(57)【要約】本発明は、隣接するが同じはない標的部位に結合するホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームを含む核酸検出プローブに関する組成物および使用の方法を提供する。本発明は、一部、ホーグスティーン塩基対合およびワトソン−クリック塩基対合の両方を用いて標的核酸分子に結合し得る新規な分子の発見に関する。この新規分子は、２アームプローブと称される。それは、２つの鎖または「アーム」から構成されるからであり、その１つはホーグスティーン結合し得、そしてその１つはワトソン−クリック結合し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の標的部位で、標的核酸分子にホーグスティーン塩基対合によって結合するホーグスティーン結合アーム、および
第２の標的部位で、標的核酸分子にワトソン−クリック塩基対合によって結合するワトソン−クリック結合アーム、
を含む組成物であって、
ここで、該ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームが、互いに結合し、そして核酸または核酸模倣エレメントから構成される、組成物。
【請求項２】
前記ホーグスティーン結合アームが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびＬＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ワトソン−クリック結合アームが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびＬＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記標的核酸分子が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ホーグスティーン結合アームが、少なくとも１つの骨格改変を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ワトソン−クリック結合アームが、少なくとも１つの骨格改変を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの骨格改変が、ペプチド改変、およびホスホロチオエート改変からなる群から選択される、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームが、互いに共有結合で結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームが、互いにリンカー分子を用いて結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記リンカー分子が、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（Ｏリンカー）、Ｅリンカー、およびＸリンカーからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記リンカー分子が、切断可能な結合を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記リンカー分子が、１００オングストロームより少ない長さを有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ホーグスティーン結合アームが、ホモプリンヌクレオチド配列またはホモピリミジンヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ワトソン−クリック結合アームが、ランダムであるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ホーグスティーン結合アームが、長さ５〜１２ヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ワトソン−クック結合アームが、長さ５〜１２ヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームが、異なる長さを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記第１の標的部位および第２の標的部位が、１塩基対、２塩基対、５塩基対、７塩基対、１０塩基対、２０塩基対、および２５塩基対からなる群から選択される距離だけ互いから間隔を置いて配置される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームが、両方がそれらの個々の標的部位に結合しているとき、互いに、１塩基対、２塩基対、５塩基対、７塩基対、１０塩基対、２０塩基対、および２５塩基対からなる群から選択される距離だけ互いから間隔を置いて配置される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ホーグスティーン結合アームが、試薬に結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ワトソン−クリック結合アームが、試薬に結合している、請求項１または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記試薬が検出可能な標識である、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記検出可能な標識が、電子スピン共鳴分子（例えば、ニトロキシルラジカル）、蛍光分子、化学発光分子、ラジオアイソトープ、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、電気電荷運搬分子、半導体ナノクリスタル、半導体ナノ粒子、コロイド金ナノクリスタル、リガンド、ミクロビーズ、磁性ビーズ、常磁性粒子、量子ドット、色原体基質、アフィニティー分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗原、ハプテン、抗体、抗体フラグメント、および脂質からなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記検出可能な標識が、電荷結合デバイス検出システム、電子スピン共鳴検出システム、蛍光検出システム、電気検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学的検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近距離場検出システム、および全反射（ＴＩＲ）検出システムからなる群から選択される検出システムを用いて検出される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記試薬が、細胞傷害性試薬である、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記標的核酸分子が、ゲノムＤＮＡ分子またはミトコンドリアＤＮＡ分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
第１の標的部位で、標的核酸分子にホーグスティーン塩基対合によって結合するホーグスティーン結合アーム、および
第２の標的部位で、標的核酸分子にワトソン−クリック塩基対合によって結合するワトソン−クリック結合アーム、
を含む組成物であって、
ここで、該ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームが、互いにリンカーにより結合する、組成物。
【請求項２８】
標的核酸分子を標識するための方法であって、
ａ）標的核酸分子を、請求項１または２７に記載の組成物と接触させる工程、および
ｂ）該組成物を、該標的核酸分子に特異的に結合させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記組成物の前記標的核酸分子への結合を検出する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ホーグスティーン結合アームが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびＬＮＡからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ワトソン−クリック結合アームが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびＬＮＡからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ホーグスティーン結合アームが、少なくとも１つの骨格改変を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記ワトソン−クリック結合アームが、少なくとも１つの骨格改変を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの骨格改変が、ペプチド改変、およびホスホロチオエート改変からなる群から選択される、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームが、互いに共有結合で結合している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームが、互いにリンカー分子を用いて結合している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記リンカー分子が、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（Ｏリンカー）、Ｅリンカー、およびＸリンカーからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記リンカー分子が、加水分解可能な切断可能物を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記リンカー分子が、１００オングストロームより少ない長さを有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記ホーグスティーン結合アームが、ホモプリンヌクレオチド配列またはホモピリミジンヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ワトソン−クリック結合アームが、ランダムであるヌクレオチド配列を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記ホーグスティーン結合アームが、長さ５〜１２ヌクレオチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記ワトソン−クック結合アームが、長さ５〜１２ヌクレオチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
前記ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームが、異なる長さを有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１の標的部位および第２の標的部位が、１塩基対、２塩基対、５塩基対、７塩基対、１０塩基対、２０塩基対、および２５塩基対からなる群から選択される距離だけ互いから間隔を置いて配置される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４６】
前記ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームが、両方がそれらの個々の標的部位に結合しているとき、１塩基対、２塩基対、５塩基対、７塩基対、１０塩基対、２０塩基対、および２５塩基対からなる群から選択される距離だけ互いから間隔を置いて配置される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４７】
前記ホーグスティーン結合アームが、試薬に結合している、請求項２８に記載の方法。
【請求項４８】
前記ワトソン−クリック結合アームが、試薬に結合している、請求項２８または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記試薬が検出可能な標識である、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記検出可能な標識が、電子スピン共鳴分子（例えば、ニトロキシルラジカル）、蛍光分子、化学発光分子、ラジオアイソトープ、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、電気電荷運搬分子、半導体ナノクリスタル、半導体ナノ粒子、コロイド金ナノクリスタル、リガンド、ミクロビーズ、磁性ビーズ、常磁性粒子、量子ドット、色原体基質、アフィニティー分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗原、ハプテン、抗体、抗体フラグメント、および脂質からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記検出可能な標識が、電荷結合デバイス検出システム、電子スピン共鳴検出システム、蛍光検出システム、電気検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学的検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近距離場検出システム、および全反射（ＴＩＲ）検出システムからなる群から選択される検出システムを用いて検出される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記試薬が、細胞傷害性試薬である、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記試薬が、核酸切断試薬である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的核酸分子が、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的核酸分子が、ゲノムＤＮＡ分子またはミトコンドリアＤＮＡ分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項５６】
前記組成物の前記標的核酸分子への結合のパターンを決定する工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項５７】
前記結合のパターンが、直線状ポリマー分析システム、ＦＩＳＨ、または光学的マッピングを用いて決定される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記結合のパターンが、前記標的核酸分子からの切断産物を検出および測定することにより決定される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記結合のパターンが、転写の損失の指標である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記ホーグスティーン結合アームが、ＰＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６１】
前記ワトソン−クリック結合アームが、ＰＮＡを含む、請求項１または６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ホーグスティーン結合アームが、ＰＮＡを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項６３】
前記ワトソン−クリック結合アームが、ＰＮＡを含む、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、核酸分子のためのプローブとしての使用に適切である新規な分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックされた核酸（ＬＮＡ）のような核酸模倣物がプローブとして用いられている。ＰＮＡプローブの例は、一本鎖ＰＮＡ（ｓｓＰＮＡ）プローブ、ｂｉｓＰＮＡプローブ、および偽相補的ＰＮＡ（ｐｃＰＮＡ）プローブを含む。
【０００３】
ｓｓＰＮＡは、異なるモードで一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に結合する。その配列（および逆にその標的の配列）に依存して、ｓｓＰＮＡは、ＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重鎖のワトソン−クリックＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成し得、ここで、ＰＮＡ鎖上で、ワトソン−クリック機構により結合し、そしてその他はホーグスティーン結合によって結合する。（Ｗｉｔｔｕｎｇら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：７９７３〜７９７９；Ｋｏｓａｇａｎｏｖら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１１７４２〜１１７４７）。
【０００４】
ｓｓＰＮＡは、ワトソン−クリックまたはホーグスティーン結合機構のいずれかによって二重鎖（ｄｓＤＮＡ）に結合する。前者の場合、ＤＮＡ鎖の１つが置換され、そしてｓｓＰＮＡがそれを相補鎖としてとる。後者の場合、ｓｓＰＮＡは、ｄｓＤＮＡ構造を妨害することなくホーグスティーンハイブリダイゼーションを経由して、ＰＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡ三重鎖を形成する。ホーグスティーンハイブリダイゼーションから生じる三重鎖形成は、配列制限を有する。なぜなら、十分に長いポリプリン標的配列のみがｓｓＰＮＡによって結合されるからである（Ｓｉｎｄｅｎ、１９９４）。その結果、このｓｓＰＮＡは、ポリプリンまたはポリピリミジン配列のいずれかを有し得る。
【０００５】
ｓｓＰＮＡの高濃度では、ワトソン−クリック塩基対合を用いるｄｓＤＮＡへのそのハイブリダイゼーションのための律速ステップは、標的の二本鎖領域の局所融解（すなわち、開放）である。このプロセスは、高いエネルギー障壁を有し、そしてそれ故、遅い。しかし、それは、温度を上昇することにより促進され得る。局所融解は、特に室温では、稀であって、かつ標的核酸または配列に沿ってランダムに間隔を置かれ、ｓｓＰＮＡは、その標的に効率的に侵入およびハイブリダイズするために、その標的部位に緊密に近接して位置決めされなければならない。ｓｓＰＮＡが、局所融解の時点で、核酸分子上の標的部位の近傍にある可能性を増加するために、ｓｓＰＮＡの濃度が増加され得るか、または核酸分子の近傍の局所ｓｓＰＮＡ濃度を増加するためにｓｓＰＮＡ構造中に正電荷が含められ得る（Ｋｏｓａｇａｎｏｖら、２０００）。
【０００６】
図１Ａ〜１Ｄは、標的ＤＮＡと異なるタイプのプローブとの間の、異なるモードの結合および複合体形成を示す。ワトソン−クリックまたはホーグスティーン様式のいずれかのｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡへのｓｓＰＮＡ結合は、図１Ａおよび１Ｂに示されている。ワトソン−クリックハイブリッドでは、ＰＮＡのＣ末端は、ＤＮＡの５’末端と整列される。ホーグスティーンハイブリッドでは、ＰＮＡのＮ末端がＤＮＡの５’末端と整列される。ホーグスティーン結合は、標的部位（そしてそれ故ｓｓＰＮＡ配列）に特定の要求を課し、そしてホーグスティーンハイブリッドにおけるｓｓＰＮＡの配向は、図１Ｃに示されるように、その配列に依存する。図１Ｃでは、標的部位は、ホーグスティーン対合によって上のｓｓＰＮＡに結合し、そしてワトソン−クリック対合によって下のｓｓＰＮＡに結合する。２つのＰＮＡの使用は、図１Ｃおよび１Ｄに示されるように、ｓｓＰＮＡ／ｓｓＤＮＡ／ｓｓＰＮＡ三重鎖に至り得る。図１Ｄに示されるように、ｓｓＰＮＡを互いに連結することにより、ｂｉｓＰＮＡが形成され、そしてこれは、個々のｓｓＰＮＡに対し、増加した量の塩基対合に起因して、標的ＤＮＡと、より速くハイブリダイズし、そしてより安定な複合体を形成する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重鎖もまた、相補性配列をもつ２つのｓｓＰＮＡを用いて同じ標的配列に結合する場合、可能である。リンカーによって連結されるとき、この２つのｓｓＰＮＡは、ｂｉｓＲＮＡと称される。ｂｉｓＰＮＡは、比較的短い標的とでさえ安定な複合体を形成し得る。なぜなら、２つのＰＮＡ塩基対が、標的核酸分子の塩基毎で形成されるからである。さらに、それらは、より速いワトソン−クリック反応を許容する標的部位にＰＮＡを結合および濃縮するために、二本鎖核酸の局所的融解を必要としないｂｉｓＰＮＡ上のホーグスティーン鎖の存在に起因する比較的速いハイブリダイゼーション速度を有している。従って、このプロセスは、より低いエネルギー障壁を有し、そしてｓｓＰＮＡより迅速に進行する。しかし、ｓｓＰＮＡのホーグスティーン結合に関し、標的配列制限がなお存在している。ｓｓＤＮＡへのｂｉｓＰＮＡ結合は、図１Ｄに示されている。
【０００８】
偽相補的ＰＮＡ（ｐｃＰＮＡ）は、その配列内に少なくとも３３％のアデニンまたはチミン残基を有する任意の標的に結合し得る（Ｉｚｖｏｌｓｋｙら、２０００）。これらＰＮＡは、ｄｓＤＮＡに侵入し、そしてワトソン−クリック様式で両方の置換された鎖を結合する。それらの結合速度は、遅くかつ非効率的である。なぜなら、それらは、ホーグスティーン結合エレメントを欠いているからである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要約）
本発明は、一部、ホーグスティーン塩基対合およびワトソン−クリック塩基対合の両方を用いて標的核酸分子に結合し得る新規な分子の発見に関する。この新規分子は、２アームプローブと称される。なぜなら、それは、２つの鎖または「アーム」から構成されるからであり、その１つはホーグスティーン結合し得、そしてその１つはワトソン−クリック結合し得る。本明細書で「ホーグスティーン結合鎖」または「ホーグスティーン結合アーム」および「ワトソン−クリック結合鎖」または「ワトソン−クリック結合アーム」と称されるこの２つのアームは、必ずしも、標的核酸分子上の同じ部位に結合する必要はない。むしろ、それらは、ホーグスティーン結合アームの組成に依存して、互いに対してシスまたはトランスである異なる配列に結合する。シス部位は、標的と同じ鎖上に位置決めされ、そして互いに連続的であり得るが、それらの間に所定量の距離が存在し得る部位である。トランス部位は、二本鎖標的の対向する鎖上に位置決めされる部位である。この２アームプローブのワトソン−クリックおよびホーグスティーン結合アームは、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸分子から、または、特にＰＮＡ（例えば、ｓｓＰＮＡ、ｐｃＰＮＡなど）、およびＬＮＡのような核酸模倣物から作製され得る。いくつかの重要な実施形態では、１つまたは両方のアームはＰＮＡである。
【００１０】
ｂｉｓＰＮＡは、ホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合の両方を用いて核酸分子に結合するが、ｂｉｓＰＮＡの「アーム」は、必ずしも標的核酸分子上の同じ部位に結合しなければならないわけではない。さらに、ｂｉｓＰＮＡのホーグスティーン結合は、一般に、核酸配列のポリプリンストレッチにのみ結合するので、純粋にｂｉｓＰＮＡを用いて検出され得る配列の数および多様性は、幾分制限される。
【００１１】
本発明は、その一方で、ｂｉｓＰＮＡ分子の利点を有するが、ワトソン−クリック結合アームの存在に起因して特有配列を同定し得る分子を提供する。すなわち、本発明の２アームプローブは、代表的なｂｉｓＰＮＡによって結合される標的核酸分子のサブセットに結合し、そしてそれらの結合パターンは、一部、ワトソン−クリック結合アーム配列によって決定される。
【００１２】
一般に、この新規タイプのプローブのホーグスティーン結合アームは、ポリプリン標的部位に結合するが、それ自身が、ポリプリンまたはポリピリミジンヌクレオチド配列から構成され得る。この新規プローブのワトソン−クリック結合アームは、それが相補的である任意のヌクレオチド配列に結合し得る。従って、配列多様性の多くは、２アームプローブのワトソン−クリック結合アームに由来する。２アームプローブは、従って、ｂｉｓＰＮＡより稀な配列に結合するが、ｂｉｓＰＮＡの結合効率をなお保持している。ｂｉｓＰＮＡと形成されるようなホーグスティーン複合体は、（特定された時間の間、インキュベーション温度で存在するために）最小長さに依存するが、本明細書で記載される２アームプローブは、さらに、ポリプリンホーグスティーン結合アームを含むか、ｂｉｓＰＮＡのホーグスティーン結合アームより短いように設計され得る。なぜなら、結合安定性が、ワトソン−クリック結合アームによって同様に与えられるからである。
【００１３】
従って、本発明の１つの局面は、２アームプローブを含む組成物を提供する。より詳細には、この組成物は、第１の標的部位で標的核酸分子にホーグスティーン塩基対合により結合するホーグスティーン結合アーム、および第２の標的部位で標的核酸分子にワトソン−クリック対合によって結合するワトソン−クリック結合アームを含む。ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームは、互いに結合されている。
【００１４】
ホーグスティーン結合およびワトソン−クリック結合アームは、各々がポリマー、好ましくは線状ポリマーであり、核酸残基（例えば、ヌクレオチド、フクレオシド、またはアデニン、チミン、ウラシル、シトシン、グアニン、またはイノシンのような有機塩基）、または核酸残基の模倣物を含む。ポリマー骨格は、核酸残基（またはその模倣物）を一緒に連結する任意の骨格であり得、そしてそれ故、ホスホジエステル骨格、ホスホロチオエート骨格、ペプチド骨格などであり得る。これらアームは、組成において均一でなければならないことはなく、むしろ、各々は、核酸残基と核酸残基模倣物との組み合わせ、ならびに、例として、ホスホジエステル結合とペプチド結合との組み合わせのような骨格結合の組み合わせを含み得る。従って、アームの各々は、本明細書に記載されるような、核酸または核酸模倣物エレメントから構成され得る。
【００１５】
ホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合アームは、一部またはそれらの全体が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡ、それらの模倣物、および前述の組み合わせから構成され得る。好ましくは少なくとも１つ、そしてより好ましくは両方のアームはＰＮＡから構成される。ホーグスティーン結合アームおよび／またはワトソン−クリック結合アームは、各々が独立して少なくとも１つの骨格改変を有し得る。１つのアームの骨格改変は、他方のアームのそれとは異なり得る。いくつかの実施形態では、この骨格改変は、ペプチド改変（ＰＮＡにおけるような）またはホスホロチオエート改変であるが、それはそのように制限されない。
【００１６】
ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームは、例えば、共有結合また非共有結合により、互いに結合される。いくつかの実施形態では、それらは、リンカー分子（それはまた、本明細書ではテザーとも称され得る）を用いて互いに結合される。このリンカー分子は、標的核酸分子上のそれらの個々の標的部位に結合するそれらの能力に対して衝撃を与えることなく、これらアームを互いに結合するために適切な任意のリンカーであり得る。それらは、制限されないで、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（Ｏリンカー）、Ｅリンカー、およびＸリンカーを含む。いくつかの例では、リンカー分子は、切断可能な結合、好ましくは、光（恐らくは、特定波長の）また化学的試薬のような外部刺激への曝露に際し切断される結合のような容易に切断可能な結合を含む。このリンカー分子は、２アームプローブが用いられ適用に依存して任意の長さであり得る。いくかの実施形態では、それは、１００オングストロームより少ない、７５オングストロームよりも少ない、５０オングストロームより少ない、２５オングストロームよりも少ない、または１０オングストロームより少ない長さを有する。
【００１７】
ホーグスティーン結合アームは、ホモプリンヌクレオチド配列またはホモピリミジンヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を有する。本明細書で用いられるとき、用語「ヌクレオチド配列」は、プローブのアームを構成するポリマーの各単位上の塩基の配列をいう。従って、いくつかの例では、本明細書で用いられるときこの「ヌクレオチド」は糖、そして恐らくはリン酸残基を欠くが、相補鎖と対合する塩基に含まれる有機塩基をなお含む。これは、例えば、アームが１つ以上のＰＮＡ残基を含むときの事例であり得る。同じ但書きが、ワトソン−クリック結合アームについて適用され、それは、それ自身がランダムであるヌクレオチド配列を有し得る。
【００１８】
ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームのいずれか、または両方は、適用に依存して任意の長さであり得、そして２〜１０００より多いヌクレオチド長さ、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド長さそしてなおより好ましくは２〜２０ヌクレオチド長さの範囲であり得る。１つの実施形態では、これらアームは、独立して５〜１２ヌクレオチド長さである。１つのアームの長さは、他方のアームの長さとは独立しており、そしてこれ故、ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームの長さは、同じであり得るか、または異なり得る。
【００１９】
１つの実施形態では、第１の標的部位および第２の標的部位は、所望の適用および配列解像度に依存して、１塩基対、２塩基対、５塩基対、７塩基対、１０塩基対、２０塩基対、および２５塩基対、またはそれ以上の距離だけ、（一本鎖または二本鎖核酸分子であり得る、標的核酸分子上で）互いに間隔を置いて離れている。その他の実施形態では、この距離は、０〜１００ｂｐ、または３〜１５ｂｐである。いくつかの関連する実施形態では、ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームは、１塩基対、２塩基対、５塩基対、７塩基対、１０塩基対、２０塩基対、２５塩基対、またはそれ以上の距離だけ互いから離れた間隔である。その他の実施形態では、この距離は、０〜１００ｂｐ、または３〜１５ｂｐである。塩基対における距離は、当業者によってオングストロームに変換され得る。この距離は、ホーグスティーン結合アームとワトソン−クリック結合アームの連結端部間の距離に対応し得る。例えば、両方のアームが、両方がカルボキシ（Ｃ）およびアミノ（Ｎ）末端を有するＰＮＡである場合、そのときは、この距離は、ホーグスティーン結合アームのＮ末端と、ワトソン−クリック結合アームのＣ末端との間の距離に対応し得る（例えば、図３Ａに示されるように）。この距離はまた、両方のアームがそれらの標的部位に結合されるとき、これらの端部間の距離に対応する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ホーグスティーン結合アームは試薬に結合され、および／またはワトソン−クリック結合アームは試薬に結合される。この試薬は検出可能な標識であり得る。
【００２１】
この２アームプローブ（および／またはその個々のアーム成分）は、電子スピン共鳴分子（例えば、ニトロキシルラジカル）、蛍光分子、化学発光分子、ラジオアイソトープ、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、電気電荷運搬分子、半導体ナノクリスタル、半導体ナノ粒子、コロイド金ナノクリスタル、リガンド、ミクロビーズ、磁性ビーズ、常磁性粒子、量子ドット、色原体基質、アフィニティー分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗原、ハプテン、抗体、抗体フラグメント、および脂質を含むがこれらに限定されない群から選択される検出可能な標識を含み得る。
【００２２】
この検出可能な標識は、検出システムを用いて検出され得る。この検出システムは、（電荷結合デバイス（ＣＣＤ）検出システムのような）元来電気的であり得るか、またはそれは、（写真フィルム検出システムのような）元来非電気的であり得るが、それはそのように制限されない。この検出システムは、電荷結合デバイス検出システム、電子スピン共鳴検出システム、蛍光検出システム、電気検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学的検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近距離場検出システム、および全反射（ＴＩＲ）検出システムを含むがこれらに限定されない群から選択され得る。
【００２３】
この試薬はまた、細胞傷害性試薬または核酸切断剤であり得るが、それはそのように制限されない。
【００２４】
標的核酸分子は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｒＲＮＡのような、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得るが、それはそのように制限されない。標的核酸分子はまた、検出可能標識のような試薬で標識され得る。これらの検出可能な標識は、標的核酸分子の骨格（全部または一部）を標識し得るか、またはそれは、（セントロメアまたは反復配列のような）標的核酸分子上の特異的な「ランドマーク」を標識し得る。
【００２５】
関連する局面では、本発明は、上記に開示のような、そしてワトソン−クリック結合アームにホーグスティーン結合アームを結合するリンカーを含む、２アームプローブを提供する。
【００２６】
なお別の局面では、本発明は、標的核酸分子を標識するための方法を提供し、標的核酸分子を、上記に開示のような２アームプローブ組成物と接触する工程、およびこの組成物を、この標的核酸分子に特異的に結合させる工程を包含する。
【００２７】
２アームプローブ組成物について上記に記載の実施形態は、この方法に等しく適用され、そしてそれ故、本明細書で繰り返されない。
【００２８】
この方法は、制限されずに、標的核酸分子への２アームプローブの結合を検出する工程、または２アームプローブの標的核酸分子への結合のパターンを決定する工程のようなさらなる工程をさらに包含し得る。２アームプローブの標的核酸分子への結合は、Ｇｅｎｅ  Ｅｎｇｉｎｅ（登録商標）、ＦＩＳＨ、または光学的マッピングのような線状ポリマー分析システムを用いて決定され得る。２アームプローブの結合はまた、標的核酸分子からの切断産物を検出および測定することにより決定され得る。いくつかの実施形態では、結合のパターンは、転写の損失の指標である。
【００２９】
本発明のこれらおよびその他の実施形態は、本明細書中により詳細に記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
図面は例示の目的のために提供され、そしてそれらは、本発明を実施可能にするために必要とされないことを理解すべきである。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一部、先行技術のプローブより大きな効率およびより迅速に非ホモプリン標的に結合する新規なプローブ設計の発見に関する。これらの分子は、標的核酸分子に結合する（そしてそれによって「標識する」）ために用いられ得る。これらの分子は、それらは、最小、その一方が標的核酸分子とのホーグスティーンハイブリッドを形成し、そしてその他方が標的核酸分子とのワトソン−クリックハイブリッドを形成する、２つの鎖またはアームから構成されるので、２アームプローブと称される。この２アームプローブは、一本鎖または２本鎖核酸のような標的核酸分子上の異なるが、なお近接する標的部位に結合するように設計されている。好ましくは、この２アームプローブは、２つのアームを互いに連結するリンカーを含む。本発明は、この２アームプローブの使用の組成物および方法を提供する。
【００３２】
本明細書で用いられるとき、隣接する標的部位は、互いに近傍にある部位であるが、必ずしも互いにすぐ次である必要はない。本明細書で用いられるとき、連続する部位は、互いにすぐ次にあるものである。従って、本明細書でより詳細に記載されるように、ホーグスティーンおよびワトソン−クリックアームに対する個々の標的部位は、連続的であり得るか、またはそれらは互いに離れて間隔を置かれ得る。同様に、この標的部位は、標的の同じ鎖上に存在し得るか、またはそれらは、２本鎖標的の対向する鎖上に存在し得る。
【００３３】
２アームプロープの結合効率（結合の速度によって測定され得る）は、ｓｓＰＮＡまたはＤＮＡ−またはＲＮＡ−ベースのオリゴヌクレオチドプローブのそれより大きい。しかし、本発明の２アームプローブは、ホーグスティーンアームの必要なポリプリン配列のため、それらが結合する、（ｓｓＰＮＡまたはＤＮＡ−またはＲＮＡ−ベースのオリゴヌクレオチドプローブと比較したとき）標的のより制限されたセットを有する。２アームプローブの結合効率は、ｂｉｓＰＮＡのそれに近似するが、それは、ワトソン−クリック結合アームの存在に起因してｂｉｓＰＮＡよりも制限された結合パターンを有する。
【００３４】
任意の特定の機構によって拘束されることは意図しないが、１つの局面では、本発明は、配列特異的様式で標的核酸分子を結合する２アームプローブの能力を開発することであると考えられる。一旦、ホーグスティーン結合アームが、適切なコンポーネントに結合されると、ワトソン−クリック結合アームの結合がより効率的に生じる。ホーグスティーン結合アームは、ワトソン−クリック結合アームを、標的核酸分子上のその相補体の近傍に保持するアンカーとして作用する。
【００３５】
２アームプローブの標的核酸分子へのハイブリダイゼーションは、本明細書に記載のように、ｂｉｓＰＮＡ分子の機構と類似の機構を用いて増大され得る。ホーグスティーン結合アームは、ホーグスティーン塩基対合により、２本鎖ヘリックスに直接結合し、そして局所融解（すなわち、開放）および２本鎖ヘリックスの侵入を必要としない。これ故、ホーグスティーン結合アームは、２本鎖核酸と迅速に複合体を形成し得る。なぜなら、このような結合に対する低エネルギー障壁のためであり、そしてそのようにすることで、ワトソン−クリック結合アームを標的部位の近傍に配置するためのアンカーとして作用するからである。ワトソン−クリック結合アームは、２本鎖標的に侵入しなければならないので、律速段階は、２本鎖ヘリックスを局所融解することである。このヘリックスの開放を促進するため、ハイブリダイゼーション反応は、通常、高められた温度で、またはより低い塩濃度で実施される。ハイブリッドを形成するために、ワトソン−クリック結合アームは、融解の時にその標的部位の近傍になければならない。一旦、ワトソン−クリック結合アームの局所濃度が（ホーグスティーン結合アームの結合を経由して）増加すると、そのときは、図２Ｂおよび２Ｃに示されるように、ワトソン−クリック結合アームがその標的に結合する可能性は増加する。
【００３６】
２アームプローブのハイブリダイゼーション速度はまた、この２アームプロープ構造中に正電荷を取り込むことによって増加され得る。この例は、ＰＮＡ構造中へのリジン残基の取り込みである。
【００３７】
図２は、ｄｓＤＮＡ標的への２アームプローブの結合を示す。図２Ａは、ポリプリンモチーフ（これは、すべてアデニン（Ａ）塩基、すべてグアニン（Ｇ）塩基、またはＡおよびＧ塩基の混合物のいずれかから構成される）をともなうｄｓＤＮＡを示す。図２Ｂは、ｄｓＤＮＡおよび２アームプローブのホーグスティーン結合アーム（「Ｈ−アーム」）から構成される、３重鎖の形成を示す。ワトソン−クリック結合アーム（即ち、「ＷＣアーム」）は、ホーグスティーン結合部位に隣接する（必ずしも連続である必要はない）ヌクレオチド配列に相補的である配列を有する。しかし、このＷＣアームは、２本鎖ヘリックスが開くまで標的ｄｓＤＮＡとハイブリダイズすることはできない。図２Ｃは、一旦ｄｓＤＮＡが開く（これは、例えば、上昇した温度で生じ得る）と、この２アームプローブのＷＣアームがヘリックスに侵入し、そしてその相補的ヌクレオチド配列とワトソン−クリック塩基対合を形成することを示す。この例では、ＷＣアームが対向するＤＮＡ鎖に結合することに注目のこと。
【００３８】
図３は、ｄｓＤＮＡのような標的核酸分子上の２アームプローブの可能な配向を示す。図３Ａおよび３Ｂは、ｄｓＤＮＡの標的部位に対し、両方がＰＮＡであるＨアームおよびＷＣアームの配向を示す。このＨアームは、ポリプリン（Ｒ）ヌクレオチド配列（ここで、Ｒは、Ａ、ＧまたはＡおよびＧの混合物であり得る）を含み、そしてそれ自身を、図３Ａに示されるように、ホーグスティーン対合した複合体を形成するためにその標的部位の５’末端でそのＣ末端と整列する。次に、このＷＣアームの水素は、Ｈアームが結合されるＤＮＡの同じ鎖、しかしＨアーム結合部位に隣接している部位に結合する。図３Ｂは、ポリピリミジン（Ｙ）ヌクレオチド配列（ここで、Ｙはシトシン塩基（Ｃ）またはチミン塩基（Ｔ）またはＣおよびＴ塩基の混合物）を含み、そしてそれ自身を、そのホーグスティーン標的部位の５’末端でそのＮ末端と整列するＨアームを示す。このＷＣアームは、ワトソン−クリック塩基対合を経由してＤＮＡの対向する鎖に結合する。両方の場合において、ＷＣアームは、任意の組み合わせの塩基からなる標的部位（各Ｎは、独立してＡ、Ｇ、ＣもしくはＴ、またはその誘導体もしくは模倣物であり得る）に結合し得る。しかし、このＷＣアームは、それ自身に相補的である配列に結合する。その一方、Ｈアームは、それ自身に相補的である配列に結合し得るが、それはそのように制限されない。ＨおよびＷＣアームを一緒に連結するリンカーの長さは、形成され得る複合体および各アームの個々の標的部位間の距離に影響し得る。他の配向もまた可能であることが理解されるべきであり、これには、２アームＰＮＡのＮ末端が、標的の１つの鎖へのワトソン−クリック結合で関与すること、および２アームＰＮＡのＣ末端が標的の対向する鎖へのホーグスティーン結合で関与する配向を含まれる。本明細書で提供される教示に基づき、当業者は、本発明の２アームプローブを用いて可能である、ホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合の種々の配向を想定し得る。
【００３９】
本発明によれば、２アームプローブが、その他のプローブ設計と特に比較するとき、標的核酸分子（ｄｓＤＮＡのような）と迅速かつ効率的にハイブリダイズするように設計され、かつ示されている。例として、２アームプローブは、先行技術のｂｉｓＰＮＡプローブがするように迅速かつ効率的にｄｓＤＮＡとのハイブリッドを形成し得、これは、リンカー分子と、またはリンカーなしで互いに付着した２つのＰＮＡから同様に構成される。ｂｉｓＰＮＡの１つのアームは、ホーグスティーン塩基対合により標的核酸分子にハイブリダイズし、その一方、他方のアームは、ワトソン−クリック塩基対合によって標的核酸分子上の同じ部位にハイブリダイズする。しかし、ｂｉｓＰＮＡプローブは、それらの配列認識能力が制限されている。なぜなら、ホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合アームが同じ標的部位に結合しなければならないからである。ホーグスティーン結合は、標的ホモプリンヌクレオチド配列とのみ生じ得るので、ｂｉｓＰＮＡを用いて検出され得る配列は、ホモプリン配列のみである。本明細書に提供される２アームプローブは、この様式に制限されない。なぜなら、ホーグスティーン結合アームは、ワトソン−クリック結合アームと同じ標的部位に結合する必要はないからである（逆もまた同様）。
【００４０】
２アームプローブの各アームの標的部位は、好ましくは、緊密に隣接している（例えば、０〜１０００塩基対の範囲）。しかし、図２に示されるように、それらは、互いにすぐ隣接（すなわち、連続的）である必要はない（図２Ａ）。好ましい実施形態では、２アームプローブのアーム（そして結果として、ＨアームおよびＷＣアームの標的部位）は、互いにすぐ隣接していない（すなわち、連続していない）。いくつかの例では、ＨアームとＷＣアームは、１０００塩基対（ｂｐ）より大きい、または５００ｂｐより大きい、または１００ｂｐより大きい、または１〜１００ｂｐの間、または１〜５０ｂｐの間、または１〜２５ｂｐの間、または３〜１５ｂｐの間の距離だけ、本明細書であたかも明瞭に記載されるようにそれらの間のすべての整数を含んで分離していることが好ましい。以下のより詳細に記載されるように、プローブの２つのアームは、互いに直接、またはリンカーを経由して間接的に結合され得る。２アームプローブの２つのアーム間の距離（そしてそれ故、各アームがハイブリダイズする標的部位間の距離）は、これらアームを連結するリンカーの長さおよび可撓性によって制御され得る。
【００４１】
この２アームプローブは、本明細書に記載のような多くの適用に用いられ得、制限されないで、標的配列情報、および転写および／または標的からの翻訳の阻害を決定することを含む。別の適用は、配列特異的末端標識のための２アームプローブの使用である。ホーグスティーン結合アームは、ハイブリダイゼーション効率を増大し、その一方、ワトソン−クリック結合アームは、標的核酸分子末端に結合し、そして長いＤＮＡ分子（例えば、ゲノムＤＮＡフラグメント）上の他に結合されることを避ける。末端標識を実施する能力は、Ｇｅｎｅ  Ｅｎｇｉｎｅ（登録商標）のような単一のポリマー分析器を用いる適用で特に有用である（２００２年３月１２日に発行された米国特許第６，３５５，４２０号Ｂ１に記載のように）。これら後者の適用では、（ＤＮＡのような）標的分子の末端またはその近傍に位置している特有の配列を標識することがしばしば所望される。
【００４２】
２アームプローブはまた、特定のヌクレオチド配列の存在（そしてその逆に不在）を検出するために用いられ得る。これらの配列は、特定条件と関連する既知の変異に対応し得るか、またはそれらは、遺伝子材料の供給源を同定するために用いられ得る（例えば、法医学的または同定目的のためのフィンガープリンティング）。いくつかの実施形態では、これら配列は特有であり、そしてそれ故、好ましくは、サンプルに結合する１つのみの２アームプローブが存在する。標的配列は長いかも知れず、例えば、（例えば、ハンチントン病で観察されるような）増幅または短縮化されるゲノムまたはミトコンドリアＤＮＡの領域であり得る。あるいは、それは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に対応し得る。
【００４３】
標的核酸分子への２アームプローブの結合パターンは、ＤＮＡ物理的マップのような標的に関する配列情報を誘導するために用いられ得る。上記で述べたように、２アームプローブ（そしてそれ故、その相補配列）の長さは、このような情報の解像度をある程度まで制御する。例えば、２アームプローブが長い場合、そのときは解像度は低い。２アームプローブが短くなるほど、連続的に位置決めされたプローブが互いから識別され得ることを前提に、可能な解像度は高くなる。すなわち、連続的に位置決めされたプローブは、用いられる検出システムの解像限度より大きい距離で間隔を置いて配置されるべきである。これは、２００３年３月２７日に公開され、その全体の内容が本明細書にそれら全体で援用される、公開された米国特許出願公開第ＵＳ−２００３−００５９８２２−Ａ１により詳細に記載されている。
【００４４】
図４は、例えば、制限エンドヌクレアーゼによる切断に対して選択された部位を保護するための２アームプローブの使用を示す。大部分の制限エンドヌクレアーゼは、パリンドローム配列に特異的である（すなわち、核酸を切断するそれらの能力は、パリンドローム配列を認識および／または結合するそれらの能力に依存している）。パリンドローム配列の例は、図に示されている。箱の配列は、ポリピリミジン配列（すなわち、ＣＣＴ）およびポリプリン配列（すなわち、ＡＧＧ）から構成され、そしてそれ故、それは、本発明の２アームプローブとハイブリダイズし得、そしてそれによって、ヌクレアーゼ攻撃に対して保護される。ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ配列５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’を認識、結合、および切断する。この配列は、示されるように、２アームプローブにハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、制限配列の隣接領域にハイブリダイズするより長いアームを用いることが好適であり得る（例えば、室温における場合）。相補的隣接配列は、ＷおよびＨアームの１つまたは両方に付加され得る。
【００４５】
ホーグスティーン結合アームは、それが標的分子とホーグスティーンハイブリダイゼーションし得ることを前提に、任意のタイプの核酸または核酸模倣物から構成され得る。その配列は、一般に、ポリプリンまたはポリピリミジン（図３Ａおよび３Ｂに示されるような）であり得、それは、すべてアデニン、すべてグアニン、またはアデニンとグアニンとの混合物、あるいはすべてシトシン、すべてチミジン、またはシトシンとチミジンとの混合物から構成され得ることを意味する。いくつかの実施形態では、ホーグスティーン結合アームには、ポリピリミジンヌクレオチド配列が好ましい。
【００４６】
ワトソン−クリック結合アームは、同様に、それが標的とワトソン−クリックハイブリダイゼーションし得ることを前提に、任意のタイプの核酸または核酸模倣物から構成され得る。その配列は、完全にランダムであり、そして特定の適用において、標的上に求められる特定タイプの配列によってのみ指示される。
【００４７】
２アームプローブ（およびその個々の構成アームの各々）は、ＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸、ならびにＰＮＡのような核酸模倣物（例えば、ｓｓＰＮＡおよびｐｃＰＮＡ）、ＬＮＡ、または上記のコポリマーもしくは組み合わせ（例えば、ＤＮＡ／ＬＮＡコポリマー）を含み得る。重要な実施形態では、プローブの少なくとも１つのアーム、そして好ましくは両方のアームはＰＮＡである。これらの後者の実施形態では、プローブは、２アームＰＮＡと称され得る。この２アームプローブは、ホーグスティーンアームであるポリピリミジンまたはポリプリンヌクレオチド配列のいずれか、およびワトソン−クリックアームであるランダムヌクレオチド配列から構成される。
【００４８】
ホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合アームの長さは、それらの組み合わされた長さが標的核酸分子と安定な複合体を形成するに十分な長さであることを前提に、互いに独立している。必要なハイブリッド安定性のレベルは、適用に依存して変動する。例えば、２アームプローブがインビトロ配列決定の目的のために標的を標識するために用いられるべきとき、そのときは、恐らくは減少した温度で、複合体は数時間安定である必要があり得る。しかし、２アームプローブが、標的核酸分子の転写または翻訳を阻害するために、アンチセンス分子として用いられるべきとき、そのときは、複合体は、恐らくは体温で数日間安定である必要があり得る。
【００４９】
プローブの特異性は、一部、その長さに依存している。２アームプローブと標的核酸分子との間の単一のミスマッチのエネルギーコストは、より長い配列についてより、より短い配列について相対的により高い。平衡特異性は、項ｅｘｐ（−ΔＧ／ｋＴ）に依存し、ここでΔＧは、ミスマッチに起因する自由エネルギー損失である。より短い配列は、より低い融解温度を有する。融解領域の近傍では、同じエネルギー損失は、かなりより強い影響を有し得る。同様の機構が、ストリンジェント条件下のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに関与している。従って、小配列のハイブリダイゼーションは、より長い配列のハイブリダイゼーションより特異的であり得る。
【００５０】
適切なプローブ長さを決定する際の別の考慮は、検出されるべき標的が特有であるか否かである。この方法が、標的核酸分子を配列決定することを意図する場合、そのときは、それは、非特有配列を標的にすることが好ましい。なぜなら、このアプローチは、特有配列に対応する単一の結合事象より多くの配列情報を生じるからである。非特有配列は、連続的結合事象を識別するために、標的核酸分子中で互いから十分に間隔を置いて離れているべきである。結合事象が、検出システムの解像限度内で生じる場合、そのときは、これらの事象は、解像されず、そしてそれ故、データの半分は失われる。好ましくは、標的配列は、標的核酸分子に沿って別個の部位として識別され得る距離でランダムにあるべきである。
【００５１】
２アームの長さは、同じであり得るが、これは必須ではない。いくつかの実施形態では、ホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合アームの長さが異なることが好ましい。ホーグスティーン結合アームは、標的核酸分子中のポリプリンまたはポリピリミジン配列の最も一般的な長さと同じ長さであり得る。ワトソン−クリック結合アームは、例えば、得られるべき配列情報に依存してより長くまたははより短くあり得る。より長い配列はより稀であり、そして平均してより大きな距離で間隔を置いて離れている。より短い配列はより一般的であり、そして互いにより短い距離で存在する。従って、いくつかの例では、より短いワトソン−クリック結合アームは、高解像度の配列情報が所望される場合に所望される。その他の例では、より長いワトソン−クリック結合アームが、特有配列が求められる場合に所望される。しかし、２アームプローブの結合は、両方のアームが関与し、全体の配列がその結合部位を決定していることに注目することが重要である。従って、ＷＣアームの影響は、ＷＣアームのみが存在しているより少ない。
【００５２】
これらの但書きにもかかわらず、本発明のホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合アームは、少なくとも４ヌクレオチドから、１０００ヌクレオチド長を超えるまでの範囲の任意の長さであり得る。ホーグスティーン結合アームは、それ故、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、または少なくとも２００ヌクレチオド長、またはそれより長くあり得る。これらのサイズ範囲は、ワトソン−クリック結合アームに等しく適用される。ホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合アームの各々の好ましい長さは、各々が、５〜２０の間、そしてより好ましくは５〜１２ヌクレオチドの間である。
【００５３】
２アームプローブの必ずしもすべて残基が標的核酸分子中の相補的残基にハイブリダイズする必要はないことを理解すべきである。例えば、標的部位は、長さが５０残基であり得、なおこれら残基のほんの２５が２アームプローブにハイブリダイズする。好ましくは、ハイブリダイズする残基は、互いに連続的である。しかし、ハイブリダイゼーションは、ホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合アームの両方で起こるべきである。なぜなら、複合体の安定性およびその結合効率は、ホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合の両方の存在に関係しているからである。
【００５４】
１つの実施形態では、同じ長さの２アームプローブのライブラリーが生成される。好ましくは、このライブラリーは、その特定の長さに対する配列のすべての組み合わせを含む。ライブラリーの各メンバーは、（以下に論議されるように）別個の標識で標識され得、そしてそれ故、その他のライブラリーメンバーから識別可能である。標的核酸分子は、ライブラリーに曝され得、そして検出され得るすべての２アームプローブの結合について分析される。
【００５５】
その一方で、方法が、特有配列、例えば、トランスローケーション事象のような変異配列、または特定の障害または疾患への素因に関連する遺伝子変異の存在を試験するために用いられる場合、そのときは、２アームプローブは、その真実の相補物のみを捕獲するためにより長くあり得る。各２アームプローブの別個の標識が与えられ、そしてそれ故、２アームプローブの組み合わせが標的核酸分子に適用されれば、所定の操作で１つ以上の特有配列が分析され得、各２アームプローブが特有に標識されていることを前提に、それらの結合が同時に分析され得る。
【００５６】
ホーグスティーン結合アームを、ワトソン−クリック結合アームを局在化するためにアンカーとして用いる一方で、それはまた配列情報を与えることを理解すべきである。好ましくは、ホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合アームの両方が、配列情報が誘導されるときに標的に結合しているので、この情報は、ホーグスティーン結合アーム配列（または代わって、その相補物）およびワトソン−クリック結合アーム配列（または代わって、その相補物）を含む。これは、ワトソン−クリック結合アームのみを用いて入手可能であるより多い配列情報である。
【００５７】
先に述べたように、ホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合アームの個々の標的部位は、必ずしも互いにすぐ隣接している必要はない。実際、いくつかの実施形態では、個々の標的部位の間には距離がある。
【００５８】
プローブの２つのアームは、同様に、それらの間にスペースありまたはなしで互いに連結され得る。好ましいいくつかの実施形態では、ホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合アームの連結された端部間には距離がある。
【００５９】
ホーグスティーン結合アームとワトソン−クリック結合アームとの間の長さが既知である場合、標的部位の相対的位置決めもまた既知である。例えば、２アームプローブが、最後のホーグスティーン塩基と最初のワトソン−クリック塩基との間の１００オングストロームの距離で設計される場合（即ち、ワトソン−クリックアームに連結されたホーグスティーン塩基間の距離、そして逆もまた同様）、そのときは、標的部位間に約３０塩基対の距離が存在する。この距離は、Ｂ形態ＤＮＡ中の２つの隣接する塩基対間の３．４オングストロームの距離を考慮している。ワトソン−クリックアームとホーグスティーンアームとの間にテザーが存在し、そして標的部位がヘリックスの異なる側上にある場合には、ＤＮＡシリンダーの周りの２アームプローブの配置を容易にするため、テザー領域中に余分の３ｎｍが取り込まれなければならない。３０ｂｐ距離の場合には、両方の標的部位は、ＤＮＡヘリックスの同じ側にあり（１０ｂｐ／ターンの距離とする）、そしてこれ故、さらなるテザー長さを取り込む必要はない。
【００６０】
本明細書で用いる「標的核酸分子」は、本発明の２アームプローブを用いて分析されているか、または影響される核酸分子である。この分析は、標的部位がサンプル中に存在または不在であるかを決定すること、または標的核酸分子の配列を一部またはその全部決定すること（解像の変動する程度で）、（標的からの転写を阻害すること、または標的の切断を防ぐことのような）標的の活性を調節することなどを含み得る。２アームプローブはまた、高度に特異的なＰＣＲプライマーまたはプローブとして、および／または分子ビーコンとして用いられ得る。
【００６１】
２アームプローブは、細胞内適用に特に良好に適合されている。例えば、生存細胞に添加され、そしてそれに取り込まれ得るプローブの量には制限がある。生存細胞が曝され得、そしてなお生存したままである温度に関してもまた制限がある。本明細書中に提供される本発明の組成物およびその使用の方法は、２アームプローブを用いて行われ得る加速された速度のハイブリダイゼーションに起因してこれらの制限を克服する。生存細胞を用いる細胞内適用は、抗原およびアンチセンス技術を含むがこれに制限されるわけではない。
【００６２】
標的核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。この核酸分子は、（組織または細胞培養のような）生物学的サンプルから直接回収および／または単離され得るか、またはデノボ合成され得る。核酸分子の回収および単離は、当該技術分野では慣用的に実施され、そして標準的な分子生物学の教科書（例えば、分子生物学のＭａｎｉａｔｉｓのハンドブック）中に見出され得る。インビボの供給源から回収され得る核酸分子の例は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｒＲＮＡ、またはそのフラグメントであり得る。標的核酸分子は、一本鎖および二本鎖核酸であり得る。いくつかの実施形態では、この標的核酸分子は、ＰＮＡおよび／またはＬＮＡのような核酸模倣物から構成され得るが、それらはそのように制限されない。重要な実施形態では、この標的核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００６３】
本明細書に提供される方法の感度は、個々の核酸分子の分析（即ち、単一の標的核酸分子分析）を可能にする。これらの方法は、標的核酸分子の先のインビトロ増幅に依存しない。従って、いくつかの実施形態では、この標的核酸分子は、インビトロ増幅された核酸分子ではない。本明細書で用いられるとき、「非インビトロ増幅核酸分子」は、ポリメラーゼ連鎖反応または組換えＤＮＡ法のような技法を用いてインビトロで増幅されていない核酸分子をいう。非インビトロ増幅核酸分子は、インビボの細胞の発育の自然の結果として、（それが回収された生物学的サンプル中で）インビボで増幅される核酸分子であり得る。これは、この非インビトロ増幅核酸分子が、いくつかの変異したか、または悪性細胞中の共通の現象である、遺伝子座増幅の一部としてインビボで増幅されているものであり得ることを意味する。しかし、本発明は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む、増幅産物、またはその中間体である標的核酸分子を用いて実施され得る。
【００６４】
この標的核酸分子のサイズは、本発明には重要ではなく、そしてそれは、一般に、用いられる検出システムによってのみ制限される。標的核酸分子は、長さが、数ヌクレオチド、数百、数千、または数百万のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、この標的核酸分子は、染色体の長さであり得る。
【００６５】
用語「核酸分子」は、本明細書で、複数のヌクレオチド（即ち、ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））、またはプリン（例えば、アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ））またはイノシン（Ｉ）、あるいはそのアナログのいずれかである交換可能な有機塩基に連結された糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を意味するために用いられる。「核酸分子」および「核酸」は、交換可能に用いられ、そしてオリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチドをいう。これらの用語はまた、ポリヌクレオシド（即ち、ポリヌクレオチドからリン酸を除く）、および任意のその他の有機塩基を含むポリマーを含む。この有機塩基は、アデニン、ウラシル、グアニン、チミン、シトシンおよびイノシンを含む。核酸分子は天然に存在し得る（例えば、天然の供給源から得られる）か、または合成（例えば、核酸合成機を用いて作製される）であり得る。
【００６６】
核酸模倣物もまた、本発明に抱き込まれ、そして糖およびリン酸骨格の存在ありまたはなしで、互いに連結された塩基を含む化合物を含む。例は、ＰＮＡおよびＬＮＡを含むが、そのように制限されるわけではない。
【００６７】
核酸およびそれらの模倣物は、Ｃ−５プロピン改変塩基（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４０〜８４４，１９９６）、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、２−チオウラシル、シュードイソシトシン、およびその他の天然に存在する、および天然に存在しないヌクレオ塩基、置換および非置換芳香族成分のような置換されたプリンおよびピリミジンを含み得る。その他のこのような改変物は、当業者に周知である。
【００６８】
核酸分子はまた、塩基および／または糖における、ならびにそれらの骨格組成におけるような置換または改変を包含する。例えば、それらは、３’位置で水酸基以外の、そして５’位置でリン酸以外の低分子量の有機基に共有結合している骨格糖を有する核酸を含む。従って、改変された核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含み得る。さらに、改変された核酸は、リボースの代わりにアラビノースのような糖を含み得る。
【００６９】
ホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合アームは、核酸、その誘導体、または核酸模倣物である。本明細書における実施形態は、本発明のホーグスティーンおよびワトソン−クリック結合アームに等しく適用される標的核酸分子に関して記載される。
【００７０】
標的核酸分子、そしてより好ましくは、２アームプローブは、不均質または均質骨格を有し得る。２アームプローブがインビボで、例えば、エンド−およびエクソ−ヌクレアーゼを含む生存細胞または組織に添加されて用いられる場合、それらは、このような酵素からの分解に耐性であることが好適であり得る。「安定化された２アームプローブ」は、インビボ分解（例えば、エンド−およびエクソ−ヌクレアーゼによる）に比較的耐性であるプローブを意味し得る。安定化プローブの例は、ホスホロチオエート改変骨格、またはペプチド改変骨格（これは、本来非分解性である）を有するプローブである。しかし、これらの例は、限定することは意図されない。
【００７１】
標的核酸分子、そしてより詳細には、ホーグスティーン結合およびワトソン−クリック結合アームはまた、その他の骨格改変によって安定化され得る。本発明は、本明細書で論議されるペプチドおよびロックされた核酸に加えて、制限されずに、ホスホロチオエート結合ホスホジエステル改変核酸、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート核酸の組み合わせ、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホルホルアミデート、カルバメート、カーボネート、ホスフェートリエステル、アセトアミデート、カルボシキメチルエステル、メチルホルホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ、およびそれらの組み合わせのようなその他の骨格改変の使用を包含する。
【００７２】
その他の骨格改変、特にＰＮＡに関係する改変は、ペプチドおよびアミノ酸改変体および修飾物を含む。従って、ＰＮＡの骨格成分は、ペプチド結合であり得るか、またはそれに代わり、それらは非ペプチド結合であり得る。例は、アセチルキャップ、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（本明細書では、Ｏ−リンカーと称される）のようなアミノスペーサー、リジンのようなアミノ酸（ＰＮＡ中に正電荷が所望されるとき特に有用である）などを含み得る。種々のＰＮＡ改変が公知であり、そしてこのような改変を取り込むタグが、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．今やＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのような供給源から市販され入手可能である。
【００７３】
上記で述べたように、２アームプローブは、種々のＰＮＡタイプから構成され得る。ＰＮＡは、２−アミノエチルグリシン残基で置換されたそれらのリン酸骨格を有するＤＮＡアナログである。これらのグリシン残基は、グリシンアミノ窒素およびメチレンカルボニルリンカーを介してヌクレオチド塩基に連結される。ＰＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的の両方に、ワトソン−クリックおよびホーグスティーン塩基対合によって結合し得、そしてそうすることで、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドより強力なハイブリッドを形成する。
【００７４】
ＰＮＡは、標準的な固相ペプチド合成技術を用い、ペプチド結合によって連結されたモノマーから合成され得る（ＮｉｅｌｓｅｎおよびＥｇｈｏｌｍ  １９９９）。ＰＮＡ化学および合成は、ＰＮＡ設計中にアミノ酸およびペプチド配列の包含を可能にする。例えば、リジン残基は、ＰＮＡ骨格中に正電荷を導入するために用いられ得る。アミノ酸即鎖の改変のために利用可能なすべての化学的アプローチは、ＰＮＡに直接適用可能である。
【００７５】
ＰＮＡは、電荷中性の骨格を有し、そしてこれは、負に荷電した骨格を有するＤＮＡとのハイブリダイゼーションのその速度に寄与する（ＮｉｅｌｓｅｎおよびＥｇｈｏｌｍ  １９９９）。このＰＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションの速度は、正に荷電した側鎖をもつアミノ酸（例えば、リジン）の付加によるような、ＰＮＡ構造における正の電荷の導入によりさらに増加され得る。ＤＮＡ／ＰＮＡの安定性は、一般に、その環境のイオン強度とは独立であり（Ｏｒｕｍら、１９９５）、これは、ＰＮＡの非荷電性質に起因する可能性が最も高い。これは、ＰＮＡが、インビボまたはインビトロで用いられる多能をＰＮＡに提供する。しかし、正電荷を含むＰＮＡのハイブリダイゼーション速度は、イオン強度に依存しており、そしてそれ故、塩の存在下でより低い。
【００７６】
ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの構造は、特定のＰＮＡおよびその配列に依存している。ｓｓＰＮＡは、ｓｓＤＮＡに、ワトソン−クリック塩基対合を用い、そして好ましくはアンチ平行配向で結合する（即ち、ｓｓＰＮＡのＮ末端がｓｓＤＮＡの３’末端に対向している）。このｓｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡの開放から生じ得る。この相互作用の最終結果は、二本鎖複合体である。ｓｓＰＮＡはまた、ホーグスティーン結合対合でｄｓＤＮＡに結合し得、それによってｄｓＤＮＡ標的と三重鎖複合体（即ち、トリプレックス）を形成する（Ｗｉｔｔｕｎｇら、１９９７）。
【００７７】
ミスマッチの存在は、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドより大きな程度まで、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを不安定にする傾向がある（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。従って、ＰＮＡプローブは、標的配列に対してより特異的であり、なぜなら、それらは、高い程度の相補性（または絶対相補性）が存在するときのみ、安定な様式でそれに結合するためである。これの増加した特異性は、より短いＰＮＡを用いることによりさらに増大され得る。なぜなら、より長いハイブリッドは、より短いハイブリッドよりミスマッチの存在下でより安定であり
得るからである。
【００７８】
ｓｓＰＮＡは、最も単純なＰＮＡ分子である。このＰＮＡ形態は、核酸と相互作用し、ワトソン−クリック塩基対合を経由してハイブリッド二重鎖を形成する。この二重鎖は、ｄｓＤＮＡとは異なる空間的構造およびより高い安定性を有する（ＮｉｅｌｓｅｎおよびＥｇｈｏｌｍ  １９９９）。しかし、異なる濃度比が用いられるとき、および／または相補的ＤＮＡ鎖の存在下では、ＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡまたはＰＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡ三重鎖がまた形成され得る（Ｗｉｔｔｕｎｇら、１９９７）。二重鎖または三重鎖の形成は、さらにＰＮＡの配列に依存する。チミンが豊富なホモピリミジンｓｓＰＮＡは、ｄｓＤＮＡ標的とＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重鎖を形成し、ここで１つのＰＮＡ鎖は、ワトソン−クリックアンチ平行対合で含まれ、そして他方は平行ホーグスティーン対合で含まれる。シトシンが豊富なホモピリミジンｓｓＰＮＡは、好ましくはホーグスティーン対合によりｄｓＤＮＡに結合し、ＰＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡ三重鎖を形成する。ｓｓＰＮＡ配列が混合されるとき、それは、ｄｓＤＮＡ標的に侵入し、ＤＮＡ鎖を置換し、そしてワトソン−クリック二重鎖を形成する。ポリプリンｓｓＰＮＡはまた、逆ホーグスティーン対合で三重鎖ＰＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡを形成する。
【００７９】
ｐｃＰＮＡは、ｄｓＤＮＡａに付加される２つのｓｓＰＮＡを含む（Ｉｚｖｏｌｓｋｙら、２０００）。１つのｐｃＰＮＡは、標的配列に相補的であり、その一方で、他方は置換されるＤＮＡ鎖に相補的である。ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖がより安定であるとき、置換されたＤＮＡは、一般に、ｄｓＤＮＡ構造を回復しない。このＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＰＮＡ二重鎖よりも安定であり、そしてＰＮＡ成分は、自己相補性である。なぜなら、それらは、相補的ＤＮＡ配列に対して設計されているからである。これ故、添加されたＰＮＡは、好ましくは、互いにハイブリダイズする。ｐｃＰＮＡ単位の自己ハイブリダイズを防ぐために、アデニンの代わりに２，６−ジアミノプリン（Ｄ）、チミンの代わりに２−チオウラシル（ＳＵ）を含む改変された塩基がそれらの合成に用いられる。ＤおよびＳＵは、なお、ＴおよびＡとそれぞれハイブリダイズし得るが、それらの自己ハイブリダイゼーションは立体的に禁止される。
【００８０】
ｐｃＰＮＡはまた、標的核酸分子のヌクレオチド毎に２つの塩基対合を作製する。これ故、それは、ｓｓＤＮＡプローブから予測されるより大きな特異性で、短い配列に結合し得る。ｐｃＰＮＡのハイブリダイゼーションは、ｂｉｓＰＮＡのそれよりも効率的でなくあり得る。なぜなら、それは、複合体を形成するために３つの分子を必要とするからである。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＰＮＡから構成される２アームプローブが好適である。なぜなら、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドより安定であるからである。これは、特に、ゲノムＤＮＡのような２本鎖核酸を分析するとき重要である（特にインサイチュで実施される場合）、なぜなら、ＰＮＡは、標的上の相補的ＤＮＡ鎖によって置換されないからである。従って、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体は、室温で数日間存在し得る。さらに、ＰＮＡは、効率的かつ特異的ハイブリダイゼーション、安定複合体の形成、柔軟な化学、およびその他の酵素による分解に対する耐性の利点を提供する。
【００８２】
ＬＮＡは、ＤＮＡとハイブリッドを形成し、それは、低塩濃度で少なくともＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドと同程度安定である（ＢｒａａｓｃｈおよびＣｏｒｅｙ  ２００１）。しかし、このハイブリダイゼーションに対するエネルギー障壁は、ＬＮＡ骨格負電荷のために、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのそれよりかなり高い。従って、ＬＮＡのハイブリダイゼーション動力学は、ＰＮＡのそれより遅くあり得る。ＬＮＡの結合効率は、いくつかの実施形態では、ＰＮＡについて本明細書に記載されるように、それに正電荷を添加することにより増加され得る。市販の核酸合成機および標準的なホルホルアミダイト化学を用いてＬＮＡオリゴヌクレオチドを作製する。従って、混合されたＬＮＡ／ＤＮＡ配列の生産は、混合されたＰＮＡ−ペプチド配列のそれと同様に単純である。
【００８３】
２アームプローブは、ホーグスティーン結合アームを、ワトソン−クリック結合アームに連結することにより形成される。この結合は、元来、共有結合であるか、または非共有結合であり得るが、共有結合が好適である。ホーグスティーン結合アームのワトソン−クリック結合アームへの結合は、しかし、いずれかのアームがその相補的配列を認識かつ結合する能力を妨害すべきではない。
【００８４】
ホーグスティーン結合アームおよびワトソン−クリック結合アームは、リンカーを経由して直接的または間接的のいずれかで互いに結合される。いくつかの事例では、リンカーは、立体的妨害から生じる問題を克服し得る。ここで、ホーグスティーンおよび／またはワトソン−クリック標的部位への接近が、恐らくは、２アームプローブの他方のアームへの近接度に起因して防止される。好ましくは、このリンカーは、２アームプローブの両方のアームが、それらの個々の標的部位と相互作用するに十分長くかつ可撓性である。
【００８５】
これらのリンカーは、種々の分子の任意であり得、好ましくは非活性で、例えば、Ｃ１〜Ｃ３０の直鎖またはなお分岐している炭素鎖、飽和または不飽和、ホスホリピド、アミノ酸、そして特にグリシンなど、天然物または合成物である。さらなるリンカーは、アルキルおよびアルケニルカーボネート、カルバメート、およびカルバミドを含む。これらは、先に述べたＣ１〜Ｃ３０のようなリンカーにすべて関連し、そしてそれに極性官能性を付加し得る。
【００８６】
広範な範囲のスペーサーが用いられ得、これらの多くは、例えば、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．（今はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のような供給元から市販され入手可能である。スペーサーは、有機スペーサーに限定されず、そしてむしろまた無機（例えば、−Ｏ−Ｓｉ−Ｏ−、またはＯ−Ｐ−Ｏ−）であり得る。さらに、それらは、元来、不均質であり得る（例えば、有機エレメントおよび無機エレメントから構成される）。本質的に、その末端に反応基をもつ任意の分子が、スペーサーとして用いられ得る。例は、Ｅリンカー（これはまた、溶解度増加剤として機能する）、Ｅリンカーに類似しているＸリンカー、グリコールリンカーであるＯリンカー、および芳香族一級アミン基を含むＰリンカーを含む（すべては、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．今は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって供給される）。その他の適切なリンカーは、アセチルリンカー、４−アミノ安息香酸を含むリンカー、Ｆｍｏｃリンカー、４−アミノ安息香酸リンカー、８−アミノ−３，６−ジオキサクタン酸リンカー、スクシンイミジルマレイミジルメチルシクロヘキサンカルボキシレートリンカー、スクシニルリンカーなどである。適切なレンカーの別の例は、１９９６年６月１１日に発行された米国特許第５，５２５，４６５号中Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓらによって記載されるリンカーである。
【００８７】
スペーサーの長さは、適用およびホーグスティーン結合アーム、ワトソン−クリック結合アームの性質、および標的核酸分子上のそれらの標的間の許容され得る距離に依存して変動し得る。いくつかの重要な実施形態では、それは、１００ｎｍより大きくない長さを有し、そしていくつかの重要な実施形態では、それは、１〜１０ｎｍの長さを有する。
【００８８】
本明細書に記載される結合または改変は、慣用的な化学を採用し、これは、化学の当業者に公知である。保護基の使用、およびモノ−およびヘテロ−二官能性リンカーのような公知のリンカーは、文献（例えば、Ｈｅｒｍａｎ−Ｓｏｎ、１９９６）中に記載されており、そして本明細書では繰り返さない。
【００８９】
共有結合の詳細な例は、二官能性架橋リンカー分子が用いられるものを含む。この架橋リンカー分子は、結合される分子の性質に依存して、ホモ−二官能性またはヘテロ−二官能性であり得る。ホモ−二官能性架橋リンカーは、２つの同じ反応基を有する。ヘテロ−二官能性架橋リンカーは、連続的結合反応を可能にする２つの異なる反応基を有するとして規定される。種々のタイプの市販される入手可能な架橋リンカーは、以下の１つ以上の基と反応性である：一級アミン、二級アミン、スルフィドリル、カルボシキル、カルボニルおよび炭水化物。アミン特異的架橋リンカーの例は、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、ビス［２−（スクシンイミドキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、ジスクシンイミジルスベレート、ジスクシンイミジルタータレート、ジメチルアジピメート・２ＨＣｌ、ジメチルピメリミデート・２ＨＣｌ、ジメチルスベリミデート・２ＨＣｌ、およびエチレングリコールビス−［スクシンイミジル−［スクシネート］］である。スルフヒドリル基と反応性の架橋リンカーは、ビスマレイミドヘキサン、１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン、１−［ｐ−アジドサリチルアミド］−４−［ヨードアセトアミド］ブタン、およびＮ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミドを含む。炭水化物と優先的に反応性の架橋リンカーは、アジドベンゾイルヒドラジンを含む。カルボキシル基と優先的に反応性の架橋リンカーは、４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミンを含む。アミンおよびスルフヒドリルと反応するヘテロ二官能性架橋リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート、スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、スクシンイミジル［４−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル６−［３−［２−ピリジルジチオ］プロピオアミド］ヘキサノエート、およびスルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサノン−１−カルボキシレートを含む。カルボキシ基およびアミン基と反応するヘテロ二官能性架橋リンカーは、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミドヒドロクロライドを含む。炭水化物およびスルフヒドリルと反応するヘテロ二官能性架橋リンカーは、４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシヒドラジド・２ＨＣｌ、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−酪酸ヒドラジド・２ＨＣｌ、および３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジドを含む。架橋リンカーは、ビス−［β−４−アジドサリチルアミド］エチル］ジスルフィド、およびグルタルアルデヒドである。
【００９０】
アミド基またはチオール基は、二官能性架橋分子の付着のための点を提供するように、合成核酸の任意のヌクレオチドに付加され得る。核酸は、Ｕｎｉ−Ｌｉｎｋ  ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ、３’−ＤＭＴ−Ｃ６−Ａｍｉｎｅ−ＯＮ  ＣＰＧ、ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ  ＩＩ、Ｎ−ＴＦＡ−Ｃ６−ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ、Ｃ６−ＴｉｏｌＭｏｄｉｆｉｅｒ、Ｃ６−Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ＰｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅおよびＣ６−Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ＣＰＧ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）のよう結合能力のある試薬を取り込んで合成され得る。
【００９１】
結合の非共有結合もまた、ワトソン−クリック結合アームにホーグスティーン結合アームを結合するため、または２アームプローブに標識を付着するために用いられ得る。非共有結合は、疎水性相互作用、イオン的相互作用、ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジン複合体化およびその他の親和性相互作用のような高親和性相互作用を含む。例として、アビジンのような分子が、ホーグスティーン結合アームに付着され得、そしてその結合パートナービオチンがワトソン−クリック結合アームに付着され得る。別の例として、アビジンが２アームプローブに付着され得（恐らく好ましくは、存在する場合リリンカーに）そしてビオチンが試薬に付着され得る。
【００９２】
いくつかの例では、特定の条件下で切断可能である結合を含むリンカーを用いて２つのアームを付着することが所望され得る。例えば、この結合は、通常の生理学的条件下で切断するものであり得るか、または光のような刺激物の付与に際し、特異的に切断され得、それによって１つのアームが放出され得、標的核酸分子に結合した他方のアームを残すものであり得る。いくつかの実施形態では、ホーグスティーン結合アームを除去し、そして標的核酸分子に付着したワトソン−クリック結合アームのみを残すことが所望され得る。容易に切断可能な結合は、容易に加水分解可能な結合、例えば、エステル結合、アミド結合およびＳｈｃｉｆｆ塩基タイプの結合を含む。光によって切断可能な結合は当該分野で公知である。これらの切断可能な結合はまた、２アームプローブおよび／またはそれらの構成アームに試薬または検出可能な標識を付着するリンカーで用いられ得る。
【００９３】
２アームプローブは、検出可能な部分（即ち、検出可能標識）で標識され得る。本明細書で用いられるとき「検出可能標識」は、蛍光、電気的伝導度、放射能活性、サイズなどを含む種々の方法によって検出され得る分子または化合物である。この標識は、化学的、ペプチドまたは核酸性質であり得るが、それはそのように限定されない。標識は、例えば、その特定波長の光を発する、および／または吸収するその能力によって直接検出され得る。標識は、それ自身が特定波長の光を発するか、または吸収し得る別の化合物を結合、リクルートおよびいくつかの場合には、切断するその能力により間接的に検出され得る。間接検出の例は、基質を可視産物に切断する第１の酵素標識の使用である。
【００９４】
用いられる標識のタイプは、実施される分析の性質、用いられるエネルギー供給源のタイプおよび標的核酸分子および／または２アームプローブのタイプを含む種々の因子に依存する。標識は、標的核酸分子および２アームプローブと立体的、化学的に適合性であるべきである。この標識は、２アームプローブの標的核酸分子への結合を妨害するべきではなく、２アームプローブの結合特異性に衝撃を与えるべきではない。
【００９５】
一般に、検出可能な標識は、（例えば、ニトロオキシラジカルのような）電子スピン共鳴分子、蛍光分子、化学発光分子、ラジオアイソトープ、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、ストレプトアビジン分子、ペプチド、電気的電荷運搬分子、半導体ナノクリスタル、半導体ナノ粒子、コロイド金ナノクリスタル、リガンド、ミクロビーズ、磁性ビーズ、常磁性粒子、量子ドット、色原体基質、アフィニティー分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗原、ハプテン、抗体、抗体フラグメント、および脂質からなる群から選択され得る。本明細書で用いられるとき、用語「電荷伝達」および「電荷運搬」は交換可能に用いられる。本明細書で記載される検出可能な標識は、それらを検出するシステムによって言及される。例として、化学発光標識は、化学発光検出システムを用いて検出され得る標識である。
【００９６】
標識することは、２アームプローブ形成の前または後のいずれか、または２アームプローブの標的核酸分子への結合の前後で実施され得る。
【００９７】
検出可能標識は、３２Ｐまたは３Ｈのような放射性アイソトープ、光学的または電子密度マーカー、ジゴキシゲニンおよびジニトロフェニルのようなハプテン、ＦＬＡＧまたはＨＡエピトープのようなエピトープタグ、およびアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼなどのような酵素タグを含む。その他の標識は、化学発光基質、およびフルオレセインソチオシアナート（「ＦＩＴＣ」）、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄＴＭ、テトラメチルローダミンイソチオシアナート（「ＴＲＩＴＣ」）、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａおよび４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（「ＢＯＤＩＰＹ」）、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、Ｃｙ−７、Ｃｙ−ＣｈｒｏｍｅＴＭ−、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）、ＰｅｒＣＰアロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＰｈａｒＲｅｄＴＭ、Ｍａｕａｎ  Ｂｌｕｅ、ＡｌｅｘａＴＭ３５０、およびＣａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（登録商標）のような蛍光発色団を含む。
【００９８】
本発明によってまた想定されるのは、標識として米国特許第６，２０７，３９２号に記載の量子ドットのような半導体ナノクリスタルの使用である。量子ドットは、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＥｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販され入手可能である。
【００９９】
２アームプローブおよび／または標的核酸分子は、抗体または抗体フラグメントおよびそれらの対応する抗原またはハプテン結合パートナーを用いて標識され得る。このような結合した抗体およびタンパク質またはペプチドの検出は、当業者に周知の技法によって達成され得る。ジゴキシゲニンまたはジニトロフェニルのようなハプテン結合物の使用もまた、本明細書で良好に適合される。ハプテン結合物に応答して形成する抗体／抗原複合体は、標識を、ハプテンまたはハプテンを認識する抗体に連結すること、そして次に標識の部位を観察することにより容易に検出される。あるいは、抗体は、用いられる一次抗体に特異的である二次抗体またはそのフラグメントを用いて可視化され得る。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が用いられ得る。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ＦｄおよびＣＤＲ３領域を含む抗体フラグメントを含む。結合体はまた、二重特異性抗体を用いて標識され得る。
【０１００】
いくつかの例では、２アームプローブは、細胞傷害性試薬（例えば、抗生物質）または核酸切断酵素で標識され得る。このようにして、２アームプローブは、治療目的ならびに核酸検出および分析のために用いられ得る。これは、２アームプローブが、既知の、疾患に関する既知の遺伝子変異もしくは転座、または疾患の素因に特異的な配列を有する場合に特に有用である。
【０１０１】
検出可能標識は、当該分野で公知の任意の手段によって２アームプローブに連結または結合され得る。例えば、標識は、２アームプローブに直接付着され得るか、または２アームプローブに付着されているリンカーに付着される。２アームプローブは、リンカーを含むようにか、またはこのプロセスを促進するためにリンカーへの結合を容易にするように化学的に誘導体化され得る。例えば、蛍光発色団は、化学的手段によって直接核酸中に取り込まれているが、核酸中に導入された活性アミノ基またチオール基を通じて核酸中にまた導入されている。（ＰｒｏｕｄｎｉｋｏｖおよびＭｉｒａｂｅｋｏｖ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４：４５３５〜４５３２、１９９６）。２アームプローブ上で実施され得る改変手順、リンカーおよび／または標識の広範な説明は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６に見出され得、これは、参考として本明細書に援用されている。
【０１０２】
ＤＮＡの直接的化学的標識のいくつかの公知の方法がある（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６；Ｒｏｇｅｔら、１９８９；ＰｒｏｕｄｍｉｋｏｖおよびＭｉｒａｂｅｋｏｖ、１９９６）。方法の１つは、ＤＮＡの部分的脱プリン化によるアルデヒド基の導入に基づく。付着されたヒドラジン基での蛍光標識は、アルデヒド基と効率的に結合し、そしてヒドラジン結合は、ナトリウムを用いる還元により安定化され、標識効率は約６０％である。過剰のアミン蛍光発色団の存在下、シトシンの亜硫酸水素塩との反応は、Ｎ４位置におけるアミノ基転移に至る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６）。ｐＨ、アミノ蛍光発色団濃度、およびインキュベーション時間および温度のような反応条件は、形成される産物の収率に影響する。高濃度（３Ｍ）のアミン蛍光発色団では、アミノ基転移は１００％に到達し得る（ＤｒａｐｅｒおよびＧｏｌｄ、１９８０）。
【０１０３】
上記の方法に加え、蛍光標識されたヌクレオチドを用いて核酸を（例えば、自動化核酸合成機を用いて）デノボ合成することも可能である。このようなヌクレオチドは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｏｌｅｃｕｌｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒのような供給元から市販され入手可能である。
【０１０４】
標識は、当該分野で公知に任意の機構によって、２−アームプローブおよび／または標的核酸分子に取り付けられ得る。例えば、種々の標識と反応性である官能基は、制限されないで、（反応基：光放射性化合物の官能基）活性化エステル：アミンまたはアニリン；アシルアジド；アミンまたはアニリン；アシルハライド：アミン、アニリン、アルコールまたはフェノール；アシルニトリル；アルコールまたはフェノール；アルデヒド；アミンまたはアニリン；アルキルハライド：アミン、アニリン、アルコール、フェノールまたはチオール；アルキルスルホネート：チオール、アルコールまたはフェノール；アルデヒド：アルコール、フェノール、アミンまたはアニリン；アリールハライド：チオール；アジリジン：チオールまたはチオエーテル；カルボン酸：アミン、アニリン、アルコールまたはアルキルハライド；ジアゾアルカン：カルボン酸；エポキシド：チオール；ハロアセタミド：チオール；ハロトリアジン：アミン、アニリンまたはフェノール；ヒドラジン：アルデヒドまたはケトン；ヒドロキシアミン：アルデヒドまたはケトン；イミドエステル：アミンまたはアニリド；イソシアネート：アミンまたはアニリン；およびイソチオシアナート：アミンまたはアニリンを含む。
【０１０５】
２アームプローブに結合した標識は、同じタイプであり得、例えば、それらはすべて蛍光標識であり得るか、またはそれらはすべて放射活性標識であり得るか、またはそれらはすべて核磁気標識であり得る。同じタイプである標識は、（例えば、光学的照射のような）エネルギー供給源と一旦接触してそれらが生成するシグナルを基に互いからなお区別可能である。例として、２つの蛍光標識は、異なる波長の蛍光照射を発する場合、区別可能である。あるいは、標識は異なるタイプであり得、例えば、１つの標識は蛍光標識であり得、そして１つは放射活性標識であり得る。
【０１０６】
１つの実施形態では、標識は、ドナーまたはアクセプター蛍光発色団である。ドナー蛍光発色団は、その蛍光エネルギーを緊密に近接するアクセプター分子に運搬し得る蛍光発色団である。アクセプター蛍光発色団は、緊密に近接するドナーからエネルギーを受容し得る蛍光発色団である。（アクセプターは、蛍光発色団でなければならないことはない。それは，非蛍光性であり得る）。蛍光発色団は、それらに光を照射することにより、光化学的に励起状態またはより高いエネルギーレベルに促進され得る。励起波長は、一般に、紫外、青、または緑の領域のスペクトルである。この蛍光発色団は、それらのエネルギーを放出し、そして基底状態に戻る前に、非常に短い時間の期間の間、励起された状態にある。それらのエネルギーを放射される光として放散させる蛍光発色団は、ドナー蛍光は色団である。出て行く光子の波長分布は、放射スペクトルを形成し、これは、励起スペクトルより長い波長（より低いエネルギー）にピークを持つが、特定の蛍光発色団について等しく特徴的である。
【０１０７】
エネルギー転移システムの１つの改変例では、蛍光ドナーとクエンチングアクセプターの組み合わせが用いられる。この場合には、２−アームプローブは、「分子ビーコン」と同様に作動する。プローブが結合されないとき、アクセプターは、蛍光発色団の蛍光をリリカー可撓性によって消光する。それが結合されるとき、２つのアームは、アクセプターが消光することができないように十分互いに分離され、そしてその代わりプローブが蛍光を発する。
【０１０８】
核酸の分析は、標識からのシグナルを検出すること、およびこれら標識の互いに対する相対的位置を決定することを含む。いくつかの例では、そのように得られた情報を、分析されるその他の標的核酸分子からのそれと比較することを容易にする標準的マーカーで、標的核酸分子をさらに標識することが所望され得る。例えば、標準的マーカーは、骨格標識、特定のヌクレオチド配列に結合する標識（それが、特有の配列であっても、そうでなくても）または核酸分子中の特定の位置（例えば、複製起点、転写プロモーター、セントロメアなど）に結合する標識であり得る。
【０１０９】
骨格標識の１つのサブセットは、配列非依存性様式で核酸を結合する核酸染色である。例は、フェナンスリジンおよびアクリジンのようなインターカーレート剤（例えば、エチジウムブロマイト、プロピジウムアイオダイド、ヘキシジウムアイオダイド、ジヒドロエチジウム、エチジウムホモダイマー−１および−２、エチジウムモノアジド、およびＡＣＭＡ）；インドールおよびイミダゾールのようなマイナーグルーブ結合剤（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３４５８０およびＤＡＰＩ）；およびアクリジンオレンジ（またインターカーレートし得る）、７−ＡＤＤ、アクチノマイシンＤ、ＬＤＳ７５１、およびヒドロキシスチバミジンのような雑多核酸染色剤を含む。すべての前記の核酸染色剤は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．のような供給元から市販され、入手可能である。核酸染色剤のなおその他の例は、Ｍｏｌｅｃｕａｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓからの以下の色素を含む：ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＪＯＪＯ−１、ＬＯＬＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＳＹＴＯ−４０、−４１、−４２、−４３、−４４、−４５（青）、ＳＹＴＯ−１３、−１６、−２４、−２１、−２３、−１２、−１１、−２０、−２２、−１５、−１４、−２５（緑）、ＳＹＴＯ−８１、−８０、−８２、−８３、−８４、−８５（オレンジ）、ＳＹＴＯ−６１、−１７、−５９、−６１、−６２、−６０、−６３（赤）のようなシアン色素。
【０１１０】
核酸分子は、線状ポリマー分析システムを用いて分析される。線状ポリマー分析システムは、核酸分子のような線状様式にあるポリマーを分析するシステムである（即ち、ポリマーの１つの位置で開始し、そして次にそれからいずれかの方向に線状に進行する）。核酸分子が分析されるとき、それに付着された検出可能な標識は、逐次的または同時様式のいずれかで検出される。同時に検出されるとき、通常、シグナルは、核酸分子のイメージからであり、それから標識間の距離が決定され得る。逐次的に検出されるとき、シグナルはヒストグラム中で観察され（シグナル強度  対  時間）、それは、次に、核酸分子の速度の知識とともにマップに翻訳され得る。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、固相支持体に付着され、その一方、他では、それは自由に流動することが理解される。いずれの場合においても、例えば、相互ステーションまたは検出器を通過するときの標的核酸分子の速度は、互いに対して標識の位置を決定する際に支援する。
【０１１１】
従って、線状ポリマー分析システムは、核酸分子上の標識の合計量だけでなく、恐らくより重要なことには、このような標識の位置を推論し得る。標識を位置決めかつ配置する能力は、分析されているゲノムの領域を正しく判断し、および／または同定するために、その他の遺伝子マップ上に重ねられるべきこれらのパターンを可能にする。好ましい実施形態では、線状ポリマー分析システムは、核酸分子を個々に分析し得る（即ち、それらは、単一分子検出システムである）。
【０１１２】
このようなシステムの例は、１９９８年８月１３日、および２月２４日にそれぞれ公開された、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／３５０１２およびＷＯ００／０９７５７、ならびに２００２年３月１２日に発行された米国特許第６，３５５，４２０Ｂ１号に記載される、Ｇｅｎｅ  Ｅｎｇｉｎｅ（登録商標）システムである。これらの出願および特許の内容、ならびにその他の出願および特許のそれら、ならびにその中に引用される参考文献は、それらの全体が参考として援用される。このシステムは、単一の核酸分子が、線状様式で相互作用ステーションを通過することを可能にし、それによって核酸分子中のヌクレオチドは、核酸分子に結合した検出可能な標識が存在するか否かを決定するために、個々に取り調べられる。この取り調べは、核酸分子を、１セットの波長の照射のようなエネルギー供給源に曝すことを含む。エネルギー供給源曝露に応答して、ヌクレオチド上の検出可能な標識は、（存在すれば）検出可能なシグナルを発する。シグナル放射および検出の機構は、検出することが求められる標識のタイプに依存する。
【０１１３】
この線状ポリマー分析システムは、光学的照射を発するための光源；光学的照射、および検出可能なシグナルを生成するためにこの光学的照射に曝される核酸分子を受けるための相互作用ステーション；およびシグナルを含む検出された照射に基づき、核酸分子を分析するために構築および配置されたプロセッサーを備える。本発明の上記の局面に記載されるように、この核酸分子は、２−アームプローブに結合している。
【０１１４】
１つの実施形態では、相互作用ステーションは、局在化された照射スポットを含む。さらなる実施形態では、このシステムは、標的核酸分子を受け、そしてこれを、局在化された照射スポットを通って進行するよう構築されている微小チャネルをさらに備え、必要に応じて、局在化した照射スポットを生成し得る。別の実施形態では、このシステムは、偏光器をさらに備え、ここで、光源は、照射のビームを発するために構築されたレーザーを含み、そしてこの偏光器は、ビームを偏光するよう配置されている。レーザービームは、元来偏光されているが、ある種のダイオードレーザーは、偏光器の使用からの利益を受け得る。いくつかの実施形態では、この局在化された照射スポットは、相互作用ステーション中に位置決めされたスリットを用いて生成される。このスリットは、１ｎｍ〜５００ｎｍの範囲、または１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲のスリット幅を有し得る。いくつかの実施形態では、偏光器は、ビームがスリットに到達する前にそれを偏光するよう配置されている。その他の実施形態では、偏光器は、スリットの幅と平行にビームを偏光するように配置されている。
【０１１５】
なお別の実施形態では、光源は、チップ上に一体化された光源である。励起光はまた、外部ファイバーまたは一体化された光ガイドを用いて送達され得る。後者の例では、このシステムは、チップに送達される外部レーザーからの第２の光源をさらに備え得る。
【０１１６】
標的核酸分子を分析するための別の方法は、局在化された照射スポットを生成するために既知の波長の光学的照射を生成すること；標的核酸分子を微小チャネルを通って通過させること；標的核酸分子をこの局在化された照射スポットで照射すること；続いて、局在化された照射スポットにおける標的核酸分子の光学的照射との相互作用から得られる照射を検出すること；およびこの検出された照射に基づき、標的核酸分子を分析することを包含する。
【０１１７】
１つの実施形態では、この方法は、微小チャネルを通って標的核酸分子を通過させるために電場をさらに採用する。別の実施形態では、検出する工程は、標的核酸分子が微小チャネルを通過している間に、経時的にシグナルを収集することを包含する。
【０１１８】
ＤＮＡ分子のような標的核酸分子の伸長を含む、その他の単一分子核酸分析法もまた、本発明の方法で用いられ得る。これらは、光学的マッピング（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９３；Ｍｅｎｇら、１９９５；Ｊｉｎｇら、１９９８；Ａｓｔｏｎ、１９９９）およびファイバー−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ファイバー−ＦＩＳＨ）（Ｂｅｎｓｉｍｏｎら、１９９７）を含む。光学的マッピングでは、核酸分子は、流体サンプル中で伸長され、そしてゲル中または表面上に伸長された形態で固定される。次に、制限消化が、伸長され、かつ固定された核酸分子に対して実施される。次に、順序立てた制限マップが制限フラグメントのサイズを決定することにより生成される。ファイバーＦＩＳＨでは、核酸分子は、分子コーミングによって表面上で伸長および固定される。蛍光的に標識された２−アームプローブとのハイブリダイゼーションは、標的核酸分子上の配列目印の決定を可能にする。両方の方法は、伸長された分子の固定を必要とし、その結果、分子長さ、および／またはマーカー間の距離が測定され得る。パルスフィールドゲル電気泳動は、標識された核酸分子を分析するために用いられ得る。パルスフィールドゲル電気泳動は、Ｓｃｈｗａｒｔｚら（１９８４）によって記載されている。その他の核酸分析システムがＯｔｏｂｅら（２００１）、Ｂｅｎｓｉｍｏｎら、２００１年６月１９日発行米国特許第６，２４８，５３７号に、ＨｅｒｒｉｃｋおよびＢｅｎｓｉｍｏｎ（１９９９）、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、２０００年１１月２１日発行米国特許第６，１５０，０８９号および２００１年９月２５日発行米国特許第６，２９４，１３６号によって記載されている。その他の線状ポリマー分析システムもまた用いられ得、そして本発明は、本明細書に列挙されたもののみに制限されることは意図されない。
【０１１９】
本明細書に記載されたシステムは、少なくとも１つの検出システムを包含する。このような検出システムの性質は、検出可能な標識の性質に依存する。検出システムは、当該技術分野で公知の任意の数の検出システムから選択され得る。これらは、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）検出システム、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）検出システム、蛍光検出システム、電気検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学的検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近距離場検出システム、および全反射（ＴＩＲ）検出システムを含み、これらの多くは、電磁気検出システムである。
【０１２０】
（等価物）
先行するのは、特定の実施形態の単なる詳細な説明であることが理解されるべきである。従って、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、そして慣用的な実験より多くはなしで種々の改変および等価物がなされ得ることは当業者に明らかである。このようなすべての改変および等価物は、添付の請求項の範囲内に包含することが意図される。
【０１２１】
すべての刊行物、本出願に引用される特許および特許出願は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１Ａ〜図１Ｄは、ＤＮＡである標的核酸分子と、変化するタイプのＰＮＡプローブとの間の異なるモードの結合および複合体形成を示す概略図である。
【図２】図２は、２アームＰＮＡの標的ｄｓＤＮＡへの結合を示す概略図である。
【図３】図３は、２アームプローブをともなう標的ｄｓＤＮＡの可能な構造を示す概略図である。
【図４】図４は、例えば、制限エンドヌクレアーゼによる切断に対して選択された部位を保護するための２アームＰＮＡの使用を示す概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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