(57)【要約】本発明は、サッカロマイセス・セレビシエ由来の特定のプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いる、目的遺伝子の発現方法、及び、目的遺伝子産物の製造方法を提供するものである。サッカロマイセス・セレビシエ由来の特定のプロモーター（ＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター）を、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いることを特徴とする目的遺伝子の発現方法。
【請求項２】
以下の（Ａ）記載の組換えポリヌクレオチド、又は、以下の（Ｂ）記載のベクターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られる形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の目的遺伝子の発現方法：
（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターと、その制御下に作動可能に配置された目的遺伝子とを含む組換えポリヌクレオチド：
（Ｂ）上記（Ａ）に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３】
プロモーターとしてサッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーターを用い、かつ、形質転換体の培養をガラクトース存在下で行うことを特徴とする請求項２に記載の目的遺伝子の発現方法。
【請求項４】
サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いることを特徴とする目的遺伝子産物の製造方法。
【請求項５】
以下の（Ａ）記載の組換えポリヌクレオチド、又は、以下の（Ｂ）記載のベクターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られる形質転換体を培養する工程（Ｐ）と、培養して得られた形質転換体から目的遺伝子産物を回収する工程（Ｑ）とを含むことを特徴とする請求項４に記載の目的遺伝子産物の製造方法：
（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターと、その制御下に作動可能に配置された目的遺伝子とを含む組換えポリヌクレオチド：
（Ｂ）上記（Ａ）に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
プロモーターとしてサッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーターを用い、かつ、形質転換体の培養をガラクトース存在下で行うことを特徴とする請求項５に記載の目的遺伝子産物の製造方法。
【請求項７】
サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いることを特徴とする目的遺伝子の発現効率を上昇させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的遺伝子の発現方法、及び、目的遺伝子産物の製造方法に関する。より詳細には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の特定のプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）において用いる、目的遺伝子の発現方法、及び、目的遺伝子産物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子組換え技術の進展とともに、様々な有用なタンパク質の生産を、大腸菌等の微生物を用いて行うことが可能となった。しかし、真核生物由来の異種タンパク質遺伝子を、大腸菌を宿主として発現させると、正常なプロセシングや糖鎖の付加などの翻訳後の正常な修飾が行われないという問題があることが知られている。そのため、真核生物である酵母が、宿主として比較的利用されている。宿主酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ハンゼヌラ・アノマーラ、クリベロマイセス・ラクティスなどが知られている（例えば特許文献１参照）。【０００３】
異種タンパク質遺伝子を宿主にて発現させる際には、宿主内で機能するプロモーターの制御下にその異種タンパク質遺伝子を作動可能に配置した組換えポリヌクレオチドを宿主内に導入し、その形質転換体内においてその異種タンパク質を発現させる。プロモーターの転写活性は、異種タンパク質の発現効率を大きく左右する。そのため、転写活性の高いプロモーターが一般的に用いられている。例えば、宿主がサッカロマイセス・セレビシエである場合は、サッカロマイセス・セレビシエ由来の高転写活性プロモーターであるＰＧＫ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＰＹＫ１プロモーター、ＥＮＯ１プロモーター、ＰＭＡ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーターなどが用いられることがあった。【０００４】
ところで、クルイベロマイセス・マルシアヌスは、耐熱性酵母である（例えば、非特許文献１及び２）。通常の酵母でエタノール発酵をする場合、発酵熱によって発酵液の温度が上昇していくため、エタノール発酵を持続させるには発酵液を冷却しなければならなかった。そのため、エタノール発酵を工業的に行うには、大規模な冷却設備と、その冷却に要する多大なエネルギーコストが不可欠となる。しかし、クルイベロマイセス・マルシアヌスは４８℃もの高温でも増殖が可能であるため（非特許文献３及び４）、そのような冷却設備やエネルギーコストを必要とせずに、効率的なエタノール発酵が可能となる。【０００５】
一般的に、プロモーターは、そのプロモーターが由来する生物種の細胞内において最も高いプロモーター活性を示し、他の生物種においては、プロモーター活性そのものを示さないか、あるいは、低下したプロモーター活性を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２９２３９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bioresource Technology (2007) 98, 3367-3374
【非特許文献２】Appl. Microbiol. Biotechnol. (2008) 79, 339-354
【非特許文献３】Applied and Environmental Microbiology (2008) 74, 7514-7521
【非特許文献４】Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 85, 861-867
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、サッカロマイセス・セレビシエ由来の特定のプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いる、目的遺伝子の発現方法、及び、目的遺伝子産物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、サッカロマイセス・セレビシエ由来の特定のプロモーター（ＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター）を、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いると、意外なことに、元来の宿主であるサッカロマイセス・セレビシエにおいて用いた場合よりも目的遺伝子が高発現することを見い出した。【００１０】
さらに、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーターは、サッカロマイセス・セレビシエにおいてはガラクトース誘導的な発現を全く示さないことが知られているが、本発明者らは、このプロモーターをクルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いると、非常に意外なことに、ガラクトース誘導的な発現を示すことを見い出した。【００１１】
本発明者らは、以上の知見に基づいて、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、（１）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いることを特徴とする目的遺伝子の発現方法や、（２）以下の（Ａ）記載の組換えポリヌクレオチド、又は、以下の（Ｂ）記載のベクターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られる形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする上記（１）に記載の目的遺伝子の発現方法：（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターと、その制御下に作動可能に配置された目的遺伝子とを含む組換えポリヌクレオチド：（Ｂ）上記（Ａ）に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター：や、（３）プロモーターとしてサッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーターを用い、かつ、形質転換体の培養をガラクトース存在下で行うことを特徴とする上記（２）に記載の目的遺伝子の発現方法に関する。【００１３】
また、本発明は、（４）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いることを特徴とする目的遺伝子産物の製造方法や、（５）以下の（Ａ）記載の組換えポリヌクレオチド、又は、以下の（Ｂ）記載のベクターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られる形質転換体を培養する工程（Ｐ）と、培養して得られた形質転換体から目的遺伝子産物を回収する工程（Ｑ）とを含むことを特徴とする上記（４）に記載の目的遺伝子産物の製造方法：（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターと、その制御下に作動可能に配置された目的遺伝子とを含む組換えポリヌクレオチド：（Ｂ）上記（Ａ）に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクターや、（６）プロモーターとしてサッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーターを用い、かつ、形質転換体の培養をガラクトース存在下で行うことを特徴とする上記（５）に記載の目的遺伝子産物の製造方法や、（７）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いることを特徴とする目的遺伝子の発現効率を上昇させる方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の目的遺伝子の発現方法によると、目的遺伝子を高発現させることができる。また、本発明の目的遺伝子産物の製造方法によると、目的遺伝子産物を高効率で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＳｃＴＤＨ３プロモーターの発現解析試験１（グルコース培地）の結果（相対発現量（ＲＬＵ／μｌ））を示す図である。
【図２】ＳｃＴＤＨ３プロモーターの発現解析試験１（グルコース培地）の結果（相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ））を示す図である。
【図３】ＳｃＴＤＨ３プロモーターの発現解析試験２（ガラクトース培地）の結果（相対発現量（ＲＬＵ／μｌ））を示す図である。
【図４】ＳｃＴＤＨ３プロモーターの発現解析試験２（ガラクトース培地）の結果（相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ））を示す図である。
【図５】ＳｃＴＤＨ３プロモーターの発現解析試験３（様々な糖培地）の結果（相対発現量（ＲＬＵ／μｌ））を示す図である。
【図６】ＳｃＴＤＨ３プロモーターの発現解析試験３（様々な糖培地）の結果（相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ））を示す図である。
【図７】サッカロマイセス・セレビシエ由来の様々なプロモーター（ＳｃＴＤＨ３プロモーター、ＳｃＩＬＶ５プロモーター、ＳｃＣＷＰ２プロモーター）の発現解析試験の結果（相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ））を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．本発明の目的遺伝子の発現方法
本発明の目的遺伝子の発現方法は、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーター（以下、まとめて「本発明におけるプロモーター」とも表示する。）を、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いることを特徴とする。本発明におけるプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いると、目的遺伝子を高発現させることができる。
【００１７】
本発明の目的遺伝子の発現方法のより好適な態様としては、以下の（Ａ）記載の組換えポリヌクレオチド、又は、以下の（Ｂ）記載のベクターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られる形質転換体を培養する工程を含む。
（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターと、その制御下に作動可能に配置された目的遺伝子とを含む組換えポリヌクレオチド：
（Ｂ）上記（Ａ）に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター：
【００１８】
上記（Ａ）における、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーターとしては、配列番号１に示されるポリヌクレオチドを好適に例示することができ、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＩＬＶ５プロモーターとしては、配列番号２に示されるポリヌクレオチドを好適に例示することができ、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＣＷＰ２プロモーターとしては、配列番号３に示されるポリヌクレオチドを好適に例示することができる。
【００１９】
上記（Ａ）におけるプロモーターの変異体とは、配列番号１〜３のいずれかに示されるポリヌクレオチドの変異体であって、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいてプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを意味する。かかるプロモーターの変異体としては、
（ａ）配列番号１〜３のいずれかに示されるポリヌクレオチドに対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有し、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド：
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかに示されるポリヌクレオチドにおいて、１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなり、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド：
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかに示されるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド：
【００２０】
上記（ｂ）における「１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドを意味する。
【００２１】
上記（ｃ）における「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、８０％以上、好ましくは８５％以上の同一性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。上記（ｃ）における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」としては、プローブとして使用するポリヌクレオチドと一定以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げることができ、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを好適に例示することができる。
【００２２】
上記の配列番号１〜３のいずれかに示されるポリヌクレオチドは、例えば、鋳型としてサッカロマイセス・セレビシエのゲノムＤＮＡを用い、該ヌクレオチド配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるＰＣＲ反応によって、または該ヌクレオチド配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特開２００８−２３７０２４号公報）に開示された方法により取得できる。
【００２３】
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて常法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ ＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ ２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して常法に従って行なうことができる。
【００２４】
また、前述のポリヌクレオチドの変異体は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１〜３のいずれかに示されるポリヌクレオチドに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらポリヌクレオチドに変異を導入することにより、ポリヌクレオチドの変異体を取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２５】
本発明におけるプロモーターは、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいてプロモーター活性を有する。あるポリヌクレオチドがクルイベロマイセス・マルシアヌスにおいてプロモーター活性を有するかどうかは、例えばそのポリヌクレオチドの下流にレポーター遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドを作製する工程、その組換えポリヌクレオチドをクルイベロマイセス・マルシアヌスに形質転換して形質転換酵母を得る工程、その形質転換酵母におけるそのレポーター遺伝子の発現の程度を測定する工程を含む周知のレポーターアッセイ等により容易に確認することができる。
【００２６】
本発明の目的遺伝子の発現方法における「高発現」や、後述の本発明の目的遺伝子産物の製造方法における「高効率」には、本発明におけるプロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＤ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％グルコース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）が、１００００以上、好ましくは１２０００以上、より好ましくは１４０００以上、さらに好ましくは１６０００以上、より好ましくは１８０００以上であることを好適に含む。また、上記の「高発現」や、「高効率」は、上記培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／μｌ）が、３０万以上、好ましくは４５万以上、より好ましくは６０万以上、さらに好ましくは７５万以上であることも、好適に含む。
【００２７】
本発明の目的遺伝子の発現方法おける「高発現」や、後述の本発明の目的遺伝子産物の製造方法における「高効率」の他の例としては、本発明におけるプロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＤ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％グルコース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）が、上記組換えポリヌクレオチドをサッカロマイセス・セレビシエに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＤ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％グルコース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）に対して、割合として、３倍以上、好ましくは４倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは７倍以上、より好ましくは１５倍以上、さらに好ましくは２５倍以上、さらに好ましくは５０倍以上であることを好適に含む。
【００２８】
本発明の目的遺伝子の発現方法おける「高発現」や、後述の本発明の目的遺伝子産物の製造方法における「高効率」のさらなる他の例としては、本発明におけるプロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＧａｌ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％ガラクトース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）が、上記組換えポリヌクレオチドをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＤ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％グルコース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）に対して、割合として、３倍以上、好ましくは４倍以上であることを好適に含む。
【００２９】
本発明におけるポリヌクレオチドとしては、相補的な二本鎖ポリヌクレオチドを好適に例示することができ、中でも相補的な二本鎖ＤＮＡを特に好適に例示することができる。
【００３０】
上記（Ａ）の組換えポリヌクレオチドの「本発明におけるプロモーターの制御下に作動可能に配置された目的遺伝子」とは、本発明のプロモーターに転写因子が結合することにより、その目的遺伝子の発現が誘導されるように、本発明のプロモーターと、その目的遺伝子とが連結されていることを意味する。上記「目的遺伝子」としては、任意の遺伝子であればよいが、なんらかの有用なタンパク質をコードする有用タンパク質遺伝子を好適に例示することができる。有用タンパク質遺伝子としては、セルラーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子等の糖化酵素遺伝子や、ウイルスワクチンタンパク質の遺伝子を好適に例示することができる。
【００３１】
上記（Ｂ）記載の本発明におけるベクターは、上記の本発明における組換えポリヌクレオチドを含む。本発明におけるベクターを用いると、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて、本発明における組換えポリヌクレオチドを保持したり、目的遺伝子を発現させるためにクルイベロマイセス・マルシアヌスを形質転換したりすることができる。本発明におけるベクターは、直鎖状であってもよいし、環状であってもよい。クルイベロマイセス・マルシアヌスは、直鎖状のベクターであっても染色体上において高頻度で組換えを生じさせることができ、その結果、形質転換することができる。また、環状のベクターの場合、さらに自己複製配列を含んでいれば、該ベクターはクルイベロマイセス・マルシアヌス細胞内にて自律複製し、酵母細胞内で保持され、その結果、形質転換することができる。
【００３２】
上記ベクターは、クルイベロマイセス・マルシアヌス細胞内で目的遺伝子を発現させることが可能であるものである限り特に制限されず、環状のプラスミドベクターとしては、例えばｐＫＤ１等を好適に例示することができる。
【００３３】
本発明における形質転換体は、本発明における組換えポリヌクレオチド、又は、本発明におけるベクターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスに導入することにより得られる。本発明における形質転換体は、その細胞内で目的遺伝子を高発現することができる。
【００３４】
本発明における組換えポリヌクレオチド、又は、本発明におけるベクターの酵母への導入方法としては、特に制限されず、ウイルスベクターを利用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法等の生物学的方法；エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、超音波遺伝子導入法等の物理的方法；リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の化学的方法；などの公知の方法を例示することができ、中でも簡便であって汎用性が高い点でリポフェクション法を好適に例示することができる。また、本発明における組換えポリヌクレオチド、又は、本発明におけるベクターがその酵母へ導入されたかどうかは、目的遺伝子として、又は、目的遺伝子に加えて、マーカー遺伝子を本発明における組換えポリヌクレオチドや本発明におけるベクターにマーカー遺伝子を挿入しておき、形質転換体におけるそのマーカー遺伝子の発現を確認するなどして容易に確認することができる。
【００３５】
本発明の目的遺伝子の発現方法のより好適な態様としては、前述したように、本発明における形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする。「本発明における形質転換体を培養する方法」としては、その形質転換体が増殖し得る限り特に制限されないが、例えばその形質転換体が増殖可能な温度条件下（例えば２５〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃、より好ましくは２８〜３３℃）、ＹＰＤ培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％グルコース）にて、適当な時間（例えば１〜１０日間、好ましくは１〜５日間、より好ましくは１〜３日間）、振盪培養する方法を好適に例示することができる。なお、本発明におけるプロモーターのうち、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーターを用いた場合は、目的遺伝子をより顕著に高発現させ得ることから、糖源として、グルコースに代えて、ガラクトースを用いることが好ましい。すなわち、本発明におけるプロモーターのうち、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーターを用いた場合は、得られた形質転換体の培養を、ガラクトース存在下で行うことが好ましい。
【００３６】
２．本発明の目的遺伝子産物の製造方法
本発明の目的遺伝子産物の製造方法は、本発明におけるプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いることを特徴とする。本発明におけるプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いると、目的遺伝子産物を高効率で製造することができる。
【００３７】
本発明の目的遺伝子産物の製造方法のより好適な態様としては、以下の（Ａ）記載の組換えポリヌクレオチド、又は、以下の（Ｂ）記載のベクターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られる形質転換体を培養する工程（Ｐ）と、培養して得られた形質転換体から目的遺伝子産物を回収する工程（Ｑ）とを含む。
（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターと、その制御下に作動可能に配置された目的遺伝子とを含む組換えポリヌクレオチド：
（Ｂ）上記（Ａ）に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター：
【００３８】
本発明の目的遺伝子産物の製造方法のより好適な態様における工程（Ｐ）は、前述の本発明の目的遺伝子の発現方法のより好適な態様における工程と同じである。また、上記工程（Ｑ）における「培養して得られた形質転換体から目的遺伝子産物を回収する」方法としては、目的遺伝子産物を回収し得る限り特に制限されず、クロマトグラフィーを利用した方法、タグを利用した方法などの公知の方法を例示することができる。
【００３９】
３．本発明の目的遺伝子の発現効率を上昇させる方法
本発明の目的遺伝子の発現効率を上昇させる方法は、本発明におけるプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いることを特徴とする。本発明におけるプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いると、目的遺伝子の発現効率を向上させることができる。本発明の目的遺伝子の発現効率を上昇させる方法における好適な態様としては、前述の本発明の目的遺伝子の発現方法における好適な態様と同様の態様を例示することができる。
【実施例１】
【００４０】
［サッカロマイセス・セレビシエからのプロモーターの単離］
公知の配列情報に基づき、サッカロマイセス・セレビシエからのＴＤＨ３プロモーター（ＳｃＴＤＨ３プロモーター）、ＩＬＶ５プロモーター（ＳｃＩＬＶ５プロモーター）、ＣＷＰ２プロモーター（ＳｃＣＷＰ２プロモーター）をそれぞれ単離した。ＳｃＴＤＨ３プロモーターの配列は配列番号１に示され、ＳｃＩＬＶ５プロモーターの配列は配列番号２に示され、ＳｃＣＷＰ２プロモーターの配列は配列番号３に示される。
【実施例２】
【００４１】
［ＳｃＴＤＨ３プロモーターの発現解析試験１（グルコース培地）］
サッカロマイセス・セレビシエ由来のＳｃＴＤＨ３プロモーターが、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて目的遺伝子を発現させることができるかどうかを調べるために、以下のような発現解析試験を行った。【００４２】
まずは以下の２つの形質転換体を、公知の形質転換法により、作製した。
（１）ＳｃＴＤＨ３プロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結したＳｃＴＤＨ３ｐ−ＣＬｕｃをサッカロマイセス・セレビシエに導入して得られた比較例形質転換体１（Ｓｃ  ＴＦ  ＳｃＴＤＨ３ｐ−ＣＬｕｃ）。
（２）上記のＳｃＴＤＨ３ｐ−ＣＬｕｃをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた実施例形質転換体１（Ｋｍ  ＴＦ  ＳｃＴＤＨ３ｐ−ＣＬｕｃ）。【００４３】
これらの両形質転換体を、それぞれＹＰＤ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％グルコース）にて２８℃で振盪培養した。その培養液を経時的にサンプリングして、培養液１μｌ中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／μｌ）、及び、培養液のＯＤ６００を測定した。培養開始直後、培養開始から２４時間経過後、４８時間経過後、７２時間経過後、９６時間経過後、１２０時間経過後、及び、１４４時間経過後における測定結果（相対発現量（ＲＬＵ／μｌ））を図１に示す。なお、図１のグラフは、各種の形質転換体につき、３クローンずつの平均値で示した。また、上記相対発現量（ＲＬＵ／μｌ）の値を、培地のＯＤ６００の測定値で割って算出した値（相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ））で表した結果を図２に示す。図１及び図２の結果から分かるように、実施例形質転換体１は、比較例形質転換体１に比べて、早期かつ顕著な高発現性を示した。特に、実施例形質転換体１は、比較例形質転換体１と比較して、培養開始直後から高発現性を示し、培養開始から４８時間経過後には、実施例形質転換体１は、比較例形質転換体１に比べて、割合として、１３９倍以上もの相対発現量（ＲＬＵ／μｌ）（６６倍以上もの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ））を示した。実施例形質転換体１のこの「早期かつ顕著な高発現性」は、目的遺伝子産物等の単位時間当たりの製造効率を飛躍的に高めることとなるので、顕著な効果といえる。【００４４】
以上のように、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター（ＳｃＴＤＨ３プロモーター）は、サッカロマイセス・セレビシエにおいて用いた場合に比べて、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いた場合に、早期かつ顕著な高発現性を示した。一般的に、プロモーターは、そのプロモーターが由来する生物種の細胞内において最も高いプロモーター活性を示し、他の生物種においては、プロモーター活性そのものを示さないか、あるいは、低下したプロモーター活性を示すことを考慮すると、本発現解析試験の結果は意外であった。なお、本明細書中の「活性量」は「相対発現量」と同義である。
【実施例３】
【００４５】
［ＳｃＴＤＨ３プロモーターの発現解析試験２（ガラクトース培地）］
実施例形質転換体１の早期かつ顕著な高発現性が、他の種類の糖を用いた場合にも得られるかどうか確認するために、上記実施例２における発現解析試験において、ＹＰＤ液体培地に代えて、ＹＰＧａｌ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％ガラクトース）を用いたこと以外は同じ方法で、発現解析を行った。その結果を図３に示す。また、その発現解析で得られた相対発現量（ＲＬＵ／μｌ）の値を、培地のＯＤ６００の測定値で割って算出した値（相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ））で表した結果を図４に示す。図３及び図４の結果から分かるように、グルコース培地に代えてガラクトース培地を用いると、実施例形質転換体１は、より顕著な高発現性を示した。例えば、実施例形質転換体１は、ガラクトース培地条件下では、グルコース培地条件下に比べて、培養開始から４８時間経過後には４．９倍以上もの相対発現量（ＲＬＵ／μｌ）（５．１倍以上もの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ））を示し、１２０時間経過後には４．９倍以上もの相対発現量（ＲＬＵ／μｌ）（４．８倍以上もの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ））を示した。ＳｃＴＤＨ３プロモーターは、サッカロマイセス・セレビシエにおいてガラクトース誘導性を全く示さないことからすると、本発現解析試験の結果はきわめて意外であった。
なお、ガラクトース培地条件下における実施例形質転換体１は、比較例形質転換体１に比べて、培養開始から４８時間経過後には８３３倍以上もの相対発現量（ＲＬＵ／μｌ）（６０７倍以上もの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ））を示し、１２０時間経過後には８６倍以上もの相対発現量（ＲＬＵ／μｌ）（７２倍以上もの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ））を示した。
【実施例４】
【００４６】
［ＳｃＴＤＨ３プロモーターの発現解析試験３（様々な糖培地）］
上記の実施例形質転換体１が、様々な糖培地を用いた場合にどのような発現性を示すかどうかを調べるために、実施例形質転換体１を用いた発現解析試験を行った。その発現解析試験の方法としては、上記実施例２における発現解析試験において、ＹＰＤ液体培地中のグルコースに代えて、ガラクトース、フルクトース、又は、マンノースを同質量用いたこと以外は同じ方法を用いた。なお、ＹＰＤ液体培地中のグルコースに代えてガラクトースを同質量用いた培地はＹＰＧａｌ液体培地となる。今回の発現解析において、培養開始から４８時間経過後に測定した相対発現量（ＲＬＵ／μｌ）の結果を図５に示す。また、その発現解析で得られた相対発現量（ＲＬＵ／μｌ）の値を、培地のＯＤ６００の測定値で割って算出した値（相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ））で表した結果を図６に示す。【００４７】
図５及び図６の結果から分かるように、フルクトースやマンノースを用いた場合は、グルコースを用いた場合と同程度の相対発現量を示した。ガラクトースを用いた場合にのみ、他の糖を用いた場合と比較して、約５倍以上もの相対発現量（ＲＬＵ／μｌ）（約４．５倍以上もの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ））を示した。この結果から、ＳｃＴＤＨ３プロモーターをクルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いたときのガラクトース誘導性は、ガラクトースに特異的な誘導性であることが示された。
【実施例５】
【００４８】
［サッカロマイセス・セレビシエ由来の様々なプロモーターの発現解析試験］
ＳｃＴＤＨ３プロモーター以外の、サッカロマイセス・セレビシエ由来のプロモーターでも同様の効果が得られるかどうかを調べるために、以下のような発現解析試験を行った。【００４９】
以下の４つの形質転換体を、公知の形質転換法により、作製した。
（３）ＳｃＩＬＶ５プロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結したＳｃＩＬＶ５ｐ−ＣＬｕｃをサッカロマイセス・セレビシエに導入して得られた比較例形質転換体２（Ｓｃ  ＴＦ  ＳｃＩＬＶ５ｐ−ＣＬｕｃ）。
（４）上記のＳｃＩＬＶ５ｐ−ＣＬｕｃをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた実施例形質転換体２（Ｋｍ  ＴＦ  ＳｃＩＬＶ５ｐ−ＣＬｕｃ）。
（５）ＳｃＣＷＰ２プロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結したＳｃＣＷＰ２ｐ−ＣＬｕｃをサッカロマイセス・セレビシエに導入して得られた比較例形質転換体３（Ｓｃ  ＴＦ  ＳｃＣＷＰ２ｐ−ＣＬｕｃ）。
（６）上記のＳｃＣＷＰ２ｐ−ＣＬｕｃをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた実施例形質転換体３（Ｋｍ  ＴＦ  ＳｃＣＷＰ２ｐ−ＣＬｕｃ）。【００５０】
ＳｃＴＤＨ３プロモーターを用いた比較例形質転換体１及び実施例形質転換体１に加えて、上記の比較例形質転換体２〜３及び実施例形質転換体２〜３を用いて、上記実施例２における発現解析試験と同様の発現解析試験を行った。培養開始から４８時間経過後に測定した相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）の結果を図７に示す。なお、図７には、左から順に、比較例形質転換体１、実施例形質転換体１、比較例形質転換体２、実施例形質転換体２、比較例形質転換体３、実施例形質転換体３の結果を示す。【００５１】
図７の結果から分かるように、実施例形質転換体１は、比較例形質転換体１に比べて１８倍以上の相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）を示し、実施例形質転換体２は、比較例形質転換体２に比べて７倍以上の相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）を示し、実施例形質転換体３は、比較例形質転換体３に比べて４倍以上の相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）を示した。また、実施例形質転換体２の相対発現量（４０８８２ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）、及び、実施例形質転換体３の相対発現量（２９３２４ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）は、いずれも、実施例形質転換体１の示した相対発現量（２８２５１ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）より高かった。【００５２】
以上のように、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＩＬＶ５プロモーター（ＳｃＩＬＶ５プロモーター）、ＣＷＰ２プロモーター（ＳｃＣＷＰ２プロモーター）も、サッカロマイセス・セレビシエにおいて用いた場合に比べて、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いた場合に、顕著な高発現性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、目的遺伝子の高発現や、目的遺伝子産物の高効率での製造の分野において特に有用に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年8月17日(2011.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的遺伝子の発現効率を上昇させる方法であって、
サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用い、かつ、
前記プロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＤ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％グルコース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）が、１００００以上であることを特徴とする方法。
【請求項２】
目的遺伝子の発現効率を上昇させる方法であって、
サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用い、かつ、
前記プロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＤ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％グルコース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）が、
前記プロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをサッカロマイセス・セレビシエに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＤ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％グルコース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）に対して、割合として、３倍以上であることを特徴とする方法。
【請求項３】
以下の（Ａ）記載の組換えポリヌクレオチド、又は、以下の（Ｂ）記載のベクターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られる形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の目的遺伝子の発現効率を上昇させる方法：
（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターと、その制御下に作動可能に配置された目的遺伝子とを含む組換えポリヌクレオチド：
（Ｂ）上記（Ａ）に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
目的遺伝子の発現効率を上昇させる方法であって、
（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３プロモーター、ＩＬＶ５プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、及び、それらの変異体からなる群から選択されるプロモーターと、その制御下に作動可能に配置された目的遺伝子とを含む組換えポリヌクレオチド：又は
（Ｂ）上記（Ａ）に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター：
を、クルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られる形質転換体をガラクトース存在下で培養する工程を含み、かつ、
前記プロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＧａｌ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％ガラクトース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）が、前記プロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＤ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％グルコース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）に対して、割合として、３倍以上であることを特徴とする方法。
【国際調査報告】
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