(57)【要約】プロトン(Ｈ＋)−ゲートカチオンチャンネルサブファミリー、ヒト酸感受性イオンチャンネル2b(hASIC2b)に属する新規ポリペプチドをコードする新規ポリヌクレオチド配列を提供する。hASIC2bと他のhASICsは侵害受容性神経の生来のプロトン−ゲートカチオンチャンネルの少なくとも一部を構成するようなので、hASIC2bと他のhASICsを共発現させた細胞は侵害に関連した酸の知覚を調節する候補化合物をスクリーニング方法に役立つ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一つかそれ以上を含むポリヌクレオチド：
(a)  配列番号:2に規定されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(b)  配列番号:1の核酸配列を含むポリヌクレオチド；
(c)  (a)又は(b)のポリヌクレオチドに少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチド；
(d)  (a)から(c)の何れか一つのポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチド；
(e)  (a)から(d)の何れか一つのポリヌクレオチドに対する相補鎖；又は
(f)  (a)から(e)の何れか一つのポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項２】
ヒト酸感受性イオンチャンネル(ASIC)２bをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターで形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞
【請求項５】
請求項１又は請求項２に記載のポリヌクレオチドのRNA転写産物。
【請求項６】
請求項５に記載のRNA産物に関してアンチセンスであり、当該RNA産物にハイブリダイズすることができるRNA分子又はそのフラグメント。
【請求項７】
請求項１又は請求項２に記載のポリヌクレオチドに結合することができるリボザイム又はジンクフィンガータンパク質。
【請求項８】
ポリペプチド又はそのフラグメントを生産する方法であって、
請求項４に記載の形質転換／トランスフェクトされた宿主細胞を当該ポリヌクレオチド又はそのフラグメントの発現のために十分な条件下において培養すること
を含む方法。
【請求項９】
ポリペプチド又はそのフラグメントを発現することができる細胞の製造方法であって、
請求項３に記載のベクターで細胞を形質転換又はトランスフェクトすること
を含む製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法により製造される細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の細胞の膜調製物。
【請求項１２】
請求項８又は請求項９に記載の方法により製造されるポリペプチド又はそのフラグメント。
【請求項１３】
以下を含むポリペプチド：
(a)配列番号:1におけるポリヌクレオチド配列から翻訳される推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、そのバリアント、フラグメント、ホモログ、アナログ又は誘導体；又は
(b)配列番号:2のポリペプチド、そのバリアント、フラグメント、ホモログ、アナログ又は誘導体。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリペプチドであって、hASIC1a、hASIC1b、hASIC2a、hASIC3、hASIC4及びそれらの誘導体からなるグループから選択される追加のヒト酸感受性イオンチャンネル(hASIC)と融合したポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１３に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１６】
請求項１３に記載のポリペプチドを調節する化合物。
【請求項１７】
請求項１３に記載のポリペプチドを調節することができる物質をスクリーニングする方法であって、
(a)請求項１３に記載のポリペプチドの少なくとも一分子、及び所望によりhASIC1a、hASIC1b、hASIC2a、hASIC3、hASIC4及びそれらの誘導体からなるグループから選択されるヒト酸感受性イオンチャンネル(hASIC)の少なくとも一分子をその表面に発現している細胞と試験物質とを接触させること；
(b)当該ポリペプチド又は少なくとも一つの当該hASIC又は誘導体の輸送機能に対する当該物質の効果を測定すること；及び
(c)当該輸送機能に対して陽性又は陰性の効果を有する物質を同定すること
を含む方法。
【請求項１８】
請求項１３に記載のポリペプチドに結合し調節する化合物を同定する方法であって、
候補化合物と当該ポリペプチドを接触させること及び調節が生じるかを同定すること
を含む方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、
(a)請求項１３に記載のポリペプチドの少なくとも一分子、及び所望によりhASIC1a、hASIC1b、hASIC2a、hASIC3、hASIC4及びそれらの誘導体からなるグループから選択されるヒト酸感受性イオンチャンネル(hASIC)の少なくとも一分子をその表面に発現している細胞と試験物質とを接触させること（ここで、当該ポリペプチド又は当該hASIC又は誘導体の少なくとも一つへの化合物の接触に応答し、当該ポリペプチド又は当該hASIC又は誘導体の少なくとも一つが検出することができるシグナルを提供することができる2番目の成分と相関することであり、当該接触は化合物の当該ポリペプチド又は当該hASIC又は誘導体の少なくとも一つへの結合を許す十分な条件の元に接触することである）；及び
(b)当該2番目の成分によって生じるシグナルを検出することにより当該ポリペプチド又は当該hASIC又は誘導体の少なくとも一つに結合することができる化合物を同定することを含む方法。
【請求項２０】
請求項１３に記載のポリペプチドの調節が必要な患者の治療用医薬の製造のための請求項１６に記載の化合物の使用。
【請求項２１】
請求項１３に記載のポリペプチドを調節する必要がある患者の治療方法であって、請求項１６に記載の化合物の治療上有効量を投与することを含む方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、当該化合物がポリペプチドであり、当該化合物の治療上有効量が、当該化合物をコードしin vivoで当該化合物を発現するDNAを患者へ提供することにより投与される方法。
【請求項２３】
請求項１５に記載の抗体の請求項１３に記載のポリペプチドの調節が必要な患者の治療用医薬の製造のための使用。
【請求項２４】
請求項１３に記載のポリペプチドを調節する必要がある患者の治療方法であって、請求項１５に記載の抗体の治療上有効量を投与することを含む方法。
【請求項２５】
請求項１３に記載のポリペプチドを発現、過剰発現、又は抑制発現し、又は、請求項１３に記載のポリペプチドの標的挿入又は欠失を示す、ex vivo又はin vivoで遺伝子工学により作製された細胞。
【請求項２６】
請求項２５に記載の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロトン（H＋）−ゲート（proton(H＋)-gated）カチオンチャンネルサブファミリー、すなわちヒト酸感受性イオンチャンネル２b（human
Acid Sensing Ion Channel 2b（HASIC2b））をコードする新規ポリヌクレオチド配列に関する。本発明はまた、特に、該ポリヌクレオチドの製造方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
H＋−ゲートカチオンチャンネルはプロトンにより活性化されるリガンド−ゲートイオンチャンネルである。異なるｐH感受性及び反応速度を有するH＋−ゲートカチオンチャンネルが知覚神経(1-7)、中枢神経系の神経細胞(7-9)、及びオリゴデンドロサイト(oligodendrocytes)(10,38)で報告されている。組織における細胞外ｐHは炎症及び多くの無酸素状態による組織の酸性症の間にｐH単位で2以上減少させられる。疼痛の知覚はｐHの減少をともなうと信じられている(12,38)。このため、知覚神経末端におけるH＋−ゲートカチオンチャンネルが組織酸性症を伴う疼痛の知覚に関与すると提起されている(1,6,11,38)。
ASICs（酸感受性イオンチャンネル）はENaC/DEGスーパーファミリーに属するH＋−ゲートカチオンチャンネルサブファミリーのメンバーである(22,25)。このスーパーファミリーには内皮性Na＋チャンネル(ENaC)(13-17,38)、デジェネリンズ(degenerins)(DEG)と命名されたタンパク質のファミリー(18-22,38)及びFMRFアミド−ゲートNa＋チャンネル(FaNaC)(23,38)が含まれる。
【０００３】
４つのラットH＋−ゲートカチオンチャンネルサブユニット(ASICI-4)が最近クローニングされたので下記に簡単に説明する。
H＋−ゲートNa＋チャンネルサブファミリーの最初のメンバーである酸感受性イオンチャンネル１(ASIC1、多くの場合ASIC1aと言及される)(24)は脳及び後根神経節細胞(DRGs)に発現している。pH7以下のpHの変動により活性化する。脳全体におけるこのチャンネルの存在はH＋が神経伝達物質又は神経調節物質として本質的な役割をしているかもしれないことを示唆する(38)。ENaC/DEGスーパーファミリーの他のメンバーのように(22,25)、ASIC1には細胞外ループタンパク質部分を有する２つの膜ドメインがある(24)。FaNaCチャンネルのように、ASIC1は４量体として会合しているようだ(26)。ASIC1はNa＋やLi＋だけでなくCa2＋を透過し、1指数時間進行で急速に脱感作する(38)。ASIC1はアミロリド及びその誘導体、ベンドアミル及びエチルイソプロピルアミロリドで阻害される(38)。ASIC1をコードしている転写物は選択的にスプライシングされ、ASIC1の追加の誘導体(ASIC1bと言及される)を生成する(24,38)。ラット及びヒトのASIC1aタンパク質及びASIC1bタンパク質は両方ともクローニングされている。ヒトASIC1a(以前はBNaC2として言及されていた)のアミノ酸配列はヒトcDNAライブラリー上で同定された(32)。特許協力条約公開番号WO
00/08149はラットASIC1a及びヒトASIC1aタンパク質は機能的に同等とみなされることを公表している。これら二つのタンパク質のアミノ酸配列は高ホモロジーではあるが同一ではない。置換配列は本質的機能の特徴に影響を与えることなく、容易にASIC1aタンパク質の1次配列に導入することができる。
【０００４】
ASIC2a、哺乳類神経デジェネリン相同物は、実際にはASIC1aの前にクローニングされ、以前はMDEG1(27,38)(mammalian
degenerinの略)又はBNC1(28,38)(brain Na＋ channel 1の略)と命名されていた。ASIC2aはASIC1aと67%配列が同一であり、ASIC1aがクローニングされて直ぐに、MDEG1もH＋−ゲートカチオンチャンネルであることが示された(29,30,38)。すなわち、ASIC1a及びASIC2aによるカチオンの輸送はアミロリドに感受性があり、酸によって制御されている。しかしながら、これら２つのチャンネルの生物物理的特徴はASIC2aチャンネルがより酸性のpH値、すなわちpH5.5より低いpH値を活性化のために必要なこと、ASIC1aより遅い脱感作、Ca2＋よりもNa＋を選択する点において異なる。ASIC2aのmRNAは中枢神経系の神経細胞及び知覚神経で検出される。rASIC2aチャンネルが線虫(C.elegans)で神経変性を引き起こす同じ変異により活性化されることが示されている。これはASIC2aの機能の増大がヒトの神経変性の形成に関与しているかもしれないことを示唆する(27)。ラット及びヒト両方のASIC2aタンパク質はクローニングされている(28)。
【０００５】
ASIC2bは以前MDEG2と命名されていたが、ASIC2aのスプライシングバリアントである(29)。マウス及びラットの脳からASIC2bはクローニングされ、最初の膜領域を含む最初の236アミノ酸が異なる。この新規膜タンパク質は脳及び知覚神経において発現している。ASIC2bは線虫(C.elegans)デジェネリンズに導入すると神経変性をもたらす変異によっても、低pHによっても活性化しない。しかしながら、このタンパク質はASIC2a及びもう一つの最近クローニングされたH＋−ゲートチャンネルDRASIC(この後はASIC3と言及し、下記で説明する)と関連し、ヘテロポリマーを形成し、異なった反応速度、pH依存性及びイオン選択性を示す。特に興味深いことのひとつは、知覚神経特異的なサブユニットの組み合わせ、ASIC2b/ASIC3(MDEG2/DRASIC)である。これは、pHの低下に反応し、サブユニットの組み合わせにより、後根神経節細胞で記録される生来のH＋−ゲート電流のような、Na＋とK＋を不十分に区別する維持電流を有する二相性電流が生じるためである。この維持電流は酸により生じる疼痛の強壮な感覚のために必要と考えられる。特許協力条約公開番号WO98/35034はラットASIC2bタンパク質を公開している。しかしながら、ヒトASIC2bタンパク質は本発明がなされるまでクローニングされていなかった。
【０００６】
ASIC３は、以前DRASIC（DRG acid sensing ion channelの略）(ASIC3)と命名されていたが、特異的にDRGｓに存在し、脳に存在しない、そして維持された構成要素を伴う二相性反応速度(35)を示す。ASIC1a(24)及びASIC2a(30)は細胞外の酸の延長した適用の間の数秒内に脱感作する(38)。しかしながら、組織酸性症と関連する疼痛はpHが中性に戻るまで続く(12,38)。維持された構成要素を伴う二相性H＋−ゲートカチオンチャンネルが知覚神経において記載され(1)、組織酸性症に適合しない疼痛の原因となっていることが提案されている(1,11,38)。知覚神経におけるASIC3の特異的発現とASIC3チャンネルの反応速度はそれが知覚神経における維持されたH＋−ゲートカチオンチャンネル複合体の一部であることを示唆する。しかしながら、維持されたASIC3電流は知覚神経における生来のH＋−ゲート電流(<pH5.8)より酸性のpH(<pH4)を活性のために必要とする(1)。これは翻訳における修飾又は相関したサブユニットが生来のH＋−ゲートカチオンチャンネルを形成するのに必要であることを示唆する。特許協力条約公開番号WO00/08149はラット及びヒトASIC3タンパク質を公開している。
【０００７】
もう一つのASICチャンネルはASIC4である。ASIC4は他のASICsに約45%の同一性を示す新規タンパク質である。ASIC4はラットとヒトの間で97%の同一性があり脳下垂体で最も強い発現を示す(39)。アフリカツメガエル卵母細胞における細胞外pHの低下はASIC4を活性化することができない、このことは他のサブユニットとの相関又はプロトンとは異なるリガンドによる活性化を示唆する。
【０００８】
簡単には、ASIC2b(MDEG2)は知覚神経に存在する、そこでASIC2bはASIC3(DRASIC)の発現を調節する。２つのタンパク質の共発現は非選択的な維持構成成分を含むH＋−ゲート電流を生ずる。そのため、これら２つの構成単位、ASIC2b及びASIC3は侵害受容性神経の生来のプロトン−ゲートカチオンチャンネルの少なくとも一部を構成することを証明できるようだ(1,29,38)。
【０００９】
このため、ASICsの変化はヒトにとって治療的因果関係を持つので、新規ASIC及びそれのアゴニスト及びアンタゴニストの提供が継続して必要となる。特に、hASIC2b及び他のhASICsは侵害受容性神経の生来のプロトン−ゲートカチオンチャンネルの少なくとも一部構成するので、hASIC2b及び他のhASICsを共発現している形質転換細胞と候補物質を接触させることにより、ASICsを変化させることができる候補物質をスクリーニングする新規方法を提供することが必要である。
【００１０】
（発明の要約）
広範な面において、本発明はヒトASIC2bをコードする新規核酸に関する。これに関して、特異的な新規核酸配列が単離され、そして本発明がその配列だけでなく、新規バリアント、フラグメント、誘導体、及びそのホモログを含むことは理解される。
別の面において、本発明は新規アミノ酸配列に関する。これに関して、特異的な新規アミノ酸配列が単離され、そして本発明がその配列だけでなく、新規バリアント、フラグメント、誘導体、及びそのホモログを含むことは理解される。
【００１１】
このため、簡略には、本発明のいくつかの面は
１．新規核酸配列；
２．新規アミノ酸；
３．当該新規配列を用いたアッセイ；
４．当該アッセイの使用により同定された化合物／組成物；
５．当該新規配列と所望によりその他のASICsとを含む又は発現する発現システム；
６．当該新規配列に基づく治療方法；
７．当該新規配列に基づく医薬組成物
に関連する。
【００１２】
本発明の核酸配列及び／又は本発明のアミノ酸配列に関する他の面は；本発明の配列を含む又は発現することができる構築物；本発明の配列を含む又は発現することができるベクター；本発明の配列を含む又は発現することができるプラスミド；本発明の配列を含む又は発現することができる構築物／ベクター／プラスミドで形質転換又はウイルストランスデュース(virally-transduced)された細胞；本発明の配列を含む又は発現することができる組織；本発明の配列を含む又は発現することができる臓器；本発明の配列を含む又は発現することができる形質転換された宿主；及び本発明の配列を含む又は発現することができる形質転換された生物を含む。また本発明は上記と同じ物を移動する方法を含む上記と同じ物を発現する方法、例えば微生物における発現、を含有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
図１Ａ及び図１ＢはhASIC2a（上）及びhASIC2ｂ（下）の推定タンパク質配列のアライメントを示す；
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆ、図２Ｇ、及び図２ＨはhASIC2bの核酸配列を示す；
図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、及び図３ＤはhASIC2bのアミノ酸配列を示す；
図４はヒトASIC2b及びASIC2aの組織分布を示す；
図５はhASIC2b、hASIC2ａ及びhASIC2a／hASIC2b発現CHO−K1細胞からの全−細胞記録を示す；及び
図６ＡはhASIC2a／hASIC2b共発現CHO−K1細胞における酸感受性電流の電気生理的特徴を示す；図６ＢはhASIC2ａ及びhASIC2a／hASIC2bCHO−K1形質転換細胞におけるピーク電流密度の比較を示す。
【００１４】
（配列リストの同定）
配列番号:1はhASIC2bをコードする核酸配列を示す；
配列番号:2はhASIC2bをコードする対応アミノ酸配列を示す；
配列番号:3はGENE TRAPPER III実験で遺伝子に使用されるオリゴヌクレオチドプローブを示す；
配列番号:4はGENE TRAPPER III実験で遺伝子に使用されるオリゴヌクレオチドプローブを示す；
配列番号:5はGENE TRAPPER III実験で遺伝子に使用されるオリゴヌクレオチドプローブを示す；
配列番号:6はhASIC2bのセンスプライマーを示す；
配列番号:7はhASIC2bのアンチセンスプライマーを示す；
配列番号:8はhASIC2aのセンスプライマーを示す；
配列番号:9はhASIC2aのアンチセンスプライマーを示す；
配列番号:10はGAPDHのセンスプライマーを示す；及び
配列番号:11はGAPDHのアンチセンスプライマーを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の一つの面に基づき、以下の一つかそれ以上を含むポリヌクレオチドを提供する：
(a)  配列番号:2に規定されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(b)  配列番号:1の核酸配列を含むポリヌクレオチド；
(c)  (a)又は(b)のポリヌクレオチドに少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチド；
(d)  (a)から(c)の何れか一つのポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチド；
(e)  (a)から(d)の何れか一つのポリヌクレオチドに対する相補鎖；又は
(f)  (a)から(e)の何れか一つのポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメント。
ポリヌクレオチドは単離され及び／又は精製されているポリヌクレオチドであることが好ましい。ポリヌクレオチドは(a)又は(b)のポリヌクレオチドに少なくとも75％の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましい。ポリヌクレオチドは(a)又は(b)のポリヌクレオチドに少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドであることがより好ましい。ポリヌクレオチドは(a)又は(b)のポリヌクレオチドに少なくとも85％の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドであることが更に好ましい。ポリヌクレオチドは(a)又は(b)のポリヌクレオチドに少なくとも90％の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドであることが更により好ましい。ポリヌクレオチドは(a)又は(b)のポリヌクレオチドに少なくとも95％の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドであることがより好ましい。
上記のポリヌクレオチドは好ましくはヒト酸感受性イオンチャンネル(ASIC)２bをコードする。
本発明はまた更に上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明の更なる面に基づき、上記ベクターで形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を提供する。好ましくは、宿主細胞は哺乳類、昆虫、カビ、細菌又は酵母細胞である。
本発明の更なる面に基づき、上記ポリヌクレオチドのRNA転写産物を供給する。また、RNA分子又はそのフラグメント、それは該RNA産物に関連するアンチセンスであり該RNA産物にハイブリダイズすることができる。
更に、上記ポリヌクレオチドに結合することができるリボザイム又はジンクフィンガータンパク質を提供する。
本発明の更なる面に従い、ポリペプチド又はそのフラグメントを生産する方法であって、形質転換／トランスフェクトされた宿主細胞を当該ポリヌクレオチド又はそのフラグメントの発現のために十分な条件下において培養することを含む方法を提供する。好ましくは、該ポリペプチド又はフラグメントは該細胞の表面で発現している。好ましくは、該方法は培地からフラグメントのポリペプチドの回収も含んでいる。
本発明はまたポリペプチド又はそのフラグメントを発現することができる細胞の製造方法であって、上記ベクターで細胞を形質転換又はトランスフェクトすることを含む製造方法を提供する。
本発明の更なる態様により、上記方法で製造される細胞を提供する。また、該細胞の膜の調製物も提供する。
本発明の別の面に従い、上記方法により製造されるポリペプチド又はそのフラグメントを提供する。
【００１６】
本発明の別の面に従い、
(a)配列番号:1におけるポリヌクレオチド配列から翻訳される推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、そのバリアント、フラグメント、ホモログ、アナログ又は誘導体；又は
(b)配列番号:2のポリペプチド、そのバリアント、フラグメント、ホモログ、アナログ又は誘導体
を含むポリペプチドを提供する。
また、本発明は別のヒト酸感受性イオンチャンネル(hASICs)と融合した当該ポリペプチドを提供する。好ましくは、当該別のhASICsはhASIC1a、hASIC1b、hASIC2a、hASIC3、hASIC4及びそれらの誘導体からなるグループから選択される。
上記ポリペプチドに対する抗体も提供する。
本発明はまた更に、上記ポリペプチドを調節する化合物を提供する。好ましくは、該化合物はポリペプチドをアンタゴナイズ(antagonize)、又は選択的にアンタゴナイズ(antagonize)する。又は、該化合物はポリペプチドをアゴナイズ(agonize)する。
本発明の別の面は、上記のポリペプチドを調節することができる物質をスクリーニングする方法であって、
(a)当該ポリペプチドの少なくとも一分子と所望によりhASIC1a、hASIC1b、hASIC2a、hASIC3、hASIC4及びそれらの誘導体からなるグループから選択されるヒト酸感受性イオンチャンネル(hASIC)の少なくとも一分子とをその表面に発現している細胞と試験物質を接触させること；
(b)当該ポリペプチド及び／又は少なくとも一つの当該hASICs又は誘導体の輸送機能に対する当該物質の効果を測定すること；
(c)当該輸送機能に対して陽性又は陰性の効果を有する物質を同定することを含む方法を提供する。テストされる物質はあらかじめ設定された量であることが好ましい。
本発明の別の面に従い、上記ポリペプチドに結合し調節する化合物を同定する方法であって、候補化合物と当該ポリペプチドを接触させること及び調節が生じるかを同定すること含む方法を提供する。
好ましくは、当該方法は、
(a)当該ポリペプチドの少なくとも一分子、及び所望によりhASIC1a、hASIC1b、hASIC2a、hASIC3、hASIC4及びそれらの誘導体からなるグループから選択されるヒト酸感受性イオンチャンネル(hASIC)の少なくとも一分子をその表面に発現している細胞と試験物質とを接触させること（ここで、当該ポリペプチド又は当該hASIC又は誘導体の少なくとも一つへの化合物の接触に応答し、当該ポリペプチド又は当該hASIC又は誘導体の少なくとも一つが検出することができるシグナルを提供することができる2番目の成分と相関することであり、当該接触は化合物の当該ポリペプチド又は当該hASIC又は誘導体の少なくとも一つへの結合を許す十分な条件の元に接触することである）；及び当該ポリペプチドの少なくとも一分子と所望によりhASIC1a、hASIC1b、hASIC2a、hASIC3、hASIC4及びそれらの誘導体からなるグループから選択されるヒト酸感受性イオンチャンネル(hASIC)の少なくとも一分子とをその表面に発現している細胞と試験物質を接触させること；及び
(b)当該2番目の成分によって生じるシグナルを検出することにより当該ポリペプチド又は当該hASICs又は誘導体の少なくとも一つに結合することができる化合物を同定することを含む方法。
好ましくは、当該化合物は上記ポリペプチドに結合し、及び(i)上記ポリペプチドをアンタゴナイズ(antagonize)、又は選択的にアンタゴナイズ(antagonize)する、又は(ii)上記ポリペプチドをアゴナイズ(agonize)する。
【００１７】
hASICsはカチオントランスポーターに含まれるので、本発明のポリペプチドの調節因子（例えば、アゴニスト又はアンタゴニスト）はカチオン輸送工程の干渉に用途を見出すことができる。
このため、本発明の別の態様に従い、医薬用途のための上記抗体又は化合物を提供する。
本発明のポリペプチドを調節することができるこのような抗体、及び化合物等は、それゆえ、カチオン輸送の面に関る治療領域に用途を見出すことができる。治療に有用な領域はこれに限定されないが、痛覚及び味覚障害に関する酸の知覚障害、疼痛、酸味覚障害、ASICsの高発現で誘導される神経変性、脳神経障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側策硬化症、小脳性運動失調症、炎症、虚血、いくつかの腫瘍を含む。
従って、上記化合物の上記ポリペプチドの調節が必要な患者の治療用医薬の製造のための使用を提供する。好ましくは、治療はポリペプチドをアンタゴナイズ(antagonize)、又は選択的にアンタゴナイズ(antagonize)する必要がある患者に対してである。又は治療はポリペプチドをアゴナイズ(agonize)する必要がある患者に対してである。
【００１８】
本発明の更なる面に従うと、当該ポリペプチドを調節する必要がある患者の治療のための方法であって、当該化合物の治療上有効量を投与することを含む方法ポリペプチドを調節する必要がある患者の治療のために、治療上有効量の化合物を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、当該方法はポリペプチドをアンタゴナイズ(antagonize)、又は選択的にアンタゴナイズ(antagonize)する必要がある患者の治療に対してである。又は当該方法はポリペプチドをアゴナイズ(agonize)する必要がある患者に対してである。
好ましくは、当該化合物がポリペプチドであり、当該化合物の治療上有効量が、当該化合物をコードしin vivoで当該化合物を発現するDNAを患者へ提供することにより、投与される。
【００１９】
本発明はまた、上記抗体の上記ポリペプチドの調節が必要な患者の治療用医薬の製造のための使用を提供する。好ましくは、治療はポリペプチドをアンタゴナイズ(antagonize)、又は選択的にアンタゴナイズ(antagonize)する必要がある患者に対してである。又は治療はポリペプチドをアゴナイズ(agonize)する必要がある患者に対してである。
本発明の更なる面に従うと、上記ポリペプチドを調節する必要がある患者の治療のための方法であって、上記抗体の治療上有効量を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、当該方法はポリペプチドをアンタゴナイズ(antagonize)、又は選択的にアンタゴナイズ(antagonize)する必要がある患者の治療に対してである。又は当該方法はポリペプチドをアゴナイズ(agonize)する必要がある患者に対してである。
【００２０】
本発明の更なる面に従うと、本発明のポリペプチドを発現、過剰発現、抑制発現し、又は本発明のポリペプチドの標的挿入又は欠失を示す、ex vivo又はin vivoで遺伝子工学により作製された細胞を提供する。また本発明はこのような細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
【００２１】
上で議論した通り、ASIC2bは脳及びDRGsにおける酸感受性イオンチャンネルの調節サブユニットと考えられる(29)。RASIC2bはそれ自体では活性化しない、rASIC2a又はrASIC3と相関し性質を変化させる。例えば、それは非選択性を与え、H＋−誘導電流を遅らせる。RASIC2bはrASIC2aと相互作用すると考えられ、新しい性質を有するヘテロ多量体を形成する(29)。後根知覚神経細胞における生来のプロトン−ゲート電流のように、rASIC3電流は２つの成分、急速不活性電流それに続く維持電流よりなることも示されている(31)。また、rASIC2bとrASIC3の共発現がrASIC3に似た電流のような電流を生ずることが示されている(31)。RASIC2bは知覚神経に存在し、そこでRASIC2bはrASIC3の発現を調節する。２つのタンパク質の共発現は非選択的維持成分を含むH＋−ゲート電流を生ずる。これにより、おそらくこれら２つのユニットrASIC2bとrASIC3は侵害受容性神経の生来のプロトン−ゲートカチオンチャンネルの少なくとも一部である(1,29,38)。
【００２２】
ヒトASICsのアミノ酸配列ホモロジーは下記表１に示される。
2005536997.tif 000002
細胞外酸性の大きな変化は虚血及びてんかん発作中の脳において生じる。このため、このクラスのASIC−タイプチャンネルは確かにこれらの病態生理学的状態において活性化される。この活性化は悪影響を生じると思われている。この効果は細胞の脱分極及びよく知られた大量のNa＋注入に対する特異的貢献、それらは特に虚血、(Na＋,K＋)ATPaseが細胞外ＡＴＰ欠如によりNa＋の排出においてより不活性になるときに生じる。アミロライド（amiloride）より特異的なＨ+−ゲートカチオンチャンネルの阻害剤が疼痛の認識及び、生理学的及び病態生理学的脳機能におけるそれらのチャンネルの役割を研究する上で重要となる。このような有用な阻害剤はまだなく、本発明のhASIC2b
cDNAクローンを含むcDNAクローンはこれらの阻害剤の探索を非常に促進する。
【００２３】
hASIC2bのポリペプチドは炎症疾患、虚血及びある種の腫瘍において見出された酸性の疼痛知覚を引き起こす病状の治療又は予防のための医薬開発のために有用である。
【００２４】
本発明は本発明のhASIC2b及び所望により他のhASICs又はそれらの誘導体の少なくとも一つを発現する形質転換細胞を提供する。これらの細胞は、これらのポリペプチドによるカチオン輸送及びそれによる痛覚及び味覚変化に関する酸性の知覚を調節することができる候補物質をスクリーニングするのに有用である。このスクリーニングはあらかじめ定めた量の物質をhASICチャンネルを（共）−発現している細胞と接触させ、該カチオンチャンネルの電流における該物質の効果を決めることにより行われる。これらのスクリーニングは例えば鎮痛薬のような疼痛の治療又は予防に有用な新しい医薬の同定することができる。それらはまた酸味を調節する試薬の同定をすることもできる。
【００２５】
上記方法で単離及び検出された物質はまた本発明の一部である。このため本発明はまた、ヒト及び動物検体における痛覚並びに味覚変化に関する酸性知覚を調節することができる医薬の製法における本発明に従い、イオンチャンネル及び／又はハイブリッドチャンネルの電流を調節することができる化学又は生物物質を提供する。
【００２６】
本発明のhASIC2bをコードするポリヌクレオチド又はそれらの誘導体、又はポリヌクレオチドを含むベクター又はhASIC2bを発現している細胞はまた新しい医薬を開発するために使用される非ヒトトランスジェニック動物を準備するために有用である。これらの非ヒトトランスジェニック動物は当該チャンネルを過剰発現又は抑制発現することができるだけでなく、“ノック−アウト”動物はこれらのチャンネルの発現又はこれらのチャンネルのカチオン輸送活性を欠失している。これらの非ヒトトランスジェニック動物はその分野で知られている、本質的な方法によって用意でき、ASICチャンネルと相関した病態を研究する生きた動物モデルとして提供される。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドで形質転換された細胞は患者のある組織におけるhASIC2bチャンネルの欠損を代償する遺伝子治療のためにも使用できる。このため、本発明は、hASIC2b又はその誘導体を含む病態の治療のための本発明のポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドによって形質転換された細胞を提供する。
【００２８】
プロトンによって活性化される特徴、及び酸性知覚に関する結果として起こる上記適用に加えて、遺伝的変異を有するhASIC2bはいくつかの神経変性の過程に含まれるかもしれない。ある神経細胞の死は多くのタイプの神経変性疾患、たとえばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側策硬化症、及び小脳性運動失調症の特徴である。このような神経変性疾患に含まれる欠損遺伝子はわずか数個が同定されただけである。線虫、C.elegansの原始的神経ネットワークは神経の発達及び死のよいモデルである。C.elegansにおける遺伝的変性は遺伝子deg-1、mec-4及びmec-10の変異のためである。ASIC2aは同じ変異によって活性化される(27)。
このため、本発明は神経変性へつながるかもしれないこれらの病態変化の研究におけるhASIC2bの使用を提供する。上で検討したスクリーニング方法はこれらのチャンネルの過剰発現又は抑制発現により誘導される神経変性を止める又は阻害することができる物質を同定するのに有用である。ASICチャンネルはナトリウム、カルシウム、リチウム及びカルシウムを選択的に透過させることに関してイオンの特徴を有する。該ASICチャンネルが過刺激されたとき選択的透過性は興奮毒性を引き起こすかもしれない。
hASIC2bのポリペプチド、当該タンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストは脳神経変性疾患を含む病態防止の治療のための医薬の製造において有用である。
【００２９】
本発明の特徴及び優位性は本発明のhASIC2bチャンネルの証明及び特徴につながる研究活動に関連する下記の例に見られる、そこにおいて参照は付けられた配列及び図にもなされる。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）
ヒトASIC2b cDNAのクローニング
【００３１】
ヒト後根神経節（hDRG）から単離した全RNAサンプルをアナリティカルバイオロジカルサービスインク（Analytical Biological
Services Inc.）(Wilmington, DE)から購入した、そして全部で1.5X107クローンのサイズ分画した（平均長：2.0kb）オリゴ(dT)プライムhDRG
cDNAライブラリーをライフテクノロジーインク（Life Technology Inc.）のpCMVSPORT6で構築した。
GNEN TRAPPER III cDNA Positive Selection System(ライフテクノロジーインク（Life
Technology Inc.）)を新規ASICクローンのスクリーニングのために用いた。実験は製品指示書に従い行った。縮合オリゴヌクレオチドプローブを４つの刊行されたヒト酸感受性イオンチャンネル(ASIC)ポリペプチド配列（ジーンバンクアクセッションナンバー：AF095897,AF057711,AB010575,及びNM_001094）のアライメントによってデザインした。３つのオリゴヌクレオチドプローブ（A1:
5’-TTY CCR GCN GTN ACC CCT STG YA-3’ (SEQ 番号:3); A4: 5’-CTG GAC RTK CAN CAN GAN
GAR T-3’ (SEQ 番号:4);及びA9: 5’-GGN YTK TTY ATH GGK GCY AG-3’ (SEQ 番号:5)を選択し、GNEN
TRAPPER III実験及びコロニーハイブリダイゼーションで使用した。縮合プローブはTdT及びビオチン-14-dCTP（ライフテクノロジーインク）で30℃で1時間ビオチン化した、そしてオリゴヌクレオチドのビオチン化は15％TBE/尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ノベックス(Novex))で確認した。一本鎖cDNA(ssDNA)は二本鎖hDRG
cDNAライブラリーをGeneII及びExonuclease III（ライフテクノロジーインク）で30℃、30分間反応させることにより得た。ビオチン化オリゴヌクレオチド及びssDNAは37℃で1時間ハイブリダイズした。ストレプトアビジン
パラマグネチック ビーズをハイブリダイゼーション混合物にビオチン化プローブにハイブリダイズしたssDNAを捕まえるために30℃、30分間加えた。捕らえたssDNAはTP-3000サーマルサイクラー（タカラ）と修復酵素を用いて修復した（ライフテクノロジーインク）。修復反応はサーマルサイクラーで１サイクル（変性ステップ、90℃、1分、アニ−リングステップ、55℃、30秒、伸長ステップ、70℃、15分そしてソーキング（soaking）ステップ、4℃）で行った。大腸菌（E.coli）株DH5α（ライフテクノロジーインク）を修復cDNAで形質転換し、ハイブリダイゼーションの前にHybond-N(アマシャム(Amersham))フィルターにトランスファー(transfer)した。フィルター上のcDNAを室温で７分間変性溶液（0.5N
NaOH及び1.5M NaCL）で変性し、室温で3分間中和溶液（1.5N NaOH及び0.5M Tris-HCl, pH7.5に調整）2回中和した。フィルターを室温で2分間2xSSCで洗浄した。フィルター上の変性cDNAはCL-1000ウルトラバイオレットクロスリンカー(ultraviolet
cross linker)を用いて固定した。
変性オリゴヌクレオチドプローブはthe Gene Images 3’-oligolabelling kit（アマシャム）を用いてフルオレセイン-dUTPで3’末端をラベルした、そして42℃で1時間、ExpressHyb Hybridization Solution(クローンテック(CLONTECH))でハイブリダイゼーションを実施した。フィルターは室温で5分間、0.1%5xSSCで2回洗浄した、次に42℃で15分間、0.1%1xSSCで洗浄した。陽性クローンは製品説明書に従いthe
Gene Images CDP-Star detection kit(アマシャム)及びLAS-1000 imaging system(フジフィルム(Fuji
Film))を用いて選択した。陽性クローンをピックアップし、それらの核酸配列をCEQ2000DNA analyzer(ベックマン(Beckman))で決めた。その配列をブラストサーチ(Blast
search)で分析した。ASICファミリーに属するクローンの中で、特異的なN末端配列236アミノ酸(aa)を持つ人(h)ASIC2のスプライスバリアントを発見した、それは563aaのタンパク質をコードする1689塩基対のオープンリーディングフレイム(open
reading frame)を含んでいた。このクローンはヒトASIC2bと命名した。hASIC2bの核酸及びアミノ酸配列は配列番号:1に示される。
【００３２】
（実施例２）
ヒトASIC2b及びASIC2aの発現プロファイリング
【００３３】
材料及び方法
ヒトASIC2a及びASIC2b転写物の発現は逆転写PCR法によって調べた。様々なヒト組織から全RNAサンプル（クローンテック及びABS）を逆転写反応に用いた。全RNAの2μgアリコットをオリゴ(dT)12-18でプライムし(primed)、反応全量20μlでSuperScriptII(ライフテクノロジーインク)で逆転写した。PCRは反応量20μlで第一鎖(First
strand)cDNA0.5μlで行った。
用いたプライマーは（5’-3’, センス／アンチセンス）
hASIC2b: CTG CTC TCC TGC AAG TAC C (配列番号:6)/
AGC TCT TGG ATG AAA GGT GGC (配列番号:7);及び
hASIC2a: ACC ACC AAC GAC CTG TAC C (配列番号:8)/
AGA GGT TTG CCA TCC TCG C (配列番号:9)。
PCRは以下の条件で行った：PCR条件：hASIC2b (94℃1分；94℃20秒、56℃20秒、72℃20秒の35サイクル；72℃5分)、及びhASIC2a
(94℃1分；94℃20秒、60℃20秒、72℃20秒の30サイクル；72℃5分)。グリセールアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) mRNAのPCR増幅もコントロール実験として行った。GAPDH特異的プライマーの配列は以下のとおりである：
（5’-3’, センス／アンチセンス）GTC TTC ACC ACC ATG GAG
AAG GCT (配列番号:10)/GTG ATG GCA TGG ACT GTG GTC ATG A (配列番号:11)。
PCR生産物の半分を2% TAE-アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、UVライト下で撮影した。
【００３４】
結果
図４に見られる通り、hASIC2a及びhASIC2b転写物はほとんどの調べたヒト組織で検出された。hASIC2aの発現は調べた全ての組織で等しく分布している、しかしながら、hASIC2bの発現は脊髄、脳及びDRGのような神経組織、及び副腎と小腸で高発現している。これらの結果は神経機能におけるhASIC2bの重要な役割を示唆する。
【００３５】
（実施例３）
hASIC2bの機能分析
【００３６】
材料及び方法
hASIC2a及びhASIC2bの哺乳類用発現ベクターを通常の分子生物学的方法により、pcDNA3.1（クロンテック）のような適当な発現ベクターを用いて構築した。チャイニーズハムスター卵母細胞(CHO)-K1細胞を20000細胞の密度で35mm径のディッシュに撒いた、その後製品説明書に従い、FuGENE6
transfection reagent(ロッシュ(Roche))で下記の様々な組み合わせのASIC発現ベクターでトランスフェクションした：ホモメリック(homomeric)なhASIC2b発現のためにhASIC2b発現ベクターのみ(1μg)、hASIC2a発現のためにhASIC2a及び緑色蛍光タンパク質（Green
Fluorescent Protein(GFP)）発現ベクター(1:2モル比、全量1μg)、ヘテロメリック(heteromeric)な発現のためにhASIC2b/hASIC2a(1:2モル比、全量1μg)。細胞はトランスフェクションの2日後、電気生理学的方法のために使用した。トランスフェクションが成功した細胞はGFPの放出するシグナルにより認識された。イオン電流は全細胞パッチクランプ(patch
clamp)法を用いて測定した。記録はAxopatch 200B amplifier(アキソンインスツルメント(Axon Instruments))で行った。電流は5kHzでフィルターをかけ、Digital
1321A インターフェイスを用いてデジタル化した。データはOrigin6.0(version 6.0, マイクロカル(Microcal))を用いて挿入された。ピペットはホウケイ酸ガラス製で細胞内溶液で満たしたときピペットの抵抗が1-4MΩとなった。全ての測定は室温（23±2℃）で行った。
細胞内溶液は140mM CsCl, 1mM MgCl2,
5mM EDTA及び10mM HEPES,pH7.2を含む。細胞外溶液は140mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl2,
2mM CsCl2及び10mM グルコース及び10mM HEPES, pH7.0-7.4を含む。pH6.0以下の細胞外溶液は10mM
MESで調整した、しかし他の構成物は同じだった。細胞外pHの急激な変化はRapid Solution Changes(バイオ−ロッジク社(Bio-Logic
Co.))を用いた。
【００３７】
結果
図５に見られる通り、hASIC2a及びhASIC2bはCHO-K1細胞で発現し、低pH溶液の5秒の適用で引き起こされる細胞内の電流が記録された。ASIC2a発現細胞で、酸誘導細胞内電流は調べたpH値(2.0-4.0)で得られた、しかしながら、ASIC2b発現細胞ではいかなるpH値においても電流は得られなかった。このため、ASIC2bそれ自体はイオンチャンネルとして不活性であった。次に、hASIC2bはhASIC2aのチャンネル特性における効果をみるためにhASIC2aと共発現した。hASIC2a／hASIC2b共発現細胞はhASIC2a発現細胞に比較すると非常に小さい酸感受性電流を示した。これらの結果はhASIC2bが酸感受性イオン電流において阻害的効果を働かせていることを示唆する。
hASIC2aとhASIC2a／hASIC2bの酸感受性電流のpH依存性を細胞外pHをさげることによって調べた。hASIC2aとhASIC2a／hASIC2bの活性のためのpH50値はそれぞれ3.73±0.09(n=4)及び3.43±0.17(n=4)だった(図６Ａ)。hASIC2bとhASIC2aを共発現することによって酸刺激に対する感受性に特異的変化がなかった。次に、図６Ｂに示すように、電流密度のピークをhASIC2aとhASIC2a／hASIC2b形質転換体でpH2.0,3.0及び4.0で比較した。（hASIC2a;
752.6±140.6 pA/pF pH2において、619.6±116.8 pA/pF pH3において、284.4±77.7 pA/pF pH4において、hASIC2a／hASIC2b;
112.8±16.3 pA/pF pH2において、88.9±12.0 pA/pF pH3において、21.0±4.83 pA/pF pH4）
【００３８】
ここで行った一連の研究はhASIC2aにより生じる酸感受性電流におけるhASIC2bの阻害的役割を示す。それらはヒトの生理学的システムの健康及び病気の状態における酸感受性電流の制御におけるhASIC2bの重要な役割を示唆する。
本明細書で引用された特許及び特許出願を含むすべての文献は、参照よりここに組み込まれる。
上記で述べられたことは実施例としてのみ提供されること及び詳細の変更は本発明の範囲を外れることなくなされうることは理解される。
【００３９】
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2005536997.tif 000003
2005536997.tif 000004
2005536997.tif 000005
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2005536997.tif 000012
2005536997.tif 000013
【図１Ａ】
2005536997.tif 000014
【図１Ｂ】
2005536997.tif 000015
【図２Ａ】
2005536997.tif 000016
【図２Ｂ】
2005536997.tif 000017
【図２Ｃ】
2005536997.tif 000018
【図２Ｄ】
2005536997.tif 000019
【図２Ｅ】
2005536997.tif 000020
【図２Ｆ】
2005536997.tif 000021
【図２Ｇ】
2005536997.tif 000022
【図２Ｈ】
2005536997.tif 000023
【図３Ａ】
2005536997.tif 000024
【図３Ｂ】
2005536997.tif 000025
【図３Ｃ】
2005536997.tif 000026
【図３Ｄ】
2005536997.tif 000027
【図４】
2005536997.tif 000028
【図５】
2005536997.tif 000029
【図６Ａ】
2005536997.tif 000030
【図６Ｂ】
2005536997.tif 000031
【国際調査報告】
2005536997.tif 000032
2005536997.tif 000033
2005536997.tif 000034
2005536997.tif 000035
2005536997.tif 000036