(57)【要約】本発明は、DNAzymesに提供する本および特異的にmRNAをPAI-1をコードすることを切断するリボザイム。発明もmRNAをPAI-1をコードして、特異的に翻訳を阻害するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供する本。本発明も、PAI-1の発現を阻害する種々の方法を提供する、および疾患を治療する方法このような。最後に、本発明は直前に記載のDNAzymesを含む薬学的組成物を提供する、リボザイム、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、または、活性成分としてのPAI-1発現のその他の阻害剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1（PAI-1）をコードするmRNAを特異的に切断する触媒核酸であって、5’から3’の向きに：
(a)少なくとも4ヌクレオチドの第1の結合ドメインを定義する連続したヌクレオチド;
(b)前記第1の結合ドメインの3’末端に近接して位置する触媒ドメインを定義し、かつPAI-1コードするmRNAを所定のホスホジエステル結合で切断することができる連続したヌクレオチド;および、
(c)前記触媒ドメインの3’末端に近接して位置する少なくとも4ヌクレオチドの第2の結合ドメインを定義する連続したヌクレオチドを含み、
前記それぞれの結合ドメインのヌクレオチドの配列は、前記PAI-1をコードするmRNAの一連のリボヌクレオチドに相補的であり、および前記触媒核酸は、PAI-1をコードするmRNAにハイブリダイズし、かつ特異的に切断する触媒核酸。
【請求項２】
前記第1の結合ドメインのヌクレオチドが、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１の触媒核酸。
【請求項３】
前記第2の結合ドメインのヌクレオチドが、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１の触媒核酸。
【請求項４】
前記第1の結合ドメインのヌクレオチドが、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド誘導体を含む、請求項１の触媒核酸。
【請求項５】
前記第2の結合ドメインのヌクレオチドが、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド誘導体を含む、請求項１の触媒核酸。
【請求項６】
前記第1の結合ドメインのヌクレオチドが、少なくとも1つのリボヌクレオチドを含む、請求項１の触媒核酸。
【請求項７】
前記第2の結合ドメインのヌクレオチドが、少なくとも1つのリボヌクレオチドを含む、請求項１の触媒核酸。
【請求項８】
前記第1の結合ドメインのヌクレオチドが、少なくとも1つのリボヌクレオチド誘導体を含む、請求項１の触媒核酸。
【請求項９】
前記第2の結合ドメインのヌクレオチドが、少なくとも1つのリボヌクレオチド誘導体を含む、請求項１の触媒核酸。
【請求項１０】
前記第1の結合ドメインのヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾塩基を含む、請求項１の触媒核酸。
【請求項１１】
前記第2の結合ドメインのヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾塩基を含む、請求項１の触媒核酸。
【請求項１２】
前記第1の結合ドメインのヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項１の触媒核酸。
【請求項１３】
前記第2の結合ドメインのヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項１の触媒核酸。
【請求項１４】
前記修飾されたヌクレオシド間結合が、ホスホロチオネート結合である、請求項12または13の触媒核酸。
【請求項１５】
PAI-1をコードするmRNAが、ヒトPAI-1をコードする、請求項１の触媒核酸。
【請求項１６】
前記ヒトPAI-1をコードするmRNAが、配列番号：5に記載された配列を有する、請求項15の触媒核酸。
【請求項１７】
請求項１に記載の触媒核酸および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項１８】
発現を阻害しなければPAI-1を発現する細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害する方法であって、前記細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害するために、請求項1に記載の触媒核酸と前記細胞を接触させることを含む方法。
【請求項１９】
被検体の細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害する方法であって、被検体の細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害するために有効な請求項１に記載の触媒核酸の量を被検体に投与することを含む方法。
【請求項２０】
被検体の細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害する方法であって、前記被検体の細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害するために有効な請求項17に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与することを含む方法。
【請求項２１】
被検体の心筋細胞のアポトーシスを含む被検体の循環器病を治療する方法であって、前記被検体の心筋細胞のアポトーシスを阻害するために有効な請求項17の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより循環器病を治療することを含む方法。
【請求項２２】
被検体の新内膜形成を含む被検体の循環器病を治療する方法であって、前記被検体の新内膜形成を阻害するために有効な請求項17に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより前記被検体の循環器病を治療することを含む方法。
【請求項２３】
原線維形成を含む被検体の線維性の疾患を治療する方法であって、前記被検体の原線維形成を阻害するために有効な請求項17に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより前記線維性の疾患を治療することを含む方法。
【請求項２４】
前記線維性の疾患が腎疾患である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記線維性の疾患が肝臓の疾患である、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
線維性の疾患が肺の疾患である、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
線維性の疾患が皮膚の病気である、請求項23に記載の方法。
【請求項２８】
線維性の疾患が眼の疾患である、請求項23に記載の方法。
【請求項２９】
高いストリンジェンシーの条件下でPAI-1をコードするmRNAとハイブリダイズし、かつ8〜40ヌクレオチドの間の長さである連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチド内の少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオネート結合を含む、請求項29に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記ヌクレオチドが、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項29に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記ヌクレオチドが、少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む、請求項29に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
前記PAI-1をコードするmRNAが、ヒトPAI-1をコードする、請求項29のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
前記ヒトPAI-1をコードするmRNAが、配列番号：5に記載されている配列の連続したヌクレオチドを含む、請求項33に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項29に記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項３６】
被検体を治療する方法であって、前記被検体のPAI-1の発現を阻害するために有効な請求項29のオリゴヌクレオチドの量を前記被検体に投与して、これにより前記被検体を治療することを含む方法。
【請求項３７】
被検体の心筋細胞のアポトーシスを含む前記被検体の循環器病を治療する方法であって、前記被検体の心筋細胞のアポトーシスを阻害するために有効な請求項35の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより循環器病を治療することを含む方法。
【請求項３８】
被検体の原線維形成を含む前記被検体の線維性の疾患を治療する方法であって、前記被検体の原線維形成を阻害するために有効な請求項35の薬学的組成物の量を前記被検体に投与してこれにより線維性の疾患を治療することを含む方法。
【請求項３９】
被検体の新内膜形成を含む前記被検体の循環器病を治療する方法であって、前記被検体の新内膜形成を阻害するために有効な請求項35の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより被検体の循環器病を治療することを含む方法。
【請求項４０】
前記被検体がバルーン血管形成術を受けている、請求項22または39に記載の方法。
【請求項４１】
前記被検体がステント移植を受けている、請求項22または39に記載の方法。
【請求項４２】
前記循環器病が再狭窄である、請求項22または39に記載の方法。
【請求項４３】
被検体の血管疾患を治療する方法であって、前記疾患は、トロンビンまたはフィブリン産生の減少によって治療される疾患であり、該方法は、前記被検体の血管疾患を治療するために、PAI-1発現を阻害し、これによりトロンビンまたはフィブリン産生を減少させるために有効なPAI-1発現の阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項４４】
前記触媒核酸が、ステント、足場を経て、静脈内に、経口的に、吸入によって、皮下に、直接の筋注投与によって、または遺伝子ベクターを介して投与される、請求項19に記載の方法。
【請求項４５】
前記薬学的組成物が、ステント、足場を経て、静脈内に、経口的に、吸入によって、皮下に、直接の筋注投与によって、または遺伝子ベクターを介して投与される、請求項20、21、22、23、37、38、または39のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４６】
前記オリゴヌクレオチドが、ステント、足場を経て、静脈内に、経口的に、吸入によって、皮下に、直接の筋注投与によって、または遺伝子ベクターを介して投与される、請求項36記載の方法。
【請求項４７】
被検体の血管疾患を治療する方法であって、前記血管疾患は、PAI-1発現の阻害によって治療される疾患であり、該方法は、前記被検体のPAI-1発現を阻害するために有効なPAI-1発現の阻害剤を前記被検体に投与して、これにより前記被検体の血管疾患を治療する方法。
【請求項４８】
前記PAI-1発現の阻害剤がアンチセンス・オリゴヌクレオチド、抗体、触媒核酸、小分子、またはRNAiである、請求項43または47に記載の方法。
【請求項４９】
前記疾患が虚血性の疾患である、請求項43または47に記載の方法。
【請求項５０】
前記虚血性の疾患が末梢動脈疾患または脳血管障害である、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
被検体の心臓組織の新血管新生を誘導する方法であって、前記心臓のPAI-1の発現を阻害するために有効なPAI-1発現の阻害剤の量を前記被検体に投与して、これにより前記被検体の心臓組織の新血管新生を誘導ことを含む方法。
【請求項５２】
前記被検体が循環器病を患っている、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
前記疾患が心筋梗塞、アンギナ、鬱血性心不全、末梢動脈疾患、または心筋の低酸素症である、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
被検体の組織の新血管新生を誘導する方法であって、前記被検体の組織のPAI-1の発現を阻害するために有効なPAI-1発現の阻害剤の量を前記被検体に投与して、これにより前記被検体の組織の新血管新生を誘導することを含む方法。
【請求項５５】
前記被検体が虚血性の疾患を患っている、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患が虚血性の腎疾患、脳血管障害、脳卒中、または肝臓の疾患である、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
PAI-1発現の阻害剤および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項５８】
前記PAI-1発現の阻害剤が、触媒核酸、オリゴヌクレオチド、モノクローナル抗体、小分子、またはRNAiである、請求項57に記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
被検体の循環器病を治療する方法であって、前記疾患は、被検体の心筋機能を改善することによって治療され、該方法は、心筋機能の改善を阻害する請求項58に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより前記被検体の循環器病を治療することを含む方法。
【請求項６０】
前記被検体に薬学的組成物を投与する前に、同時に、または後に薬剤を投与することをさらに含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
前記薬剤が、内皮前駆細胞、骨髄細胞、心臓前駆細胞、胚幹細胞、または脈理血液幹細胞である、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
薬剤が、G-CSF、GM-CDF、SDF-1、IL-8、SCF、VEGF、FGF、またはGROファミリーケモカインである、請求項60に記載の方法。
【請求項６３】
被検体の組織の平滑筋細胞の増殖を阻害する方法であって、前記被検体の組織の平滑筋細胞の増殖を阻害するために有効な請求項58に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与することを含む方法。
【請求項６４】
被検体の心臓においてトロンビンおよびフィブリン沈着を阻害する方法であって、前記被検体の心臓におけるトロンビンおよびフィブリン沈着を阻害するために前記被検体に有効な請求項58に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与することを含む方法。
【請求項６５】
請求項63または64に記載の方法であって、内皮前駆細胞、骨髄細胞、心臓前駆細胞、胎生期、幹細胞、または脈理血液幹細胞を前記被検体に投与することをさらに含む方法。
【請求項６６】
前記薬学的組成物が、ステント、足場を経て、静脈内に、経口的に、吸入によって、皮下に、直接の筋注投与によって、または遺伝子ベクターを介して投与される、請求項59、63、または64に記載の方法。
【請求項６７】
被検体の組織におけるトロンビンおよびフィブリン沈着を阻害する方法であって、前記被検体の組織におけるトロンビンおよびフィブリン沈着を阻害するために前記被検体に有効な請求項58の薬学的組成物の量を投与することを含む方法。
【請求項６８】
前記被検体は、深部静脈血栓、肺塞栓症、腎疾患、冠状動脈梗塞、転移、炎症、播種性血管内血液凝固、アテローム性動脈硬化症、リウマチ様関節炎、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性神経障害、肉芽腫症、または同種異系移植片拒絶反応に罹患している、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
被検体の感染性ショックを治療する方法であって、前記被検体の治療方法感染性ショックに有効な請求項58の薬学的組成物の量を前記被検体に投与することを含む方法。
【請求項７０】
血栓性疾患、血栓性障害、または止血性障害を患っている被検体を治療する方法であって、前記疾患または障害は、PAI-1の高い発現と関係する疾患または障害であり、該方法は、前記被検体のPAI-1発現を減少させるために有効な請求項58の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより疾患を治療することを含む方法。
【請求項７１】
前記疾患または障害は、深部静脈血栓、肺塞栓症、腎性疾患、冠状動脈梗塞、転移、炎症、播種性血管内血液凝固、アテローム性動脈硬化症、リウマチ様関節炎、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性の神経障害、肉芽腫症、または同種異系移植片拒絶反応である、請求項58記載の方法。
【請求項７２】
請求項70記載の方法であって、被検体血小板溶解薬または血小板溶解薬の活性化因子を投与することをさらに含む方法。
【請求項７３】
前記血小板溶解薬の活性化物質が、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、またはプロウロキナーゼである、請求項72に記載の方法。
【請求項７４】
請求項70または72に記載の方法であって、前記被検体に抗凝固薬を投与することをさらに含む方法。
【請求項７５】
前記抗凝固薬が、ヘパリン、ワルファリン、アスピリン、アニシンジオン、フェニンジオン（phenindone）、またはヒドロキシクマリンである、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
前記被検体が哺乳類である、請求項19、20、21、22、23、36、37、38、39、43、47、51、54、59、63、64、67、69、または70に記載の方法。
【請求項７７】
前記哺乳類がヒトである、請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
PAI-1発現の阻害剤の治療的に有効な量および薬学的に許容されるキャリアを混合することを含む請求項57の薬学的組成物の方法。
【請求項７９】
心筋細胞の減少を含む被検体の心臓の障害を治療する方法であって、前記被検体の心臓内で心筋細胞増殖を引き起こすために有効なPAI-1発現の阻害剤の量を前記被検体に投与して、これにより前記障害を治療することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2002年4月23日に出願の米国特許出願第10/128,738号の優先権を主張し、その内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本出願を通じて、種々の刊行物が括弧内のアラビア数字によって参照される。これらの参照の完全な引用は、以下の本明細書の最後に見いだされるであろう。これらの刊行物の開示は、より完全に本発明が属する技術分野における水準を記載するために、これらの全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
背景  
心筋梗塞後において、その後の心筋細胞ネクローシスが、冒された心筋内への炎症性細胞の遊走、細胞外基質の分解、および新血管新生によって特徴づけられる創傷治癒反応を刺激する。これらの成分のそれぞれは、プラスミン（これは、浸潤している骨髄由来細胞の表面上に発現されるウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ（u-PA）による活性化を介してプラスミノーゲンに由来する）による潜在性のメタロプロテイナーゼの活性化を必要とすると考えられる(1-3)。さらに最近には、細胞表面u-PAの役割は、細胞遊走に必要な隠れた細胞接着部位の暴露を容易にすることである可能性が示唆された(4)。これは、u-PAとプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1(PAI-1)（これは、その天然の状態において、ビトロネクチンと複合対を形成する）の間の直接的な相互作用に関与すると思われる（4、5）。u-PAなどのプロテイナーゼとPAI-1の反応は、迅速に高次構造の変化を生じ、これをビトロネクチンから分離させ、低密度リポタンパク質受容体に対するその親和性を増大させ(6)、そのクリアランスおよび分解を引き起こす。ビトロネクチンからのPAI-1の除去により、そのリガンドのもう一つであるインテグリンαvβ3に対する結合のために必要なビトロネクチン上のエピトープが曝露する（4、7）。細胞表面インテグリンαvβ3と組織ビトロネクチンの間の相互作用は、血管形成の発生に重要なことが示されたので（4、8、9）、本発明者らは、心筋梗塞後の過剰のPAI-1タンパク質の発現が、骨髄に由来する血管芽細胞による最適な新血管新生を防げるのかもしれず、またPAI-1発現の阻害が、新血管新生を促進するであろうと仮定した。
【０００４】
臨床的な適応性を有するPAI-1発現を阻害するためのアプローチを開発するために、本発明者らは、特定のmRNA活性を阻害するための種々のストラテジーの可能性を検討した。
【０００５】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、mRNA内のこれらに相補的な標的部位とハイブリダイズして、リボソームの作用を立体的に阻害することによって、または、内因性のRNAseHによってトリガーされる切断によって、タンパク質への翻訳を遮断する(10)。現在の構築物は、ホスホロチオネート結合を介して血清による分解に耐性に作製されているが、ターゲットされていないmRNAの「無関係な切断」による非特異的な生物学的効果は、主要な懸念として残ったままである(11)。
【０００６】
リボザイムは、触媒部位を含む天然に存在するRNA分子であり、これらはアンチセンス・オリゴヌクレオチドよりも強力な薬剤になる。しかし、リボザイムの広範な用途が、化学的および酵素的分解に対してこれらが感受性であることによって妨げられ、標的部位特異性は制限されていた(12)。
【０００７】
触媒核酸の新世代のものは、特定のRNA配列（13-16）に対して触媒活性を有するDNA分子を含むことが記載されていた。これらのDNA酵素は、ハンマーヘッド・リボザイムよりも大きな触媒効率を示し、自発性のRNA切断の速度よりも約10,000,000倍の速度の増進を生じ、より高い基質特異性を提供し、化学的および酵素的な分解により耐性であり、および合成するのがはるかに安い。
【発明の開示】
【０００８】
概要
本発明は、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1（PAI-1）をコードするmRNAを特異的に切断する触媒核酸であって、5’から3’の向きに：
(a)少なくとも4ヌクレオチドの第1の結合ドメインを定義する連続したヌクレオチド;
(b)前記第1の結合ドメインの3’末端に近接して位置する触媒ドメインを定義し、かつPAI-1コードするmRNAを所定のホスホジエステル結合で切断することができる連続したヌクレオチド;および、
(c)前記触媒ドメインの3’末端に近接して位置する少なくとも4ヌクレオチドの第2の結合ドメインを定義する連続したヌクレオチドを含み、
前記それぞれの結合ドメインのヌクレオチドの配列は、前記PAI-1をコードするmRNAの一連のリボヌクレオチドに相補的であり、および前記触媒核酸は、PAI-1をコードするmRNAにハイブリダイズし、かつ特異的に切断する触媒核酸を提供する。
【０００９】
本発明は、直前に記載の触媒核酸および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００１０】
本発明は、発現を阻害しなければPAI-1を発現する細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害する方法であって、前記細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害するために、請求項1に記載の触媒核酸と前記細胞を接触させることを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明は、被検体の細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害する方法であって、被検体の細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害するために有効な直前に記載の触媒核酸の量を被検体に投与することを含む方法をさらに提供する。
【００１２】
本発明は、被検体の細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害する方法であって、前記被検体の細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害するために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与することを含む方法をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、被検体の心筋細胞のアポトーシスを含む被検体の循環器病を治療する方法であって、前記被検体の心筋細胞のアポトーシスを阻害するために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより循環器病を治療することを含む方法をさらに提供する。
【００１４】
本発明は、原線維形成を含む被検体の線維性の疾患を治療する方法であって、前記被検体の原線維形成を阻害するために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより前記線維性の疾患を治療することを含む方法をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、高いストリンジェンシーの条件下でPAI-1をコードするmRNAとハイブリダイズし、かつ8〜40ヌクレオチドの間の長さである連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドをさらに提供する。
【００１６】
本発明は、前記ヒトPAI-1をコードするmRNAが配列番号：5に記載されている配列の連続したヌクレオチドを含む、直前に記載のオリゴヌクレオチドをさらに提供する。
【００１７】
本発明は、被検体を治療する方法であって、前記被検体のPAI-1の発現を阻害するために有効な直前に記載のオリゴヌクレオチドの量を前記被検体に投与して、これにより前記被検体を治療することを含む方法をさらに提供する。
【００１８】
本発明は、被検体の心筋細胞のアポトーシスを含む前記被検体の循環器病を治療する方法であって、前記被検体の心筋細胞のアポトーシスを阻害するために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより循環器病を治療することを含む方法をさらに提供する。
【００１９】
本発明は、被検体の原線維形成を含む前記被検体の線維性の疾患を治療する方法であって、前記被検体の原線維形成を阻害するために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与してこれにより線維性の疾患を治療することを含む方法をさらに提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
詳細な説明  
本明細書において使用されるものとして、他に言及しない限り、以下のそれぞれの用語は、以下に記載の定義を有するものとする。
【００２１】
「投与すること」は、当業者に既知の任意の種々の方法およびデリバリー系を意味する。投与することは、例えば、インプラントを経て、経粘膜的に、経皮的に、および皮下に、経口的に、非経口的に、局所的に、心臓注射によって、吸入によって、カテーテル、たとえば逆方向性輸尿管カテーテルによって、動脈内注射によって、ステントによって行うことができる。
【００２２】
「触媒の」は、触媒、すなわちそれ自体は永久的な構造変化を受けずに化学反応の割合を増大する薬剤としての薬剤の機能を意味するものとする。
【００２３】
「コンセンサス配列」は、触媒による核酸の切断が生じる長さの少なくとも2つの残基のヌクレオチド配列を意味するものとする。例えば、触媒デオキシリボ核酸を含むコンセンサス配列は、プリンで：ピリミジン、たとえば「A：U」および「G：U」である。
【００２４】
「プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1タンパク質」は、ヒトとして同定されたときは、（配列番号：5）として同定されたヌクレオチド配列によってコードされ、かつ配列番号：6に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、ラットに由来するものとして同定されたときは、配列番号：15として同定されるヌクレオチド配列によってコードされ、かつ配列番号：16に示したアミノ酸配列を有するタンパク質を、および人工によるか、または天然に存在するかにかかわらず、これらのいずれかの任意の変種を意味するものとする。変種は、相同体、翻訳後修飾、変異体、および多型を含むが、これらに限定されない。
【００２５】
「プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1 mRNA」は、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1タンパク質をコードする配列を含むmRNA分子を意味するものとする。プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1 mRNAは、タンパク質コード配列、並びに5’および3’の非タンパク質コード配列を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
「ハイブリダイズする」は、配列相補性に基づいて、1つの一本鎖核酸分子がもう一つの核酸分子にアニーリングすることを意味するものとする。核酸間のハイブリダイゼーションの性向は、これらの環境の温度およびイオン強度、核酸の長さ、および相補性の程度に依存する。ハイブリダイゼーションに対するこれらのパラメータの効果は、当該技術分野において周知である（38を参照されたい）。
【００２７】
「阻害する」は、遅くすること、停止すること、またはさもなければ妨げることを意味するものとする。
【００２８】
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェンシー」は、核酸、塩、および温度によって定義されるハイブリダイゼーションの条件をいうものとする。これらの条件は、当該技術分野において周知であり、変更してもよい。低いまたは高いストリンジェンシーを含む多くの同等の条件は、配列（DNA、RNA、塩基組成）の長さおよび性質、標的（DNA、RNA、塩基組成）の性質、環境（溶液中で、または固形基質に固定される）、塩およびその他の成分（たとえば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、および／またはポリエチレングリコール）の濃度、並びに反応の温度（プローブの融解温度以下の約5℃〜融解温度以下の約20℃〜25℃の範囲内で）などの因子に依存する。上記の列記した条件とは異なるが、同等の低いまたは高いストリンジェンシーの条件を作製するために、1つまたは複数の因子を変化させてもよい。当業者にはよく理解されているであろうが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、同一または関連したポリヌクレオチド配列を、同定または検出するために変更してもよい。
【００２９】
「核酸」は、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含むが、これに限定されない任意の核酸、およびこれらの類似体または誘導体を含むものとする。核酸を形成するヌクレオチドは、これらのヌクレオチド類似体または誘導体であってもよい。核酸は、非ヌクレオチドを組み込んでいてもよい。
【００３０】
「ヌクレオチド」は、限定されるものではないが、ヌクレオチドおよびこれらの類似体または誘導体を含む。たとえば、ヌクレオチドは、塩基A、C、G、T、およびU、並びにこれらの誘導体を含んでいてもよい。これらの塩基の誘導体は、当該技術分野において周知であり、PCR Systems、ReagentsおよびConsumables（Perkin Elmer Catalogue 1996-1997, Roche Molecular Systems, Inc. , Branchburg, New Jersey, USA）において例示される。
【００３１】
「薬学的に許容されるキャリア」は、当業者に既知の任意の種々のキャリアを意味するものとする。
【００３２】
「特異的に切断する」は、標的mRNA分子に対する直前に記載の触媒デオキシリボ核酸分子のうちの1つの作用をいうときは、触媒デオキシリボ核酸分子の2つの結合ドメインのいずれに対する配列相補性も欠いている別のmRNA分子を切断することなく、標的mRNA分子を切断することを意味するものとする。
【００３３】
「被検体」は、ヒト、霊長類、マウス、ラット、モルモット、またはウサギなどの任意の動物を意味するものとする。
【００３４】
「DNA酵素」、「DNAzyme」、および「触媒デオキシリボ核酸」の用語は、同義的に使用される。
【００３５】
「ベクター」は、特異的な核酸配列を生物体のゲノムに安定に導入するために使用することができる核酸分子を含むものとする。
【００３６】
本発明は、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1（PAI-1）をコードするmRNAを特異的に切断する触媒核酸であって、5’から3’の向きに：
(a)少なくとも4ヌクレオチドの第1の結合ドメインを定義する連続したヌクレオチド;
(b)前記第1の結合ドメインの3’末端に近接して位置する触媒ドメインを定義し、かつPAI-1コードするmRNAを所定のホスホジエステル結合で切断することができる連続したヌクレオチド;および、
(c)前記触媒ドメインの3’末端に近接して位置する少なくとも4ヌクレオチドの第2の結合ドメインを定義する連続したヌクレオチドを含み、
前記それぞれの結合ドメインのヌクレオチドの配列は、前記PAI-1をコードするmRNAの一連のリボヌクレオチドに相補的であり、および前記触媒核酸は、PAI-1をコードするmRNAにハイブリダイズし、かつ特異的に切断する触媒核酸を提供する。
【００３７】
異なる態様において、触媒デオキシリボ核酸分子は、5'-A(またはG)およびU(T)-3'(またはC)の間の結合において、すなわちプリン：ピリミジンのコンセンサス配列においてPAI-1をコードするmRNAを切断する。さらなる態様において、触媒デオキシリボ核酸分子は、mRNA内の5'-AU-3’;5’-AC-3’;5’-GU-3’;または5'-GC-3’部位のいずれかの結合においてPAI-1をコードするmRNAを切断する。
【００３８】
ヒトPAI-1-コードするmRNAをターゲットするために、触媒核酸は、mRNA内のコンセンサス切断部位5'-プリン：ピリミジン-3’（GenBankアクセッション番号：M16006）(36)に基づいて設計することができる。RNAの折りたたみのソフトウエア、たとえばRNAdraw 2.1により、オープン・ループ上に位置する潜在的な切断部位は、特に標的として好ましい（22）。DNAに基づいた触媒核酸には、2つの配列特異的なアームがPAI-1をコードするmRNA配列（配列番号：5として示した対応するDNA）に基づいた触媒コア（配列番号：1)に付着された構造を利用することができる。触媒DNA構造のさらなる例は、(23)および(24)において詳述されている。商業的に入手可能なマウス脳ポリA-RNA（Ambion）は、触媒デオキシリボ核酸の効率を試験するためのインビトロでの開裂反応の鋳型として役立ち得る。
【００３９】
触媒核酸分子は、PAI-1をコードするmRNAを、その中のコンセンサス配列のそれぞれおよびいずれかにおいて切断することができる。触媒リボおよびデオキシリボ核酸のコンセンサス配列は、既知であり、PAI-1をコードするmRNA配列も既知であるので、当業者であれば、本願明細書に基づいて、PAI-1をコードするmRNAコンセンサス配列のいずれかに向けられた触媒リポ核酸分子または触媒デオキシリボ核酸分子を容易に構築することができる。本発明の好ましい態様において、触媒デオキシリボ核酸は、10〜23の構造を含む。DNAzymeによるPAI-1 mRNAの切断は、51 5'-AT-3’（-AU）部位、76-AC部位、53-GT-（-GU-）部位、および84-GC-部位を含む、ヒトPAI-1をコードするmRNAのコード領域中の264の切断部位で生じるであろう。PAI-1をコードするmRNAに対応するDNA配列で表されたATおよびAC切断部位のそれぞれについては、図10および11を参照されたい。
【００４０】
例として-AT-を挙げると、切断部位ヌクレオチドは、配列番号：5のヌクレオチド76、82、152、159、254、277、316、328、333、340、344、355、374、391、399、410、415、433、449、472、543、547、550、554、583、586、644、717、745、748、773、794、800、811、847、853、866、901、919、939、1027、1036、1120、1125、1168、1183、1198、1201、1204、1261、および1273を含む。
【００４１】
触媒リボ核酸の例は、ヘアーピンおよびハンマーヘッド・リボザイムを含む。本発明の好ましい態様において、触媒リボ核酸分子は、ハンマーヘッド（25）またはヘアーピン・モチーフ（26、27、28）に形成されるが、デルタ型肝炎ウイルス（29）、グループIイントロン（35）、RNaseP RNA（RNAガイド配列に結合）（30、31）、またはパンカビ属(Neurospora)VS RNA（32、33、34）のモチーフに形成されてもよい。ハンマーヘッド・リボザイムは、mRNAの5'-NUH-3'トリプレットであって、Uは保存されており、Nは任意のヌクレオチドであり、HはG以外のC、U、Aであるものを切断することができる。たとえば、ヒトPAI-1をコードするmRNAのコード領域には、ハンマーヘッド・リボザイムによって切断することができる151部位がある。図12を参照されたい。
【００４２】
触媒核酸によるPAI-1をコードするmRNAの切断は、PAI-1をコードするmRNAの1つまたは複数の通常の機能を妨げる。たとえば、妨げられるmRNAの機能は、タンパク質の翻訳部位へのRNAの転位置、RNAからのタンパク質の翻訳、1つまたは複数のmRNA種を産生するRNAのスプライシング、およびRNAに結合するであろう触媒活性などの全ての生命の機能を含む。
【００４３】
一つの態様において、第1の結合ドメインのヌクレオチドは、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドを含む。もう一つの態様において、第2の結合ドメインのヌクレオチドは、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドを含む。一つの態様において、第1の結合ドメインのヌクレオチドは、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド誘導体を含む。もう一つの態様において、第2の結合ドメインのヌクレオチドは、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド誘導体を含む。一つの態様において、第1の結合ドメインのヌクレオチドは、少なくとも1つのリボヌクレオチドを含む。もう一つの態様において、第2の結合ドメインのヌクレオチドは、少なくとも1つのリボヌクレオチドを含む。一つの態様において、第1の結合ドメインのヌクレオチドは、少なくとも1つのリボヌクレオチド誘導体を含む。もう一つの態様において、第2の結合ドメインのヌクレオチドは、少なくとも1つのリボヌクレオチド誘導体を含む。一つの態様において、第1の結合ドメインは、結合ドメインのヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾塩基を含む。もう一つの態様において、第2の結合ドメインのヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾塩基を含む。
【００４４】
ヌクレオチドは、イノシン、デオキシイノシンなどのその他の塩基を含んでもよく、ヒポキサンチンを使用してもよい。加えて、同等負担物の（isoteric）プリン2'デオキシフラノシド類似体、2'-デオキシネブラリン（2'-deoxynebularine）もしくは2'-デオキシキサントシン（deoxyxanthosine）、またはその他のプリンまたはピリミジン類似体を使用してもよい。塩基および塩基同族体を慎重に選択することによって、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの性質を微調整してもよい。たとえば、ハイブリダイゼーション特異性を減少させるためにイノシンを使用してもよく、一方で、ハイブリダイゼーション特異性を増大するためにジアミノプリンを使用してもよい。
【００４５】
アデニンおよびグアニンは、位置N3、N7、N9、C2、C4、C5、C6、またはC8で修飾してもよく、なおもその水素結合能力を維持するであろう。シトシン、チミン、およびウラシルは、位置N1、C2、C4、C5、またはC6で修飾されてもよく、なおもその水素結合能力を維持するであろう。一部の塩基同族体は、天然に存在する塩基とは異なる水素結合性を有する。たとえば、2-アミノ-2'-dAは、通常の2つの（2）チミン（T）に対する水素結合の代わりに、3つ（3）形成する。二重鎖安定度を増大することが示された塩基同族体の例は、5-フルオロ-2'-dU、5-ブロモ2'-dU、5-メチル-2'-dC、5-プロピニル-2'-dC、5-プロピニル-2'-dU、2-アミノ2'-dA、7-デアザグアノシン、7-デアザデノシン（7-deazadenosine）、およびN2-イミダゾリルプロピル-2'-dGを含むが、これらに限定されない。
【００４６】
ヌクレオチド類似体は、糖残基を修飾および／または置換することによって作製されてもよい。また、ヌクレオチドの糖残基は、1つまたは複数の置換基の付加によって修飾されてもよい。たとえば、糖残基の1つまたは複数が、以下の置換基の1つまたは複数を含んでいてもよい：アミノ、アルキルアミノ、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノアルキルアミノ、O、H、アルキル、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCN、O-アルキル、S-アルキル、SOMe、SO2Me、ONO2、NH-アルキル、OCH2CH=CH2、OCH2CCH、OCCHO、アリル、0-アリル、NO2、N3、およびNH2。たとえば、糖の2'位置は、以下の基のうちの1つを含むように修飾されてもよい：H、OH、OCN、O-アルキル、F、CN、CF3、アリル、O-アリル、OCF3、S-アルキル、SOMe、SO2Me、ONO2、NO2、N3、NH2、NH-アルキル、またはOCH=CH2、OCCHであって、アルキルは、直鎖、分枝、飽和、または不飽和であってもよい。加えて、ヌクレオチドは、その糖の1つもしくは複数が、リボースまたは六炭糖（すなわち、グルコース、ガラクトース）になるように修飾および／または置換されてもよく、または1つもしくは複数のアノマーの糖を有していてもよい。また、ヌクレオチドは、1つまたは複数のL-糖を有していてもよい。
【００４７】
このような修飾された塩基／ヌクレオシド／ヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第6,248,878号および第6,251,666号を含むが、これらに限定されず、これらは本明細書に参照により援用される。
【００４８】
糖は、蛍光ラベルなどのその他の化学薬品に付着するための1つまたは複数のリンカーを含むように修飾されてもよい。ある態様において、糖は、1つまたは複数のアミノアルキルオキシ・リンカーに結合される。もう１つの態様において、糖は、1つまたは複数のアルキルアミノ・リンカーを含む。アミノアルキルオキシおよびアルキルアミノ・リンカーは、これらのアミノ基でビオチン、コール酸、フルオレッセイン、またはその他の化学的成分に付着されてもよい。
【００４９】
ヌクレオチド類似体または誘導体は、ペンダント基が付着されていてもよい。ペンダント基は、オリゴヌクレオチドの細胞の取込みを増大すること、標的核酸の分解を増強すること、およびハイブリダイゼーション親和性を増大することを含む（しかし、これらに限定されない）種々の目的を果たす。ペンダント基は、オリゴヌクレオチドの任意の部分に結合することができるが、一般にオリゴヌクレオチド鎖の末端（群）に結合される。ペンダント基の例は、以下を含むが、これらに限定されない：アクリジン誘導体（すなわち、2-メトキシ6-クロロ9-アミノアクリジン）;ソラレン誘導体、アジドフェナシル（azidophenacyl）、プロフラビン、およびアジドプロフラビン（azidoproflavin）などの架橋剤;人工エンドヌクレアーゼ;EDTA-Fe（II）、o-フェナントロリン-Cu（I）、およびポルフィリン-Fe（II）などの金属錯体;アルキル化の部分;アミノ-1-ヘキサノールブドウ球菌ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼおよびアルカリホスファターゼ;末端転移酵素;アブザイム;コレステリル部分;親油性のキャリア;ペプチド抱合体;長鎖アルコール;リン酸エステル;アミノ;メルカプト基;放射性マーカー;色素などの非放射性マーカー;およびポリリジンまたはその他のポリアミン。1つの例において、核酸は、炭水化物、硫酸化炭水化物、またはグリカン（gylcan）に結合されたオリゴヌクレオチド含む。抱合体は、選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに対してこれらを共有結合で結合することによって別の非特異的なDNA結合分子に対して特異性を導入することと同じ方法によるものと考えられるであろう。
【００５０】
触媒核酸結合ドメインは、その糖の1つまたは複数が、リボース、グルコース、シュークロース、もしくはガラクトース、または任意のその他の糖であるように修飾または置換されていてもよい。あるいは、ホスホロチオネート・オリゴヌクレオチドは、その糖の1つまたは複数が、その2'位置、すなわち2'アリルまたは2'-O-アリルにおいて置換または修飾されていてもよい。2'-O-アリル糖の例は、2'-O-メチルリボヌクレオチドである。さらに、ホスホロチオネート・オリゴヌクレオチドは、その糖の1つまたは複数が、α-アノマー糖を形成するように置換または修飾されていてもよい。
【００５１】
触媒核酸は、非ヌクレオチド置換を含んでもよい。非ヌクレオチド置換は、アベーシックな（abasic）ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、またはポリ炭化水素化合物を含む。「アベーシックな（abasic）」または「アベーシックな（abasic）ヌクレオチド」の用語は、本明細書に使用されるものとして、1'位置において、塩基を欠いているか、または塩基の代わりにその他の化学基を有する糖残基を含む。
【００５２】
一つの態様において、第1の結合ドメインのヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合を含む。もう一つの態様において、第2の結合ドメインのヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む。核酸は、修飾された結合を含んでもよい。たとえば、触媒核酸のヌクレオシド間の結合には、ホスホロチオネート結合を含んでもよい。核酸は、-NH、-CH2、または-S部分などの類似体と結合している2つの架橋酸素原子の一方または両方にを置換することによって修飾されているヌクレオチドを含んでもよい。また、当該技術分野において既知のその他の酸素類似体を使用してもよい。ホスホロチオネート結合は、立体規則性または立体不規則性であってもよい。
【００５３】
一つの態様において、PAI-1をコードするmRNAは、ヒトPAI-1をコードする。さらなる態様において、ヒトPAI-1をコードするmRNAは、配列番号：5に記載した配列を有する。
【００５４】
本発明は、直前に記載の触媒核酸および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物を提供する。以下の薬学的に許容されるキャリアは、これらの最も一般的な関連したデリバリー系に関して、実施例により記載してある。
【００５５】
経皮デリバリー系は、例えば水性および非水性のゲル、クリーム、複合エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性および非水性の溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素ベースおよび粉末を含み、可溶化剤、浸透賦活薬（たとえば脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、およびアミノ酸）、および親水性ポリマー(たとえば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含むことができる。一つの態様において、薬学的に許容されるキャリアは、リポソームまたは経皮の賦活薬である。本発明において使用することができるリポソームの例は、以下を含む：(1)CellFectin、陽イオン性の脂質N,NI,NII,NIII-テトラメチルN,NI,NII,NIII-テトラパルミチ-スペルミンおよびジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）（GIBCOBRL）の1：1.5(M／M)リポソーム製剤;(2)CytofectinGSV、陽イオン性の脂質およびDOPE（Glen Research）の2：1（M／M）リポソーム製剤;(3)DOTAP（ノルマル[l-（2,3-ジオレオイルオキシ）-N,N,N-3メチル-アンモニウムエチルサルフェート）（Boehringer Manheim）;および(4)リポフェクトアミン（Lipofectamine）、ポリカチオン性脂質DOSPAおよび中性脂質DOPE（GIBCOBRL）の3：1（M／M）リポソーム製剤。
【００５６】
経壁デリバリー系は、パッチ、タブレット、坐薬、ペッサール、ゲル、およびクリームを含み、可溶化剤および賦活薬（たとえば、プロピレングリコール、胆汁酸塩、およびアミノ酸）、およびその他の媒体（たとえば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸などの親水性ポリマー）などの賦形剤を含むことができる。
【００５７】
注射用の薬物デリバリー系は、溶液、懸濁液、ゲル、微粒子、および重合体の注射可能薬物を含み、溶解度を変える薬剤（たとえば、エタノール、プロピレングリコール、およびシュークロース）および重合体（たとえばポリカプリルアクトン（polycaprylactones）およびPLGA's)などの賦形剤を含むことができる。移植可能な系は、ロッドおよびディスクを含み、PLGAおよびポリカプリルアクトン（polycaprylactones）などの賦形剤含むことができる。
【００５８】
経口デリバリー系は、タブレットおよびカプセルを含む。これらは、結合剤（たとえば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、その他のセルロース材料、およびデンプン）、希釈液（たとえば、ラクトースおよびその他の糖、デンプン、リン酸二カルシウム、およびセルロース材料）、崩壊剤（たとえば、デンプン重合体およびセルロース材料）、および潤滑剤（たとえば、ステアリン酸エステルおよびタルク）などの賦形剤を含むことができる。
【００５９】
本発明は、発現を阻害しなければPAI-1を発現する細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害する方法であって、前記細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害するために、直前に記載の触媒核酸と前記細胞を接触させることを含む方法を提供する。
【００６０】
本発明は、被検体の細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害する方法であって、被検体の細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害するために有効な直前に記載の触媒核酸の量を被検体に投与することを含む方法を提供する。
【００６１】
本発明は、被検体の細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害する方法であって、前記被検体の細胞におけるPAI-1の発現を特異的に阻害するために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与することを含む方法を提供する。
【００６２】
本発明は、被検体の心筋細胞のアポトーシスを含む被検体の循環器病を治療する方法であって、前記被検体の心筋細胞のアポトーシスを阻害するために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより循環器病を治療することを含む方法を提供する。
【００６３】
一つの態様において、循環器病は、鬱血性心不全である。もう一つの態様において、循環器病は、心筋梗塞である。もう一つの態様において、循環器病は、アンギナである。もう一つの態様において、循環器病は、心筋虚血である。もう一つの態様において、循環器病は心筋症である。
【００６４】
本発明は、被検体の新内膜形成を含む被検体の循環器病を治療する方法であって、前記被検体の新内膜形成を阻害するために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより前記被検体の循環器病を治療することを含む方法を提供する。循環器病は、医原性であってもよく、循環器病は、再狭窄であることができる。一つの態様において、新内膜形成は、被検体のバルーン血管形成術により生じる。一つの態様において、新内膜形成は、被検体のステント移植により生じる。
【００６５】
本発明は、原線維形成を含む被検体の線維性の疾患を治療する方法であって、前記被検体の原線維形成を阻害するために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより前記線維性の疾患を治療することを含む方法を提供する。異なる態様において、線維性の疾患は、腎疾患、肝臓の疾患、肺疾患、皮膚の病気、または目の病気である。さらなる態様において、皮膚の線維性の病気は、強皮症またはソラシス（psorasis）である。
【００６６】
「有効な量」は、少なくとも、所与の疾病状態を治療する、減少させる、逆転させる、またはそうでなければ阻害するために十分な量である。線維性の疾患の場合、これは、原線維形成を減少する、逆転させる、またはそうでなければ阻害するために十分な量を意味する。循環器病の場合、これは、心筋細胞アポトーシスを減少する、逆転させる、またはそうでなければ阻害するために十分な量を意味する。新内膜形成の場合、これは、新内膜形成減少する、逆転させる、またはそうでなければ阻害するために十分な量を意味する。
【００６７】
直前に記載の薬学的組成物の有効な量の決定は、ルーチンの計算方法を使用して、動物データに基づいて行うことができる。一つの態様において、有効な量は、kg体重につき約10ng〜約100μgの間の上記核酸分子を含む。もう１つの態様において、有効な量は、kg体重につき約100ng〜約10μgの間の核酸分子を含む。さらなる態様において、有効な量は、kg体重あたり約1μg〜約5μgの間の核酸分子を含む。もう1つの態様において、有効な量は、kg体重につき約10ng〜約100μgの間の上記核酸分子を含む。好ましい態様において、有効な量は、kg体重につき約500μg〜約1000μgの間の核酸分子を含む。もう一つの態様において、有効な量は、kg体重あたり約1mg〜約2mgの間の核酸分子を含む。
【００６８】
また、本発明の化合物は、その他の分子、分子構造、または化合物の混合物、例えば、リポソーム、受容体にターゲットされた分子、経口、直腸、局所、もしくは取込み、分布、および／または生体吸収を助けるためのその他の製剤と、混合され、カプセル化され、縫合され、またはそうでなければ結合されていてもよい。このような取込み、分布、および／または生体吸収を助ける製剤の標品を教示する代表的な米国特許は、米国特許第5,108,921号；第5,354,844号；第5,416,016号；第5,459,127号；第5,521,291号；第5,543,158号；第5,547,932号；第5,583,020号；第5,591,721号；第4,426,330号；第4,534,899号；第5,013,556号；第5,108,921号；第5,213,804号；第5,227,170号；第5,264,221号；第5,356,633号；第5,395,619号；第5,416,016号；第5,417,978号；第5,462,854号；第5,469,854号；第5,512,295号；第5,527,528号；第5,534,259号；第5,543,152号；第5,556,948号；第5,580,575号；、および第5,595,756号を含むが、これらに限定されず、それぞれは本明細書に参照として組み入れられる。
【００６９】
循環器病または線維性の疾患を患っている哺乳類に対して、循環器病または線維性の疾患の有害効果を減少するために治療的に哺乳類を治療するために有効である量および処理スケジュールで、天然の形態かまたはキャリア培地に懸濁するかのいずれかで、触媒核酸を投与することが好ましい。PAI-1をコードするmRNAの核酸配列の異なる切片をターゲットする、1つまたは複数の異なる触媒核酸またはアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはこれらの類似体を共に、単一用量で、または異なる用量で、および所望の治療によって異なる量および時間で投与してもよい。触媒核酸またはアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、初めにオリゴヌクレオチドを血流に、およびその後に細胞に入れることができる方法で、または代わりに、触媒核酸もしくはアンチセンス・オリゴヌクレオチドを細胞または細胞群、たとえば心筋細胞に直接導入するために、電気穿孔法によって、または腎組識へのカテーテルによる直接注射によってなどにの手段により、哺乳類に投与することができる。このような治療法のための最適用量および治療スケジュールを決定することは、当業者の範囲内のことである。
【００７０】
触媒核酸の有効な量は、PAI-1発現の阻害（または、原線維形成の阻害）を必要とするヒト患者に対して、1日に1〜6回以上または1日おきに投与される。用量は、治療される異常な循環器病の重篤さおよび効果の応答性に依存的であり、数日から数月の持続的な治療経過であるか、または治癒がなされるか、もしくは効果の減少が達成されるまでである。投与される実際の用量は、患者の大きさおよび重量、治療の性質が予防的または治療的な性質かどうか、患者の年齢、健康、および性、投与の経路、並びにその他の因子を考慮してもよい。
【００７１】
薬学的組成物は、薬学的に使用することができる標品中に、触媒核酸のプロセシングを容易にする適切な賦形剤および助剤を含んでいてもよい。好ましくは、標品、特に、経口投与することができ、およびタブレット、糖衣丸、およびカプセルなどの好ましいタイプの投与に使用することができるもの、並びに坐薬などの直腸に投与することができる標品、並びに非経口的または経口的な投与のために適した溶液、封入化合物を含む頬または舌下に投与することができる組成物は、活性成分の重量の約0.1〜約99パーセントを賦形剤と共に包含する。
【００７２】
本発明の製剤は、それ自体当該技術分野において周知の方法で製造される。例えば、
製剤は、従来の混合、顆粒化、糖衣丸を作製、溶解、または凍結乾燥プロセスによって作製されてもよい。使用されるプロセスは、使用される活性成分の最終的に物性に依存する。
【００７３】
適切な賦形剤は、特に、糖、例えばラクトースもしくはシュークロース、マンニトールもしくはソルビトール、セルロース標品、および／またはリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウムもしくはリン酸カルシウムなどの充填剤、並びにデンプン、ペースト、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドンを使用するものなどの結合剤である。必要に応じて、上述のデンプン並びにカルボキシメチルデンプン、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのこれらの塩などの、崩壊剤が加えられてもよい。助剤は、たとえばシリカ、タルク、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムなどのこれらの塩、および／またはポリエチレングリコールなどの、流れを調節する薬剤および滑沢剤である。糖衣丸コアは、適切なコーテングによって提供されてもよく、必要に応じて、これは胃液に耐性であってもよい。このために、濃縮砂糖溶液を使用されてもよく、これは、任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、グリコール、および／または酸化チタン(IV)、ラッカー溶液、および適切な有機溶剤または混合溶媒を含んでいてもよい。胃液に耐性のコーテングを製造するためには、フタル酸アセチルセルロースまたはフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの適切なセルロース標品の溶液を使用する。例えば、異なる組み合わせの活性化合物用量を同定または特徴づけるために、染料および色素を糖衣丸コーテングのタブレットに添加してもよい。その他の経口的に使用することができる医薬品には、ゼラチンでできたプッシュフィットカプセル、並びにゼラチンおよびグリセリンまたはソルビトールなどの可塑剤でできている軟らかい密封されたカプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、顆粒の形態で活性化合物を含むことができ、これは、ラクトースなどのフィルター、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意に安定剤が混合されていてもよい。軟カプセルにおいて、適切な活性化合物は、望ましくは脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解され、または懸濁される。加えて、安定剤が添加されてもよい。
【００７４】
直腸に使用することができる可能性のある薬学的標品は、例えば、坐剤基剤と活性化合物の組み合わせからなる坐薬を含む。適切な坐剤基剤は、例えば天然のまたは合成のトリグリセリド、パラフィン族炭化水素、ポリエチレングリコール、またはより高級なアルカノールである。加えて、基剤と活性化合物の組み合わせからなるゼラチン直腸投与カプセルを使用することもできる。可能な基剤材料は、例えば液状のトリグリセリド、ポリエチレングリコール、またはパラフィン族炭化水素を含む。
【００７５】
非経口投与のための適切な製剤は、水溶性または水に分散可能な形態の活性化合物の水溶液を含む。加えて、適切な油性注射懸濁液として、活性化合物の懸濁液を投与してもよい。適切な親油性溶媒または媒体は、脂肪油、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリドを含む。水性注射懸濁液は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／またはデキストランを含む懸濁液の粘性を増大する物質を含んでもよい。任意に、懸濁液は、安定剤も含んでいてもよい。
【００７６】
さらに、本発明の触媒核酸は、また、活性成分が、脂質層に対して接着性の水性同心性層からなる微粒子中に散在またはさまざまに存在して含まれる薬学的組成物である、リポソームまたは免疫リポソームに封入されて投与されてもよい。リポソームは、肝細胞にオリゴヌクレオチドをターゲットする際に特に活性である。活性成分は、その溶解度によって、水層および脂質層の両方に、または一般に脂質懸濁液と呼ばれるものに存在する。疎水性の層は、一般に、しかしもっぱら、レシチンおよびスフィンゴミエリンなどのリン脂質、コレステロールなどのステロイド、ジセチルホルフェート（dicetylphosphate）、ステアリルアミン、またはホスファチジン酸などの多かれ少なかれイオン性の界面活性物質、および／または疎水性の性質のその他の材料を含む。リポソームの直径は、約15nm〜約5ミクロンで一般に変動する。
【００７７】
また、本発明は、高いストリンジェンシーの条件下でPAI-1をコードするmRNAとハイブリダイズする、8〜40ヌクレオチドの間の長さの連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。異なる態様において、オリゴヌクレオチドは、40〜80ヌクレオチドの間の長さである。
【００７８】
好ましい態様において、PAI-1をコードするmRNAとアンチセンス・オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、PAI-1をコードするmRNAの通常の機能の1つまたは複数を妨げる。妨げられるmRNAの機能は、タンパク質の翻訳部位へのRNAの転位置、RNAからのタンパク質の翻訳、1つまたは複数のmRNA種を産生するRNAのスプライシング、およびRNAによる関与するであろう触媒活性などの全ての生命の機能を含む。例えば、ヒトPAI-1アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ヒトPAI-1 mRNA分子上の標的と所与のストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズして、こうしてPAI-1タンパク質へのこれらの翻訳を阻害する。
【００７９】
妨げられるmRNAの機能は、タンパク質の翻訳部位へのRNAの転位置、RNAからのタンパク質の翻訳、1つまたは複数のmRNA種を産生するRNAのスプライシング、およびRNAによる関与するであろう触媒活性などの全ての生命の機能を含む。PAI-1アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、特異的にPAI-1をコードするmRNA分子上の標的図書世のストリンジェントの条件下でハイブリダイズして、この際にPAI-1へのこれらの翻訳を阻害する。
【００８０】
本発明によれば、当業者は、メッセンジャーRNAには3文字遺伝暗号を使用するタンパク質をコードする情報だけでなく、5'-非翻訳の領域、3'-非翻訳の領域、5'キャップ領域、およびイントロン／エキソン接合部リボヌクレオチドなどの当業者に既知の領域を形成する関連したリボヌクレオチドも含むことを理解するものと考えられる。したがって、以下に記載されているアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたは触媒核酸は、本発明に従って処方されてもよく、これらは、これらの関連したリボヌクレオチドに対し、並びに情報のリボヌクレオチドに対し、完全にまたは一部にターゲットされる。したがって、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、転写開始点領域、翻訳開始コドン領域、5'キャップ領域、イントロン／エキソン接合部、コード配列、翻訳終止コドン領域、または5'-もしくは3'-非翻訳領域の配列と特異的にハイブリダイズしてもよい。同様に、触媒核酸は、転写開始点領域、翻訳開始コドン領域、5'キャップ領域、イントロン／エキソン接合部、コード配列、翻訳終止コドン領域、または5'-もしくは3'-非翻訳領域の配列を特異的に切断してもよい。当該技術分野において既知のとおり、翻訳開始コドンは、典型的には5'-AUG（転写されたmRNA分子において;対応するDNA分子においては5'-ATG）である。RNA配列5'-GUG、5'UUGまたは5'-CUG、および5'-AUA、5'-ACGおよび5'-CUGを有する翻訳開始コドンを有する少数の遺伝子は、インビボで機能することが示されている。したがって、「翻訳開始コドン」の用語は、イニシエーターアミノ酸がそれぞれの例において、典型的には真核生物のメチオニンである場合であっても、多くのコドン配列を含むことができる。また、真核細胞遺伝子は、2つ以上の他の翻訳開始コドンを有するであろうことは当該技術分野において既知であり、その内のいずれか一つが、特定の細胞タイプまたは組織において、または特定の条件設定下で、翻訳開始のために優先して利用されてもよい。本発明に関して、「翻訳開始コドン」は、このようなコドンの配列（群）に関係なく、PAI-1をコードする遺伝子から転写されるmRNA分子の翻訳を開始するためにインビボで使用されるコドンまたはコドン類をいう。また、遺伝子の翻訳終止コドンは、3つの配列（すなわち、5'-UAA、5'-UAG、および5'-UGA（対応するDNA配列は、それぞれ5'-TAA、5'-TAG、および5'-TGAである。）のうちの1つを有してもよいことが、当該技術分野において既知である。「翻訳開始コドン領域」の用語は、翻訳開始コドンからいずれかの向き（すなわち、5'または3'）で、約25〜約50の隣接するヌクレオチドを含むようなmRNAまたは遺伝子の部分をいう。同様に、この領域は、好ましい標的領域の1つである。同様に、「翻訳終止コドン領域」の用語は、翻訳終止コドンからいずれかの向き（すなわち、5'または3'）で、約25〜約50隣接するヌクレオチドを含むようなmRNAまたは遺伝子の部分をいう。この領域も、好ましい標的領域の1つである。また、オープンリーディングフレームまたは「コード領域」は、当該技術分野において翻訳開始コドン〜翻訳終止コドンの間の領域をいうことが既知であり、効率的にターゲットされるであろう領域である。その他の好ましい標的領域は、当該技術分野において翻訳開始コドンから5'方向のmRNA部分をいうことが知られる5'非翻訳領域（5'UTR）を含み、したがって、5'キャップ部位とmRNAまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドの翻訳開始コドンの間のヌクレオチドを含み、かつ当該技術分野において翻訳終止コドンから3'方向のmRNA部分をいうことが知られる3'非翻訳領域（3'UTR）を含み、したがって翻訳終止コドンとmRNAまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドの3'末端の間のヌクレオチドを含む。また、mRNAスプライス部位は、好ましい標的領域であろうし、異常なスプライシングが疾患に関係する局面、または特定のmRNAスプライス産物の過剰産生が疾患に関係する局面において、特異的に有用である。また、再編成または欠失による異常な融合の結合部は、好ましい標的であろう。
【００８１】
一旦標的部位または部位群が同定されると、標的に対して十分に相補的である、すなわち十分によく、かつ十分な特異性でハイブリダイズするアンチセンス・オリゴヌクレオチドを選択して、所望の分子の機能を破壊することができる。「ハイブリダイゼーション」は、本発明に関して、相補的な塩基の間、通常は反対の核酸鎖または核酸鎖の2つの領域の間の水素結合（ワトソン‐クリック型塩基対としても知られる）を意味する。グアニンおよびシトシンは、これらの間で3つの水素が結合を形成することが知られる相補的な塩基類の例である。アデニンおよびチミンは、これらの間で2つの水素結合を形成する相補的な塩基類の例である。「特異的にハイブリダイズできる」および「相補的である」は、DNAまたはRNA標的と触媒核酸との間で安定かつ特異的な結合が生じるように十分な相補性の程度を示すために使用される用語である。一旦PAI-1 mRNA分子上の切断標的部位、たとえばDNA酵素の場合、任意のプリン：ピリミジンコンセンサス配列が同定されたならば、触媒核酸が合成される。PAI-1の多形または変異体を破壊するためにターゲットされる触媒核酸およびアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、おそらくPAI-1 mRNA配列の多型および変異体に基づいて上記と同じように作製されるであろう。
【００８２】
特定のタンパク質をコードするmRNAに対して向けられたアンチセンス・オリゴヌクレオチド配列を、所与の標的mRNA内で最も安定なDNA：RNAハイブリッドを形成するように選択する方法は、当該技術分野において既知であり、米国特許第6,183,966号に例示されており、これは本明細書に参照として組み入れられる。
【００８３】
一つの態様において、直前に記載のオリゴヌクレオチド内の少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオネート結合を含む。ホスホロチオネート・バックボーンによって合成されるアンチセンス・オリゴヌクレオチド分子は、標準的なデオキシリボ核酸と比較して、特異的にエキソヌクレアーゼによる損傷に耐性であるということが証明されており、したがってこれらが優先的に使用される。PAI-1 mRNAに対するホスホロチオネート・アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems （Foster City, CA）model 380B DNA合成装置で、標準的な方法によって合成することができる。たとえば、硫化は、テトラエチルチウラムジスルフィド／アセトニトリルを使用して行うことができる。制御された細孔ガラス支持体からの切断に続いて、オリゴデオキシヌクレオチドを水酸化アンモニウム中で8時間60℃において塩基脱保護（deblocked）し、逆相HPLC[0.1Mの炭酸水素トリエチルアンモニウム／アセトニトリル;PRP-1支持体]によって精製することができる。オリゴマーは、3%の酢酸中で脱トリエチル化し、2%の過塩素酸リチウム／アセトンによって沈殿させて、滅菌水に溶解し、1MのNaCl／エタノールからナトリウム塩として再沈殿させることができる。全長種の濃度は、UV分光法によって決定することができる。
【００８４】
当該技術分野において既知のこのような合成のための任意のその他の手段を、さらに、または代わりに使用してもよい。ホスホロチオネートおよびアルキル化された誘導体など、オリゴヌクレオチドを調製するために同様の技術を使用することが周知である。
【００８５】
好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド・バックボーンは、たとえば、ホスホロチオネート、キラルなホスホロチオネート、ホスホロジチオネート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、3'-アルキレンホスホナート、5'-アルキレンホスホナート、およびキラルなホスホナートを含むメチルおよびその他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3'-アミノホスホラミダート（3'-amino phosphoramidates）およびアミノアルキルホスホラミダート（aminoalkylphosphoramidates）を含むホスホラミダイト（phosphoramidates）、チオノホスホラミダート（thionophosphoramidates）、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の3'-5'結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体、並びに反転した極性を有するものであって、1つまたは複数のヌクレオチド間の結合が、3'から3'、5'から5'、または2'から2'の結合であるものを含む。また、反転した極性を有するオリゴヌクレオチドは、最も3'のヌクレオチド間結合において単一の3'から3'の結合を含み、すなわちアベーシック（abasic）（核酸塩基がなくなっているか、またはこれらの代わりにヒドロキシル基を有するもの）である単一の反転したヌクレオシド残基ヌクレオシド残基が含まれる。また、種々の塩、混合塩、および遊離酸の形態が含まれる。
【００８６】
上記のリンを含有する結合の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,196号；第5,188,897号；第5,264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,306号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799号；第5,587,361号；第5,194,599号；第5,565,555号；第5,527,899号；第5,721,218号；第5,672,697、および第5,625,050号を含むが、これらに限定されず、これらのいくつかは、本出願と共に係属しており、それぞれが本明細書に参照により援用される
1つの態様において、直前に記載のオリゴヌクレオペプチド（oligonucleoptide）のヌクレオチドは、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドで含む。もう一つの態様において、ヌクレオチドは、少なくとも1つのリボヌクレオチドで含む。このようなデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドは、前述のように修飾または誘導体化することができる。
【００８７】
一つの態様において、PAI-1をコードするmRNAは、ヒトPAI-1をコードする。さらなる態様において、ヒトPAI-1をコードするmRNAは、配列が配列番号：5に記載されている連続したヌクレオチドを含む。
【００８８】
本発明は、被検体を治療する方法であって、前記被検体のPAI-1の発現を阻害するために有効な直前に記載のオリゴヌクレオチドの量を前記被検体に投与して、これにより前記被検体を治療することを含む方法をさらに提供する。
【００８９】
本発明は、被検体の心筋細胞のアポトーシスを含む前記被検体の循環器病を治療する方法であって、前記被検体の心筋細胞のアポトーシスを阻害するために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより循環器病を治療することを含む方法をさらに提供する。
【００９０】
本発明は、被検体の原線維形成を含む前記被検体の線維性の疾患を治療する方法であって、前記被検体の原線維形成を阻害するために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与してこれにより線維性の疾患を治療することを含む方法をさらに提供する。
【００９１】
本発明は、被検体の新内膜形成を含む前記被検体の循環器病を治療する方法であって、前記被検体の新内膜形成を阻害するために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより被検体の循環器病を治療することを含む方法をさらに提供する。循環器病は、医原性であってもよく、循環器病は、再狭窄であることができる。一つの態様において、新内膜形成は、被検体のバルーン血管形成術により生じる。一つの態様において、新内膜形成は、被検体のステント移植により生じる。
【００９２】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、静脈内注射、点滴静注、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内注射、経口的に、または直腸によって投与することができる。特定のアンチセンス・オリゴヌクレオチドのヒトの薬物生体反応学が研究されている。(37)を参照し、その全体が参照により援用される。
【００９３】
本発明は、被検体の血管疾患を治療する方法であって、前記疾患は、トロンビンまたはフィブリン産生の減少によって治療される疾患であり、該方法は、前記被検体の血管疾患を治療するために、PAI-1発現を阻害し、これによりトロンビンまたはフィブリン産生を減少させるために有効なPAI-1発現の阻害剤を投与することを含む方法をさらに提供する。
【００９４】
本発明は、被検体の血管疾患を治療する方法であって、前記血管疾患は、PAI-1発現の阻害によって治療される疾患であり、該方法は、前記被検体のPAI-1発現を阻害するために有効なPAI-1発現の阻害剤を前記被検体に投与して、これにより前記被検体の血管疾患を治療する方法をさらに提供する。
【００９５】
本発明は、被検体の肝臓疾患を治療する方法であって、前記肝臓疾患は、PAI-1発現の阻害によって治療される疾患であり、該方法は、前記被検体のPAI-1発現を阻害するために有効なPAI-1発現の阻害剤を前記被検体に投与して、これにより前記被検体の肝臓疾患を治療する方法をさらに提供する。一つの態様において、疾患は、急性劇症肝不全である。一つの態様において、PAI-1発現の阻害は、毒素ショックまたはウイルス性肝炎からなどの傷害後の幹細胞再生を増強する。
【００９６】
本発明は、PAI-1発現の阻害剤がアンチセンス・オリゴヌクレオチド、抗体、触媒核酸、小分子、またはRNAiである直前に記載の方法を提供する。本発明は、疾患が、虚血性の疾患である直前に記載の方法を提供する。異なる態様において、疾患は、末梢の動脈疾患または脳血管障害である。
【００９７】
本発明は、被検体の心臓組織の新血管新生を誘導する方法であって、前記心臓のPAI-1の発現を阻害するために有効なPAI-1発現の阻害剤の量を前記被検体に投与して、これにより前記被検体の心臓組織の新血管新生を誘導ことを含む方法をさらに提供する。さらなる態様において、疾患は、心筋梗塞、アンギナ、鬱血性心不全、末梢動脈疾患、または心筋の低酸素である。
【００９８】
本発明は、被検体の組織の新血管新生を誘導する方法であって、前記被検体の組織のPAI-1の発現を阻害するために有効なPAI-1発現の阻害剤の量を前記被検体に投与して、これにより前記被検体の組織の新血管新生を誘導することを含む方法方法をさらに提供する。さらなる態様において、疾患は、虚血性の腎疾患、脳血管障害、脳卒中、または肝臓の疾患である。
【００９９】
本発明は、PAI-1発現の阻害剤および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物をさらに提供する。異なる態様において、PAI-1発現の阻害剤は、触媒核酸、オリゴヌクレオチド、モノクローナル抗体、小分子、またはRNAi（米国特許第6,506,599号（これは参照として本明細書に組み入れられる）に詳述されるRNA干渉）である。
【０１００】
本発明は、被検体の循環器病を治療する方法であって、前記疾患は、被検体の心筋機能を改善することによって治療され、該方法は、心筋機能の改善を阻害する直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより被検体の循環器病を治療することを含む方法をさらに提供する。1つの態様において、直前に記載の方法は、被検体に薬学的組成物を投与する前に、同時に、または後に薬剤を投与することをさらに含む。さらなる態様において、薬剤は、内皮前駆細胞、骨髄細胞、心臓前駆細胞、胚幹細胞、または脈理血液幹細胞である。その他の態様において、薬剤は、G-CSF、GM-CDF、SDF-1、IL-8、SCF、VEGF、FGF、またはGROファミリーケモカインである。
【０１０１】
本発明は、被検体の組織の平滑筋細胞の増殖を阻害する方法であって、前記被検体の組織の平滑筋細胞の増殖を阻害するために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与することを含む方法をさらに提供する。
【０１０２】
本発明は、被検体の心臓においてトロンビンおよびフィブリン沈着を阻害する方法であって、前記被検体の心臓におけるトロンビンおよびフィブリン沈着を阻害するために前記被検体に有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与することを含む方法をさらに提供する。
【０１０３】
本発明は、被検体に内皮細胞、前駆細胞、骨髄細胞、心臓前駆細胞、胎生期、幹細胞、または脈理血液幹細胞を投与することをさらに含む直前に記載の方法をさらに提供する。
【０１０４】
本発明は、薬学的組成物がステント、足場を経て、静脈内に、経口的に、吸入によって、皮下に、直接の筋注投与によって、または遺伝子ベクターを介して投与される直前に記載の方法をさらに提供する。
【０１０５】
本発明は、被検体の組織におけるトロンビンおよびフィブリン沈着を阻害する方法であって、前記被検体の組織におけるトロンビンおよびフィブリン沈着を阻害するために前記被検体に有効な直前に記載の薬学的組成物の量を投与することを含む方法をさらに提供する。
【０１０６】
本発明は、被検体が、深部静脈血栓、肺塞栓症、腎疾患、冠状動脈梗塞、転移、炎症、播種性血管内血液凝固、アテローム性動脈硬化症、リウマチ様関節炎、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性神経障害、肉芽腫症、または同種異系移植片拒絶反応に罹患している直前に記載の方法をさらに提供する。
【０１０７】
本発明は、被検体の感染性ショックを治療する方法であって、感染性ショックに有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与することを含む方法をさらに提供する。
【０１０８】
本発明は、血栓性疾患、血栓性障害、または止血性障害を患っている被検体を治療する方法であって、前記疾患または障害は、PAI-1の高い発現と関係する疾患または障害であり、該方法は、前記被検体のPAI-1発現を減少させるために有効な直前に記載の薬学的組成物の量を前記被検体に投与して、これにより疾患を治療することを含む方法方法をさらに提供する。
【０１０９】
本発明は、疾患または障害が、深部静脈血栓、肺塞栓症、腎性疾患、冠状動脈梗塞、転移、炎症、播種性血管内血液凝固、アテローム性動脈硬化症、リウマチ様関節炎、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性の神経障害、肉芽腫症、または同種異系移植片拒絶反応である直前に記載の方法をさらに提供する。一つの態様において、直前に記載の方法は、被検体血小板溶解薬または血小板溶解薬の活性化因子を投与することをさらに含む。異なる態様において、血小板溶解薬の活性化物質は、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、またはプロウロキナーゼである。
【０１１０】
直前に記載の方法の1つの態様において、本方法は、被検体に抗凝固薬を投与することをさらに含む。異なる態様において、抗凝固薬は、ヘパリン、ワルファリン、アスピリン、アニシンジオン、フェニンジオン（phenindone）、またはヒドロキシクマリンである。
【０１１１】
本発明は、PAI-1発現の阻害剤の治療的に有効な量および薬学的に許容されるキャリアを混合することを含む直前に記載の薬学的組成物を作製する方法をさらに提供する。
【０１１２】
本発明は、被検体が哺乳類である、直前に記載の全ての方法を提供する。好ましい態様において、哺乳類はヒトである。
【０１１３】
本発明において、被検体、薬学的に許容されるキャリア、用量、細胞種、投与の経路、および標的核酸配列の種々の態様が、各々の直前に記載の核酸分子、オリゴヌクレオチド、PAI-1発現の阻害剤、小分子、薬学的組成物、および方法について想定される。
【０１１４】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することで、よりよくよく理解されるであろうが、当業者であれば、詳述した特定の実験が、請求の範囲をより完全に記載するものとして本発明のを例辞するだけであることを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０１１５】
実験結果  
ヒトおよびラットPAI-1 mRNAをターゲットするDNA酵素の構築。
【０１１６】
本発明者らは、特異的にヒトおよびラットPAI-1メッセンジャーRNAの翻訳開始部位AUGで、又はその近くで、種の間で保存されており、かつ低い相対的自由エネルギーを有する領域である、ピリミジン-プリン結合をターゲットするための3つのDNA酵素を設計した(17)。図1aに示すように、3つのDNA酵素、E1（配列番号：2）、E2（配列番号：4）、およびE3（配列番号：3）は、ヒト(E1、E3）またはラット（E2）のPAI-1 mRNAに対して相補性を有する8ヌクレオチド（E1、E2）または9ヌクレオチド（E3）の2つのアームの側面に位置された同一の15ヌクレオチドの触媒ドメイン（配列番号：1)を含む。対照DNA酵素E0（配列番号：7）を作製するために、E2の2つのフランキングアームのヌクレオチド配列を、触媒ドメイン変更することなくスクランブルさせた（図1a）。それぞれの分子の3’末端は、3'-から-5’エキソヌクレアーゼ消化に耐性にするために、反転した3’-3’結合されたチミジンでキャップした。
【０１１７】
E1およびE3 DNA酵素によるヒトPAI-1 mRNAの特異的な切断。
【０１１８】
図1bに示すように、ヒトPAI-1 mRNAから合成し、32Pで5’末端をラベルした21塩基のオリゴヌクレオチドS1（配列番号：8）は、10：1の基質：酵素過剰でE1と共に培養したときに、2分以内に切断され、2時間までに最大の切断が生じた。10ヌクレオチドの切断産物は、5'末端の32Pラベルした断片の大きさと一致する。また、E1は、インビトロ転写によって調製されたより大きな32PのラベルされたヒトPAI-1 mRNAの断片を時間および濃度依存的な様式で切断した、図1c。520ヌクレオチドの転写産物は、320および200ヌクレオチドの予想される切断産物に、2-4時間で最大に切断された。同様の用量依存性は、E3によっても見られ、ヒトPAI-1 mRNA転写産物の最大の切断は、使用した最高の濃度の20μMで生じた。DNA酵素の切断の配列特異的な性質は、図1Dに示してあり、ここでは、E1およびE3に同一の触媒ドメインを含むが、側方のアームのスクランブルされた配列を含まない対照DNA酵素E0は、ヒトPAI-1 mRNA転写産物の切断を生じなかった。E1とインキュベーションする前に、転写産物を72℃に10分間予熱すると、さらに切断が増大されたが、E0ではされなかった。
【０１１９】
E2 DNA酵素によるラットPAI-1 mRNAの特異的な切断。
【０１２０】
DNA酵素反応の特異性についてのさらなる証拠は、図2に見ることができる。DNA酵素E2は、ラットPAI-1 mRNAの配列から合成した23塩基のオリゴヌクレオチドS2を濃度および時間依存的な様式で切断した、図2a。また、E2は、2〜4時間までに、用量依存的な様式でラットPAI-1 mRNA転写産物を切断し、156ヌクレオチドの切断産物を生じる、図2b。対照的に、スクランブルされた対照DNA酵素E0またはE3のいずれも、ラットPAI-1 mRNA転写産物を切断しなかった。ラットPAI-1 mRNA転写産物（配列番号：10）は、E3によって切断することができるヒトmRNA PAI-1転写産物（配列番号：9）とは1ヌクレオチドだけが異なり、図2c、これらの結果は、これらのDNA酵素の洗練された標的特異性を示す。
【０１２１】
DNA酵素は、内因性のPAI-1 mRNAおよびタンパク質の誘導を阻害する。
【０１２２】
内因性のPAI-1産生に対するDNA酵素の効果を決定するために、ヒトおよびラット起源の内皮の単層をコンフルエントまで培養し、種特異的なDNA酵素またはスクランブルされた対照をトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトした細胞をTGFベータによって8時間活性化し、PAI-1の発現を最大に誘導した。細胞のmRNAの逆転写に続くRT-PCR産物の濃度測定の解析では、培養ラット内皮において、E2がTGFベータ誘導性の定常状態のmRNAレベルを、E0スクランブルされたDNAと比較して、52%阻害することを示した、図3a。構成的PAI-1 mRNAレベルは、DNA酵素のトランスフェクションによる影響を受けなかった。図3bは、TGFベータを媒介したPAI-1タンパク質の誘導に対する内皮細胞のE2 DNA酵素のトランスフェクションの効果を示す。スクランブルされたDNA酵素をトランスフェクトした内皮細胞は、ウエスタンブロットによって検出すると、約50%の細胞質のPAI-1タンパク質の増大を示した。対照的に、この効果は、PAI-1 DNA酵素E2をトランスフェクションすることによってほぼ完全になくなった。
【０１２３】
血清依存的な分解に対するDNA酵素の耐性。
【０１２４】
3’末端に適切な向きでチミジンを有するDNA酵素は、24時間以内に血清（1〜5%濃度）中の因子によって、有意に分解されるので(14)、本発明者らは、PAI-1 DNA酵素の血清依存的な核分解性の（nucleolytic）分解に対する3’末端の反転したチミジンの保護作用を調査した。DNA酵素E1を32Pラベルし、生理的な(2%)または超生理的な（supraphysiologic）（20%）血清濃度を含む培地中で培養したヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)の単層を3〜24時間インキュベートした。図3cに示したとおり、DNA酵素は、20%の血清を含む培地中での細胞培養の6時間以内にほぼ完全に分解されたが、2%血清を含む培地では、24時間の細胞培養の間に完全に無傷のままであった。図3dに示すように、E1またはE3 DNA酵素をトランスフェクトして、2%の血清中で12時間培養したHUVECでは、スクランブルされたDNA E0のトランスフェクションと比較して、TGFベータ依存的なPAI-1の活性の20%および28%の減少を示した（両方とも、p<0.01）。合わせると、これらの結果は、3’末端の反転したチミジンは、インビボで遭遇する可能性が高い生理的な血清中濃度における核分解性の（nucleolytic）分解からPAI-1 DNA酵素を保護することができ、結果的に細胞のPAI-1活性を阻害することができることを示す。
【０１２５】
E2の心臓内注射は、マクロファージのPAI-1発現を減少する。
【０１２６】
本発明者らは、心筋梗塞時のE2の心臓内注射が、ラット心臓のPAI-1発現を阻害することができるかどうかを調査した。左前脚（LAD）動脈の結紮および心筋梗塞の誘導の2週後において、免疫組織化学的な研究では、PAI-1発現が梗塞帯内でおよび梗塞周囲領域内のCD68陽性のラット・マクロファージに主に生じることを示した。わずかな血管内皮細胞が陽性に染色されたが、PAI-1発現は、梗塞から遠い筋細胞または間質細胞内では検出されなかった。本発明者らは、梗塞のラット心臓におけるPAI-1タンパク質の主要な供与源が、浸潤するマクロファージおよび貪食細胞による産生のためであると結論する。E2を注射した2週後において、梗塞ラット心臓におけるPAI-1発現は劇的に変化し、梗塞周囲領域でマクロファージによるPAI-1発現が71%減少した（p＜0.01)、図4a。梗塞ゾーンの中央のマクロファージ内のPAI-1発現は、E2注射の後にも影響を受けないままであり、かつスクランブルされたDNA酵素E0の注射では、梗塞周囲のPAI-1発現を減少しなかったので、この部位のPAI-1発現の阻害は、非常に特異的であった。
【０１２７】
E2の心臓内注射は、梗塞周囲の新血管新生を生じる。
【０１２８】
2週までに、PAI-1発現の減少と並行して、E2を注射したラットに由来する心臓では、梗塞周囲領域で大型の内腔の毛細血管（＞6核）の数の有意な増大を示した、図4b。E2単独の注射では、E0スクランブルされたDNA酵素の注射と比較して、梗塞周囲領域における大型の内腔の毛細血管の有意な増加を引き起こしたが、より著しかったのは、静脈内にデリバリーされたヒト成人の骨髄由来CD34+CD117bright血管芽細胞と共にE2を同時投与したときに、大型の内腔毛細血管の数がさらに62%増加したことであった。ヒト抗CD31mAbによって定義すると、新たに形成された血管の多くが、ラット起源（血管形成）のものであり、有意な数がヒト起源（血管形成）のものであった。E2の存在下では、梗塞ゾーンおよび梗塞周囲領域において、取り込まれずに、分離された、間質性のヒト血管芽細胞は、E0対照酵素と比較して5.2倍まで減少していた、図4c。逆に、梗塞周囲領域の大型の内腔毛細血管（＞6核）の数は、E0と比較して、E2注射後に14倍まで増大した。本発明者らは、梗塞周囲領域におけるPAI-1発現を阻害することによって、E2は、ヒト血管芽細胞を心臓組織を通ってより効率的に遊走させ、合着させ、および新たな血管形成に参加することができると結論する。
【０１２９】
E2は、梗塞周囲領域において心筋細胞をアポトーシスから保護する。
【０１３０】
本発明者らは、骨髄に由来する内皮前駆体によって誘導される、梗塞周囲領域の新血管新生が、隣接した生存可能な心筋細胞をアポトーシスから保護できることを示した。E2単独の心臓内注射によって、梗塞ラット心臓のこの部位に新血管新生を誘導したので、本発明者らは、心筋細胞アポトーシスに対するE2注射の効果を検査した。LAD結紮時にE2を注射すると、梗塞周囲領域における心筋細胞のアポトーシスの70%の減少を生じた（p＜0.01）、図5a。これは、スクランブルされた対照DNA酵素E0の注射によっては観察されなかった。心筋細胞アポトーシスに対する保護のレベルは、ヒト血管芽細胞の静脈内注入によって観察されるレベルと同様であった。
【０１３１】
腎線維症。
【０１３２】
進行性腎疾患におけるレニン−アンジオテンシン系（RAS）は、広範囲に調査されており、血行動から塩／水の恒常性にわたって多くの活性を示す。RASは、現在、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1(PAI-1)の誘導にリンクしていると認識されており、タイプ1(AT1)およびタイプ４（AT4）受容体の両者を介し、したがって血栓症および線維症を促進する可能性が高い（39）。したがって、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１型は、腎臓の原線維形成における適切な標的である。腎臓の病変部の線維症への進行は、いくつかの機構を含み、その中で、細胞外基質（ECM）分解の阻害は、重要な役割を果たしている。2つの相互に関係のあるタンパク質分解系：プラスミノーゲン活性化系およびマトリックスメタロプロテイナーゼ系は、マトリックス分解に関与している。プラスミノーゲン活性化の主な阻害剤としてのPAI-1は、フィブリン溶解およびプラスミンを媒介したマトリックスメタロプロテイナーゼの活性化を調節する。また、PAI-1は、ECMの成分であり、これは、ビトロネクチンに結合する。PAI-1は、正常ヒト腎臓に発現されていないが、腎臓病の種々の形態において強力に誘導されており、腎臓の線維症および末期の腎不全を引き起こす。トロンビン、アンギオテンシンII、およびトランスフォーミング成長因子-βは、インビトロおよびインビボでのPAI-1合成を増大する強力なアゴニストである。いくつかの実験的および臨床的な研究により、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎障害、焦点分節糸球体硬化症（focal segmental glomerulosclerosis）、およびその他の線維性の腎疾患で生じる腎臓の原線維形成性のプロセスにおけるPAI-1の役割を支持する（40）。
【０１３３】
末期腎疾患（ESRD）は、莫大な公衆衛生載負担を構成し、ますます発病率および有病率を上昇する。この罹患率の増大は、現在の治療のアプローチを補足するために新たな治療的な介入およびストラテジーが必要なことを示唆する。アンジオテンシンIIは、進行性の腎疾患を媒介することを、多くの証明で確証的に示しているが、最近の証明でも、進行性腎疾患の重要な病原因子としてアルドステロンを意味づけている。最近、実験的な証拠のいくつかの系では、アルドステロンの選択的な遮断は、レニン−アンジオテンシン・ブロッケードに非依存的であり、自然発症高血圧の発作誘発性ラット（SHRSP）のモデルにおいてタンパク尿および腎硬化症を減少し、また、ほぼ全面的に腎摘出されたラットのモデル（すなわち、残った腎臓）においてタンパク尿および糸球体硬化症を減少することを示す。アンジオテンシンII受容器遮断薬およびアンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤による薬理的な遮断により、タンパク尿および腎硬化症／糸球体硬化症が減少するが、アルドステロンの選択的な再注入により、レニン−アンジオテンシン遮断は続けられるにもかかわらず、これらの異常状態が回復する。アルドステロンは、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1(PAI-1）発現およびそれに伴う血管のリブリノリシス（ribrinolysis）の変化、トランスフォーミング成長因子（TGFβ1）刺激によって、並びに活性酸素種（ROS）の刺激によってを含むいくつかの機構によって、線維症を促進しているのであろう（41）。したがって、PAI-1は、腎臓の線維症への治療的な介入のための適切な標的であることが予想される。進行性の腎疾患は、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1（PAI-1）の誘導によって特徴づけられ、腎臓のプラスミン・カスケード活性の障害が、腎臓の線維症において役割を果たしているであろうことを示唆する。輸尿管閉塞症の線維性の効果に対して耐性を示すPAI-1ノックアウト・マウスでの研究により、腎臓の原線維形成反応におけるPAI-1の重要な原線維形成性の役割が確認される。結果は、PAI-1が線維症を促進する1つの重要な機能は、筋線維芽細胞およびマクロファージを含む線維症を誘導する細胞の動員においてその役割を果たすことであることを示す(42)。
【０１３４】
肝臓線維症。
【０１３５】
慢性肝傷害の間には、トランスフォーミング成長因子β（TGFベータ）が、肝臓の星状細胞(HSCs)に由来する筋線維芽細胞様の細胞による肝臓の原線維形成の刺激において顕著な役割を果たす。急性の肝傷害においては、HSC由来のTGFベータが、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１型（PAI-1）およびアルファ2(I)プロコラーゲン（COLlA2）の転写を増大した。肝傷害の間のHSCsおよび初代培養HSCsのSmad2では、高レベルのSmad2リン酸化およびTGFベータによるPAI-1転写産物の誘導が、HSCsにおいて観察されたので（43）、自己分泌機構によって活性化されていた。
【０１３６】
uPA、uPAR、およびtPAと共にPAI-1の増大は、硬化肝臓におけるマトリックス分解の全体的な阻害と関連する。肝臓の星状細胞は、肝臓線維症の際のPAI-1の重要な供与源である。ラットの肝臓原線維形成の間のプラスミノーゲンアクチベーターおよびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の発現は増加した：星状細胞の役割（44）。したがって、PAI-1は、肝線維症への治療的な介入のための適切な標的であるとを思われる。
【０１３７】
肺線維症：
気管支肺胞洗浄（BAL）の上静液中のPAI-1レベルは、健常人におけるよりも特発性肺線維症（IPF）の患者において有意に高い。特発性肺線維症の肺では、凝血原および抗フィブリン溶解性の活性が増大された。したがって、PAI-1は、肺線維症への治療的な介入のための適切な標的であると思われる。
【０１３８】
加えて、眼における白内障は、上記の機構による虚血のためであろうと考えられる、生じる症候性の線維症を逆転させることによって治療されるであろう。
【０１３９】
再狭窄：
PAI-1レベルは、心筋梗塞患者において、特に糖尿病患者において、末梢の動脈疾患において、特に糖尿病患者において、およびバルーン血管形成術および／またはステント移植および再狭窄に非常に上昇する。PAI-1レベルの上昇により、活性化されたプロテインCのレベルが減少し、これにより、トロンビン生成、フィブリン、および血餅形成の増大を生じる。トロンビンは、バルーン血管形成術またはステント移植後の再狭窄の特徴である平滑筋細胞の遊走および増殖を誘導する。
【０１４０】
したがって、本発明者らは、バルーン血管形成術の部位にPAI-1 DNA酵素を局所投与すると、内因性のプロテインCの活性化を増大し、トロンビン生成を減少し、フィブリン沈着を減少し、平滑筋細胞の遊走および増殖を減少し、かつバルーン血管形成術またはステント移植後の再狭窄を妨げるると理論づけた。
【０１４１】
本発明者らは、頚動脈内のPAI-1 DNA酵素、スクランブルされたDNA酵素、または塩類の滴下と連動してバルーン血管形成術を行った14日後に新内膜形成を測定した。図13および14に示すように、PAI-1 DNA酵素は、面積測定により、および侵入した血管の比率によって定義すると、有意に新内膜形成を阻害した。PAI-1 DNA酵素の局部的な滴下を受けている動物では、スクランブルされたDNA酵素または塩類溶液を受けているものと比較して、新内膜形成の50%以上の減少を示した（両方とも、p＜0.05）。塩類溶液を受けているバルーン血管形成術処理した動物では、14日目において0.178+/-0.067μm2の平均頚動脈内腔領域および0.281+/-0.082μm2の平均内膜領域を有し、スクランブルされたDNAzymeを受けているものでは、0.129+/-0.051μm2の平均内腔領域および0.247+/-0.058μm2の平均内膜領域を有し、およびPAI-1 DNAzymeを受けているものでは、0.231+/-0.028μm2の平均内腔領域および0.292+/-0.025μm2の平均内膜領域を有した。したがって、バルーン血管形成術後に塩類溶液またはスクランブルされたDNA酵素の滴下を受けている動物では、42+5%および43+10%の平均動脈内腔の侵入を示す新生内膜形成を有したが、PAI-1 DNA酵素を受けているものでは、動脈内腔の22+5%だけに侵入した新生内膜形成を示した（p＜0.05）。バルーン血管形成術後の3群の中央の領域（塩類溶液、スクランブルされたDNAzyme、PAI-1 DNAzyme）は、有意に異ならなかった（0.281+0.082μm2、対、0.247+0.058μm2、対、0.292+0.025μm2）。
【０１４２】
次に、本発明者らは、PAI-1 DNA酵素の投与に付随する新内膜形成の減少により、平滑筋細胞の増殖の減少を生じたかどうかを検査した。図15および16に示すように、PAI-1 DNA酵素は、デスミンおよびKi67抗原の二重の免疫染色によって定義すると、有意に平滑筋細胞の増殖を阻害した。PAI-1 DNA酵素の局部的な滴下を受けている動物では、スクランブルされたDNA酵素または塩類溶液を受けているものと比較して、新生内膜平滑筋細胞増殖の60%以上の減少を示した（両方とも、p＜0.05)。バルーン血管形成術に塩類またはスクランブルされたDNA酵素滴下を受けている動物では、それぞれ強拡大の一視野につき80+12および89+20の複製している平滑筋細胞を示したが、PAI-1 DNA酵素を受けているものでは、新内膜における強拡大の一視野につき35+6だけの複製している平滑筋細胞を有した（p＜0.05）。
【０１４３】
PAI-1およびプロテインCの阻害。
【０１４４】
プロテインCは、セリンプロテアーゼおよび天然に存在する抗凝固薬であり、凝固カスケードにおいて第Va因子および第VIIIa因子を不活性化することによってトロンビン産生の生成を遮断するというその能力を介して、止血の調節の役割を果たす。敗血症は、感染に対する全身の炎症反応として定義され、サイトカイン・ネットワーク、白血球、並びに補体および凝固／フィブリン溶解系を含む多くの宿主防御機構の活性化に関連し、および媒介する[Mestersら、Blood88：881-886、1996]。播種性血管内血液凝固[DIC]は、種々の器官の微小血管系におけるフィブリンの広範囲にわたる沈着を伴い、敗血症／感染性ショックの初期の徴候である。DICは、多臓器不全症候群の発生における重要なメディエーターであり、感染性ショック患者の予後不良に関与する[Fourrierら、Chest 101：816-823,1992]。活性化されたプロテインCは、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1（PAI-1）依存的な様式で、プロ線維素溶解性の（profibrinolytic）因子として機能する。多量の血漿および血小板糖タンパク質であるビトロネクチンは、活性化されたプロテインC（APC）がPAI-1と反応する能力を劇的に改善する補因子として同定された。ビトロネクチンは、PAI-1とAPCの反応性を〜300倍増強し、PAI-1は、報告された最も効率的なAPCの阻害剤であることが明らかとなっている。
【０１４５】
したがって、PAI-1を阻害する方法により、APCの活性を増大し、プラスミノーゲン活性化の増大を誘導してフィブリン溶解カスケードのアップレギュレーションに至るであろう。
【０１４６】
材料および方法  
DNA酵素およびRNA基質：3'-3'の反転チミジンを有するDNA酵素は、組み込みDNA技術（Integrated DNA technologies）（Coralville（IA））によって合成し、RNA分解酵素フリーのIE-HPLCまたはRP-HPLCによって精製した。標的DNA酵素に対応する短いRNA基質を化学的に合成し、続いてRNAseフリーのPAGEで精製し、またDNA鋳型からのインビトロ転写によっても作製した。
【０１４７】
インビトロ転写：ヒトPAI-1 cDNAは、以下のプライマー対を使用して、培養したHUVECの総RNAからRT-PCRによって増幅した：5'-CCAAGAGCGCTGTCAAGAAGAC3'（フォワードプライマー;配列番号：11)および5'-TCACCGTCTGCTTTGGAGACCT3'（リバースプライマー;配列番号：12)（位置25-10600、J.Biol.Chem.（1988）263(19)：9143)。PCR産物の長さは、1598塩基である。PAI-1 cDNAをpGEM-Tベクター（Promega）にクローン化して、プラスミド構築物pGEM-hPAGを得た。DNA配列は、自動シーケンシング装置を使用して検証した。32PラベルしたヌクレオチドのヒトPAG RNA転写物は、20mlの体積で、32℃で1時間のインビトロ転写（SP6ポリメラーゼ、Promega）によって調製した。取り込まれなかったラベル、および短いヌクレオチド（＜350塩基）を、Chromaspin-200カラム（Clontech, Palo Alto, CA）での遠心によって放射標識された種から分離した。
【０１４８】
切断反応：合成RNA基質には、T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して32Pで末端ラベルした。切断反応系は、60mMのトリス-HCl（pH7.5）、10mMのMgCl2、150mMのNaCl、0.5Mの32PラベルしたRNAオリゴ、0.05-5μMのDNA酵素を含んだ。インビトロ転写産物の切断のために、反応系には、1%のPAI-1転写産物、25mMのトリス-HCl（pH7.5）、5mMのMgCl2、100mMのNaCl、および0.2-20μMのDNA酵素を含んだ。反応を37℃で進行させて、90%のホルムアミド、20mMのEDTA、およびローディング色素を含むチューブに一定分量を移すことによって「停止」させた。試料を15%のTBE-尿素変性ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動法によって分離し、-80℃でのオートラジオグラフィーによって検出した。
【０１４９】
血清中におけるDNA酵素の安定性：DAN酵素は、T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して放射標識した。ラベル反応液(20μl体積）は、1μlの20μM DNA酵素、2μlの10×キナーゼ緩衝液、1/μlのT4 PNK（10u／μl）、10μlのH2O、および6μlの32P-ATP(3000uCi/mmol、10uCi／μl）からなる。反応時間は、37℃において30分間である。HUVECを2%または20%のFCSを含む培地（Clonetic）中で培養し、放射標識したオリゴマーを100nMの終濃度で添加した。混合物の一定分量を0、3、6、12、24時間の異なる時間点で取り除き、フェノール／クロロホルムによってクエンチして、使用する間で凍結させた。それぞれの実験終了後、全ての試料をフェノール抽出し、15%変性ポリアクリルアミドゲルによって解析し、オートラジオグラフィーによって視覚化した。
【０１５０】
培養条件およびDNA酵素のトランスフェクション：初代HUVEC内皮細胞は、Clonetic（USA）から得て、2%のFCS、100μg/mlストレプトマイシンおよび100IU/mlペニシリンを含む培地中で、5%のCO2の加湿された雰囲気において37℃で増殖させた。HUVECは、6および8継代の間で実験において使用した。DNA酵素のトランスフェクションのために、ラット内皮細胞（EC）を収集し、6穴プレート（〜1×105細胞／ウェル）のそれぞれのウェルにまいた。サブコンフルエントな（70〜80%）ECを1mlのHEPES緩衝液（pH7.4）で2回洗浄し、1μMの試験分子（E2またはE0）および20μg/mlのカチオン性の脂質（DOTAP）を含む0.5mlの無血清培地を使用してトランスフェクトした。3時間のインキュベーション後、0.5mlの2%血清培地をそれぞれのウェルに添加し;3時間後、TGFβを、終濃度1.8ng/mlで半分のウェルに添加した。トランスフェクション細胞を8時間インキュベートし続けて、Trizol試薬（Life Sciences, CA）を使用して溶解し、RNA（RT-PCRのため）およびタンパク質（ウエスタンブロットのため）を単離した。
【０１５１】
RT-PCR：6穴プレートのそれぞれのウェルからの総RNAを1mlのTrizol試薬を使用して単離し、20μlのDepc処理したH2Oに溶解した。2μlの試料を使用して20μlの反応系で逆転写を行い、次いで4μの産物を鋳型として使用して、50μlのPCR系（5μlの10×緩衝液、1μlのdNTP、0.2μlのTaqポリメラーゼ、1μlのフォワードおよびリバースプライマー、38μlのH2O、2μlの32pdCTP（3000ci/mmol、lOμci／μl）でPAI-1またはヒトGAPDHを増幅した。反応条件は、95℃-2分（プレ変性）、95℃-0.5分、58℃-1分、72℃-2分、を35サイクル、72℃-10分であった。ヒトGAPDHを内部標準として使用し（フォワードプライマー5'TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTG3';配列番号：13,リバースプライマー5’CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC3';配列番号：14)、そのPCR産物452塩基である。
【０１５２】
ウエスタンブロット：対照およびDNA酵素処理した細胞を収集し、PBSで洗浄し、次いで細胞ペレットを溶解緩衝液に再懸濁した。等量のタンパク質（15g／レーン）をミニゲル（Bio-Rad）を使用する10%のポリアクリルアミン分離ゲルによるSDSゲル電気泳動によって分離した。電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜に電気転写（Protran、Schleicler & Schuell）によって転写し、5％BSAのTBS-T緩衝液(0.1Ｍのトリス-塩基(pH7.5）、0.15MのNaclおよび、0.1%のTween-20）溶液で、室温で少なくとも1時間ブロックした。この工程の後、膜をヤギIgGポリクローナル抗PAI-抗体（Santa Cruz bioteck）でイムノブロットし、次いで西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗ヤギIgG（Sigma）を使用してECL系（Amersham）によって視覚化した。
【０１５３】
プラスミン活性（PAX-1機能的アッセイ法）の測定：条件培地および細胞可溶化液を介入後の種々の時点で収集した。細胞をPBSによって2回洗浄し、プラスミンをアッセイするために400mlの0.5%のTriton X-100に溶解した。条件培地およびTriton細胞可溶化物をプラスミン基質のVal-Leu-Lys-pNA(S2251、Kabivitru、Stockholm、Sweden)（終濃度0.35mM）と共に96穴マイクロタイタープレートにおいて（最終体積、200μl）60分間室温でインキュベートした。プラスミン活性を410nmで吸光度を読み込むことによって測定し、プラスミン（Sigma）標準回帰直線に対して算出した。
【０１５４】
動物、外科的手技、ヒト細胞の注射、および組織への細胞の遊走の定量：ローワット（Rowett）（rnu／rnu）胸腺欠損ヌードラット（Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, Indiana）を「動物看護および使用委員会のためのコロンビア大学研究所（Columbia University Institute for Animal Care and Use Committee）」によって承認された研究に使用した。麻酔後、左の開胸術を行い、心膜を切開して、左前下行（LAD）冠動脈を結紮した。手術時に、ラットの一群は、E2 DNA酵素の心臓内注射を3回受け、もう一つは、E0スクランブルされた対照の心臓内注射を3回受け、および第3群は、塩類溶液の心臓内注射を3回受けた。新血管新生の研究にために、G-CSFの遊走後の単一のドナーに由来する2.0×106のヒト細胞を2.0×105個の免疫精製したCD34+CD117bright細胞で再構成し、LAD結紮の48時間後にラット尾静脈に注入した。各群は、6〜10匹のラットからなった。
【０１５５】
毛細血管の密度の定量：毛細血管の密度および毛細血管の種起源を定量するために、さらなる切片を、ラットまたはヒトCD31（それぞれSerotec, UK, and Research Diagnostics, NJ）、第VIII因子（Dako, CA）、およびラットまたはヒトMHCクラスI（Accurate Chemicals, CT）に対するmAbsで新たに染色した。染色は、アビジン／ビオチン・ブロッキング・キット、ラット吸着したビオチン化抗マウスのIgG、およびペルオキシダーゼ抱合体（全てVector Laboratories Burlingame, CA）を使用して免疫ペルオキシダーゼ法によって行った。毛細血管の密度を梗塞の2週後に抗第VIII因子mAbでラベルした切片から決定し、障害のない心筋の毛細血管の密度と比較した。値は、HPF（600×）あたりの第VIII因子の毛細血管の数として表してある。
【０１５６】
パラフィン組織切片のDNA末端ラベリングによる筋細胞アポトーシスの測定：単一細胞レベルでアポトーシスをインサイチュウで検出するために、本発明者らは、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）（Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）によって媒介されるDNA末端ラベリングのTUNEL方法を使用した。ラット心筋の組織切片は、塩類溶液またはCD34+ヒト細胞のいずれかの注射の2週間後にLAD結合されたラットから、およびネガティブ対照としての健康なラットから得た。簡単には、組織をキシレンによって脱パラフィン化（deparaffinized）し、エタノールの段階的な希釈およびリン酸塩緩衝食塩水（PBS）の2回の洗浄液によって再水和した。次いで、組織切片をプロテイナーゼK（10μg/mlのトリス／HCl溶液）で、37℃において30分間消化した。次いで、スライドをPBSで3回洗浄し、50μlのTUNEL反応混合物（TdTおよびフルオレッセインでラベルしたdUTP）と共にインキュベートし、湿気のある大気中で37℃において60分間インキュベートした。ネガティブ対照については、TdTを反応混合物から除いた。PBS中での3回の洗浄液に続いて、次いで切片をフルオレッセイン結合アルカリホスファターゼ（AP）（Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）に対して特異的な抗体と共に30分間インキュベートした。TUNEL染色は、DNA断片化を有する核が青く染色される基質系（BCIP／NBT基質系、Dako, Carpinteria, CA）によって視覚化した。反応は、PBSに3分暴露後に終了させた。筋細胞内の青く染色しているアポトーシス核の比率を決定するために、組織をデスミンに特異的なモノクローナル抗体で対比染色した。内因性のペルオキシダーゼは、3%の水素ペルオキシダーゼ（perioxidase）のPBS溶液で15分間に続き、20%のヤギ血清溶液での洗浄を使用することによって遮断した。抗デスミン抗体（Accurate Chemicals, CT）は、40℃で一晩（1：100）インキュベートした。3回洗浄後、次いで切片を抗ウサギIgGで、続いてビオチン結合二次抗体で30分間処理した（Sigma, Saint Louis
, Missouri）。次いで、アビジン-ビオチン複合体（Vector Laboratories, Burlingame, CA）をさらに30分間添加して、筋細胞をDAB溶液混合物（Sigma, Saint Louis, Missouri）に5分照射に続いて褐色に視覚化した。組織切片を40×の拡大率で顕微鏡によって検査し、少なくとも100個の細胞を少なくとも8個の強拡大の視野において計数した。アポトーシスの筋細胞の割合は、アポトーシスインデックスで測定し;アポトーシスのインデックスは、ポジティブ染色の筋細胞核の数を筋細胞核の総数によって割り、100をかけることによって算出した。組織の縁において染色された細胞は、計数しなかった。1以下のアポトーシスインデックスは、アポトーシスの非存在を示すとみなした。
【０１５７】
心筋機能の解析：高頻度ライナー・アレイ・トランスデューサ（SONOS 5500, Hewlett Packard, Andover, MA）を使用して心エコー研究を行った。二次元イメージは、中間の乳頭（mid-papillary）および尖端レベルで得た。拡張終期（EDV）および収縮終期（ESV）の左心室容積は、双面領域-長さ法（bi-plane area-length method）によって得て、%左心室駆出率を[（EDV-ESV）／EDV]×100として算出した。心拍出量（CO）は、超音波フロープローブ（ultrasonic flowprobe）（Transonic Systems Inc., Ithaca, NY)を使用して測定し、心係数は、重量あたりのCOとして算出した。全ての心エコーの研究が、盲検で研究者によって行った(ST)。
【０１５８】
バルーン血管形成術および頸動脈傷害のラット・モデル：雄のSDラット（重量350〜400g、
SD系のハーラン、Indianapolis、IN)をケタミン（90mg/kgのi.p.）およびキシラジン（10mg/kgのi.p.）によって麻酔し、2F塞栓摘出バルーンカテーテル（Baxter Health Care）を外側の動脈を経由して左総頚動脈に導入した。バルーンを空気によって膨張させて、総頚動脈を膨張させ、次いで外側の動脈に取り除いた。この手順を3回繰り返し、次いでカテーテルを除去した。左総頚動脈のバルーン傷害の後、傷害から遠い部分を一時的な結紮法によって分離した。PAI-1またはスクランブルされた対照DNAzymeを遠くの傷害部分に注入し、室温で5分間インキュベートした。インキュベーション後、カニューレを除去して、総頚動脈に対する血流を回復した。バルーン傷害の2週後、ラットを麻酔さして左右の頸動脈を除去してパラフィンに包埋した。それぞれの動脈を3つの部分に分割して、別々にパラフィンに包埋した。横断面のリング（5μm）をそれぞれの部分から切除し、ヘマトキシリン‐エオジンで染色した。スライドを40×の拡大率で顕微鏡によって撮した。内腔、新内膜、および媒体類領域をNIH Image 1.60ソフトウェア・パッケージを用いて測定した。領域の測定は、内腔周辺（内腔領域[LA]、Um2）、新内膜周辺（内膜領域[IA]、Um2）、および外部弾性薄膜（external elastic lamina）（血管領域[VA]、Um2）トレースすることによって得た。破損の長さに対する内膜領域の比(IA/FL)を得て、傷害の範囲に対して補正した。測定は、治療について盲検とした観察者によって行った。
【０１５９】
新内膜形成の形態計測解析：それぞれの頸動脈部分に由来する約3mm離れた2つの切片をマソンのトリクロームで染色し、内膜および内側領域を、コンピューターを利用した面積測定によって測定した。2つの切片の内膜および内側領域の平均をそれぞれの動脈について算出した。14日目の動脈において、内膜細胞密度を、各々の2つの切片の4つの強拡大視野において核を計数することによって測定した。次いで、動脈について平均密度を算出し、内膜細胞数を、細胞密度に内膜領域を乗ずることによって算出した。測定は、治療について盲検とした観察者によって行った。
【０１６０】
平滑筋増殖の定量：平滑筋細胞のDNA合成および細胞サイクリングは、バルーン血管形成術およびPAI-1 DNAzymeまたはスクランブルされた対照DNAzymeのいずれかによる処理の14日後に得たラット心筋の組織切片の二重の染色によって決定した。対照頸動脈は、バルーン血管形成術を受けなかった動物から、および実験動物の関与しない動脈からのものを検査した。簡単には、パラフィン包埋した切片を0.1MのEDTA緩衝液中でマイクロ波処理して、1：3000希釈のラットKi-67（Giorgio Catoretti、コロンビア大学の寄贈）または1：300希釈のヒトKi-67（Dako, CA）に対する一次モノクローナル抗体のいずれかで染色し、4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、1：200希釈のアルカリホスファターゼと結合された種特異的な二次抗体（Vector Laboratories Burlingame, CA）と共に切片を30分間インキュベートして、陽性染色の核をBCIP／NBT基質キット（Dako, CA）によって青く視覚化した。次いで、デスミンに対するモノクローナル抗体（Accurate Chemicals, CT）と共に切片を4℃で一晩インキュベートし、陽性染色細胞を上記したアビジン／ビオチン系で褐色に視覚化した。頸動脈の内膜および内側における細胞周期を進行している平滑筋細胞を、Ki-67を同時発現する強拡大の一視野あたりのデスミン陽性細胞の比率として算出した。
【参照文献】
【０１６１】
1. Heymans, S. et al. Inhibition of plasminogen activators or matrix metalloproteinases prevents cardiac rupture but impairs therapeutic angiogenesis and causes cardiac failure. Nat. Med. 5, 1135-1142 (1999). 
2. Johnsen, M, Lund, L. R. , Romer, J. , Almholt, K, and Dano, K. Curr. Opin. Cell. Biol. 10, 667-671 (1998). 
3. Lijnen, H. R. et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18, 1035-1045 (1998). 
4. Steffanson, S, and Lawrence, D. A. Nature 383, 441-443 (1996). 
5. Deng, G. , royle, G. , Wang, S., Crain, K. , and Loskutoff, D. J. J. Biol. Chem. 272, 7678-7680 (1996). 
6. Stefansson, S. et al. J. Biol. Chem. 273, 6358-6366 (1998). 
7. Stefansson, S. et al. J. Biol. Chem. 276, 8135-8141 (2001). 
8. Brooks, P. C. et al. Cell 79, 1157-1164 (1994). 
9. Brooks, P. C. , Clark, R. A. F. , and Cheresh, D. A. Science 264, 569-571(1994). 
10. Bennett, M. R. , and Schwartz, S. M. Antisense therapy for angioplasty restenosis: some critical considerations. Circulation 92, 1981-1993 (1995). 
11. Stein, C. A. Is irrelevant cleavage the price of antisense efficacy? Pharmacology and Therapeutics 85, 231-236 (2000). 
12. Simayama, T. , Nishikawa, F. , Nishikawa, S. , and Taira, K. Nuclease-resistant chimeric ribozymes containingdeoxyribonucleotides snd phosphorothioate linkages. Nucleic Acid Res.21, 2605-2611 (1993). 
13. Santoro, S. W. , and Joyce, G. F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 4262-4266 (1977). 
14. Santiago, F. S. , et al. New DNA enzyme targeting Egr-1 mRNA inhibits vascular smooth muscle proliferation and regrowth after injury. Nat Med 5, 1264-1269 (1999). 
15. Breaker, R. R. Making catalyticDNAs. Science 290, 2095-2096 (2000). 
16. Khachigian, L.M. Catalytic DNAs as potential therapeutic agents and sequence-specific molecular tools to dissect biological function. J Clin Invest 106, 1189-1195 (2000). 
17. Zuker, M. On finding all suboptimal foldings of an RNA molecule. Science 244, 48-52 (1989). 
18. Soonpaa MH, Field LJ. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol 272, H220-6 (1997). 
19. Kellerman S, Moore JA, Zierhut W, Zimmer HG, Campbell J, Gerdes AM. Nuclear DNA content and nucleation patterns in rat cardiac myocytes from different models of cardiac hypertrophy. J Mol Cell Cardiol 24, 497-505 (1992). 
20. Kajstura J, Leri A, Finato N, di Loreto N, Beltramo CA, Anversa P. Myocyte proliferation in end-stage cardiac failure in humans. Proc Natl Acad Sci USA 95, 8801-8805 (1998). 
21. Beltrami AP, et al. Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction. N EnglJ Med 344, 1750-7 (2001). 
22: MatzuraO, Wennborg A (1996) RNAdraw: an integrated program for RNA secondary structure calculation and analysis under 32-bit Microsoft Windows. Comput Appl 
Biosci 12: 247-9. 
23. Santoro SW, Joyce GF (1997) A general purpose RNA- cleaving DNA enzyme. Proc Nat1 Acad Sci USA 94: 4262-6. 
24. Santoro SW, Joyce GF (1998) Mechanism and utility of an RNA-cleaving DNA enzyme. Biochemistry 37: 13330-42. 
25. Rossi et al., 1992, Aids Research and Human Retroviruses 8, 183. 
26. Hampel et al. , EP0360257. 
27. Hampel and Tritz, 1989 Biochemistry 28, 4929. 
28. Hampel et al. , 1990 Nucleic Acids Res. 18, 299. 
29. Perrotta and Been, 1992 Biochemistry 31, 16. 
30. Guerrier-Takada et al. , 1983 Cell35, 849. 
31. Forster and Altman, 1990 Science 249, 783. 
32. Saville and Collins, 1990 Cell 61, 685-696. 
33. Saville and Collins, 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8826-8830. 
34. Guo and Collins, 1995 EMBO J.14, 368. 
35. Cech et al. , U. S. Pat. No. 4, 987, 071. 
36. M. , Andreasen, P. A. , Nielsen, L. , Dano, K., Lebo, R. V. Gelehrter, T. D. (1986) " cDNA cloning of human plasminogen activator-inhibitor from endothelial cells " J. Clin. Invest. 78 (6): 1673-1680. 
37. Zhang et al. (1995) Clinical Pharmacology & Therapeutics 58(1), 44-53. 
38. Sambrook et al. , " Molecular Cloning: A Laboratory Manual " , Second Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 
39. MaL, Fogo AB. (2001) " Role of angiotensin II in glomerularinjury " Semin. Nephrol. 21 (6):544-53. 
40. Rerolle JP, Hertig A, Nguyen G, Sraer JD, Rondeau EP. (2000) Kidney Int. 58 (5): 1841-50. 
41. EpsteinM. (2001) " Aldosterone as a mediator of progressive renal dysfunction : evolving perspectives " . Intern. Med. 40 (7): 573-83. 
42. Oda T, Jung YO, Kim HS, Cai X, Lopez-Guisa JM, Ikeda Y, EddyAA. (2001) " PAI-1 deficiency attenuates the fibrogenic response-to ureteral obstruction. " Kidney Int. 60 (2): 587-96. 
43. Tahashi Y, Matsuzaki K, Date M, Yoshida K, Furukawa F, Sugano Y, Matsushita M, Himeno Y, Inagaki Y, Inoue K. (2002) " Differential regulation of TGF-beta signal in hepatic stellate cells between acute and chronic rat liver injury. " Hepatology 35(1) : 49-61. 
44. Zhang LP, Takahara T, Yata Y, Furui K, Jin B, Kawada N, Watanabe A. (1999) J. Hepatol. 31 (4): 703-11. 
45. Kotani I, Sato A, Hayakawa H, Urano T, Takada Y, Takada (1999) A. Thromb. Res. 77 (6): 493-504. 
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１Ａ】(A)この図は、8ヌクレオチド（E1、E2）または9ヌクレオチド（E3）の2本のアームに隣接する同一の15ヌクレオチドの触媒ドメイン（配列番号：1)を含み、ヒト(E1、E3）またはラットPAI-1（E2）mRNAに対して相補性を有する、E1（配列番号：2）、E2（配列番号：4）、およびE3（配列番号：3）と名付けられた3つのDNA酵素を示す。また、この図は、対照DNA酵素E0（配列番号：7）、オリゴヌクレオチドS1（配列番号：8）、オリゴヌクレオチド転写産物（配列番号：9）、およびオリゴヌクレオチドS2（配列番号：10)を示す。
【図１Ｂ】(B)この図は、ヒトPAI-1 mRNAから合成され、5’末端が32Pでラベルされた21塩基のオリゴヌクレオチドS1（配列番号：8）が、10：1の基質：酵素過剰で、E1と共に培養したときに、2分以内に切断され、2時間までに最大の切断が生じていることを示す。
【図１Ｃ】(C)この図は、E1が、インビトロ転写によって調製されたヒトPAI-1 mRNAの大きな32Pラベルされた断片を、時間および濃度依存的な様式で切断したことを示す。
【図１Ｄ】(D)この図は、DNA酵素の切断の配列特異的な性質を示し：列特異的な性質を示す：E1およびE3と同じ触媒ドメインを含むが、隣接するアームがスクランブルされた配列である対照DNA酵素E0は、ヒトPAI-1 mRNA転写産物の切断を生じなかったことを示す。
【図２Ａ】(A)この図は、DNA酵素E2が、ラットPAI-1 mRNAの配列から合成された23塩基のオリゴヌクレオチドS2（配列番号：10)を、時間および濃度依存的な様式で切断したことを示す。
【図２Ｂ】(B)この図は、E2も、2〜4時間までに用量依存的な様式でラットPAI-1 mRNA転写産物を切断し、156ヌクレオチドの切断産物を与えることを示す。
【図２Ｃ】(C)この図は、ラットS2 PAI-1 mRNA転写産物（配列番号：10）が、ヒトmRNA PAI-1転写産物（配列番号：9）とは1ヌクレオチドだけ異なり、E3によって切断することができることを示す。
【図３Ａ】(A)この図は、細胞のmRNAの逆転写に続くRT-PCR産物の濃度測定の解析を示し：E2は、培養したラット内皮のTGFベータ誘導性の定常状態のmRNAレベルを、E0スクランブルされたDNAと比較して52%まで阻害した。
【図３Ｂ】(B)この図は、PAI-1タンパク質のTGFベータを媒介した誘導に対する、E2 DNA酵素での内皮細胞トランスフェクションの効果を示す。スクランブルされたDNA酵素をトランスフェクトした内皮細胞では、ウエスタンブロットによって検出される細胞質のPAI-1 E0タンパク質の約50%の増大を示した。対照的に、この効果は、PAI-1 DNA酵素E2でのトランスフェクションによってほぼ完全になくなった。
【図３Ｃ】(C)この図は、DNA酵素が、20%血清を含む培地中での細胞培養の6時間以内にほぼ完全に分解したが、2%の血清を含む培地での細胞培養の全24時間の間に無傷のままであったことを示す。
【図３Ｄ】(D)この図は、E1またはE3 DNA酵素をトランスフェクトし、2%の血清中で12時間培養したHUVECは、スクランブルされたDNA酵素E0でのトランスフェクションと比較して、TGFベータ依存的なPAI-1活性の20%および28%の減少を示した（両者とも、p<0.01)。
【図４Ａ】(A)この図は、E2を注射した2数週間後において、梗塞ラット心臓のPAI-1発現が劇的に変化し、梗塞周囲領域でのマクロファージによるPAI-1発現が71%減少（p<0.01）したことを示す。
【図４Ｂ】(B)および(C)E2および血管芽細胞の注射により、CD31陽性の毛細血管の数を増大したことを示す。
【図４Ｃ】(B)および(C)E2および血管芽細胞の注射により、CD31陽性の毛細血管の数を増大したことを示す。
【図５Ａ】(A)この図は、E2による梗塞周囲領域における心筋細胞アポトーシスの阻害を示す。
【図５Ｂ】(B)この図は、E2での処理後、並びにE2および血管芽細胞での処理後の左室駆出率（LVEF）の割合の回復を示す。
【図６】この図は、ヒトプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1タンパク質（配列番号：5）をコードするDNA配列を示す。
【図７】この図は、ラットプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1タンパク質（配列番号：15）をコードするDNA配列を示す。
【図８】この図は、ヒトプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1タンパク質（配列番号：6）のアミノ酸配列を示す。
【図９】この図は、ラットプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1タンパク質（配列番号：16）のアミノ酸配列を示す。
【図１０】この図は、触媒デオキシリボ核酸のための、可能性のあるヒトPAI-1 mRNAの5'-AT-3’切断部位（対応するDNAとして示してある、配列番号：5)を示す。太字は、タンパク質コード領域を示し、頭文字は、コンセンサス切断部位を示す。
【図１１】この図は、触媒デオキシリボ核酸のための、ヒトPAI-1 mRNAの可能性のある5'-AT-3’切断部位（対応するDNAとして示してある、配列番号：5)を示す。太字は、タンパク質コード領域を示し、頭文字は、コンセンサス切断部位を示す。
【図１２】この図は、触媒ハンマーヘッドリボ核酸のための、ヒトPAI-1 mRNAコード領域の可能性のある切断部位（対応するDNAとして示してある、配列番号：17)を示す。大文字の「T」は、切断部位を表す。
【図１３】この図は、PAI-1触媒DNA酵素（E2）が、バルーン血管形成術傷害の後でラット頸動脈新内膜形成を防止することを示す。
【図１４】この図は、PAI-1触媒DNA酵素（E2）が、バルーン血管形成術の後でラット新内膜形成を減らすことを示す。
【図１５】この図は、PAI-1触媒DNA酵素（E2）が、バルーン血管形成術傷害の後で新内膜形成における平滑筋細胞増殖を防止することを示す。
【図１６】この図は、PAI-1触媒DNA酵素（E2）が、バルーン血管形成術傷害の後で新内膜形成における平滑筋細胞増殖を防止することを示す。
【図１Ａ】
2005523708.tif 000002
【図１Ｂ】
2005523708.tif 000003
【図１Ｃ】
2005523708.tif 000004
【図１Ｄ】
2005523708.tif 000005
【図２Ａ】
2005523708.tif 000006
【図２Ｂ】
2005523708.tif 000007
【図２Ｃ】
2005523708.tif 000008
【図３Ａ】
2005523708.tif 000009
【図３Ｂ】
2005523708.tif 000010
【図３Ｃ】
2005523708.tif 000011
【図３Ｄ】
2005523708.tif 000012
【図４Ａ】
2005523708.tif 000013
【図４Ｂ】
2005523708.tif 000014
【図４Ｃ】
2005523708.tif 000015
【図５Ａ】
2005523708.tif 000016
【図５Ｂ】
2005523708.tif 000017
【図６】
2005523708.tif 000018
【図７】
2005523708.tif 000019
【図８】
2005523708.tif 000020
【図９】
2005523708.tif 000021
【図１０】
2005523708.tif 000022
【図１１】
2005523708.tif 000023
【図１２】
2005523708.tif 000024
【図１３】
2005523708.tif 000025
【図１４】
2005523708.tif 000026
【図１５】
2005523708.tif 000027
【図１６】
2005523708.tif 000028
【配列表】
2005523708000001.app
【国際調査報告】
2005523708.tif 000029
2005523708.tif 000030