(57)【要約】ストレプトコッカス ウベリス（Ｓ．ウベリス）のＣＡＭＰ因子遺伝子、及びそれからの組換えＣＡＭＰ因子の生成を記載する。１種を超える細菌種由来のＣＡＭＰ因子エピトープを含むキメラＣＡＭＰ因子構築体も開示する。ＣＡＭＰ因子及びそれを含むキメラを細菌感染症の予防及び治療をするための免疫原性組成物に使用することができる。
2005523704.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種を超える細菌種に由来する１つ又は複数のＣＡＭＰ因子エピトープを含む免疫原性ポリペプチド。
【請求項２】
前記１つ又は複数のＣＡＭＰ因子エピトープが、１〜２０アミノ酸からなるスペーサによって分離されている、請求項１に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、ストレプトコッカス属の１種を超える細菌種に由来する１つ又は複数のＣＡＭＰ因子エピトープを含む、請求項１又は２に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項４】
前記細菌種が、ストレプトコッカス ウベリス、ストレプトコッカス アガラクティエ、及び化膿連鎖球菌からなる群から選択される、請求項３に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項５】
前記ＣＡＭＰ因子のエピトープの少なくとも１つが、図２のアミノ酸１〜９０によって画定された領域に相当するＣＡＭＰ因子のＮ末端可変領域に由来する、請求項４に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｎ末端可変領域由来のＣＡＭＰ因子エピトープを、図２又は図３のＣＡＭＰ因子蛋白質に対して少なくとも８０％の配列相同性を有するＣＡＭＰ因子蛋白質内に介在させ、さらに前記ＣＡＭＰ因子蛋白質は前記Ｎ末端可変領域由来のＣＡＭＰ因子エピトープとは異なる連鎖球細菌種由来である、請求項５に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｎ末端可変領域由来のＣＡＭＰ因子エピトープが、図３の位置３１〜８７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＣＡＭＰ因子蛋白質が図２のＣＡＭＰ因子蛋白質に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する、請求項６に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、図８の位置２７〜３１４に示す連続アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、図８の位置２７〜３１４に示すアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項１０】
さらにシグナル配列を含む、請求項９に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項１１】
前記シグナル配列が、図８の位置１〜２６に示すアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項１２】
図８に示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド、及び薬剤として許容されるビヒクルを含む免疫原性組成物。
【請求項１４】
（１）請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチドを得るステップ、及び
（２）前記ポリペプチドを薬剤として許容されるビヒクルと合わせるステップ
を含む免疫原性組成物の製造法。
【請求項１５】
脊椎動物対象に治療有効量の請求項１３に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む、前記対象で細菌感染症を治療し又は予防する方法。
【請求項１６】
前記細菌感染症が、連鎖球菌感染症である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌感染症が、乳房炎を引き起こす、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチドを標的とした抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、ポリクローナルである、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、モノクローナルである、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチドをコードするコード配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２２】
（ａ）請求項２１に記載のポリヌクレオチド、及び（ｂ）前記ポリヌクレオチドに動作可能に結合し、それによって前記コード配列が宿主細胞中で転写及び翻訳されるようにする少なくとも１個の制御要素を含む、組換えベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
前記ポリペプチドを生成する条件下で、請求項２３に記載の宿主細胞集団を培養するステップを含む、免疫原性ポリペプチドの生成方法。
【請求項２５】
（ａ）前記連鎖球菌に対する抗体が、生体試料中に存在するときには前記ポリペプチドと結合して抗体／抗原複合体を形成できるような条件下で、前記生体試料と請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチドを反応させるステップ、及び
（ｂ）前記複合体が存在するか否かを検出し、それによって前記試料に連鎖球菌に対する抗体が存在するか否かを検出するステップ
を含む生体試料中の連鎖球菌に対する抗体を検出する方法。
【請求項２６】
連鎖球菌感染症検出用免疫診断試験キットであって、前記試験キットが請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド、及び免疫診断試験を実施するための使用説明書を含む試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
概括的には、本発明は細菌抗原に関する。より詳細には、本発明はストレプトコッカス  ウベリス（Streptococcus uberis）（S.uberis）からＣＡＭＰ因子を組換え生成すること、及びＣＡＭＰ因子のワクチン組成物での使用に関する。本発明は、１種を超える細菌種に由来するＣＡＭＰ因子のエピトープを含むキメラＣＡＭＰ因子構築体の生成及び使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓ．ウベリスは、乳牛乳房炎の重大な原因であり全乳房炎臨床例の約２０％の原因である［Bramley,A.J. and Dodd,F.H.(1984) J.Dairy Res. 第５１号 ４８１〜５１２頁, Bramley,A.J.(1987)Animal Health Nutrition、第４２号 １２〜１６頁、Watts,J.L.(1988)J.Dairy Sci. 第７１号 １６１６〜１６２４頁］。一般に、抗菌剤治療は、Ｓ．ウベリス乳房炎の治療に効果がないので、抑制手段の開発は乳腺の侵入及び防御に伴う病原性因子及び防御抗原の理解に基づく必要がある［Collins et al. (1988) J.Dairy Res. 第５５号 ２５〜３２頁、Leigh et al. (1990) Res.Vet.Sci. 第４９号 ８５〜８７頁、Marshall et al. (1986) J.Dairy Res. 第５３号 ５０７〜５１４頁］。
【０００３】
一部のＳ．ウベリス株からヒアルロン酸カプセル［Hill,A.W. (1988) Res.Vet.Sci. 第４５号 ４００〜４０４頁］、ヒアルロニダーゼ［Schaufuss et al. (1989) Zentralbl.Bakteriol.Ser.A 第２７１号 ４６〜５３頁］、Ｒ様蛋白質［Groschup,M.H.及びTimoney、J.F. (1993) Res.Vet.Sci. 第５４号、１２４〜１２６頁］、及び共溶血素、ウベリス因子としても知られているＣＡＭＰ因子を製造できることが知られている［Skalka,B. and Smola,J. (1981) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 第２４９号 １９０〜１９４頁］。しかし、病原性におけるその役割はほとんど知られていない。
【０００４】
ＣＡＭＰ因子の作用は、１９４４年にChristieらによって初めて記載された［Christie et al.(1944)Aus.J.Exp.Biol.Med.Sci. 第２２号 １９７〜２００頁］。彼ら著者は、Ｓ．アガラクティエ（S. agalactiae）などのＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）は、黄色ブドウ球菌β−トキシン、スフィンゴミエリナーゼの拡散ゾーン域付近で増殖すると、明瞭な完全溶血ゾーンを生じることを見出だした。この現象は、ＣＡＭＰ反応と称され、この反応化合物はＣＡＭＰ因子、分子量２３，５００、細胞外蛋白質であるとして特徴付けられた［Bernheimer et al. (1979)Infect.Immun. 第２３号、８３８〜８４４頁］。続いて、ＣＡＭＰ因子はＳ．アガラクティエから精製され、蛋白質、２５，０００Ｄａ、ｐＩ＝８．９であることが特徴付けられた［Jurgens et al. (1985)J.Chrom. 第３４８号 ３６３〜３７０頁］。Ｓ．アガラクティエＣＡＭＰ因子のアミノ酸配列はRuhlmannらによって決定された［Ruhlmann et al. (1988)FEBS Lett 第２３５号 ２６２〜２６６頁］。
【０００５】
ＣＡＭＰ反応の機序は記載されている。たとえば、Bernheimer et al. 、(1979)Infect.Immun. 第２３号 ８３８〜８４４頁、Sterzik et al. 「Interaction of the CAMP factor from S.agalactiae with artificial membranes.」、Alouf et al. 編、『Bacterialprotein toxins』、英国ロンドン、Academic Press Inc.、１９８４、１９５〜１９６頁、Sterzik et al. (1985) Zentralbl.Bakteriol.Mikrobiol. Hyg. Abt.1 Suppl.、第１５号、１０１〜１０８頁、Fehrenbach et al.  「Role of CAMP-factor (protein B) for virulence.」、Fehrenbach et al. 編、『Bacterial protein toxins』、独国シュトゥットガルト、Gustav Fischer Verlag、１９８８、３５１〜３５７頁、Fehrenbach et al. 「Interaction of amphiphilic bacterial polypeptides with artificialmembranes」、Alouf et al.編、『Bacterial protein toxins』、英国ロンドン、Academic Press Inc.、１９８４、３１７〜３２４頁、を参照のこと。
【０００６】
ＣＡＭＰ因子は、ヒツジやウシの赤血球を含む様々な標的細胞、及び膜リン脂質及びスフィンゴミエリンがホスホリパーゼ又はスフィンゴミエリナーゼによって加水分解されている人工膜に対して溶解作用を有する。
【０００７】
病原性におけるＣＡＭＰ因子の役割は不明である。Ｓ．アガラクティエ（S. agalactiae）から部分精製したＣＡＭＰ因子は、ウサギに静脈内投与すると致死的であることが示されている［Skalka,B. and Smola,J. (1981) Zentralbl.Bakteriol. Ser. A 第２４９号 １９０〜１９４頁］。さらに、マウスに精製したＣＡＭＰ因子を腹腔内注射すると、致死量以下の用量のＢ群連鎖球菌の病原性を著しく上昇させることが示されている［Fehrenbachet al. 「Role of CAMP-factor (protein B) for virulence.」、Fehrenbach et al.編、『Bacterial protein toxins』、独国シュトゥットガルト、Gustav Fischer Verlag、１９８８、３５１〜３５７頁］。さらに、Ｓ．アウレウス蛋白質Ａのように、ＧＢＳのＣＡＭＰ因子は免疫グロブリンのＦｃ部位を結合することができ、それによって蛋白質Ｂと称されている［Jurgens et al. (1987)J.Exp.Med. 第１６５号 ７２０〜７３２頁］。
【０００８】
ＧＢＳ及びＳ．ウベリスの他に、リステリア  モノサイトゲネス（Listeria monocytogeneｓ）及びリステリア  セエリゲリ（Listeria seeligeri）［Rocourt, J. and Grimont, P. A. D. (1983) Int. J. Syst. Bacterial 第３３号 ８６６〜８６９頁］、アエロモナス属［Figura, N. and Guglielmetti, P. (1987) J. Clin. Microbiol 第２５号 １３４１〜１３４２頁］、ロドコッカス  エクイ［Fraser, G. (1961) Nature 第１８９号 ２４６頁］、及びある種のビブリオ属［Kohler, W. (1988) Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. A、第２７０号、３５〜４０頁］を含む他の細菌がＣＡＭＰ作用に類似する反応を生ずる。
【０００９】
ＧＢＳ及びＡ．プルロニューモニエ（pleuropneumoniae）のＣＡＭＰ因子遺伝子は、大腸菌中にクローン化され発現している［Schneewind et al. (1988) Infect. Immun. 第５６号 ２１７４〜２１７９頁、Frey et al. (1989) Infect. Immun. 第５７号、２０５０〜２０５６頁］。加えて、Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）株である化膿連鎖球菌由来のＣＡＭＰ因子をコードする遺伝子も単離されている［Gase et al. (1999) Infect. Immun. 第６７号 ４７２５〜４７３１頁］。ＣＡＭＰ蛋白質生成物は、Ｓ．アガラクティエ及びＳ．ウベリスＣＡＭＰ蛋白質に類似する大きさであり相同性を有していた。Ａ．プルロニューモニエのクローン化ＣＡＭＰ蛋白質に対して生じた抗体はＣＡＭＰ反応を中和し、このＣＡＭＰ反応はクローン化ＣＡＭＰ遺伝子及びＡ．プルロニューモニエのそれを含む大腸菌株によって媒介され、さらにＳ．アガラクティエＣＡＭＰ因子と交差反応した。ＧＡＳ株では、ｃｆａ（ＣＡＭＰ）遺伝子の分布が分析された。この遺伝子は、ＧＡＳ間で広く伝播された：１００個の臨床ＧＡＳ単離物のうち８２個が陽性ＣＡＭＰ反応を生じた。ＣＡＭＰ陰性株の中では、１８のＧＡＳ株のうち１７株がｃｆａ遺伝子を含んでいた。さらに、Ｃ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、及びＵ血清型由来の連鎖球菌でＣＡＭＰ活性が検出された［Gase et al. (1999) Infect. Immun. 第６７号 ４７２５〜４７３１頁］。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９１／０４２８２号
【特許文献２】米国特許第４，７０８，８７１号
【特許文献３】米国特許第４，４３１，７３９号
【特許文献４】米国特許第４，４２５，４３７号
【特許文献５】米国特許第４，３３８，３９７号
【特許文献６】米国特許第４，３４１，７６１号
【特許文献７】米国特許第４，３９９，１２１号
【特許文献８】米国特許第４，４２７，７８３号
【特許文献９】米国特許第４，４４４，８８７号
【特許文献１０】米国特許第４，４５２，５７０号
【特許文献１１】米国特許第４，４６６，９１７号
【特許文献１２】米国特許第４，４７２，５００号
【特許文献１３】米国特許第４，４９１，６３２号
【特許文献１４】米国特許第４，４９３，８９０号
【特許文献１５】米国特許第５，０７１，６５１号
【特許文献１６】米国特許第４，７２２，８４０号
【特許文献１７】国際公開第ＷＯ／９０／１１０９２号
【非特許文献１】Bramley, A. J. and Dodd, F. H. (1984) J. Dairy Res. 第５１号 ４８１〜５１２頁
【非特許文献２】Bramley, A. J. (1987) Animal Health Nutrition 第４２号 １２〜１６頁
【非特許文献３】Watts, J. L. (1988) J. Dairy Sci. 第７１号 １６１６〜１６２４頁
【非特許文献４】Collinset al. (1988) J. Dairy Res. 第５５号 ２５〜３２頁
【非特許文献５】Leigh et al. (1990) Res. Vet. Sci. 第４９号 ８５〜８７頁
【非特許文献６】Marshall et al. (1986) J. Dairy Res. 第５３号 ５０７〜５１４頁
【非特許文献７】Hill, A. W. (1988) Res. Vet. Sci. 第４５号 ４００〜４０４頁
【非特許文献８】Schaufuss et al. (1989) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 第２７１号 ４６〜５３頁
【非特許文献９】Groschup, M. H. and Timoney、 J. F. (1993) Res. Vet. Sci. 第５４号 １２４〜１２６頁
【非特許文献１０】Skalka, B. and Smola, J. (1981) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 第２４９号 １９０〜１９４頁
【非特許文献１１】Christie et al. (1944) Aus. J. Exp. Biol. Med. Sci. 第２２号 １９７〜２００頁
【非特許文献１２】Bernheimer et al. (1979) Infect. Immun. 第２３号 ８３８〜８４４頁
【非特許文献１３】Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 第３４８号 ３６３〜３７０頁
【非特許文献１４】Ruhlmann et al. (1988) FEBS Lett 第２３５号 ２６２〜２６６頁
【非特許文献１５】Sterzik et al. 「Interaction of the CAMP factor from S.agalactiae with artificial membranes.」 Alouf et al.編、『Bacterialprotein toxins』、英国ロンドン、Academic Press Inc. １９８４、１９５〜１９６頁
【非特許文献１６】Sterzik et al. (1985) Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Abt. 1 Suppl.、第１５号、１０１〜１０８頁
【非特許文献１７】Fehrenbach et al. 「Role of CAMP-factor (protein B) for virulence.」 Fehrenbach et al.編、『Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏｘｉｎｓ』、独国シュトゥットガルト、Gustav Fischer Verlag、１９８８、３５１〜３５７頁
【非特許文献１８】Fehrenbach et al. 「Interaction of amphiphilic bacterial polypeptides with artificialmembranes」 Alouf et al.編、『Bacterial protein toxins』、英国ロンドン、Academic Press Inc.、１９８４、３１７〜３２４頁
【非特許文献１９】Jurgens et al. (1987) J. Exp. Med.、第１６５号、７２０〜７３２頁
【非特許文献２０】Rocourt, J. and Grimont, P. A. D. (1983) Int. J. Syst. Bacterial 第３３号 ８６６〜８６９頁
【非特許文献２１】Figura, N. and Guglielmetti, P. (1987) J. Clin. Microbiol. 第２５号 １３４１〜１３４２頁
【非特許文献２２】Fraser, G. (1961) Nature 第１８９号 ２４６頁
【非特許文献２３】Kohler, W. (1988) Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. A 第２７０号 ３５〜４０頁
【非特許文献２４】Schneewind et al.、(1988) Infect. Immun. 第５６号 ２１７４〜２１７９頁
【非特許文献２５】Frey et al. (1989) Infect. Immun. 第５７号 ２０５０〜２０５６頁
【非特許文献２６】Gase et al. (1999) Infect. Immun. 第６７号 ４７２５〜４７３１頁
【非特許文献２７】Sambrook, Fritsch and Maniatis 「Molecular Cloning」、『ALaboratory Manual』第２版（１９８９）
【非特許文献２８】「DNA Cloning」第Ｉ巻及びＩＩ巻、（D. N. Glover編、１９８５）、
【非特許文献２９】「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait編、１９８４）
【非特許文献３０】「Nucleic Acid Hybridization」、(B. D. Hames and S. J. Higgins編、１９８４）
【非特許文献３１】「Animal Cell Culture」 （R. K. Freshney編、１９８６）
【非特許文献３２】「Immobilized Cells and Enzymes」（IRL press、１９８６）
【非特許文献３３】Perbal, B. 「A Practical Guide to Molecular Cloning」（１９８４）
【非特許文献３４】シリーズ「Methods In Enzymology」（S. Colowick and N. Kaplan編、 Academic Press Inc.)
【非特許文献３５】「Handbook of Experimental Immunology」第Ｉ〜ＩＶ巻、D. M. Weir and C. C. Blackwell編、１９８６、Blackwell Scientific Publications
【非特許文献３６】The Merck Veterinary Manual、「A Handbook of Diagnosis, Therapy, and Disease Prevention and Control for the Veterinarian」 Merck and Co.、米国ニュージャージー州 Rahway、１９９１年
【非特許文献３７】「Epitope Mapping Protocols」 Methods in Molecular Biology、第66巻 (Glenn E. Morris編、1996) Humana Press、米国ニュージャージー州 Totowa
【非特許文献３８】Geysen et al. （１９８４）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８１号、３９９８〜４００２頁
【非特許文献３９】Geysen et al. （１９８６）Molec. Immunol. 第２３号 ７０９〜７１５頁
【非特許文献４０】Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA（１９８１） 第７８号 ３８２４〜３８２８頁
【非特許文献４１】Kyte et al., J.Mol.Biol.(1982) 第１５７号 １０５〜１３２頁
【非特許文献４２】「ALIGN」、 Dayhoff, M. O.『Atlas of Protein Sequence and Structure』 M. O. Dayhoff編、5 Suppl.，３：３５３〜３５８頁、National biomedical Research Foundation、米国ワシントン市
【非特許文献４３】Smith and Waterman（１９８１）Advances in Appl. Math. 2:４８２〜４８９頁
【非特許文献４４】http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST
【非特許文献４５】Skalka et al.(1980) Zbl. Vet. Med. Ｂ２７号、５５９〜５６６頁
【非特許文献４６】Skalka et al.(1979) Zbl. Vet. Med.Ｂ２６号、６７９〜６８７頁
【非特許文献４７】Edge (1981) Nature 第２９２号 ７５６頁
【非特許文献４８】Nambair et al. (1984) Science 第２２３号 １２９９頁
【非特許文献４９】Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 第２５９号 ６３１１頁
【非特許文献５０】Christie et al. (1944) Aus. J. Exp. Biol. Med. Sci. 第２２号 １９７〜２００頁
【非特許文献５１】Brown et al. (1974)Infect.Immun. 第９号 ３７７〜３８３頁
【非特許文献５２】Darling, C. L. (1975) J. Clin. Microbiol 第１号 １７１頁
【非特許文献５３】Wilkinsin, H. W. (1977) J. Clin. Microbiol 第６号 ４２頁
【非特許文献５４】Huser et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 第１２９号 １２９５頁
【非特許文献５５】M.Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980)
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【非特許文献５７】『Remington’s Pharmaceutical Sciences』 Mack Publishing Company、米国ペンシルベニア州 Easton、第１８版、１９９０年
【非特許文献５８】Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980)
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【非特許文献６０】Hazinski et al. (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 第４号 ２０６〜２０９頁
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【非特許文献６６】Anjaneyulu and Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987)、第３０号、１１７〜１２４頁
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【非特許文献７４】Lloubes et al. (1986) Nucleic Acid Res. 第１４号 ２６２１〜２６３６頁
【非特許文献７５】Miller et al. (1986) Nucleic Acids Res. 第１４号 ７３４１〜６０頁
【非特許文献７６】Theisen, M. and Potter, A. A. (1992) J. Bacteriol. 第１７４号 １７〜２３頁
【非特許文献７７】Rossi-Campos et al. (1992) Vaccine、第１０号、５１２〜５１８頁
【非特許文献７８】Podbielski et al. (1994) Med. Microbiol. Immunol. 第１８３号 ２３９〜５６頁
【非特許文献７９】Jiang et al. (1996) Microbiol. Path. 第２０号 ２９７〜３０７頁
【非特許文献８０】Kurien and Scofield (1995) BioTechniques 第１８号 １０２３〜１０２６頁
【非特許文献８１】Frohelich and Scott (1991) Gene 第１０８号 ９９〜１０１頁
【非特許文献８２】Van Drunen Littel-Van Den Hurk et al. (1993) Vaccine 第１１号 ２５〜３５頁
【非特許文献８３】Finch et al. (1994) Infect. Immun. 第６２号 ３５９９〜３６０３頁
【非特許文献８４】Finch et al. (1997) Vaccine 第１５号 １１３８〜１１４３頁
【非特許文献８５】Finch et al. (1994) Infect. Immun. 第６２号 ３５９９〜３６０３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、本発明者らの発見前にＳ．ウベリスＣＡＭＰ因子遺伝子はクローン化されていない。さらにＣＡＭＰ因子の防御能は今まで研究されていない。さらに、１種を超える微生物から得たＣＡＭＰ因子に由来するエピトープを含むキメラＣＡＭＰ因子構築体の生成及び使用は今まで記載されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子遺伝子の発見、並びにＣＡＭＰ因子、及び多数のＣＡＭＰ因子エピトープを含むキメラ構築体は脊椎動物対象を感染から防御することができるという発見に基づく。ＣＡＭＰ因子、その活性免疫原性断片、その活性類似体、又は１つを超える生物体に由来する多数のＣＡＭＰ因子を含むキメラ蛋白質は、脊椎動物対象を細菌感染症から防御するために、又は診断試薬として提供するために、単独で或いは他の抗原と組み合わせて新規なサブユニットワクチンで使用することができる。
【００１２】
したがって、一実施形態では、本発明は、１種（species）を超える細菌種に由来する１つ又は複数のＣＡＭＰ因子エピトープを含む免疫原性ポリペプチドを目的とする。ある実施形態では、１つ又は複数のＣＡＭＰ因子エピトープは、１〜２０アミノ酸からなるスペーサによって分離されている。さらに、１つ又は複数のＣＡＭＰ因子エピトープは、Ｓ．ウベリス、Ｓ．アガラクティエ、及び化膿連鎖球菌（Ｓ．pyogenes）からなる群から選択される細菌種など、ストレプトコッカス属の１種を超える細菌種に由来してよい。
【００１３】
別の実施形態では、少なくとも１つのＣＡＭＰ因子エピトープが、図２のアミノ酸１〜９０によって画定された領域に相当するＣＡＭＰ因子のＮ末端可変領域に由来する。ある実施形態では、エピトープを、図２又は図３のＣＡＭＰ因子蛋白質に対して少なくとも８０％の配列相同性を有するＣＡＭＰ因子蛋白質内に介在させ、さらにＣＡＭＰ因子蛋白質はＮ末端可変領域由来のＣＡＭＰ因子エピトープとは異なる連鎖球細菌種(Streptococcal species)由来である。特定の実施形態では、Ｎ末端可変領域由来のＣＡＭＰ因子エピトープは、図３の位置３１〜８７に示したアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＡＭＰ因子蛋白質が図２のＣＡＭＰ因子蛋白質に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する。
【００１４】
他の実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、図８の位置２７〜３１４に示した連続アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、シグナル配列は含むことも含まないこともある。さらに別の実施形態では、免疫原性ポリペプチドは図８に記載したアミノ酸配列を含む。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、先に説明した免疫原性蛋白質を含み薬剤として許容される免疫原性組成物を目標とする。組成物には、さらにアジュバントを含めてよい。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、
（１）上記した免疫原性ポリペプチドを得るステップ、及び
（２）前記ポリペプチドを薬剤として許容されるビヒクルと合わせるステップ
を含む免疫原性組成物の生成法を目的とする。
【００１７】
その他の実施形態では、本発明は、対象に先に説明した治療有効量の免疫原性組成物を投与するステップを含む、脊椎動物対象で細菌感染症を治療し又は予防する方法を目的とする。ある実施形態では、感染は連鎖球菌感染症（streptococcus infection）であり乳房炎を引き起こす。
【００１８】
さらに別の実施形態では、本発明は、上記の免疫原性ポリペプチドを標的とした抗体に関する。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってもよい。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、上記した免疫原性ポリペプチドをコードするコード配列を含むポリヌクレオチド、組換えベクターであってそのポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチドに動作可能に結合し、それによってコード配列が宿主細胞中で転写及び翻訳されるようにする少なくとも１個の制御要素を含むベクター、組換えベクターを含む宿主細胞、並びに免疫原性ポリペプチドの生成法を目的とし、この方法は前記ポリペプチドを生成する条件下で、上記した宿主細胞集団を培養するステップを含む。
【００２０】
他の実施形態では、本発明は、
（ａ）連鎖球菌に対する抗体が、生体試料中に存在するときにはポリペプチドと結合して抗体／抗原複合体を形成できるようにする条件下で、生体試料と上記した免疫原性ポリペプチドを反応させるステップ、及び
（ｂ）複合体が存在するか否かを検出し、それによって試料に連鎖球菌に対する抗体が存在するか否かを検出するステップ
を含む生体試料中の連鎖球菌に対する抗体を検出する方法を目的とする。
【００２１】
さらに別の実施形態では、本発明は、連鎖球菌感染症検出用免疫診断試験キットを目的とし、試験キットは上記した免疫原性ポリペプチド及び免疫診断試験を実施するための使用説明書を含む。
【００２２】
本発明のこれらの及び他の実施形態は、本明細書の開示に照らして当業界の通常の技術を有する者に容易に生じるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の実施は、別段の指示が無い限り、従来技術の分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術、及び免疫学を使用し、それらは当技術分野の技術の範囲内である。そのような技術は、文献に十分に説明されている。たとえば、Sambrook、Fritsch and Maniatis 「Molecular Cloning」『ALaboratory Manual』第２版（１９８９）、「DNA Cloning」第Ｉ巻及びII巻、（D.N.Glover編、１９８５）、「Oligonucleotide Synthesis」（Ｍ．J. Gait編、１９８４）、「Nucleic Acid Hybridization」、（B. D. Hames and S. J. Higgins編、１９８４）、「Animal Cell Culture」（R.K.Freshney編、１９８６）、「Immobilized Cells and Enzymes」（IRL press、１９８６）、Perbal,B.、「A Practical Guide to Molecular Cloning」（１９８４）、シリーズ「Methods In Enzymology」（S. Colowick and N. Kaplan編、AcademicPress、Inc.）、及び「Handbook of Experimental Immunology」第Ｉ〜ＩＶ巻、D. M. Weir and C. C. Blackwell編、１９８６、Blackwell Scientific Publications、を参照のこと。
【００２４】
以下のアミノ酸の略語は、本明細書全体にわたって使用されている。
アラニン：Ａｌａ（Ａ）        アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）    アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）      グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）    グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）      イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）        リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）      フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）        セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
トレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）      トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）        バリン：Ｖａｌ（Ｖ）
【００２５】
Ａ．定義
本発明を記述する際に、以下の用語を使用し以下に示すように定義するものとする。
【００２６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するように、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、その内容が明瞭に単数でないことを指示していない限り、複数指示物も含むことに留意しなければならない。すなわち、たとえば、「ＣＡＭＰ因子」の指示内容は２種以上のＣＡＭＰ因子の混合物を含む、などである。
【００２７】
用語「ＣＡＭＰ因子」又はそれをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、それだけには限らないが、連鎖球菌ウベリス；Ｓ．アガラクティエ［Jurgens et al. (1985) J. Chromatogr. ３４８号 ３６３〜３７０頁、Ruhlmann et al.(1988) FEBS Lett 第２３５号 ２６２〜２６６頁、Schneewind et al. (1988) Infect. Immun. 第５６号 ２１７４〜２１７９頁］などのＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）、Ａ．プルロニューモニエ［Frey et al.(1989) Infect. Immun. 第５７号 ２０５０〜２０５６頁］；化膿連鎖球菌［Gase et al. (1999) Infect. Immun. 第６７号 ４７２５〜４７３１頁］などのＡ群連鎖球菌（ＧＡＳ）；Ｃ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、及びＵ血清型由来連鎖球菌、リステリアモノサイトゲネス及びリステリアセエリゲリ［Rocourt, J. and Grimont,P.A.D. (1983) Int.J.Syst.Bacteriol、第３３号、８６６〜８６９頁］、アエロモナス属［Figura, N. and Guglielmetti, P.(1987) J. Clin. Microbiol、第２５号、１３４１〜１３４２頁］、ロドコッカスエクイ［Fraser, G. (1961) Nature、第１８９号、２４６頁］、及びある種のビブリオ属［Kohler, W. (1988) Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. A、第２７０号、３５〜４０頁］を含め、様々な細菌種中に見出されるＣＡＭＰ因子遺伝子に由来する蛋白質又はヌクレオチド配列を意図している。
【００２８】
Ｓ．ウベリス由来の代表的なＣＡＭＰ因子遺伝子は、プラスミドｐＪＬＤ２１（ＡＴＴＣアクセッション番号第６９８３７号）に見出される。Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列は図２（配列番号１及び２）に記載している。図３（配列番号３及び４）には、Ｓ．アガラクティエＣＡＭＰ因子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を示す。他のＣＡＭＰ因子の配列は、詳細に上記した当技術分野で知られており記載されている。
【００２９】
しかし、本明細書で定義したＣＡＭＰ因子は、図示し記載した配列だけには限らない。これらの細菌種のそれぞれのサブタイプが知られており、ＣＡＭＰ蛋白質の変種もその相互間で生ずるからである。さらに、派生した蛋白質又はヌクレオチド配列は、上記遺伝子から物理的に派生するとは限らず、たとえば、化学合成、単離（たとえば、そのＣＡＭＰ因子を生成する生物体から）、又は本明細書で提供する情報に基づく組換え生成を含め、いかなる方式によっても生成することができる。
【００３０】
この用語は、蛋白質のプロセシンク及び欠失を含み、シグナル配列が存在する場合はそれも含む。図２、３、及び４に示す通り、Ｓ．ウベリス及びＳ．アガラクティエは共に、それぞれ、アミノ酸位置１〜３０及び１〜２９に生じたシグナル配列を含む。一般に、用語「成熟」ＣＡＭＰ因子は、シグナル配列を欠くＣＡＭＰ因子をさす。したがって、図２及び３に記載した配列に関して用語「成熟」ＣＡＭＰ因子は、図２の位置３１〜２５８及び図３の位置３０〜２５５に示すアミノ酸配列をさす。用語ＣＡＭＰ因子は、その調製方式に応じて中性形、並びに塩基付加塩形又は酸付加塩形の蛋白質をもさす。そのような酸付加塩には遊離アミノ基を含めることができ、塩基性塩は遊離カルボキシルを用いて形成することができる。薬剤として許容される塩基付加塩及び酸付加塩は以下に詳しく述べる。さらに、蛋白質は、脂質（免疫活性を消失させない分子又は他の脂質によって自然に生じた両脂質）や糖類など、他の生体材料と組み合わせることによって、或いはアミノ基のアセチル化、水酸基側鎖のリン酸化、スルフヒドリル基の酸化、アミノ酸残基のグリコシル化など、側鎖の修飾、及びコードされている一次配列の他の修飾によって改変することができる。
【００３１】
用語「連鎖球菌ＣＡＭＰ因子」は、先に定義した、その因子を生成する連鎖球細菌種由来のＣＡＭＰ因子を意図し、それだけには限らないが、Ｓ．ウベリス、Ｓ．アガラクティエなどのＧＢＳ、化膿連鎖球菌などのＧＡＳ、並びにＣ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、及びＵ血清型由来連鎖球菌を含む。たとえば、「Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子」は、先に定義したＳ．ウベリス由来のＣＡＭＰ因子である。「Ｓ．アガラクティエＣＡＭＰ因子」は、先に定義したＳ．アガラクティエ由来のＣＡＭＰ因子である。
【００３２】
ＣＡＭＰ因子蛋白質の「変異体」及び「突然変異タンパク質」の語は、本明細書で定義した免疫活性を保持する、先に定義したＣＡＭＰ因子の生体活性誘導体又はそのような誘導体断片をさす。用語「突然変異タンパク質」は、国際公開第ＷＯ９１／０４２８２号に記載されているものなど、１つ又は複数のペプチド模倣体（「ペプトイド」）を含むペプチドをさす。変異体又は突然変異タンパク質は、少なくとも天然分子と同じ活性を有することが好ましい。ポリペプチド変異体及び突然変異タンパク質の製造方法は、当技術分野で周知であり以下に詳しく説明する。
【００３３】
一般に、用語「変異体」は、その修飾が活性を消失させない限り、天然分子と関連して１つ又は複数のアミノ酸の付加、置換（一般にその性質上保存的）、及び／又は欠失を伴う天然のポリペプチド配列及び構造を有する化合物をさす。したがって、ＣＡＭＰ因子蛋白質「変異体」には、免疫活性を示すＣＡＭＰ因子遺伝子によってコードされている連続アミノ酸配列に実質上相同のアミノ酸配列（以下に定義）を伴う蛋白質が含まれる。一般に、置換はその性質上保存的であり、すなわち、アミノ酸ファミリー内で行われるような置換が特に好ましい。一般に、たとえば、アミノ酸は４つのファミリーに分類される：（１）酸性−アスパラギン酸及びグルタミン酸、（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及び（４）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリントレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを芳香族アミノ酸として分類する場合もある。たとえば、ロイシンをイソロイシン又はバリンを用いて或いはその逆で、アスパラギン酸をグルタミン酸を用いて又はその逆で、トレオニンをセリンを用いて又はその逆で隔離置換すること、或いはアミノ酸と構造的に関連するアミノ酸との類似する保存的置換が、その生体活性に対して大きな影響を及ぼさないことは合理的に予想することができる。したがって、参照分子と実質上同じアミノ酸配列を含むが、蛋白質の免疫原性に実質上作用しないアミノ酸のわずかな置換がある蛋白質が参照ポリペプチドの定義内にある。
【００３４】
他の置換には、自然に存在するアミノ酸とアミノ酸類似体との置換が含まれる。そのようなアミノ酸類似体は周知であり、それだけには限らないが、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２、２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリジン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチンが含まれる。
【００３５】
たとえば、当該ポリペプチドには、約５〜１０ヵ所までの保存的又は非保存的アミノ酸置換、或いはさらに約１５〜２５又は２０〜５０ヵ所までの保存的又は非保存的アミノ酸置換含めてよく、或いは所望の分子機能が依然として無傷である場合に限りこれらの値の間のどんな整数でもよい。
【００３６】
「断片」とは、参照遺伝子の無傷のポリペプチド配列及び構造の、或いはヌクレオチド配列及び構造の一部のみからなるポリペプチド又はポリヌクレオチドを意図している。ポリペプチド断片には、Ｃ末端欠失及び／又はＮ末端欠失天然ポリペプチドを含めてもよく、或いは断片はその分子の内部部分に由来してよい。同様に、ポリヌクレオチド断片には、３’欠失及び／又は５’欠失の天然ポリヌクレオチドを含めてもよく、或いは断片はその分子の内部部分に由来してよい。ＣＡＭＰ因子のポリペプチド「断片」は、一般に、少なくとも約２〜５個の隣接アミノ酸残基、好ましくは少なくとも約１０個の隣接アミノ酸残基全長分子、好ましくは少なくとも約１５〜２５個の隣接アミノ酸残基全長分子、最も好ましくは少なくとも約２０〜５０個以上の隣接アミノ酸残基全長分子、或いは２つのアミノ酸間のどんな整数及び全長配列を含み、ただし当該断片は所望の活性を保持している。
【００３７】
一般に、当該遺伝子のヌクレオチド断片は、その遺伝子の少なくとも約８個の隣接塩基対、より好ましくは少なくとも約１０〜２０個の隣接塩基対、最も好ましくは少なくとも約２５〜５０個以上の隣接塩基対、或いはこれらの値間のどんな整数をも含む。そのような断片は、プローブとして、かつ診断法で有用であり以下により詳細に述べる。
【００３８】
「乳房炎」とは、以下により詳細に記載したＣＡＭＰ因子を生成する様々な細菌によって生じた、ウシ、雌羊、ヤギ、雌豚、雌馬などを含む哺乳動物の乳房炎を意味する。感染自体は、その腺での食細胞の侵入によって明らかになる。一般に、４つの乳房炎の臨床型が認められている：（１）最急性型、腺での腫脹、熱、疼痛、及び異常な分泌に関連付けられ、発熱、及び顕著な機能低下、微弱頻脈、目のくぼみ、衰弱、完全な摂食障害などの他の全身障害の徴候が伴う、（２）急性型、先の変化に類似する腺の変化が伴うが、発熱、摂食障害、及び機能低下は軽微から中等度である、（３）亜急性型、全身的変化は見られないが、腺及びその分泌の変化が若干見られる、（４）無症状性型、乳房炎用標準的試験によってのみ炎症反応が検出され得る。
【００３９】
乳房炎検出用の標準的試験には、それだけには限らないが、乳中の高い白血球含有量の持続を検出するために使用されるカリフォルニア乳房炎試験、ウィスコンシン乳房炎試験、ナガセ試験、電子式細胞数算定、及び体細胞数算定が含まれる。一般に、母乳１ｍｌ当たり体細胞数約３００，０００〜約５００，０００細胞以上で感染が示唆される。したがって、たとえば、母乳の体細胞数が１ｍｌ当たり約５００，０００細胞未満で保持されている場合は、ワクチンが乳房炎の治療及び／又は予防に有効であると見なされる。乳房炎の考察及びその診断に関しては、たとえば、The Merck Veterinary Manual、「A Handbook of Diagnosis,Therapy,and Disease Prevention and Control for the Veterinarian」、Merck and Co.、米国ニュージャージー州 Rahway、１９９１年、を参照のこと。
【００４０】
用語「エピトープ」は、特異的Ｂ細胞及びＴ細胞が応答する抗原又はハプテン上の部位をさす。この用語は、「抗原決定基」又は「抗原決定部位」と互換的に使用される。同じエピトープを認識する抗体は、別の抗体が標的抗原へ結合することを阻止する１つの抗体の能力を示す簡単なイムノアッセイで同定することができる。
【００４１】
組成物又はワクチンへの「免疫応答」とは、当該組成物又はワクチンに対して、宿主に細胞及び／又は抗体が媒介する免疫反応を発生させることである。通常、「免疫応答」は、それだけには限らないが、１つ又は複数の以下の作用：抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサＴ細胞、及び／又は細胞障害性Ｔ細胞及び／又はγδＴ細胞の生成を含み、これらの生成は当該組成物又はワクチンに含まれる１種又は複数の抗原を特異的に標的とする。宿主は、当該ＣＡＭＰ因子に対して防御免疫応答を示し、たとえば、宿主は続いて起こる病原体による感染から防御されることになり、そのような防御は感染した宿主によって通常示される症状の減少又は欠如、或いは素早い回復時間によって実証されることが好ましい。
【００４２】
「免疫原性」蛋白質又はポリペプチドの語は、上記の免疫応答を引き出すアミノ酸配列をさす。本明細書で使用される「免疫原性」蛋白質又はポリペプチドは、その前駆体、成熟体、類似体、又はその免疫原性断片を含む、当該ＣＡＭＰ因子の全長配列を含む。
【００４３】
「免疫原性断片」とは、１つ又は複数のエピトープを含み、それによって上記の免疫応答を引き出すＣＡＭＰ因子断片を意味する。そのような断片は、当技術分野で周知の多数のエピトープマッピング技術を使用し同定することができる。たとえば、「Epitope Mapping Protocols」、Methods in Molecular Biology、第６６巻（Glenn E.Morris編、１９９６)Humana Press、米国ニュージャージー州 Totowa、を参照のこと。たとえば、線状エピトープは、たとえば、固体担体上に多数のペプチドを同時に合成し、ペプチドは蛋白質分子部分に相応し、ペプチドを担体に結合させたままペプチドを抗体と反応させることによって決定することができる。そのような技術は、当技術分野で公知であり、たとえば、米国特許第４，７０８，８７１号、Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８１号、３９９８〜４００２頁、Geysen et al.(1986) Molec. Immunol.、第２３号、７０９〜７１５頁に記載されている。同様に、高次構造エピトープは、たとえば、Ｘ線結晶構造解析及び２次元核磁気共鳴などによってアミノ酸の空間的高次構造を決定することによって容易に同定される。たとえば、上のエピトープマッピングプロトコルを参照のこと。蛋白質の抗原領域もたとえば、Oxford Molecular Group社製ソフトウェアプログラムOmigaバージョン１．０を使用し算出したプロットなど、標準的な抗原性及び疎水親水度プロットを使用し同定することができる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールの決定にＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法［Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981)、第７８号、３８２４〜３８２８頁］を、疎水親水度プロットにKyte-Doolittle技術［Kyte et al., J. Mol. Biol.(1982)、第１５７号、１０５〜１３２頁］を使用する。
【００４４】
本発明の目的のためには、通常、免疫原性断片は、少なくとも約２アミノ酸長、より好ましくは約５アミノ酸長、最も好ましくは少なくとも約１０〜１５アミノ酸長である。断片長に決定的な上限は存在せず、この断片長は蛋白質配列のほぼ全長、或いは２個以上の、ＣＡＭＰ因子又は当該因子のエピトープを含む融合蛋白質でさえ含み得るはずである。
【００４５】
「免疫原性組成物」は、対象へ組成物を投与すると対象に当該抗原分子に対する体液性及び／又は細胞性免疫反応が発生する抗原分子を含む組成物である。
【００４６】
「サブユニットワクチン組成物」とは、抗原全てではないが、当該病原体に由来する抗原から派生し又は相同である少なくとも１個の免疫原性ポリペプチドを含む組成物を意味する。そのような組成物には、無傷の病原性細胞又は粒子、或いはそのような細胞又は粒子のライセートが実質上皆無である。したがって、「サブユニットワクチン組成物」は、病原体又はその組換え類似体に由来する、少なくとも部分的に精製した（好ましくは十分に精製した）免疫原性ポリペプチドからから調製する。サブユニットワクチン組成物には、その病原体に由来する他の抗原又はポリペプチドが実質上皆無な当該サブユニット抗原又は抗原を含めてよい。
【００４７】
「薬剤として許容される」又は「薬理学的に許容される」とは、生物学的にせよ、そうでないにせよ、望ましくないことはない材料を意味し、すなわち、どんな望ましくない生物学的作用を引き起こすことも、又はその中にそれが含まれている組成物の成分のどれかによって有害な方式で相互作用することもなく、その材料を製剤又は組成物に含めて個体に投与することができる。
【００４８】
用語「多数のエピトープ」蛋白質又はポリペプチドは、本明細書で定義したエピトープを含み、線状分子内に２回以上繰り返す少なくとも１個のエピトープを含むアミノ酸配列を指定する。それ自体に直接結合するとは限らない繰り返し配列は、自然では同じ方式で繰り返されず、さらに繰り返されない他のアミノ酸を含むより大きな配列内に存在している可能性がある。本発明の目的については、エピトープ配列は、野生型エピトープ配列の、又は本明細書で定義した配列と「機能的に同等」な配列の厳密なコピーであってよい。
【００４９】
「融合」又は「キメラ」の蛋白質又はポリペプチドは、１つを超える発生源由来のアミノ酸配列が接合したものである。そのような分子は、さらに本明細書に記載したように合成して又は組換え手法で生成することができる。主鎖としてＳ．ウベリスの成熟ＣＡＭＰ蛋白質、さらにＳ．ウベリスＣＡＭＰ生成物とは相同性が低い領域に由来するＳ．アガラクティエＣＡＭＰ蛋白質由来のＮ末端ペプチドを含む、代表的なキメラ蛋白質を図４のアミノ酸位置２７〜３１４に示す。スペーサ配列は、位置８７、１４５、及び１４６に存在する。図に記載したＣＡＭＰキメラを図４位置１〜２６に表示したＬｉｐｏＦシグナル配列に融合した。
【００５０】
「単離した」核酸分子は、その分子が自然に見出される生物体全体から分離され別個になった核酸分子、通常、自然ではそれに伴っている配列を全て又は部分的に欠く核酸分子、又は自然に存在する通りであるがそれに関連した（以下に定義した）異種配列を含む配列である。
【００５１】
「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって生成された、すなわち、所望のポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ構築体によって形質転換された細胞から生成したポリペプチドをさす。「合成」ポリペプチドは、化学合成によって調製したポリペプチドである。
【００５２】
「ベクター」は、結合させたセグメントを複製させるために、別のＤＮＡセグメントを結合させることができるプラスミド、ファージ、又はコスミドなどのレプリコンである。
【００５３】
ＤＮＡ「コード配列」又は特定の蛋白質を「コードするヌクレオチド配列」は、適切な調節要素の制御下に置いたときｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドに転写し翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン、及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、それだけには限らないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡ、真核生物の（たとえば哺乳動物の）ＤＮＡ由来ゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列でさえも含めてもよい。通常、転写停止配列はコード配列の３’に位置する。
【００５４】
ＤＮＡ「制御要素」は、宿主細胞中でコード配列を集合的に転写し翻訳する、プロモータ、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写停止配列、上流調節領域、エンハンサなどを集合的にさす。所望の遺伝子が転写翻訳され得る限り、これらの制御配列の全てが常に組換えベクター中に存在するとは限らない。
【００５５】
「動作可能に結合」は、そのように記載した成分がその通常の機能を実施するように構成されている要素の配置をさす。すなわち、コード配列に動作可能に結合した制御要素は、コード配列を発現させることができる。制御要素がコード配列の発現を指揮するように機能する限り、制御要素はコード配列に隣接するとは限らない。すなわち、たとえば、まだ翻訳されていないが転写されている配列をプロモータとコード配列の間に介在させることができ、プロモータは依然としてコード配列に「動作可能に結合」されていると見なしてもよい。
【００５６】
同様に、ＲＮＡポリメラーゼが２つのコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでそのｍＲＮＡが、その２つのコード配列によってコードされているポリペプチドに翻訳されるとき、コード配列は別のコード配列に「動作可能に結合」している（すなわちキメラ蛋白質の場合）。転写された配列が最終的に加工されて所望の蛋白質を生成する限り、コード配列は互いに隣接するとは限らない。
【００５７】
ＲＮＡポリメラーゼが、プロモータを結合しコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでこのｍＲＮＡがこのコード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳されるとき、プロモータなどの制御要素は細胞中でコード配列の「転写を指揮する」。
【００５８】
「宿主細胞」は、形質転換されている、又は、外来性核酸分子によって形質転換することができる細胞である。
【００５９】
そのような外来ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたとき、細胞は外来ＤＮＡによって「形質転換」されている。外来ＤＮＡは、染色体ＤＮＡに（共有結合で）組み込まれて細胞ゲノムを構成することもできるし、しなくてもよい。原核生物及び酵母では、たとえば、外来ＤＮＡはプラスミドなどのエピソーム要素で維持することができる。真核生物細胞に関しては、安定して形質転換された細胞とは、外来ＤＮＡが染色体に組み込まれるようになった結果、染色体の複製によって娘細胞に受け継がれる細胞である。この安定性は、外来ＤＮＡを含む娘細胞集団を含む細胞系又はクローンを確立する真核生物細胞の能力によって実証される。
【００６０】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド部分間のパーセント類似性をさす。配列が、所定の長さの分子にわたって少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列類似性又は相同性を示すとき、２つのＤＮＡ、又は２つのポリペプチド配列は互いに「実質上相同」である。本明細書で使用する、実質上相同は、明示したＤＮＡ又はポリペプチド配列に完全な相同性を示す配列もさす。
【００６１】
一般に、「相同性」は、それぞれ、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列の厳密なヌクレオチド対ヌクレオチド、又はアミノ酸対アミノ酸の対応関係をさす。パーセント相同性は、配列を整列させ、２列に整列した配列間での厳密な適合数を算定し、短い配列長で割り、その結果に１００を掛けることで、２つの分子間の配列情報を直接比較して決定することができる。容易に入手可能なコンピュータプログラムを分析に役立てるために使用することができ、ペプチドの分析には、「ALIGN」、Dayhoff, M. O. 『Atlas of Protein Sequence and Structure』 M. O. Dayhoff編、5 Suppl.，３：３５３〜３５８頁、National biomedical Research Foundation、米国ワシントン市、などがあり、これはSmith and Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2：４８２〜４８９頁の局所的相同性アルゴリズムを改作している。ヌクレオチド配列の相同性を決定するためのプログラムは、たとえば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＧＡＰプログラムなど、Wisconsin Sequence Analysis Package、バージョン８（Genetics Computer Group社製、米国ウィスコンシン州マディソン）、が利用可能で、これらもSmith and Watermanのアルゴリズムに依存している。これらのプログラムは、メーカーにより推奨され、かつ前記のWisconsin Sequence Analysis Packageに記載されているデフォルトパラメータを用いて容易に利用される。たとえば、特定のヌクレオチド配列の参照配列に対するパーセント相同性は、６個のヌクレオチド位置のデフォルトスコア表及びギャップペナルティによって、Smith-Watermanの相同性アルゴリズムを使用して決定することができる。
【００６２】
本発明の文脈においてパーセント相同性を確立するための別の方法は、エディンバラ大学が著作権を有し、John F. Collins及びShane S. Sturrokによって開発され、IntelliGenetic社（米国カリフォルニア Mountain View）から販売されているＭＰＳＲＣＨパッケージプログラムを使用することである。この１組のパッケージから、Smith-Watermanアルゴリズムを使用することができ、そこではデフォルトパラメータはスコア表（たとえば、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップエクステンションペナルティ１、及びギャップ６）を使用する。得られたデータから「適合」値が「配列相同性」を反映する。配列相互間のパーセント相同性又は類似性を算出するための他の適当なプログラムは、当技術分野で公知であり、たとえば、別の整列プログラムはＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメータと共に使用する。たとえば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータ：遺伝子コード＝ｓｔａｎｄａｒｄ、フィルタ＝ｎｏｎｅ、鎖＝ｂｏｔｈ、カットオフ＝６０、イクスペクト＝１０、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、記述＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、ソートバイ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ、データベース＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを利用し使用することができる。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスに見出すことができる：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
【００６３】
或いは、相同領域間で安定した２重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリッド形成、それに続く１本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、及び消化断片のサイズ決定によって相同性を決定することができる。実質上相同のＤＮＡ配列は、たとえば、その特定の系のために定めた厳格な条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適切なハイブリッド形成条件を定めることは、当技術分野の技術内である。たとえば、上記Sambrookら、上記ＤＮＡクローニング、上記核酸ハイブリッド形成を参照のこと。
【００６４】
用語「機能的に同等」は、参照ＣＡＭＰ因子の成熟配列、又はその免疫原性部分で相同性を有するＣＡＭＰ因子によって導き出される応答と比べて、ＣＡＭＰ因子のアミノ酸配列が、先に定義した実質上同等又は強化された免疫応答を引き出す配列であることを意図する。
【００６５】
ＤＮＡ構築体の「異種」領域は、自然には他の分子と関連して見出されない別のＤＮＡ分子内に又はそのＤＮＡに結合した同定可能なＤＮＡセグメントである。したがって、異種領域が細菌遺伝子をコードするときは、通常、源細菌のゲノム中では細菌遺伝子に隣接していないＤＮＡの脇にその遺伝子は置かれることになる。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が自然には見出されない構築体である（たとえば、天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。対立形質の変異又は自然発生突然変異事象が、本明細書で使用するＤＮＡ異種領域を生ずることはない。
【００６６】
本明細書で使用する「生体試料」は、ただしそれだけには限らないが、たとえば、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚試料；皮膚、気道、腸管、及び尿生殖路の外分泌液；涙、唾液、乳、血液細胞、臓器、生検試料を含む対象から単離した組織又は流体試料、さらに、ただしそれだけには限らないが、培地での細胞及び組織、たとえば、組換え細胞及び細胞成分を増殖させた結果として生じた調整培養液を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養成分試料をさす。
【００６７】
本明細書で使用される「標識」及び「検出可能な標識」の語は、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、酵素基質、酵素補助要因、酵素阻害剤、発色団、染料、金属イオン、金属ゾル、リガンド（たとえば、ビオチン又はハプテン）などを含むがそれだけには限らない検出することができる分子をさす。用語「蛍光剤」は、検出可能な範囲で蛍光を示すことができる物質又はその一部をさす。本発明下で使用することができる特定の標識の例には、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、α−β−ガラクトシダーゼが含まれる。
【００６８】
本明細書で使用される用語「治療」は、（ｉ）感染又は再感染の予防（予防）、又は（ii）当該疾患の症状の緩和又は除去（治療）をさす。
【００６９】
「脊椎動物対象」とは、それだけには限らないが、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒトなどの哺乳動物、イヌやネコなどの飼い動物、ニワトリ、シチメンチョウ、他のキジ目の鳥類を含む、雄鶏や雌鶏などの家禽、野生鳥、狩猟鳥を含む鳥類、並びに魚類を含め、コルダタ亜門（subphylum cordata）のどんな構成員をも意味する。この用語は、特定の年齢を意味しない。したがって、成体、新生動物、及び胎児も包含するものとする。
【００７０】
Ｂ．一般的な方法
本発明の中心は、ＣＡＭＰ因子が脊椎動物対象で防御免疫応答を引き出すことができるという発見である。Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子の遺伝子を単離し特徴付け、それによってコードされているＣＡＭＰ因子を配列決定している。Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子遺伝子由来の蛋白質生成物が、続くＳ．ウベリスによる挑戦からウシを守ることが分かっている。加えて、多数の細菌種に由来するＣＡＭＰ因子エピトープを含むキメラ蛋白質は、細菌の挑戦に対して防御を授け、様々な細菌種と交差反応し個々のＣＡＭＰ因子よりもさらに免疫原性に富むワクチン抗原を提供する。さらに、精製Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子に対して引き起こされた抗体は、Ｓ．アガラクティエ蛋白質Ｂと交差反応する。実施例に示すように、Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子は、大腸菌中で遺伝子組換えされると分泌する。
【００７１】
Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子の完全なコード配列を図２に示す（配列番号１）。Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子遺伝子は、約３０アミノ酸長のＮ末端シグナル配列（図６Ｂ、配列番号７を参照）を含む、約２５８アミノ酸前蛋白質（図２、配列番号２、アミノ酸残基１以上２５８以下）をコードする。前駆体分子の算出分子量は約２８．５ｋＤａである。したがって、成熟Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子は、図２に示すアミノ酸残基３１以上２５８以下を含む。さらに、Ｓ．アガラクティエＣＡＭＰ因子のコード配列を図３に示す（配列番号３）。Ｓ．アガラクティエＣＡＭＰ因子遺伝子は、約２９アミノ酸長のＮ末端シグナル配列（参照、図６Ａ、配列番号６）を含む約２５５アミノ酸の前蛋白質（図３、配列番号４、アミノ酸残基１以上２５５以下）をコードする。さらに以下に述べるように、シグナル配列をコードするＣＡＭＰ因子遺伝子部分を、ＣＡＭＰ因子及びそのキメラをコードする構築体に含め、発現の祭にＣＡＭＰ因子の分泌を指揮させることができる。或いは、そのような構築体に異種シグナル配列を含めてもよい。さらに、ＣＡＭＰ因子シグナル配列及びそのシグナル配列をコードする核酸配列を異種蛋白質及び核酸分子と共に使用してその分泌に役立てることができる。
【００７２】
図４に示すように、Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子由来の配列を用いてＳ．アガラクティエＣＡＭＰ因子のアミノ酸配列を整列させると全般的類似性は約６９％を示す。約６３％のアミノ酸残基は同一である．２つの蛋白質を低い相同性領域と高い相同性領域に分離することができる。保存されているアミノ酸の大多数は、Ｓ．アガラクティエＣＡＭＰのアミノ酸８７及びＳ．ウベリスＣＡＭＰのアミノ酸９０に対応するロイシン残基の後に位置する。したがって、相同性が低い領域（本明細書ではＮ末端可変領域とも言う）には、Ｓ．ウベリスの残基１〜９０及びＳ．アガラクティエの残基１〜８７が含まれ、２つの種間での全般的相同性は約４９％を示す。要するに、２つのＣＡＭＰ蛋白質の最初の１／３には、それぞれ、２９アミノ酸（Ｓ．アガラクティエ）及び３０アミノ酸（Ｓ．ウベリス）の非同一シグナル配列と、それに続く広範な相同性を共有しない、それぞれ、５７アミノ酸領域及び５９アミノ酸領域が含まれる。高い相同性領域は、Ｓ．ウベリスの残基９１から、Ｓ．アガラクティエの残基８８から見い出され、全般的相同性は約７９％を示している。
【００７３】
厳密な局在化及びＣＡＭＰ因子遺伝子の配列によってＣＡＭＰ蛋白質上の異なる領域の機能を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発研究が可能となる。さらに、遺伝子置換及び他の分子技術により、本発明のデータによって安定したＣＡＭＰ因子合成不能突然変異体の生成も可能になる。動物で天然及び突然変異体のＳ．ウベリス株の病原性を比較すると、ＣＡＭＰ因子を発現する細菌の病原性に対するＣＡＭＰ因子の寄与に関しての重要な情報が得られる。
【００７４】
乳房炎などの細菌感染症に対して広範な防御を授ける多価ワクチンを得るために、多数の細菌種から得た様々なＣＡＭＰ因子由来のエピトープを組み合わせて使用することができる。１つ又は複数のサブユニットワクチン組成物において別個に、或いはキメラ蛋白質として好都合に、そのようなエピトープを得ることができ、融合蛋白質として組換え手法で発現させ、又は別個に発現させ続いて融合させることができる。
【００７５】
特に、先に説明したようにＣＡＭＰ因子は様々な細菌種中に見出されており、それだけには限らないが、Ｓ．ウベリス；Ｓ．アガラクティエ［Jurgens et al. (1985) J. Chromatogr. ３４８号、３６３〜３７０頁、Ruhlmann et al.(1988)FEBS Lett、第２３５号、２６２〜２６６頁、Schneewind et al.、(1988) Infect. Immun. 第５６号 ２１７４〜２１７９頁］などのＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）；Ａ．プルロニューモニエ［Frey et al.(1989)Infect.Immun. 第５７号 ２０５０〜２０５６頁］；化膿連鎖球菌［Gase et al.(1999)Infect.Immun. 第６７号 ４７２５〜４７３１頁］などのＡ群連鎖球菌（ＧＡＳ）；Ｃ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、及びＵ血清型連鎖球菌、リステリアモノサイトゲネス及びリステリアセエリゲリ［Rocourt, J. and Grimont, P. A. D. (1983) Int. J. Syst. Bacteriol、第３３号、８６６〜８６９頁］、アエロモナス属［Figura, N. and Guglielmetti, P. (1987) J. Clin. Microbiol 第２５号 １３４１〜１３４２頁］、ロドコッカスエクイ［Fraser, G. (1961) Nature 第１８９号 ２４６頁］、並びにある種のビブリオ属［Kohler, W. (1988) Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. A、第２７０号、３５〜４０頁］が含まれる。Ｎ末端領域を除き、様々な細菌株によって生成されるＣＡＭＰ因子のアミノ酸配列蛋白質は高度に保存的である。他の局在化可変領域は、ＣＡＭＰ因子分子全体にわたって生じている。たとえば図４を参照のこと。したがって、ＣＡＭＰ因子の高度保存領域と、１つを超える上記細菌種から得たＣＡＭＰ因子蛋白質可変領域に由来するエピトープとを含む、多数のエピトープのＣＡＭＰ因子融合蛋白質を構築することが望ましい。本発明を裏付けるために実施した実験によって、そのような蛋白質が連鎖球菌感染症に対する免疫を引き出すことができると共に、最終製剤中に存在する抗原数を最小限に抑え、かつ同時に製剤製造コストを削減するという追加の経済的利点を提供するということが実証されている。
【００７６】
したがって、本発明ＣＡＭＰ因子キメラは、たとえば、少なくとも約５〜１０個から約５０〜９０個までのアミノ酸、或いはその間のどんな整数のアミノ酸を含む連続アミノ酸配列など、ＣＡＭＰ因子のＮ末端可変領域由来のエピトープ；Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子の１〜９０アミノ酸、及びＳ．アガラクティエＣＡＭＰ因子の１〜８７アミノ酸によって代表されるＣＡＭＰ因子のＮ末端可変領域由来のエピトープ；本明細書に記載の様々な細菌種のどれかから得られる、この領域に由来する好ましくは２０個以上の隣接アミノ酸、より好ましくは約３０〜８０個、さらに好ましくはこの領域に由来する４０〜６０個の隣接アミノ酸に由来するエピトープなど、多数のエピトープを含むことができる。キメラは、Ｓ．ウベリスやＳ．アガラクティエなど、１つを超える連鎖球菌ＣＡＭＰ因子のＮ末端可変領域に由来するエピトープを含むことが好ましい。キメラは、ＣＡＭＰ因子の他の領域に由来する追加のエピトープを場合によっては含み、少なくとも１つの細菌種、場合によっては１つを超える細菌種に由来するＣＡＭＰ因子分子の残部を含めてよい。さらに、同じ種に由来する多数のエピトープが存在してよい。
【００７７】
本発明のＣＡＭＰ因子キメラで使用するエピトープは、たとえば、２つ以上の上掲の細菌種に由来するＣＡＭＰ因子配列を整列させ、可変及び保存領域を探索することによって容易に同定することができる。通常、様々な細菌に対して広範な防御を授けるためには、ＣＡＭＰ因子の可変領域に由来するエピトープを含めることが望ましい。追加のエピトープは、標準的な抗原性及び疎水親水度プロットの使用など、当技術分野で周知の技術を使用し同定することができる。たとえば、Oxford Molecular Group社製ソフトウェアプログラムＯｍｉｇａバージョン１．０などを使用し算出したプロットである。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールの決定にＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法［Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 第７８号 ３８２４〜３８２８頁］を、疎水親水度プロットにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術［Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982)、第１５７号、１０５〜１３２頁］を使用する。このプログラムは、以下のパラメータを用いて使用することができ：ウインド７の結果を平均し：表面確率はＥｍｉｎｉにより、鎖柔軟性はＫａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚにより、抗原性指数はＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆにより、２次構造はＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎにより、２次構造はＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎにより決定し、予想されるグリコシル化部位を同定する。当業者は、得られた情報を本明細書の教示と組み合わせて容易に使用して、本発明のキメラ蛋白質の構築に使用できる抗原領域を同定することができる。
【００７８】
一般に、様々なエピトープは、スペーサ配列によって分離される。典型的には、スペーサ配列は、１〜５００アミノ酸のアミノ酸配列であり、好ましくは１〜１００アミノ酸、より好ましくは１〜５０アミノ酸、好ましくは１〜２５アミノ酸、最も好ましくは１〜１０アミノ酸であり、すなわち１〜５００間の任意の整数である。スペーサアミノ酸は、様々なエピトープ間で同じ又は異なってよい。スペーサとしての使用に特に好ましいアミノ酸は、アラニン、グリシン、バリンなどの小さな側基を有するアミノ酸である。
【００７９】
本発明のキメラには、シグナル配列も含めてよい。シグナル配列は、図６Ａ及び６Ｂに記載したシグナル配列のいずれかなど、ＣＡＭＰ因子シグナル配列でよく、又は様々な異種配列のどれかであってよい。特に適当なシグナル配列の非制限的な例には、大腸菌のＬｉｐｏＦシグナル配列やＯｍｐＦシグナル配列が含まれる。ＬｉｐｏＦシグナル配列は、細菌宿主細胞からの効率的な分泌を助け、脂質部分によって宿主細胞膜に結合することになる。次いで、蛋白質をＳａｒｋｏｓｙｌやＴｒｉｔｏｎＸ−１００（実施例を参照のこと）などの洗浄剤を用いて示差的に可溶化することにより細胞表面から抽出することができる。本発明で使用するための追加のシグナル配列をさらに以下に述べる。
【００８０】
本発明の特に好ましい実施形態は、本明細書に記載の様々なＣＡＭＰ因子のどれかに由来する、１つ又は複数のエピトープを含むキメラであり、多数のエピトープを使用する場合、それらのエピトープは少なくとも１つのエピトープが得られる細菌とは異なる細菌に由来する全長ＣＡＭＰ因子主鎖内に介在される。主鎖は、当該ＣＡＭＰ因子由来のシグナル配列を含んでも含まなくてもよい。エピトープは、それぞれ、Ｓ．ウベリスの残基１〜９０及びＳ．アガラクティエの残基１〜８７によって表されるＣＡＭＰ因子のＮ末端可変領域に由来することが好ましい。このエピトープが、相当するＮ末端可変領域を有するＣＡＭＰ因子を生成する、他のストレプトコール（streptoccoal）や菌類に由来してよいことは理解されよう。さらに、「介在される」は、エピトープを全長配列の内部のどこかに挿入することを意味し、この用語は、エピトープと、中にエピトープを挿入した全長ＣＡＭＰ因子のｔｈｅ末端領域及びＣ末端領域との間のスペーサ配列の存在を除外しない。
【００８１】
そのような構築体は、本明細書で「ＣＡＭＰ−３」と名付けた図８位置２７〜３１４に示すキメラによって代表される。図８のアミノ酸１〜２６は、大腸菌ＬｉｐｏＦのシグナル配列を示す。図８のアミノ酸２７〜８６は、図２に示すＳ．ウベリスＣＡＭＰ因子配列のアミノ酸３１〜９０に相当する（アミノ酸１〜６０、成熟Ｓ．ウベリス配列と関係付けて番号が付されている）。アミノ酸８７は、リンカーアミノ酸である。図８のアミノ酸８８〜１４４は、図３に示すＳ．アガラクティエ配列のアミノ酸３１〜８７に相当する（アミノ酸２〜５８、成熟Ｓ．アガラクティエ配列と関係付けて番号が付されている）。図８のアミノ酸１４５及び１４６は、スペーサアミノ酸である。図８に示すアミノ酸１４７〜３１４は、図２に示すＳ．ウベリスＣＡＭＰ因子配列のアミノ酸９１〜２５８に相当する（アミノ酸６３〜２３０、成熟Ｓ．ウベリス配列と関係付けて番号が付されている）。したがって、図８に示すキメラは、そこに挿入されたＳ．アガラクティエから得たＣＡＭＰ因子のＮ末端配列に由来するエピトープと共に全長Ｓ．ウベリス主鎖を含む。
【００８２】
上記したＣＡＭＰ因子、その免疫原性断片、又はそれを含むキメラ蛋白質は、サブユニットワクチン組成物で提供することができる。ワクチン組成物での使用の他に、その蛋白質又はそれ対する抗体は、脊椎動物対象が感染しているかどうかを検出するための診断試薬として使用することができる。同様に、この蛋白質をコードする遺伝子は、他の細菌株中の相同遺伝子を検出し単離するためのプローブを設計するためにクローン化し使用することができる。
【００８３】
本発明のワクチン組成物は、脊椎動物対象の広範な細菌感染症を治療し又は予防するために使用することができる。たとえば、Ｓ．ウベリス、Ｓ．アガラクティエなどのＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）、並びに／或いはたとえば、化膿連鎖球菌などのＡ群連鎖球菌（ＧＡＳ）、血清型Ｃ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、及びＵ連鎖球菌由来のＣＡＭＰ因子を含むワクチン組成物を使用して、これらの種によって生じた脊椎動物対象の連鎖球菌感染症を治療することができる。たとえば、Ｓ．ウベリス及びＳ．アガラクティエは、ウシ類、ウマ類、ヒツジ類、及びヤギ類の乳房炎を伴う一般的な細菌性病原体である。さらに、Ｓ．アガラクティエなどのＢ群連鎖球菌は、脊椎動物で、敗血症、髄膜炎、菌血症、膿痂疹、関節炎、尿路感染症、膿瘍、流産などを含め、他の多数の感染症を引き起こすことが知られている。したがって、連鎖球菌ＣＡＭＰ因子を含むワクチン組成物は、広範な連鎖球菌感染症の治療及び／又は予防に使用されるであろう。
【００８４】
同様に、リステリアモノサイトゲネス及びＬ．セエリゲリ、アエロモナス属、ロドコッカスエクイ、並びにビブリオ属由来のＣＡＭＰ因子は、これらの種によって生じた細菌感染症の治療に使用されるであろう。たとえば、ＣＡＭＰ因子は、ヒトを含む広範な動物や鳥類のリステリア症を予防し又は治療するために使用することができる。感染は、反芻動物、及びガン、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、カナリア、オウムなどの鳥類で脳炎及び髄膜脳炎として、単胃動物、新生仔反芻動物、及び家禽で敗血症として、並びに広範な動物で流産及び潜伏感染として顕在化し得る。アエロモナスは、サケ類、水槽魚、キンギョ、淡水魚、海水魚を含む魚類で感染症を、並びに飼育鳥、両生類、及び爬虫類でも感染症を引き起こす。ロドコッカスエクイは、ウマで呼吸器感染症、リンパ管炎、腹膜炎、腸炎、膿瘍、及び流産を引き起こす。ビブリオは、多くの養殖魚、水槽魚及び野生魚（ｗｉｌｄ  ｍａｒｉｎｅ）、海水魚及び河口魚でビブリオ病を、クジラ目で開放創感染症を、並びにニワトリで鳥類ビブリオ肝炎及び鳥類感染性肝炎を引き起こす。
【００８５】
したがって、ＣＡＭＰ因子ワクチンを使用して多種の広範な細菌感染症を治療し及び／又は予防することができることは容易に明らかである。
【００８６】
様々な種に由来するＣＡＭＰ因子を本発明のワクチン組成物に単独で又は組み合わせて使用することができる。たとえば、先に説明したように、当該対象が感染に対して広範囲にわたって防御できるように、１つ又は複数のＣＡＭＰ因子の、１つを超えるエピトープを本発明のワクチン組成物に含めることが好ましい場合もある。その最も単純な形では、これは、ＣＡＭＰ因子の１つの完全配列をコードするポリペプチドを使用すること、或いは２個以上の、ＣＡＭＰ因子配列又はＣＡＭＰ因子エピトープ配列をコードするポリペプチドの組合せを使用することによって実現することができる。したがって、ワクチン組成物には、たとえば、上記したＣＡＭＰ因子キメラなど、１つ又は複数のＣＡＭＰ因子の様々な組合せを、いくつかのＣＡＭＰ因子の組合せを、又はさらにいくつかのＣＡＭＰ因子由来のエピトープの組合せなどを含めてよいはずである。
【００８７】
さらに、本発明のワクチン組成物には、他の細菌、真菌、ウイルス、又は原生動物の抗原を含めてもよい。これらの抗原は、これらの抗原に融合された１つ又は複数のＣＡＭＰ因子断片を含む融合蛋白質として別個に提供することさえできる。
【００８８】
ＣＡＭＰ因子の生成
上記のＣＡＭＰ因子、並びにそれに由来する活性断片、類似体、及びキメラ蛋白質は、様々な方法によって生成することができる。具体的には、ＣＡＭＰ因子は、それを発現する細菌から直接単離することができる。一般に、これは、まず細胞成分やいくつかの外来蛋白質を欠く粗抽出物を準備することによって実現される。次いで、精製、すなわち、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、免疫吸着技術、又は当技術分野で周知の他の従来法によって所望の蛋白質をさらに精製することができる。
【００８９】
より具体的には、ＣＡＭＰ因子を単離する技術は、たとえば、Skalka, B. and Smola,J. (1981) Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A 第２４９号、１９０〜１９４頁、Skalka et al. (1980) Zbl. Vet. Med. B ２７号、５５９〜５６６頁、Skalka et al. (1979) Zbl. Vet. Med. B２６号 ６７９〜６８７頁、Bernheimer et al. (1979) Infect. Immun. 第２３号 ８３８〜８４４頁、Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 第３４８号 ３６３〜３７０頁、Jurgens et al. (1987) J. Exp. Med. 第１６５号 ７２０〜７３２頁に記載されている。
【００９０】
或いは、この蛋白質は、本明細書に記載したように組換え手法によって生成することができる。先に説明したように、これらの組換え生成物は、蛋白質部分配列、全長配列、シグナル配列を含む前駆体、シグナルを欠く成熟体、又は融合蛋白質（たとえば、組換え宿主用の適切なリーダーを有する、或いは連鎖球菌又は別の病原体用の別のサブユニット抗原配列を有する）の形をとってもよい。
【００９１】
以下に記述するように、本発明のＣＡＭＰ因子遺伝子は、ＣＡＭＰ検定を使用し蛋白質生成物のＣＡＭＰ活性を示す能力に基づいて単離することができる。したがって、遺伝子ライブラリを構築し、得られたクローンを使用して適切な宿主細胞を形質転換することができる。コロニーをプールし、ＣＡＭＰ活性を有するクローンをスクリーニングすることができる。コロニーもポリクローナル血清、又は所望の抗原に対するモノクローナル抗体を使用しスクリーニングすることができる。
【００９２】
或いは、ひとたびアミノ酸配列が決定された場合、決定したアミノ酸配列部分のコドンを含むオリゴヌクレオチドプローブを調製し使用して、本件蛋白質をコードする遺伝子についてＤＮＡライブラリをスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドプローブ及びＤＮＡライブラリの調製、並びに核酸ハイブリッド形成によるそのスクリーニングのための基本戦略は、当業界の通常の技術を有する者に広く知られている。たとえば、上記DNA Cloning：第Ｉ巻、上記Nucleic Acid Hybridization、上記Oligonucleotide Synthesis、上記Sambrookらを参照のこと。ひとたび、スクリーニングしたライブラリから得たクローンが正のハイブリッド形成によって同定されたのならば、制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定によって、特定のライブラリ挿入物に所望のＣＡＭＰ因子遺伝子又はその同等物が含まれることを裏付けることができる。
【００９３】
或いは、当該蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、クローンではなく合成して調製することができる。そのＤＮＡ配列は、特定のアミノ酸配列の適切なコドンを用いて設計することができる。一般に、その配列を発現用に使用する場合、所期の宿主向けに好ましいコドンが選択される。完全配列は、標準的方法により調製された重なり合うオリゴヌクレオチドから完全コード配列に組み立てられる。たとえば、Edge (1981) Nature 第２９２号 ７５６頁、Nambair et al. (1984) Science、第２２３号、１２９９頁、Jay et al.(1984) J. Biol. Chem. 第２５９号 ６３１１頁を参照のこと。
【００９４】
ひとたび、所望の蛋白質のコード配列が調製され又は単離されたならば、それらをどんな適当なベクター又はレプリコンにクローン化することもできる。多数のクローニングベクターが当業者に知られており、適切なクローニングベクターを選ぶことが選択の問題である。クローニング及び形質転換することができる宿主細胞向け組換えＤＮＡベクターの例には、バクテリオファージλ（大腸菌）、ｐＢＲ３２２（大腸菌）、ｐＡＣＹＣ１７７（大腸菌）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性細菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性細菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性細菌）、ｐＭＥ２９０（非大腸菌グラム陰性細菌）、ｐＨＶ１４（大腸菌及び枯草菌）、ｐＢＤ９（桿菌）、ｐＩＪ６１（ストレプトマイセス）、ｐＵＣ６（ストレプトマイセス）、ＹＩｐ５（サッカロミセス）、ＹＣｐｌ９（サッカロミセス）、牛乳頭腫ウイルス（哺乳動物細胞）が含まれる。一般に、上記、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：第Ｉ及びII巻、上記Sambrookら、上記B. Perbalを参照のこと。
【００９５】
遺伝子は、プロモータ、（細菌を発現するための）リボソーム結合部位、及び場合によっては（本明細書では集合的に「制御」要素と呼ぶ）オペレータの制御下に置くことができ、それによってこの発現構築体を含むベクターによって形質転換される宿主細胞中で、所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列をＲＮＡに転写する。コード配列にはシグナルペプチド又はリーダー配列を含めても含めなくてもよい。シグナル配列を含める場合、それらは天然の相同配列でも又は異種配列でもよい。当技術分野で周知の他のいくつかのシグナル配列を使用できるのと同様に、たとえば、Ｓ．ウベリス又はＳ．アガラクティエＣＡＭＰ因子のシグナル配列（それぞれ図６Ａ及び６Ｂに示す）を様々なＣＡＭＰ因子の分泌に使用することができる。リーダー配列は、翻訳後処理の際に宿主によって除去され得る。たとえば、米国特許第４，４３１，７３９号、同第４，４２５，４３７号、同第４，３３８，３９７号を参照のこと。
【００９６】
宿主細胞の増殖に関連する蛋白質配列の発現を調節できるようにする他の調節配列も望ましいかもしれない。調節配列は、当業者に知られており、たとえば、調節化合物の存在を含め、化学的又は物理的刺激に呼応して遺伝子発現のオン又はオフの切り替えを引き起こす調節配列が含まれる。ベクターには、たとえば、エンハンサ配列など、他の型の調節要素も含めてよい。
【００９７】
制御配列及び他の調節配列は、コード配列に連結後、上記のクローニングベクターなど、ベクター中に挿入することができる。或いは、コード配列は、制御配列及び適切な制限部位を既に含んでいる発現ベクターに直接クローン化することもできる。
【００９８】
場合によっては、コード配列が適切な向きを有する制御配列に結合できるように、すなわち、適切な読み枠を維持するためにコード配列を改変する必要があるかもしれない。当該ＣＡＭＰ因子の突然変異体又は類似体を生成することも望ましいかもしれない。突然変異体又は類似体は、その蛋白質をコードする配列部分の欠失、配列の挿入、及び／又は配列内の１つ又は複数のヌクレオチドの置換によって調製することができる。部位特異的変異導入などのヌクレオチド配列改変技術は、たとえば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋら、上記のＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ及びＩＩ巻、上記の核酸ハイブリッド形成に記載されている。
【００９９】
次いで、発現ベクターを使用して適切な宿主細胞を形質転換する。いくつかの哺乳動物細胞系統が、当技術分野で知られており、それだけには限らないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（たとえば、ＨｅｐＧ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞など、米国基準菌株保存機構（ＡＴＣＣ）から入手可能な不滅化細胞系が含まれる。同様に、大腸菌、枯草菌、連鎖球細菌種などの細菌宿主が本発明の発現構築体と共に使用される。本発明で有用な酵母宿主には、とりわけ、サッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ  アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ  マルトーサ（Candida maltosa）、ハンゼヌラ  ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス  フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロミセス  ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ピキア  グイレリモンジイ（Pichia guillerimondii）、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）、スキゾサッカロミセス  ポンブ（Schizosaccharomyces pombe）、ヤロウィア  リポリチカ（Yarrowia lipolytica）が含まれる。バキュロウイルス発現ベクターと共に使用される昆虫細胞には、とりわけ、ネッタイシマカ、ガマキンウワバ、カイコ、キイロショウジョウバエ、スポドプテラ  フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、イラクサギンウワバが含まれる。
【０１００】
選択した発現系及び宿主に応じ、上記の発現ベクターによって形質転換した宿主細胞を、当該蛋白質が発現する条件下で培養することによって本発明の蛋白質が生成される。次いで、蛋白質を宿主細胞から単離し精製する。発現系が蛋白質を増殖培地に分泌する場合、蛋白質を培地から直接精製することができる。蛋白質が分泌されない場合、蛋白質は細胞ライセートから単離する。適切な増殖条件及び回収方法の選択は当技術の範囲内である。
【０１０１】
本発明の蛋白質は、既知のアミノ酸配列、又は当該遺伝子のＤＮＡ配列に由来するアミノ酸配列を使用し固相ペプチド合成などの化学合成によっても生成することができる。そのような方法は当業者に知られている。当該抗原の小断片が当該対象の免疫応答を引き起こすことができる場合、ペプチドを化学合成することが好ましいかもしれない。
【０１０２】
ＣＡＭＰ因子、それを含む断片、類似体、及びキメラは、いくつかの標準的試験のどれかを使用し、ＣＡＭＰ活性に関して試験することができる。たとえば、ＣＡＭＰ因子は、ウシやヒツジの赤血球を含め、様々な標的細胞に対して溶解作用を示すことが知られている。したがって、ＣＡＭＰ因子活性について試験するための好都合な方法では、ヒツジ又はウシの赤血球を使用する標準溶血反応が利用される。たとえば、Christie et al. (1944) Aus. J. Exp. Biol. Med. Sci. 第２２号 １９７〜２００頁、Brown et al. (1974) Infect. Immun. 第９号 ３７７〜３８３頁、Darling, C. L. (1975) J. Clin. Microbiol 第１号 １７１頁、Wilkinsin, H. W. (1977) J. Clin. Microbiol、第６号、４２頁、Bernheimer et al. (1979) Infect. Immun. 第２３号 ８３８〜８４４頁、Skalka, B. and Smola, J. (1981) Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A 第２４９号、１９０〜１９４頁、Huser et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 第１２９号 １２９５頁を参照のこと。
【０１０３】
ＣＡＭＰ因子によって増殖しやすい材料から製造されたリポソームが、捕捉しているマーカー分子を放出することをモニタリングすることによっても活性を試験することができる。たとえば、ＣＡＭＰ活性は、たとえば、スフィンゴミエリン、コレステロール、リン酸ジセチルから調製した［１４Ｃ］グルコース含有リポソームを使用してモニタすることができ、ＣＡＭＰ因子によるリポソームの増殖のために放出される捕らわれている［１４Ｃ］グルコースを測定することができる。たとえば、BERNHEIMER ET AL. (1979)INFECT.IMMUN. 第２３号 ８３８〜８４４頁を参照のこと。同様に、ＣＡＭＰ因子の存在下でのリポソームからのＡＴＰ放出は、Sterzik et al. 「Interaction of the CAMP factor from S.agalactiae with artificial membranes.」 Alouf et al.編、『Bacterial protein toxins』、英国ロンドン、Academic Press Inc.、１９８４、１９５〜１９６頁、及びSterzik et al. (1985) Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Abt.1 Suppl.、第１５号、１０１〜１０８頁に記載されている通りモニタすることができる。さらに、Fehrenbach et al. (1984) 「Interaction of amphiphilic bacterial polypeptides with artificial membranes」、Alouf et al.編『Bacterial protein toxins』、英国ロンドン、Academic Press Inc.、１９８４：３１７〜３２４頁、を参照のこと。
【０１０４】
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成するために、本発明のＣＡＭＰ因子又はその断片を使用することができる。ポリクローナル抗体を所望する場合、選択した哺乳動物（たとえば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を本発明の抗原又はその断片、或いは変異させた抗原で免疫化する。免疫化させた動物から血清を採取し、既知の手順によって処理する。たとえば、Jurgens et al. (1985) J. Chrom.、第３４８号、３６３〜３７０頁を参照のこと。ポリクローナル抗体含有血清を使用する場合、ポリクローナル抗体は既知の手順を使用し免疫アフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。
【０１０５】
ＣＡＭＰ因子及びその断片に対するモノクローナル抗体も当業者によって容易に生成され得る。ハイブリドーマ技術の使用によるモノクローナル抗体の一般的な製造方法は広く知られている。不滅抗体生成細胞系統は、細胞融合によっても、また発癌性ＤＮＡを用いてのＢリンパ球の直接形質転換やエプスタイン−バーウイルスでのトランスフェクションなど、他の技術によっても作出することができる。たとえば、M. Schreier et al. Hybridoma Techniques (1980)、Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas(1981)、Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980)を参照のこと。さらに米国特許第４，３４１，７６１号、同第４，３９９，１２１号、同第４，４２７，７８３号、同第４，４４４，８８７号、同第４，４５２，５７０号、同第４，４６６，９１７号、同第４，４７２，５００号、同第４，４９１，６３２号、同第及び４，４９３，８９０号を参照のこと。当該ＣＡＭＰ因子、又はその断片に対して生成されたモノクローナル抗体のパネルを様々な特性に関して、すなわちアイソタイプ、エピトープ、親和性などに関してスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体は、免疫アフィニティ技術を使用する、それらの抗体を標的とした個々の抗原の精製の際に有用である。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、受動的免疫化に使用することもでき、又はサブユニットワクチン調製物と組み合せて免疫反応を強化することもできる。
【０１０６】
ワクチン製剤及び投与
本発明のＣＡＭＰ因子は、以下に記述した対象を免疫化する際の使用を目的として、単独で或いは他の抗原と組み合わせてワクチン組成物に処方することができる。そのような製剤の調製方法は、たとえば、『Remington’s Pharmaceutical Sciences』、Mack Publishing Company、米国ペンシルベニア州 Easton、第１８版、１９９０年に記載されている。典型的には、本発明のワクチンは、溶液又は懸濁液として注入可能な医薬品として調製される。注入前に液体ビヒクルに溶解又は懸濁させるのに適当な固形物形も調製することができる。調製物は、乳化させることも、又は活性成分をリポソームビヒクルに封入することもできる。一般に、活性免疫原性成分は、相溶性のある薬剤ビヒクル、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組合せなどと混合する。さらに、必要に応じてビヒクルには湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、少量の補助物質を含めてもよい。
【０１０７】
ワクチンの有効性を強化するアジュバンドを製剤に加えることもできる。アジュバンドには、たとえば、ムラミルジペプチド、アブリジン、水酸化アルミニウム、臭化アンモニウムジメチルジオクタデシル（ＤＤＡ）、油、水中油滴型乳濁液、サポニン、サイトカイン、及び当技術分野で知られている他の物質を含めてよい。
【０１０８】
その免疫原性を増強するためにＣＡＭＰ因子を担体と結合させることができる。適当な担体には、血清アルブミン、スカシガイヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵白アルブミン、当業者に知られている他の蛋白質を含む蛋白質、セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどの多糖類、ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、不活性ウイルス粒子などの大型緩徐代謝性マクロ分子が含まれる。
【０１０９】
ＣＡＭＰ因子は、その天然形で使用することができ、又はその官能基成分は、たとえば、リジン残基のスクシニル化、又はＣｙｓ−チオラクトンとの反応によって改変することができる。スルフヒドリル基は、たとえば、アミノ官能基と、２−イミノチオラン又は３−（４−ジチオピリジルプロピオナートのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によって担体（又は抗原）に組み込むこともできる。ペプチドを接合するために、適当な担体を改変してスペーサアーム（ヘキサメチレンジアミン又は他の同様な大きさの２官能性分子など）を組み込むこともできる。
【０１１０】
本発明のＣＡＭＰ因子用の他の適当な担体には、米国特許第５，０７１，６５１号に開示されるロータウイルスのＶＰ６ポリペプチド又はその機能性断片が含まれる。同様に有用な担体は、米国特許第４，７２２，８４０号で開示されている方法によって製造された、ウイルス蛋白質と対象免疫原の融合生成物である。さらに別の適切な担体はリンパ球などの細胞を含む。この形での提示が免疫化状態を生じさせる対象での自然方式の提示を模倣しているからである。或いは、本発明の蛋白質は、赤血球に、好ましくは対象自身の赤血球に結合させることができる。ペプチドを蛋白質又は細胞に結合させる方法は当業者に知られている。
【０１１１】
さらに、ＣＡＭＰ因子（又はその複合体）は、そのままで又は塩の形でワクチン組成物に処方することができる。薬剤として許容される塩には、酸付加塩（活性ポリペプチドの遊離アミノ基を用いて形成）、及びたとえば塩酸やリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成した塩が含まれる。遊離カルボキシル基から形成する塩は、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から派生させることができる。
【０１１２】
注入可能なワクチン製剤には、「治療有効量」の活性成分、すなわち、この組成物を投与した対象で免疫反応を引き出すことができる量が含まれる。乳房炎の治療及び予防では、たとえば、「治療有効量」は、たとえば、乳中の体細胞数を１ｍｌ当たり約５００，０００細胞未満に保持し又はそのようにする組成物の能力によって測定した、感染を制御する量が好ましいはずである。厳密な量は、当業者によって標準的試験を使用し容易に定量される。通常、ＣＡＭＰ因子は、組成物の約１％〜約９５％（ｗ／ｗ）の範囲であり、或いは適切な場合にはさらに高く又は低くなる。本発明のワクチン製剤を用いて動物１頭につき１〜３ｍｌの用量を投与するとき、免疫応答を引き出すためには注入した溶液１ｍｌ当たり２０〜５００μｇの活性成分が適切なはずである。
【０１１３】
一般に、対象を免疫化するためには、ワクチンを非経口で通常筋肉内注射によって投与する。しかし、皮下、腹腔内、静脈内注射など、他の投与方式も容認される。投与する量は、治療対象となる動物、動物免疫系の抗体を合成する能力、及び所望する防御程度によって決まる。有効な用量は、当技術分野の通常の技術者が用量反応曲線を確立する常法の試行を行うことによって容易に確立され得る。対象は、少なくとも１回用量の、好ましくは２回用量のワクチン投与によって免疫化する。さらに感染に対して免疫状態を維持するために必要とされる程の用量を動物に投与することができる。
【０１１４】
他の投与方式に適切な別のワクチン製剤には、座薬、さらに場合によっては、エアロゾル製剤、鼻腔内製剤、経口製剤、持続放出製剤が含まれる。座薬に関しては、ビヒクル組成物には、従来の結合剤、及びポリアルカリングリコールやトリグリセリドなどの担体を含める。そのような座薬は、約０．５％〜約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１％〜約２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成することができる。経口ビヒクルには、通常使用されるビヒクル、たとえば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、マグネシウム、ステアリン酸塩、ナトリウムサッカリンセルロース、炭酸マグネシウムなどを含める。これらの経口ワクチン組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤、又は粉剤の形をとることができ、約１０％〜約９５％の、好ましくは約２５％〜約７０％の活性成分を含む。
【０１１５】
通常、鼻腔内製剤には、鼻粘膜に過敏症を引き起こさず、毛様体機能を著しく阻害しないビヒクルを含める。水、生理食塩水、知られている他の物質などの希釈液を本発明と共に使用することができる。経鼻製剤には、それだけには限らないが、クロロブタノールや塩化ベンザルコニウムなどの保存料を含めてもよい。本件蛋白質の鼻粘膜による吸収を強化するために界面活性剤を含めてもよい。
【０１１６】
制御放出又は持続放出製剤は、リポソームなどの担体又はビヒクル、酢酸エチレンビニルコポリマーやＨｙｔｒｅｌ（登録商標）コポリマーなどの非再吸収不浸透性ポリマー、ヒドロゲルなどの膨張性ポリマー、コラーゲンやある種のポリ酸などの再吸収可能ポリマー、或いは再吸収可能な縫合糸を製造するために使用されるものなどのポリエステルに蛋白質を組み込むことによって製造される。ＣＡＭＰ因子は、当技術分野で周知の移植ミニポンプを使用し送達することもできる。
【０１１７】
本発明のＣＡＭＰ因子は、その因子を発現する担体ウイルスによって投与することもできる。本発明と共に使用される担体ウイルスには、それだけには限らないが、ワクシニアウイルス及び他のポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスが含まれる。例として、新規な蛋白質を発現するワクシニアウイルス組換え体を以下のように構築することができる。チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列など、特定の蛋白質をコードするＤＮＡを最初に適切なベクターに挿入し、その結果そのＤＮＡをワクシニアのプロモータ配列及びフランキングワクシニアＤＮＡ配列に隣接させる。次いで、このベクターを使用して同時にワクシニアに感染している細胞にトランスフェクトさせる。相同組換えは、ワクシニアのプロモータに加えて本蛋白質をコードする遺伝子をウイルスゲノム中に挿入する働きをする。生じたＴＫ組換え体の選択は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下で細胞を培養し、それに対して耐性なウイルスのプラークを選択することによって行うことができる。
【０１１８】
別の投与経路には、遺伝子治療又は核酸免疫化が含まれる。すなわち、本件ＣＡＭＰ因子をコードするヌクレオチド配列（及び随伴する調節要素）は、それをｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳させるために対象に直接投与することができる。或いは、対象の細胞又は組織に生体外でトランスフェクトさせ、形質転換した材料を宿主に再導入することによって遺伝子転移を実現することができる。ＤＮＡは、宿主生物に直接、すなわち、注射によって導入することができる（国際公開第ＷＯ／９０／１１０９２号、及びＷｏｌｆｆら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４７号、１４６５〜１４６８頁を参照のこと）。リポソーム媒介遺伝子転移は、既知の方法を使用して実現することもできる。たとえば、Hazinski et al. (1991) Am. J. Respir. Cell Mol.Biol. 第４号 ２０６〜２０９頁、Brigham et al. (1989) Am. J. Med. Sci. 第２９８号 ２７８〜２８１頁、Canonico et al. (1991) Clin. Res., 39：２１９Ａ、及びNabel et al. (1990) Science 第２４９号、１２８５〜１２８８頁を参照のこと。特定の細胞型上に発現する表面抗原を標的とした抗体など、標的薬剤は、リポソーム表面に共有結合させることができ、その結果その核酸を感染しやすい特定の組織及び細胞に送達することができる。
【０１１９】
診断検定
先に説明したように、連鎖球菌感染しているかどうかの判定するために、連鎖球菌、たとえば、Ｓ．ウベリス、Ｓ．アガラクティエ、Ｓ．ディスガラクティエ（dysgalactiae）の反応性抗体の存在を生体試料中で検出するために、ＣＡＭＰ因子、その変異体、及び免疫原性断片、並びにＣＡＭＰ因子エピトープを含むキメラを診断薬として使用することもできる。たとえば、ＣＡＭＰ因子と反応する抗体の存在は、競合検定、直接反応検定、サンドウィッチ型検定など、イムノアッセイ含む標準電気泳動技術及び免疫診断技術を使用し検出することができる。そのような検定には、ただしそれだけには限らないが、ウェスタンブロット法、凝集反応試験、ＥＬＩＳＡなどの酵素標識及び媒介イムノアッセイ、ビオチン／アビジン型検定、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動法、免疫沈降法などが含まれる。一般に、反応には、蛍光、化学発光、放射性、酵素標識、染料分子などの顕在化標識、又は抗原とそれに反応する抗体間での複合体の形成を検出する他の方法が含まれる。
【０１２０】
一般に、前述の検定は、液相中で抗原−抗体複合体が結合している固相担体からの未結合抗体の分離を含む。本発明の実施にあたって使用することができる固体担体には、ニトロセルロース（たとえば、膜又はマイクロタイターウェル形）、ポリビニル塩化物（たとえば、シート又はマイクロタイターウェル）、ポリスチレンラテックス（たとえば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）、ポリビニリジンフッ化物、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、磁力応答性ビーズなどの基板が含まれる。
【０１２１】
典型的には、構成成分が十分に担体に固定されるような適当な結合条件下で、固体担体を最初に固相構成成分（たとえば１つ又は複数のＣＡＭＰ因子）と反応させる。時には、最初に蛋白質に抗原を結合させることによって担体への抗原の固定を強化することができ良好な結合特性を伴う。適当な結合蛋白質には、それだけには限らないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシガイヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵白アルブミン、及び当業者には周知の他の蛋白質を含む血清アルブミンなど、巨大分子が含まれる。抗原を担体に結合させるために使用することができる他の分子には、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーなどが含まれる。そのような分子及びこれらの分子を抗原に結合させる方法は、当業界の通常の技術を有する者に広く知られている。たとえば、Brinkley, M. A. Bioconjugate Chem.(1992)、第３号、２〜１３頁、Hashida et al., J. Appl. Biochem.(1984)、第６号、５６〜６３頁、及びAnjaneyulu and Staros, International J. of Peptide and Protein Res. （１９８７） 第３０号 １１７〜１２４頁を参照のこと。
【０１２２】
固体担体を固相構成成分と反応させた後、固定されなかったどんな固相構成成分も洗浄によって担体から除去し、次いで適当な結合条件下で担体に結合した構成成分を、リガンド部分を含むことが推測される生体試料（たとえば、固定した抗原に向けた抗体）に接触させる。結合していないどんなリガンドも除去するために洗浄した後、適当な結合条件下で第２の結合部分を加える。その際、第２の結合体は、結合しているリガンドと選択的に結合することができる。次いで、当技術分野で周知技術を使用し第２の結合体の存在を検出することができる。
【０１２３】
より具体的には、ＥＬＩＳＡ法を使用することができ、その場合マイクロタイタープレートのウェルをＣＡＭＰ因子蛋白質でコートする。次いで、コートしたウェルに抗ＣＡＭＰ因子免疫グロブリン分子を含む、又は含むことが推測される生体試料を加える。固定した抗原に抗体を結合させるために十分な時間培養した後、プレートを洗浄して未結合部分を除去し、検出可能に標識した第２の結合分子を加えることができる。第２の結合分子をどんな捕捉された試料抗体とも反応させ、プレートを洗浄し、当技術分野で周知の方法を使用し第２の結合分子の存在を検出する。
【０１２４】
したがって、具体的な一実施形態では、結合した抗ＣＡＭＰ因子リガンドの存在は、抗体リガンドを標的とした抗体を含む第２の結合体を使用し生体試料から容易に検出することができる。当業者に知られている方法を使用し、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ウレアーゼなどの検出可能な酵素標識に容易に結合することができる、いくつかの抗ウシ免疫グロブリン（Ｉｇ）分子が当技術分野で知られている。次いで、適切な酵素基質を使用して検出可能なシグナルを発生させる。他の関連する実施形態では、当業者に知られている方法を使用し競合型ＥＬＩＳＡ技術を実施することができる。
【０１２５】
ＣＡＭＰ因子蛋白質及びそれらの蛋白質に特異な抗体が沈殿する条件下で複合体を形成するように検定を溶液中で実施することもできる。具体的な一実施形態では、直接的な化学的又は間接的結合などによる、当技術分野で知られている結合技術を使用し、ＣＡＭＰ因子蛋白質を固相粒子（たとえばアガロースビーズなど）に結合させることができる。次いで、適当な結合条件下で、ＣＡＭＰ因子蛋白質の抗体を含むことが推測される生体試料に、抗原をコートした粒子を接触させる。結合した抗体間の架橋によって粒子−抗原−抗体複合凝集体が形成され、この凝集体を洗浄及び／又は遠心分離を利用し試料から沈殿分離させることができる。上記の免疫診断法など、いくつかの標準的方法のどれかを使用し、反応混合物を分析して抗体−抗原複合体が存在するかどうかを決定することができる。
【０１２６】
さらに別の実施形態では、免疫アフィニティマトリックスを提供することができ、抗ＣＡＭＰ因子分子を含むことが推測される生体試料から得た抗体のポリクローナル集団を基板に固定する。その際に、固定した抗原を使用し、試料の初期アフィニティ精製を行うことができる。それによって、得られた試料調製物は、親和性担体の潜在的な非特異的結合特性を回避し抗連鎖球菌部分しか含まない。いくつかの高収量免疫グロブリン（無傷の断片又は特異的断片）固定化法、及び抗原結合活性の良好な保持法が当技術分野で知られている。どんな特定の方法にも限定されないで、固定した蛋白質Ａ又は蛋白質Ｇを使用して免疫グロブリンを固定化することができる。
【０１２７】
したがって、ひとたび免疫グロブリン分子が固定されて免疫アフィニティマトリックスが得られたならば、適当な結合条件下で標識ＣＡＭＰ因子蛋白質と結合している抗体を接触させる。非特異的に結合したどんな抗原も免疫アフィニティ担体から洗い落とした後、当技術分野で知られている方法を使用し、標識を調べることよって結合している抗原の存在を決定することができる。
【０１２８】
さらに、所与の試料中の蛋白質に対する抗体の存在を検出するために、ＣＡＭＰ因子それ自体ではなくＣＡＭＰ因子蛋白質によって生じた抗体を上記検定で使用することができる。これらの検定は、基本的に上記のように実施され当業者によく知られている。
【０１２９】
上記のイムノアッセイを実施するために、ＣＡＭＰ因子蛋白質、又はそれに対する抗体を含む上記検定試薬を、適当な使用説明書及び他の必要な試薬と共にキットで提供することができる。キットには、使用した特定のイムノアッセイに応じて、適当な標識及び他のパッケージングした試薬及び材料（すなわち洗浄用緩衝液など）も含めてよい。これらのキットを使用し上記した検定などの標準イムノアッセイを実施することができる。
【０１３０】
以下は本発明を実施するための特定の実施形態の例である。実施例は、例示目的にしか過ぎず、どんな方式でも本発明の範囲を制限しないものとする。
【０１３１】
本発明を実施する際に有用な株の寄託物
ブタペスト条約の条項により、以下の株の生物学的純粋培養物を米国基準菌株保存機構（米国バージニア州  Manassas、University Boulevard 10801）に寄託した。好首尾な生存能力試験後、表示したアクセッション番号が与えられ必要な手数料を支払った。指定寄託物は、寄託日から３０年間、又は寄託についての最後の要請から５年間のどちらか長期である方で維持される。万一、培養物が死滅し、又は不注意により破壊され、或いはプラスミド含有株の場合にはそのプラスミドが消失した場合には、培養物は同じ分類学的説明の生存培養物と交換される。
【０１３２】
万一、常法の配列決定誤りのために本出願で示された配列と寄託されているプラスミドの当該遺伝子配列の間に相違点があった場合、寄託プラスミド中の配列が支配する。
株                            寄託日          ＡＴＣＣ番号
大腸菌ＪＦ１７５４中のｐＪＬＤ２１    １９９５年６月９日    第６９８３７号
【０１３３】
Ｃ．実験用
材料及び方法
酵素を市販業者から購入し、製造業者の使用説明書に従って使用した。放射性ヌクレオチド及びニトロセルロースフィルタも市販業者から購入した。
【０１３４】
ＤＮＡ断片の単離では、記載したものを除きＤＮＡ操作は全て、標準手順に従って行った。上記Sambrookらを参照のこと。制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノー断片、及び他の生物試薬は、市販業者から購入することができ、製造業者の使用説明書に従って使用した。２本鎖ＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分離した。
【０１３５】
細菌株、プラスミド、及び増殖条件
指摘したものを除き、Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子遺伝子のクローニングに使用した大腸菌株は、ＪＦ１７５４（ｈｓｄＲ  ｌａｃ  ｇａｌ  ｍｅｔＢ  ｌｅｕＢ  ｈｉｓＢ）であった（McNeil, J. B. and Friesen, J. D. (1981) Mol. Gen. Genet.、第１８４号、３８６〜３９３頁）。複製能のある大腸菌ＪＦ１７５４を先に述べたように製造した（Hanahan, D. 「Techniques for transformation of E. coli.」、 Glover DM編、DNA cloning（第Ｉ巻）、a practical approach.、Oxford:IRL Press、1985：１０９〜１３５頁）。キメラＣＡＭＰ因子の生成に使用した大腸菌株は、ＸＬＩ  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ（ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ  １、ｌａｃ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃｌｑ  ＺΔＭ１５  Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ］（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国カリフォルニア州ラホーヤ）、及びＪ５、ＡＴＴＣアクセッション番号第４３７４５号、J. Clin. Microbiol (1987)、第２５号、１００９〜１０１３頁であった。
【０１３６】
ルリアブロス（Difco Laboratories）中で、又はルリア寒天（Difco Laboratories）プレート上で大腸菌細胞を増殖した。組換えプラスミドを含む大腸菌株の増殖にアンピシリンを５０μｇ／ｍｌで使用した。４種のＳ．ウベリス株、並びにＳ．アガラクティエ及びＳ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）を米国基準菌株保存機構（それぞれＡＴＣＣアクセッション番号第９９２７号、同第１３３８６号、同第１３３８７号、同第１９４３６号、同第２７５４１号、同第２５９２３号）から得た。他のＳ．ウベリス株は、Saskatchewan大学、M.Chirino-Trejoの好意により提供された野生単離物である。脳心臓注入ブロス（ＢＨＩ、Difco Laboratories）中で、又は５％ヒツジ血液（PML microbiologicals）を含むベース＃２血液寒天プレート上で連鎖球菌株全てを増殖した。
【０１３７】
クローニングベクターｐＴＺ１８Ｒ［Mead et al.(1986)Protein Eng、第１号、６７〜７４頁］をPharmacia Canada Ltd.から得た。キメラＣＡＭＰ構築体の調製に使用されるクローニングベクターはｐＡＡ５５６ａ及びｐＥＴ１５−ｂであった。
【０１３８】
Ｓ．アウレウスβ−トキシンの調製
Ｓ．アウレウスをＢＨＩ中、３７℃で１８時間培養し、５，０００ｇで遠心分離後、得られた上清を０．２２−μＭフィルタ（Ｎａｌｇｅ  ｃｏｍｐａｎｙ）用いるろ過により滅菌した。粗β−トキシンと称するこの材料を−２０℃で貯蔵した。
【０１３９】
ＣＡＭＰ反応
［Schneewind et al.(1988) Infect. Immun. 第56号 2174〜2179頁]に記載されている通りに細菌をCAMP活性に関してスクリーニンク゛した。手短に言えば、血液寒天フ゜レート上で、β-トキシン-を生成するS.アウレウスの播種(streak)に対して直角に株を播種(streak)した。37℃で6〜20時間培養後溶血が観察された。
【０１４０】
ＣＡＭＰ因子の精製
Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 第３４８号 ３６３〜３７０頁に記載のようにオクチル−セファロースＣＬ−４Ｂ（Pharmacia）クロマトグラフィーによってＳ．ウベリス（ＡＴＴＣアクセッション番号第９９２７号）培養上清からＣＡＭＰ因子を部分的に精製した。
【０１４１】
ポリクローナル抗体
Ｓ．ウベリスの組換えＣＡＭＰ因子を分析するために、精製ＣＡＭＰ因子を標的としたポリクローナル抗体を得た。マウスの免疫化を完全フロイントアジュバントと一緒に精製ＣＡＭＰ蛋白質２０μｇを腹腔内注射することによって行った。この第１次免疫化から３週間後、不完全フロイントアジュバントと一緒に、同量のＣＡＭＰ蛋白質の２回目の腹腔内注射を行い、さらに３週間後に不完全フロイントアジュバントと一緒に、ＣＡＭＰ蛋白質２０μｇの３回目の静脈内注射を行った。次いで１０日後に血清試料を採取した。
【０１４２】
ＰＡＧＥ及び免疫ブロット
最終濃度１０％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿法によって培養上清からＳ．アガラクティエ及び大腸菌の蛋白質試料を得た。Laemmli（Laemmli, U. K. (1970)Nature、第２２７号、６８０〜６８５頁）に記載のように、蛋白質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実施した。以下の変更をして、業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）が提示するように蛋白質をニトロセルロース膜上に電気ブロットし、別の箇所（Theisen, M. and Potter, A. A. (1992) J. Bacteriol、第１７４号、１７〜２３頁）に記載されている通りにブロットを展開した。使用した第１の抗血清は、部分精製したＳ．ウベリスＣＡＭＰ蛋白質に対するマウスポリクローナル抗血清であり、既に［Frey et al. (1989) Infect. Immun. 第５７号 ２０５０〜２０５６頁］に記載されている通り、その血清を大腸菌宿主株の抗原を用いて吸収させた。ブロッティング手順で使用した第２の抗体は、アルカリフォスファターゼ（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.）に結合させたヤギ抗マウスＩｇＧであった。
【０１４３】
ＤＮＡ操作
分子技術は全て、業者（Pharmacia Canada Ltd.）又は上記Sambrookらによって提示された通りであった。５％グリシン（ｗ／ｖ）を加えたＢＨＩ１００ｍｌ中で増殖させた細胞からＳ．ウベリスの染色体ＤＮＡを調製した。細胞をペレット化し、２５％スクロース及びリゾチーム１．６ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）を含むＴＥＳ緩衝液（３０ｍＭのトリス塩酸、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）２．５ｍｌに再懸濁した。懸濁液を３７℃で１時間培養し、続いて−７０℃で冷凍した。凍結細胞を６５℃の湯槽中で解凍した。６５℃で３０分間培養する前に、ＥＤＴＡ及びプロテイナーゼＫ（Pharmacia）を加えて、それぞれ、最終濃度２０ｍＭ及び１．２ｍｇ／ｍｌにした。細胞を完全に溶解するために、サルコシルを加えて１％にし３７℃で１時間培養した。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．９）２ｍｌを加えた後、フェノール：クロロホルム抽出を行った。ＤＮＡをエタノール沈殿によって回収し、ＲＮａｓｅ（Pharmacia Canada Ltd.）で処理した。
【０１４４】
サイズ分画したＳａｕ３ＡＩ消化染色体ＤＮＡ断片をスクロース密度勾配遠心法によって単離した（上記Sambrookら）。
【０１４５】
Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第７４号、５４６３〜５４６７頁のジデオキシ鎖末端法により、Ｔ７配列決定キット（Pharmacia Canada Ltd.）を使用してＤＮＡ配列を２本鎖プラスミド鋳型について決定した。
【０１４６】
ＲＮＡ分析
既に［Lloubes et al.(1986) Nucleic Acid Res. 第１４号、２６２１〜２６３６頁］に記載されている通り、追加のＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅＩ消化によって大腸菌株からＲＮＡを単離した。Ｓ．ウベリスからＲＮＡを以下のように調製した。培養物（ＯＤ６００＝０．６）１０ｍｌから得た細胞ペレットを、ムタノリシン（mutanolysin）（Ｓｉｇｍａ）５００ｕを含むＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）２５０μｌ中に再懸濁し、３７℃で３０分間培養した。溶解緩衝液（６０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．４、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ）（２５０μｌ）及びプロテイナーゼＫ１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）を加え１時間培養を続けた。試料を６５℃のフェノール（飽和水、ｐＨ４．０）で１度、室温のフェノールで２度抽出した。ＲＮＡをエタノール沈殿によって回収し、ＤＮａｓｅＩ（Pharmacia Canada Ltd.）で処理した。
【０１４７】
Miller et al. (1986) Nucleic Acids Res. 第１４号 ７３４１〜６０頁に記載のようにプライマー伸長検定を実施した。ＲＮａｓｉｎ及びモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素をPharmacia Canada Ltd.から得た。
【実施例１】
【０１４８】
Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子遺伝子のクローニング及び発現
Ｓ．ウベリスの染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ第９９２７号）をＳａｕ３ＡＩで部分消化し、スクロース勾配でサイズ分画した。これから、２〜５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。これらの断片の末端をｄＧＴＰ及びｄＡＴＰで部分的に充填し、ＳａｌＩで切断しｄＴＴＰ及びｄＣＴＰで部分的に充填したｐＴＺｌ８Ｒに連結した。大腸菌ＪＦ１７５４の複製能のある細胞の形質転換に続き、ＣＡＭＰ因子遺伝子を発現しているクローンをアンピシリンを用いて血液プレート上に、β−トキシンをその表面上に同定した。合計１０，０００個中から６個のクローンが表現型上溶血であり、その各個が異なるＣＡＭＰ反応を媒介した。組換えプラスミドｐＪＬＤ２１を含むそれらの１個をさらに研究するために選択した。
【０１４９】
プラスミドｐＪＬＤ２１には５．２ｋｂの挿入物断片を含め、ＣＡＭＰ陽性サブクローンｐＪＬＤ２１−２が生成後、ＣＡＭＰ因子遺伝子ｃｆｕを３．２ｋｂのＢａｍＨＩ断片内に局在化させた（図１）。配列決定のためにより多くの制限酵素を用いてこのサブクローンをさらに分析した。
【０１５０】
組換えＣＡＭＰ因子の発現を研究するために、Ｃｆｕ＋大腸菌ＪＦ１７５４（ｐＪＬＤ２１）及び宿主大腸菌ＪＦ１７５４（ｐＴＺｌ８Ｒ）から得た上清蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。ベクター対照と比較して、Ｃｆｕ＋クローンから得た上清を含むレーンでは区別可能なバンドは観察されず、発現は非常に低レベルであり、又は蛋白質は効率よく分泌されなかったことを示唆していた。ｐＪＬＤ２１によってコードされているＣＡＭＰ因子を同定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された蛋白質をニトロセルロース膜に移し免疫ブロットした。ｐＪＬＤ２１を有するＣｆｕ＋大腸菌クローンは、Ｓ．ウベリスの天然ＣＡＭＰ因子に類似する分子量２８，０００の蛋白質を発現した。
【０１５１】
Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子ｐＧＨ−ＣＡＭＰ用の別の発現プラスミドを図５に示すように構築した。特に、ｐＪＬＤ２１−２の１．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をクレノーポリメラーゼで充填し、ＢａｍＨＩによって切断し、同様の方式で充填したｐＧＨ４３３中に挿入した。プラスミドｐＧＨ４３３は、ｔａｃプロモータ、翻訳開始部位、全３個の読み枠のライゲーションを可能にする制限酵素部位、それに続く読み枠全ての終止コドン含む発現ベクターである。Theisen, M. and Potter, A. A. (1992) J. Bacteriol.、第１７４号、１７〜２３頁を参照のこと。
【０１５２】
発現プラスミドを使用して大腸菌ＪＦ１７５４（上記）を形質転換した。以下のワクチン試行で使用するために、たとえば、Rossi-Campos et al.(1992) Vaccine、第１０号、５１２〜５１８頁に記載されているように封入体からＣＡＭＰ因子を調製した。手短に言えば、細菌を中対数期まで増殖させ、イソプロピル−β、Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、培地を勢いよく攪拌して３７℃で培養した。細菌を遠心分離によって回収し、再懸濁し、７０℃で凍結した。凍結細胞を室温で解凍しリゾチームを加えた。次いで、混合洗浄剤を加えた。粘度を超音波処理によって低減し蛋白質凝集体を遠心分離によって回収した。ペレットを最小容量の４Ｍグアニジン塩酸塩に溶解した。蛋白質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、クーマシーブルーで染色されたバンドの強度をウシ血清アルブミン基準と比較することによって蛋白質濃度を推定した。
【実施例２】
【０１５３】
Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子遺伝子のヌクレオチド配列
Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子遺伝子のヌクレオチド配列を得るために、ｐＪＬＤ２１−２のＥｃｏＲＩ断片、ＨｉｎｄＩＩＩ断片、ＨｉｎｃＩＩ断片、及びＳａｃＩ断片のそれぞれを別個にｐＴＺｌ８Ｒにクローン化した。断片を図１に示すように両向きに配列決定した。Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子のコード配列、及び派生したアミノ酸配列を図２に示す（配列番号１及び２）。
【実施例３】
【０１５４】
ＳウベリスＣＡＭＰ因子とＳ．アガラクティエＣＡＭＰ因子の比較
Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子とＳ．アガラクティエ蛋白質Ｂを比較するために、蛋白質Ｂ［Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 第３４８号 ３６３〜３７０頁］を含むＳ．アガラクティエの濃縮培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、精製Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子に対する抗体の免疫ブロットによって分析した。Ｓ．アガラクティエ上清から得た２５ｋＤａの蛋白質バンドが免疫ブロットで反応した。Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子に対して引き起こされた単一特異性抗体は、Ｓ．アガラクティエ蛋白質Ｂと交差反応する恐れがあることをこのデータは示唆した。Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子から派生したアミノ酸を伴うＳ．アガラクティエＣＡＭＰ因子のアミノ酸配列の並びは６６．４％同一残基を示したので（図４）これは驚くにはあたらない。
【実施例４】
【０１５５】
Ｓ．ウベリス８株中のＣＡＭＰ因子遺伝子の分布
他のＳ．ウベリス株中のＣＡＭＰ因子遺伝子の分布を研究するために、Ｓ．ウベリス８株から調製した染色体ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化しアガロースゲル上で分離した。ｐＪＬＤ２１の５７６ｂｐのＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ断片（図１）をプローブとするサザンブロット分析を行った。この分析からｐＪＬＤ２１のＨｉｎｄIII断片（１．２ｋｂ）と同一サイズの断片が、ＣＡＭＰ反応で陽性であった３つのＳ．ウベリス株中に存在した一方で、プローブと反応してＣＡＭＰ反応で陰性だった株は存在しなかったことが示された。したがって、ＣＡＭＰ陰性株はｃｆｕ遺伝子を含まない。
【実施例５】
【０１５６】
ＣＡＭＰ因子の免疫原性及び防御能
ｐＧＨ−ＣＡＭＰによってコードされているＳ．ウベリスＣＡＭＰ因子を実施例１に記載したように封入体から調製した。MVP Laboratories（米国ネブラスカ州 Ralston）社製Emulsigen Plus（商標）、及びKodak（米国ニューヨーク州ロチェスター）社製臭化アンモニウムジメチルジオクタデシル（ＤＤＡ）の合剤であるＶＳＡ３アジュバントで抗原を製剤化した。最終濃度は、ＣＡＭＰ因子２５μｇ／ｍｌ、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ  Ｐｌｕｓ３０％、Ｔｗｅｅｎ−８０  ０．９％、及びＤＤＡ２．５ｍｇ／ｍｌであった。用量容量は、組換え抗原５０μｇを含む２ｃｃであった。
【０１５７】
ペンシルベニア州立大学乳房炎研究飼育場から得た１５頭の健康な乳分泌中の乳牛を使用してＳ．ウベリスＣＡＭＰ因子の乳房炎からウシを守る能力を研究した。この動物をウシ５頭の２群に割り振った。投与群は以下からなる：１）実験用、Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子を含むワクチンを投与、乾乳時に筋肉内に投与し再度２８日後に投与、２）プラセボ（ビヒクル）、筋肉内注射によって乾乳時に投与し再度２８日後に投与。
【０１５８】
動物は全て、乳分泌４日目に４個の乳房の１個をＳ．ウベリスで攻撃した。表１に示すように乳及び血液試料を得た。
【０１５９】
【表１】
2005523704.tif 000003
【０１６０】
攻撃株Ｓ．ウベリス（ＡＴＣＣ株９９２７号）をウシ乳房炎の臨床例から得た。Ｓ．ウベリスの保存培養物をトリプシン大豆ブロス中で増殖し、必要とされるまで個々のアリコットを−７０℃で血液ビーズ上に貯蔵した。全血５％を含むエスクリン血液寒天プレート上でストックビーズ培養物をローリングすることによって細菌攻撃体を調製した。３７℃で２４時間培養後、単一コロニーを使用して超高温殺菌（ＵＨＴ）乳１００ｍｌに接種し３７℃で１２時間培養した。培養物を２４時間よく混合し、アリコット１００μｌを取り出して２個目のＵＨＴ乳１００ｍｌに接種した。２個目の３７℃で９時間培養後、培養物を滅菌生理食塩水を使用し連続的に希釈して１０倍増にした。各希釈液１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を分光光度計の吸光度によって定量し、血液寒天プレート上に注いだプレートによって裏付けた。生理食塩水１ｍｌ当たりＳ．ウベリス２００ＣＦＲを含む希釈液を各攻撃用に選択した。
【０１６１】
ＣＡＭＰ因子の総Ｉｇタイターを間接的ＥＬＩＳＡによって定量した。Ｉｍｍｕｎｌｏｎ−２プレートを、抗原を含む炭酸塩緩衝液でコートした。使用に先立ち、プレートをＴＢＳＴ（１００ｍＭトリスＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）及び３％ＢＳＡで１時間ブロックした。ブロッキング後、プレートを蒸留水で洗浄した。血清及び乳試料を１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴを使用し連続的に希釈して３倍増にした。Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子のウサギ抗血清も希釈し正の対照として使用した。負の対照試料には１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴを含めた。希釈試料及び対照を、コートしたプレートに移し室温で１時間培養した。プレートを蒸留水で完全に洗浄しウェルは全て、ヤギ抗ＩｇＧを１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴで１：２０００に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートで培養した。室温で１時間培養後、プレートを蒸留水で洗浄した。試料中に存在する抗体量は、ＡＢＴ基板を使用して可視化した。各試料のタイターは、４０５ｎｍ（参照波長４９５ｎｍ）での吸光度読取り値に基づいた。試料の正の読取り値は、その吸光度がブランク（負の対照）の吸光度の２倍のものであった。タイターは、正の読取り値を示す最終希釈の逆数（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）を取ることによって定量した。検定プレート間の粘稠性は、正の対照の吸光度読取り値によってモニタした。
【０１６２】
結果を表２及び３に示す。見ての通り、抗体タイターはプラセボ群よりもワクチン接種動物で高い。
【０１６３】
【表２】
2005523704.tif 000004
【０１６４】
【表３】
2005523704.tif 000005
【０１６５】
体細胞数算定は、ウシ乳房炎の従来からの測定法である。したがって、標準的検定を使用し乳を体細胞について検定した。結果を表４に示す。すぐにも明らかなように、免疫化動物の体細胞数は正常限度内であるが、プラセボ群の細胞数算定は乳房炎の存在を示唆していた。したがって、ＣＡＭＰ因子ワクチンは乳房炎予防に有効であった。
【０１６６】
【表４】
2005523704.tif 000006
【実施例６】
【０１６７】
キメラＣＡＭＰ因子構築体のクローニング、発現、及び精製
高度に免疫原性、交差反応性ワクチン抗原を得るためにＳ．ウベリス及びＳ．アガラクティエＣＡＭＰ因子に由来するエピトープを含むキメラＣＡＭＰ蛋白質（ＣＡＭＰ−３）を構築した。図７は、ＣＡＭＰ−３キメラを構築するために使用した中間生成物及び最終プラスミドを示す。最終構築体のＤＮＡ及びアミノ酸配列を図８に示す。構築体は、図３に示すＳ．アガラクティエ配列のアミノ酸３１〜８７をコードし、Ｓ．ウベリスＣＡＭＰのＬｅｕ９０及びＬｙｓ９１残基をコードする配列間にクローン化されたＤＮＡを含む。
【０１６８】
それぞれ、Ｓ．アガラクティエ及びＳ．ウベリスから得たＣＡＭＰコード遺伝子ｃｆｂ［Podbielski et al.(1994) Med. Microbiol. Immunol. 第１８３号 ２３９〜５６頁］及びｃｆｘ［Jiang et al.(1996) Microbiol. Path. 第２０号 ２９７〜３０７頁］の公にされたヌクレオチド配列を使用してＰＣＲプライマー（表５に示す）を設計し、キメラＣＡＭＰコード遺伝子ｃａｍｐ−３の構築を可能にした。ｃｆｘのアミノ酸残基３０〜９０をコードするＰＣＲ断片を、プライマーＣＡＭＰ−１及びＣＡＭＰ−２で増幅した。ＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩ制限部位をコードされているプライマーを使用し、（ＯｍｐＦ末端コード配列を含み、ＯｍｐＦ融合蛋白質の大腸菌細胞表面への輸送を指揮する）発現ベクターｐＡＡ５５６ａ中に断片をクローン化し、得られた構築体をｐＰｏｌｙＣＡＭＰ−１と名付けた。ｃｆｂの残基３１〜８７をコードする第２のＰＣＲ断片を、プライマーＣＡＭＰ−３及びＣＡＭＰ−４で増幅し、ＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ部位を使用し、ｐＰｏｌｙ−ＣＡＭＰ−１中にクローン化してｐＰｏｌｙＣＡＭＰ−２を得た。最後に、ｃｆｘの残基９１〜２５８をコードする第３のＰＣＲ断片を、プライマーＣＡＭＰ−５及びＣＡＭＰ−６で増幅し、Ｅｃｏ４７−３及びＮｃｏＩで消化した。この断片をＳｔｕＩ／ＮｃｏＩで消化したｐＰｏｌｙＣＡＭＰ−２にクローン化し、得られた構築体ｐＰｏｌｙＣＡＭＰ−３に、算出Ｍｒが３４，９５６Ｄａ及びｐＩが５．５の蛋白質３１７ａａをコードするキメラ遺伝子ｃａｍｐ−３を含めた。この蛋白質は、ＬｉｐｏＦシグナル配列に融合されたＣＡＭＰ−３キメラである。ＣＡＭＰ−３構築体は、プライマー５５６−１及び５５６−２を使用し両方向に配列決定した。キメラ構築体のＤＮＡ配列は、ＡＢＩ３７３ＤＮＡ自動シーケンサ（Applied Biosystems）を使用し決定した。ＣＡＭＰ−３キメラのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を図８ＤＮＡ位置７９〜９４２（アミノ酸位置２７〜３１４）に示す。ヌクレオチド位置１〜７８（アミノ酸位置１〜２６）は、ＬｉｐｏＦシグナル配列を示す。
【０１６９】
次のワクチン研究用に、十分高純度の蛋白質を得るために、ｐＰｏｌｙＣＡＭＰ−３のｃａｍｐ−３領域を含み、ＯｍｐＦシグナル配列を欠く、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ断片を、ＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩで消化して、ある発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国ウィスコンシン州マディソン）にクローン化した。ＰＣＲ生成物をこの部位へクローニングすると、ＣＡＭＰコード配列のヘキサヒスチジル（６×Ｈｉｓ）タグ用のインフレームコード配列が付加される。続いて生じる発現によってヒスチジンタグが結合した蛋白質が得られ、このタグによって金属キレートクロマトグラフィーを使用する非変性条件下での蛋白質の精製が可能となる。したがって、最終構築体プラスミドｐＥＴ−ＣＡＭＰ３は、（６×Ｈｉｓ）ＣＡＭＰ−３融合蛋白質をコードした。この構築体のＤＮＡ配列分析によって、ＣＡＭＰ−３ＯＲＦはヒスチジンタグをコードするペプチドには融合されていないが、その発現は依然としてＩＰＴＧによって制御されていたことが明らかになった。ポリエチレングリコール法［Kurien and Scofield (1995) BioTechniques、第１８号、１０２３〜１０２６頁］を使用し、又は先に述べた通り、滅菌蒸留水で細胞を繰り返し洗浄することによって上記大腸菌株を形質転換するために［Frohelich and Scott (1991) Gene、第１０８号、９９〜１０１頁］この構築体を使用した。
【０１７０】
【表５】
2005523704.tif 000007
2005523704.tif 000008
【０１７１】
ｐＥＴ−ＣＡＭＰ３を含むＢＬ２１（ＤＥ３）をＩＰＴＧ誘発した培養物のろ過ライセートをアニオン交換クロマトグラフィーにかけることによって、ＣＡＭＰ−３蛋白質を精製した。４℃、６，０００×ｇ、１０分間の遠心分離によって細胞を回収し、０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄し、超音波処理によって分裂させた。可溶性画分容量は、２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）で６５０ｍｌに調整し０．２２ｍＭフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過した。ＸＫ２６／２０カラム中に、Ｑ−セファロース高速フロー陰イオン交換樹脂を床高１３ｃｍ（７０ｍｌカラム容量）まで詰めた。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５）で平衡化させ、蛋白質溶液を速度７ｍｌ／分間で通した。７．４カラム容量（ＣＶ）の緩衝液Ａでカラムを洗浄し、蛋白質を勾配緩衝液［０％緩衝液Ａ〜１２．８５ＣＶを超える５０％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）、３．６ＣＶの５０〜１００％緩衝液Ｂ、最後に１．７ＣＶの１００％の緩衝液Ｂ］で溶出させた。カラム溶出液を２６０ｎｍでモニタし、画分をＢＩＯＭＡＸ−３０Ｋフィルタで濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによる分析によって、ＣＡＭＰ−３蛋白質が初出液（breakthrough）及び緩衝液画分に溶出されたことを決定した。ＳＤＳ−ＰＡゲルのデンシトメトリから蛋白質の純度が＞６０％であることが推定された。
【実施例７】
【０１７２】
キメラＣＡＭＰ因子による乳分泌中のウシの免疫化及び攻撃
以下のように、キメラＣＡＭＰ因子、並びにＳ．ウベリス及びＳ．ディスガラクティエ由来の連鎖球菌蛋白質ＧａｐＣを含むワクチンの有効性を試験するための実験を乳分泌中のウシで行った。合計９９頭の乳分泌中のホルスタイン種ウシを、Ｓ．ウベリスの全細胞ＧａｐＣ及びＣＡＭＰに対する血清ＩｇＧが存在するかどうかスクリーニングした。プラセボ、Ｓ．ウベリスの（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ、Ｓ．ディスガラクティエの（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ、及びＣＡＭＰ−３をワクチン接種するために４群の８頭の動物を選択した。各ワクチン用量（２ｍｌ）には、１００ｍｇ／ｍｌの精製（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ、ＣＡＭＰ−３、又は抗原不含プラセボ（０．８５％（ｗ／ｖ）生理食塩水）、並びに３０％ＶＳＡ３［ＶＩＤＯ、カナダ国サスカチェワン州、Saskatoon、Van Drunen Little−Van Den Hurk et al.（１９９３）Vaccine、第１１号、２５〜３５頁］を含めた。ウシには、攻撃前３６日目（第０日）及び１５日目に首に２回の皮下注射を施した。攻撃前８日目に各乳房から得た乳試料を細菌の存在について分析し感染動物を試験から除外した。続いて、各群６頭のウシに攻撃を実施した。攻撃３時間前には、乳首を清浄な温湯で洗い乾かしアルコール消毒した。体細胞数算定（ＳＣＣ）及び細菌検査のために乳試料を採取した。左側乳房は、対照として未攻撃のまま残した。各動物の右側乳房に３ｍｌの接種原を乳房内注入によって投与した。この接種原には、３．０×１０７ｃｆｕ／ｍｌの指数関数相培養のＳ．ウベリスＳＵ２１（Animal Health Laboratory、カナダ国アルバータ州から得た臨床単離物）を懸濁させた０．８５％（ｗ／ｖ）生理食塩水を含んでいた。ＳＳＣ算定及び細菌検査用に攻撃後７日間毎日全乳房から乳試料を採取した。試料は全て、氷中貯蔵し採取から４８時間以内に分析した。動物の臨床評価には、直腸温度測定及び乳房腫脹（視診及び触診）を含めた。数値スコア１（正常）〜３．５（重篤な乳房炎）を各動物に割り当て、ワクチン群間の乳房炎の重症度を比較するための手段として使用した。凝塊の存在によって乳品質を評価した。
【０１７３】
攻撃前８日目（第２８日）及び攻撃後１１日目（第４７日）の１回目及び２回目のワクチン接種時に血清ＩｇＧタイターを定量した。同様に、第２１日及び第４３日に乳ＩｇＧタイターを定量した。第２１日及び第４７日に血清ＩｇＡタイターを定量し、第２１日及び第４３日に乳ＩｇＡタイターを定量した。丸底９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、ＣＡＭＰ−３、並びにＳ．ウベリス及びＳ．ディスガラクティエの（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ［１００ｎｇ／ウェル（炭酸塩緩衝液１００ｍｌ、ｐＨ９．６）］を用いて終夜４℃でコートし、３７℃で１時間２００ｍｌのＰＢＳＴｇでブロックした。１ウェルにつき１００ｍｌの試験試料を加えプレートを室温で２時間培養した。洗浄後、アルカリフォスファターゼをコンジュゲートしたヤギ抗ウシＩｇＧ（H & L、 Kirkegaard and Perry Labs. Inc.、米国メリーランド州 Gaithersburg）を加え（１００ｍｌ／ウェル）、プレートを室温で１時間培養した。プレートを洗浄し、１Ｍジエタノールアミン（ｐＨ９．８）及び０．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むｐ−ニトロフェニルリン酸塩を用いて１．５時間室温で培養後、アルカリフォスファターゼ活性を４０５ｎｍで検出した。
【０１７４】
乳を市販のレンニン溶液で以下のように処理した後、乳ＩｇＧ及びＩｇＡの定量を行った：１錠のレンネット（ＣＨＲ  ＨＡＮＳＥＮ）を４０ｍｌのＨ２Ｏに溶解し、この溶液０．１ｍｌを乳２ｍｌに添加し室温で４時間培養した。凝固したカゼインを３，０００×ｇで２０分間の遠心分離によってペレット化し、中間層を除去し（上層には脂肪が含まれていた）、血清試料について分析した。血清及び乳タイターをＯＤ４０５の最小二乗法による回帰と、血清を含まないウェルから得たＯＤ４０５での希釈対数との交差によって定量した。
【０１７５】
Pacific Milk Analysis Laboratory（カナダ国ブリティッシュコロンビア州 Chilliwak）で乳試料のＳＣＣの算定を行った。保存料を入れた１４ｍｌポリスチレン製丸底チューブ（Falcon）に試料を採取した。乳試料０．５ｍｌと固定液１０ｍｌ（０．２ｍｇ／ｍｌエオシン、３．３％ホルムアルデヒド溶液）を３０℃で１８時間混合することによってＳＣＣを固定した。試料を乳化電解質溶液（１２％エタノール、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１ＭのＮａＣｌ）で１／１００に希釈し８０℃で１０分間培養した。室温に冷却後、ＳＣＣをＣｏｕｌｔｅｒカウンタで定量した。経時的な処理間のＳＣＣの反復測定分散分析をＳＹＳＴＡＴ１０ソフトウェアパッケージ（SPSS Science、米国シカゴ）を使用し実施した。
【０１７６】
表６は、攻撃前後のタイターを示し、各投与群の全動物から得た血清タイター（括弧は標準偏差）の自然対数形質転換値の計算手段として表される。ワクチン接種前、（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣに対して検出可能な血清ＩｇＧタイターを示したのは４頭の動物だけだった。ワクチン接種後、（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣをワクチン接種した動物は全て、血清及び乳の抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ  ＩｇＧタイターで著しい上昇が示され、このタイターは終始、対照動物より少なくとも１０倍は高く維持されたが、ＣＡＭＰ−３によりワクチン接種した動物の抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ  ＩｇＧタイターは対照群のタイターと類似した。乳中の抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ  ＩｇＧタイターは、血清の相当値より一貫して低かった。しかし、攻撃直前では、対照及びＣＡＭＰ−３ワクチン接種動物と比較して、（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣワクチン接種動物で血清及び乳のＩｇＧタイターが上昇したことは明らかであった。血清の抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ  ＩｇＡ濃度は、攻撃前全群で検出可能であったが、攻撃後は著しく上昇した。ＣＡＭＰ−３によりワクチン接種した群でさえ血清抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ  ＩｇＡタイターの上昇が見られたが、これはＳ．ウベリス攻撃細菌の細胞表面随伴ＧａｐＣに曝露された結果として生じた可能性が最も高かった。ＣＡＭＰ−３ワクチン接種動物では、抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ乳ＩｇＧタイターでも攻撃後上昇が観察されたが、血清ＩｇＧタイターでは相応する上昇は観察されなかった。血清とは対照的に、攻撃前後、乳抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ  ＩｇＡは事実上全群で検出不可能であった。
【０１７７】
ＣＡＭＰ−３によるウシのワクチン接種後、対照及び（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣワクチン接種動物のタイターと比較して、血清及び乳の抗ＣＡＭＰ  ＩｇＧタイターに顕著な上昇があった。さらに、抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ  ＩｇＧタイターとは対照的に、抗ＣＡＭＰ−３タイターは攻撃後上昇したが、（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣのタイターはわずかに減少した。原因は不明であるが、以下の観察は全ワクチン群を通して一貫していた：攻撃後血清抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ  ＩｇＧタイターは、減少したことが判明したが、相応する乳のタイターは上昇した（Ｓ．ディスガラクティエ（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣをワクチン接種した群を除く）。攻撃前、血清抗ＣＡＭＰ−３ＩｇＡタイターは、同時に定量した同等の血清抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣタイターよりも高く（第２１日）、攻撃後血清試料を採取した時点では、抗ＣＡＭＰ−３ＩｇＡ濃度は全群で上昇し、ＣＡＭＰ−３によりワクチン接種した群で最も著しかった。それに反して、攻撃前後乳抗ＣＡＭＰ−３ＩｇＡタイターは、事実上検出不可能であった。
【０１７８】
Ｓ．ウベリスＳＵ２１での攻撃後、どの時点でも、どんな動物、ワクチン接種した動物又はしなかった動物からも細菌は回収されなかった。これは、以前の研究［Finch et al. (1994) Infect.Immun. 第６２号 ３５９９〜３６０３頁］の結果と一致し、攻撃後熱滅菌したＳ．ウベリスによりワクチン接種した乳牛からは細菌は単離されなかったが、ワクチン接種していない対照動物からは細菌は単離された。現在の研究では、接種原投与動物は、持続的な感染を引き起こすこともなく、ワクチン接種していない動物でさえ乳房炎の誘発を十分低くすることができる。しかし、回収可能な細菌がなかったにも関わらず、動物はまさに臨床的な疾患の徴候を示し、ＳＣＣは炎症が生じたことを示した。したがって、攻撃は成功したと見なされた。ワクチン群間では、直腸温度に著しい差異は観察されず、臨床スコアによって感染重症度に著しい差異がなかったことが決定された。どの動物でも乳収量に変化は観察されず、乳品質は以下に記載した通り全群でわずかに影響を受けた。
【０１７９】
ウシ乳房は、結合していない乳房からなり、Ｓ．ウベリスで２個の乳房だけを攻撃することによって各動物に内部対照を準備した。図９は、特定のワクチン群ごとの試行を通じてのＳＣＣを示す。初期の分析では、報告された対照群のＳＣＣは多少変動を見せたが、全般的な関係では、時間の経過につれてＳＣＣは上昇をし、２次式（ｐ＝０．０２）によって説明された。攻撃２日後、対照群のＳＣＣは顕著に上昇して４日後に最高濃度に達した。次いで、攻撃７日後までにＳＣＣは再度顕著に上昇する前にわずかに減少した。Ｓ．ウベリスによる乳分泌中のウシの攻撃後、多少不安定なこの傾向は別の箇所で報告したＳＣＣ値と一致している［Finch et al. (1997) Vaccine、第１５号、１１３８〜１１４３頁、Finch et al. (1994) Infect. Immun. 第６２号 ３５９９〜３６０３頁］。Ｓ．ディスガラクティエ（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣワクチン接種動物のＳＣＣは、攻撃直後に急激に上昇して３日目に最高に達した後、試行の残りの期間にわたって不安定に減少した。とはいえ、攻撃４日以後の明らかな相違にも関わらず、どの時点でもＳＣＣの減少において対照群のＳＣＣとは統計学的に有意な誤差はなかった。この結果は、Ｓ．ディスガラクティエ（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣがＳ．ウベリスの（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣほど防御的ではないからであろう。
【０１８０】
Ｓ．ウベリス（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣによるワクチン接種は、対照群と比較してＳＣＣを著しく減少させた。３日目以降、この群のＳＣＣは対照群のＳＣＣよりも統計学的に有意に低かった（ｐ値は攻撃後３日目０．０２３、４日目０．００１、５日目０．０１１、６日目０．００６、及び７日目０．０００）。ＣＡＭＰ−３抗原によりワクチン接種したウシのＳＣＣは、Ｓ．ウベリス（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣワクチン接種動物のＳＣＣよりもわずかに高かったが、そのＳＣＣは依然として対照群のＳＣＣより明瞭に低かった。対照及びＣＡＭＰ−３ワクチンを接種した群のＳＣＣを比較することによって、統計学的に有意な誤差が攻撃後３日目（ｐ値０．０３３）、６日目、及び７日目（それぞれ、ｐ値は０．０３２及び０．０４６）に明らかになったが、たとえこの日数でＣＡＭＰ−３ワクチン接種した群でＳＣＣが明らかに低くても４日目及び５日目に有意な誤差なかった。
【０１８１】
ＳＵ２１で攻撃後、乳品質が影響を受け続けた時間はワクチン群間で変化した。攻撃後、対照群、Ｓ．ディスガラクティエ（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣワクチン接種群、ＣＡＭＰ−３ワクチン接種群、及びＳ．ウベリス（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣワクチン接種群の乳品質は、それぞれ、合計２１日、２４日、１１日、及び９日低下した。このデータによれば、Ｓ．ディスガラクティエ（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣをワクチン接種した群の乳房炎は、悪くないにしても、対照群の乳房炎と同程度に重篤であった。これに反して、Ｓ．ウベリス（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣによるワクチン接種は乳品質の低下を完全には防げなかったが、乳品質が影響を受けていた期間を著しく短縮した。ＣＡＭＰ−３によるワクチン接種も乳品質が低下していた期間を短縮したように見えたが、Ｓ．ウベリス（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ群ほどではなくこれはＳＣＣの結果と一致する。
【０１８２】
【表６】
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【０１８３】
したがって、免疫原性ＣＡＭＰ因子が、その製造及び使用方法と同様に開示されている。本発明の好ましい実施形態を一部詳細に記載しているが、添付の特許請求の範囲によって定義した本発明の精神及び範囲から逸脱することなしに明白な変更を行うことができることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】組換えプラスミドｐＪＬＤ２１、並びにｐＪＬＤ２１−１及びｐＪＬＤ２１−２と称するそのサブクローンの制限酵素マップを示す図である。線が、Ｓ．ウベリス挿入ＤＮＡを示す一方で、四角は、ベクターｐＴＺ１８Ｒの多数のクローニング部位を示す。組換えプラスミドｐＪＬＤ２１及びその派生したサブクローンのＣＡＭＰ活性を右側に示す（＋、ＣＡＭＰ反応陽性：−、ＣＡＭＰ反応陰性）。水平な小矢印は、配列決定実験の開始点及び方向を示す。サザンブロット実験に使用するプローブ断片を大矢印で示す。下部の棒は、Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子遺伝子の読み枠の位置を示す（ｃｆｕ）。
【図２】Ｓ．ウベリスＣＡＭＰ因子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列（配列番号１及び２）を示す図である。ヌクレオチドの位置を左側に示し、他方アミノ酸の位置を右側に示す。図のアミノ酸１〜３０でシグナルペプチドが生じ、成熟ペプチドはアミノ酸位置３１〜２５８によって表される。
【図３】Ｓ．アガラクティエＣＡＭＰ因子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列（配列番号３及び４）を示す図である。ヌクレオチド位置左側にを示し、他方アミノ酸位置を右側に示す。図のアミノ酸１〜２９でシグナルペプチドが生じ、成熟ペプチドはアミノ酸位置３０〜２５５によって表される。
【図４】Ｓ．アガラクティエ（配列番号４）ＣＡＭＰ蛋白質とＳ．ウベリス（配列番号２）ＣＡＭＰ蛋白質の間の相同性を示す図である。コンセンサス配列（配列番号５）も示す。Ｓ．アガラクティエ（ＡｇａｌＣＡＭＰ）ＣＡＭＰ蛋白質及びＳ．ウベリス（ＵｂｅｒＣＡＭＰ）ＣＡＭＰ蛋白質の公にされている配列の並びをＰｉｌｅＵｐで生成し、Ｐｒｅｔｔｙソフトウェア（Canadian Bioinformatics Resource社製SeqWeb sequence analysis package、バージョン１．１によって提供されたGCG Wisconsin Packageのコンポーネント、バージョン１０）で表示した。コンセンサス配列を整列した蛋白質の下に示す。残りは上に番号を付す。波線は、異なる大きさの蛋白質を修正するためにアルゴリズムによって加えられたスペースを示す。点は、整列した配列間の切れ目を示す。コンセンサス配列のダッシュは非同一残基を示す。整列に使用するパラメータ：比較表：ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ重量：８及びＧａｐ長重量：２．成熟配列の開始を矢印で示す。整列した配列は、約６９％配列類似性及び６３％配列相同性を示す。図に示すＳ．ウベリス配列のアミノ酸残基１〜３０は、シグナル配列を示し、他方Ｓ．アガラクティエ配列のアミノ酸残基１〜２９はシグナル配列を示す。
【図５】ｐＧＨ−ＣＡＭＰの構築を示す図である。プラスミドが派生した各クローンのＣＡＭＰ反応を図の右に示す：＋は陽性反応を示し、−は陰性反応を示す。白四角はｐＴＺｌ８Ｒを示し、線影の四角はｐＧＨ４３３を示す。
【図６】Ｓ．アガラクティエＣＡＭＰ因子（図６Ａ、配列番号６）及びＳ．ウベリスＣＡＭＰ因子（図６Ｂ、配列番号７）の推定上シグナル配列を示す図である。Ｓ．アガラクティエ及びＳ．ウベリスＣＡＭＰ蛋白質の予想されるシグナルペプチダーゼＩ切断部位（＾によって示す）を示す。２つのＣＡＭＰ蛋白質ごとのシグナルペプチドの確率スコア及び長さも示す。ＧＣＧソフトウェアパッケージのＳＰＳｃａｎアルゴリズムによって配列を分析した。
【図７】ＣＡＭＰ−３キメラを構築するために使用したプラスミドを示す図である。中間生成物及び最終プラスミドを示す。プラスミドごとに関連の遺伝子の制限酵素、位置、及び配向を示す。これらのプラスミドの構築は、実験の節で説明する。
【図８】ＬｉｐｏＦのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列：ＣＡＭＰ３キメラ（配列番号８及び９）を示す図である。ＬｉｐｏＦシグナル配列に融合させたＣＡＭＰ−３キメラのヌクレオチド及び蛋白質配列を示す。ヌクレオチドは、図の左側に番号を付し、他方アミノ酸残基は右側に番号を付す。下線配列は、ＬｉｐｏＦシグナル配列を表す。スペーサアミノ酸は、位置８７、１４５及び１４６にある。
【図９】実施例に記載したように、攻撃７日後、ウシ群のＳ．ウベリスで攻撃した乳房の幾何平均ＳＣＣ（プラス１標準偏差）を示す図である。データセットは、第０日（最も左の棒）、第１日（左から２本目の棒）、第２日（左から３本目の棒）、第３日（左から４本目の棒）、第４日（左から５本目の棒）、第５日（左から６本目の棒）、第６日（左から７本目の棒）、及び第７日（左から８本目の棒）に対応する。図の見かけに関わらず、攻撃後、７日目及び８日目のＳ．ディスガラクティエ（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣワクチン接種動物のＳＣＣ、及び４日目及び５日目のＣＡＭＰ−３ワクチン接種動物のＳＣＣと対照のＳＣＣには統計学的に有意な誤差はなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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