(57)【要約】  標的分子への高い結合能ならびに高い光音響信号を発信する新規な光音響イメージング用造影剤を提供すること。近赤外線領域の光を吸光する酸化鉄粒子を含有する粒子と、前記酸化鉄粒子を含有する粒子に固定された少なくとも１つ以上のリガンド分子とを含み、前記リガンド分子の固定化密度が標的分子の細胞表面密度以上であることを特徴とし、化１で表される光音響分子イメージング用造影剤。ＭＮＰ−（（Ｌ）ｌ−（Ｐ）ｍ）ｎ    （化１）（式中、ＭＮＰは酸化鉄粒子を含有する粒子であり、Ｌはリンカー分子、Ｐはリガンド分子である。ｌは０あるいは１である。ｍ、ｎは１以上の整数である。）
2011043061.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
近赤外線領域の光を吸収する酸化鉄粒子を含有する粒子と、前記酸化鉄粒子を含有する粒子に固定された少なくとも１つ以上のリガンド分子とを含み、前記リガンド分子の固定化密度が標的分子の細胞表面密度以上であることを特徴とし、化１で表される光音響イメージング用造影剤。
ＭＮＰ−（（Ｌ）ｌ−（Ｐ）ｍ）ｎ      （化１）（式中、ＭＮＰは酸化鉄粒子を含有する粒子であり、Ｌはリンカー分子、Ｐはリガンド分子である。ｌは０あるいは１である。ｍ、ｎは１以上の整数である。）
【請求項２】
前記リガンド分子は、前記酸化鉄粒子を含有する粒子１個に対して、３個以上、固定されていることを特徴とする請求項１に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項３】
前記リガンド分子が、少なくともモノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、もしくは抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチド、または上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に結合する抗体またはペプチドの何れかであることを特徴とする請求項１または２のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。  
【請求項４】
前記リンカー分子がポリエチレンオキシドであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項５】
前記ポリエチレンオキシドの分子量が１００から１００００であることを特徴とする請求項４に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項６】
前記酸化鉄粒子を含有する粒子がデキストランをマトリックスとする粒子であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項７】
前記酸化鉄粒子を含有する粒子がマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤を用いた標的分子を検出するためのイメージング方法であって、該光音響イメージング用造影剤を細胞、組織、動物、あるいはヒトの検体に投与するステップと、パルス光を該検体に照射するステップと、該検体内に存在する該標的分子に結合した該光音響イメージング用造影剤由来の光音響信号を測定するステップと、を少なくとも有することを特徴とする標的分子の光音響イメージング方法。
【請求項９】
前記酸化鉄粒子を含有する粒子の粒子モル吸光係数が１０９（Ｍ−１・ｃｍ−１）以上であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１０】
前記酸化鉄粒子を含有する粒子中に含まれる鉄原子量が１０７個以上であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１１】
酸化鉄粒子を有する光音響イメージング用造影剤において、一本鎖抗体が前記粒子に結合していることを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項１２】
請求項１１に記載の光音響イメージング用造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程と、
前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波を検出する工程と、
を有することを特徴とする光音響イメージング方法。
【請求項１３】
酸化鉄粒子を有する光音響イメージング用造影剤において、前記酸化鉄粒子の粒径が１５ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項１４】
酸化鉄粒子を有する光音響イメージング用造影剤において、前記酸化鉄粒子の粒径が２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項１５】
前記酸化鉄粒子が、炭素数６以下のヒドロキシカルボン酸を有するモノマーからなるホモポリマー、又は前記ヒドロキシカルボン酸を有する２種類のモノマーからなるコポリマー、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルのいずれかの疎水性ポリマーで被覆されていることを特徴とする請求項１３または１４に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１６】
請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤はさらに両親媒性化合物を有し、前記両親媒性化合物が、リン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、両親媒性ポリマーのうちの、各々単独の両親媒性化合物、又は各々複数の両親媒性化合物であることを特徴とする請求項１及び２の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１７】
前記ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルが、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、及びＴｗｅｅｎ８０のいずれかであることを特徴とする請求項１６に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１８】
前記リン脂質が、アミノ基、カルボキシル基、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシニミド）基、マレイミド基、メトキシ基、及び水酸基より選ばれた１つ以上の官能基と、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）鎖を有するホスファチジル系リン脂質であることを特徴とする請求項１６に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１９】
前記両親媒性ポリマーがＰＥＧ鎖を導入したオクタデセン−無水マレイン酸交互共重合体、ＰＥＧ鎖を導入したスチレン−無水マレイン酸共重合体、ＰＥＧ鎖を導入したポリ乳酸、ＰＥＧ鎖を導入した乳酸−グリコール酸共重合体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリビニルアルコールのいずれかであることを特徴とする請求項１６に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項２０】
前記両親媒性化合物の少なくとも一部に捕捉分子が結合した請求項１３乃至１９のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項２１】
前記捕捉分子が、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物より選ばれた請求項２０に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項２２】
請求項１３乃至２０のいずれかに記載の光音響イメージング用造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程と、
前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波を検出する工程と、
を有することを特徴とする光音響イメージング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光音響イメージング用造影剤、及び、それを用いた光音響イメージング方法に関する
【背景技術】
【０００２】
近年、光学的画像診断法としての光音響イメージングが報告されている。これは、光に比べて生体（検体）内での散乱が少ない超音波の特性を利用し、生体内における光エネルギーの吸収密度分布を高解像度でイメージングする方法である。具体的には、パルス光を生体に照射し、生体内で伝播・拡散した前記パルス光のエネルギーを吸収した生体組織から発生した音響波（超音波）信号を検出し、それらの信号を解析処理することにより、生体内の光エネルギー吸収密度分布を取得する方法である。光音響イメージングは、簡便で非侵襲な診断方法であるが、生体組織における光の散乱と吸収により、生体内で入射光のエネルギーが体表からの距離に依存して大きく減衰してしまう結果、生体深部の情報を得ることは困難となる。生体透過性の観点から、近赤外光を用いた光音響イメージングの実現が期待されている。【０００３】
光音響イメージングにおいて、検出感度やコントラストを向上させるための光音響イメージング用造影剤が報告されている（非特許文献１）。生体内に投与された前記造影剤は、観察対象となる生体組織内に分布し、前記組織に照射されたパルス光エネルギーを吸収し、音響波を発生させることが出来る。従って、前記光音響イメージング用造影剤は、それらが存在する組織のみかけの吸光係数を増加させること、すなわち内因性組織由来の音響波に前記光音響イメージング用造影剤由来の音響波を加算することができ、観察対象組織の検出感度を向上させることになる。前記光音響イメージング用造影剤の化合物の例として、非特許文献１には酸化鉄粒子を含有する粒子が開示されている。マグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）を主成分とする酸化鉄粒子を含有する粒子から光音響信号を取得しており、前記光音響イメージング用造影剤としての実用可能性を示している。【０００４】
また、病変部位に特異的に発現する分子の光音響イメージングのための造影剤が報告されている（例えば特許文献１、非特許文献２）。特定の分子に特異的に結合することのできるリガンド分子を有する造影剤は標的分子に結合し、造影剤からの光音響信号を検出することで、標的分子の在否、量、ならびにその位置情報を得ることが可能になる。【０００５】
特許文献１と非特許文献２では、光音響イメージング用造影剤の光音響信号発信部として、近赤外蛍光色素で修飾されたペプチドあるいは抗体が開示されている。この蛍光色素標識化されたペプチドあるいは抗体を用いると、標的分子への特異的な結合が可能になるため、光音響イメージングが可能になると考えられる。しかしながら、光音響イメージングにおいて、光音響イメージング用造影剤の感度が低い、すなわち造影剤１分子あたりの吸光係数が低いという課題がある。この課題は、標的分子の発現量が低い時に、あるいは標的分子が生体深部に存在する時に、よりいっそう深刻になる。一方、一本鎖抗体単独では、全抗体単独に比べて結合性能は低い。また、全抗体に有機色素を多数結合させた場合、抗原への結合性能が不十分である。そこで、色素を結合させたときでも、抗原への結合性能が十分な光音響イメージング用造影剤が求められていた。【０００６】
また、特許文献２には、抗ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）抗体の一本鎖抗体フラグメントを酸化鉄粒子を含有する粒子に固定化した粒子が開示されている。しかし、特許文献２の粒子は腫瘍の温熱療法に用いることを目的としたものであり、イメージング用造影剤としての最適な分子設計ならびにその光音響発信能についてはなんら開示されていない。【０００７】
酸化鉄粒子は、その物理的性質を利用して、医療分野に応用がされてきた。その超常磁性を利用し、酸化鉄粒子は、磁気共鳴装置（ＭＲＩ）の造影剤としてすでに実用化されている。酸化鉄粒子のＭＲＩ造影剤としての有効性や、生体への安全性は確認されている。【０００８】
また、酸化鉄粒子を含有するデキストラン粒子であるリゾビスト（登録商標）を用いて、光音響造影が試みられている（非特許文献３）。酸化鉄粒子が光を吸収し、音波を発生するメカニズムを利用している。【０００９】
さらに、特定の組織に特異的に結合する捕捉分子を酸化鉄粒子に固定化すれば、診断に使うプローブとして用いることができる。癌組織には、正常組織とは異なり、特異的な受容体が発現している。上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）は、癌組織に特異的に発現している受容体の１つである。酸化鉄を含有する造影剤にＨＥＲ２の抗体を固定化し、癌に集積した造影剤をＭＲＩで検出することで、癌をイメージングできることが報告されている（特許文献２）。【００１０】
特許文献２には、抗ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）抗体の一本鎖抗体フラグメントを酸化鉄ナノ粒子に固定化した粒子が開示されている。しかし、特許文献２の粒子は腫瘍の温熱療法に用いることを目的としたものであり、イメージング用造影剤としての最適な分子設計ならびにその光音響発信能についてはなんら開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００３−５００３６７号公報
【特許文献２】ＷＯ２００８／１３４５８６号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ＩＥＥＥ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ３９３，（２００６）
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１９（６），１１８６−１１９３（２００８）
【非特許文献３】Ｂｉｏｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｋ  （ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）  ２００９、５４：８３−８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
非特許文献１に記載の光音響イメージング用造影剤としての酸化鉄粒子では、リガンド分子を持たないため、原理上、標的分子を特異的に造影することは困難である。【００１４】
特許文献１と非特許文献２に記載の蛍光色素修飾抗体や蛍光色素修飾ペプチドでは、標的分子への特異的な結合は可能であるものの、蛍光発光による入射光エネルギーの損失ならびに蛍光色素１分子あたりの低い吸光係数から、十分な光音響信号が得られない可能性がある。さらに、抗体やペプチドを多くの蛍光色素で修飾することは、当該抗体やペプチドの標的分子に対する結合能の低下を引き起こすため、感度向上には制限がある。【００１５】
そこで本発明は、標的分子への高い結合能を有し、ならびに高い光音響信号を発信する新規な光音響イメージング用造影剤を提供することを目的とする。【００１６】
また、非特許文献３では、酸化鉄粒子を含有するデキストラン粒子であるリゾビスト（登録商標）が光音響造影剤として使われている。しかし、この文献では、ＭＲＩで肝癌を造影することを目的として開発され造影剤であるリゾビストを用いており、その酸化鉄粒子の粒径はＭＲＩの造影に好ましい１〜１０ｎｍと、粒径が小さく、光音響造影剤として、得られる信号強度が弱いという課題があった。【００１７】
そこで本発明では、酸化鉄粒子を有し、該酸化鉄粒子の粒径は１５ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることを特徴とする光音響イメージング用造影剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は近赤外線領域の光を吸収する酸化鉄粒子を含有する粒子と、前記酸化鉄粒子を含有する粒子に固定された少なくとも１つ以上のリガンド分子とを含み、前記リガンド分子の固定化密度が標的分子の細胞表面密度以上であることを特徴とし、化１で表される光音響イメージング用造影剤を提供する。
ＭＮＰ−（（Ｌ）ｌ−（Ｐ）ｍ）ｎ      （化１）（式中、ＭＮＰは酸化鉄粒子を含有する粒子であり、Ｌはリンカー分子、Ｐはリガンド分子である。ｌは０あるいは１である。ｍ、ｎは１以上の整数である。）【００１９】
また、酸化鉄粒子を有し、該酸化鉄粒子の粒径は平均１５ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることを特徴とする光音響イメージング用造影剤を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の光音響イメージング用造影剤は、リガンド分子が固定化され、高い近赤外線領域の光を吸収する酸化鉄を含有する粒子を用いたため、高感度な光音響イメージング用造影剤として用いられることができる。【００２１】
特に、リガンド分子として、ＨＥＲ２に結合する分子を用いることで、ＨＥＲ２発現細胞表面、細胞内またはその周辺に前記造影剤を多く存在させることができる。結果的にＨＥＲ２発現細胞表面、その細胞内またはその周辺からの光音響信号は他の部位に比べて大きくなる。【００２２】
また、抗体として一本鎖抗体を用い、酸化鉄を含む粒子に結合させることで、抗原に対する結合性能がより高い光音響イメージング用造影剤を提供することができる。【００２３】
本発明によれば、強い光音響信号を発する酸化鉄粒子を用いることから、従来技術に比べて優れた光音響信号を発する造影剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明のリガンド分子と酸化鉄粒子を含有する粒子からなる光音響イメージング用造影剤を示す模式図である。
【図２】本発明の光音響イメージング用造影剤の一例である抗体固定された酸化鉄粒子の細胞表面ＨＥＲ２分子１個あたりの抗体数（抗体／ＨＥＲ２のモル比）を示すグラフである。
【図３Ａ】本発明の光音響イメージング用造影剤の一例である抗体固定された酸化鉄粒子のＨＥＲ２結合能ならびに結合特異性評価の結果である。
【図３Ｂ】本発明の光音響イメージング用造影剤の一例である抗体固定された酸化鉄粒子のＨＥＲ２結合能ならびに結合特異性評価の結果である。
【図４Ａ】抗体固定された酸化鉄粒子の光音響信号測定の結果である。
【図４Ｂ】抗体固定された酸化鉄粒子の光音響信号測定の結果である。
【図４Ｃ】抗体固定された酸化鉄粒子の光音響信号測定の結果である。
【図５】担癌マウスに投与されたリガンド分子固定化酸化鉄粒子の体内動態結果（投与後２４時間目）である。
【図６】担癌マウスに投与された粒子サイズの異なるｓｃＦｖ固定化酸化鉄粒子の体内動態結果（投与後２４時間目）である。
【図７Ａ】（１）光音響信号と粒子モル吸光係数の関係を示すグラフ。（２）粒子モル吸光係数と粒子中の鉄含有量（１粒子あたりの鉄量）の関係を示すグラフ。
【図７Ｂ】（１）光音響信号と粒子モル吸光係数の関係を示すグラフ。（２）粒子モル吸光係数と粒子中の鉄含有量（１粒子あたりの鉄量）の関係を示すグラフ。
【図８】担癌マウスに投与された粒子サイズの異なるｓｃＦｖ固定化酸化鉄粒子の腫瘍集積性（投与後２４時間目、％ＩＤ／ｇ表記）を示すグラフである。
【図９】担癌マウスに投与されたＨＥＲ２結合性ペプチドを固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子ＨＢＰ−ＥＯ−ＮＰ―２００の体内動態結果（投与後２４時間目）である。
【図１０】担癌マウスに投与されたｓｃＦｖ−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００およびｓｃＦｖ−ＥＯ５ｋ−ＮＰ―２００の体内動態結果（投与後２４時間目）である。
【図１１】自作した小動物用光音響イメージング装置の略図である。
【図１２】マウス皮下におけるｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００の光音響イメージングの結果である。
【図１３Ａ】本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤の構造を示す概略図である。
【図１３Ｂ】本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤の構造を示す概略図である。
【図１３Ｃ】本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤の構造を示す概略図である。
【図１３Ｄ】本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤の構造を示す概略図である。
【図１３Ｅ】本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤の構造を示す概略図である。
【図１３Ｆ】本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤の構造を示す概略図である。
【図１３Ｇ】本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤の構造を示す概略図である。
【図１３Ｈ】本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤の構造を示す概略図である。
【図１３Ｉ】本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤の構造を示す概略図である。
【図１３Ｊ】本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤の構造を示す概略図である。
【図１４Ａ】本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤を製造する工程の一例を示す図である。
【図１４Ｂ】本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤を製造する工程の一例を示す図である。
【図１５】光音響信号強度の波形である。
【図１６Ａ】酸化鉄粒子の粒径に対するモル吸光係数と光音響信号である。
【図１６Ｂ】酸化鉄粒子の粒径に対するモル吸光係数と光音響信号である。
【図１６Ｃ】酸化鉄粒子の粒径に対するモル吸光係数と光音響信号である。
【図１６Ｄ】酸化鉄粒子の粒径に対するモル吸光係数と光音響信号である。
【図１７Ａ】光音響イメージング用造影剤１（ＮＰ１）の評価結果である。
【図１７Ｂ】光音響イメージング用造影剤１（ＮＰ１）の評価結果である。
【図１８Ａ】光音響イメージング用造影剤２（ＮＰ２）の評価結果である。
【図１８Ｂ】光音響イメージング用造影剤２（ＮＰ２）の評価結果である。
【図１９】光音響イメージング用造影剤３（ＮＰ３）のｃｒｙｏ−ＴＥＭ像である。
【図２０Ａ】光音響イメージング用造影剤の粒径と光音響信号の関係を示す図である。
【図２０Ｂ】光音響イメージング用造影剤の粒径と光音響信号の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、図面等を通して本発明の実施形態について説明する。なお、個々に開示する実施形態は、本発明光音響イメージング用造影剤、及び、その造影剤を用いた光音響イメージングの例であり、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
【００２６】
（第一実施形態）
第一の実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、化１で表される、近赤外線領域の光を吸収する酸化鉄粒子を含有する粒子と、前記酸化鉄粒子を含有する粒子に固定された少なくとも１つ以上のリガンド分子とを含み、前記リガンド分子の固定化密度が標的分子の細胞表面密度以上であることを特徴とする。
【００２７】
ＭＮＰ−（−（Ｌ）ｌ−（Ｐ）ｍ）ｎ                          （化１）（式中、ＭＮＰは酸化鉄粒子を含有する粒子であり、Ｌはリンカー分子、Ｐはリガンド分子であり、ｌは０あるいは１で、ｍ、ｎは１以上の整数である。）
【００２８】
本実施形態の光音響イメージング用造影剤は、酸化鉄粒子を含有する粒子の持つ高い近赤外線領域における吸光係数に注目し、近赤外線領域の光を吸収する前記酸化鉄粒子を含有する粒子を前記リガンド分子と組合せて光音響イメージングに利用できることと、前記リガンド分子の固定化密度が標的分子の細胞表面密度以上であることとに特徴がある。
【００２９】
本発明は、酸化鉄粒子を含有する粒子とターゲッティング分子からなる複合体とが、光音響イメージング用造影剤として好適であることと、前記ターゲッティング分子の固定化密度が標的分子の細胞表面密度以上であることが光音響イメージング用造影剤として好適であることを示した最初の例である。
【００３０】
（光音響イメージング用造影剤）
本発明において「造影剤」とは、主に検体内にあって観察したい組織や分子とその周囲の組織や分子とのコントラスト差を生じさせ、当該観察したい組織や分子の形態情報あるいは位置情報の検出感度を向上させることができる化合物と定義する。ここで「光音響イメージング用造影剤」とは、光音響イメージングに用いられる造影剤を意味する。
【００３１】
（酸化鉄粒子）
本実施形態に用いる酸化鉄粒子としては、６００ｎｍ以上１３００ｎｍ以下の近赤外波長領域の光を吸収して光音響信号を発信し、人体に無害なものであれば特に制限されないが、Ｆｅ３Ｏ４（マグネタイト）、γ−Ｆｅ２Ｏ３（マグヘマイト）、またはこれらの混合物を用いることが好ましい。特に好ましくは、マグネタイトである。当該マグネタイトは、マグヘマイトより近赤外波長領域におけるモル吸光係数が高いことが知られており、従って光音響信号も強くなると考えられる。前記マグネタイトを信号発信部として用いることで、従来の光音響イメージング用造影剤よりも感度を向上させることが可能になる。また、酸化鉄粒子は、単結晶、多結晶、非晶質のいずれの結晶状態でもよい。また、酸化鉄粒子の数は、１個でも良いし、２個以上からなる２次粒子でも良い。なお、酸化鉄粒子の粒径が大きい場合、例えば５０ｎｍの場合、造影剤に含まれる酸化鉄粒子の数が多くなるほど、鉄原子１モルあたりのモル吸光係数の値、及び、鉄原子１モルあたりから測定される光音響信号の値は大きい。一方で、酸化鉄粒子の粒径が５ｎｍの場合、造影剤に含まれる酸化鉄粒子の数が多くなっても、鉄原子１モルあたりのモル吸光係数、及び測定される光音響信号の値はあまり変わらない。
【００３２】
本実施形態の酸化鉄粒子の粒径は、１〜１０００ｎｍのものを利用できるが、好ましくは１〜１００ｎｍのものが好ましい。前記酸化鉄粒子の粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察やＸ線回折法などの公知の方法で測定することができる。前記酸化鉄粒子は、公知の酸化鉄粒子作製法により適宜作製して使用することもできるし、市販品を使用してもよい。
【００３３】
ここで近赤外光あるいは近赤外線領域の光とは、近赤外線領域６００〜２５００ｎｍの波長を有する電磁波のことをいう。本実施形態において、６００〜１３００ｎｍの波長を有する近赤外線領域の光が好ましく、７００〜８００ｎｍの波長の近赤外線領域の光が特に好ましい。この波長領域では、検体分子による吸収が低く、検体組織に比較的深く浸透でき、また検体に対して安全だからである。
【００３４】
なお、本実施形態の光音響イメージング用造影剤の吸収領域が近赤外線領域６００〜２５００ｎｍであることが好ましいが、この領域に限ることはない。検体内に投与後、検体内観察あるいは観察対象を検体外に取り出して観察を行う場合は、紫外光及び７００ｎｍ以下の可視光領域の光も使用することができる。
【００３５】
（酸化鉄粒子を含有する粒子）
本実施形態において酸化鉄粒子を含有する粒子とは、上記酸化鉄粒子のみからなる粒子、あるいは、デキストランなどの高分子やシリカなどのマトリックスに酸化鉄粒子が含まれている粒子を意味する。本実施形態に係る酸化鉄粒子を含有する粒子の直径は流体力学的観点から１〜１０００ｎｍであることが好ましい。ここで、「マトリックス」とは、酸化鉄粒子を内包あるいは保持し、酸化鉄粒子と複合体形成可能な化合物のことをいい、前記酸化鉄粒子を安定して内包あるいは保持できる化合物であればどのようなものでもよい。水溶性や水分散性の観点から、前記マトリックスはデキストラン、ポリアミノ酸、ポリエチレングルコール、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、アルブミン、コラーゲンなど親水性高分子が好ましく、その中でも特にデキストランが好ましい。
【００３６】
酸化鉄粒子を含有する粒子を構成する、前記マトリックス、例えばデキストランと酸化鉄粒子の重量比（マトリックス（ｇ）／酸化鉄（ｇ））は１以上であることが好ましい。この値は、酸化鉄粒子の被覆状態を表しており、値が小さいほど酸化鉄粒子が表面に露出しやすくなり、粒子の分散安定性が悪くなる。通常０．１から１０が好ましく、更に好ましくは１から５の範囲内である。
【００３７】
また、前記マトリックスは、酸化鉄粒子を含有する粒子の凝集を抑制する作用を有する化合物であることが好ましく、かつリガンド分子を固定化させるための官能基を有する化合物が好ましい。例えば、好ましい前記化合物はデキストランであり、好ましい前記官能基は、カルボキシル基、アミノ基、マレイミド基、ヒドロキシル基である。前記デキストランへの前記官能基の導入は、公知の化学修飾法に従って実施可能である。例えば、デキストラン粒子をエピクロロヒドリンで架橋後、アンモニア処理により、アミノ基を有するデキストラン粒子を作製できる。前記酸化鉄粒子を含有する粒子は、公知の粒子を含有する粒子作製法により適宜作製して使用することができるし、市販品を使用してもよい。  
【００３８】
（リガンド分子）
「リガンド分子」とは、標的分子と特異的に結合することのできる化合物を意味する。また、ここでいう「特異的に結合」とは、標的分子との解離定数ＫＤ（値が低いほど結合親和性は高い）が１μＭ以下であると定義されている。前記リガンド分子としては、標的分子に対して１μＭ以下の解離定数を有する化合物であれば特に限定されず、酵素、抗体、受容体、サイトカイン、ホルモン、血清タンパク等が挙げられる。本実施形態のリガンド分子として、解離定数の低さ、分子の構造安定性の観点から、特に抗体が好ましい。
【００３９】
ここでいう「抗体」とは、特定の抗原又は物質に応答して免疫系により誘発されるイムノグロブリンファミリーのタンパク質の総称であり、特定の標的分子を認識し、かつこの標的分子に結合することができる物質である。前記抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体であり得、または他の種から由来し得る。また、前記抗体は、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体とのいずれでもよい。さらに、前記抗体の一部分であり、当該抗体より低分子化された、標的分子結合能を有するそれらの誘導体である抗体フラグメントであってもよい。前記抗体フラグメントとしてはＦａｂフラグメント（以下「Ｆａｂ」と略すことがある）、Ｆａｂ’フラグメント（以下「Ｆａｂ’」と略すことがある）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン単独、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン単独、ＶＨとＶＬの複合体、あるいはラクダ化ＶＨドメイン、または抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチド等がある。
【００４０】
これらのうち、特に好ましくはペプチドリンカーで、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結した一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）であり、更には、ヒト化一本鎖抗体が特に好ましい。前記一本鎖抗体は、各種抗原に対応して安価かつ簡便に作製することができ、かつ、通常の抗体と比べて分子量が小さいため、前記酸化鉄粒子を含有する粒子あたりの抗体固定化量を増加させることが可能になる。さらに、前記抗体のＦｃ部位（定常部位）を持たないため抗原性（本発明の光音響イメージング用造影剤が投入される個体での抗原性）を低減させることができる。そのため、一本鎖抗体は本実施形態の光音響イメージング用造影剤のリガンド分子として特に好ましい。
【００４１】
（標的分子）
本実施形態の光音響イメージング用造影剤は、腫瘍のような病的組織の診断における光音響イメージングに用いられることが特に好ましい。従って、本実施形態において、「標的分子」とは、生物由来の検体分子であれば特に制限されないが、病変部位で特異的に発現している検体分子、特に腫瘍部位に特異的に発現している検体分子を意味する。例えば腫瘍抗原、受容体、細胞表面の膜タンパク質、タンパク質分解酵素、サイトカイン等が挙げられ、本実施形態にとっての標的分子は腫瘍抗原であることが好ましい。
【００４２】
前記腫瘍抗原の具体例としては、Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ファミリー、Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）ファミリー、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）ファミリー、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ファミリー、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、インテグリンファミリー、Ｉ型インスリン様増殖因子受容体（Ｔｙｐｅ  １ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＩＧＦ−１Ｒ）、ＣＤ１８４抗原（ＣＸＣケモカインレセプター４：ＣＸＣＲ４）、胎盤増殖因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰｌＧＦ）などが挙げられ、特に好ましくは、ＥＧＦＲファミリーである上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）である。  
【００４３】
前記腫瘍抗原と特異的に結合するリガンド分子は当業者であれば容易に入手可能であり、例えば、前記抗原又はその部分ペプチドを免疫原として公知の抗体作製法により抗体を適宜作製して使用することもできる。その作製された抗体の遺伝子配列情報から、遺伝子組み換え法により一本鎖抗体を組換えタンパク質として取得することもできる。また、市販品を使用してもよい。
【００４４】
（酸化鉄粒子を含有する粒子とリガンド分子との結合反応）
前記酸化鉄粒子を含有する粒子とリガンド分子とは、当該酸化鉄粒子を含有する粒子の表面に存在する官能基、例えばカルボキシル基、アミノ基、マレイミド基、ヒドロキシル基などを反応基とし、リガンド分子と従来周知のカップリング反応によって直接に結合する。直接結合の具体例として、アミド化反応等が挙げられる。この反応は、例えば、カルボキシル基またはそのエステル誘導体とアミノ基の縮合により行なわれる。カルボキシル基を直接アミド化する場合には、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’−Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）や１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）などのカルボジイミド縮合剤を用いることができるし、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などを用いてカルボキシル基を予め活性化エステルとしてアミド化反応を促進させることもできる。
【００４５】
そのほかにも、チオール基とマレイミド基との結合反応も好ましい。この反応では、中性領域において効率的かつ選択的な結合反応が行える。前記反応によりリガンド分子を結合した酸化鉄粒子を含有する粒子は、限外ろ過法、ゲルろ過クロマトグラフィー法などにより洗浄、精製することができる。また、酸化鉄粒子を含有する粒子が強磁性体であれば永久磁石を用いた磁気分離法により、洗浄や精製を行うことができる。一方、酸化鉄粒子が非常に小さく、超常磁性を示す場合では、高勾配磁場下での磁気カラムを用いて、酸化鉄粒子を含有する粒子の洗浄、精製を行うことができる。
【００４６】
（リンカー分子）
また、本実施形態の光音響イメージング用造影剤において、前記酸化鉄粒子を含有する粒子と前記リガンド分子との結合は直接結合に限らず、適宜リンカー分子を介して結合していてもよい。ここで「リンカー分子」とは、前記酸化鉄粒子を含有する粒子と前記リガンド分子とを連結させる化合物と定義する。前記リンカー分子としてはアルカンジチオール、アルカンジアミンなどの二官能性短鎖アルカン、二官能性ポリエチレンオキシドなどが利用できる。例えば、前記リンカー分子の末端基を前記酸化鉄粒子を含有する粒子の有する官能基と、前記リンカー分子のもう一方の末端基を前記リガンド分子の有する官能基とそれぞれ結合させればよい。
【００４７】
前記化１において、リンカー分子の数ｌは０あるいは１である。０の場合は酸化鉄粒子を含有する粒子とリガンド分子が直接結合している。この場合、ｍは１となり、ｍとｎは等しく、粒子に固定されるリガンド分子の数はｎである。一方、ｌが１である場合は、酸化鉄粒子を含有する粒子と前記リガンド分子はリンカー分子Ｌを介して結合している。ｌ、ｍがともに１の場合は、粒子に固定されるリガンド分子の数はｎである。しかし、リンカー分子が多官能性分子であり、リンカー１分子に複数のリガンド分子が結合している場合、つまりｌは１で、ｍは２以上となるとき、粒子に固定されるリガンド分子の数はｍ×ｎとなる。ｌとｍは１であることが好ましい。
【００４８】
前記酸化鉄粒子を含有する粒子と前記リガンド分子とが前記リンカー分子と結合する方法や、前記リンカー分子の種類については前記のものに限定されることはなく、利用可能な種々の結合方法及び公知のリンカー分子から当業者が適宜に選択できる。なお、本発明の光音響イメージング用造影剤は、検体内で利用される観点から、水中で安定に分散できることが好ましいため、前記リンカー分子は水溶性のものが特に好ましい。例えば、二官能性ポリエチレンオキシドが好ましい。実施例で後述するように、ポリエチレンオキシドをリンカー分子として用いると、造影剤の粒子収量（仕込み量に対する最終精製量の割合）が向上するばかりでなく、光音響イメージング用造影剤の水中における分散安定性も向上する。ポリエチレンオキシドの分子量は、前記酸化鉄粒子を含有する粒子と前記リガンド分子の機能を阻害しない範囲で、自由に選択可能であるが、ポリエチレンオキシドの分子量の過剰な増加は、前記酸化鉄粒子を含有する粒子の表面への前記リガンド分子の結合反応効率を低下させることが考えられる。従って、その平均分子量が１００〜２０００、特に平均分子量３００のポリエチレンオキシドが好ましい。従って、その平均分子量が１００〜１００００、特に１００〜５０００の範囲が好ましく、さらに好適なものとして、平均分子量３００のポリエチレンオキシドが好ましい。
【００４９】
（光音響イメージング用造影剤の粒径）
流体力学の観点から、本実施形態の光音響イメージング用造影剤の平均粒径は１〜５００ｎｍ、好ましくは１０〜２００ｎｍである。前記造影剤の粒径の増大は、当該造影剤の被貪食性を高め、その血中半減期を低下させ、また、組織拡散性を低下させることが考えられる。前記標的分子の存在部位によって、最適な粒径に適宜調整して用いればよい。例えば、血管内に標的分子が存在する場合、前記造影剤の粒径は１μｍ程度まで大きくてもよい。一方、血管外の標的分子に対しては、前記造影剤の流体力学的平均粒径は１〜５００ｎｍ、特に１０〜２００ｎｍであることが好ましい。光音響信号強度の観点からは、１粒子あたりの鉄含有量は高いほうがよい。そのため、体内動態と光音響信号の両観点からは、１００〜５００ｎｍが好ましい。実施例で後述するように、鉄含有量が高い、１７１．７ｎｍ（個数換算分布）のターゲット分子を有する酸化鉄粒子において、高い吸光係数と標的分子への高い結合能、ならびに良好な腫瘍集積性が確認されており、光音響イメージング用造影剤としての高い実用性が示されている。
【００５０】
一般的な血管外腫瘍組織への前記造影剤の輸送において、血管内から血管外組織への移行、血管外組織中における標的分子への移行経路において、小さい粒径の前記造影剤は前記造影剤の組織拡散性の観点で有利だと考えられる。一方で、表面に前記リガンド分子が固定化された酸化鉄粒子を含有する粒子の平均粒径が大きくなるため、血管外組織の腫瘍の光音響イメージングにおいては、小さいサイズのリガンド分子が好ましいと考えられる。したがって、通常の抗体と比べて分子量が小さい一本鎖抗体は、本実施形態の光音響イメージング用造影剤のリガンド分子として特に好ましい。また、当該光音響イメージング用造影剤の平均粒径は、動的光散乱法などの公知の方法で測定することができる。
【００５１】
（光音響イメージング用造影剤の機能的親和性）
本実施形態の光音響イメージング用造影剤では、前記酸化鉄粒子を含有する粒子１個あたり、少なくとも１つ以上のリガンド分子を有している。前記酸化鉄粒子を含有する粒子１個あたりに結合する前記リガンド分子の数（価数）、すなわち前記リガンド分子の固定化密度（ｎｇ／ｃｍ２）は、前記光音響イメージング用造影剤の標的分子への結合能に大きく影響すると考えられる。具体的には、前記リガンド分子の価数の増加で生じた多点結合作用は、前記光音響イメージング用造影剤の機能的親和性（「みかけの親和性」とも言うが、以下「結合能」ということがある）を増強したことになる。前記機能的親和性の増強により、前記光音響イメージング用造影剤は標的分子により強く結合することができ、高コントラストな光音響イメージングが可能になる。また、前記機能的親和性の評価は、ＥＬＩＳＡ（ＥＮＺＹＭＥ−ＬＩＮＫＥＤ  ＩＭＭＵＮＯＳＯＲＢＥＮＴ  ＡＳＳＡＹ）による方法、分光学的方法、水晶発振子（ＱＣＭ）を用いる方法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を利用した方法などで行うことが出来る。前記光音響イメージング用造影剤と標的分子との解離定数（もしくは「みかけの解離定数」）は１μＭ以下であるべきであるが、好ましくは１０ｎＭ以下であり、さらに好ましくは１ｎＭ以下である。
【００５２】
化１において、粒子に固定されるリガンド分子の数はｍ×ｎである。後述するように、造影剤の機能的親和性を高めるためには、ｍ並びにｎは大きい方が好ましい。標的分子の細胞表面密度以上の固定化密度でリガンド分子を固定することが本発明の本質であり、従って、ｎは標的分子の細胞表面密度に依存する値である。一般には、ｍは１、ｎは１から３０００００から選択することが好ましいが、更に好ましくは、粒子径が２０ｎｍ程度の酸化鉄粒子に対しては、ｍは１、ｎは２から５０である範囲である。粒子径が大きくなるにつれて、多くのリガンド分子を固定することが可能になる。例えば、２００ｎｍの酸化鉄粒子に対しては、数百から数万個のリガンド分子を固定することが可能になる。固定化数はリガンド分子のサイズに依存する。
【００５３】
また、前記リガンド分子の固定化密度は、前記光音響イメージング用造影剤の前記標的分子への結合能以外にも、分散安定性や体内動態にも影響すると考えられる。例えば、マレイミド基を表面に有する前記酸化鉄粒子を含有する粒子が疎水性であるために水中での分散安定性が悪い場合があるが、前記リガンド分子の固定化密度の増加により、前記酸化鉄粒子を含有する粒子の分散安定性を改善しうる。
【００５４】
（光音響イメージング用造影剤の結合能向上）
前記リガンド分子の固定化密度が、前記標的分子が細胞表面に存在する密度（細胞表面密度）以上である場合に、高い結合状態を実現できると考えられる。従って、効果的に多点結合作用を生じさせることができるように、前記標的分子の細胞表面密度がわかれば、それに対応した所望のリガンド分子の固定化密度を有する光音響イメージング用造影剤を設計可能になる。ここで重要なことは、前記リガンド分子が固定化された状態でどれだけ結合活性を保っているかという問題があり、これにより固定化密度と結合能との関係は変化しうる。また、前記酸化鉄粒子を含有する粒子の表面に固定化できる前記ターゲット分子数は前記酸化鉄粒子を含有する粒子の表面積と活性基との数により上限があり、さらに前記リガンド分子のサイズにも依存する。従って、前記光音響イメージング用造影剤の結合能向上のためには、前記標的分子密度や前記リガンド分子のサイズ、前記リガンド分子の固定化後の結合活性維持率などに基づいた合理的なリガンド分子を固定することが重要である。
【００５５】
実施例で後述するように、本実施形態の光音響イメージング用造影剤の一例として、ＨＥＲ２に対して高い結合能と結合選択性を有する造影剤が示されている。具体的には、前記リガンド分子の固定化密度をＨＥＲ２の細胞表面密度以上とするために次のような構成とする。すなわち、後述の実施例のように、前記ターゲット分子は、前記酸化鉄粒子を含有する粒子（流体力学的直径２０ｎｍ）に、前記酸化鉄粒子を含有する粒子１個あたり３個以上、特に好ましくは７個以上に固定化されている。さらに、一本鎖抗体を選択し、かつ酸化鉄粒子を含有する粒子への固定化には前記一本鎖抗体のＣ末端に変異導入したシステインを用いて、部位特異的固定化法を採用した。その結果、前記一本鎖抗体の結合活性を維持した形で、前記酸化鉄粒子を含有する粒子に多く固定された一本鎖抗体の固定化密度がＨＥＲ２の細胞表面密度を上回った結果、前記酸化鉄粒子を含有する粒子のＨＥＲ２に対する結合能を大きく向上させることに成功した。
【００５６】
（好ましい光音響イメージング用造影剤の例）
本実施形態の光音響イメージングにおいて、投与された検体内の光音響イメージング用造影剤からの光音響信号、すなわち音響波の音圧は、前記光音響イメージング用造影剤の吸光係数ならびにその濃度に比例する。従って、前記光音響イメージング用造影剤に求められる性質は、高い吸光係数と前記標的分子への高い結合能である。
【００５７】
本実施形態の光音響イメージング用造影剤の好ましい例は、マグネタイトを含むデキストランマトリックス（流体力学的直径２０ｎｍ）に、ＨＥＲ２に結合する一本鎖抗体を固定化させた光音響イメージング用造影剤である。実施例で後述するように、ＨＥＲ２への高い結合能を実現するために、前記一本鎖抗体が、酸化鉄粒子を含有する粒子１個に対して、３個以上、特に好ましくは６個以上、固定されている。このような構成とすることで、前記一本鎖の固定化密度をＨＥＲ２の細胞表面密度以上にすることができる。
【００５８】
ＨＥＲ２陽性細胞（強発現株）における一般的なＨＥＲ２の細胞表面密度（ＨＥＲ２が１０６個／細胞で細胞直径１０μｍとすると１ｐｍｏｌ／ｃｍ２）から考えると、前記光音響イメージング用造影剤はＨＥＲ２への多点結合が十分可能であり、強い結合能を実現できると思われる。高い光音響信号を発信するマグネタイト酸化鉄粒子の利用は、光音響イメージングのボトルネックの一つである感度の向上に貢献するばかりではなく、その検体への無毒性より、投与量の厳しい制限は受けることがないという利点を有する。このような合理的な設計がなされた光音響イメージング用造影剤はこれまでに報告されていなく、その実用可能性は本発明で初めて実証されたものである。
【００５９】
（光音響イメージング用造影剤を用いた光音響イメージング方法）
本実施形態の光音響イメージング用造影剤は、前記標的分子の光音響イメージングに用いることができる。すなわち、本実施形態の標的分子の光音響イメージング方法は、前記本実施形態の光音響イメージング用造影剤を検体もしくは前記検体から得られる試料に投与するステップと、前記検体もしくは前記検体から得られる試料にパルス光を照射するステップと、前記検体内もしくは前記検体から得られる試料内に存在する前記標的分子に結合した前記光音響イメージング用造影剤由来の光音響信号を測定するステップと、を少なくとも含むことを特徴とする。
【００６０】
本実施形態の標的分子のイメージング方法の一例は以下の通りである。すなわち、本実施形態の光音響イメージング用造影剤を検体に投与し、あるいは前記検体より得られた臓器等の試料に添加する。なお、前記検体とは、ヒト、実験動物やペット等の哺乳類、その他、特に限定されることなく、あらゆる生物を指し、前記検体中もしくは検体より得られた試料としては、臓器、組織、組織切片、細胞、細胞溶解物などを挙げることができる。前記光音響イメージング用造影剤の投与あるいは添加後、前記検体等に対し近赤外線域の波長をもつレーザーパルス光を照射する。
【００６１】
前記光音響イメージング用造影剤からの光音響信号（音響波）を音響波検出器、例えば圧電トランスデューサで検出し、電気信号に変換する。この音響波検出器より得られた電気信号に基づき、前記検体等の内の吸収体の位置や大きさ、あるいは光吸光係数などの光学特性値分布を計算することができる。例えば、前記光音響信号が基準とする閾値以上で検出されれば、その検体に前記標的分子、あるいは、前記標的分子を産生する部位が存在すると推定され、または、前記試料に前記標的分子が存在する、あるいは、前記試料の由来となる前記検体に前記標的分子を産生する部位が存在すると推定することができる。  
【００６２】
（光音響イメージング用造影剤の用途）
本実施形態の光音響イメージング用造影剤は、上記の原理に基づいて、前記標的分子、例えば腫瘍に特異的に発現している腫瘍抗原の光音響イメージングに用いられることができる。例えば、前記光音響イメージング用造影剤は抗原量との相関を有する腫瘍の診断に用いられることができ、好ましくは、乳癌に関連した腫瘍抗原の光音響イメージング方法に用いられることもできる。前記光音響イメージング用造影剤の使用は、培養された細胞や組織を測定試料として疾病の研究を目的として使用することもできる。また、本実施形態の光音響イメージング用造影剤は、前記標的分子のスクリーニングに用いられうる。
【００６３】
また、前記疾病の患者の状態の診断や健常者における疾病の予防のための診断を目的として、前記造影剤を検体、あるいは前記検体から取得した細胞もしくは組織に導入して、前記標的分子の光音響イメージング方法に用いることもできる。本実施形態の光音響イメージング用造影剤を用いる光音響イメージングによる診断方法は、前記光音響イメージング用造影剤を培養細胞、検体から採取した細胞もしくは組織、又は前記検体に導入するステップと、疾病に関連した標的分子を検出することにより疾病の位置と状態をモニタリングするステップと、を有する。
【００６４】
特に好ましい用途として、本実施形態の光音響イメージング用造影剤を用いたＨＥＲ２の光音響イメージング、具体的には、リガンド分子として、ＨＥＲ２に結合する分子、を用いた、本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤が挙げられる。ここでいうＨＥＲ２は、ＥｒｂＢ２、ｃ−Ｅｒｂ−Ｂ２、ｐ１８５ＨＥＲ２といわれることもある。ＨＥＲ２はＥＧＦＲファミリーであり、チロシンキナーゼ型受容体の一つである。ＨＥＲ２は乳癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、肺癌などの腺癌（以下、「ＨＥＲ２発現細胞」と略すことがある）で遺伝子増幅及び過剰で発現する物質（タンパク質）である。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２同士のニ量体（ホモダイマーともいう）あるいは別のＥＧＦＲとのニ量体（ヘテロダイマーともいう）の形成によって活性化する。より具体的には、ホモダイマーあるいはヘテロダイマーの形成により自己リン酸化し、次いで細胞増殖シグナルが核内へ伝えられ、その結果、細胞増殖、浸潤、転移、アポトーシス抑制などが起こると考えられている。
【００６５】
ここで、ＨＥＲ２は他のＥＧＦＲファミリーとヘテロダイマーを形成するとＨＥＲ２の内在化（インターナリゼーションともいう）が起こりにくくなる。すなわち、この状況では、ＨＥＲ２を介した物質の細胞内への取り込みが起こりにくくなり、細胞外物質のＨＥＲ２発現細胞内への取り込みは少なくなる。従って、ＨＥＲ２のヘテロダイマー形成を阻害すれば、ＨＥＲ２をＨＥＲ２発現細胞内に移行させやすくなると考えられる。
【００６６】
本実施形態の光音響イメージング用造影剤では、ＨＥＲ２に結合する抗体を酸化鉄粒子を含有する粒子に数多く固定化させることで、ＨＥＲ２の細胞表面密度以上の固定化密度を実現している。そのため、ＨＥＲ２のホモダイマー形成の促進によるヘテロダイマー形成の阻害、または、該造影剤が、ＨＥＲ２と他のＥＧＦＲファミリーとが結合するより先にＨＥＲ２と結合することによるヘテロダイマー形成の阻害、または該造影剤が直接ヘテロダイマーを解離させることによるヘテロダイマー形成の阻害が可能になっている。
【００６７】
すなわち、本実施形態の光音響イメージング用造影剤は、該造影剤がＨＥＲ２に結合するので、ＨＥＲ２発現細胞内あるいはＨＥＲ２発現細胞の周辺には、他の部位に比べて、該造影剤が多く存在することになる。さらに、該造影剤がＨＥＲ２と結合することで、ヘテロダイマー形成の阻害が起り、ＨＥＲ２をＨＥＲ２発現細胞内に留まらせやすくなるため、該造影剤はさらにＨＥＲ２発現細胞内に存在しやすくなる。このような相乗効果によって、ＨＥＲ２発現細胞内あるいはＨＥＲ２発現細胞周辺における該造影剤の濃度が高まり、強い光音響信号が得られる。
【００６８】
（第二実施形態）
（ＨＥＲ２に結合する一本鎖抗体を有する酸化鉄粒子を含有する粒子）
本発明の第二の実施形態は、化２で表される、酸化鉄粒子を含有する粒子と、少なくとも１つ以上の上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に結合する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を有する化合物を含む。
【００６９】
ＭＮＰ−（−（Ｌ）ｌ−（Ｐ）ｍ）ｎ                          （化２）（式中、ＭＮＰは酸化鉄粒子を含有する粒子であり、Ｌはリンカー分子、Ｐは上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に結合する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。ｌは０あるいは１である。ｍ、ｎは１以上の整数である。）
【００７０】
前記化合物は本発明の光音響イメージング用造影剤として用いることが出来るほか、核磁気共鳴イメージング（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ，ＭＲＩ）の造影剤としても用いることが可能である。さらに、酸化鉄粒子を含有する粒子が強磁性や常磁性を有する場合では、ＨＥＲ２に特異的に結合する性質を利用して、ＨＥＲ２の磁気分離や精製に用いることができる。
【００７１】
（第三実施形態）  
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、酸化鉄を含む粒子を有する光音響イメージング用造影剤において、一本鎖抗体が前記粒子に結合していることを特徴とする。
本発明者は、酸化鉄を含む粒子と結合した一本鎖抗体は、酸化鉄を含む粒子と結合した全抗体に比べて結合性能が高いことを見出した。これは、一本鎖抗体の場合は、抗原認識部位以外の部位を酸化鉄を含む粒子に結合させることができるが、全抗体の場合は、抗原認識部位が酸化鉄を含む粒子に結合してしまうと考えられるからである。
【００７２】
（第四実施形態）
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、酸化鉄粒子を有し、酸化鉄粒子の粒径が１５ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることを特徴としている。酸化鉄粒子の粒径が１５ｎｍ以上の場合、１５ｎｍ未満の場合に比べて、鉄原子１モルあたりのモル吸光係数の値、及び、鉄原子１モルあたりから測定される光音響信号の値が大きい。そのため、光音響イメージング方法において、本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤を用いることで、大きな光音響信号を得ることができる。また、酸化鉄粒子の粒径が２０ｎｍ以上であることがより好ましい。
【００７３】
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤の粒径は、１５ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。光音響イメージング用造影剤の粒径が１０００ｎｍ以下の場合、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くの造影剤を集積させることができる。その結果、造影剤を生体内に投与した後、生体に光を照射すると、腫瘍部位から発せられる光音響信号は正常部位から発せられる光音響信号よりも大きくなる。したがって、光音響イメージング用造影剤の粒径を１０００ｎｍ以下とすることにより、本実施形態に係る造影剤は腫瘍部位を特異的に検出することができる。また、光音響イメージング用造影剤の粒径は５００ｎｍ以下であることがより好ましく、２００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。光音響イメージング用造影剤の粒径が２００ｎｍ以下であると、血中のマクロファージに取り込まれにくく、血中滞留性が高くなると考えられるからである。
【００７４】
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、酸化鉄粒子を１個のみ有していてもよく、２個以上有していてもよい。
【００７５】
本実施形態において、酸化鉄粒子の粒径は５００ｎｍ以下である。本実施形態において、酸化鉄粒子の粒径は２００ｎｍ以下であることがより好ましい。また、本実施形態において、酸化鉄粒子の粒径が５００ｎｍである場合、光音響イメージング用造影剤の有する酸化鉄粒子は３個以下であることが好ましい。
【００７６】
（酸化鉄粒子）
本実施形態に用いる酸化鉄粒子としては、６００ｎｍ以上１３００ｎｍ以下の近赤外波長領域の光を吸収して光音響信号を発信し、人体に無害なものであれば特に制限されないが、Ｆｅ３Ｏ４（マグネタイト）、γ−Ｆｅ２Ｏ３（マグヘマイト）、またはこれらの混合物を用いることが好ましい。特に好ましくは、マグネタイトである。当該マグネタイトは、マグヘマイトより近赤外波長領域におけるモル吸光係数が高いことが知られており、従って光音響信号も強くなると考えられる。前記マグネタイトを信号発信部として用いることで、従来の光音響イメージング用造影剤よりも感度を向上させることが可能になる。また、酸化鉄粒子は、単結晶、多結晶、非晶質のいずれの結晶状態でもよい。また、酸化鉄粒子の数は、１個でも良いし、２個以上でもよい。２個以上からなる場合、２次粒子となる。なお、酸化鉄粒子の粒径が大きい場合、例えば５０ｎｍの場合、造影剤に含まれる酸化鉄粒子の数が多くなるほど、鉄原子１モルあたりのモル吸光係数の値、及び、鉄原子１モルあたりから測定される光音響信号の値は大きい。一方で、酸化鉄粒子の粒径が５ｎｍの場合、造影剤に含まれる酸化鉄粒子の数が多くなっても、鉄原子１モルあたりのモル吸光係数、及び測定される光音響信号の値はあまり変わらない。
【００７７】
本実施形態の酸化鉄粒子の粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察やＸ線回折法などの公知の方法で測定することができる。前記酸化鉄粒子は、公知の酸化鉄粒子作製法により適宜作製して使用することもできるし、市販品を使用してもよい。
【００７８】
本実施形態に係る酸化鉄粒子は、その酸化鉄粒子、あるいは、酸化鉄粒子の２次粒子の表面が表面修飾剤で被覆されていてもよい。表面修飾剤としては、脂肪酸、両親媒性化合物などが挙げられる。脂肪酸としては、オレイン酸などが挙げられる。両親媒性化合物としては、リン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、両親媒性ポリマーなどが挙げられる。また、疎水性ポリマーに複数の酸化鉄粒子を含有させ、そのポリマーに両親媒性化合物を結合させてもよい。表面修飾剤は１種類を用いてもよいし、複数種類用いてもよい。  本実施形態における酸化鉄粒子は市販のものを用いてもよいし、以下の方法で得たものを用いてもよい。例えば、ＦｅＣｌ３とＦｅＣｌ２を水に溶解させて溶解液とし、この溶解液を攪拌しながらアンモニア水を加えて、元素Ｆｅと元素Ｏからなる酸化鉄粒子を得る方法である。
【００７９】
（光音響イメージング用造影剤）
本実施形態の光音響イメージング用造影剤の一例の概略図を図１３A−Jに示す。光音響イメージング用造影剤１は、図１３Aのように、酸化鉄粒子２と、両親媒性化合物３からなる。両親媒性化合物３は、光音響イメージング用造影剤１の表面に存在する。
【００８０】
両親媒性化合物３は、リン脂質４、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル５、又は両親媒性ポリマー６の各々を単独で使用しても良いし、複数の組合せで使用しても良い。
【００８１】
酸化鉄粒子２は、炭素数６以下のヒドロキシカルボン酸を有するモノマーからなるホモポリマー、又は前記ヒドロキシカルボン酸を有する２種類のモノマーからなるコポリマー、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルから選択された疎水性ポリマー７に含有されていても良い。
【００８２】
図１３Bは、リン脂質４のみで酸化鉄粒子２を被覆した光音響イメージング用造影剤１の概略図である。
【００８３】
図１３Cは、両親媒性ポリマー６のみで酸化鉄粒子２を被覆した光音響イメージング用造影剤１の概略図である。
【００８４】
図１３Dは、疎水性ポリマー７に含有された酸化鉄粒子２をポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル５のみで被覆した光音響イメージング用造影剤１の概略図である。
【００８５】
図１３Eは、疎水性ポリマー７に含有された酸化鉄粒子２をリン脂質４、及びポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル５の両化合物で被覆した光音響イメージング用造影剤１の概略図である。
【００８６】
図１３Fは、疎水性ポリマー７に含有された酸化鉄粒子２を両親媒性ポリマー６のみで被覆した光音響イメージング用造影剤１の概略図である。
【００８７】
リン脂質４をもつ光音響イメージング用造影剤１には、少なくとも一部のリン脂質４に捕捉分子８を固定化することができる。図１３G、及び１３Iは、リン脂質４をもつ光音響イメージング用造影剤１に、捕捉分子８を固定化した光音響イメージング用造影剤９の概略図である。このようにして得られた光音響イメージング用造影剤９は、標的組織、細胞、及び物質を特異的に認識することができる。
【００８８】
また、両親媒性ポリマー６をもつ光音響イメージング用造影剤１には、少なくとも一部の両親媒性ポリマー６に捕捉分子８を固定化することができる。図１３H、及び１３Jは、両親媒性ポリマー６をもつ光音響イメージング用造影剤１に、捕捉分子８を固定化した光音響イメージング用造影剤９の概略図である。このようにして得られた光音響イメージング用造影剤９は、標的組織、細胞、及び物質を特異的に認識することができる。
【００８９】
また、本実施形態の光音響イメージング用造影剤１及び９は、目的とする用途に対して、光音響イメージング用造影剤の粒径を制御することが可能である。その粒径は１５ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることを特徴とする。２００ｎｍを超えると、マクロファージに貪食されやすくなり、血中滞留性が低下することから、血管を造影する場合および癌に光音響イメージング用造影剤を集積させる場合、光音響イメージング用造影剤の粒径は、１５ｎｍ以上２００ｎｍ以下に制御するのが好ましい。
【００９０】
（光音響イメージング用造影剤の製造方法）
本実施形態における光音響イメージング用造影剤１の製造方法について説明する。
本実施形態の光音響イメージング用造影剤１を得る方法として、下記のドライアップ法や、ナノエマルジョン法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００９１】
ドライアップ法で光音響イメージング用造影剤１を製造する工程の一例を図１４Aに示している。具体的には、以下の（１）から（２）の工程を経て、光音響イメージング用造影剤の水分散液を得ることができる。
（１）有機溶媒に酸化鉄粒子２と、リン脂質４又は両親媒性ポリマー６を加えた第一液体１０から、有機溶媒を留去させる工程。
（２）水１３を加えた後、乳化させる工程。
【００９２】
ナノエマルジョン法で光音響イメージング用造影剤１を製造する工程の一例を図１４Bに示している。具体的には、以下の（１）から（３）の工程を経て、光音響イメージング用造影剤の水分散液を得ることができる。
（１）有機溶媒に酸化鉄粒子２と疎水性ポリマー７を加えた第一液体１０を、水にリン脂質４とポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル５又は両親媒性ポリマー６を加えた第二液体１１に加えて混合液を得る工程。
（２）前記混合液を乳化することによりＯ／Ｗ型のエマルジョン１２を得る工程。
（３）前記エマルジョン１２の分散質から有機溶媒を留去する工程。
【００９３】
酸化鉄粒子の表面には、オレイン酸などが被覆されていても良い。乾燥させた酸化鉄粒子に有機溶媒を加え酸化鉄粒子の分散溶液とし、この分散溶液にオレイン酸を加え、酸化鉄粒子の表面にオレイン酸を被覆させる。その後、酸化鉄粒子の表面に存在しないオレイン酸を有機溶媒で洗浄し、オレイン酸で被覆された酸化鉄粒子を得ることができる。両親媒性化合物３との親和性を上げる、あるいは第一液体１０に含まれる有機溶媒に酸化鉄粒子２が分散する目的を達成する化合物であれば、オレイン酸に限定されない。
【００９４】
本実施形態の光音響イメージング用造影剤に含まれる酸化鉄粒子の数は、１個でも良いし、２個以上でも良い。更に、光音響イメージング用造影剤に複数個の酸化鉄粒子を含有させることによって、鉄原子あたりの光音響信号が強くなる効果を見出し、より強い光音響信号を取得することができる。
【００９５】
（リン脂質）
リン脂質４としては、少なくとも一部に、アミノ基、カルボキシル基、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）基、マレイミド基、メトキシ基、又は水酸基のいずれかの官能基とＰＥＧ鎖を有するホスファチジル系リン脂質が含まれていることが好ましい。官能基がアミノ基、カルボキシル基、ＮＨＳ基、又はマレイミド基の場合、捕捉分子８を固定化することができる。
【００９６】
例えば、化学式１で示されるＮ−（Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｃａｒｂａｍｙｌ−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２）、化学式２で示される３−（Ｎ−Ｇｌｕｔａｒｙｌ）ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙ，ｐｏｌｙｅｔｈｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）、化学式３で示される３−（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｇｌｕｔａｒｙｌ）ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙ，ｐｏｌｙｅｔｈｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、化学式４で示されるＮ−［（３−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂａｍｙｌ］  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）、化学式５で示されるＮ−（Ｃａｒｂｏｎｙｌ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）−１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＮ）、化学式６で示され１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）］  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）等のリン脂質を挙げることができる。
【００９７】
【化１】
2011043061.tif 000003
【００９８】
【化２】
2011043061.tif 000004
【００９９】
【化３】
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【０１００】
【化４】
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【０１０１】
【化５】
2011043061.tif 000007
【０１０２】
【化６】
2011043061.tif 000008
【０１０３】
（ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル）
本実施形態におけるポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル５として、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０等を挙げることができる。
【０１０４】
（両親媒性ポリマー）
本実施形態における両親媒性ポリマー６として、ＰＥＧ鎖を導入したオクタデセン−無水マレイン酸交互共重合体、ＰＥＧ鎖を導入したスチレン−無水マレイン酸共重合体、ＰＥＧ鎖を導入したポリ乳酸、ＰＥＧ鎖を導入した乳酸−グリコール酸共重合体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリビニルアルコール等を挙げることができる。
【０１０５】
ＰＥＧ鎖の重量平均分子量は１０００〜１０００００であり、好ましくは２０００〜２００００のものを好適に利用できる。
【０１０６】
また、ＰＥＧ鎖の末端には、水酸基、メトキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ＮＨＳ基、又はマレイミド基のいずれかの官能基を有し、官能基がアミノ基、カルボキシル基、ＮＨＳ基、又はマレイミド基の場合、捕捉分子８を固定化することができる。
【０１０７】
（疎水性ポリマー）
本実施形態における疎水性ポリマー７は、炭素数６以下のヒドロキシカルボン酸を有するモノマーからなるホモポリマー、又は前記ヒドロキシカルボン酸を有する２種類のモノマーからなるコポリマー、ポリスチレン、又はポリメタクリル酸メチルのいずれかである。これらのポリマーの重量平均分子量は２０００〜１００００００であり、好ましくは１００００〜６０００００のものを好適に利用できる。
【０１０８】
（第一液体）
ドライアップ法における第一液体１０とは、有機溶媒に、酸化鉄粒子２、及びリン脂質４又は両親媒性ポリマー６を分散、及び溶解させた液のことである。ナノエマルジョン法における第一液体１０とは、有機溶媒に、酸化鉄粒子２、及び疎水性ポリマー７を分散、及び溶解させた液のことである。
【０１０９】
第一液体１０に含まれる有機溶媒は、リン脂質４、あるいは疎水性ポリマー７を溶解し、かつ酸化鉄粒子２が分散できる有機溶媒であればいかなる溶媒も適用可能であるが、揮発性の有機溶媒であることが好ましい。
【０１１０】
このような有機溶媒の具体例として、次の溶媒が挙げられる。ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）、エーテル類（エチルエーテル、イソブチルエーテル、ブタノール等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、芳香族炭化水素（ベンゼン、トルエン、キシレン等）等。これらを単独で用いても良いし、あるいは２種類以上を適宜の割合で混合して用いることもできる。但し、第一液体１０に含まれる有機溶媒は上記に限定されるものではない。
【０１１１】
また、第一液体１０中のリン脂質４、両親媒性ポリマー６、あるいは疎水性ポリマー７の濃度は、これらが溶解する範囲であれば特に限定されないが、好ましい濃度として例えば、リン脂質４については１〜１００ｍｇ／ｍｌ、両親媒性ポリマー６については１〜１００ｍｇ／ｍｌ、疎水性ポリマー７については０．５〜１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【０１１２】
また、ドライアップ法における第一液体１０に含まれるリン脂質４と酸化鉄粒子２との重量比は、好ましくは、１０：１〜１：１０の範囲である。ドライアップ法における第一液体１０に含まれる両親媒性ポリマー６と酸化鉄粒子２との重量比は、好ましくは、１０：１〜１：１００の範囲である。ナノエマルジョン法における第一液体１０に含まれる疎水性ポリマー７と酸化鉄粒子２との重量比は、好ましくは、１０００：１〜１：９の範囲である。
【０１１３】
（第二液体）
ナノエマルジョン法における第二液体１１とは、第一液体１０と混合した際にエマルジョンを安定化させることを目的として、水にリン脂質４とポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル５のうち、各々単独の化合物、あるいは各々複数の化合物、又は両親媒性ポリマー６をあらかじめ加えた水溶液である。但し、第一液体１０と水を混合した分散液にリン脂質４、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル５、あるいは両親媒性ポリマー６を含ませることができれば、上記の方法に限定されるものではない。
【０１１４】
また、ナノエマルジョン法における第二液体１１に含まれるリン脂質４とポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル５の濃度は、第一液体１０との混合比にも依るが、好ましい濃度として例えば、リン脂質４の好ましい濃度として、０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。また、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル５については０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。両親媒性ポリマー６については１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【０１１５】
（乳化）
ドライアップ法では、酸化鉄粒子２と、リン脂質４又は両親媒性ポリマー６の混合溶液を乾燥させた後に、水を加えた溶液を乳化させて、ミセルを得る。ナノエマルジョン法では、第一液体１０と第二液体１１との混合液を乳化させて、水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンを得る。
【０１１６】
エマルジョン及びミセルとは、本実施形態の目的を達成可能な範囲において如何なる物性のエマルジョン及びミセルも含めるものであるが、好ましくは１ピークの粒径分布のエマルジョン及びミセルである。
【０１１７】
このようなエマルジョンやミセルは従来公知の乳化手法によって調製することが可能である。従来公知の方法とは、例えば、断続振とう法、プロペラ型攪拌機、タービン型攪拌機等のミキサーを利用する攪拌法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法等がある。これらの方法は、単独で用いることも、あるいは複数を組み合わせて用いることも可能である。また、エマルジョン、及びミセルは１段階の乳化によって調製しても良いし、多段階の乳化によって調製しても良い。但し、乳化手法は、本実施形態の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【０１１８】
特に、ナノエマルジョン法におけるエマルジョン１２は、第一液体１０と第二液体１１との混合液から調製される水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンである。ここで、第一液体１０と第二液体１１の混合とは、第一液体１０と第二液体１１を空間的に隔離せずに互いに接触して存在させることであり、必ずしも互いに混和することを要さない。
【０１１９】
上記の混合液における第一液体１０と第二液体１１との割合は、水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョン１２を形成することができれば特に限定はないが、好ましくは、第一液体と第二液体との重量比が、１：２〜１：１０００となる範囲で混合することが好ましい。
【０１２０】
（留去）
留去とは、第一液体１０に含まれる有機溶媒を除去する操作である。
【０１２１】
留去は、従来知られる何れの方法でも実施可能であるが、加熱によって除去する方法、あるいはエバポレーター等の減圧装置を利用した方法を挙げることができる。加熱による除去の場合の加熱温度は、好ましい温度は０℃から８０℃の範囲である。但し、留去は、本実施形態の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【０１２２】
（捕捉分子）
本実施形態において、捕捉分子８とは、癌などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質など、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択される物質である。具体的には、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。
【０１２３】
本実施形態において、捕捉分子８は、リン脂質４又は両親媒性ポリマー６をもつ光音響イメージング用造影剤１に化学的に結合し、本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤９を構成する。このような光音響イメージング用造影剤９を用いることで、標的部位の特異的な検出や、標的物質の動態、局在、薬効、及び代謝等の追跡を行うことができる。
【０１２４】
（捕捉分子の固定化）
リン脂質４をもつ光音響イメージング用造影剤１に捕捉分子８を固定化することにより、本実施形態の光音響イメージング用造影剤９を得ることができる。
【０１２５】
本実施形態において、リン脂質４や両親媒性ポリマー６をもつ光音響イメージング用造影剤１に捕捉分子８を固定化する方法として、リン脂質４や両親媒性ポリマー６が持つ官能基と捕捉分子８の官能基を反応させて化学結合する方法を使用することができる。
【０１２６】
即ち、リン脂質４や両親媒性ポリマー６の官能基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である場合、捕捉分子８のアミノ基と反応させて、光音響イメージング用造影剤１に捕捉分子８を固定化することができる。捕捉分子８の固定化後、リン脂質４や両親媒性ポリマー６の未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基に対して、グリシン、エタノールアミン、末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコールやポリエチレングリコール等と反応させてスクシンイミド基を失活することが好ましい。
【０１２７】
あるいは、リン脂質４や両親媒性ポリマー６の官能基がマレイミド基である場合、捕捉分子８のチオール基と反応させて、光音響イメージング用造影剤１に捕捉分子８を固定化することができる。捕捉分子８の固定化後、リン脂質４や両親媒性ポリマー６の未反応のマレイミド基に対して、Ｌ−システイン、メルカプトエタノール、末端にチオール基を有するオリゴエチレングリコールやポリエチレングリコール等と反応させてマレイミド基を失活することが好ましい。
【０１２８】
あるいは、リン脂質４や両親媒性ポリマー６の官能基がアミノ基である場合、グルタルアルデヒドを用いて捕捉分子８のアミノ基と反応させ、光音響イメージング用造影剤１に捕捉分子８を固定化することができる。捕捉分子８の固定化後、エタノールアミン、末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコールやポリエチレングリコール等を反応させてアルデヒド基の活性をブロックすることが好ましい。
【０１２９】
あるいは、アミノ基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド基やマレイミド基に置換して、捕捉分子８を固定化しても良い。
【０１３０】
（光音響イメージング用造影剤の造影）
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤１及び９は、生体透過性に優れた光を用いた光音響イメージング用の造影剤として用いることができる。
【０１３１】
尚、前記の光音響イメージング用造影剤１及び９は、生理食塩水や注射用蒸留水等の溶媒中に分散して使用することができる。また、必要に応じて薬理上許容できる添加物を適宜添加しても良い。これら光音響イメージング用造影剤は、静脈注射あるいは皮下注射によって体内に導入することができる。
【０１３２】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有する光音響イメージング用造影剤が得られる範囲で自由に変えることができる。
【０１３３】
（光音響イメージング方法）
本実施形態に係る光音響イメージング方法は、以下の各工程を有する。
（ｉ）上記の光音響イメージング用造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程
（ｉｉ）前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波を検出する工程と、
ここで、音響波を検出する装置としては特に限定されないが、超音波探触子などを用いることができる。
【実施例】
【０１３４】
以下の実施例で本発明の光音響イメージング用造影剤で用いる具体的な試薬や反応条件を挙げているが、これらの試薬や反応条件の変更が可能であり、それらの変更は本発明の範囲に包摂されるものとする。従って以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。【０１３５】
（酸化鉄粒子を含有する粒子の作製）
酸化鉄粒子を含有する粒子は多数市販されており、当業者が適宜のものを容易に入手し利用できる。なお、酸化鉄粒子を含有する粒子の製造方法についても多数の文献があり、それらを参照することで、容易に合成することが可能である。例えば、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（２５．５ｇ）とＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（１０．２ｇ）を混合、溶解した水溶液（６００ｍｌ）と、粉末状デキストラン（分子量１００００ダルトン、３６０ｇ）と３０％ＮＨ４ＯＨ溶液（３０ｍｌ）を用いて、米国特許第５２６２１７６号の方法に準じて、酸化鉄粒子を含むデキストラン粒子のコロイド溶液を調製できる。また、酸化鉄粒子を含有する粒子の表面に各種リンカー分子を結合させることも可能である。例えば、カルボジイミド縮合剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３．６ｍｇ）と３，６−ジオキサオクタン二酸（３．６ｍｇ）を、０．５Ｍ  β−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（１．２５ｍｌ、ｐＨ＝６．３）で溶解し、５０℃で１０分間インキュベートして、前記デキストラン粒子懸濁液に加え、室温で２時間反応させ、磁石を用いて酸化鉄粒子を含有する粒子を精製することで、オリゴエチレンオキシドをリンカー分子とし、その末端にカルボキシル基を持つ酸化鉄粒子を含有する粒子が得られる。【０１３６】
（一本鎖抗体ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖの調製）
ＨＥＲ２へ結合するＩｇＧの可変領域の遺伝子配列（ｈｕ４Ｄ５−８）を基に、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖを作製した。まずｈｕ４Ｄ５−８のＶＬ、ＶＨ遺伝子をペプチド（ＧＧＧＧＳ）３をコードするｃＤＮＡで連結したｃＤＮＡを作製した。５’末端には制限酵素ＮｃｏＩ−  を、３’末端には制限酵素ＮｏｔＩの認識サイトを導入した。以下に塩基配列を示す。【０１３７】
５’−ＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＴＡＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＣＧＡＡＡＣＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＧＧＣＴＣＡＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＡＣＧＡＡＴＧＧＴＴＡＴＡＣＴＡＧＡＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡＡＧＣＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’  （配列番号１）
（制限酵素の認識サイトを下線で示す。）【０１３８】
上記遺伝子断片ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖをプラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＴ７／ｌａｃプロモーターの下流に挿入した。具体的には、制限酵素ＮｃｏＩ−とＮｏｔＩで消化処理したｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に、上記のｃＤＮＡをライゲーションする。【０１３９】
この発現プラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３））に形質転換し、発現用菌株を得た。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地４ｍｌで一晩前培養後、全量を２５０ｍｌの２ｘＹＴ培地に添加し、２８℃、１２０ｒｐｍで８時間振とう培養した。その後、終濃度１ｍＭでＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、２８℃で一晩培養した。培養した大腸菌を８０００ｘｇ、３０分、４℃で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の６０％重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩４℃で静置後、８０００ｘｇ、３０分、４℃で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／５００  ｍＭ  ＮａＣｌバッファーに溶解し、１リットルの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（登録商標）Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を充填したカラムへ添加し、Ｎｉイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりシングルバンドを示し分子量は約２８ｋＤａであることを確認した。以下に調製された抗体のアミノ酸配列を示す。以後、ｈｕ４Ｄ５−８  ｓｃＦｖをｓｃＦｖと略すことがある。【０１４０】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣ（配列番号２）【０１４１】
（一本鎖抗体ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖと酸化鉄粒子との結合）
上記で調製したｓｃＦｖを５  ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸バッファー（２．６８  ｍＭＫＣｌ／１３７  ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／  １ｍ  Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）にバッファー置換後、１０倍モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、以下ＴＣＥＰと略すことがある）によって、２５℃で約２時間、還元処理した。この還元処理したｓｃＦｖを、２５℃で約２時間、マレイミド表面修飾された酸化鉄粒子を含有する粒子、ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ−ｓｐｉｏ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２０ｎｍ）（以後、ＮＰ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅと略す）と反応させた。仕込みの反応モル比（ｓｃＦｖ／酸化鉄粒子を含有する粒子）は、１、４、１０、１５で行った。ここで「仕込み」とは反応系に加えられた、という意味であり、「仕込みの反応モル比」とは、反応系に加えられたｓｃＦｖと酸化鉄粒子を含有する粒子のモル濃度の比のことをいう。反応後、１００ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社）を用いた限外ろ過により酸化鉄粒子を含有する粒子へ結合しなかったｓｃＦｖを除去して、ｓｃＦｖと酸化鉄粒子を含有する粒子との複合体を得た。なお、限外ろ過後、ろ液中に含まれる未反応ｓｃＦｖを定量することで、酸化鉄粒子を含有する粒子へのｓｃＦｖの固定化量を算出した。また、粒子収率は、濃度既知の酸化鉄粒子を含有する粒子溶液の標準曲線を用いて、サンプルの４９０ｎｍにおける吸光度から求めた。以後、得られた粒子をｓｃＦｖ−ＮＰと略す。ｓｃＦｖ−ＮＰの平均流体力学的直径を動的光散乱法で決定したところ、３０〜４０ｎｍ（個数換算分布）であった。  【０１４２】
（抗体と酸化鉄粒子との結合）
カルボジイミド法により酸化鉄粒子を含有する粒子への抗体（ＩｇＧと略すことがある）の結合を行った。２０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、及び２４ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを、１ｍｌの０．５Ｍβ−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ＝６．３）に溶解した。次に、ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ−ｓｐｉｏＣＯＯＨ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２０ｎｍ）（以後、ＮＰ−ＣＯＯＨと略す）を含む粒子濃度５ｍｇ／ｍｌの粒子懸濁液７ｍｌに加えた。この粒子懸濁液を室温で１時間撹拌した後、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、カルボキシル基を活性化させた酸化鉄粒子を含有する粒子と低分子試薬を分離した。展開溶媒は炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）を用い、同時にバッファー交換を行った。次に、この粒子懸濁液に、抗ＨＥＲ２抗体としてハーセプチン（登録商標）（中外製薬製）（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）を加えた。仕込みの反応モル比（ＩｇＧ／酸化鉄粒子を含有する粒子）は、１、４、１０、２０で行った。この粒子懸濁液を室温で４時間撹拌した後、グリシンの１Ｍの水溶液をグリシン終濃度１ｍＭとなるように加え、室温で３０分間撹拌し、前記酸化鉄粒子を含有する粒子の表面の残存活性部位をブロックした。得られたハーセプチン（登録商標）を固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子は、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘの２００ＧＬ１０／３００カラム、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により精製した。展開溶媒はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）を用いた。ボイドボリューム画分にハーセプチン（登録商標）固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子が溶出し、これを回収した。なお、未反応抗体由来のピーク面積からその濃度を定量することで、酸化鉄粒子を含有する粒子へのＩｇＧの固定化量を算出した。また、粒子収率は、濃度既知の酸化鉄粒子を含有する粒子の溶液の標準曲線を用いて、サンプルの４９０ｎｍにおける吸光度から求めた。粒子収率（仕込み粒子量に対する回収粒子量）は２０〜４０％であった。以下、ハーセプチン（登録商標）を固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子をＩｇＧ−ＮＰと示す。ＩｇＧ−ＮＰの平均流体力学的直径を動的光散乱法で決定したところ、５０〜６０ｎｍ（個数換算分布）であった。【０１４３】
（抗体とエチレンオキシドリンカーを有する酸化鉄粒子との結合）
前記「抗体と酸化鉄粒子との結合」に従い、エチレンオキシドリンカーを有する酸化鉄粒子を含有する粒子に抗体を結合させた。酸化鉄粒子を含有する粒子としてｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ−ｓｐｉｏＣＯＯＨ−ＰＥＧ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２０ｎｍ、ＰＥＧリンカーの分子量３００）（以後、ＮＰ−ＥＯ−ＣＯＯＨと略す）を用いる以外は、前記「抗体と酸化鉄粒子との結合」と同様にして行った。粒子収率（仕込み粒子量に対する回収粒子量）は７０〜８０％であった。以下、該ハーセプチン（登録商標）を固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子をＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰと示す。ＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰの平均流体力学的直径を動的光散乱法で決定したところ、３０〜６０ｎｍ（個数換算分布）であった。また、ＰＢＳ中における粒子のゼータ電位は、−４．５ｍＶであった。【０１４４】
（コントロール抗体と酸化鉄粒子との結合）
前記「抗体とエチレンオキシドリンカーを有する酸化鉄粒子との結合」に従って、酸化鉄粒子を含有する粒子へのコントロール抗体の結合を行った。ここで、コントロール抗体は、精製ヒトＩｇＧ（ポリクローナル、大日本住友製薬）を用いた。仕込みの反応モル比（ＩｇＧ／酸化鉄粒子を含有する粒子）は、１０で行った。酸化鉄粒子を含有する粒子へのＩｇＧの固定化量は、４（ＩｇＧ／酸化鉄粒子を含有する粒子）であった。以下、コントロール抗体を固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子をｃＩｇＧ−ＮＰと示す。
【実施例１】
【０１４５】
（抗体固定化酸化鉄粒子の特性評価）
前記通りに作製した抗体固定化酸化鉄粒子の抗体固定化量、結合効率、抗体固定化密度、及び粒子収率を表１にまとめた。【０１４６】
【表１】
2011043061.tif 000009
【０１４７】
酸化鉄粒子への抗体の仕込み比を増加させることで、抗体の固定化量を増加させることが可能であった。リガンド分子がＩｇＧのＩｇＧ−ＮＰとＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰでは、仕込み比に対して固定化量は大きく低下した。すなわち結合効率は低く、１１〜３３％であった。一方、リガンド分子がｓｃＦｖの場合、結合効率は非常に良好であった（６４〜８５％）。ここで用いた酸化鉄粒子の平均粒径は２０ｎｍであり、その表面積からＩｇＧの最大固定化量を見積もると、約８〜１０個となる（ＩｇＧを直径１０ｎｍの球状分子と仮定する）。したがって、仕込みの反応モル比を２０としたＩｇＧの系では、結合効率５０〜７０％と考えるほうが正しいと思われる。【０１４８】
また、粒子収率（仕込み粒子量に対する回収粒子量）については、オリゴエチレンオキシド（分子量３００）をリンカー分子として持つ抗体固定化酸化鉄粒子において、７１〜８５％と高い収率を示した。一方、リンカー分子を持たないＩｇＧ−ＮＰでは１０〜３０％まで低下した。この原因は、ＩｇＧの場合では、粒子への固定化反応の際、抗体分子をバインダーとして粒子間の凝集が起こる、または、固定化されたＩｇＧが粒子表面で変性することをトリガーとして粒子間の凝集が起こる、ということが考えられる。ｓｃＦｖ−ＮＰの場合も同様の現象が起こると思われる。実際に、ＩｇＧ−ＮＰならびにｓｃＦｖ−ＮＰの系で、抗体の固定化反応後、粒子の凝集沈殿物が確認された。一方、オリゴエチレンオキシドリンカーを有するＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰでは、粒子間の分散性が良好であり、粒子間の凝集が抑制されていると考えられる。興味深いことに、ｓｃＦｖ−ＮＰの系では、抗体と粒子の仕込み比と共に、粒子収率が増加した。おそらくマレイミド基を持つ酸化鉄粒子を含有する粒子は不安定であり、ｓｃＦｖを多く固定化することで、粒子の分散性が改善されたと考えられる。【０１４９】
抗体の固定化密度は、ＩｇＧの系では７．５〜３２０．５ｎｇ／ｃｍ２、ｓｃＦｖの系では６．９〜１０４．９ｎｇ／ｃｍ２であった。ここでＨＥＲ２の細胞表面密度を計算する。まずＨＥＲ２陽性細胞（強発現株）におけるＨＥＲ２は１０６個／細胞とし、細胞直径を１０μｍとすると、ＨＥＲ２の細胞表面密度は１ｐｍｏｌ／ｃｍ２と計算される。前記抗体の固定化密度もそれぞれモル密度に変換して、前記ＨＥＲ２の細胞表面密度（１ｐｍｏｌ／ｃｍ２）で除すると、ＨＥＲ２分子１個あたりの抗体数（抗体／ＨＥＲ２のモル比）が算出される。これを図２に示す。ＨＥＲ２への多点結合を十分可能なものにするためには、（抗体／ＨＥＲ２のモル比）が少なくとも１以上である必要がある。図２の結果より、ｓｃＦｖ−ＮＰ（１２．９）ではＨＥＲ２とのマルチバレントな相互作用が十分期待でき、強い結合能を実現できると思われる。
【実施例２】
【０１５０】
（抗体固定化酸化鉄粒子の結合特異性評価）
作製した抗体固定化酸化鉄粒子のＨＥＲ２への結合活性ならびに結合特異性を評価するため、蛍光免疫染色を行った。用いた細胞は、ＨＥＲ２陽性細胞（ＨＥＲ２＋）として、Ｎ８７を用いた。ＨＥＲ２陰性細胞（ＨＥＲ２−）として、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を用いた。被検粒子としては、ＩｇＧ−ＮＰ（６．７）、ＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰ（５．３）、ｓｃＦｖ−ＮＰ（１２．９）、ｃＩｇＧ−ＮＰを用いた。ポジティブコントロールとして、ハーセプチン（登録商標）を用いた。検出抗体（蛍光標識抗体）は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗ｈｕｍａｎＩｇＧ抗体（ハーセプチン（登録商標）、ＩｇＧ−ＮＰ、ＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰ、ｃＩｇＧ−ＮＰ検出用）と、抗Ｈｉｓｔａｇ抗体（マウス）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗ｍｏｕｓｅＩｇＧ抗体（ｓｃＦｖ−ＮＰ検出用）を用いた。各細胞を２４ウェルプレートで一晩培養した後、細胞を５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定化した。細胞をＰＢＳで洗浄後、増殖培地中で、ハーセプチン（登録商標）ならびに各抗体固定化酸化鉄粒子を添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。その後、増殖培地で洗浄後、検出抗体でインキュベート（１時間、３７℃）し、洗浄後、蛍光顕微鏡で観察を行った。【０１５１】
前記蛍光免疫染色の結果を図３A、３Bに示す。図３Aには、本発明の抗体固定化酸化鉄粒子によるＨＥＲ２陽性細胞（Ｎ８７、上段）、陰性細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、下段）それぞれの蛍光像を示している。図中の蛍光はリガンド分子の抗体の存在、すなわち抗体固定化酸化鉄粒子の存在を間接的に示している。ポジティブコントロールのハーセプチン（登録商標）の染色結果から明らかなように、Ｎ８７はＨＥＲ２を発現していることが、一方、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はＨＥＲ２を発現していても、今回の実験系では検出できない程度に十分低いレベルであることが確認された。図３Bは図３Aの染色結果をテーブルにしたものであり、表中、＋は染色可能を示し、−は染色不可を示す。作製した抗体固定化酸化鉄粒子はＨＥＲ２陽性細胞Ｎ８７に結合することが確認された。またｃＩｇＧ−ＮＰはＮ８７には結合しなかったことから、粒子の非特異的な結合ではないことが確認された。一方、ＨＥＲ２陰性細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では、いずれの粒子でも染色されなかったことより、本発明の抗体固定化酸化鉄粒子はＨＥＲ２への結合特異性を有していることが明らかとなった。
【実施例３】
【０１５２】
（抗体固定化酸化鉄粒子の光音響信号測定）
作製した抗体固定化酸化鉄粒子の光音響信号発信能を評価するための被検粒子として、ＩｇＧ−ＮＰ（６．７）、ＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰ（５．３）、ｓｃＦｖ−ＮＰ（１２．９）、ｃＩｇＧ−ＮＰを用いた。また、抗体を固定化していない酸化鉄粒子（ＮＰ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ、ＮＰ−ＣＯＯＨ、ＮＰ−ＥＯ−ＣＯＯＨ）の光音響信号発信能も測定した。各粒子は、少なくとも３つの濃度で光音響信号の測定を行った。溶媒はＰＢＳを用いた。光音響信号の測定前後で、７１０ｎｍの吸光度を測定した結果、その変動は５％以内であった。なお、すべての粒子のマグネタイト含有量ならびに酸化鉄粒子の粒径（すなわちコア粒子の粒径）は同じである。【０１５３】
光音響計測は、パルスレーザー光をＰＢＳ中に分散したサンプルに照射し、サンプルから光音響信号を圧電素子を用いて検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザ（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ製）を用いた。波長は７１０ｎｍ、エネルギー密度はおよそ１０から２０ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は約２０ナノ秒、パルス繰返し周波数は１０Ｈｚの条件とした。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径１．２７ｃｍ、中心帯域１ＭＨｚの非収束型超音波トランスデューサ（Ｖ３０３、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ製）。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μｌであった。【０１５４】
水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を２．５ｃｍとした。光音響信号を増幅する高速プリアンプは増幅度＋３０ｄＢの超音波プリアンプ（Ｍｏｄｅｌ  ５６８２、オリンパス製）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（ＤＰＯ４１０４、テクトロニクス製）に入力した。前記ガラス容器の外からパルスレーザ光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを３２回平均表示モードとし、レーザーパルス照射３２回平均の光音響信号取得を行った。【０１５５】
図４A−４Cに光音響信号の測定結果を示す。図４Aには、オシロスコープで取得したｓｃＦｖ−ＮＰ（１２．９）の光音響信号波形を代表例として示す。グラフにはｓｃＦｖ−ＮＰ（１２．９）溶液の吸光度（すなわちｓｃＦｖ−ＮＰの濃度）を変化させたときの結果を並べてある。時間遅れで検知されるピークは、セル内での反射などの影響を受けていると考えられるため，最初のピークのみが信号として有効である。図４Aから明らかなように、被検粒子からの光音響信号が確認され、また光音響信号強度におけるｓｃＦｖ−ＮＰ（１２．９）溶液の吸光度依存性が観察された。その他の全ての被検粒子においても、同様にして光音響信号の発信ならびに信号強度の吸光度依存性を確認できた。図４Bには、すべての被検粒子の光音響信号強度と７１０ｎｍの吸光度をプロットしたものを示す。【０１５６】
図４Bより、光音響信号は被検粒子溶液の吸光度と直線関係があることが確認された。また、それぞれの被検粒子の信号強度と７１０ｎｍ吸光度のデータの線形近似曲線より、単位吸光度あたりの光音響信号強度（ｍＶ／ａｂｓ）を求め、それらをグラフにしたものを図４Cに示す。ｍＶ／ａｂｓは粒子の光音響信号の発信能を表すものであり、光音響イメージング用造影剤としては、ｍＶ／ａｂｓの高いものが望ましいといえる。図４Cより、抗体固定化前後で、その光音響信号の発信能は変化していない（図中、ＮＰ−ＣＯＯＨとＩｇＧ−ＮＰ、ＮＰ−ＭａｌｅｉｍｉｄｅとｓｃＦｖ−ＮＰ、ＮＰ−ＥＯ−ＣＯＯＨとＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰあるいはｃＩｇＧ−ＮＰとの比較より）、ならびにＩｇＧとｓｃＦｖの違いによる光音響信号の発信能の違いはないことが確認された（ＩｇＧ−ＮＰとｓｃＦｖ−ＮＰの比較より）。以上の結果より、本発明の抗体固定化酸化鉄粒子は、信号発信部である酸化鉄粒子の光音響信号発信能を低下させることなしに、リガンド分子を固定化できており、高い感度と結合能を有する光音響イメージング用造影剤として機能することが実証された。
【実施例４】
【０１５７】
（抗体とエチレンオキシドリンカーを有する２０ｎｍ酸化鉄粒子との結合）
前記「抗体とエチレンオキシドリンカーを有する酸化鉄粒子との結合」に従い、２０ｎｍ酸化鉄粒子に抗体（ハーセプチン（登録商標））を結合させた。仕込みの反応モル比（抗体／酸化鉄粒子を含有する粒子）は、２０で行った。酸化鉄粒子を含有する粒子への抗体の固定化量は、５．４（抗体／酸化鉄粒子を含有する粒子）であった。以下、該ハーセプチン（登録商標）を固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子をＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰ（５．４）と示す。ＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰ（５．４）の平均流体力学的直径を動的光散乱法で決定したところ、３９．４ｎｍ（個数換算分布）であった。また、ＰＢＳ中における粒子のゼータ電位は、−４．５ｍＶであった。
【実施例５】
【０１５８】
（人工抗体とエチレンオキシドリンカーを有する２０ｎｍ酸化鉄粒子との結合）
前記「一本鎖抗体ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖと酸化鉄粒子との結合」に従い、エチレンオキシドリンカーを有する酸化鉄粒子を含有する粒子に人工抗体ｓｃＦｖを結合させた。酸化鉄粒子を含有する粒子としてマレイミド表面修飾されたｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ−ｓｐｉｏ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２０ｎｍ、ＰＥＧリンカーの分子量３００）（以後、ＮＰ−ＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―２０と略す）を用いた。ＮＰ−ＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―２０を用いた以外は、前記「一本鎖抗体ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖと酸化鉄粒子との結合」と同様にして行った。仕込みの反応モル比（ｓｃＦｖ／酸化鉄粒子を含有する粒子）は、２０で行った。粒子収率は、エチレンオキシドリンカーを持たないＮＰ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅを用いた場合の粒子収率（最大５７％）よりも高く、７４％であった。これは、ＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰの結果と同様に、エチレンオキシドリンカーにより、粒子の分散安定性が向上したと考えられる。以下、ここで得られたｓｃＦｖを固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子をｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０と示す。ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０の平均流体力学的直径を動的光散乱法で決定したところ、２２．３ｎｍ（個数換算分布）であった。酸化鉄粒子を含有する粒子へのｓｃＦｖの固定化量は、１２．２（ｓｃＦｖ／粒子）であった。また、ＰＢＳ中における粒子のゼータ電位は、−４．６ｍＶであった。
【実施例６】
【０１５９】
（ペプチド固定化酸化鉄粒子の調製）
（ＨＥＲ２結合性ペプチドと酸化鉄粒子との結合）
ＨＥＲ２結合性ペプチド（アミノ酸配列ＭＡＲＳＧＬＧＧＫＧＳＣ、以後ＨＢＰと略す）をリン酸バッファー（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ／１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に溶解させ、４℃で約１６時間、ＮＰ−ＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―２０と反応させた。仕込みの反応モル比（ＨＢＰ／酸化鉄粒子を含有する粒子）は、７１で行った。反応後、１０ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社）を用いた限外ろ過により酸化鉄粒子を含有する粒子へ結合しなかったＨＢＰを除去して、ＨＢＰと酸化鉄粒子を含有する粒子との複合体を得た。なお、限外ろ過後、ろ液中に含まれる未反応ＨＢＰを定量することで、酸化鉄粒子を含有する粒子へのＨＢＰの固定化量を算出した。酸化鉄粒子を含有する粒子へのＨＢＰの固定化量は、４７（ＨＢＰ／酸化鉄粒子を含有する粒子）であった。以下、ここで得られたＨＢＰを固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子をＨＢＰ−ＥＯ−ＮＰ―２０と示す。ＨＢＰ−ＥＯ−ＮＰ―２０の平均流体力学的直径を動的光散乱法で決定したところ、２８．１ｎｍ（個数換算分布）であった。また、ＰＢＳ中における粒子のゼータ電位は、−０．６ｍＶであった。ここで用いたＨＥＲ２結合性ペプチドは、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９２，７４８−７５５（２００１）に報告されたＨＥＲ２結合ペプチドＭＡＲＳＧＬを元に設計された。このペプチドに、リンカー配列としてＧＧＫＧＳＣを連結させており、Ｃ末端のシステインの側鎖チオールを用いて、粒子に結合させている。
【実施例７】
【０１６０】
（リガンド分子を固定化した、酸化鉄粒子のＨＥＲ２への結合能評価）粒子とＨＥＲ２との相互作用をＢｉａｃｏｒｅ  Ｘシステム（ＧＥヘルスケア株式会社）を用いて解析した。抗原として、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ２／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いた。そして、メーカーの推奨プロトコールに従って、ＣＭ−５チップ表面のカルボキシメチルデキストラン鎖へのアミンカップリングにより固定した。固定化量は、約１０００〜２０００ＲＵ程度とした。ランニングバッファーとしてはＰＢＳ−Ｔ（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ／１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）を用いた。粒子濃度は、ｓｃＦｖ濃度として０．１〜１００ｎＭとした。流速は２〜４ｕｌ／ｍｉｎ、結合時間は１０〜２０ｍｉｎとした。各粒子濃度をアプライした際の結合量、すなわちレスポンスＲｅｑを計測した。スキャッチャードプロットを作成し、その傾きから見かけの平衡解離定数（Ｋｄ）を求めた。その結果、ＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰ（５．４）、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０、ならびにＨＢＰ−ＥＯ−ＮＰ―２０のＨＥＲ２への平衡解離定数（Ｋｄ）は、それぞれ、０．６ｎＭ、０．０１ｎＭ、ならびに３６．７ｎＭであった。ｓｃＦｖを固定化した粒子において、最も強い結合能が得られた。
【実施例８】
【０１６１】
（リガンド分子を固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子のＨＥＲ２発現細胞への結合能評価）
ＨＥＲ２発現細胞に対する粒子の結合能評価を行った。前日にＨＥＲ２陽性細胞（Ｎ８７細胞）を２４ウェルプレートに播種した（５ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。翌日、培地を除去し、増殖培地２００ｕＬを入れた後、粒子サンプルを添加した。３７℃で４時間、ＣＯ２インキュベータ内で静置した。その後、粒子を含む培地を除去し、ＰＢＳ  １ｍＬで２回、しっかり洗った。ＰＢＳを除去した後、細胞を溶かすため、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＰＢＳ溶液を１５０ｕＬ／ｗｅｌｌ加えた。室温で２時間以上インキュベートした。次いで、濃塩酸（１２Ｎ）を１５０ｕＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で２時間以上インキュベートした。このサンプル酸溶解液（６Ｎ  ＨＣｌ溶液、３００ｕＬ）中の鉄量を測定することで、細胞に結合した粒子濃度が求められた。粒子のＮ８７に対する飽和結合カーブから、スキャッチャードプロットを作成し、細胞に対する粒子の見かけの平衡解離定数（Ｋｄ）を求めた。その結果、ＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰ（５．４）、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０、ならびにＨＢＰ−ＥＯ−ＮＰ―２０のＮ８７細胞への平衡解離定数（Ｋｄ）は、それぞれ、１０ｎＭ、５．８ｎＭ、ならびに７８ｎＭであった。ｓｃＦｖを固定化した粒子において、最も強い結合能が得られた。
【実施例９】
【０１６２】
（リガンド分子を固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子のマウス体内動態評価）
前記通りに作製したリガンド分子固定化酸化鉄粒子の担癌マウスにおける体内動態を評価した。被検粒子として、ＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰ（５．４）、ｃＩｇＧ−ＮＰ、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０、ならびにＨＢＰ−ＥＯ−ＮＰ―２０を用いた。まず、公知の方法に従い、各粒子を放射性同位体（以後、ＲＩと略す）で標識した。ＲＩ核種としては、エネルギー・半減期・放射標識の容易性の観点から最も体内動態検討に適している１１１−インジウム（１１１Ｉｎと略す事がある）を用いた。１１１Ｉｎを粒子に標識するために、二官能性キレートのジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ、ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｔｒｉａｍｉｎｅ−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）無水物（ＤＴＰＡ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を用いた。まず、抗体のリジン残基あるいは粒子のアミノ基にＤＴＰＡ無水物を反応させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）で精製した。その後、１１１−インジウムを標識してＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）で精製することで、ＲＩ標識粒子を得た。【０１６３】
ＲＩ標識粒子（４７０μｇ／１００μＬ  ＰＢＳ、放射化学的純度：＞９０％）を担癌モデルマウスに静脈内投与し、投与７２時間後までの体内動態を臓器摘出法により調べた。評価タイムポイントは投与１，３，６，２４，４８，７２時間とし、各タイムポイントで３匹以上のマウスを用いた。担癌モデルマウスは、ＨＥＲ２を高発現するＮ８７細胞をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下移植したものを用いた。より具体的には、ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（日本エスエルシー株式会社）の肩に、５×１０６個のＮ８７細胞を皮下注射した。１４日後には４〜６ｍｍ程度のＮ８７腫瘍が形成された担癌モデルマウスを調製した。この時点で粒子を投与した。マウスへの粒子の投与量は、粒子数として７．４ｘ１０１３個／匹、鉄量として０．２２ｍｇ／匹であった。放射能量として、３７０ｋＢｑ／匹であった。【０１６４】
投与後２４時間目の体内動態結果を図５に示した。図５は各組織における集積量（投与量と組織重量で規格化された値）のグラフである。腫瘍（Ｎ８７細胞）集積性はｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０が最も高く（５．６％ＩＤ／ｇ）、次いでＨＢＰ−ＥＯ−ＮＰ―２０（４．０％ＩＤ／ｇ）、ＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰ（５．４）（２．５％ＩＤ／ｇ）、ｃＩｇＧ−ＮＰ（２．５％ＩＤ／ｇ）、であった。抗体を固定化した粒子（ＩｇＧ−ＥＯ−ＮＰ（５．４）、ｃＩｇＧ−ＮＰ）はいずれも肝臓への集積が顕著であり、一方、人工抗体やペプチドを固定化した粒子（ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０、ＨＢＰ−ＥＯ−ＮＰ―２０）は腎臓への集積が顕著であった。【０１６５】
抗体の場合、抗体を粒子に結合させた結果生じる抗体の変性、ならびに抗体のＦｃ部分の存在により、オプソニン化を受けやすく、多くが肝臓・脾臓へ移行したものと考えられる。抗体とコントロール抗体の腫瘍集積性は差が無かったことより、抗体粒子の集積はパッシブな集積である可能性がある（ＥＰＲ効果による腫瘍集積）。【０１６６】
一方、人工抗体は粒子に部位特異的に固定化されており、抗体の変性は少なく、高い結合能を有している。サイズも小さく、肝臓・脾臓への移行を抑制でき、血中濃度が抗体固定化粒子よりも向上した。これらの結果、人工抗体粒子の腫瘍集積性が向上したと考えられる。腎臓への顕著な移行は、粒子表面から遊離した人工抗体が集積している可能性を示唆している。ペプチドでは、結合能は低いものの、サイズが小さく、Ｆｃ部分を持たないために肝臓への集積が減じられ、その結果、腫瘍集積性が抗体粒子よりも向上したと思われる。本結果より、本発明にかかる酸化鉄粒子を含有する粒子のリガンド分子として、人工抗体の優位性が実証された。
【実施例１０】
【０１６７】
（人工抗体とエチレンオキシドリンカーを有する５０ｎｍ酸化鉄粒子との結合）
実施例５に従い、エチレンオキシドリンカーを有する５０ｎｍ酸化鉄粒子を含有する粒子に人工抗体ｓｃＦｖを結合させた。酸化鉄粒子を含有する粒子としてマレイミド表面修飾された５０ｎｍの酸化鉄粒子を含有する粒子、ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ−ｓｐｉｏ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径５０ｎｍ、ＰＥＧリンカーの分子量３００）（以後、ＮＰ−ＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―５０と略す）を用いた。ＮＰ−ＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―５０を用い、仕込みの反応モル比（ｓｃＦｖ／酸化鉄粒子を含有する粒子）を１２５で行った以外は、実施例４と同様にして行った。粒子収率は、７６％であった。以下、ここで得られたｓｃＦｖを固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子をｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―５０と示す。ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―５０の平均流体力学的直径を動的光散乱法で決定したところ、５４．５ｎｍ（個数換算分布）であった。酸化鉄粒子を含有する粒子へのｓｃＦｖの固定化量は、９１（ｓｃＦｖ／粒子）であった。また、ＰＢＳ中における粒子のゼータ電位は、−０．５ｍＶであった。
【実施例１１】
【０１６８】
（人工抗体とエチレンオキシドリンカーを有する１００ｎｍ酸化鉄粒子との結合）
実施例５に従い、エチレンオキシドリンカーを有する１００ｎｍ酸化鉄粒子を含有する粒子に人工抗体ｓｃＦｖを結合させた。酸化鉄粒子を含有する粒子としてマレイミド表面修飾された１００ｎｍの酸化鉄粒子を含有する粒子、ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ−ｓｐｉｏ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径１００ｎｍ、ＰＥＧリンカーの分子量３００）（以後、ＮＰ−ＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―１００と略す）を用いた。ＮＰ−ＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―１００を用い、仕込みの反応モル比（ｓｃＦｖ／酸化鉄粒子を含有する粒子）を５００で行った以外は、実施例４と同様にして行った。粒子収率は、６２％であった。以下、ここで得られたｓｃＦｖを固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子をｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―１００と示す。ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―１００の平均流体力学的直径を動的光散乱法で決定したところ、１１４．２ｎｍ（個数換算分布）であった。酸化鉄粒子を含有する粒子へのｓｃＦｖの固定化量は、３７５（ｓｃＦｖ／粒子）であった。また、ＰＢＳ中における粒子のゼータ電位は、−３．１ｍＶであった。
【実施例１２】
【０１６９】
（人工抗体とエチレンオキシドリンカーを有する２００ｎｍ酸化鉄粒子との結合）
実施例５に従い、エチレンオキシドリンカーを有する２００ｎｍ酸化鉄粒子を含有する粒子に人工抗体ｓｃＦｖを結合させた。酸化鉄粒子を含有する粒子としてマレイミド表面修飾された２００ｎｍの酸化鉄粒子を含有する粒子、ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２００ｎｍ、ＰＥＧリンカーの分子量３００）（以後、ＮＰ−ＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―２００と略す）を用いた。ＮＰ−ＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―２００を用い、仕込みの反応モル比（ｓｃＦｖ／酸化鉄粒子を含有する粒子）を２０００で行った以外は、実施例４と同様にして行った。粒子収率は、８０％であった。以下、ここで得られたｓｃＦｖを固定化した、鉄粒子を含有する粒子をｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００と示す。ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００の平均流体力学的直径を動的光散乱法で決定したところ、１７１．７ｎｍ（個数換算分布）であった。酸化鉄粒子を含有する粒子へのｓｃＦｖの固定化量は、１４６０（ｓｃＦｖ／粒子）であった。また、ＰＢＳ中における粒子のゼータ電位は、−１．８ｍＶであった。
【実施例１３】
【０１７０】
（粒子サイズの異なるｓｃＦｖ−ＮＰの結合能評価）
実施例７に記載の方法に従い、粒子サイズの異なるｓｃＦｖ−ＮＰのＨＥＲ２への結合能評価を行った。その結果、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―５０、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―１００、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００のＨＥＲ２への平衡解離定数（Ｋｄ）は、それぞれ０．０１ｎＭ、０．６９ｎＭ、０．３６ｎＭ、０．０５ｎＭであった。また、実施例８に記載の方法に従い、粒子サイズの異なるｓｃＦｖ−ＮＰのＨＥＲ２発現細胞に対する結合能評価を行った。その結果、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―５０、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―１００、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００のＨＥＲ２発現細胞に対する平衡解離定数（Ｋｄ）は、それぞれ５．８ｎＭ、７．８７ｎＭ、１．６３ｎＭ、０．０９ｎＭであった。これらの結果より、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００において、最も強い結合能が得られた。
【実施例１４】
【０１７１】
（粒子サイズの異なるｓｃＦｖ−ＮＰのマウス体内動態評価）
前記通りに作製した粒子サイズの異なるｓｃＦｖ−ＮＰの担癌マウスにおける体内動態を評価した。被検粒子として、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―５０、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―１００、ならびにｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００を用いた。実施例９に従い、ＲＩ標識粒子を調製し、担癌モデルマウスに静脈内投与し、粒子の体内動態を臓器摘出法により調べた。マウスへの粒子の投与量は、鉄量として０．２２ｍｇ／匹とした。投与粒子数は、粒子サイズで異なり、次のとおりであった。ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―５０、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―１００、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００のそれぞれで７．４ｘ１０１３個／匹、５．１ｘ１０１２個／匹、７．０ｘ１０１１個／匹、３．２ｘ１０１０個／匹であった。【０１７２】
投与後２４時間目の体内動態結果を図６に示した。図６は各組織における集積量（投与量と組織重量で規格化された値）のグラフである。腫瘍（Ｎ８７細胞）集積性はｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００が最も高く（７．４％ＩＤ／ｇ）、次いでｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０（５．６％ＩＤ／ｇ）、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―５０とｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―１００は同じ（３．３％ＩＤ／ｇ）であった。ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００の高い腫瘍集積性は、粒子のＮ８７細胞に対する高い結合能を反映した結果と思われる。粒子サイズの増加により、肝臓や脾臓の集積量は増加し、腎臓への集積量は減少した。粒子の血中濃度は、粒子のサイズ増加により、減少する傾向が見られた。腫瘍と血液の比（コントラスト）は、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００が最も高く（６．３）、次いでｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０（２．５）、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―１００（２．３）、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―５０（２．０）、であった。ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００では、腫瘍集積性が高く、一方で血中濃度が低いために、高いコントラストが実現できている。腫瘍集積性ならびにコントラストの両観点から、本発明にかかるｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００は、光音響イメージングのための造影剤として高い実用性を備えていることが示された。
【実施例１５】
【０１７３】
（種々のリガンド分子を固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子ならびに粒子サイズの異なるＮＰのモル吸光係数評価と光音響信号評価）
作製したリガンド分子を固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子のモル吸光係数（ε）ならびに光音響信号（ＰＡ信号と略す事がある）を評価した。モル吸光係数の測定は、粒子をＰＢＳ中に分散させ、波長７１０ｎｍの吸光度を計測する事で求めた。また、ＰＡ信号評価は、実施例３の方法に従った。なお、ＰＡ信号は、得られた信号強度値（電圧値：Ｖ）をレーザー入射強度（Ｊ）ならびに粒子濃度（ｎＭ）で規格化した値（Ｖ／Ｊ／ｎＭ）で示した。結果を以下の表２、表３にまとめた。これらの結果より、図４Cにも示されているように、粒子のモル吸光係数ならびにＰＡ信号は粒子サイズに依存しており（表３）、固定化されたリガンド分子には依存しない事が示された（表２）。粒子のモル吸光係数ならびにＰＡ信号は粒子サイズが大きくなるにつれて増大した。このことは、ＰＡ信号とモル吸光係数は比例関係にあることを示すものである。【０１７４】
【表２】
2011043061.tif 000010
【０１７５】
【表３】
2011043061.tif 000011
【０１７６】
図７Aは、光音響信号と粒子モル吸光係数の関係を示している（両対数プロット）。グラフ中の数字は粒子サイズである。本実施例では、上記で調製した粒子のほかに、１３０ｎｍならびに１６０ｎｍの酸化鉄粒子（ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ、Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径１３０ｎｍあるいは１６０ｎｍ、ＰＥＧリンカーの分子量３００）のデータを加えてある。一方、図７Bは、粒子モル吸光係数と粒子中の鉄含有量（１粒子あたりの鉄量）の関係を示している（両対数プロット）。これらのグラフより、粒子の吸光係数に比例して、ＰＡ信号強度が増加し、その粒子の吸光係数は粒子中の鉄量に依存することが明らかとなった。すなわち、光音響信号を高めるためには、粒子サイズを大きくし、粒子中の鉄含量を高めること、単位酸化鉄あたりの吸光係数を上げること（マグヘマイトに対するマグネタイト含率を増加させること）、が必要になる。本実施例に係るリガンド分子を固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子では、以上の課題を解決できる合理的な設計がされている。光音響イメージング用造影剤の光音響信号を、効率よく取得するためには、高い吸光係数が必須であり、例えば、該造影剤の粒子モル吸光係数が１０９（Ｍ−１・ｃｍ−１）以上であると、高いコントラストでの造影が容易になると考えられる。この理由は、既に光音響イメージング用造影剤として多数の報告がある、金ナノロッド（近赤外波長領域におけるモル吸光係数が１０９（Ｍ−１・ｃｍ−１）程度である）を参考にしている。本実施例に係るリガンド分子を固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子では、モル吸光係数１０９（Ｍ−１・ｃｍ−１）以上を達成するには、該粒子に含まれる鉄原子量は１０７個以上であればよく、これまでに報告されている酸化鉄を有する光音響イメージング用造影剤やリガンド分子を固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子では、そのような高い鉄原子量を有するものではない。しかしながら、造影剤の用途やターゲットへの集積性によっては、粒子モル吸光係数は１０９（Ｍ−１・ｃｍ−１）を必要としない場合がある。例えば、血液などのノイズが少ない観察系や、本実施例に係る造影剤が標的への高い集積性を有する場合などである。  
【実施例１６】
【０１７７】
（ｓｃＦｖ−ＮＰの腫瘍集積性、ＨＥＲ２特異性の評価）
図８に、担癌マウスに投与された粒子サイズの異なるｓｃＦｖ固定化酸化鉄粒子の腫瘍集積性（投与後２４時間目、％ＩＤ／ｇ表記）を示した。ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―５０、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―１００、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００、それぞれの、腫瘍（Ｎ８７細胞）への％ＩＤ／ｇ（実施例１４の結果）、ならびにｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００について、ＨＥＲ２陰性腫瘍（ＳＵＩＴ２細胞）への％ＩＤ／ｇを示した（Ｎ８７細胞の代わりにＳＵＩＴ２細胞を使う以外は、実施例９ならびに実施例１４に従って試験した）。各％ＩＤ／ｇの統計的な有意差について、検定結果を示してある（図中、＊、＃で有意差を示す）。その結果、腫瘍集積性（ＨＥＲ２陽性腫瘍）は、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００が最も高く、次いでｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２０、次に、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―５０ならびにｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―１００であった（ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―５０とｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―１００の間には有意差はない）。また、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００について、ＨＥＲ２陰性腫瘍（ＳＵＩＴ２細胞）への集積性は、ＨＥＲ２陽性腫瘍（Ｎ８７細胞）に比べて、有意に低い事が確認された。これは、本実施例のｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００の腫瘍集積は、ＨＥＲ２特異性を有していることを意味し、光音響イメージング用造影剤、例えば、ＨＥＲ２分子を特異的に検出できる光音響イメージング用造影剤として十分に機能しうることが実証された。なお、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００の試験の際、Ｎ８７腫瘍ならびにＳＵＩＴ２腫瘍の大きさが１〜３ｍｍ程度であった。本系における、腫瘍集積性に対する腫瘍サイズの影響については不明であるが、影響している可能性がある。
【実施例１７】
【０１７８】
（ＨＥＲ２結合性ペプチドとエチレンオキシドリンカーを有する２００ｎｍ酸化鉄粒子との結合）
酸化鉄粒子を含有する粒子としてマレイミド表面修飾された２００ｎｍの酸化鉄粒子を含有する粒子、ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２００ｎｍ、ＰＥＧリンカーの分子量３００）（以後、ＮＰ−ＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―２００と略す）を用いた。ＨＥＲ２結合性ペプチド（アミノ酸配列ＭＡＲＳＧＬＧＧＫＧＳＣ  配列番号３  、以後ＨＢＰと略す）をリン酸バッファー（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ／１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に溶解させ、２５℃で約２時間、ＮＰ−ＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―２００と反応させた。仕込みの反応モル比（ＨＢＰ／酸化鉄粒子を含有する粒子）は、１Ｘ１０６で行った。反応後、１００ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社）を用いた限外ろ過により酸化鉄粒子を含有する粒子へ結合しなかったＨＢＰを除去して、ＨＢＰと酸化鉄粒子を含有する粒子との複合体を得た。なお、限外ろ過後、ろ液中に含まれる未反応ＨＢＰを定量することで、酸化鉄粒子を含有する粒子へのＨＢＰの固定化量を算出した。酸化鉄粒子を含有する粒子へのＨＢＰの固定化量は、１．８×１０５（ＨＢＰ／酸化鉄粒子を含有する粒子）であった。以下、ここで得られたＨＢＰを固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子をＨＢＰ１−ＥＯ−ＮＰ―２００と示す。ＨＢＰ−ＥＯ−ＮＰ―２００の平均流体力学的直径を動的光散乱法で決定したところ、１６１．１ｎｍ（個数換算分布）であった。また、ＰＢＳ中における粒子のゼータ電位は、−６．５ｍＶであった。ＨＢＰ１−ＥＯ−ＮＰ―２００の７１０ｎｍにおけるモル吸光係数（ε）は、１．１×１０１０（Ｍ−１×ｃｍ−１）であった。７１０ｎｍにおける光音響信号（Ｖ／Ｊ／ｎＭ）は、２１９．１であった。
【実施例１８】
【０１７９】
（ＨＥＲ２結合性ペプチドの固定化数が異なる２００ｎｍ酸化鉄粒子の調製）
実施例１７に従い、ＨＥＲ２結合性ペプチドの固定化数が異なる２００ｎｍ酸化鉄粒子を調製した。仕込みの反応モル比（ＨＢＰ／酸化鉄粒子を含有する粒子）をそれぞれ、１Ｘ１０５、２Ｘ１０４、２Ｘ１０３で行った以外は実施例１７と同様にして行った。得られたＨＥＲ２結合性ペプチドを固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子を、それぞれ、ＨＢＰ２−ＥＯ−ＮＰ―２００、ＨＢＰ３−ＥＯ−ＮＰ―２００、ＨＢＰ４−ＥＯ−ＮＰ―２００と略す。それぞれの酸化鉄粒子を含有する粒子へのＨＢＰの固定化量（ＨＢＰ／酸化鉄粒子を含有する粒子）は、４．４×１０４、１．４×１０４、２．０×１０３であった（２．０×１０３については、ペプチドの仕込みモル量の値を記す）。それぞれの平均流体力学的直径ならびにゼータ電位は、実施例１７で調製されたＨＢＰ１−ＥＯ−ＮＰ―２００とほとんど変わらなかった。
【実施例１９】
【０１８０】
（ＨＥＲ２結合性ペプチドを固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子のＨＥＲ２発現細胞への結合能評価）
実施例８に従い、粒子のＮ８７細胞に対する飽和結合カーブから、スキャッチャードプロットを作成し、細胞に対する粒子の見かけの平衡解離定数（Ｋｄ）を求めた。その結果、ＨＢＰ１−ＥＯ−ＮＰ―２００、ＨＢＰ２−ＥＯ−ＮＰ―２００、ならびにＨＢＰ３−ＥＯ−ＮＰ―２００のＮ８７細胞への平衡解離定数（Ｋｄ）は、それぞれ、０．６７ｎＭ、０．４３ｎＭ、ならびに０．４９ｎＭであった。ＨＥＲ２結合性ペプチドの固定化数の最も少ないＨＢＰ４−ＥＯ−ＮＰ―２００では、結合が弱く、スキャッチャードプロットから平衡解離定数（Ｋｄ）が求められなかった。ＨＥＲ２に対するＨＥＲ２結合性ペプチド固有の平衡解離定数（Ｋｄ）は、μＭ以下であると考えられ、非常に弱い。本実施例で示すように、ＨＥＲ２結合性ペプチドを粒子に大量に固定化することで、ＨＥＲ２への強い結合能を有する酸化鉄粒子を含有する粒子が得られた。
【実施例２０】
【０１８１】
（エチレンオキシドリンカーの分子量が異なるＨＥＲ２結合性ペプチド固定化酸化鉄粒子の調製）
実施例１７、１８に従い、エチレンオキシドリンカーの分子量が２０００であるＨＢＰ−ＥＯ−ＮＰ―２００を調製した。酸化鉄粒子を含有する粒子としてマレイミド表面修飾された２００ｎｍの酸化鉄粒子を含有する粒子、ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２００ｎｍ、ＰＥＧリンカーの分子量２０００）（以後、ＮＰ−ＥＯ２ｋ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―２００と略す）を用いた以外は実施例１７、１８と同様にして行った。得られたＨＥＲ２結合性ペプチドを固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子を、それぞれ、ＨＢＰ１−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００、ＨＢＰ２−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００、ＨＢＰ３−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００、ＨＢＰ４−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００と略す。それぞれの酸化鉄粒子を含有する粒子へのＨＢＰの固定化量（ＨＢＰ／酸化鉄粒子を含有する粒子）は、２．５×１０５、４．９×１０４、１．２×１０４、２．０×１０３であった（２．０×１０３については、ペプチドの仕込みモル量の値を記す）。それぞれの平均流体力学的直径（キュムラント値）は、２４８ｎｍ、２０７ｎｍ、２５０ｎｍ、ならびに２１１ｎｍであった。それぞれのＰＢＳ中におけるゼータ電位は、−２．６ｍＶ、−２．８ｍＶ、−２．８ｍＶ、ならびに−３．１ｍＶであった。【０１８２】
実施例８に従い、粒子のＮ８７細胞に対する飽和結合カーブから、スキャッチャードプロットを作成し、細胞に対する粒子の見かけの平衡解離定数（Ｋｄ）を求めた。その結果、ＨＢＰ１−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００、ＨＢＰ２−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００、ＨＢＰ３−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００、ＨＢＰ４−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００のＮ８７細胞への平衡解離定数（Ｋｄ）は、それぞれ、０．０７ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、ならびに０．１１ｎＭであった。
【実施例２１】
【０１８３】
（ＨＢＰ−ＥＯ−ＮＰ―２００のマウス体内動態評価）
ＨＢＰ−ＥＯ−ＮＰ―２００の担癌マウスにおける体内動態を評価した。実施例９に従い、ＲＩ標識粒子を調製し、担癌モデルマウスに静脈内投与し、粒子の体内動態を臓器摘出法により調べた。マウスへの粒子の投与量は、鉄量として０．２２ｍｇ／匹とした。投与粒子数は、３．２ｘ１０１０個／匹であった。【０１８４】
投与後２４時間目の体内動態結果を図９に示した。図９は各組織における集積量（投与量と組織重量で規格化された値）のグラフである。腫瘍（Ｎ８７細胞）集積性は１．５％ＩＤ／ｇであった。
【実施例２２】
【０１８５】
（エチレンオキシドリンカーの分子量が異なる人工抗体固定化２００ｎｍ酸化鉄粒子の調製）
実施例１２に従い、分子量２０００あるいは分子量５０００のエチレンオキシドリンカーを有する２００ｎｍ酸化鉄粒子を含有する粒子それぞれに人工抗体ｓｃＦｖを結合させた。酸化鉄粒子を含有する粒子としてマレイミド表面修飾された２００ｎｍの酸化鉄粒子を含有する粒子、ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２００ｎｍ、ＰＥＧリンカーの分子量２０００）（以後、ＮＰ−ＥＯ２ｋ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―２００と略す）ならびに、マレイミド表面修飾された２００ｎｍの酸化鉄粒子を含有する粒子、ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２００ｎｍ、ＰＥＧリンカーの分子量５０００）（以後、ＮＰ−ＥＯ５ｋ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ―２００と略す）を用いた以外は、実施例１２と同様にして行った。ここで得られたｓｃＦｖを固定化した、酸化鉄粒子を含有する粒子をｓｃＦｖ−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００、ｓｃＦｖ−ＥＯ５ｋ−ＮＰ―２００と示す。ｓｃＦｖ−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００とｓｃＦｖ−ＥＯ５ｋ−ＮＰ―２００の平均流体力学的直径（個数換算分布）を動的光散乱法で決定したところ、それぞれ、１７５．６ｎｍ、１８０．９ｎｍであった。酸化鉄粒子を含有する粒子へのｓｃＦｖの固定化量（ｓｃＦｖ／粒子）は、それぞれ、１４９０、１３８０であった。また、ＰＢＳ中における粒子のゼータ電位は、それぞれ、−３．９ｍＶ、−４．０ｍＶであった。【０１８６】
ｓｃＦｖ−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００、ｓｃＦｖ−ＥＯ５ｋ−ＮＰ―２００の７１０ｎｍにおけるモル吸光係数（ε）は、それぞれ、１．３×１０１０（Ｍ−１×ｃｍ−１）、１．１×１０１０（Ｍ−１×ｃｍ−１）であった。７１０ｎｍにおける光音響信号（Ｖ／Ｊ／ｎＭ）は、それぞれ、２６０．０、１６８．０であった。【０１８７】
実施例８に従い、粒子のＮ８７細胞に対する飽和結合カーブから、スキャッチャードプロットを作成し、細胞に対する粒子の見かけの平衡解離定数（Ｋｄ）を求めた。その結果、ｓｃＦｖ−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００とｓｃＦｖ−ＥＯ５ｋ−ＮＰ―２００のＮ８７細胞への平衡解離定数（Ｋｄ）は、それぞれ、０．２２ｎＭ、０．０４ｎＭであった。
【実施例２３】
【０１８８】
（ｓｃＦｖ−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００とｓｃＦｖ−ＥＯ５ｋ−ＮＰ―２００のマウス体内動態評価）
ｓｃＦｖ−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００とｓｃＦｖ−ＥＯ５ｋ−ＮＰ―２００の担癌マウスにおける体内動態を評価した。実施例９に従い、ＲＩ標識粒子を調製し、担癌モデルマウスに静脈内投与し、粒子の体内動態を臓器摘出法により調べた。マウスへの粒子の投与量は、鉄量として０．２２ｍｇ／匹とした。投与粒子数は、３．２ｘ１０１０個／匹であった。【０１８９】
投与後２４時間目の体内動態結果を図１０に示した。図１０は各組織における集積量（投与量と組織重量で規格化された値）のグラフである。ｓｃＦｖ−ＥＯ２ｋ−ＮＰ―２００およびｓｃＦｖ−ＥＯ５ｋ−ＮＰ―２００の腫瘍（Ｎ８７細胞）集積量は、それぞれ４．０％ＩＤ／ｇおよび、２．２％ＩＤ／ｇであった。
【実施例２４】
【０１９０】
（マウス皮下に投与されたｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００の光音響イメージング）
図１１に、自作した小動物用光音響イメージング装置の略図を示す。ＴＩ：ＳＡレーザ光源からのレーザー（波長：７１０ｎｍ、パルス幅  約１０ナノ秒、繰返し１０ＨＺ、ビーム径：約２ミリメーター））を適度に減衰させ、小動物に照射し、発生した光音響信号を超音波トランスデューサー（ＢＤ＝１．５ミリメーター，  ＦＣ＝３．５ＭＨＺ）で検出し、アンプで信号増幅後、オシロスコープ（５０Ω  ＩＮＰＵＴ  ＩＭＰＥＤＡＮＣＥ、２．５ＧＳ／Ｓ、ＲＥＣＯＲＤ  ＬＥＮＧＴＨ  １０Ｋ）に取り込んだ。走査範囲は３．５センチ四方とした。【０１９１】
光音響イメージング用造影剤の一例として、実施例１２で調製されたｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００を用いた。ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（日本エスエルシー株式会社）に、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００のＰＢＳ溶液（鉄濃度  ２．２ｍｇ／ｍＬ）の１００μＬを皮下注射した。その後、マウス麻酔下で、ＰＡイメージング装置にマウスを固定し、マウス皮下におけるｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００の光音響イメージングを行った。結果を図１２に示す。図１２から明らかなように、ｓｃＦｖ−ＥＯ−ＮＰ―２００（鉄  ０．２ｍｇ）からの強い光音響信号を確認した。
【実施例２５】
【０１９２】
（酸化鉄粒子の粒径に対するモル吸光係数と光音響信号）
粒径の異なる酸化鉄粒子のモル吸光係数と光音響信号は、以下の方法で求めた。【０１９３】
粒径の異なる酸化鉄粒子として高分子で被覆された酸化鉄粒子５ｎｍ（鉄原子濃度１．４５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度１０ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−０５、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ製）、１０ｎｍ（鉄原子濃度５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度４．３ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−１０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ製）、２０ｎｍ（鉄原子濃度５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度０．５５ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−２０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ製）、及び５０ｎｍ（鉄原子濃度５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度０．０３４ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ製）を用いた。なお、この粒径は１次粒子径であって、２次粒子径ではない。【０１９４】
これらの酸化鉄粒子を水に分散させ、酸化鉄粒子の分散液を得た。分光光度計（Ｌａｍｂｄａ  Ｂｉｏ４０、Ｐｅｒｋｉｎ  ｅｌｅｍｅｒ製）を用いて、７１０、７５０、８００、及び８５０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定容器は、ポリスチレン製キュベットで、幅１ｃｍ、光路長０．１ｃｍを用いた。この容器に、酸化鉄粒子の分散液２００μｌを入れて、吸光度を測定した。酸化鉄粒子の鉄原子濃度と粒子濃度は、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈの添付資料から求めた。【０１９５】
鉄原子１モルあたりのモル吸光係数と酸化鉄粒子数１モルあたりのモル吸光係数は、吸光度と鉄原子濃度および粒子濃度から計算した。【０１９６】
光音響信号の計測は、パルスレーザー光を水に分散した光音響イメージング用造影剤に照射し、圧電素子を用いて造影剤からの光音響信号を検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで波形を取得して行った。具体的な条件は以下の通りである。パルスレーザー光源として、チタンサファイアレーザ（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ製）を用いた。波長は７１０、７５０、８００、及び８５０ｎｍ、エネルギー密度は２０〜５０ｍＪ／ｃｍ２（選択した波長に依存する）、パルス幅は約２０ナノ秒、パルス繰返周波数は１０Ｈｚとした。水に分散した光音響イメージング用造影剤をおさめる測定容器には、上記ポリスチレン製キュベットを用いた。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径１．２７ｃｍ、中心帯域１ＭＨｚの非収束型超音波トランスデューサ（Ｖ３０３、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ製）を用いた。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を２．５ｃｍとした。光音響信号を増幅する高速プリアンプは増幅度＋３０ｄＢの超音波プリアンプ（Ｍｏｄｅｌ  ５６８２、オリンパス製）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（ＤＰＯ４１０４、テクトロニクス製）に入力した。前記ガラス容器の外からパルスレーザ光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを３２回平均表示モードとし、レーザーパルス照射３２回平均の光音響信号取得を行った。図１５は、典型的な光音響信号の波形である。図中の矢印で示すように、波形から光音響信号強度（Ｖ）を求めた。得られた光音響信号強度を照射パルスレーザーのエネルギー（Ｊ）で割った値を規格化光音響信号（ＶＪ−１）と定義し、以下評価手段として用いた。【０１９７】
鉄原子１モルあたりの規格化光音響信号および酸化鉄粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は、それぞれ鉄原子濃度および粒子濃度から計算した。【０１９８】
図１６A−Dは、粒径の異なる酸化鉄粒子のモル吸光係数および光音響信号である。図１６Aは７１０ｎｍにおける酸化鉄粒子中に含まれる鉄原子１モルあたりのモル吸光係数を、図１６Bは７１０ｎｍにおける酸化鉄粒子数１モルあたりのモル吸光係数を示している。酸化鉄粒子の粒径が大きくなると、鉄原子１モルあたりのモル吸光係数が上昇する傾向にあった。他の波長においても、鉄原子１モルあたりのモル吸光係数の上昇が認められた。この効果により、酸化鉄粒子数１モルあたりのモル吸光係数は、酸化鉄粒子の粒径が大きくなるにつれて著しく上昇した。【０１９９】
図１６Cは７１０ｎｍにおける酸化鉄粒子中に含まれる鉄原子１モルあたりの規格化光音響信号を、図１６Dは７１０ｎｍにおける酸化鉄粒子数１モルあたりの規格化光音響信号を示している。酸化鉄粒子の粒径が大きくなると、鉄原子１モルあたりの規格化光音響信号が上昇した。他の波長においても、同様に、鉄原子１モルあたりの規格化光音響信号が上昇した。この効果により酸化鉄粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は、酸化鉄粒子の粒径が大きくなるにつれて著しく上昇した。【０２００】
酸化鉄粒子の粒径が大きくなるほど、光の吸収量が多くなり、それにともなって、酸化鉄粒子から出る光音響信号が強くなった。特に、１５ｎｍ以上の酸化鉄粒子において、光の吸収量の増加と、光音響信号の増加が認められた。
【実施例２６】
【０２０１】
（光音響イメージング用造影剤１（ＮＰ１）の作製）
ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響イメージング用造影剤は、以下の方法で作製した。【０２０２】
オレイン酸に被覆された５０ｎｍの酸化鉄粒子（１３．８ｍｇ、約５０ｎｍ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ製）及び、ポリ乳酸とグリコール酸の共重合体（９．２ｍｇ、Ｍ．Ｗ．２００００、乳酸：グリコール酸＝１：１、ＰＬＧＡ５０２０、和光純薬工業製）をクロロホルム（１ｍｌ）に加えて、超音波バスで１０分間照射し、クロロホルム溶液を調製した。【０２０３】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（６０ｍｇ、キシダ化学製）を溶解した水溶液（１２ｍｌ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とした。【０２０４】
その後、超音波分散機（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ  ＵＤ−２００、Ｔｏｍｙ製）で４分間処理することによって、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。【０２０５】
次に、前記エマルジョンを４０℃、１００ｈＰａで１時間以上減圧し、分散質からクロロホルムを留去することによって、光音響イメージング用造影剤１の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤１をＮＰ１と略す場合がある。
【実施例２７】
【０２０６】
（光音響イメージング用造影剤２（ＮＰ２）の作製）
リン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響イメージング用造影剤は、以下の方法で作製した。【０２０７】
上記のオレイン酸に被覆された５０ｎｍの酸化鉄粒子（１３．８ｍｇ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ製）及び、ポリ乳酸とグリコール酸の共重合体（９．２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍｌ）に加えて、超音波バスで１０分間照射し、クロロホルム溶液を調製した。【０２０８】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（６０ｍｇ）とリン脂質（７．３ｍｇ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ、Ｎ−［（３−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂａｍｙｌ］  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、日油製）を溶解した水溶液（１２ｍｌ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とした。【０２０９】
その後、超音波分散機で４分間処理することによって、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。【０２１０】
次に、前記エマルジョンを４０℃、１００ｈＰａで１時間以上減圧し、分散質からクロロホルムを留去することによって、光音響イメージング用造影剤２の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤２をＮＰ２と略す場合がある。【０２１１】
（ＮＰ１及び２の物性評価）
ＤＬＳを用いて、ＮＰ１及びＮＰ２の粒径を求めた。ＮＰ１及びＮＰ２は水に分散させ、動的光散乱解析装置（ＤＬＳ、大塚電子製、ＥＬＳ−Ｚ）を用いて、平均粒径を測定した。その結果を図１７A及び図１８Aに示す。ＮＰ１及びＮＰ２の平均粒径（重量換算）は、各々２０５及び１７６ｎｍであった。【０２１２】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｈ８００、日立製）を用いて、ＮＰ１及びＮＰ２を観察した。図１７B及び図１８Bは光音響イメージング用造影剤のＴＥＭ写真である。酸化鉄粒子を複数個含有する光音響イメージング用造影剤が観察できた。【０２１３】
発光分光装置（ＩＣＰ、ＣＩＲＯＳ  ＣＣＤ、ＳＰＥＣＴＲＯ製）を用いて、ＮＰ１及びＮＰ２に含まれる酸化鉄粒子量を定量した。光音響イメージング用造影剤を濃硝酸で溶解し、ＩＣＰでＦｅ量を定量し、酸化鉄粒子の質量を計算した。光音響イメージング用造影剤の水分散液を凍結乾燥し、その後に質量を測定して、光音響イメージング用造影剤全体の質量を求めた。酸化鉄粒子の質量と、光音響イメージング用造影剤の質量から、光音響イメージング用造影剤中の酸化鉄粒子の含有率を計算したところ、ＮＰ１及びＮＰ２は各々５８及び６３（ｗｔ）％であった。酸化鉄粒子を高い率で含有する光音響イメージング用造影剤が得られた。【０２１４】
得られたＮＰ１及びＮＰ２の光吸収性は、光音響イメージング用造影剤の粒子数１モルあたりのモル吸光係数を求めることで評価した。水に分散したＮＰ１及びＮＰ２の光吸収は、分光光度計を用いて測定した。光音響イメージング用造影剤の粒子濃度は、上記の方法で得られた物性値より計算した。波長７１０、７５０、８００、及び８５０ｎｍにおける光音響イメージング用造影剤の粒子数１モルあたりのモル吸光係数は表１にまとめた。波長７１０ｎｍにおけるＮＰ１、ＮＰ２、及びリゾビスト（登録商標）のモル吸光係数は、各々２．１×１０１０、９．９×１０９、１．６×１０６  （Ｍ−１ｃｍ−１（粒子数１モル））であった。既知の光音響イメージング用造影剤であるリゾビスト（登録商標）に比べて、優れた光吸収をもつ光音響イメージング用造影剤が得られた。【０２１５】
2011043061.tif 000012
表１．各波長における光音響イメージング用造影剤の粒子数１モルあたりのモル吸光係数    【０２１６】
表２は、ＮＰ１及びＮＰ２の１粒子あたりの規格化光音響信号である。波長７１０ｎｍにおけるＮＰ１、ＮＰ２、及びリゾビスト（登録商標）の粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は、それぞれ３．５×１０１１、２．０×１０１１、６．０×１０７（ＶＪ−１Ｍ−１（粒子数１モル））であった。既知の光音響イメージング用造影剤であるリゾビスト（登録商標）に比べて、強い音響信号を発する光音響イメージング用造影剤が得られた。
2011043061.tif 000013
表２．各波長における光音響イメージング用造影剤の粒子数１モルあたりの規格化光音響信号【０２１７】
（ＮＰ２上のリン脂質の定量）
ＮＰ２の表面に導入されたリン脂質の量は、末端のマレイミド基の活性を利用して定量した。ＮＰ２とＬ−システインを混合し、１晩インキュベートすることにより、ＮＰ２上のマレイミド基と、Ｌ−システイン上のチオール基との共有結合反応をさせた。遠心分離でＮＰ２を沈殿させ、上澄みを回収することで、未反応のＬ−システインを回収した。未反応のＬ−システインは、５，５’−Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）と混合し、４２０ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。１粒のＮＰ２上にあるリン脂質の量は、５．６×１０５個／個であった。
【実施例２８】
【０２１８】
（一本鎖抗体ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖの調製）
ＨＥＲ２へ結合するＩｇＧの可変領域の遺伝子配列（ｈｕ４Ｄ５−８）を基に、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖを作製した。まずｈｕ４Ｄ５−８のＶＬ、ＶＨ遺伝子をペプチド（ＧＧＧＧＳ）３をコードするｃＤＮＡで連結したｃＤＮＡを作製した。５’末端には制限酵素ＮｃｏＩ−  を、３’末端には制限酵素ＮｏｔＩの認識サイトを導入した。以下に塩基配列を示す。
５’−ＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＴＡＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＣＧＡＡＡＣＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＧＧＣＴＣＡＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＡＣＧＡＡＴＧＧＴＴＡＴＡＣＴＡＧＡＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡＡＧＣＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号１）
（制限酵素の認識サイトを下線で示す。）【０２１９】
上記遺伝子断片ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖをプラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＴ７／ｌａｃプロモーターの下流に挿入した。具体的には、制限酵素ＮｃｏＩ−とＮｏｔＩで消化処理したｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に、上記のｃＤＮＡをライゲーションする。【０２２０】
この発現プラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３））に形質転換し、発現用菌株を得た。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地４ｍｌで一晩前培養後、全量を２５０ｍｌの２ｘＹＴ培地に添加し、２８℃、１２０ｒｐｍで８時間振とう培養した。その後、終濃度１ｍＭでＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、２８℃で一晩培養した。培養した大腸菌を８０００ｘｇ、３０分、４℃で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の６０％重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩４℃で静置後、８０００ｘｇ、３０分、４℃で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／５００  ｍＭ  ＮａＣｌバッファーに溶解し、１リットルの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（登録商標）Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を充填したカラムへ添加し、Ｎｉイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりシングルバンドを示し分子量は約２８ｋＤａであることを確認した。以下に調製された抗体のアミノ酸配列を示す。以後、ｈｕ４Ｄ５−８  ｓｃＦｖをｓｃＦｖと略すことがある。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣ（配列番号２）【０２２１】
（一本鎖抗体ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖとＮＰ２との結合）
上記で調製したｓｃＦｖを５  ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸バッファー（２．６８  ｍＭ  ＫＣｌ／１３７  ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／  １ｍ  Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）にバッファー置換後、ｓｃＦｖのモル量に対して２０倍のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）によって、２５℃で約２時間、還元処理した。この還元処理したｓｃＦｖを、２５℃で３時間、上記で作製したＮＰ２と反応させた。ＮＰ２の粒子モル量に対して２０００倍のｓｃＦｖを反応に用いた。遠心分離により、ｓｃＦｖを固定化したＮＰ２の沈殿物と、未反応のｓｃＦｖの上澄みを得た。未反応のｓｃＦｖを液体クロマトグラフィーで定量した。１粒のＮＰ２上に固定化されたｓｃＦｖは、１．４×１０３個／個であった。
【実施例２９】
【０２２２】
（光音響イメージング用造影剤３（ＮＰ３）の作製）
両親媒性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響イメージング用造影剤は、以下の方法で作製した。【０２２３】
クロロホルム（３ｍｌ）にスチレン−無水マレイン酸共重合体（１２．５ｍｇ、平均分子量：９５００、スチレン：無水マレイン酸＝７５：２５（モル比）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を溶解し、そこへＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２（４５ｍｇ、平均分子量：５０００、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−５０ＥＡ、日油製）を加えて反応させることによって、両親媒性ポリマー（ＰＥＧ鎖を導入したスチレン−無水マレイン酸共重合体）を得た。【０２２４】
オレイン酸に被覆された５０ｎｍの酸化鉄粒子（１４ｍｇ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、及び上記の両親媒性ポリマー（５０ｍｇ）をクロロホルム（３ｍｌ）に加えた後、エバポレーションによってクロロホルムを留去した。【０２２５】
その後、水（１８ｍｌ）を加えて超音波バスで１分間処理することによって、光音響イメージング用造影剤３の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤３をＮＰ３と略す場合がある。【０２２６】
ＮＰ３の平均粒径は２１１ｎｍ（重量換算）であった。また、ＮＰ３の粒子数１モルあたりのモル吸光係数は１．９×１０１０  （Ｍ−１ｃｍ−１（粒子数１モル））であり、粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は４．８×１０１１（  Ｖ  Ｊ−１Ｍ−１（粒子１モル））であることを確認した。【０２２７】
ｃｒｙｏ−ＴＥＭを用いてＮＰ３を観察し、その結果を図１９に示した。図１９から、ＮＰ３では、複数個の酸化鉄粒子が含有されていることが確認された。
【実施例３０】
【０２２８】
（光音響イメージング用造影剤の粒径と光音響信号）
粒径の異なる光音響イメージング用造影剤は、以下の方法で作製した。酸化鉄粒子として、オレイン酸に被覆された５０ｎｍの酸化鉄粒子（ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ製）と、オレイン酸に被覆された５ｎｍの酸化鉄粒子（ＳＯＲ−０５、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ製）を用いた。【０２２９】
５ｎｍ又は５０ｎｍの酸化鉄粒子（１３．８ｍｇ）、及びポリ乳酸とグリコール酸の共重合体（９．２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍｌ）に加えて、超音波バスで１０分間照射し、クロロホルム溶液を調製した。次に、Ｔｗｅｅｎ２０（６０ｍｇ、キシダ化学製）を溶解した水溶液（１２ｍｌ）に、リン脂質の有無、リン脂質の種類を変え、様々な種類のＴｗｅｅｎ２０水溶液を作製し、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とした。以下、ＮＰ１及びＮＰ２と同様の方法で作製した。なお、５ｎｍの酸化鉄粒子を含有する光音響イメージング用造影剤及び５０ｎｍの酸化鉄粒子を含有する光音響イメージング用造影剤は鉄原子の重さをそろえて作製した。ＴＥＭ観察と、光音響イメージング用造影剤中の酸化鉄粒子の含有率から、得られた光音響イメージング用造影剤には、複数個の５ｎｍの酸化鉄粒子、複数個の５０ｎｍの酸化鉄粒子が密に詰まっていることが確認できた。【０２３０】
図２０A 、２０Bは、５０ｎｍまたは５ｎｍの酸化鉄粒子を含有する光音響イメージング用造影剤の平均粒径（重量換算）と、光音響信号との関係を示している。光音響信号として、図２０Aでは鉄原子１モルあたりの規格化光音響信号を、図２０Bでは光音響イメージング用造影剤粒子数１モルあたりの規格化光音響信号を示している。５０ｎｍの酸化鉄粒子を含有させた光音響イメージング用造影剤では、光音響イメージング用造影剤の粒径が大きくなると、鉄原子１モルあたりの光音響信号の増加が認められた。その傾向は、作製方法、つまり酸化鉄粒子以外の成分に関係がなかった。また、この傾向により、５０ｎｍの酸化鉄粒子を含有する光音響イメージング用造影剤では、光音響イメージング用造影剤の粒子数１モルあたりの光音響イメージング用造影剤も増加し、強い光音響信号を発する光音響イメージング用造影剤が得られた。
【符号の説明】
【０２３１】
１    光音響イメージング用造影剤
２    酸化鉄粒子
３    両親媒性化合物
４    リン脂質
５    ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル
６    両親媒性ポリマー
７    疎水性ポリマー
８    捕捉分子
９    光音響イメージング用造影剤
１０  第一液体
１１  第二液体
１２  エマルジョン
１３  水【０２３２】
この出願は２００９年１０月５日に出願された日本国特許出願第２００９−２３１９９４及び２０１０年６月２４日に出願された日本国特許出願第２０１０−１４４３２２からの優先権を主張するものであり、その内容を引用してこの出願の一部とするものである。
【図１】
2011043061.tif 000014
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年2月27日(2012.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
近赤外線領域の光を吸収する酸化鉄粒子を含有する粒子と、前記酸化鉄粒子を含有する粒子に固定された少なくとも１つ以上のリガンド分子とを含み、前記リガンド分子の固定化密度が標的分子の細胞表面密度以上であることを特徴とし、化１で表される光音響イメージング用造影剤。
ＭＮＰ−（（Ｌ）ｌ−（Ｐ）ｍ）ｎ      （化１）
（式中、ＭＮＰは酸化鉄粒子を含有する粒子であり、Ｌはリンカー分子、Ｐはリガンド分子である。ｌは０あるいは１である。ｍ、ｎは１以上の整数である。）
【請求項２】
前記リガンド分子は、前記酸化鉄粒子を含有する粒子１個に対して、３個以上、固定されていることを特徴とする請求項１に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項３】
前記リガンド分子が、少なくともモノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、もしくは抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチド、または上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に結合する抗体またはペプチドの何れかであることを特徴とする請求項１または２のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項４】
前記リンカー分子がポリエチレンオキシドであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項５】
前記ポリエチレンオキシドの分子量が１００から１００００であることを特徴とする請求項４に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項６】
前記酸化鉄粒子を含有する粒子がデキストランをマトリックスとする粒子であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項７】
前記酸化鉄粒子を含有する粒子がマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項８】
前記酸化鉄粒子の粒径が１５ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項９】
前記酸化鉄粒子の粒径が２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤を用いた標的分子を検出するためのイメージング方法であって、該光音響イメージング用造影剤を細胞、組織、動物、あるいはヒトの検体に投与するステップと、パルス光を該検体に照射するステップと、該検体内に存在する該標的分子に結合した該光音響イメージング用造影剤由来の光音響信号を測定するステップと、を少なくとも有することを特徴とする標的分子の光音響イメージング方法。
【請求項１１】
前記酸化鉄粒子を含有する粒子の粒子モル吸光係数が１０９（Ｍ−１・ｃｍ−１）以上であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１２】
前記酸化鉄粒子を含有する粒子中に含まれる鉄原子量が１０７個以上であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１３】
酸化鉄粒子を有する光音響イメージング用造影剤において、一本鎖抗体が前記粒子に結合していることを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項１４】
請求項１３に記載の光音響イメージング用造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程と、
前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波を検出する工程と、
を有することを特徴とする光音響イメージング方法。
【国際調査報告】
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