(57)【要約】(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩を過硫酸化して極めて高度に硫酸化された(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩を製造する新規な方法、及びこれらの中間体を、凝固パラメ-タに対して基本的に活性をもたない、且つ化粧品又は医薬品分野で有用な新規なＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩に転換する方法を開示する。(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩を活性成分の１つとして含む医薬組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とするＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体及びその化学的又は薬剤上許容される塩を製造する方法。
（ａ）酸型(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩誘導体を、第３級又は第４級有機塩基で処理し、反応混合物を３０〜６０分間放置し、溶液のｐＨを約７に維持し、その塩を前記有機塩基で単離すること、
（ｂ）前記酸型(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩誘導体の前記有機塩基の塩を、Ｏ-過硫酸化条件で、Ｏ-硫酸化剤で処理すること、
（ｃ）生成された(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体を、(Ｃ2〜Ｃ4)カルボン酸の官能性誘導体で処理し、Ｎ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体を単離する。
【請求項２】
前記Ｎ-アシル-(エピ)Ｋ５-Ｎ,Ｏ-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体が、ナトリウム塩型で単離され、任意に他の化学的又は薬剤上許容される塩に転換される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）で、テトラブチルアンモニウムハイドロオキサイドを有機塩基として使用する請求項１及び２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）で、Ｏ-過硫酸化を、二糖類に対して利用できるＯＨに対して２〜４モルのＯ-硫酸化剤を使用して、ジメチルホルムアミド中で温度４０〜６０℃で１５〜２０時間実施する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
平均分子量が約1,000〜約25,000の出発物質(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩誘導体を使用する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記出発物質が４０〜６０％エピマー化されている請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記出発物質の平均分子量が約1,500〜約25,000である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記出発物質の平均分子量が約10,000〜約25,000である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記出発物質の平均分子量が約1,500〜約12,000である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記出発物質の平均分子量が約1,500〜約8,000である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
鎖混合体であって、その鎖の少なくとも９０％が式（Ｉ）を有する鎖混合体を含む(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体を出発物質として使用する請求項５に記載の方法。
【化１】
2005536577.tif 000030
ここで、グルクロン酸単位／イズロン酸単位比が100／０〜４０／６０、ｎが２〜100の整数、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるものである。
【請求項１２】
前記出発物質が、鎖混合体であって、その鎖の少なくとも９０％が式（Ｉ）を有し、ウロン酸単位が４０〜６０％のイズロン酸から成る請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記出発物質が、鎖混合体を有しているlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩で、その鎖の少なくとも９０％が式（Ｉ）を有し、ウロン酸単位が全てグルクロン酸、又は４０〜６０％イズロン酸で、ｎが３〜１５の整数、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるものである請求項１１の方法。
【請求項１４】
前記出発物質が、鎖混合体を有しているlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩で、その鎖の少なくとも９０％が式（I'）を有する請求項１１の方法。
【化２】
2005536577.tif 000031
ここで、ウロン酸単位が100％グルクロン酸又は６０〜４０％のグルクロン及び４０〜６０％のイズロン酸で、ｑが２〜２０の整数、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるものである。
【請求項１５】
前記出発物質が、鎖混合体を有しているlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩で、主要種が式（I'a）を有する請求項１１の方法。
【化３】
2005536577.tif 000032
ここで、ウロン酸単位が100％グルクロン酸又は６０〜４０％のグルクロン及び４０〜６０％のイズロン酸で、ｐが４〜８の整数である。
【請求項１６】
前記出発物質が、対応する(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩を亜硝酸解重合、次いで還元により得たlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩である請求項５〜１５のいずれか１項の方法。
【請求項１７】
前記出発物質lmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩が、前記鎖混合体の鎖の大部分の還元端部に、構造式（ａ）の２,５-無水マンノ単位を含んでいる請求項１６の方法。
【化４】
2005536577.tif 000033
ここで、Ｘはヒドロキシメチル基である。
【請求項１８】
鎖混合体の主要種が式（I'b）の化合物である鎖混合体を有するlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩を前記出発物質として使用する請求項１６又は１７の方法。
【化５】
2005536577.tif 000034
ここで、Ｘはヒドロキシメチル基、ｍは４、５又は６、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるイオン、ウロン酸単位が全てグルクロン酸、又はグルクロン及びイズロン酸単位が、グルクロン及びイズロン酸単位で出発して、交互に存在する。
【請求項１９】
前記出発物質(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩誘導体が、ナトリウム塩型で使用される請求項１〜１８のいずれか１項の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項の方法によるＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項２１】
アンモニウム(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム又は亜鉛のアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩の型で請求項２０のＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項２２】
イズロン酸含量が２０〜６０％、平均分子量が約2,000〜約45,000、硫酸化度が少なくとも３.４のＮ-アシル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体、又はその化学的又は薬剤上許容されるその塩。
【請求項２３】
平均分子量が約15,000と約45,000の間である請求項２２のＮ-アシル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項２４】
平均分子量が約4,500と約8,500の間である請求項２２のＮ-アシル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項２５】
硫酸化度が３.４〜３.８である請求項２２〜２４のいずれか１項のＮ-アシル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項２６】
鎖混合体であって、その鎖の少なくとも９０％が式（IV）を有するものである鎖混合体を有するＮ-アシル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【化６】
2005536577.tif 000035
ここで、ウロン酸単位が２０〜６０％のイズロン酸、ｎは２〜100の整数、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、硫酸化度は少なくとも３.４、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【請求項２７】
鎖混合体であって、その鎖の少なくとも９０％が式（IV）を有し、ウロン酸単位が４０〜６０％イズロン酸、ｎは３〜100の整数、平均分子量が約2,000〜約45,000、Ｒは少なくとも４０％SO3-、Ｒ'及びＲ''は両方ともSO3-、又はモノ硫酸塩グルクロン酸の場合、一方が水素、他方が５〜１０％SO3-、モノ硫酸塩イズロン酸の場合、１０〜１５％SO3-、対応するカチオンが、化学的又は薬剤上許容されるものである請求項２６のＮ-アシル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項２８】
Ｎ-アシル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体が、鎖混合体であって、その鎖の少なくとも９０％が式（IV'）を有するものである鎖混合体を有するするlmw-Ｎ-アシル-エピＫ５-Ｏ-過硫酸塩であることを特徴とする請求項２６又は２７のＮ-アシル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【化７】
2005536577.tif 000036
ここで、ｑは２〜２０の整数、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、硫酸化度は3.55〜４、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【請求項２９】
前記式（IV'）の鎖混合体において、ウロン酸単位が５０〜５５％イズロン酸、Ｒは少なくとも４０％SO3-、Ｒ'及びＲ''は、両方がSO3-、又はグルクロン酸の場合、一方が水素、他方が５〜１０％SO3-、ｑは３〜１５の整数、平均分子量が約4,5000〜約9,000、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものであることを特徴とする請求項２８のlmw-Ｎ-アシル-エピＫ５-Ｏ-過硫酸塩。
【請求項３０】
lmw-Ｎ-アシル-エピＫ５-Ｏ-過硫酸塩が、鎖混合体を含み、その主要種が式（IV'a）の化合物である請求項２８又は２９のlmw-Ｎ-アシル-エピＫ５-Ｏ-過硫酸塩。
【化８】
2005536577.tif 000037
ここで、ｐは４〜８の整数、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、硫酸化度は３.５〜４、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【請求項３１】
前記主要種が式（IV'b）の化合物である請求項３０のlmw-Ｎ-アシル-エピＫ５-Ｏ-過硫酸塩。
【化９】
2005536577.tif 000038
ここで、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、Ｘ''は、ＯＨ又はOSO3-、ｍは４、５又は６、硫酸化度は3.55〜４、ウロン酸単位は、グルクロン酸又はイズロン酸単位から出発して、交互に存在し、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【請求項３２】
置換基(Ｃ2〜Ｃ4)アシルが、アセチル、(２-カルボキシ)アセチル、(２-メトキシカルボニル)アセチル、(２-エトキシカルボニル)アセチル、プロピオニル、(３-カルボキシ)プロピオニル、Ｎ-(３-メメトキシカルボニル)プロピオニル、及び(３-エトキシカルボニル)プロピオニルから成る群から選択される請求項２２〜３１のいずれか１項のlmw-Ｎ-アシル-エピＫ５-Ｏ-過硫酸塩。
【請求項３３】
前記塩又は対応するカチオンが、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム又は亜鉛である請求項２２〜３１のいずれか１項のＮ-アシル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項３４】
鎖混合体であって、その鎖の少なくとも９０％が式（Ｖ）をもつものであるＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【化１０】
2005536577.tif 000039
ここで、ｎは２〜100の整数、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、硫酸化度は少なくとも２.２、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【請求項３５】
Ｎ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体が、鎖混合体であって、その鎖の少なくとも９０％が式（V'）をもつものであるlmw-Ｎ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩であることを特徴とするＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【化１１】
2005536577.tif 000040
ここで、ｑは２〜２０の整数、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、硫酸化度は２.２〜３、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【請求項３６】
lmw-Ｎ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩が、鎖混合体であって、その鎖の主要種が式（V'a）の化合物であることを特徴とするlmw-Ｎ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩。
【化１２】
2005536577.tif 000041
ここで、ｐは４〜８の整数、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、硫酸化度は２.２〜３、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【請求項３７】
前記主要種が式（V'b）の化合物であることを特徴とする請求項３６のlmw-Ｎ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩。
【化１３】
2005536577.tif 000042
ここで、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、Ｒ'、Ｒ''及びＲ'''は、水素又はSO3-、Ｘ''はＯＨ又はOSO3-、硫酸化度は２.２〜３、ｍは４、５又は６、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【請求項３８】
前記硫酸化度が２.３〜３である請求項３４〜３７のいずれか１項のＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項３９】
前記硫酸化度が２.５〜３である請求項３８のＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項４０】
前記硫酸化度が２.７〜２.９である請求項３９のＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項４１】
置換基(Ｃ2〜Ｃ4)アシルが、アセチルではない請求項３４〜４０のいずれか１項のＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項４２】
置換基(Ｃ2〜Ｃ4)アシルが、硫酸化度が２.７〜２.９のアセチルである請求項３４〜４０のいずれか１項のＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項４３】
硫酸化度が約２.８の請求項４２のＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項４４】
前記塩又は対応するカチオンが、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム又は亜鉛である請求項３４〜４３のいずれか１項のＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体。
【請求項４５】
請求項１の工程（ａ）及び（ｂ）の方法により製造され、ナトリウム塩の型で単離され、任意に他の薬剤上許容される塩に転換された(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体又はその化学的又は薬剤上許容される塩の１つを活性成分の１つとして含み、医薬品添加剤との混合物を含む医薬組成物。
【請求項４６】
前記活性成分が、平均分子量が約4,500〜約40,000の(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体である請求項４５の医薬組成物。
【請求項４７】
前記活性成分が(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体であって、鎖混合体であってその鎖の少なくとも９０％が式（II）を有するものである請求項４５又は４６の医薬組成物。
【化１４】
2005536577.tif 000043
ここで、ｎは２〜100の整数、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、Ｒ'、Ｒ''及びＲ'''は、水素又はSO3-、硫酸化度が２.２〜３の場合、，ウロン酸単位は、全てグルクロン酸、又は硫酸化度が３.４の場合、２０〜６０％のイズロン酸、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【請求項４８】
前記活性成分がlmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩であって、鎖混合体であって、その鎖の少なくとも９０％が式（II'）を有するものである請求項４７の医薬組成物。
【化１５】
2005536577.tif 000044
ここで、ｑは２〜２０の整数、Ｒ'、Ｒ''及びＲ'''は、水素又はSO3-、硫酸化度が3.55〜４の場合、ウロン酸単位は、２０〜６０％、好ましくは４０〜６０％イズロン酸である。
【請求項４９】
前記式（II'）の鎖混合体において、ウロン酸単位が４０〜６０％のイズロン酸で、Ｒが少なくとも４０％SO3-、Ｒ'及びＲ''は、両方ともSO3-、又はグルクロン酸の場合、一方が水素、他方が５〜１０％SO3-、イズロン酸の場合、１０〜１５％SO3-、平均分子量が、約4,000〜約8,000であることを特徴とする請求項４８の医薬組成物。
【請求項５０】
前記lmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩が、鎖混合体であって、その主要種が式（II'a）を有していることを特徴とする請求項４８又は４９の医薬組成物。
【化１６】
2005536577.tif 000045
ここで、ｐは４〜８の整数、Ｒ'、Ｒ''及びＲ'''は上記定義通り、硫酸化度が3.55〜４、対応するカチオンが薬剤上許容されるものである。
【請求項５１】
前記主要種が式（II'b）の化合物であることを特徴とする請求項５０の医薬組成物。
【化１７】
2005536577.tif 000046
ここで、Ｒ'、Ｒ''及びＲ'''は、水素又はSO3-、Ｘ''はＯＨ又はSO3-、ｍは４、５又は６、硫酸化度が3.55〜４の場合、ウロン酸単位は、４０〜６０％イズロン酸、グルクロン酸又はイズロン酸単位で出発して、イズロン酸単位は交互に存在し、対応するカチオンは、薬剤上許容されるイオンである。
【請求項５２】
鎖混合体であってその鎖の少なくとも９０％が式（III）をもつ鎖混合体を有するＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩を活性成分の１つとして含む医薬組成物。
【化１８】
2005536577.tif 000047
ここで、ｎは２〜100の整数、Ｒ'、Ｒ''及びＲ'''は、水素又はSO3-、硫酸化度は、少なくとも２.２、対応するカチオンは、薬剤上許容されるイオンである。
【請求項５３】
前記活性成分が、鎖混合体であってその鎖の少なくとも９０％が式（III'）を有する鎖混合体を有するlmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩である請求項５２の医薬組成物。
【化１９】
2005536577.tif 000048
ここで、ｑは２〜２０の整数、Ｒ'、Ｒ''及びＲ'''は、硫酸化度が２.２〜３の場合、水素又はSO3-である。
【請求項５４】
前記lmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩が、鎖混合体であってその主要種が式（III'a）を有する鎖混合体を有することを特徴とする請求項５３の医薬組成物。
【化２０】
2005536577.tif 000049
ここで、ｐは４〜８の整数、Ｒ'、Ｒ''及びＲ'''は、上記定義と同じ、硫酸化度が２.２〜３である。
【請求項５５】
前記主要種が式（III'b）の化合物であることを特徴とする請求項５０の医薬組成物。
【化２１】
2005536577.tif 000050
ここで、Ｒ'、Ｒ''及びＲ'''は、硫酸化度が２.２〜３の場合、水素又はSO3-、ｍは４、５又は６、対応するカチオンは薬剤上許容されるものである。
【請求項５６】
薬剤上許容される塩又はカチオンが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、又は亜鉛である請求項４５〜５５のいずれか１項の医薬組成物。
【請求項５７】
剤形が、局所投与用のクリ-ム、軟膏、リニメント剤、ジェル、フォーム、バルサム、膣ペッサリー、座薬、溶液又はサスペンションである請求項４５〜５６のいずれか１項の医薬組成物。
【請求項５８】
基本的にアセチル基を含まないlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩、又はその薬剤上許容される塩を活性成分の１つとして、医薬品添加剤との混合物で含む医薬組成物。
【請求項５９】
前記カチオンの塩が、化粧品添加剤との混合物として薬剤上許容されるのものである請求項１〜１０及び２５〜３７のいずれか１項の化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度に硫酸化されたＫ５多糖類の新規な誘導体、その製造方法、その合成に有用なく高度にＯ-硫酸化された中間体、およびＫ５多糖類の前記誘導体を、凝固活性がない活性成分として含む医薬組成物に関する。
【０００２】
特に、本発明は、予め-脱アセチル化し、Ｎ-硫酸化し、任意に解重合或いは任意に少なくとも２０％Ｃ５-エピマー化し、及び任意に解重合したＫ５多糖類から出発して、適当な条件下でＯ-過硫酸化し、さらに遊離アミンのＮ-アシル化によって製造されたＫ５多糖類の誘導体に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘパリン、硫酸ヘパラン、硫酸デルマタン、硫酸コンドロイチン、及びヒアルロン酸のようなグリコースアミノグルカンは、種々の動物組織から工業的に抽出される生体高分子である。
【０００４】
特に、主として豚腸管粘膜或いは牛肺臓から抽出して製造されるヘパリンは、ウロン酸（グルクロン酸又はイルドロン酸）を含む鎖の混合体、及びα-１→４又はβ-１→４結合により結合されたアミノ糖（グルコースアミン）の混合物により生成された分子量分布がが約3,000〜約30,000Ｄの多分散性コポリマーである。ヘパリンは、ウロン酸単位が、２位がＯ-硫酸化され、グルコースアミン単位が、存在するグルコースアミン単位の約０.５％がＮ-アセチル化又はＮ-硫酸化、６-Ｏ-硫酸化及び３-Ｏ-硫酸化されている。
【０００５】
哺乳動物におけるヘパリンの物性及び天然生合成は、Lindahl et al, 1986  Lane, D. 及びLindahl, U.（編集者）, "Heparin, Chemical and Biological Properties; Chemical Applications", Edward Arnold, London, Page 159-190, Lindahl, U, Feingold D. S. and Roden L, 1986 TIBS, 11 221-225 及びConrad H. E. "Heparin Binding Proteins", Chapter 2: Structure of Heparinoids, Academic Press, 1998に記載されている。ヘパリンの生合成は、グルクロニル-β-１→４-Ｎ-アセチルグルコースアミン二糖類繰り返し単位を含む鎖状混合体を含むＮ-アセチル-ヘパロサン前駆体から出発する。前記前駆体は酵素修飾を受けて、Ｎ-アセチル基を部分加水分解し、それをSO3-基で置換し、グルクロン酸単位の５位のカルボキシルをエピマー化し、グルクロン酸単位をイズロン酸単位に変換し、Ｏ-硫酸塩基を導入して生成物を得ている。さらに、生成物を一旦工業的に抽出すると、二糖類単位当たりのカルボキシ基に関して、ほぼ２倍の硫酸塩基を有している。これらの酵素修飾は、抗トロンビンIII（AT III）に対して五糖類部分結合、いわゆる活性五糖類を形成する。この活性五糖類は、AT IIIに対するヘパリンの高親和性結合に必要な構造であり、ヘパリン自体の抗凝固および抗トロンビン活性にとって必須である。五糖類は、ヘパリンを形成する幾つかの鎖の中にだけ存在していて、３位に硫酸化グルコースアミン単位と、イズロン酸を含む二糖類の間に間隔を空けたグルクロン酸を有している。
【０００６】
本来、活性五糖類の生成は、イズロン酸単位への、グルクロン酸単位の一部のカルボキシのエピマー化反応によって可能になる。このエピマー化反応は、グルクロニル-Ｃ５-エピメラ-ゼ（Ｃ５-エピマー化）、及びグルコースアミンの３位のヒドロキシに硫酸塩基を導入する適当な硫酸化によって実行される。特に、本来、活性五糖類の生成は、Ｃ５-エピマー化が、集合状態、即ち、鎖上で起こり、且つ、グルクロン酸単位より多くのイズロン酸単位を含む生成物を生成するという事実によって可能になる。事実、産業用ヘパリンは、イズロン酸単位が約７０％、グルクロン酸単位が３０％である。
【０００７】
抗凝固及び抗トロンビン活性以外に、へパリンは、脱コレステロール作用、抗増殖作用、抗ウイルス作用、抗ガン作用、及び抗腫瘍転移作用を示す。然しながら、抗凝固作用が出血の原因となる副作用のために、その医薬としての用法は限定されている。
【０００８】
European Journal of Biochemistry, 1981, 116, 359-364（"Vann 1981"）にVann W, F. et al.が記載した大腸菌から単離した莢膜多糖類は、繰り返し二糖類単位グルクロニル-β１→４-Ｎ-アセチルグルコースアミンの混合鎖を含んでいて、それ故下記（Ａ）に示した、ヘパリンのＮ-アセチル-ヘパロサン前駆体と同じ繰り返しシーケンスを示していることが知られている。
【化１】
2005536577.tif 000002
以下、莢膜Ｋ５多糖類を、「Ｋ５多糖類」又は単に「Ｋ５」という。Ｋ５多糖類は、米国特許5,50,116にLormeau等が記載したように、またCarbohydrate Research 1994, 263, 271-284にCasu等が記載したように、化学修飾されていた。特に、抗ガン作用、抗腫瘍転移作用、抗ウイルス作用を有するＫ５-Ｏ-硫酸塩は、EP 333243及びW098/34958に記載されている。さらに、Ｋ５は、化学修飾及び酵素修飾されて、動物組織から抽出されたヘパリン（抽出ヘパリン）と同じタイプの凝固に対して生体外生物活性をもつ生成物を生成する。
【０００９】
抽出ヘパリンと同じタイプの凝固に対して活性をもつ生成物の生成は、Ｄ-グルクロニルＣ５エピメラーゼによるＣ５-エピマー化の全工程を予測する方法により成される。
【００１０】
IT 1230785、WO92/17507、WO96/14425及びWO97/43317に記載されている方法が、Ｋ５を出発物質として使用している。発酵起源のＫ５が、Ｎ-脱アセチル化、次いでＮ-硫酸化される。このようにして生成されたＫ５-Ｎ-硫酸塩に対して、Ｃ５-エピメラーゼによるＣ５-エピマ-ーが、溶液中で行われ、マウスマストシトーマ（IT 1230785）或いはウシ肝臓（WO92/17507、、WO96/14425及びWO97/43317）からのミクロゾーム酵素の溶液のクロマトグラフィーによって生成されている。
【００１１】
ウシ肝臓起源のＤ-グルクロニルＣ５エピメラーゼが、Campbell, P. et. al., in I. Biol. Chem., 1994, 269/43, 26953-26958（"Campbell 1994"）により精製されていた。さらに、Campbell, P. et.al. は、その組成物をアミノ酸中に提供し、さらにそれを溶液中で使用してＫ５-Ｎ-硫酸塩を対応する３０％エピマー化生成物に転換することを記載し、HPLC法次いで全亜硝酸解重合による二糖類転換によるイズロン酸の生成を証明している。
【００１２】
文献WO98/48006は、DNA配列を記載している。当該DNA配列は、当該DNAを含む組み換え発現から得、次いでJ. Biol. Chem., 2001, 276, 20069-20077（"Jin-Ping 2001"）にJin-PingL. et.al. が記載したようにCampbell, P. et.al. により精製されたＤ-グルクロニルＣ５エピメラーゼ及び組み換えＤ-グルクロニルＣ５エピメラーゼをコード（遺伝暗号化）している。
【００１３】
Ｃ５-エピメラーゼの完全配列が、Crawford B.E. et al., in J. Biol. Chem., 2001, 276(24), 21538-21543（Crawford 2001）に記載されている。
【００１４】
文献WO01/72848は、Ｋ５多糖類のＮ-脱アセチル化誘導体の製造方法を記載している。このＫ５多糖類のＮ-脱アセチル化誘導体は、全ウロン酸に関して少なくとも４０％のイズロン酸がエピマー化されていて、分子量が2000〜30,000で、AT IIIに対して２５〜５０％の高親和性鎖を有し、HCII／抗Ｘａ比で表す抗凝固作用及び抗血栓作用が１.５〜４である。文献WO01/72848は、４０〜６０％エピマー化Ｋ５-Ｎ-硫酸塩の過硫酸化を記載していて、その13C-RMNを記載しているが、二糖類単位当たり２〜３.５の硫酸塩基を有していること示している。
【００１５】
前述した過硫酸を記載した条件で反復し、13C-RMN試験をすると、得られた生成物が、実際は遊離アミンで、６-Ｏ-硫酸塩含有量が８０〜９５％であり、アミノ糖への３-Ｏ-硫酸塩含有量が３０％であること、硫酸化度が３.２であることが確認され、さらにWO01/72848に記載された過硫酸条件下では、３.２以上の硫酸化度を得ることができないことが確認される。
【００１６】
特許出願MI 2001A/00397（WO02/068477）は、硫酸化度が３.２以上のＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸誘導体を記載している。これは、親油性物質又は分子量が約5,000の成分の１つを含まないＫ５を出発物質として、（ａ）Ｎ-脱アセチル化／Ｎ-硫酸化、（ｂ）Ｏ-過硫酸化、及び任意に（ｃ）Ｎ-再硫酸化によって製造されたものである。
【００１７】
上述した引用文献は、いずれも、４０〜５０％がエピマー化されていてもよく、NH2又はＮ-アセチル基が殆ど存在しないLMW-Ｋ４-Ｎ-硫酸塩を記載していない。
【００１８】
学術用語を統一して、その用法を理解し易くするために、本明細書では、単数又は複数形で通常の用語又は表現を使用する。
【００１９】
「Ｋ５」又は「Ｋ５多等類」は、発酵法によって得た大腸菌起源の莢膜多糖類、即ち、上述したように、（Ａ）非還元端部の２重結合を含んでいてもよい二糖類単位を含む鎖混合体を意味している。いずれの場合も、文献に記載された方法、特にVann 1981, Manzoni M. et.al., Journal of Bioactive Compatible Polymers, 1996, 11, 301-311（"Manzoni 19996"）による方法、又はWO01/72848及びWO02/068447に記載された方法によって製造され、精製される。以下に示すことが、Ｎ-アセチルヘパロサンに適用されることは当業者には明らかなことである。
【００２０】
「Ｃ５-エピメラーゼ」は、Ｄ-グルクロニルＣ-５エピメラーゼを意味する。いずれの場合も、特に、Campbell 1994、WO98/48006、Jin-Ping L. et al.、J. Biol Chem., 2001, 276,20069-20077（Jin-ping 2001"）又はCrawford 2001 が記載したようにして製造、単離、精製したものである。
【００２１】
「Ｋ５アミン」は、少なくとも９５％がＮ-脱アセチル化されたＫ５を意味し、通常、アセチル基の検出は、現在のNMR装置では不可能である。
【００２２】
「Ｋ５-Ｎ-硫酸塩」は、以下に説明するように、少なくとも９５％がＮ-脱アセチル化されたＮ-硫酸塩Ｋ５を意味し、通常、現在のNMR装置ではアセチル基の検出が不可能である。
【００２３】
「エピＫ５」は、Ｋ５及びその誘導体を意味し、グルクロン酸単位の２０〜６０％がイズロン酸単位へＣ５-エピマー化されている。
【００２４】
「エピＫ５-Ｎ-硫酸塩」は、Ｋ５-Ｎ-硫酸塩を意味し、グルクロン酸単位の２０〜６０％が、WO92/17507又はWO01/72848に記載されているタイプのイズロン酸単位へＣ５-エピマー化されている。
【００２５】
「エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩」は、硫酸化度が少なくとも３.４のＯ-硫酸化エピＫ５-アミンを意味する。
【００２６】
「Ｎ-アシル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩」は、硫酸化度が少なくとも３.４のＮ-アシル化エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩を意味する。
【００２７】
「Ｋ５-Ｏ-過硫酸塩」は、硫酸化度が少なくとも２.２のＯ-硫酸化Ｋ５-アミンを意味する。
【００２８】
「Ｎ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩」は、硫酸化度が少なくとも２.２のＮ-アシル化Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩を意味する。
【００２９】
上記で定義した従来の用語及び表現は、発酵後単離したＫ５で、通常、分子量分布が約1,500〜約50,000で、平均分子量が10,000〜25,000、好ましくは15,000〜25,000のものに関してである。
【００３０】
分子量に、上記で定義した従来の用語及び表現に関して特記する以外に、略語「lmw」（低分子量）を付記した場合、たとえばlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩、lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩は、平均分子量が12,000の低分子量生成物を意味する。
【００３１】
上記で定義した従来の用語及び表現の後に「誘導体」を付記すると、全体として、天然Ｋ５の誘導体及び低分子量の誘導体を意味する。
【００３２】
上記で定義した従来の用語及び表現の前に付記する接頭語「エピ」は、全体として、天然Ｋ５の誘導体、及び上記定義した２０〜６０％エピマー化物、即ち、全量がグルクロン酸、又はグルクロン酸と２０〜６０％のイズロン酸の鎖混合体で、各式において、シンボル
2005536577.tif 000003
で表される。
【００３３】
分子量に付記する用語「約」は、サンプルの分子量をHPLCで計算したサンプルを標準として使用して、Johnson et al., Carb. Res., 1976, 51, 119-127に従って、粘度計で測定した分子量を意味し、[（エピＫ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体）の場合、ナトリウムの量を含めて二糖類の±理論量で計算して酸461である]。
【００３４】
表現「主要種成分」は、lmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩、lmw-(エピ)Ｋ５-アミン-過硫酸塩、又はlmw-Ｎ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩から成る混合物の中で、最も代表的な化合物で、HPLCで測定した分子量のカーブのピークで決定される化合物である。
【００３５】
特記しない限り、「硫酸化度」は、SO3-／COO- 比を意味し、二糖類に対する硫酸塩基の数としても表され、Carbohydrate Research, 1975, 39, 168-176（Casu 1975）でCasu B. et al. が記載した電導度測定法、WO01/72848で利用している電導度測定法で測定される。
【００３６】
「Ｏ-過硫酸化」は、Carbohydrate Research, 1994, 263, 271-284（Casu 1994）でCasu B.et al. が記載した方法Ｃにより実施される過剰のＯ-硫酸化を意味する。
【００３７】
用語「アルキル基」は、線状或いは有枝鎖アルキルで、「テトラブチルアンモニウム」は、テトラ-ｎ-ブチルアンモニウムである。
【００３８】
エピＫ５-Ｎ-硫酸塩を出発物質とし、前記エピＫ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体の第３級又は第４級有機塩基もつ塩でｐＨを約７に維持しながら、反応混合物を３０〜６０分放置して、前記エピＫ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体の第３級又は第４級有機塩基もつ塩を製造し、次いで製造された塩をＯ-過硫酸化条件下でＯ-硫酸化剤で処理することにより、たとえばWO01/72848に記載されているエピＫ５-アミン-Ｏ-硫酸塩のどれよりも硫酸化度が大きなエピＫ５-アミン-Ｏ-硫酸塩を製造することができることが分かった。さらに、lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩を、同じ塩化及びＯ-過硫酸化すると、硫酸化度が極めて大きなlmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-硫酸塩が製造される。このようなエピＫ５-アミン-過硫酸塩誘導体の場合、その硫酸化度は３.２以上である。
【００３９】
同じように、上述したＯ-過硫酸化条件をlmw-Ｋ５-Ｏ-硫酸塩に適用すると、硫酸化度が高いlmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-硫酸塩が製造されることが分かった。また、Ｋ５-Ｎ-硫酸塩を、同じ塩化及びＯ-過硫酸化すると、硫酸化度が大きなＫ５-アミン-Ｏ-硫酸塩が製造される。このようなＫ５-アミン-過硫酸塩誘導体の場合、その硫酸化度は２.２以上である
【００４０】
事実、前述した条件で、(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体のテトラブチルアンモニウム塩を製造すると、塩化が完遂され、後続のＯ-過硫酸化の間、硫酸塩基が、グルコースアミンの２位の窒素原子からグルコースアミン自体の酸素原子、特に、３位の酸素原子に全て移動し、NH2基が完全に無い硫酸化度が高い(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-硫酸塩誘導体になる。誘導体エピＫ５及びＫ５の硫酸化度の定量的な違いは、エピマー化誘導体の硫酸化に有利なそれらの構造に依存している。
【００４１】
このようにして製造した(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩をＮ-アセチル化すると、新規なＮ-アセチル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-硫酸塩-誘導体が製造されること、そしてこの誘導体は、凝固作用が無く、医薬又は化粧品組成物の製造に有用であることが分かった。この新規で汎用性のある方法により、再現性のある方法で、硫酸化度が正確なエピＫ５-Ｏ-硫酸塩-誘導体、それらのＮ-アシル類似物、Ｋ５-Ｏ-硫酸塩誘導体が製造されること、中でも、その低分子量誘導体とそれらのＮ-アシル-類似物が製造されることが分かった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４２】
本発明は、Ｎ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体の製造方法を提供する。本発明が提供するＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体の製造方法は、下記に工程を特徴とする。
（ａ）酸型(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩誘導体を、第３級又は第４級有機塩基で処理し、反応混合物を３０〜６０分間放置し、溶液のｐＨを約７に維持し、その塩を前記有機塩基で単離すること、
（ｂ）前記酸型(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体の前記有機塩基の塩を、Ｏ-過硫酸化条件で、Ｏ-硫酸化剤で処理すること、
（ｃ）生成された(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体を、(Ｃ2〜Ｃ4)カルボン酸の官能性誘導体で処理し、Ｎ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体を単離する。
【００４３】
通常、Ｎ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体は、ナトリウム塩型として単離され、このナトリウム塩は、化学的又は薬剤上許容される塩に変換してもよい。
【００４４】
本明細書では、用語「化学的又は薬剤上許容される」は、化学合成上又は生成物の精製に有用なカチオン、たとえばナトリウム、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウムを言う。「薬剤上許容される」は自明である。
【００４５】
有用なカチオンは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム、及び亜鉛から誘導される。好ましいカチオンは、ナトリウム、カルシウム、及びテトラブチルアンモニウムイオンである。
【００４６】
有利な方法として、予めＮ-アセチル化、Ｎ-硫酸化、好ましくは100％、任意に２０〜６０％Ｃ５-エピマー化され、且つ任意に亜硝酸で解重合され、平均分子量が約1,000〜約25,000、有利には約1,500〜約25,000の(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩誘導体、即ち、Ｋ５多糖類の溶液を、酸イオン交換樹脂、たとえばタイプIR 120H+を通過させ、溶出液を採取し、樹脂を水洗浄し、溶出液を第３級又は第４級有機塩基、好ましくは水酸化第４級アンモニウム塩の水溶液で中和して工程（ａ）を実施する。この溶液を１時間放置し、第３級又は第４級有機塩基、好ましくは水酸化第４級ブチルアンモニウム塩の水溶液を添加してｐＨを約７に維持し、（即ち、中性に維持するように試み）、生成された塩を凍結乾燥により回収する。
【００４７】
工程（ｂ）において、Ｏ-硫酸化は、過剰量のＯ-硫酸化剤を使用して中性極性溶媒中で、２０〜７０℃の温度で２４時間までの時間作用させると起こる。
【００４８】
有利な方法として、工程（ａ）で単離された、予めＮ-アセチル化、Ｎ-硫酸化、好ましくは100％、任意に２０〜６０％Ｃ５-エピマー化され、且つ任意に亜硝酸で解重合され、平均分子量が約1,000〜約25,000、有利には約1,500〜約25,000の(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体、即ち、Ｋ５多糖類の第３級又は第４級有機塩基をジメチルホルムアミドに溶解し、遊離ヒドロキシ毎に２〜１０モルのＯ-硫酸化剤で温度４０〜６０℃で１０〜２０時間処理する。Ｏ-硫酸化剤として、ピリジンＳ０3付加物を、二糖類に対して遊離ヒドロキシ当たり２.５〜５モル、好ましくは２.５〜４モル使用する。反応終了直後に生成される生成物を、０.１〜１モルの水を添加し、好ましくは水酸化ナトリウムて中和し、飽和塩化ナトリウム溶液でアセトン中に沈殿させ、濾過し、できれば遠心分離して単離する。
【００４９】
このようにして製造された生成物は、通常、上述したグルクロン酸イズロン含有量を有する(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体の塩の溶液である。過硫酸化反応を、第３級又は第４級塩基、好ましくは平均分子量が約1,000〜約25,000、有利には約1,500〜約25,000でイズロン酸が、全ウロン酸の２０〜６０％のエピＫ５-Ｎ-硫酸塩誘導体のテトラブチルアンモニウム塩に対して実行すると、平均分子量が約3,500〜約40,000、有利には約4,500〜約40,000で、硫酸化度が少なくとも３.４、有利には少なくとも３.５、一層有利には3.55〜４、好ましくは3.55〜３.８のエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体が製造される。
【００５０】
過硫酸化反応を、第３級又は第４級塩基、好ましくは平均分子量が約1,500〜約25,000のＫ５-Ｎ-硫酸塩誘導体に対して実行すると、平均分子量が約3,500〜約40,000、有利には約4,500〜約40,000で、硫酸化度が少なくとも２.２、有利には２.２〜３又は２.３〜３、より好ましくは２.５〜３、好ましくは２.７〜２.９のＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体が製造される。好ましくは、このようにして製造された生成物は、lmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩起源であり、且つ好ましくは、硫酸化度が２.３〜３のlmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸されたナトリウム塩である。かかる生成物の平均分子量は、約3,500〜約11,000とすることができる。
【００５１】
このようにして製造されたナトリウム塩は、他の塩に変換することができる。たとえば、限外濾過膜によりカルシウムイオン交換ができる。
【００５２】
工程（ｃ）では、過剰に硫酸化された(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体は、文献記載の公知の方法によりＮ-アセチル化される。
【００５３】
Ｎ-アセチル化は、工程（ｂ）起源の(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体を、２〜４個の炭素原子を含むモノカルボン酸又はジカルボン酸の官能性誘導体と、塩酸溶液中で約４℃の温度で反応させて実行する。前記(Ｃ2〜Ｃ4)カルボンの官能性誘導体として、好ましくは酢酸、プロピオン酸、マロン酸、又はコハク酸、又はモノエステル、特に後者のメチル又はエチルエステル、無水物、塩化物、活性エステルの混合無水物を使用することができる。製造された生成物、即ち、Ｎ-(Ｃ2〜Ｃ4)アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体を、塩基、好ましくは、水酸化ナトリウムで中和し、次いで限外濾過及び飽和塩化ナトリウム溶液でのアセトン中への沈殿により単離される。Ｎ-アセチル化工程を反復して、全置換又は９５％以上置換してもよい。このようにして製造したＮ-アシル-(エピ)-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩は、特に、Ｎ-アセチル-、Ｎ-(２-カルボキシ)アセチル-、Ｎ-(２-メトキシカルボニル)アセチル-、Ｎ-(２-エトキシカルボニル)アセチル-、Ｎ-プロピオニル-、Ｎ-(３-カルボキシ)プロピオニル-、Ｎ-(３-メトキシカルボニル)プロピオニル-、Ｎ-(３-エトキシカルボニル)プロピオニル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩である。
【００５４】
このようにして製造されたＮ-アシル-(エピ)-Ｋ５-Ｏ-過硫酸塩誘導体は、通常、そのナトリウム塩である。前記ナトリウム塩は、他の化学的又は薬剤上許容される塩に転換することができる。特に有利な塩は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム、及び亜鉛の塩である。ナトリウム、カルシウム、及びテトラブチルアンモニウムが好ましい。
【００５５】
硫酸化度が０.５〜４のＫ５-Ｏ-硫酸塩（此処で使用する用語「Ｎ-アセチル-Ｋ５-アミン-Ｏ-硫酸塩」に従った）を製造するために、Ｋ５ナトリウム塩を不均質相で硫酸化し、且つ制御し難い方法で低分子量の誘導体を製造するのに、クロロスルホン酸を使用しなけらばならないWO98/34958に記載されている方法と異なり、本発明の方法は、極めて汎用性に富んでいる。事実、本発明の方法は、あらゆるタイプのＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩を容易に制御できる反応で高収率で製造することができる。特に、本発明の方法は、天然のＫ５に存在するアセチルとは異なるアシルをもつエピマー化Ｃ-５-誘導体、Ｎ-アシル化誘導体、及び低分子量の誘導体の様なＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩を製造するが、そうでない方法では製造されない。さらに、WO98/34958に記載されている方法と異なり、本発明の方法は、lmw-Ｋ５-Ｏ-硫酸化を制御可能な方法で実行して、平均分子量を所望のものとし、中でも硫酸化度を２.３〜３の範囲、通常２.７〜２.９の範囲にすることができる。最後に、本発明全ての生成物、特に遊離中間体アミンとＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩は、医薬又は化粧剤組成物製造の活性剤として有用である。
【００５６】
工程（ａ）の出発物質は、文献公知の(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩誘導体、或いはそれらの成分、又は対応する(エピ)Ｋ５-硫酸塩の亜硝酸解重合により製造されたlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩である。
【００５７】
出発物質(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体の平均分子量は、約1,000〜約25,000、有利には約1,500〜約25,000である。好ましくは、出発物質としては、平均分子量が10,000〜25,000の範囲の(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体、又は平均分子量が約1,500〜約8,000、好ましくは約1,500〜約7,500の間のlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩である。
【００５８】
Ｋ５の成分のＮ-脱アセチル化、Ｎ-硫酸化、及びＣ５-エピマー化によって製造されたイズロン酸単位含量が約２０％で、平均分子量が5,000のlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩は、WO92/17507に記載されているが、この生成物は、高パーセンテージのアセチル基を含んでいる。
【００５９】
出発物質として特に有用なエピＫ５-Ｎ-硫酸塩は、特に純粋Ｋ５から製造したアセチル基を含まないＫ５-Ｎ-硫酸塩のエピマー化によって製造したもので、特に新油性物質を含まないもので、WO02/068477に記載されている。
【００６０】
イズロン酸を高含量、特に４０〜６０％、好ましくは５０〜５５％含む低分子量Ｃ５-エピマー化Ｋ５-Ｎ-硫酸塩が、本発明のＮ-置換エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸化誘導体を製造するための特に有利で新規な生成物である。
【００６１】
lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩は、好ましくは平均分子量が4,000以上の場合の対応するlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩のＣ５-エピマー化によって製造することができる。実質的にアセチル基を含まないlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩は、アセチル基を含まないＫ５-Ｎ-硫酸塩の分別又は好ましくは解重合によって製造される新規な生成物である。Ｋ５-Ｎ-硫酸塩は文献公知であり、当業界の状況を説明するために本明細書に引用した文献に記載されている。前述した出発物質は、Ｋ５のＮ-脱アセチル化、次いで生成されたＫ５-アミンのＮ-硫酸化により必ず製造される。然しながら、原料としてのＫ５が特に純粋で、特に親油性物質を含まない場合、アセチル又はNH2基を含まないＫ５-Ｎ-硫酸塩の製造は助長されることが確認される。従って、本発明により、WO02/068477に記載されたように精製されたＫ５から製造したＫ５-Ｎ-硫酸塩を出発物質として使用することが好ましい。13C-RMNスペクトルがトレース量のＮ-アセチル又はNH2基を示さないＫ５-Ｎ-硫酸塩もWO02/068477に記載されている。
【００６２】
上述したように、新規なlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩は、Ｋ５-Ｎ-硫酸塩に、下記のいずれかの工程を、いずれかの順序で課すことを特徴とする方法によって製造される。
（ｉ）カルシウム、マグネシウム、バリウム、及びマンガンから選択された少なくとも１個の２価イオンの存在、１２〜２４時間、約３０℃でｐＨ約７で、単離され、精製され、且つ溶液状態又は固体支持体に固定されるＤ-グルクロニルＣ５-エピメラーゼによるＣ５-エピマー化、又は
（ii）亜硝酸解重合、次いで、任意に、通常水素化ホウ素ナトリムによる還元。
【００６３】
表現「いずれかの順序」は、工程を、（ｉ）→（ii）の方向、又は（ii）→（ｉ）の方向の両方で実施することができることを意味し、先ずＫ５-Ｎ-硫酸塩を亜硝酸解重合反応させ、次いで任意に水素化ホウ素ナトリウムによる還元をし、次いで前述した条件下でＣ５-エピマー化する。
【００６４】
好ましい順序は、（ｉ）→（ii）の方向である。方向（ii）→（ｉ）は、好ましくは、平均分子量が4,000以上のlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩で出発する場合、好ましくは平均分子量が約6,000のlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩で出発する場合に使用される。たとえば、１ｇのエピＫ５-Ｎ-硫酸塩で出発する場合、分子量が4,000以上、特に少なくとも6,000のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩を得ることができる亜硝酸ナトリウムの量を決定して、lmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸塩を製造するための中間体を製造することができる。事実、この場合、工程（ii）で、最適のエピマー化率を得ることができる。
【００６５】
本発明の好ましい態様により、Ｃ５-エピメラーゼが不活性担体に固定される。
【００６６】
たとえばCampbell 1994、 WO98/48006、 Jin-Ping 2001又はCrawford 2001に従って組み換えられ、単離され、精製されたＣ５-エピメラーゼが、基質の存在下、即ち、下平均分子量が4,000以上、好ましく少なくとも6,000の出発物質Ｋ５-Ｎ-硫酸塩誘導体又はlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩の存在下で、担体に固定される。この固定は、通常の方法、たとえばWO01/72848に記載されている方法により実行される。
【００６７】
Ｃ５-エピメラーゼ反応は、0.001〜１０ｇの基質（好ましくは分子量が4,000以上、特に少なくとも6,000のＫ５-Ｎ-硫酸塩又はlmw-Ｋ５-硫酸塩）、及びカルシウム、マンガン、バリウム及マグネシウムから選択された濃度が１０〜６０mMのカチオンを含みｐＨが約７のHEPESの２５mM溶液２０〜1,000mlを、１.２×１０7〜３×１０11cpmの固定酵素を含むカラム中を、ｐＨを約７に維持しながら、約３０℃で流速３０〜200ml/hで、１２〜２４時間、好ましくは１５〜２４時間再循環させることにより実行される。
【００６８】
好ましくは、前記溶液を、約200ml/hの流速でオーバーナイト（１５〜２０時間）再循環させる。得た生成物を、従来の方法、たとえば限外濾過及びエタノールでの精製により精製、単離する。得た生成物は、エピＫ５-Ｎ-硫酸塩（生成物が水に溶解され、解重合させた場合）か、又はlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩（生成物が最終生成物でる場合）を含んでいる。エピマー化率、実際にはグルクロン酸単位と見なしたイズロン酸単位の量は、WO96/4425に記載された方法により1H-RMNで計算する。
【００６９】
亜硝酸解重合反応は、たとえば、EP 37319及びWO82/03627に記載された方法に従って、或いはEP 544592に記載されたＫ５-Ｎ-硫酸塩の解重合による方法に従って、ただし０〜１０％未満、好ましくは５％未満のアセチル基を含むＫ５-Ｎ-硫酸塩又はエピＫ５-Ｎ-硫酸塩を出発物質として、ヘパリンの解重合による従来の方法で実行する。好ましくは、ほとんどアセチル基を含まないエピＫ５-Ｎ-硫酸塩に対して亜硝酸ナトリウム及び塩酸で実施された解重合に次いで、水素化ホウナトリウムによる現場還元を行う。
【００７０】
実際には、エピＫ５-Ｎ-硫酸塩の冷水溶液を、塩酸で酸ｐＨ（約２）にし、冷水溶液のまま、温度を約４℃に、ｐＨを約２に一定に維持しながら、亜硝酸ナトリウムで処理し、解重合が終了したら（約１５〜３０分）、水酸化ナトリウムで溶液を中和し、約４℃のまま、水素化ホウ素ナトリウムの水溶液で処理する。
【００７１】
還元が終了したら（約４時間）直ちに、過剰量の水素化ホウ素ナトリウムを、塩酸で破壊し、溶液を水酸化ナトリウムで中和し、従来の方法、たとえばエタノール又はアセトンによる完全沈殿により、解重合（及び還元）された生成物を単離する。
【００７２】
解重合が終了して生成される生成物は、特に、平均分子量が4,000以上、好ましくは少なくとも6,000以上の場合、或いは抗脈管形成作用及び抗ウイルス作用をもつlmw-Ｋ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸塩を製造するために使用する場合は、lmw-エピ-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩（最終生成物から成る場合）か、lmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩（単離後、又は予め単離せずに溶液状態で上述したように直接Ｃ５-エピマー化を行う場合）である。解重合反応を適切に制御することにより、特に種々の量の亜硝酸ナトリウム／塩酸を使用して解重合反応を適切に制御することにより、２,５-無水マニトールのＣ２に起因する信号の積分による13C-RMNスペクトルを、多糖類鎖内部のグルコースアミンのアノマー炭素のそれで計算した平均分子量が約1,500〜約12,000、有利には約1,500〜約10,000、好ましくは約1,500〜約7,500のlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩又はlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩が製造される。
【００７３】
たとえば、１ｇのＫ５-Ｎ-硫酸塩又はエピＫ５-Ｎ-硫酸塩から出発する一般的な方法によれば、出発生成物を100〜200mlの脱イオン水に溶解し、４℃の温度設定する。次いで、所定量の亜硝酸ナトリウムを添加して、所望の分子量、たとえば約2,000〜約4,000を得る。従って、BioRad BioSil 250カラムを具備したHPLC法で、分子量が既知のヘパリン標準物質を使用して測定した分子量が20,000のエピＫ５-Ｎ-硫酸塩から出発すると、０.２％の水溶液に溶解した330〜480mgの亜硝酸ナトリウムを添加する必要がる。エピＫ５-Ｎ-硫酸塩及び亜硝酸ナトリウムを含み４℃に維持した溶液に、４℃に冷やした０.１Ｎ HClを添加してｐＨを２にする。２０〜４０分間ゆっくりと攪拌して反応させ、次いで０.１Ｎ NaOHで中和する。得た生成物を室温にし、水素化ホウ素ナトリウム（５０〜100mlの水に250〜500mgを溶解したもの）のような還元剤で処理し、４〜８時間反応させる。０.１Ｎ HClを添加してｐＨを５〜５.５にし、過剰量の水素化ホウ素ナトリウムを除去し、さらに２〜４時間放置する。最後に、０.１Ｎ NaOHで中和し、減圧下で蒸留して濃縮した後、アセトン又はエタノールで沈殿して生成物を回収する。
【００７４】
同様に、１ｇのＫ５-Ｎ-硫酸塩又はエピＫ５-Ｎ-硫酸塩から出発した場合、平均分子量が約4,000〜約12,000、好ましくは約4,000〜約7,500，特に6,000〜7,500のlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩又はlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩を生成する亜硝酸ナトリウムの量を定量することができる。
【００７５】
このようにして製造したlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩は、イズロン酸含量が２０〜６０％、好ましくは５０〜５５％で、NH2及びＮ-アセチル基を含まず、平均分子量が約1,500〜約12,000、有利には約1,500〜約10,000、好ましくは約1,500〜約7,500で、それらの化学的又は薬剤上許容される塩が、特に重要なlmw-エピＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸を製造するための出発物質として有用な新規生成物を含んでいて、それ自体が医薬又は化粧品組成物の活性成分として有用で、本発明を構成する。
【００７６】
有利なことに、本発明のＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体を製造する出発物質は鎖混合体を含んでいて、その鎖混合体の少なくとも９０％が式（Ｉ）の酸鎖を有するものである(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体である。
【化２】
2005536577.tif 000004
ここで、グルクロン酸単位／イズロン酸単位比は100／０〜４０／６０、ｎは２〜100、好ましくは３〜100の整数、対応するカチオンは、化学的又は薬剤上許容されるものである。
【００７７】
特に、前記出発物質(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体は鎖混合体を含んでいて、その鎖混合体の少なくとも９０％が式（Ｉ）の酸鎖を有し、グルクロン酸単位含量が100〜４０％、好ましくはグルクロン酸含量が100％又は８０〜４０％、イズロン酸含量が２０〜６０％、ｎは２〜100、好ましくは３〜100の整数、対応するカチオンが化学的に許容されるものである。好ましくは、グルクロン酸含量が100％、又はウロン酸４０〜６０％の全量以外がグルクロン酸で、６０〜４０％がイズロン酸である。
【００７８】
好ましい出発物質はlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩で、鎖混合体を含んでいて、その鎖混合体の少なくとも９０％が式（Ｉ）の酸鎖を有し、ウロン酸単位が全てグルクロン酸から成り、又は４０〜６０％、好ましくは５０〜５５％のイズロン酸から成り、ｎが２〜２０、好ましくは３〜１５の整数、対応するカチオンが化学的に許容されるものである。Ｋ５-Ｎ-硫酸塩のＣ５-エピマー化によリ製造されたエピＫ５-Ｎ-硫酸塩は周知であり、広く文献に記載されている。Ｄ-グルクロニルＣ５エピメラーゼでＫ５-Ｎ-硫酸塩のグルクロニル単位をＣ５-エピマー化する製造は、当業界の状況を説明するために本明細書で引用した文献、たとえばWO92/17507、 WO98/14425、WO97/43317、 WO01/72848及びUS 2002/0062019に記載されている。然しながら、エピマー化による好ましい製造方法によれば、親油性物質を含まないＫ５起源のＫ５-硫酸塩を、WO02/068477に記載されたように使用され、Ｃ５エピマー化が、単離されたＤ-グルクロニルＣ５エピメラーゼで実施され、精製され、上述したようにカルシウム、マグネシウム、バリウム、及びマンガンから選択された少なくとも１個の２価イオンの存在下、ｐＨが約７，温度約３０℃、１２〜２４時間で固体担体に固定される。さらに、Ｋ５-Ｎ-硫酸塩が、上記に示してある。
【００７９】
低分子量の完全にＮ-硫酸化された(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩、特にウロン酸単位が全てグルクロン酸にあり、且つイズロン酸単位が４０〜６０％、好ましくは５０〜５５％の低分子量の完全にＮ-硫酸化された(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩が、特に有利な新規生成物で、本発明によるＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体を製造する出発物質として使用される。この出発物質は、全ウロン酸に関しイズロン酸含量が４０〜６０％で、平均分子量が約1,500〜約12,000、有利には約1,500〜約8,000、好ましくは約1,500〜約7,500であるlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩、及びその化学的又は薬剤上許容される塩である。その分布は、約1,000〜約10,000の範囲である。
【００８０】
前記lmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩は、好ましくは、鎖混合体で、その鎖の少なくとも９０％が式（I'）を有している。
【化３】
2005536577.tif 000005
ここで、ウロン酸単位は、100％グルクロン酸又は６０〜４０％グルクロン酸及び４０〜６０％のイズロン酸から成り、ｑは２〜２０の整数、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【００８１】
本明細書では、「化学的」とは、ナトリウム、アンモニウム、(Ｃ2〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウムのように化学合成に有用なカチオン、又は生成物の精製に有用なカチオンに対して使用する。
【００８２】
有利なカチオンは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム、及び亜鉛から誘導されるものである。好ましいカチオンは、ナトリウム、カルシウム、及びテトラブチルアンモニウムイオンである。
【００８３】
好ましい出発物質は、鎖混合体を含み、その主成分が式（I'a）を有するものである新規なlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩である。
【化４】
2005536577.tif 000006
ここで、ウロン酸単位は、100％グルクロン酸又は６０〜４０％グルクロン酸及び４０〜６０％のイズロン酸から成り、ｐは４〜８の整数である。これらの生成物の平均分子量は、約2,000〜約4,000、対応するカチオンは、化学的又は薬剤上許容されるものである。
【００８４】
特に、新規なlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩は、上記の対応する(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩を亜硝酸解重合し、次いで、たとえば水素化ホウ素ナトリウムで還元して得た有用な出発物質で、鎖混合体を含み、その鎖の少なくとも９０％が上記式（I'）を有している。
【００８５】
亜硝酸解重合工程からこれら(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩の生成は、前記鎖混合体の大部分の鎖の還元端部への、２,５-無水マンノース単位の導入、或いはたとえば水素化ホウ素ナトリウムによる還元の場合、構造式（ａ）の２,５-無水マニトールの導入を含む。
【化５】
2005536577.tif 000007
ここで、Ｘは、ホルミル基又はヒドロキシメチル基を表す。
【００８６】
したがって、鎖の大部分（６０〜７０％）の還元端部は、実際には構造式（ｂ）で表される。
【化６】
2005536577.tif 000008
ここで、Ｘは、ホルミル基又はヒドロキシメチル基を表す。
【００８７】
構造（ａ）の存在は、(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩及びその誘導体の化学特性に対して何ら影響を与えない。その理由は、硫酸化により、１又は２個の硫酸塩基が導入されるが、この硫酸塩は、Ｏ-硫酸化誘導体の硫酸化度を著しくは変化させないからである。その上、構造（ａ）の存在は、生成物の生物活性に対して影響を与えない。このことは、Thrombosis Research, 1987, 45, 739-749  (φstergaard 1987)でφstergaard P.B. et al. が低分子量ヘパリンに対して立証している。
【００８８】
特に好ましい本発明のlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩は鎖混合体を有し、その主要化学種は式（I'b）の化合物である。
【化７】
2005536577.tif 000009
ここで、Ｘは、ホルミル基又はヒドロキシメチル基、ｍは４、５又は６、対応するカチオンは、化学的又は薬剤上許容されるイオン、ウロン酸単位は、全てがグルクロン酸、又はグルクロン酸単位が、グルクロン酸又はイズロン酸単位から始まって、交互に存在している。このような場合、グルクロン／イズロン比は、４５／５５〜５５／４５、即ち、５０／５０である。
【００８９】
上記の全lmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩は新規な生成物で、本発明の別の目的である。
【００９０】
lmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩、即ち上述したlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩、及びたとえばWO92/17507に記載された非類似のエピＫ５-Ｎ-硫酸塩及び本発明のlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩は、Ｎ-アシル基を含まないので、抗凝固作用を有していないで、遊離ラジカルに抗する重要な作用を有している。
【００９１】
その低毒性のお陰で、新規なlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩及びlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩は、虚血性心臓病の治療、及び放射線皮膚炎の治療の補助薬として有用な医薬組成物、或いは皮膚の抗老化剤として有用な化粧品組成物を製造するための活性成分となる。
【００９２】
上述したlmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩を、Ｏ-過硫酸化反応の出発物質として使用する場合、上記の亜硝酸解重合による製造で、前記解重合の次ぎに、たとえば水素化ホウ素ナトリウムによる還元を行って、末端単位（ａ）のＸがヒドロキシメチルを特徴とするlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩を製造することが好ましい。この理由は、本発明の方法により、前記lmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩に、硫酸化反応とアシル化を課すと、構造（ａ）（ここでＸはホルミル基を表す）の２,５-無水マンノースラジカルのホルミル基に対する影響が未知だからである。
【００９３】
塩が上述した工程（ａ）による方法で第３級又は第４級有機塩基、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩と一緒に利用されていない場合は、前記出発物質を、好ましくは、ナトリウム塩の形で使用する。
【００９４】
本発明に従って、好ましくは100％Ｎ-硫酸化された出発物質(エピ)-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩誘導体を、前述した工程（ａ）及び（ｂ）に付し、それが終了すると直ちに、アミンが置換されていないで、通常ナトリウム塩の形の対応する新規な(エピ)-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体を単離する。この(エピ)-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体は、他の化学的又は薬剤上許容される塩に変換することができる。
【００９５】
従って、本発明の別の特徴により、本発明は、下記を特徴とする方法で製造される新規な(エピ)-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体及びその化学的又は薬剤上許容される塩に関する。
（ａ）酸型の(エピ)-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体を、第３級又は第４級有機塩基で処理し、反応混合物を３０〜６０分間放置し、その溶液のｐＨを、前記第３級又は第４級有機塩基を添加して約７に維持し、その塩を有機塩基で単離する：
（ｂ）前記(エピ)-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体の有機塩基の前記塩を、Ｏ-過硫酸化条件下でＯ-硫酸化剤で処理し、(エピ)-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体を単離する。
【００９６】
このようにして製造した誘導体は、通常、平均分子量が約4,500〜約40,000で、ナトリウム塩の形で単離された(エピ)-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体で、他の化学的又は薬剤上許容される塩に転換される。特に有利な塩は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニム、アルミニウム、及び亜鉛の塩であり、中でも、ナトリウム、カルシウム、及びテトラブチルアンモニウムの塩が好ましい。
【００９７】
既に前述したように、上述した(エピ)-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体の硫酸化度は、出発物質(エピ)-Ｋ５-Ｎ-過硫酸塩誘導体の構造に依存している。この理由は、ウロン酸単位がグルクロン酸だけから構成されているＫ５-Ｎ-硫酸塩誘導体の二糖類鎖の容量が、特にエピ-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩誘導体のエピマー化度が、グルクロン酸４０〜６０％、及びイズロン酸６０〜４０％の場合、エピ-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩誘導体により起こる過硫酸化より少ない過硫酸化を起こさせるからである。
【００９８】
事実、Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体を、前述した工程（ａ）及び（ｂ）に付すと、硫酸化度が２.２〜３、有利には２.５〜３、好ましくは２.７〜２.９のＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体が製造される。
【００９９】
エピＫ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体を、イズロン酸含量が全ウロン酸の２０〜６０％、好ましくは４０〜６０％である前述した工程（ａ）及び（ｂ）に付すと、硫酸化度が、少なくとも３.４、有利に少なくとも３.５、より有利には3.55〜４、好ましくは3.55〜３.８のエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体が製造される。
【０１００】
これら(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体は、医薬組成物の製造に有用なＮ-(Ｃ1〜Ｃ4)アシル化誘導体を製造する中間体として、且つ凝固パラメーターに対して基本的に活性を有さないが、他の重要な薬理性能を有する活性成分として有用である。本発明のエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体を、医薬組成物の活性成分として使用するためには、平均分子量が約3,000〜約11,500，好ましくは約4,500〜約8,500で、分子量分布が約1,000〜約15,000、好ましくは約2,000〜約10,000の低分子量誘導体、及び平均分子量が約15,000〜約45,000，好ましくは約20,000〜約45,000、分子量分布が約2,000〜約70,000の高分子量誘導体の両方を製造することが好ましい。
【０１０１】
従って、本発明は、本発明の別の態様により、鎖混合体であって、その鎖の少なくとも９０％が式（II）を有するものである(エピ)Ｋ５-アミン-０過硫酸塩誘導体を含む医薬組成物の新規な活性成分を提供する。
【化８】
2005536577.tif 000010
ここで、ｎは、２〜100、好ましくは３〜100の整数、Ｒ、Ｒ'、及びＲ''は水素又はSO3-、硫酸化度が少なくとも２.２、有利には２.２〜４、又は２.３〜３、より有利には２.５〜３、好ましくは２.７〜２.９の場合、ウロン酸単位は全てグルクロン酸、或いは硫酸化度が少なくとも３.４、有利には少なくとも３.５，より有利には3.55〜４、好ましくは3.55〜３.８の場合、ウロン酸単位は２０〜６０％のイズロン酸であり、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【０１０２】
硫酸化度が極めて高い有利なエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体は、鎖混合物を有していて、その鎖の少なくとも９０％が式（II）で表され、ウロン酸単位がイズロン酸４０〜６０％から成り、ｎが２〜100、好ましくは３〜100の整数で、平均分子量が約2,000〜約40,000、有利には約4,500〜約40,000、Ｒが少なくとも４０％、好ましくは５０〜８０％SO3-、Ｒ'及びＲ''は、モノ硫酸塩グルクロン酸の場合、両方ともSO3-、又は一方が水素、他方が５〜１０％SO3-、モノ硫酸塩イズロン酸の場合、１０〜１５％SO3-、対応するカチオンが、化学的又は薬剤上許容されるものである。
【０１０３】
硫酸化度が極めて高い好ましいエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体は、lmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩で、鎖混合体であって、その鎖の少なくとも９０％が式（II'）を有しているものである。
【化９】
2005536577.tif 000011
ここで、ｑは、２〜２０の整数、Ｒ、Ｒ'、及びＲ''は水素又はSO3-、ウロン酸単位は、２０〜６０％、好ましくは４０〜６０％のイズロン酸から成り、硫酸化度は3.55〜４で、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【０１０４】
特に重要なものは、式（II'）の鎖混合体で、ウロン酸単位が４０〜６０％、好ましくは５０〜５５％のイズロン酸から成り、Ｒが少なくとも４０％、有利には５０〜８０％、好ましくは約６５％SO3-、Ｒ'及びＲ''が、グルクロン酸の場合、両方ともSO3-、又は一方が水素、他方が５〜１０％SO3-、イズロン酸の場合、１０〜１５％SO3-、ｎは３〜１５の整数で、平均分子量が約4,000〜約8,000、対応するカチオンが、化学的又は薬剤上許容されるものである。
【０１０５】
これらのlmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩の中で、好ましいものは、鎖混合体を有していて、その主要成分種が式（II'a）を有している。
【化１０】
2005536577.tif 000012
ここで、ｐは、４〜８の整数、Ｒ、Ｒ'、及びＲ''は上記定義した通り、硫酸化が3.55〜４で、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【０１０６】
亜硝解重合、次ぎに、たとえば水素化ホウ素ナトリウムによる還元によって得たlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩からlmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩を製造する方法は、構造式（ａ'）の硫酸化２,５-無水マニトール単位の前記鎖混合体の鎖部分の還元端部へ導入することを含んでいる。
【化１１】
2005536577.tif 000013
ここで、Ｒ''は、水素又はSO3-である。
【０１０７】
従って、前記鎖混合体の鎖の大部分が構造式（ｂ'）で表される。
【化１２】
2005536577.tif 000014
ここで、ウロン酸単位は、グルクロン酸又はイズロン酸である。
【０１０８】
前記新規なlmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩の中で好ましいものは、主要種が式（II'b）の化合物の混合物を含むものである。
【化１３】
2005536577.tif 000015
ここで、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、Ｘ''はＯＨ又はOSO3-、ｍは、４、５又は６、ウロン酸単位は２０〜６０％のイズロン酸、硫酸化度が3.55〜４、グルクロン酸又はイズロン酸単位で出発する場合、イズロン酸単位は交互に存在し、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるイオンである。
【０１０９】
本発明は、別の態様により、鎖混合体であって、その鎖の少なくとも９０％が式（III）を有するものである新規なＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体を提供する。
【化１４】
2005536577.tif 000016
ここで、ｎは、２〜100、好ましくは３〜100の整数、Ｒ、Ｒ'、及びＲ''は水素又はSO3-、硫酸化度が少なくとも２.２、有利には２.２〜３、又は２.３〜３、より有利には２.５〜３、好ましくは２.７〜２.９であり、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【０１１０】
好ましいＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩は、lmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩で、鎖混合を有し、その少なくとも９０％が式（III'）を有するものである。
【化１５】
2005536577.tif 000017
ここで、ｑは、２〜２０の整数、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、硫酸化度が少なくとも２.２、有利には２.２〜３、より有利には２.５〜３、好ましくは２.７〜２.９、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるイオンである。
【０１１１】
これらのlmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩の中で、好ましいものは、鎖混合体を有していて、その主要成分種が式（III'a）を有しているものである。
【化１６】
2005536577.tif 000018
ここで、ｐは、４〜８の整数、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は上記定義した通り、硫酸化度が少なくとも２.２、有利には２.２〜３、又は２.３〜３、より有利には２.５〜３、好ましくは２.７〜２.９、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【０１１２】
亜硝解重合、次ぎに、たとえば水素化ホウ素ナトリウムによる還元によって得たlmw-Ｋ５-硫酸塩からlmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩を製造する方法は、前述した構造式（ａ'）（ここで、Ｒ''は、水素又はSO3-である）の硫酸化２,５-無水マニトール単位を、前記鎖混合体の大部分の鎖部分の還元端部へ導入することを含んでいる。
【０１１３】
従って、前記鎖混合体の鎖の大部分が、上述した構造式（ｂ'）（ここで、ウロン酸単位が、依然としてグルクロン酸である）で表される。
【０１１４】
前記新規なlmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩の中で好ましいものは、主要種が式（III'b）の化合物の混合物を含むものである。
【化１７】
2005536577.tif 000019
ここで、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、Ｘ''はＯＨ又はOSO3-、硫酸化度が、少なくとも２.２、有利には２.２〜３、又は２.３〜３、より有利には２.５〜３、好ましくは２.７〜２.９、ｍは４、５又は６、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるイオンである。
【０１１５】
これらlmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩は、それらのＮ-硫酸化又はＮ-アシル化誘導体を製造するための中間体として有用な新規生成物であるが、それ自体が、特に抗遊離ラジカル及び殺菌剤、並びに医薬組成物の新規な活性成分を構成するものとして重要な薬理特性を有している。従って、これも本発明に包含される。
【０１１６】
特に、本発明の別の態様は、硫酸化度が高い前述した(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体を、新規なＮ-置換エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体の製造に使用することに関する。
【０１１７】
本発明によるＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩は、(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体を、本発明の方法の工程（ｃ）に付すことによって製造される。
【０１１８】
従って、本発明の別の態様により、本発明は、下記を特徴とする方法によって製造される新規なＮ-アシル(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体を提供する。
（ａ）酸型の(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体を、第３級又は第４級有機塩基で処理し、反応混合物を３０〜６０分間放置し、前記第３級又は第４級有機塩基を添加して、溶液のｐＨを７に維持し、その塩を前記有機塩基で単離する。
（ｂ）前記(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体の有機塩基の塩を、Ｏ-過硫酸化条件下でＯ-硫酸化剤で処理する。
（ｃ）このようにして得た生成物を、(Ｃ2〜Ｃ4)カルボン酸の官能性誘導体で処理し、このようにして得たＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体を単離する。一般に、Ｎ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体は、ナトリウム塩の形で単離され、任意に、前記ナトリウム塩は、別の化学的又は薬剤上許容される塩に変換される。
【０１１９】
(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体に起こるものとして、上述したようにして製造したＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体の硫酸化度は、出発物質(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体の凝固に依存している。この理由は、ウロン酸単位がグルクロン酸だけから構成されているＫ５-Ｎ-硫酸塩誘導体の二糖類の量が、特に、エピＫ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体のエピマー化度が、グルクロン酸４０〜６０％及びイズロン酸６０〜４０％の場合、過硫酸化が、エピＫ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体で起きるより小さいからである。
【０１２０】
事実、Ｋ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体を、前述した工程（ａ）〜（ｃ）に付すと、硫酸化度が２.２〜３、有利には２.５〜３、好ましくは２.７〜２.９のＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体が製造される。
【０１２１】
エピＫ５-Ｎ-硫酸塩-誘導体を、イズロン酸含量が全ウロン酸の２０〜６０％である前述した工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に付すと、硫酸化度が、少なくとも３.４、有利に少なくとも３.５、より有利には3.55〜４、好ましくは3.55〜３.８のＮ-アシル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体が製造される。
【０１２２】
従って、本発明の別の態様は、含有するアシルが(Ｃ2〜Ｃ4)カルボン酸である新規なＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体を提供する。この新規なＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体の平均分子量は、約2,000〜約45,000、好ましくは約4,500〜約40,000の間で、硫酸化度が上記したもので、前記誘導体が、凝固パラメ-タ-に対して基本的に不活性であるが、医薬又は化粧品組成物の活性成分として有用である。
【０１２３】
従って、本発明のＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体を医薬又は化粧品生成物として使用するためには、平均分子量が約3,000〜約11,500、好ましくは約4,500〜約8,500で、分子量分布が約1,000と約15,000の間、好ましくは約2,000と約10,000の間の低分子量誘導体、及び平均分子量が約15,000〜約45,000、好ましくは約20,000〜約45,000の間で、分子量分布が約2,000と約70,000の間で、未分画Ｋ５起源の高分子量誘導体である。
【０１２４】
本発明のＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体の場合、硫酸化度は極めて高い。この理由は、二糖類単位当たりの利用できる４個の遊離ヒドロキシ基に、少なくとも３.４、好ましくは３.４〜３.８が硫酸化され、一方グルコースアミンの窒素が、殆ど100％アシル化されているからである。さらに、硫酸化度が少なくとも３.４と考えた場合、Ｎ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体は、そのグルコースアミン単位の100％が６-Ｏ-硫酸化されていて、５０〜８０％が３-Ｏ-硫酸化されていて、グルクロン酸単位の５〜１０％が３-Ｏ-モノ硫酸化されていて、イズロン酸単位の１０〜１５％がＯ-モノ硫酸化されていて、残りのウロン酸単位が２,３-ジ-Ｏ-硫酸化されている。
【０１２５】
上述したように、硫酸化度が２.２〜３のＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体は、少なくとも９０％が６-Ｏ-硫酸化されている。
【０１２６】
本発明の別の態様により、全鎖の少なくとも９０％が式（IV）をもつ鎖混合体を有する新規なＮ-アシル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体を提供する。
【化１８】
2005536577.tif 000020
ここで、ウロン酸単位は、２０〜６０％のイズロン酸を含み、ｎは、２〜100、好ましくは３〜100の整数、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、Ｚは、(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、硫酸化度は、少なくとも３.４、有利には少なくとも３.５、より有利には3.55〜４、好ましくは３.５〜３.８、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるイオンである。
【０１２７】
硫酸化度が極めて高く、優れたＮ-アシル-エピＫ５-Ｏ-過硫酸塩誘導体は、鎖混合体であって、その鎖の少なくとも９０％が式（IV）で表され、その中のウロン酸単位が４０〜６０％のイズロン酸、ｎが２〜100の整数、好ましくは３〜100の整数で、平均分子量が約2,000〜約45,000、有利には約4,500〜約45,000、Ｒが少なくとも４０％、好ましくは５０〜８０％SO3-、Ｒ'及びＲ''は両方ともSO3-、又は一方が水素、他方がモノ硫酸塩グルクロン酸において５〜１０％SO3-、及びモノイズロン酸において１０〜１５％SO3-、硫酸化度が３.４以上、そして対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるイオンである。
【０１２８】
硫酸化度が極めて高く特に重要なＮ-アシル-エピＫ５-Ｏ-過硫酸塩誘導体は、Ｎ-アシル-lmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸化誘導体で、鎖混合体を鎖混合体であって、その鎖の少なくとも９０％が式（IV'）で表され、その中で、ｑが２〜２０の整数、Ｒ、Ｒ'及びＲ''が水素又はSO3-基、硫酸化度が3.55〜４.７、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、そして対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるイオンである。
【化１９】
2005536577.tif 000021
ここで、ｑは２〜２０の整数、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、硫酸化度は3.55〜４、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【０１２９】
式（IV'）の鎖混合体の中で、ウロン酸単位が４０〜６０％、好ましくは５０〜５５％のイズロン酸、Ｒが少なくとも４０％、有利には５０〜８０％、好ましくは６５％のSO3-、Ｒ'及びＲ''は両方ともSO3-、又は一方が水素、他方がグルクロン酸において５〜１０％SO3-、及びイズロン酸において１０〜１５％SO3-、ｑが３〜１５の整数、平均分子量が約4,500〜約9,000、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるイオンである。
【０１３０】
他の特に重要なＮ-アシル-lmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩は、鎖混合物を鎖混合体であって、その鎖の主成分種が式（IV'a）の化合物である低分量のものである。
【化２０】
2005536577.tif 000022
ここで、ｐは４〜８の整数、Ｒ、Ｒ'及びＲ''が水素又はSO3-基、硫酸化度が3.55〜４、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、そして対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるイオンである。
【０１３１】
亜硝解重合、次ぎに、たとえば水素化ホウ素ナトリウムによる還元によって得たlmw-Ｋ５-硫酸塩からＮ-アシル-lmw-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩を製造する方法は、前述した構造式（ａ'）（ここで、Ｒ''は、水素又はSO3-である）の硫酸化２,５-無水マニトール単位を、前記鎖混合体の大部分の鎖部分の還元端部へ導入することを含んでいる。
【０１３２】
従って、前記鎖混合体の鎖の大部分の還元端部が、上述した構造式（b''）で表される。
【化２１】
2005536577.tif 000023
ここで、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、ウロン酸単位は、グルクロン酸又はイズロン酸である。
【０１３３】
前記新規なＮ-アシル-lmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩の中で好ましいものは、主要種が式（IV'b）の化合物の混合物を含むものである。
【化２２】
2005536577.tif 000024
ここで、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、Ｘ''はＯＨ又はOSO3-、ｍは４、５又は６、硫酸化度が3.55〜４、ウロン酸単位は交互に存在し、グルクロン酸又はイズロン酸から出発し、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるイオンである。
【０１３４】
前記カチオンは、有利には、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム、及び亜鉛から誘導されるものである。好ましいカチオンは、ナトリウム、カルシウム、及びテトラブチルアンモニウムイオンである。
【０１３５】
上述した全てのＮ-アシル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩において、特に、式（IV）、（IV'）、（IV'a）、（IV'b）、また構造式（b''）において、アシル基（Ｚ）は、好ましくは、アセチル、(２-カルボキシ)アセチル、(２-メトキシカルボニル)アセチル、(２-エトキシカルボニル)アセチル、プロピオニル、(３-カルボキシ)プロピオニル、Ｎ-(３-メトキシカルボニル)プロピオニル、及び(３-エトキシカルボニル)プロピオニルから成る群から選択される(Ｃ2〜Ｃ4)アシルである。
【０１３６】
本発明の別の態様により、新規なＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体が提供されるが、この-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体は鎖混合体であって、この鎖の少なくとも９０％が式（Ｖ）をもつ。
【化２３】
2005536577.tif 000025
ここで、ｎは２〜100、好ましくは３〜100の整数、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、硫酸化度が、少なくとも２.２、有利には２.２〜３、又は２.３〜３、より有利には２.５〜３、好ましくは２.７〜２.９、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるイオンである。
【０１３７】
特に重要なものは、新規なＮ-アシル-lmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩である。これは、鎖混合体であってこの鎖の少なくとも９０％が式（Ｖ'）をもつ。
【化２４】
2005536577.tif 000026
ここで、ｑは２〜２０の整数、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、硫酸化度が、少なくとも２.２、有利には２.２〜３、又は２.３〜３、より有利には２.５〜３、好ましくは２.７〜２.９、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるイオンである。
【０１３８】
これらのＮ-アシル-lmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩の中で、好ましいものは、鎖混合体を有していて、その主要成分種が式（V'a）を有しているものである。
【化２５】
2005536577.tif 000027
ここで、ｐは、４〜８の整数、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は上記定義通り、硫酸化度が、少なくとも２.２、有利には２.２〜３、又は２.３〜３、より有利には２.５〜３、好ましくは２.７〜２.９、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるものである。
【０１３９】
亜硝解重合、次ぎに、たとえば水素化ホウ素ナトリウムによる還元によって得たlmw-Ｋ５-硫酸塩からＮ-アシル-lmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩を製造する方法は、前述した構造式（ａ'）（ここで、Ｒ''は、水素又はSO3-である）の硫酸化２,５-無水マニトール単位を、前記鎖混合体の大部分の鎖部分の還元端部へ導入することを含んでいる。
【０１４０】
従って、前記鎖混合体の鎖の大部分の還元端部が、構造式（b'''）で表される。
【化２６】
2005536577.tif 000028
ここで、Ｚ、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は上記定義通り。
【０１４１】
前述した新規なＮ-アシル-lmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩の中で、好ましいものは、鎖混合体を有していて、その主要成分種が式（V'b）を有しているものである。
【化２７】
2005536577.tif 000029
ここで、Ｚは(Ｃ2〜Ｃ4)アシル、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、Ｘ''はＯＨ又はOSO3-、硫酸化度が、少なくとも２.２、有利には２.２〜３、又は２.３〜３、より有利には２.５〜３、好ましくは２.７〜２.９、ｍは４、５又は６、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるイオンである。
【０１４２】
上述した全てのＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩において、特に、式（Ｖ）、（Ｖ'）、（V'a）、（V'b）、また構造式（B'''）において、アシル基（Ｚ）は、好ましくは、アセチル、(２-カルボキシ)アセチル、(２-メトキシカルボニル)アセチル、(２-エトキシカルボニル)アセチル、プロピオニル、(３-カルボキシ)プロピオニル、Ｎ-(３-メトキシカルボニル)プロピオニル、及び(３-エトキシカルボニル)プロピオニルから成る群から選択される(Ｃ2〜Ｃ4)アシルである。
【０１４３】
特に重要なものは、上述したＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩で、Ｚがアセチルではない(Ｃ2〜Ｃ4)アシルのもである。また、特に重要で活性があるものは、上述したＮ-アシル-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩で、Ｚがアセチルで、硫酸化度が２.７〜２.９、好ましくは約２.８のもである。
【０１４４】
新規なＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体、特にそれらの塩型は、高度なアニオン性生成物で、遊離ラジカルを捕捉することができる。これらは、化粧品業界で、抜け毛対抗補助剤として、又は「抗老化」クリ-ムの製造に使用することができるが、中でも、医薬品業界で、皮膚炎治療剤及び抗菌剤として有用である。
【０１４５】
従って、本発明の別の態様により、薬理量の上述したＮ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体又はその許容された塩を、活性成分の１つとして含み、医薬品添加物との混合物から成る医薬組成物が提供される。
【０１４６】
本発明の経口、皮下注射、静脈注射、経皮吸収剤又は局所適用用医薬組成物において、活性成分は、好ましくは、剤形単位で、従来の医薬品添加物又は担体との混合物として投与される。剤形処方は、患者の年齢、体重、健康状態により広範囲に変えることができる。剤形処方は、１〜100mg、好ましくは１０〜750mg、より好ましくは250〜500mgで、一日１〜３回、経口、皮下注射、静脈注射、経皮吸収により投与される。
【０１４７】
さらに、本発明は、Ｎ-アシル-(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体又は薬剤上許容された塩の活性量と、医薬品添加物との混合物から成る化粧品組成物を提供する。
【０１４８】
その他に、本発明は、上述した方法の工程（ａ）及び（ｂ）により製造される(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体又は薬剤上許容されるその塩を活性成分の１つとして含み、医薬品添加物との混合物から成る医薬品組成物を提供する。
好ましくは、前記(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体は、鎖の混合体を含んでいて、その鎖の少なくとも９０％が式（II）、（II'）、（III）又は（III'）を有しているか、又は主要種が式（IIa）、（II'a）、（III'a）、又は（III'b）の化合物である。好ましい活性成分は、lmw-Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩で、硫酸化度が２.３〜３で、平均分子量が、有利には約3,500〜約11,000、より有利には約3,500〜約5,200で、基本的にＮ-アシル及びＮ-硫酸基を含んでいない。
【０１４９】
本発明の経口、皮下注射、静脈注射、経皮吸収剤又は局所適用用医薬組成物において、活性成分(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体は、好ましくは、剤形単位で、従来の医薬品添加物又は担体との混合物として投与される。剤形処方は、患者の年齢、体重、健康状態により広範囲に変えることができる。剤形処方は、(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩誘導体を、１〜1,000mg、好ましくは１０〜750mg、より好ましくは250〜500mgで、一日１〜３回、経口、皮下注射、静脈注射、経皮吸収により投与される。
【０１５０】
上述したような(エピ)Ｋ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩-誘導体を含む医薬組成物は、種々の投与方法に適した従来の医薬品添加物と一緒に製剤される。局所投与剤として特に有利な製剤法は、クリーム、軟膏、リニメント剤、ジェル、フォーム、バルサム、膣ペッサリー、座薬、溶液又はサスペンションである。
【０１５１】
最後に、本発明は、上述したlmw-(エピ)Ｋ５-硫酸塩、即ち、lmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩、又はlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩、又はその薬剤上許容される塩の薬理活性量を活性成分の１つとして含み、医薬品添加物との混合物を含む医薬組成物を提供する。
【０１５２】
本発明の経口、皮下注射、静脈注射、経皮吸収剤又は局所適用用医薬組成物において、活性成分は、好ましくは、剤形単位で、従来の医薬品添加物又は担体との混合物として投与される。剤形処方は、患者の年齢、体重、健康状態により広範囲に変えることができる。投与方法は、１〜1,000mg、好ましくは１０〜750mg、より好ましくは250〜500mgで、一日１〜３回、経口、皮下注射、静脈注射、経皮吸収により投与される。
【０１５３】
本発明の別の態様により、lmw-Ｋ５-硫酸塩、又はlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩又はその薬剤上許容される塩の薬理活性量を活性成分の１つとして含み、化粧品添加物との混合物を含む化粧品組成物を提供する。
【０１５４】
有利には、前記lmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩誘導体は、鎖混合体を含み、その鎖の少なくとも９０％が式（Ｉ）又は（Ｉ'）を有し、又は主要種が式（I'a）又は（I'b）の化合物であるものである。好ましい活性成分は、lmw-(エピ)Ｋ５-Ｎ-硫酸塩誘導体で、平均分子量が、約1,000〜約12,000、有利には約1,500〜約8,000、好ましくは約1,500〜約7,500で、基本的にＮ-アセチル基を含んでいない。
【０１５５】
アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、(Ｃ1〜Ｃ4)テトラアルキルアンモニウム、アルミニウム、及び亜鉛の塩から成る群から選択された塩、特に、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、又は亜鉛の塩が、本発明の組成物の効果的な活性成分を構成する。
【０１５６】
本発明を以下の実施例を参照して説明するが、本発明はそれらに限定されない。
製造例 Ｉ
lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩
ａ）Ｋ５-Ｎ-硫酸塩のエピマー化
WO02/068477の実施例１，工程（ｉ）及び（ii）に記載されているようにして得たＫ５-Ｎ-硫酸塩２ｇを、５０mMのCaCl2を含む２５mMのHEPESバッファ-（ｐＨ７）の120mlに溶解する。得た溶液を、WO96/14425に記載されているようにして得た固定化酵素を含む樹脂を充填した５０mlカラムを通過させる。この操作を、流速200ml/h、３０℃で２４時間行う。得た生成物を、100Ｄ膜以上の限外濾過、及びイオン交換樹脂ｌＲ 120Ｈ+を通過させて精製し、１Ｎ NaOHで溶出液を中和する。エタノール又はアセトンでサンプルを回収する。
【０１５７】
イズロン酸／グルクロン酸比が、出発物質の０／100に対して５５／４５であるエピマー化された生成物を得る。エピマー化率は、WO96/14425に記載された方法による1H-RMNで計算した。（Bitter and Mui Anal., Biochem., 39, 88-92-1971）のカルバゾ-ル法により、標準物質に対するウロン酸含量を測定して計算した収率は、９０％である。
【０１５８】
ｂ）エピＫ５-Ｎ-硫酸塩の解重合
工程ａ）で得た生成物１ｇを、亜硝酸及び後続の生成されるアルデヒドの還元による分解法で解重合する。この反応を、生成物を２５mlの蒸留水に溶解し、115mlの蒸留水に溶解した230mgの亜硝酸ナトリウムを添加して継続する。次いで、この溶液を４℃にし、０.１Ｎ HClでｐＨを２にし、３０分間維持する。反応終了時に、溶液を室温にし、０.１Ｎ NaOHでｐＨを７にする。次いで、溶液に、450mgのNaBH4を添加し４時間反応させる。４℃のアセトン３容量で沈殿させ、濾過ロートで濾過し、真空炉中で４０℃で乾燥させて生成物をか回収する。900mgのlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩を得る。このlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩の分子量分布は、HPLC法で計算して1,000〜4,000の範囲で、グルクロン酸単位含量は４５％、イズロン酸単位含量は５５％である。
【０１５９】
製造例II
lmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩
WO02/068477の実施例１，工程（ｉ）及び（ii）に記載されているようにして得た生成物を、亜硝酸及び後続の生成されるアルデヒドの還元による分解法で解重合する。この反応を、１ｇのＫ５-Ｎ-硫酸塩を、200mlの蒸留水に溶解し、240mlの蒸留水に溶解した480mgの亜硝酸ナトリウムを添加して継続する。次いで、この溶液を４℃にし、０.１Ｎ HClでｐＨを２にし、３０分間維持する。反応終了時に、０.１Ｎ NaOHで溶液のｐＨを７にし、次いで、溶液を室温にする。次いで、溶液に450mgのNaBH4を添加し４時間反応させる。HClで過剰量のNaBH4を除去し、ｐＨを５〜６にする。０.１Ｍ NaOHで中和した生成物を、４℃のアセトン３容量で沈殿させ、濾過ロートで濾過し、真空炉中で４０℃で乾燥させて生成物を回収する。900mgのlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩を得る。このlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩の平均分子量は、約2,000で、鎖混合体を含み、その主要主は、式（I'b）の化合物である（式（I'b）において、ｍは４、ウロン酸は、グルクロン酸である）。
【０１６０】
製造例III
（ａ）Ｋ５-Ｎ-硫酸塩の解重合
WO02/068477の実施例１，工程（ｉ）及び（ii）に記載されているようにして得たＫ５-Ｎ-硫酸塩２ｇを、亜硝酸ナトリウム100mg、及び水素化ホウ素ナトリウム300mgを使用して製造例IIに記載したようにして解重合する。平均分子量が5,000のlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩を得る。
【０１６１】
（ｂ）lmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩のエピマー化
工程（ａ）で得たlmw-Ｋ５-Ｎ-硫酸塩１ｇを、実施例１の工程（ａ）に記載されているようにして処理する。得たエピマー化生成物の出発物質の比０/100に対するイズロン酸／グルクロン酸比が４４/５６、分子量分布が2,000〜10,000で、平均分子量が5,000Ｄである。（Bitter and Mui Anal. Biochem., 39, 88-92-1971）のカルバゾ-ル法により、標準物質に対するウロン酸含量を測定して計算した収率は、９０％である。
【０１６２】
製造例IV
エピＫ５-Ｎ-硫酸塩の製造
WO02/068477の実施例１，工程（ｉ）及び（ii）に記載されているようにして、濃度５０mMのCaCl2を含み、ｐＨが７の２５mM HEPESの600ml中に製造したＫ５-Ｎ-硫酸塩１０ｇを、WO01/72848に記載されているようにして得た固定化組み換えＣ５-エピメラ-ゼ（WO96/14425）５ｇを含むSepharose 樹脂を充填した５０mlカラムを環流させる。この反応を、流速200ml/h、ｐＨ７、温度３０℃で２４時間行う。得た生成物を、限外濾過、エタノールで精製する。このようにしてイズロン酸含量が５４％のエピＫ５-Ｎ-硫酸塩を得る。
【０１６３】
製造例Ｖ
lmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩の製造
製造例IVで得た生成物１ｇを、亜硝酸及び後続の生成されるアルデヒドの還元による分解法で解重合する。この反応を、生成物を、２５mlの蒸留水に溶解し、115mlの蒸留水に溶解した230mgの亜硝酸ナトリウムを添加して継続する。次いで、この溶液を４℃にし、０.１Ｎ HClでｐＨを２にし、３０分間維持する。反応終了時に、溶液を室温にし、０.１Ｍ NaOHで溶液のｐＨを７にする。次いで、溶液に450mgのNaBH4を添加し、４時間反応させる。４℃のアセトン３容量で沈殿させ、濾過ロートで濾過し、真空炉中で４０℃で乾燥させて生成物を回収する。900mgのlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩を得る。このlmw-エピＫ５-Ｎ-硫酸塩の分子量分布は、HPLC法で計算して1,000〜4,000の範囲である。
【実施例１】
【０１６４】
エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩
（ａ）エピＫ５-Ｎ-硫酸塩のテトラブチルアンモニウム塩
製造例IVのようにして得たイズロン酸含量が５４％のエピＫ５-Ｎ-硫酸塩400mgを水４０mlに溶解させた溶液を４℃にし、次いで４℃の水で予備調整したイオン交換樹脂IR 120H+を通過させる。ｐＨが1.94の溶液100mlを含む溶出液を、水酸化テトラブチルアンモニウムの１５％溶液で中和し、室温で１時間放置し、１５％の酸化テトラブチルアンモニウムを添加してｐＨを７に維持し、最後に凍結乾燥する。かくて、805mgのエピＫ５-Ｎ-硫酸塩のテトラブチルアンモニウム塩を得る。
【０１６５】
（ｂ）エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩
このようにして得た塩805mgを３０mlのジメチルホルムアミドに溶解させた溶液を５５℃にし、2.26ｇのピリジン・SO3付加物を含むジメチルホルムアミド３０mlで処理する。反応を５５℃でオーバーナイト継続し、次いで混合物に水６０mlを添加する。１ＮのNaOHで中和した後、生成物を、NaClで飽和させたアセトン３容量で沈殿させ、４℃でオーバーナイト放置する。沈殿物を、guchＧ４に濾過して回収し、次いで100Ｄ Millipore TFFシステムで限外濾過し、減圧下で乾燥する。550mgのエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩を得る。このエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩のイズロン酸含量は５４％、グルコースアミン-６-Ｏ-硫酸塩含量は100％、グルコースアミン-３-Ｏ-硫酸塩含量は６０％、モノ硫酸塩グルクロン酸含量は１０％、モノ硫酸塩イズロン酸含量は１５％、残部は二硫酸塩化されていないのでウロン酸単位で、Casu et al.による電導度測定法で測定した硫酸化度が3.55である。
【実施例２】
【０１６６】
Ｎ-アセチル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩
実施例１で得たエピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩250mgを水７５mlに溶解させた４℃の溶液に、７.５mlのメタノール及び3.75mlの無水酢酸を添加する。５ＭのNaOHの７容量を添加してｐＨを７に維持しながら、反応を４℃で２時間維持する。1,000Ｄ膜での限外濾過後、塩化ナトリムで飽和したアセトン３容量を添加し、5,000rpmで５’遠心分離して沈殿物を回収する。このようにして、249ｇのＮ-アセチル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩を得る。このＮ-アセチル-エピＫ５-アミン-Ｏ-過硫酸塩のイズロン酸含量は５４％、グルコースアミン-６-Ｏ-硫酸塩含量は100％、Ｎ-アセチル含量は100％、グルコースアミン-３-Ｏ-硫酸塩含量は６０％、モノ硫酸塩グルクロン酸含量は１０％、モノ硫酸塩イズロン酸含量は１５％、残部は二硫酸塩化されていないのでウロン酸単位で、Casu et al.による電導度測定法で測定した硫酸化度が３.５である。
【実施例３】
【０１６７】
Ｎ-アセチル-５-アミン-Ｏ-過硫酸塩
WO02/068477の実施例２で得たＫ５-Ｎ,Ｏ-過硫酸塩１ｇを、水200mlに溶解させ、１ＮのHClでｐＨを２にし、５０℃に維持する。反応を、５０℃で３時間維持し、次いで室温に冷却し、１ＮのNaOHで中和する。津で、サンプルを４℃に冷却し、２０mlのMeOHと１０mlの無水酢酸を添加し、ｐＨを７に一定に維持しながら、４℃で２時間放置する。反応終了時に、サンプルを1000Ｄカットオフのメンブランを具備した限外濾過で塩から精製し、減圧下で乾燥する。100％Ｎ-アセチル化された生成物を得る。グルクロン酸に対して、100％６-０硫酸塩、３０％モノ硫酸塩、及び７０％二硫酸塩を得る。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】実施例１で製造した硫酸基／カルボキシ比が2.87のＫ５-NH2-Ｏ-硫酸塩のNMRプロトンスペクトルを示すチャートである。
【図２】実施例２で製造した硫酸基／カルボキシ比が4.26のエピＫ５-Ｎ-アセチル化Ｏ-硫酸塩のNMRプロトンスペクトルを示すチャートである。
【図３】実施例３で製造した硫酸基／カルボキシ比が2.87のエピＫ５-Ｎ-アセチル化Ｏ-硫酸塩のNMRプロトンスペクトルを示すチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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