【手続補正書】
【提出日】令和2年8月28日(2020.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置を用いて微生物を分析する方法であって、
アルキルホスホン酸及び界面活性剤の少なくとも一方である添加剤と、マトリックス物質とを混合したマトリックス・添加剤混合溶液を、マトリックス支援レーザ脱離イオン化の際に使用することを特徴とする微生物分析方法。
【請求項２】
前記アルキルホスホン酸がメチレンジホスホン酸である、請求項１に記載の微生物分析方法。
【請求項３】
前記界面活性剤がデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、請求項１又は２に記載の微生物分析方法。
【請求項４】
前記マトリックス物質がシナピン酸である、請求項１〜３のいずれかに記載の微生物分析方法。
【請求項５】
前記マトリックス・添加剤混合溶液が、３０〜７０％のアセトニトリルと０．１〜３％のトリフルオロ酢酸を含む水溶液に、前記マトリックス物質を１０〜３０ｍｇ／ｍＬ、メチレンジホスホン酸を０．１〜５％、デシル−β−Ｄ−マルトピラノシドを０．１〜１０ｍＭ含むように溶解して調製されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の微生物分析方法。
【請求項６】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置を用いて微生物を分析する方法であって、
a)１０〜３０ｍｇ／ｍＬのシナピン酸を含むエタノール溶液、あるいはシナピン酸のエタノ−ル飽和溶液をサンプルプレートに滴下し、乾燥させる工程と、
b)マトリックス物質を含む溶液と被検微生物を混合してマトリックス・微生物混合溶液を調製する工程と、
c)前記サンプルプレートに滴下された前記エタノール溶液、あるいは前記エタノール飽和溶液の乾燥物の上にさらに前記マトリックス・微生物混合溶液を滴下し、乾燥させる工程と
を備える、微生物分析方法。
【請求項７】
被検微生物について得られたマススペクトルのうち質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域を含む質量域のマススペクトルパターンを、データベースに格納されているマススペクトルパターンと比較した結果に基づいて前記被検微生物の同定を行う、請求項１〜６のいずれかに記載の微生物分析方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
マトリックス物質としては、分析対象となる微生物の種類や微生物の同定レベル（科、属、種、亜種、病原型、血清型、株等）に応じた適宜の物質を選択することができる。そのようなマトリックス物質として、シナピン酸（Sinapinic acid (ＳＡ)）、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 （α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (ＣＨＣＡ)）、フェルラ酸（ferulic acid (ＦＡ)）などが挙げられるが、本発明の好ましい形態としては、マトリックス物質としてＳＡを用いることができる。一般に、ＳＡは、ＭＡＬＤＩ分析において、タンパク質などの高質量分子の分析に有効であることが知られている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
また、本発明の微生物分析方法は、
a)１０〜３０ｍｇ／ｍＬのシナピン酸を含むエタノール溶液、あるいはシナピン酸のエタノ−ル飽和溶液をサンプルプレート上に滴下し、乾燥させる工程と、
b)マトリックス溶液と被検微生物を混合してマトリックス・微生物混合溶液を調製する工程と、
c)前記サンプルプレート上に滴下された前記エタノール溶液、あるいは前記エタノール飽和溶液の乾燥物の上にさらに前記マトリックス・微生物混合溶液を滴下し、乾燥させる工程と
を備える。 
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
＜４．２  添加剤の後載せ法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物溶液をマトリックス溶液ＳＡ−２を用いて５０倍希釈し、マトリックス・微生物混合溶液を調製した。
(2) 次に、１μＬのマトリックス・微生物混合溶液をサンプルプレートの各ウェルに滴下し、乾燥させた。
(3) 続いて、各ウェル内のマトリックス・微生物混合溶液の上に添加剤溶液Ａ−１を１μＬ滴下したもの、添加剤溶液Ａ−２を１μＬ滴下したものを作製し、それぞれ乾燥させて、得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
＜５．結果＞ 
図１、図２、図３、図４Ａ、及び図４Ｂに、実施例１で得られたマススペクトルを示す。
図１及び図２の（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれマトリックス・添加剤混合溶液としてＳＡ−５、ＳＡ−３を用いた添加剤pre-mix法により調製した試料のマススペクトルである。図１及び図２の（Ｃ）は、いずれも、マトリックス添加剤溶液Ａ−１を用いた添加剤後載せ法により調製した試料のマススペクトルである。図１及び図２の（Ｄ）は、いずれも、添加剤なし法により調製した試料のマススペクトルである。図１には、質量電荷比m/z 7000〜20000の領域のマススペクトルが、図２には、質量電荷比m/z 20000〜40000の領域のマススペクトルが示されている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
＜４．３  添加剤なし法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物のコロニー数個分を、１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、ＳＡ−２／試料懸濁液を調製した。 
(2) 次に、サンプルプレート上に、マトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下した後、乾燥させ、その上に、ＳＡ−２／試料懸濁液を１．２μＬ滴下した。
(3) 各ウェル内のＳＡ−２／試料懸濁液を乾燥させた後、得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
＜４．３  添加剤なし法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物のコロニー数個分を、１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ−２に懸濁し、ＳＡ−２／微生物懸濁液を調製した。 
(2) 次に、サンプルプレート上に、マトリックス溶液ＳＡ−１を０．５μＬ滴下した後、乾燥させ、その上に、ＳＡ−２／微生物懸濁液を１．２μＬ滴下した。
(3) 各ウェル内のＳＡ−２／微生物懸濁液を乾燥させた後、得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
＜５．結果＞
図１０〜図１４に実施例３で得られたマススペクトルを示す。
図１０〜図１２の（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれマトリックス・添加剤混合溶液として、ＳＡ−５、ＳＡ−３を用いた添加剤pre-mix法により調製した試料のマススペクトルである。図１０〜図１２の（Ｃ）は、いずれも、添加剤溶液Ａ−１を用いた添加剤後載せ法により調製した試料のマススペクトルである。図１０〜図１２の（Ｄ）は、いずれも、添加剤なし法により調製した試料のマススペクトルである。
図１０は質量電荷比m/z 10000〜20000の領域のマススペクトルが、図１１には質量電荷比m/z 20000〜40000の領域のマススペクトルが、図１２には質量電荷比m/z 40000〜90000のマススペクトルが示されている。