(57)【要約】  本発明は、ＭＡＬＤＩターゲット・スライド（１）を処理する方法、並びにグラファイト粒子の懸濁液の滴をターゲット・スライド（１）のターゲット表面（４）に適用して蒸発するそのような処理後のスライドに関する。ターゲット表面に残される得られたスポット（２）は、均一に分布したグラファイト粒子（３）を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を適用する前に、質量分析ターゲット・スライドを前処理する方法であって、
ａ）ターゲット・スライドのターゲット表面に、グラファイト粒子の懸濁液の一又はそれ以上の滴を適用する工程；及び
ｂ）該一又はそれ以上の滴を乾燥して、ターゲット・スライド上にグラファイト粒子を含む一又はそれ以上のスポットを残す工程
を含んで成る質量分析ターゲット・スライドを前処理する方法。
【請求項２】
グラファイト粒子の該懸濁液は、約２ｍｇ／ｍｌの濃度でグラファイト粒子を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グラファイト粒子は、５０μｍより小さい、好ましくは１０μｍより小さい、最も好ましくは２μｍより小さい最大の寸法を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該懸濁液は、水を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該懸濁液は、揮発性液体を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該液体は、アルコール又は有機溶剤又は無機溶媒であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該スポットは、スポット上に均一に分布したグラファイト粒子を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＭＡＬＤＩ分析用試料製造方法であって、
請求項１〜７のいずれかに記載の方法を用いてターゲット・スライドを前処理する工程；
該試料を含むマトリックス溶液の滴を、ターゲット・スライド上の該スポット又は各々のスポットに適用する工程；及び
該マトリックスと試料の溶液を乾燥する工程
を含んで成るＭＡＬＤＩ分析用試料製造方法。
【請求項９】
グラファイト粒子を含むターゲット領域を含んで成ることを特徴とする質量分析計にて使用するターゲット・スライド。
【請求項１０】
該スライドは、金属製であることを特徴とする請求項９に記載のターゲット・スライド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、独立請求項のプレアンブル部に記載したタイプの、質量分析ターゲット・スライド（target slide）・デバイス及びそのようなスライドの製造方法（又は準備方法）に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックス−アシステッド・レーザー・デソープション／イオニゼーション（又はマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization）: ＭＡＬＤＩ）マススペクトロメトリー（又は質量分析）は、光吸収低分子からなる結晶マトリックスを、マトリックス分子の振動運動を生じさせる短いレーザーパルスによって励起する方法である。この運動は、表面のいくつかのマトリックス分子を放出し、埋め込まれている被検体分子も、イオン源の周囲の真空中へ引きずり出される。この方法の間にいずれかの地点で、マトリックス分子と被検体のフラクションは、一価にイオン化する。分子のこのフラクションは、チャージに対する質量の比（Ｍ／Ｚ）の分析のために、しばしばタイム−オブ−フライト（time-of-flight：ＴＯＦ）システムにて、イオン源から加速される。
【０００３】
ＭＡＬＤＩ質量分析を用いて調べる前に、調べる被検体を、ＭＡＬＤＩ質量分析に適切な形態となるように調製しなければならない。典型的には、下記の方法で調製する：
被検体をレーザー光吸収マトリックスの溶液に加える；
その後、被検体／マトリックス混合物の滴（液滴もしくは小滴）をＭＡＬＤＩターゲット・スライド上に配置する；及び、
溶媒を蒸発させてターゲット・スライド上に試料（もしくはサンプル）／マトリックスの結晶を残す。
【０００４】
この方法を用いる際に一般的に生ずる問題は、結晶の寸法（又はサイズ）が不均一であることと、表面上の結晶の分布が不均一であることである。例えば、アルファ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＡＣＣＡ）を用いる場合、適用された試料のスポットの外辺部の周囲にしばしば結晶を生じ、結晶に乏しい中央の空隙又は領域が残る。２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を用いる場合、ターゲット・スライド表面上にランダムに積み重なった大きな針状の結晶が、しばしば生成する。双方のマトリックスの場合、結果は、大きな領域が極めて小さな信号（又はシグナル）をもたらす又は全く信号をもたらさないということである。このことは、乏しい信号再現性をもたらす。従って、質量分析計（又はオペレーター）は、良好な信号を与える領域を探すことが必要である。このことは、カメラを装備した質量分析計を用いて、目視により結晶の位置決めをすることによって、又は試料をぐるっと動かしながら質量分析計の信号のスペクトルの質を正しく調べることによって、しばしば行われる。第一の方法は、カメラの費用と試料のスポットを探すオペレーターの使用が必要であり、第二の方法もオペレーターが必要で時間がかかることから、いずれの方法も全く満足なものではない。
【０００５】
問題のよりよい解決方法は、実質的に均一な結晶分布を含む試料スポットを生じさせることである。このことを達成する試みが、例えば、疎水性表面によって囲まれた親水性アンカー（anchor）を供給することによって行われている。滴は、親水性アンカー上に配置され、疎水性の周囲の表面は、溶媒が蒸発するにつれて滴がアンカーから動くことを防止する。このことは、適切に特定された領域上に結晶を形成することをもたらす。更に、溶媒が蒸発したとき、滴からのマトリックス材料が、結晶層を有する領域を十分にカバーすることを確保するために、マトリックスの濃度を調節することができる。しかし、この方法は、結晶化が領域のへりの周囲にのみ生じないということと、大きな針状の結晶を生じないということを保証できない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要約
本発明に基づいて、従来技術の有する少なくとも一部の課題は、請求項１の特徴部分に存する特徴を有する方法、請求項８の特徴を有する方法、及び請求項９の特徴部分に記載された特徴を有するデバイスを用いることによって、解決される。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明を説明する態様の詳細な説明
本発明の第一の態様に基づいて、そのようなターゲット・スライド上のマトリックス結晶の分布を向上させるための質量分析ターゲット・スライドを前処理する方法は、下記の工程を含む：
ａ）被検体を適用する前に、ターゲット・スライド１のターゲット表面４に、間隔をあけて、液体中のグラファイト粒子３の懸濁液（又はサスペンジョン）の滴（液滴又は小滴）２を適用することによって、ターゲット・スライド１を前処理する工程；及び
ｂ）液体を、放置して蒸発させて、又は強制的に（例えば、加熱すること又は滴に空気を吹き付けることによって）蒸発させて、懸濁液のこれらの滴を乾燥して、それによってターゲット・スライド上にグラファイト粒子のスポットを残す工程。
【０００８】
懸濁液に使用される液体は、いずれの適当な液体であってもよい。本発明に適するものは、次の要件を好ましくは満たすべきである：
ａ）それが蒸発するための待ち時間を最小時間とするために、それは十分に揮発性であるべきであり（即ち、相当な低温において容易に蒸発でき）、通常の実験室の環境で十分に迅速に蒸発するべきであるが、同時に、あまりに迅速に蒸発すべきではない。これは、懸濁液が、滴によってカバーされる領域によって、付着（沈殿又は堆積）領域を特定するからである。重力の影響下、グラファイト粒子は、ターゲット表面に沈降する。液体溶液の蒸発が早すぎる場合、重力による降下速度より早く蒸発し得る。そのことは、例えば、グラファイト粒子がその付着領域に渡って均一に分布する代わりにターゲット領域の中央に集まり得るような、乱れた不均一を生じさせ得る速度の流体の運動を生じさせる。好ましくは、グラファイト懸濁液体を体積で１μｌ含む滴は、５秒間〜１日間で乾燥するべきであり、１０秒間〜１時間で乾燥することが最も好ましい。従って、液体の選択は周囲の条件に依存し、最適化することができる；並びに
ｂ）液体が十分に表面を濡らす場合、その液体は表面をより濡らさない液体よりより広がる。水は、ステンレススチールの表面をメタノールほど濡らさないが、下記に示すように、水はより均一なターゲットを与える。適切な液体の選択は、それが適用される表面の材料と表面仕上げと、そのような表面上での液体の表面張力に依存する。
適当な液体の例として、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル等及びそれらの組み合わせを例示できる。
【０００９】
グラファイト粒子の懸濁液は、液体を含む容器（又はコンテナ）に粒子を加えることによって、例えば、液体を含む試験管に粒子を加えることによって、調製（又は製造）することができる。別法では、懸濁液を、表面上の液体の滴に粒子を加えることによって、調製することができる。例えば、一又はそれ以上の液体の滴をターゲット・スライドに適用した後、グラファイト粒子を吹き付ける粒子チャンバー中にスライドを配置することによって、粒子を適用することができる。粒子は、滴の中に入り、ある時間経過後、スライドを粒子チャンバーから取り出し、滴の外側のターゲット・スライド上に沈降した不必要な粒子を、好ましくは穏やかに、吹き飛ばして（又は吹き付けて）、吸引して、洗浄して、又はこすり取る等して除去するが、必ずしも全部を除去する必要はない。その後、滴を蒸発させて、粒子を含む領域を残す。
【００１０】
他の方法では、その表面上の領域に接着性又はタック性を有する物質を適用することによって、スライドを前処理することができる。その後、例えば、表面上に粒子を落とすことによって、または粒子を吹き付ける粒子チャンバー中に配置することによって、スライドのこれらの領域を粒子によってコートすることができる。吹き付けて又は吸引によって、過剰の粒子を除去することができる。
【００１１】
本発明に基いて前処理されたターゲット・スライドを、被検体を分析するために使用する場合、調べる被検体を含む、好ましくは飽和の、マトリックス溶液の滴を、ターゲット・スライド上のグラファイト粒子のスポットの各々に適用し、溶媒を放置して蒸発させる又は強制的に蒸発させる。これでターゲット・スライドは、分析準備が完了し、質量分析機に配置され、通常の方法を用いて、分析できる。
【実施例】
【００１２】
実験手順
本発明に基づく方法によって得られる改良を説明するために実験を以下に説明するように行った。ペプチドと粉状の化学品はシグマアルドリッチ（Sigma Aldrich）から購入した。溶媒は、多くの実験室用品を供給する会社から市販されている標準溶媒である。試料ターゲット・スライドは、エタン標準ステンレススチール・ターゲット・スライド（Ettan standard stainless steel target slide）（スウェーデン国、ウプサラのアメルシャム・バイオサイエンシーズ製のエタン・ステンレススチールＭＡＬＤＩターゲット・スライド：Ettan stainless steel MALDI target slide from Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）であった。これらのターゲット・スライドは、試料を付着（沈殿又は堆積）させる一列のターゲット領域を含む。
【００１３】
実験は、エタンＭＡＬＤＩ質量分析計（Ettan MALDI mass spectrometer）（スウェーデン国、アメルシャム・バイオサイエンシーズＡＢ製）を用いて行った。
【００１４】
１〜２μｍのグラファイト粒子（シグマアルドリッチ２８−２８６−３）の懸濁液を、約２ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。二種類の懸濁液を検討した。一つはメタノール中にグラファイトを懸濁した懸濁液であり、他は、水にグラファイトを懸濁した懸濁液である。
【００１５】
α−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸（ＡＣＣＡ）及び４ｐｍｏｌ／μｌのアンギオテンシン（Angiotensin）ＩＩＩ（Ｍ／Ｚ＝８９７）を含む飽和マトリックス溶液を、５０％アセトニトリル、５０％水、１％ＴＦＡ中に調製した。
【００１６】
２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＢＨ）及び２００ｆｍｏｌ／ｌのブラジキニン（Bradykinin：Ｍ／Ｚ＝１０６０）、アンギオテンシン（Ｍ／Ｚ＝１２９７）、ニューロテンシン（Neurotensin：Ｍ／Ｚ＝１６７３）を含む１０ｍｇ／ｍｌのマトリックス溶液を、水中に０．１％のＴＦＡ９部とエタノール１部中に、調製した。
【００１７】
一のＭＡＬＤＩターゲット・スライドを、Ｃ６０（バックミンスター・フラレン）溶液（それは極めて非極性の溶媒中にのみ可溶である）を用いて前処理した。アルコールを用いて清浄にし、拭き取った。
【００１８】
ターゲット・スライド上のターゲットスポットの三分の一を、グラファイトのメタノール中懸濁液（振り混ぜた後）１μｌを適用し、滴を乾燥することによって前処理した。ターゲット・スライド上のターゲットスポットの三分の一を、グラファイトの水中懸濁液（振り混ぜた後）１μｌを適用し、滴を乾燥することによって前処理した。メタノール溶液は、迅速に乾燥した。水溶液は、水が室温で乾燥するために約１時間を要した。スライド上の残りの清浄なターゲットスポットを、コントロールとして機能させるために、未処理のまま残した。
【００１９】
水溶液前処理、メタノール溶液前処理及び未処理ターゲットスポットの各々の半分は、それらの上に付着させられる試料とマトリックスの溶液０．５μｌを有し、残りのターゲットスポットはそれらの上に沈殿させられる溶液１μｌを有した。溶媒を蒸発させ、ターゲットスポットを質量分析計で分析した。
【００２０】
ＡＣＣＡマトリックス試料は、単一の位置で分析した。ＤＨＢ試料は、薄層クロマトグラフィー・モードを用いてスライドのフルの長さを走査することによって、分析した。これらの実験は、ＡＰＢエタンＭＡＬＤＩ質量分析計（APB Ettan MALDI mass spectrometer）を用いて行った。
【００２１】
平均スペクトル当たり１００ショットを用いるブルカー・バイフレックスＩＩＩ（Bruker Biflex III）を、一般的なステンレススチール、とグラファイト前処理ターゲット・スライドの間の検知レベルの比較実験に用いた。
【００２２】
実験結果を抜粋して図１ａ）、１ｂ）、２ａ）、２ｂ）に示した。
【００２３】
全てのターゲットを、ターゲット・スライドに平行方向から光を当てて、写真撮影をした。これにより、結晶がライトアップされた。図１ａ）と１ｂ）は、イメージの理解を向上するために、黒色を電子的に除去した。
【００２４】
未処理ステンレススチールターゲット上に、通常の試料付着を用いると、リング状の結晶化を生ずるが、グラファイト前処理ターゲットはより均一な結晶分布を示すことが確認された。グラファイトの水懸濁液は、よりコントロールされたスポットの中で乾燥するが、メタノールの懸濁液は、スポットの外側に流れる傾向にあることが見出された。グラファイト処理された試料は、全部の試料スポットにわたって信号を与えたが、未処理ステンレススチールターゲットは、より弱い信号強度（おそらく不均一な結晶分布による）及び異なる位置からのより不満足なデータを与えるという結果になった。被検体の信号が観測されなかった位置に、Ｃ６０の信号が観測されたという観察（及びその逆の観察）は、信号が存在しないということはステンレススチール（それはＣ６０によって被覆されている）をさらしたことによるという意見を、更に強くするものである。
【００２５】
本発明の上述の態様は、カーボン粒子を用いることを示すものであるが、他の適当な粒子、即ち、直径（又は寸法）が５０μｍより小さい粒子、好ましくは直径が１０μｍより小さい粒子、最も好ましくは直径が２μｍより小さい粒子であって、マトリックス／試料溶液に対して不活性であり、質量分析において使用される試料から容易に見分けられるマス又はフラグメント・マスを有し、好ましくはレーザーによってイオン化したときにフラグメントを生じない粒子を用いることも考えられる。懸濁している流体中の粒子濃度は、粒子を配合できるいずれの濃度であってよい。濃度は、粒子の材料と寸法、及び懸濁する流体に依存する。濃度は、流体が十分容易に適用できる流体であるように十分に低濃度であり、同時に流体が蒸発する時間を短時間に維持でき、流体が蒸発した後残った粒子の層が目に見えるほどの隙間のない緻密なパターンを形成するほど十分に高い濃度であることが好ましい。流体が蒸発後に残る粒子の層は、一つの粒子の厚さであることが最も好ましい。これを達成することができる必要な濃度は、実験的に決定することができ、例えば、種々の濃度の粒子の懸濁液をターゲット・スライドに適用し、懸濁流体を蒸発させ、得られたスポットを調べることによって、いずれの濃度が最良の被覆を与えるかを決定することができる。
【００２６】
上述の態様は、単に本発明を説明することを意図するものであり、特許請求の範囲によって記載した保護範囲を何ら制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１ａ）】図１ａ）は、ＡＣＣＡのイメージ（又は像）であって、一般的な乾燥した滴の試料の標本（又はプレパラート）を示す。
【図１ｂ）】図１ｂ）は、水中のグラファイト懸濁液を用いて前処理されたＡＣＣＡ試料のイメージを示す。
【図２ａ）】図２ａ）は、従来技術のスライド上の滴を乾燥して調製されたＡＣＣＡ試料（dried-droplet prepared ACCA samples）の任意の単位の信号強度分布を示す。
【図２ｂ）】図２ｂ）は、水中グラファイト懸濁液を用いて前処理されたスライド上に、滴を乾燥して調製されたＡＣＣＡ試料の同じ任意の単位の信号強度分布を示す。
【図３ａ）】図３ａ）は、本発明に基づくターゲット・スライドの上方からの概略図を示す。
【図３ｂ）】図３ｂ）は、図３ａ）のスライドの側方からの概略図を示す。
【図１ａ）】
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【図１ｂ）】
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【図２ａ）】
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【図２ｂ）】
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【図３ａ）】
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【図３ｂ）】
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【国際調査報告】
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