(57)【要約】  ＣＲＦＲ２に結合するよりもはるかに高い親和性でＣＲＦＲ１に結合するＣＲＦペプチド類似体。このような類似体は、ＣＲＦ作動活性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＦＲ２に結合するより実質的に強い親和性でＣＲＦＲ１に結合する３８残基のＣＲＦＲ１リガンドペプチドであって、次式：
Ｙ1−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｒ6−Ｓｅｒ−Ｒ8−Ａｓｐ−Ｒ10−Ｒ11−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｒ13−Ｒ14−Ｒ15−Ａｒｇ−Ｒ17−Ｒ18−Ｒ19−Ｒ20−Ｒ21−Ｒ22−Ｒ23−Ｒ24−Ｒ25−Ｒ26−Ｒ27−Ｒ28−Ｒ29−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｒ32−Ｒ33−Ｒ34−Ａｒｇ−Ｒ36−Ｒ37−Ｒ38−Ｒ39−Ｒ40−Ｒ41−ＮＨ2［式中、Ｙ1は、１５個以下の炭素原子を有するアシル基、または放射ヨウ素標識されたチロシンであり；Ｒ6は、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＮｌｅであり；Ｒ8は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり；Ｒ10は、ＬｅｕまたはＣＭＬであり；Ｒ11は、ＴｈｒまたはＳｅｒであり；Ｒ13は、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、またはＧｌｕであり；Ｒ14は、ＣＭＬまたはＬｅｕであり；Ｒ15はＣＭＬまたはＬｅｕであり；Ｒ17は、Ｇｌｕ、ＣＭＬ、Ａｓｎ、またはＬｙｓであり；Ｒ18は、Ｖａｌ、ＣＭＬ、Ｎｌｅ、またはＭｅｔであり；Ｒ19は、ＣＭＬ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅであり；Ｒ20は、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、またはＨｉｓであり；Ｒ21は、Ｎｌｅ、Ｌｅｕ、ＣＭＬ、またはＭｅｔであり；Ｒ22は、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、またはＧｌｕであり；Ｒ23は、ＡｒｇまたはＬｙｓであり；Ｒ24は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、ＣＭＬ、またはＡｉｂであり；Ｒ25は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；Ｒ26は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、またはＬｙｓであり；Ｒ27は、ＣＭＬ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり；Ｒ28は、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＡｉｂであり；Ｒ29は、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、またはＧｌｕであり；Ｒ32は、Ａｉｂ、またはＣｙｓ以外の天然αアミノ酸のＬもしくはＤ異性体であり；Ｒ33は、Ａｉｂ、またはＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＣＭＬ、もしくはＩｌｅのＬもしくはＤ異性体であり；Ｒ34はＬｙｓまたはＯｒｎであり；Ｒ36は、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ａｒｇ、Ｈａｒ、ＣＭＬ、またはＬｅｕであり；Ｒ37は、ＣＭＬ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、またはＴｙｒであり；Ｒ38は、Ｎｌｅ、Ｍｅｔ、ＣＭＬ、またはＬｅｕであり；Ｒ39は、Ｇｌｕ、Ａｉｂ、またはＡｓｐであり；Ｒ40は、Ｉｌｅ、Ａｉｂ、ＣＭＬ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｐｈｅ、Ｎｖａ、Ｇｌｙ、またはＧｌｎであり；Ｒ41は、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｉｌｅ、ＣＭＬ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｐｈｅ、Ｎｖａ、またはＧｌｎであり；ただし、環化結合が３１位のＧｌｕとＲ34の間に存在していてよく、さらにＤ−Ｐｈｅの代わりにＤ−２ＮａｌまたはＤ−Ｌｅｕとしてもよい］を有することを特徴とするペプチドまたはその非毒性の塩。
【請求項２】
次式：
（シクロ３１−３４）Ｙ1−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｒ6−Ｓｅｒ−Ｒ8−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｒ11−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｒ14−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｒ18−Ｌｅｕ−Ｒ20−Ｎｌｅ−Ｒ22−Ｒ23−Ａｌａ−Ｒ25−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｒ29−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｒ32−Ｒ33−Ｒ34−Ａｒｇ−Ｒ36−Ｒ37−Ｎｌｅ−Ｒ39−Ｒ40−Ｒ41−ＮＨ2［式中、Ｙ1は、７個以下の炭素原子を有するアシル基であり；Ｒ20はＧｌｕまたはＤ−Ｇｌｕであり；Ｒ22はＡｌａまたはＴｈｒであり；Ｒ29はＧｌｎまたはＧｌｕであり；Ｒ32は、Ｈｉｓ、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕであり；Ｒ36は、ＬｙｓまたはＬｅｕであり；Ｒ37はＬｅｕまたはＣＭＬであり；Ｒ39はＧｌｕまたはＡｓｐであり；Ｒ40は、Ｉｌｅ、ＣＭＬ、またはＧｌｕであり；Ｒ41は、Ｉｌｅ、Ａｉｂ、またはＡｌａであり；残りの可変基は、請求項２で規定したとおりである］を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
次式：
（シクロ３１−３４）Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2、または
（シクロ３１−３４）Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−ＣＭＬ−ＮＨ2；または
（シクロ３１−３４）Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Iｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−ＣＭＬ−ＮＨ2
を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
次式：
（シクロ３１−３４）Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2、または
（シクロ３１−３４）Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Iｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−ＣＭＬ−ＮＨ2；または
（シクロ３１−３４）Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−ＣＭＬ−ＮＨ2を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
次式：
Ｙ1−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｒ6−Ｓｅｒ−Ｒ8−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｒ11−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｒ14−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｒ18−Ｌｅｕ−Ｒ20−Ｎｌｅ−Ｒ22−Ｒ23−Ａｌａ−Ｒ25−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｒ29−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｒ32−Ｒ33−Ｒ34−Ａｒｇ−Ｒ36−Ｒ37−Ｎｌｅ−Ｒ39−Ｒ40−Ｒ41−ＮＨ2［式中、Ｙ1は、７個以下の炭素原子を有するアシル基であり；Ｒ20はＧｌｕまたはＤ−Ｇｌｕであり；Ｒ22はＡｌａまたはＴｈｒであり；Ｒ23はＡｒｇまたはＬｙｓであり；Ｒ29はＧｌｎまたはＧｌｕであり；Ｒ32は、Ｈｉｓ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ａｉｂ、またはＡｌａであり；Ｒ36はＬｙｓまたはＬｅｕであり；Ｒ37はＬｅｕまたはＣＭＬであり；Ｒ39はＧｌｕまたはＡｓｐであり；Ｒ40は、Iｌｅ、ＣＭＬ、またはＧｌｕであり；Ｒ41は、Ｉｌｅ、Ａｉｂ、またはＡｌａであり；残りの可変基は、請求項２で規定したとおりであり、Ｇｌｕ31およびＲ34の側鎖は共有結合していてもよい］を有することを特徴とする請求項１に記載のＣＲＦ。
【請求項６】
Ｒ18がＶａｌであり、Ｒ22がＡｌａであり、Ｒ23がＡｒｇであり、Ｒ24がＡｌａであり、Ｒ25がＧｌｕであり、Ｒ28がＡｌａであり、Ｒ39がＧｌｕであり、Ｒ41がＩｌｅであることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
次式：
（シクロ３１−３４）Ｙ1−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ｒ22−Ｒ23−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｒ27−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｒ32−Ｒ33−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｒ40−Ｉｌｅ−ＮＨ2［式中、Ｒ22はＡｌａまたはＴｈｒであり；Ｒ27はＬｅｕまたはＣＭＬであり；Ｒ32はＨｉｓまたはＡｉｂであり；Ｒ33はＳｅｒまたはＡｉｂであり；Ｒ40はＩｌｅまたはＣＭＬである］を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチドまたはその非毒性の塩。
【請求項８】
次式：
（シクロ３１−３４）Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2、または
（シクロ３１−３４）Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−ＣＭＬ−ＮＨ2；または
（シクロ３１−３４）Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−ＣＭＬ−ＮＨ2
を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｙが放射ヨウ素標識されたＤ−ＴｙｒまたはＬ−Ｔｙｒであることを特徴とする、ＣＲＦＲ１に選択的に結合するトレーサーとして有用な請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
ＣＲＦＲ２に結合するより実質的に強い親和性でＣＲＦＲ１に結合する３８残基のＣＲＦＲ１リガンドペプチドであって、次式：
式Ｙ1−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ−Ｄ−Ｘａａ−Ｂ−Ｇｌｕ−Ｘａａa−Ｘａａb−Ｘａａc−Ｃ−ＮＨ2［式中、Ｙ1は、１５個以下の炭素原子を有するアシル基、または放射ヨウ素標識されたチロシンであり；Ａは、ｒ／ｈＣＲＦまたは他のＣＲＦファミリーペプチドの対応する配列の、５位のＰｒｏと１２位のＰｈｅの間に見られる６アミノ酸残基の配列であり；Ｄ−Ｘａａは、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−２Ｎａｌ、またはＤ−Ｌｅｕであり；Ｂは、ｒ／ｈＣＲＦまたは他のＣＲＦファミリーペプチドの対応する配列の、１２位のＰｈｅと３１位のＡｌａの間に見られる１８アミノ酸残基の配列であり；Ｘａａaは、Ｃｙｓ以外の任意のＬもしくはＤ型天然α−アミノ酸、またはＡｉｂであり；Ｘａａbは、Ａｉｂ、またはＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＣＭＬ、もしくはＩｌｅのＬもしくはＤ−異性体であり；Ｘａａcは、ＬｙｓまたはＯｒｎのいずれかであり、その側鎖がＧｌｕの側鎖にアミド環化結合で結合していてよく；Ｃは、任意のＣＲＦファミリーペプチドのＣ末端部分の最後の７アミノ酸残基の配列であり；ただし、Ａ、Ｂ、および／またはＣにおいて、Ｍｅｔの代わりにＮｌｅまたはＬｅｕとしてもよい］を有することを特徴とするペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ペプチド、およびそのペプチドを使用する哺乳動物の薬剤治療に関する。より詳細には、本発明は、１ファミリーのＣＲＦレセプターに選択的な、ヘンテトラコンタペプチドＣＲＦのペプチド類似体、そのようなＣＲＦ類似体を含有する薬剤組成物、そのようなＣＲＦ類似体を使用する哺乳動物の治療方法、およびそのようなペプチドを使用して新薬のスクリーニングを行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所より与えられた許可番号Ｐ０１−ＤＫ−２６７４１のもと、政府の援助を受けて創出されたものである。米国政府は、本発明の中で一定の権利を有する。
【０００３】
ヒツジＣＲＦ（ｏＣＲＦ）は、４１残基のアミド化されたペプチドとして１９８１年に特徴付けられた。ｏＣＲＦは、末梢への注射時に哺乳動物の血圧を低下させ、またＡＣＴＨおよびβエンドルフィンの分泌を刺激する。ラットＣＲＦ（ｒＣＲＦ）は、それより後に単離、精製、特徴付けが行われ、特許文献１に記載されているように、同族のアミド化されたヘンテトラコンタペプチドであることがわかった。ヒトＣＲＦ（ｈＣＲＦ）のアミノ酸配列は、ｒＣＲＦと同じものであると決定された。ｈＣＲＦおよびｏＣＲＦは、静脈内（ｉｖ）投与時に、哺乳動物において腸間膜動脈の血管拡張を引き起こして血圧を低下させる他、ＡＣＴＨおよびβエンドルフィンの分泌を刺激することも報告されている。しかし、脳室内（ｉｃｖ）投与時には、交感神経系の活性化に付随して、心拍数および平均動脈血圧が上昇する。
【０００４】
もともとは、この視床下部−下垂体−副腎（ＨＰＡ）系での役割に基づいて単離および特徴付けがなされたものの、ＣＲＦは、中枢神経系のいたるところに加え、副腎、胎盤、および精巣など、神経以外の組織中にも広く分布し、パラクリン調節因子または神経伝達因子としても働き得ることがわかっている。さらに、不安、うつ病、アルコール依存症、および神経性食欲不振症などの情動障害に、また生殖および免疫応答の調節にＣＲＦが関与していそうなことは、ＣＲＦの発現の変化が、重要な生理的および病態生理学的結果を伴い得ることを示唆している。たとえば、ＨＰＡ系を含む調節ループの乱れは、しばしば循環グルココルチコイド濃度を慢性的に上昇させるが、そのような患者は、躯幹肥満、筋肉の消耗、および受胎能の低下を含むクッシング症候群の身体的特徴を示す。
【０００５】
視床下部−下垂体−副腎の活性化の媒介となる役割に加え、ＣＲＦは、ストレス応答の際に生じるものもある自律神経性および行動神経性の変化を調節することも示されている。このような行動神経性の変化の多くは、デキサメタゾン投与によって２倍にならず、下垂体切除に感受性でないので、ＨＰＡの活性化とは無関係に生じることが示されている。さらに、ＣＲＦをＣＮＳに直接に注入すると、種々のストレッサーに対する自律神経性および行動神経性の応答が模倣される。ＣＲＦの末梢投与は、これらの変化に確かに影響を及ぼさないので、ＣＲＦは、食欲の抑制、覚醒の増強、および学習能力を含む機能に関して脳に直接に作用するようである。
【０００６】
ＣＲＦの解剖学的分布が広範囲であり、生体作用が複合的である結果として、この調節性ペプチドは、多数の生体プロセスの調節に関与していると考えられる。ＣＲＦは、炎症性の応答の調節にも関与している。ある動物モデルでは、ＣＲＦが炎症誘発性の役割を担うことが認められているが、損傷によって誘発される血管透過性の増大を低減することにより、他では炎症を抑えるようである。
【０００７】
最近の臨床データによって、コルチコトロピン放出因子（「ＣＲＴ」）は、神経精神医学的な障害や、アルツハイマー病などの神経変性疾患と関連付けられている。アルツハイマー病は、進行性の記憶喪失および痴呆をもたらす神経変性脳疾患である。最近の推定によると、米国では２百万人以上がこの疾患に罹患している。特に、いくつかの系統の証拠は、ＣＲＦをアルツハイマー病（ＡＤ）と関連付けている（非特許文献１）。まず第１に、ＡＤに罹患している大脳皮質領域では、ＣＲＦが劇的に（５０％より多く）減少し（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）、相反してＣＲＦレセプターが増大するが（非特許文献３、非特許文献５）、罹患していない大脳皮質領域では、ＣＲＦにもＣＲＦレセプターにも量的な変化がない（非特許文献３）。次に、化学親和性架橋の研究によって、ＡＤ大脳皮質中の増加したＣＲＦレセプター集団は、正常な生化学的性質を有することが示されている（非特許文献７）。さらに、脳脊髄液中のＣＲＦ濃度が低下しているという観察報告（非特許文献８、非特許文献９）は、世界的な神経心理学的障害の評点とかなりの相関があり、認知障害が重いほど、脳脊髄液中のＣＲＦ濃度は低いことが示唆される（非特許文献１０）。
【０００８】
痴呆の治療に利用できる療法は、ごく限られている。最近認可された薬物Ｔａｃｒｉｎｅ（登録商標）は、アルツハイマー病患者の記憶をかろうじて改善するにすぎず、肝臓の酵素を上昇させる望ましくない副作用を伴う。脳ＣＲＦ含有量の変化は、ある臨床的および病理学的特徴がＡＤと共通している神経疾患のパーキンソン病および進行性核上麻痺でも見出されている。パーキンソン病の場合では、ＣＲＦ含有量が減少し、ＡＤの場合と同様の染色パターンを示す（非特許文献４、非特許文献５）。進行性核上麻痺では、前頭葉、側頭葉、および後頭葉中のＣＲＦが、対照の値のほぼ５０％に減少する（非特許文献４、非特許文献５）。
【０００９】
ある種の抑うつ障害も、ＣＲＦレベルの低下と関連している。季節性うつ病の抑うつ状態にある患者および慢性疲労症候群の疲労期にある患者では、脳脊髄液中のＣＲＦレベルがより低いことが示されている（非特許文献１１）。改善速度の速いうつ病もあるが、多くは最終的に自然に制限されることになり、患者の回復速度には大きな違いがある。治療の主目的は、この種のうつ病の症状の重症度を軽減し、回復速度を速めること、ならびに再発および反復を予防することである。抗うつ薬が通常は投与されるが、重い副作用が結果として生じ得る（たとえば、フルオキセチンの自殺傾向、ブプロピオンの痙攣）。（非特許文献１２を参照のこと。）
【００１０】
低ＣＲＦレベルを徴候とするストレス系の機能低下は、他の障害でも同様に役割を担うことがある。たとえば、ある形の肥満は、視床下部−下垂体−副腎系の機能低下を特徴とし（非特許文献１３、非特許文献１４）、ある心的外傷後ストレス症候群の患者は、コルチゾール排泄が低く（非特許文献１５）、禁煙中の患者は、アドレナリンおよびノルアドレナリンの排泄、ならびに血中コルチゾール量が減少している（非特許文献１６、非特許文献１７）。ＣＲＦは、視床下部−下垂体−副腎系の主要な調節因子であるので、これらの徴候はすべて、このような障害でＣＲＦが中心的役割を担っていることを指している。これらの障害の治療は効力が弱い。たとえば、肥満治療への最も有効な手法は、行動変更プログラムである。しかし、ほとんどの参加者は、目標体重に到達せず、再発率が高い（非特許文献１８を参照のこと）。
【００１１】
このような障害および疾患の治療の欠陥を考慮して、より有効な治療が求められている。本発明は、ＣＲＦレベルの低下と、神経生理に基づく様々な障害および疾患との相関関係を利用して、遊離のＣＲＦレベルを上昇させることによりそのような疾患を有効に治療し、さらに、他の関連する利益を提供するものである。その作用は、ＣＲＦＲ２を媒介とするので、他のＣＲＦレセプターが活性化されて生じるかもしれない副作用のために非選択的類似体よりもＣＲＦＲ２選択的類似体が好ましい。
【００１２】
特許文献２に示されているものなど、αアミノ酸のＤ−異性体を含有するＣＲＦ作動薬が開発された。他のＣＲＦ作動薬は、特許文献３で開示されている。特許文献４および特許文献５で開示されているように、生物作用能（ｂｉｏｐｏｔｅｎｃｙ）を示す環状ＣＲＦ作動薬がその後に開発された。
【００１３】
ＣＲＦ−Ｒは、ＣＲＦに対する細胞のＧタンパク質結合応答に関与するレセプタータンパク質サブタイプのファミリーを指して用いる。ＣＲＦ−Ｒは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質によって、様々な細胞内酵素、イオンチャネル、および輸送体に結合する。Ｇタンパク質は、原形質膜の細胞内側の面でレセプタータンパク質と会合する。ＣＲＦ−Ｒに結合する作動薬は、αサブユニット上でＧＴＰがＧＤＰと交換されるのを触媒し（Ｇタンパク質の「活性化」）、解離し、１種（または複数）の種々のシグナル伝達酵素およびチャネルを刺激する。Ｇタンパク質は、特定のエフェクターを優先的に刺激し、したがって、Ｇタンパク質／レセプター相互作用の特異性によってシグナル伝達の特異性が決定される。ＣＲＦ−Ｒタンパク質は、アデニル酸シクラーゼの調節、またおそらくはＰＩ代謝回転を通してシグナル伝達を媒介する。たとえば、ＣＲＦがＣＲＦ−Ｒに結合し、それを活性化するときには、アデニル酸シクラーゼが、細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇を引き起こす。試験化合物が細胞内ｃＡＭＰを上昇させられるかを評価する有効なバイオアッセイは、ＣＲＦレセプタータンパク質のシグナル伝達活性を調節できるかを判定する対象となる潜在的な作動薬または拮抗薬の存在下で、ＣＲＦレセプタータンパク質を発現させるｃＤＮＡを含む細胞を培養して実施する。そのような形質転換細胞では、潜在的な作動薬または拮抗薬の有効性の判定となる細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇または低下をモニタする。細胞内ｃＡＭＰレベルまたはシクラーゼ活性を測定する方法は、当技術分野でよく知られている。
【００１４】
ＣＲＦの生理活性は、少なくとも２種の親和性の高いレセプター、すなわち７回膜貫通型ファミリーのレセプターであるＣＲＦＲ１およびＣＲＦＲ２の活性化を通して媒介される［非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２、および非特許文献２３］。トランスジェニックノックアウト動物［非特許文献２４、非特許文献２５、および非特許文献２６］、アンチセンスオリゴヌクレオチド研究［非特許文献２７、非特許文献２８、および非特許文献２９］、およびＣＲＦＲ１拮抗薬［非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２、および非特許文献３３］からの証拠は、ＣＲＦＲ１が、ＣＲＦの抗不安効果の媒介に関与しているという証拠を提供する。
【００１５】
ＣＲＦ２は、より最近になって同定されたものであり［非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６、および非特許文献３７］、少なくとも３種のスプライス変異体として存在する。ＣＲＦＲ１およびＣＲＦＲ２サブタイプは、そのアミノ酸配列が７０％相同的であるが、薬理学的にも［非特許文献３８および非特許文献３９］解剖学的にも［非特許文献４０および非特許文献４１］異なっていると思われる。
【００１６】
ＣＲＦＲ１は、脳や感覚および運動の中継部位にくまなく分布しているが、ＣＲＦＲ２は、末梢部位、たとえば血管、心臓、消化管、肺、および皮膚など、ＣＲＦＲ１の発現がほとんどまたはまったくない体内領域中に発現される。さらに、ＣＲＦＲ１の発現は、新皮質、小脳、および感覚中継構造中で非常に高いが、ＣＲＦＲ２の発現は、一般に皮質下構造に限られる。下垂体内では、ＣＲＦＲ２  ｍＲＮＡは、散在している細胞中に低レベルで検出可能であり、ＣＲＦ１レセプターのｍＲＮＡは、前葉および中葉中で容易に検出可能である。
【００１７】
ＣＲＦＲ１およびＣＲＦＲ２  ｍＲＮＡの分布がこのように不均一であることは、ＣＲＦ関連系での各々のレセプターの機能的役割が特異的であることを示唆している。ＣＲＦＲ１は、主たる神経内分泌下垂体ＣＲＦレセプターであり、ＣＲＦの皮質および小脳での役割、および感覚性の役割において重要であるとみなすことができる。
【００１８】
ＣＲＦＲ１およびＣＲＦＲ２はともに、霊長類の下垂体、および新皮質（特に、前頭葉前部、帯状回（ｃｉｎｇｕｌａｔｅ）、有線野（ｓｔｒｉａｔｅ）、および島皮質）、扁桃体、海馬体のいたるところに見られた。霊長類では、ＣＲＦＲ１とＣＲＦＲ２の両方が、認知、行動、および下垂体−副腎機能に対するＣＲＦの作用の媒介に関与するといえる。青斑、小脳皮質、孤束核、視床、および線条内に（ＣＲＦＲ２でなく）ＣＲＦＲ１が存在し、脈絡叢、ある種の視床下部核、舌下神経前位核（ｎｕｃｌｅｕｓ  ｐｒｅｐｏｓｉｔｕｓ）、および分界条核中に（ＣＲＦＲ１でなく）ＣＲＦＲ２が存在することも、霊長類の各々のレセプターサブタイプが中枢神経系内で別個の機能的役割を担うことを示唆している。たとえば、非特許文献４２を参照されたい。
【００１９】
ＣＲＦは、ストレスに対する内分泌性、自律神経性、行動神経性、および免疫性の応答が調節される際に主要な役割を果たすものと示唆されてきた。多数のＣＲＦレセプターが最近になってクローニングされたことに加え、ＣＲＦレセプターの非ペプチドレセプター拮抗薬が発見されたことで、ＣＲＦ研究の新時代が幕を開けた。現在、ＣＲＦの異なるターゲットが５種類存在し、特有のｃＤＮＡ配列、薬理、および局在性を備えている。これらは、３種の異なる遺伝子によってコードされる３つの異なるクラスに分類され、（Ｇタンパク質結合レセプタースーパーファミリーに属する）ＣＲＦＲ１およびＣＲＦＲ２、ならびにＣＲＦ結合タンパク質と呼ばれている。
【００２０】
哺乳動物細胞系でこれらのレセプターを発現させたことで、親和性の高い非ペプチド選択的レセプター拮抗薬の同定が可能になった。自然の哺乳動物リガンドであるｏＣＲＦおよびｒ／ｈＣＲＦは、ＣＲＦＲ１サブタイプに対する親和性は高いものの、ＣＲＦＲ２ファミリーに対する親和性がそれよりも低く、ＣＲＦ２に対する標識を無効にする。［125Ｉ］ソーバジンは、ＣＲＦＲ１とＣＲＦＲ２サブタイプの両方に対する親和性の高いリガンドとして特徴付けられており、放射性リガンド結合とレセプターオートラジオグラフィーの両方の研究において、選択的小分子レセプター拮抗薬発見の助けとなるツールとして使用されている。ＣＲＦＲ１サブタイプを特異的かつ選択的にブロックすることのできるいくつかの非ペプチドＣＲＦＲ１拮抗物質は、最近になって同定された。ＣＰ１５４，５２６、ＮＢＩ２７９１４、およびアンタラルミン（Ａｎｔａｌａｒｍｉｎ）などの化合物は、ＣＲＦがｃＡＭＰを刺激し、またはＣＲＦが培養ラット下垂体前葉細胞からのＡＣＴＨ放出を刺激するのを抑制する。さらに、末梢に投与したときに、これらの化合物は、ｅｘ  ｖｉｖｏの脳切片中で［125Ｉ］ソーバジンのＣＲＦＲ１への結合に競合し、血液脳関門を超えられることを示している。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、ラットにおいて、これら化合物を末梢に投与すると、ストレスによって誘発される血漿ＡＣＴＨ濃度の上昇が低減され、末梢でＣＲＦＲ１をブロックできることが実証されている。さらに、ＣＲＦＲ１拮抗薬の末梢投与では、ＣＲＦによって誘発される発作活性が抑制されることも実証されている。これらのデータは、非ペプチドＣＲＦＲ１拮抗薬が、全身投与時に中枢のＣＲＦＲ１を特異的にブロックし得ることを明らかに示しており、ＣＲＦＲ１が様々な神経精神医学的疾患および神経変性疾患で担う役割を決定するのに使用できるツールとなることになる。その上、これらの分子は、経口投与で活性をもつこうした疾患向けの潜在的治療薬の発見および開発に有用であることがわかるであろう。非特許文献４３。
【００２１】
【特許文献１】米国特許第４，４８９，１６３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，１０９，１１１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，２７８，１４６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８２４，７７１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，８４４，０７４号明細書
【特許文献６】米国特許第４，２４４，９４６号明細書
【特許文献７】米国特許第５，０６４，９３９号明細書
【特許文献８】米国特許第５，０４３，３２２号明細書
【特許文献９】米国特許第４，１１５，５５４号明細書（１９７８年９月１９日）
【特許文献１０】米国特許第４，１３３，８０５号明細書（１９７９年１月９日）
【特許文献１１】米国特許第４，１４０，７６７号明細書（１９７９年２月２０日）
【特許文献１２】米国特許第４，１６１，５２１号明細書（１９７９年７月１７日）
【特許文献１３】米国特許第４，１９１，７５４号明細書（１９８０年３月４日）
【特許文献１４】米国特許第４，２３８，４８１号明細書（１９８０年１２月９日）
【特許文献１５】米国特許第４，２４４，９４７号明細書（１９８１年１月１３日）
【特許文献１６】米国特許第４，２６１，８８５号明細書（１９８１年４月１４日）
【特許文献１７】国際公開第９６／１８６４９号パンフレット
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
ＣＲＦＲ１は、ＣＲＦＲ２と異なる機能を制御するので、他のファミリーにそれほどは影響を与えずに一方のファミリーのレセプターを調節できることは価値があるはずである。ｏＣＲＦおよびｒＣＲＦは、ＣＲＦＲ１とＣＲＦＲ２の両方のファミリーを実質的に同じように結合する。非特許文献４４は、［Ｄ−Ｐｈｅ11、Ｈｉｓ12］ソーバジン（１１−４０）が、ＣＲＦＲ２に選択的に作用し、当時最高のＣＲＦＲ１拮抗薬の約３０％と同等であり、かつこれまでで最高のこの報告される化合物に匹敵するＣＲＦＲ２拮抗作用に近い競合的拮抗作用を示す拮抗薬であることを報告した。その後、ＣＲＦＲ１選択的作動薬として生理活性をもつＣＲＦ類似体、ならびにまた有効な競合的拮抗薬として働いて、ＣＲＦＲ２にはそれほど影響を及ぼさずにＣＲＦＲ１の活性化を調節する類似体を求めて、探索が続けられている。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
今回、ＣＲＦＲ１のリガンドである１クラスのＣＲＦペプチドが発見されたが、それらは、ｈＣＲＦ／ｏＣＲＦの類似体であり、好ましくは、未変性のＣＲＦ分子の３１および３４残基に対応する残基間に環化結合を有し、その環化結合が、そのような位置にあるアミノ酸残基の側鎖間のアミド結合であることが好ましい。このような分子のＣ末端は、未変性のアミドであるが、しかし、Ｎ末端は、最初の３残基を除去し、Ｎ末端の４位にある残基をアシル化することにより、短縮されていることが好ましい。類似の線状ペプチドも、ＣＲＦＲ１に対する選択性および高い結合強度を示すが、しかし、生物作用能があるとは考えられない。当技術分野でよく知られている技術を使用して、コア構造の環状部分を露出したままにすることにより、選択的作動薬を、ＣＲＦＲ１を選択的にブロックするＣＲＦ拮抗薬に変換することができる。
【００２４】
本発明による薬剤組成物には、薬剤として許容される液体もしくは固体担体中に分散させたこのようなＣＲＦＲ１リガンドまたはその非毒性の付加塩が含まれる。これらの物質は、生理的ｐＨでの溶解性が高いので、そのような製剤が容易である。本発明によれば、哺乳動物、特にヒトにこのようなペプチドまたは薬剤として許容されるその付加塩を投与して、ＡＣＴＨ、βエンドルフィン、βリポタンパク質、コルチコステロン、および他のプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）遺伝子産物の分泌を調節し、かつ／または気分、行動機能、消化管機能、および自律神経系の活動に影響を及ぼすことができる。たとえば、このようなＣＲＦ類似体を投与して、ＡＣＴＨレベルを上昇させると、ショックや同様の状態を治療することができる。ごく一般には、本発明の化合物の投与を利用すると、特にＣＲＦＲ１に関連する広範な種類の障害または疾患を治療することができる。特に、本発明の化合物は、動物に投与して、うつ病、不安障害、パニック障害、強迫性障害、反応性高血圧、神経性食欲不振症、過食症、過敏性腸症候群、ストレス誘発性の免疫抑制、およびてんかんを治療することができる。
【００２５】
このペプチドは、ＣＲＦレセプターに対する親和性が高いので、ＣＲＦレセプターに結合し、かつ／またはそれを活性化するさらにより強力な分子を求めて薬物スクリーニングを行うための価値ある方法の基盤も提供し、放射性の類似体は、ＣＲＦＲ１に選択的に結合するトレーサーとして使用することができ、高処理量のスクリーニングの目的で役立つ。
【００２６】
特別な一態様では、本発明は、ＣＲＦＲ２に結合するより実質的に強い親和性でＣＲＦＲ１に結合する３８残基のＣＲＦＲ１リガンドペプチドを提供するが、そのペプチドは、以下の式を有するペプチドまたはその非毒性の塩であり、その式とは、Ｙ1−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｒ6−Ｓｅｒ−Ｒ8−Ａｓｐ−Ｒ10−Ｒ11−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｒ13−Ｒ14−Ｒ15−Ａｒｇ−Ｒ17−Ｒ18−Ｒ19−Ｒ20−Ｒ21−Ｒ22−Ｒ23−Ｒ24−Ｒ25−Ｒ26−Ｒ27−Ｒ28−Ｒ29−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｒ32−Ｒ33−Ｒ34−Ａｒｇ−Ｒ36−Ｒ37−Ｒ38−Ｒ39−Ｒ40−Ｒ41−ＮＨ2［式中、Ｙ1は、１５個以下の炭素原子を有するアシル基、または放射ヨウ素標識されたチロシンであり；Ｒ6は、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＮｌｅであり；Ｒ8は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり；Ｒ10は、ＬｅｕまたはＣＭＬであり；Ｒ11は、ＴｈｒまたはＳｅｒであり；Ｒ13は、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、またはＧｌｕであり；Ｒ14は、ＣＭＬまたはＬｅｕであり；Ｒ15はＣＭＬまたはＬｅｕであり；Ｒ17は、Ｇｌｕ、ＣＭＬ、Ａｓｎ、またはＬｙｓであり；Ｒ18は、Ｖａｌ、ＣＭＬ、Ｎｌｅ、またはＭｅｔであり；Ｒ19は、ＣＭＬ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅであり；Ｒ20は、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、またはＨｉｓであり；Ｒ21は、Ｎｌｅ、Ｌｅｕ、ＣＭＬ、またはＭｅｔであり；Ｒ22は、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、またはＧｌｕであり；Ｒ23は、ＡｒｇまたはＬｙｓであり；Ｒ24は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、ＣＭＬ、またはＡｉｂであり；Ｒ25は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；Ｒ26は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、またはＬｙｓであり；Ｒ27は、ＣＭＬ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり；Ｒ28は、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＡｉｂであり；Ｒ29は、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、またはＧｌｕであり；Ｒ32は、Ａｉｂ、またはＣｙｓ以外の天然αアミノ酸のＬもしくはＤ異性体であり；Ｒ33は、Ａｉｂ、またはＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＣＭＬ、もしくはＩｌｅのＬもしくはＤ異性体であり；Ｒ34はＬｙｓまたはＯｒｎであり；Ｒ36は、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ａｒｇ、Ｈａｒ、ＣＭＬ、またはＬｅｕであり；Ｒ37は、ＣＭＬ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、またはＴｙｒであり；Ｒ38は、Ｎｌｅ、Ｍｅｔ、ＣＭＬ、またはＬｅｕであり；Ｒ39は、Ｇｌｕ、Ａｉｂ、またはＡｓｐであり；Ｒ40は、Ｉｌｅ、Ａｉｂ、ＣＭＬ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｐｈｅ、Ｎｖａ、Ｇｌｙ、またはＧｌｎであり；Ｒ41は、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｉｌｅ、ＣＭＬ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｐｈｅ、Ｎｖａ、またはＧｌｎであり；だだし、環化結合が３１位のＧｌｕとＲ34の間に存在していてよく、さらにＤ−Ｐｈｅの代わりにＤ−２ＮａｌまたはＤ−Ｌｅｕとしてもよい］である。
【００２７】
別の特別な態様では、本発明は、ＣＲＦＲ２に結合するよりも実質的に強い親和性でＣＲＦＲ１に結合する３８残基のＣＲＦＲ１リガンドペプチドを提供するが、そのペプチドは、式Ｙ1−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ−Ｄ−Ｘａａ−Ｂ−Ｇｌｕ−Ｘａａa−Ｘａａb−Ｘａａc−Ｃ−ＮＨ2［式中、Ｙ1は、１５個以下の炭素原子を有するアシル基、または放射ヨウ素標識されたチロシンであり；Ａは、ｒ／ｈＣＲＦまたは他のＣＲＦファミリーペプチドの対応する配列の、５位のＰｒｏと１２位のＰｈｅの間に見られる６アミノ酸残基の配列であり；Ｄ−Ｘａａは、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−２Ｎａｌ、またはＤ−Ｌｅｕであり；Ｂは、ｒ／ｈＣＲＦまたは他のＣＲＦファミリーペプチドの対応する配列の、１２位のＰｈｅと３１位のＡｌａの間に見られる１８アミノ酸残基の配列であり；Ｘａａaは、Ｃｙｓ以外の任意のＬもしくはＤ型天然α−アミノ酸、またはＡｉｂであり；Ｘａａbは、Ａｉｂ、またはＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＣＭＬ、もしくはＩｌｅのＬもしくはＤ−異性体であり；Ｘａａcは、ＬｙｓまたはＯｒｎのいずれかであり、その側鎖がＧｌｕの側鎖にアミド環化結合で結合していてよく；Ｃは、任意のＣＲＦファミリーペプチドのＣ末端部分の最後の７アミノ酸残基の配列であり；ただし、Ａ、Ｂ、および／またはＣにおいて、Ｍｅｔの代わりにＮｌｅまたはＬｅｕとしてもよい］を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明のＣＲＦレセプターリガンドは、ＣＲＦＲ１レセプター部位で活性を示すので、内分泌、精神医学、および神経性の障害または疾患を含む広範な種類の障害または疾患を治療するための治療薬として使用することができる。より詳細には、本発明のＣＲＦレセプターリガンドは、ＣＲＦの過剰分泌から生じる生理的状態または障害を治療するのに有用であるといえる。ＣＲＦは、ストレスに対する内分泌、行動神経、および自律神経の応答を活性化し、調整している中枢の神経伝達物質であると考えられるので、本発明のＣＲＦレセプターリガンドは、神経精神医学的な障害の治療に使用できる。本発明のＣＲＦレセプターリガンドによって治療できる神経精神病学的障害には、うつ病などの情動障害；一般化した不安障害、パニック障害、強迫性障害、異常な攻撃性など、不安に関連する障害；不安定狭心症や反応性高血圧など、心血管の異常；および神経性食欲不振症、過食症、過敏性腸症候群などの摂食障害が含まれる。ＣＲＦレセプターリガンドは、様々な疾患状態に随伴するストレス誘発性の免疫抑制、ならびに発作の治療にも使用できる。本発明のＣＲＦレセプターリガンドの他の使用例には、（リウマチ様関節炎、ブドウ膜炎、喘息、炎症性腸疾患、および消化管の運動性などの）炎症状態、クッシング病、乳児痙攣、てんかん、乳幼児と成人の他の発作、および（アルコール依存症を含む）種々の物質乱用および禁断の治療が含まれる。
【００２９】
本発明のもう１つの実施形態では、１種または複数のＣＲＦレセプターリガンドを含有する薬剤組成物が開示される。投与する目的で、本発明の化合物を薬剤組成物として製剤してよい。薬剤組成物は、本発明のＣＲＦレセプターリガンドと、薬剤として許容される担体および／もしくは希釈剤とを含む。ＣＲＦレセプターリガンドは、組成物中に、特定の障害を治療するのに有効な量、すなわち、所望のＣＲＦ活性を得るのに十分な量が存在すべきであり、毒性が患者に許容されることが好ましい。好ましくは、本発明の薬剤組成物は、投与経路に応じて用量あたり０．１ｍｇから２５０ｍｇ、より好ましくは１ｍｇから６０ｍｇのＣＲＦレセプターリガンドを含んでいてよい。適切な濃度および投与量は、当分野の技術者によって容易に決定することができる。
【００３０】
ペプチドを規定するのに使用した命名法は、非特許文献４５で明細に述べられているものであり、慣例の表示に従って、アミノ基を左側に、カルボキシル基を右側に示す。標準の３文字表記を使用して、α−アミノ酸残基を特定し、アミノ酸残基が異性体をもつ場合、別段の指示がない限り、表されているのはＬ型のアミノ酸である。たとえば、Ｓｅｒ＝Ｌ−セリン、Ｏｒｎ＝Ｌ−オルニチン、Ｎｌｅ＝Ｌ−ノルロイシン、Ｎｖａ＝Ｌ−ノルバリン、Ａｇｌ＝アミノグリシン、Ａｂｕ＝Ｌ−２−アミノ酪酸、Ｄｂｕ＝Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸、Ｄｐｒ＝Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｈｌｙ＝Ｌ−ホモリジン、およびＨａｒ＝Ｌ−ホモアルギニンとする。さらに、以下の略語を使用する。すなわち、ＣＭＬ＝ＣαＣＨ3−Ｌ−ロイシン、Ａｉｂ＝ＣαＣＨ3−Ｌ−アラニンまたは２−アミノイソ酪酸、Ｎａｌ＝Ｌ−β−（１−もしくは２−ナフチル）アラニン、Ｐａｌ＝Ｌ−β−（２−，３−もしくは４−ピリジル）アラニン、Ｃｐａ＝Ｌ−（２−，３−，もしくは４−クロロ）フェニルアラニン、Ａｐｈ＝Ｌ−（２−，３−もしくは４−アミノ）フェニルアラニン、Ａｍｐ＝（２−，３−もしくは４−アミノメチル）フェニルアラニン、Ｎｉｃ＝３−カルボキシピリジン（またはニコチン酸）。
【００３１】
一般に、ＣＲＦＲ１リガンドは、１２位にＤ−異性体を含み、３１位と３４位の残基間に環化結合を含むことが好ましく、以下のアミノ酸配列を有するか、または等価なその非毒性の塩であり、その式とは、Ｙ1−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｒ6−Ｓｅｒ−Ｒ8−Ａｓｐ−Ｒ10−Ｒ11−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｒ13−Ｒ14−Ｒ15−Ａｒｇ−Ｒ17−Ｒ18−Ｒ19−Ｒ20−Ｒ21−Ｒ22−Ｒ23−Ｒ24−Ｒ25−Ｒ26−Ｒ27−Ｒ28−Ｒ29−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｒ32−Ｒ33−Ｒ34−Ａｒｇ−Ｒ36−Ｒ37−Ｒ38−Ｒ39−Ｒ40−Ｒ41−ＮＨ2［式中、Ｙ1は、１５個以下の炭素原子を有するアシル基、または放射ヨウ素標識されたチロシンであり；Ｒ6は、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＮｌｅであり；Ｒ8は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり；Ｒ10は、ＬｅｕまたはＣＭＬであり；Ｒ11は、ＴｈｒまたはＳｅｒであり；Ｒ13は、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、またはＧｌｕであり；Ｒ14は、ＣＭＬまたはＬｅｕであり；Ｒ15はＣＭＬまたはＬｅｕであり；Ｒ17は、Ｇｌｕ、ＣＭＬ、Ａｓｎ、またはＬｙｓであり；Ｒ18は、Ｖａｌ、ＣＭＬ、Ｎｌｅ、またはＭｅｔであり；Ｒ19は、ＣＭＬ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅであり；Ｒ20は、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、またはＨｉｓであり；Ｒ21は、Ｎｌｅ、Ｌｅｕ、ＣＭＬ、またはＭｅｔであり；Ｒ22は、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、またはＧｌｕであり；Ｒ23は、ＡｒｇまたはＬｙｓであり；Ｒ24は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、ＣＭＬ、またはＡｉｂであり；Ｒ25は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；Ｒ26は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、またはＬｙｓであり；Ｒ27は、ＣＭＬ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり；Ｒ28は、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＡｉｂであり；Ｒ29は、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、またはＧｌｕであり；Ｒ32は、Ａｉｂ、またはＣｙｓ以外の天然αアミノ酸のＬもしくはＤ異性体であり；Ｒ33は、Ａｉｂ、またはＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＣＭＬ、もしくはＩｌｅのＬもしくはＤ異性体であり；Ｒ34はＬｙｓまたはＯｒｎであり；Ｒ36は、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ａｒｇ、Ｈａｒ、ＣＭＬ、またはＬｅｕであり；Ｒ37は、ＣＭＬ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、またはＴｙｒであり；Ｒ38は、Ｎｌｅ、Ｍｅｔ、ＣＭＬ、またはＬｅｕであり；Ｒ39は、Ｇｌｕ、Ａｉｂ、またはＡｓｐであり；Ｒ40は、Ｉｌｅ、Ａｉｂ、ＣＭＬ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｐｈｅ、Ｎｖａ、Ｇｌｙ、またはＧｌｎであり；Ｒ41は、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｉｌｅ、ＣＭＬ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｐｈｅ、Ｎｖａ、またはＧｌｎであり；だだし、環化結合が３１位のＧｌｕとＲ34の間に存在していてよく、さらにＤ−Ｐｈｅの代わりにＤ−２ＮａｌまたはＤ−Ｌｅｕとしてもよい］である。
【００３２】
特に好ましい群のＣＲＦ作動薬は、（その非毒性の塩を含めて）次のアミノ酸配列、すなわち、
（シクロ３１−３４）Ｙ1−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｒ6−Ｓｅｒ−Ｒ8−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｒ11−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｒ14−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｒ18−Ｌｅｕ−Ｒ20−Ｎｌｅ−Ｒ22−Ｒ23−Ａｌａ−Ｒ25−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｒ29−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｒ32−Ｒ33−Ｒ34−Ａｒｇ−Ｒ36−Ｒ37−Ｎｌｅ−Ｒ39−Ｒ40−Ｒ41−ＮＨ2［式中、Ｙ1は、７個以下の炭素原子を有するアシル基であり；Ｒ20はＧｌｕまたはＤ−Ｇｌｕであり；Ｒ22はＡｌａまたはＴｈｒであり；Ｒ29はＧｌｎまたはＧｌｕであり；Ｒ32は、Ｈｉｓ、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕであり；Ｒ36は、ＬｙｓまたはＬｅｕであり；Ｒ37はＬｅｕまたはＣＭＬであり；Ｒ39はＧｌｕまたはＡｓｐであり；Ｒ40は、Ｉｌｅ、ＣＭＬ、またはＧｌｕであり；Ｒ41は、Ｉｌｅ、Ａｉｂ、またはＡｌａであり；残りの可変基は、上で規定したとおりである］を有する。
【００３３】
ＡＣＴＨレベルを上昇させるという見地から特に生物作用能があると考えられる特別な類似体は、
シクロ（３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4、Ｄ−Ｐｈｅ12、Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）、
（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｏＣＲＦ（４−４１）、
（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ａｉｂ33，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）、
（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，ＣＭＬ27，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）、
（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，ＣＭＬ27,40，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）、および
（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，ＣＭＬ27,40，Ｇｌｕ31，Ａｉｂ33，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）である。
【００３４】
このペプチドは、全面的固相法、部分的固相法、断片縮合、または古典的な溶液添加など、適切な方法によって合成する。
【００３５】
ペプチドの化学合成に共通しているのは、様々なアミノ酸部分の不安定な側鎖基を、その基が最後に除去されるまで、化学反応がその部位で起こらないようにする適切な保護基で保護することである。通常は、アミノ酸または断片上のα−アミノ基を保護し、その間にその物質がカルボキシル基の所で反応した後、α−アミノ保護基を選択的に除去して、後続の反応がその位置で起こるようにすることも共通している。したがって、合成での１ステップとして、そのペプチド鎖の中に所望の配列中に位置する各々のアミノ酸残基を含み、それら残基のいくつかが側鎖保護基を有する中間化合物を生成することが一般的である。
【００３６】
このペプチドは、非特許文献４６および／または非特許文献４７に記載のものなど、固相合成を使用して調製することが好ましい。したがって、ＣＲＦ類似体は、直接的な方法で調製し、次いで生体活性があるかを簡単に試験することができ、これによって、ＣＲＦＲ１リガンドの即座の調製、評価がしやすくなる。１９８１年１月２１日に発行されたＲｉｖｉｅｒらの特許文献６に大体が述べられているように、固相合成は、保護されたα−アミノ酸を適切な樹脂に結合させることにより、ペプチドのＣ末端から開始する。ＣＲＦＲ１リガンドの出発材料は、たとえば、α−アミノ保護されたＩｌｅをＭＢＨＡ樹脂に結合させることにより調製することができる。
【００３７】
所望のアミノ酸配列が完成した後、樹脂に結合させたまま環化結合を形成させることが求められない限り、中間体ペプチドを以下に述べるとおりに樹脂担体から外す。液体フッ化水素（ＨＦ）などの試薬で処理することにより外すのであるが、こうすると、ペプチドが樹脂から切断されるだけでなく、残っている側鎖保護基およびα−アミノ保護基がまだ存在すればそれもすべて切断されて、ペプチドが得られる。フッ化水素を切断に使用するときには、アニソールもしくはクレゾールとメチルエチルスルフィドを捕捉剤として反応容器に含める。配列中にＭｅｔが存在するときには、樹脂からペプチドを切断する前に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／エタンジチオールを用いてＢＯＣ保護基を切断して、Ｓ−アルキル化を排除してもよい。
【００３８】
ＣＲＦペプチド類似体の環化ステップは当然、３１位と３４位の残基間の所望される結合の種類に応じて変わる。アミド環化結合（ラクタム架橋）を得るには、特許文献７および特許文献８で開示されているように、部分的に保護されたペプチドが樹脂に結合したままである間に環化を行うことができる。このような手順では、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、および／またはＬｙｓなど、ペプチド中間体中にある他の残基の側鎖が保護されたままである間に、２箇所の所望の側鎖間にアミド環化結合が有効に与えられる。
【００３９】
３１位残基の側鎖カルボキシル基と３４位残基の側鎖アミノ基の間、または、等価な結合であると考えられるがその逆の間でのアミド結合による環化を行うときには、特許文献８に記載されているように、保護されたペプチドをＭＢＨＡもしくはＢＨＡ樹脂上で合成し、ペプチドが樹脂にまだ結合している間に、特定のカルボン酸側鎖のベンジルエステルをヒドラジドに誘導体化し、次いで、これを選択的に脱保護されたアミノ側鎖と反応させることが好ましい。アミド結合架橋に関与する残基のカルボキシル側鎖には、塩基に不安定な保護基、たとえばＯＦｍを使用し、関与する他方の残基上のアミノ側鎖には、保護基としてＦｍｏｃを使用して環化を行うことが好ましい。それがアシル化されようとされなかろうと、Ｎ−末端残基上のα−アミノ保護基、および他の側鎖の保護基がすべてしかるべき位置にある間に、ピペリジンなどを使用して、２個の塩基不安定基を除去する。この選択的な除去の後、ＢＯＰ処理することにより、環化を実現する反応を実施するが、これによって、アミド結合がほぼ完全に生じる。環化した後、ＨＦなどの試薬を使用して、ペプチドを完全に脱保護し、樹脂から除去する。任意選択で、ＴＦＡを使用してＮ末端からＢＯＣ保護基を最初に除去することもできる。
【００４０】
あるいは、このようなアミド結合によるペプチドの環化は、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、および特許文献１６の教示を利用して実施することもできる。
【００４１】
実施例で後述するのは、こうしたペプチドを合成するある好ましい方法であるが、しかし、当分野の技術者ならば、本発明のペプチドを合成する技術が容易にわかるであろう。たとえば、非特許文献４８、非特許文献４９、非特許文献５０、非特許文献５１、非特許文献５２を参照されたい。
【００４２】
単層培養でラットの下垂体前葉細胞を使用して直接的なアッセイを実施すると、候補ペプチドが示すＣＲＦ活性が何であるかを決定することができる。使用する手順は、非特許文献５３に大体が述べられている。このアッセイは、候補ペプチドがＣＲＦ作動薬として何らかの活性を示し、その細胞上のＣＲＦレセプターを活性化することによりＡＣＴＨ分泌を刺激するかを示すものであり、この方法では、高用量の使用によって、固有のＣＲＦ活性を測定する。候補ＣＲＦＲ１リガンドも、非特許文献５４に記載のものなど、既知のＣＲＦレセプターを使用する結合アッセイで容易に評価される。ＣＲＦレセプターおよび結合アッセイの詳細は、本明細書中で後に論じる。ごく一般には、結合アッセイは、（シクロ３０−３３）［Ｉ125−Ｄ−Ｔｙｒ12，Ｇｌｕ30，Ｌｙｓ33，Ｎｌｅ21,38］−ｒ／ｈＣＲＦ（１２−４１）や、Ｄ−Ｈｉｓ32を有するその類似体など、ヒトＣＲＦ−Ｒ１に対する親和性の高い放射性リガンドを使用し、ヒトＣＲＦ−Ｒ１を用いて実施することができる。たとえば、最初に命名した化合物は、ｈＣＲＦＲ１に対する結合のＫDが２．０ナノモル（１．４〜２．９）であり、これは、比較可能なＤ−Ｐｈｅ12類似体と実質的に等しい。ＣＲＦ−Ｒ１レセプターを利用する１つの代表的な結合アッセイは、非特許文献５５に記載されている。このようなアッセイは、好ましくは標識された親和性の高い環状ＣＲＦ作動薬もしくは拮抗薬のような、標識された環状ＣＲＦ類似体を使用して、ペプチド状または他の形状の潜在的なＣＲＦ様リガンドをスクリーニングするのに使用すると有利である。
【００４３】
現在、ＣＲＦレセプターは、クローン化されており、前述の非特許文献５５、非特許文献２０、および非特許文献２１で開示されている。結合親和性は、リガンドとレセプター間の相互作用の強度を指すのに使用する用語である。ＣＲＦレセプターに対する結合親和性を明らかにするために、本発明のペプチドは、当技術分野でよく知られている結合アッセイ実験で、125Ｉで放射標識したｏＣＲＦや［Ｄ−Ｔｙｒ12，Ｎｌｅ21,38］−ｒ／ｈＣＲＦ（ｌ２−４１）など、既知の親和性のトレーサーリガンドを使用して容易に評価される。このようなアッセイの結果は、各々のリガンドがＣＲＦレセプターに結合する親和性を示し、既知の標準物質などに対するＫi、すなわち阻害性結合親和性定数で表示される。Ｋi（阻害性結合親和性定数）は、「標準物質」または「トレーサー」の放射性リガンドを使用して決定され、したがってレセプターまたは結合タンパク質からのトレーサーの置換を測定するのであるが、この定数は、そうしたトレーサーに関して最も正確に表示される。しかし、これらのアッセイが、レセプターなどの濃度を比較的低くした特別な条件下で慎重に実施される限り、算出されたＫiは、その解離定数ＫDと実質的に同じになる。解離定数ＫDは、レセプターなどの結合部位の２分の１（５０％）を占有するのに必要なリガンド濃度を表すものである。Ｋiを試験することは、標識、たとえば放射ヨウ素標識する必要のあるトレーサーが１種だけであるので特に効率的である。ＣＲＦレセプターに対する結合親和性の高い所与のリガンドは、空いている結合部位の少なくとも５０％に結合するのに非常に少量のリガンドの存在しか必要としないので、そのリガンドとレセプターのＫD値の数字は小さくなる。一方、特定のＣＲＦレセプターに対する結合親和性の低い所与のリガンドは、そうした部位の５０％に結合するのに比較的高濃度のリガンドの存在を必要とするので、そのリガンドとレセプターのＫD値は、より大きな数字となる。
【００４４】
特定のレセプタータンパク質に関して、ＫDが約１０ｎＭ以下であるＣＲＦ類似体ペプチドとは、レセプタータンパク質の活性結合部位の少なくとも５０％を占有するのに、約１０ｎＭ以下のリガンド（すなわち、ＣＲＦ類似体ペプチド）の濃度が必要となることを意味する。このような値は、放射ヨウ素標識した標準物質とわずか約０．８ｎＭ以下のレセプター（約１０〜２０ピコモルのレセプター／膜タンパク質ｍｇ）とを使用して得た結果から公正に決定することができる。本発明によって提供される好ましいペプチドは、レセプター結合部位の少なくとも５０％を占有（またはそれに結合）するために、約１０ナノモル以下のリガンド濃度が必要となるような結合親和性（ＫD）を有するので、高い親和性を有するとみなされる。このようなＣＲＦ類似体ペプチドには、結合親和性が約２ｎＭ以下であるものもある。一般に、この出願の目的では、約５ナノモル以下の解離定数を強い親和性を示すものであるとみなし、約２ナノモル以下のＫDを非常に強い親和性を示すものであるとみなす。上述のように、このようなＣＲＦ類似体ペプチドのＣＲＦＲ１に対する親和性が実質的に高く、したがってその生体への効果が選択的である点が、特に有利であると考えられる。
【００４５】
ＣＲＦレセプターを使用するこれらの結合アッセイは、すぐに実施でき、最初に同定し、または合成したペプチドで実施すると、そうしたペプチドが有効なＣＲＦＲ１選択的リガンドとして見込みがあるかを容易に判定することができる。このような結合アッセイは、当分野の技術者によく知られている様々な方法の中で実施することができる。そうしたアッセイの詳細な例が、非特許文献５４に述べられている。さらに、放射ヨウ素標識したチロシン残基を組み込まれた本発明のペプチドは、ＣＲＦＲ１に選択的な有効なトレーサーであり、高処理量スクリーニングに使用することができる。
【００４６】
以下の実施例１は、固相法によって問題のＣＲＦＲ１リガンドを合成する好ましい方法を述べるものである。これらの実施例は、限定するのでなく例示するために示すものである。
【実施例１】
【００４７】
アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有する（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）の合成は、Ｂａｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．から入手できるものなど、置換範囲が約０．１から０．５ミリモル／樹脂ｇｍである約３グラムのＭＢＨＡ塩酸塩樹脂上で段階的に行う。この合成は、以下のようなプロトコルを使用して、樹脂１グラムあたり約０．２８ミリグラム当量の置換度を有するＭＢＨＡ樹脂上で、手作業で行う。
【００４８】
【表１】
2005510458.tif 000002
【００４９】
脱保護および中和を行った後、樹脂上にペプチド鎖を段々と構築する。一般に、２モルの塩化メチレン中ＤＩＣ  １当量を加えた樹脂１グラムあたり、１から２ミリモルの塩化メチレン（ＤＣＭ）中ＢＯＣ保護アミノ酸（たとえば、樹脂の置換度に応じて２〜５倍過剰）を２０から３０分間使用する。ＢＯＣ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）を結合させるときには、５０％ＮＭＰと塩化メチレンの混合物を使用する。ＳｅｒおよびＴｈｒには、ヒドロキシル側鎖の保護基としてＢｚｌを使用する。ｐ−ニトロフェニルエステル（ＯＮｐ）を使用すると、ＡｓｎまたはＧｌｎのカルボキシル末端が活性化されるが、たとえば、ＢＯＣ−Ａｓｎ（ＯＮｐ）は、ＤＭＦと塩化メチレンの５０％混合物中に１当量のＨＯＢｔを使用して、１晩かけて結合させることができる。ＡｓｎまたはＧｌｎのアミド基は、活性エステル法の代わりにＤＩＣ結合を使用するときには、Ｘａｎによって保護する。２−Ｃｌ−Ｚは、Ｌｙｓ側鎖の保護基として使用するが、ラクタム架橋に加わることになるＬｙｓ残基は例外であり、Ｌｙｓ34の保護にはＦｍｏｃを使用する。Ｔｏｓは、Ａｒｇのグアニジノ基およびＨｉｓのイミダゾール基を保護するのに使用し、ＧｌｕまたはＡｓｐの側鎖カルボキシル基は、ＯＦｍで保護するＧｌｕ31を除き、ＯＣｈｘによって保護する。この合成の終わりには、以下の組成物、すなわち、
ＢＯＣ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＣｈｘ）−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｇｌｕ（ＯＣｈｘ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＣｈｘ）−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯＣｈｘ）−Ｇｌｎ（Ｘａｎ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｘａｎ）−Ｇｌｎ（Ｘａｎ）−Ｇｌｕ（ＯＦｍ）−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＣｈｘ）−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−樹脂担体が得られる。Ｘａｎは、α−アミノ保護基を非ブロック化するのに利用したＴＦＡ処理によって部分的または完全に除去されていることがある。次いで、このペプチド樹脂をＴＦＡで処理して、Ｎ末端のＢＯＣ保護基を除去する。次いでこれを無水酢酸で処理して、プロリン残基をアセチル化する。
【００５０】
次いで、上で言及し、以下でさらに十分に述べる方法によって、残基３１と３４の環化（ラクタム化）を行う。ジクロロメタン（ＤＣＭ）（２×）および１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）（２×）で洗浄した後、Ｇｌｕ31およびＬｙｓ34のＯＦｍ／Ｆｍｏｃ基をそれぞれ、ＮＭＰ中２０％ピペリジン（１×１分および２×１０分）で除去してから、ＮＭＰ（２×）、ＤＣＭ中１０％ＥＴ3Ｎ（ｖ／ｖ）（１×）、メタノール（ＭｅＯＨ）（２×）、およびＤＣＭ（２×）で洗浄する。適切な結合剤を使用して、たとえば、過剰のＮＭＰ中ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の存在下、室温で、２倍過剰のＨＢＴＵまたはホウ酸Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム（ＴＢＴＵ）と３０分間反応させることによって、ペプチド樹脂の環化を行う。他の適切な試薬もよく知られており、それを使用してもよい。洗浄した後、所望であれば環化を繰り返して、確実に完成させてもよい。反応の完了は、周知のＫａｉｓｅｒニンヒドリン試験によって確認される。
【００５１】
最初に−２０℃で２０分間、次いで０℃で３０分間、ペプチド樹脂１グラムあたり１．０ｇのｐ−クレゾールおよび１５ｍｌのフッ化水素（ＨＦ）で処理することによって、得られる環状ペプチド樹脂を切断し、脱保護する。高真空中でＨＦを除去した後、樹脂およびペプチドを乾燥ジエチルエーテルで洗浄し、次いでペプチドを、０．１％ＴＦＡを加えたＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ（６０：４０）での抽出にかけ、濾過によって樹脂から分離する。
【００５２】
非特許文献５６、非特許文献５７、および非特許文献５８に記載されているように、分取ＨＰＬＣによってペプチドを精製する。ＨＰＬＣによってクロマトグラフィーの画分を慎重にモニタし、ほぼ純粋な画分だけをプールする。
【００５３】
正確な組成物が得られているかを調べるには、一定に沸騰しているＨＣｌ、３μｌのチオグリコール／ｍｌ、および（内部の標準物質として）１ナノモルのＮｌｅを含む封をした排気管中で、ｒ／ｈＣＲＦ類似体を１４０℃で９時間加水分解することができる。Ｂｅｃｋｍａｎ１２１ＭＢアミノ酸分析装置を使用して、加水分解物のアミノ酸分析を行うと、３８残基のペプチド構築物が得られたことが確認されるアミノ酸比が示される。ＭＳ分析は、後述のように使用する。
【００５４】
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して、このペプチドが均一であるとの判断を下す。孔径３００Åの５μｍＣ18シリカおよびｐＨの異なるＴＥＡＰ緩衝液を充填した０．４６×２５ｃｍカラムを備えたＷａｔｅｒｓＨＰＬＣシステムを使用して、これをさらにＲＰ−ＨＰＬＣにかける。溶液１０００ｍｌあたり１．０ｍｌのＴＦＡからなる０．１％トリフルオロ酢酸水溶液である緩衝液Ａと、６０％アセトニトリルである緩衝液Ｂを使用して、精製されたペプチドの脱塩を行う。ペプチドの純度は、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）による測定で約９８％である。Ｃｓ+ガンを装備したＪＥＯＬモデルＪＭＳ−ＨＸ１１０二重収束質量分析計を用いて、液体２次イオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）の質量スペクトルを測定する。１０ｋＶの加速電圧、および２５ｋＶと３０ｋＶの間のＣｓ+ガンボルト数を用いる。ＬＳＩＭＳを使用して得られた測定値４４７１．３３は、計算値の４４７０．５３と一致している。
【００５５】
環化ステップを省いて（すなわち、すべてのＧｌｕ残基をＯＣｈｘで保護し、すべてのＬｙｓ残基を２Ｃｌ−Ｚで保護するか、または単にＨＦ処理の前にピペリジンでＦＭＯＣ基を脱封鎖して）、合成を繰り返し、比較できる線状ペプチドを生成する。
【００５６】
非特許文献５５に記載のとおりに、ヒトＣＲＦＲ１を発現させる細胞を用いる結合アッセイを実施する。ＣＨＯ細胞中で安定に発現されたＣＲＦＲ１およびＣＲＦＲ２に対する試験ペプチドの親和性は、記載のとおりに、125Ｉ−（Ｎｌｅ21，Ｔｙｒ32）ヒツジＣＲＦ（対ＣＲＦＲ１）または［125Ｉ−Ｔｙｒo−］Ｕｃｎ（対ＣＲＦＲ２）の競合的置換によって決定した。少なくとも３回の実験からのデータをプールし、非特許文献５９のＬＩＧＡＮＤプログラムを使用して、阻害性解離定数（Ｋi）値（９５％信頼限界）を算出した。クローン化されたｈＣＲＦＲ１は、結合した放射性リガンドが競合的に置換されたことによって判定されるように、環状ペプチドを高い親和性で結合する。Ｋiは、約１．５（０．９〜２．６）ｎＭであると決定されたが、これをｒ／ｈＣＲＦの約０．９５（０．４７〜２．０）ｎＭと比較することができる。線状ペプチドは、２．７（２．２〜３．４）ナノモルのＫiを示す。ヒトＣＲＦＲ２を発現させる、安定にトランスフェクトされた同様のＣＨＯ細胞での差は歴然としており、環状ペプチドと線状ペプチドでの結果はそれぞれ、２２４（１４０〜３７０）ｎＭと５００（３３０〜７７０）ｎＭであった。
【００５７】
ＣＲＦ作動薬が、ＡＣＴＨおよびβエンドルフィンの分泌に影響を及ぼすかをｉｎ  ｖｉｔｒｏだけでなくｉｎ  ｖｉｖｏで調べる。非特許文献５３に大体が記載されている手順を使用して、培養したラット下垂体細胞によってＡＣＴＨおよびβエンドルフィンの分泌を刺激するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を測定し、合成ｏＣＲＦ（実験室標準）またはｒ／ｈＣＲＦ（代替標準）と比較する。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、非特許文献６０に記載の一般の手順を使用して実施する。環状ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では、標準（ｏＣＲＦ）よりもかなり強い効力が示されるのに対し、線状ペプチドでは、標準よりは強いものの、より弱い効力が示される。環状ペプチドでは、末梢投与時に、血圧をかなり低下させることが示される。
【実施例２】
【００５８】
実施例１で大体を述べた手順を使用して、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｏＣＲＦ（４−４１）を合成する。対応する線状ペプチドを得るために、環化の前にペプチド樹脂の一部を取り除き、それを切断し、脱保護する。この環状ペプチドは、ＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を強く刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。線状ペプチドの生理活性は、それよりも非常に有意に低い。しかし、どちらのペプチドも、ＣＲＦＲ１を発現させるＣＨＯ細胞への結合は強く、ＣＲＦＲ２を発現させるＣＨＯ細胞への結合は弱い。
【実施例３】
【００５９】
実施例３Ａ
実施例１で大体を述べた手順を使用して、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ18,21，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ＡＨＣ（４−４１）を合成する。対応する線状ペプチドを得るために、環化の前にペプチド樹脂の一部を取り除き、それを切断し、脱保護する。この環状ペプチドは、ＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を強く刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。線状ペプチドの生理活性は、それよりも非常に有意に低い。どちらのペプチドもＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。
【００６０】
実施例３Ｂ
実施例１で大体を述べた手順を使用して、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｎｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ18,21，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−サッカーウロテンシン（４−４１）を合成する。
【００６１】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００６２】
実施例３Ｃ
実施例１で大体を述べた手順を使用して、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ブタＣＲＦ（４−４１）を合成する。
【００６３】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００６４】
実施例３Ｄ
実施例１で大体を述べた手順を使用して、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｎｌｅ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,37,38，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−魚類ＣＲＦ（４−４１）を合成する。
【００６５】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００６６】
実施例３Ｅ
実施例１に大体を述べた手順を使用して、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｎｌｅ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ14,18,24，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−マギーウロテンシン（４−４１）を合成する。
【００６７】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００６８】
実施例３Ｆ
実施例１に大体を述べた手順を使用して、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｎｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ18,21，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−コイウロテンシン（４−４１）を合成する。
【００６９】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００７０】
実施例３Ｇ
実施例１に大体を述べた手順を使用して、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｎｌｅ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ14,18,24，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−カレイウロテンシン（４−４１）を合成する。
【００７１】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【実施例４】
【００７２】
３３位にＳｅｒの代わりにＡｉｂ（２−アミノイソ酪酸）を用いて実施例１のように合成を行い、アミノ酸配列：（シクロ３１−３４）Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド：（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ａｉｂ33，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を生成する。対応する線状ペプチドを得るために、環化の前にペプチド樹脂の一部を取り除き、それを切断し、脱保護する。この環状ペプチドは、ＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を強く刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。線状ペプチドの生理活性は、それよりも非常に有意に低い。どちらのペプチドもＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。
【実施例５】
【００７３】
Ｌｅｕ15の代わりにＣαＭｅＬｅｕを用いて実施例１のように合成を行い、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ＣＭＬ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−ＩＩｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，ＣＭＬ15，Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を生成する。
【００７４】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００７５】
実施例５Ａ
Ｌｅｕ14の代わりにＣαＭｅＬｅｕを用いて実施例１のように合成を行い、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−ＣＭＬ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，ＣＭＬ14，Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を生成する。
【００７６】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００７７】
実施例５Ｂ
Ｌｅｕ19の代わりにＣαＭｅＬｅｕを用いて実施例１のように合成を行い、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＣＭＬ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，ＣＭＬ19，Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を生成する。
【００７８】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００７９】
実施例５Ｃ
Ｌｅｕ27の代わりにＣαＭｅＬｅｕを用いて実施例１のように合成を行い、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，ＣＭＬ27，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を生成する。
【００８０】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００８１】
実施例５Ｄ
Ｌｅｕ37の代わりにＣαＭｅＬｅｕを用いて実施例１のように合成を行い、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＣＭＬ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34，ＣＭＬ37］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を合成する。
【００８２】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００８３】
実施例５Ｅ
Ｇｌｕ17の代わりにＣαＭｅＬｅｕを用いて実施例１のように合成を行い、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＣＭＬ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，ＣＭＬ17，Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を生成する。
【００８４】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００８５】
実施例５Ｆ
Ｌｅｕ27の代わりにＣαＭｅＬｅｕを用い、Ｈｉｓ32の代わりにＤ−Ｈｉｓを用いて実施例１のように合成を行い、式：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，ＣＭＬ27，Ｇｌｕ31，Ｄ−Ｈｉｓ32，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を生成する。
【００８６】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【実施例６】
【００８７】
実施例６Ａ
ここではＬｅｕ14の代わりにもＣαＭｅＬｅｕを用いることを除き、実施例５Ｃの合成を繰り返して、式Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−ＣＭＬ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，ＣＭＬ14,27，Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を生成する。
【００８８】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００８９】
実施例６Ｂ
ここではＶａｌ18の代わりにもＣαＭｅＬｅｕを用いることを除き、実施例５Ｃの合成を再び繰り返して、式Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−ＣＭＬ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，ＣＭＬ18,27，Ｎｌｅ21,38，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を生成する。
【００９０】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００９１】
実施例６Ｃ
Ｌｙｓ36の代わりにもＣαＭｅＬｅｕを用いることを除き、実施例５Ｃの合成をもう１度繰り返して、アミノ酸配列Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＣＭＬ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，ＣＭＬ27,36，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を生成する。
【００９２】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００９３】
Ｈｉｓ32の代わりにＤ−Ｈｉｓを用いて上の合成を大体繰り返し、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＣＭＬ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，ＣＭＬ27,36，Ｇｌｕ31，Ｄ−Ｈｉｓ32，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を生成する。
【００９４】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００９５】
実施例６Ｄ
Ｌｅｕ37の代わりにもＣαＭｅＬｅｕを用いて実施例５Ｃの合成を繰り返し、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＣＭＬ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，ＣＭＬ27,37，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を生成する。
【００９６】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【００９７】
実施例６Ｅ
ここではＩｌｅ40の代わりにもＣαＭｅＬｅｕを用いて実施例５Ｃの合成を繰り返し、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−ＣＭＬ−ＩＩｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，ＣＭＬ27,40，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）のほか、その線状対応物も生成する。
【００９８】
ＨＰＬＣおよびキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）によってペプチドの純度が約９５％であることを確認し、質量分析（ＭＳ）によって同一性を確認する。液体２次イオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）を使用して得た、この環状ペプチドの測定値４４９８．３２は、計算値の４４９８．５６と一致している。線状ペプチドの測定値は、４５１６．４５であり、計算値の４５１６．５７に対応している。
【００９９】
ヒトＣＲＦＲ１を発現させる細胞を用いる結合アッセイは、実施例１に関して記載したとおりに実施する。少なくとも３回の実験からのデータをプールし、非特許文献５９ＬＩＧＡＮＤプログラムを使用して、阻害性解離定数（Ｋi）値（９５％信頼限界）を算出する。クローン化されたｈＣＲＦＲ１は、結合した放射性リガンドが競合的に置換されたことによって判定されるように、この環状ペプチドを高い親和性で結合する。線状ペプチドは、それより若干高いＫiを示す。ヒトＣＲＦＲ２を発現させる、トランスフェクトされた同様のＣＨＯ細胞では、その差は有意であり、環上ペプチドおよび線状ペプチドでの結果はそれぞれ、共に弱い結合しか示さない。この環状ペプチドは、ＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【０１００】
実施例６Ｆ
ここではＩｌｅ41の代わりにもＣαＭｅＬｅｕを用いて実施例５Ｃの合成を繰り返し、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−ＣＭＬ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，ＣＭＬ27,41，Ｇｌｕ31，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）を生成する。
【０１０１】
この環状ペプチドは、ＣＲＦＲ１に強く結合し、ＣＲＦＲ２にはごく弱くしか結合しない。またＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【０１０２】
実施例６Ｇ
ここではまたＳｅｒ33の代わりにＡｉｂを用いて実施例６Ｅの合成を繰り返し、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−ＣＭＬ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，ＣＭＬ27,40，Ｇｌｕ31，Ａｉｂ33，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）のほか、その線状対応物も生成する。
【０１０３】
ＨＰＬＣおよびキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）によってペプチドの純度が約９８％であることを確認し、質量分析（ＭＳ）によって同一性を確認する。液体２次イオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）を使用して得た、この環状ペプチドの測定値４４９６．２０は、計算値の４４９６．５８と一致している。線状ペプチドの測定値は、４５１４．４５であり、計算値の４５１４．５９に対応している。
【０１０４】
ヒトＣＲＦＲ１を発現させる細胞を用いる結合アッセイは、実施例１に関して記載したとおりに実施する。クローン化されたｈＣＲＦＲ１は、結合した放射性リガンドが競合的に置換されたことによって判定されるように、この環状ペプチドを高い親和性で結合する。線状ペプチドは、それより若干高いＫiを示す。ヒトＣＲＦＲ２を発現させる、安定にトランスフェクトされた同様のＣＨＯ細胞では、その差は有意であり、環状ペプチドおよび線状ペプチドでの結果はそれぞれ、共に弱い結合しか示さない。この環状ペプチドは、ＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【０１０５】
実施例６Ｈ
ここではまたＳｅｒ33の代わりにＤ−Ｓｅｒを用いて実施例６Ｅの合成を繰り返し、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−ＣＭＬ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，ＣＭＬ27,40，Ｇｌｕ31，Ｄ−Ｓｅｒ33，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）のほか、その線状対応物も生成する。
【０１０６】
ＨＰＬＣおよびキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）によってペプチドの純度が約９６％であることを確認し、質量分析（ＭＳ）によって同一性を確認する。液体２次イオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）を使用して得た、この環状ペプチドの測定値４４９８．４６は、計算値の４４９８．５６と一致している。線状ペプチドの測定値は、４５１６．２７であり、計算値の４５１６．５７に対応している。
【０１０７】
ヒトＣＲＦＲ１を発現させる細胞を用いる結合アッセイは、実施例１に関して記載したとおりに実施する。線状ペプチドは、若干高めのＫiを示す。ヒトＣＲＦＲ２を発現させる、安定にトランスフェクトされた同様のＣＨＯ細胞では、その差は有意であり、環状ペプチドおよび線状ペプチドでの結果はそれぞれ、共に弱い結合しか示さない。この環状ペプチドは、ＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、末梢投与時に血圧を非常に有意に低下させる。
【０１０８】
実施例６Ｉ
ここではまたＳｅｒ33の代わりにＤ−Ａｌａを用いて実施例６Ｅの合成を繰り返し、アミノ酸配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＭＬ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−ＣＭＬ−Ｉｌｅ−ＮＨ2を有するペプチド（シクロ３１−３４）［Ａｃ−Ｐｒｏ4，Ｄ−Ｐｈｅ12，Ｎｌｅ21,38，ＣＭＬ27,40，Ｇｌｕ31，Ｄ−Ａｒａ33，Ｌｙｓ34］−ｒ／ｈＣＲＦ（４−４１）のほか、その線状対応物も生成する。
【０１０９】
ＨＰＬＣおよびキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）によってペプチドの純度が約９７％であることを確認し、質量分析（ＭＳ）によって同一性を確認する。液体２次イオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）を使用して得た、この環状ペプチドの測定値４４８２．４７は、計算値の４４８２．５７と一致している。線状ペプチドの測定値は、４５００．６１であり、計算値の４５００．５８に対応している。
【０１１０】
ヒトＣＲＦＲ１を発現させる細胞を用いる結合アッセイは、実施例１に関して記載したとおりに実施する。クローン化したｈＣＲＦＲ１は、結合した放射性リガンドが競合的に置換されたことによって判定されるように、この環状ペプチドを高い親和性で結合する。線状ペプチドは、それよりも若干高いＫiを示す。ヒトＣＲＦＲ２を発現させる、安定にトランスフェクトされた同様のＣＨＯ細胞では、その差は有意であるが、環状ペプチドと線状ペプチドでの結果はそれぞれ、両方とも弱くしか結合しないことを示す。この環状ペプチドは、ＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＲＩの分泌を刺激し、末梢投与時には血圧を非常に有意に低下させる。
【０１１１】
ＣＲＦは、下垂体−副腎皮質系を深く刺激し、脳内で広範なストレス応答の媒介となるように作用する。このようなＣＲＦ作動薬は、内因性グルココルチコイド産生が少ない、ある種の患者においてこの系の機能を刺激するのに有用なはずであり、たとえば、外部からグルココルチコイド療法を受けても下垂体−副腎皮質機能が抑制されたままである患者の下垂体−副腎機能を回復させるのに有用なはずである。
【０１１２】
学習および記憶の向上
上述のように、本発明は、患者に治療有効量のＣＲＦＲ１リガンドを投与することにより、学習および記憶を向上させる方法を提供する。そのような患者は、痴呆、または学習および記憶の喪失という症状に基づき、臨床での診断を通して確認することができる。健忘障害のある個人は、新しい情報を学習する能力を損なっており、または予め学習した情報や過去の出来事を思い出すことができない。記憶障害は、自発的な想起を必要とする課題を与えると最も明らかとなり、検査官が後で思い出すように患者に刺激を与えるときに明らかになることもある。記憶障害は、社会的または職業的役目に顕著な障害を起こすほど十分に重くなければならず、それまでの機能レベルからの有意な衰えが表われていなければならない。記憶障害は、年齢に関係していることも、疾患もしくは他の原因の結果であることもある。
【０１１３】
痴呆は、臨床的に有意な複合的な認知能力の障害を特徴とし、それまでの機能レベルからの有意な変化に表われる。新しい題材の学習不能、または予め学習した題材の忘却を伴う記憶障害には、痴呆の診断を下す必要がある。記憶は、患者に情報を記録し、憶え、思い出し、認知するよう要求することにより正式に試験することができる。痴呆の診断にはまた、次の認知障害、すなわち、失語、失行、失認、または執行能力障害の少なくとも１つが必要である。これらの、それぞれ言語、運動能力、対象認知、および抽象的思考の障害は、記憶障害と共に、職業的または社会的役目に障害を起こすほど十分に重くなければならず、それまでのより高い機能レベルからの衰えが表われていなければならない。
【０１１４】
さらに、ＣＲＦレベルと学習および記憶の障害とを相互に関連させるいくつかの生化学的試験を利用してもよい。たとえば、脳脊髄液中の遊離ＣＲＦレベルをＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって測定することができる。追加として、またはこのアッセイの代わりに、ＣＲＦ−ＢＰまたはＣＲＦレセプターに特異的な標識されたリガンドで描かれた脳画像診断を利用して、遊離のレセプターまたはＣＲＦ−ＢＰを定量することもでき、こうすると遊離ＣＲＦの減少がわかるようになる。最後に、結合していないＣＲＦに特異的なリガンドを用いる脳の画像診断を利用して、脳中遊離ＣＲＦ量を直接に評価することもできる。
【０１１５】
患者のミニメンタルステータスは、臨床医が患者に学習および記憶障害があるかを判定するのに使用する標準テストである学習および記憶のミニメンタルテスト（Ｍｉｎｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｍｏｒｙ）によって記録される（非特許文献６１）。このテストは、いくつかの簡単な課題および筆記問題を含む。たとえば、頭部外傷、コルサコフ病、または発作の患者を含む、いく例かのタイプの健忘症の患者では、「対連合」学習能力に障害がある（Ｓｑｕｉｒｅ、１９８７年）。１０組の無関係な単語（たとえば、軍隊−テーブル）を患者に読ませる。次いで、患者に、各組の最初の単語を述べたときに２番目の言葉を思い出すように要求する。記憶障害の尺度は、マッチングさせた対照群に対する、思い出された対連合単語数の減少である。これは、迅速に悪化して痴呆または健忘障害の初期段階になる種類の短期作業記憶の指標として役立つ。
【０１１６】
学習および記憶の向上とは、（ａ）リガンド阻害薬で治療した患者の作業をプラセボ群のメンバーと比べた統計的に有意な差、または（ｂ）疾患モデルに直接関係のある測定値について、作業の正常な方向への統計的に有意な変化のどちらかとなる。この戦略は、記憶を向上させる治療上有用なコリン様作用薬の同定にうまく用いられてきた。疾患の動物モデルまたは臨床例は、正常な対照と識別できる定義付けによる症状を示す。したがって、必ずしも完全な症状の逆転でなく、有効な薬物療法の尺度が重要となる。記憶病状の動物モデルおよびヒトモデルでは共に、記憶の課題作業の向上に役立つ臨床的に有効な「認知強化」薬によって向上を促進することができる。たとえば、アルツハイマー病型の痴呆および記憶喪失の患者のコリン様作用薬に代わる療法として機能する認知能力強化薬は、対連合課題などのパラダイムで短期作業記憶を有意に向上させる（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｔｅｍ、１９９１年）。記憶障害に治療によって介入するための別の潜在的な適用例として示されるのは、年齢に関係のある作業障害であり、これは、加齢マウスでの近時記憶の長期的研究によって有効にモデル化されている（ＦｏｒｓｔｅｒおよびＬａｌ、１９９２年）。
【０１１７】
動物では、有益な認知強化作用および不安に関連した潜在的な副作用があるかＣＲＦ感受性ニューロンの活性化を調べるのに利用できる学習および記憶のモデルがいくつか確立されている。認知強化作用は、モリス迷路（非特許文献６２）、Ｙ字迷路（非特許文献６３）、一方向能動的回避試験、および二方向受動的回避試験によって測定し、不安に関連する作用は、高架式十字迷路で評価する。（非特許文献６４）
【０１１８】
モリス水迷路は、学習および記憶の最も確実なモデルの１つであり、様々な薬理作用物の認知強化作用に感度がある（非特許文献６５）。この迷路で行われる課題は、動物の空間学習およびヒトの記憶固定に重要な脳領域である脳の海馬の操作に特に感度がある。さらに、モリス水迷路作業の向上は、認知強化薬としての化合物が臨床で効力を発揮する前兆である。たとえば、コリンエステラーゼ阻害薬または選択的ムスカリン性コリン作動薬による治療は、学習および記憶のモリス迷路動物モデル、ならびに痴呆のある臨床集団で学習障害を逆転させる（ＭｃＮａｍａｒａおよびＳｋｅｌｔｏｎ、１９９３年；ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｔｅｍ、１９９１年；ＭｃＥｎｔｅｅおよびＣｒｏｏｋ、１９９２年；Ｄａｗｓｏｎら、１９９２年）。その上、この動物パラダイムは、加齢に伴う障害度の増大（Ｌｅｖｙら、１９９４年）、および健忘症患者の特徴である、試験前の遅滞または干渉に対する記憶痕跡の脆弱性の増大（ＳｔｅｗａｒｔおよびＭｏｒｒｉｓ、１９９３年）を実際にモデル化している。
【０１１９】
この試験は、粉乳が加えてあるために不透明な微温水中に動物を入れる簡単な空間学習課題である。動物は、迷路内および試験空間内に置かれた視覚的な手がかりから踏み台の位置を学習するのであるが、この学習を位置の学習と呼ぶ。
【０１２０】
以下でより詳細に論じるように、１〜３日の各日につき訓練の１５分前に、各群の動物に対照溶液または１回分のリガンド阻害薬を経口投与する。対照動物は通常、３日間の訓練後に５秒から１０秒以内に踏み台に到達する。リガンド阻害薬の記憶調節作用の尺度は、この時間の変動である。リガンド阻害薬を投与した結果、シナプスＣＲＦの有用性が用量依存的に増大し、習得および記憶回復の行動が用量依存的に向上する。
【０１２１】
視覚的弁別に基づくＹ字型迷路試験は、動物の学習および記憶のもう１つの検定法である。この迷路では、迷路の２本のアームの末端が、透明なプラスチックパネルになっており、その後に４０ワットの電球がある。スタートボックスは、手動で作動させるギロチン扉によって第３のアームから隔てられている。最初のトライアルでは、すべての動物に５分間迷路を探検させ、各アームでペレット餌にありつけるようになっている。２日目に、各動物を、扉を閉めた状態のスタートボックスに入れる。扉を開けてすぐに、動物がアームを下り、両方のアームに置かれたペレットを食べるようにする。３日目に、選択地点で１本のアームが封鎖されている群、区別を示す刺激が存在しない群、開いた目標ボックスで２個のペレット餌にありつける群の３群にして動物に６回のトライアルを受けさせる。４〜１０日目に、ペレット餌のあるアームの先端で光を照らし、ここでも３つの群にして１０回試験を行う。動物がペレット餌に到達するのにかかる時間を記録する。
【０１２２】
リガンド阻害薬がＹ字型迷路において学習および記憶を向上させるのに有効であるかは、次のように試験する。４〜１０日目の各訓練トライアル単位の１５分前に、各群の動物に対照溶液または各投与分のリガンド阻害薬を経口投与する。対照動物は、５０％正確な選択をすることが予想される。記憶についての治療効力の尺度は、正確な応答の増加である。
【０１２３】
一方向能動回避試験は、動物の学習および記憶のもう１つの検定法である。この試験を使用して、年齢に関係した記憶障害の向上を評価することができる。動物をフットショック区画に置き、安全区画への開放扉を回避のための信号として使用する。簡潔に述べると、この試験では、動物を、ステンレス鋼の棒で組み立てられた格子状の床を入れてあるスキナー箱の囲いに入れる。箱の各端にある７ワットの光および音の発生器を条件刺激として使用する。ラットまたはマウスは、扉から向きがそれているフットショック区画に置くことにより最初に訓練を行う。安全区画への扉の開放と同時にショックを与える。時折、この試験を、扉を開放した後に１０秒間遅らせてショックを与えることを除き、繰り返す。動物がフットショック区画を離れるのにかかる時間を記録する。
【０１２４】
リガンド阻害薬が一方向回避において記憶および学習を向上させるのに有効であるか、または対照溶液を以下のように試験する。訓練の１５分前に動物にリガンド阻害薬を投与する。２４時間後、リガンド阻害薬をさらに投与せずに保持されているか各群を試験する。効力の尺度は、フットショック区画を離れるまでの滞在時間の短縮である。
【０１２５】
二方向受動的回避試験は、学習および記憶のもう１つの検定法である。動物をスキナー箱の安全区画に置き、動物がフットショック区画に入るとすぐに、扉が閉じ、弱いショックが与えられる。２番目の区画に入るまでの滞在時間を記録する。１日から７日後に記憶を試験する。そのときは、ショックを与えない。
【０１２６】
リガンド阻害薬が学習および記憶を向上させるのに有効であるかは、次のように試験する。訓練の直前に、各群の動物に対照溶液または各投与分のリガンド阻害薬を傾向投与する。次いで、フットショック区画に入るまでの滞在時間を測定する。
【０１２７】
高架式十字迷路試験は、明るい開かれた空間対暗い囲まれた空間を使用する接近−回避状況で不安発生応答を測定するものである。両方の空間は、高架式であり、十字の形で交差する２本の通路に仕立てられている。この種の接近−回避状況は、「情動性」の古典的な試験であり、脱抑制およびストレスを生じさせる処置に非常に感度がある。動物を迷路の中央にのせ、５分間の試験期間中に４本のアームすべてに自由に出入りさせる。各アームで過ごした時間を記録する。
【０１２８】
ヒトでは、学習および記憶を向上させる方法は、ウェクスラー記憶検査や対連合記憶課題のような試験によって測定することができる。ウェクスラー記憶検査は、認知機能および記憶容量の広く使用されている筆記試験である。正常な集団では、この標準テストの平均が１００であり、標準偏差が１５であるので、得点が１０〜１５点低いことで軽い健忘症を、２０〜３０点低いことでより重い健忘症をというように検出することができる（Ｓｑｕｉｒｅ、１９８７年）。臨床面接を行う間、ミニメンタルテスト、ウェクスラー記憶検査、または対連合学習を含むがこれだけに限らない一連の試験を適用して、記憶喪失の症候を診断する。これらの試験は、一般の認知障害と特殊な学習／記憶容量喪失の両方に対して大体の感度を備えている（Ｓｑｕｉｒｅ、１９８７年）。痴呆または健忘障害の特殊な診断は別として、これらの臨床手段では、加齢の経過に伴う精神機能の他覚的な減退を反映する、年齢に関係した認知障害で、その対象者の年齢を考えれば正常範囲内にあるものも同定される（非特許文献６６）。上述のように、本発明では、たとえば、リガンド阻害薬によって治療した患者の作業をプラセボ群のメンバーと比べて、または同じ患者に課した後続の試験と比べて、対連合試験において正常に向かう方向に統計的に有意な差があれば、学習および記憶の「向上」が存在する。
【０１２９】
摂食量の減少
上述のように、本発明は、患者に治療有効量のＣＲＦＲ１リガンドを投与することを通して摂食量を減少させる方法を提供する。ＣＲＦは、摂食量の重要な調節因子であることがわかっている。たとえば、ＣＲＦ作動薬の投与、または内在ＣＲＦレベルを上昇させる条件（たとえばストレス）によって摂食量は縮小する（非特許文献６７、非特許文献６８、非特許文献６９）。したがって、ＣＲＦの投与は、夜間の摂食量を有意に減少させ（非特許文献７０）、ラットの体重を減らし（非特許文献７１）、褐色脂肪組織中での温度応答を増大させる（非特許文献７２）。さらに、既知の最強の摂食刺激物質であるニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）の作用は、ＣＲＦレセプターリガンドを同時投与すると、効力が高まり得る。
【０１３０】
患者は、肥満している状態から確認することができる。肥満した個人は、その個人の年齢、性別、および身長で正常であるとみなされる目標体重よりも目方があり、体格指数（ＢＭＩ、体重ｋｇ／身長ｍ2として算出）が同じ基準集団の上位１５パーセント以内に入っていることにより客観的に同定することができる（非特許文献７３）。さらに、特定の個人についてＣＲＦが関与しているという証拠は、脳脊髄液中のＣＲＦレベルが低下していることを証明するか、または上述のような脳画像診断を実施することにより得ることができる。視床下部は、摂食および内分泌パラメーターに対するＣＲＦの作用を媒介する共通の脳領域であるので、下垂体ホルモン濃度の変動は、視床下部のＣＲＦレベルの変動をも反映するといえる。
【０１３１】
摂食量の減少は、食事開始の遅れ、および全体からみた食物消費時間もしくは食物消費量の縮小の両方で測定することができる（非特許文献７４）。さらに、食物選択状況下で特定の栄養素が選択されることが、飢餓感の詳細を測る補足尺度として役立つ（非特許文献７５）。
【０１３２】
２種の食欲調節動物モデルが確立されている。一方は、摂食量の単純な測定法であり、他方は、カフェテリア環境で食物の自己選択を測定するものである。最初の方法では、２４時間摂食制限を行った後、その動物の飼育かごの中で、予め秤量した分の実験食に２時間接触させる。６０分と１２０分の時点で、残っているペレットを秤量することにより接触量を測定する。このような試験は、遺伝的な突然変異のために肥満し、過食および乱れた栄養素選択の症状を有効に再現する動物で実施してもよい（非特許文献７６）。
【０１３３】
カフェテリア環境では、感覚的な魅力または摂取後の利益に基づく特別な栄養素の好みが測定されるように、食事は、炭水化物、タンパク質、脂肪など、多量栄養素の割合を様々にして特別に調製する。食物選択は、一部には、広範な種類の神経化学系によって変更される。このような試験は、渇望や暴食などの現象に影響し、神経性食欲不振症や肥満などの摂食障害の診断に関係する、摂食量調節の微妙な変化の検出に有用である。動物での基準を定めてから、試験の１５分前に各動物にリガンド阻害薬を経口投与する。カフェテリア環境で、食餌試験または食物自己選択について記載のとおりに摂食量を測定し、試験結果を基準と比較する。さらに、リガンド阻害薬が食欲調節に及ぼす作用を試験する別のモデルとなるのが、ニコチン離脱症状動物モデルおよび遺伝的肥満ラット（Ｚｕｃｋｅｒ系統）での過食である。簡潔に述べると、ニコチン離脱症状モデルでは、動物に常習的にニコチンを投与する。そのような動物では、正常な体重増加が抑制され、食物および水の摂取量が減少する。ニコチン処置を休止すると、動物の体重と食物および水の摂取量は共に有意に増加する。ニコチン離脱症状の間にリガンド阻害薬が食欲に及ぼす作用は、ニコチン休止後３日目にリガンド阻害薬を投与することにより評価する。
【０１３４】
過食の遺伝的根拠は、マウス（たとえばｏｂ／ｏｂ）とラット（Ｚｕｃｋｅｒ系統、ｆａ／ｆａ）の両方で発見されている。このような動物は、リガンド阻害薬の効力を評価する他の過食モデルにもなる。特に、Ｚｕｃｋｅｒラットが被験対象として使用される。１週間など、設定した期間にわたり、ラットの各群に毎日賦形剤またはリガンド阻害薬処置を施す。その後の体重増加または摂食量を測定する。（遺伝的に肥満でない）正常なＺｕｃｋｅｒラットを対照として利用する。リガンド阻害薬を投与すると、正常なラットよりも摂食量および体重増加が減少する。
【０１３５】
ヒトでは、肥満は過食だけに関係しているのでなく、甘いものや高脂肪食の摂取が不釣合いに多いなど、栄養のバランスを欠いた消費にも関係しているといえる。（非特許文献７７）したがって、臨床での食欲調節の証は、量、食事にかかる時間、および選択に関して摂取パターンを記録する対照実験食またはカフェテリア式自己選択プロトコルを使用して容易に検出される（非特許文献７８）。このような試験では、各個人の基準を決定した後、摂食量またはカフェテリア環境での自己選択を測定する。肥満治療に関して、向上するとは、治療を受けた患者がプラセボ群のメンバーと比べて体重減少または摂食量の縮小を示すことである。さらに、この戦略は、肥満のためのセロトニン様作動薬の同定でも成功を収めている。
【０１３６】
低ＣＲＦレベルに随伴する疾患
上述のように、本発明は、患者にリガンド阻害薬であるＣＲＦ／ＣＲＦ−ＢＰ複合体を治療有効量投与することを通して、低ＣＲＦレベルに随伴する疾患を治療する方法を提供する。その患者は、摂食障害、神経内分泌障害、およびアルツハイマー病などの認知障害の診断を通して確認できる。さらに、非定型うつ病、季節性うつ病、慢性疲労症候群、肥満、炎症疾患に対する脆弱性、心的外傷後ストレス障害、精神刺激薬の禁断症状など、ＣＲＦレベルの減少に随伴する他の状態はしばしば、甲状腺機能低下症およびストレス系活性低下のプロフィールを呈するが、これは、尿中遊離コルチゾールおよび血漿ＡＣＴＨの減少を特徴として同定される。したがって、これらの疾患および状態は、一部には、脳ＣＲＦレベルの回復または強化によって解決する見込みがあるはずである（非特許文献７９）。
【０１３７】
このような多様なヒト疾患状態の一群の特徴は、下垂体−副腎系の調節不全であり、脳ＣＲＦの撹乱が推定される。したがって、実験動物でＣＲＦ／下垂体−副腎系を実験的に交替すると、上の症候に必須の特徴、すなわち無気力（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｄｅｓｐａｉｒ）（Ｐｅｐｉｎら、１９９２年）、運動疲労（ＲｉｖｅｓｔおよびＲｉｃｈａｒｄ、１９９０年）、肥満（Ｒｏｔｈｗｅｌｌ、１９８９年）、および精神刺激薬の禁断症状に随伴する過度の覚醒状態（Ｋｏｏｂら、１９９３年；Ｓｗｅｒｄｌｏｗら、１９９１年）に必須の特徴が再現されるということは、内在ＣＲＦレベルを正常にするように設計された薬物療法の有用性が広いことを示唆している。
【０１３８】
季節性うつ病（季節にならう主要な抑うつ障害）の必須の特徴は、主うつ病発症期間が年の特徴的な時期に襲来し、緩解することである。大方の場合では、うつ病発症期間は、秋または冬に始まり、春に緩解する。季節に応じて生じる主うつ病発症期間は、しばしば顕著なアネルギー、過眠症、過食、体重増加、および炭水化物への渇望を特徴とし、抑うつ気分があるか、またはほぼすべての活動への関心もしくは喜びが喪失している期間が少なくとも２週間持続していなければならない。
【０１３９】
心的外傷後ストレス障害に必須の特徴は、自身または別の者の健全な身体が死に至り、または重い傷害を受けた事実またはその恐れを含む事象を直接個人的に経験することを含む極端な心的外傷ストレッサーに曝された後に特徴的な症候が発生することである。その事象に対する応答は、極度の不安、無力感、または恐怖感を伴わなければならない。心的外傷事象は、極度の心理的苦痛または生理的反応性の引き金となる割り込みの記憶再生または悪夢として再度経験される。完全な症候の病像は、１ヶ月より長く続き、臨床的に重要な苦痛または社会的もしくは職業的役目における障害を生じていなければならない。
【０１４０】
ニコチン離脱症状（ニコチンによって誘発される障害）に必須の特徴は、ニコチン含有製品を長期間（少なくとも数週間）日常的に使用してから使用を突然に休止し、または控えた後に発症する特徴的な離脱症状症候群が存在することである。ニコチン離脱症状の診断には、不快または抑うつ気分、不眠、被刺激性もしくは怒り、不安、集中困難、不穏状態もしくは短気、心拍数の減少、および食欲増加もしくは体重増加のうち４つ以上が確認される必要がある。これらの症状は、臨床的に重要な苦痛、または社会的職業的役目における障害を生じていなければならない。
【０１４１】
向上するとは、（ａ）疾患モデルに直接関係のある測定値について、基準または治療前の状態と比べた、治療を受けた個人の症候状態の統計的に有意な変化、または（ｂ）リガンド阻害薬によって治療した患者とプラセボ群の症候状態の統計的に有意な差である。疾患の臨床例は、当然、正常な状態とは区別される症状を示す。うつ病では、いくつかのうつ病評価尺度が使用される。（非特許文献８０を参照のこと）。試験の１つであるハミルトンうつ病評価尺度は、うつ病の評価に広く使用されており、治療に応答して生じた変化の評価にも用いられる。他の試験および尺度は、ＤＳＭ−ＩＶマニュアルで見ることができる。ニコチン離脱症状、ならびに他の障害については、障害の重症度を評価する試験がＤＳＭ−ＩＶマニュアルに出ている。
【０１４２】
アルツハイマー病
上述のように、本発明は、患者に治療有効量のＣＲＦＲ１リガンドを投与することを通してアルツハイマー病（「ＡＤ」）を治療する方法を提供する。その患者は、他の原因にあるとすることのできない痴呆、または学習能力および記憶の喪失といった症状に基づく臨床診断を通して確認することができる。さらに、磁気共鳴画像診断によって判定される脳の萎縮の診断を通して患者を同定してもよい。
【０１４３】
ＣＲＦレベルの低下のアルツハイマー病との関連が示唆されている。ＡＤに罹患している１０人の個人および神経学的に正常な１０人の対照から死後に得た脳を研究用に選択した。前頭極、頭頂極、側頭極、および後頭極の基準領域を新鮮な脳から解体し、ドライアイス中で凍らせ、−７０℃で貯蔵しておいたものを、ＣＲＦラジオイムノアッセイおよびＣＲＦ−ＢＰアッセイ用に加工した。ホルマリン固定した大脳皮質および海馬のサンプルをパラフィン中に包埋し、順次薄切し、ヘマトキシリン／エオジンおよび銀含浸で染色した。ＡＤ患者の脳の染色された切片を調べると、ＡＤに典型的な神経炎の斑および神経原線維錯綜が豊富に示されたが、対照の場合は何も示されなかった。
【０１４４】
コリン欠乏に焦点を当てた、確立されているいくつかのアルツハイマー病動物モデルが利用可能である。ＡＤにおけるコリン欠乏の主たる役割は十分に確立されている。ＡＤでは、コリンアセチルトランスフェラーゼ活性の低下と、前頭葉、後頭葉、側頭葉でのＣＲＦレベルの低下とに有意の正の相関が認められる（ＤｅＳｏｕｚａら、１９８６年）。同様に、コリンアセチルトランスフェラーゼ活性の低下と、これら３皮質中のＣＲＦ受容体数の増加とには、負の相関がある（同上）。他の２種の神経変性疾患では、パーキンソン病でＣＲＦとコリンアセチルトランスフェラーゼとにかなり有意な相関があるが、進行性核上麻痺では若干の相関しかない（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅら、１９８７年）。
【０１４５】
ラットでは、解剖研究および行動研究によってＣＲＦとコリン作用系の相互作用が証明されている。まず第１に、ある脳幹神経核では、ＣＲＦとアセチルコリンエステラーゼが共同で局在しており、またあるコリン作動性ニューロンは、ＣＲＦを含んでいる。第２に、ＣＲＦは、カルバコール誘発性の挙動を抑制し（カルバコールは、ムスカリン性コリン作用性受容体拮抗薬）、ＣＲＦがコリン作用系に影響を及ぼすことが示唆される（非特許文献８１）。別のムスカリン性コリン作用性レセプター拮抗薬であるアトロピンで処置すると、ＣＲＦレセプターが増加する（非特許文献８２）。ひとまとめにして考えると、これらのデータは、ＣＲＦとコリン作用系がヒトでも動物でも同様に相互に作用することを示している。
【０１４６】
コリン欠乏に焦点を当てたアルツハイマー病の動物モデルは、アセチルコリンによるシナプス後受容体への刺激をブロックする非選択的シナプス後ムスカリン性受容体拮抗薬であるスコポラミンを投与することにより生み出される。そのような動物では、記憶障害は、行動障害もしくは知覚障害と健忘症もしくは実験的治療による認知強化作用とを識別する受動的回避試験または位置再認試験（ｄｅｌａｙｅｄ−ｍａｔｃｈｉｎｇ−ｔｏ−ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）によって測定されるのですぐにわかる。したがって、スコポラミンによって健忘症を誘発した後にモリス迷路およびＹ字型迷路試験を利用して、記憶障害、ならびにリガンド阻害薬の投与に従う後続の強化作用を試験する。モリス迷路では、実験の設計は本質的に上述のとおりであるが、１日から３日の各日の訓練３０分前に、臭化水素酸スコポラミンのｉｐ注射（０．３ｍｇ／ｋｇ）によって処置を行うことを含むように変更する。ラットにおいては、この健忘用量のスコポラミンによって、空間および回避学習パラダイムの獲得および保持が損なわれる。リガンド阻害薬の抗健忘作用は、スコポラミンを与えた、または与えない同時対照群に関して測定する。Ｙ字迷路を使用する、スコポラミンによって誘発した健忘の逆転に対するリガンド阻害薬の作用については、上述のＹ字型迷路試験と同様に実施する。この試験の変更点は、５日から１０日目の訓練の３０分前に、臭化水素酸スコポラミンのｉｐ注射（０．３ｍｇ／ｋｇ）によって処置を行うことを含む。中枢または全身に投与されたリガンド阻害薬の抗健忘作用を、同時対照群およびスコポラミン処置対照群に関して測定する。
【０１４７】
ＡＤにおける認知行動を測定するいくつかの試験が設計されている。（非特許文献８３を参照のこと。）そのような試験の１つであるＢＣＲＳは、集中力、近時記憶、過去の記憶、見当識、任務遂行およびセルフケアを測定するものである。ＢＣＲＳは、認知機能のみを測定するように設計されている。この試験、ならびにウェクスラー記憶検査およびアルツハイマー病関連尺度（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｓｃａｌｅ）を使用して、リガンド阻害による治療処置の後に向上があったかを判定することができる。上述のように、本発明では、たとえば、リガンド阻害薬によって治療した患者の作業をプラセボ群のメンバーと比べて、または同じ患者に課した後続の試験と比べて、ウェクスラー記憶検査において正常に向かう方向に統計的に有意な差があれば、アルツハイマー病の「改善」が存在する。さらに、スコポラミンによって誘発したヒトの健忘をモデル系として使用して、リガンド阻害薬の効力を試験することができる。
【０１４８】
本発明のＣＲＦＲ１リガンドペプチドはまた、多種類の血管床中、および特に所望の組織および臓器中の血流を調節するのに治療上有用となる。これらのペプチドは、腸間膜血管床を拡張させることが予想されるので、動物、特にヒトおよび他の哺乳動物の消化管への血流を増加させるのに使用すべきはずのものである。ＣＲＦは、血管透過性を調節することが示されており（非特許文献８４）、これらＣＲＦＲ１リガンドは、血管からの漏出を低減し、損傷もしくは手術によって生じた組織の腫脹および炎症に対して有益な作用を及ぼすことにもなる。したがって、これらＣＲＦＲ１リガンドを非経口的に投与して、炎症、腫脹、および浮腫を軽減し、心臓が損傷を受けた後の体液の損失を低減することができる。
【０１４９】
ｏＣＲＦ、ｒ／ｈＣＲＦ、ウロテンシンＩ、およびソーバジンは、胃酸の産生を抑制することが示されており、本発明のＣＲＦＲ１リガンドは、哺乳動物において、胃酸の産生を低下させ、かつ／または特定の胃腸機能を抑制することにより胃潰瘍の治療にも有効である見込みがあると考えられる。
【０１５０】
これらＣＲＦＲ１リガンドペプチドは、適切な投与を行った後に身体機能をモニターすることにより、内分泌系または中枢神経系の病態が疑われる哺乳動物の視床下部下垂体副腎機能を評価するのに使用してもよい。たとえば、抑うつ性疾患のようなクッシング病および情動障害を評価する診断ツールとして投与を利用することができる。
【０１５１】
ＣＲＦＲ１リガンドまたはその非毒性の付加塩は、通常、薬剤として、または動物用として許容される担体と合わせて、ヒトを含む哺乳動物に投与されるはずである。本明細書では、用語「薬剤として許容される」、「生理的に許容される」、およびその文法上の変形語は、組成物、担体、希釈剤、および試薬を指す限り、交換して使用することが可能である。好ましいことに、この物質は、悪心、めまい、胃の不調など、望ましくない生理的影響を生じることなく、哺乳動物に投与することができる。このペプチドは、純度を少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９７％とすべきである。患者には治療有効量が投与されるはずであるが、治療有効量とは、脳中遊離ＣＲＦレベルの上昇、学習および記憶の向上、摂食量の減少、脳中ＣＲＦ神経回路の活性化、低脳ＣＲＦレベルに随伴する疾患の治療、アルツハイマー病に随伴する症状の治療、肥満治療、非定型うつ病の治療、物質乱用離脱症状の治療、産後うつ病または年齢に関係した記憶喪失の治療のいずれかの所望の作用を実現するために算出された量である。当分野の技術者には、その特定の治療に応じて、さらにまたペプチドリガンド阻害薬もしくは非ペプチドリガンド阻害薬のどちらを投与するかに応じて、投与経路が様々に変わることがわかるであろう。投与経路は、非侵襲的または侵襲的（ｉｎｖａｓｉｖｅ）でよい。非侵襲的投与経路には、経口、頬側／舌下、直腸、経鼻、（経皮および点眼（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）を含む）局所、経膣、膀胱内、および経肺投与が含まれる。侵襲的投与経路には、ＩＣＶ、動脈内、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、くも膜下、および眼内投与が含まれる。
【０１５２】
動物での脳室内（ＩＣＶ）注射は、次のように行う。動物にハロタンで麻酔をかけ、ＫＯＰＦ定位固定装置に固定する。側脳室の上方に向けたガイドカニューレを、２本のステンレス鋼製スクリューおよび歯科用セメントを用いて頭蓋骨にはめ込み、固定する。注射するには、６０ｃｍのＰＥ１０管材料に取り付けた３０ゲージのステンレス鋼製カニューレを、ガイドを通してその先端の１ｍｍ先にまで挿入する。流れができるまで単に管材料を動物の頭より上に持ち上げることにより、２マイクロリットルのリガンド阻害薬を重力流によって１分間かけて注入する。他の投与経路についての手順は、当技術分野でよく知られている。
【０１５３】
求められる投与量は、治療対象となる特定の状態、その状態の重症度、および所望の治療に要する期間によって様々となり、１日に多種類の投与を使用することもある。非経口投与では、ラッカセイ油溶液、水性プロピレングリコール溶液、または無菌水溶液を使用することができる。静脈内、筋肉内、皮下（ｓ．ｃ．）、および腹腔内投与には、適切に緩衝剤処理を施した水溶液が特に適する。無菌の水性媒質は用意に入手可能であり、ｓ．ｃ．投与については、トウモロコシ油または３〜６％のマンニトール溶液が好ましいといえる。このペプチドは、しばしば酸の付加塩や金属錯体など、薬剤として許容される非毒性の塩の形で投与される。トリフルオロ酢酸およびパモ酸の塩が好ましいといえる。
【０１５４】
このペプチドは、医師の指導のもと、１回用量または複数回用量として投与されるはずであり、薬剤組成物は、通常、このペプチドと共に、慣用の薬剤として許容される担体を含有する。そのような担体は、当技術分野でよく知られており、通常は非毒性の塩および緩衝液を含有している。そうした担体は、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝食塩水のような緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース、マンニトール、デキストランなどの炭水化物；グリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡやグルタチオンなどのキレート剤、補助剤、および保存剤を含むこともある。許容される非毒性の塩には、酸の付加塩、またはたとえば亜鉛、鉄、カルシウム、バリウム、マグネシウム、アルミニウムなどとの金属錯体（本出願の意図では、付加塩であるとみなす）が含まれる。そのような酸の付加塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、タンニン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、アルギン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。活性成分を錠剤の形で投与しようとする場合、錠剤は、トラガカント、コーンスターチ、ゼラチンなどの結合剤；アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含有していてよい。液体形態での投与が所望される場合、甘味剤および／または着香剤を使用してもよく、等張性食塩水、リン酸緩衝溶液などで静脈内投与を行ってもよい。
【０１５５】
有効な投与量は、一般に、医師に広く知られているような、意図する投与経路や、患者の年齢、体重などの他の要因だけでなく、治療対象となる疾患に応じても変わる。通常、投与量は、１日に宿主動物の体重キログラムあたりペプチド約０．０１から約１０ミリグラムとなる。ある適応症の治療では、最高で約１００ｍｇ／ｋｇまでの１日投与量を用いることができる。１日投与量は、１回分として投与しても、最高で３回分まで分割して投与してもよい。
【０１５６】
上述のように、ＣＲＦレセプターは、現在はクローン化されており、特許文献１７に記載されているように、ＣＲＦレセプターを使用する結合親和性試験および結合アッセイを、はじめに同定または合成したペプチドを用いて容易に実施し、そのペプチドに有効なＣＲＦＲ１リガンドである見込みがあるか判定することができる。ＣＲＦおよび／またはＣＲＦレセプターと相互に作用する潜在的な薬物を求めて、このようなレセプターアッセイをふるい（ｓｃｒｅｅｎ）として使用することができる。
【０１５７】
本明細書では、温度はすべて℃であり、比率はすべて体積比である。液体物質の百分率も体積比である。
【０１５８】
発明者にそれまでにわかっている最良の方式となる好ましい実施形態に関して本発明を説明してきたが、添付の特許請求の範囲で述べる本発明の範囲から逸脱することなく、当分野の技術者に明らかとなるような様々な変更および修正を行ってもよいことを理解されたい。これまでに言及した米国特許の開示をすべて参照により本発明に組み込むことを明示しておく。