(57)【要約】  腫瘍の存在をより高い確度で、簡便かつ迅速に検出することができる腫瘍の検出方法等を提供する。本発明に係る腫瘍の検出方法は、患部組織中のN1,N12-ジアセチルスペルミンの量とその周辺の正常組織中のN1,N12-ジアセチルスペルミンの量とをともに測定し、得られる測定結果を指標として腫瘍を検出する方法である。
2011136343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織中のN1,N12-ジアセチルスペルミンの量を測定し、得られる測定結果と腫瘍とを関連づけることを特徴とする腫瘍の検出方法であって、前記測定は、患部組織中のN1,N12-ジアセチルスペルミンの量と当該患部周辺の正常組織中のN1,N12-ジアセチルスペルミンの量とをともに測定するものであることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
生体組織中のN1,N12-ジアセチルスペルミンの量を測定し、得られる測定結果と腫瘍の状態とを関連づけることを特徴とする腫瘍の状態の評価方法であって、前記測定は、患部組織中のN1,N12-ジアセチルスペルミンの量と当該患部周辺の正常組織中のN1,N12-ジアセチルスペルミンの量とをともに測定するものであることを特徴とする、前記方法。
【請求項３】
腫瘍の状態が、癌の有無、癌の進行度、癌の悪性度、癌の転移の有無及び癌の再発の有無からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
腫瘍が、大腸癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、肺癌、肝臓癌、尿路悪性腫瘍、子宮癌、脳腫瘍、骨髄性白血病及び悪性リンパ腫からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍が早期癌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
N1,N12-ジアセチルスペルミンに対する抗体、及び生体組織抽出液調製用の酸性溶液又は中性緩衝液を含む、腫瘍の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の存在を早期の段階で簡便かつ迅速に検出することができるがんの検出方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアミンは、プトレッシン、カダベリン、スペルミジン及びスペルミン並びにそれらの誘導体等の総称で、生体内に広く分布する生理活性物質である。1971年、Russelらは、がん患者の尿中にポリアミンが増加することを見いだし（非特許文献１）、尿中ポリアミンが腫瘍マーカーとなる可能性を指摘した。しかし、その後の研究により、「尿中総ポリアミン」ないし「尿中の特定ポリアミン成分のアミン体並びにそれらのモノアセチル体」は、いずれも腫瘍マーカーとして実用に耐える性能を有しないことが明らかになった（非特許文献２）。【０００３】
このような状況の中で、平松らは、尿中にN1,N12-ジアセチルスペルミン（以下、「DiAcSpm」という）が存在することを見いだし（非特許文献３）、さらに、この物質が各種の癌患者の尿中で高頻度に増加することを明らかにして、尿中DiAcSpmが新たな腫瘍マーカーとして有望であることを示した（非特許文献４）。特に、大腸癌においては、早期癌（0期及びI期）においても約60%の患者で尿中DiAcSpmが上昇することが示された（非特許文献５）。【０００４】
近年、三木らは腎尿細管由来細胞を用いてポリアミンの原尿からの再吸収について研究した結果、スペルミン及びモノアセチルスペルミンは刷子縁側から再吸収されるのに対して、DiAcSpmは全く再吸収されないことを明らかにした。原尿からの再吸収が起こる成分では、体内における生産量と尿中への排泄量は直接に対応しない。しかし、再吸収されない成分は、体内で生産された全量が尿中に排泄されることになり、生産量が直接排泄量に反映される。このようなしくみで生体内におけるDiAcSpm生成量の変化が直接的に尿中排泄量の変化に反映されることが、この物質を特に性能のよい癌の病態の指標とするための生理学的基礎の一つであると考えられる（非特許文献６）。【０００５】
前述のように、癌患者の尿中でDiAcSpmが高頻度に上昇することは従来から知られていたが、これまで、生体から単離された癌組織の中でDiAcSpmが検出されたという報告は1件もない。
また、生体内においてDiAcSpmがどのようにして生成するか、特に、スペルミンのアセチル化が生体内のどの部分で行われるかということもまだ解明されていない。この点に関連して、最近、Hamaokiら（非特許文献７）は、DiAcSpmの合成部位すなわちアセチル化反応が行われる場所について研究し、DiAcSpm合成部位が癌組織そのものではないこと、実際にDiAcSpmの合成を担っているのは担癌個体内の活性化マクロファージであることを示す実験結果を報告した。担癌個体の血清中でポリアミン濃度が全般的に上昇することは周知であるが、Hamaokiらが実験的に示したような仕組みがあれば、そのポリアミンを利用するマクロファージのアセチル化反応系が活発に働き、多量のDiAcSpmが生成して、それが上述の仕組みで尿中に排泄されることは容易に推論される。【０００６】
ところで、生体から単離された組織（特に腫瘍組織）中の所定の物質を検出し、当該組織の特徴を決定する方法として、例えば、特許文献１には、前立腺組織中のヘプシンポリペプチドの発現の有無を検出し、前立腺癌の病期を評価する方法が開示されている。この方法は、複数人（4名）の正常前立腺組織から得たRNAの等量混合物を参照プールと規定し、その値を病変組織と比較して診断に利用する方法である。
また、特許文献２には、ヒト哺乳動物から生体試料として組織を採取し、DiAcSpm又はN1,N8-ジアセチルスペルミジン（以下、「DiAcSpd」という）を検出することにより、その検出結果を指標として非ヒト哺乳動物が腫瘍に罹っているかどうかを診断することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2003/012067号
【特許文献２】特開2007-256129号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Cancer Res., vol. 31, p. 749-790 (1971)
【非特許文献２】Prog. Drug Res., vol. 39, p.9-33 (1992)
【非特許文献３】J. Biochem., vol. 117, p107-112 (1995)
【非特許文献４】J. Biochem., vol. 139, p. 315-322 (2006)
【非特許文献５】Clin. Cancer Res., vol. 11, p. 2986-2990 (2005)
【非特許文献６】J. Biochem., vol. 138, p. 479-484 (2005)
【非特許文献７】Cancer Lett., vol. 243, p. 128-134 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
尿中DiAcSpmを指標とした場合の0〜I期大腸癌に対する陽性検出率（約60％）は、CEAやCA19-9（約10％）を指標とした場合との比較においては高い割合であるが、同時に、なお多数の癌患者が偽陰性として見逃されることを意味しており、早期癌に対してより高い陽性検出率を示す検査方法を開発することが求められている。【００１０】
早期癌を含めた大腸癌の判定は、現在は、癌が疑われる組織標本の病理組織検査によって行われ、現状ではその所見が確定診断として採用されている。しかしながら、これは組織の一部から作製された組織切片についての観察に基づくものであるため、癌病変箇所の見落としの危険もあり、また検査者の熟練度や最終的には主観によって結果が影響される場合があることが知られている。これは病理組織検査の問題点の一つである。また、病理組織検査の結果が確定するまでには、通常、数日以上の日数がかかる。これもまた、大きな問題である。【００１１】
このような問題点を克服し、組織標本全体について、数値化可能な客観的指標を採用した判定基準を作製し、さらに判定に至るまでの時間を大幅に短縮することができれば、癌診断に新たな基準を提供することができる。しかしながら、特許文献１及び２に開示されているように、これまでの診断法では、複数の個体（ヒト又は非ヒト哺乳動物）における正常値の平均値を一般的な基準値としているため、個体差により、もともと正常値が当該平均値とは大きく異なる個体の場合は、偽陽性や偽陰性の結果となる場合があった。【００１２】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、腫瘍の存在（特に早期癌の存在）をより高い確度で、簡便かつ迅速に検出することができる腫瘍の検出方法、及び腫瘍の状態の評価方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、生体組織中のDiAcSpmの量を測定するにあたり、患部組織（癌組織又は癌が疑われる組織）中のDiAcSpmの量を測定するとともに、その患部周辺の正常組織中のDiAcSpmの量も測定したところ、患部組織からは、正常組織よりも単位組織重量あたりのDiAcSpmの量が多く検出されることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）生体組織中のN1,N12-ジアセチルスペルミン（DiAcSpm）の量を測定し、得られる測定結果と腫瘍（例えば癌の有無）とを関連づけることを特徴とする腫瘍の検出方法であって、前記測定は、患部組織中のDiAcSpmの量と当該患部周辺の正常組織中のDiAcSpmの量とをともに測定するものであることを特徴とする、前記検出方法。【００１５】
（２）生体組織中のN1,N12-ジアセチルスペルミン（DiAcSpm）の量を測定し、得られる測定結果と腫瘍の状態とを関連づけることを特徴とする腫瘍の状態の評価方法であって、前記測定は、患部組織中のDiAcSpmの量と当該患部周辺の正常組織中のDiAcSpmの量とをともに測定するものであることを特徴とする、前記評価方法。【００１６】
上記(2)の方法において、腫瘍の状態としては、例えば、癌の有無、癌の進行度、癌の悪性度、癌の転移の有無及び癌の再発の有無からなる群より選ばれる少なくとも１つが挙げられる。
上記(1)及び(2)の方法において、腫瘍としては、例えば、大腸癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、肺癌、肝臓癌、尿路悪性腫瘍、子宮癌（例えば、子宮体癌、子宮頸癌、子宮内膜癌）、脳腫瘍、骨髄性白血病及び悪性リンパ腫からなる群より選ばれる少なくとも１つが挙げられ、さらに、これら腫瘍は、例えば、早期癌であってもよい。【００１７】
（３）N1,N12-ジアセチルスペルミンに対する抗体、及び生体組織抽出液調製用の酸性溶液又は中性緩衝液を含む、腫瘍の検出用キット。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、腫瘍の存在（特に早期癌の存在）をより高い確度で、簡便かつ迅速に検出することができる腫瘍の検出方法、及び腫瘍の状態の評価方法等を提供することができる。
具体的には、本発明の方法を用いれば、同一個体（同一患者等）に由来する生体組織、すなわち患部組織とその周辺の正常組織とについて、単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量を比較することにより、当該含有量の個体差による影響を消去することができるため、極めて高い確度で癌組織の存在を判定することができる。【００１９】
また、癌組織に関して、病期を問わず、また原発巣であるか転移病巣であるかによらず、正常組織と比較してDiAcSpmが明らかに高値を示す結果が得られる。すなわち、本発明は、一つの実施態様では感度及び特異度ともに実質的に100％を示す方法を提供するものであり、極めて高い確度で癌を検出することができる。また、本発明の方法は、例えば0期-1期の早期大腸癌を実質的に100％の陽性検出率で検出することができ、早期癌に対してより高い陽性検出率を示す検査方法の開発という課題を達成し得るものである。【００２０】
さらに、本発明の方法は、患者から採取した生体組織（検体）からのDiAcSpmの抽出、及びDiAcSpm濃度の測定に至る一連の操作に要する時間を極めて短時間に抑えることができ（例えば1時間未満）、その過程には特に高度の熟練を必要とする操作は含まれないため、一般の生化学検査室等の環境でも容易に実施することができるものである。ところで、これまで子宮癌の診断においては、術中迅速診断法として、腹腔内洗浄液を用いた細胞診が用いられており、当該診断法は、本発明の方法と同様に迅速性に優れた方法である。しかしながら、癌組織の所在の検出能の点においては、当該診断法の確度は十分ではなく、本発明の方法は当該診断法に比べてはるかに確度が高いものである。【００２１】
本発明の方法は、従来の病理組織検査と比較して格段に容易かつ迅速であり、また、検出結果を客観的な数値として比較することができ、前述の通り高い確度で癌組織の所在を検出する能力を有するため、迅速性に欠ける病理組織検査の短所を十分に補い得る極めて有用な腫瘍検出法である。なお、本発明の方法は、ヒトから採取した生体組織のほか、ヒト以外の哺乳動物から採取した生体組織についても適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ESI-TOF質量分析法と金コロイド凝集法とによる、単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の測定値を示す図（両方法による測定値の比較結果を示す図）である。
【図２】本実施例において検討した大腸癌の全症例について、癌部と非癌部との間でDiAcSpm値を比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2010-103371号明細書（2010年4月28日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００２４】
１．本発明の概要
本発明者は、前述したような、スペルミンのアセチル化が担癌個体の体内ではマクロファージによって行われるという従来の知見にとらわれることなく、独自の観点から鋭意実験及び調査等を進めた。その結果、本発明者は、生体組織として患部組織（癌組織又は癌が疑われる組織）とその患部周辺の正常組織とからDiAcSpmを抽出し、これら抽出液中のDiAcSpm濃度を測定し比較することにより、患部組織中には、それに隣接する正常組織よりも、単位組織重量あたりのDiAcSpm量が多く検出されることを見出した。本発明は、これらの知見に基づき完成されたものであり、生体組織中のDiAcSpm量の測定結果を指標とする、具体的には患部組織中のDiAcSpm量の測定結果と正常組織中のDiAcSpm量の測定結果とを指標とする、腫瘍の検出方法及び腫瘍の状態の評価方法等を提供するものである。
【００２５】
２．腫瘍の検出方法
本発明においては、DiAcSpmは、癌の臨床マーカー（腫瘍マーカー）として利用することができ、生体試料（生体組織）として患部組織（癌組織又は癌が疑われる組織）とその患部周辺の正常組織との両組織中のDiAcSpmの量を測定することにより、それらの測定結果を指標として腫瘍を検出する（腫瘍の存在を検出する）ことができる。
本発明において、腫瘍としては、例えば以下に示すものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
(1) 口腔、鼻、咽頭
舌癌、歯肉癌、悪性リンパ腫、悪性黒色腫（メラノーマ）、上顎癌、鼻癌、鼻腔癌、喉頭癌、咽頭癌
(2) 脳神経系
神経膠腫、髄膜腫
(3) 甲状腺
甲状乳頭腺癌、甲状腺濾胞癌、甲状腺髄様癌
【００２７】
(4) 呼吸器
肺癌（例えば、扁平上皮癌、腺癌、肺胞上皮癌、大細胞性未分化癌、小細胞性未分化癌、カルチノイド）
(5) 乳房
乳癌、乳房ページェット病、乳房肉腫
(6) 血液
急性骨髄性白血病、急性前髄性白血病、急性骨髄性単球白血病、急性単球性白血病、急性リンパ性白血病、急性未分化性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型T細胞白血病、悪性リンパ腫（例えば、リンパ肉腫、細網肉腫、ホジキン病）、多発性骨髄腫、原発性マクログロブリン血症
【００２８】
(7) 消化器
食道癌、胃癌、胃・腸悪性リンパ腫、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌
(8) 女性性器
子宮癌（例えば、子宮体癌、子宮頸癌、子宮内膜癌）、卵巣癌、子宮肉腫（例えば、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、リンパ肉腫、細網肉腫）
(9) 泌尿器
尿路悪性腫瘍（例えば、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、精巣腫瘍、尿道癌）
【００２９】
(10) 運動器
横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、滑液膜肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫、多発性骨髄腫
(11) 皮膚
皮膚癌、皮膚ボーエン病、皮膚ページェット病、皮膚悪性黒色腫
【００３０】
本発明において検出の対象となる癌の種類は、上記のうち1種類でもよく、2種類以上が併発したものでもよい。好ましくは、大腸癌、尿路悪性腫瘍（例えば、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、精巣腫瘍）、乳癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、肺癌、肝臓癌、子宮癌（例えば、子宮体癌、子宮頸癌、子宮内膜癌）、脳腫瘍、骨髄性白血病及び悪性リンパ腫から選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
【００３１】
本発明の検出方法においては、前述の通り、生体組織中のDiAcSpmの量、具体的には患部組織中のDiAcSpmの量と当該患部周辺の正常組織中のDiAcSpmの量を測定する。この際、各組織中のDiAcSpmの量は、単位組織重量あたりのDiAcSpm量（すなわち各組織中のDiAcSpm濃度）として測定する。なお、患部組織は、癌組織でもよいし、癌が疑われる組織でもよく、限定はされない。また、本発明において、生体組織が採取される対象（被験動物）としては、ヒトが好ましいが、特に限定はされず、ヒト以外の哺乳動物（非ヒト哺乳動物）も対象とすることができる。非ヒト哺乳動物としては、限定はされないが、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル（マーモセットも含む）及びハムスター等が挙げられる。本明細書において、「患者」には被験動物としての非ヒト哺乳動物も含まれることができるものとする。
【００３２】
生体組織中のDiAcSpm量を測定する方法は、限定はされず、癌患者又は癌が疑われる患者（好ましくは同一患者）から、生体組織診断（生検）において通常用いられる手法等により所望の組織を採取し、採取した組織を酸性溶液又は中性緩衝液を用いて適宜処理し、DiAcSpmの抽出液等を調製した上で、当該抽出液におけるDiAcSpm濃度を測定する方法が好ましい。
組織の採取方法は、限定はされず、例えば、外科的手術による切除、内視鏡下生検、針生検（エコー下針生検も含む）及びパンチ生検等が挙げられ、採取する組織の種類及び部位によって適宜選択することができる。
【００３３】
本発明の方法においては、患部組織中のDiAcSpm量の測定とともに、当該患部周辺の正常組織中のDiAcSpm量の測定も行う。すなわち、まず患部組織の採取と正常組織の採取とをともに行い、採取した各組織についてDiAcSpm量の測定を行う。よって、患者からの患部組織及び正常組織の採取、並びに採取した各組織中のDiAcSpm量の測定は、ともに同時期に行うことが好ましく、特に患部組織及び正常組織の採取をともに同時期に行うことがより好ましい。ここで、同時期とは、完全に同時であることには限定されず、一般的に、同一手技時または同一実験系であると判断される時間範囲内であればよい。例えば、特に限定はされないが、組織採取からDiAcSpm量の測定までは、１日（24時間以内）であってもよいし、あるいは12時間以内、6時間以内、又は3時間以内であってもよい。また、採取した患部組織及び正常組織を一旦保存（例えば-80℃下で保存）しておいて、その後、抽出・測定に用いる場合も、採取時及び抽出・測定時（特に採取時）が同時期であれば、前述した同時期の範囲に含まれる。なお、患部組織及び正常組織は、いずれを先に採取し、抽出・測定を行ってもよく、限定はされない。
【００３４】
採取する試料の量は、限定はされず、下記処理後のDiAcSpm濃度の測定において、十分な精度で測定できる濃度のDiAcSpmを含む抽出液を得るのに十分な量であればよいが、3mg以上であることが好ましく、10mg以上であることがより好ましい。
採取する試料の数は、限定はされず、患部組織及び正常組織とも複数採取しDiAcSpm濃度の測定に用いることができる。複数の組織試料をDiAcSpm濃度の測定に用いた場合は、各々の測定結果の平均値を当該組織のDiAcSpm濃度とすることができる。なお、患部組織及び正常組織とも、試料数は１つであってもよい。
【００３５】
採取した組織の処理方法は、限定はされず、後述する実施例に記載のように、メス等による細切や、攪拌及び超音波等によるホモジナイズ等が挙げられる。このようにして得られた組織を、酸性溶液又は中性緩衝液を用いて処理（逐次処理等）し、抽出液とする。酸性溶液としては、例えば0.1M塩酸及び0.5M過塩素酸等が挙げられ、中性緩衝液としては、例えばHEPES、Tris及びリン酸等（pH6.5〜8.0（好ましくはpH7.5））が挙げられるが、DiAcSpmが有効に抽出され、安定に保持される溶液ないし緩衝液であれば、これらに限定はされない。
【００３６】
上記処理後のDiAcSpm濃度の測定方法は、DiAcSpmについて十分な検出感度と測定精度を有する方法であればよく、限定はされず、公知の分析方法や免疫学的方法、例えば、分析方法としては質量分析法等が挙げられ、免疫学的測定法としては金属コロイド凝集法、イムノクロマト法、RIA法、EIA法、免疫比濁法及びラテックス凝集法等が挙げられる。なかでも、質量分析法（特にESI-TOF法等）、イムノクロマト法、金属コロイド凝集法（特に金コロイド凝集法）及びラテックス凝集法が好ましく挙げられる。
【００３７】
金属コロイド凝集法で用いられる金属コロイドとしては、金、銀、セレン等のコロイドが挙げられ、利用しやすい点から、金コロイドが好ましい。反応液の分離や洗浄操作を行わない検査の自動化が容易な免疫凝集法が好ましく、特にラテックス凝集法や金コロイド凝集法が好ましい。例えば、被測定物質であるDiAcSpmを測定する場合、ラテックス凝集法及び金属コロイド凝集法では、当該被測定物質に対する抗体（抗DiAcSpm特異抗体）を、担体となるラテックスや金属コロイドに予め結合させておく。例えば、金コロイド凝集法の場合、予め金コロイドと結合させた標識抗体が、被測定物質であるDiAcSpmを介して凝集する。その際に生じる色差（色調変化）を光学的に測定し、DiAcSpm量を測定する。また、DiAcSpmが免疫学的に測定される場合、特開2006-38594号公報に記載の方法も好ましく用いられる。また、イムノクロマト法では、例えば、組織抽出液を浸透させる浸透性素材及びメンブレン（両者を併せてイムノクロマト用メンブレンと呼ぶ）として、標識化した抗DiAcSpm抗体（標識抗体）、及び、キャリア蛋白質とN1-アセチルスペルミン（以下、「AcSpm」という）とをアシルアミド結合させ、DiAcSpm類似構造物を側鎖として多数持つ蛋白質（抗原類似体）、並びに、上記標識抗体に対する抗体（捕捉抗体）を含有させたイムノクロマト用メンブレンを用いることが好ましい。キャリア蛋白質としては、例えば牛血清アルブミンを用いることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３８】
上述した抗DiAcSpm特異抗体の作製について以下に実験等を例説するが、これらに限定されるものではない。
＜抗原の調製＞
DiAcSpmは、低分子量のアルキルアミン誘導体であるため、これを直接ウサギ等に免疫してもDiAcSpmに特異的な抗体を得ることはできない。そこで、キャリア蛋白質である牛血清アルブミンとAcSpmをアシルアミド結合させ、DiAcSpm類似構造物を側鎖として多数持つ免疫抗原を作製する。
免疫抗原は、川喜田らの方法に準じて作製することができる（Hiramatsu, K. et al., J. Biochem., 124, 231-236 (1998)）。まず、キャリア蛋白質であるBSAとS-アセチルメルカプトコハク酸を反応させ、反応生成物であるS-アセチルメルカプトコハク酸(AMS)-BSA複合体を作製する。さらに、AMS-BSAに二価性架橋試薬であるGMBS(N-(4-Maleimidobutyryloxy) succinimide）を介して、AcSpmをアシルアミド結合させ、免疫抗原AcSpm-GMB-BSAを作製する。
【００３９】
＜抗体の作製＞
本発明に用いる「抗体」とは、抗原であるDiAcSpmに結合し得る抗体分子全体（ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい）、又はその断片（例えば、Fab又はF(ab')2断片）若しくは抗原抗体反応活性を有する活性フラグメント、具体的には、Fab、Fv、組替えFv体、１本鎖Fvを意味する。
本発明に用いる抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体および活性フラグメント）は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である。
【００４０】
(1) ポリクローナル抗体の作製
上記の通り作製した抗原を哺乳動物に投与する。哺乳動物は特に限定されるものではなく、例えばラット、マウス、ウサギなどが挙げられるが、ウサギが好ましい。
抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは5〜2mgであり、アジュバントを用いるときは5〜2mgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜5週間間隔で、1〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から6〜60日後に、酵素免疫測定法(ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)又は EIA(enzyme immunoassay))、放射性免疫測定法(RIA；radioimmuno assay)等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。
【００４１】
その後は、BSAなどを用い、これら蛋白質に対する抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をELISA法などで測定する。DiAcSpmに反応する抗体は、さらに高精度に選択されることが好ましく、具体的にはDiAcSpmに強い反応性を示す抗体であって、(a) N1-AcSpdとの交差反応性が0.1％以下である抗体、及び／又は、(b) DiAcSpm類似物質（DiAcSpd、Spd、Spm等）との交差反応による測定結果への干渉の総和が5％以下(好ましくは3％以下）である抗体が特に好ましい。
【００４２】
(2) モノクローナル抗体の作製
(i) 抗体産生細胞の採取
前記のようにして作製した抗原を、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは500〜200μgであり、アジュバントを用いるときは500〜200μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜5週間間隔で、1〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から1〜60日後、好ましくは1〜14日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【００４３】
(ii) 細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、NS-Iなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、1×106〜1×107個/mlの抗体産生細胞と2×105〜2×106個/mlのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比5：1が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００４４】
(iii) ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、DiAcSpmに反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によってスクリーニングすることができる。
【００４５】
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行う。この場合も、ポリクローナル抗体の項で説明したのと同様に、DiAcSpmに強い反応性を示す抗体であって、(a) N1-AcSpdとの交差反応性が0.1％以下である抗体、及び／又は、(b) DiAcSpm類似物質（DiAcSpd、Spd、Spm等）との交差反応による測定結果への干渉の総和が5％以下(好ましくは3％以下）である抗体を産生するハイブリドーマを選択し、樹立する。
【００４６】
(iv) モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、5％ CO2濃度)で7〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約1×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水を採集する。
上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４７】
＜検出方法＞
本発明の検出方法は、生体組織中のDiAcSpm量の測定結果と腫瘍とを関連づけることにより検出する方法であり、具体的に当該測定結果を腫瘍とどのように関連づけるか（どのような基準を適用するか）は、特に限定はされない。本発明の検出方法の一態様として、例えば、患部組織中における単位組織重量あたりのDiAcSpm量(A)と、当該患部組織周辺の正常組織中における単位組織重量あたりのDiAcSpm量(B)との比（病変部／正常部比；具体的には「A／B」の値）が、2以上の場合に腫瘍・癌の検出について陽性と判定し、1.0以上かつ2.0未満の場合に擬陽性と判定することができる。本発明の検出方法の他の態様として、例えば、上記「A／B」の値が、2.6以上の場合に陽性、1.0以上かつ2.6未満の場合に擬陽性と判定することができ、
また2.5以上の場合に陽性、1.0以上かつ2.5未満の場合に擬陽性と判定し、
また2.4以上の場合に陽性、1.0以上かつ2.4未満の場合に擬陽性と判定し、
また2.3以上の場合に陽性、1.0以上かつ2.3未満の場合に擬陽性と判定し、
また2.2以上の場合に陽性、1.0以上かつ2.2未満の場合に擬陽性と判定し、
また2.1以上の場合に陽性、1.0以上かつ2.1未満の場合に擬陽性と判定し、
また2.0以上の場合に陽性、1.0以上かつ2.0未満の場合に擬陽性と判定し、
また1.9以上の場合に陽性、1.0以上かつ1.9未満の場合に擬陽性と判定し、
また1.8以上の場合に陽性、1.0以上かつ1.8未満の場合に擬陽性と判定し、
また1.7以上の場合に陽性、1.0以上かつ1.7未満の場合に擬陽性と判定し、
また1.6以上の場合に陽性、1.0以上かつ1.6未満の場合に擬陽性と判定し、
また1.5以上の場合に陽性、1.0以上かつ1.5未満の場合に擬陽性と判定しすることもできる。
【００４８】
上記判定結果は、一定の確率をもって癌である可能性があることを意味するリスクファクターとして使用することができる。
【００４９】
他方、患部組織周辺の正常組織が採取困難な場合は、本発明の検出方法の一態様として、患部組織中における単位組織重量あたりのDiAcSpm量（nmol/g(wet tissue)）が、0.9 nmol/g以上の場合に腫瘍・癌の検出について陽性と判定し、0.7 nmol/g以上かつ0.9 nmol/g未満の場合に擬陽性と判定することができる。本発明の検出方法の他の態様として、例えば、患部組織中における単位組織重量あたりのDiAcSpm量（nmol/g(wet tissue)）が、1.0 nmol/g以上の場合に陽性、0.7 nmol/g以上かつ1.0 nmol/g未満の場合に擬陽性と判定し、また、1.1 nmol/g以上の場合に陽性、0.7 nmol/g以上かつ1.1 nmol/g未満の場合に擬陽性と判定することができ、
また、1.2nmol/g以上の場合に陽性、0.7 nmol/g以上かつ1.2nmol/g未満の場合に擬陽性と判定し、
また、1.3nmol/g以上の場合に陽性、0.7 nmol/g以上かつ1.3nmol/g未満の場合に擬陽性と判定することもできる。
【００５０】
本発明の検出方法の別の態様において、癌患者の組織内DiAcSpmのレベルは、被検試料中の濃度が0.9 nmol/g以上であれば正常組織との統計学的差異は90％であり、被検試料中の濃度が1.0 nmol/g以上であれば正常組織との統計学的差異は95％であり、1.3 nmol/g以上において正常組織との統計学的差異は99.7％以上（ほぼ100％）である。従って、DiAcSpmが上記濃度以上であれば所定確率で癌を検出することができる。
ところで、本発明の方法では、複数の患者由来の生体組織試料を用いてDiAcSpmのレベルを測定する場合がある。従って、予め規定された数の癌患者（１次母集団）において上記DiAcSpm量を測定し、得られた測定値を基本データとして、この基本データと、検出の対象となる個々の被験者由来の組織由来のDiAcSpmの量とを比較することができる。
【００５１】
さらに、上記測定された被験者患者のデータを前記母集団の値に組み込んでDiAcSpmレベルを再度データ処理し（平均値化等）、対象となる患者（母集団）の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、DiAcSpmの臨界値の精度を高め、これにより検出又は診断精度を高めることができる。
上記検出結果は、例えば癌の確定診断を行う場合の主要資料又は補助資料とすることができる。癌であることの確定診断を行う場合には、上記検出結果に加えて、その他の組織学的検査結果、血清学的検査の結果等から選択される少なくとも１つと組み合わせて、総合的に判断すればよい。
【００５２】
３．腫瘍の状態の評価方法
前記２.項に示す検出方法と同様に、得られたDiAcSpm量の測定結果と腫瘍の状態とを関連付けて腫瘍の状態を評価又は診断することができる。陽性と判定される場合には、癌を発症している又はその可能性があると判断し、腫瘍の状態を評価することができる。よって、本発明においては、上記評価の結果に基づいて、ヒト又は非ヒト哺乳動物における癌を診断する方法を提供することもできる。
【００５３】
腫瘍の状態とは、腫瘍の罹患の有無又はその進行度を意味し、癌発症の有無、癌の進行度、癌の悪性度、癌の転移の有無及び癌の再発の有無等が挙げられる。上記評価に際し、これらの腫瘍の状態は１つを選択してもよく、複数個を適宜組み合わせて選択してもよい。癌の有無を評価するには、癌に罹患しているか否かを判断する。癌の悪性度は、癌がどの程度進行しているのかを示す指標となるものであり、本発明により良性又は悪性の鑑別が可能となる。また、病期(Stage)を分類して評価し、いわゆる早期癌と進行癌とを分類して評価することも可能である。癌の転移は、原発巣の位置から離れた部位に新生物が出現しているか否かにより評価する。再発は、間欠期又は寛解の後に再び癌が現れたか否かにより評価する。
【００５４】
本発明によれば、癌組織に関しては、病期を問わず、また原発巣であるか転移病巣であるかによらず、隣接する正常組織と比較してDiAcSpmが明らかに高値を示すことが確認できる。すなわち、本発明の方法の一つの態様においては、感度及び特異度ともに実質的に100％を示す方法である。本発明の方法によれば、極めて高い確度で特定の病巣に癌組織が含まれるか否かを判定することができる。本発明によれば、Stage 0及びIの大腸癌（すなわち早期大腸癌）の陽性検出率についても実質的に100％であり、本発明の方法は、早期癌に対してより高い陽性検出率を示す検査方法及び評価方法であるということができる。
【００５５】
４．キット
本発明は、DiAcSpmに対する抗体、及び生体組織抽出液調製用の酸性溶液又は中性緩衝液（緩衝液等とよぶ）を含む、腫瘍の検出用キットを提供する。また、当該検出用キットは、ヒト又は非ヒト哺乳動物における癌の診断用キットとしても用いることができる。抗体及び緩衝液等は、前記の通りである。本発明のキットには、さらに滅菌水、検出反応用の溶液又は試薬（金コロイド液、BSA、アジ化ナトリウム等）、洗浄剤、生体組織抽出液の調製に利用する容器、検出反応に利用する容器、使用説明書などが含まれていてもよい。また、イムノクロマト法を利用した検出用キットの場合は、イムノクロマト用メンブレンとして、例えば、標識化した抗DiAcSpm抗体（標識抗体）、及び、キャリア蛋白質とAcSpmとをアシルアミド結合させ、DiAcSpm類似構造物を側鎖として多数持つ蛋白質（抗原類似体）、並びに、当該標識抗体に対する抗体（捕捉抗体）を含有させたイムノクロマト用メンブレンも含まれていてもよい。さらに、生体組織抽出液の調製に利用する容器としては、例えば、採取した組織の破砕と抽出液の回収とを１つの容器内で一度に行うことができるものが好ましく挙げられる。例えば、エッペンドルフチューブ等の遠心チューブ内に、組織を破砕するための破砕棒と、破砕した組織からの抽出液を遠心後に回収するためのフィルター等とを共に備えたものが好ましく挙げられる。特に、当該遠心チューブ、上記緩衝液等、及び上記イムノクロマト用メンブレンを含む腫瘍の検出用キットは、特に迅速かつ簡便な検出が可能であり実用性に優れたものである。
【００５６】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５７】
大腸癌患者（II期、4例；III期、4例；IV期、6例）について、それぞれの患者の癌組織及びそれに隣接する正常組織からDiAcSpmを抽出し、当該抽出液それぞれについて金コロイド凝集法でDiAcSpm濃度を測定した。また、ESI-TOF質量分析法によってもDiAcSpm濃度を測定した。当該測定の手順の詳細については、下記(1)〜(5)の通りに行った。なお、金コロイド凝集法の手順及び条件については、後述する参考例に記載の通りとした。【００５８】
(1) 大腸癌患者の患部組織を外科手術によって切除し、切除標本上の癌組織、及び、癌性腫瘍部分に隣接する正常組織を採取し、直ちに液体窒素中に投じて凍結した。凍結標本は、-80℃で保存するか又は直ちにDiAcSpmの抽出のために使用した。
(2) 凍結標本を、解剖用剪刀を用いて氷浴上で細切し、10〜300mgの組織片を採り、組織300mgあたり1mlの0.1M HClを加えてホモゲナイズした後、さらに1mlの0.5M HClO4溶液を加えて再び十分にホモゲナイズした。
(3) 遠心分離によって上清を回収し抽出液とした。【００５９】
(4) 回収した上清に対して以下の前処理を行った後に、ESI-TOF質量分析法によりDiAcSpmを定量した。上清0.1mlに内部標準として、15N標識DiAcSpm 0.25nmolを加えた試料を3個（試料1〜試料3）作製した。試料2に0.025nmol、試料3に0.050nmolのDiAcSpm標準物質をそれぞれ、さらに加えた。試料1〜試料3に0.05Mピリジン 1mlを加え、あらかじめ0.01Mピリジン/酢酸緩衝液で平衡化したカルボキシメチルセルロースの小カラム（0.2ml）に添加した。カラムを0.01Mピリジン／酢酸緩衝液 1.5ml、0.05Mピリジン/酢酸緩衝液 3mlで洗浄後、0.33Mピリジン/酢酸緩衝液 1mlを用いてDiAcSpmをカラムから溶出し、回収した。溶出液を遠心減圧乾燥した後、公知の方法（たとえばSamejima et al., Biol. Pharm. Bull., 30, 1943(2007) ）に従ってヘプタフルオロブチル化した試料について、ESI-TOF質量分析法によりDiAcSpmを定量した。【００６０】
(5) 上記(3)で得られた抽出液の一部を取り、2M KOHで中和し、析出したKClO4の沈殿を遠心分離で除いた後の上清について、生化学自動分析機を用いて、金コロイド凝集法によりDiAcSpm濃度を測定した。測定試薬としてはAuto DiAcSpm（登録商標） （Alfresa Pharma, Osaka）を使用した。
上記のDiAcSpm濃度の測定結果を単位組織重量あたりの含有量に換算し、下記表1に示した。また、IV期大腸癌6例のうち5例については、肝転移部位の癌組織、及び、それに隣接する正常組織中のDiAcSpm量を測定及び比較し、この結果についても、併せて下記表1に示した。【００６１】
【表１】
2011136343.tif 000003
【００６２】
大腸癌組織及び肝転移癌組織のいずれについても、全症例において癌組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量は、対応する正常組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の少なくとも2.78倍であり、癌性組織と正常組織とは、単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の比較によって容易に判別することができた。
同一の組織片から得た抽出液中のDiAcSpm濃度を、ESI-TOF質量分析法と金コロイド凝集法とで測定し、単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の測定値を比較した（図１）。その結果、DiAcSpmの測定法は十分な検出感度と測定精度をもつ方法であればいかなる方法でもよいことが示された。
【実施例２】
【００６３】
大腸内視鏡検査所見から早期（0-I期）大腸癌と診断された5例の大腸ポリープについて、それぞれの患者の腫瘍組織及びそれに隣接する正常組織からDiAcSpmを抽出し、当該抽出液それぞれについて金コロイド凝集法でDiAcSpm濃度を測定した。当該測定の手順の詳細については、下記(1)〜(3)の通りに行った。なお、金コロイド凝集法の手順及び条件については、後述する参考例に記載の通りとした。【００６４】
(1) 大腸癌が疑われる患者の患部組織を大腸内視鏡手術によって摘除し、摘除標本上の腫瘍組織、及び、癌が疑われる腫瘍部分に隣接する正常組織の4〜15mgをそれぞれ採取し、直ちに液体窒素中に投じて凍結した。凍結標本は-80℃で保存するか又は直ちにDiAcSpmの抽出のために使用した。
(2) 凍結標本を秤量し、組織1mgあたり6〜12μlの0.1M HEPES 緩衝液 (pH 7.5)を加えて十分にホモゲナイズした。ここで、上記緩衝液は、中性pHのものであればHEPES以外のもの（例えばTris及びリン酸等）も使用できる。また、通常は、1mlあたり2.15mgのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma, P8465）を含むが、プロテアーゼ阻害剤はDiAcSpmの抽出に不可欠のものではない。【００６５】
試料の散逸を防ぎ、少量の検体を効率よく処理するために、ホモゲナイザーとしてはPelletPestles（登録商標）(Kimble Chase, Vineland, NJ, USA)、及び、専用処理チューブを利用した（なお、試料の散逸を防ぐことができ、かつ、組織を有効に破砕できる方法であればこれら以外の機器等を用いてもよい。）。
(3) 遠心分離によって上清を回収し、生化学自動分析機を用いて、金コロイド凝集法でDiAcSpm濃度を測定した。【００６６】
上記のDiAcSpm濃度の測定結果を単位組織重量あたりの含有量に換算し、下記表2に示した。【００６７】
【表２】
2011136343.tif 000004
【００６８】
腫瘍組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量は、全症例において、対応する正常組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の少なくとも2.65倍であり、癌性組織と正常組織とは単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の比較によって容易に判別できることが明らかであった。
実施例1及び2において検討した大腸癌の全症例について、癌部と非癌部との間でDiAcSpm値を比較した結果を、まとめて図２に示した。
【実施例３】
【００６９】
大腸内視鏡摘除標本の病理検査所見から中等度異型腺腫又は高度異型腺腫と診断された9例の大腸ポリープについて、それぞれの患者の腫瘍組織及びそれに隣接する正常組織からDiAcSpmを抽出し、当該抽出液それぞれについて金コロイド凝集法でDiAcSpm濃度を測定した。当該測定の手順の詳細については、実施例２の(1)〜(3)の通りに行った。なお、金コロイド凝集法の手順及び条件については、後述する参考例に記載の通りとした。【００７０】
上記のDiAcSpm濃度の測定結果を単位組織重量あたりの含有量に換算し、下記表3に示した。【００７１】
【表３】
2011136343.tif 000005
【００７２】
中等度異型腺腫では50％の症例（検体番号：A-mod-2及びA-mod-3）で、腫瘍組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量が、対応する正常組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の1.2〜1.3倍と微増を示したが、全体として正常組織と同程度のDiAcSpm含有量であった。これに比して、より悪性化の傾向が強い高度異型腺腫では、40％の症例（検体番号：A-sev-2及びA-sev-3）でDiAcSpmの病変部／正常部比が、0期大腸癌（実施例２参照）に匹敵する数値（具体的には、6.5倍及び3.9倍）を示した。また、残りの約60％の症例（検体番号：A-sev-1、A-sev-4及びA-sev-5）では、DiAcSpmの病変部／正常部比が0.3〜1.4倍の範囲にとどまり、中等度異型腺腫と同程度の数値を示した。【００７３】
これらの結果は、0期大腸癌と大腸腺腫との間にはDiAcSpmの病変部／正常部比に関して明確な差があることを示しており、このことは、DiAcSpmの病変部／正常部比に基づいて大腸腫瘍組織の悪性及び良性の鑑別を行うことができることを示すものであった。すなわち、本実施例中の高度異型腺腫の2症例のように（表3）、正常部より著しく高いDiAcSpm値を示す病変部は、悪性と判断すべきと考えられることが分かった。
【実施例４】
【００７４】
子宮癌患者5名（具体的には、子宮体癌患者3名、子宮内膜癌患者1名、子宮頸癌患者1名）、卵巣癌患者1名、および子宮筋腫患者1名について、それぞれの患者の癌組織及びそれに隣接する正常組織からDiAcSpmを抽出し、当該抽出液それぞれについて金コロイド凝集法でDiAcSpm濃度を測定した。
(1) 子宮癌患者、卵巣癌患者、および子宮筋腫患者の患部組織を外科手術によって切除し、切除標本上の癌性及び良性腫瘍組織、及び、癌性及び良性腫瘍部分に隣接する正常組織を採取し、直ちに液体窒素中に投じて凍結した。凍結標本は、-80℃で保存するか又は直ちにDiAcSpmの抽出のために使用した。【００７５】
(2) 当該標本からDiAcSpmを抽出し、当該抽出液それぞれについて金コロイド凝集法でDiAcSpm濃度を測定した。当該測定の手順の詳細については、実施例２の(2)〜(3)と同様に行った。なお、金コロイド凝集法の手順及び条件については、後述する参考例に記載の通りとした。
上記のDiAcSpm濃度の測定結果を単位組織重量あたりの含有量に換算し、下記表4に示した。【００７６】
【表４】
2011136343.tif 000006
【００７７】
子宮癌及び卵巣癌の83%の症例において、腫瘍組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量と、対応する正常組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の比は2以上であった。また、子宮癌及び卵巣癌の全症例において、腫瘍組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量と、対応する正常組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の比は1.5以上であった。一方、良性腫瘍である子宮筋腫においては、腫瘍組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量と、対応する正常組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の比は0.74であった。【００７８】
これらの結果は、悪性腫瘍と良性腫瘍の間にはDiAcSpmの病変部／正常部比に関して明確な差があることを示しており、このことは、DiAcSpmの病変部／正常部比に基づいて子宮及び卵巣腫瘍組織の悪性及び良性の鑑別を行うことができることを示すものであった。
【実施例５】
【００７９】
胃癌患者4名、および難治性胃潰瘍患者1名について、それぞれの患者の癌組織及びそれに隣接する正常組織からDiAcSpmを抽出し、当該抽出液それぞれについて金コロイド凝集法でDiAcSpm濃度を測定した。
(1) 胃癌患者、および難治性胃潰瘍患者の患部組織を外科手術によって切除し、切除標本上の癌組織及び潰瘍組織、及び、癌性腫瘍部分及び潰瘍部分に隣接する正常組織を採取し、直ちに液体窒素中に投じて凍結した。凍結標本は、-80℃で保存するか又は直ちにDiAcSpmの抽出のために使用した。【００８０】
(2) 当該標本からDiAcSpmを抽出し、当該抽出液それぞれについて金コロイド凝集法でDiAcSpm濃度を測定した。当該測定の手順の詳細については、実施例２の(2)〜(3)と同様に行った。なお、金コロイド凝集法の手順及び条件については、後述する参考例に記載の通りとした。
上記のDiAcSpm濃度の測定結果を単位組織重量あたりの含有量に換算し、下記表5に示した。【００８１】
【表５】
2011136343.tif 000007
【００８２】
胃癌の75%の症例において、腫瘍組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量と、対応する正常組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の比は2以上であった。また、胃癌の全症例において、腫瘍組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量と、対応する正常組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の比は1.5以上であった。一方、良性疾患である難治性胃潰瘍においては、病変部組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量と、対応する正常組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の比は0.81であった。
これらの結果は、胃癌組織と隣接正常組織の間には、病変部／正常部比に関して明確な差があることを示しており、このことは、DiAcSpmの病変部／正常部比に基づいて胃癌組織と正常組織の鑑別を行うことができることを示すものであった。
【実施例６】
【００８３】
肺癌患者5名について、それぞれの患者の癌組織及びそれに隣接する正常組織からDiAcSpmを抽出し、当該抽出液それぞれについて金コロイド凝集法でDiAcSpm濃度を測定した。
(1) 肺癌患者の患部組織を外科手術によって切除し、切除標本上の癌性組織、及び、癌性腫瘍部分に隣接する正常組織を採取し、直ちに液体窒素中に投じて凍結した。凍結標本は、-80℃で保存するか又は直ちにDiAcSpmの抽出のために使用した。【００８４】
(2) 当該標本からDiAcSpmを抽出し、当該抽出液それぞれについて金コロイド凝集法でDiAcSpm濃度を測定した。当該測定の手順の詳細については、実施例２の(2)〜(3)と同様に行った。なお、金コロイド凝集法の手順及び条件については、後述する参考例に記載の通りとした。
上記のDiAcSpm濃度の測定結果を単位組織重量あたりの含有量に換算し、下記表6に示した。【００８５】
【表６】
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【００８６】
肺癌の60%の症例において、腫瘍組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量と、対応する正常組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の比は2以上であった。また、肺癌の全症例において、腫瘍組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量と、対応する正常組織の単位組織重量あたりのDiAcSpm含有量の比は1.5以上であった。
これらの結果は、肺癌組織と正常組織の間には単位組織重量あたりのDiAcSpmの含有量比に関して明確な差があることを示しており、このことによって、単位組織重量あたりのDiAcSpmの含有量の比較に基づいて肺癌組織と正常組織を容易に判別することができた。【００８７】
〔参考例〕
本実施例で使用した免疫学的測定法（金コロイド凝集法）の手順及び条件等について、以下に説明する。
１．アセチルスペルミン結合BSAの調製
アセチルスペルミン結合BSAを、「ヒラマツ（Hiramatsu, K.）ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J. Biochem.），1998年，第124巻，p.231-236」に記載の方法に準じて調製した。まず、担体蛋白質であるBSA 200mgとS-アセチルメルカプト無水コハク酸15mgとを0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）中で混合し、室温で30分間攪拌して、S-アセチルメルカプトコハク酸(AMS)-BSA複合体を作製した。これとは別に、二価性架橋試薬であるGMBS 45mgとN-アセチルスペルミン・3塩酸塩147mgとをテトラヒドロフラン／50mMリン酸緩衝液（pH7.0）（1:1(v/v)）中で室温にて30分間混合して、アセチルスペルミン-GMB結合物を作製した。次いで、AMS-BSA 200mgにヒドロキシルアミン塩酸塩4.2mgを加え、メルカプトスクシニル-BSA(MS-BSA)とした。次いで、アセチルスペルミン-GMB結合物とMS-BSAとを混合して、N-アセチルスペルミンがアシルアミド結合した免疫抗原アセチルスペルミン-GMB-BSAを作製した。このようにしてアセチルスペルミンを担体にアシルアミド結合させることにより、DiAcSpm類似化合物を側鎖として多数有する免疫抗原を作製した。
アセチルスペルミン結合BSAの濃度は、1mg/mLのBSA溶液の280nmにおける吸光度（光路長1cm）であるA280を0.66として、A280値に基づいて算出した。【００８８】
２．抗DiAcSpmモノクローナル抗体の調製
上記１.項で得たアセチルスペルミン結合BSAとアジュバントとの混和物をマウスに投与した。投与は、2週間間隔で4回免疫を行った。免疫する最終日の4日後に抗体産生細胞を採取した。
次に、採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行い、ハイブリドーマを得た。細胞融合は、血清を含まない動物細胞培養用培地（RPMI-1640培地）で、1×106〜1×107個／mLの抗体産生細胞と2×105〜2×106個／mLのミエローマ細胞とを混合し、細胞融合促進剤（1000〜6000Daのポリエチレングリコール）を添加した状態で融合させた。細胞融合後、細胞から目的とするハイブリドーマを選択した。このために、細胞懸濁液をウシ胎児血清含有RPMI-1640培地で希釈し、マイクロタイタープレートにまいた。各ウェルにHAT選択培地を加え培養し、2週間程度で生育した細胞をハイブリドーマとして得た。増殖してきたハイブリドーマの培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法によって、DiAcSpmに反応する抗体をスクリーニングした。融合細胞は、限界希釈法によりクローニングを行った。DiAcSpmに強い反応性を示し、かつ(a) N1-アセチルスペルミジンとの交差反応が0.1％以下であり、及び／又は、(b) 尿中のDiAcSpm類似物質との交差反応による測定結果への干渉の総和が5％以下である抗体を産生するハイブリドーマを選択し、樹立した。樹立したハイブリドーマから、37℃にて、5％CO2濃度で7〜14日の培養によってモノクローナル抗体を採取した。採取した抗体を、硫安塩析法により精製した。【００８９】
３．金コロイド液の調製
95℃の蒸留水1Lに10％塩化金酸溶液2mLを攪拌しながら加え、1分後に2％クエン酸ナトリウム溶液10mLを加え、さらに20分間攪拌した後30℃に冷却した。冷却後、0.1M炭酸カリウム溶液でpH7.1に調節した。【００９０】
４．第1試薬の調製
上記１.項で調製したアセチルスペルミン結合BSA 66.0ng/mL、2.0％塩化ナトリウム、及び1.85％ポリエチレングリコール20000(PEG)（PEG濃度は、測定感度を出すため、ロットにより若干異なった。）を含む、0.2％ EDTA、0.2％ TWEEN80、0.001％ DTT、0.025% 1-チオグリセロールおよび0.01％アジ化ナトリウムを含む250mM MES（pH6.2）を調製し、第1試薬とした。【００９１】
５．第2試薬の調製
上記２.項で調製した抗DiAcSpm抗体を、0.05％アジ化ナトリウムを含む10mM HEPES（pH7.1）で希釈し、40μg/mLの濃度にした。この液100mLを上記３.項で調製した金コロイド液1Lに加え、冷蔵下で2時間攪拌した。この混合物に、5.46％マンニトール、0.5％ BSA、及び0.05％アジ化ナトリウムを含む10mM HEPES（pH7.1）を110mL添加し、37℃で90分間攪拌し、8,000回転で40分間遠心分離し、上清を除去した。得られた残渣に、3％マンニトール、0.1％ BSA、及び0.05％アジ化ナトリウムを含む5mM HEPES（pH7.5）（A溶液）を約1L加え、抗体結合金コロイドを分散させた後、8,000回転で40分間遠心分離し、上清を除去した。残渣をA溶液に分散させ、この抗DiAcSpm抗体結合金コロイドの分散液を精製水で30倍希釈したときに540nmでの吸光度が1.0となるようにA溶液を添加し、抗体結合金コロイド原液とした。
さらに、抗体結合金コロイド原液をA溶液で3倍希釈して、抗DiAcSpm抗体結合金コロイド試薬を調製し、第2試薬とした。【００９２】
６．生体組織抽出液中のDiAcSpmの測定
DiAcSpm含有生体組織抽出液7μＬに対し、上記４.項で調製した第1試薬180μLを混合及び攪拌し、37℃で約5分加温した。次いで、上記５.項で調製した第2試薬60μLを添加及び攪拌した後、日立7070形自動分析装置により主波長540nmおよび副波長660nmで測光ポイント18から31の二ポイント測定を行って、二ポイント間の吸光度差を求めた。測定時間は約10分間であった。
標準曲線を作成するために、希釈液を用いて標準液を調製した。必要に応じて、DiAcSpm含有生体組織抽出液の調製のために希釈液を用いた。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明により、腫瘍の存在（特に早期癌の存在）をより高い確度で、簡便かつ迅速に検出することができる腫瘍の検出方法及び腫瘍の状態の評価方法、ならびに当該方法に使用し得るキットが提供される。
【図２】
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【図１】
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【国際調査報告】
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