(57)【要約】本発明は動物に多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物を投与するための薬学的組成物を含む。とりわけ、経口投与後に多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物を消化管に配達するために有利に用いられるプロリポソーム組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸溶性のコーティングおよび、プロリポソーム調製物と腸溶性のコーティングの間に保護コーティングを含むカプセルまたは錠剤中の多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物のプロリポソーム調製物を含む薬理学的組成物であって、ここでプロリポソーム調製物は本質的に１つ、２つまたは３つの脂質、第１級脂肪族アミンおよびコレステロールからなる薬理学的組成物。
【請求項２】
多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物がシス−スチルベン；トランス−スチルベン；３−、４−もしくは４’−ヒドロキシ、または（３，４’−）もしくは（４’，５−）ジヒドロキシ  シス−スチルベン；３−、４−もしくは４’−ヒドロキシ、または（３，４’−）もしくは（４’，５−）ジヒドロキシ  トランス−スチルベン；シス−スチルベンまたはトランス−スチルベンのカルボキシル化誘導体；シス−スチルベンまたはトランス−スチルベンのハロゲン化誘導体；レスベラトロール（トランス−３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン）；クリシン（５，７−ジヒドロキシフラボン）またはクエルセチン（３，３’，４’，５，７−ペンタヒドロキシフラボン）、またはその生物学的に活性な誘導体である請求項１に記載の薬理学的組成物。
【請求項３】
腸溶性コーティングが酢酸フタル酸セルロースまたはポリ（アクリレート、メタクリレート）共重合体である請求項２に記載の薬理学的組成物。
【請求項４】
保護コーティングがヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコールまたはエチルセルロースである請求項２に記載の薬理学的組成物。
【請求項５】
第１級脂肪族アミンがステアリルアミンである請求項１に記載の薬理学的組成物。
【請求項６】
脂質がリン脂質である請求項５に記載の薬理学的組成物。
【請求項７】
保護コーティングが更に可塑剤を含む請求項１に記載の薬理学的組成物。
【請求項８】
可塑剤がクエン酸トリエチルまたはポリビニルピロリドンである請求項７に記載の薬理学的組成物。
【請求項９】
更に粒子滑沢剤、すなわちタルク、ラクトース、トウモロコシデンプン、エチルセルロース、脂肪酸もしくはその塩、寒天、ペクチン、ゼラチンまたはアカシアを含む請求項１に記載の薬理学的組成物。
【請求項１０】
多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物がレスベラトロール、クエルセチンまたはクリシンである請求項２に記載の薬理学的組成物。
【請求項１１】
脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴシンまたはセラミドである請求項１に記載の薬理学的組成物。
【請求項１２】
ホスファチジルコリンがジステアリルホスファチジルコリン、ジミリスチルホスファチジルコリンまたはその混合物である請求項１１に記載の薬理学的組成物。
【請求項１３】
多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物の生物学的利用能を高めるための方法であって、腸溶性コーティングおよび、プロリポソーム調製物と腸溶性コーティングの間に保護コーティングを含むカプセルまたは錠剤中の多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物のプロリポソーム調製物であって、本質的に脂質、第１級脂肪族アミンおよびコレステロールからなるプロリポソーム調製物を必要とする動物に経口投与することを含む方法。
【請求項１４】
動物がヒトである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物がシス−スチルベン；トランス−スチルベン；３−、４−もしくは４’−ヒドロキシ、または（３，４’−）もしくは（４’，５−）ジヒドロキシ  シス−スチルベン；３−、４−もしくは４’−ヒドロキシ、または（３，４’−）もしくは（４’，５−）ジヒドロキシ  トランス−スチルベン；シス−スチルベンまたはトランス−スチルベンのカルボキシル化誘導体；シス−スチルベンまたはトランス−スチルベンのハロゲン化誘導体；レスベラトロール（トランス−３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン）；クリシン（５，７−ジヒドロキシフラボン）またはクエルセチン（３，３’，４’，５，７−ペンタヒドロキシフラボン）、またはその生物学的に活性な誘導体である請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物がレスベラトロール、クエルセチンまたはクリシンである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
腸溶性コーティングが酢酸フタル酸セルロースまたはポリ（アクリレート、メタクリレート）共重合体である請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
保護コーティングがヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコールまたはエチルセルロースである請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
第１級脂肪族アミンがステアリルアミンである請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
脂質がリン脂質である請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
保護コーティングが更に可塑剤を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
可塑剤がクエン酸トリエチルまたはポリビニルピロリドンである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
プロリポソーム調製物が更に粒子滑沢剤、すなわちタルク、ラクトース、トウモロコシデンプン、エチルセルロース、脂肪酸もしくはその塩、寒天、ペクチン、ゼラチンまたはアカシアを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴシンまたはセラミドである請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
ホスファチジルコリンがジステアリルホスファチジルコリン、ジミリスチルホスファチジルコリンまたはその混合物である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１４の組成物をそれを必要とするヒトに投与することを含む冠動脈心臓疾患、心筋梗塞、虚血、発作、血栓症、肺塞栓症または癌を予防する方法。
【請求項２７】
多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物を腸または結腸に配達するための方法であって、腸溶性コーティングおよび、プロリポソーム調製物と腸溶性コーティングの間に保護コーティングを含む錠剤中の多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物のプロリポソーム調製物であって、本質的に脂質、第１級脂肪族アミンおよびコレステロールからなるプロリポソーム調製物を必要とする動物に経口投与することを含む方法。
【請求項２８】
動物がヒトである請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物がシス−スチルベン；トランス−スチルベン；３−、４−もしくは４’−ヒドロキシ、または（３，４’−）もしくは（４’，５−）ジヒドロキシ  シス−スチルベン；３−、４−もしくは４’−ヒドロキシ、または（３，４’−）もしくは（４’，５−）ジヒドロキシ  トランス−スチルベン；シス−スチルベンまたはトランス−スチルベンのカルボキシル化誘導体；シス−スチルベンまたはトランス−スチルベンのハロゲン化誘導体；レスベラトロール（トランス−３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン）；クリシン（５，７−ジヒドロキシフラボン）またはクエルセチン（３，３’，４’，５，７−ペンタヒドロキシフラボン）、またはその生物学的に活性な誘導体である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物がレスベラトロール、クエルセチンまたはクリシンである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
腸溶性コーティングが酢酸フタル酸セルロースまたはポリ（アクリレート、メタクリレート）共重合体である請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
保護コーティングがヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコールまたはエチルセルロースである請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
第１級脂肪族アミンがステアリルアミンである請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
脂質がリン脂質である請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
保護コーティングが更に可塑剤を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
可塑剤がクエン酸トリエチルまたはポリビニルピロリドンである請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
プロリポソーム調製物が更に粒子滑沢剤、すなわちタルク、ラクトース、トウモロコシデンプン、エチルセルロース、脂肪酸もしくはその塩、寒天、ペクチン、ゼラチンまたはアカシアを含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴシンまたはセラミドである請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
ホスファチジルコリンがジステアリルホスファチジルコリン、ジミリスチルホスファチジルコリンまたはその混合物である請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００２年１月９日出願の米国仮特許出願第６０／３４７７５９号に対する優先権を主張するものであり、その開示は出展明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
発明の背景
１．技術分野
本発明は多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物の生物体への配達に関する。特に、本発明は、薬物、栄養素およびその他の化合物の、生物体の細胞および組織への配達を改善または達成するための、リポソーム並びにかかる有益な化合物のリポソームへの処方に関する。具体的には、本発明は、動物に有利に経口投与される処方の多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物のかかるリポソーム組成物を提供する。
【０００３】
２．関連技術の背景
心臓血管疾患（アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、虚血、発作、肺塞栓症およびその他の血栓性疾患など）および癌は米国における死亡の主要な原因であり、年間の全死亡数の３分の２を占める。米国市民の平均寿命を延長し、そして若年死亡数を低下させた予防薬、食事、運動、診断および治療研究法の進歩に関わらず、これらの疾患は最終的には一世代前の死亡率と変わらない死亡率を占めている。
【０００４】
特定の植物由来の化合物は抗癌および抗心臓血管疾患剤の双方として有益であると認識されている。このクラスの化合物は概して抗酸化または抗炎症活性を有する多環式芳香族化合物を含み、そしてフラボノイド（例えばフラボン、クエルセチンおよびクリシン）およびスチルベン誘導体、例えばレスベラトロールを含む。抗癌薬および抗心臓血管疾患剤としてのこれらの化合物の効果は双方共に逸話的であり、現代科学的な綿密な調査に供される。これらの化合物の有益な効果の逸話的証拠の一例は「フレンチ・パラドックス」と称されていることに関するものである。パラドックスは、フランス人の食事にはアテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患のリスクに随伴されている栄養素（例えばコレステロールおよび飽和脂肪）が多いが、フランス市民はその他の西洋諸国の比較相手よりも心臓血管疾患が少ないということである。この結果に関して表明された理由は、フランス市民はその他の西洋諸国の市民よりも多くの赤ワインを摂取するということであり、そして赤ワインはある多環式芳香族抗酸化化合物、レスベラトロールを多く含む（５〜５０ＰＰＭ）（ＳｉｅｍａｎｎおよびＣｒｅａｓｙ、Ａｍ．Ｊ．Ｅｎｏｌ．Ｖｉｔｉｃ．４３：４９−５２（１９９２）；Ｋｏｐｐら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：６１９−６２０（１９９８））。レスベラトロールはまた心臓、血管および肝臓の病気を処置するために用いられる伝統的な漢方薬、コジョウコンの成分でもある。Ｓｏｌｅａｓら、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９１−１１３（１９９７）。
【０００５】
レスベラトロールはブドウの皮に存在するために、赤ワインに見出され、そして真菌に対する保護を提供するフィトアレキシンであると考えられている。Ｃｅｌｏｔｔｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．７３０：４７−５２（１９９６）。これはユーカリ、トウヒ、ユリ、桑および落花生にも（更に低濃度で）見出される。
【０００６】
レスベラトロールはまたいくつかの科学的研究の対象でもある。Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｓｔｕｄｙ（１９９５）は冠動脈疾患による死亡の相対的危険性は、赤ワインを月１回摂取した場合、２０％まで、週１または２回摂取した場合、３０％まで、そして週３から５回摂取した場合、４０％まで低下することを示した。別の研究者はこれらの結果に関する生理学的基礎を研究した。Ｐｅｎｄｕｒｔｈｉら（１９９９）は、レスベラトロールは用量依存的に内皮細胞の組織因子の転写および発現を阻止することを示した。Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｈｅｒｏｓｉｓ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．１９：４１９−４２６。レスベラトロールは抗酸化（Ｃｈａｎｖｉｔａｙａｐｏｎｇｓら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８：１４９９−１５０２（１９９７）；Ｂｅｌｇｕｅｎｄｏｕｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：８１１−８１６（１９９８）；Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４１：１１０３−１１０４（１９９３））、血小板凝集阻止（Ｂｅｒｔｅｌｌｉら、Ｄｒｕｇｓ  Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．２２：６１−６３（１９９６）；Ｒｏｔｏｎｄｏら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２３：１６９１−１６９９（１９９８））および血管拡張（Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍ．２７：３６３−３６６（１９９６））特性を有することが示されている。またレスベラトロールが、推定によるとＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２並びにそれによる腫瘍促進を阻止することにより、癌化学的予防特性（Ｊａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：２１８−２２０（１９９７））を有することも示されている（Ｓｕｂｂａｒａｍａｉａｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２１８７５−２１８８２；Ｃｌｅｍｅｎｔら、Ｂｌｏｏｄ  ９２：９９６−１００２（１９９８）；Ｆｏｎｔｅｃａｖｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２１：２７７−２７９（１９９８））。
【０００７】
結果的に、世界保健機構は、レスベラトロールまたはレスベラトロール含有食品を適当な量で摂取した場合、冠動脈疾患は４０％まで低下すると推定した。
【０００８】
クリシン（５，７−ジヒドロキシフラボン）はトケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｃｏｅｒｕｌｅａ）抽出物に見出される天然発生フラボンである。クリシンは抗不安剤（Ｗｏｌｆｍａｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．４７：１−４（１９９４）；Ｐａｌａｄｉｎｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１：５１９−５２６（１９９９））、抗痙攣薬（Ｍｅｄｉｎａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．４０：２２２７−３１（１９９０））、ヒト癌細胞の多剤耐性を媒介するＰ糖タンパク質を逆転させる薬物（Ｂａｒｒｏｎら、合成有機化学に関する第２回国際電子会議（ＥＣＳＯＣ−２）、１９９８年９月１から２０日、ｗｗｗ．ｍｄｐｉ．ｏｒｇ／ｅｃｓｏｃ）として、およびタンパク質キナーゼインヒビター（Ｈａｇｉｗａｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７：２９８７−２９９２（１９８８））としての活性を有している。老齢者の心筋梗塞の危険性はクリシンにより低下する（Ｈｅｒｔｏｇら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４２：１００７−１０１１（１９９３））。クリシンはとりわけテストステロンのエストロゲンへの変換に寄与する酵素であるアロマターゼを阻止することにより作用すると考えられている。
【０００９】
クエルセチン（３，３’，４’，５，７−ペンタヒドロキシフラボン）はリンゴ、タマネギ、お茶および赤ワイン（レスベラトロール同様、これはブドウの皮に由来する）に見出される天然物質である。クエルセチンは抗酸化剤であることが示されている。Ｃａｉら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２７：８２２−８２９（１９９９）。クエルセチンはＭａｙｏクリニックの医師により前立腺がんの予防および処置に有効な薬物であることが示されている。Ｘｉｎｇら、米国癌学会、第２６回年次大会、２００１年３月２６日。前立腺癌は男性における第２の主要な死亡原因であり、年間３１５００人が死亡し、そして２０００００人が診断を受けている。クエルセチンは現在、炎症性疾患および障害を処置するために治療用に用いられている。
【００１０】
薬理学の分野における主要な目標は治療用化合物、薬物およびその他の作用物質の侵襲的（すなわち例えば注射による）投与の必要性を低減させる試薬および方法の開発である。最も好ましくは、経口投与を可能にする治療用化合物、薬物および作用物質並びにその処方を開発することが当分野における一貫した目標である（例えば１９９０年１０月１６日、Ｅｃａｎｏｗに対して発行された米国特許第４９６３５２６号）が、侵襲性が低減されたその他の処方、例えば坐剤もまた開発されている。種々の薬物投与経路の中で、汎用性、安全性および患者の安心のために、薬物の経口摂取がまぎれもなく好ましい。
【００１１】
加えて、特定の栄養素の血流への取り込みおよび配達を増加させるために、消化管を通して一定の栄養素の通過を増加させる調製物を開発することが栄養学の分野における目標である。特に、化学的に不安定な栄養素（例えばビタミンおよびその他の鋭敏な化合物）を、腸内で吸収させるために胃の化学的に不利な環境を通過させることができる調製物が開発されている（例えば１９９９年９月２８日にＴａｓｈｉｒｏに対して発行された米国特許第５９５８４５０号参照）。腸管摂取が増強されている調製物もまた望ましいと考えられている。
【００１２】
治療用化合物、薬物およびその他の作用物質の配達効率を改善するための先行技術で公知の１つの研究法は、かかる化合物をリポソームと称する特殊化された脂質構造に被包することである（例えば１９８８年５月１７日にＰａｙｎｅらに対して発行された米国特許第４７４４９８９号参照）。リポソームは一般に化合物を含有するコア、典型的には水性コアを有する被包化された脂質小滴を含む。特定の実施形態では、化合物はリポソームの脂質成分に化学的に抱合されている。別の実施形態では、化合物は単にリポソーム内部の水性区画内に含まれている。
【００１３】
特定のリポソーム処方は当分野で公知である。
【００１４】
１９９３年６月２９日にＨｏｓｔｅｔｌｅｒらに対して発行された米国特許第５２２３２６３号はリポソームの封入のための抗ウイルスヌクレオシドアナログと極性脂質間の抱合を開示している。
【００１５】
１９９５年１１月１４日にＳｃｈｎｅｉｄｅｒらに対して発行された米国特許第５４６６４６８号は合成脂質を含む、非経口的に投与できるリポソーム処方を開示している。
【００１６】
１９９６年１月１６日にＨｏｓｔｅｔｌｅｒらに対して発行された米国特許第５４８４８０９号はリン脂質に抱合されたタクソールおよびタクソール誘導体を開示している。
【００１７】
１９９６年１２月３日にＨｏｓｔｅｔｌｅｒらに対して発行された米国特許第５５８０５７１号はリン脂質に抱合されたヌクレオシドアナログを開示している。
【００１８】
１９９７年５月６日にＮｙｑｖｉｓｔらに対して発行された米国特許第５６２６８６９号は、薬学的に活性な化合物が、少なくとも１つの両親媒性および極性脂質成分並びに少なくとも１つの非極性脂質成分を含む定義された脂質系に含まれるヘパリンまたはそのフラグメントである薬学的組成物開示している。
【００１９】
１９９８年４月２８日にＨｏｓｔｅｔｌｅｒらに対して発行された米国特許第５７４４４６１号はホスホノ酢酸脂質誘導体に抱合されたヌクレオシドアナログを開示している。
【００２０】
１９９８年４月２８日にＨｏｓｔｅｔｌｅｒらに対して発行された米国特許第５７４４５９２号はリン脂質に抱合されたヌクレオシドアナログを開示している。
【００２１】
１９９８年５月２６日にＨｏｓｔｅｔｌｅｒらに対して発行された米国特許第５７５６１１６号はリン脂質に抱合されたヌクレオシドアナログを開示している。
【００２２】
１９９８年１２月１日にＣａｌｖｏ  Ｓａｌｖｅらに対して発行された米国特許第５８４３５０９号は水溶性および正に荷電した多糖類並びに負に荷電したリン脂質を含む脂質−多糖類複合体の形成によるコロイド系の安定化を開示している。
【００２３】
１９８９年４月にＶｉｃａｌに対して公開された国際特許出願公開番号ＷＯ８９／０２７３３は抗ウイルスヌクレオシドアナログと極性脂質との間の抱合体を開示している。
【００２４】
Ｖｉｃａｌに対する欧州特許出願公開番号０３５０２８７Ａ２は抗ウイルスヌクレオシドアナログと極性脂質との間の抱合体を開示している。
【００２５】
Ｖｉｃａｌに対する国際特許出願公開番号ＷＯ９３／００９１０は抗ウイルスヌクレオシドアナログと極性脂質との間の抱合体を開示している。
【００２６】
Ｒａｈｍａｎら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３１：２０６１−７１（１９８２）は脂質の一部としてガラクトリピッドを含有するリポソームは、ガラクトリピッドを欠くリポソームよりも実質細胞に対する親和性が高いようであることを見出した。
【００２７】
Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５２７−５３７（１９９５）は標的化薬物配達のためのリポソームの使用に随伴される進歩および問題を概説している。
【００２８】
Ｌｅｄｌｅｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１１２９−１１４４（１９９５）は遺伝子治療のためのリポソームの使用を概説している。
【００２９】
Ｍｉｃｋｉｓｃｈ、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ  １３：１７８−１８５（１９９５）は腎細胞癌腫の遺伝子治療のためのリポソームの使用を概説している。
【００３０】
Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １４：２８１−２９７（１９９７）は中枢神経系を指向する遺伝子治療のためのカチオン性リポソームの使用を概説している。
【００３１】
ＳｔｏｒｍおよびＣｒｏｍｍｅｌｉｎ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：１１９−１２５（１９９７）は腫瘍部位に対して化学療法剤を標的化するためのリポソームの予備的な使用を概説している。
【００３２】
Ｍａｎｕｓａｍａら、Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１４：２３２−２３７（１９９８）は癌処置のためのリポソームに封入した腫瘍壊死因子の前臨床および臨床試験に関して報告している。
【００３３】
リポソームは慣習的に非経口的に投与されているが（例えば米国特許第５４６６４６８号参照）、リポソーム関連処方の経口投与の報告が当分野で出されている。
【００３４】
１９９０年５月１日にＷｈｅａｔｌｅｙらに対して発行された米国特許第４９２１７５７号は半透過性マイクロカプセルまたは透過性ポリマーマトリックス内への封入により生物学的環境から保護されるリポソームに捕捉された生物学的活性物質、例えば薬物およびホルモンの放出制御を開示している。
【００３５】
１９９１年８月２７日にＲａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎに対する米国特許第５０４３１６５号はステロイド性薬物の持続放出のためのリポソーム組成物を開示している。
【００３６】
１９９８年６月９日にＯｋａｄａらに対して発行された米国特許第５７６２９０４号は重合リポソームを用いるワクチンの経口配達を開示している。
【００３７】
１９９９年９月２１日にＬｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇｅｒらに対して発行された米国特許第５９５５４５１号は双性イオン性または中性リン脂質のいずれかと、またはその双方と複合化し、胃腸管刺激作用が低減され、そして解熱、鎮痛および抗炎症活性が増強されている非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む組成物を開示している。
【００３８】
プロリポソームは慣用されるリポソーム処方の代替である。プロリポソームは乾燥、流動性顆粒生成物であり、これは水の添加時に分散して多重ラメラリポソーム懸濁液を形成する。慣用されるリポソームに随伴される安定性の問題、例えば凝集、加水分解に対する感受性および／または酸化はプロリポソームを使用することにより回避される。
【００３９】
Ｇａｎｔｅｒらに対する米国特許第５６３５２０６号はリポソームまたはプロリポソームの調製のための方法を開示している。
【００４０】
Ｂａｌｌｙらに対する米国特許第５５９５７５６号は、そのリポソーム膜にアミン担持脂質を含んでいるリポソーム内に生物活性物質が捕捉されている溶液のｐＨを（およそ２〜３に）低下させることにより相乗効果が誘導される場合、血漿中の生物活性物質濃度が上昇することを開示している。
【００４１】
Ａｌｖｉｎｇらに対する米国特許第６０９３４０６号は、リポソーム、および正味の負電荷、正味の正電荷（ステアリルアミンによる）を含有するかまたは水酸化アルミニウムに吸収されているリポソームと併せて中性である化合物を使用するリポソーム誘導ワクチンを教示している。
【００４２】
水和時に封入効率の高いリポソームを生じ、そして抗炎症活性が増強され、潰瘍誘発指数が低下しているインドメタシンのプロリポソームを、発泡性顆粒を用いて調製した（例えばＫａｔａｒｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ８１：１−７（１９９１）参照）。
【００４３】
プロリポソームの概念は種々の経路を経る薬物の投与に、および酵素固定が種々食品加工計画に必須である食品工業にも拡張されている。典型的な実例は酵素、キモトリプシンの、プロリポソームから得られたリポソーム内での固定である
多環式芳香族抗酸化剤もしくは抗炎症、または抗炎症化合物のような化合物の動物への経口投与による配達のための一般的な、安価なそして有効な手段に関する当分野における必要性が残存している。かかる配達手段の有利な実施形態は、有効な吸収のために消化管の適当な部分にかかる化合物を有効に配達するために処方されている。
【００４４】
発明の概要
本発明は経口投与により多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物を動物に配達するための改善された方法を指向する。本配達系は化合物をリポソームおよびプロリポソーム成分と結び付けることにより、かかる多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物の特異的な配達を達成する。
【００４５】
好ましい実施形態では、多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物をインビボで再構成されてリポソーム調製物を提供することができるプロリポソーム組成物として処方する。好ましくは、本発明は多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物およびプロリポソーム調製物として処方された脂質を含む薬学的組成物を提供する。更に好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物を経口投与用に処方する。最も好ましくは、経口投与用に処方された本発明の薬学的組成物は、動物の胃における組成物の分解を防御するのに十分な腸溶性コーティングを含む。また別の実施形態では、薬学的組成物は腸溶性コーティングとそのプロリポソーム成分を含む組成物のコアとの間に保護コーティングをも含む。当業者に理解されるように、該経口投与用薬学的組成物の更に有利な成分は更に薬学的組成物を含む。
【００４６】
本発明の具体的な好ましい実施形態は以下の更に詳細な特定の好ましい実施形態の記載および請求の範囲から明らかになろう。
【００４７】
好ましい形態の詳細な説明
本発明は経口投与後の多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物の動物組織への配達を促進するための物質の組成物および方法を提供する。本発明の目的のために、「多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物」なる用語は抗酸化または抗炎症特性を有し、そしてシス−スチルベン；トランス−スチルベン；３−、４−もしくは４’−ヒドロキシ、または（３，４’−）もしくは（４’，５−）ジヒドロキシ  シス−スチルベン；３−、４−もしくは４’−ヒドロキシ、または（３，４’−）もしくは（４’，５−）ジヒドロキシ  トランス−スチルベン；シス−スチルベンまたはトランス−スチルベンのカルボキシル化誘導体；シス−スチルベンまたはトランス−スチルベンのハロゲン化誘導体；およびレスベラトロール（トランス−３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン）；またはフラボノイド、最も好ましくはクリシン（５，７−ジヒドロキシフラボン）もしくはクエルセチン（３，３’，４’，５，７−ペンタヒドロキシフラボン）、またはその生物学的に活性な誘導体を含む天然発生の、最も好ましくは植物由来の、または合成による化合物を包含することを意図する。
【００４８】
好ましくは、本発明の多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物を含む薬学的組成物は、最も好ましくはインビボで再構築されて、多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物のリポソーム組成物を生成することができるプロリポソーム組成物として提供される。
【００４９】
本明細書で用いる「プロリポソーム」および「プロリポソームの」なる用語は、水の添加時に分散して本発明の多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物を含む多重ラメラリポソーム懸濁液を形成するカルシウムを含まない、乾燥、流動性顆粒生成物を包含することを意図する。本発明のリポソームおよびプレリポソームは水酸化アルミニウムに吸収されていない。有利には、慣用されるリポソームに随伴される安定性の問題（例えば凝集、加水分解に対する感受性および酸化）はプロリポソームを使用することにより回避される。
【００５０】
本発明により提供されるプロリポソーム組成物はとりわけインビボで再構築されて、リポソーム内に本発明の多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物が封入されている該リポソーム組成物を提供する。なお更に好ましくは、プロリポソーム組成物は動物の腸で再構成される。本発明のプロリポソームが腸でリポソームを形成する場合、リポソームはｐＨおよそ６．４（ヒトにおいて）の環境にある。これは、低ｐＨ（およそ２〜３）においてステアリルアミンと生物学的に活性な成分との間の相乗効果を妨げ、このことは米国特許第５５９５７５６号に開示および特許請求されている。
【００５１】
本発明のプロリポソーム組成物の調製において、中性脂質、正に荷電した脂質または種、負に荷電した脂質または種、両性脂質、例えばリン脂質およびコレステロールを含む脂質成分を用いるのが有利である。本明細書で定義するように、本発明のプロリポソーム組成物の「脂質成分」は脂質の単一の種（例えば特定のリン脂質）またはかかる脂質の組み合わせ、例えばリン脂質の組み合わせ（例えばホスファチジルコリンにホスファチジルエタノールアミンを加えたもの）または異なる型の組み合わせ（例えばリン脂質に、荷電した脂質、荷電した種、中性脂質または中性種を加えたもの）のいずれかの型を包含することを意図する。多数の異なる型の脂質を含む組み合わせもまた本発明のプロリポソーム組成物に有利に包含される（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、１９７５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、第１１および２４章、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＳｍａｌｌ、１９８６、「アルカンからリン脂質まで」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ、第４巻、第４および１２章、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照）。
【００５２】
更に好ましくは、プロリポソーム組成物の「脂質成分」は少なくとも１つの脂質およびカルシウムではない正に荷電した種を包含する。好ましい正に荷電した種は第１級脂肪族アミン、例えばステアリルアミンである。更に好ましくは、脂質成分はまたコレステロールをも含有する。最も好ましくは、脂質成分は本質的に、別個に選択された１つ、２つまたは３つの脂質、正に荷電した種およびコレステロールからなる。脂質は別個に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴシンまたはセラミドである。更に好ましくは、ホスファチジルコリンはジステアリルホスファチジルコリン、ジミリスチルホスファチジルコリンまたはその混合物である。なお更に好ましくは、ホスファチジルコリンはジステアリルホスファチジルコリンまたはジミリスチルホスファチジルコリンである。負に荷電した種は作用しないで、これらは本発明の薬物の生物学的利用能を低下させることにも留意すべきである。図２および４参照。
【００５３】
胃で不安定であるか、または胃もしくは消化管の別の部分を通過するために吸収事象が低減されていることを示す多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物、または胃を刺激する多環式芳香族抗酸化剤もしくは抗炎症化合物、および小腸で優先的に吸収される多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物は、本発明のリポソーム処方に有用な好ましい化合物である。好ましい実施形態では該化合物は、限定はされないが、シス−スチルベン；トランス−スチルベン；３−、４−もしくは４’−ヒドロキシ、または（３，４’−）もしくは（４’，５−）ジヒドロキシ  シス−スチルベン；３−、４−もしくは４’−ヒドロキシ、または（３，４’−）もしくは（４’，５−）ジヒドロキシ  トランス−スチルベン；シス−スチルベンまたはトランス−スチルベンのカルボキシル化誘導体；シス−スチルベンまたはトランス−スチルベンのハロゲン化誘導体；およびレスベラトロール（トランス−３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン）；またはフラボノイド、最も好ましくはクリシン（５，７−ジヒドロキシフラボン）もしくはクエルセチン（３，３’，４’，５，７−ペンタヒドロキシフラボン）、またはその生物学的に活性な誘導体などを含む。
【００５４】
本発明の多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物を含むプロリポソーム調製物は、好ましくは、経口投与できる形態、限定はされないが、シロップ、エリキシル、カプセル、錠剤および乳剤を含む形態で提供される。好ましい形態は錠剤またはカプセルであり、最も好ましくは胃の化学的に過酷な環境下で早すぎる分解を防御する腸溶性コーティングを含む。腸溶性コーティングは当業者に理解されているように調製され、そして好ましくは、限定はされないが、オイドラジット（ｅｕｄｒａｇｉｔ）および酢酸フタル酸セルロースなどのコーティングが含まれる。
【００５５】
好ましい実施形態では、本発明の錠剤またはカプセルは腸溶性コーティングと本発明のプロリポソーム調製物を含むカプセルまたは錠剤のコアとの間に保護コーティングを含む。かかる実施形態では、保護コーティングは当業者に理解されているように調製され、そして好ましくは、限定はされないが、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコールおよびエチルセルロースなどのコーティングが含まれる。更なる実施形態では、保護コーティングは更に、限定はされないが、クエン酸トリエチルおよびポリビニルピロリドンを含む可塑剤を含む。
【００５６】
プロリポソーム調製物の錠剤、カプセルおよびその他の同様の実施形態、並びに本発明の薬学的組成物は更に顆粒プロリポソーム組成物が凝集する傾向を最小にする粒子滑沢剤を含むのが有利である。本明細書で用いる「粒子滑沢剤」とは医薬用錠剤の製造において錠剤化過程での活性物質の流動性を改善し、そして凝集を防ぐための滑沢剤として用いられる材料のクラスを意味する。粒子滑沢剤の例は、タルク、ラクトース、トウモロコシデンプン、エチルセルロース、ステアリン酸マグネシウムのような脂肪酸塩、寒天ペクチン、ステアリン酸のような脂肪酸、ゼラチンおよびアカシアを含む。
【００５７】
本発明はとりわけ以下の実施例において開示するような本発明のプロリポソーム組成物の調製および投与方法、並びに多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物のプロリポソーム調製物を含む薬学的組成物を提供する。
【００５８】
本発明のプロリポソーム調製物および薬学的組成物で処置する動物は全ての脊椎動物、好ましくは家畜、例えばウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、家禽、魚類、家庭用ペット等、および野生動物、並びに最も好ましくはヒトを含むことを意図する。
【００５９】
非経口的に投与される処方に対する、経口的に投与されるリポソーム処方の１つの利点は、経口投与が肝臓によるリポソームの取り込みを低減し、従って肝臓毒性を低減することである（これは非経口投与されたリポソーム処方の特に不利な点である）。経口処方は多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物の吸収のための表面積が大きい腸への配達を標的化し、その結果、投与された化合物はゆっくりと放出される。最終的に経口投与により、本発明の多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物の、輸送により媒介される飽和が回避される。
【００６０】
以下の実施例は前記した方法の特定の態様および有利な結果を説明する。以下の実施例は説明のために示すものであり、限定のために示すものではない。
【００６１】
実施例１
経口投与に有用なプロリポソーム処方を、インビトロモデル系を用いて開発した。半透過性フィルター上で成長させたヒトＣａｃｏ−２細胞（結腸腺癌細胞）は腸粘膜を通る薬物輸送を研究するための単純で、そして信頼できるインビトロモデルを提供する。Ｃａｃｏ−２細胞は当分野では、新しい薬物処方の経口吸収に関する有用な予測を生み出すことで知られている。
【００６２】
１．プロリポソーム処方の調製
本発明のプロリポソーム錠剤を評価するために、Ｃａｃｏ−２系での取り込みがこの細胞系により形成された単層を通る輸送を測定することによりモニター観察できるので、スルホニル尿素類の経口ゲルコース低下薬であるグリブリド（グリベンクラミド）を薬物モデルとして使用した。
【００６３】
プロリポソーム錠剤を以下のように調製した。本発明の錠剤を調製するために用いた各試薬の同定および量を表Ｉに示す。リン脂質ＤＭＰＣおよびＤＳＰＣをＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、アラバマ州）から入手し、グリブリド、コレステロール、ステアリルアミン、リン酸ジセチルおよび全ての組織培養試薬をＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）から入手し、精製タルクおよび無水ラクトースをＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ニュージャージー州）およびＱｕｅｓｔ，Ｉｎｔ’ｌ．（Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｅｓｔａｔｅｓ、イリノイ州）から入手し、クロロホルム、メタノールおよびエタノールをＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒｌａｗｎ、ニュージャージー州）から入手し、Ｃａｃｏ−２細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州；受入れ番号ＨＴＢ  ３７）から入手し、そしてトランスウェル培養チャンバーをＣｏｓｔａｒ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、マサチューセッツ州）から入手した。
【００６４】
グリブリド、脂質およびコレステロールを室温でクロロホルム１０ｍｌに溶解した。ラクトース（２５ｍｇ／錠剤）を有機混合物に懸濁し、そして懸濁液を慣用されるコーティングパンで、６０℃で蒸発乾固した（パン乾燥法）。固体残留物を収集し、そして＃６０メッシュスクリーンを通すふるいにかけた。次いでふるいにかけた残留物をＥｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）（３ｍｇ／錠剤）、ラクトース（５０ｍｇ／錠剤）およびタルク（２ｍｇ／錠剤）と混合し、そしてＭａｎｅｓｔｙ  Ｂ３Ｂ  １６ステーション・プレスを用いて錠剤に圧縮した。次いで錠剤を可塑剤としてクエン酸トリエチル（ポリマー重量の１５％）を含有するエチルアルコール中ヒドロキシプロピルメチルセルロースの溶液（３重量／容量％）でコートした。次いでＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０  Ｄ−５５（７重量／重量％）をコートした錠剤に適用した。
【００６５】
表Ｉは本発明によるプロリポソーム錠剤を調製するための処方を提供する。
【００６６】
また別法では、プロリポソーム処方を凍結乾燥により調製することができる。これらの実施形態では、脂質および薬物の混合物を水溶液中で調製し、そして次に超音波処理し、小型の単層状のリポソームを形成し、そして光学的に透明な溶液を得る。次いでかかる溶液を凍結−乾燥し、そして前記した錠剤の別の成分と混合する。この方法は５工程で実施でき、そして処方の調製において毒性の可能性のある有機溶媒の使用を避けることができるという利点を有している。
【表１】
2005523249.tif 000002
【００６７】
ＤＳＰＣ＝ジステアリルホスファチジルコリン
ＤＭＰＣ＝ジミリスチルホスファチジルコリン
ＳＴＡ＝ステアリルアミン（Ｐｏｓ：正に荷電した種）
ＣＨＯ＝コレステロール（Ｎｅｕ：中性の脂質）
ＤＣＰ＝リン酸ジセチル（Ｎｅｇ：負に荷電した種）
その他の別法では、プロリポソーム処方を噴霧乾燥により調製することができる。これらの実施形態では、脂質および薬物の混合物を水溶液中で調製する。かかる混合物に界面活性剤例えばＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標）を加え、そして次に噴霧乾燥器を用いて乾燥する。得られた乾燥プロリポソーム調製物を前記したような錠剤のその他の成分と混合する。この方法は５工程で実施でき、温度に鋭敏な材料の使用に適し、そして処方の調製において毒性の可能性のある有機溶媒の使用を避けることができるという利点を有している。
【００６８】
この別法のもう１つの実施形態は、界面活性剤を用いる代わりに混合機を用いる。混合機は前記した噴霧乾燥できる界面活性剤を含まないプロリポソーム組成物を生成する。この実施形態は、本発明によるプロリポソーム処方の調製において界面活性剤および有機溶媒の双方の使用を回避するので、とりわけ有利である。
【００６９】
２．試薬およびプロリポソーム処方の化学的アッセイ
本明細書に記載した本発明のプロリポソーム錠剤を作製するために用いる試薬の純度を、示差走査熱量計を用いて試験した。過剰のクロロホルム中、グリブリドおよびコレステロールを別個に脂質と１：１（重量：重量）の比率で溶解することによりサンプルを調製した。有機層を除去し、示差走査熱量計（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ、デラウェア州、２９１０モデル）を用いてサーモグラムを得た。各成分を個別に、およびグリブリド、脂質およびコレステロール、１：１：１（重量：重量：重量）の比率で含む混合物を用いての双方でスキャンした。密閉アルミニウムパンで分あたり２０℃の率で適当な温度範囲（２５〜２２５℃）にわたってサンプル２〜５ｍｇをスキャンした。分散物のピーク遷移温度を純粋な化合物と比較した。これらの実験の結果を図１Ａから１Ｃで示す。
【００７０】
図１ＡはＤＭＰＣおよびコレステロール（ＤＭＰＣ／ＣＨＯＬ）、ＤＭＰＣおよびグリブリド（ＤＭＰＣ／ＧＬＹＢ）並びにＤＭＰＣ、コレステロールおよびグリブリド（ＤＭＰＣ／ＣＨＯＬ／ＧＬＹＢ）の混合物と比較したＤＭＰＣ単独のサーモグラムを示す。ピーク遷移温度を図に示す。単純なおよび容易に認識できる、ＤＭＰＣに関して得られたピーク遷移温度とは対照的に、混合物は異種性であり、熱遷移を生じる１つ以上の局在ピーク領域を有する。
【００７１】
図１ＢはＤＳＰＣおよびコレステロール（ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ）、ＤＳＰＣおよびグリブリド（ＤＭＰＣ／ＧＬＹＢ）並びにＤＳＰＣ、コレステロールおよびグリブリド（ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＧＬＹＢ）の混合物と比較したＤＳＰＣ単独のサーモグラムを示す。ピーク遷移温度を図に示す。ここで類似のパターンが観察され、ＤＳＰＣに関して単純なおよび容易に認識できるピーク遷移温度が得られるが、混合物は異種性であり、熱遷移を生じる１つ以上の局在ピーク領域を有する。
【００７２】
サーモグラムは個別に、並びにグリブリドおよびコレステロールの混合物でも得られ、そしてこれらの結果を図１Ｃに示す。これらのサーモグラムから、コレステロールの存在が薬物の「不純物」として作用し、その融点を低下させることは明白である。薬物および脂質の混合物で同一の影響が観察される。コレステロールおよび脂質の双方の存在下、グリブリドの融点は更に低下し、相乗効果が実証される。これらの結果はまた、純粋な状態の薬物を溶融するのに必要な熱量は、薬物をコレステロールまたは脂質と組み合わせた場合に必要とされる量よりもはるかに高いことを示している。これは脂質および／またはコレステロールの固体分散物中で調製した場合、薬物の溶解性を増強することを説明している。
【００７３】
滅菌ガラスバイアル中１個の錠剤をリン酸塩緩衝食塩水１ｍｌに加えることにより、リポソームをプロリポソーム錠剤から再構築した。錠剤を３７℃で１時間、振盪しながら放置し、これにより錠剤は十分に溶解し、そしてリポソーム調製物を再構築した。
【００７４】
粒子サイズ分析器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＢＩ−９０モデル）を用いて大角度動的光散乱により再構築されたリポソームをサイズ分布に関して特徴付けした。各調製物を濾過した生理食塩水で適当な濃度に希釈して室温で中程度の粘性、０．０８９センチポアズおよび中程度の相対屈折率、１．３３２を達成した。これらの条件下で得られた測定値を表ＩＩに示す。これらの結果は、得られたリポソームの粒子サイズがコレステロールの存在または不在およびリン脂質成分の同定の双方で変化することを示した。リポソームの平均直径は荷電したリポソーム実施形態よりも中性リポソーム実施形態においてより大きく、そして中性リポソームの互いに凝集または融合する傾向が大きいことにより説明できる。
【００７５】
リポソームに封入されたグリブリドのパーセンテージとして定義される封入効率を、Ｋｕｌｋａｒｎｉら（Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１：３５９−３６２（１９９５））に記載されるようなプロタミン誘起凝集法を用いて決定した。簡単には、各錠剤をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ  ｐＨ７．４）１ｍｌ中で崩壊させて１０ｍｇ／ｍｌの濃度の脂質を得た。調製物１００μｌにＰＢＳ中プロタミン溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）等量を加え、そして約１分間ボルテックスした。次いで混合物を約１２時間、室温でインキュベートした。インキュベーションの後、混合物を約１６０００ｘｇで約５分間遠心した。上澄み１００μｌを除去し、そしてペレットを試薬用アルコール（９５％  エタノール）約１ｍｌに溶解し、そして５分間超音波処理した。
【表２】
2005523249.tif 000003
【００７６】
ペレットおよび上澄み中のグリブリドの量をＳｔａｒ（登録商標）９０１０溶媒系およびＳｔａｒ（登録商標）９０９５可変波長紫外／可視スペクトル分光光度検出器（Ｖａｒｉａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ、カリフォルニア州）を用いてＨＰＬＣ分析により決定し、そしてデータをＤｙｎａｍａｘ（登録商標）ＭａｃＩｎｔｅｇｒａｔｏｒ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、Ｗｏｂｕｒｎ、マサチューセッツ州）により分析した。５μｍ粒子を充填し、そして長さ２５０ｍｍおよび内径４．６ｍｍ寸法のＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｉｎｅｘ（登録商標））を用いてＨＰＬＣ分析を実施した。可動相は０．１Ｍ  リン酸塩バッファー（ｐＨ３．５）中メタノールの容量比で７５：２５の率の溶液であった。カラム流速は１．０ｍｌ／分であり、そして溶出物を波長２２５ｎｍでスキャンした。
【００７７】
これらの特徴付け実験の結果を表ＩＩＩに示す。
【００７８】
これらの結果は、わずかに高いパーセンテージの薬物がＤＭＰＣに封入されたことを実証した。これらの結果は３７℃で「液体」リポソーム（すなわちＤＭＰＣを含むもの）に封入されている薬物が、ゲル状態のリポソーム（すなわちＤＳＰＣを含むもの）よりもわずかに高量であることと合致する。
【表３】
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【００７９】
実施例２
孔径４ｎｍの膜を有するポリカーボネートトランスウェル上でＣａｃｏ−２細胞培養物を単層として調製した。Ｃａｃｏ−２細胞を最初にＴ−１５０フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ、Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ、ニュージャージー州）中、通常の補充を行ったダルベッコ修飾イーグル培地（ｐＨ７．２、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）で５％ＣＯ２および９５％空気の大気圧下、３７℃で成長させた。単層が約９０％の集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）になるまで培地を隔日に交換した。培地を除去し、そして細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Ｓｉｇｍａ）で洗浄した。１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．２５％  トリプシン溶液０．５ｍｌを各フラスコに加え、そして単層を３７℃で１０分間インキュベートすることにより細胞をトリプシン処理した。分離した細胞をフラスコから除去し、そして遠心チューブに収集し、２００ｘｇで１０分間遠心分離機にかけ、上澄を除去し、そしてペレットを十分量のダルベッコ修飾イーグル培地に再懸濁して、プレーティングで約６００００セル／ｃｍ２を生成する懸濁液を生じた。次いでＣａｃｏ−２細胞を、４μｍ孔径を有するトランスウェル半透過性膜インサートに播種した。トランスウェルでは、以下に記載する輸送研究のために細胞を用いるまで、培地を隔日に交換した。
【００８０】
前記したように調製したトランスウェル膜上のＣａｃｏ−２細胞培養物をプレーティングの約１７日後に輸送研究に使用した。ＨＢＳＳ  ２ｍｌ中３７℃で振盪しながら１時間インキュベートすることによりプロリポソーム錠剤を前記したように溶解した。対照としてクロロホルムで処理した純粋なグリブリドをラクトースおよびＥｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）で錠剤形態に圧縮し、全ての対照を正確に実験どおりに処理した。
【００８１】
マイクロピペットを用いて培地をトランスウェルプレートから穏やかに除去した。再構築したリポソーム懸濁液０．５ｍｌをトランスウェルの供給区画に穏やかに加え、そしてＨＢＳＳ  １．５ｍｌを受容区画に加えた。次いでＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ  １００μｌを供給区画に加えて、供給側のＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの最終濃度を１０μｇ／ｍｌにした。あるとすれば半透過性トランスウェル膜を覆う単層上の漏れの存在を試験するためのマーカーとしてＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを使用した。添加後５０、１２０、１８０、２４０、３００分に受容側からサンプル（３００μｌ）を注意して抜き取り、そしてサンプルを採取した各時間に受容側に新鮮ＨＢＳＳ  ３００μｌを補給した。これらのアッセイ中ずっと５％ＣＯ２／９５％空気の大気圧下、３７℃で細胞をインキュベートした。薄層の気流フード中、無菌状態でサンプリングを行った。
【００８２】
各サンプリング間隔の間に輸送されたグリブリドの量を、実施例１で記載したＨＰＬＣ系へのサンプル９０μｌの注入により決定し、そしてピーク面積を記録した。これらの実験を３検体ずつで行ない、そして結果の平均を報告した。実験の結果を図２から５に示す。
【００８３】
図２はジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含有する処方中のＣａｃｏ−２細胞単層を通るグリブリドの通過の結果を示す。ＤＳＰＣ不在下で実施した対照実験は流速およそ１μｇ／時・ｃｍ２であった。ＤＳＰＣ（生理学的ｐＨで「中性」脂質）を伴うグリブリドの処方は類似のレベルの単層をわたる流れを示したが、これらの処方へのコレステロールの添加は流れをほぼ２倍に増加させた。一方負に荷電した脂質を伴うグリブリドの処方は、コレステロールの存在下または不在下のいずれかで、低率で単層をわたって輸送された。対照的に、正に荷電した脂質を伴うグリブリドの処方は対照よりも約４倍高い率で膜をわたって輸送され、そしてコレステロールの添加により対照の約５倍高い率までこれを増加させた。
【００８４】
図３は脂質成分としてジミリスチルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）を用いる並行実験の結果を示す。これらの実験でグリブリドの流れと同様のパターンが認められたが、しかしながら、Ｃａｃｏ−２細胞単層をわたる輸送の増強の程度はＤＭＰＣを含有する処方に関するよりもかなり高かった。例えばＤＭＰＣおよび正に荷電した脂質を含有するグリブリド処方は対照よりもほぼ３０倍高い輸送率を有した。中性脂質の処方はより少ない程度までしか上昇せず、コレステロールの存在下でかかる処方は対照よりも約８倍高い輸送率を有し、コレステロールの不存在下ではこの率は対照よりも約５倍高かった。
【００８５】
図４および５は５時間にわたるＤＳＰＣ−およびＤＭＰＣ含有処方を用いたグリブリドの輸送累積量を示す。図４はＤＳＰＣ含有処方を示し、ここではＤＳＰＣおよび正に荷電した脂質を含有するグリブリド処方で最高の蓄積レベルが達成された（約２７μｇ）。更にコレステロールを含有する類似の処方は全量が少なかった（約１３μｇ）。中性脂質およびコレステロールを含有するＤＳＰＣ処方はゆっくりとした動態を示したが、ＤＳＰＣ／正荷電脂質／コレステロール処方と本質的に同一の全蓄積量を達成した。コレステロール不在下でＤＳＰＣおよび中性脂質を含有する処方は対照と同一の全蓄積量を示した（約２．５μｇ）が、一方、負に荷電した脂質を伴うＤＳＰＣ処方は（コレステロールの存在下または不在下で）全蓄積量が少ないことが示された。
【００８６】
図５はＤＭＰＣ処方で実施した類似の実験の結果を示す。全蓄積レベルはＤＭＰＣ、正に荷電した脂質およびコレステロールを含有する処方に関しては、対照のみよりも著しく高かった（３４μｇ）が、中性脂質を伴うＤＭＰＣ処方は（コレステロールの存在下または不在下で）対照に等しいレベルの全蓄積量に至った（約２〜５μｇ）。
【００８７】
これらの結果は、腸溶性コートされたプロリポソーム錠剤の形態の経口投与用にリポソームをうまく調製できることを実証した。コレステロールの存在は処方の粒子サイズを低減させる。プロリポソームは経口投与用のリポソームを生成する安定した系を提供する。胃での錠剤のプロリポソーム内容物の分解は、腸溶性コートされた錠剤としてプロリポソームを投与することにより有効に回避することができる。Ｃａｃｏ−２細胞をわたるグリブリドの輸送の増強がかかるリポソーム処方で観察された。インビトロでＤＭＰＣ処方でのグリブリドの輸送はＤＳＰＣ処方での輸送よりも多いが、胆汁酸塩および腸の酵素の攻撃に対する膜の剛性および増加した安定性のために、ＤＳＰＣ処方はインビボ条件でよりよく適している。Ｃａｃｏ−２細胞をわたるインビトロ輸送は生物学的利用能の指標であるので、リポソーム処方での輸送の増加は、他の状態では吸収が悪い化合物の生物学的利用能の増強を示唆している。例えば、本発明のプロリポソーム錠剤に対し適当なポリマーコーティングを用いて、薬物、特にペプチドの結腸配達が可能になる。
【００８８】
かかる多環式芳香族抗酸化剤または抗炎症化合物の大部分が脂質相に分配されるので、プロリポソームは親油性化合物に理想的に適している。これらの結果はまた封入された薬物を安定化する処方の開発をも意味している。
【００８９】
前記の開示は本発明の特定の具体的な実施形態を強調し、そしてそれに等価な全ての修飾または代替は添付の請求の範囲に示すような本発明の精神および範囲内であることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１Ａ】実施例１に示すように、示差走査熱量計により生成されたサーモグラムを表す。
【図１Ｂ】実施例１に示すように、示差走査熱量計により生成されたサーモグラムを表す。
【図１Ｃ】実施例１に示すように、示差走査熱量計により生成されたサーモグラムを表す。
【図２】実施例２に示すように、本発明のリポソーム組成物を用いるＣａｃｏ−２細胞単層を通るグリブリドの移動速度を表す。
【図３】実施例２に示すように、本発明のリポソーム組成物を用いるＣａｃｏ−２細胞単層を通るグリブリドの移動速度を表す。
【図４】実施例２に示すように、本発明のリポソーム組成物を用いるＣａｃｏ−２細胞単層を含むトランスウェルの受入れチャンバーにおけるグリブリドの全蓄積量を表す。
【図５】実施例２に示すように、本発明のリポソーム組成物を用いるＣａｃｏ−２細胞単層を含むトランスウェルの受入れチャンバーにおけるグリブリドの全蓄積量を表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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