(57)【要約】本発明は個体内の肺転移の成長を抑制する方法を提供する。この方法は、エアゾール化されたポリエチレンイミン−ＤＮＡ複合体とエアゾール化されたリポソーム−抗癌剤複合体とを組み合わせて投与するステップで構成され、上記複合体の両方ともエアゾール化によって送達される。こうした方法による上記ＤＮＡと抗癌剤の両者の送達は、前記個体内の肺転移の成長を抑制する。さらに、ポリエチレンイミン−ｐ５３複合体とジラウロイルホスファチジルコリン−９−ニトロカンプトセシン複合体をエアゾール化によって組み合わせて投与することで個体内の肺転移の成長を抑制する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体内の肺転移の成長を抑制する方法において：
エアゾール化されたポリエチレンイミン−核酸複合体とエアゾール化されたリポソーム−抗癌剤複合体を組み合わせて投与するステップで構成され；
前記核酸と前記抗癌剤の送達によって前記個体内の肺転移の成長を抑制することを特徴とする個体内の肺転移の成長を抑制する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記組み合わせが：
エアゾール化されたポリエチレンイミン−核酸複合体を投与するステップと；そして同時に、
エアゾール化されたリポソーム−抗癌剤複合体を投与するステップとで構成されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記組み合わせが：
エアゾール化されたポリエチレンイミン−核酸複合体を投与するステップと；そして連続的に、
エアゾール化されたリポソーム−抗癌剤複合体を投与するステップとで構成されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、前記組み合わせが更に：
エアゾール化されたリポソーム−抗癌剤複合体を少なくとも１回再投与するステップで構成されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記エアゾール化されたポリエチレンイミン−核酸複合体と前記エアゾール化されたリポソーム−抗癌剤複合体の組み合わせの投与が少なくとも１回繰り返されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、触媒活性核酸、リボザイム、アンチセンス・オリゴヌクレオチド及び修飾核酸で構成される群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記核酸が腫瘍抑制活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記核酸が、ｐ５３遺伝子、ｐ５３遺伝子の切断誘導体、ＣＤ１遺伝子、インターロイキン１２、及びインターフェロン−γで構成される群から選択されるＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、前記抗癌剤が、９−ニトロカンプトセシン、パクリタキセル、ドキソルビシン、カルボプラチン、メトトレキサート、ビンブラスチン、エトポシド、ドセタキセル・ヒドロキシウレア、フルオロウラシル、ブスルファン、メシル酸イマチニブ、アレンブズマブ、アルデスロイキン及びシクロフォスファミドで構成される群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１記載の方法において、前記リポソームがジラウロイルホスファチジルコリンであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法において、前記エアゾールが約３％から約７．５％の二酸化炭素を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１記載の方法において、ポリエチレンイミン窒素の核酸リン酸に対する前記比率が約２：１から約５０：１であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、ポリエチレンイミン窒素の核酸リン酸に対する前記比率が約５：１から約２０：１であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１記載の方法において、前記ポリエチレンイミン−核酸複合体がポリエチレンイミン−ｐ５３であり、前記リポソーム−抗癌剤複合体がジラウロイルホスファチジルコリン−９−ニトロカンプトセシンであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記ｐ５３が、エアゾール化溶液１０ｍｌあたり２ｍｇのｐ５３を含んでなる投与量で投与されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４記載の方法において、前記９−ニトロカンプトセシンが、約１：５０の９−ニトロカンプトセシン：ジラウロイルホスファチジルコリンの重量比率で１ｍｌあたり約０．５ｍｇの９−ニトロカンプトセシンを含んでなる投与量で投与されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
個体内の肺転移の成長を抑制する方法において：
エアゾール化されたポリエチレンイミン−ｐ５３複合体とエアゾール化されたジラウロイルホスファチジルコリン−９−ニトロカンプトセシン複合体を組み合わせて投与するステップで構成され；
ｐ５３と９−ニトロカンプトセシンの両方の送達によって前記個体内の肺転移の成長を抑制することを特徴とする個体内の肺転移の成長を抑制する方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法において、前記組み合わせが：
エアゾール化されたポリエチレンイミン−ｐ５３複合体を投与するステップと；そして同時に
エアゾール化されたジラウロイルホスファチジルコリン−９−ニトロカンプトセシン複合体を投与するステップとで構成される方法。
【請求項１９】
請求項１７記載の方法において、前記組み合わせが：
エアゾール化されたポリエチレンイミン−ｐ５３複合体を投与するステップと；そして連続的に
エアゾール化されたジラウロイルホスファチジルコリン−９−ニトロカンプトセシン複合体を投与するステップとで構成される方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法において、前記組み合わせが更に：
エアゾール化されたジラウロイルホスファチジルコリン−９−ニトロカンプトセシン複合体を少なくとも１回再投与するステップで構成される方法。
【請求項２１】
請求項１７記載の方法において、前記エアゾール化されたポリエチレンイミン−ｐ５３複合体と前記エアゾール化されたジラウロイルホスファチジルコリン−９−ニトロカンプトセシン複合体の組み合わせの投与が少なくとも１回繰り返されることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１７記載の方法において、ポリエチレンイミン窒素のｐ５３リン酸に対する比率が約５：１から約２０：１であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、ポリエチレンイミン窒素のｐ５３リン酸に対する前記比率が約１０：１であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１７記載の方法において、前記ｐ５３が、エアゾール化溶液１０ｍｌあたり２ｍｇのｐ５３を含んでなる投与量で投与されることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１７記載の方法において、前記９−ニトロカンプトセシンが、１：５０の９−ニトロカンプトセシン：ジラウロイルホスファチジルコリンの重量比率で、１ｍｌあたり約０．５ｍｇの９−ニトロカンプトセシンを含んでなる投与量で投与されることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１７記載の方法において、前記エアゾールが約３％から約７．５％の二酸化炭素を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２６記載の方法において、前記エアゾールが約５％の二酸化炭素を含んでなることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物学及び癌治療に関するものである。より具体的には、本発明は、肺転移腫瘍の成長抑制の効果的な方法としての、ｐ５３遺伝子及び抗癌化合物の連続的エアゾール送達に関するものである。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００２年２月１４日に提出され、現在は放棄された米国特許出願番号６０／３５６，８６４の仮出願の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
肺癌は癌による死亡の単独で最大の原因であり、新たに診断される患者の５年超生存率は１５％未満である。８０％以上の肺癌は化学療法による良好な反応がない。既存の肺転移の治療は、臨床環境においては難しい課題であり、多種のアプローチを要することが多い。主な臨床課題の１つは、化学療法薬物に対する腫瘍の抵抗性に打ち勝つことである。ｐ５３腫瘍抑制遺伝子突然変異が肺癌の大多数で報告され、ｐ５３機能の損失の結果、薬物抵抗と腫瘍再発が増加する（１）。ここ数年前提とされてきたアプローチは、ｐ５３遺伝子を腫瘍細胞内に入れ替えて、細胞をアポトーシスに導入するのみならず、化学療法薬に対する細胞の感受性を増大できるようにすることである（２，３）。
【０００４】
ほとんどの抗癌剤は、従来は経口または静脈経路を介して送達されてきた。これらの送達方法による薬物の生体分布は広範囲に及び、肺に沈着する薬物の割合は低い（４）。種々の組織内の導入遺伝子発現の類似の分布は、遺伝子治療のためのベクターDNA複合体の静脈内又は腹腔内送達の後に見られる（５）。もう１つの問題は、経口又は静脈経路を介して送達した後に見られる全身毒性である。遺伝子及び化学療法薬物のエアゾール送達は、特に肺を標的とする非常に有望な技術を代表し、薬物及び遺伝子の肺への沈着と薬物動態学的特長を増大させる（４，６）。
【０００５】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、エアゾール送達後に高いレベルで導入遺伝子発現を実現し（６）、最小限の毒性又はサイトカイン反応を伴う（６，７）。エアゾールで送達されるポリエチレンイミンの投与の結果、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子を用いた２つの異なる肺癌モデルにおいて抗癌効果が示されている（８，９）。ポリエチレンイミン−ｐ５３複合体のエアゾール送達によって、肺にあるＢ１６−Ｆ１０腫瘍病巣内に多少のアポトーシスの痕跡がもたらされる。導入遺伝子発現のための免疫組織化学は、ポリエチレンイミン−ＤＮＡ複合体が肺にあるＢ１６−Ｆ１０腫瘍病巣をトランスフェクトすることを明らかにしている（１３）。
【０００６】
９−ニトロカンプトセシン（９ＮＣ）のリポソーム形成、すなわち９−ニトロカンプトセシンのジラウロイルホスファチジルコリン・リポソーム形成（９ＮＣ−ＤＬＰＣ）などのトポイソメラーゼI抑制剤のエアゾール送達は、肺転移のみならず皮下腫瘍の成長も抑制できる（１０，１１）。しかし、９−ニトロカンプトセシンも含め、ｐ５３遺伝子とカンプトセシンの両方が、単独でも他の物質と組み合わせても、肺転移のみならず皮下腫瘍の成長も抑制できるとは言え（８，１０，１１，１４，１５）、送達される投与量は大きい。９−ニトロカンプトセシンを用いたエアゾール治療は、１日２回、週５日、５ｍｇの９−ニトロカンプトセシンをマウスに送達させる必要があり、この治療は腫瘍接種後１日目から開始された。９−ニトロカンプトセシンの投与量は、１日あたり１ｍｇから９ｍｇの間で変化させてもよい（２８）。同様に、腫瘍接種後１日目から週２回の処方で治療を開始すると、ＰＥＩ−ｐ５３  ＤＮＡ複合体のエアゾール送達は、Ｂ１６−Ｆ１０肺転移の大きな抑制をもたらす（８）；肺の中で微少癌組織の転移が既に定着した時に治療が開始された場合、遺伝子治療は不活性であった。
【０００７】
カンプトセシンは、ＤＮＡにおいて単一ストランド切断を誘発することによって腫瘍細胞内にアポトーシスを誘発するトポイソメラーゼ抑制剤である（１６）。カンプトセシン及び類似物質はｐ５３独立経路を介していくつかの細胞株にアポトーシスを誘発するが、ｐ５３は多様な腫瘍細胞株にカンプトセシンに対する感受性を持たせることが明らかになっている（１７，１８）。また、Ｋａｌｅｃｈｍａｎら（１９）は、ＡＳ１０１（トリクロロ（ジオキソエチレン−０，０’）テルル酸アンモニウム）がｐ５３の上方制御によってＢ１６−Ｆ１０細胞内のアポトーシスを増大させ得ることを既に示している。
【０００８】
血管形成は、腫瘍が直径１−２ｍｍを超えて成長するために必要である（２０）。更に、カンプトセシンは、腫瘍内で活発に成長する新しい血管を損傷させることによって、血管形成の調節を通じて腫瘍成長を抑制することが明らかになっている（２１，２２）。ｐ５３は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの多様な血管形成因子及びトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）などの抗血管形成因子の転写調節による血管形成の主要な調整因子であることが明らかになった（２３，２４）。Ｂ１６−Ｆ１０細胞株はｉｎ  ｖｉｖｏで血管形成能力が高く、Ｂ１６−Ｆ１０細胞のｐ５３トランスフェクションは、血管内皮成長因子の下方制御とＴＳＰ−１の上方制御を通して、この血管形成表現型を無効にし、腫瘍の成長を抑制することができる（１３）。
【０００９】
ｐ５３は動物モデルにおいて腫瘍に抗癌剤に対する感受性を持たせる能力があることが研究によって実証されており（２５）、これらの組み合わせ実験のいくつかは臨床試験の初期段階にも組み込まれている（２６）。Ｆｕｊｉｗａｒａらは、ｐ５３がｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも腫瘍細胞にDNA破壊薬であるシスプラチナムに対する感受性を持たせる能力があることを実証した（２５）。ある程度の臨床上のメリットも、臨床試験でこのアプローチを用いて実証された（２６）。これらの研究におけるｐ５３遺伝子は、カチオン・リポソーム又はアデノウイルスを利用して送達された。更に、肺癌患者への遺伝子送達ベクターを投与するのに利用された方法は、主にコンピュータ断層撮影誘導の経皮細針注射又は気管支鏡検査法を用いた腫瘍内注射を手段とした（２６，２７）。治療上の反応がある程度見られたものの、これらの方法はかなり侵襲性であった。
【００１０】
ほとんどの遺伝子トランスフェクションは気管支上皮に局在するため（１３）、ｐ５３発現の直接的な影響は気管支及び肺胞上皮に対するものである可能性が高く、肺のいずれかの部位の腫瘍成長に対しては潜在的に間接的な効果がある。９−ニトロカンプトセシンのエアゾール送達は、腫瘍成長に対して更に付加的な抑制効果を持つであろう。ｐ５３が腫瘍細胞をカンプトセシンの働きに対して感受性にすることができ、更に抗血管形成因子を調節することによるカンプトセシンとｐ５３遺伝子の両方の役割を考慮すると、ｐ５３と９−ニトロカンプトセシンの組み合わせは既存の肺転移の成長を抑えると考えられる。
【００１１】
本発明者等は、その技術において、遺伝子／抗癌薬物の組み合わせの連続的なエアゾール送達を用いて、既存の肺転移腫瘍のための改良された治療法の必要性を認識した。先行技術は、肺転移腫瘍の成長を抑制するために抗癌剤と共にｐ５３遺伝子を連続的に用いるための方法が欠けている点において不十分である。本発明は、本技術分野におけるこの長年のニーズと願望を実現するものである。
【発明の開示】
【００１２】
（発明の概要）
本発明の１つの実施の形態において、個体の肺転移の成長を抑制する方法が提供され、その方法はエアゾール化されたポリエチレンイミン−核酸複合体及びエアゾール化されたリポソーム−抗癌剤複合体を組み合わせて投与するステップからなり、前記ステップにおいて、核酸と抗癌剤の両方の送達によって前記個体内の肺転移の成長が抑制される。
【００１３】
本発明の別の実施の形態において、個体の肺転移の成長を抑制する方法が提供され、その方法はエアゾール化されたポリエチレンイミン−ｐ５３複合体及びエアゾール化されたジラウロイルホスファチジルコリン−９−ニトロカンプトセシン複合体を組み合わせて投与するステップからなり、前記ステップにおいて、ｐ５３と９−ニトロカンプトセシンの両方の送達によって前記個体内の肺転移の成長が抑制される。
【００１４】
本発明のその他の、そして更なる態様、特徴、便益及び利点は、開示の目的で提供される本発明の現在のところ望ましい実施の形態の以下の記述から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の１つの実施の形態において、個体の肺転移の成長を抑制する方法が提供され、その方法はエアゾール化されたポリエチレンイミン−核酸複合体及びエアゾール化されたリポソーム−抗癌剤複合体を組み合わせて投与するステップからなり、前記ステップにおいて、核酸と抗癌剤の両方の送達によって前記個体内の肺転移の成長が抑制される。
【００１６】
この実施の形態の１つの態様において、エアゾール化ポリエチレンイミン−核酸複合体及びエアゾール化されたリポソーム−抗癌剤複合体が同時に投与される。この実施の形態の別の態様において、ポリエチレンイミン−核酸複合体及びエアゾール化されたリポソーム−抗癌剤複合体が連続して投与される。この態様に関して更に、エアゾール化されたリポソーム−抗癌剤複合体が繰り返して投与されてもよい。これらすべての態様において、複合体の投与に用いられる組み合わせは、少なくとも１回繰り返されてもよい。
【００１７】
この実施の形態のすべての態様において、ポリエチレンイミン窒素対核酸リン酸の比率、又は窒素対リン酸の比率は約２：１から約５０：１、好適には約５：１から２０：１を用いることができる。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、触媒活性核酸、リボザイム、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、または修飾核酸であってもよい。上記核酸は、腫瘍抑制活性を示してもよい。本実施の形態のポリエチレンイミン核酸複合体に用いてもよいDNAの代表例は、ｐ５３遺伝子、ｐ５３の切断誘導体、ＣＤ１遺伝子、ＩＬ−１２、及びＩＮＦ−γである。リポソーム−抗癌剤複合体は、９−ニトロカンプトセシン、パクリタキセル、ドキソルビシン、カルボプラチン、メトトレキサート、ビンブラスチン、エトポシド、ドセタキセル・ヒドロキシウレア、フルオロウラシル、ブスルファン、メシル酸イマチニブ、アレンブズマブ、アルデスロイキン、及びシクロフォスファミドを含んでもよい。
【００１８】
ポリエチレンイミン核酸複合体は、窒素：リン酸の比率が５：１から２０：１、好ましくは１０：１である、エアゾール１０ｍｌあたり２ｍｇのｐ５３を含むポリエチレンイミン−ｐ５３複合体であってもよい。また、リポソーム−抗癌剤は、９−ニトロカンプトセシン：ＤＬＰＣの重量比率が約１：５０で、１ｍｌあたり約０．５ｍｇの９−ニトロカンプトセシンを含んでいるＤＬＰＣ−９−ニトロカンプトセシン・リポソームである。更に、ポリエチレンイミン核酸及びリポソーム−抗癌剤の複合体は、約３％から約７．５％の二酸化炭素を含んでなるエアゾールで投与されてもよい。
【００１９】
本発明の別の実施の形態において、ｐ５３と９−ニトロカンプトセシンの両方の送達によって個体内の肺転移の成長を抑制するように、エアゾール化されたポリエチレンイミン−ｐ５３複合体とエアゾール化されたジラウロイルホスファチジルコリン−９−ニトロカンプトセシン複合体を組み合わせて投与するステップを含んでなる、個体内の肺転移の成長を抑制する方法が提供される。ポリエチレンイミン−ｐ５３複合体とジラウロイルホスファチジルコリン−９−ニトロカンプトセシン複合体の投与量と配合及びその投与方法は、上記に開示したとおりである。。
【００２０】
下記の定義は、本明細書に開示された発明を容易に理解する目的で提供される。特に定義されない用語は、本技術分野の用語の一般的な意味に従って解釈される。
【００２１】
本明細書において、「個体」という用語は、動物又はヒトを意味する。
【００２２】
本明細書において、ＰＥＩ−核酸及びリポソーム抗癌剤の複合体のエアゾール送達によって個体内の肺転移の成長を抑制する方法が提供される。ｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、患者が既存の肺腫瘍を呈し、そのような疾患の治療がしばしば多種の診療を要するような臨床状態を、厳密に再現する。通常、ポリエチレンイミンは、腫瘍抑制活性を有する遺伝子からのＤＮＡなどの核酸との複合に利用され、例えば９−ニトロカンプトセシン、パクリタキセル、ドキソルビシン、カルボプラチンなどのリポソーム抗癌剤組成物との組み合わせ投薬において、連続的に又は同時に送達されてもよい。更に、核酸又は抗癌剤のいずれかが、異なる組み合わせによって２回以上投与されてもよい。
【００２３】
抗癌剤は更に、代謝拮抗剤、アルキル化剤、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシナーゼ抑制剤、インターロイキン−２−デリビターゼ（derivitase）、ナイトロジェンマスタード誘導体、及び葉酸拮抗剤などの抗腫瘍剤を特に含んでもよい。限定することなく、そのような物質の例は、それぞれドセタキセル・ヒドロキシウレア、ビンブラスチン又はエトポシド、フルオロウラシル又はブスルファン、メシル酸イマチニブ又はアレンブズマブ、アルデスロイキン、シクロフォスファミド、及びメトトレキサートである。
【００２４】
特にＰＥＩ−ｐ５３及び９−ニトロカンプトセシン−ジラウロイルホスファチジルコリンのエアゾール複合体は、いずれかの薬剤単独と比較すると、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマという難題に対して強力な治療反応を実現できる。肺の重量と腫瘍の負荷は、コントロールやｐ５３又は９−ニトロカンプトセシン単独と比較すると、ｐ５３と９−ニトロカンプトセシンの両方を用いて治療されたマウスにおいて著しく減少した。
【００２５】
更に、ｐ５３も９−カンプトセシンも単独では転移の成長を抑制したり腫瘍を持つマウスの生存を延ばすのに十分な効力がないとはいえ、連続して投与すれば、既存のＢ１６−Ｆ１０肺転移の成長を抑制するには、はるかに少ないｐ５３と９−ニトロカンプトセシンの投与量、すなわち、少なくとも約２倍少ない量が必要量となる。効果が確認された処方計画は、遺伝子の前に薬剤を使うより、９−ニトロカンプトセシン−ジラウロイルホスファチジルコリンによる治療の前のＰＥＩ−ｐ５３の送達を含む。リポソーム薬調剤の送達の結果、導入遺伝子発現レベルとＰＥＩ−ＤＮＡエアゾール送達の難治期間が減少することが考えられる。ｐ５３と９−ニトロカンプトセシンの連続的なエアゾール送達は、異なるコントロール・グループにおけるそれらの動物と比較すると、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマを持つマウスの平均生存時間において３０−４０％の増加をまねく。また、約３％−７．５％のＣＯ２を含む薬剤のエアゾール送達は、９−ニトロカンプトセシンの肺沈着及び薬物動態学の増加を導くことができる。
【００２６】
腫瘍抑制活性を持つその他の核酸は、本明細書に開示された抗癌化合物と組み合わせて使用することができる。ＰＥＩは、例えば、その他のＤＮＡ、ＲＮＡ、触媒活性核酸、リボザイム、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、又は修飾核酸と組み合わせてもよい。ＣＤ１遺伝子のような遺伝子を制限することなく、ｐ５３の切断誘導体、ＩＩ−１２、およびＩＮＦ−γは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗癌の可能性を示した。更に、腫瘍発現においてｐ５３によって調節される抗血管形成因子の役割は、肺のどの部位の腫瘍にも、恐らくは小細胞肺癌（ＳＣＬＳ）のようなｐ５３陽性腫瘍に対しても間接的に効果をもたらすことができるであろう。
【００２７】
以下の実施例は、本発明の種々の実施の形態を示す目的で提供されるが、いかなる意味でも本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００２８】
ＰＥＩ−ｐ５３複合体と９−ＮＣリポソームの調製
参考文献６に記載のとおり、ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体を調製した。ＮｅｏＢａｍ（Ｎｅｏ）はプラスミドを含んでいるｐ５３遺伝子のプラスミド・バックボーンであるが、ｐ５３遺伝子は含まない。ｐ５３複合体は、Ｎ：Ｐの比率を５：１で調製する；ポリエチレンイミン窒素：ＤＮＡリン酸の比率は、１μｇのＤＮＡが３ｎｍｏｌのリン酸を含み、０．１Ｍのポリエチレンイミン溶液１μｌが１００ｎｍｏｌのアミン窒素を含み、１０：１のＮ：Ｐの比率は１．２９：１のＰＥＩ：ＤＮＡ重量比率に対応することを考慮して計算することができる。９ＮＣ−ジラウロイルホスファチジルコリン・リポソームは、参考文献１０に記載の通りに調製する。
【実施例２】
【００２９】
Ｂ１６−Ｆ１０細胞増殖におけるｐ５３遺伝子及び９ＮＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果
組織培養プレートで培養されたＢ１６−Ｆ１０細胞（４８ウェル・プレートに２０，０００細胞／ウェル；１２ウェル・プレートに１×１０５細胞／ウェル）をＰＥＩ−ＤＮＡ複合体（１μｇ／ｍｌ；ｐ５３又はコントロールの空のプラスミド、Ｎｅｏ）で２４時間トランスフェクトする。次に培地をＰＢＳで洗浄し、トランスフェクション媒体を９−ニトロカンプトセシン−ジラウロイルホスファチジルコリン（１００ｎＭ）を含んでいる新しい媒体と交換した。２４時間後のＢ１６−Ｆ１０細胞の増殖を、血球計を用いて評価した。細胞を数えるため、上記細胞層をＰＢＳで洗浄した後に０．２５％トリプシンでトリプシン化した。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ検定（Ｔｒｅｋ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ）も実施して細胞の生存能力をテストした（データ図示せず）。
【００３０】
コントロール・グループは、遺伝子（ｐ５３及びＮｅｏｂａｍ）のみ、又は薬剤（９−ニトロカンプトセシン）のみ、あるいはＮｅｏｂａｍと９−ニトロカンプトセシンの組み合わせで処置した細胞などであった。単独物質又はポリエチレンイミン−ＮｅｏＢａｍと９−ニトロカンプトセシン−ジラウロイルホスファチジルコリンの組み合わせで処置された細胞と比較すると、ポリエチレンイミン−ｐ５３でトランスフェクトされ９−ニトロカンプトセシン−ジラウロイルホスファチジルコリンで処置されたＢ１６−Ｆ１０細胞の増殖におけるきわめて有意な減少が示された（図１）。更に、薬剤（＞０．５ｍｇ／ｍｌ）又はｐ５３プラスミド（＞２μｇ／ｍｌ）の濃度の増加は、単独物質としてＢ１６−Ｆ１０抑制の非常に強力な抑制を示し、同時に検査してもなんら相加効果は現れなかった（データ図示せず；８）。親細胞及びｐ５３処置済みＢ１６−Ｆ１０細胞におけるｐ５３発現レベルは、既に報告されている（８）。９−ニトロカンプトセシン＋ｐ５３の値は、他のグループと大きく異なる（ｐ＜０．０１；スチューデントｔ検定、両側）。
【実施例３】
【００３１】
Ｂ１６−Ｆ１０転移におけるｐ５３遺伝子及び９ＮＣのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７−８週齢、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）に、尾部血管から２５，０００個のＢ１６−Ｆ１０細胞を０日目に注入した。腫瘍細胞注入後１１日目より、腫瘍病巣が肺に十分定着して（図示せず）顕微鏡で見える大きさに成長したとき、９−ニトロカンプトセシン−ジラウロイルホスファチジルコリンを週に２回、及びＰＥＩ−ｐ５３エアゾール複合体を週に１回マウスに投与した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検査と同様、ｐ５３遺伝子を薬剤治療の前に送達した；週ごとの組み合わせ治療のため、ｐ５３を月曜日に投与し、９−ニトロカンプトセシンは火曜日と金曜日にエアゾール吸入させた。単独物質治療グループのマウスには、ｐ５３を週１回、又は９−ニトロカンプトセシンを週２回投与した。
【００３２】
治療のための投薬量は、ＰＥＩ：ＤＮＡ（Ｎ：Ｐ）比率１０：１のＤＮＡのエアゾール溶液１０ｍｌあたり２ｍｇのプラスミド、及び９−ニトロカンプトセシン：ジラウロイルホスファチジルコリン重量比率１：５０での濃度０．５ｍｇ／ｍｌの９−ニトロカンプトセシン５ｍｇであった。薬剤及び遺伝子のエアゾール送達は、肺への沈着が増加するように、空気中５％のＣＯ２を使用して実施した。腫瘍接種後２５日目に、マウスを致死させ、肺を処置して腫瘍指数を計算した。
【００３３】
図２Ａに示すように、他のすべてのグループと比較して、ｐ５３と９−ニトロカンプトセシンで治療されたマウスの腫瘍指数は著しく低く（ｐ＜０．００１）、一方、他のすべてのグループのマウスには多くの腫瘍の小結節があった。ｐ５３と９−ニトロカンプトセシンを組み合わせたグループのすべてのマウスには、非常に小さい個別的な腫瘍病巣があった（図２Ｂ、２Ｃ）。９−ニトロカンプトセシン−ジラウロイルホスファチジルコリン治療グループからの肺（図示せず）は、９−ニトロカンプトセシンとＰＥＩ−ＮｅｏＢａｍの組み合わせで見られたものと同様の大きさ及び形状であった。５％ＣＯ２のみでは、未治療マウスと比較して、腫瘍の成長に影響がなかった（データ図示せず）。
【００３４】
腫瘍指数は公式を使って計算した：腫瘍指数＝肺重量×当該グループの平均等級。コントロール・グループのほとんどの肺に数え切れないほど多くの病巣があったので、先に（８）で記述されたような１−５のスケールに基づいて肺を等級付けした；１  腫瘍病巣が１０個未満の場合、２  腫瘍病巣が１０−１００個の場合、３  １つの肺葉が腫瘍で満たされている場合、４  両方の肺葉が腫瘍で満たされている場合、及び５  肺が腫瘍で満たされ、腫瘍が肺の外に出て胸壁内にまで成長している場合。肺に隣接した腫瘍の成長は、肺の重量を測定する際には肺の一部とみなされた。値は平均値＋ＳＤである（１グループあたりｎ＝マウス１０匹）。
【００３５】
肺の重量はまた、９ＮＣ＋ｐ５３組み合わせグループと他のすべてのグループの間の著しい差異を示した（ｐ＜０．０１；スチューデントｔ検定、両側）（図２Ｄ）。偽接種（腫瘍なし）マウスの肺重量は、約０．１７ｇｍである。
【実施例４】
【００３６】
ＰＥＩ−ｐ５３／９ＮＣ−ＤＬＰＣ治療したＢ１６−Ｆ１０罹患マウスの生存
０日目に２５，０００個のＢ１６−Ｆ１０細胞を尾部血管からＣ５７ＢＬ／６マウス（１グループあたりｎ＝マウス１０匹）に注入し、上記腫瘍を１０日目まで定着させた。次に腫瘍細胞接種後１１日目からマウスを治療せずに放置；又はＰＥＩ−ｐ５３エアゾール複合体、９−ニトロカンプトセシン単独又はｐ５３と９−ニトロカンプトセシンの連続組み合わせ、又は９−ニトロカンプトセシンとＮｅｏＢａｍの組み合わせを受けさせた。ＮｅｏＢａｍをネガティブ・コントロールとして用いた。投与量は、単独の薬剤又は遺伝子で週に２回；そして組み合わせでは、遺伝子を週に１回と薬剤治療を週に２回であった。マウスを２週間治療し、その後時間をかけて生存を監視した。
【００３７】
図３に示すように、ｐ５３と９−ニトロカンプトセシンの両方で治療されたマウスの平均生存時間は、他のグループのマウスと比較して、３０−４０％増加した（９ＮＣ＋ｐ５３の３７±６日に対して、９−ニトロカンプトセシン単独で２９±３日、他のグループで２５±４日）。上記治療は十分許容された。更に、ｐ５３と９−ニトロカンプトセシンの組み合わせグループのマウスの約２０％は、腫瘍接種後５０日まで生存し、５２日目に解剖したところ腫瘍はなかった（肺に明らかな腫瘍病変がなかった）。各ステップは、指定された時点で死亡したマウスの数を示す。データは少なくとも２つの別個の実験の代表地である。９−ニトロカンプトセシン＋ｐ５３の値は、他のグループと著しく異なる（ｐ＜０．０５；マンホイットニー順位和検定）。
【実施例５】
【００３８】
ヒトＳＡＯＳ  ＬＭ−６骨肉腫におけるｐ５３遺伝子及び９ＮＣのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果
ｐ５３は、放射線治療と同様、パクリタキセルなど他の抗癌剤に対する感受性を腫瘍に持たせる可能性があると考えられる。ｐ５３治療と組み合わせたパクリタキセル（ＰＴＸ）の有効性が、ヒトＳＡＯＳ  ＬＭ−６骨肉腫異種移植マウス・モデルで検査される。免疫不全（ｎｕ／ｎｕ）マウスの尾部血管に静脈注射された１×１０６個のＳＡＯＳ  ＬＭ−６細胞は、マウスの体内で肺転移を形成する。上記腫瘍を、微少癌組織が転移するまで、８週間成長させた。上記のスケジュールにしたがって、治療を行ない、治療期間は８週間であった。次にマウスを致死させ、肺表面の腫瘍を数え、測定した。
【００３９】
抗癌効果を被治療及び未治療グループの間の肺重量の差によって評価した。治療のために腫瘍があまり成長しなかった肺の方が、腫瘍成長が抑制されなかった未治療マウスからの肺よりも軽かった（図４）。ｐ５３遺伝子治療と組み合わせたパクリタキセルは、相加効果よりも腫瘍抑制の方が大きいことを示した。ｐ５３単独とパクリタキセル単独は、同様の治療効果があった（データ図示せず）。
【００４０】
本明細書に引用される参考文献は以下の通り：
１．Lowe SW, Bodis S, McClachey A, et al. P53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo.Science 1994; 266:807-810.
２．Fujiwara T, Grimm EA, Mukhopadhyay T, et al. A retroviral wild-type p53 expression vector penetrates human lung cancer spheroids and inhibits growth by inducing apoptosis. Cancer Res 1993; 53(18):4129-33.
３．Horio Y, Hasegawa Y, Sekido Y, et al. Synergistic effects of adenovirus expressing wild-type p53 on chemosensitivity of non-small cell lung cancer cells. Cancer Gene Ther 2000; 7(4):537-44.
４．Koshikina NV, Gilbert BE, Waldrep JC, et al. Distribution of camptothecin after delivery as a liposome aerosol or following intramuscular injection in mice. Cancer Chemother Pharmacol 1999; 44(3):187-92.
５．Thierry AR, Lunardi-Iskandar Y, Bryant JL, et al. Systemic gene therapy; biodistribution and long-term expression of a transgene in mice. Proc Natl Acad Sci 1995; 92(21):9742-6.
６．Gautam A, Densmore CL, Xu B, and Waldrep JC. Enhanced gene expression in mouse lung after PEI-DNA aerosol delivery. Mol Ther 2000; 2(1):63-70.
７．Gautam A, Densmore CL, and Waldrep JC. Pulmonary cytokine responses associated with PEI-DNA aerosol delivery. Gene Ther 2001; 8:254-257.
８．Gautam A, Densmore CL, and Waldrep JC. Inhibition of experimental lung metastasis by aerosol delivery of PEI-p53 complexes. Mol Ther 2000; 2(4):318-323.
９．Densmore CL, Kleinerman E, Gautam A, et al. Growth inhibition of established human osteosarcoma lung metastases in mice by aerosol delivery of PEI-p53 complexes. Cancer Gene Ther 2001; 8(9):619-627.
１０．Koshkina NV, Kleinerman ES, Waldrep JC, et al. 9-Nitrocamptothecin liposome aerosol treatment of melanoma and osteosarcoma lung metastases in mice. Clin Cancer Res 2000; 6(7): 2876-80.
１１．Knight V, Koshkina NV, Waldrep JC, et al. Anticancer effect of 9-nitrocamptothecin liposome aerosol on human cancer xenografts in nude mice. Cancer Chemother. Pharmacol. 1999; 44(3):177-86.
１２．Koshkina NV, Knight V, Gilbert BE, et al. Improved respiratory delivery of the anticancer drugs, camptothecin and paclitaxel, with 5%CO2-enriched air: pharmacokinetic studies. Cancer Chemother Pharmacol 2001; 47:451:456.
１３．Gautam A, Densmore CL, Melton S, et al. Aerosol delivery of PEI-p53 complexes inhibits B16-F10 lung metastases through regulation of angigenesis. Cancer Gene Therapy, 2001; In press.
１４．Murren JR, Anderson S, Fedele J, et al. Dose-escalation and pharmacodynamic study of topotecan in combination with cyclophosphamide in patients with refractory cancer. J Clin Oncol 1997; 15(1):148-57.
１５．Lebedeva S, Bagdasarova S, Tyler T, et al. Tumor suppression and therapy sensitization of localized and metastatic breast cancer by adenovirus p53. Hum Gene Ther 2001; 12(7): 763-72.
１６．Cummings J, Smyth JF. DNA topoisomerase I and II as targets for rational design of new anticancer drugs. Ann Oncol 1993; 4(7):533-43.
１７．Liu W, Zhang R. Upregulation of p21WAF1/CIP1 in human breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-468 undergoing apoptosis induced by natural product anticancer drugs 10-hydroxycamptothecin and camptothecin through p53-dependent and independent pathways. Int J Oncol 1998; 12(4):793-804.
１８．Nieves-Neira W, Pommier Y. Apoptotic response to camptothecin and 7-hydroxystaurosporine (UCN-01) in the 8 human breast cancer cell lines of the NCI Anticancer Drug Screen: multifactorial relationships with topoisomerase I, protein kinase C, Bcl-2, p53, MDM-2 and caspase pathways. Int J Cancer 1999; 82(3):396-404.
１９．Kalechman Y, Strassman G, Albek M, and Sredni B. Up-regularion by ammonium trichloro(dioxoethylene-0,0') tellurate (AS101) of Fas/Apo-l expression on B16 melanoma cells: implications for the antitumor effects of AS101. J, Immunol 1998; 161(7):3536-42.
２０．Hanrahan D, and Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell 1996; 86(3):353-64.
２１．Clements MK, Jones CB, Cumming M, Daoud SS. Antiangiogenic potential of camptothecin and topotecan. Cancer Chemother Pharmacol 1999; 44(5):411-6.
２２．O'Leary JJ, Shapiro RL, Ren CJ, et al. Antiangiogenic effects of camptothecin analogues 9-amino-20(S)-camptothecin, topotecan, and CPT-11 studied in the mouse cornea model. Clin Cancer Res 1999; 5(1):181-7.
２３．Zhang L, Yu D, Hu M, et al. Wild-type p53 suppresses angiogenesis in human leiomyosarcoma and synovial sarcoma by transcriptional suppression of vascular endothelial growth factor expression. Cancer Res 2000: 60(13):3655-61.
２４．Dameron KM, Volpert OV, Tainsky MA, Bouck N. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1.Science 1994; 265(5178):1582-4.
２５．Fujiwara T, Grimm EA, Mukhopadhyay T, et al. Induction of chemosensitivity in human lung cancer cells in vivo by adenovirus-mediated transfer of the wild-type p53 gene. Cancer Res 1994; 54(9):2287-91.
２６．Nemunaitis J, Swisher SG, Timmons T, et al. Adenovirus-mediated p53 gene transfer in sequense with cisplatin to tumors of patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology 2000: 18(3): 609.
２７．Swisher SG, Roth JA, Nemunaitis J, et al. Adenovirus-mediated p53 gene transfer in advanced non-small-cell lung cancer. J Natl Cancer Inst 1999; 91(9):763-71.
２８．Knight, V., et al. Cancer Chemotherapy Pharmacology 44:177-186 (1999))
【００４１】
本明細書に記載されるいずれの特許又は刊行物も、本発明に関する当業者のレベルを示すものである。更に、これらの特許及び刊行物は、個々の刊行物が参照によって具体的に個別にあたかも組み込まれるかのように、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４２】
当業者であれば、本発明が、本明細書に固有のものと同様に、目的を実行し、述べられた結果と利点を獲得するために、十分適していることを理解するであろう。本実施例、ならびに本明細書記載の方法、手順、処置、分子、及び特定の化合物は、現在のところ好ましい実施の形態の代表例であり、典型例であり、発明の範囲の限定として意図されたものではない。特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神に含まれるその変更及びその他の利用は、当業者によって想起されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
上記に明示される本発明の特徴、利点及び目的が達成され、詳細に理解され得るように、本発明のより具体的な説明を簡単に要約する。上記の詳細は、添付図面に示される本発明の特定の実施の形態を参照して得ることができる。これらの図面は、本明細書の一部を構成する。ただし、添付図面は本発明の望ましい実施の形態を示すものであり、従ってその範囲を限定することを意図したものではない。
【図１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢ１６−Ｆ１０細胞増殖に対するｐ５３及び９−ニトロカンプトセシンの影響を示す図である。
【図２Ａ】図２は既存のＢ１６−Ｆ１０肺転移の成長に対するｐ５３及び９−ニトロカンプトセシンの組み合わせの影響を示す図であり、図２において、、図２Ａは、腫瘍指数を、コントロール及びPEI：ｐ５３−及び／又は９−ニトロカンプトセシンで処理したＢ１６−Ｆ１０肺転移と比較する図である。値は中間値＋ＳＤである（１グループあたりｎ＝マウス１０匹）。
【図２Ｂ】未処置（上列）、ｐ５３（中列）、及び９−ニトロカンプトセシンとｐ５３の組み合わせ（下列）で処置されたマウスの典型的な肺を示す（１グループあたりｎ＝マウス１０匹）。
【図２Ｃ】未処置（上列）、９−ニトロカンプトセシンとＮｅｏｂａｍ（中列）、及び９−ニトロカンプトセシンとｐ５３（下列）の組み合わせで処置されたマウスの典型的な肺を示す（１グループあたりｎ＝マウス１０匹）。データは少なくとも２つの個別の実験の代表値である。
【図２Ｄ】異なるグループからのマウスの肺の重量を示す。値は中間値＋ＳＤである（１グループあたりｎ＝マウス１０匹）。
【図３】ＰＥＩ−ｐ５３エアゾール複合体で処置されたマウス（１グループあたりｎ＝マウス１０匹）の生存時間を示す図である。データは少なくとも２つの個別の実験の代表値である（ｐ＜０．０５；マンホイットニー順位和検定）。
【図４】コントロール及びＰＥＩ：ｐ５３及び／又はＰＴＸで処置されたＬＭ−６骨肉腫肺転移における、腫瘍の大きさと腫瘍病巣の数を比較する図である。
【図１】
2005522454.tif 000002
【図２Ａ】
2005522454.tif 000003
【図２Ｂ】
2005522454.tif 000004
【図２Ｃ】
2005522454.tif 000005
【図２Ｄ】
2005522454.tif 000006
【図３】
2005522454.tif 000007
【図４】
2005522454.tif 000008
【国際調査報告】
2005522454.tif 000009