(57)【要約】本発明は、安定なヒト肝癌細胞系を得るためのレポーター選択的Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）レプリコン、および、本レプリコンの使用に関する。本レプリコンおよび細胞系は、ＨＣＶ薬の創薬における化合物のスクリーニングプロセスにおいて有用である。
2005523705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子で安定して形質転換されたＨｕｈ−７細胞系であって、該核酸分子は：
キャプシドコード領域のＮ末端に融合したＨＣＶ５’ＮＴＲ；
機能的なウミシイタケルシフェラーゼポリペプチドをコードするヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈＲＬｕｃ）核酸分子［該ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ核酸分子のＮ末端は該キャプシドに融合し、そのＣ末端は口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテイナーゼに融合し、ＦＭＤＶは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴII）遺伝子に融合しており、該ｈＲＬｕｃ２Ａ−ＮＰＴII融合体は、ＨＣＶレプリコンから発現される際に、２Ａペプチドの位置で切断され、ｈＲＬｕｃタンパク質、続いてｈＲＬｕｃシグナル、およびＧ４１８に対する耐性を与えるＮＰＴIIタンパク質が生成される］；および、
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）［ＮＰＴII遺伝子の下流に挿入され、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂの翻訳を指示する］；および、
適応的突然変異を含むＨＣＶ ＮＳ３〜５Ｂポリタンパク質コード領域、
を含む、上記細胞系。
【請求項２】
ＨＣＶＮＳ３〜５Ｂポリタンパク質コード領域における適応的突然変異は、Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、およびＳ２１９７Ｐである、請求項１に記載の細胞系。
【請求項３】
核酸分子は、ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃの自己複製するＲＮＡ分子である、請求項２に記載の細胞系。
【請求項４】
核酸分子は、配列番号１を含む、請求項３に記載の細胞系。
【請求項５】
インビトロで転写され、複製ＨＣＶ ＲＮＡ転写物を生産することができるＨＣＶ二本鎖ｃＤＮＡであって：
キャプシドコード領域のＮ末端に融合したＨＣＶ５’ＮＴＲ；
機能的なウミシイタケルシフェラーゼポリペプチドをコードするヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈＲＬｕｃ）核酸分子［該ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ核酸分子のＮ末端は該キャプシドに融合し、そのＣ末端は口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテイナーゼに融合し、ＦＭＤＶは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴII）遺伝子に融合しており、該ｈＲＬｕｃ２Ａ−ＮＰＴII融合体は、翻訳の際に、自己切断ペプチドにより放出される］；
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）からの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）［ＮＰＴII遺伝子の下流に挿入され、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂの翻訳を指示する］；および、
適応的突然変異を含むＨＣＶ ＮＳ３〜５Ｂポリタンパク質コード領域、
を含む、上記ｃＤＮＡ。
【請求項６】
ｈＲＬｕｃ２Ａ−ＮＰＴII融合体は、発現の際に、２Ａペプチドの位置で切断され、ｈＲＬｕｃタンパク質、続いてｈＲＬｕｃシグナル、およびＧ４１８に対する耐性を与えるＮＰＴIIタンパク質が生成される、請求項５に記載のＨＣＶ二本鎖ｃＤＮＡ。
【請求項７】
ＨＣＶ ＮＳ３〜５Ｂポリタンパク質コード領域における適応的突然変異は、Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、およびＳ２１９７Ｐである、請求項６に記載のＨＣＶ二本鎖ｃＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のｃＤＮＡを含む細胞。
【請求項９】
原核細胞である、請求項８に記載のｃＤＮＡを含む細胞。
【請求項１０】
核酸分子を、ｈＲＬｕｃタンパク質、ＦＭＤＶ２Ａペプチド、およびＮＰＴIIタンパク質をコードする融合タンパク質へ翻訳することにより、タンパク質合成の際に、ＦＭＤＶ
２Ａペプチドの自己切断により、該ｈＲＬｕｃタンパク質とＮＰＴIIタンパク質とが分離される、請求項７に記載のＨＣＶ二本鎖ｃＤＮＡ。
【請求項１１】
安定してＨＣＶ ｈＲＬｕｃ選択的サブゲノムレプリコンＲＮＡを複製するＨｕｈ−７細胞系を作製する方法であって、以下の工程：
（ａ）ＨＣＶレプリコンをコードするＲＮＡ配列を含む核酸分子を構築する工程、
ここで、該核酸分子は；
（ｉ）キャプシドコード領域に融合したＨＣＶ５’ＮＴＲ、
（ii）機能的なウミシイタケルシフェラーゼポリペプチドをコードするヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈＲＬｕｃ）核酸分子［該ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ核酸分子のＮ末端は前記キャプシドに融合し、そのＣ末端は口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテイナーゼに融合し、ＦＭＤＶは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴII）遺伝子に融合しており、該ｈＲＬｕｃ２Ａ−ＮＰＴII融合体は、発現の際に、２Ａペプチドの位置で切断され、該ｈＲＬｕｃタンパク質、続いてｈＲＬｕｃシグナル、およびＧ４１８に対する耐性を与えるＮＰＴIIタンパク質が生成される］；
（iii）脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）からの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）［ＮＰＴII遺伝子の下流に挿入され、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂの翻訳を指示する］；
（iv）適応的突然変異を含むＨＣＶ ＮＳ３〜５Ｂポリタンパク質コード領域；および、
（ｂ）Ｈｕｈ−７細胞を、工程（ａ）からの核酸分子で安定して形質転換する工程、
を含む、上記方法。
【請求項１２】
ＨＣＶ ＮＳ３〜５Ｂポリタンパク質コード領域における適応的突然変異は、Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、および、Ｓ２１９７Ｐである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載のレポーター選択的ＨＣＶレプリコンのトランスフェクションにより誘導された哺乳動物細胞系を用いた分析であって、エンドポイントとしてレポーター遺伝子活性を用いることによって、標準用量反応での阻害剤の特異的抗ウイルス活性を決定するのに用いられる、上記分析。
【請求項１４】
レポーター遺伝子活性はｈＲＬｕｃ由来である、請求項１３に記載の分析。
【請求項１５】
細胞系はＨｕｈ−７であり、レポーター遺伝子活性はｈＲＬｕｃ由来である、請求項１４に記載の分析。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レポーター選択的Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）レプリコン、および安定なヒト肝癌細胞系を生成するための本レプリコンの使用に関する。本レプリコンおよび細胞系は、ＨＣＶ薬を発見する化合物のスクリーニングプロセスにおいて有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルスは、フラビウイルス科ヘパシウイルス属のメンバーである。これは、非Ａ非Ｂウイルス性肝炎の主要な原因因子であり、輸血後肝炎の主要な原因であり、世界的に肝炎の原因のかなりの割合を占める。急性ＨＣＶ感染はしばしば無症状であるが、ほぼ８０％が慢性肝炎となる。ＨＣＶ感染の持続性の特性は、エンベロープタンパク質Ｅ２で露出した領域の高い変異可能性によって宿主の免疫監視から逃れる能力によって説明されてきた（Ｗｅｉｎｅｒ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：８４２〜８４８（１９９１年）；Ｗｅｉｎｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３４６８〜３４７２（１９９２年））。患者の約６０％は、無症状の保因状態から、慢性活性肝炎や肝硬変（患者の約２０％で発症する）に至る様々な臨床的な転帰を伴う肝臓病を発症し、肝臓病は、肝細胞ガンの発症に高い関連性を示す（患者の約１〜５％で発症する）。Ｃｕｔｈｂｅｒｔ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７：５０５〜５３２（１９９４年）；世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）のランセット（Ｌａｎｃｅｔ）３５１：１４１５（１９９８年）を参照。世界保健機関は、１億７０００万人が慢性的にＨＣＶに感染しており、このうち４００万人が米国に居住していると推測している。ＨＣＶは、長さ約９.５ｋｂの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを含むエンベロープを有するリボ核酸（ＲＮＡ）ウイルスである（Ｃｈｏｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３５９〜３６２（１９８９年））。このＲＮＡゲノムは、３４１個のヌクレオチドからなる５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ）（Ｂｒｏｗｎ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：５０４１〜５０４５（１９９２年）；Ｂｕｋｈ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４９４２〜４９４６（１９９２年））、３,０１０〜３,０４０個のアミノ酸からなる１つのポリペプチドをコードする大きいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（上述のＣｈｏｏ等，（１９８９年））、および約２３０個のヌクレオチドからなる可変長の３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ）（Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３３６３〜３３７１（１９９６年）；Ｔａｎａｋａ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３３０７〜３３１２（１９９６年））を含む。その他のプラス鎖ＲＮＡウイルスと同様に、３’非翻訳領域が、ウイルス性のＲＮＡ合成に重要な役割を果たすと推測される。ＨＣＶは、アミノ酸配列やゲノム構成がフラビウイルスやペスチウイルスに類似しており（Ｍｉｌｌｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２０５７〜２０６１（１９９０年））、それゆえに、ＨＣＶは、フラビウイルス科ファミリーの第三の属として分類されている（Ｆｒａｎｃｋｉ等，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．２：２２３〜２３３（１９９１年）。
【０００３】
ＨＣＶ複製の研究や特異的な抗ＨＣＶ剤の探索は、ＨＣＶ増殖に効率的な組織培養系がないこと、ＨＣＶ感染に適切な小動物モデルがないこと、低いレベルのウイルス複製、およびウイルスに関する相当な遺伝的な不均質性のために妨げられてきた（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．８：２８１〜３０１（１９９７年）；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ等，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２３９１〜２３９９（１９９３年））。ＨＣＶゲノムおよびコードされたタンパク質の構造および機能に関する現在の認識は、主として様々な組換え系を用いたインビトロでの研究で得られたものである（上述のＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ（１９９７年））。
【０００４】
５’ＮＴＲは、ウイルスゲノムのなかでも最も保存された領域の１つであり、ウイルスのポリタンパク質翻訳の開始において中心的な役割を果たす（上述のＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ（１９９７年））。１つの長いＯＲＦは、翻訳中または翻訳後に、細胞のプロテイナーゼまたはウイルスのプロテイナーゼのいずれかにより構造（コア、Ｅ１、およびＥ２）、および非構造（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂ）ウイルスタンパク質に、プロセシングされるポリタンパク質をコードする（上述のＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ（１９９７年））。３’ＮＴＲは、３つの別個の領域：ポリタンパク質の停止コドンに続く約３８個のヌクレオチドからなる可変領域、シトシンが分散して置換された可変長のポリウリジン領域、および様々なＨＣＶ種間で高度に保存されている最も３’末端にある９８個のヌクレオチド（ｎｔ）からなる。ゲノム内での遺伝子の順番は、ＮＨ2−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨである（Ｇｒａｋｏｕｉ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１３８５〜１３９５（１９９３年））。
【０００５】
構造タンパク質コア（Ｃ）、エンベロープタンパク質１および２（Ｅ１、Ｅ２）、ならびに、ｐ７領域のプロセシングは、宿主のシグナルペプチダーゼにより仲介される。それとは異なり、非構造的な（ＮＳ）領域の成熟は、２つのウイルス性酵素により達成される。ＨＣＶポリタンパク質は、まず宿主シグナルペプチダーゼにより切断され、構造タンパク質Ｃ／Ｅ１、Ｅ１／Ｅ２、Ｅ２／ｐ７、およびｐ７／ＮＳ２が生産される（Ｈｉｊｉｋａｔａ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５５４７〜５５５１（１９９１年）；Ｌｉｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５０６３〜５０７３（１９９４年））。次に、メタロプロテアーゼであるＮＳ２〜３プロテイナーゼが、ＮＳ２／ＮＳ３のジャンクションを切断する。次に、ＮＳ３／４Ａプロテイナーゼ複合体（ＮＳ３はセリンプロテアーゼであり、ＮＳ４ＡはＮＳ３プロテアーゼの補因子として作用する）が、残りの全ての部位でのプロセシングを起こす（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３８３５〜３８４４（１９９３年）；上述のＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ（１９９７年））。ＲＮＡヘリカーゼおよびＮＴＰアーゼ活性はまた、ＮＳ３タンパク質において同定されている。ＮＳ３タンパク質のＮ末端側の３分の１は、プロテアーゼとして機能し、残りの分子の３分の２は、ＨＣＶ複製に関与すると考えられるヘリカーゼ／ＡＴＰアーゼとして作用する。ＮＳ４Ａは、ＮＳ３プロテアーゼの補因子であり、それにＮＳ４Ｂが続くがその機能はわかっていない。ＮＳ５Ａは、リン酸化タンパク質であり、その機能は現在わかっていない。第四のウイルス酵素であるＮＳ５Ｂは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）であり、ウイルスＲＮＡゲノムの複製を引き起こす重要な成分である（Ｌｏｈｍａｎｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８４１６〜８４２８（１９９７年））。ＮＳ５Ｂは、「ＧＤＤ」配列モチーフを含み、このモチーフは、これまで特徴付けられた全てのＲｄＲｐで高度に保存されている（Ｐｏｃｈ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：３８６７〜３８７４（１９８９年））。
【０００６】
ＨＣＶ複製は、膜結合型複製複合体で生じると考えられる。その中で、ゲノムのプラス鎖ＲＮＡをテンプレートとして用いてマイナス鎖ＲＮＡを合成し、次いで次世代のゲノムのプラス鎖の合成のためのテンプレートとして使用することができる。少なくとも２種のウイルスタンパク質、すなわちＮＳ３タンパク質（カルボキシ末端側の３分の２にヌクレオシドトリホスファターゼ／ＲＮＡヘリカーゼを有する）、および、ＲｄＲｐ活性を有するＮＳ５Ｂタンパク質が、このプロセスに関与すると考えられる。Ｈｗａｎｇ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２２７：４３９〜４４６（１９９７年）を参照。
【０００７】
ＲＮＡ複製におけるＮＳ３の役割が不明確であるが、ＮＳ５Ｂは、子孫のＲＮＡ鎖合成に関与する重要な酵素と考えられる。昆虫細胞でＮＳ５Ｂと基質として合成非ウイルスＲＮＡを発現させる組換えバキュロウイルスを用いることによって、ＮＳ５Ｂが、プライマー依存性のＲｄＲｐ活性を有することがわかった。続いて、基質としてＨＣＶのＲＮＡゲノムを用いることによって確認され、さらに特徴付けられた（Ｌｏｈｍａｎｎ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４９：１０８〜１１８（１９９８年））。近年の研究によれば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現したＣ末端の２１個のアミノ酸を切り詰めたＮＳ５Ｂも、インビトロでＲＮＡ合成を行う活性を有することが示された（Ｆｅｒｒａｒｉ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１６４９〜１６５４（１９９９年）；Ｙａｍａｓｈｉｔａ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１５４７９〜１５４８６（１９９８年））。
【０００８】
持続的なＨＣＶ感染は、慢性肝炎に関連し、ついには肝発ガンに至るため、ＨＣＶ複製は、ＨＣＶ繁殖を排除し、肝細胞ガンを予防するための標的の１つである。遺憾ながら、現在のＨＣＶ感染の治療アプローチは、比較的低い有効性、および好ましくない副作用を特徴とする。それゆえに、徹底的な研究が、この病気を治療するための分子の発見に向けられている。新しいアプローチとしては、予防ワクチンや治療ワクチンの開発、改善された薬物動態学的特徴を有するインターフェロンの同定、および３種の重要なＨＣＶタンパク質：プロテアーゼ、ヘリカーゼ、およびポリメラーゼの機能を阻害するように設計された薬物の発見が挙げられる。また、ＨＣＶのＲＮＡゲノムそれ自体、特に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が、抗ウイルス性の標的として、アンチセンス分子と触媒性のリボザイムを用いて研究されている。総論としては、Ｗａｎｇ等，Ｐｒｏｇ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．５５：１〜３２（２０００年）を参照。
【０００９】
ＨＣＶ感染のための特定の治療としては、α−インターフェロン単独、およびα−インターフェロンとリバビリンとの組み合わせが挙げられる。このような治療は、慢性的なＨＣＶ感染に罹った患者の一部において有効であることが示されている（Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ等，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ  １２７：８７５〜８８１（１９９７年）；Ｚｅｕｚｅｍ等，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２８：２４５〜２５２（１９９８年））。また、ＨＣＶ感染治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばＡｎｄｅｒｓｅｎ等，米国特許第６,１７４,８６８号（２００１年））、同様に、遊離胆汁酸の使用（例えばウルソデオキシコール酸や、ケノデオキシコール酸）、または、抱合型胆汁酸（例えばタウロウルソデオキシコール酸）の使用も提唱されている（Ｏｚｅｋｉ，米国特許第５,８４６,９６４号（１９９８年））。ＨＣＶなどの多数のウイルス感染を標的とするのに有用であるとして、ホスホノギ酸エステルが提唱されている（Ｈｅｌｇｓｔｒａｎｄ等，米国特許第４,５９１,５８３号（１９８６年））。しかしながら、ワクチンの開発は、高度な免疫回避と再感染に対する防御の欠如により妨げられてきた（Ｗｙａｔｔ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１７２５〜１７３０（１９９８年））。
【００１０】
特異的なウイルス標的に向けられた低分子阻害剤の開発は、抗ＨＣＶ研究の焦点となりつつある。ＮＳ３プロテアーゼの結晶構造決定、例えばＫｉｍ等，Ｃｅｌｌ  ８７：３４３〜３５５（１９９６年）、およびＬｏｖｅ等，Ｃｅｌｌ  ８７：３３１〜３４２（１９９６年）、およびＮＳ３のＲＮＡヘリカーゼの結晶構造決定、例えば、Ｋｉｍ等，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：８９〜１００（１９９８年）により、特異的な阻害剤の合理的な設計のための重要な構造的な知見が提供されている。
【００１１】
ウイルスのゲノム構成とウイルスタンパク質の機能における解明が進んでいるにもかかわらず、ＨＣＶ複製の基本的な性質と病原性は未知のままである。ＨＣＶ複製に対して実験的にアクセスする際の主要な問題点は、感染性ウイルス粒子を生産させる効率的な細胞培養系がないことである。初代培養細胞および特定のヒト細胞系の感染が報告されているが、このようなシステムで生産されたウイルスの量とＨＣＶ複製のレベルは、詳細な分析を行うには低すぎるものであった。
【００１２】
ヒト肝癌細胞系Ｈｕｈ-７において最小限の効率で複製する選択的サブゲノムＨＣＶ ＲＮＡの構築が報告されている。Ｌｏｈｍａｎ等は、タンパク質コード領域のＣ−ｐ７また
はＣ−ＮＳ２領域を欠失させることによって、クローニングされた完全長ＨＣＶコンセンサスゲノム（遺伝子型Ｉｂ）から誘導されたレプリコン（Ｉ377／ＮＳ３−３’）の構築を報告している。Ｌｏｈｍａｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１１０〜１１３（１９９９年）。このレプリコンは、以下の要素を含む：（ｉ）キャプシドコード領域の１２個のアミノ酸に融合したＨＣＶ５’ＮＴＲ；（ii）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＰＴII）；（iii）ＮＰＴII遺伝子の下流に挿入され、ＨＣＶタンパク質ＮＳ２またはＮＳ３〜ＮＳ５Ｂの翻訳を指示する、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳ；および、（iv）３’ＮＴＲ。Ｈｕｈ-７細胞のトランスフェクションの後、ＨＣＶ ＲＮＡ複製を維持する細胞だけがＮＰＴIIタンパク質を増幅し、Ｇ４１８に対する耐性を発現した。このようなＧ４１８耐性コロニーから誘導された細胞系は、相当量のレプリコンＲＮＡとウイルスタンパク質を含んでいたが、ＨＣＶ複製を維持したのは１０6個のトランスフェクトされたＨｕｈ-７細胞のうちわずか１個だけであった。
【００１３】
ＨＣＶ−Ｈ遺伝子型１ａ感染性クローンを基礎とする類似の選択的ＨＣＶレプリコンが構築されている（Ｂｌｉｇｈｔ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１９７２〜７４（２０００年））。ＨＣＶ−Ｈ由来のレプリコンは効率的なＨＣＶ複製を行うことができなかったことから、上述のＬｏｈｍａｎｎ（１９９９年）により構築された初期のレプリコンは、この実験で用いられた特定の遺伝子型ＩｂコンセンサスｃＤＮＡクローンに依存することが示唆された。上述のＢｌｉｇｈｔ等（２０００年）は、ＰＣＲによる遺伝子構築方法を行うことによって、上述のＬｏｈｍａｎｎ等（１９９９年）によってなされたレプリコンの構築を再現し、Ｇ４１８耐性Ｈｕｈ-７細胞コロニーを得た。独立したＧ４１８耐性細胞クローンを配列解析して、高いレベルのＨＣＶ複製が、レプリコンの宿主細胞への適応を必要とするかどうかを決定した。ＨＣＶ非構造タンパク質ＮＳ５Ａにおいてクラスターを形成する複数の独立した適応的突然変異が同定された。これらの突然変異により、インビトロにおいて、当業界で構築された初期のレプリコンより高い複製能を獲得し、形質導入効率は、トランスフェクトされた細胞の０.２〜１０％であった（例えば、Ｉ377／ＮＳ３−３’レプリコンの形質導入効率は、０.０００１％）。
【００１４】
その他の報告、例えば、Ｋｒｉｅｇｅｒ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５，４６１４〜４６２４（２００１年）によれば、適応的突然変異を有するレプリコンが同定されている。Ｇ４１８耐性コロニー形成に関して最高の効率を有するこのレプリコンは、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ａにおける数種の突然変異を有することがわかった。これらの適応的突然変異以外にも、ＮＳ３における２種の突然変異（Ｅ１２０２ＧおよびＴ１２８０Ｉ）およびＮＳ５Ａにおける１種の突然変異（Ｓ２１９７Ｐ）が、より高い複製（コロニー形成）表現型を獲得するのに十分であることがわかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
近年の選択的レプリコンの構築およびそれらの哺乳動物細胞系へのトランスフェクションは、ＨＣＶのレプリコンプロセスへの重要な洞察を提供してきた。それにもかかわらず、レポーター遺伝子活性をモニターすることによるＨＣＶ複製の検出を簡単にするＨＣＶレポーター選択的レプリコンが必要とされている。改良されたレポーター選択的ＨＣＶレプリコンは、これら細胞系においてＨＣＶ複製をモニターする能力を高める可能性があり、ＨＣＶ薬の創薬を加速するために大きな影響を与えると思われる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、レポーター選択的サブゲノムＨＣＶ ＲＮＡ（レプリコン）の構築に関し、本レプリコンは、ヒト肝癌細胞系Ｈｕｈ−７において高い効率で複製する。特に、ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含むレプリコンが構築され、このヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテイナーゼの自己切断
ペプチドでＮＰＴII遺伝子と隔てられている。本レプリコンは、ＮＳ３において２種の適応的突然変異（Ｅ１２０２ＧおよびＴ１２８０Ｉ）およびＮＳ５Ａにおいて１種の適応的突然変異（Ｓ２１９７Ｐ）を有する。レポーター選択的レプリコンを有するＨｕｈ−７細胞系は、２０世代を超えて極めて効率的なレポーター遺伝子シグナル（ＨＣＶ ＲＮＡ複製を示す）を有することがわかった。本細胞系の、レポーター遺伝子シグナルをモニターすることによって測定されたＥＣ50は、その他のレプリコン細胞系から得られたものと比較して既知のＨＣＶ阻害剤（例えば、インターフェロン、ＩＦＮ）に対して極めて高感度であることがわかった。
【００１７】
全般的な一観点において、本発明は、以下の（ｉ）〜（iv）を含む核酸分子で安定して形質転換されたＨｕｈ−７細胞系を目的とする：（ｉ）キャプシドコード領域のＮ末端に融合したＨＣＶ５’ＮＴＲ；（ii）機能的なウミシイタケルシフェラーゼポリペプチドをコードするヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈＲＬｕｃ）核酸分子［前記ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ核酸分子のＮ末端は前記キャプシドに融合し、そのＣ末端は口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテイナーゼに融合し、ＦＭＤＶは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴII）遺伝子に融合しており、前記ｈＲＬｕｃ２Ａ−ＮＰＴII融合体は、ＨＣＶレプリコンから発現される際に、２Ａペプチドの位置で切断され、ｈＲＬｕｃタンパク質、続いてｈＲＬｕｃシグナル、およびＧ４１８に対する耐性を与えるＮＰＴIIタンパク質が生成される］；（iii）脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）［ＮＰＴII遺伝子の下流に挿入され、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂの翻訳を指示する］；および、（iv）適応的突然変異を含むＨＣＶ ＮＳ３〜５Ｂポリタンパク質コード領域。ＨＣＶ ＮＳ３〜５Ｂポリタンパク質コード領域における適応的突然変異は、Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、およびＳ２１９７Ｐからなる群より選択される。
【００１８】
本発明はまた、上述のような細胞系を目的とし、この細胞系において、前記核酸分子は、配列番号１に記載のＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃの自己複製するＲＮＡ分子である。
【００１９】
本発明はさらに、インビトロで転写され、複製ＨＣＶ ＲＮＡ転写物を生産することができるＨＣＶ二本鎖ｃＤＮＡを目的とし、前記ｃＤＮＡは、以下の（ｉ）〜（iv）を含む核酸分子を含む：（ｉ）キャプシドコード領域のＮ末端に融合したＨＣＶ５’ＮＴＲ；（ii）機能的なウミシイタケルシフェラーゼポリペプチドをコードするヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈＲＬｕｃ）核酸分子［前記ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ核酸分子のＮ末端は前記キャプシドに融合し、そのＣ末端は口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテイナーゼに融合し、ＦＭＤＶは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴII）遺伝子に融合しており、前記ｈＲＬｕｃ２Ａ−ＮＰＴII融合体は、ＨＣＶレプリコンから発現される際に、２Ａペプチドの位置で切断され、ｈＲＬｕｃタンパク質、続いてｈＲＬｕｃシグナル、およびＧ４１８に対する耐性を与えるＮＰＴIIタンパク質が生成される］；（iii）脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）［ＮＰＴII遺伝子の下流に挿入され、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂの翻訳を指示する］；および、（iv）適応的突然変異を含むＨＣＶ ＮＳ３〜５Ｂポリタンパク質コード領域。ＨＣＶ ＮＳ３〜５Ｂポリタンパク質コード領域における適応的突然変異は、Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、およびＳ２１９７Ｐからなる群より選択される。
【００２０】
本発明はさらに、上述のようなＨＣＶ二本鎖ｃＤＮＡを提供し、ここで、ｈＲＬｕｃ２Ａ−ＮＰＴII融合体は、発現の際に２Ａペプチドの位置で切断され、ｈＲＬｕｃタンパク質、続いてｈＲＬｕｃシグナル、およびＧ４１８に対する耐性を与えるＮＰＴIIタンパク質を生成させる。上述のｃＤＮＡは、細胞中に、好ましくは原核細胞中に存在させることができる。
【００２１】
本発明はまた、安定してＨＣＶ ｈＲＬｕｃ選択的サブゲノムレプリコンＲＮＡを複製するＨｕｈ−７細胞系を生成する方法を提供し、本発明は、以下の工程を用いる：
【００２２】
（ａ）ＨＣＶレプリコンをコードするＲＮＡ配列を含む核酸分子を構築する工程、ここで、前記核酸分子は、以下の（ｉ）〜（iv）を含む：（ｉ）キャプシドコード領域のＮ末端に融合したＨＣＶ５’ＮＴＲ；（ii）機能的なウミシイタケルシフェラーゼポリペプチドをコードするヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈＲＬｕｃ）核酸分子［前記ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ核酸分子のＮ末端は前記キャプシドに融合し、そのＣ末端は口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテイナーゼに融合し、ＦＭＤＶは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴII）遺伝子に融合しており、前記ｈＲＬｕｃ２Ａ−ＮＰＴII融合体は、ＨＣＶレプリコンから発現される際に、２Ａペプチドの位置で切断され、ｈＲＬｕｃタンパク質、続いてｈＲＬｕｃシグナル、およびＧ４１８に対する耐性を与えるＮＰＴIIタンパク質が生成される］；（iii）脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）［ＮＰＴII遺伝子の下流に挿入され、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂの翻訳を指示する］；および、（iv）適応的突然変異を含むＨＣＶ ＮＳ３〜５Ｂポリタンパク質コード領域；ならびに、（ｂ）Ｈｕｈ−７細胞を、工程（ａ）からの核酸分子で安定して形質転換する工程。ＨＣＶ ＮＳ３〜５Ｂポリタンパク質コード領域における適応的突然変異は、Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、およびＳ２１９７Ｐからなる群より選択される。
【００２３】
本発明はさらに、請求項１０に記載のレポーター選択的ＨＣＶレプリコンのトランスフェクションにより誘導された哺乳動物細胞系を用いた分析法を提供し、本分析法は、エンドポイントとしてレポーター遺伝子活性を用いることによって、標準用量反応での阻害剤の特異的抗ウイルス活性を決定するのに用いられる。本分析法のための細胞系は、本発明に記載のＨｕｈ−７細胞系が可能であり、レポーター遺伝子活性は、本発明で記載されたようなｈＲＬｕｃからの活性であり得る。
【００２４】
本発明はさらに、本発明の核酸分子の全部または一部を含む宿主細胞を目的とする。適切な宿主細胞の例としては、Ｈｕｈ−７細胞、ＨｅＬａ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＰＧ２細胞、３Ｔ３細胞、またはＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。
本発明の核酸分子および細胞系は、キットで用いてもよい。
本発明のその他の特徴および利点を、以下の本発明およびその好ましい実施形態を説明する記載で述べる。
【００２５】
図面の簡単な説明
図１は、ＨＣＶゲノム、およびＨＣＶ ｈＲＬｕｃ選択的レプリコンコンストラクト（ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ）の模式図を示す。５’および３’非翻訳領域（ＮＴＲ）は、オープンリーディングフレームの両端に存在し、構造タンパク質はポリタンパク質のＮＨ2末端部分に位置する。その他の部分に、非構造タンパク質（ＮＳ２〜ＮＳ５Ｂ）がコードされている。ＢＢ７−Ｍ４−ｈＲＬｕｃと名付けられたレポーター選択的レプリコンは、コアをコードする領域のわずかな部分に融合した５’ＮＴＲ、ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲＬｕｃ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテイナーゼの自己切断ペプチド、ＮＰＴII遺伝子、およびＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（「ＥＩ」と名付けられた）を有し、続いて、ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂ  ＨＣＶコード領域、および、３’ＮＴＲ領域を有する。
図２は、ＨＣＶ ｈＲＬｕｃ選択的レプリコン（ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ）を構築するプロセスのフローチャートを示す。図２Ａ：突然変異Ｉ２２０４Ｓ、Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、およびＳ２１９７Ｐを、ＰＣＲによる変異誘発によりＢＢ７プラスミドに導入した（核酸の変化は示された通り）。突然変異したＢＢ７プラスミドからのＳｓｐＢＩ−ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ断片を、元の突然変異していないＢＢ７プラスミドの同断片と置き換え、ＢＢ７−Ｍ４を得た。図２Ｂ：２種のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ｈＲＬｕｃ遺伝子とＦＭＤＶ２Ａ自己切断ペプチドとの融合体を生成した。最終ＰＣＲ産物は、５’末端にＡｓｃＩ部位を有し、３’末端にｈＲＬｕｃに融合したＦＭＤＶ２Ａを有し、続いてＡｓｃＩ部位を有する。このＰＣＲ産物を、ＢＢ７のＸｂａＩ−ＰｍｅＩ断片（ｐｃＤＮＡ３.１−ＨＣＶＩＲＥＳＮｅｏ）を含むプラスミドのＡｓｃＩ部位にクローニングした。それにより、ＨＣＶコアタンパク質の３６個のヌクレオチドと、ｈＲＬｕｃのＯＲＦとの融合体（ＦＭＤＶ２Ａペプチドを介してＮＰＴIIコード領域に融合している）を得た（ｐｃＤＮＡ３.１−ＨＣＶＩＲＥＳ−ｈＲＬｕｃ２Ａ  Ｎｅｏ中）。図２Ｃ：ｐｃＤＮＡ３.１−ＨＣＶＩＲＥＳ−ｈＲＬｕｃ２Ａ  Ｎｅｏコンストラクト、および、ＢＢ７−Ｍ４を、ＡｇｅＩおよびＰｍｅＩで消化した。ｐｃＤＮＡ３.１−ＨＣＶＩＲＥＳ−ｈＲＬｕｃ２Ａ  Ｎｅｏコンストラクトからの小さいＡｇｅＩ−ＰｍｅＩ断片を、ＢＢ７Ｍ４の大きいＡｇｅＩ−ＰｍｅＩ断片とライゲートすることによって、ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃを構築した。
図３Ａ〜図３Ｅは、ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。
図４は、Ｈｕｈ−７細胞系ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ＃１０を確認するために得られたデータを示す。
図５は、Ｈｕｈ−７細胞系ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ＃１０と、その他の従来使用されてきたレポーター−レプリコン系との、ＨＣＶ ＲＮＡ複製を示す相対発光量（ＲＬＵ）でみた実際のルシフェラーゼ活性およびシグナル・ノイズ比の比較を示す。
図６Ａ〜図６Ｂは、ＢＢ７のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【００２６】
発明の詳細な説明および好ましい実施形態
本発明は、選択的サブゲノムＨＣＶレプリコンＲＮＡの構築に関し、このＨＣＶレプリコンＲＮＡは、レポーター遺伝子を含み、従来使用されてきたレポーター選択的レプリコンより大きいシグナル・ノイズ比によって示されるように、ヒト肝癌細胞系Ｈｕｈ−７において高いレベルの複製が可能である。特に、ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含むレプリコンが構築され、このヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子は、口蹄疫ウイルス２Ａプロテイナーゼの自己切断ペプチドでＮＰＴII遺伝子と隔てられている。レポーター選択的レプリコンを有するＨｕｈ−７細胞系は、２０世代を超えて安定なレポーター遺伝子シグナル、および、既知のＨＣＶ阻害剤に対する感度を有し、阻害値（ＥＣ50）は、他のレプリコン細胞系から得られた阻害値に匹敵することがわかった。
【００２７】
本発明で用いられる用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、他を含みうる非限定的な意味で使用される。
【００２８】
本発明において、当業界の技術の範囲内で従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を用いることができる。このような技術は、文献でよく説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８９年）；Ａｕｓｕｂｅｌ編，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｉ〜III巻（１９９４年）；Ｃｅｌｉｓ編，「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，Ｉ〜III巻（１９９４年）；Ｃｏｌｉｇａｎ編，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｉ〜III巻（１９９４年）；Ｇａｉｔ編，「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８４年）；Ｈａｍｅｓ等編，「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（１９８５年）；Ｈａｍｅｓ等，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（１９８４年）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（１９８６年）；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」（１９８６年）；および、Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）を参照。
【００２９】
従って、以下の用語は、本発明において用いられる場合、以下に記載するような定義を有するべきである。
【００３０】
「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、一般的に、あらゆるポリリボヌクレオチド、またはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、これらは、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる。「ポリヌクレオチド」としては、これらに限定されないが、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混在したＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖領域と二本鎖領域とが混在したＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子（ＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖が可能であり、またより典型的には二本鎖であり、または一本鎖領域および二本鎖領域が混在している）が挙げられる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡを含む、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域も意味する。用語「ポリヌクレオチド」はまた、１もしくはそれ以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性やその他の理由のために修飾された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡも挙げられる。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基や、イノシンのような通常ではない塩基が挙げられる。多種多様な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされている；従って、「ポリヌクレオチド」は、天然に通常みられるようなポリヌクレオチドを化学的、酵素的または代謝的に修飾した形態、同様に、ウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡの性質の化学的な形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短いポリヌクレオチドも包含し、これらは場合によってはオリゴヌクレオチドともいう。
【００３１】
加えて、用語「ＤＮＡ分子」は、ＤＮＡ分子の一次と二次構造のみを意味し、どのような特定の三次的な形態にも限定されない。従って、この用語は、特に直鎖状ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、ウイルス、プラスミド、および染色体においてみられる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察する際、本発明において、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）にそって５’から３’方向の配列のみを示す標準的な慣例に従って配列を記載することができる。
【００３２】
「ＲＮＡ分子」は、リボヌクレオチドの高分子形態を意味し、これらは一本鎖型または二本鎖へリックス型のいずれかである。特定のＲＮＡ分子の構造を考察する際、本発明において、５’から３’方向で配列を示す標準的な慣例に従って配列を記載することができる。
【００３３】
本発明に記載のアミノ酸残基は、「Ｌ型」異性体であることが好ましい。しかしながら、望ましい機能的特性がポリペプチドに保持されていれば、どのようなＬ型アミノ酸残基でも「Ｄ型」異性体の残基で、置換されていてもよい。
【００３４】
用語「ＮＨ2」は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を意味し、「ＣＯＯＨ」は、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシ基を意味する。本発明においては、標準的なポリペプチドの命名およびアミノ酸残基の略語が用いられる。
【００３５】
本発明において、アミノ酸残基の配列は、左から右への方向が、慣例的なアミノ末端からカルボキシ末端への方向を示す式で示される。さらに、アミノ酸残基配列の始点または終点におけるダッシュは、さらなる１またはそれ以上のアミノ酸残基配列に結合したペプチドを示すことに留意すべきである。
【００３６】
「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡまたはＲＮＡ複製の自律的なユニットとして機
能するあらゆる遺伝学的要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルスＲＮＡ）である。すなわち、レプリコンは、それ自身の制御下で複製可能である。Ｂｒａｄｅｎｂｅｃｋ等，Ｓｅｍｉｎ．Ｖｉｒａｌ．３：２９７〜３１０（１９９２年）。
【００３７】
「ベクター」は、環状ＤＮＡであり、例えばプラスミド、ファージ、またはコスミドであり、これらに他のＤＮＡセグメントを連結させて、連結されたセグメントの複製、発現または組込みを起こしてもよい。
【００３８】
多種多様な発現ベクターを核酸分子を発現させるのに用いることができる。このようなベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母人工染色体などの酵母の染色体の要素、バキュロウイルスのようなウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスから誘導されたベクターが挙げられる。ベクターはまた、これらの源の組み合わせから誘導されてもよく、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的要素から誘導されたベクターであり、例えば、コスミドおよびファージミドである。原核性宿主および真核性宿主に適したクローニングおよび発現ベクターは、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ等で説明されている。
【００３９】
適切な核酸分子を含むベクターは、既知の技術を用いて、増殖または発現させるために適切な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞としては、細菌細胞、例えば、これらに限定されないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、真核細胞、例えば、これらに限定されないが、酵母、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、動物細胞、例えばＨｕｈ−７、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＭＴ−２Ｔ、ＣＥＭ−ＳＳ、およびＣＨＯ細胞、および植物細胞が挙げられる。
【００４０】
一般的に、ベクターは、組換えベクターコンストラクトを含む細胞の亜集団の選択を可能にする選択的マーカーを含んでいる。マーカーは、本発明に記載の核酸分子を含む同じベクターに含まれてもよいし、または、別のベクターに含まれてもよい。マーカーとしては、原核宿主細胞のためにはテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性遺伝子、および真核宿主細胞のためにはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性が挙げられる。しかしながら、表現型の特性に関する選択を可能にするあらゆるマーカーが有効と考えられる。
【００４１】
「コード配列」または「オープンリーディングフレーム」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、インビボで転写され、ポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン、および３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンで決められる。コード配列としては、これらに限定されないが、原核生物の配列、真核性のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列が挙げられ、さらに、合成ＤＮＡまたはＲＮＡ配列も挙げられる。
【００４２】
転写制御配列はＤＮＡ調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどであり、これらは、ＤＮＡテンプレートからメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を合成することによって宿主細胞においてコード配列を発現させるのに役立つ。
【００４３】
「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼを結合させ、コード配列の
転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を明確にするために、プロモーター配列はその３’末端で転写開始部位と結合し、上流に伸長することによって（５’方向）、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最小数の塩基または要素を含めることができる。プロモーター配列内に、ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによりうまく定義された転写開始部位、同様に、ＲＮＡポリメラーゼの結合を引き起こすタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される場合がある。原核生物のプロモーターは、−１０および−３５のコンセンサス配列を含む。プロモーターを用いて、ＲＮＡ配列またはＲＮＡウイルス複製における構造について言及することもできる。
【００４４】
「発現制御配列」は、その他のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメラーゼによりコード配列がｍＲＮＡに転写され、続いてコード配列によりコードされるタンパク質に翻訳される場合、コード配列は細胞中の転写および翻訳制御配列の「制御下」である。ＲＮＡ配列はまた、翻訳、ＲＮＡの安定性、および複製（ＲＮＡウイルスについて）を調節するそれらの能力に基づき、発現制御配列として役立ち得る。
【００４５】
「シグナル配列」をコード配列の前に含ませてもよい。この配列は、シグナルペプチドをコードしており、ポリペプチドに対してＮ末端にあり、宿主細胞にシグナルを伝えて、ポリペプチドを細胞表面に向けさせたり、ポリペプチドを培地に分泌させたりする。シグナルペプチドは、タンパク質が細胞から離れる前に宿主細胞により除去される。真核生物に通常存在する多種多様なタンパク質と関係を有するシグナル配列を見出すことができる。
【００４６】
用語「オリゴヌクレオチド」は、２個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド、好ましくは４個以上のデオキシリボヌクレオチドからなる分子と定義される。その正確なサイズは多くの因子に依存し、それらの因子はまた、オリゴヌクレオチドの最大の機能および使用に依存すると考えられる。
【００４７】
本発明で用いられる用語「プライマー」は、オリゴヌクレオチドであって、精製された制限酵素分解物にあるような天然に存在するもの、または合成により生産されたものどちらも意味し、これらは、核酸の鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導されるような条件下に置かれた場合、合成開始点として作用することが可能である。すなわち、ヌクレオチドおよび誘導物質（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の存在下、および適切な温度およびｐＨでの誘導である。プライマーは、一本鎖でも二本鎖でもよく、誘導物質の存在下で望ましい伸長産物の合成を開始させるのに十分な長さを有さなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの源、および使用される方法などの多くの因子に依存する。例えば、診断用途においては、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的に、１５〜２５個またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、それよりも少ないヌクレオチドを含むものでもよい。
【００４８】
本発明においてプライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるように選択される。プライマーは、それぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。それゆえに、プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映していなくてもよい。例えば、非相補的ヌクレオチド断片が、プライマーの５’末端に結合しており、プライマー配列の残りが、鎖に相補的であることも可能である。あるいは、プライマー配列が鎖とハイブリダイズし、それにより伸長産物の合成が行える程度に十分な、鎖の配列との相補性を有しているのであれば、非相補的塩基またはより長い配列がプライマーに点在していてもよい。
【００４９】
本発明で用いられる用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、細菌の酵素を意味し、これらはいずれも、特異的なヌクレオチド配列で、またはその近辺で二本鎖ＤＮＡを切断する。
【００５０】
外来または異種のＤＮＡまたはＲＮＡが細胞内部に導入された場合、細胞は、外来または異種のＤＮＡまたはＲＮＡで「形質転換」されている。形質転換するＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組込（共有結合した）まされていてもよいし、組込まれていなくもよい。例えば、原核生物、酵母および哺乳動物細胞において、形質転換するＤＮＡは、プラスミドのようなエピソームの要素に維持され得る。真核細胞に関して、安定して形質転換した細胞とは、形質転換するＤＮＡが染色体複製により娘細胞に受け継がれるように形質転換するＤＮＡが染色体に組込まれた細胞である。この安定性は、形質転換するＤＮＡを含む娘細胞群で構成される細胞系またはクローンを確立する真核細胞の能力によって実証される。本発明で説明されたような哺乳動物細胞を形質転換させるＲＮＡレプリコンの場合において、このＲＮＡ分子、例えばＨＣＶ ＲＮＡ分子は、半自律的に複製する能力を有する。ＨＣＶ ＲＮＡ複製により、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質生産によるＧ４１８に対する耐性が生じるため、ＨＣＶレプリコンを有するＨｕｈ−７細胞は、Ｇ４１８の存在下で選択される。これによりＧ４１８耐性のＨｕｈ−７細胞のクローンが得られ、細胞系を形成することができる。
【００５１】
「クローン」は、単一の細胞から誘導された、または有糸分裂により共通の祖先から誘導された細胞群である。
【００５２】
用語「組換え宿主細胞」は、遺伝子または核酸分子の新しい組み合わせが含まれるように改変された細胞を意味する。組換え宿主細胞は、当業界で簡単に利用可能な技術で本発明に記載のベクターコンストラクトを細胞に導入することによって製造された。このような技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランが介在するトランスフェクション、カチオン脂質が介在するトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション、およびその他の技術、例えば上述のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載の技術が挙げられる。
【００５３】
宿主細胞は、２以上のベクターを含んでもよい。従って、様々なベクターで様々なヌクレオチド配列が同じ細胞に導入することができる。同様に、核酸分子は、単独で、または、上記核酸分子とは無関係のその他の核酸分子（例えば発現ベクターのトランス作用因子を提供する核酸分子）と共に導入することもできる。２以上のベクターを細胞に導入する場合、ベクターを独立して導入してもよいし、共に導入してもよく、または各ベクターのセグメントを１つのベクターに合わせることもできる。本発明はまた、本発明に記載のベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【００５４】
バクテリオファージおよびウイルスベクターの場合、これらは、標準的な感染方法および形質導入方法により、パッケージングされたウイルスまたはカプセル化されたウイルスとして細胞に導入することができる。ウイルスベクターは、複製可能型でも、複製欠陥型でもよい。ウイルス複製欠陥型の場合、複製は、欠陥を補足する機能を付与する宿主細胞で起こると考えられる。
【００５５】
「細胞系」は、インビトロで何世代も安定して成長できる初代細胞のクローンである。この定義は、細胞を形質転換または「トランスフェクト」させるのに用いることができるＲＮＡ分子に対しても適用することができる。いくつかのＲＮＡウイルスに関して、このような方法を用いて、一時的または連続的にウイルス複製を維持する細胞系、場合によっては、感染性ウイルス粒子を生産する細胞系を生産することができる。
【００５６】
規定の長さのＤＮＡ配列にわたって、少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、および最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）のヌクレオチドが一致する場合、２つのＤＮＡまたはＲＮＡ配列は「実質的に相同」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで従来使用されてきた標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによって、または、例えば、その特定のシステムに関して設定されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験によって同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は、当業界の技術の範囲内である。例えば上述のＭａｎｉａｔｉｓ等を参照。
【００５７】
ＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトの「異種」領域は、より大きい核酸内で天然では存在しない同定可能なＤＮＡまたはＲＮＡ分子のセグメントである。例えば、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、通常、源となる生物のゲノムにおいて哺乳動物ゲノムＤＮＡの端に存在しないＤＮＡが、その遺伝子の端に存在すると考えられる。異種コード配列のその他の例は、コード配列それ自体は天然ではみられないコンストラクトである（例えば、ゲノムコード配列が、イントロン、または、天然型遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列を含むようなｃＤＮＡ）。対立遺伝子変異または自然に起こる突然変異現象は、本発明において定義されたＤＮＡの異種領域を生じない。
【００５８】
発現制御配列が、ＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節する場合、そのＤＮＡ配列は、発現制御配列に「操作可能に結合」している。用語「操作可能に結合」とは、発現され得るＤＮＡ配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧ）を有し、正しいリーディングフレームを維持することを含み、それにより、発現制御配列の制御下でＤＮＡ配列を発現し、そのＤＮＡ配列によりコードされた望ましい生成物を生産することを可能にする。組換えＤＮＡ分子に挿入され得る遺伝子が適切な開始シグナルを含まない場合、このような開始シグナルをその遺伝子の前に挿入することができる。
【００５９】
一般的に、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のいずれにおいても、実質的に５×ＳＳＣ、６５℃に相当する塩および温度条件を意味する。しかしながら、当業者であれば理解可能であるが、このような「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、特定の条件、例えば緩衝液中のナトリウムおよびマグネシウム濃度、ヌクレオチド配列の長さおよび濃度、ミスマッチ率（％）、ホルムアミド百分率（％）などによる。また、標準的なハイブリダイゼーション条件の決定において重要なことは、２つの配列のハイブリダイズは、ＲＮＡ−ＲＮＡ間なのか、ＤＮＡ−ＤＮＡ間なのか、または、ＲＮＡ−ＤＮＡ間なのかということである。このような標準的なハイブリダイゼーション条件は、周知の式に従って当業者により容易に決定され、典型的には、ハイブリダイゼーションは、予測または決定されたＴmより１０〜２０℃低い温度である。
【００６０】
本発明で用いられる「ｐｇ」はピコグラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｕｇ」または「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｕｌ」または「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｌ」は、リットルを意味し、「ｍｉｎ．」は、分を意味し、「ｓｅｃ．」は、秒を意味する。
【００６１】
Ｃ型肝炎ウィルスまたはＨＣＶは、フラビウイルス科において別個の属として分類された関連ウイルスの多様な群を意味する。この属の特徴は、上記発明の背景で説明されており、例えば、ＨＣＶ−１、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣＶ−Ｈ、ＨＣ−Ｊ６、ＨＣ−Ｊ８、ＨＣ−Ｊ４／８３、ＨＣ−Ｊ４／９１、ＨＣ−Ｃ２、ＨＣＶ−ＪＫ１、ＨＣＶ−Ｔ、ＨＣＶ−ＪＴ、ＨＣ−Ｇ９などが挙げられる。
【００６２】
ＨＣＶ類似体は、本発明の範囲内で得られたヌクレオチド配列から製造することができる。断片または突然変異体のような類似体は、標準的な制限酵素による切断、または、ＨＣＶコーディングおよび非コーディング（５’および３’末端）配列の部位特異的変異誘発により生産することができる。「ＨＣＶ阻害活性」を示す分子、例えば小さい分子またはアンチセンス分子は、例えばインターフェロンを用いた分析法により同定することができる。
【００６３】
細胞におけるＨＣＶの複製は、分岐（ｂｒａｎｃｈｅｄ）ＴａｑＭａｎ定量ＲＴ／ＰＣＲおよび免疫学的方法によって確認することができる。これら方法およびその用途は当業界既知であるため、本発明の範囲内で使用可能である。「競合的な」抗体結合方法が、米国特許第３,６５４,０９０号、および第３,８５０,７５２号で説明されている。「サンドイッチ」法は、米国特許第ＲＥ３１,００６号および第４,０１６,０４３号で説明されている。さらにその他の方法が知られており、例えば「二重抗体」または「ＤＡＳＰ」法である。
【００６４】
いずれの場合においても、ＨＣＶタンパク質は、１またはそれ以上の抗体または結合パートナーと複合体を形成し、この複合体の一部分が検出可能な標識で標識される。複合体の形成結果、および、場合によってそれらの量は、標識の検出に適用できる既知の方法で測定することができる。
【００６５】
あるいは、ＨＣＶ ＲＮＡの存在は、ノーザン分析、プライマー伸長法などによって測定することができる。これらの研究に最も一般的に用いられる標識は、放射活性元素、基質と接触すると蛍光を発する酵素などである。数々の蛍光性物質が知られており、標識として用いることができる。蛍光性物質としては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー、およびルシファー・イエローが挙げられる。
【００６６】
ＨＣＶタンパク質に対する抗体、または、ＨＣＶ ＲＮＡに対するプローブはまた、放射活性元素または酵素で標識することもできる。放射活性標識は、現在利用可能なカウント方法のいずれかにより検出することができる。好ましい同位体は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、および186Ｒｅから選択することができる。
【００６７】
同様に、酵素標識も有用であり、現在利用されている比色技術、分光光度技術、蛍光分光光度技術のいずれかによって検出することができる。このような酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどのような架橋分子との反応により選択されたプローブと結合する。これらの方法で用いることができる多くの酵素が知られており、使用することができる。好ましいこのような酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ、ならびにアルカリホスファターゼが挙げられる。その他の標識物質および方法の開示に関する例で、米国特許第３,６５４,０９０号；第３,８５０,７５２号；および第４,０１６,０４３号が参照される。加えて、プローブをビオチンで標識し、標識されたアビジン、またはアビジンと標識された抗−アビジン抗体との組み合わせで検出してもよい。プローブはまた、ジゴキシゲニンを包含してもよく、続いて標識された抗ジゴキシゲニン抗体で検出してもよい。
【００６８】
ＥＣ50値は、ウイルス複製の５０％阻害が達成される阻害剤濃度である。ＨＣＶレプリコンレポーター分析システムを、標準用量反応での阻害剤の特異的抗ウイルス活性を決定するために開発できる。このような分析において、レポーター選択的なＨｕｈ−７細胞は、試験阻害剤の一連の希釈液を含むまたは阻害剤を含まない９６個のウェルでインキュベ
ートされる。インキュベート後の所定時間で、適切なレポーター分析方法を用いて、その細胞系におけるウイルスをコードするレポーター遺伝子の活性を測定する。レポーター遺伝子の測定データは、阻害剤を含まない細胞のレポーター遺伝子活性に対する、阻害剤で処理した細胞におけるレポーター遺伝子活性のパーセントで示すことができる。このようなデータの抗ウイルス成分の分析により、５０％の有効濃度（ＥＣ50）を計算することができる。
【００６９】
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は、キャップ非依存的な様式でリボソームをリクルートし、翻訳を行う。ＨＣＶ ＲＮＡゲノムは、内部リボソーム侵入部位を含む。
【００７０】
「ＢＢ７」コンストラクト（アパス（Ａｐａｔｈ），Ｌ.Ｌ.Ｃ．（セントルイス，ミズーリ州）から得られた）は、ＮＳ５Ａドメインに１つの適応的突然変異（Ｓ２２０４Ｉ）を有するサブゲノムＨＣＶ ＲＮＡ（レプリコン）である。
【００７１】
レポーター選択的ＨＣＶレプリコン（本発明においてＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃと指定される）は、レポーター遺伝子を有し、それによりＨＣＶ複製、および３つの適応的突然変異（そのうち２つはＮＳ３ドメイン中、１つはＮＳ５Ａドメイン中）をモニターすることができる（図１）。レポーター遺伝子（ｈＲＬｕｃ）は、ＦＭＤＶの２Ａプロテイナーゼをコードする自己切断ペプチドを介してＮＰＴII遺伝子に融合する。この融合タンパク質は、ＨＣＶ ＲＮＡの５’非翻訳領域（ＮＴＲ）に存在するＨＣＶＩＲＥＳの翻訳制御下である。ＮＳ３〜ＮＳ５ＢからのＨＣＶ非構造タンパク質領域を含むレプリコンの第二のシストロンは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳの翻訳制御下である。
【００７２】
ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ２Ａレプリコンを含む細胞系において、ＨＣＶ複製によるレプリコンＲＮＡの増加は、ｈＲＬｕｃおよびＮＰＴIIタンパク質生産の増加をもたらす。前者の高い活性は、レプリコン細胞系において基質を加えることによって検出することができ、およびＮＰＴII活性は安定なコロニー形成と細胞系形成をもたらす。
【００７３】
本発明のシグナル・ノイズ比は、当業界でこれまで開示されているものに比べて７０倍高いことから、本発明は、当業界でにおけるその他のＨＣＶを基礎とするレポーター選択的レプリコンを改善したものである。
【実施例】
【００７４】
典型的な方法および材料
ＨＣＶレプリコンの構築
Ａ．ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ
本発明のレポーター選択的レプリコンは、レポーター遺伝子として役立つヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲＬｕｃ）を含む。
遺伝子の調節要素を同定および分析するための手段として、生物科学を通じてレポーター遺伝子が用いられる。組換えＤＮＡ技術を用いて、レポーター遺伝子を、対象の調節配列に融合させることができる。次に、得られた組換え遺伝子は細胞に導入され、その細胞において、レポーターｍＲＮＡの測定、レポータータンパク質の測定、またはレポーター酵素活性の測定などの様々な方法を用いてレポーターの発現を検出することができる。一般的に用いられるレポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が挙げられる。
【００７５】
多くのレポーターシステムが、ルシフェラーゼ遺伝子を利用している。ルシフェラーゼは、様々な基質の酸化を触媒し、光を放出させる酵素群を意味する。一般的に、ルシフェ
ラーゼ活性は真核細胞ではみられない。様々なルシフェラーゼがそれぞれ異なる特異的な要求を有し、多種多様な物質を検出および定量するするのに用いることができる。
【００７６】
ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の野生型ルシフェラーゼ酵素は、分子量３６ｋＤａの単量体タンパク質である。この酵素は、酸素とルシフェリンセレンテラジンの存在下で可視光の放出を触媒し、青色の光を生産する。ウミシイタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子は、細菌（Ｊｕｂｉｎ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：１８５〜１８８（１９９８年））、酵母（Ｓｒｉｋａｎｔｈａ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７８：１２１〜１２９（１９９６年））、植物（Ｍａｙｅｒｈｏｆｅｒ等，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７：１０３１〜１０３８（１９９５年））、および、哺乳動物細胞（Ｌｏｒｅｎｚ等，Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．１１：３１〜３７（１９９６年））における遺伝子発現の分析に用いられてきた。
【００７７】
野生型ウミシイタケルシフェラーゼのクローニング、発現および使用は、米国特許第５,２９２,６５８号および第５,４１８,１５５号で報告されている。
【００７８】
ウミシイタケルシフェラーゼは、市販されている（ベーリンガー・マンハイム、シグマ、およびプロメガ）。プロメガ（マディソン，ウィスコンシン州）は、哺乳動物細胞における効率的な発現に対して最適化されたコドンを含む合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を開発している。プロメガの文献が示すところによれば、この改変遺伝子のさらなる特徴は、遺伝子から干渉する可能性のある制限部位や遺伝学的な調節部位を除去したことが挙げられる（プロメガ・テクニカルマニュアル第０５５号，６／０１／０１改訂）。プロメガのヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含む様々なプラスミドに関する配列情報は、寄託番号ＡＦ３６２５４５〜ＡＦ３６２５５１でＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。
ポリペプチドに関する用語「機能的な誘導体」は、本発明に記載のヒト化ウミシイタケルシフェラーゼの生物学的活性または免疫学的特徴に実質的に類似している生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）または免疫学的特徴を有するポリペプチドをいう。
【００７９】
Ｂ．適応的突然変異
突然変異Ｉ２２０４Ｓ、Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、およびＳ２１９７Ｐを、クイックチェンジ（ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ）部位特異的ＰＣＲによる変異誘発によりＢＢ７に導入した。（図２Ａ，ストラタジーン，ラ・ホヤ；Ｗａｎｇ等，「ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，第２６巻，第４号（１９９９年）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ８２：４８８（１９８５年）；Ｖａｎｄｅｙａｒ等，Ｇｅｎｅ  ６５：１２９〜１３３（１９８８年）；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ等，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７９：３０９〜３１１（１９８９年）；Ｔａｙｌｏｒ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６４（１９８５年）；Ｐａｐｗｏｒｔｈ等，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ９：３〜４（１９９６年）；Ｂｅｒｇｓｅｉｄ等，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：３４〜３５（１９９１年）；Ｎｅｌｓｏｎ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：２７９〜３０３（１９９２年）；およびＢｕｒｋｅ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：１０３１〜１０４０（１９９８年）。
ＢＢ７ＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２２０４Ｉを、野生型配列に再び戻した（Ｉ２２０４Ｓ）。
４つのアミノ酸の変換体を作製するのに用いられたプライマーを以下の表１に示す。
【００８０】
【表１】
2005523705.tif 000003
【００８１】
ＢＢ７コンストラクトにおいてＩ２２０４Ｓの変換体を作製するために、以下の表２で列挙した成分を２本の薄壁型ＰＣＲチューブに加えた。
【００８２】
【表２】
2005523705.tif 000004
【００８３】
ポリメラーゼ連鎖反応を、９５℃で３０秒間、続いて５５℃で１分間、および６８℃で２６分間を３サイクルで行った。伸長反応が完了した後、両方の反応液からの２５μｌを混合し、ハーキュレース（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ）（またはＰＦＵ）１μｌを加え、その後、９５℃で３０秒間、続いて５５℃で１分間、および６８℃で２６分間を１２サイクルで反応させた。反応を終えたＰＣＲ反応液２μｌを用いて、コンピテント大腸菌細胞（インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州）を形質転換した。テトラサイクリンを含むプレート（１０μｇ／ｍｌ）でクローンを選択した。陽性クローンを制限酵素消化で同定した。続いて、配列解析により点突然変異が確認された。新しいコンストラクトをＢＢ７−Ｍ２と命名した。
【００８４】
同じ方法を用いて、Ｅ１２０２Ｇ突然変異を導入した（ただしＢＢ７−Ｍ１をＰＣＲテンプレートとして用い、プライマーとしてＢＢ７−Ｅ１２０２Ｇ（＋）、およびＢＢ７−Ｅ１２０２Ｇ（−）を用いたことを除く）。新しいコンストラクトをＢＢ７−Ｍ２と命名した。ＢＢ７−Ｍ３−テンプレートを作製するために、ＰＣＲテンプレートとしてＢＢ７−Ｍ２を用い、ＰＣＲ反応においてプライマーとしてＢＢ７−Ｔ１２８０Ｉ（＋）、およびＢＢ７−Ｔ１２８０Ｉ（−）を用いた。プライマーＢＢ７−Ｓ２１９７Ｐ（＋）、およびＢＢ７−Ｓ２１９７Ｐ（−）を用い、テンプレートとしてＢＢ７−Ｍ３を用いて、ＢＢ７−Ｍ４を得た。
【００８５】
配列解析により全ての突然変異を確認した。ＰＣＲ反応中に第二の突然変異が導入されていないことを確認するために、突然変異したＢＢ７−Ｍ４プラスミドからのＳｓｐＢＩ−ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ断片を、元の突然変異していないＢＢ７プラスミドの同断片と置換し、最終的なＢＢ７−Ｍ４プラスミドを得た。置換を行うために、変異誘発を受けたプラスミドとＢＢ７を制限酵素ＳｓｐＢＩとＸｈｏＩで切断した。突然変異誘発を受けたプラスミドからの小さいＳｓｐＢＩ−ＸｈｏＩ断片をゲルで精製し、ＢＢ７の大きいＳｓｐＢＩ−ＸｈｏＩ断片とライゲートした（または、ゲルで精製した）。得られたコンストラクトは、変異誘発を受けたＤＮＡの断片のみを有していたことから、プラスミドＤＮＡ中のどこにも変異誘発プロセス中に生じる可能性のある意図しない突然変異を有さないコンストラクトが得られた。
【００８６】
Ｃ．ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃの構築（ｈＲＬｕｃ２ＡとｈＲＬｕｃ２ＡＮＰＴIIとの融合体を介する）
本発明のルシフェラーゼ遺伝子を用いて、融合タンパク質を構築することができる。融合タンパク質の構築は、当業界既知であり、例えば、Ｄａｙ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２５：８４８〜５０，８５２〜４，８５６（１９９８年）；Ｋｏｂａｔａｋｅ等，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：３００〜３０５（１９９３年））；および、Ｗａｎｇ等，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６４：５７８〜８７（２００１年））である。
【００８７】
ｈＲＬｕｃ遺伝子と口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の自己切断ペプチドとの融合体を得るために、２種のポリメラーゼ連鎖反応を用いた。ＰＣＲ技術は当業界周知である。例えば、Ｉｎｎｉｓ等編，「ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ」（１９９９年）；Ｇｅｌｆａｎｄ等編，「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（１９９０年）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（１９８６年）；およびＰｅｒｂａｌ，「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）を参照。
【００８８】
簡単に言えば、それぞれの適切なオリゴヌクレオチドプライマー５０ｐモル、テンプレートＤＮＡ（２０ｎｇ）、最終濃度２００μＭの各ｄＮＴＰ（ロシュ，インディアナポリス，インディアナ州）、ハーキュレース・エンハンスド（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン，サンディエゴ，カリフォルニア州）（５ユニット）、および製造元（ストラタジーン）より供給された１０×ハーキュレース
・エンハンスドＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（５μｌ）を含むＰＣＲ混合液５０μｌを調製した。９５℃で２分間インキュベートすることによってＰＣＲ反応を開始した。次に、ＰＣＲ増幅を、（１）９５℃で３０秒間；（２）６０℃で１分間；および（３）７２℃で１分間の工程からなるサイクルを３０回繰り返して行った。
【００８９】
第一のＰＣＲ反応において、オリゴヌクレオチドＡｓｃＩ−ｈＲＬｕｃ（＋）、およびＦＭＤＶ２Ａ−ｈＲＬｕｃ（−）を用いて、ｐｈＲＬ−ＣＭＶ（プロメガ（マディソン）より購入）からｈＲＬｕｃ遺伝子を増幅した。
【００９０】
ＰＣＲ反応のためのプライマー配列を以下に示す：
ＡｓｃＩ−ｈＲＬｕｃ（＋）：
５’−ＣＣＡ  ｇｇｃ  ｇｃｇ  ｃｃＡ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＴＧＴ  ＡＣＧ  ＡＣＣ  ＣＣＧ  ＡＧＣ−３’（配列番号１１）。ＡｓｃＩ部位（ｇｇｃｇｃｇｃｃ）の後、ｈＲＬｕｃのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’末端からの２８ｎｔが続く。
ＦＭＤＶ２Ａ−ｈＲＬｕｃ（−）：
５’−ｇａｃ  ｔｃｇ  ａｃｇ  ｔｃｔ  ｃｃｃ  ｇｃａ  ａｇｃ  ｔｔａ  ａｇａ  ａｇｇ  ｔｃａ  ａａａ  ｔｔｃ  ａａｃ  ａｇｃ  ｔｇＣ  ＴＧＣ  ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＣＧＣ  ＴＣＣ  ＡＣＧ−３’（配列番号１２）。小文字は、部分的なＦＭＤＶ２Ａ配列を示し、大文字はｈＲＬｕｃ配列を示し、終止コドンは欠失している。
【００９１】
得られたＰＣＲ産物は、５’末端にＡｓｃＩ部位、およびｈＲＬｕｃ遺伝子に融合した部分的なＦＭＤＶ２Ａｐｒｏを有していた。第二のＰＣＲにおいて、第一のＰＣＲからのＰＣＲ産物をテンプレートとして用い、オリゴヌクレオチドＡｓｃＩ−ｈＲＬｕｃ（＋）、およびＡｓｃＩ−Ｇ−ＦＭＤＶ２Ａ（−）をプライマーとして用いた。
【００９２】
ＡｓｃＩ−Ｇ−ＦＭＤＶ２Ａ（−）の配列を以下に示す：
５’−ｃｃａ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣｃ  ｇｇｇ  ｃｃｃ  ａｇｇ  ｇｔｔ  ｇｇａ  ｃｔｃ  ｇａｃ  ｇｔｃ  ｔｃｃ  ｃｇｃ  ａａｇ  ｃｔｔ  ａａｇ  ａａｇ  ｇｔｃ  ａａａ  ａｔｔ  ｃ（配列番号１３）。（ＯＲＦをＮＰＴIIのＯＲＦとフレームを揃えるために、ＡｓｃＩ部位（大文字）の前に余分なＣが挿入された）。
【００９３】
最終ＰＣＲ産物は、５’末端にＡｓｃＩ部位、３’末端にｈＲＬｕｃに融合したＦＭＤＶ２Ａ、続いてＡｓｃＩ部位を有していた（図２Ｂを参照）。
【００９４】
次に、ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＡｓｃＩで消化し、ＮＰＴII遺伝子に融合した部分的なコアと共にＨＣＶ ＩＲＥＳを含むｐｃＤＮＡ３.１−ＨＣＶＩＲＥＳ−Ｎｅｏ（図２Ｂを参照）に導入した。ｐｃＤＮＡ３.１−ＨＣＶＩＲＥＳ−ｈＲＬｕｃ２Ａ  Ｎｅｏ中でのｈＲＬｕｃ遺伝子の方向は、ＨＣＶゲノムのｎｔ３３２〜３６１に対応するポジティブセンスプライマーと、ｈＲＬｕｃ遺伝子にアニールするネガティブセンスプライマーからなるプライマー対を用いたＰＣＲによって確認した。正確なｈＲＬｕｃ遺伝子の方向を含むクローンからのみＰＣＲ産物を得た。ｐｃＤＮＡ３.１−ＨＣＶＩＲＥＳ−ｈＲＬｕｃ２Ａ  Ｎｅｏにおける正確なｈＲＬｕｃ遺伝子の方向を確認した後、このコンストラクトとＢＢ７−Ｍ４をＡｇｅＩおよびＰｍｅＩで消化した。ｐｃＤＮＡ３.１−ＨＣＶＩＲＥＳ−ｈＲＬｕｃ２Ａ  Ｎｅｏからの小さいＡｇｅＩ−ＰｍｅＩ断片をゲルで精製し、ゲルで精製したＢＢ７Ｍ４の大きいＡｇｅＩ−ＰｍｅＩ断片とライゲートした。これにより、ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃが構築された（図２Ｃを参照）。
【００９５】
Ｄ．細胞系の作製
Ｈｕｈ−７細胞（アパス，Ｌ.Ｌ.Ｃ．から得られた）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢ
Ｓ，ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ），ローガン，ユタ州）、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、および、１００ｍｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン（インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州（以前のライフ・テクノロジーズ））で増殖させた。
【００９６】
ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ ｃＤＮＡを制限ヌクレアーゼＳｃａＩで消化することにより直線状にした。ＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出し、１００％エタノールで沈殿させて精製した。直線化したｃＤＮＡを用いて、メガスクリプト（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ）キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ），オースティン，テキサス州）を用いたインビトロでの転写を行った。簡単に言えば、直線化ｃＤＮＡ１μｇを、提供されたＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ溶液（それぞれ２μｌ）、１０×反応緩衝液（２μｌ）、およびＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（２μｌ）（ヌクレアーゼ非含有水で最終体積２０μｌとした）と共にインキュベートした。製造元が推奨する方法に基づき、反応液を３７℃で１時間インキュベートし、ＤＮアーゼＩで処理した。ＲＮｅａｓｙTMミニキット（キアゲン，パロアルト，カリフォルニア州）を用いて、インビトロで合成されたＲＮＡ転写物を精製した。
【００９７】
一実施形態において、レプリコンＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃのインビトロで転写されたＲＮＡをエレクトロポレーションによりＨｕｈ−７細胞に導入し、３種の細胞系を得た。Ｈｕｈ−７細胞を別々のＴ２２５組織培養フラスコに４.１×１０6個植えた。この細胞を、３７℃、５％ＣＯ2で、約２４時間インキュベートした。それぞれのエレクトロポレーションに、およそ２個のフラスコを用いた。
【００９８】
まず各フラスコから培地を除去し、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄することにより細胞を回収した。次に、ＰＢＳを吸引により除去した。トリプシン−ＥＤＴＡ（３ｍｌ）を各フラスコに加え、確実に全ての細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで覆い、次に、吸引により除去した。次に、この細胞を、３７℃、５％ＣＯ2で、３分間インキュベートした。１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン（インビトロジェン，カールスバッド）を含むＤＭＥＭ完全培地（７ｍｌ）を各フラスコに加えた。細胞培地を上下にピペッティングして混合し、細胞を均一に懸濁した。次に、この細胞を、５０ｍｌファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）（ベクトン・ディッキンソン，パロアルト）遠心管に移した。上記工程を全フラスコで繰り返した。細胞懸濁液を５０ｍｌ遠心管に合わせ、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞をペレット化した。
【００９９】
この細胞を以下のようにＰＢＳで２回洗浄した。遠心管内の培地を捨て、各遠心管で、ＰＢＳ（１０ｍｌ）を用いて細胞を再懸濁した。全ての細胞を１つの５０ｍｌのファルコン遠心管に合わせ、ＰＢＳを加えて最終体積を５０ｍｌにした。サンプルを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心管内のＰＢＳを捨て、遠心管内でＰＢＳ（１０ｍｌ）を用いて細胞を再懸濁した。ＰＢＳを再び加え、最終体積を５０ｍｌにした。サンプルを混合し、アリコートを取り、細胞をカウントした。サンプルを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心管内のＰＢＳを捨て、細胞を、ＰＢＳ（１．０×１０7細胞／ｍｌ）で、温度（２５℃）で再懸濁した。
【０１００】
遠心分離の際、１５ｍｌのファルコン遠心管それぞれにＤＭＥＭ完全培地（１０ｍｌ）を調製した。氷上で、レプリコンＲＮＡ（１μｇ）を滅菌したマイクロ遠心管に加えた。次に、未処理のＨｕｈ−７トータルＲＮＡ（９μｇ）をマイクロ遠心管に加えて、最終ＲＮＡ量を１０μｇにした。２μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ，プロメガ，
マディソン）を各サンプルに加えた。
【０１０１】
バイオ・ラッド・ジーン・パルサーII（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒII）エレクトロポレーター（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ，ハーキュリーズ，カリフォルニア州）で、以下の一般的なパラメーター、２７０Ｖ、９５０μＦ、および、０.４ｃｍのバイオ・ラッドキュベットを用いて、レプリコンをＨｕｈ−７細胞にエレクトロポレーションした。
【０１０２】
Ｈｕｈ−７細胞懸濁液（上記参照）のアリコート（０.４ｍｌ）を、ＲＮＡサンプルを含む１本のマイクロ遠心管に加えた。上下に数回ピペッティングすることによってサンプルを混合した。次に、全部のＲＮＡ−細胞混合物を、０.４ｃｍ バイオ・ラッドキュベットに移した。エレクトロポレーターに電荷をかけ、パルスを放出した。パルスした後、完全培地（１０ｍｌ）を含む１５ｍｌのファルコン遠心管（上記参照）からのＤＭＥＭ完全培地を即座に加えた。この混合液を同じ１５ｍｌのファルコン遠心管に移した。サンプルを上下にピペッティングすることによって混合し、全混合液を１００×２０ｍｍの組織培養皿に移した。
【０１０３】
細胞を３７℃、５％ＣＯ2で、約２４時間インキュベートした。培地を５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭ完全培地で交換した。細胞がコロニー選択または染色できるようになるまで、インキュベーターで、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で、約３〜４週間インキュベートした。インキュベートの際、１週間に１回選択培地を交換した。
【０１０４】
Ｅ．ＨＣＶレポーター−レプリコン細胞系の作製およびその確認
ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃのインビトロで転写されたＲＮＡをＨｕｈ−７細胞にエレクトロポレーションした後、６０個のコロニーを選択し、レポーター遺伝子発現について試験した。３つのコロニーが、バックグラウンドを超える顕著なレポーター遺伝子発現を示し、この発現は細胞系に増殖させても安定していた（図４を参照）。９６ウェルプレートに、ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃレプリコンを含む各Ｈｕｈ−７細胞系の細胞２×１０4個を植え、３７℃、５％ＣＯ2で３日間インキュベートすることによってレポーター遺伝子（ｈＲＬｕｃ）発現を測定した。培地を吸引により除去し、各ウェルの細胞を１×パッシブリシス（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ）緩衝液（プロメガ，マディソン，ＷＩ）に溶解させた。２０μｌのウミシイタケルシフェラーゼ基質（プロメガ，マディソン，ＷＩ）を各ウェルに加え、マイクロベータ・ジェットプレート・リーダー（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ｊｅｔ  ｒｅａｄｅｒ）（パーキン・エルマー，ボストン，マサチューセッツ州）で読み取った。これら３種の細胞系のなかでも、＃１０（ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ＃１０）が最高の発現を示し、確認研究のために選択された。トータルＲＮＡを、ＱｉａＡｍｐ  ＲＮＡ抽出キット（キアゲン，パロアルト）で抽出した。製造元の説明書に従ってマルチスクライブ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ）（ＡＢＩ，パロアルト，カリフォルニア州）用い、さらに、ランダムヘキサマーを用いてＲＮＡ（２０μｌ）を逆転写させ、ｃＤＮＡを得た。
【０１０５】
ＰＣＲ工程のために、ｃＤＮＡ（１０μｌ）を、１０μＭの各プライマー（１.５μｌ）（ＨＣＶ  ５ＵＴＲ−１２７Ｆ：５’−ＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧ−３’；
ＨＣＶ  ５ＵＴＲ−２１９Ｒ：５’−ＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＴＴＧＡＴＣ−３’）、１０μＭのプローブ（０.５μｌ）（ＨＣＶ  ５ＵＴＲ−１６８Ｔ：ＦＡＭ−ＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣＣＧ−ＢＨＱ１）、蒸留水（１１.５μｌ）、および２×マスターミックス（２５μｌ）（ＡＢＩ，パロアルト，カリフォルニア州）とインキュベートした。ＡＢＩ７７００におけるインキュベーションのパラメーターは以下の通り：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、続いて、９５℃で１５秒、および６０℃で１分間を４５回繰り返す。標準サンプルで同時に得られた標準曲線に基づきＴａｑＭａｎでＲＮＡを定量した。この細胞系がゲノムへの核酸の組込みにより得られたものではないこ
とを除外するために、逆転写酵素存在下または非存在下でＴａｑＭａｎ ＰＣＲを行った。
【０１０６】
マルチスクライブ存在下または非存在下では、約１０,０００倍のシグナルの差がみられた（図４）。これは、レプリコンＲＮＡからのｃＤＮＡの増幅後に得られたシグナルは、抽出後に残ったＤＮＡからのシグナルよりずっと高いことを示す。これにより、シグナルは、ＨＣＶ ＲＮＡが細胞質中に蓄積（複製）されることによるものであって、ＨＣＶ核酸がＨｕｈ−７ゲノムに組込まれることによるものではないことが確認された。
【０１０７】
ＨＣＶ複製の信頼できるインジケーターとしてｈＲＬｕｃレポーターシグナルが使用できるかどうかを確認するために、ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ＃１０細胞系を、４種の異なる濃度のＩＦＮ（３０、１０、３および１ＩＵ／ｍｌ）とインキュベートする実験を行った。この実験により、ｈＲＬｕｃシグナルにおいて用量依存性の減少が起こり、外挿で推測されたＥＣ50は１.７７ＩＵ／ｍｌであった（図４）。この結果は、より高感度でないとしても、当業界で報告されたものに類似している。（ＢａｒｔｅｎｓｃｈａｌｇｅｒおよびＬｏｈｍａｎｎ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．５２：１〜１７（２００１年））。
【０１０８】
本発明の核酸分子を含む組換え宿主細胞は、多種多様な用途を有する。例えば、本細胞は、複製における非構造タンパク質とＲＮＡ要素の役割、翻訳におけるＲＮＡ要素の役割、ウイルスタンパク質およびＲＮＡ要素と、宿主因子との相互作用を研究するのに有用であり、一般的には、ウイルス遺伝子とＲＮＡ複製の調節を研究するのに有用である。ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃから誘導された細胞系ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ＃１０および他の細胞系は、創薬のためのスクリーニング分析で容易に用いることができる。発現目的で好ましい細胞は、哺乳動物細胞であり得る。その他の細胞型、例えば細菌、酵母、真菌、昆虫、線虫、および植物細胞も可能である。適切な哺乳動物組換え宿主細胞の例としては、Ｈｕｈ−７、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、またはその他の哺乳動物細胞系が挙げられる。
【０１０９】
Ｆ．Ｈｕｈ−７細胞系ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ＃１０と、その他の従来使用されてきたレポーター選択的レプリコン細胞系との比較
本発明で得られた細胞系（ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ＃１０）の実際のレポーター（ｈＲＬｕｃ）シグナルを、その他の従来使用されてきたレポーター選択的レプリコン細胞系（ＥＴ）からのシグナルと比較したところ、顕著で驚くべき差が観察された。ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ＃１０系は、７００,０００相対発光量（ＲＬＵ，ルシフェラーゼ活性の発現に関するユニット）のレポーター遺伝子活性を生成することができた。同じ条件下で、ＥＴ系は、１０,０００カウントのレポーター遺伝子活性を生産した（図５を参照）。これにより生じたシグナル・ノイズ比は、ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ＃１０系で３５００、ＥＴ系で５０であったことから、シグナル・ノイズ比の差は７０倍であった。
本発明を様々な好ましい実施形態と特定の実施例で説明したが、本発明は、上述の詳細な説明により制限されると理解されるべきではなく、添付の請求項によって定義されるか、それと同等のものとして理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ＨＣＶゲノム、および、ＨＣＶｈＲＬｕｃ選択的レプリコンコンストラクト（ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ）の模式図を示す。
【図２Ａ】ＨＣＶｈＲＬｕｃ選択的レプリコン（ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ）を構築するプロセスのフローチャートを示す。
【図２Ｂ】ＨＣＶｈＲＬｕｃ選択的レプリコン（ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ）を構築するプロセスのフローチャートを示す。
【図２Ｃ】ＨＣＶｈＲＬｕｃ選択的レプリコン（ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ）を構築するプロセスのフローチャートを示す。
【図３Ａ】ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。
【図３Ｂ】ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃのヌクレオチド配列の図３Ａの続きである。
【図３Ｃ】ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃのヌクレオチド配列の図３Ｂの続きである。
【図３Ｄ】ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃのヌクレオチド配列の図３Ｄの続きである。
【図３Ｅ】ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃのヌクレオチド配列の図３Ｅの続きである。
【図４】Ｈｕｈ−７細胞系ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ＃１０を確認するために得られたデータを示す。
【図５】Ｈｕｈ−７細胞系ＢＢ７Ｍ４ｈＲＬｕｃ＃１０と、その他の従来使用されてきたレポーター−レプリコン系との、ＨＣＶ ＲＮＡ複製を示す相対発光量（ＲＬＵ）でみた実際のルシフェラーゼ活性およびシグナル・ノイズ比の比較を示す。
【図６Ａ】ＢＢ７のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図６Ｂ】ＢＢ７のヌクレオチド配列の図６Ａの続きである。
【図６Ｃ】ＢＢ７のヌクレオチド配列の図６Ｂの続きである。
【図６Ｄ】ＢＢ７のヌクレオチド配列の図６Ｃの続きである。
【図６Ｅ】ＢＢ７のヌクレオチド配列の図６Ｄの続きである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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