(57)【要約】本発明は、一般に、慢性の免疫を介した炎症性疾患などの（しかし、これらに限定されない）炎症性の症状の影響を治療し、または防止し、またはさもなければ改善するための方法に関する。本発明は、さらに、1つまたは複数の炎症性のサイトカインを阻害し、および／または炎症性のサイトカインをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートする薬剤を含む薬学的組成物を提供する。このような組成物は、その他の慢性の免疫を介した炎症性疾患のなかで炎症性の関節炎などの炎症性の症状の治療および予防に有用である。本発明は、炎症性の症状の治療または予防に有用な薬剤の動態を研究し、および／またはスクリーニングするための動物モデルをさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の炎症性の症状を治療または予防するための方法であって、炎症性のサイトカインまたはその受容体の活性を阻害する薬剤、および／または該炎症性のサイトカインまたはその受容体をコードする遺伝子の発現レベルを減少させる薬剤の有効量を被検者に投与する段階を含む、方法。
【請求項２】
炎症性のサイトカインが、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）またはその機能的もしくは構造的な相同体である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
受容体が、顆粒球コロニー刺激因子受容体（G-CSFR）またはその構造的もしくは機能的な相同体である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
炎症性の症状が、関節炎または徴候的に関連した疾患である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
症状が慢性関節リウマチ（RA）である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
症状がコラーゲン誘導性関節炎（CIA）である、請求項4記載の方法。
【請求項７】
被検者が動物または鳥類の種である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
動物が哺乳類である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
哺乳類が霊長類である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
霊長類がヒトである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
哺乳類が齧歯類である、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
齧歯類がマウスである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
薬剤がサイトカインまたはその受容体に対して生じた抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
薬剤がG-CSF、G-CSFR、またはその一部もしくは免疫学的な関係物に対して生じた抗体である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項13または14記載の方法。
【請求項１６】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項l3または14記載の方法。
【請求項１７】
薬剤が可溶性G-CSFRまたはその機能的な相同体、類似体、もしくは誘導体である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
薬剤がG-CSFの化学的類似体である、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
薬剤がG-CSFRの化学的類似体である、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
薬剤がタンパク質である、請求項17〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
薬剤が核酸である、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
核酸がDNAまたはRNAであり、センスもしくはアンチセンスポリヌクレオチド配列、またはG-CSFもしくはG-CSFRもしくはその一部もしくはその転写物をコードする遺伝子配列を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
炎症性のサイトカインまたはその受容体の活性を阻害する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、該炎症性のサイトカインまたはその受容体と推定上の阻害剤を接触させる段階を含み、薬剤が、該サイトカインまたはサイトカイン受容体と結合すること、またはそうでなければ会合することによって阻害剤として同定される、方法。
【請求項２４】
炎症性サイトカインまたはその受容体をコードする遺伝子配列の発現を調節する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、炎症性サイトカインまたはその受容体をコードする該遺伝子配列と推定上の調節性の薬剤を接触させる段階を含み、薬剤が、該サイトカインまたはサイトカイン受容体をコードする遺伝子配列と結合すること、またはさもなければ会合することによって調節性の薬剤として同定される、方法。
【請求項２５】
炎症性のサイトカインが、G-GSFまたはその機能的もしくは構造的な相同体である、請求項23または24記載の方法。
【請求項２６】
受容体がG-CSFRまたはその機能的もしくは構造的な相同体である、請求項23または24記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子配列が、G-CSFをコードするエキソンおよび／またはイントロンを含む遺伝子配列、またはG-CSFRをコードするエキソンおよび／またはイントロンを含む遺伝子配列、またはそのプロモーターもしくはエンハンサー領域である、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
被検者において炎症性のサイトカインまたはその受容体の活性を阻害し、および／または被検者において該炎症性のサイトカインまたはその受容体をコードする遺伝子の発現レベルを減少させる薬剤を、薬学的に許容される担体または希釈液と共に含む薬学的組成物。
【請求項２９】
炎症性のサイトカインが、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）またはその機能的もしくは構造的な相同体である、請求項28記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
受容体が顆粒球コロニー刺激因子受容体（G-CSFR）またはその構造的もしくは機能的な相同体である、請求項28または29記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
炎症性の症状が、関節炎または徴候的に関連した疾患である、請求項28〜30のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
症状が慢性関節リウマチ（RA）である、請求項31記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
症状がコラーゲン誘導性関節炎（CIA）である、請求項32記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
被検者が動物または鳥類の種である、請求項28記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
動物が哺乳類である、請求項34記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
哺乳類が霊長類である、請求項35記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
霊長類がヒトである、請求項36記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
哺乳類が齧歯類である、請求項34記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
齧歯類がマウスである、請求項38記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
薬剤がサイトカインまたはその受容体に対して生じた抗体である、請求項28記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
薬剤がG-CSF、G-CSFR、またはその一部もしくは免疫学的な関係物に対して生じた抗体である、請求項40記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項40または41記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項40または41記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
薬剤が可溶性G-CSFRまたはその機能的な相同体、類似体、もしくは誘導体である、請求項28記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
薬剤がG-CSFの化学的類似体である、請求項28記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
薬剤がG-CSFRの化学的類似体である、請求項28記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
薬剤がタンパク質である、請求項44〜46のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
薬剤が核酸である、請求項28記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
核酸がDNAまたはRNAであり、センスもしくはアンチセンスポリヌクレオチド配列、またはG-CSFもしくはG-CSFRもしくはその一部もしくはその転写物をコードする遺伝子配列を含む、請求項48記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
請求項20〜22のいずれか1項において詳述した薬剤をコードする遺伝子配列を含むベクターであって、該遺伝子配列は、動物で動作可能なプロモーター配列に対して動作可能な状態で接続されているベクター。
【請求項５１】
請求項50記載のベクターを含む動物細胞。
【請求項５２】
請求項51記載の細胞を含む動物。
【請求項５３】
請求項51または52記載の動物またはこれらの細胞であって、該動物またはこれらの細胞は、マウスまたはマウス細胞である動物またはこれらの細胞。
【請求項５４】
請求項51または52記載の動物またはこれらの細胞であって、該動物またはこれらの細胞は、ヒトまたはヒト細胞である動物またはこれらの細胞。
【請求項５５】
ポジティブまたはネガティブ選択可能なマーカーの側面に位置するG-CSFもしくはG-CSFR、またはこれらの断片をコードする遺伝的物質の2つのセグメントを含む、細胞内でG-CSFまたはG-CSFRをコードする遺伝子を不活性化するために有用なターゲッティングベクターまたはマーカー交換突然変異誘発ベクター。
【請求項５６】
請求項30記載のベクターまたは該ベクターの一部を含む、遺伝子改変された動物細胞。
【請求項５７】
細胞が胚幹細胞である、請求項30または31記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項５８】
請求項31または32記載の細胞の1つまたは複数を含むか、またはそれに由来する、遺伝子改変された動物または胚であって、該動物は、同じ種の遺伝子改変されていない動物と比較して少ない量のG-CSFまたはG-CSFRを産生する、動物または胚。
【請求項５９】
動物がマウスである、請求項33記載の遺伝子改変された動物、または請求項31もしくは32記載の細胞。
【請求項６０】
動物がヒトである、請求項33記載の遺伝子改変された動物、または請求項31もしくは32記載の細胞。
【請求項６１】
請求項31または32記載の遺伝子改変された細胞を産生する方法であって、該方法は、請求項30記載のベクターを1つまたは複数の胚幹（ES）細胞に導入する段階、および選択可能なマーカー遺伝子の発現について選択する段階を含み、生じる形質転換細胞のG-CSFおよび／またはG-CSFR遺伝子は、該ベクターとの相同組換えによって不活性化される、方法。
【請求項６２】
G-CSFの活性を阻害し、および／またはG-CSFRとG-CSFの相互作用を阻害し、これにより炎症の影響を改善することができる薬剤を同定するためのインビボ方法であって、該方法は、請求項33〜35のいずれか一項記載の動物に対して推定上の阻害剤を投与する段階を含み、該薬剤は、同じ種の野生型動物において検出可能な生理作用を有するが、G-CSFおよび／またはG-CSFRの発現減少を示す請求項33〜35のいずれか一項記載の動物において影響の減少を有する薬剤によって、G-CSFまたはG-CSFRとの相互作用力を有するとして同定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、慢性の免疫を介した炎症性疾患などの（しかし、これらに限定されない）炎症性の症状の影響を治療し、または防止し、またはさもなければ改善するための方法に関する。本発明は、さらに、1つまたは複数の炎症性のサイトカインを阻害し、および／または炎症性のサイトカインをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートする薬学的組成物を含む薬剤を提供する。このような組成物は、その他の慢性の免疫を介した炎症性疾患の中で炎症性の関節炎などの炎症性の症状の治療および予防に有用である。本発明は、炎症性の症状の治療または予防に有用な薬剤の動態を研究し、および／またはスクリーニングするための動物モデルをさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本明細書において提供された参照の書誌的な詳細は、明細書の終わりの一覧表に記載してある。
【０００３】
この明細書におけるいずれの参照も、この従来技術が、いずれの国においても一般的な一般知識を形成することを示差する承認または何らかの形式として考慮されず、かつされるべきではない。
【０００４】
顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF、CSF-3遺伝子によってコードされる）は、顆粒球の産生を調節する造血成長因子である（Nicolaら、Nature 314：625, 1985；Metcalf, International Journal of Cancer 25：225, 1980；Nicolaら、Journal of Biological Chemistry 258：9017, 1983）。G-CSFは、顆粒球コロニー刺激因子受容体（G-CSFR、CSFR-3遺伝子によってコードされる）（I型サイトカイン受容体スーパーファミリーのメンバー）との相互作用によってその効果を媒介する（Demetriら、Blood 78：2791-2808, 1991）。ヒトおよびマウスにおけるG-CSFの主要な生物活性には、骨髄からの好中球の産生を増大することおよび放出すること（Souzaら、Science 232：61, 1986；Lordら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：9499-9503, 1989）、髄から末梢血への造血前駆細胞を移動させること（Bungartら、British Journal of Haematology 22：1156, 1990；de Haanら、Blood 86：2986-2992, 1995；Robertsら、Blood 89：2736-2744, 1997）、並びに成熟した好中球の分化およびエフェクター機能を調整すること（Yongら、European Journal of Haematology 49：251-259, 1992；Colottaら、Blood 80：2012-2020, 1992；Rexら、Transfusion 35：605-611, 1995； Gerickeら、Journal of Leukocyte Biology 57：455-461, 1995；Xuら、British Journal of Haematology 93：558-568, 1996；Yong, British Journal of Haematology 94：40-47, 1996；Jacobら、Blood 92：353-361, 1998）を含む。G-CSFは、好中球減少、並びに自己および同種間の幹細胞移植のための造血性幹細胞（HSC）の動員を治療するために使用される（Welteら、Blood 88：1907-1929, 1996）。
【０００５】
HSC動員のためのG-CSFの使用は、慢性関節リウマチ（RA）の悪化を引き起こし得る（Snowdenら、Bone Marrow Transplantation 22：1035-1041, 1998）。G-CSFは、コロニー刺激因子、GM-CSF、およびM-CSFとともに、インビトロでIL-1およびTNFに応答してヒト滑膜の線維芽細胞および軟骨細胞によって産生され（Leizerら、Blood 76：1989-1996, 1990；Hamiltonら、Blood 79：1413-1419, 1992）、G-CSFは、RA患者の血清および滑液中に見いだされた（Tanabeら、Rheumatology International 16：67-76, 1996；Nakamuraら、Clinical and Experimental Rheumatology 18： 713-718, 2000）。G-CSFの全身投与は、マウスのコラーゲンで誘導される関節炎（CIA）を悪化させ、DBA/1マウス（Campbellら、Journal of Leukocyte Biology 68：144-150, 2000）、並びにラットのCIAの受動的な伝播モデル（Miyaharaら、Clinical Immunology and Immunopathology 69：69-76, 1993）における疾患の重篤さおよび発病率を増大させることが示された。G-CSFトランスジェニックマウスは、骨吸収が増大され、骨形成が減少されており（Takahashiら、Laboratory Investigation 74：827-834, 1996）、G-CSFは、骨代謝回転において役割を担っているであろうことを示す。
【０００６】
G-CSFは、単球／マクロファージ・サブセットを拡大し、マウスを内毒血症から保護することができる抗炎症性のサイトカインを誘導し得る（Gorgenら、Journal of Immunology 149：918, 1992）。また、G-CSFは、ヒトおよびマウスの両者において、同種間および分裂促進的なT細胞応答を障害すること（Fosterら、Transplantation 59：1557, 1995；Panら、Blood 86：4422, 1995）、およびTh2サイトカイン産生の方へのT細胞サイトカイン・プロフィールの変化を引き起こし、対応してTh1 IFN-γ発現を減少させること（Panら、1995、前記；Franzkeら、Blood 102：734-739）が報告された。マウスの研究では、このTh2サイトカイン産生への偏りが、急性移植片対宿主病、実験的な自己免疫性の脳脊髄炎（EAE）、および自然全身性エリテマトーデスに対する保護と関係していた（Panら、1995,前記：Zavalaら、Journal of Immunology 163：5125-5132, 1999；Zavalaら、Journal of Immunology 168：2011-2019, 2000）。G-CSFを欠損したマウスは、好中球を介した糸球体腎炎から保護されていたが、T細胞／マクロファージを介した糸球体腎炎では保護されなかった（Kitchingら、Journal of the American Society of Nephrologh 13：350-358, 2000）。
【０００７】
従って、G-CSFは、機能の範囲で多面的な分子である。これらの機能をより完全に特徴づけ、これらの機能の調整によって健康利益に導くことができるかどうかを解明する必要がある。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本明細書を通じて、前後関係から他に必要でない限り、「含む」の語または「含む」もしくは「含むこと」などのバリエーションは、述べられたエレメントもしくは整数、またはエレメントもしくは整数の群を含むことを意味するが、その他のいずれのエレメントもしくは整数、またはエレメントもしくは整数の群も除外しないことが理解されるであろう。
【０００９】
好中球の役割を関節炎のマウスのモデルで研究された。マウスのモデルには、好中球を除去するための抗体の使用、並びにG-CSFノックアウトマウスの使用を含んだ。これらのマウスは、急性関節炎の誘導に対して非常に抵抗性であることが証明されたが、この効果は、好中球数が少ないことによっては説明されないようであった。同様に、G-CSFは、局所投与によって関節炎を直接誘導することができること、および急性関節炎のモデルのIL-1の代わりに全身性のG-CSFを使用することができることが見いだされた。
【００１０】
コラーゲンで誘導される関節炎（CIA）は、慢性関節リウマチ（RA）の病因を調査するため、および予想される治療の評価のために広く使用される慢性自己免疫モデルである。慢性関節疾患において内因性G-CSFが必要であることを検査するために、G-CSF-/-および野生型（WT）マウスに、完全フロイントアジュバント（CFA）中のニワトリII型コラーゲン（CII）を免疫してCIAを誘導した。G-CSFを欠損したマウスでは、顕著な疾患からの保護があり、CIAにおけるG-CSFの主要な役割が同定された。CIIに対するT細胞応答は、G-CSFノックアウトマウスで正常であった。
【００１１】
ひとまとめにすると、これは、内因性のG-CSFが炎症性の関節炎において主要な役割を果たすことを示す。G-CSF活性をダウンレギュレートすること、局所的もしくは全身的に、またはG-CSFのレベルを減少させること、またはG-CSF受容体（G-CSFR）を阻害すること、もしくはダウンレギュレートすることは、慢性炎症性の関節炎および慢性関節リウマチまたはその他の慢性の免疫を介した炎症性疾患症状などの炎症性の症状の重篤さを治療または減少させるための有用な機構であることが提唱される。
【００１２】
従って、本発明は、G-CSFまたはその機能的な同等物もしくは相同体またはその受容体（G-CSFR）などの（しかし、これらに限定されない）炎症性のサイトカインの活性を阻害するまたはそのレベルを減少させる薬剤を被検者に対して投与することによって、炎症性の症状を予防および／または治療するための方法を想定する。
【００１３】
G-CSFに対する中和モノクローナル抗体（mAb）の投与の治療上の有効性を急性関節炎モデルで試験した。急性関節炎の間にG-CSFを阻害すると、BMにおける骨髄球系統の細胞の用量依存的な減少、末梢血中の好中球の減少、および関与する関節における細胞浸潤の減少を生じた。
【００１４】
本発明は、G-CSFおよび／またはその他の炎症性のサイトカインおよび／またはこれらの受容体をコードする遺伝子の活性を阻害するか、またはその発現をダウンレギュレートする薬剤およびこのような薬剤を含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、慢性炎を研究するための動物モデル、および炎症性の関節炎などの炎症性の症状の治療および／または予防に有用な薬剤のスクリーニングにおけるその使用をさらに提供する。
【００１６】
本明細書に使用される略語のリストを表1に提供してある。
【００１７】
（表１）略語
2005536535.tif 000002
2005536535.tif 000003
【００１８】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、一部において、炎症プロセスにおける炎症性のサイトカインの役割をさらに解明することを内包する。より詳細には、G-CSFの役割は、慢性の免疫を介した炎症などの炎症性の症状に対して効果を有することが想定される。本発明によれば、従って、炎症性のサイトカインの活性を局所的または全身的に阻害し、および／または炎症性のサイトカインをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることは、炎症性の症状の治療または予防に有用であることが提唱される。
【００１９】
従って、本発明の一つの側面は、動物または鳥類の種において炎症性の症状を治療または予防するために方法であって、該方法は、該動物または鳥類の種に対して炎症性のサイトカインもしくはその受容体の活性を阻害する薬剤、および／または該炎症性のサイトカインもしくはその受容体をコードする遺伝子の発現レベルを減少させる薬剤の有効量を投与することを含む方法を想定する。
【００２０】
本発明は、特にG-CSFおよびその相同体および誘導体に向けられる。「G-CSF」またはその完全な名称「顆粒球コロニー刺激因子」に対する言及は、その相同体および誘導体を含む。「相同体」または「誘導体」は、G-CSFの多形性の変種を含む。また、本明細書におけるG-CSFに対する言及は、その他の炎症性のサイトカインにあてはまるものとして解釈してもよい。
【００２１】
従って、もう一つの本発明の側面は、動物または鳥類の種における炎症性の症状の治療および／または予防のための方であって、該方法は、該動物に対して、G-CSFの活性を阻害し、および／またはG-CSFもしくはG-CSFRをコードする遺伝子の発現レベルを減少させる薬剤を投与することを含む方法を提供する。
【００２２】
上記のように、「G-CSF」に対する言及は、その相同体およびその誘導体を含む。投与は、全身的または局所的であってもよい。局所投与は、特に関節炎などの局在化しているか、または炎症性の症状の治療に有用である。しかし、G-CSFは、造血細胞に対して効果を及ぼす可能性が高いので、全身投与も一般の免疫系を調整するために有用であろう。「全身的」に対する言及は、関節腔内、静脈内、腹腔内、皮下、およびくも膜下腔内の投与、並びに経口、直腸、鼻のルートを経た投与を含む。
【００２３】
「炎症性の症状」の用語は、その最も幅広い状況に使用されるが、特に免疫系を媒介された炎症性の症状を含む。特に重要な態様において、炎症性の症状は、慢性関節リウマチ（RA）を含む炎症性の関節炎である。
【００２４】
従って、好ましい態様において、本発明は、動物または鳥類の種における炎症性の関節炎またはその他の慢性の免疫を介した炎症性の症状の治療および／または予防のための方法であって、該方法は、該動物または鳥類の種に対して、G-CSFもしくはG-CSFRの活性を阻害し、および／またはG-CSFもしくはG-CSFRをコードする遺伝子の発現レベルを減少させる薬剤を投与することを含む方法を想定する。
【００２５】
好ましい動物は、ヒトおよびその他の霊長類などの哺乳類、家畜動物（たとえば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、臨床検査動物（たとえば、ウサギ、マウス、ハムスター、モルモット）、伴侶動物（たとえば、イヌ、ネコ）、および捕えられた野生動物である。鳥類の種は、家禽鳥（たとえば、ニワトリ、カモ、ガチョウ、シチメンチョウ、チャボ）、猟鳥（たとえば、カモ、エミュー、キジ）およびケージ内の鳥類を含む。ヒトは、霊長類で最も好ましい動物である。ウマは、家畜動物で特に好ましい。
【００２６】
従って、好ましい態様において、本発明は、ヒトの炎症性の症状の治療および／または予防のための方法であって、該方法は、該ヒトに対してG-CSFもしくはG-CSFRの活性を阻害し、および／またはG-CSFもしくはG-CSFRをコードする遺伝子の発現レベルを減少させる薬剤を投与することを含む方法を提供する。
【００２７】
薬剤は、タンパク質、非タンパク質（たとえば、化学成分）、または核酸分子であってもよい。
【００２８】
タンパク質および非タンパク質の分子は、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質、小さな、中間の、または大きな化学分子、並びに天然物スクリーニングまたは化学的ライブラリーのスクリーニングから同定された分子を含む。天然物スクリーニングは、植物、微生物、土壌河床、珊瑚、水性環境、および地球外の環境からの抽出物または試料を、G-CSF活性もしくはG-CSFの遺伝子発現レベルに対して影響を有する分子または分子群に対してスクリーニングすることを含む。また、これらの分子は、G-CSF/G-CSFRの相互作用に影響を及ぼしてもよい。
【００２９】
薬剤の1つの例は、G-CSFもしくはG-CSFRまたはこれらのエピトープに対する抗体である。これは、全身的または局所的に使用することができる。
【００３０】
モノクローナル抗体の使用は、多量にこれらを産生する能力および産物の均質性のために、特に好ましい。モノクローナル抗体の産生のための、不死化株化細胞と免疫原性標品に対して感作されたリンパ球を融合することに由来するハイブリドーマ株化細胞の調製は、当業者に周知の技術によって行うことができる（たとえば、Douillard and Hoffman, Basic Facts about Hybridomas, in Compendium of Immunology Vol. II, ed. by Schwartz, 1981； Kohler and Milstein, Nature 256：495-499, 1975；Kohler and Milstein, European Journal of Immunology 6：511-519,1976を参照されたい）。
【００３１】
有用な薬剤のもう1つの例は、膜結合G-CSFRとのG-CSFの相互作用と競合するG-CSFRの可溶性形態である。
【００３２】
または、薬剤は、これらがG-CSFまたはG-CSFRの遺伝物質に結合する能力についてスクリーニングすることができる。一つの態様において、G-CSFもしくはG-CSFRをコードするcDNAまたはゲノムDNAまたはmRNA転写物またはESTもしくはSAGEタグなどのこれらの部分は、ナノ粒子または微粒子などの固体担体に固定される。次いで、潜在的な薬剤を固定された核酸分子と接触させて、放射、放出、原子励起、質量、および／または密度の変化によって結合を検出する。
【００３３】
一旦同定したら、薬剤を核酸分子から溶出させて、さらに詳細に特徴づける。たとえば、G-CSF/G-CSFR遺伝物質と結合する薬剤は、発現（転写および／または翻訳）を阻害するであろう。
【００３４】
本発明は、G-CSFまたはその受容体のアンタゴニストとして、G-CSFまたはG-CSFRの化学的類似体を使用することをさらに想定する。上記のように、可溶性G-CSF受容体を使用してもよい。
【００３５】
本明細書において想定される化学的類似体は、側鎖の修飾、非天然のアミノ酸、および／またはペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質合成の間のこれらの誘導体の組み込み、並びに架橋剤およびタンパク質の分子またはこれらの類似体に対して高次構造上の制約を課すその他の方法の使用を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明によって想定される側鎖修飾の例は、アルデヒドとの反応に続きNaBH4での還元による還元アルキル化などによるアミノ基の修飾；メチルアセチミダートによるアミジン化；無水酢酸によるアシル化；シアナートによるアミノ基のカルバモイル化；2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸およびテトラヒドロフタル酸の無水物によるアミノ基のアシル化；およびピリドキサール-5-ホスフェートによるリジンのピリドキシル化に続く、NaBH4による還元を含む。
【００３７】
アルギニン残基のグアニジン基を2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサール、およびグリオキサールなどの試薬で複素環式縮合物を形成することによって修飾してもよい。
【００３８】
カルボキシル基は、O-アシルイソウレアの形成を経たカルボジイミドの活性化に続く、その後の、たとえば対応するアミドに対する誘導体化によって修飾してもよい。
【００３９】
スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸に対する過ギ酸酸化；その他のチオール化合物による混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸、またはその他の置換されたマレイミドとの反応；4-塩化安息香酸水銀、4-クロロ水銀フェニルスルホン酸、フェニルクロロ水銀、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、およびその他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成；アルカリ性pHでのシアナートによるカルバモイル化などの方法によって修飾してもよい。
【００４０】
トリプトファン残基は、たとえばN-ブロモコハク酸イミドによる酸化または2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドもしくはスルフェニルハロゲン化物によるインドール環のアルキル化によって修飾してもよい。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化によって変化させて、3-ニトロチロシン誘導体を形成させてもよい。
【００４１】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカルボネートによるN-カルボエトキシル化によって達成してもよい。
【００４２】
非天然のアミノ酸およびペプチド合成の間の誘導体の組み込みの例は、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のD-アイソマーの使用を含むが、これらに限定されない。本明細書において想定される非天然のアミノ酸の一覧を表2に示してある。
【００４３】
（表２）
2005536535.tif 000004
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【００４４】
たとえば（CH2）nスペーサー基（n=1〜n=6）を有する二官能性のイミドエステル、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ二官能性の架橋剤、並びに通常N-ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応性の部分およびマレイミドまたはジチオ部分（SH）またはカルボジイミド（COOH）などのもう一つの基の特異的に反応する部分を含むヘテロ官能性試薬を用いて、3D高次構造を安定化するために、架橋剤を使用することができる。加えて、ペプチドは、たとえばCαおよびNα-メチルアミノ酸の取り込み、アミノ酸のCαとCβ原子の間の二重結合の導入、N末端とC末端の間、2つの側鎖の間、または側鎖とN末端もしくはC末端の間のアミド結合を形成することなどの共有結合を導入することによる環状ペプチドまたは類似体の形成によって高次構造的に拘束することができる。
【００４５】
RNAまたはDNAなどの核酸分子は、特にアンチセンスまたはセンスを介した機構によって遺伝子サイレンシングを誘導するために有用である。また、センスを介した遺伝子サイレンシングは、コサプレッションともいわれ、RNAiの誘導を含む機構の範囲も含む。
【００４６】
「核酸」、「ヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」の用語は、RNA、cDNA、ゲノムDNA、合成の形態、並びにセンス鎖およびアンチセンス鎖の両者の混合重合体を含み、化学的もしくは生化学的に修飾されてもよく、または当業者によって容易に認識されるであろう非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。このような修飾は、たとえばラベル、メチル化、1つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの類似体（モルフォリン環などの）との置換、荷電されない結合（たとえば、メチルホスホネート、リン酸トリエステル、ホスホアミダート、カルバメート、その他）、荷電された結合（たとえば、ホスホロチオネート、ホスホロジチオネート、その他）、ペンダント部分（たとえば、ポリペプチド）、インターカレータ（たとえば、アクリジン、ソラレン、その他）、キレート剤、アルキル化剤、および修飾された結合（たとえば、α-アノマー核酸、その他）などのヌクレオチド間修飾を含む。また、ポリヌクレオチドの水素結合およびその他の化学相互作用を経て指定された配列に対してこれらが結合する能力を模倣する合成分子も含まれる。このような分子は、当該技術分野において既知であり、たとえばペプチド結合により、分子のバックボーンのリン酸結合を置換するものを含む。
【００４７】
アンチセンス・ポリヌクレオチド配列は、たとえばG-CSF遺伝子配列またはG-CSFR遺伝子配列の転写物のサイレンシングに有用である。さらに、G-CSF遺伝子座位の全てまたは一部を含むポリヌクレオチド・ベクターをセンスまたはアンチセンスの向きのいずれかでプロモーターの制御下に配置して、細胞に導入してもよい。このようなセンスまたはアンチセンス構築物の細胞内での発現は、標的の転写および／または翻訳を妨害する。さらに、コサプレッション（すなわち、センス-サプレッションを使用する）およびRNAiまたはsiRNAを誘導する機構を使用してもよい。または、アンチセンスまたはセンス分子を直接投与してもよい。この後者の態様において、アンチセンスまたはセンス分子は、組成物中に処方し、次いで標的細胞にいかなる数の手段によって投与してもよい。
【００４８】
アンチセンスおよびセンス分子のバリエーションには、モルフォリンヌクレオチド誘導体およびホスホロジアミデート結合から成るオリゴヌクレオチドであるモルフォリノ（たとえば、Summerton and Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 7：187-195, 1997）の使用を含む。このような化合物を胚に注入し、mRNAに対する妨害の効果が観察される。
【００４９】
一つの態様において、本発明は、G-CSFまたはG-CSFRをコードする核酸分子の機能または効果の調整に使用されるオリゴヌクレオチドおよび同様の種、すなわち転写または転写後の遺伝子サイレンシングを誘導するオリゴヌクレオチドなどの化合物を使用する。これは、阻害剤をコードする1つまたは複数の核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することによって達成される。オリゴヌクレオチドは、細胞に直接提供されてもよく、または細胞内で作製してもよい。本明細書に使用されるものとして、「標的核酸」および、「G-CSFまたはG-CSFRをコードする核酸分子」の用語は、便宜上、コードするDNA、このようなDNAから転写されるRNA（プレmRNAおよびmRNAまたはこれらの部分を含む）、更にはこのようなRNAに由来するcDNAを含めるために使用した。本発明の化合物とその標的核酸のハイブリダイゼーションは、一般に「アンチセンス」と呼ばれる。従って、本発明のいくつかの好ましい態様の実施に含まれると考えられる好ましい機構は、本明細書において、「アンチセンス阻害」と称される。このようなアンチセンス阻害は、典型的には、少なくとも1つの鎖またはセグメントが切断され、分解され、またはさもなければ動作不能になるような、水素結合に基づいたオリゴヌクレオチド鎖またはセグメントのハイブリダイゼーションに基づいている。この点に関しては、このようなアンチセンス阻害のために、特異的な核酸分子およびこれらの機能をターゲットすることが、目下のところ好ましい。
【００５０】
妨害されるDNAの機能は、複製および転写を含み得る。複製および転写は、たとえば、内因性の細胞のテンプレート、ベクター、プラスミド構築物、またはその他に由来することができる。妨害されるRNAの機能は、タンパク質の部位へのRNAの転位置、RNA合成部位から遠く離れている細胞内の部位へのRNAの転位置、RNAからのタンパク質の翻訳、1つまたは複数のRNA種を産生するためのRNAのスプライシング、およびRNAに結合されるか、RNAによって促進されるであろうRNAが関与する触媒活性もしくは複合体形成などの機能を含むことができる。
【００５１】
本発明に関連して、「ハイブリダイゼーション」は、オリゴマー化合物の相補鎖の対形成を意味する。本発明において、対形成の好ましい機構は、水素結合を含み、これは、オリゴマー化合物の鎖の相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）との間の、ワトソン-クリック、Hoogsteen、または逆Hoogsteen水素結合であってもよい。たとえば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を介して対になる相補的な核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、種々の状況下で生じさせることができる。
【００５２】
アンチセンス化合物は、標的核酸に対する化合物の結合が、標的核酸の正常な機能を妨害して、機能喪失を生じさせ、かつ特異的な結合が要求される症状下において、非標的核酸配列に対するアンチセンス化合物の非特異的な結合を回避するために十分な程度の相補性があるときに、特異的にハイブリダイズする。
【００５３】
「相補的な」は、本明細書に使用されるものとして、オリゴマー化合物の2つの核酸塩基間で正確に対形成する能力をいう。たとえば、オリゴヌクレオチド（オリゴマー化合物）の特定の位置の核酸塩基が、標的核酸の特定の位置の核酸塩基と水素結合することができ、該標的核酸は、DNA、RNA、またはオリゴヌクレオチド分子である場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の水素結合の位置は、相補的な位置であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよびさらなるDNA、RNA、またはオリゴヌクレオチド分子は、それぞれの分子において十分な数の相補的な位置が、互いに水素結合することができる核酸塩基によって占められるときは、互いに対して相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズできる」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間で安定かつ特異的な結合が生じるように、核酸塩基の十分な数の上の十分な程度の正確な対形成または相補性を示すために使用する用語である。
【００５４】
本発明によれば、化合物は、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（EGS）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズするその他のオリゴマー化合物を含む。したがって、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、またはヘアピンオリゴマー化合物の形態で導入されて、内部もしくは末端の膨隆またはループなどの構造エレメントを含んでいてもよい。一旦系に導入されると、本発明の化合物は、標的核酸の修飾を行う1つもしくは複数の酵素または構造タンパク質の作用を誘発するであろう。このような酵素の1つの非限定の例は、RNAse H（RNA：DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞のエンドヌクレアーゼ）である。「DNA様」である一本鎖アンチセンス化合物は、RNase Hを誘発することが当該技術分野において知られている。従って、RNase Hの活性化により、RNA標的の切断を生じ、これによりオリゴヌクレオチドを介した遺伝子発現の阻害の効率を非常に増強する。RNase IIIおよびリボヌクレアーゼLファミリーの酵素などのその他のリボヌクレアーゼについても、同様の役割が想定された。
【００５５】
アンチセンス化合物の好ましい形態は、一本鎖アンチセンス・オリゴヌクレオチドであるが、多くの種において、二重鎖RNA（dsRNA）分子などの二本鎖構造の導入により、強力かつ特異的なアンチセンスを介した、遺伝子またはその関連した遺伝子産物の機能の減少を誘導することを示した。
【００５６】
本発明に関連して、「オリゴマー化合物」の用語は、複数の単量体単位を含む重合体またはオリゴマーをいう。本発明に関連して、「オリゴヌクレオチド」の用語は、リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）またはこれらの擬態、キメラ、類似体、および相同体のオリゴマーまたは重合体をいう。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖、および共有結合性のヌクレオシド間（バックボーン）結合から成るオリゴヌクレオチド、並びに天然に存在しない同様に機能する部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。このような、修飾されまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、たとえば増強された細胞の取り込み、標的核酸に対する増強された親和性、およびヌクレアーゼの存在下における安定性の増大などの望ましい性質であるために、天然の形態以上に好ましいことが多い。
【００５７】
オリゴヌクレオチドは、本発明の化合物の好ましい形態であるが、本発明は、本明細書に記載されているものなどのオリゴヌクレオチドの類似体および擬態を含む（しかし、これらに限定されない）、化合物のその他のファミリーを同様に包含する。
【００５８】
オープンリーディングフレーム（ORF）または「コード領域」は、翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間の領域をいうことが当該技術分野において既知であり、効率的にターゲットされるであろう領域である。本発明に関連した範囲内において、1つの領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）の翻訳開始または終止コドンを含む遺伝子内の領域である。
【００５９】
他の標的領域には、翻訳開始コドンから5'方向のmRNA部分をいい、したがって5'キャップ部位とmRNA（または、遺伝子上の対応するヌクレオチド）の翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドを含むことが当該技術分野において既知である5'非翻訳領域（5'UTR）、並びに翻訳終止コドンから3'方向のmRNA部分をいい、したがって翻訳終止コドンとmRNA（または、遺伝子上の対応するヌクレオチド）の3'末端との間のヌクレオチドを含むことが当該技術分野において既知である3'非翻訳領域（3'UTR）を含む。mRNAの5'キャップ部位は、5'-5'三リン酸結合を介してmRNAの最も5'の残基に接続された、N7-メチル化されたグアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造自体、並びにキャップ部位に隣接した最初の50ヌクレオチドを含むと考えられる。また、5'キャップ領域をターゲットすることも好ましい。
【００６０】
いくつかの真核生物のmRNA転写物は、直接翻訳されるにもかかわらず、多くは、「イントロン」として既知の1つまたは複数の領域を含み、これは、これが翻訳される前に、転写物から切除される。残りの（従って、翻訳された）領域は、「エキソン」として既知であり、共にスプライスされて連続的なmRNA配列を形成する。また、スプライス部位（すなわち、イントロン-エキソン接合部またはエキソン-イントロン接合部）をターゲットすることは、異常なスプライシングが疾患に関係するか、または特定のスプライス産物の過剰産生が疾患に関係する場合に特に有用であろう。また、再編成または欠失による異常な融合接合も、好ましい標的部位である。異なる遺伝子源に由来する二つ（またはそれ以上）のmRNAのスプライシングプロセスを経て産生されるmRNA転写物は、「融合転写物」として知られている。また、たとえばDNAまたはプレmRNAに対してターゲットされるアンチセンス化合物を使用して、イントロンを効率的にターゲットすることができることも既知である。
【００６１】
当該技術分野において既知のとおり、ヌクレオシドは、塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部は、通常複素環塩基である。このような複素環塩基のうちの2つの最も一般的な分類は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、共有結合性にヌクレオシドの糖部分に結合されたリン酸基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについては、リン酸基を糖の2'、3'、または5'ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基は、隣接したヌクレオシドを互いに共有結合性に結合して、直鎖状の重合体化合物を形成する。次に、この直鎖状の重合体化合物のそれぞれの末端をさらに接続させて、環状の化合物を形成することができるが、通常、直線的な化合物が好ましい。加えて、直線的な化合物は、内部の核酸塩基に相補性を有していてもよく、従って、完全にまたは部分的に二本鎖化合物を産生するような方法で折りたたまれていてもよい。オリゴヌクレオチド内において、リン酸基は、一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成するものをいう。RNAおよびDNAの正常な結合またはバックボーンは、5'に対する3'のホスホジエステル結合である。
【００６２】
アンチセンス化合物を局所的にデリバリーするために、これらのオリゴヌクレオチドは、修飾されたバックボーンまたは非天然のヌクレオシド間の結合を含んでもよい。この明細書において定義したように、修飾されたバックボーンを有するオリゴヌクレオチドは、バックボーンにリン原子を保持するものおよびバックボーンにリン原子を有しないものを含む。本明細書のために、時に当該技術分野において言及されるとおり、これらのヌクレオシド間バックボーンにリン原子を有しない修飾されたオリゴヌクレオチドは、また、オリゴヌクレオシドであるとも考えられ得る。
【００６３】
その中にリン原子を含む好ましい修飾されたオリゴヌクレオチドバックボーンは、たとえばホスホロチオネート、キラルなホスホロチオネート、ホスホロジチオネート、リン酸トリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび3'-アルキレンホスホネート、5'-アルキレンホスホネート、およびキラルなホスホネートを含むその他のアルキルホスホネート、ホスフィナート、3'-アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含むホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常な3'-5'結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの2'-5'結合された類似体、並びに逆位の極性を有するものであって、1つまたは複数のヌクレオチド間結合が、3'に対する3'、5'に対する5'、または2'に対する2'結合であるものを含む。逆位の極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も3'のヌクレオチド間結合での単一の3'に対する3'結合、すなわちアベーシック（abasic）（核酸塩基を失っているか、またはその場所にヒドロキシル基を有する）であろう単一の逆位のヌクレオシド残基を含む。種々の塩類、混合塩、および遊離酸の形態も含まれる。
【００６４】
別の態様において、アンチセンスまたはセンス分子哺乳類細胞を作製するために、DNA「ワクチン」を含む遺伝子の構築物が使用される。さらにまた、上記の好ましい特徴の多くは、センス核酸分子に適している。
【００６５】
本発明に従って同定された薬剤は、薬学的組成物で便利に供給される。
【００６６】
本発明は、G-CSF活性もしくはG-CSFとG-CSFRの間の相互作用のモジュレーター、またはG-CSF/G-CSFRの発現のモジュレーターを含む組成物であって、該組成物は、1つもしくは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈液をさらに含む組成物をさらに想定する。
【００６７】
注射用の使用に適した組成物形態は、無菌の注射用の溶液の即座の調製のための滅菌水溶液（水溶性の場合）および無菌の粉を含む。これは、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならないし、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対しても保存されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および植物油を含む、溶媒または希釈培地であることができる。たとえば、界面活性物質の使用によって適当な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、サーメロサル（thirmerosal）などの種々の抗細菌薬および抗真菌薬によってもたらすることができる。多くの場合、等張性の薬剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用の組成物の遷延性の吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすることができる。
【００６８】
無菌の注射用溶液は、必要に応じて活性成分および選択的にその他の活性成分を有する適切な溶媒中に必要とされる量の活性化合物を組み込むことに続いて、ろ過滅菌またはその他の適切な滅菌手段によって調製される。無菌の注射用溶液の調製のための無菌の粉の場合、適切な調製法は、活性成分に加えて任意のさらに所望の成分の粉を産生する真空乾燥および凍結乾燥技術を含む。
【００６９】
モジュレーターが最適に保護されるときは、たとえば不活性な希釈剤と共に、もしくは同化できる食用の担体と共に経口的に投与してもよく、または堅いもしくは柔らかいシェルのゼラチンカプセルに封入してもよく、またはタブレットに圧縮してもよく、または食事の食品に直接組み込んでもよく、または母乳を介して投与してもよい。経口治療の投与のためには、活性成分を賦形剤と共に組み込んでもよく、摂取できるタブレット、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ剤、ウェーハなどの形態で使用されてもよい。このような組成物および製剤は、少なくとも1重量%のモジュレーターを含むべきである。組成物および製剤の割合は、もちろん変更してもよく、便利に単位重量の約5〜約80%の間であってもよい。このような治療的に有用な組成物中のモジュレーターの量は、適切な用量が得られるようにする。本発明にしたがった好ましい組成物または製剤は、約0.1μg〜200mgの間のモジュレーターを含む経口単位剤形のように調製される。他の投与量は、約1μg〜約1000mgおよび約10μg〜約500mgを含む。これらの用量は、個体あたり、またはkg体重あたりのものであってもよい。投与は、時間、日、週、月、または年あたりのものであってもよい。
【００７０】
また、タブレット、トローチ、ピル、カプセル、クリームなどは、以下一覧に挙げた成分を含んでいてもよい。ゴム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびショ糖、ラクトース、またはサッカリンなどの甘味料を添加してもよく、またはペパーミント、ウインターグリーン油、または桜の香味料などの香味薬を添加してもよい。単位剤形がカプセルであるときは、上記のタイプの材料に加えて、液体担体を含んでいてもよい。その他の種々の材料がコーティングとして存在してもよく、またはさもなければ単位剤形の物理的な形状を修飾してもよい。例えば、タブレット、ピル剤、もしくはカプセル剤は、シェラック、糖、またはその両方でコーティングされてよい。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味料としてのショ糖、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、染料、および桜またはオレンジ風味などの香味料を含んでいてもよい。もちろん、いずれの単位剤形を調製する際に使用されるいずれの材料も、薬学的に純粋で、実質的に使用される量で非毒性であるべきである。加えて、活性化合物（類）は、徐放性のプレパレーションおよび製剤に組み込まれてもよい。
【００７１】
薬学的に許容される担体および／または希釈液は、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌薬および抗真菌薬、等張性の吸収を遅延させる薬剤などのいずれかおよび全てを含む。薬学的作用物質のためのこのような媒体類および薬剤の使用は、当該技術分野において周知であり、いずれの従来の媒体類または薬剤もモジュレーターと適合しない限り、治療組成物におけるこれらの使用が想定される。また、補助的な活性化合物を組成物に組み込むことができる。
【００７２】
上記のように、投与は、いずれの手段によってもよい。関節炎治療または局部的な炎症のためには、関節腔内または皮下の投与が特に好ましい。
【００７３】
また、組成物は、モジュレーターがタンパク質分子であるときに、ベクターがモジュレーターをコードすることができる核酸分子を有する場合に、標的細胞をトランスフェクトすることができるベクターなどの遺伝的分子を含んでいてもよい。ベクターは、たとえばウイルスベクターであってもよい。この点に関しては、本発明により、特定の細胞を単離すること、遺伝的に操作すること、および細胞を同じ被検者に、または遺伝的に関連し、もしくは類似する被検者に戻すことを含む遺伝子治療の範囲が想定される。
【００７４】
本発明は、G-CSFまたはG-CSFRを阻害することができ、これにより炎症作用を寛解させる薬剤をスクリーニングするために有用な炎症の動物モデルをさらに提供する。動物モデルは、高レベルまたは低レベルのG-CSFまたはG-CSFRを産生することが想定される。このような動物は、炎症症状を改善するか、またはその発症を防止する薬剤をスクリーニングするために有用である。さらに、G-CSFのレベルが減少された動物において、G-CSFの非存在を打ち消すために、その他のサイトカインまたは内因性分子が現れてもよい。次いで、これらは、さらに治療分子のための標的となる。
【００７５】
従って、本発明のもう一つの側面は、遺伝子改変された動物であって、該動物は、同じ種の遺伝子改変されていない動物と関連して少ない量のG-CSFまたはG-CSFRを産生する動物を提供する。
【００７６】
好ましくは、遺伝子改変された動物は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、またはヤギである。より好ましくは、遺伝子改変された動物は、マウスまたはラットである。最も好ましくは、遺伝子改変された動物は、マウスである。
【００７７】
従って、本発明の好ましい側面は、遺伝子改変されたマウスであって、該マウスは、同じ系統の遺伝子改変されていないマウスと関連して少ない量のG-CSFまたはG-CSFRを産生するマウスを提供する。
【００７８】
本発明の動物モデルは、動物の形態であってもよく、またはたとえば移植のための胚の形態であってもよい。胚は、好ましくは凍結状態で維持され、選択的に使用説明書と共に販売されてもよい。
【００７９】
本発明のさらにもう1つの側面は、G-CSFまたはG-CSFRをコードする遺伝子を不活性化するために有用なターゲッティングベクターであって、該ターゲッティングベクターは、ポジティブ選択可能なマーカーに隣接する該G-CSFまたはG-CSFRをコードする遺伝物質の2つのセグメントを含み、該ターゲッティングベクターが胚幹（ES）細胞にトランスフェクトして、マーカーで選択したときに、該G-CSFまたはG-CSFRをコードする遺伝子が相同組換えによって不活性化されているES細胞が作製されるターゲッティングベクターを提供する。
【００８０】
好ましくは、ES細胞は、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ヒツジ、またはヤギに由来する。最も好ましくは、ES細胞は、マウスに由来する。
【００８１】
さらに、また、本発明のもう一つの側面は、上記記載の通り実質的にG-CSFまたはG-CSFRを産生することができない遺伝子改変された動物の製造におけるターゲッティングベクターの使用に向けられる。
【００８２】
本発明のさらに別の態様は、上記記載の通り実質的にG-CSFまたはG-CSFRを産生することができない遺伝子改変されたマウスの製造におけるターゲッティングベクターの使用に向けられる。
【００８３】
好ましくは、ベクターは、DNAである。ターゲッティングベクターの中の選択可能なマーカーにより、ターゲットするDNAを安定に組み込んだターゲットされた細胞を選択することができる。これは、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、およびリポソーム融合などの相対的に低い効率の形質転換技術を使用するときに、典型的には、1000細胞のうちの1つ未満が外来性DNAを安定に組み込む場合に、特に有用である。核への微量注入などの高効率の方法を使用すると、典型的には、細胞の5〜25%がターゲッティングDNAを組み込み；および従って、選択可能なマーカーの安定な組込みについて最初に選択する必要なく、直接ターゲットされた細胞をスクリーニングすることができる。同質遺伝子または非同質遺伝子のDNAを使用してもよい。
【００８４】
選択可能なマーカーの例は、抗生物質などの化合物に対する抵抗性を与える遺伝子、選択された基質上で成長する能力を与える遺伝子、発光などの検出可能なシグナルを産生するタンパク質をコードする遺伝子を含む。広範なこのようなマーカーが既知であり、利用でき、たとえば抗ネオマイシン耐性遺伝子（neo）およびハイグロマイシン耐性遺伝子（hyg）などの抗生物質耐性遺伝子を含む。また、選択可能なマーカーは、HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）に対して増殖能を与えるtk遺伝子（チミジンキナーゼ）またはhprt遺伝子（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）；およびMAX培地（ミコフェノール酸、アデニン、およびキサンチン）に対して増殖することができる細菌gpt遺伝子（グアニン／キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）などの特定の培地基質に対して増殖能を与える遺伝子を含む。種々の選択マーカーを有する哺乳類細胞およびプラスミドで使用されるその他の選択可能マーカーは、Sambrookら、Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, New York, USA, 1990に記載されている。
【００８５】
ターゲッティング構築物におけるマーカー遺伝子の好ましい位置は、遺伝子ターゲッティングの目的に依存する。たとえば、目的が標的遺伝子発現を破壊することである場合、選択可能なマーカーは、標的DNA内のコード配列に対応するターゲッティングDNAにクローン化することができる。または、目的が、標的遺伝子からの、アミノ酸置換を有するタンパク質などの改変された産物を発現することである場合、コード配列を修飾して、置換をコードするようにすることができ、選択可能なマーカーは、コード領域の外に、たとえばイントロンの近くに配置することができる。
【００８６】
選択可能なマーカーは、それ自体の発現のためのプロモーターに依存してもよく、マーカー遺伝子は、ターゲットされる生物体以外の非常に様々な生物体に由来してもよい（たとえば、哺乳類細胞をターゲットする際に使用する原核生物マーカー遺伝子）。しかし、受容細胞で機能することが既知の転写機構を有する本来のプロモーターを置換することが好ましい。たとえば、メタロチオネインプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、β-アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、SV40プロモーター、およびヒトサイトメガロウイルスプロモーターを含む多くの転写開始領域をこのような目的に利用できる。広く使われている例は、SV40初期プロモーターの制御下に細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有し、哺乳類細胞にG418（ネオマイシンに関連した抗生物質）に対する抵抗を与えるpSV2-neoプラスミドである。動物細胞における選択マーカーの発現を増強するために、ポリ（A）配列の付加および合成翻訳開始配列の付加などの多くのその他のバリエーションを使用してもよい。構成的および誘導性のプロモーターを使用してもよい。
【００８７】
DNAは、好ましくは相同組換えによって修飾される。標的DNAは、核およびミトコンドリアを含む動物細胞のいずれの細胞小器官にあることもでき、無処理の遺伝子、エキソンまたはイントロン、制御配列、または遺伝子間の任意の領域であることができる。
【００８８】
相同的なDNAは、参照DNA配列と少なくとも70%同一であるDNA配列である。2つの配列が相同的であることの指標は、これらがストリンジェントな条件下（Sambrookら、1990、前記）で互いにハイブリダイズされることである。
本発明は、G-CSFまたはG-CSFRの発現をダウンレギュレートするためのコサプレッション（すなわち、センスサプレッション）およびアンチセンスサプレッションをさらに想定する。これは、一般に、疾患モデルを作製するためなど、標的試験動物に生じさせる。
【００８９】
また、遺伝的に改変された動物は、大量のG-CSFまたはG-CSFRを産生する。たとえば、正常G-CSFまたはG-CSFRの過剰発現によりドミナントネガティブ効果を生じるであろうし、有用な疾患モデルとなるであろう。
【００９０】
従って、本発明のもう一つの側面は、G-CSFまたはG-CSFRをコードする遺伝子配列を過剰発現する遺伝子改変された動物に向けられる。
【００９１】
遺伝子改変された動物は、トランスジェニック動物、または「ノックアウト」もしくは「ノックイン」動物を含む。
【００９２】
本発明は、以下の非限定の実施例によって、さらに記載される。
【００９３】
実施例1
マウス
C57BL/6（B6；野生型[WT]）マウスは、ウォルターおよびエリザ・ホール研究所（WEHI）動物供給（Victoria, Australia）から得た。G-CSF欠損（G-CSF-/-）マウスを癌研究のためにルートヴィヒ研究所（Ludwig Institute for Cancer Research）Victoria, Australiaから得て、129/OLA胚幹（ES）細胞のCysf3遺伝子をターゲットされた破壊によって作製し、B6胚盤胞へ注射した（Lieschkeら、Blood 84：1737-1746, 1994）。マウスは、B6バックグランドに対して20世代以上戻し交配した。全てのマウスは、実験時に≧8週間目であり、自由に標準的な齧歯類の食事および水を与え、おがくずを並べたケージに収容した（≦6マウス／ケージ）。全ての動物の処理は、施設内倫理委員会（Institutional Ethics Committee）によって承認された。
【００９４】
実施例2
mBSA/IL-lで誘導される関節炎（急性関節炎）の誘導
手順は、以前の記載に基づいた（Lawlorら、Arthritis and Rheumatism 44 : 442-450, 2001）。マウスを、麻酔下で、10μlの20mg/mlのmBSA（Sigma, St Louis, MO）を膝関節内に関節内に注入した。対照関節には、同じ量の媒体（通常の生理食塩水）を受けさせた。次に、マウスには、20μlの12.5μg/mlの組換えヒトIL-1β（比活性5×108U/mg；Amgen, Thousand Oaks, CA）の通常生理食塩水/0.5%（v/v）正常マウス血清（媒体）溶液を後部足蹠に皮下（s.c.）に注射し、注射を次の2日間繰り返した。
【００９５】
マウスを7日目（または、示した時点で）に屠殺し、膝関節を切除して、少なくとも2日間10%（v/v）の中性緩衝ホルマリン中で固定して、脱灰し、パラフィン処理した。正面の組織切片（4μm）を4つの深さで約100μmの間隔で切断し、関節の病理学を評価するためにヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）で染色した。
【００９６】
関節炎の評価は、実験群に盲目に行った。関節炎の5つの構成要素、すなわち関節空間浸出物、滑膜炎、パンヌス形成、軟骨、および骨分解を評価した。これらは、0（正常な）から5（重篤な）までの重篤さについて等級分けした。組織学的なスコアに基づいて、1以上の浸出物スコアおよび2以上の滑膜炎スコアがである場合、関節は、炎症性の関節炎を示すものとして分類した。破壊的な関節炎は、パンヌスについて2以上、および軟骨および／または骨分解について1以上のスコアとして分類した。また、全体の平均の組織学的な重篤さのスコアを、25（Lawlorら、2001、前記）の関節につき最大限起こり得るスコアについて算出した。サフラニンO染色した切片を調製し、軟骨プロテオグリカン減少について盲目的に評価した。
【００９７】
実施例3
コラーゲンで誘導される関節炎（CLA）の誘導
2mg/mlの濃度で4℃で一晩おいた10mMの酢酸に溶解したニワトリ・コラーゲンII型（CII；Sigma）を、等量のフロイント完全アジュバント（CFA）に乳化し、熱で死滅させた結核菌（株H37 Ra； Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）をフロイント不完全アジュバント（Difco）に添加することによって5mg/mlで調製した。マウスには、100μlのエマルジョンを尾部の基部のいくつかの部位に内経皮的に（i.d.）注射し、これを21日後に繰り返した。
【００９８】
40日間までの間に1週につき3回それぞれのマウスに示される肢の紅斑および膨張、並びに臨床的なスコアについて動物をモニターした。スコアリング・システムは、前述したとおりにし（Campbellら、European Journal of Immunology 30 : 1568-1575）、0=正常、1=わずかに膨張、2=広範に膨張、および3=関節の歪曲および／または強固にであり、マウスあたりの最大スコアは、12であった。臨床的な評価は、実験群に対して盲検の2人の独立した研究者によって完了した。屠殺時に、足を除去して、固定し、脱灰し、上記の通りにパラフィン包埋処理した。最も高い臨床スコアを有する4匹のマウスの前足および後足のH&E染色した切片（5μm）を前述したように評価した（Campbellら、2000、上記）。30日および屠殺日（62日）に、血清抗CII Abの決定のために血液を採取した。
【００９９】
実施例4
G-CSFの投与
関節内G-CSFおよびIL-1
マウスには、10μlのIL-1（25ng）、または組換えヒトG-CSF（rHuG-CSF；0.1、0.5、1、および1.5μg）、または媒体（生理食塩水；通常生理食塩水／0.5%（v/v）の0、1、および2日目における正常マウス血清（媒体）を、毎日i.a.注射を受けさせた。マウスを3日目に屠殺し、H&E染色した切片で組織学的に関節を評価した。
【０１００】
急性関節炎におけるIL-1βの代わりの皮下のG-CSF
マウスには、mBSAをi.a.注射し、0〜2日目にIL-1（250ng）またはrHuG-CSF[フィルグラスチム]（15μg）または媒体対照を、足蹠にs.c.処理した。マウスは、上記の通り7日目に屠殺した。
【０１０１】
WTおよびG-CSF-/-マウスにおける好中球の枯渇
WT（B6）およびG-CSF-/-マウスには、疾患誘導の2日前に、かつ0〜2日目に、0.6mgの好中球を枯渇させるモノクローナル抗体（mAb）、RB6.8C5、またはアイソタイプ対照mAb GL121を腹腔内に処理した。次いで、マウスには、0.5mgのmAbを3〜6日目から毎日処理した。ディファレンシャル細胞数解析によって、0、2、および7日目に、好中球数について末梢血を解析した。
【０１０２】
実施例6
T細胞増殖反応アッセイ法
一次注射の52〜62日後に、CIAに対して免疫したマウス（n＞5マウス／実験）から、鼠径部のリンパ節（LN）を収集した。単個細胞浮遊液を、2-メルカプトエタノール（50μM）および5%（vol/vol）ウシ胎児血清（FCS）を含むRPMI中に調製した。200μlのLN細胞（2×105細胞）を丸底96穴プレート（Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, New Jersey, USA）にまき、0〜100μg/mlの変性したCII（10分煮沸した）で刺激する。細胞を37℃（5% CO2）で72時間インキュベートし、20および48時間において上清を採取し、1μCi[3H]チミジンで最後の8時間パルスした。細胞をInotech Cell Harvester (Inotech)によって収集し、[3H]チミジンの取り込みをマイクロプレート・シンチレーションカウンター（Canberra Packard, Victoria, Australia）を使用するT細胞増殖反応の測定として測定した。細胞上清の一定分量を20および48時間に採取した。
【０１０３】
浸潤する白血球のフローサイトメトリー解析
mBSA/生理食塩水で処理したB6マウスおよびmBSA/IL-1-処理したB6およびG-CSF-/-マウスからの膝蓋骨および付着する軟部組織を、3および7日目に切開した。骨、脂肪、および筋肉断片を廃棄し、滑膜を2mmの部分に細かく切り刻んで、2.4mg/mlのディスペース（dispase） II（Boehringer、Mannheim、Germany）、1mg/mlのコラゲナーゼII型（Sigma）、および100μg/mlのDNAse I（Boehringer Mannheim, Indianapolis, USA）のRPMI 1640溶液を使用して単個細胞浮遊液に消化した。懸濁液を37℃で45分間穏やかに撹拌し、次いで10%[v/v]FCSのRPMI溶液で70μMナイロン細胞濾過器（Falcon）を通して洗浄した。細胞染色の前に細胞の計数を行った。非特異的な染色は、ラット抗マウスFcγRIIb/III（CD16／CD32；クローン2.4G2；American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, USA）を使用してブロックした。白血球は、ビオチン化されたラット抗マウスCD45.2（PharMingen, San Diego, California, USA）、および蛍光色素ストレプトアビジン三色旗（SA-TRI） (Caltag)、および下記の実施例12に一覧を示したAbの組み合わせを使用して染色した。また、滑膜の消化細胞を37℃、5% CO2で一晩付着させて、ディスペースによって切断したCD４などのマーカーの発現を回復させる。非接着細胞を2% v/v FCSのPBS溶液中に収集し、蛍光標示式細胞分取（FACS）のために染色した。
【０１０４】
実施例7
サイトカインアッセイ法および白血球の形態学的な定量
製造業者（Pharmingen）の説明書にしたがって、対になったモノクローナル抗体を使用する捕獲ELISAによって、T細胞上清中のIFN-γ、IL-4、およびIL-2を測定した。
【０１０５】
関節の浸出物白血球の形態学的な定量
限局的な関節空間の浸出物の5格子領域における多形核白血球、単球／マクロファージおよびリンパ球を定量化することによって、浸出物の成分について、H&E染色した関節切片（関節につきn=2切片の深さ）を高拡大（1000×）で解析した。
【０１０６】
実施例8
血清抗CII抗体（Ab）の決定
前述のとおりに（Campbellら、2000、前記）、ELISAを行って、CIIに対するAbを検出した。西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG（Sigma Chemical Co.）、IgG2b、IgG2c、IgG1、IgG3、またはIgM（Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Alabama, USA）抗血清を検出Abとして使用した。検量線は、任意単位を使用して高免疫されたDBA/1マウスのプールした血清から構築した。
【０１０７】
血清Igレベルの測定
未処置およびCII/CFA免疫したマウスの眼窩後洞血からの血清Abを、総IgG、IgM、IgG2c、IgG2b、IgG1、IgG3、およびIgAに対する関連したAbで捕獲し、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）結合Ab（Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Alabama, USA）を使用して検出した。
【０１０８】
実施例9
末梢血白血球数
末梢血を、急性関節炎モデルの0、3、および7日目の眼窩後叢瀉血によってマウスから得て、EDTA被覆チューブに収集した。マウスにつき1本の大腿骨から、BMを3% [v/v]ウシ胎仔血清（FCS）／リン酸緩衝食塩水（PBS）中に流した。総白血球数および重曹解析は、Advia 120 Hematology System （Bayer Diagnostics, Tarrytown, New York, USA）を使用して行った。また、手動でのBM計数をサイトスピンで行った（1×105細胞を7分間1200rpmで顕微鏡スライド上に遠心した）。
【０１０９】
実施例10
関節炎症は、G-CSFの直接の関節腔内の投与に応答して発症する
顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が、3日連続にわたる野生型（WT）C57BL/6マウスの膝関節へのrHuG-CSF（0.1、0.5、および1μg）の関節内注射によって、関節における前炎症性の性質を有するかどうかを最初に調査した。対照には、IL-1（IL-1；25ng）および媒体（通常生理食塩水中の0.5%[v/v]の正常マウス血清）の関節内注射を含めた。3日目に、組織学的な評価のために関節を採取した。G-CSFは、用量依存的な様式で炎症を誘導することが判明した（図1）が、反応は、IL-1によって誘導されたものよりも有意に低かった。この結果は、外因性のG-CSFが、正常関節内において炎症誘発性の効果を有することを示す。
【０１１０】
実施例11
G-CSF欠損マウスは、IL-1誘導される関節の炎症をあまり発症しない
局部的なIL-1で誘導される炎症性の効果を調整する際のG-CSFの関与を調査するために、G-CSFを欠損したマウス（G-CSF-/-）およびB6マウスに、IL-1をi.a.で注射した。IL-1は、G-CSF-/-マウスにおいて関節の炎症を誘導したが、正常なB6マウス（図2A）と比較して減少したレベルであり、G-CSFは、関節区画においてIL-1の下流のメディエータであることを示している。G-CSF-/-マウスにおけるこの炎症性の特徴の減少にもかかわらず、関節軟骨プロテオグリカンの減少（図2B）に相違がなかったことは、IL-1が軟骨に直接ダメージを与える得ることを示唆した。
【０１１１】
末梢血、BM、および滑膜の浸透物解析
mBSAおよびIL-1によって誘導される炎症反応に対するG-CSF欠損の効果を検討するために、mBSAをi.a.に、およびIL-1もしくは塩類媒体をs.c.に処理したB6およびG-CSF-/-マウスから末梢血、BM、および滑膜を、このモデルの0、3および7日目において採取した。結果は、表3および4に、および図6に示してある。G-CSF欠損では、mBSA/IL-1に対する好中球の反応が鈍くなった。B6およびG-CSF-/-マウスのBM細胞性は、IL-1投与（表3）によって減少され、血液へのBM細胞の動員を反映している。B6マウスと比較したときに、G-CSF-/-マウスは、後骨髄球および多形の数が有意に減少し、並びに基底およびIL-1に応答した際の両者においてBM区画（表3）の前骨髄球および骨髄球が少なくなった。B6マウスは、急性関節炎の過程の間に顕著な末梢好中球増多を発症した。非常に対照的なことに、G-CSF-/-マウスは、モデルの過程を通じて有意な好中球減少を示したことから（表4）、IL-1によって誘導される好中球増多は、G-CSF依存的であることを示した。
【０１１２】
mBSA/IL-1処理したG-CSF-/-マウスの炎症を起こした滑膜における細胞組成の調査では、3および7日目に白血球の浸潤の減少がみられた（図6A〜C）。滑液組織消化での細胞の計数により、B6マウスからのmBSA/IL-1処理した滑液組織と比較して、7日目にmBSA/IL-1処理したG-CSF-/-関節滑液組織の総細胞に約2倍の減少がみられた（1.87±0.07×105細胞/B6mBSA/生理食塩水関節対、3.13±0.10×105細胞/B6mBSA/IL-1関節対、1.66±0.05×105細胞/G-CSF-/- mBSA/IL-1関節）。特に、両方の時点で有意な割合および数の好中球の減少（GR1hi CD1 1bhi）、並びにマクロファージ／単球（GR1lo CD1 1bhi）浸潤の割合および数の減少があった。その他の表現型変化には、急性関節炎を有するG-CSF-/-マウスの滑液組織中におけるより低い割合のM-CSFR+ CD16/CD32+およびCD44+細胞を含み、G-CSFは、滑膜細胞上でのこれらの活性化マーカーの完全な誘導を必要とするであろうことを示唆する。
【０１１３】
一晩培養後の非接着白血球の染色により、7日目にCD4+リンパ球浸潤が減少することが明らかとなり、G-CSFは、非好中球およびマクロファージだけでなく、CD4+ Tリンパ球の関節への輸送にも必要とされることが示唆される（図6C）。
【０１１４】
実施例12
急性の炎症性の関節炎におけるG-CSF-/-およびWTマウスの好中球の枯渇
G-CSF-/-マウスにおけるmBSA/IL-1で誘導される関節炎の減少が、単に好中球の減少の結果であったかどうか調査するために（Lieschkeら、1994、前記）、モノクローナル抗体（mAb）（RB6.8C5）を使用して好中球を枯渇させた。WTおよびG-CSF-/-マウスには、抗好中球mAb（RB6.8C5）またはアイソタイプ対照mAb（GL121）を腹腔内に（i.p.）注射した。ディファレンシャル細胞数解析（図7A）によって、0、2、および7日目の好中球のレベルについて末梢血を解析した。抗好中球mAbで処理したWT動物では、アイソタイプ対照mAb処理した動物と比較して、いつでも＞90%の枯渇が観察された（これにより、顕著な好中球増多を発症する）。WTマウスの好中球の枯渇は、関節炎の発症を抑止しなかったが（図7B）、これは関節空間の浸出物を有意に減少させた。対照的に、G-CSF-/-マウスは、疾患に対して比較的抵抗力があり、さらなる好中球の枯渇によっても重篤度をさらに減少させることはなかった。これは、G-CSF-/-マウスにおける好中球の減少が、単にmBSA/IL-1で誘導される関節炎から保護の役割を果たしているだけではないことを示す。
【０１１５】
実施例13
外来性のG-CSFは、急性の炎症性の関節炎においてIL-1を部分的に置換することができる
mBSAおよびG-CSF（mBSA/G-CSF）で処理したマウスの関節では、炎症性および破壊的な関節炎を発症したが、これは、mBSA/IL-1を処理した動物よりも重篤ではなかった（図4A-B）。mBSA/G-CSF処理した動物の関節に浸透する主要な細胞は、mBSA/IL-1で誘導される関節炎において優勢な顆粒球の浸透物と比較して、単球／マクロファージであった。これらの結果は、外因性のG-CSFの全身投与が、この急性関節炎モデルを駆動する際に全身性のIL-1を少なくとも部分的に置換することができること、およびG-CSFが単球／マクロファージを関節に動員させることを示す。
【０１１６】
実施例14
G-CSF欠損は、コラーゲンで誘導される関節炎（C1A）を障害する
G-CSF欠損マウスは、急性の炎症性の関節炎を減少させた
関節疾患に対するi.a.注射および全身性のフィルグラスチムの炎症誘発性効果を考慮して、本発明者らは、G-CSF-/-マウスを使用して、G-CSFに対する急性関節炎モデルの絶対的な依存性を決定することを試みた。G-CSF-/-およびB6マウスには、i.a.にmBSA（0日）を、および0、1および2日目にs.c.にIL-1を足蹠に注射した。7日目における疾患の組織学的な評価では、炎症性および破壊的な特徴が有意に減少することが明らかとなった（図5AおよびB）。軟骨プロテオグリカン含量のためのサフラニンO染色は、B6マウス（図5C）と比較して、G-CSF-/-マウスの軟骨プロテオグリカン減少に主な減少があることが明らかとなった。従って、内因性G-CSFは、この急性関節炎のモデルの炎症および破壊の重要なメディエータである。
【０１１７】
G-CSF欠損は、CIAの発病率および重篤さを減少させる
CIAは、RAを調査するために広く使用されている慢性自己免疫性関節炎である。CIAに対するG-CSFの寄与を検査するために、B6 WTおよびG-CSF-/-マウスをCFA中のCIIで免疫し、続いて21日後にブースト注射し（Lieschkeら、Blood 84： 1737-46, 1994）、疾患発病率および重篤さを比較した。G-CSF-/-マウスにおけるCIAの開始は、遅延性であり、マウスは、WTマウス（図8AおよびB）と比較して、著しく減少した発病率および重篤さで疾患を発症した。G-CSF-/-マウスにおける疾患発病率および重篤さの減少は、慢性自己免疫性関節炎における内因性G-CSFの重要な役割を示差する。
【０１１８】
実施例15
G-CSF-/-マウスにおけるCIAの組織学的な解析
CIAの間に最高の臨床スコアの4匹のB6およびG-CSF-/-マウスからの足のH&E染色した切片の組織学的な評価を行った。個々の関節は、0の正常から3（実施例18を参照されたい）でスコアして、正常および関節炎の関節の割合を決定した。G-CSF-/-マウスでは、WTマウスと比較して正常な関節の割合が有意に多く（図9A）、G-CSF-/-マウスにおいて影響を受けた小数の足でも、重篤ではなかった（図9B）。対照的に、WTマウスからの関節では、穏やかから重篤な関節炎を示す組織学的な特徴の範囲を有した（図9AおよびB）。これらの組織学的な観察は、本明細書において概説した臨床的な評価と一致する。
【０１１９】
実施例16
CIIに対するインビトロでのT細胞増殖およびサイトカイン産生
CIIに対する細胞免疫反応を評価するために、インビトロでのT細胞増殖反応およびT細胞サイトカイン（IFNγおよびIL-2）産生をG-CSF-/-マウスにおいて測定し、WTと比較した。単個細胞浮遊液を、CFA中のCIIを免疫したマウスからの鼠径部のLNから調製し、0〜100μg/mlの変性したCIIでインビトロで72時間刺激した。培養の最後の8時間に、トリチウム化したTdRの取り込みによってT細胞応答を測定した。図10Aは、G-CSF-/-およびWTマウスで観察される刺激の指標を示し、これは比較できた。G-CSF-/-LN細胞によるT細胞サイトカインIFN-γおよびIL-2の産生は、比較的正常であった（図10B）。
【０１２０】
実施例17
G-CSF-/-マウスにおけるIgMからIgGへの抗CIIアイソタイプ転換の障害
CIAの誘導は、CIIに対する体液性および細胞免疫応答に依存的である（Campbellら、2000、前記）。G-CSF欠損は、CIA（30および62日）の間に抗CII Ab産生の血清レベルを変化させるかどうかを検査した。30および62日において、WTおよびG-CSF-/-マウスの抗CII IgMは同等なレベルにもかかわらず、抗CII IgGの総レベルは減少した（図11）。抗CII IgGアイソタイプの解析により、全てのアイソタイプ-IgG2b、IgG2c、IgG3、およびIgG1産生の減少が明らかとなった。これは、G-CSF-/-マウスにはアイソタイプ転換に欠陥があり、これがCIAに対する保護に寄与しているのであろうことを示唆する。この観察は、内因性G-CSFが、少なくともCFA中の抗原での免疫化に応答して、B細胞によるAb産生において役割を果たすことを示唆する。
【０１２１】
実施例18
未処置のG-CSF-/-マウスにおけるIgの基礎レベルの増大、およびCII/CFAを免役したマウスにおける総IgGの増大
CIIに対する体液性免疫応答の研究により、G-CSF-/-マウスがIgMからIgGへの転換反応に欠陥を有することが明らかとなった。この欠陥が、循環Ab中に予め存在する欠陥を反映したものかどうかを決定するために、未処置のマウスからの血清の総IgG、IgM、およびIgGアイソタイプについて解析した。血清Abレベルの解析により、未処置のG-CSF-/-マウスの総IgG並びにアイソタイプIgG2bおよびIgG2cが、未処置のB6マウス並びにIgM、IgG1、IgG3、およびIgA（図12A）の正常なベースラインの産生と比較して有意に優れた産生であることが明らかとなった。さらに、CII/CFA免疫されたG-CSF-/-マウスにおいて、非特異的な総IgGのレベルは、著しく増強された（図12B）。これらの観察は、少なくともG-CSFがCFA中の抗原での免疫化に応答して、B細胞成熟（抗体産生およびアイソタイプ転換）において役割を果たすことを示唆する。
【０１２２】
実施例19
G-CSF-/-マウスにおける正常なT依存的およびT非依存的なAg B細胞応答
CII/CFAに応答するAb産生の障害がT依存的またはT非依存的なAg応答によるものであるかどうかを決定するために、B6およびG-CSF-/-マウスには、ミョウバン中のT依存的なNP-KLHを、またはT非依存的な抗原のDNP-デキストランのPBS溶液をチャレンジした。G-CSF-/-マウスは、T依存的およびT非依存的なAgの両者に対して正常な応答を発生し（図13）、CIAにおける障害されたB細胞応答は、CFA中のCIIでのチャレンジに特異的であることが証明される。
【０１２３】
実施例20
G-CSF枯渇は、末梢血好中球の減少を引き起し、急性（mBSA/IL-1）関節炎における炎症を減少させる
WTマウスにおけるG-CSF遮断の治療的な適用を評価するために、B6マウスには、急性関節炎（0日）の誘導より前に50もしくは250μgのラット抗G-CSF mAb（クローン67604； R & D systems, Minneapolis, Minnesota, USA）またはアイソタイプ対照（GL113）mAbを注射した。また、mAbは、1、2、3、および5日目に投与した。4および7日目に末梢血を採取し、示差解析に供した（図14A）。高用量（250μg）の抗G-CSF mAbを受けたマウスは、両方の日において、アイソタイプ対照mAb mBSA/IL-1処理したマウスと比較して、末梢血好中球の有意な減少を有した。より低い用量の抗G-CSF mAbを受けているマウスでは、7日目のみで好中球の有意な減少を有した。また、BM集団の解析では、G-CSF枯渇したmBSA/IL-1処理したマウスの骨髄球系統の細胞の有意な減少を示した（データ示さず）。抗G-CSFまたはアイソタイプ対照mAbで処理したマウスの関節炎関節の巨視的な評価では、抗G-CSF mAb（250μg）処理したマウスで疾患が減少することが明らかとなった（図14B）。高用量の抗G-CSF mAbを受けているマウスでは、滑液組織細胞の減少があり（図14C）、浸潤する白血球、特に好中球の割合の減少があった（GR1hi CDllbhi；図14D）。これらの結果は、野生型マウスのG-CSF阻害に応答した急性関節炎の疾患の特徴の用量依存的な減少を示す。
【０１２４】
（表３）mBSA/IL-1で誘導される関節炎の間の骨髄集団
2005536535.tif 000008
細胞の計数は、Adviaカウンタを使用して行った。手動白血球示差を、マウスにつき1本の大腿骨から回収した細胞に対するdiff-quik染色したサイトスピンで行った。値は、平均±SDである。
＊  研究0日は、処理前であり；括弧内の値は、その群について研究したマウスの数である。
†  同じ研究日でのB6とG-CSF-/-の間の比較についてP＜0.05。
‡  ベースラインと示した研究日における同じ遺伝形質のマウスの間のP＜0.05。
【０１２５】
（表４）mBSA/IL-1で誘導される関節炎の間のG-CSF-/-マウスの末梢血解析
2005536535.tif 000009
末梢血は、Adviaカウンタを使用して解析し、μlあたりの細胞数×103を決定した。データは、平均±SEMとして表してある。
＊ 研究0日は、処理前のベースラインカウントであり；括弧内の数は、その群について検査したマウスの数である。
† 検査時点での群間のP＜0.05。
【０１２６】
当業者であれば、本明細書に記載されている本発明が、特に記載されているもの以外のバリエーションおよび修飾に対する余地があることを認識するであろう。本発明は、全てのこのようなバリエーションおよび修飾を含むことが理解される。また、本発明は、この明細書において参照しまたは示した工程、特徴、組成物、および化合物の全て、並びに該工程または特徴のいずれか二つ以上の組み合わせのいずれかおよび全てを、個々に、またはひとまとめにして含む。
【０１２７】
参考文献
2005536535.tif 000010
2005536535.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】G-CSFの関節腔内の効果を示すグラフ表示である。A.マウスには、フィルグラスチム（G-CSF；0.1、0.5、または1μg）、IL-1（25ng）、または生理食塩水（媒体）を3日連続で関節内に処理し、組織学的に3日目に検査した。塩類対照と比較して、＊P＜0.05；†P＜0.005。B.G-CSF（0.5、1.5μg）またはIL-1を注射した関節における関節浸出細胞を定量した。G-CSFを注射した関節において、顕著な単球／マクロファージ浸出があった。群につきn＞12関節。
【図２】G-CSFが局部的なIL-1で誘導される関節炎症に必要であるが、IL-1で誘導されるプロテオグリカンの減少には必要でないことを示すグラフ表示である。B6およびG-CSF-/-マウスには、0、1、および2日目にIL-1（25ng）をi.a.で注射し、A.炎症性および破壊的な特徴の重篤さおよびB.関節軟骨プロテオグリカンの減少について、3日目に組織学的に評価した。結果は、平均±SEM（5つをスコアした）を示してある。データは、2つの実験のうちの一方であり；n=14関節／群；*p＜0.05。
【図３】急性のmBSA/IL-1で誘導されるモデルにおけるIL-1の代わりにフィルグラスチムの全身的な効果のグラフ表示を示す。B6マウスには、mBSAをi.a.で、生理食塩水[黒線]、IL-1（250ng）[灰色の線]、またはフィルグラスチム（15μg）[白い線]を0、1、2日にs.c.で注射した。A.2日目における末梢血数およびB.7日目における膝窩リンパ節（LN）および脾臓の重量を示す。データは、群につきn＞5マウスで3回の実験を示す。mBSA／生理食塩水対照群と比較して＊P＜0.05；†P＜0.01。
【図４】急性関節炎モデルにおけるIL-1の代わりにG-CSFの全身の効果を図示する。マウスには、mBSAをi.a.で、生理食塩水媒体、IL-1、またはG-CSFのいずれかをs.c.で注射し、注射した膝を7日目に組織学的に検査した。A.総組織学スコアの平均±SEM。B.i関節空間に最小の浸出細胞を有するmBSA/生理食塩水で処理した関節（100×）、ii適度〜顕著な浸出物および滑膜炎を有するmBSA/IL-1で処理した関節、iii適度な炎症性の特徴を有するmBSA/G-CSFで処理した関節（200×）を例示する代表的な組織学。n＞10  関節／群／実験；3回の代表的な実験。＊mBSA／生理食塩水対照と比較したp＜0.05。
【図５】G-CSF-/-マウスは、mBSA/IL-1で誘導される関節炎に対して比較的抵抗力がある。B6およびG-CSF-/-マウスには、mBSAをi.a.で、IL-1または生理食塩水をs.c.で注射し、7日目に組織学的に評価した。ヒストグラムは、A.総組織学的な重篤さのスコアおよびB.軟骨プロテオグリカンの減少（サフラニンO染色による）を図示する。C.mBSA/IL-1-処理した（i、iii）B6および（ii、iv）G-CSF-/-マウスに由来するH&E（上部パネル）およびサフラニンO（底部パネル）切片を示す代表的な切片。n＞6関節／群／実験；3回の実験の代表。
【図６】B6 mBSA/生理食塩水、B6 mBSA/IL-1、およびG-CSF-/- mBSA/IL-1で処理した3および7日目のマウスからの、滑液組織を浸潤させている白血球集団の代表的なFACSプロットを示す。A.3日およびB.7日目に6つ以上の関節／群から滑膜を切開し、酵素カクテル中で分離させ、次いで特定のマーカーを染色した。AおよびBにおいて、総浸潤白血球は、CD45.2での染色によって同定された（A、B；上部パネル）。CD45.2+集団のみをその後の解析に使用した。C.B6 mBSA/生理食塩水、B6 mBSA/IL-1、およびG-CSF-/- mBSA/IL-1で処理したマウスからの滑膜を消化し、一晩付着させて、非接着細胞をCD4発現について染色した。データは、2回の実験を代表する。
【図７】WT B6およびG-CSF-/-マウスでの急性関節炎における好中球の枯渇の効果を示すグラフ表示である。マウスには、mBSA/IL-1で誘導される関節炎誘導の前に、好中球またはアイソタイプ対照に対する枯渇mAbで処理した。A.好中球枯渇mAbまたはアイソタイプ対照mAbで処理したWTおよびG-CSF-/-マウスにおける急性関節炎モデルの0、2、および7日目での末梢血解析。B.抗好中球mAbまたはアイソタイプ対照で処理したWTおよびG-CSF-/-マウスの総組織学的スコア。群につきn＞5関節、＊P＜0.05 WTアイソタイプ対照mAbで処理したマウスを好中球レベルと比較した。†P＜0.05 WTアイソタイプ対照および抗好中球mAbで処理した対照群の総スコアと比較した。
【図８】B6マウスと比較したG-CSF-/-マウスにおけるCIAの障害を示すグラフ表示である。マウスには、CFAのCIIを尾部の底部に内経皮的に注射し、21日目にブーストした。21日目から疾患について臨床的にマウスを評価し、それぞれの足を0（正常）から3（重篤）まででスコアした；最大スコア12（詳細は、実施例8を参照されたい）。A.は、疾患の累積的な発病率を図示する。B.B6およびG-CSF-/-マウスにおけるCIAの臨床的な重篤さ。データは、3回の実験からプールし；群につきn＞30マウス。＊P＜0.001 B6 G-CSF-/-と比較した。
【図９】B6対G-CSF-/-マウスにおけるCIAの組織学的な評価の結果を示す。最も重篤に臨床的な影響を受けたB6およびG-CSF-/-マウスのうちの4匹からの関節を、組織病理学的重篤さについて0から3でスコアした。Aは、正常、穏やか、中程度、および重篤に影響を受けた関節の割合のグラフ表示である。Bは、i非関節炎B6関節、ii重篤な炎症を起こしたB6 CIA関節、およびiii典型的な炎症を示さないG-CSF-/-関節由来の代表的なH&E切片を示す。
【図１０】B6およびG-CSF-/-マウスにおけるインビトロでのCIIに対するT細胞応答を示すグラフ表示である。一つの鼠径部のLN懸濁液をまいて、変性したCIIで刺激した。細胞を最後の8時間[3H]TdRでパルスし、T細胞増殖反応を評価するために放射活性の取り込みを測定した。A.B6およびG-CSF-/-LN細胞における増殖刺激インデックス。B.64時間で培養から採取した上清を、ELISAによって（i）IFN-γおよび（ii）IL-2のレベルについてアッセイした。n＞6ウェル／試料。
【図１１】CIA免役したB6およびG-CSF-/-マウスにおける抗CII Abを示す。血清をA.30日およびB.62日で採取し、抗CII Abs総IgG、IgM、並びにアイソタイプIgG2b、IgG2c、IgG1、およびIgG3についてELISAによって解析した。データは、3回の実験からプールし；群につきn＞30試料。＊P＜0.05、†P＜0.005。
【図１２】未処置およびCII/CFA免疫したB6並びにG-CSF-/-マウスにおける基礎Igレベルおよび非特異的な総IgGレベルのグラフ表示を示す。A.未処置のB6およびG-CSF-/-マウス（n=6マウス／群）を出血させて、循環総IgG、IgM、およびアイソタイプ（IgG2b、IgG2c、IgG1、IgG3、およびIgA）のレベルについてELISAによって血清を試験した。B.CIA免疫したB6およびG-CSF-/-マウスからの62日目の血清を非特異的な総IgGについて解析した。3回の別々の実験からのマウスが含まれる；n＞16マウス／群；＊P＜0.05。
【図１３】G-CSF-/-マウスにおけるB6マウスと比較したT依存的およびT非依存的な抗原へのAbの反応を示す。B6およびG-CSF-/-マウスには、ミョウバン中に沈殿させたT依存的なAgのNP-KLHを、またはPBS中のT非依存的な抗原DNP-デキストランをチャレンジし、特定の日に出血させた。NP-KLH群は、42日目にブーストした。A.i、NP2（総）およびii、NP20（高親和性）特異的なIgG1、iii、NP20 Ig2bの力価によって評価されるT依存的なNP-KLH反応、並びにB.T非依存的なDNP-デキストラン抗NP IgMの評価のために、ELISAによって血清を解析した。群につきn＞4マウス。
【図１４】急性関節炎モデルにおけるG-CSF中和の効果を示す。0、1、2、3、および5日目に、中和抗G-CSF（50および250μg）またはアイソタイプ対照mAbでB6マウスを処理した。A.4および7日目における末梢血好中球数（n=5）、B.関節あたりの臨床的な肉眼による平均スコア（4から）（n=10）、C.マウス関節あたりの平均滑膜組織細胞性（n=3）、D.浸潤した好中球（GR1hi CD11bhi）および単球／マクロファージ（CD11bhi GR1lo）を示すドットブロットのグラフ表示。データは、単一の実験を示す；＊P＜0.01。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月21日(2004.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の関節炎を治療または予防するための方法であって、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）またはその機能的もしくは構造的な相同体、または顆粒球コロニー刺激因子受容体（G-CSFR）またはその構造的もしくは機能的な相同体の活性を阻害する薬剤、および／または該G-CSFもしくはG-CSFRをコードする遺伝子の発現レベルを減少させる薬剤の有効量を被検者に投与する段階を含む方法。
【請求項２】
関節炎が慢性炎症性関節炎である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
症状が慢性関節リウマチ（RA）である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
関節炎がコラーゲン誘導性関節炎（CIA）である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
被検者が動物または鳥類の種である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
動物が哺乳類である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
哺乳類が霊長類である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
霊長類がヒトである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
哺乳類が齧歯類である、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
齧歯類がマウスである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
薬剤がG-CSFまたはG-CSFRに対して生じた抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
薬剤が可溶性G-CSFRまたはその機能的な相同体、類似体、もしくは誘導体である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
薬剤がG-CSFの化学的類似体である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
薬剤がG-CSFRの化学的類似体である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
薬剤がタンパク質である、請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
薬剤が核酸である、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
核酸がDNAまたはRNAであり、センスもしくはアンチセンスポリヌクレオチド配列、またはG-CSFもしくはG-CSFRもしくはその一部もしくはその転写物をコードする遺伝子配列を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
G-CSFまたはG-CSFRの活性を阻害する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、該G-CSFまたはG-CSFRに推定上の阻害剤を接触させる段階を含み、薬剤が、G-CSFまたはG-CSFRに結合すること、またはそうでなければ会合することによって阻害剤として同定される、方法。
【請求項２１】
G-CSFまたはG-CSFRをコードする遺伝子配列の発現を調節する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、G-CSFまたはG-CSFRをコードする該遺伝子配列に推定上の調節性の薬剤を接触させる段階を含み、薬剤が、G-CSFまたはG-CSFRをコードする遺伝子配列に結合すること、またはさもなければ会合することによって調節性の薬剤として同定される、方法。
【請求項２２】
被検者においてG-CSFまたはG-CSFRの活性を阻害する、および／または被検者において該G-CSFまたはG-CSFRをコードする遺伝子の発現レベルを減少させる薬剤を、薬学的に許容される担体または希釈液と共に含む薬学的組成物。
【請求項２３】
被検者が動物または鳥類の種である、請求項22記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
動物が哺乳類である、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
哺乳類が霊長類である、請求項24記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
霊長類がヒトである、請求項25記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
哺乳類が齧歯類である、請求項26記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
齧歯類がマウスである、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
薬剤がG-CSFまたはG-CSFRに対して生じた抗体である、請求項22記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項29記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項29記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
薬剤が可溶性G-CSFRまたはその機能的な相同体、類似体、もしくは誘導体である、請求項22記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
薬剤がG-CSFの化学的類似体である、請求項22記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
薬剤がG-CSFRの化学的類似体である、請求項22記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
薬剤がタンパク質である、請求項32〜34のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
薬剤が核酸である、請求項22記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
核酸がDNAまたはRNAであり、センスもしくはアンチセンスポリヌクレオチド配列、またはG-CSFもしくはG-CSFRもしくはその一部もしくはその転写物をコードする遺伝子配列を含む、請求項36記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
ポジティブまたはネガティブ選択可能なマーカーの側面に位置するG-CSFもしくはG-CSFR、またはその断片をコードする遺伝的物質の2つのセグメントを含む、細胞内でG-CSFまたはG-CSFRをコードする遺伝子を不活性化するために有用なターゲッティングベクターまたはマーカー交換突然変異誘発ベクター。
【請求項３９】
請求項35記載のベクターまたは該ベクターの一部を含む、遺伝子改変された動物細胞。
【請求項４０】
細胞が胚幹細胞である、請求項29記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項４１】
請求項39または40記載の細胞の1つまたは複数を含むか、またはそれに由来する、遺伝子改変された動物または胚であって、該動物は、同じ種の遺伝子改変されていない動物と比較して少ない量のG-CSFまたはG-CSFRを産生する、動物または胚。
【請求項４２】
動物がマウスである、請求項39または40記載の細胞。
【請求項４３】
動物がヒトである、請求項42記載の細胞。
【請求項４４】
請求項39または40記載の遺伝子改変された細胞を産生する方法であって、該方法は、請求項38記載のベクターを1つまたは複数の胚幹（ES）細胞に導入する段階、および選択可能なマーカー遺伝子の発現について選択する段階を含み、生じる形質転換細胞のG-CSFおよび／またはG-CSFR遺伝子は、該ベクターとの相同組換えによって不活性化される、方法。
【請求項４５】
G-CSFの活性を阻害し、および／またはG-CSFRとG-CSFの相互作用を阻害し、これにより関節炎の影響を改善することができる薬剤を同定するためのインビボ方法であって、該方法は、動物に対して推定上の阻害剤を投与する段階を含み、該薬剤が、G-CSFまたはG-CSFRとの相互作用力を有するとして同定される、方法。
【国際調査報告】
2005536535.tif 000028
2005536535.tif 000029
2005536535.tif 000030