(57)【要約】本発明は、末梢カンナビノイド受容体ＣＢ２のリガンドである、非古典的カンナビノイド、及び活性成分として新規な（＋）α−ピネン誘導体を含むその薬剤組成物に関するものであり、これらは、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、肝炎、乾癬、臓器移植における組織拒絶だけには限られないが、これらを含めた自己免疫疾患、小児脂肪便症などの吸収不良症候群、喘息及びシェーグレン症候群などの肺疾患、炎症性腸疾患を含めた炎症、末梢痛、内臓痛、神経障害痛、炎症痛及び関連痛を含めた痛み、筋肉の痙攣、不整脈、高血圧及び心筋虚血を含めた心臓血管障害、脳卒中、片頭痛、及び群発頭痛を含めた神経障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側策硬化症、ハンチントン舞踏病、プリオン関連神経変性、中枢神経系の中毒を含めた神経変性疾患、及びいくつかの型の癌を予防及び治療するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）の化合物であって、
（式Ｉ）
【化１】
2005523259.tif 000040
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、かつ  Ｒ１が
（ａ）Ｏ又はＳ、
（ｂ）Ｃ（Ｒ’）２であって、Ｒ’が出現するごとに水素、シアノ、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’又はＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から独立に選択され、出現するごとにＲ’’が、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、Ｃ（Ｓ）Ｒ’’’、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’’）２からなる群から独立に選択され、出現するごとにＲ’’’が水素、又は飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から独立に選択されるＣ（Ｒ’）２、及び
（ｃ）Ｒ’’が前に定義したものであるＮＲ’’又はＮ−ＯＲ’’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、
（ａ）ハロゲン、
（ｂ）出現するごとにＲ’’が前に定義したものである、−Ｒ’’、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｃ）−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂであって、Ｒｂが水素、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択され、Ｒ’’が前に定義したものである−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、及び
（ｄ）−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、又はＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２によって終結している−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖であって、Ｒｄが飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒｅが出現するごとに水素及び前に定義したＲｄからなる群から選択される、−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖からなる群からそれぞれ独立に選択され、かつ
Ｒ４が、
（ａ）Ｒが水素、ハロゲン、出現するごとにＲ’’’が前に定義したものである、ＯＲ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、ＣＮ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｒ’’’、ＮＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＳＲ’’’、及びＣ（Ｓ）Ｒ’’’からなる群から選択されるＲ、
（ｂ）Ｒが前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−Ｒ、
（ｃ）前に定義したＲによって、任意の位置においてさらに置換することができる芳香環、及び
（ｄ）飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルであって、（ｃ）で定義したさらに置換することができる芳香環によって、場合によっては終結しているＣ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、
ただし、Ｒ１がＯであり、かつＲ２及びＲ３がＯＨであるときは、Ｒ４が直鎖又は分枝鎖Ｃ５〜Ｃ１０アルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ５〜Ｃ８シクロアルキル及びＣ５〜Ｃ８シクロアルケニル以外のものである、
化合物、及びその薬剤として許容可能な塩、エステル又は溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ１がＯ、ＣＨ２又はＮ−ＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３、スクシネート、フマレート又はジエチルホスフェートであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ペンチル、１，１−ジメチル−ヘプチル、１，１−ジメチル−ペント−４−エニル、１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニル、１，１−ジメチル−３−フェニル−プロピル、１，１−ジメチル−５−ブロモ−ペンチル、１，１−ジメチル−５−シアノ−ペンチル、１，１，３−トリメチル−ブチル、１−メチル−１−ｐ−クロロフェニル−エチル、又は１−エチル−１−メチル−プロピルであり、ただしこれらが式（Ｉ）に関して定義したものである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−３−フェニル−プロピル、１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニル、１，１−ジメチル−５−ブロモ−ペンチル、１，１−ジメチル−５−シアノ−ペンチル、又は１−メチル−１−ｐ−クロロフェニル−エチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１がＯであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、かつＲ２及びＲ３がいずれもＨ、ＯＣＨ３、ジエチルホスフェート又はスクシネートである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１がＯであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、Ｒ２がＯＨであり、かつＲ３がＯＣＨ３、ジエチルホスフェート、フマレート又はスクシネートである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１がＯであり、Ｒ２がスクシネートであり、Ｒ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ペンチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１がＣＨ２であり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、Ｒ２及びＲ３がいずれもＯＣＨ３又はジエチルホスフェートである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１がＮＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
一般式（ＩＩ）の化合物であって、
（式ＩＩ）
【化２】
2005523259.tif 000041
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、Ｃ−２とＣ−３の間は任意選択の二重結合であり、かつ  Ｒ５が
（ａ）ハロゲン又は水素、
（ｂ）−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’であって、出現するごとにＲ’’が水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、Ｃ（Ｓ）Ｒ’’’、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’’）２からなる群から独立に選択され、出現するごとにＲ’’’が水素、又は飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から独立に選択される、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｃ）Ｒ’’が前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＳＲ’’又はＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｄ）−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂであって、Ｒｂが水素、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択され、出現するごとにＲ’’が前に定義したものである−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、
（ｅ）Ｒｂが前に定義したものである飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、及び
（ｆ）Ｒｃが、出現するごとにＲ’’が前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択される−Ｒｃからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、
（ａ）ハロゲン、
（ｂ）出現するごとにＲ’’が前に定義したものである、−Ｒ’’、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｃ）Ｒｂが前に定義したものである、−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、及び
（ｄ）−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、又はＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２によって終結している−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖であって、Ｒｄが飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒｅが出現するごとに水素及び前に定義したＲｄからなる群から選択される、−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖からなる群からそれぞれ独立に選択され、かつ
Ｒ４が、
（ａ）Ｒが水素、ハロゲン、出現するごとにＲ’’’が前に定義したものである、ＯＲ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、ＣＮ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｒ’’’、ＮＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＳＲ’’’、及びＣ（Ｓ）Ｒ’’’からなる群から選択されるＲ、
（ｂ）Ｒが前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−Ｒ、
（ｃ）前に定義したＲによって、任意の位置においてさらに置換することができる芳香環、及び
（ｄ）飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルであって、（ｃ）で定義したさらに置換することができる芳香環によって、場合によっては終結しているＣ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、
ただし、Ｒ５がＲｃであるとき、Ｒ４が直鎖又は分枝鎖飽和Ｃ１〜Ｃ１２アルキル鎖、フェニル基によって末端炭素が場合によっては置換された、直鎖又は分枝鎖飽和−Ｏ−Ｃ２〜Ｃ９アルコキシ鎖、及びヒドロキシル又は直鎖又は分枝鎖飽和−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ鎖によって終結した、直鎖又は分枝鎖飽和Ｃ１〜Ｃ７アルキル鎖以外のものである、
化合物、及びその薬剤として許容可能な塩、エステル又は溶媒和物。
【請求項１０】
Ｒ５がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３、ＯＨ又はＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、又はジエチルホスフェートであり、Ｒ４がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３ＣＨ３、１，１−ジメチル−ヘプチル、１，１−ジメチル−エチル−フェニル、又は１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニルであり、Ｃ−２とＣ−３の間に任意選択の二重結合が存在し、ただしこれらが式（ＩＩ）に関して定義したものである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ５がＯＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、Ｒ２及びＲ３がいずれもＨ、ＯＨ、又はジエチルホスフェートであり、かつＣ−２とＣ−３の間に単結合が存在する、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ５がＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニル、１，１−ジメチル−エチル−フェニル又はＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３ＣＨ３であり、かつＣ−２とＣ−３の間に二重結合が存在する、請求項９に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ５がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３であり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ペンチルであり、かつＣ−２とＣ−３の間に二重結合が存在する、請求項９に記載の化合物。
【請求項１４】
一般式（ＩＩＩ）の化合物であって、
（式ＩＩＩ）
【化３】
2005523259.tif 000042
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、かつ
Ｒ１が
（ａ）Ｏ又はＳ、
（ｂ）Ｃ（Ｒ’）２であって、Ｒ’が出現するごとに水素、シアノ、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’又はＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から独立に選択され、出現するごとにＲ’’が、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、Ｃ（Ｓ）Ｒ’’’、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’’）２からなる群から独立に選択され、出現するごとにＲ’’’が水素、又は飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から独立に選択されるＣ（Ｒ’）２、及び
（ｃ）Ｒ’’が前に定義したものであるＮＲ’’又はＮ−ＯＲ’’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、
（ａ）ハロゲン、
（ｂ）出現するごとにＲ’’が前に定義したものである、−Ｒ’’、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｃ）−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂであって、Ｒｂが水素、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択され、Ｒ’’が前に定義したものである−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、及び
（ｄ）−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、又はＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２によって終結している−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖であって、Ｒｄが飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒｅが出現するごとに水素及び前に定義したＲｄからなる群から選択される、−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖からなる群からそれぞれ独立に選択され、かつ
Ｒ４が、
（ａ）Ｒが水素、ハロゲン、出現するごとにＲ’’’が前に定義したものである、ＯＲ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、ＣＮ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｒ’’’、ＮＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＳＲ’’’、及びＣ（Ｓ）Ｒ’’’からなる群から選択されるＲ、
（ｂ）Ｒが前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−Ｒ、
（ｃ）前に定義したＲによって、任意の位置においてさらに置換することができる芳香環、及び
（ｄ）飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルであって、（ｃ）で定義したさらに置換することができる芳香環によって、場合によっては終結しているＣ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択される、
化合物を活性成分として含み、薬剤として許容可能な希釈剤又は担体をさらに含む薬剤組成物。
【請求項１５】
Ｒ１がＯ、ＣＨ２又はＮ−ＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３、スクシネート、フマレート又はジエチルホスフェートであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ペンチル、１，１−ジメチル−ヘプチル、１，１−ジメチル−ペント−４−エニル、１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニル、１，１−ジメチル−３−フェニル−プロピル、１，１−ジメチル−５−ブロモ−ペンチル、１，１−ジメチル−５−シアノ−ペンチル、１，１，３−トリメチル−ブチル、１−メチル−１−ｐ−クロロフェニル−エチル、又は１−エチル−１−メチル−プロピルである、請求項１４に記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ペンチル、１，１−ジメチル−ヘプチル、１，１−ジメチル−ペント−４−エニル、１，１−ジメチル−３−フェニル−プロピル、１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニル、１，１−ジメチル−５−ブロモ−ペンチル、１，１−ジメチル−５−シアノ−ペンチル、１，１，３−トリメチル−ブチル、１−メチル−１−ｐ−クロロフェニル−エチル、又は１−エチル−１−メチル−プロピルである、請求項１４に記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
Ｒ１がＯであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、Ｒ２及びＲ３がいずれもＨ、ＯＣＨ３、ジエチルホスフェート又はスクシネートである、請求項１４に記載の薬剤組成物。
【請求項１８】
Ｒ１がＯであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、Ｒ２がＯＨであり、かつＲ３がＯＣＨ３、ジエチルホスフェート、フマレート又はスクシネートである、請求項１４に記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
Ｒ１がＯであり、Ｒ２がスクシネートであり、Ｒ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ペンチルである、請求項１４に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
Ｒ１がＣＨ２であり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、Ｒ２及びＲ３がいずれもＯＣＨ３又はジエチルホスフェートである、請求項１４に記載の薬剤組成物。
【請求項２１】
Ｒ１がＮＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである、請求項１４に記載の薬剤組成物。
【請求項２２】
一般式（ＩＩ）の化合物であって、
（式ＩＩ）
【化４】
2005523259.tif 000043
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、Ｃ−２とＣ−３の間は任意選択の二重結合であり、かつ  Ｒ５が
（ａ）ハロゲン又は水素、
（ｂ）−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’であって、出現するごとにＲ’’が水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、Ｃ（Ｓ）Ｒ’’’、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’’）２からなる群から独立に選択され、出現するごとにＲ’’’が水素、又は飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から独立に選択される、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｃ）Ｒ’’が前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＳＲ’’又はＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｄ）−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂであって、Ｒｂが水素、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択され、出現するごとにＲ’’が前に定義したものである−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、
（ｅ）Ｒｂが前に定義したものである飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、及び
（ｆ）Ｒｃが、出現するごとにＲ’’が前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択される−Ｒｃからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、
（ａ）ハロゲン、
（ｂ）出現するごとにＲ’’が前に定義したものである、−Ｒ’’、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｃ）Ｒｂが前に定義したものである、−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、及び
（ｄ）−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、又は−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｅ）２によって終結している−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖であって、Ｒｄが飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒｅが出現するごとに水素及び前に定義したＲｄからなる群から選択される、−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−ＯＲｄ又は−ＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖からなる群からそれぞれ独立に選択され、かつ
Ｒ４が、
（ａ）Ｒが水素、ハロゲン、出現するごとにＲ’’’が前に定義したものである、ＯＲ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、ＣＮ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｒ’’’、ＮＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＳＲ’’’、及びＣ（Ｓ）Ｒ’’’からなる群から選択されるＲ、
（ｂ）Ｒが前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−Ｒ、
（ｃ）前に定義したＲによって、任意の位置においてさらに置換することができる芳香環、及び
（ｄ）飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルであって、（ｃ）で定義したさらに置換することができる芳香環によって、場合によっては終結しているＣ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、
ただし、Ｒ５がＲｃであるとき、Ｒ４が直鎖又は分枝鎖飽和Ｃ１〜Ｃ１２アルキル鎖、フェニル基によって末端炭素が場合によっては置換された、直鎖又は分枝鎖飽和−Ｏ−Ｃ２〜Ｃ９アルコキシ鎖、及びヒドロキシル又は直鎖又は分枝鎖飽和−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ鎖によって終結した、直鎖又は分枝鎖飽和Ｃ１〜Ｃ７アルキル鎖以外のものである、
化合物を活性成分として含み、薬剤として許容可能な希釈剤又は担体をさらに含む薬剤組成物。
【請求項２３】
Ｒ５がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３、ＯＨ又はＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、又はジエチルホスフェートであり、Ｒ４がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３ＣＨ３、１，１−ジメチル−ヘプチル、１，１−ジメチル−エチル−フェニル、又は１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニルであり、Ｃ−２とＣ−３の間に任意選択の二重結合が存在し、ただしこれらが式（ＩＩ）に関して定義したものである、請求項２２に記載の薬剤組成物。
【請求項２４】
Ｒ５がＯＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、Ｒ２及びＲ３がいずれもＨ、ＯＨ、又はジエチルホスフェートであり、かつＣ−２とＣ−３の間に単結合が存在する、請求項２２に記載の薬剤組成物。
【請求項２５】
Ｒ５がＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニル、１，１−ジメチル−エチル−フェニル又はＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３ＣＨ３であり、かつＣ−２とＣ−３の間に二重結合が存在する、請求項２２に記載の薬剤組成物。
【請求項２６】
Ｒ５がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３であり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ペンチルであり、かつＣ−２とＣ−３の間に二重結合が存在する、請求項２２に記載の薬剤組成物。
【請求項２７】
希釈剤が、薬剤として許容可能な共溶媒を含む水性共溶媒溶液、天然又は合成のイオン性又は非イオン性界面活性剤を用いて調製したミセル溶液又は乳濁液、又はこのような共溶媒及びミセル又は乳濁液溶液の組合せを含む、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項２８】
担体がエタノール、界面活性剤及び水の溶液を含む、請求項２７に記載の薬剤組成物。
【請求項２９】
担体がトリグリセリド、レシチン、グリセロール、乳濁剤、及び水を含む乳濁液である、請求項２７に記載の薬剤組成物。
【請求項３０】
単位剤形である、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項３１】
経口投与に適した、請求項３０に記載の薬剤組成物。
【請求項３２】
非経口投与に適した、請求項３０に記載の薬剤組成物。
【請求項３３】
治療上有効量の請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の薬剤組成物を、必要性のある個体に投与することによって、ＣＢ２受容体の調節の影響を受けやすい疾患又は障害を予防、軽減又は治療するための方法。
【請求項３４】
治療上有効量の請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の薬剤組成物を、必要性のある個体に投与することによって、自己免疫疾患及び炎症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、肝炎、乾癬、炎症性腸疾患、臓器移植における組織拒絶、吸収不良症候群、小児脂肪便症、肺疾患、喘息及びシェーグレン症候群を予防、軽減又は治療するための方法。
【請求項３５】
治療上有効量の請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の薬剤組成物を、必要性のある個体に投与することによって、神経障害、脳卒中、片頭痛、群発頭痛、神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側策硬化症、ハンチントン舞踏病、プリオン関連疾患、中枢神経系の中毒、及び筋肉の痙攣及び震えを予防、軽減又は治療するための方法。
【請求項３６】
治療上有効量の請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の薬剤組成物を、必要性のある個体に投与することによって、末梢痛、内臓痛、神経障害痛、炎症痛及び関連痛を含めた痛みを予防、軽減又は治療するための方法。
【請求項３７】
治療上有効量の請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の薬剤組成物を、必要性のある個体に投与することによって、心臓血管障害、不整脈、高血圧及び心筋虚血による障害を予防、軽減又は治療するための方法。
【請求項３８】
治療上有効量の請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の薬剤組成物を、必要性のある個体に投与することによって、癌を予防、軽減又は治療するための方法。
【請求項３９】
（＋）｛４−［４−（１，１−ジメチルヘプチル）−２，６−ジメトキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−イル｝−メタノールを活性成分として含む薬剤組成物を治療上有効量、必要性のある個体に投与することによって、神経障害痛を予防、軽減又は治療するための方法。
【請求項４０】
（＋）｛４−［４−（１，１−ジメチルヘプチル）−２，６−ジメトキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−イル｝−メタノールを活性成分として含む薬剤組成物を治療上有効量、必要性のある個体に投与することによって、パーキンソン病を予防、軽減又は治療するための方法。
【請求項４１】
組成物を経口的、非経口的、静脈内、筋肉内、病巣内、皮下、経皮的、クモ膜下、直腸及び鼻腔内に投与する、請求項３３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ＣＢ２受容体の調節の影響を受けやすい疾患又は障害を予防、軽減又は治療するための薬剤を調製するための、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４３】
自己免疫疾患及び炎症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、肝炎、乾癬、炎症性腸疾患、臓器移植における組織拒絶、吸収不良症候群、小児脂肪便症、肺疾患、喘息及びシェーグレン症候群を予防、軽減又は治療するための免疫調節及び抗炎症薬剤を調製するための、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４４】
神経障害、脳卒中、片頭痛、群発頭痛、神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側策硬化症、ハンチントン舞踏病、プリオン関連疾患、中枢神経系の中毒、及び筋肉の痙攣及び震えを予防、軽減又は治療するための神経保護薬剤を調製するための、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４５】
末梢痛、内臓痛、神経障害痛、炎症痛及び関連痛を含めた痛みを予防、軽減又は治療するための鎮痛薬剤を調製するための、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４６】
心臓血管障害、不整脈、高血圧及び心筋虚血による障害を予防、軽減又は治療するための薬剤を調製するための、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４７】
癌を予防、軽減又は治療するための薬剤を調製するための、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４８】
神経障害痛を予防、軽減又は治療するための薬剤を調製するための、（＋）｛４−［４−（１，１−ジメチルヘプチル）−２，６−ジメトキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−イル｝−メタノールの使用。
【請求項４９】
パーキンソン病を予防、軽減又は治療するための薬剤を調製するための、（＋）｛４−［４−（１，１−ジメチルヘプチル）−２，６−ジメトキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−イル｝−メタノールの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢カンナビノイド受容体ＣＢ２のリガンドである（＋）α−ピネン誘導体、及びその薬剤組成物に関するものであり、これらは自己免疫疾患及び関連障害、炎症、痛み、筋肉の痙攣、心臓血管障害、神経障害、神経変性疾患、中枢神経系中毒、及びいくつかの型の癌を予防及び治療するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａの調製物は、さまざまな疾患を治療するための治療剤として長い間知られてきている（Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ、Ｒ．「治療剤としてのカンナビノイド（Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ  ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ）」中、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．、１〜１９、１９８６）。元の活性成分、デルタ９−テトラヒドロカンナビノール（Δ９−ＴＨＣ）が、主にＡＩＤＳ患者において食欲を高めるために抗嘔吐剤として、Ｄｒｏｎａｂｉｎｏｌの商品名で今日処方されている。しかしながら、臨床的に望ましくない向精神薬効果と、血管の血圧低下及び免疫調節などの治療上望ましい効果の分離ができるようになったのはごく最近である。２つのカンナビノイド受容体、ＣＢ１及びＣＢ２の発見は、多様なカンナビノイド効果の解明を手助けしている。
【０００３】
これらの受容体は、４４％のアミノ酸配列相同性を共有するが組織特異性が異なる、Ｇ−タンパク質共役型７回膜貫通構造を有していることが示された（Ｍｕｎｒｏ、Ｓ．、Ｔｈｏｍａｓ、Ｋ．Ｌ．＆  Ａｂｕ−Ｓｈａａｒ、Ｍ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：６１〜５、１９９３）。これらの受容体は、百日咳毒素感受性ＧＴＰ−結合タンパク質を介したアデニルシクラーゼ活性の負の制御によって、それらの効果を発揮する。これらの受容体は、いくつかの細胞型において、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を活性化することも示された（Ｐａｒｏｌａｒｏ、Ｄ．、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６５：６３７〜４４、１９９９）。
【０００４】
ＣＢ１受容体は中枢神経系中で主に発現され、他の組織中ではさらに低い程度で発現される。ＣＢ１受容体は、カンナビノイドの作用効果と関連がある脳領域、例えば海馬、扁桃、皮質、大脳基底核及び小脳などで主に見られる。さらに、高レベルのＣＢ１受容体が、侵害反射プロセスを調節する領域中で見られる。ＣＢ２受容体は、マクロファージ、Ｂ及びＴ細胞を含めた、免疫機能と関連がある末梢組織中、及び末梢神経末端中、及びマスト細胞上で主に発現される（Ｐｅｒｔｗｅｅ、Ｒ．Ｇ．、Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６３：５６９〜６１１、２００１）。主に中枢神経系においてＣＢ１によって仲介される効果は完全に調べられてきているが、ＣＢ２によって仲介される効果はごく最近解明されている。
【０００５】
受容体の神経解剖学的分布は、［３Ｈ］ＣＰ−５５９４０などの放射標識したＴＨＣ類似体を使用して決定された（Ｅｌｐｈｉｃｋ、Ｍ．Ｒ．＆  Ｅｇｅｒｔｏｖａ、Ｍ．、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５６：３８１〜４０８、２００１）。最高濃度のカンナビノイド結合部位、特にＣＢ１受容体は、大脳基底核及び小脳、運動と関連がある脳の領域中に見られる。受容体の小集団は、背根神経節の末梢端において発現される。カンナビノイドの鎮痛効果は、それらの運動効果と解剖学的に異なる部位で仲介されることが示唆されてきている。免疫組織化学、特定の転写産物（Ｇａｌｉｅｇｕｅ、Ｓ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：５４〜６１、１９９５）及びノックアウトマウス（Ｂｕｃｋｌｅｙ、Ｎ．Ｅ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９６：１４１〜９、２０００）を使用するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを含めた、他の技法を使用して、受容体の発現パターン及び機能の理解に貢献してきている。ＣＢ２受容体は脳内では発現されないが、免疫組織中に非常に豊富であり、発現レベルはＣＢ１のそれより１０〜１００倍高い。脾臓及び扁桃では、ＣＢ２のｍＲＮＡ含有量は、中枢神経系中のＣＢ１のｍＲＮＡ含有量と同等であった。主なヒト血液細胞小集団中では、ＣＢ２のｍＲＮＡの分布パターンは、ナチュラルキラー細胞又は単球中よりもＢ細胞中において高度の、多形核好中球細胞、Ｔ８細胞及びＴ４細胞中において低度の重要な変化を示した。
【０００６】
ＣＢ１ノックアウトマウスは、行動のアッセイにおいてカンナビノイドに対して応答性がないことが示されてきており、鎮静、幻覚及びうわごと、及び抗侵害反射を含めた向精神薬効果が、中枢神経系中に主に存在するＣＢ１受容体の活性化によって現れるという、分子的証拠が与えられる。ＣＢ２ノックアウトマウスの分析によって、免疫系の調節におけるＣＢ２受容体の機能に関する証拠が確かとなっている。ＣＢ２は、ＣＢ２ノックアウトマウスの脾臓、リンパ節及び胸腺からの細胞のＦＡＣＳ分析により決定されるように、免疫細胞の成長及び分化に影響を与えることはないが、Δ９−ＴＨＣの抑制効果を仲介する。
【０００７】
免疫細胞及びニューロンのサブセット中では、ＣＢ２受容体の発現が制限されているために、選択的ＣＢ２リガンドは治療的な価値を有する（Ｐｅｒｔｗｅｅ、Ｒ．Ｇ．、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：６３５〜６４、１９９９）。特に興味深いのは、ＣＢ２受容体に関して親和性が高く特異性が高い化合物である。これらの化合物は、ＣＢ１受容体と親和性がある化合物で見られる有害な副作用を回避しながら、ＣＢ２アゴニスムの利点を与えることができると思われる。このような化合物は、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、肝炎、炎症性腸疾患又は過敏症腸症候群、乾癬だけには限られないが、これらを含めた自己免疫疾患、及び臓器移植における組織拒絶、小児脂肪便症などの吸収不良症候群、喘息及びシェーグレン症候群などの肺疾患だけには限られないが、これらの他の免疫関連障害の治療において有効であると思われる。
【０００８】
カンナビノイド受容体の発見、及びさらに近年のエンドカンナビノイド、ＣＢ受容体を活性化させることができる内因性リガンドの同定によって、カンナビノイド及び関連化合物によって発揮される多数の効果が理解されるようになった。いくつかのカンナビノイドのアゴニストの一般的な神経保護効果の上に、より具体的な適用例を見出すことができる。したがって、例えば、エンドカンナビノイド系による痙攣の緊張調節に関する証拠によって、カンナビノイドのアゴニストが、多発性硬化症における筋肉の痙攣及び震えの治療において役立つ可能性があることが示唆され（Ｂａｋｅｒ  Ｄ．他、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１５：３００〜２、２００１）、さらに免疫細胞によって発現されるＣＢ２受容体上の作用による免疫調節によって、疾患を緩和することが可能である。カンナビノイドのアゴニストが、癌及びＨＩＶ／ＡＩＤＳ（Ｈａｌｌ  Ｗ．Ｄ．、Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ  Ｌ．Ｊ．＆  Ｃｕｒｒｏｗ  Ｄ．、Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔ．１７５：３９〜４０、２００１）、及び神経筋肉障害の筋肉痙攣の治療において、有用であることが明らかになる可能性もある。
【０００９】
ＣＢ１受容体の活性化には、痛み及び炎症、さらに鎮静及び望ましくない向精神薬効果の治療において、治療上の利点がある。カンナビノイドは、侵害反射ニューロンの作用によって急性痛のプロセスを阻害するだけでなく、持続的な痛み、及び炎症誘導性の過敏症も調節する。それらの中枢での効果以外に、カンナビノイドは損傷部位の痛みも抑制し、興味深いことに、末梢におけるカンナビノイドの抗炎症及び抗痛覚過敏作用は、ＣＢ２受容体仲介の活性も含む可能性がある。ＣＢ２受容体を選択的に活性化させる化合物は、免疫調節物質としての能力を有し、自己免疫疾患及び関連障害を治療するための治療的手法を与えることができる。さらに、選択的なＣＢ２受容体のアゴニストは、炎症及び痛み、心筋虚血、及びいくつかの型の癌の治療において、有用であることが示されてきている。ＴＨＣ、及びこれまでに同定されている２つの主要な内因性リガンド、アラキドノイルエタノールアミド（アナンドアミド又はＡＥＡ）（Ｄｅｖａｎｅ、Ｗ．Ａ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１９４６〜９、１９９２）及び２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）（Ｓｕｇｉｕｒａ、Ｔ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１５：８９〜９７、１９９５）は、両方のカンナビノイド受容体と結合することによって、それらの効果の大部分を発揮する。
【００１０】
いくつかの合成化合物が、ＣＢ１受容体よりもＣＢ２受容体と高い親和性で、結合することが示されてきている（Ｐｅｒｔｗｅｅ、Ｒ．Ｇ．、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ９：１５５３〜７１、２０００）。カンナビノイド受容体のアゴニストは、４つの主要な群の化合物を含む。古典的カンナビノイドはＴＨＣのジベンゾピラン環系を維持しているが、一方で非古典的カンナビノイドは、ピラン環が欠けた二環式又は三環式類似体を含む。アミノアルキルインドール及び類似体が第三の系を構成し、アナンドアミド及び他の脂肪酸誘導体を含むエンドカンナビノイドは、第四の系を構成する。例えば、Ｌ−７５９６５６は古典的カンナビノイドの類似体であり、ＨＵ−３０８は二環式類似体である。両方共３００〜４００のＣＢ２／ＣＢ１結合親和性比率を有し、両方共に機能アッセイにおいて、強力で特異的なＣＢ２アゴニストとして働くことが示されてきている（Ｈａｎｕｓ、Ｌ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１４２２８〜３３、１９９９；Ｒｏｓｓ、Ｒ．Ａ．他、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２６：６６５〜７２、１９９９）。
【００１１】
ＣＢ２受容体の活性化と治療的性質を関連付ける証拠は、多種多様である。特にＣＢ２の活性化による、心臓保護におけるカンナビノイドの関与、不整脈を含めた虚血及び再灌流効果に対するカンナビノイドの関与が、ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ０１／２８５８８中、及びＫｒｙｌａｔｏｖ他（Ｋｒｙｌａｔｏｖ  Ａ．Ｖ．他、Ｂｕｌｌ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１３１：５２３〜５、２００１）によって近年記載されており、それらの開示は参照として本明細書に組み込まれる。カンナビノイドは、動物モデルの肺腺癌、グリオーム、甲状腺上皮腫、及び皮膚の非メラノーマを含めた、さまざまな型の腫瘍の退縮を誘導するそれらの能力のために、潜在的な抗癌剤である可能性がある。いくつかの腫瘍、特にグリオームは、ＣＢ２受容体を発現する。Ｇｕｚｍａｎ他（Ｇａｌｖｅ−Ｒｏｐｅｒｈ、Ｉ．他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：３１３〜９、２０００；Ｇｕｚｍａｎ、Ｍ．、Ｓａｎｃｈｅｚ、Ｃ．、Ｇａｌｖｅ−Ｒｏｐｅｒｈ、Ｉ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８：６１３〜２５、２００１）は、天然リガンドＴＨＣ及び合成カンナビノイドＷＩＮ５５２１２−２は、動物の悪性脳腫瘍の退縮又は根絶を誘導することを示した。ラットのグリオームＣ６細胞系はＣＢ２を発現し、選択的ＣＢアンタゴニストを用いた研究に基づいて、いずれかの受容体を活性化することによって、アポトーシスを誘導する可能性があることが提案されてきている。
【００１２】
免疫抑制におけるエンドカンナビノイド系の役割は、多くの研究の焦点である（Ｂｅｒｄｙｓｈｅｖ、Ｅ．Ｖ．、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ  １０８：１６９〜９０、２０００）。アナンドアミド（ＡＥＡ）、パルミトイルエタノールアミド（ＰＥＡ）及び２−ＡＧは、さまざまな実験系において免疫応答を下方制御し、抗炎症剤及び免疫抑制剤として機能することが示された。
【００１３】
ＴＨＣは、その鎮痛性に関して知られている。２つの主要な内因性リガンド、ＡＥＡ及び２−ＡＧも、鎮痛剤として作用し、２つのカンナビノイド受容体と結合することによって、その効果を発揮することができることが示されてきている（Ｃａｌｉｇｎａｎｏ、Ａ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：２７７〜８１、１９９８）。したがって、ＣＢ２受容体又は推定ＣＢ２様受容体のアゴニストは、末梢痛、内臓痛、神経障害痛、炎症痛及び関連痛を抑制するための物質として有用である。さらに、ＣＢ２受容体リガンドは、中枢神経系の中毒に対して保護性がある可能性がある。
【００１４】
米国特許第４，２０８，３５１号は、古典的な三環式カンナビノイドを調製するための立体選択的方法における中間体として、光学的に活性がある二環式化合物を開示している。しかしながら、治療活性はこれらの中間体に原因があるわけではなく、このような化合物がカンナビノイド受容体と完全に結合する能力に関しては言及されておらず、したがって、このような化合物を含む薬剤組成物は想定されなかった。
【００１５】
米国特許第４，２８２，２４８号は、ピネン誘導体の異性体混合物と、個々の異性体の両方を開示している。鎮痛、中枢神経系抑制、鎮静及び精神安定活性を含めた治療活性は、これらの化合物に起因していたが、この開示は、前記化合物が任意のカンナビノイド受容体と結合するであろうことを教示しなかった。
【００１６】
米国特許第５，４３４，２９５号は、新規な４−フェニルピネン誘導体の系を開示し、中枢神経系への損傷を伴うさまざなま病状の治療において有用な薬剤組成物中への、前記化合物の使用の仕方を教示している。この開示は、これらの任意のものは末梢カンナビノイド受容体に関して選択的であることを、教示も示唆もしていない。国際特許出願ＷＯ  ０１／３２１６９は、ＣＢ２特異的なアゴニストとして、ＨＵ−３０８を含めた二環式化合物の系を開示し、痛み及び炎症、自己免疫疾患、胃腸障害の治療における化合物の使用、及び血圧降下剤としての使用を例示している。
【００１７】
米国特許第６，０１３，６４８号は、ＣＢ２特異的なアゴニストであり、免疫調節薬剤を調製するために使用することができる、インドール誘導体を開示している。国際特許出願ＷＯ  ０１／２８４９７は、ＣＢ２受容体に関して高い親和性を示す、新規な二環式カンナビノイド類似体を開示している。前記特許中の化合物は、本開示中に取り入れた名称を指すとき、Ｃ−１、Ｃ−４及びＣ−５がＲである立体化学的配向であることは、当業者には明らかである。しかしながら、対応する（＋）α−ピネン誘導体は合成されておらず、それらの治療活性も知られていない。
【００１８】
本発明が、米国特許第４，２０８，３５１号、４，２８２，２４８号及び５，４３４，２９５号中、及び国際特許出願ＷＯ  ０１／３２１６９中に開示された化合物を含めた、知られている化合物を明らかに除外していることは理解されるが；これらの化合物のいくつかの新規な性質は、そのように特許請求する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、新規なα−ピネン誘導体及びその組成物を提供することである。詳細には、好ましい化合物は、末梢カンナビノイド受容体ＣＢ２に対して特異的な結合親和性を示し、したがって特異的な治療用ＣＢ２結合リガンドを含む治療法が提供される。これらの方法は、適切に配合された薬剤組成物を使用することを含む。本発明の他の目的は、ｉｎ  ｖｉｖｏでそのＣＢ２受容体特異的な効果を発揮することができる、ＣＢ２結合リガンドを提供することである。本発明は、治療上有効量のＣＢ２に特異的なリガンドを活性成分として含む薬剤組成物を、必要性のある個体に投与することによって、疾患を予防又は治療するための方法をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の第一の実施形態によれば、
一般式（Ｉ）の化合物であって、
（式Ｉ）
【化１】
2005523259.tif 000002
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、かつ  Ｒ１が
（ａ）Ｏ又はＳ、
（ｂ）Ｃ（Ｒ’）２であって、Ｒ’が出現するごとに独立に水素、シアノ、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’又はＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択され、出現するごとにＲ’’が、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、Ｃ（Ｓ）Ｒ’’’、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’’）２からなる群から独立に選択され、出現するごとにＲ’’’が水素、又は飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から独立に選択されるＣ（Ｒ’）２、及び
（ｃ）Ｒ’’が前に定義したものであるＮＲ’’又はＮ−ＯＲ’’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、
（ａ）ハロゲン、
（ｂ）出現するごとにＲ’’が前に定義したものである、−Ｒ’’、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｃ）−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂであって、Ｒｂが水素、又は飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択され、Ｒ’’が前に定義したものである−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、及び
（ｄ）−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖であって、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、又は−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｅ）２によって終結しており、Ｒｄが飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒｅが出現するごとに水素及び前に定義したＲｄからなる群から選択される、−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖からなる群からそれぞれ独立に選択され、かつ
Ｒ４が、
（ａ）Ｒが水素、ハロゲン、出現するごとにＲ’’’が前に定義したものである、ＯＲ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、ＣＮ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｒ’’’、ＮＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＳＲ’’’、及びＣ（Ｓ）Ｒ’’’からなる群から選択されるＲ、
（ｂ）Ｒが前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−Ｒ、
（ｃ）前に定義したＲによって、任意の位置においてさらに置換することができる芳香環、及び
（ｄ）飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルであって、（ｃ）で定義したさらに置換することができる芳香環によって、場合によっては終結しているＣ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、
ただし、Ｒ１がＯであり、かつＲ２及びＲ３がＯＨであるときは、Ｒ４が直鎖又は分枝鎖Ｃ５〜Ｃ１０アルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ５〜Ｃ８シクロアルキル及びＣ５〜Ｃ８シクロアルケニル以外のものである、
化合物、及びその薬剤として許容可能な塩、エステル又は溶媒和物を、我々は開示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
現在好ましい実施形態によれば、一般式（Ｉ）の化合物であって、Ｒ１がＯ、ＣＨ２又はＮ−ＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３、スクシネート、フマレート又はジエチルホスフェートであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ペンチル、１，１−ジメチル−ヘプチル、１，１−ジメチル−ペント−４−エニル、１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニル、１，１−ジメチル−３−フェニル−プロピル、１，１−ジメチル−５−ブロモ−ペンチル、１，１−ジメチル−５−シアノ−ペンチル、１，１，３−トリメチル−ブチル、１−メチル−１−ｐ−クロロフェニル−エチル、又は１−エチル−１−メチル−プロピルであり、ただしこれらが式（Ｉ）に関して定義したものである化合物を、我々はここで開示する。
【００２２】
本発明の他の実施形態によれば、
一般式（ＩＩ）の化合物であって、
（式ＩＩ）
【化２】
2005523259.tif 000003
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、Ｃ−２とＣ−３の間は任意選択の二重結合であり、かつ  Ｒ５が
（ａ）ハロゲン又は水素、
（ｂ）−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’であって、出現するごとにＲ’’が水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、Ｃ（Ｓ）Ｒ’’’、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’’）２からなる群から独立に選択され、出現するごとにＲ’’’が水素、又は飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から独立に選択される、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｃ）Ｒ’’が前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＳＲ’’又はＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｄ）−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂであって、Ｒｂが水素、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択され、出現するごとにＲ’’が前に定義したものである−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、
（ｅ）Ｒｂが前に定義したものである飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、及び
（ｆ）Ｒｃが、出現するごとにＲ’’が前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択される−Ｒｃからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、
（ａ）ハロゲン、
（ｂ）出現するごとにＲ’’が前に定義したものである、−Ｒ’’、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｃ）−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂであって、Ｒｂが水素、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択され、Ｒ’’が前に定義したものである、−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、及び
（ｄ）−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、又はＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２によって終結している−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖であって、Ｒｄが飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒｅが出現するごとに水素及び前に定義したＲｄからなる群から選択される、−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖からなる群からそれぞれ独立に選択され、かつ
Ｒ４が、
（ａ）Ｒが水素、ハロゲン、出現するごとにＲ’’’が前に定義したものである、ＯＲ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、ＣＮ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｒ’’’、ＮＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＳＲ’’’、及びＣ（Ｓ）Ｒ’’’からなる群から選択されるＲ、
（ｂ）Ｒが前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−Ｒ、
（ｃ）前に定義したＲによって、任意の位置においてさらに置換することができる芳香環、及び
（ｄ）飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルであって、（ｃ）で定義したさらに置換することができる芳香環によって、場合によっては終結しているＣ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、
ただし、Ｒ５がＲｃであるとき、したがってＲ４が直鎖又は分枝鎖飽和Ｃ１〜Ｃ１２アルキル鎖、フェニル基によって末端炭素が場合によっては置換された、直鎖又は分枝鎖飽和−Ｏ−Ｃ２〜Ｃ９アルコキシ鎖、及びヒドロキシル又は直鎖又は分枝鎖飽和−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ鎖によって終結した、直鎖又は分枝鎖飽和Ｃ１〜Ｃ７アルキル鎖以外のものである、
化合物、及びその薬剤として許容可能な塩、エステル又は溶媒和物を、我々は開示する。
【００２３】
現在好ましい実施形態によれば、一般式（ＩＩ）の化合物であって、Ｒ５がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３、ＯＨ又はＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立にＯＨ、Ｈ、又はジエチルホスフェートであり、Ｒ４がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３ＣＨ３、１，１−ジメチル−ヘプチル、１，１−ジメチル−エチル−フェニル、又は１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニルであり、Ｃ−２とＣ−３の間に任意選択の二重結合が存在し、ただしこれらが式（ＩＩ）に関して定義したものである化合物を、我々はここで開示する。
【００２４】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、
一般式（Ｉ）のＣＢ２結合化合物であって、
（式Ｉ）
【化３】
2005523259.tif 000004
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、かつ置換基Ｒ１〜Ｒ４が前に定義したものである化合物を、我々は開示する。
【００２５】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、
一般式（ＩＩ）のＣＢ２結合化合物であって、
（式ＩＩ）
【化４】
2005523259.tif 000005
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、Ｃ−２とＣ−３の間は任意選択の二重結合であり、かつ置換基Ｒ２〜Ｒ５がこの中で定義した式（ＩＩ）に関して定義したものである化合物を、我々は開示する。
【００２６】
本発明は、
一般式（ＩＩＩ）の化合物であって、
（式ＩＩＩ）
【化５】
2005523259.tif 000006
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、かつ
Ｒ１が
（ａ）Ｏ又はＳ、
（ｂ）Ｃ（Ｒ’）２であって、Ｒ’が出現するごとに水素、シアノ、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’又はＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から独立に選択され、出現するごとにＲ’’が、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、Ｃ（Ｓ）Ｒ’’’、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’’）２からなる群から独立に選択され、出現するごとにＲ’’’が水素、又は飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から独立に選択されるＣ（Ｒ’）２、及び
（ｃ）Ｒ’’が前に定義したものであるＮＲ’’又はＮ−ＯＲ’’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、
（ａ）ハロゲン、
（ｂ）出現するごとにＲ’’が前に定義したものである、−Ｒ’’、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｃ）−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂであって、Ｒｂが水素、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択され、Ｒ’’が前に定義したものである−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、及び
（ｄ）−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、又はＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２によって終結している−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖であって、Ｒｄが飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒｅが出現するごとに水素及び前に定義したＲｄからなる群から選択される、−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖からなる群からそれぞれ独立に選択され、かつ
Ｒ４が、
（ａ）Ｒが水素、ハロゲン、出現するごとにＲ’’’が前に定義したものである、ＯＲ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、ＣＮ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｒ’’’、ＮＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＳＲ’’’、及びＣ（Ｓ）Ｒ’’’からなる群から選択されるＲ、
（ｂ）Ｒが前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−Ｒ、
（ｃ）前に定義したＲによって、任意の位置においてさらに置換することができる芳香環、及び
（ｄ）飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルであって、（ｃ）で定義したさらに置換することができる芳香環によって、場合によっては終結しているＣ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択される、
化合物、及びその薬剤として許容可能な塩、エステル又は溶媒和物を活性成分として含む薬剤組成物も含む。
【００２７】
現在好ましい実施形態によれば、Ｒ１がＯ、ＣＨ２又はＮ−ＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３、スクシネート、フマレート又はジエチルホスフェートであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ペンチル、１，１−ジメチル−ヘプチル、１，１−ジメチル−ペント−４−エニル、１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニル、１，１−ジメチル−３−フェニル−プロピル、１，１−ジメチル−５−ブロモ−ペンチル、１，１−ジメチル−５−シアノ−ペンチル、１，１，３−トリメチル−ブチル、１−メチル−１−ｐ−クロロフェニル−エチル、又は１−エチル−１−メチル−プロピルである一般式（ＩＩＩ）の化合物を、活性成分として含む薬剤組成物を、我々はここで開示する。
【００２８】
本発明は、
一般式（ＩＩ）の化合物であって、
（式ＩＩ）
【化６】
2005523259.tif 000007
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、Ｃ−２とＣ−３の間は任意選択の二重結合であり、かつ  Ｒ５が
（ａ）ハロゲン又は水素、
（ｂ）−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’であって、出現するごとにＲ’’が水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、Ｃ（Ｓ）Ｒ’’’、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’’）２からなる群から独立に選択され、出現するごとにＲ’’’が水素、又は飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から独立に選択される、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｃ）Ｒ’’が前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＳＲ’’又はＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｄ）−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂであって、Ｒｂが水素、又は飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択され、出現するごとにＲ’’が前に定義したものである−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、
（ｅ）Ｒｂが前に定義したものである飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、及び
（ｆ）Ｒｃが、出現するごとにＲ’’が前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択される−Ｒｃからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、
（ａ）ハロゲン、
（ｂ）出現するごとにＲ’’が前に定義したものである、−Ｒ’’、−ＯＲ’’、−Ｎ（Ｒ’’）２、−ＳＲ’’、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲ’’、
（ｃ）−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂであって、Ｒｂが水素、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ＯＲ’’、及びＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｎ（Ｒ’’）２からなる群から選択され、Ｒ’’が前に定義したものである、−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｂ、及び
（ｄ）−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、又はＰ−（Ｏ）（ＯＲｅ）２によって終結している−ＯＲｄ又はＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖であって、Ｒｄが飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒｅが出現するごとに水素及び前に定義したＲｄからなる群から選択される、−ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｅ）２、−ＯＲｄ又は−ＯＣ（Ｏ）−Ｒｄ鎖からなる群からそれぞれ独立に選択され、かつ
Ｒ４が、
（ａ）Ｒが水素、ハロゲン、出現するごとにＲ’’’が前に定義したものである、ＯＲ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、ＣＮ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｒ’’’、ＮＣ（Ｏ）ＯＲ’’’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＮＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’’）２、ＳＲ’’’、及びＣ（Ｓ）Ｒ’’’からなる群から選択されるＲ、
（ｂ）Ｒが前に定義したものである、飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−Ｒ、
（ｃ）前に定義したＲによって、任意の位置においてさらに置換することができる芳香環、及び
（ｄ）飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式Ｃ１〜Ｃ１２アルキルであって、（ｃ）で定義したさらに置換することができる芳香環によって、場合によっては終結しているＣ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、
ただし、Ｒ５がＲｃであるとき、したがってＲ４が直鎖又は分枝鎖飽和Ｃ１〜Ｃ１２アルキル鎖、フェニル基によって末端炭素が場合によっては置換された、直鎖又は分枝鎖飽和−Ｏ−Ｃ２〜Ｃ９アルコキシ鎖、及びヒドロキシル又は直鎖又は分枝鎖飽和−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ鎖によって終結した、直鎖又は分枝鎖飽和Ｃ１〜Ｃ７アルキル鎖以外のものである、
化合物、及びその薬剤として許容可能な塩、エステル又は溶媒和物を活性成分として含む薬剤組成物をさらに含む。
【００２９】
現在好ましい実施形態によれば、Ｒ５がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３、ＯＨ又はＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立にＯＨ、Ｈ、又はジエチルホスフェートであり、Ｒ４がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３ＣＨ３、１，１−ジメチル−ヘプチル、１，１−ジメチル−エチル−フェニル、又は１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニルであり、Ｃ−２とＣ−３の間に任意選択の二重結合が存在し、ただしこれらが式（ＩＩ）に関して定義したものである一般式（ＩＩ）の化合物を、活性成分として含む薬剤組成物を、我々はここで開示する。
【００３０】
本発明の新規な組成物は、活性成分以外に、生理学的に許容可能な安定した配合物を生成させるために必要な、従来の薬剤として許容可能な担体、希釈剤及びベヒクルを含む。
【００３１】
本発明の薬剤組成物は、経口的、非経口的、静脈内、筋肉内、病巣内、皮下、経皮的、クモ膜下、直腸又は鼻腔内経路を含めた、任意の従来的な適切な経路によって投与することができる。
【００３２】
本発明の他の態様は、ＣＢ２受容体を刺激することにより患者を治療する方法であって、本発明の一般式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物を治療上有効量含む薬剤組成物を、前記患者に投与することを含む方法を提供する。
【００３３】
したがって本発明は、ＣＢ２受容体の調節の影響を受けやすい指標を免疫調節するために、一般式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物を治療上有効量、必要性のある個体に投与することを含む、方法を提供する。これらの指標には、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、肝炎及び乾癬を含めた自己免疫疾患、及び臓器移植における組織拒絶、小児脂肪便症などの吸収不良症候群、喘息及びシェーグレン症候群などの肺疾、炎症性腸疾患を含めた炎症だけには限られないが、これらを含めた免疫関連障害、末梢痛、内臓痛、神経障害痛、炎症痛及び関連痛を含めた痛み、筋肉の痙攣、不整脈、高血圧及び心筋虚血を含めた心臓血管障害、脳卒中、片頭痛、及び群発頭痛を含めた神経障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側策硬化症、ハンチントン舞踏病、プリオン関連神経変性を含めた神経変性疾患、中枢神経系中毒、及びいくつかの型の癌があるが、これらだけには限られない。
【００３４】
本発明は、本明細書中に示すように、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、肝炎、乾癬を含めた自己免疫疾患、及び臓器移植における組織拒絶、小児脂肪便症などの吸収不良症候群、喘息及びシェーグレン症候群などの肺疾患、炎症性腸疾患を含めた炎症だけには限られないが、これらを含めた免疫関連障害、末梢痛、内臓痛、神経障害痛、炎症痛及び関連痛を含めた痛み、筋肉の痙攣、不整脈、高血圧及び心筋虚血を含めた心臓血管障害、脳卒中、片頭痛、及び群発頭痛を含めた神経障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側策硬化症、ハンチントン舞踏病、プリオン関連神経変性を含めた神経変性疾患、中枢神経系中毒、及びいくつかの型の癌を治療及び予防するための薬剤を調製するための、一般式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物の使用を含む。
【００３５】
本発明の化合物及び組成物は、末梢カンナビノイド受容体ＣＢ２のリガンドとして働くように特異的に設計されているが、ＣＢ２受容体により仲介されるかどうかに関係なく、「非古典的カンナビノイド」と呼ばれる化合物群の他の望ましい治療性を有する可能性もある。したがって、一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物及び組成物は、その免疫調節活性以外に神経保護性を有する。
【００３６】
本明細書において以下で例示するように、その完全な化学名が（＋）｛４−［４−（１，１−ジメチルヘプチル）−２，６−ジメトキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−イル｝−メタノールであり、ＷＯ  ０１／３２１６９中にも（＋）４−［２，６−ジメトキシ−４−（１，１−ジメチルヘプチル）フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−カルビノールとして開示された、知られているＣＢ２特異的アゴニストＨＵ−３０８は、末梢痛の治療において有効であるばかりではなく、神経障害痛の治療においても有効であることを、我々は現在見出している。さらに我々は、ＨＵ−３０８がパーキンソン病の治療及び予防において非常に有効であることを、現在見出している。
【００３７】
本発明、特に実施例中に与えるデータの理解を助長するために、以下の図面を本明細書において示す。
【００３８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、非古典的カンナビノイドに属する新規な化合物、及びこれらの化合物を含む薬剤組成物、及びこのような化合物及び組成物を使用する方法を提供する。このクラスの化合物は、カンナビノイド受容体に関して親和性を示す。本発明の好ましい新規な化合物は、末梢ヒトカンナビノイド受容体、ＣＢ２に関して親和性を示す。本発明の組成物は、免疫調節、抗炎症、鎮痛、神経保護、及びいくらかの抗腫瘍性を有することが示されてきている。いくつかの化合物の作用が、免疫調節及び炎症に関する遺伝子の転写、又はこのようなプロセスと関係があるシグナル変換要素の調節をもたらす可能性がある。
【００３９】
カンナビノイドは、主に受容体仲介の機構によって、その生理学的効果を発揮すると考えられているが、非受容体仲介の活性も報告されてきている（Ｆｅｌｄｅｒ  Ｃ．Ｃ．他、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２：８３８〜４５、１９９２）。さらに、これまで発見されているＣＢ１及びＣＢ２以外の、他の型のカンナビノイド受容体の存在に関する、薬理学的証拠が増大している（Ｈｏｗｌｅｔｔ  Ａ．Ｃ．他、「薬理学概要（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗ）」５４：１６１〜２０２、２００２）。したがって、本発明の化合物の作用の、最も考えられる機構は、ＣＢ２受容体とのそれらの選択的結合、及び特定のシグナル変換経路との機能的結合によるものであるが、他の機構、例えば他の今だに同定されていないカンナビノイド受容体との結合による機構、又は非受容体仲介の手段による機構、又はこのような機構の組合せを、我々は除外することができない。
【００４０】
本明細書中で、用語「プロドラッグ」は、例えば血液中での加水分解によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の親化合物に即座に変換される化合物を表す。式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物のいくつかは、薬剤として許容可能な塩及びエステルをさらに形成することができる。「薬剤として許容可能な塩及びエステル」は、薬剤として許容可能であり所望の薬理学的性質を有する、任意の塩及びエステルを意味する。このような塩には、アミノ酸を含めた、無機又は有機酸、あるいは無機又は有機塩基から誘導することができる塩があり、これらは決して毒性であるわけでも望ましくないわけでもない。本発明はその範囲内に、式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物の溶媒和物及びその塩、例えば水和物も含む。これらの薬剤形はいずれも、本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００４１】
本明細書及び以下の特許請求の範囲では、「予防上有効である」は、有害な副作用を避けながら、障害が発生する危険性の予防、低下又は根絶の目標を達成するであろう、化合物の量を限定することを目的とする。用語「治療上有効である」は、ひとたび障害がこれ以上遅延する可能性がなくなり、患者がもはや無症候性ではないとき、副作用なしで、障害の軽減、低下した進行又は治療を達成するであろう、化合物の量を限定することを目的とする。本発明の組成物は、予防的かつ治療的なものである。
【００４２】
治療目的の「個体」又は「患者」は、疾患のいずれかに罹患している任意のヒト又は哺乳動物被験者を含み、治療には有益な治療的影響がある。
【００４３】
その抗炎症性及び免疫調節性によって、本発明の組成物は、慢性関節リウマチ、関節炎を含めた関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、肝炎及び乾癬、臓器移植における組織拒絶、小児脂肪便症などの吸収不良症候群、喘息及びシェーグレン症候群などの肺疾患、炎症性腸疾患、及びリウマチ性疾患だけには限られないが、これらを含めた免疫関連障害によって例示される病因又は病原と関連がある、炎症又は自己免疫機構を有する徴候を治療するのに、有用であることが理解されるであろう。
【００４４】
本発明の化合物及び組成物はＣＢ２リガンドであるように設計したものであるが、これらは、神経保護性を含めた、このクラスの非古典的カンナビノイドの他の性質を共有する（米国特許第５，４３４，２９５号）。それらの神経保護性によって、本発明の組成物は、脳卒中、片頭痛、及び群発頭痛だけには限られないが、これらを含めた神経障害を治療する際に有用であることが理解されるであろう。本発明の組成物は、段階的で選択的なニューロンの損失によって特徴付けられる、いくつかの慢性変性疾患の治療においても、有効である可能性がある。この文脈において、本発明の組成物は、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側策硬化症、ハンチントン舞踏病及びプリオン関連疾患の治療において、治療上有効であるとして企図される。ＣＢ２アゴニストによって与えられる神経保護は、神経ガスなどの神経毒物質、及び化学物質又は生物学的物質による脳又は神経組織に対する他の障害の、保護及び／又は治療においても有効であると思われる。
【００４５】
その鎮痛特性によって、本発明の組成物は、末梢痛、内臓痛、神経障害痛、炎症痛及び関連痛を含めた、痛みを治療する際に有用であることが理解されるであろう。本発明の組成物は、不整脈、高血圧及び心筋虚血からの心臓保護においても、有効である可能性がある。本発明の組成物は、筋肉の痙攣及び震えの治療においても、有効である可能性がある。
【００４６】
本発明の他の特徴は、悪性脳腫瘍、皮膚腫瘍、肺腺癌、グリオーム、甲状腺上皮腫を含めた、いくつかの癌を予防又は治療する、開示する化合物の能力であり、ＣＢ２結合リガンドは腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、かつ腫瘍の血管新生を阻害することができる。
【００４７】
さらに、いくつかの好ましいＣＢ２結合化合物が、免疫調節及び炎症に関する遺伝子の転写を調節することによって作用することもできることを、我々は見出している。
【００４８】
さらに、我々はここで、末梢痛の治療において有効であることが見出された、知られているＣＢ２特異的アゴニストＨＵ−３０８は、げっ歯類モデルの坐骨神経の慢性的収縮による評価と同様に、神経障害痛の治療においても予想外に有効であることを開示する。
【００４９】
さらにＨＵ−３０８が、神経毒ＭＰＴＰで処理したマウスの黒質において生じた、細胞死の程度を大幅に低下させることも発見された。これによって、この化合物はパーキンソン病の治療において非常に有効である可能性があることが示唆される。
【００５０】
ＣＢ２受容体に関する高い親和性及び特異性を有することが示された二環式化合物は、国際特許出願ＷＯ  ０１／２８４９７においてＭａｋｒｉｙａｎｎｉｓ及び同僚によって開示されている。その開示中では、開示されている化合物は本発明の化合物と反対の立体化学的性質であることを、当業者は理解すると思われる。なぜなら、その開示の式Ｉ及びＩＩにおいて図示されるように、４員環のジメチルはテルペン環の平面の下にあるが、アリール基がこの同じ平面の上に存在するからである。本開示中に取り入れた名称に従うと、Ｍａｋｒｉｙａｎｎｉの化合物は、Ｃ−１、Ｃ−４及びＣ−５がＲである立体化学的配向である。
【００５１】
一般に、カンナビノイド及びカンナビノイド関連化合物の、Ｒ鏡像異性体とＳ鏡像異性体を機能的に区別することが可能となっている。化合物ＨＵ−２１０及びＨＵ−２１１は、これを例示するものである。ＨＵ−２１０は、合成カンナビノイドの（−）（３Ｒ，４Ｒ）鏡像異性体、７−ヒドロキシ−Δ６−テトラヒドロカンナビノール−１，１−ジメチル−ヘプチルである。ＨＵ−２１１は、この化合物の（＋）（３Ｓ，４Ｓ）鏡像異性体である。ＨＵ−２１０とは対照的に、ＨＵ−２１１は、カンナビノイド受容体に対して低い親和性を示し、したがって非向精神性である。さらにＨＵ−２１１は、非競合的ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストとして、及び神経保護物質として機能し、この２つの性質はＨＵ−２１０には存在しない（米国特許第５，２８４，８６７号）。
【００５２】
本発明の発明者は、ＷＯ  ０１／２８４９７中に開示された化合物と立体化学的性質が反対である鏡像異性体は、有効なＣＢ２受容体リガンドであることを予想外に見出している。本開示は、式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に示すように、Ｃ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形である、（＋）α−ピネンの新規な誘導体を教示するものである。本発明の好ましい化合物は、これらの知られている鏡像異性体と比較して、ＣＢ２に対する高い親和性、及びより良い選択性を有するだけでなく、実験結果によって確証されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもさらに有効である。この文脈において、ＷＯ  ０１／２８４９７中に開示された鏡像異性体は、その発明者によって結合のみを試験され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける他の生物学的活性に関しては試験されなかったことを記さなければならない。
【００５３】
さらに本発明は、自己免疫疾患及び関連障害、炎症、痛み、筋肉の痙攣、心臓血管障害、神経障害、神経変性疾患、中枢神経系中毒、及びいくつかの型の癌を予防又は治療するための化合物を調製するための、これらの新規なＣＢ２リガンドの使用に関する。
【００５４】
本発明において我々は、位置１、４及び５がキラル中心である、環構造中の以下の番号の位置を言及する。本発明において開示する化合物の立体化学的性質は、式（ＩＶ）に示すように、Ｃ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であるような立体化学的性質である。
（式ＩＶ）
【化７】
2005523259.tif 000008
【００５５】
本発明では、結合親和性はＩＣ５０値、すなわち５０％のＣＢ受容体から放射標識アゴニストの５０％がはずれる試験化合物の濃度によって表す。好ましい化合物は、５０ｎＭ以下、好ましくは３０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは１ｎＭ以下の、ＣＢ２結合に関するＩＣ５０値を示す。「ＣＢ２特異的又は選択的」は、少なくとも１０、好ましくは２０、より好ましくは５０、及び最も好ましくは１００以上である、ＣＢ２／ＣＢ１結合親和性の比を有する化合物を示す。これらの比は、ヒトＣＢ１及びＣＢ２受容体に関して得られるものであることが好ましい。ＣＢ２に対する選択性、示されるＣＢ２／ＣＢ１親和性は、ＣＢ１特異的放射性リガンドの置換に関する試験化合物によって得られたＩＣ５０値を、ＣＢ２特異的放射性リガンドの置換に関して得られたＩＣ５０値で割ったもの、すなわちＩＣ５０ＣＢ１／ＩＣ５０ＣＢ２として計算される。本発明の好ましい化合物のいくつかは、必ずしも両方の性質を共有しているわけではない、言い換えれば、いくつかの化合物は、１ｎＭ以下のＣＢ２に関するＩＣ５０を有するが、比はわずかに約３０である。
【００５６】
本明細書を通じて、本発明のいくつかの化合物は、その完全な化学名によってではなく、大文字によって表すことができる。アルキル置換基は飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環式であってよく、アルキル鎖中の炭素原子の数が３以上であるときだけは後者である。ＯＣ（Ｏ）Ｒはエステル、ＯＣ（Ｏ）ＮＲはカルバメート、ＯＣ（Ｓ）Ｒはチオエステル、ＮＲ２はアミン、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒはアミド、ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲはウレア、ＮＲＣ（Ｓ）Ｒはチオアミド、ＳＲはチオール又はスルフィド、Ｓ（Ｏ）Ｒはスルホキシド、ＳＣ（Ｏ）Ｒはチオエステル、ＳＣ（Ｏ）ＮＲはチオカルバメート、ＳＣ（Ｓ）Ｒはジチオエステル、Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒはスルホン、Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＯＲはスルホネート、Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＲはスルホンアミド、Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＣ（Ｏ）Ｒはアシルスルホンアミド、Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＣ（Ｏ）ＮＲはスルホンウレア、Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＮＣ（Ｓ）Ｒはチオアシルスルホンアミドを表し、このときＲは水素又はアルキル鎖である。
【００５７】
本発明は、
一般式（Ｉ）の化合物であって、
（式Ｉ）
【化８】
2005523259.tif 000009
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、かつ置換基Ｒ１〜Ｒ４がこの中で定義した式（Ｉ）に関して定義したものである化合物に関する。
【００５８】
現在好ましい実施形態に従い、一般式（Ｉ）の化合物であって、Ｒ１がＯ、ＣＨ２又はＮ−ＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３、スクシネート、フマレート又はジエチルホスフェートであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ペンチル、１，１−ジメチル−ヘプチル、１，１−ジメチル−ペント−４−エニル、１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニル、１，１−ジメチル−３−フェニル−プロピル、１，１−ジメチル−５−ブロモ−ペンチル、１，１−ジメチル−５−シアノ−ペンチル、１，１，３−トリメチル−ブチル、１−メチル−１−ｐ−クロロフェニル−エチル、又は１−エチル−１−メチル−プロピルであり、ただしこれらが式（Ｉ）に関して定義したものである化合物を、我々はここで開示する。
【００５９】
他の現在好ましい実施形態に従い、一般式（Ｉ）の化合物であって、Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＣＨ３であり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＮ−ＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−３−フェニル−プロピルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１−メチル−１−ｐ−クロロフェニル−エチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−５−ブロモ−ペンチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−５−シアノ−ペンチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２がスクシネートであり、Ｒ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がスクシネートであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２がスクシネートであり、Ｒ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ペンチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３がＯＣＨ３であり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＣＨ２であり、Ｒ２及びＲ３がＯＣＨ３であり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がジエチルホスフェートであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２がジエチルホスフェートであり、Ｒ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＣＨ２であり、Ｒ２及びＲ３がジエチルホスフェートであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；及びＲ１がＯであり、Ｒ２がフマレートであり、Ｒ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである化合物を、我々はここで開示する。
【００６０】
本発明は、
一般式（ＩＩ）の化合物であって、
（式ＩＩ）
【化９】
2005523259.tif 000010
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、Ｃ−２とＣ−３の間は任意選択の二重結合であり、かつ置換基Ｒ２〜Ｒ５がこの中で定義した式（ＩＩ）に関して定義したものである化合物にも関する。
【００６１】
現在好ましい実施形態に従い、一般式（ＩＩ）の化合物であって、Ｒ５がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３、ＯＨ又はＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立にＯＨ、Ｈ、又はジエチルホスフェートであり、Ｒ４がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３ＣＨ３、１，１−ジメチル−ヘプチル、１，１−ジメチル−エチル−フェニル、又は１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニルであり、Ｃ−２とＣ−３の間に任意選択の二重結合が存在し、ただしこれらが式（ＩＩ）に関して定義したものである化合物を、我々はここで開示する。
【００６２】
他の現在好ましい実施形態に従い、一般式（ＩＩ）の化合物であって、Ｒ５がＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、かつＣ−２とＣ−３の間に単結合が存在する；Ｒ５がＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニルであり、かつＣ−２とＣ−３の間に二重結合が存在する；Ｒ５がＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−エチル−フェニルであり、かつＣ−２とＣ−３の間に二重結合が存在する；Ｒ５がＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、かつＣ−２とＣ−３の間に単結合が存在する；Ｒ５がＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、Ｒ４がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３ＣＨ３であり、かつＣ−２とＣ−３の間に二重結合が存在する；及びＲ５がＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がジエチルホスフェートであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、かつＣ−２とＣ−３の間に単結合が存在する化合物を、我々はここで開示する。
【００６３】
本発明はさらに、
一般式（Ｉ）のＣＢ２結合化合物であって、
（式Ｉ）
【化１０】
2005523259.tif 000011
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、かつ置換基Ｒ１〜Ｒ４が式（Ｉ）に関して定義したものである化合物に関する。
【００６４】
本発明はさらに、
一般式（ＩＩ）のＣＢ２結合化合物であって、
（式ＩＩ）
【化１１】
2005523259.tif 000012
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、Ｃ−２とＣ−３の間は任意選択の二重結合であり、かつ置換基Ｒ２〜Ｒ５がこの中で定義した式（ＩＩ）に関して定義したものである化合物に関する。
【００６５】
本発明は、
一般式（ＩＩＩ）の化合物であって、
（式ＩＩＩ）
【化１２】
2005523259.tif 000013
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、かつ置換基Ｒ１〜Ｒ４が式（ＩＩＩ）に関して定義したものである化合物を、活性成分として前述の目的で含む薬剤組成物に関する。
【００６６】
現在好ましい実施形態によれば、Ｒ１がＯ、ＣＨ２又はＮ−ＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３、スクシネート、フマレート又はジエチルホスフェートであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ペンチル、１，１−ジメチル−ヘプチル、１，１−ジメチル−ペント−４−エニル、１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニル、１，１−ジメチル−３−フェニル−プロピル、１，１−ジメチル−５−ブロモ−ペンチル、１，１−ジメチル−５−シアノ−ペンチル、１，１，３−トリメチル−ブチル、１−メチル−１−ｐ−クロロフェニル−エチル、又は１−エチル−１−メチル−プロピルである一般式（ＩＩＩ）の化合物を、活性成分として含む薬剤組成物を、我々はここで開示する。
【００６７】
他の現在好ましい実施形態によれば、Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＣＨ３であり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＮ−ＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−３−フェニル−プロピルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１，３−トリメチル−ブチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１−メチル−１−ｐ−クロロフェニル−エチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ペンチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１−エチル−１−メチル−プロピルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−５−ブロモ−ペンチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−５−シアノ−ペンチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２がスクシネートであり、Ｒ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がスクシネートであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２がスクシネートであり、Ｒ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ペンチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３がＯＣＨ３であり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＣＨ２であり、Ｒ２及びＲ３がＯＣＨ３であり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がジエチルホスフェートであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２がジエチルホスフェートであり、Ｒ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；Ｒ１がＯであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ペント−４−イルである；Ｒ１がＣＨ２であり、Ｒ２及びＲ３がジエチルホスフェートであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである；及びＲ１がＯであり、Ｒ２がフマレートであり、Ｒ３がＯＨであり、かつＲ４が１，１−ジメチル−ヘプチルである一般式（ＩＩＩ）の化合物を、活性成分として含む薬剤組成物を、我々はここで開示する。
【００６８】
本発明はさらに、
一般式（ＩＩ）の化合物であって、
（式ＩＩ）
【化１３】
2005523259.tif 000014
特異的な立体化学的配置を有し、上式でＣ−５がＳであり、Ｃ−１及びＣ−５におけるプロトンが互いに関してシス形であり、Ｃ−４及びＣ−５におけるプロトンがトランス形であり、Ｃ−２とＣ−３の間は任意選択の二重結合であり、かつ置換基Ｒ２〜Ｒ５がこの中で定義した式（ＩＩ）に関して定義したものである化合物を、活性成分として前述の目的で含む薬剤組成物に関する。
【００６９】
現在好ましい実施形態によれば、Ｒ５がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３、ＯＨ又はＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立にＯＨ、Ｈ、又はジエチルホスフェートであり、Ｒ４がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３ＣＨ３、１，１−ジメチル−ヘプチル、１，１−ジメチル−エチル−フェニル、又は１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニルであり、Ｃ−２とＣ−３の間に任意選択の二重結合が存在し、ただしこれらが式（ＩＩ）に関して定義したものである一般式（ＩＩ）の化合物を、活性成分として含む薬剤組成物を、我々は開示する。
【００７０】
他の現在好ましい実施形態によれば、Ｒ５がＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、かつＣ−２とＣ−３の間に単結合が存在する；Ｒ５がＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニルであり、かつＣ−２とＣ−３の間に二重結合が存在する；Ｒ５がＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−エチル−フェニルであり、かつＣ−２とＣ−３の間に二重結合が存在する；Ｒ５がＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がＨであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、かつＣ−２とＣ−３の間に単結合が存在する；Ｒ５がＣＨ３であり、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、Ｒ４がＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３ＣＨ３であり、かつＣ−２とＣ−３の間に二重結合が存在する；及びＲ５がＯＨであり、Ｒ２及びＲ３がジエチルホスフェートであり、Ｒ４が１，１−ジメチル−ヘプチルであり、かつＣ−２とＣ−３の間に単結合が存在する一般式（ＩＩ）の化合物を、活性成分として含む薬剤組成物を、我々はここで開示する。
【００７１】
本発明の新規な非古典的カンナビノイドは、最も好ましくはＣＢ２受容体と効果的に結合するが、ＣＢ１受容体とわずかに結合し、後者は中枢神経系の向精神薬活性、さらに有用な治療効果を仲介することが知られている。
【００７２】
本発明はさらに、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、肝炎及び乾癬を含めた自己免疫疾患、及び臓器移植における組織拒絶、小児脂肪便症などの吸収不良症候群、喘息及びシェーグレン症候群などの肺疾患、炎症性腸疾患を含めた炎症だけには限られないが、これらを含めた免疫関連障害、末梢痛、内臓痛、神経障害痛、炎症痛及び関連痛を含めた痛み、筋肉の痙攣、不整脈、高血圧及び心筋虚血を含めた心臓血管障害、脳卒中、片頭痛、及び群発頭痛を含めた神経障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側策硬化症、ハンチントン舞踏病、プリオン関連神経変性を含めた神経変性疾患、中枢神経系中毒、及びいくつかの型の癌を予防及び治療するための、本発明の組成物を使用する新しい療法に関する。
【００７３】
本発明の新規な組成物は、活性成分以外に、生理学的に許容可能な安定した配合物を生成させるために必要な、従来の薬剤として許容可能な担体、希釈剤及びベヒクルを含む。溶解度に関する問題を有する化合物のために、本発明のいくつかの化合物は特徴的に疎水性であり、それらの高いオクタノール／水分配係数及びｌｏｇ  Ｐ値により表されるように、高い親油性によって水には特に不溶であり、許容可能な剤形を調製するための配合戦略を適用する。本発明の化合物の治療上有効であり好都合な投与を可能にすることは、本発明の不可欠な部分である。
【００７４】
水溶性化合物に関しては、標準的な配合物が使用される。経口投与用の固形組成物、例えば錠剤、ピル、カプセル、軟質ゲルなどは、活性成分を従来の薬剤として許容可能な成分、例えばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、デキストラン、グリセロール、ポリグリコール化グリセリド、トコフェリルポリエチレングリコールスクシネート、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリエトキシル化ひまし油、非イオン性界面活性剤、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、及び薬剤として許容可能な希釈剤としてのガムなどと混合させることによって、調製することができる。錠剤又はピルは、当分野で知られている薬剤として許容可能な物質、例えば微晶質セルロース、及びセルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）でコーティング、あるいはそれ以外の場合はこれらを配合して、長期の作用又は徐放を与える剤形をもたらすことができる。他の固形組成物を、座薬として、直腸投与用に調製することができる。液体形を、経口投与用又は注射用に調製することができ、この語は皮下、経皮的、静脈内、クモ膜下、病巣内、腫瘍の周辺又は腫瘍中、及び他の非経口的投与経路だけには限られないが、これらを含む。液体組成物には、有機共溶媒を含むかあるいは含まない水溶液、シクロデキストリンだけには限られないがこれらを懸濁剤として含む水性又は油性懸濁液、食用油、トリグリセリド及びリン脂質を含む香りつき乳濁液、並びにエリキシル剤及び類似の薬剤ベヒクルがある。さらに本発明の組成物は、エアロゾルとして、鼻腔内などの投与用に形成することができる。本発明の局所用薬剤組成物は、溶液、ローション、ゲル、クリーム、軟膏、乳濁液又は粘着性フィルムとして、プロピレングリコール、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ポリソルベート、界面活性剤、ヒドロゲル、石油、又は当分野で知られている他のこのようなベヒクルだけには限られないが、これらを含めた薬剤として許容可能なベヒクルを用いて、配合することができる。
【００７５】
薬剤としてそれらを使用する前に、薬剤組成物は一般に単位用量に配合する。ヒトに関する活性用量は一般に、１日１〜４回のレジメンにおいて、体重１ｋｇ当たり０．０５ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲である。用量の好ましい範囲は、体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜約２０ｍｇである。しかしながら、受け持ちの医師により、治療される疾患、投与法、患者の年齢、体重、禁忌などに従って、用量が決定されるであろうことは、当業者には明らかである。
【００７６】
本発明の原理は、以下の実施例においてさらに完全に理解され、これらの実施例は非制限的に解釈すべきである。
【実施例】
【００７７】
合成実施例
化合物Ａの合成：（−）−４−［４−（１，１−ジメチル−ヘプチル）−２，６−ジヒドロキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
レソルシノール化合物のＲ部分が１，１−ジメチル−ヘプチルであるときの、化合物Ａの合成を反応式１に示す。
【００７８】
（反応式１）
【化１４】
2005523259.tif 000015
【００７９】
ｎ−ブチルリチウム（１９６ｍｌ、２Ｍ）及び４４ｇのカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドを含む３つ口フラスコに、−７８℃において窒素雰囲気下で、５０ｍｌの（＋）−α−ピネン（１）を一滴ずつ加えた。反応混合物を室温に温め、４８時間連続的に攪拌した。次いで反応混合物を−７８℃に冷却した。ホウ酸トリメチル（１１３ｍｌ）を８０ｍｌのエーテルに溶かしたものを加え、反応混合物を室温に温め、１時間さらに攪拌した。有機層を分離し、水性層をｎ−ヘキサン（３×８０ｍｌ）を用いて抽出した。併せた有機相を塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、乾燥状態まで蒸発させて、化合物（２）、（＋）−β−ピネンを得た。この手順は、Ｂｒｏｗｎ他（Ｂｒｏｗｎ  Ｈ．Ｃ．他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：１７６４〜６、１９８９）に従うものである。（＋）−β−ピネン（２）（３０．８ｇ）にＲｕＣｌ３（０．４７０ｇ）、及びベンジルトリブチル塩化アンモニウム（２．１２ｇ）を２５０ｍｌの酢酸エチルに溶かしたものを加えた。この混合物に、過ヨウ素酸ナトリウム（１４５．５ｇ）を１．３Ｌの水に溶かしたものを一滴ずつ加え、室温で３時間攪拌し一晩放置した。２５０ｍｌの酢酸エチルを反応混合物に加えた。有機相を分離し、５００ｍｌの塩水、５００ｍｌの１０％硫酸ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて、化合物（３）、（−）−ノピノンを得た。この手順は、Ｙｕａｓａ他（Ｙｕａｓａ  Ｙ．他、Ｊ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｏｉｌ．Ｒｅｓ．１０：３９〜４２、１９９８）に従うものである。（−）−ノピノン（３）（１４．８６ｇ）、及びｐ−トルエンスルホン酸（１．４８ｇ）を、酢酸イソプレニル（１４８ｍｌ）に溶かした。反応混合物を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を使用して５時間の還流で加熱して、アセトンを除去した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を４００ｍｌのエーテル中に取り、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて化合物（４）、（＋）−ノピノンエノールアセテートを得た。この手順は、Ａｒｃｈｅｒ他（Ａｒｃｈｅｒ  Ｒ．Ａ．他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４２：２２７７〜８４、１９７７）によって、正反対の鏡像異性体用に開発された方法に基づくものである。１６．１７ｇの（＋）−ノピノンエノールアセテート（４）を、２０２ｍｌの乾燥トルエンに溶かした溶液に、６２．２ｇのＰｂ（ＯＡｃ）４（事前にＰ２Ｏ５／ＫＯＨを用いて一晩真空中で乾燥させたもの）を加えた。反応混合物を８０℃で３．５時間加熱し、冷却し、濾過し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させて、（＋）−６，６−ジメチル−２，４−ジアセトキシ−２−ノルピネン（５）、及び（−）−６，６−ジメチル−２，２−ジアセトキシ−３−ノルピネン（６）を得た。５及び６（１．１８ｇ、５ｍｍｏｌ）、Ｒが１，１−ジメチルヘプチルであるレソルシノール（７）（１．１８ｇ、５ｍｍｏｌ）、及びｐ−トルエンスルホン酸（０．９５ｇ、５ｍｍｏｌ）を、クロロホルム（５０ｍｌ）に溶かした混合物を、室温で４時間反応させた。次いでエーテル（３０ｍｌ）を加え、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム、水で洗浄���、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し蒸発させた。残留物をアセトニトリル中で結晶化させて、０．５ｇの結晶を得た。母液をシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、さらに０．７ｇの純粋な化合物Ａを得た。
【００８０】
化合物Ｌの合成：（−）−４−［４−（１，１−ジメチル−ペンチル）−２，６−ジヒドロキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
レソルシノール化合物のＲ部分が１，１−ジメチル−ペンチルであるときの、化合物Ｌの合成を反応式１に示す。化合物１〜６は、化合物Ａの合成に関して記載したのと同様に調製した。
【００８１】
化合物Ｂの合成：（−）−４−［４−（１，１−ジメチル−ヘプチル）−２，６−ジメトキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
化合物Ｂの合成を反応式２に示す。
【００８２】
化合物Ａ（１１５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶かした溶液に、炭酸カリウム（０．５ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１０分間攪拌した。次いでヨードメタン（０．１５ｍｌ、２４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩室温で攪拌した。水を反応混合物に加え、ＥｔＯＡｃを用いて抽出した。有機相を水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。残留物を、１０％の水をアセトニトリルに溶かしたものを溶離剤として使用して、逆相Ｃ−１８カラム上でクロマトグラフィーにかけて、９８ｍｇの化合物Ｂを得た。
【００８３】
（反応式２）
【化１５】
2005523259.tif 000016
【００８４】
化合物Ｃの合成：（−）−５−（１，１−ジメチル−ヘプチル）−２−（４−ヒドロキシ−６，６−ジメチルバイシクロ［３．１．１］ヘプト−２−イル）−ベンゼン−１，３−ジオール。
化合物Ｃの合成を反応式３に示す。
【００８５】
１００ｍｇの化合物Ａを１０ｍｌのメタノールに溶かしたものを、０℃に冷却した。水素化ホウ素ナトリウム（２００ｍｇ）を一滴ずつ加え、反応混合物を４時間攪拌した。混合物を５０ｍｌの５％ＨＣｌに注ぎ、酢酸エチル（２×３０ｍｌ）を用いて抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過及び蒸発させて、９０ｍｇの化合物Ｃを白い粉末の形で得た。
【００８６】
（反応式３）
【化１６】
2005523259.tif 000017
【００８７】
化合物Ｄの合成：４−［４−（１，１−ジメチル−ヘプチル）−２，６−ジメトキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オンオキシム。
化合物Ｄの合成を反応式４に示す。
【００８８】
塩酸ヒドロキシアミン（３７．３ｍｇ）を５ｍｌの水に溶かし、その溶液を０℃に冷却した。水酸化カリウム（３０ｍｇ）を１ｍｌの水に溶かしたものを、ゆっくり加えた。化合物Ａ（３７２．５ｍｇ）を加え、次にメタノールを加えて、全ての成分を溶かした。攪拌の３時間後、出発原料を確認することはできなかった。次いで水を加え、溶液を酢酸エチルを用いて抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過及び蒸発させて、３８０ｍｇの化合物Ｄを得た。
【００８９】
（反応式４）
【化１７】
2005523259.tif 000018
【００９０】
化合物Ｅの合成：（＋）−５−（１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニル）−２−（４，６，６−トリメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−イル）−ベンゼン−１，３−ジオール。
レソルシノール化合物のＲ部分が１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニルであるときの、化合物Ｅの合成を反応式５に示す。
【００９１】
（反応式５）
【化１８】
2005523259.tif 000019
【００９２】
この反応は、無水条件下で行った。（＋）ベルベノール（０．５０５ｇ、３．３ｍｍｏｌ）、３−（１，１−ジメチルヘプト−６−イニル）レソルシノール（０．７７ｇ、３．３ｍｍｏｌ）、及び触媒量の無水ｐ−トルエンスルホン酸を乾燥クロロホルム（１０ｍｌ）に溶かしたものを充分攪拌した混合物を、０℃で１時間攪拌した。この混合物を炭酸水素ナトリウムの水溶液（５０ｍｌ）に注ぎ、水性相をクロロホルム（３×３０ｍｌ）を用いて抽出した。次いで併せた有機層を水（３×３０ｍｌ）、及び塩水（３×１００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過及び蒸発させた。このようにして得た粗製物質を、５％エーテル／石油エーテルを溶離剤として使用する、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１．０３４ｇの化合物Ｅを得た。
【００９３】
化合物Ｑの合成：５−（１，１−ジメチル−エチル−フェニル）−２−（４，６，６−トリメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−イル）−ベンゼン−１，３−ジオール。
レソルシノール化合物のＲ部分が１，１−ジメチル−エチル−フェニルである、化合物Ｑの合成を反応式５に示す。
【００９４】
１，１−ジメチル−エチル−フェニルレソルシノールを、フェニルリチウムを使用して、化合物１４に関して記載したのと同様に調製した。（＋）ベルベノールとの縮合は、化合物Ｅに関して記載したのと同様に行った。
【００９５】
化合物Ｆの合成：（−）−４−［４−（１，１−ジメチル−ヘプト−６−イニル）−２，６−ジヒドロキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
化合物Ｆの合成を反応式６に示す。
【００９６】
（３，５−ジメトキシフェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチルカルボキサミド（８）を、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ他（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｐ．Ｅ．他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：６５７６〜８２、２０００）によって記載されたのと同様に調製した。１−（トリメチルシリル）−６−ブロモ−１−ヘキシン（９）は、Ｎｅｇｉｓｈｉ他（Ｎｅｇｉｓｈｉ  Ｅ−Ｉ他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：５３８３〜９６、１９８８）に従って調製した。［７−（３，５−ジメトキシフェニル）−７−オキソ−１−ヘプチニル］トリメチルシラン（１０）は、以下の手順に従って調製した。
【００９７】
（反応式６）
【化１９】
2005523259.tif 000020
【００９８】
マグネシウム金属（３００ｍｇ）を５ｍｌの無水ＴＨＦに溶かしたものに、触媒量のジブロモメタンを加え、反応混合物を加熱して数分間還流した。加熱を停止し、０．９ｍｌの化合物９を、還流を維持する添加率でシリンジを使用して注射した（約２０分）。添加が終了した後、還流をさらに１時間続けた。反応混合物を室温に冷却した。このようにして得たグリニャール反応物を、カニューレを介して、溶液化合物８（０．９ｇ）を２ｍｌのＴＨＦに溶かしたものに０℃において移した。３０分後、反応混合物を１ＭのＨＣｌ溶液を用いて急冷し、エーテルで希釈した。有機相を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、１．５ｇの粗製物質を得た。１０％酢酸エチルを石油エーテルに溶かしたものを溶離剤として使用する、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製によって、６８０ｍｇの純粋な化合物１０を得た。３−（１，１−ジメチル−６−イニル）レソルシノール（１１）を、国際特許出願ＷＯ  ０１／２８４９７中に記載されたのと同様に化合物１０から得た。５及び６（１．１８ｇ、５ｍｍｏｌ）、３−（１，１−ジメチル−６−イニル）レソルシノール（１１）（１．１８ｇ、５ｍｍｏｌ）、及びｐ−トルエンスルホン酸（０．９５ｇ、５ｍｍｏｌ）を、クロロホルム（５０ｍｌ）に溶かした混合物を、室温で４時間反応させた。次いでエーテル（３０ｍｌ）を加え、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム、水で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し蒸発させた。残留物をアセトニトリル中で結晶化させて、０．５ｇの結晶を得た。母液をシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、さらに０．７ｇの純粋な化合物Ｆを得た。
【００９９】
化合物Ｇの合成：４−［４−（１，１−ジメチル−３−フェニル−プロピル）−２，６−ジヒドロキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
Ｒが２−エチル−ベンゼンであるときの、化合物Ｇの合成を反応式７に示す。
【０１００】
化合物８、１２及び１３を、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ他（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｐ．Ｅ．他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：６５７６〜８２、２０００）によって記載されたのと同様に調製した。化合物１４は、国際特許出願ＷＯ  ０１／２８４９７中に記載されたのと同様に調製した。化合物５及び６は、化合物Ａの合成において前に記載したのと同様に調製した。化合物５、６及び１４の縮合は、化合物Ａの合成に関して記載したのと同様に行った。
【０１０１】
（反応式７）
【化２０】
2005523259.tif 000021
【０１０２】
化合物Ｈの合成：（−）−４−［２，６−ジヒドロキシ−４−（１，１，３−トリメチル−ブチル）−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
Ｒがｓｅｃ−ブチルであるときの、化合物Ｈの合成を反応式７に示す。化合物５、６、８、１２〜１４は、化合物Ａ及びＦの合成に関して記載したのと同様に調製した。化合物５、６及び１４の縮合は、化合物Ａの合成に関して記載したのと同様に行った。
【０１０３】
化合物Ｊの合成：（−）−４−｛４−［１−（４−クロロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−２，６−ジヒドロキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
Ｒがｐ−クロロベンゼンであるときの、化合物Ｊの合成を反応式７に示す。
【０１０４】
化合物５、６、８、１２〜１４は、化合物Ａ及びＦの合成に関して記載したのと同様に調製した。化合物５、６及び１４の縮合は、化合物Ａの合成に関して記載したのと同様に行った。
【０１０５】
化合物Ｍの合成：（−）−４−［４−（１−エチル−１−メチル−プロピル）−２，６−ジヒドロキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
化合物Ｍの合成を反応式８に示す。
【０１０６】
（反応式８）
【化２１】
2005523259.tif 000022
【０１０７】
化合物１６、１−（１−ヒドロキシ−１−エチル−プロピル）−３，５−ジメトキシ−ベンゼンの合成は、以下のように行った。反応は、無水条件下で行った。メチル−３，５−ジメトキシベンゾエート（５ｇ、２５．５ｍｍｏｌｅ）を乾燥ＴＨＦ（１００ｍｌ）に溶かした溶液に０℃において、エチル−臭化マグネシウム（ＴＨＦ中に１Ｍ、７６．５ｍｌ）を加えた。反応混合物を７２時間室温で攪拌した。酢酸エチルと水を加え、水性層を酢酸エチルを用いて抽出した。次いで併せた有機層を水及び塩水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過して６．３ｇの化合物１６を得た。
【０１０８】
以下の手順は、国際特許出願ＷＯ  ０１／２８４９７中に記載されたものである。化合物１７、１−（１−クロロ−１−エチル−プロピル）−３，５−ジメトキシ−ベンゼンの合成は、以下のように行った。化合物１６（６．３ｇ、２５ｍｍｏｌｅ）を無水ＣＣｌ４（３０ｍｌ）に溶かし、ＨＣｌ（ｇ）を１時間発泡させた。有機層を水及び１０％炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて６．３ｇの化合物１７を得た。化合物１８、１−（１−エチル−１−メチル−プロピル）−３，５−ジメトキシ−ベンゼンの合成は、以下のように行った。化合物１７（６ｇ、２５ｍｍｏｌｅ）を乾燥トルエンに溶かした溶液を、Ｎ２下で−３０℃に冷却し、トリメチルアルミニウム（ヘプタン中に２Ｍ溶液）（２５ｍｌ）を加えた。反応混合物を室温に温め、一晩攪拌した。ＨＣｌ（１Ｎ）を加え、次いで有機層を分離し、水で洗浄し、乾燥させ蒸発させた。粗製物質を、１％酢酸エチル／石油エーテルを溶離剤として使用する、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにかけて、５．３ｇの化合物１８を得た。
【０１０９】
化合物１９、５−（１−エチル−１−メチル−プロピル）−レソルシノールの合成は、以下のように行った。化合物１８を乾燥ジクロロメタンに溶かした冷却（−５０℃）溶液に、三臭化ホウ素（１０．１５ｍｌ、１０７．３ｍｍｏｌｅ）をＮ２雰囲気下で加えた。反応混合物を室温に温め、一晩攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウムを加え、有機層を分離させ、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて４．２ｇの所望のレソルシノール１９を得た。化合物５及び６とレソルシノール１９の縮合は、化合物Ａの合成に関して記載したのと同様に行った。
【０１１０】
化合物Ｎの合成：（−）−４−［４−（５−ブロモ−１，１−ジメチル−ペンチル）−２，６−ジヒドロキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
Ｒが臭素原子であるときの、化合物Ｎの合成を反応式９に示す。
【０１１１】
化合物５及び６は、化合物Ａの合成に関して記載したのと同様に調製した。化合物２０は、Ｓｉｎｇｅｒ他（Ｓｉｎｇｅｒ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：４４００〜７、１９９８）によって記載されたのと同様に調製した。化合物５、６及び２０の縮合は、化合物Ａの合成に関して記載したのと同様に行った。
【０１１２】
化合物Ｐの合成：（−）−４−［４−（１，１−ジメチル−ペンチル−５−ニトリル）−２，６−ジヒドロキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
Ｒがシアノ基であるときの、化合物Ｐの合成を反応式９に示す。
【０１１３】
（反応式９）
【化２２】
2005523259.tif 000023
【０１１４】
化合物５及び６は、化合物Ａの合成に関して記載したのと同様に調製した。化合物２１は、Ｓｉｎｇｅｒ他（Ｓｉｎｇｅｒ他、同書）によって記載された手順と類似の手順で、化合物２０から調製した。化合物５、６及び２１の縮合は、化合物Ａの合成に関して記載したのと同様に行った。
【０１１５】
化合物Ｒの合成：（−）−４−｛４−［１，１−ジメチル−ヘプチル］−２−スクシナート−６ヒドロキシ−フェニル｝−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
化合物Ｒの合成を反応式１０に示す。
【０１１６】
化合物Ｓの合成：４−｛４−［１，１−ジメチル−ヘプチル］−２，６−バイスクシナート−フェニル｝−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
化合物Ｓの合成を反応式１０に示す。
【０１１７】
化合物Ａ（２２７ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌｅ）及び無水コハク酸（７３１ｍｇ、７．３１ｍｍｏｌｅ）を、乾燥ピリジン（１０ｍｌ）に溶かした混合物を、Ｎ２雰囲気下で５０℃に加熱した。カリウムｔ−ブトキシドを加え、得られた混合物を一晩攪拌した（５０℃）。この混合物を１ＮのＨＣｌに注ぎ、酢酸エチルを用いて抽出した。併せた有機相を１ＮのＨＣｌ及び塩水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。２つの生成物を、カラムクロマトグラフィーにより分離して（２０％酢酸エチル／石油エーテル＋０．１％酢酸）、２２０ｍｇの化合物Ｒ（油）及び１５０ｍｇの化合物Ｓ（固体）を得た。
【０１１８】
（反応式１０）
【化２３】
2005523259.tif 000024
【０１１９】
化合物Ｔの合成：４−｛４−［１，１−ジメチル−ヘプチル］−２，６−バイ−ジエチルリン酸−フェニル｝−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
化合物Ｔの合成を反応式１１に示す。
【０１２０】
（反応式１１）
【化２４】
2005523259.tif 000025
【０１２１】
反応はＮ２雰囲気下で行った。化合物Ａ（１．９７ｇ、５．２９ｍｍｏｌｅ）を新鮮に蒸留して得たＴＨＦに溶かした、充分攪拌した溶液に、カリウムｔ−ブトキシド（１．５４ｇ、１３．７５ｍｍｏｌｅ）を加え、混合物を１０分間攪拌した。ジエチルクロロリン酸を次いで加え、反応混合物を一晩攪拌した。水を加え、水性相を酢酸エチルを用いて抽出した。併せた有機層を塩水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。２５％〜７０％酢酸エチル−石油エーテルを溶離剤として使用する、シリカゲル上でのクロマトグラフィーによる精製によって、２．２ｇの純粋な化合物Ｔを得た。
【０１２２】
化合物Ｕの合成：４−｛４−［１，１−ジメチル−ヘプチル］−２−ジエチルリン酸−６−ヒドロキシ−フェニル｝−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
化合物Ｕの合成を反応式１１に示す。
【０１２３】
化合物Ｗの合成：（−）−４−｛４−［１，１−ジメチル−ヘプチル］−２，６−バイ−ジエチルリン酸−フェニル｝−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−メチレン。
化合物Ｗの合成を反応式１２に示す。
【０１２４】
この合成はＮ２雰囲気下で行った。メチル−トリフェニル−ホスホニウムヨウ素（５．９２ｇ、１４．６５ｍｍｏｌｅ）を無水ＴＨＦ（１００ｍｌ）に懸濁させた懸濁液に、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＰＢＴＳＡ）（トルエン中に０．５Ｍ、２８．７ｍｌ）を加え、混合物を室温で０．５時間攪拌した。化合物Ｔ（１．８９ｇ、２．９３ｍｍｏｌｅ）をＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶かした溶液を次いで加え、混合物を一晩攪拌した。塩化アンモニウムの水溶液を加え、有機層を分離させ、水性層はＥｔＯＡｃを用いて抽出した。併せた有機相を塩水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し蒸発させた。生成物は、１５％〜３０％のＥｔＯＡｃ／石油エーテルを溶離剤として使用する、シリカゲルカラム上でのクロマトグラフィーにより精製した。
（反応式１２）
【０１２５】
【化２５】
2005523259.tif 000026
【０１２６】
化合物Ｙの合成：（−）−４−｛４−［１，１−ジメチル−ペンチル］−２−スクシナート−６−ヒドロキシ−フェニル｝−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
化合物Ｙの合成は、反応式１０に示す化合物Ｒの合成と同様である。唯一の違いは出発原料であり、同じ合成手順を使用して、化合物Ａによって化合物Ｒが生じ、一方化合物Ｌによって化合物Ｙが生じる。
【０１２７】
化合物Ｚの合成：（−）−４−｛４−［１，１−ジメチル−ヘプチル］−２−フマレート−６−ヒドロキシ−フェニル｝−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
化合物Ｚの合成を反応式１３に示す。
（反応式１３）
【０１２８】
【化２６】
2005523259.tif 000027
【０１２９】
化合物Ａ（６００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌの乾燥ジエチルエーテルに溶かした。次いで０．２１ｍｌのトリエチルアミン（１．６ｍｍｏｌ）、及び０．１８ｍｌのフマル酸クロライド（１．７ｍｍｏｌ）を加えた。約１５分攪拌した後、塩化トリメチルアンモニウム塩を濾過し、濾過物を蒸発させた。次いで酢酸エチルを残留物に加え、ｐＨが４を超えるまで水で３回洗浄した。次いで有機相を飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し蒸発させた。次いで化合物Ｚを、２０％酢酸エチル及び石油エーテルを溶離剤として使用する、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【０１３０】
化合物ＡＡの合成：（−）−４−［４−（１，１−ジメチル−ヘプチル）−２−ヒドロキシ−６−メトキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
化合物ＡＡの合成を反応式１４に示す。
（反応式１４）
【０１３１】
【化２７】
2005523259.tif 000028
【０１３２】
化合物Ａ（１５０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１６ｍｌ）に溶かした溶液に、炭酸カリウム（４００ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１０分間室温で攪拌した。ヨードメタン（８５．２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を次いで加え、混合物を一晩室温で攪拌した。水を反応混合物に加え、ＥｔＯＡｃを用いて抽出した。有機相を水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し蒸発させた。残留物を、５０％の水をアセトニトリル中に溶かしたものを溶離剤として使用する、逆相カラム上でのクロマトグラフィーにかけて、３０ｍｇの化合物ＡＡを得た。
【０１３３】
化合物ＡＢの合成：４−｛４−［１，１−ジメチル−ヘプチル］−２，６−バイ−ジエチルリン酸−フェニル｝−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オール。
化合物ＡＢの合成を反応式１５に示す。
【０１３４】
（反応式１５）
【化２８】
2005523259.tif 000029
【０１３５】
化合物Ｔ（０．１２ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を乾燥エチルアルコール（６ｍｌ）に溶かした、充分冷却した溶液（−５０℃）に、水素化ホウ素ナトリウム（５１ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を−４０℃で１時間攪拌し、次いで室温に温めた。３時間後、ＴＬＣ分析によって、出発原料の完全な消失が示された。次いで水を加え、反応混合物は酢酸エチルを用いて抽出した。有機層を水、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。残りの溶媒は蒸発により除去して、０．１７ｇの化合物ＡＢを得た（収率９２％）。
【０１３６】
化合物ＡＣの合成：４−［４−（１，１−ジメチル−ヘプチル）−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オール。
化合物ＡＣの合成を反応式１６に示す。
【０１３７】
（反応式１６）
【化２９】
2005523259.tif 000030
【０１３８】
この反応は、無水条件下で行った。化合物ＡＢ（０．１０７ｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）を無水ＴＢＦ（６ｍｌ）及び液体アンモニア（〜５０ｍｌ）に溶かした、充分冷却した溶液（−７８℃）に、リチウム（〜５０ｍｇ、７．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器は青色が消えるまで（約３０分間）完全に密封して保ち、次いで一晩開いた状態にして、アンモニアを蒸発させた。残留物は、酢酸エチル（３０ｍｌ）及び塩化アンモニウムの飽和溶液に溶かした。水相は酢酸エチルを用いて抽出した。併せた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し蒸発させて、ＨＰＬＣに従い１００％純粋な７７．６ｍｇの化合物ＡＣを得た。
【０１３９】
化合物ＡＤの合成：（−）−４−［４−（１，１−ジメチル−ヘプチル）−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
化合物ＡＤの合成を反応式１７に示す。
【０１４０】
（反応式１７）
【化３０】
2005523259.tif 000031
【０１４１】
化合物ＡＣ（０．２０４ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタンに溶かした、充分攪拌した溶液に、重クロム酸ピリジニウム（０．４４８ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を１片ずつ加えた。反応混合物は、室温で一晩攪拌した。固体はセライトを介して濾過し、ＤＣＭで洗浄した。溶媒は蒸発により除去して、０．２７ｇの残留物を得た。粗製物質は、１０％酢酸エチル／石油エーテルを溶離剤として使用する、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、０．１５ｇの純粋な化合物ＡＤを得た（収率７４％）。
【０１４２】
化合物ＡＥの合成：（＋）−５−（メチルエステルペンタン酸）−２−（４，６，６−トリメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−イル）−ベンゼン−１，３−ジオール。
化合物ＡＥの合成を反応式１８に示す。
【０１４３】
メチル３，５−ジメトキシベンゾエート（２０ｇ、０．１２ｍｏｌｅ）、イミダゾール（１００ｇ、１．４７ｍｏｌｅ）、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクリライド（１００ｇ、０．６６ｍｏｌｅ）を、ＤＭＦ（無水、４００ｍｌ）に溶かした溶液を、室温で２時間攪拌した。反応混合物を水（３００ｍｌ）で希釈し、水性層はエーテル（３×３００ｍｌ）を用いて抽出した。併せた有機相を水で洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、蒸発させた。得られた粗製物質はＴＨＦ（３００ｍｌ）に溶かし、−２０℃に冷却し、ＬｉＡｌＨ４（ＴＨＦ中に１Ｎ、１４０ｍｌ、０．１４ｍｏｌｅ）を一適ずつ加えた。反応混合物を室温で２時間攪拌した。反応混合物を−３０℃に冷却し、酢酸エチル（３００ｍｌ）、次にＭｇＳＯ４の飽和溶液を加えた。得られた溶液はセライトを介して濾過した。
【０１４４】
（反応式１８）
【化３１】
2005523259.tif 000032
【０１４５】
有機層を分離させ、水相は酢酸エチルを用いて３回抽出した。併せた有機相は飽和塩化ナトリウムで洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、蒸発させて、４４．２ｇの粗製生成物（２３）（０．１２ｍｏｌｅ）を得た。いかなる精製ステップも無しで、トリエチルアミン（２５ｍｌ、０．１８ｍｏｌｅ）及び塩化バレリル（３０ｍｌ、０．２５ｍｏｌｅ）を、粗製生成物（２３）を乾燥ジクロロメタン（１リットル）に溶かしたものに加えた。生成した混合物は、室温で一晩攪拌した。次いで水を加え、有機層を分離させ、水相はＤＣＭ（３×３００ｍｌ）を用いて抽出した。併せた有機相は飽和塩化ナトリウムで洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、蒸発させた。残留物を、４％酢酸エチル／石油エーテルを溶離剤として用いる、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにかけた。４５ｇの黄色い油を得た（２４）。この黄色い油（４５ｇ、０．１ｍｏｌｅ）をＴＨＦ（１リットル）に溶かしたものに、フッ化テトラブチルアンモニウム（８７ｇ、０．３３ｍｏｌｅ）を加え、混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を水（１リットル）中に注ぎ、酢酸を用いてｐＨ〜４．５までの酸性状態にし、酢酸エチルを用いて数回抽出した。併せた有機相は飽和塩化ナトリウムで洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、蒸発させた。残留物を、３０％酢酸エチル及び石油エーテルを溶離剤として用いる、シリカゲルカラム上でのクロマトグラフィーにかけて、２０ｇの灰色がかった白色の固体（２５）を得た。この灰色がかった白色の固体（０．７５ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を、（＋）−ベルベノール（０．５ｇ、３．３ｍｍｏｌ）と共にＣＨＣｌ３（４０ｍｌ）に溶かし、生成した溶液を０℃に冷却した。無水ｐ−トルエンスルホン酸（触媒量）を加え、生成した混合物は０℃で１５分間攪拌した。反応混合物は、炭酸ナトリウムの飽和溶液中に注いだ。水相はＣＨＣｌ３を用いて抽出し、併せた有機相は炭酸ナトリウムの水溶液で洗浄した。有機相を乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し蒸発させた。化合物ＡＥを単離し、２０％水及びアセトニトリルを溶離剤として用いる、調製ＨＰＬＣにより精製した。
【０１４６】
化合物ＡＦの合成：４−｛４−［１，１−ジメチル−ヘプチル］−２，６−ジメトキシ−フェニル｝−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−メチレン。
化合物ＡＦの合成を反応式１９に示す。
【０１４７】
（反応式１９）
【化３２】
2005523259.tif 000033
【０１４８】
この反応は、Ｎ２雰囲気及び無水条件下で行った。ヨウ化メチルトリフェニルホスホニウム（１．０８３ｇ、２．６８ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）に懸濁させた懸濁液に、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド（トルエン中に０．５Ｍ、５．２６ｍｌ、２．６３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３０分間、室温で攪拌した。次いで、化合物Ｂ（０．２１４ｇ、０．５３７ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（２ｍｌ）に溶かした溶液を加え、生成した混合物を一晩攪拌した。塩化アンモニウムの飽和溶液を反応混合物に加え、水相は酢酸エチルを用いて抽出し（３回）、併せた有機相は飽和塩化ナトリウムで洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し蒸発させた。得られた粗製の茶色い固体を、ヘキサンを用いてタイトレート(titurate)して、トリフェニルホスフィンオキシドを除去した。次いでそれを、１００％ヘキサンを溶離剤として用いる、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにかけて、薄い黄色の油として化合物ＡＦを得た。
【０１４９】
化合物ＡＧの合成：（−）−４−［４−（１，１−ジメチル−ペント−４−エニル）−２，６−ジヒドロキシ−フェニル］−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプタン−２−オン。
化合物ＡＧの合成を反応式２０に示す。
【０１５０】
１グラムのナトリウム金属（４３ｍｍｏｌ）を、乾燥メチルアルコール（２５ｍｌ）に溶かし、次いで４−（７−ブロモ−１，１−ジメチル−ヘプチル）−２，６−ジヒドロキシ−フェニル（２０）を、メタノール（３．５ｇ、１２ｍｍｏｌ）に溶かしたものを加えた。反応混合物を約３０分間攪拌した。次いで反応混合物を、１００ｍｌの１ＮのＨＣｌに注いだ。水相は酢酸エチルを用いて抽出し（３×１００ｍｌ）、併せた有機相は飽和塩化ナトリウムで洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し蒸発させた。８００ｍｇの粗製レソルシノール生成物（２６）を得て、石油エーテル中に２０％酢酸エチルを用いる、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによってこれを精製した。生成物レソルシノール（１７０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）を、ノピノン二酢酸の２つの異性体、ＣＨＣｌ３中の（５）及び（６）（５４０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸と反応させた。室温で４時間攪拌した後、反応を終了させた。反応混合物を炭酸水素ナトリウムで洗浄し、酢酸エチルを用いて抽出し（３回）、併せた有機相は飽和塩化ナトリウムで洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し蒸発させた。得られた粗製物質を、石油エーテルを用いて粉末状にして、１５０ｍｇの粗製化合物ＡＧを得た。次いで生成物を、溶離剤として５０％水：アセトニトリルを用いる、逆相クロマトグラフィーによって精製した。
【０１５１】
（反応式２０）
【化３３】
2005523259.tif 000034
【０１５２】
化合物ＡＨの合成：２，２−ジメチルプロピオン酸−４−｛４−［１，１−ジメチル−フェニル］−２，６−ジヒドロキシ−フェニル｝−６，６−ジメチル−バイシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−イルメチルエステル。
化合物ＡＨの合成を反応式２１に示す。
【０１５３】
（反応式２１）
【化３４】
2005523259.tif 000035
【０１５４】
４−ヒドロキシミリテニル−ピバレートを、米国特許第４，８７６，２７６号中に記載されたのと同様に調製し、５−（１，１−ジメチルフェニル）−レソルシノールを以下のように調製した。２５０ｍｌの丸底フラスコに、１００ｍｌのメタノール及び１００ｍｌのＴＨＦを加えた。次いで５．５ｇの３，５−ジメトキシ−安息香酸（０．０３ｍｏｌｅ）、及び１．２７ｇの水酸化リチウム一水和物（０．０３ｍｏｌｅ）を加えた。次いで１０ｍｌの水を加え、反応混合物を１時間攪拌した。得られたスラリーを濾過し、蒸発させた。残留物をエーテルを用いて粉末状にし、再び蒸発させて黄色がかった固体を得た。この固体を、６０℃で減圧下においてＰ２Ｏ５で乾燥させた。３，５−ジメトキシ安息香酸リチウムの乾燥塩を、１００ｍｌのＴＨＦを満たした２５０ｍｌの丸底フラスコに加えた。Ｎ−ブチルリチウム（２０ｍｌ、１．７Ｍ、０．０３２ｍｏｌｅ）を加えた。反応混合物を５０℃に温め、２時間攪拌した。次いで反応混合物を室温に冷却し、２５０ｍｌの１ＮのＨＣｌに一滴ずつ加えた。次いでＮａ２ＣＯ３をｐＨ１１まで加えた。次いで反応混合物を、エーテルを用いて３回抽出した。併せた有機相は硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し蒸発させてオレンジ色の油が得られ、これはｎ−ペンタンから結晶化させたものであった。Ｒがブチルである２．６ｇの化合物１２を、全体的な収率３９％で得た。Ｒがブチルである化合物１３及び１４を、反応式７に記載したのと同様に調製した。４−ヒドロキシミリテニル−ピバレートと５（１，１−ジメチルフェニル）−レソルシノールの間の縮合は、化合物Ｅに関して記載したのと同様に行い、その収率は６５％であった。
【０１５５】
生理学的実施例
新規な二環式ＣＢ２リガンドの治療効果の評価を、一連の実験系で行って、免疫調節、抗炎症、鎮痛、神経保護、及び抗腫瘍剤としての、これらの薬剤の有用性を支持した。これらの効果はｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で評価し、以下に記載する系を使用して確認した。他に示さない限り、試験化合物は以下のように調製する：ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ用には、化合物を最初にＤＭＳＯに溶かし、次いで段階的にアッセイ緩衝液、一般には組織培養基に、０．１％  ＤＭＳＯの最終濃度まで希釈する。ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ用には、試験化合物を最初にＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（登録商標）：エタノール（それぞれ７０％及び３０％ｗ／ｗ）に希釈し、生理的緩衝液、一般には生理食塩水中に１：２０にさらに希釈して、適切な用量に到達させる。したがってベヒクルは、適切な緩衝液に希釈した元の「溶媒」である。
【０１５６】
（実施例１）
ＣＢ１及びＣＢ２受容体に関する結合親和性。
ｈＣＢ１を安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮ）由来の膜上のＣＢ１受容体から［３Ｈ］ＣＰ５５９４０を除去する、新しい化合物の能力を試験することにより、ＣＢ１結合アッセイを行った。膜をアッセイ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ＝７．４）で希釈して、５００μｇタンパク質／ｍｌにした。５０μｌの希釈した膜（２５μｇ）を、合計体積０．５ｍｌで二環式試験化合物の存在下又は不在下において、［３Ｈ］ＣＰ５５９４０と共にインキュベートした。試験化合物をＤＭＳＯに溶かし、アッセイ緩衝液に希釈して、０．１％溶媒の最終濃度にした。対照サンプルには、同量のベヒクルを加えた。１０μＭのＷＩＮ  ５５２１２−２を加えることによって、非特異的結合を測定した。１．５時間３０℃でインキュベーションした後、反応混合物をＷｈａｔｍａｎ  ９３４Ａ／Ｈフィルタ（０．１％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を予め浸したもの）で濾過した。
【０１５７】
新規な二環式類似体のＣＢ２受容体への親和性を、ｈＣＢ２を安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮ）由来の膜中の受容体から［３Ｈ］ＷＩＮ  ５５２１２−２を除去する、それらの能力によって決定した。膜をアッセイ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ＝７．４）で希釈して、５００μｇタンパク質／ｍｌにした。５０μｌの希釈した膜（２５μｇ）を、合計体積１ｍｌでいくつかの濃度の二環式試験化合物の存在下又は不在下において、０．８ｎＭの［３Ｈ］ＷＩＮ  ５５２１２−２と共にインキュベートした。試験化合物は、ｈＣＢ１アッセイに関して前に記載したように溶解させ希釈した。１０μＭのＣＰ  ５５９４０を加えることによって、非特異的結合を測定した。４０分間３０℃でインキュベーションした後、反応混合物を前に記載したように濾過した。すべての結合アッセイ用のフィルタはβ−カウンターで測定し、類似体の濃度の対数と対結合の％をプロットした。ＩＣ５０値はこのプロットから外挿した。
【０１５８】
結合アッセイの結果を表１に示し、これは好ましい化合物の構造と活性の関係（ＳＡＲ）を、ＣＢ２又はＣＢ１結合部位それぞれから、［３Ｈ］ＷＩＮ  ５５２１２−２又は［３Ｈ］ＣＰ５５９４０を除去する、それらの能力に関して示すものである。
【０１５９】
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４を定義するために表１で使用する略語は、以下の置換基を指す：
ＤＭＢＰ＝１，１−ジメチル−５−ブロモ−ペンチル
ＤＭＣＰ＝１，１−ジメチル−５−シアノ−ペンチル
ＤＭＥＰ＝１，１−ジメチル−エチル−フェニル
ＤＭＨ＝１，１−ジメチルヘプチル
ＤＭＨ６＝１，１−ジメチルヘプト−６−イニル
ＤＭＰ＝１，１−ジメチルペンチル
ＤＭＰＰ＝１，１−ジメチル−３−フェニル−プロピル
ＥＭＰ＝１−エチル−１−メチル−プロピル
ＭＣＰＥ＝１−メチル−１−（ｐ−クロロ−フェニル）−エチル
【０１６０】
表１に報告するＩＣ５０の値は、図１に示すグラフなどのグラフから計算したものであり、選択した二環式化合物とカンナビノイド受容体の結合を示す。ＣＢ１との結合は、ヒトＣＢ１受容体遺伝子を用いて安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞における、［３Ｈ］ＣＰ５５９４０の競合阻害によって測定する。ＣＢ２との結合は、ヒトＣＢ２受容体遺伝子を用いて安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞における、［３Ｈ］ＷＩＮ  ５５２１２−２の競合阻害によって測定する。化合物濃度の関数として阻害の％を表す、２つの曲線（ｈＣＢ１■及びｈＣＢ２◆）をこのグラフに載せる。Ａ−は化合物Ａに関して得られた結果を示す。Ｂ−は化合物Ｂに関して得られた結果を示す。Ｃ−は化合物Ｊに関して得られた結果を示す。Ｄ−は化合物Ｌに関して得られた結果を示す。
【０１６１】
【表１】
2005523259.tif 000036
【０１６２】
星印付きの化合物は式（Ｉ）及び（ＩＩ）の定義内には入らず、比較のみのために含まれる。ＨＵ−２１０は米国特許第５，２８４，８６７号中で開示され、ＨＵ−３０８は国際特許出願ＷＯ  ０１／３２１６９中で開示された。
【０１６３】
（実施例２）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける二環式ＣＢ２リガンドの抗炎症性。
炎症応答カスケードの特定の態様は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−１βなどのサイトカインにより、及びＣＯＸ−２及びＰＧＥ２などの炎症仲介物質により仲介されている。これらの前炎症性物質のレベルを調節することは、最終的な炎症転記の重症度にとって非常に重要である。これらの物質は、免疫系の活性化細胞によっても産生され、この研究の目的は、新しい二環式ＣＢ２リガンドの、活性化マクロファージ及びＴ細胞からの、これらの炎症物質の分泌に対する影響を試験することである。さまざまな試験群における分泌のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定し、阻害のレベルはベヒクル投与群に対して計算する。
【０１６４】
ＥＬＩＳＡを使用するタンパク質の定量
組織培養物の上清又は体液のいずれかの液体サンプル中の所与のタンパク質の量を定量するために使用するこの技法は、酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）に基づくものである。市販のものであれ社内で確立されたものであれ、アッセイは、ＥＬＩＳＡ用プレートのウエルの底部と結合している特異的な抗体による、当該のタンパク質の捕捉に基づくものである。非結合物質を洗浄除去し、次いで捕捉したタンパク質を、ホースラディッシュペルオキシド（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で一般的に標識された二次抗体に曝す。再び非結合物質を洗浄除去し、次いでサンプルを、比色定量反応をもたらす適切な基質と共にインキュベートする。反応を停止させ、分光光度計中において適切な波長で読み取りを行う。サンプルは少なくとも２回試験し、組み換え標的タンパク質の一連の希釈物からなる適切な標準曲線を、それぞれのプレートに取り込ませる。サンプル中のタンパク質の濃度は、この標準曲線から計算する。
【０１６５】
マクロファージの活性化
ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ、マウス細胞系（ＡＴＣＣ  ＃  ＴＩＢ−７１）を、４ｍＭのＬ−グルタミンを含み、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコース、及び１０％の非働化ウシ胎児血清を含むよう調節したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させる。細胞は組織培養フラスコ中で増殖させ、適切な密度で２４ウエルの組織培養プレートに接種した。１ミリリットル中０．５×１０６のＲａｗ細胞を、２μｇ／ｍｌのリポ多糖大腸菌０５５：Ｂ５（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で刺激した。マウスのマクロファージを、対照又は１０μＭの二環式ＣＢ２リガンドで１時間予備処理し、その後ＬＰＳで活性化させた。デキサメタソンを、５０ｎＭで陽性対照として使用した。上清は、活性化後４時間（ＰＧＥ２の場合）及び２４時間（ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの場合）で回収し、試験対象の炎症性物質のレベルを、前に記載したようにＥＬＩＳＡによって決定した。阻害はベヒクル処理した細胞に対して計算した。
【０１６６】
活性化マクロファージにおけるＩＬ−１βの阻害
ＩＬ−１βに関して得られた結果は図２Ａに示し、この場合、分泌のレベルをそれぞれの処置群に関してプロットする。この図から、二環式ＣＢ２リガンドは１０μＭにおいてＩＬ−１βの強力な阻害剤である可能性があり、化合物Ａは分泌を７６％阻害し、化合物Ｄは分泌を６７％阻害し、化合物Ｂは分泌を３４％阻害し、かつ化合物Ｃは分泌を２６％阻害することが分かる。デキサメタソンは、同じ実験においてＩＬ−１β分泌を９７％阻害した。
【０１６７】
活性化マクロファージにおけるＴＮＦ−αの阻害
マクロファージの活性化を、前に記載したように行う。ＴＮＦ−αのレベルを、前に記載したようにＥＬＩＳＡアッセイによって測定する。阻害はベヒクル処理した細胞に対して計算する。１０μＭの化合物Ａを用いた処理によってＴＮＦ−α分泌が５３％低下し、ＩＣ５０は１０μＭであると計算した。１μＭ〜２０μＭの範囲のさまざまな用量の試験化合物で処理を行って、化合物Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ及びＹなどの本発明の他の化合物のＩＣ５０値を決定し、これらはいずれも、２０μＭまでの用量でＴＮＦ−α分泌に重大な影響を与えることはなかった。
【０１６８】
活性化マクロファージにおけるＰＧＥ２の阻害
マクロファージの活性化を、前に記載したように行う。ＰＧＥ２のレベルを、前に記載したようにＥＬＩＳＡアッセイによって測定する。阻害はベヒクル処理した細胞に対して計算する。１μＭ〜２０μＭの範囲のさまざまな用量の試験化合物で処理を行って、ＩＣ５０値を決定した。結果は図２Ｂに示す。化合物Ａ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、及びＹによる、ＰＧＥ２分泌の阻害に関するＩＣ５０値は、それぞれ９μＭ、７μＭ、７μＭ、１８μＭ、９μＭ、及び７μＭであった。
【０１６９】
Ｔ細胞活性化
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒト急性リンパ腫Ｔ−細胞系；ＡＴＣＣ  ＃  ＴＩＢ−１５２）を、２ｍＭのＬ−グルタミンを含み、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び１０％の非働化ウシ胎児血清を含むよう調節したＲＰＭＩ  １６４０培地中で増殖させた。細胞は組織培養フラスコ中で増殖させ、適切な密度で２４ウエルの組織培養プレートに接種する。１ミリリットル中２×１０６の細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）、及び１μＭのＡ２３１８７カルシウムイオノフォア（Ｓｉｇｍａ）を使用して刺激する。シクロスポリンＡ（Ｓａｎｄｏｚ）、知られている免疫抑制剤を陽性対照として使用する。対照及び試験化合物を、刺激の１時間前に指定濃度で加える。上清は刺激後２４時間で回収し、試験対象の炎症性物質のレベルを、前に記載したようにＥＬＩＳＡアッセイによって測定する。阻害はベヒクル処理した細胞に対して計算する。
【０１７０】
活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２の阻害
Ｔ細胞の活性化を、前に記載したように行う。ＩＬ−２のレベルを、前に記載したようにＥＬＩＳＡアッセイで測定する。阻害はベヒクル処理した細胞に対して計算する。この実験の結果は図３に示し、ベヒクル又は化合物処理した細胞によって得たＩＬ−２分泌のレベルを、それぞれの濃度に関してプロットする。この図から我々は、二環式ＣＢ２リガンドはＩＬ−２の強力な阻害剤である可能性があり、化合物Ａは３μＭという計算上のＩＣ５０値を有し、一方化合物Ｌ、Ｒ及びＹは、それぞれ８μＭ、９μＭ及び９μＭという計算上のＩＣ５０値を有することが分かる。二環式合成カンナビノイドのファミリーが由来するＨＵ−３０８は、１０μＭまでの用量でこの実験設定において、それ自体が最小限の効果を有する。１０ｎＭの濃度でシクロスポリンＡは、同じ実験においてＩＬ−２分泌を９８％阻害した。化合物Ａ及びＬも、０．５〜５μＭのＣＢ１アンタゴニストＳＲ１４１７１６Ａ、又はＣＢ２アンタゴニストＳＲ１４４５２８の存在下で、この実験設定において試験し、これらの化合物のＩＬ−２分泌阻害活性は、任意のこれらのアンタゴニストによって逆転することはなかったことに留意しなければならない。この観察結果は、これらのアンタゴニストが、この特異的なおそらく受容体仲介の活性を阻害するのに充分完全なものではないという事実、又は化合物の活性のいくつかは、ＣＢ２結合によって仲介されておらず、他の機構、例えば他の今だに同定されていないカンナビノイド受容体によって、あるいは非受容体仲介の機構によって仲介されている可能性があるという仮説によって説明することができる。
【０１７１】
概してこれらの実験結果は、本発明の二環式ＣＢ２結合化合物が、ＣＢ２結合によるものであれ他の機構によるものであれ、免疫系の活性化細胞からの前炎症物質分泌の強力な阻害剤であるという結論を支持する。
【０１７２】
マスト細胞の活性化
マスト細胞は多機能で骨髄由来の細胞であり、活性化すると強力な炎症仲介物質を放出する。放出は予備形成された顆粒から、あるいは顆粒消失のプロセス、又はその後の刺激誘導型新合成によって行われる。マスト細胞によって放出される分子には、ヒスタミンなどの生体アミン、ケモカイン、サイトカイン、酵素、増殖因子、ペプチド、アラキドン酸生成物及びプロテオグリカンがある。マスト細胞は、痛みのシグナルを生成させる際に重要な役割を果たすことも、知られていることに留意しなければならない。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ラットの好塩基球性白血病の細胞系；ＡＴＣＣ  ＃  ＣＲＬ−２２５６）は、ＣＢ２様受容体を発現し、ＣＢ２選択的リガンドの抗炎症活性の根底にある機構の研究に最も適している。ＲＢＬ−２Ｈ３はＩｇＥ依存性の機構によって、あるいはＰＭＡ及びカルシウムイオノフォアを加えることによって、刺激することができる。
【０１７３】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、アールのＢＳＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含み１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び１５％の非働化ウシ胎児血清を含むよう調節したＥＭＥＭ培地中で増殖させる。細胞は組織培養フラスコ中で増殖させ、適切な密度で２４ウエルの組織培養プレートに接種する。１ミリリットル中の２×１０５の細胞を、以下のいずれか１つによって刺激する。最初に、ＩｇＥ依存性の方法であって、一晩平板培養した後に、培地を交換し、ＩｇＥ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ−８４０６）と結合した０．５μｇ／ｍｌの抗ＤＮＰ（ジニトロフェニル）を含む培地を用いて、細胞を１時間感作状態にする方法。次いで細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．１μｇ／ｍｌのＤＮＰ−ＨＡＳ（ジニトロフェニルアルブミン、ヒト血清、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ６６６１）を含む新しい事前に温めた培地に曝す。ＤＭＳＯに希釈した試験化合物及び対照を、最終的な刺激の前に０．１％  ＤＭＳＯを超えない最終濃度で加える。顆粒消失プロセスを、評価する仲介物質に応じて３７℃でさまざまな時間進行させ、次いで２００μｌの上清を回収する。例えば細胞は、ヒスタミンに関するサンプル採取の前に１時間、セロトニン、ＴＮＦ−α及びＩＬ−４の分泌レベルの観察用には３時間刺激する。このモデルを使用する第二の可能性は、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）及び１μＭのＡ２３１８７カルシウムイオノフォア（Ｓｉｇｍａ）を使用して、刺激を行うときである。Ｓｒｃファミリーの阻害剤ＰＰ１、又はＰＫＣ阻害剤ＧＦ１０９２０３Ｘ（両方共Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍからのもの）は、陽性対照として使用する。対照及び試験化合物を、刺激前に指定濃度で加える。上清は、試験対象の仲介物質に応じて、刺激後２４時間までに回収し、この物質のレベルを、前に記載したようにＥＬＩＳＡアッセイで測定する。阻害はベヒクル処理した細胞に対して計算する。
【０１７４】
（実施例３）
遺伝子発現に対する化合物の影響。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、いくつかの二環式ＣＢ２結合化合物によって示される、免疫系の活性化細胞中の炎症物質の分泌に対する、阻害活性は、遺伝子発現の制御と関連がある可能性がある。
【０１７５】
ＲＮＡ調製及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＳＶ全ＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、全ＲＮＡを調製する。細胞又は組織を、溶解緩衝液中において均質化する。キットの教示書に従い、溶解物をＲＮＡ単離カラムに移し、ＤＮＡｓｅで処理し、洗浄し溶離させる。ＲＮＡの濃度は、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ  ＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して決定した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、全ＲＮＡから合成する。キットの教示書に従い、２μｇの全ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）１５プライマー、０．５ｍＭのｄＮＴＰ  ｍｉｘ、８単位の逆転写酵素、及び他の反応要素と、最終体積２０μｌまで組み合わせる。反応混合物を４２℃で４５分間インキュベートし、７０℃で１５分間失活させる。定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、１μｌのｃＤＮＡ、３００ｎＭの適切な正方向及び逆方向プライマー（調べる遺伝子に従って）、及び緩衝液、ヌクレオチド、Ｔａｑポリメラーゼ、及びＳＹＢＥＲグリーン（ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含む７．５μｌの反応混合物を、１５μｌの合計反応体積で含む。遺伝子の増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して得られる。増幅は１０分間９５℃の一段階、次に２−ステップループ：２０秒間９５℃、及び１分間６０℃の４０サイクルを含む。それぞれのアニーリングステップ中に、増幅産物の量を、二本鎖ＤＮＡ結合染料、ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎの蛍光により測定する。基底シグナルを超える蛍光の増大を最初に検出することができるＰＣＲサイクルを表す、閾値のサイクル（ＣＴ）を、それぞれの産物に関して決定する。ＣＴの１ＰＣＲサイクル遅れは、出発鋳型分子の２倍の減少に翻訳され、逆も然りである。特定の遺伝子産物のＣＴの変化を、参照遺伝子シクロフィリン又はＧＡＰＤＨのＣＴの変化に正規化する。これらの結果は、適切な対照、例えば失活細胞系又はベヒクル「投与した」動物などを超える、試験系における遺伝子発現の倍増として表す。いずれの場合も結果は、シクロフィリン又はＧＡＰＤＨなどの、参照ハウスキーピング遺伝子にも正規化する。
【０１７６】
（実施例４）
ＣｏｎＡ誘導型肝臓障害における化合物の影響。
二環式ＣＢ２結合化合物の肝臓保護活性を、コンカナバリンＡ誘導型肝臓障害のネズミモデルにおいて評価した。
【０１７７】
Ｔ細胞仲介型障害のＣｏｎＡモデル
ヒトの生命を脅かすＴ細胞仲介の肝臓障害の最も一般的な原因は、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎ウイルスによる感染及び自己免疫性肝炎である。自己免疫性肝臓障害の異なる動物モデルが、マウスの急性肝不全を含めて開発されてきており、これはＴ細胞刺激植物レクチンであるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を静脈内注射することによって誘導される。ＣｏｎＡは、肝臓洞と高い親和性がある。マウスをＣｏｎＡで処置することによってＴ細胞が活性化され、これが肝臓中に蓄積し、サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−２など）を放出し、肝臓障害を調節する。シクロスポリンＡ又はＦＫ５０６などの、免疫抑制剤を用いた予備処置により、ＣｏｎＡ注射によって引き起こされる肝臓障害が完全に予防され、このモデルにおけるＴ細胞活性化の主な役割が示される。
【０１７８】
それぞれの実験群は、少なくとも５匹のＢＡＬＢ／ｃ近交系メスマウス（平均重量２５ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）を含む。陰性対照群は、ＣｏｎＡではなく生理食塩水を注射したマウスから構成される。ＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ）の注射は、生理食塩水中に１０ｍｇ／ｋｇで尾の基部において静脈内に行う。これらの処置は、ＣｏｎＡ注射の３０分前に１ｍｇ／ｋｇで静脈内注射する。化合物はＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（登録商標）：エタノールに溶かし、内部対照としてはベヒクルのみを含ませた。
【０１７９】
処置の影響を３つのレベルで調べる。最初に、血液サンプル（２００〜４００μｌ）を、眼窩後穿刺を使用して、ＣｏｎＡ注射後の所定の時点で採取する。短時間の遠心分離（５０００ｒｐｍで２分間）の後、血清を回収し、ＥＬＩＳＡ、及び肝臓障害の指標としての肝臓からのアミノトランスファーゼ漏出による、サイトカインレベルの決定用にさらに使用するまで−８０℃で保存する。平行して、サイトカイン、又は他の炎症仲介物質のレベルも、当該の器官において決定する。この目的のために、ＣｏｎＡ注射後の所定の時点での頚椎脱臼によって、マウスを殺処分する。脾臓及び肝臓を取り出す。肝臓の一部を４％ホルムアルデヒド中に固定し、他の部分はタンパク質又はＲＮＡ抽出用に−８０℃に保った。脾臓の重量を量り、脾臓の小さな部分を４％ホルムアルデヒド中に固定し、一方脾臓の大部分は、以下の手順に従い培養する。それぞれの脾臓を、５ｍｌシリンジの丸い端部を有する細胞濾過器によって、４ｍｌのＲＰＭＩ培地に圧搾する。大きな組織断片を重力沈降によって除去し、上清を回収する。細胞を５ｍｌの赤血球溶解緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で３回洗浄し、２ｍＭのＬ−グルタミンを補った４ｍｌのＲＰＭＩ培地に再懸濁させ、これを調節して１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び１０％の非働化ウシ胎児血清を含ませ、６ウエルの培養皿に平板培養する。細胞は２４時間インキュベートし、上清中のサイトカインレベルを、前に記載したようにＥＬＩＳＡにより決定する。
【０１８０】
化合物Ａの肝臓障害に対する影響を、８時間のＣｏｎＡ処置の後に、血漿中のＡＬＴのレベルを測定することによって評価した。ＣｏｎＡに曝すことによって、３０ＩＵ／ｌから２８００ＩＵ／ｌを超えて、ＡＬＴ血漿濃度の劇的な増大が引き起こされた。ベヒクルのみで処置した動物は、ＡＬＴの２９％という著しくない減少を示し、一方１ｍｇ／ｋｇの化合物Ａで処置した動物は、著しい６５％という低下を示した。ＡＬＴは肝臓障害の確固たる指標であり、これらの実験結果は、肝臓の炎症における二環式ＣＢ２リガンドの潜在的な治療効果を支持するものである。
【０１８１】
（実施例５）
ＬＰＳ注射後の脳組織中における化合物の影響。
中枢神経系炎症の場合の、二環式ＣＢ２結合化合物の神経保護活性を、ＬＰＳをマウスの脳心室中に注射することによって炎症障害が生じるモデルで、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて評価する。ＰＢＳを対照として使用する。ＬＰＳは５０ｎｇ／μｌでＰＢＳ中に溶かし、５μｌを、シリンジポンプ及び脳灌流用カニューレの助けにより、１μｌ／分の割合でそれぞれの心室中に注射する。それぞれの注射の後、カニューレはｉｎ  ｓｉｔｕで２分以上放置して、環流を回避する。さまざまな処置群及び対照に、ＬＰＳのｉ．ｃ．ｖ（脳心室内）注射の直後に、腹腔内注射する（０．１ｍｌ／１０ｇ身体重量）。それぞれの処置群は、５匹のＣ５７／ＢＬオスマウス（６〜８週齢、平均重量２５ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）で構成される。ＬＰＳ注射の６時間後、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射することによって動物を殺処分し、それらの脳を取り出し、次のステップまで−８０℃に保つ。ＲＮＡをそれぞれの全脳から抽出し、炎症物質の遺伝子の発現レベルを、前に記載したようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析する。この実験の結果は、ＬＰＳ及びＰＢＳを注射した脳内の、研究中の遺伝子の活性化の倍数として表す。
【０１８２】
この実験モデルによって、二環式ＣＢ２結合化合物の脳炎症に対する影響を、グリオーシスの程度を測定することによって調べることもできる。この目的のために、ＬＰＳ及び処置注射の３日後に動物を殺処分し、それらの脳を取り出す。２０μｍの凍結切片を海馬のレベルに切断し、Ｆ４／８０マーカーに対する抗体を使用する、標準的な免疫組織化学法によって染色する。定量分析を、Ｆ４／８０免疫応答細胞を計数することによって行う。処置群の間の差異は、分散分析ＡＮＯＶＡ、次に多重比較ｔ−検定を使用して比較する。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。
【０１８３】
（実施例６）
中大脳動脈閉塞における化合物の影響。
マウスにおける一過性のＭＣＡｏ
本発明の化合物の神経保護活性を、大脳虚血を模倣した、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）ネズミモデルにおいて評価する。このモデルは、脳卒中で観察される大脳虚血に対応する。マウス（Ｃ５７／Ｂ１、オス、平均重量２５ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）に、３０％酸素及び７０％窒素中においてハロタンで麻酔をかける（麻酔チャンバー中での誘導用に４％、及びメンテナンス用のフェイスマスク中に１〜２％）。首の皮膚に正中線切開を行い、その下の組織をおおまかに切開する。右総頚動脈（ＣＣＡ）及びその接合部、並びに外側頚動脈（ＥＣＡ）及び内側頚動脈（ＩＣＡ）を、おおまかな切開によって探す。ＥＣＡ、後頭部及び上甲状腺動脈の分岐を、次いで電気メスで切る。次いでＣＣＡを、その周辺に５−０絹糸縫合物質（Ａｓｓｕｔ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を置くことによって一時的に閉じる。２ｃｍ片のナイロン縫合物質を切断し、１％のポリ−Ｌ−リシンの溶液中に置き、次いでオーブン（６０℃）中で６０分間乾燥させる。それぞれの片の先端を炎の下で円形にする。ＥＣＡは同じ型の縫合物質で永久に閉じる。第三の閉塞を、今回は一時的に、５−０絹糸縫合物質を用いてＩＣＡ中に行う。小さな穴をＥＣＡに開け、翼口蓋動脈中に侵入するのを避けながら、ナイロン糸をＩＣＡ中に挿入する。わずかな抵抗を感じるまで、この糸は１１ｍｍ挿入する。次いで５−０絹糸縫合結節によって、糸を固定する。外側に残った１ｃｍの糸を、次いで切断する。皮膚の損傷を、５−０絹糸縫合物質によって閉じる。
【０１８４】
手術後、動物はケージ中において目覚めたままの状態にする。障害開始の１時間後、動物を臨床的に試験して、ＭＣＡ閉塞の成功を確認する。この評価システムは、Ｂｅｌａｙｅｖ他による作品に基づくものであった（Ｓｔｒｏｋｅ  ２７：１６１６〜２３、１９９６；Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８３３：１８１〜９０、１９９９）。これは２つの試験：姿勢反射試験及び前脚置換試験からなる。姿勢反射は、動物を尾部で吊るしながら評価し、一方で前脚置換試験は、動物を胃の近くで保持しながら行う。表１に、これらの試験及びその計測システムを要約する。
【０１８５】
【表２】
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【０１８６】
８と１２の間の合計値を有する動物のみを、本研究に含める。障害開始の９０分後、選択した動物に同じ方法を使用して再び鎮静剤を飲ませ、次いで首の損傷を再び開き、ナイロン糸をＩＣＡから引き出す。次いで皮膚の損傷を、５−０絹糸縫合物質で閉じる。対照及び試験化合物は、障害の終了の１分前に投与する。処置剤はすべて、５ｍｇ／ｋｇで静脈内に送達する。ベヒクルは５ｍｇ／ｋｇで投与する。それぞれの処置群は、少なくとも６匹の動物を含む。次いでこれらの動物を、３つの主なパラメータ：臨床的機能の評価、傷害の程度を含めた病理組織学的評価、及び免疫／炎症指標の評価に関して追跡調査する。研究の終わりに、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射することによって動物を殺処分する。次いで脳を取り出し、検査用に調製する。全ＲＮＡは、試験化合物の虚血の指標に対する影響を調べるために、脳の同側半分から調製する。遺伝子の発現レベルを、前に記載したようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析する。これらの結果は、擬似処置した動物に関する活性化の倍数として表す。遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子シクロフィリンに正規化する。
【０１８７】
（実施例７）
炎症の治療：マウスの耳水腫モデル。
新規な二環式ＣＢ２リガンドの抗炎症活性を、マウスの耳水腫モデルを使用し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてスクリーニングした。この試験系では、クロトン油（ＣＯ）及びアラキドン酸（ＡＡ）を含めたさまざまな炎症誘導物質を使用し、その結果は耳組織の膨張を測定することによって評価する。非ステロイド性抗炎症薬が、このモデルにおいて膨張を低下させることが示されてきている（Ｙｏｕｎｇ、Ｊ．Ｍ．他、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８２：３６７〜７１、１９８４）。これらの刺激物質に対する炎症応答を予防するかあるいは低下させる、試験化合物の能力は、これらの全身性抗炎症性の指標である。
【０１８８】
化合物ＡをＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（登録商標）：エタノールに溶かし、滅菌０．９％塩化ナトリウムで希釈して必要とされる用量に従った所望の最終濃度にした後、成体のオスＩＣＲマウス（平均重量３０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）に腹腔内注射した。０〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲の、さまざまな用量の化合物を調べた。それぞれの処置群は８〜１０匹の動物から構成されており、一方でベヒクル処置群は、１６匹の動物から構成されていた。５０％  ＣＯをアセトンに溶かしたもの２０μｌを１つの耳の外側表面に施すことによって、炎症はすぐに誘導され、反対側の耳はアセトンのみに曝し、対照として働かせた。耳の厚さは、ＣＯを施した３時間後に目盛り付き厚さゲージ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して、（０．０１ｍｍ単位で）決定した。最後に耳を手入れし、直径６ｍｍの耳穿孔を除去し、その重量を測定した。耳水腫は、ＣＯ処置した耳と反対側のアセトン処置した耳の、耳穿孔の重量の比として表す。これらの結果は、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（登録商標）：エタノール、ベヒクル処置した動物と比較した、阻害の％として計算する。この研究で行った用量応答の分析から、我々は、化合物Ａは腹腔内に注射すると、３０ｍｇ／ｋｇ又は８１μｍｏｌｅ／ｋｇのＥＤ５０を有することが分かる。これらの結果によって、二環式ＣＢ２リガンドは、全身性抗炎症性化合物として働くことができることが示される。
【０１８９】
（実施例８）
炎症の治療：マウスの脚部水腫モデル。
この研究の目的は、動物の後脚に１％カラゲナンを注射することによって誘導された脚部水腫における、本発明の化合物のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗炎症活性を試験することである。メスのＢａｌｂ／ｃマウス（平均重量２０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）に、滅菌生理食塩水に希釈したキシラジンとペントバルビタールの組合せを、それぞれ１５及び６ｍｇ／ｋｇ静脈内注射し麻酔をかける。麻酔をかけたマウスに、一方の（右）脚の胎盤下領域に、１％ｗ／ｖカラゲナンを滅菌水に溶かしたもの０．０５ｍｌを皮下注射する。反対側の（左）脚は文献からのデータと同様には注射せず、我々の独自の経験によって確認し、０．０５ｍｌの通常の生理食塩水を注射することによって、後の厚さ又は体積測定に影響を与えることはないことが示された。知られている抗炎症性の対照を含めた試験化合物を、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（登録商標）：エタノールに溶かし、腹腔内注射の前に滅菌生理食塩水に１：２０又は１：５０にさらに希釈し、これはカラゲナン注射の直前に行う。注射の３時間後、前に記載した手順に従い、動物に再び鎮静剤を飲ませる。脚部の厚さは、目盛り付き厚さゲージ（Ｓｐｒｉｎｇ−ｄｉａｌ、一定の低圧ゲージ、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、ＴＧ／Ｌ−１、０．０１ｍｍ）を使用して測定し、脚部の体積は、体積変動記録器（モデル＃７１５０、Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、Ｉｔａｌｙ）を使用して測定する。脚部の水腫は、同じ動物の右の処置済みの脚と左の未処置の脚の間の差異として、１立方ミリメートル中のΔ脚部体積（ΔＰＶ）として、あるいは１ミリメートル中のΔ脚部の厚さ（ΔＰＴ）として表す。それぞれの群は、少なくとも１０匹の動物を含む。これらの結果は、０ｍｇ／ｋｇ（ベヒクルのみ）におけるそれぞれの処置群のΔＰＶ及びΔＰＴ値に、さらに正規化することができる。この研究の最後に、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビトンを腹腔内注射することによって、動物を安楽死させる。
【０１９０】
これらの結果は、ΔＰＶ又はΔＰＴとして最初に計算し、脚部の体積又は厚さに対する処置剤及びベヒクルの影響を比較することにより、次いで阻害の％としてさらに分析する。さまざまな処置群間の差異は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって、次に多重比較フィッシャー検定によって分析する。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。
【０１９１】
結果を脚部の厚さの阻害の％として表し、ベヒクルに正規化し、試験化合物の用量に対してプロットすると、得られたパターンは、所与の用量において最大観察効果（ＭＯＥ）まで最初は勾配であり、次に高用量において安定状態になる。試験化合物の抗炎症活性の分析は２つのパラメータ、脚部の厚さの最大阻害％、及び最大効果が観察された用量に関して行った。第一の一般的な観察結果は、二環式ＣＢ２リガンドが、デキサメタソン及びセレコキシブなどの、知られている抗炎症化合物に匹敵する低濃度、いずれも２ｍｇ／ｋｇまでの範囲において有効であったことである。二環式ＣＢ２リガンドの原形であるＨＵ−３０８によって、０．６ｍｇ／ｋｇにおいて、脚部の厚さの約２８％という最大の低下がもたらされた。化合物Ａによって、２．５ｍｇ／ｋｇにおいて、脚部の厚さの同様の２８％という低下がもたらされたが、一方で化合物Ｌ及びＲによって、０．２５及び０．５ｍｇ／ｋｇにおいて、３４％及び３１％のＭＯＥがそれぞれ示された。比較するために、セレコキシブ及びデキサメタソンなどの知られている抗炎症剤によって、関連用量の範囲において、０．１ｍｇ／ｋｇにおいて脚部の厚さの７％及び２６％という低下、０．２５ｍｇ／ｋｇにおいて１６％及び３１％という低下、０．５ｍｇ／ｋｇにおいて２４％及び３３％という低下がそれぞれもたらされた。したがって、試験した化合物の大部分は、セレコキシブよりは少なくとも優れている。これらの市販の薬剤は、相補的な保護薬剤なしでは慢性的な使用が妨げられる、重大な副作用を示すことに留意しなければならない。本発明の化合物が、これらの薬剤に匹敵する抗炎症活性を有するという事実は、非常に有望である。なぜならこの系の化合物には、副作用がないという利点があり、それらを既存の抗炎症剤に代わる興味深い候補にしているからである。これらの結果によって、本発明の二環式ＣＢ２リガンドが、炎症要素に関する広範囲のヒトの状態と関連がある可能性がある、抗炎症効果を有することが支持される。
【０１９２】
（実施例９）
実験的自己免疫疾患：ＣＩＡ、ＥＡＥ及びＤＴＨ。
自己免疫疾患は、高レベルの炎症サイトカインと関連がある。最も一般的に研究されているげっ歯類モデルは、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、ヒトの多発性硬化症に関するモデル、実験的自己免疫関節炎、ヒトの慢性関節リウマチに関するモデル、及び遅延型過敏症（ＤＴＨ）、ヒトのアレルギー反応に関するモデルである。ＥＡＥは、塩基性の脳炎誘発性タンパク質としても知られている、中枢神経系からのミエリン塩基性タンパク質に対する動物の感作によって誘導される、自己免疫性神経疾患である。実験的自己免疫関節炎は、フロイントの完全アジュバント中のコラーゲンを用いた免疫処置によって、動物中で誘導され：したがってこのモデルは、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）と名付けられる。遅延型過敏症は、厳密なタイムスケジュールに従いジニトロフルオロベンゼンを施すことによって誘導され、したがって作製されるこのモデルは、ヒトのアレルギー接触性皮膚炎に対応する。本研究の目的は、これら３つの自己免疫疾患モデルの臨床的徴候を予防又は低下させる、我々の化合物の能力を試験することである。
【０１９３】
コラーゲン誘導関節炎
成体ＤＢＡ／１オスマウス（平均重量２０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）を、処置群当たり少なくとも８匹、この研究では使用する。ウシコラーゲン２型を、４℃で攪拌することによって、２ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０５Ｍの酢酸に溶かす。このコラーゲン溶液を、等体積のフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）にさらに乳濁させる。それぞれの動物に、１００μｇのコラーゲン２型を０．１ｍｌのＣＦＡ乳濁液に乳濁させたものを投与する。コラーゲンは、尾の底部に皮下投与する。初回抗原刺激の２１日後に、フロイントの不完全アジュバント中に１００μｇのコラーゲンの皮内への追加注射を、マウスに与える。
【０１９４】
それぞれの後脚の体積は体積変動記録器（Ｈｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｌ、Ｉｔａｌｙ）を使用して測定し、その厚さは目盛り付き定圧ゲージ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して測定する。測定は、コラーゲン投与の前に、指定の追跡調査期間中２日毎に行う。処置剤はすべて、腹腔内に投与する。処置期の終わりに、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールを腹腔内注射することによって、動物を殺処分する。
【０１９５】
さまざまな処置群中の、脚部膨張の重度間の差異は、分散分析ＡＮＯＶＡ、次に多重比較ｔ−検定を使用して比較する。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。
【０１９６】
実験的自己免疫性脳脊髄炎
自己免疫性脳脊髄炎のさまざまな動物モデルが、誘導の方法、疾患を誘導するために使用される動物の系統及び抗原に応じて、当分野で知られている。二環式ＣＢ２リガンドの影響は、Ｌｅｗｉｓラットを使用してＥＡＥにおいて試験し、その中で疾患の発症は、誘導後約１０日の臨床症状の出現によって観察される。疾患の進行及び臨床スコアは増大し、１５日頃にピークに達し、自然な回復は疾患誘導後の１８日頃に観察される。動物（研究の開始時には試験群当たり少なくとも９匹、ただし未処置の対照群は５匹のラットのみを含む）は、２２℃の一定温度で、食物及び水を随意で与えながら、１２時間の光／１２時間の暗所という規則飼育に保った。精製したモルモットのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、Ｓｉｇｍａ）を０．１ｍｌのフロイントの完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）に乳濁させたもの２５μｇを、後脚に皮下注射することによる免疫処置によって、これらの動物においてＥＡＥを誘導した。
【０１９７】
０．５と１の間の臨床スコアをとると思われる、この疾患の症状を示した動物を、試験化合物又はベヒクル対照を用いて処置し、これらを５ｍｌ／ｋｇの体積で、疾患の発症時から始めて（疾患誘導後１０日まで）３日連続で静脈内投与した。メチルプレドニソロンを陽性対照として使用し、これは静脈内に５日連続で、ＭＢＰ注射により疾患を誘導した日から始めて３０ｍｇ／ｋｇで毎日投与した。これらの結果は臨床スコアとして記録する；値０は臨床的徴候がない正常な動物を示し、０．５は尾の末端部の緊張性の損失を示し、１は尾全体の麻痺を示し、２は対麻痺を示し、３は四肢麻痺を示し、４は完全な身体の麻痺及び瀕死状態を示し、さらに５は死を示す。動物の臨床スコアを、疾患の発症後１１日間記録し、曲線下の領域（ＡＵＣ）をこの期間中計算する。さまざまな処置群中の、臨床的結果の重度間の差異は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次にフィッシャーのＬＳＤ検定によって分析した。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。
【０１９８】
これらの結果は、それぞれの処置群に関する、平均ＡＵＣの低下の％として図４に示す。化合物Ａによって、用量に関連した臨床スコアのＡＵＣの低下、及び１ｍｇ／ｋｇの用量で３５％という著しい低下がもたらされた。未処置及びＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（登録商標）：エタノール、ベヒクル処置した動物に関して得られた結果より、統計上優れた結果（ｐ＜０．０５）は、図４に＃によって示す。この実験設定では、陽性対照であるメチルプレドニソロン（ＭＰｒｅｄ）は、３０ｍｇ／ｋｇの用量で疾患発症の前に５回投与すると、３４％の低下をもたらした。ベンジルアルコールはＭＰｒｅｄのベヒクルとして働き、それ自体はＡＵＣを１８％増大させ、データは図中には示さない。この実験は盲検的に独立に繰り返し、同様の結果、例えば１ｍｇ／ｋｇの化合物Ａで臨床スコアの３０％の低下を得た。
【０１９９】
さらに別の研究では、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールを腹腔内注射することによって、疾患の誘導１５日後に動物を安楽死させた。脳及び脊髄を取り出し、４％パラホルムアルデヒドによる一晩のインキュベーションによって固定した。脊髄の頚部切片を、高濃度のエタノール溶液を使用して脱水し、次いでパラプラストに包埋した。次いで脊髄を切片化し（１０μｍ）、ヘマトキシリン及びエオシンを使用して染色を行った。染色したスライドを、湿潤リンパ球の病巣に関して光学顕微鏡下で調べた。病巣の数を数え、それぞれの動物の６つの切片を平均した。それぞれ少なくとも４匹の動物の３群：未処置、ベヒクル処置、及び０．５ｍｇ／ｋｇの化合物Ａで処置した動物を、この系では試験した。結果は、病巣の数の平均±ＳＤとして表す。さまざまな処置群中の、湿潤病巣の数の間の差異は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次にスチューデントのｔ検定によって分析した。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。
【０２００】
未処置動物は、それらの脊髄中に、２３±１６病巣／切片の平均値で最高数の湿潤病巣を示した。ベヒクルのみの処置がこの結果に影響を与えることはなく、２１±６病巣であり、一方０．５ｍｇｋｇの化合物Ａは、５０％を超えて湿潤を著しく低下させ、１０±５病巣／切片であった。これらの観察は、疾患が既に確定したとき（発症から５日まで）に行ったものであり、二環式ＣＢ２リガンドは、有害な炎症／免疫カスケードを生み出す細胞の湿潤を予防することによる、強力な神経保護物質であるという事実を、支持するものである。
【０２０１】
しかしながら、これらの実験結果によって、二環式ＣＢ２リガンドは、ヒトの多発性硬化症に関するモデルにおいて、神経系の組織学的レベル、及び機能的な臨床結果のレベルで、有効な治療剤であることが示唆される。
【０２０２】
マウスの遅延型過敏症
成体のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（平均重量２０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）を、０．１５％のジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）をアセトンに希釈したもの３０μｌを、腹部の剃毛した皮膚に施すことによって、第０日及び第１日に感作状態にした。第６日に動物を、ＤＮＦＢをアセトンに溶かしたもの１０μｌを１つの耳に施すことによって攻撃した。反対側の耳は攻撃しなかったが、１０μｌのアセトンを施した。試験化合物は、０〜１５ｍｇ／ｋｇの増大的用量で腹腔内に２回投与し、最初の注射はＤＮＦＢ攻撃の直後であり（第６日）、第二回目の注射は攻撃の１６時間後であった（第７日）。それぞれの処置群は、少なくとも７匹の動物を含んでいた。デキサメタソン（ＤＸＭ）を、陽性対照として使用した。耳の厚さは、攻撃の２４時間後（及び第７日の二回目の処置の６時間後）に、目盛り付き厚さゲージ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して、（０．０１ｍｍ単位で）決定した。
【０２０３】
これらの結果は、ＤＮＦＢ処置した耳とＤＮＦＢ未処置である反対側の耳の、耳の厚さとして分析する。試験化合物の影響は、処置群の動物に対する化合物の平均的影響と、適切なベヒクルのみによって生じた応答を比較することによって、さらに評価した。結果は図５に示し、この場合、耳の厚さの減少の％を、処置用量に対してプロットする。一般的に述べると、得られた型は、活性が安定状態に達した曲線の型である。陽性対照に関して我々は、最大の阻害は約８０％であり、一方ＨＵ−３０８に関しては、最大の阻害は６０％の範囲であることが分かる。計算上のＩＣ５０は、デキサメタソンに関しては３．２ｍｇ／ｋｇであり、ＨＵ−３０８に関しては４．８ｍｇ／ｋｇである。化合物Ａ及びＬが、試験した用量において５０％の阻害に達することはなく、それらの最大低下率は３５〜４３％の範囲である。これらの実験結果によって、二環式ＣＢ２リガンドは、ヒトのアレルギー及び免疫応答に関するモデルにおいて、有効な治療剤であることが示唆される。
【０２０４】
（実施例１０）
神経変性障害の治療：ＭＰＴＰモデル。
パーキンソン病（ＰＤ）は、震え、動きの緩慢さ、硬直性、及びバランスの悪さによって特徴付けられる、神経変性障害である。すべてではないが、大部分のこれらの障害は、線条体の黒質微密部（ＳＮｐｃ）中、及びその突出した神経線維の、ドーパミン作動性ニューロンの損失によって引き起こされる、線条体のドーパミン含量の大幅な減少によるものである。１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）は、ヒトを含めた数種の、線条体中のドーパミン含量の低下、及び黒質線条体のドーパミン作動性ニューロンの数の減少を引き起こす可能性がある、よく知られている神経毒である（Ｔｕｒｓｋｉ  Ｌ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：５７３、１９９１）。本研究の目的は、ＭＰＴＰ誘導型のドーパミン作動性の毒性の進行に対する、二環式ＣＢ２リガンドの影響を調べることであった。
【０２０５】
動物の処置及び手順
マウス（Ｃ５７／ＢＬオスマウス、平均重量３０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）に、ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）（２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｌ／ｋｇ）を生理食塩水に溶かしたもの（Ｔｅｖａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｓｒａｅｌ）を、第１日に２時間間隔で、４回注射することによって腹腔内投与した。（ａ）生理食塩水、未処理、（ｂ）ＭＰＴＰ、未処理、（ｃ）ベヒクル（１：２０のＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（登録商標）：エタノール）、５ｍｌ／ｋｇ腹腔内、及び（ｄ）試験化合物：を含めた処置群に、最初のＭＰＴＰ投与の直前に１回腹腔内投与した。ＭＰＴＰ処置の７日後に、動物を殺処分し（ペントバルビタールナトリウムＣＴＳ  Ｉｓｒａｅｌ  １００ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与することによって）、免疫組織化学技法を使用するチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）検出用に、それらの脳を取り出した。
【０２０６】
免疫組織化学
４％パラホルムアルデヒドによる心臓灌流によって脳を固定し、次に同じ固定液中に少なくとも７２時間脳を浸す。次いで脳をＰＢＳで洗浄し、３０％スクロースをＰＢＳに溶かしたものに、それらが沈むまで移した。脳がスクロース中に沈んだ後、低温保持装置による非常に迅速な凍結（−６０℃）を使用して、それらを凍結させた。次いでこれらの脳を、黒質（ＳＮ）のレベルで低温保持した（２０μｍ）。免疫組織化学染色を、ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ（１：１００、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して行った。スライドは、自動免疫染色システム（Ｖｅｎｔａｎａ）の、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）検出キットを使用して染色した。胆管内核のレベルで中央ＳＮと側面ＳＮを隔てる第３脳神経の根部の、側面のＳＮｐｃの最大寸法で免疫活性（ＩＲ）細胞を計数することによって、定量分析を行った。線条体レベルでの標識の量を、コンピュータによる画像分析システムを使用して評価した。
【０２０７】
データはすべて、平均±ＳＤとして表す。データは、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次に多重比較フィッシャー検定を使用し分析した。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。
【０２０８】
ＳＮｐｃのレベルでのＴＨ免疫活性
図６は、パーキンソン病のＭＰＴＰモデルに２０ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射した、ＨＵ−３０８の影響を示す。ＭＰＴＰ注射及び処置の後のＳＮｐｃレベルでの、１ｍｍ２当たりのＴＨ−ＩＲ細胞の数を、それぞれの処置群に関してプロットする。黒い円柱は、生理食塩水を注射した未処置群である。黒い点の円柱は、ＭＰＴＰを注射した未処置群である。あや目引きの円柱は、ＭＰＴＰを注射し、化合物ベヒクルで処置したものである。白い円柱は、ＭＰＴＰを注射した群であり、ＨＵ−３０８で処置したものである。円柱の上の印は、統計分析値を指す：＃はｐ＜０．０５、生理食塩水と比較したもの；＊はｐ＜０．０５、ベヒクルと比較したもの。ＭＰＴＰ注射の後、ＴＨ−ＩＲ細胞の数は、生理食塩水で処置した動物と比較して６５％減少した（５８±１０生理食塩水群及び２０±３ＭＰＴＰ群）。ＭＰＴＰ処置群に対する、処置群からのＴＨ−ＩＲの結果を計算することによって、ＨＵ−３０８が約４３％のＳＮドーパミン作動性細胞を、ＭＰＴＰの毒性から救援したことが明らかになった。ベヒクルそれ自体には、ＴＨ−ＩＲ細胞に対する救援効果がなかった。これらの結果は、二環式ＣＢ２リガンドは、パーキンソン病などの慢性の神経変性疾患のモデルにおいて、有効であることを示す。
【０２０９】
（実施例１１）
内臓痛の治療：機械的異痛の低下。
この研究の目的は、内臓痛の動物モデルにおける新規な二環式ＣＢ２結合化合物の、潜在的な鎮痛効果を評価することであった。内臓痛は、胃、腎臓、胆嚢、膀胱、小腸、及びその他などの内部器官の障害によって引き起こされる。これらの障害には、埋伏による膨張、又は腫瘍、虚血、炎症、及び隔膜上での牽引があり、これらは関連症状、例えば熱、不快感及び痛みなどを引き起こす可能性がある（Ａｌ−Ｈａｅｒ  Ｅ．Ｄ．他、Ｐａｉｎ  ９６：２２１〜５、２００２）。酢酸を腹腔内注射することによって、マウスにおいて内臓痛を誘導した。
【０２１０】
オスＩＣＲマウス（平均重量２５ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）を、５ｍｌ／ｋｇのベヒクル、さまざまな用量の対照及び試験化合物の体積用量で、静脈内注射によって予備処置した。それぞれの処置群は、少なくとも４匹の動物から構成されていた。１５分後、マウスに１０ｍｌ／ｋｇの０．６％酢酸を腹腔内注射し、萎縮の数を、酢酸投与の５分後から始めて５分の間計数した。これらの結果は、萎縮±ＳＤの平均数として表す。データは、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次に多重比較フィッシャー検定を使用して分析した。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。
【０２１１】
未処置動物は、平均３０．５±４．３の萎縮を示し、ベヒクルのみは、わずかな重要ではない影響があり、萎縮の数を２１．８±３．４に減少させる。しかしながら化合物Ａは、０．５〜２ｍｋ／ｋｇの範囲の用量で、さらに少ない用量よりも統計的有意性に関して、このモデルにおいて非常に有効である（ｐ＝０．０１５）。０．５ｍｇ／ｋｇにおいて化合物Ａは、ベヒクルと比較して６４％、７．９±４．８まで萎縮の数を既に減少させ、１ｍｇ／ｋｇにおいては、阻害は９５％にもなり、わずかに１．２±０．６の萎縮であり、一方２ｍｇ／ｋｇにおいて化合物Ａは、１００％の阻害率で完全な阻害を示し、萎縮は全くない。これらの実験結果により、二環式ＣＢ２結合化合物は強力な鎮痛剤であり、内臓痛に対する保護性があることが支持される。
【０２１２】
（実施例１２）
慢性的な神経障害痛の治療：機械的異痛の低下。
この研究の目的は、神経障害痛の動物モデルにおける新規な二環式ＣＢ２結合化合物の、潜在的な鎮痛効果を評価することであった。ラットの右後脚において、末梢単一部疾患、次に坐骨神経の慢性的な締め付けを誘導した（Ｂｅｎｎｅｔ、Ｇ．Ｊ．＆  Ｘｉｅ、Ｙ−Ｋ．、Ｐａｉｎ  ３３：８７〜１０７、１９８８）。機械的異痛の進行を、確立された挙動試験（フォンフレイのフィラメント）を使用して調べた。
【０２１３】
手術前基底値は、２つの手術前値の平均として確認した。ひとたび基底値を確定した後、４本のクロム製のカットグット、緩い結さつ糸で右坐骨神経を締め付けることによって、動物を手術により調製した。手術後第１１日に、機械的異痛が進行した動物を、手術前値に基づいて、さまざまな処置群に任意に割り当てた。
【０２１４】
デザインはランダム化であり、薬剤又はベヒクルのいずれを与えるかについて隠す方式で行った。動物、オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（平均重量２４０〜２９０ｇ）は、試験前に挙動試験用装置に順応させた。試験日に、処置群当たり少なくとも６匹の動物に、２．５ｍｌ／ｋｇの体積で試験化合物の１つを、１回用量で腹腔内に与えた。１５分後、一連のフォンフレイのフィラメント（試験前に予め目盛り付けしたもの）を、後脚の足底表面に下から施した。フィラメントは最も弱い力から初めて昇順に施し、及び同側及び反対側の後脚の、離脱閾値を評価した。それぞれのフィラメントは、脚の中央足底表面、フィラメントがちょうど曲がり始める地点にインデントをつけ；約１Ｈｚの周波数でフィラメント当たり約８〜１０回、これを繰り返す。離脱閾値は、反射的離脱応答（すなわち、わずかな脚の動き）を誘導する、２つ以上の連続したフォンフレイのフィラメントの最も弱い力として定義し、グラムで測定する。
【０２１５】
図７は、神経障害痛の慢性的な締め付けによる神経障害モデルにおける、化合物Ａの影響を示す。これらの結果は、試験化合物処置群とベヒクル処置動物における、フォンフレイのフィラメントに対する応答の閾値の増大の％として表し、定義に従ってベヒクル処置群は、０という基底値をもたらす。黒い円柱は、モルフィン処置動物（４ｍｇ／ｋｇ）を表し、灰色及び点の円柱棒は、２つの用量の化合物Ａ（それぞれ、０．５及び１ｍｇ／ｋｇ）を表す。この研究から、処置１５分後、４ｍｇ／ｋｇの用量のモルフィンで処置した動物は、ベヒクル処置群の閾値よりも、それらの同側の後脚において９１％大きな痛みの閾値を有するようである。０．５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの化合物Ａで処置した群は、その痛みの閾値の７１％及び６４％の向上をそれぞれ示すが、一方別の実験では、５ｍｇ／ｋｇのＨＵ−３０８で処置した動物は、１１７％の向上を示す（データは示さず）。これらの結果により、本発明の二環式ＣＢ２リガンド、及び知られているＣＢ２アゴニストＨＵ−３０８は、慢性的な神経障害痛を軽減又は治療することができることが教示される。これまでＨＵ−３０８は、ホルマリン試験において評価されたように（ＷＯ  ０１／３２１６９）、末梢痛を軽減することが知られていた。
【０２１６】
さらに化合物Ａは、実施例１０に記載するように、ヒトの多発性硬化症をモデルにした実験的自己免疫性脳脊髄炎系において、有効であることが見出されたことに留意しなければならない。ＭＳに苦しむ患者では、神経障害を経験するだけでなく、重度の神経障害痛も進行する。本発明の化合物は、疾患のこの２つの側面に同時に対処できるという事実によって、明らかな治療上の利点が与えられる。
【０２１７】
（実施例１３）
急性の末梢痛の治療：テールフリックモデル。
この研究の目的は、急性痛の動物モデルにおける新規な二環式ＣＢ２結合化合物の、潜在的な鎮痛効果を評価することであった。このモデルでは、痛みを与える刺激は熱であり、動物がその尾を動かすまでの潜時を調べる（Ｌｅ  Ｂａｒｓ  Ｄ．、Ｇｏｚａｒｉｕ  Ｍ．  ＆  Ｃａｄｄｅｎ  Ｓ．Ｗ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５３：５９７〜６５２、２００１）。
【０２１８】
ＩＣＲオスマウス（平均重量２０〜３０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）に、５ｍｌ／ｋｇの体積用量を腹腔内注射した。それぞれの処置群は、少なくとも６匹の動物を含んでいた。モルフィンＨＣｌを、５ｍｇ／ｋｇの最終用量で陽性対照として使用した。そのベヒクル、生理食塩水も、対照として含ませた。試験化合物はＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（登録商標）：エタノールに溶かし、注射前に生理食塩水に１：２０に希釈し、この第二の型のベヒクルも陰性対照として含ませた。注射した最終用量は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇで変えた。処置注射後の所定の時点で、動物をテールフリック系（Ｓｏｃｒｅｌ、モデルＤＳ２０）中に置いた。それらの尾を光電セル上に置きながら、動物は優しく保持した。次いでそれらの尾を、先端部から２ｃｍの所を照射し（２１Ｖ）、秒単位で測定される潜時を同様に記録した。研究の最後に、１００ｍｇ／ｋｇのナトリウムペントバルビタールを腹腔内注射することによって、動物を安楽死させた。
【０２１９】
２つのパラメータ、潜時及び無痛覚症を示す動物の％を使用して、結果を分析した。この後者によって我々は、処置群中の何匹の動物が、潜時によって測定される痛みに対してより高い耐性を有するかを決定することを意味し、この潜時は、ベヒクル処置動物で観察される潜時の２倍以上優れたものである。結果はいずれの場合も、平均±ＳＥとして表す。さまざまな処置群中の、潜時又は無痛覚症を示す動物の％の間の差異は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次に多重比較チューキー検定（潜時に関して）又はフィッシャーの精度検定（動物の％に関して）によって分析した。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。
【０２２０】
図８は、急性痛のテールフリックモデルにおける、さまざまな用量の化合物Ａ（点の円柱）及び化合物Ｒ（あや目引きの円柱）の影響を示す。注射の３０分後に測定を行うと（パネルＡ）、２つの対照群の潜時は類似しており、生理食塩水に関しては２．６５秒、試験化合物のベヒクルに関しては２．８９秒であった。陽性対照のモルフィンによって、潜時が５ｍｇ／ｋｇにおいて７．５秒に増大した（生理食塩水と比較してｐ＜０．０５、グラフ上に星印によって示す）。試験化合物Ａによって、２〜１０ｍｇ／ｋｇの試験したすべての用量で、潜時が有意に増大し（ベヒクルと比較してｐ＜０．０５、グラフ上に星印によって示す）、最大の試験用量において最大の潜時は７．１秒であった。注射の９０分後に測定を行うと（パネルＢ）、モルフィンの影響は著しく低下し、その潜時は、ここではわずかに３．９秒でほぼ基底状態に戻っており、一方化合物Ａ及びＲの影響は、比較的安定した状態のままである。試験した最適用量、１０ｍｇ／ｋｇでは、化合物Ａは７．３秒という潜時を、注射の９０分後に依然としてもたらし、化合物Ｒは８．５秒もの最大潜時を保った。これらの結果は、無痛覚症を示す動物の％に基づいて分析すると、一層劇的に見える。したがって我々は、注射の９０分後に、５ｍｇ／ｋｇのモルフィンで処置した、わずか約４０％の動物が依然として無痛覚症を示し、一方１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａで処置した８０％を超える動物、及び１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｒで処置した動物の１００％は、ベヒクル処置動物の２倍優れた、潜時を有することが分かる。注射の３３０分後においても化合物Ａ８ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で、有意な無痛覚症が依然として明らかであった。化合物Ｒは、１０ｍｇ／ｋｇで処置した動物の１００％に関してさらに印象的であり、注射の３３０分後に増大した無痛覚症を依然として示し、この時点では、絶対潜時は依然として６．８秒もあった。４ｍｇ／ｋｇ及び８ｍｇ／ｋｇというさらに低用量では、化合物Ｒは、無痛覚症を生み出す際に５ｍｇ／ｋｇのモルフィンより、依然として２倍優れていた。
【０２２１】
すべての他のパラメータが同一でありＣ−５がＲである、化合物Ａの正反対の鏡像異性体をこの実験設定において試験し、無効であることが証明されたことが、興味深いことに記される。化合物Ａの（＋）鏡像異性体、すなわち（４Ｒ）−４−［４−（１’，１’−ジメチルヘプチル）−２，６−ジヒドロキシフェニル］−６，６−ジメチル−２−ノルピナノンを、（−）−β−ピネンを出発原料として使用して、Ｍａｋｒｉｙａｎｎｉｓ及び同僚のプロトコルに従って合成した（Ｄｒａｋｅ  Ｄ．Ｊ．他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：３５９６〜３６０８、１９９８）。化合物Ａ、（−）鏡像異性体４ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射によって処置した動物は、投与の３０分後に４．９秒という充分な潜時を示し、これと比較してベヒクル処置動物は２．８秒であり、一方４ｍｇ／ｋｇの（＋）鏡像異性体で処置した動物は、わずか２．４秒という平均潜時を有していた。（＋）鏡像異性体と（−）鏡像異性体に関して得られた結果の間の差異は、統計上有意である（対応のない２群のｔ検定、ｐ＝０．０４）。さらに化合物Ａは、ＣＢ２に対して１０倍低いＩＣ５０値を有するその（＋）鏡像異性体よりも、さらにＣＢ２選択的でもあり、鏡像異性体のわずか１０と比較して、ＣＢ２／ＣＢ１比は約３０である。
【０２２２】
同様の研究をＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙオスラットに行い、この場合薬剤を、マウスモデルの腹腔内ではなく静脈内注射した。比較可能な結果が得られ、ごくわずかな差異は、潜時（腹腔内より静脈内のほうが短い）、作用の発症（腹腔内より静脈内のほうが迅速である）、及び作用の時間（腹腔内より静脈内のほうが短い）の、大幅な増大を誘導するのに必要な用量に関することであった。これらの観察結果は、投与の経路と一致する。腹腔内注射の研究では、注射後の最初の時点は３０分であり、一方静脈内注射ではそれは１０分後であり、したがって作用の発現は、これらの実験では完全には決定されなかった。静脈内注射の９０分後、３ｍｇ／ｋｇ又は４ｍｇ／ｋｇの化合物Ａで処置した１００％の動物が、ベヒクル処置動物より２倍優れた潜時を依然として有していた。試験した時点の最後では（注射後３３０分）、４ｍｇ／ｋｇの化合物Ａで処置した約７０％の動物が、痛みに対してより高い耐性を保持していた。
【０２２３】
ひとたび最適用量を確立した後、実験をこの１つの用量で長時間繰り返して、鎮痛活性の時間を確立する。図９Ａは、モルフィン５ｍｇ／ｋｇにおいて、潜時がかなり迅速にベヒクルの基底値に戻り、注射の２時間半後、モルフィン処置動物の潜時は３．１秒であり、これと比較してベヒクル処置群は２．６秒であることが示され、生理食塩水と同様であることは前に示した。これらの観察結果は、モルフィンの知られている短期の鎮痛活性と一致する。しかしながら、化合物Ａ、Ｎ、Ｒ及びＺは、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、実験中試験する最後の時点まで、徐放性の鎮痛効果をもたらす。注射の５時間半後、化合物Ａ、Ｎ、Ｒ及びＺで処置した動物は、それぞれ４．９、５．４、６．８及び５．２秒の潜時を示す。この時点では、ベヒクル処置動物は尾を動かすまで２．５秒の潜時を有し、一方モルフィン処置動物は、３．６秒の潜時でわずかに保護される。図９Ｂは、増大した無痛覚症を示す動物の数によって分析したときの、同じ実験の結果を示す。これらの結果は類似の型を示し、増大した無痛覚症を示す動物の数は、モルフィン処置動物では、注射の１時間半後の８８％から処置の５時間半後１７％に急速に減少する。向上した無痛覚症を示す動物の割合は、１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａで処置した群では、１００％の研究阻害から５時間半後に８０％程度まで、化合物Ｎ及びＺは７０〜９０％から研究の終わりには約６０％程度まで、一層穏やかなペースで減少する。最も印象的な結果は、１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｒで処置した群で得られ、１００％の動物が、ベヒクルの２倍の潜時によって表される痛みに対する高い耐性を、研究の間中示した。
【０２２４】
概してこれらの結果によって、二環式ＣＢ２リガンドにはモルフィンより長期の鎮痛効果があり、急性の末梢痛を軽減又は治療することができることが教示される。治療の初期段階で比較可能であるが、注射の最大で９０分後、二環式ＣＢ２リガンドは、得られる潜時に関して、及び充分な潜時を得た動物の％に関して、モルフィンに優りはじめる。本発明の化合物はＣＢ２選択的であるが、いくつかの化合物は、ＣＢ１受容体に対する生理的に有意な結合能も保持していることに、留意しなければならない。観察されたいくつかの活性は、単独又はより強力なＣＢ２活性化と併せた、ＣＢ１活性化によるものであることを、我々は無視することはできない。本発明のいくつかの化合物の、残りのＣＢ１との結合活性にもかかわらず、二環式ＣＢ２リガンドは、副作用の面でモルフィンに優る明らかな利点、耐性などを依然として有し、これは以下で論じる。
【０２２５】
（実施例１４）
炎症の治療：ラットの脚部水腫モデル。
この研究の目的は、動物の後脚に２％λカラゲナンを注射することによって誘導された脚部水腫における、本発明の化合物の抗炎症痛活性を試験することである。オスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（平均重量２００ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）を、注射の間中ドライアイス上に置くことによって、一時的に平静状態にする。これらのラットに、一方の（右）脚の胎盤下領域に、２％ｗ／ｖλカラゲナンを滅菌生理食塩水に溶かしたもの０．１ｍｌを皮下注射する。反対側の（左）脚は文献からのデータと同様には注射せず、我々の独自の経験によって確認し、０．１ｍｌの通常の生理食塩水を注射することによって、後の鎮痛測定に影響を与えることはないことが示された。知られている抗炎症性の対照を含めた試験化合物を、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（登録商標）：エタノールに溶かし、腹腔内注射の前に滅菌生理食塩水に１：２０又は１：５０にさらに希釈し、これはカラゲナン注射の直後に行う。炎症痛を誘導する前、注射の３時間後に、痛みの刺激に対する動物の反応を、２つの系で試験した。最初の刺激は熱によるものであり、Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅモデル７３７０を使用し、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓに従ったＰｌａｎｔａｒ  Ｔｅｓｔによって評価した。規模は、５０任意単位の強度に設定した。熱刺激に対する反応として、動物が脚を動かすまでの潜時を、炎症状態及び非炎症状態の後脚に関して記録した。第二の刺激は機械的（接触）によるものであり、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｌａｎｔａｒ  Ｓｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｈｅｒ（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅモデル７３４００−００２）を使用して評価した。この系は最大５０グラムの力に設定し、施す力は１０ｇ／秒の割合で徐々に増大させた。研究の最後に、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビトンを腹腔内注射することによって、動物を安楽死させる。
【０２２６】
これらの結果は、０時間及び３時間の２本の後脚の間の差異として、この研究の熱部分の潜時に関してはΔＬＴとして、この研究の機械的部分に関してはΔＦｏｒｃｅとして測定する。結果はそれぞれの処置群の平均±ＳＤとして表し、これらの群中の差異は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって、次に多重比較チューキー検定によって分析する。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。
【０２２７】
２％λカラゲナンを投与することによって、脚の膨張及び発赤によって特徴付けられる、脚部の炎症が誘導された。炎症を誘導した３時間後、未処置又はベヒクルのみで処置した動物は、熱刺激の後に後脚の間で約５〜７秒のΔＬＴを示した。この結果は、動物を８ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ（ΔＬＴ＝１．５秒）、又は１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｎ（ΔＬＴ＝２秒）で処置すると約３倍低下し、動物を１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｒで処置するとΔＬＴ＝０秒に低下した。このモデルでは、５ｍｇ／ｋｇのモルフィンも有効であり、ΔＬＴを０秒に低下させた。施した刺激が接触によるものであったとき、ラットのその脚を動かさせるために必要とされる力は、１７低下したこと（カラゲナン注射前の４７ｇから、３時間後に３０ｇ）が観察された。ここでもこの結果は、未処置動物とベヒクル処置動物で非常に類似しており、８ｍｇ／ｋｇの化合物Ａによって、この結果がわずか２ｇのΔＦｏｒｃｅに大幅に低下したが、化合物Ｎは６ｇのΔＦｏｒｃｅを与え、化合物Ｒは４ｇのΔＦｏｒｃｅを与え、化合物Ｚはわずか２ｇのΔＦｏｒｃｅを与え、後者の化合物は１０ｍｇ／ｋｇで試験した。２ｍｇ／ｋｇにおいて、化合物Ｌは未処置動物又はベヒクル処置動物で、約２０ｇから１１ｇへのΔＦｏｒｃｅの低下を引き起こした。これらの値は、１ｍｇ／ｋｇの化合物Ｒに関して得られた結果と類似しており、これは高濃度において非常に強力であることが証明されたが、しかしながら、このプラスの傾向には統計的有意性はない。このモデルでは、５ｍｇ／ｋｇのモルフィンも同様に有効であり、ΔＦｏｒｃｅを２．７グラムに低下させた。
【０２２８】
二環式ＣＢ２リガンドの抗炎症痛活性を、オピエートだけでなく、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）とも比較した。３つの薬剤：セレコキシブ（ＣＯＸ−２阻害剤）、ケトプロフェン（ＣＯＸ−１阻害剤）及びジクロフェナク（ＣＯＸ−１阻害剤とＣＯＸ−２阻害剤を混合させたもの）をこのモデルでは試験した。ＮＳＡＩＤは３つの用量：５、１０及び２０ｍｇ／ｋｇで試験し、中間用量１０ｍｇ／ｋｇを研究の残り部分用に選択した。１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射において、３つの薬剤すべてが非常に有効であり、ΔＬＴを０秒に低下させたが、しかしながらこれらの結果は、１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｒの効果とは反対に、有意ではなかった。ΔＦｏｒｃｅとして表すと、ジクロフェナク及びケトプロフェンのみが、それぞれ２ｇと７ｇの活性を示した。これらの値は、化合物Ａ、Ｎ、Ｒ及びＺと同じ範囲内にある。
【０２２９】
化合物Ｒも、腹腔内に５ｍｇ／ｋｇのＣＢ１アンタゴニストＳＲ１４１７１６Ａ、又はＣＢ２アンタゴニストＳＲ１４４５２８の存在下で、この実験設定において試験し、カラゲナン及び化合物の１５分前に投与されたことに留意しなければならない。アンタゴニスト自体には、鎮痛活性はなかった。熱刺激及び機械的刺激に対する化合物Ｒの鎮痛活性は、任意のアンタゴニストよって逆になることはなかった。この観察結果は、これらのアンタゴニストが、この特異的な活性を阻害するのに充分完全なものではないという事実、又は化合物の活性のいくつかは、ＣＢ２結合によって仲介されておらず、他の機構、例えば他の今だに同定されていないカンナビノイド受容体によって、あるいは非受容体仲介の機構によって仲介されている可能性があるという仮説によって説明することができる。
【０２３０】
概してこれらの実験結果は、本発明の二環式ＣＢ２リガンドが、モルフィン又はＮＳＡＩＤに匹敵するかあるいはそれより優れた活性を有する、強力な鎮痛剤であることを実証する。この活性がＣＢ２結合により仲介されているか、あるいは他の機構により仲介されているかは、依然として確かではない。市販の前述の治療剤の副作用はよく知られており、本発明の化合物は有利なことにそれらに置き換わることができる。
【０２３１】
（実施例１５）
末梢の不快な痛みの治療：ホルマリン試験。
末梢神経系によって仲介される痛みを、皮膚（末梢の）痛みに関する「ホルマリン試験」で試験する（Ｔｊｏｌｓｏｎ  Ａ．他、Ｐａｉｎ５１：５〜１７、１９９２）。最初に、試験化合物を腹腔内注射する。次いでホルマリンを、試験化合物の９０分後に、マウスの後脚の足底表面に皮下注射する。ホルマリン投与の直後に、動物がホルマリン注射された脚をなめるときの回数によって、痛みを評価する（１時間に５分毎）。
【０２３２】
（実施例１６）
アデニルシクラーゼアッセイ。
カンナビノイド及び誘導体は、Ｇタンパク質結合ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体と結合し、アデニルシクラーゼ活性の阻害によってその活性を発揮する。アデニルシクラーゼアッセイは、ホルスコリン活性型ｃＡＭＰ生成を阻害又は促進する化合物の能力を決定することによって、化合物の機能分析の基本を形成する。このアッセイは、Ｃｈｉｎ他（Ｃｈｉｎ、Ｃ．Ｎ．他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７０：３６６〜７３、１９９８）に従い行う。簡潔には、ヒトＣＢ１又はＣＢ２受容体（ｃＤＮＡ）を用いて安定的にトランスフェクトした、ＨＥＫ−２９３ヒト腎臓細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５７３）を、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補ったＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞は５×１０４個の細胞／ウエルで２４ウエルのプレートに接種し、４８時間インキュベートした。次いで培地を除去し、接着細胞をＰＢＳで洗浄した。０．２ｍＭのＲｏ  ２０１７  ２４、０．２５％のＢＳＡ、及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳを補った、２００μｌの血清を含まない培地を、次いでそれぞれのウエルに加えた。次いで細胞を、１０ｐＭ〜１μＭの範囲の濃度の二環式試験化合物の存在下で、１μＭのホルスコリンを用いて活性化させた。次いで活性化させた細胞を、３７℃で２０分間インキュベートし、１．２ＭのＨＣｌを用いて反応を停止させ、最終濃度０．１Ｍにした。細胞を凍結解凍により溶解させ、溶解物を２ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で中和し、５０μｌの等分試料中のｃＡＭＰを、［３Ｈ］−ｃＡＭＰアッセイシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して測定した。
【０２３３】
このシステムでは２つのパラメータ、ｃＡＭＰレベルの最大阻害の５０％が観察される用量（ＩＣ５０）、及び１μＭの試験化合物を用いて到達する阻害のレベルを評価した。ホルスコリンは多くの方法によってｃＡＭＰ生成を活性化するので、化合物による完全な１００％の阻害は予想されず、これらの化合物は、１つの受容体又は限られた数の活性化経路のみに作用するはずであることに、留意しなければならない。この実験は最初に、ＣＢ２受容体でトランスフェクトした細胞に行った。１μＭにおけるＩＣ５０及び阻害の％を、参照としてのＨＵ−２１０（１．４３ｎＭ及び５０％）、化合物Ａ（０．２４ｎＭ及び６３％）、Ｌ（決定せず、及び３３％）、Ｒ（０．４７ｎＭ及び６４％）、Ｓ（０．１６ｎＭ及び５８％）、及びＹ（１．１３ｎＭ及び６０％）に関して決定した。対照に関しては、試験化合物を非トランスフェクト状態のＨＥＫ−２９３細胞においても試験し、ｃＡＭＰのレベルでは阻害を観察することはできず、前に記載した結果が、実際にＣＢ２受容体に特異的であったという事実が支持される。そのＣＢ１結合に関するＩＣ５０が０．３２８ｎＭである、参照化合物ＨＵ２１０は、ＣＢ１でトランスフェクトした細胞において、ｃＡＭＰに関して０．３５ｎＭというＩＣ５０を示し、１μＭにおける最大阻害は７３％であった。同様に化合物Ａは、ＣＢ１でトランスフェクトした細胞において、ホルスコリン誘導型のｃＡＭＰ生成の阻害に関して１０．３ｎＭというＩＣ５０を示し、１μＭにおける最大阻害は６９％であった。化合物ＡのＣＢ１結合に関するＩＣ５０は、同じ範囲で２８ｎＭという値である。結合活性とｃＡＭＰ生成の機能阻害の間の、ＩＣ５０範囲の類似性によって、この実験設定の妥当性がさらに支持される。これらの結果は、二環式ＣＢ２リガンドは受容体と結合するだけではなく、適切な受容体活性化から生じる適切な機能誘導物質も誘導することを示す。これらの観察結果から、本発明の二環式ＣＢ２リガンドは、受容体に対するアゴニストとして作用することが導かれた。
【０２３４】
さらに、外来性のヒトＣＢ１又はＣＢ２受容体、及び環状ＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）と結合したルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現する哺乳動物細胞は、ホルスコリン又はカルシウムイオノフォアなどの異なる刺激によって活性化される。活性化の後、細胞を抽出し、蛍光単位中のレポーター遺伝子の活性を、ルシフェラーゼアッセイにより測定する。環状ＡＭＰの増大は、ルシフェラーゼ活性の増大によって表される。
【０２３５】
（実施例１７）
化合物の向精神薬効果。
オスＩＣＲマウス（平均重量２５ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）を、向精神薬効果、具体的には運動能力及び直腸温度に関する、一連の試験用に使用する。試験化合物、及び知られている特定のＣＢ１及びＣＢ２アンタゴニストを、適切なときに、ベヒクルに溶かし、生理食塩水に希釈し、０．０５ｍｌ／体重１０ｇを超えない体積でマウスに、腹腔内注射、又は３ｍｇ／ｋｇまでの用量で静脈内に静脈内注射した。非投薬マウスを、対照として使用した。それぞれの処置群は、少なくとも６匹の動物から構成される。
【０２３６】
動物は、処置剤を静脈内投与した５分後、又は腹腔内注射の３０分後に、開放領域（６０×５０ｃｍ）に置いた。動物の運動能力は、ビデオ系コンピュータシステム（ＶｉｅｗＰｏｉｎｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して記録した。以下のパラメータ：動物が移動した全体の距離、時間及び速度を３分間記録した。他のパラメータ、直腸体温は、サーモスタット温度計（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｋｅｒモデル８４０２−００）及びサーモスタットプローブ（ＹＳＩ  ４００モデル４０２）を使用して、開放領域での実験の最後に調べた。
【０２３７】
結果は平均±ＳＥとして表し、ベヒクルと処置剤の間の差異は、ＡＮＯＶＡによって、次に多重比較チューキー検定によって比較する。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。
【０２３８】
動物が移動した全体の距離に関する限り、処置群の間で変動が観察された。ベヒクルを静脈内注射した動物は、３分間の追跡調査中に１０００ｃｍ移動した。０．１、０．５及び１ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを投与した動物は、高い運動能力を示し、全体の距離は１３００ｃｍと１４００ｃｍの間であった。この増大は、統計上有意ではなかった。１、２、３、４、５及び６ｍｇ／ｋｇの化合物Ｒを投与した動物も、合計移動距離の変動を示し、ここでもこの現象には統計的有意性がなかった。同様に、ベヒクル処置動物の平均速度は５．９秒／ｃｍであり、一方０．１、０．５及び１ｍｇ／ｋｇの化合物Ａで静脈内処置した動物は、７〜７．２秒／ｃｍというわずかに大きな速度で移動した。１、２、３、４、５及び６ｍｇ／ｋｇの化合物Ｒで処置した動物は、用量依存的に４〜８秒／ｃｍの範囲の速度で移動した。速度のこれらの差異は、いずれの方向でも統計上有意ではなかった。最後に、ベヒクル処置動物の平均直腸体温は３８．４℃であった。化合物Ａ及びＲは約２℃という適度な低体温症を誘導し、これは統計上有意であったが、ある範囲内では重要な生理的意味はなかった。これらの実験は腹腔内投与経路で繰り返し、同様の観察を行った。２つの投与経路間の唯一の違いは、腹腔内注射で試験した用量が約１桁大きかったことであり、化合物Ａは腹腔内で３０ｍｇ／ｋｇまで試験し、一方で化合物Ｒは４０ｍｇ／ｋｇまで試験した。
【０２３９】
化合物Ａ及びＲはいくらか中程度の副作用を示したが、これらの現象は、少なくとも６〜８倍その有効用量を大幅に超える用量において観察され、これらの化合物は概してマウスによって充分許容された。死亡は観察されず、したがって最大耐性用量は、４０ｍｇ／ｋｇ腹腔内を大幅に超える。二環式ＣＢ２リガンドの挙動の影響を、注射後の非常に短時間において調べ、それは中程度であるだけでなく一過性でもあることが分かった。なぜなら注射の２４時間後、すべての動物が元の挙動に戻ったからである。本発明の化合物はＣＢ２受容体と優先的に結合するが、いくつかの化合物は、このような副作用を仲介することが知られている、ＣＢ１受容体との結合能を保持していることに留意しなければならない。この文脈において、化合物Ａ及びＲは、約３０〜４０ｎＭのＩＣ５０でＣＢ１受容体と結合することを記さなければならない。したがって、４０ｎＭを超えないＩＣ５０値によって表される低い親和性で、ＣＢ１受容体と結合する化合物がさらに安全であると考えることができる。
【０２４０】
試験化合物の全体的な運動能力に対する影響を、第二の実験設定において評価し、この場合動物は、Ｒｏｚａｓ他（Ｒｏｚａｓ  Ｇ．他、Ｊの「神経科学の方法（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」８３：１６５  ７５、１９９８）によって記載された回転式装置を使用する機能試験に施した。動物、オスＩＣＲマウス（平均重量４０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）を、実験開始前に４日間訓練した。それらの課題は、落下せずに１２分間（それぞれの速度で３分間）加速ロッド上に留まることであった。試験した速度は：１５、１９、２３及び２７ｒｐｍであった。ロッド上での動物の性能を、以下のように記した：それぞれの動物は、それぞれの速度においてロッド上を完全に歩くと、最大３ポイントを得ることができた（１分につき１ポイント）。したがって動物は、１２ポイントの最大値を得ることができた（それぞれの速度で３ポイント）。動物によって囲まれるそれぞれ３つの円に関して、歩かずにロッドの旋回ビームを捕らえると、０．５ポイントを差し引いた。最初の３つの円が、値に影響を与えることはなかった。適切な訓練の後、群当たり少なくとも６匹の動物に、さまざまな用量の試験化合物、及び５ｍｌ／ｋｇの体積用量の対照を腹腔内投与した。化合物注射前の時間０、及び化合物又はベヒクル投与の３０分、３時間及び２４時間後に、回転式装置において値を決定した。
【０２４１】
結果は平均±ＳＤとして表し、ベヒクルと処置剤の間の差異は、ＡＮＯＶＡによって、次に多重比較チューキー検定によって比較する。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。ベヒクル処置動物は、すべての時点で最大値１２を示した。なぜならそれらの運動能力は、決して影響を受けなかったからである。１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａで処置した動物は、統計的有意性を示したが、注射の３０分後に５．６の平均値で運動能力が一時的に低下した。この影響は、それぞれ３時間及び２４時間において９．７及び１１．９の平均値で、後の時点において無くなった。最初の３０分で観察されたこのような一時的な影響は、化合物ＡのＣＢ１結合能によるものである可能性があり、最も低い親和性でＣＢ１受容体と結合する化合物が、さらに安全であることが示唆される。これらの結果に基づき、化合物を注射の少なくとも３０分後の時点で試験して、観察される影響は、すべてではないが残留ＣＢ１との結合能によって、最小限の影響を受けると思われることを確かめた。
【０２４２】
（実施例１８）
心血管系に対する化合物の影響。
この研究の目的は、オスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２７０〜３５０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）における、試験化合物の安全性を評価することであった。試験化合物をベヒクルに溶かし、滅菌生理食塩水に１：２０に希釈し、静脈内投与に関しては０．１〜２ｍｇ／ｋｇ、あるいは腹腔内投与に関しては１０〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量、０．５ｍｌ／体重ｌ００ｇの体積で、静脈内又は腹腔内注射した。それぞれの処置群は、少なくとも６匹の動物から構成されていた。カニューレ（ＰＥ５０、Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ、ＵＳＡ）を、ハロタン麻酔（誘導用４％及び維持用１％））下で、大腿動脈に挿入した。薬剤投与用に、静脈にカニューレを挿入した。動脈用カニューレを、圧力トランスデューサー（Ｏｈｍｅｄａ  ＤＴ−ＸＸ  ＵＳＡ）に取り付けた。そのトランスデューサーは、データ取得システム（Ｂｉｏｐａｃ、ＵＳＡ）と結びつけた。心拍数（ＨＲ）、平均動脈圧（ＭＡＢＰ）、及び心電図（誘電心電図２）の記録を、処置前に２０分間に、安定した基底状態を確立するために、試験化合物の注射後６０分まで行った。動物も直腸サーミスタプローブ（ＹＳＩモデル４００、ＵＳＡ）によって、温度記録装置と結びつけ、直腸温度を研究の間中調べた。研究の最後に、１００ｍｇ／ｋｇのナトリウムペントバルビトンを腹腔内注射することによって、動物を安楽死させた。
【０２４３】
ベヒクルと処置剤の間の差異は、一元配置ＡＮＯＶＡによって、次に多重比較ニューマンカウル検定（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏからのＰｒｉｓｍソフトウェア）によって比較する。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。
【０２４４】
ベヒクル処置動物は、その血圧値の変化を示さなかった。ＭＡＢＰは約１００ｍｍＨｇの平均値で、安定した状態のままであった。化合物Ａは、用量関連の一時的な低血圧を誘導した。静脈内で試験した最も低い用量、０．１ｍｇ／ｋｇによって、注射後５分でわずか４ｍｍＨｇの低下が引き起こされ、その後の時点（１５、３０、４５及び６０分）で、処置した動物のＭＡＢＰは基底状態に戻った。０．５ｍｇ／ｋｇの化合物Ａという中程度の用量では、ＭＡＢＰの低下は５分で約２５ｍｍＨｇであり、累進的に増大し、注射後３０分で基底状態範囲に戻り、一方１ｍｇ／ｋｇの最高用量では、ＭＡＢＰの低下は５分で約３０ｍｍＨｇであり、累進的に増大し、注射後４５分で基底状態範囲に戻った。同様の結果が、１ｍｇ／ｋｇの化合物Ｒに関して得られた。腹腔内注射すると、化合物Ａは、３０ｍｇ／ｋｇまでは１５ｍｍＨｇを超えない中程度の低血圧を引き起こし、一方化合物Ｒは、４０ｍｇ／ｋｇにおいて最大で３６ｍｍＨｇの低下を引き起こした。試験した用量のいずれにおいても、低血圧による致死はなく、さらにこの現象は、高用量の化合物Ａ及びＲにおいて最大で４５分中、一時的なものであった。５０％を超えるＭＡＢＰの低下によって、あるいは長期の影響によって低血圧を表す場合、試験化合物の安全性は疑わしいものであったと思われる。
【０２４５】
心拍数は、非常に類似したパターンを示し、ベヒクル処置動物に関しては１分間当たり約３５０拍の安定した基底値を示し、一方０．１ｍｇ／ｋｇの化合物Ａは、ＨＲのわずかな重要ではない一時的な低下を引き起こし、高用量は、ＨＲの明らかなより長期の低下を引き起こした。ＨＲの最大の下降は、１分間当たり約８０拍であり、これは１５分を超えて続かず、注射から最大で４５分以内に正常な基底値に戻った。ここでも化合物を腹腔内注射すると、ＨＲに対する影響は、化合物Ａは２０ｍｇ／ｋｇまで、化合物Ｒは４０ｍｇ／ｋｇまでの用量で、ほぼゼロであった。２０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａによって、１時間の追跡調査で１分間当たりわずか約１７拍の、わずかな低下が引き起こされ（基底から５％）、一方４０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｒによって、１０％幅のわずかな変動が引き起こされ、１分間当たりわずか約４拍の平均的低下がもたらされた。比較用に、ベヒクル処置動物も、１分間当たり約１７拍のＨＲのわずかな低下を示し、基底状態と比較して５％の減少が表された。５０％を超える１分間当たりの拍数の低下によって、あるいは長期の影響によって心拍数に対する影響を表す場合、試験化合物の安全性は疑わしいものであったと思われる。
【０２４６】
この研究の過程で最大耐性用量に達することはなく、腹腔内投与経路では、この値は少なくとも４０ｍｇ／ｋｇより大きいと考えることができる。使用するモデル及び試験する徴候に応じて、本発明の化合物は、ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ）で治療上有意な活性を示した。したがって治療範囲は、少なくとも４倍高い今だ確認されていない毒性範囲よりも充分低い。例えばＥＡＥでは、化合物Ａを１ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射することにより、臨床スコアＡＵＣの有意な３５％の低下が引き起こされ、この場合治療係数は少なくとも４０であり、一方脚部水腫では、化合物Ｒを０．５ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射することにより、脚部の厚さの３１％の減少が引き起こされ、この場合治療係数は少なくとも８０である。これらのモデルでは、試験化合物の結果は、市販の薬剤に活性が匹敵したことに留意しなければならない。概してこれらの結果によって、本発明の二環式ＣＢ２リガンドは安全であり、広範囲の疾患及び障害を治療するための強力な代替品であることが支持される。
【０２４７】
（実施例１９）
化合物を繰り返し投与することの、耐性の進行に対する影響。
激しい痛みの状態を治療するためにモルフィンを使用するときに、医学界が出くわす重要な問題の１つは、時間と共に、患者は薬剤に対する耐性が進行するという事実である。鎮痛活性を維持するために、モルフィンの用量を最初は段階的に増大させることができるが、慢性的な使用は最終的に、薬剤が痛みをそれ以上軽減することができない飽和点に達するであろう。ＣＢ１受容体に選択的なカンナビノイドに対する耐性も、進行する可能性がある。前の実施例１７及び１８に記載した研究において、いくつかの二環式ＣＢ２リガンドの残留ＣＢ１との結合能によって、重度あるいは長期に副作用が引き起こされることはなく、全体的に充分耐性があったことは既に証明されている。本発明の化合物の安全性をさらに高めるために、耐性を誘導する化合物の能力を試験した。
【０２４８】
前に記載したテールフリックモデルにおいて、耐性を評価した。簡潔には、試験化合物を、それぞれ動物１０匹の群に第１０日まで、１日２回腹腔内投与した。有害な痛みの閾値を、第１、４、８及び１０日に最初の薬剤投与の３０分後に、実施例１３において前に記載したように測定した。これらの結果は、動物がその尾を動かすまでの平均潜時±ＳＥとして表す。さまざまな処置群中の、潜時又は無痛覚症を示す動物の％の間の差異は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって、次に多重比較チューキー検定（潜時に関して）又はフィッシャーの精度検定（動物の％に関して）によって分析した。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。
【０２４９】
これらの結果は図１０に示し、パネルＡはモルフィンと比較した潜時に対する化合物Ａの影響を示し、パネルＢは増大した無痛覚症を示す動物のパーセントに対する影響を示す。１０日間に１日２回、５ｍｇ／ｋｇのモルフィンを投与することによって、研究の過程で潜時及び無痛覚症が改善された動物の割合の段階的低下によって表されるように、処置した動物において予想された耐性の進行が引き起こされた。潜時は第１日では７．５秒、第１０日ではわずか５．８秒であり、一方増大した無痛覚症を示す動物のパーセントは第１日では８０％、第１０日では３０％であった。他方では、１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを１日２回注射することは、これらのパラメータに対して有意な影響が無く、化合物Ａを２０回投与することによって、治療上有効であることが前に示された用量で、耐性の進行を引き起こすことはなかったことを意味する。具体的には、１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａで処置した動物において観察された潜時は第１日では８．１秒、第１０日で依然として７秒もあり、一方増大した無痛覚症を示す動物のパーセントは第１日では８８％、第１０日では依然として８０％であった。さらに、直腸体温を第１０日に評価し、両方の処置群に関して正常な範囲内であることが分かったことに留意しなければならない。概してこれらの研究によって、本発明の化合物は痛みを和らげる際にモルフィンより有効であるばかりでなく、耐性を誘導しなかったので安全でもあることが証明された。
【０２５０】
（実施例２０）
Ｉ型糖尿病：ＮＯＤマウスモデル。
ヒトインシュリン依存性糖尿病に関する実験設定における、二環式ＣＢ２結合化合物の保護活性を、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルで試験する。
【０２５１】
ＮＯＤ／Ｉｔメスマウス（研究開始時に７０〜８０日齢、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）を、第１日に重量を量った。マウスの基底グルコースレベルを、尾の先端を切断することによって得た血液滴、及び適切なグルコスティックを備えるグルコメーター（Ｅｌｉｔｅ、Ｂａｙｅｒ）を使用して確定する。次いでマウスに、生理食塩水に希釈したシクロホスファミド（Ｓｉｇｍａ）を、３００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射する。動物の尿中のグルコースの様子を、尿マルチスティック（Ｂａｙｅｒ）を使用して２日毎に調べる。この試験によって動物が糖尿素に達することが示されるとき、したがって血中のグルコースのレベルは、一晩の飢餓状態の後に２日連続して再度評価する。動物の血中グルコースレベルが３００ｍｇ／ｄｌを超える場合、動物は糖尿病であるとして定義する。糖尿病診断の３日後、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビトンを腹腔内注射することによって、動物を殺処分する。動物の脾臓及び膵臓を、脾臓中のＴ細胞の部分集団のＦＡＣＳ分析、及び膵臓の組織−及び免疫病理的評価を含めた、さらなる研究用に除去する。
【０２５２】
組織病理的評価をそれぞれの動物の１０個のランゲルハンス島細胞に行い、その記録は、以下の方法（Ｓｅｍｐｅ  Ｐ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１１６３〜９、１９９１）に従うものである。障害の重度は、単球の湿潤のレベル：０−湿潤なし、１−胆管周囲の湿潤、２−島細胞周囲の湿潤、３−島細胞内の湿潤、４−β細胞の破壊を伴う島細胞内の湿潤に従って記録する。それぞれの動物の膵臓に関する平均値は、全体の値を調べた島細胞の数で割ることによって計算する。
【０２５３】
（実施例２１）
腎虚血。
二環式ＣＢ２結合化合物の腎臓保護活性を、ラットの急性腎虚血モデルにおいて試験する。
【０２５４】
オスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（平均重量２５０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）に、それぞれ腹腔内に８ｍｇ／ｋｇと３５ｍｇ／ｋｇで、キシラジンとペントバルビトンの組合せを用いて麻酔をかける。次いで４５分に、両方の腎臓の両側で虚血を誘導する。鎮静剤を飲ませた動物を、仰向けにする。腹部の皮膚を剃毛し、７０％エタノールで洗浄する。正中線の皮膚切開を行い（２〜３ｃｍ長）、白線を切開することによって腹部を開く。小腸を反対方向に軽く除去した後に、腎臓を診査する。このことを終え、小腸を湿った（温かい生理食塩水３７℃）滅菌スポンジで覆う。腎動脈を周囲の脂肪から鈍的切開によって単離し、動脈用マイクロクリップ（ＦＳＴ  Ｃａｎａｄａ）によって腎臓門の腎静脈と共に塞ぐ。動脈閉塞の直後に紫色になる腎臓は、虚血であるとみなす。両方の腎臓が虚血であることを示す動物のみを、この研究に含める。虚血発作中に、小腸を腹腔内に戻す。傷は湿ったスポンジで覆う（スポンジは、温かい生理食塩水で洗浄することにより湿った状態に保った）。さらに、直腸温度を監視して、３７℃と３８℃の間に保つ。直腸温度は、サーミスター（ＹＳＩ  ＵＳＡモデル４００）及び測定装置（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒモデル８４０２−００）を使用して測定する。
【０２５５】
虚血開始の４５分後、動脈用クリップを除去する。ピンク色の腎臓の復帰によって、再灌流を確認する。次いで傷を、３−０絹糸縫合物質（Ａｓｓｕｔ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて２層（腹壁及び皮膚）で閉じる。虚血発作の１、３及び７日後に、エーテルを用いて麻酔チャンバー中で動物にかるく麻酔をかけ、眼か下洞穿刺後に血液サンプルを回収する。血液はエッペンドルフチューブ中に回収し、遠心分離にかける（４０００ｒｐｍで５分間）。次いで血清を分離し、血液中のクレアチニンレベル及び血液中の尿素窒素（ＢＵＮ）を評価する前に−２０℃に保つ。この研究の最後に、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビトンナトリウムを腹腔内注射することによって、動物を安楽死させる。腎臓を除去し、重量を量り、考えられる他の使用のために４％ホルムアルデヒド溶液中に保つ。
【０２５６】
虚血発作の最後の直後に、群当たり１０匹の動物に５ｍｌ／ｋｇで大腿静脈中に、処置剤を静脈内投与する。これらの結果を、虚血（ベヒクル処置）及び擬似（同じ手順、腎動脈閉塞なし）と比較する。
【０２５７】
血液中のＢＵＮ及びクレアチニンのレベルを、ＡＮＯＶＡを使用して、次にダンカンの多重比較検定によって比較する。
【０２５８】
（実施例２２）
心臓保護を測定するためのランゲンドルフ灌流モデル。
内生カンナビノイドは、心筋虚血に対するＬＰＳの心臓保護効果と関連があることが近年示された（Ｌａｇｎｅｕｘ、Ｃ．＆  Ｌａｍｏｎｔａｇｎｅ、Ｄ．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３２：７９３〜６、２００１）。新規な二環式化合物の心臓保護効果を、単離灌流させたラットの心臓のランゲンドルフモデルにおいて試験する。重量２８０±２０ｇのオスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、「実験用動物のケア及び使用に関するＮＩＨガイド（ＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）」（ＮＩＨ公開番号８５−２３、１９９６年改定）に従い、灌流実験用に使用する。動物にナトリウムヘパリン（５００Ｕ）を腹腔内注射し、ペントバルビタール（３０ｍｇ／動物）を用いて麻酔をかける。心臓をすぐに除去し、ヘパリン投与した氷冷生理食塩水溶液中に置く。大動脈、ランゲンドルフの灌流器具にカニューレ挿入し、肺動脈を切断し開いて、流出液の自由な排出をもたらす。逆行性の動脈灌流を、改変クレブス−ヘンゼライト（ＫＨ）溶液を用いて保つ。９５％の酸素と５％の二酸化炭素の混合物によって、ＫＨに酸素供給する。動脈灌流は、３７℃、９０ｃｍ  Ｈ２Ｏの一定圧力に保つ。
【０２５９】
平熱における短期の虚血
２０分のＫＨ灌流、２５分の流れのない全体的虚血（３７℃）、及び４５分のＫＨ再灌流を、心臓に施す。これによって、作業指数（ＬＶＤＰｘＨＲ）の回復が４０％まで低下すること、薬剤による改善の可能性が示されてきている。異なる濃度の化合物を、予備虚血灌流、再灌流又はこの両方中に加える。
【０２６０】
血行動態の測定
ラテックス製のバルーン端型カテーテルを、左心房中の小断片を介して挿入し、僧帽弁を介して左心室に進ませる。このバルーンは、圧力トランスデューサーを介して、記録システム（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ７７５８Ｂ、ＵＳＡ）と結びつける。バルーンを膨張させ平衡状態にして、０ｍｍＨｇの最終的な拡張期圧を与える。左心室の収縮期圧及び拡張期圧、及び圧力の時間誘導を、収縮（＋ｄＰ／ｄｔ）及び弛緩（−ｄＰ／ｄｔ）中に測定する。左心室の活動圧力（ＬＶＤＰ）は、収縮期圧と拡張期圧の間の差異から計算する。心臓の作業指数（ＬＶＤＰｘＨＲ）は、ＬＶＤＰ及び心拍数（ＨＲ）の生成から計算する。冠状動脈血流量（ＣＦ）は、虚血期前及び再灌流中に肺動脈から排出される流出液を回収することによって測定する。不整脈が進行する、血栓が形成される、あるいは灌流の最初の２０分後のＬＶＤＰ及び心拍数が、それぞれ６０ｍｍＨｇ未満、２１０拍／１分間である場合、心臓はこの研究から除外する。
【０２６１】
これらの結果は、平均±ＳＥＭとして表す。心臓群の間の統計上の差異は、ＡＮＯＶＡ及びマンホイットニーの順位検定を使用して計算する。ｐ＜０．０５の値は、統計上有意であるとみなす。
【０２６２】
（実施例２３）
腫瘍細胞系及び腫瘍に対する化合物の影響。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ
いくつかの腫瘍由来の細胞系からの細胞を、我々の試験化合物の存在下における、それらの増殖能力に関して試験する。腫瘍細胞系はＡＴＣＣから得たものであり、供給者の奨励事項に従って増殖させる。細胞は２４ウエルプレートに接種し（１０５個の細胞／ｍｌ／ウエル）、一晩増殖させる。細胞は、試験化合物（１〜１００μＭ）又はベヒクル（０．１％  ＤＭＳＯ最終濃度）と共にインキュベートする。細胞の生存能力は、標準的なクリスタルバイオレット染色を使用して２４時間後に決定する。培養基をウエルから除去し、２％のホルムアルデヒドをＰＢＳに溶かしたものを１ｍｌ／ウエル、１０分間加えることによって、細胞を固定する。固定後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２５０μｌの０．５％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットをそれぞれのウエルに加え、プレートを穏かに攪拌しながら室温で、３０分間インキュベートする。次いで染色した細胞を、２回蒸留水で３回洗浄し、２５０μｌの１０％酢酸をそれぞれのウエルに加えることによって、着色液を抽出する。プレートを１５分間室温で攪拌し、１００μｌを読み取り用に９６ウエルプレートに同様に移す。細胞の光学濃度（ＯＤ）を、ＥＬＩＳＡ読み取り装置中で６２０ｍｍにおいて測定し、結果は生存能力のある細胞の％として表す。未処理細胞の吸光度は、１００％として記録する。ＩＣ５０（細胞の増殖を５０％阻害する用量）を決定する。
【０２６３】
さらに、細胞を活性化カスパーゼ３に関して染色して、細胞がアポトーシス機構によって死んだかどうかを決定する。ウエルからの培地を捨て、４％のホルムアルデヒドをＰＢＳに溶かしたもの１ｍｌを１０分間加えることによって、細胞を固定する。細胞をＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、２０分間氷冷メタノールで浸透処理する。細胞をＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、１ｍｌの阻害溶液（３％ＢＳＡ、ＰＢＳ−Ｔ）と共に３０分間インキュベートする。一次抗体（ウサギ抗−切断カスパーゼ３（ａｓｐ１７５）Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、阻害溶液で１：５０に希釈）を加え、細胞を６０分間３７℃でインキュベートする。細胞をＰＢＳ−Ｔで２回洗浄する。二次抗体（Ｈ−ＰＰ結合型抗−ウサギＩｇＧ、阻害溶液で１：２００に希釈）をウエルに加え、６０分間室温でインキュベートする。細胞をＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、フルオレセインチアミド試薬（ＮＥＮ、増幅用希釈液で１：５０に希釈）と共に１０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、蛍光又は共焦顕微鏡によって、そのシグナルを目に見える状態にする。活性化カスパーゼ３を調べること以外に、デキサナビノール及びその類似体で処理した細胞中での、アポトーシス関連遺伝子の発現を、未処理細胞中でのそれと比較する。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに関する手順は、前に記載したものと同様である。それぞれの遺伝子用に、一対の特異的なＰＣＲプライマーを設計し、反応はＡＢＩプロトコルに従って行う。それぞれの遺伝子の発現レベルを定量化したものを、ハウスキーピング遺伝子に正規化し、未処理細胞からのＲＮＡサンプルと比較する。
【０２６４】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ
その増殖がｉｎ  ｖｉｔｒｏで二環式ＣＢ２結合試験化合物によって阻害される、腫瘍細胞系をひとたび選択した後、我々はｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を試験する。細胞は供給者の奨励事項に従って増殖させる。所定量（１×１０６個の細胞、一定体積０．１２ｍｌ／動物）を、ヌードＣＤ−１オスマウス（平均重量２０〜２５ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）の右大腿関節の上に皮下注射する。それぞれの処置群は、少なくとも７匹の動物から構成される。それぞれの動物を、毎日臨床的に調べる。腫瘍の増殖も毎日の観察中に調べるが、実際の測定値は週に一度記録する。腫瘍が適切な大きさに達したとき、ベヒクル、５ｍｌ／ｋｇ／１日、あるいは我々の試験化合物、２．５〜１０ｍｌ／ｋｇ／１日の範囲で動物を処置する。
【０２６５】
（実施例２４）
炎症性腸疾患のモデルにおける化合物の影響。
二環式ＣＢ２結合化合物の抗炎症活性を、ラット中での酢酸誘導型ＩＢＤの、遮断された研究において試験する。
【０２６６】
オスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（１０週齢、２００〜２５０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）に、ケタミン：ロンパンの組合せ（それぞれ１００：１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射することによってかるく麻酔をかける。ポリエチレン製カテーテル（外径１．７ｍｍ）を、直腸を介して結腸中に５ｃｍ挿入する。次いでさらに２ｍｌの５％酢酸を、結腸中にゆっくりと投与する。１５秒後、結腸を３ｍｌの生理食塩水で洗浄し、１５秒後さらに３ｍｌの生理食塩水で洗浄する。直後にそれぞれの群の動物を、適切な処置剤のいずれか１つで処置する。処置剤はすべて、７日間の間１日１回投与する。動物は１週間臨床的に追跡する。この期間中に、以下のパラメータ：体重、便中の血液の存在、及び便の硬さを毎日調べ記録した。これらの発見を、表１に従って記録する。
【０２６７】
【表３】
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【０２６８】
疾患を誘導した７日後、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールを腹腔内注射することによって、動物を殺処分する。結腸全体を切除し、縦に裂き、拡大鏡の下で調べ、任意の目に見える障害を記録し、表２に従って記録する。
【０２６９】
【表４】
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【０２７０】
臨床結果は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次にダンカンの多重比較検定を使用して分析する。非パラメータ検定（ウイルコクソンの順位和検定）は、全体的な病的発見を評価するために使用する。
【０２７１】
配合実施例
再溶解用の凍結乾燥粉末。
前に記したように、本発明のいくつかの化合物は非常に親油性であり、５を超える計算上のｌｏｇＰを有し、これらはさらに水に溶けないものとなっている。これらの化合物は、その親油性を有するさまざまな組成物中に配合することができるが、親化合物の化学的改変に基づく手法を使用して、水溶性が改善されてきており、したがって前記化合物に適した配合物及び投与経路の範囲が広がっている。１つのこのような例は化合物Ｒであり、これは化合物Ａのヘミスクシネート誘導体である。このエステル化ステップによって、ｐＨ７における化合物の計算上のｌｏｇＤが大幅に改善される。化合物Ａは６．２１というｌｏｇＤを有し、一方そのヘミスクシネート誘導体化合物Ｒは、わずか３．７６というｌｏｇＤを有する（ＡＣＤソフトウェアを使用して計算したもの）。水溶性の点において、中性ｐＨの化合物Ａは７．６×１０５ｇ／ｌの濃度で水に溶けると予想され、一方化合物Ｒは０．０２４ｇ／ｌまで溶けると予想されることを意味する。改善された溶解度によって、再溶解用の凍結乾燥粉末の調製などの、他の配合への道が開かれた。
【０２７２】
３０ミリグラムの化合物Ｒを、０．３ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノールに溶かした。最終５ｍｇ／ｍｌの薬剤濃度を得るために、６ｍｌのリン酸緩衝液（ＮａＨ２ＰＯ４及びＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．８、８０ｍＭ）を加えた。次いで１５０ｍｇのラクトースを加えて、最終ラクトース濃度２５ｍｇ／ｍｌを得た。化合物の溶解と共に、溶液のｐＨは低下する傾向にあり、それを０．２ＮのＮａＯＨを使用してｐＨ７．８に再調整した。生成した溶液を一晩凍結乾燥させて、凍結乾燥粉末を得た。化合物Ｒの凍結乾燥粉末を、後に水を用いて再溶解させて、最終濃度約５ｍｇ／ｍｌの範囲のエステル誘導体の透明な溶液を得て、これは親薬剤化合物Ａの最初の７６ｎｇ／ｍｌと比較して、溶解度の予想外の劇的な増大である。リン酸緩衝液以外に、９ｍｇ／ｍｌの濃度のベンジルアルコール、スクロース５％、又はマンニトール５％、又はグリセロール２％、又はデキストラン５％を含む同じ配合物も調製し、あるいは５％まで、好ましくは１〜２．５％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）Ｋ−３０、又はＰＶＰ  Ｋ−１０を、凍結乾燥プロセス中に希釈剤及び凍結保護物質として、ラクトースの代わりに加えることができる。凍結乾燥させた化合物Ｒを洗浄用の滅菌水で再溶解させ、ＨＰＬＣによって調べたように、少なくとも２時間まで安定性があることが示された。この時間の間中に、１４％までの化合物Ｒを、親化合物Ａに加水分解した。前に報告したように、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（登録商標）：エタノールに配合すると、化合物Ｒは生物学的に活性がある。予備研究によって、再溶解させた凍結乾燥化合物Ｒも、化合物の治療上の目標を達成することが示されている。例えば、共溶媒中に配合した化合物Ｒは、約１ｍＭ／ｋｇにおいて３１％という脚部水腫の最大の低下をもたらし、一方再溶解させた凍結乾燥化合物Ｒは、同じモデルで、約０．５μＭ／ｋｇにおいて脚部水腫の２９．５％の低下をもたらした。この研究によって、本発明の化合物の、薬剤として許容可能な塩又はエステル誘導体を調製することができ、したがってさまざまな型の配合物を調製すること、及びこのような化合物をさまざまな経路により投与して、前に記載したモデルで誘導される疾患を治療することができることが示される。
【０２７３】
本発明を、それが表すさまざまな具体的な実施形態に関して、例示のみのために記載してきたが、このような具体的に開示された実施形態を、制限的なものとみなすべきではない。多くの他のこのような実施形態は、本明細書の出願者の開示に基づいて、当業者には思い浮かび、出願者の目的は、添付の特許請求の範囲に定義する本発明の精神及び範囲によってのみ縛られる。
【図面の簡単な説明】
【０２７４】
【図１】選択した二環式化合物と、ＣＢ１及びＣＢ２ヒトカンナビノイド受容体の結合を示す。
【図２】選択した二環式化合物の、活性化マクロファージからの分泌に対する影響を示す。パネルＡは、１つの用量でのＩＬ−１β分泌に対する影響を示す。パネルＢは、さまざまな用量でのＰＧＥ２分泌に対する影響を示す。
【図３】さまざまな用量における本発明の化合物の、活性化Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌に対する影響を示す。
【図４】多発性硬化症のＥＡＥモデルにおける、さまざまな用量における本発明の化合物の影響を示す。
【図５】アレルギー又は他の免疫反応のＤＴＨモデルにおける、さまざまな用量での、知られているＣＢ２アゴニストＨＵ−３０８及び本発明の化合物の、影響を示す。
【図６】パーキンソン病のＭＰＴＰモデルにおける、知られているＣＢ２アゴニストＨＵ−３０８の影響を示す。
【図７】慢性の神経障害痛の収縮性神経障害モデルにおける、２つの用量の本発明の化合物の影響を示す。
【図８】急性の末梢痛のテールフリックモデルにおける、さまざまな用量の本発明の化合物の影響を示す。パネルＡは、処置後３０分で得られた結果を示し、パネルＢは、処置後９０分で得られた結果を示す。
【図９】急性の末梢痛のテールフリックモデルにおける５．５時間中の、ベヒクル及びモルフィンと比較した、１回用量の本発明の化合物の影響を示す。パネルＡは、潜時として結果を示し、パネルＢは、ベヒクルで処置した動物より２倍長い潜時を示す処置群中の動物のパーセントとして結果を示す。
【図１０】テールフリックモデルで測定した耐性の進行において、モルフィンと比較した、本発明の化合物の影響を示す。パネルＡは、潜時の結果を示し、パネルＢは、無痛覚症を示す動物のパーセントの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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