(57)【要約】本発明は、細胞のグルコース取り込みを増加させるための、ならびに、例えばＩＩ型糖尿病などの、インスリン抵抗性によって引き起こされる疾患又はそれに関連する疾患の治療及び／又は予防における、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤の使用に関する。特に、本発明は、（ｉ）候補物質を哺乳類ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体に接触させること；及び（ｉｉ）前記候補物質がＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の生物活性を阻害するかどうかを判定することを含む、高い血中グルコース濃度に関連する医学的状態の治療又は予防のために有用な物質を同定するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞によるグルコース取り込みを増加させる物質を同定するための方法であって、
細胞を、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の活性を阻害する候補物質と接触させること；
前記候補物質の存在下において前記細胞によるグルコース取り込みを測定すること；
及び
前記候補物質が前記細胞によるグルコース取り込みを増加させるかどうかを判定すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体がヒトＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はヒトＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が筋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が脂肪細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体が、ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、Ｍｏｘ２、Ｎｏｘ４、Ｎｏｘ５、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、（ｂ５＋ｂ５Ｒ）オキシドレダクターゼ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、Ｒａｃ−１及びＲａｃ−２からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記候補物質が、ピリジン、イミダゾール、ジエチルピロカルボナート、クロロ第二水銀安息香酸、４−（２−アミノメチル）−スルホニルフルオリドアセトバニロン及びそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記候補物質の存在下における前記細胞によるグルコース取り込みを、前記候補物質の不存在下における細胞によるグルコース取り込みと比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記候補物質をＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体と接触させること及び前記候補物質が前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の活性を阻害するかどうかを判定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞におけるグルコース取り込みを増加させるための方法であって、細胞を、前記細胞によるグルコース取り込みを増加させるために有効な量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の阻害剤と接触させることを含む、前記方法。
【請求項１０】
前記細胞が前記阻害剤と接触することに応答した、前記細胞によるグルコース取り込みの増加を検出することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が筋細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が脂肪細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体が、ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、Ｍｏｘ２、Ｎｏｘ４、Ｎｏｘ５、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、（ｂ５＋ｂ５Ｒ）オキシドレダクターゼ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、Ｒａｃ−１及びＲａｃ−２からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体がヒトＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はヒトＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記阻害剤が、ピリジン、イミダゾール、ジエチルピロカルボナート、クロロ第二水銀安息香酸、４−（２−アミノメチル）−スルホニルフルオリドアセトバニロン及びそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
医学的状態の治療のための方法であって、
高い血中グルコース濃度を特徴とする医学的状態を有すると診断された個体を選択すること；及び
前記個体において血中グルコース濃度を低下させるために有効な量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の阻害剤を前記個体に投与すること
を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記阻害剤の投与に応答した、前記個体における血中グルコース濃度の低下を検出することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記医学的状態がインスリン抵抗性を特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記医学的状態がインスリン受容体の活性上昇の必要性を特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記医学的状態が細胞内インスリンシグナル伝達経路の活性上昇の必要性を特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記医学的状態が糖尿病である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記医学的状態がＩＩ型糖尿病である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体が、ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、Ｍｏｘ２、Ｎｏｘ４、Ｎｏｘ５、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、（ｂ５＋ｂ５Ｒ）オキシドレダクターゼ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、Ｒａｃ−１及びＲａｃ−２からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体がヒトＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はヒトＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記阻害剤が、ピリジン、イミダゾール、ジエチルピロカルボナート、クロロ第二水銀安息香酸、４−（２−アミノメチル）−スルホニルフルオリドアセトバニロン及びそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
細胞におけるグルコース取り込みを増加させるための薬剤の製造における、細胞によるグルコース取り込みを増加させるために有効な、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞のグルコース取り込みを増加させるための、ならびに、例えばＩＩ型糖尿病などの、インスリン抵抗性によって引き起こされる疾患又はそれに関連する疾患の治療及び／又は予防における、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤の使用に関する。
【０００２】
背景技術
多くの人々が代謝障害に罹患しているか、又は代謝障害を患う素因をもっている。そのような障害の１つはインスリン抵抗性を含み、これは、西欧世界でその数が急速に増加しつつある疾患である、代謝症候群（Ｘ症候群）、多嚢胞性卵巣症候群、肥満及びＩＩ型糖尿病に特徴的である。これらの疾患は多因子性であり、それらの代謝又は生理学は、大部分の症例において、十分には特徴付けられていないか又は理解されていない。ＩＩ型糖尿病は、インスリン分泌欠損を伴うインスリン抵抗性から生じる、最も一般的な型の糖尿病を含む。メトホルミン及びロシグリタゾンなどの薬理学的治療は、インスリン抵抗性の改善作用を有しており、内因性インスリンの有効性を高め、それによってＩＩ型糖尿病患者における高い血中グルコース濃度の低下に寄与すると考えられている。
【０００３】
インスリン抵抗性が誘導されうる１つの機構は、活性酸素種（ＲＯＳ）の増加によってである。インスリンシグナル伝達系及びグルコース輸送へのＲＯＳの対照的な作用が報告されているが、ＲＯＳへの細胞の長期的な暴露はインスリン抵抗性を引き起こすことが示されている。ＲＯＳのインスリン模倣作用は、筋細胞及び脂肪細胞を用いて報告されている。Ｈ２Ｏ２への脂肪細胞の急性暴露は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性及び脂質合成を活性化することが示された［Ｍａｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５４：９０１７−２１（１９７９）］。インスリンシグナル伝達の、すべてではないが一部の様態は、Ｈ２Ｏ２によって活性化されると思われる。Ｌ６筋細胞を使用して、Ｈ２Ｏ２が処理の３０分以内にＰＫＢのＰＩ３Ｋ依存性の活性化及びＧＳＫ３の阻害を引き起こすことが示された［Ｔｉｒｏｓｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４：１０５９５−６０２（１９９９）］。ＲＯＳ生成系を用いた、Ｌ６筋細胞及び３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の長期的な処理（２４時間）は、高い基礎グルコース輸送をもたらすＧＬＵＴ１の発現を増加させた［Ｋｏｚｌｏｖｓｋｙら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２３：８５９−６９（１９９７）；Ｋｏｚｌｏｖｓｋｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７２：３３３６７−７２（１９９７）］。これらの細胞系のＨ２Ｏ２による処理は、インスリンシグナル伝達にも干渉する［Ｒｕｄｉｃｈら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２７２：Ｅ９３５−４０（１９９７）］。インスリンとＨ２Ｏ２による同時処理は、無傷ＰＫＢの活性化にもかかわらず、インスリン刺激性のグルコース輸送及びグリコーゲン合成を阻害することが示された［Ｂｌａｉｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４：３６２９３−９（１９９９）］。ＲＯＳによる前処理は、インスリン刺激性のＩＲＳ−１及びＰＩ３Ｋ細胞の再分布、ＰＫＢセリンリン酸化及びグルコース輸送を阻害した［Ｔｉｒｏｓｈ、Ｐｏｔａｓｈｎｉｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４：１０５９５−６０２（１９９９）］。抗酸化薬であるリポ酸は、これらの作用を予防することができた［Ｒｕｄｉｃｈら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，４２：９４９−５７（１９９９）］。合わせて考えると、これらの結果は、インスリンシグナル伝達が酸化還元反応を含み、そのいくつかの段階はＨ２Ｏ２によって模倣され、また別の段階はＨ２Ｏ２によって阻害されうることを示唆している。これらの所見を、インスリンがＨ２Ｏ２の産生を刺激しうることの実証と統合すると、ＲＯＳはインスリンのシグナル伝達に関与しており、インスリン及び他の物質による長期的処理後に認められるインスリン抵抗性の原因となりうるという仮説を立てることができる。
【０００４】
酸化ストレスは、細胞代謝における過剰のフリーラジカル産生によって引き起こされる。酸素の反応産物に由来するフリーラジカルは、しばしば活性酸素種（ＲＯＳ）と称される。細胞内部の還元環境は、酸化による損傷を予防し、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオン、セレン依存性グルタチオン、チオレドキシンヒドロペルオキシダーゼ、チオレドキシン、ビタミンＣ及びＥ、ならびにおそらくもっと多くの未知の作用物質のような、抗酸化酵素及び物質の作用によって維持されうる。
【０００５】
酸化ストレスは、いくつかの異なる疾患において明らかにされ、老化過程の重要な推進力として示唆されている［Ｆｉｎｋｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，４０８：２３９−４７（２０００）；Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１６：１９３−２０１（２０００）］。増加しつつあるデータにより、ＩＩ型糖尿病における酸化ストレスの増加の徴候が明らかにされている。酸化ストレスは、この疾患の後期段階で起こる血管合併症の多くに寄与している可能性が高いが、インスリン抵抗性の発現及びβ細胞機能の低下における原因因子としての酸化ストレスに関する証拠はまだ存在しない。グルコース除去へのインスリン作用と血漿スーパーオキシドイオンとの間の逆相関関係、及びグルコース除去へのインスリン作用と血漿ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比との間の正の相関関係が、オイグリセミック・高インスリン血症クランプ法によりＩＩ型糖尿病患者において認められた［Ｐａｏｌｉｓｓｏら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ，４３：１４２６−９（１９９４）］。酸化／抗酸化状態の障害のマーカーである、血清ビタミンＥ含量の低下は、ＩＩ型糖尿病を発症する危険度の増加に関連していることが報告された［Ｓａｌｏｎｅｎら、ＢＭＪ，３１１：１１２４−７（１９９５）］。動物実験において、化学的に誘導した酸化ストレスが肥満ズッカーラットにおいてインスリン抵抗性と高血糖症を増悪することが最近明らかにされた［Ｌａｉｇｈｔら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１２８：２６９−７１（１９９９）］。また、実験動物糖尿病を誘導するために使用されるアロキサン及びストレプトゾトシンのようなβ細胞毒性物質は、酸化ストレスを介して作用するとの指摘も存在する［Ｄａｖｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５５：１３０１−７（１９９８）；Ｈｏｔｔａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８８：１４４５−５１（１９９８）］。
【０００６】
スーパーオキシドは多くの細胞酵素系によって産生されうる：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、Ｐ−４５０モノオキシゲナーゼ、及びミトコンドリアの酸化的リン酸化の酵素。フリーラジカルの大部分は、呼吸鎖の不必要な副産物としてミトコンドリアによって産生されるが、細胞もまた、意図的にフリーラジカルを産生する。身体の細胞防御系は、侵入してきた微生物を死滅させるために酸素ラジカルを利用し、血管系は、血管状態の調節における中間体として一酸化窒素ラジカルを使用する。もともと、細菌の死滅に関与するスーパーオキシドの産生を担うＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ系は、好中球及び他の食細胞において明らかにされた［Ｓｅｇａｌら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８３２：２１５−２２（１９９７）］。増加しつつある数の、内皮細胞及び他の細胞型からの実験データは、ＲＯＳがＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性化を通して産生されうることを示している［Ｊｏｎｅｓら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２７１：Ｈ１６２６−３４（１９９６）；Ｋｒｉｅｇｅｒ−Ｂｒａｕｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７２：１０１３５−４３（１９９７）］；Ｂａｙｒａｋｔｕｔａｎら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８：２５６−６２（１９９８）］。活性化されたとき、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼは形質膜に集合し、分子Ｏ２のスーパーオキシド（Ｏ２−）への単電子還元を触媒する。スーパーオキシドジスムターゼの存在下で、Ｏ２−は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）へと不均化し、過酸化水素は第一鉄イオンの存在下でヒドロキシルラジカル（ＯＨ−）へと変換されうる。細胞内で形成されうるＯ２−から生じる他のフリーラジカルはさらに多く、本明細書においてはこれ以上論じない。活性ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の形成のためには、少なくとも５つのタンパク質が必要である：膜結合型シトクロムｂ５５８及びサイトゾルタンパク質、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ及び低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、Ｒａｃ−１又はＲａｃ−２［Ａｂｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６７：１６７６７−７０（１９９２）；Ｂａｂｉｏｒ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｒｅａｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６５：４９−９５（１９９２）；Ｋｎａｕｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６７：２３５７５−８２（１９９２）］。シトクロムｂ５５８は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ結合部位を有するフラボタンパク質であり、２つのサブユニット、ｇｐ９１ｐｈｏｘ及びｐ２２ｐｈｏｘからなる［Ｓｕｍｉｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１８６：１３６８−７５（１９９２）］。
【０００７】
血糖降下薬、ジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを阻害することによってミトコンドリアの呼吸速度を低下させることが示された。Ｈｏｌｌａｎｄら（１９７３；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８：６０５０−６０５６）は、前記酵素の阻害が、ミトコンドリア酸化と肝及び全身ＡＴＰ含量とを低下させることにより血糖降下作用を生じさせることを開示している（Ｇａｔｌｅｙ、Ｓ．Ｊ．＆  Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｌ．（１９７９）Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ９：５３９−５４６も参照のこと）。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを阻害する作用物質がインスリン受容体及び／又は細胞内インスリンシグナル伝達経路の活性を増加させるために有用であり、それ故インスリン抵抗性に対して有用であることは、これまでには示されていない。
【０００８】
発明の開示
驚くべきことに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの阻害はラット骨格筋細胞においてグルコース取り込みを刺激することが認められた。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体は、一般的に、ＲＯＳの生成を通してインスリンシグナル伝達の下方制御に関与すると考えられている。それ故、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性の薬理学的阻害はインスリンシグナル伝達を増加させ、インスリン感受性を回復させるはずである。この驚くべき作用はこれまでに認められておらず、ＩＩ型糖尿病、特にインスリン抵抗性を治療するために使用できる薬剤を見出すためのツールとしての、ＲＯＳを生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の全体又は部分の有用性を明らかにする。
【０００９】
その結果、第１の側面において本発明は、
（ｉ）候補物質を哺乳類ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体と接触させること；及び
（ｉｉ）前記候補物質がＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の生物活性を阻害するかどうかを判定すること
を含む、血中グルコース濃度の増加に関連する医学的状態の治療又は予防のために有用な物質を同定するための方法を提供する。
【００１０】
前記医学的状態は、好ましくは、特にＩＩ型糖尿病などのインスリン抵抗性に関連する。糖尿病の１つの臨床的定義は、いわゆる空腹時血糖値である。２回の測定でグルコースの量が１２６ｍｇ／ｄｌ以上である場合、患者は糖尿病であると診断される。空腹時血糖異常及び耐糖能異常は、インスリン抵抗性症候群に関連している。ＷＨＯが述べているように［世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ），Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ．，Ｎｏ．７２７（１９８５）］、実施される試験において、水に溶解した無水ブドウ糖７５ｇによる経口ブドウ糖負荷試験により≧２００ｍｇ／ｄｌの２時間目血漿グルコース値を生じた場合、個体は空腹時高血糖の不存在下でもインスリン抵抗性でありうる。
【００１１】
本発明の１つの実施形態では、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体を含む細胞をＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の阻害剤と接触させ、その後これらの細胞によるグルコース取り込みをモニターして、この活性を、阻害剤の不存在下におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の活性と比較することができる。これらの細胞のグルコース取り込みに影響を及ぼす化合物は、潜在的な薬剤候補物質と考えられる。
【００１２】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体は、好ましくはｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、Ｍｏｘ２、Ｎｏｘ４、Ｎｏｘ５、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、（ｂ５＋ｂ５Ｒ）オキシドレダクターゼ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、Ｒａｃ−１及びＲａｃ−２からなる群より選択される。
【００１３】
前記タンパク質はいかなる哺乳類種のものでもよいが、好ましい種はホモ・サピエンスである。ホモ・サピエンスからのヌクレオチド及びアミノ酸配列を添付の配列表に開示する。
【００１４】
１つの実施形態では、本発明は、細胞によるグルコース取り込みを増加させる物質を同定するための方法を含む。前記方法は、次の段階：細胞を、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の活性を阻害する候補物質と接触させること；前記候補物質の存在下において前記細胞によるグルコース取り込みを測定すること；及び、前記候補物質が前記細胞によるグルコース取り込みを増加させるかどうかを判定すること、を含む。
【００１５】
前記方法は、任意に、前記候補物質存在下における前記細胞によるグルコース取り込みを、前記候補物質の不存在下における細胞によるグルコース取り込みと比較する付加的な段階を含みうる。
【００１６】
前記方法は、任意に、前記候補物質をＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体と接触させること及び前記候補物質が前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の活性を阻害するかどうかを判定することの段階を含みうる。
【００１７】
１つの実施例においては、前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体は、ヒトＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はヒトＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体である。前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体は、任意に、ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、Ｍｏｘ２、Ｎｏｘ４、Ｎｏｘ５、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、（ｂ５＋ｂ５Ｒ）オキシドレダクターゼ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、Ｒａｃ−１及びＲａｃ−２からなる群より選択されうる。例示的なＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の核酸及びアミノ酸配列を本明細書において述べる。
【００１８】
前記細胞は、例えば、筋細胞又は脂肪細胞でありうる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、前記候補物質は、ピリジン、イミダゾール、ジエチルピロカルボナート、クロロ第二水銀安息香酸、４−（２−アミノメチル）−スルホニルフルオリドアセトバニロン及びそれらの誘導体からなる群より選択される。
【００２０】
別の側面では、本発明は、細胞を、前記細胞によるグルコース取り込みを増加させるために有効な量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の阻害剤と接触させることにより、細胞におけるグルコース取り込みを増加させるための方法を特徴とする。前記細胞は、例えば、筋細胞又は脂肪細胞でありうる。前記方法は、任意に、前記細胞が前記阻害剤と接触することに応答した、前記細胞によるグルコース取り込みの増加を検出する付加的な段階を含みうる。
【００２１】
１つの実施例においては、前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体は、ヒトＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はヒトＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体である。前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体は、任意に、ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、Ｍｏｘ２、Ｎｏｘ４、Ｎｏｘ５、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、（ｂ５＋ｂ５Ｒ）オキシドレダクターゼ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、Ｒａｃ−１及びＲａｃ−２からなる群より選択されうる。例示的なＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の核酸及びアミノ酸配列を本明細書において述べる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、前記阻害剤は、ピリジン、イミダゾール、ジエチルピロカルボナート、クロロ第二水銀安息香酸、４−（２−アミノメチル）−スルホニルフルオリドアセトバニロン及びそれらの誘導体からなる群より選択される。
【００２３】
別の側面では、本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の阻害剤又は拮抗物質の有効量をその必要のある患者に投与することを含む、高い血中グルコース濃度に関連する医学的状態の治療のための方法を提供する。
【００２４】
１つの実施形態では、本発明は、次の段階：高い血中グルコース濃度を特徴とする医学的状態を有すると診断された個体を選択すること；及び、前記個体において血中グルコース濃度を低下させるために有効な量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の阻害剤を前記個体に投与すること、を含む、医学的状態の治療のための方法を特徴とする。
【００２５】
前記医学的状態は、例えば、インスリン抵抗性、インスリン受容体の活性上昇の必要性、及び／又は細胞内インスリンシグナル伝達経路の活性上昇の必要性によって特徴付けることができる。
【００２６】
１つの実施例においては、前記医学的状態は糖尿病、例えばＩＩ型糖尿病である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、前記個体は、血管損傷、例えば内皮細胞の血管透過性亢進を特徴とする疾患（例えばアテローム性動脈硬化症）を有していない及び／又は有すると診断されていなかった。さらに、いくつかの実施形態では、前記方法は、前記個体への前記阻害剤の投与の前及び／又は後に前記個体において血管損傷（存在する場合）を評価する段階を含まない。
【００２８】
いくつかの実施形態では、前記方法は、前記阻害剤の投与に応答した、前記個体における血中グルコース濃度の低下を検出する付加的な段階を含む。
【００２９】
１つの実施例においては、前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体は、ヒトＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はヒトＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体である。前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体は、任意に、ｇｐ９１ｐｈｏｘ、ｐ２２ｐｈｏｘ、Ｍｏｘ２、Ｎｏｘ４、Ｎｏｘ５、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、（ｂ５＋ｂ５Ｒ）オキシドレダクターゼ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、Ｒａｃ−１及びＲａｃ−２からなる群より選択されうる。例示的なＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の核酸及びアミノ酸配列を本明細書において述べる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、前記阻害剤は、ピリジン、イミダゾール、ジエチルピロカルボナート、クロロ第二水銀安息香酸、４−（２−アミノメチル）−スルホニルフルオリドアセトバニロン及びそれらの誘導体からなる群より選択される。
【００３１】
前記阻害剤又は拮抗物質は、上述したような方法に従って同定することができる。既知の阻害剤又は拮抗物質の例は、その誘導体を含む、ピリジン、イミダゾール、ジエチルピロカルボナート、クロロ第二水銀安息香酸、４−（２−アミノメチル）−スルホニルフルオリドアセトバニロンからなる群より選択されるものである。前記阻害剤又は拮抗物質は、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体のＲＯＳ生成活性に対する阻害作用を有する化合物である。前記阻害剤又は拮抗物質は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性部位又は調節部位又は両方の部位と相互作用することによってその作用を及ぼしうる。
【００３２】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の活性を阻害することに関して望ましい特性を示す化合物を、分化したＬ６−Ｋ１細胞又は他の骨格筋細胞、筋組織生検、脂肪細胞又は脂肪細胞系におけるインスリン刺激性グルコース取り込みのアッセイにおいてさらに試験する。活性化合物は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤、ジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）と同じように、基礎的及びインスリン刺激性グルコース取り込みを刺激するはずである。前記化合物は、好ましくは、経口投与に適する性質のものであるが、静脈内、坐薬又は非経口経路などのいかなる投与経路も考慮される。
【００３３】
さらに別の側面では、本発明は、高い血中グルコース濃度に関係する医学的状態の治療及び／又は予防ための薬剤の製造における、上述したような、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の阻害剤又は拮抗物質の使用を提供する。
【００３４】
本明細書において定義する、「予防する」又は「治療する」の語は、疾患又は病態の完全な消滅をもっぱら意味するのではなく、予想される総合的症状に比べて臨床的に改善が認められるように、完全な又は何らかの改善が存在することを意味する。そのような判定基準の一例は、血中グルコース濃度の２５％以上の低下でありうる。当該技術分野でよく知られている他のそのような判定基準が想定されうる。
【００３５】
本明細書において定義する、「活性酸素種」の語は、Ｈ２Ｏ２、ＯＨ−及びＯ２−などの化合物又は化合物種を含む群から選択される化合物を意味する。これらのような化合物を「ＲＯＳ」と称する。
【００３６】
本明細書において定義する、「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ」又は「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体」の語は、その組合せが活性酸素種を生じる、ｇｐ９１ｐｈｏｘ（配列番号１に記載のヌクレオチド配列、配列番号２に記載のアミノ酸配列）、ｐ２２ｐｈｏｘ（配列番号３に記載のヌクレオチド配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列）、Ｍｏｘ２（配列番号５に記載のヌクレオチド配列、配列番号６に記載のアミノ酸配列）、Ｎｏｘ４（配列番号７に記載のヌクレオチド配列、配列番号８に記載のアミノ酸配列）、Ｎｏｘ５（配列番号９に記載のヌクレオチド配列、配列番号１０に記載のアミノ酸配列）、ＤＵＯＸ１（配列番号１１に記載のヌクレオチド配列、配列番号１２に記載のアミノ酸配列）、ｐ１３８Ｔｏｘ（ＤＵＯＸ２）（配列番号１３に記載のヌクレオチド配列、配列番号１４に記載のアミノ酸配列）、（ｂ５＋ｂ５Ｒ）オキシドレダクターゼ（配列番号１５に記載のヌクレオチド配列、配列番号１６に記載のアミノ酸配列）からなる膜結合型シトクロムｂ５５８、及びサイトゾルタンパク質、ｐ４７ｐｈｏｘ（配列番号１７に記載のヌクレオチド配列、配列番号１８に記載のアミノ酸配列）、ｐ６７ｐｈｏｘ（配列番号１９に記載のヌクレオチド配列、配列番号２０に記載のアミノ酸配列）、ｐ４０ｐｈｏｘ（配列番号２１に記載のヌクレオチド配列、配列番号２２に記載のアミノ酸配列）、及び低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、Ｒａｃ−１（２つの異なるアミノ酸変異体を有する）（配列番号２３に記載のヌクレオチド配列、配列番号２４及び配列番号２５に記載のアミノ酸配列）又はＲａｃ−２（配列番号２６に記載のヌクレオチド配列、配列番号２７に記載のアミノ酸配列）からなる群より選択されるタンパク質の１つあるいは２以上のタンパク質の組合せ、あるいは、基本的にＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性を有する他のタンパク質又はタンパク質の集合を意味する。好ましくは、これらの酵素は、ＦＡＤ及び／又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ結合部位についてのコンセンサス配列を含む。
【００３７】
本明細書において述べる特定のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼアミノ酸及びヌクレオチド配列に加えて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性を保持するそのフラグメント又は変異体（あるいは、そのような活性を保持するポリペプチドをコードするそのフラグメント又は変異体）が本発明の方法（例えばスクリーニング方法）において使用できる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用されるポリペプチドは、１個又はそれ以上の残基において本明細書において述べるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼアミノ酸配列と異なるが、それでもＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性を保持する。その相違は、好ましくは、非必須残基又は保存的置換における相違又は変化である。１つの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書において述べるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼアミノ酸配列又はそのフラグメントと少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記ポリペプチドは、本明細書において述べるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上同一である。好ましいポリペプチドフラグメントは、本明細書において述べるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼアミノ酸配列の長さの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又はそれ以上である。
【００３９】
本明細書において使用する、２個のアミノ酸配列又は２個の核酸配列の「％同一性」は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３において修正された、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，１９９０）を用いて決定される。そのようなアルゴリズムをＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込む。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２で、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施する。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施する。比較を目的としてギャップ・アラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）が述べたように、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを使用する。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを使用するときは、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルト・パラメータを使用して、本明細書において述べる核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得る。
【００４０】
本明細書において述べる、「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性」の語は、それによって活性酸素種（ＲＯＳ）が産生される、本明細書において定義するＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体のいずれかの酵素活性を指す。そのような酵素活性は容易に確立され、このための手順は当業者によく知られている。この活性は当該技術分野においてよく知られており、これをモニターすることができる方法もよく知られている。
【００４１】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体のＲＯＳ生成活性に関して「阻害する」の語は、前記方法で測定したとき前記活性を正常活性の２０％−１００％の範囲に低下させることを意味する。阻害定数Ｋｉの好ましい値は＜１０μＭ、又はより好ましくは＜１μＭである。
【００４２】
本明細書において定義する、「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤」の語は、上記定義に従って、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の活性を低下させることができる化合物を意味する。
【００４３】
活性化されると、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体は形質膜に集合し、分子Ｏ２のスーパーオキシド（Ｏ２−）への単電子還元を触媒する。スーパーオキシドジスムターゼの存在下で、Ｏ２−は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）へと不均化し、過酸化水素は第一鉄イオンの存在下でヒドロキシルラジカル（ＯＨ−）へと変換されうる。細胞内で形成されうるＯ２−から生じる他のフリーラジカルはさらに多く、本明細書においてはこれ以上論じない。活性のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の形成のためにはいくつかのタンパク質が必要であり、次のものを含みうる：ｐ２２ｐｈｏｘ、Ｍｏｘ２、Ｎｏｘ４、Ｎｏｘ５、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、（ｂ５＋ｂ５Ｒ）オキシドレダクターゼ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、ｐ４０ｐｈｏｘ、Ｒａｃ−１、Ｒａｃ−２［Ｌａｍｂｅｔｈら、（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：４５９−４６１］。
【００４４】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＦＡＤ、ＧＴＰ及び両親媒性化合物の存在下において酸素ラジカルを生成する十分に活性な複合体は、インビトロで個々の組換えタンパク質を用いて再構成することができる［Ｒｏｔｒｏｓｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８：１４２５６−６０（１９９３）］。
【００４５】
本発明を下記の実施例によって明らかにする。これらの実施例は例示のみを目的とし、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図しない。これらの実験を実施するために必要な情報は参考文献の中に示されている。これらのアッセイの正しい機能のために行う必要のある変更及び調整（ｐＨ、濃度範囲などの変更）は、当業者には明白であろう。
【００４６】
特に異なる定義がない限り、本明細書において使用するすべての技術的及び学術的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。適切な方法及び材料を下記で述べるが、本発明の実施又は試験においては、本明細書において述べるものと同様の又は等価の方法及び材料もまた使用することができる。本明細書において言及するすべての公表文献、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。不一致の場合には、定義を含み、本明細書が支配する。さらに、材料、方法及び実施例は単なる例示であり、限定を意図しない。
【００４７】
実施例
実施例１：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤  ＤＰＩはラット骨格筋細胞においてグルコース取り込みを増加させる
細胞培養培地、ウシ胎仔血清、抗生物質、トリプシン−ＥＤＴＡはライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）より購入し、ジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）、シチジン、ウシインスリン、ウシ血清アルブミン及びグルコースオキシダーゼはシグマ（Ｓｉｇｍａ）より購入した。２−デオキシ−［３Ｈ］グルコース（比活性  １１０２．６ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）はＮＥＮライフ・サイエンス・プロダクツ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）より、２−デオキシ−［１４Ｃ］グルコースはアマーシャム・ファーマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）より購入した。組織培養プラスチック製品はベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）より購入した。
【００４８】
ラット骨格筋Ｌ６−Ｋ細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含む最小必須培地（α−ＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ）において３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。前記細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡで処理し、細胞の１／３を新鮮培地の入った新しいフラスコに移すことによって、週に２回継代した。筋管への分化のために、２４穴プレートにおいて１ｍｌ中に３０，０００細胞を接種した。細胞がコンフルエントになったとき、通常は３日後に、培地を、α−ＭＥＭ、２％ウシ胎仔血清及びそれぞれ１００Ｕ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌの濃度のペニシリン／ストレプトマイシンからなる分化培地に交換した。培地を２−３日ごとに交換した。４日目から７日目までは、１ｍＭシチジンを含む分化培地を使用した。前記細胞を８−１０日間分化させた後、実験で使用した。
【００４９】
グルコース輸送アッセイの前日に、培養プレートのウェルを空にし、５ｍＭグルコース及びペニシリン／ストレプトマイシンを含む無血清ＤＭＥＭ  １ｍｌを加えた。いくつかの実験では、細胞を１ｍｌ中にて被験化合物で一晩処理し、その翌日に追加処理を行って、総容量２ｍｌとした。これらの実験では、インスリン（１００−１０００ｎＭ）を０．２ｍｌ中で加えた。無血清培地中で２０−２４時間後にすべての処理を実施したとき、総容量１ｍｌを使用した。ウェルを空にし、１μＣｉ／ｍｌの放射活性の２−デオキシ−グルコースを含む、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なしのあらかじめ温めておいたＰＢＳ  ０．５ｍｌを加えた。３７℃で１０分後、ウェルを空にし、冷ＰＢＳで３回洗浄した。細胞単層を、室温で３時間、０．５Ｍ  ＮａＯＨ  ０．５ｍｌに可溶化させた。４００μｌをシンチレーション液８ｍｌ（ワラック社のオプティフェイズ（Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ，Ｗａｌｌａｃ）と混合し、シンチレーション計数器（パッカード・トリカーブ（Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｒｉＣａｒｂ）で計数した。２つの１０μｌの分液を、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）からのＢｒａｄｆｏｒｄ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７６，７２：２４８−５４）に従った方法を用いてタンパク質濃度の測定のために使用した。
【００５０】
分化したＬ６細胞をＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤  ＤＰＩと共にインキュベートすると［Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  Ｖ．Ｂ．ら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９０：４１−４９］、グルコース取り込みの有意の増加を認めることができる（図１）。この増加は、インスリンによって生じるものと同等か又はそれを上回る。この作用は、細胞を０．１−１０μＭ  ＤＰＩで１時間刺激したときに認められる。１μＭにおいて最適値を有するＤＰＩに関する鐘型用量反応曲線が記録される。１時間の処理中において最適状態に及ばない濃度のＤＰＩの作用は、ＤＰＩの３０分後にインスリンを添加すると、さらに刺激されうる。しかしながら、１時間のプロトコールにおいてＤＰＩの最大作用が達成されるときには、インスリンはほとんど付加的な作用を及ぼさない（図１）。ＤＰＩがグルコース輸送を刺激する有効濃度は、無細胞系においてＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性を阻害する濃度と良好に対応する［Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２９０：４１−９（１９９３）］。これらの結果は、ＤＰＩがインスリンと同じ機構の活性化によってグルコース輸送を刺激することを示唆する。上記の結果に基づいて、ＤＰＩはインスリン受容体の構成的活性及び／又は細胞内インスリンシグナル伝達経路を増強すると仮定される。そのような構成的活性の存在は、脂肪細胞をチロシンホスファターゼ  ＰＴＰ１Ｂでトランスフェクトした実験から示唆されている［Ｃｈｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７２：８０２６−３１（１９９７）］。これらのデータは、ＤＰＩがインスリンによって使用されるのと同じ経路を介して構成的細胞内シグナル伝達を増加させることと合致する。
【００５１】
実施例２：グルコースオキシダーゼはグルコース取り込みに対するＤＰＩの作用を低下させる
インスリンシグナル伝達に対するＤＰＩの増強作用はＲＯＳ産生の阻害によるものであると仮定して、外因性のＨ２Ｏ２がＤＰＩの作用を妨げることができるかどうかを調べた。この目的のために、Ｌ６細胞を２５ｍＵ／ｍｌのグルコースオキシダーゼで３０分間処理した後、ＤＰＩを加えた。そのような処理は結果として、細胞膜を自由に通過することができインスリンシグナル伝達の阻害を引き起こしうる、マイクロモル濃度のＨ２Ｏ２の安定産生をもたらすことが、以前に示されている［Ｔｉｒｏｓｈ，Ｐｏｔａｓｈｎｉｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４：１０５９５−６０２（１９９９）］。
【００５２】
グルコースオキシダーゼはＤＰＩの刺激作用を６８％低下させ、インスリンはグルコース輸送を６５％刺激することが認められた（図２）。得られる結果は、Ｈ２Ｏ２が、インスリン抵抗性を誘導することに加えてＤＰＩの作用を妨げうることを示唆する。これは、インスリンの作用とＤＰＩの作用との間の類似性をさらに強調するものであり、そして、ＤＰＩがＨ２Ｏ２産生を阻害することによって作用することを示している。スーパーオキシドがＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの一次産物であるにもかかわらず、スーパーオキシドはスーパーオキシドジスムターゼによってＨ２Ｏ２に変換されるので、Ｈ２Ｏ２が細胞における主要エフェクターである。
【００５３】
実施例３：ＤＰＩはｏｂ／ｏｂマウスにおいて血中グルコース濃度を低下させる
インスリン抵抗性を特徴とする肥満の動物モデルにおいてインビボでの試験を実施した。８ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ  ｏｂ／ｏｂマウス（デンマークのＭ＆Ｂ社（Ｍ＆Ｂ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ））を、性別、体重及び空腹時血中グルコース濃度に関して揃えた。動物にＤＰＩ（１ｍｇ／ｋｇ）又は水を１日１回４日間、腹腔内注射した。５日目に、動物を２．５時間絶食させ、その後ヒトインスリン０．５Ｕ／ｋｇ（アクトラピド、デンマークのノボ・ノルディスク社（Ａｃｔｒａｐｉｄ，Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ））を腹腔内注射して、尾からサンプルを採取することによって血中グルコース濃度を４時間モニターした。ロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ）のグルコメーター・アキュトレンド・センサー（Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ａｃｃｕｔｒｅｎｄ  Ｓｅｎｓｏｒ）を用いてグルコース濃度を測定した。
【００５４】
ＤＰＩ処置の明らかな副作用を伴わずに、処置動物は、インスリン注射の１−４時間後において対照群よりも有意に低い血中グルコース濃度を示し、これは、インスリン抵抗性の低下を示唆している（図３）。
【００５５】
実施例４：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを阻害する物質の同定
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ複合体の活性を阻害する化合物を同定するために使用する方法を説明する。
【００５６】
（Ａ）スーパーオキシド媒介シトクロムｃ還元についての好中球膜及びサイトゾルアッセイ（Ｄｉａｔｃｈｕｋ，Ｖ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３２９２−１３３０１）。正常ドナーの軟膜からの好中球膜及びサイトゾルの供給源は、血液バンクから入手可能である。スーパーオキシド媒介還元の検出のための酵素補因子及びシトクロムｃは市販されている。前記アッセイは、シトクロムｃの還元時に起こる色の変化に基づく。この変化は、標準マイクロプレート分光光度計を使用して吸光度の変化として測定することができる。
【００５７】
（Ｂ）スーパーオキシド媒介シトクロムｃ還元（吸光度）についての好中球膜＋組換えｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ及びｒａｃ１（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１８８３４−１８８４１）。
【００５８】
（Ｃ）スーパーオキシド媒介シトクロムｃ還元についての完全組換えＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼアッセイ［Ｒｏｔｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４２５６−１４２６０］。
【００５９】
（Ｄ）ｒａｃとｐ６７ｐｈｏｘとの間の相互作用を測定する蛍光アッセイ［Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１８８３４−１８８４１］。このアッセイは、スクリーニングを、オキシダーゼの活性化におけるこの特定の段階に干渉する化合物の検出に限定する。蛍光ＧＴＰ類似体  ２’−（又は３’）−Ｏ−（Ｎ−メチルアントラニロイル）−βγ−イミドグアノシン  ５’−トリホスフェート（ＭＡＮＴ−ＧＭＰＰＮＰ、モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）から入手可能）はＲａｃに密接に結合して、ｐ６７ｐｈｏｘを加えたとき蛍光の上昇を示し、複合体の形成を指示する。Ｒａｃ１及びＲａｃ２は、１：１の化学量論及びそれぞれ１２０ｎＭと６０ｎＭのＫｄ値でｐ６７ｐｈｏｘに結合する。
【００６０】
（Ｅ）１２５Ｉ又は蛍光標識マストパランを使用する結合アッセイ。マストパランは、おそらくｐ６７ｐｈｏｘに結合するその能力によって、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性化を阻害することが示されたスズメバチ毒素中に存在するペプチドである［Ｔｉｓｃｈ−Ｉｄｅｌｓｏｎ，Ｄ．ら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６１：１０６３−１０７１］。
【００６１】
（Ｆ）被験化合物は、チオレドキシン−ｇｐ９１ｐｈｏｘ融合タンパク質を使用するニトロブルー・テトラゾリウム色素還元アッセイにおいて分析することができる。このタンパク質は、ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＦＡＤの存在下において弱いジアホラーゼ活性を有し、ＤＰＩによって阻害される。
【００６２】
（Ｇ）被験化合物を適切な量で培養細胞に加えることができる。前記細胞から放出される活性酸素種を、過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在下で蛍光物質となるプローブ、レゾルフィンを使用して測定しうる［Ｚｈｏｕ，Ｍ．ら（１９９７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５３：１６２−１６８］。
【００６３】
ＲＯＳの細胞内産生は、Ｘｉｅ，Ｊ．Ｉ．ら［（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９３２３−１９３２８］が述べたように、ジクロロフルオレシン アセタートの様々な細胞透過性類似体を使用して測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、種々の濃度（０．１−１０μＭ）のＤＰＩを単独で３０分間、又はインスリン（２００又は１０００ｎＭ）と共にさらに３０分間処理したときのＬ６細胞における、インスリン刺激性グルコース輸送に対するＤＰＩの作用を示すグラフである。
【図２】図２は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）によって生成されるＨ２Ｏ２の、ＤＰＩ刺激性グルコース輸送に対する作用を示すグラフである。分化したＬ６細胞を２５ｍＵ／ｍｌのＧＯで３０分間処理した後、ＤＰＩを加えた。さらに３０分後、２００ｎＭのインスリンを加え、３０分後にグルコース輸送を測定した。
【図３】図３は、ＤＰＩ、１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）又は賦形剤（ｎ＝８）を４日間毎日 腹腔内注射処置したｏｂ／ｏｂマウスにおけるインスリン耐性試験中の血中グルコース濃度を示すグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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