(57)【要約】新規なカノーラタンパク質に加え、新規なカノーラタンパク質単離物を提供する。新規カノーラタンパク質単離物は、カノーラタンパク質ミセル集積物を製造する際の上澄液から得られ、２Ｓタンパク質を多く含む。ＰＭＭから得られるカノーラタンパク質単離物は７Ｓタンパク質を多く含む。カノーラタンパク質単離物から作った組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥重量基準およびＮ×６．２５のケルダール窒素換算で少なくとも約９０ｗｔ％のタンパク質含有量を有し、
約６０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
約５〜約４０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、かつ
０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質
であるタンパク質プロフィールを示すカノーラタンパク質単離物。
【請求項２】
約７０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
約５〜約３０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、かつ
０〜２ｗｔ％１２Ｓタンパク質
であるタンパク質プロフィールを示す、請求項１に記載の単離物。
【請求項３】
少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含有量を有する、請求項２に記載の単離物。
【請求項４】
（１）乾燥重量基準およびＮ×６．２５のケルダール窒素換算で少なくとも約９０ｗｔ％のタンパク質含有量を有し、
約６０〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
約１〜約１５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、かつ
０〜約２５ｗｔ％の２Ｓタンパク質
であるタンパク質プロフィールを示す第一カノーラタンパク質単離物、および
（２）乾燥重量基準およびＮ×６．２５のケルダール窒素換算で少なくとも約９０ｗｔ％のタンパク質含有量を有し、
約６０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
約５〜約４０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、かつ
０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質
であるタンパク質プロフィールを示す第二カノーラタンパク質単離物
を含むカノーラタンパク質単離物の組成物。
【請求項５】
前記第一カノーラタンパク質単離物および前記第二カノーラタンパク質単離物が前記組成物中に約５：９５〜９５：５の重量比で存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記第一カノーラタンパク質単離物が、
約８８〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
約１〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、かつ
０〜約６ｗｔ％の２Ｓタンパク質
であるタンパク質プロフィールを示す、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記第一カノーラタンパク質単離物が少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含有量を有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記第二カノーラタンパク質単離物が、
約７０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
約５〜約３０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、かつ
０〜約２ｗｔ％の１２Ｓタンパク質
であるタンパク質プロフィールを示す、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記第二カノーラタンパク質単離物が少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含有量を有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
カノーラから単離し、かつ精製した７Ｓタンパク質。
【請求項１１】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳで測定して約１４５ｋＤａの分子量を有する、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
各々が約４１３個のアミノ酸の大きさに作られた３個のサブユニットを含む、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
実質的に表７または表８に示したようなアミノ酸分析値を有する、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
カノーラタンパク質ミセル集積物から単離し、かつ精製した、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質ミセル集積物が、弱い酸性条件下でカノーラ油糧種子粗粉から抽出されたカノーラタンパク質の濃縮塩溶液を希釈することによって形成される、請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１６】
カノーラタンパク質の単離されかつ精製された７Ｓタンパク質と、２Ｓおよび１２Ｓカノーラタンパク質からなる群から抽出された少なくとも１種の単離されかつ精製された追加のカノーラタンパク質との混合物を含む組成物。
【請求項１７】
２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質からなる群から選択された少なくとも２つの異なるカノーラタンパク質の混合物を含むカノーラタンパク質単離物から個々のカノーラタンパク質を単離しかつ精製する方法であって、
乾燥重量基準およびＮ×６．２５のケルダール窒素換算で少なくとも約９０ｗｔ％のタンパク質含有量を有する前記カノーラタンパク質単離物を準備すること、
カノーラタンパク質単離物を可溶性にすること、
得られるタンパク質溶液を分取高圧液体クロマトグラフィー、または分子のサイズを基にしてタンパク質を分離する同等の方法にかけること、
選択した個々のカノーラタンパク質を含む溶離液の分画を集めること、
溶出液の容積を減容するために、選択した分画を限外濾過にかけること、
可溶化物質を除去するために、濃縮した溶離液を透析すること、および
個々のカノーラタンパク質を取り出すために、透析物を乾燥すること、を含む方法。
【請求項１８】
前記カノーラタンパク質単離物が、
約６０〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
約１〜約１５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、かつ
０〜約２５ｗｔ％の２Ｓタンパク質
であるタンパク質プロフィールを示すものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記カノーラタンパク質が、
約８８〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
約１〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、かつ
０〜約６ｗｔ％の２Ｓタンパク質
であるタンパク質プロフィールを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記カノーラタンパク質単離物を処理して、７Ｓおよび／または１２Ｓタンパク質を単離しかつ精製する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記カノーラタンパク質単離物が、
約６０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
約５〜約３０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、かつ
０〜約２ｗｔ％の１２Ｓタンパク質
であるタンパク質プロフィールを示すものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記カノーラタンパク質単離物が、
約７０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
約５〜約３０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、かつ
０〜約２ｗｔ％の１２Ｓタンパク質
であるタンパク質プロフィールを示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記カノーラタンパク質単離物を処理して２Ｓタンパク質を単離しかつ精製する、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の開示)
本出願は、米国特許法第119条(e)項に拠り、同時係属米国特許出願、2002年４月15日出願の第60/372,165号、および2002年12月４日出願の第60/430,687号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
(技術分野)
本発明は、カローラタンパク質単離物からなる組成物、および該組成物中の個々のタンパク質成分に関する。
【０００３】
(発明の背景)
カノーラタンパク質単離物はカノーラ油糧種子粗粉から形成できる。その譲受人に全て譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、同時係属米国特許出願、2001年５月４日出願の第60/288,415号、2001年10月５日出願の第60/326,987号、2001年11月７日出願の第60/331,066号、2001年11月26日出願の第60/333,494号、2002年４月24日出願の第60/374,801号、および2002年５月３日出願の第10/137,391号には、カノーラ油糧種子粗粉からカノーラタンパク質単離物を作る方法が記載されており、その単離物のタンパク質含有量(Ｎ×6.25)は少なくとも100 wt％である。その方法には、塩溶液を用いてカノーラ油糧種子粗粉を抽出すること、得られたタンパク質水溶液を油糧種子粗粉残渣から分離すること、選択膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、その水溶液のタンパク質濃度を少なくとも約200ｇ／Ｌにまで増加させること、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水へ希釈してミセルの形成を生じさせること、そのタンパク質ミセルを沈降させて非晶性の粘着性ゼラチン状グルテン様タンパク質ミセル集積物(ＰＭＭ)を形成させること、および上澄液からケルダール窒素(Ｎ)×6.25で測定してタンパク質含有量が少なくとも約100 wt％であるタンパク質ミセル集積物を回収すること、を含む多段階の工程が含まれている。
【０００４】
上記方法、特に出願第60/326,987号、第60/331,066号、第60/333,494号、第60/374,801号、および第10/137,391号に記載の方法の一実施形態では、ＰＭＭ沈降段階からの上澄液を処理して、湿潤ＰＭＭおよび上澄液由来の乾燥タンパク質を含むタンパク質単離物を取り出している。この方法は、初めに限外濾過膜を使用して上澄液を濃縮し、その濃縮上澄液を湿潤ＰＭＭと混合し、その混合物を乾固することによって実施できる。得られるカノーラタンパク質単離物は、タンパク質(Ｎ×6.25)が少なくとも約90 wt％、好ましくは少なくとも約100 wt％である高い純度を有する。
【０００５】
上記方法、特に出願第60/333,494号、第60/374,801号、および第10/137,391号に記載の方法の他の実施形態では、ＰＭＭ沈降段階からの上澄液を処理してその上澄液からタンパク質を取り出す。この方法は、初めに限外濾過膜を使用して上澄液を濃縮し、その濃縮物を乾固することによって実施できる。得られるカノーラタンパク質単離物は、タンパク質(Ｎ×6.25)が少なくとも約90 wt％、好ましくは少なくとも約100 wt％である高い純度を有する。
【０００６】
前記米国特許出願に記載された方法は基本的にバッチ法である。その譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、同時係属米国特許出願、2001年11月20日出願の第60/331,646号、2002年５月30日出願の第60/383,809号、2002年11月19日出願の第10/298,678号には、カノーラタンパク質単離物の連続製造法が記載されている。それによれば、カノーラ油糧種子粗粉を塩溶液と連続的に混合し、その混合物をパイプを通して輸送する間にカノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出してタンパク質水溶液を形成し、そのタンパク質水溶液をカノーラ油糧種子粗粉残渣から連続的に分離し、そのタンパク質水溶液を選択膜操作を介して連続的に輸送して、イオン強度を実質的に一定に維持しながらタンパク質水溶液のタンパク質含有量を少なくとも約200ｇ／Ｌまで増加させ、得られる濃縮タンパク質溶液を連続的に冷水と混合してタンパク質ミセルを形成させ、上澄液を連続的にオーバーフローさせながらタンパク質ミセルを所望量のＰＭＭが沈降槽に蓄積するまで連続的に沈降させる。ＰＭＭを沈降槽から取り出し乾燥すればよい。ＰＭＭのタンパク質含有量は、ケルダール窒素(Ｎ)×6.25で測定して少なくとも約90 wt％、好ましくは少なくとも約100 wt％(Ｎ×6.25)である。
【０００７】
前記米国特許出願第60/326,987号、第60/331,066号、第60/333,494号、第60/333,494号、第60/374,801号、および第10/137,391号に記載されているように、オーバーフローさせた上澄液を処理して上澄液からカノーラタンパク質単離物を回収できる。
【０００８】
カノーラ種子には約10〜約30 wt％のタンパク質が含まれていることが知られており、その幾つかのタンパク質成分が同定されている。これらのタンパク質は異なる沈降係数(Ｓ)によって区別される。これら既知でかつ同定されたタンパク質としては、クルシフェリン(cruciferin)として知られる１２Ｓグロブリン、およびナピン(napin)として知られる２Ｓ貯蔵タンパク質が挙げられる。
【０００９】
カノーラは、菜種または油糧種子アブラナとしても知られている。
【００１０】
(発明の要旨)
１２Ｓおよび２Ｓタンパク質に加え、本発明者らは、カノーラタンパク質単離物を単離するための上記方法により、新規なタンパク質と思われるかなりの量の７Ｓタンパク質を取り出せることを見出した。従って、本発明の一態様では、カノーラから単離、精製した７Ｓタンパク質が提供される。
【００１１】
また、本発明者らは、上記方法を用いて調製すると、タンパク質ミセル集積物から得られる(ミセル集積物由来)カノーラタンパク質単離物と上澄液から得られる(上澄液由来)カノーラタンパク質単離物では、１２Ｓ、７Ｓおよび２Ｓタンパク質の相対比率が異なることを見出すに至った。詳細には、タンパク質含有量が少なくとも約90 wt％(Ｎ×6.25)、好ましくは少なくとも約100 wt％である、ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物のタンパク質成分含有量は、７Ｓタンパク質が約60〜約98 wt％、１２Ｓタンパク質が約１〜約15 wt％、および２Ｓタンパク質が０〜約25 wt％であることが見出された。これと対照的に、タンパク質含有量が少なくとも約90 wt％(Ｎ×6.25)、好ましくは少なくとも約100 wt％である、上澄液由来カノーラタンパク質単離物のタンパク質成分含有量は、１２Ｓタンパク質が０〜約５ wt％、７Ｓタンパク質が約５〜約40 wt％、および２Ｓタンパク質が約60〜約95 wt％である。
【００１２】
ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物は、好ましくは、７Ｓタンパク質が約88〜約98 wt％、１２Ｓタンパク質が約１〜約10 wt％、および２Ｓタンパク質が０〜約６ wt％のタンパク質成分含有量を有し、一方、上澄液由来カノーラタンパク質単離物は、好ましくは、２Ｓタンパク質が約70〜約95 wt％、７Ｓタンパク質が約５〜約30 wt％、および１２Ｓタンパク質が０〜約２ wt％のタンパク質成分含有量を有する。
【００１３】
従って、タンパク質成分のプロフィールは、２つのカノーラタンパク質単離物で大きく異なっている。ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物の場合、主なタンパク質種は７Ｓタンパク質であり、一方上澄液由来カノーラタンパク質の場合には、主な種は２Ｓタンパク質である。これらの相違によりカノーラタンパク質単離物が使用される状況での挙動が異なることになる。
【００１４】
異なるタンパク質含有量のプロフィールにより、カノーラタンパク質単離物組成物を提供することが可能になり、特定の応用分野に求められる任意の比率で、２つの異なるカノーラタンパク質の混合物を配合し、ＰＭＭ由来単離物のプロフィールと上澄液由来単離物のプロフィールの間の所望する任意の２Ｓ／７Ｓ／１２Ｓタンパク質プロフィールを提供できる。
【００１５】
上澄液由来単離物は新規なカノーラタンパク質単離物である。従って、本発明の他の態様では、乾燥重量基準およびＮ×6.25のケルダール窒素換算で少なくとも約90 wt％、好ましくは少なくとも約100 wt％のタンパク質含有量を有し、２Ｓタンパク質が約60〜約95 wt％、７Ｓタンパク質が約５〜約40 wt％、および１２Ｓタンパク質が０〜約５ wt％であるタンパク質プロフィールを示すカノーラタンパク質単離物が提供される。上澄液由来カノーラタンパク質単離物は、好ましくは２Ｓタンパク質が約70〜約95 wt％、７Ｓタンパク質が約５〜約30 wt％、１２Ｓタンパク質が０〜約２ wt％である。
【００１６】
希望する比率の２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓカノーラタンパク質を含む組成物を提供するための、任意所望比率のＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物製品と任意所望比率の上澄液由来カノーラタンパク質単離物製品との配合物は、新規カノーラタンパク質単離物組成物である。従って、他の態様で、本発明は、(１)乾燥重量基準およびＮ×6.25のケルダール窒素換算で少なくとも約90 wt％、好ましくは少なくとも約100 wt％のタンパク質含有量を有し、７Ｓタンパク質が約60〜約98 wt％、１２Ｓタンパク質が約１〜約15 wt％、および２Ｓタンパク質が０〜約25 wt％であるタンパク質プロフィールを示す第一カノーラタンパク質単離物、ならびに(２)乾燥重量基準およびＮ×6.25のケルダール窒素換算で少なくとも約90 wt％、好ましくは少なくとも約100 wt％のタンパク質含有量を有し、２Ｓタンパク質が約60〜約95 wt％、７Ｓタンパク質が約５〜約40 wt％、および12Ｓタンパク質が０〜約５ wt％であるタンパク質プロフィールを示す第二カノーラタンパク質単離物を含む、カノーラタンパク質分離物から作られる組成物を提供する。
【００１７】
第一カノーラタンパク質単離物は、７Ｓタンパク質が約88〜約98 wt％、１２Ｓタンパク質が約１〜約10 wt％、および２Ｓタンパク質が０〜約６ wt％であるタンパク質プロフィールを示すことが好ましい。第二カノーラタンパク質単離物は、本明細書に記載の新規カノーラタンパク質単離物の好ましいタンパク質プロフィールを示すことが好ましい。
【００１８】
具体的なＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物および／または具体的な上澄液由来カノーラタンパク質単離物の１２Ｓ／７Ｓ／２Ｓタンパク質比率は、カノーラ油糧種子粗粉からそれぞれのカノーラタンパク質単離物を得るのに使用される処理条件を変えることによって変更できる。
【００１９】
カノーラタンパク質単離物の個々の成分を単離、精製し、特性を分析した。個々のタンパク質は、上記方法により製造されるそれぞれＰＭＭおよび上澄液由来カノーラタンパク質単離物から、大きさの相違に基づいてタンパク質混合物を分離できる通常の方法、好ましくは、高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)によって、続いて溶出液の容積を減容させるための限外濾過、および可溶化のために使用した塩の残留量を減少させるための透析によってタンパク質混合物を分離できる。透析した物質を乾固し、純粋のタンパク質を取り出すことができる。
【００２０】
本明細書に記載のＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物および上澄液由来カノーラタンパク質単離物を含め、２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質からなる群から選択される少なくとも２種の異なるカノーラタンパク質の混合物を含むカノーラタンパク質単離物から個々のカノーラタンパク質を単離、精製する方法は、本発明の更なる態様を構成する。
【００２１】
２Ｓタンパク質は、通常、上澄液由来カノーラタンパク質単離物から単離、精製され、一方、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、通常、タンパク質ミセル集積体から単離、精製される。２Ｓタンパク質はＭＡＬＤＩ−ＭＳで測定すると約14 kDaの分子量を有し、７Ｓタンパク質はＭＡＬＤＩ−ＭＳで測定すると約145 kDaの分子量を有し、１２Ｓタンパク質はＭＡＬＤＩ−ＭＳで測定すると約290 kDaの分子量を有する。
【００２２】
７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、極めて類似したアミノ酸プロフィールを有し、それぞれ約413個のアミノ酸を含むいくつかの同一サブユニットから構成されている。７Ｓタンパク質は約1240個のアミノ酸を含み、一方、１２Ｓタンパク質は約2480個のアミノ酸を含む。２Ｓタンパク質は７Ｓおよび１２Ｓタンパク質とは全く異なるアミノ酸プロフィールを有し、約120個のアミノ酸を含んでいる。後記実施例の中で得られたアミノ酸プロフィールを示す。
【００２３】
単離、精製した個々の２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓカノーラタンパク質を準備すると、精製タンパク質を利用することで特有の機能をもつ可能性のある組成物を提供するために、１２Ｓおよび／または２Ｓタンパク質の異なる比率をもつ７Ｓタンパク質の組成物を作ることが可能になる。このような組成物も本発明の一態様を構成する。
【００２４】
本明細書の方法により製造したカノーラタンパク質単離物は、加工食品のタンパク質強化、油の乳化、焼き物の本体形成材、気体を内包させる製品における発泡剤など、従来からのタンパク質単離物の応用分野で使用できる。それに加え、カノーラタンパク質単離物は、タンパク質繊維に形成してもよく、肉類似物として有用であり、卵白代替物、または結合剤として卵白を使用する食品の増量剤としても使用できる。カノーラタンパク質単離物は栄養補給剤としても使用できる。他にも、カノーラタンパク質単離物は、ペットフード、動物飼料、工業および化粧の応用分野、パーソナルケアー製品で使用される。単離、精製した個々のタンパク質も同様の用途に使用できる。
【００２５】
(図面の簡単な説明)
図１は、本発明の実施形態の１つによる、様々なタンパク質プロフィールをもつカノーラタンパク質単離物の製造方法に関する概略フローシートであり、
図２は、本発明の他の実施形態による、様々なタンパク質プロフィールをもつカノーラタンパク質単離物の連続製造方法に関する概略フローシートであり、
図３〜５は、低温粗粉からの抽出物のＨＰＬＣ分析クロマトグラムであり、
図６および７は、２Ｓ，７Ｓおよび１２Ｓカノーラタンパク質を個々に集めるための７回連続の分取ＨＰＬＣを重ねたものを含む。
【００２６】
(発明の一般的説明)
ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物および上澄液由来カノーラタンパク質単離物のそれぞれは、前記米国特許出願に概括的に記載したように、バッチ法または連続法または半連続法のいずれかによって、カノーラ油糧種子粗粉から単離できる。
【００２７】
カノーラタンパク質単離物を準備する過程の最初の段階としては、カノーラ油糧種子粗粉からタンパク質系物質を溶出させることを含む。カノーラ種子粗粉から取り出されるタンパク質系物質は、カノーラ種子またはその他の油糧種子中に本来的に存在するタンパク質であってもよく、あるいは遺伝子操作により改変されているが天然タンパク質に特徴的な性質である疎水性および極性を有するタンパク質であってもよい。カノーラ粗粉は、様々な濃度の未変性タンパク質をもつカノーラ油糧種子からカノーラ油を取り出した後に生じる任意のカノーラ粗粉でよく、例えば、熱へキサン抽出または冷油押出法から生じる。カノーラ油糧種子からカノーラ油を取り出すのは、通常、本明細書で述べるタンパク質単離物の回収法とは別個な操作として実施される。
【００２８】
タンパク質の可溶化は、塩が存在すると油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の取出しが高まるので、食品級塩溶液を使用して実施するのが最も効率的である。カノーラタンパク質単離物が非食品用途を目的としている場合には、非食品級の化学物質を使用してもよい。塩としては、塩化カリウムなどのその他の塩も使用できるが、通常塩化ナトリウムである。塩溶液は、可溶化され得るタンパク質のかなりの量の可溶化を可能にするため、少なくとも約0.10、好ましくは少なくとも約0.15のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増加するにつれて、油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化する度合いが、初めは最大値に到達するまで増加する。イオン強度を続いて増加させても、可溶化されるタンパク質の総量は増加しない。最大のタンパク質可溶化をもたらす食品級塩溶液のイオン強度は、関与する塩および選択した油糧種子粗粉に応じて変動する。
【００２９】
イオン強度の増加に伴ってタンパク質の沈殿に必要な希釈度がより大きくなることを考慮すると、通常、約0.8未満のイオン強度値、より好ましくは約0.15〜約0.6の値を利用する。
【００３０】
バッチ法において、塩によるタンパク質の可溶化は、低くとも約５℃かつ好ましくは約35℃までの温度で、好ましくは、同時に撹拌しながら実施して、通常約10〜約60分である可溶化時間を短縮する。高い総括製品収率を得るため、油糧種子粗粉から実現可能な限りのタンパク質を十分に抽出できるように可溶化を実施することが好ましい。
【００３１】
低温限界として約５℃を選んだのは、この温度より低いと可溶化が遅く実際的でないからであり、好ましい温度上限として約35℃を選んだのは、バッチ方式でより高い温度になるとそのプロセスが経済的でなくなるからである。
【００３２】
連続法では、カノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出は、カノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続抽出を実施することと矛盾しない任意の方式で実施される。ある１つの実施形態では、カノーラ油糧種子粗粉を食品級塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、ある長さを有するパイプまたは導管を通して、本明細書に記載したパラメーターによる所望の抽出を実施するに十分な滞留時間を確保できる流速で運搬する。このような連続法では、塩による可溶化段階は、約10分までの時間で急速に実施され、好ましくはカノーラ油糧種子粗粉から実現可能な限りのタンパク質を十分に抽出するように可溶化を実施する。連続法における可溶化は、高められた温度、好ましくは約35℃より高く、一般には約65℃までの温度で実施される。
【００３３】
食品級塩水溶液およびカノーラ油糧種子粗粉のｐＨは、約５〜約6.8の中性であり、以下、詳細に説明するように、ミセル経路によりタンパク質単離物を形成することが可能になる。
【００３４】
ｐＨ範囲の限界点およびその近傍では、タンパク質単離物の形成はミセル経路を介して部分的にのみ起こり、収率はｐＨ範囲の他の部分で得られるよりも低い。これらの理由により、約5.3〜約6.2の弱酸ｐＨ値が好ましい。
【００３５】
必要なら、任意の都合のよい酸、通常は塩酸、あるいはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、塩溶液のｐＨを約５〜約6.8の範囲内の任意の所望値に調節し、抽出段階に使用できる。
【００３６】
可溶化段階中における食品級塩溶液中の油糧種子粗粉濃度は広範に変化できる。典型的な濃度値は約５〜約15％w/vである。
【００３７】
塩水溶液によるタンパク質抽出の段階には、カノーラ粗粉中に存在する脂肪を可溶化するという副次的効果があり、そのため水相に脂肪が存在することになる。
【００３８】
抽出段階から得られるタンパク質溶液のタンパク質濃度は、一般に約５〜約40ｇ／Ｌ、好ましくは約10〜約30ｇ／Ｌである。
【００３９】
次いで、抽出段階から得られる水相を、粗粉残渣を除去するための真空濾過、それに続く遠心分離および／濾過を採用するなど、任意の適当な方式でカノーラ粗粉残渣から分離できる。分離した粗粉残渣は乾燥して廃棄すればよい。
【００４０】
分離したタンパク質溶液を粉末活性炭またはその他の色素吸着剤と混合し、続いて簡便には濾過によって吸着剤を除去することにより、最終カノーラタンパク質単離物の着色を淡色から淡黄色に改善して、タンパク質溶液を提供することができる。また、透析法を用いて色素を除去してもよい。
【００４１】
このような色素除去段階は、適当な任意の色素吸着剤を使用し、任意の都合のよい条件、一般には分離したタンパク質水溶液自体の温度で実施すればよい。粉末活性炭については、約0.025％〜約5％w/v、好ましくは約0.05％〜約２％w/vの量が使用される。
【００４２】
その譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,844,086号および第6,005,076号に記載されているように、カノーラ種子粗粉がかなりの量の脂肪を含有する場合には、分離したタンパク質水溶液および以下で触れる濃縮タンパク質水溶液に前記特許に記載されている脱脂の段階を施してもよい。着色改善の段階を実施する場合には、最初の脱脂段階の後に行えばよい。
【００４３】
油糧種子粗粉から塩水溶液で抽出する代わりに、このような抽出を水だけで行ってもよいが、水だけを使用すると、油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出が塩水溶液よりも少ない傾向がある。このような代替法を採用した場合には、以下で説明する濃縮段階中にタンパク質を溶液中に保持するために、油糧種子粗粉残渣から分離した後のタンパク質溶液に上で触れた濃度で塩を添加すればよい。着色除去段階および／または第一脱脂段階を実施する場合には、このような操作が完了した後に塩を添加するのが一般的である。
【００４４】
他の代替法では、約6.8を超え、一般には約9.9までの比較的高いｐＨで、食品級塩溶液を用いて油糧種子粗粉から抽出する。食品級塩溶液のｐＨは、水酸化ナトリウム水溶液など、都合のよい食品級アルカリを使用してｐＨを所望のアルカリ値に調節できる。別法としては、約５より低いｐＨから、一般には下側に約３までの比較的低いｐＨで、塩溶液を用いて油糧種子粗粉から抽出してもよい。このような代替法を採用する場合には、油糧種子粗粉抽出段階から得られる水相を、真空濾過、それに続く遠心分離および／または濾過を採用するなど、任意の都合のよい方式でカノーラ粗粉残渣から分離し、残渣粗粉を除去する。分離した残渣粗粉は乾燥して廃棄すればよい。
【００４５】
次いで、高ｐＨまたは低ｐＨでの抽出段階から得られるタンパク質水溶液のｐＨを、以下で触れるような更なる処理に先立って、上で触れたように約５〜約6.8、好ましくは約5.3〜約6.2の範囲に調整する。該当するなら、このようなｐＨ調整は、塩酸など、任意の都合のよい酸、あるいは水酸化ナトリウムなどのアルカリを使用して実施すればよい。
【００４６】
次いで、そのイオン強度を実質的に一定に維持しながら、タンパク質水溶液を濃縮してそのタンパク質濃度を高める。一般には、このような濃縮を行い、少なくとも約200ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約250ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する濃縮タンパク質溶液を得る。
【００４７】
濃縮段階は、約3000〜約50,000ダルトンなど、適切な分画分子量をもつ中空糸膜またはスパイラル膜などの膜を使用する限外濾過または透析濾過などの任意の都合のよい選択膜技術を採用するなど、様々な膜材料および配置を考慮し、連続操作に対してはタンパク質水溶液が膜を通過する際に所望の濃縮度が可能になるような大きさにし、バッチまたは連続操作と矛盾しない都合のよい任意の方式で実施できる。
【００４８】
濃縮段階は、任意の都合のよい温度、一般には約20℃〜約60℃で、所望の濃縮度が得られる時間実施すればよい。利用する温度およびその他の条件は、ある程度、濃縮を実施するのに使用する膜装置および所望する溶液のタンパク質濃度に応じて決まる。
【００４９】
この段階でタンパク質溶液の濃度を約200ｇ／Ｌを超えるまでに濃縮すると、プロセス収率が、乾燥タンパク質単離物として回収される抽出タンパク質の割合として約40％超、好ましくは約80％超のレベルにまで増加するのみならず、乾燥後の最終タンパク質単離物中の塩濃度が減少する。塩濃度の変動が特定の食品応用分野における機能および感覚特性に影響を与えるような単離物の応用分野では、単離物の塩濃度を制御できることが重要である。
【００５０】
周知のように、限外濾過および類似の選択膜技術により、高分子量種が通過するのを阻止しながら低分子量種を通過させることができる。低分子量種には、塩のイオン種のみならず、炭水化物、色素および抗栄養因子など、原料から抽出される低分子量物質、ならびにタンパク質の任意の低分子量型が含まれる。膜の分画分子量は、通常、汚染物を通過させると同時にタンパク質のかなりの部分を溶液中に確実に保持するように、様々な膜材料および配置を考慮して選択される。
【００５１】
濃縮段階で採用される温度に応じて、濃縮タンパク質溶液を、少なくとも約20℃、最大約60℃まで、好ましくは約25℃〜約40℃の温度に加温し、濃縮タンパク質溶液の粘度を低減し、後に続く希釈段階およびミセル形成の実施を容易にすることができる。冷水による希釈でミセルを形成できなくなる濃縮タンパク質の温度を超えて濃縮タンパク質溶液を加熱すべきでない。米国特許第5,844,086号および第6,005,076号に記載されているように、必要であれば、濃縮タンパク質溶液を更なる脱脂操作に付してもよい。
【００５２】
次いで、濃縮段階および任意の脱脂段階から得られる濃縮タンパク質溶液を、濃縮タンパク質溶液を所望の希釈度を達成するに必要な容積を有する冷水と混合することによって、ミセルの形成が起こるように希釈する。ミセル経路によって入手することを望むカノーラタンパク質の比率、および上澄液からの比率に応じて濃縮タンパク質溶液の希釈度を変更できる。一般に、希釈レベルが高いと水相に留まるカノーラタンパク質の割合が高くなる。
【００５３】
ミセル経路によるタンパク質の割合を最大にしたい場合には、濃縮タンパク質溶液を約15倍以下で、好ましくは約10倍以下で希釈する。
【００５４】
濃縮タンパク質と混合する冷水は、約15℃未満の温度、一般には約３℃〜約15℃、好ましくは約10℃未満の温度を有する。なぜなら、タンパク質ミセル集積物の形態でのタンパク質単離物の収率は、採用した希釈倍率においてこのような低温で向上するからである。
【００５５】
バッチ操作では、上で触れたと同様、濃縮タンパク質溶液のバッチを所望の容積を有する静止冷水本体に添加する。濃縮タンパク質溶液の希釈およびその結果として起こるイオン強度の低下によって、ミセルの形態で分離したタンパク質小滴の形態で高度に会合したタンパク質分子の雲状集積物が生成してくる。バッチ法では、冷水本体中でタンパク質ミセルを沈降させ、凝集、合着した、密で、非晶質の粘着性グルテン様タンパク質ミセル集積物(ＰＭＭ)を生成させる。遠心沈降などによって沈降を助けてもよい。このような誘導沈降によって、タンパク質ミセル集積物の液体含有量が減少し、それによって、一般にはミセル集積物総量の約70重量％〜約95重量％である水分含有量が、一般には約50重量％〜約80重量％の値に減少する。この方法でミセル集積物の水分含有量を減らすと、ミセル集積物の吸蔵塩含有量、従って乾燥分離物の塩含有量も減少する。
【００５６】
別法として、Ｔ型パイプの一方の流入口に濃縮タンパク質溶液を連続的に通過させ、同時に、Ｔ型パイプの他の流入口に希釈水を供給し、パイプ中で混合できるようにして、希釈操作を連続的に実施してもよい。Ｔ型パイプの中には、所望の希釈度を達成するに十分な比率で希釈水を供給する。
【００５７】
パイプ中での濃縮タンパク質溶液と希釈水の混合によりタンパク質ミセルの形成が始まり、混合物がＴ型パイプの出口から沈降槽へ連続的に供給され、沈降槽が満杯になると、そこから上澄液がオーバーフローできる。液体本体内での乱れを最小にする仕方で沈降槽中の液体本体内に混合物を供給することが好ましい。
【００５８】
連続法では、タンパク質ミセルを沈降槽内で沈降させて、凝集、合着した、密で、非晶質、粘着性のグルテン様タンパク質ミセル集積物(ＰＭＭ)を形成させ、この手順を沈降槽の底部に所望量のＰＭＭが蓄積するまで継続し、そこで、蓄積したＰＭＭを沈降槽から取り出す。
【００５９】
タンパク質溶液を少なくとも約200ｇ／Ｌのタンパク質含有量にまで濃縮する処理パラメーターを組み合わせ、かつ、約15未満の希釈倍率を採用すると、最初の粗粉抽出物からのタンパク質ミセル集積物の形態でのタンパク質回収率が向上、多くの場合大幅に向上し、しかも、前記米国特許で触れられている既知従来技術であるタンパク質単離物形成方法のいずれかを用いて達成されるよりもタンパク質含有量の点で単離物の純度が向上する。
【００６０】
カノーラタンパク質分離物の回収に連続法を利用することによって、バッチ法と比較すると、タンパク質抽出の程度が同等の場合、最初のタンパク質抽出段階の時間をかなり短縮することができ、かつ、抽出段階でかなりの高温を採用することができる。更に、連続法では、バッチ法よりも汚染の機会が少なく、製品の高品質に繋がり、かつ、処理をより小型の装置で実施できる。
【００６１】
沈降集積物からの残留水相のデカンテーションまたは遠心分離などによって、残留水相または上澄液から沈降単離物を分離する。ＰＭＭは、湿潤形で使用してもよいし、噴霧乾燥、凍結乾燥または真空ドラム乾燥など、任意の都合のよい技術によって乾燥形に乾燥することもできる。乾燥ＰＭＭは、高いタンパク質含有量、約90 wt％を超えるタンパク質、好ましくは少なくとも約100 wt％のタンパク質(ケルダールＮ×6.25として計算)を有し、実質的に未変性である(示差走査熱量測定法で判定)。また、米国特許第5,844,086号および第6,005,076号の方法を採用した場合、脂肪油糧種子粗粉から単離される乾燥ＰＭＭの残留脂肪含有量は低く、約１wt％未満であろう。
【００６２】
ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物は、主として少量の１２Ｓカノーラタンパク質および場合によっては少量の２Ｓカノーラタンパク質を伴った７Ｓタンパク質から構成される。一般に、ＰＭＭは、
約６０〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
約１〜約１５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、
０〜約２５ｗｔ％の２Ｓタンパク質を含有する。
ＰＭＭは、
約８８〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
約１〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、
０〜約６ｗｔ％の２Ｓタンパク質を含有するのが好ましい。
【００６３】
ＰＭＭ形成および沈降の段階からの上澄液には、希釈段階で沈殿しなかったかなりの量のカノーラタンパク質が含まれているので、上澄液を処理してカノーラタンパク質を回収する。希釈段階からの上澄液を、ＰＭＭを取り出した後に濃縮してそのタンパク質濃度を高める。このような濃縮は、塩、およびタンパク質原料から抽出されたその他の非タンパク質系低分子量物質を含む低分子量種を通過させ、一方、カノーラタンパク質を溶液内に留めるような適切な分画分子量をもつ膜を用いる限外濾過など、任意の都合のよい選択膜技術を使用して実施される。様々な膜材料および配置を考慮して、約3,000〜10,000ダルトンの分画分子量をもつ限外濾過膜が使用できる。この方式で上澄液を濃縮すると、タンパク質を取り出すために乾燥させる必要のある液体量も減少する。上澄液は、一般に、乾燥に先立って、約100〜約400ｇ／Ｌ、好ましくは約200〜約300ｇ／Ｌのタンパク質濃度にまで濃縮する。このような濃縮操作は、タンパク質溶液の濃縮段階について上で説明したと同様、バッチ方式または連続操作で実施できる。
【００６４】
濃縮上澄液を、噴霧乾燥、凍結乾燥または真空ドラム乾燥など、任意の都合のよい技術によって、乾固して乾燥形とし、更なるカノーラタンパク質単離物を提供できる。このような更なるカノーラタンパク質単離物は、高いタンパク質含有量、約90 wt％、好ましくは少なくとも約100 wt％を超えるタンパク質(ケルダールＮ×6.25として計算)を含有し、実質的に未変性である(示差走査熱量測定法で判定）。
【００６５】
乾燥した上澄は、主として少量の７Ｓカノーラタンパク質および場合によっては少量の１２Ｓカノーラタンパク質を伴った２Ｓタンパク質から構成される。一般に、上澄液由来カノーラタンパク質単離物は、
約６０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
約５〜約４０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質を含有する。
上澄液由来カノーラタンパク質単離物は、
約７０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
約５〜約３０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
０〜約２ｗｔ％の１２Ｓタンパク質を含有するのが好ましい。
【００６６】
望むなら、湿潤ＰＭＭの少なくとも一部を濃縮上澄液の少なくとも一部と混合し、その後、その混合したタンパク質流れを任意の都合のよい技術によって乾燥して、カノーラタンパク質単離物が混合された本発明による組成物を提供してもよい。一緒に混合するタンパク質系材料の相対比率を選択し、結果として所望の２Ｓ／７Ｓ／１２Ｓタンパク質プロフィールをもつカノーラタンパク質単離物の組成物を提供できる。別法としては、乾燥タンパク質単離物を所望の比率で混合してその混合物に所望する任意の特定２Ｓ／７Ｓ／１２Ｓタンパク質プロフィールを具備させ、それによって本発明による組成物を提供してもよい。カノーラタンパク質単離物を混合した組成物は、約90 wt％、好ましくは少なくとも約100％ wtを超える(ケルダールＮ×6.25として計算)高いタンパク質含有量を有し、実質的に未変性である(示差走査熱量測定法で判定)。
【００６７】
その他の別法としては、濃縮上澄液の一部のみをＰＭＭの一部のみと混合し、得られる混合物を乾燥してもよい。濃縮上澄液の残りもＰＭＭの任意の残余と同様乾燥してもよい。更に上で触れたように、乾燥ＰＭＭおよび乾燥上澄を所望する任意の相対比率でドライ混合してもよい。
【００６８】
この方式で操作することによって、多くのカノーラタンパク質分離物を、乾燥ＰＭＭの形態で、乾燥上澄の形態で、および、ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物と上澄液由来カノーラタンパク質単離物の重量比率が異なり、一般には、組成物の様々な２Ｓ／７Ｓ／１２Ｓたんぱく質比率に基づく各種の機能的および栄養学的性質を達成するのに望ましい、重量で約５：95〜約95：５である乾燥混合物の形態で取り出すことができる。
【００６９】
濃縮タンパク質を冷水中に希釈し、得られる沈殿物と上澄液を上述のように処理する替わりに、濃縮タンパク質溶液を透析してその塩含有量を低減させることによって濃縮タンパク質溶液からタンパク質を回収できる。濃縮タンパク質溶液の塩含有量を低減すると、透析チューブ中にタンパク質ミセルの形成が生じる。透析に続いて、上記同様、タンパク質ミセルを沈降させ、回収し、乾燥できる。タンパク質ミセルの沈降段階からの上澄液を上述のように処理して、上澄液から更なるタンパク質を取り出すことができる。別法としては、透析チューブの内容物を直接的に乾固してもよい。後者の代替方法は、少量の実験室規模のタンパク質が必要な場合に有用である。
【００７０】
ある与えられたタンパク質単離物のそれぞれのタンパク質の相対量は、分析的分離技術など、任意の都合のよい分析技術によって測定できる。これらの中で最も一般的な技術は、カラムに充填した、大きさに基づいた分離を可能にする選択性媒体を使用する。ゲル浸透クロマトグラフィー(ＧＰＣ)を利用する場合には、球状のゲル状材料を使用する。高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)のように圧力を利用する場合には、剛性媒体を使用する。後者の技術は、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)としても知られている。本明細書に記載したのと同様にして調製したカノーラタンパク質単離物のサンプルについて、このような技術を使用して得られた結果を後記実施例中に含める。
【００７１】
質量分析(ＭＳ)の手法を利用して、本明細書に記載のカノーラからの２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を含むタンパク質サンプルを同定、分析できる。エレクトロンスプレーイオン化(ＥＳＩ)質量分析では、低エネルギーの電子でタンパク質に衝撃を加え、衝突で生成した帯電フラグメントまたは種を検出する。特に、特殊な分子マトリックスを含む分析用試料の乾燥サンプルをレーザーで気化させるマトリックス支援レーザー脱離イオン化(ＭＡＬＤＩ)質量分析を使用できる。マトリックスには、分析中に生体高分子を十分に保護し、レーザーの衝撃エネルギーで生成するイオン化種の総数を減少させるための相溶性低分子量有機分子が含まれている。
【００７２】
本明細書に記載したと同様のタンパク質単離物から得られるデータは、２Ｓタンパク質がＥＳＩ−ＭＳによる電子衝撃に対して安定ではなく、４ kDa、10 kDaおよび21 kDaの種を含む多数のポリペプチドフラグメントに容易に開裂してしまうことを示唆している。しかし、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用すると、14,000ダルトンに近い分子質量をもつ完全な２Ｓフラクションが生成した。
【００７３】
ＰＭＭから得られるタンパク質単離物中の７Ｓタンパク質も、10 kDa以下のフラグメントを多数生成したが、ＥＳＩ−ＭＳにおける電子衝撃に対する分子の不安定性を示唆している。更に、ＰＭＭから得られるカノーラタンパク質単離物からの７Ｓタンパク質の分析で21 kDaの種が確認されたが、この種は、上澄液から得られるカノーラタンパク質単離物からの７Ｓタンパク質中には存在しなかった。
【００７４】
また、ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物からの７Ｓタンパク質のＥＳＩ−ＭＳ分析は126〜166 kDaの範囲に６個のタンパク質分子質量の存在を示し、一方、上澄液由来カノーラタンパク質単離物からの７Ｓタンパク質は167 kDaに１個の大きな種の存在を示した。
【００７５】
本明細書に記載したＭＡＬＤＩ−ＭＳの分析結果は、２Ｓタンパク質が13,960〜14,250daの分子質量をもち、弱い酸処理にかなり耐えることを示唆している。７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は48,200〜48,400 daの基本サブユニットをもつ同一構成ブロックを含んでいる。７Ｓタンパク質は、サブユニット３個の分子質量すなわち約145,000 daの分子質量を有し、一方、１２Ｓタンパク質は６個のサブユニットを含み、合わせて約290,000 daの分子質量を有する。７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を酸加水分解しても２Ｓタンパク質は生成せず、ほとんど同一結果を生じる。このことはこれら２つの球状タンパク質は同じサブユニットから得られることを裏付けている。
【００７６】
それぞれのタンパク質単離物から、少量タンパク質用の分析高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、大量用の分取ＨＰＬＣを含む任意の通常方法によって、個々の２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を単離および精製できる。分子質量に基づいて組成を明らかにするその他の方法を使用してもよい。２Ｓタンパク質は一般に上澄液由来カノーラタンパク質単離物から単離、精製され、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は一般にＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物から単離、精製される。塩水を用いるなどによりカノーラタンパク質単離物を可溶化してからＨＰＬＣカラムに通す。１種類のタンパク質を含む溶出液の分画に含まれるＨＰＬＣで分離したタンパク質を、通常、限外濾過に付して溶出液の容積を減容し、続いてタンパク質単離物の透析によってタンパク質中の残存塩含有量を減少させる。透析物を乾燥して、単離、精製、乾燥した個々のカノーラタンパク質を提供できる。
【００７７】
(好ましい実施形態の説明)
図１を参照にして、カノーラタンパク質単離物を調製するためのバッチ法に関するフローシートを概略的に説明する。カノーラ油糧種子粗粉および水性抽出媒体をライン10を経由して抽出槽12に供給し、その中で油糧種子粗粉を抽出に付し、タンパク質水溶液を形成させる。タンパク質水溶液と油糧種子粗粉残渣とのスラリーを、ライン14を経由して油糧種子粗粉残渣を分離するための真空濾過機ベルト16を通過させ、油糧種子粗粉残渣はライン18を経由して除去する。次いで、タンパク質水溶液を、ライン20を経由して清澄操作部22に通し、その中でタンパク質水溶液を遠心分離および濾過して微紛を除去し、微粉はライン24を経由して回収する。
【００７８】
清澄タンパク質水溶液を、ライン26を経由してポンプで限外濾過膜28に通液し、ライン30中に保持液としての濃縮タンパク質溶液を生成させ、透過液はライン32を経由して回収する。濃縮タンパク質溶液を、ライン36を経由して供給される冷水が入っている沈殿槽34に送り込む。沈殿槽34内で形成されるタンパク質ミセル集積物をライン38を経由して取り出し、噴霧乾燥機40に通して乾燥カノーラタンパク質分離物42を得る。
【００７９】
沈殿槽34からの上澄液をライン44を経由して取り出し、ポンプで限外濾過膜46に通液し、ライン48中に保持液としての濃縮タンパク質溶液を生成させ、透過液はライン50を経由して除去する。濃縮タンパク質溶液を噴霧乾燥機52に通して更なる乾燥カノーラタンパク質単離物54を得る。
【００８０】
別法としては、ライン48の濃縮タンパク質溶液を、ライン56を経由して送液しタンパク質ミセル集積物と混合し、その後、続いてその混合物を噴霧乾燥機40中で乾燥してもよい。
【００８１】
図２を参照にして、カノーラタンパク質単離物を調製するための連続法に関するフローシートを概略的に説明する。カノーラ油糧種子粗粉および水性抽出媒体をそれぞれライン110および112を経由してブレンダー114に供給し、その中で油糧種子粗粉と水性抽出媒体を混合し、その混合物をライン116を経由してミキシングパイプ118を通過させる。ミキシングパイプ118中で油糧種子粗粉を抽出に付してタンパク質水溶液を形成させる。タンパク質水溶液と油糧種子粗粉残渣のスラリーを、油糧種子粗粉残渣を除去するためにライン120を経由して真空濾過機ベルト122を通過させ、油糧粗粉残渣はライン124を経由して除去する。次いで、タンパク質水溶液をライン126を経由して清澄操作部128に通し、その中でタンパク質水溶液を遠心分離および濾過して微紛を除去し、微粉はライン130を経由して回収する。
【００８２】
清澄タンパク質水溶液を、ポンプでライン132を経由して、タンパク質水溶液の所望する濃縮度が得られるような大きさの限外濾過膜134に通液し、ライン136中に保持液としての濃縮タンパク質溶液を生成させ、透過液はライン138を経由して回収する。濃縮タンパク質溶液はミキシングＴ字管140の入り口に送られ、そこへライン142を経由して所望の希釈度を得るに十分な容積の冷水が供給される。得られた溶液をライン144を経由して沈殿槽146に供給し、タンパク質ミセル集積物を沈殿させる。沈殿槽146内に沈殿したタンパク質ミセル集積物をライン148を経由して時々取り出し、噴霧乾燥機150を通過させて乾燥カノーラタンパク質分離物152を得る。
【００８３】
沈降槽からの上澄液はライン154を経由して取り出し、ポンプで限外濾過膜152を通過させてライン158中に保持液としての濃縮タンパク質溶液を生成させ、透過液はライン160を経由して除去する。濃縮タンパク質溶液を噴霧乾燥機162に送り、さらなる乾燥カノーラタンパク質単離物164を得る。
【００８４】
別法として、ライン158の濃縮タンパク質溶液をライン166を経由して送液し、タンパク質ミセル集積物と混合し、その後、続いてその混合物を噴霧乾燥機150中で乾燥してもよい。
【００８５】
(実施例)
（実施例１）
この実施例では、本発明のカノーラタンパク質単離物を得るために採用した方法を説明する。
【００８６】
市販カノーラ粗粉「ａ」ｋｇを0.15Ｍ NaCl溶液「ｂ」Ｌに外界温度で添加し、30分間撹拌してタンパク質含有量が「ｃ」ｇ／Ｌであるタンパク質水溶液を得た。真空濾過ベルト上でカノーラ粗粉残渣を除去、洗浄した。得られたタンパク質溶液を遠心分離により清澄化し、タンパク質含有量が「ｅ」ｇ／Ｌである清澄タンパク質溶液「ｄ」Ｌを生成させた。
【００８７】
タンパク質抽出液の一部「ｆ」Ｌを、分画分子量が「ｈ」ダルトンの膜を用いる限外濾過装置で濃縮して「ｇ」Ｌまで減溶した。得られた濃縮タンパク質溶液のタンパク質濃度は[ｉ]ｇ／Ｌであった。
【００８８】
「ｊ」℃の濃縮液を４℃の水に比率「ｋ」で希釈した。直ちに形成された白雲を沈降させた。上部の希釈水を除去し、槽の底部から沈殿した粘性のある粘着性集積物(ＰＭＭ)を、抽出したタンパク質から「ｌ」ｗｔ％の収率で回収した。乾燥したＰＭＭ由来タンパク質のタンパク質含有量(Ｎ×6.25)は、乾基準で「ｍ」％であることが判った(窒素のパーセンテージ値はLeco FP528型窒素測定器を用いて測定)。製品には呼称「ｎ」を付与した。
【００８９】
５つのＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物に対するパラメーター[ａ]〜[ｎ]を下表１に示す。
【００９０】
【表１】
2005522522.tif 000002
取り出した希釈水の容積を、分画分子量が[ｏ]ダルトンの膜を用いる限外濾過によって「ｐ」ｇ／Ｌのタンパク質濃度にまで減容した。この濃縮物を乾燥した。上澄液から更なるタンパク質を回収して、タンパク質の総括回収率は「ｑ」ｗｔ％であった。形成された乾燥タンパク質のタンパク質含有量は、乾基準で「ｒ」ｗｔ％(Ｎ×6.25)であった。
【００９１】
製品には呼称「ｓ」を付与した。５つの上澄液由来カノーラタンパク質単離物に対するパラメーター[ｏ]〜[ｓ]を下表２に示す。
【００９２】
【表２】
2005522522.tif 000003
（実施例２）
この実施例では、実施例１のＰＭＭ由来および上澄液由来カノーラタンパク質単離物の分析について説明する。
【００９３】
100cmのカラムとSephacryl 300HRメディア(Sephacryl 300HRメディアはメチレンビス−アクリルアミドで架橋したデキストランポリマーであり、10,000〜1,500,000ダルトンの大きさの球状タンパク質を分画できる)を具備したGradi-Fracタンパク質分離装置(Pharmacia Amersham社)により、一連の標準タンパク質基準を分析し、1.0ｍＬ／分の溶出流量で、280 nmの吸光度で測定した場合の各成分の滞留時間(ＲＴ)を求めた。ｐＨを調整し、抗菌剤としてアジ化ナトリウムを入れた塩溶液をカラム溶媒として使用した。溶出液は自動サンプルラック上の試験管に集め、各試験管には５ｍＬの液体を入れた。タンパク質の相対比は、ベース半幅値に最大ピーク高さを掛けて得られるピーク面積によって計算した。
【００９４】
5,000〜700,000ダルトンの大きさの球状タンパク質を分離できる、直径が５ミクロン、孔径が290オングストロームの親水性結合剛性シリカ担体メディアを含む、300×7.8ｍｍのBioSep S3000サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)カラムを使用する、Varian高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)分析カラムにより、Gradi−Frac装置と同じBioRadタンパク質標準を分析した。BioRadタンパク質は17,000ダルトン(ミオグロブリン)〜670,000ダルトン(チログロブリン)の範囲を受け持ち、低分子質量マーカーとして1,350ダルトンのビタミンＢ12を添加した。溶出流量を1.0ml／分とし280 nmで各成分を測定する。カラム溶媒としてはｐＨを調整し抗菌剤としてアジ化ナトリウムを入れた生理食塩水溶液を用い、その溶液で乾燥サンプルを溶解する。１回の分析に必要なサンプルは多くても50マイクロリットルなのでＵＶ検出後の溶出液は廃棄した。ＨＰＬＣ Prostar装置が自動的に保持時間およびピーク面積を算出し、要約レポートを印刷してくる。
【００９５】
実施例１に記載したと同様にして調製したＰＭＭ由来および上澄液由来カノーラタンパク質単離物、ロットBW-AL-017-B14-02A-C300およびBW-AL017-B20-02A-C300のサンプルを各カラムで分析した。ピーク面積の計数値を各ピークに対する比率に変換した。異なる分析の全ピークを算入し、次いで３つの主要タンパク質分画、１２Ｓ、７Ｓおよび２Ｓを別個に再計算した。
【００９６】
更に、BioRad標準品から得られる標準曲線を用いて、３つのタンパク質分画、１２Ｓ、７Ｓおよび２Ｓに対する大まかな分子量をＧＰＣおよびＨＰＬＣの双方を用いて行われた分析について算出した。Gradi-Frac装置はＨＰＬＣ装置よりも変動が大きいが、これはサンプルの大きさ(25マイクロリットルに対し１ミリリットル)およびカラム直径がより大きいこと、Gradi-Fracの結果を手で計算していること、分析時間の相違(Gradi-Fracの５時間に対しＨＰＬＣでは25分)に由来するものである。更に、Gradi-Frac装置はタンパク質保持の測定に容積を使用するがＨＰＬＣでは時間を使用する。
【００９７】
下表３および４に示したデータの変動は上で指摘した相違を反映している。統計的にはＨＰＬＣ装置の方がGradi-Frac装置よりも優れている(変動が小さい)。Gradi-Frac装置には、ＨＰＬＣ装置とは異なり、更なる試験(例えば質量分析を利用する)に使用できる個々のサンプル分画を準備できるという利点がある。
【００９８】
ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物(ＣＰＩ)で得られた結果を次表３に、上澄液由来カノーラタンパク質単離物(ＣＰＩ)で得られた結果を表４に示す。
【００９９】
【表３】
2005522522.tif 000004
【０１００】
【表４】
2005522522.tif 000005
表３に示したデータから判るように、ＰＭＭ由来のサンプルには大量の７Ｓタンパク質が含まれており、２Ｓおよび１２Ｓタンパク質の割合は低い。
【０１０１】
表４から判るように、上澄液由来のカノーラタンパク質単離物には１２Ｓタンパク質が実質上存在せず、主なタンパク質は２Ｓタンパク質であり、７Ｓタンパク質も大量に存在する。
【０１０２】
ＨＰＬＣ分析での分子量計算値は１２Ｓおよび７Ｓタンパク質に対しては小さいが、２Ｓタンパク質に対しては大きい。この明らかな不一致は、ある程度全てが手で行われるＧＰＣ分析の場合にピーク最大値を正確に示すことが困難であることによるものであろう。
【０１０３】
１２Ｓに対するＧＰＣでの計算分子量385,000ダルトンは、カノーラのクルシフェリンについて文献に報告されている300,000〜310,000 daの範囲よりも大きい。７Ｓに対するＧＰＣおよびＨＰＬＣによる計算分子量は類似しており、かつ、報告値約150,000 daに近い。２Ｓに対するＨＰＬＣの評価はＧＰＣの平均値より大きいが、双方ともナピンに対する報告値14,000 daよりも小さい。
【０１０４】
上のデータから判るように、試験したサンプルのＰＭＭ由来カノーラタンパク質には82〜89％(ＧＰＣ)の範囲および94％(ＨＰＬＣ)の量の７Ｓ分画が含まれる。上で述べたように、ＨＰＬＣ法はＧＰＣよりも迅速でかつより正確であると考えられる。３つのタンパク質分画の面積に基づいて、ＰＭＭ由来サンプルには、
約８８〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
約１〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、
０〜約６ｗｔ％の２Ｓタンパク質が含まれると考えられる。
同様に、上澄液由来のサンプルの場合、３つのタンパク質分画の面積に基づいて、これらのサンプルには、
約７０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
約５〜約３０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
０〜約２ｗｔ％の１２Ｓタンパク質が含まれると考えられる。
【０１０５】
上で使用したような用語「タンパク質分画」とは、BioRadから入手できるような妥当と認められたＧＰＣ／ＨＰＬＣタンパク質標準品によって上で述べた範囲の計算分子量を与えるＨＰＬＣ(またはＧＰＣ)保持時間のピーク領域として定義される。これらのピークには他の成分が含まれていてもよいが、その成分が分子量範囲の容認できる領域に存在するなら、その存在は不適切である。
【０１０６】
この実施例に含まれる知見に基づく分子量の容認できる範囲は
１２Ｓが300,000〜360,000 da、
７Ｓが125,000〜160,000 da、
２Ｓが9,000〜15,000 daであると思われる。
【０１０７】
（実施例３）
この実施例では、タンパク質抽出に与える幾つかのパラメーターの影響を示す。
【０１０８】
実験の最初の組では、100℃の低温でトーストして(ＬＴ粗粉)残存溶媒を除去したカノーラ油糧種子粗粉サンプル50ｇを室温(20℃)で0.05Ｍまたは0.10ＭのNaCl溶液サンプル500ｍＬに添加し、15分間撹拌した。このスラリーを5000×ｇで10分間遠心分離して抽出し、粗粉を廃棄した。
【０１０９】
実験の次の組では、塩を添加していない水500ｍＬを先ずホットプレート撹拌機上で60℃に加熱し、次いで100℃の低温でトーストして残留溶媒を除去したカノーラ油糧種子粗粉50ｇを添加し、温度を維持しながら15分間撹拌した。5000×ｇで10分間遠心分離することにより廃棄粗粉から抽出液を分離した。
【０１１０】
これらの実験で得られた各種タンパク質水溶液のタンパク質濃度を測定し、結果を次表５に示す。
【０１１１】
【表５】
2005522522.tif 000006
粗粉からのタンパク質の抽出能を表５のタンパク質濃度データから求め、その結果を次表６に示す。
【０１１２】
【表６】
2005522522.tif 000007
この実施例に記載したと同様にして調製した抽出液のサンプルを実施例２に記載したＨＰＬＣおよびＳＥＣカラムのそれぞれで分析した。ピーク面積計数は各ピークに対するパーセンテージに変換した。異なる分析でのピークを全て計算に算入し、次いで３つの主要タンパク質分画、１２Ｓ、７Ｓおよび２Ｓを個々に再計算した。得られた結果を図２〜４のグラフデータに示す。
【０１１３】
各クロマトグラムには、７Ｓカノーラタンパク質分画を表す明瞭なピーク、および１２Ｓカノーラタンパク質分画の小さなこぶ状ピークがある。２Ｓカノーラタンパク質分画に対するピークは抽出液中の他の成分に対するピークに混じって存在する。クロマトグラムの低分子量側のピークは正確には同定されないが、短鎖ペプチドおよび遊離アミノ酸などの非タンパク質窒素系化合物、ならびにフェノール性化合物、グルコシノレートおよびフィテートなど、その他の粗粉中の成分に対応しているのであろう。
【０１１４】
(実施例４)
この実施例では、カノーラタンパク質単離物サンプルの分析について説明する。
【０１１５】
実施例１に記載したと同様にして調製したロットBW-AL017-D29-C200およびBW-AL017-D29-C300からの噴霧乾燥カノーラタンパク質単離物サンプルについて、実施例２に記載したと同様のゲル浸透クロマトグラフィーを行い、２Ｓ、＞２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓと標記する４つのタンパク質分画が得られ、２Ｓおよびおそらく＞２Ｓ分画も小さな水溶性アルブミンを意味し、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質はより疎水性で水溶性の低いグロブリンを意味している。
【０１１６】
これらの分画および弱く酸処理したサンプルをＭＡＬＤＩ質量分析で分析し、次の結果を得た。
【０１１７】
２Ｓ分画
ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いた分析によって分子質量は14,000ダルトンに近いことが判った。ピーク先端が分裂し、アミノ酸２〜３個の差である13,960 daと14,250 daの間に主な突起がある、狭い帯ピークが観察された。これは異なるタンパク質アイソザイムを示唆しているのかもしれない。
【０１１８】
２Ｓ分画を５％酢酸中で24時間酸処理しても、8,000 daの分画下限より小さなポリペプチド種は何も現れず、温和な酸性化に対する２Ｓタンパク質の耐性を示唆している。
【０１１９】
＞２Ｓ分画
この物質をＭＳ走査すると、約13,950〜13,990 daに２Ｓタンパク質に帰属できる小さなピーク、および13,380〜13,410 daに起源不明の主要なピークが現れた。この分画には17,160〜17,260 daにこれも起源不明の目立つが強度の弱いピークが含まれていた。
【０１２０】
後者の分画を５％酢酸で24時間、温和に処理すると、13,400 daの大きなピークのみが減少し、約7,000〜8,000 daにおそらく加水分解生成物と思われる幾つかの少量成分が現れた。２Ｓピークは減少していなかった。
【０１２１】
７Ｓ分画
この物質をＭＳ走査すると、最も目立つピークが48,150〜49,950ダルトンに現れ、約48,400±100 daに大きな突起があった。それぞれ約95,940および97,510 daに２つの突起があるより強度が弱く幅の広いピークが現れたが、これは２つのサブユニットを含む少量のタンパク質の存在を示唆している。実施例２で実施した分析で７Ｓタンパク質の分子質量は約150,000であることが判ったが、ここでのＭＡＬＤＩ分析によれば分子質量は若干低く約145,000 daであった。
【０１２２】
大きな＞２Ｓ分画のピーク領域の13,420 daに小さな成分が現れたが、14,000 daにはなかった。16,975〜17,905 daに大きなトリプレットピークが現れた。これらのピークはおそらくタンパク質サブユニット中の主要ポリペプチドに帰属可能であり、＞２Ｓ分画にも存在したが、２Ｓ分画にはなかった。
【０１２３】
７Ｓ分画を１％酢酸で24時間酸処理すると、大きな種は48,310 daにそのまま残り、45,750 daにより小さいピーク(多分小さなポリペプチドの消失)が付随した。16,310 da、22,710 daおよび24,070 daに新しいピークが現れたが、おそらく加水分解生成物を意味しているのであろう。
【０１２４】
７Ｓ分画を20％ギ酸を用いて更に酸処理した。処理から１時間後および再びギ酸に３日間暴露した後に走査した。
【０１２５】
１時間の暴露後に約26,300 daに新しい種が現れ、その他のピークは５％酢酸処理の場合に示した場所の近くにあった。３日間暴露すると、16,315daおよび17,850daの主要ピークが高くなると共に、主要サブユニット(48,260 da)に対するピーク強度が低下した。
【０１２６】
9,000 da未満を走査すると、4,490 da、5,720 da、6,530 da、7,030 daおよび7,330 daの６個のピークからなる特徴的なパターンが現れたが、4,490daのピークは３日目までにかなり増加した。
【０１２７】
１２Ｓ分画
１２Ｓ分画をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析すると、48,150〜48,200 daに中心のある大きなピークが生成し、これは主要タンパク質サブユニットを意味している。大きな低磁場側ピークが94,960 daに現れ、他にも64,620 da、77,540 da、126,990 daおよび143,280 daにより小さなピークを伴っていた。大きな分子質量ピークは明確には特定されず、真の分子質量に近似できるだけである。大きな低磁場側ピークはサブユニットの分子質量の２倍に近く、一方、143,280 daの幅の広いピークはサブユニットの質量の３倍に近い。
【０１２８】
その他目立つピークが約13,400 da、16,400 da、17,900 daおよび29,000〜29,700 daに現れ、これらはおそらくタンパク質サブユニットを構成している幾つかのポリペプチドである。
【０１２９】
１２Ｓ分画を５％酢酸で24時間酸処理すると、７Ｓ分画および上述に対するものとほぼ同一のプロフィールを生じた。20％ギ酸で処理すると３日後に48,100 daの主要サブユニットが減少し、17,900 daの種が増加した。
【０１３０】
9,000da未満の走査は20％ギ酸中で１時間後の７Ｓ加水分解とほとんど同じで、4,480 da、5,730 da、6,510 da、6,650 da、7,020 daおよび7,310 daに６個の大きなピークがあった。4,480 daのピークは、７Ｓ分画の場合と異なりギ酸処理３日目で有意には増加しなかった。
【０１３１】
この実施例で報告したＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析の結果を考慮すると以下のように結論付けることができる。
【０１３２】
(a)２Ｓタンパク質は、14,000付近と発表されている結果と一致する13,960〜14,250daの分子質量を有し、温和な酸処理に対してかなり耐える。
【０１３３】
(b)７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、48,200〜48,400 daの範囲の基本サブユニットをもつ同一構成ブロックを含んでいる。７Ｓタンパク質は、サブユニット３個の、すなわち約145,000 daの分子質量を有し、１２Ｓタンパク質は、６個のサブユニットを含み、合わせた分子質量は約290,000 daとなる。これらの値は、実施例２におけるＧＰＬおよびＨＰＬＣ ＳＥＣによる分子質量の計算によって得られた値よりも小さいが、それらの結果は動物性標準品に基づくものである。
【０１３４】
(c)７Ｓおよび１２Ｓを酸で加水分解しても、２Ｓタンパク質は生成しない。
【０１３５】
(d)２つの球状タンパク質を酸で加水分解すると、ほとんど同じ結果が得られるが、この２つのタンパク質が同一サブユニットから得られることを裏付けている。
【０１３６】
(実施例５)
この実施例では、分取高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)について説明する。
【０１３７】
直径５ミクロン、孔径290オングストロームの親水性結合シリカ剛性担体メディアを含む、300×21.20ｍｍ Phenomenex BioSep S3000サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)メインカラムを用いるVarian分取高圧液体クロマトグラフィー装置(prep−ＨＰＬＣ)を使用してカノーラタンパク質を分画した。メインカラムの前には大きさが60×21.20ｍｍで同じ充填剤を入れた使い捨てのプレカラムを取り付けた。
【０１３８】
各分析目的物質を６〜８ｍＬ／分の流速のもと280ｎｍで監視した。これらの流速であればカラムの圧力上限6.89ＭＰａ(1,000 psi)を超えることはない。抗菌剤としてアジ化ナトリウムを含む塩溶液をカラム移動相として使用し、かつ、その塩溶液を使用して乾燥カノーラタンパク質のサンプルを溶解した。溶離液をVarian701型フラクションコレクターに集めた。分析時間はサンプルに応じて12〜15分の範囲で変化する。
【０１３９】
注入サンプル容積は、サンプル濃度がタンパク質単離物の乾燥重量で2.0〜3.0 wt％の場合、1.0〜1.5ｍＬ、すなわち１回の注入当たり個体で20〜45ｍｇである。カラムの受入れ能力はサンプルの種類および濃度に応じて1.5ｍＬを超えることもできる。サンプルを調製するには、少なくとも30分間撹拌し、その後、10,000 rpmで20分間遠心分離する。次いで、上澄液を少なくとも0.45ミクロンのメンブランディスクを通して真空濾過する。
【０１４０】
装置は連続的に24時間を超えて運転できるが、カラムから不純物を除去するため、アセトニトリル水を必要とする洗浄処理が毎日必要なので、通常この様な運転はしない。それでも、１日に80〜100回の分離操作を行い、0.5〜1.2ｇの分析目的物質を集めるのが通常である。
【０１４１】
実施例１に記載したと同様にして調製した、BW-AL-017-D29-02A-C200、BW-AL021-I24-02A-C200、BW-AL021-I30-02A-C200、BW-AL-017-D29-02A-C300、BW-AL021-I24-02A-C300およびBW-AL021-I30-02A-C300を含む、ＰＭＭ由来および上澄液由来のカノーラタンパク質単離物からサンプルを調製した。
【０１４２】
ＰＭＭ(C300)サンプルを使用して７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を集め、上澄液由来(C200)サンプルを主に使用して２Ｓを集めた。Varian分析ＳＥＣ−ＨＰＬＣで分画の一部を分析して純度を調べた。溶離液のタンパク質濃度は典型的には0.3 wt％(Ｎ×6.25)未満、または280 nmで吸光度単位2.0未満であり、塩含有量は伝導度で測定して通常NaClで0.5〜0.7 wt％であった。
【０１４３】
(実施例６）
この実施例では実施例５で集めた分画の限外濾過および透析について説明する。
【０１４４】
溶離液の大きな容積および高い塩−タンパク質比率を減らすために、限外濾過と、それに続く透析の双方を実施した。実施例５に記載したVarian分取ＨＰＬＣ装置からの希薄溶離液を、それぞれ容積400ｍｌの定格最大能力をもつ２個のAmiconシリーズ8000撹拌付き限外濾過セルユニット中で濃縮した。
【０１４５】
各ユニットには、選択した分画分子サイズをもつ直径76ｍｍの膜を取り付けた。２Ｓタンパク質の場合に使用される膜としては、再生セルロースを付けた1,000ＮＭＷＬ(公称分子量限界)のUltracel Amicon YM1 UFディスク、＃13342、および、再生セルロースからなり10,000ＮＭＷＬ(公称分子量限界)のUltracel Amicon YM10 UFディスク、＃13642が挙げられる。
【０１４６】
より大きな７Ｓおよび１２Ｓ球状タンパク質の場合には、より大きなＮＭＷＬの膜、すなわち、ポリエチレンスルホン(ＰＥＳ)からなる50,000ＮＭＷＬのBiomax PBQK UFディスク、＃PBQK07610、またはＰＥＳからなる100,000ＮＭＷＬのBiomax PBHK UFディスク、＃PBHK07610が使用される。
【０１４７】
膜のＮＭＷＬが大きいと、タンパク質保持率、いわゆる保持液の損失がわずかに生じたが、タンパク質と弱く会合した低分子量不純物も除去された。分画ＮＭＷＬが大きいと、ＵＦ操作時間も短縮される。1,200ｍＬのＨＰＬＣサンプルの場合、２個のＵＦユニットでの典型的な操作時間は４〜５時間であった。
【０１４８】
典型的な運転では、各ユニットの325ｍＬの線までサンプルを入れた。撹拌すると約375ｍＬまで上昇する。ユニットを密閉し、サンプルを撹拌しながら0.4ＭＰａ(60psi)まで加圧した。ユニット内部の保持液が約100ｍＬまで低下したら、圧力を放出し、各ユニットにサンプルを追加した。この操作を全てのサンプルを添加するまで継続した。最終的には保持液を各セルの内部で75〜100ｍＬまで濃縮した。
【０１４９】
溶出液、いわゆる透過液を各ユニットから取り出し、伝導度によって塩分濃度を、紫外可視UltraSpec1000Ｅ分光光度計で１ｃｍセルを用いる280ｎｍでの吸光度によって相対的タンパク質含有量測定した。ＵＦ膜の効率についての知見を得るために物質収支を計算した。ＵＦ透過液および最終保持液のサンプルを、実施例２と同様に、分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣで分析して純度を調べた。
【０１５０】
限外濾過の保持液を、1,000ＭＷＣＯ(Molecular Weight Cut-off、分画分子量)、直径24.2ｍｍのSpectra／Por7透析膜、＃132104に注ぎ込んだ。各チューブ片を約300ｍｍに切断した。次いで充填した膜をＲＯ水(逆浸透水)を入れた４リットル密閉ボトル中に配置した。ＲＯ水を２回交換した後、透析済のサンプルをチューブから取り出し、平型容器に入れて−65℃で凍結した。最終塩濃度は、伝導度によれば典型的には0.1 wt％未満であった。
【０１５１】
次いで、凍結したサンプルをVirtis SRCX-15型凍結乾燥機に入れた。乾燥時間は水の保持量に応じて変動した。乾燥したサンプルを平型容器から取り出し、重量を測定した後、分析用に分配した。
【０１５２】
（実施例７）
この実施例ではアミノ酸の分析について説明する。
【０１５３】
実施例５および６に記載したと同様にして調製し、限外濾過、透析、凍結乾燥を行った個々のカノーラタンパク質単離物、２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓのアミノ酸含有量を分析した。２Ｓのサンプルはカノーラタンパク質単離物AL021-I30-02A C200から、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質はカノーラタンパク質単離物AL017-D29-02A C300から得た。
【０１５４】
アミノ酸分析の結果を次表７に示す。
【０１５５】
【表７】
2005522522.tif 000008
表７に示した値は、乾燥重量100ｇあたりのアミノ酸のグラム数を表している。１２Ｓのサンプルには限外濾過の後でさえ塩が残留しており、このことが７Ｓおよび２Ｓのサンプルに比較してサンプル中のアミノ酸総重量が少ないことの原因である。このデータをアミノ酸100グラムを基準に調整し、修正したデータを次表８に示す。
【０１５６】
【表８】
2005522522.tif 000009
表８から判るように、アルブミン２Ｓタンパク質は、各種アミノ酸の相対量において球状の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質と異なる。違いは表に挙げたほとんどのアミノ酸についても明らかであるが、主な相違は、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、リジンおよびプロリンに現れる。比較してみると、７Ｓと１２Ｓのプロフィールはほとんど同一であり、この分析の標準変動内に確実に収まる。グルタミン酸の量にはグルタミンの量も含まれ、アスパラギン酸の量にはアスパラギンの量が含まれる。グルタミンおよびアスパラギンの双方とも、酸による加水分解中に脱アミノ化され、アミノ酸分析で検出されることになる。
【０１５７】
表７には、個々のアミノ酸に対する分子量を記載している。個々のアミノ酸量と組み合わせて２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓに対する「遊離」アミノ酸の平均分子量を示したが、全て135 daのすぐ下である。タンパク質は無水アミノ酸からなる生体高分子なので、無水重量平均分子量(ポリペプチド１個につき１個の末端アミノ酸を除き、それぞれ１個の水分子を引いた)も記載した。２つのタンパク質の型の相違にも拘らず、重合性アミノ酸の平均分子量はほとんど同一で約117ダルトンである。このことは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで測定して14 kDaの分子量をもつ２Ｓは約120個のアミノ酸からなり、145 kDaのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分子量をもつ７Ｓには約1,240個のアミノ酸が含まれ、１２Ｓにはこの数の倍すなわち2,480個のアミノ酸が含まれている。７Ｓ／１２Ｓの各サブユニットには約413個のアミノ酸が含まれている。
【０１５８】
表８には、人が合成できない必須アミノ酸も示した。11個の必須アミノ酸の総含有量は、２つの型のタンパク質で極めて類似している。ある１つのアミノ酸が少ないと他の必須アミノ酸が増えることによってバランスが取れている。リジンは、２Ｓ中に７Ｓおよび１２Ｓ中の約２倍量が見出される。しかし、球状タンパク質は、芳香族必須アミノ酸であるチロシンおよびフェニルアラニンの総量が多く、かつ、メチオニンおよびシステインを除くと一般に脂肪族疎水性必須アミノ酸の量が多い。
【０１５９】
表８のアミノ酸の疎水性はアミノ酸100グラムあたりのKJとして表されるギブスの自由エネルギー値により判定した。ギブスの自由エネルギー値は、1996年、ニューヨーク、Marcel Dekker出版、Owen Fennema編、「食品化学(Food Chemistry)」第３版、330頁に記載されている。２つの型のタンパク質は、疎水性に対する重量合計またはエネルギー合計に関して実質的相違はないが、疎水性は、個々のアミノ酸の化学的性質だけではなく、ポリペプチドの構造的配列にも依存している。結局、球状タンパク質は中性ｐＨ(7.2)に近い等電点を有し、一方、２Ｓは、Miethらによる菜種タンパク質に関する総説(次表９)によればｐＨ9.0を超える等電点を有している。２Ｓは分子量が極めて小さく、７Ｓおよび１２Ｓはかなり大きく、水の水和に抵抗する潜在的により疎水性である内部領域を有している。
【０１６０】
アミノ酸組成は、生体高分子中のアミノ酸残基数の見積を使用することによってアミノ酸残基に換算できる。前に触れたように、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析によれば、２Ｓには約120個のアミノ酸残基が含まれ、７Ｓには約1,240個、１２Ｓには約2,480個の残基が含まれている。
【０１６１】
次表９は、２Ｓのアミノ酸について上に示したアミノ酸分析の結果を換算し、その結果を発表されているアミノ酸残基の範囲と比較したものである。
【０１６２】
【表９】
2005522522.tif 000010
換算値は発表されている結果と極めてよく一致している。Monsalveらによるより最近の研究(1990年、表９参照)更にGehrigらの研究、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93巻3647〜3652頁、1996年４月、およびEricsonらの研究、J.Biological Chem.、261巻、31号、14576〜14581頁、1986年11月により、２Ｓおよび前駆体分子、プロ-ナピン(pro-Napin)に関する実際のアミノ酸配列を含む知見が得られる。
【０１６３】
個々のアミノ酸は、表９に示した発表論文の範囲内にある。表に挙げた範囲は、菜種の種類の変化よるものであり、また、報告した実験における加水分解による少量の損失のためかもしれない。
【０１６４】
クルシフェリン(１２Ｓ)についての発表は少ないが、球状カノーラタンパク質について知られているものは本発明者らの今回の結果とよく一致している。アミノ酸分析データを表10のアミノ酸残基に換算し、１２Ｓタンパク質に対して発表されている範囲と比較した。
【０１６５】
【表１０】
2005522522.tif 000011
発表された知見は1983年のMiethらによる菜種タンパク質に関する総説からの引用である。この参照文献には特定アミノ酸残基の範囲が記載されている。本明細書に示したデータは、一般に示したようなこれら範囲と一致している。
【０１６６】
著者ら(Mieth他)は、１２Ｓの分子は６個の主要サブユニットを含み、その各ユニットは分子質量が約18,000 daおよび31,000 daの２つのポリペプチドから構成されている、と述べている。この知見は、実施例４で示したＭＡＬＤＩ−ＭＳデータで示されたことと一致している。
【０１６７】
(開示の要約)
本開示を要約すれば、本発明は、２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の特有なプロフィールを有する新規カノーラタンパク質単離物からなる組成物、ならびに単離、精製した個々のタンパク質を提供する。本発明の範囲内で修正が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】本発明の実施形態の１つによる、様々なタンパク質プロフィールをもつカノーラタンパク質単離物の製造方法に関する概略フローシートである。
【図２】本発明の他の実施形態による、様々なタンパク質プロフィールをもつカノーラタンパク質単離物の連続製造方法に関する概略フローシートである。
【図３】低温粗粉からの抽出物のＨＰＬＣ分析クロマトグラムである。
【図４】低温粗粉からの抽出物のＨＰＬＣ分析クロマトグラムである。
【図５】低温粗粉からの抽出物のＨＰＬＣ分析クロマトグラムである。
【図６】２Ｓ，７Ｓおよび１２Ｓカノーラタンパク質を個々に集めるための７回連続の分取ＨＰＬＣを重ねたものである。
【図７】２Ｓ，７Ｓおよび１２Ｓカノーラタンパク質を個々に集めるための７回連続の分取ＨＰＬＣを重ねたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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