(57)【要約】非アルブミンタンパク質を含む組成物は高度に精製されたリコンビナントヒト血清アルブミンによって安定化される。前記非アルブミンタンパク質は第ＶＩＩＩ因子であろう。
2005536452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルブミンタンパク質を含む組成物であって、前記非アルブミンタンパク質の安定化のために十分な量の高度精製ｒＨＡをさらに含む前記組成物。
【請求項２】
非アルブミンタンパク質を含む組成物であって、高度精製ｒＨＡおよび１つ以上の追加の安定化剤をさらに含む前記組成物。
【請求項３】
前記非アルブミンタンパク質がリコンビナントタンパク質である請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
単数または複数の前記追加の安定化剤が、イオン性塩、アミノ酸、糖、洗剤およびポリマーから選択される請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムから選択されるイオン性塩を、前記組成物の水による再構成後に塩化物イオンの濃度が０から２ｍｇ／ｍＬの範囲となるレベルで含む請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、１つ以上のヒスチジン、リジン、グリシンおよびアルギニンから選択されるアミノ酸を、前記組成物の水による再構成後にアミノ酸の濃度が０から１００ｍｇ／ｍＬとなるレベルで含む請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物がポリオキシエチレンソルビタンエステルを、前記組成物の水による再構成後に前記ポリオキシエチレンソルビタンエステルの濃度が１ｍｇ／ｍＬ未満となるレベルで含む請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物がポリエチレングリコールを、前記組成物の水による再構成後に前記ポリエチレングリコールの濃度が０から１０ｍｇ／ｍＬの範囲となるレベルで含む請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリエチレングリコールが、１００００ダルトン未満、より好ましくは５０００ダルトン未満の平均分子量を有する請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、マンニトール、シュクロース、フラクトース、ラクトースおよびマルトースから選択される糖を、前記組成物の水による再構成後に前記糖の濃度が０から５０ｍｇ／ｍＬの範囲となるレベルで含む請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
水溶液または懸濁水の形態である請求項１から１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
凍結乾燥粉末の形態である請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１３】
水で再構成したとき、約０．１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬまでの高度精製ｒＨＡを含む請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
水で再構成したとき、約０．１ｍｇ／ｍＬから約５ｍｇ／ｍＬまでの高度精製ｒＨＡを含む請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記非アルブミンタンパク質がＦ−ＶＩＩＩである請求項１から１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記Ｆ−ＶＩＩＩがｒＦ−ＶＩＩＩである請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記非アルブミンタンパク質が、以下の物質：酵素、酵素インヒビター、抗原、抗体、ホルモン、血液凝固の制御に関する因子、インターフェロン、サイトカイン［インターロイキン、その単数または複数のレセプターに対する結合の天然アンタゴニストである前記インターロイキンの変種、ＳＩＳ（小型誘発分泌（small induced secreted））型サイトカインおよび例えばマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）など］、増殖因子および／または細胞分化に関する因子［例えばトランスフォーマント増殖因子（ＴＧＦ）、血液細胞分化因子（エリスロポエチン、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなど）、インスリンおよびこれを類似する増殖因子（ＩＧＦ）、また別には細胞透過性因子（ＶＰＦ／ＶＥＧＦ）など］、骨組織の発生／吸収に関する因子（例えばＯＩＦおよびオステオスポンチン）、細胞の運動性または移動に関する因子［例えばオートクライン運動性因子（ＡＭＦ）、移動刺激因子（ＭＳＦ）また別にはスキャター因子（スキャター因子／肝細胞増殖因子）］、殺菌性または抗カビ因子、走化性因子［および例えば血小板因子４（ＰＥ４）、また別には単球ケモアトラクティングペプチド（ＭＣＰ／ＭＣＡＦ）または好中球ケモアトラクティングペプチド（ＮＣＡＦ）など］、細胞増殖抑制因子（例えばガラクトシドに結合するタンパク質）、細胞外マトリックスの形成に関する血漿粘着分子もしくはタンパク質（例えばフォンビルブラント因子、フィブリノゲンなど）または間隙性粘着分子もしくはタンパク質（ラミニン、テナシン、ヴィトロネクチンなど）、また別には循環性コンパートメントおよび間隙性コンパートメントの病理、および例えば動静脈血栓の形成、癌転移、腫瘍血管形成、炎症性ショック、自己免疫疾患、骨および骨関節病理などに関する分子および／または細胞間相互作用のアンタゴニストまたはアゴニストであるいずれものペプチド配列、の全体または部分から成る群から選択される請求項１から１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記高度精製ｒＨＡが以下の特性の１つ以上を示す請求項１から１７のいずれか１項に記載の組成物：
（ｉ）  着色物質が極めて低レベルである；
（ii）  アルミニウム、乳酸塩、クエン酸塩、金属、非アルブミンヒトタンパク質（例えば免疫グロブリン）、プレカリクレインアクチベーター、トランスフェリン、α１−酸糖タンパク質、ヘモグロビンおよび血液凝固因子、原核細胞タンパク質、アルブミンフラグメント、アルブミンアグリゲートもしくはポリマー、または内毒素、ビリルビン、ヘム、酵母たんぱく質、動物たんぱく質およびウイルスが、極めて低レベルまたは本質的に含まない；
（iii）  少なくとも９９．５％がモノマーおよびダイマー、好ましくは本質的に１００％がモノマーおよびダイマーである；
（iv）  アルブミン１グラムに対してニッケルイオンレベルが１００ｎｇ未満である；
（ｖ）  アマドリ（Amadori）生成物アッセイで測定したとき、タンパク質１モルにつきグリケーションレベルが０．６モルヘキソース未満、好ましくは０．１０、０．０７５または０．０５モルヘキソース未満である；
（vi）  アルブミン分子の少なくとも９０％または９５％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９８％、なお好ましくは少なくとも９９％、もっとも好ましくは実質的に１００％が、完全なＣ−末端を有する；
（vii）  コンカナバリンＡ−結合アルブミンの含有量が０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．３％、０．２％または０．１５％未満である；
（viii）エルマン（Ellman's）試薬を用いて測定したとき、遊離チオール含有量が少なくとも０．８５、０．８、０．７５、０．６５または０．６０モルＳＨ／モルタンパク質である；
（ix）  Ｃ１７：０内部標準を用いて酸性溶媒抽出およびガスクロマトグラフィーで遊離脂肪酸を分析したとき、Ｃ１８またはＣ２０脂肪酸が実質的に存在しない；
（ｘ）  エレクトロスプレー質量分析法を用いる質量分析によって決定したとき、高度の分子量均質性を有し、特に少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９、９９．９％または実質的に１００％のアルブミン分子の分子量分布が２０００、１５００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００ダルトンまたはそれ未満を越えない分子量分散を示す。
【請求項１９】
前記高度精製ｒＨＡが以下の特徴の組み合わせを有することを特徴とする請求項１から１８のいずれか１項に記載の組成物：
（ｉ）エレクトロスプレー質量分析法を用いる質量分析によって決定したとき少なくとも９０、より好ましくは９５、９８、９９、９９．９％または実質的に１００％のアルブミン分子の分子量分布が１０００ダルトンを越えない、より好ましくは９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００ダルトンまたはそれ未満を越えない分子量分散を示す；
（ii）グリケーションレベルが０．１０モルヘキソース／モルタンパク質未満、より好ましくは０．０７５または０．０５モルヘキソース／モルタンパク質未満である；
（iii）コンカナバリンＡ−結合アルブミンの含有量が０．３％（ｗ／ｗ）未満、より好ましくは０．２％または０．１５％未満である。
【請求項２０】
ｐＨ８．０−９．５および１−７５ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有する第一のｒＨＡ溶液をアフィニティークロマトグラフィー工程に付し、前記工程はｒＨＡに対して陰性モードで実施され、また、前記工程は固定化ジヒドロキシボリル基を含むマトリックスを利用するものであり、これにより精製ｒＨＡ溶液を得ることによって前記高度精製ｒＨＡが調製される請求項１から１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記高度精製ｒＨＡが、ｒＨＡ溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーに付すことによって調製され、ここで、そのようにして精製されたｒＨＡ溶液が、場合によって、緩衝液交換；濃縮；希釈；透析；ダイアフィルトレーション；ｐＨ調整（好ましくはｐＨ２．０またはｐＨ４．０より高いｐＨ、および好ましくはｐＨ１０．０未満のｐＨに調整される）；還元剤の添加；脱色処理（例えば木炭による）；加熱（滅菌を含む）；冷却；またはコンディショニング、の１つ以上に付される請求項１から１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記高度精製ｒＨＡが、以下の工程：
（ａ）ｒＨＡ溶液を、ｒＨＡに対し陽性モードで実施される陽イオン交換クロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｂ）ｒＨＡ含有陽イオン交換溶出液を採集すること；
（ｃ）前記陽イオン交換溶出液を、ｒＨＡに対して陽性モードで実施される陰イオン交換クロマトグラフィーに工程に付すこと；
（ｄ）ｒＨＡ含有陰イオン交換溶出液を採集すること；
（ｅ）前記陰イオン交換溶出液を、ｒＨＡに対し陽性モードで実施されるアフィニティークロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｆ）ｒＨＡ含有アフィニティークロマトグラフィー溶出液を採集すること；
（ｇ）前記アフィニティークロマトグラフィー溶出液を、ｒＨＡに対し陰性モードで且つ糖共役物（糖化アルブミンおよび／または糖タンパク質）に対し陽性モードで実施されるアフィニティークロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｈ）ｒＨＡ含有アフィニティークロマトグラフィーフロースルーを採集すること；
（ｉ）前記アフィニティークロマトグラフィーフロースルーを、ｒＨＡに対し陰性モードで実施される陽イオン交換クロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｊ）前記ｒＨＡ含有陽イオン交換フロースルーを採集すること；
（ｋ）前記陽イオン交換フロースルーを、陰性モードまたは陽性モードで実施される陰イオン交換クロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｌ）前記陰イオン交換工程が陰性モードで実施される場合は、前記ｒＨＡ含有陰イオン交換フロースルーを採集すること；または前記陰イオン交換工程が陽性モードで実施される場合は、陰イオン交換溶出液を陰イオン交換マトリックスから溶出させること；
を含む方法によって調製され、また、それぞれの精製工程のいずれかの前または後で、場合によって、緩衝液交換；濃縮；希釈；透析；ダイアフィルトレーション；ｐＨ調整（好ましくはｐＨ２．０またはｐＨ４．０より高いｐＨ、および好ましくはｐＨ１０．０未満のｐＨに調整）；還元剤による処理；脱色処理（例えば木炭による）；加熱（滅菌を含む）；冷却；またはコンディショニング、の１つ以上が実施される請求項１から１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記高度精製ｒＨＡが、以下の工程：
（ａ）ｒＨＡ溶液を、ｒＨＡに対し陽性モードで実施される陽イオン交換クロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｂ）ｒＨＡ含有陽イオン交換溶出液を採集すること；
（ｃ）前記陽イオン交換溶出液を、ｒＨＡに対して陽性モードで実施される陰イオン交換クロマトグラフィーに工程に付すこと；
（ｄ）ｒＨＡ含有陰イオン交換溶出液を採集すること；
（ｅ）前記陰イオン交換溶出液を、ｒＨＡに対し陽性モードで実施されるアフィニティークロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｆ）ｒＨＡ含有アフィニティークロマトグラフィー溶出液を採集すること；
（ｇ）前記アフィニティークロマトグラフィー溶出液を、ｒＨＡに対し陰性モードおよび糖共役物に対し陽性モードで実施されるアフィニティークロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｈ）ｒＨＡ含有アフィニティークロマトグラフィーフロースルーを採集すること；
（ｉ）前記アフィニティーマトリックスフロースルーを、ｒＨＡに対し陰性または陽性モードで実施される陰イオン交換クロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｊ）前記陰イオン交換工程が陰性モードで実施される場合は、前記ｒＨＡ含有陰イオン交換フロースルーを採集すること；または前記陰イオン交換工程が陽性モードで実施される場合は、陰イオン交換溶出液を陰イオン交換マトリックスから溶出させること；
（ｋ）陰イオン交換クロマトグラフィー工程によって精製された前記ｒＨＡ溶液を、ｒＨＡに対し陰性モードで実施される陽イオン交換クロマトグラフィー工程に付すること；
（ｌ）ｒＨＡ含有陽イオン交換フロースルーを採集すること；
を含む方法によって調製され、また、それぞれの精製工程のいずれかの前または後で、場合によって、緩衝液交換；濃縮；希釈；透析；ダイアフィルトレーション；ｐＨ調整（好ましくはｐＨ２．０またはｐＨ４．０より高いｐＨ、および好ましくはｐＨ１０．０未満のｐＨに調整）；還元剤による処理；脱色処理（例えば木炭による）；加熱（滅菌を含む）；冷却；またはコンディショニング、の１つ以上が実施される請求項１から１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記高度精製ｒＨＡが、ｐＨ２．５から７．５、好ましくはｐＨ２．５から６．０にｒＨＡ溶液を付すこと、およびニッケルイオンを除去することによって調製される請求項１から１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
ａ）非アルブミンリコンビナントタンパク質をコードするヌクレオチド配列で細胞を形質転換して、非アルブミンリコンビナントタンパク質を発現させること；さらに、
ｂ）前記非アルブミンリコンビナントタンパク質を単離および／または精製すること；
ここで工程ａ）および／または工程ｂ）は第一の形態のｒＨＡの存在下で実施され、前記第一の形態のｒＨＡは第二の形態のｒＨＡよりも純度が低い；
ｃ）工程ｂ）で得られた単離および／または精製された非アルブミンタンパク質を第一の形態のｒＨＡから分離すること；
ｄ）前記単離および／または精製された非アルブミンリコンビナントタンパク質を第二の形態のｒＨＡおよび、安定な組成物を提供するために場合によって他の賦形剤と一緒にして組み合わせること、
を含む、非アルブミンリコンビナントタンパク質を含む組成物の調製方法。
【請求項２６】
Ｆ−ＶＩＩＩを含む組成物のＦ−ＶＩＩＩ活性を保護または維持する方法であって、安定化量の高度精製ｒＨＡをＦ−ＶＩＩＩ含有組成物に添加することを含む方法。
【請求項２７】
前記Ｆ−ＶＩＩＩがｒＦ−ＶＩＩＩである請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を含む組成物の安定化に関し、特に高度に精製されたリコンビナントヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）を、タンパク質、特に遺伝子組換え方法よって得られたタンパク質を含む組成物の安定化のために使用することに関する。具体的な実施形態では、本発明は、リコンビナント第ＶＩＩＩ因子（ｒＦ−ＶＩＩＩ）を含有する組成物の安定化のために高度に精製されたｒＨＡを使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
第ＶＩＩＩ因子（Ｆ−ＶＩＩＩ）は血液凝固過程に中心的に関与し、またこの過程に必須の血漿タンパク質である。Ｆ−ＶＩＩＩの欠乏は、先天的出血疾患である血友病Ａをもたらす。Ｆ−ＶＩＩＩの大量欠乏（例えば正常レベルの１から２％の規模の欠乏）を示す患者は偶発的出血および外傷後の大出血を示すであろう。身体の閉鎖領域内への前記のような出血は、そのような患者における病的症状の主要原因である。
Ｆ−ＶＩＩＩを含む組成物は、国際単位（IU）によって表されるＦ−ＶＩＩＩ“活性”によって特徴づけられる。１IUは、ヒト血液凝固Ｆ−ＶＩＩＩの世界保健機構スタンダードによって定義されるとおり、ヒト新鮮血漿プール１ｍＬ中に見出されるＦ−ＶＩＩＩ活性レベルにほぼ等しい。臨床医は一定ＩＵ量の投与を患者に処方するであろう。したがって組成物中の表示されたＦ−ＶＩＩＩ活性は真のＦ−ＶＩＩＩ活性の信頼すべき表示であることが所望される。換言すれば、Ｆ−ＶＩＩＩ活性は一定であり、組成物製造時と患者への投与時との間で変化しないことが所望される。
【０００３】
血友病Ａの効果的な治療は、出血への対応または規則的な予防投与スキームのいずれかで輸液によって、失われた第ＶＩＩＩ凝固因子を補充することを伴う。補充される第ＶＩＩＩ因子は、最初はヒト血漿からの単離によって得られた。しかしながら、最近ではｒＦ−ＶＩＩＩを製造する試みが為されている。リコンビナント供給源に由来する第ＶＩＩＩ因子は、血液製剤に存在し得る潜在的な夾雑物質を回避するとともに、献血から単離される材料に関連した供給物の潜在的な制限がないという利点を有するであろう。
明らかに、ｒＦ−ＶＩＩＩの主要な利点は、血液から単離される物質に存在し得る潜在的夾雑物質を前記ｒＦ−ＶＩＩＩは含まないということであるので、ｒＦ−ＶＩＩＩから製剤化された組成物はいずれも、血液起源の物質を同様に含まないことが所望される。しかしながら、実際にはｒＦ−ＶＩＩＩは幾分不安定で、保存期間が限られていることが判明した。この問題を克服するために、血清由来アルブミンがｒＦ−ＶＩＩＩ組成物に取り入れられ、安定剤として機能しているが、これによって再び汚染のリスクが生じる。安定剤として追加される物質、例えば種々のイオン性塩、糖およびアミノ酸を含むアルブミン非含有製剤もまた提案された。しかしながら、満足な製剤安定化を達成するためには、これら追加の賦形剤はむしろ高濃度で存在する必要があり、また例えば凍結乾燥および再構成には不向きであるといった別の欠点を示すであろう。
同様な見解はｒＦ−ＶＩＩＩ製剤の安定化だけでなく、リコンビナントタンパク質製剤に一般的に適用される。
ｒＨＡもまたタンパク組成物のための安定剤として提案されたが、ｒＨＡを安定剤として含有する、市販に供されるために満足なｒＦ−ＶＩＩＩ製剤は今日まで開発されていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
高度に精製されたｒＨＡはタンパク質製剤、特にリコンビナントタンパク質、特にｒＦ−ＶＩＩＩ製剤の安定化に有効であり、従来技術の上述の欠点または他の欠点のいくつかもしくは全てを克服または軽減することが見出された。
【０００５】
本発明の第一の態様にしたがえば、非アルブミンタンパク質を含む組成物であって、前記タンパク質を安定化させるために十分な量の高度に精製されたｒＨＡを含む組成物が提供される。
非アルブミンタンパク質を含む組成物への前記高度に精製されたｒＨＡの取り込みによって、前記組成物を安定化させることができる。特に、前記高度に精製されたｒＨＡは非アルブミンタンパク質（そのようなタンパク質の多くは変化し易く、長期間保存したとき不安定になる）が時間の経過にしたがって変化し分解するのを阻止または予防することができる。高度精製ｒＨＡを含有することによって、ｒＨＡが比較的低濃度であっても組成物の満足な安定性がもたらされる。高度に精製されたｒＨＡの使用によって、非アルブミン性タンパク質（例えばＦ−ＶＩＩＩ）の活性が保護されることもまた見出された。
【０００６】
本発明は、遺伝子組換え方法によって調製される非アルブミンタンパク質を含む組成物の安定化に関して特に有用である。
ｒＨＡはまた、リコンビナントタンパク質に対して安定化作用を示すことが知られている他の物質を含む製剤に取り込まれることができる。そのような事例では、ｒＨＡが存在することによって、満足な安定性を達成するために要求される前記のような他の物質の濃度を低下、時には極めて低下させることができる。
したがって、本発明の第二の態様にしたがえば、非アルブミンタンパク質を含む組成物であって、高度に精製されたｒＨＡおよび１つ以上の追加の安定化剤を含む組成物が提供される。
前記の追加安定化剤は以下から選択される：
イオン性塩、特に塩化物、例えば塩化カリウム、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウム；
アミノ酸、例えばヒスチジン、リジン、グリシン、アルギニンなど；
糖、例えばマンニトール、シュクロース、フラクトース、ラクトースおよびマルトース；
洗剤、特に非イオン性洗剤および特にポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えばポリソルベート）；
ポリマー、特に合成ポリマー、および特に親水性合成ポリマー、例えばポリエチレングリコール。
【０００７】
本発明で使用される高度に精製されたｒＨＡは、最終組成物中には必ず存在するが、最終組成物に至る処理段階では必ずしも要求されない。例えば、リコンビナント非アルブミンタンパク質の発酵および／または精製中にｒＨＡを安定化のために用いることができるが、前記ｒＨＡは必ずしも高度に精製されたｒＨＡである必要はない。
したがって、本発明の第三の態様にしたがえば、非アルブミンリコンビナントタンパク質を含む組成物の製造方法が提供される。前記方法は以下の工程を含む：
ａ）非アルブミンリコンビナントタンパク質をコードするヌクレオチド配列で細胞を形質転換して、非アルブミンリコンビナントタンパク質を発現させること；さらに、
ｂ）前記非アルブミンリコンビナントタンパク質を単離および／または精製すること；
ここで工程ａ）および／または工程ｂ）は第一の形態のｒＨＡの存在下で実施され、前記第一の形態のｒＨＡは第二の形態のｒＨＡよりも純度が低い；
ｃ）工程ｂ）で得られた単離および／または精製非アルブミンタンパク質を第一の形態のｒＨＡから分離すること；さらに
ｄ）前記単離および／または精製した非アルブミンリコンビナントタンパク質を第二の形態のｒＨＡおよび場合によって他の賦形剤と一緒にして安定な組成物を提供すること。
【０００８】
上記に記載したように、本発明の利点の１つは、Ｆ−ＶＩＩＩを含む組成物に高度に精製したｒＨＡを取り込むことによって、Ｆ−ＶＩＩＩの活性が保護されることが見出されるということである。
したがって、本発明の第四の態様にしたがえば、Ｆ−ＶＩＩＩ（特にｒＦ−ＶＩＩＩ）を含む組成物のＦ−ＶＩＩＩ活性を保護または維持する方法が提供され、前記方法は、前記組成物に安定化量の高度精製ｒＨＡを添加することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明の組成物は、通常水溶液または懸濁水の形態で用いられる。しかしながら、本組成物は、使用直前または使用の少し前に前記のような形態にされるであろう。本組成物は、粉末形態（例えば凍結乾燥によって調製された粉末）で供給および保存することができ、患者に本組成物を投与する前に水で再構成することができる。そのような手順は当技術分野では一般的で、当業者にはよく知られている。
典型的には、本組成物は凍結乾燥粉末の形態で封入バイアルで供給される。前記組成物は特定の容積の注射水（もっとも一般的には２．５、５または１０ｍＬの水）で再構成される。
水で再構成されるときは、本発明の第一および第二の態様の組成物は、典型的には約０．１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬまで、より一般的には約１０ｍｇ／ｍＬまでの高度精製ｒＨＡを含むであろう。さらに典型的には約７ｍｇ／ｍＬまで、または約５ｍｇ／ｍＬまで、または約１ｍｇ／ｍＬまでの高度精製ｒＨＡを含むことができる。
【００１０】
非アルブミンタンパク質（例えばｒＦ−ＶＩＩＩ）および高度精製ｒＨＡの他に、本組成物は場合によって１つ以上のさらに別の多数の安定化剤および他の賦形剤を含むことができる。
含有することができるさらに別の安定化剤には、上記で述べたようにイオン性塩、アミノ酸、糖、洗剤およびポリマーが含まれる。
イオン性塩が存在する場合は、前記の塩は、塩化カリウム塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムから選択されることが特に好ましい。そのような事例では、水による再構成の後、塩化物のイオン濃度は０．０５から２ｍｇ／ｍＬの範囲であろう。
アミノ酸が存在する場合は、アミノ酸はヒスチジン、リジン、グリシンおよびアルギニンの１つ以上であることが特に好ましい。再構成組成物中の全体的なアミノ酸濃度は広い範囲、例えば０．１から１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１から５０ｍｇ／ｍＬで変動可能であり、さらに顕著に低濃度でもよく、例えば前記濃度は１０ｍｇ／ｍＬ未満、例えば０．０１から１０ｍｇ／ｍＬの範囲でもよい。
【００１１】
洗剤が存在する場合には、非イオン性洗剤が好ましく、特にポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリソルベート）が好ましい。ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０）が特に好ましい。再構成組成物中の洗剤の濃度は非常に低くてもよく、例えば１ｍｇ／ｍＬ未満、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ未満、例えば０．００１から０．１ｍｇ／ｍＬであろう。
合成ポリマー、特に親水性合成ポリマーもまた本組成物に取り込むことができる。合成ポリマーの好ましい種類はポリエチレングリコールである。前記ポリマーは好ましくは、平均分子量が１０，０００ダルトン未満、より好ましくは５，０００ダルトン未満である。合成ポリマーが再構成組成物に存在する場合は、その濃度は０．１から１０ｍｇ／ｍＬまたはそれより低く、例えばその濃度は１ｍｇ／ｍＬ未満、例えば０．０１から１ｍｇ／ｍＬであろう。
【００１２】
前記組成物に糖が含まれる場合は、それらはマンニトール、シュクロース、フラクトースおよびマルトースから選択することができる。再構成組成物中の糖の濃度は１から５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１から２０ｍｇ／ｍＬまたは５から１５ｍｇ／ｍＬの範囲であろうが、それよりも顕著に低くても、例えば０．１から５ｍｇ／ｍＬでもよい。
前記組成物に存在することができる他の賦形剤には、緩衝剤、例えばクエン酸の塩、例えばクエン酸ナトリウムが含まれる。
【００１３】
上記で述べた追加の賦形剤および／またはさらに別の安定化剤は任意であるので、再構成組成物中のそのような物質の濃度は、上記で引用した下限よりも低くてもよく、０であってもよい（または実際上０であって、検出可能限界よりも少ないことを意味する）。したがって、前記の濃度は０から上限、好ましくは上記に引用した限界まで（またはそれより高い）であろう。
前記組成物に、例えば組成物に用いられるｒＨＡの存在のために一般的には低レベルで、他の賦形剤を導入することができることもまた理解されよう。ｒＨＡ調製物は、例えば一定量のオクタン酸（またはその塩）、Ｎ−アセチルトリプトファンまたは洗剤（例えばポリソルベート８０）を含むことができる。そのような追加の賦形剤は一般的には相当に低レベルで存在し、最終組成物中のそれらの濃度はそれに対応して相応に低い（前記組成物中のｒＨＡの濃度はほんの０．５％程度であろう）。
【００１４】
本発明の第三の態様の（または第二もしくは第三の態様の組成物で使用される）非アルブミンリコンビナントタンパク質の発現は、当業者に周知の方法によってもたらされるであろう。リコンビナント細胞は真核細胞でも原核細胞でもよい。前記リコンビナント細胞は、細菌（例えば大腸菌（Escherichia coli）または枯草菌（Bacillus subtilis））、酵母（例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属（例えばS. cerevisiae）、クリベロミセス（Kluyveromyces）属（例えばk. lactis）またはピキア（Pichia）属（例えばP. pastoris）の酵母）、糸状菌（例えばアスペルギルス）、植物または植物細胞、動物または動物細胞（トランスジェニックであってもよい）または昆虫細胞であろう。
好ましい実施形態では、非アルブミンリコンビナントタンパク質は、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換した真菌（それによって前記真菌は前記タンパク質を発現し培養液中にこれを分泌する）を発酵培養液中で培養することによって得られる真菌の培養液から得ることができる。前記真菌は糸状菌、例えばアスペルギルス種であろう。好ましくは、前記真菌は酵母である。より好ましくは、前記真菌は、サッカロミセス属（例えばS. cerevisiae）、クリベロミセス（Kluyveromyces）属（例えばK. lactis）またはピキア（Pichia）属（例えばP. pastoris）である。
【００１５】
非アルブミンリコンビナントタンパク質の単離、精製および分離はまた、それ自体当業者に周知の技術によって実施することができる。
上記では特にｒＦ−ＶＩＩＩに言及したが、他のタンパク質も本発明にしたがって高度精製ｒＨＡを用いて安定化させることができる。そのようなリコンビナントタンパク質の例には以下の物質の全体または部分が含まれる：酵素、酵素インヒビター、抗原、抗体、ホルモン、血液凝固の制御に関する因子、インターフェロン、サイトカイン［インターロイキン、その単数または複数のレセプターに対する結合の天然アンタゴニストである前記インターロイキンの変種、ＳＩＳ（小型誘発分泌（small induced secreted））型サイトカイン、および例えばマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）など］、増殖因子および／または細胞分化に関する因子［例えばトランスフォーマント増殖因子（ＴＧＦ）、血液細胞分化因子（エリスロポエチン、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなど）、インスリンおよび前記と類似する増殖因子（ＩＧＦ）、また別には細胞透過性因子（ＶＰＦ／ＶＥＧＦ）など］、骨組織の発生／吸収に関する因子（例えばＯＩＦおよびオステオスポンチン）、細胞の運動性または移動に関する因子［例えばオートクライン運動性因子（ＡＭＦ）、移動刺激因子（ＭＳＦ）また別にはスキャター因子（スキャター因子／肝細胞増殖因子）］、殺菌性または抗カビ因子、走化性因子［および例えば血小板因子４（ＰＥ４）、また別には単球ケモアトラクティングペプチド（ＭＣＰ／ＭＣＡＦ）または好中球ケモアトラクティングペプチド（ＮＣＡＦ）など］、細胞増殖抑制因子（例えばガラクトシドと結合するタンパク質）、細胞外マトリックスの形成に必要な血漿粘着分子（例えばフォンビルブラント因子、フィブリノゲンなど）もしくは間隙性粘着分子（ラミニン、テナシン、ヴィトロネクチンなど）またはタンパク質、また別には循環性コンパートメントおよび間隙性コンパートメントの病理および例えば動静脈血栓の形成、癌転移、腫瘍血管形成、炎症性ショック、自己免疫疾患、骨および骨関節病理などに関する分子および／または細胞間相互作用のアンタゴニストまたはアゴニストであるいずれものペプチド配列。
【００１６】
本発明で用いられる非アルブミンタンパク質はもっとも好ましくは組換えによって製造される。したがって、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドで細胞を形質転換して前記ヌクレオチドが発現される。細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含む多くの発現系が知られている。
【００１７】
ｒＨＡの供給源
ｒＨＡの調製方法は当業者には一般的によく知られており、例えばＷＯ９６／３７５１５およびＷＯ００／４４７７２に記載されている。
本発明の好ましい実施形態では、最初のｒＨＡ溶液は、ｒＨＡをコードするヌクレオチド配列で形質転換した真菌（それによって前記真菌はｒＨＡを発現し、これを培養液中に分泌する）を発酵培養液で培養することによって得られる真菌の培養液に由来する。前記真菌は、糸状菌（例えばアスペルギルス種）であろう。好ましくは、前記真菌は酵母である。より好ましくは、前記真菌は、サッカロミセス属（例えばS. cerevisiae）、クリベロミセス（Kluyveromyces）属（例えばK. lactis）またはピキア（Pichia）属（例えばP. pastoris）である。
【００１８】
好ましくは、ｒＨＡの少なくともいくらかは、リコンビナントアルブミンのコード配列の３'末端が２つまたは３つ以上のインフレーム翻訳終止コドン、好ましくは３つのインフレーム翻訳終止コドンを含むリコンビナントアルブミンコード配列を含む細胞によって生成されるか、またはリコンビナントアルブミンコード配列を発現する真菌細胞を培養すること、およびｒＨＡを得ることを含む方法によって生成される。後者の方法では、遺伝子組換えによって発現されるアルブミンのマンノシル化能力が少なくとも低下するように細胞は遺伝的に改変されてあり、培養液は少なくとも１０００リットルでｐＨは５．５−６．８である。
【００１９】
リコンビナント細胞は真核細胞でも原核細胞でもよい。リコンビナント細胞は、細菌（例えば大腸菌（Escherichia coli）または枯草菌（Bacillus subtilis））、酵母（例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属（例えばS. cerevisiae）、クリベロミセス（Kluyveromyces）属（例えばk. lactis）またはピキア（Pichia）属（例えばP. pastoris）の酵母）、糸状菌（例えばアスペルギルス）、植物または植物細胞、動物または動物細胞（トランスジェニックであってもよい）または昆虫細胞であろう。
【００２０】
本明細書で用いられるように、遺伝的改変は好ましくは、真菌細胞ＤＮＡ配列フラグメントの１つ以上の塩基の如何なる抑制、置換、欠失または付加をも意味する。そのような遺伝的改変はin vitro（単離ＤＮＡで直接的に）またはin situ（例えば遺伝子工学技術によって、または真菌細胞を突然変異誘発物質に暴露することによって）で実施することができる。突然変異誘発物質には、例えば物理的物質、例えばエネルギー放射線（Ｘ線、γ線、ＵＶなど）またはＤＮＡの種々の官能基と反応することができる化学物質、例えばアルキル化剤（エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、４−ニトロキノリンＮ−オキシド（ＮＱＯ）など）、ビスアルキル化剤、インターカレーション剤などが含まれる。遺伝的改変はまた遺伝子破壊、例えば文献（Rothstein et al., Meth. Enzymol. 194:281-301, 1991）に開示された方法にしたがって達成することができる。この方法にしたがえば、in vitro改変方法で遺伝子の部分または全てが相同組換えによって置換される。遺伝的改変はまた、ＤＮＡ配列（例えばトランスポゾン、ファージ）の変異誘発挿入によって得ることができる。
【００２１】
ある種の改変（例えば点突然変異）は細胞メカニズムによって復帰または減弱されることが知られている。そのような改変は、その表現型特性が非常に安定というわけではないので改変真菌細胞のもっとも有用な形態を提供することができない。したがって、遺伝的改変は安定的に受け継がれるか、および／またはリークしないことが好ましい。そのような改変は一般的には欠失または遺伝子破壊によって得られる。
“リーク変異体”には、野生型機能の完全な不活化ではなくむしろ部分的不活化から生じる変異体が含まれる。
【００２２】
真菌細胞によって保持される遺伝的改変は、細胞のＤＮＡ配列のコード領域、および／または遺伝子の発現に影響を与える領域に存在するであろう。より具体的には、前記改変は一般的にはコード領域および／または、１つ以上の遺伝子（その発現生成物がマンノシル化に必要な酵素である）の発現をもたらすかまたはその発現に必要な領域に影響を与えるであろう。
【００２３】
したがって、タンパク質をマンノシル化する真菌細胞の能力の低下は、構造的および／または構成的変化による不活性な酵素の生成、生物学的特性が変化した酵素の生成、酵素の生成欠如、または前記酵素の低レベルの生成の結果であろう。
真菌細胞のマンノシル化経路は、タンパク質またはペプチドのセリルおよび／またはスレオニルアミノ酸のヒドロキシル残基への第一のマンノシル残基の結合、さらにそれに続くマンノシル残基の付加によるＯ−連結ジおよびオリゴサッカリドへの伸長を含む。前記第一のマンノシル残基は、ドリコールモノホスフェートマンノース（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ）から小胞体内のタンパク質に移され、さらに付加されるマンノシル残基はゴルジのＧＰＤ−Ｍａｎから移される。
【００２４】
好ましい実施形態では、改変真菌細胞は、その遺伝子の発現生成物がセリルまたはスレオニルアミノ酸のヒドロキシル基へのマンノシル残基の結合に必要な少なくとも１つの遺伝子に遺伝的改変を有する。
別の好ましい実施形態では、前記改変真菌細胞は、その発現生成物がＤｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ前駆体からセリルまたはスレオニルアミノ酸のヒドロキシル基にマンノシル残基を移すために必要な少なくとも１つの遺伝子に遺伝的改変を有する。さらに好ましくは、これら遺伝子の１つはＰＭＴ遺伝子（例えばＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５、ＰＭＴ６またｈＰＭＴ７）である。好ましくは、ＰＭＴ遺伝子はＰＭＴ１、ＰＭＴ５またはＰＭＴ７である。
【００２５】
ｐＨ６．０−６．８の増殖培養液が、大規模発酵時のホスト細胞の完全性という関係で有利である。
セリルまたはスレオニルアミノ酸のヒドロキシル基へのマンノシル残基の結合に必要な遺伝子における改変の他に、真菌細胞はまた、ジもしくはオリゴサッカリドを生じるその後のマンノシル残基の付加、またはマンノシル残基ドナー（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ）の合成に必要な遺伝子の改変も有することができる。
【００２６】
好ましくは、真菌細胞は、ＰＭＴ遺伝子またはＰＭＴ遺伝子の発現もしくは前記遺伝子生成物に影響を与える遺伝子内に遺伝的改変を有する。ＰＭＴ遺伝子の発現に影響を与える遺伝子は、例えばｍＲＮＡ転写物レベルまたはＰＭＴ生成物レベルに影響を与えるであろう。
真菌細胞は糸状菌および酵母から選択することができる。好ましくは細胞は酵母、例えばサッカロミセス属（例えばS. cerevisiae）、クリベロミセス属（例えばK. lactis）またはピキア属（例えばP. pastoris）である。
好ましくは、リコンビナントアルブミンのコード配列を発現する真菌細胞は、少なくとも５０００リットル、より好ましくは少なくとも７５００リットルの培養液中で培養される。
【００２７】
ある実施形態では、リコンビナントアルブミンのコード配列を発現する真菌細胞は、ｐＨ６．２−６．７、より好ましくはｐＨ６．３−６．５の範囲で維持される培養液中で培養される。好ましくは、培養液のｐＨは、ｐＨコントローラーセットを用いてｐＨ６．３からｐＨ６．５の間のｐＨで、好ましくはｐＨ６．３５からｐＨ６．４５の間のｐＨで、さらに好ましくはｐＨ約６．４で維持される。好ましくは、ｐＨコントローラーは、上記のｐＨ範囲内のいずれかのｐＨ値の０．２０または０．１０ｐＨ単位以内、またはｐＨ６．４の０．２０または０．１０ｐＨ単位以内で制御される。
また別の実施形態では、真菌細胞は、ｐＨ５．３０−ｐＨ５．９０、好ましくはｐＨ５．５０−ｐＨ５．９０、ｐＨ５．４０−ｐＨ５．９０、またはｐＨ５．４０−ｐＨ５．６０の範囲内で維持される培養液で培養される。好ましくは、より低い制御セットポイントはｐＨ５．４０からｐＨ５．６０の間、好ましくはｐＨ５．４５からｐＨ５．５５の間、さらに好ましくはより低い制御セットポイントは約５．５０である。
【００２８】
高度精製ｒＨＡの特徴
本発明で使用される高度に精製されたｒＨＡは１つ以上の以下の特性を示すであろう：
（ｉ）  着色物質が極めて低レベルである。本明細書で用いられる“着色物質”という用語は、アルブミンを着色する一切の化合物を指す。例えば、リコンビナントアルブミンを調製するために用いられる生物（例えば酵母）から生じる色素は着色物質であり、一方アルブミンの精製のためのクロマトグラフィー工程から生じる染料も着色物質である。
（ii）  アルミニウム、乳酸塩、クエン酸塩、金属、非アルブミンヒトタンパク質（例えば免疫グロブリン）、プレカリクレインアクチベーター、トランスフェリン、α１−酸糖タンパク質、ヘモグロビンおよび血液凝固因子、原核細胞タンパク質、アルブミンフラグメント、アルブミンアグリゲートもしくはポリマー、または内毒素、ビリルビン、ヘム、酵母タンパク質、動物タンパク質およびウイルスが、極めて低レベルまたは本質的に含まない。“本質的に含まない”とは検出可能レベルより低いことを意味する。
（iii）  少なくとも９９．５％がモノマーおよびダイマーであり、好ましくは本質的に１００％がモノマーおよびダイマーである。０．５％まで、好ましくは０．２％までのトリマーは許容されるが、それより大型のアルブミンは概ね存在しない。
（iv）  ＷＯ００／４４７７２で定義された方法で測定したとき、アルブミン１グラムに対してニッケルイオンレベルは１００ｎｇ未満である。
【００２９】
（ｖ）  アマドリ（Ａｍａｄｏｒｉ）生成物アッセイ（グリケートタンパク質のためのマイクロアッセイ）で測定したとき、グリケーションレベルは０．６モルヘキソース／モルタンパク質未満、好ましくは０．１０、０．０７５または０．０５モルヘキソース／モルタンパク質未満である。過ヨウ素酸塩によるＡＰのＣ−１ヒドロキシル基の酸化によって、前記マイクロアッセイは、グリケートタンパク質の安定なアマドリ生成物（ＡＰ）形を測定する。過ヨウ素酸塩の酸化によって遊離されるホルムアルデヒドが、アンモニア中でのアセチルアセトンとの反応により発色団ジアセチルジヒドロルチジン（ＤＤＬ）への変換によって定量される。ＤＤＬは比色法により検出される。サンプルはファルマシアＰＤ−１０（Ｇ２５セファデックス）カラムを用いて脱塩した後アッセイされる。続いてサンプル中のアルブミンをブラッドフォード法（Bradford, Anal. Biochem., 72:248-254(1976)）によって再定量し、１０ｍｇのアルブミンをアッセイする。フラクトース陽性コントロールを含ませ、シマズＵＶ２１０１分光光度計を用い吸収を４１２ｎｍで読み取る。ヘキソース１モル毎に、１モルのアマドリ生成物が形成される。
【００３０】
（vi）  アルブミン分子の少なくとも９０％または９５％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９８％、なお好ましくは少なくとも９９％、もっとも好ましくは実質的に１００％が完全なＣ−末端を有する。
（vii）  コンカナバリンＡ−結合アルブミンの含有量は０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．３％、０．２％または０．１５％未満である。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）は、α−Ｄ−マンノピラノシル、α−Ｄ−グルコピラノシルおよび立体的に関連する残基を含む分子と結合する。ＣｏｎＡ結合は、マンノシル化アルブミンの含有量を決定するために、ｒＨＡのＣｏｎＡセファロース（Pharmacia, Cat. No.17-0440-01）アフィニティークロマトグラフィーを用いてアッセイすることができる。１４５ｍＭの塩化ナトリウムで５％（ｗ／ｖ）に希釈し、続いてＣｏｎＡ希釈緩衝液（２００ｍＭの酢酸ナトリウム、８５ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭの塩化マグネシウム、２ｍＭの塩化マンガン、２ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ５．５）で１：１に希釈する。続いて１００ｍｇのｒＨＡを平衡化させた２ｍＬのＣｏｎＡセファロースカラムにロードし、これを続いてＣｏｎＡ平衡化緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭの塩化マンガン、１ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ５．５）で洗浄する（５ｘ４ｍＬ）。前記カラムを６ｍＬのＣｏｎＡ溶出緩衝液（１００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、０．５Ｍのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド、ｐＨ５．５）で溶出させる。０−０．１２ｍｇ／ｍＬのアルブミン標準曲線を用いブラッドフォード法により、溶出液（サンプルが標準曲線の中央にくることを確実にするために適切に希釈する）中のモノマーアルブミンを定量し、前記溶出液中の回収されたＣｏｎＡ結合アルブミンモノマーをロードの百分率として表す。
【００３１】
（viii）  エルマン（Ellman's）試薬、５，５'−ジチオビス−（２−ニトロベンゾエート）（ＤＴＮＢ）を用いて測定したとき、遊離チオール含有量が少なくとも０．８５、０．８、０．７５、０．６５または０．６０モルＳＨ／モルタンパク質である（前記試薬は遊離スルフヒドリル基（例えばｃｙｓ−ＳＨ（ｒＨＡの場合Ｃｙｓ−残基３４））の検出に特異的な手段である）。この反応によって５−チオ−２−ニトロベンゾエートイオンＴＮＢ2-が遊離される。前記イオンは４１２ｎｍで最大吸収を示す。４１２ｎｍでの吸収の増加を測定し、ＴＮＢ2-イオンの４１２ｎｍにおけるモル吸光係数で割ることにより、ｒＨＡの遊離スルフヒドリル含有量を算出することができる。
（ix）  Ｃ１７：０内部スタンダードを用いて酸性溶媒抽出およびガスクロマトグラフィーで遊離脂肪酸を分析したとき、実質的にＣ１８またはＣ２０脂肪酸が存在しない；
【００３２】
（ｘ）  エレクトロスプレー質量分析法を用いる質量分析によって決定したとき高度の分子量均質性を有し、特に少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９、９９．９％または実質的に１００％のアルブミン分子の分子量分布が２０００、１５００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００ダルトンまたはそれ未満を越えない分子量分散を示す。標準的な方法、例えば透析またはクロマトグラフィーを用いてタンパク質サンプルを脱塩し、さらに典型的には５０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒（例えばアセトニトリルまたはメタノール）に交換または希釈する。前記有機溶媒は、陽性イオンエレクトロスプレーの場合には酸（例えば０．１−１０％（ｖ／ｖ）ギ酸）が補充され、陰性イオンエレクトロスプレーの場合には塩基（例えば０．１−１０％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム）が補充される。用いられるイオン源に最適な濃度のタンパク質溶液（典型的には１−５０μＭ）をエレクトロスプレーイオン源に適切な流速（典型的には０．０１−１００μＬ／分）で、標準的な方法（例えば連続フロー、ループインジェクションまたはオフライン（それぞれ注射筒ポンプ、ＨＰＬＣポンプまたはナノエレクトロスプレーを用いる））を用いて導入する。分析装置は最適トランスミッションおよび分解を得られるように調節し（５００−５０１ｍ／ｚの基準分離によって定義されるように、後者は５００を越えるはずである）、さらにローカルプロトコルおよび適切なカリブラント（典型的にはタンパク質（例えばウマミオグロビン）または界面活性剤（例えばＰＥＧ））を用いてカリブレーションを実施する。スペクトルを入手し、平均を取り、さらに当業界で知られている市販の適切なソフトウェアを用いて基線ノイズ、平坦シグナル、セントロイドピーク、測定質量およびデコンヴォルート（deconvolute）データを差し引いて真の質量スケールを得るために処理する。プロトコルの１例（Bertucci et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1544:386-392(2001)）では、５％ＨＣＯＯＨでＨ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ５０：５０中で最終アルブミン濃度４０−５０μＭに希釈され、イオンスプレー質量分析法で分析される。前記分析は、連結式（articulated）イオンスプレーインターフェースを装備したパーキンエルマー（Perkin-Elmer）ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ  ＩＩＩトリプル四極子分光計（Sciex, Thomill, Canada）で以下のパラメーターを用いて実施される：イオンスプレー電圧５．５ｋＶ；オリフィス電圧９０Ｖ；走査レンジ１４００−２２００質量ユニット；走査時間８．４２秒；レゾルーション＞１質量ユニット。スペクトルはマルチチャネルアクィジッション（ＭＣＡ）モードで２０スキャンを合計して得られる。分析は、ハーバードモデル２２注射筒ポンプ（Harvard Apparatus, South Natick, MA）によってイオン源に５Ｔｌ／分の流速で連続輸液して実施される。全ての測定は室温で実施される。例えば、そのような高度に均質なＨＡＳは、６６４００から６７０００ダルトンの範囲内のタンパク質分子を上述の百分率で有するものであろう。典型的には、上記の方法の１つによって分析したとき、高度に均質なｒＨＡについて得られる主ピークは好ましくは理論的質量の０．０５％以内、より好ましくは０．０１％以内である（ＨＡＳの場合、理論的質量は６６，４３８ダルトンである）。ある実施形態では、質量プロフィルは、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって主ピークのいずれかの側に１０００ダルトンの広がりで決定される。前記プロフィルは、個々に分解した成分として観察されるか、また別には半分の高さをもつ質量ピークの幅の拡大として観察されるミクロの不均一性の有無について精査される。分解成分の相対的豊富さを相対的イオン含有量として測定し、百分率（％）組成として表すことができる。本発明で使用される高度に均質なｒＨＡのプロフィルは、典型的には少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上天然の（未改変）一次構造組成と類似する。高度に均質なｒＨＡにおける成分の相対的含有量は、また別の他の定量技術（ＵＶ領域での吸収により検出される中性被覆毛細管ゾーン電気泳動（Denton & Harris, J. Chromatog. A., 705:335-341(1995)）を含む）を用いて測定することができる。
【００３３】
ｒＨＡ分子集団の均質性は電気泳動技術およびクロマトグラフィー技術によって決定できる。例えば、ＳＤＳ ＰＡＧＥを標準的な方法を用いて実施してもよい。ローカルプロトコルでは、２０−２００ｋＤａの分子量サイズの範囲内でタンパク質を分離することができるＰＡＧＥゲルを利用すべきである。非変性ＰＡＧＥを最適化して、種々の質量および／または電荷を有するタンパク質のフォーカシングおよび分離が達成される。電気泳動によって分離されたタンパク質成分を化学的染色方法（例えばクーマシーブルー染料、検出限界は典型的には０．１μｇより大きいはずである）によって可視化する。定量はその後で、タンパク質スタンダードに対して修正を施しながら、比色計により吸収をスキャンニングして達成される。
ゲル透過クロマトグラフィーはカラムを用い、典型的には１０−５００ｋＤａの分子量サイズの分離範囲でさらに分析的容量で実施される。至適な水性緩衝泳動相はＨＰＬＣシステムを用いてポンプで送られ、溶出成分はＵＶ領域における吸収で検出される。ピークの定量は、クロマトグラフィー像の一体化およびテストｒＨＡのスタンダードに対する目盛りの修正によって促進される。
【００３４】
ＳＤＳ ＰＡＧＥ、非変性ＰＡＧＥおよびゲル透過クロマトグラフィーによって分析するときは通常、高度に均質なｒＨＡ調製物は以下の特性の１つまたは２つを示すであろう：
（ａ）調製物中のタンパク質分子の少なくとも９９％、好ましくは９９．９％がｒＨＡであろう。
（ｂ）調製物中のアルブミンタンパク質分子の１０、９、８、７、６、５、４、３％未満、好ましくは２％未満がダイマーであろう。
【００３５】
ｒＨＡ分子集団の均質性は、またエレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＭＳ）によって、およびペプチドマッピングによって分析することができる。好ましい実施形態では、ＥＳＭＳおよびペプチドマッピングによって調べたとき、高度に均質なｒＨＡ調製物は、上記で定義された完全長ＨＡＳまたはそのフラグメントの正確な天然の一次配列を有しており、翻訳後修飾をもたないであろう。
【００３６】
ある実施形態では、高度に均質なｒＨＡは、上記に定義した特性（ｖ）、（viii）および（ｘ）の少なくとも２つまたは３つを有する。前記特性の１つは（ｘ）で特性（ｖ）および（viii）の１つまたは２つが組み合わされてある。
【００３７】
特に好ましい実施形態では、高度精製ｒＨＡは以下の特徴の組み合わせを特徴とする：
（ｉ）  エレクトロスプレー質量分析法を用いる質量分析によって決定したとき、少なくとも９０、より好ましくは９５、９８、９９、９９．９％または実質的に１００％のアルブミン分子の分子量分布は９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００ダルトン未満の分子量分散を示す；
（ii）  グリケーションレベルは０．１０モルヘキソース／モルタンパク質未満、より好ましくは０．０７５または０．０５モルヘキソース／モルタンパク質未満である；および
（iii）  コンカナバリンＡ−結合アルブミンの含有量は０．３％（ｗ／ｗ）未満、より好ましくは０．２％または０．１５％未満である。
本発明で使用される高度精製ｒＨＡは下記を含む種々の方法によって調製することができる。
【００３８】
高度精製ｒＨＡの第一の調製方法
高度精製ｒＨＡの第一の調製方法は、ｐＨ８．０−９．５および１−７５ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有する第一のｒＨＡ溶液を、ｒＨＡに対して陰性モードで実施され且つ固定化ジヒドロキシボリル基を含むマトリックスを利用するアフィニティークロマトグラフィー工程に付すこと、これによって精製ｒＨＡを得る工程を含む。
好ましくは、前記第一のｒＨＡ溶液のｐＨはｐＨ８．０−９．０、より好ましくはｐＨ８．３−８．６である。第一のｒＨＡ溶液が上述のｐＨ範囲内のｐＨを有する緩衝液で緩衝されるのが好ましい。
好ましくは、前記緩衝液は１０−５００ｍＭ、好ましくは２５−２００ｍＭ、より好ましくは５０−１５０ｍＭの濃度でアミノ酸を含む。好ましくは、前記アミノ酸はグリシンである。
【００３９】
好ましくは、前記緩衝液は一価陽イオンを０−５００ｍＭ、好ましくは２５−２００ｍＭ、より好ましくは５０−１５０ｍＭの濃度で含む。好ましくは、前記一価の陽イオンはナトリウム、好ましくはＮａＣｌの形態のナトリウムである。したがって、好ましい実施形態では、前記緩衝液はＮａＣｌを０−５００ｍＭ、好ましくは２５−２００ｍＭ、より好ましくは５０−１５０ｍＭの濃度で含む。
好ましくは、前記緩衝液は二価の陽イオンを５−２５０ｍＭ、好ましくは１０−１００ｍＭの濃度で含む。好ましくは、前記二価の陽イオンはカルシウム、好ましくはＣａＣｌ2の形態のカルシウムである。したがって、好ましい実施形態では、前記緩衝液はＣａＣｌ2を５−２５０ｍＭ、好ましくは１０−１００ｍＭの濃度で含む。
特に好ましい実施形態では、前記第一のｒＨＡ溶液および／または緩衝液は、約１００ｍＭのグリシン、約１００ｍＭのＮａＣｌおよび約５０ｍＭのＣａＣｌ2を含む。
【００４０】
好ましくは、前記第一のｒＨＡ溶液および／または緩衝液の導電率は１０−５０ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは１８−２２ｍＳ／ｃｍである。
有利には、前記第一のｒＨＡ溶液のｒＨＡ濃度は２０−１２０ｇ／Ｌ、好ましくは７０−１２０ｇ／Ｌ、より好ましくは１００±１０ｇ／Ｌの範囲である。ｒＨＡは、好ましくは０．５カラム容積未満、より好ましくは０．３５カラム容量未満でロードされる。
適切には、前記マトリックスはボロン酸を含む。本明細書で用いられる“酸”という用語はその塩を含む。有利には、前記ボロン酸は、トリアジンまたは置換トリアジンを介して、例えばモノボロトリアジンまたはジボロトリアジンを形成して、支持体、例えばアガロースに結合される。
フェニルボロネートの代替物、例えば脂肪族および置換芳香族リガンドを包含する文献には以下が含まれる：V. Adamek et al., J. Chrom. 625:91-99(1992)； R.P. Singhal et al., J. Chrom. 543:17-38(1991)； X. Liu et al., 687:61-69(1994)。
【００４１】
適切には、アフィニティークロマトグラフィー工程に続いて、精製されたｒＨＡ溶液は、更なる精製、好ましくは更なるクロマトグラフィー精製に付される。好ましくは、ｒＨＡは、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて更に精製される。陽イオンおよび陰イオン交換工程の順序は相互に入れ替えることができ、その精製の目的は達成される。操作の観点からは、より完全な方法では陽イオン交換クロマトグラフィーの後で陰イオン交換クロマトグラフィーが実施される。
適切には、上記に記載した方法にしたがって製造される精製ｒＨＡ溶液は以下の１つ以上の処理を経る：緩衝液交換；濃縮；希釈；透析；ダイアフィルトレーション；ｐＨ調整（好ましくはｐＨ２．０またはｐＨ４．０より高いｐＨに、より好ましくはｐＨ１０．０未満のｐＨに調整）；還元剤による処理（例えばＥＰ５７０９１６に記載）；脱色処理（例えば木炭による）；加熱（滅菌を含む）；冷却またはコンディショニング。
【００４２】
高度精製ｒＨＡの第二の調製方法
本発明で使用するために適した形態にｒＨＡ溶液を精製するまた別の方法は、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを含み、そのようにして精製されたｒＨＡ溶液は、場合によって、以下の：緩衝液交換；濃縮；希釈；透析；ダイアフィルトレーション；ｐＨ調整（好ましくはｐＨ２．０またはｐＨ４．０より高いｐＨに、より好ましくはｐＨ１０．０未満のｐＨに調整）；還元剤の添加；脱色処理（例えば木炭による）；加熱（滅菌を含む）；冷却またはコンディショニング、の１つ以上の処理を経る。
陽イオン交換クロマトグラフィー工程はインイオン交換クロマトグラフィー工程の後でもよく、逆もまた正しい。好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後にインイオン交換クロマトグラフィー工程が続く。
好ましくは、陰イオンおよび陽イオン交換工程の間には更なる精製工程は存在しないが、ただしｒＨＡは上記に記載したように緩衝液交換などに付される。
【００４３】
コンディショニングは非精製ハンドリング工程を意味し、前記は、次ぎの処理工程のためまたは最終使用のためにｒＨＡの環境または状態を改善する。コンディショニングにはアルブミン安定化剤（例えばオクタノエートおよび／または脂肪酸、例えばＣ6またはＣ1-10脂肪酸、またはナトリウムアセチルトリプトファネートまたはマンデレート）の添加が含まれる。コンディショニングにはまた塩の添加などが含まれ、ｒＨＡ溶液の導電率の調節を含むことができる。
本発明の第一および第二の態様の陽イオン交換工程は、ｒＨＡに対して陰性または陽性モードで実施することができる。好ましい実施形態では、陽イオン交換工程はｒＨＡに対して陰性モードで実施される。有利には、前記条件は糖化アルブミンが非糖化アルブミンよりも強力に陽イオン交換物質に結合することができるように選択される。
【００４４】
本発明の第一および第二の態様の陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、市販の陽イオン交換マトリックス、例えばＳＰ−セファロースＦＦ、ＳＰ−スフェロシル、ＣＭ−セファロースＦＦ、ＣＭ−セルロース、ＳＥ−セルロースまたはＳ−スフェラデックスを用いることができる。好ましくは、陽イオン交換工程は、陽イオン交換物質として固定スルフォプロピル置換基を含むマトリックスを利用する。
好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィーに付されるｒＨＡ溶液は４．５−６．０のｐＨ、より好ましくは５．０−５．６のｐＨ、さらに好ましくは５．２−５．４のｐＨを有する。
好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィーに付されるｒＨＡ溶液は、１０−２５０ｇ／Ｌ、好ましくは２０−７０ｇ／Ｌ、より好ましくは５０±１０ｇ／ＬのｒＨＡ濃度を有する。
好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィーに付されるｒＨＡ溶液は、２−１５ｍＭ、好ましくは５‐１０ｍＭ、より好ましくは６−９ｍＭのオクタノエートイオン濃度を有する。
【００４５】
便利には、陽イオン交換工程の前に、ｒＨＡ溶液は、（ｉ）ｐＨ調整（好ましくはｐＨ２．０またはｐＨ４．０より高いｐＨに、より好ましくはｐＨ１０．０未満のｐＨに調整）；（ii）濃縮；（iii）ダイアフィルトレーション；または（iv）安定化剤（例えばオクタノエートおよび／または脂肪酸（例えばＣ6もしくはＣ10脂肪酸）、またはナトリウムアセチルトリプトファネートもしくはマンデレート）の添加によるコンディショニング、の１つ以上のプロセスを経る。前記と別の選択として、または前記に加えて、ｒＨＡ溶液は、緩衝液交換；希釈；透析；ダイアフィルトレーション；還元剤による処理；脱色処理（例えば木炭による）；加熱；冷却；またはコンディショニング、の１つ以上の処理を経る。
一般的には、いずれの修飾も除去ではなく添加を必要とする。好ましくは、ｒＨＡ溶液のｐＨの調整は酢酸の添加によって調節される。好ましくは、ｒＨＡ溶液は限外ろ過によって濃縮される。
【００４６】
本発明の第一および第二の態様の陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、市販の陰イオン交換マトリックス、例えばＱセファロース−ＦＦ、ＱＭＡ−スフェロシル、ＤＥＡＥ−スフェロデックス、Ｑ−ハイパーＤ、ＤＥＡＥ−セルロース、ＱＡＥ−セルロース、またはＴＭＡＥ、ＤＭＡＥもしくはＤＥＡＥフラクトゲルを利用することができる。好ましくは陰イオン交換工程は、陰イオン交換物質として固定されたジアルキルアミノアルキル（例えばジエチルアミノエチル）置換基を含むマトリックスを利用する。
【００４７】
ある好ましい実施形態では、上記で述べた方法のインイオン交換クロマトグラフィーは、ｒＨＡに対して陰性モードで実施される。
好ましくは、陰性モードの陰イオン交換クロマトグラフィーを実施されるｒＨＡ溶液は４．０−５．２のｐＨ、より好ましくは４．２−４．９のｐＨ、さらに好ましくは４．５−４．７のｐＨを有する。
好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施されるｒＨＡ溶液は、４．０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率、より好ましくは１．０５±０．５ｍＳ／ｃｍ、さらに好ましくは１．０５±０．１ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。
便利には、陰イオン交換工程の前に、ｒＨＡ溶液はｐＨ調整および／または水による希釈を実施される。好ましくは、ｒＨＡ溶液のｐＨは酢酸で調整される。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、上記で述べた方法の陰イオン交換クロマトグラフィー工程はｒＨＡに対して陽性モードで実施される。
適切には、陽性モードの陰イオン交換クロマトグラフィーを実施されるｒＨＡ溶液は６．０−８．０のｐＨ、好ましくは６．５−７．５のｐＨ、より好ましくは６．８−７．２のｐＨを有する。好ましくはｒＨＡ溶液はオルトホスフェートイオンを用いてｐＨが調整された。
ある好ましい実施形態では、ｒＨＡ濃度は１０−１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２５−８０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは３０−６０ｇ／Ｌである。好ましくはｒＨＡ溶液の導電率は、１．０−２．０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは１．２−１．６ｍＳ／ｃｍである。
適切には、ｒＨＡは、２０−９０ｍＭ、好ましくは３０−７０ｍＭ、さらに好ましくは３５−６５ｍＭのリン酸塩（例えばリン酸ナトリウム）を含む緩衝液で陰イオン交換物質から溶出される。好ましくは、ｒＨＡは、ｐＨ６．０−８．０、好ましくはｐＨ６．５−７．５の緩衝液で陰イオン交換物質から溶出される。
【００４９】
上記で述べた方法では、下記の工程：発酵；一次分離；濃縮コンディショニング；陽イオン交換クロマトグラフィー（好ましくは陽イオン交換物質としてスルホプロピル置換基を用いる）；陰イオン交換クロマトグラフィー（好ましくは陰イオン交換物質としてジエチルアミノアルキル置換基を用いる）；またはアフィニティークロマトグラフィー（好ましくは固定されたアルブミン特異的染料（好ましくはCibacron Blueタイプの染料）を含むアフィニティーマトリックスを用いる）、の１つ以上が先行するのが特に好ましい。
【００５０】
ｒＨＡ精製のための好ましい方法は以下の工程：
（ａ）ｒＨＡ溶液を、ｒＨＡに対し陽性モードで実施される陽イオン交換クロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｂ）ｒＨＡ含有陽イオン交換溶出液を採集すること；
（ｃ）前記陽イオン交換溶出液を、ｒＨＡに対して陽性モードで実施される陰イオン交換クロマトグラフィーに工程に付すこと；
（ｄ）ｒＨＡ含有陰イオン交換溶出液を採集すること；
（ｅ）前記陰イオン交換溶出液を、ｒＨＡに対し陽性モードで実施されるアフィニティークロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｆ）ｒＨＡ含有アフィニティークロマトグラフィー溶出液を採集すること；
（ｇ）前記アフィニティークロマトグラフィー溶出液を、ｒＨＡに対し陰性モードおよび糖共役物（糖化アルブミンおよび／または糖タンパク質）に対し陽性モードで実施されるアフィニティークロマトグラフィー工程に付すこと；
【００５１】
（ｈ）ｒＨＡ含有アフィニティークロマトグラフィーフロースルーを採集すること；
（ｉ）前記アフィニティークロマトグラフィーフロースルーを、ｒＨＡに対し陰性モードで実施される陽イオン交換クロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｊ）前記ｒＨＡ含有陽イオン交換フロースルーを採集すること；
（ｋ）前記陽イオン交換フロースルーを、陰性モードまたは陽性モードで実施される陰イオン交換クロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｌ）前記陰イオン交換工程が陰性モードで実施される場合は、前記ｒＨＡ含有陰イオン交換フロースルーを採集すること；または前記陰イオン交換工程が陽性モードで実施される場合は、陰イオン交換溶出液を陰イオン交換マトリックスから溶出させること；
を含み、また、それぞれの精製工程のいずれかの前または後で、場合によって、以下の：緩衝液交換；濃縮；希釈；透析；ダイアフィルトレーション；ｐＨ調整（好ましくはｐＨ２．０またはｐＨ４．０より高いｐＨ、および好ましくはｐＨ１０．０未満のｐＨに調整）；還元剤による処理；脱色処理（例えば木炭による）；加熱（滅菌を含む）；冷却；またはコンディショニング、の１つ以上が実施される。
【００５２】
したがって、前記精製工程は、下記の：緩衝液交換；濃縮；希釈；透析；ダイアフィルトレーション；ｐＨ調整；還元剤による処理；脱色処理；加熱；冷却；またはコンディショニング、の１つ以上によって分断されてもよいが、また分断されてなくてもよい。
工程がｒＨＡに対して陰性モードで実施される場合はいずれも、洗浄物はフロースルーと同様に採集することができる。
【００５３】
ｒＨＡ精製のまた別の好ましい方法は下記の工程：
（ａ）ｒＨＡ溶液を、ｒＨＡに対し陽性モードで実施される陽イオン交換クロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｂ）ｒＨＡ含有陽イオン交換溶出液を採集すること；
（ｃ）前記陽イオン交換溶出液を、ｒＨＡに対して陽性モードで実施される陰イオン交換クロマトグラフィーに工程に付すこと；
（ｄ）ｒＨＡ含有陰イオン交換溶出液を採集すること；
（ｅ）前記陰イオン交換溶出液を、ｒＨＡに対し陽性モードで実施されるアフィニティークロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｆ）ｒＨＡ含有アフィニティークロマトグラフィー溶出液を採集すること；
（ｇ）前記アフィニティークロマトグラフィー溶出液を、ｒＨＡに対し陰性モードおよび糖共役物に対し陽性モードで実施されるアフィニティークロマトグラフィー工程に付すこと；
【００５４】
（ｈ）ｒＨＡ含有アフィニティークロマトグラフィーフロースルーを採集すること；
（ｉ）前記アフィニティーマトリックスフロースルーを、ｒＨＡに対し陰性または陽性モードで実施される陰イオン交換クロマトグラフィー工程に付すこと；
（ｊ）前記陰イオン交換工程が陰性モードで実施される場合は、前記ｒＨＡ含有陰イオン交換フロースルーを採集すること；または前記陰イオン交換工程が陽性モードで実施される場合は、陰イオン交換溶出液を陰イオン交換マトリックスから溶出させること；
（ｋ）陰イオン交換クロマトグラフィー工程によって精製された前記ｒＨＡ溶液を、ｒＨＡに対し陰性モードで実施される陽イオン交換クロマトグラフィー工程に付すること；
（ｌ）ｒＨＡ含有陽イオン交換フロースルーを採集すること；
を含み、また、それぞれの精製工程のいずれかの前または後で、場合によって、緩衝液交換；濃縮；希釈；透析；ダイアフィルトレーション；ｐＨ調整（好ましくはｐＨ２．０またはｐＨ４．０より高いｐＨ、および好ましくはｐＨ１０．０未満のｐＨに調整）；還元剤による処理；脱色処理（例えば木炭による）；加熱（滅菌を含む）；冷却；またはコンディショニング、の１つ以上が実施される。
【００５５】
したがって、前記精製工程は、下記の：緩衝液交換；濃縮；希釈；透析；ダイアフィルトレーション；ｐＨ調整；還元剤による処理；脱色処理；加熱；冷却；またはコンディショニング、の処理によって分断されてもよいが、また分断されてなくてもよい。
好ましくは、陽性モードの陽イオン交換工程の前に、ｒＨＡ溶液は上記のようにコンディショニングを施される。好ましくは、オクタノエートがｒＨＡ溶液に約１１０ｍＭの最終濃度で添加され、ｐＨは約４．０−５．０に調整される。
【００５６】
有利には、陽性陽イオン交換工程で保持されているｒＨＡは、高塩溶液（例えば０．５−３．０ＭのＮａＣｌで、ｐＨ３．５から４．５、好ましくは約ｐＨ４．０で１０−１００ｍＭ、好ましくは２０−４０ｍＭ、例えば２５−３０ｍＭの酢酸ナトリウムで緩衝されてある）で溶出の前に洗浄される。
好ましくは、ｒＨＡは、陽イオン交換工程でアルブミンに対し特異的な親和性を有する化合物（特に酸、例えばオクタノエートまたは別の脂肪酸、例えばＣ6またはＣ10）を含む緩衝液を用いて溶出される。
【００５７】
適切には、ｒＨＡは、第一の陰イオン交換工程の陰イオン交換物質から高レベル（例えば少なくとも５０ｍＭ、好ましくは５０−２００ｍＭ、例えば８０−１５０ｍＭ）のホウ酸塩、例えば四ホウ酸ナトリウムまたはカリウムを含む緩衝液で溶出される。
好ましくは陽性モードのアフィニティークロマトグラフィー工程は、固定されたアルブミン特異的染料（例えばCibacron Blueタイプの染料）を含む樹脂を用いる。前記染料は、スペーサー、例えば１，４−ジアミノブタンまたは別のスペーサーで長さがＣ1-8、好ましくはＣ1-6、例えばＣ1-5、もっとも好ましくはＣ4で、好ましくはα，ω−ジアミノ置換基を有するものを介して樹脂に固定されてある。好ましくは、前記マトリックスは“デルタブルーアガロース”（ＤＢＡ）で、ＷＯ９６／３７５１５に記載されているように調製される。
【００５８】
高度精製ｒＨＡの第三の調製方法
ｒＨＡ溶液を精製、特にｒＨＡ溶液中のニッケルイオンレベルを減少させる他の方法は、ｒＨＡ溶液をｐＨ２．５から７．５、好ましくはｐＨ２．５から６．０に付すこと、およびニッケルイオンを除去することを含む。好ましくは、ｒＨＡ溶液は、ｐＨ４．０から７．５、好ましくはｐＨ４．０から６．０、より好ましくはｐＨ４．０から５．５、さらに好ましくはｐＨ４．０から５．０、もっとも好ましくはｐＨ４．０から４．５に付される。
好ましくは、そのような方法はｐＨ２．５−６．０の緩衝液または上述のｐＨ範囲の１つの範囲内のｐＨを有する緩衝液に対するダイアフィルトレーションを含む。また別にはニッケル除去は、上記に挙げたｐＨ範囲のいずれかの範囲内のｐＨを有する緩衝液によるゲル浸透クロマトグラフィーを用いて達成することができる。ゲル浸透クロマトグラフィーは、セファクリルＳ２００ＨＲを用いて実施することができる。好ましくは、前記緩衝液は酢酸イオンおよび／またはリンゴ酸イオンを含む。また別に、ｐＨを調節し、さらに水でダイアフィルトレーション／ゲル浸透クロマトグラフィーを実施するために十分なｒＨＡの緩衝能力が存在する。
【００５９】
ニッケルイオンはまた別にはキレートしてｒＨＡから除去することができる。これは、キレート剤、例えばイミノ二酢酸をセファロース（Chelating Sepharose, Pharmacia）また別のポリマー（例えばChelex, Bio Rad Laboratories）に低ｐＨ（好ましくはｐＨ４．０から６．０、より好ましくはｐＨ４．０から４．５）で固定したものを用いて達成することができる。
好ましくは、直前に記載した方法による生成物を直ちに陰性陽イオンクロマトグラフィーに付すときは、その方法は、ｒＨＡ溶液をｐＨ５．０−５．６に付すことを含むことが好ましい。逆に、前記方法による生成物を直ちに陰性陰イオンクロマトグラフィーに付さないときは、前記方法は、ｒＨＡ溶液をｐＨ４．３−４．９に付すことを含むことが好ましい。
上記で述べたように調製した精製ｒＨＡ溶液を更なる処理に付すことができる。例えば、前記を限外ろ過膜で限外ろ過して、ｒＨＡが１リットル当たり少なくとも１０ｇ、好ましくは少なくとも４０ｇ、より好ましくは約８０ｇのｒＨＡ濃度を有する限外ろ過保持物を得ることができる。前記限外ろ過保持物は、前記保持物の少なくとも５倍に等しい水に対してダイアフィルトレーションを施される。
【００６０】
上記で述べたように、本発明で使用される高度精製ｒＨＡは、不純なｒＨＡ溶液から得ることができる。本方法は、ヒトアルブミンのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列で形質転換した微生物を発酵培養液中で培養すること；好ましくは前記微生物を前記発酵培養液から分離すること；必要な場合には更なる精製のために前記培養液にコンディショニングを施すること；前記コンディショニングを施した培養液を連続する３つのクロマトグラフィー工程に付すること；前記精製物に限外ろ過／ダイアフィルトレーションを施すること；前記限外ろ過生成物を更なるクロマトグラフィー工程に付すること；さらに２つのクロマトグラフィー工程による精製の前に再度限外ろ過／ダイアフィルトレーションを実施すること；さらに最後の限外ろ過／ダイアフィルトレーションを実施すること、の１つ以上を含むことができる。
【００６１】
上記に記載した工程のいずれかの前または後で、ｒＨＡ溶液を緩衝液交換、濃縮、希釈、加熱（殺菌を含む）、冷却に付すことができ、また塩などをｒＨＡ溶液に添加してもよい。前記によって例えばｒＨＡ溶液はコンディショニングまたはｐＨ調節が達成されるであろう。場合によって、ｒＨＡを還元剤で処理することができ、また脱色工程に付すこともできる。以下の実施例および添付の図面を（単に例示として）参照しながら本発明をこれから極めて詳細に記述するであろう。
【実施例１】
【００６２】
Ｆ−ＶＩＩＩ調製物の調査用ロットは以下のようにして調製した：
高度精製ｒＨＡをＦ−ＶＩＩＩおよび他の賦形剤の溶液に添加した。前記溶液を２５０ＩＵのＦ−ＶＩＩＩ活性を含有するバイアルに満たした。続いて前記溶液を凍結乾燥させた。
アンプルを５℃で保存し、４８ヶ月にわたって注射水で時折再構成した。再構成溶液は以下の組成を有する：
高度精製ｒＨＡ                ５ｍｇ／ｍＬ
グリシン                      ２０ｍｇ／ｍＬ
クエン酸ナトリウム        ５．３５ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム            ３ｍｇ／ｍＬ
以下の変数について４８ヶ月の期間にわたって調べた：
残留水分
溶解時間
ｐＨ
タンパク質含有量
第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性
ｖＷＦ：ＲｃｏＦ活性
ｖＷＦ抗原
ｖＷＦマルチマー
ポリマーおよびアグリゲート
得られたデータを、高度精製ｒＨＡが同じ濃度の血清由来ＨＡＳに置き換えられている対応するサンプルで同一条件下で得られた対応するデータと比較した。
【００６３】
結果
以下のパラメーターについては高度精製ｒＨＡ含有サンプルと血清由来ＨＡＳ含有サンプルとの間に顕著な相違は認められなかった：
残留水分
溶解時間
ｐＨ
タンパク質含有量
ｖＷＦ：ＲｃｏＦ活性
ｖＷＦ抗原
ｖＷＦマルチマー
ポリマーおよびアグリゲート
しかしながら、２つの生成物の第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性は図１および２に示すように顕著な相違を示した。
３６ヶ月の間に第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性で観察された変化は、高度精製ｒＨＡを含むサンプルについては０．２ＩＵ／ｍＬの平均低下（図１）で、血清由来ＨＡＳを含むサンプルについては４．４ＩＵ／ｍＬの平均増加（図２）であった。この差は有意であった（ｐ＝０．００４）。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】４８ヶ月にわたって実施した長期安定性実験で測定された、０．５％（ｗ／ｖ）の高度精製ｒＨＡで安定化させたＦ−ＶＩＩＩを含む組成物（３ロット）のＦ−ＶＩＩＩ：Ｃ活性を示す。
【図２】血清由来のＨＡＳで安定化させた組成物の対応するデータを示す。
【図１】
2005536452.tif 000003
【図２】
2005536452.tif 000004
【国際調査報告】
2005536452.tif 000005
2005536452.tif 000006
2005536452.tif 000007
2005536452.tif 000008
2005536452.tif 000009