(57)【要約】水溶性ポリマーおよびその誘導体を含む一つまたは複数の添加物を、ポリオール由来のテトラアルコキシシランを含むゾルに加えることにより、ケイ質材料を調製する。ポリマーは、伸長中のシリカゲルマトリックスの相分離を容易にし、室温で硬化が起こる、高い表面積自己支持性シリカゲルを生じる。この材料は、収縮性も著しく低減されている。
2005536625.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケイ質材料の調製法であって、有機ポリオールシラン前駆体と添加物（添加物は一つまたは複数の水溶性ポリマーおよび一つまたは複数の式Iの三官能性シラン：
2005536625.tif 000047
（式中、R1、R2およびR3は同じまたは異なっていて、通常のゾル-ゲル条件下で加水分解されてSi-OH基を提供することができる基を表し；R4は通常のゾル-ゲル条件下で加水分解されない基である）からなる群より選択される）とを、前駆体のケイ質材料への加水分解および縮合に適した条件下で混合する段階を含む方法。
【請求項２】
添加物が、ポリエーテル、ポリアルコール、多糖、ポリ(ビニルピリジン)、ポリ酸、ポリアクリルアミド、およびポリアリルアミンからなる群より選択される水溶性ポリマーである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
添加物が、ポリエチレンオキシド（PEO)、ポリエチレングリコール（PEG)、末端がアミノであるポリエチレングリコール（PEG-NH2）、ポリプロピレングリコール（PPG)、ポリプロピレンオキシド（PPO)、ポリプロピレングリコールビス(2-アミノ-プロピルエーテル)（PPG-NH2）、ポリビニルアルコール、ポリ(アクリル酸)、ポリ(ビニルピリジン)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)（ポリNIPAM）、およびポリアリルアミン（PAM）からなる群より選択される水溶性ポリマーである、請求項2記載の方法。
【請求項４】
添加物が、PEO、PEO-NH2、PEG、PPG-NH2、ポリNIPAM、およびPAMからなる群より選択される水溶性ポリマーである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
添加物が、PEO、PEO-NH2、およびポリNIPAMからなる群より選択される水溶性ポリマーである、請求項3記載の方法。
【請求項６】
添加物が水溶性ポリマーの混合物である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
水溶性ポリマーの混合物がPEOおよびPEO-NH2を含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
添加物がPEOである、請求項5記載の方法。
【請求項９】
PEOが約10,000g/molよりも大きい分子量を有する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
PEOを最終溶液1mLあたり約0.005gよりも高い濃度で用いる、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
添加物がPEO-NH2である、請求項5記載の方法。
【請求項１２】
PEO-NH2が約3,000g/molよりも大きい分子量を有し、これを最終溶液1mLあたり約0.005gの濃度で用いる、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
水溶性ポリマーがポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)である、請求項5記載の方法。
【請求項１４】
ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)が約10,000g/molの分子量を有し、これを最終溶液1mLあたり約0.005gの濃度で用いる、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
一つまたは複数の添加物が式Iの化合物である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
OR1、OR2およびOR3は同じまたは異なっていて、有機モノ、ジ、またはポリオール由来である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
OR1、OR2およびOR3は同じまたは異なっていて、糖アルコール、糖酸、糖類、オリゴ糖、および多糖由来である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
OR1、OR2およびOR3は同じまたは異なっていて、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、トレオース、エリトロース、グリセルアルデヒド、ソルボース、フルクトース、デキストロース、レブロース、ソルビトール、スクロース、マルトース、セロビオース、ラクトース、デキストラン、（500〜50,000 MW）、アミロース、ペクチン、グリセロール、プロピレングリコール、およびトリメチレングリコール由来である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
OR1、OR2およびOR3は同じまたは異なっていて、グリセロール、ソルビトール、マルトース、トレハロース、グルコース、スクロース、アミロース、ペクチン、ラクトース、フルクトース、デキストロース、およびデキストラン由来である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
OR1、OR2およびOR3は同じまたは異なっていて、グリセロール、ソルビトール、マルトース、およびデキストラン由来である、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
OR1、OR2およびOR3は同じまたは異なっていて、C1-4アルコキシ、アリールオキシ、およびアリールアルキレンオキシから選択される、請求項15記載の方法。
【請求項２２】
OR1、OR2およびOR3は同じまたは異なっていて、C1-4アルコキシ、フェニオキシ、ナフチルオキシ、およびベンジルオキシから選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
OR1、OR2およびOR3は同じまたは異なっていて、C1-4アルコキシから選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
OR1、OR2およびOR3が全てエトキシである、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
R4が下記の群の一つから選択される、請求項15〜25のいずれか一項記載の方法：
2005536625.tif 000048
（式中、nは0〜1である）。
【請求項２６】
ポリオールが、有機モノ、ジ、またはポリオールである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
ポリオールが、糖アルコール、糖酸、糖類、オリゴ糖、および多糖からなる群より選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
ポリオールが、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、トレオース、エリトロース、グリセルアルデヒド、ソルボース、フルクトース、デキストロース、レブロース、ソルビトール、スクロース、マルトース、セロビオース、ラクトース、デキストラン、（500〜50,000 MW）、アミロース、ペクチン、グリセロール、プロピレングリコール、およびトリメチレングリコールからなる群より選択される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
ポリオールが、グリセロール、ソルビトール、マルトース、トレハロース、グルコース、スクロース、アミロース、ペクチン、ラクトース、フルクトース、デキストロース、およびデキストランからなる群より選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
ポリオールが、グリセロール、ソルビトール、マルトース、およびデキストロースからなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
ポリマーが水溶性ポリマーである、請求項25記載の方法。
【請求項３２】
ポリマーが、ポリエチレンオキシド（PEO)、ポリエチレングリコール（PEG)、末端がアミノであるポリエチレングリコール（PEG-NH2）、ポリプロピレングリコール（PPG)、ポリプロピレンオキシド（PPO)、ポリプロピレングリコールビス(2-アミノ-プロピルエーテル)（PPG-NH2）、ポリビニルアルコール、ポリ(アクリル酸)、ポリ(ビニルピリジン)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)（ポリNIPAM）、およびポリアリルアミン（PAM）からなる群より選択される、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
水溶性ポリマーが、PEO、PEO-NH2、PEG、PPG-NH2、ポリNIPAM、およびPAMからなる群より選択される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
ポリマーがPEOである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
リンカーが、C1-20アルキレン、C1-20アルケニレン、有機エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、アミド、ウレタン、炭酸塩、および尿素からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項３６】
式Iの化合物が下記からなる群より選択される、請求項25記載の方法：
グルコンアミドSi（化合物1）；
マルトンアミドSi（化合物2）；
デキストロンアミドSi（化合物3）；
(CH2CH2O)p[(EtO)3Si(C3H6)]2、pは約4〜5、平均MW 200（化合物5a）；
(CH2CH2O)p[(EtO)3Si(C3H6)]2、pは約13、平均MW 600（化合物5b）；
(CH2CH2O)p[(EtO)3Si(C3H6)]2、pは約44、平均MW 2000（化合物5c）；および
(CH2CH2O)p[(EtO)3Si(C3H6)]2、pは約227、平均MW 10,000（化合物5d）。
【請求項３７】
有機ポリオールシラン前駆体が、ジグリセリルシラン（DGS）、モノソルビチルシラン（MSS）、モノマルトシルシラン（MMS）、ジマルトシルシラン（DMS）、およびデキストラン系シラン（DS）からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３８】
前駆体のケイ質材料への加水分解および縮合に適した条件が、水溶液中、溶解を助けるために超音波処理をしてもよい、約4〜11.5の範囲のpHを含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
低い収縮特性を有するケイ質材料の調製法であって：
（a）一つまたは複数の式Iの化合物：
2005536625.tif 000049
（式中、R1、R2およびR3は同じまたは異なっていて、通常のゾル-ゲル条件下で加水分解されてSi-OH基を提供することができる基を表し；R4は通常のゾル-ゲル条件下で加水分解されない基である）の水溶液を有機ポリオールシラン前駆体の水溶液と混合する段階と；
（b）（a）の溶液のpHを約4〜11.5に調節する段階と；
（c）（b）の溶液をゲル化させる段階と；
（d）（c）のゲルをエージングさせる段階と；
（e）エージングしたゲルを風乾する段階とを含む方法。
【請求項４０】
請求項1〜39のいずれか一項記載の方法を用いて調製されるケイ質材料。
【請求項４１】
モノリシックシリカ材料の調製法であって、有機ポリオールシラン前駆体を、水溶性ポリマーおよび式Iの化合物：
2005536625.tif 000050
（式中、R4はポリマー-(リンカー)n-および
2005536625.tif 000051
から選択される基である）から選択される一つまたは複数の添加物と、ゲル化前に相転移が起こる条件下で混合する段階を含む方法。
【請求項４２】
R4が
2005536625.tif 000052
である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
リンカー基がC1-4アルキレン基であり、nが1である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
OR1、OR2およびOR3は同じで、C1-4アルコキシから選択される、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
ポリマーがPEOである、請求項42記載の方法。
【請求項４６】
式Iの化合物が下記からなる群より選択される、請求項41記載の方法：
(CH2CH2O)p[(EtO)3Si(C3H6)]2、pは約4〜5、平均MW 200（化合物5a）；
(CH2CH2O)p[(EtO)3Si(C3H6)]2、pは約13、平均MW 600（化合物5b）；
(CH2CH2O)p[(EtO)3Si(C3H6)]2、pは約44、平均MW 2000（化合物5c）；および
(CH2CH2O)p[(EtO)3Si(C3H6)]2、pは約227、平均MW 10,000（化合物5d）。
【請求項４７】
水溶性ポリマーが、PEO、PEO-NH2、およびポリ(NIPAM)からなる群より選択される、請求項41記載の方法。
【請求項４８】
請求項41〜47のいずれか一項記載の方法を用いて調製される、二峰性メソ/マクロ孔シリカモノリス。
【請求項４９】
ケイ質材料の調製法であって、有機ポリオールシラン前駆体、目的の生体分子、および添加物（添加物は一つまたは複数の水溶性ポリマーおよび一つまたは複数の式Iの三官能性シラン：
2005536625.tif 000053
（式中、R1、R2およびR3は同じまたは異なっていて、通常のゾル-ゲル条件下で加水分解されてSi-OH基を提供することができる基を表し；R4は通常のゾル-ゲル条件下で加水分解されない基である）からなる群より選択される）を、前駆体のケイ質材料への加水分解および縮合に適した条件下で混合する段階を含む方法。
【請求項５０】
その中に取り込まれた生体分子を含むケイ質材料であって、請求項49記載の方法を用いて調製されるケイ質材料。
【請求項５１】
ケイ質材料中に封入されている活性生体物質と反応する、またはその反応が活性生体物質によって触媒される試験物質の定量的または定性的検出法であって：（a）請求項49記載の方法を用いて多孔性シリカマトリックス内に取り込まれた活性生体物質を含むケイ質材料を調製する段階と；
（b）生体物質含有ケイ質材料を試験物質を含むガスまたは水溶液と接触させる段階と；
（c）ケイ質材料中に取り込まれた生体物質の一つまたは複数の特徴の変化を定量的または定性的に検出、観察、または測定する、あるいは、試験物質の一つまたは複数の特徴の変化を定量的または定性的に検出、観察、または測定する段階とを含む方法。
【請求項５２】
取り込まれた生体物質の一つまたは複数の特徴の変化を、UV、IR、可視光、蛍光、ルミネセンス、吸収、発光、励起、および反射からなる群より選択される一つまたは複数の技法を用いて、分光法により定性的または定量的に測定する、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
生物学的に活性な生体物質をシリカマトリックス中に保存する方法であって、生体物質は活性蛋白質または活性蛋白質断片であり、シリカマトリックスは請求項49記載の方法を用いて調製される方法。
【請求項５４】
モノリシックシリカクロマトグラフィーカラムの調製法であって、有機ポリオールシラン前駆体、ならびに水溶性ポリマーおよび式Iの化合物：
2005536625.tif 000054
（式中、R4はポリマー-(リンカー)n-および
2005536625.tif 000055
から選択される基である）から選択される一つまたは複数の添加物を含む溶液を、ゲル化前に相転移が起こるのに適した条件下でカラムに入れる段階を含む方法。
【請求項５５】
溶液が、非選択的相互作用を低下させるために、シリカのアニオン電荷を平衡させるカチオン部位を提供する、一つまたは複数の物質をさらに含む、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
有機ポリオールシラン前駆体、ならびに水溶性ポリマーおよび式Iの化合物：
2005536625.tif 000056
（式中、R4はポリマー-(リンカー)n-および
2005536625.tif 000057
から選択される基である）から選択される一つまたは複数の添加物を、ゲル化前に相転移が起こる条件下で混合することにより調製されるシリカモノリスを含む、クロマトグラフィーカラム。
【請求項５７】
その中に取り込まれた活性生体分子を有するモノリシックシリカカラムの調製法であって：
a）ポリオール-シラン由来シリカ前駆体と；
b）水溶性ポリマーおよび式Iの化合物：
2005536625.tif 000058
（式中、R4はポリマー-(リンカー)n-および
2005536625.tif 000059
から選択される基である）から選択される一つまたは複数の添加物と；
c）生体分子とを、ゲル化前に相分離が起こる条件下で混合する段階を含む方法。
【請求項５８】
添加物が一つもしくは複数の水溶性ポリマーまたは式Iの化合物（式中、R4は
2005536625.tif 000060
である）である、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
有機ポリオールシランシリカ前駆体、一つまたは複数の添加物、および生体分子を、非選択的相互作用を低下させるためのシリカのアニオン電荷を平衡させるカチオン部位を提供する物質、例えばアミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）、PAM、PPG-NH2、およびPEG-NH2とも混合する、請求項57記載の方法。
【請求項６０】
請求項57記載の方法を用いて調製されるクロマトグラフィーカラム。
【請求項６１】
イムノアフィニティークロマトグラフィー、試料の浄化、分析物の固相抽出または予備濃縮、不要な混入物の除去（例えば、抗体結合による）、固相触媒作用、およびフロンタルアフィニティークロマトグラフィー（質量スペクトル検出ありまたはなしで）のための方法における、請求項59記載のカラムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生体分子適合性ケイ質材料の調製法、これらの方法を用いて調製されるケイ質材料、およびケイ質材料の使用、特にクロマトグラフィー支持体として、バイオセンサーとして、および/または酵素を固定化するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
（a）クロマトグラフィー支持体としてのシリカの利用
様々な微粒子体のシリカは、クロマトグラフィー支持体として広く利用されてきた。溶解した分子の親水性ケイ質表面と流動性溶媒との間の分配によって、多くの異なる規模（ngからkg規模）の化合物の分離が可能になる。これらのシステムにおける分離の効率は、化合物混合物が曝露されるシリカの表面積に関係する。
【０００３】
一般的分離システムの構造は、ガラス、金属、またはポリマー被覆内の微粒子シリカの円柱床を用いている。そのようなシステムによる分離効率（理論段）を改善するための伝統的アプローチは、所与の粒径（または粒径範囲）の微粒子シリカのより長いカラムを用いることである。または、より高い分離効率は、表面積が大きい、非常に小さい粒子の使用に関係する。
【０００４】
充填微粒子システムによる実用的分離には重要な物理的制限がある。理論段数が増えるにつれ、カラム上の背圧が付随して高まる。したがって、高い分離効率と実用的操作圧との間にはトレードオフが存在する。高圧には危険が伴い、かつ/またはコストの視点から非実用的である。高圧ではたらく効率の高いカラムでも、実現することができる処理量は比較的低いことが多い1。
【０００５】
自己支持モノリシックシリカカラムの使用により、表面積/背圧の関係における顕著な改善を実現することができる1,2。例えば、スチレンモノリスはポリヌクレオチドの分離に有用であることが報告されている3。特に、Tanakaらはシリカモノリスの調製を報告している4。Merckは現在、商標Chromolithとしてモノリスシリカカラムを販売している5。これらのモノリスの構造は、シリカ層によって溶融された一連のゆがんだシリカ球を含む。顕微鏡分析によって、結合した直径数ミクロンのシリカビーズの間にマクロ孔の存在をはっきり見ることができ、他の方法でさらに注意深く立証することができる。マクロ孔に加えて、シリカビーズは典型的に、メソ孔構造を有している（Merckカラムの場合、全多孔度80％とされており、これはマクロ孔とメソ孔からなり、メソ孔とはおよそ直径13nmである）5。
【０００６】
（b）既存のモノリシックシリカに伴う問題
ゾル-ゲル法によって生成したシリカは収縮しやすい。ゲル化は大量の溶媒や、しばしば他のドーピング剤存在下で開始する（下記参照）。溶媒の蒸発には著しい収縮力が伴う：Si(OEt)4由来ゲルは空気中で85％まで収縮することがある6。これは、得られたシリカをクロマトグラフィー支持体として用いる場合には、いくつかの状態で問題となりうる。第一に、極端な条件では、カラムが破損し、分離性能の変化/劣化を起こすことがある。第二に、モノリスが被覆材料から引き離され、分離する化合物に別の溶出路を提供することもある。これは、最も良くて、分離を複雑にする。最悪の場合、溶出混合物はカラム表面積の大部分を迂回し、まったく分離されないことになる。
【０００７】
収縮の問題を減らすために、いくつかの戦略が開発されている。例えば、DMFなどの、元のゾル中の「乾燥物質」が、シリカの焼きなまし工程で役に立つ7。収縮に対処する最も一般的な手段は、収縮が起こることを受け入れ、シリカを、基本的には完了するまで、熱硬化させることである。シリカを溶解/再沈殿させるために熱水処理を用いることができ、これにより収縮時によく見られる亀裂が減少する8,9。ゾル中の尿素のようなドーピング剤は溶解/再沈殿過程を促進することが報告されている10。別の戦略は、収縮が起こった後にカラムの被覆を熱収縮させ、モノリスと被覆材料との間の有効界面を修正することである。最後に、ポリ(エチレンオキシド)などの可溶性ポリマーをゾルに加えてもよい。これらはモノリスの多孔度を高める効果がある11。
【０００８】
ゾル-ゲル法の使用により、シリカの調製における非常にすぐれた形態制御が可能になる。したがって、様々な出発原料、反応条件およびドーピング剤を用いることにより、全多孔度、細孔のサイズおよび形状、細孔分布の規則性などを操作することができる12。しかし、これらの条件の多くは、生体分子、特に蛋白質などの脆弱な化合物の取り込みには不適合である。合成条件が蛋白質構造に損傷を与える（例えば、pH条件、エタノールなどの変性剤の存在）か、または最終の硬化条件が高温を必要とする。そのような生体分子をシリカに取り込んでバイオセンサー、固定化酵素、またはアフィニティークロマトグラフィー支持体として役立つ材料を作ることは興味が持たれる。
【０００９】
（c）バイオアフィニティークロマトグラフィーへのモノリシックシリカの適用
バイオアフィニティークロマトグラフィーは、試料の精製および浄化（cleanup）13、キラル分離14、蛋白質のオンライン蛋白分解消化15、支持された生体触媒の開発16、ならびに最近ではフロンタルアフィニティークロマトグラフィー法による化合物ライブラリのスクリーニング17,18のために広く用いられている。どの場合にも、蛋白質充填カラムを調製するために用いる主な方法は、蛋白質のシリカビーズへの共有結合または親和性結合に基づいていた。しかし、蛋白質のビーズへの結合は下記を含むいくつかの制限を有している：結合による活性消失（蛋白質の配向および立体配座に対する制御が弱いため）、低い表面積、背圧が高い可能性があること（これによりKd値が変わることがある）、口径が狭いカラムへのビーズの充填が困難であること、非常に細いカラム（内径<50μm）への小型化が困難であること、および特に膜結合蛋白質を用いる場合には汎用性が低いこと18。
【００１０】
近年、非常に緩和で生体適合性のゾル-ゲル加工法を用いて、活性蛋白質を多孔性無機ケイ酸塩マトリックス内に取り込み可能であることが明らかにされている20。この方法では、蛋白質を含む緩衝溶液を加水分解したシリカゾルに加えて、蛋白質適合性条件下でゲル化を開始する、2段階加工法を用いる21。取り込まれた蛋白質の立体配座22,23,24、力学25,26,27、到達性24,28、反応動力学22,29、活性30、および安定性31などのそれらの基本的局面、ならびにそれらの触媒作用およびバイオセンサー機能20,21に対する多くの適用例の両方を記載している多くの報告が出されている。ゾル-ゲル系イムノアフィニティーカラム32、および酵素系カラム33について記載している、いくつかの報告もあるが、どの場合にもこれらは蛋白質をドープしたシリカモノリスを粉砕し、次いでバイオガラスをスラリーでカラムに充填することによって作られた。
【００１１】
蛋白質をドープしたモノリシックゾル-ゲルカラムの開発における非常に最近の研究が、Zusman34およびToyo'oka35らから発表されている。Zusmanらは、アフィニティークロマトグラフィーのための新しい支持体として、ゾル-ゲルガラスで覆ったガラス繊維を用いたカラムを開発した。Toyo'okaらは、蛋白質をドープしたゾル-ゲル系カラムの調製、および化合物の溶出の両方のためにキャピラリー電気クロマトグラフィー（CEC）を用いた。これらのモノリスはもっぱら非常に高い水：シリコン比を用いたTEOSまたはTMOSに由来しており、溶出剤の流動を可能にする、緩く充填された、大きい細孔を有するモノリスが得られた。これは顕著な進歩であるが、すべてのクロマトグラフィーを電気浸透流（CEC）を用いて行われており、これは電荷、質量およびアフィニティーの組み合わせに基づいて化合物を分離し、溶出剤のイオン強度が高いためにMS検出との適合性が低い。また、これらの著者は阻害剤の可能性があるものと、取り込まれた蛋白質とのカラム上での相互作用を調べていなかった。このことは、固定化酵素による高処理量スクリーニング（HTS）法の出現を考慮すると、特に重要な問題である17,18,36。
【００１２】
本発明者らは以前、一連の糖アルコール、糖酸またはオリゴおよび多糖由来シランからのシリカの調製を記載した6。これらの出発原料は、より古典的に用いられるテトラエトキシおよびテトラメトキシシラン（それぞれTEOSおよびTMOS）に比べていくつかの利点を提供する。その中には、ゾル中で用いるpHのより大きい制御（5.5〜11の範囲が可能）を含む緩和な条件、非常に低い処理温度、工程の再現性、収縮の低減および様々なドーピング剤、特に蛋白質の取り込みとの適合性がある。しかし、亀裂の進展を避けるために、得られたシリカの収縮を制御する必要が残っている。さらに、クロマトグラフィー、バイオセンサーなどを含む特定の適用のために材料を適応させることができるように、形態制御を可能にする必要がある。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
ケイ質材料が緩和な条件下で調製されているが、得られた材料は収縮の低減を示し、特定の条件下では二峰性メソ/マクロ孔構造を有するモノリスを生成する。そのような材料はクロマトグラフィー上の適用において有用であり、特に生体分子の連行に適している。
【００１４】
本発明者らは、特定の添加物が、以前、発明者らの同時係属中の特許出願S.N. PCT/CA03/00790に記載した有機ポリオール修飾シランから得たケイ質材料の形態を制御し、収縮を低減することを見いだしている6。例えば、二峰性メソ/マクロ孔モノリシックシリカ材料を、水溶性ポリマー（例えば、PEOおよびその誘導体）とポリオール由来シリカ前駆体とを、材料がゲル化する前に相転位、またはスピノダル分解が起こる条件下で混合することにより得た。相転位は前駆体/ポリマー溶液の濁度の増大によって特徴付けられる。さらに、三官能性シランを含むよう化学的に修飾された水溶性ポリマーを含む、特定の三官能性シランは、収縮性が劇的に低下したシリカを提供した。三官能性シランを含むよう化学的に修飾された水溶性ポリマーは、二峰性メソ/マクロ孔モノリシックシリカ材料も提供した。
【００１５】
したがって、本発明は、ケイ質材料の調製法であって、有機ポリオールシラン前駆体と添加物（添加物は一つまたは複数の水溶性ポリマーおよび一つまたは複数の式Iの三官能性シラン：
2005536625.tif 000003
（式中、R1、R2およびR3は同じまたは異なっていて、通常のゾル-ゲル条件下で加水分解されてSi-OH基を提供することができる基を表し；R4は通常のゾル-ゲル条件下で加水分解されない基である）からなる群より選択される）とを、前駆体のケイ質材料への加水分解および縮合に適した条件下で混合する段階を含む方法を含む。
【００１６】
本発明は、本発明の方法を用いて調製したケイ質材料、ならびに例えばクロマトグラフィー上の適用（特にマクロ孔材料による）における、バイオアフィニティー支持体として、バイオセンサーとして、および/または酵素を固定化するためであるが、これらに限定されることはない、これらの材料の使用も含む。さらに、本発明は、本発明の方法を用いて調製した材料を含む、分析用および他のタイプのハードウェア（例えば、クロマトグラフィーカラム、マイクロアレイ、バイオアフィニティーカラムなど）にも広がる。
【００１７】
ケイ質材料を本発明の方法を用いて調製する緩和な条件は、蛋白質および他の生体分子に適合性である。これは、様々な適用のために、これらのタイプの分子をこれらのケイ質材料に容易に取り込むことを可能にする。また、本発明の方法を用いて調製した材料の収縮は、TEOSまたはTMOS由来材料（ならびに以前に報告した6条件下で調製したポリオール-シラン由来材料）に比べて顕著に低減し、これは連行された生体分子により安定な環境を提供する。
【００１８】
本発明者らは、本発明の方法を用いて、生体分子適合性、二峰性メソ/マクロ孔シリカ材料も開発した。これらの材料は蛋白質取り込みのために用いることができ、圧力駆動液体クロマトグラフィーに適し、かつMS検出に適合性の、これらの材料によるキャピラリーカラムを調製しうることが示されている。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明を読めば明らかになると思われる。しかし、この詳細な説明から、当業者であれば本発明の精神および範囲内の様々な変更および改変が明らかになると思われるため、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、これらは例示のために示すにすぎないことが理解されるべきである。
【００２０】
本発明は、添付の図面と関連して説明される。
【００２１】
発明の詳細な説明
（i）本発明の方法
本発明者らは、有機ポリオール修飾シラン由来のケイ質材料の形態および収縮特性を制御する方法を開発した。特に、より高分子量のPEOまたは他の水溶性ポリマーを有機ポリオール系ゾルに、ゲル化前に相転位またはスピノダル分解が起こる条件下で加えると、二峰性メソ/マクロ孔モノリシックシリカ材料が得られることが見いだされている。さらに、アルキルアミド結合を通して糖ラクトン（グルコンアミド、マルトンアミドおよびデキストロンアミドを含む）に結合された三官能性シランを、有機ポリオール系四官能性シラン（代表的非限定例として、ジグリセリルシラン（DGS）およびモノソルビチルシラン（MSS）を含む）に加えると、収縮性が劇的に低下したケイ質材料が得られることも明らかにされている。同様に、プロピルエーテル結合を通して三官能性シランで修飾されたPEOでは、シリカの収縮が低減した。したがって、広範囲のpHで容易に生成され、室温またはわずかに高い温度（例えば37℃）で調製することができ、熱硬化または風乾の必要がない、TEOS由来ゲルに比べて収縮が低減したケイ質材料への経路が開発された。結果として、これらのケイ質材料に様々な種、特に蛋白質などの生体分子をドープすることが可能である。
【００２２】
したがって、本発明は、ケイ質材料の調製法であって、有機ポリオールシラン前駆体と添加物（添加物は一つまたは複数の水溶性ポリマーおよび一つまたは複数の式Iの三官能性シラン：
2005536625.tif 000004
（式中、R1、R2およびR3は同じまたは異なっていて、通常のゾル-ゲル条件下で加水分解されてSi-OH基を提供することができる基を表し；R4は通常のゾル-ゲル条件下で加水分解されない基である）からなる群より選択される）とを、前駆体のケイ質材料への加水分解および縮合に適した条件下で混合する段階を含む方法に関する。
【００２３】
水溶性ポリマーはいかなるそのような化合物から選択してもよく、ポリエーテル、例えば、ポリエチレンオキシド（PEO)、ポリエチレングリコール（PEG)、末端がアミノであるポリエチレングリコール（PEG-NH2）；ポリプロピレングリコール（PPG)、ポリプロピレンオキシド（PPO)、ポリプロピレングリコールビス(2-アミノ-プロピルエーテル)（PPG-NH2）；ポリアルコール、例えば、ポリビニルアルコール；多糖；ポリ(ビニルピリジン)；ポリ酸、例えば、ポリ(アクリル酸)；ポリアクリルアミド、例えば、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)（ポリNIPAM）；およびポリアリルアミン（PAM）を含むが、これらに限定されることはない。好ましくは、水溶性ポリマーは、PEO、PEO-NH2、PEG、PPG-NH2、ポリNIPAMおよびPAMから選択される。より好ましくは、水溶性ポリマーは、PEO、PEO-NH2、およびポリNIPAMから選択される。「水溶性」とは、ポリマーが適当な濃度の水性溶液中に生成可能であることを意味する。「オキシド」（ポリエチレンオキシドなど）および「グリコール」（ポリエチレングリコールなど）なる用語は相互交換可能に用いることができ、一方の用語を他方の用語よりも使用することは、いかなる様式でも限定的であることを意味していないことに留意すべきである。
【００２４】
本発明の態様において、OR1、OR2および/またはOR3は同じまたは異なっていて、有機モノ、ジ、またはポリオール由来である。「ポリオール」とは、化合物が複数のアルコール基を有することを意味する。ポリオールの有機部分は、直鎖および分枝鎖アルキルおよびアルケニル基から環状および芳香族基までの範囲のいかなる適当な構造を有していてもよい。生体分子適合性シランの調製のために、有機ポリオールは生体分子適合性であることが好ましい。本発明の態様において、基OR1、OR2および/またはOR3は、糖アルコール、糖酸、糖類、オリゴ糖および多糖由来である。単純糖類は炭水化物または糖としても知られている。炭水化物は、ポリヒドロキシアルデヒドもしくはケトン、または加水分解されてそのような化合物を生じる物質と定義することができる。ポリオールは、糖または炭水化物の最も単純なものである単糖であってもよい。単糖は、開いた鎖または環状体いずれかの、いかなるアルドまたはケトトリオース、ペントース、ヘキソースまたはヘプトースであってもよい。本発明において用いることができる単糖の例には、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、トレオース、エリトロース、グリセルアルデヒド、ソルボース、フルクトース、デキストロース、レブロースおよびソルビトールが含まれるが、これらに限定されることはない。ポリオールは二糖、例えば、スクロース、マルトース、セロビオースおよびラクトースであってもよいが、これらに限定されることはない。ポリオールは多糖、例えば、デキストラン、（500〜50,000 MW）、アミロースおよびペクチンも含むが、これらに限定されることはない。用いることができる他の有機ポリオールには、グリセロール、プロピレングリコールおよびトリメチレングリコールが含まれるが、これらに限定されることはない。本発明の態様において、基OR1、OR2および/またはOR3は、グリセロール、ソルビトール、マルトース、トレハロース、グルコース、スクロース、アミロース、ペクチン、ラクトース、フルクトース、デキストロースおよびデキストランなどから選択されるポリオール由来である。本発明のさらなる態様において、有機ポリオールはグリセロール、ソルビトール、マルトースおよびデキストランから選択される。
【００２５】
本発明の他の態様において、OR1、OR2およびOR3は同じで、C1-4アルコキシ、例えば、メトキシまたはエトキシ、アリールオキシおよびアリールアルキレンオキシから選択される。本発明のさらなる態様において、OR1、OR2およびOR3は全てエトキシである。
【００２６】
本明細書において用いられる「アリールオキシ」なる用語は、フェノキシまたはナフチルオキシ（フェニルおよびナフチル基は、ハロ（フルオロ、ブロモ、クロロまたはヨード）、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、OH、NH2、N(C1-6アルキル)2、NHC1-6アルキル、C(O)C1-6アルキル。C(O)NH2、C(O)NHC1-6アルキル、OC(O)C1-6アルキル、OC(O)OC1-6アルキル、NHC(O)NHC1-6アルキル、フェニルなどからなる群より独立に選択される、1〜5個の基、好ましくは1〜3個の基で任意に置換されていてもよい）を意味する。
【００２７】
本明細書において用いられる「アリールアルキレンオキシ」なる用語は、アリール-(C1-4)-オキシ（アリールは「アリールオキシ」における意味と同じ意味を有する）を意味する。好ましくは、「アリールアルキレンオキシ」はベンジルまたはナフチルメチル基（すなわち、アリール-CH2-O）である。
【００２８】
基OR1、OR2およびOR3は加水分解/重縮合反応に直接関与しうることに留意すべきである。特に、これらの官能基は、酸素でシリコン原子に結合されたアルコキシ基、すなわち「Si-OR」で、これは加水分解されて「Si-O-H」を生じることができ、SiOHは他の「Si-O-H」または「Si-OR」基と縮合して「Si-O-Si」結合を生じ、ついには堅いゲル内の三次元ネットワークを生じることができる。三官能性シランは加水分解後にシルセスキオキサンを生成し、これに由来する系では、特に四官能性シラン由来の系に比べると、架橋度が低い。シリコン原子に結合された残りの基（R4）は、一般には加水分解/重縮合反応に直接関与しない基である。
【００２９】
R4は、通常のゾル-ゲル条件下では加水分解されず、好ましくは生体物質、特に蛋白質を安定化する基である。特定の態様において、R4は下記の群の一つから選択される：
2005536625.tif 000005
（式中、nは0〜1であり、かつOR1、OR2およびOR3は前述の定義のとおりである）。R4における「ポリオール」なる用語は、基OR1、OR2およびOR3に対して前述したものと同じ定義を有する。R4における「ポリマー」なる用語は、ポリエーテル、例えば、末端がアミノであるポリエチレンオキシド（PEO)、ポリエチレングリコール（PEG)、ポリエチレングリコールビス(2-アミノ-プロピルエーテル)（PEG-NH2）；ポリプロピレングリコール（PPG)、ポリプロピレンオキシド（PPO)、ポリプロピレングリコールビス(2-アミノ-プロピルエーテル)（PPG-NH2）；ポリアルコール、例えば、ポリビニルアルコール；多糖；ポリ(ビニルピリジン)；ポリ酸、例えば、ポリ(アクリル酸)；ポリアクリルアミド、例えば、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)（ポリNIPAM）；およびポリアリルアミン（PAM）などであるが、これらに限定されることはない、いかなる水溶性ポリマーも意味する。シリコン原子とポリマーとの間の直接結合が通常のゾル-ゲル条件下で加水分解される場合、リンカー基が必要である（すなわち、n＝1）。本明細書の態様において、ポリマーはPEOなどの水溶性ポリエーテルである。
【００３０】
糖およびポリマー残基はシリコン原子に、任意の数のリンカーを通して結合されていてもよい。そのようなリンカーは、例えば、アルキレン基（すなわち、-(CH2)m-、m＝1〜20、好ましくは1〜10、より好ましくは1〜4）、アルケニレン基（すなわち、-(CH=CH)m-、m＝1〜20、好ましくは1〜10、より好ましくは1〜4）、有機エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、アミド、ウレタン、炭酸塩および尿素に基づくものであってもよい。当業者であれば、それらは基R4をシリコン原子に結合するために用いることができる可算リンカーであることを理解すると思われる。
【００３１】
「生体分子適合性」とは、蛋白質および/もしくは生体分子を変性に対して安定化するか、またはそれらの変性を促進しない物質を意味する。
【００３２】
本明細書において用いられる「生体分子」または「生体物質」なる用語は相互交換可能で、シリカ中に取り込むことができる、様々な蛋白質、酵素や、DNAおよびRNAを含む他の感受性生体ポリマー、ならびに全植物、動物および微生物細胞を含む複雑な系のいずれをも意味する。生体分子は、好ましくは、適当な溶媒、例えば、トリス緩衝液などの水性緩衝溶液に溶解する。本発明の態様において、生体物質はその活性体である。
【００３３】
「通常のゾル-ゲル条件」とは、有機ポリオール由来シランの加水分解および縮合を行う、本明細書において用いられる条件を意味する。これには、水溶液中、1〜13の範囲、好ましくは4〜11.5の範囲のpH、および0〜80℃の範囲、好ましくは0〜40℃の範囲の温度、ならびに任意に超音波処理、および/または酸、アミン、ジアルキルスズエステル、チタン酸塩などを含む室温加硫の当業者には公知の触媒存在下が含まれる。
【００３４】
本発明の式Iの化合物の実例は、糖類を基にする三官能性シランの2つのクラスであり、下記のとおりに調製した：単糖系（化合物1）および二糖系（化合物2および3）三官能性シランをスキーム1および2に示す。ポリマー系ビス(三官能性シラン)5も調製した（スキーム3参照）。
【００３５】
スキーム1および2に示す糖類のいずれの例においても、シランによる修飾について多くの異なる可能性があるが、糖鎖末端のヘミアセタールのアノマー中心の修飾を選択した。いずれかの糖の酸化により、アノマーであるヘミアセタールがラクトンに変換される（スキーム1）。次いで、これをアミノ修飾アルコキシシランで開環して糖修飾カップリング剤を生成することができた38。この場合に2つの基をつなぐ鍵となる官能基はアルキルアミドである。本明細書において調製したそのような糖修飾シランの例をスキーム2に示す。
【００３６】
2005536625.tif 000006
【００３７】
R4が
2005536625.tif 000007
であり、OR1、OR2およびOR3は前述の定義の通りである、式Iの化合物の実例は、スキーム3に示す化合物5である。化合物5は、スキーム3に示すとおり、例えば、ポリ(エチレンオキシド)をまず臭化アリル（または任意の他の適当なアリル化剤）と反応させた後、白金触媒などの触媒存在下、トリアルコキシ-、トリアリールアルキレンオキシ-またはトリアリールオキシシランと反応させることにより、調製することができる。修飾PEOポリマー、例えば、式5の化合物を用いる場合、出発PEOは約2000g/molよりも大きいMWを有することが好ましい。この例において、リンカーはm＝3のアルキレン基である。末端がアリルであるいくつかのPEOポリマー4は市販されていることに留意されたい。当業者であれば、これらの種をケイ質マトリックスに結合させるために、R3-kJkSi-リンカー-ポリマー-リンカー-SiJkR3-kおよびポリマー-リンカー-SiJkR3-k（k＝1〜3で、Jは加水分解およびシリカネットワークとの縮合に関与しうる基である）などの他のレベルの官能基も用いうることが明らかであると思われる。
【００３８】
2005536625.tif 000008
【００３９】
前述のとおり、有機ポリオール由来シラン前駆体が発明者らの同時係属中の特許出願（PCT特許出願S.N. PCT/CA03/00790）6に記載されており、その内容は参照として本明細書に組み込まれる。「ポリオール」なる用語はここでも前述と同じ定義を有する。様々な比の糖/シリコン（例えば、モノソルビチルシラン（MSS）、ジソルビチルシラン、トリソルビチルシラン）が容易に調製されるが、当業者には理解されるとおり、そのような化合物の硬化挙動は非常に異なる。下記に挙げる、得られたポリオール修飾シランは、本明細書の方法のために特に好都合である：ジグリセリルシラン（DGS）、モノソルビチルシラン（MSS）、モノマルトシルシラン（MMS）、ジマルトシルシラン（DMS）およびデキストラン系シラン（DS）。当業者であれば、単純糖類、オリゴ糖、および関連するヒドロキシル化化合物を含む他の分子も、実行可能なシリカ前駆体を導きうることを容易に理解することができる。より分子量の大きいポリオールおよび多糖、例えば、デキストランなどは、いったん生成するとシリカから完全に浸出することはない。
【００４０】
グリセロール（DGS−ジグリセリルシラン；またはMSS−モノソルビチルシラン）などの糖修飾シランからのシリカの調製は以前に報告されている6。それらの場合、得られたゲル中に含まれるすべてのシリコン原子は四官能性のQ-型39（酸素への4つの結合、Si(OR)4）であった。任意の水溶性ポリマーまたは式Iの化合物のDGSまたはMSSとの共加水分解により、非常に異なる性質のシリカが生じた。
【００４１】
有機ポリオール由来シランの一つまたは複数の添加物存在下での加水分解および重縮合は、典型的には、水溶液中で試薬を放置する、または溶解を助けるために超音波処理することにより起こった。本発明の好ましい態様において、添加物は適当な緩衝液中の溶液として加える。加水分解および縮合を開始するために、水溶液を緩衝液、例えばトリス緩衝液を用いて4〜11.5の範囲のpHに調節してもよい（生体分子をマトリックス中に連行することになる場合は、その生体分子に適合させてもよい）。本発明の態様において、pHは約4〜10の範囲内であるように調節する。得られた溶液は最終的にはゲル化し（流動性を失う）、材料を十分な時間硬化またはエージングさせてもよい。当業者であれば、この時間をケイ質材料の所望の適用に応じて決定することができる。「硬化」または「エージング」なる用語は、ゲル化後のシリカのエージングによる、シリカマトリックスの連続的進展を意味する。材料を十分に硬化させた後、使用前に乾燥させてもよい。材料を、溶液が粘稠性となるのに合わせ、しかし完全にゲル化する前に、任意の所望の形状、例えば、フィルム、スポット、繊維、モノリス、ペレット、顆粒、錠剤、ロッドおよびバルクに成形してもよい。
【００４２】
添加物が式Iの三官能性化合物である場合、収縮が低減したケイ質材料が生じることが明らかにされている。したがって、本発明の態様において、低い収縮特性を有するケイ質材料の調製法であって：
（a）一つまたは複数の式Iの化合物の水溶液を有機ポリオールシラン前駆体の水溶液と混合する段階と；
（b）（a）の溶液のpHを約4〜11.5に調節する段階と；
（c）（b）の溶液をゲル化させる段階と；
（d）（c）のゲルをエージングさせる段階と；
（e）エージングしたゲルを風乾する段階とを含む方法が提供される。
【００４３】
さらなる態様において、式Iの化合物はR4が下記の群の一つから選択されるものから選択される：
2005536625.tif 000009
（式中、nは0〜1であり、かつOR1、OR2およびOR3は前述の定義のとおりである）。
【００４４】
グルコンアミド-Si(OEt)3 1、マルトンアミド-Si(OEt)3、2またはPEO-[Si(OEt)3]2、5とそれぞれ混合したDGS由来の一連の化合物を調製した。複合体のゲル化時間は、出発原料の比に依存していた。特に、添加物の比率が高まるに伴い硬化（ゲル化）がより遅くなる傾向があった（表1）。これらの材料はIRおよびNMRを含む標準の分光法によって特徴付けることができた（図1〜4および表2参照）。特に、前者は、1650と1700cm-1との間の領域に現れるアミド結合のために特徴的である（図1〜2）。
【００４５】
有機ポリオールシラン前駆体を式Iの化合物と混合することにより調製したケイ質材料の物理的挙動も試験した。前述のとおり、得られた生成物の挙動に対する最も重要な影響は、収縮の程度に見ることができる。通常、開放環境下（すなわち、水中でない）に放置すると、DGSゲルの収縮は約66％までのレベルで起こり（図5の試料6参照）、約85％収縮するTEOS由来ゲルよりもはるかに低い。これとは対照的に、糖修飾三官能性シランを取り込むと、同じ期間（45日間）の収縮は15％未満まで劇的に低減した（図5の試料8〜11、13〜15）。収縮の低減は、DGSを加水分解し、化合物5の存在下で縮合した場合にも観察された。三官能性シランが得られたケイ質表面の挙動を改変した程度を評価するために、移動度測定を行った。これらの結果を表3、図6に示す。全ての場合に、表面はアニオン性のままである。
【００４６】
DGSまたはMSS（および関連する化合物）の加水分解により、ポリオールが混入したシリカネットワークが生じる。これらのネットワークはTEOSから調製したシリカよりも収縮がはるかに小さく、またゲル形成中に変性剤が存在しないため、蛋白質への適合性も高い。加えて、前述のとおり、ゲル形成は補助触媒なしに4〜11.5のpH範囲で都合よく起こるため、ゲル合成のために用いるpHは取り込もうとする特定の蛋白質に合わせることができる。糖ラクトンまたはポリマー系の三官能性化合物の添加は、その結果起こる硬化過程の挙動を著しく変え、最終材料中の収縮を最も顕著に低減した。
【００４７】
本発明は、本発明の方法を用いて調製したケイ質材料も含む。したがって、本発明は収縮性が低下したケイ質材料に関する。「収縮性が低下した」とは、ケイ質材料が空気中、室温、45日間で約5〜15％（v/v）の範囲で収縮することを意味する。
【００４８】
本発明の他の局面において、有機ポリオールシラン前駆体を一つまたは複数の水溶性ポリマーおよび/もしくは式Iの化合物（R4はポリマー-(リンカー)n-および
2005536625.tif 000010
から選択される基である）と、得られたゾルがゲル化前に相転移を起こす条件下で混合したとき、二峰性メソ/マクロ孔シリカモノリスが生成した。
【００４９】
したがって、本発明は、モノリシックシリカ材料の調製法であって、有機ポリオールシラン前駆体を、水溶性ポリマーおよび式Iの化合物（R4はポリマー-(リンカー)n-および
2005536625.tif 000011
から選択される基である）から選択される一つまたは複数の添加物と、ゲル化前に相転移が起こる条件下で混合する段階を含む方法を含む。
【００５０】
本発明の態様において、R4は
2005536625.tif 000012
である。本発明のさらなる態様において、リンカー基はC1-4アルキレン基であり、nは1である。OR1、OR2およびOR3の選択は前述の定義のものと同じである。
【００５１】
本発明は、本発明の方法を用いて調製した新規二峰性メソ/マクロ孔シリカモノリスにも広がる。したがって、本発明は収縮特性が改善されたシリカモノリスに関し、これは生体分子に適合性で、室温で調製される。
【００５２】
ゲル化前に相転移が起こる条件は、主に水溶性ポリマーの同一性に応じて変動することがある（表4）。水溶性ポリマーがPEOである場合、ゲル化のタイミングはPEO濃度と分子量の両方に依存していた（表7）。相転移がゲル化前に起こるために、官能基を持たないPEOが比較的高い分子量（MW）、例えば、約5000よりも大きく、好ましくは約7500よりも大きく、より好ましくは約10,000g/molよりも大きく、最も好ましくは約100,000g/molよりも大きく、かつ比較的高濃度、例えば、最終溶液1mLあたり約0.005gよりも高く、好ましくは最終溶液1mLあたり約0.025gよりも高いことが好ましい。ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)（ポリNIPAM）を水溶性ポリマーとして用いた場合、マクロ孔シリカモノリスも生成した。ポリNIPAMの分子量は、約5000よりも大きくてよく、好ましくは約7500よりも大きく、より好ましくは約10,000g/molよりも大きく、最も好ましくは約100,000g/molよりも大きくてもよく、かつその濃度は最終溶液1mLあたり約0.005gよりも高くてよく、好ましくは最終溶液1mLあたり約0.025gよりも高くてもよい。アミノ修飾PEO（PEO-NH2）については、分子量は約1000g/molよりも大きくてよく、好ましくは約2000g/molよりも大きく、より好ましくは約3000g/molよりも大きくてもよく、かつその濃度は最終溶液1mLあたり約0.005gよりも高くてよく、好ましくは最終溶液1mLあたり約0.025gよりも高くてもよい。
【００５３】
水溶性ポリマー上の異なる官能基の、硬化特性への影響は明白であった。ゲル化前に相分離が起こるには、10,000 MWの官能基を持たないPEOが必要であった。これに対し、末端アミノ基を有するポリ(エチレンオキシド)（PEO-NH2）は、分子量がわずか3400でマクロ孔構造を形成することができ、末端にO(CH2)3Si(OEt)3基を有するPEO（PEO-TES2）は約200より大きい分子量でマクロ孔構造を形成することができた。
【００５４】
マクロ孔シリカモノリスは、水溶性ポリマーの混合物を用いて調製することもできた。この場合、得られたシリカの形態は、濃度、分子量、およびポリマーの特徴によって影響を受けた。例えば、様々な量のPPG-NH2をDGS-PEOゾルに加えると、非常に異なる形態のシリカが生じた（図8参照；基本の処方はDGS（0.2g）/H2O（200μL）＋0.5g/mlのPEO 10,000 MW（60μL）からなり、これにPPG-NH2 200 MW（0.5g/mL）からなるPPG-NH2溶液を、最終PEO/PPG-NH2比がi）1000/1、ii）1000/5、およびiii）1000/10となるように加えた）。
【００５５】
当業者であれば、例えば、ゾル中の濁度の発生を観察することにより、いつ相転移が起こったかを容易に決めることができる。本明細書において用いる場合、溶液が完全に不透明になった時間を相分離時間（tps）として記録し、不透明相が流動性を失った時間をゲル化時間（tgel）として記録した。
【００５６】
相分離後のゲル化の結果生成したシリカは、互いに融合して開いた構造を作る、小さい非対称ビーズからなる。開いた構造が進展する様式は、アルコキシシランの反応を完了する前に、未反応の出発原料または低分子量のオリゴマーをゲルから洗浄することにより見ることができた。ゲルの進展は図9に見ることができる。凝集物のサイズは用いた特定の処方に相関し、特に、取り込んだ添加物の分子量および種類、ならびに重量パーセントに依存する。
【００５７】
モノリスを含む凝集シリカビーズは、本来メソ孔性である。これは窒素吸収データ（表5）から明らかに認められ、これによれば平均孔径は3.3nmである。
【００５８】
本発明の方法を用いて生成したシリカマクロ孔モノリスは、相分離を引き起こすために用いた著しい量の有機ポリマーを含む。熱重量分析（TGA）は、DGSから生成し、ポリマーをドープしたゲルでは、ドーピング剤非存在下でDGSおよび水を含んでいたゲルよりも著しく多量の有機材料が検出されることを示していた（図10）。ポリマーをドープしたゲルで、加熱により、水の蒸発が原因の10〜15％程度のさらなる重量減少が観察された。
【００５９】
本発明の方法を用いて調製したゾル-ゲルモノリスの性質のさらなる特徴付けは、熱量測定により行うことができた。DGS、水およびPEOの反応から得られるゲルの示差走査熱量測定（DSC）により、グリセロール（DGS由来）に関連する特徴が示されるが、ポリマードーピング剤に関連する特徴は示されない。したがって、DGSだけからのシリカの未洗浄試料は、200℃よりも上でグリセロールの減少を示す（図11A）。これに対し、洗浄試料は最初の加熱サイクルでグリセロールを示さず、二回目の加熱サイクルで顕著な熱事象を示さない。純粋なPEO（MW 100,000）の融点は、図11Bに示すとおり67℃である。DGSおよびPEOから調製したシリカにおいて、DSCはゲルを粉砕、洗浄および乾燥した後に、ゲル中にPEOまたはグリセロールの連行されたドメインの徴候は示さない。曲線2のピークはいくらかの水の減少に相関している（図11B）。しかし、洗浄後、ゲル中には約24％のPEOが残留している（図10）。したがって、表6に示すとおり、これらのゲルからのデータは、分散したPEOを含むシリカ構造に一致している。
【００６０】
PEO以外のポリマーを用いると、得られるモノリシックシリカの形態が異なることがある。これらの相違は電子顕微鏡写真で容易に認識できる。PEOで調製したシリカ（図9B）とポリNIPAM存在下で調製したもの（図12A）との比較により、非常に異なる凝集挙動が認められる。PEO、PPG-NH2および式Iの化合物（R4はポリマー-(リンカー)n-または
2005536625.tif 000013
である）のDGSへの、ゲル化前に相転位が起こる条件下での添加により、凝集物のサイズおよび形態が異なる様式で変化した（図8および12B）。
【００６１】
本発明の方法の特定の利点は、それらが生体分子をドープしたケイ質材料の調製に適用可能であることは前述した。したがって、本発明は、ケイ質材料の調製法であって、有機ポリオールシラン前駆体、目的の生体分子、および添加物（添加物は一つまたは複数の水溶性ポリマーおよび一つまたは複数の式Iの三官能性シラン：
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（式中、R1、R2およびR3は同じまたは異なっていて、通常のゾル-ゲル条件下で加水分解されてSi-OH基を提供することができる基を表し；R4は通常のゾル-ゲル条件下で加水分解されない基である）からなる群より選択される）を、前駆体のケイ質材料への加水分解および縮合に適した条件下で混合する段階を含む方法にさらに関する。
【００６２】
本発明は、その中に取り込まれた生体分子または生体物質を含むケイ質材料であって、前述の方法を用いて調製されるケイ質材料にさらに関する。
【００６３】
本発明の方法を用いて調製したシリカモノリスへの生体分子の取り込みは、表面活性蛋白質のヒト血清アルブミン40（HSA）またはリゾチーム存在下、ドーピング剤として100,000 MW PEOを取り込む処方を用いて生成したシリカによって例示される（表7）。蛍光標識したHSAを用いて示しているとおり、大規模な洗浄により蛋白質を部分的に除去することが可能であった：元の処方中のPEOが多いほど、洗浄後のカラム中に残る蛋白質は少ない。PEO/DGS/FITC-標識HSAシリカからの洗液をUV-可視分光法により試験した。3回目の洗液中に非常に弱い吸収シグナルがまだ検出された（図13）。しかし、3日間の完全浸漬後の共焦点顕微鏡検査により観察された強い蛍光シグナルによって示されるとおり、得られたゲルは著しい量のHSAをまだ含んでいた（図14）。PPG-NH2をゾルに添加すると、最終的蛋白質保持程度が変化する。表7および8に示すとおり、蛋白質の保持においてPPG-NH2は他のポリマーよりもはるかに効率的である。したがって、水溶性ポリマーの添加により提供される形態上の変化に加えて、これらのポリマーはシリカモノリス中の全蛋白質含有量の制御においても役割を果たしている。
【００６４】
本発明の方法を用いて調製した二峰性メソ/マクロ孔モノリスは、ゾル-ゲル由来シリカによくあるとおり、収縮を起こす。しかし、これらの材料の収縮の程度も、TEOS由来ゲルで観察されるより著しく低い。水中で1ヶ月後、DGS/PEOで調製したゲルの直径14mmの円柱の半径方向の収縮は、1ヶ月後に約10％である。これは純粋なDGSゲルと同じ収縮である。ゲルを水なしの開放系でエージングすると、収縮はDGS/PEOゲルでは約14％、DGSゲルでは約21％、TEOSゲルでは約43％である。したがって、本発明は、収縮特性が改善された、二峰性メソ/マクロ孔シリカモノリスの調製法に関する。
【００６５】
ゾル-ゲル経路によるシリカの生成は、複雑な一連の加水分解および縮合を含む41。グリセロール、ソルビトール、マンニトール、デキストランまたは他の糖由来材料に由来するシランなどの、多座配位出発原料を用いる場合、出発原料からシリカへの反応カスケードに関与する平衡の数は著しく増加する。この過程中、低分子量材料はオリゴマーおよびポリマーへと重合し始める。著しい量の他のドーピング剤非存在下で、最終シリカモノリスは水、アルコールおよび他の添加ドーピング剤を含む、光学的に澄明な材料を生成する。全過程は一つの相で起こる。
【００６６】
ゾル-ゲル化学に関与しうる式Iの化合物などの、水溶性ポリマーおよび他の添加物を元のゾルに加える処置は、シリカの進展を複雑にする。状況は分散重合に似ており、オリゴマー化の後、伸長中のポリマーは粒子成長の核をなす42。この場合、伸長中のシリカポリマーは、ゲル化が続く間にゾルから沈殿する。特定のタイミング、重合の程度、最終的形態（一次粒子および凝集物のサイズ、結合シリカ層の厚さ、粒径、孔径および多孔度の均一性を含む）は、前述のとおり、添加物の量、分子量および特定の分子特性によって影響される。
【００６７】
本明細書に記載の研究と以前の文献報告との間には違いがある。それには、シリコンを基本とした出発原料およびそれらと添加物との相互作用が含まれる。第一に、本発明のシラン前駆体上のアルコキシ基の性質により、モノヒドロキシシラン由来シランと比べてこれらの化合物は非常に異なるpH硬化特性を有する。すなわち、本発明の前駆体の残留アルコールは発生中のシリカネットワークを可塑化するはたらきをする。また、これらは取り込まれた蛋白質を不安定化しない環境も提供する。もう一つの違いは反応の温度依存性である。ゲル化は広いpH範囲で室温で起こり、ここでも本発明の方法における蛋白質および他の生体分子の取り込みを促進する。最後に、本発明のこれらのモノリスの収縮は、TEOSまたはTMOS由来材料に比べて顕著に低減され、ここでも連行された生体分子のためにより安定な環境を提供する。
【００６８】
ゾル-ゲルシリカ処方において異なる添加物、異なるMWおよび量を使用することで、糖アルコールおよび関連シリカからゾル-ゲル法により調製した広い範囲にわたって、得られる構造の表面積、全多孔度、形態および蛋白質保持、ならびに収縮の程度および強さを調節することが可能となる。この試薬の組み合わせの伝統的経路に比べてのもう一つの利点は、その製造に用いることができる緩和な温度条件である。特に、合成経路は蛋白質および他の生体分子の取り込みに適合性である。
【００６９】
（ii）使用
本発明の方法を用いて調製したケイ質材料は新規であり、したがって本発明は、クロマトグラフィー、バイオセンサー、酵素の固定化、アフィニティー支持体などにおけるそれらの使用を含むが、これらに限定されることはない、これらの材料の全ての使用をさらに含む。これらの材料の多くの適用において、生体物質がそのマトリックス内に取り込まれている。
【００７０】
したがって、本発明は、その中に取り込まれた活性生体物質を含むケイ質材料の、バイオセンサー、固定化酵素またはアフィニティークロマトグラフィー支持体としての使用を含む。したがって、本発明は、活性生体物質と反応する、またはその反応が活性生体物質によって触媒される試験物質の定量的または定性的検出法であって、生体物質はケイ質材料中に封入されており、ケイ質材料は本発明の方法を用いて調製される方法も含む。定量的/定性的方法は、（a）本発明の方法を用いて調製した多孔性シリカマトリックス内に取り込まれた活性生体物質を含むケイ質材料を調製する段階と；（b）生体物質含有ケイ質材料を試験物質を含むガスまたは水溶液と接触させる段階と；（c）ケイ質材料中に取り込まれた生体物質の一つまたは複数の特徴の変化を定量的または定性的に検出、観察または測定する、あるいは、試験物質の一つまたは複数の特徴の変化を定量的または定性的に検出、観察または測定する段階とを含む。そのような試験は、当業者には容易に理解することができると思われる、様々な形態において実施することができる。これらには、ピンスポッターを用いて達成されるものなどのマイクロアレイ43が含まれうるが、これらに限定されることはない。
【００７１】
特に、本発明は、取り込まれた生体物質の一つまたは複数の特徴の変化を、UV、IR、可視光、蛍光、ルミネセンス、吸収、発光、励起および反射からなる群より選択される一つまたは複数の技法を用いて、分光法により定量的または定性的に測定する方法を含む。
【００７２】
同様に、生物学的に活性な生体物質をシリカマトリックス中に保存する方法であって、生体物質は活性蛋白質または活性蛋白質断片であり、シリカマトリックスは本発明の方法を用いて調製される方法も含まれる。
【００７３】
本発明の方法を用いて調製した二峰性メソ/マクロ孔シリカモノリスは、クロマトグラフィー上の適用において特に有用である。クロマトグラフィーカラムの調製のために、シリカ前駆体（任意に加水分解体で）および水溶性ポリマー（および他の添加物）を相転位およびゲル化が起こる前にクロマトグラフィーカラムに入れてもよい。
【００７４】
したがって、本発明は、モノリシックシリカクロマトグラフィーカラムの調製法であって、有機ポリオールシラン前駆体ならびに水溶性ポリマーおよび式Iの化合物（R4はポリマー-(リンカー)n-および
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から選択される基である）から選択される一つまたは複数の添加物を含む溶液を、ゲル化前に相転移が起こるのに適した条件下でカラムに入れる段階を含む方法に関する。
【００７５】
ゾルゲルカラムと共に用いるための、当技術分野において公知の他の添加物も、本発明の方法において用いることができる。これには、例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）などの物質が含まれ、これらは非選択的相互作用を低下させるために、シリカのアニオン電荷を平衡させるカチオン部位を提供する。前述の他のアミノ官能基を持つ材料、PEG-NH2、PPG-NH2および/またはPAMも同様にこの役割を果たすことができる。
【００７６】
本発明の態様において、クロマトグラフィーカラムはキャピラリーカラムである。通常のキャピラリーカラムは、内壁および外壁を有する円柱状のものを含み、内径が5μmから0.5mmの範囲の円形断面の管内に常置された固定相を含む。管壁はガラス、金属、プラスティックおよび他の材料製でありうる。管壁がガラス製の場合、キャピラリーの壁はシリカモノリス上の末端Si-OHまたはSi-OR基と縮合反応して、モノリスとキャピラリー壁との間に共有結合「Si-O-Si」を生じることができる、末端Si-OH基を有する。これはカラムに、モノリスをカラム内に維持する構造上の完全性を与えることになる。キャピラリーカラムの径が小さいため、シリカ前駆体および水溶性ポリマーを含む溶液を、適度の減圧を適用することによりキャピラリー中に導入してもよい。
【００７７】
添加物のいくつかは、水および/またはアルコールなどの適当な溶媒で洗浄することにより、クロマトグラフィー前に除去または溶出することができる。カラムは、超臨界乾燥などの方法またはシランもしくは曝露されたシリカ表面を修飾するための他のカップリング剤などの試薬の使用により、さらに調製することもできる。モノリスはその中に散在する添加物と共に保存することもできる。
【００７８】
本発明の態様において、本発明の方法を用いて調製したシリカモノリスを、様々なクロマトグラフィーによる分離にモノリスを合わせられるように、さらに誘導体化する。例えば、逆相クロマトグラフィーのために有用な表面をモノリスに取り込むことができる。そのような表面は、長鎖アルキル基または他の非極性基を含んでいてもよい。そのような誘導体化は、シリカ上のSi-OHまたはSi-OR基を、これらの官能基をアルキル、アリールまたは有機官能基（例えば、カルボキシレートまたはアミン）などの他の有機基への表面結合に変換する試薬と反応させることにより行うことができる。さらなる態様において、他の有機基は、キラル化合物の分離を容易にするキラル分子である。これらの誘導体化は当技術分野において公知で、本発明の範囲内に含まれる。
【００７９】
本発明は、本明細書に記載のとおりに調製したシリカモノリスを含むクロマトグラフィーカラムも含む。したがって、本発明は、有機ポリオールシラン前駆体ならびに水溶性ポリマーおよび式Iの化合物（R4はポリマー-(リンカー)n-および
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から選択される基である）から選択される一つまたは複数の添加物を、ゲル化前に相転移が起こる条件下で混合することにより調製したシリカモノリスを含むクロマトグラフィーカラムを含む。
【００８０】
加えて、本発明は、本発明の方法を用いて調製し、その中に取り込まれた活性生体物質を含むシリカモノリスの、クロマトグラフィーカラム、バイオセンサー、固定化酵素またはアフィニティークロマトグラフィー支持体としての使用も含む。したがって、本発明は、封入された活性生体物質と反応する、またはその反応が活性生体物質によって触媒される試験物質を定量的または定性的に検出するための、その中に取り込まれた活性生体物質を含むシリカモノリスの使用に関する。
【００８１】
同様に、活性生体物質と反応する、またはその反応が活性生体物質によって触媒される試験物質の定量的または定性的検出法であって、生体物質はシリカモノリス中に封入されており、シリカモノリスは本発明の方法を用いて調製される方法も含まれる。定量的/定性的方法は、（a）本発明の方法を用いて調製した多孔性シリカマトリックス内に取り込まれた活性生体物質を含むシリカモノリスを調製する段階と；（b）生体物質含有シリカモノリスを試験物質を含むガスまたは水溶液と接触させる段階と；（c）シリカモノリス中に取り込まれた生体物質の一つまたは複数の特徴の変化を定量的または定性的に検出、観察または測定する、あるいは、試験物質の一つまたは複数の特徴の変化を定量的または定性的に検出、観察または測定する段階とを含む。
【００８２】
特に、本発明は、取り込まれた生体物質の一つまたは複数の特徴の変化を、UV、IR、可視光、蛍光、ルミネセンス、吸収、発光、励起および反射からなる群より選択される一つまたは複数の技法を用いて、分光法により定量的または定性的に測定する方法を含む。
【００８３】
（iii）バイオアフィニティークロマトグラフィーへの特定の適用
本発明者らは、生体分子（例えば、蛋白質）取り込みのために用いることができる、生体適合性の二峰性メソ/マクロ孔シリカ材料を開発し、圧力駆動液体クロマトグラフィーに適し、質量スペクトル（MS）検出に適合性の、この材料に基づくキャピラリーカラムを調製可能であることを示した。カラムを、生体適合性シリカ前駆体のジグリセリルシラン（DGS）6,44,45、形態を制御するポリエチレンオキシド（PEO、MW 10,000）、非選択的相互作用を低下させるためのシリカのアニオン電荷を平衡させるカチオン部位を提供するアミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）34、およびカラム内でバイオアフィニティー部位を提供するための目的の生体分子の緩衝化溶液の混合物を用いて調製した。得られたゾル混合物を融合シリカキャピラリー（内径150〜250μm）内に充填し、そこでPEOの相分離と、続いてシリカのゲル化が起こった。シリカからポリマーの相分離は、背圧が最小限で溶出剤の良好な流動が可能になる大きいマクロ孔（＞0.1μm）、および取り込まれた蛋白質のかなりの画分を保持するメソ孔（直径約3〜5nm）を生じる二峰性孔分布を示すこととなった。
【００８４】
したがって、本発明は、その中に取り込まれた活性生体分子を有するモノリシックシリカカラムの調製法であって：
a）ポリオール-シラン由来シリカ前駆体と；
b）水溶性ポリマーおよび式Iの化合物（R4はポリマー-(リンカー)n-および
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から選択される基である）から選択される一つまたは複数の添加物と；
c）生体分子とを、ゲル化前に相分離が起こる条件下で混合する段階を含む方法に関する。
【００８５】
本発明の態様において、添加物は一つもしくは複数の水溶性ポリマーまたは式Iの化合物（R4は
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である）である。さらなる態様において、R1、R2およびR3は同じまたは異なっていて、C1-4アルキル、特にメチルまたはエチルから選択される。さらなる態様において、リンカーはC1-4アルキレン基、特にC2-3アルキレン基であり、nは1である。さらなる態様において、水溶性ポリマーおよびR4における「ポリマー」基はいずれも、PEO、ポリNIPAMおよびPEO-NH2から選択される。
【００８６】
本発明の態様において、有機ポリオールシランシリカ前駆体、一つまたは複数の添加物、および生体分子を、非選択的相互作用を低下させるためのシリカのアニオン電荷を平衡させるカチオン部位を提供する物質、例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）、PEG-NH2、PPG-NH2および/またはPAMとも混合する。本発明のさらなる態様において、非選択的相互作用を低下させるためのシリカのアニオン電荷を平衡させるカチオン部位を提供する物質の量は、アニオン種の保持を引き起こすレベルよりも低く維持する。例えば、この物質がAPTESである場合、約0.2〜0.4％（w/v）の範囲、好ましくは約0.3％の量が、非選択的保持を最小限にするのに最適であることが判明した。
【００８７】
本発明の態様において、モノリシックシリカをクロマトグラフィーカラム内で直接調製する。有機ポリオールシランシリカ前駆体を、例えば、任意に超音波処理しながら、任意に酸、例えば、1M HCl存在下、必要があれば有害な微粒子を除去するためにろ過した水溶液中に溶解することにより加水分解してもよく、次いで加水分解した前駆体を一つまたは複数の添加物、生体分子および任意のさらなる添加物の緩衝化溶液と混合してもよい。特に、加水分解した前駆体を一つまたは複数の添加物、生体分子および非選択的相互作用を低下させるためのシリカのアニオン電荷を平衡させるカチオン部位を提供する物質、例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）、PEG-NH2、PPG-NH2および/またはPAMの緩衝化溶液と混合してもよい。次いで、得られた混合物を、相分離およびゲル化が起こる前にカラムに移してもよい。好ましくは、カラムの内表面は、モノリシックシリカの吸着を促進する物質、例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）、PEG-NH2、PPG-NH2および/またはPAMで前処理されている。本発明の態様において、カラムはキャピラリーカラムである。
【００８８】
新しいバイオアフィニティーカラムの特定の適用として、小さい酵素阻害剤が取り込まれた酵素と相互作用し、したがってカラム上に保持される能力を調べた。この試験のために選択した酵素は、臨床上適切な蛋白質のジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）であった。DHFRはジヒドロ葉酸（DHF）のテトラヒドロ葉酸へのNADPH依存性還元を触媒し、テトラヒドロ葉酸は次いでチミジル酸、プリンおよびいくつかのアミノ酸の生合成における補助因子として用いられる46,47,48。DHFRは細胞における必須酵素で、葉酸代謝拮抗薬の標的である49。この蛋白質を選択した主な理由は、アフィニティーの50年間にわたる公知のDHFR阻害剤が多数あり、取り込まれた酵素への阻害剤の結合を調べる有用なモデルシステムが得られることである49。この酵素は、DGS由来材料中に取り込まれた場合に、活性を保持し、阻害剤に結合可能であることも明らかにされている44。
【００８９】
リガンド結合の試験は、質量分析検出を行うフロンタルアフィニティークロマトグラフィー（FAC/MS）により行った。この方法は最近、化合物混合物に適用できる高処理量スクリーニング手段としての可能性があるとして推進されている17。基本的前提は、化合物の連続注入により、遊離リガンドの正確な濃度が既知の場合に、リガンドの遊離状態と結合状態との間の平衡が可能になることである。この場合、化合物の破過時間（breakthrough time）はリガンドの固定化生体分子に対する親和性に対応することになる。すなわち、親和性が高いリガンドは破過が起こるのが遅い。以下に示すとおり、ゾル-ゲル法によるDHFR充填カラムは、リガンド混合物のFAC/MSに基づくスクリーニングに適しており、固定化蛋白質のナノモルの阻害剤を同定するために用いることができる。
【００９０】
融合シリカキャピラリー、例えば、内径150〜250μmのキャピラリー内でカラムを形成することで、有用なバイオアフィニティーカラムを作るために非常に少量の蛋白質（50pmol充填、12pmol活性蛋白質）しか必要としないシステムが得られる。そのようなカラムは、圧力駆動液体クロマトグラフィーに適しており、低い背圧で、比較的高い流速（500μL/分まで）で操作することができる。さらに重要なことに、低いイオン強度の溶出剤でこれらのカラムを操作することにより、エレクトロスプレー質量分析計への直接接続が可能となり、多反応モニタリング（multiple reaction monitoring）モードを用いて小分子の同一性を直接同定することができる。化合物混合物中の阻害剤をMS検出と組み合わせた保持時間により検出する能力は、化合物混合物の高処理量スクリーニングのために非常に強力であることが明らかになると考えられる。FAC/MS技術を取り込まれた蛋白質に拡大することで、特に膜結合受容体50を含む広範な蛋白質をゾル-ゲル由来シリカ中に取り込むことができるため、FAC法の汎用性を改善することができる。
【００９１】
本発明は、ポリオール-シラン由来シリカ前駆体を一つまたは複数の添加物、生体分子、および任意に非選択的相互作用を低下させるためのシリカのアニオン電荷を平衡させるカチオン部位を提供する物質と、ゲル化前に相分離が起こる条件下で混合することにより調製したクロマトグラフィーカラムにさらに関する。同様に、例えば、イムノアフィニティークロマトグラフィー、試料の精製、分析物の固相抽出または予備濃縮、不要な混入物の除去（例えば、抗体結合による）、固相触媒およびフロンタルアフィニティークロマトグラフィー（質量スペクトル検出と共に、または単独で）のための方法においてであるが、これらに限定されることはない、このカラムの使用も、本発明の範囲内に含まれる。
【００９２】
下記の非限定的実施例は、本発明の例示である。
【００９３】
実施例
実施例1〜6の材料と方法
D-グルコノラクトン（グルラクトン）、D-マルトース一水和物、ヨウ素、炭酸銀、3-アミノプロピルトリエトキシシラン（Aldrich Chemical Co.）、無水メチルスルホキシドおよびデキストラン（Sigma Chemical Co.）は受け取ったまま用いた。強カチオン交換樹脂Amberlite IR-120（Aldrich Chemical Co.）は使用前に蒸留水で洗浄した。D-マルトノラクトン（マルトラクトン）、デキストランラクトン（デキストランから、平均MW 10200）およびデキストランラクトン（デキストランから、平均MW 43000）は文献にしたがって調製した51。ポリ(エチレングリコール)（平均MW 200、600、2000、10000）はAldrich Chemical Co.から購入した。トリエトキシシランおよび臭化アリルはAldrichより提供された。Gelest Inc.から提供されたビニル末端ポリジメチルシロキサン中の白金-ジビニルテトラメチルジシロキサン錯体を白金触媒として用いた。ジクロロメタンおよびペンタンはCaHから蒸留し、EtOHは使用前にMgから蒸留した。
【００９４】
1Hおよび13C NMRはBruker AC-200分光計により室温で記録した；固体状態の13Cおよび29Si CPMAS NMRスペクトルはBruker AC-300により、それぞれ75.47および59.62 MHzで記録した。FT-IRスペクトルはPerkin-Elmer 283分光計で得、試料はKBrペレットとして調製した。エレクトロスプレー質量スペクトルはMicromass Quattro LC、トリプル四重極MSで記録した。平均移動度データはPALS Zeta Potential Analyzer Ver. 3.19で記録した。熱重量分析はThermowaage Sta STA 409を用いて得た。
【００９５】
実施例1：シルセスキオキサン前駆体の調製
グルコンアミドSi、1
DMSO（10mL）およびEtOH（5mL）中のD-グルコノラクトン（0.91g、5.2mmol）の溶液に、3-アミノプロピルトリエトキシシラン（1.11g、5.0mmol）を加えた。混合物を60℃で20時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、油状残渣をジクロロメタンに溶解した。未反応のD-グルコノラクトンをろ去し、ろ液を濃縮し、大量のペンタンに加えた。白色沈殿を回収し、減圧下で乾燥して、1を淡黄色固体で得た（1.83g、収率92％）。
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【００９６】
マルトンアミドSi、2
DMSO（10mL）およびEtOH（5mL）中のD-マルトノラクトン（0.75g、2.2mmol）の溶液に、3-アミノプロピルトリエトキシシラン（0.44g、2.0mmol）を加えた。混合物を60℃で20時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、油状残渣をジクロロメタンに溶解した。未反応のD-マルトノラクトンをろ去し、ろ液を濃縮し、大量のペンタンに加えた。白色沈殿を回収し、減圧下で乾燥して、2を淡黄色固体で得た（0.98g、収率87％）。
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【００９７】
デキストロンアミドSi-10K、3a
DMSO（50mL）およびEtOH（10mL）中のデキストラン10K-ラクトン（2.0g、0.2mmol）の溶液に、3-アミノプロピルトリエトキシシラン（0.44g、2.0mmol）を加えた。混合物を60℃で48時間撹拌した。混合物を濃縮し、大量のジクロロメタンに加えた。白色沈殿を回収し、ジクロロメタンで洗浄し、減圧下で乾燥して、3aを白色固体で得た（1.8g）。
【００９８】
デキストロンアミドSi-40K、3b
DMSO（50mL）およびEtOH（10mL）中のデキストラン40K-ラクトン（4.3g、0.1mmol）の溶液に、3-アミノプロピルトリエトキシシラン（0.44g、2.0mmol）を加えた。混合物を60℃で48時間撹拌した。混合物を濃縮し、大量のジクロロメタンに加えた。白色沈殿を回収し、ジクロロメタンで洗浄し、減圧下で乾燥して、3bを白色固体で得た（4.0g）。
【００９９】
実施例2：PEO-シリル添加物の調製
[(CH2CH2O)p(CH2CH=CH2)2、4a
反応をN2雰囲気下で実施した。THF（100mL）中のポリ(エチレングリコール)（平均MW 200、10.0g、50mmol）の溶液に0℃でNaH（2.4g、100.0mmol）を30分かけてゆっくり加えた。混合物を室温まで加温し、2時間撹拌した。混合物を0℃まで冷却し、臭化アリル（12.1g、100.0mmol）を加えた。混合物を室温まで加温し、さらに15時間撹拌した。白色沈殿をろ去し、THF（3×10mL）で洗浄した。ろ液および洗液を合わせ、THFを蒸発させて、淡黄色の粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィー（SiO2、溶出剤としてCH2Cl2中2％MeOH）で精製し、アリル末端ポリ(エチレングリコール)、4aを無色油状物で得た（11.1g、収率約76％）。
2005536625.tif 000021
【０１００】
(CH2CH2O)p(CH2CH=CH2)2、ATPEO600：4b
THF（100mL）中のポリ(エチレングリコール)（平均MW 600、6.0g、約10mmol）の溶液に0℃でNaH（0.50g、20.8mmol）を15分かけてゆっくり加えた。混合物を室温まで加温し、5時間撹拌した。混合物を0℃まで冷却し、臭化アリル（2.42g、20.0mmol）を加えた。混合物を40℃まで加温し、さらに3時間撹拌した。白色沈殿をろ去し、THF（3×10mL）で洗浄した。ろ液および洗液を合わせ、THFを蒸発させて、淡黄色の粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィー（SiO2、溶出剤としてヘキサン中10％酢酸エチル）で精製し、アリル末端ポリ(エチレングリコール)、4bを無色油状物で得た（6.1g、収率約90％）。
2005536625.tif 000022
【０１０１】
(CH2CH2O)p(CH2CH=CH2)2、4c
THF（20mL）中のポリ(エチレングリコール)（平均MW 2000、2.0g、約1mmol）の溶液に室温でNaH（0.050g、2.1mmol）を加えた。混合物を50℃で2時間撹拌した。臭化アリル（0.24g、2.0mmol）を加えた。混合物を室温でさらに10時間撹拌した。白色沈殿をろ去し、THF（3×10mL）で洗浄した。ろ液および洗液を合わせ、THFを蒸発させて、淡褐色の粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィー（SiO2、溶出剤としてCH2Cl2）で精製し、アリル末端ポリ(エチレングリコール)、4cを白色固体で得た（1.89g、収率約91％）。
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【０１０２】
(CH2CH2O)p(CH2CH=CH2)2、4d
THF（100mL）中のポリ(エチレングリコール)（平均MW 10K、10g、約1mmol）の溶液に室温でNaH（0.050g、2.1mmol）を加えた。混合物を50℃で2時間撹拌した。臭化アリル（0.24g、2.0mmol）を加えた。混合物を室温でさらに10時間撹拌した。白色沈殿をろ去し、THF（3×20mL）で洗浄した。ろ液および洗液を合わせ、THFを蒸発させて、淡褐色の粗生成物を得た。粗生成物をジクロロメタン（20mL）に溶解し、大量のジエチルエーテルに加えて、白色沈殿を得た。沈殿処理をもう一度繰り返し、アリル末端ポリ(エチレングリコール)、4dを白色固体で得た（7.9g、収率約77％）。
2005536625.tif 000024
【０１０３】
(CH2CH2O)p[(EtO)3Si(C3H6)]2、5a
4a（1.98g、7.1mmol）およびトリエトキシルシラン（2.33g、14.2mmol）の混合物に、カールステッドの白金触媒（1滴）を加えた。混合物を室温で2時間撹拌した（反応を1H NMRでモニターした）。揮発性有機物を減圧下、100℃で除去した。残渣をCH2Cl2（50mL）で希釈し、活性炭（0.5g）を加え、混合物を室温で終夜撹拌した。炭でろ過した後、CH2Cl2を蒸発させて、5aを無色油状物で得た（4.20g、収率約98％）。
2005536625.tif 000025
【０１０４】
(CH2CH2O)n[(EtO)3Si(C3H6)]2、5b
4b（2.1g、約3mmol）およびトリエトキシルシラン（1.2g、6.9mmol）の混合物に、カールステッドの白金触媒（1滴）を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した（反応を1H NMRでモニターした）。揮発性有機物を減圧下、110℃で除去した。残渣をCH2Cl2（50mL）で希釈し、活性炭（0.5g）を加え、混合物を室温で終夜撹拌した。炭でろ過した後、CH2Cl2を蒸発させて、5bを無色油状物で得た（2.45g、収率約80％）。
2005536625.tif 000026
【０１０５】
(CH2CH2O)p[(EtO)3Si(C3H6)]2、5c
ジクロロメタン（20mL）中の4c（2.0g、約1mmol）およびトリエトキシルシラン（0.36g、2.2mmol）の混合物に、カールステッドの白金触媒（1滴）を加えた。混合物を還流しながら3時間撹拌した（反応を1H NMRでモニターした）。溶媒を蒸発させ、その後揮発性有機物を減圧下、110℃で除去した。残渣をCH2Cl2（50mL）で希釈し、活性炭（0.5g）を加え、混合物を室温で終夜撹拌した。炭でろ過した後、CH2Cl2溶液を濃縮し、その後大量のジエチルエーテルに加えて、5cを無色固体で得た（2.1g、収率約88％）。
2005536625.tif 000027
【０１０６】
(CH2CH2O)p[(EtO)3Si(C3H6)]2、5d
ジクロロメタン（50mL）中の4d（5g、約0.5mmol）およびトリエトキシルシラン（0.18g、1.1mmol）の混合物に、カールステッドの白金触媒（1滴）を加えた。混合物を還流しながら5時間撹拌した（反応を1H NMRでモニターした）。溶媒を蒸発させ、その後揮発性有機物を減圧下、110℃で除去した。残渣をCH2Cl2（100mL）で希釈し、活性炭（1.0g）を加え、混合物を室温で終夜撹拌した。炭でろ過した後、CH2Cl2溶液を濃縮し、その後大量のジエチルエーテルに加えて白色固体を沈殿させた。沈殿処理を繰り返して、5dを白色固体で得た（2.7g、収率約50％）。
2005536625.tif 000028
【０１０７】
実施例3：DGS/修飾PEOゲルの調製
DGS（0.2648g、1.27mmol）を(EtO)3Si(CH2)3PEO(CH2)3Si(OEt)3（実施例3、0.1274g、0.053mmol）と混合し、水（600μL、33.3mmol）を加えた。混合物を0℃で1.5時間超音波処理し、その間に混濁した溶液が生じた。次いでトリス緩衝液（600μL、50mM、pH＝8.4）を加えた。5分後にゲルが溶液底部から生成した。
【０１０８】
実施例4：試料6〜15の調製
下記の試料はすべて、ゲル化後に下記のとおり処理した：
新鮮なゾル-ゲルを密閉容器内、5℃で20時間エージングし、次いで室温で7または20日間さらにエージングした。エージングしたヒドロゲルを水（5×5mL）で洗浄した。これはエージングした全ゲル（初期体積1mL）を水（5mL）に室温で4時間浸漬することにより行った。水を4回交換し、最後はゲルを8時間放置して、合計24時間浸漬した。次いで、ゲルを開放容器内、室温で45日間乾燥させた。試料ゾルの初期体積に対する収縮を記録した。結果を図5に示す。
【０１０９】
（a）試料6.  H2O（0.50mL）中のDGS（240mg、1.1mmol）の溶液に、トリス緩衝液（0.50mL、50mM、pH＝8.4）を加えた。混合物を室温で放置してゲル化させた（表1）。次いで、ヒドロゲルを密閉容器内、5℃で20時間エージングし、次いで室温で6日間さらにエージングし、風乾した。ゲルを水洗し、次いで開放容器内、室温で45日間乾燥させた。次いで収縮を記録した。凍結乾燥により無色固体を得た。
【０１１０】
（b）試料7.  H2O（0.50mL）中のDGS（240mg、1.1mmol）の溶液に、ソルビトール（60mg、0.33mmol/トリス緩衝液（0.50mL、50mM、pH＝8.4））を加えた。混合物を室温で放置してゲル化させた（表1）。ヒドロゲルを密閉容器内、4℃で20時間エージングし、次いで室温で6日間さらにエージングし、風乾した。ゲルを水洗し、次いで開放容器内、室温で45日間乾燥させた。次いで収縮を記録した。凍結乾燥により白色粉末を得た。
【０１１１】
（c）試料8〜15：同様の様式で調製した。反応条件を表1に示す。
【０１１２】
実施例5：移動度測定：ゼータ電位
凍結乾燥後、試料6〜11を粉砕して粉末とした。シリカ粉末をトリス緩衝溶液に加えてコロイド分散液を生成し（表3に示すとおり）、これを移動度測定のためのキュベットに移した。
【０１１３】
機器パラメーター：波長＝661.0nm；フィールド周波数＝5.00Hz；電圧＝10.00ボルト；電場＝25.45V/cm。結果を表3に示す。
【０１１４】
実施例6：収縮および膨潤
試料の元のゾル体積からの45日間の体積変化を、体積/体積％で測定した。結果を図5に示す。
【０１１５】
実施例7〜18の材料と方法
DGSを、以前の報告の方法6を用いて合成した。用いたポリ(エチレンオキシド)（PEO）はAldrichから提供され、平均MWはそれぞれ約10,000および100,000であった。ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)（pNIPAM）はPolysciences, Inc.から提供され、分子量は17,000および65,000であった。末端がアミノ基のポリ(エチレングリコール)（PEG-NH2）はNektar Therapeuticsから提供され、分子量は3400であった。ポリ(プロピレングリコール)ビス(2-アミノ-プロピルエーテル)はAldrichから提供され、分子量はそれぞれ230および400であった。GPCにより求めた分子量は104,000（Mn、較正物質としてポリスチレン）。ヒト血清アルブミン（HSA）はSigmaから入手し、以前の記載のとおり52、FITCで蛍光標識した。ヒト血清アルブミン（HSA）、リゾチームおよびローリー蛋白質アッセイキット（P5656）もSigmaから提供された。
【０１１６】
DSC
示差走査熱量測定（DSC）分析を、TA 2100 Modulated Differential Scanning Calorimeterにより、窒素雰囲気下、加熱速度15℃/分で実施した。
【０１１７】
TGA
熱重量測定分析を、THERMOWAAGE STA409を用いて実施した。分析は、流速50cc/分の気流下で測定した。加熱速度は室温から出発して5℃/分であった。
【０１１８】
多孔度BET
表面積、孔容積および孔半径を、Quantachromeからの機器Autosorb 1で測定した。試料を加熱前に100ミリトルまで減圧した。減圧を200℃でのガス放出の間維持し、ガス放出完了時の最終減圧度は約10ミリトル（またはそれ未満）であった。試料を、分析前にガス放出ステーションから取り出すために窒素で再充填した。BET表面積をBET（ブルナウアー、エメットおよびテラー）の式で算出した。孔径分布および孔半径窒素吸着-脱着等温式をBJH（バレット、ジョイナーおよびハレンダ）の方法により算出した。すべてのデータは機器に付属のソフトウェアで計算した。
【０１１９】
電子顕微鏡
試料をJEOL 840 Scanning Electron Microscopy（SEM）およびJEOL Transmission Electron Microscopeで観察した。
【０１２０】
ゲル内のHSAを調べるための共焦点顕微鏡画像
FITC標識HSA溶液を取り込んだゲルをバイアルおよびペトリ皿に調製した。洗浄後、ゲル内の標識HSAの領域を調べるために、ゲルの非常に薄いフィルムを用いて共焦点顕微鏡検査を行った。画像をZeiss LSM510 Confocal Microscopeで得た。
【０１２１】
UV-可視分光光度計
ゲルをDGS/PEO/FITC-標識HSAで前述の通りに調製した。ゲルを0.05M NaHCO3で洗浄し、洗液を、遠心分離により微粒子（ゲル）を除去した後、Cary 400 Bio UV-可視分光光度計で検査した。
【０１２２】
実施例7：DGSゲルの調製
DGS（0.50g、2.40mmol）を水（500μL、27.8mmol）に0℃で超音波処理しながら完全に溶解した。トリス緩衝液（500μL、10〜50mM、pH＝8.35）を加えた。溶液が流動性を失った時間をゲル化時間（tgel）として記録した。
【０１２３】
実施例8：DGS/PEOゲルの調製
PEO（MW＝100,000）をトリス緩衝液（1.0mL、10〜50mM、pH＝8.35）に溶解し、異なる濃度の溶液を調製した。DGS（0.50g、2.40mmol）を水（500μL、27.8mmol）に溶解し、完全に溶解するまで0℃で超音波処理した。PEO溶液（500μL）を加えた。ゾルを生成するために0.01〜0.08g/mLの濃度のPEO溶液を用いると、マクロ孔ゲルが生じた。溶液が完全に不透明になるのに要した時間を相分離時間（tps）として記録し、不透明相が流動性を失った時間をゲル化時間（tgel）として記録した（表1）。ゲル化後、ゲルを水（5mL）に12時間浸漬し、次いで新鮮な水中に保存するか、または室温で風乾した。BETデータを表10に示す。図7は、この実施例に記載のものと同様の様式で調製した、異なる濃度のPEOをドープしたDGSのゲル化時間を示すグラフである。
【０１２４】
実施例9：DGS/PEO/PPG-NH2ゲルの調製
PEO（0.5g、MW＝10,000）をリン酸緩衝液（1.0mL、5〜10mM、pH＝7.5〜8.5）に溶解し、PPG-NH2（0.5g、MW＝230）をリン酸緩衝液（1.0mL、5mM、pH＝7.5）に溶解し、PEO/PPG-NH2の異なる比の溶液を調製した（表9参照）。DGS（0.50g、2.40mmol）を水（500μL、27.8mmol）に溶解し、完全に溶解するまで0℃で超音波処理した。DGS溶液（200μL）をPEO/PPG-NH2溶液（60μL）と共に加えた。溶液が完全に不透明になるのに要した時間を相分離時間（tps）として記録し、不透明相が流動性を失った時間をゲル化時間（tgel）として記録した（表1および10）。ゲル化後、ゲルを水（5mL）に12時間浸漬し、次いで新鮮な水中に保存するか、または室温で風乾した。
【０１２５】
実施例10：DGS/ポリNIPAMゲルの調製
ポリNIPAMを水に溶解した（50mg NIPAM/1000μL H2O）。DGS（0.50g、2.40mmol）を水（500μL、27.8mmol）に0℃で超音波処理しながら完全に溶解した。次いで、ポリNIPAM溶液（500μL）を加え、溶液を徹底的に混合して、0.025g/mLのポリNIPAMを含むゾルを得た。ゲル化後、ゲルを水（10mL）に12時間浸漬し、次いで新鮮な水中に保存するか、または室温で風乾した。
【０１２６】
実施例11：DGS/PEO-NH2およびDGS/PEO/PPG-NH2の調製
PEO-NH2（MW＝3,400）をリン酸緩衝液（1.0mL、5〜50mM、pH＝7〜8.5）に溶解し、異なる濃度の溶液を調製した。DGS（0.50g、2.40mmol）を水（500μL、27.8mmol）に溶解し、完全に溶解するまで0℃で超音波処理した。PEO-NH2溶液（500μL）を加えた。ゾルを生成するために0.05g/mLよりも高濃度のPEO-NH2溶液を用いると、マクロ孔ゲルが生じた。溶液が完全に不透明になるのに要した時間を相分離時間（tps）として記録し、不透明相が流動性を失った時間をゲル化時間（tgel）として記録した。ゲル化後、ゲルを水（5mL）に12時間浸漬し、次いで新鮮な水中に保存するか、または室温で風乾した。
【０１２７】
同様の方法を用いて、PEOおよびPPG-NH2の両方をドープしたゲルを調製した。PEOおよびPPG-NH2のいくつかの保存水溶液を調製した（表9）。DGS（1.001g）を蒸留水（1mL）に溶解したDGSに約20分かけて超音波処理しながら溶解した。DGS溶液（200μL）に「ポリマー混合物」を撹拌しながら加えた。次いでゾルをゲル化させた（表10）。
【０１２８】
実施例12：蛋白質を取り込んだゲル
これらのゲルを、蛋白質（HSA）をDGS溶液に加える前にポリマー/緩衝溶液中に溶解する以外は、実施例8、10〜12に記載のとおりに調製した（10mg HSA/1000μL溶液、すなわち、0.5g DGS、5mg HSA、25mg PEO、1000μL水）。
【０１２９】
実施例13：熱重量測定分析を用いた、洗浄後にゲル中に残るPEOの量の算出
DGSおよびDGS/PEOモノリスを、相分離およびゲル化が起こった後に過剰の液体を流すことにより生成した。ゲルを水に浸漬することにより3回洗浄した（各回20mLの水で1日間浸漬）。ゲルはモノリスとして、または粉砕後に洗浄することもでき、同等の結果が得られた。洗浄したゲルを2日間風乾し、次いで1日よりも長く凍結乾燥した。試料を、まずドライアイスで冷却したフラスコ中で減圧にかけ、次いで室温で減圧にかけた。グラフは、洗浄後のゲルにおよそ24％のPEOが残っていることを示している（図10）。
【０１３０】
実施例14：示差走査熱量計を用いた、PEOのゲル中での構造の測定
DSCを用いて、DGSおよびDGS/PEOゲルの熱特性および構造を測定した（図11）。
【０１３１】
実施例15：ゲル内のHSAを調べるための共焦点顕微鏡画像
DGS（0.5g）、水（0.5mL）、およびPEO（0.05g PEO/1mL緩衝液（10mMトリス緩衝液）溶液0.5mL）ならびに0.750mL PEOおよび0.250mL標識HSAからなるFITC標識HSA溶液から調製したゲルをバイアルおよびペトリ皿に作成した。洗浄後、ゲル内の標識HSAの位置を、カミソリの刃を用いて調製した非常に薄いゲルのフィルムで、共焦点顕微鏡検査により調べた（図14）。
【０１３２】
実施例16：BET分析のためのゲルの調製
TEOS（0.5g）、HCl水溶液（pH1.6、0.024M溶液0.5mL）、およびトリス緩衝液（0.5mL、pH＝8.25）から調製した2つのゲルをBET分析のために作成し、それぞれゲル化時間6.5および6分であった。
【０１３３】
DGS（0.5g）、水（0.5mL）およびPEO（MW 100,000、0.05g/mL溶液0.5mL）から調製したゲルもBET分析のために作成し、それぞれ相分離時間3分およびゲル化時間7分であった。
【０１３４】
実施例17：UV-可視分光光度計によるゲルからのHSA損失の試験
ゲルをDGS/PEO/FITC標識HSAにより前述のとおりに調製した（すなわち、DGS 0.5g、H2O 500μL、PEO溶液［PEO MW 100000 50mg/10mMトリス緩衝液1000μL］750μL、FITC標識HSA溶液［HSA 10mg/10mMトリス緩衝液1000μL］1000μL）。これは1.5分で相分離し、3分でゲル化した。ゲルを0.05M NaHCO3 20mLで3回、各回24時間洗浄し、洗液をUV分光法で試験した。HSAピーク上のFITC標識によるピークの強度は、それぞれその後の洗浄によりはるかに小さくなった。しかし、洗液は微粒子が混入しており、これが分析法の感度を低下させた。したがって、蛋白質検出のローリー法も用いた53。フルオレセインイソチオシアネート（FITC、Aldrich）を用いて蛋白質を標識した。標識はpH9.5の炭酸緩衝液（0.05M）中、5℃で2時間行った。HSAのPEOによる希釈液およびHSAのトリス緩衝液による希釈液を調製して、フルオレセインを用いたHSA標準曲線を作成した。第一の組のゲルは、水0.5mL中のDGS 0.5g、ならびにHSA 10mgおよび様々な濃度のPEO（MW 100,000）1mLのHSA/PEO溶液0.5mLを含んでいた。ゲルを、ゲル調製日（第一洗液）、ゲル調製の翌日（第二洗液）、およびゲル調製の4日後（第三洗液）に洗浄（水で）した。洗液の蛋白質含有量を、下記のとおりローリー法を用いて定量した。
【０１３５】
ローリー法による蛋白質濃度の定量：
蛋白質5.0〜10.0mgをDGS 0.5gで調製したゲル内に取り込んだ。ゲル化後、5〜10mMリン酸緩衝液20mlを三回加え、ゲルを浸漬した。緩衝液は24時間毎に交換する。全ての洗液およびゲルを4℃の冷蔵庫に保存した。洗液をSigmaから証明された試薬（Sigma Protein Assay Kit、処理No. P5656）を用いてローリー法により測定した。標準曲線を、それぞれHSA、BSAおよびリゾチームを標準として用いてプロットした。測定は96穴プレートで、TECAN Safire吸光度/蛍光プレート読み取り器を用い、750nmの吸光度モードで操作して実施した。
【０１３６】
これらのデータは表7および8にそれぞれHSAおよびリゾチームについて報告しているが、PEO濃度が高い場合により多くの蛋白質が洗い流され、PPG-NH2は他のポリマーに比べて、はるかに有効で蛋白質を保持することが明らかである。
【０１３７】
実施例18〜20の材料と方法
化学物質
オルトケイ酸テトラエチル（TEOS、99.999％）はAldrich（オークビル、ON）から入手した。ジグリセリルシラン前駆体は下記のとおりにTEOSから調製した。ヒト血清アルブミン（HSA）、トリメトプリム、ピリメタミン、葉酸、ポリエチレングリコール（PEG/PEO、MW 2Kから100K）およびフルオレセインはSigma（オークビル、ON）から入手した。クマリンはMolecular Probes Inc.（ユージーン、OR）から入手した。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（大腸菌由来）はEric Brown教授（McMaster University）から提供された。融合シリカキャピラリー管（内径150〜250μm、外径360μm、ポリイミドコーティング）はPolymicro Technologies（フェニックス、AZ）から入手した。水は全てMilli-Q合成A10水精製システムを用いて蒸留および脱イオンした。他の試薬はすべて分析等級で、受け取ったままで用いた。
【０１３８】
DGSの調製
TEOSを蒸留して、残留水分があればそれを除去し、無水TEOS（2.08g、10.0mmol）およびグリセロール（1.84g、20.0mmol）のニート混合物を130℃で36時間加熱し、その間にEtOHを留去した。減圧下、140℃でEtOHおよび未反応の出発原料を完全に除去して、DGSを残留エタノールの混入がない固体化合物として得た。NMRによるDGSの構造の特徴付けおよびDGS由来シリカの性質は別に報告する45。
【０１３９】
カラムの調製
カラムの充填前に、モノリシックシリカカラムの吸着を促進するために、融合シリカキャピラリーの内部表面をAPTESでコーティングした。キャピラリーをまず3〜4倍量の1M NaOH；H2O；1M HCl；H2OおよびEtOHで洗浄した。この時点で、無水EtOH中の2％（v/v）APTES 1mLをカラムに充填し、110℃で12時間放置して反応させ、その後過剰のAPTESを水で洗浄し、キャピラリーを110℃で12時間乾燥した。
【０１４０】
シリカゾルを次の通りに調製した。まずDGS 1g（細かく粉砕した固体）をH2O 990μLおよび任意に1M HCl 10μLと混合し、15〜25分間の超音波処理後に約1.5mLの加水分解されたDGSを得た。加水分解されたDGSを、使用前に0.45μmシリンジを通してろ過し、微粒子を除去した。16％（w/v）PEO（MW＝10000）および0.6％（v/v）APTESを含む50mM HEPES（pH7.5）の第二の水溶液を調製した。この水溶液は、約20μMのDHFRも含んでいた。緩衝液/PEG/APTES/DHFR溶液100μLを加水分解されたDGS100μLと混合し、混合物をただちにシリンジポンプから融合シリカキャピラリー（長さ約2m、内径150〜250μm）に充填した。溶液の最終組成は、25mM HEPES緩衝液中8％w/v PEO（10K）、0.3％v/v APTESおよび10μM DHFRであった。混合物は約2〜3分でスピノダル分解（相分離）を起こし、その後シリカ重合が起こって（約10分）、取り込まれた蛋白質を含む水和マクロ孔モノリシックカラムを生成した。ゾル-ゲル混合物を充填後、モノリシックカラムを4℃で最低5日間エージングし、次いで使用前に長さ10cmに切断した。いくつかの場合には、カラム中のAPTESを最終濃度0.03％ポリアリルアミン（PAM、MW 17,000）または0.3％ジメチルジメトキシシラン（DMDMS）のいずれかと置換して、表面誘導体化の非選択的保持に対する硬化を調べた。
【０１４１】
シリカの形態の特徴付け
カラムの形態を、窒素吸着多孔度測定法（メソ孔の特徴付け）またはマクロ孔の特徴付けには走査電子顕微鏡（SEM）を用いて評価した。完全に乾燥したモノリスの孔径分析を、Quantachrome Nova 2200表面積/孔径分析器で実施した。分析前に、モノリスを大々的に洗浄して、取り込まれたグリセロールがあればこれを除去し、微粉末に粉砕し、凍結乾燥し、120℃で4時間ガス放出して、空気および粉末表面から結合水を除去した。-196℃の一定温度で窒素が吸着および脱着した際の、圧を測定した。得られた等温線の脱着ブランチを用いて、平均孔径および孔径の分布をBJH（バレット、ジョイナーおよびハレンダ）の計算により求めた54。キャピラリーを切断して新しい表面を曝露し、次いでこれを伝導度を改善するために減圧下で金フィルムによりコーティングすることにより、SEM分析を行った。撮像をJEOL 840 Scanning Electron Microscopeを用いて10kVで実施した。
【０１４２】
FAC/MS試験
フロンタルアフィニティークロマトグラフィーシステム/質量分析計システムを図15に示す。シリンジポンプ（Harvard Instruments PhD 2000）を用いて溶液を送達し、流動切り替えバルブを用いて、アッセイ緩衝液と化合物混合物を含む溶液との間を切り替えた。次いで、この溶液をポンプでカラムを通して流し、平衡化した。溶出液を適当な有機調節剤と混合して、安定なエレクトロスプレーおよびトリプル四重極MSシステム（Sciex API 3000）を用いてスプレーした成分の検出性を得るのを補助した。この配置により化合物導入における最大の柔軟性が可能になっている。FAC-MS法の安全操作には、カラムのヘッドに接続した二つの溶液間の頻繁な流動切り替えが必要である。Upchurchマイクロインジェクションバルブにより、操作中にシリンジの内容物を交換することができる。カラムはルアー-キャピラリーアダプター（Luer Adapter、Ferrule and Green Microtight Sleeve from Upchurch（P-659、M-100、F-185X））を用いてFACシステムに接続した。構成要素間の他の接続は全て、融合シリカ管を用いて行った。
【０１４３】
典型的FAC/MS実験は、空隙マーカーとしてのクマリンおよびフルオレセイン、葉酸（マイクロモル阻害剤）ならびにピリメタミンおよびトリメトプリム（nM阻害剤）を含む、各化合物1〜200nMを含む化合物の混合物の注入を含んでいた。最初の運転の前に、カラムに0.05M NH4OAc緩衝液（pH6.6、100mM NaCl）を異なる流速（1から5μL/分）で30分間流し、グリセロールおよび取り込まれていない蛋白質を除去し、次いで2mM NH4OAcにより異なる流速（1から5μL/分）で30分間平衡化した。試験した全ての化合物は2mM NH4OAc中にあり、シリンジポンプを用いて5μL/分の速度で送達した。10％（v/v）NH4OAc緩衝液（2mM）を含むメタノールからなる補給流（安定なエレクトロスプレーの生成を助けるために用いた）を5μL/分で送達した。質量分析計を多反応モニタリング（MRM：multiple reaction monitoring）モードでm/z 147_m/z 103（クマリン）、CE 25；m/z 249_m/z 177（ピリメタミン）、CE40；m/z 291_m/z 230（トリメトプリム）、CE 35；m/z 333_m/z 287（フルオレセイン）、CE 45およびm/z 442_m/z 295（葉酸）、CE 15の同時検出で操作した。
【０１４４】
カラム性能の特徴付け
蛋白質を含まない（ブランク）、活性DHFR 50pmol、使用前に煮沸により部分変性させたDHFR 50pmol、またはHSA 50pmol（選択性の対照）を含む、長さ10cmのカラムを調製した。全ての場合に、FAC/MS測定を、前述の5つの化合物混合物を用いて実施し、得られたフロンタルクロマトグラムを用いて化合物のカラムとの非選択的相互作用、結合の可逆性、カラムの再生能および取り込まれた蛋白質の浸出レベルを評価した。
【０１４５】
活性DHFRを含むカラムを、ピリメタミンまたはトリメトプリムのいずれかを用いて、分析物濃度の関数としての破過容量（流速に破過時間をかけることにより得た）をモニターすることにより、さらに特徴付けた。それぞれの場合に、データを下記の等式にあてはめた17：
2005536625.tif 000029
（式中、V0は空隙容量（μL）であり、Vは保持容量（μL）であり、[A]は分析物濃度（μM）であり、Kdはリガンドの蛋白質への結合常数（μM）であり、Btはカラム中の活性蛋白質の全ピコモルである）。
【０１４６】
実施例18：カラムの作成および最適化
バイオアイフィニティカラムを蛋白質に適合性の方法を用いて作ることは非常に重要で、したがって実行可能なモノリシックバイオアイフィニティカラムを作成するためにいくつかの問題に取り組んだ。モノリシックバイオアイフィニティカラムを開発する際の主要なゴールは下記であった：1）生体分子を活性体で取り込んだ生体適合性カラムマトリックスを生成すること；2）マクロ孔性を促進するために、カラム充填後であるがシリカ相のゲル化前にスピノダル組成を起こさせること；3）望ましくない流路を生じるカラムの収縮および亀裂を避けること；4）シリカゲル後の蛋白質浸出を最小限にすること；および5）小分子とシリカマトリックスとの間の非選択的相互作用を最小限にすること。このゴールを達成するために、シリカ前駆体（TEOS対DGS）、シリカ濃度（1〜10mol％）、ゲル化pH（5から8）、イオン強度（0から100mM）、ならびにPEOの濃度（2〜12％w/v）および分子量（2kDa〜100kDa）を含む、様々なパラメーターを最適化した。いくつかの組成物で実行可能なカラムができたが、最高の性能は、初期レベル3.3mol％のSiO2を含む蛋白質適合性前駆体DGS由来の組成物を用いた場合に得られた。これよりも低いレベルでは、カラムが移動相中にゆっくり溶解することになり、これよりも高いレベルでは、ゲル化が速すぎて、カラム充填が容易にできなかった。最適なゲル化条件は、4℃、pH約7、イオン強度25mMの緩和な条件下で達成された。最適なマクロ孔性は8％w/vの10kDa PEOを用いて得られた。相分離は分子量の値が10kDa以上で、分子量10kDa以上のPEOのレベル2％w/v以上で起こった。この組成物を用いてカラムを作成するために良好な均質性および再現性が得られたため、および高いレベルまたはPEOの分子量は、粘稠溶液を生じてカラムの充填が容易にできなかったため、10K PEOの最適レベル8％w/vを選択した。
【０１４７】
初期のカラムは未処理、NaOH、メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランまたは3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン処理したキャピラリーを支持体として用いていた。しかし、高い流速ではモノリスがキャピラリーから押し出されることがしばしば観察された。この問題を克服するために、キャピラリーの内部表面をAPTESで前処理し、これによりモノリスとキャピラリー表面との間に良好な結合が得られた。そのようなカラムでは、モノリスがキャピラリーから脱離することなく、500μL/分という高い流速を達成することができた。
【０１４８】
実施例19：カラムの特徴付け
図16は、DGS/PEO/APTESモノリシックシリカ固定相の走査電子顕微鏡画像を示している。A図は、コーティングしていないキャピラリーから押し出された内径1.0mmのカラムの画像を示し、シリカが自己支持モノリスを形成することを示している。B図は、シリカ骨格のマクロ孔性を示す、250μmキャピラリー中のモノリスの高拡大画像を示している。シリカマトリックスは、主に直径1〜2μmのシリカビーズで構成されているようで、互いに結合して連続的モノリスを形成している。空隙（貫通孔スペース）は直径数ミクロン程度で、低い背圧で液体の良好な流動を選るのに十分な空隙容量を提供する。全体に見て、カラムのマクロ孔性の形態はTanakaにより逆相カラムについて報告されたもの（骨格サイズ1〜2μm、貫通孔直径2〜8μm）と非常に類似しているようであるが、Tanakaのカラムの場合には、撮像前にPEOを熱分解で除去したことに留意することが重要である。
【０１４９】
内径150〜250μmのキャピラリーカラム内のモノリスをSEMにより撮像する試みにより、カラムを超高減圧（UHV）にすることでキャピラリー壁からモノリスが引き離されることが明らかとなった。UHVを避けるため、モノリスを明視野（brightfield）顕微鏡を用いて画像化した。図17は、緩衝液中3ヶ月間のエージング後の充填キャピラリー（内径250μm）の明視野画像を示しており（A図）、モノリスは脱離することなく、キャピラリーを完全に充填していることが明らかである。B図は、デシケーター中24時間保存後の同じモノリスを示している。取り込まれた水が除去されると、シリカモノリスは顕著に収縮し、亀裂および脱離を示している。これらの結果は、カラムの完全性を維持するには、カラムを湿潤状態に保存しなければならないことを示すものである。そのような保存条件は、取り込まれた蛋白質の活性を維持するためにも必要である。
【０１５０】
シリカ骨格内のメソ孔の形態を評価するために、BET測定を、PEOをドープした試料で行った（注：測定は熱分解していない試料についてのみ行った）。表11は、平均孔径、表面積およびカラム内のメソ孔が占める容積を示している。10kDa PEOを加えることにより、純粋なDGSに比べて表面積はわずかに減少するにすぎないが、PEOの存在は細孔（直径＜2nm）に比べてメソ孔（2〜50nm）の割合を劇的に高めることが明らかである。また、PEOを加えることにより、全孔容積の増大および平均孔径のわずかな増大も見られ、これらはいずれも流動性を幾分改善することになるはずである。SEMデータと合わせて考えると、カラムが所望のメソ/マクロ孔の形態を有することは明らかであるが、この時点では、発明者らはまだモノリシックシリカカラムの貫通孔サイズおよび骨格サイズを最適化していなかった。
【０１５１】
実施例20：バイオアイフィニティーカラムの性能
FAC/MSへの適用のためのバイオアイフィニティーカラムの開発における主な考察は、分析物のカラムマトリックスへの非選択的吸着を最低限にする一方で、取り込まれた蛋白質への選択的結合による化合物の保持を最大にすることである。図18は、ジメチルジメトキシシラン、アミノプロピルシランまたはポリ(アリルアミン)誘導体化シリカを含むカラムに対する、非修飾カラムのフロンタルクロマトグラフィ図を示している。これらの添加物により、荷電および非荷電添加物を調べることが可能になり、分析物とシリカとの相互作用を調節するために、カラムの疎水性を変更することが可能になった。A図に示すとおり、非修飾シリカはカチオン種（ピリメタミンおよびトリメトプリム）を保持する傾向があるが、アニオンまたは中性種は保持しない。DMDMSまたはPAMを加えても保持特性が著しく変わることはなかったが、これはおそらく、これらの添加物はカラムの性能を低下させずに用いることができるレベルが低いためであると考えられる。しかし、APTESは低いレベルでも、シリカマトリックスとカチオン性分析物との間の相互作用をほとんど完全に除去したが、アニオンおよび中性種の非選択的吸着を低い程度で保持しており、ゾル-ゲル系ガラス繊維アフィニティーカラムについてのZusmanによる以前の知見34と一致していた。より高レベルのAPTESはアニオン種の保持を引き起こし、したがって0.3％APTESが非選択的保持を最低限にするのに最適であることが判明した。おそらく、このレベルのAPTESは、APTESに関連するプロピル鎖のために幾分両親媒性である正味中性の表面を提供する。重要なことに、この表面は何ヶ月にもわたって非選択的保持を阻止する能力を維持し、APTESは組成物注で経時的に変化しない安定な表面コーティングを生成することを示していた。図19は、蛋白質を含まない、活性DHFR、部分変性させたDHFRまたはDHFR阻害剤に結合しない蛋白質であるHSAを含む、DGS/PEO/APTESカラムを通してのDHFR阻害剤および対照化合物の混合物の溶出について得たFAC/MSトレースを示している。ブランクカラムは、最初の数分以内にすべての化合物で予想された破過を示し、これは非選択的相互作用が最低限であることを示している。B図は、二つのDHFR阻害剤、トリメトプリム（Kd＝4nM、溶出時間39分）およびピリメタミン（Kd＝45nM、保持時間55分）の顕著な保持と、弱い阻害剤（葉酸、Kd＝11μM、溶出時間7分）の短い保持、ならびに非選択的リガンド（フルオレセイン、クマリン、保持時間2分）は保持されないことを示している。この結果は、DHFRがカラムに取り込まれた状態で活性であることを示しており、発明者らのグループが最近報告した、DGS由来材料中に取り込まれた場合のDHFRの良好な活性を示す結果44と一致している。取り込み前にDHFRを煮沸すると、すべてのDHFR結合リガンドは保持時間の著しい低下を示し、これは蛋白質の部分変性に矛盾しない。DHFRは非常に安定であることが知られており、DHFRの熱による変性は部分的に可逆的で55、したがって熱変性後でも部分的活性が保持されているのは意外ではないことに留意すべきである。二次対照として、取り込まれたHSAを含むカラムを試験し、D図に示すとおり、ブランクカラムで得た以上の結合は基本的に見られず、リガンドの保持はリガンドとDHFRとの間の選択的相互作用と一致する��とが示された。トリメトプリムおよびピリメタミンで予想された溶出時間の逆転（それぞれのKd値に基づいて）は、この時点では完全に理解されていないが、カラム上での化合物の全般的保持時間を決定する際に重要な役割を果たすと考えられる、オンオフ比の差に関係する可能性がある。このことは詳細に検討中で、別の報告で論じることになる。
【０１５２】
DHFRをドープしたカラムの特性をさらに調べるために、保持時間に対するリガンド濃度の影響を、ピリメタミンおよびトリメトプリムの両方で調べた。リガンドの濃度が上がるほど、カラムは所与の流速でより速く飽和すると予想され、したがって、化合物はより早く破過点に達すると予想される。分析物濃度に対して溶出容積をプロットすることにより、カラム上に直接固定化された蛋白質の量（Bt）および蛋白質の解離定数を求めることができる。図20は、様々な濃度のピリメタミンの破過曲線と、得られたV対[A]のプロットを示している。このデータから、カラム上の全蛋白質濃度は12pmolであり、Kdは47nMであることが導き出される。Kd値は基本的に溶液中の値（37nM）と等しく、DGS由来材料中に取り込まれたDHFRで得られた値（46nM）と非常に良く一致している44。トリメトプリムから得たデータでは、Kd値は21nMで、Bt値は7pmolであった（データは示していない）。DGS中のトリメトプリムのKd値は3nMで、したがって、阻害剤の親和性は以前に報告されたものよりも幾分低いが、まだnMの範囲内で、したがって高処理量スクリーニングにおける「当たり」と考えられる。Bt値は、当初存在した蛋白質の約75〜85％は変性した、接近不能である、またはカラムのコンディショニング中にカラムから除去されたことを示している。後者の可能性は、マクロ孔の著しい割合を考慮すれば、驚くことではなく、保持されている蛋白質画分はメソ孔で存在し、かつ/またはマクロ孔の表面に緊密に吸着されている可能性が示唆される。APTESでコーティングした表面がカチオン性またはアニオン性化合物のいずれとも強く相互作用しないらしいことを考慮して、発明者らは蛋白質が分析物にとって接近可能なメソ孔に取り込まれていると推測しているが、この時点では蛋白質の一部はマクロ孔の表面に関与している可能性を排除することはできない。
【０１５３】
図21は、同じバッチ内の（すなわち、同じキャピラリーから切断した）カラム間の再現性を示している。この場合、10cmのカラムを長さ1mのキャピラリーの中央部分から切断し、床体積の10倍量の緩衝液をカラムを通して洗浄し、グリセロールおよび緩く吸着した蛋白質があればそれを除去後、試験した。データはすべて、化合物をカラムに最初に流した際に得た。カラムがすぐれた再現性を示すことは明らかで、カラム間の相対標準偏差は5％未満の範囲内である。異なるバッチのカラム間の再現性はわずかに低く、RSD値はおよそ8％であった（データは示していない）。これらのデータは、カラムを作成するために用いるゾル-ゲル組成物および加工法によって再現性のあるカラム性能が得られ、異なるカラムから得たデータを直接比較することが可能となることを示唆している。このことは、4つの異なるカラムから得たデータを合わせて、r2＞0.998の信頼できるKdおよびBt値を出した、図6に示すデータによってもさらに支持される。
【０１５４】
図22は、より強い結合リガンド（ピリメタミンおよびトリメトプリム）を置換するために弱い親和性リガンド（葉酸）を用いた場合の、運転間の再現性（AおよびB図）およびカラムの再生可能性（C図）を示している。カラム再生後のピリメタミンの保持時間は60分から15分へと短くなる一方で、トリメトプリムの保持時間は40分から7分へと短くなる。したがって、強いリガンドのカラムへの結合は、基本的に蛋白質機能の不可逆的消失を引き起こし、これは強いリガンドの置換を助けるために過剰の弱いリガンドでカラムを洗浄した後も回復することはできない。同様の挙動が抗体を用いたカラムで報告されており、この場合は親和性が高い抗原またはハプテンの結合がカラム機能の不可逆的消失を引き起こす傾向がある13f。DHFRカラムを、chaeotropic試薬（3M KSCN）、変性剤（尿素または塩酸グアニジニウム）、またはpH変化などの代替法を用いて再生することは可能かもしれないが、いかなるそのような再生法も、取り込まれた蛋白質の少なくとも一部の不可逆的変性を引き起こし、これが次いで破過時間の変更を生じる可能性がある。
【０１５５】
実施例18〜20についての考察
前述のとおり、メソ/マクロ孔ゾル-ゲル系モノリシックバイオアイフィニティーカラムは、混合物中の特定の化合物を同定するための、フロンタルアフィニティークロマトグラフィーおよび質量分析検出を用いた化合物混合物のスクリーニングに理想的に適している。キャピラリーカラムをエレクトロスプレー（ESI）質量分析計に直接接続する能力は、新しいカラムの主要な利点であり、これらをFAC/MSを用いた化合物混合物のHTSに適合させる可能性がある。ビーズ系カラムとの直接比較は本試験では行わなかったが、モノリシックカラムは明らかに、容易なカラム充填および蛋白質充填の制御に関して利点を提供する。カラムは単純に、加水分解したシリカをポリマーおよび蛋白質をドープした緩衝液と混合し、スピノダル分解およびゲル化前に混合物をキャピラリーにポンプで送り込むことにより作成した。この1段階カラム作成法により、カラム間の良好な再現性が得られる。モノリシックカラムは、充填した蛋白質を活性体で25％まで保持した。モノリシックカラムは背圧も低く（材料のマクロ孔性による）、これにより溶出液のポンピングのために低圧シリンジポンプを用いることが可能になる。低圧および低流速で操作する能力は、モノリシックカラムを、流動を分割する必要なしに、ESI/MSへの直接接続に適用できるようにする。これにより感度が最大となり、したがって低レベルの化合物と、それ故少量の固定化蛋白質（約10pmol）を用いることが可能になる。この後者の点は、高価かつ/または存在量の少ない蛋白質をFAC/MSによるスクリーニングの標的として用いる場合に、非常に重要であると考えられる。ライブラリ化合物は、少量で同等に有用かつ利用可能となる可能性があり、この技術がより魅力的になる。
【０１５６】
新しいカラムの開発における主な利点の一つは、カラム作成のための生体適合性ゾル-ゲル前駆体DGSの使用である。発明者らの最近の研究により、DGSおよび関連する糖修飾シランは様々な蛋白質の活性を維持することができ、特にオルトケイ酸テトラエチルなどのアルコキシシラン由来材料中に取り込まれた場合に、容易に変性する蛋白質を安定化しうることが確証的に示された44。DGS加水分解の副生成物としてグリセロールが発生することにより、取り込まれた蛋白質はカラムのエージング中に活性体で維持され、さらにグリセロールは最初のカラム洗浄段階中にカラムから容易に除去され、グリセロールの質量分析計内への溶出が回避される。
【０１５７】
カラム最適化の一部として調べた主な問題は、化合物とシリカマトリックスとの相互作用によって起こりうる、非選択的保持のメチルの最小化であった。シリカは極性およびアニオン性であるため、発明者らの研究で見られたとおり、極性およびカチオン性化合物との相互作用が起こると予想される。カチオン性シランAPTESを用いてアニオン電荷を平衡化させることで、非選択的保持の顕著な低下が起こったが、同時に取り込まれた蛋白質の挙動における目立った変化は起こらなかった。APTESは、緩衝化PEO/蛋白質溶液に加えることで容易にカラムに取り込むことができ、レベルは出発緩衝液混合物中のAPTES濃度を変えることにより単純に調節できた。
【０１５８】
今後取り組むべき問題は再生可能性であるが、前述のとおり、この問題は高親和性リガンド結合後のイムノアフィニティークロマトグラフィーでは広範に認められ13a、取り込まれた蛋白質を不可逆的に変性することなく、結合したリガンドを解離することができる条件を特定するには、多大な努力が必要と考えられる。すべての可能性において、これらの条件はそれぞれの新しい蛋白質について最適化しなければならないと考えられる。幸運なことに、一つの長さのキャピラリーを用いて良好な再現性を備えたいくつかのカラムを調製することができ、したがってカラムを再生するよりも、各運転のために新しいカラムを単純に用い、必要があればカラム間の運転を比較してBtまたはKdデータを得ることができる。
【０１５９】
現行の研究は、可溶性酵素の取り込みに焦点を合わせてきたが、本明細書において用いたゾル-ゲル法は、膜結合酵素および受容体21、ならびに全細胞56さえも含む、広範囲の重要な薬物標的の取り込みにも適用可能である。さらに、DGS由来材料中への取り込みは、第Xa因子およびCox-IIなどの、他の方法では固定化が難しい、不安定な酵素の固定化を可能にする44。したがって、モノリシックカラムは、広範囲の有用な標的に対する化合物混合物のスクリーニングにおいて有用でありうる。
【０１６０】
本発明を前述の実施例に関して説明してきたが、本発明は開示された実施例に限定されないことが理解されるべきである。反対に、本発明は添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる様々な改変および等価の配列を対象とすることが意図される。
【０１６１】
すべての発行物、特許および特許出願は、各個別の発行物、特許または特許出願が具体的かつ個別にその全体が参照として本明細書に組み込まれると示されているのと同等に、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０１６２】
本明細書において言及された文書の全引用
2005536625.tif 000030
2005536625.tif 000031
2005536625.tif 000032
2005536625.tif 000033
2005536625.tif 000034
【０１６３】
（表１）TQ樹脂の調製
2005536625.tif 000035
aトリアルコキシシランは存在しなかったが、DGS：ソルビトールの比4：1であった。
b緩衝液添加後、ゾルを含む試験管をゲル化が起こるまで繰り返し傾斜させることにより判断して、溶液が流動しなくなる時間を意味する。
2005536625.tif 000036
cトリアルコキシシランは存在しなかったが、DGS：マルトースの比16：1であった。
【０１６４】
（表２）試料8および15の固体状態13Cおよび29Si CPMAS NMRスペクトルデータ
2005536625.tif 000037
【０１６５】
（表３）試料6〜11の平均移動度［25℃、(μ/s)/(V/cm)］
2005536625.tif 000038
aPBS＝リン酸緩衝液
【０１６６】
（表４）ゾル成分の関数としてのゲル化（tgel）相分離（tps）のタイミング
2005536625.tif 000039
aモノソルビチルシラン  bポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)
【０１６７】
（表５）DGS/PEOゲルのBET結果
2005536625.tif 000040
DGS 0.5g/H2O 500μL/PEO溶液（0.05g/1000μL）500μL
試料を粉砕し、水で3日間の洗浄を3回行った（各回20mLよりも多くの水で）。試料を24時間凍結乾燥し、100℃で6時間脱気した後、測定した。
【０１６８】
（表６）DGS由来シリカ中の残留PEO
2005536625.tif 000041
a PEOのMWを意味する；b 加えたPEOに基づいて計算；c 熱重量分析を用いて測定
【０１６９】
（表７）硬化後のシリカゲル洗浄により除去された蛋白質：HSAを取り込んだゲル
2005536625.tif 000042
【０１７０】
（表８）硬化後のシリカゲル洗浄により除去された蛋白質：リゾチームを取り込んだゲル
2005536625.tif 000043
【０１７１】
（表９）DGS/PEOおよびPPG-NH2からゲルを調製するために用いた溶液
2005536625.tif 000044
a分子量を意味する
【０１７２】
（表１０）DGS/PEOおよびPPG-DGS処方から調製したゲル
2005536625.tif 000045
【０１７３】
（表１１）いくつかのシリカ組成物のBETデータ
2005536625.tif 000046
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】グルコンアミド修飾したDGS由来シリカのFT-IRスペクトルを示す図である。
【図２】マルトンアミド修飾したDGS由来シリカのFT-IRスペクトルを示す図である。
【図３】固体状態13C CPMAS NMRスペクトルを示す図である：（a）8、（b）15。
【図４】固体状態29Si CPMAS NMRスペクトルを示す図である：（a）8、（b）15。
【図５】試料6〜15の45日間の収縮データを示す棒グラフである。
【図６】試料6から11の粉砕粒子の移動度測定を示す棒グラフである。
【図７】異なる分子量および異なる濃度のPEO溶液をドープしたDGSのゲル化時間を示すグラフである。白い記号はゲル化時間において透明なゲルを意味し、黒い記号はゲル化前の相分離を意味する。
【図８】ドーピング剤としてPPG-NH2およびPEOの両方を用い、DGSから調製したシリカの電子顕微鏡写真を示す図で、PPG-NH2の量が増加するにつれての形態の変化を示している；i）PEO/PPG-NH2＝1000/1  ii）（b）PEO/PPG-NH2＝1000/5および（c）PEO/PPG-NH2＝1000/10。
【図９】DGS/PEO由来シリカの電子顕微鏡写真を示す図である  A：相分離が完了することができなかった；B：完全な相分離およびゲル化の後；C：Bのクローズアップ。
【図１０】1：DGS、および2：DGS/PEO（0.5g DGS/500μL H2O/0.05g/ml PEO 100,000 MW溶液500μL）由来の、洗浄および凍結乾燥後のシリカモノリスのTGAを示す図である。
【図１１】A：DGS；B：DGS＋100000 MW PEO 由来シリカのDSCを示す図である。
【図１２】A：ドーピング剤としてポリNIPAMを用いて；B：ドーピング剤として末端Si(OEt)3基を有するPEOを用いて（どちらの場合も実験項参照）、DGSから調製したシリカゲルを示す図である。
【図１３】FITC標識したHSAの洗液のUV-可視スペクトルを示す図である。
【図１４】3回目の洗浄後に蛍光FITC-HSAにより取り込まれたPEO/DGSゲルの共焦点顕微鏡画像を示す図である。
【図１５】FAC/MSに用いた器具のケマティック（chematic）を示す図である。切替バルブを用いて緩衝液から緩衝液＋分析物に切り替え、分析物のカラムへの連続的注入を可能にする。PE/Sciex API 3000トリプル四極子質量分析計に直接流入する補給緩衝液の添加のために、カラムの出口を混合T字管に接続する。
【図１６】5日間のエージング後の、DGS/PEO/APTESを含むゾル-ゲル由来カラムのSEM画像を示す図である。A図：キャピラリー壁から引き離され、流動下でキャピラリーから除去された、1mmキャピラリー中で生成したモノリスの画像；B図：ゾル-ゲル由来モノリス内の二峰性孔分布を示す、250μmキャピラリー中のモノリスの拡大画像。
【図１７】緩衝液中3ヶ月間のエージング後（A図）、およびデシケーター中24時間保存後（B図）の充填キャピラリー（内径250μm）の明視野画像を示す図である。
【図１８】非選択的吸着に対する表面修飾の効果を示すFAC/MSデータを示す図である。A図：非修飾DGS/PEOモノリス；B図：0.3％ w/v DMDMSを含むDGS/PEOモノリス；C図：0.03％ w/v ポリ(アリルアミン）MW17,000を含むDGS/PEOモノリス；D図：0.3％ w/v APTESを含むDGS/PEOモノリス。すべてのクロマトグラフの溶出順序は、メトトレキセート、フルオレセイン、トリメトプリム、ピリメタミンである。
【図１９】蛋白質充填およびブランクDGS/PEO/APTESモノリシックカラムを用いて得た典型的FAC/MSトレースを示す図である。A図：蛋白質を含まないブランクカラム；B図：50pmolのDHFR（初期充填）を含むカラム；C図：初期充填50pmol熱変性DHFRを含むカラム；D図：初期充填50pmolのHSAを含むカラム。クマリン、ピリメタミン、トリメトプリムおよび葉酸を20nMで注入した。フルオレセインは100nMで注入した。すべてのトレースは化合物の破過後に得られた最大シグナルに対して正規化した。
【図２０】破過量に対するリガンド濃度の効果に基づくDHFRカラムのKdおよびBt値の決定を示す図である。A図：ブランクカラムに対する4つの異なるリガンド濃度でのFAC/MSトレースの重ね合わせ；B図：V対[A]のプロット。データは4つの個別のDHFR充填カラムおよび1つのブランクカラムで行った一回目の運転から得ていることに留意されたい。
【図２１】5つの化合物についてのカラム間の再現性を示す図である。AおよびB図は、1つの連続して充填されたキャピラリーから切断した2つの異なるカラムについて得たFAC/MSデータを示している。カラムに、2mM酢酸アンモニウム中に20nMクマリン、葉酸塩、トリメトプリムおよびピリメタミンならびに100nMフルオレセインを含む溶液を注入した。溶出順序は、クマリン（2.7および2.6分）、フルオレセイン（3.1および2.9分）、葉酸塩（8.9および8.4分）、トリメトプリム（37.2および41.4分）およびピリメタミン（56.7および61.4分）であった。
【図２２】初期充填50pmolのDHFRを含む、5日目のDGS/PEO/APTESカラムについて、運転間の再現性およびカラムの再生を示す図である。A図（一回目の運転）の溶出順序は、クマリン、フルオレセイン、葉酸塩、トリメトプリムおよびピリメタミンであった。B図では、カラムを2mM酢酸アンモニウムで再平衡化した後、30mM葉酸塩を40分間カラムに流し、緊密に結合した親和性分析物を置換した。次いで、C図では、カラムを2mM酢酸アンモニウムで再平衡化した後、FACを繰り返した。
【図１】
2005536625.tif 000061
【図２】
2005536625.tif 000062
【図３】
2005536625.tif 000063
【図４】
2005536625.tif 000064
【図５】
2005536625.tif 000065
【図６】
2005536625.tif 000066
【図７】
2005536625.tif 000067
【図８】
2005536625.tif 000068
【図９】
2005536625.tif 000069
【図１０】
2005536625.tif 000070
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2005536625.tif 000074
【図１５】
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【図１６】
2005536625.tif 000076
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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