(57)【要約】本発明は、一般的には血小板新生活性を有する新規ペプチド及び関連化合物に関する。本発明の化合物は哺乳動物において血小板または血小板前駆体（例えば、巨核球）の産生を高めるために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｐｌ受容体に結合し、配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｐ−Ｔ−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｗ−Ｌ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８
（式中、Ｘ１〜Ｘ４、Ｘ９〜Ｘ１０及びＸ１３〜Ｘ１８はそれぞれ独立してアミノ酸である）
を含み、配列：
Ｘ１９−Ｘ２０−Ｉ−Ｅ−Ｇ−Ｐ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ｑ−Ｗ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ａ−Ｘ２１−Ｘ２２
（式中、Ｘ１９〜Ｘ２０及びＸ２１〜Ｘ２２はそれぞれ独立してアミノ酸である）
を有する化合物よりも高いｍｐｌ受容体に対する結合アフィニティーを有する化合物及びその医薬的に許容され得る塩。
【請求項２】
ｍｐｌ受容体に結合し、配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｐ−Ｔ−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｗ−Ｌ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８
（式中、Ｘ１〜Ｘ４、Ｘ９〜Ｘ１０及びＸ１３〜Ｘ１８はそれぞれ独立してアミノ酸である）
を含み、配列：
Ｘ１９−Ｘ２０−Ｉ−Ｅ−Ｇ−Ｐ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ｑ−Ｗ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ａ−Ｘ２１−Ｘ２２
（式中、Ｘ１９〜Ｘ２０及びＸ２１〜Ｘ２２はそれぞれ独立してアミノ酸である）
を有する化合物よりも高い生物活性を有する化合物及びその医薬的に許容され得る塩。
【請求項３】
Ｘ１はＡ、Ｖ、Ｗ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｒ及びＨからなる群から選択され、
Ｘ２はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｓ及びＣからなる群から選択され、
Ｘ３はＬ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｋ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ４はＬ、Ｇ、Ｑ、Ｄ、Ｅ及びＨからなる群から選択され、
Ｘ９はＫ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ１０はＱ及びＥからなる群から選択され、
Ｘ１３はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｑ、Ｅ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ１４はＡ、Ｗ、Ｔ、Ｙ、Ｃ及びＱからなる群から選択され、
Ｘ１５はＶ、Ｌ、Ｇ、Ｙ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ１６はＡ、Ｌ、Ｆ、Ｇ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ１７はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｃ、Ｑ及びＮからなる群から選択され、
Ｘ１８はＡ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｇ、Ｃ、Ｑ及びＫからなる群から選択される
請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ１はＡ、Ｖ、Ｗ、Ｍ、Ｇ、Ｃ、Ｅ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ２はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｇ、Ｓ、Ｃ、Ｄ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ３はＡ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｑ、Ｋ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ４はＬ、Ｇ、Ｑ、Ｄ及びＥからなる群から選択され、
Ｘ９はＫ、Ｒ及びＨからなる群から選択され、
Ｘ１０はＱ及びＥからなる群から選択され、
Ｘ１３はＡ、Ｌ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｅ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ１４はＬ、Ｗ、Ｍ、Ｃ、Ｑ及びＨからなる群から選択され、
Ｘ１５はＶ、Ｌ、Ｐ、Ｇ、Ｙ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ１６はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｋ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ１７はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、Ｃ及びＮからなる群から選択され、
Ｘ１８はＡ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｃ、Ｑ及びＫからなる群から選択される
請求の範囲第２項に記載の化合物。
【請求項５】
ｍｐｌ受容体に結合し、配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｒ−Ｅ−Ｇ−Ｐ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ｑ−Ｗ−Ｌ−Ｘ１３−Ｗ−Ｒ−Ｒ−Ｘ１７−Ｘ１８
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ１３、Ｘ１７及びＸ１８はそれぞれ独立してアミノ酸である）
を含む化合物。
【請求項６】
ｍｐｌ受容体に結合し、配列番号２〜配列番号３０
【表１】
2005523682.tif 000030
2005523682.tif 000031
からなる群から選択される配列を含む化合物。
【請求項７】
環状である請求の範囲第１項、第２項または第６項に記載の化合物。
【請求項８】
アミノ酸残基の少なくとも１つがＤ立体配置を有する請求の範囲第１項、第２項または第６項に記載の化合物。
【請求項９】
全てのアミノ酸残基がＤ立体配置を有する請求の範囲第１項、第２項または第６項に記載の化合物。
【請求項１０】
請求の範囲第１項、第２項または第６項に記載の化合物のダイマーまたはマルチマー。
【請求項１１】
ｍｐｌ受容体に結合し、式：
（ＬＮ１）ｌ−（ＴＭＰ１）ａ−（ＬＮ２）ｍ−（ＴＭＰ２）ｂ−（ＬＮ３）ｎ−（ＴＭＰ３）ｃ−（ＬＮ４）ｏ−（ＴＭＰ４）ｄ
（式中、ＴＭＰ１、ＴＭＰ２、ＴＭＰ３及びＴＭＰ４はそれぞれ独立して請求の範囲第１項、第２項及び第６項に記載の化合物からなる群から選択され、ＬＮ１、ＬＮ２、ＬＮ３及びＬＮ４はそれぞれ独立してリンカーであり、ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｌ、ｍ、ｎ及びｏはそれぞれ独立して０〜２０の整数である）
を含む組成物。
【請求項１２】
更にベヒクルを含み、式：
（Ｖ１）ｖ−（ＬＮ１）ｌ−（ＴＭＰ１）ａ−（ＬＮ２）ｍ−（ＴＭＰ２）ｂ−（ＬＮ３）ｎ−（ＴＭＰ３）ｃ−（ＬＮ４）ｏ−（ＴＭＰ４）ｄ−（Ｖ２）ｗ
（式中、Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立してベヒクルであり、ｖ及びｗはそれぞれ独立して０〜１の整数である）
を有する請求の範囲第１１項に記載の組成物。
【請求項１３】
ＬＮ１、ＬＮ２、ＬＮ３及びＬＮ４はペプチドからなる請求の範囲第１２項に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｖ１及び／またはＶ２はＦｃドメインからなる請求の範囲第１２項に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｖ１及び／またはＶ２はＩｇＧ１  Ｆｃドメインからなる請求の範囲第１２項に記載の組成物。
【請求項１６】
請求の範囲第１２項に記載の組成物からなる群から選択される組成物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求の範囲第１２項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求の範囲第１２項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
細胞が大腸菌細胞である請求の範囲第１２項に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
細胞が原核細胞である請求の範囲第１２項に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
細胞が真核細胞である請求の範囲第１２項に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
有効量の請求の範囲第１２項に記載の組成物をその医薬的に許容され得る担体と共に含む医薬組成物。
【請求項２３】
治療有効量の請求の範囲第１２項に記載の組成物を投与することを含む哺乳動物における血小板減少症の治療方法。
【請求項２４】
治療有効量の請求の範囲第１２項に記載の組成物を投与することを含む治療を要する患者における巨核球または血小板の増加方法。
【請求項２５】
ｍｐｌ受容体に結合し、式：
（Ｖ１）ｖ−（ＴＭＰ１）ａ−（Ｖ２）ｗ
（式中、Ｖ１及びＶ２はそれぞれＩｇＧ１  Ｆｃドメインであり、ｖが１のときｗは０であり、ｖが０のときｗは１であり、ＴＭＰ１は配列番号２〜３０のペプチドであり、ａは１〜２０の整数である）
からなる化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、包括的には血小板新生活性を有するペプチド及び関連化合物に関する。本発明の化合物は哺乳動物において血小板または血小板前駆体（例えば、巨核球）の産生を高めるために使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、血小板及びその前駆体細胞（例えば、巨核球）のインビトロ及びインビボ産生を刺激する能力を有する化合物、特にペプチドに関する。以下、血小板新生活性を有することが公知の２つのタンパク質、すなわちトロンボポエチン（ＴＰＯ）及び巨核球成長発達因子（ＭＧＤＦ）に関する背景技術を説明する。
【０００３】
内因性トロンボポエチン（ＴＰＯ）のクローニングにより（Ｌｏｋら，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５６８−５７１（１９９４）；Ｂａｒｔｌｅｙら，Ｃｅｌｌ，７７：１１１７−１１２４（１９９４）；Ｋｕｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１１１０４−１１１０８（１９９４）；ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５３３−５３８（１９９４）；Ｋａｔｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１９：２２９−２３６（１９９５）；Ｃｈａｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７０：５１１−５１４（１９９５））、巨核球新生（巨核球産生）及び血小板新生（血小板産生）に対する我々の理解が急速に深まった。
【０００４】
主に肝臓及び腎臓で産生される６０〜７０ｋＤａグリコシル化タンパク質である内因性ヒトＴＰＯは３３２アミノ酸から構成されている（Ｂａｒｔｌｅｙら，Ｃｅｌｌ，７７：１１１７−１１２４（１９９４）；Ｃｈａｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７０：５１１−５１４（１９９５））。前記タンパク質は異なる種間で高度に保存され、ヒトエリスロポエチンとはアミノ末端（アミノ酸１〜１７２）（Ｂａｒｔｌｅｙら，Ｃｅｌｌ，７７：１１１７−１１２４（１９９４））で２３％の相同性を有する（Ｇｕｒｎｅｙら，Ｂｌｏｏｄ，８５：９８１−９８８（１９９５））。内因性ＴＰＯは血小板新生の主要生物学的調節因子の特徴をすべて有していることが判明している。そのインビトロ作用には、精製マウス造血幹細胞（Ｚｅｉｇｌｅｒら，Ｂｌｏｏｄ，８４：４０４５−４０５２（１９９４））及びヒトＣＤ３４＋細胞（Ｌｏｋら，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５６８−５７１８１９９４）；Ｒａｓｋｏら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，１５：３３−４２（１９９７））からの巨核球コロニーの特異的誘導、高い倍数性での巨核球の生成（Ｂｒｏｕｄｙら，Ｂｌｏｏｄ，８５：４０２−４１３（１９９５））、及び末端巨核球成熟及び血小板産生の誘導（Ｚｅｉｇｌｅｒら，Ｂｌｏｏｄ，８４：４０４５−４０５２（１９９４）；Ｃｈｏｉら，Ｂｌｏｏｄ，８５：４０２−４１３（１９９５））が含まれる。逆に、ＴＰＯ受容体（ｃ−ｍｐｌ）に対する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは巨核球祖先のコロニー形成能を大きく抑制する（Ｍｅｔｈｉａら，Ｂｌｏｏｄ，８２：１３９５−１４０１（１９９３））。更に、ｃ−ｍｐｌノックアウトマウスはかなり血小板減少性であり、巨核球欠乏である（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｂｌｏｏｄ，８７：２１６２−２１７０（１９９６））。
【０００５】
組換えヒトＭＧＤＦ（ｒＨｕＭＧＤＦ；カリフォルニア州サウザンドオークスに所在のＡｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．）はＴＰＯに関連する別の血小板新生ポリペプチドである。これは、ヒトＴＰＯのアミノ末端受容体結合ドメインを包囲する切断タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌を用いて産生される（Ｕｌｉｃｈら，Ｂｌｏｏｄ，８６：９７１−９７６（１９９５））。前記ポリペプチドは抽出、リフォールディング及び精製され、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分はアミノ末端に共有結合している。本明細書中、生じた分子をＰＥＧ−ｒＨｕＭＧＤＦまたはＭＧＤＦと略称する。
【０００６】
動物モデルを用いたいろいろな研究（Ｔ．Ｒ．Ｕｌｉｃｈら，Ｂｌｏｏｄ，８６：９７１−９７６（１９９５）；Ｍ．Ｍ．Ｈｏｋｏｍら，Ｂｌｏｏｄ，８６：４４８６−４４９２（１９９５））から、ＴＰＯ及びＭＧＤＦが骨髄移植において及びしばしば化学療法または放射線治療により生ずる状態である血小板減少症の治療において治療上有効であることが明らかに立証された。ヒトにおける予備データーから、ＭＧＤＦが各種設定で血小板数の増加に有用であることが確認された（Ｂａｓｓｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ，３４８：１２７９−８１（１９９６）；Ｋａｔｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１９：２２９−２３６（１９９５）；Ｕｌｉｃｈら，Ｂｌｏｏｄ，８６：９７１−９７６（１９９５））。健康な血小板提供者にＭＧＤＦを投与するとその提供者の循環血小板数が元の値の約３倍に増加するので、ＭＧＤＦは血小板提供プロセスを強化するために使用され得るであろう。
【０００７】
ＴＰＯ及びＭＧＤＦは、主にある造血細胞（例えば、巨核球、血小板、ＣＤ３４＋細胞及び原始始原細胞）の表面上で発現するｃ−ｍｐｌ受容体への結合を介してその作用を発揮する（Ｎ．Ｄｅｂｉｌｉら，Ｂｌｏｏｄ，８５：３９１−４０１（１９９５）；Ｆ．Ｊ．ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５３３−５３８（１９９４）；Ｔ．Ｄ．Ｂａｒｔｌｅｙら，Ｃｅｌｌ，７７：１１１７−１１２４（１９９４）；Ｓ．Ｌｏｋ，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５６５−８（１９９４））。インターロイキン及びタンパク質ホルモンに対する多くの受容体と同様に、ｃ−ｍｐｌはクラスＩサイトカイン受容体スーパーファミリーに属する（Ｉ．Ｖｉｇｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５６４０−５６４４（１９９２））。このクラスの受容体の活性化はリガンド結合誘導受容体ホモダイマー化を含み、これによりシグナル伝達事象のカスケードがトリガーされる。
【０００８】
一般的に、タンパク質リガンドとその受容体の相互作用は多くの場合比較的大きな界面で起こる。しかしながら、受容体に結合したヒト成長ホルモンの場合に立証されているように、界面上の数少ない主要残基が結合エネルギーの大部分に実際関与している（Ｔ．Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７：３８３−３８６（１９９５））。この事実と残りのタンパク質リガンドの大部分が右トポロジーで結合エピトープを表示するだけに役立つという事実から、非常に小さい活性リガンドを見つけることができる。従って、“ペプチド”長（例えば、２〜８０アミノ酸）の分子のみが所与の大型タンパク質リガンドの受容体タンパク質に結合し得る。前記ペプチドは大型タンパク質リガンドの生物活性を模倣し得るか、または競合結合により大型タンパク質リガンドの生物活性を阻害し得、通常“ペプチド模擬体”または“模擬ペプチド”と称されている。
【０００９】
ファージディスプレーペプチドライブラリーは前記ペプチド模擬体を同定する際の強力な方法として提案された。例えば、いずれも援用により本明細書に含まれるとするＪ．Ｋ．Ｓｃｏｔｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６（１９９０）；Ｊ．Ｊ．Ｄｅｖｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４（１９９０）；１９９３年６月２９日に付与された米国特許第５，２２３，４０９号明細書；１９９８年３月３１日に付与された米国特許第５，７３３，７３１号明細書；１９９６年３月１２日に付与された米国特許第５，４９８，５３０号明細書；１９９５年７月１１日に付与された米国特許第５，４３２，０１８号明細書；１９９４年８月１６日に付与された米国特許第５，３３８，６６５号明細書；１９９９年７月１３日に付与された米国特許第５，９２２，５４５号明細書；１９９６年１２月１９日に公開された国際特許出願公開第９６／４０９８７号パンフレット；及び１９９８年４月１６日に公開された国際特許出願公開第９８／１５８３３号パンフレットを参照されたい。前記ライブラリーでは、ランダムペプチド配列が糸状ファージのコートタンパク質との融合により表示されている。典型的には、表示ペプチドは受容体の抗体固定化細胞外ドメインに対してアフィニティー溶離される。保持されたファージは一連のアフィニテイー精製及び再増殖により濃縮され得る。最良の結合ペプチドを配列決定すると、ペプチドの１つ以上の構造的に関連するファミリー内の主要残基を同定し得る。例えば、Ｃｗｉｒｌａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１６９６−９（１９９７）を参照されたい。ペプチド配列から、残基がアラニンスキャンニングまたはＤＮＡレベルでの突然変異誘発により安全に置換され得ることも示唆され得る。最良の結合剤の配列を更に最適化するために突然変異誘発ライブラリーが構築され、スクリーニングされ得る（Ｌｏｗｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，２６：４０１−２４（１９９７））。
【００１０】
タンパク質−タンパク質相互作用の構造分析も、大型タンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを示唆するために使用され得る。前記分析では、結晶構造から大型タンパク質リガンドの重要な残基の同定及び相対方位が示唆され、そこからペプチドが設計され得る。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：１２６６−７０（１９９７）を参照されたい。上記分析方法はまた、ファージディスプレーにより選択されたペプチドと受容体タンパク質の相互作用を調べるために使用され得、そこから結合アフィニティーを高めるためのペプチドの更なる修飾が示唆され得る。
【００１１】
他の方法はペプチド研究においてファージディスプレーと対抗する。ペプチドライブラリーはｌａｃリプレッサーのカルボキシ末端に融合し、大腸菌において発現され得る。別の大腸菌ベース方法により、ペプチドグリカン関連リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合により細胞外膜上で表示され得る。以後、この方法及び関連方法をまとめて“大腸菌ディスプレー”と称する。別の方法では、リボソーム放出前にランダムＲＮＡの翻訳を停止し、その結果関連ＲＮＡが依然として結合したポリペプチドライブラリーが生ずる。以後、この方法及び関連方法をまとめて“リボソームディスプレー”と称する。他の方法はＲＮＡに連結したペプチドを用いる。例えば、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎテクノロジー，Ｐｈｙｌｏｓ，Ｉｎｃ．。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＳｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２２９７−３０３（１９９７）を参照されたい。以後、この方法及び関連方法をまとめて“ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング”と称する。ペプチドが安定な非生物材料（例えば、ポリエチレンロッドまたは溶媒浸透性樹脂）上に固定化されている化学誘導ペプチドライブラリーが開発された。別の化学誘導ペプチドライブラリーはガラススライド上に固定したペプチドをスキャンするために写真平板法を用いている。以後、これらの方法及び関連方法をまとめて“化学−ペプチドスクリーニング”と称する。化学−ペプチドスクリーニングは、Ｄ−アミノ酸や他の非天然アナログ及び非ペプチド要素を使用できる点で有利であり得る。生物学的及び化学的方法はＷｅｌｌｓ及びＬｏｗｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：３５５−６２（１９９２）で検討されている。概念上、ファージディスプレー、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング及び上記した他の方法を用いてタンパク質のペプチド模擬体を見つけることができる。
【００１２】
ファージディスプレーペプチドライブラリー法を用いることにより、ｃ−ｍｐｌ受容体のアゴニストとして作用する小ペプチド分子が発見された（Ｓ．Ｅ．Ｃｗｉｒｌａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１６９６−１６９９（１９７７））。この研究では、糸状ファージのコートタンパク質への融合物として表示されたランダム小ペプチド配列がｃ−ｍｐｌの抗体固定化細胞外ドメインに対してアフィニティー溶離され、残ったファージは第２回アフィニティー精製のために濃縮された。この結合選択及び再増殖プロセスを何回も繰り返して、密接な結合剤のプールを濃縮した。その結果、配列の点で相互に関連しないｃ−ｍｐｌ結合ペプチドの２ファミリーがまず同定された。その後、最良結合剤を更に最適するために突然変異誘発ライブラリーを構築し、最後にＩｃ５０＝２ｎＭ及びＥＣ５０＝４００ｎＭを有する非常に活性なペプチドが単離された（Ｓ．Ｅ．Ｃｗｉｒｌａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１６９６−１６９９（１９９７））。この１４残基ＴＰＯ模擬体はＴＰＯにもＭＧＤＦに対しても明らかな配列相同性を持たない。この特定ＭＰＯ模擬ペプチド（ＴＭＰ）化合物の構造は一文字アミノ酸略記を用いて以下の通りである。
【００１３】
【化１】
2005523682.tif 000002
【００１４】
従来、ＥＰＯ模擬ペプチドに対する同様の研究で、ＥＰＯ模擬ペプチド（ＥＭＰ）が同一方法を用いて発見され（Ｎ．Ｃ．Ｗｒｉｇｈｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：４５８−４６３（１９９６））、ＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）に対する結合においてダイマーとして作用することが判明した。こうして形成された（リガンド）２／（受容体）２複合体はＸ線結晶学データーによるとＣ２対象性を有していた（Ｏ．Ｌｉｖｎａｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：４６４−４７１（１９９６））。この構造情報に基づいて、２つのＥＭＰモノマーのＣ末端が可撓性スペーサーで架橋されているＥＭＰの共有結合ダイマーを設計し、大きく向上した結合及びインビボ／インビトロ生物活性を有することが判明した（Ｎ．Ｃ．Ｗｒｉｇｈｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：１２６１−１２６５（１９９７））。
【００１５】
類似のＣ末端ダイマー化戦略をＴＰＯ模擬ペプチド（ＴＭＰ）に適用した（Ｓ．Ｅ．Ｃｗｉｒｌａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１６９６−１６９９（１９９７））。特定ＴＰＯ模擬ペプチドのＣ末端結合ダイマー（Ｃ−Ｃ連結）が０．５ｎＭの改善された結合アフィニティーを有し、細胞増殖アッセイにおいて高いインビトロ活性（ＥＣ５０＝０．１ｎＭ）を有していることが判明した（Ｓ．Ｅ．Ｃｗｉｒｌａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１６９６−１６９９（１９９７））。
【００１６】
組換えタンパク質の治療用途に対する利用可能性から、前記タンパク質の薬剤としての特性を強化または改善するためにタンパク質修飾が進められた。前記修飾により、タンパク質分解を減らすかまたは無くすことにより高いタンパク質保護及び低い分解を与え得る。別の利点には、特定環境で治療用タンパク質の安定性、循環時間及び生物活性の上昇が含まれる。タンパク質修飾を記載している文献はＦｒａｎｃｉｓ，「成長因子について(Focus on Growth Factors)」，３：４−１０，英国ロンドンに所在のＭｅｄｉｓｃｒｉｐｔ（１９９２年５月）発行である。
【００１７】
タンパク質治療剤の有用な修飾には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びデキストランのようなポリマーへの結合が含まれる。前記修飾は、いずれも援用により本明細書に含まれるとする米国特許出願第０９／４２８，０８２号明細書（発明の名称：治療剤としての修飾ペプチド）及び国際特許出願公開第００／２４７８２号パンフレットにおいて詳細に検討されている。
【００１８】
別の修飾は免疫グロブリン分子のＦｃ領域の使用である。抗体は２つの機能的に独立した部分、すなわち抗原に結合する“Ｆａｂ”として公知の可変ドメイン及び補体または食細胞のようなエフェクター機能に連結する“Ｆｃ”として公知の定常ドメインからなる。免疫グロブリンのＦｃ部分は長い血漿半減期を有するのに対して、Ｆａｂは短命である（Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９））。
【００１９】
治療用タンパク質産物は、より長い半減期を与えるかまたはいずれも免疫グロブリンのＦｃタンパク質中に存在するＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体固定及び胎盤移動のような機能を導入するためにＦｃドメインを用いて構築された（Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９））。例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域をホジキン病、腫瘍細胞、未分化リンパ腫細胞、Ｔ細胞白血病細胞及び他の悪性細胞タイプ上で発現したＣＤ３０受容体に結合する分子であるＣＤ３０−Ｌに融合させた。米国特許第５，４８０，９８１号明細書を参照されたい。サイトカインの短い循環半減期を延長させるために消炎・拒絶反応防止剤のＩＬ−１０をマウスＦｃ２ａに融合させた（Ｘ．Ｚｈｅｎｇら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５４：５５９０−５６００（１９９５））。敗血症性ショック患者を治療するためにヒトＩｇＧ１のＦｃタンパク質に連結させた腫瘍壊死因子受容体の使用することも研究されている（Ｃ．Ｆｉｓｈｅｒら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３４：１６９７−１７０２（１９９６）；Ｋ．Ｖａｎ  Ｚｅｅら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５６：２２２１−２２３０（１９９６））。Ｆｃはまた、ＡＩＤＳを治療するための治療用タンパク質を産生するためにＣＤ４受容体と融合されている。Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９）を参照されたい。加えて、インターロイキン２はインターロイキン２の短い半減期及びその全身毒性を改善するためにＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃ部分に融合されている。Ｈａｒｖｉｌｌら，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：９５−１０５（１９９５）を参照されたい。
【００２０】
国際特許出願公開第００／２４７７０号パンフレットには、タンデム（すなわち、Ｎ末端−Ｃ末端）方位を有し、Ｎ末端で線状ポリマー、オリゴサッカライドまたはＦｃ基のような担体分子に結合させたタンデムペプチドダイマーを有する特定の血小板新生化合物、通常ペプチドが記載されている。
【００２１】
血小板の産生を刺激する優れた生物活性（血小板新生活性）及び／または血小板前駆細胞、特に巨核球の産生を刺激する優れた生物活性（巨核球新生活性）を有する別の化合物の提供が依然として要望されている。血小板新生活性を示し且つ長い半減期のような優れた治療品質をも有する化合物も依然として要望されている。前記化合物は産生、単離、精製、生物活性、安定性及び循環時間に関して有利な特性を示すであろう。本発明は前記諸活性を有する新規化合物及び関連態様を提供する。
【発明の開示】
【００２２】
本発明は、ｃ−ｍｐｌ受容体（以後、“ｍｐｌ受容体”）に結合する治療用化合物に関する。より具体的には、本発明は、内因性トロンボポエチン（ＴＰＯ）の活性を媒介する同一受容体であるｍｐｌ受容体に結合する及び／または前記受容体を介して、すなわちｍｐｌ受容体を活性化して貫通シグナルをトリガーする高い能力を示す化合物を提供する。よって、本発明の化合物は優れた血小板新生活性、すなわちインビボ及びインビトロで血小板の産生を刺激する能力及び／または巨核球新生活性、すなわちインビボ及びインビトロで血小板前駆体の産生を刺激する能力を有する。本発明の幾つかの化合物は改善された血小板半減期、生物活性及びインビボ循環時間のような優れた治療特性をも発揮する。
【００２３】
１つの態様で、本発明は、ｍｐｌ受容体に結合し、配列：
【００２４】
【化２】
2005523682.tif 000003
（式中、Ｘ１〜Ｘ４、Ｘ９〜Ｘ１０及びＸ１３〜Ｘ１８はそれぞれ独立して本明細書に定義したアミノ酸である）
を含む化合物を提供し、前記化合物は配列：
【００２５】
【化３】
2005523682.tif 000004
を有する化合物よりも高いｍｐｌ受容体に対する結合アフィニティー及び／または生物活性を有することを特徴とする。
【００２６】
更なる態様で、本発明は、ｍｐｌ受容体に結合し、配列：
【００２７】
【化４】
2005523682.tif 000005
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ１３、Ｘ１７及びＸ１８はそれぞれ独立してアミノ酸である）
を含む化合物を提供する。
【００２８】
更に別の態様で、本発明は、ｍｐｌ受容体に結合し、配列番号２〜配列番号３０からなる群から選択される配列を含む化合物を提供する。
【００２９】
別の態様で、本発明は、配列番号２〜配列番号３０からなる群から選択される配列を含む化合物のダイマーまたはマルチマーである。
【００３０】
別の態様で、本発明は、ｍｐｌ受容体に結合し、式：
【００３１】
【化５】
2005523682.tif 000006
（式中、ＴＭＰ１、ＴＭＰ２、ＴＭＰ３及びＴＭＰ４はそれぞれ独立して本明細書に定義したＴＭＰからなる群から選択され、ＬＮ１、ＬＮ２、ＬＮ３及びＬＮ４はそれぞれ独立してリンカーであり、ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立して０〜１０の整数であり、ｌ、ｍ、ｎ及びｏはそれぞれ独立して０〜２０の整数である）
を有する組成物を提供する。
【００３２】
別の態様で、本発明は、ｍｐｌ受容体に結合し、式：
【００３３】
【化６】
2005523682.tif 000007
（式中、Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立してベヒクルであり、ｖ及びｗはそれぞれ独立して０〜１の整数である）
を有する組成物を提供する。
【００３４】
本発明の化合物は、一般的な合成法、組換えＤＮＡ技術、またはペプチド及び融合タンパク質を製造するための他の方法により製造され得る。非ペプチド部分を含む本発明の化合物は、一般的なペプチド化学反応が適用されるときにはその反応に加えて一般的な有機化学反応により合成され得る。
【００３５】
本発明の化合物は、該化合物を適当な薬用担体物質と一緒に処方し、有効量を治療を要する患者、例えばヒトまたは他の哺乳動物に対して投与することにより治療または予防目的で使用され得る。ベヒクル結合ペプチドは、ペプチド（本発明では、トロンボポエチン）に模擬した天然リガントに匹敵するかまたはそれ以上の活性を有し得る。
【００３６】
別の態様で、本発明は血小板減少症の治療方法を提供する。他の態様で、本発明は巨核球または血小板の増加方法及び本明細書に記載の化合物の製造方法を提供する。
【００３７】
更に別の態様で、本発明は関連医薬組成物をも提供する。
【００３８】
他の態様で、本発明は本明細書に記載されている組成物をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３９】
本発明の多数の他の態様及び作用効果は、図面を参照しながらの下記詳細説明から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
Ｉ．  用語の定義
本明細書中で使用される用語は、特定の場合に他の方法で限定されない限り以下のように定義される。
【００４１】
用語「ペプチド」は、約２〜８０アミノ酸を有する分子を指し、３〜４０アミノ酸を有する分子が好ましい。典型的なペプチドは、ペプチドライブラリー（例えば、ファージディスプレーライブラリー）において実施される、化学合成により作成される、タンパク質の消化により誘導される等のような本明細書に記載されている方法によりランダムに製造され得る。
【００４２】
ペプチド配列に関連して使用される用語「ランダム化」は、完全ランダム配列（例えば、ファージディスプレー方法またはＲＮＡ−ペプチドスクリーニングにより選択される）及び天然分子の１つ以上の残基が該天然分子中のその位置に存在しないアミノ酸残基で置換されている配列を指す。ランダム化ペプチド配列を作成及び同定する方法の例には、ファージディスプレー、大腸菌ディスプレー、リボソームディスプレー、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、化学スクリーニング等が含まれる。
【００４３】
ペプチドに対して適用される用語「ダイマー」は、場合によりリンカーを介して共有的または非共有的に結合している２つのペプチド鎖を有する分子を指す。ペプチドがＣ末端−Ｎ末端結合しているペプチドダイマーは“タンデム反復単位”または“タンデムダイマー”とも称される。ペプチドがＣ末端−Ｃ末端またはＮ末端−Ｎ末端結合しているペプチドダイマーは“パラレル反復単位”または“パラレルダイマー”とも称される。
【００４４】
ペプチドに対して適用される用語「マルチマー」は、場合によりリンカーを介して共有的、非共有的、または共有と非共有相互作用により結合している３つ以上のペプチド鎖を有する分子を指す。
【００４５】
用語「誘導体化（derivatizing）」、「誘導体（derivative）」または「誘導体化した（derivatized）」には、（１）化合物は環状部分、例えば化合物内のシステイニル残基間に架橋を有する；（２）化合物は架橋されているかまたは架橋部位を有する。例えば、化合物はシステイニル残基を有し、培養またはインビボで架橋ダイマーを形成する；（３）１つ以上のペプチジル結合が非ペプチジル結合で置換されている；（４）Ｎ末端が−ＮＲＲ１、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシンイミド基、または置換もしくは未置換ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ（ここで、Ｒ、Ｒ１及び環置換基は以下に定義する通りである）；（５）Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ２または−ＮＲ３Ｒ４（ここで、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は以下に定義する通りである）；（６）各アミノ酸部分が特定側鎖または末端残基と反応し得る物質を用いる処理により修飾されている化合物；を生ずる方法及び生じた化合物が含まれる。誘導体については以下に更に説明する。
【００４６】
用語「トロンボポエチン模擬ペプチド」、「ＴＰＯ模擬ペプチド」または「ＴＭＰ」は、ｍｐｌ受容体に結合する及び／または血小板新生活性、すなわちインビボまたはインビトロで血小板または血小板前駆体の産生を刺激する能力を有するペプチドを指す。前記血小板前駆体の例には巨核球が含まれるが、これに限定されない。
【００４７】
用語「ｍｐｌ−結合ドメイン」は、ｍｐｌ受容体に結合し、天然配列またはランダム化配列を含むアミノ酸配列を指す。典型的なｍｐｌ結合ドメインはファージディスプレーまたは本明細書に記載されている他の方法により同定または誘導され得る。
【００４８】
用語「ｍｐｌ受容体アゴニスト」は、ｍｐｌ受容体に結合し、天然ｍｐｌ受容体リガンドの内因性トロンボポエチン（ｅＴＰＯ）のように１つ以上のアッセイパラメーターを増減させる分子を指す。
【００４９】
用語「含む(comprising)」は、化合物が所与配列のＮ末端及び／またはＣ末端上に追加アミノ酸を含み得ることを意味する。勿論、追加アミノ酸は化合物の活性を有意に妨害してはならない。
【００５０】
更に、本発明の化合物の生理学的に許容され得る塩も本発明に包含される。用語「生理学的に許容され得る塩」は、医薬的に許容され得ると公知であるか後に判明する塩を指す。幾つかの塩の例は酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ヒドロハロゲン化物（例えば、塩酸塩及び臭化水素酸塩）、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩及びシュウ酸塩である。
【００５１】
用語「ベヒクル」は、治療用タンパク質の分解を防止及び／または半減期を延長、毒性を低減、免疫原性を低下及び／または生物活性を向上させる分子を指す。ベヒクルの例には、Ｆｃドメイン（好ましい）；線状ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリシン、デキストラン等）；分枝状ポリマー（例えば、１９８１年９月１５日にＤｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒらに付与された米国特許第４，２８９，８７２号明細書、１９９３年７月２０日にＴａｍに付与された米国特許第５，２２９，４９０号明細書及び１９９３年１０月２８日に公開されたＦｒｅｃｈｅｔらの国際特許出願公開第９３／２１２５９号パンフレット参照）；脂質；コレステロール基（例えば、ステロイド）；炭水化物またはオリゴサッカライド（例えば、デキストラン）；サルベージ受容体に結合する天然または合成タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含めたアルブミン；ロイシンジッパードメイン；及び他のタンパク質及びタンパク質断片が含まれる。
【００５２】
用語「天然Ｆｃ」は、全抗体の消化により生ずる非抗原結合断片の配列を含む分子または配列を指し、モノマー形態でもマルチマー形態のいずれでもよい。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン起源は好ましくはヒト起源であり、いずれの免疫グロブリンであってもよいが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃはモノマーポリペプチドから構成され、このモノマーポリペプチドは共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有会合によりダイマーまたはマルチマー形態に連結され得る。天然Ｆｃ分子のモノマーサブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に応じて１〜４の範囲である。天然Ｆｃの１例はＩｇＧのパパイン消化により生じるジスルフィド結合されたダイマーである（Ｅｌｌｉｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：４０７１−９（１９８２）参照）。本明細書中、用語「天然Ｆｃ」は包括的にモノマー、ダイマー及びマルチマー形態を指す。
【００５３】
用語「Ｆｃ変異体」は、天然Ｆｃから修飾されているがなおサルベージ受容体ＦｃＲｎに対する結合部位を含む分子または配列を指す。援用により本明細書に含まれるとする国際特許出願公開第９７／３４６３１号パンフレット（１９９７年９月２５日に公開）及び国際特許出願公開第９６／３２４７８号パンフレットは典型的なＦｃ変異体及びサルベージ受容体との相互作用を記載している。よって、用語「Ｆｃ変異体」は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子または配列を含む。更に、天然Ｆｃは、本発明の融合分子に必要でない構造的特徴または生物活性を与えるので除去されていてもよい部位を含む。よって、用語「Ｆｃ変異体」は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）特定宿主細胞との不適合性、（３）特定宿主細胞での発現時のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に影響を与えるかまたは関与する１つ以上の天然Ｆｃ部位または残基を欠く分子または配列を含む。
【００５４】
用語「Ｆｃドメイン」は、上記した天然Ｆｃ及びＦｃ変異体の分子及び配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃに関して、用語「Ｆｃドメイン」には全抗体から消化されたか他の方法により産生されたモノマーまたはマルチマーの形態の分子が含まれる。
【００５５】
ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む分子に対して適用される用語「ダイマー」は、共有的または非共有的に結合した２つのポリペプチド鎖を有する分子を指す。
【００５６】
ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む分子に対して適用される用語「マルチマー」は、共有的、非共有的、または共有と非共有相互作用により結合した２つ以上のポリペプチド鎖を有する分子を指す。ＩｇＧ分子は典型的にはダイマーを形成する。ＩｇＭ分子は典型的にはペンタマーを形成する。ＩｇＤ分子は典型的にはダイマーを形成する。ＩｇＡ分子は典型的にはモノマー、ダイマー、トリマーまたはテトラマーを形成する。マルチマーは配列及び生じたＦｃの天然Ｉｇソースの活性を利用することにより、または天然Ｆｃを（本明細書に定義したように）誘導体化することにより形成され得る。
【００５７】
用語「ペプチ体」は、少なくとも１つのペプチドに結合した抗体Ｆｃドメインを含む分子を指す。前記ペプチ体はマルチマーでも、ダイマーでもその断片でもよく、誘導体化されていてもよい。
【００５８】
ＩＩ．  化合物の構造
概説：本発明は、ｍｐｌ受容体に結合及び／またはｍｐｌ受容体の生物活性を調節し得る化合物を提供する。より具体的には、本発明は内因性トロンボポエチン（ＴＰＯ）の活性を媒介する同一受容体であるｍｐｌ受容体に結合及び／または前記受容体を介して、すなわちｍｐｌ受容体を活性化して貫膜シグナルをトリガーし得る化合物群を提供する。すなわち、本発明の化合物は血小板新生活性（すなわち、インビボ及びインビトロで血小板の産生を刺激する能力）及び／または巨核球形成活性（すなわち、インビボ及びインビトロで巨核球を含めた血小板前駆体の産生を刺激する能力）を有する。
【００５９】
簡単に説明すると、本発明の化合物は式Ｉ：
【００６０】
【化７】
2005523682.tif 000008
（式中、Ｘ１〜Ｘ４、Ｘ９〜Ｘ１０及びＸ１３〜Ｘ１８はそれぞれ独立してアミノ酸である）
の配列を有する１つ以上のペプチドからなる。
【００６１】
本発明に従って製造される他の組成物では、化合物は例えばダイマーまたはマルチマーとして相互に結合または他の方法で連結した式Ｉの配列を有する１つ以上のペプチドからなり得る。
【００６２】
本発明に従って製造される他の組成物では、化合物はペプチドのＮ末端またはＣ末端でベヒクルに結合または他の方法で連結した１つ以上の式Ｉの配列を有するペプチドからなり得る。前記ペプチドはタンデム（すなわち、Ｎ末端−Ｃ末端に順次）またはパラレルに（すなわち、Ｎ末端−Ｎ末端、またはＣ末端−Ｃ末端）に場合によりリンカーを介して連結され得る。
【００６３】
ペプチド：本発明の化合物は、単独でまたは別のＴＭＰと組み合わせて例えばダイマーまたはマルチマーとしてＴＰＯ模擬ペプチドからなる。本発明のＴＭＰは、配列：
【００６４】
【化８】
2005523682.tif 000009
（式中、Ｘ１〜Ｘ４、Ｘ９〜Ｘ１０及びＸ１３〜Ｘ１８はそれぞれ独立してアミノ酸である）
を含む。上記配列の好ましいアミノ酸残基を下表１に更に定義する。
【００６５】
【表１】
2005523682.tif 000010
【００６６】
本発明のより好ましいＴＭＰ配列は、配列：
【００６７】
【化９】
2005523682.tif 000011
（式中、Ｘ１〜Ｘ４、Ｘ９〜Ｘ１０及びＸ１３〜Ｘ１８はそれぞれ独立してアミノ酸である）
を有するものであり、前記ペプチドは配列：
【００６８】
【化１０】
2005523682.tif 000012
を有するものと同等またはそれ以上のｍｐｌ受容体に対する結合アフィニティー及び／または生物活性を有する。
【００６９】
結合アフィニティーは当業者に公知であるかまたは当業者が利用し得るアッセイにより測定され得る。そのアッセイには、ＢＩＡｃｏｒｅ測定、ＥＬＩＳＡアッセイ、競合アッセイ等が含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
生物活性はインビボまたはインビトロで当業者に公知であるかまたは当業者が利用し得るアッセイにより測定され得る。そのアッセイの例には、細胞ベースアッセイ、すなわち巨核球増殖アッセイ、３２Ｄ細胞アッセイ（国際特許出願公開第９５／２６７４６号パンフレットに詳記されているようなヒトｍｐｌ受容体をトランスフェクトしたマウス３２Ｄ細胞のＩＬ−３依存性クローン）、ＣＤ３４＋アッセイ、ＣＤ６１細胞アッセイ等が含まれるが、これらに限定されない。生物活性は各種インビボ動物アッセイによっても測定され得る。
【００７１】
本発明の更に好ましいＴＭＰ配列を下表２に同定する。
【００７２】
【表２】
2005523682.tif 000013
【００７３】
ペプチドＴＭＰ２〜ＴＭＰ３０についての結合アッセイ及び生物活性データは実施例に詳記されている。ペプチドを選択したファージ環境をより良く模倣するため、及び好ましい１８アミノ酸ペプチドの帯電アミノ−及びカルボキシ−末端を保護するために、各ペプチドの各末端に２つのアミノ酸“キャップ”を付加した。特に、ＴＭＰ２〜ＴＭＰ３０の各々のアミノ末端にグルタミン（Ｑ）及びシステイン（Ｃ）を付加した。同様に、各ペプチドのカルボキシ末端に２つのアミノ酸“キャップ”、すなわちヒスチジン（Ｈ）及びセリン（Ｓ）を付加した。これらのキャップは帯電末端を保護するためだけであって好ましいペプチドの結合アフィニティー及び／または生物活性を増減させることを意図していないことは当業者には自明であろう。
【００７４】
ペプチドが長くなるとペプチドアフィニティーが上昇することは公知であるので、基準生物活性ペプチド（配列番号１）を試験ペプチドＴＭＰ２〜ＴＭＰ３０と同じ長さとなるように１４アミノ酸から２２アミノ酸に増加させた。実施例６〜１１参照。当業者は理解しているように、比較ペプチドの生物活性領域は配列番号１として同定され、ＴＭＰ１と称されるコア１４アミノ酸配列である。
【００７５】
システイニル残基を含むペプチドは、片方または両方の末端がベヒクルに連結していてもよい別のＣｙｓ−含有ペプチドと交差結合してもよい。２つ以上のＣｙｓ残基を有するペプチドはペプチド内ジスルフィド結合を形成し得る。前記ペプチドは後記するように誘導体化されていてもよい。
【００７６】
別の有用なペプチド配列は、本明細書に記載されているＴＭＰのアミノ酸配列の保存的及び／または非保存的修飾により生じ得る。保存的修飾により、該修飾を加える前のペプチドと同様の機能的及び化学的特性を有するペプチドが生ずる。対照的に、ペプチドの機能的及び／または化学的特性は、（ａ）例えばシートまたはヘリカルコンフォメーションとしての置換域での分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、または（ｃ）分子のサイズの維持に対するその効果の点で実質的に異なるアミノ酸配列の置換を選択することにより実質的に修飾され得る。
【００７７】
例えば、“保存的アミノ酸置換”には、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷に殆どまたは全く影響を及ぼさないように天然アミノ酸残基を非天然残基で置換することが含まれ得る。更に、ポリペプチド中の天然残基は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発を記載しているＭａｃＬｅｎｎａｎら，Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．，６４３：５５−６７（１９９８）；Ｓａｓａｋｉら，Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３５：１−２４（１９９８）参照）について既報されているようにアラニンでも置換され得る。
【００７８】
望ましいアミノ酸置換（保存的でも非保存的でも）は、そのような置換が望ましいときに当業者により決定され得る。例えば、アミノ酸置換はペプチド配列の重要な残基を同定するため、または本明細書に記載されているペプチドまたはベヒクル−ペプチド分子（上記した式参照）のアフィニティーを増減させるために使用され得る。アミノ酸置換の例を下表３に示す。
【００７９】
【表３】
2005523682.tif 000014
2005523682.tif 000015
【００８０】
ある実施態様では、保存的アミノ酸置換は、生物学的系での合成よりもむしろ通常化学的ペプチド合成により導入される非天然アミノ酸残基をも含む。
【００８１】
天然残基は配列の修飾のために有用であり得る共通の側鎖特性に基づいて分類され得る。例えば、非保存的置換はあるクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを含み得る。前記の置換された残基は非ヒトオルソログに相同のペプチドの領域または分子の非相同領域に導入され得る。加えて、鎖方位に影響を与える目的でＰまたはＧを用いて修飾を加えることができる。
【００８２】
上記修飾を加える場合、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。各アミノ酸に対してその疎水性及び電荷特性に基づいて次のようにヒドロパシー指数が割り当てられている。イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋４．２）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタメート（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパルテート（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）。
【００８３】
タンパク質に対して相互作用的生物学的機能を付与する際のアミノ酸ヒドロパシー指数の重要性は当業界で理解されている（Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２））。特定のアミノ酸がなお類似の生物活性を保持しながら類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換され得ることは公知である。ヒドロパシー指数に基づいて変化を加える場合、ヒドロパシー指数が±２以内のアミノ酸の置換が好ましくは、±１以内のアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸の置換が更に特に好ましい。
【００８４】
類似アミノ酸の置換は親水性に基づいて効果的になされ得ることは当業界で理解されている。隣接するアミノ酸の親水性により決定されるタンパク質の最高局部平均親水性(local average hydrophilicity)はその免疫原性及び抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性に相関している。
【００８５】
各アミノ酸残基に対して以下のように親水性値が割り当てられている。アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパルテート（＋３．０±１）、グルタメート（＋３．０）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化を加える場合、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸の置換が更に特に好ましい。親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は“エピトープコア領域”とも呼ばれる。
【００８６】
当業者は公知の技術を用いて適当な変異体を決定することができる。活性を破壊することなく変化を加えられる分子の適当な領域を同定するためには、当業者は活性にとって重要でないと考えられている領域をターゲッティングすることができる。例えば、同一種または他の種由来の類似活性を有する類似ポリペプチドが公知の場合、当業者はペプチドと類似ペプチドのアミノ酸配列を比較することができる。その比較で、当業者は類似ポリペプチドの中で保存される分子の残基及び部分を同定することができる。類似のペプチドに比して保存されないペプチドの領域に変化を加えてもペプチドの生物活性及び／または構造が悪影響を受ける可能性は少ないと認められる。当業者は、比較的保存領域においても活性を維持しながら天然残基の代わりに化学的に類似のアミノ酸を置換し得る（保存的アミノ酸残基置換）。従って、生物活性または構造にとって重要であろう領域にも生物活性を破壊したりペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく保存的アミノ酸置換を加えることができる。
【００８７】
アミノ酸は（ＬでもＤでもないＧｌｙを除いて）ＬまたはＤ立体化学を有し得、本発明のＴＭＰは立体化学の組合せからなり得る。しかしながら、ＴＭＰ鎖中のアミノ酸の全てに対してＬ立体化学が好ましい。本発明はまた、アミノ酸のアミノ末端−カルボキシ末端配列が逆転している逆ＴＭＰ分子を提供する。例えば、正常な配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３を有する分子の逆はＸ３−Ｘ２−Ｘ１である。本発明はまた、逆ＴＭＰのようにアミノ酸のアミノ末端−カルボキシ末端が逆で、ＴＭＰ中の通常“Ｌ”エナンチオマーである残基が“Ｄ”立体異性体形態に変化しているレトロ逆分子も提供する。
【００８８】
ＴＭＰの“誘導体”は上記したＴＭＰに対して置換され得ることも考えられる。前記ＴＭＰ誘導体は以下の修飾の１つ以上を加えた部分を含む：
非ペプチジル結合、例えば−ＣＨ２−カルバメート結合［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート結合、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］結合、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］結合、−ＣＨ２−第２級アミン結合またはアルキル化ペプチジル結合［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−］（ここで、Ｒ６は低級アルキルである）により置換された１つ以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］結合；
Ｎ末端が−ＮＲＲ１−基、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基（ここで、Ｒ及びＲ１の両方が水素でないという条件でＲ及びＲ１は水素または低級アルキルである）、スクシンイミド基、ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）基、またはフェニル環上に低級アルキル、低級アルコキシ、クロロ及びブロモからなる群から選択される１〜３個の置換基を有するベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−基に誘導体化されているペプチド；及び
遊離Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ２｛式中、Ｒ２は低級アルコキシ及び−ＮＲ３Ｒ４（ここでＲ３及びＲ４は独立して水素及び低級アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される｝に誘導体化されているペプチド。ここで、「低級」は炭素数１〜６の基を意味する。
【００８９】
更に、各アミノ酸の修飾は、ペプチドの標的化アミノ酸残基を特定側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることによりＴＭＰ分子に誘導され得る。例えば、リシニル及びアミノ末端残基を無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反応させ得る。これらの物質を用いる誘導体化はリシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬には、メチルピコリンイミデートのようなイミドエステル、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロホウ水素化物、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４−ペンタンジオン、及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【００９０】
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンのような１つ以上の慣用の試薬と反応させることにより修飾され得る。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基のｐＫａが高いのでアルカリ条件下で反応を実施しなければならない。更に、上記試薬はリシン基及びアルギニングアニジノ基と反応し得る。
【００９１】
チロシル残基そのものの特異的修飾は広く研究されており、特に芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりチロシル残基にスペクトル標識を導入することに特に興味が向けられている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジアゾール及びテトラニトロメタンがそれぞれＯ−アセチルチロシル物質及び３−ニトロ誘導体を形成するために使用され得る。
【００９２】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）はカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドと反応させることにより選択的に修飾され得る。更に、アスパルチル及びグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換され得る。
【００９３】
グルタミニル及びアスパラギニル残基はしばしば対応のグルタミル及びアスパルチル残基に脱アミド化される。或いは、これらの残基は穏和な酸性条件下で脱アミド化され得る。いずれの形態の残基も本発明の範囲内である。
【００９４】
二官能性物質を用いる誘導体化は、ペプチドまたはその官能性誘導体を水不溶性支持体マトリックスまたは他のマクロ分子担体に架橋させるために有用である。一般的に使用される架橋剤の例には、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステルを含めたホモジ官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクチンのような二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導体化剤により、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化し得る中間体が生ずる。或いは、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性水不溶性マトリックス及び米国特許第３，９６９，２８７号明細書、同第３，６９１，０１６号明細書、同第４，１９５，１２８号明細書、同第４，２４７，６４２号明細書、同第４，２２９，５３７号明細書及び同第４，３３０，４４０号明細書に記載されている反応性物質がタンパク質固定化のために使用され得る。
【００９５】
他の可能性ある修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシ基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リシン，アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，「タンパク質：構造及び分子特性(Proteins: Structure and Molecular Properties)」，ｐ．７９−８６，サンフランシスコに所在のＷ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．（１９８３年）発行）、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び幾つかの場合にはＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【００９６】
前記誘導体化部分により本発明化合物の血小板新生活性、溶解性、吸収、生物学的半減期等を含めた１つ以上の特性を改善させることが好ましい。或いは、誘導体化部分により、誘導化前の化合物と同一または本質的に同一の特徴及び／または特性を有する化合物が生じ得る。或いは、前記部分により、化合物等の望ましくない副作用を解消または軽減し得る。
【００９７】
本発明化合物はＤＮＡレベルでも変化を受け得る。本発明化合物の任意部分のＤＮＡ配列は特定宿主細胞とより適合性のコドンに変化され得る。好ましい宿主細胞である大腸菌の場合の最適化コドンは当業界で公知である。コドンは制限部位を除去するかまたは沈黙制限部位を導入するように置換され得、こうすると特定宿主細胞におけるＤＮＡのプロセシングが助長され得る。ベヒクル、リンカー及びペプチドＤＮＡ配列は上記した配列変化のいずれかを含むように修飾され得る。よって、本明細書で検討されている全ての修飾、置換、誘導体化等は本発明の全ての態様に等しく適用される。この全ての態様には、ペプチド、ペプチドダイマー及びマルチマー、リンカー、ベヒクルが含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
更に、当業者は活性または構造にとって重要である残基を類似ポリペプチド中で同定する構造−機能研究を検討することができる。比較のために、類似ペプチドにおいて活性または構造にとって重要であるアミノ酸残基に相当するペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者はこのように予測されたペプチドの重要なアミノ酸残基に対して化学的に類似のアミノ酸置換を選択し得る。
【００９９】
当業者は、類似ポリペプチドにおける構造に関連して３次元構造及びアミノ酸配列を分析することもできる。前記情報にてらして、当業者は３次元構造に対するペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを予測し得る。当業者はタンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関与し得るので、前記残基に対してラジカル変化を加えないように選択することができる。また、当業者はそれぞれの所望アミノ酸残基で１つのアミノ酸置換を含む試験変異体を作成することができる。その後、前記変異体を当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングし得る。前記データーは適当な変異体に関する情報を集めるために使用することができる。例えば、特定アミノ酸残基に変化を加えて破壊された、望ましくなく低下した、または不適当な活性が生ずることを知見したならば、そのような変化を有する変異体は避けられ得る。換言すると、ルーチンな実験から集めた情報に基づいて、当業者は単独でまたは他の変異と併せて更なる置換を避けなければならないアミノ酸を容易に決定することができる。
【０１００】
二次構造を予測するために多数の科学文献が発表されている。Ｊ．Ｍｏｕｌｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）；Ｃｈｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６；及びＣｈｏｕら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）を参照されたい。また、二次構造を予測するのを助けるためにコンピュータープログラムが現在利用されている。二次構造を予測する１つの方法はホモロジーモデリングに基づいている。例えば、３０％以上の配列同一性または４０％以上の類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質はしばしば類似の構造トポロジーを有する。ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の可能性ある襞の数を含めた二次構造の予測性が向上したタンパク質構造データーベース（ＰＤＢ）が最近開発された。Ｈｏｌｍら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質における襞の数は限られており、決定的な数の構造が解明されたら構造予測は劇的により正確になるであろうと示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
【０１０１】
二次構造を予測する別の方法には、“縫合(treading)”（Ｄ．Ｊｏｎｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６））、“プロフィール分析”（Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））及び“進化的連結”（上掲のＨｏｌｍ（１９９９）；上掲のＢｒｅｎｎｅｒ（１９９７））が含まれる。
【０１０２】
本発明の好ましいペプチド及びペプチド−リンカー分子の式を図１に示す。また、ＴＭＰの生理学的に許容され得る塩も包含される。
【０１０３】
ペプチド化合物
新規ペプチドに加えて、本発明は、本発明の１つ以上のペプチドが相互に、リンカー（ＬＮ）に及び／またはベヒクル（Ｖ）に結合または他の方法で連結されている新規ペプチド化合物を提供する。ＴＭＰはタンデムに（すなわち、順次Ｎ末端−Ｃ末端に）またはパラレルに（すなわち、Ｎ末端−Ｎ末端またはＣ末端−Ｃ末端）連結され得る。ＴＭＰを他のＴＭＰまたは同一ＴＭＰに対して場合によりリンカーを介して結合させてもよい。また、ＴＭＰを他のＴＭＰまたは同一ＴＭＰに対して場合によりリンカーを介して、場合によりベヒクルを介して結合させてもよい。本発明のペプチド−リンカー−ベヒクル化合物は下記式により表され得る。
【０１０４】
【化１１】
2005523682.tif 000016
上記式中、Ｖ１及びＶ２はベヒクルであり、ＬＮ１、ＬＮ２、ＬＮ３及びＬＮ４はそれぞれ独立してリンカーであり、ＴＭＰ１、ＴＭＰ２、ＴＭＰ３及びＴＭＰ４はそれぞれ独立して式Ｉを有するペプチド配列であり、ａ、ｂ、ｃ及びｄ、ｌ、ｍ、ｎ及びｏはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｖ及びｗはそれぞれ独立して０〜１の整数である。
【０１０５】
本発明の化合物として、下記式：
【０１０６】
【化１２】
2005523682.tif 000017
（式中、Ｖ１はベヒクル（好ましくは、Ｆｃドメイン）であり、ＴＭＰのＣ末端に場合によりリンカーを介して結合している）
で示される化合物及びそのマルチマー、下記式：
【０１０７】
【化１３】
2005523682.tif 000018
（式中、Ｖ１はベヒクル（好ましくは、Ｆｃドメイン）であり、ＴＭＰのＮ末端に場合によりリンカーを介して結合している）
で示される化合物及びそのマルチマーが例示される。本発明の好ましいペプチド−ベヒクル分子及びペプチド−リンカー−ベヒクル分子の式を図２に示す。
【０１０８】
本発明の好ましい化合物の多くは、２つのＴＭＰ部分を有するダイマー、または複数のＴＭＰ部分を有するマルチマーである。ＴＭＰ１〜ＴＭＰ４等の各々は同一または異なる構造を有し得る。好ましくは、本発明化合物は２〜５個、特に好ましくは２〜３個、最も好ましくは２個のＴＭＰ部分を有する。
【０１０９】
これらの化合物は、好ましくは直接結合しているかまたはリンカー基（下記参照）を介して連結しているダイマーである。モノマーＴＭＰ部分は左から右に見てＮ末端からＣ末端の慣用の方位で示されている。従って、ＴＭＰ１のＣ末端がＴＭＰ２のＮ末端に直接またはリンカーを介して結合するように（タンデムダイマー）本発明化合物は方位され得ることが分かる。或いは、ＴＭＰ１のＣ末端がＴＭＰ２のＣ末端に直接またはリンカーを介して結合しているかＴＭＰ１のＮ末端がＴＭＰ２のＮ末端に直接またはリンカーを介して結合連結するように（パラレルダイマー）本発明化合物は方位され得ることが分かる。これらの化合物は、ＴＭＰ１及びＴＭＰ２が構造的に違っていてもダイマーと称される。すなわち、ホモダイマーもヘテロダイマーも意図される。
【０１１０】
リンカー
別の実施態様において、本発明は別のＴＭＰペプチドに“リンカー”基（ＬＮ１、ＬＮ２等）を介して共有結合または他の方法で連結もしくは結合している１つ以上のＴＭＰを提供する。リンカー基は任意である。リンカー基を存在させるとき、リンカー基は主にスペーサーとして機能するのでその化学構造は重要でない。リンカーは、最終化合物の生物活性を妨害せず且つ最終化合物の免疫原性が有意に増加しないように選択されなければならない。リンカーは、好ましくはペプチド結合により連結されたアミノ酸から構成される。よって、好ましい実施態様では、リンカーはペプチド結合により連結された１〜３０個のアミノ酸から構成され、前記アミノ酸は２０個の天然アミノ酸から選択される。前記アミノ酸の幾つかは当業者が理解しているようにグリコシル化され得る。より好ましい実施態様では、１〜２０個のアミノ酸はグリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリシンから選択される。より好ましくは、リンカーは大部分が立体障害でないアミノ酸、例えばグリシン及びアラニンで構成される。よって、好ましいリンカーはポリグリシン（特に、（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）及びポリアラニンである。リンカーの他の具体例は
【０１１１】
【化１４】
2005523682.tif 000019
である。上記した命名法を説明するために、例えば（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。ＧｌｙとＡｌａの組合せも好ましい。ここに示したリンカーは例である。本発明の範囲内のリンカーは非常に長くてもよく、他の残基を含んでいてもよい。
【０１１２】
非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ここで、ｓ＝２〜２０）のようなアルキルリンカーも使用し得る。前記アルキルリンカーが更に非立体障害基、例えば低級（例えば、Ｃ１−６）アルキル、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等で置換されていてもよい。非ペプチドリンカーの例はＰＥＧリンカーである。
【０１１３】
【化１５】
2005523682.tif 000020
（式中、ｎはリンカーが１００〜５０００ｋＤ、好ましくは１００〜５００ｋＤの分子量を有するような値である）
ペプチドリンカーは、上記と同様にして誘導体を形成するように改変され得る。
【０１１４】
一般的に、本発明の血小板新生化合物に対しては約０〜１４サブユニットの長さ（例えば、アミノ酸）を有するリンカーが好ましいことが知見された。ペプチドリンカーはＴＭＰについて上記したと同様にして誘導体を形成するように改変され得る。更に、この実施態様の化合物は線状であっても環状であってもよい。「環状」とは分子の少なくとも２つの分離した、すなわち非連続部分が相互に連結していることを意味する。例えば、分子の端部のアミノ及びカルボキシ末端は共有結合して環状分子を形成し得る。或いは、分子がジスルフィド結合の形成により環化し得る２つ以上のＣｙｓ残基（例えば、リンカー中に）を含んでいてもよい。更に、２つ以上のタンデムペプチドリンカーが連結して複数のダイマーの１つのダイマーを形成し得ることも考えられる。例えば、Ｃｙｓ残基を含むタンデムダイマーは別のダイマーのＣｙｓと分子間ジスルティド結合を形成し得る。本発明のペプチド−リンカー化合物の例を以下に示す：
【０１１５】
【化１６】
2005523682.tif 000021
【０１１６】
従って、好ましい実施態様では、リンカーは（ＬＮ１）ｎ（式中、ＬＮ１は天然アミノ酸またはその立体異性体であり、ｎは１〜２０である）からなる。好ましいペプチド−リンカー分子の式を図１に示す、更に好ましいペプチド−リンカー分子には、
ｉ）ＴＭＰ１−ＬＮ１−ＴＭＰ２−ＬＮ２
ｉｉ）ＬＮ１−ＴＭＰ１−ＬＮ２−ＴＭＰ２
ｉｉｉ）ＬＮ１−ＴＭＰ１−ＬＮ２−ＴＭＰ２
ｉｖ）ＴＭＰ１−ＬＮ１−ＴＭＰ１−ＬＮ１−ＴＭＰ１−ＬＮ１
ｖ）ＬＮ１−ＴＭＰ１−ＬＮ２−ＴＭＰ２−ＬＮ３−ＴＭＰ３−ＬＮ４−ＴＭＰ４
（ここで、ＬＮ１〜ＬＮ４はそれぞれ独立してリンカーである）
が含まれる。
【０１１７】
ベヒクル
更に別の実施態様において、本発明のペプチドまたはペプチド化合物はベヒクル（Ｖ）に連結または結合され得る。ベヒクルは包括的には治療用タンパク質の分解を防止し及び／または半減期を延長、毒性を低減、免疫原性を低下または生物活性を上昇させる分子を指す。ベヒクル（Ｖ）はペプチドにＮ末端、Ｃ末端、ペプチド骨格または側鎖を介して結合され得る。
【０１１８】
ベヒクル（Ｖ）は担体分子、例えば線状ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリリシン、デキストラン等）、分枝鎖ポリマー（例えば、１９８１年９月１５日にＤｅｎｅｎｗａｌｔｅｒらに付与された米国特許第４，２８９，８７２号明細書、１９９３年７月２０日にＴａｍに付与された米国特許第５，２２９，４９０号明細書、１９９３年１０月２８日に公開されたＦｒｅｃｈｅｔらの国際特許出願公開第９３／２１２５９号パンフレット）；コレステロール基（例えば、ステロイド）；または炭水化物またはオリゴサッカライドであり得る。他の可能性ある担体には、１つ以上の水溶性ポリマー、例えば米国特許第４，６４０，８３５号明細書、同第４，４９６，６８９号明細書、同第４，３０１，１４４号明細書、同第４，６７０，４１７号明細書、同第４７９１，１９２，号明細書及び同第４，１７９，３３７号明細書に記載されているポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールが含まれる。当業界で公知の他の有用なポリマーには、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースまたは他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコール、並びに前記ポリマーの混合物が含まれる。ベヒクルの例には、Ｆｃドメイン；サルベージ受容体に結合し得る他のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；ロイシンジッパー（ＬＺ）ドメイン；５ｋＤ、２０ｋＤ及び３０ｋＤポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含めたＰＥＧ及び他のポリマー；デキストラン；及び半減期を延長させ及び／またはタンパク質分解またはクリアランスから保護することが当業界で公知の他の分子も含まれる。
【０１１９】
典型的な担体はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ基は任意の都合のよい分子量を有し得、直鎖でも分枝鎖でもよい。ＰＥＧの平均分子量は好ましくは約２〜約１００ｋＤ、より好ましくは約５〜約５０ｋＤ、最も好ましくは約５〜約１０ｋＤである。
【０１２０】
ＰＥＧ基は通常、アシル化、還元アルキル化、ミカエル付加、チオールアルキル化、またはＰＥＧ部分上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基）を介する標的化合物上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基）への他の化学選択的コンジュゲーション／ライゲーション方法により本発明の化合物に結合される。
【０１２１】
炭水化物（オリゴサッカライド）基は有利にはタンパク質においてグリコシル化されることが公知の部位に結合され得る。通常、Ｏ−連結オリゴサカライドはセリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合するが、Ｎ−連結オリゴサカライドが配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｘはプロリン以外のアミノ酸であり得る）の一部の場合はアスパラギン（Ａｓｎ）に結合する。Ｘは好ましくはプロリン以外の１９天然アミノ酸の１つである。Ｎ−連結及びＯ−連結オリゴサッカライドの構造及び各タイプ中に存在する糖残基は異なる。両方で共通に見られる糖の１タイプはＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される）である。シアル酸は通常Ｎ−連結及びＯ−連結オリゴサッカライドの末端残基であり、負電荷のためにグリコシル化化合物に対して酸性を付与し得る。前記部位は本発明化合物のリンカーに導入され得、好ましくは（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳのような哺乳動物細胞における）ポリペプチド化合物の組換え産生中に細胞によりグリコシル化される。しかしながら、前記部位は更に当業界で公知の合成または半合成手順によりグリコシル化され得る。
【０１２２】
より好ましい実施態様では、ベヒクル（Ｖ）は１つ以上の抗体Ｆｃドメインからなり得る。よって、上記したペプチド化合物は更に１つ以上のＦｃドメインに直接またはリンカーを介して融合され得る。Ｆｃベヒクルはヒト免疫グロブリンＩｇＧ−１重鎖（Ｊ．Ｗ．Ｅｌｌｉｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１０：４０７１−４０７９（１９８２）参照）または当業界で公知の他のＦｃ配列、例えば他のＩｇＧクラス（この中にはＩｇＧ−２，ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４が含まれるが、これらに限定されない）または他の免疫グロブリンから選択され得る。
【０１２３】
抗体のＦｃ領域がジスルフィド結合または非共有会合によりダイマーまたはマルチマー形態に連結され得るモノマーポリペプチドセグメントから構成されることは公知である。天然Ｆｃ分子のモノマーサブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、関係する抗体のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて１〜４の範囲である。本明細書中、用語「Ｆｃ」はＦｃ分子のモノマー、ダイマー及びマルチマー形態の総称である。Ｆｃモノマーは、ジスルフィド結合形成によるダイマー化を防ぐ特定条件が存在しない限り適当なＣｙｓ残基が存在するときには自然にダイマー化することに留意すべきである。通常Ｆｃダイマー中にジスルフィド結合を形成するＣｙｓ残基が除去されているかまたは他の残基で置換されるならば、モノマー鎖は通常非共有相互作用によりダイマー化する。本明細書中、「Ｆｃ」は天然モノマー、天然ダイマー（ジスルフィド結合により連結）、修飾ダイマー（ジスルフィド及び／または非共有結合）及び修飾モノマー（すなわち、誘導体）を意味するように使用される。
【０１２４】
Ｆｃ部分の変異体、アナログまたは誘導体は、例えば残基または配列を各種置換することにより構築され得る。
【０１２５】
変異体（または、アナログ）ポリペプチドには、Ｆｃアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸残基が付加されている挿入変異体が含まれる。挿入はタンパク質の片方または両方の末端のいずれの位置であっても、またはＦｃアミノ酸配列の内部領域内に位置していてもよい。片方または両方の末端に追加残基を有する挿入変異体の例には、融合タンパク質及びアミノ酸タグまたは標識を含むタンパク質が含まれ得る。例えば、Ｆｃ分子は場合によりＮ末端Ｍｅｔを含み得、特に分子を大腸菌のような細菌細胞において組換え発現させるときにはＮ末端Ｍｅｔを含み得る。
【０１２６】
Ｆｃ欠失変異体では、Ｆｃポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基が除去されている。欠失はＦｃポリペプチドの片方または両方の末端で生起されてもＦｃアミノ酸配列内の１つ以上の残基が除去されてもよい。従って、欠失変異体にはＦｃポリペプチド配列の全て断片が含まれる。
【０１２７】
Ｆｃ置換変異体では、Ｆｃポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基が除去され、代替残基で置換されている。１つの態様では、置換は本質的に保存的であるが、本発明は非保存的である置換も含まれる。
【０１２８】
例えば、Ｆｃ配列の幾つかまたは全てのジスルフィド架橋の形成を防止するためにシステイン残基を欠失させてもまたは他のアミノ酸で置換してもよい。前記したシステイン残基の各々を除去しても、１つ以上のシステイン残基を他のアミノ酸、例えばＡｌａまたはＳｅｒで置換してもよい。別の例として、（１）Ｆｃ受容体結合部位を切除する、（２）相補（Ｃｌｑ）結合部位を切除する及び／または（３）抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）部位を切除するためにアミノ酸置換を導入するように修飾を加えることもできる。前記部位は当業界で公知であり、公知の置換は本発明で使用されるＦｃの範囲内である。例えば、ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関するＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２９：５，６３３−６３９（１９９２）を参照されたい。
【０１２９】
同様に、１つ以上のチロシン残基をフェニルアラニン残基で置換することもできる。加えて、他の変異体アミノ酸挿入、欠失（例えば、１〜２５アミノ酸）及び／または置換も本発明の範囲内である。保存的アミノ酸置換が通常好ましい。更に、改変はペプチド模擬体またはＤ−アミノ酸のような改変アミノ酸の形態であってもよい。
【０１３０】
本発明のＦｃ配列はまた誘導体化され得る。すなわち、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換以外の修飾を有し得る。好ましくは、修飾は本質的に共有であり、その例にはポリマー、脂質、他の有機及び無機部分との化学結合が含まれる。本発明の誘導体は循環半減期を延長させるように製造され得、またはポリペプチドの所望細胞、組織または臓器に対するターゲッティング能力を改善するように設計され得る。
【０１３１】
国際特許出願公開第９６／３２４７８号パンフレット（発明の名称：向上した半減期を有する改変ポリペプチド）に記載されているように無傷Ｆｃ分子のサルベージ受容体結合ドメインを本発明化合物のＦｃ部分として使用することも可能である。本明細書中にＦｃとして呼ばれる分子のクラスの別のメンバーは国際特許出願公開第９７／３４６３１号パンフレット（発明の名称：向上した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン）に記載されているものである。上記した国際特許出願公開パンフレットはいずれも援用により本明細書に含まれるとする。
【０１３２】
Ｆｃ融合はＴＭＰ１またはＴＭＰ２のＮ末端及び／またはＣ末端で生じ得る。また、Ｆｃ融合はＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端で生じ得る。
【０１３３】
本発明の好ましい化合物には、本明細書に記載されているＴＭＰのダイマーまたはマルチマーに連結または他の方法で結合されているＩｇＧ１  Ｆｃ融合ダイマーが含まれる。この場合、各ＦｃドメインはＴＭＰペプチドのダイマーまたはマルチマーに場合によりリンカーを介して連結される。前記化合物の概略例を図２に示す。
【０１３４】
複数のベヒクルを使用することもできる。例えば、各末端にＦｃを使用したり、１つの末端にＦｃ、他端または側鎖にＰＥＧ基を使用してもよい。
【０１３５】
ペプチド−ベヒクル化合物の例を下表４に示す。
【０１３６】
【表４】
2005523682.tif 000022
【０１３７】
更に、本発明の好ましい実施態様を表５にリストする。
【０１３８】
【表５】
2005523682.tif 000023
【０１３９】
ＩＩＩ．  作成方法
本発明の化合物は各種方法により製造され得る。多くの化合物はペプチドであるかまたはペプチドを含むので、ペプチドの合成方法が特に適切である。固相合成法が使用され得る。適当な技術が当業界で公知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐ．３３５−６１，Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ及びＰａｎａｙｏｔｉｓ編（１９７３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）；Ｄａｖｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．，１０：３９４−４１４（１９８５）；Ｓｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９６９）；米国特許第３，９４１，７６３号明細書；Ｆｉｎｎら，「タンパク質(The Proteins)」，第３版，第２巻，ｐ．１０５−２５３（１９７６）；及びＥｒｉｃｋｓｏｎら，「タンパク質(The Proteins)」，第３版，第２巻，ｐ．２５７−５２７（１９７６）に記載されている方法が含まれる。固相合成は小ペプチドを製造する最も費用効率的な方法であるので、固相合成が各ペプチドを製造するための好ましい方法である。
【０１４０】
ペプチドは組換えＤＮＡ技術を用いて形質転換した宿主細胞においても作成され得る。そうするためには、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を作成する。そのようなＤＮＡ及び／又はＲＮＡ分子の作成方法は当業界で公知である。例えば、ペプチドをコードする配列を適当な制限酵素を用いてＤＮＡから切り出し得る。関連配列は、その後のクローニングのために有用な制限部位を挿入するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作成され得る。或いは、ＤＮＡ／ＲＮＡ分子はホスホルアミダイト法のような化学合成技術を用いて合成され得る。また、上記した方法または他の方法を組み合わせて使用することもできる。
【０１４１】
本発明は、適当な宿主においてペプチドをコードするベクターにも関する。前記ベクターは適当な発現制御配列に作動的に連結したペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。ペプチド−コード化ＤＮＡ分子をベクターに挿入する前またはその後に作動的に連結させる方法は公知である。発現制御配列には、プロモーター、アクチベータ、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、終止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルが含まれる。
【０１４２】
生じたペプチド−コード化ＤＮＡ分子を含むベクターは適当な宿主を形質転換するために使用される。この形質転換は当業界で公知の方法を用いて実施され得る。
【０１４３】
本発明を実施する際に多数の市販されている公知の宿主細胞が使用され得る。特定宿主は当業界で認識されている複数の要因に依存して選択される。これらの要因には、例えば選択発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によりコードされるペプチドの宿主細胞への毒性、形質転換率、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、生物安全性及びコストが含まれる。前記要因のバランスは全ての宿主が特定ＤＮＡ分子の発現のために等しく有効でないことを理解しなければならない。
【０１４４】
一般的なガイドラインの範囲で、有用な微生物宿主には細菌（例えば、大腸菌）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、培養中の他の真菌、昆虫、植物、哺乳動物（ヒトを含む）細胞、または当業界で公知の他の宿主が含まれる。形質転換した細胞を所望のペプチドが発現するように一般的な発酵条件下で培養する。前記した発酵条件は当業界で公知である。その後、ペプチドが発現している発酵培養物または宿主細胞からペプチドを精製する。精製方法も当業界で公知である。
【０１４５】
誘導体化ペプチドまたは非ペプチド基を含む化合物は公知の有機化学方法を用いて合成され得る。例えば、固相合成法が使用され得る。適当な方法は当業界で公知であり、その中にはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐ．３３５−６１，Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ及びＰａｎａｙｏｔｉｓ編；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）；Ｄａｖｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．，１０：３９４−４１４（１９８５）；Ｓｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９６９）；米国特許第３，９４１，７６３号明細書；Ｆｉｎｎら，「タンパク質(The Proteins)」，第３版，２：１０５−２５３（１９７６）；及びＥｒｉｃｋｓｏｎら，「タンパク質(The Proteins)」，第３版，２：２５７−５２７（１９７６）に記載されている方法が含まれる。固相合成は小ペプチドを製造する最も費用効率的な方法であるので、固相合成が各ペプチドを製造するための好ましい方法である。
【０１４６】
ＩＶ．  化合物の使用
本発明化合物はｍｐｌ受容体に結合及び／またはｍｐｌ受容体を活性化させる能力を有し、及び／または血小板のインビボ及びインビトロ産生を刺激する能力（血小板新生活性）及び血小板前駆体のインビボ及びインビトロ産生を刺激する能力（巨核球形成活性）を有する。前記化合物の活性を測定するために、国際特許出願公開第９５／２６７４６号パンフレット（発明の名称：巨核球増殖及び分化を刺激するための組成物及び方法）に記載されているような一般的アッセイが使用され得る。インビボアッセイは本明細書の実施例の欄に詳記されている。
【０１４７】
本発明の方法及び組成物を用いて治療される状態は通常、現在巨核球／血小板欠乏が起こっている、または、将来（例えば、手術または血小板の提供が予定されてる）巨核球／血小板欠乏が起こると予想される状態である。前記状態はインビボで活性ｍｐｌリガンドが一時的または永久に欠乏した結果生じ得る。血小板減少に対する総称は血小板減少症であり、従って本発明の方法及び組成物は通常治療を要する患者における血小板減少症を予防的または治療的に処置するために利用され得る。
【０１４８】
世界保健機構は血小板減少症の程度を患者中の循環血小板の数に基づいて分類している（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ，４７：２１０−２１１（１９８１））。例えば、血小板減少症の兆候を示していない（グレード０）患者は通常１ｍｍ３あたり少なくとも１００，０００個の血小板を有する。軽度の血小板減少症（グレード１）は１ｍｍ３あたり７９，０００〜９９，０００個の血小板レベルを示す。中程度の血小板減少性（グレード２）は１ｍｍ３あたり５０，０００〜７４，０００個の血小板を示し、重篤な血小板減少症は１ｍｍ３あたり２５，０００〜４９，０００個の血小板により特徴づけられる。生命を脅かすまたは衰弱させる血小板減少症の場合の血小板の循環濃度は１ｍｍ３あたり２５，０００個未満である。
【０１４９】
血小板減少症（血小板欠乏）は、化学療法、各種薬物を用いる他の治療、放射線療法、手術、偶発的血液損失や他の特別の病的状態を含めたいろいろな理由で存在し得る。血小板減少症を含み、本発明に従って治療され得る特別の病的状態の例は、再生不良性貧血；乳癌に関連する特発性血小板減少性紫斑病を含めた特発性または免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）；ＨＩＶ関連ＩＴＰ及びＨＩＶ関連血栓性血小板減少性紫斑病；血小板減少症を引き起こす転移性腫瘍；新生児全身性エリテマトーデスを含めた全身性エリテマトーデス；ファンコーニ症候群；ビタミンＢ１２欠乏症；葉酸欠乏症；メイ−ヘグリン異常；ビスコット−オールドリッチ症候群；慢性肝疾患；血小板減少症に関連する骨髄異形成症候群；発作性夜間血色素尿症；Ｃ７Ｅ３  Ｆａｂ（アブシキマブ）治療後の急性深在性血小板減少症；先天性自己免疫性血小板減少症を含めた自己免疫性血小板減少症；抗リン脂質抗体及び血栓症に関連する血小板減少症；自己免疫性血小板減少症；カルボプラスチン誘発性血小板減少症やヘパリン誘発性血小板減少症を含めた薬物誘発性免疫性血小板減少症；胎児性血小板減少症；妊娠性血小板減少症；ヒューズ症候群；ルポイド血小板減少症；偶発的及び／または大量の血液損失；骨髄増殖性疾患；悪性疾患患者における血小板減少症；ガン患者において血栓性血小板減少性紫斑病／溶血性尿毒症として発現する血栓性細小血管障害として発現する血栓性血小板減少性紫斑病；自己免疫性溶血性貧血；潜在性空腸憩室穿孔；赤芽球ろう；自己免疫性血小板減少症；流行性腎症；リファンピシリン関連急性腎不全；パリス−トルソー血小板減少症；新生児自己免疫性血小板減少症；発作性夜間ヘモグロビリン尿症；胃癌における血液変化；幼児における溶血性尿毒症；Ａ型肝炎ウイルスを含めたウイルス感染に関連する血液学的発症；及びＣＭＶ関連血小板減少症である。また、ＡＩＤＳに対するある治療（例えば、ＡＺＴ）により血小板減少症が生ずる。ある創傷治癒疾患も血小板数の上昇の恩恵を受け得る。
【０１５０】
例えば将来の手術のために血小板欠乏が予想される場合には、本発明化合物が血小板が必要となる数日〜数時間前に投与され得る。偶発的な大量血液損失のような急な状況では、本発明の化合物が血液または精製血小板と一緒に投与され得る。
【０１５１】
本発明化合物は、巨核球以外のある細胞タイプがｍｐｌ受容体を発現することが判明したならば前記細胞を刺激する際に有用であり得る。ｍｐｌ受容体を発現する前記細胞に関連し、ｍｐｌリガンドによる刺激に応答する状態も本発明の範囲内である。
【０１５２】
本発明化合物は、血小板または血小板前駆体の産生が所望されたりｍｐｌ受容体の刺激が所望される状況で使用され得る。例えば、本発明化合物は血小板、巨核球等が必要な哺乳動物の状態を治療するために使用され得る。そのような状態は、援用により本明細書に含まれるとする国際特許出願公開第９５／２６７４６号パンフレット、同第９５／２１９１９号パンフレット、同第９５／１８８５８号パンフレット及び同第９５／２１９２０号パンフレットに詳記されている。
【０１５３】
本発明化合物は血小板及び／または巨核球及び関連細胞の生存率または貯蔵寿命を維持する際にも使用され得る。従って、前記細胞を含む組成物中に１つ以上の本発明化合物を有効量配合することが有用であり得る。
【０１５４】
「哺乳動物」は、ヒト、イヌやネコを含めた愛玩動物、サルを含めた外来及び／または動物園の動物、マウス，ラットやモルモットのような実験動物、ウマ，ウシ，ヒツジ，ヤギやブタを含めた家畜のような動物を意味する。好ましい哺乳動物はヒトである。
【０１５５】
Ｖ．  医薬組成物
本発明は、本発明の化合物の医薬組成物及び前記組成物の使用方法も提供する。前記医薬組成物は、例えば静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、鞘内、眼内、眼球後、肺内（例えば、エーロゾル化薬物）または（長時間放出させるための蓄積投与を含めた）皮下注射により；舌下、肛門、膣を介して；または脾膜下、脳下または角膜内に埋め込むような外科移植を含めた注射、或いは経口、点鼻、経皮膚または他の投与形態で投与され得る。治療では、ある期間に亘って１回または複数回投与し得る。一般的に、有効量の本発明の化合物を医薬的に許容され得る希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、助剤及び／または担体と一緒に含む医薬組成物が本発明に含まれる。前記組成物は、異なる緩衝剤含量、ｐＨ及びイオン強度を有する希釈剤（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）；添加剤、例えば洗剤及び可溶化剤（例えば、ツイーン８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメルソール、ベンジルアルコール）及び増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）を含み、前記物質をポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等）の粒状調製物またはリポソームへ配合させる。ヒアルロン酸も使用可能であり、これは循環中の持続時間を延長させる効果を有し得る。前記医薬組成物は、場合により他の医薬的に許容され得、医薬用ベヒクル、賦形剤または媒体として機能する液体、半固体または固体希釈剤を含み得る。その希釈剤の例には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチル−及びプロピル−ヒドロキシベンゾエート、スターチ、スクロース、デキストロース、アカシアガム、リン酸カルシウム、鉱油、カカオ脂及びカカオ油が含まれるが、これらに限定されない。前記組成物は本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を与え得る。例えば、援用により本明細書に含まれるとするＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，ｐ．１４３５−１７１２，ペンシルバニア州イーストンに所在のＭａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（１９９０年）発行を参照されたい。前記組成物は液体形態で製造されても、乾燥粉末（例えば、凍結乾燥形態）であってもよい。皮下処方物のような移植可能な徐放性処方物も意図される。
【０１５６】
本発明では、援用により本明細書に含まれるとするＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，第８９章，ペンシルバニア州イーストンに所在のＭａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（１９９０年）発行に包括的に記載されている経口固体剤形の使用も意図される。固体剤形には、錠剤、カプセル剤、ピル剤、トローチ剤またはロゼンジ、カシェ剤またはペレットが含まれる。また、本発明の組成物を処方するためにリポソームまたはプロテイノイドカプセル化（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号明細書に記載されているプロテイノイドミクロスフェア）も使用され得る。リポソームカプセル化が使用され得、リポソームは各種ポリマーで誘導体化され得る（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号明細書）。治療用に考えられる固体剤形については、援用により本明細書に含まれるとするＫ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，「現代薬学(Modern Pharmaceutics)」，Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ及びＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編，第１０章（１９７９）に記載されている。一般的に、処方物は本発明の化合物に加えて、胃環境を保護し、生物活性成分を腸で放出させる不活性成分を含み得る。
【０１５７】
上記した本発明化合物の経口剤形も特に意図される。所要により、前記化合物は、効率的に経口デリバリーされるように化学的に修飾されてもよい。一般的に、意図される化学修飾は（ａ）タンパク質加水分解を抑制し、（ｂ）胃または腸から血流へ取り込み得る部分の少なくとも１つの化合物分子それ自体への付着である。化合物の全安定性を上昇させ、身体中の循環時間を延長させることも望ましい。前記部分の例には、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンが含まれる（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ及びＤａｖｉｓ，「可溶性ポリマー−酵素付加物、薬物としての酵素(Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs)」，Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ及びＲｏｂｅｒｔｓ編，ｐ．３６７−３８３，ニューヨーク州ニューヨークに所在のＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８１年）発行；Ｎｅｗｍａｒｋら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４：１８５−１８９（１９８２））。使用され得る他のポリマーはポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−トリオキソカンである。上記した医薬用途のために好ましいものはポリエチレングリコール部分である。
【０１５８】
経口デリバリー剤形の場合には、本発明の治療用化合物の吸収を高めるための担体として修飾脂肪族アミノ酸、例えばＮ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）も使用し得る。ＳＮＡＣを用いるヘパリン処方物の臨床効果はＥｍｉｓｐｈｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが実施したフェーズＩＩ試験で立証されている。米国特許第５，７９２，４５１号明細書（経口薬物デリバリー組成物及び方法）を参照されたい。
【０１５９】
治療薬は約１ｍｍの粒径を有する顆粒またはペレットの形態の細かいマルチ粒子として処方物中に配合され得る。カプセル投与用の材料は粉末、軽く圧縮したプラグまたは錠剤として処方され得る。治療薬は圧縮により作成され得る。
【０１６０】
着色剤及びフレーバーが配合され得る。例えば、タンパク質（または、誘導体）は（例えばリポソームまたはミクロスフェアカプセル化により）処方され、その後着色剤及びフレーバーを含む冷蔵飲料のような飲食物中に配合され得る。
【０１６１】
治療薬の容量を不活性物質で希釈しても増量させてもよい。前記希釈剤には、炭水化物、特にマンニトール、ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、改質デキストラン及びスターチが含まれる。充填剤として特定の無機塩、例えばトリリン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムも使用され得る。数種の市販されている希釈剤はＦａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、Ｅｎｃｏｍｐｒｅｓｓ及びＡｖｉｃｅｌｌである。
【０１６２】
治療薬を固体剤形に処方する際に崩壊剤を配合し得る。崩壊剤として使用される物質には、スターチを主成分とする市販の崩壊剤であるＥｘｐｌｏｔａｂを含めたスターチが含まれるが、これに限定されない。ナトリウムスターチグリコレート、アンバーライト、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ウルトラマイロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、天然スポンジ及びベントナイトも使用され得る。他の形態の崩壊剤は不溶性カチオン交換樹脂である。粉末化ガムは崩壊剤及び結合剤として使用され得、これには寒天、カラヤガムやトラガカントガムのような粉末状ガムが含まれる。アルギン酸及びそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
【０１６３】
硬質錠剤を形成すべく治療薬を一緒に保持するために結合剤が使用され、その中にはアカシア、トラガカント、スターチ及びゼラチンのような天然産物由来の材料が含まれる。他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）はいずれも治療薬を造粒化するためにアルコール溶液中で使用され得る。
【０１６４】
調製過程での固着を防止するために減摩剤を治療薬の処方物中に配合し得る。滑沢剤が治療薬とダイ壁の間の層として使用され、その中にはステアリン酸（そのマグネシウム及びカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油及びワックスが含まれるが、これらに限定されない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、各種分子量を有するポリエチレングリコール、カーボワックス４０００及び６０００のような可溶性滑沢剤も使用され得る。
【０１６５】
調製中の薬物の流動性を改善し、圧縮中の再編成を助ける潤滑剤(glidants)も添加され得る。潤滑剤にはスターチ、タルク、発熱性シリカ、水和シリコアルミネートが含まれ得る。
【０１６６】
治療薬の水性環境への溶解を助けるために、界面活性剤を湿潤剤として添加し得る。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムのようなアニオン性界面活性剤が含まれる。カチオン性界面活性剤を使用し得、その中にはベンザルコニウムクロリドまたはベンゼソニウムクロリドが含まれる得る。界面活性剤として処方物中に配合され得るノニオン性界面活性剤には、ｌａｕｒｏｍａｃｒｏｇｏｌ  ４００、ポリオキシ４０ステアレート、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０，５０及び６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート４０，６０，６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースがリストされ得る。これらの界面活性剤はタンパク質または誘導体の処方物中に単独でまたはいろいろな比率の混合物として存在し得る。
【０１６７】
化合物の吸収を潜在的に高める添加剤の例は、脂肪酸オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。
【０１６８】
制御放出性組成物が望ましいことがある。薬物は拡散または浸出メカニズムにより放出する不活性マトリックス、例えばガム中に配合され得る。ゆっくり変性するマトリックス、例えばアルギネートまたはポリサッカライドも処方物中に配合され得る。治療薬の制御放出の別の形態はＯｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づく方法である。すなわち、薬物を、水は進入し浸透効果により１つの小さな開口を介して薬物を押し出す半透過性膜に包囲する。幾つかの経腸コーティングも遅放作用を有する。
【０１６９】
処方物に対して他のコーティングも使用され得る。これらには、コーティングパンで適用され得る各種糖が含まれる。治療薬はフィルムコーティング錠剤の形をも有し得、この場合に使用される材料は２群に分けられる。１群は非腸溶性材料であり、この中にはメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、プロビドン及びポリエチレングリコールが含まれる。第２群はフタル酸の一般的エステルである腸溶性材料である。
【０１７０】
最適なフィルムコーティングを与えるために材料ミックスを使用し得る。フィルムコーティングはパンコーターで、流動床でまたは圧縮コーティングにより実施され得る。
【０１７１】
本発明では、本発明のタンパク質（または、その誘導体）の肺デリバリーも意図される。タンパク質（または、その誘導体）は吸入しながら哺乳動物の肺にデリバリーされ、肺上皮内層を横切って血流に運ばれる。この他の報告には、Ａｄｊｅｉら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７：５６５−５６９（１９９０）；Ａｄｊｅｉら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，６３：１３５−１４４（１９９０）（酢酸リュープロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１３（補遺５）：ｓ．１４３−１４６（１９８９）（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら，Ａｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３：２０６−２１２（１９８９）（１−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８４：１１４５−１１４６（１９８９）（１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら，「タンパク質のエアゾール化(Aerosolization of Proteins)」，１９９０年３月にコロラド州キーストンで開催された呼吸薬デリバリーに関するシンポジウムの議事録(Proceedings of Symposium of Respiratory Drug Delivery)ＩＩ（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４０：３４８２−３４８８（１９８８）（インターフェロン及び腫瘍壊死因子）及びＰｌａｔｚらの米国特許第５，２８４，６５６号明細書（顆粒球コロニー刺激因子）が含まれる。
【０１７２】
治療薬の肺デリバリー用に設計された各種機械的デバイスを用いて本発明を実施することも考えられる。前記デバイスには、いずれも当業者に周知のネブライザー、定量吸入器及び粉末吸入器が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７３】
本発明を実施するのに適した市販デバイスの幾つかの例は、ミズーリー州セントルイスに所在のＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ製Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー、コロラド州エングルウッドに所在のＭａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ製Ａｃｏｒｉｎ  ＩＩネブライザー、ノースカロライナ州リサーチ・トライアグル・パークに所在のＧｌａｘｏ  Ｉｎｃ．製Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器、及びマサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．製造Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。
【０１７４】
前記デバイスではすべて本発明化合物を分配するのに適した処方物を使用しなければならない。典型的には、各処方物は使用するデバイスのタイプに特異的であり、治療に有用な希釈剤、アジュバント及び／または担体以外に適当な噴射剤を使用し得る。
【０１７５】
遠位の肺に最も有効にデリバリーさせるためには１０μｍ未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの平均粒径を有する粒状の形態で本発明化合物を製造することが最も好都合である。
【０１７６】
担体には、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトースやソルビトールのような炭水化物が含まれる。処方物中に使用される他の成分には、ＤＰＥＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＣが含まれる得る。天然または合成界面活性剤が使用され得る。（タンパク質またはアナログを誘導体化するときの使用とは別の）ポリエチレングリコールが使用され得る。シクロデキストランのようなデキストランが使用され得る。胆汁酸塩及び他の関連エンハンサーが使用され得る。セルロース及びセルロース誘導体が使用され得る。緩衝剤処方物中に使用されるようなアミノ酸が使用され得る。
【０１７７】
また、リポソーム、マイクロカプセルまたはマイクロスフェア、封入複合体または他のタイプの担体の使用も考えられる。
【０１７８】
ジェット式または超音波式ネブライザーと共に使用するのに適した処方物は、通常溶液１ｍｌあたり約０．１〜２５ｍｇの生物活性タンパク質の濃度で本発明化合物を水に溶解して含む。前記処方物は緩衝剤及び単純糖（例えば、タンパク質の安定化及び浸透圧の調節のために）をも含み得る。ネブライザー処方物は、エアゾールを形成するときに溶液を噴霧することにより生ずるタンパク質の界面誘導凝集を低下もしくは防止するために界面活性剤も含み得る。
【０１７９】
定量吸入器と共に使用するための処方物は、通常界面活性剤を用いて噴射剤中に懸濁させた本発明化合物を含む微粉末からなる。噴射剤はこの目的で使用されている慣用物質、例えばクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、炭化水素（トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタンを含む）及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン、またはその組合せであり得る。好適な界面活性剤にはソルビタントリオレエート及び大豆レシチンが含まれる。オレイン酸も界面活性剤として使用され得る。
【０１８０】
粉末吸入器から分配するための処方物は本発明化合物を含む乾燥微粉末からなり、デバイスからの粉末の消散を容易とする量、例えば処方物の５０〜９０重量％の増量剤、例えばラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはキシリトールをも含み得る。
【０１８１】
本発明化合物の経鼻デリバリーも意図される。経鼻デリバリーにより、治療薬を鼻に投与後その治療薬を肺に沈積させる必要なく血流に直接運び得る。経鼻デリバリーのための処方物には、デキストランまたはシクロデキストランを含むものが含まれる。他の粘膜を横切って移動させるデリバリーも意図される。
【０１８２】
用量
上記した状態を治療する方法に関する用量レジメは、薬物の作用を変化させる各種要因、例えば患者の年齢，状態，体重，性別及び食事、感染の重篤度、投与時期及び他の臨床要因を考慮して担当医により決定される。
【０１８３】
本発明化合物はまずボーラス注射後薬物の治療循環レベルを維持するために連続注入することにより投与され得る。別の例として、本発明化合物は１回投与として投与され得る。当業者は、良好な医学的プラクティス及び各患者の臨床状態により決定される有効用量及び投与レジメを容易に最適化する。投与頻度は薬剤の薬物動態パラメーター及び投与ルートに依存する。最適な医薬処方物は、投与ルート及び所望用量に依存して当業者により決定される。例えば、援用により本明細書に含まれるとするＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，ｐ．１４３５−１７１２，ペンシルバニア州イーストンに所在のＭａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｉｎｇ  Ｃｏ．（１９９０年）発行を参照されたい。前記処方物は、投与する薬物の物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を与え得る。投与ルートに応じて、適当な用量は体重、体表面積または臓器サイズに従って計算され得る。上記した各処方物を含む治療のための適切な用量を決定するために必要な計算は過度の実験を実施することなく、特に本明細書に記載されている用量情報及びアッセイ並びに上記したヒト臨床試験で見られる薬物動態的データーにてらして当業者が日常的に更に精査し得る。適当な用量は血液レベル用量を決定するための確立されたアッセイ及び適当な用量−応答データーを用いて決定され得る。最終投与レジメは、薬物の作用を変化させる各種要因、例えば薬物の特定活性、ダメージの重篤度及び患者の応答性、患者の年齢，状態，体重，性別及び食事、感染の重篤度、投与時期及び他の臨床要因を考慮して担当医により決定される。研究を実施したら、各種疾患及び状態に対する適当な用量レベル及び治療期間に関する更なる情報が得られる。
【０１８４】
本発明の治療方法、組成物及び化合物は、血小板欠乏及び他の症状により特徴づけられる病気の治療において単独でまたは他のサイトカイン、可溶性ｍｐｌ受容体、造血因子、インターロイキン、成長因子または抗体と一緒に使用され得る。本発明の化合物は幾つかの形態の血小板減少症の治療において一般的な造血刺激剤、例えばＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦと一緒に使用されると予想される。他の巨核球刺激因子、すなわちｍｅｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、または巨核球刺激活性を有する他の分子もｍｐｌリガンドと一緒に使用され得る。同時投与するための別のサイトカインまたは造血因子の例には、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、アンギオポエチン（例えば、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ）、ヒトアンギオポエチン様ポリペプチド、脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオゲニン、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体１Ａ、骨形態形成タンパク質受容体１Ｂ、脳由来神経栄養性因子、毛様体神経栄養性受容体、サイトカイン誘導好中球走化因子１、サイトカイン誘導好中球走化性因子２、サイトカイン誘導好中球走化性因子２、内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮細胞増殖因子、上皮誘導好中球誘因物質、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子８ｂ、線維芽細胞増殖因子８ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体１、グリア細胞株誘導好中球因子受容体２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラノサイト増殖因子、白血病阻害因子、白血病阻害因子受容体、神経増殖因子、神経増殖因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子２、血小板誘導内皮細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、血小板増殖因子Ａ鎖、血小板誘導増殖因子ＡＡ、血小板誘導増殖因子ＡＢ、血小板誘導増殖因子Ｂ鎖、血小板誘導増殖因子ＢＢ、血小板誘導増殖因子受容体、血小板誘導増殖因子受容体、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ０，ＴＮＦ１，ＴＮＦ２を含めたＴＮＦ、トランスホーミング増殖因子、トランスホーミング増殖因子、トランスホーミング増殖因子１、トランスホーミング増殖因子１．２、トランスホーミング増殖因子２、トランスホーミング増殖因子３、トランスホーミング増殖因子５、潜伏トランスフォーミング増殖因子１、トランスホーミング増殖因子結合タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子結合タンパク質ＩＩ、トランスホーミング増殖因子結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体タイプＩ、腫瘍壊死因子受容体タイプＩＩ、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、血管内皮細胞増殖因子及びキメラタンパク質、並びにその生物学的または免疫学的活性断片が含まれる。更に、巨核球が成熟形に達したときに巨核球を血小板に断片化する作用を有するとみられる可溶性哺乳動物ｍｐｌ受容体を有効量同時にまたは逐次投与することも有用であり得る。よって、（成熟巨核球の数を増加させるために）本発明化合物を投与した後（リガンドを不活性にし、成熟巨核球から血小板を産生させるために）可溶性ｍｐｌ受容体を投与することが血小板産生を刺激するための特に有効な手段であると予想される。上記した用量は治療用組成物中の追加成分を相殺するように調節される。治療される患者の進行は一般的方法を用いてモニターされ得る。
【０１８５】
本発明化合物を血小板組成物及び／または巨核球及び関連細胞の組成物に添加する場合その量は通常当業界で公知の技術及びアッセイにより実験的に決定される。その量は、例えば１０６細胞あたり０．１μｇ〜１ｍｇである。
【０１８６】
当業者は本明細書に記載されている教示内容にてらして本発明の教示を特定の問題または状況に適用することは理解される。本発明の産物及びその単離、使用及び製造のための代表的方法の例を以下に示す。
【実施例】
【０１８７】
以下、本明細書に記載されている幾つかの化合物を作成し、特性づける方法を例示する。
【０１８８】
（実施例１）
１．第２ペプチドライブラリーの構築
（Ａ）  エレクトロコンピテント大腸菌細胞の作成
３７℃において２ｘＹＴ培地（１．６％  バクトトリプトン、１％  酵母抽出物、８５．５ｍＭ  ＮａＣｌ）（１０ｍｌ）中で一晩大腸菌（ＴＧ１株；ニュージャージ州ピスカタウェーに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）培養物を調製した。この一晩培養物（１ｍｌ）を用いて、０．４％  グルコース及び１０ｍＭ  Ｍｇｌ２を含有する２ｘＹＴ培地（１Ｌ）を接種し、この１Ｌ培養物をＯＤ６００＝０．８まで３７℃において振とう機において増殖させた。培養物を氷上で１５分間冷却し、４℃において４０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−１０ローター）で２０分間遠心した。細菌ペレットを氷冷１０％グリセロール溶液（５００ｍｌ）に再懸濁し、生じた混合物を４℃において４０００ｒｐｍで２０分間遠心した。細菌ペレットを再び氷冷１０％グリセロール溶液（５００ｍｌ）に再懸濁し、生じた混合物を再び４℃において４０００ｒｐｍで２０分間遠心した。次いで、細胞ペレットを氷冷１０％グリセロール溶液（２５ｍｌ）に再懸濁した。この濃縮細菌サンプルを氷冷５０ｍｌ容量の円錐チューブに移し、４℃において卓上遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣＳ−６Ｒ）を用いて３５００ｒｐｍで１５分間遠心した。細胞ペレットを小容量の氷冷グリセロール溶液に再懸濁し、細菌ストック（１００または３００μｌ）を直ちにエタノール／ドライアイス浴において凍結し、−８０℃フリーザーで保存した。
（Ｂ）  ｐＣＥＳ１ベクターの修飾
ＰＣＲ反応を、Ｅｘｔｅｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム（インディアナ州インディアナポリスに所在のＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）、鋳型としてｐＣＥＳ１ベクター（ＴａｒｇｅｔＱｕｅｓｔ  Ｉｎｃ．）（１μｇ）を用いて実施した。ＰＣＲ混合物の容量は１００μｌであり、１×ＰＣＲ緩衝液、２００ｎＭずつの２つのプライマー５’−ＣＡＡＡＣＧＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡ−３’及び５’−ＧＧＴＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＡＧＣＡ−３’、２００ｎｍ  ｄＮＴＰ、３Ｕ  Ｔａｇ  ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。ＴＲＩＯ−Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）ＰＣＲシステムを以下のプログラムを実行するために使用した：９４℃×５分間；９４℃×３０秒間、５０℃×３０秒間、７２℃×４５秒間を１サイクルとして３０サイクル；７２℃×１０分間；４℃に冷却。ＰＣＲ産物を１％  アガロースゲルに流し、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎカラム（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）を製造業者のプロトコルに従って用いて精製した。第２回ＰＣＲ反応を、５μｌのＰＣＲ産物及び２００ｎＭずつの２つのプライマー、５’−ＣＡＡＡＣＧＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡ−３’及び５’−ＡＡＣＡＣＡＡＡＡＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴ−３’を用いて上記と同一ＰＣＲ条件で実施した。
【０１８９】
ＰＣＲ産物及びオリジナルのｐＣＥＳ１ベクターを別々に１×ＮＥＢ２緩衝液、６０ＵＡｐａＬＩ（マサチューセッツ州ビバリーに所在のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、６０Ｕ  ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む反応液（１００μｌ）中３７℃において１時間消化した。両方の消化ＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎカラムを用いて精製し、１×ライゲーション緩衝液及び４０Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する反応液（４０μｌ）中室温において一晩ライゲートした。
【０１９０】
ベクターを大腸菌にトランスフェクトし、３７℃において一晩インキュベートした。単離した単一コロニーを選択し、プラスミドをＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎカラムを用いて精製した。適正なインサートをＤＮＡ配列決定により確認した。
（Ｃ）  ベクターＤＮＡの作成
修飾ｐＣＥＳ１ベクターＤＮＡ（セクション１Ｂ）（１μｇ）を２５００Ｖ、２５°Ｆ及び２００オームに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩを用いてエレクトロコンピテントＴＧ１大腸菌（セクション１Ａ）（１００μｌ）に形質転換した。次いで、形質転換した細菌サンプルを直ちにＳＯＣ（２％  トリプトン、０．５％  酵母抽出物、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  グルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（９００μｌ）を収容したチューブに移し、この培養物を３７℃において振とうさせながら１時間増殖させた。次いで、細胞を２×ＹＴＡＧ（１００ｕｇ／ｍｌ  アンピシリン及び２％  グルコース含有２ｘＹＴ）寒天プレート上に散布し、３７℃において一晩インキュベートした。単一コロニーを用いて、３７℃において２ｘＹＴＡＧ培地（１Ｌ）に振とうさせながら一晩接種した。プラスミドベクターＤＮＡをＱＩＡＧＥＮプラスミドＭａｘｉキットを製造業者のプロトコルに従って用いて精製した。
（Ｄ）  ベクターＤＮＡの消化
ベクターＤＮＡ（セクション１Ｃ）（５０μｇ）を３７℃において１×ＮＥＢ緩衝液２、２００Ｕ  ＡｐａＬＩ及び２００Ｕ  ＸｈｏＩを含む反応物（４００μｌ中で一晩消化した。この制限消化反応物を３７℃において一晩インキュベートし、予備調製した１％  アガロースゲル（カリフォルニア州サンディエゴに所在のＥｍｂｉ  Ｔｅｃ．）で分析した。直線化ベクターＤＮＡをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＩＮＣ．）を製造業者の指示に従って用いて抽出した。
（Ｅ）  ライブラリーオリゴヌクレオチドの作成
２つのライブラリーオリゴヌクレオチド（固定及びドープド）を設計した、固定ライブラリーオリゴヌクレオチド５’−ＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＧＴＣＣＴＡＣＴＣＴＧＭＲＫＳＡＲＴＧＧＣＴＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＣＡＴＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧ−３’及びドープドライブラリーオリゴヌクレオチド５’−ＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣ−ＡＧＧＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫｇｇＫｃｃ−ＫａｃＫｃｔＫＮＮＫＮＮＫｔｇＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＣＡＴＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧ−−３’（小文字は７０％の表示塩基と１０％のそれぞれ他の３つのヌクレオチドの混合物を表す）を合成した。これらの各オリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応における鋳型として使用した。
【０１９１】
ＰＣＲ反応のためにＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステムキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いた。各ＰＣＲ反応物の容量は１００μｌであり、１０ｎＭ  ライブラリーオリゴヌクレオチド、１×ＰＣＲ緩衝液、３００ｎＭずつのプライマー５’−ＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴ−３’及び５’−ＴＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＧＡＡＴＧ−３’、２００ｎＭ  ｄＮＴＰ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、５Ｕ  Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼを含んでいた。サーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて以下のプログラムを実行した：９４℃×５分間；９４℃×３０秒間、５５℃×３０秒間及び７２℃×４５秒間を１サイクルとして３０サイクル；７２℃×７分間；４℃に冷却。遊離ヌクレオチドをＱＩＡｑｕｉｃｋ  ヌクレオチド除去キット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）を製造業者のプロトコルに従って用いて除去した。
（Ｆ）  ライブラリーオリゴヌクレオチドの消化
各ＰＣＲ産物（セクション１Ｅ）（５μｇ）を３７℃において１×ＮＥＢ緩衝液２、２００Ｕ  ＡｐａＬＩ及び２００Ｕ  ＸｈｏＩを含む反応物（４００μｌ）中で一晩消化した。消化したＤＮＡを３％  アガロースゲル（Ｅｍｂｉ  Ｔｅｃ）で分離した。各反応からの当該ＤＮＡバンドをゲルから切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて抽出した。
（Ｇ）  ライブラリーオリゴヌクレオチドとのベクターのライゲーション
線状化したベクター（セクション１Ｄ，２５μｇ）及び各消化ＰＣＲ産物（セクション１Ｆ，５μｇ）を１６℃において１×ＮＥＢライゲーション緩衝液及び８０Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを含む反応物（４００μｌ）中で一晩ライゲートした。ライゲートした産物を６５℃において２０分間インキュベートしてＤＮＡリガーゼを不活性とし、更に３７℃において８Ｕ  ＮｏｔＩと２時間インキュベートしてベクターの自己ライゲーションを最小限とした。次いで、ライゲートした産物を一般的なフェノール／クロロホルム抽出（Ｍａｎｉａｔｉｓら，「分子クローニング(Molecular CLoning)」，第３版）により精製し、Ｈ２Ｏ（３０μｌ）中に再懸濁した。
（Ｈ）  エレクトロポレーション形質転換
各ライブラリーに対して、１０エレクトロポレーション反応を実施した。各形質転換につき、ライゲートしたベクターＤＮＡ（セクション１Ｇ）（３μｌ）及びＴＧ１細胞（セクション１Ａ）（３００μｌ）を０．２ｃｍキュベット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）において混合した。生じた混合物に２５００Ｖ、２５ｕＦ及び２００オームに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩを用いてパルスを加えた。１０エレクトロポレーション反応からの形質転換した細菌サンプルを合わせ、３７℃において１時間インキュベートするためにＳＯＣ（２７ｍｌ）を収容しているフラスコに移した。次いで、細胞を２ｘＹＴＡＧ（１７０ｍｌ）に添加し、３７℃において振とうさせながら３時間増殖させた。細胞を４℃において５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。次いで、細胞ペレットを１５％  グリセロール／２ｘＹＴ（１０ｍｌ）中に再懸濁し、−８０℃で保存した。これはライブラリーの初期ストックである。力価は固定ライブラリー及びドープドライブラリーのそれぞれについて１．０×１０９独立形質転換体及び２．４×１０９独立形質転換体のライブラリーザイズを示した。
【０１９２】
２．ライブラリーの増幅
（Ａ）  ライブラリーの第２ストックの作成
初期ライブラリー細胞ストック（セクション１Ｈ）を用いて、出発ＯＤ６００＝０．１であるように２ｘＴＡＹＧ培地１３００ｍｌ（固定ライブラリーの場合）及び２６００ｍｌ（ドープドライブラリーの場合）に接種した。培養物を３７℃において振とうさせながらＯＤ６００＝０．５まで数時間増殖させた。固定ライブラリーの場合には１２０ｍｌアリコート及びドープドライブラリーの場合には２４０ｍｌアリコートを採取して、別のフラスコ中３７℃において更に２時間増殖させた。これらのサブ培養物を４℃において５０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−１４ローター）を用いて１０分間遠心し、−８０℃での保存のために細菌ペレットを１５％  グリセロール／２ｘＹＴ（各ライブラリーで１０ｍｌ）中に再懸濁した。
（Ｂ）  ファージ誘導
Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージアリコート（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をＯＤ６００＝０．５の残りの細胞培養物（セクション２Ａ）に３×１０９ｐｆｕ／ｍｌまで添加した。ヘルパーファージを用い、３７℃で振とうさせることなく３０分間、ゆっくり振とうさせながら３０分間細菌を感染させた。感染細胞を４℃において５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。細胞ペレットを２ｘＹＴＡＫ（１００ｕｇ／ｍｌ  アンピシリン及び４０ｕｇ／ｍｌ  カナマイシン含有２ＹＴ）１３００ｍｌ（固定ライブラリー）及び２６００ｍｌ（ドープドライブラリー）中に再懸濁させた。ファージミドの産生は３７℃において振とうさせながら一晩で生じた。
（Ｃ）  ファージの収集
細菌培養物（セクション２Ｂ）を４℃において５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を新しいボトルに移し、０．２容量の２０％  ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを添加し、氷上で１時間インキュベートして、ファージミドを沈殿させた。沈殿したファージミドを４℃において８０００ｒｐｍで２０分間遠心し、冷ＰＢＳ（１００ｍｌ）と注意深く再懸濁させた。残りの細胞を４℃において８０００ｒｐｍで１０分間遠心して除去し、０．２容量の２０％  ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを添加することによりファージを沈殿させることにより、ファージミド溶液を更に精製した。ファージミドを４℃において８０００ｒｐｍで２０分間遠心し、ファージミドペレットを冷ＰＢＳ（１２ｍｌ）で再懸濁した。−８０℃での保存のために６０％  グリセロール溶液（４ｍｌ）をファージミド溶液に添加した。ファージミド力価を一般的手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら，「分子クローニング(Molecular CLoning)」，第３版）により測定した。
【０１９３】
３．ヒトＭＰＬ結合ファージの選択
（Ａ）  ヒトＭＰＬのビオチニル化
組換えヒトＭＰＬ（１ｍｇ）をＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチニル化キット（イリノイ州ロックフォードに所在のＰＩＥＲＣＥ）を製造業者の指示に従って用いてビオチニル化した。
【０１９４】
（Ｂ）  ＭＰＬの磁気ビーズ上への固定化
ビオチニル化ＭＰＬ（セクション３Ａ）をＤｙｎａｂｅａｄ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン（ニューヨーク州レークサクセスに所在のＤＹＮＡＬ）上に製造業者からのビーズストック１００μｌあたり１μｇのＭＰＬの濃度で固定化した。磁石を用いてチューブの片面にビーズを引き寄せ、ピペットで排液した後、ビーズをリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。ビオチニル化ＭＰＬタンパク質を洗浄ビーズに上記濃度で添加し、室温において回転させながら１時間インキュベートした。次いで、ＭＰＬ被覆ビーズを、ＢＳＡを２％最終濃度まで添加し、４℃において回転させながら一晩インキュベートすることによりブロックした。次いで、生じたＭＰＬ被覆ビーズをＰＢＳＴ（０．０５％  ツイーン２０含有ＰＢＳ）で２回洗浄した後、選択手順にかけた。
【０１９５】
（Ｃ）  ＭＰＬ被覆ビーズを用いる選択
約１００倍ライブラリー等価ファージミド（セクション２Ｃ；固定ライブラリーでは１×１０１１ｃｆｕ、ドープドライブラリーでは２．４×１０１１ｃｆｕ）を２％  ＢＳＡ含有ＰＢＳ（１ｍｌ）を用いて１時間ブロックした。ブロックしたファージミドサンプルをブランクビーズ（セクション３Ｂと同じビーズであるがＭＰＬで被覆されていない）に添加してネガティブ選択ステップにかけ、この混合物を室温において回転させながら１時間インキュベートした。ファージミド含有上清を磁気を用いて引き抜き、ＭＰＬ被覆ビーズ（セクション３Ｂ）を収容した新しいチューブに移し、この混合物を室温において回転させながら１時間インキュベートした。上清を捨てた後、ファージミド結合ビーズをＰＢＳＴで１０回、ＰＢＳで１０回洗浄した。次いで、ファージミドをローターを用いて１００ｍＭ  トリエチルアミン溶液（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ）（１ｍｌ）に１０分間溶離させた。ファージミド含有溶液のｐＨを１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（０．５ｍｌ）を添加して中和した。生じたファージミドを用いて、新しく成長させたＴＧ１細菌（ＯＤ６００＝０．５）（５ｍｌ）を３７℃において振とうさせることなく３０分間、ゆっくり振とうさせながら３０分間感染させた。全ての感染ＴＧ１細胞を大きな２ｘＹＴＡＧプレートで平板培養し、３０℃において一晩インキュベートした。
【０１９６】
（Ｄ）  ファージの誘導及び収集
２ｘＹＴＡＧ培地の１０ｍｌアリコートをプレート（セクション３Ｃ）に添加して、ＴＧ１細胞を再懸濁した。全てのＴＧ１細胞をチューブに集め、前記細胞の２５０μｌアリコートを２ｘＹＴＡＧ（２５ｍｌ）に添加し、ＯＤ６００＝０．５まで３７℃において増殖させた。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを３×１０９ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度まで添加し、３７℃において振とうせずに３０分間、ゆっくり振とうさせながら３０分間インキュベートした。細胞を４℃において５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、２ｘＹＴＡＫ（２５ｍｌ）中に再懸濁した。これらの細菌を振とうさせながら３０℃において一晩培養した。誘導したファージミドを収集し、セクション２Ｃに記載したように精製した。
【０１９７】
（Ｅ）  第２回選択
以下の点を除きセクション３Ｂ及び３Ｃに概説したように第２回選択を実施した。セクション３Ｄからのファージミド溶液の約０．５ｍｌアリコートを入力ファージミドとして用いた。ビオチニル化ＭＰＬ（セクション３Ａ）の０．１μｇのみを用いてＤｙｎａｂｅａｄ  Ｍ−２８０ストレプトアビジンを被覆した。ファージ結合ビーズをＰＢＳＴで１６回洗浄し、最終洗浄にはＰＢＳＴ中室温において３０分間のインキュベーションを含めた。ビーズをＰＢＳで１０回以上洗浄した。
【０１９８】
４．クローン分析
（Ａ）  マスタープレートの作成
第２回選択からの単一コロニーを選択し、１２０μｌ／ウェルの２ｘＹＴＡＧを収容している９６ウェルプレートに接種した。９６ウェルプレートを３０℃振とう装置を用いて一晩インキュベートした。−８０℃での保存用に６０％  グリセロール（４０μｌ／ウエル）を添加した。
【０１９９】
（Ｂ）  ファージミドＥＬＩＳＡ
マスタープレート（セクション４Ａ）からの細胞の約３μｌアリコートを１２０μｌ／ウェルの２ｘＹＴＡＧを収容している新しい９６ウェルプレートに接種し、この新しいプレートの細胞を約ＯＤ６００＝０．５まで３７℃において増殖させた。各ウェルに２ｘＹＴＡＧ含有Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（１．２×１０１０ｃｆｕ／ｍｌ）（４０μｌ）を添加し、９６ウェルプレートを３７℃において振とうせずに３０分間、ゆっくり振とうさせながら更に３０分間インキュベートした。プレートを４℃において２０００ｒｐｍで（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣＳ−６Ｒ卓上遠心機）１０分間遠心した。上清をウェルから除去し、各細胞ペレットを２ｘＹＴＡＧ（１６０μｌ／ウェル）を用いて再懸濁した。プレートをファージ発現のために３０℃において一晩インキュベートした。
【０２００】
４℃において組換えヒトＭＰＬで９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）を０．１Ｍ  炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌで一晩被覆した。コントロールとして、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で別のＭａｘｉｓｏｒｐプレートを５ｕｇ／ｍｌで被覆した。
【０２０１】
翌日、一晩細胞培養物を４℃において２０００ｒｐｍで１０分間遠心した。各ウェルからの上清（２０μｌ）を２％  ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液（１８０μｌ／ウェル）を収容した新しい９６ウェルプレートに移した。生じた混合物を室温において振とうさせながら１時間インキュベートして、ファージミドをブロックした。一方、ＭＰＬ被覆プレートを室温において２％  ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液（２００μｌ／ウェル）を用いて振とうさせながらブロックした。ＢＳＡ溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した。最後の洗浄ステップ後、ブロックしたファージミド溶液（５０μｌ）をＭＰＬ被覆プレート及びコントロールプレートの各ウェルに添加し、室温において振とうさせながら１時間インキュベートした。液体を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した。１：１５，０００希釈度のＨＲＰコンジュゲートした抗−Ｍ１３ｍＡｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（５０μｌ）をＭＰＬ被覆プレート及びコントロールプレートの各ウェルに添加し、これらのプレートを室温において振とうさせながら１時間インキュベートした。液体を再び捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した。ＬｕｍｉＧＬ０化学ルミネッセント基質（メリーランド州ゲーザーズバーグに所在のＫｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（５０μｌ）をウェルに添加し、各ウェルをＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＤＬＲｅａｒｌｙ機（マサチューセッツ州フランクリンに所在のＬａｂｓｙｓｔｅｍ）を用いて読んだ。
【０２０２】
（Ｃ）  ファージクローンの配列決定
ＰＣＲ反応を、鋳型としてマスタープレート（セクション４Ａ）の各ウェルからの細菌（１μｌ）を用いて実施した。各ＰＣＲ混合物の容量は２０μｌであり、１×ＰＣＲ緩衝液、３００ｎＭずつの２つのプライマー５’−ＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣ−３’及び５’−ＧＴＡＣＣＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＧＴＴＴＣＧ−３’、２００ｎＭ  ｄＮＴＰ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２及び５Ｕ  ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含んでいた。ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて以下のプログラムを実行した：９４℃×５分間；９４℃×４５秒間、５５℃×４５秒間及び７２℃×９０秒間を１サイクルとして４０サイクル；７２℃×１０分間；４℃に冷却。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ９６  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）を製造業者の指示に従って用いて精製した。全ての精製ＰＣＲ産物をＡＢＩ  ３７７０シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造業者の指示に従って用いてプライマー５’−ＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’で配列決定した。
【０２０３】
５．配列ランキング
上記したヌクレオチド配列から翻訳したペプチド配列をＥＬＩＳＡデーターと相関させた。ＭＰＬ被覆ウェルで高いＯＤ測定値及びＢＳＡ被覆ウェルで低いＯＤ測定値を示したクローンは更なる研究のための候補物と見做された。複数回現れる配列も更なる研究のための候補物と見做された。これらの基準に基づいて選択したファージクローンをＥＬＩＳＡ測定実験において更に特性づけた。図９（特定ファージクローンのＥＬＩＳＡ用量−応答）参照。
【０２０４】
（実施例２）
ペプチドの作成
全てのペプチドを十分に確立されている段階的固相合成法により作成した。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｄ及びＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９６９）参照。Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸をビルディングブロックとして使用し、ペプチド鎖をＡＢＩまたはＳｙｍｐｈｏｎｙペプチド合成装置を用いて構築した。典型的には、ペプチド合成を予備充填Ｗａｎｇ樹脂を用いて開始して、Ｃ末端に遊離カルボン酸を有するペプチドを作成した（或いは、Ｃ末端アミド官能基を有するペプチドを作成するためにＲｉｎｋ樹脂を使用することができる）。一般的なピペリジンプロトコルを用いてＦｍｏｃを除去した。カップリングはウロニウム（例えば、ＨＢＴＵ）またはカルボジイミド（例えば、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ）化学を用いて実施した。側鎖保護基はＧｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）、Ａｓｐ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）、Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）、Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（ｔ−Ｂｏｃ）、Ｔｒｐ（Ｔ−Ｂｏｃ）及びＣｙｓ（Ｔｒｔ）であった。全てのペプチジル樹脂の最終脱保護及び開裂は２．５％  Ｈ２Ｏ、５％  フェノール、２．５％  トリイソプロピルシラン及び２．５％  チオアニソールまたはメルカプトエタノールを含むトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて室温において４時間実施した。ＴＦＡを除去後、開裂ペプチドを冷無水エーテルを用いて沈殿させた。ジスルフィド結合を含むペプチドの場合、Ｈ２Ｏ中１５％  ＤＭＳＯ（ｐＨ７．５）を用いることにより粗物質に対して環状産物の直接形成を実施した。全ての粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣにより精製し、精製したペプチドの構造をＥＳＩ−ＭＳ及びアミノ酸分析により確認した。
【０２０５】
（実施例３）
ＴＭＰ−Ｆｃペプチ体化合物の作成
数種のペプチドをペプチド−Ｆｃ融合物（すなわち、ＦｃがペプチドのＣ末端に結合）（Ｃ末端融合物）として発現させるために選択した。各ＴＰＯ−模擬ペプチドにインフレームで融合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を次のようにプラスミド発現ベクターｐＡＭＧ２１中にＬｕｘＰＲプロモーターの制御下に置いた。
【０２０６】
ＴＭＰ１−Ｆｃをコードするプラスミド（Ａｍｇｅｎ株＃３７８８）を、アニーリングしたオリゴヌクレオチドから短ペプチドを簡単にクローニングするためにＡｐａＬＩ部位及びＸｈｏＩ部位を含むように改変した。プライマー２３９６−６９を用いてＡｐａＬＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を付加した。ＰＣＲをＥｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇポリメラーゼを用い、２３９６−６９及び３７８８ＤＮＡ鋳型上のユニバーサル３’プライマー１９１−２４で実施した。プライマー配列は以下の通りである：
【０２０７】
【化１７】
2005523682.tif 000024
【０２０８】
生じたＰＣＲ断片をＮｄｅＩ及びＢｓｒＧＩで消化し、ゲル精製し、インサートとして使用した。株＃３７８８由来のプラスミドもＮｄｅＩ及びＢｓｒＧＩで消化し、ゲル精製し、ベクターとして使用した。ベクター及びインサートをライゲートし、生じたライゲーション混合物をＧＭ２２１細胞（以下参照）にエレクトロポレーションした。単一コロニーを選び、プラスミドＤＮＡを作成し、ＤＮＡを配列決定した。１つの生じたプラスミド２００００３１８０は適正なＤＮＡ配列を有していることが判明し、ＴＭＰ−Ｆｃ融合物を構築するためのベクターとして使用した。このベクターを図６に示す。
【０２０９】
プラスミド２００００３１８０をＡｐａＬＩ及びＸｈｏＩで消化し、ベクターとして使用した。オリゴヌクレオチドの各対（図７）をアニーリングして、ＡｐａＬＩ及びＸｈｏＩ付着末端と二重鎖を形成した。これらの分子をベクターにライゲートして、当該の融合タンパク質を生成した。オリゴヌクレオチドの各対応対に対するＡｐａＬＩ−ＸｈｏＩ断片を図７に示す。
【０２１０】
ＴＭＰ１〜２３、２５、２６及び２８をＣ末端融合物として発現させた。
【０２１１】
（実施例４）
Ｆｃ−ＴＭＰペプチ体化合物の作成
数種のペプチドをＦｃ−ペプチド融合物（すなわち、ＦｃがペプチドのＮ末端に結合）（Ｎ末端融合物）として発現させた。Ｆｃ−ＴＭＰ１をコードするプラスミド（Ａｍｇｅｎ株＃３７２８）を、アニーリングしたオリゴヌクレオチドから短ペプチドを容易にクローニングするためにＡｐａＬＩ部位及びＸｈｏＩ部位を含むように改変した。プライマー２３９６−７０をＡｐａＬＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を付加するように設計した。ＰＣＲをＥｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇポリメラーゼを用い、２３９６−７０及び３７８８ＤＮＡ鋳型上のユニバーサル５’プライマー１２０９−８５で実施した。プライマー配列は以下の通りである：
【０２１２】
【化１８】
2005523682.tif 000025
【０２１３】
生じたＰＣＲ断片をＢｓｒＧＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、インサートとして使用した。株＃３７２８由来のプラスミドもＢｓｒＧＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、ベクターとして使用した。ベクター及びインサートをライゲートし、生じたライゲーション混合物をＧＭ２２１細胞にエレクトロポレーションした。単一コロニーを選び、プラスミドＤＮＡを作成し、ＤＮＡを配列決定した。１つの生じたプラスミド２００００３１８２（図８）は適正なＤＮＡ配列を有していることが判明し、Ｆｃ−ＴＭＰ融合物を構築するためのベクターとして使用した。
【０２１４】
プラスミド２００００３１８２をＡｐａＬＩ及びＸｈｏＩで消化し、ベクターとして使用した。ＡｐａＬＩ及びＸｈｏＩ付着末端を有するアニーリングしたオリゴをベクターにライゲートして、当該の融合物を生成した。
【０２１５】
このようにして、ＴＭＰ２０、ＴＭＰ２４、ＴＭＰ２７、ＴＭＰ２９及びＴＭＰ３０をＮ末端融合物として発現させた。
【０２１６】
形質転換
各ライゲーションをエレクトロポレーションにより下記する宿主株ＧＭ２１１に形質転換した。組換えタンパク質産物を産生し、適正なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合物を有する能力についてクローンをスクリーニングにかけた。
【０２１７】
ｐＡＭＧ２１
発現プラスミドｐＡＭＧ２１はＡＴＣＣに１９９６年７月２４日に寄託され、寄託番号９８１１３でＡＴＣＣから入手可能である。
【０２１８】
ＧＭ２２１（Ａｍｇｅｎ宿主株＃２５９６）
Ａｍｇｅｎ宿主株＃２５９６は、初期ｅｄｇ領域に温度感受性ラムダリプレッサーｃＩ８５７ｓ７及び後期ｅｄｇ領域（６８分）にｌａｃＩＱリプレッサーを含むように修飾した大腸菌Ｋ−１２株である。２つのリプレッサー遺伝子を存在させたことにより、この宿主を各種発現系で使用することができるが、これらのリプレッサーはｌｕｘＰＲからの発現に無関係である。非形質転換宿主は抗生物質耐性を有していない。
【０２１９】
ｃＩ８５７ｓ７遺伝子のリボソーム結合部位は強化ＲＢＳを含むように修飾した。Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ６４４４１Ｇｂ＿ＢａのナンバリングでヌクレオチドＮｏ．１１７０とＮｏ．１４１１の間のｅｂｇオペロンに挿入し、介入ｅｂｇ配列を欠失させた。
【０２２０】
構築物を、Ｆ’ｔｅｔ−３９３にＭＭｅｂｇ−ｃＩ１８５７ｓ７強化ＲＢＳ＃４と称される組換えファージを用いて染色体にデリバリーした。組換え及び回復後、上記した染色体インサートのみが細胞中に残っている。それはＦ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１と名付けられた。
【０２２１】
次いで、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ６４４４１Ｇｂ＿ＢａのナンバリングでヌクレオチドＮｏ．２４９３とＮｏ．２９３７の間のｅｂｇオペロンにｌａｃＩＱ構築物をデリバリーし、介入ｅｂｇ配列を欠失させることにより、Ｆ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１を修飾した。構築物をＦ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１にＡＧｅｂｇ−ＬａｃＩＱ＃５と称される組換えファージを用いて染色体にデリバリーした。組換え及び回復後、上記した染色体インサートのみが細胞中に残っている。それはＦ’ｔｅｔ／ＧＭ２２１と名付けられた。Ｆ’ｔｅｔエピソームをＬＢ中２５ｕｇ／ｍｌの濃度でアクリジンオレンジを用いて株から除去した。除去した株はテトラサイクリン感受性として同定され、ＧＭ２２１として保存した。
【０２２２】
発現
各融合タンパク質を発現するＧＭ２２１の培養物を３７℃においてＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地で増殖させた。合成オート誘導物質Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリンラクトンを２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで培地に添加し、３７℃で更に３時間インキュベートした後、ｌｕｘＰＲプロモーターからの遺伝子産物発現を誘導した。３時間後、細菌培養物を封入体の存在について顕微鏡で検査した後、遠心により集めた。屈性折封入体が誘導培養物中で観察され、このことから融合タンパク質が大腸菌において不溶性分画中に産生された可能性が高いことが示された。細胞ペレットを、１０％  β−メルカプトエタノール含有Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中に再懸濁して直接溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。適当なサイズ（約３０ｋＤａ）を有する強いクーマシー染色バンドが各タンパク質について観察された。
【０２２３】
（実施例５）
ペプチ体の精製
細胞を高圧ホモジナイゼーション（１４，０００ＰＳＩで２回通す）により水（１／１０）中で破壊し、封入体を遠心（Ｊ−６Ｂにおいて４２００ｒｐｍで１時間）して収集した。封入体を６Ｍ  グアニジン、５０ｍＭ  トリス、８ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ８．７）中１／１０比で可溶化した。可溶化混合物を２Ｍ  尿素、５０ｍＭ  トリス、１６０ｍＭ  アルギニン、３ｍＭ  システイン（ｐＨ８．５）に２０倍希釈した。混合物を冷所で一晩撹拌した。次いで、混合物を限外濾過により約１０倍濃縮した、次いで、１０ｍＭ  トリス、１．５Ｍ  尿素（ｐＨ９）で３倍希釈した。次いで、この混合物のｐＨを酢酸を用いてｐＨ５に調節した。遠心により沈殿を除去し、上清を２０ｍＭ  ＮａＡｃ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５）で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに充填した（１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質充填、室温）。タンパク質を同一緩衝液中１００ｍＭ  ＮａＣｌから５００ｍＭ  ＮａＣｌの範囲の濃度勾配で２０カラム容量を用いて溶離させた。前記カラムからのプールを３倍希釈し、２０ｍＭ  ＮａＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５）で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムに充填した（１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質充填、室温）。タンパク質を同一緩衝液中１５０ｍＭ  ＮａＣｌから４００ｍＭ  ＮａＣｌの範囲の濃度勾配で２０カラム容量を用いて溶離させた。ピークをプールし、濾過した。
【０２２４】
（実施例６）
ペプチドアフィニティー結合調査
数種のＴＭＰペプチド（ＴＭＰ１〜ＴＭＰ２３）について結合アフィニティーを調べるために実験をＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００を用いて室温において実施した。Ｈｕ−ｍｐｌをアミンカップリング法（ＮＨＳ／ＥＤＣにより活性化及びエタノールアミンによりブロッキング）を用いてセンサーチップ（ＣＭ５）表面上に固定化した。０．７８〜１００ｎＭのＴＭＰペプチドをｈｕ−ｍｐｌ表面に注入した。ＢＩＡＣＯＲＥランニング緩衝液は０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０を含むＰＢＳであった。サンプルをコントロール用のブランク表面に注入した。実験データーをＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ  ３．１ソフトウェアパッケージを用いて分析した。
【０２２５】
上記したように、ペプチドを選択したファージ環境をよりうまく模倣し、受容体から１８個のアミノ酸からなる好ましいペプチド（ＴＭＰ２〜ＴＭＰ３０）の帯電アミノ−及びカルボキシ−末端を隠すために、２つのアミノ酸“キャップ”を各ペプチドのカルボキシ末端及びアミノ末端のそれぞれに付加した。アミノ末端にはグルタミン−システイン（ＱＣ）、カルボキシ末端にヒスタジン−セリン（ＨＳ）を付加して、各ペプチドの長さを２２アミノ酸とした。ペプチドアフィニティーはペプチドが長くなると増加することは公知であるので、基準生物活性１４アミノ酸ペプチド配列（配列番号１）も全部で２２アミノ酸に増加させた。しかしながら、各ペプチドの生物活性領域は同じままであり、以下に太字で示す。
【０２２６】
【表６】
2005523682.tif 000026
【０２２７】
（実施例７）
ペプチド生物活性調査
ペプチドＴＭＰ１〜ＴＭＰ２３の生物活性を調べるために細胞ベースアッセイを用いた。
【０２２８】
マウス３２Ｄ細胞増殖アッセイはヒトｍｐｌ受容体をトランスフェクトしたマウス３２Ｄ細胞を使用する。以下の結果はＴＭＰ１に相対させて報告する。
【０２２９】
ＣＤ６１細胞アッセイは一次ヒトＣＤ３４＋細胞を使用し、この細胞をペプチドＴＭＰ１〜ＴＭＰ２３の存在下で数日間培養した。次いで、前記細胞を選別して、細胞表面上で巨核球特異的マーカー（ＣＤ６１）を発現する細胞の％を測定した。活性化合物は用量依存的に血小板前駆体細胞の出現を刺激したのに対して、赤血球前駆体（ＣＤ３６＋）及び好中球（ＣＤ１５＋）に対するマーカーはベースラインに留まった。３つの異なる濃度の平均値で表すＣＤ６１細胞アッセイの定性結果を以下に示す。
【０２３０】
【表７】
2005523682.tif 000027
2005523682.tif 000028
【０２３１】
（実施例８）
ペプチ体調査
数種のＴＭＰペプチ体を、ＢＩＡｃｏｒｅでの直接結合分析においてそのｈｕ−ＭＰＬに対する結合活性について試験した。実験をＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｉｎｃ．）を用いて２５℃において実施した。ランニング緩衝液は０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０を含むＰＢＳであった。組換えプロテインＧ（Ｐｉｅｒｃｅ  ２１１９３ＺＺ）を標準アミンカップリング手順（ＮＨＳ／ＥＤＣによる活性化及びエタノールアミンによるブロッキング）に従ってＣＭ５チップ上に固定化して、ＴＭＰペプチ体を約４００ＲＵまで捕捉した。組換えｈｕ−ＭＰＬ（ロット２７３１５−５３）を同一緩衝液（０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０及び１００ｕｇ／ｍｌ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ）で１ｕＭから０．１５ｎＭに連続希釈した後捕捉したペプチ体表面上に５０ｕｌ／分で３分間注入した。非特異的結合バックグラウンドを減じるためにｒｈｕ−ＭＰＬサンプルもブランクのプロテインＧ表面に注入した。プロテインＧ表面をＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＩｇＧ溶離緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  ２１００９ＺＺ，ｐＨ２）（１００ｕｌ）及び８ｍＭ  グリシン（ｐＨ１．５）（１００ｕｌ）を逐次注入し、２サイクルの間に１Ｍ  ＮａＣｌを５０ｕｌ／分注入して再生した。ペプチ体のｒｈｕ−ＭＰＬに対する結合アフィニティー（ＫＤ）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｉｎｃ）を用いてデーターを非線形回帰分析して求めた。結果を以下に要約する。
【０２３２】
【表８】
2005523682.tif 000029
【０２３３】
（実施例９）
ペプチ体活性アッセイ
一次ヒトＣＤ３４＋細胞を数種のＴＭＰ−Ｆｃ融合タンパク質の存在下で数日間培養した。次いで、前記細胞を選別して、細胞表面上で巨核球特異的マーカー（ＣＤ６１）を発現する細胞の％を調べた。活性化合物は用量依存的に血小板前駆体細胞の出現を刺激したのに対して、赤血球前駆体（ＣＤ３６＋）（示さず）及び好中球（ＣＤ１５＋）（示さず）に対するマーカーはベースラインに留まった。図１０、１１及び１２（ＣＤ６１細胞アッセイ）を参照。
【０２３４】
（実施例１０）
インビボ活性
約１０〜１２週令の正常雌ＢＤＦ１マウスをインビボ活性研究のために用いた。
【０２３５】
マウスにボーラス治療のために皮下注射した。皮下注射により０．２ｍｌ容量をデリバリーした。化合物を０．１％  ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈した。全ての実験群に１つのコントロール群（この希釈剤のみで処置した“担体”）を含めた。
【０２３６】
１群あたり１０匹のマウスを０日目に処置し、１群あたり全部で２０匹のマウスとして２つの群は４日ずらして始めた。５匹のマウスは各時点で出血させ、マウスは最低でも１週に３回出血させた。マウスをイソフルランで麻酔し、全部で１４０〜１６０ｕｌの血液を眼窩をせん孔することにより採取した。血液をＴｅｃｈｎｉｃｏｎ  Ｈ１Ｅ血液分析装置ランニングソフトウェァを用いてカウントした。測定したパラメーターは白血球、赤血球、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板及び好中球であった。図１３及び１４参照。
【０２３７】
本発明を詳細に説明してきたが、本明細書に記載した本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく多くの変化及び修飾を加えることができることは当業者には自明である。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】本発明のペプチド及びペプチド−リンカー化合物の典型的な構造を示す。
【図２】本発明のペプチド−ベヒクル及びペプチド−リンカー−ベヒクル化合物の典型的な構造を示す。
【図３】本発明において好ましいベヒクルとして使用され得るヒトＩｇＧ１  Ｆｃの核酸（配列番号３１）及びアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。
【図４】ＩｇＧ１抗体から誘導され得る本発明の典型的なＦｃモノマー及びダイマーを示す。図中、“Ｆｃ”は本明細書中のＦｃドメインの定義の範囲内のＦｃ変異体を表す。“ペプチド”は本明細書に記載されているペプチド、リンカー−ペプチド、ペプチド−ペプチド組合せ、またはその任意の組合せを表す。特定ダイマーは次の通りである：  図４Ａ及び４Ｄは１つのジスルフィドで結合されたダイマーを示す。ＩｇＧ１抗体は通常抗体のヒンジ領域に２つのジルフィド結合を有する。図４Ａ及び４Ｄ中のＦｃドメインは２つのジスルフィド結合部位間を切端するかまたはシステイニル残基を非反応性残基（例えば、アラニル）で置換することにより形成され得る。図４ＡではＦｃドメインはペプチドのアミノ末端に連結しており、図４Ｄではペプチドのカルボシキ末端で連結している。  図４Ｂ及び４Ｅは２つのジスルフィドで結合されたダイマーを示す。このＦｃドメインはＦｃドメイン鎖中の両方のシステイニル残基を保持するように親抗体を切端することにより、またはＦｃドメインをコードする配列を含む構築物から発現することにより形成され得る。図４Ｂでは、Ｆｃドメインはペプチドのアミノ末端に連結しており、図４Ｅではペプチドのカルボキシ末端で連結している。  図４Ｃ及び４Ｆは非共有ダイマーを示す。このＦｃドメインは切端または置換によりシステイニル残基を除去して形成され得る。システイニル残基を宿主細胞中に存在する他のタンパク質のシステイニル残基と反応させることにより形成される不純物を避けるために前記システイニル残基を除去することが望ましい。Ｆｃドメインの非共有結合はダイマーを一緒に保持するのに十分である。他のダイマーは異なるタイプの抗体（例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＭ）由来のＦｃドメインを用いることにより形成され得る。  図４Ｇ及び図４ＨはペプチドのＮ末端（図４Ｇ）及びペプチドのＣ末端（図４Ｈ）で結合した１本鎖Ｆｃドメインを示す。
【図５】Ｆｃドメインに結合した医薬的に活性なペプチドのタンデム反復単位の特徴を有する本発明の好ましい化合物の典型的な構造を示す。図５Ａはタンデムペプチドダイマーを結合して有する一本鎖（すなわち、Ｆｃモノマー）分子を示し、分子のＤＮＡ構築物をも表し得る。図５Ｂはリンカー−ペプチド部分がＦｃダイマーの１つの鎖上にのみ存在しているＦｃダイマーを示す。図５Ｃは両方の鎖にペプチド部分（この場合には、タンデムペプチドダイマー）を有するＦｃダイマーを示す。図５Ｃのダイマーは図５Ａに示す一本鎖をコードするＤＮＡ構築物の発現時にある宿主細胞において自動的に形成する。他の宿主細胞では、細胞はダイマーの形成を支持する条件に置かれ得るか、またはダイマーはインビボで形成され得る。図５Ｄ〜５Ｉは別の典型的な一本鎖（Ｆｃモノマー）及び二本鎖（Ｆｃダイマー）好ましい実施態様を示す。
【図６−１】本明細書の実施例３に示すＴＭＰ−Ｆｃ融合化合物を構築する際に使用するための好ましいベクター（２００００３１８０）の核酸配列（配列番号３３）及びアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。
【図６−２】本明細書の実施例３に示すＴＭＰ−Ｆｃ融合化合物を構築する際に使用するための好ましいベクター（２００００３１８０）の核酸配列（配列番号３３）及びアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。
【図７−１】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−２】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−３】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−４】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−５】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−６】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−７】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−８】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−９】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−１０】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−１１】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−１２】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−１３】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−１４】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−１５】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−１６】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図７−１７】実施例３に示す本発明の好ましいペプチドを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの典型的な対の断片を示す。核酸及びアミノ酸をそれぞれ示す（配列番号３５〜９３）。
【図８−１】Ｃ末端Ｆｃ融合化合物（すなわち、そのＮ末端でＦｃのＣ末端に結合したペプチド）を構築する際に使用するための典型的なベクター（２００００３１８２）の核酸配列（配列番号９４）及びアミノ酸配列（配列番号９５）を示す。
【図８−２】Ｃ末端Ｆｃ融合化合物（すなわち、そのＮ末端でＦｃのＣ末端に結合したペプチド）を構築する際に使用するための典型的なベクター（２００００３１８２）の核酸配列（配列番号９４）及びアミノ酸配列（配列番号９５）を示す。
【図９】特定ファージクローンのＥＬＩＳＡ用量応答を示す。
【図１０】本発明の特定化合物の生物活性を示す。
【図１１】本発明の特定化合物の生物活性を示す。
【図１２】本発明の特定化合物の生物活性を示す。
【図１３】本発明の特定化合物をマウスに１回注射した後のインビボ血小板数を示す。
【図１４】本発明の特定化合物をマウスに１回注射した後のインビボ血小板数を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図７−１３】
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【図７−１４】
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【図７−１５】
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【図７−１６】
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【図７−１７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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