(57)【要約】この発明は、基質がリム部を持つ開口部を有し、このリム部が、細胞膜組織と接触した時にギガシールを形成するように構成された、グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性をパッチクランプ法により分析するのに使用するほぼ平坦な基質に関する。この発明は、更にそのような基質を作る方法およびグリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性を分析する方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性をパッチクランプ法により分析するのに使用するほぼ平坦な基質であって、その際この基質が、開口部と、この開口部の境界を区分するリム部とを有し、このリム部が、細胞膜組織と接触した時にギガシールを形成するように構成されている基質。
【請求項２】
当該のリム部が、グリコカリックスの厚さを超える高さにまで基質の平面から突き出ている請求項１に記載の平坦な基質。
【請求項３】
当該のリム部が、平坦な基質の表面上から少なくとも２０ｎｍの高さにまで、好ましくは少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、あるいは少なくとも１００ｎｍの高さにまで基質の平面から突き出ている請求項１または２に記載の平坦な基質。
【請求項４】
当該のリム部の幅が、５０〜２００ｎｍの範囲内にある請求項１から３までのいずれか一つに記載の平坦な基質。
【請求項５】
当該の開口部の長さ（すなわち、深さ）が、２〜３０μｍの範囲内、好ましくは２〜２０μｍ、２〜１０μｍあるいは５〜１０μｍの範囲内にある請求項１から４までのいずれか一つに記載の平坦な基質。
【請求項６】
当該の開口部の直径が、０．５〜２μｍの範囲内にある請求項１から５までのいずれか一つに記載の平坦な基質。
【請求項７】
当該のリム部が、基質の平面に対してほぼ垂直に突き出ている請求項１から６までのいずれか一つに記載の平坦な基質。
【請求項８】
当該のリム部が、基質の平面に対して斜めの角度を成す請求項１から６までのいずれか一つに記載の基質。
【請求項９】
当該のリム部が、基質の平面に対してほぼ平行である請求項１から６までのいずれか一つに記載の基質。
【請求項１０】
当該のリム部が、開口部の口の部分によって境界を区分され、この口の部分が、４５〜９０度の範囲の角度で、５〜１００ｎｍの範囲の曲率半径を有する請求項１に記載の基質。
【請求項１１】
基質が、シリコン、プラスチック、純粋なシリカまたはその他のガラス（石英、パイレックス（登録商標）、またはＢｅ，Ｍｇ，Ｃａ，Ｂ，Ａｌ，Ｇａ，Ｇｅ，Ｎ，Ｐ，Ａｓの群から選択された一つ以上のドーパントでドーピングされたシリカなど）から構成される請求項１から１０までのいずれか一つに記載の平坦な基質。
【請求項１２】
基質が、シリコンから構成される請求項１１に記載の平坦な基質。
【請求項１３】
基質の表面および／または開口部の壁面が、第二のコーティング材料でコーティングされている請求項１から１２までのいずれか一つに記載の基質。
【請求項１４】
当該のコーティング材料が、シリコン、プラスチック、純粋なシリカ、その他のガラス（石英、パイレックス（登録商標）、またはＢｅ，Ｍｇの群から選択された一つ以上のドーパントでドーピングされたシリカなど）である請求項１３に記載の基質。
【請求項１５】
当該のコーティング材料が、酸化シリコンである請求項１１に記載の基質。
【請求項１６】
請求項１から１５までのいずれか一つに記載の基質を作る方法であって、
（ｉ）基質のテンプレートを準備することと、
（ii）このテンプレートに開口部を形成することと、
（iii ）この開口部の周囲にリム部を形成すること、
の措置を有する方法。
【請求項１７】
基質が、シリコン微細加工技術を用いて作られる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
措置（ii）が、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）によるディープ反応性イオンエッチング処理を用いて開口部を形成することで構成される請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
更に、基質の表面をコーティングする措置を有する請求項１６から１８までのいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】
措置（iii ）が、基質のコーティングと同時に行われる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
措置（iii ）が、基質の前面側を方向性および選択性のエッチングにより、基質の前面側のマスク層を除去するとともに、当該の突き出る長さをその下にある基質にまで更に延ばす中間措置を有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
当該のコーティングが、プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）および／または低圧化学蒸着法（ＬＰＣＶＤ）を用いて行われる請求項１９から２１までのいずれか一つに記載の方法。
【請求項２３】
当該のコーティングが、プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）を用いて行われる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
措置（iii ）が、プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）を用いて、被膜された表面のコーティング膜からリム部を形成することで構成される請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性を分析する方法であって、（ｉ）請求項１から１５までのいずれか一つに記載の、リム部を持つ開口部を有する基質を準備することと、
（ii）細胞膜組織と基質間にギガシールが形成されるように、細胞膜組織を基質の開口部のリム部に接触させることと、
（iii ）細胞膜組織の電気生理学的な特性を測定すること、
の措置を有する方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法を実行するためのキットであって、
請求項１から１５までのいずれか一つに記載の基質と一つ以上のを有するキット。
【請求項２７】
ほぼ明細書において図面を参照して記載したとおりの基質。
【請求項２８】
ほぼ明細書において図面を参照して記載したとおりの方法。
【請求項２９】
ほぼ明細書において図面を参照して記載したとおりのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞膜組織の測定電極の周りに高抵抗のシールを形成して、細胞膜組織を流れる電流を測定・観測することを可能とする電気生理学的な測定構成を構築することにより、イオン・チャネルを有する構造、典型的には細胞のような脂質膜組織を有する構造のイオン・チャネルにおける電気生理学的な特性を測定および／または観測するための基質と方法を提供するものである。より詳細には、この発明は、グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性を分析するための基質と方法に関する。この基質は、典型的には、生体膜におけるイオン伝達チャネルを研究するために用いられるパッチクランプ法を実行するための装置のような、細胞膜組織における電気的な事象を研究するための装置の一部である。
【背景技術】
【０００２】
・序文
膜組織のパッチを電気的に絶縁し、電位固定状態のもとでこのパッチのイオン・チャネルを研究するという一般的なアイデアは、非特許文献１に要約されている。アセチルコリン（ＡＣｈ）を含んだピペットを筋肉細胞膜組織の表面に押し付けることによって、ＡＣｈによるイオン・チャネルの活性化の開始と終了に起因する電流の不連続なジャンプを見ることができることを発見した。しかし、ピペットのガラスと膜組織間におけるシールの抵抗（１０〜５０ＭΩ）がチャネルの抵抗（１０ＧΩ）に比べて非常に小さいという事実によって、研究者は彼らの研究を制限されていた。そのようなシールから生じる電気ノイズは、その抵抗に対して反比例し、その結果そのコンダクタンスがＡＣｈチャネルのコンダクタンスよりも小さいイオン・チャネルを流れる電流を不明瞭にするのに十分な大きさとなっていた。また、それは、シールに大電流を流すことになるため、ピペットの電圧を浴の電圧と異なる値に固定するのを妨げていた。
【０００３】
そして、ガラス製のピペットを先端熱加工（fire polishing）するとともに、ピペットの内部に吸引力を働かせることによって、細胞の表面において非常に高い抵抗（１〜１００ＧΩ）のシールを得ることができることが発見され、それによって、ノイズレベルが、ほとんどの生物学的な対象となるチャネルを研究できる程度の大きさに低減されるとともに、これらの研究を行うことが可能な電圧の範囲が大幅に拡大された。この改良されたシールは、「ギガシール」と称されるようになるとともに、このピペットは「パッチピペット」と称されるようになった。ギガシールの更に詳細な記述は、非特許文献２にある。ネーアー（Neher ）とサグマン（Sakmann ）両氏は、パッチクランプ法の開発における彼らの業績に対して、1991年のノーベル生理学医学賞を受賞した。
【０００４】
イオン・チャネルは、無機イオンが細胞膜組織を通り抜ける際の触媒として作用する膜貫通型タンパク質である。このイオン・チャネルは、活動電位の生成および同期、シナプス伝達、ホルモン分泌、筋肉の収縮等の多様なプロセスに関与している。多くの薬物が、イオン・チャネルの調節を通してその特有の効果を発揮する。例えば、脳内における電位依存性のＮａ+ チャネルをブロックするフェニトインやラモトリジンのような抗てんかん化合物、平滑筋細胞における電位依存性のＣａ2+チャネルをブロックするニフェジピン、ジルチアゼムのような高血圧治療薬、およびすい臓におけるＡＴＰ調節性のＫ+ チャネルをブロックするグリベンクラミドやトルブタミドのようなインスリン放出の刺激薬がある。パッチクランプ法によって、科学者は、イオン・チャネルの活動を化学的に誘発して調節するのに加え、電位依存性のチャネルを操作することが可能となった。これらの手法には、パッチピペットの電極の極性を調整すること、および塩類化合物を変化させて浴溶液内における自由イオンレベルを緩和することがある。
【０００５】
・パッチクランプ法
パッチクランプ法は、生物学と医学において大きな発展を示しており、この方法により単一のイオン・チャネルのタンパク質を通るイオンフローの測定が可能となるとともに、薬の投与に対する単一のイオン・チャネルの反応の研究が可能となった。簡単に言うと、標準的なパッチクランプ法においては、薄い（直径が約０．５〜２μｍ）ガラス製のピペットを用いる。このパッチピペットの先端部を細胞膜組織の表面に押し付ける。このピペット先端部は、細胞膜組織をしっかりと密閉して、ピペットの口の部分によって境界を区分された膜組織の小さなパッチ内に少量のイオン・チャネルのタンパク質を隔離する。これらのチャネルの活動は、個別的に測定すること（「シングル・チャネル・レコーディング」）が可能であるか、これに代わって、パッチを破壊して、細胞膜組織全体のチャネル活動を測定すること（「ホールセル構成」）が可能である。ホールセル測定を実施するための細胞内部への高コンダクタンスでのアクセスは、ピペットに吸い込む方向の圧力をかけて膜組織を破壊することによって実現することができる。
【０００６】
・ギガシール
前述したとおり、シングル・チャネルにおける電流のパッチクランプ測定に関する重要な要件は、細胞膜組織とガラス製マイクロピペットの先端間において高抵抗のシールを構成して、イオンの動きをこれらの二つの表面間の空間に制限することである。典型的には、１ＧΩを超える抵抗が必要であり、そのためこの物理的な接触領域は、「ギガシール」と呼ばれている。
【０００７】
ギガシールを形成するには、細胞膜組織とピペットのガラスを互いに近接させることが必要である。従って、一般的には、隣接する細胞組織間または培養された細胞とその基質間における間隔を２０〜４０ｎｍのオーダーにする（非特許文献４）一方、ギガシールにおける細胞膜組織とピペットのガラス間の間隔は、オングストロームの範囲（すなわち、１０-10 ｍ）にするものと考えられている。ギガシールの物理化学的な性質は、知られていない。しかし、ギガシールは、細胞膜組織と、水晶、アルミノケイ酸塩やホウケイ酸塩（非特許文献６）など広範囲の種類のガラス間において形成されうるものであり、このことは、ガラスの特定の化学組成が重要ではないことを示している。
【０００８】
・細胞膜組織構造
細胞膜組織は、糖タンパク質が間に介在した形のリン脂質二重層で構成されており、糖タンパク質は、様々な作用物質に対する受容体として活動することなど多くの機能を果たしている。これらの細胞膜組織に広がる糖タンパク質は、典型的にはペプチドと糖の部分を有し、これらの部分は、細胞膜組織から細胞外の空間に突き出ており、リン脂質二重層の周りに、所謂「グリコカリックス」層を形成し、この層は、２０〜５０ｎｍの高さに達して、リン脂質二重層に隣接した電解質で満たされた区画を構成している（図１を参照）。従って、このグリコカリックスは、細胞とその水性環境間の隙間を構成する親水性で負電荷の領域を形成している。
【０００９】
・細胞骨格とグリコカリックス
細胞膜組織の直下には、アクチン・フィラメント、スペクトリン、アンキリンおよびその他の多数の大きな構造の分子の編目構造である細胞骨格がある。この細胞骨格の重要な役割の一つは、ある種の膜内在性タンパク質および糖タンパク質を膜組織内の固定位置に繋ぎとめておくことである。しかし、間に介在する膜組織の糖タンパク質は、一定の限度（脂質マイクロドメインまたは「ラフツ（rafts ）」、解説は、非特許文献７を参照）内においてリン脂質二重層内を側方に自由に動くものと信じられている。実際、そのような構成が、「脂質の海の中におけるタンパク質の氷山のよう」であると記述されている。
【００１０】
・ギガシール構造に対するグリコカリックスの影響
従来のパッチクランプ法では、（約１００ｎｍの肉厚を有する）ガラス製ピペットの先端と細胞間の最初の接触点は、グリコカリックスに対するものである。グリコカリックスの高さ（例えば、２０〜４０ｎｍ）で、ガラス表面と脂質膜組織間で境界を区分された隙間に含まれる１５０ｍＭの電解質で代表される電気抵抗を推定すると、その結果は、２０〜６０ＭΩとなる。この推定は、通常４０ＭΩ（またはＧΩの僅かに４％）のオーダーの抵抗を示す、ＴＥＯＳ（トリエチルオキシラン）型のチップの水晶をコーティングした滑らかな表面上における実験結果と一致する。この推定では、電解質は、脂質膜組織とほぼ円筒形状のガラスの表面間に存在し、約１μｍの直径と約３〜１０μｍの長さになると仮定されている。続いてピペットに加えられる穏やかな吸引力（＜２０ｈＰａ）は、更に抵抗を増大させて、理想的にはギガシールへと導く。ギガシールの形成は、０．１から１０秒の時間スケールで高速に起こるか、あるいは何回か連続して吸引力を増大させた後にようやく完結する長時間のプロセスである。ギガシールを形成する時間的経過には、「液晶」のリン脂質二重層において、糖タンパク質を物理的に（膜組織／ピペットが）接触する領域から横方向にずらして排除することを考慮している。言い換えると、グリコカリックス、すなわち糖タンパク質の成分は、リン脂質二重層（リン脂質の親水性の電極ヘッド）をガラスの表面（親水性のシラノール群）に押し付けているピペットに加えられる負の静水圧のために接触領域から搾り出される。
【００１１】
しかし、時には抵抗増大プロセスが、準ギガシール（０．５〜１ＧΩ）を形成するまでにしか進行しない場合がある。経験的に、このポイントでピペットに大きな負の電圧（５０〜７０ｍＶ；非特許文献５）を印加することは、ギガシールで完結する最終的な抵抗増大を引き起こすものである。グリコカリックスに関して、後者の結果は、糖タンパク質の負電荷領域が、ピペットに印加された負電圧により動かされて横方向にずらされるものであると説明できる。糖タンパク質に作用している電界、すなわちピペットの内腔から周囲の浴への電界の強さ（Ｅ）は、以下のとおり相当に大きい。
【数１】
2005523011.tif 000003
ここで、ピペットの先端の肉厚（ｘ）を１００ｎｍと、ピペットに印加する電圧（Ｖ）を−７０ｍＶと仮定している。
【００１２】
・従来のピペットと平坦な基質間の比較
パッチクランプ法における最近の進歩は、従来のガラス製マイクロピペット（例えば、特許文献１と非特許文献３を参照）の代わりに平坦な基質（例えば、シリコンチップ）を用いることに見られるものである。
【００１３】
平坦なシリコンベースのチップと生きた細胞間においてギガシールを形成しようとする試みは、問題があることが分かっている（例えば、非特許文献３を参照）。
【００１４】
しかし、外側にグリコカリックスを持たない人工的なリン脂質の小胞体間にギガシールを形成することに成功した。この発見は、ギガシールを形成するプロセスにおけるグリコカリックスの決定的な重要性を示すものである。
【００１５】
【特許文献１】国際特許公開第０１／２５７６９号明細書
【特許文献２】ドイツ特許公開第４２４１０４５号明細書
【非特許文献１】Neher,Sakmann, and Steinback (1978) "The Extracellular Patch Clamp, A Method For Resolving Currents Through Individual Open Channels In Biological Membranes", Pflueger Arch. 375; 219-278
【非特許文献２】O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann & F. J. Sigworth (1981) "Improved patch-clamp techniques for high resolution current recordings from cells and cell-free membrane patches" Pflueger Arch. 391, 85-100
【非特許文献３】Mayer, M (2000). Screening for bioactive compounds: Chip-based functional analysis of single ion channels & capillary electrochromatography for immunoaffinity selection. Ph.D thesis, Lausanne.
【非特許文献４】Neher, E (2001). Molecular biology meets microelectronics. Nature Biotechnology 19:114.
【非特許文献５】Penner, R (1995). A practical guide to ptach clamping. In: Single-Channel Recording. (Ed. E Neher) Plenum Press, New York, London.
【非特許文献６】Rae, JL and Levis, RA (1992). Glass technology for patch clamp electrodes. Methods Enzymol. 207:66-92.
【非特許文献７】Simons, K and Toomre, D (2000). Lipid rafts and signal transduction. Nature Reviews 1:31-41.
【非特許文献８】Madou, M., "Fundamentals of Microfabrication", 2nd Ed (December 2001) CRC Press; ISBN:0849308267
【非特許文献９】Christopher Miller (1986), "Ion Channel Reconsititution", Plenum 1986, p.577
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、細胞膜組織の電気生理学におけるパッチクランプ法による研究に使用するのに適した改良された平坦な基質に対するニーズが存在し、それは、グリコカリックスを有する細胞膜組織に対してギガシールを形成することを可能とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
・この発明の概要
この発明は、細胞または細胞膜組織が受ける影響に関して現実的な条件下において、イオン・チャネルを有する構造、特にグリコカリックスを有する細胞膜組織を流れる電流を測定および／または観測するのに最適な基質と方法を提供するものである。従って、例えば、細胞膜組織に様々な試験化合物で影響を与えた結果としてのイオン・チャネルの活動における変化などの、この発明の基質と方法を用いて得られたデータは、測定システムによって引き起こされた人為的なものではなく、正確な影響を正しく表すものとして信頼することができるとともに、与えられた条件下における細胞膜組織の導電率または容量に関係する電気生理学的な現象を研究するための有効なベースとして使用することができるものである。
【００１８】
この明細書において、「細胞」または「細胞膜組織」という用語を使用する場合には、一般的に文脈に依存して、その他のイオン・ チャネルを有する脂質膜組織やイオン・ チャネルを有する人工的な膜組織など、その他の如何なるイオン・チャネルを有する構造を使用することが可能であるものと解釈する。
【００１９】
前述したとおり、シングル・チャネルにおける電流のパッチクランプ測定に関して重要な要件は、細胞膜組織と基質間に高抵抗のギガシールを構築することである。ギガシールを形成するための決定的な要素は、細胞膜組織を基質に近接させることであり、次にこのことは、細胞膜組織と基質間の接触領域のサイズに依存するものである。
【００２０】
細胞膜組織と滑らかに丸くされた漏斗状の開口部を有する平坦なシリコンチップ間の物理的な接触領域（接触するリム部の幅は、約１μｍ；図２の右側の図を参照）は、細胞膜組織とガラス製マイクロピペット間に形成される接触領域（幅は、約１００ｎｍ；図２の左側の図を参照）よりもずっと大きい。この結果、ピペット構造に比べて、このチップでは、単位面積当りの力が著しく低減されて、接触領域において間に介在する糖タンパク質の数がずっと多くなり、ギガシールの形成に必須である、リン脂質二重層と基質の表面間における所要のオングストロームの間隔を容易に阻止してしまうものである。
【００２１】
この発明は、細胞膜組織の電気生理学的な特性のパッチクランプ法による研究に適した平坦な基質（例えば、シリコンベースのチップ）を提供することによって、この問題に対処しようとしており、この基質は、細胞膜組織との接触領域を低減し、それによってギガシールの形成を促進するように設計されている。
【００２２】
従って、この発明の第一の特徴は、グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性のパッチクランプ法による分析で使用するためのほぼ平坦な基質を提供するものであり、その際この基質は、開口部と、この開口部の境界を区分するリム部とを有し、このリム部は、細胞膜組織と接触した時にギガシールを形成するように構成されている。
【００２３】
好ましい実施形態において、この基質は、シリコンベースのチップである。
【００２４】
この発明の文脈において、ギガシールという用語は、一般的に少なくとも１Ｇオームのシールを表し、この値は、一般的に最小値として目指すべきシールのサイズであるが、電流が大きくなるある種の測定に関しては、閾値として、これより低い値で十分である。
【００２５】
「グリコカリックス」とは、細胞膜組織の脂質二重層における糖タンパク質から細胞外の空間に延びるペプチドと糖の部分によって構成される層を意味する。
【００２６】
好ましくは、リム部は、基質の平面から、細胞膜組織のリン脂質二重層の上にグリコカリックスの高さを超える長さで突き出ている。より好ましくは、このリム部は、基質の平面上に、少なくとも２０ｎｍ、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、あるいは少なくとも１００ｎｍ突き出ている。
【００２７】
有利には、このリム部は、基質と細胞膜組織間の物理的に接触する領域が最小化されるような形状とされ、そのことはグリコカリックスへの進入とギガシールの形成に好都合である。
【００２８】
当業者には、リム部の好適な横断面の輪郭が分かる。例えば、リム部の壁面は、先細の形状あるいはほぼ平行とされる。同様に、リム部の最先端部は、様々な形状とされる、例えばドーム形状、平坦あるいは尖った状態とされる。更に、リム部の突出は、基質の平面に対して、ほぼ垂直、斜めあるいは平行とされる。平行に突き出たリム部は、開口部の口の部分に、あるいはその近傍に配置されるか、それに代わって開口部のより奥の部分に置かれる。好都合には、リム部の幅は、１０〜２００ｎｍの範囲内にある。
【００２９】
これに代わって、リム部は、突き出るのではなく、開口部の口の部分それ自体によって形成される。この開口部の口の部分は、４５°〜９０°の角度において、５〜１００ｎｍの範囲内の曲率半径を持つ形で鋭くなっている。
【００３０】
更に、当業者には、開口部は、完全な細胞が平坦な基質を通り抜けできないような寸法を持つべきことが分かる。
【００３１】
好ましくは、開口部の長さ（すなわち、深さ）は、２〜３０μｍの範囲内、例えば２〜２０μｍあるいは５〜１０μｍの範囲内にある。
【００３２】
最適なギガシールの形成とホールセルの実現に最適な開口部の直径は、使用する個々の種類の細胞に依存する。有利には、開口部の直径は、０．５〜２μｍの範囲内にある。
【００３３】
この発明による基質は、典型的には細胞などの脂質膜組織におけるイオン伝達チャネルの電気生理学的な特性の測定を行うための装置に用いられる構成部品である。
【００３４】
この装置は、短時間で多数の個別実験を実行するための手段を提供するように設計されている。このことは、それぞれが統合された測定電極を有するサイトを持つ、複数の試験区画（すなわち、細胞を接触させるためのリム部を持つ開口部）を有するとともに、好適な試験サンプルを供給するマイクロシステムを提供することによって実現される。各試験区画は、細胞の位置決め、ギガシールの実現、ギガシールが実現されているサイトを選定するための手段、測定電極および一つ以上の基準電極を有する。これらによって、各試験区画における独立した試験を実施するとともに、コンピュータなどの中央制御ユニットからすべての試験の準備と測定を制御することが可能となる。試験区画のサイズが小さいために、この発明は、ほんの少量の支持液と試験サンプルを使用して、試験を実行することを可能としている。
【００３５】
この発明による基質は、シリコン、プラスチック、純粋なシリカまたはその他のガラス（石英、パイレックス（登録商標）、またはＢｅ，Ｍｇ，Ｃａ，Ｂ，Ａｌ，Ｇａ，Ｇｅ，Ｎ，Ｐ，Ａｓの群から選択された一つ以上のドーパントでドーピングされたシリカなど）など、ウェーハ処理技術に適した材料で構成することができる。
【００３６】
この発明の第一の特徴の好ましい実施形態では、基質の表面および／または開口部の壁面は、細胞膜組織に対してシールを形成するのに好適な材料でコーティングされる。そのような材料には、シリコン、プラスチック、純粋なシリカおよびその他のガラス（石英、パイレックス（登録商標）、またはＢｅ，Ｍｇ，Ｃａ，Ｂ，Ａｌ，Ｇａ，Ｇｅ，Ｎ，Ｐ，Ａｓおよびこれらの酸化物の群から選択された一つ以上のドーパントでドーピングされたシリカなど）がある。好ましくは、基質は、少なくとも部分的に酸化シリコンでコーティングされる。
【００３７】
この発明の第一の特徴の別の好ましい実施形態では、平坦な基質は、第一の表面部とその反対側の第二の表面部とを有し、この第一の表面部は、イオン・ チャネルを有する構造を保持するように構成された少なくとも一つのサイトを有し、各サイトがリム部を持つ開口部とそれに関連した測定電極とを有し、この基質は、一つ以上の基準電極を有し、これらの測定電極と基準電極は、開口部の各側面上において電解質を満たされた区画内に配置されており、これらの測定電極およびそれに対応する一つまたは複数の基準電極は、互いに電解質を介して接続しており、これらの間に電圧差が加えられた場合に、一方の電極からイオンが放出され、他方の電極でイオンが受け入れられることによって電流を発生させることができる電極であって、各サイトは、サイトに保持したイオン・ チャネルを有する構造とこのサイトの表面部分間に高電気抵抗のシールを提供するように構成されており、このシールが提供された場合、このシールは、イオン・ チャネルを有する構造の一方の側面上において境界を区分された、測定電極と電解質を介して接触する領域を、イオン・ チャネルを有する構造の他方の側面上において境界を区分された、対応する基準電極と電解質を介して接触する領域から分離して、このイオン・ チャネルを有する構造のイオン・ チャネルを通って電極間を流れる電流を測定および／または観測することを可能としており、これらの電極は、基質の各側面上に配置されているものである。
【００３８】
基質が統合された電極を有する（が、この発明によるリム部を持つ開口部の特徴を持たない）形の、この発明による第一の特徴の好ましい実施形態の一般的な構成の例が、特許文献１に記載されている。
【００３９】
この発明の第二の特徴は、この発明の第一の特徴にもとづく基質を作る方法を提供することであり、この方法は、
（ｉ）基質のテンプレートを準備することと、
（ii）このテンプレートに開口部を形成することと、
（iii ）この開口部の周りにリム部を形成すること、
の措置を有する。
【００４０】
好ましくは、この基質は、シリコン微細加工技術（非特許文献８）を用いて作られる。
【００４１】
当業者には、措置（ii）と（iii ）は、順番に（すなわち、時間的に別々の措置として）あるいは同時に実施することができることが分かる。
【００４２】
有利には、措置（ii）は、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）によるディープ反応性イオンエッチング処理（特許文献２）を用いて開口部を形成することで構成される。
【００４３】
基質の平面に対してほぼ垂直な突出を形成する必要がある場合、この方法は、基質の正面側を方向性および選択性のエッチングにより、基質の正面側にあるマスク層を除去するとともに、所定の突き出る長さをその下にある基質にまで更に延ばす中間措置を含むものである。
【００４４】
シリコンのエッチング速度が、マスキング材料のエッチング速度に比べてより速いため、その結果マスキング材料が、開口部内に残されて、表面から突き出ることとなる。続いて、表面全体に対するコーティングが行われる。
【００４５】
ほぼ基質の平面内にある突出を形成する必要がある場合、この方法は、細孔を形成するために誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）エッチングまたは高度シリコンエッチング（ＡＳＥ）を用いる中間措置を有し、細孔のところでは、これらの方法の特徴であるエッチングとパシベーションの交互の繰り返しが、開口部の口の部分に向かって波形に仕上げる結果となる。処理パラメータを適切に調整することにより、この波形仕上げ（scallopping ）で平面内において内側に突き出る形のリム部を形成することができる。
【００４６】
またもや、続いて、表面全体に対するコーティングが行われる。
【００４７】
好都合には、この方法は、更に開口部および／またはリム部の形成の前または後のどちらかにおいて、（例えば、酸化シリコンでの）基質の表面へのコーティングを含むものである。これに代わって、措置（iii ）は、基質のコーティングと同時に実施される。
【００４８】
このようなコーティングは、プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）および／または低圧化学蒸着法（ＬＰＣＶＤ）を用いて行われる。
【００４９】
基質が統合された電極を有する形の、この発明の第一の特徴の好ましい実施形態は、特許文献１に記載されているとおり作られる。
【００５０】
この発明の第三の特徴は、グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性を分析する方法を提供することであり、この方法は、
（ｉ）この発明の第一の特徴にもとづく、リム部を持つ開口部を有する基質を準備することと、
（ii）細胞膜組織と基質間にギガシールが形成されるように、細胞膜組織を基質の開口部のリム部と接触させることと、
（iii ）細胞膜組織の電気生理学的な特性を測定すること、
の措置を有する。
【００５１】
この発明の第三の特徴の好ましい実施形態では、一つ以上のイオン・ チャネルを有する構造の一つ以上のイオン・ チャネルの電気生理学的な特性を測定および／または観測するためのホールセル測定構成を構築する方法が規定され、その方法は、
（ｉ）上記の基質を準備することと、
（ii）一つ以上のイオン・ チャネルを有する構造を含むキャリア液（carrier liquid）を一つ以上の開口部に供給することと、
（iii ）イオン・ チャネルを有する構造の中の少なくとも一つを、それと同じ数の開口部に配置することと、
（iv）サイトに関連する測定電極と基準電極間に第一の電位差を連続的に印加し、これらの測定電極と基準電極間を流れる第一の電流を観測して、この第一の電流を所定の閾値電流と比較し、第一の電流が、この所定の閾値電流以下である場合、このサイトがイオン・ チャネルを有する構造とこのサイトの表面部分間に許容し得るシールを有するものと是認することによって、高電気抵抗のシールを実現しようとするサイト（すなわち、開口部）に保持されたイオン・ チャネルを有する構造とこのサイトの表面部分（すなわち、リム部）間において高電気抵抗のシールが存在するかを検査することと、
（ｖ）この是認されたサイトにおいて、ホールセル構成を構築すること、
の措置で構成され、これによって、測定電極と基準電極間において、イオン・ チャネルを有する構造のイオン・ チャネルを流れる第三の電流を測定および／または観測することができるものである。
【００５２】
溶液内におけるイオン・ チャネルを有する構造（例えば、細胞）は、能動的または受動的な手段のどちらかにより基質上のサイトに誘導される。イオン・ チャネルを有する構造が、開口部のリム部と接触する状態となった時に、この接触面は、このサイトにおいて、高電気抵抗のシール（ギガシール）を形成し、その結果電極を用いて、イオン・ チャネルの電気化学的な特性を測定することができる。そのような電気化学的な特性は、ギガシールによって取り囲まれたイオン・ チャネルを有する構造の膜組織の部分を流れる電流である。
【００５３】
ホールセル構成は、各是認されたサイトと関連する測定電極と基準電極間に、一連の第二の電位差パルスを印加し、測定電極と基準電極間を流れる第二の電流を観測して、この第二の電流が所定の閾値を超えた時点で、この一連の第二の電位差パルスを中断し、こうすることによってイオン・ チャネルを有する構造の測定電極に最も近い部分を破壊することにより実現される。
【００５４】
これに代わって、ホールセル構成は、イオン・ チャネルを有する構造の測定電極に最も近い部分を、開口部を構成する物質と相互作用を起こさせることによって実現される。
【００５５】
この発明の関係において、「ホールセル構成」という用語は、細胞全体を、測定サイトにおいて基質と接触するようにして破裂させるか、開口部を構成する物質を用いて、切開して細胞内部と電気的に接触するようにする構成だけでなく、切除された細胞膜組織の断片を、膜組織の外側の面が適用する試験サンプルに対して「上方に」向くように準備する構成をも意味することに留意されたい。
【００５６】
一つのサイトに関連する測定電極は、基質上にある複数の電極の中の一つであり、イオン・ チャネルを有する構造は、溶液内にある多数の構造の中の一つなので、そのように準備した多数の測定構成を基質上に設定することが可能である。典型的な測定には、このような構成に特定の試験サンプルを付加することが含まれており、このため、各測定構成を、他の測定構成から分離して、試験サンプルの混ざり合いと構成間における電気誘導を防止している。
【００５７】
使用時において、細胞支持液（cell-supporting liquid）および細胞の基質への付加は、以下の方法の中の一つで行われる。好ましい実施形態では、試験区画は、上方からアクセス可能であり、支持液と細胞の液滴は、投与またはピペットシステムを用いて各試験区画に供給することができる。インクジェットプリンタのヘッドまたはバブルジェット（登録商標）プリンタのヘッドなどのシステムを使用することができる。別の可能性は、少量の液体を投与するように構成された、ｎカッド吸引ディスペンサ（nQUAD aspirate dispenser）またはその他の投与／ピペット機器である。これに代わって、支持液と細胞を、全体として（例えば、細胞を含む支持液を基質上に注ぐか、あるいはそのような中に基質を浸すことによって）基質上に付加し、それによって各試験区画に支持液と細胞を配備する。支持液とその後の試験サンプルの体積は、ナノリットルほどに小さいので、水の蒸発が問題となる可能性がある。そのため、個々の体積に依存して、基質上での液の取り扱いは、好ましくは高い湿度雰囲気内で行われる。
【００５８】
別の実施形態では、細胞は、増殖培地に浸されて、基質上で直に培養される。最適な状態では、細胞は、表面を細胞の増殖に対して故意に適さないようにした領域を除いて、（増殖させる細胞の種類に依存して）表面全体に渡って均一な単層を形成する。基質上での細胞の培養の成功は、大きく基質の材料に依存する。
【００５９】
更に別の実施形態では、細胞の代わりに、イオン・ チャネルを組み込んだ人工的な膜組織を使用する。そのような人工的な膜組織は、開口部上に小さな塊の脂質を配置することにより、脂質の飽和溶液から作ることができる。この方法は、非特許文献９に完全な形で記載されている。開口部サイズが適切であり、水などの極性液体が開口部の両側に存在する場合、開口部上に脂質二重層を形成することができる。次の措置は、この二重層にタンパク質のイオン・ チャネルを組み込むことである。これは、脂質の小胞体を供給して、二重層の片側にイオン・ チャネルを組み込むことによって実現される。これらの小胞体は、例えば浸透勾配によって引き込まれて、二重層と融合し、それによってイオン・ チャネルを二重層に組み込むものである。
【００６０】
細胞とガラス製ピペット間を良く接触させて、それにより細胞とピペットの先端間にギガシールを形成することは、従来の技術に良く記載されている。ピペットの先端に細胞を引き寄せるとともに、同じくギガシールを実現するのに必要な接触を実現するためには、ピペットに吸引力を加えるのが一般的である。しかし、この発明による平坦な基質では、細胞を表面と接合させてギガシールを形成させるためには、細胞膜組織と基質、典型的には超純粋なシリカ間を単に接触させるだけで十分である。
【００６１】
基質の開口部上への細胞の位置決めは、電極からの電界が帯電した細胞をそこに引き寄せる電気泳動法により実現することができる。負電荷を持つ細胞は、正電極に引き寄せられる、ならびにその逆も同様である。静電気による引力は、電極グループに関する誘導手段としても機能することができる。これに代わって、試験区画内において、ちょうど電極の周囲の領域を除いて、基質の表面を疎水性材料で被膜するものである。こうすることによって、細胞は、電極の位置にだけ接合することができる。これらの両方の方法は、基質表面における電極の周囲の適切な幾何学的な形状と組み合わせて、同時にあるいは二者択一的に適用して、沈降する細胞を電極の方に誘導することが可能である。
【００６２】
これに代わって、基質の開口部上への細胞の位置決めは、電気浸透によって行うことができる。
【００６３】
吸引力を適用すれば、それは、細胞を開口部に引き寄せて、細胞と開口部間の接合を実現し、開口部内部と溶液とを切り離すギガシールを形成する。このギガシールは、如何なる形状、例えば環状、楕円形あるいは方形にすることができる。基質が、統合された電極を有する場合、支持液は、細胞膜組織と基準電極間の電気的な接続を形成する。細胞は、吸引力により変形させることが可能であり、制御可能であれば、細胞は、開口部に突き出る（が、貫通しない）状態が望ましい。
【００６４】
この発明の基質と方法を用いて、細胞膜組織におけるイオン・ チャネルの活動を電気的に測定することができる（シングル・チャネル・レコーディング）か、これに代わって、パッチを破壊して、細胞膜組織全体のチャネル活動を測定することができる（ホールセル・レコーディング）。ホールセル測定を行うための細胞内部への高コンダクタンスでのアクセスは、少なくとも三つの異なる方法で実現することができる（すべての方法が実行可能であるが、異なるアプローチにより、様々な細胞がより良好に動作する）。
（ａ）開口部側面からの吸引により、膜組織を破壊することができる。強度を増大させて行く形の短いパルスまたは強度を増大させて行く形のランプ波または階段波のどちらかの形で準大気圧を加える。膜組織の破壊は、加えた試験電圧パルスに応答して、（細胞膜組織の全キャパシタンスを反映して）急増する容量性電流スパイクによって検出される。
（ｂ）電圧パルスを印加することによる膜組織の破壊。電極間に、強度（ｍＶからＶに）と時間（μｓからｍｓに）を増大させて行く形の短いパルスまたは強度を増大させて行く形のランプ波または階段波のどちらかの形で電圧パルスを加える。典型的な細胞の膜組織を構成する脂質は、これらの電圧パルスによる大きな電界強度によって影響を受け、それによって膜組織は、電極の近傍で崩壊する。膜組織の破壊は、加えた試験電圧パルスに応答して、急増する容量性電流スパイクによって検出される。
（ｃ）膜組織の透過化処理。例えば、サイトに開口部を形成する物質を事前に被膜することによって、開口部を形成する物質（例えば、ナイスタチンやアンフォテリシンＢなどの抗生物質）を適用する。膜組織を破壊するというよりは、透過化分子を組み入れることによって、膜組織の抵抗を選択的に低下させて、その結果電極対を用いて効果的な細胞電圧制御を行うものである。この組み入れにより、全抵抗が徐々に低下するとともに、キャパシタンスが増大することとなる。
【００６５】
基質が複数の試験区画を有し、各区画が開口部を持つ場合、試験サンプルは、各試験区画に異なる試験サンプルを付与する形で、各試験区画に個別的に付与される。これは、支持液を全体的に基質に加える方法以外の支持液を加える方法を用いて行われる。
【００６６】
細胞を測定構成に配置したら、イオン・ チャネルを流れる電流（電圧固定法）やイオン・ チャネルを有する膜組織のキャパシタンスなど、幾つかの電気生理学的な特性を測定することができる。いずれの場合でも、相応の電子測定回路を配備することが求められる。当業者には、そのような適切な測定回路を選定することができる。
【００６７】
この発明の第四の特徴は、この発明の第三の特徴にもとづく方法を実行するためのキットを提供することであり、このキットは、この発明の第一の特徴にもとづく基質とパッチクランプ法による研究を行うための一つ以上の媒体または試薬を有する。
【００６８】
好ましくは、このキットは、複数の基質を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
ここでは、以下における制限を加えるものではない例と図面を参照して、この発明について述べる。
【００７０】
図１は、パッチピペットを付着させた形の細胞を表している。（ピペットの先端と細胞膜組織間の接触点において網かけした領域で示された）ギガシール領域では、グリコカリックスの糖タンパク質が、側方に押し退けられて、膜組織のリン脂質二重層とピペット間の直接的な接触が可能となっている。
【００７１】
図２は、ピペットの先端（左）および平坦な基質（右）に付着した細胞を表している。細胞膜組織と基質表面間の接触領域は、ピペット構成（左）よりも基質構成（右）のほうがかなり大きい。
【００７２】
図３は、各基準抵抗セットに対する実際のピペット抵抗の変化を表している。
【００７３】
図４は、ピペット抵抗に対するギガシールの成功率を表している。
【００７４】
図５は、ピペット抵抗に対する（成功したギガシールによる）ホールセル実現の成功率を表している。
【００７５】
図６は、異なる開口部サイズに対するギガシール形成の時間依存性を表しており、誤差線は、平均値からの標準偏差を示している。
【００７６】
図７は、開口部の側に位置する突き出たリム部を持つ平坦な基質に付着した細胞の例を表している。ギガシールを形成する領域は、非常に限定されている。
【００７７】
図８は、垂直なリム部（一番上）、傾いたリム部（上から二番目）、水平なリム部（上から三番目）ならびに埋め込まれたリム部（一番下）の、突き出たリム部を有する四つの異なる開口部構造（処理形態）を表している。
【００７８】
図９は、突き出た部分を持たないが、膜組織／基質の接触領域を５０〜２００ｎｍに低減するのに十分な鋭さ（ｒ＝２５〜１００ｎｍ）を持つリム部を有する構造を表している。開口角（θ）は、４５〜９０度である。
【００７９】
図１０ａと図１０ｂは、表面加工にＩＣＰとＬＰＣＶＤを用いて、表面の平面の内側において突き出たリム部を有する、長い細孔を持つ基質の走査型電子顕微鏡写真である。
【００８０】
図１１は、表面加工にＩＣＰとＬＰＣＶＤを用いて、表面の平面の外側において突き出たリム部を有する、長い細孔を持つ基質の走査型電子顕微鏡写真である。
【００８１】
この発明は、細胞膜組織にグリコカリックスを有する生きた細胞に対して実施するパッチクランプ測定において、ギガシールの形成とホールセルの実現に関して重要な三つの要素を特定するものである。
１．開口部の長さは、吸引力を働かせた時に比較的柔らかい細胞が穴を貫通するのを防止するのに十分に長い。
２．また、研究しようとしている細胞の膜組織と細胞の種類の弾性特性に関連したギガシールの形成とホールセルの実現に対して最適な開口部サイズが存在し得る。
３．平坦な基質の開口部は、リム部によって境界を区分し、このリム部は、細胞の表面に近づいた時にグリコカリックスを押し退けることが可能である。
各要素について、以下のとおり説明する。
【００８２】
・開口部の長さ
チップの膜組織の厚さによって規定される開口部の長さ（すなわち、深さ）は、また重要である。アスペクト比の小さい構造（短い開口部）は、細胞が、位置決めし、次に吸引した時に、その本来の弾力性のために穴を貫通してしまう傾向を持つという欠点を有する。研究により、この問題は、典型的には２μｍを超える、より長い開口部を用いて効果的に防止することができることが分かっている（データは示していない）。
【００８３】
・最適な開口部サイズの決定
ギガシールとホールセル構成を実現するのに最適な開口部サイズを決定するために、様々なサイズのパッチピペットを用いて、これを標準的なパッチクランプ構成で実現できる成功率を比較した。実験は、カバースリップに付着させたＨＥＫ２９３細胞を、ナトリウムリンゲル液に浸して実施した。ピペットを作るのに、ホウケイ酸塩の毛細管（ヒルゲンベルグ[Hilgenberg]社、カタログ番号１４０３５７３番、Ｌ＝７５ｍｍ，ＯＤ＝１．５ｍｍ，ＩＤ＝０．８７ｍｍ，０．２ｍｍフィラメント）を使用した。相対的な開口部サイズの指標として、ピペット抵抗を用いることとし、０．５，１，２，５，１０および１５ＭΩの基準抵抗を持つピペットを作った。測定時には、実際のピペット抵抗を記録しており、各セットに対する実際の平均ピペット抵抗を、平均値からの標準偏差とともに図３に示す。
【００８４】
図４は、ギガシールとホールセル成功率のピペット開口部抵抗（開口部サイズ）への依存性を表している。各データセットに対して行った実験数が、データ点の上に表示されている。この結果は、５ＭΩの抵抗を持つピペットがギガシールの形成とホールセルの実現の両方に対して最適であることを示している一方、５ＭΩを超え１５ＭΩまでの抵抗では、成功率が約２０％低下している。ピペット抵抗が５ＭΩを下回って低下すると、より悪くなっており、２ＭΩの抵抗は、５０％の成功率を示し、５ＭΩより３７％低い一方、１ＭΩ以下の抵抗では、ほぼ全くギガシールの形成が行われなかった。
【００８５】
図５は、ギガシールの形成が成功した実験（すなわち、ギガシールに達しなかった実験を差し引いた）においてホールセルが実現された百分率を表している。このデータは、５ＭΩのピペットが最も高いホールセル成功率であったが、その他の開口部サイズは、それよりほんの僅かに低い成功率であったことを示している。
【００８６】
ＧΩの抵抗に達するのにかかる時間に関するピペット抵抗の効果についても実験した（図６を参照）。その結果は、２ＭΩのピペットが、５，１０または１５ＭΩのピペットより、ギガシールに達するのにかなり長い時間がかかったことを示している。５，１０および１５ＭΩのピペットに関する結果が似ていることは、この範囲内での開口部サイズの増大は、ギガシールに達するのにかかる時間に影響を与えないことを示している。
【００８７】
これらの結果は、ギガシールの形成の成功は、ピペット開口部のサイズに依存することを明らかに示している。５ＭΩのピペットは、最適な開口部サイズを有し、これより大きな（すなわち、より低い抵抗を持つ）サイズは、ギガシール形成の成功率において著しい低下を示した。
【００８８】
上記の実験は、従来のガラス製マイクロピペットを用いて行ったが、これらの結果は、パッチクランプ実験に使う平坦な基質に外挿することができる。従って、これらの結果は、チップシステムにおける開口部のサイズが、一般的に５ＭΩのピペットの開口部のサイズより大きくすべきではないことを示している。しかし、５ＭΩより小さいピペットは、かなり悪かったけれども、まだわりと良好に機能していた。そのため、チップの開口部を５ＭΩのピペットより僅かに小さく作るのは、より大きく作るよりは良い。
【００８９】
ピペット開口部のサイズを変化させることは、ホールセルの形成に対して効果を持たないように見える。ホールセル構成の成功率は、５ＭΩのピペットにおいて最大となったが、２ＭΩから１５ＭΩまでのピペットに対しては、成功率において僅かに低下しただけであった。
【００９０】
また、ピペットの開口部サイズが、ＧΩの抵抗に達するのにかかる時間に対して影響力を持つことが観察された。５と１５ＭΩのピペットは、ギガシールに達するのに同程度の時間がかかったが、２ＭΩのピペットは、２．５から３倍長い時間がかかった。
【００９１】
実験で使用したガラス製ピペットの顕微鏡検査は、５ＭΩの抵抗を示したピペットが０．５〜１μｍのオーダーの開口部サイズを持つことを示した。しかし、最適な開口部サイズは、細胞の種類と細胞のサイズに関連すると考えられる。
【００９２】
従来のパッチクランプ実験においてギガシールが実現できる成功率は、典型的には高く、ＨＥＫやＣＨＯのような培養した細胞でのパッチの場合、大抵は約９０％である。上述した考察にもとづき、従来のピペット先端の口の部分と類似した開口部の幾何形状を用いて、平坦なチップにおいて、同程度の成功率が得られるものと期待される。そのような幾何形状は、０．５〜１μｍの開口部孔の側に位置する突き出たリム部で構成される。更に、開口部の長さ（すなわち、深さ）は、好ましくは２μｍを超える。
【００９３】
・平坦なパッチクランプ基質の製造
この発明の平坦なパッチクランプ基質の好ましい製造方法は、シリコン表面を酸化シリコンでコーティングして、高品質なガラス面を効果的に形成することが可能なシリコン（Ｓｉ）ウェーハ微細加工・処理法を用いるものである。好ましくは、長い細孔と表面加工は、ＩＣＰ（誘導結合プラズマ）とＬＰＣＶＤ（低圧化学蒸着法）を用いて実現することができる。突き出たリム部を持つ長い開口部は、ＬＰＣＶＤで表面加工を行うのと組み合わせて、ＩＣＰを用いて細孔を作り、ＲＩＥ（反応性イオンエッチング）で突き出たリム部を形成することによって実現することができる。
【００９４】
（ａ）表面加工のためにＩＣＰとＬＰＣＶＤを用いて、表面の平面の内側において突き出たリム部を持つ長い開口部を形成するための処理手順の例（図１０）。
【００９５】
１．開始基質：結晶方向＜１００＞の単一の結晶シリコンウェーハ。
２．シリコンの一方の表面をフォトレジストでコーティングし、開口部位置と直径を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
３．誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度シリコンエッチング（ＡＳＥ）により、シリコンに開口部パターンを転写して、１〜５０μｍの深さを持つ深く垂直な細孔を生成する。
４．シリコン表面を、ＫＯＨまたはＴＭＡＨ溶液に耐えるエッチマスクでコーティングする。一例として、これは、酸化シリコンまたは窒化シリコンである。
５．ウェーハの反対側（底側）をフォトレジストでコーティングし、窒化シリコンにおいて膜組織の境界を区分する開口部を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
６．適切なパターン転写プロセスを用いて、ウェーハの底側にあるフォトレジストの開口部によって境界を区分された領域内のウェーハをエッチングで除去する。一例として、これは、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）である。
７．ウェーハを、ＫＯＨまたはＴＭＡＨ溶液で異方性エッチングし、ウェーハの底側にピラミッド形の開口部を形成する。エッチングの時間は、ウェーハの上側に残すシリコンの膜組織の厚さを決める。これに代わって、エッチストップを規定するために、ボロンドーピング法を用いて、厚さをより良好に制御することができる。
８．シリコン基質に対して、選択的にエッチマスクを除去する。
９．プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）による熱酸化またはＬＰＣＶＤのどちらかにより、酸化シリコンでシリコンをコーティングする。
【００９６】
これに代わって、以下のプロセスで基質を組み上げることができる。
１．開始基質：単一の結晶シリコンウェーハ。
２．シリコンの一方の表面をフォトレジストでコーティングし、開口部位置と直径を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
３．誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度シリコンエッチング（ＡＳＥ）により、シリコンに開口部パターンを転写して、１〜５０μｍの深さを持つ深く垂直な細孔を生成する。
４．ウェーハの反対側（底側）をフォトレジストでコーティングし、膜組織の境界区分を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
５．誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度シリコンエッチング（ＡＳＥ）を用いて、ウェーハを異方性エッチングし、ウェーハの底側に円筒形の開口部を形成する。エッチングの時間は、ウェーハの上側に残すシリコンの膜組織の厚さを決める。
６．プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）による熱酸化またはＬＰＣＶＤのどちらかにより、酸化シリコンでシリコンをコーティングする。
【００９７】
これに代わって、以下のプロセスで基質を組み上げることができる。
１．開始基質：キャリアの結晶方向＜１００＞で、上側表面の１〜５０μｍ下に位置する埋め込まれた酸化物層を有する絶縁体上シリコン（ＳＯＩ）。
２．シリコンの一方の表面をフォトレジストでコーティングし、開口部位置と直径を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
３．誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度シリコンエッチング（ＡＳＥ）により、シリコンに開口部パターンを転写して、埋め込まれた酸化物層の深さにまで達する深く垂直な細孔を生成する。
４．シリコン表面を、ＫＯＨまたはＴＭＡＨ溶液に耐えるエッチマスクでコーティングする。一例として、これは、酸化シリコンまたは窒化シリコンである。
５．ウェーハの反対側（底側）をフォトレジストでコーティングし、窒化シリコンにおいて膜組織の境界を区分する開口部を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
６．適切なパターン転写プロセスを用いて、ウェーハの底側にあるフォトレジストの開口部によって境界を区分された領域内のウェーハをエッチングで除去する。一例として、これは、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）である。
７．ウェーハを、ＫＯＨまたはＴＭＡＨ溶液で異方性エッチングし、ウェーハの底側にピラミッド形の開口部を形成する。埋め込まれた酸化物は、このプロセスに対するエッチストップとして機能し、そのため上側のシリコン層の厚さは、残す膜組織の厚さを決める。
８．ＲＩＥ、ウェットフッ化水素酸（ＨＦ）エッチング、またはＨＦガスエッチングによって、埋め込まれた酸化物層の露光された領域を除去する。これは、ウェーハにおける上側と底側の開口部間の接続を確実にするものである。
９．シリコン基質に対して、選択的にエッチマスクを除去する。
１０．プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）による熱酸化またはＬＰＣＶＤのどちらかにより、酸化シリコンでシリコンをコーティングする。
【００９８】
これに代わって、以下のプロセスで基質を組み上げることができる。
１．開始基質：上側表面の１〜５０μｍ下に位置する埋め込まれた酸化物層を有する絶縁体上シリコン（ＳＯＩ）。
２．シリコンの一方の表面をフォトレジストでコーティングし、開口部位置と直径を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
３．誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度シリコンエッチング（ＡＳＥ）により、シリコンに開口部パターンを転写して、埋め込まれた酸化物層の深さにまで達する深く垂直な細孔を生成する。
４．ウェーハの反対側（底側）をフォトレジストでコーティングし、膜組織の境界区分含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
５．ウェーハを、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度シリコンエッチング（ＡＳＥ）により異方性エッチングし、ウェーハの底側に垂直な空洞を形成する。埋め込まれた酸化物は、このプロセスに対するエッチストップとして機能し、そのため上側のシリコン層の厚さは、残す膜組織の厚さを決める。
６．ＲＩＥ、ウェットフッ化水素酸（ＨＦ）エッチング、またはＨＦガスエッチングによって、埋め込まれた酸化物層の露光された領域を除去する。これは、ウェーハにおける上側と底側の開口部間の接続を確実にするものである。
７．プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）による熱酸化またはＬＰＣＶＤのどちらかにより、酸化シリコンでシリコンをコーティングする。
【００９９】
これに代わって、以下のプロセスで基質を組み上げることができる。
１．開始基質：ガラスまたはパイレックス（登録商標）製ウェーハ。
２．シリコンの一方の表面をフォトレジストでコーティングし、開口部位置と直径を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
３．誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度酸化物エッチング（ＡＯＥ）により、シリコンに開口部パターンを転写して、１〜５０μｍの深さを持つ深く垂直な細孔を生成する。
４．ウェーハの反対側（底側）をフォトレジストでコーティングし、膜組織の境界区分を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
５．ウェーハを、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度酸化物エッチング（ＡＯＥ）により異方性エッチングし、ウェーハの底側に垂直な空洞を形成する。エッチングの時間は、ウェーハの上側に残すガラスまたはパイレックス（登録商標）の膜組織の厚さを決める。
６．プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）による熱酸化またはＬＰＣＶＤのどちらかにより、酸化シリコンでシリコンをコーティングする。
ガラス製ウェーハを用いたプロセスは、実証しなかった。
【０１００】
（ｂ）表面加工ためにＩＣＰとＬＰＣＶＤを用いて、表面の平面の外側において突き出たリム部を持つ長い開口部を形成するための処理手順の例（図１１）。
【０１０１】
１．開始基質：結晶方向＜１００＞の単一の結晶シリコンウェーハ。
２．シリコンの一方の表面をフォトレジストでコーティングし、開口部位置と直径を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
３．誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度シリコンエッチング（ＡＳＥ）により、シリコンに開口部パターンを転写して、１〜５０μｍの深さを持つ深く垂直な細孔を生成する。
４．シリコン表面を、ＬＰＣＶＤ（低圧化学蒸着法）またはプラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）により、窒化シリコンでコーティングする。
５．ウェーハの反対側（底側）をフォトレジストでコーティングし、窒化シリコンにおいて膜組織の境界を区分する開口部を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
６．反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）を用いて、ウェーハの底側にあるフォトレジストの開口部によって境界を区分された領域内の窒化シリコンをエッチングで除去する。
７．ウェーハを、ＫＯＨまたはＴＭＡＨ溶液で異方性エッチングし、ウェーハの底側にピラミッド形の開口部を形成する。エッチングの時間は、ウェーハの上側に残すシリコンの膜組織の厚さを決める。これに代わって、エッチストップを規定するために、ボロンドーピング法を用いて、厚さをより良好に制御することができる。
８．背面側に対して、ＲＩＥにより、ウェーハの背面側の窒化シリコンのマスクを除去し、開口部の背面の端部を開放する。
９．前面側に対して、ＲＩＥにより、穴の上に突き出た窒化シリコンを残す形で前面側の窒化シリコンを除去する。
１０．プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）による熱酸化またはＬＰＣＶＤのどちらかにより、酸化シリコンでシリコンをコーティングする。
【０１０２】
これに代わって、以下のプロセスで基質を組み上げることができる。
１．開始基質：単一の結晶シリコンウェーハ。
２．シリコンの一方の表面をフォトレジストでコーティングし、開口部位置と直径を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
３．誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度シリコンエッチング（ＡＳＥ）により、シリコンに開口部パターンを転写して、１〜５０μｍの深さを持つ深く垂直な細孔を生成する。
４．シリコン表面を、低圧化学蒸着法（ＬＰＣＶＤ）またはプラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）により、窒化シリコンでコーティングする。
５．ウェーハの反対側（底側）をフォトレジストでコーティングし、窒化シリコンにおいて膜組織の境界を区分する開口部を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
６．反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）を用いて、ウェーハの底側にあるフォトレジストの開口部によって境界を区分された領域内の窒化シリコンをエッチングで除去する。
７．誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度シリコンエッチング（ＡＳＥ）を用いて、ウェーハを異方性エッチングし、ウェーハの底側に円筒形の開口部を形成する。エッチングの時間は、ウェーハの上側に残すシリコンの膜組織の厚さを決める。
８．背面側に対して、ＲＩＥにより、ウェーハの背面側の窒化シリコンのマスクを除去し、開口部の背面の端部を開放する。
９．前面側に対して、ＲＩＥにより、穴の上に突き出た窒化シリコンを残す形で前面側の窒化シリコンを除去する。
１０．プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）による熱酸化またはＬＰＣＶＤのどちらかにより、酸化シリコンでシリコンをコーティングする。
【０１０３】
これに代わって、以下のプロセスで基質を組み上げることができる。
１．開始基質：キャリアの結晶方向＜１００＞で、上側表面の１〜５０μｍ下に位置する埋め込まれた酸化物層を有する絶縁体上シリコン（ＳＯＩ）。
２．シリコンの一方の表面をフォトレジストでコーティングし、開口部位置と直径を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
３．誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度シリコンエッチング（ＡＳＥ）により、シリコンに開口部パターンを転写して、埋め込まれた酸化物層の深さにまで達する深く垂直な細孔を生成する。
４．シリコン表面を、低圧化学蒸着法（ＬＰＣＶＤ）またはプラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）により、窒化シリコンでコーティングする。
５．ウェーハの反対側（底側）をフォトレジストでコーティングし、窒化シリコンにおいて膜組織の境界を区分する開口部を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
６．反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）を用いて、ウェーハの底側にあるフォトレジストの開口部によって境界を区分された領域内の窒化シリコンをエッチングで除去する。
７．ウェーハを、ＫＯＨまたはＴＭＡＨ溶液で異方性エッチングし、ウェーハの底側にピラミッド形の開口部を形成する。埋め込まれた酸化物は、このプロセスに対するエッチストップとして機能し、そのため上側のシリコン層の厚さは、残す膜組織の厚さを決める。
８．ＲＩＥ、ウェットフッ化水素酸（ＨＦ）エッチング、またはＨＦガスエッチングによって、埋め込まれた酸化物層の露光された領域を除去する。これは、ウェーハにおける上側と底側の開口部間の接続を確実にするものである。
９．背面側に対して、ＲＩＥにより、ウェーハの背面側の窒化シリコンのマスクを除去し、開口部の背面の端部を開放する。
１０．前面側に対して、ＲＩＥにより、穴の上に突き出た窒化シリコンを残す形で前面側の窒化シリコンを除去する。
１１．プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）による熱酸化またはＬＰＣＶＤのどちらかにより、酸化シリコンでシリコンをコーティングする。
【０１０４】
これに代わって、以下のプロセスで基質を組み上げることができる。
１．開始基質：上側表面の１〜５０μｍ下に位置する埋め込まれた酸化物層を有する絶縁体上シリコン（ＳＯＩ）。
２．シリコンの一方の表面をフォトレジストでコーティングし、開口部位置と直径を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
３．誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度シリコンエッチング（ＡＳＥ）により、シリコンに開口部パターンを転写して、埋め込まれた酸化物層の深さにまで達する深く垂直な細孔を生成する。
４．シリコン表面を、低圧化学蒸着法（ＬＰＣＶＤ）またはプラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）により、窒化シリコンでコーティングする。
５．ウェーハの反対側（底側）をフォトレジストでコーティングし、窒化シリコンにおいて膜組織の境界を区分する開口部を含むパターンを紫外光で露光してフォトレジストに転写する。
６．反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）を用いて、ウェーハの底側にあるフォトレジストの開口部によって境界を区分された領域内の窒化シリコンをエッチングで除去する。
７．ウェーハを、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を用いたディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）または高度シリコンエッチング（ＡＳＥ）により異方性エッチングし、ウェーハの底側に垂直な空洞を形成する。埋め込まれた酸化物は、このプロセスに対するエッチストップとして機能し、そのため上側のシリコン層の厚さは、残す膜組織の厚さを決める。
８．ＲＩＥ、ウェットフッ化水素酸（ＨＦ）エッチング、またはＨＦガスエッチングによって、埋め込まれた酸化物層の露光された領域を除去する。これは、ウェーハにおける上側と底側の開口部間の接続を確実にするものである。
９．背面側に対して、ＲＩＥにより、ウェーハの背面側の窒化シリコンのマスクを除去し、開口部の背面の端部を開放する。
１０．前面側に対して、ＲＩＥにより、穴の上に突き出た窒化シリコンを残す形で前面側の窒化シリコンを除去する。
１１．プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）による熱酸化またはＬＰＣＶＤのどちらかにより、酸化シリコンでシリコンをコーティングする。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】パッチピペットを付着させた形の細胞
【図２】ピペットの先端および平坦な基質に付着した細胞
【図３】基準ピペット抵抗に対する実際の平均ピペット抵抗のグラフ
【図４】ピペット抵抗に対するギガシールの成功率のグラフ
【図５】ピペット抵抗に対するホールセル実現の成功率のグラフ
【図６】異なる開口部の寸法に対するギガシール形成の時間依存性のグラフ
【図７】開口部の側に位置する突き出たリム部を持つ平坦な基質に付着した細胞
【図８】突き出たリム部を有する異なる四つの開口部構造
【図９】突き出た部分を持たないが、膜組織／基質の接触領域を低減するのに十分な鋭さ（ｒ）を持つリム部を有する構造
【図１０ａ】表面加工にＩＣＰとＬＰＣＶＤを用いて、表面の平面の内側において突き出たリム部を有する、長い細孔を持つ基質の走査型電子顕微鏡写真。
【図１０ｂ】表面加工にＩＣＰとＬＰＣＶＤを用いて、表面の平面の内側において突き出たリム部を有する、長い細孔を持つ基質の走査型電子顕微鏡写真。
【図１１】表面加工にＩＣＰとＬＰＣＶＤを用いて、表面の平面の外側において突き出たリム部を有する、長い細孔を持つ基質の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１】
2005523011.tif 000004
【図２】
2005523011.tif 000005
【図３】
2005523011.tif 000006
【図４】
2005523011.tif 000007
【図５】
2005523011.tif 000008
【図６】
2005523011.tif 000009
【図７】
2005523011.tif 000010
【図８】
2005523011.tif 000011
2005523011.tif 000012
2005523011.tif 000013
2005523011.tif 000014
【図９】
2005523011.tif 000015
【図１０ａ】
2005523011.tif 000016
【図１０ｂ】
2005523011.tif 000017
【図１１】
2005523011.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月3日(2004.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性をパッチクランプ法により分析するのに使用するほぼ平坦な基質であって、その際この基質が、開口部と、この開口部の境界を区分するリム部とを有し、このリム部が、グリコカリックスの厚さを超える高さにまで基質の平面から突き出ており、このリム部が、細胞膜組織と接触した時にギガシールを形成するように構成されている基質。
【請求項２】
当該のリム部が、平坦な基質の表面上から少なくとも２０ｎｍの高さにまで、好ましくは少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、あるいは少なくとも１００ｎｍの高さにまで基質の平面から突き出ている請求項１に記載の平坦な基質。
【請求項３】
当該のリム部の幅が、５０〜２００ｎｍの範囲内にある請求項１または２に記載の平坦な基質。
【請求項４】
当該の開口部の長さ（すなわち、深さ）が、２〜３０μｍの範囲内、好ましくは２〜２０μｍ、２〜１０μｍあるいは５〜１０μｍの範囲内にある請求項１から３までのいずれか一つに記載の平坦な基質。
【請求項５】
当該の開口部の直径が、０．５〜２μｍの範囲内にある請求項１から４までのいずれか一つに記載の平坦な基質。
【請求項６】
当該のリム部が、基質の平面に対してほぼ垂直に突き出ている請求項１から５までのいずれか一つに記載の平坦な基質。
【請求項７】
当該のリム部が、基質の平面に対して斜めの角度を成す請求項１から５までのいずれか一つに記載の基質。
【請求項８】
当該のリム部が、基質の平面に対してほぼ平行である請求項１から５までのいずれか一つに記載の基質。
【請求項９】
当該のリム部が、開口部の口の部分によって境界を区分され、この口の部分が、４５〜９０度の範囲の角度で、５〜１００ｎｍの範囲の曲率半径を有する請求項１に記載の基質。
【請求項１０】
基質が、シリコン、プラスチック、純粋なシリカまたはその他のガラス（石英、パイレックス（登録商標）、またはＢｅ，Ｍｇ，Ｃａ，Ｂ，Ａｌ，Ｇａ，Ｇｅ，Ｎ，Ｐ，Ａｓの群から選択された一つ以上のドーパントでドーピングされたシリカなど）から構成される請求項１から９までのいずれか一つに記載の平坦な基質。
【請求項１１】
基質が、シリコンから構成される請求項１０に記載の平坦な基質。
【請求項１２】
基質の表面および／または開口部の壁面が、第二のコーティング材料でコーティングされている請求項１から１１までのいずれか一つに記載の基質。
【請求項１３】
当該のコーティング材料が、シリコン、プラスチック、純粋なシリカ、その他のガラス（石英、パイレックス（登録商標）、またはＢｅ，Ｍｇ，Ｃａ，Ｂ，Ａｌ，Ｇａ，Ｇｅ，Ｎ，Ｐ，Ａｓおよびこれらの酸化物の群から選択された一つ以上のドーパントでドーピングされたシリカなど）である請求項１２に記載の基質。
【請求項１４】
当該のコーティング材料が、酸化シリコンである請求項１０に記載の基質。
【請求項１５】
グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性をパッチクランプ法により分析するのに使用するほぼ平坦な基質であって、その際この基質が、開口部と、この開口部の境界を区分するリム部とを有し、このリム部が、細胞膜組織と接触した時にギガシールを形成するように構成されている基質を作る方法であって、
（ｉ）基質のテンプレートを準備することと、
（ii）このテンプレートに開口部を形成することと、
（iii ）このリム部が、グリコカリックスの厚さを超える高さにまで、この基質から突き出る形で、この開口部の周囲にリム部を形成すること、
の措置を有する方法。
【請求項１６】
基質が、シリコン微細加工技術を用いて作られる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
措置（ii）が、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）によるディープ反応性イオンエッチング処理を用いて開口部を形成することで構成される請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
更に、基質の表面をコーティングする措置を有する請求項１５から１７までのいずれか一つに記載の方法。
【請求項１９】
措置（iii ）が、基質のコーティングと同時に行われる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
措置（iii ）が、基質の前面側を方向性および選択性のエッチングにより、基質の前面側のマスク層を除去するとともに、当該の突き出る長さをその下にある基質にまで更に延ばす中間措置を有する請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
当該のコーティングが、プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）および／または低圧化学蒸着法（ＬＰＣＶＤ）を用いて行われる請求項１８から２０までのいずれか一つに記載の方法。
【請求項２２】
当該のコーティングが、プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）を用いて行われる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
措置（iii ）が、プラズマ支援化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）を用いて、被膜された表面のコーティング膜からリム部を形成することで構成される請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性を分析する方法であって、（ｉ）グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性をパッチクランプ法により分析するのに使用するほぼ平坦な基質であって、その際この基質が、開口部と、この開口部の境界を区分するリム部とを有し、このリム部が、細胞膜組織と接触した時にギガシールを形成するように構成されている基質を作ることであり、
（ii）基質のテンプレートを準備することと、
（iii ）このテンプレートに開口部を形成することと、
（iv）このリム部が、グリコカリックスの厚さを超える高さにまで、この基質から突き出る形で、この開口部の周囲にリム部を形成することで、この基質を作ることと、
（ｖ）細胞膜組織と基質間にギガシールが形成されるように、細胞膜組織を基質の開口部のリム部に接触させることと、
（vi）細胞膜組織の電気生理学的な特性を測定すること、
の措置を有する方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法を実行するためのキットであって、
グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性をパッチクランプ法により分析するのに使用するほぼ平坦な基質であって、その際この基質が、開口部と、この開口部の境界を区分するリム部とを有し、このリム部が、グリコカリックスの厚さを超える高さにまで基質の平面から突き出ており、このリム部が、細胞膜組織と接触した時にギガシールを形成するように構成されている基質ならびにパッチクランプ法による研究を行うための一つ以上の媒体または試薬を有するキット。
【請求項２６】
ほぼ明細書において図面を参照して記載したとおりの基質。
【請求項２７】
ほぼ明細書において図面を参照して記載したとおりの方法。
【請求項２８】
ほぼ明細書において図面を参照して記載したとおりのキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
従って、この発明の第一の特徴は、グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性のパッチクランプ法による分析で使用するためのほぼ平坦な基質を提供するものであり、その際この基質は、開口部と、この開口部の境界を区分するリム部とを有し、このリム部が、グリコカリックスの厚さを超える高さにまで基質の平面から突き出ており、このリム部が、細胞膜組織と接触した時にギガシールを形成するように構成されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
好ましくは、このリム部は、基質の平面上に、少なくとも２０ｎｍ、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、あるいは少なくとも１００ｎｍ突き出ている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
この発明の第二の特徴は、グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性をパッチクランプ法により分析するのに使用するほぼ平坦な基質であって、その際この基質が、開口部と、この開口部の境界を区分するリム部とを有し、このリム部が、細胞膜組織と接触した時にギガシールを形成するように構成されている基質を作る方法を提供することであり、この方法は、
（ｉ）基質のテンプレートを準備することと、
（ii）このテンプレートに開口部を形成することと、
（iii ）このリム部が、グリコカリックスの厚さを超える高さにまで、この基質から突き出る形で、この開口部の周囲にリム部を形成すること、
の措置を有する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
この発明の第三の特徴は、グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性を分析する方法を提供することであり、この方法は、
（ｉ）グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性をパッチクランプ法により分析するのに使用するほぼ平坦な基質であって、その際この基質が、開口部と、この開口部の境界を区分するリム部とを有し、このリム部が、細胞膜組織と接触した時にギガシールを形成するように構成されている基質を作ることであり、
（ii）基質のテンプレートを準備することと、
（iii ）このテンプレートに開口部を形成することと、
（iv）このリム部が、グリコカリックスの厚さを超える高さにまで、この基質から突き出る形で、この開口部の周囲にリム部を形成することで、この基質を作ることと、
（ｖ）細胞膜組織と基質間にギガシールが形成されるように、細胞膜組織を基質の開口部のリム部に接触させることと、
（vi）細胞膜組織の電気生理学的な特性を測定すること、
の措置を有する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
この発明の第四の特徴は、請求項２４に記載の方法を実行するためのキットを提供することであって、このキットは、グリコカリックスを有する細胞膜組織の電気生理学的な特性をパッチクランプ法により分析するのに使用するほぼ平坦な基質であって、その際この基質が、開口部と、この開口部の境界を区分するリム部とを有し、このリム部が、グリコカリックスの厚さを超える高さにまで基質の平面から突き出ており、このリム部が、細胞膜組織と接触した時にギガシールを形成するように構成されている基質ならびにパッチクランプ法による研究を行うための一つ以上の媒体または試薬を有する。


【国際調査報告】
2005523011.tif 000019
2005523011.tif 000020
2005523011.tif 000021