【手続補正書】
【提出日】令和2年10月12日(2020.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型グルタチオン合成酵素において下記より選ばれる１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、且つ、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する、変異型グルタチオン合成酵素：
M165、V7、N13、I14、N15、K17、F22、F95、N199、Y200、P202、I274、T285、P287。
【請求項２】
前記変異が、下記より選ばれる１つまたはそれ以上の変異に相当する変異を含む、請求項１に記載の変異型グルタチオン合成酵素：
M165（A, C, F, G, H, S, W）、V7（I）、N13（K）、I14（V）、N15（H, K）、K17（R,
Y）、F22（I）、F95（L）、N199（A, E, G）、Y200（F, H）、P202（A）、I274（M）、T285（S）、P287（V）。
【請求項３】
前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、請求項１または２に記載の変異型グルタチオン合成酵素：
M165H/V7I、M165H/N13K、M165H/I14V、M165H/N15K、M165H/N15H、M165H/K17Y、M165H/K17R、M165H/F22I、M165H/I274M、Y200F/M165S、Y200F/N199A、Y200F/N199G、Y200F/N199E、Y200F/P202A、Y200F/T285S、Y200F/F95L。
【請求項４】
前記野生型グルタチオン合成酵素が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異型グルタチオン合成酵素：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項５】
下記工程（Ｂ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型グルタチオン合成酵素をγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
【請求項６】
さらに、下記工程（Ａ）：
（Ａ）γ−グルタミルバリン合成酵素をGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Val
を生成する工程
を含み、
前記工程（Ｂ）におけるγ-Glu-Valが、前記工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
下記工程（Ｃ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｃ）γ−グルタミルバリン合成酵素および請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型グルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
【請求項８】
前記変異型グルタチオン合成酵素が、精製酵素である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記変異型グルタチオン合成酵素が、固定化酵素である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異型グルタチオン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素および変異型グルタチオン合成酵素が、両酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１３】
下記工程（Ｂ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型グルタチオン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-ValおよびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
【請求項１４】
さらに、下記工程（Ａ）：
（Ａ）γ−グルタミルバリン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりGluおよびValからγ-Glu-Valを生成する工程
を含み、
前記工程（Ｂ）におけるγ-Glu-Valが、前記工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
下記工程（Ｃ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｃ）γ−グルタミルバリン合成酵素および請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型グルタチオン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりGlu、Val、およびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
【請求項１６】
前記微生物が、γ−グルタミルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物が、エシェリヒア・コリである、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記各工程がATPの存在下で実施される、請求項５〜１７のいずれか１項に記載の方法
。
【請求項１９】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項６〜１２および１４〜１８のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号２２、２４、または２６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２２、２４、または２６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２２、２４、または２６に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２０】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、野生型グルタミン酸−システインリガーゼにおいて下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する変異型グルタミン酸−システインリガーゼである、請求項６〜１２および１４〜１８のいずれか１項に記載の方法：
L135、Q144、Y241、N243、Y300。
【請求項２１】
前記野生型グルタミン酸−システインリガーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項２０に記載の方法：
（ａ）配列番号２８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２８に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号２８に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子。
【請求項２３】
請求項２２に記載の遺伝子を搭載するベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載の遺伝子を有する微生物。
【請求項２５】
γ−グルタミルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項２４に記載の微生物。
【請求項２６】
γ−グルタミルバリン合成酵素をコードする遺伝子を有する、請求項２４または２５に記載の微生物。
【請求項２７】
エシェリヒア・コリである、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の微生物。