(57)【要約】KCC2、KCC3およびKCC4カリウム−クロライド共輸送体タンパク質、およびそれをコードする核酸分子。組換え宿主細胞、組換え核酸および組換えタンパク質が各々を作製する方法とともに開示される。また、KCC2、KCC3およびKCC4相同体に対する単離および精製された抗体、ならびにそれらを作製する方法も開示される。KCC2、KCC3およびKCC4遺伝子産物はカリウム−クロライド共輸送体において生物活性を有する。従って、この活性を含む治療方法も開示される。
2005522179.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)  配列番号3、5、7、9および15のいずれかで示される核酸配列によってコードされるポリペプチド；
(b)  配列番号3、5、7、9および15のヌクレオチド1〜434と75％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるポリペプチド；
(c)  配列番号4、6、8、10および16で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(d)  配列番号4、6、8、10および16で示されるポリペプチドの生物学的同等物であるポリペプチド；
(e)  配列番号4、6、8、10および16のいずれかの最初の90のアミノ酸の一部または全てを含むポリペプチドと免疫反応性のある抗体と免疫学的に交差反応するポリペプチド；または
(f)  配列番号3、5、7、9および15のいずれかの最初の434のヌクレオチドを含む核酸分子またはその相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるポリペプチド
を含む、単離および精製された生物学的に活性なKCC3 カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチド。
【請求項２】
マウスKCC3 カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドまたはヒトKCC3 カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
検出可能なように標識された形態に改変された、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合し得る、単離および精製された抗体。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドの生物活性を調節し得る、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
請求項５に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項７】
請求項１に記載の生物学的に活性なKCC3ポリペプチドをコードする、単離および精製された核酸分子。
【請求項８】
コードされるポリペプチドがヒトまたはマウスKCC3ポリペプチドを含む、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
コードされるポリペプチドが配列番号4、6、8、10および16のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１０】
配列番号3、5、7、9および15のいずれかの最初の434のヌクレオチドの一部または全てを含むDNAセグメントとしてさらに定義される、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１１】
プロモーターの制御下にあるものとしてさらに定義される、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１２】
該核酸分子がDNAセグメントであって、そのDNAセグメントとプロモーターが組換えベクター内で作動可能なように連結されている、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
請求項７に記載の核酸分子を含む、組換え宿主細胞。
【請求項１４】
単離および精製された生物学的に活性なKCC4 カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチド。
【請求項１５】
(a)  配列番号1および13のいずれかで示される核酸配列によってコードされるポリペプチド；
(b)  配列番号1および13のいずれかで示されるDNA配列と少なくとも約75％以上の配列同一性を有する核酸によってコードされるポリペプチド；
(c)  配列番号1および13のいずれかで示される配列または配列の相補体を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸によってコードされるポリペプチド；
(d)  配列番号2および14のいずれかで示されるペプチドの生物学上の機能的同等物であるポリペプチド；
(e)  配列番号2および14のいずれかで示される核酸配列によってコードされるペプチドと免疫反応性のある抗体と免疫学的に交差反応するポリペプチド；
(f)  配列番号1および13のいずれかの配列、またはその断片もしくは変異体もしくは相補的配列を有する核酸分子と高いストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるポリペプチド；または
(g)  a)、b)、c)、d)、e)、またはf)のポリペプチドの一部を含むポリペプチド
を含む、請求項１４に記載の単離および精製された生物学的に活性なKCC4 カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチド。
【請求項１６】
KCC4ポリペプチドがマウスKCC4 カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドまたはヒトKCC4 カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドを含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
検出可能なように標識された形態に改変された、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１４に記載のポリペプチドと特異的に結合し得る、単離および精製された抗体。
【請求項１９】
請求項１４に記載のポリペプチドの生物活性を調節し得る、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
請求項１８に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項２１】
請求項１４に記載の生物学的に活性なKCC4ポリペプチドをコードする、単離および精製された核酸分子。
【請求項２２】
コードされるポリペプチドがマウスKCC4ポリペプチドまたはヒトKCC4ポリペプチドを含む、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
コードされるポリペプチドが配列番号2および14のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２４】
配列番号1および13のいずれかの核酸配列を含むものとしてさらに定義される、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２５】
DNAセグメントとしてさらに定義される、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２６】
プロモーターの制御下にあるものとしてさらに定義される、請求項２５に記載の核酸分子。
【請求項２７】
該DNAセグメントとプロモーターが組換えベクター中に作動可能なように挿入されている、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項２８】
請求項２１に記載の核酸分子を含む、組換え宿主細胞。
【請求項２９】
単離および精製された生物学的に活性なKCC2 カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチド。
【請求項３０】
(a)  配列番号11で示される核酸配列によってコードされるポリペプチド；
(b)  配列番号11で示されるDNA配列と少なくとも約75％以上の配列同一性を有する核酸によってコードされるポリペプチド；
(c)  配列番号11で示される配列または配列の相補体を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸によってコードされるポリペプチド；
(d)  配列番号12で示されるペプチドの生物学上の機能的同等物であるポリペプチド；
(e)  配列番号12で示される核酸配列によってコードされるペプチドと免疫反応性のある抗体と免疫学的に交差反応するポリペプチド；
(f)  配列番号11の配列、またはその断片もしくは変異体もしくは相補的配列を有する核酸分子と高いストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるポリペプチド；または
(g)  a)、b)、c)、d)、e)、またはf)のポリペプチドの一部を含むポリペプチド
を含む、請求項２９に記載の単離および精製された生物学的に活性なKCC2 カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチド。
【請求項３１】
KCC2ポリペプチドがマウスKCC2 カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドを含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
KCC2ポリペプチドがヒトKCC2 カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドを含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
検出可能なように標識された形態に改変された、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
請求項２９に記載のポリペプチドと特異的に結合し得る、単離および精製された抗体。
【請求項３５】
請求項２９に記載のポリペプチドの生物活性を調節し得る、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３６】
請求項３４に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項３７】
請求項２９に記載の生物学的に活性なKCC2ポリペプチドをコードする、単離および精製された核酸分子。
【請求項３８】
コードされるポリペプチドが配列番号12で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の核酸分子。
【請求項３９】
配列番号11の核酸配列を含むものとしてさらに定義される、請求項３７に記載の核酸分子。
【請求項４０】
DNAセグメントとしてさらに定義される、請求項３７に記載の核酸分子。
【請求項４１】
プロモーターの制御下にあるものとしてさらに定義される、請求項４０に記載の核酸分子。
【請求項４２】
該DNAセグメントとプロモーターが組換えベクター中に作動可能なように挿入されている、請求項４１に記載の核酸分子。
【請求項４３】
請求項４０に記載の核酸分子を含む、組換え宿主細胞。
【請求項４４】
カリウム−クロライド共輸送体の生物活性を調節し得る生物学的に活性なKCC2、KCC3またはKCC4ポリペプチドをコードする核酸分子をゲノムに組み込んだトランスジェニック非ヒト動物(該核酸分子は該ゲノム中に、動物内でKCC2、KCC3またはKCC4ポリペプチドの発現を付与するに十分なコピー数で存在する)。
【請求項４５】
単離および精製されたKCC2、KCC3またはKCC4ゲノムDNA分子。
【請求項４６】
配列番号20〜110のいずれかのヌクレオチド配列を含むものとしてさらに定義される、請求項４５に記載の単離および精製されたKCC2、KCC3またはKCC4ゲノムDNA分子。
【請求項４７】
KCCポリペプチドと免疫反応性のある抗体を作製する方法であって、
(a)  組換え宿主細胞を、KCCポリペプチドをコードする請求項７、１４または３７のいずれかに記載の核酸分子でトランスフェクトし、
(b)  宿主細胞をポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、
(c)  ポリペプチドを回収し、さらに
(d)  ポリペプチドに対する抗体を作製する
ステップを含む方法。
【請求項４８】
ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16および113のいずれかで示されるポリペプチドを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
核酸分子が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15および112で示される核酸分子配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドを検出する方法であって、ポリペプチドを請求項４７に記載の方法によって作製された抗体と免疫反応させて抗体−ポリペプチド複合体を形成し、その複合体を検出することを含む方法。
【請求項５１】
核酸材料を含有する生物サンプルにおいてカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドをコードする核酸分子を検出する方法であって、
(a)  請求項７、１４または３７のいずれかの核酸分子をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で生物サンプルの核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション二重らせんを形成し、さらに
(b)  そのハイブリダイゼーション二重らせんを検出する
ステップを含む方法。
【請求項５２】
生物サンプルにおいてカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドの存在を検出するアッセイキットであって、請求項１、１４および２９のいずれかのポリペプチドと免疫反応し得る第1の抗体を含むキット。
【請求項５３】
第1の抗体と免疫反応する第2の抗体を含有する第2の容器をさらに含む、請求項５２に記載のアッセイキット。
【請求項５４】
第1の抗体および第2の抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項５２に記載のアッセイキット。
【請求項５５】
第1の抗体が固相支持体に固定されている、請求項５２に記載のアッセイキット。
【請求項５６】
第1の抗体および第2の抗体が各々指標を含む、請求項５２に記載のアッセイキット。
【請求項５７】
指標が放射性標識または酵素である、請求項５６に記載のアッセイキット。
【請求項５８】
生物サンプルにおいてカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドと免疫反応性のある抗体の存在を検出するアッセイキットであって、抗体と免疫反応する請求項１、１４および２９のいずれかのポリペプチドを含むキット(なお、このポリペプチドは少なくとも1回のアッセイを行うのに十分な量で存在する)。
【請求項５９】
生物サンプルにおいてカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドの存在を検出するアッセイキットであって、請求項７、１４または３７のいずれかの核酸分子の少なくとも10個の連続するヌクレオチド塩基のセグメントと同一または相補的な核酸分子を含有する第1の容器を含むキット。
【請求項６０】
イオン輸送の変化を媒介とする病状を付与する変異体の有無を決定する方法であって、KCC2、KCC3およびKCC4からなる群より選択されるヒト遺伝子において突然変異の存在に関して核酸またはタンパク質サンプルを分析するステップを含む方法。
【請求項６１】
核酸増幅法および該KCC2遺伝子、KCC3遺伝子またはKCC4遺伝子を選択的に増幅するプライマーを用いてサンプル中の核酸分子を増幅し、さらに、増幅された核酸分子に突然変異が存在するかどうかを同定するステップをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
KCC2、KCC3およびKCC4からなる群より選択されるヒト遺伝子によってコードされるタンパク質における突然変異の存在に関してタンパク質サンプルを分析するステップをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
該ヒトKCC2、KCC3およびKCC4が、配列番号1〜100、112〜113、および118〜129のいずれかで示されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を含むものとしてさらに定義される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
カリウム−クロライド共輸送体の生物活性を調節する能力に関して候補物質をスクリーニングする方法であって、
(a)  KCC2、KCC3またはKCC4ポリペプチドを含む試験サンプルを確立し、
(b)  候補物質を試験サンプルに投与し、さらに
(c)  試験サンプルに対する候補物質の相互作用、作用、またはその組合せを測定し、それにより、候補物質がカリウム−クロライド共輸送体の生物活性を調節することができるかどうかを調べる
ステップを含む方法。
【請求項６５】
候補物質が候補ポリペプチドとしてさらに特徴付けられ、候補ポリペプチドをコードする遺伝子を精製および単離するステップをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ポリペプチドが細胞培養中の細胞内に含まれる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
請求項６６に記載の方法で用いるのに好適な組換え細胞株。
【請求項６８】
候補化合物をカリウム−クロライド共輸送体の生物活性のモジュレーターとして同定する方法であって、
(a)  細胞サンプルを試験する候補化合物と接触させ(なお、この細胞サンプルは、KCC2、KCC3および／またはKCC4コード遺伝子と、検出可能なシグナルを生じ得るレポーター遺伝子の調節可能な転写調節配列を含むDNA構築物を含有する少なくとも1つの細胞を含む)、
(b)  対照サンプルに対して、生じたシグナルの量を評価し、さらに
(c)  対照サンプルに対する生じたシグナルの量に基づいて、候補化合物をカリウム−クロライド共輸送体の生物活性のモジュレーターとして同定する
ステップを含む方法。
【請求項６９】
レポーター遺伝子がKCC2、KCC3またはKCC4を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
脊椎動物被験体においてカリウム−クロライド共輸送体の生物活性を調節する方法であって、脊椎動物被験体に、その脊椎動物被験体においてKCC2、KCC3、KCC4ポリペプチドおよびそれらの組合せの活性を調節し得る有効量の物質を投与し、それにより、脊椎動物被験体においてリウム−クロライド共輸送体の生物活性を調節するステップを含む方法。
【請求項７２】
KCC活性を調節する物質が抗カリウム−クロライド共輸送体抗体を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
投与ステップが、脊椎動物においてKCC2、KCC3、またはKCC4をコードする核酸分子の発現を調節する有効量の物質を投与することをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
KCC2、KCC3、またはKCC4をコードする核酸分子の発現を調節する物質がアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
KCC2、KCC3、またはKCC4をコードする核酸分子の発現を調節する物質がKCC2、KCC3、またはKCC4をコードする核酸分子の調節可能な転写調節配列のリガンドを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
脊椎動物被験体が哺乳類である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
KCC2、KCC3、KCC4、およびそれらの組合せの生物活性モジュレーターの治療上有効な量と医薬上許容される希釈剤またはビヒクルとを含む、医薬組成物。
【請求項７８】
KCC2、KCC3および／またはKCC4生物活性モジュレーターが
(a)  KCC2、KCC3、KCC4、それらの組合せ、またはそれらの断片もしくは誘導体と優先的に結合する精製抗体、および
(b)  KCC2、KCC3、KCC4、それらの組合せ、またはそれらの断片もしくは誘導体と相互作用するポリペプチド
からなる群より選択される、請求項７７に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
脊椎動物被験体においてカリウム−クロライド共輸送体を調節する方法であって、カリウム−クロライド共輸送体を伴う脊椎動物被験体の組織に、プロモーターに作動可能なように連結されたKCC2、KCC3またはKCC4遺伝子産物をコードする核酸配列を含む構築物を導入する(ここで、組織中のKCC2、KCC3またはKCC4遺伝子産物はカリウム−クロライド共輸送体の調節をもたらす)方法。
【請求項８０】
構築物がプラスミドベクターまたはウイルスベクターからなる群より選択されるベクターをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
構築物がリポソーム複合体をさらに含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
KCC2、KCC3またはKCC4遺伝子産物が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、および113のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
核酸配列が
(a)  配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、および112のいずれかで示されるDNA配列、またはその相補鎖、
(b)  配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、および112のいずれかで示される核酸配列と、塩濃度が約200mMの洗浄液および少なくとも約45℃の洗浄温度で示されるストリンジェントな洗浄条件下でハイブリダイズし、かつ、KCC2、KCC3またはKCC4ポリペプチドをコードするDNA配列、および
(c)  遺伝子コードの縮重のために上記(a)または(b)の単離された核酸分子とは異なるが、上記(a)または(b)の単離された核酸分子によってコードされるKCC2、KCC3またはKCC4ポリペプチドをコードするDNA配列
からなる群より選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
被験体においてKCC遺伝子の多形を検出するキットであって、
(a)  被験体からの生物サンプルにおけるKCC遺伝子の多形を検出する試薬、および
(b)  その試薬の容器
を含むキット。
【請求項８５】
KCC遺伝子の多形を含む核酸分子を増幅する試薬をさらに含む、請求項８４に記載のキット。
【請求項８６】
増幅試薬が、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるのに好適なポリメラーゼ酵素とオリゴヌクレオチド対を含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項８７】
被験体から得た生物サンプルから核酸サンプルを抽出する試薬をさらに含む、請求項８４に記載のキット。
【請求項８８】
カリウム−クロライド共輸送体の生物活性を調節し得る生物学的に活性なKCC2、KCC3またはKCC4ポリペプチドをコードする核酸分子をそのゲノムから改変または欠失させたトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８９】
(a)  配列番号112で示される核酸配列によってコードされるポリペプチド、
(b)  配列番号112で示されるDNA配列と少なくとも約75％以上の配列同一性を有する核酸によってコードされるポリペプチド、
(c)  配列番号112で示される配列または配列の相補体を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸によってコードされるポリペプチド、
(d)  配列番号113で示されるペプチドの生物学上の機能的同等物であるポリペプチド、
(e)  配列番号112で示される核酸配列によってコードされるペプチドと免疫学的に反応性のある抗体と免疫学的に交差反応するポリペプチド、
(f)  配列番号112の配列、またはその断片もしくは変異体もしくは相補的配列を有する核酸分子と高いストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるポリペプチド、または
(g)  a)、b)、c)、d)、e)、またはf)のポリペプチドの一部を含むポリペプチド
を含む、単離および精製された生物学的に活性なアフリカツメガエルKCCカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチド。
【請求項９０】
検出可能なように標識された形態に改変された、請求項８９に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
請求項８９に記載のポリペプチドと特異的に結合し得る、単離および精製された抗体。
【請求項９２】
請求項８９に記載のポリペプチドの生物活性を調節し得る、請求項９１に記載の抗体。
【請求項９３】
請求項９１に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項９４】
請求項８９に記載の生物学的に活性なKCC4ポリペプチドをコードする、単離および精製された核酸分子。
【請求項９５】
コードされるポリペプチドが配列番号113で示されるアミノ酸配列を含む、請求項９４に記載の核酸分子。
【請求項９６】
配列番号112のヌクレオチド配列を含むとしてさらに定義される、請求項９４に記載の核酸分子。
【請求項９７】
DNAセグメントとしてさらに定義される、請求項９４に記載の核酸分子。
【請求項９８】
プロモーターの制御下にあるものとしてさらに定義される、請求項９７に記載の核酸分子。
【請求項９９】
そのDNAセグメントとプロモーターが組換えベクター内に作動可能なように挿入されている、請求項９８に記載の核酸分子。
【請求項１００】
請求項９４に記載の核酸分子を含む、組換え宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願のクロスリファレンス）
本願は、出典明示によりそのまま本明細書の一部とする、2000年4月14日出願の米国仮出願出願番号60/197,350に基づき、その優先権を主張するものである。
【０００２】
（助成に関して）
本研究は米国国立衛生研究所助成DK02103、DK57708、およびNS36758によって援助を受けた。従って米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は一般に、単離および精製されたタンパク質および核酸に関する。より詳しくは、本発明は、単離および精製されたカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチド、ならびにそれをコードする単離および精製された核酸に関する。
【０００４】
（略号表）
ACCPN      脳梁の非形成を伴う、または伴わない抹消神経障害
A−T       運動失調−毛細管拡張症
ATTC       American Tissue Type Collection
BSA        ウシ血清アルブミン
CDR        相補性決定領域
CITB       California Institute of Technology BAC
CNPアーゼ  2',3'−サイクリックヌクレオチド3'−ホスホジエステラーゼ
CNS        中枢神経系
EMBL       ヨーロッパ分子生物学研究所(European Molecular Biology Laboratory)
EST        発現配列タグ
HAT        ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン含有細胞培養培地
hKCC2      ヒトKCC2
hKCC3      ヒトKCC3
hKCC4      ヒトKCC4
IMAGE      ゲノムおよびそれらの発現の統合分子解析
KCC        カリウム−クロライド共輸送体；また「K+−Cl−共輸送体」とも
KCC3a      KCC3イソ型a
KCC3b      KCC3イソ型b
KCC3a2m    エクソン2を欠損するKCC3a
KLH        キーホールリンペット・ヘモシアニン
mKCC3      マウスKCC3
mKCC4      マウスKCC4
ML−7      ミオシンL鎖キナーゼ阻害剤
mOsm       ミリオスモル
NCC        ナトリウム−クロライド共輸送体；また「Na+−Cl−共輸送体」とも
NKCC1      Na+−K+−2Cl−共輸送体
NKCC2      Na+−K+−2Cl−共輸送体
NEM        N−エチルマレイミド
NIGMS      National Institute of General Medical Science
NKCC       ナトリウム−カリウム−クロライド共輸送体；また「Na+−K+−2Cl−共輸送体」とも
NMDG       N−メチル−D−グルカミン
NRSE       ニューロン神経制限サイレンシングエレメント
NRSE       ニューロン制限サイレンシング因子
ORF        オープンリーディングフレーム
PBS        リン酸緩衝生理食塩水
PCR        ポリメラーゼ連鎖反応
PTZ        ペンチレンテトラゾール
PKA        プロテインキナーゼA
PKC        プロテインキナーゼC
rabKCC1    ウサギKCC1
RACE       cDNA末端の迅速増幅
RT−PCR     逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
STS        配列タグ部位
TIGR       The Institute for Genome Research
TM         トランスメンブランドメイン
TMn        トランスメンブランドメインn(nは整数)
UTR        非翻訳領域
VNTR       タンデムリピートの変数
xKCC       アフリカツメガエルKCC
【０００５】
（発明の背景）
カチオン−クロライド共輸送体は典型的には3つのグループ：Na+−K+−2Cl−共輸送体、Na+−Cl−共輸送体、およびK+−Cl−共輸送体のうちの1つに分類される。カリウム−クロライド共輸送体(K+−Cl−共輸送体またはKCC)は当初、細胞の膨張によって誘導された赤血球からのカリウム流出として記載されていた。赤血球におけるK+とCl−の共輸送体は相互依存し、理論量1:1であり、両イオンに対して低い親和定数を有する。KCCは電気的に中性のカチオン−クロライドの遺伝子ファミリーに属し、すなわち、それらは膜電位によって影響を受けない。それらはほとんどの生理学的条件下では、容積低下調節に関与する流出経路として機能する。K+−Cl−共輸送体は利尿薬のブメタニドおよびフロセミド感受性であるが、親和性はNa+−K+−2Cl−共輸送体よりもはるかに低い。
【０００６】
2つのカリウム−クロライド共輸送体KCC1およびKCC2をコードする全長cDNAがある哺乳類で報告されている。ヒトでは、ヒトKCC1がクローニングされているが(Gillen et al. (1996) J Biol Chem 271(27):16237−16244; Holtzman et al. (1998) Am J Physiol 275 (4Pt2):F550−564)、KCC2はクローニングされていない。両タンパク質とも、ブメタニド感受性Na+−K+−2Cl−共輸送体NKCC1およびNKCC2(それぞれBSC2およびBSC1としても知られる)、ならびにチアジド感受性Na+−Cl−共輸送体NCC(TSCとしても知られる)をはじめ、他の電気的に中性なカチオン−クロライド共輸送体と一定レベルの類似性を示す。選択的スプライシング形態のヒトKCC3もまた報告されている(Hiki et al. (1999) J Biol Chem 274: 10661−10667参照)。
【０００７】
1998年7月9日公開の国際公開番号WO98/29431(発明者: Lifton et al.; 譲渡人: Yale University)では、一連の異常なまたは病的な状態を引き起こす上での、ヒトチアジド感受性Na−Cl共輸送体であるTSC、ヒトATP感受性カリウムチャネルであるROMK、およびヒトNa+−K+−2Cl−共輸送体であるNKCC2の役割が開示されている。いくつかのヒト野生型および変異型TSC、NKCC2およびROMKタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が開示されている。
【０００８】
1990年1月23日にCherkseyに対して発行された米国特許第4,895,807号では、細胞膜をわたるK+およびCl−イオン双方の輸送に関連することが分かった精製膜チャネルタンパク質が開示されている。このチャネルタンパク質は、例えばSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で求めた場合、約280ないし300kDの分子量を有するとされている。
【０００９】
1998年11月28日公開の国際公開番号WO98/53067(発明者: Bevensee et al.; 譲渡人: Yale University)では、ナトリウム−ビカーボネート共輸送体(NBC)に関するポリペプチドおよび核酸の単離および精製が開示されている。
【００１０】
1998年8月27日公開の国際公開番号WO98/37198(発明者: Lal et al.; 譲渡人: Incyte Pharmaceuticals Inc.)では、精製および単離されたヒト・ナトリウム依存性リン酸共輸送体(NAPTR)、ならびにそれをコードする精製および単離されたポリヌクレオチドが開示されている。これらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドは機能上、体内のリン酸レベルのホメオスタシスに関連している。
【００１１】
1996年10月31日公開の国際公開番号WO96/34288(発明者: Ni et al.; 譲渡人: Eli Lilly and Company. Ltd.)では、ナトリウム依存性無機リン酸共輸送体およびそれを含む核酸の単離が開示されている。この共輸送体はヒト脳組織から単離されたものである。これらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドもまた機能上、体内のリン酸レベルのホメオスタシスに関連している。
【００１２】
1995年4月25日にWright et al.(譲渡人: University of California System)に対して発行された米国特許第5,410,031号では、哺乳類Na+/ヌクレオシド共輸送体タンパク質、略してSNSTに対応するアミノ酸配列をコードするcDNA配列が開示されている。従って、コードされるタンパク質はナトリウムイオンとヌクレオシド(例えば、アデノシン)に関して機能する共輸送体である。
【００１３】
1995年8月15日にHediger(譲渡人: Brigham and Women's Hospital)に対して発行された米国特許第5,441,875号では、尿素輸送体ポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチドの単離および精製が開示されている。従って開示されているポリペプチドは、尿素のトランスメンブラン輸送体に機能するとして記載されている。
【００１４】
カリウム−クロライド共輸送体は、血液、皮膚、心臓、骨格筋および脳をはじめとするいくつかの細胞、組織および器官に関して記載されている。カリウム−クロライド共輸送体は細胞容積の調節、上皮を介する塩吸収、腎臓のカルシウム分泌、ならびに細胞内および細胞外のカリウムおよび塩素イオン濃度の調節に関与していると考えられる。
【００１５】
イオン輸送体は高血圧症、癲癇、鎌状赤血球貧血症、バーター症候群、およびメニエール病をはじめとするいくつかの疾病に関連づけられてきた。しかし、現在イオン輸送の欠陥と関連すると考えられている疾病の全てが既知のイオン輸送遺伝子と関連することが示されているわけではない。従って、これらの疾病において欠陥がある、あるいは影響を受けているその他のイオン輸送体対立遺伝子も存在し得る。
【００１６】
また、K+−Cl−共輸送体の研究に対する主な障害は固有の高い親和性の阻害剤がないことであった。従って、カリウム−クロライド共輸送体の分子の不均一性のさらなる同定は、いくつかの組織の生理学および病態生理学と密接な関わりを持つ。さらに、KCCのさらなるイソ型の同定は、イオン輸送を調節し得る、従ってこれらの疾病または疾患の作用を軽減する治療を提供し得る抗体または医薬組成物のスクリーニングに特に有用である。最後に、ヒトKCC遺伝子の染色体上の位置決定およびゲノム同定は、一遺伝子性疾患、ポリジーン性疾患、および高血圧症などの複合形質におけるそれらの役割の検討に非常に貴重である。従ってこのような同定は当技術分野における長年にわたる継続した必要を示すものである。
【００１７】
（発明の概要）
本発明は哺乳類KCC2、KCC3およびKCC4遺伝子をはじめとするKCC遺伝子をコードする単離および精製されたポリヌクレオチド、単離および精製されたKCCポリペプチド(KCC2、KCC3およびKCC4ポリペプチドを含む)、およびカリウム輸送の調節においてKCCポリペプチド(KCC2、KCC3およびKCC4タンパク質を含む)によって果たされる役割の同定を開示する。好ましくは、本発明のポリペプチドは組換えポリペプチドであって、哺乳類KCC2、KCC3またはKCC4ポリペプチドを含む。より好ましくは、本発明のポリペプチドはヒトまたはマウスKCC2、KCC3またはKCC4ポリペプチドを含む。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号1〜16または112〜113のいずれかの配列から選択されるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明はまた、カリウムおよび／またはクロライドレベル、ならびにそれによって作用される生物活性を調節するKCCポリペプチド(KCC2、KCC3またはKCC4ポリペプチドを含む)をコードする単離および精製されたポリヌクレオチドを提供する。好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは哺乳類由来のDNA分子を含む。好ましい哺乳類はマウスまたはヒトである。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、および113のいずれかのアミノ酸残基配列を含むポリペプチドをコードする。より好ましくは、本発明の単離および精製されたポリヌクレオチドは配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、および112のいずれかのヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
もう1つの実施形態では、本発明は、上記のようにKCCポリペプチド(KCC2、KCC3またはKCC4ポリペプチドを含む)と免疫反応性のある抗体を提供する。配列番号1〜16および112〜113は例えば、哺乳類、マウスまたはヒト由来の、また、非哺乳類脊椎動物アフリカツメガエル(Xenopus laevis)由来のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。より好ましくは、本発明の抗体は、ヒトまたはマウスKCC2、KCC3またはKCC4ポリペプチドを含むカリウム−クロリド共輸送体ポリペプチドと免疫反応性があるものである。いっそう好ましくは、本発明の抗体は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、および113のいずれかのアミノ酸残基配列を含むポリペプチドと免疫反応性のあるものである。また本発明は、他の脊椎動物および哺乳類で見られる相同または生物学的に同等なカリウム−クロライド共輸送体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドと免疫反応性のある抗体も提供する。所望により、本発明の抗体はモノクローナル抗体であってもよい。
【００２０】
もう1つの態様では、本発明は、上記のカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドと免疫反応性のある抗体を作製する方法を提供し、その方法は、(a)組換え宿主細胞を、生物学的に活性なカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトし、(b)宿主細胞をポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、(c)ポリペプチドを回収し、さらに(d)ポリペプチドに対する抗体を作製するステップを含む。配列番号1〜16および112〜113は代表的な哺乳類ヒト、マウスおよびアフリカツメガエル由来のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。好ましくは、宿主細胞は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、および112のポリヌクレオチドでトランスフェクトする。いっそう好ましくは、本発明は、上記方法に従って作製された抗体を提供する。また、本発明は、抗体を作製するための、他の哺乳類に見られる相同または生物学的に同等なKCC2、KCC3およびKCC4ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用も意図する。
【００２１】
あるいは、本発明は、上記のカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドを検出する方法を提供し、その方法はポリペプチドを、上記方法に従って作製した抗体と免疫反応させて抗体−ポリペプチド複合体を形成し、さらにその複合体を検出することを含む。
【００２２】
さらにもう1つの実施形態では、本発明は、上記のカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドをコードするメッセンジャーRNA転写物を検出する方法を提供し、その方法は、メッセンジャーRNA転写物をそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とハイブリダイズさせて二重らせんを形成し、さらに、その二重らせんを検出することを含む。あるいは、本発明は上記カリウム−クロライド共輸送体をコードするDNA分子を検出する方法を提供し、その方法は、DNA分子を、生物学的に活性なカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて二重らせんを形成し、さらに、その二重らせんを検出することを含む。
【００２３】
もう1つの態様では、本発明は、生物サンプルにおいてカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドの存在を検出するアッセイまたはアッセイキットを提供し、そのキットは、生物学的に活性なカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドと免疫反応し得る第1の抗体を含む。好ましくは、この第1の抗体は少なくとも1回のアッセイを行うのに十分な量で存在する。また好ましくは、本発明のアッセイキットは、第1の抗体と免疫反応する第2の抗体をさらに含む。より好ましくは、本発明のアッセイキットで用いる抗体はモノクローナル抗体である。いっそう好ましくは、第1の抗体は固相支持体に固定されている。さらにいっそう好ましくは、第1および第2の抗体は指標を含み、好ましくは、その指標は放射性標識、蛍光標識または酵素である。
【００２４】
もう1つの態様では、本発明は、生物サンプルにおいてカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドの存在を検出するアッセイまたはアッセイキットを提供し、そのキットは、カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、少なくとも10個の連続するヌクレオチド塩基のセグメントと同じまたは相補的なポリヌクレオチドを含む。
【００２５】
もう1つの実施形態では、本発明は、生物サンプルにおいてカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドと免疫反応性のある抗体の存在を検出するアッセイまたはアッセイキットを提供し、そのキットは、その抗体と免疫反応する生物学的に活性なカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドを含有する第1の容器を含む(なお、ポリペプチドは少なくとも1回のアッセイを行うのに十分な量で存在する)。
【００２６】
なおさらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを介してカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドの生物活性の調節に基づいた治療法に関する。かかる治療法は、単離および精製された本発明のポリヌクレオチドを用いた遺伝子療法のアプローチを含む。
【００２７】
もう1つの実施形態では、本発明は、ヒトKCC2、KCC3、およびKCC4遺伝子のゲノム配列に基づく遺伝子アッセイを提供する。これら3つの遺伝子をコードする個々のエクソンをフランキングするイントロン配列はヒトゲノムDNAの突然変異解析に好適なオリゴヌクレオチドプライマーのデザインに用いられる。従って、イントロンプライマーは、増幅されたエクソンの一本鎖コンホメーション多形(SSCP)解析、SSCP/ヘテロ二重らせん解析、酵素ミスマッチ切断、および直接配列解析をはじめとするPCRに基づくいくつかの技術によって遺伝子変異体をスクリーニングするのに使用される。同様の技術が、推定5'調節領域、例えばヒトKCC3のエクソン1aおよび1bの推定プロモーター5'に適用できる。また、自動化法も、ヒトKCC遺伝子内およびその付近の単一ヌクレオチド多形の大規模同定に適用することができる。
【００２８】
ひと度、特定の患者集団において遺伝子変異体が検出されれば(例えばアンデルマン症候群患者におけるKCC3変異)、本発明はその特定の変異を含むゲノムDNAを増幅したものの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、または制限解析などの方法によって突然変異を検出するアッセイを提供する。ここでもこれらの検出法は自動化可能である。リピート拡大により起こる遺伝病またはヒト表現型の場合、本発明は関与するリピートをフランキングするオリゴヌクレオチドプライマーを用いるゲノムDNAのPCRに基づくアッセイを提供する。
【００２９】
なおもう1つの態様では、本発明はトランスジェニック動物を提供する。本発明のある実施形態では、トランスジェニック動物はマウスKCC2、KCC3、およびKCC4遺伝子のターゲッティング改変を含み、全ての体細胞におけるKCC遺伝子の完全なまたは部分的な機能的不活性化を有するマウス系統をさらに含み得る。もう1つの実施形態では、体細胞における個々のKCCのレベルを低下させ、従って個々のイソ型の「ノックダウン」を達成すべく、本発明のトランスジェニック動物を、万能プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって駆動されるアンチセンスまたはリボザイムKCC構築物を用いて作製する。また本発明は、個々の、または複数のKCC遺伝子の条件付きまたは誘導的不活性化を伴うネズミ系統の作出を含む。
【００３０】
本発明はまた、KCC2、KCC3、またはKCC4遺伝子において特定の「ノックイン」修飾を有するマウス系統も提供する。これは、疾病特異的リピート拡大の挿入などの操作に加え、KCC遺伝子における遺伝的および／または機能的に関連する点突然変異を有するマウスを含む。
【００３１】
このように、本発明の重要な態様は、新規なカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドおよび核酸の発見に関する。好ましい核酸およびアミノ酸配列は配列番号1〜16および112〜113に記載される。従ってカリウム−クロライド濃度調節の生物活性において役割を有する精製および単離されたカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドを提供することが本発明のもう1つの態様である。
【００３２】
上記の態様および実施形態は、カリウム−クロライド共輸送体タンパク質の生物学的重要性を考えれば広範な有用性を有する。例として、上記の態様および実施形態は、カリウム−クロライド共輸送体の生物活性に作用する、またはそれを調節する化合物を同定するのに用いる、あるいは生物サンプルにおいて本発明のタンパク質および核酸の存在を検出するのに用いるスクリーニングアッセイおよびアッセイキットを製造する上で有用である。
【００３３】
本明細書の上記に述べられている本発明のいくつかの態様および目的は、その他の態様および目的は、添付の図面および本明細書の以下に最良なものとして記載される実施例とともに以下に続く記載を理解するにつれ明らかとなる。
【００３４】
(配列表の配列の概要)
配列番号1〜15の奇数は表１に示されるようにヒト、マウスおよびアフリカツメガエルKCCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号2〜16の偶数は、すぐ前のヌクレオチド配列によってコードされるヒト、マウスおよびアフリカツメガエルKCCポリペプチド配列である(例えば、配列番号2は配列番号1のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質であり、配列番号4は配列番号3のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質である)。
【００３６】
配列番号17〜19はマウスおよびヒトKCC3プロモーター領域である。
配列番号20〜42の偶数はヒトKCC2エクソン1〜24をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号44〜110はヒトKCC遺伝子をコードするゲノム配列である。
配列番号111はヒト第5染色体ゲノムクローンpMS621のヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号112および113はそれぞれアフリカツメガエルKCCのヌクレオチド配列とポリペプチド配列である。
配列番号114〜115はKCC2プライマー配列である。
配列番号116はKCC3抗原のペプチド配列である。
配列番号117はKCC4抗原のペプチド配列である。
配列番号118〜129は図４４に示されたKCC2多形である。
配列番号130は図４Ａおよび４Ｂで述べられているNRSEオリゴヌクレオチドである。
【００３８】
配列番号131はマウスKCC2プロモーター配列である。
【表１】
2005522179.tif 000003
【００３９】
(発明の詳細な説明)
本発明は、KCC遺伝子ファミリーの新規なメンバーを開示し、新規なヒトKCC2(代表例は配列番号11〜12で示される)、ヒトKCC3遺伝子の新規な選択的スプライシング型(本明細書では「hKCC3a」と呼び、代表例は配列番号15〜16で示される)ならびに新規なイソ型であるマウスKCC3a(代表例は配列番号7〜8で示される)およびマウスKCC3b(代表例は配列番号9〜10で示される)、エクソン2を欠いたヒトおよびマウスKCC3a(mKCC3a−2mおよびhKCC3a−2m、代表例は配列番号3〜6で示される)、ヒトKCC4(代表例は配列番号1〜2で示される)およびマウスKCC4(代表例は配列番号13〜14で示される)、ならびにアフリカツメガエルKCC遺伝子(代表例は配列番号112〜113で示される)を提供する。
【００４０】
推定される4つのKCCタンパク質は一次構造において65〜75％の同一性を共有する。これらのKCCタンパク質はまた、12の高度に保存されたトランスメンブラン(TM)セグメントの疎水性の中核をフランキングする親水性アミノ末端およびカルボキシ末端細胞質ドメインを有する、共通の推定膜トポロジーを共有する。TM5とTM6の間にグリコシル化された大きな細胞外ループが推定される。これらの推定される細胞質ドメイン、特にカルボキシ末端(C末端)は可変セグメントによって分散させられているが実質的相同なセグメントを含む。最もC末端はこれらの4つのタンパク質で完全に同一であるが、このことは重要な機能的役割を示唆している。4つのKCCで推定されるリン酸化部位はいずれも保存されていなかったが、このことは転写後調節が著しく異なることを示唆している。細胞容積の調節におけるタンパク質リン酸化/脱リン酸化の公知の役割(Hoffmann & Dunham (1995) Int Rev Cytol 161:173−262)を考慮すれば、これら4つのKCCの容積感受性は実質的に異なる。TMセグメントは一般に高度に保存されているが、Na+−K+−2Cl−共輸送体のカチオン親和性に影響を及ぼすと考えられるTMセグメントであるTM2内には興味深いバリエーションがある。TM4とTM7はNa+−K+−2Cl−共輸送体のアニオン親和性に関連づけられている(Isenring et al. (1998) J Gen Physiol 112(5):549−558)。これら4つのKCCの動態特性は一様でない。
【００４１】
これら4つのKCCは組織分布が異なる。KCC1はほとんど偏在しており、細胞容積調節における「ハウスキーピング」的な役割と一致している。KCC2は神経系および網膜のニューロン細胞に限られているが、in vitroにおいてレチノイン酸によるNT2奇形癌細胞のニューロンへの分化によって誘導され得る(Pleasure & Lee (1993) J Neurosci Res 35(6):585−602)。KCC4は広く発現するが、心臓および腎臓に最も豊富で、KCC3は筋肉、脳、肺、心臓、および腎臓で発現する。図２９Ａ〜２９Ｋに示したように、KCC3bは腎臓に優勢であるが、KCC3aは脳に優勢である。
【００４２】
このように本発明は、カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドをコードする単離および精製された核酸、単離および精製されたカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチド、細胞の内外でカリウムおよびクロライドを調節する上でカリウム−クロライド共輸送体が果たす役割の同定、ならびにかかる調節によって影響を受ける下流のプロセスの同定に関する。
【００４３】
カリウム−クロライド共輸送体は、上皮組織および腎臓における塩輸送、腎臓におけるカリウム分泌、細胞の容積調節、および細胞内クロライド濃度と細胞外クロライド濃度の調節をはじめ、複数の組織およびプロセスで重要な生理的役割を果たす。従って、カリウム−クロライド共輸送体は、特に高血圧、癲癇および鎌状赤血球貧血などの疾患に関して主要な薬理上の関心が持たれている。
【００４４】
これらの4つのヒトKCC遺伝子は実施例に記載のように異なる染色体上に位置している。KCC1は染色体16q22に、KCC2は染色体20q13に、KCC3は15q14に、そして、KCC4は5p15に存在する。KCC3はいくつかの一遺伝子性疾患およびポリジーン性疾患に関する機能的および位置的候補である。この遺伝子はアンデルマン症候群に関して重要な領域内にある(Casaubon et al. (1996) Am J Hum Genet 58(1):28−34)。この劣性疾患は脳梁の非形成、進行性の末梢神経障害、発達遅延、および精神遅滞を含む。これもまた15q14上にマッピングされており、アンデルマン症候群と対立遺伝的であると考えられる、より軽度の疾患である劣性家族性痙攣性不全対麻痺と重複するいくつかの表現型がある(Martinez Murillo et al. (1999) Neurology 53(1):50−56)。
【００４５】
これらの一遺伝子性疾患の他、KCC3をフランキングするマーカーは、強い遺伝的要素を持った2つの特発性癲癇亜型である若年性筋間代癲癇および家族性ローランド癲癇と関連づけられている(Neubauer et al. (1998) Neurology 51(6):1608−1612; Elmslie et al. (1997) Hum Mol Genet 6(8):1329−1334)。特発性全身性癲癇のよくある亜型である若年性筋間代癲癇患者(全ての癲癇の4〜10％)(Callenbach & Brouwer (1997) Clin Neurol Neurosurg 99(3):159−171)は筋間代発作と全身性強直−間代発作の両者に見舞われる。多くは健康な家族員の10％までという異常なEEGに加え、他の癲癇亜型の家族歴を有する。
【００４６】
転移性脳腫瘍および乳癌で、hKCC3遺伝子近傍の遺伝子マーカーに異型接合性が失われていることが報告されている(Wich et al. (1996) Oncogene 12(5):973−978)が、このことは、染色体15q14のこのセグメントが腫瘍抑制因子を含んでいることを示唆している。またKCC3近傍のマーカーは、遺伝性の慢性悪性腫瘍感受性とも関連づけられている(Tomlinson et al. (1999) Gastroenterology 116(4):789−795)。
【００４７】
このネフロンセグメントにおけるK+−Cl−共輸送の機能的根拠に加え(Amlal et al. (1994) American Journal of Physiology 267(6 Pt 1):C1607−1615)、その腎の太いヘンレ上行脚における局在性をもとにすると、hKCC4はNKCC2(Simon et al. (1996) Nat Genet 13(2):183−188)、ROMK (Simon et al. (1996) Nat Genet 14:152−156)、またはCLC−NKB (Simon et al. (1997) Nat Genet 17:171−178)の突然変異によらないバーター症候群の亜型の候補となる遺伝子である。連鎖解析では、苦味認識のバリエーションにおけるヒトKCC4を含むゲノム領域の連座を示す(Reed et al. (1999) Am J Hum Genet 64(5):1478−1480)。ヒト染色体5p15に対するシンテニーを基にすると、マウスKCC4は第13染色体の、「frings」マウス系統における聴源発作に関連した領域に位置付けられる(Skradski et al. (1998) Genomics 49(2):188−192)。
【００４８】
KCCに関する機能的および生理学的データはまた、これらの輸送体をヒト疾病に関連づける。このように鎌状赤血球貧血における赤血球のK+−Cl−共輸送は脱水とそれに続く赤血球の鎌状赤血球化に関連づけられる(Brugnara et al. (1986) Science 232(4748):388−390; De Franceschi et al. (1996) Blood 88(7):2738−2744)。近位尿細管をはじめとする尿細管細胞におけるKCC3およびKCC4の発現は腎臓の塩の運用におけるK+−Cl−共輸送、従って高血圧に関連づけられる。さらに、KCC4は緻密斑細胞で発現し、そこでその活性は糸球体の濾過およびレニン放出を調節することができる。
【００４９】
最後に、遺伝的にKCC2を欠損したマウスが発作性疾患を有するという知見(図３６)はこの輸送体を癲癇発生に関連づける。Cl−の電気化学的勾配の大きさは、神経伝達物質γ−アミノ酪酸(GABA)など、クロライドコンダクタンスに作用する刺激に対するニューロンの応答を調節する(Misgeld et al. (1986) Science 232(4756):1413−1415; Miles (1999) Nature 397(6716):215−216)。Cl−の著しい内向き輸送を備えたニューロンでは、細胞内Cl−濃度(Cl−i)は高く、GABAAレセプターの刺激は脱分極性であり、興奮性である。これに対し、外向きCl−輸送を備えた細胞では、GABAA活性は過分極性であり、阻害的である(Miles (1999) Nature 397(6716):215−216)。
【００５０】
ニューロンにおけるCl−の内向き輸送および外向き輸送はそれぞれNa+−K+−2Cl−共輸送体NKCC１およびKCCにコードされている。Misgeld et al. (1986) Science 232(4756):1413−1415; Clayton et al. (1998) Brain Res Dev Brain Res 109(2):281−292参照。中枢神経系におけるNKCC1は発達調節され、出生時および出生後最初の数日は高レベルで発現し、その後は発現が低下する(Hubner et al. (2001) Mech Dev 102:267−269)。これに対し、KCC2の発現は出生後の発達中に劇的に増加する(Lu et al. (1999) J Neurobiology 39:558−568; Rivera et al. (1999) Nature 397:251−255; Clayton et al. (1998) Brain Res Dev Brain Res 109(2):281−292)。これら発達中に起こることは、出生後最初の数週間のうちの、脱分極から過分極へのGABAの作用の切り替えと関連する。
【００５１】
その他の経路もニューロンのCl−のホメオスタシスに作用し得るが(Clayton etal. (1998) Brain Res Dev Brain Res 109(2):281−292)、最近の培養ニューロンにおけるアンチセンス実験は、KCC2ノックアウトマウスの表現型がそうであるように、KCC2を強く関連づける(Rivera et al. (1999) Nature 397:251−255)。結果として生じるGABAおよびその他の神経伝達物質に対するニューロン応答における変化はニューロンの発達およびニューロンの再構成の双方に重要な作用を持つと考えられる(Miles (1999) Nature 397(6716):215−216)。培養ニューロンに対する外傷も、ニューロンのCl−1に対して、またGABA応答に対して作用がある(van den Pol et al. (1996) J Neurosci 16 (13):4283−4292)。ニューロンのK+およびCl−を調節する上でのKCC2およびその他のK+−Cl−輸送体の中枢的な役割はこれらの輸送体を発作活動および癲癇の発生に強く関連づけるものである(Payne (1997) Am J Physiol 273:C1516−C1525)。しかし、KCCはまた細胞容積に対する作用を介して癲癇様活動にも作用し得る(Hochman et al. (1995) Science 270(5233):99−102)。
【００５２】
また、カリウム−クロライド共輸送は癲癇における癲癇様活動および鎌状赤血球貧血における赤血球の水和の発生に役割を果たしているとも考えられる。腎臓による塩吸収におけるカリウム−クロライド共輸送の明白な重要性はまた、カリウム−クロライド共輸送体を塩バランスおよび高血圧に関連づけるものである。イソ型特異的抗体による免疫蛍光はKCC3およびKCC4をマウス近位曲尿細管の基底外側膜に限局化する。このニューロンセグメントまたは他のニューロンセグメントにおける膨張により活性化されるK+−Cl−共輸送体はネフロンに沿った上皮を介する塩輸送に主要な役割を果たすと仮定される(Mount et al. (1999) J Biol Chem 274(23):16355−16362)。さらに、緻密斑細胞の基底外側膜にKCC4が局在することはこの輸送体を管状糸球体のフィードバックと管のレニン放出調節の双方に関連づけるが、これは両プロセスがこの極めて専門化したネフロンセグメントによるクロライドの感知および輸送を含むためである(Mount et al. (1997) J Membr Biol 158:177−186)。
【００５３】
このようにカリウム−クロライド共輸送体をターゲッティングする薬剤の応用には多数のもがある。生理学的および病態生理学的に意味のあるカリウム−クロライド共輸送を求める上で、情報が十分でないことが進行の妨げとなっている。従って、ヒトKCC2の、また種々の動物からのKCC3およびKCC4のクローニングが本分野の主要な進歩となる。カリウム−クロライド共輸送体の組織内での局在を研究するイソ型特異的抗体の開発は4種のカリウム−クロライド共輸送体イソ型の遺伝子阻害研究を助け、またその研究に重要なものとなる。また、4種のKCCの機能比較もそれらの調節および役割の研究にインパクトを与える。例えば、動態比較からは、イオン結合部位をはじめ、重要な構造−機能データが得られる。また、薬理比較でもイソ型特異的かつ種別特異的インヒビターおよびアクチベーターの開発がもたらされる。
【００５４】
要するに、ヒトにおいてKCC2を、マウスおよびヒトにおいてKCC3を、またマウスおよびヒトにおいてKCC4をコードする遺伝子の同定、それらのcDNAのクローニング、およびそれらのタンパク質の発現はカリウム−クロライドのホメオスタシスの調節に必要な分子ツールを提供し、種々の疾患の薬理処置および／または治療処置の開発に応用性を持つ。
【００５５】
A.  ポリペプチドおよび核酸
以下の詳細な説明および特許請求の範囲において、「KCC」、「KCC2」、「KCC3」および「KCC4」とは、カリウム−クロライド共輸送体をコードする核酸およびポリペプチドを含む。「KCC」、「KCC2」、「KCC3」および「KCC4」は無脊椎動物相同体を含み、好ましくはKCC、KCC2、KCC3およびKCC4核酸およびポリペプチドは真核生物源から単離されたものである。「KCC」、「KCC2」、「KCC3」および「KCC4」はさらに、限定されるものではないが、哺乳類および鳥類相同体をはじめ、カリウム−クロライド共輸送体系に属するものの脊椎動物相同体を含む。カリウム−クロライド共輸送体遺伝子系に属するものの代表的な哺乳類相同体としては、限定されるものではないが、ネズミおよびヒト相同体が挙げられる。本明細書において「KCC」は一般に開示されているKCC核酸およびポリペプチド、例えばKCC2、KCC3、KCC4またはアフリカツメガエルKCC(xKCC)のいずれをもさし得る。
【００５６】
「KCC遺伝子産物」、「KCC2遺伝子産物」「KCC3遺伝子産物」、「KCC4遺伝子産物」、「KCCタンパク質」、「KCC2タンパク質」、「KCC3タンパク質」、「KCC4タンパク質」、「KCCポリペプチド」、「KCC2ポリペプチド」、「KCC3ポリペプチド」、および「KCC4ポリペプチド」はアミノ酸配列を有するペプチドをさし、これらは実質的に目的生物由来の天然のアミノ酸配列と同一であり、かつ、それらがカリウム−クロライド共輸送体のアミノ酸配列の全てまたは一部を含むか、あるいはKCC、KCC2、KCC3またはKCC4ポリペプチドに対して作製された抗体と交差反応するか、あるいは天然のアミノ酸配列またはタンパク質の生物活性の全てまたはいくらかを保持するという点で生物学的に活性である。かかる生物活性には免疫原性を含み得る。
【００５７】
「KCC遺伝子産物」、「KCC2遺伝子産物」「KCC3遺伝子産物」、「KCC4遺伝子産物」、「KCCタンパク質」、「KCC2タンパク質」、「KCC3タンパク質」、「KCC4タンパク質」、「KCCポリペプチド」、「KCC2ポリペプチド」、「KCC3ポリペプチド」、および「KCC4ポリペプチド」はまたカリウム−クロライド共輸送体分子の類似体を含む。「類似体」とは、DNAまたはペプチド配列が本明細書に開示される配列に対して変更を含んでもよいが、これらの配列の生物活性の全てまたはいくらかをなお保持していることを意図するものである。類似体は本明細書に開示されるようなゲノムヌクレオチド配列に由来するものであってもよいし、他の生物に由来するものであってもよいし、あるいは合成によって作り出すこともできる。当業者ならば、まだ開示されていない、あるいは発見されていない他の類似体を用いてもカリウム−クロライド共輸送体類似体を設計および／または構築することができるということが分かるであろう。「KCC遺伝子産物」、「KCC2遺伝子産物」「KCC3遺伝子産物」、「KCC4遺伝子産物」、「KCCタンパク質」、「KCC2タンパク質」、「KCC3タンパク質」、「KCC4タンパク質」、「KCCポリペプチド」、「KCC2ポリペプチド」、「KCC3ポリペプチド」、および「KCC4ポリペプチド」には、必ずしも天然のカリウム−クロライド共輸送体遺伝子産物のアミノ酸配列の全てまたは実質的に全てを含む必要はない。より短いまたはより長い配列も本発明で使用されると考えられ、短い配列は本明細書ではセグメントと呼ぶ。このように、「KCC遺伝子産物」、「KCC2遺伝子産物」「KCC3遺伝子産物」、「KCC4遺伝子産物」、「KCCタンパク質」、「KCC2タンパク質」、「KCC3タンパク質」、「KCC4タンパク質」、「KCCポリペプチド」、「KCC2ポリペプチド」、「KCC3ポリペプチド」、および「KCC4ポリペプチド」はまた、本発明の配列を含む融合または組換えカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドおよびタンパク質も含む。かかるタンパク質を製造する方法は当技術分野で公知である。
【００５８】
「KCC遺伝子」、「KCC2遺伝子」「KCC3遺伝子」、「KCC4遺伝子」、「KCC遺伝子配列」、「KCC2遺伝子配列」、「KCC3遺伝子配列」、「KCC4遺伝子配列」、「KCC遺伝子セグメント」、「KCC2遺伝子セグメント」、「KCC3遺伝子セグメント」、および「KCC4遺伝子セグメント」とは、上記定義のカリウム−クロライド共輸送体遺伝子産物、タンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と実質的に同一ないずれのDNA配列もさし、いずれの組合せの連結制御配列を含んでもよい。この用語はまた、かかるDNA配列と相補的なRNAまたはアンチセンス配列もさす。本明細書において「DNAセグメント」とは、特定の種の全ゲノムDNAから単離されたDNA分子をさす。さらに、カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドをコードするDNAセグメントとは、KCC2、KCC3またはKCC4コード配列を含み、なお、ヒトなどの供給源種の全ゲノムDNAから単離または精製されたDNAセグメントをさす。「DNAセグメント」には、DNAセグメントおよびかかるセグメントのより小さな断片、ならびに例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどをはじめ組換えベクターも含まれる。
【００５９】
「実質的に同一」とは、KCC、KCC2、KCC3もしくはKCC4遺伝子産物、またはアミノ酸配列、あるいはKCC、KCC2、KCC3もしくはKCC4遺伝子または核酸配列のいずれかを定義するのに用いる場合、特定の配列が、1以上の欠失、置換または付加により天然型のKCC、KCC2、KCC3またはKCC4の配列とは異なり、その正味の作用は天然型の遺伝子、遺伝子産物、または配列の生物活性の少なくともいくらかを保持していることを意味する。かかる配列としては「変異」配列、すなわち、生物活性はある程度変化しているがもとの生物活性を少なくともいくらか保持している配列を含む。
【００６０】
あるいは、DNA類似体配列は、もし、(a)そのDNA類似体配列が天然のKCC、KCC2、KCC3またはKCC4遺伝子のコード領域に由来していれば、あるいは(b)そのDNA類似体配列がストリンジェントな条件下で(a)のDNA配列とハイブリダイズ可能であり、かつ、生物学的に活性なKCC、KCC2、KCC3またはKCC4遺伝子産物をコードしていれば、あるいは(c)そのDNA配列が選択的遺伝子コードの結果として(a)および／または(b)で定義されたDNA類似体配列と縮重していれば、本明細書で開示された特定のDNA配列と「実質的に同一」である。実質的に同一な類似体タンパク質は、対応する天然型タンパク質配列と約60％を超えて同一であるものである。それより同一性の程度が低いが匹敵する生物活性を有する配列は同等物とみなされる。核酸配列を決定する上で、実質的に同じアミノ酸配列をコードし得る目的核酸配列は全て、生物学上機能的に同等なものを作り出すコドン配列の違いや同等なアミノ酸の置換に関わらず、対照ヌクレオチド配列と実質的に同等であるとみなされる。
【００６１】
DNAまたはペプチド配列の配列同一性または類似％は、例えばウイスコンシン州立大学遺伝学者コンピューターグループから提供されるGAPコンピュータープログラムを用いて配列情報を比較することで求めることができる。GAPプログラムは、Smith et al. (1981) Adv Appl Math 2:482によって総説されているように、Needleman et al. (1970) J Mol Biol 48:443のアライメント法を用いている。要するに、GAPプログラムは、同じである整列記号(すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸)の数を、2者の配列のうち短い方の全記号数で割ったものとして類似性を定義する。GAPプログラムの好ましいパラメーターは、末端ギャップにペナルティーを課さないデフォルトパラメーターである。Schwartz et al. (1979) Nuc Acids Res 6(2):745−755; Gribskov et al. (1986) Nuc Acids Res 14(1):327−334参照。
【００６２】
ある実施形態では、本発明はKCC、KCC2、KCC3およびKCC4遺伝子、およびそれらの個々の配列内に、KCC、KCC2、KCC3およびKCC4遺伝子のものと実質的に同じ配列を含む遺伝子産物、またはその対応するタンパク質の使用に関する。「KCC、KCC2、KCC3またはKCC4遺伝子のものと実質的に同じ配列」とは、その配列がKCC、KCC2、KCC3またはKCC4遺伝子の一部と実質的に同一または実質的に類似であって、KCC、KCC2、KCC3もしくはKCC4タンパク質、またはKCC、KCC2、KCC3もしくはKCC4遺伝子のものと同一でない、あるいは生物学上の機能的同等物ではない塩基またはアミノ酸(DNAであれタンパク質であれ)も少数含むことを意味する。「生物学上の機能的同等物」とは、当技術分野では十分に理解され、本明細書でも重ねて定義する。ヌクレオチド配列は、それらが、KCC、KCC2、KCC3またはKCC4遺伝子のヌクレオチド配列と同一な核酸残基の約70％から約80％の間またはそれ以上、好ましくは約81％から約90％の間、あるいはいっそう好ましくは約91％から約99％の間で有する場合に「実質的に同等」という。同様に、KCC、KCC2、KCC3またはKCC4ポリペプチドのアミノ酸配列と同一、または機能上同等、または生物学上機能的同等なアミノ酸配列を約35％、または45％、あるいは好ましくは45〜55％、あるいはより好ましくは55〜65％、あるいは最も好ましくは65％以上有するペプチド配列が「実質的に同等」な配列となる。
【００６３】
KCC、KCC2、KCC3またはKCC4遺伝子産物、および機能上同等なコドンを有するKCC、KCC2、KCC3またはKCC4をコードする核酸配列も本発明に含まれる。「機能上同等なコドン」とは、本明細書ではセリンに対するACGとAGUなど、同じアミノ酸をコードするコドンをさすのに用いられる。このように、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15および112で示される配列例をいう場合、出願者らは配列番号1、3、5、7、9、11、13、15および112の配列例に表２の機能上同等なコドンの置換も意図する。このように出願者らは、かかる置換を含むが便宜のためにそれらの全容については本明細書では示さないアミノ酸および核酸配列を所有している。
【００６４】
【表２】
2005522179.tif 000004
【００６５】
また、当業者ならば、アミノ酸および核酸配列が付加的なNBまたはC末端アミノ酸、または5'もしくは3'核酸配列などの付加的な残基を含んでもよく、その配列がタンパク質発現が関連する生物学的なタンパク質活性を保持する限り、なお本明細書に開示の配列の1つで実質的に示される通りであることも分かるであろう。末端配列の付加は特に、例えばコード領域の5'または3'いずれかの部分をフランキングする種々の非コード配列を含み得るか、または遺伝子内に存在することが知られている種々の内部配列、すなわちイントロンを含み得る核酸配列に当てはまる。
【００６６】
本発明はまた、本発明の配列に相補的なヌクレオチドセグメントの使用も包含する。「相補的な」核酸配列とは、標準的なワトソン−クリック相補性規則に従って塩基対を形成するものである。本明細書において「相補的配列」とは、上記に示したように同じヌクレオチドの比較によって評価できるように実質的に相補的な核酸配列を意味するか、あるいは本明細書に記載のものなどの相対的にストリンジェントな条件下で目的核酸セグメントとハイブリダイズし得るものと定義される。考えられる相補的核酸セグメントの特定の例としてアンチセンスオリゴヌクレオチドがある。
【００６７】
相補的配列を評価し、かつ／または相補的ヌクレオチド配列を単離する当技術分野での1つの技術としてハイブリダイゼーションがある。当業者ならば容易に分かることであるが、核酸ハイブリダイゼーションは、塩基組成、相補鎖の長さ、ハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基のミスマッチの数の他、塩濃度、温度、または有機溶媒といった条件によって影響を受ける。ストリンジェントな温度条件としては、一般に約30℃を超える、典型的には約37℃を超える、好ましくは約45℃を超える温度が挙げられる。ストリンジェントな塩濃度条件としては、通常約1,000mM未満、典型的には約500mM未満、好ましくは約200mM未満である。しかし、単独のパラメーターの基準よりもパラメーターの組合せの方が遙かに重要である。例えば、Wethmur & Davidson (1968) J Mol Biol 33:349−370参照。高いレベルの相同性を含む配列を同定および／または単離するのに適当なハイブリダイゼーション条件の決定は当技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York参照。
【００６８】
高ストリンジェント条件を特定するのを目的とする場合、好ましい条件は塩濃度約200mMおよび温度約45℃である。かかるストリンジェント条件の一例は、4XSSC、65℃でハイブリダイゼーションした後、0.1XSSC中65℃で1時間洗浄するものである。もう一例のストリンジェントなハイブリダイゼーションスキームでは、50％ホルムアミド、4XSSC、42℃を用いる。本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、高ストリンジェンシー条件、例えば、6XSSC、0.2％ポリビニルピロリドン、0.2％フィコール、0.2％ウシ血清アルブミン、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、100μg/mlサケ精子DNAおよび15％ホルムアミド、68℃を意味する。配列類似性を有する核酸は低ストリンジェンシー条件、例えば、50℃にて10XSSC(0.9M NaCl/0.09Mクエン酸ナトリウム)下でのハイブリダイゼーションにより検出され、55℃、1XSSC中で洗浄しても結合したままである。配列同一性はストリンジェントな条件下、例えば、50℃以上、0.1XSSC(9mM NaCl/0.9mMクエン酸ナトリウム)下でのハイブリダイゼーションにより決定することができる。
【００６９】
与えられたKCC配列と実質的に同一な核酸、例えば遺伝的に遺伝子の型が変更された対立遺伝子変異体などは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で与えられたKCC配列と結合する。プローブ、特に標識したDNA配列プローブを用いれば、相同な、あるいは関連の遺伝子を単離することができる。相同遺伝子の供給源は、例えば霊長類、特にヒト、ラットおよびマウスなどの齧歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、酵母、線虫など、いずれの種であってもよい。
【００７０】
哺乳類種、例えばヒト、マウスおよびアフリカツメガエルの間では、相同体は実質的配列類似性、すなわち、ヌクレオチド配列間で少なくとも75％の配列同一性を有する。配列類似性は参照配列を基に算出されるが、これは保存モチーフ、コード領域、フランキング領域などのようなより大きな配列のサブセットであってもよい。参照配列は通常は少なくとも約18ヌクレオチドの長さ、より通常には少なくとも約30ヌクレオチドの長さであり、比較される完全配列に及んでもよい。配列解析アルゴリズムは当技術分野で公知であり、Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215:403−410に記載のBLASTなどがある。本明細書で提供される配列はデータベース検索でKCC関連タンパク質およびKCC相同タンパク質を認識するのに不可欠なものである。
【００７１】
生物学的レベルでは、同一とは、すなわちある遺伝子ファミリーのあるファミリーメンバーにおいて同じ相対的位置にある同じアミノ酸であることである。相同性および類似性は一般にもっと広い言葉として見られる。例えば、生化学上同等なアミノ酸、例えばロイシンとイソロイシン、またはグルタミン酸／アスパラギン酸は同じ位置に存在することができ、これらはそれ自体同一ではないが、生化学上「同等」である。本明細書に開示されるように、これらは保存的相違または保存的置換と呼ばれる。これは、コードされたアミノ酸を変化させずにヌクレオチド配列を変更する、例えばTCCからTCA(双方ともセリンをコードする)へ変更するDNAレベルにおける保存的突然変異とは異なる。
【００７２】
このように本発明に開示されるKCCは相同なタンパク質であるが、本明細書でパーセンテージという場合、同一％を意味する。本明細書でいう同一％はGeneWorksプログラム(Oxford Molecular, Inc. of Campbell, California)および／またはNCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)のBLASTプログラムを用いたアライメントによって得たのものである。一般に用いられる別のアライメントとしてはCLUSTALWというものがあり、これはThompson et al. (1994) Nucleic Acids Res 22(22):4673−4680その他に記載されている。
【００７３】
プローブ配列はまた、ある条件下で二重らせんDNAと特異的にハイブリダイズして三重らせんまたはより高次のDNA複合体も形成し得る。かかるプローブの製造および好適なハイブリダイゼーション条件は本明細書に開示されているし、また、当技術分野で公知である。
【００７４】
「遺伝子」は単純に機能的タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドコード単位をいうのに用いられる。当業者ならば分かるであろうが、この機能とはゲノム配列およびcDNA配列を双方を含む。本明細書ではゲノムおよびcDNA配列の好ましい具体例を開示している。
【００７５】
特定の実施形態では、本発明は、本発明のそのアミノ酸配列内に含むカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドをコードする単離されたDNAセグメント、およびDNA配列を組み込んだ組換えベクターに関する。他の特定の実施形態では、本発明は、ヒトカリウム−クロライド共輸送体のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAセグメントを組み込んだ組換えベクターに関する。
【００７６】
A.1.  生物学上の機能的同等物
上記のように、改変および変化は本明細書に記載のカリウム−クロライド共輸送体タンパク質およびペプチドの構造内で起こる可能性があり、さらに好ましい、あるいは望ましい特徴を有する分子を構築し得る。例えば、あるタンパク質構造においてあるアミノ酸は、例えば細胞核の構造との相互作用能の目に見える欠損なく、他のアミノ酸と置換可能である。タンパク質の生物学上の機能的活性を定義するのはタンパク質の相互作用能および性質であるので、同じ特性、増強された特性、阻害的な特性を有するタンパク質を得るには、タンパク質配列(または、それをコードする核酸配列)において特定のアミノ酸配列置換を行えばよい。かかる特性は天然型タンパク質の通常標的との相互作用によって達成できるが、この場合に限らず、本発明の生物活性は特定の作用機構に限定されるものではない。このように、本発明によれば、カリウム−クロライド共輸送体タンパク質およびペプチド配列、またはその基礎をなす核酸配列においてそれらの生物利用度または活性に目に見える欠損なく、種々の変異を作り出すことができる。
【００７７】
本明細書において生物学上機能的に同等なペプチドとは、特定のアミノ酸(大部分または全てでない)が置換され得るペプチドである。このように、配列番号1、3、5、７、9、11、13、15および／または112で示される配列例に関しては、出願者らは配列番号1、3、5、７、9、11、13、15および／または112の配列例における、本明細書に記載の生物学上同等なアミノ酸をコードするコドンの置換を意図する。従って、出願者らは、便宜のためにここではそれらの全容を示さないが、かかる置換を含むアミノ酸および核酸配列を所有している。
【００７８】
あるいは、機能上同等なタンパク質またはペプチドは組換えDNA技術を用いて作り出すこともでき、ここでは、交換されるアミノ酸の特性を考慮することで(例えば、配列番号1〜2のhKCC4についてはアミノ酸53、86および／または1028におけるLeuのIleへの置換；配列番号3〜4のhKCC3a2mについてはアミノ酸35、472および／または1075におけるLeuのIleへの置換；配列番号5〜6のmKCC3a2mについてはアミノ酸102、631および／または1113におけるLeuからIleへの置換；配列番号7〜8のmKCC3aについてはアミノ酸35、308および／または848におけるLeuからIleへの置換；配列番号9〜10のmKCC3bについてはアミノ酸66、537および／または974におけるLeuからIleへの置換；配列番号11〜12のhKCC2についてはアミノ酸120、358および／または916におけるLeuからIleへの置換；配列番号13〜14のmKCC4についてはアミノ酸71、467および／または639におけるLeuまらIleへの置換；および配列番号15〜16のhKCC3aについてはアミノ酸35、346および／または789におけるLeuからIleへの置換)、タンパク質構造の変化を操作することができる。人為的にデザインした変異は位置指定突然変異技術の適用によって導入し、例えば、タンパク質の免疫原性に改良を施したり、あるいはKCC輸送活性またはその他の活性を分子レベルで調べるためにKCC変異体を試験したりすることができる。
【００７９】
本明細書に記載のカリウム−クロライド共輸送体タンパク質およびペプチドを改変する上で使用できるものなどのアミノ酸置換は一般にアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づく。アミノ酸側鎖置換基の大きさ、形状、および種類の分析によれば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンはいずれも正電荷残基であり；アラニン、グリシンおよびセリンはいずれも同様の大きさであり；また、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはいずれも全般的に同じ形状であることが明らかである。従って、これらの条件を基に、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；また、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは本明細書では生物学上の機能的同等物であると定義される。当業者ならば、他の生物学上機能的に同等な変化も分かるであろう。
【００８０】
生物学上機能的に同等なアミノ酸置換を作製する際には、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮すればよい。アミノ酸は各々それらの疎水性および電荷特性を基にあるハイドロパシーインデックスが割り当てられている、これらはイソロイシン(+4.5)、バリン(+4.2)、ロイシン(+3.8)、フェニルアラニン(+2.8)、システイン(+2.5)、メチオニン(+1.9)、アラニン(+1.8)、グリシン(−0.4)、トレオニン(−0.7)、セリン(−0.8)、トリプトファン(−0.9)、チロシン(−1.3)、プロリン(−1.6)、ヒスチジン(−3.2)、グルタミン酸(−3.5)、グルタミン(−3.5)、アスパラギン酸(−3.5)、アスパラギン(−3.5)、リジン(−3.9)およびアルギニン(−4.5)である。
【００８１】
タンパク質に相互作用性の生物機能を付与する上でのハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は当技術分野で一般に理解されている(Kyte et al. (1982) J Mol Biol 157:105、出典明示により本明細書の一部とする)。あるアミノ酸は同じハイドロパシーインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸で置換でき、かつ、おな同じ生物活性を保持することが知られている。ハイドロパシーインデックスをもとに変異を作出する際には、そのハイドロパシーインデックスがもとの値の±2以内であるアミノ酸置換が好ましく、もとの値の±1以内であるのが特に好ましく、もとの値の±0.5以内であるのがよりいっそう特に好ましい。
【００８２】
また当業界では、好ましいアミノ酸の置換は親水性に基づいて効率的になすことができることも分かっている。出典明示により本明細書の一部とする米国特許第4,554,101号には、その隣接アミノ酸の親水性に司られているタンパク質の最大局部的平均親水性はその免疫原性および抗原性と、すなわち、そのタンパク質の生物特性と相関していると述べられている。アミノ酸は同等の親水性値を有する別のものに置換可能であり、なお生物学上同等なタンパク質を得ることができると思われる。
【００８３】
米国特許第4,554,101号に詳細に記載されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン(+3.0)、リジン(+3.0)、アスパラギン酸(+3.0±1)、グルタミン酸(+3.0±1)、セリン(+0.3)、アスパラギン(+0.2)、グルタミン(+0.2)、グリシン(O)、トレオニン(−0.4)、プロリン(−0.5±1)、アラニン(−0.5)、ヒスチジン(−0.5)、システイン(−1.0)、メチオニン(−1.3)、バリン(−1.5)、ロイシン(−1.8)、イソロイシン(−1.8)、チロシン(−2.3)、フェニルアラニン(−2.5)、トリプトファン(−3.4)。
【００８４】
同等の親水性値に基づいて変異を作出する際には、その親水性値はもとの値の±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、もとの値の±1以内であるのが特に好ましく、もとの値の±0.5以内であるのがよりいっそう特に好ましい。
【００８５】
考察をアミノ酸変異から生じる機能的に同等なポリペプチドに絞ったところ、これらの変異は、遺伝子コードが縮重していて2つ以上のコドンが同じアミノ酸をコードする場合があることも考慮に入れて、そのコードDNAの変更によって達成し得る。
【００８６】
このように、本発明は、配列番号1〜16および112〜113の特定の核酸およびアミノ酸配列に限定されないということも分かるであろう。従って、組換えベクターおよび単離されたDNAセグメントはカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドコード領域自体を含むか、基本のコード領域に選択された変更または改変を有するコード領域を含むか、あるいは、やはりカリウムークロライド共輸送体ポリペプチドコード領域を含むか、または変異型のアミノ酸配列を有する生物学上機能的に同等なタンパク質もしくはペプチドをコードし得るより大きなポリペプチドを含む。カリウム−クロライド共輸送体の生物活性は、例えば、本明細書で開示されるように、目的DNAをアフリカツメガエル卵母細胞へ形質転換した後に86Rb+の取り込み量を測定することで求めることができる。
【００８７】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16および113のいずれかのアミノ酸を含むタンパク質をコードするDNA配列を組み込んだ単離されたDNAセグメントおよび組換えベクターを用いる遺伝子療法に関する。他の特定の実施態様では、本発明は、ヒトまたはマウス組織由来のカリウム−クロライド共輸送体タンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAを組み込んだ単離されたDNAおよび組換えDNAベクターに関する。他のある実施態様では、本発明は、実質的に配列番号1、3、5、7、9、11、13、15および／または112のいずれかで示される核酸配列を含む単離されたDNAセグメントおよび組換えベクターに関する。
【００８８】
本発明の核酸セグメントはそのコード配列それ自体の長さに関わらず、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、その他のコードセグメントなどのその他のDNA配列と組み合わせ可能であるので、それらの全長は極めて様々である。従って、ほとんどどんな長さの核酸断片でも使用できると考えられるが、その全長は好ましくは意図される組換えDNAプロトコールにおける調製および使用の容易さによって制限される。例えば、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15および／または112のいずれかで示される核酸配列に、約10ヌクレオチドといった相補的な短いストレッチ核酸断片を含むものや、10,000ないし5,000bpの長さまでの核酸断片が調製できるが、ある例では3,000が好ましい。全長が約4,000、3,000、2,000、1,000、500、200、100および約50bpの長さのDNA断片も有用であると考えられる。
【００８９】
本発明のDNAセグメントは生物学上機能的に同等なカリウム−クロライド共輸送体タンパク質およびペプチドを包含する。かかる配列はコドンの重複性と、核酸配列および従ってコードされるタンパク質内に天然に存在することが知られている機能的同等性との結果として生じ得るものである。あるいは、機能的に同等なタンパク質またはペプチドは組換えDNA技術の適用によって作り出すことができ、そこでは交換されるアミノ酸の特性を考慮してタンパク質構造の変化を操作することができる。変異は位置指定突然変異誘発技術の適用によって導入することができ、例えば、タンパク質の抗原性に改変を導入したり、カリウム−クロライド共輸送体の調節における活性、またはその他の活性を分子レベルで調べるためにカリウム−クロライド共輸送体変異体を試験したりすることができる。位置指定突然変異誘発技術は当業者に公知であり、本明細書にも開示されている。
【００９０】
本発明はさらに、カリウム−クロライド共輸送体コード領域が、精製または免疫検出目的などについて所望の機能を有するその他のタンパク質またはペプチドと同じ発現ユニット内に配置されている、融合タンパク質およびペプチドを包含する。
【００９１】
組換えベクターは本発明のさらなる重要な態様をなす。特に有用なベクターはDNAセグメントのコード部分がプロモーターの制御下に置かれているものである。このプロモーターは、例えば組換えクローニングおよび／またはPCR技術および／または当技術分野で公知のその他の配列を本明細書に開示される組成とともに用いて、コードセグメントまたはエクソンの上流にある5'非コード配列を単離することで得られるような、カリウム−クロライド共輸送体遺伝子と天然に連結しているものであり得る。
【００９２】
その他の実施形態では、コードDNAセグメントを組換えまたは異種プロモーターの制御下に置くことによりある利点が得られると考えられる。本明細書において、組換えまたは異種プロモーターとは、その天然環境でカリウム−クロライド共輸送体とは通常連結していないプロモーターである。かかるプロモーターは細菌、ウイルス、真核生物または哺乳類細胞から単離されたプロモーターが含まれる。本来、発現のために選択された細胞種においてDNAセグメントの発現を効果的に指示するプロモーターを用いることが重要である。タンパク質発現のためのプロモーターと細胞種の組合せの使用は、分子生物学の分野の熟練者には一般に知られている(例えば、Sambrook et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York参照)。用いられるプロモーターは構成的なものでも誘導性のものでもよく、組換えタンパク質またはペプチドの大規模生産において有利であるような、導入されたDNAセグメントの高レベルの発現を指示するのに適当な条件下で使用できる。高レベル発現における使用に対して考えられる適当なプロモーター系としては、限定されるものではないが、ワクシニアウイルスプロモーターおよびバキュロウイルスプロモーターが挙げられる。
【００９３】
もう1つの実施形態では、本発明は、本発明に従う生物学的に活性なカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。また好ましくは、本発明の発現ベクターはヒトまたはマウスカリウム−クロライド共輸送体遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。より好ましくは、本発明の発現ベクターは配列番号2、4、6、8、10、12、14、16および113のいずれかのアミノ酸残基配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。より好ましくは、本発明の発現ベクターは配列番号1、3、5、7、9、11、13、15および／または112のいずれかのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。よりいっそう好ましくは、本発明の発現ベクターはエンハンサー−プロモーターに作動可能なように連結されたポリヌクレオチドを含む。なおより好ましくは、本発明の発現ベクターは原核プロモーターに作動可能なように連結されたポリヌクレオチドを含む。あるいは、本発明の発現ベクターは真核生物プロモーターであるエンハンサー−プロモーターに作動可能なように連結されたポリヌクレオチドを含み、この発現ベクターはさらにカルボキシ末端アミノ酸の3'で、コードされるポリペプチドの転写ユニット内にあるポリアデニル化シグナルを含む。
【００９４】
なおもう1つの実施形態では、本発明は、本発明に従う生物学的に活性なカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされた組換え宿主細胞を提供する。配列番号1〜16および112〜113は例として脊椎動物、ヒト、マウスおよびアフリカツメガエル由来のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。また、相同または生物学上機能的に同等なポリヌクレオチド、ならびに特にラットおよびウシ相同体をはじめとする他の脊椎動物に見られるカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドも本発明によって意図される。好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は、ヒトまたはマウスカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされている。より好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は配列番号1〜16および112〜113のいずれかをコードする、またはそれらのいずれかで示されるポリヌクレオチド配列でトランスフェクトされている。最も好ましくは、組換え宿主細胞は哺乳類細胞である。
【００９５】
もう1つの態様では、本発明の組換え宿主細胞は、寄生虫細胞または細菌細胞をはじめとする原核生物宿主細胞である。好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は細菌細胞であり、好ましくは大腸菌(Escherichia coli)細胞株である。より好ましくは、組換え宿主細胞はその組換え宿主細胞で機能的な調節シグナルの転写制御下にポリヌクレオチドを含み、ここでこの調節シグナルは必要な全ての転写および転写後修飾を可能とする方法で、カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドの発現を適宜制御する。
【００９６】
さらにもう1つの実施形態では、本発明は、本発明に従い生物学的に活性なカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトして形質転換宿主細胞を作製し、さらにポリペプチドの発現に十分な生物学的条件下で形質転換宿主細胞を維持することを含む、カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドを作製する方法を提供する。このポリペプチドは所望により好適ないずれかの技術を用いて単離してもよい。宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。好ましくは、原核細胞は大腸菌の細菌細胞である。より好ましくは、形質転換細胞へトランスフェクトされるポリヌクレオチドは配列番号1、3、5、7、9、11、13、15および／または112のいずれかのヌクレオチド塩基配列を含む。配列番号1〜16および112〜113は代表的な脊椎動物、ヒト、マウスおよびアフリカツメガエルのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。また、その他の脊椎動物、詳しくは温血脊椎動物、より詳しくは哺乳類に見られる相同体または生物学上同等なカリウム−クロライド共輸送体ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、よりいっそう詳しくはウシおよびラット相同体も本発明が意図するものである。
【００９７】
上記のように、組換えカリウム−クロライド共輸送体タンパク質およびペプチドを作製するための発現の実施形態に関しては、より長いDNAセグメントが使用されることが最も多く、全カリウム−クロライド共輸送体タンパク質をコードするDNAセグメント、その機能的ドメインまたは切断産物が最も好ましいと考えられる。しかし、抗カリウム−クロライド共輸送体抗体を作製するのに使用できるような、カリウム−クロライド共輸送体ペプチドまたはコア領域の発現を指示するより短いDNAセグメントの使用も本発明の範囲内にあると考えられる。
【００９８】
約15ないし約50アミノ酸の長さ、またはより好ましくは約15ないし約30アミノ酸の長さのペプチド抗原をコードするDNAセグメントが特に有用であると考えられる。ペプチドをコードするDNAセグメントの最低コード長は一般に約45ないし約150、または約90ヌクレオチドまでのオーダーである。全長タンパク質をコードするDNAセグメントの最低コード長は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、および112のいずれかに従うタンパク質に関しては約4,000または5,000ヌクレオチド長のオーダーである。本発明のDNAセグメントは300、400、500、1,000、1,500、2,000、3,000、3,500、4,000、4,500、または5,000ヌクレオチドまでを含み得る。本発明のペプチドは10、20、50、100、200、300、400、500、750、1,000、または1,500までのアミノ酸を含み得る。
【００９９】
A.2.  配列改変技術
本明細書に記載のカリウム−クロライド共輸送体タンパク質およびペプチドの改変は、位置指定突然変異誘発をはじめとする当技術分野で公知の技術を用いて実施できる。位置指定突然変異誘発は、基礎となるDNAの特定の突然変異誘発を介した個々のペプチド、または生物学上機能的に同等なタンパク質もしくはペプチドの作製に有用な技術である。この技術はさらに、例えば、1以上のヌクレオチド配列変異をDNAに導入することでこれまでの1以上の観点を組み込んだ配列変異体の作製および試験を容易にする方法を提供する。位置指定突然変異誘発は所望の突然変異のDNA配列、ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドをコードする特定のオリゴヌクレオチド配列の使用による突然変異の作出を可能として、トラバースされる欠損連結部の両側に安定した二重らせんを形成するに十分な大きさおよび配列が複合したプライマー配列を提供する。典型的には約17ないし30ヌクレオチドの長さのプライマーが好ましく、その配列の連結部の両側の約5ないし10残基が変更されている。
【０１００】
一般に、刊行物で例示されるように、位置指定突然変異誘発の技術は当技術分野で周知であり(例えば、Adelman et al. (1983) DNA 2:183; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)、一般に当業者に公知の種々の方法で達成することができる。
【０１０１】
A.3.  その他の構造同等物
本発明のカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドの構造に関する知見は被験体においてこれらのタンパク質の作用機構を調べる手段を提供する。例えば、これらのタンパク質の種々の基質分子への結合は種々のコンピューターモデルによって推定することができる。かかる結合が実際に起こることを確認した上で、このタンパク質構造の知見により次ぎに、カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドの基質への機能的結合を模倣する小分子のデザインおよび合成が可能となる。これは「合理的な」薬剤デザインの方法となる。
【０１０２】
このように本発明に従い、合理的薬剤デザインにおける本発明の単離および精製されたカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドの使用が意図される。さらなる合理的薬剤デザイン技術が、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第5,834,228号および同第5,872,011号に記載されている。
【０１０３】
このように、本明細書に記載のペプチジル化合物に加え、本発明はまたその他の立体的に同等な化合物がペプチド構造の鍵となる部分を模倣するよう処方できることを意図する。かかる化合物は本発明のペプチドと同様に使用でき、ゆえに機能的同等物でもある。構造上の機能的同等物の作出は当業者に公知のモデリングおよび化学デザインの技術によって達成できる。かかる立体的に同等な構築物は全て本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１０４】
B.  遺伝子産物の導入
本発明によれば、KCC遺伝子自体がKCC遺伝子産物を導入するために使用されるが、導入の便宜な方法は、所望の遺伝子を連結されているその制御配列とともに組み込む組換えベクターの使用によるものである。組換えベクターの作製は当業者に周知であり、例えば、出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるSambrook et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkなどの多くの参考文献に記載されている。
【０１０５】
B.１.  ベクターの構築
発現されるDNAコード配列(この場合、カリウム−クロライド共輸送体遺伝子産物をコードするもの)はプロモーターに隣接していてその制御下にあるベクターに置かれる。当技術分野では、コード配列をかかるプロモーターの制御下にもっていくには、一般に、発現される遺伝子産物の転写読み取り枠の転写開始部位の5'末端を選択されたプロモーターの「下流」(すなわち3')の約1から約50のヌクレオチド間に配置する。
【０１０６】
また、もし元の挿入DNA内に含まれない場合には、ベクターの転写ユニットに適当なポリアデニル化部位(例えば、5'−AATAAA−3')を組み込むことを意図することができる。典型的にはこれらのポリA付加部位は転写末端の前の位置で、コード配列の約30ないし2000ヌクレオチド「下流」に置かれる。
【０１０７】
特定の遺伝子の制御配列の使用が好ましいが、他の制御配列も、処置される細胞の遺伝子型に適合する限り使用できる。このように、例示すれば例えばSV40初期プロモーター、レトロウイルス由来の長い末端反復プロモーター、アクチンプロモーター、熱ショックプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどをはじめとする他の有用なプロモーターも挙げられる。
【０１０８】
当技術分野では公知であるが、プロモーターは典型的には転写が開始する地点(すなわち転写開始部位)の上流(すなわち5')約100ヌクレオチド対以内のDNA分子領域である。この領域は典型的には種々の遺伝子において同じ相対的位置にある数種のDNA配列エレメントを含む。
【０１０９】
別の種の個々の転写調節配列エレメントとしてはエンハンサーがある。エンハンサーは特定のコード領域または遺伝子に時間、位置、および発現レベルの特異性を課す。エンハンサーの主な働きは、そのエンハンサーに結合する1以上の転写因子を含む細胞内のコード配列の転写レベルを増強することである。エンハンサーは、プロモーターが存在する限り、転写開始部位から様々な距離に置かれたときに機能することができる。
【０１１０】
本明細書において「エンハンサー−プロモーター」とは、エンハンサーとプロモーターエレメントの両者を含む複合ユニットを意味する。エンハンサー−プロモーターは、少なくとも1つの遺伝子産物をコードするコード配列に作動可能なように連結される。本明細書において「作動可能なように連結される」とは、エンハンサー−プロモーターが、コード配列の転写がそのエンハンサー−プロモーターによって制御および調節されるようにコード配列と連結されることを意味する。エンハンサー−プロモーターをコード配列に作動可能なように連結する手段は当技術分野で周知であり、目的コード配列に対して適切な配向および位置はとりわけエンハンサー−プロモーターの特定の性質によって異なる。
【０１１１】
本発明のベクター構築物で用いられるエンハンサー−プロモーターはトランスフェクトされる細胞において発現を駆動するものであればいずれのエンハンサー−プロモーターであってもよい。周知の特性を有するエンハンサー−プロモーターを用いることで、遺伝子産物の発現のレベルおよびパターンを至適化することができる。
【０１１２】
例えば、ヒトカリウム−クロライド共輸送体遺伝子の導入では、罹患細胞に遺伝子を送達するベクター構築物が望ましい。ウイルスベクターが使用できる。これらのベクターは好ましくはアデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスであるが、これらのベクターは所望の配列を細胞に送達するのにこれまで首尾良く使用されており、高い感染効率を有する傾向にあることから好ましい。好適なベクター−カリウム−クロライド共輸送体遺伝子構築物は本明細書の下記で記載されるように医薬組成物として投与するのに適している。本発明のベクターにはウイルスプロモーターも使用でき、これらは当技術分野で公知である。
【０１１３】
一般に発現ベクターに用いられるウイルスプロモーターはポリオーマ、サイトメガロウイルス、アデノウイルス2、およびシミアンウイルス40(SV40)に由来する。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウイルス複製起点も含む断片としてこのウイルスから容易に両者が得られることから特に有用である。ウイルス複製起点に位置するHind III部位からBgl I部位にわたる約250bp配列を含んでいる限り、それより小さいまたは大きいSV40断片でも使用できる。さらに、通常は所望の遺伝子配列と連結したプロモーターまたは制御配列を、かかる制御配列が宿主細胞系に適合する限り用いることもでき、それが望ましいことが多い。
【０１１４】
複製起点はSV40またはその他のウイルス起源に由来し得るような外来の起点を含むようにベクターを構築することによって提供できるか、あるいは宿主細胞染色体複製機構によって提供できるかのいずれかである。ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれるならば、後者で十分であることが多い。
【０１１５】
カリウム−クロライド共輸送体遺伝子自体が用いられる場合、野生型カリウム−クロライド共輸送体遺伝子を単に直接用いるのが最も便宜である。しかし、全野生型カリウム−クロライド共輸送体遺伝子を用いずにカリウム−クロライド共輸送体遺伝子のある領域がもっぱら用いればよいと考えられる。結局のところ、カリウム−クロライド共輸送体遺伝子構築物を受容する細胞へ不必要なDNAを導入しないように、生物活性を調節するのに必要な最小領域を用いるのが好ましいと提案される。これらの領域の、細胞のシグナル伝達を調節する能力は実施例で報告されるアッセイによって容易に調べることができる。
【０１１６】
B.2.  トランスジェニック動物
本発明のカリウム−クロライド共輸送体遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物を作出することも本発明の範囲内であると考えられる。好ましいトランスジェニック動物はマウスである。
【０１１７】
トランスジェニック動物の作出技術は当技術分野で公知である。技術の例としては、米国特許第5,489,742号(トランスジェニックラット)、米国特許第4,736,866号、同第5,550,316号、同第5,614,396号、同第5,625,125号、および同第5,648,061号(トランスジェニックマウス)、米国特許第5,573,933号(トランスジェニックブタ)、同第5,162,215号(トランスジェニック鳥類種)および米国特許第5,741,957号(トランスジェニックウシ種)(各々、出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる)に記載されている。
【０１１８】
トランスジェニックマウスの代表的作出方法については、カリウム−クロライド共輸送体遺伝子産物をコードする、クローニングした組換えもしくは合成DNA配列またはDNAセグメントを受精させたマウス卵に注入する。注入した卵を偽妊娠雌に移植し、限界まで成長させて、その細胞がカリウム−クロライド共輸送体遺伝子産物を発現するトランスジェニックマウスを得る。
【０１１９】
例えば、本発明のトランスジェニック動物はマウスKCC2、KCC3およびKCC4遺伝子のターゲッティング改変されたマウスを含み得る。あらゆる体細胞におけるKCC遺伝子の完全または部分的な機能的不活性化を伴うマウス系統はネズミ胚幹細胞における部位特異的組換えの標準技術を用いて作出される。Capecchi (1989) Science 244(4910):1288−1292; Thomas & Capecchi (1990) Nature 346(6287):847−850; Delpire et al. (1999) Nat Genet 22(2):192−195参照。「ノックアウト」ネズミKCC2マウスが作出され、得られた同型接合KCC2−/−マウスは発作性疾患および高い周産期死亡率を示した。このようにHCC2ノックアウトマウスは、KCC2が癲癇の薬剤標的であるという証拠を示し、さらにヒトKCC2が医療上関連のある遺伝子であるという証拠を示した。
【０１２０】
別法では、万能または組織特異的プロモーターによって駆動されるアンチセンスまたはリボザイムKCC構築物を用いて体細胞における個々のKCCレベルを低下させることを含み、このようにして個々のイソ型の「ノックダウン」が達成される(Luyckx et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(21):12174−12179)。本発明はまた、個々のまたは複数のKCC遺伝子の条件付きまたは誘導性の不活性化を伴うネズミ系統の作出を提供する(Sauer (1998) Methods 14(4):381−392)。例えば、KCC3およびKCC4の発現の既知部分である腎臓の近位曲尿細管においていずれのKCCの発現も欠いたマウスは、lox−P−フランキングKCC遺伝子を有するマウス系統を腎アンドロゲンにより調節されるタンパク質のプロモーターを用いる近位曲尿細管でCre−レコンビナーゼを発現するトランスジェニック系と順次交配することで作出する(Ding et al. (1997) J Biol Chem 272(44):28142−28148)。
【０１２１】
本発明はまたKCC2、KCC3またはKCC4遺伝子に特定の「ノックイン」改変を有するマウス系統を提供する。これは疾病特異的リピート拡大の挿入(White et al. (1997) Nat Genet 17(4):404−410)などの操作に加え、KCC遺伝子の遺伝的に関連する点突然変異(Forlino et al. (1999) J Biol Chem 274(53):37923−37931)および機能的に関連する点突然変異(Kissel et al. (2000) EMBO J 19(6):1312−1326)を有するマウスを含む。
【０１２２】
C.  抗体の作製
なおもう1つの実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドと免疫反応性のある抗体を提供する。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。抗体を作製および同定する技術は当技術分野で周知である(例えば、Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York参照)。
【０１２３】
要するに、ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む免疫原で動物を免疫化し、免疫動物から抗血清を回収することで作製する。抗血清の作製のためには広範な動物種を使用できる。ウサギは比較的血液量が多いため、ポリクローナル抗体の作製に好ましい選択肢である。
【０１２４】
当技術分野では周知であるが、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドによりその免疫原性は異なる。従って、本発明の免疫原(例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド)を担体と組み合わせる必要がある場合が多い。例としての、また好ましい担体としては、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)およびウシ血清アルブミン(BSA)がある。卵白アルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンなどのその他のアルブミンも担体として使用できる。
【０１２５】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを担体タンパク質と共役させる手段は当技術分野で周知であり、グルタルアルデヒド、NCマレイミドベンコイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビス−ビアゾ化ベンジジンが挙げられる。
【０１２６】
当技術分野では周知であるが、特定の免疫原に対する免疫原性はアジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激剤を用いることで増強させることができる。例としての、また好ましいアジュバントとしては、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
【０１２７】
ポリクローナル抗体の生産について用いられる免疫原の量はとりわけ免疫原の性質ならびに免疫化に用いられる動物によって異なる。種々の経路で免疫原を投与することができ、例えば、皮下、筋肉内、皮内、静脈内、および腹腔内がある。ポリクローナル抗体の生産は、免疫化後の様々な時点で免疫動物を採血することでモニターする。所望のレベルの免疫原性が得られたら、免疫動物を放血させ、血清を単離して保存すればよい。
【０１２８】
もう1つの態様では、本発明は、カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドと免疫反応性のある抗体を作製する方法を提供し、その方法は、(a)組換え宿主細胞を、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトし、(b)宿主細胞をポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、(c)ポリペプチドを回収し、さらに(d)ポリペプチドに対する抗体を作製するステップを含む。好ましくは、カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドは本発明に従って細胞内外のカリウムおよび／またはクロライドレベルを調節し得るものである。
【０１２９】
本発明のモノクローナル抗体は、米国特許第4,196,265号に例示されるハイブリドーマ法、および米国特許第5,260,230号(なお、これらの内容は出典開示により本明細書の一部とされる)に開示されるファージ展示法などの周知の技術を用いて容易に作製できる。
【０１３０】
典型的な技術としてはまず、好適な動物を選択された抗原(例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド)で、免疫応答を得るに十分な方法で免疫化することを含む。マウスおよびラットなどの齧歯類は好ましい動物である。次ぎに、免疫動物由来の脾臓細胞を不死化ミエローマ細胞と融合させる。免疫動物がマウスであれば、好ましいミエローマ細胞はネズミNS−1ミエローマ細胞である。
【０１３１】
融合した脾臓/ミエローマ細胞は、親細胞から融合した脾臓/ミエローマ細胞を選択する選択培地で培養する。融合細胞は、例えば組織培養培地にヌクレオチドのde novo合成を遮断する薬剤を添加することで非融合親細胞の混合物から分離する。この培養によりハイブリドーマ集団が得られ、そこから特定のハイブリドーマを選択する。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートで単一クローンを希釈培養し、次ぎに個々のクローン上清を抗原−ポリペプチドとの反応性に関して試験することで行う。選択されたクローンは次ぎに無制限に増殖させてモノクローナル抗体を得る。
【０１３２】
特定の例では、本発明の抗体を作製するため、マウスに本発明のポリペプチドを含む抗原を約1〜200μgの間で腹腔内注射する。Bリンパ球をフロイントの完全アジュバント(殺した結核菌(Mycobacterium tuberculosis)を含有する免疫応答の非特異的刺激剤)などのアジュバントとともに抗原を注射することで刺激されて増殖する。最初の注射から一定期間の後(例えば、少なくとも2週間)、マウスに、フロイントの不完全アジュバントを混合した抗原の2回目の用量を注射して追加抗原投与を行う。
【０１３３】
2回目の注射から数週間後、マウスの尾から採血し、放射性標識した抗原に対する免疫沈降により血清力価を求める。好ましくは、追加抗原投与および力価測定の方法を好適な力価となるまで繰り返す。最高力価を有するマウスの脾臓を摘出し、シリンジで脾臓をホモジナイズすることにより脾臓リンパ球を得る。
【０１３４】
ミエローマ細胞として知られる変異型リンパ球は、種々の周知の方法によってかかる細胞の増殖を促進させた実験動物から得る。ミエローマ細胞はヌクレオチド生合成の再利用経路を欠いている。ミエローマ細胞は腫瘍細胞であるので、それらは組織培養で無制限に増殖させることができ、従って「不死」である。ネズミNS−1ミエローマ細胞など、マウスおよびラット由来のミエローマ細胞の多くの培養細胞株が確立されている。
【０１３５】
ミエローマ細胞は、フォスター融合に適当な条件下で、本発明の抗原/ポリペプチドを注射したマウスまたはラットの脾臓由来の正常な抗体産生細胞と合体させる。融合条件としては、例えば、ポリエチレングリコールの存在が挙げられる。得られた融合細胞がハイブリドーマ細胞である。ミエローマ細胞同様、ハイブリドーマ細胞も培養で無制限に増殖する。
【０１３６】
ハイブリドーマ細胞は、HAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン)などの選択培地で培養することで非融合ミエローマ細胞から分離される。非融合ミエローマ細胞は、アミノプテリン、メトトレキサート、またはアザセリンの存在下で死滅させてあるので、再利用経路からヌクレオチドを合成するのに必要な酵素を欠いている。また、非融合リンパ球は組織培養では増殖し続けることはない。このように、この選択培地では上手く融合した細胞(ハイブリドーマ細胞)だけが増殖可能である。
【０１３７】
生存しているハイブリドーマ細胞はそれぞれ単一の抗体を産生する。これらの細胞を次ぎに本発明の抗原/ポリペプチドと免疫反応性のある特異的抗体の産生に関してスクリーニングする。単一細胞ハイブリドーマはハイブリドーマの制限希釈によって単離する。これらのハイブリドーマを何倍も連続希釈し、その希釈物を増殖させた後、モノクローナル抗体が存在しているかどうか上清を試験する。次ぎに、抗体を産生しているクローンを大量培養して便宜な量で本発明の抗体を作製する。
【０１３８】
本発明のモノクローナル抗体を使用すれば、本発明の特定のポリペプチドおよびポリヌクレオチドが抗原として認識でき、従ってそれが同定できる。一度同定してしまば、それらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、抗体アフィニティークロマトグラフィーなどの技術によって単離および精製することができる。抗体アフィニティークロマトグラフィーでは、モノクローナル抗体を固相基質に結合させ、所望の抗原を含有する溶液に曝す。結合した抗体との免疫特異的反応により溶液から抗原が取り出せる。このポリペプチドまたはポリヌクレオチドは次ぎに基質から容易に取り出せ、精製される。
【０１３９】
D.  本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの検出
あるいは、本発明は、本発明のポリペプチドを検出する方法を提供し、その方法は、ポリペプチドを、上記の方法に従って作製した抗体と免疫反応させて抗体−ポリペプチド複合体を形成し、その複合体を検出することを含む。
【０１４０】
なおもう1つの実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするメッセンジャーRNA転写物を検出する方法を提供し、その方法はメッセンジャーRNA転写物を、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とハイブリダイズさせて二重らせんを形成し、その二重らせんを検出することを含む。あるいは、本発明は本発明のポリペプチドをコードするDNA分子を検出する方法を提供し、その方法は、DNA分子を該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて二重らせんを形成し、その二重らせんを検出することを含む。
【０１４１】
本明細書に開示される検出およびスクリーニングアッセイは所望により予後手段および／または診断補助として使用できる。KCC2、KCC3および／またはKCC4をコードするポリペプチドおよび核酸は、カリウム−クロライド共輸送体の発現レベルまたは天然配列の変更をスクリーニングする予後および／または診断指標として臨床環境で容易に使用できる。本発明のヌクレオチド配列は正常、キャリヤー、または罹患個体間の遺伝子または遺伝子産物の配列における違いを検出するのに使用できる。このような違いは、転写、翻訳、または活性もしくは生物活性、または遺伝子もしくは遺伝子産物の特性の変化をもたらす天然配列における単一ヌクレオチド変異もしくは複数変異、欠失または付加からなり得る。これらの違いは本発明の組成物、および限定されるものではないが、SSCP解析、RFLP解析またはその他のPCRもしくはヌクレオチドベースの解析をはじめ、当技術分野で公知の技術を用いて容易に検出できる。
【０１４２】
配列番号1、3、5、7、9、11、13、15または112の配列、またはそれらに相補的な配列を有する本発明のDNAセグメントまたはRNAが使用できる。かかるポリ核酸は10、20、40、50、70、100、250、300、400、500、もしくは1000ヌクレオチド、または配列番号1、3、5、7、9、11、13、15または112の全長配列までのヌクレオチドを含む。かかるポリ核酸は、必ずしも必要ではないが、天然型の遺伝子または遺伝子産物の生物活性のいくらか、または全てを保持するポリペプチドをコードし得る。
【０１４３】
D.1.  本発明のポリペプチドのスクリーニングアッセイ
本発明は、カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドが存在するかどうか生物サンプルをスクリーニングする方法を提供する。スクリーニングする生物サンプルは細胞外液もしくは細胞内液、または細胞もしくは組織抽出液もしくはホモジネートなどの生体液であってよい。生物サンプルはまた、単離細胞(例えば、培養)であってもよいし、あるいは組織サンプルまたは組織学サンプルにおけるもののような細胞コレクションであってもよい。組織サンプルは液体培地に懸濁されていてもよいし、あるいは顕微鏡スライドなどの固相支持体に固定されていてもよい。スクリーニングアッセイ法によれば、生物サンプルを、その存在をアッセイするポリペプチドと免疫反応性のある抗体に曝す。典型的には暴露は、液体培地中で抗体と候補ポリペプチドの両者を含有する混合物を形成することで達成される。抗体か、ポリペプチドを含むサンプルかのいずれかを固相支持体(例えば、カラムまたはマイクロタイタープレート)に固定してもよい。かかるアッセイに関してさらに詳細なことは当技術分野で公知である。サンプル中のポリペプチドの存在は、抗体−ポリペプチド複合体の形成および存在を評価することで検出される。かかる抗体−ポリペプチド複合体を検出する方法は当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、遠心分離、アフィニティークロマトグラフィーなど、また、抗体−候補レセプター複合体に対する二次抗体の結合が挙げられる。
【０１４４】
ある実施形態では、検出は、抗体に付着させた指標を検出することで達成される。例としての、また周知の指標としては、放射性標識(例えば、32P、125I、14C)、二次抗体、またはワサビダイコン・ペルオキシダーゼなどの酵素が挙げられる。指標を抗体に付着させる方法は当技術分野で公知である。
【０１４５】
ある実施形態では、KCC4ポリペプチドを認識する抗体を用い、実施例22に記載のように哺乳類組織においてKCC4を検出した。KCC4は、筋肉、脳、肺、心臓および腎臓での豊富な発現をはじめとして種々の組織で検出される。もう1つの実施形態では、KCC3ポリペプチドを認識する抗体を用いて、実施例22〜23に記載のように哺乳類組織においてKCC3を検出した。この方法を行うことで、KCC3イソ型KCC3aおよびKCC3bが大きさによって区別された。さらに、KCC3bイソ型は腎臓で優勢であることが分かったが、KCC3aは中枢神経系で優勢である。KCC3aは大ニューロン、脊椎背側および前柱、ならびに脳の有髄灰白質束の脈絡叢上皮の基部で検出される(図２９Ｌ〜２９Ｍおよび３２)。脳および腎臓におけるKCCイソ型KCC3aおよびKCC3bの発現の違いも個々に開示されている。脳におけるKCC3aの発現は、神経連絡の調節およびCNS興奮性の制御におけるKCC3の役割を支持するものである。かかる生物学的役割は、癲癇およびその他の神経障害、例えばアンデルマン症候群の理解、診断および治療に関連がある。腎臓におけるKCC3bの発現は、高血圧およびその他の浸透圧不均衡疾患を調節する際の役割を指し示している。
【０１４６】
D.2.  抗ポリペプチド抗体に関するスクリーニングアッセイ
もう1つの態様では、本発明は、カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドと免疫反応性のある抗体が存在するかどうか生物サンプルをスクリーニングする方法を提供する。好ましくは、そのように同定された抗体は本発明に従ってカリウム−クロライド共輸送体の生物活性の調節に活性を有する。かかる方法によれば、生物サンプルは、生物学的条件下で抗体−ポリペプチド複合体の形成に十分な時間、KCC2、KCC3および／またはKCC4ポリペプチドに曝し、形成した複合体を検出する。
【０１４７】
D.3.   本発明のKCC2、KCC3および／またはKCC4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出
DNAまたはRNA分子、特にDNAセグメントまたはポリヌクレオチドは、本発明のKCCポリペプチドをコードすると思われるDNAもしくはRNA源、またはサンプルとのハイブリダイゼーションに使用できるが、かかる分子を「プローブ」と呼び、かかるハイブリダイゼーションが「プロービング」である。かかるプローブは合成により作製できる。このプロービングは通常、オリゴヌクレオチドと、KCC(例えば、KCC2、KCC3および／またはKCC4)遺伝子を有すると思われるDNA源とをハイブリダイズさせることで達成される。これらのプローブは単一のプローブだけからなる場合もあるし、あるアミノ酸配列またはポリペプチド配列をもとに、遺伝子コードに本来備わっている縮重に関するそれらの多様性を考慮したプローブコレクションからなる場合もある。
【０１４８】
また、DNAでもRNAでもないが、同様にハイブリダイズでき、かつ、KCC(KCC2、KCC3および／またはKCC4)遺伝子のDNAまたはRNA配列を構造上模倣するようにデザインされたその他の分子も考えられる。ここで、試験に好適な供給源は本発明のポリペプチドを発現可能であり、目的細胞株のゲノムライブラリーであってもよい。あるいは、DNAまたはRNAの供給源は目的細胞株由来の全DNAまたはRNAを含み得る。本発明のハイブリダイゼーション法で候補DNAセグメントが一度同定されれば、さらなるハイブリダイゼーション、制限酵素マッピング、シーケンシングおよび／または発現および試験によって陽性クローンを確認することができる。
【０１４９】
あるいは、かかるDNA分子は、(1)患者の細胞に由来するDNAにおいて正常および異常DNA配列を検出する診断手段、(2)かかる配列を含む可能性のあるDNAライブラリーからのポリペプチドファミリーの他のメンバーおよび関連ポリペプチドを検出および単離する試薬、(3)それらの配列を増幅することを目的とした関連配列とハイブリダイズするプライマー、(4)天然型のカリウム−クロライド共輸送体DNA配列を変更するプライマー、ならびに(5)目的配列の、本明細書に開示される配列との類似性による他の技術としてのそれらの使用をはじめ、多くの技術に用いることができる。
【０１５０】
上記で示すように、ある態様では、本発明によって提供されるDNA配列情報は選択されたカリウム−クロライド共輸送体遺伝子のコード配列と特異的にハイブリダイズするプローブの作製を考慮する。これらの態様では、本発明のポリペプチドのコード配列を考慮して、適当な長さのプローブが作製される。かかるプローが他のコード配列と特異的にハイブリダイズする能力は、種々の実施形態においてそれらに特定の利用を与える。最も重要には、これらのプローブはあるサンプルにおいて相補配列の存在を検出する種々のアッセイに使用できる。しかし、変異種プライマー、または他の遺伝子構築物を作製するのに用いるプライマーの作製を目的としたその配列情報の使用をはじめ、その他の利用も考えられる。
【０１５１】
本発明に従って特定の利点を得るには、ハイブリダイゼーション研究またはアッセイに用いられる好ましい核酸配列は、少なくとも14ないし40、または配列番号1、3、5、7、9、11、13、15および112のいずれかで示される配列など、本発明の核酸配列のヌクレオチドストレッチほどの長さに相補的または模倣するプローブ配列を含む。少なくとも14ヌクレオチド長の大きさであれば、その断片は安定かつ選択的な二重らせん分子を形成するに十分な長さであることを保証する助けとなる。しかしながら、ハイブリッドの安定性および選択性を高め、それにより得られる特定のハイブリッド分子の品質および程度を向上させるには、14塩基長よりも長いストレッチにわたる相補配列を有する分子が一般に好ましい。一般に14ないし20ヌクレオチドの遺伝子相補ストレッチを有する核酸分子を設計するのが好ましいが、あるいは望まれる場合には、30、40、50、60、100、200、300またた500ヌクレオチド、あるいは配列番号1、3、5、7、9、11、13、15および112のいずれかの全長までといった長いものでもよい。かかる断片は、例えば、化学合成により断片を直接合成することにより、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第4,683,202号のPCR法のような核酸増幅技術の適用により、あるいは組換え産生のための組換えベクターに選択された配列を導入することにより容易に作製できる。
【０１５２】
従って、本発明のヌクレオチド配列は、KCC遺伝子の相補ストレッチと二重らせん分子を選択的に形成するその能力ゆえに使用することができる。考えられる適用にもよるが、様々なハイブリダイゼーション条件を用いれば、標的配列に対して様々な程度のプローブ選択性が得られる。高い程度の選択性を必要とする適用では、典型的には比較的ストリンジェントな条件を用いてハイブリッドを形成する。例えば、0.02M〜0.15M塩(例えば、NaCl)、特に200mM塩、温度50℃〜70℃、特に約55℃、約60℃、および約65℃などといった比較的低い塩および／または高温条件を選択する。このような条件は特に選択的で、プローブと鋳型または標的鎖の間のミスマッチがあるにしてもわずかしか許容しない。
【０１５３】
もちろん適用の中には、ヘテロ二重らせんの形成を可能とするために典型的に低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が必要となることもあり、当業者ならば、特定の手法を至適化するためにハイブリダイゼーション条件をいかに調整するかが分かるであろう。例えば一般に、温度の上昇と同様にハイブリッド二重らせんを不安定にする働きをするホルムアミド量を増加させて添加することで条件はよりストリンジェントなものにすることができると考えられる。このように、ハイブリダイゼーション条件は、当業者ならば、過度な実験を行わずとも所望の機能または実験を行うのに公知の方法を用いて容易に操作することができる。
【０１５４】
ある実施形態では、本明細書に開示されるKCC配列を用いて実施例19に記載のKCC RNAポリヌクレオチドを検出した。この方法を行うことで、KCC4は筋肉、脳、肺、心臓および腎臓での著しい発現をはじめ、多数の組織で発現されることが分かった。腎臓におけるKCC4の発現は腎臓での発現における可能性のある役割を支持し、高血圧およびその他の浸透圧不均衡疾患を調節する上での役割を指し示す。
【０１５５】
もう1つの実施形態では、KCC3は筋肉、脳、肺、心臓、および腎臓で発現されることが分かった。KCCイソ型KCC3aおよびKCC3bのそれぞれ脳および腎臓での差別的発現もまた開示される。脳におけるKCC3aの発現は神経連絡を調節する上で、またCNS興奮性を制御する上でのKCC3の役割を支持するものである。かかる生物学的役割は癲癇およびその他の神経障害、例えばアンデルマン症候群の理解、診断および治療に関連する。腎臓におけるKCC3bの発現は高血圧およびその他の浸透圧不均衡疾患を調節する上での役割を指し示す。
【０１５６】
D.4.  検出アッセイキット
もう1つの態様では、本発明は、生物サンプルにおいて本発明のポリペプチドの存在を検出するアッセイキットを提供し、ここでこのキットはポリペプチドと免疫反応し得る第1の抗体を含む。好ましくは、本発明のアッセイキットはさらに第1の抗体と免疫反応する第2の抗体を含有する第2の容器を含む。より好ましくは、本発明のアッセイキットに用いられる抗体はモノクローナル抗体である。よりいっそう好ましくは、第1の抗体は固相支持体に固定されている。なおより好ましくは、第1および第2の抗体は指標を含み、好ましくはこの指標は放射性標識または酵素である。
【０１５７】
本発明はまた、薬剤をスクリーニングするためのアッセイキットを提供する。かかるキットは本発明のポリペプチドを含有していてよい。このキットは薬剤と本発明のポリペプチドの間の相互作用を検出する試薬もさらに含有する。
【０１５８】
もう1つの態様では、本発明は、生物サンプルにおいて、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出するアッセイキットを提供し、このキットは、好ましい例としては配列番号1、3、5、7、9、11、13、15および112のいずれかの少なくとも10個の連続するヌクレオチド塩基のセグメントと同一または相補的な第2のポリヌクレオチドを含む第1の容器を含む。もう1つの実施形態では、本発明は、生物サンプルにおいて、本発明のポリペプチドと免疫反応性のある抗体の存在を検出するアッセイキットを提供し、このキットは抗体と免疫反応するKCC(例えば、KCC2、KCC3および／またはKCC4)ポリペプチドを含む。
【０１５９】
E.  マッピングおよびポリヌクレオチドシーケンシグ
本発明のもう1つの実施形態では、KCC2、KCC3および／またはKCC4をコードする核酸配列を用いて、天然に存在するゲノム配列および／または疾病遺伝子座をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することもできる。これらの配列は周知の技術を用いて特定の染色体に、あるいは染色体の特定領域にマッピングすることができる。かかる技術としては、Price (1993) Blood Rev 7:127−134、およびTrask (1991) Trends Genet 7:149−154に概説されているように、FISH、FACS、または酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌P1構築物、もしくは単一染色体cDNAライブラリーなどの人工染色体構築物が挙げられる。
【０１６０】
FISH(Verma et al. (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, New Yorkに記載)は他の物理的染色体マッピング技術および遺伝子マップデータと相関させることができる。遺伝子マップデータの例は1994年のGenome Issue of Science (265:1981f)に見出せる。物理的染色体マップ上のKCC2、KCC3および／またはKCC4をコードする遺伝子の位置と特定の疾病または特定の疾病に対する素因の間の相関はその遺伝疾患に関連するDNA領域を限局化する助けとなり得る。本発明のヌクレオチド配列は正常、キャリヤーまたは罹患個体間の遺伝子配列における違いを検出するのに使用できる。
【０１６１】
染色体調製物のin situハイブリダイゼーションと、確立された染色体マーカーを用いた連鎖解析などの物理的マッピング技術は遺伝子マップを拡張するのに使用できる。マウスなどの別の哺乳類種の染色体上に遺伝子が乗っていれば、特定のヒト染色体の番号や腕が未知であったとしても、ヒトなどの他の哺乳類に見られる関連マーカーも明らかとなることが多い。新しい配列は物理的マッピングによって染色体腕またはその一部に割り当てることができる。これはポジショナルクローニングまたはその他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を研究している研究者にとって価値のある情報を提供する。例えば毛細管拡張性運動失調(A−T)の11q22−23へといったように(Gatti et al. (1988) Nature 336:577−580)、疾病または症候群が遺伝子連鎖により特定のゲノム領域に大まかに限局化されれば、その領域へマッピングされるいずれかの配列がさらなる研究のための関連遺伝子または調節遺伝子ということになる。従って、本発明のヌクレオチド配列は、正常、キャリヤーまたは罹患個体間の転座、逆位などによる染色体位置における違いを検出するのにも使用できる。
【０１６２】
本発明のマッピング法はまた、KCC2、KCC3およびKCC4のエクソンのゲノムクローンも用いる。ヒトKCC2のコード配列およびゲノム配列は配列番号20〜63で示されている。ヒトKCC2エクソン1〜24(配列番号20〜43)由来のコード配列も本明細書に示されている。ヒトKCC2エクソン2〜7(配列番号44〜49)、エクソン9〜14(配列番号50〜55)、およびエクソン17〜24(配列番号56〜63)のゲノム配列も本明細書に示されている。
【０１６３】
ヒトKCC4のゲノム配列は配列番号64〜83で示されている。ヒトKCC4エクソン2(配列番号64)、エクソン3(配列番号65)、エクソン5(配列番号66)、エクソン6〜10(配列番号67〜71)、エクソン12〜19(配列番号72〜79)、およびエクソン21〜24(配列番号80〜83)のゲノム配列も本明細書に示されている。
【０１６４】
ヒトKCC3aおよびヒトKCC3bのゲノム配列は配列番号84〜110で示される。ヒトKCC3エクソン1−hKCC3a(配列番号84)、エクソン1−hKCC3b(配列番号85)、エクソン2(配列番号86)、エクソン3(配列番号87)、エクソン4−HKCC3b(配列番号88)、エクソン4−HKCC3a(配列番号89)、エクソン6〜11(配列番号90〜95)、エクソン12−hKCC3b(配列番号96)、エクソン12−hKCC3a(配列番号97)およびエクソン13−25(配列番号98〜110)のゲノム配列も本明細書に示されている。
【０１６５】
もう1つの実施形態では、本発明は、ヒトKCC2、KCC3およびKCC4遺伝子のゲノム配列に基づく遺伝子アッセイを提供する。この3つの遺伝子をコードする個々のエクソンをフランキングするイントロン配列は配列番号44〜110で示され、ヒトゲノムDNAの突然変異解析に好適なオリゴヌクレオチドプライマーのデザインに用いられる。このようにイントロンプライマーは、一本鎖コンホメーション多形(SSCP)解析(Orita et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86(8):2766−2770)、SSCP/ヘテロ二重らせん解析、酵素ミスマッチ切断、および増幅したエクソンの直接配列解析(Kestila et al. (1988) Mol Cell 1(4), 575−582; Yuan et al. (1999) Hum Mutat 14(5):440−446)をはじめとするPCRを基にしたいくつかの技術によって遺伝子変異体をスクリーニングするのに使用できる。
【０１６６】
5'調節領域、例えばヒトまたはマウスKCC3のエクソン1aおよび1b(例えば、配列番号17〜19)の5'側の推定プロモーターを推定するためにも同様の技術が適用できる。また自動化法もヒトKCC遺伝子内およびその付近の単一ヌクレオチド多形の大規模同定(Brookes (1999) Gene 234(2):177−186; Wang et al. (1998) Science 280(5366):1077−1082)に適用できる。例えば、アンデルマン症候群患者にけるKCC3突然変異といったように、特定の患者集団で遺伝子変異体が検出されれば、本発明により、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(Stoneking et al. (1991) Am J Hum Genet 48(2):370−382)、または特定の突然変異を含む増幅ゲノムDNAの制限解析などの方法によって突然変異を検出するアッセイが提供される。ここでも、これらの検出法は既存の技術(Wang et al. (1998) Science 280(5366):1077−1082を用いて自動化できる。遺伝疾患またはリピート拡大によって引き起こされるヒト表現型(Lafreniere et al. (1997) Nat Genet 15(3):298−302; Timchenko & Caskey (1996) FASEB J 10(14):1589−1579)の場合、本発明は関連リピートをフランキングするオリゴヌクレオチドプライマーを用いたゲノムDNAのPCRに基づくアッセイを提供する。
【０１６７】
本発明および特許請求の範囲において「多形」とは、集団内に2以上の遺伝的に同定された択一配列または対立遺伝子が存在することをさす。多形マーカーは多様性が生じる遺伝子座である。好ましいマーカーは少なくとも2つの対立遺伝子を有し、それぞれは1％を超える頻度で存在する。多形遺伝子座は1bpといった小さなものでもよい。
【０１６８】
本発明および特許請求の範囲において「遺伝子」とは、単に機能的タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単位をさすのに用いられる。当業者ならば分かるであろうが、この機能的な用語はゲノム配列とcDNA配列の双方を含む。「他のコード配列から実質的に単離された」とは、目的遺伝子、この場合にはKCC遺伝子がDNAセグメントのコード領域の有意な一部をなしており、かつ、そのDNAセグメントが、大きな染色体断片またはその他の機能的遺伝子もしくはcDNAコード領域など、天然に存在するコードDNAの大部分を含まないことを意味する。もちろんこれは最初に単離されたDNAセグメントをさすが、その後に人の手でそのセグメントに付加された遺伝子またはコード領域を除外するものではない。
【０１６９】
提供される核酸分子は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、配列タグなど、当技術分野で公知のいずれかの技術に従って標識することができる。かかる分子は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブとして使用できる。身体サンプルをKCC遺伝子が多形を含むかどうか調べるために試験すればよい。試験に好適な身体サンプルとしては、例えば、肝臓および腸組織生検をはじめとする生検、または血液、胎児期もしくは胚組織から得られるDNA、RNAまたはタンパク質を含むものが挙げられる。
【０１７０】
本発明のある実施形態では、2対の単離オリゴヌクレオチドプライマーが提供される。これらのプライマーセットは所望によりKCCエクソンに由来するものであってもよい。これらのオリゴヌクレオチドプライマーは例えばKCC遺伝子の多形を検出する上で有用である。これらのプライマーはシーケンシングに先立って標的ポリヌクレオチドの増幅を指示する。本発明のもう1つの実施形態では、単離された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)が提供される。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドもまたKCC遺伝子の多形を検出する上で有用である。
【０１７１】
「実質的に〜に相補的」または「実質的に〜の配列」とは、本明細書で開示されるようなストリンジェント条件下で、提供される配列(例えば、配列番号44〜110)とハイブリダイズする配列、および／または本発明の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが配列番号44〜110のいずれかとハイブリダイズするように、その配列と十分な相同性を有する配列をさす。本明細書において「単離された」とは、他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、またはそれらが会合可能なその他の材料(このような会合は細胞材料内か合成媒体内かのいずれかにおけるものである)を実質的に含まないオリゴヌクレオチドをさす。「標的オリゴヌクレオチド」または「標的核酸」とは、目的核酸配列、例えばKCCをコードするポリヌクレオチドをさす。プライマーハイブリダイゼーションに使用できる他のプライマーは、当業者ならば、本明細書の開示を基に容易に確認することができる。
【０１７２】
本発明のプライマーは、多形遺伝子座において有意な数の核酸に対して重合を開始させるのに十分な長さおよび適当な配列のオリゴヌクレオチドを包含する。具体的には本明細書における「プライマー」は、2以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは3を超える、より好ましくは8を超える、最も好ましくは少なくとも約20のヌクレオチドの、本明細書に開示されるKCCエクソンまたはイントロン領域を含む配列をさす。かかるオリゴヌクレオチドは好ましくは10ないし30塩基の間の長さである。かかるオリゴヌクレオチドは所望により検出可能な標識をさらに含んでもよい。
【０１７３】
合成の助けとなる環境条件としては、ヌクレオチド三リン酸およびDNAポリメラーゼなどの重合剤の存在、ならびに好適な温度およびpHが挙げられる。プライマーは、増殖の最大効率のためには一本鎖が好ましいが、二本鎖であってもよい。二本鎖である場合、伸張産物の作製のために使用する前に、まずプライマーを処理してその鎖を分離する。プライマーは重合誘導剤の存在下で伸張産物の合成を誘導するに十分な長さでなければならない。プライマーに厳密な長さは、温度、バッファーおよびヌクレオチド組成をはじめ多くの因子によって異なる。オリゴヌクレオチドプライマーは12〜20またはそれ以上ヌクレオチドを含むのが典型的であるが、それより少ないヌクレオチドを含むものであってもよい。
【０１７４】
本発明のプライマーは増幅するゲノム遺伝子座の各鎖に「実質的に」相補的となるように設計する。これは、プライマーが、薬剤に重合を行わせる条件下でそれら個々の鎖とハイブリダイズするのに十分相補的でなければならないことを意味する。言い換えれば、プライマーは、転移部分をフランキングする5'および3'配列と、それらとハイブリダイズしてゲノム遺伝子座を増幅させるに十分な相補性を有していなければならない。
【０１７５】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、含まれる反応ステップの数に対して指数関数的量の多形遺伝子座をもたらす酵素連鎖反応である増幅法で用いられる。典型的には一方のプライマーは多形遺伝子座のネガティブ(−)鎖に相補的であり、他方はポジティブ(+)鎖に相補的である。これらのプライマーを変性した核酸とアニーリングさせた後、DNAポリメラーゼIの大断片(クレノウ)などの酵素およびヌクレオチドを用いて伸張させると、標的多形遺伝子座配列を含む+および−鎖が新たに合成される。これらの新たに合成された配列は鋳型でもあるので、変性、プライマーアニーリング、および伸張のサイクルを繰り返すと、それらのプライマーによって定義される領域(すなわち、標的多形遺伝子座配列)が指数関数的に生産される。この連鎖反応の産物は用いる特定のプライマーの末端に対応する末端を有する個々の核酸二重らせんである。
【０１７６】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、従来のホスホトリエステルおよびホスホジエステル法またはその自動化形態などの好適ないずれの方法を用いて作製してもよい。かかる自動化形態の1つでは、ジエチルホスホルアミダイトを開始物質として用い、Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859−1862によって記載されているように合成できる。修飾した固相支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する方法の1つが米国特許第4,458,066号に記載されている。
【０１７７】
精製または非精製形態の核酸標本は、それが多形遺伝子座を含む核酸配列を含む、または含むと思われる限り、開始核酸として利用できる。従って、本方法は例えばDNA、またはメッセンジャーRNAをはじめとするRNAを増幅できる(なお、ここでDNAまたはRNAは一本鎖であっても二本鎖であってもよい)。RNAが鋳型として用いられる場合、鋳型をDNAへと逆転写するのに最適な酵素および／または条件を用いる。さらに、各々一方の鎖を含むDNA−RNAハイブリッドも使用できる。また核酸混合物も使用でき、あるいは、同一または異なるプライマーを用いて本明細書のこれまでの増幅反応で作製された核酸もこのように使用できる。増幅する特定の核酸配列、すなわち多形遺伝子座は、より大きな分子の一部であってもよいし、最初に個別の分子として提供されたものでもよく、結局、この特定の配列とは核酸全体を構成する。増幅する配列は最初は純粋な形態で存在する必要はなく、全ヒトDNAに含まれるものといった複雑な混合物の微量部分であってもよい。
【０１７８】
本明細書で用いるDNAは、Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, New Yorkによって記載されるものなど、種々の技術によって血液、組織材料(例えば、脳または腎組織)などの身体サンプルから抽出することができる。抽出されたサンプルが不純である場合、増幅前に、その細胞、またはそのサンプルの動物細胞膜を開き、核酸鎖を露出させ、かつ／または分離するのに有効な一定量の試薬で処理することができる。この鎖の露出および分離のための溶解および核酸変性ステップにより増幅は遙かに容易に行える。
【０１７９】
デオキシリボヌクレオチド三リン酸dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPをプライマーとともに、あるいは別々に適当な量で合成混合物に加え、得られた溶液を約90〜100℃まで1ないし10分間、好ましくは1ないし4分間加熱する。この加熱後、溶液を冷却するが、これはプライマーハイブリダイゼーションに好ましい。この冷却混合物にプライマー伸張反応を行うのに適当な薬剤(本明細書では「重合剤」と呼ぶ)を加え、当技術分野で公知の条件下で反応を起こさせる。重合剤はまた、熱に安定なものであれば、他の試薬とともに加えてもよい。この合成(または増幅)反応は、それを超えるとその重合剤が働かなくなる温度までの室温で行える。従って、例えば、薬剤としてDNAポリメラーゼを用いる場合、温度は一般にせいぜい約40℃である。この反応は室温で行うのが最も便宜である。
【０１８０】
重合剤は、酵素をはじめ、プライマー伸張産物の合成を達成する働きをするものであればいずれの化合物または系であってもよい。この目的で好適な酵素としては、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼI、大腸菌ポリメラーゼクレノウ断片、ポリメラーゼムテイン、逆転写酵素、Taqポリメラーゼなどの熱安定酵素(すなわち、変性を起こすために十分高い温度を受けてもプライマー伸張を行う酵素)をはじめとするその他の酵素が挙げられる。好適な酵素は、各多形遺伝子座の核酸鎖に相補的なプライマー伸張産物を形成するのに適当なようにヌクレオチドの組合せを促進するものである。一般に、合成は各プライマーの3'末端で始まり、合成が終結するまで鋳型鎖に沿って5'方向へ進行し、種々の長さの分子ができる。
【０１８１】
新たに合成された鎖およびその相補的核酸鎖は、本明細書に記載のハイブリダイゼーション条件下で二本鎖分子を生じ、このハイブリッドが本方法の次ぎにステップに用いられる。次のステップでは、新たに合成された二本鎖分子を、一本鎖分子を得る上記の手順のいずれかを用いた変性条件下におく。
【０１８２】
変性、アニーリングおよび伸張産物合成のステップは、標的多形遺伝子座の核酸配列が検出に必要な程度まで増幅するのに必要な回数繰り返すことができる。作製される特定の核酸配列の量は指数関数的に集積する。McPherson et al., eds. (1991) PCR. A Practical Approach, IRL Press, Oxford University Press, New York, New York参照。
【０１８３】
増幅産物は放射性プローブを用いた、あるいは用いないサザンブロット解析によって検出できる。かかる方法の1つでは、例えば、極めて低レベルの多形遺伝子座核酸配列を含む微量DNAサンプルを増幅し、サザンブロッティング法、または同様にドットブロット解析を用いて解析する。非放射性プローブまたは標識を使用する場合は、高レベルの増幅シグナルが助けとなる。あるいは、増幅産物を検出するのに用いるプローブは、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素で検出可能なように直接的または間接的に標識することができる。当業者ならば、プローブに結合させるのに好適なその他の標識が分かり、通常の実験を用いてそのような確認ができる。
【０１８４】
本発明の方法によって増幅された配列は、ジデオキシシーケンシング、PCR、オリゴマー制限(Saiki et al. (1985) Bio/Technology 3:1008−1012)、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)プローブ解析(Conner et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:278)、オリゴヌクレオチド連結解析(OLAs)(Landgren et al. (1988) Science 241:1007)などのような特定のDNA配列の検出に通常適用されるいずれかの方法により、溶液中で、または固相支持体に結合させた後に、さらに評価、検出、クローンニング、配列決定などが可能である。DNA解析のための分子技術についてはすでに総論がある(Landgren et al. (1988) Science 242:229−237)。
【０１８５】
本明細書および米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、および同第4,965,188号(これらは各々、出典開示により本明細書の一部とされる)に記載のように、また、当業者により一般に用いられているように、増幅法はPCRによるのが好ましい。別の増幅法も記載されており、本発明のプライマーを用いてPCRにより増幅されたKCC遺伝子座がその別の手段でも同様に増幅される限り使用できる。かかる別の増幅系としては、限定されるものではないが、目的RNAの短配列とT7プロモーターを用いて開始する自立配列複製が挙げられる。逆転写酵素がRNAをcDNAへと転写してRNAを分解した後、逆転写酵素は第2のDNA鎖を重合する。
【０１８６】
もう1つの核酸増幅技術として核酸配列に基づく増幅(NASBATM)があり、逆転写とT7 RNAポリメラーゼを用い、2つのプライマーを組み込んでそのサイクルスキームを標的とする。NASBATM増幅はDNAまたはRNAのいずれかで開始し、いずれかで終わり、60ないし90分内に約108コピーまで増幅する。
【０１８７】
あるいは、核酸は連結活性化転写(LAT)により増幅させることもできる。LATは、一部が一本鎖で一部が二本鎖である単一プライマーを用いて一本鎖鋳型から始める。増幅は、cDNAとプロモーターオリゴヌクレオチドとを連結することで開始し、数時間内に約108ないし約109倍に増幅する。このQBレプリカーゼ系は、MDV−1と呼ばれるRNA配列を、目的DNA配列に相補的なRNAに付加することで利用できる。サンプルと混合すると、このハイブリッドRNAは試料のmRNAの中からその相補物を見つけ出して結合し、目的タグに沿った配列をコピーするレプリカーゼを活性化する。
【０１８８】
また別の核酸増幅技術であるリガーゼ連鎖反応(LCR)は、サンプル中の隣接配列の存在下でリガーゼと共有結合する目的配列の半分に2種の異なる標識をして用い、新しい標的を形成することで行う。修復連鎖反応(PCR)核酸増幅技術では、2種の相補的かつ標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ対、熱安定ポリメラーゼおよびリガーゼ、ならびにDNAヌクレオチドを用いて標的配列を幾何学的に増幅する。2塩基ギャップがこれらのオリゴプローブ対を離し、PCRがこのギャップを埋めて連結させ、正常なDNA修復を模倣する。
【０１８９】
鎖置換活性(SDA)による核酸増幅では、標的DNAと結合する短いオーバーハングを5'末端に有するHinc II認識部位を含む短プライマーを用いる。DNAポリメラーゼは、そのオーバーハングと反対側のプライマー部分を、硫黄を含有するアデニン類似体で埋める。Hinc IIを加えても、修飾されていないDNA鎖しか切断しない。5'エキソヌクレアーゼ活性を欠いたDNAポリメラーゼはニック部位に入って重合を開始し、下流にある最初のプライマー鎖に取って代わり、さらにプライマーとして働く新しいものを形成する。
【０１９０】
SDAは37℃にて2時間で約107倍を超える増幅をもたらす。PCRやLCRとは違って、SDAは装置による温度サイクルを必要としない。本発明の方法で有用なもう1つの増幅系としてQBレプリカーゼ系がある。PCRは本発明において好ましい増幅法であるが、これらの他の方法を用いても本発明の方法に記載のKCC遺伝子座を増幅することができる。このように本明細書および特許請求の範囲において「増幅技術」とは、これまでの方法を全て包含するものとする。
【０１９１】
本発明のもう1つの実施形態では、KCC遺伝子多形を有する被験体を同定する方法であって、被験体由来のサンプルの標的核酸を、好ましくはその標的核酸を増幅させた後、ジデオキシシーケンシグより配列決定することを含む方法が提供される。
【０１９２】
本発明のもう1つの実施形態では、KCC遺伝子多形を有する被験体を同定する方法であって、被験体由来のサンプルの標的核酸を、KCC多形の存在を検出する試薬と接触させ、その試薬を検出することを含む方法が提供される。多くのハイブリダイゼーション法が当業者に周知である。それらの多くが本発明を実施する上で有用である。
【０１９３】
当業者ならば容易に分かるであろうが、核酸のハイブリダイゼーションは、塩基組成、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数の他、塩濃度、温度または有機溶媒などの条件に左右される。ストリンジェントな温度条件としては、一般に30℃を超える、典型的には37℃を超える、好ましくは45℃を超える温度が挙げられる。ストリンジェントな塩条件とは、通常には1,000mM未満、典型的には500mM未満、好ましくは200Mm未満である。しかし、いずれか単独のパラメーターの基準よりもパラメーターの組合せの方が遙かに重要である。例えば、Wethmur & Davidson (1986) J Mol Biol 31:349−370参照。
【０１９４】
従って、本発明のヌクレオチド配列は、KCC遺伝子の相補ストレッチと二重らせん分子を選択的に形成するその能力ゆえに使用することができる。考えられる適用にもよるが、様々なハイブリダイゼーション条件を用いれば、標的配列に対して様々な程度のプローブ選択性が得られる。高い程度の選択性を必要とする適用では、典型的には比較的ストリンジェントな条件を用いてハイブリッドを形成する。例えば、0.02M〜0.15Mの塩、約50℃〜約70℃の温度(特に約55℃、約60℃、および約65℃など)といった比較的低い塩および／または高温条件を選択する。このような条件は特に選択的で、プローブと鋳型または標的鎖の間のミスマッチがあるにしてもわずかしか許容しない。
【０１９５】
もちろん適用の中には、例えば基礎となる鋳型とハイブリダイズした変異型プライマー鎖を用いて変異体を作製することが望まれる場合、または関連の種、機能的同等物などからポリペプチドコード配列を単離しようとする場合には、ヘテロ二重らせんを形成させるために典型的に低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が必要となることもある。このような状況の下では、0.15M〜0.9Mの塩、約20℃〜約55℃の範囲の温度(特に約25℃、約37℃、および約45℃、および約50℃など)といった条件を用いる。交差ハイブリダイズする種はこれにより、対照ハイブリダイゼーションに対して陽性のハイブリダイゼーションシグナルとして容易に識別できる。いずれの場合でも、一般に、温度の上昇と同様にハイブリッド二重らせんを不安定にする働きをするホルムアミド量を増加させて添加することで条件はよりストリンジェントなものにすることができると考えられる。このように、ハイブリダイゼーション条件は容易に操作でき、従って通常、所望の結果に応じて選択される方法である。
【０１９６】
ある実施形態では、ハイブリダイゼーションを判定する標識などの適当な手段とともに本発明の核酸配列を用いるのが有利である。当技術分野では、放射性リガンド、酵素的リガンド、またはアビジン／ビオチンなど、検出可能なシグナルを生じ得るその他のリガンドをはじめ、適当な指示薬が多彩に知られている。好ましい実施形態では、放射性試薬または環境上望ましくないその他の試薬の代わりに、ウレアーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはペルオキシダーゼなどの酵素タグが用いるのが好ましい。酵素タグの場合、相補的核酸を含有するサンプルとの特異的ハイブリダイゼーションを同定するために肉眼または分光光度計で認識できる試薬を提供するのに使用できる熱量測定指標物質が知られている。
【０１９７】
一般に、本明細書に記載のハイブリダイゼーションプローブは液相ハイブリダイゼーションならびに固相を用いた実施形態の双方で試薬として有用であると考えられる。固相を含む実施形態では、試験DNA(またはRNA)を含有するサンプルを選択されたマトリックスまたは表面に吸着、あるいは固定する。固定されたこの一本鎖核酸を次ぎに、所望の条件下で、選択されたプローブと特異的にハイブリダイズさせる。選択された条件はとりわけ、必要とされる特定の基準に基づいた特定の状況よって異なる(例えば、G+C含量、標的核酸の種類、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブの大きさなどによる)。非特異的に結合したプローブ分子を除去するためハイブリダイズした表面を洗浄した後、標識手段によって特異的ハイブリダイゼーションを検出、またはさらに定量する。
【０１９８】
本発明の方法で用いる材料はスクリーニングキットの作製に好適であることが理想的である。かかるキットは、バイアル、チューブなどの1以上の容器を密閉して収容するコンパートメントを有する担体を含んでよく、各容器は本方法で用いる個別の構成要素の1つを含む。例えば、容器の1つは、必要な酵素などKCC DNAを増幅する増幅試薬、および被験体由来の標的DNAを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【０１９９】
オリゴヌクレオチドプライマーとしては、限定されるものではないが、配列番号44〜110を含む群に由来する配列を有するプライマー、またはそれと実質的に相補的または実質的に相同なプライマー配列がある。標的フランキング5'および3'ポリヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーは実質的に配列番号1〜16、44〜110、112〜113のいずれかのフランキング5'および3'部分で示される配列、およびそれと実質的に相相補的または相同な配列を有する。KCCを増幅するためのその他のオリゴヌクレオチドプライマーも当業者に公知であるか、本明細書に示される本発明の開示を読めば容易に確認できる。
【０２００】
本発明によればキットは、被験体から得られた生物サンプルに由来する核酸サンプルを抽出するための溶液、バッファーまたはその他の試薬をさらに含んでもよい。当業者ならば容易に分かるであろうが、かかる試薬はいずれも本発明の範囲内にあるものとする。特定の例を示せば、核酸サンプルを捕捉するガラスビーズ懸濁液を伴った組織または細胞用の好適な溶解バッファー、およびガラスビーズから核酸サンプルを溶出する溶出バッファーは被験体から得られた生物サンプルから核酸サンプルを抽出する試薬を含む。
【０２０１】
他の例としては、GENOMIC ISOLATION KIT A.S.A.P.(商標) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana)、ゲノムDNA単離システム(GIBCO BRL, Gaithersburg, Maryland)、ELU−QUIK(商標)DNA精製キット(Schleicher & Schuell, Keene, New Hampshire)、DNA抽出キット(Stratagene, La Jolla, California)、TURBOGEN(商標)単離キット(Invitrogen, San Diego, California)など、市販の抽出キットが挙げられる。これらのキットの製造業者の説明書に従った使用は一般に、本発明の方法の実施に先立つDNAの精製に許容されるものである。
【０２０２】
F.  KCCの生物活性モジュレーターのスクリーニング
なおもう1つの態様では、本発明は、カリウム−クロライド共輸送体遺伝子産物の生物活性に作用する、またはそれを調節するそれらの能力、およびin vivoにおいてカリウム−クロライド共輸送体レベルに作用する、またはそれを調節するそれらの能力に関して物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、KCC2、KCC3および／またはKCC4遺伝子産物の生物活性に作用する、またはそれを調節するそれらの能力、およびin vivoにおいてCC2、KCC3および／またはKCC4レベルに作用する、またはそれを調節するそれらの能力に関して物質をスクリーニングする方法を提供する。この調節は細胞の増殖および分化に作用し得る。
【０２０３】
本発明の方法および組成物を用い、候補物質を試験するスクリーニングアッセイを行う。候補物質とは、KCC2、KCC3および／またはKCC4遺伝子または遺伝子産物または制御配列と結合またはその他の分子内相互作用することにより、遺伝子産物の生物活性を促進または阻害できる可能性のある物質である。
【０２０４】
F.1.   KCC2、KCC3および／またはKCC4の生物活性モジュレーターに関するスクリーニング法
候補物質を、KCC生物活性を調節するそれらの能力に関してスクリーニングする代表的な方法は、(a)生物学的に活性なKCCポリペプチドを含む、試験サンプルおよび対照サンプルの複製を確立し、(b)試験サンプルに候補物質を投与し、(c)試験サンプルおよび対照サンプルにおいてKCCポリペプチドの生物活性を測定し、さらに(d)その候補化合物が適当な対照に対してKCCの生物活性を調節するかどうかを調べることを含む。「調節」とは、KCCの生物活性または特性のいずれか、また全ての増強、低下、またはその他の変更を意図する。本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定される候補物質はKCC生物活性調節能を有する。かかる候補化合物は、KCC2、KCC3および／またはKCC4などのKCCの生物活性に関連する疾患および症状の治療に有用である。候補化合物は典型的には約500〜1000ダルトンであり、疎水性、多環式、またはその双方の分子であり得る。
【０２０５】
細胞フリー系では、本方法はKCCポリペプチドおよびKCCポリペプチドが結合し得るリガンドを含む制御系を確立し、KCCポリペプチド、リガンドおよび候補化合物を含む試験系を確立し、さらにその候補化合物が細胞フリー系でKCC活性を調節するかどうかを調べるステップを含む。代表的なリガンドはモノクローナル抗体を含み、この実施形態では、スクリーニングする生物活性または特性は結合親和性を含む。
【０２０６】
本発明のもう1つの実施形態では、KCCポリペプチド(例えば、KCC2、KCC3および／またはKCC4)、またはその触媒断片もしくは免疫断片もしくはオリゴペプチドは種々の薬剤スクリーニング技術のいずれかで化合物ライブラリーをスクリーニングするのに使用できる。このようなスクリーニングで用いられる断片は液相に遊離していてもよいし、固相支持体に固定されていてもよいし、細胞表面に保持されていてもよいし、あるいは細胞内にあってもよい。KCCポリペプチドと試験する薬剤の間の結合複合体の形成は測定可能である。
【０２０７】
使用できる薬剤スクリーニングのもう1つの技術は、出典明示により本明細書の一部とされる公開国際特許公報WO84/03564に記載されているような、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。本方法では、KCCポリペプチドに適用されるように、多数の異なる小試験化合物を、プラスチックピンまたは数種の他の表面などの固相支持体上で合成する。これらの試験化合物をKCCポリペプチドまたはその断片と反応させ、洗浄する。次ぎに結合したKCCを当技術分野で周知の方法によって検出する。精製したKCCポリペプチドはまた、上記の薬剤スクリーニング技術で用いるプレート上に直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、それを固相支持体に固定化することもできる。
【０２０８】
本発明のスクリーニングアッセイはまた、候補物質がKCCの生物活性を調節、すなわち阻害または促進し、それにより好ましくは標的細胞におけるカリウム−クロライド共輸送体の生物活性を調節する能力を調べることも含み得る。標的細胞は本発明のポリペプチドを含むことが分かっている天然に存在する細胞か、または本明細書の上記で示される形質転換法に従って作製される形質転換細胞かのいずれであってもよい。これらの試験サンプルはKCCポリペプチドを発現する細胞または細胞株をさらに含んでもよく、本発明はまた、この方法例で用いるのに好適な組換え細胞株を提供する。かかる細胞株は哺乳類またはヒトであってもよく、あるいは、限定されるものではないが、酵母をはじめ別の生物に由来するものであってもよい。遺伝子スクリーニングアッセイ、および酵母ツーハイブリッドスクリーニングのような分子生物学的スクリーニングをはじめとするアッセイ例は、カリウム−クロライド共輸送体またはその他のKCCを媒介とする細胞プロセスに重要なKCC相互作用遺伝子を効果的に同定する。酵母ツーハイブリッド系の一形式が記載されており(Chien et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA, 88:9578−9582)、Clontech (Palo Alto, California)から市販されている。
【０２０９】
K+−Cl−共輸送体活性の測定のための好ましいスクリーニング系は、実施例11に記載されるような個々のKCCイソ型をコードするcRNA(コピーRNA)の、アフリカツメガエル卵母細胞への注入である。実際、本発明は、K+−Cl−共輸送体のための卵母細胞の使用を初めて開示するものである。アフリカツメガエル卵母細胞の著しい利点は、最小の時間で複数の異なる構築物を発現する能力にある。また、内在するK+−Cl−共輸送活性も無視できるものであり、KCC構築物の解析の助けとなる。欠点としては、卵母細胞間、実験間、およびカエル間の変動性がある。しかし、同一の実験で複数の構築物および条件を比較できるので、この変動性は補正できる。さらにアフリカツメガエル卵母細胞はカチオン−クロライド共輸送体の動態分析に首尾良く用いられてきた(Gamba et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90(7):2749−2753; Gimenez et al. (1999) FASEB J 13:A64)。他のいくつかの容積感受性輸送体、イオンチャネルおよび関連タンパク質も、適当な生理応答とともにアフリカツメガエル卵母細胞で発現されている(Ji et al. (1998) Am J Physiol 275(5 Pt 1):C1182−119O; Krapivinsky et al. (1994) Cell 76(3):439−448; Vandorpe et al. (1998) J Biol Chem 273(34):21542−21553;およびGrunder et al. (1992) Nature 36O(6406):759−762)。このように、Na+−K+−2Cl−共輸送体BSC2/NKCC1は、哺乳類細胞でもそうであるように、卵母細胞で発現した場合に高張性によって活性化される。細胞膨張もまた、赤血球におけるその挙動から推定されるように、卵母細胞で発現する主要赤血球K+−Cl−共輸送体KCC1 (Su et al.(1999) Am J Physiol 277(5 Pt 1):C899−C912)およびCa2+活性化K+チャネルISK1(Vandorpe et al. (1998) J Biol Chem 273(34):21542−53)を活性化する。
【０２１０】
当技術分野では周知であるが、スクリーニングアッセイでは、KCC生物活性および／またはカリウム−クロライド共輸送体のレベルの調節を試験するのに好適な条件下にある細胞を提供する。これらの条件としては、限定されるものではないが、pH、温度、張力、関連する代謝因子(例えば、Ca++などの金属イオン、増殖因子、インターロイキンまたはコロニー刺激因子)の存在、およびグリコシル化またはプレニル化などのポリペプチドに対する関連する修飾が挙げられる。本発明のポリペプチドは原核細胞でも真核細胞でも発現可能であり、利用可能であると考えられる。この宿主細胞はまた分画して、レセプターが見られる細胞下画分としてもよい。例えば、そのポリペプチドを発現する細胞を核、小胞体、小胞、または細胞の膜表面に分画することができる。米国特許第5,837,479号、同第5,645,999号、同第5,786,152号、同第5,739,278号、および同第5,352,660号もスクリーニングアッセイ例を開示しており、それらの内容は全て出典明示により本明細書の一部とする。
【０２１１】
ある実施形態では、スクリーニングアッセイは本発明の1以上の遺伝子または遺伝子産物と相互作用する、またはそれらを調節する選択的能力を有する候補物質を識別できるように計画されている(ただし、これらの物質は別の遺伝子または遺伝子産物と実質的に重複する活性を持たない)。例えば、ある物質はKCC3の生物活性を調節できるが、KCC4に対しては全く作用しないか、低い作用しか示さない。かかる選択的作用はある試験サンプルの作用が別のものに対して30％以上、あるいは好ましくは100％以上であればよい。
【０２１２】
本発明は、合理的薬剤設計によってカリウム−クロライド共輸送体のモジュレーターを同定する方法を意図するものである。本方法は、KCC(例えば、KCC2、KCC3および／またはKCC4)ポリペプチドの構造に基づいて、基質結合部位においてアミノ酸と非共有結合を形成するカリウム−クロライド共輸送体の可能性あるモジュレーターを設計し、そのモジュレーターを合成し、さらに、その可能性あるモジュレーターがカリウム−クロライド共輸送体の活性を調節するかどうかを調べるステップを含む。モジュレーターは当技術分野で公知の技術を用いて合成することができる。そのモジュレーターがカリウム−クロライド共輸送体の生物活性を調節するかどうかの決定は、本明細書に記載のスクリーニング法に従うか、または当技術分野で公知の他のスクリーニング法によって行う。
【０２１３】
F.2.  in vivoカリウム−クロライド共輸送体レベルモジュレーターのスクリーニング法
本発明によれば、in vivoカリウム−クロライド共輸送体レベルおよび／または活性を調節する能力に関して候補化合物をスクリーニングする方法もまた提供される。KCC(例えば、KCC2、KCC3および／またはKCC4)レベルの代表的モジュレーターはカリウム−クロライド共輸送体転写または発現モジュレーターを含み得る。カリウム−クロライド共輸送体をコードする遺伝子の転写または発現を増強する、または低下させる医薬はカリウム−クロライド共輸送体の生物活性の調節にとっての重要な臨床適用を有する。この調節はカリウム−クロライドのホメオスタシスを左右し得る。
【０２１４】
このように本発明は、本発明のKCC2、KCC3および／またはKCC4のみならず、その他のカリウム−クロライド共輸送体をコードする遺伝子も含むカリウム−クロライド共輸送体コード遺伝子の発現レベルを調節する化合物の発見方法も含み、かかる化合物の使用も記載する。この一般的アプローチはKCC2、KCC3および／またはKCC4コード遺伝子の発現を増強する、または低下させる物質の化合物ライブラリーをスクリーニングするものである。技術例が米国特許第5,846,720号および同第5,580,722号に記載されており、それらの内容は出典明示により全て本明細書の一部とする。
【０２１５】
以下の用語は当業者には十分理解されていると考えられるが、本発明の説明を助けるため、以下の定義を示す。
【０２１６】
「転写」とは、RNAポリメラーゼと、遺伝子のコード配列中に存在する構造情報のRNAとしての発現を指示する遺伝子との相互作用を含む細胞内プロセスを意味する。このプロセスには、限定されるものではないが、以下のステップ：(a)転写の開始、(b)転写物の伸張、(c)転写物のスプライシング、(d)転写物のキャップ、(e)転写物の終結、(f)転写物のポリアデニル化、(g)転写物の核輸送、(h)転写物の編集、および(i)転写物の安定化が含まれる。「発現」とは一般に、生物学的に活性なポリペプチドがRNAから作製される細胞内プロセスをさす。
【０２１７】
「転写因子」とは、かかる遺伝子と結合する、またはかかる遺伝子のRNA転写物と結合する、あるいはかかる遺伝子もしくはかかるRNA転写物と結合する別のタンパク質、または次ぎにかかる遺伝子もしくはかかるRNA転写物と結合する別のタンパク質と結合し、それによりその遺伝子の発現を調節する細胞質タンパク質または核タンパク質を意味する。かかる調節はさらに他の機構によって達成してもよく、「遺伝子の転写因子」の神髄は遺伝子の転写レベルがなんらかの方法で変更されることにある。
【０２１８】
本発明によれば、カリウム−クロライド共輸送体をコードする遺伝子の転写レベルを調節し得る、従ってカリウム−クロライド共輸送体作用の調節において治療薬として機能し得る候補化合物または分子を同定する方法が提供される。この調節は細胞の増殖と分化に作用し得る。かかる調節は直接的なもの、すなわち、DNA転写物であれRNA転写物であれヌクレオチド配列への候補化合物の直接的結合を介するものであってもよいし、あるいはかかる調節は、候補化合物によって作用されて最終的に直接的結合、リン酸化または脱リン酸化などをはじめとするいずれかの機構によりカリウム−クロライド共輸送体転写を調節する、KCC2、KCC3および／またはKCC4以外のタンパク質など1以上の中間体を介して達成してもよい。
【０２１９】
この方法は、細胞または核酸サンプルを、試験する候補化合物または分子と接触させることを含む。これらのサンプルは、KCC2、KCC3もしくはKCC4プロモーターまたは推定上流調節領域(本明細書に配列番号17〜19および113として開示される代表的プロモーター)など、KCC2、KCC3および／またはKCC4遺伝子の転写および／または翻訳を調節するエレメント、および何らかの方法で検出できるポリペプチドをコードするDNA配列を含み得る核酸を含む。従ってこのポリペプチドは「レポーター」または「マーカー」として記載することができる。好ましくは、この候補化合物は、カリウム−クロライド共輸送体コード遺伝子の発現を直接的または特異的に転写調節する。かかる化合物はカリウム−クロライド共輸送体に関連する疾病および／または疾患を治療する上で治療または医薬用途を持つと期待される。
【０２２０】
このDNA配列をプロモーターと連結して、そのプロモーターの制御下、候補化合物または分子が、KCC2、KCC3および／またはKCC4をコードする遺伝子の転写モジュレーターとして機能することができるとすれば、発現されるポリペプチドを生じ、そして検出可能なシグナルを生じ、それを定量的にアッセイして適当な対照と比較することができるような条件に置く。目的の候補化合物または分子としては、KCC2、KCC3および／またはKCC4プロモーターからの転写を増強する、または低下させる、すなわち調節するものがある。レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼなど、当技術分野で公知のレポーターをコードするか、あるいはKCC2、KCC3および／またはKCC4をコードするものであってもよい。
【０２２１】
本発明のある実施形態では、このようにして生じたポリペプチドは抗体との複合体を形成させてもよいし、あるいはビオチンとの複合体を形成させてもよい。この場合、得られた複合体は当技術分野で公知の方法によって検出できる。このアッセイの検出可能なシグナルはまた、該レポーター遺伝子の転写によって生じたメッセンジャーRNAにより提供してもよい。シグナルがいかに正確に生じて検出されるかは多様であり、これは本発明の課題ではなく、むしろ本発明はかかるアッセイに用いるKCC2、KCC3および／またはKCC4のヌクレオチド配列および／または推定調節領域を提供する。これらの方法で試験する分子は精製された分子であっても、均質なサンプルであっても、分子または化合物の混合物であってもよい。さらに、本発明の方法では、細胞内のDNAは1を超える調節可能な転写調節配列を含んでもよい。
【０２２２】
本発明によれば、上記の方法による迅速ハイスループットスクリーニング法も提供する。このスクリーニング法は実質的に同一の複数のサンプルの各々を個別に接触させることを含む。かかるスクリーニング法では、この複数のサンプルは好ましくは約104サンプルを含み、あるいはより好ましくは約5x104サンプルを含む。
【０２２３】
F.3.  動物モデル
さらに、KCC2、KCC3および／またはKCC4の生物活性を調節し得る化合物を同定するためには動物に基づく系を使用できる。かかる動物モデルはカリウム−クロライド共輸送体の生物活性を調節するのに効果的であり得る薬剤、医薬、療法および介入の確認に使用できる。例えば、動物モデルは、カリウム−クロライド共輸送体の生物活性徴候を調節する能力を示すと思われる化合物に、その曝された動物においてカリウム−クロライド共輸送体の生物活性徴候の調節を誘起するに十分な濃度および時間で曝すことができる。この暴露に対する動物の応答はin vivoにおいてカリウム−クロライド共輸送体の発現レベルおよび活性をアッセイすることで、あるいはその動物由来の生物サンプルを試験することでモニターすることができる。上記の方法では、化合物がKCC2、KCC3、KCC4、またはその他のカリウム−クロライド共輸送体もしくはイオン輸送体活性を調節する、あるいは治療効果を達成する機構は様々であると考えられ、本発明の有用性は、効果が達成される厳密な機構によらない。
【０２２４】
例えば、本発明の動物モデルはマウスKCC2、KCC3およびKCC4遺伝子がターゲッティング調節されるマウスを含み得る。全ての体細胞のKCC遺伝子の完全機能不活性化または部分的機能不活性化を伴うマウス系統はネズミ胚幹細胞における位置指定組換えの標準技術を用いて作出する。Capecchi (1959) Science 244(4910):1288−92; Thomas & Capecchi (1990) Nature 346(6287):847−5O; Delpire et al. (1999) Nat Genet 22(2):192−5参照。「ノックアウト」ネズミKCC2マウスが作出されており、得られた同型接合KCC−/−マウスは発作症状と高い周産期死亡率を示す。このようにHCC2ノックアウトマウスは、KCC2が癲癇の薬剤標的となるという証拠、さらにはヒトKCC2が医療上適切な遺伝子であるという証拠を示す。
【０２２５】
別法としては、万能または組織特異的プロモーターによって駆動されるアンチセンスまたはリボザイムKCC構築物を用いて体細胞における個々のKCCのレベルを低下させ、個々のイソ型の「ノックダウン」を達成することを含む(Luyckx et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(21):12174−12179)。本発明はまた、個々のまたは複数のKCC遺伝子の条件による不活性化または誘導性不活性化を伴うネズミ系統の作出を提供する(Sauer (1998) Methods 14(4):381−392)。例えば、lox−PフランキングKCC4遺伝子を有するマウス系統と、腎臓のアンドロゲンによって調節されるタンパク質のプロモーターを用いて近位曲尿細管でCre−レコンビナーゼを発現するトランスジェニック系統とを連続交配することにより、KCC3およびKCC4の公知の発現部位である腎臓の近位曲尿細管においていずれのKCCの発現も欠くマウスを作出する(Ding et al. (1997) J Biol Chem 272(44);28142−28148)。
【０２２６】
本発明はまた、KCC2、KCC3、またはKCC4遺伝子における特異的「ノックイン」改変を有するマウス系統を提供する。これは、疾病特異的リピート拡張の挿入(White et al. (1997) Nat Genet 17(4):404−410)などの操作の他、KCC遺伝子に遺伝学上(Forlino et al. (1999) J Biol Chem 274(53):37923−37931)および機能上(Kissel et al. (2000) EMBO J 19(6):1312−1326)関連のある点突然変異を有するマウスを含む。
【０２２７】
本発明のある態様は、カリウム−クロライド共輸送体を媒介とする生物活性のいずれかの態様を変更するいずれの処理も含む。かかる化合物は本明細書の以下に記載される方法に従うヒトへの治療的介入の候補とみなせるはずである。試験薬の用量は、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第5,849,578号に記載のものなど、用量応答曲線を導くことで求めることができる。
【０２２８】
G.  治療法
本明細書において「活性」および「生物活性」とは同義語であり、例えば、KCC2、KCC3および／またはKCC4ポリペプチドのいずれかの生物活性をさすものとする。KCC3および／またはKCC4の代表的生物活性は、カリウム−クロライド共輸送体活性または本発明に従うその他の生物活性の調節における活性を含む。
【０２２９】
本発明の治療法に関しては、好ましい被験体は脊椎動物被験体である。好ましい脊椎動物は温血動物であり、好ましい温血脊椎動物は哺乳類である。好ましい哺乳類はマウスであり、あるいはより好ましくはヒトである。本明細書において、また特許請求の範囲では、「患者」とは、ヒトおよび動物の双方を含むものとする。従って獣医学的治療用途も本発明に従うものとする。
【０２３０】
ヒトなどの哺乳類、ならびにシベリアンタイガーのような絶滅の危機に瀕していることで重要な哺乳類、人間の消費目的で農場飼育される動物のような経済的に重要な哺乳類、および／またはペットとして、あるいは動物園で飼育されいる動物のような人間とって社会的に重要な動物の治療が意図される。かかる動物の例としては、限定されるものではないが、ネコおよびイヌなどの肉食動物；子豚、去勢食用豚をはじめとするブタ；畜牛、去勢牛、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、およびラクダなどの反芻動物および／または有蹄類、ならびにウマが挙げられる。また、絶滅の危機に瀕している、または動物園で飼育されている種の鳥、ならびに鳥、より詳しくは飼い鳥、すなわち、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなどの家禽などの治療をはじめ、鳥類の治療も、それらもヒトにとって経済上重要なものであることから意図される。従って、限定されるものではないが、飼い豚、反芻動物、有蹄類、馬、家禽などをはじめとする家畜の治療が意図される。
【０２３１】
G.1.  カリウム−クロライド共輸送体の生物活性の調節
ある実施形態では、本発明に従う治療方法は、カリウム−クロライド共輸送体の生物活性を調節する、すなわち阻害または促進する物質を被験体に投与することを含む。かかる物質はin vitroまたはin vivoいずれかで、上記に示したスクリーニングアッセイのいずれかに従って同定することができる。この方法はカリウム−クロライド共輸送体の生物活性と関連する、またはそれによって調節される疾患を患う脊椎動物被験体を、上記のスクリーニングアッセイに従って同定された有効量の物質を被験体に投与することによって治療することを含む。「調節する」とは、その物質が、治療する疾患に応じてカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドの生物活性を促進することができるか阻害することができるかのいずれかであって、KCC2、KCC3および／またはKCC4をはじめとするカリウム−クロライド共輸送体の1つまたはいくつか、ならびに他のイソ型のカリウム−クロライド共輸送体、イオン輸送体、またはその他の関連のない遺伝子もしくは遺伝子産物に作用し得ることを意図する。治療処置としては、選択されたカリウム−クロライド共輸送体の領域に対する抗体の投与、活性を増強するタンパク質の投与、またはカリウム−クロライド共輸送体の転写を阻害するタンパク質の投与を含む。かかる投与は、限定されるものではないが、高血圧症、癲癇、鎌状赤血球貧血症、バーター症候群、およびメニエール病をはじめとするカリウム−クロライド共輸送体を媒介とする機構によって引き起こされる、または悪化され得る疾患の治療を提供することができる。
【０２３２】
カリウム−クロライド共輸送体活性のモジュレーターがポリペプチドの、すなわち抗カリウム−クロライド共輸送体モノクローナル抗体またはそのフラグメントの形態をとり得る限り、効力は様々であり、従って「治療効果」も様々であり得ると考えるべきである。しかし、本アッセイ方法で示されるように、当業者ならば、本発明の候補となるカリウム−クロライド共輸送体生物活性モジュレーターの効力および効果を容易に評価でき、従って治療計画を調整することができる。カリウム−クロライド共輸送体生物活性のモジュレーターは、レポーター遺伝子の発現を駆動する応答性レポーターの使用；カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドと本明細書に記載のモノクローナル抗体との相互作用；および当業者に公知であり、本明細書にも記載されている他のアッセイを通じるものなど、種々の手段で評価することができる。
【０２３３】
本発明のモノクローナル抗体またはポリペプチドは注射または経時的な逐次注入によって非経口投与できる。治療する組織は全身投与により体内接近できるのが典型であることから、治療組成物の静脈投与によって治療することが最も多いが、ターゲッティングされる組織が標的分子を含み得る場合には、その他の組織および送達手段も考えられ、当業者に公知である。これらの組成物は適当な方法で処方し、投与処方に適合した方法で投与する。
【０２３４】
G.2.  モノクローナル抗体
本発明はある実施形態において、KCC2、KCC3および／またはKCC4との応答を誘起するが、いずれのカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドとも、あるいはカリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドの特定のイソ型とは免疫反応し、カリウム−クロライド共輸送体ポリペプチドと結合して生物活性を調節できるモノクローナル抗体の形態のカリウム−クロライド共輸送体モジュレーターを記載する。本発明はまた、これらの抗体を産生する細胞株、それらの細胞株を作製する方法、およびモノクローナル抗体を産生する方法も記載する。
【０２３５】
「抗体」または「抗体分子」とは、免疫グロブリン分子の集団および／または免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわちパラトープを含む分子を包括的にさす。パラトープとは、抗原決定基、すなわちエピトープとの抗体結合を司る抗体部分である。
【０２３６】
本発明で用いる代表的な抗体は完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子、一本鎖免疫グロブリンまたは抗体、抗体フラグメントをはじめ、パラトープを含むこれらの免疫グロブリン分子の一部である。実際、所望により一価のモジュレーターを使用できることも本発明の範囲内であると考えられる。従って、「調節する」、「調節」および「モジュレーター」とはかかる機構を包含するものとする。
【０２３７】
「モノクローナル抗体」とは、1種類のパラトープしか含まないことから、それが免疫反応するいずれの特定のエピトープに対して、典型的には単一の結合親和性しか示さない抗体分子の集団をさし、モノクローナル抗体は、各々異なるエピトープに免疫特異性を持つ複数の抗体結合部位を有することができ、例えば二特異性モノクローナル抗体がある。モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞、またはハイブリドーマ細胞培養系を作製する方法は上記されている。
【０２３８】
また、あるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じまたは同等の特異性または免疫反応特性を有しているかどうかは、前者が後者の、予め選択した標的分子との結合を妨げるかどうかを確認することにより、過度な実験を行わずに調べることができる。試験するモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合すれば(固相で存在する場合、標的分子との結合に関する標準的競合アッセイにおいて本発明のモノクローナル抗体によって結合が低下することで示される)、その2つのモノクローナル抗体は同じ、または密接に関連するエピトープと結合するものと考えられる。
【０２３９】
モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを調べるなお別の方法としては、本発明のモノクローナル抗体を、通常それが反応する標的分子とともにプレインキュベートした後、試験するモノクローナル抗体を加えて、試験するモノクローナル抗体の、その標的分子と結合する能力が阻害されるかどうかを調べるものがある。試験するモノクローナル抗体が阻害されれば、おそらくは本発明のモノクローナル抗体と同じ、または機能上同等なエピトープ特性を有する。
【０２４０】
あるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを調べるさらなる方法としては、目的抗体のCDR領域のアミノ酸残基配列を調べるものがある。「CDR」(相補性決定領域)とは、超可変配列を有し、主として抗原との直接接触を司るループ構造を形成する軽鎖または重鎖可変領域3つのサブ領域を意味する。CDR領域に同一、または機能上同等のアミノ酸残基配列を有する抗体分子は同じ結合特異性を有する。ポリペプチドを配列決定する方法は当技術分野で周知である。さらに、抗体が同様の免疫特異性を有するかどうかを調べる他の方法も当技術分野で公知であり、本発明の実施に有用であり得る。
【０２４１】
抗体の免疫特異性、その標的分子結合能、およびその抗体がエピトープに対して示す不随の親和性は、その抗体が免疫反応するエピトープによって規定される。このエピトープ特異性は少なくともある部分は、その抗体を含む免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸残基配列によって、またある部分は軽鎖可変領域アミノ酸残基配列によって規定される。「〜の結合特異性を有する」または「〜の結合選択性を有する」を使用する場合、同等のモノクローナル抗体が同じまたは類似の免疫反応(結合)特性を示し、予め選択した標的分子との結合に関して競合することを示す。
【０２４２】
ヒト化モノクローナル抗体は、特にそれらがヒトにおいて治療的に使用できる場合には、他の哺乳類に由来するモノクローナル抗体に優る特定の利点を示す。具体的には、ヒト抗体は「外来」抗原ほど迅速に循環から排除されず、外来抗原および外来抗体と同様の様式で免疫系を活性化することはない。「ヒト化」抗体の作製方法は一般に当技術分野で周知であり、本発明の抗体にも容易に応用することができる。
【０２４３】
また、抗体、特にモノクローナル抗体、より詳しくは一本鎖モノクローナル抗体を作製するための分子クローニングアプローチの使用も意図される。一本鎖抗体の作製は当技術分野で記載されている(例えば、その内容が出典明示により本明細書の一部とされる、米国特許第5,260,203号参照)。このアプローチでは、免疫動物の脾臓から単離したRNAからコンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーを作製し、適当な抗体を発現するファージミドを、内皮組織上をパンニングすることで選択する。このアプローチの従来のハイブリドーマ法に優る利点は、約104倍といった多数の抗体が1回で作製およびスクリーニングできること、および経時的に一本鎖における軽鎖の組合せによって新しい特異性が得られ、これにより適当な抗体を発見できる確率がさらに高まることである。このように、本発明の抗体、または本発明の抗体の「誘導体」は、本明細書に記載の抗体の軽鎖および重鎖凝集可変領域の結合特異性および親和性と実質的に同じ結合特異性および親和性を有する一本鎖ポリペプチド結合分子に適する。
【０２４４】
G.3.  他のモジュレーター
本明細書において組織中のカリウム−クロライド共輸送体活性が開示されれば、本発明の方法に従って化学化合物(例えば、小分子模倣体)を用いて、組織中のカリウム−クロライド共輸送体活性を調節することができるということも考えられる。かかる化合物の同定には、上記に示された組織中のカリウム−クロライド共輸送体活性に対するスクリーニングアッセイの説明が助けとなる。
【０２４５】
例えば、最初の機能データ(図２４〜２５)はタンパク質ホスファターゼ−1を増強する薬剤がK+−Cl−共輸送体活性を増強することを示す。ブメタニド、フロセミド、DIDSおよびDIOAなどのアニオン輸送阻害剤誘導体はK+−Cl−共輸送体に対して著しい阻害可能性を有し得る。最後に、その変異体およびキメラに加えて4つのKCCを用いた構造機能研究により、KCC特異的およびイソ型特異的阻害剤の作製に決定的な重要なデータが得られる。
【０２４６】
G.4.  遺伝子療法
カリウム−クロライド共輸送体遺伝子は本発明に従って遺伝子療法に使用できる。遺伝子療法法の例としては、宿主細胞への核酸のリポソームトランスフェクションが挙げられ、米国特許第5,279,833号、同第5,286,634号、同第5,399,346号、同第5,646,008号、同第5,651,964号、同第5,641,484号、および同第5,643,567号に記載されている(なお、これら各々の内容は出典明示により本明細書の一部とされる)。
【０２４７】
要するに、標的細胞におけるカリウム−クロライド共輸送体の生物活性に作用する、またはそれを調節することを目的とした、カリウム−クロライド共輸送体レベルの調節に向けられる遺伝子療法が記載される。この調節は細胞の細胞の増殖と分化に作用し得る。ある実施形態では、本発明の治療法は、(a)1以上のカリウム−クロライド共輸送体の生物活性を調節するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、有効量のDNA分子を細胞に送達し、さらに(b)該ポリペプチドの発現に十分な条件下で細胞を維持するステップを含むカリウム−クロライド共輸送体レベルの調節方法を提供する。
【０２４８】
好ましい実施形態では、送達されるポリペプチドは配列番号1、3、5、7、9、11、13、15および112のいずれかの配列を含む。送達はDNA分子を細胞に注入することで達成できる。その細胞が被験体内のものであれば、投与は、(a)そのDNA分子を含むビヒクルを準備し、さらに(b)そのビヒクルを被験体に投与するステップを含んでなる。
【０２４９】
ビヒクルはDNA分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞であるか、あるいはかかる形質転換またはトランスフェクト細胞に由来するトランスフェクトであるのが好ましい。例としての好ましい形質転換またはトランスフェクト細胞はリンパ球、または治療する腫瘍由来の腫瘍細胞である。本発明のDNA分子で細胞を形質転換またはトランスフェクトする手段は上記に示されている。
【０２５０】
あるいは、ビヒクルは標的組織または腫瘍の抗原に特異的に感染する、またはそれと免疫反応するウイルスまたは抗体である。ウイルス感染系の利点は適当なレシピエント細胞に極めて高レベルの感染が考慮できることである。また抗体はDNA分子のターゲッティングおよび送達にも使用されている。
【０２５１】
また、本発明のこの実施形態はレトロウイルスベクターおよびワクシニアウイルスをはじめ、ウイルスを非病原性とするように何らかの方法でゲノムを操作した代替のウイルスまたはファージベクターを用いて実施することもできる。かかるウイルス変異を作出する方法は、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第4,769,331号に詳細に示されている。
【０２５２】
G.5.  関連の疾病および疾患の治療におけるin vivoカリウム−クロライド共輸送体レベルの調節方法
多細胞生物においてカリウム−クロライド共輸送体をコードする遺伝子の発現を転写調節して、温血脊椎動物被験体のカリウム−クロライド共輸送体活性を調節する方法も本発明により意図される。この方法は温血脊椎動物被験体へ化合物を、カリウム−クロライド共輸送体の発現を転写調節するのに有効な濃度で投与することを含む。
【０２５３】
本発明によれば、意図される化合物は所望により、上記のように製造され、カリウム−クロライド共輸送体の発現を転写調節する抗体またはポリペプチドを含んでもよい。所望により、この抗体またはポリペプチドはDNAまたはRNAと直接結合してもよいし、あるいは転写に関与するタンパク質と直接結合してもよい。
【０２５４】
本発明に従って用いられる特に意図される化学物質(例えば、小分子模倣体)は、多細胞生物であれ単細胞生物であれ、いずれの細胞にも天然には存在しない。いっそうより詳しくは、意図される化学物質は天然に存在する分子ではなく、例えば化学的に合成されたものである。所望により、この化合物は遺伝子の調節可能な転写配列に連結してもよい。例えば、この化合物はKCC2、KCC3および／またはKCC4、ならびにその他のカリウム−クロライド共輸送体をコードする核酸配列の上流のプロモーター領域に連結することができる。
【０２５５】
上記の方法では、転写の調節によって、細胞と接触する分子の特徴に応じ、目的タンパク質をコードする遺伝子の発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかがもたらされる。
【０２５６】
G.6.  アンチセンスオリゴヌクレオチド療法
また、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15および112のいずれかに記載されるものなどのカリウム−クロライド共輸送体をコードする核酸分子に由来するアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を通じて、脊椎動物被験体においてカリウム−クロライド共輸送体の発現が調節できるということも、本発明により意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する治療法は当技術分野において、例えば米国特許第5,627,158号および同第5,734,033号(なお、これら各々の内容は出典明示により本明細書の一部とされる)に記載されている。
【０２５７】
G.7.  用量
本明細書において「有効」量とは、K+−Cl−共輸送体機能不全の症状を示す個々の患者がその改善を生じるに十分なように調整された用量で投与されるものをさす。本発明の本明細書における開示を再考すれば、当業者ならば、特定の処方およびその組成物とともに用いられる投与法、ならびに患者の身長、体重、症状の重篤度、および治療する疾患のステージを考慮して個々の患者の用量を調整することができる。
【０２５８】
有効な用量と治療上有効な用量は一般に同義である。しかし、化合物は症状の軽減した患者に投与することができるし、あるいは治療処置として患者に投与することもできる。ゆえに、この化合物は疾患の症状がない場合の治療処置にも有効であり得る。
【０２５９】
例えば1日1〜4回、単位用量を投与することができる。より好ましくは、1日2回(BID)単位用量を投与する。用量は投与経路および化合物を含有する組成物の処方によって異なる。さらに、当業者ならば本発明の開示を理解すれば、用いる薬剤の組合せ、患者の齢および体重、ならびに治療する症状の重篤度に応じた用量に調節または変更を行う必要があることが分かるであろう。
【０２６０】
かかる調節または変更、ならびにかかる調節または変更をいつ、そしてどのように行うかという評価も、製薬業の熟練者には周知である。評価パラメーターおよび技術は患者により、また疾病の重篤度によって異なり得る。特に有用な評価法は実施例に開示されている。
【０２６１】
G.7.1.  遺伝子療法ベクター構築物の投与
罹患組織に直接投与する場合のベクター構築物の最大許容用量(MTD)を求める。第一の終点は、1)異常および／または正常細胞における導入率、2)全身循環および罹患細胞におけるこのベクターの存在および安定性、および3)ベクターによって引き起こされる全身毒性(発熱、筋肉痛)および局部毒性(感染症、痛み)の性質である。第二の終点はベクター構築物の臨床効果である。
【０２６２】
例えば、1セッション当たり4ml血清フリー量のウイルス(例えば、アデノウイルス、レトロウイルスなど)ベクター構築物(AIM V培地中に5x107までのウイルス粒子を含有)を毎日投与する。各セッションでは、適当な力価のウイルス構築物を含有する1ml培地を、臨床試験室で1セッション当たり全4mlを4箇所の罹患組織に注射する。これを4日間毎日繰り返す(4セッション)。この4日間にわたる全接種量16mlはヌードマウスに安全に許容されるもの(0.5ml/20g体重)を比例的に十分下回るものである。
【０２６３】
患者の評価は、療法の開始前およびベクター構築物の4日間毎日の履歴および身体検査が含まれる。毒性の階級付けはECOG一般毒性基準を用いて行う。CBC, SMA−20検尿および通常の試験をこの期間中毎日行う。
【０２６４】
G.7.2.  段階的用量増加およびMTD
患者は3x106のウイルス粒子4倍で処置する。患者の全てがグレード2以下の全ての毒性(脱毛を除く)から回復したところで、グレード3〜4の毒性が克服されなければ、患者にその次の用量レベルを開始する。所定の用量レベルでグレード3または4の毒性が生じた場合、6名の患者の最小値をそのレベルとして記録する。6名の患者のうち1名だけがグレード3または4の毒性を有するので、段階的用量増加を続ける。ベクター構築物のMTDは、6名の患者のうち2名がグレード3または4の毒性を受ける用量と定義される。3名の患者のうち2名、6名のうち3名がグレード3または4の毒性を受ける場合、MTDは即時低用量レベルと定義される。
【０２６５】
段階的増加計画は以下の通りである：1)レベル1,3x106ウイルス粒子;2)レベル2,1x107;3)レベル3,3x107;4)レベル4,5x107。測定可能な疾病を有する患者はベクター構築物に対する臨床応答を評価する。組織学および局所症状も追跡する。NEクリアランス、チラミン投与、および実施例に記載されるものなどその他の標準試験も使用する。
【０２６６】
G.8.  治療化合物の処方
カリウム−クロライド共輸送体生物活性調節物質、遺伝子療法ベクターおよび上記のカリウム−クロライド共輸送体をコードする核酸セグメントの発現を阻害または促進する物質は上記のような医薬組成物として投与するのに適合している。さらなる処方剤および用量調整法は当技術分野に記載されている(例えば、1994年7月5日にSeipp et al.に発行された米国特許第5,326,902号、1993年8月10日にMarnett et al.に発行された米国特許第5,234,933号、および1993年12月23日に公開されたJohnson et al.の国際特許公報WO93/25521(なお、これらの内容は各々出典明示により本明細書の一部とされる)に記載のものを参照)。
【０２６７】
上記を目的に、同定された物質は一般に、通常は経口または非経口投与により全身または局所投与することができる。投与する用量は齢、体重、症状、所望の治療効果、投与経路および処置期間などに応じて決定され、治療処置分野の熟練者ならば有効な療法のための適当な投与計画を定めるのに適した手順および技術が分かっている。種々の組成物および投与形が考えられ、それらは当技術分野で一般に公知である。その他の投与組成物としては、1種以上の有効物質を含む外用水剤、および塗布剤(軟膏など)、坐剤およびペッサリーがあり、公知の方法によって製造できる。
【０２６８】
このように本発明は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または分子もしくは化合物と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。より詳しくは、医薬組成物は本明細書の以下に記載されるスクリーニング法によって発見される化合物を含む。
【０２６９】
本発明の組成物は、所望に応じて、標準的な、周知の無毒で生理学上許容される担体、アジュバントおよびビヒクルを含有する単位投与製剤で非経口投与するのが典型である。本明細書において「非経口」とは、静注、筋肉注射、動脈注射または点滴法を含む。
【０２７０】
注射製剤、例えば滅菌水性注射液または油性注射懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および沈殿防止剤を用いて公知の技術に従って処方する。また滅菌注射製剤は無毒な非経口上許容される希釈剤または溶剤(例えば、1,3−ブタンジオール)中の滅菌注射溶液または懸濁液であってもよい。
【０２７１】
使用できる許容ビヒクルおよび溶剤としては、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。また通常は、滅菌固定油が溶剤または懸濁媒体として使用されている。この目的では、合成モノグリセリドまたはジグリセリドをはじめ、いずれの銘柄の固定油を用いてもよい。また、オレイン酸などの脂肪酸も注射液の製造に使用できる。
【０２７２】
好ましい担体としては、リン酸、乳酸、トリスなどで緩衝させた中性生理食塩水溶液が挙げられる。もちろんベクターは、そのベクター構築物を受容する個体において不都合な反応を何ら起こさないよう、欠陥干渉アデノウイルス粒子または内毒素およびその他の発熱物質などの望ましくない夾雑物を実質的に含まないように十分精製する。ベクターを精製する好ましい手段としては、塩化セシウム勾配遠心分離などの浮揚性密度勾配の使用が挙げられる。
【０２７３】
またトランスフェクト細胞も担体として機能し得る。例として、肝細胞を生物から取り出し、上記の方法を用いて本発明のポリヌクレオチドでトランスフェクトした後、そのトランスフェクト細胞を再びその生物に戻す(例えば、血管注入)ことができる。
【０２７４】
【実施例】
以下の実施例は本発明の様式を説明するために記載されたものである。以下の実施例の特定の態様は、本発明の実施に役立つよう本発明者らによって見出された、あるいは本発明によって意図される技術および手順に関して記載されている。これらの実施例は発明者らの標準的な実験室での実践の使用を通して例示される。本開示および当技術分野の一般の技術水準を鑑みれば、当業者ならば、以下の実施例が単に例示を意図するものであって、本発明の精神および範囲から外れることなく、多くの変化、改変および変更が使用できることが分かるであろう。
【０２７５】
実施例１
mKCC4 cDNAのクローニング
ESTデータベースのBLAST(basic alignment and search tool)検索では、ラットKCC1およびKCC2と相同であったいくつかのマウスESTが明らかとなった。これらのESTのうち4つに相当するcDNA(IMAGEクローン568084、633794、313521および698105)をIMAGEコンソーシアム(Research Genetics, Genome Systemsおよび／またはAmerican Type Culture Collection)から入手して配列決定した。これらのESTはKCC1およびKCC2の種々のセグメントと相同な部分的オープンリーディングフレームを含んでいた(図１)。オープンリーディングフレームの3'末端および全3'−UTRは5番目のMAGE cDNA(クローン1314678)において確認された。
【０２７６】
次ぎにmKCC4の組織分布をRT−PCRによって評価し、mKCC4の広範な発現を検出し、特に腎臓および心臓に豊富な転写物が存在した。IMAGEクローン313521と568084の間のギャップにわたるプライマー対を用い、マウスC57BL/6J系統腎臓から1.2−kb断片を増幅し、平滑末端連結によってベクターpBluescriptのEcoR V部位にサブクローニングした。これらの、またその他の遺伝子特異的プライマーのためのPCR条件を、Taq2000およびOpti−Primeバッファー系(La Jolla, CaliforniaのStratageneから入手)を用いて至適化した。特に断りのない限り、以下の増幅プロトコールに従った：変性(92℃、2分)30サイクル、アニーリング(54℃、1分)、および伸張(72℃、1分)、その後最後の伸張ステップ(72℃、8分)。MKCC4の5'最末端はBALB/cマウス腎臓5'−RACE鋳型(Clontech, Palo Alto, California)から、2つのアンチセンスプライマーおよびAP1アダプタープライマー/S3プライマー(Clontech, Palo Alto, California)を用いてクローニングした。このPCRではAmpliTaq−Gold DNAポリメラーゼ(Perkin−Elmer Corp., Boston, Massachusetts)および94℃9分の酵素活性化ステップの後、94℃1分、68℃2.5分および最後に72℃10分の伸張の35サイクルからなるホットスタート増幅プロトコールを用いた。
【０２７７】
実施例２
ヒトKCC4 cDNAのクローニング
ヒトKCC ESTクローン(TIGRクローン150738)はATCCから入手した。DNAシーケンシングにより、このcDNAはmKCC4のヒトオーソログに由来するものであることが明らかとなった。別のヒト5'−EST(GenBank受託番号F12342)によりコードされるポリペプチドは他のKCCのアミノ末端と著しいアミノ酸相同性を示した。このESTはIMAGEクローン22250および51311をはじめ、hKCC4の3'−UTR由来の多数のESTと重複している(図１)。これらのcDNAとTIGRクローン150738(図１)との間のギャップは、RT−PCRにより、ヒト腎臓鋳型(Clontech, Palo Alto, California)を用いてプライマー対で橋渡しした。この反応のPCR産物をpBluescript(Stratagene, La Jolla, California)にサブクローニングした。最後に、hKCC4の5'末端をヒト腎臓の連続RT−PCRによってクローニングした。
【０２７８】
実施例３
KCC3a cDNAのクローニング
別のヒトEST cDNA(TIGRクローン150620)の配列解析により、4番目のKCC、hKCC3Aの存在が示された。ノーザンブロット解析により、筋肉における著しい発現が明らかになり、単一の5'−RACE cDNAがヒト筋肉鋳型(Clontech, Palo Alto, California)からクローニングされた。この5'−RACE PCRではAdvantageポリメラーゼミックス(Clontech, Palo Alto, California)および以下：94℃1分、次いで94℃30秒、62℃30秒および68℃3分の35サイクルからなるホットスタート増幅プロトコールを用いた。hKCC3のヌクレオチド741〜871を包含するプローブによる、ランダムプライム・ヒト筋肉cDNAライブラリー(Clontech, Palo Alto, California)のスクリーニングでは、開始コドンの5'側が延長された単一のcDNAが得られた。最後に、重複する2つのPCR断片をヒト脳鋳型(Clontech, Palo Alto, California)から増幅し、TAクローニング(Invitrogen, Carlsbad, California)によりpCR2.1へサブクローニングした。
【０２７９】
ヒトKCC3a cDNAは、Hiki et al. (1999) J Biol Chem 274(15):10661−10667によって報告された別のcDNAであるヒトKCC3bと同一性を有するが、推定輸送体タンパク質のアミノ末端の最初の40個のアミノ酸が異なる。マウスおよびヒトKCC3のゲノム同定では、このバリエーションが、エクソン1aおよびエクソン1bと呼ばれていた2つの別個の第一コードエクソンの2つの別個のプロモーター5における転写の開始によって作り出されることが示された。このヒトKCC3bイソ型に対応する部分的cDNAを、Hiki et al. (1999) J Biol Chem 274(15):10661−10667により報告された配列に由来するヒトKCC3bセンスプライマーをKCC3の両変異体に共通する配列内に由来のアンチセンスプライマーとともに用いてRT−PCRによりクローニングした。ヒト、マウスおよびアフリカツメガエル組織のRT−PCR(図２５Ｂ)もまた、その選択的排除がオープンリーディングフレームの残部を保存しつつアミノ末端から15個のアミノ酸を欠失させる45個のヌクレオチドのエクソンである、エクソン2の保存された選択的スプライシングを明らかにした。
【０２８０】
実施例４
マウスKCC3aおよびKCC3b cDNAのクローニング
ヒトKCC3の配列データとcDNAクローンを用いてKCC3のマウスオーソログの全長cDNA配列を決定した。まず、ヒトKCC3aおよびKCC3b由来のコード配列オリゴヌクレオチドプライマー対を用い、マウス組織RNAの連続RT−PCRにより、マウスKCC3aおよびKCC3b cDNA配列に沿って「ウォーキング」を行った。マウス全3'−UTRは、ヒトKCC3 3'−UTRと相同な配列を示したマウスEST cDNA(IMAGEクローン1290431)の配列決定によって同定した。3'非コード配列と既知の3'コード配列との間のギャップはRT−PCRによって橋渡しした。KCC3aおよびKCC3bと呼ばれていた2つの主要5'末端をクローニングするため、ヒトKCC3配列に従ってデザインしたプライマーを用いてマウスRNA由来のKCC3部分クローンを増幅した。次ぎにマウスKCC3aおよびKCC3b配列の5'最末端を、マウスゲノムクローンの配列決定により決定した。得られた全長マウスKCC3aおよびKCC3b cDNAはそれぞれ6120および6052ヌクレオチドの長さである。
【０２８１】
実施例５
ヒトKCC2 cDNAのクローニング
ヒトKCC2の5'末端は、ヒトKCC2アンチセンスプライマーおよびラットKCC2センスプライマーを用いて、逆転写したヒト脳ポリ−A+ RNAのRT−PCRによりクローニングした。それぞれhKCC2のヌクレオチド1〜1650から伸びる2つの異なるcDNAを2回の個別のPCR反応からクローニングし、pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, California)にサブクローニングした。hKCC2の3'末端の重複配列は3' EST cDNA, IMAGEクローン363600(hKCC2のヌクレオチド1370−3327)および362310(ヌクレオチド3320−5907)から入手した。この2つのIMAGEクローンは共通のNot I部位(hKCC2の3322)で重複する。
【０２８２】
実施例６
KCC2、KCC3およびKCC4 cDNAの配列解析
全てのcDNAクローンは、蛍光色素ターミネーター化学(Applied Biosystems, Foster City, California)を用いて両鎖を配列決定した。もっぱらPCRから導き出されたcDNA配列については、2回の個別のPCR反応から少なくとも2つのcDNAを配列決定した。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の解析はGENEWORKS(商標)2.5およびMACVECTOR(商標) 6.5ソフトウエアパッケージ(Oxford Molecular, Inc., Campbell, California)を用いて行った。アライメントおよびその他の解析では、コンピュータープログラムBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)、DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin)およびSMART (simple modular architecture research tool) (Schultz et at (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:5857−5864; Schultz et al. (2000) Nuc Acids Res 28:231−234; EMBL, Heidelberg, Germanyから入手)も使用した。
【０２８３】
完全なマウスおよびヒトKCC4 cDNAはそれぞれ5132および5230ヌクレオチドの長さであり、ノーザンブロットで見られたKCC3転写物の大きさに近い。両cDNAは85％同一な3248ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む。推定されるタンパク質は1083のアミノ酸からなり、91％の同一性を示す。KCC4 3−UTRは34％の同一性しかなく、マウスおよびヒトオーソログ間での保存の下限に近いものである(Makalowski & Boguski (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:9407B9412)。
【０２８４】
hKCC3a cDNA配列は4237ヌクレオチドの長さであり、165bpの5'−UTRと622bpの3'−UTRを有する。hKCC3a cDNAのヌクレオチド165と195の間に3つのフレーム内開始コドンがあり、そこでの転写の開始から1150、1141または1135アミノ酸の長さのタンパク質が生じる。しかし、KCC1およびKCC4に対する相同体は3番目のメチオニンの前で始まることから、翻訳開始部位ではなさそうである。マウスKCC3a配列と比較したところ、最初の9つのコドンが著しく保存されていることが示され、これはPKC部位も含み、従って翻訳はおそらく最初の開始コドンで起こると考えられる。6B7kbの少なくとも2つのKCC3転写物はノーザンブロット解析により検出され、選択的スプライシングと一致している。他のKCC3 cDNA(図１)と比較したところ、1つの5'−RACE cDNAは、推定KCC3タンパク質においてTM1とTM2をコードするヌクレオチド708B854の欠失を含んでいた。この欠失領域はhKCC1のエクソン4に正確に相当することから、KCC3転写物における少なくとも部分的なヘテロ性はコードエクソンの選択的スプライシングの結果である。RT−PCR実験では、ヒト、マウスおよびアフリカツメガエルKCC3aのいずれものエクソン2が、推定アミノ末端由来の15のアミノ酸の欠失に相当する転写物の大部分で欠損している。
【０２８５】
4つのKCCタンパク質は65B75％同一である。配列アライメントは、hKCC4がラットKCC2と69％の同一性を有し、hKCC1と65％の同一性を有し、また、hKCC4と66％の同一性を有することを示す。hKCC3aタンパク質はhKCC1と71％の同一性を有し、ラットKCC2と66％の同一性を有し、また、hKCC4と66％の同一性を有する。ヒトKCC3bはhKCC3aよりもhKCC1に若干類似している(75％の同一性)。マウスおよびヒトKCC3aおよびKCC3bオーソログは98％同一である。ヒトKCC2は次ぎにラットKCC2タンパク質と99％同一である。KCCと他のカチオン−クロライド共輸送体の間の同一性は約27〜33％である。
【０２８６】
系統発生樹は、哺乳類カチオン−クロライド共輸送体は2つのグループに属し、一方はNa+−K+−2Cl−共輸送体およびNa+−Cl−共輸送体からなり、他方は4つのK+−Cl−共輸送体を包含することを示す。直接配列アライメントによって示されるように、この4つのKCCは2つのサブグループをなし、一方のグループはKCC1およびKCC4を含み、もう一方のグループはKCC3およびKCC2を含む。
【０２８７】
7種の哺乳類カチオン−クロライド共輸送体は推定される膜トポロジーを共有している。12のTMドメインの中心核は、細胞質配向を持つ親水性アミノ末端とカルボキシル末端ドメインにフランキングされている(Mount et al. (1998) J Exp Biol 201:2091B2102)。これらのKCCとNa+1−関連共輸送体の間の主要な構造の違いは、大きなグリコシル化細胞外ループの位置であり、KCCではTM5とTM6の間、そしてNa+1−K+1−2Cl−2共輸送体およびNa+1−Cl−2共輸送体ではTM7とTM8の間に存在すると推定される(Mount et al. (1998) J Exp Biol 201:2091B2102)。相同性はTMドメイン、細胞内ループおよび細胞質カルボキシル末端で最も著しい。
【０２８８】
この4つのKCCの比較によっていくつかの興味深い差が明らかとなる。KCC3aは、アミノ最末端における60のアミノ酸が延長されているので4つのうち最長である。著しく保存されてはいるが、これら4つのKCCのTMドメインで完全に一致しているものはない。細胞質ドメイン内において、これら4つのKCCでは、チロシンキナーゼ、タンパク質キナーゼAおよびタンパク質キナーゼC(PKC)の共通リン酸化部位の分布が著しく異なる。KCC2(Tyr1087)におけるカルボキシル末端チロシンリン酸化部位はマウスおよびヒトKCC4で保存されている(Tyr1054)。hKCC3a配列は全11カ所のPKC部位を推定し、7カ所は最初の90個のアミノ酸内に含まれる。KCC3aは可能性として2つのタンパク質キナーゼA部位を有し、その1つ(Ser939)はタンパク質キナーゼAおよびCの双方の推定基質である。KCC4配列は少数fewerのPKC部位を推定し、そのうち2カ所だけがマウスとヒトの双方で保存されている(Thr814およびSer1006)。
【０２８９】
KCC1、KCC3およびKCC4に関して本明細書で開示されたKCCの一次構造およびNKCC1キメラの動態特性をもとに(Isenring & Forbush (1997) J Biol Chem 272:24556−24562; Isenring et al. (1998a) Proc Natl Acad Sci USA 95:7179−7184; Isenring at al. (1998b) J Biol Chem 273:11295−11301; Isenring et al. (1998c) J Gen Physiol 112:549−558)、これら4つのKCCはトランスメンブランドメインの中核内におけるバリエーションにより輸送特性に違いがあるものと考えられる。特に、TM2はカチオン親和性を制御すると思われ、TM4およびTM7はアニオン親和性を付与するものと思われる。かかる特性は、本明細書の以下の実施例１１〜１５にさらに記載されているが、アフリカツメガエル卵母細胞におけるKCCの異種発現によって試験した。
【０２９０】
実施例７
hKCC2、hKCC3およびhKCC4の染色体位置およびゲノム構造
ヒトKCC3およびKCC4遺伝子の染色体割付けは、National Institute of General Medical Sciences (NIGMS)ヒト/齧歯類体細胞雑種マッピングパネル1によるPCRに基づくスクリーニングアプローチを用いて行った。hKCC4マッピングに用いるプライマーはゲノムDNA由来の3'非コード領域の377bpセグメントを増幅し、hKCC3マッピングプライマーは3'非コード配列の561bpセグメントを増幅する。NIGMSパネル由来のDNAを用いたPCR反応物は、アガロースゲル電気泳動を用いて適宜サイズ分画した産物の存在および不在下で評価した。hKCC4の染色体位置は第5染色体ゲノムクローンpMS621(配列番号111で示される)の配列決定によって確認した。hKCC3の詳細マッピングは、Stanford G3パネル(Research Genetics, Boston, Massachusetts)による放射線雑種解析を用いるPCRによって行った。PCRによって生じた反応産物をアルカリ変性させ、ドットブロット装置を用いてナイロンメンブランに適用し、32P標識内部オリゴヌクレオチドプローブを用いてサザンブロッティングを行った。結果はStanford radiation hybrid map(http://www−shgc.stanford.edu/RH/)を検索することで解析した。
【０２９１】
ヒトKCC3およびKCC4の染色体割付けは、PCRに基づいた体細胞雑種マッピング法を用いて決定した。KCC3およびKCC4の遺伝子はそれぞれ第15染色体および第5染色体に割り付けられた。放射線雑種解析による詳細マッピングでは、hKCC3遺伝子は染色体15q14のD15S1040とD15S118マーカーの間に位置付けられた。KCC4のさらなる位置決定は、第5染色体VNTR(可変数のタンデムリピート)ミニサテライトマーカーであるD5S110(Armour et al. (1996) Ann Hum Genet 60:11B20)がその遺伝子内に含まれていることを見出すことで助けとした。対応するゲノムサブクローン、pMS621を配列決定して、それがVNTRのすぐ5'側にhKCC3を含んでいることを確認した。hKCC1遺伝子におけるエクソン/イントロン境界(Holtzman et al. (1998) Am J Physiol 275:F550BF564)はこのhKCC4部分で保存されており、pMS621のエクソンはhKCC1のエクソン14B17に相当していた。Wessex Human Genetics Institute (http://cedar.genetics.soton.ac.uk/pub/chrom5/map.html)によって作製した第5染色体概略マップでは、D5S110が染色体5p15.3のD5A628とテロメアの間にあることが示されている。
【０２９２】
hKCC4の染色体位置はSTS(配列タグ部位)データベースを用いて独自に確認されている。このようにSTS stSG1490は染色体領域5p15の第5染色体D5S678とD5S417マーカーの間にマッピングされている。Gene Map−99 URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap99/loc.cgi? ID=11342およびhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap99/map.cgi? MAP=GB4&BIN=164&MARK=stSG1490参照。
【０２９３】
hKCC2の染色体位置はまた、STSデータベースを用いても決定した。STS WI−9597/stSG2530はhKCC2のヌクレオチド5724−5896と同一である。これによると、STSは染色体領域20q13のD20S836とD2OS888の間にマッピングされる。Gene Map−99 URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap99/loc.cgi? ID=35899およびhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap99/map.cgi? MAP=GB4&BIN=583&MARK=stSG2530参照。
【０２９４】
hKCC2、hKCC3およびhKCC4のゲノム構造はヒトゲノムBAC(細菌人工染色体)クローンの解析から求められている。これらのクローンはResearch Genetics (Boston, Massachusetts)からのヒトCITB BACプールのPCRに基づくスクリーニングによって同定されたが、あるhKCC3 BACの場合、クローンはTIGRおよびワシントン州立大学(St. Louis, Missouri)BACendデータベースのBLAST検索によって同定した。少なくとも24全てのコードエクソンを包含する全hKCC2遺伝子はCITBクローン24H13(エクソン2−24)および90C12(エクソン1−10)に見出せる。エクソン1aの少なくとも1.0kbのプロモーター配列5を含む全hKCC3遺伝子はBACクローンR−122P18 (GenBank受託番号AQ345102)およびCITBクローン278L3上にある。hKCC4のエクソン2−24はCITBクローン330M20内に含まれる。
【０２９５】
個々のKCCエクソンのイントロン−エクソン境界は、改良型チェーンターミネション法(PerkinElmer, Inc., Boston, Massachusettsから入手できるBIGDYE(商標))を用いてBACクローンの直接配列決定により決定した。hKCC2の場合、この直接配列決定は上手くいかず、PCRおよび広範囲PCRにより個々のイントロンを増幅させた後、pCR2.1 (Clontech, Palo Alto, California)へサブクローニングし、次ぎにこのサブクローンを配列決定してイントロン−エクソン境界を決定した。
【０２９６】
図２Ａおよび２Ｂは、4つのヒトKCC遺伝子が全て異なる染色体に位置していることを示す。ヒトKCC2、KCC3およびKCC4のゲノム構造はヒトゲノムBAC(細菌人工染色体)クローンの同定により決定されている。hKCC3の全て、hKCC2およびhKCC4の大部分についてイントロン−エクソン境界配列が分かっている。イントロンの大きさは、各イントロンを増幅させるために隣接するエクソンのプライマー対を用いた関連BACクローンのPCR解析によってマッピングした。
【０２９７】
hKCC3のゲノム構造は図２Ａに示されている。KCC3は1aおよび1bと呼ばれる2つの別個の第1コードエクソンを有する。マウス腎臓の5'−RACE PCRにより、mKCC3bの転写開始部位はエクソン1bの開始コドンのずぐ5'側にマッピングされ、従ってこの2つのイソ型は2つの別個のプロモーターにおける転写誘導によって生じる。ヒトエクソン1aは、これまでにCross et al. (1994) Nat Genet 6(3):236−44によって同定されている5−フランキングCpGアイランド(GenBank/EMBL受託番号Z63283)を有する。推定マウス1aおよび1bプロモーターの配列はそれぞれ配列番号18−19に含まれ、ヒトエクソン1aの配列は配列番号17に含まれている。
【０２９８】
KCC4のエクソン2−24のゲノム構造は図2Bに示されている。ゲノムサブクローンpMS621に含まれる多形VNTR(可変数のタンデムリピート)マーカーD5A110 (Armour et al. (1996) Ann Hum Genet 60(Pt 1):11−20)はhKCC4のエクソン17および18の間のイントロンに見られる。
【０２９９】
実施例８
KCC2のNSREの同定
マウスKCC2遺伝子はイントロン1内、エクソン1のすぐ3'側にニューロン制限サイレンシングエレメント(NSRE)を含む(Karadesh & Delpire (2001) J Neurophysiol 85:995−997)(図３)。本明細書に開示されるように、このエレメントは標準的な電気移動度シフトアッセイを用いてネズミ神経始原細胞系由来の核タンパク質と結合する(図４Ａおよび４Ｂ)。ニューロン組織以外でニューロン特異的遺伝子の発現を抑制する上でのニューロン制限サイレンシング因子(NRSF)の機能が示されているので(Schoenherr et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93:9881−9886)、NRSEを含むKCC2プロモーター構築物の発現を非ニューロン細胞系で試験した。要するに、C17神経始原細胞から単離した核タンパク質(15μg)を32P末端標識NSREオリゴヌクレオチドとともに室温で15分間インキュベートした。この反応物を4％アクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィー露光により視覚化した。PGL3ベクター中のKCC2−NRSE構築物によって指示されたルシフェラーゼの発現は、PGL3ベクター中のNRSEエレメントを含まないプロモーターによって指示されたルシフェラーゼ発現レベルと比べて低かった(図５)。用いたプロモーター構築物はmKCC2プロモーター(配列番号131)を含み、NSREを含む場合と含まない場合があった。
【０３００】
実施例９
アフリカツメガエルKCCのクローニング
アフリカツメガエルKCCの最後の2290のヌクレオチド配列(配列番号112)は重複するRT−PCR cDNA(EST PBX0118E03由来のプライマーを用いてクローニング)およびEST (IMAGEクローン3399678)クローンから得た。「xKCC」(配列番号113)のC末端の358のアミノ酸の配列はhKCC3と76％の同一性を示す。RT−PCRによる組織検査では、卵母細胞内をはじめ、この転写物が広く発現していることを示す。卵母細胞における極めて相同なKCCの発現は、これらの細胞を哺乳類KCCのモデル発現系として批准するものである。
【０３０１】
実施例１０
mKCC4タンパク質のin vitro翻訳
1.0mgの全長mKCC4 cDNA(配列番号13)を、[35S]メチオニンおよびT7 RNAポリメラーゼ結合ウサギ網状赤血球溶解液(Promega, Madison, Wisconsinから入手できるTNT(商標) T7 RNAポリメラーゼ)を用い、膵臓ミクロソームとともに、また伴わずに30℃で90分間、in vitro翻訳した。7％SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質を分離した後、オートラジオグラフィーを得た。
【０３０２】
KCC1、KCC2およびカチオン−クロライド共輸送体遺伝子系のその他のメンバーは糖タンパク質であることが分かっており、これら4つのKCC配列はそれ以外の点ではあまり保存されていない細胞外ループにおいて3つの同一のN結合グリコシル化部位を含む。このmKCC4のin vitro翻訳の結果、推定コア質量119kDaより若干小さい見かけの分子量が115kDaのタンパク質が生じる。イヌ膵臓ミクロソームを添加すると分子量のより大きいバンドがさらに現れ、これはin vitroグルコシル化と一致している。KCC3およびKCC4特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析によれば、天然タンパク質は推定コアタンパク質の分子量より40〜60kDa大きいことが明らかとなり、これは天然タンパク質のグリコシル化に一致している。
【０３０３】
実施例１１
アフリカツメガエル卵母細胞におけるmKCC4およびhKCC3aの異種発現
KCCトランスメンブランドメインの違いはK+−Cl−共輸送体の違いを付与するものと推定された。表３は、本明細書の以下の実施例１４〜１５でさらに示されるように、イオン親和性、利尿感受性およびアニオン選択性におけるKCC間の違いをまとめたものである。
【表３】
2005522179.tif 000005
【０３０４】
0.17％トリカイン下で麻酔した雌成体アフリカツメガエルから卵母細胞を外科的に採取し、2mg/mlコラゲナーゼBの存在下、カエルリンゲルND96 (96mM塩化ナトリウム、2mM塩化カリウム、1.8mM塩化カルシウム、1.0mM塩化マグネシウム、および5mM Hepes/Tris、pH7.4)中で激しく振盪しながら1時間インキュベートした。次ぎに卵母細胞をND96で4回洗浄し、手作業で卵胞を除去し、ND96中18℃で一晩インキュベートした。翌日、卵胞除去したステージV〜VIの卵母細胞に50nlの水または0.25〜0.5μg/μl濃度でcRNA(25ng/卵母細胞)を含有する溶液を注入した。卵母細胞を、ND96 (96mM塩化ナトリウム、2mM塩化カリウム、1.8mM塩化カルシウム、1.0mM塩化マグネシウム、および5mM Hepes/Tris、pH7.4)中、17〜18℃でインキュベートし、3〜4日間、2.5mMピルビン酸ナトリウムおよび5mg/100mlゲンタマイシンを添加した。インキュベーション培地は24時間おきに交換した。試験当日、取り込みアッセイの2時間前に、卵母細胞をCl−フリーND96 (96mM Na+ イセンチオン酸Na+、2mMグルコン酸K+、6mMグルコン酸Ca2+、1mMグルコン酸Mg2+、5mM Hepes、2.5mMピルビン酸ナトリウム、5mg/lOOmlゲンタマイシン、pH7.4)に移行した。
【０３０５】
機能発現およびin vitro翻訳では、アフリカツメガエル発現ベクターpGEMHE(Liman et al. (1992) Neuron 9:861−871)において全長mKCC4 cDNAを標準として用いた。得られた構築物はmKCC4のヌクレオチド55〜3812(配列番号13)を含む。mKCC4との機能比較については、全長ウサギKCC1 cDNAをpGEMHEにサブクローニングした。また、全長hKCC3a構築物も、rabKCC1、hKCC3a、およびmKCC4に関する機能発現および比較データのために作製した。cRNAの鋳型を作製するため、ウサギKCC1およびmKCC3 cDNAをNhe Iを用いて3'末端で線状化し、T7 RNAポリメラーゼおよびmMESSAGE mMACHINEキット(Ambion, Inc., Austin, Texas)を用いてcRNAをin vitro翻訳した。転写産物の完全性をアガロースゲル上で確認し、260nmで吸光度を読み取る(Beckman, Fullerton, Californiaから入手できるDU 640)ことで濃度を求めた。
【０３０６】
実施例１２
K+−Cl−共輸送体の評価
K+−Cl−共輸送体は、少なくとも15個の卵母細胞の試験群でトレーサー86Rb+の取り込み(NEN(登録商標) Life Science Products, Boston, Massachusetts)を測定することで評価した。KCC4およびKCC1はいずれも等張条件下で最少の活性を示すことから、一般に、1mMウアバインを含む低張K+およびCl−フリー培地(50mM N−メチル−D−グルカミン(NMDG)グルコネート、4.6mMグルコン酸Ca2+、1.0mMグルコン酸Mg2+、5mM Hepes、pH7.4)中で30分間のインキュベーション過程、その後種々のK+−Cl−含量を含む低張Na+フリー培地中で60分間の取り込み過程によって膨潤させた卵母細胞で86Pb+取り込みを評価した。K+およびCl−濃度は最大全濃度50mMとしてKCl、塩化NMDG、グルコン酸カリウム、およびグルコン酸NMDGの組合せを用いてそれぞれ多様なものとし、例えば、50mM K+−Cl−を含む取り込み溶液には塩化NMDG、グルコン酸カリウム、またはグルコン酸NMDGを含まなかった。また全ての取り込み溶液には1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、5mM Hepes、pH7.4を含み、1mMウアバミンおよび5.0mCi/ml86Rb+を添加した。等張条件は同じ溶液に3.5g/100mlのスクロースを添加して卵母細胞と同じオスモル条件(〜210mOsm/kg)とすることで作製した。ウアバミンはNa+−K+−ATPアーゼを介する86Rb+取り込みを防ぐために加えた。細胞外Na+が存在しないこと、および取り込み培地が低張なことで卵母細胞に存在する内在性のNa+−K+−2Cl−共輸送体を介した86Rb+取り込みは妨げられた(Gamba et al. (1994) J Biol Chem 269:17713−17722)。
【０３０７】
取り込みアッセイは全て32℃で行った。取り込みが完了したら、卵母細胞を放射性同位元素を含まない氷冷取り込み溶液で5回洗浄して細胞外の液体のトレーサーを除去した。卵母細胞を10％SDSに溶かし、各卵母細胞のトレーサー活性をβ−シンチレーションカウントにより求めた。
【０３０８】
KCC4およびKCC1のイオン輸送動態を調べるため、86Rb+取り込み試験を種々の濃度のK+およびCl−にて行った。数種の阻害剤に対する感受性は、卵母細胞群を20mM〜2mMの異なる濃度で阻害剤に曝すことで評価した。これらの試験では、所望の濃度の阻害剤を、特に断りのない限り、インキュベーション過程および取り込み過程の双方に供した。
【０３０９】
等張条件では、KCC4、KCC1および水を注入した卵母細胞間で差は見られなかった。取り込み試験が低張条件で行われた場合、KCC4およびKCC1 cRNAのマイクロインジェクションの結果は、水を注入した対照卵母細胞と比較した場合に有意なK+−Cl−輸送活性が生じた。図６は異なるカエルに由来する卵母細胞に水またはKCC4もしくはKCC1 cRNAを注入した後、それぞれ10mMおよび50mMの細胞外K+およびCl−を含有する低張取り込み溶液を用いて86Rb+取り込みアッセイを行った5回の試験をまとめたものである。対照卵母細胞では、86Rb+取り込みはCl−の存在下では588±19pmol/卵母細胞/時、また、Cl−の不在下では147±23pmol/卵母細胞/時であり、内在するK+−Cl−共輸送体の存在を示している。KCC4 cRNAのマイクロインジェクションの結果、86Rb+取り込みは24,457±3,476pmol/卵母細胞/時まで上昇した。この86Rb+取り込みは、細胞外Cl−の不在下でのKCC4卵母細胞における取り込みが1723±402pmol/卵母細胞/時であるということからCl−依存的であった。KCC1を注入した卵母細胞では、86Rb+取り込みは12,632±2205pmol/卵母細胞/時まで上昇し、その流入はCl−依存的であった。KCC4とKCC1の間の取り込み量の差は統計学的に有意であった(p<0.05)。全ての試験で同量のKCC4およびKCC1 cRNAを注入したが、低張条件下での相対的発現レベルは常にKCC1よりもKCC4で高かった。さらに各KCCでは、絶対的な取り込みは動物ごとに異なっていた。取り込み試験の結果はCl−依存的な86Rb+取り込みの割合(％)として示す。従って通常100％は(KCC4またはKCC1対照群で見られる取り込み)−(水を注入した卵母細胞で見られる取り込み)を示す。
【０３１０】
hKCC2に媒介されるK+−Cl−共輸送を検出するための取り込みアッセイを同じ方法を用いて行った。図７Ａ、７Ｂおよび８は等張および低張条件の双方におけるhKCC2輸送体の機能的発現を示す。
【０３１１】
実施例１３
KCC4およびKCC1の動態特性
図９Ａ〜９ＤはKCC1、KCC3およびKCC4の動態特性をまとめたものである。この4つのKCCは鍵となるトランスメンブランセグメント(TMs)の配列が異なり、K+およびCl−に対する親和性が異なるものと仮定された(Mount et al. (1999) J Biol Chem 274(23):16355−16362)。K+−Cl−共輸送体をK+およびCl−の双方の外部濃度の関数としてプロットすることで(KCC3aについてそれぞれ図９Ａおよび９Ｂに示されている)、これらの輸送イオンの個々の見かけの親和定数が求められている。
【０３１２】
同じ発現系におけるKCC4とKCC1の動態特性を測定および比較するため、KCC4およびKCC1を注入した卵母細胞において86Rb+取り込みを各輸送イオンの濃度の関数として測定した(図９)。取り込みアッセイはK+またはCl−を50mLに固定し、対イオンの濃度を0から50mMまで変更して行った。取り込みアッセイはまた、水を注入した卵母細胞でも行い、水を注入した卵母細胞の平均値を対応するKCC注入卵母細胞から差し引いて、各異種発現イソ型によって媒介される86Rb+取り込みだけを評価した。図６に示されるように、水を注入した卵母細胞の86Rb+取り込みは低かったので、この相関は一般に少ないものであった。
【０３１３】
KCC4の場合、86Rb+流入は各輸送イオンの濃度上昇に伴って増加した。20〜40mMを超えるイオン濃度で平衡に達し、これはミカエル−メンテン挙動に一致していた。細胞外K+濃度の見かけのKmおよびVmax算出値はそれぞれ17.5±2.7mMおよび32,370±2,115pmol/卵母細胞/時であった。細胞外Cl−濃度の見かけのKmおよびVmax算出値はそれぞれ16.12±4.2mMおよび41,440±4,147pmol/卵母細胞/時であった。両イオンのHill係数は一定に近いままでそれぞれK+およびCl−に関して1.08±0.2および1.06±0.3であった。KCC1もまた同様のミカエル−メンテン挙動を示した。KCC1の見かけのKmおよびVmaxは細胞外K+では25.5±3.2mMおよび39,540±2,199pmol/卵母細胞/時、Cl−では17.2±8.3mMおよび14,930±2,822pmd/卵母細胞/時であった。またKCC1のK+(1.04±0.13)およびCl−(1.3±0.5)のHill係数は一定に近かった。
【０３１４】
図１０はhKCC2に媒介されるK+−Cl−共輸送体の濃度依存性を示す線グラフであるが、これを用いて同様の方法でイオン親和性を算出した。取り込みアッセイでは水を注入した卵母細胞も同時に評価した。KCC2による86Rb+取り込みを測定するため、水群処理の平均値を対応するKCC2処理群の平均値から差し引いた。取り込みアッセイは低張培地で、K+またはCl−濃度を50mMに固定して60分間行った。対イオンの濃度は示されたように0〜50mMまで変更した。ミカエル−メンテン方程式を用いて直線の当てはめを行うと、86Rb+のKm(K+置換)およびKmのCl−はそれぞれ9.3+/−1.8mMおよび6.31+/−0.92となった。このカチオンKmはHEK293細胞で分析されたラットKCC2に関して報告されたものと同等である(Payne et al. (1990) Am J Physiol 273:C1516−1525)が、クロライド親和性は有意に高い(>50mM rKCC2の報告値)。hKCC2のクロライド親和性測定値はニューロンのクロライド濃度に近いことが示されている(Hera et al. (1992) Neurosci Lett 143:135−138)。
【０３１５】
図１１に示されているように、細胞の膨張によるhKCC3aおよびhKCC3bの活性化の傾きであるが、両イソ型とも160mOsm/kgの細胞外浸透圧で活性化を始める。これらの活性化の違いはそれらの発散型アミノ末端間の推定されるリン酸化の違いに帰することができる(Mount et al. (1999) J Biol Chem 274:16355−16362)。
【０３１６】
表３に示されているように、4つのKCCはK+およびCl−に対する親和性が、おそらくはTM2(カチオン親和性)内の、およびTM4とTM7内のバリエーションのために著しく異なる(Mount (1999) J Biol Chem 274(23):16355−16362)。ラットKCC2の動態データはPayne (1997) Am J Physiol 273:C1516−C1525からのものであり、「xKCC」とは内在するアフリカツメガエル卵母細胞輸送体をさす。TM2の配列によって推定されるように、4つのKCCはK+親和性に関して、低親和性サブグループ(KCC1およびKCC3)と高親和性サブグループ(KCC2およびKCCC4)の2つのいグループに分けられる。
【０３１７】
実施例１４
KCC1、KCC2、KCC3aおよび／またはKCC4のアニオン依存性
3つのKCCのアニオン感受性も調べ、Cl−以外のアニオンがK+/86Rb+輸送を助ける能力を検討した。これらの結果は、KCCではK+−Cl−共輸送のこの「アニオン系」に違いがあることを示す。このデータは各アニオンの活性のパーセンテージ(クロライドに対する)として、図１２および１３にまとめられている。ここでも、このアニオン系の変動は、カチオン−クロライド共輸送体に対してアニオン親和性を付与すると考えられるセグメントであるTM4とTM7によるバリエーションによるものである可能性がある。Mount et al. (1999) J Biol Chem 274(23):16355−16362; Isenring et al. (1998) J Gen Physiol 112(5):549−558参照。
【０３１８】
Cl−以外の数種の細胞外アニオンはヒツジおよびヒト双方の赤血球のK+−Cl−共輸送体を介してイオン輸送を助けることが示されている(Payne et al. (1990) Am J Physiol 259:C819−827)。従って、KCC4おいKCC1による86Rb+輸送は種々のアニオンの存在下で測定した。40mMグルコン酸カリウムおよび10mM KClを含有する取り込み溶液を用いるKCC4およびKCC1注入卵母細胞の86Rb+流入は、40mMグルコン酸カリウムおよび10mM KBr、KH2PO4、KI、グルコン酸カリウム、またはKSCNを含有する培地に曝した卵母細胞における取り込み活性と比較する場合に、これらの試験の参照活性として用いた。図１２は、これら種々のアニオン置換を用いて86Rb+取り込みアッセイを行った場合のKCC4およびKCC1機能のパーセンテージを示している。KCC4は10mM KClの存在下で高い86Rb+流入を示す。他のアニオンの存在下でも86Rb+流入はなお見られ、10mM KBrでは58±9％、10mM KH2PO4では22±5.9％、また、KIでは17±3.8％であったが、グルコン酸カリウムおよびKSCNは輸送を助けなかった。これらの結果はKCC1注入卵母細胞で見られたものとは対照的であり、アニオンが助ける輸送の順序はCl−>SCN−=Br−>PO4−3>I>グルコネートであった。
【０３１９】
図１３は、種々のアニオン置換の存在下で行った86Rb+取り込みアッセイによって求めたhKCC2のK+−Cl−共輸送体のイオン依存性を示している。KCC2はKCC4と同じ様式でK+−Cl−共輸送を媒介する(表３参照)。
【０３２０】
実施例１５
KCCの阻害プロフィール
図１４〜１９はアニオンおよびカチオン輸送のいくつかの異なる阻害剤の作用を検討したKCCの薬理特性をまとめたものである。特に重要な知見は細胞外K+の存在に対するアニオン阻害剤の全般的な依存性である。このように図１４〜１９では、結果を個々のKCCのパーセンテージ関数(膨張により誘導された活性に比べて)として表されている。
【０３２１】
ループ利尿薬フロセミドおよびブメタニドの作用をまず、2および50mMの異なる2種の細胞外K+濃度を用いて評価した。K+濃度2mMを含む取り込み培地では、相対的KCC4活性は、2mMフロセミドおよびブメタニドの存在下でそれぞれ61±3および90±4％であった。興味深いことに、取り込み培地が50mM K+を含んだ場合にループ利尿薬によるKCC4の阻害が高まり、これらの条件下でKCC4活性は、フロセミドまたはブメタニドの存在下でそれぞれ9±4または17±4％であった。これに対しKCC1では、この細胞外K+の作用はフロセミドでは認められず、ブメタニドでは下限であった。フロセミドの存在下でのKCC1の機能は2mM K+では9±2％であり、50mM K+では18±8％であり(pは有意でない)、ブメタニドの存在下では2および50mMでそれぞれ51±12と19±7％であった(p=0.05; t=1.99)。KCC4とKCC1の間のループ利尿薬感受性に対するK+の作用の違いをさらに定義するため、フロセミドおよびブメタニドの阻害作用を数種の濃度の細胞外K+で評価した(図１４)。フロセミドおよびブメタニドの双方によるKCC4の阻害パーセンテージは細胞外K+によって著しく影響された(図１４の上のパネル)。両ループ利尿薬による最少および最大阻害はそれぞれ2および6mMで見られ、より高いK+濃度でもそれ以上の作用は見られなかった。これに対し、フロセミドまたはブメタニドのいずれかによるKCC1阻害剤のパーセンテージは細胞外K+濃度の関数として違いはなかった(図１４の下のパネル)。
【０３２２】
この2つのKCC間のループ利尿剤感受性における違いを定義するため、10mM細胞外K+を用いてKCC4またはKCC1によって誘導されたCl−依存性の86Rb+取り込みに対するフロセミドおよびブメタニド阻害の濃度曲線を評価した。図１５が示すように、KCC4は見かけの最大1/2阻害(K=0.5)値はフロセミドおよびブメタニドの双方について〜900μMを示す。これらはKCC1に対する個々の値より低かった(フロセミドおよびブメタニドについて〜180μM)。従ってKCC4はループ利尿薬に対してKCC1よりも低い親和性を示す。図１４におけるフロセミドによるKCC1の阻害はループ利尿薬に対する第2の親和性部位の可能性を示唆する。しかし、この阻害は1つの阻害剤結合部位を有するミカエル−メントン動態パターンに十分当てはまった。このデータは2つの結合部位を有する方程式には当てはまらなかった。
【０３２３】
図１６はフロセミドまたはブメタニドによるKCC2の用量依存的阻害を示す線グラフである。KCC2 cRNAをマイクロインジェクションした卵母細胞群を2〜2000μMのプレインキュベーションおよび取り込み培地中で増加濃度のフロセミドまたはブメタニドに曝した。取り込みアッセイは低張条件で行った。各点は少なくとも15個の卵母細胞の平均値±標準誤差を示す。
【０３２４】
図１７はアフリカツメガエル卵母細胞におけるhKCC3bに媒介されるK+−Cl−共輸送を示す棒グラフであるが、等張条件下で最小活性(220mOsm/kg)、低張条件下では著しい活性(110mOsm/kg)が見られる。白いバーは10mM K+および50mM Cl−を含有する対照培地で行った取り込みアッセイ、黒いバーはCl−を欠いた培地、グレーのバーは2mMフロセミドを含有する培地で行った取り込みアッセイ。
【０３２５】
赤血球K+−Cl−共輸送の他の阻害剤に対するKCCの感受性も、KCC4またはKCC1を注入した卵母細胞にて評価した。図１８は各KCC cRNAのマイクロインジェクションによって誘導される86Rb+取り込みに対する100μM DIDSおよび100μM DIOAの作用を示している。共輸送の阻害に対する細胞外K+濃度の作用はDIDSで極めて劇的であった。細胞外K+濃度が2mMであったとき、細胞外培地へDIDSを添加すると、KCC4の機能が65±10％(p<0.003)まで低下し、KCC1では85±6％(p<0.113、有意でない)まで低下した。これに対し、細胞外K+を50mMとしたとき、DIDSはKCC4およびKCC1をそれぞれ13±4および13±2％と、有意な低下をもたらした。また、細胞外培地へ100μMのDIOAを添加してもKCCの阻害が生じた。しかし、KCC4の阻害は細胞外K+が低いほど高かったが、KCC1の場合はそうではなかった。DIOAは報告ではNa+−K+−2Cl−共輸送よりもK+−Cl−共輸送に特異的であるが(Garay et al. (1988) Mol Pharmacol 33:696−701)、同濃度のDIOAはアフリカツメガエル卵母細胞のNa+−K+−2Cl−共輸送の機能に全く効果がなかった(Gamba et al. (1994) J Biol Chem 269:17713−17722)。
【０３２６】
クロライド依存性の86Rb+取り込みのパーセンテージに対する2mM濃度のチアジド系利尿薬トリクロルメチアジドの作用も測定した。驚くことに、Na+−Cl−共輸送に対するチアジドの特異性が示唆されているが(Rose et al. (1991) Kidney Int 39:336−252)、KCC4のトリクロルメチアジド感受性はほどほどであった。フロセミドおよびDIDSで見られたように、細胞外K+ 2mMでは86Rb+取り込みは79±3％まで低下し、50mMでは57±9％まで低下したことから、細胞外K+が高いほどチアジドによる阻害は高い。この差は有意なものであった(p<0.01)。
【０３２７】
KCC1注入卵母細胞では、トリクロルメチアジドは86Rb+取り込みを、2mM K+で64±4％と統計学的に有意な量で低下させたが、この阻害作用は50mM K+では統計学的に有意なものではなかった(74±8％の活性低下)。従って一貫したトリクロルメチアジド感受性はKCC4に独特なものである。また別の実験では、バリウムが腎臓のK+−Cl−共輸送体を阻害し得ることが示唆されている(Greger & Schlatter (1983) Pflugers Arch 396:325−334; Amlal et al. (1694) Am J Physiol Cell Physiol 267:C1607−1625; Di Stefano et al. (1998) Cell Physiol Biochem 8:89−105)。このような点から、KCC4およびKCC1の作用に対する細胞外10mMバリウムの作用を測定した。図１９は10mM BaCl2を取り込み培地に加えたとき、KCC4によって誘導される流入がKCC4を注入した対照卵母細胞で見られた取り込みの58±4.3％まで低下したことを示している。KCC1の機能は79±4.2％までしか低下しなかったことから、KCC1よりもKCC4に対するバリウムの阻害作用が有意に大きかった(P=0.01)。
【０３２８】
実施例１６
NEMによるKCC4およびKCC1の調節
いくつかの細胞および種において最も顕著なK+−Cl−共輸送の特徴の1つは、アルキル化剤NEMによって活性化されることである(Lauf et aL. (1992) Am J Physiol 263:C917−932)。KCC4またはKCC1を発現する卵母細胞における86Rb+流入に対するNEMの作用を等張または低張条件下でアッセイした。等張培地での、KCC4またはKCC1を注入した卵母細胞で見られた取り込みは、水を注入した卵母細胞における取り込みとの違いはなかった。しかし、等張条件で1mM NEMを加えるとKCC4では5倍の活性化が(KCC4対照群の214±12pmol/卵母細胞/時に対し、NEM処理群では1062±70pmol/卵母細胞/時、p<0.001)、KCC1では2.6倍の活性化が生じた(120±27に対し、319±76pmol/卵母細胞/時、p<0.05)(図２０Ａおよび２０Ｂ)。取り込みアッセイを低張培地で行った場合、NEMの添加は両イソ型の劇的な阻害をもたらし(図２０Ｃおよび２０Ｄ)、従って、KCC4およびKCC1によって誘導された86Rb+取り込みはそれぞれ68％および55％低下したことに注目。同じ試験で、内在する卵母細胞K+−Cl−共輸送体(水を注入した卵母細胞)による86Rb+取り込みは、取り込みアッセイを等張および低張条件いずれで行った場合でも、著しく増強された。
【０３２９】
水銀によるKCCの調節
水銀はトランスメンブランまたは膜近傍システインとの相互作用を介していくつかの輸送体を阻害することが知られている(Kuwahara et al. (1997) Biochemistry 36:13973−13978; Jacoby (1999) Am J Physiol 277:C684−692)。システイン残基のアルキル化によるものであると思われるが、室温でのミリモルNEMによるKCCの阻害が示されていることから(Mercado et al. (2000) J Biol Chem 275:30326−3034)、50μM水銀(Hg−Cl2)に対するKCCの種々の応答を調べた。低張条件によって活性化されるKCC1およびKCC3aは50μM水銀(Hg−Cl2)に耐性があるが、KCC2、特にKCC4はこの薬剤に感受性である(図２１)。MKCC4のアミノ酸配列を調べたところ、KCC1、KCC3および／またはKCC2では見られない全部で5つのトランスメンブランシステインが明らかである。変異したこれら5つのシステインのうち4つ(C256A/C469N/C565A/C647M)を有する変異体はなお弱いHg−Cl2感受性であるが(図２２の4重)、対応する5重変異体(C256A/C469N/C565A/C647M/C633S)は耐性である(図２２の5重)。これらの結果は、システイン−633を、トランスメンブランドメイン12内でmKCC4のHg−Cl2感受性に関連づけるものである。NKCC1のTM11のシステイン残基は水銀に対するNa+−K+−2Cl−共輸送の応答に関与することが示されている(Jacoby (1999) Am J PhysioL 277:C684−692)。この分析は、KCC4のシステイン−633、およびhKCC2の同等の残基システイン−613などの機能上重要な残基をターゲッティングすることによるKCCのイソ型特異的阻害剤の開発を示唆するものである。
【０３３０】
実施例１８
リン酸化によるKCC機能の調節
赤血球K+−Cl−共輸送体は等張条件下で容積感受性キナーゼによってリン酸化され、セリン−トレオニンホスファターゼPP−1およびPP−2により脱リン酸化および活性化されると考えられる(Bize et al. (1999) Am J Physiol 277:C926−936)。この容積感受性キナーゼがどんなものかは知られていない。しかし、このキナーゼも、細胞収縮によって刺激され、スタウロスポリンによって阻害される経路であるNa+−K+−2Cl−共輸を活性化するという仮説(Lytle (1998) Am J Physiol 274:C1002−1010)からついに洞察を得ることができた。Kelley et al. (2000) J Membr Biol 178:31−41は、K+−Cl−共輸送の活性化における、収縮により活性化されるもう1つのセリン−トレオニンキナーゼである、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)の役割を検討した。彼らは生理学的浸透圧でMLCK阻害剤ML−7によってヒト赤血球K+−Cl−共輸送が若干活性化されることを見出した。hKCC3の動態は、本明細書に開示されたように、それが主要な赤血球K+−Cl−共輸送体であることを示唆するので、アフリカツメガエル卵母細胞におけるKCC3aの発現に対するML−7の作用を評価した。KCC3aの活性化のちょうど閾値およびそれ未満(160〜180mOsm/kg)で、100μM ML−7によるK+−Cl−共輸送の活性化が明らかとなる(KCC3aについてML−7の不在下では989±15pmol/卵母細胞/時に対し、160mOsm/kgのML−7の存在下では1698±298(図２３)。180mOsm/kgのML−7によるhKCC3aの若干の活性化も見られるが、ML−7は等張条件下ではK+−Cl−共輸送に作用しない。このように等張条件下で作用がないことから、ML−7によって阻害されるキナーゼは細胞膨張によって誘導される複雑なシグナル伝達カスケードの一部でしかない可能性がある。しかし、このアプローチはKCC発現の調節を研究する上でのアフリカツメガエル発現系の有用性を示している。
【０３３１】
タンパク質ホスファターゼの阻害は細胞膨張またはNEMのいずれかによる赤血球K+−Cl−共輸送の活性化を妨げる。クローニングされたKCCの制御におけるホスファターゼの役割は明らかでないことから、3つのタンパク質ホスファターゼ阻害剤の作用を評価した。あるアッセイでは、タンパク質ホスファターゼ1および2Aの機能を阻害する100nMカリクリンAを含んだ。オカダ酸1nM(タンパク質ホスファターゼ2Aだけに影響を及ぼす濃度)を用い、特定のホスファターゼの相対的な役割を評価した。シペルメトリンは、この化合物がタンパク質ホスファターゼ2Bの機能を阻害する濃度である100pMで用いた。カリクリンAの添加は細胞膨張によるKCC4およびKCC1の活性化を完全に阻害する(図２４)。これに対し、オカダ酸にもシペルメトリンもこの活性化を阻害しない(図２４)。これらの結果は、細胞の膨張によるKCC4およびKCC1の両者の活性化にはタンパク質ホスファターゼ1が必要であることを示すものである。
【０３３２】
図２５ＡはhKCC2により媒介される等張性K+−Cl−共輸送体に対するタンパク質ホスファターゼ阻害剤カリクリンA(100nM)の作用を示す棒グラフである。対照群(白いバー)、細胞外Cl−の不在下(黒いバー)、または100mMカリクリンの存在下(斜線のバー)で86Rb+流入を評価した。各バーは少なくとも15個の卵母細胞を用いて得られたデータの平均値±標準誤差を示す。アステリスク(*)は86Rb+流入がCl−の不在下で有意に低下したことを示す。
【０３３３】
図２５ＢはhKCC2に媒介される、膨張誘導性のK+−Cl−共輸送に対するタンパク質ホスファターゼ阻害剤カリクリンA(100nM)の作用を示す棒グラフである。対照群(白いバー)、細胞外Cl−の不在下(黒いバー)、または100mMカリクリンの存在下(斜線のバー)で86Rb+流入を評価した。各バーは少なくとも15個の卵母細胞を用いて得られたデータの平均値±標準偏差を示す。アステリスク(*)は86Rb+流入がCl−の不在下、またはCl−の不在とカリクリンの存在の組合せで有意に低下したことを示す。
【０３３４】
図２６は推定阻害剤の存在下、示されたようにH20またはKCC3b cRNAをマイクロインジェクションしたアフリカツメガエル卵母細胞における、hKCC3bに媒介されるK+−Cl−共輸送を示す棒グラフである。hKCC3bに媒介されるK+−Cl−共輸送はフロセミド処理に感受性であり、カリクリンA処理によって遮断される。白いバーは10mM K+および50mM Cl−を含有する対照培地で行った取り込みアッセイ、斜線のバーはCl−を欠いた培地で行った取り込みアッセイ、横縞のバーは100nMカリクリンAの存在下で行った取り込みアッセイ、黒いバーはオカダ酸の存在下で行った取り込みアッセイ、グレーのバーはシペルメトリンの存在下で行った取り込みアッセイ。
【０３３５】
実施例１９
KCC3およびKCC4転写物の組織分布
イソチオシアン酸グアニジンおよび塩化セシウムを用い、マウス組織(C57BL/6J系統)からRNAを抽出した。全RNA(10mg/レーン)を電気泳動(5％ホルムアルデヒド、1％アガロース)によりサイズ分画し、ナイロンメンブラン(Stratagene, La Jolla, California)に移し、全長グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼに相当する32P標識ランダムプライムプローブおよびmKCC4のヌクレオチド4417B5062(3'−UTR)で一連のプロービングを行った。2mg/レーンのポリ(A)+ RNA (Clontech, Palo Alto, California)を含有するヒト・マルチプルティッシュ・ノーザンブロットを、PCRによって作製したhKCC4の3'−UTR(ヌクレオチド4598−4957)およびhKCC３の3'−UTR(ヌクレオチド3624−4185)からヒトβ−アクチンプローブまでのプローブとハイブリダイズさせた。全てのブロットでハイブリダイゼーションは4XSSCP、40％ホルムアミド、4Xデンハート溶液、0.5％ SDSおよび200mgサケ精子DNA中、42℃で一晩行い、膜を室温、2xSSCP、0.1％ SDS中で10分間2回、さらに65℃、0.1XSSCP、0.1％ SDS中で1時間2回洗浄した。露光時間は様々であった。
【０３３６】
ノーザンブロット解析はKCC3およびKCC4の3'−UTRに由来するプローブを用いて行った。KCC4プローブはいくつかの組織で5.3−kbの転写物を検出し、大部分は主として心臓および腎臓である。成人脳でも極めて微量のKCC4転写物が検出できる。KCC3はもっと限定された発現パターンを示し、有意な量の転写物は筋肉、脳、肺、心臓および腎臓でのみ見られる。6B7kbの異なる少なくとも2つの転写物がKCC3とハイブリダイズするが、これは選択的スプライシングに一致する。
【０３３７】
ヒトKCC2は、ヒトNT2奇形癌細胞の「NT2−N」ニューロン細胞へのin vitro分化中に強く誘導される(このヒトNT2奇形癌細胞は未分化状態ではこの輸送体を発現しない)(Pleasure & Lee (1993) J Neurosci Res 35(6):585−602)(図２７Ａ)。NT2−N細胞はますますよく特徴づけられてきているニューロン細胞モデルであり、数種のサブタイプのGABAAレセプター(Neelands et al. (1998) J Neurosci 18(13):4993−5007; Neelands et al. (1999) J Neurosci 19(16):7057−7065)、ならびに複数のノイロトロピンレセプター(Piontek et al. (1999) J Neurochem 73(1):139−146)を発現することが知られている。これらの細胞自体、ヒトKCC2の機能、転写後調節、および転写著調節を理解するための重要な細胞モデルとなる。
【０３３８】
KCC3エクソン1a特異的プローブおよびKCC3bエクソン1b特異的プローブの双方でプロービングしたマウス組織のノーザンブロットが図２７Ｂに示されている。KCC3aは特に脳および筋肉に豊富であって、KCC3bは腎臓に最も豊富であるが、このことはこの2つのプロモーターが別々に調節されていることを示唆するものである。マウス組織の、エクソン1aおよび4におけるプライマーを用いたRT−PCRが図２７Ｃに示されている。エクソン2の選択的スプライシングに相当する2つのバンドが増幅され、短いバンドがこの45bpのカセットエクソンを欠いたイソ型に相当する。エクソン2を欠くマウスおよびヒトKCC3a(KCC3a−2m)に関する配列データは配列番号3〜6に含まれている。
【０３３９】
実施例２０
KCC3およびKCC4抗体の作製
ポリクローナル抗体は、KLH結合KCC3特異的ペプチド(KKARNAYLNNSNYEEGDEY;配列番号116)をニュージーランド白ウサギ(Quality Control Biochemicals, Hopkinkon, Massachusetts)に皮下注射することで作製した。この抗原ペプチドはこの共輸送体の推定細胞内アミノ末端テール内に位置し、他の3つのK+−Cl−共輸送体イソ型KCC1、KCC2およびKCC4の対応する領域との、また、2つのNa+−K+−2Cl−共輸送体NKCC1およびNKCC2との、あるいはNa+−Cl−共輸送体NCCとの相同性は示さない。さらに、非冗長データベースおよびESTデータベースに対するBLASTアライメントによっては関連のないタンパク質との有意な相同性は検出されない。最後に、このペプチドは主要タンパク質キナーゼの基質ではなく、MACVECTOR(商標)ソフトウエア(Oxford Molecular, Inc, Campbell, Californiaから入手可能)を用いて高い抗原性があると推定された。ペプチドをAFFI−GEL(商標)15支持体(BioRad, Hercules, California)に結合させ、さらに、この免疫血清を、5倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で溶出させたAffiゲル−ペプチド複合体をとともに4℃にて2日間インキュベートすることで高い力価を有する1個体のウサギからの抗血清をアフィニティー精製した。5xPBSで洗浄した後、特異的抗体を0.1Mクエン酸ナトリウム(pH2.5)で溶出し、1M Tris(pH8.8)で中和し、4℃、1xPBS中で一晩透析した。精製した抗体を30kDaカットオフのCENTRIPULUS(商標)カラム(Amicon, Beverly, Massachusetts)を用いて濃縮し、アリコートを−20℃で保存した。
【０３４０】
抗KCC3免疫血清を用いたマウス膜タンパク質のウエスタンブロットにより、160〜170kDa前後のタンパク質を表す幅広のバンドが検出されたが、これは同じウサギ由来の免疫前の血清では見られなかった(図２８、レーン１および２)。この免疫血清を特異的抗原を用いて精製したところ、150〜170kDaのバンドのみ検出された(図２８、レーン３)。ウエスタンブロットの迅速露光では、明瞭な2つのバンドからなる幅広のシグナルが明らかとなった(図１８、レーン２)。アフィニティー精製した抗体を用いた際に得られた強いシグナルは、その抗体に特異的の抗原を予め吸着させた場合には見られなかったが(図２８、レーン４)、このことはKCC3タンパク質としての〜160kDaのシグナルの特異性を証明するものである。
【０３４１】
実施例２１
KCC3およびKCC4タンパク質の組織分布
エクソン3由来のペプチド抗原(KKARNAYLNNSNYEEGDEY;配列番号116)に対して作製したアミノ末端KCC3特異的抗体を用いたウエスタンブロットは図２７Ｄおよび２７Ｅに示されている。アフリカツメガエルで異種発現した5つのKCCに対する反応性は試験しなかったが、KCC1、KCC2またはKCC4配列にはこのペプチド抗原は見られず、非冗長データベースおよびESTデータベースのストリンジェントなBLAST検索(Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25(17):3389−3402)においてタンパク質のタンパク質は検出されない。KCC3抗体は脳および腎臓をはじめいくつかの組織で〜160kDaのタンパク質と反応する(図２７Ｄで腎皮質および外髄(OM)、ならびに脳に関して示されている)。この反応性は抗体をペプチド抗原とプレインキュベートした場合には無効となる(図２７Ｄの腎皮質に関して示されている「IAB」サンプル)。KCC3タンパク質はまた、ネズミ赤血球細胞由来(図２７ＥのRBCレーン)、ならびにマウス近位曲尿細管細胞株(Loghman−Adham et al. (1997) Kidney Int 52(1):229−239)(図２７ＥのtsMPTレーン)およびヒト臍静脈内皮細胞(図２７ＥのHUVECレーン)由来の膜サンプルでも検出される。赤血球におけるKCC3の存在は、KCC3が赤血球K+−Cl−共輸送体活性に寄与することを示唆している(Lauf et al. (1992) Am J Physiol 263(5 Pt 1):C917−932)。
【０３４２】
エクソン1由来の抗原ペプチド(AERTEEPESPESVDQTSP;配列番号117)アミノ末端KCC4特異的抗体に対して作製したアミノ末端KCC4特異的抗体は、分子量にして160から180kDaの間のタンパク質の幅広のバンドを検出する(図２７Ｆ)。腎皮質および外髄(OM)では、皮質で優勢な低分子量のバンドと外髄で優勢な高分子量のバンドの2つの別個のバンドが分かれた(図２７Ｇ)。この不均一性はグリコシル化の違いによるものである可能性もあるが、まだ確認されていない選択的スプライシングによって作り出されるものである可能性の方が高い。最後に、KCC3抗体の場合については、反応性はペプチド抗原を免疫吸着させることで無効となる(図２７Ｈ)。
【０３４３】
図２７Ａ〜２７Ｈは4つのKCCが、異なるが重複した組織分布を有することを示す。KCC1およびKCC4は広く発現し(Gillen et al. (1996) J Biol Chem 271(27):16237−16244; Mount  et al. (1999) J Biol Chem 274(23):16355−16362)、KCC3は若干それより限定された発現パターンを示し(Mount et al. (1999) J Biol Chem 274(23):16355−16362)、さらにKCC2は中枢神経系と網膜のニューロンに限定される。Lu et al. (1999) J Neurobiology 39:558−568; Williams et al. (1999) J Biol Chem 274(18):12656−12664参照。
【０３４４】
マウス脳におけるKCC3タンパク質の発現は細胞体および乏突起神経膠細胞の過程に特に顕著であり、脳梁をはじめCNS中の白質束で見られる。この発現パターンはアンデルマン症候群(Casaubon et al. (1996) Am J Hum Genet 58(1):28−34)および痙性対麻痺(Martinez Murillo et al. (1999) Neurology 53(1):50−56) との遺伝的関連をさらに強めるものである。KCC3はまた脈絡叢細胞の基底外側膜での発現するが、ニューロンでの発現の証拠はまだ明らかでない。しかし、ヒトKCC3はNT2奇形癌細胞のNT2−Nニューロン細胞への1ヶ月のin vitro分化中に誘導される。NT2−N細胞はhKCC2を発現する(図２７Ａ)。このようにヒトニューロンは少なくともKCC2およびKCC3双方を発現する可能性を持つ。KCC4は脳において極めて低レベルで発現するが、免疫限局化では海馬内のCA1ニューロンでの局部発現が示される。
【０３４５】
腎臓におけるKCC3およびKCC4の発現
KCC3抗体によるマウスおよびラット腎臓の免疫蛍光によれば、近位曲尿細管S1からS3の基底外側膜での発現が明らかであり、免疫吸着対照は陰性である。末梢ネフロンマーカー(NKCC2、NCC、H−ATPアーゼなどに対する抗体)による同時免疫蛍光は、KCC3が末梢ネフロンには局在しないことを示す。HUVEC細胞における発現にかかわらず、KCC3は腎動脈には検出されない。KCC3同様、KCC4も近位曲尿細管細胞の基底外側膜で著しく発現するが、発現はS1内で最大であって、S3では最初である。KCC3もKCC4も糸球体では発現しないが、KCC1は報告によれば糸球体間質細胞で発現する(Liapis et al. (1998) Am J Physiol 275(6 Pt 1):C1432−1437)。
【０３４６】
KCC3とは異なり、KCC4は末梢ネフロンで発現し、同時免疫蛍光は、全縁の太いヘンレ上行脚(TAL)の基底外側膜ならびに緻密斑および末梢曲細尿管(DCT)での発現を示す。アクアポリン−1との同時局在は、膨張により活性化されるK+−Cl−共輸送を含むと思われる(Lopes et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(8):2873−2877)細いヘンレ下行脚はKCC4を発現しないことを示唆している(図２９Ｉから１９Ｊ)。最後に、H+−ATPアーゼとの同時局在は、腎の酸分泌に中枢的役割を果たす細胞であるA型インターカレート細胞の基底外側膜での発現を示す。
【０３４７】
KCC3およびKCC4の腎内の局在は、近位曲細尿管の基底外側膜(Seki et al. (1993) J Clin Invest 92(3):1229−1235)および太いヘンレ上行脚(Di Stefano et al. (1998) Cell Physiol Biochem 8(1−2):89−105; Hurst et al. (1992) Am J Physiol 263(2 Pt 2):F262−267)におけるK+−Cl−共輸送の存在または不在をめぐる長年の論争を鎮静させるものである。A型インターカレート細胞の基底外側膜におけるKCC4の発現は末梢酸分泌における予期しない役割を示すものである。
【０３４８】
実施例２３
脳におけるKCC3イソ型の発現
イソ型特異的cDNAプローブを用いてKCC3aよKCC3bの発現を調べた。この2つのイソ型は大きさでも識別でき、KCC3a転写物はKCC3a転写物よりも若干大きい(図２９Ａ)。KCC3aは脳で豊富に発現し、KCC3bの方は主として腎臓で発現する。さらに、脈絡叢、海馬、小脳、脳幹、大脳皮質、および白質はじめ特定の脳の領域または構造から全RNAを単離した。KCC3aは、脈絡叢で発現が低かったことを除けば、記載の全ての脳領域で同レベルで検出された。
【０３４９】
C5b6マウスからの脳および腎臓を摘出し、新鮮な組織を液体窒素で凍結させた。これまでに記載の(Delpire et al. (1994) J Biol Chem 269:25,677−25,683)イソチオシアン酸グアニジンを用いて全RNAを抽出した。RNアーゼシリカゲルカラム(Qiagen, Valencia, California)を用いて全RNAからポリ(A)+ RNAを精製した。全RNA(10μg/レーン)またはポリ(A)+ RNA(3μg/レーン)を1％アガロース−O.63％ホルムアルデヒドゲルで分離し、ナイロンメンブランへ移し、1aまたは1b特異的DNA配列からなるマウス特異的32P標識プローブでプロービングした。全長cDNAはKCC3aおよびKCC3bからクローニングしたものであった(それぞれGenBank受託番号AF21185およびZF211855)。42℃、ホルムアミド含有ハイブリダイゼーション溶液で一晩ハイブリダイゼーションさせた後、そのメンブランを高ストリンジェンシー(65℃)にて洗浄し、オートラジオグラフィーに露光した。
【０３５０】
脳におけるKCC3タンパク質の相対的存在量および分布を調べるため、大脳皮質、海馬、間脳、脳幹、および小脳由来のミクロソームタンパク質を用いてウエスタンブロットを作製し、このブロットを抗KCC3精製抗体を用いて分析した。KCC3タンパク質は調べた脳の全ての領域に豊富である(図３０Ａ)。3回のうち2回のウエスタンブロット解析では、KCC3シグナルは海馬では低かった。内包および外包の白質束ならびに脳梁を摘出したところ、KCC3はこれらの有髄経路で著しく発現していることが示された(図３０Ｂ)。
【０３５１】
ウエスタンブロットの作製のため、C47b6マウスの脳、脊髄、後根神経節、および末梢神経ならびに種々の齢のラットの白質脳を摘出し、スクロースバッファー(0.32Mスクロース、5mM Tris−HCl、pH7.5、2mM EDTA)中でテフロン乳棒を用いてホモジナイズした。3000g、20,000gおよび100,000gでの一連の遠心分離によりミクロソームタンパク質を得た。この高速ペレットを、5nM Tris−HCl(pH7.5)および2mM EDTAを含有するバッファーに再懸濁した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によってタンパク質を分離し、二フッ化ポリビニリデンメンブラン(BioRad, Hercules, California)へ電気ブロッティングした。特に断りのない限り、メンブランはアフィニティー精製したKCC3抗体1:1000希釈液でプロービングした。タンパク質は増強化学ルミネセンス(Amersham, Arlington Heights, Illinois)を用いて検出した。
【０３５２】
組織におけるKCC3タンパク質を検出するため、C57b6マウスの脳、脊髄および末梢神経を摘出し、4℃、PBS中4％のパラホルムアルデヒド中で一晩固定した。次ぎに組織をPBSで洗浄し、PBS中30％のスクロースで凍結保護した。間接的免疫蛍光では、7〜10μmの凍結切片をSUPEREROST PLUS(商標)スライド(VWR Scientific, West Chester, Pennsylvania)に解凍マウントした。次ぎに切片を1％ SDSおよび8％ 2−メルカプトエタノールで5分間処理し、PBSで洗浄し、室温にて30分間PBS、1％ウシ血清アルブミン(BSA)でブロックした後、KCC3アフィニティー精製抗体、または抗原ペプチドを予め吸着させた抗体(いずれもPBS−1％BSA中に1:200希釈)とともに4℃にて一晩インキュベートした。PBSで洗浄した後、スライドを、暗所、室温で1時間、PBS中1％のBSAに1:1000希釈したCy3−結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG(Jackson Immunoresearch, West Grove, Pennsylvania)とともにインキュベートした。次ぎにそれらをPBSで洗浄し、Vectashield (Vector Labs, Burlingame, California)でマウントした。二重標識試験では、切片を抗KCC3抗体とともに一晩、次いでCy3結合二次抗体、さらにモノクローナル抗微小管会合タンパク質2(抗MAP2)抗体または抗MBP抗体、その後イソチオシアン酸フルオレセイン結合抗マウス免疫グロブリンG(Jackson Immunoresearch, West Grove, Pennsylvania)とともに一晩、一連のインキュベーションを行った。切片はカラーTektronix Phaser 450プリンター(Tektronics, Wilsonwill, Oregon)に接続したIBMコンパチブル200MHZコンピューターと組み合わせたOptronics DEI−750カラーCCDカメラ(Optronics Engineering, Goleta, California)を備えたNikon Eclipse E800顕微鏡で分析した。
【０３５３】
抗原検索のため、凍結した脳の切片をSUPEREROST PLUS(商標)スライドに解凍マウントし、室温で風乾し、室温にて5分間100％エタノールで処理し、42℃で風乾し、37℃にて4分間PBS、1％BSA中20g/mlのプロテイナーゼKで処理した。PBSで2回洗浄した後、切片を5分間1％ SDSおよび8％ 2−メルカプトエタノールで処理し、上記のように処理した。
【０３５４】
またKCC3の発現は脊髄、後根神経節、および末梢神経をはじめその他の神経系領域でも調べた。記載の領域からミクロソームタンパク質を調製した。ウエスタンブロット解析では、脊髄におけるKCC3の著しい発現が明らかとなった(図３０Ｂ)。これに対し、後根神経節では低レベルのKCC3しか検出されず、座骨神経および三叉神経では微量が検出されたに過ぎなかった(図３０Ｂ)。
【０３５５】
KCC3発現の出生後発達プロフィールを調べるため、1日目(P1)、P7、P14、P21および成体(>P60)において単離した脳由来タンパク質をウエスタンブロット解析により分析した(図３０Ｃ)。KCC3レベルは出生時では低く、出生後の成熟中に著しく上昇する。成体の脳におけるKCC3レベルはP1脳より30倍高い。各齢で、155と165kDaの2本のタンパク質バンドが検出されたが、これにより出生後発達を通じた抗体の特性が確認される。出生後発達中高レベルであることとともに白質に豊富な構造中にKCC3が存在することは、有随化および関連の生物活性にKCC3を関連づけるものである。
【０３５６】
脳および脊髄におけるKCC3の解剖学的分布および細胞局在を調べるため、ポリクローナル抗KCC3抗体を用いて成体マウスおよび脊髄の7〜10μm切片を標識した（図３１）。脊髄では、KCC3の発現は脊柱の著しく有随化された束で最も高かった。このパターンは乏突起神経膠細胞マーカーCNPアーゼおよびミエリン塩基性タンパク質の分布と同じである。抗KCC3および抗CNPアーゼ抗体を用いた二重標識によれば、実質的に同時に染色されることが明らかになった。腹側外側脊柱の白質束も同様にKCC3およびCNPアーゼの両者で標識された。抗体に予め特異的抗原を吸着させた場合にはKCC3免疫染色は見られなかった。
【０３５７】
脳におけるKCC3の免疫限局は、最初、おそらくタンパク質間相互作用のために標的エピトープの見かけ上の接近のしにくさにより損なわれた。標準的な免疫染色プロトコールを用いたところ、特異的シグナルは脈絡叢上皮の基底部にしか検出されなかった。この染色は、抗体に予め抗原ペプチドを吸着させることで妨げられた。また、均一な高いバックグラウンドシグナルも見られた。
【０３５８】
脳におけるKCC3エピトープを露出させるため、組織切片をプロテイナーゼKで処理した(Hardt et al. (2000) J Comp Pathol 122:43−53)。前脳では、高レベルKCC3が白質束に見られた(例えば脳梁、図３２Ａ)。脳梁におけるKCC3の大部分は乏突起神経膠細胞マーカーCNPアーゼ(図３２Ｂ)およびミエリン塩基性タンパク質とともに局在していたが、KCC3陽性細胞体のいくつかはCNPアーゼ反応性を欠いていた(図３２Ｂ、矢印)。KCC3はまた海馬のパッケージ細胞層(CA1、図３２Ａ、３２Ｄ)および皮質(図３２Ｅ、３２Ｆ)でも検出されたが、これはニューロンでの発現を示唆する。ニューロンの染色は、(i)海馬のCA1層(図３２Ａ、３２Ｃ)および歯状回(図３２Ｄ)において標識された高密度の細胞体、および(ii)分子層Iの数細胞、層IIの多数の細胞、および深層に分散した細胞(図３２Ｆ)など、大脳皮質における標識細胞の存在で識別した。深層の皮層においては、KCC3は、明瞭な形態によって確認できる錐体ニューロンで検出された(図３２Ｅ)。
【０３５９】
小脳においては、KCC3はプルキニエニューロンおよびそれらの軸索で検出されたが、顆粒性ニューロンでは検出されなかった。白質束もKCC3抗体で標識された。白質のKCC3レベルは脳幹にある垂直束で相対的に高かった。白質のKCC3は乏突起神経膠細胞マーカーCNPアーゼとともに局在していたが、このことはKCC3のミエリン鞘との関連を証明するものである。
大抵の場合、脳幹のMAP2陽性細胞もKCC3免疫反応性を示した。
【０３６０】
実施例２４
KCC2ノックアウトマウス
KCC2に遺伝的欠損があるマウス系統が作製されたが、同型接合マウスは早期新生児死亡を被ることが示された。このマウスに関するターゲッティング法が表３３Ａに示されている。この図面はSlc 12a5/KCC2遺伝子の5'末端の構造、5'プローブの位置、および遺伝子に挿入されるDNA断片の構造を示している。この構築物を、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK−1)プロモーターの下にネオマイシンおよびチミジンキナーゼ遺伝子の両者を含むベクターpPNTを用いて作製した。2.1kbのSph I−Xho I断片(左腕)をネオマイシンカセットの上流に連結し、7kb BamHI断片(右腕)をネオマイシンとチミジンキナーゼの間に挿入した。図３３ＢはNhe IおよびBam HIで消化した胚幹(ES)細胞ゲノムDNAのサザンブロット解析を示すが、3kbバンドは対照遺伝子を示し、4.5kbバンドは変異型遺伝子に由来するものである。
【０３６１】
図３３Ｃに示されるように、ゲノムDNAのPCR解析によれば、2つのES細胞変異体の変異遺伝子の存在が確認される(1F12および2B9)。このPCR産物の位置が示されている(矢印)。上のバンドはプライマーを示す。
【０３６２】
図３３Ｄは野生型マウス、異型接合KCC2+/−マウス、および同型接合KCC2−/−マウスの平均余命のチャートである。出生後、出生個体を調べ、1日2回数えた。死んだ出生個体を取り出し、PCRで遺伝子型を分類した。11日目から17日目の間の同型接合個体の著しい死亡率が示され、同型接合変異体は全て17日目までに死に至った。
【０３６３】
図３３Ｅは発作中のKCC2−/−マウスの写真である。同型接合変異体および対照マウスは逆さまに置かれている。対照マウス(右下)はすぐに正しい向きに戻ったが、異型接合変異体は発作を起こし始めた。KCC2−/−変異個体の四肢の全般的な硬直に注目。
【０３６４】
KCC2変異個体の発作活動を司るニューロンの欠損を調べるため、癲癇KCC2−/−マウスの脳を組織学的に評価した。対照動物の脳に比べ、KCC2−/−の脳は高い前初期遺伝子の発現(例えばfos)および介在ニューロン集団 (例えばパルブアルブミン陽性介在ニューロン)の欠損をはじめ、傷害の徴候を示す。
【０３６５】
KCC2+/−異型接合マウスでは、発作活動誘導閾値の引き下げも見られた。発作は、GABAAレセプター遮断剤である60mg/kgペンチレンテトラゾール(PTZ)を毎日注射することで、野生型マウスと同腹子交配KCC2+/−マウスで誘導された。PTZ注射後1時間の間の動物の挙動を観察し、発作誘導の重篤度を以下の尺度に従って評価した：スコア=0は発作活動なし、スコア=1は耳および顔面の引きつり、スコア=2は筋間代痙攣、スコア=3は緊張性伸展および痙攣重積状態を伴った間代性前脚痙攣、スコア=5は死亡。スコア3、4または5に当てはまったマウスは群から除いた。図３４はスコア1または2に当てはまったマウスの数を時間の関数としてまとめたものである。野生型とKCC2+/−異型接合マウスの間には有意な差が見られたが、これはKCC2+/−異型接合マウスの発作活動発生度がおよそ2倍上昇したことに相当する。
【０３６６】
実施例２５
KCC3ノックアウトマウス
図３５はKCC3ノックアウトマウス系統を作出するためのターゲッティング構築物を示す。PCR法を用い、エクソン3を除去し、XhoI部位を1450bp SphI断片内に導入した。このIRES/bgeo断片を遺伝子のXhoI部位に挿入した。この突然変異は、選択的にスプライシングされずにKCC3aおよびKCC3b転写物の双方に利用されるエクソン3を欠いている。
【０３６７】
KCC3−/−変異型マウスは協同を欠いた歩行/運動、探査行動の減退として明らかな神経系の欠陥、プレパルスインヒビション、および末梢軸索の有随化の減少をはじめとするいくつかの異常を示す。ヒトKCC3はヒト染色体15q15にマッピングされるが、この領域は精神分裂病の亜型である周期性緊張病と遺伝的に連鎖している(Stober et al. (2000) Am J Hum Genet 67:1201−1207)。KCC3−/−マウスで見られた表現型は、精神分裂病の発生におけるKCC3の関与を支持するものである。初期の運動表現型および末梢神経の脱髄はACCPN(脳梁非形成を伴うまたは伴わない末梢神経障害)の患者で見られるものと同様である(Casaubon et al. (1996) Am J Hum Genet 58:28−34)。さらに、KCC3−/−およびKCC3+/−マウスによって示される強いプレパルスインヒビション表現型は、ACCPN患者について記載されている精神分裂病様の精神病症状(Casaubon et al. (1996) Am J Hum Genet 58:28−34)を連想させる。本明細書に開示されるヒトKCC3のゲノム構造は成人分裂症状を有する患者の診断の助けとなる。
【０３６８】
KCC3−/−マウスは離乳前(出生後21日)に異常な姿勢および歩行を表す。KCC−/−個体の四肢は弱く、低い姿勢および協同を欠いた四肢の動きとして現れる。この感覚運動の欠陥をさらに記載するため、運動特性に着目した3つの挙動試験(回転ロッド試験、ワイヤー懸垂試験、および梁試験)を用いた。それぞれは本明細書の下記に簡単に記載されている。これらのデータを考え合わせると、KCC3−/−マウスでは強さと協同性の双方を含む運動欠陥を示し、KCC3+/−異型接合マウスではそれを示さないことが分かる。
【０３６９】
回転ロッド試験では、動物を乗せ、その動物が落下するまでの持続時間を評価する。回転ロッド試験は1日3回、3日間行い、この一連の試験を動物が1ヶ月齢および4ヶ月齢の際に行った。図３６Ａは各試験シリーズ3日目の試験動物の特性をまとめたものである。野生型とKCC3+/−異型接合マウスの間には有意な差は見られなかった。これに対し、KCC3−/−変異型マウスでは、ロッドに乗せた後すぐに落下しまったので回転ロッド試験は行えなかった。
【０３７０】
ワイヤー懸垂試験では、動物の前脚にワイヤーを持たせる。正常な応答としては、ワイヤーを握ってぶら下がり、やがて後脚および尾もワイヤーに掛けるという特徴を持つ。図３６Ｂに示されるように、野生型およびKCC3+/−異型接合マウスは難なくワイヤーをつかんだが、KCC3−/−マウスは上手くつかめなかった。1ヶ月齢と4ヶ月齢で動物を試験したが、結果は一致した。
【０３７１】
梁試験では、細い梁の上に動物を乗せ、その動物が梁から落下するまでの経過時間を測定する。図３６Ｃに示されるように、野生型およびKCC3+/−異型接合マウスは梁の上で1分間(試験時間)姿勢を保ったが、KCC3−/−マウスはすぐに落下した。1ヶ月齢と4ヶ月齢で動物を試験したが、結果は一致した。
【０３７２】
KCC3−/−変異型マウスにおける運動表現型への神経の寄与を評価するため、活動室アッセイを行った。野生型、KCC3+/−異型接合マウス、またはKCC3−/−変異型マウスをそれぞれ活動室に入れ、移動した距離および／または後脚立ちを示した回数を5分間隔で連続4回記録した。結果は図３７Ａおよび３７Ｂにまとめてある。野生がマウスは最初の5分間に高い活動レベルを示し、その後の時間では徐々に活動レベルは低下した。この挙動は新しい環境の探索、その後の慣れという正常なパターンとなる。KCC3−/−変異型マウスは、最大に達しない一定レベルの活動に根拠付けられるように、環境を探索することができず、慣れることもできない。KCC3+/−異型接合マウスでは探索および慣れの活動は低下を示したが、なくならなかった。このようにKCC3+/−異型接合個体では、測定できる運動欠陥の存在もなく(図３６Ａ〜３６Ｃ)、探索行動(図３７Ａ)および後脚立ち行動(図３７Ｂ)の低下が見られたが、このことは活動室アッセイにおける妥協特性が運動特性と関連がないことを示唆するものである。
【０３７３】
KCC3−/−マウスはまた、精神分裂病様挙動を検出するプレパルスインヒビション試験を用いても評価した。この試験はプレパルス(この場合、音のプレパルス)が感覚パルスを阻害する能力に基づいている。野生型個体はこのプレパルスに基づく感覚パルスを予測することを学習するが、精神分裂病個体はこの関連性を学習することができない。音の刺激に対する跳びはね応答を記録し、音の刺激の100ミリ秒前にそれより弱いプレパルスを与える。これらの実験の結果は図３８にまとめてある。野生型マウスとKCC3−/−変異体マウスの間には跳びはね応答の差は見られなかったが、このことはKCC3−/−変異体マウスでは聴覚機能は損なわれていないことを示す。
【０３７４】
ヒトKCC3遺伝子は、ある部分、抹消神経の脱髄を特徴とする疾患であるACCPNと遺伝子連鎖を示す。KCC3−/−マウスにおける有随化を評価するため、組織病理検査のため野生型およびKCC3−/−変異体マウスに由来する座骨神経の厚い切片(1μm)を作製した。野生型マウスから単離された大きな軸索は厚い有随化を示す(図３９Ａ〜３９Ｂ)。これに対し、KCC3−/−変異型マウスに由来する軸索では、薄いミエリン鞘、軸索の退化、および環状の外観を有する多数の軸索が見られた(図３９Ｃ〜３９Ｄ)。
【０３７５】
実施例２６
KCC2多形の確認
マウスKCC2遺伝子のターゲット欠失の結果として反復性発作と早期新生児死亡がもたらされたが(Delpire & Lovinger (2000) J Neurosci 26:1148)、hKCC2遺伝子を含む染色体20q13領域は遺伝性の癲癇症候群に関連がない。しかし、依然としてhKCC2の発現および機能における変異性はヒトの疾病に役割を果たしている可能性がある。マウスKCC2で見られたNRSEはヒト遺伝子では複合体(CA/GT)nリピートのすく5'側で保存されている(図４０)。このリピートが多形であるかどうかを調べるため、この領域をフランキングするプライマー(配列番号114〜115)を用いて数個体からゲノムDNAを増幅した。増幅条件は94℃5分の変性の後、94℃30秒の35サイクル、60℃で30秒のアニーリング、72℃30秒の伸張、最後に72℃で5分の伸張からなった。数個体からの両対立遺伝子の配列は図４１に示されているが、このリピートは実際に多形であることが明らかである。このリピートはNRSEの結合に作用することで、hKCC2遺伝子の転写調節に作用すると考えられる。他の遺伝子の調節エレメント内またはその近傍の同様のジヌクレオチドリピートは転写に対して多形作用を有することが示されている(Gebhardt et al. (1999) J Biol Chem 274:13176−13180; Shimajiri et al. (1999) FEBS Lett 455:70−74)。hKCC2遺伝子の転写におけるこのような遺伝的変異性はヒト発作性疾患および／またはそれらの治療に、またはニューロンのクロライドホメオスタシスおよびGABAに対する応答に作用するその他の疾患に大きな影響を与え得る(van den Pol et al. (1996) J Neurosci 16:4283−4292)。発明者らがhKCC2を発現することを示したヒトNT2−Nニューロン細胞は、これは明らかにKCC2を発現する細胞株に限られているので、hKCC2の転写同定において極めて重要な供給源となる(Williams et al. (1999) J Biol Chem 274:12656−12664)。
【０３７６】
【参照文献】
本発明の背景を説明するため、またある場合には実施に関してさらに詳細なことを示すために以下に挙げられた、かつ／または著者が示した公報および他の文献、および上記明細書の日付は出典明示により本明細書の一部とする。本明細書で用いられる文献は、限定されるものではないが、以下に挙げる参照文献を含む。
Adelman et al. (1983) DNA 2 : 183.
Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215 : 403-410.
Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25 (17) : 3389-3402.
Amial et al. (1994) Am J Physiol Cell Physiol 267 : C1607-1625.
Armour et al. (1996) Ann Hum Genet 60 : 11 B20.
Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22 : 1859-1862.
Bize et al. (1999) Am J Physiol 277 : C926-936.
Brookes (1999) Gene234 (2) : 177-186.
Brugnara et al. (1986) Science 232 (4748) : 388-390.
Callenbach & Brouwer (1997) Clin Neurol Neurosurg 99 (3) : 159-171.
Capecchi (1989) Science 244 (4910) : 1288-1292.
Casaubon et al. (1996) Am J Hum Genet 58 (1) : 28-34.
Chien et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88 : 9578-9582.
Clayton et a). (1998) Brain Res Dev Brain Res 109 (2) : 281-292.
Conner et al. (1983) Proc Natt Acad Sci USA 80 : 278.
De Franceschi et al. (1996) Blood 88 (7) : 2738-2744.
Delpire et al. (1994) J Biol Chem 269 : 25, 677-25, 683.
Delpire et al. (1999) Nat Genet 22 (2) : 192-195.
Delpire & Lovinger (2000) J Neurosci 26 : 1148.
Ding et al. (1997) J Biol Chem 272 (44) : 28142-28148.
Di Stefano et al. (1998) Cell Physiol Biochem 8 : 89-105.
Elmslie et al. (1997) Hum Mol Genet 6 (8) : 1329-1334.
Forlino et al. (1999) J Biol Chem 274 (53) : 37923-37931.
Gamba et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90 (7) : 2749-2753.
Gamba et al. (1994) J Biol Chem 269 : 17713-17722.
Garay et al. (1988) Mol Pharmacol 33 : 696-701.
Gatti et al. (1988) Nature 336 : 577-580.
Gebhardt et al. (1999) J Biol Chem 274 : 13176-13180.
Gillen et al. (1996) J Biol Chem 271 (27) : 16237-16244.
Gimenez et al. (1999) FASEB J 13 : A64.
Greger & Schlatter (1983) Pfluges Arch 396 : 325-334.
Gribskov et al. (1986) Nuc Acids Res 14 (1) : 327-334.
Grunder et al. (1992) Nature 360 (6406) : 759-762.
Hara et al. (1992) Neurosci Lett 143 : 135-138.
Hardt et al. (2000) J Comp Pathol 122 : 43-53.
Harlow & Lane (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Hiki et. al. (1999) J Biol Chem 274 : 10661-10667.
Hochman et al. (1995) Science 270 (5233) : 99-102.
Holtzman et al. (1998) Am J Physiol 275 (4 Pt 2) : F550-564.
Hubner et al. (2001) Mech Dev 102 : 267-269.
Hurst et al. (1992) Am J Physiol 263 (2 Pt 2) : F262-267.
Isenring et al. (1998) J Gen Physiol 112 (5) : 549-558.
Jacoby (1999) Am J Physiol 277 : C684-692.
Ji et al. (1998) Am J Physiol 275 (5 Pt 1) : C1182-1190.
Karadesh & Delpire (2001) J Neurophysiol 85 : 995-997.
Kelley et al. (2000) J Membr Biol 178 : 31-41.
Kestila et al. (1998) Mol Cell 1 (4), 575-582.
Kissel et al. (2000) EMBO J 19 (6) : 1312-1326.
Krapivinsky et al. (1994) Cell 76 (3) : 439-448.
Kuwahara et al. (1997) Biochemistry 36 : 13973-13978.
Kyte et al. (1982) J Mol Biol 157 : 105.
Lafreniere et al. (1997) Nat Genet 15 (3) : 298-302.
Landgren et al. (1988) Science 241 : 1007.
Landgren et al. (1988) Science 242 : 229-237.
Lauf et al. (1992) Am J Physiol 263 : C917-932.
Liapis et al. (1998) Am J Physiol 275 (6 Pt 1) : C1432-1437.
Liman et al. (1992) Neuron 9 : 861-871.
Loghman-Adham et al. (1997) Kidney Int 52 (1) : 229-239.
Lopes et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85 (8) : 2873-2877.
Lu et al. (1999) J Neurobiology 39 : 558-568.
Luyckx et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96 (21) : 12174-12179.
Lytle (1998) Am J Physiol 274 : C1002-1010.
Makalowski & Boguski (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95 : 9407B9412.
Maniatis et. al. (1982) in Molecular Cloning : A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, New York.
Martinez Murillo et al. (1999) Neurology 53 (1) : 50-56.
McPherson et al., eds. (1991) PCR. A Practical Approach, IRL Press, Oxford University Press, New York, New York.
Mercado et al. (2000) J Biol Chem 275 : 30326-3034.
Miles (1999) Nature 397 (6716) : 215-216.
Misgeld et al. (1986) Science 232 (4756) : 1413-141.
Mount et al. (1997) J Membr Biol 158 : 177-186.
Mount et al. (1998) J Exp Bio 201 : 2091 B2102.
Mount et al. (1999) J Biol Chem 274 : 16355-16362.
Needleman et al. (1970) J Mol Biol 48 : 443.
Neelands et al. (1998) J Neurosci 18 (13) : 4993-5007.
Neelands et al. (1999) J Neurosci 19 (16) : 7057-7065.
Neubauer et al. (1998) Neurology 51 (6) : 1608-1612.
Orita et al. (1989) Proc NaUAcad Sci USA 86 (8) : 2766-2770.
Payne et al. (1990) Am J Physio259 : C819-827.
Payne (1997) Am J Physiol 273 : C1516-C1525.
Piontek et al. (1999) J Neurochem 73 (1) : 139-146.
Pleasure & Lee (1993) J Neurosci Res 35 (6) : 585-602.
Price (1993) Blood Rev 7 : 127-134.
Reed et al. (1999) Am J Hum Genet 64 (5) : 1478-1480.
Rivera et al. (1999) Nature 397 : 251-255.
Rose et al. (1991) Kidney Int 39 : 336-352.
Saiki et al. (1985) Bio/Technology 3 : 1008-1012.
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Sauer (1998) Methods 14 (4) : 381-392.
Schoenherr et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93 : 9881-9886.
Schultz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95 : 5857-5864.
Schultz et al. (2000) Nuc Acids Res 28 : 231-234.
Schwartz et al., (1979) Nuc Acids Res 6 (2) : 745-755.
Seki et al. (1993) J Clin Invest 92 (3) : 1229-1235.
Shimajiri et al. (1999) FEBS Lett 455 : 70-74.
Simon et al. (1996) Nat Genet 13 (2) : 183-188.
Simon et al. (1996) Nat Genet 14 : 152-156.
Simon et al. (1997) Nat Genet 17 : 171-178.
Smith et al. (1981) Adv Appl Math 2 : 482.
Skradski et al. (1998) Genomics 49 (2) : 188-192.
Stober et al. (2000) Am J Hum Genet 67 : 1201-1207.
Stoneking et al. (1991) Am J Hum Genet 48 (2) : 370-382.
Su et al. (1999) Am J Physiol 277 (5 Pt 1) : C899-C912.
Thomas & Capecchi (1990) Nature 346 (6287) : 847-850.
Thompson et al. (1994) Nuc Acids Res 22 (22) : 4673-4680.
Timchenko & Caskey (1996) FASEB J 10 (14) : 1589-1597.
Tomlinson et al. (1999) Gastroenterology 116 (4) : 789-795.
Trask (1991) Trends Genet 7 : 149-154.
U. S. Patent No. 4, 196, 265
U. S. Patent No. 4, 458, 066
U. S. Patent No. 4, 554, 101
U. S. Patent No. 4, 683, 195
U. S. Patent No. 4, 683, 202
U. S. Patent No. 4, 736, 866
U. S. Patent No. 4, 769, 331
U. S. Patent No. 4, 895, 807
U. S. Patent No. 4, 965, 188
U. S. Patent No. 5, 162, 215
U. S. Patent No. 5, 234, 933
U. S. Patent No. 5, 260, 203
U. S. Patent No. 5, 279, 833
U. S. Patent No. 5, 286, 634
U. S. Patent No. 5, 326, 902
U. S. Patent No. 5, 352, 660
U. S. Patent No. 5, 399, 346
U. S. Patent No. 5, 410, 031
U. S. Patent No. 5, 441, 875
U. S. Patent No. 5, 489, 742
U. S. Patent No. 5, 550, 316
U. S. Patent No. 5, 573, 933
U. S. Patent No. 5, 580, 722
U. S. Patent No. 5, 614, 396
U. S. Patent No. 5, 625, 125
U. S. Patent No. 5, 627, 158
U. S. Patent No. 5, 641, 484
U. S. Patent No. 5, 643, 567
U. S. Patent No. 5, 645, 999
U. S. Patent No. 5, 646, 008
U. S. Patent No. 5, 648, 061
U. S. Patent No. 5, 651, 964
U. S. Patent No. 5, 734, 033
U. S. Patent No. 5, 739, 278
U. S. Patent No. 5, 741, 957
U. S. Patent No. 5, 786, 152
U. S. Patent No. 5, 834, 228
U. S. Patent No. 5, 837, 479
U. S. Patent No. 5, 846, 720
U. S. Patent No. 5, 849, 578
U. S. Patent No. 5, 872, 011
van den Pol et al. (1996) J Neurosci 16 (13) : 4283-4292.
Vandorpe et al. (1998) J Biol Chem 273 (34) : 21542-21553.
Verma et al. (1988) Human Chromosomes : A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, New York.
Wang et al. (1998) Science 280 (5366) : 1077-1082.
Wethmur & Davidson (1968) J Mol Biol 31 : 349-370.
White et al. (1997) Nat Genet 17 (4) : 404-410.
Wick et al. (1996) Oncogene 12 (5) : 973-978.
Williams et al. (1999) J Biol Chem 274 (18) : 12656-12664.
WO 84/03564
WO 93/25521
WO 96/34288
WO 98/29431
WO 98/37198
WO 98/53067
Yuan et al. (1999) Hum Mutat 14 (5) : 440-446.
【０３７７】
本発明の種々の詳細は本発明の範囲を外れない限り変更可能であると理解される。また、これまでの記載は単に説明を目的としたものであって限定されるものではなく、本発明は特許請求の範囲により定義される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトKCC2、ヒト、マウスおよびアフリカツメガエルKCC3およびKCC4をコードするcDNAの模式図である。各イソ型について全長cDNAを示し、コード配列を四角で示し、実線は5'−および3'−UTRを表す。EST cDNAクローン、RT−PCR、5'−RACE RT−PCR、およびライブラリースクリーニングから得られた部分的cDNAの相対的な位置は各全長配列の下の影付きの四角で示されている。IMAGEまたはTIGRクローン番号は個々のEST cDNAの下に表示されている。マウスKCC3aおよびKCC3b cDNAはヒトKCC3bおよびKCC3bプライマー対を用い、ネズミ組織の連続RT−PCRによって得られたものである。次ぎに、KCC3aおよびKCC3bコード配列の最も5'末端をネズミエクソン1aおよび1b、およびマウスEST cDNAから得られた3'−UTRの配列解析により決定した。hKCC2の場合、そのcDNAの5'末端はRT−PCRによりクローニングし、2つの3'コード配列EST(363600および362310)はNotI部位(全長cDNAにおけるヌクレオチド3322)で重複する。図面は示されたスケールで描かれている。
【図２Ａ】  ヒトKCC3のゲノム構造を示す模式図である。四角はエクソン配列を表し、示されたようにナンバリングされ、直線は5'UTR、3'UTRおよびイントロン領域を表す。KCC3は2つの個別の第1のコードエクソンを有し、1aおよび1bで示される。マウス腎臓の5'−RACE PCRで、エクソン1bの開始コドンのちょうど5'のmKCC3bの転写開始部位がマッピングされたので、この2つのイソ型は2つの個別のプロモーターにおける転写開始により作製される。ヒトエクソン1aは5'フランキングCpGアイランド(GenBank/EMBL受託番号Z63283)を有する。推定マウスKCC3エクソン1aおよび1bプロモーターの配列は配列番号18および19に含まれ、ヒトKCC3エクソン1aプロモーター配列は配列番号17に含まれている。図面は示されたスケールで描かれている。
【図２Ｂ】  ヒトKCC4のエクソン2〜24のゲノム構造を示す模式図である。白い四角はエクソン配列を示し、示されたようにナンバリングされ、直線は5'UTR、3'UTRおよびイントロン領域を表す。ゲノムサブクローンpMS621に含まれている多形VNTR(タンデムリピートの変数;影付きの四角)マーカーD5S110はhKCC4のエクソン17と18の間のイントロンに見られる。図面は示されたスケールで描かれている。
【図３】  KCC2遺伝子をコードする18−kbマウスゲノムクローンの構造を示すマップである。エクソン1の拡大はラットcDNAの5'末端、5'非翻訳領域(UTR)、KCC2タンパク質のATG開始部位(矢印の起点、M, メチオニン; L, ロイシン; N, アスパラギン)、およびエクソン/イントロン境界(5'スプライシング連結点)に相当する位置を示す。星で示されているKCC2 NRSE配列の位置はエクソン1の下流に見られる。KCC2推定ニューロン制限サイレンシングエレメント(NRSE)配列のアライメントがNRSE共通配列とともに示されている。同一の残基は四角で示し、修飾を受けたと思われる残基はアステリスクで示されている。共通配列のMおよびSはそれぞれ(AまたはC)および(CまたはG)を表す。選択された制限部位を目印として示している: X, XhoI; E, EcoRI。EcoRI部位から始まる太い黒線は、配列決定された断片を示し、太いグレーの線は、GenBankで受託番号AJ011033として公表されている10.2kbゲノム断片を示している。ゲノムクローンは1kbバーで示されたスケールで描かれ、エクソン1の拡大は20bpバーで示されているスケールで描かれている。
【図４】  実施例に記載のように行われたネズミニューロン始原細胞株由来の核タンパク質と結合したmKCC2 NSREを示す電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)のオートラジオグラフである。
図４Ａは、核タンパク質をプローブとともにインキュベートした反応で遅延バンドを示すEMSAのオートラジオグラフであり、DNAプローブと核タンパク質の間の相互作用を示す。
図４Ｂは、非標識(非放射性)NRSE DNAまたは関係のないDNAを用いて行ったEMSAのオートラジオグラフである。遅延バンドによって明らかとなるタンパク質−DNA複合体(矢印は標識「複合体」)は、関連のない配列の過剰量の非放射性DNA(非特異的オリゴ)を反応に加えた場合にもなお存在していた。これに対し、過剰量の非放射性NSRE DNAはNSREプローブと競合することができ、このことは標識タンパク質−DNA複合体が存在しないことで示される。
【図５】  mKCC2 NSREにより付与される転写抑制を示す棒グラフである。非ニューロンC17細胞で、示されたレポーター構築物の発現をアッセイした。ルシフェラーゼ相対活性はプロモーターを含まないPGL3−基本ベクター(白いバー)、KCC2遺伝子の1,500bp5'フランキング領域を含むPGL3ベクター(EcoRI−XhoI断片)(黒いバー)、およびKCC2プロモーターおよび21bpNRSEエレメントの両者を含むPGL3ベクター(グレーのバー)を用いて測定した。KCC2プロモーターによって有意なルシフェラーゼ活性が生じ(p<0.01)、KCC2によって誘導されたルシフェラーゼ活性はNRSEエレメントの存在によって完全に阻害される。各バーは3回の測定の平均値±標準誤差を示す。この図面に示された実験を4回繰り返したところ同じ結果が得られた。
【図６】  アフリカツメガエル卵母細胞で発現したKCC1およびKCC4の定常の機能的同定をまとめた棒グラフである。示されたように、アフリカツメガエル卵母細胞に各々水(H2O)またはrabKCC1またはmKCC4をコードするcRNAを注入した。K+−Cl−共輸送は、実施例12に記載されるように、クロライド依存性の86Rb+(K+の代用)取り込みを測定することでアッセイした。細胞外クロライドの存在下(白いバー)または不在下(黒いバー)、等張(200mOsm/kg)および低張(100mOsm/kg)両条件の下で取り込みを行った。各バーは5個体から取り出した90個の卵母細胞から回収したデータの平均値を示す。86Rb+取り込みは60分間間隔で測定した。アステリスク(*)は、mKCC4を発現するアフリカツメガエル卵母細胞における、細胞外クロライドの存在下での86Rb+の取り込みが、対照卵母細胞での86Rb+取り込みと比較した場合に有意に高まる(p<0.01)ことを示している。
【図７Ａ】  示されたように水またはhKCC2 cRNA 25ngを注入したアフリカツメガエル卵母細胞におけるK+−Cl−共輸送体の機能的発現を示す。細胞外Cl−の存在下(白いバー)または不在下(黒いバー)、等張溶液(210mOsm/kg)で86Rb+取り込みアッセイを行った。取り込み溶液は10mM K+および50mM Cl−を含んだ。各バーは5個体の異なるカエルから取り出した40〜60個の卵母細胞から得たデータの平均値を示す。86Rb+取り込みは60分間行った。アステリスク(*)は、細胞外Cl−の存在下で水を注入した卵母細胞で見られた86Rb+取り込みに対して86Rb+取り込みの有意差を示し(p<0.001)、十字の記号(†)は、クロライドの存在下のKCC2群で、細胞外Cl−の不在下で水を注入した卵母細胞と比べた場合に有意に高い取り込みを示す(p<0.001)。86Rb+取り込み値は平均値±標準誤差を示す。H2O/白いバーは210mOsm/kgでのxKCC(アフリカツメガエルK+−Cl−共輸送体)の活性＝145±13、H2O/黒いバーはCl−の不在下における210mOsm/kgでのxKCCの活性＝69.3±6.7、hKCC2/白いバーは210mOsm/kgでのKCC2の活性＝434±31、hKCC2/黒いバーはCl−の不在下における210mOsm/kgでのhKCC2の活性＝119±8.5。
【図７Ｂ】  示されたように水またはhKCC2由来cRNA 25ngを注入したアフリカツメガエル卵母細胞におけるK+−Cl−共輸送体の機能的発現を示す。細胞外Cl−の存在下(白いバー)または不在下(黒いバー)、低張溶液(120mOsm/kg)で86Rb+取り込みアッセイを行った。取り込み溶液は10mM K+および50mM Cl−を含んだ。各バーは5個体の異なるカエルから取り出した40〜60個の卵母細胞から得たデータの平均値を示す。86Rb+取り込みは60分間行った。アステリスク(*)は、H2O対照群における取り込みとの有意差を示し(p<0.001)、十字の記号(†)は、クロライドの存在下のhKCC2群での取り込みとの有意差を示す(p<0.001)。86Rb+取り込み値は平均値±標準誤差を示す。H2O/白いバーは120mOsm/kgでのxKCCの活性＝221±11、H2O/黒いバーはCl−の不在下における120mOsm/kgでのxKCCの活性＝71.5±6.6、hKCC2/白いバーは120mOsm/kgでのhKCC2の活性＝8713±545、hKCC2/黒いバーはCl−の不在下における120mOsm/kgでのhKCC2の活性＝430±50。
【図８】  等張(210mOsm/kg)および低張(120mOsm/kg)条件下でのxKCC2、hKCC2およびmKCC4によって媒介されるK+−Cl−共輸送を比較する棒グラフを示す。〜70％同一であるhKCC2とmKCC4は細胞容積に対するそれらの応答において劇的な違いを示す。しかし、他のKCC同様、hKCC2の膨張活性はセリン−トレオニンタンパク質ホスファターゼによって媒介される脱リン酸化に依存するが、定常の等張活性はそうではない。KCC2は、等張条件下で有意なK+−Cl−共輸送を媒介する上で、4種のKCCの間で独特なものである。白いバーは10mM K+および50mM Cl−を含有する対照培地で行った取り込みアッセイ、黒いバーは細胞外クロライドの不在下で行った取り込みアッセイ。
【図９Ａ】  mKCC4 cRNAを注入したアフリカツメガエルにおける細胞外K+濃度に応答した86Rb+取り込みの動態特性をまとめた線グラフである。
【図９Ｂ】  mKCC4 cRNAを注入したアフリカツメガエルにおける細胞外Cl−濃度に応答した86Rb+取り込みの動態特性をまとめた線グラフである。
【図９Ｃ】  rabKCC1 cRNAを注入したアフリカツメガエルにおける細胞外K+濃度に応答した86Rb+取り込みの動態特性をまとめた線グラフである。
【図９Ｄ】  rabKCC1 cRNAを注入したアフリカツメガエルにおける細胞外Cl−濃度に応答した86Rb+取り込みの動態特性をまとめた線グラフである。
【図１０】  hKCC2によって媒介されるK+−Cl−共輸送の濃度依存性を示す線グラフである。取り込みアッセイは水を注入した卵母細胞でも同時に評価した。hKCC2による86Rb+取り込みを測定するため、水群の平均値を対応するhKCC2群の平均値から差し引いた。
【図１１】  細胞の膨張によってhKCC3aおよびhKCC3の活性の傾きにおける差を示す棒グラフを示すが、両イソ型とも細胞外浸透圧160mOsm/kgで活性化し始めた。活性化におけるこれらの違いはそれらの分岐したアミノ末端間の推定されるリン酸化の違いによるものである可能性がある(Mount et al. (1999) J Biol Chem 274:16355−16362)。
【図１２】  rabKCC1、hKCC3a、およびmKCC4のアニオン依存性を示す一連の棒グラフである。86Rb+流入は、40mMグルコン酸NMDGおよび10mM濃度のKCl(対照群)または各アニオン置換基の10mMカリウム塩(KBr、KH2PO4、KI、グルコン酸カリウム、およびKSCN)を含有する低張取り込み培地で評価した。プレインキュベーションは50mMグルコン酸NMDGを含有する溶液中で行った。データは対照群を100％として86Rb+取り込みを示すことでノーマライズした。各バーは少なくとも15個の卵母細胞で測定した平均値±標準誤差を示す。rabKCC1、hKCC3a、およびmKCC4間のアニオン選択性において見られた違いは、おそらく、カチオン−クロライド共輸送体に対してアニオン親和性を付与すると思われるセグメントTM4およびTM7を有するバリエーションによるものである。アステリスク(*)は対照群で見られた取り込みと比較した場合に有意に高い86Rb+取り込みを示す。
【図１３】  hKCC2によって媒介されるK+−Cl−共輸送のアニオン依存性、すなわち、クロライド以外のアニオンの存在下での輸送体の相対活性を示す棒グラフである。86Rb+流入は、40mMグルコン酸NMDGおよび10mM濃度のKCl(対照群)またはアニオン置換基のいずれかの10mM濃度のカリウム塩(KBr、KH2PO4、KI、グルコン酸カリウム、およびKSCN)を含有する低張取り込み培地を用い、hKCC2を注入した卵母細胞で評価した。アステリスク(*)は対照群で見られた取り込みと比較した場合に有意に高い86Rb+取り込みを示す(p<0.01)。
【図１４】  ループ利尿薬フロセミドおよびブメタニドによる86Rb+取り込みの阻害に対する細胞外K+濃度([K+]e)の作用を示す線グラフを示す。mKCC4を注射した卵母細胞からのデータは上のパネルに示され、rabKCC1を注射した卵母細胞からのデータは下のパネルに示されている。全ての実験で、細胞外培地のCl−濃度は50mMであったが、細胞外カリウム濃度は2〜20mMまで変動した。各KCCの対照群はループ利尿薬で処理しない卵母細胞からなり、各KCCに関してループ利尿薬の不在下での平均取り込みを100％の取り込みとして示した。利尿薬処理群からのデータは対照群の取り込みに対してノーマライズした。試験群はインキュベーションおよび取り込み中、2mMフロセミドまたはブメタニドに曝した。各点は少なくとも15個の卵母細胞から得たデータの平均値±標準誤差を示す。
【図１５】  フロセミドおよびブメタニドによるKCC4およびKCC1により媒介されるカチオン−クロライド輸送の阻害の濃度応答プロフィールを示す線グラフである。mKCC4またはrabKCC1をマイクロインジェクションした15個のアフリカツメガエル卵母細胞の群をプレインキュベーションおよび取り込み培地中で20〜2000μMフロセミドまたはブメタニドに曝した。ループ利尿薬に曝さなかった卵母細胞は対照群とし、この群で見られた流入％を100％とした。データは対照群に対する流入％としてノーマライズした。各点は少なくとも15個の卵母細胞から得たデータの平均値±標準誤差を示す。(○)/実線はmKCC4を注入した卵母細胞、(□)/破線はrabKCC1を注入した卵母細胞。
【図１６】  フロセミドおよびブメタニドによる、hKCC2に媒介されるカチオン−クロライド共輸送の用量依存的阻害を示す線グラフである。hKCC2 cRNAをマイクロインジェクションした卵母細胞の群を、プレインキュベーションおよび取り込み培地中、2ないし2000μMの増加濃度のフロセミドまたはブメタニドに曝した。取り込みアッセイは低張条件で行った。各点は少なくとも15個の卵母細胞の平均値±標準誤差を示す。(□)/破線はフロセミド処理、(○)/実線はブメタニド処理。
【図１７】  アフリカツメガエル卵母細胞におけるhKCC3bに媒介されるK+−Cl−共輸送を示す棒グラフを示すが、等張条件(220mOsm/kg)下で最小の活性、および低張条件(110mOSM/kg)下で顕著な活性であった。白いバーは10mM K+および50mM Cl−を含有する対照培地で行った取り込みアッセイ、黒いバーはCl−を欠いた培地で行った取り込みアッセイ、グレーのバーは2mMフロセミドを含有する培地で行った取り込みアッセイ。アステリスク(*)は対応する対照群の取り込みと比較した場合の86Rb+取り込みにおける有意差を示す(p<0.01)。
【図１８Ａ】  mKCC4、hKCC3、またはrabKCC1をマイクロインジェクションし、さらに、2mM細胞外K+、50mM Cl−(白いバー)または50mM細胞外K+、50mM Cl−(斜線のバー)の存在下、低張条件(120mOsm/kg)でインキュベートしたアフリカツメガエル卵母細胞における86Rb+取り込みに対する阻害剤DIDSの作用を示す棒グラフである。86Rb+取り込みはDIDSの不在下の対照群で評価した。試験群はインキュベーションおよび取り込み中、100μM DIDSに曝した。各バーは少なくとも15個の卵母細胞から得られたデータの平均値±標準誤差を示す。
【図１８Ｂ】  mKCC4、hKCC3、またはrabKCC1をマイクロインジェクションし、さらに、2mM細胞外K+、50mM Cl−(白いバー)または50mM細胞外K+、50mM Cl−(斜線のバー)の存在下、低張条件(120mOsm/kg)でインキュベートしたアフリカツメガエル卵母細胞における86Rb+取り込みに対する阻害剤DIOAの作用を示す棒グラフである。86Rb+取り込みはDIOAの不在下の対照群で評価した。試験群はインキュベーションおよび取り込み中、100μM DIOAに曝した。各バーは少なくとも15個の卵母細胞から得られたデータの平均値±標準誤差を示す。
【図１９】  アフリカツメガエルKCC(KCCx)、rabKCC1、hKCC3、またはmkCC4 cRNAでの卵母細胞のマイクロインジェクションによって誘導される86Rb+取り込みに対する10mM BaCl2の作用を示す棒グラフを示す。対照群の86Rb+取り込み(白いバー)は、40mM NMDGクロライドおよび10mM KClを含有する低張取り込み培地で測定した。BaCl2で処理した卵母細胞の86Rb+取り込み(黒いバー)は30mM NMDGクロライド、10mM BaCl2および10mM KClを含有する低張培地を用いて測定した。各バーは20個の卵母細胞から得られたデータの平均値を示す。アステリスク(*)は、対照群の86Rb+取り込みと比べた場合に有意に異なるBaCl2処理した卵母細胞の86Rb+取り込み値を示す(p<0.01)。特にKCC4は10mMバリウムに部分的に感受性があり、このことは太いヘンレ上行脚細胞の基底外側膜にKCC4が局在していることと一致する。
【図２０】  等張および低張条件においてmKCC4注入卵母細胞およびrabKCC1注入卵母細胞における86Rb+取り込みに対する1mM NEMの作用を示す棒グラフを示す。
図２０Ａは等張培地でのmKCC4注入卵母細胞における86Rb+取り込みを示す棒グラフである。各バーは20個の卵母細胞から得られたデータの平均値±標準誤差を示す。白いバーはNEMを欠いた対照条件下での86Rb+取り込み、黒いバーは細胞外Cl−の不在下での86Rb+取り込み、斜線のバーはNEMの存在下での86Rb+取り込み。アステリスク(*)は、NEM処理した卵細胞の86Rb+取り込みが対照群に対して有意に高まったことを示す(p<0.0001)。
図２０Ｂは等張培地においてrabKCC1注入した卵母細胞における86Rb+取り込みを示す棒グラフである。各バーは20個の卵母細胞から得られたデータの平均値±標準誤差を示す。白いバーはNEMを欠いた対照条件下での86Rb+取り込み、黒いバーは細胞外Cl−の不在下での86Rb+取り込み、斜線のバーはNEMの存在下での86Rb+取り込み。アステリスク(*)は、NEM処理した卵細胞の86Rb+取り込みが対照群に対して有意に高まったことを示す(p<0.0001)。
図２０Ｃは低張培地においてmKCC4注入した卵母細胞における86Rb+取り込みを示す棒グラフである。各バーは20個の卵母細胞から得られたデータの平均値±標準誤差を示す。白いバーはNEMを欠いた対照条件下での86Rb+取り込み、黒いバーは細胞外Cl−の不在下での86Rb+取り込み、斜線のバーはNEMの存在下での86Rb+取り込み。アステリスク(*)は、NEM処理した卵細胞の86Rb+取り込みが対照群に対して有意に低下したことを示す(p<0.0001)。
図２０Ｄは低張培地においてrabKCC1注入した卵母細胞における86Rb+取り込みを示す棒グラフである。各バーは20個の卵母細胞から得られたデータの平均値±標準誤差を示す。白いバーはNEMを欠いた対照条件下での86Rb+取り込み、黒いバーは細胞外Cl−の不在下での86Rb+取り込み、斜線のバーはNEMの存在下での86Rb+取り込み。アステリスク(*)は、NEM処理した卵細胞の86Rb+取り込みが対照群に対して有意に低下したことを示す(p<0.0001)。
【図２１】  50μM水銀(HgCl2)に対するKCCの異なる応答を示す棒グラフを示す。低張条件によって活性化されるrabKCC1およびhKCC3は50μM水銀HgCl2に対して耐性があるが、hKCC2および特にmKCC4はこの薬剤に対して感受性である。白いバーは10mM K+および50mM Cl−を含有する対照培地で行った取り込みアッセイ、黒いバーは50μM水銀HgCl2を含有する培地で行った取り込みアッセイ。アステリスク(*)は、対照群に対する取り込み活性の有意な低下を示す(p<0.001)。
【図２２】  HgCl2に対する天然型および変異型mKCC4ポリペプチドの異なる応答を示す棒グラフを示す。4重変異体mKCC4はHgCl2感受性をいくらか維持するが、5重mKCC4変異体はは耐性であった。4重は4つのシステインが変異した(C256A/C469N/C565A/C647M)mKCC4変異体、5重は5つのシステイン残基が変異した(C256A/C469N/C565A/C647M/C633S)、白いバーは10mM K+および50mM Cl−を含有する対照培地で行った取り込みアッセイ、黒いバーはCl−を欠いた培地で行った取り込みアッセイ、斜線のバーはHgCl2を含有する培地で行った取り込みアッセイ。アステリスク(*)は、KCC4活性における有意な低下を示す(p<0.01)。
【図２３】  アフリカツメガエル卵母細胞におけるhKCC3a活性に対するミオシンL鎖キナーゼ阻害剤ML−7の作用を示す棒グラフである。K+−Cl−共輸送は100μM ML−7によって活性化される(ML−7の不在下でのKCC3aの989±115pmol/卵母細胞/時に対し、160mOsm/kgのML−7の存在下では1698±298pmol/卵母細胞/時)。黒いバーは左から右へ、Cl−の存在下でのxKCCによる86Rb+取り込み、Cl−およびML−7の存在下でのxKCCによる86Rb+取り込み、Cl−の存在下でのhKCC3aによる86Rb+取り込み、Cl−およびML−7の存在下でのhKCC3aによる86Rb+取り込み、グレーのバーは左から右へ、Cl−の不在下でのxKCCによる86Rb+取り込み、Cl−の不在下、ML−7の存在下でのxKCCによる86Rb+取り込み、Cl−の不在下でのhKCC3aによる86Rb+取り込み、Cl−の不在下、ML−7の存在下でのhKCC3aによる86Rb+取り込み。
【図２４】  膨張によって誘導されるmKCC4またはrabKCC1の活性に対するタンパク質ホスファターゼ阻害剤カリクリンA、オカダ酸、およびシペルメトリンの作用を示す棒グラフを示す。白いバーは低張培地中で阻害剤で処理しなかった対照卵母細胞における86Rb+流入、斜線のバーは低張培地中で100nMカリクリンAで処理した卵母細胞における86Rb+流入、黒いバーは低張培地中で1nMオカダ酸で処理した卵母細胞における86Rb+流入、グレーのバーは低張培地中で100pMシペルメトリンで処理した卵母細胞における86Rb+流入。各バーは少なくとも15個の卵母細胞で観察された平均値±標準偏差を示す。
【図２５Ａ】  hKCC2に媒介される等張K+−Cl−共輸送に対するタンパク質ホスファターゼ阻害剤カリクリンA(100nM)の作用を示す棒グラフである。対照群(白いバー)、細胞外Cl−の不在下(黒いバー)、または100mMカリクリンの存在下(斜線のバー)で86Rb+流入を評価した。各バーは少なくとも15個の卵母細胞を用いて得られたデータの平均値±標準偏差を示す。アステリスク(*)は、対照群に対してCl−の不在下で86Rb+流入が有意に低下したことを示す。
【図２５Ｂ】  hKCC2に媒介される膨張により誘導されるK+−Cl−共輸送に対するタンパク質ホスファターゼ阻害剤カリクリンA(100nM)の作用を示す棒グラフである。対照群(白いバー)、細胞外Cl−の不在下(黒いバー)、または100mMカリクリンの存在下(斜線のバー)で86Rb+流入を評価した。各バーは少なくとも15個の卵母細胞を用いて得られたデータの平均値±標準偏差を示す。アステリスク(*)は、対照群に対してCl−の不在下、Cl−の不在とカリクリンの存在の組合せで86Rb+流入が有意に低下したことを示す。
【図２６】  推定阻害剤の存在下、示されたようにH20またはhKCC3b cRNAをマイクロインジェクションしたアフリカツメガエル卵母細胞における、hKCC3bに媒介されるK+−Cl−共輸送を示す棒グラフである。hKCC3bに媒介されるK+−Cl−共輸送はフロセミド処理に感受性であり、カリクリンA処理によって遮断される。白いバーは10mM K+および50mM Cl−を含有する対照培地で行った取り込みアッセイ、斜線のバーはCl−を欠いた培地で行った取り込みアッセイ、横縞のバーは100nMカリクリンAの存在下で行った取り込みアッセイ、黒いバーはオカダ酸の存在下で行った取り込みアッセイ、グレーのバーはシペルメトリンの存在下で行った取り込みアッセイ。
【図２７Ａ】  in vitroにおけるヒトNT2奇形癌細胞(未分化状態ではこの輸送体を発現しない)の「NT2−N」ニューロン細胞への分化の際にヒトKCC2が著しく誘導されることを示すノーザンブロットのオートラジオグラフ。NT2−N細胞はニューロン細胞モデルとして用いられ、GABAAレセプターのいくつかのサブタイプならびに複数のノイロトロピンレセプターを発現することが知られている。これらの細胞はそれ自体、ヒトKCC2の機能、転写後調節、および転写調節を理解するための細胞モデルを提供する。
【図２７Ｂ】  KCC3エクソン1a特異的、およびKCC3エクソン1b特異的プローブ双方でプロービングされたマウス組織のノーザンブロットのオートラジオグラフである。KCC3aは特に脳および筋肉に豊富であるが、KCC3Bは腎臓に最も豊富であり、このことはこの2つのプロモーターが異なる調節を受けていることを示している。
【図２７Ｃ】  KCC3エクソン1aおよび4におけるプライマーによるマウス組織のRT−PCRの写真である。エクソン2の選択的スプライシングに対応する2つのバンドが増幅され、短い方のバンドはこの45bpのカセットエクソンを欠いたイソ型に対応する。エクソン2を欠いたマウスおよびヒトKCC3a(KCC3a−2m)の配列データは配列番号3〜6に含まれている。
【図２７Ｄ】  エクソン3からペプチド抗原(KKARNAYLNNSNYEEGDEY; 配列番号116)まで作製されたアミノ末端KCC3特異的抗体を用いたウエスタンブロットのオートラジオグラフである。アフリカツメガエル卵母細胞で異種発現した5種類のKCCに対する免疫反応性は試験しなかったが、このペプチド抗原はKCC1、KCC2またはKCC4配列には見られず、非冗長データベースおよびESTデータベースのストリンジェントBLAST検索でも他のタンパク質を検出しない。KCC3抗体は、脳および腎臓をはじめいくつかの組織の〜160kDaのタンパク質と反応する(腎皮質およびその他の外髄(OM)ならびに脳に関しては図２７Ｄに示されている)。この反応性は、抗体をペプチド抗原でプレインキュベートすると無効となる(図２７Ｄでは腎皮質に関して示される「IAB」サンプル)。
【図２７Ｅ】  エクソン3からペプチド抗原(KKARNAYLNNSNYEEGDEY; 配列番号116)まで作製されたアミノ末端KCC3特異的抗体を用いたウエスタンブロットのオートラジオグラフである。KCC3タンパク質はネズミ赤血球(RBCレーン)、およびマウス近位曲尿細管細胞系(tsMPYレーン)およびヒト臍静脈内皮細胞(HUVECレーン)由来の膜サンプルで検出される。赤血球にKCC3が存在することは、KCC3がK+−Cl−共輸送活性に寄与することを示唆する。
【図２７Ｆ】  エクソン1からペプチド抗原(AERTEEPESPESVDQTSP; 配列番号117)まで作製されたアミノ末端KCC4特異的抗体が分子量160から180kDaの間のタンパク質の幅広バンドを検出することを示すウエスタンブロットのオートラジオグラフである。
【図２７Ｇ】  エクソン1からペプチド抗原(AERTEEPESPESVDQTSP; 配列番号117)まで作製されたアミノ末端KCC4特異的抗体に関して、腎皮質および外髄(OM)で個別の2つのバンドを明らかにすることができ、皮質では分子量の小さいバンドが優勢であって、外髄では分子量の大きいバンドが優勢であることを示す、マウス組織を用いて行ったウエスタンブロットのオートラジオグラフである。このヘテロ性はグリコシル化の違いによるものである可能性もあるが、選択的スプライシングによるものである可能性のほうが高い。
【図２７Ｈ】  エクソン1からペプチド抗原(AERTEEPESPESVDQTSP; 配列番号117)まで作製されたアミノ末端KCC4特異的抗体に関して、反応性がペプチド抗原の免疫吸着によって無効となることを示す、マウス組織を用いて行ったウエスタンブロットのオートラジオグラフである。
【図２７Ｉ】  水を注入した、またはrabKCC1、hKCC2、hKCC3a、もしくはmKCC4をコードするcDNA単独を注入した(25ng/卵母細胞)アフリカツメガエル卵母細胞に由来する全タンパク質のウエスタンブロットのオートラジオグラフである。C末端融合タンパク質特異的KCC1およびKCC2抗体を、KCC1およびKCC2の発現の陽性対照として用いる。KCC3エクソン3抗体およびKCC4エクソン1抗体はそれらのそれぞれのイソ型に対して特異的である。
【図２７Ｊ】  野生型マウス(+/+)およびmKCC3のエクソン3のターゲッティング欠失に関して同型接合のマウス(−/−)の両者の近位曲尿細管におけるKCC3の免疫蛍光を示す写真である(KCC3 1:4000, Alexa 594 1−5,000)。KCC3の存在は薄いグレーのシグナルとして観察される。反応性はノックアウトマウスでは失われており、このことはこの抗体の特異性を証明する。
【図２８】  マウス脳由来のタンパク質を用いて作製したウエスタンブロットのオートラジオグラフである。抗KCC3抗体を用いてKCC3を検出する。7.5％SDS−PAGEによりマウス脳由来のミクロソームタンパク質(70g/レーン)を分離し、これを移し、免疫前血清(1:300)、免疫血清(1:300)、精製抗体(1:1000)および免疫ペプチドに予め吸着させた精製抗体でプロービングした。免疫血清にはタンパク質二量体(155〜165kDa、レーン3)からなる特異的KCC3シグナルも見られたが、免疫前血清にも抗原性ペプチドに予め吸着させた精製抗体でも見られなかった。
【図２９】  マウス脳の種々の領域から単離した全RNA(10μg/レーン)を用いて行ったノーザンブロットである。このメンブランはKCC3 1a特異的プローブ、KCC3 1b特異的プローブ、およびアクチンプローブで連続的にプロービングした。KCC3bはまったく検出されなかったが、KCC3aは調べたどの脳領域にも存在した。KCC3aおよびアクチンの濃度分析を行い、KCC3a/アクチンの濃度比を算出した。脈絡叢以外は全ての脳領域で同量のKCC3a転写物が測定され、脈絡叢は他の領域の量の3分の1しか発現しなかった。
【図３０Ａ】  示された脳領域由来のマウスおよびラットミクロソームタンパク質サンプル(70μg/レーン)から作製したウエスタンブロットである。抗KCC3ポリクローナル抗体を用いてKCC3タンパク質を検出した。全脳、大脳皮質、海馬、間脳、脳幹、および小脳でタンパク質二量体が確認される。3回のウエスタンブロット解析のうち2回は海馬での発現は低かった。
【図３０Ｂ】  示された脳領域由来のマウスおよびラットミクロソームタンパク質サンプル(70μg/レーン)から作製したウエスタンブロットである。抗KCC3ポリクローナル抗体を用いてKCC3タンパク質を検出した。白質束および脊髄では比較的高いレベルのKCC3が検出され、後根神経節および末梢神経ではそれより低いレベルで検出される。
【図３０Ｃ】  示された発達段階のラット脳由来の粗膜サンプルから作製したウエスタンブロットである。P1は出生後1日、P7は出生後7日、P14は出生後14日、P21は出生後21日、Adは成体の脳(>出生後60日)。各レーンの下に示された数字は濃度分析によって測定した場合の、P1脳のKCC3レベルに対するKCC3の数度を示す。
【図３１Ａ】  抗KCC3ポリクローナル抗体を用いて染色した成体マウス脊髄の蛍光顕微鏡写真である。KCC3の存在は薄いグレーのシグナルの領域として観察される。KCC3は有髄度の高い軸索束からなる脊柱で検出される。スケールバー=100μm。
【図３１Ｂ】  乏突起神経膠細胞マーカー抗CNPアーゼ抗体を用いて染色した、図３１Ａに示したものと同一の脊髄切片の蛍光顕微鏡写真である。CNPアーゼの存在は薄いグレーのシグナルの領域として観察される。
【図３１Ｃ】  脊柱のKCC3およびCNPアーゼの染色を示す、図３２Ａおよび３２Ｂの合成画写真である。KCC3とCNPアーゼの同時染色は白いシグナルの領域として観察されるが、このことは図３２Ａおよび３２Ｂで示される薄いグレーのシグナルが組み合わさったことを示す。
【図３１Ｄ】  抗KCC3抗体を用いて染色した成体腹側脊椎の蛍光顕微鏡写真である。KCC3は腹側白質束で検出され、薄いグレーのシグナルとして観察される。灰白質では、KCC3は交差繊維でしか検出されない。
【図３１Ｅ】  抗CNPアーゼ抗体を用いて染色した、図17Dに示したものと同一の腹側脊髄切片の蛍光顕微鏡写真である。CNPアーゼの存在は薄いグレーのシグナルとして観察される。CNPアーゼはまた腹側脊髄の白質束でも検出されるが、このことは前外側ではKCC3およびCNPアーゼが同時に局在することを示す。スケールバー=100μm。
【図３１Ｆ】  組織とともにインキュベートする前に対応する特異的抗原と免疫吸着させた抗KCC3および抗CNPアーゼ抗体で染色した成体脊髄の蛍光顕微鏡写真である。KCC3およびCNPアーゼは検出されていない。
【図３２Ａ】  抗KCC3抗体で標識した前脳の冠状切片の蛍光顕微鏡写真である。KCC3の存在は薄いグレーのシグナルを有する領域として検出される。KCC3は脳梁の白質束、ならびに海馬のCA1ニューロン層で検出される。矢印は白質束近傍のKCC3陽性細胞体をさす。スケールバー=50μm。
【図３２Ｂ】  乏突起神経膠細胞(ミエリン)マーカー抗CNPアーゼを用いて染色した、図３４Ａに示したものと同じ前脳領域の蛍光顕微鏡写真である。CNPアーゼの存在は薄いグレーのシグナルを有する領域として観察される。CNPアーゼは白質束で検出され、海馬のCA1層には存在しない。
【図３２Ｃ】  図３４Ａと３４Ｂの合成画写真である。KCC3とCNPアーゼの同時局在は白いシグナルの領域として観察されるが、このことはグレーのシグナルの重複領域が組み合わさったことを示す。KCC3とCNPアーゼは脳梁に同時に局在する。しかし、多くの細胞体はKCC3陽性であるが、CNPアーゼシグナルは存在しない(矢印)。
【図３２Ｄ】  抗KCC3抗体で標識した歯状回を示す蛍光顕微鏡写真である。多くの顆粒細胞体が標識され、薄いグレーのシグナルの領域として観察される。スケールバー=50μm。
【図３２Ｅ】  抗KCC3抗体を用いて染色した深大脳皮質の蛍光顕微鏡写真である。KCC3の存在は薄いグレーのシグナルの領域として観察される。多くの皮層細胞体が標識され、また細胞体および錐体ニューロンのプロセス(矢印)(も標識されている）。スケールバー=50μm。
【図３２Ｆ】  抗KCC3抗体を用いて染色した浅皮質の大細胞体の蛍光顕微鏡写真である。KCC3の存在は薄いグレーのシグナルの領域として観察される。KCC3は分子層(II)および(III)で検出されるが、分子層(I)にはまれにしか見られない。矢印は脳の周縁部。スケールバー=50μm
【図３３Ａ】  遺伝的にKCC2を欠損するマウス系統を作製するためのターゲッティング戦略を示す模式図である。同型接合KCC2マウスは早期新生児死を受けることが示された。このターゲッティング戦略は5'プローブの位置、すなわちSlc12a5/KCC2遺伝子の5'末端の構造、および遺伝子に挿入されたDNA断片の構造を示す。この構築物は、ホスホグリセレートキナーゼ−1(PGK−1)プロモーターの下でネオマイシンおよびチミジンキナーゼ遺伝子双方を含むベクターpPNTを用いて作出した。A2.1kb Sph I−XhoI断片(左腕)をネオマイシンカセットの上流に連結し、7kb Bam HI断片(右腕)をネオマイシンとチミジンキナーゼの間に挿入した。
【図３３Ｂ】  NheIおよびBamHIで消化した胚幹(ES)細胞ゲノムDNAのサザンブロット解析を示すオートラジオグラフである。3−kbバンドは対照遺伝子を示し、4.5kbバンドは変異型遺伝子に由来するものである。
【図３３Ｃ】  ゲノムDNAのPCR解析により、2種類のES細胞変異体に変異型遺伝子が存在することが確認されることを示す写真である(1F12および2B9)。PCR産物の位置が示されている(矢印)。上のバンドはプライマーである。
【図３３Ｄ】  野生型マウス、異型接合KCC2−/+マウス、および同型接合KCC2−/−マウスの平均余命のチャートグラフである。出生後、出生個体を調べ、1日2回数えた。死んだ出生個体を取り出し、PCRで遺伝子型を分類した。11日目から17日目の間の同型接合個体の著しい死亡率に着目。同型接合変異体は全て17日目までに死に至った。
【図３３Ｅ】  発作中のKCC2−/−マウスの一連の写真である。同型接合変異体および対照マウスは逆さまに置かれている。対照マウス(右下)はすぐに正しい向きに戻ったが、異型接合変異体は発作を起こし始めた。それらの四肢の全般的な硬直も見られた。
【図３４Ａ】  野生型マウス(■)と比較した場合のKCC2+/−マウス(●)の高い発作活動傾向を示すグラフである。実施例２４に記載したようにアッセイした発作活動を示すマウスの数を受けた注射回数(または投じた注射日数)の関数としてプロットした。このアッセイでは、KCC2+/−マウス(●)は野生型マウス(■)より約2倍、発作活動傾向が高い。
【図３４Ｂ】  発作誘発KCC2+/−異型接合マウス(グレーのバー)と野生型マウス(黒いバー)で見られた死亡率％を示す棒グラフである。KCC2+/−異型接合マウスの約35％がPTZ注射に応答して死亡したが、野生型マウスでは同様のPTZ注射の後に死亡した個体は5％未満であった。
【図３５】  KCC3ノックアウトマウス系統を作出するためのターゲッティング構築物の模式図である。PCRを用い、エクソン3を除去し、XhoI部位を1450bp SphI断片内に導入した。このIRES/bgeo断片を遺伝子のXhoI部位に挿入した。この構築物は、選択的にスプライシングされずにKCC3aおよびKCC3b転写物の双方に利用されるエクソン3を欠いている。
【図３６Ａ】  回転ロッド挙動試験における野生型マウス(黒いバー)、KCC3+/−異型接合マウス(グレーのバー)、およびKCC3−/−変異型マウス(斜線のバー)の能力を示すグラフである。各遺伝子型の個体を回転ロッドに乗せ、その個体が回転ロッドから落下するまでの経過時間(落下までの回転ロッド持続秒数)を測定した。示されたように全ての個体の1ヶ月齢と4ヶ月齢で試験した。回転ロッド上の最初のマウスの位置を示した模式図をグラフの隣に示す。
【図３６Ｂ】  ワイヤー懸垂試験における野生型マウス(黒いバー)、KCC3+/−異型接合マウス(グレーのバー)、およびKCC3−/−変異型マウス(斜線のバー)の能力を示すグラフである。各遺伝子型の個体にワイヤーを持たせ、マウスがワイヤーを握っている時間(ワイヤー懸垂持続秒数)を測定した。示されたように全ての個体の1ヶ月齢と4ヶ月齢で試験した。ワイヤーを握っているマウスを示した模式図をグラフの隣に示す。
【図３６Ｃ】  梁挙動試験における野生型マウス(黒いバー)、KCC3+/−異型接合マウス(グレーのバー)、およびKCC3−/−変異型マウス(斜線のバー)の能力を示すグラフである。各遺伝子型の個体を細い梁に乗せ、その個体が梁から落下するまでの時間(梁試験持続秒数)を60秒間で測定した。示されたように全ての個体の1ヶ月齢と4ヶ月齢で試験した。細い梁上の最初のマウスの位置を示した模式図をグラフの隣に示す。
【図３７Ａ】  野生型マウス(●)と比較した場合の、KCC3+/−異型接合マウス(五角形の記号)、およびKCC3−/−同型接合マウス(■)における探査挙動の減退を示すグラフである。活動室に入れたときの各マウスが移動した距離を5分間隔で連続4回測定した。
【図３７Ｂ】  野生型マウス(●)と比較した場合の、KCC3+/−異型接合マウス(五角形の記号)、およびKCC3−/−同型接合マウス(■)における後脚立ち挙動の減退を示すグラフである。活動室に入れたときの各マウスが後脚立ちを示した回数を5分間隔で連続4回測定した。
【図３８】  野生型マウス(●)と比較した場合の、KCC2+/−異型接合マウス(五角形の記号)、およびKCC3−/−同型接合マウス(■)におけるプレパルスインヒビションの減退を示すグラフである。プレパルスインヒビションを示す個体の割合％はKCC3−/−変異型個体では有意に低く、KCC3+/−異型接合マウスではある程度低い。グラフの下の右隅の線図は音のプレパルスおよびパルス刺激の大きさを示し、これを実施例２５にさらに記載される。
【図３９Ａ】  野生型マウスの座骨神経の典型的な横断面を示す顕微鏡写真である。ミエリン被覆は大きな軸索の周りに厚い(細い矢印)。シュワン細胞が軸索を取り囲んで見える(矢印)。
【図３９Ｂ】  野生型マウスの座骨神経の典型的な横断面を示す顕微鏡写真である。ミエリン被覆は大きな軸索の周りに厚い(細い矢印)。シュワン細胞が軸索を取り囲んで見える(矢印)。
【図３９Ｃ】  KCC3−/−変異型マウスの座骨神経の典型的な横断面を示す顕微鏡写真である。多数の大きな軸索が、野生型マウスの有髄程度に比べて比較的薄いミエリン被覆(細い矢印)を持っている。多くの軸索がリング状の外観を持っているが(太い矢印)、この外観はまた野生型個体から単離した軸索でも見られる。繊維の変性およびミエリンの沈着も見られる(矢印)。
【図３９Ｄ】  KCC3−/−変異型マウスの座骨神経の典型的な横断面を示す顕微鏡写真である。多数の大きな軸索が、野生型マウスの有髄程度に比べて比較的薄いミエリン被覆(細い矢印)を持っている。多くの軸索がリング状の外観を持っているが(太い矢印)、この外観はまた野生型個体から単離した軸索でも見られる。繊維の変性およびミエリンの沈着も見られる(矢印)。
【図４０】  hKCC2をコードするゲノム領域のマップである。上の線はKCC2遺伝子の構成を示す。エクソンは四角で示し、エクソンのサブセットがナンバリングされている。エクソンをつなぐ線はイントロン領域を示す。hKCC2エクソン1の拡大図およびイントロン1の最初のセグメントが下のKC2遺伝子マップに示されている。NSRE配列はhKCC2では保存されており、イントロン1の(GC)n(CG)n(GT)nジヌクレオチドリピートのすぐ上流に位置する。
【図４１】  (GC)n(CG)n(GT)nジヌクレオチドリピート領域の示された多形配列(配列番号118〜129)を示すKCC2対立遺伝子の分布をまとめたものである。対立遺伝子「A」および「B」は任意に、サンプル1〜7のいずれか1つで見られる第1および第2の対立遺伝子をさす。トータルは各対立遺伝子を有する各個の数である。
【配列表】
2005522179.tif 000006
2005522179.tif 000007
2005522179.tif 000008
2005522179.tif 000009
2005522179.tif 000010
2005522179.tif 000011
2005522179.tif 000012
2005522179.tif 000013
2005522179.tif 000014
2005522179.tif 000015
2005522179.tif 000016
2005522179.tif 000017
2005522179.tif 000018
2005522179.tif 000019
2005522179.tif 000020
2005522179.tif 000021
2005522179.tif 000022
2005522179.tif 000023
2005522179.tif 000024
2005522179.tif 000025
2005522179.tif 000026
2005522179.tif 000027
2005522179.tif 000028
2005522179.tif 000029
2005522179.tif 000030
2005522179.tif 000031
2005522179.tif 000032
2005522179.tif 000033
2005522179.tif 000034
2005522179.tif 000035
2005522179.tif 000036
2005522179.tif 000037
2005522179.tif 000038
2005522179.tif 000039
2005522179.tif 000040
2005522179.tif 000041
2005522179.tif 000042
2005522179.tif 000043
2005522179.tif 000044
2005522179.tif 000045
2005522179.tif 000046
2005522179.tif 000047
2005522179.tif 000048
2005522179.tif 000049
2005522179.tif 000050
2005522179.tif 000051
2005522179.tif 000052
2005522179.tif 000053
2005522179.tif 000054
2005522179.tif 000055
2005522179.tif 000056
2005522179.tif 000057
2005522179.tif 000058
2005522179.tif 000059
2005522179.tif 000060
2005522179.tif 000061
2005522179.tif 000062
2005522179.tif 000063
2005522179.tif 000064
2005522179.tif 000065
2005522179.tif 000066
2005522179.tif 000067
2005522179.tif 000068
2005522179.tif 000069
2005522179.tif 000070
2005522179.tif 000071
2005522179.tif 000072
2005522179.tif 000073
2005522179.tif 000074
2005522179.tif 000075
2005522179.tif 000076
2005522179.tif 000077
2005522179.tif 000078
2005522179.tif 000079
2005522179.tif 000080
2005522179.tif 000081
2005522179.tif 000082
2005522179.tif 000083
2005522179.tif 000084
2005522179.tif 000085
2005522179.tif 000086
2005522179.tif 000087
2005522179.tif 000088
2005522179.tif 000089
2005522179.tif 000090
2005522179.tif 000091
2005522179.tif 000092
2005522179.tif 000093
2005522179.tif 000094
2005522179.tif 000095
2005522179.tif 000096
2005522179.tif 000097
2005522179.tif 000098
2005522179.tif 000099
2005522179.tif 000100
2005522179.tif 000101
2005522179.tif 000102
2005522179.tif 000103
2005522179.tif 000104
2005522179.tif 000105
2005522179.tif 000106
2005522179.tif 000107
2005522179.tif 000108
2005522179.tif 000109
2005522179.tif 000110
2005522179.tif 000111
2005522179.tif 000112
2005522179.tif 000113
2005522179.tif 000114
2005522179.tif 000115
2005522179.tif 000116
2005522179.tif 000117
2005522179.tif 000118
2005522179.tif 000119
2005522179.tif 000120
2005522179.tif 000121
2005522179.tif 000122
2005522179.tif 000123
2005522179.tif 000124
2005522179.tif 000125
2005522179.tif 000126
2005522179.tif 000127
2005522179.tif 000128
2005522179.tif 000129
2005522179.tif 000130
2005522179.tif 000131
2005522179.tif 000132
2005522179.tif 000133
2005522179.tif 000134
2005522179.tif 000135
2005522179.tif 000136
2005522179.tif 000137
2005522179.tif 000138
2005522179.tif 000139
2005522179.tif 000140
2005522179.tif 000141
2005522179.tif 000142
2005522179.tif 000143
2005522179.tif 000144
2005522179.tif 000145
2005522179.tif 000146
2005522179.tif 000147
2005522179.tif 000148
2005522179.tif 000149
2005522179.tif 000150
2005522179.tif 000151
2005522179.tif 000152
2005522179.tif 000153
【図１】
2005522179.tif 000154
【図２】
2005522179.tif 000155
【図３】
2005522179.tif 000156
【図４】
2005522179.tif 000157
【図５】
2005522179.tif 000158
【図６】
2005522179.tif 000159
【図７】
2005522179.tif 000160
【図８】
2005522179.tif 000161
【図９】
2005522179.tif 000162
【図１０】
2005522179.tif 000163
【図１１】
2005522179.tif 000164
【図１２】
2005522179.tif 000165
【図１３】
2005522179.tif 000166
【図１４】
2005522179.tif 000167
【図１５】
2005522179.tif 000168
【図１６】
2005522179.tif 000169
【図１７】
2005522179.tif 000170
【図１８】
2005522179.tif 000171
【図１９】
2005522179.tif 000172
【図２０】
2005522179.tif 000173
【図２１】
2005522179.tif 000174
【図２２】
2005522179.tif 000175
【図２３】
2005522179.tif 000176
【図２４】
2005522179.tif 000177
【図２５】
2005522179.tif 000178
【図２６】
2005522179.tif 000179
【図２７Ａ】
2005522179.tif 000180
【図２７Ｂ】
2005522179.tif 000181
【図２７Ｃ】
2005522179.tif 000182
【図２７Ｄ】
2005522179.tif 000183
【図２７Ｅ】
2005522179.tif 000184
【図２７Ｆ】
2005522179.tif 000185
【図２７Ｇ】
2005522179.tif 000186
【図２７Ｈ】
2005522179.tif 000187
【図２７Ｉ】
2005522179.tif 000188
【図２７Ｊ】
2005522179.tif 000189
【図２８】
2005522179.tif 000190
【図２９】
2005522179.tif 000191
【図３０】
2005522179.tif 000192
【図３１】
2005522179.tif 000193
【図３２】
2005522179.tif 000194
【図３３】
2005522179.tif 000195
【図３４】
2005522179.tif 000196
【図３５】
2005522179.tif 000197
【図３６】
2005522179.tif 000198
【図３７】
2005522179.tif 000199
【図３８】
2005522179.tif 000200
【図３９Ａ】
2005522179.tif 000201
【図３９Ｂ】
2005522179.tif 000202
【図３９Ｃ】
2005522179.tif 000203
【図３９Ｄ】
2005522179.tif 000204
【図４０】
2005522179.tif 000205
【図４１】
2005522179.tif 000206