(57)【要約】哺乳類のＢＡＲ／ＦＸＲレセプターの活性を調節する方法。本方法は、哺乳類を、ＢＡＲ／ＦＸＲレセプターの活性の特徴を調節することができる合成化合物と接触させることを含む、低コレステロール血症の哺乳類を処置する方法を含む。他の方法として、ＢＡＲ／ＦＸＲアンタゴニスト活性を有する化合物を投与することを含む哺乳類の結腸癌を処置する方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
低コレステロールによって特徴付けられる哺乳類の病理学的状態を処置する方法であって、ＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１からなる群から選択される合成ＢＡＲ／ＦＸＲリガンドを含有する製薬的に許容し得る組成物を該哺乳類に投与する工程を含む方法。
【請求項２】
前記組成物がＡＧＮ２９を含有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記組成物がＡＧＮ３１を含有する請求項１記載の方法。
【請求項４】
IBABPの病的発現によって特徴付けられる哺乳類の病理学的状態を処置する方法であって、ＡＧＮ３４を含有する製薬的に許容し得る組成物を該哺乳類に投与する工程を含む方法。
【請求項５】
前記病理学的状態が低コレステロール血症を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記病理学的状態が結腸癌を含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記病理学的状態が高レベル胆汁酸によって特徴付けられる、請求項４記載の方法。
【請求項８】
Cyp7Aの発現を増加させることなしに哺乳類における結腸癌を処置する方法であって、ＡＧＮ３４を含有する製薬的に許容し得る組成物を該哺乳類に投与する工程を含む方法。
【請求項９】
ＡＧＮ３４が結腸癌細胞のアポトーシスを刺激する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
哺乳類細胞における癌細胞の胆汁酸介在の増殖を阻害する方法であって、ＡＧＮ３４の薬学的有効量を含有する組成物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび獣医薬の分野、生理学および生化学、特に脂質代謝および異化およびコレステロール合成および分解の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な具体的な代謝、発達および異化のプロセスは、in vivoで、ステロイド、レチノイドおよび甲状腺ホルモン等の比較的小さい分子によって、直接または間接的に調節されているようである。
【０００３】
そのような単一の化合物が多数の異なる細胞の事象の調節に寄与し得るメカニズムは、これらの化合物が各々転写の上で活性なタンパク様のレセプターと結合する能力を共有するということが発見されるまで比較的最近まで、大いに議論の対象であった。これらのタンパク質レセプターは、次に、応答エレメント、即ちＲＥと称する、ある特定の遺伝子のコード配列の上流に位置する特異的なシス作動性の核酸調節配列領域を結合して、これらの遺伝子の転写を活性化することができる。このように、タンパク様レセプターは、遺伝子転写および発現の、特異的な、リガンド依存の調節因子として供し得る。
【０００４】
間もなくして、これらのさまざまなレセプターのアミノ酸配列が、この特定の各々のレセプターが、リガンド調節されるレセプター分子のファミリーの構成員とする相同領域を共有することが分かった。このファミリーは、通常細胞の核に高濃度で存在するので、核内ホルモンレセプターのステロイドスーパーファミリーと呼ばれている。
核内ホルモンレセプター間の構造上、機能上の関連性に関する更なる研究は、配列相同性に加えて、それらの間での共通の特定の特性を示した。例えば、Evansら、Science 240：889-895(1988)参照。上記したように、核内ホルモンレセプターは、標的遺伝子のプロモータに存在するシス作動性の調節エレメントと結合することができる。グルココルチコイド、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲスチンおよび電解質コルチコイドレセプターが、ホモダイマーとして、逆位反復配列として構成される特定の応答エレメントに結合することがわかった。
【０００５】
レチノイドレセプターRAR（レチノイン酸レセプター）、甲状腺のレセプター、ビタミンＤレセプター、ペルオキシゾーム増殖因子レセプターを含む、核内ホルモンレセプターの他のクラス、昆虫エクジソンレセプターは、レチノイドＸレセプター（RXR）と連動してヘテロダイマーとしてそれらの応答エレメントと結合し、9-シスレチノイン酸によって正に活性化される。本明細書の一部を構成するMangelsdorf, et al., The Retinoid Receptors in The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine Ch.8 (Sporn et al., eds. 2d ed., Raven Press Ltd. 1994); Nagpal and Chandraratna, Current Pharm. Design 2:295-316 (1996）を参照。多くの核内レセプターと同様、レチノイドレセプターRARおよびRXRは、多くのサブタイプ（RARα、RARβ、RARγ、およびRXRα、RXRβおよびRXRγ）として存在する。さらに、各々のサブタイプは、異なるアイソフォームとして存在し得る。
【０００６】
上記で示される核内ホルモンレセプターが全て特定のリガンドパートナーを有することが示されている一方、核酸およびアミノ酸配列決定の実験および配列アライメントと比較によって、核内ホルモンレセプタースパーファミリーに対して有意の配列相同性および構造上の類似性を保持するタンパク質分子のクラスが明らかになったが、対応するリガンドは未だ発見されていない。事実、いくつかのこれらの「レセプター」は、リガンドの結合を必要とせずに転写活性を示すことが発見された。総合して、これらの割り当てられていないレセプターはまとめて「オーファン」レセプターと呼ばれている。
【０００７】
中間代謝の産物は、原核生物および下等真核生物（例えば酵母）における周知の転写調節因子であるため、おそらく核内ホルモンレセプターとの相互作用によって、そのような代謝産物が高等生物においてもこの機能に供しているかもしれないと推測された。
【０００８】
ファルネソールは、コレステロール、胆汁酸、ポルフィリン、ドリコール、ユビキノン、カロチノイド、レチノイド、ビタミンＤ、ステロイドホルモンの合成に至って、タンパク質をファルネシル化さらたタンパク質の合成へとつながる、メバロン酸の生合成経路に関係しているイソプレノイドである。ファルネソールの誘導体であるファルネシルピロリン酸塩は、メバロン酸生合成経路における最後の共通する中間体である。
【０００９】
Forman et al., Cell 81:687-693 (1995)は、ここではファルネソイドＸ活性化レセプター（FXR）または胆汁酸レセプター（BAR）と称する、オーファンレセプターがファルネソールおよび関連分子によって活性化されることを示している。この文献は、本願明細書においての一部を構成する。BAR/FXRは、肝臓、腸、副腎および腎臓において発現する。
【００１０】
BAR/FXRのアミノ酸配列から、保存されたＤＮＡ結合領域（DBD）とリガンドリガンド結合領域（LBD）が明らかになっている。LBDは、リガンド結合、レセプター二量体化およびトランス活性化を担うサブドメインを含んでいる。さらに、酵母GAL4転写アクチベータのDBDに融合しているBAR/FXRのＬＢＤを含むキメラタンパク質を発現する細胞は、BAR/FXR構築物が、ＲＸＲの二量体化およびリガンド結合サブドメインを含む別のタンパク質とともに同時発現していなければ、GAL4応答エレメントを含んでいるレポーター遺伝子を転写しなかった。これらのデータは、BAR/FXRとＲＸＲが相互作用して転写的に活性な二量体を形成することを示唆している。BAR/FXRと試験した他のいずれの核内ホルモンレセプターとの間でもみられなかった。同上。
【００１１】
核内ホルモンレセプターの中で、BAR/FXRに対するアミノ酸配列の相同性は昆虫エクジソンレセプター（EcR）で高く、RXRホモログと二量体化する。RXRαと二量体化するとき、BAR/FXRは、ＥｃＲ応答エレメントであるhsp27と特異的に結合するが、BAR/FXRが単独で発現する場合には結合はみられないことが示された。BAR/FXRおよびRXRは、ヘテロダイマーとして特定の配列と結合する。
【００１２】
BAR-RXR複合体は、RXRおよびBARでトランスフェクトした細胞の幼虫ホルモンIII（JH III）インキュベーションによって、活性化されることがわかった。さらに細胞を、蛍ルシフェラーゼ遺伝子の上流に配置した、マウス乳癌ウイルス（ＭＴＶ）プロモーター部分において、hsp27応答エレメントの５コピーを含むレポータープラスミドでトランスフェクトした。この遺伝子の活性化によって、トランス活性化活性の測定値として容易に定量可能なルシフェラーゼの発現を生じる。選択されたステロイドを含む他の潜在的なリガンドおよびエイコサノイドは、この系において効果を有しないとわかった。JH IIIは、他の核内ホルモンレセプターを活性化せず、BAR/FXRまたはRXRを単独で活性化しない。Forman et al., Cell 81:687-693 (1995)。
【００１３】
JH IIIは、ファルネシルピロリン酸の誘導体である。他のファルネシル誘導体をBAR-RXR複合体を活性化する能力について試験した。ファルネソールは、ヘテロダイマーを強力に活性化することが示された。ファルネサール、酢酸ファルネシル、farnesoicな酸およびゲラニルゲラニオール等の他の誘導体は、BAR-RXR複合体の活性化は幾分弱く、ファルネシル代謝産物ゲラニオール、スクアレンおよびコレステロールは、BAR-RXRを活性化しなかった。同上。
【００１４】
コレステロール合成は、3-ヒドロキシ3-メチルグルタリル-補酵素Ａのメバロン酸への変換を調節する3-ヒドロキシ3-メチルグルタリル-補酵素Ａ レダクターゼ (HMG-CoA)のレベルの調節によって、密接に調節される。一連のリン酸エステル化および脱炭酸反応で、メバロン酸は、3-イソペンテニルピロリン酸に変換され、3,3-ジメチルアリルピロリン酸に異性化する。５炭素イソプレニル化合物3-イソペンテニルピロリン酸および3,3-ジメチルアリルピロリン酸との間の、酵素により媒介される縮合反応によって、１０炭素のジイソプレニル化合物ゲラニルピロリン酸が形成する。これが、別の3-イソペンテニルピロリン酸の分子と反応して、１５炭素化合物であるファルネシルピロリン酸を形成する。この後者化合物の２分子が反応して３０炭素分子であるプレスクオリンピロリン酸を形成し、これが脱リン酸化されてスクオリンを形成する。次いで、スクオリンは環化してコレステロールを形成する。このように、HMG-CoAレダクターゼは最初のイソプレン単位の形成を媒介し、後に一連の構築およびコレステロールの形成と続く。
【００１５】
HMG-CoAレダクターゼのレベルは、遺伝子転写、翻訳の制御、および酵素の分解によって部分的に支配される。ファルネソールは、HMG-CoAレダクターゼ分解の調節に関与していることが示されている。証明が、ファルネソールおよびステロール成分（例えば25-ヒドロキシコレステロール）によるHMG-CoAレダクターゼ分解の相乗的な促進の証拠が存在する。例えば、本明細書の一部を構成する、Meigs et al., J. Biol. Chem. 271:7916-7922 (1996）を参照。
【００１６】
コレステロールは、さまざまな化合物（例えばステロール、コール酸等の胆汁酸およびステロイドホルモン（例えばテストステロンおよびプロゲステロン）の前駆体である。これらの化合物はすべて、基本のコレステロール核を保持している。より極性の強い胆汁酸は、肝臓で形成され、小腸に分泌され、脂質の吸収を助ける。したがって、コレステロールからの胆汁酸の形成は、コレステロールの重要な分解経路であって、身体のコレステロールの定常状態の鍵となる決定因子である。
【００１７】
コレステロールからの胆汁酸形成の律速酵素は、コレステロール７α水酸化酵素（Cyp7a）である。かねてから、胆汁酸がネガティブフィードバックにおいて作用し、この経路を介して自分自身の産生を制限することが知られていたが、これがどのような手段によって達成されているのかは理解が困難であった。最近、Cyp7a合成および発現が胆汁酸によって抑制されるという証拠が示された。本願明細書の一部を構成するChiang, Front. Biosci. 3:D176-93 (1998)参照。
【００１８】
コレステロールが細胞膜および種々のホルモンおよび他の小分子の合成に決定的であるという事実にもかかわらず、コレステロールレベル、特に低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）の形態での、上昇は、動脈硬化症および他の心疾患との強い関連があった。さらに、適当な胆汁酸濃度の維持は、脂質代謝を調節に重要であり、大腸癌および胆石形成の予防に有用であるかもしれない。
【００１９】
具体的には、CDCAおよびＤＣＡなどの胆汁酸は、シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）転写を活性化する。COX-2は多くの癌細胞系において過剰発現し、アポトーシス（癌に対する生体防御における重要な要素）を阻害することが可能で、脈管形成の刺激および侵襲性に関係していたプロスタグランジンの産生をもたらす。COX-2発現の阻害物質は、腸ポリープの大きさと催起を減少することが知られている。このように、身体内の胆汁酸濃度の維持が非常に重要であろう。
【００２０】
コレスチポールやよびコレスチラミン等のイオン交換媒体は、高コレステロール血症の処置のための現在入手可能な医薬の一つである。これらの医薬は、腸の胆汁酸を隔離することによって機能し、胆汁酸はその後大便中に排出される。小腸が隔離された胆汁酸を再吸収しないので、胆汁酸は、コレステロール分解による胆汁酸の形成の抑制にもはや利用されることはない。結果として、コレステロールの定常状態の濃度が低下するという結果でもって、胆汁酸合成が「抑制」される。
【００２１】
残念ながら、これらのイオン交換薬は、齧歯動物の腸腫瘍の発病率の増加と関係していた。さらに、この医薬は非常に荷電しているので、天然のホルモン、調節因子などの他の化合物を吸着し得る。
【００２２】
1999年1月8〜11日にカリフォルニアのパーム・スプリングスで開かれた核内レセプターのAACRカンファレンスにおいてNeisor, Flach, Weinberger & Bentzenが示したポスターでは、BAR/FXRを活性化し、哺乳類の血漿コレステロールレベルを低下させる特定の１,１−ビホスホネートエステルの能力をについて議論された。このポスターの抄録を、本願明細書において、引用したものとする。
【００２３】
ある特許出願が、本願のある特定の発明者によって出願され、2000年12月21日に公開された。この特許出願（公開番号ＷＯ００／７６５２３で公開）は、本願と同じ譲受人の帰属の下にあった。この出願においてクレームされている発明は、特定の化合物を使用するBAR/FXRレセプター活性の調節方法に関するものである。
【００２４】
さらに、胆汁酸合成におけるBAR/FXRの役割について記載する国際特許出願WO00/40965は、2000年7月13日に公開された。コレステロールまたは胆汁酸合成を調節するための合成化合物は、ここには開示されていない。
【００２５】
現在、BAR/FXRが一体的に胆汁酸の生物学に関与していることは知られている。胆汁酸活性化BAR/FXRは、多くの核内レセプターと結合し得るできるＤＮＡ結合部位を欠いている分子である、SHP（小さいヘテロダイマーパートナー）の発現を誘導する。さらに、BAR/FXRは、胆汁酸が細胞内を動く際に細胞毒性活性を及ぼすのを防ぐのを助けるタンパク質である、回腸胆汁酸結合蛋白質（IBABP）の発現を調節する。特定の胆汁酸輸送体は、胆汁酸が細胞に入るために必要であり、そのような輸送体の少なくとも１つ、BSEPの発現は、胆汁酸活性化BARによって増加する。BAR/FXRはまた、トリグリセリドレベルの胆汁酸関与の制御に関与しており；CDCAはヒトのトリグリセリドレベルを減少させ、BAR/FXRはCDCAの合成を媒介する。
【００２６】
多数の疫学的研究によって、高い食事性コレステロールと大腸癌の発達との間の関連性が実証されている。例えば、Potter, J.D. Colorectal Cancer: Molecules And Populations J Natl Cancer Inst 91: 916-32, 1999。しかしながら、コレステロール代謝産物が大腸癌に関与する詳細なメカニズムは、依然として不明である。コレステロールは、肝臓で胆汁酸に変換された後、そこから消化管に排出される。このように、コレステロールの高い食事は、結果として腸の内容物中の胆汁酸を高濃度にする。食事性コレステロールおよび胆汁酸の上昇との関連性は、大腸癌患者において、糞便中の胆汁酸濃度が通常の人よりもかなり高いので問題である。Hill, M.J., Drasar, B.S., Williams, R.E., Meade, T.W., Cox, A.G., Simpson, J.E.およびMorson, B.C. Faecal Bile-Acids And Clostridia In Patients With Cancer Of The Large Bowel Lancet 1: 535-9, 1975参照。
【００２７】
ヒトの疫学調査に加えて、胆汁酸はさまざまな齧歯動物モデルの大腸癌の成長を促進することが示されている。例えば、胆汁酸の経口または直腸内投与は、大腸癌の発癌物質誘発モデルにおいて、有意のより多くの数の大腸アデノーマおよび腺癌を誘導した。ヒトにおいて、ＡＰＣ遺伝子の突然変異性による不活性化は、大部分の大腸癌腫を発症する。別の有用な大腸癌発癌の別の齧歯動物モデルは、ＡＰＣ遺伝子の突然変異によって腸ポリープを発症するＡＰＣ/Ｍｉｎ（multiple intestinal neoplasia）マウスである。これらマウスに対する胆汁酸の投与は、膨大部腫瘍（Ampullary cancer）の数の増加をもたらす。このように、これらの齧歯動物モデルの実験結果は、胆汁酸レベルの増加と大腸癌を発症する危険性の増加とを関連づける疫学調査を支持するものである。
【００２８】
どのようなメカニズムが、胆汁酸と大腸癌との関連の基礎となっているのか？いくつかの調査によって、内因性の胆汁酸が細胞増殖およびアポプトーシスの間のバランスを変え得ることが示されている。内因性の胆汁酸の枯渇によって、齧歯動物における腸管の上皮細胞増殖速度が低下することが報告されている。Roy, C.C., Laurendeau, G., Doyon, G., Chartrand, L.およびRivest, M.R. The Effect Of Bile And Of Sodium Taurocholate On The Epithelial Cell Dynamics Of The Rat Small Intestine Proc Soc Exp Biol Med 149: 1000-4, 1975。
【００２９】
逆に、現在FXRを活性化することが知られている胆汁酸への急性暴露（１〜２日）によって、腸管上皮細胞増殖が３倍ほど増加することが示されている。明らかに、上皮細胞集団を維持する補償措置なしに増殖の急性の増大を慢性的に維持することは不可能であろう。実際、胆汁酸に対する慢性暴露（２〜４週以上）の後、増殖のこの増加は、観察されないかまたは劇的に減少する。
【００３０】
細胞増殖に加えて、大腸アデノーマからの腺癌への進行がアポプトーシスの抑制と関連しているため、アポプトーシスも大腸癌の発達に重要である。いくつかの胆汁酸は、大腸癌細胞系においてアポプトーシスを誘導することが示されている。対照的に、胆汁酸は良性の大腸アデノーマに由来する細胞系においてアポプトーシスを減少させた。生体内でのアポプトーシスの調節における胆汁酸の役割はいまだ研究途中であるが、これらの研究は、胆汁酸が、より分化の少ない腺癌と比較して、良性のアデノーマに対して種々の影響を及ぼし得ることを示唆している。胆汁酸がどのように最終的に細胞増殖およびアポプトーシスを調節するシグナルを伝達するかを支配している詳細なメカニズムは、解明されていない。
【００３１】
胆汁酸は、また、大腸癌の発生に重要な転写の事象を調節することが示されている。特に、ケノデオキシコール酸（CDCA）およびＤＣＡは、消化器細胞系においてシクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）転写を活性化する。このことは、多くの大腸癌において過剰発現するCOX-2が、アポプトーシスを抑制し脈管形成および侵襲性を刺激するプロスタグランジンを産生するので有意である。さらに、選択的なCOX-2阻害物質は、ＡＰＣ/Ｍｉｎマウスにおいてポリープの数および大きさを減少し、現在臨床試験においえ評価中である。このように、食事性コレステロールに由来する胆汁酸の転写を調節する能力は、大腸癌の発現に重要な密接な関係があるかもしれない。しかしながら、胆汁酸がどのようにしてシグナルを伝達してCOX-2遺伝子転写を刺激するのかは分かっていない。
【００３２】
まとめると、上記の研究は、胆汁酸と腸癌との間の有意な疫学的および実験的関連を示している。特に胆汁酸がBARに結合するという最近の証拠と合わせて、転写を調節する胆汁酸の能力は、リガンド調節される転写制御因子としてのBARが、大腸癌において胆汁酸の活性を媒介し得ることを示している。
【００３３】
大腸細胞増殖の潜在的な媒介因子としての、BAR/FXRなどの核内レセプターの同定は、相当な臨床的価値を有する。第１に、コレステロール摂取量と大腸癌を発症する危険に関する食事のガイドラインを改良する分子的な基礎を提供する。第２に、この知見は、大腸癌を処置および／または予防することを目的とした将来の治療のための特定の分子標的を提供する。特異的で比較的非毒性（すなわち、望ましくない活性が最小限度で有する）となるように設計されれば、「ホルモン」療法は非常に有効であろう。
【００３４】
このように、生体内でのコレステロールおよび／または胆汁酸の定常状態の濃度を調節する方法が当分野において必要とされている。この特定の調節は、胆汁酸合成経路について少なくともいくぶん選択的で、胆汁酸合成に直接関係していない遺伝子の発現に対するBARの効果からは分離されることが好ましい。さらに、化合物がある特定のBAR/FXRの発現を選択的に阻害する一方、他のBAR/FXR標的遺伝子の発現を阻害しない、あるいは実際に増加させることが分かれば、好ましいであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
本発明は、BAR：RXRヘテロダイマーの合成のリガンドを使用することによるBAR/FXRの転写活性を調節する方法に関する。このようなリガンドによって、ＢＡＲは、好ましくはRXRのような他の核内ホルモンレセプターと一緒になって、標的遺伝子の転写を抑制、阻害または刺激することができる。１つの好ましい態様では、本発明は、有効量のBAR/FXR活性の合成のアゴニストを投与することを含む、BAR/FXR活性を調節する方法に関する。好ましい合成アゴニストは、ＡＧＮ ２９およびＡＧＮ ３１であると同定される。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
他の好ましい態様では、本発明は、有効量のＡＧＮ ３４の投与することを含んでなる腸管胆汁酸結合蛋白質（IBABP）のBAR介在性の刺激を阻害するための方法に関する。
【００３７】
本発明は、哺乳類の胆汁酸濃度を調節する方法を企図する。哺乳類の胆汁酸濃度の上昇は、大腸癌の発生の増加と関連し、Cyp7a発現を有意に増加するまたは減少させるBAR/FXRリガンドの使用は、異常に高い胆汁酸濃度を効果的に低減するので、この症状に対して治療および／または予防効果をもたらす。Cyp7a以外のタンパク質の転写は胆汁酸により調節され；これらには腸管胆汁酸結合蛋白質およびシクロオキシゲナーゼ2（両方とも、CDCAによって、上方調節される）およびステロール−２７−水酸化酵素、腸管胆汁酸輸送体および肝胆汁酸性輸送体（これらのタンパク質は、CDCAにより下方調節される）が挙げられる。したがって、本発明の方法は、同様にこれらのタンパク質の発現の調節に有用である。
【００３８】
このように、他の好ましい例では、本発明は、IBABP：胆汁酸複合体の形成の減少を引き起こすBAR/FXRリガンドの薬学的に有効な量の必要な患者への投与による直腸癌の治療方法に関する。好ましくは、BAR/FXRリガンドは、BAR/FXRレセプターの作動性の特性の他の少なくとも一つ活性を拮抗することなくIBABPの発現を減少させる。好ましくは、BAR/FXRリガンドとして好ましいのはＡＧＮ ３４である。
【００３９】
「BAR/FXRリガンド」は、リガンドが、BAR/FXRレセプターか、BAR/FXRレセプターを含みBAR/FXRレセプターに伴う活性を調節する分子間複合体もしくはマルチマーのいずれかに結合することを意味する。
【００４０】
本発明のBAR/FXRリガンドは、BAR/FXRアンタゴニスト、BAR/FXR逆アゴニストであってよいか、またはこれらのうちの1つ以上の性質を有してもよい。「アゴニスト」は、リガンドが、リガンドの非存在下での基線レベルでみられるよりもリガンド依存のBAR/FXR活性を刺激することを意味する。「アンタゴニスト」は、リガンドがBARに結合し、BAR/FXRアゴニスト活性の競争的または非競争的な阻害物質として機能することを意味する。「逆アゴニスト」は、リガンドがBAR/FXRと結合して、BAR/FXRリガンドの非存在下で見られるよりも低いレベルまでBAR/FXR活性の抑制をもたらすことを意味する。
【００４１】
BAR/FXRレセプターに伴う活性を調節することは、リガンドは、本質的にBAR/FXRレセプター単独でのまたは他の因子と組み合わせに関連する、BAR：RXRヘテロダイマーに関連するが、RXRホモダイマーには関連しない活性に影響を及ぼすことを意味する。リガンドは、BAR/FXRサブユニットと結合すること、RXRサブユニットと結合すること、またはBAR/FXRとRXRサブユニットの両方と結合することによって、その活性を発揮しうる。調節のメカニズムは、本発明とは無関係である。
【００４２】
別の態様において、本発明は、哺乳類のＢＡＲ／ＦＸＲレセプターに関連する活性を刺激または阻害するか、または関連する１一方の活性を刺激し他方の活性を阻害する方法であって、ＡＧＮ ２９、ＡＧＮ ３１およびＡＧＮ ３４からなる群から選択される化合物を含有する製薬的に許容し得る組成物を用いてそのような哺乳類を処置することによる方法に関する。
【００４３】
ＡＧＮ ２９は、以下の構造を有する：
【化１】
2005523241.tif 000002
【００４４】
ＡＧＮ ３１は、以下の構造を有する：
【化２】
2005523241.tif 000003
【００４５】
ＡＧＮ ３４は、以下の構造を有する：
【化３】
2005523241.tif 000004
【００４６】
本発明の他の態様および実施例は、以下の開示および本明細書を結論づける請求の範囲に含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、哺乳動物BAR/FXRレセプター、好ましくはヒトBAR/FXRタンパク質、の活性を調節する方法に関する。
そのような方法には、BAR/FXRレセプターまたはBAR/FXRレセプターを含む複合体と結合するBAR/FXRリガンドの使用を含み、それによって、生体影響を行うためにBAR/FXRの能力に影響を及ぼして生物学的効果を発揮するか、または天然のリガンドの能力をブロックすることによってその影響を発揮する。本発明のBAR/FXRリガンドは、BAR/FXRアンタゴニスト、BAR/FXRアゴニストまたはBAR/FXR逆アゴニストであってよい。好ましくは、必須ではないがBAR/FXRリガンドが、レチノイド核内レセプター、RAR、およびRXRに対して実質的に活性を有しない。さらなる態様では、BAR/FXRリガンドは、結合して、RXRおよびBARを調節することが可能な二重特異性の化合物であってもよい。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、BAR/FXRアゴニストの使用による、哺乳類のコレステロールの病的欠乏においてコレステロールの血漿濃度を増加させる方法に関する。
【００４９】
理論に束縛されることを望まないが、本出願人は現在、BAR/FXRアゴニストが結合するとき、BAR/FXRレセプターがオキシステロールレセプターLXRαの転写を阻害し、Cyp7ａの転写を活性化することができると考えている。したがって、胆汁酸の生合成におけるこの鍵となる酵素の転写の抑制は、体内で胆汁酸のより低い濃度をもたらし、高い胆汁酸濃度は、大腸癌の危険度の増大と関係している。
【００５０】
本発明の更なる理解の手助けとして、出願人は以下の実施例を提供するが、それらは本発明を説明することを意図するものであって、請求の範囲の限定を意図しない。
【００５１】
材料および方法
哺乳類の発現ベクターはすべて細菌/哺乳類のシャトルベクターpCMXの誘導体であり、発現ベクターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を含み、クローニングされた遺伝子の生体内での転写のためのバクテリオファージT7プロモーターが続く。プラスミドpCMXはさらに、PUC19の大きなPvu II断片にクローニングされた、SV40小tイントロン/ポリアデニル化シグナル配列、ポリオーマウイルスエンハンサ/オリジンおよびプラスミドCDM8のＳＶ４０エンハンサー／オリジンを含む（本明細書の一部を構成するSeed, Nature 329:840-842 (1987）を参照）。PUC19は、New England Biolabs, Inc.から入手可能な一般的に用いられているクローニングベクターである。このPvu II断片は、Col E1複製起点およびプラスミド選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を含むが、pUC19ポリリンカークローンニング部位を欠いている。新たなポリリンカー部位を作出するために、以下の制限部位を含んでいる合成のポリリンカー：5'-KpnI、EcoRV、BamHI、MscI、NheI-3'、続いてこれら３つのすべての読み取り枠に挿入される翻訳終止配列。本明細書の一部を構成するUmesono et al., Cell 65:1255-1266 (1991）を参照。
【００５２】
以下の全長タンパク質をコードしている核酸領域を、CMV発現ベクターにクローニングした。これらの遺伝子および／またはそれらの対応するポリペプチドの配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有する：
ラットBAR/FXR（受託番号U18374）、ヒトRXRα（受託番号X52773）、ヒトTRβ（受託番号X04707）、ヒトLXRα（受託番号U22662）、マウスCARβ（受託番号AF009327）、マウスPPARα（受託番号X57638）、マウスPPARβ（受託番号U10375）、マウスPPARγ(受託番号U10374）、VDR受託番号NM_000376。示されたタンパク質断片を含んでいるGal4融合物は、酵母Gal4 ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸1-147、受託番号X85976）：Gal-RAR（ヒトRARリガンド結合ドメイン、Glu 156〜セリン463、受託番号X06614）、Gal-RXR（ヒトRXRリガンド結合ドメイン、Glu 203〜Thr 462、受託番号X52773）のＣ末端の端に融合させた。βGalは、pCH110（受託番号U02445）に由来する大腸菌β−ガラクトシダーゼコード配列を含む。RXRmは、ヒトRXRαのLBDに点変異（Asp-322-Ｐro）を含む。ルシフェラーゼレポーター構築物（Tk-luc）は、同じコピー数の以下の応答エレメントに結合したヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモータ（−105/＋51）を含む：
hsp27 EcRE ｘ 6、Yao et al., 71 Cell 63-72 (1992)参照）；IBABP IR-1 ｘ 3（CCTTAAGGTGAATAACCTTGGGGCTCC）（配列番号１３）；UASG ｘ 4（MH100ｘ4）、PPREx3（Forman et al., 81 Cell 687 (1995)参照）、RE2x3（Forman et al., 395 Nature 612 (1998)参照）、LXREx3（Willy et al., 9 Genes Dev. 1033 (1995)参照）、SPPx3（Umesono et al, 65 Cell 1255 (1991)参照）、およびT3RE（MLV)x3（Perlmann et al., 7 Genes Dev. 1411 (1993)参照）。上記の各々を含め、この出願において引用される全ての文献は本願明細書において、本願明細書に引用したものとする。これらの受託番号に対応するＧｅｎＢａｎｋ情報は、本願明細書に全体を引用したものとする。ラットBAR/FXRアミノ酸配列、マウスBAR/FXRアミノ酸配列およびヒトBAR/FXRアミノ酸配列は、本明細書においてそれぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号３で示される。ヒトRXRαアミノ酸配列は、本願明細書において配列番号４で示される。
【００５３】
GAL4融合タンパク質は、標準の分子生物学的方法（例えば、本明細書の一部を構成する、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989を参照）を用い、本明細書の一部を構成するSadowski et al., Nucleic Acids Research 17:7539に記載されたプラスミドpSG424の酵母ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメイン領域、すぐ下流の示されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入することによって構築した。酵母GAL4 DBD（ここでは配列番号５で示される）のアミノ酸配列は次の通りである：
【数１】
2005523241.tif 000005
【００５４】
融合タンパク質は上記のように、一般の分子生物学的の技術を用いて、示されたポリペプチドをコードしている核酸の読み枠の作成し、pCMXのポリリンカー部分へクローンニングすることによって作成した。
【００５５】
GAL-L-RXRについては、プラスミド核酸は、GAL4配列に融合したヒトRXRαのアミノ酸Glu203からThr462をコードした（配列番号４）。GAL4のカルボキシ末端部分とRXR LBDのアミノ末端部分との間の接合部は、以下の構造を有した：
【数２】
2005523241.tif 000006
【００５６】
この接合部のヌクレオチド配列
【数３】
2005523241.tif 000007
は本明細書において配列番号６で示される。
【００５７】
GAL-L-BARについては、プラスミド核酸は、GAL4配列に融合したラットBAR/FXRのアミノ酸Leu181からGln469をコードした（配列番号１）。GAL4のカルボキシ末端部分とBAR/FXR LBDのアミノ末端部分との間の接合部は、以下の構造を有した：
【数４】
2005523241.tif 000008
【００５８】
この接合部のヌクレオチド配列（５'から３’）
【数５】
2005523241.tif 000009
は本明細書において配列番号７で示される。
【００５９】
RXRリガンド結合ドメイン（LBD）発現構築物L-RXRは、ヒトRXRαLBD（Glu203からThr462）をコードしているヌクレオチド配列のすぐ上流（すなわち、コード鎖の５’側）に位置する、SV40Tag核内局在シグナル配列をコードするヌクレオチド残基を含む（アミノ末端からカルボキシ末端：
【数６】
2005523241.tif 000010
）。CMX-βgalは、プラスミドpCMXのCMVプロモータの下流に挿入されたプラスミドpCH110（受託番号U 02445）に由来する大腸菌β-ガラクトシダーゼコード配列を含む。RXRmは、ヒトのRXRαのLBDにおいてAsp-322からＰroへと変わる点変異を含む。
【００６０】
ルシフェラーゼレポータープラスミド（Tk-Lucと称する）は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター（チミジンキナーゼヌクレオチド配列のヌクレオチド残基-105から+ 51に位置）のすぐ下流に蛍ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを配置して、さまざまな応答エレメントにさせることにより構築した。TK-Lucプラスミドのプロモータ領域、以下の構造を有する：
【数７】
2005523241.tif 000011
【数８】
2005523241.tif 000012
このヌクレオチド配列（５’から３’）：
【数９】
2005523241.tif 000013
は配列番号９で示される。
【００６１】
応答エレメントは、プラスミドTk-Lucの固有のHind III部位に挿入した。例えば、酵母GAL4 UASG応答エレメントは、ヌクレオチド配列を有し、4つのダイレクトリピートを挿入してUASG ｘ 4を得た。
【数１０】
2005523241.tif 000014
【００６２】
さらなる例として、hsp EcRE（エクジソン応答エレメント）は、以下の配列の6つのダイレクトリピートとして、プラスミドTk-LucのHind III部位に挿入し、EcREx６を得た。
【数１１】
2005523241.tif 000015
【００６３】
当業者は、本願明細書において議論した他の応答エレメントの配列が引用された文献に開示されており、例えば、本明細書の一部を構成する米国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から容易に入手することができることを認識するであろう。
【００６４】
一過性トランスフェクション分析
CV-1アフリカミドリザル細胞を、１０％樹脂-木炭ストリップしたウシ胎児血清（ＦＢＳ）、50Ｕ／ｍLのペニシリンＧおよび50μg／ｍLの硫酸ストレプトマイシンを添加したダルベッコの改良イーグル培地（DMEM-ＦＢＳ）にて、５％ＣＯ2、３７℃で培養した。トランスフェクションの前日に、フェノールレッド不含DMEM-ＦＢＳを用いて、細胞を50-80％コンフルエントでプレートした。細胞は、Forman et al., 81 Cell 687 (1995)の記載に従って、リポフェクションによって一過性トランスフェクションした。商品名DOTAPとしてBoehringer Mannheimが販売している、リポソーム、N-[1-(2,3-ジオールエオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-アンモニウム硫酸ジメチルを、製造者の指示書に従って調製した。リポソームは、レポーター遺伝子構築物（300ng/105細胞）を含み、サイトメガロウイルス作動性発現ベクター（25ng/105細胞）を、指示されたとおり、内部標準としてのCMX-βgal（５００ｎg／１０５細胞）とともに加えた。２時間後、リポソームを除去し、新しい培地と取り替えた。細胞を、示された化合物を含むフェノールレッド不含DMEM-ＦＢＳと約４０時間インキュベーションした。特定のリガンドへ暴露した後、細胞を回収した。
【００６５】
回収した細胞は、ルシフェラーゼ活性の存在について検定した。細胞を、０．１ＭのKPO4（pH 7.8）、1.0％のTRITON（登録商標）X-100、1.0ｍＭのジチオスレイトール（DTT）および２ｍMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）中で溶解した。ルシフェラーゼ活性を、以下を含む反応緩衝液中で、細胞リゼートとルシフェリンとの反応により測定した：
20ｍＭのトリシン、1.07ｍＭのMg(CO3)4-Mg(OH)2-5 H20、2.67ｍＭのMgSO4-7H20、0.1ｍＭのEDTA、0.5ｍＭのルシフェリンナトリウム、0.15mg/mlの補酵素Ａ、5ｍＭのDTTおよび0.5ｍＭのアデノシン三リン酸。生じた化学発光を照度計で測定した。本明細書の一部を構成するde Wet et al., Mol.Cell Biol. 7:725 (1987)を参照。すべてのポイントを３回分析し、変動は１５％未満であった。各々の実験は、３回以上反復し、同様の結果を得た。示された濃度および処置時間に用いた場合、細胞毒性はいずれの化合物にも観察されなかった。
【００６６】
ノーザン分析
HepG2細胞（肝細胞モデルとして用いられる肝癌細胞系）を、10％のＦＢＳ、1ｍＭのピルビン酸ナトリウム、2ｍＭのL-グルタミン、非必須アミノ酸、50Ｕ／ｍLのペニシリンＧおよび50μg／ｍL硫酸ストレプトマイシンを添加したイーグル最小基本培地中に維持した。Caco-2細胞（小腸細胞と特徴を共有する細胞に自発的に分化可能な大腸癌腫に由来の細胞系）は、20％のＦＢＳ、50Ｕ／ｍLのペニシリンＧおよび50μg／ｍLの硫酸ストレプトマイシンを添加したDMEM中に維持した。Ｃａｃｏ−２細胞をコンフルエント後２０日間維持して分化させた。この期間に、通常培地を週２回供給した。
【００６７】
処置の前日に、コンフルエントHepG2および分化したCaco-2細胞を、樹脂木炭ストリップしたＦＢＳを含有するフェノールレッド不含培地に移し替え、所定の化合物でさらに２４時間処置した。全RNAを、Trizol試薬を使用して単離した。Oligotex法（Qiagen）を用いてpolyA+ RNAからノーザンブロットを調製し、以下のプローブを用いて分析した：
ヒトCYP7A（受託番号M93133）ヌクレオチド1617-2576（KaramおよびChiang, 185 Biochem. Biophys. Res. Commun. 588 (1992)）、ヒトSHP（受託番号L76571）ヌクレオチド888-1355、ヒトのIBABP（受託番号AI311734）、IBABPの全コード配列を含むEST。
【００６８】
コアクチベーター動員分析
RARおよびRXRを含むが、これに限定されるものではないアゴニスト活性化核内レセプターと結合するコアクチベーターは、活性化された核内レセプターを援助するように機能し、転写制御因子としてのその活性を発揮する。特徴づけられたコアクチベーターとしては、CBP、p300、RIP140、ＳＲＣ-1、ACTR、TIF2（ＧＲＩＰ１とも呼ばれる）およびTIF1が挙げられる。多くの場合、コアクチベーターはアゴニストの非存在下でレセプターと結合せず、さらに、レセプターアンタゴニスト、直接またはコリプレッサの動員により、コアクチベーターの結合をブロックする。コアクチベーター動員分析は、したがって、予想されるリガンドの付加によって生じるレセプターに対する関連した変化を直接視覚化するための有益な方法である。
【００６９】
ＧＲＩＰ１は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（選択的にグルタチオンを結合して、親和性試薬として用いることができる酵素）との融合タンパク質として発現した。例えば、米国特許第5,654,176号参照。GST-GRIP1融合タンパク質は、大腸菌において発現し、グルタチオン-セファロースカラムで精製した。in vitroで翻訳されたBAR/FXR ＼RXR（各々0.6〜1.2μL）およびGST-ＧＲＩＰ１（5μg）を、10ｍＭのトリス（pH 8.0）、50ｍＭのKCl、6％のグリセロール、0.05％のNp-40、1ｍＭのDTT、12.5のng/μLのポリdI-dCおよび所定のリガンド中、室温で１０００００ｃｐｍの大腸菌DNAポリメラーゼKlenow断片標識されたプローブと３０分間インキュベーションした。複合体を、室温にて、0.5％のTBE（45ｍＭのトリス塩基、45ｍＭのホウ酸、1ｍＭのEDTA）中の5％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。オリゴヌクレオチドプローブを、特定のレセプターダイマーを同定するために作成した；最適化DR-1（ダイレクトリピート1；RXRが結合するヌクレオチド配列モチーフ）プローブ（5'-GCTACCAGGTCAAAGGTCACGTAGCT）（配列番号１２)をRXRホモダイマーおよびに対して用い、BAR/RXRヘテロダイマーがそれに対して結合するIBABPプロモーターのIR-1配列をBAR/RXRヘテロダイマーに対して用いた。
【実施例】
【００７０】
実施例１
合成ＢＡＲ／ＦＸＲアゴニスト の同定
コレステロール分解/胆汁酸形成におけるＢＡＲ／ＦＸＲの中心的役割のために、有効量のＢＡＲ／ＦＸＲ活性化因子および抑制因子は、様々な胆汁酸関連疾患において有益な薬学的効果を有すると提唱した。ＢＡＲ／ＦＸＲ調節因子の同定を起点として、我々は、合成レチノイドであるＴＴＮＰＢ、即ち[E]-4-[2-(5, 6, 7, 8-テトラヒドロ-5, 5, 8, 8-テトラメチル-2-ナフタレニル)プロパン-1−イル]安息香酸、がＢＡＲを活性化することを観察した。ＴＴＮＰＢは、以下の構造：
【化４】
2005523241.tif 000016
を有する。
【００７１】
以下に記載する高感度の、ハイ・スループットな、細胞ベースの一過性トランスフェクションアッセイを用いてＢＡＲ／ＦＸＲ活性化因子についてスクリーニングを行った。この方法を用いて、２つの有効なアゴニスト を同定し、ＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１と命名した。ＢＡＲ／ＦＸＲおよびＲＸＲの全長発現プラスミドを、ＩＢＡＢＰプロモーター(ＩＢＡＢＰＩＲ−１)に由来するＢＡＲ／ＦＸＲ結合部位を含むルシフェラーゼレポーター構築物を用いてCV-1細胞に同時トランスフェクションした。
【００７２】
次いで、トランスフェクションした細胞を、表示したリガンドで４０時間処理した。上記の同時トランスフェクションにおけるルシフェラーゼ発現を用いて活性を測定した。５μＭの濃度で用いた場合、ＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１は確実にＢＡＲ／ＦＸＲを活性化した(それぞれ91および85倍)が、CDCAは１００μＭで２００倍近い活性化を生じた（図1A)。上記で示したように、ＴＴＮＰＢもまた有意のＢＡＲ／ＦＸＲ活性を誘導した（65倍)。上記で示したように、ＲＸＲ特異的リガンドLG268もまた、ＲＸＲサブユニットを介してＢＡＲ−ＲＸＲヘテロダイマーを活性化した（図1A)。ＴＴＮＰＢは強力なＲＡＲ活性化因子であるので、ＲＡＲおよびＲＸＲ両方を活性化するＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１の能力を試験した。内因性レセプターに対するリガンドの効果を分析から排除するため、目的のレセプターのGal 4 DNA 結合ドメイン (DBD)およびリガンド結合ドメイン (ＬＢＤ)の融合タンパク質を用いた。このようにして、Gal-L-ＲＡＲまたはGal-L-ＲＸＲ融合物をGal 4 レポーター(MH100x4)を用いてCV-1細胞へトランスフェクションし、種々のリガンドの効果を評価した。図1Bに示すように、ＴＴＮＰＢは、ＲＡＲを強力に活性化することが可能であったが、ＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１での処理によりＲＡＲに対する特異性が失われた。これらの化合物は、一方で、ＲＸＲを活性化するいくつかの能力を保持した(図1C)が、AR, mPXR, hPXR, ERα, CARβ, LXRα, PPARα, PPARγ, PPARδ, VDRおよびTRβを含む核レセプターを含む他のＲＸＲヘテロダイマーに対する効果はなかった。
【００７３】
化合物の相対的な効力を試験するために、完全長のＢＡＲ／ＦＸＲでトランスフェクションしたCV-1細胞を、増加用量のＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１で処理した。図2Aに示されるように、CDCAについてＥＣ50が５０μMであるのに対して、ＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１についてのＥＣ50は約２μMであった。ＥＣ50は、応答が最大の５０％である濃度を意味する。
【００７４】
２つの同定された化合物がＢＡＲに対するリガンドであるか否かの問いに答えるために、in vitro コアクチベーター動員アッセイ（recruitment assay）を用いた。ＢＡＲを含む大部分の核レセプターは、コアクチベーターと相互作用することができないのでアゴニスト の非存在下で不活性である。アゴニスト の存在下では、ＬＢＤはコアクチベーターの動員およびその後の転写が可能なコンフォメーション変化を受けるようである。動員は、通常は、そのようなレセプターコモジュレーターの添加に応答する、レセプターＬＢＤとコアクチベーターまたはコリプレッサーとの間の可逆の非共有的な会合の形成を意味する。コアクチベーターとレセプターの会合は、新たなより高分子量の化学種の形成をもたらすので、コアクチベーターのリガンドに依存する動員はゲルシフトアッセイで検出することができ、リガンド結合の指標として一般に用いられる。Blumberg et al., 12 Genes Dev. 1269 (1998); Forman et al., 395 Nature 612 (1998); Kliewer et al., 92 Cell 73 (1998); Krey et al., 11 Mol. Endocrinol. 779 (1997)。
【００７５】
コアクチベーター動員アッセイは、ＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１をＢＡＲ、ＲＸＲm、32P-標識ＢＡＲ／ＦＸＲ応答エレメント(ＩＢＡＢＰＩＲ１) GRIP 1のレセプター相互作用ドメインと混合することによって行った。ＲＸＲmは、リガンドに結合する機能を失ったＲＸＲ変異体であり、ＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１がＢＡＲ／ＦＸＲサブユニットに結合しＲＸＲに結合しないかどうかを調べるために用いる。結合反応の後、生じた複合体をポリアクリルアミドゲルによって分離した。予想通り、ＢＡＲ−ＲＸＲm ヘテロダイマーは、リガンドの不在下ではコアクチベーターを動員しなかった（図２Ｂ）。しかし、ＡＧＮ２９ またはＡＧＮ３１の添加は、コアクチベーターＧＲＩＲ１との複合体をシフトし、ＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１がＢＡＲ／ＦＸＲと結合し、ＲＸＲと結合しないことを示唆した。これらの実験をＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１について用量の範囲で行い、コアクチベーター動員が一過性トランスフェクトにおいてこれらの化合物の効力と同等の用量で見られた（図2B）。
【００７６】
実施例２
次に、ＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１がＢＡＲ／ＦＸＲ標的遺伝子を調節する能力について試験した。コレステロール代謝および胆汁酸が介在する遺伝子調節を調べるために広く用いられているので、肝細胞系HepG2を肝細胞モデルとして用いた。２つの周知のＢＡＲ／ＦＸＲ標的遺伝子をモニターした：胆汁酸合成を律速する酵素であるCYP7AはHepG2細胞中で胆汁酸により下方調節される。遺伝子標的試験により、胆汁酸がＢＡＲ／ＦＸＲを介して、この遺伝子に対し阻害的役割を発揮することが今や明らかになる (Sinal et al., 102 Cell 731 (2000)。さらに、核レセプターSHPおよびIBABPの発現をモニターした。Ｃａｃｏ−２細胞を理想的な腸細胞のモデルとして用いた。この細胞系を用いて、SHPおよびIBABPのレベルをモニターした。両細胞をＡＧＮ２９ またはＡＧＮ３１ (10μＭ)、または陽性対照としてCDCA (100μＭ)について２４時間試験した。
【００７７】
ノーザンブロット分析による分析したように、分化したＣａｃｏ−２細胞では、ＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１は、CDCAと同じレベルまでIBABPおよびSHP発現を強力に誘導した。
（図3A)。HepG2細胞では、ＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１はCYP7A発現を抑制し、ＳＨＰの転写を誘導することが可能である（図3B)。これらのリガンドは、ＢＡＲ／ＦＸＲ発現またはGAPDHに対して効果はなかった。これらの結果は、in vitro のデータと一致し、ＡＧＮ２９およびＡＧＮ３１がＢＡＲに対するリガンドのアゴニスト であることを確認するものである。
【００７８】
実施例3
ＢＡＲ／ＦＸＲを活性化することができない場合はアゴニスト 活性を有しうるので、次に、我々が以前に同定した化合物がどうなのかをこれらのアッセイで調べた。そのような１つの化合物、ＡＮＧ３４（上記の構造を有する）、を同定した。ＢＡＲ／ＦＸＲ活性を抑制するＡＮＧ３４の能力を試験するために、ＣＶ−１細胞を、完全長のＢＡＲ／ＦＸＲおよびＲＸＲ、およびＩＲ−１含有ルシフェラーゼレポーター遺伝子で一過性トランスフェクションした。次いで、細胞を、ＡＧＮ３４ (1μＭ)有りまたはなしで、次善のレベルのＣＤＣＡ (50μＭ)で処理した。５０μＭ のCDCAの添加によりＢＡＲの活性化のほぼ１００倍になった。
【００７９】
濃度アッセイでは、ＡＧＮ３４は、ルシフェラーゼ遺伝子発現の基底の活性に影響を及ぼさなかったが、CDCA-活性化されたＢＡＲ介在転写は１０倍近く抑制した（図4A)。同じ分析計での用量応答アッセイ(ＡＧＮ３４の増大濃度;一定濃度のCDCA) は、ＡＧＮ３４が非常に強力な抑制因子であることを示し、0.03μＭで約85%の抑制を示し、１μＭで最大活性を示した（図4B)。
【００８０】
その他の様々な核レセプター/ＲＸＲヘテロダイマーを、ヘテロダイマーの非ＲＸＲ成分の同族リガンドとインキュベーションした。以下のものがある：ヒトＡＲ(アンドロゲンレセプター)、マウスＰＸＲ(10μＭプレグネノロン-16-カルボニトリル)、ヒトPXR (10μＭリファンピシン)、ERα (100ｎＭ 17β-エストラジオール)、ヒトLXRα (30μＭヒオデオキシコール酸メチルエステル)、マウスPPARα (5 μＭ  Wy 14,643）、マウスPPARα (1 μＭ  ロシグリタゾン）、マウスPPARγ(1 μＭ  カルバプロクタサイクリン）、ヒトVDR (100ｎＭ 1,25-ジヒドロキシビタミン D3)およびヒトTRβ (100ｎＭ トリヨードサイロニン)。構成的に活性なマウスCARβにはリガンドを加えなかった。各化合物を1 mM ＡＧＮ３４の存在下または非存在下でインキュベーションした後、ルシフェラーゼレポーター活性について分析した。図4Ｃに示されるように、ＡＧＮ３４は、これらの核レセプターの特異的なリガンド誘発性の活性を抑制することができなかったが、ＡＧＮ３４はいぜんとしてＢＡＲ/ＲＸＲヘテロダイマーほぼ10倍抑制することが可能であった。
【００８１】
次に、ＢＡＲからGRIP-1 コアクチベーターと取って代わるＡＧＮ３４の能力を試験した。結果を図4Dに示す。この０．７５μＭ ＡＧＮ２９の場合、ＢＡＲ:ＲＸＲ:GRIP1は、アゴニスト の存在下でのみ複合体を形成する（レーン２）。ＡＧＮ３４の増加する濃度の添加は、その複合体の進行的な解離を生じ、ＡＧＮ３４がＢＡＲとの結合に関して拮抗することを示唆している。この実験をＲＸＲｍ、ＲＸＲＬＢＤのＡsp３２２がプロリンで置換されているＲＸＲ変異体について繰り返し、リガンドに対してＫｄが１００倍以上減少した。ＢＡＲ／ＲＸＲｍヘテロダイマー結合を用いた競合実験は、ＢＡＲ／ＲＸＲｍヘテロダイマーを用いて得られた結果と同じ結果であった（図４Ｄ）。
【００８２】
ＡＧＮ３４がＢＡＲ／ＢＡＲ／ＦＸＲをin vivoで抑制することを確認するために、ノーザンブロッティング分析により培養細胞におけるＢＡＲ／ＦＸＲ標的遺伝子に対する効果をみた。分化したCaco-2細胞およびHepG2細胞を100μＭ CDCA単独でまたは1μＭ ＡＧＮ３４と組み合わせて２４時間処理した後、RNAを抽出して、ノーザンブロッティングを上記の通り行った。
【００８３】
予想通り、Caco-2細胞においてCDCAはＩＢＡＢＰ発現を急激に増大させ、ＡＧＮ３４の添加は、誘導されたＩＢＡＢＰレベルを基底のレベル近くまで減少させた（図5A)。ＡＧＮ３４の役割をさらに確認するために、Caco-2およびHepG2の両細胞において、SHP発現に対するＡＧＮ３４の効果を調べた。両細胞系では、ＡＧＮ３４は基底のSHPレベルに影響を及ぼさなず、CDCA-で増大した発現を減少しなかった。CYP7A発現に対するＡＧＮ３４の効果をさらに試験した。ＢＡＲ／ＦＸＲ完全アゴニスト から予想されることとは対照的に、ＡＧＮ３４はCYP7A発現を刺激するよりむしろ抑制し、この活性はＡＧＮ３４とCDCAの組み合わせによっても示された（図5B)。
【００８４】
これらの結果は、明らかに示しているＡＧＮ３４が選択的なＢＡＲ／ＦＸＲ調節因子 (ＢＡＲM)であること、即ち種々のＢＡＲ／ＦＸＲ標的遺伝子を区別を付けて調節するＢＡＲ／ＦＸＲ部分的アゴニスト であることを明らかに示している。ＡＧＮ３４によるＩＢＡＢＰ発現の拮抗は、胆汁酸の過剰なレベルの存在によって特徴付けられる結腸直腸癌等の状態の処置のための治療方法として有用である。さらに、ＡＧＮ３４が、Cyp 7A等の、他のＢＡＲ調節される遺伝子と拮抗しないという事実は、そのような治療での使用が非常に特異的であり、それ故望ましくない副作用が最小限であろうということを意味する。
【００８５】
実施例４
ＡＧＮ３４がＢＡＲ／ＦＸＲレセプターの特徴である活性を調節することおよびそれがＲＸＲホモダイマーを介して機能するものでないことを確認するために、以下の実験を行った。
【００８６】
示されたコピー数の以下の応答エレメント：ｈｓｐ２７EcRE×6およびMH100×4 (UASG×4)に連結したヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター（−１０５／＋５１）を含むルシフェラーゼレポーター構築物（ＴＫ−luc）を、以下の発現プラスミドととみに同時トランスフェン分析に用いた：GAL-L-hＲＸＲα、hFXR、rFXRop、mFXRおよびhＲＸＲop。以下に示されるように、大部分の場合で、hＲＸＲopをもう１つの示されたレセプター構築物で組み換え的に同時発現させて、hＲＸＲopを含むヘテロまたはホモダイマーを形成させた。
【００８７】
これらの構築物を以下の試薬と組み合わせて試験した： CDCA、ＡＧＮ３４、および種々濃度のこれら２つの試薬。トランスフェクションの方法はすべて同じである。濃度を表の２行目にμＭ で表示する。「None」の欄を除き、すべての欄には50μＭCDCA ＋／− 示された量のＡＧＮ３４（μＭ）を含む。例えば、右端の欄は、50 μＭ  CDCA＋10 μＭ  ＡＧＮ３４である。ルシフェラーゼレポーター遺伝子産物の発現を上記のとおり検出し定量した。結果を以下の表に示す：
【表１】
2005523241.tif 000017
【００８８】
これらのデータは、組み換えＲＸＲを単独で発現させた場合(ＲＸＲホモダイマーの形成を促進する）、CDCA, ＡＧＮ３４および示された濃度の両試薬の添加は、レポーター遺伝子のシストランス活性化の刺激をもたらさないことを示した。しかし、ヒトＲＸＲが、トランスフェクトされたＣＶ−１細胞においてヒト、ラットまたはマウスFXR (ＢＡＲ)と同時発現する場合、遺伝子発現の結果と０もたらされる刺激は胆汁酸ＣＤＣＡを加えた時に検出される。ＡＧＮ３４単独ではレポーター遺伝子の転写の刺激を引き起こさない。この系においてＡＧＮ３４を一定量のCDCAに増加させて加えた場合、レポーター遺伝子転写のCDCA介在の刺激は用量依存的に減少した。このように、データはＡＧＮ３４がＢＡＲ／ＦＸＲ転写活性化のCDCA介在の刺激を拮抗することをしめしており、ＣＤＣＡによるトランス活性化活性の刺激およびＡＧＮ３４によるこの活性の拮抗の両方がＢＡＲ／ＦＸＲレセプターまたはＢＡＲ:ＲＸＲヘテロダイマーについて選択的であることを示している；ＲＸＲのみ(および恐らくＲＸＲホモダイマーのみ）を含む系において活性を示す試薬はなかった。
【００８９】
同じレポーターおよび発現構築物を以下の試薬と組み合わせて同様に試験した：ＡＧＮ３４、LG 268、および種々の濃度のＡＧＮ３４と一定濃度のLG 268。LG 268はＲＸＲアゴニスト である。結果を以下の表に示す。
【表２】
2005523241.tif 000018
【００９０】
データから分かるように、この実験において単独のリガンドとして用いたとき、そしてＲＸＲが細胞において組み換えにより発現する唯一のレセプターであるとき、LG 268はＲＸＲ介在のレポーター遺伝子転写を刺激する。LG 268はさらに、ＲＸＲがラットまたはマウスＢＡＲと同時発現するが、ヒト組み換えＢＡＲ／ＦＸＲとは同時発現しないレポーター遺伝子のトランス活性化を刺激する。この結果は、LG 268が、ＲＸＲ自身と同様、ラットおよびマウス受容体に対するＢＡＲ／ＦＸＲ(またはＢＡＲ:ＲＸＲ) アゴニスト活性の尺度を有することを示唆している。一定のLG 268濃度に増加する濃度のＡＧＮ３４を添加すると、LG 268活性の拮抗と一致するようにLG 268介在のトランス活性化の現弱をもたらす。ＡＧＮ３４単独では、レセプター介在のトランス活性化を刺激しない。
【００９１】
次のゲル移動実験ではＡＧＮ３４は完全にLG 268を加えたＢＡＲ:ＲＸＲヘテロダイマーから会合したコアクチベーター (GRIP1)を置き換えることを示している。完全な置き換えを引き起こすのに必要であるＡＧＮ３４の用量は、ＲＸＲ:ＢＡＲ−CDCA複合体からのコアクチベーターの置き換えについて必要な量よりもかなり少ない。同様の結果がCoAの動員を検出する哺乳類ツーハイブリッドアッセイにおいてみられ;ＡＧＮ３４がＢＡＲ:ＲＸＲヘテロダイマーに対するCoAの動員を阻害する。
【００９２】
実施例5
試薬として、CDCA (50 μＭ )単独、またはＡＧＮ３４ (1 μＭ ) またはLG 754(1 μＭ ) (ＲＸＲホモダイマーアンタゴニストであるがPPAR-ＲＸＲの活性化因子である)と組み合わせて用い、実施例４と同様に実験を行った。結果を以下の表に示す
【表３】
2005523241.tif 000019
【００９３】
上記のとおり、これらの結果は、CDCAがレポーター遺伝子のＢＡＲ介在のトランス活性化を刺激することが可能であることを確認するものである。LG 754は、CDCA介在の活性を拮抗するがその程度ＡＧＮ３４よりずっと低い。
【００９４】
以下の実施例にＢＡＲ／ＦＸＲ調節活性を有する化合物を、その化合物の製造方法と共に詳細に記載する。
【００９５】
実施例６
ＡＧＮ３１の合成
【化５】
2005523241.tif 000020
4−ヘキサン−1−イニル安息香酸エチル (3)
1-ヘキシン (1.72 mL, 15 mmol）、4-ヨード安息香酸エチル(1.38 g, 5 mmol）、トリエチルアミン (1.05 mL, 7.5 mmol),およびTHF (20 mL)の溶液を１０分間アルゴンで脱気した。この溶液をビス（トリフェニルホスフィン)パラジウム (II) クロリド (17.5 mg, 0.25 mmol)およびヨウ化銅 (11.4 mg, 0.06 mg)で処理し、室温で２４時間攪拌した。この溶液を減圧下で濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(ヘキサン) により精製し標題の化合物を得た。
HNMR (CDCl3, 300 MHz): δ0.95 (t, 3H, J = 7.3 Hz）、1.39 (t, 3H, J = 7.1 Hz）、1.49 (m, 2H）、1.59 (m, 2H）、2.43 (t, 2H, J = 7.1 Hz）、4.36 (q, 2H, J = 7.3 Hz）、7.44 (d, 2H, J = 8.3 Hz）、7.95 (d, 2H, J = 8.3 Hz)。
【００９６】
6−ヨード−1,1,4,4-テトラメチル-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン (6)
三塩化アルミニウムを、ヨードベンゼン (6.1 mL, 54.6 mmol)および2,5-ジクロロ-2,5-ジメチルヘキサン (5 g, 27.3 mmol)の氷冷溶液に非常にゆっくりと加えた。２０分後、この溶液をヘキサンで希釈し、氷水に投入した。層を分離し、水層をヘキサンで２回抽出した。集めた有機層を 水およびブラインで洗浄し, MgSO4で乾燥し、濾過した溶媒を減圧下で留去した。過剰のヨードベンゼンを 高真空下で留去して標題の化合物を無色の固体として得た。
HNMR (CDCl3, 300 MHz)：δ0.1.25 (s, 6H）、1.26 (s, 6H）、1.65 (s, 2H）、1.66 (s, 2H）、7.03 (d, 1H, J = 8.3 Hz）、7.42 (dd, H, J = 2.0, 8.3 Hz）、7.59 (d, 1H, J = 2.0 Hz)。
【００９７】
4-[2-(5,5,8,8−テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン−2−イル)ヘキサン−1−エニル]安息香酸 (ＡＧＮ３１)
4−ヘキサン−1−イニル安息香酸エチル  (192 mg, 0.83 mmol)および6−ヨード−1,1,4,4-テトラメチル-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン (628 mg, 2 mmol)をトリエチルアミン (0.4 mL)と混合した。ビス（トリフェニルホスフィン)パラジウム (II)ジアセテート(16 mg, 0.021 mmol)およびアセトニトリル (0.3 mL)を加え、溶液をアルゴンで数分間パージした。酢酸(0.083 mL, 2.20 mmol)を加え、溶液を８０℃にて一晩攪拌した。反応物を水およびエーテルで希釈し、層を分離し、水層をエーテルで２回抽出した。集めたエーテル層をブラインで洗浄し、乾燥し（ＭgＳＯ4）、濾過し、溶媒を減圧下で留去した。残留物を、溶離液として9:1 ヘキサン:酢酸エチルを用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、異性体エステルの分離不可能な混合物を得た。このエステルをエタノール（４ｍL）中の２ＮKOH (1mL) 水溶液で加水分解し、１ＮＨＣlで酸性化し、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機抽出物をブラインで洗浄しおよび乾燥した（ＭgＳＯ4）。濾過した溶媒を減圧留去しおよび得られた固体をヘキサンおよび酢酸エチルの溶液から結晶化させて標題の化合物を得た。
HNMR (CDCl3, 300 MHz)：δ0.882 (t, 3H, J = 7.1 Hz）、1.22-1.55 (m, 4H）、1.31(s, 6H）、1.32 (s, 6H）、1.71 (s, 4H）、2.69 (t, 2H, J = 8.3 Hz）、6.72 (s, 1H）、7.24 (d, 1H, J = 8.2 Hz）、7.30 (d, 1H, J = 8.3 Hz）、7.40 (s, 1H）、7.42 (d, 1H, J = 8.4 Hz）、8.11 (d, 1H, J = 8.4 Hz)。
【００９８】
実施例7
ＡＧＮ３４の合成
【化６】
2005523241.tif 000021
2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピル安息香酸エチル(9)
塩化チオニル(48 mL, 675 mmol)を2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピル安息香酸 (15 g, 67.5 mmol)およびジクロロメタン (60 mL)の溶液に加え、得られた溶液を１８時間加熱還流した。溶液を室温に冷却しおよびこの溶液を減圧留去した。エタノールを加え、この溶液を室温で４時間攪拌した。溶媒を留去し,および残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した (ヘキサン:酢酸エチル::4:1)。
HNMR (CDCl3, 300 MHz)：δ1.24 (d, 6H, J = 3.6 Hz）、1.27 (d, 6H, J = 3.6 Hz）、1.43 (t, 3H, J = 7.0 Hz）、2.87 (m, 1H, J = 3.6 Hz）、3.37 (m, 1H, J = 3.6 Hz）、4.42 (q, 2H, J = 7.0 Hz）、7.27 (s, 1H）、7.55 (s, 1H）、11.1 (s, 1H)。
【００９９】
エチル 2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピル安息香酸 (10)
2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピル安息香酸エチル (19.1 g, 76.4 mmol)および10 mL DMFの溶液を、０℃にて水素化ナトリウム (4 g, 99.3 mmol)およびDMF (90 mL) の懸濁液ににゆっくりと加えた。１０分後、1−ヨードヘキサン (17.0 mL, 114.6 mmol)を加え、この溶液を室温で１８時間攪拌した。反応物を水の添加によりクエンチし、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層を集め、ブラインで洗浄し、ＭgＳＯ4で乾燥した。濾過した溶媒をロータリーエバポレーターで留去し、標題の化合物を黄色の油状物として得、これをさらに精製することなく次の工程で使用した。
HNMR (CDCl3, 300 MHz)：δ0.91 (t, 3H, J = 7.2 Hz）、1.15-1.53 (m, 6H）、1.23 (d, 12H, J = 6.9Hz）、1.41 (t, 3H, J =7.2 Hz）、1.81 (m, 3H, J = 7.2 Hz）、2.89 (m, 1H, J = 7.2 Hz）、3.39 (m, 1H, J = 7.2 Hz）、3.85 (t, 2H, J = 6.9 Hz）、4.39 (q, 2H, J = 6.9 Hz）、7.25 (d, 1H, J = 2.4 Hz）、7.45 (d, 1H, J = 2.4 Hz)。
【０１００】
2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピル安息香酸 (11)
2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピル安息香酸エチル (25.5 g, 76.4 mmol)およびエタノール (200 mL)の溶液を２ＮNaOH (50 mL, 100 mmol)水溶液で処理した。この溶液を室温で３日間攪拌し、２Ｎ HClで酸性化し、生成物を酢酸エチルで抽出した。集めた有機抽出物をブラインで洗浄し、ＭgＳＯ4で乾燥した。濾過した溶媒を減圧下で濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し(酢酸エチル:ヘキサン::3:2)、標題の化合物を黄色の固体として得た。
HNMR (CDCl3, 300 MHz)：δ0.91 (t, 3H, J = 7.2 Hz）、1.18-1.42 (m, 4H）、1.24 (d, 6H, J = 6.9 Hz）、1.26 (d, 6H, J = 6.9 Hz）、1.48 (m, 2H）、1.88 (m, 3H, J = 7.2 Hz）、2.92 (m, 1H, J = 6.9 Hz）、3.28 (m, 1H, J = 6.9 Hz）、3.92 (t, 2H, J = 6.9 Hz）、7.34 (d, 1H, J = 2.4 Hz）、7.82 (d, 1H, J = 2.4 Hz)。
【０１０１】
2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピルベンゾフェノン (12)
CH3Liのエーテル溶液(1.4 M, 48 mL, 67.2 mmol)を2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピル安息香酸 (5.2 g, 16.9 mmol)およびTHF (100 mL)の溶液に、アルゴン下、０℃にて加えた。溶液を０℃で３．５時間攪拌し、トリメチルシリル クロリド (50 mL)で処理した。得られた 濁った溶液を２０分間 室温で攪拌した後、反応物を２ＮＨＣlを加えることによりクエンチした。この溶液を室温で攪拌した後、生成物を酢酸エチルで３回抽出した。抽出物を集め、ブラインで洗浄し,および乾燥し（ＭgＳＯ4）、濾過し、溶媒を減圧濃縮して標題の化合物を褐色の油状物として得、これはさらに精製しなかった。
HNMR (CDCl3, 300 MHz)：δ0.91 (t, 3H, J = 6.9 Hz）、1.16-1.42 (m, 4H）、1.24 (d, 12H, J = 7.2 Hz）、1.45 (m, 2H）、1.79 (m, 3H, J = 7.2 Hz）、2.63 (s, 3H）、2.89 (m, 1H, J = 7.2 Hz）、3.35 (m, 1H, J = 6.9 Hz）、3.72 (t, 2H, J = 7.2 Hz）、7.21 (d, 1H, J = 2.1 Hz）、7.24 (d, 1H, J = 2.1 Hz)。
【０１０２】
1-エチニル-2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピルベンゼン (13)
ジイソプロピルアミン (3.4 mL, 24.2 mmol)のTHF (20 mL)溶液（０℃）にn-BuLiのヘキサン溶液 (1.6 M, 17 mL, 27.4 mmol)を加えた。この溶液を０℃で３０分間攪拌した後、−７８℃に冷却した。２-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピルベンゾフェノン (4.9 g, 16.1 mmol)およびTHF (20 mL)の溶液を加え、この溶液をー７８℃で１時間攪拌した。クロロリン酸ジエチル (3.1 mL, 20.9 mmol)をこの溶液に加え、反応物を３時間かけて室温にゆっくりと加温した。別のリチウムジイソプロピルアミン (LDA)の溶液を上記のようにn-BuLi (33 mL, 82.2 mmol)を０℃のジイソプロピルアミン (10.2 mL, 72.6 mmol)およびTHF (20 mL)の溶液に添加することによって調製した後、この溶液を−７８℃に冷却した。最初の溶液を−７８℃でＬＤＡに加え、得られた溶液を３時間かけて室温に加温した。水および酢酸エチルを加えて反応をクエンチした。層を分離し、水層を酢酸エチルで２回抽出した。集めた抽出物をブラインで洗浄し、ＭgＳＯ4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を、4:1のヘキサンおよび酢酸エチルを用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物を黄色の油状物として得た。
HNMR (CDCl3, 300 MHz)：δ0.92 (t, 3H, J = 6.9 Hz）、1.13-1.45 (m, 4H）、1.22 (d, 6H, J = 7.2 Hz）、1.23 (d, 6H, J = 7.2 Hz）、1.50 (m, 2H）、1.82 (m, 3H, J = 7.2 Hz）、2.84 (m, 1H, J = 6.9 Hz）、3.22 (s, 1H）、3.33 (m, 1H, J = 6.9 Hz）、4.03 (t, 2H, J = 6.6 Hz）、7.08 (d, 1H, J = 2.1 Hz）、7.17 (d, 1H, J = 2.1 Hz)。
【０１０３】
シアナトベンゼン
臭化シアン(24.3 g, 230 mmol)および水(75 mL)の溶液をフェノール(20.7 g, 220 mmol)および四塩化炭素(75 mL)溶液（０℃）に加えた。この溶液をトリエチルアミン (31 mL, 220 mmoL) で３０分間処理した後、室温に加温し、１８時間攪拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、乾燥し（ＭgＳＯ4）、濾過し、溶媒をロータリーエバポレーターで留去した。残留物を、シリカゲル(4:1/ヘキサン:酢酸エチル) を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製し標題の化合物を透明な油状物として得た。
HNMR (CDCl3, 300 MHz)：δ7.34 (br s, 3H）、7.45 ( br s, 2H)。
【０１０４】
(2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピルフェニル)プロピンニトリル (14)
n-BuLiのヘキサン溶液 (1.6 M, 3.2 mL, 8.06 mmol)の溶液を1-エチニル-2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピルベンゼン (2.1 g, 7.33 mmol)およびTHF (20 mL)（−７８℃）の溶液にゆっくりと加えた。この溶液を−７８℃にて１０分間攪拌し、シアナトベンゼン(1.0 g, 8.06 mmol)およびTHF (3 mL)の溶液で処理した。溶液を２時間かけて室温に加温した後、２Ｎ NaOHを加えた。生成物を酢酸エチルで抽出し (3x）、有機層を集め、ブラインで洗浄し、ＭgＳＯ4で乾燥した。濾過した溶媒を減圧下で濃縮し、残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し (SiO2, 4:1/ヘキサン:酢酸エチル)、標題の化合物を黄色の油状物として得た。
HNMR (CDCl3, 300 MHz)：δ0.94 (t, 3H, J = 6.9 Hz）、1.13-1.40 (m, 4H）、1.22 (d, 6H, J = 6.9 Hz）、1.23 (d, 6H, J = 6.9 Hz）、1.53 (m, 2H）、1.83 (m, 3H）、2.85 (m, 1H, J = 6.9 Hz）、3.30 (m, 1H, J = 6.9 Hz）、3.99 (t, 2H, J = 6.6 Hz）、7.24 (s, 1H）、7.24 (s, 1H)。
【０１０５】
(Z)-3-(2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピルフェニル)ブタン-2-エンニトリル (15)
MeLiおよびエーテル(1.4 M, 27.5 mL, 38.5 mmol)の溶液を、攪拌したヨウ化銅 (3.70 g, 19.2 mL)のTHF (50 mL)溶液（０℃）に加えた。この溶液を−７８℃に冷却し、 (2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピルフェニル)プロピンニトリル(2.99 g, 9.62 mmol)のＴＨＦ (5 mL)溶液をゆっくりと加えた。この溶液を−７８℃で１時間攪拌した後、１５ｍLのメタノールを加えることによりクエンチした。生成物を酢酸エチルおよび飽和NH4Clで抽出した。集めた有機層をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥した。濾過した溶媒を減圧下で濃縮し、濃縮物を、ヘキサン:酢酸エチルの95:5混合物を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物を黄色の油状物として得た。
HNMR (CDCl3, 300 MHz)：δ0.92 (t, 3H, J = 6.6 Hz）、1.13-1.40 (m, 4H）、1.24 (d, 6H, J = 6.6 Hz）、1.25 (d, 6H, J = 6.9 Hz）、1.44 (m, 2H）、1.72 (m, 3H, J = 6.9 Hz）、2.30 (d, 3H, J = 1.5 Hz）、2.89 (m, 1H, J = 6.9 Hz）、3.32 (m, 1H, J = 6.9 Hz）、3.70 (t, 2H, J = 6.6 Hz）、5.42 (d, 1H, J = 1.5 Hz）、6.92 (d, 1H, J = 2.1 Hz）、7.12 (d, 1H, J = 2.1 Hz)。
【０１０６】
(Z)-3-(2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピルフェニル)ブタン−2−エナール(16)
DIBAL-H のジクロロメタン溶液 (1.0 M, 4.50 mL, 4.50 mmol)を、 (Z)-3-(2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピルフェニル)ブタン−2-エンニトリル(1.02 g, 3.12 mmol)およびヘキサン (30 mL)の溶液（−７８℃）に加えた。この溶液を−７８℃で６時間攪拌し、酒石酸カリウムナトリウムの２０％溶液を−７８℃で添加した。この溶液を室温に加温し、生成物を酢酸エチルで抽出した(3x)。集めた有機層をブラインで洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過した。溶媒をロータリーエバポレーターで留去しおよび残留物を、ヘキサンおよび酢酸エチルの95:5混合物を用いるシリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製し、標題の化合物を黄色の油状物として得た。
HNMR (CDCl3, 300 MHz)：δ0.91 (t, 3H, J = 6.3 Hz）、1.13-1.40 (m, 4H）、1.23 (d, 6H, J = 6.6 Hz）、1.25 (d, 6H, J = 6.6 Hz）、1.44 (m, 2H）、1.72 (m, 3H, J = 6.9 Hz）、2.30 (s, 3H）、2.89 (m, 1H, J = 6.6 Hz）、3.32 (m, 1H, J = 6.6 Hz）、3.64 (t, 2H, J = 6.6 Hz）、6.21 (d, 1H, J = 8.4 Hz）、6.81 (d, 1H, J = 2.4 Hz）、7.12 (d, 1H, J = 2.4 Hz）、9.44 (d, 1H, J = 8.4 Hz)。
【０１０７】
エチル (2E, 4E, 6Z)-7-(2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピルフェニル)-3-メチルオクタン−2,4,6-トリエノエート (18)
n-BuLiのヘキサン溶液 (2.5 M, 6.4 mL, 15.9 mmol) をDMPU (4.0 mL)およびエチル (E)-4-(ジエトキシホスホリル)-3-メチルブタン−2−エノエート1 (4.2 g, 15.9 mmol)およびTHF (20 mL)の溶液（−７８℃）に加えた。１５分後、(Z)-3-(2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピルフェニル)ブタン−2-エナール (1.05 g, 3.18 mmol) およびTHF (5 mL)の溶液を１０〜１５分間かけて滴加し、溶液を０℃に加温し、１時間攪拌した。反応物を０℃でNH4Cl水溶液を添加することによりクエンチした。生成物を酢酸エチルで抽出し、集めた有機層をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥した。濾過した溶媒を減圧下で濃縮し、濃縮物を、ヘキサン:酢酸エチルの90:10混合物を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し標題の化合物を黄色の油状物として得た。
HNMR (CDCl3, 300 MHz)：δ0.89 (t, 3H, J = 6.6 Hz）、1.13-1.45 (m, 4H）、1.23 (d, 6H, J = 6.9 Hz）、1.25 (d, 6H, J = 6.9 Hz）、1.28 (t, 3H, J = 7.1 Hz）、1.39 (m, 2H）、1.65 (m, 3H, J = 6.6 Hz）、2.15 (s, 3H）、2.21 (s, 3H）、2.86 (m, 1H, J = 6.9 Hz）、3.34 (m, 1H, J = 6.9 Hz）、3.63 (t, 2H, J = 6.3 Hz）、4.15 (q, 2H, J = 7.2 Hz）、5.74 (s, 1H）、6.21 (d, 1H, J = 15.4 Hz）、6.22 (d, 1H, J = 10.5 Hz）、6.50 (dd, 1H, J = 10.5, 15.4 Hz）、6.75 (d, 1H, J = 2.3 Hz）、7.04 (d, 1H, J = 2.3 Hz)。
【０１０８】
(2E, 4E, 6Z)-7-(2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピルフェニル)-3-メチルオクタン−2,4,6-トリエン酸 (ＡＧＮ３４)
(2E, 4E, 6Z)-7-(2-ヒドロキシ-3,5-ジイソプロピルフェニル)-3-メチルオクタン−2,4,6-トリエン酸エチル (1.2 g, 2.73 mmol)およびエタノール (40 mL)の溶液を２ＮのNaOH水溶液(30 mL, 60 mmol) で処理した。この溶液を６０℃で１８時間攪拌し、２ＮＨＣlで酸性化し、生成物を酢酸エチルで抽出した。集めた有機抽出物をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥した。濾過した溶媒を減圧下で濃縮し、残留物をエタノールから再結晶することにより精製し、標題の化合物を黄色の固体として得た。
HNMR (CDCl3, 300 MHz)：δ0.89 (t, 3H, J = 6.3 Hz）、1.13-1.45 (m, 4H）、1.22 (d, 6H, J = 6.9 Hz）、1.24 (d, 6H, J = 6.9 Hz）、1.29 (m, 2H）、1.65 (m, 3H, J = 6.3 Hz）、2.15 (s, 3H）、2.21 (s, 3H）、2.86 (m, 1H, J = 6.9 Hz）、3.33 (m, 1H, J = 6.9 Hz）、3.62 (t, 2H, J = 6.3 Hz）、5.75 (s, 1H）、6.23 (d, 1H, J = 15.3 Hz）、6.25 (d, 1H, J = 10.8 Hz）、6.62 (dd, 1H, J = 10.8, 15.3 Hz）、6.74 (d, 1H, J = 2.1 Hz）、7.03 (d, 1H, J = 2.1 Hz)。
【０１０９】
実施例8
ＡＧＮ２９の合成
4-ブロモベンジル tert-ブチルジフェニルシリルエーテル  
Tert-ブチルジフェニルシリル クロリド (10.4 mL, 40.1 mmol)を、4-ブロモベンジル アルコール( 5.0 g, 26.7 mmol)および50 mLのジクロロメタンの溶液に加えた。この溶液をトリエチルアミン (3.72 mL, 26.7 mmol)および(ジメチルアミノ)ピリジン (163 mg, 1.34 mmol)で処理し、室温で一晩攪拌した。この溶液を300 mLのジクロロメタンで希釈し、50 mLの10％ＨＣl水溶液で洗浄した。層を分離し、水層を50 mLのジクロロメタンで抽出した。集めた有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥（MgSO4)し、濾過し、溶媒を減圧留去した。残留物を、９７％ヘキサン/酢酸エチルを用いてシリカゲルのプラグ(6＠×２＠)で精製した。溶媒を留去した後、残留物を減圧下 (3 torr)で１７０℃に１時間加熱し低沸点の不純物を除去した。残留した生成物が標題の化合物である。
PNMR (300 MHz, CDCl3) δ1.09 (s, 9 H）、4.70 (s, 2 H）、7.20 (d, 2 H, J = 7.9 Hz）、7.35-7.45 (m, 8 H）、7.65 (オーバーラップ ds, 4 H)。
【０１１０】
4-[(トリメチルシリル)エチニル]ベンジル tert-ブチルジフェニルシリル エーテル
２５ｍL容の丸底フラスコを高真空下で炎乾燥した。乾燥アルゴンを添加することにより真空を解除し、フラスコを室温に冷却した。フラスコに2.0 g (4.70 mmol)の4-ブロモベンジル tert-ブチルジフェニルシリル エーテル (化合物１）、2.0 mL (14.1 mmol)の(トリメチルシリル)アセチレン、および16.5 mLのトリエチルアミンを加えた。この溶液をアルゴンで１５分間パージし、ビス（トリフェニルホスフィン)パラジウム (II) クロリド (83 mg, 0.12 mmol)およびヨウ化銅（Ｉ）(22 mg, 0.12 mmol)を添加し、溶液を室温で３日間攪拌した。溶液を水およびエーテルを含む分液漏斗に注いだ。層を分離し、水層をエーテルで３回抽出した。集めたエーテル層をブラインで１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去した。残留物を蒸留により精製し(沸点＝１８０℃Ｂ１８５℃、１toor）標題の化合物を得た。
PNMR (300 MHz, CDCl3) δ0.23 (s, 9 H）、1.09 (s, 9 H）、4.73 (s, 2 H）、7.23 (d, 2 H, J = 7.9 Hz）、7.31-7.45 (m, 8 H）、7.65 (オーバーラップds, 4 H)。
【０１１１】
(Z)-4-[2-(3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン−2−イル)-2-(トリメチルシリル)ビニル]ベンジルアルコール
２５ｍLの三頸丸底フラスコに還流冷却器を取り付け、高真空下で炎乾燥した。乾燥アルゴンを添加（３×）することにより真空を解除し、フラスコを室温に冷却した。フラスコに0.5 mL (1.0 mmol)のボラン-硫化メチルとTHF (0.3 mL)を入れ、０℃に冷却した。この溶液を0.20 mL (2 mmol)のシクロヘキサンで処理し０℃にて１時間攪拌した。次いで、4-[(トリメチルシリル)エチニル]ベンジル tert-ブチルジフェニルシリル エーテル (443 mg, 1 mmol)を加え、１５分後、 この溶液を室温に加温し、2.25時間攪拌した。別のフラスコにて、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム (0)  (58 mg, 0.05 mmol)および2-ブロモ-3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン (1.26 g, 4.5 mmol)のTHF（５ｍL）溶液を調製し、アルゴンで１０分間パージした。最初のフラスコ内の溶媒を高真空下で留去し、残留物を１ｍLのTHFおよび１ｍLの２ＭNaOH水溶液に溶解し、得られた溶液をアルゴンで１０分間パージした。後の方のフラスコの溶液の一部（１ｍL）を最初にフラスコに入れ、反応物を光から保護し、５時間還流した。反応物を室温に冷却し、２ＭNaOH (1 mL)および３０％の過酸化水素 (０．４ｍL)で処理した。溶液を水およびペンタンを含有する分液漏斗に注いだ。層を分離し、水層をペンタンで３回抽出した。集めた有機層をブラインで１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー (99:1, ヘキサン:酢酸エチル)で部分的に精製した。後の方の画分を集め、減圧下で濃縮した。残留物 (203 mg)を3.2 mLのTHFに溶解し、シリカゲルに吸着させた313 mgのフッ化テトラブチルアンモニウム(Tbaf) (１ｇあたり1.6 mmolのフッ化物)で処理した。懸濁液を５時間室温にて攪拌した後、シリカゲルをエーテルで洗浄し、分離したエーテル抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過した溶媒を 減圧下で留去し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー (4:1, ヘキサン:酢酸エチル)により精製し、標題の化合物を得た。
PNMR (300 MHz, CDCl3)−0.10 (s, 9 H）、1.29 (s, 12 H）、1.68 (s, 4 H）、2.24 (s, 3 H）、4.72 (s, 2 H）、6.87 (s, 1 H）、7.07 (s, 1 H）、7.17 (s, 1 H）、7.35 (s, 4 H)。
【０１１２】
(Z)-4-[2-(3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン−2−イル)-2-(トリメチルシリル)ビニル]安息香酸エチル
二酸化マンガン(265 mg, 2.96 mmol)を (Z)-4-[2-(3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン−2−イル)-2-(トリメチルシリル)ビニル]ベンジル アルコール  (60 mg, 0.15 mmol)および3.65 mLのヘキサンに加えた。この溶液を室温で１６時間攪拌し、二酸化マンガンを濾過により除き、ヘキサン減圧留去した。残留物を２ｍLのエタノールに溶解し、シアン化ナトリウム(37.5 mg, 0.77 mmol)および酢酸(13.7 mg, 0.23 mmol)で処理した。１５分後、この溶液を265 mg (3.0 mmol)の二酸化マンガンでで処理した。懸濁液を室温で６時間攪拌し、二酸化マンガンを濾過により除去した。溶液を、水およびエーテルを含む分液漏斗に注いだ。層を分離し、水層をエーテルで３回抽出した。集めた有機層をブラインで１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(97:3, ヘキサン:酢酸エチル) により精製し標題の化合物を得た。
PNMR (300 MHz, CDCl3)−0.11 (s, 9 H）、1.28 (s, 12 H）、1.41 (t, 3 H, J = 7.1 Hz）、1.68 (s, 4 H）、2.23 (s, 3 H）、4.39 (q, 2 H, J = 7.1 Hz）、6.86 (s, 1 H）、7.08 (s, 1 H）、7.17 (s, 1 H）、7.41 (d, 2 H, J = 8.5 Hz）、8.03 (d, 2 H, J = 8.5 Hz)。
【０１１３】
(Z)-4-[2-(3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン−2−イル)-2-(トリメチルシリル)ビニル]安息香酸 (ＡＧＮ２９)
(Z)-4-[2-(3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン−2−イル)-2-(トリメチルシリル)ビニル]安息香酸エチル ( 0.034 g, 0.076 mmol)および２ｍLのエチル アルコールの溶液に１ＮＫＯＨ水溶液(0.5 mL)を加えた。得られた溶液を、加水分解反応が、薄層クロマトグラフィーにより完結が認められるまで５０℃の浴で加熱した。この溶液を室温に冷却し、水で希釈し、１：１エーテル:ヘキサン溶液で１回洗浄し、層を分離した。水層を１ＮＨＣl水溶液で酸性化し、生成物を酢酸エチルで３回抽出した。集めた有機抽出物をブラインで洗浄し、ＭgＳＯ4で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧留去してＡＧＮ２９を白色の固体として得た。
PNMR (300 MHz, CDCl3) δ- 0.09 (s, 9 H）、1.28 (s, 12 H）、1.68 (s, 4 H）、2.24 (s, 3 H）、6.86 (s, 1 H）、7.08 (s, 1 H）、7.18 (s, 1 H）、7.46 (d, 2 H, J = 8.1 Hz）、8.11 (d, 2 H, J = 8.1 Hz)。
【０１１４】
さらなる開示は、本明細書の一部を構成する米国特許第5,675,033号および国際特許公開WO00/77011に記載されている。後者は、さらにＡＧＮ２９の合成を開示している。
【０１１５】
本明細書に記載した実施例は単なる説明であって、本明細書を結論付ける請求の範囲を参照して専ら定義される本発明の範囲の限定を意図しない。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１Ａ】CMX-BAR、CMX-RXRおよびEcRE x TK lucレポーターによってトランスフェクトされたCV-1細胞の活性化を示す。レポーター活性化は、トランスフェクタント細胞単独および１００μＭCDCA、5μＭAGN 29、５μＭ AGN 31、５μＭ TTNPBおよび１００ｎＭ LG268で処理した細胞において測定した。
【図１Ｂ】CMX-BAR、CMX-RXRおよびEcRE x TK lucレポーターによってトランスフェクトされたCV-1細胞の活性化を示す。細胞をさらにRAR融合ベクターGal-L-RARでトランスフェクトした。レポーター活性化は、トランスフェクタント細胞単独および１００μＭCDCA、5μＭAGN 29、５μＭ AGN 31、５μＭ TTNPBおよび１００ｎＭ LG268で処理した細胞において測定した。
【図１Ｃ】ＣＭＸ−ＢＡＲ、ＣＭＸ−ＲＸＲおよびＥｃＲＥ ｘ ＴＫ ｌｕｃレポーターによってトランスフェクトされたＣＶ−１細胞の活性化を示す。細胞をさらにＲＸＲα融合ベクターＧａｌ−Ｌ−ＲＸＲでトランスフェクトした。レポーター活性化は、トランスフェクタント細胞単独および１００μＭＣＤＣＡ、５μＭ ＡＧＮ ２９、５μＭ ＡＧＮ ３１、５μＭ ＴＴＮＰＢおよび１００ｎＭ ＬＧ２６８で処理した細胞において測定した。
【図２Ａ】CDCA、AGN 29およびAGN 31の増加用量で処理した、完全長のBAR/FXRでトランスフェクトされたＣＶ−１細胞の活性化を示す。
【図２Ｂ】コアクチベーターＧＲＩＰ１のレセプター相互作用ドメインおよび種々の濃度のAGN 29またはAGN 31とともにインキュベーションした後の、BAR：RXRmヘテロダイマのポリアクリルアミドゲル電気泳動の移動の変化を示す。
【図３Ａ】単独でまたはCCDA、AGN 29またはAGN 31の存在下でインキュベーションしたときの、Caco-2細胞におけるIBABP発現のノーザンブロット分析を示す。
【図３Ｂ】単独でまたはCCDA、AGN 29またはAGN 31の存在下でインキュベーションしたときの、HepG2細胞における、CYP7A、SHPおよびGAPDH発現のノーザンブロット分析を示す。
【図４Ａ】ＢＡＲ/FXR活性に対するAGN 34とＣＤＣＡの併用効果を測定する、実施した同時トランスフェクションの結果を示す。
【図４Ｂ】細胞を一定量のＣＤＣＡおよび増加する量でのAGN 34の存在下でインキュベーションした、トランス活性化の活性の用量応答曲線を示す。
【図４Ｃ】AGN 34とのインキュベーションの種々の核内レセプターのトランス活性化の活性に対する効果を示す。
【図４Ｄ】AGN 34の濃度を増加させる、AGN 34およびAGN 29（単独でまたは共に）の「ゲルシフト」コアクチベーター（ＧＲＩＰ）漸増文責を示す。
【図５Ａ】CDCA、AGN34、およびCDCAおよびAGN 34でCaco-2細胞を処理したときの、IBABP、SHPおよびGAPDH RNA発現のウエスタンブロットである。
【図５Ｂ】CDCA、AGN34、およびCDCAおよびAGN 34でHepG2細胞を処理したときの、IBABP、SHPおよびGAPDH RNA発現のウエスタンブロットである。
【配列表】
2005523241.tif 000022
2005523241.tif 000023
2005523241.tif 000024
2005523241.tif 000025
2005523241.tif 000026
2005523241.tif 000027
2005523241.tif 000028
2005523241.tif 000029
【図１Ａ】
2005523241.tif 000030
【図１Ｂ】
2005523241.tif 000031
【図１Ｃ】
2005523241.tif 000032
【図２Ａ】
2005523241.tif 000033
【図２Ｂ】
2005523241.tif 000034
【図３Ａ】
2005523241.tif 000035
【図３Ｂ】
2005523241.tif 000036
【図４Ａ】
2005523241.tif 000037
【図４Ｂ】
2005523241.tif 000038
【図４Ｃ】
2005523241.tif 000039
【図４Ｄ】
2005523241.tif 000040
【図５Ａ】
2005523241.tif 000041
【図５Ｂ】
2005523241.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月13日(2004.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005523241000001.app
【国際調査報告】
2005523241.tif 000043
2005523241.tif 000044
2005523241.tif 000045
2005523241.tif 000046