(57)【要約】本発明は、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質(FAPα)の触媒作用によって薬剤に変換できるプロドラッグに関する。前記プロドラッグは生理的条件下で化学的に安定であり且つ物理的に安定な水性製剤の製造に使用し得る。プロドラッグはFAPαによって認識される切断部位をもち、FAPαの酵素活性によって放出される薬剤は生理的条件下で殺細胞剤又は静細胞剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式(I)の化合物又はその薬学的に許容しうる塩。
【化１】
2005523264.tif 000029
［式中、R1はアミノアルカノイル基又はオリゴペプチドイル基であり、そのN末端アミノ官能基は下記式(II)
【化２】
2005523264.tif 000030
（式中、X1はC=O又はSO2であり、
X2はC=O、SO2、NH-C=O又は単結合であり、
sは1又は2の整数であり、
tは0又は1、2又は3の整数である。）
を有するキャッピング基(Cg)に結合しており、
RaとRbは中間にあるN-C基と共に、置換されていてもよくベンゾ-又はシクロヘキサノ-縮合されていてもよい3員〜7員飽和又は不飽和複素環を形成し、ここで、1つ又は2つのCH2基はNH、O又はSで置換されてもよく、
R3はH、C1-C6-アルキル、C3-C8-シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Cyt’は殺細胞化合物又は静細胞化合物の残基である。］
【請求項２】
X1がC=O又はSO2であり、
X2がC=O又はSO2であり、
sが1又は2の整数であり、
tが1又は2の整数である、
請求項1記載の式(I)の化合物。
【請求項３】
X1とX2がC=Oであり、
sとtが1である、
請求項1又は2記載の式(I)の化合物。
【請求項４】
R1が式Cg-A、Cg-B-A又はCg-(D)n-B-Aの残基であり、ここで、
Cgは式(II)のキャッピング基であり、
A、B、Dは各々独立して式-[NR4-(X)p-CO]-（式中、XはCR5R6であり、R4、R5、R6は各々独立して水素原子、置換されていてもよいC1-C6-アルキル基、C3-C8-シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基又はヘテロアリールアルキル基であり、pは1、2、3、4、5である。）を有するアミノカルボン酸から誘導された部分であるか又は
A、B、Dは各々独立して下記式
【化３】
2005523264.tif 000031
（式中、R7はC1-C6-アルキル、OH又はNH2であり、
nは1〜10の整数であり、
qは0、1又は2であり、
rは0、1又は2である。）
を有する環状アミノカルボン酸から誘導された部分である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の式(I)の化合物。
【請求項５】
Ra、Rb及び中間にあるN-Cで形成された複素環がR8とR9で置換され、ここで、R8とR9は各々独立して水素原子又はハロゲン原子又はC1-C6-アルキル基、C1-C6-アルキルアミノ基、ジ-C1-C6-アルキルアミノ基、C1-C6-アルコキシ基、チオール基、C1-C6-アルキルチオ基、オキソ基、イミノ基、ホミル基、C1-C6-アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、C3-C8-シクロアルキル基、アリール基、又はヘテロアリール基である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の式Iの化合物。
【請求項６】
下記式IAの化合物。
【化４】
2005523264.tif 000032
（式中、R1、R3、R8、Cyt’は請求項1〜5のいずれか1項で定義した通りであり、
X-YはCHR9-CH2、CR9=CH、NH-CH2、CH2-NH、-CR9-、CH2-CHR9-CH2である。）
【請求項７】
下記式IA1の化合物。
【化５】
2005523264.tif 000033
（式中、R3、R4、R5、Cyt’、Cg、X、Yは請求項1〜6のいずれか1項で定義した通りであるか又は
R4とR5が中間にあるN-C基と共に、置換されていてもよくベンゾ-又はシクロヘキサノ-縮合されていてもよい3員〜7員飽和又は不飽和複素環を形成し、ここで、1つ又は2つのCH2基がNH、O又はSで置き換えられてもよい。）
【請求項８】
下記式IA2の化合物。
【化６】
2005523264.tif 000034
（式中、R3、R4、R5、Cyt’、Cg、X、Yは各々独立して請求項1〜7のいずれか1項で定義した通りであるか又は
R4とR5が中間にあるN-C基と共に、置換されていてもよくベンゾ-又はシクロヘキサノ-縮合されていてもよい3員〜7員飽和又は不飽和複素環を形成する。）
【請求項９】
R1がCg-A、Cg-B-A-及びCg-(D)n-B-A-より選ばれた基であり、ここで、
A、B、Dはアミノ酸部分であり、各々独立してグリシン(Gly)、及びD形又はL形のアラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、フェニルアラニン(Phe)、チロシン(Tyr)、トリプトファン(Trp)、システイン(Cys)、メチオニン(Met)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、リシン(Lys)、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、プロリン(Pro)、4-ヒドロキシプロリン(Hyp)、5-ヒドロキシリシン、ノルロイシン(Nle)、5-ヒドロキシノルロイシン(Hyn)、6-ヒドロキシノルロイシン、オルニチン、シクロヘキシルグリシン(Chg)、N-メチルグリシン(N-MeGly)、N-メチルアラニン(N-MeAla)、N-メチルバリン(N-MeVal)、N-メチルロイシン(N-MeLeu)、N-メチルイソロイシン(N-MeIle)、N-メチルノルロイシン(N-MeNle)、N-メチル-2-アミノ酪酸(N-MeAbu)及びN-メチル-2-アミノペンタン酸(N-MeNva)より選ばれる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項１０】
単位Aが、L-プロリン、グリシン、L-ノルロイシン、L-シクロヘキシルグリシン、L-5-ヒドロキシノルロイシン、L-6-ヒドロキシノルロイシン、L-5-ヒドロキシリシン、L-アルギニン、及びL-リシンより選ばれる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の式Iの化合物。
【請求項１１】
単位Dが、 L-プロリン、(Pro)、N-メチルグリシン(N-MeGly)、N-メチルアラニン(N-MeAla)、N-メチルバリン(N-MeVal)、N-メチルロイシン(N-MeLeu)、N-メチルイソロイシン(N-MeIle)、N-メチルノルロイシン(N-MeNle)、N-メチル-2-アミノ酪酸(N-MeAbu)及びN-メチル-2-アミノペンタン酸(N-MeNva)より選ばれる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の式Iの化合物。
【請求項１２】
R1が下記式(1)〜(14)より選ばれた基である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の化合物。
Cg-Gly                        (1) 
Cg-Nle                        (2) 
Cg-Val                        (3) 
Cg-Met                        (4) 
Cg-Xxx-Gly                    (5) 
Cg-Xxx-Hyn                    (6) 
Cg-Xxx-Pro                    (7) 
Cg-Xxx-His                    (8) 
Cg-Xxx-Met                    (9) 
Cg-Xxx-Ala                    (10) 
Cg-Xxx-Hyn                    (11) 
Cg-Xxx-Ala-Gly                (12) 
Cg-(Xxx)n-Xxx-Gly             (13) 
Cg-(Xxx)n-Xxx-Ala-Gly         (14) 
（式中、Cgは式IIのキャッピング基であり;
Xxxはアミノカルボン酸から誘導された部分であり;
nは1〜6の整数である。）
【請求項１３】
アミノアルカン酸部分が(L)-配置で存在する、請求項12記載の化合物。
【請求項１４】
Cyt’がアントラサイクリン基である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項１５】
下記式(III-A)〜(III-K)より選ばれた、請求項14記載の化合物。
【化７】
2005523264.tif 000035
【化８】
2005523264.tif 000036
【化９】
2005523264.tif 000037
【化１０】
2005523264.tif 000038
【化１１】
2005523264.tif 000039
【化１２】
2005523264.tif 000040
【化１３】
2005523264.tif 000041
【化１４】
2005523264.tif 000042
【化１５】
2005523264.tif 000043
【化１６】
2005523264.tif 000044
【請求項１６】
プロドラッグが、13個までのアミノカルボキシル残基を含み、そのC末端アミノカルボキシルがFAPαによって認識されるオリゴマー部分と、殺細胞又は静細胞部分とを示す、FAPαの触媒作用によって殺細胞剤又は静細胞剤に変換できるプロドラッグであって、
該オリゴマー部分のN末端アミノ官能基が下記式(II)
【化１７】
2005523264.tif 000045
（式中、X1はC=O又はSO2であり、
X2はC=O、SO2、NH-C=O又は単結合であり、
sは1又は2の整数であり、
tは0又は1、2又は3の整数である。）
を有するキャッピング基(Cg)に結合していることを特徴とする、前記プロドラッグ。
【請求項１７】
C末端アミノカルボキシル残基がD-プロリン、L-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びL-ヒドロキシプロリンより選ばれ、オリゴマー部分が2、3、又は4個のアミノカルボン酸残基を含んでいる、請求項16記載のプロドラッグ。
【請求項１８】
医薬使用のための請求項1〜17のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか1項に記載の化合物と、任意により1種以上の薬学的に許容しうる賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項２０】
がん治療用医薬組成物を調製するための請求項1〜18のいずれか1項に記載の化合物の使用。
【請求項２１】
がん治療用の安定な薬剤を製造するための請求項16又は17のプロドラッグの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、腫瘍部位で薬剤に変換されるプロドラッグを投与することによる腫瘍治療の分野に関する。特に、本発明は、FAPαの触媒作用によって薬剤に変換することができるプロドラッグ、その製造及び医薬使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ヒト線維芽細胞活性化タンパク質(FAPα)は、モノクローナル抗体(mAb) F19で最初に同定されたMr 95,000の細胞表面分子である(Rettig et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3110-3114; Rettig et al. (1993) Cancer Res. 53, 3327-3335)。FAPα cDNAは大きな細胞外ドメイン、トランスメンブランセグメント、及び短い細胞質尾部をもつII型内在性膜タンパク質をコードしている(Scanlan et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5657-5661; 国際出願第O 97/34927号)。FAPαは、ジペプチジルペプチダーゼ活性を有する膜結合タンパク質、ジペプチジルペプチダーゼIV (DPPIV; EC 3.4.14.5)としても知られるT細胞活性化抗原CD26と48 %のアミノ酸配列の同一性を示す(Scanlan et al., loc. cit.)。FAPαは、酵素活性を有し、セリンプロテアーゼファミリーの1種であり、セリン624は酵素機能が重要である(国際出願第97/34927号)。膜オーバーレイアッセイを用いた研究から、FAPα二量体はAla-Pro-7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン、Gly-Pro-7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン、Lys-Pro-7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンのジぺプチドを切断することができることがわかった(国際出願第97/3492号)。
FAPαは、ヒト上皮がんの多くの組織型、創傷を治癒する顆粒組織、ある種の骨肉腫や軟組織肉腫の反応性間質線維芽細胞において選択的に発現される。成人の正常組織は、一般的には、検出できるFAPαを欠いているが、ある胎児間葉細胞組織はその分子を一時的に発現する。対照的に、>90%の乳がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がんを含む共通型の上皮がんのほとんどはFAPα反応性間質線維芽細胞を含有している(Scanlan et al., loc. cit.)。これらのFAPα+線維芽細胞は、新たに形成された腫瘍血管を随伴し、腫瘍毛管内皮と悪性上皮細胞クラスターの基本様相とに挟まれた異なる細胞コンパートメントを形成する(Welt et al. (1994) J. Clin. Oncol. 12(6), 1193-1203)。FAPα+間質線維芽細胞は原発性がんにも転移性がんにも見られるが、乳房や結腸直腸の腺腫の線維腺腫のような試験された良性や前がん性上皮病巣(Welt et al., loc. cit.)はFAPα+ 間質細胞をまれにしか含有しない。正常組織や多くの悪性腫瘍の支持間質における一様な発現におけるFAPαの限定分布パターンに基づき、転移性結腸がんに罹った患者において131I-標識mAb F19による臨床試験が開始された(Welt et al., loc. cit.)。
【０００３】
殺細胞剤又は静細胞（cytostatic）剤に基づく新しいがん治療について、主な考察は、がん組織が死滅すること及び/又は殺細胞物質又は静細胞物質の正常組織に対する毒性を低下させることの効力を改善することにより治療指数を上げることである。腫瘍細胞が死滅することの特異性を高めるとともに正常組織における毒性を低下させるために、プロドラッグ又は不活性な形で合成された毒性物質が必要とされる時や場所で、特にがん組織内で活性にするようにトリガーメカニズムが設計され得る(Panchal (1998) Biochem. Pharmacol. 55, 247-252)。トリガーメカニズムには、光又は化学薬品のような外因性要因又はがん組織内に限定された発現をもつ酵素のような細胞の内因性要因が含まれてもよい。更に詳述された他の概念は、‘抗体特異的酵素プロドラッグ治療’(ADEPT)又は‘抗体特異的触媒作用’(ADC)と呼ばれるものである(Huennekens (1994) Trends Biotechnol. 12, 234-239; Bagshawe (1994) Clin. Pharmacokinet. 27, 368-376; Wang et al. (1992) Cancer Res. 52, 4484-4491; Sper-ker et al. (1997) Clin. Pharmacokinet. 33(1), 18-31)。ADEPTにおいては、腫瘍関連抗原に特定された抗体を用いて腫瘍部位に特異的な酵素を標的にする。腫瘍位置の酵素は、続いて投与されたプロドラッグを活性殺細胞物質へ変換する。抗体-酵素結合体(AEC)は細胞膜上の標的抗原又は細胞外液(ECF)中の遊離抗原に結合する。AECとプロドラッグを投与している間の時間間隔は、AECが正常組織から一掃されることを可能にするので、プロドラッグは正常組織内又は血液中で活性化されない。しかしながら、ADEPTのある欠点は AECの特性に関するものである(Bagshawe、同書)。例えば、ヒトにおいては、ターゲティングAECの投与量の少量だけが腫瘍組織に結合し、残りは体液に分配され、かなり時間が遅れて一掃される。血漿や正常ECFの体積は腫瘍ECFの体積より非常に大きいことから、非常に低濃度の非結合酵素さえ毒性作用を十分有するだけプロドラッグを触媒することができる。AECは免疫原性があってもよいので、多くの場合、投与の反復が妨げられる。
国際出願第97/12624号及び同第97/14416号には、次のペンタぺプチドやヘキサぺプチド (配列番号151、177: hArg-Tyr-Gln-Ser-Ser-Pro; hArg-Tyr-Gln-Ser-Pro;)が含まれるオリゴぺプチドであって、そのようなオリゴぺプチドと既知の治療物質又は殺細胞物質の結合体を含む遊離前立腺特異的抗原(PSA)と治療剤によって認識されタンパク質分解的に切断されるアミノ酸配列を含む、前記オリゴぺプチドが開示されている。グルタミン-セリン部分を少なくとも1つ含むこれらのオリゴぺプチドは、前立腺がんのみを治療するのに有効である。
国際出願第00/71571号には、FAPαの触媒作用によって薬剤に変換できるプロドラッグであって、前記プロドラッグがFAPαによって認識される切断部位をもち、前記薬剤が生理的条件下で殺細胞剤又は静細胞剤である、前記プロドラッグが開示されている。しかしながら、これらのプロドラッグは比較的溶解性が悪い。
本発明の基礎にある問題は、溶解性が改善された同様のプロドラッグを提供することであった。
【０００４】
発明の簡単な説明
驚くべきことに、オリゴマー部分のN末端アミノ官能基が下記式(II) 
【０００５】
【化１】
2005523264.tif 000002
【０００６】
（式中、X1はC=O又はSO2であり、
X2はC=O、SO2、NH-C=O又は単結合であり、
sは1又は2の整数であり、
tは0又は1、2又は3の整数である。）
を有するキャッピング基(Cg)に結合しているプロドラッグの溶解性が高いことが見出された。
本発明は、FAPαの触媒作用によって殺細胞剤又は静細胞剤に変換できるプロドラッグであって、前記プロドラッグが、13個までのアミノカルボン酸残基を含み、そのC末端アミノカルボン酸がFAPαによって認識されるオリゴマー部分と、殺細胞部分又は静細胞部分とを示し、該オリゴマー部分のN末端アミノ官能基が式IIのキャッピング基(Cg)に結合している、前記プロドラッグに関する。 
本発明に関連して、“薬剤”は、疾患の治療の援助としてヒト又は動物に投与することができる化合物を意味する。特に、薬剤は薬理学的活性剤である。
“殺細胞化合物”という用語は、生細胞に毒性である化合物、特に細胞を破壊又は死滅する薬剤を意味する。“静細胞化合物”という用語は、細胞増殖や増殖を抑制するので、細胞の増殖を阻止する化合物を意味する。本発明に適した殺細胞化合物又は静細胞化合物の例は、アントラサイクリン誘導体、例えば、ドキソルビシン、メトトレキセート類似体、例えば、メトロレキセート、プリトレキシム、トリメトレキセート又はDDMP、メルファラン、シスプラチンの類似体、例えば、シスプラチン、JM216、JM335、ビス(白金)又はカルボプラチン、プリンやピリミジンの類似体、例えば、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、6-チオグアニン、フルルダラビン又は2-デオキシコホルマイシン、又は他の化学療法剤の類似体、例えば、9-アミノカムプトテシン、D,L-アミノグルテチミド、トリメトプリム、ピリメタミン、マイトマイシンC、マイトキサントロン、シクロホスファナミド、5-フルオロウラシル、エキストラムスチン、ポドフィロトキシン、ブレオマイシン、例えば、米国特許第6,204,388号に記載されるエポチロンやエポチロン誘導体又はタキソールである。
“プロドラッグ”は、投与時に代謝過程で化学変換を受けた後に薬理学的活性物質にならなければならない化合物を意味する。特に、プロドラッグは薬剤の前駆体である。本発明に関連して、プロドラッグはFAPαの触媒作用時に変換される薬剤より著しく殺細胞剤又は静細胞剤でない。当業者は化合物の細胞毒性を求める方法を知っている。例えば、国際出願第00/71571号の実施例６又はMosmann ((1983) J. Immun. Meth. 65, 55-63)を参照のこと。好ましくは、プロドラッグは、試験管内分析において薬剤と比較して細胞毒性が少なくとも1/3である。
【０００７】
“生理的条件下で静細胞剤又は殺細胞剤である薬剤”は、生きたヒト又は動物体内で静細胞化合物又は殺細胞化合物である化合物、特に生きたヒト又は動物体内で細胞を死滅させるか又は細胞の増殖を阻止する化合物を意味する。
“FAPαによって認識される切断部位を有するプロドラッグ”は、FAPαの酵素活性の基質として作用し得るプロドラッグを意味する。特に、FAPαの酵素活性は生理的条件下でプロドラッグの共有結合の切断を触媒し得る。この共有結合の切断により、プロドラッグは直接或いは間接に薬剤に変換される。間接活性化は、FAPα触媒段階の切断産物が薬理学的に活性な物質自体ではないが反応段階、例えば、加水分解を受けて活性になる例である。更に好ましくは、プロドラッグの切断部位はFAPαによって特異的に認識されるが、ヒト又は動物体内に存在する他のタンパク質分解酵素によっては認識されない。好ましくは、切断部位はFAPαによって特異的に認識されるが、ヒト又は動物体液、特に血漿に存在するタンパク質分解酵素によって認識されない。特に好ましい実施態様においては、プロドラッグは血漿、他の体液、又は組織において安定であり、生物学的に活性なFAPαは存在もせず検出もできない。国際出願第00/71571号の実施例7で行なわれた試験管内分析においては50%を超える、更に好ましくは80%を超える、更に好ましくは90%を超えるプロドラッグが37℃で8時間後の10% (v/v)のヒト血漿を含有する溶液中になお存在している。その明細書の記載は本願明細書の含まれるものとする。切断部位は、最も好ましくはFAPαに特異的でなければならない。好適実施態様においては、切断部位はL-プロリン残基を含み、アミド結合を介して殺細胞又は静細胞薬剤に結合する。この種類の一例は、ドキソルビシン-ぺプチド結合体である。FAPαは、ぺプチドのC末端アミノ酸残基、好ましくはL-プロリンと、殺細胞化合物又は静細胞化合物との間のぺプチド結合の切断を触媒することができる。
下記標準条件下で遊離薬剤へ少なくとも10%の変換を示す化合物が好ましい。標準条件下で遊離薬剤へ少なくとも20％の変換を示す化合物が更に好ましい。標準条件下で遊離薬剤へ少なくとも50％の変換を示す化合物がなお更に好ましい。これに関連して標準条件は次のように定義される。各化合物を50 mM Hepes緩衝液、150 mM NaCl、pH 7.2に5μMの最終濃度で溶解し、100 ngのCD8FAPα(国際出願第00/71571号の実施例4を参照のこと)と37℃で24時間インキュベートする。国際出願第00/71571号の実施例5に記載されるように CD8FAPαによる遊離薬剤の放出を求める。
【０００８】
発明の詳細な説明
好ましくは、本発明は、下記式(I)の化合物又はその薬学的に許容しうる塩に関する。
【０００９】
【化２】
2005523264.tif 000003
【００１０】
［式中、R1はアミノアルカノイル基又はオリゴペプチドイル基であり、そのN末端アミノ官能基は下記式(II)
【００１１】
【化３】
2005523264.tif 000004
【００１２】
（式中、X1はC=O又はSO2であり、
X2はC=O、SO2、NH-C=O又は単結合であり、
sは1又は2の整数であり、
tは0又は1、2又は3の整数である。）
を有するキャッピング基(Cg)に結合しており、
RaとRbは中間にあるN-C基と共に、置換されていてもよくベンゾ-又はシクロヘキサノ-縮合されていてもよい3員〜7員飽和又は不飽和複素環を形成し、ここで、1つ又は2つのCH2基はNH、O又はSで置換することができ、
R3はH、C1-C6-アルキル、C3-C8-シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Cyt’は殺細胞化合物又は静細胞化合物の残基である。］
X1がC=O又はSO2、特にC=Oであり、
X2がC=O又はSO2、特にC=Oであり、
sが1又は2の整数、特に1であり、
tが1又は2の整数、特に1である
式Iの化合物が好ましい。
基HO-X1-(CH2)s-が基(CH2)t-X2-についてメタ位又はパラ位で結合するキャッピング基が特に好ましい。下記式IIA又はIIB:
【００１３】
【化４】
2005523264.tif 000005
【００１４】
より選ばれたキャッピング基が最も好ましい。
更に、R1が式Cg-A、Cg-B-A又はCg-(D)n-B-Aの残基であり、ここで、
Cgは式(II)のキャッピング基であり、
A、B、Dは各々独立して式-[NR4-(X)p-CO]-（式中、XはCR5R6であり、R4、R5、R6は各々独立して水素原子、置換されていてもよいC1-C6-アルキル基、C3-C8-シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基又はヘテロアリールアルキル基であり、pは1、2、3、4、5である。）を有するアミノカルボン酸から誘導された部分であるか又は
A、B、Dは各々独立して下記式
【００１５】
【化５】
2005523264.tif 000006
【００１６】
（式中、R7はC1-C6-アルキル、OH又はNH2であり、
nは1〜10の整数であり、
qは0、1又は2であり、
rは0、1又は2である。）
を有する環状アミノカルボン酸から誘導された部分である式Iの化合物、特に
R1がCg-A、Cg-B-A-及びCg-(D)n-B-A-より選ばれた基であり、ここで、
A、B、Dはアミノ酸部分であり、各々独立してグリシン(Gly)、及びD形又はL形のアラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、フェニルアラニン(Phe)、チロシン(Tyr)、トリプトファン(Trp)、システイン(Cys)、メチオニン(Met)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、リシン(Lys)、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、プロリン(Pro)、4-ヒドロキシプロリン(Hyp)、5-ヒドロキシリシン、ノルロイシン(Nle)、5-ヒドロキシノルロイシン(Hyn)、6-ヒドロキシノルロイシン、オルニチン、シクロヘキシルグリシン(Chg)、N-メチルグリシン(N-MeGly)、N-メチルアラニン(N-MeAla)、N-メチルバリン(N-MeVal)、N-メチルロイシン(N-MeLeu)、N-メチルイソロイシン(N-MeIle)、N-メチルノルロイシン(N-MeNle)、N-メチル-2-アミノ酪酸、(N-MeAbu)及びN-メチル-2-アミノペンタン酸(N-MeNva)より選ばれる式Iの化合物が好ましい。
単位Aは、好ましくはL-プロリン、グリシン、L-ノルロイシン、L-シクロヘキシルグリシン、L-5-ヒドロキシノルロイシン、L-6-ヒドロキシノルロイシン、L-5-ヒドロキシリシン、L-アルギニン及びL-リシンより選ばれる。
N末端単位Dは、好ましくはアミノ酸であり、そのアミノ基はキャッピング基への結合で形成する第二級アミノ基、、特にL-プロリン(Pro)、アゼチジン-2-イルカルボン酸及びN-C1-6アルキルアミノ酸、例えば、N-メチルグリシン(N-MeGly)、N-メチルアラニン(N-MeAla)、N-メチルバリン(N-MeVal)、N-メチルロイシン(N-Me-Leu)、N-メチルイソロイシン(N-Me-Ile)、N-メチルノルロイシン(N-MeMle)、N-メチル-2-アミノ酪酸(N-Me-Abu)及びN-メチル-2-アミノペンタン酸(N-MeNva)より選ばれた第三級アミノ基である。
更に、Ra、Rb及び中間にあるN-Cで形成された複素環がR8とR9で置換され、ここで、R8とR9は各々独立して水素又はハロゲン原子又はC1-C6-アルキル基、C1-C6-アルキルアミノ基、ジ-C1-C6-アルキルアミノ基、C1-C6-アルコキシ基、チオール基、C1-C6-アルキルチオ基、オキソ基、イミノ基、ホミル基、C1-C6-アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、C3-C8-シクロアルキル基、アリール基、又はヘテロアリール基である式Iの化合物が好ましい。
下記式IA
【００１７】
【化６】
2005523264.tif 000007
【００１８】
（式中、R1、R3、R8、Cyt’は上記の通りであり、
X-YはCHR9-CH2、CR9=CH、NH-CH2、CH2-NH、-CR9-、CH2-CHR9-CH2、特にCH2-CH2である。）
を有する化合物が特に好ましい。
式IA1やIA2
【００１９】
【化７】
2005523264.tif 000008
【００２０】
（式中、R3、R4、R5、Cyt’、Cg、X、Yは上で定義した通りであるか又は
R4とR5が中間にあるN-C基と共に、置換されていてもよくベンゾ-又はシクロヘキサノ-縮合されていてもよい3〜7員飽和又は不飽和複素環を形成し、ここで、1つ又は2つのCH2基はNH、O又はSで置き換えられてもよい。）
を有する化合物が最も好ましい。
特にことわらない限り、簡単な立体異性体や立体異性体の混合物又はラセミ体も本発明に包含される。
“C1-C6-アルキル”は、一般的には、炭素原子1〜6個を有する直鎖又は分枝鎖炭化水素基である。
基又は部分について本明細書に用いられる“置換されていてもよい”という用語は、1個又は数個のハロゲン原子、ヒドロキシル、アミノ、C1-C6-アルキルアミノ、ジ-C1-C6-アルキルアミノ、C1-C6-アルキルオキシ、チオール、C1-C6-アルキルチオ、、=O、=NH、-CHO、-COOH、-CONH2、-NHC(=NH)NH2、C3-C8-シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリール置換基で置換されていてもよく、相互に同じでも異なってもよい基又は部分を意味する。
次の基を例として挙げることができる。
メチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル(イソプロピル)、ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、n-ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、ヘキシル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-1-メチルプロピル又は1-エチル-2メチル-プロピル、HOCH2-、CH3CH(OH)-、CH3CH(OH)CH2CH2-、HOCH2CH2CH2CH2-、H2NCH2CH2CH2-、H2NCH2CH2CH2CH2-、H2NCH2CH(OH)CH2CH2-、
H2NC(=NH)NHCH2CH2CH2-、HSCH2-、CH3SCH2CH2-、HOOCCH2-、HOOCCH2CH2-、H2NC(=O)CH2-、H2NC(=O)CH2CH2-、ベンジル、p-ヒドロキシベンジル、4-(p-ヒドロキシフェノキシ)ベンジル、
【００２１】
【化８】
2005523264.tif 000009
【００２２】
C1-C6-アルキル基が置換される場合には、置換基は、好ましくはヒドロキシル、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、チオール、メチルチオール、メトキシ、エトキシ、=O、=NH、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3、-CONH2、-NHC(=NH)NH2、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、p-ヒドロキシベンジル、
【００２３】
【化９】
2005523264.tif 000010
【００２４】
C1-C6-アルキルがアリール又はヘテロアリールで置換される場合には、C1-C6-アルキルは、好ましくはC1、更に好ましくはメチレン基である。
基R1について上記又は下記に用いられる“ジ-又はトリペプチドイル”を含む“アミノアルカノイル”や“オリゴペプチドイル”という用語は、アミノ酸又は12個まで、好ましくは2個又は3個のアミノ酸部分を含むオリゴマーがC末端で複素環の窒素原子にアミド結合によって結合している基を意味する。
アミノ酸とオリゴぺプチドの化学における当業者は、ある種のアミノ酸が他の類似アミノ酸、活性中心に作用するアミノ酸及び/又は等電子アミノ酸で置換することができ、修飾時にもとのアミノ酸又はオリゴぺプチドの生物活性が保存されていることを容易に理解する。ある種の非天然アミノ酸又は修飾した天然アミノ酸は、対応する天然アミノ酸を置き換えるために用いることができる。従って、例えば、チロシンは3-ヨードチロシン、2-又は3-メチルチロシン、3-フルオロチロシンで置き換えることができる。
“C3-C8-シクロアルキル”は、一般的には炭素原子3〜8個を有する環状炭化水素基であり、1個又は数個のヒドロキシル、アミノ、C1-C6-アルキルアミノ、ジ-C1-C6-アルキルアミノ、C1-C6-アルキル、C1-C6-アルキルオキシ、チオール、C1-C6-アルキルチオ、=O、=NH、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3、-CONH2、-NHC(=NH)NH2、又はハロゲンの置換基で置換されていてもよく、相互に同じでも異なってもよい。
中間にあるN-C基と共にRaとRbによって形成される基について本明細書に用いられる“複素環”は、一般的には、1個の窒素原子と窒素、酸素及びイオウの群より選ばれた任意により1又は2個の追加のヘテロ原子を有する3員〜7員、好ましくは4-、5-又は6員芳香族複素環系であり、1個又は数個のハロゲン原子又はC1-C6-アルキル基、C1-C6-アルキルアミノ基、ジ-C1-C6-アルキルアミノ基、C1-C6-アルコキシ基、チオール基、C1-C6-アルキルチオ基、オキソ基、イミノ基、ホルミル基、C1-C6-アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、C3-C8-シクロアルキル基、アリ−ル基、又はヘテロアリール基であり、相互に同じでも異なってもよく、ベンゾ縮合又はシクロヘキサノ縮合であってもよい。そのような複素環は、好ましくはアゼチジンであるか又は全部又は部分的に水素添加したピロール基、ピリジン基、チアゾール基、イソキサゾール基、ピラゾール基、イミダゾール基、インドール基、ベンズイミダゾール基、インダゾール基、ピリダジン基、ピリミジン基、ピラジン基から誘導されるものである。アゼチジン、ピロリジン、3,4-デヒドロピロリジン、ピペリジン、ヘキサヒドロ-1H-アゼピン、オクタヒドロインドール、イミダゾリジン、チアゾリジンである。
そのような複素環が置換される場合には、置換基は、好ましくはメチル、エチル、プロピル、1-メチル-エチル(イソプロピル)、ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、ヒドロキシル、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、チオール、メチルチオール、メトキシ、エトキシ、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3、又は-CONH2である。
【００２５】
“アリール”は、一般的には炭素原子6〜10個、好ましくは6個を有する芳香環系であり、1個又は数個のヒドロキシル、アミノ、C1-C6-アルキルアミノ、ジ-C1-C6-アルキルアミノ、C1-C6-アルキル、C1-C6-アルキルオキシ、チオール、C1-C6-アルキルチオ、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3、-CONH2、又はハロゲン置換基で置換されていてもよく、相互に同じでも異なってもよく、ベンゾ縮合されていてもよい。アリール置換基は、好ましくはベンゼンから誘導することもでき、好ましい例はフェニル、2-ヒドロキシフェニル、3-ヒドロキシフェニル、4-ヒドロキシフェニル、4-アミノフェニル、2-アミノフェニル、3-アミノフェニルである。
アリールが置換される場合には、置換基は、好ましくはメチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル(イソプロピル)、ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、ヒドロキシル、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、チオール、メチルチオール、メトキシ、エトキシ、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3、又は-CONH2である。
“ヘテロアリール”は、一般的には窒素、酸素、又はイオウより選ばれたヘテロ原子1〜5個を有する5〜10員芳香族複素環系であり、1個又は数個のヒドロキシル、アミノ、C1-C6-アルキルアミノ、ジ-C1-C6-アルキルアミノ、C1-C6-アルキル、C1-C6-アルキルオキシ、チオール、C1-C6-アルキルチオ、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3、-CONH2、又はハロゲンの置換基で置換されていてもよく、相互に同じでも異なってもよく、ベンゾ縮合されていてもよい。ヘテロアリール置換基は、好ましくは、フラン、ピロール、チオフェン、ピリジン、チアゾール、イソキサゾール、ピラゾール、イミダゾール、ベンゾフラン、チアナフテン、インドール、ベンズイミダゾール、インダゾール、キノリン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、キナゾリン、ピラン、プリン、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシルから誘導することができる。
ヘテロアリールが置換される場合には、置換基は、好ましくはメチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル(イソプロピル)、ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、ヒドロキシル、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、チオール、メチルチオール、メトキシ、エトキシ、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3、又は-CONH2である。
“殺細胞化合物又は静細胞化合物の残基”は、式(I)に示されるアミド結合の切断時に放出される化合物H2N-Cyt’が殺細胞化合物か又は静細胞化合物自体であるか又は続いての段階で殺細胞化合物又は静細胞化合物に変換できることを意味する。
後者の場合には、-Cyt’は式-L-Cyt”の残基であってもよく、Lは二官能分子、例えば、ジアミンH2N-L’-NH2、アミノアルコールH2N-L’-OH、例えば、p-アミノベンジルアルコール(PABOH)、アミノカーボネート、例えば、
【００２６】
【化１０】
2005523264.tif 000011
【００２７】
又は非天然アミノカルボン酸から誘導されたリンカー残基である。-Cyt’が式-L-Cyt”である場合には、化合物H2N-L’-Cyt”は式(I)に示されたアミド結合の酵素切断によって生成される。化合物H2N-L’-Cyt”は殺細胞又は静細胞物質を放出する続いての段階でCyt”から切断されるリンカー残基であってもよい。例えば、化合物H2N-L’-Cyt”は生理的条件下で、活性治療剤である化合物H2N-L’-OHと殺細胞化合物又は静細胞化合物H-Cyt”へ加水分解することができる(下記において、簡単にするためにCyt’なる語はCyt’とCyt”の両者に用いられ、Lなる語はLとL’の両者に用いられる)。
本発明の化合物の薬学的に許容しうる塩としては、非毒性無機酸又は有機酸から形成された通常の非毒性塩が含まれる。例えば、そのような通常の非毒性塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等の無機酸からの塩、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸から調製された塩が含まれる。
H2N-Cyt’は下記式IV
【００２８】
【化１１】
2005523264.tif 000012
【００２９】
（式中、RcはC1-C6アルキル、C1-C6ヒドロキシアルキル又はC1-C6アルカノイルオキシC1-C6アルキル、特にメチル、ヒドロキシメチル、ジエトキシアセトキシメチル又はブチリルオキシメチルであり;
Rdは水素、ヒドロキシ又はC1-C6アルコキシ、特にメトキシであり;
ReとRfの一方は水素原子であり; もう一方は水素原子又はヒドロキシ基又はテトラヒドロピラン-2-イルオキシ(OTHP)基である。
次の式IIの化合物が特に好ましい。
【００３０】
2005523264.tif 000013
【００３１】
ドキソルビシン(Dox)が最も好ましい。他の殺細胞残基又は静細胞残基Cyt’は、例えば、メトトレキセート、トリメトレキセート、5,10-ジデアザテトラヒドロホレートピリメタミン、トリメトプリム、10-プロパルギル-5,8-ジデアザホレート2,4-ジアミノ-5(3’,4’-ジクロロフェニル)-6-メチルピリミジン、アミノグルテチミド、ゴレセレリン、メルファラン、クロラムブシル、他の化学療法剤の類似体、例えば、9-アミノカンプトテシン(例えば、Burris HA, r. d. and S. M. Fields (1994).“Topoisomerase I inhibitors. An overview of the camp-tothecin ana-logs. [Re-view].”Hematol. Oncol. Clin. North Am. 8(2): 333-355; Iyer, L. and M. J. Ratain (1998).“Clinical pharmacology of camptothecins. [Review] [137 refs].”Cancer Chemo-ther. Pharmacol. 42 Suppl: S31-S43.を参照のこと)又はエポチロン又はその誘導体から誘導することもできる。
式(I)においては、Cyt’はエフェクター生物分子であり、TNFαのように腫瘍細胞の破壊に直接又は間接に作用する。
好ましいアントラサイクリンプロドラッグは下記式III
【００３２】
【化１２】
2005523264.tif 000014
【００３３】
（式中、Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf、R1は上で定義した通りである。）
下記式(IIIA)〜(IIIK)を有するドキソルビシン誘導体が最も好ましい化合物である。
【００３４】
【化１３】
2005523264.tif 000015
【００３５】
【化１４】
2005523264.tif 000016
【００３６】
【化１５】
2005523264.tif 000017
【００３７】
【化１６】
2005523264.tif 000018
【００３８】
【化１７】
2005523264.tif 000019
【００３９】
【化１８】
2005523264.tif 000020
【００４０】
【化１９】
2005523264.tif 000021
【００４１】
【化２０】
2005523264.tif 000022
【００４２】
【化２１】
2005523264.tif 000023
【００４３】
【化２２】
2005523264.tif 000024
【００４４】
式(I)の一部分Cg-B-A又はCg-(D)m-B-Aが2つ以上のイオウ原子を有する場合には、本発明の化合物は1つ以上のジスルフィド結合を含むことができる。
本発明に用いることができる殺細胞化合物又は静細胞化合物の1種は、ドキソルビシンのような式(I)に示されたアミド結合の形成に利用できる一次アミノ官能基を有する。この場合、リンカー分子Lは必要ない。静細胞化合物又は殺細胞化合物がそのようなアミノ官能基をもたない場合には、そのような官能は、例えば、官能基を導入又は変換するか又はリンカー分子を化合物に結合することにより化学修飾によってそのような化合物に生成することができる。オリゴマー部分と殺細胞部分又は静細胞部分との間のアミド結合の切断を確実にするか或いは最適化するためにオリゴマー部分(即ち、アミノカルボキシル残基を含む部分)と本発明の化合物の静細胞部分又は殺細胞部分との間にリンカー分子を挿入することができる。リンカー分子が存在する場合、即ち、構造L-Cyt’を有する化合物内に存在する場合には、LとCyt’間の結合はアミド結合又はエステル結合であることが好ましい。好適実施態様においては、そのようなリンカー分子が酵素切断後の生理的条件下で静細胞化合物又は殺細胞化合物から加水分解されるので、遊離静細胞化合物又は殺細胞化合物が生成される。いずれにしても、本発明の化合物はFAPαの触媒作用時に切断でき、この切断の直接又は間接結果として、生理的条件下に静細胞化合物又は殺細胞化合物を放出する性質をもたなければならない。
態様においては、更に、本発明は、13個までのアミノカルボキシル残基を含み、そのC末端アミノカルボキシルがFAPαによって認識されるオリゴマー部分と、殺細胞部分又は静細胞部分とを示す、FAPαの触媒作用によって殺細胞剤又は静細胞剤へ変換できるプロドラッグであって、該オリゴマー部分のN末端アミノ官能基が式IIのキャッピング基(Cg)に結合していることを特徴とする、前記プロドラッグに関する。
オリゴマー部分は、好ましくはぺプチドである。オリゴマー部分は、好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12のアミノカルボン酸残基、更に好ましくは2、3、又は4アミノカルボン酸残基である。
本発明の化合物は、当該技術において既知の方法で合成することができる(E. Wuensch, Synthese von Peptiden,“Methoden der organischen Chemie,”Houben-Weyl (Eds. E. Mueller, O. Bayer), Vol. XV, Part 1 and 2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974)。例えば、本化合物は、式VIの化合物のオリゴマー部分の末端アミノ官能基と下記式V
【００４５】
【化２３】
2005523264.tif 000025
【００４６】
（式中、X1、X2、s、tは上で示した意味をもち、
LG1はOH又は活性化脱離基であり、
PG1はH又は適切な保護基である。）
を有する化合物とを下記反応スキーム:
【００４７】
【化２４】
2005523264.tif 000026
【００４８】
（式中、Cyt’、Ra、Rb、R3、R4は上で示した意味をもち、R1aはアミノアルカノイル基又はオリゴペプチドイル基であり、そのN末端アミノ官能基は少なくとも1つの水素原子を有する。）
に従って縮合することにより合成することができる。
そのようなアミド形成を達成するために、アミンの求核攻撃のカルボン酸のカルボニル基、即ち、アミノ基によって置換されるのに適した活性化基又は脱離基であるLG1を活性化することが必要とすることがある。この活性化は、カルボン酸を酸塩化物又は酸フッ化物に変換することにより又はカルボン酸を活性化エステル、例えば、N-ヒドロキシスクシニミジルエステル又はペンタフルオロフェニルエステルへ変換することにより行なうことができる。活性化の他の方法は、対称又は非対称無水物への転換である。また、アミド結合の形成は、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)(E. Frerot et al., Tetrahedron, 1991, 47, 259-70)、1,1’-カルボニルジイミダゾール(CDI) (K. Akaji et al., THL, 35, 1994, 3315-18)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU) (R. Knorr et al., THL, 30, 1989, 1927-30)、1-(メシチレン-2-スルホニル)-3-ニトロ-1H-1,2,4-トリアゾール(MSNT) (B. Blankenmeyer-Menge et al., THL, 31, 1990, 1701-04)のようなその場カップリング試薬の使用により達成し得る。
保護基PG1は合成の終わりに除去される。
式VIの化合物は、国際出願第00/71571号に記載されるように調製することができ、その明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする。
本発明の化合物は、医薬使用に企図される。特に、これらの化合物は、FAPαを発現する間質線維芽細胞と関連があり且つ一般に用いうる殺細胞物質及び/又は静細胞物質で治療されることが最適でない腫瘍の治療に有効である。この性質を有する腫瘍は、例えば、肺がん、乳がん、結腸がんのような上皮がんである。FAPαを発現する骨肉腫や軟組織肉腫のような腫瘍もこれらの化合物で治療することができる。
【００４９】
その結果、本発明の他の態様は、Remington: the science and practice of pharmacy. 19th ed. Easton : Mack Publ., 1995に例示されるように、本発明の化合物と、任意により１種以上の適切で且つ薬学的に許容しうる賦形剤とを含む医薬組成物である。医薬組成物は、固体又は溶液として処方することができる。固体製剤は、注入前に溶液に調製されてもよい。好ましくは、本発明の医薬組成物は、注射用溶液である。全身的に、例えば、静脈内注射、又は局所的に、例えば、腫瘍部位に直接注入することにより投与することができる。用量は、患者の体重や健康状態、基礎疾患の種類、適用される化合物の治療窓、溶解性等の要因によって調整される。用量を適切に調整することは、当業者の知識の範囲内である。ドキソルビシン結合体の場合、例えば、投与量は、好ましくは10 mg/m2〜2000 mg/m2の範囲内であるが、それより多い投与量も少ない投与量も適当であってよい。
従って、本発明の態様は、更に、がん治療用医薬組成物を調製するための本発明の化合物の使用である。更に、本発明の態様は、がんの治療方法であって、本発明の医薬組成物の有効量を患者に投与する段階を含む、前記方法である。適応症には、がん治療、特に:
1) 乳房、肺、結腸直腸、頭頚部、膵、卵巣、膀胱、胃、皮膚、子宮内膜、卵巣、精巣、食道、前立腺、腎由来を含む上皮がんの治療;
2) 骨肉腫や軟組織肉腫: 骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫瘍(MFH)、平滑筋肉腫; 
3) 造血悪性腫瘍: ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫;
4) 神経外胚葉腫瘍: 末梢神経腫瘍、星状細胞腫、メラノーマ;
5) 中皮腫
が含まれる。
慢性関節リウマチ、骨関節症、肝硬変、動脈硬化、異常創傷治癒のような慢性炎症症状の治療も含まれる。
本発明の態様は、更に、がんの治療方法であって、プロドラッグが患者に投与され、前記プロドラッグが酵素活性によって殺細胞剤又は静細胞剤へ変換でき、前記酵素活性が腫瘍組織と関連がある細胞の発現産物である、前記方法である。好ましくは、前記酵素活性はFAPαのタンパク質分解活性である。
化合物を投与する一方法は、静脈内注入である。他の可能な投与経路には腹腔内注入(ボーラスとして或いは輸液として)、筋肉内注入又は腫瘍内注入が含まれる。適切な場合、直接適用も可能である(例えば、肺線維症)。
当業者は、個々の試薬や反応条件が次の次に示されるが、本発明の範囲によって包含されることを意味する変更がなされ得ることは理解される。それ故、次の実施例は本発明を更に具体的に説明するものであり、限定するものではない。
【００５０】
実施例 1
(4-カルボキシメチルフェニル)酢酸 N-ヒドロキシスクシニミジルエステルの合成
1,4-フェニレンジ酢酸(4.8 g、25ミリモル)をアセトニトリル(100 ml)とN,N-ジメチルホルムアミド(100 ml)に溶解した。その溶液を0℃に冷却し、N-ヒドロキシスクシンイミド(2,9 g、25ミリモル)とジイソプロピルエチルアミン(8.6 ml、50ミリモル)を添加した。その溶液を0℃で30分間撹拌した。次に、アセトニトリル(50 ml)に溶解したジシクロヘキシルカルボジイミド(5.2 g、25ミリモル)の溶液を1時間かけて滴下した。氷浴を除去し、懸濁液を一晩撹拌した。その懸濁液をろ過し、ろ液の溶媒を減圧下で濃縮した。ジエチルエーテルを添加することによりジシクロヘキシル尿素の残存している量が沈殿し、ろ過により除去した。そのろ液をアセトニトリル/水勾配を加えた逆相HPLCで精製した。生成物画分を凍結乾燥して生成物を白色結晶として得た(1.1 g、16 %)。生成物は満足な分析データを示した。HPLC > 95 %; ES-MS: [M+H]+ = 292
同様に(3-カルボキシメチルフェニル)酢酸 N-ヒドロキシスクシニミジルエステルを調製した。
【００５１】
実施例 2
[2-(4-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox (III-G)
すべての段階を窒素雰囲気下で行なった。
2A Aloc-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox:
Aloc-Pro-Ala-Gly-Pro-OH (190 mg 0.45ミリモル)とドキソルビシン塩酸塩(260 mg 0.49ミリモル)をN,N-ジメチルホルムアミド(5 ml)に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン(153μl 0.90ミリモル)を添加し、その溶液を0℃に冷却した。その撹拌溶液にN,N-ジメチルホルムアミド(10 ml)中のO-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU) (221mg 0.582ミリモル)の溶液を30分間かけて滴下した。その溶液を0℃で1時間撹拌した。ジイソプロピルエチルアミン(25 μl、0.14ミリモル)を添加した後、溶媒を減圧下30℃で除去した。粗生成物をメタノール(1 ml)と水(6 ml)に溶解し、アセトニトリル/水勾配を加える逆相HPLCで精製した。生成物画分を凍結乾燥し、Aloc-Pro-Ala-Gly-Pro-Doxの赤色結晶を得た(345 mg、81 %)。生成物は満足な分析データを示した。HPLC > 95 %; ES-MS: [M+Na]+ = 972
2B H-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox:
Aloc-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox (343 mg 0.36ミリモル)をジクロロメタン(20 ml)に溶解し、ジエチルアミン(185μl、1.81ミリモル)とPd(Ph3P)4 (20.8 mg 0.02ミリモル)を添加した。その溶液を室温で1時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗油状物を水(3 ml)とアセトニトリル(1 ml)に溶解した。生成物をアセトニトリル/水勾配を加える逆相HPLCで精製し、生成物画分を凍結乾燥してH-Pro-Ala-Gly-Pro-Doxの赤色結晶を得た(296 mg、95 %)。生成物は満足な分析データを示した。HPLC > 95 %; ES-MS: [m+H]+ = 866
2C [2-(4-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox (III-G):
H-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox (100 mg 0.12ミリモル)をN,N-ジメチルホルムアミド(5 ml)に溶解した。(4-カルボキシメチルフェニル)酢酸 N-ヒドロキシスクシニミジルエステル (36.8 mg 0.127ミリモル)とジイソプロピルエチルアミン(22μl 0.127ミリモル)を添加した。その溶液を室温で48時間撹拌した。溶媒を減圧下30℃で除去した。粗生成物をアセトニトリル/水勾配を加える逆相HPLCで精製し、生成物画分を凍結乾燥により濃縮して生成物を得た(77 mg、64 %)。生成物は満足な分析データを示した。HPLC > 95 %; ES-MS: [M+H]+ = 1043
この方法と同様に次の化合物が調製された。
[2-(4-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-N-MeIle-Ala-Gly-Pro-Dox (III-E)
[2-(4-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-N-MeLeu-Ala-Gly-Pro-Dox (III-A)
[2-(4-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-N-MeVal-Ala-Gly-Pro-Dox (III-F)
[2-(4-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-Aze-Ala-Gly-Pro-Dox (III-H)
[2-(3-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox (III-K)
[2-(3-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-N-MeIle-Ala-Gly-Pro-Dox (III-B)
[2-(3-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-N-MeLeu-Ala-Gly-Pro-Dox (III-C)
[2-(3-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-N-MeVal-Ala-Gly-Pro-Dox (III-D)
【００５２】
MNA基質のFAPによる切断の分析:
緩衝液 A:
100mMトリスHCl pH 7.8、100 mM NaCl
FAPで安定にトランスフェクトした293の細胞からの細胞抽出液を記載されるように調製した(Park, et al., Fibroblast Activation Protein, a Dual Specificity Serine Protease expressed in human tumor stromal fibroblasts. (1999) J. Biol. Chem. 36505-12を参照のこと)。同様の抽出液を293の対照親細胞からFAPを含めずに調製した。FAPトランスフェクトした細胞抽出液におけるFAP濃度を免疫分析で測り、1回の分析に対して1 ngの酵素(緩衝液Aで希釈した) を用いた。FAP負の293対照細胞抽出液を負の対照と同じ希釈度(緩衝液Aで希釈した)で用いた。基質を、はじめにジメチルホルムアミドに200 mMの濃度で溶解し、緩衝液Aに2.5 mMの最終濃度まで希釈した。基質はこの濃度でわずかに可溶でなく、更に希釈しなければならなかった。
分析条件:
10μlの10% DMSO/緩衝液A
70μlの希釈したFAP細胞抽出液、1 ngのFAP酵素含有(又はFAPを含まない293の対照細胞抽出液)
20μlの2.5 mM基質
混合し、室温で1時間インキュベートし、下記波長でフルオロスター蛍光光度計において蛍光を測定する。
MNA結合体:   励起: 355 nm、放射: 405 nm。
1 ngのFAP酵素で処理した試料において測定した蛍光値からFAPを含まない293の対照細胞抽出液で処理した試料において測定した蛍光値を引く。
【００５３】
実施例 3
[2-(4-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-Pro-Ala-Gly-Pro-MNAの合成
3A Boc-Pro-Ala-Gly-OH:
H-Gly-2-クロロトリチル-樹脂(10 g、11.1ミリモル)を反応容器に加え、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF) (150 mlを3回)で洗浄した。DMF (100 ml)に溶解したFmoc-Ala-OH (20.7 g、66.6ミリモル)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N,N-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU) (21.4 g、66.6ミリモル)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt) (9.06 g、66.6ミリモル)及びジイソプロピルエチルアミン(当量)を添加した。懸濁液を室温で一晩振盪した。樹脂をDMF、ジクロロメタン、及びDMFで4回注意深く洗浄した。Fmoc基の切断をDMF中の30% ピペリジンの溶液で30分間行ない、続いてDMF (4回)、ジクロロメタン(3回)及びDMF (4回)による洗浄段階を注意深く行なった。Boc-Pro-OHを同様の方法で取り込ませた。上記のようなFmoc基を切断した後、樹脂を最後にメタノールとジエチルエーテルで洗浄し、窒素流において乾燥した。生成物の切断をジクロロメタン中の30 % 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールの溶液を用いて室温で30分間行なった。ろ液を減圧下で濃縮してぺプチドを得た。これは反応に十分純粋であった。生成物は満足な分析データを示した。HPLC > 95 %; ES-MS: [M+H]+ = 344.2
3B H-Pro-Ala-Gly-Pro-MNA:
Boc-Pro-Ala-Gly-OH (3.3 g、9.6ミリモル)、H-Pro-MNA (3.2 g、10.6ミリモル)、TBTU (3.1 g、9.6ミリモル)、HOBt (1.3 g、9.6ミリモル)及びジイソプロピルエチルアミン(3当量)をDMF (20 ml)に溶解し、室温で4時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留油状物をトリフルオロ酢酸/水95:5 (10 ml)で3時間溶解した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をアセトニトリル/水勾配を加える逆相HPLCで精製した。生成物は満足な分析データを示した。HPLC > 95 %; ES-MS: [M+H]+ = 496.6
【００５４】
3C 4-カルボキシメチルフェニルアセチル-Pro-Ala-Gly-Pro-MNA:
N,N-ジメチルホルムアミド(4 ml)中の1,4-フェニレンジ酢酸(16 mg、80マイクロモル)、H-Pro-Ala-Gly-Pro-MNA (40 mg、80マイクロモル)、ヒドロキシベンゾトリアゾール(11 mg、80マイクロモル)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N,N-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU) (26 mg、80マイクロモル)及びDIPEA (30μl、160マイクロモル)の溶液を室温で一晩振盪した。その溶液を減圧下で濃縮乾固し、残留物をアセトニトリル/水勾配を加える逆相によってHPLC精製した。生成物含有画分を凍結乾燥して26 mg (39マイクロモル、48 %) の所望の生成物を白色粉末として得た。生成物は満足な分析データを示した。HPLC > 95 %; ES-MS: [M+H]+ = 672.7
次の表は、同様に調製したぺプチド-MNA-結合体を示すものであり、FAPによる切断データが含まれている。
MNA結合体                                                             切断
[μM]
[2-(4-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-N-MeIle-Ala-Gly-Pro-MNA      16.36
[2-(4-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-N-MeLeu-Ala-Gly-Pro-MNA      13.97
[2-(4-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-N-MeVal-Ala-Gly-Pro-MNA      13.39
[2-(4-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-Aze-Ala-Gly-Pro-MNA           9.54
[2-(3-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-Pro-Ala-Gly-Pro-MNA           2.80
[2-(3-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-N-MeIle-Ala-Gly-Pro-MNA      15.36
[2-(3-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-N-MeLeu-Ala-Gly-Pro-MNA      12.00
[2-(3-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-N-MeVal-Ala-Gly-Pro-MNA       9.52
[2-(4-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-Pro-Ala-Gly-Pro-MNA           7.25
[2-(2-カルボキシメチルフェニル)アセチル]-Pro-Ala-Gly-Pro-MNA           0.94
溶解性試験
リン酸緩衝液中の下記式
【００５５】
【化２５】
2005523264.tif 000027
【００５６】
2005523264.tif 000028
を有する化合物の溶解性を比較した。
Aの溶解度は > 10 mg/mlであるが、Bの溶解度は < 2 mg/mlであることがわかった。
【国際調査報告】
2005523264.tif 000046
2005523264.tif 000047