(57)【要約】本発明は、胃腸内分泌細胞特異的Gタンパク質共役受容体の単離核酸およびアミノ酸配列、このような受容体の検出方法、およびこのような受容体のリガンドをスクリーニングする方法を提供する。さらに、本発明は、STC-1腸内分泌細胞が複数の苦味覚受容体ならびに味覚シグナル伝達を媒介して細胞内カルシウム濃度の変化を開始させる苦味化合物に応答するGタンパク質のαサブユニットを発現することを証明する。現在、味覚受容体媒介シグナル伝達の機能的効果を決定するための培養細胞モデル系が存在しないことを考慮すると、本発明者らの所見により、STC-1細胞は、味覚媒介シグナル伝達の研究のための細胞モデルとして同定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体が、胃腸内分泌細胞中で発現し、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：9、配列番号：11、もしくは配列番号：13からなる群より、または配列番号：15、17、19、21、23、25、27、29からなる群より、または配列番号：31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67からなる群より、または配列番号：69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89からなる群より選択される配列と60％を超える核酸配列同一性を構成する、化学感覚Gタンパク質共役受容体をコードする単離核酸。
【請求項２】
配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：14のアミノ酸配列を含む受容体をコードする、請求項1記載の単離核酸。
【請求項３】
配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5および配列番号：7、配列番号：9、配列番号：11、または配列番号：13の核酸配列を含む、請求項1記載の単離核酸。
【請求項４】
マウス、ラット、またはヒト起源である、請求項1記載の単離核酸。
【請求項５】
配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：14からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする縮重プライマーと同一の配列にアニーリングするプライマーによって増幅される、請求項1記載の単離核酸。
【請求項６】
（i）化合物を味覚Gタンパク質共役受容体ポリペプチドに接触させる工程であって、該ポリペプチドは、胃腸内分泌細胞中で発現し、（a）マウスGT2R:配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30からなる群より、または（b）ラットGT2R:配列番号：32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68からなる群より、または（c）ヒトGT2R:配列番号：70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90からなる群より選択される配列と50％を超えるアミノ酸配列同一性を構成する工程と、
（ii）該ポリペプチドに対する該化合物の機能的効果を決定する工程とを含む、胃腸内分泌細胞の化学感覚応答を改変する化合物を同定する方法。
【請求項７】
ポリペプチドが、Gタンパク質共役受容体活性を有する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
機能的効果を、細胞内Ca2＋、サイクリックヌクレオチド、リン酸化および脱リン酸化、ならびにpHの変化を測定することによって決定する、請求項6記載の方法。
【請求項９】
機能的効果を、ペプチドホルモンおよび神経伝達物質の放出を測定することによって決定する、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが天然型または組換え型である、請求項6記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが、マウス、ラット、およびヒト起源である、請求項6記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドが、内分泌細胞および外分泌細胞、上皮細胞ならびに神経内分泌細胞を含むが排他的でない胃腸細胞で発現する、請求項6記載の方法。
【請求項１３】
機能的効果を、受容体のリン酸化、内在化、および再分布の変化を測定することによって決定する、請求項6記載の方法。
【請求項１４】
細胞が真核細胞である、請求項6記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドが、（a）マウスGT2R:配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30からなる群より、または（b）ラットGT2R:配列番号：32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68からなる群より、または（c）ヒトGT2R:配列番号：70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項6記載の方法。
【請求項１６】
請求項1記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１７】
請求項16記載のベクターを含む、単離細胞。
【請求項１８】
味覚受容体媒介シグナル伝達のモジュレーターを同定するための、GT2Rを天然に発現する天然のSTC-1腸内分泌細胞の使用。
【請求項１９】
STC-1腸内分泌細胞を化合物に接触させる工程と、
STC-1細胞に対する該化合物の機能的効果を測定する工程とを含む、GT2R媒介シグナル伝達のモジュレーターを同定するための請求項18記載の方法。
【請求項２０】
モジュレーターが、食物または薬学的成分、その分解産物、または夾雑物由来の味分子である、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
シグナル伝達を、細胞内Ca2＋、サイクリックヌクレオチド、リン酸化および脱リン酸化、pH、ならびにコレシストキニン（CCK）放出の変化を測定することによって決定する、請求項18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益
本発明は、国立衛生研究所（National Institute of Health）によって授与された助成金番号DK17294の政府支援を使用して実施した。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、GI内分泌細胞特異的Gタンパク共役受容体の単離核酸およびアミノ酸配列、このような核酸および受容体を検出する方法、ならびにGI特異的Gタンパク質共役受容体の天然および人工リガンドのスクリーニングモデルを提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
味覚系は、栄養になる有益な化合物ならびに有害または有毒な物質を検出するために進化過程において選択された（Hernessら、Annu.Rev.Physiol.、61、873〜900、1999）。特に、苦味は、有毒な可能性のある物質の摂取に対する中心的な警戒信号として進化してきた（Glendinningら、Behav.Neurosci.、113、840〜854、1999）。最近、舌中の味蕾内に組織されている特殊化神経上皮味覚受容体細胞で発現される大きな苦味覚受容体（T2R）ファミリーが、ヒトおよびげっ歯類で同定されている（Chandrashekarら、Cell、100、703〜711、2000;Adlerら、Cell、100、693〜702、2000;Matsunamiら、Nature（London）、404、601〜604、2000）。推定7回膜貫通ドメインによって特徴付けられるグアニンヌクレオチド結合調節タンパク質（Gタンパク質）共役受容体（GPCR）スーパーファミリーに属するこれらの推定味覚受容体は、V1R鋤鼻受容体およびオプシンと遠戚関係にある（Adlerら、Cell、100、693〜702、2000）。遺伝的および生化学的証拠は、特異的Gα、サブユニット、ガストデューシン（Gαgust）、およびトランスデューシン（Gαt）が舌上皮の味蕾における苦味および甘味の味覚シグナルを媒介することを示す（Ruiz-Avilaら、Nature（London）、376、80〜85、1995;Wongら、Nature（London）、381、796〜800、1996;Mingら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、96、9903〜9908、1999）。
【０００４】
舌の外側では、Gαgustの発現は胃細胞（Hoeferら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93、6631〜6634、1996）および膵臓細胞（Hoeferら、1998、Histochem.Cell.Biol.、110、303〜309、1998）にも局在しており、味覚機構が胃腸（GI）管にも存在する可能性が示唆される。しかし、Gαgustを発現する細胞の全てが受容体のT2Rファミリーのメンバーを同時発現するわけではない（Adlerら、Cell、100、693〜702、2000）。例えば、舌の茸状乳頭中のほとんどのGαgust陽性味覚受容体細胞はT2R陰性であり、Gαgustは他の受容体を介したシグナル伝達も媒介しうることを示唆する（Wongら、Nature（London）、381、796〜800、1996）。胃粘膜および腸粘膜が分子感知の役割を果たすことを確立し、関連するシグナル伝達機構を解明するために、胃または腸上皮の味覚受容体遺伝子転写物を同定することは極めて重要である。
【０００５】
味覚系に加えて、嗅覚系は、化学的に異なる構造から構成される何千もの臭気（臭気物質）を区別しなければならない。一般に、一次嗅覚受容体ニューロンは、吸入した臭気物質と直接接触する嗅覚上皮に存在すると認識されている。臭気物質が嗅覚ニューロン表面に存在する特異的GPCRと相互作用して、特異的ヘテロ三量体Gタンパク質（Gαolf）を活性化してcAMPの蓄積を促進した場合、臭気物質シグナル伝達が開始される（Ronnettら、Annu.Rev.Physiol.、64、189〜222、2002）。しかし、いくつかの研究により、嗅覚受容体遺伝子に密接に関連する受容体が嗅覚上皮以外の組織で発現している可能性が示されている。この所見により、この化学感覚受容体ファミリーの別の生物学的役割が存在する可能性が示唆される。
【０００６】
ヒトおよびマウス赤血球（Feingoldら、Genomics、61、15〜23、1999）、成長中のラットの心臓（Drutelら、Recept.Channel、3、33〜40、1995）、鳥類脊索（Nefら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、94、4766〜71、1997）、および舌上皮（Abeら、FEBS Lett.、316、253〜56、1993）での種々の嗅覚受容体の発現が報告された。嗅覚受容体存在の最もよい事例は、哺乳動物嗅覚GPCRに関連する遺伝子が睾丸で転写されて成熟精子表面で発現することが見出され、嗅覚受容体の精子走化性における可能な役割が示唆されていることである（Walenskyら、J.Biol.Chem.、273、9378〜87、1998）。本発明者らは、味覚受容体に加えて、胃腸管内の腸内分泌細胞または他の細胞型が臭気物質受容体および対応するシグナル伝達物質（Gαolf）を発現することができる可能性を考えた。
【０００７】
胃腸管の管腔内容物の分子感知は、運動性、GIホルモンの放出、および膵胆管（pancreatobiliary）分泌を制御するだけでなく、摂取した薬物および毒素の検出、それによる生存に重要な応答の開始も担う。20種を超える同定されたホルモンを産生および放出する腸内分泌細胞は、これらの生理学的応答の調和および調整に重要な役割を果たすと考えられる。（Furnessら、Am.J.Physiol.、277、G922〜G928、1999）。これらの基本的調節系は数十年前より公知であるにもかかわらず、管腔内容物の化学組成物を感知する最初の分子認識事象は理解されていないままである。
【０００８】
食物の摂取、消化、および毒物拒絶における化学感覚の重要性の観点からの、味覚および嗅覚受容体の発現が関心対象である。化学感覚受容体（味覚イオンチャネルを含む）およびシグナル伝達分子の同定および単離により、味覚伝達経路が薬理学的および遺伝学的に調整される。例えば、受容体およびチャネル分子の利用可能性により、化学感覚細胞活性の高親和性アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、およびモジュレーターをスクリーニング可能である。このような化合物を、味をカスタマイズするために医薬品および食品工業で使用することができる。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、薬物および毒素を含む摂取物質の化学成分を知覚する味覚受容体ファミリーであって、GI管における分子感知の理解および腸内のこれらの受容体の機能を改変する新規の治療化合物の開発に重要な意味を有する胃および腸の味覚受容体ファミリーを同定する。このような治療化合物は、胃腸の運動性および反射、粘膜成長、イオンおよび酵素の分泌、満腹および食欲の公知のレギュレーターであるペプチドホルモンおよび神経伝達物質の放出に対する機能的効果を有する。治療化合物はまた、味の感受性および適合性を改変する、受容体のリン酸化、内在化、および再分布を変化させうる。
【００１０】
1つの局面では、本発明は、（a）マウスGT2R:配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30からなる群より、または（b）ラットGT2R:配列番号：32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68からなる群より、または（c）ヒトGT2R:配列番号：70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも50％のアミノ酸同一性、通常60％を超える配列同一性を有し、70％、80％、または90％の同一性を有しうる胃腸管味覚伝達Gタンパク質共役受容体（本明細書中では、GT2Rという）をコードする単離核酸を提供する。
【００１１】
1つの局面では、本発明は、（a）マウスGT2R:配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30からなる群より、または（b）ラットGT2R:配列番号：32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68からなる群より、または（c）ヒトGT2R:配列番号：70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90からなる群より選択される膜貫通ドメイン配列と、少なくとも60％のアミノ酸配列同一性、通常70％を超える同一性を有し、80％または90％の同一性を有しうる、感覚伝達Gタンパク質共役受容体の膜貫通ドメインを含む単離ポリペプチドを提供する。
【００１２】
別の局面では、本発明は、（a）マウスGT2R:配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30からなる群より、または（b）ラットGT2R:配列番号：32、34、36、38、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68からなる群より、または（c）ヒトGT2R:配列番号：70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90からなる群より選択されるアミノ酸配列と約50％を超えるアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００１３】
別の局面では、本発明は、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：9、配列番号：11、配列番号：13からなる群より選択される配列を含む内因性GT2Rを発現する宿主細胞株STC-1を提供する。別の局面では、本発明は、（a）マウスGT2R:配列番号：15、17、19、21、23、25、27、29からなる群より、または（b）ラットGT2R:配列番号：31、33、35、37、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67からなる群より、または（c）ヒトGT2R:配列番号：69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89からなる群より選択される配列を含む組換えGT2Rを含む発現ベクターでトランスフェクトすることができる宿主細胞株STC-1を提供する。
【００１４】
別の局面では、本発明は、（i）化合物を味覚伝達Gタンパク質共役受容体ポリペプチドに接触させる工程であって、ポリペプチドが、STC-1細胞中で発現し、配列番号：2、配列番号：4、または配列番号：6、および配列番号：8、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：14からなる群より選択される配列と60％を超えるアミノ酸同一性を有する工程と、（ii）前記ポリペプチドに対する前記化合物の機能的効果を決定する工程とを含む、胃腸化学感覚細胞の味覚シグナル伝達を調整する化合物を同定する方法を提供する。
【００１５】
1つの態様では、ポリペプチドは、（a）マウスGT2R:配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30からなる群より、または（b）ラットGT2R:配列番号：32、34、36、38、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68からなる群より、または（c）ヒトGT2R:配列番号：70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90からなる群より選択されるポリペプチドと、約50％を超えるアミノ酸同一性、通常少なくとも60％の配列同一性を有し、70％、80％、または90％の同一性を有しうる、味覚Gタンパク質共役受容体である。別の態様では、ポリペプチドは、Gタンパク質共役受容体活性を有する。別の態様では、機能的効果を、細胞内cAMP、IP3、またはCa2＋の変化の測定によって決定する。別の態様では、機能的効果は、化学的効果である。別の態様では、機能的効果を、化合物の結合ドメインへの結合の測定によって決定する。別の態様では、ポリペプチドは組換え型である。別の態様では、ポリペプチドは、マウス、ラット、またはヒト由来である。別の態様では、ポリペプチドは、胃腺、腸腺、細胞株、または細胞膜で発現される。別の態様では、細胞は真核細胞である。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、マウス、ラット、およびヒトの胃腸管由来の味覚伝達Gタンパク質共役受容体ファミリーをコードする新規の核酸配列を提供する。本発明はまた、舌外のGI管に存在する公知のT2Rホモログの同一性およびいくつかの部分的に特徴付けられたT2Rフラグメントの全配列を初めて提供する。これらの核酸およびこれらがコードする受容体を、胃腸味覚受容体については「GT2R」といい、GT2R-s（STC-1細胞由来の配列番号：1〜14）、GT2R-m（マウスGI粘膜由来の配列番号：15〜30）、GT2R-r（ラットGI粘膜由来の配列番号：31〜68）、およびGT2R-h（ヒトGI cDNA由来の配列番号：69〜90）と命名する。
【００１７】
これらの特異的GT2Rおよびその一次共役Gタンパク質GαtおよびGαgustは、味覚伝達経路の構成要素である（実施例1を参照のこと）。これらの核酸は、特にGI管または細胞株で発現するので、味覚細胞の同定のための価値あるプローブを提供する。例えば、GT2Rポリペプチドおよびタンパク質のプローブを使用して、腸管ニューロンなどの化学感覚細胞または特異的内分泌細胞（例えば、腸クロム親和性（EC）細胞、腸クロム親和性様（EC）細胞、およびCCK産生I細胞）のサブセットを同定することができる。さらに、核酸およびこれらがコードするタンパク質を、味覚誘導性挙動の分析のためのプローブとして使用することができる。
【００１８】
本発明はまた、これらの新規のGT2Rのリガンド/モジュレーター（例えば、アクチベーター、インヒビター、スティミュレーター、エンハンサー、アゴニスト、およびアンタゴニスト）のスクリーニング方法を提供する。味覚伝達のこのようなモジュレーターは、味覚シグナル伝達経路の薬理学的および遺伝学的調整に有用である。これらのスクリーニング方法を使用して、GI化学感覚細胞活性の高親和性アゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる。次いで、これらの調整化合物を、腸内での味覚をカスタマイズするために食品工業および医薬品工業で使用することができる。したがって、本発明は、GT2Rがシグナル伝達に対するモジュレーター効果のための直接または間接的受容体分子として作用する、味覚調整アッセイを提供する。例えば、インビトロ、インビボ、およびエクスビボにおける、イオン濃度、膜電位、電流、イオンの流れ、転写、シグナル伝達、受容体-リガンド相互作用、二次メッセンジャー濃度の変化を測定するために、GT2Rをアッセイで使用することができる。1つの態様では、GT2Rを、緑色蛍光タンパク質などの第2のレポーター分子への結合を介する間接的レポーターとして使用することができる（例えば、Mistili＆Spector、Nature Biotechnology、15、961〜964、1997を参照のこと）。別の態様では、細胞中でGT2Rが発現し、GT2R活性を介したシグナル伝達の調整を、Ca2＋レベルの変化の測定によってアッセイする（実施例2を参照のこと）。
【００１９】
味覚伝達のモジュレーターのアッセイ方法には、GT2R-S1、膜貫通ドメインなどのその一部、または1つもしくは複数のGT2R-S1ドメインを含むキメラタンパク質を使用するインビトロリガンド結合アッセイ;組織培養細胞GT2R-S1発現;GT2R-S1の転写活性化;GT2Rのリン酸化および脱リン酸化;GT2RへのGタンパク質結合;リガンド結合アッセイ;電圧;膜電位および膜コンダクタンスの変化;イオン流アッセイ;cAMPおよびイノシトール三リン酸などの細胞内二次メッセンジャーの変化;細胞内カルシウムレベルの変化;およびホルモンまたは神経伝達物質の放出が含まれる。
【００２０】
最後に、本発明は、味覚伝達制御の調査および味覚受容体細胞の特異的同定を可能にするGT2R-S1核酸およびタンパク質発現の検出方法を提供する。GT2R-S1は、EC、ECL、および/またはCCK産生I細胞などの化学感覚内分泌細胞の下位集団の同定用の核酸プローブとして有用である。GT2R-S1受容体を使用して、味覚内分泌細胞の同定に有用なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製することもできる。mRNAの逆転写および増幅、総RNAもしくはポリA＋RNAの単離、ノーザンブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーション、RNアーゼ保護、プロービングDNAマイクロチップアレイ、ウェスタンブロットなどの技術を使用してこれらの細胞を同定することもできる。
【００２１】
GT2R遺伝子は、巨大な苦味覚受容体T2Rファミリーの一部である。哺乳動物ゲノムでは、ほとんどのT2R遺伝子は、いくつかの遺伝子クラスターのうちの1つに存在する。例えば、マウス第6染色体には、7、6、および27個の遺伝子（および偽遺伝子）を含む3つの遺伝子クラスターが同定されている。ヒトでは、第12染色体上に見出された2つの遺伝子クラスターは14個および5個の遺伝子を含み、第7染色体上に存在する別のクラスターは10個の遺伝子を含んでいる。マウスおよびヒトゲノムはそれぞれ少なくとも40〜50種の異なるT2R遺伝子を含み得ることが推定されている。GT2Rをコードする遺伝子の染色体局在化を使用して、ヒトにおけるGT2Rに関連する疾患、代謝障害、および形質を同定し、罹患個体をより良好に予防および治療する栄養補助食品および遺伝子ターゲティング研究のための動物モデルを開発することができる。
【００２２】
機能的には、GT2Rは、Gタンパク質と相互作用する苦味覚伝達に関与する7回膜貫通Gタンパク質共役受容体（味覚シグナル伝達を媒介するためのGαtまたはGαgust）を示す（例えば、Fong、Cell Signal、8、217、1996;Baldwin、Curr.Opin.Cell Biol.、6、180、1994、および実施例3を参照のこと）。
【００２３】
構造的には、GT2Rのヌクレオチド配列（例えば、マウス由来の配列番号：1、3、5、または7を参照のこと）は、推定分子量が約38kDaおよび推定範囲が35〜40kDaの約300〜350個のアミノ酸のポリペプチドをコードする（例えば、配列番号：2を参照のこと）。同種由来のGT2R遺伝子は、少なくとも約25アミノ酸長、選択的に50〜100アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約50％のアミノ酸同一性を共有する。
【００２４】
GT2Rメンバーは、GI管での発現が異なる。mT2R19と同様に、GT2R-S1は幽門、胃底、および十二指腸で豊富に発現し、GT2R-S7はこれらの組織中に中程度に豊富な配列である。他方では、GT2R-S2はあまり豊富ではなく、mT2R21はSTC-1および胃粘膜でほとんど発現しない（実施例1および4を参照のこと）。核酸プローブおよびプライマーの提供に加えて、本発明はまた、GI管およびSTC-1細胞株におけるGαt-2またはGαgust発現細胞中でのT2R転写のGI特異的発現をモニターするために使用することができるGT2Rプロモーターのヌクレオチド配列を提供する。
【００２５】
mT2R5における4個のアミノ酸の相違により、シクロヘキシミド知覚種（taster）（DBA/2J）と非知覚種（non-taster）（C57BL/6J）に分かれることが報告されている（Chandrashekarら、Cell、100、703〜711、2000）。本発明はまた、本明細書中に提供したGT2Rタンパク質の多型バリアントを提供する。例えば、GT2R-S2は、11個のアミノ酸が置換されたmT2R23と高度に相同であり、GT2R-S7は2個のアミノ酸のみを変化させるとmT2R2と同一である。部分配列GT2R-S5-1は、5個のアミノ酸が置換されているmT2R7と密接に関連する。したがって、味覚シグナル伝達を増強または除去することができる天然のバリアントまたはミュータントにおける重要な残基の同定により、味分子を改変するための有用な標的が得られる。
【００２６】
GT2R発現STC-1細胞系の同定により、リガンド結合、Gタンパク質の共役および活性化、リン酸化および脱リン酸化、細胞内二次メッセンジャー、ホルモン放出を測定するためのインビトロアッセイを使用した、味覚伝達物質（特に、苦味物質）としてのT2Rのインヒビターおよびアクチベーターのスクリーニング手段も提供される（実施例5を参照のこと）。このようなアクチベーターおよびインヒビターは、味の改変および栄養価の付加に有用な医薬品および食用薬剤（food agent）である。
【００２７】
II.定義
本明細書中で使用される、以下の用語は、特記しない限り、これらの用語に対して記載した意味を有する。
【００２８】
「胃腸内分泌細胞」は、胃腺および腸腺に存在するホルモンおよび神経伝達物質産生細胞（例えば、腸クロム親和性（EC）細胞、腸クロム親和性様（ECL）細胞、およびコレシストキニン産生I細胞、または腫瘍細胞STC-1）である。
【００２９】
「GT2R」は、胃腸味覚受容体を示し、STC-1およびGI組織中に特異的に発現するGタンパク質共役受容体をいう。このような化学感覚細胞は、Gαgust（味細胞特異的Gタンパク質）などの特異的分子を発現するので、同定することができる（McLaughinら、Nature、357、563〜569、1992）。形態学に基づいて内分泌細胞を同定することもできる（Norlenら、J.Histochem.Cytochem.、49、9〜18、2001）。
【００３０】
GT2Rは、「Gタンパク質共役受容体活性」（例えば、細胞外刺激に応答してGタンパク質に結合し、ホスホリパーゼC（PLC）およびアデニリルシクラーゼなどの酵素刺激を介してイノシトール三リン酸（IP3）、cAMP、およびCa2＋などの二次メッセンジャーの産生を促進する）を有する7回膜貫通領域を有するGPCRをコードする（GPCRの構造および機能の説明については、例えば、Fong、前記およびBaldwin、前記を参照のこと）。
【００３１】
したがって、「GT2R」という用語は、（1）約25個のアミノ酸、選択的に50〜100個のアミノ酸範囲（window）にわたって配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8と約60％のアミノ酸配列同一性を有する、（2）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、およびこれらの保存的に改変されたバリアントからなる群より選択される配列と特異的にハイブリダイズする（少なくとも約500、選択的に少なくとも約900ヌクレオチドのサイズを有する）、または（3）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7をコードする縮重プライマーセットと同一の配列と特異的にハイブリダイズするプライマーによって増幅される、多型バリアント、対立遺伝子、ミュータント、および種間ホモログをいう。
【００３２】
形態的には、味覚GPCRは、短いN末端「細胞外ドメイン」、7回膜貫通領域および対応する細胞質ループおよび細胞外ループを含む「膜貫通ドメイン」、およびC末端「細胞質ドメイン」を有する（Buck＆Axel、Cell、65、175〜187、1991を参照のこと）。疎水性および親水性ドメインを同定する配列分析プログラムなどの当業者に公知の方法を使用してこれらのドメインを構造的に同定することができる（例えば、Kyte＆Doolittle、J.Mol.Biol.、157、105〜132、1982を参照のこと）。このようなドメインは、本発明のキメラタンパク質の作製およびインビトロアッセイに有用である。
【００３３】
「細胞外ドメイン」は、細胞膜から突出して細胞の外部表面に曝されたGT2Rポリペプチドのドメインをいう。このようなドメインは、「N末端ドメイン」および膜貫通ドメインの間（例えば、膜貫通領域2と3との間および膜貫通領域4と5との間）の「細胞外ループ」を含む。
【００３４】
7回膜貫領域を含む「膜貫通ドメイン」は、原形質膜内に存在するGT2Rポリペプチドのドメインをいう。
【００３５】
「細胞質ドメイン」は、細胞の内側に面するGT2Rポリペプチドのドメインをいう。このようなドメインは、「C末端ドメイン」および膜貫通ドメインの間（例えば、膜貫通領域1と2との間および膜貫通領域3と4との間）の「細胞内ループ」を含む。「C末端ドメイン」は、最後の膜貫通ドメインの末端からポリペプチドのC末端にわたる領域をいう。
【００３６】
「GPCR活性」は、GPCRが味覚シグナルを伝達する能力をいう。このような活性を、Gタンパク質、Ggust、またはGα15などの無差別な（promiscuous）Gタンパク質、およびPLCなどの酵素へのGPCRへの共役および使用する細胞内カルシウムの増加の測定によって、GPCRを発現する天然の細胞株（例えば、SCT-1）および異種細胞で測定することができる（Offermans＆Simon、J.Biol.Chem.、270、15175〜15180、1995）。受容体活性を、蛍光Ca2＋指示色素および蛍光画像化を使用した［Ca2＋］iのリガンド誘導変化の記録によって有効に測定することができる。
【００３７】
GT2R媒介シグナル伝達を調整する化合物を試験するためのアッセイの文脈での句「機能的効果」には、受容体の影響下での間接的または直接的な、例えば、機能的、物理的、および化学的効果である任意のパラメーターの決定が含まれる。これには、インビトロ、インビボ、およびエクスビボでの、リガンド結合、イオン流の変化、膜電位、電流、転写、Gタンパク質結合、受容体のリン酸化もしくは脱リン酸化、受容体の内在化および再分布、受容体-リガンド相互作用、二次メッセンジャー濃度（例えば、cAMP、IP3、または細胞内Ca2＋）が含まれ、神経伝達物質もしくはホルモン放出の増減などの他の生理学的効果も含まれる。
【００３８】
「機能的効果の決定」は、GT2Rの影響下での間接的または直接的な、例えば、機能的、物理的、および化学的効果であるパラメーターを増減させる化合物のアッセイを意味する。このような機能的効果を、当業者に公知の任意の手段（例えば、分光学的特徴（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）の変化、水力学的特性（例えば、形状）、クロマトグラフ特性、または可溶性、パッチクランピング、電位感受性色素、細胞全体の電流（whole cell current）、放射性同位体の流出、誘導性マーカー、組織培養細胞GT2R発現;GT2Rの転写活性化;リガンド結合アッセイ;電圧、膜電位、および伝導性の変化;イオン流アッセイ;cAMPおよびIP3などの細胞内二次メッセンジャーの変化;細胞内カルシウムレベルの変化;ホルモンおよび神経伝達物質の放出など）によって測定することができる。
【００３９】
GT2Rの「インヒビター」、「アクチベーター」、および「モジュレーター」は、インビトロおよびインビボシグナル伝達アッセイを使用して同定される、阻害、活性化、または調整分子（例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、およびそのホモログおよび模倣物）をいうために交換可能に使用される。インヒビターは、例えば、結合して、味覚伝達の刺激を部分的もしくは全体的に遮断するか、活性化を減少するか、防止するか、遅らせるか、不活化させるか、脱感作するか、下方制御する化合物（例えば、アンタゴニスト）である。アクチベーターは、例えば、結合して味覚伝達の活性化を刺激するか、増加させるか、広げるか、活性化するか、促進するか、増強するか、感作するか、上方制御する化合物（例えば、アゴニスト）である。モジュレーターには、例えば、アクチベーターまたはインヒビターに結合する細胞外タンパク質;Gタンパク質;キナーゼ（例えば、ロドプシンキナーゼおよび受容体の不活化および脱感作に関与するβアドレナリン作動性受容体キナーゼのホモログ）;ならびに受容体を不活化および脱感作するアレスチン様タンパク質との受容体の相互作用を変化させる化合物が含まれる。モジュレーターには、例えば、活性が変化したGT2Rの遺伝子改変異形ならびに天然および合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、および化学的小分子などが含まれる。このようなインヒビターおよびアクチベーターアッセイには、例えば、細胞または細胞膜でのGT2Rの発現、推定モジュレーター化合物の適用、および上記の味覚伝達に対する機能的効果の決定が含まれる。潜在的なアクチベーター、インヒビター、またはモジュレーターで処理したGT2Rを含むサンプルまたはアッセイを、阻害範囲を試験するためにインヒビター、アクチベーター、またはモジュレーターを含まない対照サンプルと比較する。対照サンプル（インヒビターで未処理）に、100％の相対GT2R活性値を割り当てる。GT2R活性の値が対照と比較して約50％またはそれ以下である場合、GT2Rの有意な阻害が達成されたとする。GT2R活性の値が対照と比較して150％、選択的に200〜500％またはそれ以上である場合、GT2Rの有意な活性化が達成されたとする。
【００４０】
特に示さない限り、特定の核酸配列は、明確に示された配列に加えて、保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補配列も暗黙のうちに含む。詳細には、1つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第3の位置を、混合した塩基および/またはデオキシイノシン残基と置換した配列を作製することによって、縮重コドン置換を行うことができる（Batzerら、Nucleic Acid Res.、19、5081、1991;Ohtsukaら、J.Biol.Chem.、260、2605〜2608、1985;Rossoliniら、Mol.Cell.Probes、8、91〜98、1994）。「核酸」という用語を、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと交換可能に使用する。
【００４１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語を、アミノ酸残基のポリマーをいうために本明細書中で交換可能に使用する。この用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人為的な化学的模倣物である、アミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。
【００４２】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸、ならびにその後例えばヒドロキシプロリン、y-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンで修飾されたアミノ酸である。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）に結合した炭素）をいう。このようなアナログは、修飾R基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の全体的な化学構造は異なるが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能する構造を有する化合物をいう。
【００４３】
本明細書において、一般的に公知の3文字表記またはIUPAC-IUB生化学命名委員会が推奨する1文字表記によってアミノ酸を表すことがある。同様に、一般的に認められている一文字コードによってヌクレオチドを表すことがある。「保存的に修飾されたバリアント」を、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾されたバリアントは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列をいう。遺伝コードの縮重により、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される全ての位置で、コードされるポリペプチドを変化させることなく、コドンを任意の対応する記載のコドンに変化させることができる。このような核酸のバリエーションは、保存的に修飾されたバリエーションの一種である「サイレントバリエーション」である。ポリペプチドをコードする本明細書中の各核酸配列は、核酸の全ての可能なサイレントバリエーションも説明する。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンのみのコドンであるAUGおよび通常トリプトファンのみのコドンであるTGGを除く）を修飾して機能的に同一の分子を得ることができることを認識する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションが記載の各配列中に潜在する。
【００４４】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列の1つのアミノ酸または少数のアミノ酸を変化、添加、または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列の各置換、欠失、または付加は、変化によってアミノ酸が化学的に類似のアミノ酸に置換される「保存的に修飾されたバリアント」であることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。このような保存的に修飾されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えられるが、排他的ではない。
【００４５】
本明細書中で使用される、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」を、1つまたは複数の化学結合型、通常相補的塩基対合、通常水素結合形成によって相補配列の標的核酸に結合することができる核酸と定義する。本明細書中で使用される、「プローブ」は、天然（すなわち、A、G、C、またはT）または修飾塩基（7-デアザグアノシン、イノシンなど）を含み得る。さらに、プローブ中の塩基を、ハイブリダイゼーションを妨害しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって連結することができる。したがって、例えば、プローブは、構成塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって結合されたペプチド核酸であり得る。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存してプローブ配列と完全な相補性を欠く標的配列に結合しうることが当業者に理解される。プローブは、同位体、発色団、発光団、色素原で選択的に直接標識されるか、後にストレプトアビジン複合体が結合しうるビオチンなどで間接的に標識される。プローブの有無のアッセイにより、選択した配列またはサブシーケンス（subsequence）の有無を検出することができる。
【００４６】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用する場合、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターを、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の変化によって改変することを示すか、細胞がこのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）型の細胞内で見出されない遺伝子を発現するか、異常に発現されるか、過小発現されるか、全く発現されない天然の遺伝子を発現する。
【００４７】
「異種」という用語は、核酸の一部に関して使用する場合、核酸が天然で互いに同じ関係で見出されない2つまたはそれ以上のサブシーケンスを含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換えによって産生され、新規の機能的核酸が得られるように配置された無関係の遺伝子由来の2つまたはそれ以上の配列（例えば、ある供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域）を有する。同様に、異種タンパク質とは、タンパク質が天然で互いに同じ関係で見出されない2つまたはそれ以上のサブシーケンスを有することを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００４８】
「プロモーター」を、核酸の転写を指示する核酸調節配列のアレイと定義する。本明細書中で使用される「プロモーター」は、転写開始部位付近の必要な核酸配列を含む（ポリメラーゼII型プロモーターの場合、TATAエレメントなど）。プロモーターはまた、選択的に、転写開始部位から数千塩基対離れて存在し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。「構成性」プロモーターは、ほとんどの環境および開発条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または開発調節下で活性なプロモーターである。「作動可能に連結された」という用語は、核酸発現調節配列（プロモーター（転写因子結合部位のアレイ）など）と第2の核酸配列との間での、発現調節配列が第2の配列に対応する核酸の転写を指示する機能的結合をいう。
【００４９】
「発現ベクター」は、宿主細胞中で特定の核酸を転写する一連の特定の核酸エレメントを使用して組換えまたは合成によって作製された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに物理的に結合した転写されるべき核酸を含む。
【００５０】
「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、比較範囲、すなわち以下の配列比較アルゴリズムの1つを使用するかもしくは手動のアラインメントおよび目視によって測定した指定領域において、最大一致のために比較および整列させた場合に、同じであるか、特定のパーセンテージで同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する（すなわち、特定の領域にわたって、70％の同一性、選択的に75％、80％、85％、90％、または95％の同一性）、2つまたはそれ以上の配列またはサブシーケンスをいう。このような配列を、「実質的に同一」であるという。この定義はまた、試験配列の相補性をいう。選択的に、同一性は、少なくとも約50アミノ酸長またはヌクレオチド長の領域にわたって、より好ましくは75〜100アミノ酸長またはヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
【００５１】
配列比較のために、典型的には、1つの配列は、試験配列と比較する基準配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用した場合、試験配列および基準配列を、コンピュータに入力し、必要に応じて、サブシーケンスの座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよく、または別のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて基準配列と比較した試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００５２】
パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適切なアルゴリズムの1つの例は、それぞれAltschulら、Nuc.Acids Res.、25、3389〜3402、1977およびAltschulら、J.Mol.Biol.、215、403〜410、1990に記載のBLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムである。BLAST分析のためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードを用いて整列させた何らかの正の閾値スコアTと適合するかこれを満たすクエリー配列中の長さWの短いワードの同定によって高スコア配列対（HSP）を同定する工程を最初に含む。Tは、隣接ワードのスコア閾値をいう（Altschulら、前記）。これらの最初の隣接ワードのヒットは、これらを含むより長いHSPを見出すための検索開始の基礎として作用する。累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿った両方の方向にワードヒットが拡大される。パラメータM（適合残基組についてのリワードスコア、常に＞0）およびN（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア、常に＜0）を使用してヌクレオチド配列についての累積スコアを計算する。アミノ酸配列のために、スコア行列を使用して、累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から数量X減少した場合、1つまたは複数の負のスコアにする残基アラインメントの蓄積によって累積スコアが0またはそれ以下になる場合、またはいずれかの配列が終了した場合に、各方向でのワードヒットの拡大を停止する。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXは、アラインメントの感度およびスピードを決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（W）11、期待値（E）10、M＝5、N＝4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のために、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、ワード長3、期待値（E）10、BLOSUM62スコア行列（Henikoff ＆ Henikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89、10915、1989を参照のこと）、アラインメント（B）50、期待値（E）10、M＝5、N＝4、および両鎖の比較を使用する。
【００５３】
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Karlin ＆ Altschul、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA、90、5873〜5787、1993を参照のこと）。BLASTアルゴリズムによって得られた類似性の1つの基準は、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間で偶然に適合する可能性の指標が得られる最小総計の確率（smallest sum probability）（P（N））である。例えば、試験核酸と基準核酸の比較における最小総計の確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、核酸を基準配列と類似すると見なす。
【００５４】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である指標は、下記のように第1の核酸によってコードされるポリペプチドが第2の核酸によってコードされるポリペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に交差反応性を示すことである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、2つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第2のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、2つの分子またはその相補物が下記のようにストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイゼーションすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅できることである。
【００５５】
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、発現ベクターの複製または発現を補助する細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞、酵母などの真核細胞、昆虫細胞、両生類細胞、またはCHOなどの哺乳動物細胞、およびHeLa細胞など（例えば、培養細胞、移植片、およびインビボでの細胞）であり得る。
【００５６】
本発明は、組換え遺伝学分野の日常的な技術に依存する。本発明での一般的な使用方法を開示した基礎テキストには、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版、1989;Kriegler、Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual、1990;およびCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、1994が含まれる。
【００５７】
核酸について、キロベース（kb）または塩基対（bp）のいずれかでサイズを示す。これらは、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸、または公開されたDNA配列より見積もったものである。タンパク質について、キロダルトン（kDa）またはアミノ酸残基数でサイズを示す。タンパク質のサイズを、ゲル電気泳動、配列決定されたタンパク質、誘導アミノ酸配列、または公開されたタンパク質配列から評価する。
【００５８】
市販されていないオリゴヌクレオチドを、Van Devanterら、Nucleic Acids Res.、12、6159〜6168、1984に記載の自動化合成機を使用したBeaucage ＆ Caruthers、Tetrahedron Letts.、22、1859〜1862、1981に最初に記載の固相ホスホラミダイトトリエステル法にしたがって化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、Pearson ＆ Reanier、J.Chrom.、255、137〜149、1983に記載の未変性のアクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換HPLCによる。
【００５９】
クローン化遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列を、例えば、Wallaceら、Gene、16、21〜26、1981の二本鎖テンプレートの配列決定のための鎖延長阻止法（chain termination method）を使用してクローニング後に確認することができる。
【００６０】
プライマーを使用した増幅技術を使用して、DNAまたはRNAからGT2Rを増幅および単離することもできる。以下のアミノ酸配列をコードする縮重プライマーを使用して、配列番号：1、3、5、または7からなる群よりGT2R配列を増幅することもできる（例えば、Dieffenfach ＆ Dveksler、PCR Primer.A Laboratory Manual、1995を参照のこと）。これらのプライマーを使用して、例えば、全長配列または1〜数百ヌクレオチドのプローブを増幅し、これを全長GT2R-S1の哺乳動物ライブラリーのスクリーニングに使用することができる。
【００６１】
GT2R核酸ホモログの別の単離方法は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用とRNAまたはDNAテンプレートの増幅とを組み合わせる（米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications、Innisら編、1990を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびリガーゼ連鎖反応（LCR）などの方法を使用して、mRNA、cDNA、ゲノムライブラリー、またはcDNAライブラリーから直接GCR-S1の核酸配列を増幅することができる。本明細書中に記載の配列を使用してGCR-S1ホモログを増幅するように縮重オリゴヌクレオチドをデザインすることができる。制限エンドヌクレアーゼ部位を、プライマーに組み込むことができる。例えば、核酸配列決定または他の目的のための生理学的サンプル中のGT2RをコードするmRNAの存在を検出するためのプローブとしての核酸を作製するために、発現すべきタンパク質をコードする核酸配列のクローン化に、ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅方法も有用であり得る。PCR反応によって増幅した遺伝子を、アガロースゲルから精製し、適切なベクターにクローン化することができる。
【００６２】
GT2Rの遺伝子発現を、当技術分野において公知の技術（例えば、mRNAの逆転写および増幅、全RNAまたはポリA＋RNAの単離、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーション、RNアーゼ保護、およびプロービングDNAマイクロチップアレイなど）によって分析することもできる。1つの態様では、高密度オリゴヌクレオチド分析技術（例えば、GeneChip（商標）、Affymetrix）を使用して、本発明のGT2Rのホモログおよび多型バリアントを同定する。同定されるホモログが公知の疾患に関連する場合、これを生体サンプルにおける疾患検出における診断ツールとしてGeneChip（商標）と共に使用することができる（例えば、Gunthandら、AIDS Res.Hum.Retroviruses、14、869〜876、1998;Kozalら、Nat.Med.、2、753〜759、1996;Matsonら、Anal.Biochem.、224、110〜106、1995;Lockhartら、Nat.Biotechnol.、14、1675〜1680、1996;Gingerasら、Genome Res.、8、435〜448、1998;Haciaら、Nucleic Acids Res.、26、3865〜3866、1998を参照のこと）。
【００６３】
合成オリゴヌクレオチドを使用して、プローブとして使用するかタンパク質発現のための組換えGT2R遺伝子（例えば、配列番号：1、3、5、または7）を構築することができる。遺伝子のセンス鎖および非センス鎖の両方を示す通常40〜120bp長の一連の重複オリゴヌクレオチドを使用してこの方法を行う。次いで、これらのDNAフラグメントを、アニーリングし、ライゲーションし、クローン化する。または、正確なプライマーと共に増幅技術を使用して、GT2R核酸の特異的配列（例えば、配列番号：1、3、5、または7）を増幅することができる。次いで、特異的配列を、発現ベクターにライゲーションする。
【００６４】
GT2Rをコードする核酸を、典型的には、複製および/または発現のための原核細胞または真核細胞への形質転換前に媒介ベクター（intermediate vector）にクローン化する。これらの媒介ベクターは、典型的には、原核生物ベクター（例えば、プラスミド）またはシャトルベクターである。
【００６５】
または、GT2Rまたはそのドメインを含むキメラタンパク質をコードする核酸を、標準的技術によって作製することができる。例えば、リガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（例えば、7回膜貫通領域ならびに対応する細胞外およびサイトゾルループを含むもの）などのドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、活性部位、サブユニット結合領域などを、異種タンパク質に共有結合することができる。例えば、細胞外ドメインを異種GPCR膜貫通ドメインに結合することができ、または異種GPCR細胞外ドメインを膜貫通ドメインに結合することができる。他の異種タンパク質の選択肢には、例えば、緑色蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ、カルシウム感知（calcium sensing）受容体、およびロドプシンプレ配列が含まれる。
【００６６】
目的の配列には、表1に記載の配列表中に記載の配列が含まれる。以下の配列は、マウス、ラット、およびヒト由来の胃腸組織、細胞株、またはcDNAライブラリー中に発現されることが確定された。これらの配列は、味覚シグナル伝達で機能する公知のT2Rに対して配列類似性を示した。
【００６７】
【表１】
2005522187.tif 000002
2005522187.tif 000003
【００６８】
GT2R活性のアッセイ
GT2R-S1ならびにその対立遺伝子、多型バリアント、およびホモログは、味覚伝達に関与するGタンパク質共役受容体である。GT2Rポリペプチド活性を、機能的、化学的、および物理的効果（例えば、リガンド結合（例えば、放射性リガンド結合）、二次メッセンジャー（例えば、cAMP、cGMP、IP3、DAG、またはCa2＋）、イオン流、リン酸化レベル、転写レベル、神経伝達物質レベルなどの測定）を決定するための種々のインビトロおよびインビボアッセイを使用して評価することができる。さらに、このようなアッセイを使用して、GT2Rのインヒビターおよびアクチベーターを試験することができる。モジュレーターはまた、GT2Rの遺伝子改変形態であり得る。味覚伝達活性のこのようなモジュレーターは、味のカスタマイズに有用である。
【００６９】
アッセイのGT2Rを、配列番号：2、4、6、8、またはその保存的に改変されたバリアントからなる群より選択される配列を有するポリペプチドから選択する。または、アッセイのGT2Rは、真核生物に由来し、配列番号：2、4、6、または8とアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸サブシーケンスが含まれる。一般に、アミノ酸配列同一性は、少なくとも70％、選択的に少なくとも85％、選択的に少なくとも90〜95％である。選択的に、アッセイのポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン、サブユニット結合ドメイン、活性部位などの選択されたGT2Rのドメインを含む。GT2Rポリペプチド全体またはそのドメインのいずれかを、異種タンパク質と共有結合させて、本明細書中に記載のアッセイで使用するキメラタンパク質を作製することができる。
【００７０】
GT2R-S1活性のモジュレーターを、上記の組換えまたは天然の選択されたGT2Rポリペプチドを使用して試験する。タンパク質を、組換えまたは天然に存在する細胞中で単離、発現させるか、細胞由来の膜中で発現させるか、組織もしくは動物中で発現させることができる。例えば、胃腺、GI粘膜から分離した細胞、形質転換細胞（例えば、STC-1）、または膜を使用することができる。本明細書中に記載のインビトロまたはインビボアッセイの1つを使用して、改変を試験する。可溶性または固体状態反応を使用し、異種シグナル伝達ドメインに共有結合した受容体の細胞外ドメインまたは受容体の膜貫通ドメインおよびもしくは細胞質ドメインに共有結合した異種細胞外ドメインなどのキメラ分子を使用して、味覚伝達をインビトロで試験することもできる。さらに、目的のタンパク質のリガンド結合ドメインを、インビトロでの可溶性または固体状態反応で使用してリガンド結合をアッセイすることができる。
【００７１】
溶液中、二分子膜、固相に結合した形態、脂質単分子層、または小胞中で、GT2Rの全タンパク質、ドメイン、またはキメラタンパク質へのリガンド結合を試験することができる。モジュレーターの結合を、例えば、分光学的特徴（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）、水力学（例えば、形状）、クロマトグラフィー、または溶解性の変化を使用して試験することができる。
【００７２】
受容体-Gタンパク質の相互作用も試験することができる。例えば、受容体へのGタンパク質の結合または受容体からの放出を試験することができる。例えば、GTPの非存在下で、アクチベーターにより、Gタンパク質（3つ全てのサブユニット）の受容体との強固な複合体が形成される。この複合体を、種々の方法（上記）で検出することができる。このようなアッセイを、インヒビターを検索するように改変することができる。GTPの非存在下での受容体およびGタンパク質へのアクチベーターの添加により強固な複合体が形成され、その後、受容体-Gタンパク質複合体の解離の検索によってインヒビターをスクリーニングする。GTPの存在下での他の2つのGタンパク質サブユニットからのGタンパク質のαサブユニットの放出は、活性化の基準として使用される。
【００７３】
次いで、活性化または阻害されたGタンパク質は、標的酵素、チャネル、および他のエフェクタータンパク質の性質が変化する。古典的な例は、視覚体系における伝達によるcGMPホスホジエステラーゼの活性化、刺激Gタンパク質によるアデニリルシクラーゼ、Gqおよび他の同族Gタンパク質によるホスホリパーゼC、ならびにGiおよび他のGタンパク質による種々のチャネルの改変である。PLCによるジアシルグリセロールおよびIP3の発生およびその後のIP3によるカルシウム動員などの下流コンシーケンス（consequence）を試験することもできる。
【００７４】
活性化GPCR受容体は、受容体のC末端テール（および他の部位も同様に可能である）をリン酸化するキナーゼの基質となる。したがって、アクチベーターは、シンチレーションカウンターでアッセイすることができる32Pのγ標識GTPから受容体への移動を促進する。C末端テールのリン酸化は、アレスチン様タンパク質の結合を促進し、Gタンパク質の結合を妨害する。キナーゼ/アレスチン経路は、多くのGPCR受容体の脱感作で重要な役割を果たす。例えば、味覚受容体を活性なままにする持続時間を調整する化合物は、所望の味を延長するか望ましくない味を遮断する手段として有用である。GTPRシグナル伝達の一般的概説およびシグナル伝達のアッセイ方法については、例えば、Methods in Enzymology、第237巻および第238巻（1994）ならびに第96巻（1983）;Bourneら、Nature、10、349、117〜27、1991;Bourneら、Nature、348、125〜32、1990;Pitcherら、Annu.Rev.Biochem.、67、653〜92、1998を参照のこと。
【００７５】
調整範囲を試験するために、潜在的なGT2Rインヒビターまたはアクチベーターで処理するサンプルまたはアッセイを、試験化合物を使用しない対照サンプルと比較する。対照サンプル（アクチベーターまたはインヒビターで未処理）を、相対GT2R活性値100とする。対照と比較したGT2R活性値が、80％、選択的に50％またはそれ以下である場合、GT2Rの阻害を有意と見なす。対照と比較したGT2R活性値が、150％、好ましくは200〜500％またはそれ以上である場合、GT2Rが活性化されたとする。
【００７６】
ポリペプチド機能に対する試験化合物の効果を、上記の任意のパラメータの試験によって測定することができる。GPCR活性に影響を与える任意の適切な生理学的変化を使用して、本発明のポリペプチドに対する試験化合物の影響を評価することができる。インタクトな細胞または動物を使用して機能的コンシーケンスを測定した場合、伝達物質の放出、ホルモンの放出、公知および特徴付けられていない遺伝子マーカーに対する転写の変化（例えば、ノーザンブロット）、細胞成長もしくはpH変化などの細胞代謝の変化、ならびにCa2+、IP3、またはcAMPなどの細胞内二次メッセンジャーの変化などの種々の効果を測定することもできる。
【００７７】
Gタンパク質共役受容体の好ましいアッセイには、受容体活性を報告するためのイオンまたは電位感受性色素を負荷した細胞が含まれる。このような受容体の活性を決定するアッセイはまた、試験した化合物の活性を評価するための負または正の対照として他のGタンパク質共役受容体の公知のアゴニストおよびアンタゴニストを使用することができる。調整化合物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）の同定アッセイでは、細胞質におけるイオンレベルまたは膜電位の変化を、それぞれイオン感受性または膜電位蛍光指示薬を使用してモニターする。使用することができるイオン感受性指示薬および電位プローブは、Molecular Probes 1997 Catalogに開示のものである。Gタンパク質共役受容体について、Gα15およびGα16などの無差別の（promiscuous）Gタンパク質を、選択したアッセイで使用することができる（Wilkieら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA、88、10049〜10053、1991）。このような無差別のGタンパク質は、広範な受容体に結合可能である。
【００７８】
受容体活性化により、典型的には、その後の細胞内事象（例えば、カルシウムイオンの細胞内貯蔵物を放出するIP3などの二次メッセンジャーの増加）が開始される。いくつかのGタンパク質共役受容体の活性化により、ホスファチジルイノシトールのホスホリパーゼC媒介加水分解を介したIP3形成が刺激される（Berridge ＆ Irvine、Nature、312、315〜21、1984）。次に、IP3は、細胞内カルシウムイオン蓄積物の放出を刺激する。したがって、細胞質のカルシウムイオンレベルの変化またはIP3などの二次メッセンジャーレベルの変化を使用して、Gタンパク質共役受容体機能を評価することができる。このようなGタンパク質共役受容体を発現する細胞は、細胞内貯蔵物およびイオンチャネルの活性化の両方からの寄与の結果として細胞質カルシウムレベルの増加を示すことができ、内部貯蔵物からのカルシウム放出に起因する蛍光応答を区別するために選択的にEGTAなどのキレート剤を補足した無カルシウム緩衝液でこのようなアッセイを行うことが望ましいが、その必要はない。
【００７９】
他のアッセイは、活性化された場合にアデニリルシクラーゼなどの酵素の活性化または阻害によって細胞内サイクリックヌクレオチド（例えば、cAMPまたはcGMP）レベルが変化する受容体の活性を決定する工程を含み得る。サイクリックヌクレオチド依存性イオンチャネル（例えば、cAMPまたはcGMPの結合による活性化の際に陽イオンを透過可能な桿体光受容体細胞チャネルおよび嗅覚ニューロンチャネル）が存在する（例えば、Altenhofenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88、9868〜9872、1991およびDhallanら、Nature、347、184〜187、1990を参照のこと）。受容体の活性化によりサイクリックヌクレオチドレベルが減少する場合、アッセイにおいて受容体活性化化合物を細胞に添加する前に細胞内サイクリックヌクレオチドレベルを増加させる薬剤（例えば、フォルスコリン）に細胞を曝露することが好ましい。このアッセイ型のための細胞を、サイクリックヌクレオチド封入（crated）イオンチャネルをコードするDNA、GPCRホスファターゼ、および活性化した場合に細胞質中のサイクリックヌクレオチドレベルが変化する受容体（例えば、一定のグルタミン酸受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ドーパミン受容体、セロトニン受容体など）をコードするDNAでの宿主細胞の共トランスフェクションによって作製することができる。
【００８０】
1つの態様では、受容体をPLCCシグナル伝達経路にリンクさせる無差別なGタンパク質を有する異種細胞での選択されたGT2R（例えば、GT2R-S1、配列番号：1）の発現によってGT2R活性を測定する（Offermanns ＆ Simon、J.Biol.Chem.、270、15175〜15180、1995を参照のこと;実施例2も参照のこと）。選択的に、細胞株はHEK-293（GT2Rを天然に発現しない）であり、無差別なGタンパク質はGα15である（Offermanns ＆ Simon、前記）。この特異的GT2Rと会合する分子の投与を介してGT2Rシグナル伝達経路の調整に応答して変化する細胞内Ca2＋レベルの変化の測定によって味覚伝達の調整をアッセイする。Ca2＋レベルの変化を、選択的に、蛍光Ca2＋指示薬および蛍光画像化を使用して測定する。
【００８１】
別の態様では、細胞内cAMPまたはcGMPの変化を、免疫アッセイを使用して測定することができる。Offermanns ＆ Simon、J.Biol.Chem.、270、15175〜15180、1995に記載の方法を使用して、cAMPレベルを決定することができる。また、Felley-Boscoら、Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.、11、159〜164、1994に記載の方法を使用して、cGMPレベルを決定することができる。さらに、cAMPおよび/またはcGMPを測定するためのアッセイキットは、米国特許第4,115,538号（参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【００８２】
別の態様では、米国特許第5,436,128号（参照として本明細書に組み入れられる）にしたがってホスファチジルイノシトール（PI）加水分解を分析することができる。簡単に述べれば、アッセイは、3H-ミオイノシトールでの48時間の細胞の標識を含む。標識細胞を、試験化合物で1時間処理する。処理した細胞を溶解し、クロロホルム-メタノール-水で抽出し、その後、リン酸イノシトールをイオン交換クロマトグラフィで分離し、シンチレーションカウンティングによって定量した。緩衝液対照の存在下でのcpmに対するアゴニストの存在下でのcpmの比の計算によって倍率（fold）刺激を決定する。同様に、緩衝液対照（アゴニストを含んでいても含んでいなくてもよい）の存在下でのcpmに対するアンタゴニストの存在下でのcpmの比の計算によって倍率（fold）阻害を決定する。
【００８３】
別の態様では、シグナル伝達に対する試験化合物の効果を評価するために、転写レベルを測定することができる。目的のタンパク質を含む宿主細胞を、任意の相互作用に影響を与えるのに十分な時間試験化合物と接触させ、遺伝子の発現レベルを測定する。このような相互作用に影響を与える時間を、時間の関数としての経時変化の実施および転写レベルの測定などによって実験的に決定することができる。当業者に公知の適切な任意の方法の使用によって、転写量を測定することができる。例えば、ノーザンブロットを使用して目的のタンパク質のmRNA発現を検出することができ、または免疫アッセイを使用してそのポリペプチド産物を同定することができる。または、米国特許第5,436,128号（参照として本明細書に組み入れられる）に記載のレポーター遺伝子を使用した転写ベースのアッセイを使用することができる。レポーター遺伝子は、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼであり得る。さらに、緑色蛍光タンパク質などの第2のレポーターへの結合を介した間接的レポーターとして目的のタンパク質を使用することがきる（例えば、Mistili ＆ Spector、Nature Biotechnology、15、961〜964、1997を参照のこと）。
【００８４】
次いで、転写量を、試験化合物の非存在下でのいずれかの同じ細胞での転写量と比較するか、目的のタンパク質を欠く実質的に同一の細胞における転写量と比較することができる。実質的に同一の細胞は、組換え細胞を調製した、異種DNAの移入によって改変されていない同じ細胞に由来し得る。転写量の任意の相違は、試験化合物が何らかの様式で目的のタンパク質の活性を変化させることを示す。
【００８５】
GT2Rのモジュレーター
GT2Rのモジュレーターとして試験した化合物は、任意の化合物またはタンパク質、アミノ酸、糖、核酸、もしくは脂質などの生物学的実体であり得る。または、モジュレーターは、GT2Rの遺伝的変化形態であり得る。典型的には、試験化合物は、化学小分子およびペプチドである。本質的に任意の化合物を、本発明のアッセイでの潜在的モジュレーターまたはリガンドとして使用することができるが、ほとんどの場合、水溶液または有機溶媒（特に、DMSOベース）に溶解することができる化合物を使用する。典型的に同時進行する（例えば、ロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上でのマイクロタイター形式）アッセイ工程の自動化およびアッセイのための任意の都合の良い供給源からの化合物の提供によって巨大な化合物ライブラリーをスクリーニングするようにアッセイをデザインする。多数の化合物の供給元（Sigma（St.Louis、Mo）、Aldrich（St.Louis、Mo）、Sigma-Aldrich（St.Louis、Mo）、およびFluka Chemika-Biochemica Analytika（Buchs Switzerland）などが含まれる）の存在が認識されている。
【００８６】
1つの好ましい態様では、高処理スクリーニング法は、多数の潜在的な治療化合物（潜在的なモジュレーターまたはリガンド化合物）を含むコンビナトリアル化学またはペプチドライブラリーを提供する工程を含む。このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」を、所望の特徴的活性を示すライブラリーメンバー（特定の化合物の種またはサブクラス）を同定するための本明細書中に記載のような1つまたは複数のアッセイでスクリーニングする。このようにして同定した化合物は、従来の「リード化合物」として供することができるか、これら自体を潜在的または実際の治療薬として使用することができる。
【００８７】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬などの多数の化学的「基礎単位」の組み合わせによる化学合成または生物学的合成によって作製された多様な化合物の集団である。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの一次コンビナトリアル化学ライブラリーを、所与の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物のアミノ酸数）のためのすべての可能な方法における化学的基礎単位（アミノ酸）組の組み合わせによって形成する。化学的基礎単位のこのようなコンビナトリアル混合によって、無数の化合物を合成することができる。
【００８８】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第5,010,175号、Furka、Int.J.Pept.Prot.Res.、37、487〜493、1991、およびHoughtonら、Nature、354、84〜88、1991を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリーを作製するための他の化学論を使用することもできる。このような化学論には、ペプトイド（例えば、PCT国際公開公報第91/19735号）、コードされたペプチド（例えば、PCT国際公開公報第93/20242号）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、PCT国際公開公報第92/00091号）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのディバーソマー（diversomer）（Hobbsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90、6909〜6913、1993）、ビニロガス（vinylogous）ポリペプチド（Hagiharaら、J.Amer.Chem.Soc.、114、6568、1992）、グルコース足場を有する非ペプチドペプチド模倣物（Hirschmannら、J.Amer.Chem.Soc.、114、9217〜9218、1992）、小化合物ライブラリーの類似の有機合成（Chenら、J.Amer.Chem.Soc.、116、2661、1994）、オリゴカルバメート（Choら、Science、261、1303、1993）、および/またはホスホン酸ペプチジル（Campbellら、J.Org.Chem.、59、658、1994）、核酸ライブラリー（Ausubel、Berger、およびSambrook（全て前記）を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第5,539,083号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughnら、Nature Biotechnology、14（3）、309〜314、1996およびPCTIUS96/10287号を参照のこと）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liangら、Science、274、1520〜1522、1996および米国特許第5,593,853号を参照のこと）、小有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C＆EN、1月18日、第33頁、1993;イソプレノイド、米国特許第5,569,588号;チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号;ピロリジン、米国特許第5,525,735号および同第5,519,134号;モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号;ベンゾジアゼピン、米国特許第第5,288,514号などを参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
コンビナトリアルライブラリーを調製するためのデバイスは、市販されている（例えば、357MPS、390MPS、Advanced Chem Tech、Louisville Ky.、Symphony、Rainin、Wobum、Mass.、433A Applied Biosystems、Foster City、Calif.、9050 Plus、Millipore、Bedford、Mass.を参照のこと）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリー自体が市販されている（例えば、ComGenex、Princeton、N.J.、Tripos,Inc.、St.Louis、Mo、3D  Pharmaceuticals、Exton,Pa.、Martek Biosciences、Columbia、Md.などを参照のこと）。
【００９０】
コンピュータベースのアッセイ
GT2R活性を調整する化合物のさらに別のアッセイは、コンピュータシステムを使用してアミノ酸配列によってコードされる構造情報に基づいてGT2Rの三次元構造を作製するコンピュータ支援薬物デザインを含む。入力したアミノ酸配列は、コンピュータプログラムの予め確立されたアルゴリズムと直接的且つ積極的に相互作用して、タンパク質の二次、三次、および四次構造モデルが得られる。次いで、タンパク質構造モデルを、例えば、リガンドへの結合能力を有する構造領域を同定するために試験する。次いで、これらの構造を使用して、タンパク質に結合するリガンドを同定する。
【００９１】
タンパク質の三次元構造モデルを、コンピュータシステムへの少なくとも10個のアミノ酸残基のタンパク質アミノ酸配列またはGT2Rポリペプチドをコードする対応する核酸配列の入力によって作製する。ポリペプチドをコードする核酸のポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号：2、4、6、または8およびその保存的に改変された形態からなる群より選択する。アミノ酸配列は、タンパク質の構造情報をコードするタンパク質の一次配列またはサブシーケンスを示す。アミノ酸配列の少なくとも10個の残基（または10個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列）を、コンピューターキーボードからコンピュータシステム、コンピュータ読取可能基板（電子記憶媒体（例えば、磁気ディスケット、テープ、カートリッジ、およびチップ）、光学媒体（例えば、CD ROM、DVD）、インターネットサイトおよびRAMによって分配される情報が含まれるが、これらに限定されない）に入力する。次いで、タンパク質の三次元構造モデルを、当業者に公知のソフトウェアを使用してアミノ酸配列の相互作用およびコンピュータシステムによって作製する。
【００９２】
アミノ酸配列は、目的のタンパク質の二次、三次、および四次構造の形成に必要な情報をコードする一次構造を示す。ソフトウェアは、構造モデルを作製するための一次配列によってコードされる一定のパラメータを検索する。これらのパラメータを、「エネルギー項」といい、主に、静電ポテンシャル、疎水性ポテンシャル、溶媒接触表面、および水素結合が含まれる。二次エネルギー項は、ファンデルワールスポテンシャルを含む。生体分子は、漸増様式でエネルギー項を最小化する構造を形成する。したがって、コンピュータプログラムは、一次構造またはアミノ酸配列によってコードされるこれらの項を使用して、二次構造モデルを作製する。
【００９３】
次いで、二次構造によってコードされるタンパク質の三次構造を、二次構造のエネルギー項に基づいて形成する。この時点で、ユーザーは、タンパク質が膜結合しているか可溶性であるかどうか、体内での位置、および細胞での位置（例えば、細胞質、表面、または核）などのさらなる変数を入力することができる。二次構造のエネルギー項と共にこれらの変数を使用して、三次構造モデルを形成する。三次構造のモデリングでは、コンピュータプログラムは、二次構造の疎水性表面および二次構造の親水性表面を変数と適合させる。
【００９４】
一旦構造が得られると、コンピュータシステムによって潜在的なリガンド結合領域が同定される。潜在的なリガンドの三次元構造を、上記のような化合物のアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列または化学式の入力によって作製する。次いで、GT2R-S1に結合するリガンドの同定のために、潜在的なリガンドの三次元構造をGT2R-S1タンパク質の三次元構造と比較する。どのリガンドがタンパク質への結合能力が増強されているかを決定するために、タンパク質とリガンドとの間の結合親和性を、エネルギー項を使用して決定する。
【００９５】
コンピュータシステムを使用して、選択されたGT2R遺伝子の、変異、多型バリアント、対立遺伝子および種間ホモログについてもスクリーニングする。このような変異は、病態または遺伝形質に関連し得る。上記のようなGeneChip（商標）および関連テクノロジーを使用して、変異、多型バリアント、対立遺伝子および種間ホモログについてスクリーニングすることもできる。一旦バリアントが同定されると、診断アッセイを使用して、このような変異遺伝子を有する患者を同定することができる。変異GT2R遺伝子の同定は、配列番号：1、3、5、もしくは7または配列番号：2、4、6、または8ならびにその保存的に改変された形態からなる群より選択される第1の核酸またはアミノ酸配列の入力を受けること含む。配列を、上記のようなコンピュータシステムに入力する。次いで、第1の核酸またはアミノ酸配列を、第1の配列と実質的な同一性を有する第2の核酸またはアミノ酸配列と比較する。第2の配列を、上記の様式でコンピュータシステムに入力する。一旦第1および第2の配列が比較されると、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列間の相違が同定される。このような配列は、GT2R遺伝子の対立遺伝子の相違ならびに病態および遺伝形質に関連する変異を示すことができる。
【００９６】
キット
GT2Rホモログは、味覚細胞の同定、法医学および父子鑑別、および味覚伝達の試験のための有用なツールである。GT2R-S1プローブおよびプライマーなどのGT2R核酸に特異的にハイブリダイゼーションするGT2R特異的試薬ならびにGT2Rタンパク質に特異的に結合するGT2R特異的試薬（例えば、GT2R抗体）を使用して、胃腸味覚細胞発現および味覚伝達制御を試験する。
【００９７】
サンプル中のGT2RのDNAおよびRNAの存在についての核酸アッセイは、当業者に公知の多数の技術（サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット、RNアーゼ保護、S1分析、RT-PCRおよびQPCRなどの増幅技術、ならびにインサイチューハイブリダイゼーションなど）を含む。インサイチューハイブリダイゼーションでは、例えば、標的核酸を、その後の解釈および分析のための細胞形態を保存しながら細胞内のハイブリダイゼーションに利用可能なように細胞周囲物から遊離する。以下の文献は、インサイチューハイブリダイゼーション分野の概説を提供している:Singerら、Biotechniques、4、230〜250、1986;Haaseら、Methods in Virology、第VII巻、189〜226、1984;およびNucleic Acid Hybridization:A Practical Approach、Hamesら編、1987。
【００９８】
さらに、GT2Rタンパク質を、上記の種々の免疫アッセイ技術を使用して検出することができる。試験サンプルを、典型的には、正の対照（例えば、組換えGT2Rを発現するサンプル）および負の対照の両方と比較する。
【００９９】
本発明はまた、特異的GT2Rのモジュレーターのスクリーニングキットを提供する。このようなキットを、容易に利用可能な材料および試薬から調製することができる。例えば、このようなキットは、1つまたは複数の以下の材料を含み得る:GT2R核酸またはタンパク質、反応チューブ、およびGT2R活性試験の説明書。選択的に、キットは、生物活性GT2Rを含む。広範な種々のキットおよび成分を、キットの意図する使用者および使用者の特定のニーズに依存して、本発明にしたがって調製することができる。
【０１００】
実施例
以下の実施例は、例示のみを目的として提供されるものであって、本発明を制限するものではない。当業者は、本質的に類似の結果を得るために変化または改変することができる種々の重要でないパラメータを容易に認識するであろう。
【０１０１】
実施例１
STC-1細胞中でのGgust、Gt-2およびGT2Rの発現
腸内分泌細胞は、運動性、胃腸ホルモンの放出、および膵胆管分泌を含む多数の生理学的応答の統合および調整で重要な役割を果たす。本発明者らは、これらの細胞は管腔内容物の化学組成の感知で役割を果たすと仮定した。この仮定を試験するための最初の工程として、腸STC-1細胞株（内分泌細胞の混合集団）（Rindiら、Amer.J.Pathol.、136、1349〜1363、1990）がT2Rファミリーメンバーおよび細胞内味覚シグナル伝達に関係するGタンパク質のGαサブユニットを発現するかどうか試験した。
【０１０２】
RT-PCRおよび配列決定により、STC-1細胞におけるGαgustおよびGαt-2の転写物の存在が明らかとなった（図1A）。さらに、GαgustおよびGαt-2に指向する特異的抗体を使用したSTC-1細胞溶解物のウェスタンブロット分析により、免疫原性ペプチドの存在によって消滅する42〜46kDaの免疫反応性バンドが明らかとなった（図1B）。これらの結果は、STC-1細胞は、細胞内味覚シグナル伝達に関与し、そのため本発明者らがこれらの腸内分泌細胞も苦味覚受容体を発現することができるかどうかを試験することを考えた、Gタンパク質のαサブユニットを発現することを証明する。
【０１０３】
T2RファミリーのメンバーがSTC-1細胞で発現されるかを試験するために、mT2R5、mT2R8、およびmT2R19の利用可能な配列に基づいてマウスT2Rサブタイプ特異的プライマーを最初に使用した。RT-PCRおよび配列決定分析により、mT2R5およびmT2R19の存在が明らかとなった。これらの細胞由来のmT2R19およびmT2R5の全長受容体タンパク質をコードするcDNAの配列決定によって示されるように、STC-1細胞由来の味覚受容体は、味覚細胞由来の味覚受容体と同一である。対照的に、これらの転写物は、マウスSwiss3T3線維芽細胞から単離したRNAを使用したRT-PCRによって検出されなかった。
【０１０４】
苦味覚受容体ファミリーの他のメンバーがSTC-1細胞で発現されるかを決定するために、異種間および縮重プライマーを使用して、マウスSTC-1細胞のcDNAを増幅させた。RT-PCRおよび配列決定分析は、STC-1細胞はmT2R19、mT2R23、mT2R18、mT2R7、mT2R30、mT2R2、mT2R5、およびmT2R26（図1C）、および新規のT2R遺伝子を発現することを証明した。
【０１０５】
ゲノムDNAからマウス遺伝子フラグメントを増幅し、2つのゲノムDNAライブラリー中のこれらのマウス遺伝子をスクリーニングするために特異的プライマーを使用した（BACマウスES-129/SvJ rel.IおよびII、Incyte Genomics、St.Louis、MO）。7つのゲノムクローンが得られ、4つのGT2R遺伝子（STC-1 cDNAクローンS-1、S-2、S-7、およびS-8に対応する）が、これらのゲノムDNAクローンで見出された。
【０１０６】
実施例２
STC-1由来のGT2Rは味覚受容体である
STC-1のcDNAクローンまたはマウスゲノムDNAライブラリーから単離したゲノムクローンからアミノ酸配列を推定した（図2）。この分析により、マウスGT2R-S1およびS4が、rT2R2およびGT2R-r22とそれぞれ84％および75％相同性を有する新規の配列であることが明らかとなった。マウスGT2R-S1は、さらに、マウス胃底、幽門、および十二指腸の粘膜組織で発現されることが見出された。マウスGT2R-S2遺伝子は、mT2R23と密接に関連し（7個のアミノ酸が置換されている）、GT2R-S7は、mT2R2とほとんど同一である（2個しかアミノ酸が変化していない）。後者の2つの転写物は、既存のmT2Rのバリアントを示す。同様に、マウスcDNAクローンGT2R-S5-1およびS7-4は事実上mT2R7およびmT2R30と同一であり、それによりこれらの遺伝子のバリアント形態であり得る。しかし、全長GT2Rタンパク質をコードする遺伝子は、その真の同一性を確認することが必要である。
【０１０７】
STC-1細胞がGαgust、Gαt-2、および多数のGT2Rを発現することが証明されたので、苦味化合物の添加によりこれらの細胞における機能的応答が誘導されるかどうかを試験した。STC-1細胞集団の異種性のために、各細胞のCa2＋画像化を使用して細胞内Ca2＋濃度（［Ca2＋］i）の応答をモニターし、苦味覚シグナル伝達で広範に使用されるいくつかの化合物の効果を試験した。
【０１０８】
蛍光Ca2＋指示薬フラ2-AMを負荷したSTC-1細胞培養物への安息香酸デナトニウムの添加により、細胞内Ca2＋濃度（［Ca2＋］i）の急速且つ用量依存性の上昇が誘導された。10mMでは、デナトニウムにより、試験した細胞の97％で［Ca2＋］iの顕著な増加が誘導され、1mMでは、この苦味物質により、STC-1集団の33％で［Ca2＋］iの増加が誘導された。これらの実験で使用したデナトニウムの濃度は、味覚組織における二次メッセンジャーの変化およびイオンチャネル活性の誘発で使用した濃度と同様である。フェニルチオカルバミド、6-n-プロピル-2-チオウラシル、カフェイン、およびニコチンを含む種々の他の苦味物質によっても、STC-1細胞における強力な［Ca2＋］i応答が誘導された（図9および10）。
【０１０９】
ロドプシンのNH2末端39アミノ酸を含むキメラmT2R5受容体のHEK-293細胞における異種発現は、［Ca2＋］iの増加で示されるようにmT2R-5がシクロヘキシミドに応答することを証明した（Chandrashekarら、Cell、100、703〜711、2000）。SCT-1細胞で低レベルのmT2R5発現が検出されたので、シクロヘキシミドがこれらの細胞での［Ca2＋］i応答を刺激するかを検定した。シクロヘキシミドの添加により、STC-1細胞の小亜集団で［Ca2＋］iの振動変化が誘導されることが見出された（図9）。対照的に、アトロピン、コーヒー酸、およびエピカテキンを含む他の苦味物質によっては、STC-1細胞において［Ca2＋］iのいかなる検出可能な変化も誘導されなかった。
【０１１０】
実施例３
ラットおよびマウスGI組織におけるガストデューシン（Gαgust）およびトランスデューシン（Gt）の発現
GI管でのGαgust発現を同定するために、ラットの幽門、胃底、および十二指腸粘膜から単離した逆転写mRNAを、ラットGαgust配列に基づいた特異的プライマーを使用したPCRに供した（図7）。これらの各組織から推定サイズ（332bp）の主要なPCR産物を得た。興味深いことに、Gαgust特異的プライマーを使用したラット胃内分泌細胞で豊富なcDNAライブラリーのPCR増幅によっても、332bpフラグメントが産生された。配列分析により、これらのPCR産物が増幅Ggustに対応することが確認された。胃内分泌細胞cDNAライブラリー由来のGαgustの全読み取り枠をコードするcDNAフラグメントのクローニングおよび配列決定によって、胃Gαgustの同一性を確認した。
【０１１１】
最初に網膜の光受容体のみで発現すると考えられていたトランスデューシン1（Gαt-1）および2（Gαt-2）のαサブユニットは、細胞内味覚シグナル伝達に関与する脊椎動物味覚細胞にも存在する。ここで、トランスデューシンがGI粘膜でも発現することを同定するために、RT-PCRおよび免疫組織化学を使用した。
【０１１２】
ヒトおよびマウストランスデューシンのCOOH末端の114アミノ酸をコードするコンセンサス配列に基づいたプライマーを使用したRT-PCRによって（図1に記載）、胃底粘膜でGαt-2転写物が支配的に検出された。胃幽門および十二指腸から抽出されたRNAを使用して、より弱いRT-PCTシグナルも得られた。さらに、ラット胃内分泌細胞のcDNAライブラリーにおいてもGαt-2が検出された。対照的に、同じRT-PCR条件を使用して、胃底、幽門、十二指腸、およびラット胃内分泌細胞のcDNAライブラリーから増幅Gαt-1に対応するわずかなシグナルしか得られなかった。Gαt-1のRT-PCRをさらに15サイクル行った場合、胃底のみで推定Gαt-1産物（340bp）が検出され、さらに116bpのイントロン7を含む非スプライシングバリアント（456bp）が幽門で同定された（データ示さず）。これらの結果は、Gαgustに加えて、トランスデューシン（特にGαt-2）もまた胃腸系で発現されることを示す。
【０１１３】
Gαgust転写物が胃底および幽門で検出され、Gαt-2は胃底に優先的に存在するとみられることにより、これら2つのGαタンパク質は異なる胃細胞によって発現されることが示唆され、この可能性を調査するために、本発明者らは、GαgustおよびGαt-2の固有のアミノ酸配列に指向する特異的抗体を使用した免疫組織化学によってこれらGタンパク質のαサブユニットの発現を試験した。マウス胃底粘膜切片では、Gαt-2は、腺の先端領域よりもむしろ基底に存在する細胞に局在していた。首（neck）では、拡散したわずかなGαt-2陽性細胞のみが認められた。対照的に、胃底のほとんどのGαgust陽性細胞は、腺の上部（首）領域、峡部、または表面上皮に存在するが、基底部分に存在しなかった。幽門粘膜で稀にGαt-2染色細胞が認められたが、この胃領域ではGαgust陽性細胞が豊富であった。Gαt-2およびGαgust抗体の対応する免疫原性ペプチドへの曝露により、胃上皮細胞の免疫染色が完全に消滅した。連続切片試験によって明らかなように、Gαt-2陽性細胞の分布および形態（挿入図を参照のこと）は、Gαgust陽性細胞のものと明らかに異なっていた（図4〜6）。この所見は、GαgustおよびGαt-2が、胃粘膜中の異なる上皮細胞型によって発現されることを示す。
【０１１４】
実施例４
ラットおよびマウスGI粘膜中の推定GT2R転写物の同定
苦味覚受容体シグナル伝達に関与するガストデューシンおよびトランスデューシンがGI管で発現されるので、次の工程は、舌上皮の味覚細胞において同定された任意の味覚受容体ファミリーのメンバーも胃粘膜および十二指腸粘膜で発現されるかどうかを決定することであった。マウスまたはラットの胃粘膜または十二指腸粘膜中にT1Rファミリーの転写物は検出されなかった。非常に対照的に、縮重T2Rプライマーを使用したRT-PCR分析によって、幽門、胃底、および十二指腸で増幅産物が産生された。
【０１１５】
ラットの幽門、胃底、および十二指腸組織中の公知のT2Rサブタイプの発現をさらに試験した。ラット特異的プライマーを使用したRT-PCRによって、ラットの幽門、胃底、および十二指腸中に多数のT2R転写物が検出された（図8）。さらに、非常に富化されたラット胃内分泌細胞cDNAライブラリーで多数のT2R cDNA配列がまた見出された。全ての増幅産物をクローン化および配列決定し、これらが公知のT2R配列と同一であることを確認した。対照的に、肝臓、顎下腺、心臓、腎臓、および脳ならびに非分化腸上皮細胞株IEC-6から単離したRNAを使用したRT-PCRでは、いかなるこれらの転写物も検出されなかった。これらの結果により、ラット胃粘膜および十二指腸粘膜でのT2Rファミリーの味覚受容体の選択的発現が明らかとなった。マウス胃および十二指腸組織で任意の公知のT2Rが発現するかどうかも決定した。RT-PCRおよび配列決定分析により、mT2R19に対応する転写物が幽門、胃底、および十二指腸ならびに舌に存在するが、結腸、肝臓、心臓、および腎臓を含む他の組織には存在しないことが確認された（図3）。しかし、最初にSTC-1細胞（GT2R-S1、-S2、-S7、mT2R5、mT2R8、およびmT2R30が含まれる）から同定された他のGT2Rは、マウスの幽門、胃底、および十二指腸で発現が異なるにもかかわらず、その遺伝子は全て第6染色体の苦味遺伝子座内に存在する（図11）。
【０１１６】
実施例５
STC-1は、味覚伝達の新規の細胞モデルである
STC-1細胞が多数の苦味覚受容体および味覚シグナル伝達を媒介するGタンパク質のαサブユニットを発現することが証明された。本発明者らは、苦味覚シグナル伝達で広範に使用される化合物（例えば、デナトニウム、フェニルチオカルバミド、6-n-プロピル-2-チオウラシル、およびシクロヘキシミド）のSTC-1細胞の培養物への添加により、これらの細胞において迅速な［Ca2＋］i応答が促進されるが（図9）、IEC-18または3T3などの十分に研究された他の細胞株では促進されない（図10）ことも証明した。
【０１１７】
したがって、1つまたは多数のGT2Rの活性化は、細胞内貯蔵物からのCa2＋が放出される二次メッセンジャーの合成を促進するか、細胞へのCa2＋の侵入を媒介するイオンチャネルの開閉を調整する。苦味物質に応答した［Ca2＋］iの増加は、神経の反射を活性化し、そして/または隣接細胞の活性を調整するシグナル伝達分子の放出を誘発することができる。現時点では味覚受容体媒介シグナル伝達を研究するための長期培養細胞系が存在しないので、本発明は、GT2R遺伝子調節およびGT2R媒介シグナル伝達の研究のためのSTC-1の優れた細胞モデルを提供する。
【０１１８】
結論
薬物および毒素を含む摂取物質の化学成分を感知する胃および腸中の化学感覚受容体の同定は、これらの受容体の活性化によって開始された応答を改変する新規の分子デザインを含む多数の重要な意味を有する。例えば、薬物および毒素は嘔吐反射を開始させ、いくつかの食品成分は食欲および満腹を制御し、胃腸の運動性を変化させ、正常な消化機能に必要な神経およびホルモンの経路を開始する。本発明者らが胃および腸で同定した化学感覚受容体の巨大なファミリーは、これらの応答の媒介において重要な役割を果たす可能性が高い。
【０１１９】
口より後ろの（post-oral）GI管における味覚受容を、中枢神経系で舌上皮から生じる味覚シグナルと統合し得、または全く異なる系によって処理される。苦味化合物の挙動効果（例えば、条件付きの味の回避）は、味蕾だけでなく胃および腸で発現した味覚受容体によって感知された刺激の複雑な統合の結果である可能性がある。胃および十二指腸の粘膜における味覚受容体の同定は、分子感知理解に新たな道を開き、消化管内のこれらの受容体の機能を改変する治療化合物の開発の道を開く。
【０１２０】
本明細書中で引用された全ての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出願が具体的且つ個別に参照として組み入れられることが示されたかのように、参照として本明細書に組み入れられる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示のためであり、本発明が先行発明によるこのような刊行物よりも日付が前である権利がないという承認と解釈すべきではない。
【０１２１】
上記の発明は、明確な理解を目的として例示および実施例によって詳細に説明されているが、本発明の教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく一定の変形形態および改変形態を作製し得ることが当業者に容易には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】STC-1細胞における、Gαt-2、Gαgust、およびGT2Rファミリーメンバーの発現を示す。A:STC-1細胞から単離したポリA+RNAに対して、Gαt-2およびGαgustのαサブユニットについてRT-PCR分析を行った。推定サイズ（矢印で示す）のPCR産物を、サブクローン化し、配列決定してその同一性を確認した。B:STC-1細胞から調製した総タンパク質抽出物に対するGαt-2およびGαgustについての免疫ブロット分析を行った。通常のまたは予め吸収させたGαt-2およびGαgust特異的抗体を使用して、その各Gαの存在を検出し、総タンパク質抽出物中のサブユニットを電気泳動し、ニトロセルロースメンブレンにブロットした。C:セクションAに記載の実験で使用したものと同一のcDNAに対して、T2R特異的プライマーを使用したRT-PCR分析を行った。推定mT2Rに対応するPCR産物をサブクローン化し配列決定して、公開されているラットおよびマウス配列との関連を確認した。
【図２】STC-1細胞から単離されたマウスGT2Rホモログの推定アミノ酸配列を示す。縮重または特異的プライマーを使用したRT-PCRによって作製したSTC-1のcDNAクローンおよびマウスBACゲノムDNAライブラリーから単離したゲノムクローンから完全な配列を推定した。複数の配列および相同性分析のために、MacVectorソフトウェア（バージョン7.1、Accelrys Inc.）を使用してClustaIWアラインメントを行った。
【図３】マウス上部消化管におけるヒトT2R1およびラットT2R1の公知のマウスオルソログであるmT2R19転写物の組織分布を示す。種々のマウス組織から調製したcDNAに対してmT2R19特異的プライマーを使用したRT-PCRを行った。PCR産物を、EtBrを含む1％アガロースゲルで分離し、推定mT2R19 cDNAフラグメント（698bp）の同一性を、DNA配列決定によって確認した。A:幽門、F:胃底、D:十二指腸、I:回腸、J:空腸、C:結腸、L:肝臓、H:心臓、K:腎臓、およびT:舌。対照として、各サンプル由来のβ-アクチンを増幅し、下のパネルに示す。
【図４】図4A〜4Dは、マウス胃底（AおよびB）および幽門（CおよびD）におけるGαt-2およびGαgustの免疫染色を示す。図4A-Gαt-2に対する抗体での免疫染色。胃底腺の基部（base）は、陽性染色細胞に富む（矢印）（40倍）。挿入図:染色細胞は円く、中心またはわずかに中心から外れた核および淡色の（pale）細胞質を含むことを示す、腺の拡大図（100倍）。図4B-Gαgustに対する抗体で染色された連続切片。この腺部分で陽性細胞は認めらない（40倍）。図4C-Gαt-2に対する抗体で免疫染色した幽門粘膜。陽性細胞は認められない（40倍）。図4D-Gαgustに対する抗体で染色された連続切片。矢印は、多数の陽性染色細胞のいくつかを示す（40倍）。挿入図:基底膜に向かう管腔の棒状物（pole）および突出を有する伸長した形状を示すGαgust陽性細胞の拡大図（100倍）。
【図５】図5A〜5Dは、舌の味蕾（AおよびB）および胃幽門（CおよびD）のGαgustの免疫染色を示す。図5A-Gαgustに対する抗体での舌上皮の免疫染色により、味蕾中のGαgust陽性細胞の存在が示される。図5B-Gαgustに対する抗体で免疫染色しているが、免疫化ペプチドの存在下でインキュベートした舌上皮の連続切片。図5C-Gαgustに対する抗体で免疫染色した幽門粘膜。図5D-Gαgustに対する抗体で免疫染色しているが、免疫化ペプチドの存在下でインキュベートした連続切片。免疫原性ペプチドの添加により味蕾中の細胞または胃粘膜細胞のいずれかの染色が完全に遮断されることに留意のこと。対照的に、Gαolfのαサブユニットまたは細胞外シグナル調節キナーゼ領域に対応する構造的に無関係のペプチドの存在下での抗体のインキュベーションにより、胃上皮細胞の免疫染色は減少しなかった。使用した抗体は、Gαgustのアミノ酸93〜112に対応するペプチド（ラットタンパク質中の非常に多岐にわたる配列）［Gαgust（I-20）;Santa Cruz Biotechnology］で惹起された親和性精製ウサギポリクローナル抗体であった。ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学によって示されるように、Gαgust（I-20）は、マウス、ラット、およびヒト細胞起源のガストデューシンのαサブユニットと特異的に反応するが、桿体（Gαt-1）または錐体（Gαt-2）トランスデューシン（Santa Cruz Biotechnology）を含む他のGαサブユニットとは交差反応しない（倍率:AおよびB、40倍;CおよびD、20倍）。
【図６】図6A〜6Dは、マウス網膜（AおよびB）および胃底（CおよびD）におけるGαt-2の免疫染色を示す。図6A-網膜におけるGαt-2に対する抗体での免疫染色。図6B-網膜の連続切片を、Gαt-2に対する抗体で免疫染色したが、免疫化ペプチドの存在下でインキュベートした。図6C-胃底腺の基部におけるGαt-2に対する抗体での免疫染色。図6D-胃底腺の基部の連続切片を、Gαt-2に対する抗体で免疫染色したが、免疫化ペプチドの存在下でインキュベートした。1.色素上皮、2.光受容体（錐体および桿体）層。免疫原性ペプチドの添加により網膜の錐体細胞または胃粘膜細胞のいずれかの染色が完全に遮断されることに留意のこと。対照的に、Golfのαサブユニットまたは細胞外シグナル関連キナーゼ領域に対応する構造的に無関係のペプチドの存在下での抗体のインキュベーションにより、胃上皮細胞の免疫染色は減少しなかった。これらの実験で使用した抗体は、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学によって示されるように、マウス、ラット、およびヒト起源の細胞と反応するが、Gαt-1（Santa Cruz Biotechnology）を含む他のGαサブユニットと交差反応しない、a-トランスデューシン-2（Gαt-2（I-20）;Santa Cruz Biotechnology）に対する親和性精製ウサギポリクローナル抗体であった（倍率:20倍）。
【図７】ラットGI組織およびラット胃内分泌細胞のcDNAライブラリーにおけるGαtおよびGαgustの発現を示す。PCRによってGαt-2およびGαgustのαサブユニットを増幅するためのコンセンサスプライマーを、公開されたラット、マウス、およびヒトGα配列に基づいてデザインした。ラットの幽門（A）、胃底（F）、および十二指腸（D）由来の逆転写mRNAならびに胃内分泌細胞ライブラリー由来のcDNAに対してPCR増幅反応を行った。Gαt-2およびGαgustのPCR産物の推定サイズは、それぞれ340bpおよび332bpである。
【図８】ラットGI管における公知のrT2Rファミリーメンバーの発現を示す。ラット幽門、胃底、十二指腸粘膜、およびIEC-6細胞から単離したポリA+mRNAならびにラット胃内分泌細胞cDNAライブラリー由来のcDNAに対して、11種の各rT2Rサブタイプについてのラット特異的プライマーを使用してRT-PCRを行った。PCR産物を、臭化エチジウムを含む1％アガロースゲルで分離し、各rT2Rサブタイプについて予想されるサイズを有する産物をサブクローン化し、配列決定してその同一性を評価した。対照転写物である各サンプル由来のβ-アクチンを、隣のレーンに示す。
【図９】細胞内カルシウム濃度を増加させた苦味物質分子に対するSTC-1細胞の応答を示す。各細胞の［Ca2＋］iを、苦味物質の単一濃縮物への曝露前後に測定した。上のパネル:各味物質に応答した細胞のパーセンテージ:DB（安息香酸デナトニウム）10mM（n＝160細胞）、1mM（n＝98細胞）、0.1mM（n＝82細胞）;PTC（フェニルチオカルバミド）3mM（n＝60細胞）;6-PTU（6-n-プロピルチオウラシル）1mM（n＝63細胞）;CAP（カフェイン）10mM（n＝52）;NIC（ニコチン）10mM（n＝53細胞）;CHL（クロロキン）1mM（n＝52細胞）、CYC（シクロヘキシミド）50μM（n＝538細胞）。括弧内の値は、分析細胞数である。下のパネル:安息香酸デナトニウムまたはシクロヘキシミドに曝露した2つの細胞由来の各［Ca2＋］の軌跡。
【図１０】STC-1細胞中の［Ca2＋］iの用量依存性増加を誘導するデナトニウムの効果を示す。（A）カバーガラス上で成長させたSTC-1細胞を、0.03％NaHCO3、1.3mM CaCl2、0.5mM MgCl2、0.4mM MgSO4、および0.1％BSAを補足したハンクス平衡化塩溶液からなる緩衝液（緩衝液A）で洗浄した。洗浄後、細胞を、DMSO中、1mMのストック由来の5mM フラ-2-テトラ-アセトキシメチルエステル（fura-2/AME）と室温で30分間インキュベートした。次いで、細胞を再度緩衝液Aで洗浄し、室温でさらに30分間放置した。各カバーガラスを、2mlの緩衝液Aを含むガラスキュベット中に入れ、Hitachi F-2000蛍光光度計にて励起波長340nmおよび380nmならびに発光波長510nmで連続的に蛍光を測定した。バーは、示した種々の濃度の安息香酸デナトニウム（DB）応答における［Ca2＋］iの増加を示す。（B）5mM安息香酸デナトニウム（DB）およびその後の正の対照として添加した50nMバソプレシン（VP）の連続添加後のIEC-18細胞（正常なラット腸上皮細胞株）の［Ca2＋］i変化。（C）5mM安息香酸デナトニウム（DB）およびその後の正の対照として添加した10nMボンベシン（Bom）の連続添加後のSwiss3T3細胞の［Ca2＋］i変化。IEC-18細胞およびSwiss3T3細胞の［Ca2＋］i変化を、STC-1細胞についての上記のように測定した。
【図１１】マウス第6染色体に対するT2R遺伝子の組織化を示す。苦味遺伝子座は、約1.4Mbにわたり、7個の偽遺伝子を含む少なくとも30個のT2R関連配列を有する。STC-1から同定したGT2R遺伝子は、バンド6F3上の2つのクラスターに分布する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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