(57)【要約】マンナンもしくはＭＢＬに対する抗体に結合した構造的に正常なまたは異常なＭＢＬに対する異なる結合特性を有する種々の抗体が提供される。異なる結合特性を有するＭＢＬに対する抗体を選択する方法、およびこれらの抗体を用いて試料中の、マンナンに結合することができるＭＢＬを測定するための、または、正常にオリゴマー化されたＭＢＬおよび異常な、不十分にオリゴマー化されたＭＢＬを測定するための方法およびキットも提供される。本方法およびキットは、感染症および自己免疫疾患への増大した感受性およびこれらの悪化を診断するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＢＬに対して生成されたモノクローナル抗体を選択するための方法であって、ＭＢＬに対して生成された抗体を、マンナンに結合した構造的に正常なＭＢＬに結合するもしくは結合しないその能力について、または、可能な範囲でマンナンに結合した構造的に異常なＭＢＬに結合するもしくは結合しないその能力について評価することを含む、前記方法。
【請求項２】
ＭＢＬに対して生成されたモノクローナル抗体を選択するための方法であって、ＭＢＬに対して生成された抗体を、該抗体に結合した、もしくはＭＢＬに対する別のモノクローナル抗体に結合した構造的に正常なＭＢＬに結合するもしくは結合しないその能力について、または、該抗体に結合した、もしくはＭＢＬに対する別のモノクローナル抗体に結合した構造的に異常なＭＢＬに結合するもしくは結合しないその能力について評価することを含む、前記方法。
【請求項３】
ＭＢＬに対して生成された抗体であって、該抗体が、
（ａ）マンナンに結合した構造的に正常なＭＢＬに結合するもしくは結合しない抗体、
（ｂ）マンナンに結合した構造的に異常なＭＢＬに結合するもしくは結合しない抗体、
（ｃ）該抗体もしくはＭＢＬに対して生成された別のモノクローナル抗体に結合した、構造的に正常なＭＢＬに結合するもしくは結合しない抗体、および
（ｄ）該抗体もしくはＭＢＬに対して生成された別のモノクローナル抗体に結合した、構造的に異常なＭＢＬに結合するもしくは結合しない抗体
からなる群から選択される、前記抗体。
【請求項４】
請求項３に記載の抗体を用いて、マンナンに結合できるＭＢＬを測定するための免疫アッセイ技法。
【請求項５】
マンナンに結合できるＭＢＬが、抗体による検出の前に、マンナンに結合できるＭＢＬのための捕捉分子を介して固相に不動化されている、請求項４に記載の免疫アッセイ技法。
【請求項６】
試料中の追加の分析物を検出するように、追加の分析物のための１種または２種以上の捕捉分子が固相にコートされている、請求項５に記載の免疫アッセイ技法。
【請求項７】
請求項３に記載の抗体を用いて、試料中の総免疫反応性ＭＢＬを測定することができる、免疫アッセイ技法。
【請求項８】
構造的に正常な、および異常なＭＢＬの両方が、抗体による検出の前に、総免疫反応性ＭＢＬのための捕捉分子を介して固相に不動化されている、請求項７に記載の免疫アッセイ技法。
【請求項９】
試料中の追加の分析物を検出するように、追加の分析物のための１種または２種以上の捕捉分子が固相にコートされている、請求項８に記載の免疫アッセイ技法。
【請求項１０】
請求項３に記載の抗体を含む、マンナンに結合できるＭＢＬの体液中の濃度を測定するためのキット。
【請求項１１】
請求項３に記載の別の抗体を含む、合わせて総免疫反応性ＭＢＬと呼ぶ構造的に正常なおよび構造的に異常なＭＢＬの両方の、体液中の濃度を測定するためのキット。
【請求項１２】
マンナンに結合できるＭＢＬの体液中の濃度を、総免疫反応性ＭＢＬの濃度と比較するためのキットであって、該キットが、請求項３に記載の別の抗体を含む、前記キット。
【請求項１３】
ヒト血漿または血清の試料において、請求項３に記載の抗体を用いることにより、マンナンに結合できるＭＢＬを測定することを含む、感染症および自己免疫疾患への増大した感受性およびこれらの悪化を診断するための方法。
【請求項１４】
ヒト血漿または血清の試料において、正常にオリゴマー化されたＭＢＬおよび異常な、不十分にオリゴマー化されたＭＢＬの両方を測定することを含む、感染症および自己免疫疾患への増大した感受性およびこれらの悪化を診断するための方法。
【請求項１５】
ヒト血漿または血清の試料において、請求項３に記載の抗体を用いることにより、マンナンに結合できるＭＢＬを測定すること、および、ヒト血漿または血清の試料において、正常にオリゴマー化されたＭＢＬおよび異常な、不十分にオリゴマー化されたＭＢＬの両方を測定することを含む、ヒト血漿または血清の試料におけるＭＢＬの構造状態を解明するための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）は、異なる個体において、異なった量および異なった遺伝的に決定された変異形態で存在し得、これによりこれらの個体の感染性疾患への感受性、および自己免疫疾患の重篤度に影響を与えている。本発明は、ヒトマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）に対する一連のモノクローナル抗体を提供するものであり、これらはこのタンパク質の濃度を、特にヒト血清または血漿などの生物学的液体において定量すること、および、該タンパク質に関する構造的および機能的情報を提供することにおいて有用である。本発明の一態様において、マンナンに結合できるオリゴマー化されたＭＢＬを測定するための組成物、方法およびキットが提供される。別な態様では、総免疫反応性（total immunoreactive）ＭＢＬサブユニットを、これらが、完全な生物学的活性を有するＭＢＬを特徴づける、テトラマー、ペンタマーまたはヘキサマー構造にオリゴマー化されているか否かにかかわらず測定するための組成物、方法およびキットが提供される。本発明の組成物、方法およびキットは、生化学および医学の分野で有用である。
【０００２】
発明の背景
マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）は、先天性免疫系の重要な構成要素である。これは肝臓で合成される多量体タンパク質であるとともに、Ｃ型レクチンの１つであり、微生物表面上のある種の炭水化物（多糖類）構造へのカルシウム依存性の結合を示す。マンナンはかかる多糖類のモデルとして用いられ、そしてＭＢＬはＮ−アセチル−グルコサミンおよびＤ−マンノースなどの単糖類成分に親和性を示す。微生物多糖類に結合すると、ＭＢＬは、会合した、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２およびＭＡＳＰ−３として知られるセリンプロテアーゼにより補体を活性化し、溶解性膜攻撃複合体により微生物の殺滅を促進し、そしてそのオプソニン効果および細胞表面受容体との直接的な相互作用により食作用を促進する。
【０００３】
ＭＢＬ分子は、２２８アミノ酸残基の一本鎖のホモ三量体６組までのオリゴマー複合体である。各鎖は、２０アミノ酸のＮ末端システインリッチドメインと、これに続く１８〜２０のＧｌｙ−Ｘｘｘ−Ｙｙｙ反復構造のコラーゲン様ドメインと、αらせんに巻かれたコイルネック領域と、そして最後に炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）とからなる。これらの鎖の３本が構造単位または「ヘッド（head）」を形成し、ここで、コラーゲンドメインは、それぞれがＣＲＤを担持する３つのネック領域に終止する三重らせんを形成する。Ｎ−末端ドメインは、鎖間ジスルフィド結合によって連結している。次に、６個までのかかるホモ三量体ヘッドがそのＮ−末端領域を介して連結し、３弁花の花束に例えられる正常なＭＢＬ分子の構造を形成する。この構造は、連結したホモ三量体の個々の鎖の間のジスルフィド結合の形成により維持されている。この形態で、ＭＢＬは、セリンプロテアーゼＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２およびＭＡＳＰ−３と（およびＭＡｐ１９として知られる関連する非酵素ペプチドと）会合することが可能であり、この複合体は、ＭＢＬが炭水化物に結合すると、補体を活性化することが可能である。
【０００４】
ヒトＭＢＬ遺伝子（ｍｂｌ２）は、多くの対立遺伝子変異を示す。いくつかはプロモーター領域に生じ、最も重要な２つのものは、−５５０位（ＨまたはＬ）および−２２１位（ＹまたはＸ）に生じる。さらなる変異は、５’非翻訳領域の＋４位（ＰまたはＱ）に生じ、３つがエクソン１の＋２２３位（ＡまたはＤ、Ａｒｇ５２Ｃｙｓ）、＋２３０位（ＡまたはＢ、Ｇｌｙ５４Ａｓｐ）、そして＋２３９位（ＡまたはＣ、Ｇｌｙ５７Ｇｌｕ）に生じる。プロモーターハプロタイプＨＹ、ＬＹおよびＬＸは、ＭＢＬの高い、中程度のおよび低い血漿レベルにそれぞれ関連し、一方エクソン１のハプロタイプは、タンパク質鎖の構造および会合に影響する。連鎖不均衡により、いくつかの理論的に可能なＭＢＬハプロタイプは極めてまれであり、発見されていない。デンマーク人血液提供者１００人の間では、次のハプロタイプのみが検出された（括弧内は頻度）：ＨＹＰＡ（０．２８５）、ＬＹＱＡ（０．２３５）、ＬＸＰＡ（０．１９５）、ＬＹＰＢ（０．１３５）、ＨＹＰＤ（０．０８５）、ＬＹＰＡ（０．０４５）、ＬＹＱＣ（０．０２０）。
【０００５】
Ａ／Ａ遺伝子型（すなわち、正常なコラーゲン様領域を有するもの）の中では、ＬＸＰ／ＬＸＰ遺伝子型のみが低い血漿ＭＢＬレベルを示した。Ａ／Ｂ、Ａ／ＣおよびＡ／Ｄ遺伝子型（すなわち、正常および異常コラーゲン様領域のヘテロ接合）は、記載された旧式の方法で決定された、低減した血漿ＭＢＬレベルを示した。これをＬＸハプロタイプと組み合わせると、さらに低いレベルが記録された。Ｂ／Ｂ、Ｃ／ＤおよびＤ／Ｄ遺伝子型（すなわち、すべてのコラーゲン様領域に異常を有するもの）は、これらの対象のいずれもＬＸハプロタイプを示さないにもかかわらず、旧式の方法で決定された、極めて低いレベルのＭＢＬを示した。デンマーク人提供者におけるエクソン１ハプロタイプＡ、Ｂ、ＣおよびＤの頻度は、それぞれ０．７６、０．１３５、０．０２０および０．０８５であった。これは、Ａ／Ａ、Ｂ／Ｂ、Ｃ／ＣおよびＤ／Ｄ遺伝子型の頻度が、この２乗であること、すなわち、それぞれ人口の５８．７６％、１．８２％、０．０４％および０．７２％を占めることを意味する（Steffensen, R. et al. (2000) J Immunol Meth 241:33-42からのデータ）。
【０００６】
Ｂ／Ｂ、Ｃ／ＣおよびＤ／Ｄ遺伝子型からのヒトＭＢＬの可能な構造は、チャイニーズハムスター卵巣細胞に発現させた対応する組み換えタンパク質を分析することによって決定された。結果は、これら３つの遺伝子型で類似しており、ＭＢＬの最も一般的な重度の構造異常の原因であるＢ／Ｂ遺伝子型に関して記載された。この遺伝子型からの非還元（unreduced）ＭＢＬ（ＭＢＬ  Ｂとして知られる）の分析は、これが２本の鎖の二量体として存在し得、かかる二量体が３個連結し、Ａ／Ａ遺伝子型からの正常ＭＢＬ（ＭＢＬ  Ａとして知られる）の２つの三重「ヘッド」に相当する構造を形成し得ることを示す。より高いオリゴマーは形成されず、ＭＢＬ  Ｂは、組み換え体であるかヒト提供者から調製されたかを問わず、ＭＡＳＰｓとより弱く会合し、このため、これはin vitro試験において補体を活性化するのに失敗する。
【０００７】
Ａ／Ｂヘテロ接合体は、種々の様式で組み合わされるＭＢＬ  ＡおよびＢ一本鎖の混合物を保有するものと考えられている。正常ＭＢＬは６個の三量体ヘッドに１８本までの一本鎖を含むため、すべてが正常ＭＢＬ  Ａ鎖からなるこのような分子の割合は、Ａ／Ｂヘテロ接合体においては極めて小さい。理論的に５０％のＭＢＬ  Ｂ鎖の混合の効果は、したがって、半分より多くのＭＢＬオリゴマーの構造を乱すものであり、このため、ＭＢＬフェノタイプに関しては、Ｂ形質が優勢である。すなわち、大多数のＭＢＬはＭＢＬ  Ｂに似た構造を採用する。同様の考察がＡ／ＣおよびＡ／Ｄヘテロ接合体に適用されるが、Ｄ鎖の乱す効果は、Ｂ鎖よりもいくらか少ないようである。
【０００８】
ヒトＭＢＬを測定する既存の方法は、種々の免疫アッセイ設計において、ＭＢＬに対して生成されたポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体の使用に依存している。多くの場合、ＭＢＬのどの分子構造がこれらの方法で選択的に測定されているのかが明らかではない。一般的に用いられている一方法は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）における、精製ヒトＭＢＬに対して生成されたマウスモノクローナル抗体ＨＹＢ１３１−０１の、捕捉抗体および検出抗体の両方としての使用に依存している。この手法において、ＨＹＢ１３１−０１は、ヒト血清または血漿試料中のＭＢＬに結合できるように、マイクロタイターウェルにコートされる。結合したＭＢＬの量は、試料中のＭＢＬ濃度の関数である。結合したＭＢＬは、次に、検出抗体として標識したＨＹＢ１３１−０１を加えることにより定量する。標識は、好適な基質と共にインキュベートした場合に定量的な発色反応を起こすことができる、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素であることができ、または、好適な酵素と複合体化したアビジンもしくはストレプトアビジンに結合することができるビオチンであることができ、または、時間分解蛍光による検出を可能にするユーロピウムであることができる。
【０００９】
これらの方法はまた、単一のＭＢＬ分子の同一だが離れた２つの部位（エピトープ）への２つの同一の抗体分子（１つは捕捉するため、そして１つは検出するため）の結合に依存する。実際には、これは、ＭＢＬ分子が三量体サブユニットのオリゴマーである場合にのみ起こり、このため、ＭＢＬオリゴマーのみがこれらのアッセイにより測定される。単一の、または不十分にオリゴマー化された（poorly olilgomerized）ＭＢＬ三量体サブユニットは、捕捉抗体および検出抗体の両方の同時結合を許容しないだろう。この結果、これらの方法は、不十分にオリゴマー化されたＭＢＬを適切に測定することができないし、測定されたＭＢＬオリゴマーが、機能的ＭＢＬの決定的な特徴の１つである、マンナンに結合することが実際に可能かどうかを直接決定することもできない。しかしながら、マンナンへの結合はＭＢＬのオリゴマー状態と極めて強く相関しており、ＣＲＤ領域の構造に影響する遺伝的変異は見出されていない。ＭＢＬの血清もしくは血漿濃度を決定するための既存のアッセイ方法はまた、低く記録されたＭＢＬの濃度が、ＬＸＰＡ／ＬＸＰＡ遺伝子型でのように、正常ＭＢＬ  Ａの低い濃度によるものなのか、または、Ａ／Ｂ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｄ、Ｂ／Ｂ、Ｃ／ＤおよびＤ／Ｄ遺伝子型でのように、アッセイにおいて適切に反応しない異常構造のＭＢＬによるものなのか決定することもできない。
【００１０】
ＭＢＬ  Ａの血漿中の低い濃度と、実際には、相当な濃度のＭＢＬ  Ｂ、ＣおよびＤ変異体もしくはヘテロ接合状態のこれらの雑種形態の存在による低く記録された濃度とを識別することが望ましい。例えば、ＭＢＬ  ＢがＭＢＬ  Ａと同様の細胞媒介性の細胞障害活性、オプソニン活性および食作用促進活性を有することが報告されている。したがって、既存のアッセイ方法のＭＢＬ  Ｂの検出の失敗は、このＭＢＬのこれらの機能を反映していない。さらに、既存の免疫アッセイで測定したＭＢＬの低い血漿濃度と、かかる低い濃度に関連するプロモーターまたはエクソン１の対立遺伝子形態の両方が、小児および免疫不全症患者における感染の増大するリスクに関連づけられている。これらはまた、慢性肉芽腫性疾患および嚢胞性線維症における疾患の進行、および全身性紅斑性狼瘡および関節リウマチなどの自己免疫疾患のより深刻な経過にも関連づけられている。既存のアッセイは、患者のＭＢＬの状態について部分的な像をもたらすことしかできないため、この状態のより示差的な分析によって、より正確な相関が得られることが期待される。例えば、構造的な異常により低く測定されたＭＢＬのレベルと、または、ＬＸＰＡ／ＬＸＰＡ遺伝子型による低いレベルの正常ＭＢＬと、異なる臨床的相関があるのかどうかは知られていない。
【００１１】
発明の要約
本発明の目的は、ＭＢＬに対して生成されたモノクローナル抗体を、その構造が許す範囲で、マンナンに結合した正常もしくは異常形態のＭＢＬに結合するもしくは結合しないこれらの能力に基づいて選択するための方法を提供することである。
本発明の別の目的は、ＭＢＬに対して生成されたモノクローナル抗体を、該抗体もしくはＭＢＬに対する別のモノクローナル抗体に結合した、正常もしくは異常形態のＭＢＬに結合するもしくは結合しないこれらの能力に基づいて選択するための方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、ＭＢＬに対して生成された抗体であって、
（ａ）マンナンに結合したＭＢＬ  Ａに結合するもしくは結合しない能力、
（ｂ）マンナンに結合した構造的に異常なＭＢＬに結合するもしくは結合しない能力、
（ｃ）前記抗体もしくはＭＢＬに対して生成された別のモノクローナル抗体に結合したＭＢＬ  Ａに結合するもしくは結合しない能力、または
（ｄ）前記抗体もしくはＭＢＬに対して生成された別のモノクローナル抗体に結合した構造的に異常なＭＢＬに結合するもしくは結合しない能力、
を有するものを提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、マンナンに結合することができるＭＢＬを試料中で測定するための、in vitro方法およびキットを提供することである。
本発明の別の目的は、正常なオリゴマー化ＭＢＬと、異常な、不十分にオリゴマー化されたＭＢＬの両方を試料中で測定するための、in vitro方法およびキットを提供することである。
本発明の別の目的は、マンナンに結合できるＭＢＬ、および、正常なオリゴマー化ＭＢＬと異常な、不十分にオリゴマー化されたＭＢＬとの合計の両方を試料中で同時に測定するための、in vitro方法およびキットを提供することである。
【００１４】
本発明の方法、キットおよび抗体は、ヒト血漿もしくは血清試料において、マンナンに結合可能なＭＢＬを測定することにより、または、ヒト血漿もしくは血清試料において、ＭＢＬを、正常なオリゴマー化されたＭＢＬおよび異常な、不十分にオリゴマー化されたＭＢＬの両方を測定することができる方法によって測定することにより、感染症および自己免疫疾患への増大した感受性およびこれらの悪化を診断するのに有用である。これらの方法の使用はまた、旧式の方法で見出されたＭＢＬ欠乏を、構造的に正常なＭＢＬの欠乏によるものなのか、または構造的に異常なＭＢＬの存在によるものなのか分類することを可能にする。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、抗体、抗体を選択するための方法、および、抗体を、試料中のマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）の濃度を測定するためのin vitro方法に用いるための方法およびキットを提供する。本発明の抗体、方法およびキットを用いて、ＭＢＬの変異形態の存在と、低濃度の正常ＭＢＬの存在とを識別することができる。さらに、ＭＢＬの総量を、ＭＢＬのオリゴマー化状態に依存せずに測定し、マンナンに結合することができるオリゴマー化されたＭＢＬと比較することができる。
【００１６】
本発明の抗体、方法およびキットは、生物学的液体、特にヒト血清および血漿を包含する試料中のＭＢＬを定量し、および特徴化するのに特に有用である。血漿試料におけるマンナンに結合するＭＢＬの能力について分析するアッセイを用いる場合、血液試料は、クエン酸塩またはＥＤＴＡなどのカルシウムキレート剤ではなく、ヘパリンにより抗凝固処理するのが好ましい。なぜなら、ＭＢＬのマンナンへの結合は、遊離イオン化カルシウムの存在に依存するからである。カルシウムキレート剤で抗凝固処理した血漿しか入手できない場合、過剰のカルシウム塩を加えてキレート剤を飽和させ、キレート剤の存在下に、遊離イオン化カルシウムの生理学的濃度を確保しなければならない。
【００１７】
本発明の１側面は、異なる結合特性を有するＭＢＬに対して生成されたモノクローナル抗体を選択するための方法に関する。この方法の一態様では、ＭＢＬに対して生成されたモノクローナル抗体は、構造的に正常なＭＢＬもしくはＭＢＬ  Ａがマンナンに結合した場合に、当該構造的に正常なＭＢＬもしくはＭＢＬ  Ａに結合するまたは結合しない、前記モノクローナル抗体の能力に基づいて選択される。この態様では、モノクローナル抗体はまた、構造的に異常なＭＢＬが可能な範囲でマンナンと結合した場合に、当該ＭＢＬに結合するもしくは結合しないその能力に基づいて選択することもできる。この方法の別の態様では、ＭＢＬに対して生成されたモノクローナル抗体は、ＭＢＬ  Ａが同抗体もしくはＭＢＬに対する別のモノクローナル抗体に結合した場合に、当該ＭＢＬ  Ａに結合するもしくは結合しないその能力に基づいて選択される。この態様では、抗体はまた、構造的に異常なＭＢＬが同抗体もしくはＭＢＬに対する別のモノクローナル抗体に結合した場合に、当該ＭＢＬに結合するもしくは結合しないその能力に基づいて選択される。
【００１８】
これらの選択方法を用いると、ＭＢＬに対して生成された抗体は、１）マンナンに結合したＭＢＬ  Ａに結合するもしくは結合しない能力、２）マンナンに結合した構造的に異常なＭＢＬに結合するもしくは結合しない能力、３）同抗体もしくはＭＢＬに対して生成された別のモノクローナル抗体に結合したＭＢＬ  Ａに結合するもしくは結合しない能力、または４）同抗体もしくはＭＢＬに対して生成された別のモノクローナル抗体に結合した構造的に異常なＭＢＬに結合するもしくは結合しない能力を有するものとして同定される。典型的な構造的に異常なＭＢＬは、ＭＢＬ  Ｂである。構造的に正常なおよび異常なＭＢＬの両方が、総免疫反応性ＭＢＬを構成する。
【００１９】
したがって、本発明の別の側面は、ＭＢＬに対して生成された抗体であって、構造的に正常なＭＢＬもしくはＭＢＬ  Ａがマンナンと結合した場合に、当該構造的に正常なＭＢＬもしくはＭＢＬ  Ａに結合するもしくは結合しない能力か、構造的に異常なＭＢＬがマンナンと結合した場合に、当該ＭＢＬに結合するもしくは結合しない能力か、ＭＢＬ  Ａが同抗体もしくはＭＢＬに対して生成された別のモノクローナル抗体に結合した場合に、当該ＭＢＬ  Ａに結合するもしくは結合しない能力か、または、構造的に異常なＭＢＬが、同抗体もしくはＭＢＬに対して生成された別のモノクローナル抗体に結合した場合に、当該ＭＢＬに結合するもしくは結合しない能力を有するものに関する。
【００２０】
本発明の抗体は、以下のように調製し、特徴化した。
免疫原として用いるヒトＭＢＬは、血液提供者からの血漿から精製した。精製の前に、血液の各部分を、ＨＢｓＡｇ、およびＨＩＶ１および２ならびにＨＣＶに対する抗体についてスクリーニングした。ＭＢＬは、炭水化物カラム（セファロース）でのアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。カラムを、塩化カルシウムを含有する生理ｐＨの結合バッファーで洗浄した後、ＭＢＬを、ＥＤＴＡを含有する無カルシウムバッファーで溶出した。カルシウムを含まない、生理ｐＨのカルシウムキレートバッファーによる溶出は重要であり、他の手段、例えば、非生理ｐＨの使用またはタンパク質もしくは水の構造を変更する塩、溶質および溶媒などによる溶出は、これも炭水化物カラムに結合しているＩｇＭなどの抗体も溶出させ得る。溶出物は、セファロースカラムでの分子サイズクロマトグラフィーに供し、ボイド体積付近に現れるタンパク質のピークを回収した。この手順により、これも炭水化物へのカルシウム依存性の結合を示す、より低分子量の血清アミロイドタンパク質Ａが除去された。得られた生成物は、限外ろ過で濃縮し、還元および非還元状態で、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。
【００２１】
精製したＭＢＬは、水酸化アルミニウムゲルに吸着させ、ＢＡＬＢ／ｃ×ＣＦ２雌マウスに、吸着タンパク質２５μグラムの用量で腹腔内注射した。免疫応答をモニタリングし、モノクローナル抗体を調製するための技法は、当業者に良く知られ、Harlow, E. and Lane, D. (1988; Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York)などの標準的な参考書に記載された技法に従って行った。
【００２２】
ハイブリドーマ上清は、精製ヒトＭＢＬでコートしたマイクロウェルで行ったＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。このスクリーニングの結果、ＨＹＢ  １３１−０１ｂ、ＨＹＢ  １３１−１０およびＨＹＢ  １３１−１１とコードされる新規なハイブリドーマが選択され、それぞれ同じコードの対応するマウスモノクローナル抗体をさらに特徴化した。
【００２３】
本発明の抗体の特徴化は、先に記載されたアッセイ方法に用いられているモノクローナル抗体ＨＹＢ  １３１−０１との比較を含むものであった。この比較により、４種の抗体、ＨＹＢ  １３１−０１、ＨＹＢ  １３１−０１ｂ、ＨＹＢ  １３１−１０およびＨＹＢ  １３１−１１は、各々、ＭＢＬ分子上の異なる、重複しないそれぞれのエピトープに結合することが明らかとなった。したがって、これらの抗体の１種のＭＢＬへの結合は、他の３種の抗体の同じＭＢＬへの同時結合を妨げなかった。これら４個のエピトープの、ＭＢＬモノマーの炭水化物結合部位に対する関係の研究により、ＨＹＢ  １３１−０１が緊密にこの部位に結合し、ＭＢＬのマンナンへの結合を妨げることが明らかとなった。したがって、過剰のＨＹＢ  １３１−０１抗体と複合体化したＭＢＬは、マンナンでコートされたマイクロウェルに結合できなかった。これに対し、過剰のＨＹＢ  １３１−０１ｂ、ＨＹＢ  １３１−１０またはＨＹＢ  １３１−１１と複合体化したＭＢＬは、依然としてマンナンでコートされたマイクロウェルに結合した。したがって、これらの実験から、ＨＹＢ  １３１−０１ｂ、ＨＹＢ  １３１−１０またはＨＹＢ  １３１−１１抗体のエピトープは、炭水化物結合部位と重複しないことが結論づけられた。しかしながら、コラゲナーゼによる消化に供し、コラーゲン様ドメインおよびＮ末端ドメインを除去したＭＢＬのイムノブロットにおけるこれらの抗体の反応は、これらの抗体が、ＨＹＢ  １３１−０１のように、残った分子のネック＋ＣＲＤ部分に位置するエピトープに結合することを示している。
【００２４】
モノクローナル抗体の反応性は、それぞれＡ／ＡおよびＢ／Ｂとして遺伝子タイピングされた提供者からの血清中のＭＢＬ  ＡおよびＭＢＬ  Ｂに対して試験した。これらの実験において、ＭＢＬ  Ｂは、構造的に異常なＭＢＬの例として用いた。ＭＢＬ  ＡおよびＭＢＬ  Ｂを、マンナンで、０．３マイクログラム／ミリリットルのコーティング濃度にてコートしたＥＬＩＳＡ用マイクロウェル中で１時間インキュベートした場合、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したＨＹＢ  １３１−０１、ＨＹＢ  １３１−０１ｂ、ＨＹＢ  １３１−１０およびＨＹＢ  １３１−１１は、ＭＢＬ  Ａとはほぼ同等の反応を示したが、ＭＢＬ  Ｂとは有意な反応を示さなかった。５マイクログラム／ミリリットルでコートすることにより、マンナンコートの密度を増加させることにより、各抗体のＭＢＬ  Ａへの結合によりもたらされるシグナルが増加し、より多くのＭＢＬ  Ａがコートに結合したことが示唆された。これはまた、単一のＡ／Ａ遺伝子型の提供者からのＭＢＬ  Ａ、および健康提供者からの血清プールから精製したＭＢＬへの別の抗体の相対的結合に若干の変化をもたらした。これは、後者のＭＢＬが不均一であり、異なる密度のマンナンコート、および／または別の抗体に、若干異なって結合する形態を含んでいることを示唆するものである。抗体のＭＢＬ  Ｂへの結合が検出されたケースはなかった。
【００２５】
ＭＢＬがマンナンコートに結合している場合、当該タンパク質は、そのマンナン結合ＣＲＤが、試験した抗体のいずれも、結合したＣＲＤ上のそのエピトープへのアクセスを得ることができない方向で、保持されていると結論づけられた。十分な数のヘッドを有し、いくつかのヘッドがコートに結合する一方、他のヘッドは液相中自由に揺動することを保証できるオリゴマー化されたＭＢＬ  Ａのみが、抗体をその自由なヘッドを介して結合することができるのである。この仮定された自由ヘッドで試験した４種の抗体の反応性には、わずかな差異があった。最大２個のヘッドまたは異常な単一のヘッドを有するＭＢＬ  Ｂは、いずれの抗体もＣＲＤへの結合ができないような様式で、マンナンコートに結合している。なぜなら、利用できる結合していないＣＲＤが、液相中にないからである。また、ＭＢＬ  Ｂのマンナンコート表面への結合はＭＢＬ  Ａより弱く、別な実験で、有効な結合を得るには、長時間のインキュベーションを要することが決定された。これは、ＭＢＬ  Ａのマンナンコート表面への結合は、同じオリゴマーの多数のヘッドの当該表面への結合による相乗効果によって安定化しているが、ＭＢＬ  Ｂの結合は、同程度の結合上の相乗効果の対象とならないという事実に起因する。したがって、アッセイ手順のその後の洗浄工程により、実際、コーティングに結合した任意のＭＢＬ  Ｂが除去され、これがこの手順を正常なオリゴマー化ＭＢＬについて高度に特異的にしている可能性がある。
【００２６】
前記4種の抗体のＭＢＬ  ＡおよびＭＢＬ  Ｂとの反応性は、ペアワイズ比較においても試験した。これらのアッセイにおいて、各精製抗体を、マイクロタイターウェルをコートするのに用いた。次に、ＭＢＬ  ＡまたはＭＢＬ  Ｂのいずれかを含有するヒト血清の希釈物を加え、結合したＭＢＬへの、精製され、標識されたタイプの他の3種の抗体のそれぞれの結合を測定した。Ａ／Ａ遺伝子型の単一の提供者からの血清におけるＭＢＬ  Ａの濃度は、ＨＹＢ  １３１−０１をコートおよび検出抗体の両方として用い、そしてプールされた提供者血漿から精製したＭＢＬを重量測定の標準物質（gravimetric standard）として用いた、先に記載されたアッセイ方法によって、760ｎｇ/ｍｌと決定された。これらすべてのアッセイは、カルシウムを含まない慣用の希釈バッファーおよび洗浄バッファーを用いて行なった。表1に、抗体の各組合せにより、ＭＢＬ  Ａ血清およびＭＢＬ  Ｂ血清について、同じ標準物質との比較により得られたＭＢＬ濃度を示す。
【００２７】
【表１】
2005523435.tif 000002
【００２８】
以下の文章では、コーティング／検出抗体の組合せは、この順序で、各抗体の参照番号の最後の部分のみを用いて参照する。例えば、０１／０１ｂは、ＨＹＢ  １３１−０１をコート抗体として、そしてＨＹＢ  １３１−０１ｂを検出抗体として用いたことを意味する。
【００２９】
ＭＢＬ  Ａについて得られた見かけ上の（apparent）濃度値は、０１／０１での７６０ｎｇ／ｍｌ（先に記載されたアッセイを用いて）から、１１／０１ｂでの１１００ｎｇ／ｍｌまで異なった。したがって、異なる抗体の組合せを用いることにより、この提供者からは、先に記載されたアッセイを用いて、プールされ、精製されたＭＢＬ標準物質との比較で測定したものより４５％まで多いＭＢＬ  Ａを検出することができた。単一の提供者の血漿中のＭＢＬも、標準物質のＭＢＬも同質ではないため、単一の提供者の血漿について記録された数値の増加は、部分的に、その抗体の組合せの、プールされた標準物質との反応性の低下によるものかもしれない。異なる検出抗体を同じコーティング抗体と組み合わせて用いて、および、同じコーティング抗体を、異なる検出抗体と組み合わせて用いて得たＭＢＬ  Ａ濃度についての変動係数は、コーティング抗体としてのＨＹＢ  １３１−０１ｂは、最も少ない変動で異なる抗体による検出を許容するようにＭＢＬと結合し、一方、検出抗体としてのＨＹＢ  １３１−１０は、異なるコートに結合したＭＢＬを検出するのに最小の変動を示すことを示している。
【００３０】
異なるコートによりＭＢＬが提示される様式にわずかな感受性しか示さない、ＨＹＢ  １３１−１０の検出抗体としての信頼性は、異なる遺伝子型の提供者からの多数の血清を、マンナンを異なる濃度でコートしたマイクロウェルで試験することによって確認した。４種の検出抗体の中で、ＨＹＢ  １３１−１０が、異なるマンナンコートに結合した、同じ血清からのＭＢＬについて、最も一貫した結果をもたらした。
【００３１】
ＭＢＬ  Ａ濃度の最大の平均値は、４種の検出抗体で得られた結果を平均すると、ＨＹＢ  １３１−１１およびＨＹＢ  １３１−１０をコーティング抗体として用いた場合に得られた。これは、ＨＹＢ  １３１−１１およびＨＹＢ  １３１−１０が、ＨＹＢ  １３１−０１ｂおよびＨＹＢ  １３１−０１よりもＭＢＬに高い親和性を有することを示唆した。
【００３２】
同じコーティング抗体に結合したＭＢＬ  Ａを、異なる検出抗体で測定した場合に示される記録されたＭＢＬ  Ａ濃度の差異は、一部のコーティング／検出抗体のペアが、他より高い効率でＭＢＬ  Ａに同時に結合することを示唆するものである。ＭＢＬ  Ａについては、これは複数の因子の組合せに依存すると仮定される。異なる抗体が、結合したＭＢＬのヘッドを保持する角度は、ＣＲＤ上のそのエピトープの位置に依存し、これは、他のエピトープの、そのそれぞれの抗体へのアクセス可能性の程度に影響する。同時に、個々の抗体の親和性が結果に影響し得る。
【００３３】
検出抗体の結合は、その大部分が、液相に振り出された結合していないＭＢＬのヘッドへのその結合、コーティング抗体への結合によりブロックされているコート結合ヘッド上のエピトープに依存している。しかしながら、各ヘッドは放射相称に配置された３つのＣＲＤ領域を有するため、問題となるエピトープの位置が、三重ヘッドの、その同一エピトープの１つまたは２つを介した結合角度が、同じヘッド上の残りの２つまたは１つのエピトープへの検出抗体のアクセスを可能にするものである場合、検出抗体のコート結合ヘッドへのいくらかの結合が依然として可能であり得る。これが起こり得る程度は、同じ抗体を用いて、液相に自由に揺動するヘッドが極めて少ないか、または存在しないＭＢＬ  Ｂの濃度を測定した場合に得られる結果が示している。表１が示すとおり、組合せ０１／０１も、１１／１１も、ＭＢＬ  Ｂを測定することができない。したがって、これらの同じ抗体の組合せは、液相中、検出抗体に露出した非結合ヘッドを有するオリゴマー化したＭＢＬしか測定することができない。
【００３４】
０１ｂ／０１ｂ抗体の組合せは、ＭＢＬ  Ａについて８４０ｎｇ／ｍｌの総数値（total reading）をもたらした。これは以下のように分析できる。液相中の自由ヘッドへの結合から予想される数値＝７６０ｎｇ／ｍｌ（コート結合ヘッドに結合することができない０１／０１からの数値）、コート結合ヘッドへの結合から予想される数値＝９０ｎｇ／ｍｌ（０１ｂ／０１ｂにより、ＭＢＬ  Ｂについて得られた数値）、総予想数値＝８５０ｎｇ／ｍｌ。予想数値（８５０ｎｇ／ｍｌ）と実際に見出された数値（８４０ｎｇ／ｍｌ）との間の一致は非常によい。
【００３５】
１０／１０抗体の組合せは、ＭＢＬ  Ａについて９２０ｎｇ/ｍｌの総数値をもたらした。これは以下のように分析できる。液相中の自由ヘッドへの結合から予想される数値＝７６０ｎｇ／ｍｌ（コート結合ヘッドに結合することができない０１／０１からの数値）、コート結合ヘッドへの結合から予想される数値＝１９０ｎｇ／ｍｌ（１０／１０により、ＭＢＬ  Ｂについて得られた数値）、総予想数値＝９５０ｎｇ／ｍｌ。予想数値（９５０ｎｇ／ｍｌ）と実際に見出された数値（９２０ｎｇ／ｍｌ）との間の一致も非常によい。
【００３６】
両方の場合において、計算は概算であり、ＭＢＬ  Ｂ血清中のＭＢＬ  Ｂの量が、ＭＢＬ  Ａ試料中のコート結合ＭＢＬ  Ａヘッドの量に匹敵するという仮定に基づいている。しかしながら、ＭＢＬ  Ｂ濃度の最も高い推定値（恐らく現実に最も近いアプローチである）は５３０ｎｇ/ｍｌであり、５３０／７６０という比率は、ＭＢＬ  Ａ試料中の総ヘッドに対するコート結合ヘッドの割合からかけ離れてはいないはずである。どちらかといえば、それは、この比率より若干大きいかも知れない。
【００３７】
コーティングおよび検出のための異なる抗体の組合せは、非コート結合ヘッドとのその反応と、コート結合ヘッドとの、検出抗体のこれらのヘッド上のそのエピトープへのアクセス可能性に依存した反応との関数としてのＭＢＬ  Ａの数値を与える。これは、コーティング抗体のためのエピトープおよび検出抗体のためのエピトープの、これらの間の角度を支配する相対位置と、放射相称な三重ヘッドが一度コーティング抗体のための１つまたは２つのエピトープを介してコートに結合した場合の、前記三重ヘッド上の検出抗体のためのエピトープの露出とに依存する。幾何学的な考察により、ペア内の抗体の使用を逆にすることが、同じ結果をもたらさないことが明らかになった。すなわち、１１／０１ｂは１１００ｎｇ／ｍｌのＭＢＬ  Ａ値を与えるが、０１ｂ／１１は８７０ｎｇ／ｍｌの数値を与える。これに関するさらなる考察は、高い数値は、一般的に、より高い親和性の抗体がコートとして用いられた時に得られるということであり、これは、アッセイ手順の最中、コートとその結合ＭＢＬとが、検出抗体よりもより多く洗浄に供されるためである。
【００３８】
ＭＢＬ  Ｂについて得られた見かけ上の濃度値は、０１／０１および先に記載されたアッセイおよび１１／１１の０から、１０／１１の５３０ｎｇ／ｍｌまで変動した。ＭＢＬ  Ｂは正常なネックおよびＣＲドメインを有し、したがって、４種の抗体についてＭＢＬ  Ａと同様のエピトープを示す。しかしながら、ＭＢＬ  Ｂは、単一のＭＢＬ鎖の二量体と、ＭＢＬ  Ｂ分子中に見出されるヘッドの最大数である、２個の三重ヘッドで構成され得る六量体とからなる。ＭＢＬ  Ｂは、抗体コーティングに、全ての二重および三重ＣＲＤヘッドが、コーティング抗体のための２個または３個の同一エピトープの少なくとも１つのエピトープを介して接触した状態にあるように結合していると考えられる。ＭＢＬヘッドが結合している角度は、問題のエピトープのＣＲＤ上の位置に依存し、これは、検出抗体がコーティング抗体と同じか、または異なる抗体であるか否かに関らず、他のエピトープの、そのそれぞれの検出抗体へのアクセス可能性に影響する。
【００３９】
この系におけるＭＢＬ  Ｂの測定は、したがって、ほとんど完全に、コーティングおよび検出抗体エピトープの相対的な位置、および検出抗体のためのエピトープの露出に対するコートへの結合の効果に依存する。組合せ０１／０１も１１／１１もＭＢＬ  Ｂを測定することはできない。これは、抗体ＨＹＢ  １３１−０１およびＨＹＢ  １３１−１１のためのエピトープが、ＣＲＤ上に、二重または三重ヘッドのコート中の抗体への単一のエピトープを介した結合が、ヘッドを、他のエピトープまたは同じ抗体のための２つのエピトープが液相で利用できない位置に維持されるような位置に保持するように、位置していることを示している。ＣＲＤ上のこれらの位置は、ＣＲＤが、二重または三重ヘッドにおいて放射相称に配列された場合、これらが同じ方向を向くようなものであることが結論付けられた。
【００４０】
組合せ０１ｂ／０１ｂおよび１０／１０は、いくらかのＭＢＬ  Ｂを測定することができた。これは、これらの抗体のためのエピトープが、ＣＲＤ上に、ＣＲＤが二重または三重ヘッドに整列している時に異なる方向を向くように位置していることを示唆する。０１ｂ／０１ｂは９０ｎｇ／ｍｌの数値を与えたが、１０／１０は１９０ｎｇ／ｍｌの数値を与えたという事実は、抗体ＨＹＢ  １３１−１０のより高い親和性、および／またはＨＹＢ  １３１−１０のための非コート結合エピトープが液相により良好に露出させるエピトープ位置の影響によるものであり得る。
【００４１】
コーティングおよび検出抗体としての異なる抗体の組合せは、全ていくらかのＭＢＬ  Ｂを測定することができた。これは、４種の異なる抗体が、全て、ＣＲＤ上の重複しないエピトープに結合しているという事実によるものと考えられる。これらの間にはある角度があり、異なるエピトープの相対的な位置および角度が、得られた数値を支配する主要な因子であるとみられる。幾何学的な考察によると、ペア内の抗体の使用を逆にすると同じ結果が得られないことが明らかになった。すなわち、１１／０１ｂは、８０ｎｇ／ｍｌのＭＢＬ  Ｂ値を与え、一方０１ｂ／１１は、２１０ｎｇ／ｍｌの数値を与えた。ＭＢＬ  Ｂについての最も高い数値（５３０ｎｇ／ｍｌ）は、１０／１１で得られ、これは、ＭＢＬ  Ｂが一度ＨＹＢ  １３１−１０のコートに結合すると、ＨＹＢ  １３１−１１のためのエピトープがこの検出抗体に良好に露出されることを示唆するものである。理論的な見地からは、一連の抗体ペアから得られたＭＢＬ  Ｂ濃度の最大値は、重量濃度が決定可能な場合には、重量濃度に最も近いと思われる。
【００４２】
したがって、１０／１１抗体の組合せが、ＭＢＬ  Ｂ、そして類推的にＭＢＬ  ＣおよびＤをも測定するため、および、Ａ／Ｂ、Ａ／ＣおよびＡ／Ｄヘテロ接合体からのＭＢＬを測定するための最も好適な抗体の組合せである。この組合せはまた、ＭＢＬ  Ａについて１０４０ｎｇ／ｍｌという高い数値を与え、このため、これは患者試料中の総免疫反応性ＭＢＬを測定するのに好適であり得る。総免疫反応性ＭＢＬ濃度を測定するのに用いることができる別の組合せは、１１／０１である。この組合せを用いて、異なるＭＢＬ遺伝子型の血液提供者について記録した血漿ＭＢＬ濃度を表2に示す。そこでは、これらを先に記載されたアッセイを用いた０１／０１の組合せ、および１１／１１の組合せからの結果と比較してある。
【００４３】
表２は、１１／０１、０１／０１および１１／１１で得られた数値が、プロモーターの欠陥に関連するかどうかに関らず、すべてのＡ／Ａ遺伝子型について十分に一致していることを示している。Ａ／Ｂ、Ａ／Ｄ、Ｂ／ＢおよびＢ／Ｄ遺伝子型については、１１／０１は他の２つの抗体の組合せより顕著に多いＭＢＬを測定するが、１１／１１の組合せは、Ｂ／Ｂ遺伝子型を除き、中間的な値を与えた。Ａ／Ｄ遺伝子型は、先に記載されたアッセイによってさえ、一般的に軽度に減少したＭＢＬ値しか示さず、これは先の研究（上記Steffensen, R. et al.）を確認するものである。組換えＭＢＬ  Ｄは、組換えＭＢＬ  Ｂと類似しているが、Ｄ鎖はＢ鎖よりも、Ａ鎖に組み合わさって、正常または略正常構造のＭＢＬの
割合を形成しやすいようである。
【００４４】
【表２】
2005523435.tif 000003
【００４５】
カルシウムの影響も検討した。異なる抗体のペアを用いた前記アッセイは、全て希釈および洗浄バッファー中にカルシウムの存在なしに行なった。糖のＭＢＬへの結合はカルシウム依存性であり、カルシウム自身がＭＢＬのＣＲＤに結合し、そのコンホメーションを変化させ、糖結合機構に参加する。したがって、カルシウム含有希釈および洗浄バッファーはＭＢＬのマンナンコートへの結合に依存するＭＢＬアッセイにとって重要である。専らＭＢＬへの抗体の結合に依存するＭＢＬアッセイでは、カルシウムは必要ない。しかしながら、ＣＲＤへの抗体の結合に依存するＭＢＬアッセイにおいて、カルシウム含有バッファーを用いた場合、カルシウムにより誘導されるＣＲＤのコンホメーションの変化が、得られる結果を変更する可能性がある。これは２つの様式で起こり得る：特定のモノクローナル抗体のエピトープについてのアフィニティーが、当該エピトープのコンホメーション変化により変化し得ること、および／またはＣＲＤにおけるコンホメーション変化が、異なるモノクローナル抗体についてのエピトープ間の角度を変化させ得ること。これは、構造的に異常なＭＢＬを測定するための最適な抗体の組合せの選択が、希釈および洗浄バッファー中のカルシウムの存在に影響され得ることを意味する。それ故、異なる抗体の組合せの試験を、イオン化カルシウムの生理レベルに対する過剰量である、４ｍＭ塩化カルシウム含有バッファー中で繰り返した。多数の結果からの主要な結論は、カルシウムの存在下で、構造的に異常なＭＢＬを測定するための最適な抗体の組合せは１１／０１であり、一方、カルシウム非存在下における最適な組合せは１０／１１であるということであった。
【００４６】
本発明の別の側面は、試料中で、マンナンに結合することができるＭＢＬを測定するための、または、試料中で、正常なオリゴマー化ＭＢＬおよび異常な、不十分にオリゴマー化されたＭＢＬの両方を測定するためのin vitro方法およびキットに関する。これらの方法は、感染性疾患および自己免疫性疾患に対する増大した感受性およびこれらの疾患の悪化を診断するのに有用である。
【００４７】
よく知られた任意の種類の免疫アッセイ技術を、本発明の方法に用いることができる。本発明の免疫アッセイに関して、マンナンに結合できるＭＢＬもしくは試料中の総免疫反応性ＭＢＬが、マンナンもしくは本発明の抗体などの捕捉分子を介して、それぞれ固相に不動化されているのが好ましい。不動化された、マンナンに結合できるＭＢＬもしくは試料中の総免疫反応性ＭＢＬは、その後、検出可能に標識された本発明の二次抗体を介して検出することができる。
【００４８】
一つの好ましい態様では、前記方法は、マンナンもしくはＭＢＬに対する選択されたモノクロナール抗体でプレコートされたマイクロタイターウェル、ＭＢＬに対する選択されたモノクロナール抗体の溶液であって、この抗体が例えばビオチン、またはアルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの検出可能な酵素、または時間分解蛍光放射による検出を可能にするユーロピウムで検出可能に標識されているもの、標準物質および対照としてのヒトＭＢＬの溶液、および用いる酵素のための発色基質の溶液、を含有するＥＬＩＳＡアッセイキットからなる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む。ビオチン標識抗体の場合、上記酵素の一つに結合したストレプトアビジンの溶液も提供される。希釈および洗浄バッファーも提供される。
【００４９】
ＥＬＩＳＡに用いられ、当業者に良く知られている検出可能な酵素の例は、限定されることなく、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、リボヌクレアーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ウレアーゼ、および酵母アルコールデヒドロゲナーゼを包含する。
【００５０】
ＥＬＩＳＡを用いてマンナン結合ＭＢＬを測定することができる。マンナン結合ＭＢＬを測定するために、ＥＬＩＳＡプレートのマイクロタイターウェルもしくはウェルのストリップは、捕捉分子としてのマンナンでプレコートされる。好ましくは、マンナンはSaccharomyces cerevisiaeから調製され、適切なコーティングバッファー中、０．１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの範囲、より好ましくは３μｇ／ｍｌの濃度で、当業者に良く知られた手順に従って適用される。ウェルを、従来の組成の洗浄バッファー、例えば、ブロッキング剤として非イオン性溶剤を、および、イオン化カルシウムを０．５ｍＭ〜５ｍＭの間の濃度にて、しかし、好ましくは４ｍＭにて、可溶性カルシウム塩の形で含有するもので洗浄した後、分析すべき血清もしくはヘパリンで抗凝固処理した血漿試料および標準物質および対照であって、すべて、イオン化カルシウムを上記の濃度範囲内であるが好ましくは４ｍＭで含有する希釈バッファーで希釈したもの（ＭＢＬのマンナンへの結合はカルシウム依存性であるため）を、それぞれのウェルに加える。ウェルは、室温で１時間までの期間インキュベートし、そして洗浄する。
【００５１】
ＨＹＢ１３１−１０などの本発明の選択されたモノクローナル抗体であって、例えばビオチンなどで検出可能に標識されたものの希釈物を各ウェルに加え、１時間までの間インキュベートする。この抗体の適切な希釈は経験的に決定され、その濃度は、０．１μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの範囲であり得る。ウェルを洗浄し、結合抗体をよく知られた技法に従って検出する。例えば、ビオチン化抗体については、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合したストレプトアビジンの溶液を各ウェルに加え、１時間までの間インキュベートする。ウェルを洗浄し、発色基質溶液を各ウェルに加え、３０分までの間インキュベートする。色の生成は、各ウェルに強酸を加えて停止させ、生成した色の光学密度をマイクロプレートリーダーで読み取る。各試料ウェルにおけるマンナンに結合したＭＢＬの量は、そのウェルの光学密度を、重量測定的に（gravimetrically）調製した精製ＭＢＬの標準物質に由来する標準物質を含有するウェルについての光学密度を介して描いた標準曲線と対比することにより計算した。検出のための代替的な手段は、何ら限定されることなく、抗体を酵素もしくはユーロピウムと直接結合させ、上記手順をしかるべく、当業者に良く知られているように適合させることを包含する。
【００５２】
また、ＥＬＩＳＡを用いて総免疫反応性ＭＢＬを測定することもできる。総免疫反応性ＭＢＬを測定するために、ＥＬＩＳＡプレートのマイクロタイターウェルもしくはウェルのストリップは、捕捉分子としての、ＭＢＬに対する選択されたモノクローナル抗体、例えば、ＨＹＢ  １３１−１０もしくは類似の選択された抗体を、適切なコーティングバッファー中、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの範囲、より好ましくは３μｇ／ｍｌの濃度で、当業者に良く知られた手順に従って適用してプレコートする。ウェルを、当業者に良く知られ、ブロッキング剤として非イオン性溶剤を含有する従来の組成の洗浄バッファーで洗浄した後、すべて従来の組成の希釈バッファーで希釈した分析すべき血清もしくは血漿試料および標準物質および対照を、それぞれのウェルに加える。ウェルは、室温で１時間までの期間インキュベートし、そして洗浄する。例えばビオチンなどで検出可能に標識された異なるモノクローナル抗体であって、ＨＹＢ  １３１−１１もしくは類似の基準に従って選択された別の抗体であってもよいものの希釈物を各ウェルに加え、１時間までの間インキュベートする。この抗体の適切な希釈は経験的に決定され、その濃度は、０．１μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの範囲であり得る。
【００５３】
ウェルを洗浄し、結合抗体を検出する。ビオチン化抗体については、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合したストレプトアビジンの溶液を用い、これを各ウェルに加え、１時間までの間インキュベートすることによって行う。ウェルを洗浄し、発色基質溶液を各ウェルに加え、３０分までの間インキュベートする。色の生成は、各ウェルに強酸を加えて停止させ、生成した色の光学密度をマイクロプレートリーダーで読み取る。各試料ウェルにおける、コーティングおよび検出抗体の両方に同時に結合できるＭＢＬの量は、そのウェルの光学密度を、重量測定的に調製した精製ＭＢＬの標準物質に由来する標準物質を含有するウェルについての光学密度を介して描いた標準曲線と対比することにより計算した。代替的に、抗体を酵素もしくはユーロピウムと直接結合させ、上記手順を、他のよく知られた技法にしたがって、検出のために適合させることができる。
【００５４】
特に有用で好都合なＥＬＩＳＡ法は、マンナンを捕捉分子として用いたマンナン結合ＭＢＬアッセイと、捕捉抗体としてＨＹＢ  １３１−１１を用いたＭＢＬ総免疫反応性アッセイとの組み合わせである。この方法においては、１組のＥＬＩＳＡウェルをマンナンで上記のようにプレコートし、第２の組をＨＹＢ  １３１−１１抗体により、１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの間の濃度で、当業者に良く知られた手順に従ってプレコートする。次に、同じ希釈の血清もしくは血漿試料を、前記２組のウェル中並行して、同じ希釈および洗浄バッファーおよび同じ試薬を用いてアッセイする。これにより、正常にオリゴマー化された、マンナン結合ＭＢＬと、総ＭＢＬ免疫反応性とが、同時に、同じ血清もしくは血漿試料中で測定される。希釈バッファーおよび洗浄バッファーは、両方ともイオン化カルシウムを、０．５ｍＭ〜５ｍＭの間だが、好ましくは４ｍＭの濃度で含有し、バッファーの他の成分は、カルシウムを沈殿させないように、またはカルシウムに別の仕方で影響しないように選択される。
【００５５】
ウェルを、ブロッキング剤として非イオン性溶剤を含有する従来の組成の洗浄バッファーで洗浄した後、すべて従来の組成のカルシウムを含有する希釈バッファーで希釈した、分析すべき血清もしくは血漿試料および標準物質および対照を、３つの組の各々におけるそれぞれのウェルに加える。ウェルは、室温で１時間までの期間インキュベートし、そして洗浄する。例えばビオチンなどで検出可能に標識された、モノクローナル抗体ＨＹＢ  １３１−１１もしくは上記に概説した基準に従って選択された別の抗体の希釈物を各ウェルに加え、１時間までの間インキュベートする。この抗体の適切な希釈は経験的に決定され、その濃度は、０．１μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの範囲であり得る。ウェルを洗浄し、結合抗体を検出する。ビオチン化抗体については、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合したストレプトアビジンの溶液を用い、これを各ウェルに加え、１時間までの間インキュベートすることによって行う。ウェルを洗浄し、発色基質溶液を各ウェルに加え、３０分までの間インキュベートする。
【００５６】
色の生成は、各ウェルに強酸を加えて停止させ、生成した色の光学密度をマイクロプレートリーダーで読み取る。各ウェルに最初に添加されたＭＢＬの量は、そのウェルの光学密度を、重量測定的に調製した精製ＭＢＬの標準物質に由来する標準物質を含有する、同じ組の（同じ捕捉分子でコートされた）ウェルについての光学密度値を介して描いた標準曲線と対比することにより計算する。代替的に、検出抗体を酵素もしくはユーロピウムと直接結合させ、上記プロトコルを、他のよく知られた技法にしたがって、検出のために適合させることができる。この方法は、抗体ＨＹＢ  １３１−０１でコートされたウェルの追加の組を用いて、旧式の方法と組み合わせて行うこともできる。ＭＢＬマンナン結合（MBL mannan-binding）および総免疫反応性アッセイを組み合わせることは、ＨＹＢ  １３１−０１を用いる旧式の方法とも組み合わせるか否かにかかわらず、多数の利点を提供する。
【００５７】
特に、ＭＢＬマンナン結合法は、正常にオリゴマー化されたＭＢＬに高度に選択的であり、旧式の方法と一般的に類似の結果を与える。
さらに、ＭＢＬマンナン結合法は、旧式の方法と異なり、試料中に存在し得るいずれのリウマチ因子からの影響の対象とならない。旧式の方法では、免疫グロブリンに結合するリウマチ因子がコーティング抗体を検出抗体に架橋する可能性があり、それ故、偽の高い陽性値を与え、これが、ＭＢＬの存在によるものと解釈されていた。リウマチ因子はマンナンに結合しないため、これはマンナン結合アッセイでは生じ得ず、それ故、前記アッセイはリウマチ因子の発生と関連している、関節リウマチなどの自己免疫症状を有する患者において、正常にオリゴマー化されたＭＢＬを決定するためにより適している。免疫グロブリンもしくは熱処理免疫グロブリンのインキュベーション培地への添加は、リウマチ因子のいくらかを吸収し、捕捉および検出抗体に基づくアッセイに対するこれらの影響を減少させることができる。しかしながら、かかる影響はこの手順により減少させることができるが、それを完全に除去することはできない。この理由により、免疫グロブリンではない捕捉分子の使用が好ましい。
【００５８】
さらに、ＭＢＬマンナン結合アッセイおよび／または旧式の方法の結果を、ＭＢＬ総免疫反応性アッセイの結果と比較することにより、旧式の方法により記録されたＭＢＬの低い血清もしくは血漿レベルの背景にある遺伝的欠陥の性質が明らかになる。このタイプの比較は、総免疫反応性アッセイからの結果を、旧式の方法からの結果と比較する、表２の第３（１１／０１）および第４列（０１／０１、旧式の方法）により例証される。例えば、旧式アッセイにより、もしくはマンナン結合アッセイにより記録された高いレベル（例えば、１１００ｎｇ／ｍｌ超）は、総免疫反応性アッセイにおける類似の高いレベルと関連している。これらの対象（表２の提供者１〜４）は、プロモーターの欠陥のない、構造的に正常なＭＢＬ  Ａ（Ａ／Ａ遺伝子型）を有する。旧式アッセイにより、もしくはマンナン結合アッセイにより記録されたより低いレベル（例えば１１００ｎｇ／ｍｌ以下）を有する対象は、総免疫反応性アッセイにおいて類似の低いレベルか、または、はるかに高いレベルのいずれかを示し得る。総免疫反応性アッセイにおける類似の低いレベル（表２の提供者５および６）は、構造的に正常なＭＢＬの減少した濃度、すなわち、プロモーターの欠陥が存在するＡ／Ａ遺伝子型を示し、これは、ＬＸ／ＬＸもしくはＬＸ／ＬＹであり得る。
【００５９】
総免疫反応性アッセイにおける、旧式アッセイもしくはマンナン結合アッセイにおけるよりもはるかに高いレベルは、構造的に異常なＭＢＬの顕著なレベルの存在を示す。Ｂ鎖が正常構造に高度に破壊的である（highly disruptive）Ａ／Ｂヘテロ接合遺伝子型（表２の提供者７および８）は、典型的に、旧式アッセイにより、もしくはマンナン結合アッセイにより記録された１０００ｎｇ／ｍｌよりかなり低いレベルのＭＢＬと関連している。総免疫反応性アッセイにより記録された値は、３〜７倍高くなり得る。Ｄ鎖が、ＢもしくはＣ鎖より、正常構造に破壊的でないＡ／Ｄヘテロ接合遺伝子型（表２の提供者９）は、典型的に、旧式アッセイにより、もしくはマンナン結合アッセイにより記録された１５００ｎｇ／ｍｌより低いレベルのＭＢＬと関連している。総免疫反応性アッセイにより記録された値は、２倍高くなり得る。Ｂ／Ｂ、Ｄ／ＤおよびＣ／Ｃホモ接合体、およびＢ／Ｄ、Ｂ／ＣおよびＤ／Ｃヘテロ接合体は、構造的に異常な鎖のみを有し、表２の提供者１０〜１２により例示される。これらの遺伝子型は、典型的に、旧式アッセイにより記録された１００ｎｇ／ｍｌ未満のＭＢＬレベルと関連しているが、総免疫反応性アッセイにより記録される値は、１０〜３０倍高くなり得るものの、１０００ｎｇ／ｍｌ未満にとどまっている。
【００６０】
例示されたＥＬＩＳＡアッセイの検出限界は、１／１０の希釈を用いた場合、当初の血漿もしくは血清試料において０．５ｎｇ／ｍｌのオーダーにあり、動作範囲の上限は、試料の希釈率を適切に増大させることにより生じ得る任意の濃度へ拡張することができる。
【００６１】
当業者がこの開示を読んで理解するとおり、上記のＥＬＩＳＡ形式で用いた原理は、別の固相免疫アッセイ形式で用いるために、よく知られた手順に従い、日常的に変更することができる。例えば、１つの態様においては、マンナンもしくはＭＢＬに対するモノクローナル抗体である捕捉分子は、ポリスチレンマイクロスフェアまたは微粒子または磁性ビーズまたは常磁性ビーズ上にコートされる。別の態様では、捕捉分子は、ポリスチレンスライド上にコートされる。次に、試料を、コートされた微粒子、ビーズもしくはスライドに加え、そして、試料中の、マンナンに結合可能なＭＢＬもしくは正常のオリゴマー化されたＭＢＬおよび異常な、不十分にオリゴマー化されたＭＢＬを、本発明の抗体を用いて測定する。
【００６２】
さらに、当業者がこの開示を読んで理解するとおり、対象となる他の分析物のための追加の捕捉分子を、複数分析物の自動分析のために、プレート、微粒子、ビーズもしくはスライド上にコートすることもできる。かかる分析物は、限定されることなく、先天性免疫系の他の成分、例えば、界面活性タンパク質（surfactant protein）ＡおよびＤ、フィコリンＨ、ＬおよびＭ、および補体成分および因子、ならびに適応免疫系の成分、凝固および血栓溶解系の成分、および分析上の利益を有する実際上すべての血清もしくは血漿成分を包含する。
【００６３】
本発明の抗体に有用であり、当業者に良く知られたその他の免疫アッセイ技法は、限定されることなく、ラジオイムノアッセイ、磁気分離と例えばルビジウムで標識された抗体の電気化学発光測定、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を包含する。免疫沈降法は、当該技術分野において標準的であり、例えば、Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998に見出すことができる。ウェスタンブロット（イムノブロット）分析もまた、当該技術分野において標準的であり、例えば、Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997に見出すことができる。ＭＢＬレベルは、感染症ならびに自己免疫障害および疾患への増大した感受性、およびこれらの悪化に関連している。したがって、ヒト血漿もしくは血清試料中の、マンナンに結合できるＭＢＬ、または、正常なオリゴマー化されたＭＢＬおよび異常な、不十分にオリゴマー化されたＭＢＬの両方を測定するのに用いることができる本発明の方法、キットおよび抗体は、感染症および自己免疫疾患への増大した感受性、およびこれらの悪化を診断するのに有用である。
【国際調査報告】
2005523435.tif 000004
2005523435.tif 000005
2005523435.tif 000006
2005523435.tif 000007
2005523435.tif 000008
2005523435.tif 000009