(57)【要約】【課題】  ヒト個体の表現型を迅速かつ簡単に決定する方法の提供。【解決手段】    本発明は、１種以上のプローブ化合物を用いて、ＮＭＲ分析の前にプローブ化合物中に存在するＮＭＲ活性核種の核分極を高めて（以下、「過分極」という。）、インビボでのタンパク質活性を測定することによって表現型を分類する方法に関する。過分極化は、好ましくは、希ガスからの分極移動、ブルートフォース、動的核分極（ＤＮＰ）又はスピン凍結によって実施される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボでタンパク質活性を測定してヒト個体の特性を得ることを含むヒト個体の表現型を分類する方法であって、上記測定が、
ａ）１種以上のＮＭＲ活性核種を含有する１種以上のプローブ化合物を事前投与しておいたヒト個体から採取した試料のＮＭＲ活性核種を過分極させる工程、及び
ｂ）上記試料をＮＭＲ分光法で分析する工程、
を含んでなる方法。
【請求項２】
１種以上のＮＭＲ活性核種を含有する１種のプローブ化合物を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
１種以上のＮＭＲ活性核種を含有する１種以上のプローブ化合物を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
数種のタンパク質又はイソ酵素の活性を測定してヒト個体の一組の特性を得る、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
当該方法を数人のヒト個体で実施して数人のヒト個体の特性を得る、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
同一又は類似の特性を示すヒト個体を分類する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ある臨床試験群の表現型を分類するための、請求項６記載の方法。
【請求項８】
好ましくは請求項６の方法で得たヒト個体の特性を他のヒト個体の特性と比較してヒト個体を分類する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ヒト個体が薬物治療を受ける前にヒト個体の表現型を分類するための、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
１種以上のプローブ化合物がＮＭＲ活性核種で濃縮されている、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
過分極化を希ガスからの分極移動、ブルートフォース、動的核分極（ＤＮＰ）又はスピン凍結によって実施する、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載。
【請求項１２】
採取する試料が生体液である、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
測定すべきタンパク質活性が、ＮＡＤＰＨキノンオキシドレダクターゼ、ＣＹＰ４５０、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、チオメチルトランスフェラーゼ、チオプリンメチルトランスフェラーゼ、偽コリンエステラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、セロトニン輸送タンパク質、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）及びＰ糖タンパク質からなる群から選択されるタンパク質の活性である、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
１種以上のプローブ化合物がシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）に対する基質、誘発物質又は阻害物質である、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
１種以上のプローブ化合物が、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ８／９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１及びＣＹＰ３Ａ４からなる群から選択される１種のＣＹＰ４５０イソ酵素に対する基質、誘導物質又は阻害剤である、請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
１種以上のプローブ化合物が、フェナセチン、クマリン、トルブタミド、フェニトイン、メフェニトイン、Ｓ−メフェニトイン、ブフラロール、クロルゾキサゾン、ミダゾラム、カフェイン、ダプソン、ジクロフェナク、デブリソキン、ブプロピオン、アンチピリン、デキストロメトルファン、ワルファリン、ジアゼパム、アルプラゾラム、トリアゾラム、フルラゼパム、クロルジアゼポキシド、テオフィリン、フェノバルビタール、プロプラノロール、メトプロロール、ラベタロール、ニフェジピン、ジギトキシン、キニジン、メキシレチン、リドカイン、イミプラミン、フルルビプロフェン、オメプラゾール、テルフェナジン、フラフィリン、コデイン、ニコチン、スパルテイン、エリスロマイシン、ベンゾイルコリン、ブチリルコリン、パラオクソン、ｐ−アミノサリチル酸、イソニアジド、スルファメタジン、５−フルオロウラシル、ｔｒａｎｓ−スチルベンオキシド、Ｄ−ペニシラミン、カプトプリル、イポメアノール、シクロホスファミド、ハロセン、ジドブジン、テストステロン、アセトアミノフェン、ヘキソバルビタール、カルバマゼピン、コルチゾール、オルチプラズ、シクロスポリンＡ及びパクリタキセルからなる群から選択される、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ化合物を使用してインビボでのタンパク質活性を測定し、ＮＭＲ分析前にプローブ化合物に存在するＮＭＲ活性核種の核分極を高めること（以下、「過分極」という。）によって表現型を分類する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体が薬物を吸収、輸送、分解（代謝）し、最終的に生体から除去する能力は、特定の生体又は個体において薬物がいかによく効くかということに極めて重要である。新薬の臨床試験のみならず、薬物の治療効果には、ヒト個人又はヒト集団における薬物の動態に関する理解を高めることが重要である。そこで、集団を生物学的特性及び挙動の類似した個体群に分類する試みがなされている。この試みは表現型分類（phenotyping）として知られる。本発明に関しては、表現型とは以下の３通りの方法：ｉ）生体の遺伝子型とその生体が存在する環境との相互作用によって決定される生体の観察可能な機能的及び構造的特性の全体；ii）上記の通り決定される生体の特性又は特性の集合；及びiii）かかる特性の集合が一致する生体群、のいずれかで定義される。
【０００３】
ヒト集団における新薬の臨床試験は費用と時間のかかるプロセスである。医薬品と目された薬物が後で失敗すると、開発企業の収益性に多大な影響を与えるし、一般市場に送り出した後で医薬品を回収することは、製薬会社の評価と評判にさらに深刻な打撃を与える。そのため、臨床試験群の表現型分類は、個体が新薬に対して如何に有益に又は不都合に反応するかを理解する上で多大な潜在的価値をもつ。臨床試験に特定の表現型のボランティア患者を用いると、臨床フェーズＩ及びIIのプロトコールの設計が容易になり、治験時の臨床データの解釈及び潜在的な副作用を減らすことができる。
【０００４】
薬物の治療効果は、個体が投与された薬品に反応するか否か、また如何に反応するかに依存する。治療薬がどの程度代謝されるかによって、個体を治療薬の高代謝群、正常代謝群又は貧代謝群として特徴付けることができるであろう。
【０００５】
正常代謝群では、定常状態の薬物レベルが期待される治療範囲内にあり、毒性作用は存在しないが、高代謝群では、定常状態の薬物レベルが治療量未満であり、薬物作用は全くもたらされない。貧代謝群では定常状態の薬物レベルが期待値よりも高くなり、そのため、こうした個体は薬物の不都合な毒性その他の有害作用を受けやすい。従って、薬物治療を受ける個体の表現型分類は、個体が特定の薬品及び薬品投与量にどのように反応するかを理解するのに有益であり、最適な治療結果を達成するのに適した薬品及び薬品投与用量を決定するのに役立つ可能性がある。
【０００６】
ヒト又はヒト以外の生物体における薬物分子の代謝と輸送は、ある種のタンパク質、例えば酵素又は輸送タンパク質によって支配される。こうしたタンパク質の活性の測定を、個体の表現型分類に使用することができる。シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）は薬物代謝に重要な役割を演じる。オキシダーゼのＣＹＰ４５０スーパーファミリーのメンバーは共通の触媒メカニズムを示すが、個々のイソ酵素は異なる基質特異性を有する。ＣＹＰ４５０イソ酵素の多様性を評価するには、異なるＣＹＰ４５０イソ酵素の基質として作用する数種のプローブ化合物を用いて、代謝を研究するのがよい。
【０００７】
Ｒ．Ｊ．  Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  １３，  １９９９，  ２３０５−２３１９には、多数のプローブ薬物の「カクテル」を使用し、ヒトの尿又は血漿試料に酵素β−グルクロニダーゼを加え、カクテルのインビトロ代謝を研究したと記載されている。反応後、試料は固相抽出法で後処理され、液体クロマトグラフィー及び質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）で分析される。この方法の短所は試料の後処理に時間がかかることである。さらに、固相抽出後のプローブ薬物とその代謝物の回収率が低下するため、少量の代謝物を検出するのが難しくなりかねない。別の欠点は、方法自体を僅かでも変更するにはその妥当性を注意深く確認する必要があることである。
【０００８】
国際公開第００／３５９００号パンフレットでは、フェノール系色素を含む数種のプローブ薬物が、ＣＹＰ４５０イソ酵素の活性のインビトロスクリーニングアッセイ用の光学プローブ又はセンサーとして使用されている。この方法の短所は色素の添加が代謝分解に影響する可能性があることである。さらに、光学測定は、例えば、色素の漏出、色素の区分化又はシグナルの消光などのため十分な特異性をもたないおそれがある。この方法は潜在的な薬物間相互作用の指標を与えるが、真のインビボの状況からはかけ離れている。そのため、この方法は初期スクリーニング法としてしか用いることができない。
【０００９】
Ｋ．  Ａｋｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｐｏｓ  ２９，  ２００１，  ９０３−９０７には、13Ｃ−ＮＭＲ分光法を用いて何種類かのＣＹＰ４５０イソ酵素を評価するためのインビボプローブとして13Ｃ−標識アンチピリンを使用することが記載されている。従来の13Ｃ−ＮＭＲ分光法の感度が低いため、患者に薬の副作用を起しかねないほど大量にプローブ薬物を投与しなければならない。
【００１０】
国際公開第０１／９６８９５号パンフレットには、ＮＭＲ分析の前に試験化合物に存在するＮＭＲ活性核種の核分極（過分極）を促進することによって、生物システム中の試験化合物の運命に関して、情報を得るための方法を記述している。
【特許文献１】国際公開第００／３５９００号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／９６８９５号パンフレット
【非特許文献１】Ｒ．Ｊ．  Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  １３,  １９９９，  ２３０５−２３１９
【非特許文献２】Ｋ．  Ａｋｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｐｏｓ  ２９，  ２００１，  ９０３−９０７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで、ヒト個体の表現型を迅速かつ簡単に決定する方法に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、インビボでタンパク質活性を測定してヒト個体の特性を得ることを含むヒト個体の表現型を分類する方法であって、上記測定が、
ａ）１種以上のＮＭＲ活性核種を含有する１種以上のプローブ化合物を事前投与しておいたヒト個体から採取した試料のＮＭＲ活性核種を過分極させる工程、及び
ｂ）上記試料をＮＭＲ分光法で分析する工程、
を含んでなる方法を提供する。
【００１３】
本発明に関して、「タンパク質」とは、その活性が、当該タンパク質の基質、誘導物質又は阻害剤などとして働くプローブ化合物の影響を受け得るすべてのタンパク質を意味する。好ましいタンパク質は、酵素及び輸送タンパク質、例えば、ＮＡＤＰＨキノンオキシドレダクターゼ、ＣＹＰ４５０、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、チオメチルトランスフェラ−ゼ、チオプリンメチルトランスフェラーゼ、偽コリンエステラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、セロトニン輸送タンパク質、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）及びＰ糖タンパク質である。特に好ましい実施形態では、ＣＹＰ４５０の活性を測定する。
【００１４】
本発明の方法では、１種以上のタンパク質（＝数種のタンパク質）又はイソ酵素の活性を測定し得る。好ましい実施形態では、１種のタンパク質の活性を測定して、ヒト個体の特性を得る。別の好ましい実施形態では、数種のタンパク質又はイソ酵素の活性を測定して、ヒト個体の１組の特性を得る。
【００１５】
工程ｂ）で得られたデータは、様々な方法、例えば尿又は血漿のような生体液からプローブ化合物が時間経過に伴って消失する速度を測定することによってタンパク質活性を測定するのに使用できる。これは困難で時間のかかる作業であるので、選定した１以上の時点でプローブ化合物とそれらの代謝物との比（代謝比）を計算するのが好ましい。
【００１６】
本発明の別の態様は、インビボでのタンパク質活性を測定してヒト個体の特性を得ることを含むヒト個体の表現型を分類する方法であって、上記測定が、
ａ）１種以上のＮＭＲ活性核種を含有する１種以上のプローブ化合物をヒト個体に投与する工程、
ｂ）上記ヒト個体から試料を採取する工程、
ｃ）上記試料のＮＭＲ活性核種を過分極させる工程、及び
ｄ）上記試料をＮＭＲ分光法で分析する工程
を含んでなる方法である。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、インビボのタンパク質活性を測定してヒト個体の特性を得ることを含むヒト個体の表現型を分類する方法であって、上記測定が、
ａ）１種以上のＮＭＲ活性核種を含有する１種以上のプローブ化合物を選択する工程、
ｂ）上記プローブ化合物をヒト個体に投与する工程、
ｃ）上記ヒト個体から試料を採取する工程、
ｄ）上記試料のＮＭＲ活性核種を過分極させる工程、及び
ｅ）上記試料をＮＭＲ分光法で分析する工程
を含んでなる方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
好ましくは、本発明の方法でヒト個体に事前投与される又は本発明の方法で投与されるプローブ化合物とそれから誘導される代謝物は、プローブ化合物とその代謝物が明瞭に識別できるように、十分に離散したＮＭＲスペクトルを示す。さらに、プローブ化合物は安全で入手可能なものであるべきである。さらに、ヒト個体から採取した種類の異なる試料、特に尿や血漿のような種類の異なる生体液中でプローブ化合物及びその代謝物を分析できれば好ましい。
【００１９】
１種以上のプローブ化合物の選択は、どのようなタンパク質活性を測定するかによって決まる。そこで、本発明の方法では、１種以上のプローブ化合物を事前投与に用いてもよいし、投与してもよい。２種以上のプローブ化合物（すなわち、数種のプローブ化合物）を使用する場合、本発明の方法は毎回プローブ化合物を１種類ずつ使用して繰返し実施してもよいし、或いは数種のプローブ化合物を１回で、例えば数種のプローブ化合物の混合物として使用して実施してもよい。２種以上のプローブ化合物を使用する場合、好適には３種以上のプローブ化合物、さらに好適には４種以上のプローブ化合物、さらに好ましくは７種以上のプローブ化合物を使用する。
【００２０】
本発明の方法で対処する酵素ファミリーがＣＹＰ４５０である場合、各種イソ酵素に対して可能なプローブ化合物が多数知られている（例えば、Ｒ．Ｊ．  Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  １３，  １９９９，  ２３０５−２３１９；  Ｒ．Ｆ．  Ｆｒｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ６２，  １９９７，  ３６５参照）。プローブ化合物は、好ましくは上述の観点に即して選択される。
【００２１】
好適には、プローブ化合物は、ＣＹＰ４５０、好ましくはＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８／９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１及びＣＹＰ３Ａ４からなる群から選択されるＣＹＰ４５０イソ酵素に対する基質、誘導物質又は阻害剤である。
【００２２】
好ましくは、ＣＹＰ４５０活性を測定するためのプローブ化合物は、フェナセチン、クマリン、トルブタミド、フェニトイン、メフェニトイン、Ｓ−メフェニトイン、ブフラロール、クロルゾキサゾン、ミダゾラム、カフェイン、ダプソン、ジクロフェナク、デブリソキン、ブプロピオン、アンチピリン、デキストロメトルファン、ワルファリン、ジアゼパム、アルプラゾラム、トリアゾラム、フルラゼパム、クロルジアゼポキシド、テオフィリン、フェノバルビタール、プロプラノロール、メトプロロール、ラベタロール、ニフェジピン、ジギトキシン、キニジン、メキシレチン、リドカイン、イミプラミン、フルルビプロフェン、オメプラゾール、テルフェナジン、フラフィリン、コデイン、ニコチン、スパルテイン、エリスロマイシン、ベンゾイルコリン、ブチリルコリン、パラオクソン、ｐ−アミノサリチル酸、イソニアジド、スルファメタジン、５−フルオロウラシル、ｔｒａｎｓ−スチルベンオキシド、Ｄ−ペニシラミン、カプトプリル、イポメアノール、シクロホスファミド、ハロセン、ジドブジン、テストステロン、アセトアミノフェン、ヘキソバルビタール、カルバマゼピン、コルチゾール、オルチプラズ、シクロスポリンＡ及びパクリタキセルからなる群から選択される。
【００２３】
特に好ましくは、ＣＹＰ４５Ｏ活性を測定するためのプローブ化合物は、フェナセチン、クマリン、トルブタミド、メフェニトイン、Ｓ−メファニトイン、ブフラロール、クロルゾキサゾン、ミダゾラム、カフェイン、ダプソン、ジクロフェナク、デブリソキン、ブプロピオン、アンチピリン及びデキストロメトルファンからなる群から選択される。
【００２４】
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を測定しようとする場合、好ましいプローブ化合物は、スルファチアゾール、ダプソン、イソニアジド、スルファメトキサゾール、ヒドラザリン、カフェイン及びプロカインアミドからなる群から選択される。
【００２５】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ活性を測定しようとする場合、好ましいプローブ化合物は、フェノバルビタール、オルチプラズ及び３−メチル−コラントレンからなる群から選択される。
【００２６】
チオプリンメチルトランスフェラーゼ活性を測定しようとする場合、好ましいプローブ化合物はアザチオプリン、メルカプトプリン及びチオグアニンからなる群から選択される。
【００２７】
チオメチルトランスフェラーゼ活性を測定しようとする場合、好ましいプローブ化合物は、カプトプリル及びペニシラミンからなる群から選択される。
【００２８】
ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ活性を測定しようとする場合、好ましいプローブ化合物はビリルビン及びバルビツレートからなる群から選択される。
【００２９】
Ｐ糖タンパク質活性を測定しようとする場合、好ましいプローブ化合物はパクリタキセルのような制癌剤及びシクロスポリンＡのような免疫抑制剤からなる群から選択される。
【００３０】
事前投与又は投与に用いられるプローブ化合物は１種以上のＮＭＲ活性核種、すなわち、ゼロ以外の核スピンをもつ核種を含む。好ましい核種は13Ｃ、15Ｎ、31Ｐ、19Ｆ及び／又は1Ｈである。同位体濃縮プローブ化合物を使用することができる。非濃縮プローブ化合物を使用する場合、31Ｐ、19Ｆ及び／又は1Ｈのように天然に豊富に存在する核種を含むプローブ化合物が好ましく使用される。ただし、同位体濃縮はプローブ化合物の治療効果に実質的に影響せず、ＮＭＲでの検出を大幅に向上させるので、事前投与又は投与には、同位体濃縮プローブ化合物、好ましくは非放射活性同位体濃縮プローブ化合物を使用するのが好ましい。
【００３１】
濃縮は、プローブ化合物分子内の１以上の部位の選択的濃縮でもよいし、すべての部位の均一な濃縮でもよい。好ましくは、事前投与又は投与に用いられるプローブ化合物は分子の１箇所の部位だけで同位体濃縮される。濃縮は化学合成又は生物学的標識によって達成し得る。好適には、本発明の方法に用いられるプローブ化合物は、分子の１箇所だけの位置で１０％以上、最も好適には２５％以上、好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上、理想的には１００％に近い濃縮度で同位体濃縮された有機化合物である。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、プローブ化合物は13Ｃ及び／又は15Ｎ、好ましくは13Ｃ又は15Ｎが濃縮された化合物であるが、特に好ましくは高感度で標識の選択の幅が広いことから13Ｃが濃縮された化合物である。さらに好ましい実施形態では、すべてのプローブ化合物は同じＮＭＲ活性核種が濃縮される。従って、１回のＮＭＲ分析で情報を集めることが可能である。
【００３３】
プローブ化合物における最適な同位体濃縮の位置は、ＮＭＲ核種の緩和時間によって左右される。好ましくは、プローブ化合物はＴ１緩和時間の長い位置で同位体濃縮される。好ましい実施形態では、カルボキシル、カルボニル又は第四Ｃ原子で濃縮された13Ｃ濃縮プローブ化合物を事前投与又は投与に用いる。さらに、プローブ化合物は、好ましくは、代謝の際に構造変化の起こる分子の位置で同位体濃縮される。こうすると、プローブ化合物とその代謝物とのケミカルシフトの差が大きくなり、離散したＮＭＲスペクトルを与える。２箇所以上の位置で標識すると、複雑なＮＭＲスペクトルの解釈が容易になる。
【００３４】
１種以上以上のプローブ化合物の事前投与又は投与は、様々な方法で実施し得る。プローブ化合物は、好ましくは、ヒト個体への投与に関して使用することができる溶媒又は混合溶媒、すなわち生理的に許容される溶媒又は混合溶媒に溶解又は分散させる。撹拌、バブリング、振盪、ボルテックス又は超音波処理のような通常の混合手段を利用できる。別の実施形態では、固体プローブ化合物を事前投与又は投与に使用する。
【００３５】
事前投与又は投与に２種以上のプローブ化合物を使用する場合、プローブ化合物は順次投与してもよいし、或いはプローブ化合物の混合物として投与することもできる。
【００３６】
プローブ化合物を混合物として投与する場合、プローブ化合物を混合した後溶媒又は溶媒混合液に溶解又は分散させ、これを直接投与に使用することもできるし、或いは投与前にさらに処理してもよい。別法として、各プローブ化合物又はプローブ化合物の一部をまず溶媒又は溶媒混合液に溶解又は分散させた後、溶解／分散プローブ化合物の混液を調製する。適度な混合を達成するには、撹拌、バブリング、振盪、ボルテックス又は超音波処理のような通常の混合手段を用いる。別の実施形態では、固体プローブ化合物の混合物を準備する。
【００３７】
事前投与／投与のため、プローブ化合物は、好ましくは通常の医薬又は動物薬の投与形態に製剤化される。プローブ化合物を溶液として投与する場合には、例えば水のような水性媒体中の懸濁液、分散液、スラリーなどの形態とし得る。固形プローブ化合物を投与する場合には、錠剤又は粉末の形態とし得る。
【００３８】
事前投与／投与のためのプローブ化合物はさらに医薬的に許容し得る希釈剤、賦形剤及び製剤助剤、例えば安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤又はｐＨ調整剤などを含んでいてもよい。注射用には、プローブ化合物の無菌溶液又は懸濁液が最も好ましい。非経口投与には、好ましくは等張性又は幾分高張のキャリア媒体が好ましい。
【００３９】
プローブ化合物は、好ましくは、脈管系に投与するか、或いは器官もしくは筋組織に直接投与するか、皮下投与する。別の好ましい実施形態では、プローブ化合物は、経皮、鼻腔、舌下などの非経口経路、又は例えば口腔から胃腸管などの体腔に投与される。
【００４０】
本発明の方法の感度のため治療量未満での投与が可能であり、そのためプローブ化合物の副作用のリスクは大きく低減される。従って、事前投与又は投与の用量は、好適には、治療量又は治療量未満であり、治療量未満の投与量が好ましい。
【００４１】
「試料」という用語は単一又は複数の試料を意味する。試料の採取は１回だけ、間欠的に又は連続的（動的研究）に実施し得る。
【００４２】
採取し得る試料としては、組織もしくは細胞試料、糞便、生体液（例えば、特に限定されないが、血液、血漿、リンパ液、尿、精液、母乳、脳脊髄液、汗、涙液もしくは耳下腺分泌液、洗浄液など）が挙げられる。好ましくは、採取する試料は生体液、特に好ましくは血液、血漿又は尿である。
【００４３】
ＣＹＰ４５０イソ酵素のインビボ活性の測定に本発明の方法を用いる場合、採取する試料は好ましくは血液、血漿及び尿である。
【００４４】
採取した試料は、例えば液相からの細胞の分離など、さらに処理してもよい。例えば、血液を処理して血漿を得てもよい。試料は、過分極及び／又は分析の前に精製してもよいが、常に精製が必要というわけではない。本発明の方法の重要な利点は、分画、精製又は濃縮工程を必要とせずに、粗製試料でそのまま分析できることである。
【００４５】
プローブ化合物の消失速度の計算によってタンパク質活性を求める場合、過分極化前の試料に対照標準を加えてもよい。標準を加えると、プローブ化合物とその代謝物の濃度を求めることができる。好ましくは、１種類の標準を加える。適当な標準は、プローブ化合物及びそれらの代謝物由来のシグナルに干渉しないシグナルを含む単純な分子である。好ましい標準は１種類のシグナルのみを含む。簡便には、過分極前に、化学シフトの対照を試料に加える。
【００４６】
ＮＭＲ活性核種を過分極させる方法は幾つかあるが、好ましい方法は希ガスからの分極移動、「ブルートフォース」、ＤＮＰ及びスピン凍結であり、以下、これらについて説明する。
【００４７】
本発明においてプローブ化合物を含むＮＭＲ活性核種を過分極させる好ましい方法は、過分極した希ガスからの分極移動である。ゼロ以外の核スピンをもつ希ガスは過分極させることができ、例えば円偏光の使用によってその分極を平衡分極を超えるように高めることができる。本発明に従ってプローブ及び／又は試験化合物中に存在するＮＭＲ活性核種の過分極を起こすのに、過分極希ガス、好ましくは3Ｈｅ又は129Ｘｅ或いはかかるガスの混合物を用いることができる。過分極は、人工的に濃縮した過分極希ガス、好ましくは3Ｈｅ又は129Ｘｅを用いることによっても達成し得る。過分極ガスは気相として存在してもよいし、液体に溶解してもよいし、或いは過分極ガス自体が溶媒として作用するものでもよい。別法として、ガスを冷却固体表面に凝縮させ、その形態で使用してもよいし、或いは昇華させてもよい。これらの方法のいずれも、必要とされる過分極ガスと標的との密接な混合を起こすことができる。場合によっては、リポソーム又は微小気泡で過分極希ガスを封入してもよい。
【００４８】
本発明においてプローブ化合物を含むＮＭＲ活性核種を過分極させる別の好ましい方法は、極低温及び高磁場での熱力学的平衡によってＮＭＲ活性核種を分極させることである。ＮＭＲ分光計の動作磁場及び温度と比べて、過分極は極高磁場及び極低温（ブルートフォース）の使用によって影響される。用いる磁場強度はできるだけ高くすべきであり、好適には１Ｔより高く、好ましくは５Ｔより高く、さらに好ましくは１５Ｔ以上とし、特に好ましくは２０Ｔ以上とする。温度は極めて低くすべきであり、例えば、４.２Ｋ以下、好ましくは１.５Ｋ以下、さらに好ましくは１.０Ｋ以下、特に好ましくは１００ｍＫ以下とする。
【００４９】
本発明においてプローブ化合物を含むＮＭＲ活性核種を過分極させる別の好ましい方法は、ＤＮＰ（動的核分極）剤によって達成されるＤＮＰ法である。ＤＮＰメカニズムには、オーバーハウザー効果、いわゆる固体効果及び熱混合効果がある。例えばクロム（Ｖ）イオンのような遷移金属、マグネシウム（II）イオン、ニトロオキシドラジカル及びトリチルラジカルのような有機フリーラジカル（国際公開第９８／５８２７２号パンフレット）又は付随自由電子をもつ他の粒子など、大半の公知の常磁性化合物は、ＤＮＰ剤として使用し得る。好ましくは、低緩和性のラジカルをＤＮＰ剤として使用する。ＤＮＰ剤が常磁性フリーラジカルである場合、ラジカルは、分極直前のラジカル生成工程によって安定なラジカル前駆体からその場で簡便に調製し得るし、別法として電離放射線の使用によって簡便に調製し得る。ＤＮＰプロセスでは、エネルギーを通常はマイクロ波放射線の形態で与え、これによって最初に常磁性種を励起させる。基底状態に減衰する際に、目標物質のＮＭＲ活性核種への分極の移動がある。この方法では極低温で中程度又は高い磁場を利用でき、例えば液体ヘリウム中約１Ｔ以上の磁場でＤＮＰプロセスを実施できる。別法として、所望の研究が実施できるように十分なＮＭＲの増大が達成される温度及び中程度の磁場を使用し得る。この方法は、分極磁場を提供するための第一の磁石とＭＲ分光法の一次磁場を提供するための第二の磁石を使用することによって実施される。
【００５０】
本発明においてプローブ化合物及び／又は試験化合物を含むＮＭＲ活性核種を過分極させる別の好ましい方法は、スピン凍結法である。この方法には、スピン凍結分極による固体化合物又は系のスピン分極がある。この系は、３次以上の対称軸をもつ結晶形のＮｉ2+、ランタニド又はアクチニドイオンのような適当な常磁性物質でドープ又は均質混合される。機器は、共鳴励起磁場を印加しないので、均一磁場の必要がなく、ＤＮＰに要する機器よりも簡単である。このプロセスは、磁場の方向と垂直な軸の周りに試料を物理的に回転させることによって実施される。この方法の前提条件は、常磁性種が高い異方性ｇ因子をもつことである。試料の回転の結果、電子常磁性共鳴が核スピンと接触し、核スピン温度が低下する。試料の回転は核スピン分極が新たな平衡に達するまで行われる。
【００５１】
上述の過分極法の幾つか、例えばＤＮＰ、ブルートフォース又はスピン凍結転移は、分極を固体状態に移動させる場合にのみ有効である。試料が固体でない場合には、固体状態で実施する必要のあるいずれかの方法で過分極する前に、適当な溶媒又は溶媒混合物中で凍結すればよい。溶媒混合物、特に無定形ガラスを好ましくはグリセロールの使用により形成する混合物が特に適していることが判明した。かかる無定形ガラスのマトリックスは、好ましくは固体中のラジカルと目標物質との均一で均質な混合を担保するため、ＤＮＰ過分極において好ましく使用される。
【００５２】
本発明におけるＮＭＲ活性核種の過分極の程度は、分光計の磁場及び温度での熱平衡と比較したその増強係数によって測定し得る。好適には、増強係数は１０以上、好ましくは５０以上、さらに好ましくは１００以上である。ただし、達成される増強が小さくても本発明の方法は先行技術に記載された方法に比べると測定全体に要する時間が短いため、有用に実施できる。増強に再現性があり、過分極／ＮＭＲ分析が反復可能であれば、ＮＭＲシグナルのシグナル／ノイズ比は向上する。こうした場合、必要とされる最小ＮＭＲ増強係数は、過分極法及びプローブ／試験化合物とその代謝物の濃度に依存する。増強はプローブ／試験化合物とその代謝物からのＮＭＲシグナルが検出できる程度の十分な大きさのものでなければならない。これに関して、マルチショット実験で達成可能な増強が１０又は１０未満であれば、従来のＮＭＲに比べて、データ取得時間が節約されるため、非常に有用であることが明らかである。
【００５３】
本発明の方法の工程ｂ）では、工程ａ）で得た試料をＮＭＲ分光法で分析する。分析は連続的モニターリングで実施してもよいし、或いは単一の離散測定又は適当な時間間隔で経時的に実施し得る一連の離散測定としても実施し得る。従って、代謝における多く（好ましくはすべて）の変化とプローブ化合物の各々の代謝物の出現を同定することが可能である。
【００５４】
どのような種類のＮＭＲ分析（例えば、液相又は固相ＮＭＲ分光法）を利用するかによって、過分極試料も、ＮＭＲ分光法に適した溶媒又は溶媒混合物で希釈又は混合し得る。
【００５５】
過分極の後、ＮＭＲ分析までにできる限り分極を保つことが望ましい。上述の過分極法の幾つか、例えばＤＮＰ、ブルートフォース又はスピン凍結転移は、固体状態に分極を移す場合にのみ有効である。しかし、スペクトルの分解能と感度を向上させるため、液体状態の試料でＮＭＲスペクトルを調べるのが望ましいことが多々ある。別法として、固体状態のＮＭＲスペクトル分解能を高め、低温ＮＭＲ分析を可能とするため、マジックアングルスピンニング（ＭＡＳ）のような線幅を狭くする技術を用いることができる。
【００５６】
液体ＮＭＲ法を用いる場合、試料が過分極したら、分極チャンバから迅速に取り出して、適切な溶媒に溶解すればよい。分析段階で生じるスペクトルに干渉しない溶媒、又は安定な化学的環境を保ってＴ１緩和時間を延ばす溶媒を使用するのが有利である。Ｄ2Ｏのような重水素化溶媒又はメタノールと酸の混合物（好ましくはメタノール過剰の混合物）が特に適している。溶解速度を高めるため、撹拌、バブリング、超音波処理その他の公知の手段を使用することができる。好適には、最適な溶解と長い核緩和時間が得られるように、溶液の温度とｐＨを維持する。
【００５７】
好ましくは、緩和を防ぐため分極及び分析の間終始試料又はその溶液を保持磁場の中に置く。保持磁場は地球の磁場よりも高い磁場とし、好適には１０ｍＴよりも高くする。好適には、保持磁場は試料の領域で均一であり、最適条件は試料の性質によって左右される。
【００５８】
試料又はその溶液は次いで好ましくは標準の溶液相ＮＭＲ分析による試験に移される。この移行プロセスは手動でも自動でもよいが、好ましくは自動である。別法として、過分極工程とその後の任意工程の溶解工程は、単一自動化装置に適切に統合される。追加の好適な実施形態では、過分極と任意工程の溶解工程は自動化され、ＮＭＲ検出ハードウエアも同じ単一の完全に一体化された装置に収められる。
【００５９】
別法として、固体ＮＭＲ法を用いる場合には、固体試料は、例えばＤＮＰ、ブルートフォース、スピン凍結転移その他低温固体状態で機能する方法によって過分極させればよい。次いで、過分極試料を固体ＭＡＳ  ＮＭＲプローブに移動させる。この移動は適度に迅速かつ好ましくはリフト又は射出を介して実施する。次いで、高分解能固体ＮＭＲ分光法が実施できるようにＮＭＲプローブ中の試料をスピンさせる。プロセス全体を自動化でき、好ましくは一体型装置で実施する。
【００６０】
好ましい実施形態では、本発明の方法は数人のヒト個体に対して実施され、同一又は類似の特性を示すヒト個体に分類する。
【００６１】
従って、本発明の好ましい態様は、インビボでタンパク質活性を測定して数人のヒト個体の各々の特性を得ることを含む数人のヒト個体の表現型を分類する方法であって、上記測定が、
ａ）１種以上のＮＭＲ活性核種を含有する１種以上のプローブ化合物を事前投与しておいたヒト個体から採取した試料のＮＭＲ活性核種を過分極させる工程、及び
ｂ）上記試料をＮＭＲ分光法で分析する工程
を含んでいて、もって同一又は類似の特性を示すヒト個体を分類する方法である。
【００６２】
上の段落に記載した方法の好ましい実施形態では、数種のタンパク質又はイソ酵素の活性を測定して、数人のヒト個体について各々一組の特性を得、同一又は類似の特性の組を示すヒト個体を分類する。
【００６３】
好ましい実施形態では、本発明の方法は臨床試験群の表現型を分類する方法である。他の好ましい実施形態では、本発明の方法は、薬物治療に先立って個体の表現型を分類する方法である。
【００６４】
本発明の方法を臨床試験群の表現型分類に使用する場合、本発明によるタンパク質活性はボランティア患者で測定される。各ボランティア患者で得られた特性に基づいて、ボランティア患者を類似又は同一の特性を示すボランティア患者のグループに分類することができ、特定の表現型を示すボランティア患者に対して臨床試験を開始することができる。
【００６５】
従って、本発明の好ましい態様は、タンパク質活性をインビボで測定してヒト個体の特性を得ることを含むヒト個体の表現型を分類する方法であって、上記測定が、
ａ）１以上のＮＭＲ活性核種を含む１種のプローブ化合物を事前投与しておいたヒト個体から採取した試料のＮＭＲ活性核種を過分極させる工程、及び
ｂ）上記試料をＮＭＲ分光法で分析する工程
を含んでいて、もってヒト個体の特性を他のヒト個体の特性（好ましくは同一の方法で得たもの）と比較してヒト個体をグループに分類する方法である。
【００６６】
上の段落に記載した方法の好ましい実施形態では、数種のタンパク質又はイソ酵素の活性を測定して、一組のヒト個体の特性を得る。次いで、この１組の特性を他のヒト個体の特性と比較し、それによりヒト個体をグループに分類する。
【００６７】
本発明の方法を、薬物治療前にヒト個体の表現型分類に使用する場合、本発明の方法で得られたヒト個体の特性は、好ましくは、各人の特性に基づいて既に分類されている他のヒト個体の特性と比較される。従って、ヒト個体をグループに分類し、グループの特性によって治療薬の種類と投与量を調節することができる。
【００６８】
従って、好ましい実施形態では、本発明の方法はヒト個体に薬物治療を施す前にヒト個体の表現型を分類する方法である。
【００６９】
タンパク質の活性、例えば酵素活性はプローブ化合物とその代謝物との代謝率を計算することによって求めることができる。特定のヒト個体について代謝率を評価するため、その代謝率を統計資料と比較してもよい。かかる統計資料は多数の個体におけるプローブ化合物とその代謝物との代謝率を計算することで得られる。度数分布ヒストグラム（個体数対代謝比）を得ることもできる。例えば、評価中の酵素経路に多形性が存在する場合、その分布は双峰性を示す。双峰性分布は、母集団の部分集合がプローブ化合物を特定の酵素経路で代謝できないか、その代謝に何らかの欠損があることを反映している。分岐点（最終的分離値）は分布の個々のモードを分ける。この双峰性集団分布に基づいて、２つの集団、例えば貧代謝群と高代謝群とを識別することができることで表現型を定義することができる。分岐点は２つの表現型を識別する閾値として役立つ。分岐点を超える代謝率の値は貧代謝群を示し、分岐点を下回る代謝率の値は高代謝群の表現型を示す。
【実施例】
【００７０】
実施例
単一プローブ化合物を用いたＣＹＰ４５０イソ酵素ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｅ１の活性の測定
１ａ）プローブ化合物
ＣＹＰ４５０イソ酵素ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｅ１の活性を以下のプローブ化合物を用いて測定した。
・ＣＹＰ１Ａ２の基質としてのカフェイン、カフェインは最初にパラキサンチンに代謝される。
・ＣＹＰ２Ｄ６の基質としてのデブリソキン、デブリソキンは最初に４−ヒドロキシ−デブリソキンに代謝される。
・ＣＹＰ２Ｅ１の基質としてのクロルゾキサゾン、クロルゾキサゾンは最初に６−ヒドロキシ−クロルゾキサゾンに代謝される。
【００７１】
使用した化合物は以下の位置で同位体標識した。
【００７２】
【化１】
2005523442.tif 000002
【００７３】
１ｂ）実験作業
【００７４】
【表１】
2005523442.tif 000003
【００７５】
各時点で採取した尿の体積は各被験動物について１〜１０ｍｌであった。採取後、血液試料を２０００ｒｐｍで１０分間遠心沈降して血漿を回収した。血漿及び尿試料共に−２０℃で凍結した。
【００７６】
１ｃ）採取試料の過分極及びＮＭＲ分析
トリチルラジカル：トリス（８−カルボキシル−２，２，６，６−テトラ（２−（１−ヒドロキシエチル））ベンゾ［１，２−ｄ：４，５−ｄ’］ビス（１，３）ジチオール−４−イル）メチルナトリウム塩（４２８ｍｇ、３００μｍｏｌ）をグリセロール（１２.６１ｇ）に溶解して保存液を調製した。保存液のアリコート（５１.０ｍｇ）を体液（尿又は血漿）４０μｌと混合し、１５ｍＭトリチルラジカル溶液とした。これらの溶液を液体窒素中に液滴として注入して、過分極に適したガラス状ペレット物質とした。この固体試料を次いでＤＮＰ磁石の中に置き、一晩過分極させた。試料をメタノールと酢酸の混液（１００：１）に注入して溶解させた。溶解した試料は手作業で９.４Ｔの高分解能磁石に素早く移し（移動時間約４秒）、単一取得13Ｃ−１Ｄ−ＮＭＲスペクトルを収集した。
【００７７】
１ｄ）結果
プローブ化合物とそれらの代謝物については、多数のシグナルが予測された。さらに、生体液マトリックスのシグナル及び溶媒のシグナルもスペクトル中に存在すると予測された。カフェインについては、主要カフェイン代謝物として１，３−ジメチル尿酸、１，３，７−トリメチル尿酸及びパラキサンチンが予想された。さらに微量カフェイン代謝物として１−キサンチン、１，３−キサンチン、３，７−キサンチン、１，３，７−ＤＡＵ、３，７−尿酸、１，７−尿酸及び１−尿酸が予想された。デブリソキンについては、デブリソキン自体に加え、４−ヒドロキシデブリソキンを始めとする幾つかの代謝物が存在していた。３時間後に採取した尿試料では、デブリソキンと４−ヒドロキシデブリソキンのみが存在した。さらに、２つの未知シグナルが存在したが、これらはおそらく尿のバックグラウンドシグナルであると思われる。デブリソキン代謝物として予想されたのは、１−ヒドロキシデブリソキン、３−ヒドロキシデブリソキン、４−ヒドロキシデブリソキン２−（グアニジノエチル）安息香酸、２−（グアニジノメチル）フェニル酢酸及び「ジヒドロキシ」 デブリソキンである。
【００７８】
定量：
既知量の非標識化合物カフェイン、クロルゾキサゾン、デブリソキン及びそれらの一次代謝物をＳＰＤラットの尿試料に添加し、上記の通り過分極及びＮＭＲ分析を実施した。これらの実験から、個々のプローブ化合物とそれらの代謝物における対象炭素原子について、増強係数を推定することができた。生体液試料中の未知量のプローブ化合物／代謝物の定量は、これらの増強とその生成に用いた既知量のプローブ化合物／代謝物に基づくものであった。対象炭素シグナルを積分し、この積分値を調整（９０で除算する；13Ｃの天然存在量１.１％）して、生体液試料に用いた同位体濃縮プローブ化合物と比較して、上記添加試料に用いた非標識プローブ化合物を見積もった。この積分値を次いで上記添加試料に用いたプローブ化合物の濃度と関連付け、生体液試料中で同定された個々の炭素シグナルで得た積分値と比較した。積分の前に位相とベースラインの補正を注意深く実施し、すべての測定値について積分ウインドーを予め２５Ｈｚに調整した。シグナルがオーバーラップしている場合、推定値は対象シグナルのシグナル／ノイズ比を用いて得た。
【００７９】
以下の濃度範囲が得られた。
【００８０】
【表２】
2005523442.tif 000004
【００８１】
検出限界を改善するため、過分極化の前に生体液試料を（例えば、凍結乾燥で）濃縮してもよい。
【００８２】
表現型分類：
代謝率（個々のＣＹＰ４５０イソ酵素の活性の尺度として役立つ）は、血液又は尿中に存在する代謝物の百分率に対する未変化カフェイン、デブリソキン又はクロルゾキサゾンの百分率として計算する。従って、クロルゾキサゾンとその一次代謝物６−ヒドロキシデブリソキンの代謝率の計算値は、ＣＹＰ２Ｅ１活性の尺度として用いられ、カフェインとその一次代謝物パラキサンチンの代謝率は、ＣＹＰ１Ａ２活性の尺度として用いられ、デブリソキンとその一次代謝物４−ヒドロキシデブリソキンの代謝率は、ＣＹＰ２Ｄ６活性の尺度として用いられる。多数のＳＰＤラットでカフェイン、デブリソキン及びクロルゾキサゾンとそれらの主要代謝物との代謝率を計算することによって統計資料が得られる。度数分布ヒストグラム（ＳＰＤラットの個体数対代謝率）を作ると、双峰性分布を示し、ＳＰＤラット集団の部分集合がプローブ化合物を特定のイソ酵素のＣＹＰ４５０経路で代謝で
分岐点（最終的分離値）は分布の個々のモードを分ける。この双峰性集団分布に基づいて、２つの集団、例えば貧代謝群と高代謝群とを識別することができることで表現型を定義することができる。分岐点は２つの表現型を識別する閾値として役立つ。分岐点を超える代謝率の値は貧代謝群を示し、分岐点を下回る代謝率の値は高代謝群の表現型を示す。
【００８３】
実施例２
数種のプローブ化合物を用いたＣＹＰ４５０イソ酵素ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｅ１の活性の測定
２ａ）プローブ化合物
実施例１に記載したものと同一のプローブ化合物を使用した。
【００８４】
２ｂ）実験作業
ＳＰＤラットに以下の化合物を順次腹腔内（ｉｐ）注射した。
・４３.３μｍｏｌ／ｋｇのクロルゾキサゾン：２５０μｌのＰＥＧ４００に溶解。
・３６.９μｍｏｌ／ｋｇのカフェイン：１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.３、０.９％ＮａＣｌに溶解。
・４１.５μｍｏｌ／ｋｇのデブリソキン：１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.３、０.９％ＮａＣｌに溶解。
【００８５】
尿試料を投与直前に採取し、次いで投与後１時間目及び２.５時間目に採取した。各時点で採取した尿の体積は１〜１０ｍｌであった。血液試料は投与直前に採取し、次いで投与後１時間目、２時間目及び３時間目に採取した。採取後、血液試料を２０００ｒｐｍで１０分間遠心沈降して血漿を回収した。血漿及び尿試料共に−２０℃で凍結した。
【００８６】
２ｃ）採取試料の過分極及びＮＭＲ分析
トリチルラジカル：トリス（８−カルボキシル−２，２，６，６−テトラ（２−（１−ヒドロキシエチル））ベンゾ［１，２−ｄ：４，５−ｄ’］ビス（１，３）ジチオール−４−イル）メチルナトリウム塩（４２８ｍｇ、３００μｍｏｌ）をグリセロール（１２.６１ｇ）に溶解して保存液を調製した。保存液のアリコート（５１.０ｍｇ）を体液（尿又は血漿）４０μｌと混合し、１５ｍＭトリチルラジカル溶液とした。これらの溶液を液体窒素中に液滴として注入して、過分極に適したガラス状ペレット物質とした。この固体試料を次いでＤＮＰ磁石の中に置き、一晩過分極させた。試料をメタノールと酢酸の混液（１００：１）に注入して溶解させた。溶解した試料は手作業で９.４Ｔの高分解能磁石に素早く移し（移動時間約４秒）、単一取得13Ｃ−１Ｄ−ＮＭＲスペクトルを収集した。
【００８７】
２ｄ）結果
プローブ化合物とそれらの代謝物については、多数のシグナルが予測された。さらに、生体液マトリックスのシグナル及び溶媒のシグナルもスペクトル中に存在すると予測された。カフェインについては、主要カフェイン代謝物として１，３−ジメチル尿酸、１，３，７−トリメチル尿酸及びパラキサンチンが予想された。さらに微量カフェイン代謝物として１−キサンチン、１，３−キサンチン、３，７−キサンチン、１，３，７−ＤＡＵ、３，７−尿酸、１，７−尿酸及び１−尿酸が予想された。デブリソキンについては、デブリソキン自体に加え、４−ヒドロキシデブリソキンを始めとする幾つかの代謝物が存在していた。３時間後に採取した尿試料では、デブリソキンと４−ヒドロキシデブリソキンのみが存在した。さらに、２つの未知シグナルが存在したが、これらはおそらく尿のバックグラウンドシグナルであると思われる。
【００８８】
定量：
既知量の非標識化合物カフェイン、クロルゾキサゾン、デブリソキン及びそれらの一次代謝物をＳＰＤラットの尿試料に添加し、上記の通り過分極及びＮＭＲ分析を実施した。これらの実験から、個々のプローブ化合物とそれらの代謝物における対象炭素原子について、増強係数を推定することができた。生体液試料中の未知量のプローブ化合物／代謝物の定量は、これらの増強とその生成に用いた既知量のプローブ化合物／代謝物に基づくものであった。対象炭素シグナルを積分し、この積分値を調整（９０で除算する；13Ｃの天然存在量１.１％）して、生体液試料に用いた同位体濃縮プローブ化合物と比較して、上記添加試料に用いた非標識プローブ化合物を見積もった。この積分値を次いで上記添加試料に用いたプローブ化合物の濃度と関連付け、生体液試料中で同定された個々の炭素シグナルで得た積分値と比較した。積分の前に位相とベースラインの補正を注意深く実施し、すべての測定値について積分ウインドーを予め２５Ｈｚに調整した。シグナルがオーバーラップしている場合、推定値は対象シグナルのシグナル／ノイズ比を用いて得た。
【００８９】
以下の濃度範囲が得られた。
【００９０】
【表３】
2005523442.tif 000005
【００９１】
検出限界を改善するため、過分極化の前に生体液試料を（例えば、凍結乾燥で）濃縮してもよい。
【００９２】
代謝率の計算：
代謝率は個々のＣＹＰ４５０イソ酵素の活性の尺度として用い、生体液中に存在する代謝物の百分率に対する未変化プローブ化合物の百分率として計算される。従って、クロルゾキサゾンとその一次代謝物６−ヒドロキシデブリソキンの代謝率の計算値はＣＹＰ２Ｅ１の尺度として用いられ、カフェインとその一次代謝物パラキサンチンの代謝率はＣＹＰ１Ａ２活性の尺度として用いられ、またデブリソキンとその一次代謝物４−ヒドロキシデブリソキンの代謝率はＣＹＰ２Ｄ６活性の尺度として用いられる。
【００９３】
表現型分類：
表現型分類は数匹のＳＰＤラットで実施される。ラットに、２ｂに記載のプローブ化合物を投与し、ラットから採取した試料の過分極及びＮＭＲ分析を、２ｃ）に記載の通り実施する。酵素活性及び代謝率は、２ｄ）に記載の通り計算する。同一又は類似の代謝率を示すラットを分類する。
【００９４】
実施例３
ＣＹＰ４５０イソ酵素ＣＹＰ３Ａ４の活性の測定
３ａ）プローブ化合物
ＣＹＰ４５０イソ酵素ＣＹＰ３Ａ４（ウサギではＣＹＰ３Ａ６）の活性は、ＣＹＰ３Ａ４／ＣＹＰ３Ａ６に対する基質として同位体標識したカルバマゼピン（ＣＢＺ）を用いて測定した。ＣＢＺはこの経路を介してそのエポキシド（Ｅ−ＣＢＺ）に代謝される。
【００９５】
【化２】
2005523442.tif 000006
【００９６】
３ｂ）実験作業
実験一日目の朝、ウサギ（ｎ＝６）に４０ｍｇ／ｋｇのＣＢＺ（ソルビトール懸濁液として）を１回投与給餌した。試料は２４時間にわたって、０分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間及び２４時間目の８時点で採取した。血液２ｍｌをウサギの辺縁耳血管から採取した。この血液から血漿を抽出し、２つの試料に分けて、その一方をＬＣ−ＭＳ分析し、もう一方はＤＮＰ分析用（各〜０.５ｍｌ）とした。この実験によって、測定期間におけるＣＢＺの最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）の計算、血漿ＣＢＺ濃度測定値がその最大となる時間（Ｔｍａｘ）及び血漿中ＣＢＺの半減期（Ｔ１／２）を計算することができた。
【００９７】
３ｃ）採取試料の過分極及びＮＭＲ分析
２ｍｌバイアル中のウサギ血漿（４００μｌ）をアセトニトリル（７５０μｌ）で処理し、１５秒間超音波プローブで超音波処理した。超音波プローブが洗浄されるように追加のアセトニトリル（７５０μｌ）をバイアルに加え、バイアルを閉じて回転ミキサーで短時間撹拌し、１４０００ｒｐｍで約１分間遠心した。上清を新たなバイアルに分割して移し、ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ  ＳＰＤ１１１Ｖ  ＳｐｅｅｄＶａｃで蒸発させた。蒸発間近な時点でＥＤＴＡ（１μｇ／μｌ）の保存水溶液２０μｌを加え、混合物を蒸発乾固した。下記の保存溶媒５０μｌを固体残渣に加え、添加重量を記録した。試料を１５分間超音波処理して残渣を溶かし、遠心分離して全試料をバイアルの底に集めた。バイアルはピペットチップと共に秤量し、試料をピペットチップに集めて液体窒素に滴下分配した。使用したバイアルとピペットを再度秤量し、試料の実際の重量を算定した。冷却した試料ペレットを試料カップに入れ、ＤＮＰ分極装置に入れた。試料ペレットをヘリウム浴（Ｔ＝１.１〜１.２Ｋ）中、９３.９３４ＧＨｚ及び１００ｍＷで２３時間分極した。
【００９８】
血漿試料調製用保存液
１，１−ビス（ヒドロキシメチル）シクロプロパン−１−13Ｃ−ｄ８（ＨＰ００１）７.８２ｍｇ（７０.３μｍｏｌ）をグリコール１０.００ｇ（０.１６１ｍｏｌ）に溶解した。この溶液５００ｍｇアリコートをグリコールで５０００ｍｇ（４.４９２ｍｌ）に希釈し、トリス（８−カルボキシル−２，２，６，６−テトラ（２−（１−ヒドロキシエチル））ベンゾ［１，２−ｄ：４，５−ｄ’］ビス（１，３）ジチオール−４−イル）メチル・ナトリウム（ＯＸ０６３）９６.１４ｍｇ（６７.４μｍｏｌ）をこの混合物に加えた。この溶液の５０μｌアリコート（５５.６ｍｇ）は４.３５μｇのＨＰ００１を含み、ＯＸ０６３に関しては１５ｍＭである。上記ラジカルの体積は計算に含まれていない。
【００９９】
過分極後の試料溶解
試料を、メタノール７.０ｍｌ当たり７５μｇのＥＤＴＡを含む加熱（６０℃）メタノール−Ｄ4に溶解した。この溶解試料を、ＮＭＲスピナーに装着した１０ｍｍＮＭＲチューブに回収し、移動可能な磁場（１２ｍＴ）の中に保持した。移送時にチューブが移動可能な磁場野中に保護されていることを確認しながら、分極装置から試料をできるだけ素早くＮＭＲ磁石に移した。
【０１００】
ＮＭＲ分析
１Ｄ13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、１０ｍｍ  Ｖａｒｉａｎ直接検出プローブで１００.３９３ＭＨｚ（４００ＭＨｚ1Ｈ）で得た。１０ｍｍ試験管は０.９ｍｌの有効容積を有していた。ＮＭＲ取得パラメータはスペクトル幅４０ｋＨｚ（４００ｐｐｍ）、取得時間２.５秒、パルスアングル９０度であった。ＮＭＲスペクトルはすべてメタノール中のグリコールの６４.４８２ｐｐｍを対照した。スペクトルは溶解開始５秒後に測定した。
【０１０１】
３ｃ）結果
ＮＭＲシグナルの定量は、ＮＭＲシグナルを時間領域で解析するソフトウェアパッケージｊＭＲＵＩ（ＭＡＧＭＡ  ２００１  Ｍａｙ；  １２（２−３），  １４１−１５２）を用いて実施した。先ず、ＨＰ００１からの対照13Ｃ−ＮＭＲシグナルは、シグナルを表すのに１つのローレンツ線形モデル関数を選択して分析した。位相、振幅、減衰（又は周波数領域の線幅）及び周波数をアルゴリズムによって計算する。一次相はゼロに固定した。次に、ＣＢＺとそのエポキシド代謝物（Ｅ−ＣＢＺ）からの13Ｃ−ＮＭＲシグナルを分析した。ピークの位相はすべて主な位相に関してゼロであり、ローレンツ線形モデル関数を仮定した。ＣＢＺとＥ−ＣＢＺの13Ｃ−ＮＭＲ共鳴については、等しい線幅と９０.３５３７ｐｐｍの周波数分離を用いる。この予備知識は溶媒中２成分の使用温度でのＤＮＰ−ＮＭＲスペクトルから得たものであり、低シグナル／ノイズ比（ＳＮＲ）での特にＥ−ＣＢＺの定量法の信頼性が向上する。一次相はゼロに固定し、ゼロ次相はアルゴリズムで決定した。ＣＢＺとＥ−ＣＢＺについての振幅は対照化合物ＨＰ００１でみられた振幅で除算して、親化合物ＣＢＺとその一次代謝物Ｅ−ＣＢＺの相対強度を得た。
【０１０２】
校正曲線は13Ｃ標識ＣＢＺを用い、６つの濃度レベルで作成した。０.１１μｇ、０.３３μｇ、０.５μｇ、１.０μｇ、１.５μｇ及び２.０μｇをウサギ血漿４００μｌに添加し、３７℃でインキュベートし、試料調製の欄に記載の通り調製した。
【０１０３】
過分極血漿試料のＮＭＲスペクトルを分析してＣＢＺの一般に用いられる薬物動態パラメータを求め、ＬＣ−ＭＳで得られたパラメータと比較した（表１及び表２）。本発明の方法で測定したパラメータは、ＬＣ−ＭＳによって測定したものと完全に一致していた。また、３匹のウサギ同士の比較も２通りの方法が同等に実施し得ることを示した。
【０１０４】
【表４】
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【０１０５】
ＣＢＺ濃度を計算した。ＡＵＣは、測定時間内の曲線の下の面積を意味する。
【０１０６】
【表５】
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【０１０７】
Ｅ−ＣＢＺ濃度を計算した。ＡＵＣは、測定時間内の曲線の下の面積を意味する。
【０１０８】
代謝率の計算：
代謝率は、個々のＣＹＰ４５０イソ酵素の活性の尺度として用い、血漿試料中に存在する代謝物Ｅ−ＣＢＺの百分率に対する未変化ＣＢＺの百分率として計算される。従って、ＣＺＢ及びそのエポキシド代謝物Ｅ−ＣＺＢの代謝率の計算は、ＣＹＰ３Ａ活性に対する尺度として使用される。
【０１０９】
表現型分類：
度数分布ヒストグラム（ウサギの個体数対代謝率）を作り、同一又は類似の代謝率を示すウサギを分類する。
【国際調査報告】
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