ポリペプチドのコード化を予測する１つ以上のポリヌクレオチド配列に相当するｍＲＮＡが、１種以上の癌細胞中で非癌細胞に比べて差別的に発現するかどうかを測定する工程、
を含み、癌細胞中で非癌細胞に比べて差別的に発現したｍＲＮＡ、又は該差別的に発現したｍＲＮＡによりコード化されたポリペプチドが、哺乳動物中の癌の存在について診断するバイオマーカーとして有用である該方法。
【請求項２】
前記方法が、データベースに存在する複数のポリヌクレオチド配列について行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記データベースが、１，０００以上のポリヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記データベースが、１０，０００以上のポリヌクレオチド配列を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記データベースが、遺伝子腫瘍学協会により提供される請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記アルゴリズムが、ポリヌクレオチド配列を確認する工程を含み、該配列に対し、関連する注釈は、ポリヌクレオチド配列によりコード化されたポリペプチドが細胞から分泌されたことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アルゴリズムが、貫通膜領域を含む予測されたアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチド配列を確認する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アルゴリズムが、Ｔｍａｐを含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アルゴリズムが、信号ポリペプチド及び信号ポリペプチド切断部位の１つ以上を含む、予測されたアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチド配列を確認する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルゴリズムが、ＳｉｇＣｌｅａｖｅを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞から分泌されたポリヌクレオチドをコード化することを予測するポリヌクレオチド配列を確認する２つ以上のアルゴリズムが使用される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上のポリヌクレオチド配列が、分泌を示す関連注釈を確認することにより、かつＴｍａｐ及びＳｉｇＣｌｅａｖｅの一方又は両方により分析される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
差別的発現の測定が、癌細胞又は非癌細胞から得られたサンプル中に存在するｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ又はｃＤＮＡをハイブリダイズできる複数のプローブを含有するポリヌクレオチドアレイを用いて行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドアレイが、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
差別的発現が、複数の異なる癌から得られた細胞中で評価される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
差別的発現が、前記各々異なる癌について複数のサンプルから得られた細胞中で評価される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌細胞が、前立腺、乳房、肺、卵巣、結腸直腸、腎臓、肝臓、膵臓、ボウコウ／尿道及び胃腸／食道、の癌よりなる群から選ばれた癌から得られる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物から得たサンプルにおいて、バイオマーカー水準の増加を検出する工程を含む哺乳動物中の癌の診断方法であって、該バイオマーカーは、以下の工程：
ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドを発現する細胞から分泌されたポリペプチドをコード化することを予測するかどうかを測定するアルゴリズムを用いて、１つ以上のポリヌクレオチド配列を分析する工程、及び
該分泌ポリペプチドのコード化を予測する１つ以上のポリヌクレオチド配列に相当するｍＲＮＡが、１種以上の癌細胞中で非癌細胞に比べて差別的に発現するかどうかを測定する工程、
を含み、癌細胞中で非癌細胞に比べて差別的に発現したｍＲＮＡ、又は該差別的に発現したｍＲＮＡによりコード化されたポリペプチドが、哺乳動物中の癌の存在について診断するバイオマーカーとして有用である方法を用いて、確認したものである該診断方法。
【請求項１９】
前記癌細胞が、前立腺、乳房、肺、卵巣、結腸直腸、腎臓、肝臓、膵臓、ボウコウ／尿道及び胃腸／食道、の癌よりなる群から選ばれた癌から得られる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記バイオマーカーが、差別的に発現したｍＲＮＡによりコード化されたポリペプチドである請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルが、哺乳動物から得た血液又は血清を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記動物がヒトである請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
異なる時点で哺乳動物から得たサンプルにおいて、哺乳動物中の癌の存在を診断するバイオマーカー水準の増加又は減少を検出する工程を含む、哺乳動物での癌治療の効果を監視する方法であって、該バイオマーカーは、以下の工程：
ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドを発現する細胞から分泌されたポリペプチドをコード化することを予測するかどうかを測定するアルゴリズムを用いて、１つ以上のポリヌクレオチド配列を分析する工程、及び
該分泌ポリペプチドのコード化を予測する１つ以上のポリヌクレオチド配列に相当するｍＲＮＡが、１種以上の癌細胞中で非癌細胞に比べて差別的に発現するかどうかを測定する工程、
を含み、癌細胞中で非癌細胞に比べて差別的に発現したｍＲＮＡ、又は該差別的に発現したｍＲＮＡによりコード化されたポリペプチドが、哺乳動物中の癌の存在について診断するバイオマーカーとして有用である方法を用いて、確認したものである該監視方法。
前記哺乳動物が、２つ以上のサンプルを得る間に癌治療を行ったものである請求項２３に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物が、２つ以上のサンプルを得る間に癌治療を行ったものである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物の前立腺癌を診断するか、又はその発展体質を確認する方法であって、（ａ）前立腺癌を持つか、又は前立腺癌に発展する傾向があると疑われる哺乳動物から生体サンプルを得る工程、（ｂ）該サンプルにおいて前立腺癌の少なくとも１つの分泌したバイオマーカーの異常水準を検出し、これにより哺乳動物が前立腺癌を持つか、或いはその発展体質を確認する工程を含み、前記前立腺癌の少なくとも１つの分泌バイオマーカーが、リラキシン−１（Ｈ１）、ニューロペプチドＹ、 ＭＩＣ−１、膵臓筋（ｔｈｒｅａｄ）蛋白質様（ラット）、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的膜抗原及び一心（ｓｉｎｇｌｅ−ｍｉｎｄｅｄ）ホモログ２（ショウジョウバエ）よりなる群から選ばれる、該方法。
【請求項２６】
前記生体サンプルが、血清、プラズマ、又は全血液である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物は、癌に罹っていない対照集団のバイオマーカーの発現水準に比べてバイオマーカーの発現水準が高い請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物を慣用の癌診断法と併用して検査する工程を更に含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
哺乳動物の結腸癌を診断するか、又はその発展体質を確認する方法であって、（ａ）結腸癌を持つか、又は結腸癌に発展する傾向があると疑われる哺乳動物から生体サンプルを得る工程、及び（ｂ）該サンプルにおいて高水準のムチン２（ＭＵＣ−２）を検出する工程を含む該方法。
【請求項３０】
哺乳動物の癌を診断するか、又はその発展体質を確認する方法であって、（ａ）癌を持つか、又は癌に発展する傾向があると疑われる哺乳動物から生体サンプルを得る工程、及び（ｂ）該哺乳動物から高水準のマプシンを検出する工程を含み、該癌が、結腸癌、食道癌、肺癌、又は膵臓癌である該方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国暫定特許出願Ｎｏ．６０／４４２，８５３（２００３年１月２４日出願）及び同６０／３７７，４０２（２００２年５月１日出願）による利益を主張する。これら出願の全開示は、あらゆる目的のため、その全体をここに援用した。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般には、癌の治療介入において診断用マーカー及び／又は標的として有用な遺伝子に関する。更に詳しくは、本発明は、分泌された蛋白質をコード化して、悪性組織及び正常組織中に差別的に発現する遺伝子の確認に関する。これらの遺伝子による各種癌の診断、予後及び治療の方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
米国では、癌は死亡の主要原因で、死亡原因の４人に１人で、これは、心臓疾患にだけ続いて第二位である。米国では毎年、５０万を超える人々が癌で死んでいる。Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｈｏｗｅ等，（２００１），Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９３：９２４−８４２）によれば、肺、前立腺、乳房、直腸の４つの癌部位は、新癌患者全体の５６％を占め、いずれの人種及び民族群の癌死の主要原因となっている。これら及び他種の癌の早期段階は、多くの場合、例えば外科、放射線治療又は化学的治療により治療可能である。したがって、効果的な治療には、癌の早期診断が重要である。
【０００４】
また多くの場合、首尾よく介入するための窓が閉じた後まで、癌として診断されないため、患者は死亡する。この問題は、現存の癌診断法における重大な欠点により悪化する。第一に、癌として診断された全患者の約４％では、観察された腫瘍は、転移によるもので、腫瘍の一次（ｐｒｉｍａｒｙ）源は、測定されていない。一次腫瘍の部位を確認できないと、診断及び治療は複雑化する（Ｈｉｌｌｅｎ，Ｐｏｓｔｇｒａｄ．Ｍｅｄ．Ｊ．７６：６９０−６９３（２０００））。一次腫瘍が判っている患者に対してさえ、現存の診断法は、最適な方法に達していない。例えば、前立腺癌には、例えばＣａｔａｌｏｎａ等，ＪＡＭＡ２７０：９４８−９５４（１９９３）に記載されるように、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）選別による検出努力により、局所疾患を持つ人が数千人、確認ができた。血清ＰＳＡは、例えばＢｒａｗｅｒ，Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１８：３−９（２０００）に記載されるように、現在入手できる最良の前立腺腫瘍マーカーとして広く認識されているが、ＰＳＡ単独又はこれをデジタル直腸検査と組合せて用いる選別プログラムでは、前立腺癌を持つ人の延命率を改良できなかった。
【０００５】
ＰＳＡを診断マーカーとして使用する場合、幾つかの欠点を伴う。第一に、ＰＳＡは、前立腺組織に特異的であるが、悪性腫瘍組織ばかりでなく、正常組織によっても作られ、前立腺組織片でのＰＳＡ発現の定量は、組織を悪性か又は悪性可能性かについて明確に分類しない。第二に、いずれの前立腺腫瘍もＰＳＡを分泌しない。第三に、高水準のＰＳＡ血清は、前立腺癌の効果的な指示薬であるが、閉塞性又は炎症性神経障害を持つ人には、やや高い水準、例えば４〜１０ｎｇ／ｍＬの水準が見られ、例えばＢｒａｗｅｒ等、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，９２巻、７６０−７６４頁（１９８９）に記載されるように、ＰＳＡの癌マーカーとしての特異性を低下させる。腺性カリクレイン２（ｈＫ２）及び前立腺特異的トランスグルタミナーゼ（ｐＴＧａｓｅ）のような他のバイオマーカーは、例えばＮａｍ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１８巻，１０３６−１０４２頁（
２０００）に記載されるように、診断特異性を増大させるＰＳＡ助剤として提案され、不必要な生検を受ける人数を減らすが、これらマーカーの有用性は、なお研究段階である。
【特許文献１】ＵＳＰ  Ｎｏ．６，０４０，１３８
【特許文献２】ＵＳＰ  Ｎｏ．４，９４６，７７８
【特許文献３】ＵＳＰ  Ｎｏ．５，９３２，４４８
【特許文献４】ＵＳＰ  Ｎｏ．５，６９３，７６２
【特許文献５】ＵＳＰ  Ｎｏ．５，６９３，７６１
【特許文献６】ＵＳＰ  Ｎｏ．５，５８５，０８９
【特許文献７】ＵＳＰ  Ｎｏ．５，５３０，１０１
【特許文献８】ＵＳＰ  Ｎｏ．５，５６９，８２５
【特許文献９】ＵＳＰ  Ｎｏ．５，６２５，１２６
【特許文献１０】ＵＳＰ  Ｎｏ．５，６３３，４２５
【特許文献１１】ＵＳＰ  Ｎｏ．５，７８９，６５０
【特許文献１２】ＵＳＰ  Ｎｏ．５，６６１，０１６
【特許文献１３】ＵＳＰ  Ｎｏ．５，７７０，４２９
【特許文献１４】ＵＳＰＮ  ６，３６５，３５２
【特許文献１５】ＷＯ  ０１１１０８２
【非特許文献１】Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｈｏｗｅ等，（２００１），Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９３：９２４−８４２）
【非特許文献２】Ｈｉｌｌｅｎ，Ｐｏｓｔｇｒａｄ．Ｍｅｄ．Ｊ．７６：６９０−６９３（２０００）
【非特許文献３】Ｃａｔａｌｏｎａ等，ＪＡＭＡ２７０：９４８−９５４（１９９３）
【非特許文献４】Ｂｒａｗｅｒ，Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１８：３−９（２０００）
【非特許文献５】Ｂｒａｗｅｒ等、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，９２巻、７６０−７６４頁（１９８９）
【非特許文献６】Ｎａｍ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１８巻，１０３６−１０４２頁（２０００）
【非特許文献７】Ｅｉｚｅｎ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，１４８６３−８，１９９８
【非特許文献８】Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ等，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（第２編，１９９４）
【非特許文献９】ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ等，１９８８）
【非特許文献１０】Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＰＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）
【非特許文献１１】Ｐｅｒｓｏｎ等、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２３７：１８２−１９２，１９９４
【非特許文献１２】ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：４６８３−４６９０，１９８６
【非特許文献１３】Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，ｐｐ．４．１．１−４．２．９及び４．５．１−４．５．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）
【非特許文献１４】Ｌｏｃｋｈａｒｔ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１４巻、ｐｐ．１６７５−１６８０（１９９６）
【非特許文献１５】ＭｃＧａｌｌ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９３巻、ｐｐ．１３５５５−１３４６０（１９９６）
【非特許文献１６】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第８１巻，ｐｐ．６８５１−６８５５（１９８４）
【非特許文献１７】Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ，第３１２巻，ｐｐ．６０４−６０８（１９８４）
【非特許文献１８】Ｔａｋｅｄａ等，Ｎａｔｕｒｅ，第３１４巻，ｐｐ．４５２−４５４（１９８５））
【非特許文献１９】Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２４２巻，ｐｐ．４２３−４２６（１９８８）
【非特許文献２０】Ｈｕｓｔｏｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第８５巻，ｐｐ．５８７９−５８８３（１９８８）
【非特許文献２１】Ｗａｒｄ等，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３４，ｐｐ．５４４−５４６（１９８９）
【非特許文献２２】Ｐｅｒｓｓｏｎ等，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２３７：１８２−１９２，１９９４
【非特許文献２３】Ｐｅｒｓｓｏｎ等、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  １６，４５３−７，１９９７
【非特許文献２４】Ｍｉｌｐｅｔｚ等、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２０，２０４−５，１９９５
【非特許文献２５】Ｈｅａｓｌｅｙ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０，１５６３−９，２００１
【非特許文献２６】Ｄｉａｍａｎｄｉｓ等，Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３３，５７９−８３，２０００
【非特許文献２７】Ｌｕｏ等，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ３０６，１１１−８，２００１
【非特許文献２８】Ｊｏｈｎｓｏｎ等，Ｃｌｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  ５，１４５−５９，２００１
【非特許文献２９】Ｆｌｅｍｉｎｇ等，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９２３，７８−７９，２０００
【非特許文献３０】Ｂａｎｉ，Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２８，１３−２２，１９７７
【非特許文献３１】Ｓａｇｅｒ等、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ４２５，７７−８８，１９９７
【非特許文献３２】Ｍａｒｔｉｎ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０，２２３２−８，２０００
【非特許文献３３】Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１３７９０−５，１９９１
【非特許文献３４】Ｓｕｎｄａｙ等、Ｐａｔｈｏｌ  ２２，１０３０−９，１９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血清学免疫アッセイによる癌の早期検出は、癌患者の診断及び予後を大きく改良するための重要な目標を表わす。本発明は、このような要件及び他の要件を満足する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、哺乳動物の癌の存在を診断するバイオマーカーを確認する方法を提供する。この方法は、（ａ）ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドを発現する細胞から分泌されたポリペプチドをコード化することを予測するかどうかを測定するアルゴリズムを用いて、１つ以上のポリヌクレオチド配列を分析する工程、及び（ｂ）該分泌ポリペプチドのコード化を予測する１つ以上のポリヌクレオチド配列に相当するｍＲＮＡが、１種以上の癌細胞中で非癌細胞に比べて差別的に発現するかどうかを測定する工程を含む。癌細胞中で
非癌細胞に比べて差別的に発現するｍＲＮＡ、又はこの差別的に発現したｍＲＮＡによりコード化されるポリペプチドは、哺乳動物の癌の存在を診断するバイオマーカーとして有用である。
【０００８】
本発明は、哺乳動物の癌を診断する方法も提供する。この方法は、哺乳動物から得られたサンプル中のバイオマーカーの水準増加を検出する工程を含み、バイオマーカーは、（ａ）ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドを発現する細胞から分泌されたポリペプチドをコード化することを予測するかどうかを測定するアルゴリズムを用いて、１つ以上のポリヌクレオチド配列を分析する工程、及び（ｂ）該分泌ポリペプチドのコード化を予測する１つ以上のポリヌクレオチド配列に相当するｍＲＮＡが、１種以上の癌細胞中で非癌細胞に比べて差別的に発現するかどうかを測定する工程を含む方法を用いて、確認したものである。癌細胞中で非癌細胞に比べて差別的に発現するｍＲＮＡ、又はこの差別的に発現したｍＲＮＡによりコード化されるポリペプチドは、哺乳動物の癌の存在を診断するバイオマーカーとして有用である。
【０００９】
本発明は、哺乳動物における癌治療の有効性を監視する方法も提供する。この方法は、異なる時点で哺乳動物から得られた複数のサンプルにおいて、癌の存在を診断するバイオマーカー水準の増減を検出する工程を含み、バイオマーカーは、（ａ）ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチド発現性細胞から分泌されるポリペプチドをコード化することを予測するかどうかを測定するアルゴリズムを用いて、１つ以上のポリヌクレオチド配列を分析する工程、及び（ｂ）該分泌ポリペプチドのコード化を予測する１つ以上のポリヌクレオチド配列に相当するｍＲＮＡが、１種以上の癌細胞中で非癌細胞に比べて差別的に発現するかどうかを測定する工程を含む方法を用いて、確認したものである。癌細胞中で非癌細胞に比べて差別的に発現するｍＲＮＡ、又はこの差別的に発現したｍＲＮＡによりコード化されるポリペプチドは、哺乳動物の癌の存在を診断するバイオマーカーとして有用である。
【００１０】
更に本発明は、本発明により確認された、第１表に示す癌特異的バイオマーカーを用いて、癌の発展体質を診断又は確認する方法を提供する。この方法は、（ａ）癌を持つか、或いは癌に発展する（ｄｅｖｅｌｏｐ）傾向があると疑われる検体（例えば哺乳動物）から生体サンプル（例えば血清）を得る工程、及び（ｂ）この生体サンプルにおいて、この癌用に分泌させた少なくとも１つのバイオマーカーの異常水準を検出する工程を含む。例えば前立腺癌の診断用に分泌させたバイオマーカーは、リラクシン（ｒｅｌａｘｉｎ）１（Ｈ１）、ニューロペプチドＹ、ＭＩＣ−１、膵臓筋（ｔｈｒｅａｄ）蛋白質様（ラット）、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的膜抗原及び一心（ｓｉｎｇｌｅ−ｍｉｎｄｅｄ）ホモログ２（ショウジョウバエ）を含有できる。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、癌組織中で差別的に発現する分泌蛋白質をコード化する遺伝子を確認するための計画の概略を示す。
【００１２】
図２Ａ及び図２Ｂは、分泌したバイオマーカー候補の発現が多種類の癌で高まることを示す。注釈に基づく分析及び配列に基づく分析により選択された分泌蛋白質をコード化する３２個の遺伝子は、少なくとも１つの腫瘍−正常対応物組織対では顕著な過大発現（＞３倍）を示し、また腫瘍では、他の正常組織に比べて、顕著な過大発現（＞２倍）を示した。ＢＲ：乳房（ＥＲ＋、ＥＲ−）、ＣＯ：大腸、ＧＡ：胃／食道腺癌、ＫＩ：腎臓、ＬＩ：肝臓、ＬＵＡ：肺の腺癌、ＬＵＳ：肺の扁平上皮癌、ＬＵＯ：肺の“その他”として小細胞肺癌及び肺の大細胞非識別癌、ＯＶ：卵巣、ＰＡ：膵臓、ＰＲ：前立腺。図（図２Ａ）の右側に遺伝子記号を示す。前立腺癌において優先的に上方規制された（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ）遺伝子の拡大図を図２Ｂに示す。各対応物側からの多数の組織サンプルを
括弧内に示す。遺伝子アトラスは、Ｔｅ：精巣、Ｔｈ：甲状腺、Ｕｔ：子宮、ＳＧ：唾液腺、Ｔｒ：気管、ＡＧ：副腎、Ｈｅ：心臓、Ｐｉ：下垂体、Ｓｐ：脊髄、ＣＣ：脳皮質、Ｎｏｒ．Ｐｒ：正常前立腺である。転写水準は、Ｃｌｕｓｔｅｒで標準化され、Ｔｒｅｅ
Ｖｉｅｗで視覚化された（Ｅｉｚｅｎ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，１４８６３−８，１９９８）。
【００１３】
図３Ａ及び図３Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲ、ＩＨＣ及びＥＬＩＳＡによるマイクロアレイ遺伝子発現の証拠（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を示す。図３Ａは、複数の異なるヒト組織（ＲＴ−ＰＣＲパネル上に標識した（ｌａｂｅｌｅｄ））から発現したＲＮＡを示し、３つの正常及び６つの一次前立腺癌を、リラクシン−１に向けたプライマーを用いて標準状態で逆転写し、増幅した。一次マイクロアレイデータを上部に示し（Ｙ軸はハイブリダイゼーション強度、Ｘ軸はサンプル）、代表的なＰＣＲを下部に示す。ｃＤＮＡの増幅量を制御するため、１８Ｓに特異的なプライマーを用いた。図３Ｂは、全組織部分に対する抗ＮＰＹ抗体で行ったＩＨＣを示す。一次マイクロアレイを、正常なマイクロアレイ陽性及びマイクロアレイ陰性の前立腺癌中のＩＨＣ汚染例と共に、上部に示す。
【００１４】
図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃは、診断用蛋白質候補における水準増加の証拠を示す。３６の正常な上皮組織及び２２９の癌を含む組織マイクロアレイを汚染するため、分泌蛋白質候補に特異的な抗体であるＮＰＹ（図４Ａ）、ＭＵＣ−２（図４Ｂ）及びマスピン（ｍａｓｐｉｎ）（図４Ｃ）を用いた。各遺伝子に対する相対発現水準を、組織群及び確認された特異組織と一緒に、各図の上部に示す。遺伝子の発現水準は、Ｔｒｅｅ  Ｖｉｅｗで出力した。ＩＨＣ汚染の例を、各蛋白質に対し陰性及び陽性の両癌を強調して、各図の下部に示す。
【００１５】
図５Ａ及び図５Ｂは、マスピン発現の上方規制は、乳癌におけるエストロゲン受容体状態と相関することを示す。図５Ａは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ９５ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐの２つの独立したプローブセット（ＰＳ１及びＰＳ２）で監視したマスピン発現を示す。図５Ｂは、抗マスピン抗体を用いて正常、ＥＲ＋及びＥＲ−の腫瘍における組織マイクロアレイでのマイクロアレイデータとＩＨＣとの比較を示す。正常な管状（ｄｕｃｔａｌ）乳房組織と比べて、ＥＲ−腫瘍に対する汚染が強いことに注目。
【００１６】
図６は、正常及び腫瘍の肺組織サンプルの拡大セットにおける肺癌マーカー候補の発現を示す。正常肺、肺膜癌、小細胞非識別癌、扁平上皮癌及びカルチノイドでの肺癌候補遺伝子（第１表において、ＧＯ注釈及び配列：陽性、ＧＯ注釈：陽性のみ、及び配列：陽性のみの各候補群から誘導した）の発現水準を測定した。この研究データ（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｍｅｙｅｒｓｏｎｌａｂ／ｌｕｎｇｃａ／ｄａｔａ．ｈｔｍｌで入手できる）は、Ｔｒｅｅ  Ｖｉｅｗでダウンロードし、出力した。カルチノイドにおけるＧＲＰ、及びＳＣＬＣの高水準発現、及び扁平上皮癌におけるマスピンのほぼ均一な過大発現に注目。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
詳細な説明
本発明は、分泌した癌特異的バイオマーカーの発見について、地球規模の接近方法を提供する。この方法は、蛋白質を発現する細胞から分泌しそうな蛋白質をコード化する核酸を確認する工程及びこの分泌蛋白質コード化用核酸のセットから、癌細胞中で非癌細胞に比べて差別的発現を示す核酸を確認する工程を含む。この方法を分泌蛋白質に絞ることにより、ヒト又は他の哺乳類から得たサンプル中で検出可能なバイオマーカーを確認し、こうして哺乳類における癌の診断を容易化できる。好ましい実施態様では、バイオマーカーポリペプチドは、哺乳動物から容易に得られる血液、血清又はその他の生体サンプル中で検出できる。
【００１８】
特に定義しない限り、ここで使用した技術的、科学的用語は全て、本発明に関与する当業者が普通に理解する意味と同じ意味を有する。以下の文献は、当業者に、本発明で使用した多くの用語についての一般的な定義を与える。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ等，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（第２編，１９９４）；ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ
ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ等，１９８８）；及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＰＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
ここに記載した方法及び材料に類似又は同等のいかなる方法及び材料も本発明の実施及びテストに使用できるが、好ましい方法及び材料について説明する。
【００１９】
分泌蛋白質をコード化する核酸は、当業者に公知の方法を用いて確認できる。例えば分泌蛋白質は、例えばデータベースに存在するヌクレオチド又はアミノ酸配列と関連する注釈により確認できる。このような注釈配列の好適な供給源の一例は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｏｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）により提供されるデータベースである。これにより、分泌を指示する細胞位置に見い出されるコード化用蛋白質として注釈された配列用のデータベースを探すことができる。
【００２０】
或いは又は更に、注釈を用いて、分泌蛋白質と関連するポリヌクレオチドを確認し、ポリペプチドが分泌されるかどうかを測定するのに有用なコンピューターで実行したアルゴリズムの１つ以上を使用できる。例えばこのようなアルゴリズムは、アミノ酸配列が、例えば膜貫通領域を含むかどうかを測定できる。この分析に好適なアルゴリズムは、“Ｔｍａｐ”プログラムである（Ｐｅｒｓｏｎ等、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２３７：１８２−１９２，１９９４）。このプログラムは、インターネットの例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｂ．ｋｉ．ｓｅ／ｔｍａｐ／で入手できる。分泌ポリペプチドは、信号ペプチドを含むポリペプチド内、及び／又は信号ポリペプチドについての切断部位を認識するポリペプチド内のアミノ酸配列を確認するアルゴリズムを用いても確認できる。この種の分析を行うソフトウエアの例は、“Ｓｉｇｃｌｅａｖｅ”である（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：４６８３−４６９０，１９８６）。Ｓｉｇｃｌｅａｖｅは、任意のアミノ酸配列データにおいて、真正の信号ペプチド切断部位の可能性を評価する。Ｓｉｇｃｌｅａｖｅは、インターネットの例えばｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｓｅｑａｎａｌ／ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ／ｓｉｇｃｌｅａｖｅ．ｈｔｍｌで入手できる。
【００２１】
細胞からの分泌を予測する蛋白質をコード化するポリヌクレオチドのセットは、次に、腫瘍細胞では非腫瘍細胞に比べて差別的な発現を示すポリヌクレオチドを確認するため、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞中で発現分析を受ける。これらの差別的に発現した分泌ポリペプチドは、これらポリペプチドを過大発現する癌にバイオマーカーとして使用するのに好適である。
【００２２】
検体及び病気のない検体から得たサンプル中に分泌したポリペプチドをコード化する遺伝子の少なくとも１つの発現水準は、該遺伝子に相当するｍＲＮＡの水準、該遺伝子によりコード化した蛋白質又は該蛋白質の断片を測定することにより検出できる。本発明方法では、癌組織中に現われた遺伝子の１つの発現水準は、非癌組織中の遺伝子の発現水準とは、十分大きな量で異なる。この好ましい実施態様では、発現水準の差は、少なくとも約２倍であることが観察されている。幾つかの実施態様では、癌組織中の遺伝子の発現水準は、非癌組織に比べて、少なくとも約３、５、１０又は１００倍、又はそれ以上相違する。
【００２３】
ＲＮＡは、例えばＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，ｐｐ．４．１．１−４．２．９及び４．５．１−４．５．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）に記載されるような当業者に周知の方法でサンプルから単離できる。ｍＲＮＡの発現水準の検出方法は、当該技術分野で周知であり、限定されるものではないが、ノーザンブロッティング法、逆転写ＰＣＲ法、リアルタイム定量ＰＣＲ法及びその他ハイブリダイゼーション法が挙げられる。複数の開示遺伝子から得られたｍＲＮＡ転写の水準を検出する特に有用な方法は、オリゴヌクレオチドが規則的に整列したアレイに、標識したｍＲＮＡをハイブリダイズする方法である。このような方法は、複数の遺伝子の発現プロファイル又はパターンを発生させるため、複数の遺伝子の転写水準を同時に測定できる。検体サンプルから誘導された遺伝子発現プロファイルは、癌のない検体サンプルから誘導された遺伝子発現プロファイルと比べて、癌検体サンプルの遺伝子が、病気のない検体サンプルに比べて過大発現しているかどうかを測定し、これにより検体が癌性の病気（例えば前立腺癌又は結腸癌）を持つか或いは発展する危険があるかどうかを測定することができる。
【００２４】
このハイブリダイゼーション法で利用されるオリゴヌクレオチドは、通常、固体支持体に結合している。固体支持体の例としては、限定されるものではないが、膜、フィルター、スライド、紙、ナイロン、ウエーハー、繊維、磁気又は非磁気ビーズ、ゲル、管、ポリマー、ポリ塩化ビニル皿等が挙げられる。オリゴヌクレオチドを結合できる固体表面は、いずれも直接又は間接的に、或いは共有的又は非共有的に使用できる。特に好ましい固体支持体は、高密度のアレイ又はＤＮＡチップである（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，カナダのＵ９５ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標））。これらの高密度アレイは、アレイ上の予め選択された位置に、特定のオリゴヌクレオチドプローブを有する。各予備選択位置は、特定プローブを１分子より多く含有できる。オリゴヌクレオチドは、支持体の特定位置にあるので、ハイブリダイゼーションのパターン及び強度（これらは一緒になって、独特の発現プロファイル又はパターンを生じる）は、特定遺伝子の発現水準として解釈できる。
【００２５】
オリゴヌクレオチドプローブは、関連する前記確認された遺伝子の相補的転写にだけ特異的にハイブリダイズするのに十分な長さを持つことが好ましい。ここで用いた用語“オリゴヌクレオチド”は、１本鎖の核酸を言う。オリゴヌクレオチドプローブの長さは、一般に少なくとも１６〜２０ヌクレオチドであるが、幾つかの場合は、少なくとも２０〜２５ヌクレオチドの長さのプローブが望ましい。
【００２６】
オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイズしたプローブ／標的ポリヌクレオチド複合体を検出するため、１つ以上の標識性部分（ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）で標識できる。標識性部分は、分光的、生化学的、光化学的、生体電子的、免疫化学的、電気光学的又は化学的手段により検出可能な組成物を含有できる。標識性部分の例としては、限定されるものではないが、放射性同位元素、例えば３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、化学蛍光性化合物、標識付き結合性蛋白質、重金属原子、蛍光性のマーカー及び染料のような分光マーカー、結合酵素、質量分析タグ及び磁気標識が挙げられる。
【００２７】
発現監視用のオリゴヌクレオチドプローブは、例えばＬｏｃｋｈａｒｔ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１４巻、ｐｐ．１６７５−１６８０（１９９６）；ＭｃＧａｌｌ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９３巻、ｐｐ．１３５５５−１３４６０（１９９６）；及びＵＳＰ  Ｎｏ．６，０４０，１３８に記載されるような、当業者に周知の技術に従って、製造し、使用できる。
【００２８】
遺伝子によりコード化した蛋白質の発現又は該蛋白質断片の発現は、検出可能に標識付
けするか、引き続き標識付けできるプローブにより検出できる。一般にプローブは、発現した蛋白質を認識する抗体である。幾つかの実施態様では、多数組織での蛋白質の発現は、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）及び免疫組織化学により分析できる。組織マイクロアレイは、当該技術分野で日常的に行われる方法に従って建造できる。例えば多数の組織サンプルを含むマイクロアレイは、例えば亜鉛ホルマリン固定のパラフィン埋込み試験片を付けた（ｗｉｔｈ）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いて製造できる。各マイクロアレイは、１つの仲間（ｃｏｒｅ）の各新生物を含有でき、分析の際、新生物の転写が輪郭的に描かれる（ｐｒｏｆｉｌｅ）。こうして、組織のマイクロアレイは、異なる癌の１組の組織ばかりでなく、複数の仲間の、選択された正常組織も含有できる（以下の実施例参照）。
【００２９】
ここで用いた抗体と言う用語には、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化又は空想の抗体、及び生物的機能の抗体断片（蛋白質又は該蛋白質の断片と十分、結合可能な抗体断片）が含まれる。
【００３０】
ＴＭＡのＩＨＣ（免疫組織化学）分析に使用される抗体は、当該技術分野で周知で、日常的に行われる方法を用いて発生できる。本発明を行うのに採用される幾つかの抗体は、市販品、例えばモノクローナル抗ＭＵＣ−２（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）；モノクローナル抗マスピン（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ，ＵＫ）；及び兎ポリクローナル抗ニューロペプチドＹ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ  ＮＪ）としても入手できる。
【００３１】
開示遺伝子の１つによりコード化された蛋白質又は該蛋白質の断片に対する抗体を製造するため、各種宿主動物は、ポリペプチド又はその一部を注射して、免疫化してもよい。このような宿主動物としては、限定されるものではなく、また少しであるが、兎、マウス及びラットが挙げられる。宿主種に応じて、免疫学的応答を向上するため、各種のアジュバントを使用してもよい。アジュバントとしては、限定されるものではないが、フロイント（完全又は不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リソレシチンのような界面活性物質、プルロン性（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳液、鍵穴笠貝（ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのような有用可能なヒトアジュバントが挙げられる。
【００３２】
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子生成物又はその抗原機能誘導体のような抗原で免疫化した海洋動物（ｔｈｅ  ｓｅａ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ）から誘導した抗体分子の不均質個体集団である。ポリクローナル抗体を製造するため、前述のような宿主動物は、前述のようなアジュバントを補充したコード化蛋白質又はその一部を注射して免疫化してよい。
【００３３】
特定の抗原に対する抗体の均質個体集団であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、培養時の連続細胞株により抗体分子を製造するいずれの方法でも得られる。これらの方法としては、限定されるものではないが、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのバイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ，第２５６巻，ｐｐ．４９５−４９７（１９７５）、及びＵＳＰ  Ｎｏ．４，３７６，１１０），ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒｅｔ等，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，第４巻，ｐ．７２（１９８３）：Ｃｏｌｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第８０巻，ｐｐ．２０２６−２０３０（１９８３））、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ等，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，
Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５））が挙げられる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びそれらの下位類のいずれかを含むいかなる免疫グロブリン類であってもよい。本発明のｍＡｂを製造するハイブリドーマは、試験管内でも生体内でも培養してよい。生体内でのｍＡｂの高タイター製造は、現在、好ましい製造法である。
【００３４】
更に、適当な抗体特異性のマウス抗体分子の遺伝子を、適当な生物活性のヒト抗体分子の遺伝子と一緒にスライスすることによる“キメラ抗体”の製造について発展した技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第８１巻，ｐｐ．６８５１−６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ，第３１２巻，ｐｐ．６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ等，Ｎａｔｕｒｅ，第３１４巻，ｐｐ．４５２−４５４（１９８５））が使用できる。キメラ抗体は、ネズミ科のｍＡｂ及びヒトの免疫グロブリンの定常領域から誘導された可変又は超可変領域を有する分子のように、異なる動物の種から異なる部分が誘導される分子である。
【００３５】
或いは、一本鎖抗体の製造について記載された技術（ＵＳＰ  Ｎｏ．４，９４６，７７８；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２４２巻，ｐｐ．４２３−４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第８５巻，ｐｐ．５８７９−５８８３（１９８８）；及びＷａｒｄ等，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３４，ｐｐ．５４４−５４６（１９８９））は、差別的に発現された遺伝子−一本鎖抗体を製造するのに適応できる。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重い鎖断片と軽い鎖断片とをアミノ酸ブリッジで結合することにより形成され、一本鎖蛋白質を生成する。
【００３６】
最も好ましくは、“ヒト化抗体”の製造に有用な技術は、その蛋白質、断片又は誘導体に対する抗体を製造するのに適応できる。このような技術は、ＵＳＰ  Ｎｏ．５，９３２，４４８、同５，６９３，７６２、同５，６９３，７６１、同５，５８５，０８９、同５，５３０，１０１、同５，５６９，８２５、同５，６２５，１２６、同５，６３３，４２５、同５，７８９，６５０、同５，６６１，０１６、同５，７７０，４２９に開示されている。
【００３７】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、公知の技術で発生できる。例えばこのような断片としては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により製造できるＦ（ａｂ’）２断片、及びＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィドブリッジを還元することにより発生できるＦａｂ断片が挙げられる。或いは、モノクローナルＦａｂ断片を所望の特異性により迅速、かつ容易に確認するため、Ｆａｂ発現ライブラリーを組み立ててもよい（Ｈｕｓｅ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２４６巻，ｐｐ．１２７５−１２８１（１９８９））。
【００３８】
次に、前述の抗体を利用する免疫アッセイ法により、サンプル中の既知蛋白質の発現の程度を測定する。このような免疫アッセイ法としては、限定されるものではないが、ドットブロッティング、ウエスタンブロッティング、競争的及び非競争的蛋白質結合アッセイ、酵素結合免疫収着（ｓｏｒｂａｎｔ）アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、その他、科学及び特許文献に一般的に広く記載されている方法及び商業的に多数採用されている方法が挙げられる。
【００３９】
特に好ましい方法は、検出が容易な点から、サンドイッチ式ＥＬＩＳＡで、この方法には多数の変形が存在し、本発明は、これら変形の全てを包含することを意図する。例えば通常の前（ｆｏｒｗａｒｄ）アッセイでは、非標識抗体は、固体基質上に固定され、テストサンプルは、この結合した分子と接触し、抗体−抗原の二成分系複合体を形成するのに十分な時間、温置される。次に、この点で、検出可能な信号を誘引できるレポーター分子で標識した第二抗体を加えて、抗体−抗原−標識抗体の三成分系複合体を形成するのに十
分な時間、温置される。未反応の材料は、全て洗浄、除去する。抗原の存在は、信号の観察により測定されるが、既知量の抗原を含有する対照サンプルと比較して、定量してもよい。前アッセイの変形としては、サンプル及び抗体の両方を結合抗体に同時に加える同時アッセイ、又は標識抗体とテストサンプルとをまず結合し（ｃｏｍｂｉｎｅ）、温置して、非標識表面結合の抗体に加える逆アッセイが挙げられる。これらの技術は、当業者に周知で、小さい変形の可能性は、容易に明らかとなる。ここで用いた“サンドイッチアッセイ”は、この基本的な２サイト技術に関するあらゆる変形を包含することを意図する。本発明の免疫アッセイについての限定的ファクターは、標識抗体が、関心のある遺伝子により発現された蛋白質に特異的な抗体であるということだけである。
【００４０】
この種のアッセイで最も普通に使用されているレポーター分子は、酵素、発蛍光団−又は放射性核種−含有分子である。酵素免疫アッセイの場合、酵素は、通常、グルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸塩により第二抗体に接合される。しかし、容易に認識されるように、当業者に周知の広範な異なる結さつ技術が存在する。普通に使用される酵素としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びその他の中でもアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。これら特定の酵素と併用される基質は、一般に、対応する酵素により加水分解して、検出可能な色調変化を生じるように選択される。例えばｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリ性ホスファターゼ複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）との併用に適し、またペルオキシダーゼ複合体には、普通、１，２−フェニレンジアミン又はトルイジンが使用される。前記色素原基質よりもむしろ、蛍光生成物を生じる発蛍光団基質を採用することも可能である。次に、適当な基質を含む溶液を第三複合体に加える。基質は、第二抗体に結合した酵素と反応し、定性的可視信号を与えるが、この信号は更に通常、分光測光法で定量して、分泌（ｓｅｃｒｅｔｅｄ）蛋白質又はその断片の量、例えば血清サンプル中に存在するＰＬＡＢ又はヘプシンの触媒領域を求めることができる。
【００４１】
或いはフルオレッセンやローダミンのような蛍光化合物は、これらの結合能力を変えることなく、化学的に抗体に結合できる。特定波長の光の照射により活性化すると、蛍光色素標識の抗体は、光エネルギーを吸収して、分子に励起可能な状態を誘引し、次いで特有の長波長で発光する。この発光は、光顕微鏡で可視的に検出可能な特有の色として現われる。免疫蛍光技術もＥＩＡ技術も当該技術分野では非常によく確立され、本方法には特に好ましい。しかし、放射性同位元素、化学発光又は生物発光分子のような他のレポーター分子も採用してよい。所要の用途に合うように手法をどのように変えるかは、当業者には容易に明らかとなる。
【００４２】
他の面では本発明は、各種形態の癌又はこれら癌のいずれかに発展する体質を診断する方法を提供する。この方法は、本発明に従って確認された所定の癌に対し、差別的に発現した少なくとも１つ（例えば１、２、３、４、５又はそれ以上）の癌特異的バイオマーカーを検出する工程を含む（例えば第１表参照）。通常、診断テストは、検体（例えば哺乳動物）中の少なくとも１つのバイオマーカー（例えばＭＩＣ−１）の測定水準を、癌に罹っていない非罹患検体の対照集団について測定した基線水準と比較することにより機能する。幾つかの癌では、バイオマーカーの異常発現は、特定種類の組織（例えば乳癌については、乳房組織）に限定される。このような場合、比較用バイオマーカーの基線水準は、癌が存在しない対照組織でのバイオマーカーの発現水準であってもよい。
【００４３】
測定水準が、対照集団（又は対照組織）の基線水準と有意に相違していなければ、診断テストの結果は、マイナスとみなされる。これに対し、検体の測定水準と非罹患検体の基線水準（又は対照組織）との間に有意な隔たり（ｄｅｐａｒｔｕｒｅ）があれば、診断テストの結果はプラスであることを示し、検体は、バイオマーカーの異常な存在又は異常な水準を有するものとみなされる。一般に、この隔たりは、これらバイオマーカーの発現水
準の増加である。しかし、特定の癌の幾つかのバイオマーカーについての異常は、低い発現水準であってもよい。
【００４４】
前述のように、好ましい実施態様では、発現水準において少なくとも２倍の差が観察されれば、基線水準からの隔たりは、統計的に有意である。しかし、特定の場合（癌及びバイオマーカー）によっては、検体と実験誤差間の固有の変化のため、測定値が、非罹患検体で通常、観察される範囲外になれば、発現水準の２倍差未満の隔たりは、なお有意であるとみなし得る。例えば幾つかの方法では、測定水準が、対照集団での水準の平均＋１標準偏差以内であれば、隔たりは、有意とみなし得る。したがって、測定水準と基線水準との差が、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であれば、有意の隔たりは起こるかも知れない。測定値と対照集団の基線値との隔たりの程度は、診断についてのほぼ確実な精度及び／又は検体が受けている病気の厳しさのの指示薬ともなる。
【００４５】
癌の診断方法は、各バイオマーカーの発現水準を測定し、比較する工程の他、検体から所定の癌に対するバイオマーカーの発現プロファイルを得る工程、及びこの遺伝子発現を、癌を持つことが判っている検体の少なくとも１つの発現プロファイルと比較する工程を伴い得る。この発現プロファイルは、その癌用の少なくとも１つの（例えば１、２、３、４、５又はそれ以上）バイオマーカーの発現水準（例えば血清中で）を含有できる。発現プロファイルを得る方法及び病気診断にこれらプロファイルを使用する方法は、当該技術分野で周知である。例えば本発明方法は、例えばＵＳＰＮ  ６，３６５，３５２又はＷＯ
０１１１０８２に記載されるように、本発明者らが確認した特定のバイオマーカーを用いて実施できる。
【００４６】
この診断法では、分泌癌バイオマーカーの水準を測定するための好ましい生体サンプルは、血清である。血液からの他の組織サンプル、例えば全血液及びプラズマも、検体及び対照集団での分泌バイオマーカーの水準測定に使用できる。
【００４７】
血液関連生体サンプル以外の他のサンプルも癌バイオマーカーの発現水準の測定に使用してよい。これらサンプルとしては、例えば器官、組織又は細胞や、尿、その他の体液から得られるサンプルが挙げられる。サンプルは、皮膚、毛、尿、唾液、精液、大便、汗、乳、羊水、肝臓、心臓、筋肉、腎臓、その他の器官から得られる組織生検であってよい。組織サンプルは、通常、サンプル内細胞の蛋白質及び／又は核酸分を遊離させるため、溶解する。このような粗溶解物からの蛋白質又は核酸断片は、次に分析前に部分的又は完全に精製する。
【００４８】
下記第１表に、癌の診断に好適な分泌バイオマーカーの例を示す。例えば前立腺癌の存在又はその発展体質を診断する幾つかの方法は、リラキシン−１、ＭＩＣ−１又はニューロペプチドＹの差別的発現水準を検出する工程を含む。同様に、差別的に発現したＭＵＣ−２も、結腸癌の診断が可能である。特定組織の癌を診断する他、本発明の幾つかの方法は、数種の組織における癌の診断に向けたものである。例えばマプシン（ｍａｐｓｉｎ）又はＭＵＣ−１の差別的発現水準の検出は、前立腺、結腸又はその他の組織（実施例参照）中の癌の存在又は癌の発展体質を指示できる。これらの方法は、更に、癌を検出し、診断する従来の手法により、検体を検査する工程を含んでよい。このような手法、例えばＣＡＴ走査、ＭＲＩ及び超音波検査は、当該技術分野で周知であり、日常的に行われている。その他の各種形態の癌の診断手法は、当該技術分野で例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｃｃａｎｃｅｒ．ｂｃ．ｃａ／ＰＰＩ／ＴｙｐｅｓｏｆＣａｎｃｅｒ／ＣａｎｃｅｒｉｎＧｅｎｅｒａｌ／ＤｉａｎｏｓｉｎｇＣａｎｃｅｒに記載されている。
【００４９】
本発明方法は、各種形態の癌の存在又は癌の発展体質を診断するため、検体の集団を大
規模選別するのに好適である。これらの方法は、検体中に存在する可能性がある他の疾患についての更なる生物学及び／又は遺伝子学マーカーと共同で任意に採用できる。
【００５０】
本発明の一面では、本発明方法を用いて確認された少なくとも１つのマーカーの発現水準を検出するためのキットが提供される。例えばキットは、バイオマーカーの少なくとも１つによりコード化した蛋白質又は相当するｍＲＮＡを検出できる標識した化合物又は試剤；該蛋白質の遺伝子又は断片により、又はこれらに相当するｍＲＮＡにより、コード化した蛋白質の量を検出する手段；及び検体サンプルから得られた、該蛋白質の遺伝子又は断片により、又はこれらに相当するｍＲＮＡにより、コード化した蛋白質の量を、例えば癌のない検体からの、遺伝子の基準発現水準と比較する手段；を備えることができる。標識化合物又は試剤は、適当な容器に包装できる。キットは、更に、蛋白質の遺伝子により、又はこれらに相当するｍＲＮＡにより、コード化した蛋白質を検出するために、キットを使用する指示書を備えることができる。
【００５１】
本発明は、既に癌であると診断した検体、特に治療に対する応答を監視するのに適した方法を提供する。他の一面では、検体中の癌の進行は、経時、即ち、癌の各種段階において、検体から得られた体液サンプル又はその他の組織サンプル中で、本発明方法に従って確認されたバイオマーカーの発現水準を測定することにより監視できる。経時により、遺伝子に相当するｍＲＮＡ又はコード化した蛋白質の発現水準の増加は、疾病（例えば前立腺癌又は結腸癌）の進行を示す。遺伝子に相当するｍＲＮＡ又は蛋白質の発現水準は、前述のような標準的方法で検出できる。
実施例
以下の実施例は説明のためで、本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００５２】
実施例１：分泌蛋白質をコード化する遺伝子の確認
本実施例は、癌用バイオマーカーを確認するため、本発明の一使用例を説明する。一連の４５の正常組織サンプル及び１５０の悪性組織サンプルについて、〜１２，５００転写の発現を調べた。悪性組織サンプルは、前立腺、乳房、肺、卵巣、結腸直腸、腎臓、肝臓、膵臓、ボウコウ／尿道及び胃腸／食道の癌を有する。データーベース注釈と予測アミノ酸配列分析との組合わせにより、主として分泌蛋白質をコード化する５７６の遺伝子の部分集合が確認され、そのうち、３２は、癌特異的過大発現を示した。確認した遺伝子のうち、幾つかは、それぞれ、乳癌中のマンマグロビン、及び卵巣癌中のカリクレイン６及び１０のような既知又は候補の診断蛋白質をコード化する。従って、我々は、更に組織マイクロアレイについての免疫組織化学により、又は腫瘍細胞状態調節した媒体のウエスタンブロット分析により、幾つかの場合には高水準のコード化蛋白質を証拠した。現在の研究は、腫瘍バイオマーカー候補の体系的発見のため、転写プロファイリングと、注釈／蛋白質配列分析と、免疫アッセイとの結合力を示し、検出すれば、癌診断の感度を改良できる幾つかの蛋白質を強調する。
【００５３】
図１に示すように、２つの異なる接近方法により、分泌蛋白質をコード化する遺伝子候補に対しオリゴペプチドプローブセットをろ過した。図１Ａに示すように、プローブセットは、遺伝子腫瘍学（ＧＯ）協会（Ｇｅｎｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）注釈（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）にマップされ、蛋白質分泌を示唆する“場所”注釈を持つものが確認された（１，１６０）。図１Ｂに示すように、２つの配列に基づくアルゴリズム：“Ｔｍａｐ”（Ｐｅｒｓｓｏｎ等，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２３７：１８２−１９２，１９９４）及び“Ｓｉｇｃｌｅａｖｅ”（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：４６３８−４６９０，１９８６）を用いて、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ上に表示された遺伝子の蛋白質配列を調べた。ＳｉｇＣｌｅａｖｅは、任意のアミノ酸配列データにおける本物の信号ペプチド切断部
位の可能性を推定し、Ｔｍａｐは、蛋白質における膜貫通領域を予測する。一連の１，７２４のプローブセット（“遺伝子”）は、両配列アルゴリズムにより課された基準に適合する。
【００５４】
分泌蛋白質をコード化しそうなＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ９５ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ上の遺伝子に対し選択するため、２つの接近方法を用いた（図１）。まず、各遺伝子と関連する注釈がコード化蛋白質の細胞外間隙への分泌を意味するかどうか尋ねた。詳しくは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ９５ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐからＮＣＢＩ’ｓ  ＬｏｃｕｓＬｉｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ／）経由でＧＯ団体により提供された注釈までプローブセットをマップした。前記データベースは、蛋白質の分子機能、生物学的プロセス、及び細胞成分に関する制御された語彙を提供する。これら用語の中の３０の用語に絞ることにより、Ｕ９５ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ上の遺伝子と関連する注釈のうち、１，１６０の遺伝子が確認された。これら３０の用語は、血液凝固、血液凝固因子、細胞−細胞信号送り（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、細胞連絡、補体活性化、補体成分、利尿ホルモン、エフリン、細胞外、細胞外マトリックス、細胞外マトリックスグリコ蛋白質、細胞外マトリックス構造蛋白質、細胞外間隙、ホルモン、インスリン様成長因子受容体配位子、インターロイキン１２受容体配位子、インターロイキン２受容体配位子、インターロイキン４受容体配位子、インターロイキン５受容体配位子、インターロイキン６受容体配位子、インターロイキン７受容体配位子、インターロイキン８受容体配位子、白血病阻害剤因子、レポーター配位子、配位子、ニューロペプチドホルモン、オプソニン、蛋白質分泌、分泌ホスホリパーゼＡ２、組織カリクレイン、血管内皮成長因子受容体配位子である。
【００５５】
蛋白質配列を特徴とする遺伝子を目的とした並行接近方法は、信号ペプチド切断部位の存在と同時に、膜貫通領域の不存在も暗示し、こうして膜を通って分泌した蛋白質生成物を示唆した。ＴＭＡＰ及びＳＩＧＬＥＡＶＥプログラム用の保存的しきい値（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（例えばＰｅｒｓｓｏｎ等、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｃｈｅｍ  １６，４５３−７，１９９７；Ｍｉｌｐｅｔｚ等、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２０，２０４−５，１９９５；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１４，４６８３−９０，１９８６参照）をこれらの分析に用いた。この方法により、１，７２４の遺伝子１セットが潜在的に細胞外蛋白質をコード化していることが確認された（図１）。
同時に、これら２つの方法で２，３０８の遺伝子の部分集合を確認した。そのうちの５７６は、両方法を用いて得られた。
【実施例２】
【００５６】
実施例２：腫瘍での候補遺伝子の発現
本実施例は、各種解剖学源の腫瘍に分泌した蛋白質をコード化する遺伝子候補の過大発現について説明する。これら２，３０８の遺伝子の発現を、１０の異なる解剖学源、相当する解剖部位での４６の正常組織、及び我々の“腫瘍／正常”コレクションには示さなかった９のその他の解剖学部位を示す一連の１５０の癌で検査した（図２）。探した遺伝子は、起点（ｏｒｉｇｉｎ）の一つ以上の部位の腫瘍で発現が高く、従って他の正常体組織では発現が低いか存在しなかった遺伝子である。
【００５７】
２，３０８のプローブセットのうち、８３（３．６％）が、第１表に示すように、これらの基準に適合し、７７の異なる遺伝子を表示する。注釈及び配列の両方に基づく分析により確認された３２のプローブセット（３０の異種遺伝子）（第１表、図２Ａ参照）では、殆ど全ては分泌蛋白質をコード化し、３／３０遺伝子だけ（ＲＥＴ共同受容体、ＧＦＲＡ−１、腫瘍壊死因子スーパーファミリーの中のメンバー９であるＴＮＦＲ９、及びサイトカイン受容体様因子１であるＣＲＬＦ−１）は、このような蛋白質をコード化しそうも
ない。注釈単独で確認された１６のプローブセット（１５の異なる遺伝子）では、１１／１５が分泌することが見い出された。しかし、アミノ酸配列単独内の特徴により選択された９／２９の独特の遺伝子だけは、分泌の証拠を持っていた。これら遺伝子の大部分は、ＧＰＩ固定又は集積膜蛋白質であることが見い出された。
【００５８】
或る研究では、分泌蛋白質をコード化するｍＲＮＡに相当するとして、これらのアルゴリズムを用いて確認したヌクレオチド配列に相当するｍＲＮＡを、各種癌及び非癌サンプルの発現について分析した。図２Ａ、２Ｂに示すように、少なくとも１つの腫瘍−正常対応物組織対での有意の過大発現（＞３倍）、及びその他のいずれかの正常組織と比べた、腫瘍での有意の過大発現（＞２倍）により、分泌蛋白質をコード化する３２の遺伝子を確認した。
【００５９】
分泌蛋白質に対する転写の前立腺癌特異的高発現を示す結果を確かめるため、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。これらの結果から、確認遺伝子は、実際に前立腺癌細胞において非癌細胞に比べて過大発現することが確かめられた。これらの結果を更に確かめるため、バイオマーカー蛋白質候補に特異的な抗体を用いて、前立腺に生じるものを含む、３６の上皮組織及び２２９の癌を有する組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を汚染する免疫アッセイを行った。
【実施例３】
【００６０】
実施例３：腫瘍サンプル中の遺伝子候補の証拠
前記接近方法の証拠は、まず、ここで確認した遺伝子の多くは、癌組織中で予め調節障害がある（例えば転写に基づく他の接近方法又はＩＨＣによる）か、或いは相手の対照に比べて癌患者の血清に高まりがあるという観察に由来する。後者には、肺癌でのガストリン放出性ペプチド（ＧＰＲ／ボンベシン（ｂｏｍｂｅｓｉｎ））（Ｈｅａｓｌｅｙ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０，１５６３−９，２００１）、卵巣癌でのカリクレイン６及び１０（ＫＬＫ６、ＫＬＫ１０）（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ等，Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３３，５７９−８３，２０００）及びＬｕｏ等，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ３０６，１１１−８，２００１）、肝臓癌でのα−フェト蛋白質（ＡＦＰ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ等，Ｃｌｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  ５，１４５−５９，２００１）、及び乳癌でのマンマグロブリンＡ（ＭＧＢＡ）（Ｆｌｅｍｉｎｇ等，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９２３，７８−７９，２０００）がある。
【００６１】
【表１】
2005523727.tif 000002
【００６２】
【表２】
2005523727.tif 000003
【００６３】
【表３】
2005523727.tif 000004
【００６４】
表注：
Ｔ／ＣＮ＝腫瘍組織と相当する正常組織との発現比
Ｔ／ＯｔｈｅｒＮ＝腫瘍組織と“他の”正常組織との発現比
証拠＝遺伝子が、ＧＯ注釈及び配列分析（ＧＯとＴＭＳＣ）、ＧＯ注釈のみ（ＧＯのみ）又は配列分析のみ（ＴＭＳＣのみ）により確認されたかどうか。
乳房，ＥＲ＋＝エストロゲン受容体陽性乳癌
乳房，ＥＲ−＝エストロゲン受容体陰性乳癌
乳房，ＥＲ＋／−＝ＥＲ状態が決められない乳癌
肺，ＡｄＣａ＝肺腺癌（ａｄｅｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）
肺,ＳＣＣ＝肺扁平上皮癌
肺，他＝扁平上皮癌又は腺癌以外の組織を持った肺癌
【００６５】
更に、この接近方法で発見した他の遺伝子の多くについて、幾つかの独立した方法を用いて腫瘍の過大発現が確認された。例えば前立腺癌（図２Ｂの強調部分）では、リラキシン−１（ＲＬＮ１）の高度な組織選択性発現である、分娩管を改造する際に含まれるインスリン科の小ペプチドホルモン（Ｂａｎｉ，Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２８，１３−２２，１９７７）が、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、９の前立腺組織及び１９の非前立腺組織中に確認された。ＰＣＲにより測定されたＲＬＮ−１の発現水準は、マイクロアレイハイブリダイゼーションで得られた結果（図３Ａ）と完全に一致した。これらの結果から、確認遺伝子は、前立腺癌組織では、非癌細胞に比べて、実際に過大発現したことが確認された。
【００６６】
正常前立腺組織に比べて、１５／２５の前立腺癌で高度に発現したニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）については、各種解剖源の２２９の癌及び３６の正常組織サンプルを含む組織マイクロアレイを市販の抗−ＮＰＹ抗体で汚染した。正常細胞組織では、神経及び少数の前立腺分泌上皮細胞に汚染が見られ、一方、高いＮＰＹ遺伝子発現を持つ前立腺癌では、これに応じて高水準の蛋白質発現が見られた（図３Ｂ）。抗ＮＰＹ抗体は、ＴＭＡ上の他の解剖部位の癌、或いはこれらのアレイ上に含まれる他の非神経又は非神経性内分泌の正
常組織を汚染しなかった。
【００６７】
その他の癌部位でも、他の蛋白質候補に対して向けた抗体を用いて、同様に一定の結果が得られた。転写分析から予測されるように、ＭＵＣ−２に特異的な抗体は、結腸癌中で選択的な発現を示し、一方、マスピン（ｍａｓｐｉｎ）に特異的な抗体は、結腸、食道、肺及び膵臓の癌中で正常組織部位に比べて高い発現を示した（図４Ａ〜４Ｃ）。幾つかの乳管癌中では、正常乳管組織に比べて低いマスピン発現が見られた。これは、乳癌中の腫瘍サプレッサーとして意図した役割と一致する（Ｓａｇｅｒ等、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ
Ｂｉｏｌ  ４２５，７７−８８，１９９７）。しかし、有意に高い水準のマスピン蛋白質を有する乳癌の例も観察された（図５Ａ、５Ｂ）小シリーズの乳房腫瘍では、マスピン発現は、腫瘍のエストロゲン受容体状態と相関することが見い出された。これは、ＥＲ陰性癌でのマスピン遺伝子過大発現についての最近の報告と一致する（Ｍａｒｔｉｎ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０，２２３２−８，２０００）。
【実施例４】
【００６８】
実施例４：独立のデータセットでの遺伝子候補の過大発現
本例は、他の独立のデータセットでの遺伝子候補の過大発現を説明する。例えばＢｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ等（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１３７９０−５，１９９１）の公的にアクセス可能なデータにより、１７の正常肺サンプル、１２７の腺癌、２１の扁平上皮癌、２０の肺カルチノイド及び６の小細胞未分化癌を含む２０３の肺組織中で本発明の肺癌遺伝子候補について発現の分析が可能となった。この分析は、遺伝子発現と組織学サブタイプとの幾つかの顕著な相関関係を示した。例えばＧＲＰ／ボンベシンは、主として小細胞肺癌及びカルチノイドにおいて過大発現し、刊行された報告（Ｓｕｎｄａｙ等、Ｐａｔｈｏｌ  ２２，１０３０−９，１９９１）と一致し、腺癌では僅かに２／１２７であった。これに対し、マプシンは、扁平上皮癌の殆ど全てで発現したが、腺癌では少数で、またカルチノイドでは全く発現しなかった。これら結果の特異性は、主として前立腺癌特異的発現に対して対照として含まれるＲＬＮ１及びＮＰＹの相対的不足により反映される（図６）。正常肺組織に比べ、かつ相対的組織学特異性に対して、マプシンやヘパリン結合性蛋白質１７（ＨＢＰ−１７）及びガレクチン７のような蛋白質が、診断用バイオマーカーとして有用であると思われる。
【００６９】
ここに記載した実施例及び実施態様は、例示の目的であり、この観点から種々の変形又は変化は、当業者に示唆されるであろうし、また本願の精神及び範囲、並びに付属の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきである。ここに引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のため、ここに援用した。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】癌組織中で差別的に発現する分泌蛋白質をコード化する遺伝子を確認するための計画の概略を示す。
【図２】Ａ，Ｂは、分泌したバイオマーカー候補の発現が多種類の癌で高まることを示す。
【図３】Ａ，Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲ、ＩＨＣ及びＥＬＩＳＡによるマイクロアレイ遺伝子発現の証拠を示す。
【図４】Ａ，Ｂ，Ｃは、診断用蛋白質候補における水準増加の証拠を示す。
【図５】Ａ，Ｂは、マスピン発現の上方規制は、乳癌におけるエストロゲン受容体状態と相関することを示す。
【図６】正常及び腫瘍の肺組織サンプルの拡大セットにおける肺癌マーカー候補の発現を示す。
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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