(57)【要約】Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのＳｄｒＧタンパク質を認識および結合するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、より詳細には、ＳｄｒＧタンパク質、すなわち、ＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３タンパク質（アミノ酸５０〜５９７）、ＳｄｒＧ  Ｎ２Ｎ３タンパク質（アミノ酸２７３〜５９７）およびＳｄｒＧ  ＴＲ２（アミノ酸２７３〜５７７）として同定されるＮ２Ｎ３の短縮バージョンの特定のドメインを認識する抗体が提供される。本発明の抗体ならびにこれらの抗体を組み込む薬学的組成物は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌によって引き起こされる感染を処置または予防する際に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３、ＳｄｒＧ  Ｎ２Ｎ３およびＳｄｒＧ  ＴＲ２からなる群より選択されるＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来のタンパク質を認識する単離された抗体。
【請求項２】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗体が、キメラ、マウス、ヒト化およびヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される型のものである、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
抗体が単鎖モノクローナル抗体である、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記抗体が、ヒトまたは動物におけるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染を妨げる、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、ブドウ球菌のフィブリノゲンへの結合を抑制する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、ヒトまたは動物における非経口、経口、鼻腔内、皮下、エアゾールまたは静脈内投与に適している、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
抗体がＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＳｄｒＧタンパク質に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
抗体が、配列番号２、配列番号４および配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列を認識する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が、配列番号１、配列番号３および配列番号５ならびにその縮重体(degenerate)からなる群より選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を認識する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体を含む単離された抗血清。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体およびその抗体による結合を検出するための手段を備える診断キット。
【請求項１３】
結合を検出するための前記手段が、抗体に結合した検出可能な標識を含む、請求項１２に記載の診断キット。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体の有効量を、ヒトまたは動物患者に投与することを包含する、コアグラーゼ陰性のブドウ球菌感染を処置または予防する方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗体の有効量および薬学的に許容されるビヒクル(vehicle)、担体または賦形剤(excipient)を含む、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌を処置または予防するための薬学的組成物。
【請求項１６】
配列番号８のタンパク質配列を認識する単離された抗体。
【請求項１７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
ヒトまたは動物患者に請求項１６に記載の抗体の有効量を投与することを包含する、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染を処置または予防する方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の抗体の有効量および薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤を含む、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌を処置または予防するための薬学的組成物。
【請求項２０】
配列番号９のアミノ酸配列を認識する単離された抗体。
【請求項２１】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
ヒトまたは動物患者に請求項２０に記載の抗体の有効量を投与することを包含する、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染を処置又は予防するための方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の抗体の有効量および薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤を含む、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌を処置または予防するための薬学的組成物。
【請求項２４】
ＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３、ＳｄｒＧ  Ｎ２Ｎ３およびＳｄｒＧ  ＴＲ２からなる群より選択される、単離されたＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓタンパク質。
【請求項２５】
ヒトまたは動物に請求項２４に記載の単離されたタンパク質の免疫学的有効量を投与することを包含する、ヒト又は動物における免疫原性反応を引き出す方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の単離されたタンパク質の免疫原性量および薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤を含むワクチン。
【請求項２７】
タンパク質が、配列番号２、配列番号４および配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の単離されたタンパク質。
【請求項２８】
タンパク質が、配列番号１、配列番号３および配列番号５ならびにその縮重体からなる群より選択される核酸配列によってコードされる、請求項２４に記載の単離されたタンパク質。
【請求項２９】
ＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３、ＳｄｒＧ  Ｎ２Ｎ３およびＳｄｒＧ  ＴＲ２からなる群より選択される、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓタンパク質をコードする単離された核酸配列。
【請求項３０】
配列番号１、配列番号３および配列番号５ならびにその縮重体からなる群より選択される配列を有する、請求項２９に記載の単離された核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、２００２年３月５日に出願された、米国仮出願シルアル番号６０／３６１，３２４の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、微生物学、分子生物学、および免疫学の分野に関連し、より詳細には、新たに同定されたモノクローナル抗体、モノクローナル抗体の使用、ならびにこのようなモノクローナル抗体の産生およびヒトおよび動物におけるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染を予防、処置または診断するためのモノクローナル抗体をコードするＤＮＡで形質転換した組換え宿主細胞に関する。本発明は、マウス、キメラ、ヒト化およびヒトモノクローナル抗体、ならびにフラグメント、領域およびその誘導体を含む。さらに、本発明は、ＳｄｒＧタンパク質の特定のドメインに対して産生されたポリクローナル抗体に関連し、これは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染を処置又は予防する際に有用である。本発明において詳細に説明される抗体は、ＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３、Ｎ２Ｎ３およびＴＲ２のようなＳｄｒＧタンパク質から生成され、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのようなコアグラーゼ陰性ブドウ球菌によって発現されるフィブリノゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）タンパク質であるＳｄｒＧを特異的に認識する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのようなコアグラーゼ陰性ブドウ球菌は、一般的に、ヒト皮膚の無毒性の片利共生生物であり、末梢および中心静脈カテーテル、補綴心臓弁、人工関節、および他の補綴デバイスの感染の主要な病原体(etiologic agent)である。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  菌血症は、１０〜３４％の寄与死亡率を有し、８日間の過剰な病院滞在を生じ、１ケース当たり６，０００ドル以上に達するこのような滞在の費用がかかる。院内病原体としてのその重要性にかかわらず、これらの感染の病原性およびこの生物の毒性決定基(determinant)について、比較的知られていない。体内に留置した(indwelling)医療デバイスの最初の局在化感染は、敗血症、骨髄炎および心内膜炎のようなより重篤な侵襲性感染を導き得る。血管カテーテルは、皮膚表面からカテーテルの経皮部分への移動によって、微生物がデバイス、従って血流へのアクセスを得る場合に、感染になると考えられる。医療デバイスに関連する感染において、プラスチックおよび金属表面は、移植直後に、宿主血漿ならびにフィブリノゲン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンのようなマトリックスタンパク質でコーティングされる。
【０００４】
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌のこれらのタンパク質に接着する能力は、感染を開始するために極めて重要であることが、現在十分に確立されている。細菌または微生物の接着は、補綴デバイス感染の病原性における第１の重要な工程であると考えられている。多数の因子が、生物の補綴材料に接着する能力に影響する。これらとしては、微生物および生体材料の特徴、および室温環境の性質が挙げられる。生物と宿主との間の最初の誘因(attraction)は、表面電荷、極性、ファンデルワールス力および疎水性相互作用のような非特異的な力によって影響される。接着の重要な段階は、ＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）タンパク質と固定された宿主タンパク質との間の特定の相互作用を含む。
【０００５】
現在までのところ、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の生体材料への接着に関する調査は、それ自体、細胞外多糖または糖衣（粘液としても知られている）の役割と主に関連している。しかし、集中的な研究にもかかわらず、疾患の病原性における粘液の提唱される役割またはその組成でさえ、議論されるままである。Drewry. D. T., L Gailbraith. B. I. Wilkinson, and S. G. Wilkinson. 1990. Staphylococcal Slime: A Cautionary Tale, I.Clin. Microbiol28: 1292-1296.  現在、細胞外粘液は、感染の接着および持続性の後期の段階において、役割を果たしていると考えられる。これは、局所的な栄養環境を最適化するためのイオン交換樹脂として機能し得、抗生物質のマクロコロニーへの浸透を防ぎ、食作用性宿主防御細胞から細菌を保護する。Ｐｅｔｅｒｓらは、電子顕微鏡研究によって、細胞外多糖が接着の後期段階に出現し、接着の初期段階の間に存在しないことを示した。O. Peters, R. Locci. And G. Pulverer. 1982. Adherence and Growth of Coagulase-Negative Staphylococci on Surfaces in Intravenous Catheters. I. Infect. Dis. 65146:479-482. Ｈｏｇｔらは、反復洗浄による細胞外粘液層の除去が、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの生体材料に接着する能力を減少させないことを示した。Hogt. A. H., I. Dankert, I. A. DeVries. And I. Feijen, 1983. Adhesion of Coagulase-Negative Staphylococci to Biomaterials. J. Gen. Microbial. 129:2959-2968.
従って、細胞外多糖またはエキソ多糖(exopolysaccharide)の研究は、細菌による最初の接着の防止にほとんど手を貸さなかった。いくつかの他の研究は、Ｔｏｊｏらによって観察される多糖接着（ＰＳ／Ａ）を含むＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの他の潜在的な接着を同定した（Tojo, M., N. Yamashita, D. A. Goldmann. And G. B. Pier, 1899. Isolation and Characterization of a Capsular Polycaccharide Adhesin 10 from Staphylococcus epidermidis. J. Infect. Dis. 157:713-722;およびChristensenらの粘液関連抗原（ＳＡＡ）、Christensen. G. D., Barker, L. P., Manhinnes, T. P., Baddour, L. M., Simpson. W. A. Identification of an Antigenic Marker of Slime Production for Staphylococcus epidemidis. Infect Immun. 1990;58:2906-2911.。
【０００６】
ＰＳ／Ａは、単糖の複雑な混合物であり、精製されたＰＳ／Ａは、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのＰＳ／Ａ産生株の接着をブロックすることが実証されている。心内膜炎の動物モデルにおいて、ＰＳ／Ａに対する抗体は、保護的であった。しかし、抗体の抗接着効果に関連してかまたは血液保有細菌のオプソノファゴサイトーシス（opsonophagocytosis）の効率におけるより一般化された増加に起因して、この保護的な効果が特異的であるか否かについて明らかではない。１つ以上のこれらの接着因子(adhesin)を用いる接着プロセスの異なる段階における各機能は、最初の誘因を担い、一方、他は、マクロコロニーにおける凝集に必要とされると仮定されている。これらの全ての研究に関わらず、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの生体材料への最初の接着に関与する因子は、主として未知のままであり、感染の第１の段階、接着を防止するための実践的な方法もまた等しく未知である。
【０００７】
医療分野における別の特定の問題は、ＳｄｒＧ  ｍＡｂでの受動的な免疫化によって低出生体重児（ＬＢＷ）におけるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染の予防および/または処置である。ＬＢＷ乳児は、５００〜１５００ｇの間で生まれた乳児として定義される。胎盤を介する保護的な母の抗体の十分な移入が生じる前に、未熟な乳児は生まれる。不十分な抗体、診断目的のための血液喪失、より効果的でない食作用、抗微生物処置由来の選択圧力下での腸内微生物の過増殖、および体内に留置したカテーテルによる他に無菌の部位の繰り返される侵入の組み合わせは、この攻撃されやすい集団における非常に高い院内感染率の理由のいくつかである。
【０００８】
従って、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌による感染を処置および予防する組成物および方法を開発する挑戦が残ったままであり、そして特に、攻撃されやすい新生児における院内感染を処置または予防する非常に大きな必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのようなコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からＳｄｒＧのような表面タンパク質を認識しそして結合し得るモノクローナル抗体を提供することが、本発明の目的である。
【００１０】
低出生体重児（ＬＢＷ）における院内のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染の処置または予防において利用され得る組成物および方法を開発することが、本発明のさらなる目的である。
【００１１】
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌ＳｄｒＧタンパク質および他のフィブリノゲン結合タンパク質を認識し得、従ってブドウ球菌感染を処置または予防する方法および組成物において使用され得る、モノクローナル抗体を提供することが本発明のなおさらなる目的である。
【００１２】
Ｎ１Ｎ２Ｎ３タンパク質、Ｎ２Ｎ３タンパク質、またはその短縮バージョン(truncated version)のようなＳｄｒＧタンパク質ドメインから抗体を産生すること、ヒトおよび動物における感染を処置または予防する方法においてこれらの抗体を利用することは、本発明のなお別の目的である。
【００１３】
これらおよび他の目的は、本発明によって提供され、これは、Ｎ１Ｎ２Ｎ３（アミノ酸５０〜５９７）およびＮ２Ｎ３（アミノ酸２７３〜５９７）として同定されるＳｄｒＧ領域またはＳｄｒＧ  ＴＲ２（アミノ酸２７３〜５７７）として同定されるその短縮バージョンに由来するＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＳｄｒＧタンパク質からのモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の産生を包含し、これらは、ＳｄｒＧタンパク質を認識しそして結合し得、感染を処置または予防する組成物および方法において使用され得る。さらに、本発明は、本発明の抗体の他の使用を包含し、これは、適切なワクチンの調製、医療装置および補綴デバイスにおける感染の防止、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の感染を同定するために使用されるキットの提供を含む。
【００１４】
開示された発明の精神及び範囲内である、これらの実施形態および他の代替物および改変は、本発明の明細書および/または本明細書中に援用される参考文献を読むことから、当業者に容易に明らかであり、これらの全てが参考として援用される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明に従って、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのようなコアグラーゼ陰性細菌のＳｄｒＧタンパク質に結合し得る抗体が提供され、これは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対して保護することが示されている。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、単鎖、二重特異性、サル化(simianized)、およびヒト化または霊長類化抗体ならびにＦａｂフラグメント（例えば、Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含む、ＳｄｒＧタンパク質に対する抗体の結合特異性を維持するフラグメント）を含む。抗体のこれらの型のいずれの産生も、以下に記載されるような当業者に周知の適切な手段によって達成され得る。以下にさらに説明されるように、これらの抗体は、Ｎ１Ｎ２Ｎ３（アミノ酸５０〜５９７）およびＮ２Ｎ３（アミノ酸２７３〜５９７）として同定されるＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＳｄｒＧ領域ならびにＴＲ２（アミノ酸２７３〜５９７）として同定されるＮ２Ｎ３タンパク質の短縮バージョンから産生され、これらを認識し、従ってこれらに結合し得る。最近示されるように、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、ＷＯ００／１２６８９として公開される係属中の米国シリアル番号０９／３８６，９６２（本明細書中に参考として援用される）を含む同時係属中の特許出願に示されるようなＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）タンパク質に構造的に関連する表面タンパク質を含む。さらに、ブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）タンパク質に関する他の情報は、ＷＯ００／１２１３２として公開される米国シリアル番号０９／３８６，９６０およびＷＯ００／１２１３１として公開される米国シリアル番号０９／３８６，９５９（本明細書中に全て参考として援用される）において開示される。ＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）タンパク質に関するさらなる情報は、米国特許第６，２８８，２１４号（本明細書中に参考として援用される）において開示される。
【００１６】
例えば、ＷＯ００／１２６８９において開示されるようなＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来のタンパク質の１つ（すなわち、ＳｄｒＧ（セリン−アスパルテート反復Ｇタンパク質）として同定されるもの）は、細胞壁に係留するグラム陽性細菌タンパク質に代表的な特徴を有する。このタンパク質は、５００アミノ酸長のＡ領域、ＳＤジペプチド反復領域を含むＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣｌｆＡおよびＣｌｆＢに対する有意なアミノ酸配列相同性を示し、ＬＰＸＴＧモチーフを含む、細胞壁係留に必要とされる特徴を有する。
【００１７】
現在までのところ、ＳｄｒＧを特異的に認識し、高い親和性（＞１０8ＫD）を示し、そして疾患の動物モデルにおいて保護的であるモノクローナル抗体は、記載されていない。従って、本発明は初めて、ＳｄｒＧを特異的に認識し、高い親和性でそれを結合し得、ブドウ球菌感染に対して保護的であることが示されているモノクローナル抗体を提供する。
【００１８】
本発明に従って、そして以下にさらに記載されるように、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＳｄｒＧタンパク質のアミノ酸５０〜５９７におけるＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３タンパク質、ＳｄｒＧ  Ｎ２Ｎ３タンパク質（アミノ酸２７３〜５９７）および短縮バージョンＴＲ２タンパク質（アミノ酸２７３〜５９７）を認識する抗体が産生され、このような抗体は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染を処置又は予防する組成物および方法において使用され得る。本発明の第１の局面において、ＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３、Ｎ２Ｎ３およびＴＲ２の単離されたかそして/または精製されたバージョンは、以下に記載されるような任意の適切な様式で、本発明に従って得られ得る。これらのタンパク質の核酸及びアミノ酸配列は、以下に示される：
ＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３（５０〜５９７）：
ヌクレオチド配列（配列番号１）
【００１９】
【化１】
2005536185.tif 000002
アミノ酸配列（配列番号２）
【００２０】
【化２】
2005536185.tif 000003
ＳｄｒＧ  Ｎ２Ｎ３（２７３〜５９７）：
ヌクレオチド配列：（配列番号３）
【００２１】
【化３】
2005536185.tif 000004
アミノ酸配列（配列番号４）
【００２２】
【化４】
2005536185.tif 000005
ＳｄｒＧ  ＴＲ２（２７３〜５７７）：
ヌクレオチド配列（配列番号５）
【００２３】
【化５】
2005536185.tif 000006
アミノ酸配列（配列番号６）
【００２４】
【化６】
2005536185.tif 000007
従って、本発明は、配列番号２、配列番号４または配列番号６のような配列を有する上記のような単離されたタンパク質、ならびに核酸配列  配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５またはその縮重体によってコードされる単離されたタンパク質を包含する。さらに、以下に更に記載されるように、本発明は、これらのタンパク質から抗体を惹起すること、およびタンパク質の免疫原性量の投与によってヒトまたは動物における免疫応答を引き出すことを包含する。
【００２５】
以下により詳細に示されるように、本発明のモノクローナルおよびポリクローナル抗体は、当業者に周知の多数の適切な方法で調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生するために一般的に使用される十分に確立されたケーラーおよびミルスタイン法を使用して調製され得る。１つのこのような適切な方法において、マウスは、ＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３もしくはＳｄｒＧ  Ｎ２Ｎ３ドメインまたは上に参照されるその短縮バージョンのＴＲ２のような精製された組換えタンパク質で、延長された期間腹腔内注射され、続いて、精製されたタンパク質またはフラグメントに対する反応性を決定するために免疫されたマウスから得た血液を試験し得る。試験されるタンパク質に反応性であるマウスの同定後、マウス脾臓から単離したリンパ球を、マウス骨髄腫細胞に融合して、これらのタンパク質に対する抗体について陽性であるハイブリドーマを産生し、これらは、次いで単離され、培養され、続いて精製およびアイソタイプ決定(isotyping)される。
【００２６】
例えば、J. Biol. Chem. 1999, 274, 26939-26945（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、本発明に従う遺伝子フラグメント（例えば、ＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３タンパク質（アミノ酸５０〜５９７）、ＳｄｒＧ  Ｎ２Ｎ３タンパク質（アミノ酸２７３〜５９７）またはその短縮バージョンＴＲ２（アミノ酸２７３〜５７７）に対応するもの）を得るための１つのこのような適切な手段は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＱＥ−３０を使用するサブクローニングおよびＥ．ｃｏｌｉのＪＭ１０１株を使用する形質転換を介して、ＰＣＲを使用して増幅されるプロセスを使用する。
【００２７】
特定の実施例において、本発明のタンパク質は、ＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３（アミノ酸５０〜５９７を示す）またはＳｄｒＧ  Ｎ２Ｎ３（アミノ酸２７３〜５９７を示す）またはその短縮バージョンＴＲ２（アミノ酸２７３〜５７７）がＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  Ｋ２８ゲノムＤＮＡ（上記の配列に由来する）から増幅され、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターＰＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ）にサブクローニングされるＰＣＲプロセスにおいて得られ、これは、６つのヒスチジン残基を含む組換え融合タンパク質の発現を可能にする。このベクターは、引き続き、Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＡＴＣＣ５５１５１）に形質転換され、０．７の光学密度（ＯＤ600）まで、１５リットルの発酵槽中で増殖し、０．２ｍＭイソプロピル−１−β−Ｄガラクトシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導した。細胞を、ＡＧ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの中空糸アセンブリ（０．４５μｍの孔サイズ）を使用して収穫し、そして細胞ペーストを−８０℃で凍結した。細胞を、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ＠１１００ｐｓｉを２回通過を使用して、１×ＰＢＳ（１０ｍｌ緩衝液/細胞ペースト１ｇ）中で溶解した。溶解した細胞を、１７，０００ｒｐｍで３０分間スピンダウンして、細胞残渣を除去した。上清を、０．１Ｍ  ＮｉＣｌ2でチャージした５ｍｌのＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに通した。ローディング後、カラムを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（緩衝液Ａ）の５カラム容量で洗浄した。タンパク質を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール（緩衝液Ｂ）の０〜１００％の勾配を使用して、３０カラム容量で溶出した。ＳｄｒＧＮ１Ｎ２Ｎ３、ＳｄｒＧＮ２Ｎ３またはＴＲ２を、約１３％の緩衝液Ｂ（約２６ｍＭのイミダゾール）で溶出した。２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。ＳｄｒＧＮ１Ｎ２Ｎ３、ＳｄｒＧＮ２Ｎ３またはＴＲ２を含む画分を１×ＰＢＳ中で透析した。
【００２８】
次いで、タンパク質を、内毒素除去プロトコルを行った。このプロトコル間に使用される緩衝液を、５ｍＬのＭｏｎｏ−Ｑセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに通すことによって内毒素フリーとした。タンパク質を、４×１５ｍＬチューブ間で、均等に分配した。各チューブの容量を、緩衝液Ａで９ｍＬにした。１ｍＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を、各チューブに添加して、回転しながら４℃で１時間インキュベートした。チューブを、相を分離するために３７℃のウォーターバス中に配置した。チューブを２，０００ｒｐｍで１０分間スピンダウンし、各チューブ由来の上側の水相を回収し、界面活性剤抽出を繰り返した。２回目の抽出由来の水相を合わせて、５ｍＬのＩＤＡキレート化（Ｓｉｇｍａ）カラムを通し、０．１Ｍ  ＮｉＣｌ2でチャージして、残りの界面活性剤を除去した。タンパク質を３カラム容量の緩衝液Ｂで溶出する前に、カラムを、９カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。溶出液を、５ｍＬのＤｅｔｏｘｉｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）カラムに通し、フロースルーを回収し、カラムに再び適用した。第２の通過由来のフロースルーを回収し、１×ＰＢＳ中で透析した。精製された生成物を、マウスへの投与の前に、濃度、純度および内毒素レベルについて分析した。
【００２９】
上に示されるように、本発明に従うモノクローナル抗体の産生は、この分野において従来使用される一般的なケーラーおよびミルスタイン(Kohler and Milstein)のような当業者に周知の多数の従来の方法のいずれかを使用して進行し得る。本発明のモノクローナル抗体を調製するための１つの特定の実施例において、Ｅ．ｃｏｌｉによって発現されそして精製されるＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３、Ｎ２Ｎ３またはＴＲ２）タンパク質は、マウスモノクローナル抗体のパネルを作製するために使用され得る。手短に言うと、Ｂａｌｂ／ＣまたはＳＪＬマウスの群は、溶液またはアジュバントと混合した溶液中、１〜１０ｍｇのタンパク質の一連の皮下免疫化を受ける。犠牲の時点（ＲＩＭＭＳ）またはブースト(boost)（従来の）の７日後において、血清を回収し、ＭＳＣＲＡＭＭまたは全細胞（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）に対して、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて力価決定した。最後のブーストの３日後、脾臓またはリンパ節を取り出し、掻き裂いて単一細胞懸濁液とし、リンパ球を収穫した。次いで、リンパ球を、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８０）に融合した。細胞融合、引き続くプレーティング、およびフィーディング(feeding)を、Current Protocols in Immunology(Chapter 2, Unit 2.)からのモノクローナル抗体の産生プロトコルに従って実施した。
【００３０】
融合から産生した任意のクローンについて、次いで、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異的な抗ＳｄｒＧ抗体産生についてスクリーニングした。陽性クローンを拡大し、フローサイトメトリーによる全細菌細胞結合アッセイ中の活性、およびＢｉａｃｏｒｅ分析によるフィブリノゲン−Ｃｌｆ４０結合のＳｄｒＧ結合/阻害についてさらに試験した。分析の間ずっと、流速は、１０ｍｌ/分で一定であった。ＳｄｒＧＮ１Ｎ２Ｎ３、ＳｄｒＧＮ２Ｎ３またはＴＲ２注射の前に、試験抗体を、ＲＡＭ−Ｆｃ結合を介してチップに吸着させた。０時間において、３０ｍｇ/ｍｌの濃度のＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３、ＴＲ２またはＮ１Ｎ２Ｎ３）を、３分間、チップに注射し、続いて２分間解離した。分析のこの段階は、Ｍａｂ／ＳｄｒＧ相互作用の相対的な結合および解離速度論を測定した。この分析の第２段階において、ＳｄｒＧに結合したＭａｂの、フィブリノゲンと相互作用しそして結合する能力を測定した。１００ｍｇ/ｍｌの濃度のフィブリノゲンを、チップに注射し、３分後に報告ポイントをとった。
【００３１】
上に参照されるようなモノクローナル抗体の産生後、これらの抗体を、全細菌に結合するそれらの能力について試験した。これらの試験において、細菌サンプル（ＨＢ、９１４２またはＳｄｒＧ／Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）を回収し、洗浄し、そしてウサギＩｇＧ（５０ｍｇ/ｍｌ）でのブロッキング後、ＭａｂまたはＰＢＳ単独（コントロール）と共に２ｍｇ/ｍｌの濃度でインキュベートした。抗体とのインキュベーション後、細菌細胞を、検出抗体として機能するヤギ−Ｆ(ab')2−抗マウス−Ｆ(ab')2−ＦＩＴＣと共にインキュベートした。抗体標識後、細菌細胞を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒフローサイトメーターを通して吸引し、蛍光放出を分析した（励起：４８８、放出：５７０）。各細菌株について、１０，０００の事象を回収し、測定した。
【００３２】
これらの試験より、ＳｄｒＧ陽性ハイブリドーマは、増殖陽性ウェルの０．６〜１０％の頻度で産生されることが示された。ＳｄｒＧ  ＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマのいくつかはまた、Ｂｉａｃｏｒｅ分析およびフローサイトメトリーによる全細胞細菌結合に陽性であった。制限された分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ陰性、ＳｄｒＧ  ＥＬＩＳＡ陽性クローンが、全細胞結合フローサイトメトリーアッセイにおいて一貫して陰性であることを示した。この分析から、ＳｄｒＧ  ＥＬＩＳＡ陽性、ＳｄｒＧ  Ｂｉａｃｏｒｅ陽性及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ／ＳｄｒＧについてフローサイトメトリー陽性である増殖陽性ハイブリドーマウェルの非常に少数の亜集団が、クローン化された単一細胞であり、そして、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染モデルに対する潜在的な効力についての候補として特徴付けられた。これらの試験は、本発明に従って産生されるモノクローナル抗体が、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓによる感染を阻害または予防する際に効果的であり、従って、以下に更に示されるように、多数の治療的適用および他の有用な適用において使用され得ることを示した。
【００３３】
モノクローナル抗体に加えて、本発明はまた、上に示されるようなＳｄｒＧタンパク質からポリクローナル抗体を産生すること、ならびに本明細書中に記載されるようなＳｄｒＧタンパク質を認識し得る抗体を産生する他のタンパク質を意図する。このようなポリクローナル抗体は、例えば、適切な動物宿主に本明細書中に記載されるような精製されたＳｄｒＧタンパク質を導入し、続いて、宿主動物中で生成される産生された抗体を単離および精製するような、当業者に周知の多数の適切な方法のいずれかで産生され得る。一般に、本発明に従う抗体を産生するタンパク質の単離されそして/または精製された組換え形態を使用することが好ましいが、これらのタンパク質の天然の単離および/または精製形態由来の抗体も同様に産生され得る。
【００３４】
従って、本発明に従って、抗体は、ＳｄｒＧタンパク質Ｎ１Ｎ２Ｎ３、Ｎ２Ｎ３およびＴＲ２から産生される抗体であり、このような抗体は、ＳｄｒＧタンパク質ならびにさらに以下に記載されるようなタンパク質を含むＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来の他のフィブリノゲン結合タンパク質を認識および結合し得る。本発明の単離された抗体およびタンパク質はまた、多数の治療的適用において利用され得、そしてこのような適用は、以下により詳細に記載される。
【００３５】
ワクチン、ヒト化抗体およびアジュバント
本発明の単離された抗体、または上に記載されるような単離されたタンパク質はまた、更に以下に記載されるような、細菌感染に対する能動的および受動的免疫化のためのワクチンの開発において利用され得る。さらに、創傷に薬学的組成物として投与する場合、またはインビトロおよびインビボでの医療デバイスまたはポリマー生体材料をコーティングするために使用される場合、本発明の抗体は細菌のコラーゲンへの結合をさらに制限および阻害し、従って感染の程度および広がりを制限する、これらの抗体の能力に起因して、先の感染が存在する場合に有用であり得る。
【００３６】
さらに、抗体は、必要に応じて改変され得、その結果、特定の場合において、投与される患者において、あまり免疫原性ではない。例えば、患者がヒトである場合、抗体は、例えば、Jones et al., Nature 321:522-525(1986)またはTempest et al. Biotechnology 9:266-273(1991)によって記載されるようなヒトモノクローナル抗体にハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域を移植することによって「ヒト化」され得るか、または例えば、Padlan, Molecular Imm. 28:489-498(1991)（これらの参考文献は、本明細書中に参考として援用される）によって記載されるような相同なヒトフレームワークの対応箇所を模倣する免疫グロブリン可変領域における表面露出したマウスフレームワーク残基を変更することによって「表面を模倣(veneered)」され得る。なおさらに、そのように所望される場合、本発明のモノクローナル抗体は、本発明の組成物の細菌感染と戦う能力をさらに強化するための適切な抗生物質と同時に投与され得る。
【００３７】
好ましい実施形態において、抗体はまた、細菌感染を処置または予防するための適切な抗体を提供する際に有用である受動性ワクチン(passive vaccine)として使用され得る。当業者によって認識されるように、ワクチンは、例えば、非経口（すなわち、筋肉内、皮内、皮下）投与または鼻咽腔（すなわち、鼻腔内）投与による、多数の適切な様式で投与のためにパッケージ化され得る。１つのこのような様式は、ワクチンが、筋肉内（すなわち、三角筋に）注射される場合であるが、投与の特定の様式は、処理される細菌感染の性質および患者の状態に依存する。ワクチンは、好ましくは、投与を容易にするために、薬学的に許容される担体と組み合わされ、そして担体は、通常、水または保存剤を含むか含まない緩衝化生理食塩水である。ワクチンは、投与の時点での再懸濁のために凍結乾燥されてもよいし、溶液であってもよい。
【００３８】
本発明に従う抗体組成物の投与のための好ましい用量は、細菌感染を予防または処置する際の有効量であり、そして当業者は、感染の性質および患者の状態に依存してこの量が大きく変化することを容易に理解する。本発明に従って使用される抗体または製薬学的薬剤の「有効量」は、薬剤の非毒性であるが十分な量を意味することを意図され、その結果、所望の予防または治療効果が生じる。従って、必要とされる抗体または特定の薬剤の正確な量は、被験体の種、年齢、および一般的な状態、処置される状態の重篤度、使用される特定の担体またはアジュバントおよびその投与様式などに依存して、被験体ごとに変化する。従って、「有効量」の任意の特定の抗体組成物は、特定の状況に基づいて変化し、そして適切な有効量は、ルーチンの実験のみを使用して、当業者によって適用の各場合において決定され得る。用量は、組成物が投与される個体に適するように調整されるべきであり、個体の年齢、体重および代謝と共に変化する。組成物は、チメロサール（エチル（２−メルカプトベンゾエート−Ｓ）水銀ナトリウム塩）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のような、安定剤または薬学的に許容される保存剤をさらに含み得る。
【００３９】
さらに、本発明に従う能動的なワクチンは、上記のような単離されたタンパク質の免疫原性量が、このようなワクチンが必要なヒトまたは動物患者に投与される場合に提供される。ワクチンはまた、上記のような、適切な薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤または担体を含み得る。上に示されるように、本発明に従って使用される抗原の「免疫原性量」は、薬剤の非毒性であるが十分な量を意味することを意図し、その結果免疫原性反応が宿主において引き出され、所望の予防または治療効果が生じる。従って、必要とされる抗原の正確な量は、被験体の種、年齢、および一般的な状態、処置される状態の重篤度、使用される特定の担体またはアジュバントおよびその投与様式などに依存して、被験体毎に変化する。同様に、任意のこのような抗原性ワクチン組成物の「免疫原性量」は、特定の状態に基づいて変化し、適切な免疫原性量は、慣用的な実験のみを使用して、当業者によって、適用の各場合において決定され得る。用量は、組成物が投与される個体に適するように調整され、個体の年齢、体重および代謝と共に変化する。
【００４０】
さらに、本発明の抗体組成物および上記のようなワクチンは、複合体に対する免疫原性反応を強化するのに有効な量で、適切なアジュバントと共に投与され得る。例えば、適切なアジュバントは、ヒトにおいて広範に使用される、ミョウバン（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、ならびにサポニンおよびその精製成分Ｑｕｉｌ  Ａ、フロイント完全アジュバントのような他のアジュバント、および研究および獣医学において使用される他のアジュバントを含み得る。ムラミールジペプチチド、モノホスホリルリピドＡ、Goodman-Snitkoff et al. j. Immunol. 147:410-415(1991)によって記載され、本明細書中に参考として援用されるホスホリピド複合体、Miller et al., J. Exp. Med. 176:1739-1744(1992) によって記載され、本明細書中に参考として援用されるプロテオリポソーム中の複合体のカプセル化、およびＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）リピド小胞（Ｍｉｃｒｏ  Ｖｅｓｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｓｈｕａ，ＮＨ）のようなリピド小胞中のタンパク質のカプセル化のような、なお他の化学的に規定される調製物もまた有用であり得る。
【００４１】
薬学的組成物
当業者によって理解されるように、本発明の抗体はまた、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌によって引き起こされる感染を処置または予防するために、ヒトまたは動物患者に投与するための適切な薬学的組成物に形成され得る。定義されそして上に記載されるような本発明の抗体を含む薬学的組成物は、生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、他の治療化合物、およびその組み合わせを含む、当該分野で一般に使用される任意の適切な薬学的なビヒクル、賦形剤または担体と組み合わせて処方され得る。当業者が理解するように、使用される特定のビヒクル、賦形剤または担体は、患者および患者の状態に依存して変化し、そして投与の種々の様式は、当業者に理解されるように、本発明の組成物について適切である。本願において開示される任意の薬学的組成物の投与の適切な方法としては、局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内および皮内投与が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４２】
局所投与のために、組成物は、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、ドロップ（点眼剤および点耳剤のような）、または溶液（口内洗浄剤のような）の形態で処方される。創傷または外科用包帯、縫合糸およびエアゾールは、該組成物で浸漬され得る。該組成物は、従来の添加物（例えば、防腐剤、浸透を促進する溶媒およびエモリエント）を含み得る。局所処方物はまた、クリームまたは軟膏ベース、エタノールまたはオレイルアルコールのような従来の担体を含み得る。
【００４３】
抗体組成物のさらなる形態、および組成物に関する他の情報、他のＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）タンパク質およびＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）ペプチドに関する方法および適用は、一般的にまた、モノクローナル抗体を含む本発明に適用可能であり、例えば、本明細書中に参考として援用される米国特許第６，２８８，２１４号（Ｈｏｏｋら）において開示される。
【００４４】
上に示されるようなＳｄｒＧタンパク質に対して特に産生される本発明の抗体組成物はまた、複合体に対する免疫原性反応を強化するために有効な量で適切なアジュバントと共に投与され得る。例えば、適切なアジュバントは、ヒトにおいて広範に使用される、ミョウバン（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、ならびにサポニンおよびその精製成分Ｑｕｉｌ  Ａ、フロイント完全アジュバント、ＲＩＢＩアジュバントのような他のアジュバント、および研究および獣医学適用において使用される他のアジュバントを含み得る。ムラミールジペプチチド、モノホスホリルリピドＡ、Goodman-Snitkoff et al. J. Immunol. 147:410-415(1991)によって記載され、本明細書中に参考として援用されるホスホリピド複合体、Miller et al., J. Exp. Med. 176:1739-1744(1992) によって記載され、本明細書中に参考として援用されるプロテオリポソーム中の複合体のカプセル化、およびＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）リピド小胞（Ｍｉｃｒｏ  Ｖｅｓｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｓｈｕａ，ＮＨ）のようなリピド小胞中のタンパク質のカプセル化のような、なお他の化学的に規定される調製物もまた有用であり得る。
【００４５】
従って、いずれの事象においても、本発明の抗体組成物は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌由来の細菌と共に生じるようなフィブリノゲン結合タンパク質を含む結合相互作用と干渉し、これを調節し、阻害するために有用である。従って、本発明は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染を予防又は処置する組成物および方法を開発する際、そして宿主組織および/または細胞へのブドウ球菌の結合を阻害する際に、特別な用途を有する。
【００４６】
方法：
感染に対する処置または保護
本発明に従って、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染を予防または処置するための方法が提供され、この方法は、感染を処置又は予防するための有効量でこのような処置が必要なヒトまたは動物患者に上記の抗体の有効量を投与することを包含する。さらに、本発明に従う抗体は、種々の細菌のフィブリノゲンへの結合を損なう際に特に有用であり、従って、該結合を阻害することによってコアグラーゼ陰性ブドウ球菌のような細菌由来の感染を処置または予防する際に有効であることが証明された。
【００４７】
従って、本発明に従って、上記の従来の方法のいずれか（例えば、局所、非経口、筋肉内など）での本発明の抗体の有効量の投与は、ヒトまたは動物患者におけるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染を処置または予防する極めて有用な方法を提供する。上に示されるように、有効量とは、細菌の接着を妨げるか、細菌の宿主細胞への結合を阻害し、細菌感染の処置または予防において有用であるかのいずれかに十分である、抗体の力価のような、使用のレベルを意味する。当業者によって認識されるように、感染を処置または予防する際に有効である必要な抗体のレベルは、患者の性質および状態、ならびに/または既存の感染の重篤度に依存して変化する。
【００４８】
免疫反応を引き出すこと
本発明に従って、ヒトまたは動物における免疫原性反応を引き出す方法が提供され、この方法は、ＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３、ＳｄｒＧ  Ｎ２Ｎ３またはＳｄｒＧ  ＴＲ２のような、上記の単離されたタンパク質の免疫学的有効量をヒトまたは動物に投与することを含む。上に示されるように、免疫原性反応を得るための、本発明に従って使用される抗原の「免疫原性量」は、薬剤の非毒性であるが十分な量を意味することが意図され、その結果、免疫原性反応は、所望の予防又は治療効果が生じるように、宿主において引き出される。従って、そのような反応を引き出すのに必要とされる単離されたタンパク質の正確な量は、被験体の種、年齢、および一般的な条件、処置される状態の重篤度、使用される特定の担体またはアジュバント、およびその投与様式などに依存して、被験体ごとに変化する。本発明はまた、上記のようなＳｄｒＧタンパク質を認識する抗体を産生する方法を意図し、そしてモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を産生する適切な方法が、上により詳細に記載される。
【００４９】
コーティングデバイス
本発明に従って、上記のような抗体および組成物はまた、医療デバイスまたは補綴デバイスのような他のインプラント材料に対するコアグラーゼブドウ球菌感染の発生を処置するかまたは防ぐために利用され得る。本明細書中に記載される抗体および/または組成物で有利にコーティングされ得る医療デバイスまたはポリマー生体材料としては、ステープル、縫合糸、代替心臓弁、心臓補助デバイス、ハードおよびソフトコンタクトレンズ、眼内レンズインプラント（前眼房または後眼房）、角膜インレー、人工角膜、血管ステント、エピケラトファキアデバイス、緑内障シャント、網膜ステープル、強膜バックル、義歯、甲状腺形成(thyroplastic)デバイス、咽頭形成(laryngoplastic)デバイス、血管移植片、軟性および硬性組織プロテーゼ（ポンプ、スティミュレーターおよびレコーダーを含む電気デバイス、聴覚プロテーゼ、ペースメーカー、人工咽頭、歯科インプラント、乳房インプラント、陰茎インプラント、頭蓋/顔面腱、人工関節、腱、靱帯、半月、およびディスクを含むがこれらに限定されない）、人工骨、人工器官（人工膵臓、人工心臓、人工肢、および心臓弁を含む）、ステント、ワイヤ、ガイドワイヤ、静脈内および中心静脈カテーテル、レーザーおよび血管形成バルーンデバイス、血管および心臓デバイス（チューブ、カテーテル、バルーン）、心室補助、血液透析成分、血液酸素供給器、尿道/尿管/尿デバイス（フォーリーカテーテル、ステント、チューブおよびバルーン）、気道カテーテル（気管内および気管カニューレおよびカフ）、腸内栄養補給チューブ（経鼻胃、胃内および空腸チューブを含む）、創傷ドレナージチューブ、胸膜腔、腹膜腔、頭蓋腔、および心膜腔のような身体の腔を排出するために使用されるチューブ、血液バッグ、試験管、血液回収管、ヴァキュテーナー、シリンジ、針、ピペット、ピペットチップ、および血液チュービングが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５０】
用語「コーティングされた」または「コーティング」は、本明細書中で使用される場合、デバイスの表面、好ましくは、細菌感染に曝される外側表面に上に定義される抗体または組成物を適用することを意味することが、当業者によって理解される。デバイスの表面は、タンパク質、抗体または活性フラグメントによって完全に覆われている必要はない。
【００５１】
上に示されるように、本発明の抗体またはその活性部分もしくはフラグメントは、感染を担う細菌病原菌と哺乳動物宿主との間の最初の物理的相互作用（例えば、フィブリノゲンのような哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質への細菌の接着）と干渉するために特に有用であり、この物理的相互作用との干渉は、患者を処置する際および留置する医療デバイスに対する細菌感染を予防または減少させる際の両方において有用であり、これらを使用のためにより安全にし得る。
【００５２】
キット
本発明に従って、上に示されるような本発明の抗体は、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのようなコアグラーゼ陰性ブドウ球菌による感染を診断するためのキットにおいて使用され得る。このような診断キットは、当業者に周知であり、本発明の抗体に結合する細菌またはタンパク質の存在を測定するのに適するように一般的に調製される。これらの診断キットは、一般に、当業者によって容易に理解されるような抗体によって結合を検出するに適切な手段と共に、本発明の抗体を含む。例えば、抗体の結合を検出するための手段は、該抗体に結合された検出可能な標識を含み得る。次いで、これらのキットは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の存在を検出するための診断方法において使用され得、ここで、当業者は、個体から（例えば、ヒトの血液、唾液、組織、骨、筋肉、軟骨または皮膚から）採取されたサンプルのような、１つ以上のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌によって感染が疑われるサンプルを得、本明細書中に示されるような１つ以上の抗体をサンプルに導入し、次いで、抗体がサンプル中のそのような細菌の存在を示すサンプルに結合するか否かを決定する。
【００５３】
手短に言うと、上記のような本発明の抗体は、コアグラーゼ陰性グラム陽性菌によって引き起こされ得るフィブリノゲン結合を阻害する際、およびヒト、動物、または医療デバイスおよびプロテーゼの感染を処置または予防する際に極めて有用であり得る。特に、本発明は、低出生体重児（ＬＢＷ）における院内のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染の処置または予防において重要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
実施例
本発明の好ましい実施形態の局面を例示する以下の実施例が提供される。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが発明者らによって発見される技術を示し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられ得ることが当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本発明の開示を考慮して、多数の変化が、開示される特定の実施形態において行われ得、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様の結果を依然として得ることを理解するべきである。
【００５５】
実施例１．ＳｄｒＧタンパク質の発現および精製
本発明に従って、ＳｄｒＧタンパク質の関連ドメインから得られるタンパク質を、クローニングし、組み換え発現し、単離および/または精製した。ＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３タンパク質（５０〜５９７）は、ＳｄｒＧ遺伝子の推定Ａドメインを示す。ＳｄｒＧ  Ｎ２Ｎ３タンパク質（２７３〜５９７）は、ヒトフィブリノゲン結合に必要なサブドメインを示す。ＳｄｒＧ  ＴＲ２タンパク質（２７３〜５７７）は、フィブリノゲン結合を安定化する、Ｃ末端部分が除去された、ヒトフィブリノゲン結合に必要なサブドメインを示す。これらのタンパク質についてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を以下に示す。
ＳｄｒＧ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３（５０〜５９７）：
ヌクレオチド配列（配列番号１）
【００５６】
【化７】
2005536185.tif 000008
アミノ酸配列（配列番号２）
【００５７】
【化８】
2005536185.tif 000009
ＳｄｒＧ  Ｎ２Ｎ３（２７３〜５９７）：
ヌクレオチド配列（配列番号３）
【００５８】
【化９】
2005536185.tif 000010
アミノ酸配列（配列番号４）
【００５９】
【化１０】
2005536185.tif 000011
ＳｄｒＧ  ＴＲ２（２７３〜５７７）：
ヌクレオチド配列（配列番号５）
【００６０】
【化１１】
2005536185.tif 000012
アミノ酸配列（配列番号６）
【００６１】
【化１２】
2005536185.tif 000013
タンパク質産生および精製
ＰＣＲを使用して、ＳｄｒＧＮ１Ｎ２Ｎ３（アミノ酸５０〜５９７を示す）またはＳｄｒＧＮ２Ｎ３（アミノ酸２７３〜５９７を示す）のようなそのサブドメインもしくはその短縮物ＴＲ２（アミノ酸２７３〜５７７）を、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  Ｋ２８ゲノムＤＮＡ（上記の配列より）から増幅し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターＰＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ）にサブクローニングした。これは、６つのヒスチジン残基を含む組換え融合タンパク質の発現を可能にする。このベクターを、引き続き、Ｅ．ｃｏｉｌ株ＡＴＣＣ５５１５１に形質転換し、０．７の光学密度（ＯＤ600）まで１５リットルの発酵槽中で増殖し、０．２ｍＭイソプロピル−１−β−Ｄガラクトシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導した。細胞を、ＡＧ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ中空糸アセンブリ（０．４５□ｍの孔サイズ）を使用して収穫し、細胞ペーストを−８０℃で凍結した。細胞を、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ＠１１００ｐｓｉを二回通して、１×ＰＢＳ（１０ｍＬの緩衝液/１ｇの細胞ペースト）中で溶解した。溶解した細胞を、３０分間１７，０００ｒｐｍでスピンダウンして、細胞破片を除去した。上清を、０．１Ｍ  ＮｉＣｌ2とともにチャージした５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを通過させた。ローディング後、カラムを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（緩衝液Ａ）の５カラム容量で洗浄した。タンパク質を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール（緩衝液Ｂ）の０〜１００％の勾配を使用して、３０カラム容量で溶出した。ＳｄｒＧＮ１Ｎ２Ｎ３、ＳｄｒＧＮ２Ｎ３またはＴＲ２を、約１３％の緩衝液Ｂ（約２６ｍＭのイミダゾール）で溶出した。２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。ＳｄｒＧＮ１Ｎ２Ｎ３、ＳｄｒＧＮ２Ｎ３またはＴＲ２を含む画分を１×ＰＢＳ中で透析した。
【００６２】
次いで、タンパク質を、内毒素除去プロトコルにかけた。このプロトコル中に使用される緩衝液を、５ｍＬのＭｏｎｏ−Ｑセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに通すことによって内毒素フリーとした。タンパク質を、４×１５ｍＬチューブ間で、均等に分配した。各チューブの容量を、緩衝液Ａで９ｍＬにした。１ｍＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を、各チューブに添加して、回転しながら４℃で１時間インキュベートした。チューブを、相を分離するために３７℃のウォーターバス中に配置した。チューブを２，０００ｒｐｍで１０分間スピンダウンし、各チューブ由来の上側の水相を回収し、界面活性剤抽出を繰り返した。２回目の抽出由来の水相を合わせて、５ｍＬのＩＤＡキレート化（Ｓｉｇｍａ）カラムを通し、０．１Ｍ  ＮｉＣｌ2でチャージして、残りの界面活性剤を除去した。タンパク質を３カラム容量の緩衝液Ｂで溶出する前に、カラムを、９カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。溶出液を、５ｍＬのＤｅｔｏｘｉｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）カラムに通し、フロースルーを回収し、カラムに再び適用した。第２の通過由来のフロースルーを回収し、１×ＰＢＳ中で透析した。精製された生成物を、マウスの投与の前に、濃度、純度および内毒素レベルについて分析した。
【００６３】
実施例２．モノクローナル抗体生成のための免疫化ストラテジー
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生および特徴付ける目的で、フィブリノゲンのＳｄｒＧへの結合を阻害または制限しそしてインビボにおける治療効果を実証し得る、高い親和性でＳｄｒＧに対するｍＡｂを産生するためのストラテジーを形成した。Ｅ．ｃｏｌｉによって発現されそして精製されたＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３、Ｎ２Ｎ３またはＴＲ２）タンパク質は、マウスモノクローナル抗体のパネルを作製するために使用され得る。手短に言うと、Ｂａｌｂ／ＣまたはＳＪＬマウスの群は、以下の表１に記載されるように、溶液またはアジュバントと混合した溶液中、１〜１０ｍｇのタンパク質の一連の皮下免疫化を受けた。
表Ｉ．免疫化スキーム
【００６４】
【表１】
2005536185.tif 000014
犠牲の時点（ＲＩＭＭＳ）またはブースト（従来の）の７日後において、血清を回収し、ＭＳＣＲＡＭＭまたは全細胞（Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）に対して、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて力価決定した。最後のブーストの３日後、脾臓またはリンパ節を取り出し、掻き裂いて単一細胞懸濁液とし、リンパ球を収穫した。次いで、リンパ球を、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８０）に融合した。細胞融合、引き続くプレーティング、およびフィーディング(feeding)を、Current Protocols in Immunology(Chapter 2, Unit 2.)からのモノクローナル抗体の産生プロトコルに従って実施した。
【００６５】
実施例３．抗ＳｄｒＧモノクローナル抗体のスクリーニングおよび選択
次いで、融合から産生した任意のクローンについて、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異的な抗ＳｄｒＧ抗体産生についてスクリーニングした。陽性クローンを拡大し、フローサイトメトリーによる全細菌細胞結合アッセイ中の活性、およびＢｉａｃｏｒｅ分析によるＳｄｒＧ結合についてさらに試験した。
【００６６】
ＥＬＩＳＡアッセイ
Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２−ＨＢ  ｈｉｇｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１μｇ/ウェルのｒＣｌｆＡ−（４０〜５５９）でコーティングし、室温で２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡにおける全ての洗浄工程を、１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０洗浄緩衝液で３回実施した。プレートを洗浄し、ハイブリドーマ上清サンプルをウェルに添加する前に、室温で１時間、１％ＢＳＡ溶液でブロックした。プレートを、サンプルおよび培地単独のような関連コントロールと共に室温で１時間インキュベートし、洗浄し、１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ＢＳＡ中で１：５０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａ）を、第２の試薬として使用した。プレートを、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）（Ｓｉｇｍａ）の１ｍｇ/ｍｌ溶液の添加によって発色させ、続いて、３７℃で３０分間インキュベートした。吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用して４０５ｎｍで読んだ。バックグラウンド（培地単独、約０．１ＯＤ）の３倍以上のＯＤ405を有する抗体上清は、陽性であると考えた。
【００６７】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析
分析の間ずっと、流速は、１０ｍｌ/分で一定であった。ＳｄｒＧＮ１Ｎ２Ｎ３またはＳｄｒＧＮ２Ｎ３／ＴＲ２注射の前に、試験抗体を、ＲＡＭ−Ｆｃ結合を介してチップに吸着させた。０時間において、３０ｍｇ/ｍｌの濃度のＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３、ＴＲ２またはＮ１Ｎ２Ｎ３）を、３分間、チップに注射し、続いて２分間解離した。分析のこの段階は、Ｍａｂ／ＳｄｒＧ相互作用の相対的な結合および/解離速度論を測定した。
【００６８】
全細菌への結合
細菌サンプル（ＨＢ、９１４２またはＳｄｒＧ／Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）を回収し、洗浄し、そしてウサギＩｇＧ（５０ｍｇ/ｍｌ）でのブロッキング後、ＭａｂまたはＰＢＳ単独（コントロール）と共に２ｍｇ/ｍｌの濃度でインキュベートした。抗体とのインキュベーション後、細菌細胞を、検出抗体として機能するヤギ−Ｆ(ab')2−抗マウス−Ｆ(ab')2−ＦＩＴＣと共にインキュベートした。抗体標識後、細菌細胞を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒフローサイトメーターを通して吸引し、蛍光放出を分析した（励起：４８８、放出：５７０）。各細菌株について、１０，０００の事象を回収し、測定した。
表ＩＩ．ＳｄｒＧスクリーニングの要約
【００６９】
【表２】
2005536185.tif 000015
これらの分析より、ＳｄｒＧ陽性ハイブリドーマは、増殖陽性ウェルの０．６〜１０％の頻度で産生された。興味深いことに、ＳｄｒＧ  ＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマのごくわずかがまた、Ｂｉａｃｏｒｅ分析およびフローサイトメトリーによる全細胞細菌結合に陽性であった。一般的に、Ｂｉａｃｏｒｅ陰性、ＳｄｒＧ  ＥＬＩＳＡ陽性クローンが、全細胞結合フローサイトメトリーアッセイにおいて陰性であった。これらの観察の実施例を表ＩＩＩに示す。
表ＩＩＩ．表ＩＩにおける融合由来のハイブリドーマ上清の代表例
【００７０】
【表３】
2005536185.tif 000016
この分析から、ＳｄｒＧ  ＥＬＩＳＡ陽性、ＳｄｒＧ  Ｂｉａｃｏｒｅ陽性かつＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ／ＳｄｒＧに対してフローサイトメトリー陽性である増殖陽性ハイブリドーマウェルの非常に少数の亜集団を、単一細胞でクローン化し、そして、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染モデルに対する潜在的な効力についての候補として特徴付けた。表ＩＶは、この予備的な特徴付けを示す。
表ＩＶ．単一細胞クローン化および特徴付けられたＳｄｒＧ  Ｍａｂ
【００７１】
【表４】
2005536185.tif 000017
実施例４．クローン化された抗ＳｄｒＧモノクローナル抗体の結合速度論
速度論分析を行って、選択および特徴付けられる抗ＳｄｒＧ  ｍＡｂの多様性を示した。以下に示されるように、ｍＡｂは、オンレート(on-rate)およびオフレート(off-rate)ならびに全体の親和性において異なる。
【００７２】
Ｂｉａｃｏｒｅ速度論
速度論分析を、ソフトウェアに含まれるリガンド捕獲方法を使用してＢｉａｃｏｒｅ  ３０００で実施した。ＧＡＨ−Ｆ（ａｂ）2チップ。次いで、抗ＳｄｒＧ  ｍＡｂを、ＧＡＭ−Ｆ（ａｂ）2チップを通過させ、Ｆｃ部分への結合を可能にした。次いで、種々の濃度のＳｄｒＧタンパク質を、チップ表面を通過させ、データを収集した。Ｂｉａｃｏｒｅ提供の評価ソフトウェア（バージョン３．１）を使用して、konおよびkoffを測定し、KAおよびKDを計算した。
表Ｖ．Ｂｉａｃｏｒｅを使用する速度論分析
【００７３】
【表５】
2005536185.tif 000018
実施例５．クローン化された抗ＳｄｒＧモノクローナル抗体の全Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ細菌への結合
産生され、そして組換えＳｄｒＧを用いて選択された抗ＳｄｒＧ  ｍＡｂが、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に対して発現されるネイティブなＳｄｒＧと交差反応するかを決定するために、フローサイトメトリー分析を使用した。全ての場合において、ｍＡｂは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓに対して発現されたＳｄｒＧを認識したが、ＨＢおよびＦ４０８０２に対する反応性において変化した。
【００７４】
全細菌への結合
細菌サンプル（ＨＢ、Ｆ４０８０２またはＳｄｒＧ／Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）を回収し、洗浄し、そしてウサギＩｇＧ（５０ｍｇ/ｍｌ）でのブロッキング後、ＭａｂまたはＰＢＳ単独（コントロール）と共に２ｍｇ/ｍｌの濃度でインキュベートした。抗体とのインキュベーション後、細菌細胞を、検出抗体として機能するヤギ−Ｆ(ab')2−抗マウス−Ｆ(ab')2−ＦＩＴＣと共にインキュベートした。抗体標識後、細菌細胞を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒフローサイトメーターを通して吸引し、蛍光放出を分析した（励起：４８８、放出：５７０）。各細菌株について、１０，０００の事象を回収し、測定した。単位は、染色された集団の幾何平均によってゲート化された(gated)陽性事象のパーセントを掛けることによって決定した。
表ＶＩ．全体のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌のフローサイトメトリー染色
【００７５】
【表６】
2005536185.tif 000019
実施例６．フィブリノゲンへのＳｄｒＧ結合の阻害
高親和性の多数の選択された抗ＳｄｒＧ  ｍＡｂはまた、ＳｄｒＧ  ＭＳＣＲＡＭＭへのヒトフィブリノゲンまたはβ−フィブリノゲンペプチドフラグメントの結合を阻害する能力を示した。この阻害を、以下に記載の多数のアッセイを使用して特徴付けた。このデータは、ＳｄｒＧ  ＭＳＣＲＡＭＭのヒトフィブリノゲンへの接着特性を阻害することが可能であり得ることを示唆する。
【００７６】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析−ＳｄｒＧ−フィブリノゲン結合の阻害と組み合わせたｍＡｂのＳｄｒＧへの結合
分析の間ずっと、流速は、１０ｍｌ/分で一定であった。ＳｄｒＧＮ１Ｎ２Ｎ３、ＳｄｒＧＮ２Ｎ３またはＴＲ２注射の前に、試験抗体を、ＲＡＭ−Ｆｃ結合を介してチップに吸着させた。０時間において、３０ｍｇ/ｍｌの濃度のＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３またはＮ１Ｎ２Ｎ３）を、３分間、チップに注射し、続いて２分間解離した。分析のこの段階は、Ｍａｂ／ＳｄｒＧ相互作用の相対的な結合および/解離速度論を測定した。この分析の第２段階において、ＳｄｒＧに結合したＭａｂの、フィブリノゲンと相互作用しそして結合する能力を測定した。１００ｍｇ/ｍｌの濃度のフィブリノゲンを、チップに注射し、３分後に報告ポイントをとった。本発明に従うｍＡｂのいくつかの結合の例を図１に示す。
【００７７】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析−チップに結合したβ−フィブリノゲンペプチドへのＳｄｒＧ結合のｍＡｂ阻害
フィブリノゲン分子上のＳｄｒＧについての正確な結合部位は、β鎖のＮ末端部分に局在する。さらなる分析および特徴付けのために、本発明者らは、Ｎ末端システイン残基を追加したこの部位を含むペプチドを合成した。配列は以下である：
ＣＮＥＥＧＦＦＳＡＲＧＨＲＰＬＤ（配列番号７）
βフィブリノゲンペプチドは、Ｂｉａｃｏｒｅによって詳細に説明される手順に従って、Ｎ末端システインを介して、研究等級のＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）にチオール結合される。ＳｄｒＧタンパク質（３０μｇ/ｍｌ；完全なＡドメイン）を、１：１の割合で、種々の濃度のｍＡｂ（９０μｇ/ｍｌ〜０．７μｇ/ｍｌ）と混合した。混合物を、室温で２０分間インキュベートし、次いで、βフィブリノゲンペプチドチップ上を通過させ、結合のレベルを測定した。緩衝液と１：１で希釈したＳｄｒＧは、最大のＳｄｒＧ結合として機能し、非ＳｄｒＧ  ｍＡｂをインキュベーションすることは、ネガティブコントロールとして機能する。非インヒビターは、ペプチドへのＳｄｒＧ／ｍＡｂ複合体結合の大きい密度に起因して、共鳴単位(Resonance Units)（ＲＵ）における大きな増加（最大のＳｄｒＧ結合を超える）を引き起こすはずである。あるいは、インヒビターは、最大のＳｄｒＧ未満に結合レベルを減少させるはずである。パーセント結合は、以下のように測定した：生データ（ＲＵについて）を、ＳｄｒＧコントロールレベルによって除算し、１００を掛ける。従って、ｍＡｂを有さないＳｄｒＧは、常に、所定の実験について１００％であり、ランの間の比較を可能にする。Ｂｉａｃｏｒｅチップ上のβフィブリノゲンペプチドへのＳｄｒＧ結合の阻害を示す本発明に従うｍＡｂの例を、図２に示す。
【００７８】
ＥＬＩＳＡベースのタンパク質阻害
Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２−ＨＢ  ｈｉｇｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ９６ウェルプレートを、ＰＢＳ中の１μｇ/ｍｌ  ＳｄｒＧ（アミノ酸５０〜５９７）またはコアグラーゼ陰性ブドウ球菌タンパク質（実施例７に記載される）でコーティングし、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ溶液で１時間ブロックし、次いで洗浄し、モノクローナル抗体（ハイブリドーマ上清または精製された抗体のいずれか）と共に室温で１時間インキュベートした。抗体とのインキュベーション後、プレートを洗浄するかまたは未処理のいずれかとし、２０μｇ/ｍｌヒトフィブリノゲン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓａｒｃｈ  Ｌａｂ，Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）を添加した。プレートを、３７℃で１時間インキュベートし、洗浄し、ヤギ抗フィブリノゲン−ＨＲＰ複合体を添加した。複合体とのインキュベーション後、プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ基質を添加した。次いで、プレートを室温で１０分間インキュベートし、反応を１０％ＳＤＳの添加で停止させ、そして吸光度を４０５ｎｍで読んだ。全てのデータを、ＳＯＦＴｍａｘ  Ｐｒｏ  ｖ．３．１．２．ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して分析した。ＥＬＩＳＡにより、ＳｄｒＧに結合するヒトフィブリノゲンの阻害を示す本発明に従うｍＡｂを図３に示す。
【００７９】
実施例７．抗ＳｄｒＧモノクローナル抗体の他の細菌タンパク質への交差反応性
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に見出される他のタンパク質との潜在的な交差反応性を評価するために、以下のタンパク質（アクセス番号Ｙ１７１１６としてｇｅｎｅ  ｂａｎｋにおいて同定される）を実施例１に記載される方法と類似の方法を使用してクローニングし、発現し、精製した。興味深いことに、このタンパク質とのかなりの交差反応性が、本発明の抗ＳｄｒＧ  ｍＡｂの多くについて（従って、このタンパク質を認識する）同定された。しかし、ＳｄｒＧ−フィブリノゲン結合に対して阻害活性を有する１つの抗ＳｄｒＧ  ｍＡｂ（５９〜５９）は、交差反応せず、フィブリノゲンとの以下に記載されるタンパク質の結合を阻害しなかった。
【００８０】
このタンパク質（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ＃Ｙ１７１１６）の完全な配列（本明細書中に配列番号８として同定される）は以下の通りである：
【００８１】
【化１３】
2005536185.tif 000020
以下のアミノ酸配列もまた試験した：
アミノ酸配列（６０〜６０８）（配列番号９）
【００８２】
【化１４】
2005536185.tif 000021
本発明に従って、上に示される配列を認識する、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が惹起され得る。
ＥＬＩＳＡベースのｍＡｂ交差反応性の試験結果を、以下の表ＶＩＩに示す。
表ＶＩＩ．ＥＬＩＳＡベースのｍＡｂ交差反応性
【００８３】
【表７】
2005536185.tif 000022
アクセス番号Ｙ１７１１６のＧｅｎ  Ｂａｎｋタンパク質へのヒトフィブリノゲン結合のｍＡｂ阻害の試験の結果を図４に示す。
【００８４】
実施例８．インビボベースの治療活性
本発明に従う多数の抗ＳｄｒＧ  ｍＡｂを、インビボ動物モデルにおける効力について試験し、治療剤としてのそれらの潜在的な有用性を示す。
【００８５】
Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染のげっ歯類モデル
時期を定めて妊娠した（１３〜１５日）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）より購入した。３〜６日齢の新生児ラットに、単回の腹腔内（ＩＰ）注射によって０．３５ｍｇのモノクローナル抗体を投与した。抗体投与の２０時間後、新生児ラットを、２×１０8ＣＦＵのＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのＨＢ株の（ＩＰ）注射でチャレンジした。次いで、動物の生存を、７日間追跡した。生存曲線のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を実施し、有意性を、logランク試験（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ  Ｔｅｓｔ）を使用して試験した。試験結果を以下に示す：
性別、種、数、年齢、体重および供給源：
【００８６】
【表８】
2005536185.tif 000023
試験群：
【００８７】
【表９】
2005536185.tif 000024
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）感染の乳児ラットチャレンジモデルの結果を図５に示す。
【００８８】
抗体試験試薬の説明：
ＳｄｒＧ４１−２１１．３モノクローナル抗体、ＩＮＨ−Ｍ０１０２３（ＬＮ：ＩＡＡ２Ｉ１４５４）
４１−２１１．３モノクローナル抗体（ＩｇＧ1サブタイプ）を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを使用して、無血清ハイブリドーマ培養培地から精製した。材料は、プロテインの０．１２ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素濃度を有し、１０．４ｍｇ/ｍｌの濃度であると報告された。該材料を４℃で冷蔵貯蔵した。注射の日に、該材料を１．７５ｍｇ/ｍｌに希釈して、０．２ｍｌを腹腔内注射を介して動物の適切な群に投与した。投与される最終用量は、０．３５ｍｇのＩｇＧであった。
【００８９】
ＳｄｒＧ４１−０７５．３モノクローナル抗体、ＩＮＨ−Ｍ０１０２４（ＬＮ：ＩＡＡ２Ｉ１４４７）
４１−０７５．３モノクローナル抗体（ＩｇＧ1サブタイプ）を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを使用して、無血清ハイブリドーマ培養培地から精製した。材料は、プロテインの０．１２ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素濃度を有し、７．６ｍｇ/ｍｌの濃度であると報告された。該材料を４℃で冷蔵貯蔵した。注射の日に、該材料を１．７５ｍｇ/ｍｌに希釈して、０．２ｍｌを腹腔内注射を介して動物の適切な群に投与した。投与される最終用量は、０．３５ｍｇのＩｇＧであった。
【００９０】
ＳｄｒＧ４１−２０６．４モノクローナル抗体、ＩＮＨ−Ｍ０１０２５（ＬＮ：ＩＡＡ２Ｉ１４４８）
４１−２０６．４モノクローナル抗体（ＩｇＧ1サブタイプ）を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを使用して、無血清ハイブリドーマ培養培地から精製した。材料は、プロテインの０．１２ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素濃度を有し、８．９ｍｇ/ｍｌの濃度であると報告された。該材料を４℃で冷蔵貯蔵した。注射の日に、該材料を１．７５ｍｇ/ｍｌに希釈して、０．２ｍｌを腹腔内注射を介して動物の適切な群に投与した。投与される最終用量は、０．３５ｍｇのＩｇＧであった。
【００９１】
コントロールＣＲＬ１７７１モノクローナル抗体、ＩＮＨ−Ｍ００００２９（ＬＮ：ＩＡＡ２Ｇ１３８１）
ＣＲＬ１７７１モノクローナル抗体（ＩｇＧ1サブタイプ）を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを使用して、無血清ハイブリドーマ培養培地から精製した。材料は、プロテインの３．０ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素濃度を有し、６．６ｍｇ/ｍｌの濃度であると報告された。該材料を４℃で冷蔵貯蔵した。注射の日に、該材料を１．７５ｍｇ/ｍｌに希釈して、０．２ｍｌを腹腔内注射を介して動物の適切な群に投与した。投与される最終用量は、０．３５ｍｇのＩｇＧであった。
【００９２】
中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）関連感染のラットモデル
８〜９週齢のオスＳｐｒａｇｕ−Ｄａｗｌｅｙラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）から購入した。滅菌したポリエチレン/シリコンカテーテル（カテーテル体−ポリエチレン：０．０１１”id、０．０２４”od；カテーテル先端−シリコンゴム：０．０１２”id、０．０２５”od）を、頸静脈に外科的に配置し、カテーテル先端を、上大静脈へ進行させた。カテーテルは、所定の場所に配置したままであり、研究の間ずっと開放されていた(kept patent)。モノクローナル抗体を、２０ｍｇ/ｋｇの用量で、カテーテルを介してＩＶ投与した。２４時間後、５×１０3ＣＦＵのメチシリン耐性Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＭＲＳＥ（８９９株）を、カテーテルを介して導入した。チャレンジ後７日目において、動物を犠牲にし、尾側大静脈血、腎臓およびカテーテル関連組織を収穫した。組織サンプル中に存在するＭＲＳＥコロニー形成単位を、定量的なプレーティングによって測定した。群間の感染の発生率の統計学的分析を、フィッシャーの直接確率検定(Fisher's Exact Test)を使用して実施した。群間のＣＦＵにおける定量的差異の統計学的分析を、Ｄｕｎｎの多比較ポスト試験(Dunn's multiple comparison post-test)と共にＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験を使用して実施した。
【００９３】
抗体試験試薬の説明：
ＳｄｒＧ５９−５９．４モノクローナル抗体、ＩＮＨ−Ｍ０２００１（ＬＮ：ＩＡＡ２Ｂ２０３２）
４１−２１１．３モノクローナル抗体（ＩｇＧ1サブタイプ）を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを使用して、無血清ハイブリドーマ培養培地から精製した。材料は、プロテインの０．１２ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素濃度を有し、８．２ｍｇ/ｍｌの濃度であると報告された。材料を４℃で冷蔵貯蔵した。注射の日に、該材料を２０ｍｇ/ｋｇのＩｇＧの最終用量についてカテーテルを介して投与した。
【００９４】
ＳｄｒＧ６４−０３．６モノクローナル抗体、ＩＮＨ−Ｍ０２００８（ＬＮ：ＩＡＡ２Ｃ２０５８）
４１−０７５．３モノクローナル抗体（ＩｇＧ1サブタイプ）を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを使用して、無血清ハイブリドーマ培養培地から精製した。材料は、プロテインの０．１２ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素濃度を有し、１１ｍｇ/ｍｌの濃度であると報告された。材料を４℃で冷蔵貯蔵した。注射の日に、該材料を２０ｍｇ/ｋｇのＩｇＧの最終用量についてカテーテルを介して投与した。
【００９５】
コントロールＣＲＬ１７７１モノクローナル抗体、ＩＮＨ−Ｍ００００２９（ＬＮ：ＩＡＡ２Ｇ１３８１）
ＣＲＬ１７７１モノクローナル抗体（ＩｇＧ1サブタイプ）を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを使用して、無血清ハイブリドーマ培養培地から精製した。材料は、プロテインの３．０ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素濃度を有し、６．６ｍｇ/ｍｌの濃度であると報告された。該材料を４℃で冷蔵貯蔵した。注射の日に、該材料を２０ｍｇ/ｋｇのＩｇＧの最終用量についてカテーテルを介して投与した。
【００９６】
７日目におけるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）感染の中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）関連感染モデルを示す試験結果を図６に示す。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、ＳｄｒＧ−フィブリノゲン結合での阻害を示す、本発明に従う抗ＳｄｒＧ  ｍＡｂｓのＢｉａｃｏｒｅ分析のブラフ表示である。
【図２】図２は、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上のβ−フィブリノゲンペプチドへのＳｄｒＧ結合の阻害を示す、本発明に従う抗ＳｄｒＧ  ｍＡｂｓのグラフ表示である。
【図３】図３は、本発明に従うモノクローナル抗ＳｄｒＧ抗体についての、ＥＬＩＳＡによって示されるＳｄｒＧへのヒトフィブリノゲン結合の阻害のグラフ表示である。
【図４】図４は、以下に示されるような配列番号９として同定されるプロテインのヒトフィブリノゲン結合の阻害のグラフ表示である。
【図５】図５は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）感染のラット乳児(suckling rat pup)チャレンジモデルにおいて観察される結果のグラフ表示である。
【図６】図６は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）感染の中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）に関連する感染モデルの結果のグラフ表示である。
【図１】
2005536185.tif 000025
【図２】
2005536185.tif 000026
【図３】
2005536185.tif 000027
【図４】
2005536185.tif 000028
【図５】
2005536185.tif 000029
【図６】
2005536185.tif 000030
【配列表】
2005536185000001.app
【国際調査報告】
2005536185.tif 000031
2005536185.tif 000032
2005536185.tif 000033