(57)【要約】本発明は、哺乳動物遺伝子発現の阻害のために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩを使用して、ＲＮＡｉライブラリーを生成する方法に関する。本出願は、ｓｉＲＮＡを生成する方法を開示する。この方法は、（ｉ）二本鎖ＲＮＡを提供する工程；および（ｉｉ）この二本鎖ＲＮＡをＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩで消化し、それによってｓｉＲＮＡを生成する工程、を包含する。本出願はまた、哺乳動物遺伝子の発現を阻害する方法を開示する。この方法は、（ｉ）二本鎖ＲＮＡを提供する工程；（ｉｉ）この二本鎖ＲＮＡをＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩで消化して、ｓｉＲＮＡを形成する工程；および（ｉｉｉ）哺乳動物細胞をこのｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、それによって哺乳動物遺伝子の発現を阻害する工程、を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｉＲＮＡを生成する方法であって、該方法は、
（ｉ）二本鎖ＲＮＡを提供する工程；および
（ｉｉ）該二本鎖ＲＮＡをＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩで消化し、それによってｓｉＲＮＡを生成する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ｓｉＲＮＡは、長さが約２０〜３０塩基対である、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記ｓｉＲＮＡは、長さが約２１〜２３塩基対である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記二本鎖ＲＮＡは、合成物である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記二本鎖ＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡ集団から単離された一本鎖ＲＮＡを含む、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記二本鎖ＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡ集団に対応する一本鎖ＲＮＡを含む、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡおよびその相補物を合成すること、そして該ＲＮＡおよびその相補物をハイブリダイズさせて二本鎖ＲＮＡを形成することによって、提供される、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記ｓｉＲＮＡは、哺乳動物ＲＮＡ由来である、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記ｓｉＲＮＡは、合成物であり、かつ該ｓｉＲＮＡは、選択された標的哺乳動物遺伝子と同一である配列を有する、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡを含む、ライブラリー。
【請求項１１】
哺乳動物遺伝子の発現を阻害する方法であって、該方法は、
（ｉ）二本鎖ＲＮＡを提供する工程；
（ｉｉ）該二本鎖ＲＮＡをＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩで消化して、ｓｉＲＮＡを形成する工程；および
（ｉｉｉ）哺乳動物細胞を該ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、それによって哺乳動物遺伝子の発現を阻害する工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記ｓｉＲＮＡは、長さが約２０〜３０塩基対である、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記ｓｉＲＮＡは、長さが約２１〜２３塩基対である、方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法であって、前記二本鎖ＲＮＡは、合成物である、方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法であって、前記二本鎖ＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡ集団から単離された一本鎖ＲＮＡを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の方法であって、前記二本鎖ＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡ集団に対応する一本鎖ＲＮＡを含む、方法。
【請求項１７】
請求項１１に記載の方法であって、前記二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡおよびその相補物を合成すること、そして該ＲＮＡおよびその相補物をハイブリダイズさせて二本鎖ＲＮＡを形成することによって、提供される、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記ｓｉＲＮＡは、哺乳動物ＲＮＡ由来である、方法。
【請求項１９】
請求項１１に記載の方法であって、前記ｓｉＲＮＡは、合成物であり、かつ該ｓｉＲＮＡは、選択された標的哺乳動物遺伝子と同一である配列を有する、方法。
【請求項２０】
選択された表現型に関連する遺伝子を同定するための方法であって、該方法は、
（ｉ）二本鎖ＲＮＡを提供する工程；
（ｉｉ）該二本鎖ＲＮＡをＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩで消化し、それによってｓｉＲＮＡを形成する工程；
（ｉｉｉ）哺乳動物細胞を該ｓｉＲＮＡでトランスフェクトする工程；
（ｉｖ）該細胞を該選択された表現型についてアッセイする工程；および
（ｖ）該選択された表現型を示す細胞において、該遺伝子を同定する工程であって、該遺伝子の発現は、該ｓｉＲＮＡの発現によって調節され、そのようにして同定される該遺伝子は、該選択された表現型に関連する、工程
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記表現型は、リンパ球活性化、新脈管形成、アポトーシス、細胞増殖、肥満細胞脱顆粒、ウイルス複製、およびウイルス翻訳からなる群より選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の援用）
本出願は、２００２年５月３１日出願の米国仮特許出願番号６０／３８５，０１１に対する優先権の利益を主張する。この米国仮特許出願番号６０／３８５，０１１は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府によって資金援助される研究および開発の下でなされた発明に対する権利に関する陳述）
本発明は、ＮＩＨ助成金ＣＡ４４３３８の下で政府に支持されてなされた。米国政府は、本発明において、特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
転写後の遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡの小さい（２０〜２５ヌクレオチド、例えば、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド）フラグメントの蓄積を伴うことが報告されており、このフラグメントは、ＲＮＡテンプレートから合成されることが報告されている（ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０〜９５２（１９９９））。これらのフラグメントは、短鎖干渉（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。一定範囲の生物（哺乳動物を含む）において、ｓｉＲＮＡは、遺伝子サイレンシングをもたらす重要な成分であることが、明らかになっている（Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６〜８１１（１９９８）；ＴｉｍｍｏｎｓおよびＦｉｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：８５４（１９９８）；ＷＯ９９／３２６１９；ＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌおよびＣａｒｔｈｅｗ、Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７〜１０２６（１９９８）；Ｎｇｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４６８７〜１４６９２（１９９８）；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３９５９〜１３９６４（１９９８）；ＷＯ９９／５３０５０；ＣｏｇｏｎｉおよびＭａｃｉｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：１６６〜１６９（１９９９）；Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１４：２１１〜２１４（１９９９）；Ｓａｎｃｈｅｚ−ＡｌｖａｒａｄｏおよびＮｅｗｍａｒｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：５０４９〜５０５４（１９９９）；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４〜２９７（２００１））。遺伝子サイレンシングは、遺伝子発現（内因性遺伝子およびトランスジーンの両方の遺伝子発現）の調節のための強力なツールであるので、遺伝子サイレンシングの改良法およびｓｉＲＮＡライブラリーを生成する改良法が、望まれる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、培養哺乳動物細胞において遺伝子発現を選択的にサイレンシングするための強力なツールになっている。同じ遺伝子の異なるｓｉＲＮＡは、種々のサイレンシング能力を有するので、合成ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉は、特に機能的ゲノム研究のためには、非効率的であり得、かつコストがかかる。本発明において、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩが、二本鎖ＲＮＡをｅｓｉＮＲＡ（エンドリボヌクレアーゼにより調製したｓｉＲＮＡ）へと切断するために使用され得る。このｅｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ内の複数の部位を標的とし得る。従って、本発明は、任意の特定のＲＮＡ中の複数の部位を認識して遺伝子発現をサイレンシングし得る、ＲＮＡ二重鎖プールを提供する。長鎖二本鎖ＲＮＡとは対照的に、ｅｓｉＲＮＡは、培養哺乳動物細胞において明らかな非特異的影響を伴わずに、有効なＲＮＡ干渉を媒介する。ｅｓｉＲＮＡによる配列特異的干渉、および長鎖ｄｓＲＮＡにより活性化される非特異的インターフェロン応答は、哺乳動物細胞において独立した経路である。ｅｓｉＲＮＡは、その同族ＲＮＡの破壊を惹起することによって、作用する。その単純さおよび能力が原因で、このアプローチは、哺乳動物遺伝子機能の分析のために有用である。さらに、このアプローチは、選択された表現型（例えば、疾患表現型）に関連する遺伝子を同定して薬物開発および診断適用のための標的として使用され得る遺伝子を同定するための、機能的ゲノムスクリーニングのために有用である。
【０００５】
（発明の詳細な説明）
（導入）
二本鎖ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉは、多くの真核生物において遺伝子発現を選択的にサイレンシングするための強力な遺伝子ツールである（１〜２）。ＲＮＡｉ反応において、細胞ＲＮアーゼＩＩＩ酵素であるＤｉｃｅｒが、そのｄｓＲＮＡサイレンシングトリガーを切断して、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ）と呼ばれる２１〜２５ヌクレオチドのＲＮＡにする（３〜４）。ｓｉＲＮＡは、その同族ｍＲＮＡと対合し、標的ｍＲＮＡの分解および遺伝子特異的サイレンシングシグナルの増幅をもたらす（１〜５）。ＲＮＡｉはまた、マウスの卵母細胞、胚、胚性幹細胞、および胚癌腫細胞株において観察されているが、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ほとんどの哺乳動物細胞株において、遺伝子発現の非特異的阻害を誘発する（６〜８）。哺乳動物細胞において、３０塩基対よりも長いｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ依存性キナーゼであるＰＫＲおよび２’−５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ（これは、通常は、インターフェロンによって誘導されるＺ）を活性化し得る（９）。その小さいサイズによって、合成ｓｉＲＮＡは、このインターフェロン応答の活性化を回避する。この活性化されたＰＫＲは、翻訳因子である真核生物開始因子２α（ｅＩＦ２α）のリン酸化によって遺伝子翻訳を阻害し、一方、２’−５’−オリゴアデニル酸シンセターゼは、ＲＮアーゼＬの活性化を介して、非特異的ｍＲＮＡ分解を引き起こす（９）。
【０００６】
長鎖ｄｓＲＮＡの非特異的効果とは対照的に、ｓｉＲＮＡは、哺乳動物系において選択的遺伝子サイレンシングを媒介し得る（１０〜１１）。短いループとそのステム中の１９〜２７塩基対とを有するヘアピンＲＮＡもまた、その二本鎖ステム中の配列と相同な遺伝子の発現を、選択的にサイレンシングする（１２〜１３）。哺乳動物細胞は、短鎖ヘアピンＮＲＡをｓｉＲＮＡへと転換して、選択的遺伝子サイレンシングを媒介し得る（１２〜１３）。多くの哺乳動物細胞はまた、長鎖ｄｓＲＮＡをｓｉＲＮＡへと転換し得るが、長鎖ｄｓＲＮＡは、これらの細胞において、ＲＮＡｉを誘発することができない（７）。長鎖ｄｓＲＮＡが脊椎動物系においてＲＮＡｉを誘発することができないことは、一般的には、インターフェロン応答の非特異的活性化に帰せられている（７〜８）。しかし、インターフェロンシグナル伝達経路と、ＲＮＡ干渉との間の関係は、明確に取り組まれているわけではない。
【０００７】
ｓｉＲＮＡは、培養哺乳動物細胞における遺伝子発現を抑制する結果を評価するための有望なツールを提供するが、合成ｓｉＲＮＡを用いるＲＮＡｉは、限定される。なぜなら、遺伝子内の異なる配列に対するｓｉＲＮＡは、劇的に変化する阻害能力を有するからである（１４〜１５）。従って、各ｍＲＮＡは、効率的なｓｉＲＮＡについてスクリーニングされなければならない（骨が折れ、コストがかかるプロセスである）。しかし、長鎖ｄｓＲＮＡの処理は、標的ｍＲＮＡ上の複数の部位と相互作用可能な広範な種類のｓｉＲＮＡを生成し、少なくとも１つのｓｉＲＮＡがその標的配列と対合する機会を増加するはずである。従って、哺乳動物系における遺伝子ツールとしてのｓｉＲＮＡの能力は、ｄｓＲＮＡから処理されたｓｉＲＮＡを使用することによって、大いに増強され得る。
【０００８】
Ｄｉｃｅｒは、インビボでのｄｓＲＮＡ切断に関与するが、Ｄｉｃｅｒを使用してインビトロでｓｉＲＮＡを調製することは、問題があり得る。なぜなら、ＤｉｃｅｒによるｄｓＲＮＡ切断は、特に、短鎖ｄｓＲＮＡについては、非常に非効率的であるからである（３、１６）。対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩ（ＲＮアーゼＩＩＩ、ＥＣ３．１．２４）は、ｄｓＮＲＡを、ｓｉＲＮＡと同じ末端構造と、５’リン酸末端／３’ヒドロキシル末端と、２ヌクレオチド〜３ヌクレオチドの３’突出とを有する短い片へと非常に効率的に消化し得る（１７）。ｓｉＲＮＡのこれらの末端構造は、ＲＮＡｉ活性のために重要であることが、報告されている（１８）。さらに、大量の可溶性組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩタンパク質が、得られ得る（１７）。これらの属性によって、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩは、インビトロでｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡライブラリーを調製するための有望な酵素となる。
【０００９】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩによるｄｓＲＮＡの徹底的切断は、長さが平均１２〜１５ｂｐである二重鎖生成物をもたらす（１７）。これらの短鎖ｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉ応答を誘発することができない（６）。適切な長さのｓｉＲＮＡを得るために、ｄｓＲＮＡの限定的ＲＮアーゼＩＩＩ消化が実施され、２０〜２５ｂｐのｓｉＲＮＡを効率的に生成した。これらのｓｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞において、長鎖ｄｓＮＲＡによる強力かつ配列特異的な遺伝子サイレンシングを、再現した。より重要なことには、これらはまた、哺乳動物細胞において、非特異的影響を伴わずに、有効なＲＮＡｉを媒介した。この方法により生成されたｓｉＲＮＡは、種々の哺乳動物細胞株において、種々の内因性遺伝子を首尾良く阻害した。この方法は、比較的迅速かつ簡単であるので、この方法は、培養哺乳動物細胞における遺伝子機能の分析のためにｓｉＲＮＡを利用する際に有用である。
【００１０】
（定義）  
「標的遺伝子」とは、発現（内因性染色体遺伝子およびトランスジーンの両方、ならびにエピソーム性遺伝子または染色体外遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、葉緑体遺伝子、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、動物遺伝子、植物遺伝子、原生生物遺伝子、および真菌遺伝子の発現を含む）の調節のために適切な任意の遺伝子を指す。
【００１１】
「ｓｉＲＮＡ」とは、遺伝子または標的遺伝子の発現を、そのｓｉＲＮＡがその遺伝子または標的遺伝子と同じ細胞中で発現される場合に減少または阻害する能力を有する二本鎖ＲＮＡを、形成する核酸を指す。従って、「ｓｉＲＮＡ」は、その相補鎖によって形成される二本鎖ＲＮＡを指す。その二本鎖分子を形成するようにハイブリダイズするそのｓｉＲＮＡの相補的部分は、代表的には、実質的な同一性または完全な同一性を有する。１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子と実質的な同一性または完全な同一性を有して二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する、核酸を指す。そのｓｉＲＮＡの配列は、全長標的遺伝子またはその部分配列に対応し得る。代表的には、そのｓｉＲＮＡは、長さが少なくとも約１５〜５０ヌクレオチドであり（例えば、その二本鎖ｓｉＲＮＡの相補的配列各々は、長さが１５〜５０ヌクレオチドである）、その二本鎖ｓｉＲＮＡは、長さが、約１５〜５０塩基対、好ましくは約２０〜３０塩基ヌクレオチド、好ましくは、長さが約２０〜２５ヌクレオチド（例えば、長さが、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、または３０ヌクレオチド）である。
【００１２】
「逆方向反復」とは、センスエレメントとアンチンセスエレメントとを、その反復が転写された場合にそれらのエレメントが二本鎖ｓｉＲＮＡを形成可能であるような位置に含む、核酸配列を指す。この逆方向反復は、その反復の２つのエレメント間に、リンカーまたは異種配列（例えば、自己切断リボザイム）を必要に応じて含み得る。この逆方向反復のエレメントは、二本鎖ＲＮＡを形成するに充分な長さを有する。代表的には、この逆方向反復の各々のエレメントは、長さが約１５〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約２０〜３０塩基ヌクレオチド、好ましくは、長さが約２０〜２５ヌクレオチド（例えば、長さが、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、または３０ヌクレオチド）である。
【００１３】
「実質的な同一性」とは、ストリンジェントな条件下で参照配列にハイブリダイズする配列を指すか、または参照配列の特定の領域にわたって特定の同一性パーセントを有する配列を指す。
【００１４】
句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、代表的には核酸の複合混合物の状態で、その標的部分配列にハイブリダイズするが、他のいかなる配列ともハイブリダイズしない、条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境では異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ」（１９９３）において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度、ｐＨにおいて、特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低いように選択される。このＴｍは、（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核濃度のもとでの）温度であり、この温度において、標的に対して相補的なプローブのうちの５０％は、平衡状態にてその標的配列にハイブリダイズする（その標的配列が、過剰に存在する場合、Ｔｍにて、プローブのうちの５０％は、平衡状態を占める）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化因子の添加によって、達成され得る。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的なハイブリダイゼーションについて、ポジティブシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも１０倍である。
【００１５】
例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の通りであり得る：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％  ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または５×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、６５℃でインキュベート；そして６５℃における０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中での洗浄である。ＰＣＲについて、温度約３６℃が、低ストリンジェンシーの増幅のために代表的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに依存して、約３２℃と４８℃との間で変化し得る。高ストリンジェンシーのＰＣＲ増幅について、温度約６２℃が、代表的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に依存して、約５０℃〜約６５℃の範囲にあり得る。代表的には、高ストリンジェンシー増幅および低ストリンジェンシー増幅の両方についての代表的なサイクル条件としては、９０℃〜９５℃の変性段階を３０秒間〜２分間、３０秒間〜２分間続くアニーリング段階、および約７２℃の伸長段階を１〜２分間が、挙げられる。低ストリンジェンシー増幅反応および高ストリンジェンシー増幅反応についてのプロトコルおよび指針は、例えば、Ｉｎｎｉｓら（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．において提供される。
【００１６】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらの核酸がコードするポリペプチドが実質的に同一である場合は、依然として実質的に同一である。このようなことは、例えば、１コピーの核酸が、遺伝コードにより許容される最大のコドンの縮重を使用して生成される場合に、生じる。このような場合、それらの核酸は、代表的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、３７℃における４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳという緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および４５℃における１×ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。ポジティブなハイブリダイゼーションは、少なくともバックグラウンドの２倍である。当業者は、別のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件が、同様のストリンジェンシー条件を提供するために利用され得ることを、容易に認識する。ハイブリダイゼーションパラメーターを決定するためのさらなる指針は、多数の参考文献（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編））において提供される。
【００１７】
用語「実質的に同一」または「実質的な同一性」とは、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において、同じである２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列を指すか、あるいは比較ウィンドウまたは指定して領域にわたって最大の対応について比較および整列した場合に、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用してかまたは手動整列および視認によって測定した場合に、同じである特定の割合のアミノ酸残基またはヌクレオチド（すなわち、特定の領域にわたって、少なくとも約６０％同一性、好ましくは６５％同一性、７０％同一性、７５％同一性、好ましくは８０％同一性、８５％同一性、９０％同一性、または９５％同一性）を有する２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列を指す。この定義はまた、文脈が示す場合には、同様に、配列の相補体を指す。好ましくは、その実質的な同一性は、長さが少なくとも約６〜７アミノ酸または２５ヌクレオチドである領域にわたって、またはより好ましくは長さが５０〜１００アミノ酸または５０〜１００ヌクレオチドである領域にわたって、存在する。
【００１８】
配列比較について、代表的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として、役目を果す。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列が、コンピューター中に入力され、必要な場合、部分配列座標が指定され、そして配列アルゴリズムパラメーターが、指定される。デフォルトプログラムパラメーターが使用され得るか、または代替的なパラメーターが、指定され得る。その後、この配列比較アルゴリズムは、そのプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較してその試験配列を同定する。
【００１９】
「比較ウィンドウ」とは、本明細書中で使用される場合、配列が同じ数の連続位置の参照配列と最適に整列された後に比較され得る、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群より選択される連続位置数のうちのいずれか１つのセグメントに対する言及を包含する。比較のための配列の整列方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適整列は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動整列および視覚的検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５補遺）を参照のこと）によって、実行され得る。
【００２０】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９〜３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０は、本明細書中に記載されるパラメーターとともに使用されて、本発明の核酸およびタンパク質についての配列同一性パーセントを決定する。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて、公に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、照会配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定する。このｗｏｒｄは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に、いくらかの正の値の閾値スコアＴと一致するかまたはこのスコアを満たすかのいずれかである。Ｔは、近隣（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ）ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの開始近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシード（ｓｅｅｄ）として役立つ。このワードヒットは、累積整列スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方の方向で伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一対の一致する残基についての報酬（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基についての罰（ｐｅｎａｌｔｙ）スコア；常に＜０）を使用して、計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスが、この累積スコアを計算するために使用される。各方向でのワードヒットの伸長は、この累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ離れた場合；その累積スコアが、１つ以上の負のスコアの残基の整列の蓄積に起因して０以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達する場合に、停止する。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、その整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワードレングス（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワードレングス３および期待値（Ｅ）１０を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９））は、アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を、デフォルトとして使用する。
【００２１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を実施する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が、偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、その試験核酸を参照核酸に対して比較した際の最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、参照配列と類似すると見なされる。
【００２２】
句「標的遺伝子の発現を阻害する（こと）」とは、本発明のｓｉＲＮＡが、その標的遺伝子の遺伝子サイレンシングを開始する能力を指す。遺伝子サイレンシングの程度を試験するために、特定の構築物を発現する培養物中の目的の生物もしくは細胞のサンプルまたはアッセイが、その構築物の発現を欠くコントロールサンプルと比較される。コントロールサンプル（構築物発現を欠く）は、相対値１００％を割当てられる。標的遺伝子の発現の阻害は、そのコントロールに対する試験値が、約９０％、好ましくは５０％、より好ましくは２５〜０％である場合に、達成される。適切なアッセイとしては、例えば、当業者にとって公知である技術（例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、ならびに当業者にとって公知である表現型アッセイ）を使用する、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルの試験が挙げられる。
【００２３】
「標識」または「検出可能な部分」とは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段によって検出可能な、組成物である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＳＩＡにおいて一般に使用される酵素）、ジゴキシゲニン、ビオチン、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰ、またはハプテン、および（例えば、ペプチド中に放射性標識を組込むことによって）検出可能にされ得るかもしくはそのペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用され得るタンパク質が挙げられる。
【００２４】
「生物学的サンプル」としては、組織；培養細胞（例えば、初代培養物、外植片、および形質転換細胞）；細胞抽出物（例えば、培養細胞または組織、由来）、細胞質抽出物、核抽出物；血液などが挙げられる。生物学的サンプルとしては、生検サンプルおよび剖検サンプルのような組織切片、ならびに組織学的目的のために採取された凍結切片が挙げられる。生物学的サンプル（培養細胞を含む）は、代表的には、真核生物から、最も好ましくは哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、チンパンジーもしくはヒト）；ウシ；イヌ；ネコ；齧歯類（例えば、モルモット、ラット、マウス）；ウサギ；または鳥類；爬虫類；または魚類から、得られる。
【００２５】
「核酸」とは、一本鎖形態または二本鎖形態である、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそれらのポリマーを指す。この用語は、既知のヌクレオチドアナログまたは改変骨格残基もしくは改変結合を含む、核酸を包含し、これらの核酸は、合成物であるか、天然に存在するか、天然に存在せず、これらの核酸は、参照核酸と同様の結合特性を有し、そしてこれらの核酸は、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される。そのようなアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
他のように示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたその改変体（例えば、縮重コドン置換）、および相補配列、ならびに明示的に示される配列を、暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置を、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基が置換されている配列を生成することによって、達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８（１９９４））。この用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。
【００２７】
特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」と暗示的に包含する。同様に、核酸によりコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によってコードされる任意のタンパク質を暗示的に包含する。「スプライス改変体」とは、その名前が示唆する通り、遺伝子の選択的スプライシングの生成物である。転写の後、初期核酸転写物が、巣プライシングされ得、その結果、異なる（別の）核酸スプライス生成物が、異なるポリペプチドをコードする。スプライス改変体の生成のための機構は、変化するが、その機構としては、エキソンの選択的スプライシングが挙げられる。読み過ごし（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写により同じ核酸から誘導される別のポリペプチドもまた、この定義により包含される。スプライシング反応の任意の生成物（そのスプライス生成物の組換え形態を包含する）が、この定義中に包含される。
【００２８】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによりコードされるアミノ酸、および後に改変されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（すなわち、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。そのようなアナログは、改変Ｒ基を有する（例えば、ノルロイシン）または改変ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する、化合物を指す。
【００２９】
アミノ酸は、その一般的に公知の３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかによって、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドは、同様に、その一般的に受容されている１文字コードによって言及され得る。
【００３０】
「保存的に改変された改変体」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体は、同一のアミノ酸配列もしくは本質的に同一であるアミノ酸をコードする核酸を指すか、またはその核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列を指す。遺伝コードの縮重が原因で、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは、すべて、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるどの位置でも、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、対応するコドンのうちのいずれかへと変更され得る。そのような核酸改変体は、「スプライス改変体」であり、これは、保存的に改変された改変体の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のどの核酸配列もまた、その核酸のあらゆる可能なサイレント変化を記載する。核酸中の各コドン（ＡＵＧおよびＴＧＧ以外。ＡＵＧは、通常はメチオニンについての唯一のコドンである。ＴＧＧは、通常は、トリプトファンについての唯一のコドンである）は、機能的に同一の分子を生じるように改変され得ることを、当業者は認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変化が、発現生成物に関して各々記載される配列にて暗示されるが、実際のプローブ配列に関しては暗示されない。
【００３１】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列中の単一のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸を変更、付加、または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、もしくは付加は、その変更が、化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合に、「保存的に改変された改変体」であることを、当業者は認識する。
【００３２】
以下の８つのグループ各々は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）；グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプロファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【００３３】
用語「組換え」とは、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターに関して使用される場合、その細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくは異種タンパク質の導入またはネイティブ核酸もしくはネイティブタンパク質の変更によって改変されていること、あるいは、その細胞が、そのように改変された細胞に由来することを、示す。従って、例えば、組換え細胞は、その細胞のネイティブ形態（非組換え形態）において見出されない遺伝子を発現するか、または他の様式で異常に発現されるか、過小発現されるか、もしくは全く発現されない遺伝子を発現する。
【００３４】
用語「異種」とは、核酸の一部に関して使用される場合、その核酸が、天然で互いに対して同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを、示す。例えば、その核酸は、代表的には、組換え生成され、新規な機能的核酸を生成するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を有する（例えば、ある供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域）。同様に、異種タンパク質とは、そのタンパク質が、天然で互いに対して同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含む（例えば、融合タンパク質）を示す。
【００３５】
（ｅｓｉＲＮＡ合成）
本発明は、組換え遺伝学の分野における慣用的技術に基づく。本発明において使用される一般的方法を開示する基本的教科書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４））が挙げられる。
【００３６】
ＲＮＡ集団は、長鎖前駆体ＲＮＡを提供するために使用され得るか、あるいは、選択された標的配列と実質的な同一性または完全な同一性を有する長鎖前駆体ＲＮＡが、本発明のｅｓｉＲＮＡを生成するために使用され得る。このＲＮＡは、当業者にとって周知の方法に従って、細胞もしくは組織から単離され得、合成され得、そして／またはクローン化され得る。このＲＮＡは、混合集団（細胞もしくは組織から得られた、ｃＤＮＡから転写された、差引かれた、選択されたなどの混合集団）であり得るか、あるいは単一標的配列を示し得る。ＲＮＡは、天然に存在しても（例えば、組織サンプルもしくは細胞サンプルから単離される）、インビトロで合成されても（例えば、Ｔ７ポリメラーゼもしくはＳＰ６ポリメラーゼと、ＰＣＲ生成物もしくはクローン化ｃＤＮＡとを使用する）よい。選択された標的ＲＮＡおよびＲＮＡ集団の両方が、インビトロで合成され得る。
【００３７】
長鎖ｄｓＲＮＡを形成するために、合成ＲＮＡについて、その相補体もまた、インビトロで転写され、そしてｄｓＲＮＡを形成するようにハイブリダイズされる。天然に存在するＲＮＡ集団が使用される場合、そのＲＮＡ相補体もまた、例えば、そのＲＮＡ集団に対応するｃＤＮＡを転写することによってかまたはＲＮＡポリメラーゼを使用することによって、提供される（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩによる消化のためにｄｓＲＮＡを形成する）。その後、その前駆体ＲＮＡは、ハイブリダイズされて、ＲＮＡｓｅ  ＩＩ消化のための二本鎖ＲＮＡが形成される。その後、そのｄｓＲＮＡは、本明細書中に記載される方法に従って、インビトロでＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ（組換え体であるかまたは天然に存在するかのいずれかである）で消化される。
【００３８】
ＲＮＡを単離するための方法、ＲＮＡを合成するための方法、核酸をハイブリダイズするための方法、ｃＤＮＡライブラリーを生成およびスクリーニングするための方法、ならびにＰＣＲを実施するための方法は、当該分野で周知であり（例えば、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ  ２５：２６３〜２６９（１９８３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌら（前出））、ＰＣＲ方法もまた、同様に当該分野で周知である（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照のこと）。発現ライブラリーもまた、当業者にとって周知である。
【００３９】
（原核生物および真核生物の形質転換）
真核生物および原核生物の形質転換は、標準的な技術（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９〜３５１（１９７７）；Ｃｌａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：３４７〜３６２（Ｗｕら編、１９８３）を参照のこと）に従って、実施される。外来ヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入するための周知の手順のうちのいずれかが、使用され得る。これらとしては、裸の核酸の使用、ウイルス形質導入、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、リポソーム、マイクロインジェクション、プラスミドベクター、ウイルスベクター、およびクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ（天然に存在するかまたは合成物であるかのいずれか）または他の外来遺伝物質を宿主細胞中に導入するための他の周知の方法が、挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと）。使用される特定の遺伝子操作手順は、その宿主細胞中にｅｓｉＲＮＡを首尾良く導入可能であることだけが、必要である。
【００４０】
本明細書中に引用されるすべての刊行物および特許出願は、あたかも、個々の刊行物または特許出願の各々が、参考として援用されると具体的かつ個別に示されたかの如く、本明細書中で参考として援用さえる。
【００４１】
上記の発明は、理解を明確にする目的のために、例示および例としていくらか詳細に記載されているが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の趣旨からも範囲からの逸脱することなくなされ得ることが、本発明の教示を考慮すると当業者にとって容易に明らかである。
【実施例】
【００４２】
以下の実施例は、例示のためだけに提供され、限定のためには提供されない。当業者は、本質的に同様の結果を生じるように変化または改変され得る種々の重要でないパラメーターを、容易に認識する。
【００４３】
（Ｉ．結果および考察）
（Ａ．Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩを使用する長鎖ｄｓＲＮＡから短鎖ＲＮＡ二重鎖への処理）
１分子のｍＲＮＡ当たり複数の部位を阻害するために潜在的に標的とし得る不均質ｓｉＲＮＡ集団を調製するために、本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩを使用して、そのｍＲＮＡ標的を示す長鎖ｄｓＲＮＡを消化した。本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩをＥ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合タンパク質として過剰発現させ、そしてそのタンパク質を均質になるまで精製した（図１ａ）。ホタルルシフェラーゼ（Ｆ−ｌｕｃ）に対応する５９２ｂｐのｄｓＲＮＡ（ｄｓＦ−５９２）およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ｒ−ｌｕｃ）にの４５７ｂｐ  ｄｓＲＮＡ（ｄｓＲ−４５７）を生成するために、本発明者らは、各末端にファージプロモーターを付随させたＰＣＲ生成物からのインビトロ転写を実施した（図２ｅ）。本発明者らは、ＧＳＴ−ＲＮアーゼＩＩＩ融合物が、３７℃にてこれらのｄｓＲＮＡを切断する際に非常に活性であることを見出した。低いＲＮアーゼＩＩＩ濃度においてさえ、切断生成物は、１分間のインキュベーションの間に眼に見えた。長さが約１５〜３０ｂｐの分子が、より長いインキュベーションの間に蓄積され、主要生成物になった（図１ｂ）。同様の消化パターンがまた、２０個よりも多くの他の遺伝子を示すｄｓＲＮＡを用いて観察された（データは示さない）。最適化の後、本発明者らは、室温で１時間のｄｓＲＮＡの限定的ＲＮアーゼＩＩＩ消化が、ほとんどの遺伝子の阻害のために充分な量のｅｓｉＲＮＡを生じたことを見出した。高い配列複雑度を有するｄｓＲＮＡを短鎖種へと効率的に処理することは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩによる基質認識および切断における配列特異性の欠如（１９）と一致する。本発明者らは、ポリアクリルアミドゲル上でＲＮアーゼＩＩＩ消化生成物を分離し、そして約２１〜２３、２４〜２６、および２７〜３０ｂｐに対応するＲＮＡを精製した（図１ｃ）。簡潔さのために、本発明者らは、ＲＮアーゼＩＩＩ消化によって調製したｓｉＲＮＡを、ｅｓｉＲＮＡ（エンドリボヌクレアーゼによって調製されたｓｉＲＮＡ）と名付けた。
【００４４】
（Ｂ．ｅｓｉＲＮＡは、培養昆虫細胞および培養哺乳動物細胞において、レポーター遺伝子発現に対する有効なＲＮＡｉを媒介する）
ｅｓｉＲＮＡがＲＮＡｉ活性を有するか否かを試験するために、本発明者らは、Ｆ−ｌｕｃについての発現構築物およびＲ−ｌｕｃについての発現構築物とともに、短鎖ＲＮＡ二重鎖をＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞中に同時トランスフェクトした。以前に記載された（１６）ようにして、相対的Ｆ−ｌｕｃ活性（Ｆ−ｌｕｃ／Ｒ−ｌｕｃ）または相対的Ｒ−ｌｕｃ活性（Ｒ−ｌｕｃ／Ｆ−ｌｕｃ）を測定することによって、阻害を測定した。本発明者らは、ｄｓＲ−４５７から処理された２１〜２３ｂｐ  ｅｓｉＲＮＡが、Ｒ−ｌｕｃ活性の約９００倍の阻害を生じた（図２ａ）ことを観察した。同様のサイズのＦ−ｌｕｃのｅｓｉＲＮＡは、Ｆ−ｌｕｃ活性の５００倍の阻害を発揮した（図２ｂ）。２４〜２６ｂｐ  ｅｓｉＲＮＡおよび２７〜３０ｂｐ  ｅｓｉＲＮＡは、その同族ルシフェラーゼ活性についての同様に強力な阻害を示した（図２ａ、ｂ）。処理されていないｄｓＲＮＡ（ｄｓＲ−４５７およびｄｓＦ−５９２）は、ｅｓｉＲＮＡの２分の１〜１０分の１程度の弱さであった（図２ａ、ｂ）。長鎖ｄｓＲＮＡのＲＮＡｉ活性をそのｅｓｉＲＮＡを用いて再現することは、ｓｉＲＮＡが、そのＲＮＡｉ反応の媒介因子であることと一致する。
【００４５】
本発明者らは、ｅｓｉＲＮＡが、哺乳動物細胞において特異的遺伝子サイレンシング因子であるか否かを、さらに試験した。本発明者らは、Ｒ−ｌｕｃの２１〜２３ｂｐ  ｅｓｉＲＮＡが、Ｈｅｌａ細胞およびＣ３３Ａ細胞の両方において、相対的Ｒ−ｌｕｃ発現の８５〜９０％の阻害を引き起こしたことを観察した（図２ｃ）。同様のサイズのＦ−ｌｕｃのｅｓｉＲＮＡは、相対的Ｆ−ｌｕｃ発現の９０〜９５％を阻害した（図２ｄ）。この相互効果は、この短鎖ＲＮＡ二重鎖が、非相補的テンプレートからの発現をもたらさずに、配列特異的様式で作用したことを示す。同様に、２４〜２６ｂｐ  ｅｓｉＲＮＡおよび２７〜３０ｂｐ  ｅｓｉＲＮＡは、配列特異的阻害を発揮した。これは、２１〜２７ヌクレオチドの範囲の合成ＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡすべてが、ＲＮＡｉ活性を有するという、公開された報告と一致する（図２ｃ、ｄ、および参考文献１１）。同様の結果が、カラム精製ｅｓｉＲＮＡを用いて得られた（図２ｆ）。本発明者らは、ｓｉＲＮＡおよびｅｓｉＲＮＡの阻害能力を比較した。本発明者らは、化学合成またはインビトロ転写のいずれかにより生成されたＦ−ｌｕｃの種々のｓｉＲＮＡが、劇的に変化したサイレンシング能力を有し、そしてｅｓｉＲＮＡよりも弱い阻害剤であることを、見出した（図２ｄ、ｆ）。これはまた、短鎖ＲＮＡヘアピンについても真であった。Ｆ−ｌｕｃについて１４個のｓｉＲＮＡおよび短鎖ヘアピンＲＮＡのうち、３つだけが、妥当なＲＮＡｉ活性を示した（図２ｆ）。この合成ｓｉＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡは、ただ１つの配列エレメントを認識し、一方、ｅｓｉＲＮＡは、その標的ｍＲＮＡの包括的配列エレメントを覆った。従って、ｅｓｉＲＮＡは、同様に、少なくとも１つのｓｉＲＮＡが、その標的と対合してその標的の破壊をもたらし得る機会を増加する。
【００４６】
ｅｓｉＲＮＡによる同様の強力かつ特異的な阻害が、ＩＭＲ−９０細胞、ＣＨＯ細胞、ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞、ＭＥＦ細胞、および２９３細胞において観察された。これは、このアプローチが、哺乳動物細胞株について一般的に適用可能であることを示唆する。予期された通り、長鎖ｄｓＲＮＡ（ｄｓＦ−５９２またはｄｓＲ−４５７のいずれか）は、Ｆ−ｌｕｃ発現およびＲ−ｌｕｃ発現の両方の配列依存的阻害を引き起こした。このことは、インターフェロンシグナル伝達経路の活性化を示唆する（図３ｅ、ｆ）。対照的には、ｅｓｉＲＮＡは、これらの哺乳動物細胞株において、コントロールルシフェラーゼ発現の有意な非特異的阻害を引き起こさなかった。
【００４７】
（Ｃ．哺乳動物細胞におけるｅｓｉＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉの特徴：用量依存性）
同時トランスフェクションアッセイは、最小有効ｅｓｉＲＮＡ濃度の正確な計算を可能にしない。ｅｓｉＲＮＡ誘導性阻害の用量依存性を研究するために、本発明者らは、Ｆ−ｌｕｃ  ｅｓｉＲＮＡを使用して、Ｆ−ｌｕｃ発現構築物で安定にトランスフェクトされたｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞において、遺伝子発現を阻害した。本発明者らは、そのトランスフェクション緩衝液が少なくとも３ｎＭのｅｓｉＲＮＡを含む場合に、飽和した阻害を観察した（図３ａ）。阻害は、飽和ｅｓｉＲＮＡ用量未満で、減少した。この阻害は、そのｅｓｉＲＮＡ用量が０．５ｎＭ未満であった場合に、検出不能であった（図３ａ）。化学合成ｓｉＲＮＡ  ＣＳ１のアンチセンス鎖は、その二本鎖形態について使用された有効濃度よりも１０倍〜２０倍高い濃度においてさえ、Ｆ−ｌｕｃ活性を阻害不能であった。このことは、ｓｉＲＮＡが、アンチセンスＲＮＡよりも強いインヒビターである（図２ｆ、３ａ）ことを示唆する。
【００４８】
（Ｄ．阻害の迅速な開始および長期持続期間）
このＲＮＡｉ反応をさらに特徴付けるために、本発明者らは、上記におけるクロマチンテンプレートのＦ−ｌｕｃ  ｅｓｉＲＮＡ媒介性阻害の持続期間を決定した。
【００４９】
（ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞）本発明者らは、トランスフェクション後８時間目に、Ｆ−ｌｕｃ活性の５０〜６５％阻害を観察した。これは、サイレンシングが、迅速に確立されたことを示唆する。サイレンシングは、トランスフェクションの５〜６日後に最大に達し、その後、減少した（図３ｂ）。プラスミドＤＮＡを使用して、Ｈｅｌａ細胞における阻害のための標的を発現させた場合、本発明者らは、この阻害は、高いｅｓｉＲＮＡ用量が使用された場合に２週間継続し得ることを、観察した。低用量のｅｓｉＲＮＡは、数時間にわたって維持された、より弱い阻害を引き起こした（図３ｂ）。従って、ｅｓｉＲＮＡ媒介性阻害の有効寿命は、エピソームテンプレートまたはクロマチンテンプレートのいずれかを用いて、ｅｓｉＲＮＡ用量に少なくとも部分的に依存した。ｅｓｉＲＮＡ媒介性阻害の迅速さおよび有効寿命は、ｅｓｉＲＮＡは、タンパク質生成物が比較的安定である遺伝子を不活化するために使用され得ることを示唆する。
【００５０】
（Ｅ．ｅｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ減衰を惹起する）
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｃｅおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＲＮＡｉの重要な特徴は、ＲＮＡｉは、標的とされたｍＲＮＡの破壊を惹起することによってその効果を発揮することである（１）。ｓｉＲＮＡがまた、哺乳動物系において転写後に作用するか否かを試験するために、本発明者らは、ｅｓｉＲＮＡが、その同族ｍＲＮＡからの発現を直接阻害し得るか否かを尋ねた。本発明者らは、Ｈｅｌａ細胞中に、ｅｓｉＲＮＡおよびＦ−ｌｕｃ  ｍＲＮＡを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後に、Ｆ−ｌｕｃ  ｍＲＮＡを受容したコントロール細胞は、２００００〜５００００単位のルシフェラーゼ活性を生じた。しかし、Ｆ−ｌｕｃについての同時トランスフェクトしたｅｓｉＲＮＡは、Ｆ−ｌｕｃ活性の１５倍阻害を生じたが、Ｒ−ｌｕｃは生じなかった。このことは、ｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングが、哺乳動物細胞においてｍＲＮＡに対して指向される（図３ｃ）ことを、示唆する。このことと一致して、本発明者らは、プロモーター領域に対応するｅｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ活性を全く有さなかったことを見出した（図３ｄ）。ｅｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡの破壊を惹起するか否かを試験するために、本発明者らは、Ｈｅｌａ細胞を使用して、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚抽出物におけるＲＮＡｉ応答を特徴付けるために使用したのと同じインビトロＲＮＡｉアッセイを実施した（２０）。本発明者らは、Ｆ−ｌｕｃまたはＲ−ｌｕｃのいずれかについてのｅｓｉＲＮＡが、その同族ｍＲＮＡの分解を４倍〜８倍加速したことを見出した（図４）。これは、ｓｉＲＮＡの効果に関する以前の報告と一致する（参考文献１０、１４）。
【００５１】
（Ｆ．長鎖ｄｓＲＮＡによる非特異的遺伝子サイレンシングおよびｓｉＲＮＡによる配列特異的干渉は、独立した経路である）
ＲＮＡｉに対するインターフェロンシグナル伝達経路の効果を試験するために、本発明者らは、Ｈｅｌａ細胞における長鎖ｄｓＲＮＡによって活性化される非特異的インターフェロン応答の存在下で、ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性を検出し得るか否かを、まず尋ねた。本発明者らは、ｄｓＦ−５９２が、Ｆ−ｌｕｃおよびＲ−ｌｕｃ発現の両方の１０〜２０倍阻害が引き起こされたことを見出した。このことは、非特異的インターフェロン応答の活性化を示唆する（図３ｅ、ｆ）。Ｆ−ｌｕｃ  ｅｓｉＲＮＡは、以前に観察された通り、Ｆ−ｌｕｃ発現を選択的に阻害した。ｅｓｉＲＮＡおよびｄｓＦ−５９２が同時トランスフェクトされた場合、本発明者らは、Ｆ−ｌｕｃ発現の付加的阻害を観察した（図３ｅ）。しかし、ｅｓｉＲＮＡは、同時トランスフェクトするｄｓＦ−５９２を伴ってかまたは伴わずに、相対的Ｆ−ｌｕｃ活性を等しく阻害した。このことは、非特異的インターフェロン応答の活性化は、特異的ＲＮＡｉ阻害の強度に対して、何の効果も有さないことを示唆する（図３ｆ）。
【００５２】
その後、本発明者らは、インターフェロン応答の不活化が、長鎖ｄｓＲＮＡの特異的遺伝子サイレンシングを活性化するに充分であるか否かを試験した。本発明者らは、ＰＫＲを欠くかまたはＰＫＲおよびＲＮアーゼＬの両方を欠くかのいずれかであるマウス胚線維芽細胞が、ｄｓＦ−５９２により誘発される非特異的遺伝子サイレンシングおよび特異的遺伝子サイレンシングの両方において欠損したが、ｓｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡｉが、検出され得る（データは示さない）ことを、見出した。本発明者らは、ｓｉＲＮＡにより媒介される配列特異的ＲＮＡ干渉が、ｄｓＲＮＡ誘発性非特異的遺伝子サイレンシングとは独立していると結論付けた。
【００５３】
（Ｇ．ｅｓｉＲＮＡは、内因性遺伝子発現を選択的にサイレンシングする）
内因性遺伝子の発現が、サイレンシングされ得るか否かを試験するために、本発明者らは、広範な種類の遺伝子（豊富な長命転写物／タンパク質または希な短命転写物／タンパク質のいずれかを有する遺伝子を包含する）を標的とした。本発明者らはまず、Ｈｅｌａ細胞において、クラスリン軽鎖ａ（ＬＣａ）の発現をサイレンシングすることを試みた。本発明者らは、ｅｓｉＲＮＡトランスフェクションの５日後に、ＬＣａタンパク質のレベルを試験して、そのタンパク質（その半減期は、２４時間である（２１））の代謝回転を可能にした。ウェスタンブロット分析によって、ＬＣａ鎖が、９０％まで減少したことが明らかになった（図５ａ）。クラスリン軽鎖ｂ（ＬＣｂ）は、影響を受けなかったが、ＬＣｂは、ＬＣａとＤＮＡ配列で６６％相同性を有し、同じ抗体によって認識された。ＬＣａとＬＣｂとの間の交差サイレンシングは、予測されなかった。なぜなら、これらの２つの遺伝子は、長さが２１ｎｔよりも長いいかなる中断していないＤＮＡ配列も共有していないからである。ＬＣａは、クラスリンの他のサブユニットとは独立して代謝回転する。従って、ＬＣａ発現の阻害は、クラスリン重鎖の発現に影響を与えなかった（図５ａ）。本発明者らは、ｅｓｉＲＮＡ処理した細胞が、劇的に減少したＬＣａタンパク質にも関わらず、正常に増殖したことを見出した。これは、おそらく、ＬＣａとＬＣｂとの間の機能的重複に起因する。例えば、ＰＣ１２細胞におけるＬＣａの完全な喪失は、クラスリン媒介性エンドサイトーシスおよび分泌に対してほとんど影響を有さないことが、報告されている（２１）。
【００５４】
本発明者らは、次に、ｅｓｉＲＮＡを使用して、ｍＲＮＡ生成物およびタンパク質生成物の量が少なくて比較的不安定である遺伝子を阻害し得たか否かを尋ねた。例として、本発明者らは、２９３細胞中にｃ−ｍｙｃ  ｅｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。本発明者らは、ｃ−ｍｙｃタンパク質のレベルが、約７０％減少したことを観察した（図５ｂ）。阻害は、配列特異的であった。なぜなら、アクチン発現は、影響を受けず、無関係のＲ−ｌｕｃ  ｅｓｉＲＮＡは、ｃ−ｍｙｃ発現を減少させなかったからである。さらに、本発明者らは、サイクリン依存性キナーゼであるＣｄｋ１およびＣｄｋ２が、その対応するｅｓｉＲＮＡによる処理に応じて特異的に減少したことを観察した（図５ｃ）。このＲＮアーゼＩＩＩ／ｅｓｉＲＮＡプロトコルをまた使用して、シャペロン（ｐ２３）の発現が特異的に減少した。今日まで、本発明者らは、ｅｓｉＲＮＡを首尾良く使用して、細胞培養物中で７つの多様な遺伝子の発現を阻害した。これらの例は、ｅｓｉＲＮＡを、哺乳動物細胞における遺伝子生成物の選択的除去のための価値あるツールとして確立した。
【００５５】
本発明者らの結果は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩを用いる加水分解によって生成される短鎖ＲＮＡが、培養哺乳動物細胞において、合成ｓｉＲＮＡを用いて観察されたのと同様の様式で、遺伝子発現を特異的にサイレンシングし得ることを示す。本明細書中に提示されるｅｓｉＲＮＡプロトコルに対するいくつかの利点が存在する。ｅｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ内の複数の部位を潜在的に標的とし得るので、個々の遺伝子について効率的なｓｉＲＮＡをスクリーニング要件は、除去される。複数の部位の標的化はまた、ウイルス複製を減少するための努力において重要である。なぜなら、これは、塩基対ミスマッチによって生成されるｓｉＲＮＡ抵抗性株の出現を制限し得るからである。このプロトコルは、技術的に簡単かつ迅速であり、これは、異なる哺乳動物細胞株において広範囲のタンパク質に対して有効である。ｄｓＲＮＡを用いる大規模機能的ゲノム研究は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてすでに成功しているが、同等の分析は、脊椎動物においてはなお欠如している（２２〜２３）。その属性が原因で、ｅｓｉＲＮＡを用いるＲＮＡｉは、培養哺乳動物細胞におけるゲノム規模での遺伝子機能の分析について容易に適合され得る。ｅｓｉＲＮＡを用いる逆ゲノム学的アプローチは、生存にとって必須である遺伝子を同定するために特に有用であり得る。なぜなら、それらの遺伝子についての安定な変異体を生成することは困難であるからである。癌細胞は、その正常細胞対応物とは、遺伝的に異なり、しばしば、少なくとも６つの変異を受けている（２４）。ｅｓｉＲＮＡを使用して、ダウンレギュレーションすると原発性欠損を有する腫瘍細胞が特異的に死滅させる遺伝子を検索し得る。これは、適切な新規な薬物標的を同定すると同時確認する、体系的な致死的アプローチである。
【００５６】
（ＩＩ．材料および方法）
（Ａ．タンパク質の発現および精製）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩコード配列を、細菌株ＤＨ５αゲノムＤＮＡから、上流プライマーｃｇｃ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ａａｃ  ｃｃｃ  ａｔｃ  ｇｔａ  ａｔｔ  ａａｔ  ｃｇｇ  ｃｔｔ  ｃａと下流プライマーｇａｃ  ｇｔｃ  ｃｇａ  ｃｇａ  ｔｇｇ  ｃａａ  ｔとを用いるＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＢａｍ  ＨＩおよびＳｍａ  Ｉ中にクローン化した。ＧＣＴ−ＲＮアーゼＩＩＩタンパク質を生成するために、この発現ベクターを保有する細菌株（ＢＬ２１）（ＤＥ３）を、３７℃にてＯＤ６００が０．５になるまで増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを２時間用いて誘導した。ＧＳＴ−ＲＮアーゼＩＩＩを、グルタチオン−アガロースビーズを製造業者の指示（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に従って用いて精製し、２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、３０％グリセロール、ｐＨ７．９に対して一晩透析して、−２０℃にて維持した。約１ｍｇのＲＮアーゼＩＩＩを、１リットルの培養物から精製した。貯蔵６ヶ月後に、酵素活性の有意な損失は存在しなかった。
【００５７】
（Ｂ．一本鎖ＲＮＡ合成およびｄｓＲＮＡの調製）
ｓｉＲＮＡ  ＣＳ１およびＣＳ２を、化学合成した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）。ｓｉＲＮＡ（Ｔ１〜Ｔ６）および短鎖ＲＮＡヘアピン（Ｈ１〜Ｈ６）を、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔＴＭキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、一端にファージＴ７プロモーターを保有するオリゴＤＮＡテンプレートから合成した。すべてのｓｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長であり、かつ２ヌクレオチドの３’突出を有した。すべての短鎖ヘアピンＲＮＡは、２４ｂｐのステムを、ＵＣＵループと、効率的なインビトロ転写のための５’末端にある余分なＧＧＧＡとともに有した。他のＲＮＡ鎖を、両端にファージＴ７プロモーターを保有するＰＣＲ誘導性線状テンプレートから、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴＭキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して個別に合成した。ｄｓＲＮＡを、以前に記載された（１６）通りにアニーリングすることによって、形成させた。
【００５８】
ｄｓＲ−４５７  ＲＮＡの末端は、ｐＲＬ−ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の１２００〜１６５６に対応する。Ｆ−ｌｕｃ  ＲＮＡは、ｐＥＧＦＰＬｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中の以下の位置に対応する：ｄｓＦ−５９２、１４５５〜２０４６；ＣＳ１、１５２０〜１５３８；ＣＳ２、１９００〜１９１８；Ｔ１、６０３〜６２１；Ｔ２、６２４〜６４２；Ｔ３、２４４８〜２４６６；Ｔ４、２９９４〜３０１２；Ｔ５、３０１３〜３０３１；Ｔ６、３０４９〜３０６７；Ｈ１、９８９〜１０１２；Ｈ２、１５２０〜１５４３；Ｈ３、２５２９〜２５５２；Ｈ４、２６０１〜２６２４；Ｈ５、２９０６〜２９２９；Ｈ６、２９４７〜２９７０．ＬＣａ  ｄｓＲＮＡおよびＣｄｋ１  ｄｓＲＮＡについてのテンプレートは、それらの遺伝子の完全コード配列を示した。６８１ｂｐ  ｃ−ｍｙｃ  ｄｓＲＮＡについてのテンプレートを、順方向プライマーｇａｃｔｃａａｃｇｔｔａｇｃｔｔｃａｃｃａａｃａおよび逆方向プライマーｇｇａｃｔｃｃｇｔｃｇａｇｇａｇａｇｃａｇａを用いて増幅した。これらのプライマーはすべて、１８塩基のファージプロモーターを付属していた。
【００５９】
（Ｃ．短鎖ＲＮＡ二重鎖の生成および精製）
Ｆ−ｌｕｃについてのｅｓｉＲＮＡおよびＲ−ｌｕｃについてのｅｓｉＲＮＡを調製するために、１００μｇのｄｓＲＮＡを、２００μｌの反応緩衝液（５％グリセロール以外は、透析緩衝液と同じ）中の１μｇ組換えＲＮアーゼＩＩＩによって、３７℃にて１５分間消化した。ＥＤＴＡを２０ｍＭまで添加することによって反応を停止し、その生成物を、１２％ポリアクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ）上で分離した。１０ｂｐ  ＤＮＡマーカーを使用して、ＲＮＡ二重鎖の移動を評価した。適切なサイズの短鎖ＲＮＡを、３７℃にて１Ｍ  （ＮＨ４）２ＡＣ中に一晩浸漬することによってゲルスライスから溶出し、エタノール沈殿によって回収した。その沈殿物を、ＴＥ緩衝液中に１．０μｇ／μｌにて溶解した。他の遺伝子について、１００μｇのｄｓＲＮＡを、０．２μｇのＲＮアーゼＩＩＩを用いて２１℃にて１時間消化した。反応物を、５容量のＰＮ緩衝液（ＱＩＡｑｕｉｃｋヌクレオチド除去キット、Ｑｉａｇｅｎ）を補充した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム上に充填した。フロースルーは、通常は、１５〜２５塩基対のＲＮＡを含んだ。このＲＮＡを、エタノールによって沈殿させ、ＴＥ緩衝液中に溶解した。ｅｓｉＲＮＡ濃度を、ＵＶ２６０によって決定した。
【００６０】
（Ｄ．細胞培養物、核酸トランスフェクション、およびルシフェラーゼアッセイ）
Ｃ３３Ａヒト子宮頸部癌細胞株、ＨｅＬａヒト子宮頸部類上皮細胞癌細胞株、および２９３形質転換ヒト胚腎細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得、ＤＭＥＭ中で増殖させた。ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素サブユニット（ｈＴＥＲＴ）を安定に発現するヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である。ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞を、Ｆ−ｌｕｃ発現構築物を用いて持続性トランスフェクトして、クロマチンテンプレートからホタルルシフェラーゼを発現させ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において増殖させた。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞を、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ培地において増殖させた。すべての培地は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得、１０％  ＦＢＳ（容積／容積）を補充した。哺乳動物細胞を、３７℃にて培養し、Ｓ２細胞は、室温にて培養した。
【００６１】
プラスミドテンプレートからのｌｕｃ発現をサイレンシングするために、プラスミドＤＮＡおよびｓｉＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して同時トランスフェクトした。細胞を、２４ウェルプレート中で５０〜７０％コンフルエンスにて２．５時間トランスフェクトし、その後、新鮮な培地に交換した。他のように示されない限り、トランスフェクションは、１ウェル当たり、０．５ｍｌのトランスフェクション培地（０．５μｇ  ｐＥＧＦＰＬｕｃ、０．１μｇ  ｐＲＬ−ＳＶ４０、および０．４μｇ  ｐＵＣ１９および４７ｎＭ  ｅｓｉＲＮＡ）中１μｇのＤＮＡを使用した。データは、相対的Ｌｕｃ活性（Ｆ−ｌｕｃ／Ｒ−ｌｕｃまたはＲ−ｌｕｃ／Ｆ−ｌｕｃ）の平均比として表し、ＤＮＡのみを用いてトランスフェクトした細胞中のデータに対して正規化した。エラーバーは、±１標準偏差に等しい。ＲＰＥ細胞におけるクロマチンテンプレートからのＦ−ｌｕｃ発現をサイレンシングするために、０．２μｇのｅｓｉＲＮＡを、６ウェルプレートの各ウェル中に、リポフェクトアミン２０００を３時間使用してトランスフェクトし、その後、新鮮な培地に交換した。ルシフェラーゼ活性を、以前に記載された（１６）通りに測定した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）によって測定した。内因性遺伝子発現をサイレンシングするために、細胞を、リポフェクトアミン２０００を使用して、１μｇ  ｅｓｉＲＮＡで同時トランスフェクトした。
【００６２】
（Ｅ．インビトロＲＮＡｉアッセイ）
細胞抽出物の調製およびインビトロＲＮＡｉを、以前の記載（２０）に従って実行した。Ｈｅｌａ細胞（２×１０７）を、ＰＢＳ中で洗浄し、低等張緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．０）、０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および６ｍＭメルカプトエタノール）中に再懸濁し、そして溶解した。細胞溶解物を、２０，０００ｇにて３０分間遠心分離した。本発明者らは、−８０℃にて上清を保存した。以前に記載された（１６）通り、ｍＲＮＡを、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔＴＭキット（Ａｍｂｉｃｏｎ）を使用して生成し、そして３２Ｐ標識ＵＴＰを用いて転写反応の間に均一に標識した。インビトロＲＮＡｉのために、１０μｌの抽出物を、指示される時間の間、３７℃にて、２０μｌの反応（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．０）、１ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、１００ｍＭ  Ｋ２（ＯＡＣ）、５ｍＭ  ＤＴＴ、５００μＭ  ＮＴＰおよび２単位のＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む）中の１００ｎＭ  ｅｓｉＲＮＡとともにインキュベートした。
【００６３】
（Ｆ．ウェスタンブロッティング）
クラスリン軽鎖およびクラスリン重鎖の分析のために、細胞抽出物を、以前に記載された（２１、２５）通りに調製した。ｃ−ｍｙｃ、Ｃｄｋ１およびＣｄｋ２について、６ウェルプレート中で増殖させたトランスフェクト細胞を、１％  ＮＰ−４０を含むＰＢＳ緩衝液中に採集し、等容量のＳＤＳサンプル緩衝液と混合した。等量の総タンパク質を、１２．５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、そしてニトロセルロースに移した。標準的免疫染色を、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して実行した。ＬＣａおよびＬＣｂの両方を認識するウサギ血清、ならびにクラスリン重鎖に対するモノクローナルＴＤ．１は、以前に記載された（２１、２５）。抗ｃ−Ｍｙｃ抗体Ｎ２６２、ならびにサイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）Ａに対する抗体およびＣｄｋ２に対する抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得、抗アクチン抗体は、Ｓｉｇｍａから得る。
【００６４】
（参考文献）
【００６５】
【表１−１】
2005536195.tif 000002
【００６６】
【表１−２】
2005536195.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩを用いる加水分解による、ｄｓＲＮＡからのｓｉＲＮＡの調製を示す。（ａ）ＧＳＴ−ＲＮアーゼＩＩＩ融合物の過剰発現および精製。レーン１および２．ＩＰＴＧ誘導の前後のＥ．ｃｏｌｉ抽出物；レーン３．精製ＧＳＴ−ＲＮアーゼＩＩＩ融合物；レーンＭ．タンパク質分子量マーカー。（ｂ）ｄｓＲＮＡのＲＮアーゼＩＩＩ消化のタイムコース。ｄｓＲ−４５７  ＲＮＡまたはｄｓＦ−５９２  ＲＮＡは、指示された時間の間、ＲＮアーゼＩＩＩとともにインキュベートされ、その後、４％アガロースゲルにおいて電気泳動によって分離された。レーン１、４、および７は、ｄｓＲ−４５７である；レーン２、５および８は、ｄｓＦ−５９２である；レーン３、６、および９は、矢印により示された２１ｂｐのｓｉＲＮＡである。（ｃ）ｄｓＦ−５９２から処理された精製短鎖ＲＮＡ種のアガロースゲル分析。レーンＭ、１０ｂｐ  ＤＮＡマーカー；レーン１および２は、化学合成ｓｉＲＮＡである。レーン３、２１〜２３ｂｐ；レーン４、２４〜２６ｂｐ；レーン５、２７〜３０ｂｐ。
【図２】図２Ａ〜Ｆは、昆虫細胞および哺乳動物細胞における、ｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングを示す。Ｒ−ｌｕｃ（ａ、ｃ）またはＦ−ｌｕｃ（ｂ、ｄ）の発現に対するｅｓｉＲＮＡの効果が、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞（ａ，ｂ）および哺乳動物細胞株であるＨｅｌａおよびＣ３３Ａ（ｃ、ｄ）において決定された。種々のサイズのｄｓＲＮＡを含むプラスミドＤＮＡまたはそのｄｓＲＮＡを含まないプラスミドＤＮＡが、細胞中に同時トランスフェクトされた。（ｅ）レポータープラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡおよび短鎖ヘアピンＲＮＡ。ホタルルシフェラーゼ（Ｆ−ｌｕｃ）遺伝子およびＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ（Ｒ−ｌｕｃ）遺伝子について、この図は、インビボでｍＲＮＡを生成するため、およびインビトロでｄｓＲＮＡを生成するために使用された、ＤＮＡ構築物を示す。ｄｓＲＮＡ、化学合成ｓｉＲＮＡ（ＣＳ１およびＣＳ２）、インビトロで転写されたｓｉＲＮＡ（Ｔ１〜Ｔ６）および短鎖ヘアピンＲＮＡ（Ｈ１〜Ｈ６）の位置が、示される。（ｆ）遺伝子中の異なる配列に対する、合成ｓｉＲＮＡまたは短鎖ヘアピンＲＮＡの種々の効果。示される種々の短鎖ＲＮＡ種を含むプラスミドＤＮＡまたはこの短鎖ＲＮＡ種を含まないプラスミドＤＮＡが、Ｈｅｌａ細胞中に同時トランスフェクトされた。Ｒは、３０ｂｐよりも短いＦ−ｌｕｃ  ｅｓｉＲＮＡである。
【図３】図３Ａ〜３Ｆは、ＲＮＡｉの特徴を示す。（ａ）Ｆ−ｌｕｃに対するアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）およびｅｓｉＲＮＡについての用量応答。示される量のＦ−ｌｕｃ  ｅｓｉＲＮＡ（２１〜２３ｂｐ）またはＣＳ１のアンチセンス鎖が、ＲＰＥ細胞中にトランスフェクトされて、クロマチンテンプレートからのＦ−ｌｕｃ発現を標的とした。そしてルシフェラーゼ活性が、トランスフェクションの２４時間後に測定された。データは、３〜６つの実験の平均を示した。データは、Ｒ−ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたコントロール細胞において観察されたルシフェラーゼ単位／μｇタンパク質に対して正規化した後の、相対的ルシフェラーゼ活性として表現された。（ｂ）ｅｓｉＲＮＡ媒介性阻害の持続期間。；Ｆ−ｌｕｃ  ｅｓｉＲＮＡ（２１〜２３ｂｐ）が、ＲＰＥ細胞中にトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ活性が、示される時間にて測定された。Ｈｅｌａ細胞が使用された場合、Ｆ−ｌｕｃ標的が、同時トランスフェクトされたプラスミドＤＮＡから発現された。（ｃ）ｅｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡテンプレートからの遺伝子発現をサイレンシングする。Ｈｅｌａ細胞は、Ｆ−ｌｕｃまたはＲ−ｌｕｃのいずれかについて０．１μｇのｅｓｉＲＮＡ（２１〜２３ｂｐ）を伴うかまたは伴わずに、０．５μｇのＦ−ｌｕｃ  ｍＲＮＡを用いて３時間トランスフェクトされ、その後、ルシフェラーゼアッセイのために収集された。データは、任意（ａｒｂｉｔｒａｒｙ）ルシフェラーゼ単位として表現され、ｍＲＮＡのみを用いてトランスフェクトされた細胞において生成されたデータに対して正規化された。（ｄ）プロモーター領域に対応するｅｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ活性を全く有さない。Ｈｅｌａ細胞が、ＣＭＶプロモーターまたはＲ−ｌｕｃのいずれかに対応する２１〜２３ｂｐのｅｓｉＲＮＡを伴ってかまたは伴わずに、ｐＧＬ−３−ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびｐＲＬ−ＣＭＶを用いてトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ活性が、同時トランスフェクションの２４〜９６時間後に測定された。（ｅ，ｆ）ＲＮＡｉとインターフェロンシグナル伝達経路との間の関係。ｄｓＦ−５９２  ｅｓｉＲＮＡおよび  Ｆ−ｌｕｃ  ｅｓｉＲＮＡ（２１〜２３ｂｐ）が、個別にかまたは一緒にＨｅｌａ細胞中にトランスフェクトされて、プラスミドテンプレートからのＦ−ｌｕｃ発現がサイレンシングされた。ルシフェラーゼ活性が、同時トランスフェクションの２４〜４８時間後に測定された。データは、Ｆ−ｌｕｃ単位（ｅ）または相対Ｆ−ｌｕｃ活性のいずれかとして表され、その後、ＤＮＡのみのトランスフェクションのデータに対して正規化された。
【図４】図４は、ＥｓｉＲＮＡが、その同族ＲＮＡの分解を誘導することを示す。３２Ｐ標識Ｆ−ｌｕｃ  ｍＲＮＡまたは３２Ｐ標識Ｒ−ｌｕｃ  ｍＲＮＡが、その同族ｅｓｉＲＮＡとともにかまたは同族ｅｓｉＲＮＡを伴わずに、Ｈｅｌａ細胞抽出物中で示された時間インキュベートされ、その後、４％配列ゲル中で分析された。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ｅｓｉＲＮＡを用いる内因性哺乳動物遺伝子のサイレンシングを示す。（ａ）クラスリンＬＣａの発現の特異的阻害。ウェスタンブロッティングが、モック（ｍｏｃｋ）でトランスフェクトされたかまたはＬＣａ  ｅｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞を分析するために、使用された。３つの抗体（ＬＣａおよびＬＣｂの両方を認識するウサギ血清、アクチンに対するモノクローナル抗体、およびクラスリン重鎖（ＣＨＣ）に対するモノクローナルＴＤ．１）が、使用された。（ｂ）ｃ−Ｍｙｃ発現の選択的減少。２９３細胞が、緩衝液、ｃ−ｍｙｃ  ｅｓｉＲＮＡ、またはＲ−ｌｕｃ  ｅｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされた。ウェスタンブロッティングが、ｃ−ｍｙｃに対する抗体およびアクチンに対する抗体を用いて、トランスフェクションの７２時間後に実施された。（ｃ）ｅｓｉＲＮＡによるＣｄｋ２発現の用量依存性阻害。２９３細胞が、示される用量のＣｄｋ２  ｅｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされた。ウェスタンブロッティングが、トランスフェクションの５日間後に、Ｃｄｋ２に対する抗体およびサイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）Ａに対する抗体を用いて実施された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月27日(2004.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
（ＩＩ．材料および方法）
（Ａ．タンパク質の発現および精製）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩコード配列を、細菌株ＤＨ５αゲノムＤＮＡから、上流プライマーｃｇｃ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ａａｃ  ｃｃｃ  ａｔｃ   ｇｔａ  ａｔｔ  ａａｔ  ｃｇｇ  ｃｔｔ  ｃａ（配列番号１）と下流プライマーｇａｃ  ｇｔｃ  ｃｇａ  ｃｇａ  ｔｇｇ  ｃａａ  ｔ（配列番号２）とを用いるＰＣＲによって増幅し、 ｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＢａｍ  ＨＩおよびＳｍａ  Ｉ中にクローン化した。ＧＣＴ−ＲＮアーゼＩＩＩタンパク質を生成するために、この発 現ベクターを保有する細菌株（ＢＬ２１）（ＤＥ３）を、３７℃にてＯＤ６００が０．５になるまで増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを２時間用いて誘導した。ＧＳＴ−ＲＮアーゼＩＩＩを、グルタチオン−アガロースビーズを製造業者の指示（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に従って用いて精製し、２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、３０％グリセロール、ｐＨ７．９に対して一晩透析して、−２０℃にて維持した。約１ｍｇのＲＮアーゼＩＩＩを、１リットルの培養物から精製した。貯蔵６ヶ月後に、酵素活性の有意な損失は存在しなかった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
ｄｓＲ−４５７  ＲＮＡの末端は、ｐＲＬ−ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の１２００〜１６５６に対応する。Ｆ−ｌｕｃ  ＲＮＡは、ｐＥＧＦＰＬｕｃ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中の以下の位置に対応する：ｄｓＦ−５９２、１４５５〜２０４６；ＣＳ１、１５２０〜１５３８；ＣＳ２、１９００〜１９１８；Ｔ１、 ６０３〜６２１；Ｔ２、６２４〜６４２；Ｔ３、２４４８〜２４６６；Ｔ４、２９９４〜３０１２；Ｔ５、３０１３〜３０３１；Ｔ６、３０４９〜３０６７； Ｈ１、９８９〜１０１２；Ｈ２、１５２０〜１５４３；Ｈ３、２５２９〜２５５２；Ｈ４、２６０１〜２６２４；Ｈ５、２９０６〜２９２９；Ｈ６、 ２９４７〜２９７０．ＬＣａ  ｄｓＲＮＡおよびＣｄｋ１  ｄｓＲＮＡについてのテンプレートは、それらの遺伝子の完全コード配列を示した。６８１ｂｐ  ｃ −ｍｙｃ  ｄｓＲＮＡについてのテンプレートを、順方向プライマーｇａｃｔｃａａｃｇｔｔａｇｃｔｔｃａｃｃａａｃａ（配列番号３）および逆方向プライマー ｇｇａｃｔｃｃｇｔｃｇａｇｇａｇａｇｃａｇａ（配列番号４）を用いて増幅した。これらのプライマーはすべて、１８塩基のファージプロモーターを付属していた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
（Ｃ．短鎖ＲＮＡ二重鎖の生成および精製）
Ｆ−ｌｕｃについてのｅｓｉＲＮＡおよびＲ−ｌｕｃについてのｅｓｉＲＮＡを調製するために、１００μｇのｄｓＲＮＡを、２００μｌの反応緩衝液（５％ グリセロール以外は、透析緩衝液と同じ）中の１μｇ組換えＲＮアーゼＩＩＩによって、３７℃にて１５分間消化した。ＥＤＴＡを２０ｍＭまで添加することに よって反応を停止し、その生成物を、１２％ポリアクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ）上で分離した。１０ｂｐ  ＤＮＡマーカーを使用して、ＲＮＡ二重鎖の移動 を評価した。適切なサイズの短鎖ＲＮＡを、３７℃にて１Ｍ  （ＮＨ４）２Ａｃ中に一晩浸漬することによってゲルスライスから溶出し、エタノール沈殿によって回収した。その沈殿物を、ＴＥ緩衝液中に１．０μｇ／μｌにて溶解した。他 の遺伝子について、１００μｇのｄｓＲＮＡを、０．２μｇのＲＮアーゼＩＩＩを用いて２１℃にて１時間消化した。反応物を、５容量のＰＮ緩衝液 （ＱＩＡｑｕｉｃｋヌクレオチド除去キット、Ｑｉａｇｅｎ）を補充した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム上に充填した。フロースルーは、通常は、 １５〜２５塩基対のＲＮＡを含んだ。このＲＮＡを、エタノールによって沈殿させ、ＴＥ緩衝液中に溶解した。ｅｓｉＲＮＡ濃度を、ＵＶ２６０によって決定した


【手続補正書】
【提出日】平成17年8月26日(2005.8.26)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005536195000001.app
【国際調査報告】
2005536195.tif 000009
2005536195.tif 000010