(57)【要約】ヒト患者への移植に適した細胞懸濁液および注入に適した細胞製品の製造方法が提供される。本製造方法は、(a) 移植に適した型の細胞の第一亜集団を含む多数の細胞型を含む細胞の第一集団を、該細胞の第一亜集団の増殖を生ずる条件下で培養する段階であって、該細胞の集団が、該条件下で該増殖を阻害するかまたは該第一亜集団の細胞よりも成長が少なく、且つ移植を増強することができる細胞の第二亜集団をさらに含む段階と、(b) 段階(a)の培養前、培養中または培養後に、第一集団から、第二亜集団の細胞を除去する段階と、(c) 第二亜集団の細胞を保存する段階と、(d) 第一亜集団の細胞の増殖後、第一亜集団の細胞を保存した第二亜集団の細胞と組み合わせる段階とを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植可能な細胞懸濁液の製造方法であって、
(a) 移植に適した型の細胞の第一亜集団を含む多数の細胞型を含む細胞の第一集団を、該細胞の第一亜集団の増殖を生ずる条件下で培養する段階であって、該細胞の第一集団が、該条件下で該増殖を阻害するかまたは該第一亜集団の細胞よりも成長が少なく、且つ移植を増強することができる細胞の第二亜集団をさらに含む段階と、
(b) 段階(a)の培養前、培養中または培養後に、該第一集団から、該第二亜集団の細胞を除去する段階と、
(c) 該第二亜集団の細胞を保存する段階と、
(d) 該第一亜集団の細胞の増殖後、該移植可能細胞懸濁液を形成するために、該第一亜集団の細胞を保存した第二亜集団の細胞と組み合わせる段階とを含む方法。
【請求項２】
段階(d)が第一亜集団の増殖の終了後に行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
死んだ細胞の除去をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
段階(d)が、移植可能な細胞懸濁液に、移植増強細胞、増殖増強細胞または効力増強細胞の第三亜集団を導入する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
細胞の第三亜集団が細胞の第一亜集団の増殖の終了前に添加され、且つ該細胞の第三亜集団が該細胞の第一亜集団の増殖を増強する、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
細胞の第三亜集団が移植可能な細胞懸濁液の効力を増強する請求項4に記載の方法。
【請求項７】
段階(d)の前に、第二亜集団の細胞を増殖する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
第二亜集団の細胞が、細胞上の表面マーカーを認識する選択要素を用いて段階(b)において除去される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
ヒト患者への注入に適した細胞懸濁液の製造方法であって、
(a) 細胞の第一亜集団を含む多数の細胞型を含む細胞の第一集団を、該細胞の第一亜集団の増殖を生ずる条件下で培養する段階と、
(b) 増殖前、増殖中または増殖後に、該第一集団から、該条件下で該細胞の第一亜集団の増殖に阻害作用を有するかまたは該第一亜集団の細胞よりも成長が少ない細胞の第二亜集団を除去する段階と、
(c) 該細胞の第一集団の増殖後、該第二亜集団の細胞と該第一集団の増殖によって得られた細胞を組み合わせる段階とを含む方法。
【請求項１０】
段階(c)が第一亜集団の増殖の終了後に行われる、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
死んだ細胞の除去をさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
段階(c)が、細胞懸濁液に細胞の第三亜集団を導入する段階をさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
細胞の第三亜集団が細胞の第一亜集団の増殖の終了前に添加され、且つ該細胞の第三亜集団が該細胞の第一亜集団の増殖を増強する、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
細胞の第三亜集団が細胞懸濁液の効力を増強する、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
段階(c)の前に、第二亜集団の細胞を増殖する段階をさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１６】
第二亜集団の細胞が、細胞上の表面マーカーを認識する選択要素を用いて除去される、請求項9に記載の方法。
【請求項１７】
ヒト患者への注入に適した細胞懸濁液製品の製造方法であって、
(a) 多数の細胞集団を含む最初の細胞懸濁液を得る段階と、
(b) 該最初の細胞懸濁液から標的細胞の集団を選択する段階と、
(c) 該標的細胞の増殖が生じる条件下で該標的細胞を培養する段階と、
(d) 細胞懸濁液製品を生成するために、段階(c)の製品の少なくとも一部と該最初の細胞懸濁液の残りを組み合わせる段階とを含む方法。
【請求項１８】
最初の細胞懸濁液が、骨髄、臍帯血および末梢血からなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
最初の細胞懸濁液が、ヒトの中胚葉、外胚葉および内胚葉組織から得られた細胞を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
最初の細胞懸濁液の細胞が、膵臓、肝臓、神経、腎臓、皮膚、筋肉および心臓からなる群より選択される組織から得られる、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
最初の細胞懸濁液が胚性幹細胞を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２２】
標的細胞が、CD34+/CD38+多能性前駆細胞、CD34+/CD7+リンパ球系共通前駆細胞、CD34+/CD33+骨髄系共通前駆細胞およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
段階(d)の製品をヒト患者に注入する段階をさらに含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２４】
段階(c)中に、培養物から、培養条件下で標的細胞の増殖に阻害作用を有するか、または該標的細胞よりも成長が少ない細胞の亜集団を除去する段階をさらに含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２５】
標的細胞培養物の更なる増殖後に、亜集団の細胞と培養した該標的細胞または最初の細胞懸濁液とを組み合わせる段階をさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
亜集団を増殖する段階をさらに含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
最初の細胞懸濁液または標的細胞以外の細胞の亜集団である標的細胞の集団のいずれかから選択する段階をさらに含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２８】
段階(d)中に、亜集団の細胞の少なくとも一部と最初の細胞懸濁液を組み合わせる段階をさらに含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
ヒト患者への注入に適した細胞懸濁液の製造方法であって、
細胞の第一亜集団を含む多数の細胞型を含む細胞の第一集団を、該細胞の第一亜集団の増殖を生ずる条件下で培養する段階と；
増殖中または増殖後に、該第一集団から、該第一亜集団によって生成した細胞の第二亜集団を除去する段階とを含み、
該細胞懸濁液が該第二亜集団を含む方法。
【請求項３０】
除去段階が増殖中に行われる請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
除去が本質的に連続的に行われる請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
細胞懸濁液が本質的に第一集団の細胞を含まない請求項29に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば骨髄の枯渇の結果をもたらした治療を受けている癌患者のような患者に移植するために、患者に注入できる細胞集団の増殖および選択による製造に関する。そのような細胞集団の他の用途には、遺伝子欠損の補足として、組織再生の要素として、治療遺伝子の担体として、および免疫増強に使用される薬剤として細胞を供給することが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
移植の場合、癌患者はドナーから得られた骨髄の投与によって、または比較的未成熟で、従って、例えば臍帯血のような他の起源から得られた幹細胞を含む多能性細胞の懸濁液を投与することによって、患者の骨髄を再形成することができる。幹細胞のような所望の、即ち「標的」細胞を選択しながら、そのような細胞を培養で増殖する方法が考案されている。これを達成する方法は、参照として、本明細書に組み入れられるKrausの米国特許第5,925,567号に記載されている。そのようなシステムには通常得られる細胞懸濁液が標的細胞型で増強されていることを確実にするためにサイトカインおよび他の成長因子を使用する。更に、そのような方法には標的細胞の増殖を増強できる間質細胞のような支持細胞が使用される。
【発明の開示】
【０００３】
発明の概要
本発明は移植可能な細胞懸濁液の製造方法を特徴とし、その方法は
(a) 移植に適した型の細胞の第一亜集団を含む多数の細胞型を含む細胞の第一集団を、該細胞の第一亜集団の増殖を生ずる条件下で培養する段階であって、該細胞の集団が、該条件下で該増殖を阻害するかまたは該第一亜集団の細胞よりも成長が少なく、且つ移植を増強することができる細胞の第二亜集団をさらに含む段階と、
(b) 段階(a)の培養前、培養中または培養後に、該第二亜集団の細胞を除去する段階と、
(c) 該第二亜集団の除去された細胞を保存する段階と、
(d) 該第一亜集団の細胞の増殖後、該移植可能細胞懸濁液を形成するために、該第一亜集団の細胞を保存した第二亜集団の細胞と組み合わせる段階とを含む方法。
【０００４】
ある態様において、段階(d)は、細胞の第一亜集団の増殖の終了後に行われる。本法は更に、本方法の任意の段階で、死んだ細胞の除去を含むことができ、また懸濁液に、移植増強細胞または増殖増強細胞の第三亜集団を導入する段階を含むこともできる。第三亜集団の細胞が第一亜集団の増殖を増強する場合は、その方法を増強するために、増殖の終了前に、細胞の第一亜集団を含む培養物に第三亜集団の細胞を加える。最初に除去された第二亜集団の細胞は、第一亜集団の細胞と再び組み合わされる前に増殖させることができる。第二亜集団の細胞の除去は、例えば抗体、細胞接着因子（CAM）および／または種々の成長因子に対するリガンドのような選択要素の使用によって影響され得る。例えば米国特許第5,925,567に記載されているように、陽性選択または陰性選択ができる。1つまたはそれ以上の亜集団の繰り返しはたは連続的選択を、望まれるならば経時的に選択の基準を変えて実施することができる。
【０００５】
本発明は、例えばCD45+細胞のような所望の細胞の増殖を望ましくなく阻害しており、その除去が増殖を増強するような、例えば表面抗原CD14を発現している細胞のある亜集団が、増殖後に再び加え戻されると、移植可能な細胞懸濁液の特性を増強するという発見を利用している。さらに重要な洞察は、一時的に除去された亜集団は、細胞懸濁液に加え戻される前に、元の培養条件と異なる可能性があり、且つ除去された亜集団の増殖にさらに貢献する条件下で、増殖され得ることである。出発細胞培養物は、そのいずれもが本方法の任意の段階で除去でき、増殖でき、且つ任意の比率で加え戻せることができる多数の異なる細胞型を含む可能性があるため、最終の細胞懸濁液の特性は本発明の方法を用いて無限に調整することができる。
【０００６】
ある細胞の亜集団は、初代培養物および／または亜集団の成長を増強し、および／または細胞懸濁液の性質（効力、有効性等）を増強する。最終の細胞懸濁液の成長増強および／または性質の増強は、増殖中または増殖後の種々の時間において、初代培養物、亜集団および／または亜集団の子孫を再び組み合わせて得ることができる。
【０００７】
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかであると思われる。
【０００８】
詳細な説明
本発明は1つまたはそれ以上の細胞製品を製造するために、初代培養物または培養中でない最初の細胞懸濁液から亜集団を選択し、亜集団の1成分である亜集団および／または初代培養物を使用することによって、定義されたプロフィールを有する細胞製品を形成する方法を特徴とする。ある場合は、最終製品を形成するために初代培養物および／または細胞懸濁液に最終的に亜集団を加えてもよい。最初の細胞懸濁液の例には、骨髄、臍帯血、末梢血、ならびに膵臓、肝臓、神経、腎臓、皮膚、筋肉および心臓組織のようなヒトの中胚葉、外胚葉および内胚葉組織から得られた細胞懸濁液が含まれる。初代培養物の例には、造血幹細胞のような移植に適した型の細胞の培養物が含まれる。
【０００９】
本発明の方法は、亜集団の細胞を他の細胞と組み合わせて細胞製品を形成することを含んでもよい。例えば、初代培養物の更なる増殖後に亜集団を初代培養物に戻してもよい。または、亜集団を別に培養し、最終的に初代培養物に戻してもよく、またはその子孫を初代培養物に戻してもよい（初代培養物の更なる増殖への介入の有無に関係なく）。第一亜集団から第二亜集団を除去してもよく、その後、第一または第二亜集団を、戻されている初代培養物および／または亜集団の更なる増殖の前または後のいずれかで、初代培養物に戻してもよい。例えば、上記で考察した最初の細胞懸濁液の1つなどの、初代培養物または亜集団が得られた細胞懸濁液に亜集団を加えることもできる。
【００１０】
他の態様において、本方法には亜集団の増殖中に、亜集団中の細胞と同じ型の細胞を、亜集団の増殖を増強するために亜集団に加える段階、および／または亜集団を除去し、それを初代培養物のものでない他の細胞と組み合わせる段階が含まれる。
【００１１】
ある態様においては、上で考察した選択段階に加えて、初代培養物から望ましくない亜集団が除去され、廃棄される。
【００１２】
細胞製品は、初代培養物または最初の細胞懸濁液を提供し、且つ初代培養物から予め定められた亜集団を除去する1つまたはそれ以上の抗体カクテルを用いて、1つまたはそれ以上の選択段階（例えば、細胞分裂または増殖が始まった後の選択）を実施することによって、製造してもよい。種々の抗体カクテルの特別な初代培養物の増殖能への影響を図1に示す。図1に示した実験において、選択は細胞増殖の前に行った。しかし、以下に詳細に考察するように、抗体カクテルを用いた選択は随時実施でき、細胞分裂の前、細胞分裂中および細胞分裂後に実施できる。
【００１３】
細胞製品はまた、(a) 細胞の第一亜集団を含む多数の細胞型を含む細胞の第一集団を、細胞の第一亜集団の増殖を生ずる条件下で培養すること、および(b) 増殖中または増殖後に、第一集団から、第二亜集団の細胞を含む注入可能な細胞懸濁液である第一亜集団によって生成した細胞の第二亜集団を除去することによって、製造してもよい。ある場合は、注入可能な細胞懸濁液は、例えばそのような細胞が注入に適していなければ、第一集団の細胞を本質的に含まないであろう。ある場合、例えば第一亜集団が胚性幹細胞を含むような場合は、除去段階は増殖中に実施され、本質的に連続的に行ってもよい。
【００１４】
抗体カクテルの組成は細胞増殖中の時間経過に応じて変化させてもよい。例えば異なる細胞上で異なる時点に発現した表面分子を同定することができ、選択はこれに基づいて行うことができる。異なった抗体カクテルを用いた選択は本質的に連続的に、または間欠的に行うことができる。
【００１５】
細胞製品中の異なった細胞の割合は、例えば、非標的細胞の所定の割合だけが選択されるように抗体濃度を調整することによって、および／またはカクテル中の単数または複数の抗体の数および／または特性を変えることによって調製できる。
【００１６】
ある細胞表面マーカーは異なる細胞型で共通であるので、カクテル中の単数または複数の抗体は製品の正確さを増加するために選択できる。例えば、CD45陽性細胞は特有の白血球の亜集団を表す少なくともいくつかのCD45エピトープを有する。その結果、すべての白血球を選択するために、CD45汎白血球マーカーを用いることができ、CD45RAおよびCD45ROは特別な白血球亜集団を選択するために用いることができる。
【００１７】
細胞型の割合は、増殖中または後に、初代培養物を亜集団および／または亜集団の子孫とを再び組み合わせることによって変化させることができる。
【００１８】
初代培養物から1つまたはそれ以上の亜集団の繰り返しまたは連続的選択を、選択基準を経時的に変化させて行ってもよい。初代培養物の増殖を増強するために、例えば、細胞の特定の亜集団を最初の選択段階中に初代培養物から除去してもよいが、最終細胞製品の性質を増強するために、後の選択段階中に初代培養物から除去することはできない。
【００１９】
細胞製品の製造
患者への注入に適した細胞製品の製造に適した技術の幾つかの例を、以下で詳細に考察する。
【００２０】
細胞培養中、第一の選択段階は、CD14を発現している第一亜集団を選択する段階を含んでもよい。これは、CD14が図1Aに示すように、例えばCD45+細胞、CD34+細胞及びCD34+/38-細胞の細胞増殖を阻害すると思われるため有利である可能性がある。
【００２１】
第一亜集団から、CD34とCD38を共発現している、より狭い第二亜集団を選択してもよい。この第二亜集団は、更なる増殖が生じた後に、初代培養物に戻されるか、または最終細胞製品に加えられる。これは幾つかの理由で望ましい場合がある。
【００２２】
第一に、第一亜集団は培養が望ましくない場合があるが、第二亜集団は望ましい。例えば、第一亜集団は培養の動態において負の影響を有する場合があるが、第二亜集団は培養の動態において有利な影響を有し、および／または懸濁液の効力に好ましい影響を与える場合がある。2つの亜集団は、第二亜集団が培養物に戻されてもよいように、第一亜集団から第二亜集団を分離するための共通の選択マーカーを共有するため、上記の2つの連続選択段階を行う必要がある。このように、第二亜集団を単離することができ、望ましくない第一亜集団を戻さずに、培養物に戻すことができる。望ましい場合に、例えば、第一亜集団が培養の動態に有害であるが効力に有利であれば、第一亜集団は増殖工程の終了時に戻すことができる。
【００２３】
望ましい場合に、第一および／または第二亜集団は、第二亜集団を初代培養物に戻す前またはそれを最終細胞製品に加える前に、別々に培養してもよい。
【００２４】
亜集団は初代培養物から除去することができ、ついで初代培養物の更なる増殖後に戻すことができる。これは亜集団が最終製品において有用であるが、初代培養物の増殖に望ましくない影響を有する場合に行う。例えばCD14+細胞はCD34+/CD38-細胞の集団の増殖を阻害する傾向があるが、最終製品を患者へ送達した後の移植相中、短期の支持を提供する可能性がある。望ましい場合に、さらに亜集団を増殖することなく、亜集団を初代培養物に戻してもよい。
【００２５】
亜集団はまた別の培養物中で培養することができ、次いでその後、初代培養物に戻すことができる。例えば、再度CD34+/CD38-を初代培養物として用いて、CD7リンパ球系前駆細胞の亜集団を除去でき、リンパ球系細胞に有利な培養条件下で培養できる。増殖されたCD7亜集団はその後、例えば患者の免疫系のリンパ球産生の再構成を助けるために初代培養物に戻され、それによって免疫の再構成の動態を増す。
【００２６】
望ましい場合に、上記の例で、CD3細胞は、患者で移植片対宿主疾患 (graft versus host disease：GVHD)を起こす可能性のある、より分化したリンパ球系T細胞を除去するために、それが初代培養物に戻される前に、増殖されたCD7亜集団から分離することができる。
【００２７】
亜集団の増殖を含む方法の間、亜集団と同じ型の細胞を亜集団の増殖を高めるために亜集団培養物に加えることができる。初代培養物は増殖を続けるので、これらの細胞は初代培養物から繰り返しの選択によって得ることができる。
【００２８】
ある場合には、亜集団を初代培養物に戻すよりもむしろ、亜集団を、初代培養物が得られた出発物質に加えることができる。例えばCD34+/CD38-のような初代培養物を臍帯血から得ることができ、増殖され、次いで最終製品を生成するために臍帯血に戻される。これによって、多数のCD34+/CD38-細胞および臍帯血の他の固有の成分が必要な多くの患者への臍帯血の送達が可能になる。
【００２９】
最終製品を生成するために、初代培養物から亜集団の細胞を除去し、初代培養物の細胞でない他の型の細胞を加えることが望ましい場合がある。例えば、CD34+/CD38-細胞および樹状細胞を臍帯血から単離してもよい。CD34+/CD38-細胞が初代培養物中に樹状細胞を産生する条件下で培養される間、増殖が困難な樹状細胞は貯蔵される。ついで、樹状細胞は亜集団として初代培養物から分離され、樹状細胞からなる最終製品を生成するために、始めに単離された樹状細胞に加えられる。
【００３０】
死んだ細胞は初代培養物および／または初代培養物から分離された亜集団から分離し、廃棄してもよい。得られた精製された初代培養物および／または亜集団は、ついで個別の細胞製品または組み合わされた細胞製品として使用できる。例えば、死んだ細胞はCD34+/CD38-細胞の初代培養物またはこの初代培養物に由来する亜集団から除去でき、精製された培養物または亜集団を最終製品として使用できる。
【００３１】
初代培養物からの死んだ細胞の除去にはいくつかの利点がある。死んだ細胞は、例えば患者の免疫系による好ましくない反応を生じることによって、製品の安全性、または他の細胞の効力に影響する可能性があり、死んだ細胞から遊離される成分は標的細胞の増殖を阻害するか、もしくは分化もしくはアポトーシスを起こす可能性がある。これは、得られる製品が高精製且つ高効力であるため（臨床的改善、および効力と安全性において認知できる改善の両方）、より価値が高いので重要である。ある好ましい細胞製品では、製品中に存在する細胞の少なくとも85％が生きた細胞であり、より好ましくは、少なくとも95％が生きた細胞である。
【００３２】
選択技術
好ましい方法には、初代培養物中の細胞から、増殖と同時に、増殖中に間欠的に、または増殖後に、細胞の亜集団を選択する段階が含まれる。細胞の増殖および細胞の選択は、異なる技術と設定の殆ど無限の変形を用いて実施することができ、その内のわずか2〜3のものを実施例として以下に記載する。当業者は他の多くの技術、例えばフローサイトメトリーによる選択および望ましくない細胞を殺す化学物質を用いた選択を容易に認知すると思われる。選択は細胞表面マーカーに対する選択要素を用いて実施してもよい。例えば、本明細書に参照としてその開示が組み入れられる米国特許第5,925,567号に記載されているような、陽性選択または陰性選択を使用してもよい。
【００３３】
本発明に使用される好ましい選択法は、大きく陽性選択（標的細胞に対する親和性を有する選択要素を提供する）および陰性選択（非標的細胞に対する親和性を有する選択要素を提供する）に分類される。単独でまたは組み合わせで用いられるこれらの2つの選択技術は、望まれる場合にはいつでも、細胞を初代培養物から除去することを可能にし、また更により狭い亜集団を製造するために細胞が亜集団から再選択されることを可能にする。
【００３４】
陽性選択技術の1例を図2に図示して説明する。簡単に云うと、予め定められた標的集団に特異的な、1つまたはそれ以上の抗デキストラン結合抗体が培養物に導入される。特定されたインキュベーション時間後、磁性デキストラン鉄粒子コロイドを細胞懸濁液に導入する。細胞／抗原／抗体／抗デキストラン／デキストラン／鉄複合体が形成される。次ぎに、この複合体を磁場に通過させる。陽性選択された細胞は磁場の中に残るが、鉄結合複合体を有しない細胞は除去される。捕獲と洗浄後、磁場を除き、陽性選択された標的集団を栄養培地に戻す。
【００３５】
陰性選択技術の1例を図2Aに図示して説明する。簡単に云うと、予め定められた標的集団に特異的な、1つまたはそれ以上の抗デキストラン結合抗体を培養物に導入する。特定の培養時間後、磁性デキストラン鉄粒子コロイドを細胞懸濁液に導入する。細胞／抗原／抗体／抗デキストラン／デキストラン／鉄複合体が形成される。次ぎに、この複合体を磁場に通過させ、栄養培地から予め定められた標的集団の細胞でない細胞を除去する。予め定められた標的集団は下流で採取し、栄養培地に戻す。
【００３６】
選択要素によって所望の親和性が提供される限り、陽性選択および陰性選択の両方に他の多くの技術が利用できることは明らかである。
【００３７】
選択要素は、選択を行うために使用される抗体分子（「選択分子」）に加えて他の成分、例えば選択分子が結合される固体支持体を含むことができる。固体支持体は、選択を実施し、または選択分子を所望の位置へ維持し、または導入し、およびそれらをそのシステムから除去することを助ける物質から形成することができる。例えば、図2を参照して上述したように、選択分子は鉄または他の磁性粒子に結合することができ、磁場を加えることによって、システムから、選択された細胞の容易な除去を可能にし、ついで磁場を除いて採取できる。または、選択分子は、栄養培地を含む容器の壁、または栄養培地が本方法中にそれを通って流れるチャンバーの壁の上に結合できる。ガラスまたは他の不活性な不透過性のビーズもまた固体支持体として用いることができる。ビーズまたは他の粒子が用いられた場合、それらは栄養培地がそれを通って流れるぎっしり詰まった配置中に提供できるか、または緩い形状、懸濁液もしくは配列の任意の所望の型のシステム中に導入できる。容易に理解できるように、他の固体支持体の幅広い変形が使用できる。
【００３８】
図3〜図3Dに示すように、選択要素は、異なった方法で栄養培地がシスシテムに供給され、シスシテムから除去される操作の変法の中で用いることができる。これらの操作法は、栄養培地が細胞増殖の始めに供給され、栄養培地が加えられず、また除去されない選択的バッチ培養から、新鮮なまたはリサイクルされた栄養培地のいずれかが本質的に連続的にそのシステムを通って流れる、連続流培養またはリサイクル流培養（図3C）までの範囲にわたる。これらの代替法を以下に詳細に考察する。
【００３９】
選択的バッチ培養（図3）において、栄養培地は容器に導入され、出発細胞試料もまた容器に導入される。細胞増殖中、栄養培地は交換してもしなくてもよい。しかし、選択された細胞は物理的に選択される。即ち、選択要素に結合することによって、連続的に、間欠的にまたは細胞増殖後に、栄養培地中の他の細胞から分離される。これらの選択された細胞は、陽性選択が用いられた場合に、標的集団の細胞であり、または、陰性選択が用いられた場合に、望まない細胞である。二重（陽性選択と陰性選択）は、容器、ビーズ、バッフル、インペラー等の表面上に陽性選択分子を提供し、陰性選択で望まない細胞を除去することによって達成できる。または、細胞は培養容器の外で陽性または陰性選択されてもよく、その後、戻してもよい。
【００４０】
操作の選択的セミ-バッチ（semi-batch）（3A）および選択的フェド-バッチ（流加培養：fed-batch）（3B）法は陽性選択および陰性選択に関して選択的バッチ法に類似している。これら3法の顕著な相違は栄養培地の処理にある。バッチ法では、培地の容量は一定に保たれ、培地は（補給される場合はあるが）更新されないのに対して、セミ-バッチ法では、消費された培地を新しい培地で部分的に更新することができ、フェド-バッチ法は経時的に培地容量の段階的増加が許される。
【００４１】
細胞の成長と選択は、連続（図3C）操作法またはリサイクル（図3D）操作法で行うこともできる。これらの2法において、システムは入口と出口を有するチャンバーを含み、栄養培地はチャンバーを入口から出口に流される。連続法では、新しい栄養培地は供給源または貯蔵器からチャンバーを通って流れるのに対し、リサイクル法では、同じ栄養培地が繰り返しチャンバーを通って循環する。望むならば、システムを連続法またはリサイクル法のいずれかで運転するように配置することができる。これらの操作の方法において、任意の所望の選択要素を使用できる。
【００４２】
実施例1
9個の抗体（CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66bおよびGlyA）の陰性選択カクテル（Stemcell Tech）を正規化された対照として用いて、最初の抗体の組み合わせと、細胞系を除去した（lineage-depleted）臍帯血の接種7日目での、全体の細胞およびCD34+/CD38-との関係を検定した。培養物はFlt-3、SCFおよびTpo各100 ng/mlを含んでいた。
【００４３】
図1を参照して、示された選択カクテルはいくつかの方法で9個の抗体対照カクテル（バーの三番目のセット）からの逸脱を示した。左から右に、カクテル1〜14はそれぞれ、GlyAまたはCD24がなく、対照カクテルの他の7個の抗体プラスCD38を有し（N=2）；CD19がなく、他の8個の抗体を有し（N=4）；9個の全ての抗体を有し（対照：N=10）；CD16がなく、他の8個の抗体を有し（N=4）；CD56がなく、他の8個の抗体を有し（N=4）；CD66bがなく、他の8個の抗体を有し（N=4）；CD14がなく、他の8個の抗体を有し（N=4）；CD2がなく、他の8個の抗体を有し（N=4）；GlyAがなく、他の8個の抗体を有し（N=4）；CD24がなく、他の8個の抗体を有し（N=9）；CD3がなく、他の8個の抗体を有し（N=9）；GlyAまたはCD24がなく、他の7個の抗体を有し（N=4）；GlyAまたはCD3がなく、他の7個の抗体を有し（N=4）；ならびにGlyAまたはCD3またはCD24がなく、他の6個の抗体を有する（N=8）。
【００４４】
この組み合わせ手法は、工程のアウトプットの量と同一性の両方において、差異を有する生成を明らかにする。種々の抗体カクテル選択方法を用いる異なる集団の選択的増殖は、異なる集団のCD34+/CD38-細胞のような標的集団産生への影響があるので、重要である。このCD34+/CD38-細胞の相対的生産への潜在的な負の影響の1例は、CD14がなく、他の8個の抗体（カクテル#7）を有する立体配置におけるCD14+の存在に帰すことができる。このカクテルは9個の抗体対照（カクテル#3）の81.6％でCD34+/CD38-を増幅した。もう一つの例は、CD38+細胞を除去した培養物（カクテル#1）中でGlyA+とCD24+細胞の両方の存在下でのCD38+細胞の欠如が、9個の抗体対照の66.9％であったCD34+/CD38-細胞の増幅をもたらした独立した観察である。この最後の観察は、GlyA+またはCD24または両方をそれぞれ欠いたカクテル#9、#10、#12および#14に関する観察と対照的である。これらの例ではCD34+/CD38-の増幅は9個の抗体対照に対してそれぞれ、113.1、124.9、107.2および126.4だけ増加した。
【００４５】
実施例2
この試験は、接種物を生成するために用いたLincocktail（CD2/CD3/CD14/CD16/CD19/CD24/CD56/CD66b/GlyA-対照）が抗体CD14を含まない場合、CD34+/CD38-細胞の増幅は対照（N=10）の84.6％（N=4）と低いという経験的所見に基づいて開始した。この結果に基づいて、高度に選択されたCD34+/CD38-集団の増幅におけるCD14+細胞の影響を用量依存的な方法で検定した。臍帯血を得て、CD14+細胞を最初に陽性磁気選択（Dynal）で単離する磁性法で分離し、次いで標的集団を単離するために、細胞懸濁液をCD14抗体gを含まない以外は、上記の9個の抗体対照カクテル（StemCell Tech）を用いて処理した。同じ検体からのCD45+（5.00 x105）、CD34+（6.84 x104）、CD34+/CD38-/Lin（2.19 x104）細胞の組み合わせを含むほぼ等しい画分を、CD14+細胞数の増加と共に播種した。CD14+に対するLinの比率はそれぞれ、1:0、50:1、1:1および1:3であった。4個の補足CD14+細胞値に関して、それぞれの培養物中の最初のCD45+細胞の数はそれぞれ、5.00 x105、5.00 x105、1.00 x106、および2.00 x106であった。培養7日目に、3つの表現型画分、即ちCD45、CD34およびCD34+/CD38-細胞のそれぞれの細胞の最初の数に対する絶対数を測定するために、細胞をサンプリングした。
【００４６】
この試験の結果を図1Aに示す。3つの画分のそれぞれは、最初の50個のLin細胞あたり1個のCD14+細胞（即ち、0.5％補足された）での低い補足CD14+細胞の存在に敏感であった。更にCD14+細胞の濃度の増加はCD34+およびCD34+/CD38-画分での成長がほぼ停止し、最高のCD14+細胞比において、成熟CD45+画分は事実上絶滅した。
【００４７】
この結果は、CD14+細胞のような特別な集団は、標的集団（この場合はCD45+細胞）を有効に増殖させる能力に顕著に影響可能なことを示している。この阻害効果にもかかわらず、CD14+細胞は患者への移植の作用を改善し、従って、標的集団の増殖終了後に、CD14+細胞を標的細胞と再び組み合わせることが望ましい場合がある。
【００４８】
他の態様は特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】細胞培養物の増殖能に対する各種抗体カクテルの影響を示すグラフである。
【図１Ａ】細胞培養物の増殖能に対する各種CD14+細胞濃度の影響を示すグラフである。
【図２】標的細胞の陽性選択のためのシステムの超拡大図である。
【図２Ａ】非標的細胞の陰性選択のためのシステムの超拡大図である。
【図３Ａ−３Ｄ】本発明の異なる態様によるシステムの各種操作方法の模式図である。
【図１】
2005536179.tif 000002
【図１Ａ】
2005536179.tif 000003
【図２】
2005536179.tif 000004
【図２Ａ】
2005536179.tif 000005
【図３】
2005536179.tif 000006
【国際調査報告】
2005536179.tif 000007