(57)【要約】  本発明は、アスコルビン酸中間体の生産方法及び当該生産のための宿主細胞を提供するものである。本発明は、また、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する内因性酵素活性に対するコード化を欠失することにより酸化経路から異化経路を切り離すポリヌクレオチドにおける修飾、及び／又は、Ｄ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性に対するコード化が欠失されたポリヌクレオチドを有する宿主細胞を提供するものである。Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性が不活性化された、及びＤ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性が不活性化された核酸配列及びアミノ酸配列を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え宿主細胞においてアスコルビン酸中間体を生産する方法であって、
当該アスコルビン酸中間体の生産に適切な条件下において、グルコースの存在下で当該アスコルビン酸中間体を生産し得る宿主細胞を培養する工程を含み、
ここで、当該宿主細胞が、グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼよりなる群から選択されるキナーゼをコード化するポリヌクレオチドの群から選択される少なくとも１の欠失を含む、
当該方法。
【請求項２】
前記宿主細胞が、グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼよりなる群から選択されるキナーゼをコード化する残基の群から選択される欠失の両方をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生成物を回収する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アスコルビン酸中間体を第２の生成物へ転化する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
炭素源からのアスコルビン酸中間体の生産量を向上させる方法であって、
ｄ）細菌宿主菌株において染色体遺伝子を不活性化することを含む、改変されたＰａｎｔｏｅａ細菌菌株を得る工程、
ｅ）前記改変された細菌宿主菌株を適切な条件下で培養する工程、
ｆ）炭素源からアスコルビン酸中間体を生産させる工程であって、当該アスコルビン酸中間体の生産量が、未改変の細菌宿主菌株におけるアスコルビン酸中間体の生産量に比べて向上する当該工程、
を含む、当該方法。
【請求項６】
アスコルビン酸中間体が、グルコン酸、２−ケト−Ｄ−グルコン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、２−ケト−Ｌ−グロン酸、Ｌ−イドン酸、エリソルビン酸、及び酒石酸よりなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アスコルビン酸中間体が２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記改変された細菌菌株が、ｇｌｋ染色体遺伝子の不活性化により得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記改変された細菌菌株が、ｇｎｔｋ染色体遺伝子の不活性化により得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変された細菌菌株が、ｇｌｋ及びｇｎｔｋ染色体遺伝子の不活性化により得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌菌株がＰａｎｔｏｅａである、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌菌株がＰａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府による委託研究の下でなされた発明に対する権利の記述）
（本発明は、米国商務省により授与された授与番号第７０ＮＡＮＢ  ５Ｈ１１３８号の米国政府の委託によりなされたものである。本発明における一部の権利は、当該政府が有する。）
【０００２】
本発明は、宿主細胞における代謝経路の設計に関するものであり、宿主細胞における生成物の生産方法及びシステムを提供する。特に、本発明は、宿主細胞におけるアスコルビン酸中間体の生産方法及びシステムを提供する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子操作された宿主細胞において、多数の商業目的の製品（例えば、Ｌ−アスコルビン酸など）が生体触媒により生産されている。Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ、ＡＳＡ）は、製薬産業及び食品産業において、ビタミン及び酸化防止剤として用いられている。比較的大きな市場規模と特殊化学製品としての高価値によって、ＡＳＡの合成は、長年にわたって非常に注目されている。
【０００４】
グルコースからＡＳＡへの化学合成経路であるＲｅｉｃｈｓｔｅｉｎ−Ｇｒｕｓｓｎｅｒ法が、まず、１９３４年に発表された（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ．、１７巻、３１１−３２８頁）。Ｌａｚａｒｕｓらは、ＡＳＡの中間体であって、ＡＳＡに化学的に転化され得る２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＬＧ、ＫＬＧ）の製造のための生物転化方法を開示している（“Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ：Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｖｉａ  ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ  ＤＮＡ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、Ｃ．Ｌ．Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ編集、１９８９年）。当該ＫＬＧへの炭素源の生物転化は、種々の中間体を含み、当該酵素的工程は、補因子依存性の２，５−ＤＫＧ還元酵素活性（２，５−ＤＫＧＲ又はＤＫＧＲ）に関連する。
【０００５】
多数の細菌種、特に、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、及びアルスロバクター属（ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）を含むコリネフォルム類に属するものは、ＤＫＧＲを含むことが判明している。コリネバクテリウムｓｐ．菌株ＳＨＳ７５２００１から得られたＤＫＧＲが、ＧｒｉｎｄｌｅｙらのＡｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５４巻、１７７０−１７７５頁（１９８８年）に記載されている。Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａからのＤＫＧＲが、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５，００８，１９３号に開示されている。その他の還元酵素が、米国特許第５，７９５，７６１号、第５，３７６，５４４号、第５，５８３，０２５号、第４，７５７，０１２号、第４，７５８，５１４号、第５，００４，６９０号、及び第５，０３２，５１４号に開示されている。
【０００６】
解糖系に関与する酵素に変異を有する宿主細胞が説明されている。グルコキナーゼに変異を有する酵母が、ＨａｒｒｏｄらのＪ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８巻、３７９−３８３頁（１９９７年）；ＷｅｄｌｏｃｋらのＪ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３５巻、２０１３−２０１８頁（１９８９年）；ＷａｌｓｈらのＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５４巻、１００２−１００４頁（１９８３年）に記載されている。グルコキナーゼ欠乏細菌が説明されている。グルコキナーゼ欠乏ペジオコッカスｓｐ．が、日本国特許公報ＪＰ４２６７８６０に記載されている。グルコキナーゼ欠乏Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓが、ＲｕｓｓｅｌらのＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．、５５巻、２９４−２９７頁（１９８９年）に記載されている。グルコキナーゼ欠乏Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍが、ＢａｒｒｅｄｏらのＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ−Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、３２巻、１０６１−１０６７頁（１９８８年）に記載されている。Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓのグルコキナーゼ欠乏変異体が、ＤｉＭａｒｃｏらのＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４９巻、１５１−１５７頁（１９８５年）に記載されている。
【０００７】
腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）及びＶｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅに属する細菌等の、エムデン−マイヤーホフ経路を経てグルコースを発酵させる細菌が、ＢｏｕｖｅｔらのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、６１−６７頁（１９８９年）に記載されている。Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．におけるケトアルドン酸の代謝経路が、ＴｒｕｅｓｄｅｌｌらのＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、６６５１−６６５６頁（１９９１年）に記載されている。
【０００８】
しかしながら、化合物を生産するのに用いられる既存の手法のほとんどは、生成物を過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）させる。さらに、代謝（異化）目的の細胞による、所望の最終再生物の生産に用いられる基質の転用（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ）に関する問題も存在し、これは当該最終生成物の効率及び総生産を減少させる。従って、宿主細胞の代謝経路と連結される経路を経る生成物の改善された生産方法に対する需要が引き続き存在する。本発明は、当該需要に対応するものである。
【０００９】
本明細書に引用する全ての文献は、引用により本明細書中にそのまま取込まれる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、宿主細胞を遺伝子操作して代謝経路に転用される炭素基質を減少させ、それにより当該宿主細胞の生産性を増大させることを含む、アスコルビン酸中間体の生産方法を提供する。
【００１１】
１の実施態様では、本発明は、炭素源からのアスコルビン酸中間体の生産量を向上させる方法であって、
ａ）細菌の宿主菌株における染色体遺伝子を不活性化させることを含む、改変された細菌の菌株を得る工程、
ｂ）前記改変された細菌の宿主菌株を適切な条件下において培養する工程、及び、
ｃ）炭素源からアスコルビン酸中間体を生産させる工程であって、当該アスコルビン酸中間体の生産量が、未改変の細菌の宿主菌株におけるアスコルビン酸中間体の生産量に比べて向上する、当該工程、
を含む当該方法を提供する。
【００１２】
アスコルビン酸中間体は、グルコン酸、２−ケト−Ｄ−グルコン酸、２，５−ジケト−グルコン酸、２−ケト−Ｌ−グロン酸、Ｌ−イドン酸（ｉｏｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、エリソルビン酸、及び酒石酸塩よりなる群から選択され得る。特定の実施態様では、当該中間体は、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸である。改変された細菌の菌株は、ｇｌｋ染色体遺伝子の不活性化により得ることができる。改変された細菌の菌株は、また、ｇｎｔｋ染色体遺伝子の不活性化により得ることができる。改変された細菌の菌株は、また、ｇｌｋ及びｇｎｔｋ染色体遺伝子の不活性化により得ることができる。当該細菌の菌株は、Ｐａｎｔｏｅａ、より詳細にはＰａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａであることができる。
【００１３】
１の実施態様では、前記宿主細胞は、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性をコード化するポリヌクレオチドにおける修飾を有し、及び／又は、Ｄ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性をコード化するポリヌクレオチドにおける修飾を有する。炭素源の存在下において培養された場合の当該宿主細胞は、直接的及び／又は間接的に測定した生成物収率の増大を示す。本発明の特定の実施態様では、当該方法は、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性をコード化するポリヌクレオチドにおける修飾を有し、Ｄ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性をコード化するポリヌクレオチドにおける修飾を有する宿主細胞を含む。
【００１４】
従って、一面において、本発明は、組み換え宿主細胞においてアスコルビン酸中間体を生産する方法であって、当該アスコルビン酸中間体の生産に適切な条件の下で、グルコース（又は、宿主細胞によってグルコースに転化され得る炭素源）の存在下において当該アスコルビン酸中間体を生産することができる宿主細胞を培養することを含み、当該宿主細胞が、生物体の代謝経路に転用されるグルコースを減少させるために修飾される、当該方法を提供する。当該修飾は、前記炭素基質を前記代謝経路に転用する酵素活性をコード化する少なくとも１のポリヌクレオチドを含むことができ、前記培養の間に当該酵素活性レベルがそれに対応して影響を受けるように不活性化され又は欠失される。
【００１５】
本発明における特定の実施態様では、宿主細胞は、Ｄ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性をコード化する少なくとも１のポリヌクレオチドを更に含み、ここで、当該ポリヌクレオチドは、前記酵素活性レベルが前記培養の間に改変され、それにより、細胞膜を横切って輸送され及び／又は細胞の代謝経路に用いるためにリン酸化される基質が不活性化し又はその量が減少するように修飾される。特定の実施態様では、当該方法は前記生成物を回収する工程を含み、別の実施態様では、当該方法は前記生成物を第２の生成物へ転化する工程を含む。
【００１６】
特定の実施態様では、内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）酵素活性の程度が、例えば、転写又は翻訳調節要素などにより、培養の間に制御される。従って、特定の実施態様では、細胞膜を横切る輸送のためにＤ−グルコースをリン酸化する酵素活性をコード化するポリヌクレオチドを、調節可能プロモーターに接続することができる。別の実施態様では、Ｄ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性をコード化するポリヌクレオチドを、調節可能プロモーターに接続することができる。別の実施態様では、内因性酵素活性は、例えば、当該酵素活性をコード化するポリヌクレオチドの一部又は全てにおける変異或いは欠失などによって不活性化される。
【００１７】
本発明は、グルコン酸、２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２−ＫＤＧ又はＫＤＧ）、２，５−ジケト−グルコン酸（２，５ＤＫＧ又はＤＫＧ）、２−ケト−Ｌ−グロン酸（２ＫＬＧ又はＫＬＧ）又はＬ−イドン酸（ＩＡ）等のアスコルビン酸中間体の生産を包含する。特定の実施態様では、当該アスコルビン酸中間体はＫＬＧであり、当該ＫＬＧはアスコルビン酸に転化される。別の実施態様では、当該アスコルビン酸中間体はＫＤＧであり、当該ＫＤＧはエリソルビン酸に転化される。
【００１８】
本発明は、ＡＳＡ中間体を生産することができる組換え宿主細胞であって、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性をコード化する修飾ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供するものである。本発明は、また、Ｄ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性をコード化する修飾ポリヌクレオチドをさらに含む宿主細胞を提供するものである。
【００１９】
特定の実施態様では、宿主細胞はグラム陽性微生物であり、別の実施態様ではグラム陰性微生物である。特定の実施態様では、グラム陰性宿主細胞は、エルウィニア属、エンテロバクター属、グルコノバクター属、アセトバクター属、コリネバクター属、エシェリキア属、サルモネラ菌、クレブシエラ菌、又はＰａｎｔｏｅａ属などの腸内細菌科宿主細胞である。
【００２０】
別の実施態様では、宿主細胞は、天然に又は適切な遺伝子組換えの後に、特定の細胞機能、例えば、ＮＡＤ、ＦＡＤＨ２、又はＮＡＤＰＨの形態の還元力を発生させる機能（これに限定されるわけではない）を維持するために１の炭素源を利用することができ、その一方で別の炭素源を１以上の商業用生成物に転化する、任意の細菌であることができる。
【００２１】
特定の実施態様では、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性には、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）、又は必ずしも当該３つのグループに分類されないがそのような機能を有し得る任意の他の酵素が含まれる。例えば、好ましい基質はフルクトースであるのでフルクトキナーゼに分類される酵素が可能であり、これは測定可能な速度でＤ−グルコースをリン酸化できる。酵素が、他の同類の基質（特に高濃度の基質）に作用することも珍しいことではない。
【００２２】
別の実施態様では、Ｄ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性には、グルコン酸キナーゼ、デオキシグルコン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）、又は必ずしも当該４つのグループに分類されないがそのような機能を有し得る任意の他の酵素が含まれる。例えば、好ましい基質はデオキシグルコン酸であるのでデオキシグルコン酸キナーゼに分類される酵素が可能であり、これは測定可能な速度でＤ−グルコン酸をリン酸化できる。酵素が、他の同類の基質（特に高濃度の基質）に作用することも珍しいことではない。
【００２３】
本発明は、また、修飾レベル（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｌｅｖｅｌ）の酵素活性を有する宿主細胞の生産方法を提供する。本発明は、また、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性及びＤ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性のための、新規な核酸配列及びアミノ酸配列を提供する。
【００２４】
本発明は、また、グルコース及び／又はフルクトースに由来する種々の工業的に重要な生体分子を生成可能な宿主細胞の生産方法を提供する。
【００２５】
本発明は、また、修飾レベルの酵素活性を有する宿主細胞を提供する。本発明は、さらに、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性及びＤ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性のための、新規な核酸配列及びアミノ酸配列を提供する。
【００２６】
本発明は、また、グルコース及び／又はフルクトースに由来する種々の工業的に重要な生体分子を生成できる宿主細胞を提供する。
【００２７】
詳細な説明
本発明は、アスコルビン酸中間体の生産方法及び当該生産のための宿主細胞を提供するものである。異化経路に転用される炭素基質を減少させるために遺伝子操作された、アスコルビン酸中間体を生産する組換え宿主細胞を構築した。１の実施態様では、当該組換え宿主細胞は、異化経路に用いる細胞へ輸送する修飾レベルの酵素活性、例えば、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化し及び／又はＤ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性を生産する。これらの組換え細胞が、グルコースの存在下又は宿主細胞によってグルコースへ転化され得る炭素源の存在下で培養される場合、グルコース及び／又はグルコン酸の細胞内代謝は減少する。
【００２８】
特定の実施態様では、当該宿主細胞は、アスコルビン酸（“ＡＳＡ”）中間体等の生成物を生産するために遺伝子操作されたＰａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ細胞である。これらの実施態様では、ＡＳＡ中間体の生産において発酵工程を用いることができるという特有の利益が本発明により提供される。
【００２９】
本発明により提供される別の利益は、基質の細胞外酸化を、当該酸化物を使用する代謝経路から切り離すことである。
【００３０】
本発明により提供される別の利益は、目的生成物の生産量の増大として直接的に観測され、或いは、酸素消費又はＣＯ２オフガス（ＣＯ２生産）として間接的に観測される、野生型生物変換と比較したアスコルビン酸中間体の生産効率の向上である。
【００３１】
本発明により提供される更なる利益は、アスコルビン酸中間体の生産において、異なる２つの炭素源を同時に用いることができる宿主細胞の能力である。
【００３２】
一般技術
本発明の実施には、特に示さない限り、当該技術分野の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、及び生化学における慣用技術を用いる。そのような技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９８７年及び年次更新版）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集、１９８４年）；及び、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編集、１９９４年）；Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版（Ａ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎら編集、１９９９年）等の文献において十分に説明されている。
【００３３】
定義
本明細書において、“宿主細胞の酸化経路”とは、Ｄ−グルコース及び／又はその代謝物等の炭素源を酸化する少なくとも１の酸化酵素を宿主細胞が含むことを意味する。宿主細胞における“膜”又は“膜結合型”グルコース酸化経路とは、少なくとも１の膜結合型酸化酵素活性を経てＤ−グルコース及び／又はその代謝物等の炭素源を酸化する宿主細胞を意味する。特定の実施態様では、宿主細胞における酸化経路は少なくとも１の酵素活性を含む。別の実施態様では、宿主細胞における酸化経路は２以上の酵素活性を含む。
【００３４】
本明細書において、“宿主細胞の異化経路”とは、（例えば、Ｄ−グルコース及び／又はその代謝物等の炭素源を酸化することにより）ＡＴＰ又はＮＡＤＰＨを発生させる少なくとも１の酵素活性を含む宿主細胞を意味する。宿主細胞における“細胞内”異化経路とは、宿主細胞が宿主細胞の細胞質ゾル中に少なくとも１の前記酵素活性を含むことを意味する。特定の実施態様では、宿主細胞における異化経路は１の酵素活性を含む。別の実施態様では、宿主細胞における異化経路は２以上の酵素活性を含む。異化経路には、解糖、ペントース経路、及びＴＣＡ経路（図１７参照）が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００３５】
本明細書において、“酵素輸送系”という語は、（通常は、Ｄ−グルコースの６番目の炭素にリン酸を付加することによって）エネルギー（ＡＴＰ）を消費し、細胞膜を横切って炭素基質を輸送する酵素活性を意味する。それらには、酵素活性グルコキナーゼ（Ｅ．Ｃ．−２．７．１．２）及びホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）（Ｅ．Ｃ．−２．７．１．６９）が含まれる。
【００３６】
本明細書において、“Ｄ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性”という語は、Ｄ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性を意味し、それには酵素活性グルコキナーゼ（Ｅ．Ｃ．−２．７．１．２）が含まれる。
【００３７】
本明細書において、“Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性”という語は、Ｄ−グルコースの６番目の炭素原子にリン酸を付加する酵素活性を意味し、それには酵素活性グルコキナーゼ（Ｅ．Ｃ．−２．７．１．２）及びホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）（Ｅ．Ｃ．−２．７．１．６９）が含まれる。
【００３８】
本明細書において、“Ｄ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性”という語は、Ｄ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性を意味し、それには酵素活性グルコキナーゼ（Ｅ．Ｃ．−２．７．１．２）が含まれる。
【００３９】
本明細書において、宿主細胞によって生産される酵素活性のレベルの“修飾”、又は宿主細胞における“修飾レベル”の酵素活性とは、培養の間に生産される酵素活性のレベルを望みに応じて増加又は減少するように制御することを意味する。酵素活性のレベルにおける所望の変化は、遺伝子操作により、１又は両方の酵素活性において同時に又は任意の順番で連続的に生じさせることができる。酵素活性のレベルを制御するために、宿主細胞が遺伝子操作され、酵素活性をコード化する核酸が転写的に又は翻訳的に制御される。
【００４０】
本明細書において、核酸又はポリヌクレオチドについて用いられる“修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）”という語は、何らかの方法、例えば、核酸の一部又は全てにおける変異又は欠失又は転写調節領域へ連結により、核酸が野生型の核酸から改変されていることを意味する。本明細書において、核酸に関する“変異”という語は、核酸の生産物が部分的又は全体的に不活性化或いは排除されるような、核酸における任意の改変について用いられる。変異の例には、点変異、フレームシフト変異、及び、例えば、細胞膜を横切って基質を輸送し、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化し又はＤ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化するような酵素活性をコード化する遺伝子の一部又は全部の欠失が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００４１】
本発明における“改変細菌菌株”は、本質的に同一の増殖条件下で成長した未改変の細菌性宿主菌株における同一の最終生成物の生産量に対して、より多い生産量を有する遺伝子操作された細菌性微生物である。“未改変の細菌菌株”又は宿主は、酵素経路を転用するコード配列が不活性化されておらず、酵素活性が維持されている細菌性微生物である。当該生産量の向上は、１以上の染色体遺伝子の不活性化によって生じる。第１の実施態様では、発現レベルの向上は、１以上の染色体遺伝子の欠失によって生じる。第２の実施態様では、発現レベルの向上は、１以上の染色体遺伝子の挿入不活性化によって生じる。好ましくは、当該不活性化遺伝子は、本明細書に別記するように不活性が所望される酵素をコード化する遺伝子から選択される。例えば、１の実施態様では、ｇｌｋ及びｇｎｔｋよりなる群から選択される１以上の染色体遺伝子である。
【００４２】
特定の実施態様では、改変バチルス株は、２、３、４、５、６又はそれ以上の不活性化遺伝子を包含し得る。当該不活性化遺伝子は、互いに隣接することができ、或いはバチルス染色体の異なる領域に位置することもできる。不活性化染色体遺伝子は特定条件の下で必須の機能を有し得るが、必ずしも当該遺伝子は実験室条件におけるバチルス株の生存力に必須なものではない。好ましい実験室条件には、発酵槽、振とう板、プレートメディア（ｐｌａｔｅ  ｍｅｄｉａ）等における増殖のような条件が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００４３】
本明細書において、酵素活性について用いられる“不活性化”という語は、酵素活性をコード化する核酸の一部或いは全部における変異又は欠失を含む任意の手段によって活性が失われることを意味する。“不活性化”という語には、１以上の所望の染色体遺伝子における機能発現を抑制する任意の方法が含まれ、ここで、当該遺伝子又は遺伝子産物はその既知の機能に影響を与え得ない。所望の染色体遺伝子は、不活性化しようとする酵素活性に依存する。例えば、グルコキナーゼ活性及び／又はグルコン酸キナーゼ活性は、ｇｌｋ及び／又はｇｎｔｋ染色体遺伝子の不活性化により影響を受け得る。不活性化には、核酸遺伝子配列における欠失、変異、分断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ）、又は挿入等の方法が含まれる。１の実施態様では、不活性化遺伝子の発現産物は、タンパク質の生物活性が変化する限り、短小化された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）タンパク質であることができる。生物活性の変化は、活性の改変であることもできるが、好ましくは生物活性の喪失である。本発明における改変細菌菌株において、１以上の遺伝子の不活性化は、好ましくは安定かつ不可逆な不活性化である。
【００４４】
好ましい実施態様では、好ましくは、遺伝子は相同組換えによって欠失される。例えば、図９に示すように、欠失される遺伝子がｇｌｋである場合、クロラムフェニコール耐性遺伝子が、グルコキナーゼ遺伝子における固有の制限領域にクローン化される。ＣｍＲ遺伝子は、ＰＳＴ  Ｉ部位において遺伝子の構造コード領域へ挿入される。その後、非複製Ｒ６Ｋベクターを用いる相同組換えによって、修飾がＰ．ｃｉｔｒｅａ染色体へ繰り込まれる。続いて、ＣｍＲ遺伝子がｇｌｋコード領域から除去され、分断スペーサーはコード領域に残され、コード領域が不活性化される。別の実施態様では、ＣｍＲ遺伝子は、コード領域の一部の代わりにコード領域へ挿入される。その後、当該コード領域の交換された部分の再挿入を伴うことなしに、ＣｍＲ遺伝子が除去される。それにより、コード領域の一部が効果的に欠失し、当該コード領域が不活性化される。
【００４５】
本明細書において、遺伝子の欠失には、コード配列全体の欠失、コード配列の一部の欠失、又は、フランキング領域を含むコード配列の欠失が含まれる。染色体に残存する配列が遺伝子の生物活性には短すぎるものである限りは、当該欠失は部分的であってもよい。コード配列のフランキング領域は、５’末端及び３’末端における約１ｂｐ乃至約５００ｂｐを含み得る。当該フランキング領域は、５００ｂｐより多くてもよいが、好ましくは、本発明において不活性化又は欠失され得る領域にその他の遺伝子を含まない。最終的には、欠失される遺伝子は、事実上非機能的である。
【００４６】
別の実施態様では、不活性化は挿入によるものである。例えば、欠失される遺伝子がｇｌｋである場合、ＤＮＡ構築物は、選択マーカーにより分断されたｇｌｋ遺伝子を有する入力（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）配列を含む。当該選択マーカーの両側は、ｇｌｋコード配列の切片と隣接する。ＤＮＡ構築物は、宿主染色体におけるｇｌｋ遺伝子の本質的に同一の配列と結びつき、及び、二重交叉に場合には、ｇｌｋ遺伝子は選択マーカーの挿入により不活性化される。
【００４７】
別の実施態様では、不活性化は、ベクターとしてプラスミドを用いる単一交叉への挿入によるものである。例えば、ｇｌｋ染色体遺伝子は、遺伝子又はその一部のコード配列及び選択マーカーを含むプラスミドと結びつく。選択マーカーは、遺伝子コード配列内に、又は遺伝子から分離したプラスミドの一部に位置することができる。ベクターはバチルス染色体へ組込まれ、コード配列への当該ベクターの挿入により遺伝子が不活性化される。
【００４８】
不活性化は、また、遺伝子の変異によっても生じ得る。遺伝子を変異させる方法は当該技術分野において周知であり、それらには、化学的変異誘発、部位特異的変異、ランダム変異の発生、及びｇａｐｐｅｄ−ｄｕｐｌｅｘ法が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）（米国特許第４，７６０，０２５号；Ｍｏｒｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２巻、６４６頁、１９８４年；及び、Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２巻、９４４１頁、１９８４年）。
【００４９】
不活性化は、また、所望のゲノム領域における各プロモーター領域に上述の不活性化方法を適用することによっても生じ得る。
【００５０】
“転写制御下で”又は“転写制御された”という語は、転写の開始又は転写の促進に寄与する要素へ操作可能なように連結していることに依存する、ポリヌクレオチド配列（通常はＤＮＡ配列）の転写を意味するものとして当該技術分野において周知である。“操作可能なように連結する”という語は、当該要素が機能するように配列されている並置（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）について用いられる。
【００５１】
本明細書において、“調節可能プロモーター”という語は、活性又は機能を調節することができるプロモーター要素について用いられる。この調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）は、種々の方法により達成することができるが、最も一般的には、ＲＮＡポリメラーゼ酵素が転写を開始する能力を妨害又は増大させるタンパク質の相互作用によって達成される。
【００５２】
“翻訳制御下で”という語は、メッセンジャーＲＮＡが形成された後に生じる調節工程を意味するものとして当該技術分野において周知である。
【００５３】
本明細書において、“バッチ”という語は、固体又は濃縮液体の形状の基質が操作の開始時に最初に添加されるバッチ細胞培養を意味するものである。バッチ培養は、培養液に細胞を接種することによって開始されるが、フェドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養とは対照的に、その後、（例えば、濃縮栄養分の供給などによる）栄養分の流入はない。連続培養とは対照的に、バッチ細胞培養では、培養からの培養液又は細胞の系統的な添加或いは系統的な除去もない。培養液における栄養分及び代謝物質の濃度が、バッチ内の初期濃度及び発酵よる栄養分組成物のその後の変化に依存するので、その後、培養液に種々の被検体を添加することもない。
【００５４】
本明細書において、“フェドバッチ”という語は、固体又は濃縮液体の形状の基質が操作の間において周期的に又は連続的に添加されるバッチ細胞培養を意味するものである。バッチ培養と同様、フェドバッチ培養は、培養液に細胞を接種することによって開始されるが、バッチ培養とは対照的に、その後、（例えば、濃縮栄養分の供給などによる）栄養分の流入が行われる。連続培養とは対照的に、栄養分供給物の組成を変えることによって培養液における栄養分及び代謝物質の濃度を容易に制御又は作用することができるので、フェドバッチ培養からの培養液又は細胞の系統的な除去もなく、これは培養液における種々の被検体のレベルを監視し調整する用途において有益である。フェドバッチ培養へ供給される栄養分供給物は、典型的には、炭水化物等のエネルギー源を含有する濃縮栄養分溶液である。所望ならば、フェドバッチ培養へ供給される当該濃縮栄養分溶液は、アミノ酸、脂質前駆体、及び／又は塩類を含有することができる。フェドバッチ培養では、典型的には、この栄養分供給物は、細胞の増殖に十分な栄養分を供給しつつ、培養液の容積の増大を最小化するように濃縮される。
【００５５】
“連続細胞培養”又は、単に“連続培養”という語は、本明細書において、液体栄養分供給物の連続的な流入及び連続的な液体の流出によって特徴付けられる培養を意味するものとして用いられる。当該栄養分供給物は、濃縮栄養分供給物であることができる（ただし、必ずしもその必要はない）。細胞が使用済み培養液により反応器の外へ洗い流されるような速度において連続的に栄養分溶液を供給することによって、培養を安定な増殖及び成長の条件に維持することができる。ケモスタット（ｃｈｅｍｏｓｔａｔ）として知られるバイオリアクター型においては、新鮮な栄養分培養液が連続的に細胞培養へ供給され、使用済み培養液、細胞、及び排泄細された胞産物が連続的に流し出される。或いは、連続培養は“灌流培養”を構成することもでき、この場合、流出する液体は、実質的に細胞を含まないか又はバイオリアクターにおけるよりも実質的に低い細胞濃度の培養液を含有する。灌流培養では、細胞は、例えば、ろ過、遠心分離、又は沈降によって保持される。
【００５６】
本明細書において、“培養する”という語は、反応器における炭素基質から所望の最終生成物への発酵性生物変換について用いられる。本明細書において、生物変換は、炭素基質を微生物と接触させて当該炭素基質を所望の最終生成物へ変換することを意味する。
【００５７】
本明細書において、“酸素消費率”又は“ＯＵＲ”は、反応器における酸素の個別消費量の評価について用いられる。酸素消費量は、種々のオンライン測定を用いて測定できる。１例として、ＯＵＲ（ｍｍｏｌ／（リットル・時間））は以下の式により算出できる：（風量（１分当りの定常リットル）／発酵重量（発酵培地の重量、キログラム）Ｘ 供給Ｏ２ Ｘ 培養液密度 Ｘ （２０．０℃標準の代わりに２１．１℃における風量を校正するための補正定数））−（[風量／発酵重量] Ｘ [オフガスＯ２／オフガスＮ２] Ｘ 供給Ｎ２ Ｘ 培養液密度 Ｘ 定数）。
【００５８】
本明細書において、“炭素発生率”又は“ＣＥＲ”は、発酵の間に反応器において生成するＣＯ２量の評価について用いられる。通常、ＣＯ２が反応器に供給されることはないので、全てのＣＯ２は反応器内で起こる発酵工程によって生成したものと仮定する。“オフガスＣＯ２”は、（通常は、当該技術分野に置いて公知の質量分析法により）反応器内で測定されたＣＯ２の量について用いられる。
【００５９】
本明細書において、“収率”は、生成物の量／基質の量に対して用いられる。当該収率は、重量％（生成物のグラム／基質のグラム）、又は生成物のモル数／基質のモル数として表わすことができる。例えば、基質（例えば、グルコース）の量は、供給速度及び添加したグルコースの濃度により決定できる。存在する生成物の量は、種々の分光光度的又は分析的方法論を用いて測定できる。そのような方法論の１つは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。収率の増加とは、野生型微生物を用いる転化の収率と比較した収率の増加を意味し、例えば、野生型の収率よりも１０％、２０％、又は３０％増大することに対して用いられる。
【００６０】
本明細書において、“生産酵素”という語は、基質から所望の生成物への転化を触媒し得る酵素又は酵素系について用いられる。生産酵素には、酸化酵素及び還元酵素が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００６１】
本明細書において、“酸化酵素”という語は、所定の酸化状態の基質から、基質よりも高い酸化状態の生成物への転化を触媒し得る酵素又は酵素系について用いられる。 “還元酵素”という語は、所定の酸化状態の基質から、基質よりも低い酸化状態の生成物への転化を触媒し得る酵素又は酵素系について用いられる。本明細書で開示される１の実施態様では、ＡＳＡ中間体を生産するために改変されたＰａｎｔｏｅａ細胞におけるＤ−グルコース及びその代謝物の生体触媒反応に関する酸化酵素には、例えば、Ｄ−グルコースデヒドロゲナーゼ、Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ、及び２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼが含まれる。本明細書で開示される別の実施態様では、ＡＳＡ中間体を生産するために改変されたＰａｎｔｏｅａ細胞におけるＤ−グルコース及びその代謝物の生体触媒反応に関する還元酵素には、本明細書に示すように、例えば、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸還元酵素、２−ケト還元酵素、及び５−ケト還元酵素が含まれる。そのような酵素には、宿主菌株によって天然に生産されたもの、又は組換え手段によって移入されたものが含まれる。
【００６２】
本明細書において、“炭素源”という語には、通常は微生物によって用いられる適切な炭素源が包含され、例えば、（Ｄ体又はＬ体のいずれかの）グルコース、グロース、ソルボース、フルクトース、イドース、ガラクトース、及びマンノース（ただし、これらに限定されるものではない）を含む六炭糖、又は、グルコースとフルクトースのような六炭糖の組合せ、及び／又は、２−ケト−Ｌ−グロン酸、イドン酸、グルコン酸、６−ホスホグルコン酸、２−ケト−Ｄ−グルコン酸、５−ケト−Ｄ−グルコン酸、リン酸２−ケトグルコン酸、２，５−ジケト−Ｌ−グロン酸、２，３−Ｌ−ジケトグロン酸、デヒドロアスコルビン酸、エリソルビン酸、及びＤ−マンノン酸等の六炭糖酸、又はそれらの酵素誘導体である。
【００６３】
本明細書において、以下に示す略語を適用する：Ｄ−グルコース又はグルコース（Ｇ）；Ｄ−グルコン酸又はグルコン酸（ＧＡ）；２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２ＫＤＧ）；２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸（２，５ＤＫＧ又はＤＫＧ）；２−ケト−Ｌ−グロン酸（２ＫＬＧ又はＫＬＧ）；Ｌ−イドン酸（ＩＡ）；エリソルビン酸（ＥＡ）；アスコルビン酸（ＡＳＡ）；グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）；グルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＨ）；２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸還元酵素（ＤＫＧＲ）；２−ケト−Ｄ−グルコン酸還元酵素（ＫＤＧＤＨ）；Ｄ−リボース（Ｒ）；２−ケト還元酵素（２ＫＲ又はＫＲ）；及び、５−ケト還元酵素（５ＫＲ又はＫＲ）。
【００６４】
“アスコルビン酸中間体の生産量が未改変の細菌宿主菌株におけるアスコルビン酸中間体の生産量と比較して増大するように、炭素源からアスコルビン酸中間体を生産すること”とは、基質（例えば、炭素源）を改変細菌菌株と接触させて所望の最終生成物を生産することを意味する。本願発明者は、ゲノム発現を不活性化することにより特定の酵素活性を改変することで、当該微生物が最終生成物の生産量の増大をもたらすことを見出した。
【００６５】
本明細書において、“所望の最終生成物”という語は、炭素基質から生物転換される所望の化合物について用いられる。所望の最終生成物は、目的とする実際の化合物であっても、別の経路用の中間体であってもよい。所望の最終生成物の例を表３の右側に列挙する。
【００６６】
本明細書において、細菌という語は、原核生物、すなわち膜に囲まれた核及びオルガネラを有しない任意の微生物について用いられる。すべての細菌は、細胞に出入りする物質の流れを調節する脂質膜に囲まれている。脂質細胞壁は、細菌を完全に取り囲んでおり、膜の外側に存在する。種々のタイプの細菌が存在するが、それらには、腸内細菌科、バチルス科、ストレプトミセス科、プソイドモナス科、及びエルウィニア科に属する菌株が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００６７】
本明細書において、“腸内細菌”という分類は、グラム陰性であって通性嫌気性であるという一般的特徴を有する細菌菌株について用いられる。それらには、大腸菌、赤痢菌、エドワードシエラ、サルモネラ、シトロバクター、クレブシエラ、エンテロバクター、セラチア、プロテウス、モルガネラ、プロビデンシア、及びエルシニア等の属が含まれる。ＡＳＡ中間体の生産のための好ましい腸内細菌科菌株は、Ｄ−グルコースから、又は菌株によりＤ−グルコースに転化され得る炭素源から２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を生産できるものである。Ｄ−グルコース溶液から２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を生産することができる腸内細菌科には、例えば、エルウィニア属、エンテロバクター属、グルコノバクター属、及びＰａｎｔｏｅａ属が含まれる。炭素源からＡＳＡへの微生物経路（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐａｔｈｗａｙ）における中間体には、ＧＡ、ＫＤＧ、ＤＫＧ、ＤＫＧ、ＫＬＧ、ＩＡ、及びＥＡが含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。本発明において、ＡＳＡ中間体の生産のための好ましい腸内細菌発酵菌株は、Ｐａｎｔｏｅａ種であり、特に、Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａである。ＡＳＡ中間体を生産するその他の腸内細菌菌株には、大腸菌及びグルコノバクターが含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００６８】
本明細書において、“バチルス”という分類は、グラム陽性であって、特定の環境条件の下で胞子を線参することができるという一般的特徴を有する桿菌様の細菌菌株について用いられる。
【００６９】
本明細書において、“組換え”という語は、微生物において天然に発生しない核酸の添加、又は宿主細胞において天然に発生する拡散の修飾等によって、ゲノムが修飾されている宿主細胞について用いられ、それには、組換え手段により移入された内因性核酸の更なる複製を有する宿主細胞が含まれる。本明細書において、“異種”という語は、宿主細胞において天然に発生したものではない核酸又はアミノ酸配列について用いられる。本明細書において、“内因性”という語は、宿主において天然に発生する核酸について用いられる。
【００７０】
本明細書において、“単離された”又は“精製された”という語は、天然に結び付いた少なくとも１の成分から除去された酵素、核酸、タンパク質、ペプチド、補因子について用いられる。本発明では、単離された核酸には、当該核酸を含むベクターが含まれ得る。
【００７１】
サッカライドの酸誘導体は、溶液中で又は固体の場合にはそれが調製された溶液の外で、周囲の媒質に依存して種々のイオン化状態で存在し得ることが、当該技術分野においては周知である。そのような分子を表わすために用いられる語（例えば、イドン酸など）は、当該有機分子の全てのイオン化状態を含むことを意図するものである。従って、例えば、“イドン酸”、その環状形態である“イドノラクトン”、及び“イドン酸塩”は、同じ有機部位について用いられ、特定のイオン化状態や化学式を特定することを意図するものではない。
【００７２】
本明細書において、“ベクター”という語は、１以上の細胞型の形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のために設計されたポリヌクレオチド構築物について用いられる。それらには、例えば、挿入ヌクレオチドの単離、繁殖、複製のために設計された“クローニングベクター”、又は、宿主細胞（例えば、Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ又は大腸菌の宿主細胞）におけるヌクレオチド配列の発現のために設計された“発現ベクター”が含まれる。
【００７３】
本明細書において同義に用いられる“ポリヌクレオチド”と“核酸”という語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態であって、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドについて用いられる。これらの語には、１本鎖、２本鎖又は３本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、或いは、プリン塩基及びピリミジン塩基又はその他の天然ヌクレオチド塩基、化学的、生化学的に修飾された非天然又は誘導されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。当該ポリヌクレオチドの骨格には、（ＲＮＡやＤＮＡに典型的に見られるような）糖及びリン酸基、或いは、修飾又は置換された糖又はリン酸基を含むことができる。または、当該ポリヌクレオチドの骨格には、ホスホルアミデート等の合成サブユニットのポリマーを含むことができ、従って、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート（Ｐ−ＮＨ２）、又はホスホルアミデート−ホスホジエステルの混合オリゴマーであることができる。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４巻、１８４１−８頁（１９９６年）；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４巻、２３１８−２３頁（１９９６年）；Ｓｃｈｕｌｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４巻、２９６６−７３頁（１９９６年）を参照。ホスホジエステル連結の代わりに、ホスホチオエート連結を用いることもできる。Ｂｒａｕｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１巻、２０８４−９頁；Ｌａｔｉｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２巻、１０５７−１０６４を参照。さらに、相補鎖を合成し、当該鎖を適切な条件下でアニールすることにより、又は、適切なプライマーを有するＤＮＡポリメラーゼを用いて初めから相補鎖を合成することにより、化学合成の１本鎖ポリヌクレオチド生成物から２本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。ポリヌクレオチド配列（配列番号に用いられているもの等）の参照には、相補的も含まれる。
【００７４】
ポリヌクレオチドの非限定的な例は、遺伝子又は遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーである。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログ等）、ウラシル、及び、その他の糖及び連結基（例えば、フルオロリボース及びチオエート等）、及び分枝ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド以外の成分によって分断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば標識化成分との接合等により、重合の後にさらに修飾することもできる。この定義に含まれるその他の型の修飾は、キャップ（ｃａｐ）、１以上の天然発生ヌクレオチドのアナログを用いる置換、及び、ポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識化成分、その他のポリヌクレオチド、又は固体支持体へ接続する手段の導入である。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。本明細書において、ＤＮＡは、Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧ塩基だけでなく、これら塩基の任意のアナログ又は修飾形（例えば、メチル化ヌクレオチド）、ヌクレオチド間の修飾（無電荷の連結及びチオレート）、糖アナログの使用、及び、修飾された及び／又は別の骨格構造（例えば、ポリアミド）も含まれる。
【００７５】
ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域は、別の配列に対して特定の比率（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％）の“配列同一性”を有し、これは、２つの配列を位置合わせさせて比較した場合に同一になる塩基の割合を意味する。この位置合わせ、相同性の割合又は配列同一性は、当該技術分野において公知のソフトウェアプログラムを用いて決定でき、それらは、例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、補遺３０、セクション７．７．１８．、１９８７年に説明されている。好ましい位置合わせプログラムは、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）であり、好ましくは、以下の規定パラメーターが用いられる：ミスマッチ＝２、オープンギャップ＝０、エクステンドギャップ＝２。
【００７６】
“配列番号に”示すポリヌクレオチド配列とは、当該配列が配列番号における同一の連続配列として存在することを意味する。当該語には、配列番号に含まれる全配列と同様に、当該配列番号の配列の一部または領域も包含する。
【００７７】
“発現”には、転写及び／又は翻訳が含まれる。
【００７８】
本明細書において、“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”及びその同族語は、包括的な意味で用いられ、すなわち、“含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”という語及びその同族語と等価である。
【００７９】
冠詞である“Ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”には、特に明確に指示しない限り、複数の参照が含まれる。
【００８０】
酵素活性
リン酸エステルが、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、及びヘプトースと遭遇する。全ての糖のリン酸化は、代謝の初期ステップである。従って、グルコースは、リン酸化されてグルコース６−リン酸となることができる。グルコースを代謝し得る全ての細胞は、以下の反応
Ｍｇ２＋ 
グルコース  ＋  ＡＴＰ  →  グルコース６−リン酸  ＋  ＡＤＰ
を触媒する特定の形態のヘキソキナーゼを含有する。図９は、Ｄ−グルコースを示すものであり、“６番目の炭素”を説明している。ヘキソキナーゼ類の例には、ヘキソキナーゼ（Ｆｒｏｈｌｉｃｈら、Ｇｅｎｅ、３６巻、１０５−１１１、１９８５年）、及びグルコキナーゼ（Ｆｕｋｕｄａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５６巻、９２２−９２５頁、１９８３年）が含まれる。Ｐ．ｃｉｔｒｅａからのグルコキナーゼ構造遺伝子のＤＮＡ配列を図４に示す。制限酵素Ｎｃｏｌ（ＣＣＡＴＧＧ）及びＳｎａＢｌ（ＴＡＣＧＴＡ）に対する認識部位を強調して示す。図５は、Ｐ．ｃｉｔｒｅａからのグルコキナーゼ遺伝子のタンパク質配列を示すものである。ほとんどのヘキソキナーゼは、いくぶん非特異的であり、マンノース、フルクトース、及びガラクトースの６−リン酸エステル形成を触媒する能力を示すことが有る。さらに、その他のヘキソース誘導体も、また、ヘキソキナーゼによってリン酸化され得る。例えば、グルコース（図３）も、また、キナーゼ、特にグルコキナーゼ（列記）によってリン酸化され得る。Ｐ．ｃｉｔｒｅａからのグルコン酸キナーゼ構造遺伝子の配列を図６に示す。制限酵素Ｐｓｔ  ｌ（ＣＴＧＣＡＧ）に対する認識部位を強調して示す。Ｐ．ｃｉｔｒｅａからのグルコン酸キナーゼ遺伝子のタンパク質配列を図７に示す（配列番号４）。グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼ（ｇｌｋ、ｇｎｔｋ等）に対する遺伝子のいくつかを図８に示す。
【００８１】
図１７は、異化経路と酸化経路の相互関係を示すものである。グルコースは、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ）によるグルコースからグルコース−６−リン酸へのリン酸化により解糖経路を経て、及び、グルコン酸キナーゼ（Ｇｎｔｋ）によるグルコン酸からグルコン酸−６−リン酸へのリン酸化によりペントース経路を経て、異化経路に入ることができる。ｇｌｋ及び／又はｇｎｔｋをコード化する核酸又はポリペプチドの修飾により当該グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼのレベルを不活性化又は修飾することによって、所望の生成物（例えば、アスコルビン酸中間体等）の収率の向上がもたらされる。遺伝子組換えを用いて、所望の生成物の合成に必要な酵素反応と異化機能の間の連絡路（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）が切断される。１の実施態様ではグルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼは修飾されるが、本発明では、その他の酵素経路を修飾して同様の脱共役（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ）酸化、脱共役異化経路を達成できるということも考慮する。
【００８２】
別の実施態様では、異化経路は、５−ＫＤＧ及び／又は酒石酸塩の生産を向上するために生産経路から切り離される。図２１に示すように、グルコースは、（例えば、グルコース−６−リン酸を経る）解糖経路、グルコン酸−６−リン酸を経るペントース経路、及びイドン酸塩及び２−ＫＬＧ等のその他のアスコルビン酸副生成物を経て、異化経路に入る。グルコキナーゼ、グルコン酸キナーゼ、２，５−ＤＫＧ還元酵素、５−ケト−Ｄ−グルコン酸５−還元酵素（ｉｄｎＯ）、及びイドン酸５−デヒドロゲナーゼ（ｉｄｎＤ）のレベルを、これらをコード化する核酸又はポリペプチドの修飾により不活性化又は修飾することによって、所望の生成物（例えば、５−ＤＫＧ及び／又は酒石酸塩）の収率の向上がもたらされる。
【００８３】
別の実施態様では、異化経路は、グルコン酸の生産を向上するために生産経路から切り離される。図１８に示すように、グルコースは、（例えば、グルコース−６−リン酸を経る）解糖経路、グルコン酸−６−リン酸を経るペントース経路を経て、異化経路に入る。グルコキナーゼ、グルコン酸キナーゼ、及びグリセルアルデヒドヒドロゲナーゼのレベルを、これらをコード化する核酸又はポリペプチドの修飾により不活性化又は修飾することによって、所望の生成物（例えば、グルコン酸）の収率の向上がもたらされる。
【００８４】
別の実施態様では、異化経路は、エリソルビン酸の生産を向上するために生産経路から切り離される。図１９に示すように、グルコースは、（例えば、グルコース−６−リン酸を経る）解糖経路、グルコン酸−６−リン酸を経るペントース経路を経て、及び、２−ＫＤＧ及び２，５−ＫＤＧを細胞質へ輸送する酵素輸送系により、異化経路に入る。グルコキナーゼ、グルコン酸キナーゼ、２−ＫＤＧヒドロゲナーゼ、及び細胞質への２−ＫＤＧ輸送系のレベルを、これらをコード化する核酸又はポリペプチドの修飾により不活性化又は修飾することによって、所望の生成物（例えば、エリソルビン酸）の収率の向上がもたらされる。
【００８５】
別の実施態様では、異化経路は、２，５−ＤＫＧの生産を向上するために生産経路から切り離される。図２０に示すように、グルコースは、（例えば、グルコース−６−リン酸を経る）解糖経路、グルコン酸−６−リン酸を経るペントース経路を経て、及び、２−ＫＤＧ及び２，５−ＫＤＧを細胞質へ輸送する酵素輸送系により、異化経路に入る。グルコキナーゼ、グルコン酸キナーゼ、２−ＫＤＧヒドロゲナーゼ、及び細胞質への２−ＫＤＧ輸送系のレベルを、これらをコード化する核酸又はポリペプチドの修飾により不活性化又は修飾することによって、所望の生成物（例えば、２，５−ＤＫＧ）の収率の向上がもたらされる。
【００８６】
外部（ｆｏｒｅｉｇｎ）宿主における酵素発現を生じさせる組換え技術の有効性により、異化経路に転用される炭素基質の量を減少させつつ、容易に入手可能な炭素基質からアスコルビン酸中間体を生産するという本発明の目的が達成できる。この方法は、異化経路に転用され所望の酸化最終生成物（例えば、アスコルビン酸中間体等）への転化に利用できない基質の量を減少できるという点において、現在用いられている方法よりも著しく有益である。これは、野生型微生物を用いる発酵よりも、優れた発酵効率及び収率の向上をもたらす。特定の野生型微生物でもアスコルビン酸中間体（例えば、２−ＫＬＧ等）を生産できるが、その生産量は、経済的実用性が十分ではない。
【００８７】
野生型Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａは、グルコースから中心代謝経路に用いられるリン酸化誘導体への転化及びエネルギー（ＡＴＰ）の消費を必要とするその生産を可能とする、グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼを自身の細胞質内に有し、より多くの炭素を２−ＫＬＧ以外の生産経路に送ることが観測された。同様の制御条件下及び本明細書に記載の２つの分断プラスミドにおいて以下に記載する本発明の方法を用いて、グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼ遺伝子がＰ．ｃｉｔｒｅａから削除されることができ、それにより修飾Ｐ．ｃｉｔｒｅａは、野生型の場合と比較して向上した生産量（例えば、６３％乃至約９７−９８％の収率）のＤＫＧをグルコースから生産できる（実施例６参照）。
【００８８】
本発明に含まれる単一の微生物転化物を生産するための１つのアプローチは、上述の欠失キナーゼに対する発現ベクターを構築すること、及び、通常の代謝物を当該酵素に対する２，５−ＤＫＧ基質へ初期転化できる細胞内へ上述した任意の遺伝子導入手段（例えば、形質転換、形質導入、接合等）により当該ベクターを移転させることを含む。以下の実施例において説明するように、当該遺伝子導入によって、アスコルビン酸中間体の生産量の増大によって特徴付けられる微生物がもたらされる。ベクターの構築、遺伝子導入、及び結果として得られる微生物の使用についての詳細は、本明細書において説明する。
【００８９】
別のアプローチは、グルコース又はその他の通常の代謝物を酵素含有微生物からの２，５−ＤＫＧへ転化することができる酵素をコード化する遺伝子をクローン化すること、これらのクローン化遺伝子を含有する発現ベクターを構築すること、及び、そのようなベクターを（通常は）２，５−ＤＫＧ還元酵素を生産する細胞に移転することである。２，５−ＤＫＧへの通常の代謝物の転化に有効な酵素の例は、Ｄ−グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｏ．Ａｄａｃｈｉら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４４巻（２）、３０１−３０８頁、１９８０年；Ｍ．Ａｍｅｙａｍａら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４５巻（４）、８５１−８６１頁、１９８１年）、Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｗ．ＭｃＩｎｔｉｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２３１巻、６５１−６５４頁、１９８５年；Ｅ．Ｓｈｉｎａｇａｗａら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４０（３）巻、４７５−４８３頁、１９７６年；Ｅ．Ｓｈｉｎａｇａｗａら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４２（５）巻、１０５５−１０５７頁、１９７８年）、５−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ及び２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｓｈｉｎａｇａｗａら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４５（５）巻、１０７９−１０８５頁、１９８１年）である。第３のアプローチは、通常の代謝物を２−ＫＬＧへ転化させることを含む、酵素の全配列を中性の宿主へ移転することである。当該最後のアプローチは、どのような望ましい成長特性と栄養上の要求を有する場合でも、ほぼ随意に宿主微生物を選択できるという利益を提供する。従って、培養及び成長において妥当な実験経過を有する微生物（例えば、大腸菌及びバチルス等）の宿主細胞としての使用により、酵素又は基質の細菌性生産を含む他の手順と共に均一性という利点が得られる。
【００９０】
いったん転化反応を行うことができる微生物が得られると、本発明の方法は、組換え酵素に対する発現ベクター構築物の性質及び宿主細胞の成長特性に依存して種々の方法において実施できる。典型的には、宿主微生物は、細胞の大規模生産に好ましい条件の下で成長される。多数の細胞が蓄積すると、組換え遺伝子の配列を供給するプロモーターは活性となり（または、すでに活性であり）、これにより、コード配列の転写及び翻訳が可能となる。これらの遺伝子が発現し、それゆえ酵素の所望の触媒量存在する場合、グルコース等の出発物質が１−５００ｇ／Ｌの量で培養液に添加され、当該培養液は、２−ＫＬＧへの転化が達成するまで１−３００時間の間２０℃乃至約４０℃、好ましくは２５℃―３７℃付近に維持される。出発物質の濃度は連続的な供給制御により一定レベルに維持されることができ、生成する２−ＫＬＧは、公知の手段によりバッチ法で又は連続的に培養液から回収される。
【００９１】
本発明にかかわる一般法
以下に記載する実施例において、プローブの構築、スクリーニング、プローブと所望の物質のハイブリダイゼーション、及びベクターの構築に関連して以下の一般方法を用いた。
【００９２】
プラスミドの単離、制限酵素を用いる切断
プラスミドは、Ｄ．Ｂ．Ｃｌｅｗｅｌｌ及びＨｅｌｉｎｓｋｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９巻、４４２８頁、１９７０年（これは引用により本明細書中に取込まれる）に記載の透明溶解液法（ｃｌｅａｒｅｄ  ｌｙｓａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、特定された培養液から単離した。Ｈ．Ｃ．Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７巻、１５１３頁、１９７９年に記載の方法を用いて、少量（ミニプレップ）を調製した。
【００９３】
約２０マイクロリットルのプラスミドを、用いた制限酵素に適切なバッファー又はバッファー配列を含有する約６００マイクロリットルにおける１０−５０ユニットの適切な制限酵素又は制限酵素配列で処理することにより、クローン化したプラスミドの断片を配列決定のために調製した。各酵素の培養は、３７℃で１時間行った。各酵素の培養の後、フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈降操作により、タンパク質を除去し核酸を回収した。
【００９４】
図１に示すように、異化経路、ペントース経路、及びトリカルボン酸（ＴＣＡ）経路には、複数の重なり合った関連性が存在する。ここで、ＧＤＨ＝グルコースデヒドロゲナーゼ、ＧＡＤＨ＝グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２−ＫＤＧＨ＝２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２−ＫＤＧ＝２−ケト−Ｄ−グルコン酸、ＩＡＤＨ＝イドン酸塩デヒドロゲナーゼ、２，５−ＤＫＧ＝２，５−ジケトグルコン酸、２ＫＬＧ＝２−ケト−Ｌ−グルコン酸、５−ＫＤＧ＝５−ケト−Ｄ−グルコン酸、２ＫＲ＝２−ケト還元酵素、２，５ＤＫＧＲ＝２，５−ジケトグルコン酸還元酵素、ＧｌｋＡ＝グルコキナーゼ、ＧｎｔＫ＝グルコン酸キナーゼ、５−ＫＲ＝５−ケト還元酵素である。図から明らかなように、グルコキナーゼ活性の除去により異化経路へのグルコースの参入が阻害され、一方、グルコン酸キナーゼ活性の除去により、グルコン酸はペントース同化経路へ参入できない。このスキームから、グルコキナーゼ活性及び／又はグルコン酸キナーゼ活性が存在しないことによって、グルコースの代謝物及びその酸化生成物が減少することが明らかである。
【００９５】
ＡＳＡ中間体の生産
本発明は、宿主細胞においてアスコルビン酸中間体を生産する方法を提供するものである。本発明は、培養の一部又は全部の期間において、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性のレベル及び／又はＤ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性のレベルが減少される方法を包含する。本発明は、培養の一部又は全部の期間において、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性のレベル及び／又はＤ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性のレベルが増大される方法を包含する。本発明は、また、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性のレベル及び／又はＤ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性のレベルが、培養の初期段階では成長を促進するために（すなわち、細胞バイオマスを生産するために）修飾されておらず又は増大され、及び、培養におけるその後の段階では所望の生産物の蓄積を促進するために減少される方法を包含する。
【００９６】
本発明は、宿主微生物において酸化経路を異化経路から切り離す修飾核酸又はポリヌクレオチドを提供するものである。１の実施態様では、当該修飾核酸又はポリヌクレオチドは、所望の基質のリン酸化を発現するコーディングを有さず、それゆえ、リン酸化の酵素活性を不活性化する。
【００９７】
ＡＳＡ中間体は、ＡＳＡ又はエリソルビン酸塩等の所望の最終生成物へさらに転化され得る。ＡＳＡ中間体の生産においては、炭素源をＤＫＧへ転化することができる任意の宿主細胞を用いることができる。腸内細菌科の好ましい菌株は、Ｄ−グルコース溶液から２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を生産できるものであり（例えば、Ｐａｎｔｏｅａ等）、それらはＫａｇｅｙａｍａら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、４２巻、２０３−２１０頁（１９９２年）に記載されている。好ましい実施態様では、宿主細胞は、（配列番号１に示す核酸によってコード化される）内因性グルコキナーゼをコード化するポリヌクレオチドの一部又は全部の欠失、及び（配列番号３に示す核酸によってコード化される）内因性グルコン酸キナーゼをコード化するポリヌクレオチドの一部又は全部の欠失を有するＰａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａである。
【００９８】
ＡＳＡ中間体の生産は、発酵環境（すなわち、インビボ環境）又は非発酵環境（すなわち、インビトロ環境）において、又はインビボ／インビトロ環境の組合せにおいて行うことができる。以下でさらに説明する方法では、宿主細胞又はインビトロ環境は、不活性化されるリン酸活性（例えば、グルコキナーゼ配列及びグルコン酸キナーゼ配列）をコード化する切片を有する異種ゲノムをさらに含む。
【００９９】
Ａ．インビボ生体触媒環境
本発明は、ＡＳＡ中間体のインビボ生産における、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する内因性酵素活性をコード化するポリヌクレオチドに修飾を及び／又はＤ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する内因性酵素活性をコード化するポリヌクレオチドに修飾を含む宿主細胞の使用を包含する。生体触媒反応は、通常は腸内細菌菌株により使用される適切な炭素源、例えば、六炭糖（例えばグルコース等）、又は六炭糖酸、或いは、六炭糖及び／又は六炭糖酸の組合せの存在する環境において宿主細胞を培養する工程から始まる。その他の炭素源には、ガラクトース、ラクトース、フルクトース、又はそれらの酵素誘導体が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。適切な炭素源に加えて、発酵培地は、適切なミネラル、塩類、補因子、バッファー、及び、所望の最終生成物の生産に必須な酵素経路の促進及び培養物の成長のために当該技術分野の当業者に公知のその他の成分を含む。
【０１００】
インビボのＰａｎｔｏｅａ経路についての１の例では、Ｄ−グルコースは、酵素転化を経る一連の膜酸化工程を受け、それらには、ＧＡ、ＫＤＧ、及びＤＫＧを含む（ただし、これらに限定されるものではない）中間体を与えるための酵素であるＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ、Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ、及び２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼが含まれ得る（図１参照）。これらの中間体は、酵素転化を経る一連の細胞内還元工程を受け、それらには、ＫＬＧ及びＩＡを含む（ただし、これらに限定されるものではない）最終生成物を与えるための酵素である２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸還元酵素（ＤＫＧＲ）、２−ケト還元酵素（２−ＫＲ）、及び５−ケト還元酵素（５−ＫＲ）が含まれ得る。ＡＳＡ中間体生産のためのインビボ環境の好ましい実施態様では、５−ＫＲ活性はＩＡの消費を抑制するために欠失される。別の実施態様は、所望の生成物及び不活性化のための所望の経路に依存して、その他の所望の不活性化核酸切片を有する。
【０１０１】
ＫＬＧが所望の中間体である場合、ＤＫＧＲをコード化する核酸は、組換え技術によりＰａｎｔｏｅａ発酵菌株中に導入される。多数の細菌種、特に、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、及びアルスロバクター属を含むコリネフォルム類に属するものは、ＤＫＧＲを含むことが分かっている。
【０１０２】
本発明における特定の実施態様では、コリネバクテリウムｓｐ．菌株ＳＨＳ７５２００１からの２，５−ＤＫＧＲ（Ｇｒｉｎｄｌｅｙら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５４巻、１７７０−１７７５頁、１９８８年）が、組換え技術によりＰａｎｔｏｅａ菌株中に導入される。Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａによる組換え２，５−ＤＫＧ還元酵素の生産が、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５，００８，１９３号に開示されている。ＤＫＧ還元酵素のその他の源を、表１に示す。
【０１０３】
当該発酵は、バッチ工程又は連続工程において実施され得る。バッチ工程においては、添加されるものにかかわらず、全ての培養液が同時に収穫される。連続工程においては、培養液は定期的に下流の工程のために除去され、新たな基質が添加される。生成する中間体は、イオン交換樹脂、吸着又はイオン遅延樹脂、活性炭、濃縮−結晶化、膜透過などを含む種々の方法により、発酵培地から回収され得る。
【０１０４】
Ｂ．インビトロ生体触媒環境
本発明は、インビトロ又は非発酵環境において（例えば、バイオリアクターにおいて）、炭素源からのＡＳＡ中間体（例えば、ＫＤＧ、ＤＫＧ、及びＫＬＧ等）の生体触媒反応による生産を提供するものである。まず、成長ために細胞が培養され、非発酵工程のために、成長に利用される炭素源が除去され、ｐＨは約ｐＨ４及び約ｐＨ９の間に維持され、酸素は存在する。
【０１０５】
生産される所望の中間体に依存して、当該工程には、酵素補因子の存在が必要となる場合がある。本明細書に記載する好ましい実施態様では、当該酵素補因子は再生される。特定の実施態様では、ＫＤＧが所望のＡＳＡ中間体であり、バイオリアクターには、通常はＤ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する内因性酵素活性をコード化するポリヌクレオチドにおける修飾及び／又はＤ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性をコード化するポリヌクレオチドにおける修飾を有する、生育可能な又はそうでない（ｖｉａｂｌｅ  ｏｒ  ｎｏｎ−ｖｉａｂｌｅ）Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ宿主細胞が提供される。この実施態様では、宿主細胞は、また、グルコキナーゼ（ｇｌｋ）活性及びグルコン酸キナーゼ（ｇｎｔｋ）活性をコード化する遺伝子に変異を有する。この実施態様では、炭素源は、生体触媒反応により２つの酸化工程を経てＫＤＧに転化され、ここで、異化経路に用いられる基質（グルコース又はグルコン酸）の損失は減少する。この実施態様では、野生型の場合と比較して、所望の中間体の収率は向上する。
【０１０６】
ＤＫＧが所望のＡＳＡ中間体である場合、バイオリアクターには、通常はＤ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する内因性グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼ酵素活性をコード化するポリヌクレオチドにおける修飾及び／又はＤ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性をコード化するポリヌクレオチドにおける修飾を有する生育可能な又はそうでないＰａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ宿主細胞、及び、生体触媒反応により３つの酸化工程を経てＤＫＧに転化される炭素源が提供される。この実施態様では、補因子を再生する必要はない。
【０１０７】
ＫＬＧが所望のＡＳＡ中間体である場合、バイオリアクターには、グルコースを異化経路に転用する内因性酵素活性をコード化しない又はコード化できない（例えば、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する能力を有しない）ポリヌクレオチドにおける修飾及び／又はＤ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性をコード化しない又はコード化できないポリヌクレオチドにおける修飾を有する生育可能な又はそうでないＰａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ宿主細胞、及び、生体触媒反応により３つの酸化工程と１の還元工程を経てＫＬＧに転化される炭素源（例えば、Ｄ−グルコース）が提供される。この実施態様では、還元酵素活性は、Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ宿主細胞内に含まれる核酸又は細胞外から（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｙ）供給される核酸によってコード化され得る。この実施態様では、最初の酸化酵素活性には補因子の酸化体が必要であり、還元酵素活性には補因子の還元体が必要である。本明細書に記載の好ましい実施態様では、Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ細胞は天然に発生するＧＤＨ活性を除去するために修飾され、及び、異種ＧＤＨ活性（例えば、Ｔ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｎｉｇｕｔｔａｌａｔｕｓ、又はバチルス種から得ることができ、かつ、ＮＡＤＰＨ＋に対する特異性を有するもの）は、１の補因子を必要とし再生する補因子再循環システムを提供するために、Ｐａｎｔｏｅａ細胞中に導入される。この実施態様では、宿主細胞は、２，５−ＤＫＧ還元酵素活性をコード化する核酸をさらに含み、又は、当該２，５−ＤＫＧ還元酵素は細胞外からバイオリアクターへ添加される。
【０１０８】
ＫＬＧを生産するための別の実施態様では、バイオリアクターには、Ｄ−グルコースを６番目の炭素原子においてリン酸化する内因性酵素活性をコード化する核酸における及び／又はＤ−グルコン酸を６番目の炭素原子においてリン酸化する酵素活性をコード化するポリヌクレオチドにおける修飾を有し、さらに、膜結合ＧＤＨをコード化する核酸、適切な酵素及び補因子を含むＰａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ細胞が添加され、ＤＫＧに転化されるＤ−グルコン酸が添加される。当該ＧＤＨはグルコースをＧＡに転化し、還元酵素はＤＫＧをＫＬＧに転化する。一方、補因子は再循環される。これらの反応が完了すると、酸素の添加によりＧＡがＤＫＧに転化されて、循環は継続する。
【０１０９】
インビトロ生体触媒工程では、炭素源及びそれらの代謝物は、宿主細胞の細胞内環境の外で起こることがあり及び当該宿主細胞に関する酵素活性を活用する、酵素酸化工程又は酵素酸化と酵素還元の工程を通過し、さらに、所望のＡＳＡ中間体を生産する経路を通過する。当該酵素工程は、バイオリアクター内で連続的に又は同時に行うことができ、そのいくつかは、所望のＡＳＡ中間体を生産するために補因子を必要とする。本発明は、宿主細胞が有機基質で処理されるインビトロ工程であって、当該細胞は生育不能であるが、酵素は、なおも、炭素源からＡＳＡ中間体への生体触媒反応において所望の炭素源及び／又はそれらの代謝物を酸化し還元することができる工程を包含する。
【０１１０】
バイオリアクターは、バッチ工程又は連続工程において実施され得る。バッチ工程においては、添加されるものにかかわらず、全ての培養液が同時に収穫される。連続工程においては、培養液は定期的に下流の工程のために除去され、新たな基質が添加される。生成する中間体は、イオン交換樹脂、吸着又はイオン遅延樹脂、活性炭、濃縮−結晶化、膜透過などを含む種々の方法により、発酵培地から回収され得る。
【０１１１】
特定の実施態様では、必須の酵素活性が、異化経路への炭素源又はそれらの誘導体の部分の取込みを減少させつつ、当該炭素源又はそれらの誘導体を転化する能力を維持する限りは、宿主細胞は、透過性を上げ又は凍結乾燥される（Ｉｚｕｍｉら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、６１巻、１３５−１４２頁、１９８３年）。バイオリアクターは、細胞外から提供される特定の酵素活性を用いて、及び、当該酵素活性を安定化し又は増大させる溶媒又は長鎖ポリマーが提供される環境において行われる。
【０１１２】
Ｃ．ＡＳＡを生産する宿主細胞
宿主細胞の炭水化物経路をＡＳＡ中間体（例えば、ＫＤＧ、ＤＫＧ、又はＫＬＧ等）に導くために必須な酸化酵素又は還元酵素が、当該宿主において天然に発生しないものである場合には、それらを当該技術分野における当業者に公知な組換えＤＮＡ技術を用いて導入することができる。または、望ましくない異化経路を阻害する酵素を、組換えＤＮＡ法により不活性化することができる。本発明は、所望の経路の達成に必須な任意の酵素又は中間体を組換え技術により導入し又は不活性化することを包含する。
【０１１３】
特定の実施態様では、ＡＳＡの生産において、潜在プラスミドにより保存された（ｃｕｒｅｄ）腸内細菌科菌株が用いられる（ＰＣＴ  ＷＯ９８／５９０５４参照）。
【０１１４】
特定の実施態様では、ＡＳＡ中間体の生産に用いられる宿主細胞は、Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａである（例えば、ＡＴＣＣ受託番号３９１４０号）。Ｐａｎｔｏｅａ種におけるＡＳＡ中間体の生産に用いられ得る酸化酵素又は還元酵素をコード化する核酸の供給源には、以下のものが含まれる。
【０１１５】
【表１】
2005510999.tif 000002
【０１１６】
Ｄ．ＡＳＡ中間体の回収
ＡＳＡ中間体が生成すると、凍結乾燥、結晶化、噴霧乾燥（ｓｐｒａｙ−ｄｒｙｉｎｇ）、及び電気透析などを含む当該技術分野における当業者に公知な任意の手段により、当該ＡＳＡ中間体が回収され及び／又は精製され得る。ＡＳＡ及びＡＳＡ中間体（例えば、ＫＬＧ等）を精製するための電気透析法は、例えば、米国特許第５７４７３０６号（１９９８年５月５日発行）及び米国特許第４７６７８７０号（１９９８年８月３０日発行）に説明されている。或いは、当該中間体は、発酵培地又はバイオリアクターから直接的に形成されて、粉状され又は液剤にされることもできる。
【０１１７】
本発明の方法により生産されるＫＬＧは、当該技術分野における当業者に公知の手段によよって、さらにアスコルビン酸及びエリソルビン酸塩に転化され得る（例えば、Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ及びＧｒｕｓｓｎｅｒ、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．、１７巻、３１１−３２８頁（１９３４年）を参照）。アスコルビン酸は、４つの立体異性体が可能である：Ｌ−アスコルビン酸、Ｄ−アラボアスコルビン酸（エリソルビン酸、ビタミンＣ活性を示す）、Ｌ−アラボアスコルビン酸、及びＤ−キシロアスコルビン酸。
【０１１８】
Ｅ．分析条件
ＡＳＡ中間体、ＡＳＡ、及びＡＳＡ立体異性体を検出する方法には、２，６−ジクロロインドフェノール又はその他の適切な試薬を用いる酸化還元滴定（Ｂｕｒｔｏｎら、Ｊ．Ａｓｓｏｃ．Ｐｕｂ．Ａｎａｌｙｓｔｓ、１７巻、１０５頁、１９７９年）；アニオン交換を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．、１９６巻、１６３頁、１９８０年）；及び電気的酸化還元方法（Ｐａｃｈｉａ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、４８巻、３６３頁、１９７６年）の使用が含まれる。当業者は、これらの検出法を用いる際の調整について十分知識を有するであろう。
【０１１９】
発酵培地：
本発明における発酵培地には、適切な炭素源を含有することが必要であり、それらには、グルコース等の単糖類、ラクトースやスクロース等のオリゴ糖、澱粉やセルロース等の多糖類、及び、再生可能な供給原料（例えば、乳清透過物、コーンスティップリカー、甜菜の糖蜜、及び大麦の麦芽）に由来する未精製混合物が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。さらに、当該炭素源には、炭素等の一炭素（ｏｎｅ−ｃａｒｂｏｎ）基質も含まれ得る。本発明に用いられる炭素源は、種々の炭素含有基質を包含することができ、それは微生物の選択によってのみ制限されることを考慮すると、好ましい炭素基質にはグルコース及び／又はフルクトース、及びそれらの混合物が含まれる。本明細書に記載の修飾ゲノムと組合せてグルコースとフルクトースの混合物を用い、さらに、異化経路を酸化経路と切り離すことによって、宿主細胞の代謝の要求を満たすためにフルクトースを用いつつも、所望のアスコルビン酸中間体の収率及び転化率の向上のためにグルコースを用いることができる。上述の炭素源は、全て本発明において適切なものであるが、炭水化物であるグルコース、フルクトース、又はスクロースが好ましい。当該炭素基質の濃度は、約５５重量％乃至約７５重量％である。好ましくは、当該濃度は約６０乃至約７０重量％である。最も好ましくは、６０重量％乃至６７重量％が用いられる。
【０１２０】
適切な炭素源に加えて、発酵培地は、アスコルビン酸中間体の生産に必須な酵素経路の促進、及び成長又は培養に適した、適切なミネラル、塩類、ビタミン類、補因子、及びバッファーを含有する必要がある。
【０１２１】
培養条件：
予備培養：
細胞培養は、適切な培地において、典型的には２５乃至３２℃、好ましくは約２８乃至２９℃で成長させる。実施例には用いた成長培地が記載されているが、本発明において有用なその他の成長培地の例は、広く商業的に調製されている培地であって、例えば、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培養液、サブローデキストロース（ＳＤ）培養液、又は酵母培地（ＹＭ）等である。その他の確立した又は合成培地も用いることができ、特定の微生物の成長に適切な培地は微生物学又は発酵科学の分野における当業者に公知であろう。
【０１２２】
発酵のために好ましい適切なｐＨ範囲はｐＨ５乃至ｐＨ８であり、ここで、種フラスコ（ｓｅｅｄ  ｆｌａｓｋ）についてはｐＨ７乃至ｐＨ７．５であり、及び、反応容器についてはｐＨ５乃至ｐＨ６である。
【０１２３】
本発明の方法の実行可能性について説明してきたので、発酵微生物の分野における当業者には、アスコルビン酸中間体の生産量を最大にするためには、発酵工程に影響する多くの因子を最適化する必要があることが明らかであろう。これらの因子の多く（例えば、ｐＨ、炭素源の濃度、及び溶存酸素量など）が、アスコルビン酸中間体の生産に用いられる細胞タイプに応じて酵素工程に影響を与え得る。
【０１２４】
バッチ及び連続発酵：
本方法は、培養系における発酵にフェドバッチ法を用いる。古典的なバッチ培養は、閉鎖系であり、発酵の開始時点に培養液の組成が決定され、当該発酵の間は人為的な変更は受けない。従って、発酵の開始時点において、所望の微生物が培養液に接種されると、当該発酵の系には何も添加できない。しかしながら、典型的には、“バッチ”発酵は炭素源の添加に関するバッチであり、ｐＨや酸素濃度等の因子を制御する試みが頻繁になされる。バッチ方式では、当該方式の代謝物及びバイオマス組成物は、発酵が停止されるまで定常的に変化する。バッチ培養においては、細胞は、静的誘導期を経て高成長対数期に緩和され（ｍｏｄｅｒａｔｅ）、最終的には、成長速度が減少又は停止する静止期に至る。未処理の場合には、当該静止期の細胞は、最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞が、最終生成物又は中間体の生産の大部分を担う。
【０１２５】
標準的なバッチ方式におけるバリエーションの１つは、フェドバッチ方式である。フェドバッチ発酵工程も本発明に適しており、基質が発酵の進行と共に増加して添加されること以外は典型的なバッチ方式からなる。フェドバッチ方式は、異化の抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にあり、培養液における基質の量を制限するのが望ましい場合に有用である。フェドバッチ方式における実測基質濃度の測定は困難であり、それゆえ、例えば、ｐＨ、溶存酸素量、及び廃ガス（例えば、ＣＯ２）の分圧等の測定可能な因子の変化に基づいて推測される。バッチ及びフェドバッチ発酵は、当該技術分野において広く周知であり、その例はＢｒｏｃｋの文献に記載されている。
【０１２６】
本発明はバッチモードにおいて実施されるが、当該方法は連続発酵法にも適用できると考えられる。連続発酵は開放系であり、所定の発酵培養液が連続的にバイオリアクターへ添加され、それと同時に、同量のならし培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）が工程のために除去される。一般に、連続発酵では、培地は一定の高密度に維持され、細胞は主として対数期成長にある。
【０１２７】
連続発酵により、細胞の成長又は最終生成物の濃度に影響を与える１又はそれ以上の因子の調節が可能となる。例えば、１の方法は、栄養分（例えば、炭素源）又は固定速度の窒素量の制限を維持し、その他全ての因子の緩和を可能にする。別の方式では、培養液の濁度により測定される細胞濃度を一定に保ちつつも、成長に影響する多くの因子を連続的に変化させることができる。連続方式は定常状態の成長条件を維持することに努め、従って、排出される培養液に依存する細胞の損失は、発酵における細胞成長速度に対して均衡になる必要がある。連続発酵工程における栄養分及び成長因子を調節する方法は、生成物の生成速度を最大化する技術と同様に、工業的微生物学の分野において周知であり、種々の方法がＢｒｏｃｋの文献に記載されている。
【０１２８】
本発明は、バッチ、フェドバッチ、又は連続工程のいずれを用いても実施でき、公知の発酵モードのいずれであっても適切であると考えられる。さらに、細胞は、全細胞触媒としての基質上に固定化されることができ、アスコルビン酸中間体の生成のための発酵条件にされる。
【０１２９】
アスコルビン酸中間体の同定及び精製：
発酵培地から得た所望のアスコルビン酸中間体を精製する方法は、当該技術分野において公知である。
【０１３０】
特定のアスコルビン酸中間体は、培養液を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析することにより直接的に同定できる。本発明では、０．０１Ｎ硫酸を移動相として無勾配（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）で用いる分析用イオン交換カラムにおいて発酵培養液を分析する方法が好ましい。
【０１３１】
実施例について
一般法
細菌培養物の維持及び成長に適切な物質及び方法は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ、及びＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編集）２１０−２１３頁、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．、又はＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９年）、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ、に記載されている。細菌細胞及びその成長に用いた全ての試薬及び材料は、特に示さない限り、Ｄｉｆｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．）、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）、又はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）から入手した。
【０１３２】
予備培養又は接種（ｉｎｏｃｕｌｕｕｍ）のための成長培地は市販されており、例えば、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培養液、サブローデキストロース（ＳＤ）培養液、又は酵母培地（ＹＭ）等の製品は、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）より入手可能である。ＬＢ−５０ａｍｐは、５０マイクロｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培養液である。
【０１３３】
発酵培地：
異化の実施例における使用のために、２つの基礎発酵培地を調製した。それらを、種フラスコ培地及び発酵培地と呼ぶ。これらの基礎培地は、炭素源を変更することにより、又は他の試薬（例えば、亜硫酸塩）の添加により、修飾した。当該それぞれの培地に用いられる試薬には、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｄｉｆｃｏ  Ｓｏｙｔｏｎｅ、クエン酸ナトリウム、フルクトース、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ニコチン酸、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、及び、微量の塩（例えば、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、ただし、これらに限定されるものではない）；及び、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、グルタミン酸ナトリウム、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、塩化コリン、Ｍａｚｕ  ＤＦ−２０４（消泡剤）、ニコチン酸、パントテン酸Ｃａ、及びＨＦＣＳ（４２ＤＥ）が含まれる。ＨＦＣＳは、また、所望のグルコース対フルクトース比に従い調製することができ、例えば、２７．３ｇ／Ｌの粉末フルクトースと２５．０ｇ／Ｌの粉末グルコースからなるフルクトース／グルコース溶液である。
【０１３４】
細胞：
以下の実施例で用いた全ての市販細胞は、ＡＴＣＣから入手したものであり、本明細書ではＡＴＣＣ番号で特定する。組換えＰ．ｃｉｔｒｅａ細胞（ＡＴＣＣ３９１４０）をアスコルビン酸中間体のプロデューサー細胞（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）として用い、これらは、実施例４及び５に記載のように構築した。酵素アッセイ及びゲノム分析により、野生型菌株はグルコキナーゼ及び／又はグルコン酸キナーゼ酵素をコード化する遺伝子を含有するのに対し、菌株ＭＤＰ４１及びＤＤ６は、グルコキナーゼ、グルコン酸キナーゼをコード化する遺伝子を有しないことが明らかとなった。
【０１３５】
アスコルビン酸中間体の分析：
アスコルビン酸中間体（例えば、２−ＫＬＧ）の存在は、ＨＰＬＣ分析によって確認した。発酵反応器の試料をタンクから流出させ、Ｗａｔｅｒｓ２６９０分離モジュールとＷａｔｅｒｓ４１０示差屈折計（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）と連結したＤｉｏｎｅｘ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、製品番号０４３１１８）Ｉｏｎ  Ｐａｃ  ＡＳ  １０カラム（４ｍｍ  ｘ  ２５０ｍｍ）に装填した。
【０１３６】
アスコルビン酸中間体の生産の検出方法：
収率、ＯＵＲ、及びＣＥＲを算出する方法については、上述のとおりである。
【０１３７】
組換え方法
ベクター配列
本発明の方法に用いられる発現ベクターは、宿主細胞において機能する、酵素に関する少なくとも１のプロモーターを含む。本発明の１の実施態様では、プロモーターは選択された酵素に対する野生型プロモーターであり、本発明の別の実施態様では、プロモーターは酵素に対して異種であるが、なおも宿主細胞において機能する。本発明の１の実施態様では、酵素をコード化する核酸は、微生物のゲノム中に安定して組込まれる。
【０１３８】
特定の実施態様では、発現ベクターは、核酸の操作を容易にするために、（好ましくは、当該ベクターに特有の少なくとも１の制限エンドヌクレアーゼを含む）多重クローニング部位カセットを含有する。好ましい実施態様では、当該ベクターは、また、１以上の選択マーカーをも含む。本明細書において、選択マーカーという語は、宿主微生物において発現可能であって、ベクターを含有するこれらの宿主の選択を容易にすることができる遺伝子について用いる。そのような選択マーカーの例には、エリスロマイシン、アクチノマイシン、クロラムフェニコール、及びテトラサイクリン等の抗生物質が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。
【０１３９】
天然発生ではない酵素又は中間体を腸内細菌科の菌株へ組換え導入するために好ましいプラスミドは、ＲＳＦ１０１０であり、これは、幅広い範囲の細菌細胞（グラム陰性及びグラム陽性の細菌を含む）において複製する能力を有する、移行型であるが自己伝達型でないプラスミドである（Ｆｒｅｙら、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＩｎｃＱ  ｐｌａｓｍｉｄｓ：Ｔｈｏｍａｓ編集、Ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｇｒａｍ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、７９−９４頁、１９８９年）。Ｆｒｅｙらは、ＲＳＦ１０１０の移行特性に影響を与えることが判明した３つの領域について報告している（Ｇｅｎｅ、１１３巻、１０１−１０６頁、１９９２年）。
【０１４０】
形質転換
一般的な形質転換の手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１巻、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、第９章、１９８７年）に述べられており、それらには、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストランを用いる形質転換、及びエレクトロポレーションが含まれる。所定の宿主細胞において所望のタンパク質をコード化する核酸を導入するための種々の形質転換手法が、当該技術分野における当業者に公知である。外部から添加される経路酵素（ｐａｔｈｗａｙ  ｅｎｚｙｍｅ）の組換え技術による生産において種々の宿主細胞を用いることができ、それらには、細菌細胞、真菌細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれる。
【０１４１】
本方法の特定の実施態様では、宿主細胞は腸内細菌科のものである。腸内細菌科には、エルウィニア種、エンテロバクター種、グルコノバクター種、及びＰａｎｔｏｅａ種が含まれる。本発明において、ＡＳＡ中間体の生産のために好ましい腸内細菌科の発酵菌株は、Ｐａｎｔｏｅａ種であり、特に、Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａである。特定の実施態様では、宿主細胞は、炭素源をＫＬＧへ転化することができる経路酵素を含むＰａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａである。
【０１４２】
形質転換体の同定
宿主細胞が形質転換したかどうかは、目的の核酸の存在を示唆し得るマーカー遺伝子の発現の存在／不存在によって検出できる。しかし、その発現を確認すべきである。例えば、経路酵素をコード化する核酸がマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、当該挿入断片を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子の機能の不存在により同定され得る。または、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの制御下において経路酵素をコード化する核酸とともに位置することができる。誘導又は選択に応じたマーカー遺伝子の発現は、通常は、当該酵素の発現をも示唆する。
【０１４３】
或いは、経路酵素に対するコード配列を含み、当該酵素を発現する宿主細胞は、当該技術分野における当業者に公知の種々の手法により同定することもできる。これらの手法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、及び、核酸又はタンパク質の検出及び／又は定量のための膜、溶液、又はチップに基づく技術を含むタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイ技術が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。
【０１４４】
さらに、宿主微生物における酵素ポリヌクレオチド配列の存在は、当該酵素ポリヌクレオチド配列のプローブ、部分又は断片を用いる、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション又は増幅によって検出できる。
【０１４５】
当該技術分野における当業者は、以下の実施例を参照することで、本発明の実施における方法及び手順をより完全に理解し得る。以下の実施例は、本発明及びそれに関する請求項の範囲を制限することを意図するものではない。本明細書において参照する全ての文献及び特許公報は、引用により本明細書中に取込まれる。
【実施例１】
【０１４６】
Ｐ．ｃｉｔｒｅａ  １３９−２ａからのゲノムライブラリーの構築
ＤＮＡ−Ｐｕｒｅ（商標）ゲノムＤＮＡ単離キット（ＣＰＧ、Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）を用いて、Ｐ．ｃｉｔｒｅａゲノムＤＮＡを調製した。５０マイクログラムの当該ＤＮＡを、製造業者推薦の制限酵素Ｓａｕ３Ａ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）により部分的に消化した。当該消化生成物を１％アガロースゲルで分離し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、３−５キロベースのＤＮＡ断片をゲルから精製した。得られたＤＮＡは、ＢａｍＨ１−直線化プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）と連結（ｌｉｇａｔｅ）させた。この方法により、約１０ｘｘの異なるプラスミドのライブラリーを得た。
【実施例２】
【０１４７】
グルコキナーゼ酵素に対する構造遺伝子の単離
Ｐ．ｃｉｔｒｅａからのグルコキナーゼを伝えるプラスミドを選択するために、グルコキナーゼ遺伝子（ｇｌｋＡ）及びＰＴＳ輸送システム、菌株ＮＦ９、ｇｌｋ−を有しない大腸菌菌株にゲノムライブラリー（上記参照）を形質転換した（Ｆｌｏｒｅｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４巻、６２０−６２３頁）。形質転換の後、グルコースを唯一の炭素源として用いるＭ９培地における成長のための細胞を選択した。この戦略により、ｇｌｋ−又はｐｔｓ−変異体を補完し得るプラスミドを選択した。
【０１４８】
３７℃における培養の４８時間経過後に、多数のコロニーを確認できた。当該コロニーのいくつかをさらに精製し、それらのプラスミドを単離し、制限分析により特性評価した。全てのプラスミドが共通のＤＮＡ断片を有することが明らかとなった。
【０１４９】
これらのプラスミドをＮＦ９、ｇｌｋ−に再度形質転換した後、全てをＭ９−グルコース培地において成長させ、それらがＮＦ９、ｇｌｋ−に存在する少なくとも１の変異を補完し得ることを確認した。
【０１５０】
この方法により単離したプラスミドｐＭＤ４は、約３．９ｋｂの挿入断片を有する。当該プラスミドにおける挿入断片を配列決定した結果、大腸菌ｇｌｋＡ遺伝子と強い類似性を有する遺伝子が、約１０１０ｂｐの領域に存在することが分かった（配列番号４）。
【実施例３】
【０１５１】
相同組換えによるグルコキナーゼの不活性化
自殺ベクターを用いる相同組換えによる遺伝子の不活性化についての一般的な戦略が、既に説明されている（Ｍｉｌｌｅｒ及びＭｅｋａｌａｎｏｓ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７０巻、２５７５−２５８３頁、１９８８年）。この手法によりＰ．ｃｉｔｒｅａからのｇｌｋ遺伝子を不活性化するために、２つのプラスミド、ｐＭＤ５及びｐＭＤ６を構築した。
【０１５２】
ｐＭＤ５の構築のために、プラスミドｐＭＤ４を、製造業者に指定されたＮｃｏｌ及びＳｎａＢ１制限酵素を用いて消化した（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）。これらの酵素により生じた付着末端を、標準的な技術を用いてＴ４ポリメラーゼで平滑末端化（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）した。当該ＤＮＡを、ｐＬｏｘＣａｔ２からＳｐｅｌ−ＥｃｏＲＶ  ＤＮＡ断片として単離したｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰカセットと連結させた（Ｐａｌｍｅｒｏｓら、Ｇｅｎｅ、２４７巻、２５５−２６４頁、２０００年）。当該カセットはクロラムフェニコール耐性をコードするものである。当該ライゲーション混合物をＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｒｄ、ＣＡ）へ形質導入し、クロラムフェニコール１０マイクログラム／ｍｌにおける成長のために選択した。３７℃における培養の１８時間経過後に、いくつかのコロニーを得た。当該いくつかのコロニーのプラスミドを精製し、制限分析により特性評価した。ｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰの存在、及びｇｌｋ遺伝子におけるＮｃｏｌとＳｎａＢ１との間のＤＮＡ領域の欠失を確認した。これらの性質を有するプラスミドをｐＭＤ５と名付けた。
【０１５３】
ｐＭＤ６の構築のために、プラスミドｐＭＤ５を、ＢａｍＨ１及びＣｅｌ１１制限酵素を用いて消化した。ｌｏｘＰ−カセットにより分断したｇｌｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐＲ６Ｋｏｒｉ１から単離したＥｃｏＲＶ−Ｂｓａ１  ＤＮＡ断片と連結させた（これは未公表の結果である）。当該断片は、Ｒ６Ｋ複製起点及びカナマイシン耐性遺伝子を有する。当該ライゲーション混合物を菌株ＳＹ３２７へ形質導入し（Ｍｉｌｌｅｒ及びＭｅｋａｌａｎｏｓ、同上）、形質転換体をカナマイシン及びクロラムフェニコール（それぞれ、２０マイクログラム／ｍｌ及び１０マイクログラム／ｍｌ）を含むプレート上に選択した。３７℃における培養の２４時間経過後に、いくつかのコロニーを得た。当該いくつかのコロニーのプラスミドを精製し、制限分析により特性評価した。ｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰ及びＲ６Ｋ起点の存在を確認した。これらの性質を有するプラスミドをｐＭＤ６と名付けた。
【０１５４】
一般に、ｐＭＤ６及びＲ６Ｋ誘導体の特性の１つは、それらが、プラスミドＲ６Ｋからのｐｉｒ遺伝子を有する菌株においてしか複製ができないことである（Ｍｉｌｌｅｒ及びＭｅｋａｌａｎｏｓ、同上）。Ｐ．ｃｉｔｒｅａは、ｐｉｒ遺伝子を有さず、ｐＭＤ６の複製も行うことができない。Ｐ．ｃｉｔｒｅａ  １３９−２ａへｐＭＤ６を形質転換し、Ｃｍ（Ｒ）菌株に対し選択した後に、相同組換えによる天然遺伝子の置換を得た。グルコキナーゼ遺伝子の不活性化は、グルコキナーゼ−グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いるグルコキナーゼ活性の検出とＦｕｋｕｄａらにより説明されている検出法（Ｙ．Ｆｕｋｕｄａ、Ｓ．Ｙａｍｇｕｃｈｉ、Ｍ．Ｓｈｉｍｏｓａｋａ、Ｋ．Ｍｕｒａｔａ、及びＡ．Ｋｉｍｕｒａ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５６巻、９２２−９２５頁、１９８３年）の組合せにより確認した。グルコキナーゼ不活性が確認されたＰ．ｃｉｔｒｅａ菌株をＭＤＰ４と名付けた。さらに、１３９−２ａ又はＭＤＰ４菌株からの染色体ＤＮＡ、及び、グルコキナーゼ構造遺伝子（配列番号８、配列番号９）とハイブリダイズするプライマーを用いて得たＰＣＲ生成物のサイズを比較することにより、グルコキナーゼ遺伝子の不活性化を確認した。この手法では、ＰＣＲ生成物のサイズは、ｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰカセットがグルコキナーゼ構造遺伝子においてクローン化されたことを反映するものである。
【実施例４】
【０１５５】
ＭＤＰ４におけるクロラムフェニコール耐性マーカーの除去
ＹＥＮＢ培地（０．７５％の酵母エキス、０．８％の栄養分培養液）において３０℃で一晩成長させた後、懸濁液中のＰ．ｃｉｔｒｅａ  ＭＤＰ４０をプラスミドｐＪＷ１６８（Ｐａｌｍｅｒｏｓら、Ｇｅｎｅ、２４７巻、２５５−２６４頁、２０００年）を用いて電気的に形質転換し、それは、バクテリオファージＰ１Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子（ＩＰＴＧ誘導的）、温度感受性ｐＳＣ１０１レプリコン、及びアンピシリン耐性遺伝子を含んでいた。３０℃のＳＯＣ培地での成長において、形質転換体は、カルベニシリン（２００μｇ／ｍｌ）及びＩＰＴＧ（１ｍＭ）を補充したＬＢ寒天培地に３０℃（ｐＪＷ１６８の複製に対する許容温度）で選択した。Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｈｏｅｓｓ及びＡｂｒｅｍｓｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８１巻、３５１−３６２頁）に仲介されたｌｏｘＰにおける組換えを経る染色体クロラムフェニコール耐性遺伝子の切除のために、カルベニシリン及びＩＰＴＧを補充した新鮮なＬＢ寒天培地において、プールコロニーの一連の移転を３０℃で一晩行った。結果として得られたコロニーを、カルベニシリン及びＩＰＴＧを補充したＬＢ寒天培地にレプリカ平板化（ｒｅｐｌｉｃａ−ｐｌａｔｅｄ）し、ＬＢ寒天にクロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍｌ）を補充し、カルベニシリン耐性でありコロニーを３０℃で同定した。クロラムフェニコール感受性は、マーカー遺伝子の除去を示唆するものである。
【０１５６】
そのようなコロニーの１つを３０℃で一晩培養し、１０ｍｌのＬＢ培地を接種した。０．６のＯＤ（６００ｎｍ）までの３０℃における成長において、当該培地を３５℃で一晩培養した。いくつかの希釈液を予熱したＬＢ寒天培地に塗布し、当該プレートを３５℃（ｐＪＷ１６８の複製に許容されない温度）で一晩培養した。結果として得られたコロニーを、カルベニシリン及びＩＰＴＧを補充したＬＢ寒天培地にレプリカ平板化し、ＬＢ寒天培地にクロラムフェニコール（２００μｇ／ｍｌ）を補充し、カルベニシリン感受性であるコロニーを３０℃で同定した（これは、プラスミドｐＪＷ１６８の損失を示唆する）。そのようなｇｌｋ変異体の１つであるＭＤＰ４１を、配列番号５及び配列番号６のプライマーを用いるゲノムＰＣＲによりさらに分析し、所望のＰＣＲ生成物を得た（データは示していない）。
【実施例５】
【０１５７】
相同組換えによるグルコン酸キナーゼの不活性化
Ｐ．ｃｉｔｒｅａのグルコン酸キナーゼ遺伝子を不活性化するために用いられる一般的な戦略を図９に示す。これは、実施例３の記載のグルコキナーゼ遺伝子の不活性化に用いたものと実質的に同じである。詳細には、グルコン酸を唯一の炭素源として用いて大腸菌菌株のｇｎｔＫ、ｉｄｎＫを成長させ得るプラスミドを単離し配列決定した後に（データは示していない）、配列番号１０及び配列番号１１のプライマーを用いるＰＣＲによって、グルコン酸キナーゼに対する構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。当該約３ｋｂのＰＣＲ生成物は、Ｒ６Ｋ複製起点を含む多コピー（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ）プラスミドにおいてクローン化した。配列番号２に示すグルコン酸キナーゼ構造遺伝子中に位置する固有のＰｓｔＩ制限部位を用いて、ｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰカセットを挿入した。相同組換えにより、当該構築物をＰ．ｃｉｔｒｅａ菌株ＭＤＰ４１の染色体に移行させた。ｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰカセットによるグルコン酸キナーゼの分断の正確さを、配列番号１１及び配列番号１２のプライマーを用いるＰＣＲにより確認した。
【０１５８】
グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼのいずれも不活性である新規な菌株をＭＤＰ５と名付けた。当該菌株は、グルコン酸キナーゼ構造遺伝子に挿入されたＣａｔマーカーをなおも含有する。実施例４に述べた手順を繰り返すことにより、マーカーを有しない菌株が得られ、これをＤＤ６と名付けた。
【実施例６】
【０１５９】
Ｏ２の需要における２重欠失宿主細胞（グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼ欠失Ｐａｎｔｏｅａ宿主細胞）の利点を以下に説明する。
【０１６０】
シードトレイン（ｓｅｅｄ  ｔｒａｉｎ）：
液体窒素中に保存した培養液のガラス瓶を空気中で解凍し、５００ｍｌの種培地を含有する２リットルの無菌三角フラスコへ０．７５ｍｌを添加する。フラスコを２９℃、２５０ｒｐｍで１２時間培養する。移転の指標は、２．５より大きなＯＤ５５０である。
【０１６１】
種フラスコ培養液
培養液の組成は以下のとおりである。
成分                                量
ＫＨ２ＰＯ４                        １２．０ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４                        ４．０ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                ２．０ｇ／Ｌ
Ｄｉｆｃｏ  Ｓｏｙｔｏｎｅ        ２．０ｇ／Ｌ
クエン酸ナトリウム                ０．１ｇ／Ｌ
フルクトース                      ５．０ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                  １．０ｇ／Ｌ
ニコチン酸                        ０．０２ｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                ５ｍＬ／Ｌ（０．４ｇ／Ｌ保存溶液の）
微量塩                            ５ｍＬ／Ｌ（０．５８ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７
Ｈ２Ｏ、０．３４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、
０．４８ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ）
当該培養液のｐＨは、２０％ＮａＯＨを用いて７．０±０．１に調節した。２０ｍｇ／Ｌ（１０ｇ／Ｌの保存溶液の２ｍＬ／Ｌ）の最終濃度まで、テトラサイクリンＨＣｌを添加した。その後、得られた培養液を、０．２μのフィルターでろ過無菌化（ｆｉｌｔｅｒ  ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ）をした。その後、当該培養液を高圧滅菌（オートクレーブ）し、５００ｍＬの高圧滅菌培養液を２リットルの三角フラスコに添加した。
【０１６２】
生産発酵槽
無菌化前における反応容器への添加物。
成分                                  濃度
ＫＨ２ＰＯ４                            ３．５ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    １．０ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                       ０．９２ｇ／Ｌ
グルタミン酸ナトリウム                 １５．０ｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                     ５．７９ｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ                       ３．４４ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ                  ４．７０ｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                     ２．２０ｇ／Ｌ
塩化コリン                              ０．１１２ｇ／Ｌ
Ｍａｚｕ  ＤＦ−２０４                  ０．１６７ｇ／Ｌ
上記構成要素の培養液を１２１℃で４５分間無菌化した。
【０１６３】
タンクの無菌化の後、以下を発酵槽に添加した。
成分                                  濃度
ニコチン酸                          １６．８ｍｇ／Ｌ
パントテン酸Ｃａ                    ３．３６ｍｇ／Ｌ
ＨＦＣＳ（４２ＤＥ）                ９５．５ｇ／Ｌ（出発物質として所望ならば
グルコン酸又はグルコース）
無菌化及び無菌化後成分の添加の後の最終的な容量は、６．０Ｌであった。このように調製した槽と培養液を前述した種フラスコの全容量と接種し、容量は６．５Ｌとなった。
【０１６４】
成長条件は、２９℃及びｐＨ６．０であった。攪拌速度、背圧、及び風量は、溶存酸素が０より大きくなるように調節した。
【０１６５】
結果
アスコルビン酸中間体に対する酸化経路を図１０に示す。二酸化炭素の生産量（ＣＥＲ）を測定することにより、異化経路に利用される炭素の量を算出することができ、それゆえ、異化経路と生産（酸化）経路の脱共役（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ）を評価できる。これは、ＣＯ２についての唯一の炭素源が炭素基質からのものであり、それ以外のＣＯ２は反応器に供給されないからである。野生型微生物を発酵工程に用いた場合、グルコースの６３％がアスコルビン酸中間体へ転化し、一方、ＣＥＲの測定のよると３７％が異化生成物へ転化した（図１２）。本研究の第２段階では、グルコキナーゼの発現をコード化する核酸を当該野生型と同じ条件下で用いた。図１３Ａに示すように、ＣＥＲの測定によると、ＣＯ２の発生率は約１８％に減少した。従って、グルコースの異化は減少したが、しかし、完全に脱共役しているわけではなかった。この原因、すなわち、炭素基質が異化経路に転用されている経路を解明するために、グルコン酸を唯一の炭素源として用いた。図１３Ａと比較した図１３Ｂに示すように、グルコン酸は、グルコースが炭素源の場合とほぼ同じ割合で異化された。すなわち、グルコン酸の８３％がアスコルビン酸中間体に転化したのに対し、（ＣＥＲの測定により）グルコン酸の１７％が異化経路に転化された。表２も参照のこと。
【０１６６】
【表２】
2005510999.tif 000003
【０１６７】
本研究の最終段階は、グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼをコード化するゲノムが宿主細胞のゲノムから欠失している宿主細胞について、ＯＵＲ及びＣＥＲを評価することである。図１４は、グルコースの３％がＣＯ２に転化し、一方で、対照例（野生型）ではグルコースの４３％がＣＯ２に転化したことを示している。結果として、野生型は、異化経路によるグルコースの高い異化率を示し、これにより収率の減少及び必要なる酸素量の増加がもたらされることが明らかとなった。しかしながら、グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼの２重欠失により、原則として、異化が、初期炭素基質の１０パーセント未満、５パーセント未満、及び、特に３％未満までに不活性された。
【０１６８】
結論
グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼの２重欠失により、ほとんど全てのグルコース（約９８％）が２，５−ＤＫＧになることが明らかとなった。
【実施例７】
【０１６９】
フルクトースからのグリセロールの生産
フルクトースから誘導される化合物の生産にＰａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａを用いられ得ることを実証するために、Ｅｍｐａｔａｇｅらにより説明されている手法を用いてグリセロールを生産した（Ｍ．Ｅｍｐａｔａｇｅ、Ｓ．Ｈａｙｎｉｅ、Ｌ．Ｌａｆｆｅｎｄ、Ｊ．Ｐｕｃｃｉ、及びＧ．Ｗｈｉｔｅｄ；ハイタイターを用いる１，３−プロパンジオールの生物学的生産方法；特許ＷＯ０１１２８３３−Ａ４１、２００１年２月２２日；Ｅ．Ｉ．ＤＵ  ＰＯＮＴ  ＤＥ  ＮＥＭＯＵＲＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＡＮＹ、ＧＥＮＥＮＣＯＲ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ，ＩＮＣ．）。詳細には、図２５の反応に示すように、当該手法は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）をグリセロールに転化するために酵母由来の２つの酵素を用いるものである。
【０１７０】
ＧＰＤ１及びＧＰＰ２酵素に対する遺伝子は、Ｔｒｃプロモーターの制御下、多コピープラスミドｐＴｒｃ９９においてクローン化した（Ｅｍｐａｔａｇｅら、２００１年）。このプラスミド（ｐＡＨ４８）は、高水準のこれら２つの酵素を生産できる。
【０１７１】
Ｐ．ｃｉｔｒｅａにおけるグリセロールの生産のために、グリセロールを同化する菌株の自然能力を除去し又は減少させることが望ましいと考えられる。多くの細菌における通常のグリセロール異化経路は、グリセロールキナーゼの働きを経るものである（Ｅ．Ｃ．Ｌｉｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３０巻、５３５−５７８頁、１９７６年、細菌におけるグリセロール異化作用及びその制御）。Ｐ．ｃｉｔｒｅａは、グリセロールを唯一の炭素源として含む培地において成長できることを見出した。さらに、Ｐ．ｃｉｔｒｅａゲノム配列の検証により、当該配列が、大腸菌からのｇｌｋＡ遺伝子と非常に良く似たグリセロールキナーゼ遺伝子を有することが分かった。
【０１７２】
従って、グリセロールキナーゼ活性を除去するために、当該酵素の構造遺伝子（遺伝子ｇｌｐＫ）を不活性化した。これは実施例３及び５の記載（グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼ遺伝子の不活性化）に従って実行した。詳細には、Ｐ．ｃｉｔｒｅａからの染色体ＤＮＡ及び配列番号ｇｌｐＫ１及び配列番号ｇｌｐＫ２に記載のプライマーを用いるＰＣＲにより、ｇｌｐＫ遺伝子及びフランキング遺伝子を有する２．９ｋｂのＤＮＡ断片を得た。当該２．９ｋｂのＤＮＡ断片は、実施例３及び５に示すようにＲ６Ｋベクターにおいてクローン化した。ｇｌｐＫ遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号に、ＧｌｐＫのタンパク質配列を配列番号に示す。ｇｌｐＫのＤＮＡ配列の検証により、Ｈｐａ１部位の存在が確認され、これをｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰカセットの挿入に選んだ。所望のプラスミド構築物を得た後、実施例３及び５に記載のように、ｇｌｐＫ分断を相同組換えによりＰ．ｃｉｔｒｅａ菌株１３９−２ａ  ｐｓ−の染色体に移転した。得られたＰ．ｃｉｔｒｅａｇｌｐＫ：：Ｃｍ菌株をＭＤＧ１と名付けた。
【０１７３】
Ｐ．ｃｉｔｒｅａゲノムにおけるｇｌｐＫ遺伝子の分断を確認した後、当該変異の効果を評価した。当該目的のために、唯一の炭素源としてグリセロール０．４％を含有する最少培地Ｍ９において菌株ＭＤＧ１を成長させた。当該細胞を３０℃で４８時間培養した後に、成長は観測されなかった。これは、菌株ＭＤＧ１が炭素源としてグリセロールを利用する能力を失ったことを示唆するものである。
【０１７４】
菌株ＭＤＧ１をプラスミドｐＡＨ４８により形質転換し（Ｅｍｐｔａｇｅら、２００１年）、得られた菌株ＭＤＧ２について、唯一の炭素源としてフルクトースを用いてグリセロールを生産する能力を検証した。これは、２％フルクトースを唯一の炭素源として含有する最少培地において当該菌株を培養することにより実行した。当該細胞を３０℃で２４時間培養した後に、Ｅｍｐｔａｇｅらの文献（２００１年）に記載のように、試料を捕集し、ＨＰＬＣで分析した。これにより、菌株ＭＤＧ１は全くグリセロールを生産しないが、菌株ＭＤＧ２は１．３６ｇ／Ｌのグリセロールを生産することが分かった。これらの結果は、Ｐ．ｃｉｔｒｅａが、大部分のフルクトースをグリセロールの生産に転用することができることを実証するものである。
【０１７５】
本発明の範囲から逸脱することなく本明細書を読み終えた当該技術分野における当業者にとって、種々のその他の実施例、及び前述の詳細な説明と実施例についての種々の変更が理解できるであろう。これは、そのような実施例及び変更の全てが、特許請求の範囲に含まれることを意味するものである。本明細書において参照したすべての文献及び特許は、引用により本明細書中に完全に取込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図１は、Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａのグルコース同化に関与するいくつかの代謝ルートの略図である。本発明における遺伝子組換えによって影響を受ける酵素ステップを、Ｘで示す。Ｔで標識された枠は、推定トランスポーターを表わしている。
【図２】図２は、グルコースを細胞代謝に導くために用いられ得るいくつかの可能な異化ルートである。矢印は、少なくとも１の酵素ステップを表わしている。
【図３】図３は、示した商業的ルートから得ることができる生成物を示すものである。左側に記載した化合物を合成するために用いられる炭素源のほとんどは、異化経路又はＴＣＡサイクルから得ることができる。一方、右側の化合物の炭素は、ペントース経路及び／又はグルコースからケト酸への酸化により得られるものである。
【図４】図４は、Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ  グルコキナーゼ（ｇｌｋ）に対する核酸配列（配列番号１）を示すものである。
【図５】図５は、Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ  グルコキナーゼ（Ｇｌｋ）に対するアミノ酸配列（配列番号２）を示すものである。
【図６】図６は、Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ  グルコン酸キナーゼ（Ｇｎｔｋ）に対する核酸配列（配列番号３）を示すものである。
【図７】図７は、Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ  グルコン酸キナーゼ（Ｇｎｔｋ）に対するアミノ酸配列（配列番号４）を示すものである。
【図８】図８は、遺伝子ｇｌｋ３０、ｇｌｋ３１、ｇｎｔ１、ｇｎｔ２、ｐｃｇｎｔ３、及びｐｃｇｎｔ４に対するアミノ酸配列（配列番号８−１３）を示すものである。
【図９】図９は、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルコン酸、及びそれらの誘導体のいくつかを示すものである。グルコースにおける炭素の基準番号を番号１及び６で示す。２−ＫＤＧは２−ケト−Ｄ−グルコン酸であり、２，５−ＤＫＧは２，５−ジケトグルコン酸であり、２ＫＬＧは２−ケト−Ｌ−グルコン酸である。
【図１０】図１０は、Ｐ．ｃｉｔｒｅａからグルコン酸キナーゼ遺伝子を分断するために用いられる戦略を示すものである。
【図１１】図１１は、アスコルビン酸の生産のための酸化経路を示すものである。ここで、Ｅ１はグルコースデヒドロゲナーゼを表わし、Ｅ２はグルコン酸デヒドロゲナーゼを表わし、Ｅ３は２−ケト−Ｄグルコン酸デヒドロゲナーゼを表わし、及び、Ｅ４は２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を表わす。
【図１２】図１２は、アスコルビン酸中間体を生産可能な宿主細胞の発酵の間における正味の反応を示すものである。
【図１３】図１３は、グルコースへの接触後の野生型有機体の発酵における炭素発生率（ＣＥＲ）及び酸素消費率（ＯＵＲ）を示しものである。
【図１４】図１４は、単一欠失（グルコキナーゼ）を用いる発酵におけるＣＥＲ及びＯＵＲを示すものである。
【図１５】図１５は、単一欠失（グルコン酸キナーゼ）を用いる発酵におけるＣＥＲ及びＯＵＲを示すものである。
【図１６】図１６は、グルコキナーゼ及びグルコン酸キナーゼのいずれの欠失も有する宿主細胞を用いる発酵におけるＣＥＲ及びＯＵＲを示すものである。
【図１７】図１７は、種々の代謝経路（解糖経路、ＴＣＡサイクル、及びペントース経路を含む）及び酸化経路の相互関係についての略図である。ここで、Ｇｌｋはグルコキナーゼ、Ｇｎｔｋはグルコン酸キナーゼ、ＩｄｎＯはイドン酸還元酵素、ＩｄｎＤはイドン酸デヒドロゲナーゼ、ＴＫＴはトランスケトラーゼ、ＴＡＬはトランスアルドラーゼ、２ＫＲは２−ケト還元酵素、２，５ＤＫＧＲは２，５−ジケトグルコン酸還元酵素である。
【図１８】図１８は、種々の中心代謝経路及びグルコン酸の生産を向上させる修飾の相互関係についての略図である。Ｘは、所望のグルコン酸生産量の増大を達成するために修飾された酵素経路を示している。
【図１９】図１９は、種々の中心代謝経路及びエリソルビン酸の生産を向上させる修飾の相互関係についての略図である。Ｘは、所望のエリソルビン酸生産量の増大を達成するために修飾された酵素経路を示している。
【図２０】図２０は、種々の中心代謝経路及びリボースの生産を向上させる修飾の相互関係についての略図である。Ｘは、所望の２，５−ジケトグルコン酸生産量の増大を達成するために修飾された酵素経路又は輸送経路を示している。
【図２１】図２１は、種々の中心代謝経路及び酒石酸塩の生産を向上させる修飾の相互関係についての略図である。Ｘは、所望のリボース生産量の増大を達成するために修飾された酵素ステップを示している。ここで、ＩｄｎＯは５−ケト−Ｄ−グルコン酸５−還元酵素、ＩｄｎＤはＩ−イドン酸５−デヒドロゲナーゼである。
【図２２】図２２は、グリセロールに転化するジヒドロキシアセトンリン酸の経路についての略図である。
【図２３】図２３は、実施例７に記載のｇｌｐＫ遺伝子を含む２．９ｋｂのＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅するために用いるプライマーのＤＮＡ配列を示すものである。
【図２４】図２４は、実施例７に記載のＰ．ｃｉｔｒｅａからのグリセロールキナーゼの構造遺伝子のＤＮＡ配列を示すものである。遺伝子の分断に用いられるＨｐａｌ部位の配列を下線で示す。
【図２５】図２５は、実施例７に記載のＰ．ｃｉｔｒｅａからのグリセロールキナーゼのタンパク質配列を示すものである。
【図１】
2005510999.tif 000004
【図２】
2005510999.tif 000005
【図３】
2005510999.tif 000006
【図４】
2005510999.tif 000007
【図５】
2005510999.tif 000008
【図６】
2005510999.tif 000009
【図７】
2005510999.tif 000010
【図８】
2005510999.tif 000011
【図９】
2005510999.tif 000012
【図１０】
2005510999.tif 000013
【図１１】
2005510999.tif 000014
【図１２】
2005510999.tif 000015
【図１３】
2005510999.tif 000016
【図１４】
2005510999.tif 000017
【図１５】
2005510999.tif 000018
【図１６】
2005510999.tif 000019
【図１７】
2005510999.tif 000020
【図１８】
2005510999.tif 000021
【図１９】
2005510999.tif 000022
【図２０】
2005510999.tif 000023
【図２１】
2005510999.tif 000024
【図２２】
2005510999.tif 000025
【図２３】
2005510999.tif 000026
【図２４】
2005510999.tif 000027
【図２５】
2005510999.tif 000028
【国際調査報告】
2005510999.tif 000029