(57)【要約】  マイクロ粒子を用いて薬理活性物質の薬理作用を保護する薬理作用保護方法を提供する。まず、薬理活性物質とマイクロ粒子とを含む薬理的に許容可能な懸濁液を準備する。次に、懸濁液を上記薬理活性物質に不適合性を有する部品又は条件に晒す。マイクロ粒子は、マイクロ粒子がない場合に比べて、薬理活性物質の薬理作用を向上させる。好ましくは、マイクロ粒子は、マイクロ粒子がない場合に比べて、薬理活性物質の薬理作用を少なくとも１０％向上させる。マイクロ粒子としては、例えば、ポリスチレンマイクロ粒子等のポリママイクロ粒子が好適である。マイクロ粒子は、最大寸法が好ましくは０．０１〜１００ミクロン、より好ましくは０．１〜１０ミクロンである。好ましくは、マイクロ粒子は、懸濁液中に０．１乃至１ｗｔ％含有される。薬理活性物質としては、例えば、細胞、プラスミド又はウイルスベクタを含むポリヌクレオチドを含む薬剤が好適である。さらに、本発明は、薬理的に許容可能な懸濁液、非経口的医療器具及び治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ粒子を用いて薬理活性物質の薬理作用を保護する薬理作用保護方法において、
薬理活性物質とマイクロ粒子とを含む薬理的に許容可能な懸濁液を準備する工程と、
上記懸濁液を上記薬理活性物質に不適合性を有する部品又は条件に晒す工程とを有し、
上記マイクロ粒子は、該マイクロ粒子がない場合に比べて、上記薬理活性物質の薬理作用を向上させる
ことを特徴とする薬理作用保護方法。
【請求項２】
上記薬理的に許容可能な懸濁液は、金属を含む部品に晒されることを特徴とする請求項１記載の薬理作用保護方法。
【請求項３】
上記金属は、ステンレス鋼又はニッケル−チタン合金であることを特徴とする請求項２記載の薬理作用保護方法。
【請求項４】
上記薬理的に許容可能な懸濁液は、ポリマを含む部品に晒されることを特徴とする請求項１記載の薬理作用保護方法。
【請求項５】
上記ポリマは、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、エポキシ、ナイロン、アクリロニトリル／ブタジエン／スチレン樹脂及びポリカーボネートの中から選択されることを特徴とする請求項４記載の薬理作用保護方法。
【請求項６】
上記薬理的に許容可能な懸濁液は、凍結−融解サイクルに晒されることを特徴とする請求項１記載の薬理作用保護方法。
【請求項７】
上記マイクロ粒子は、該マイクロ粒子がない場合に比べて、上記薬理活性物質の薬理作用を少なくとも１０％向上させることを特徴とする請求項１記載の薬理作用保護方法。
【請求項８】
上記マイクロ粒子は、ポリママイクロ粒子であることを特徴とする請求項１記載の薬理作用保護方法。
【請求項９】
上記マイクロ粒子は、ポリスチレンマイクロ粒子であることを特徴とする請求項１記載の薬理作用保護方法。
【請求項１０】
上記マイクロ粒子は、最大寸法が０．０１乃至１００ミクロンであることを特徴とする請求項１記載の薬理作用保護方法。
【請求項１１】
上記マイクロ粒子は、最大寸法が０．１乃至１０ミクロンであることを特徴とする請求項１記載の薬理作用保護方法。
【請求項１２】
上記マイクロ粒子は、上記懸濁液中に０．１乃至１ｗｔ％含有されることを特徴とする請求項１記載の薬理作用保護方法。
【請求項１３】
上記薬理活性物質は、ポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の薬理作用保護方法。
【請求項１４】
上記薬理活性物質は、細胞、プラスミド又はウイルスベクタであることを特徴とする請求項１３記載の薬理作用保護方法。
【請求項１５】
上記薬理活性物質は、アデノウイルスベクタ及びアデノ随伴ウイルスの中から選択されるウイルスベクタであることを特徴とする請求項１４記載の薬理作用保護方法。
【請求項１６】
上記マイクロ粒子は、ポリママイクロ粒子であり、上記薬理活性物質は、ポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の薬理作用保護方法。
【請求項１７】
上記マイクロ粒子は、ポリスチレンマイクロ粒子であり、上記薬理活性物質は、アデノウイルスベクタ及びアデノ随伴ウイルスの中から選択されるウイルスベクタであることを特徴とする請求項１６記載の薬理作用保護方法。
【請求項１８】
薬理活性物質とマイクロ粒子とを含む薬理的に許容可能な懸濁液を準備する工程と、
上記薬理活性物質に対して不適合性を有する部品を有する医療器具を準備する工程と、
上記薬理活性物質を患者に非経口的に注入すると同時に、上記薬理的に許容可能な懸濁液から上記マイクロ粒子を取り除く工程と
を有する治療方法。
【請求項１９】
上記マイクロ粒子は、ポリママイクロ粒子であることを特徴とする請求項１８記載の治療方法。
【請求項２０】
上記マイクロ粒子は、ポリスチレンマイクロ粒子であることを特徴とする請求項１８記載の治療方法。
【請求項２１】
上記マイクロ粒子は、最大寸法が０．１乃至１０ミクロンであることを特徴とする請求項１８記載の治療方法。
【請求項２２】
上記薬理活性物質は、ポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１８記載の治療方法。
【請求項２３】
上記ポリヌクレオチドは、細胞内、プラスミド内又はウイルスベクタ内に組み込まれて提供されることを特徴とする請求項２２記載の治療方法。
【請求項２４】
上記医療器具は、血管カテーテル及び注射器の中から選択される非経口注入器であることを特徴とする請求項１８記載の治療方法。
【請求項２５】
薬理活性物質と、
上記薬理活性物質に対して不適合性を有する材料又は条件に晒されて、該薬理活性物質における薬理作用の低下を実質的に防止するマイクロ粒子と
を含む薬理的に許容可能な懸濁液。
【請求項２６】
上記マイクロ粒子は、ポリママイクロ粒子であることを特徴とする請求項２５記載の薬理的に許容可能な懸濁液。
【請求項２７】
上記マイクロ粒子は、ポリスチレンマイクロ粒子であることを特徴とする請求項２５記載の薬理的に許容可能な懸濁液。
【請求項２８】
上記マイクロ粒子は、最大寸法が０．１乃至１０ミクロンであることを特徴とする請求項２５記載の薬理的に許容可能な懸濁液。
【請求項２９】
上記薬理活性物質は、ポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項２５記載の薬理的に許容可能な懸濁液。
【請求項３０】
上記ポリヌクレオチドは、細胞内、プラスミド内又はウイルスベクタ内に組み込まれて提供されることを特徴とする請求項２９記載の薬理的に許容可能な懸濁液。
【請求項３１】
請求項２５記載の薬理的に許容可能な懸濁液を収容するアンプル。
【請求項３２】
薬理活性物質と、マイクロ粒子とを含む薬理的に許容可能な懸濁液と、
上記懸濁液に接触し、上記薬理活性物質に対して不適合性を有する器具部品と、
非経口的注入の前に、上記薬理的に許容可能な懸濁液から上記マイクロ粒子を取り除く分離手段と
を備える非経口的注入器。
【請求項３３】
上記マイクロ粒子は、ポリママイクロ粒子であることを特徴とする請求項３２記載の非経口的注入器。
【請求項３４】
上記マイクロ粒子は、最大寸法が０．１乃至１０ミクロンであることを特徴とする請求項３２記載の非経口的注入器。
【請求項３５】
上記薬理活性物質は、ポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項３２記載の非経口的注入器。
【請求項３６】
当該非経口的注入器は、血管カテーテル及び注射器の中から選択される非経口注入器であることを特徴とする請求項３２記載の非経口的注入器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１９９９年１０月２８日に出願された米国特許出願番号０９／４２９，１７８号「生体適合性医療装置（Biocompatible Medical Devices）」の一部継続出願である。さらに、本出願は、２０００年２月１４日に出願された米国特許出願番号０９／５０３，５８６号「生体適合性医療装置（Biocompatible Medical Devices）」の一部継続出願でもある。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は治療薬の保護に関し、詳しくは、マイクロ粒子を用いて治療薬を保護するための新たな手法及び構成体に関する。
【背景技術】
【０００３】
米国特許出願番号０９／４２９，１７８号及び米国特許出願番号０９／５０３，５８６号に記載されているように、医療分野では金属及びポリマ製の部品を有する器具が広く用いられている。多くの場合、これらの医療器具は、薬理活性物質を含有する溶液又は懸濁液の送達に使用され、薬理活性物質は、送達の途中に金属又はポリマ製の部品に接触する。これらの器具に用いられる金属材料としては、例えばステンレス鋼及びニッケル−チタン超弾性合金（例えば、ニチノール）等がある。また、これらの器具に用いられるポリマ材料としては、ポリカーボネート、ポリイミド、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン樹脂（acrylonitrile butadiene styrene resin：ＡＢＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（poly ether ether ketone：ＰＥＥＫ）、エポキシを主剤とする接着剤（例えば、ＦＤＡ２又はＦＤＡ２３）及びナイロン（例えば、ナイロン６，６）等がある。ここで、本発明者らは、米国特許出願番号０９／４２９，１７８号及び米国特許出願番号０９／５０３，５８６号に関連して、これらの材料が実質的に不活性であると考えられているにもかかわらず、これらの材料がある種の薬理活性物質に対してある程度の不適合性を有することがあることを見出した。
【０００４】
本発明は、上述及びその他の不適合性を解決する簡単で新規な手法を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、マイクロ粒子を用いて薬理活性物質の薬理作用を保護する薬理作用保護方法を提供する。薬理作用保護方法は、（ａ）薬理活性物質とマイクロ粒子とを含む薬理的に許容可能な懸濁液を準備する工程と、（ｂ）懸濁液を上記薬理活性物質に不適合性を有する部品又は条件に晒す工程とを有し、マイクロ粒子は、マイクロ粒子がない場合に比べて、薬理活性物質の薬理作用を向上させる。好ましくは、マイクロ粒子は、マイクロ粒子がない場合に比べて、薬理活性物質の薬理作用を少なくとも１０％向上させる。
【０００６】
薬理活性物質に不適合性を有する部品には、金属（例えば、ある種のステンレス鋼及びニッケル−チタン合金等）及びポリマ（ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、エポキシ、ナイロン、アクリロニトリル／ブタジエン／スチレン樹脂、ポリカーボネート等）が含まれる。
【０００７】
薬理活性物質に不適合性を有する条件には、凍結−融解サイクルによる変質が含まれる。
【０００８】
マイクロ粒子は、最大寸法が好ましくは０．０１〜１００ミクロン、より好ましくは０．１〜１０ミクロンである。また、好ましくは、マイクロ粒子は、懸濁液中に０．１乃至１ｗｔ％含有される。マイクロ粒子としては、例えば、ポリスチレンミクロ粒子等のポリママイクロ粒子が好適である。
【０００９】
さらに、本発明は、治療方法を提供する。治療方法は、（ａ）薬理活性物質とマイクロ粒子とを含む薬理的に許容可能な懸濁液を準備する工程と、（ｂ）薬理活性物質に対して不適合性を有する部品を有する医療器具を準備する工程と、（ｃ）薬理活性物質を患者に非経口的に注入すると同時に、薬理的に許容可能な懸濁液からマイクロ粒子を取り除く工程とを有する。好ましい医療器具としては、血管カテーテル及び注射器等がある。
【００１０】
さらに、本発明は、（ａ）薬理活性物質と、マイクロ粒子とを含む薬理的に許容可能な懸濁液と、（ｂ）懸濁液に接触し、薬理活性物質に対して不適合性を有する器具部品と、（ｃ）非経口的注入の前に、薬理的に許容可能な懸濁液からマイクロ粒子を取り除く分離手段とを備える非経口的注入器を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、薬理的に許容可能な懸濁液を提供する。この懸濁液は、（ａ）薬理活性物質と、（ｂ）薬理活性物質に対して不適合性を有する材料又は条件に晒されて、薬理活性物質における薬理作用の低下を実質的に防止するマイクロ粒子とを含む。
【００１２】
本発明により、薬理活性物質の薬理作用を単純な手法で保護することができる。
【００１３】
また、本発明により、薬理活性物質の薬理作用を実質的に低下させるおそれがある材料を含む保存容器や医療器具について、実質的に薬理作用を低下させることなく、薬理活性物質を保存容器に保存し、又は医療器具から薬理活性物質を患者に送達することができる。
【００１４】
さらに、本発明により、薬理活性物質の薬理作用を低下させるおそれがあった条件において、薬理作用を低下させることなく薬理活性物質を保存することができる。
【００１５】
さらに、本発明により、エージェント（すなわち、マイクロ粒子）によって薬理活性物質の効能を保護できるとともに、投与時にマイクロ粒子が患者に入らないようにすることもできる。
【００１６】
本発明の更なる利点は、詳細な説明、実施例、及び請求の範囲によって当業者に明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
まず第一に、この明細書で用いる薬物関連装置（pharmaceutical articles）という用語は、薬理活性物質と接触するあらゆる装置・器具を意味するものとする。
【００１８】
また、「薬理作用」又は「薬理効能」とは、あらゆる所望の薬理学的結果を意味する。特定の具体例として、ウイルスの薬理作用は、ウイルスが細胞に感染する能力によって測られる。他の具体例として、タンパク質の薬理作用は、ＥＬＩＳＡ検査によりタンパク質の活性を調べることで測定することもできる。
【００１９】
薬理作用が「実質的に低下する」、薬理作用が「実質的に低い」又は薬理作用の「実質的な低下」とは、例えば、薬理作用が少なくとも５％、通常は１０％、２０％、３０％、４０％、５０％或いはそれ以上低下することを意味する。「不適合性を有する部品」とは、薬理活性物質と接触して、薬理作用の実質的な低下を引き起こす部品である。「不適合性を有する条件」とは、薬理活性物質に接触して、薬理活性物質の薬理作用を実質的に低下させる条件を指す。
【００２０】
同様に、薬理作用が「実質的に向上する」、薬理作用が「実質的に高い」又は薬理作用の「実質的な向上」とは、例えば、薬理作用が少なくとも５％、通常は１０％、２０％、３０％、４０％、５０％或いはそれ以上向上することを意味する。
【００２１】
現在、薬理活性物質の溶液又は懸濁液を生体に送達する前に薬理活性物質の溶液又は懸濁液に接触する様々な医療器具を含む薬物関連装置が知られている。ここで、後述する具体例に示すように、及び米国特許出願番号０９／４２９，１７８号及び米国特許出願番号０９／５０３，５８６号に関連して説明するように、ある種の薬理活性物質がある種の材料を含む部品に接触すると、その薬理活性物質の薬理作用が実質的に低下することがあることが見出された。
【００２２】
例えば、ある種のウイルスベクタがステンレス鋼及び／又はニッケル−チタン合金（例えば、ニチノール）又は例えば、ポリエーテルエーテルケトン（poly ether ether ketones：ＰＥＥＫ）、ポリイミド、エポキシ、ナイロン、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン樹脂（acrylonitrile butadiene styrene resin：ＡＢＳ）及び／又はポリカーボネートポリマと接触すると、薬理作用が実質的に低下することが見出された。一般的には、これらの材料は比較的不活性であり、したがって薬理活性物質に対して悪影響を及ぼさないと考えられているため、上述した発見は、注目に値する。
【００２３】
本発明は、薬理活性物質に不適合性を有する材料又は条件に薬理活性物質が晒された際にこの薬理活性物質の薬理作用を実質的に保護するマイクロ粒子を用いることによって上述の問題を解決する。
【００２４】
上述した材料に加えて、どの材料が所定の薬理活性物質に不適合性を有するかを判定する手法は、当業者に周知である。薬理作用を実質的に低下させる可能性があるメカニズムとしては、薬理活性物質の不活性化（変性、析出、損傷等）及び吸収等がある。さらに、どのような条件が薬理活性物質に対して不適合性を有するかを判定する手法も当業者には周知である。
【００２５】
本発明は、薬理活性物質が不適合性を有する材料に接触し、又は不適合性を有する条件に遭遇した場合に、この薬理活性物質の薬理作用を実質的に保護するマイクロ粒子を利用する。マイクロ粒子及び薬理活性物質は、好ましくは、懸濁液として提供される。懸濁液中にマイクロ粒子が存在することにより、不適合性を有する材料に接触し又は不適合性を有する条件に曝されても、薬理活性物質の薬理作用が実質的に保護される。
【００２６】
「実質的に保護される」とは、マイクロ粒子を用いなかった場合と比べて、マイクロ粒子を用いた場合の方が薬理活性物質の薬理作用が高くなることを意味する。
【００２７】
本発明に基づくマイクロ粒子は、薬理活性物質の薬理作用を保護し、薬理学的に許容できない結果（例えば、許容できない毒性のレベル）を生じない限り、基本的にいかなる材料から形成してもよい。これらの材料としては、ある種の金属（例えば、金、チタン、プラチナ）、セラミック／ガラス（例えば、水晶）、ポリマ、これらの組合せ等、薬理作用物質に不適合性を有さない材料が含まれる。
【００２８】
本発明に適するポリマは、クロスリンクされた又はされていないポリマ、直鎖又は分岐ポリマ、天然又は合成ポリマ、熱可塑性又は熱硬化性ポリマ、生体安定性、生体分解性、生体吸収性又は溶解性ポリマのいずれであってもよい。
【００２９】
ポリマの具体例としては、次のようなポリマ及びコポリマがある。ＨＹＤＲＯＰＬＵＳ（商標）（マサチューセッツ州、ナティック、ボストンサイエンティフィック社）として入手可能で、参照により本願に援用される米国特許第５，９０１，２０５号に開示されているポリアクリル酸を含むポリカルボキシル酸ポリマ及びコポリマ、アセタールポリマ及びコポリマ、アクリル酸及びメタクリル酸ポリマ及びコポリマ、セルロースアセテート，ニトロセルロース，セルロースプロピオネート，セルロースアセテートブチレート，セロハン，レーヨン，レーヨントリアセテート，及びカルボキシメチルセルロースやヒドキシアルキルセルロース等のセルロースエーテルを含むセルロースポリマ及びコポリマ、ポリオキシメチレンポリマ及びコポリマ、ポリエーテルブロックイミド，ポリビスマレインイミド，ポリアミドイミド，ポリエステルイミド，ポリエーテルイミド等のポリイミドポリマ及びコポリマ、ポリアリルスルホン及びポリエーテルスルホンを含むポリスルホンポリマ及びコポリマ、ナイロン６，６，ポリカプロラクタム，ポリアクリルアミドを含むポリアミドポリマ及びコポリマ、アルキド樹脂，フェノール樹脂，尿素樹脂，メラミン樹脂，エポキシ樹脂，アルキル樹脂，エポキシド樹脂を含む樹脂、ポリカルボン酸、ポリアクリロニトリル、ポリビニルピロリドン（クロスリンクされた又はされていない）、無水マレイン酸ポリマを含む無水ポリマ及びコポリマ、ポリビニルアルコール，塩化ポリビニル等のポリビニルハライド，エチレンビニルアセテートコポリマ（ＥＶＡ），塩化ポリビニリデン，ポリビニルメチルエーテル，ポリスチレン、スチレン−ブタジエンコポリマ，アクリロニトリル−スチレンコポリマ，アクリロニトリル−ブタジエン−スチレンコポリマ，スチレン−ブタジエン−スチレンコポリマ及びスチレン−イソブチレン−スチレンコポリマ等のポリビニルエーテル，ポリビニルケトン，ポリビニルカルバゾール，ポリビニルアセテート等のポリビニルエステル，を含むビニルモノマのポリマ及びコポリマ、ポリベンゾイミダゾール、イオノマ（ionomers）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含むポリアルキルオキシドポリマ及びコポリマ、グリコサミノグリカン、例えばラクチド（乳酸、並びにｄ−，ｌ−及びメソ乳酸を含む），イプシロン−カプロラクトン，グリコリド（グリコール酸を含む），ヒドロキシ酪酸，ヒドロキシ吉草酸，パラジオキサノン，トリメチレンカーボネート（及びそのアルキル誘導体，１，４−ジオキサン−２−オン（一具体例として、ポリ乳酸及びポリカプロラクトンのコポリマがある）等のポリエチレンテレフタレート及び脂肪族ポリエステルを含むポリエステル、ポリフェニレンエーテル，ポリエーテルケトン，ポリエーテルエーテルケトン等のポリアリルエーテルを含むポリエーテルポリマ及びコポリマ、ポリフェニレンスルフィド、ポリイソシアネート（例えば、米国特許第５，０９１，２０５号には、体液に晒されたときに滑らかとなるように一又は複数のポリイソシアネートによってコーティングされた医療器具が開示されている）、ポリプロピレン，ポリエチレン（低密度及び高密度、低分子量及び高分子量），ポリブチレン（例えば、polybut-1-ene及びポリイソブチレン），poly-4-methyl-pen-1-enes，エチレン−アルファ−オレフィンコポリマ，エチレン−メチルメタクリレートコポリマ，エチレン−ビニルアセテートコポリマ等のポリアルキレンを含むポリオレフィンポリマ及びコポリマ、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ），ポリテトラフルオロエチレンコヘキサフルオロプロペン（ＰＥＰ），修飾エチレン−テトラフルオロエチレンコポリマ（ＥＴＦＥ），ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）等のフッ化ポリマ及びコポリマ、シリコーンポリマ及びコポリマ、ポリウレタン（例えば、ＢＡＹＨＹＤＲＯＬポリウレタン分散）、ｐ−キシリレンポリマ、ポリイミノカルボン酸、ポリエチレンオキシド−ポリ乳酸コポリマ等のコポリ（エーテル−エステル）、ポリホスファジン、ポリアルキレンオキサレート、ポリオキサアミド及びポリオキサエステル（アミン及び／又はアミド基を含むポリマを含む）、ポリオルトエステル、フィブリン，フィブリノーゲン，コラーゲン，エラスチン，キトサン，ゼラチン，デンプン，ヒアルロン酸等のグリコサミノグリカンを含むポリペプチド，タンパク質，多糖類，脂肪酸（及びこのエステル）等の生体高分子、及びこれらの混合物及びコポリマ。
【００３０】
当業者は、例えば実施例において用いている手法を用いて、所定の薬理活性物質に対してどのポリマが最も適合し、取り扱いが容易であるかを判断することができる。
【００３１】
本発明に関連して有用なポリママイクロ粒子の１つとして、ラテックスビーズがある。ラテックスは、天然ラテックスであってもよく、合成ラテックス（例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエンコポリマ、アクリレートポリマ、ポリビニルアセテート等から乳化重合により形成されるポリマ）であってもよく、特にポリスチレンラテックスがより好ましい。
【００３２】
「マイクロ粒子」という用語は、最大寸法が０．０１〜１０００ミクロン、好ましくは０．０１〜１００ミクロン、より好ましくは０．１〜１０ミクロン、さらに好ましくは約１ミクロンである微小な粒子を指す。ここでは、実質的に球形（球及びビーズを含む）の粒子が好ましいが、粒子は、棒状及び不規則な形状等、いかなる形状を有していてもよい。
【００３３】
マイクロ粒子及び薬理活性物質は、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、又はトレハロース、スクロース、グリセロール、トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタンバッファ及び／又はＭｇＣｌ２を含む溶液等、生理学的に許容可能ないかなる液体媒体に加えてもよい。当分野で周知の補助薬を用いてもよい。
【００３４】
マイクロ粒子の量は、懸濁液において０．０１〜１０ｗｔ％が好ましく、０．１〜１ｗｔ％がより好ましい。
【００３５】
また、薬理活性物質の量は、望まれる薬理作用に応じて決定され、当業者は、この量を適切に判断することができる。
【００３６】
「薬理活性物質」、「治療薬」、「薬物」等の用語は、ここでは置き換えることができ、遺伝子治療薬、非遺伝子治療薬及び細胞を含む。本発明に基づいて使用される薬理活性物質は、単独で用いても組合わせて用いてもよい。
【００３７】
治療薬には、幹細胞を含むヒト由来（自己由来又は同種異系）の細胞、又は必要に応じて、所望のタンパク質を送達するために遺伝子工学的に用いられる動物由来（異種）の細胞を含む細胞が含まれる。細胞の種類としては、骨髄ストローマ細胞、内皮前駆細胞、前心筋細胞（procardiomyocytes）等の心筋原細胞（cardiomyogenic cells）を含む筋原細胞、心筋細胞、骨格筋芽細胞（skeletomyoblasts）を含む筋芽細胞、繊維芽細胞、幹細胞（例えば、間充織細胞、造血細胞、神経細胞等）、多能幹細胞、マクロファージ、衛星細胞等が含まれる。さらに、本発明を実施するために好適な細胞としては、直接的な用途のための生検試料（例えば、骨髄）又はその一部（例えば、骨髄基質、白血球分離のための骨髄分別等）も含まれる。また、状況に応じて、必要であれば、細胞機能及び生存能力を維持するための媒体を用いてもよい。
【００３８】
また、治療薬は、ポリマ治療薬（例えば、タンパク質、酵素）及び非ポリマ治療薬（例えば、低分子）のいずれであってもよく、Ｃａチャネル遮断薬、セロトニン経路モジュレータ、サイクリックヌクレオチド経路薬、エンドセリン受容体拮抗薬、酸化窒素供与／放出分子、麻酔薬、ＡＣＥ阻害薬、ＡＴＩＩ（アンギオテンシン２）受容体拮抗薬、血小板接着阻害薬、血小板凝集阻害薬、凝固経路モジュレータ、シクロオキシゲナーゼ経路阻害薬、天然及び合成コルチコステロイド、リポキシゲナーゼ経路阻害薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、Ｅ−セレクチン及びＰ−セレクチンの拮抗薬、ＶＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１の相互作用の阻害薬、プロスタグラジン及びこれに類似する物質、マクロファージ活性抑制薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、魚油及びω−３−脂肪酸、フリーラジカルスカベンジャ／抗酸化剤、様々な増殖因子に影響を与える薬剤（ＦＧＦ経路薬、ＰＤＧＦ受容体拮抗薬、ＩＧＦ経路薬、ＴＧＦ−β経路薬、ＥＧＦ経路薬、ＴＮＦ−α経路薬、トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）経路モジュレータ、タンパク質チロシンキナーゼ阻害薬等を含む）、ＭＭＰ経路阻害薬、細胞運動阻害薬、抗炎症薬、抗増殖／抗腫瘍薬、マトリックス沈着／組織化経路阻害薬、内皮化促進薬、血液レオロジーモジュレータ、インテグリン、ケモカイン、サイトカイン及び増殖因子等が含まれる。
【００３９】
また、治療薬には、リボザイム、アンチセンスポリヌクレオチド、及びゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ等の特定の物質をコードするポリヌクレオチド（組み換え型核酸を含む）等の遺伝子治療薬及びタンパク質も含まれる。ポリヌクレオチドは、「裸の（naked）」形態であってもよく、ポリヌクレオチドの取り込み又は発現を促進するあらゆるベクタシステムと共に用いてもよい。これらは、ＤＮＡ圧縮物質（ヒストン等）、非感染性ベクタ（プラスミド、脂質、リポソーム、カチオン性ポリマ、カチオン性脂質等）、ウイルス及びウイルスに類似する分子（すなわち、ウイルスのように振る舞うよう合成された粒子）等のウイルス性ベクタ等を含む。これらは、さらにペプチドターゲット配列、アンチセンス核酸、ＤＮＡキメラを有していてもよく、ＤＮＡキメラは、細胞膜転座配列（membrane translocating sequences：ＭＴＳ）及び単純ヘルペスウイルス−１（ＶＰ２２）等の輸送タンパク質をコードする遺伝子配列を含む。
【００４０】
さらなる治療薬として、以下のものが含まれる。
・アンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡ
・欠陥又は欠失がある内因性分子を置換するｔＲＮＡ又はｒＲＮＡ
・内因的又は外因的に制御される遺伝子送達薬。内因的な制御の具体例としては、低酸素又はブドウ糖値の上昇等の生理学的シグナルに応答する促進薬が含まれる。外因的制御には、低分子薬投与により制御された遺伝子発現が含まれる。具体例としては、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、エクジソン及びこれに類似する物質、ＲＵ４８６、パラマイシン及びこれに類似する物質等の化学的二量体化薬（chemical dimerizers）。
・以下を含む血管形成分子
・増殖因子：例えば酸性及び塩基性繊維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、上皮成長因子、トランスフォーミング増殖因子α及びβ、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、胎盤増殖因子、ＰＲ３９、アンギオジェニン、プロスタグラジンＥ１及びＥ２、インターロイキン８、アンギオポエチン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ等）、アンドロゲン、プロリフェリン、顆粒球コロニー刺激因子、エストロゲン等
・転写因子：例えばＨｉｆｌａ、Ｄｅｌ１等
・タンパク質キナーゼ：例えばＡｋｔ
・ＣＤ阻害薬を含む細胞毒因子又は細胞周期阻害薬：例えばｐ５３、チミジンキナーゼ（ＴＫ）及び細胞増殖を阻害する他の薬剤
・ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６（Ｖｇｒ−１）、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６を含む骨形成タンパク質（bone morphogenic protein：ＢＭＰ）。現在、好ましいＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７のいずれかである。これらの二量体タンパク質は、ホモ二量体であってもよく、ヘテロ二量体であってもよく、これらの組合せであってもよく、単独で提供しても、他の分子とともに提供してもよい。これに代えて、又はこれに加えて、ＢＭＰの上流又は下流効果を誘導する分子を加えてもよい。このような分子は、あらゆる「ヘッジホッグ」タンパク質、又はこれらをコードするＤＮＡを含む。
・細胞生存分子（cell survival molecule）：例えばＡｋｔ、インスリン様増殖因子１、ＮＦ−κＢデコイ、Ｉ−κＢ等
・他の治療薬：Ｍａｄｈ６、Ｓｍａｄ６、Ａｐｏ Ａ−１等
・デコイを含む上述した遺伝子の活性薬又は阻害薬
・以下を含むベクタ及び遺伝子転写薬
・ウイルスベクタ：例えば、アデノウイルス、破壊された（gutted）アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アルファウイルス（セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス等）、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ｅｘ ｖｉｖｏ修飾細胞（例えば、幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、衛星細胞、周細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、マクロファージ等）、複製可能ウイルス（ＯＮＹＸ−０１５等）、ハイブリッドベクタ等
・非ウイルスベクタ：人工染色体、ミニ染色体、プラスミドＤＮＡベクタ（ｐＣＯＲ）、カチオン性ポリマ（ポリエチレンイミン、ポリエーテル−ＰＥＩ及びポリエチレン酸化物−ＰＥＩ等のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）グラフトコポリマ）、中性ポリマＰＶＰ、ＳＰ１０１７（ＳＵＰＲＡＴＥＫ）、脂質又はリポプレグゼ（lipoplexe）、タンパク質導入ドメイン（protein transduction domain：ＰＴＤ）等のターゲット配列を有する又は有さないナノ粒子及びマイクロ粒子
【００４１】
「ポリヌクレオチド」は、少なくとも３個のヌクレオチドを有するＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの類似体等の核酸粒子ポリマであり、２本鎖又は１本鎖配列のいずれをも含むことができる。「タンパク質」は、少なくとも２個（二量体）のアミノ酸残基からなるポリマである。
【００４２】
薬理活性物質は、好ましくは細胞又はポリヌクレオチドであり、より好ましくは、プラスミドの形態で存在し、又はウイルス又はウイルス様粒子に関連して存在する細胞又はポリヌクレオチドである。好ましい細胞の具体例としては、心筋細胞、骨格筋細胞、内皮細胞、幹細胞等がある。好ましいウイルス又はウイルス様粒子の具体例としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のパルボウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アルファウイルス、パピローマウイルス、マウス白血病ウイルス、セムリキ森林ウイルス等が含まれる。
【００４３】
本発明に基づく懸濁液を作成するためのマイクロ粒子及び薬理活性物質の混合は、例えば攪拌やシェーキング等を含む基本的に周知のいかなる手法を用いて行ってもよい。
【００４４】
この混合の後、マイクロ粒子及び薬理活性物質を含む懸濁液は、当分野において知られる周知のいかなる手法によって保存してもよい。好適な一具体例においては、懸濁液は、投与されるまでの間、アンプル（すなわち、非経口的注入のために液体を無菌状態で収納する、通常ガラス又はプラスチック製の密閉された容器）に保存される。
【００４５】
本発明に基づくマイクロ粒子を含む懸濁液は、（ａ）発酵槽（fermentor）、ガラス器具、プラスチック器具、プローブ、チューブ等を含む製造器具、（ｂ）保存管、搬送管、栓、蓋、隔壁等を含む保存及び搬送器具、（ｃ）ニードル、ピペットチップ、細胞培養装置、分析設備等を含む分析装置等と共に用いてもよい。
【００４６】
治療薬が溶液に溶解され、又は使用されるマイクロ粒子より実質的に小さいものである場合、治療薬とマイクロ粒子の分離は、比較的容易に行うことができる。例えば、患者に投与する前に、例えば適切な大きさの孔を有するフィルタ（又は適切な網目を有するふるい）に懸濁液を通し、マイクロ粒子を懸濁液から濾すことによってマイクロ粒子を治療薬から分離することができる。ここで、患者とは、好ましくは哺乳類であり、より好ましくはヒトである。
【００４７】
例えば、後述する実施例において示すように、１ミクロンのポリスチレンラテックスビーズをウイルス懸濁液に添加することにより、ウイルスが不適合性を有する材料に晒された際に、ウイルスの活性が基本的に維持される。これらの実施例では、ビーズは、ウイルス粒子の１０倍の桁のサイズを有している。このようにサイズの差異が大きいため、送達ルーメンの末端にサイズ排除メッシュ（size exclusion mesh）を設けることにより、ポリマビーズを注入物から容易に排除することができ、これにより、患者にポリマビーズを注入することなく、ウイルス粒子を注入することができる。同様に、医療器具は治療薬に適合性を有しているが、ウイルス活性の低下が保存に起因して生じる場合、ビーズは、治療薬を医療器具に接触させる以前に分離してもよい。
【００４８】
これに代えて、生体適合性を有するマイクロ粒子を選択した場合、マイクロ粒子を治療薬と共に患者に投与してもよい。後述する実施例に示すように、ラテックスポリスチレンビーズは、生体組織に適合性を有し、ウイルス粒子と共に患者に投与してもよい。ビーズを患者の生体内に注入することにより、形質転換が促進され、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性が向上すると考えられる。
【００４９】
多くの好ましい具体例において、マイクロ粒子の懸濁液は、薬物送達用医療器具又は部品を介して、患者に投与される。ここで想定される器具は多岐に亘る。例えば、本発明に関連して用いられる医療器具は、全身的な治療又は生体組織又は器官の局所的治療に使用することができる。治療の対象としては、以下に限定されるものではないが、例えば、腫瘍や、心臓、肺、脳、肝臓、腎臓、膀胱、尿道、目、腸、胃、膵臓、卵巣、前立腺を含む器官や、骨格筋、平滑筋、胸部、軟骨組織、骨等が含まれる。
【００５０】
本発明に関連して用いることができる医療器具は、非経口的注入（すなわち、皮下、筋肉内、静脈内、血管内、眼窩内、嚢内、髄腔内、胸骨内等、消化管以外の経路による投与）のための基本的にいかなる器具であってもよい。
【００５１】
好ましい医療器具としては、例えば、（心臓、心外膜、心膜への薬物投与のための）ニードル注射カテーテル、バルーンカテーテル、診断カテーテル、灌流カテーテル等の腔内カテーテル（endoluminal catheter）、周知のニードル注射器、皮下注射針、静脈注射器具、生検針及び器具、組織切除器具、吸引ニードル、ステント等がある。心臓に薬剤を投与するための器具の具体例については、米国特許第５，４５０，８４６号、米国特許第５，８４０，０５９号、米国特許第５，８７８，７５１号、米国特許第５，５５１，４２７号、米国特許第５，９３１，８３４号、米国特許第５，９２５，０１２号、米国特許第５，９２５，０３３号、米国特許第５，５３８，５０４号、国際公開第９９／３９６２４号、国際公開第９９／４４６５６号、国際公開第９９／２１５１０号、国際公開第９９／２９２５１号、欧州特許出願公開第９９−０６ ０８９５７５２号及び欧州特許出願公開第９９−０１ ０８８８７５０号等に開示されており、これらの出願は、参照により本願に援用される。
【００５２】
いくつかの具体例では、マイクロ粒子は、医療器具全体が不適合性を有する材料から形成されているために用いられる。また、他の具体例では、医療器具の一部のみが不適合性を有する材料から形成されている場合もある。
【００５３】
本発明は、特に、経皮的な経カテーテル器具を介してウイルスを送達する場合に有用できる。
【００５４】
他の具体例においては、マイクロ粒子は、保存に関連する条件下で薬理活性物質の作用を保護するために使用される。例えば、マイクロ粒子を用いて、ウイルス懸濁液の保存及び凍結−融解の間の活性を保護することができる。
【００５５】
以下、本発明の特定の実施例を示す。これらの実施例は、例示的なものであり、本発明を制限するものではない。
【００５６】
以下の実施例は、アデノウイルスベクタの保護を目的とする。アデノウイルスベクタは、遺伝物質を搬送するための非常に効率的な手段である。アデノウイルスベクタは、ターゲットではない器官にも感染するため、全身に亘る投与は望ましくない。一方、医療器具プラットフォームを用いたアデノウイルス遺伝子治療では、全身への漏れを最小限に抑えた、局所的な治療薬の送達を実現できる。しかしながら、この治療法では、ベクタの不安定性が大きな制約となっている。特に、米国特許出願番号０９／４２９，１７８号及び米国特許出願番号０９／５０３，５８６号に記載されているように、医療器具は、アデノウイルスの活性に負の影響を与える。これについては、マーシャル（Marshall）他著、分子治療（Molecular Therapy）、２０００年１月（５）、４２３〜４２９頁にも記載されている。
【実施例１】
【００５７】
ＣＭＶ−ＬａｃＺアデノウイルス（すなわち、ＬａｃＺ酵素に基づき、サイトメガロウイルスプロモータ及びβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）レポータ遺伝子によってドライブされるアデノウイルスベクタ）をストックウイルスとして用いた。
【００５８】
ＰＢＳ（−／−）中、ＡｄＣＭＶ−ＬａｃＺタイターが１×１０９感染単位／ミリリットル（ｆｕ／ｍｌ）のアデノウイルス溶液を準備した。
【００５９】
同時に、（ａ）最終的なタイターを１×１０９ｆｕ／ｍｌとするために適切なアデノウイルス溶液９０ｖｏｌ％と、（ｂ）水中に２．５％の固体濃度を有する１．０ミクロンの蛍光性ポリスチレンビーズを含むポリサイエンス社（Polysciences Inc.）製のフルオレスブライト（Fluoresbrite：商標）ＹＧマイクロスフィア（YG Microspheres）１０ｖｏｌ％とを混合して懸濁液を準備した。
【００６０】
熱加工されたステンレス鋼からなる基部と、ニチノールハイポチューブからなる末端部を有するボストンサイエンティフィック社（Boston Scientific Corporation）から入手可能なＳｔｉｌｅｔｔｏ直接注入カテーテルに上述した各物質を収容し、３７℃の温度で３０分間インキュベートした。
【００６１】
次に、カテーテルからの流出液を収集し、ＨｅＬａ細胞（ヒト上皮様癌細胞）に滴定した。この目的のために、まず、実験の前日にＨｅＬａ細胞をウェルプレートにおいて７０％コンフルエントとなるように播いた。ＨｅＬａ細胞に接触させる前に、各ウェル当たり１００〜１０００の感染細胞が得られるように、ウイルス溶液を感染培地（ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）＋２％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清））で適切に希釈した。希釈したウイルスをウェル内のＨｅＬａ細胞に加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次に、５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを各ウェルに加え、３７℃で２４〜３０時間インキュベートした。培地を吸引した後、０．５％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）内に１０分間浸し、細胞を固定化させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｘ−ｇａｌ染色溶液を用いて、３７℃の温度で一晩染色した（Ｘ−ｇａｌは、β−ガラクトシダーゼによって加水分解され、青色生成物を生成する５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトサイドである）。翌日に青色の細胞（すなわち、ガラクトシダーゼ陽性細胞）をカウントし、タイターを判定した。
【００６２】
アデノウイルス溶液と、アデノウイルス／ビーズ懸濁液の両方のウイルス活性は、βガラクトシダーゼ陽性細胞の関数として測定され、残存活性は、同条件で、ポリプロピレン製エッペンドルフチューブにおいてインキュベートしたコントロール（ここでは、標準／コントロールとして用いる）に対する百分率として算出される。アデノウイルス溶液とアデノウイルス／ビーズ懸濁液との両方に対する実験の結果を図１に示す。図１に示すように、Ｓｔｉｌｅｔｔｏカテーテル内におけるアデノウイルス溶液のインキュベーションにより、ウイルス活性は、略々完全に失われてしまう。これに対して、１ミクロンのポリスチレンラテックスビーズをアデノウイルス溶液に添加することによって、アデノウイルスの活性が略々完全に維持されている。
【実施例２】
【００６３】
マウスモデルにおける標準的な注射針からのアデノウイルス送達の効果について調べた。この実験では、それぞれＡｄＣＭＶ−ＬａｃＺタイターが１×１０９感染単位／ミリリットル（ｆｕ／ｍｌ）のアデノウイルス溶液及びビーズ（１０ｖｏｌ％のフルオレスブライト（Fluoresbrite：商標）ＹＧマイクロスフィア）を含むアデノウイルス懸濁液を準備した。マウスに麻酔をかけ、左開胸術によって心臓を露出させた。次に、左心室に直接心外膜注射（１×５０μｌ）を行った。７日後にマウスを犠牲死させ、以下のような検査を行った。すなわち、心臓全体を取り出し、４２０ｎｍにおけるスペクトロスコープ吸収によって心臓を検査し、発現したβ−ガラクトシダーゼの総量を測定した。以下に示す吸収データは、サンプルサイズ（１５０μｌ）及びｍｇタンパク質（標準的なタンパク質検査に基づいて判定される）の両方に基づいている。これらのデータから、ビーズを含む注入物の方が、β−ガラクトシダーゼの発現量が多いことが分かる。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
本発明をいくつかの具体例を用いて説明してきたが、上述の具体例において要素を明示していなくても、上述の具体例を様々に変更できることは、当業者にとって明らかである。このような変更は、本発明の範囲内にあり、本発明は、添付の請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明に基づくマイクロ粒子を含むアデノウイルス溶液及びこれを含まないアデノウイルス溶液におけるウイルス活性を比較して示す棒グラフを示す図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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