(57)【要約】本発明は、標的化された分析物を潜在的に含有する試料の導入に適合した第一の区画と、バリア（Ｂ１）によって第一の区画（Ｓ１）から分離された第二の区画（Ｓ２）とを含む分析物センサーに関し、分析物は第一の区画中の成分、またはバリアと関連付けられたポリペプチド（ＰＰ）と相互作用し、その結果、種のバリアを横切っての輸送が起こり、輸送される種またはその誘導体は検出器によって検出され、それにより、分析物の存在を示す。
2005522692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物の導入に適合した第一の区画と、
第二の区画と、
前記第一の区画および第二の区画を分離するバリアであって、前記第一の区画は前記分析物と相互作用するのに適合した少なくとも１つの成分を含有し、該相互作用の結果、前記バリアを横切って種が輸送される場バリアと、
前記輸送される種、または前記輸送される種の誘導体を検出し、それにより、前記分析物の存在を検出するのに適合した検出器と
を含んでなる分析物を検出するための分析物センサー。
【請求項２】
前記少なくとも１つの成分が少なくとも１つのポリペプチドを含み、該ポリペプチドは前記分析物または前記分析物の誘導体と相互作用して、化学反応に関与できる請求項１のセンサー。
【請求項３】
前記バリアが前記輸送される種に対して少なくとも部分的に透過性であり、前記少なくとも１つの成分は前記分析物と相互作用するのに適合している請求項１または請求項２のセンサー。
【請求項４】
前記バリアの透過性が前記輸送される種のサイズに依存する請求項３のセンサー。
【請求項５】
前記輸送される種の透過性が前記輸送される種の電荷に依存する請求項３のセンサー。
【請求項６】
前記輸送される種の透過性が前記輸送種の電荷およびサイズに依存する請求項３のセンサー。
【請求項７】
前記検出器が、電流メーター、電圧メーター、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ、質量分析計、核磁気共鳴検出器、赤外分光計、紫外分光計、またはラマン分光計、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ検出器、水分検出器、導電率センサー、温度計、酸素センサー、生物学的酸素センサー、ｐＨ検出器、比色検出器、濁度メーターおよび粒子サイズおよび分布検出器よりなる群から選択される請求項１のセンサー。
【請求項８】
分析物の導入に適合した第一の区画と、
第二の区画と、
前記第一の区画および第二の区画を分離するバリアであって、該バリアはポリペプチドと関連付けられた生物学的膜を含み、前記ポリペプチドは前記分析物、または前記分析物の誘導体との相互作用に際して前記バリアを横切っての種の輸送に関与することができるバリアと、
前記輸送される種、または前記輸送される種の誘導体を検出し、それにより、前記分析物の存在を示すのに適合した検出器であって、該検出器（ｉ）は前記膜に付着しておらず、あるいは（ｉｉ）５０ｎｍ以上だけ前記膜から分離されている検出器と
を含んでなる分析物を検出するための分析物センサー。
【請求項９】
前記輸送される種が前記第一の区画から前記第二の区画に輸送される請求項８のセンサー。
【請求項１０】
前記輸送される種が前記第二の区画から前記第一の区画に輸送される請求項８のセンサー。
【請求項１１】
前記第一の区画が、前記分析物の前記誘導体の形成を行うのに適合した少なくとも１つの成分をさらに含む請求項８のセンサー。
【請求項１２】
前記第一の区画または第二の区画は、前記輸送される種の前記誘導体の形成を行うのに適合した少なくとも１つの成分をさらに含む請求項８のセンサー。
【請求項１３】
前記検出器が電流メーター、電圧メーター、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ、質量分析計、核磁気共鳴検出器、赤外分光計、紫外分光計またはラマン分光計、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ検出器、水分検出器、導電率センサー、温度計、酸素センサー、生物学的酸素センサー、ｐＨ検出器、比色検出器、濁度メーター、および粒子サイズおよび分布検出器よりなる群から選択される請求項８のセンサー。
【請求項１４】
分析物の導入に適合した第一の区画と、
第二の区画と、
前記第一および第二の区画を分離するバリアであって、該バリアは合成ポリマーを含む少なくとも１つの層を有する生体適合性膜を含み、該膜は少なくとも１つのポリペプチドと関連付けられており、前記ポリペプチドは前記分析物、または前記分析物の誘導体との相互作用に際して前記バリアを横切っての種の輸送に関与することができるバリアと、
前記輸送される種、または前記輸送される種の誘導体を検出し、それにより、前記分析物の存在を示すのに適合した検出器と
を含んでなる分析物を検出するための分析物センサー。
【請求項１５】
前記合成ポリマーが少なくとも１つのブロックコポリマーおよび少なくとも１つの非ブロックポリマーまたは非ブロックコポリマーを含む請求項１４のセンサー。
【請求項１６】
前記輸送される種がタンパク質であり、前記少なくとも１つのポリペプチドが前記バリアを横切ってのタンパク質の輸送に関与できる請求項１４または１５のセンサー。
【請求項１７】
前記輸送が少なくとも約１０ピコアンペア／ｃｍ2の電流密度を生じる請求項１６のセンサー。
【請求項１８】
前記輸送が少なくとも約１０ミリアンペア／ｃｍ2の電流密度を生じる請求項１６のセンサー。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのポリペプチドが前記少なくとも１つの層に包埋された請求項１４のセンサー。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのポリペプチドがポリペプチド複合体である請求項１４または１９のセンサー。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、前記生体適合性膜の少なくとも約０．０１重量％の量で存在する請求項１４のセンサー。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、前記生体適合性膜の少なくとも約５重量％の量で存在する請求項１４のセンサー。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、前記生体適合性膜の少なくとも約１０重量％の量で存在する請求項１４のセンサー。
【請求項２４】
前記合成ポリマーが少なくとも１つのブロックコポリマーを含み、前記少なくとも１つのブロックコポリマーは親水性含有量を超える疎水性含有量を有する請求項１４のセンサー。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのブロックコポリマーが約１，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有する少なくとも１つのブロックを有する請求項２４のセンサー。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのブロックが、約１，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有する少なくとも第二のブロックを有する請求項２５のセンサー。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのブロックコポリマーが、前記生体適合性膜の重量に基づいて、少なくとも約３５重量％の量で供される請求項２４のセンサー。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのブロックコポリマーが、前記生体適合性膜の重量に基づいて約３５重量％〜約９９重量％の量で供される請求項２４のセンサー。
【請求項２９】
前記合成ポリマーが複数のブロックコポリマーを含む請求項２４のセンサー。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのポリペプチドがレドックス反応に関与できる請求項１４または１５のセンサー。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのポリマーまたはコポリマーが約５，０００〜約５００，０００ダルトンの分子量を有する請求項１５のセンサー。
【請求項３２】
前記輸送される種が前記第一の区画から前記第二の区画に輸送される請求項１４のセンサー。
【請求項３３】
前記輸送される種が前記第二の区画から前記第一の区画に輸送される請求項１４のセンサー。
【請求項３４】
前記第一の区画が、前記分析物の前記誘導体の形成を行うのに適合した少なくとも１つの成分をさらに含む請求項１４のセンサー。
【請求項３５】
前記第一の区画または第二の区画が、前記輸送される種の前記誘導体の形成を行うのに適合した少なくとも１つの成分をさらに含む請求項１４のセンサー。
【請求項３６】
前記検出器が電流メーター、電圧メーター、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ、質量分析計、核磁気共鳴検出器、赤外分光計、紫外分光計またはラマン分光計、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ検出器、水分検出器、導電率センサー、温度計、酸素センサー、生物学的酸素センサー、ｐＨ検出器、比色検出器、濁度メーター、および粒子サイズおよび分布検出器よりなる群から選択される請求項１４のセンサー。
【請求項３７】
前記センサーが使い捨てである請求項１、８および１４のいずれか一項のセンサー。
【請求項３８】
分析すべき試料を少なくとも２つの試料成分に分離するのに適合した分離モジュールと、
前記試料成分の少なくとも１つを請求項１、８および１４のいずれか一項に記載の分析物センサーの第一の区画に移動させるのに適合した移動エレメントと
を含む検出デバイス。
【請求項３９】
前記分離モジュールが前記試料を一連の分離に付すのに適合した請求項３８の検出デバイス。
【請求項４０】
前記分離モジュールが複数の分離デバイスを含む請求項３９の検出デバイス。
【請求項４１】
前記分離デバイスが細胞ソーター、クロマトグラフィーカラムおよび遠心分離機よりなる群から選択される請求項４０の検出デバイス。
【請求項４２】
請求項１、８および１４のいずれか一項に記載の分析物センサーを供するステップと、
分析物を含有する試料を前記第一の区画に導入するステップと、
前記分析物の存在につき前記検出器を観察するステップと
を含む分析物の存在に関して試料を分析する方法。
【請求項４３】
請求項１、８および１４のいずれかに記載の２以上の分析物センサーを含む、少なくとも１つの分析物を検出するためのセンサーアレイ。
【請求項４４】
前記分析物センサーが少なくとも２つの分析物を検出するのに適合した請求項４３のセンサーアレイ。
【請求項４５】
分析物の導入に適合した第一の区画と、
第二の区画と、
前記第一および第二の区画を分離するバリアであって、該バリアは少なくとも１つのポリペプチドと関連付けられた膜を含み、該ポリペプチドは前記バリアを横切っての検出された種の輸送に関与することができ、前記ポリペプチドは前記分析物または前記分析物の誘導体と相互作用し、それにより、前記検出された種の輸送が低下されるのに適合するバリアと、
前記低下を検出し、それにより、前記分析物の存在を検出するのに適合した検出器と
を含んでなる分析物を検出するための分析物センサー。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが孔形成性ポリペプチドである請求項４５の分析物センサー。
【請求項４７】
前記ポリペプチドがグラマシデンである請求項４６の分析物センサー。
【請求項４８】
前記膜が、合成ポリマーを含む少なくとも１つの層を有する生体適合性膜である請求項４５、４６および４７のいずれかの分析物センサー。
【請求項４９】
ポリマーに対する前記ポリペプチドの質量比が約１：１００〜約１：５０，０００である請求項４５の分析物センサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、２００２年４月５日に出願された仮出願第６０／３７０，５００号に基づく米国特許法題１９条（ｅ）の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
分析物センサー（analyte sensor）は広い範囲の適応で有用である。医療および医薬分野では、それは臨床診断および新しい薬物の発見で使用することができる。また、分析物センサーはバイオテロリズム日物質または毒性化学物質の放出を検出するのに用いる場合、個人の安全および国家の維持で役割を演じることができる。分析物センサーは、暴露を早期に警告することによって、特に労働者を毒性化学物質に暴露することから保護する産業背景で用いることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
効果的であるべき分析物センサーでは、それはある程度の感度および特異性を有し、分析物の特定の種（species）またはクラスを検出しなければならない。好ましくは、センサーは広い範囲の環境、安定な、例えば、長時間継続するセンサー能力の提供、安価で、例えば、好ましくは再使用可能であり、ポータブルであることに適合すべきである。これらの特徴の１以上における改良は、従って、望ましい。本発明の目的は、従来の分析物センサーの所望の特徴を取り込み、またはそれを改良する分析物センサーの新規な配置を提供することにある。
【０００４】
本発明は、デュアル・チャンバーおよびマルチ・チャンバーの分析物チャンバーに関し、ここに、分析物または分析物誘導体種は、チャンバーを分離するバリアを横切って輸送されて、分析物の検出を行う。
【０００５】
１つの実施形態において、分析物は第一の区画に導入され、バリアは第一の区画を第二の区画から分離する。加えて、第一の区画は分析物と相互作用させるための少なくとも１つの成分を含み、その結果、バリアを横切って種が輸送される。本発明の目的では、輸送される種は、例えば、電子、プロトン、原子、分子、またはアニオン、カチオンまたは特定の原子価のイオンを含めたイオンであり得る。輸送される種または輸送される種の誘導体は検出され、従って、分析物の存在を示す。
【０００６】
もう１つの実施形態において、バリアは合成ポリマーの少なくとも１つの層を含み、該層は比較的プロトンを透過するが、バリアを横切ってのプロトンの輸送に関与することができる。
【０００７】
さらにもう１つの実施形態において、バリアはポリペプチドに関連付けられた生物学的膜を含み、ここに、該ポリペプチドは、分析物または分析物の誘導体との相互作用に際してバリアを横切っての種の輸送に関与することができる。輸送される種または輸送される種の誘導体は検出され、従って、分析物の存在を示す。好ましくは、この実施形態の検出器は（ｉ）膜に付着していないか、あるいは（ｉｉ）５０ｎｍ以上だけ膜から分離されているのいずれかである。
【０００８】
分析物およびポリペプチドおよび／または輸送される種および検出器の相互作用を容易とするために、さらなる成分をチャンバーの１以上に供することができる。
【０００９】
特に好ましい実施形態においては、バリアは合成ポリマーの少なくとも１つの層を有する生体適合性膜を含み、該膜は少なくとも１つのポリペプチドに関連付けられている。該ポリペプチドは、分析物または分析物の誘導体との相互作用に際してバリアを横切っての種の輸送に関与することができる。輸送される種または輸送される種の誘導体が検出され、それにより、分析物の存在を検出する。
【００１０】
もう１つの好ましい実施形態において、合成ポリマーは少なくとも１つのブロックコポリマーおよび少なくとも１つの非ブロックポリマーまたはコポリマーを含み、該ポリペプチドはバリアを横切ってプロトンを輸送することができる。
【００１１】
さらに、分析物およびポリペプチドおよび／または輸送される種および検出器の相互作用を容易とするために、さらなる成分をチャンバーの１以上に供することができる。
【００１２】
さらにもう１つの実施形態において、バリアはプロトン不透過性であり、好ましい態様においては、実質的にプロトン不透過性であるが、バリアを横切ってのプロトンの輸送に関与することができる合成ポリマー材料の少なくとも１つの層を含む。バリアを横切って輸送されたプロトンが検出され、それにより、分析物の存在を検出する。
【００１３】
特に好ましい検出器は電流を検出するのに適合している。しかしながら、他のタイプの検出器が考えられる。
【００１４】
もう１つの実施形態において、検出デバイスは分析物センサーを含み、さらに、分析すべき試料を少なくとも２つの試料成分に分離するのに適合した分離モジュールを含む。移動エレメントは、分離された成分の少なくとも１つを分析物センサーの第一の区画まで移動させて、分析物の存在を検出するのに適合する。試料は多数の分離を受けることができ、これは１を超えるタイプの分離デバイスを含むことができる。
【００１５】
もう１つの実施形態は分析物センサーのアレイを含む。該アレイは１を超える分析物センサーを含み、異なる分析物を検出するのに適合している。別法として、アレイは同一分析物を検出するために種々のセンサーおよび／または検出器を使用することができる。
【００１６】
本発明のさらにもう１つの実施形態は、本発明の種々の分析物センサーを用いて１以上の分析物の存在を検出する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
一般に、分析物センサーは少なくとも１つの化学物質または生物学的物質を検出するためのデバイスであるか、該デバイスの一部である。そのようなデバイスはそれが作用する試料を受領して、物質の存在および／またはそのような物質の量を示す応答を供するのに適合している。別法として、デバイスまたはセンサーは、それについて物質の検出が望まれる試料中に入れることができる。さらに、センサーまたはデバイスは少なくとも１つのセンサーを含むことができるが、１以上のセンサー、またはセンサーのアレイを含んで、１を超える物質を同定または測定することもできる。
【００１８】
図１Ａ〜Ｃは、電流の検出に基づく検出器を有する分析物センサーの１つの実施形態を示す。分析物検出器は第一の電極Ｅ１、第二の電極Ｅ２、およびバリアＢ１を含み、該バリア−Ｂ１は、それを横切って膜Ｍ１が配置される開口を有する。１つの態様に置いて、膜Ｍ１はポリマー含有生体適合性膜、プロトン・トンネリング膜（「ＰＴＭ」）またはその組合せである。バリアＢ１および膜Ｍ１は第一の区画または側面Ｓ１および第二の区画または側面Ｓ２を分離する。第二の電極Ｅ２は、電極Ｅ１のための対電極を供する１つの方法を提供する。
【００１９】
膜Ｍ１は、ある区画からほかの区画への膜を横切っての種の輸送に関与することができる１以上のポリペプチドまたはポリペプチド複合体ＰＰを取り込んでも取り込まなくてもよい。図１Ｃは、図１Ａに示された膜Ｍ１のその部分の拡大図である。膜貫通ポリペプチドＰＰは、側面Ｓ１およびＳ２双方に暴露された部分を有する、該膜の全体にわたる膜１と関連付けられて描かれる。この構成を膜貫通ポリペプチドという。模式的ポリペプチドＰＰは膜貫通ポリペプチドとして示されるが、本発明では他の膜会合も考えられることは認識されるであろう。膜に埋められた、または該膜と関連付けられているが、膜貫通ポリペプチドでもなくてもよい一体的ポリペプチドも考えられる。膜の表面の種々の構造と、またはポリペプチド複合体の形成における一体的タンパク質との会合を有する周辺ポリペプチドも考えられる。１つの好ましい実施形態において、主として側面Ｓ１において、分析物または分析物誘導体と相互作用するポリペプチドの表面を有する、すなわち、側面Ｓ１で分析物または分析物誘導体と相互作用するように配置されたポリペプチドの活性部位を有する作り出された膜Ｍ１がある。
【００２０】
ポリペプチドが分析物化学の一部として、または膜と関連付けられて用いられるならば、ポリペプチド複合体を含むことができるポリペプチドは分析物と直接相互作用することができるか、あるいはそれは「分析物の誘導体」と相互作用することができる。「分析物の誘導体」とは、例えば、プロトンまたは反応生成物または副産物を含めた分析物の導入に際して、またはそれに続いて第一の区画で形成されたいずれの種もいい、触媒として作用し、消費されない、あるいは検出された種を生じさせる単に試薬である種を含む。分析物の誘導体が分析物それ自体よりはむしろ、または分析自体に加えてポリペプチドと相互作用する場合、第一の区画は、さらに、分析物が存在する場合に分析物の誘導体の形成を行うのに必要な成分を含む。
【００２１】
同様に、検出器は、分析物の導入に対して応答して膜を横切って輸送される種と必ずしも直接的に相互作用しなくてもよいが、「輸送される種の誘導体」に対して作用することができる。本発明の目的では、輸送される種の誘導体は、タンパク質、カチオンまたは任意の正に荷電した種、電子、アニオンまたは任意の負に荷電した種、または化合物のように、かつ、さらに、輸送される種が触媒として作用し、消費されない場合の反応の生成物を含めた、輸送される種の存在に応答して生じたいずれの種も意味する。輸送される種それ自体よりはむしろ、またはそれに加えて輸送される種の誘導体である場合、適切には、第一または第二の区画は、輸送される種が存在する場合に検出された誘導体の形成を行うための必要な成分を含む。
【００２２】
本明細書中で用いる用語「輸送」は、一般には、膜を横切るプロトン、電子、原子または分子であれ、種の移動をいい、能動的および受動的プロセスを共にいうことができる。好ましい態様において、分析物センサーは生体適合性膜を含み、そこでは、関連付けられたポリペプチドは膜を横切っての第一の区画から第二の区画への分子、原子、プロトンまたは電子の輸送に関与することができ、それは、そのような輸送を容易にする分子構造の形成に関与することを含む。より特に好ましい本発明の態様において、ポリペプチドはレドックス酵素および／またはプロトンの膜貫通輸送に関与することができる酵素である。
【００２３】
種がバリアまたは膜を横切って輸送される時に種は不変のままである必要はなく、化学反応、反応の連鎖またはシリーズが膜内で起こってもよく、その結果、膜を横切っての改変されたまたは改変されていない種が輸送される。すなわち、「輸送される種」に言及する場合、これは、第一の側において膜に侵入する種が、反対側の区画に導入される種と同一種でない状況も含む。生体適合性膜、ＰＴＭまたは他のバリアを横切るプロトンの輸送を議論する場合、正確なメカニズム、または正確な移動された種が知られている必要はないことが認識されよう。「プロトン」の場合には、移動された種はプロトンそれ自体、正に荷電した水素、ヒドロニウムイオン、Ｈ3Ｏ+または、事実、いくつかの他の正に荷電した種であろう。しかしながら、便宜のために、これらを集合的に本明細書中では「プロトン」として特徴付ける。輸送される種は負に荷電した粒子を含むこともでき、アニオンおよびカチオンを共に含むことができる。
【００２４】
本明細書中で用いる「生体適合性膜」は、膜として用いるのに適したシート、プラグまたは他の構造を形成する合成ポリマー材料の１以上の層であり、しばしば、生物学的起源のポリペプチドまたは他の分子と会合する。「生体適合性」とは、該膜が、膜およびポリペプチドが相互に会合する場合に、本発明で用いるのに適したポリペプチドの機能の全てを無力にしない、またはそうでなければ妨害しない合成ポリマー材料を含むことを意味する。生体適合性膜はＰＴＭであってもよい。生体適合性膜は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする２００２年４月１５日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／１１７１９の一部継続出願である「Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｅｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｔｈｅｒｅｗｉｔｈ」なる発明の名称の、同一出願人による同時係属米国出願第１０，２１３，５３０号、および全て２００２年４月１５日に出願された米国出願第１０，１２３，０２２号、第１０／１２３，０３９号、第１０／１２３，０２１号、第１０／１２３，０２０号および第１０／１２３，００８号の各々において詳細に議論されている。
【００２５】
本明細書中で用いられる用語「バリア」および「膜」は、共に、空間、流体（液体または気体）、固体などを選択的に分離するのに用いることができる材料のシート、層またはプラグのような構造をいう。しかしながら、用語「バリア」は、しばしば、その膜が一部にすぎないより大きな構造をいい、しばしば、該バリアはそれを横切って膜が位置する穴または孔を含有し、該バリアは、しばしば、膜の支持体として働く。「膜」は生物学的、生体適合性、およびプロトン・トンネリング膜を含むことができる。本明細書中で用いる「バリア」および「膜」は共に、他の種に対しては不透過性でありつつ、１つの区画から他の区画へのいくつかの種の通過または拡散を可能とする半透性材料を含むことができる。本明細書中でいうバリアおよび膜は共に「プロトン・トンネリング」活性を呈するように設計することができる。
【００２６】
本発明のいくつかの態様において、半透性バリアを使用して、標的化された分析物を潜在的に含有する試料の導入に適合した第一の区画、および第二の区画を分離する。区画を規定する壁のいずれかに関して包埋されまたは固定化されていてもいなくてもよい第一の区画に配置された成分は、分析物と反応し、次いで、バリアを横切って移動することができるタンパク質、電子、原子または分子であれ、種を生じるのに適合している。反応は、そのサイズ、形状または電荷、あるいはその組合せのため、バリアを横切って輸送され得る種を生じさせることができる。本明細書中において、「輸送」は、濃度勾配の結果としてそのような種が移動する状況をいうのに用いられる。
【００２７】
さらにもう１つの態様において、バリアとは、第一の区画と第二の区画とを分離し、それにより、酵素を含んでもよい第一の区画中の成分と分析物との相互作用が、プロトン・トンネリングを介してバリアを横切って輸送できるプロトンの生成を生じさせる比較的プロトン不透過性構造をいうことができる。
【００２８】
好ましくは、バリアＢ１は、ポリペプチドＰＰが作用すべき分析物またはその誘導体に対して透過性ではない。しかしながら、所与の測定に対して必要なシグナル／ノイズ比が達成される限り、いくらかの漏れは許容できる。
【００２９】
本発明によると「関連付けられた」は、状況に応じて多数の事柄を意味することができる。ポリペプチドは、１以上のその表面に結合することによって、および／または（窪みまたは孔（pore）のように）膜の表面の１以上のなかに留められるかまたは結合されることによって生体適合性膜またはＰＴＭと会合することができる。「結合した」への言及は、物理的結合ならびに静電的水素結合およびイオンまたは共有結合、またはその組合せを含む。「関連付けられた」ポリペプチドは、膜の内部内に、または膜内に含まれる小胞またはルーメン中に配置することができる。ポリペプチドは連続層の間に配置することもできる。ポリペプチドは同様に膜に埋めることができる。事実、特に好ましい実施形態においては、ポリペプチドが少なくとも膜の少なくとも１つの表面を通じて部分的に露出し、および／またはレドックス反応に関与でき、あるいは分子、原子、プロトンまたは電子のポリペプチド媒介輸送、あるいはまたは膜の一方側から他方側へ、プロトンを移動させる方法としてのプロトン・トンネリングいずれかに関与することができるような方法で、ポリペプチドは膜に埋められるか、または一体化される。
【００３０】
バリアの一方側から他方側へ分子、原子、プロトンまたは電子を輸送させる文脈で、用語「関与」および「関与する」は、例えば、ポリペプチドが物理的にまたは化学的にバリアを横切る分子、原子、プロトンまたは電子を「ポンピング」する能動的輸送を含み、これは、ポンピングがｐＨ、濃度または電荷勾配、または任意の他の能動的輸送メカニズムに従って、またはそれに抗して行われる状況を含む。しかしながら、「関与」はそのように限定される必要はない。例えば、ポリペプチドは、そのような輸送を容易とする構造を形成することによって輸送に関与することができる。さらに、ポリペプチドは、化学反応に関与し、それにより、反応生成物が、さらに修飾されまたは修飾されることなく能動的にまたは受動的にバリアを横切って輸送できるようになることによって、輸送に関与することができる。
【００３１】
「ポリペプチド媒介輸送」は、単に構造的に静的チャネルを供する以外の方法で、バリアを横切っての種の輸送においてバリア会合ポリペプチドが（受動的拡散を除く）役割を演じるプロセスを含む。もう１つの方法を述べると、「ポリペプチド媒介輸送」は、バリア会合ポリペプチドの存在の結果、濃度単独以外の何かに応答して膜の一方側から他方側へ種が効果的に輸送されることを意味する。レドックス反応の文脈では、「関与する」は、ポリペプチドが種の酸化および／または還元を引き起こし、または容易とし、あるいはその反応プロトン、電子または酸化されたもしくは還元された種へ運び、またはそこから運び出すことを意味する。ＰＴＭの文脈では、「関与」および「関与する」は、ＰＴＭを横切ってのプロトンの輸送で役割を演じることを意味する。特定の操作理論に拘束される意図はないが、これは、層または膜を横切ってのプロトン・トンネリングによるプロトンの移動を含むことができる。この用語は単なるプロトン透過性を排除する。再度、特定の操作理論に拘束される意図はないが、ポリペプチドは、もし存在すれば、ＰＴＭの表面へのプロトンの侵入を容易とすることができ、その後、プロトン・トンネリングは生体適合性膜またはＰＴＭの他方側へのプロトンの輸送を完了することができる。
【００３２】
「ポリペプチド」は、しばしば、しかし必ずしもそうではないが、触媒として化学反応に関与できるか、または（膜、生体適合性膜、ＰＴＭまたはその組合せを含めた）バリアの一方側から他方側への分子、原子、プロトンまたは電子の輸送に関与でき、またはそのような反応または輸送を容易とし、または可能とする分子構造または化合物の形成に関与できる少なくとも４つのアミノ酸を含む少なくとも１つの分子を含む。ポリペプチドは一本鎖または多重鎖であってよく、単一のサブユニットまたは多数のサブユニットとして存在することができる。それは、専ら、アミノ酸、またはアミノ酸および他の化合物または分子の組合せよりなることができる。これは、例えば、PEGペプチド（pegalated peptide）、ペプチド核酸、ペプチドミメティックス、および核タンパク質複合体を含むことができる。例えば、グリコシル化の生成物のような修飾を含むアミノ酸の鎖も考えられる。本発明によるポリペプチドは、一般には、生物学的分子または誘導体、あるいは生物学的分子のコンジュゲートである。従って、ポリペプチドは、単離することができる分子、ならびに組換え技術によって生産することができるか、あるいは全部または一部が化学的に合成されなければならない分子を含むことができる。従って、かかる用語は、天然に生じるタンパク質および酵素、その突然変異体、その誘導体およびコンジュゲート、ならびに全合成アミノ酸配列およびその誘導体およびコンジュゲートを含む。１つの実施形態において、本発明によるポリペプチドは、バリアまたは膜の一方側からそのもう１つの側への分子、原子、プロトンおよび／または電子の輸送に関与することができ、酸化または還元に関与することができ、あるいは（「複合体１」ともいう）ＤＨ-複合体Ｉのような電荷駆動プロトンポンピングポリペプチドである。
【００３３】
「生物活性物質」は、細胞、ウイルス、組織、器官または生物に作用することができる化学物質のような物質を含み、限定されるものではないが、細胞、ウイルス、器官または生物の機能の変化を生じさせる殺虫剤、薬物、または毒性物質を含む。本発明の好ましい分析物センサーは、生きた生物のある形態において見出すことができる、少なくとも部分的に機能的なポリペプチドを取り込む膜を含むので、該分析物センサーは「生物活性物質」を同定するのに特に適している。
【００３４】
図２Ａ〜図２Ｂは、用いられる分析物センサーまたは分析細胞を示す。標的化された分析物を含有する溶液は、矢印によって示されるように、側面Ｓ１に導入される。ＰＰは分析物または（存在する場合は）誘導体に作用し、側面Ｓ２において測定可能な変化を生じる。好ましい実施形態においては、測定可能な変化は、側面Ｓ１に配置された標準電極Ｅ２に抗して測定された、電極Ｅ１における電気的ポテンシャルの差を生じさせる。
【００３５】
図２Ｂに示すように、電極は複数の電極（第１の電極Ｅ１Ａ、第２の電極Ｅ１Ｂ、これを続けて、例示では、第７の電極Ｅ１Ｇ）に分割することができる。別々の電極を用いて、一時的な制御データ（temporal control data）を供することができる。例えば、もし分析細胞が正しく作動し、分析物が示したように左側から導入されるならば、ポリペプチド（ＰＰ）によって生じる効果は第一の電極で開始されるべきである。適当な相対速度論で順次の電極まで進行する。一時的制御データは、例えば、２つの方法で生じさせることができ、導入された試料を分析するのに個々にまたは一緒に用いることができるデータの２つの組を供する。第一の方法において、分析物ならびにいずれかのキャリア溶媒の全てが同一速度で区画を横切って移動するように、強制流動を用いる。直列におけるいずれかの特定の検出器の出力は、系列においてより早期に膜を横切る種の輸送をもたらす相互作用との関連で、どれだけ多くの標的化された分析物が枯渇したかによって影響されるであろう。第２の方法は自由流動を含み、そこでは、混合物中の個々の分析物に対する応答速度が分析物の移動度に応じて異なる。
【００３６】
図２Ｃに示されるように、別々の電極（Ｅ２１Ａ−Ｅ２１Ｅ）を別々の膜（Ｍ２１Ａ−Ｍ２１Ｅ）と整列させることができる。この実施形態において、電極は、非整列膜を横切る事象に効果的に感受性でないように設置することができる。従って、別々の膜は、各々、区別されるポリペプチドまたはポリペプチドの混合物を含有することができ、同一試料を側面Ｓ１を通過させて、別々の分析結果を生じさせることができる異なる応答を生じさせることができる。例えば、ポリペプチドの混合物は、活性の源を同定するためのコンビナトーリアルスクリーニングにおいて、または逆に、分析物（またはその誘導体）がポリペプチドのいくつかの別々のファミリーのいずれかにおいて活性を誘導しないスクリーニングで用いることができる。そうでなければ区画化されていない別々の膜が検出で別々に用いることができる場合、デバイス（またはより大きなアレイの成分）を「分析物センサーの組み合わせアレイ」と呼ぶことができる。
【００３７】
もう１つの実施形態において、セルまたは分析物センサーは、その各々が、異なる分析物、または同一分析物に関して異なる試料を検出または測定するのに適合し得る、セルまたはセンサーのアレイの一部であり得る。そのようなアレイは、第一のセルＣ１、第二のセルＣ２などと共に図３に模式的に示される。
【００３８】
さらにもう１つの実施形態において、アレイの区画はカスケードとすることができ、すなわち、カスケードにおいては、第一の分析物センサーの第二の区画は、試料のさらなる分析のための第二の分析物センサーの第一の区画である。この実施形態において、第一の分析物センサーの輸送される種は、効果的には、第二のセンサーの分析物である。例えば、いくつかの分析物が第一のセンサーの成分またはポリペプチドに関して反応して区別される輸送される種を生じることが知られている場合、カスケードによるおける第二および／または引き続いてのセンサーは、第一のセンサーの区別される輸送される種の間を識別し、それにより、分析物を検出するように適合させることができる。さらにもう１つの態様において、電荷が検出器によって測定される場合、第一の分析物センサーのカソード区画は第二の分析物センサーのアノード区画として働くことができる。分析物、または分析物の誘導体は第一の区画を横切って移動して、第一の検出事象を生じる相互作用に関与し、第二の検出事象はシリーズにおいて第二の膜を含む。もちろん、カスケードにおいてバリアの数、膜、センサーおよび検出事象に制限はなく、好ましくは、少なくとも２つの検出事象がある。カスケーディングセンサーアレイのもう１つの実施形態において、第一の分析物センサーにおける試料のテストに際して、試料を第一の分析物センサー区画から取り、第二の分析物センサーに適用する。チュービングおよびポンプのような移動エレメントをこの目的で使用することができる。移動は自動または手動であってよい。
【００３９】
好ましい態様において、電流を検出する場合、１つの電極は第一の区画に配置され、第二の電極は第二の区画に配置される。これは、分析物またはその誘導体と相互作用するポリペプチドによって引き起こされた化学的変化を検出する、異なる図面における電極Ｅ１およびＥ２によって示される。
【００４０】
もちろん、当業者に知られた多くの他の検出方法を使用することができる。そのような方法は、限定されるものではないが、（化学的に、酵素的に、免疫学的に発色する）比色、クロマトグラフィー、（質量分析の使用を介することを含めた）分光学、および化学物質を検出するいずれかの他の方法を含むことができる。検出は、例えば、電流または電圧メーター、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ、質量分析計、核磁気共鳴分析器、赤外分光計、紫外分光計および／またはラマン分光計、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ検出器、水分検出器、導電率センサー、温度計、酸素センサー、ｐＨ検出器、比色検出器、濁度メーター、粒子カウンター、粒子サイズ検出器などを含むことができる。
【００４１】
本発明で有用な検出器は、輸送の方向および使用される検出方法に依存して、第一の区画または第二の区画いずれかに配置することができる。そして、いくつかの例においては、１を超える検出方法を使用することができ、事実、特異的分析物を同定する必要があり得る。さらにもう１つの態様において、本発明のセンサーまたはセルへの未知試料の導入の間またはその後に試料を、第二の区画または第一の区画から取り出し、方向付けし、外部検出器に供給する。
【００４２】
いずれの検出器についても、検出される特定の物質はバリアを横切って輸送される種であってもなくてもよく、それは、例えば、当業者によって知られた試薬によって生じたさらなる代替物であってよく、側面Ｓ２に供することができる。いくつかの態様において、ポリペプチド（ＰＰ）との相互作用の結果として、または化学反応の結果として、バリアを横切って輸送される種は、分析物の導入に際して、適当であれば、そのような分子種の酸化的誘導体の使用によって測定することができる。例えば、グルコースオキシダーゼは、グルコースのグルコン酸の変換に際してグルコースから電子を生じて、その電子は電極で測定することができる。
【００４３】
好ましい電極の所定の位置にある検出器Ｄ１を利用する分析セルを図１Ｄに示す。二次サンプリングまたは分離を検出で利用する場合、クロマトグラフィーまたは質量分析におけるように、側面Ｓ２から分離デバイスへの試料の機械化された移動が、当分野で知られているように、好ましく用いられる。もし誘導体が検出されれば、輸送される種の存在に基づいて測定された物質を生じさせるのに必要な、酵素または試薬のようなさらなる成分が、分析物センサーの適当な区画に供される。
【００４４】
本発明の分析セルまたはセンサーで用いられる提案されたポリペプチド（または複合体）の多くは、分析触媒ポリペプチドを電極に付着させた生物学的膜に一体化させるシステムで用いられているものと同一である。そのようなシステムで用いられるように、生物学的膜は、図４に示すように、電極に隣接し、かつ膜によってトラップされた溶液のポケットを形成すると信じられている。図４において、生物学的膜（ＢＭ）を電極Ｅ２に付着させ、それは、取り込まれたポリペプチドＰＰを有する。分析的に重要な事象は、トラップされた溶液ＴＳ中で起こると信じられる。図４における説明は比較的大きな単一容量のトラップされた溶液を示すが、溶液は多数の非常に小さな容量、または非常に浅い容量を含むことができる。そのような小さな容量は、例えば、ＷＯ９３／２１５２８（Ｅｕｒ．Ｉｎｓｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）に教示されているように、生物学的膜がチオ含有リンカーを備えた電極と会合する場合に起こる。
【００４５】
１つの実施形態において、分析物センサーは分析に付すべきいずれかの溶液をフラッシュし、再度用いることができる。検出が側面Ｓ２において起こる場合、もし適当であれば、別々のフラッシュまたは設定溶液を用いて、使用の間にその側面は好ましくはフラッシュされる。フラッシングを、ポリペプチドと生体適合するように適合された第一の溶液で行い、続いて、分析反応を支持するように適合された溶液の再導入を行うことができる。特に、支持溶液のコストが合理的である場合、フラッシュはそのような反応性支持溶液を含むことができる。
【００４６】
別の実施形態においては、分析物センサーは使い捨てであり、これは、毒性または有害物質を検出するのに適合したセンサーで特に有用である。使い捨てセンサーは、患者からの試料中の分析物を検出するのに医療診断で特に有用であり得る。そのような分析物は、限定されるものではないが、アミノ酸、酵素基質、または病気状態もしくは疾患を示す生成物、病気状態または疾患の他のマーカー、薬物乱用、治療および／または薬理学物質、電解質、注目する生理学的分析物（例えば、塩化もしくは炭酸水素（ＣＯ2）カルシウム、カリウムもしくはナトリウム、グルコース、尿素（血中尿素窒素）、乳酸塩、ヘマトクリット、およびヘモグロビン）、脂質などを含む。もう１つの実施形態において、分析物センサーは血中グルコースをモニターするのに用いることができる。さらに、使い捨てセンサーは放射性種の検出の関係で特に有用であり得る。
【００４７】
［支持体としてのバリア］
本発明による好ましい実施形態においては、膜は、Ｂ１として図面中に示されたバリアまたは支持体の開口または孔内に、またはそれを横切って配置および／または形成することができる。「開口したバリア（perforated barrier）」は、その中へ、またはその上へ膜を配置することができる少なくとも１つの穴（hole）、開口（aperture）または孔（pore）を有するものである。開口は、例えば、パンチ、ドリル、レーザードリル、ストレッチングなどによって形成させることができる。
【００４８】
ある好ましい実施形態においては、バリアはガラスまたは（ポリ酢酸ビニル、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、Ｋａｐｔｏｎ（登録商標）（ポリイミドフィルム、Ｄｕｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥのような）ポリマー、（Ｄｕｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥからのＴｅｆｌｏｎ（登録商標）のような）過フッ素化ポリマー、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ、例えば、Ａｔｏｆｉｎａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡによってＫｙｎａｒＴＭとして販売されるほぼ５９％フッ素を含有する半結晶性ポリマー）、ＰＥＥＫ（後に定義）、ポリエステル、ＵＨＭＷＰＥ（後に記載）、ポリプロピレンまたはポリスルホン、石灰ガラスまたはボロシリケートガラス、または金属でコーティングした前記いずれかである。金属を用いて、（例えば、チオールリンカーで）（両親媒性分子の単層または二層のような）生体適合性膜またはＰＴＭを固定することができる。本発明の特に好ましい態様において、開口バリアは誘電性材料で作成される。１つの実施形態において、開口されたまたは多孔性基材はフィルムである。カプトンおよびテフロン（登録商標）のような、高天然表面電荷密度を持つ支持体または基材はいくつかの実施形態において好ましい。非共有結合相互作用が膜の付着を支持する場合、支持体の膜相互作用部分は直接的に、またはコートし、または誘導体化して、膜との相互作用を安定化する疎水性表面を供することができる。
【００４９】
膜を固定することは必須ではないが、膜と一体化された複合体Ｉとで確立されたように、当分野で知られた固定技術を用いて膜を安定化することができる。例えば、図５Ａに示すように、アルキレンテイルを適当な表面に付着させて、親油性表面ＬＳ１を形成することができる。表面付着は、金被覆表面とのチオール媒介連結を含めた当分野で知られたいずれかの数の化学を用いることができる。あるいは、図５Ｂに示すように、リン脂質を、リン脂質のヘッド基からのポリエチレンオキサイドブリッジを介して表面アタッチメントに付着させることができる（例えば、ＷＯ９３／２１５２８参照）。
【００５０】
バリアは、さらに、適当な材料の織物またはメッシュであり得る。そのような織物は、膜が規則的な近い間隔で支持され、確立されるのを可能としつつ、大きな表面積を提供する。そのような織物支持体は、さらに、より強い材料の足場によって支持することができる。例えば、図６Ａに示された足場Ｓ１は織物Ｆ１を支持する。
【００５１】
そのような織物またはメッシュは、適当なポリマーで形成すると、加熱されて重ねた織物ストランドを部分的にまたは十分に合体させつつ圧縮することができ、よりスムーズな表面を持つ織物またはメッシュを提供することができる。
【００５２】
図６Ｂに示されるように、電極Ｅ１１を位置させる方法のように、膜へ支持または付着させないにも拘わらず、電極をバリアに一体化させることができる。
【００５３】
開口されているが他は中実なバリアを用いる場合、バリアの厚みは、例えば、１５マイクロメートル（μｍ）〜５０μｍ、または１５μｍ〜３０μｍである。開口の幅は、例えば、２０μｍ〜２００μｍ、または６０μｍ〜１４０μｍ、または８０μ〜１２０μｍである。
【００５４】
バリアおよび金属化表面における開口は、例えば、当分野で周知のフォトリソグラフィーのマスキングまたはエッチング技術で構築することができる。別法として、金属化表面（電極）は、例えば、（ｉ）マスクを通じての薄膜蒸着、（ｉｉ）薄膜光規定（photo-defining）によって金属化のブランケットコーティングを適用し、パターンを選択的にエッチングして金属化とし、または（ｉｉｉ）金属含浸レジストを用いるエッチングなくして直接的に金属化パターンを光規定することによって形成することができる（ＤｕＰｏｎｔ  Ｆｏｄｅｌプロセス，Ｄｒｏｚｄｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｈｏｔｏｐａｔｔｅｒｎａｂｌｅ  Ｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｔａｐｅｓ  ｆｏｒ  ＰＴＰ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｄｉｓｐｌａｙ  １９９９  Ｄｉｇｅｓｔ，１０４４−１０４７；Ｎｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，０４９，４８０号）。１つの実施形態において、バリアはフィルムである。例えば、バリアは、金属化によって「開口」部の外側で非透過性とされる多孔性膜であってよい。金属層の表面は、例えば、電気メッキによって他の金属で修飾することができる。そのような電気メッキは、例えば、クロム、金、銀、白金、パラジウム、ニッケル、その混合物など、好ましくは金および白金で行う。
【００５５】
別の実施形態において、バリアは膜とまったく関連付けられていないが、プロトン・トンネリング活性を呈する合成材料で作成される。この例においては、分析物の第一の区画への導入、および第一のチャンバーに配置されたポリペプチドまたは他の反応性成分での分析物またはその誘導体の挿入の結果として第一の区画に放出されたプロトンはバリアを横切って輸送され、輸送される種またはその誘導体が検出され、分析物の存在を示す。
【００５６】
［膜形成、タンパク質取込み］
生物学的膜は、例えば、Ｎｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，の米国特許第４，５４１，９０８号（シトクロムＣの電極へのアニーリング）およびＰｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．２９２：１１５，１９９０に詳細に記載されている方法によってその中に取り込まれた織物バリアおよびポリペプチド中の開口穿孔または開口を横切って形成することができる。そのような方法は、脂質または他の両親媒性物質およびポリペプチドの適当な溶液を調製するステップであって、ここで、該ポリペプチドは界面活性剤で安定化された溶液中の混合物に供給することができるステップと、一旦脂質または他の両親媒性物質およびポリペプチドの適当な溶液が作成されれば、開口誘電性基材を溶液に浸漬して、ポリペプチド含有膜層を形成するステップとを含む。音波処理または界面活性剤希釈は層へのポリペプチドの取込みを容易にすることができる。例えば、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｙ  ３１：５２７−５３４，１９８２；Ｍａｄｄｅｎ，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，」Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ  ４０：２０７−２２２，１９８６；Ｍｏｎｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｎａｒ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ，」Ｑｕａｒｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１４：１−７９，１９８１；Ｈｅｌｅｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ，」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｍｅ．１１６：２７−３１，１９８１；Ｖｏｌｕｍｅｓ  ｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（ｅ．ｇ．，ＦｌｅｉｓｃｈｅｒおよびＰａｃｋｅｒ（ｅｄｓ．））Ｉｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ参照。
【００５７】
ポリペプチドを生物学的膜に取り込む１つの方法は以下の通りである。ポリペプチド（例えば、プロトン輸送酵素複合体Ｉ）の取込みは、該ポリペプチドを含有する小胞の、１０ｍＭ塩化カルシウムを含有する溶液中での、膜との融合によって達成される。小胞と膜との融合を促進するための物質としてのカルシウムの使用は、Ｌａｎｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ」１９１  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５７２，５８２（１９９０）（５８２における）；Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，「Ｐｌａｎａｒ  Ｌｉｐｉｄ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．．．」１７１  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２２５，２２６（１９８９）に記載されたように、当分野でよく認識されている。さらに詳しくは、小胞を膜上に注入し、次いで、５００マイクロリットルのような比較的小容量中で側面Ｓ１でインキュベートする。これは、実質的には、（５８２における）Ｌａｎｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，または（２３６における）Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒの方法である。タンパク質を含有する小胞は、タンパク質の界面活性剤溶液を、音波処理を用いて脂質から新たに形成された小胞と共にインキュベートすることによって調製された。これは、実質的には、（音波処理の代わりに渦を用いる）２５２におけるＳｃｈｉｎｄｌｅｒに記載された方法である。この方法は成功して適用されて、大腸菌の過剰発現から得られた複合体Ｉが、テフロン（登録商標）バリア中の開口を横切って形成された安定な膜に取り込まれた。
【００５８】
特定のポリペプチドを特定の膜に取り込む方法は、一般に、通常の方法によって最適化されることは認識されるであろう。さらなるガイダンスは、今日、生物学的膜材料にうまく取り込まれた多くの膜タンパク質から供される。
【００５９】
膜を形成する方法は共通性を有する傾向がある。小さな開口を持つテフロン（登録商標）のような疎水性材料で作成された薄い隔壁は、導入された少量の脂質（または他の両親媒性物質）を有する。両親媒性物質−被覆開口を希薄な電解質溶液に浸漬し、その際、脂質液滴は薄く、自然に、自己配向して、該開口にわたる平面二層となる。かなりの面積の膜が、この一般的技術を用いて調製されている。膜それ自体の形成のための当分野で周知の通常の方法はラングミュアー・ブロジェット技術、セルフ・アッセンブリ技術、および注入技術である。これらは、引用することにより本明細書の一部をなすものとする同時係属米国出願第１０／２１３，５３０号に詳細に記載されている。
【００６０】
膜層は、ガラス、炭素、すなわち、疎水性を増加させるように修飾された表面、またはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のようなポリマーに被覆することによるように、固体材料に対して形成することができる。ＰＤＭＳのようなポリマーは、その上を膜を用いて孔をスパンすることができる優れた多孔性支持体を供することができる。
【００６１】
（ブロックコポリマーで特に好ましい）コーティング方法は、（銅被覆のような）導電体の最初のコーティングまたはラミネーション、続いてのメッキ、スパッタリング、または金または白金のような貴導電体（noble conductor）で被覆するためのもう１つの被覆手法の使用を含む。もう１つの方法はクロムまたはチタンのような付着層を支持体に直接的にスパッタリングし、続いて、メッキ、スパッタリングまたは貴導電体を付着させるための他のコーティング手法を行うことである。外側金属層は、好都合には、ドデカンチオールなどで処理して、その疎水性を増加させる。カプトンおよびテフロン（登録商標）のような、高天然表面電荷密度を持つ支持体が、ある実施形態では、好ましい。
【００６２】
いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、膜貫通効果を有するとは予測されず、あるいはそのような膜貫通効果は親油性電子移動メディエーターによって促進される。本発明の目的では、膜貫通効果は、ポリペプチドそれ自体が、膜を横切って種を十分に輸送する能力を有することを意味する。これらの場合、膜結合性は、膜に取り込まれる両親媒性化合物の極性端部にポリペプチドを連結するために、当分野で知られた（典型的には親水性の）リンカーによってなすことができる。ＷＯ９３／２１５２８（Ｅｕｒ．Ｉｎｓｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）に記載されたポリエチレンオキシドリンカーと共にリン脂質誘導体が例示される。貫通効果がない場合、分析物センサーは、ポリマーまたはガラス支持体へのポリペプチドの時間依存性吸着からの干渉が低下したセンサーの再使用を支持するポリペプチドに対する環境を供する。また、そのような場合には、側面Ｓ２は非常に限定されたサイズのものであり得る。
【００６３】
［生体適合性膜］
本発明の分析物センサーで有用な生体適合性膜は、本明細書中で記載する１以上のポリペプチドと関連付けられた場合、本発明の目的を満足するいずれかの合成ポリマー材料から形成することができる。そのような膜を製造するのに用いられる同様の方法および材料の多くは、ＰＴＭの形成にも適用され、これは後に本明細書中でより詳細に議論する。
【００６４】
有用な合成ポリマー材料はポリマー、コポリマーおよびブロックコポリマー、ならびにそれらの混合物を含む。これらは結合でき、架橋でき、機能性化でき、またはそうでなければ相互に会合させることができる。「機能性化」は、ポリマー、コポリマーおよび／またはブロックコポリマーが、それが当分野で知られた重合（例えば、ブロックの架橋）、特定の表面化学への固定（例えば、ある種の硫黄結合の使用）、電子キャリアまたは電子移動メディエーターを共有結合させることを介する促進された電子輸送であるかを問わず、特定の機能を実行するように選択された末端または反応性基で修飾されていることを意味する。典型的には、これらの末端または反応性基はポリマーまたはブロックそれ自体の構成要素とは考えられず、しばしば、合成の最後または合成の後に付加される。合成ポリマー材料は、一般に、仕上げた膜の少なくとも約５０重量％の、より典型的には仕上げた膜の少なくとも約６０重量％、しばしば、その約７０重量％および多くて約９９重量％の間の量で仕上げた膜（用いる状態の膜）に存在させる。合成ポリマー材料の全量の一部は、仕上げた生体適合性膜中の全合成ポリマー材料の重量に基づいて、重量で一般に約１／３までが安定化ポリマーであり得る。
【００６５】
本発明で有用な生体適合性膜は、好ましくは、ポリマーまたはコポリマーのような他の合成ポリマー材料を含む、または含まない、かつ添加剤を含む、または含まない、Ａ−Ｂ、Ａ−Ｂ−ＡまたはＡ−Ｂ−Ｃブロックコポリマーのような１以上のブロックコポリマーから製造される。
【００６６】
１つの適当なブロックコポリマーは、Ｃｏｒｉｎｎｅ  Ｎａｒｄｉｎ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｍｅｉｅｒおよびその他による一連の論文に記載されている。Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．編３９：４５９９−４６０２，２０００；Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １６：１０３５−１０４１，２０００；Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １６：７７０８−７７１２，２０００。それは、機能性化ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（ジメチルシロキサン）−ブロック−ポリ（２−メチルオキサゾリン）トリブロックコポリマーとして特徴付けられる。
【００６７】
Ｎａｒｄｉｎ−Ｍｅｉｅｒポリマーは、機能的ポリペプチドを取り込むことができる比較的多くの膜を提供することができる。ポリマー分子の端部におけるメタクリレート部位は、ポリペプチド取込み後にフリーラジカル媒介架橋を可能にして、より大きな機械的安定性を供する。
【００６８】
そのような合成膜を、ある種の脂質の存在を好むまたはそれを要求するポリペプチドで用いる場合、そのような脂質は、例えば、ポリペプチドを膜に挿入するプロセスで供され、あるいは膜形成に取り込まれる。
【００６９】
有用なブロックコポリマーの他の例は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする同時係属米国出願第１０／２１３，５３０号に記載されており、限定されるものではないが、両親媒性ブロックコポリマー；５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）イソプレン、スチレンおよびメタクリル酸からのトリブロック・コポリアンフォライト類；Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な商品名ＫＲＡＴＯＮ（登録商標）下で販売されているスチレン−エチレン／ブチレン−スチレントリブロックコポリマーを含む。好ましいブロックコポリマーはスチレン−エチレン／プロピレン（Ｓ−ＥＰ）タイプのものであり、やはりＳｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な商品名ＫＲＡＴＯＮ（登録商標）下で商業的に入手可能である；シロキサントリブロックコポリマー；およびＰＤＭＳ−ｂ−ＰＣＰＭＳ−ｂ−ＰＤＭＳ（ＰＤＭＳ＝ポリジメチルシロキサン、ＰＣＰＭＳ＝ポリ（３−シアノプロピルメチルシクロシロキサン）。ＤＥＯ−ＣＰＰＯ−ＣＰＥＯトリブロックコポリマー；ＰＥＯ−ＰＤＭＳ−ＰＥＯトリブロックコポリマー［ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）は水性相に可溶性であり、他方、ポリ−ジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）は油相に可溶性である］；ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡトリブロックコポリマー；ポリスチレン−ｂ−ブタジエン−ｂ−スチレン）トリブロックコポリマー［通常用いられる熱可塑性エラストマーであり、ＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎドイツ国からのＳｔｙｒｏｌｕｘを含む］；ポリ（エチレンオキサイド）／ポリ（プロピレンオキサイド）トリブロックコポリマーフィルム［ＢＡＳＦ，Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎドイツ国からのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１０５またはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ４４］；ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）トリブロックコポリマー；ＰＤＭＳ−ＰＣＰＭＳ−ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン−ポリシアノプロピルメチルシロキサン）トリブロックコポリマー；アゾ−機能性スチレン−ブタジエン−ＨＥＭＡトリブロックコポリマー、重合可能な末端基を担う両親媒性トリブロックコポリマー；シンジオタクチックポリメチルメタクリレート（ｓＰＭＭＡ）−ポリブタジエン（ＰＢＤ）−ｓＰＭＭＡトリブロックコポリマー、第三級アミンメタクリレートトリブロック（ＡＢジブロックコポリマー）；生分解性ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＯ−ｂ−ＰＬＧＡトリブロックコポリマー；ポリラクチド−ｂ−ポリイソプレン−ｂ−ポリラクチドトリブロックコポリマー；ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯトリブロックコポリマー；ポリ（イソプレン−ブロック−スチレン−ブロック−ジメチルシロキサン）トリブロックコポリマー；ポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリスチレン−ブロック−ポリ（エチレンオキサイド）トリブロックコポリマー；ポリ（エチレンオキサイド）−ポリ（ＴＨＦ）−ポリ（エチレンオキサイド）トリブロックコポリマー；エチレンオキサイドトリブロック；ポリＥ−カプロラクトン［Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ］；ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）［Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ］；ポリ（ＤＬ−ラクチド）［Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ］；ポリ（Ｌ−ラクチド）［Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ］；ポリ（グリコリド）［Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ］；ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−カプロラクトン）［Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ］；スチレン−イソプレン−スチレントリブロックコポリマー［Ｊａｐａｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｕｂｅｒ  Ｃｏ．］；ＰＥＯ／ＰＰＯトリブロックコポリマー；ＰＭＭＡ−ｂ−ＰＩＢ−ｂ−ＰＭＭＡ［線状トリブロックＴＰＥ］；ＰＬＧＡ−ブロック−ＰＥＯ−ブロック−ＰＬＧＡトリブロックコポリマー［スルホン化スチレン／エチレン−ブチレン−スチレン（Ｓ−ＳＥＢＳ）ＴＢＣポリマープロトン伝導性膜。Ｄａｉｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃ，Ｏｄｅｓｓａ  ＦＬからＰｒｏｔｏｌｙｔｅ  Ａ７００として入手可能］；ポリ（１−ラクチド）−ブロック−ポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（１−ラクチド）トリブロックコポリマー；ポリ−エステル−エステル−エステルトリブロックコポリマー；ＰＬＡ／ＰＥＯ／ＰＬＡトリブロックコポリマー；ＰＣＣ／ＰＥＯ／ＰＣＣトリブロックコポリマー［前記ポリマーは２以上の混合物で用いることができる。例えば、第１のポリマーの重量パーセントで測定した２つのポリマー混合物において、そのような混合物は２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％または４５〜５０％を含むことができる。］；Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｄｏｒｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，カナダ国から入手可能な様々なブロックコポリマー、以下のものを含む。ポリ（ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−メチルメタクリレート−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート）；ポリ（ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−スチレン−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート）［Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．］；ポリ（ｔ−ブチルメタクリレート−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−ｔ−ブチルメタクリレート）；ポリ（ｔ−ブチルメタクリレート−ｂ−メチルメタクリレート−ｂ−ｔ−ブチルメタクリレート）；ポリ（ｔ−ブチルメタクリレート−ｂ−スチレン−ｂ−ｔ−ブチルメタクリレート）；ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−ブタジエン（１，４−付加）−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−ｎ−ブチルアクリレート−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−ｔ−ブチルメタクリレート−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−ジメチルシロキサン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−スチレン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−２−ビニルピリジン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（ブタジエン（１，２付加）−ｂ−スチレン−ｂ−ブタジエン（１，２付加））；ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−スチレン−ｂ−ブタジエン（１，４付加））；ポリ（エチレンオキサイド−ｂ−プロピレンオキサイド−ｂ−エチレンオキサイド）；ポリ（エチレンオキサイド−ｂ−スチレン−ｂ−エチレンオキサイド）；ポリ（ラクチド−ｂ−エチレンオキサイド−ｂ−ラクチド）；ポリ（ラクトン−ｂ−エチレンオキサイド−ｂ−ラクトン）；ａ，ｗ−ジアクリロニル末端ポリ（ラクチド−ｂ−エチレンオキサイド−ｂ−ラクチド）；ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−ブタジエン（１，４付加）−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−ブチレン−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−ｎ−ブチルアクリレート−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−スチレン）［Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．，］；ポリ（スチレン−ｂ−エチルアクリレート−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−エチレン−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−イソプレン−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−エチレンオキサイド−ｂ−スチレン）；ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−ブタジエン（１，２付加）−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−スチレン−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（４−ビニルピリジン−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（４−ビニルピリジン−ｂ−メチルメタクリレート−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（４−ビニルピリジン−ｂ−スチレン−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（ブタジエン−ｂ−スチレン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸−ｂ−メチルメタクリレート）：ポリ（スチレン−ｂ−ブタジエン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−ブタジエン−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（スチレン−ｂ−ブタジエン−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（スチレン−ｂ−ｔ−ブチルメタクリレート−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（スチレン−ｂ−ｔ−ブチルメタクリレート−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（スチレン−ｂ−イソプレン−ｂ−グリシジルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−ａ−メチルスチレン−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−ａ−メチルスチレン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−２−ビニルピリジン−ｂ−エチレンオキサイド）；ポリ（スチレン−ｂ−２−ビニルピリジン−ｂ−４−ビニルピリジン）。
【００７０】
前記ブロックコポリマーは単独で、あるいは同一または異なるクラスの２以上の混合物で用いることができる。例えば、第一のポリマーの重量パーセントで測定した２つのブロックコポリマーの混合物において、そのような混合物は１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％または４５〜５０％を含むことができる。３つのポリマーを用いる場合、最初のものはポリマー成分全部の１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％または４５〜５０％を含むことができ、第二のものは残りの１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％または４５〜５０％であり得る。
【００７１】
もう１つの方法を述べれば、混合物中の各ブロックコポリマーの量は、用いるブロックコポリマーの性質および数ならびに得られるべき所望の特性に従ってかなり変化し得る。しかしながら、一般には、本発明に従う混合物の各ブロックコポリマーは、膜または溶液中の全ポリマーの重量に基づいて少なくとも約１０％の量で存在させる。これらの同一の一般的範囲は１以上のポリマー、コポリマーおよび／またはブロックコポリマーとの混合物から生産される膜に適用される。また、単一のポリマー、コポリマーまたはブロックコポリマーを少量の区別されるポリマー、コポリマーまたはブロックコポリマー、１．０重量％と少ない膜で「ドープ」して、膜の特性を調整することができる場合もある。
【００７２】
本発明の実施形態は、限定されるものではないが、Ａ−Ｂ、Ａ−Ｂ−ＡまたはＡ−Ｂ−Ｃブロックコポリマーを含む。Ａ（またはＣ）のトリブロックコポリマーについての平均分子量は、例えば、１，０００〜１５，０００ダルトンであって、Ｂの平均分子量は１，０００〜２０，０００ダルトンである。より好ましくは、ブロックＡおよび／またはＣは約２，０００〜１０，０００ダルトンの平均分子量を有し、ブロックＢは約２，０００〜１０，０００ダルトンの平均分子量を有する。
【００７３】
ジブロックコポリマーを用いるならば、Ａについての平均分子量は約１，０００〜２０，０００ダルトンの間、より好ましくは、約２，０００〜１５，０００ダルトンである。Ｂの平均分子量は約１，０００〜２０，０００ダルトンの間、より好ましくは、約２，０００〜１５，０００ダルトンである。
【００７４】
好ましくは、ブロックコポリマーは、（ｉ）予期される操作および貯蔵温度にて固体を提供し、（ｉｉ）ミセルよりはむしろ膜様構造の形成を促進するように選択された疎水性／親水性バランスを有する。より好ましくは、疎水性含有量（またはブロック）は親水性含有量（またはブロック）を超える。従って、ジブロックまたはトリブロックコポリマーの少なくとも１つのブロックは好ましくは親水性である。湿潤可能な膜が可能であるが、好ましくは、疎水性および親水性合成ポリマー材料の含有量は膜をわずかに湿潤性とする。
【００７５】
前記したように、本発明の１つの好ましい実施形態において、合成ポリマー材料の混合物を用いて製造された生体適合性膜が提供される。そのような混合物は、それらの各ブロックの分子量を除いて同一である２以上のブロックコポリマーの混合物であり得る。例えば、生体適合性膜は、その双方がポリ（２−メチロオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ−２−メチロオキサゾリン）であり、その１つが２ｋＤ−５ｋＤ−２ｋＤの平均分子量を有し、他方が３ｋＤ−７ｋＤ−３ｋＤの平均分子量を有し、かつ第二のブロックコポリマーに対する第一のブロックコポリマーの比率が用いる全合成ポリマー材料の約６７％〜３３％ｗ／ｗである２つのブロックコポリマーの混合物を用いて製造することができる。この短い参照は、大部分のブロックコポリマーの第一のブロックが約２０００ダルトンの分子量を有し、第二のブロックが５０００ダルトンの分子量を有し、第三のブロックが２０００ダルトンの分子量を有することを意味する。小さな割合のブロックコポリマーは、各々、約３０００、７０００および３０００ダルトンのブロックを有する。
【００７６】
さらに、２以上の全く異なるブロックコポリマーを用いることができ、それらの各ブロックのサイズのみが異なる異なるブロックコポリマーおよび同一ブロックコポリマーの混合物も考えられる。しかしながら、混合物はブロックコポリマーに限定されない。
【００７７】
ポリマーおよびコポリマーは単独で、組み合わせて、本発明に従うブロックコポリマーと組み合わせて用いて、本明細書中に記載する特性を有する生体適合性バリアおよび膜を製造することができる。有用なポリマーおよびコポリマーは、好ましくは、室温（約２５℃）で固体である。それらは、用いるいずれかの他の合成ポリマー材料、用いるいずれかの添加剤、および用いるポリペプチドを収容することができる溶媒または溶媒系に溶解させることができる。生体適合性膜を製造するのに有用なポリマーおよびコポリマーは
、限定されるものではないが、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサンのようなポリアルキルおよびポリジアルキルシロキサン、ポリメチルメタクリレートのようなポリアクリレート、ポリブタジエンのようなポリアルケン、ポリアルキレンおよびポリアルキレングリコール、スルホン化ポリスチレン、ポリジエン、ポリオキシラン、ポリ（ビニルピリジン）、ポリオレフィン、ポリオレフィン／アルキレンビニルアルコールコポリマー、エチレンプロピレンコポリマー、エチレン−ブテン−プロピレンコポリマー、エチルビニルアルコールコポリマー、過フッ素化スルホン酸、塩化ビニルおよびアクリロニトリルのコポリマーのようなビニルハロゲンポリマーおよびコポリマー、メタクリル酸／エチレンコポリマーおよび他の可溶性であるが一般には疎水性のポリマーおよびコポリマー（全て分子量は約５，０００および約５００，０００の間）を含む。特に好ましいポリマーはポリ（ｎ−ブチルアクリレート）；ポリ（ｔ−ブチルアクリレート）；ポリ（エチルアクリレート）；ポリ（２−エチルヘキシルアクリレート）；ポリ（ヒドロキシプロピルアクリレート）；ポリ（メチルアクリレート）；ポリ（ｎ−ブチルメタクリレート）；ポリ（ｓ−ブチルメタクリレート）；ポリ（ｔ−ブチルメタクリレート）；ポリ（エチルメタクリレート）；ポリ（グリシジルメタクリレート）；ポリ（２−ヒドロキシプロピルメタクリレート）；ポリ（メチルメタクリレート）；ポリ（ｎ−ノニルメタクリレート）；ポリ（オクタデシルメタクリレート）；ポリブタジエン（１，４−付加）；ポリブタジエン（１，２−付加）；ポリイソプレン（１，４−付加）；ポリイソプレン（１，２−付加および１，４付加）；ポリエチレン；ポリ（ジメチルシロキサン）；ポリ（エチルメチルシロキサン）；ポリ（フェニルメチルシロキサン）；ポリプロピレン；ポリ（プロピレンオキサイド）；ポリ（４−アセトキシスチレン）；ポリ（４−ブロモスチレン）；ポリ（４−ｔ−ブチルスチレン）；ポリ（４−クロロスチレン）；ポリ（４−ヒドロキシルスチレン）；ポリ（ａ−メチルスチレン）；ポリ（４−メチルスチレン）；ポリ（４−メトキシスチレン）；ポリスチレン；アイソタクチックポリスチレン；シンジオタクチックポリスチレン；ポリ（２−ビニルピリジン）；ポリ（４−ビニルピリジン）；ポリ（２，６−ジメチル−ｐ−フェニレンオキサイド）；ポリ（３−（ヘキサフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）スチレン）；ポリイソブチレン；ポリ（９−ビニルアントラセン）；ポリ（４−ビニル安息香酸）；ポリ（４−ビニル安息香酸ナトリウム塩）；ポリ（塩化ビニルベンジル）；ポリ（３（４）−ビニルベンジルテトラヒドロフルフリルエーテル）；ポリ（Ｎ−ビニルカルバゾール）；ポリ（２−ビニルナフタレン）およびポリ（９−ビニルフェナントレン）を含む。ポリマーおよびコポリマーは一般には合成ポリマー材料であるので、それらは、ブロックコポリマーおよび混合物について既に記載したのと同一量で用いることができる。
【００７８】
本発明の特に好ましい態様において、生体適合性膜は合成ポリマー材料、好ましくは、少なくとも１つのブロックコポリマー（最も好ましくは、少なくとも部分的には両親媒性であるもの）および生体適合性膜を安定化させることができる合成ポリマー材料を含む。ある種のポリマー、最も顕著には、複数の水素結合（「水素結合リッチ」）を形成することができる親水性ポリマーおよびコポリマーは膜を安定化できることが判明した。安定化ポリマーの文脈では、用語「ポリマー」はモノマー、ポリマーおよびコポリマーを含む。この文脈では、「疎水性」は、安定化ポリマーが水または水混和性溶媒に溶解する、または可溶化することを意味する。いずれかの特定の操作理論に拘束される意図はないが、そのようなポリマーの使用は、生体適合性膜の構造にポリペプチドを機能的に一体化させるのを援助することができると考えられる。安定化ポリマーは、生体適合性膜に、同一条件に暴露された場合に安定化ポリマーなくして製造された同一の生体適合性膜と比較した場合に、より大きな操作寿命および／または機械的欠陥に対するより大きな抵抗性を付与する。合成ポリマー材料が分析物センサーで用いられる安定化ポリマーを含む安定化された生体適合性膜は、例えば少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約５０％、最も好ましくは少なくとも約１００％の増大した操作寿命を要することができる。
【００７９】
本発明の生体適合性膜においてポリペプチドを安定化することができる特に好ましいポリマーはデキストラン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキサイド、ポリアクリルアミド、およびポリアルキレンアミンを含む。これらの安定化ポリマー（再度、コポリマーを含む）は、一般には、合成ポリマー材料として用いられるポリマーおよびコポリマーよりも低い平均分子量を有する。それらの分子量は、一般に、約１，０００ダルトン〜約１５，０００ダルトンの範囲である。生体適合性膜を安定化することができる特に好ましいポリマーは、限定されるものではないが、約２，０００および約１０，０００の間の平均分子量を有するポリエチレングリコール、約２，０００および約１０，０００の間の平均分子量を有するポリエチレンオキサイド、約５，０００および１５，０００ダルトンの間の平均分子量を有するポリアクリルアミドを含む。他の安定化ポリマーはポリプロピレン、ポリ（ｎ−ブチルアクリレート）；ポリ（ｔ−ブチルアクリレート）；ポリ（エチルアクリレート）；ポリ（２−エチルヘキシルアクリレート）；ポリ（ヒドロキシプロピルアクリレート）；ポリ（メチルアクリレート）；ポリ（ｎ−ブチルメタクリレート）；ポリ（ｓ−ブチルメタクリレート）；ポリ（ｔ−ブチルメタクリレート）；ポリ（エチルメタクリレート）；ポリ（グリシジルメタクリレート）；ポリ（２−ヒドロキシプロピルメタクリレート）；ポリ（メチルメタクリレート）；ポリ（ｎ−ノニルメタクリレート）；およびポリ（オクタデシルメタクリレート）を含む。
【００８０】
生体適合性膜で用いる安定化ポリマーの量は、特性においていくらか測定可能な改良が実現され、かつ生体適合性膜の機能が不適切にも阻害されない限り臨界的ではない。機能および寿命のいくらかの釣合が予測される。しかしながら、一般には、仕上げられた生体適合性膜で見出される合成ポリマー材料全量の関数としての用いる安定化ポリマーの量（重量）は、一般には、１／３以下、典型的には３０重量％以下である。好ましくは、用いる量は５および約３０％の間、より好ましくは約５および約１０重量％の間であり、仕上げられた膜において合成ポリマー材料の約１５重量％が用いられる。
【００８１】
１以上のポリマー、コポリマーおよび／またはブロックコポリマー、および／または安定化ポリマーに加えて、本発明の合成ポリマー材料は少なくとも１つの添加剤を含むことができる。ポリペプチドである添加剤が用いられる。なぜならば、ポリペプチドは脂質のようなある種の添加剤の存在を好み、またはそれを要するからである。添加剤は架橋剤および脂質、脂肪酸、ステロールおよび他の天然生物学的膜成分ならびにそれらの合成類似体を含む。これらは、一般に、溶液中である場合、合成ポリマー材料に添加される。これらの添加剤は、もしまさに存在すれば、一般には、合成ポリマー材料の重量に基づいて、約０．５０％および約３０％の間、好ましくは約１．０％および約１５％の間の量で見出される。
【００８２】
生体適合性膜が架橋部位を取り込む場合、架橋で有用な手法はラジカル生成剤またはラジカル増殖剤との化学的架橋、およびさらなるラジカル増殖剤を含むまたは含まない、光化学ラジカル発生を介する架橋を含む。パラメーターは、膜材料、生体適合性膜セグメントのサイズ、支持体の構造などのような条件に依存して調整することができる。ポリペプチドに対する損傷を最小化するように注意すべきである。１つの特に有用な方法は、中性ｐＨで過酸化物を用い、続いて酸性化することを含む。
【００８３】
［プロトン・トンネリング膜］
本発明の１つの態様は２つの区画を分離するバリアを有する分析物センサーを含み、該バリアは比較的プロトン透過性であるが、該バリアを横切ってのプロトンの輸送に関与することができる。特定の操作理論に拘束される意図はないが、そのような輸送はプロトン・トンネリングの結果と考えられる。
【００８４】
本発明のさらにもう１つの実施形態は、膜の第一の側から第二の側へのプロトンの輸送に関与することができる少なくとも１つのポリペプチドに関連付けられたＰＴＭと共にバリアを含有する分析物センサーであって、輸送を促進する分子構造の形成を含むことができる、分析物センサーである。好ましくは、ポリペプチドは、それがＰＴＭを横切ってプロトンを輸送することに関与できるように、ＰＴＭと会合する。１つの実施形態において、そのようなポリペプチドは、通常、ＰＴＭに結合した、またはそれと隣接する別々の生体適合性膜の一部として提供される。もう１つの実施形態において、そのようなポリペプチドは、現実には、ＰＴＭの一部である。そのような膜は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、「Ｐｒｏｔｏｎ−Ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｅｌ  Ｃｅｌｌｓ」なる発明の名称の同時係属仮出願第６０／４１５，６８６号に詳細に記載されている。
【００８５】
「プロトン・トンネリング」は、観察された現象を記載するのに本明細書中で用いられる語である。プロトン・トンネリング膜またはバリアは、好ましくは固体、液体、気体、イオンおよび、特に、プロトンの流れに対して不浸透性である合成ポリマー材料（ポリマー、コポリマー、ブロックコポリマーおよびその混合物）の１以上の層を含む。少なくとも、電流により測定した場合、プロトンの流れの大部分は、これらの膜を横切るプロトン・トンネリングの結果であると考えられ、単なるプロトン透過性の結果ではない。本明細書中で用いるように、用語「比較的プロトン不浸透性」は、電流またはプロトンの流れが（ある条件下で）層または膜を横切って起きるが、そのような電流の少量は、もしあれば、プロトン透過性によるものであることを意味する。プロトン・トンネリングは、特に、ポリペプチドを含まない層または膜における残りの電流の輸送についての理由であると考えられる。しかしながら、たとえ説明としてのプロトン・トンネリングが不完全または不正確であったとしても、プロトン透過性によるものではありえない電流は測定可能な事実である。それは、本発明に関するプロトンのこの流れであり、「比較的プロトン不浸透性」という語は、合成ポリマー材料が、適切に選択され、層または膜に形成される場合に、その大部分が浸透性以外のメカニズムを介するプロトンの流れを許容するという事実を反映することを意味する。なお、これらのプロトン・トンネリング膜またはバリアは、本発明の最も好ましい実施形態に当てはまるように完全にプロトン不透過性であっても、誘電性ではない。これは、適当な材料を用い、その材料が本明細書中に記載されるように適切に調製される場合、プロトンの流れを許容することを意味する。適切に製造され、かつ使用されれば、完全に誘電性であると予測されていた、プロトン・トンネリングが可能な合成ポリマー材料の層は、事実、層の一方側から他方側へのプロトン輸送を効果的に可能とすることが判明した。本発明の基準を満足し、そのような挙動を呈する膜は、本明細書中では、プロトン・トンネリング挙動を呈するといい、これは、プロトン・トンネリング膜または「ＰＴＭ」である。
【００８６】
本明細書中で議論した理由で、プロトン・トンネリングは、ＰＴＭのポリマー材料内でのプロトンとある種のパイ結合との間のカチオン相互作用のため起こると考えられる。この相互作用は、過剰の正の電荷によって駆動されると考えられる。プロトンの運動エネルギーの量を修飾することによっておよび／または層内で用いられるポリマー材料のプロトン親和性の性質を改変することによって、層を横切ってのプロトン移動の速度および程度を調整、および最も好ましくは増加させることができる。
【００８７】
この現象は、ポリスチレン系ポリマーのようなある種のポリマー材料で起こることが本発明者らによって観察されており、ここに、ベンゼン環内の非局在化電子雲がプロトンに対して量子井戸（またはトラップ）として働く。現象としての、芳香族構造とのカチオンの結合は、カチオンおよび有機溶媒、またはアミノ酸に関するごとき他の文脈で注記されてきた。（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ａ．，「Ｃａｔｉｏｎ  Ｐｉ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｅｎｚｅｎｅ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，ａｎｄ  Ｔｒｐ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１６３−１６８（１９９６）；Ｓｃｒｕｔｔｏｎ，Ｎ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｒａｉｎｅ，Ａ．Ｒ．Ｃ．，「Ｃａｔｉｏｎ−Ｐｉ  ｂｏｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ−ａｒｏｍａｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｌｉｇａｎｄｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１９：１−８（１９９６）；Ｃｕｂｅｒｏ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｓ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｉｎ  ｃａｔｉｏｎ−Ｐｉ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ？」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：５９７６−８０（１９９８）；Ｇａｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｐ．およびＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ａ．，「Ｃａｔｉｏｎ−Ｐｉ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：９４５９−６４（１９９９）；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｃａｔｉｏｎ−Ｐｉ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：４８７３−７６（２００２）参照のこと）。
【００８８】
今回、本発明によるポリマー層においては、量子井戸、またはそのような井戸の間の連続経路が芳香族環の存在によって作り出され得ることが判明した。これらの環がメチル基のような電子雲を強化する置換基を担う場合、あるいは非共役環またはジ芳香族またはポリ芳香族の場合に、プロトン・トンネリング活性は、低下することが判明した。もし、別法として、置換基が電子雲を弱めるならば、ハライド置換スチレンに関しては、プロトン・トンネリング活性は増強される。これらの結果は現在の研究に合致する。
【００８９】
いずれかの特定の操作理論に制限されることなく、本発明のポリマー膜内部のプロトンは量子井戸によってトラップできると考えられる。トンネリング効果を介して膜に入る、膜の一方側から入手可能なエネルギー性プロトンがなければ、膜それ自体は、一般にはプロトンに対して不透過性のままである。１つのプロトンがトンネリングを介して膜に入れば、もう１つのプロトンは、エネルギーまたはプロトンが移動するにつれ、膜の他方側から出ると考えられる。これは、なぜプロトン輸送が、濃度勾配によるよりもむしろ過剰な電荷によって駆動されるように見えるかを説明できる。
【００９０】
本発明による「量子井戸」もまた、特定の観察を説明するのに用いられる用語である。しかしながら、それは限定することを意図しない。量子井戸はエネルギーバリアの概念化である。井戸がより深くなれば、トンネリングに必要なエネルギーは多くなる。本発明で有用でないある種のポリマー材料においては、プロトンの層の一方側から他方側への伝達が可能ではない。説明として量子井戸を用い、これらのポリマー材料は、プロトンをトラップし、プロトン・トンネリングをクエンチできる非常に深い井戸を表わす。概念的には、運動エネルギーがいかなるものであっても、前提の内では、プロトンは、そのような井戸を通じて、またはそれからトンネリングを行うには不十分であろう。そのような材料が、本発明によると完全に誘電性である。井戸がより狭くなれば、プロトンが層から逃げ、それを通ってトンネリングできる確立は高くなる。プロトンの運動エネルギーの量を調整することによっておよび／または井戸の深さを調整することによって（ある種の芳香族またはプロトンについての共鳴種の電子雲の親和性）、プロトン・トンネリングの確立を増加または減少させ、プロトン流の速度および密度を増加させることができる。
【００９１】
ジューテリウムのようなプロトン種の、「余りにも深い」井戸への強い結合、すなわち、ジューテリウム含有液体へのそのような材料の浸漬を検出するには、液体を交換し、材料からのジューテリウムの喪失速度を見る。特徴的に「余りにも浅い」井戸を含む材料はプロトンを移動させず、また対照を超えるレベルで測定可能にジューテリウムに結合しないであろう。
【００９２】
ＰＴＭは（親密に接触したまたは相互に隣接した層を含めた）単一層または複数層であってよく、ＰＴＭは固体支持体（バリア）に結合できるか、あるいはそうでなければ誘電性材料の開口または孔を横切って伸びるか、誘電性材料の開口または孔内に配置することができる。あるいは、独立構造のプロトン・トンネリングバリアを使用することができる。
【００９３】
１つの実施形態において、本発明は、第二の区画から第一の区画を分離する合成ポリマー材料の少なくとも１つの層を有する膜を含む。該層は比較的プロトン不透過性であって、誘電性ではなく、かつ、第一の側から第二の側へのプロトンの輸送に関与することができる。用いる合成ポリマー材料は、好ましくは、共鳴を呈する少なくとも１つの種、より好ましくは、少なくとも１つの芳香族基を含む。合成ポリマー材料は、好ましくは、比較的低い静電結合エネルギーおよび／または比較的低い分極エネルギーの量を有する。
【００９４】
一般的な事項において、ＰＴＭは、プロトン・トンネリングを呈する合成ポリマー材料を選択し、第一の側および第二の側を有する合成ポリマー材料から層を形成することによって作成される。層は、層の第一の側から層の第二の側へプロトンを輸送することができなければならない。
【００９５】
合成ポリマー材料を選択するにおいて、限定されるものではないが、考慮する材料の量子井戸の深さ、プロトン・トンネリングについてのその性質、一般的には薄いが不透過性の層がその材料から製造できるか否か、材料が少なくとも比較的プロトン不透過性である比較的薄い層を製造できるか否か、相対的静電結合エネルギーおよび／または相対的分極エネルギーを含めた多数の因子を考慮することができる。
【００９６】
本発明によれば、ＰＴＭについての２つの基本的基準がある。まず、それは、透過性以外のメカニズムを介して、好ましくはプロトン・トンネリングを介して、プロトン、好ましくは比較的低くさえある運動エネルギーのプロトンの流れを可能とし、促進し、または刺激する材料から作成されなければならない。これらの材料は比較的浅い量子井戸を有すべきである。比較的プロトン不透過性であるポリマー層を用いることができるが、膜を形成するポリマー層はできる限りプロトン不透過性であるのが好ましい。透過性が低くなると、より良好である。従って、偶然のプロトンの遺漏または層からの濾過を除いて全て排除する、「実質的に全体がプロトン不透過性」である材料を用いるのが好ましい。第２に、ＰＴＭは、プロトン・トンネリングを起こさせる方法で製造しなければならない。
【００９７】
第一の基準に関しては、全ての材料がプロトン・トンネリングを可能としたり、それを促進したりするのではない。プロトン・トンネリング活性は、例えば、膜がブチレンのような非共役不飽和ポリマー成分を含む場合に見掛け上ブロックされる。１−２ブタジエンおよびポリスチレンのコポリマー（Ｐ２８６７  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．）は、その双方がポリスチレン−ポリ１−４ブタジエン−ポリスチレントリブロックコポリマーである、Ｐ１２７（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ）または３Ｇ５５（ＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，ドイツ国）で製造される膜中２０％ｗ／ｗと低いところで、プロトン・トンネリング活性の劇的な低下を呈する。プロトン・トンネリング活性の完全なクエンチングは５０％ｗ／ｗだけ起こる。他方、そうでなければ、完全にＰ１２７または３Ｇ５５で作成された同一の膜は有意なプロトン・トンネリングを呈する。ポリビニルピリジンのニトロベンゼン環のような別の環構造もまた、プロトン・トンネリング活性を呈するが、プロトン化が電子雲の強度を十分に低下させるのみである。従って、本発明の重要な態様は、プロトン・トンネリングを介してプロトン移動を行うポリマー材料の選択である。選択された材料は、プロトン不透過性である他の固体／半固体三次元構造の層／膜へ形成されることができるべきである。
【００９８】
ベンゼン環のような芳香族基を含むいずれの合成ポリマー材料も、潜在的に、本発明で有用であろう。厳密に言えば芳香族環を保有しないが、共鳴電子を共有することができる他の化学種も有用であろう。共鳴を呈する種を含めたいずれの合成ポリマー材料も可能な候補である。これは、共鳴ハイブリッドを含む。芳香族化合物およびこれに関して共鳴を呈する化合物は、共鳴を呈する複素環を含むことができる。合成ポリマー材料は均一なもの（homogeneous）とすることができ、コポリマーまたはブロックコポリマーまたは混合物であり得る。層または膜で用いられる合成ポリマー材料の全てが、それがモノマーまたはブロックであろうが、プロトン・トンネリングを容易にする能力を保有する必要があるのではない。
【００９９】
前記したように、メチル基または一般的には電子陽性基（electron positive groupe）のような電子雲を強化する基で置換された共鳴構造を呈する化合物はプロトン・トンネリング活性を低下させることができる。これは、より深い井戸を堀り、従って、それをトンネリングが起こるのを困難とすると考えられる。別法として、ハライドのような電気陰性基（electron negative groupe）およびヒドロキシ基のような電子吸引種のような共鳴電子雲を弱める置換基の使用は、プロトン・トンネリングを増強させ、あるいは類似体を完成するためには、より浅い井戸を供することができる。芳香族特徴を呈するが、一般的にはプロトン・トンネリングに導かない他の化合物は、電気陰性種または十分なプロトン化での置換を増加させて、電子雲の強度を減少させることによって、本発明では有用とされ得る。
【０１００】
例えば、本明細書中で議論した溶媒蒸発方法によって製造された純粋なポリスチレン−系ホモポリマー（分子量２５０，０００−Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．Ａ０１４３０２９０１，Ｇｅｅｌ，ベルギー国）から形成された膜はプロトン・トンネリング活性を示した。また、特に有用なポリスチレン系膜は３Ｇ５５のようなポリスチレン−ブロックコポリマーから製造することもでき、ここに、ポリスチレンは柔軟性ブロックで形成され、強力であるが変形可能な膜が形成されるのを可能とする。
【０１０１】
プロトン・トンネリングの程度および、もしあれば、プロトン透過性の程度のテストは慣用的な方法で行うことができる。１つの好ましい方法は、好ましくは、ＺｎまたはＡｌ金属アノードおよびＰＴＭを有するテストセルを製造することである。テストセルは、まず、カソード区画のｐＨを測定し（カソード区画における電解質のｐＨを測定した）後、２〜２０オームのような所定の負荷下で、所定の時間、一般には約１時間以上作動させる。一旦負荷が除去されたならば、電流および電圧を経時的に測定し、カソード区画のｐＨを最後に測定する。陰極液（カソード区画中の電解質）のｐＨおよび容量のいずれかの測定可能な変化から、透過性を介してアノードからカソードへ膜を横切るプロトンの数を計算することができる。プロトンの合計数、膜の面積、テストの実行時間を用いて、プロトンに対する透過性を計算することができる。テストの間に膜を介してアノードからカソードへ横切るプロトンの正味の数は、電流の流れに相似（analogous）する。プロトン透過性による電流は、テストセルの測定された電流出力から差し引くことができ、その差はプロトン・トンネリングによるものである電流である。一般には全体を通じて真実であるように、「電流」は経時的な電子の流れであって、電流はテストセル中の（および膜を横切る）（プロトンを含めた）イオンの流れを測定するために用いることができる。従って、本明細書中では、「電流」は、しばしば、同様にプロトンの流れを記載するのに用いられる。従って、プロトンの流れを可能としない材料は、本出願の目的では、誘電性である。
【０１０２】
一般に、本発明による層または膜は比較的プロトン不透過性であり、従って、それを横切って流れるいずれの電流の大部分も、プロトン透過性以外の何かによるものであろう。好ましくは、プロトン・トンネリングはプロトンの流れの大部分、より好ましくは、圧倒的大部分に関与するであろう。しかしながら、好ましくは、プロトン透過性と比較したプロトン・トンネリングのような、透過性以外からの電流の相対的割合は１：１よりもかなり大きいであろう。より好ましくは、少なくとも１０：１における電流比が観察される（プロトン・トンネリング：プロトン透過性）。より好ましくは、少なくとも１００：１であり、なおより好ましくは少なくとも１０００：１である。最も好ましくは、電流の全ては透過性以外の何かによるものであり、好ましくは、プロトン・トンネリングによるものである。もちろん、これは、ＰＴＭが実質的にプロトン透過性であることを意味するであろう。一般に、本発明で有用なポリマーは、比較的低い静電結合エネルギーまたは比較的低い量の分極エネルギーのいずれかを有するであろう。好ましくは、双方は低い。事実、比較的高い静電結合エネルギーおよび比較的高い量の分極エネルギーを共に有する材料は、通常は、ＰＴＭベースの分析物センサーで用いられるＰＴＭを形成するのに有用ではない。逆に、もし静電結合エネルギーおよび分極エネルギーの量が共に低ければ、考慮する材料はＰＴＭで用いられる良好な候補である。好ましくは、本発明の分析物センサーで用いられるＰＴＭでは、静電結合エネルギーは約１９．３Ｋｃａｌ／モル未満、より好ましくは１５．０Ｋｃａｌ／モル以下である。分極エネルギーの量は好ましくは約１６．２Ｋｃａｌ／モル未満、より好ましくは１０．０Ｋｃａｌ／モル以下である。静電結合エネルギーおよび分極エネルギーの数値の双方は、静電結合エネルギーおよび分極エネルギー双方を測定し、計算するための方法を記載する目的でここに参照してそのテキストを組み込む、Ｃｕｂｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｓ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｉｎ  ｃａｔｉｏｎ−Ｐｉ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ？」９５Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）５９７６−８０に記載された技術および計算を用いて測定され、計算される。
【０１０３】
これらの特性を呈する合成ポリマー材料の例は、５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチレンからのトリブロックコポリアンフォライト［Ｂｉｅｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｐｈｙｓ．Ｊ．Ｅ．５：５−１２，２００１。それらのポリマーの中にはＡｉ14Ｓ63Ａ23、Ａｉ31Ｓ23Ａ46、Ａｉ42Ｓ23Ａ35、Ａｉ56Ｓ23Ａ21、Ａｉ57Ｓ11Ａ32がある］；スチレン−エチレン／ブチレン−スチレントリブロックコポリマー［（ＫＲＡＴＯＮ）Ｇ  １６５０、２９％スチレン、８０００．溶液粘度（２５重量％ポリマー）、１００％トリブロックスチレン−エチレン／ブチレン−スチレン（Ｓ−ＥＢ−Ｓ）ブロックコポリマー；（ＫＲＡＴＯＮ）Ｇ  １６５２、２９％スチレン、１３５０溶液粘度（２５重量％ポリマー）、１００％トリブロックＳ−ＥＢ−Ｓブロックコポリマー；ＫＲＡＴＯＮ］Ｇ  １６５７、４２００溶液粘度（２５重量％ポリマー）、３５％ジブロックＳ−ＥＢブロックコポリマー。スチレン−エチレン／プロピレン（Ｓ−ＥＰ）タイプは商品名（ＫＲＡＴＯＮ）Ｇ  １７２６下で商業的に入手可能である、２８％スチレン、２００溶液粘度（２５重量％ポリマー）、７０％ジブロックＳ−ＥＰブロックコポリマー；（ＫＲＡＴＯＮ）Ｇ−１７０１Ｘ  ａ３７％スチレン、＞５０，０００溶液粘度、１００％ジブロックＳ−ＥＰブロックコポリマー；および（ＫＲＡＴＯＮ）Ｇ−１７０２Ｘ、２８％スチレン、＞５０，０００溶液粘度、１００％ジブロックＳ−ＥＰブロックコポリマー、全てＳｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡから入手可能］；ポリ（スチレン−ｂ−ブタジエン−ｂ−スチレン）トリブロックコポリマー［通常用いられる熱可塑性エラストマー、ＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，ドイツ国からのＳｔｙｒｏｌｕｘを含む］；アゾ−機能性スチレン−ブタジエン−ＨＥＭＡトリブロックコポリマー、重合性末端基を担う両親媒性トリブロックコポリマー；ポリ（イソプレン−ブロック−スチレン−ブロック−ジメチルシロキサン）トリブロックコポリマー；ポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリスチレン−ブロック−ポリ（エチレンオキサイド）トリブロックコポリマー；スチレン−イソプレン−スチレントリブロックコポリマー［Ｊａｐａｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｃｏ．，ＭＷ＝１４０ｋｇ／モル、ＰＳ／ＰＩ＝１５／８５のブロック比］；［ポリ（スチレン−コ−４−スチレンスルホン酸またはその塩）のアイオノマー；ポリ（スチレン−コ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド）アイオノマー；ポリ（スチレン−コ−Ｎ−メチル４−ビニルピリジニウムヨージド）のアイオノマー；ポリ（スチレン−コ−金属アクリレート）のアイオノマー；ポリ（スチレン−コ−金属メタクリレート）アイオノマー；ポリ（スチレン−コ−金属４−ビニルベンゾエート）のアイオノマー；ビチオフェン標識ポリスチレン；ブロモ−ビチオフェン標識ポリスチレン；３−アームポリスチレン；４−アームポリスチレン８−アームポリスチレン；アミノ末端ポリ（スチレン−ｂ−イソプレン）；アミノ末端ポリスチレン；カルボキシ末端ポリエステル；塩化カルボキシル末端ポリスチレン；クロロ末端ポリスチレン；ジメチルクロロシラン末端ポリスチレン；ジメチルシラン末端ポリスチレン；ヒドロキシ末端ポリスチレン；スルホン酸ナトリウム塩末端ポリスチレン；スルホン酸末端ポリスチレン；チオール末端ポリスチレン；ビニル末端ポリスチレン；α，ω−ジカルボキシ末端ポリスチレン；α，ω−ジヒドロキシ末端ポリスチレン；α−ヒドロキシ−ω−スチレン末端ポリスチレン；α−ヒドロキシル−ω−アミノ末端ポリスチレン；α−ヒドロキシル−ω−カルボキシ末端ポリスチレン；α，ω−ジスルホン酸末端ポリスチレン；アミノ末端ポリ（２−ビニルピリジン）；カルボキシ末端ポリ（２−ビニルピリジン）；クロロ末端ポリ（２−ビニルピリジン）；ジメチルクロロシラン末端ポリ（２−ビニルピリジン）；ヒドロキシ末端ポリ（２−ビニルピリジン）；チオール末端ポリ（２−ビニルピリジン）；ビニル末端ポリ（２−ビニルピリジン）；α，ω−ジヒドロキシ末端ポリ（２−ビニルピリジン）；α，ω−ジカルボキシ末端ポリ（２−ビニルピリジン）；カルボキシ末端ポリ（４−ビニルピリジン）；ヒドロキシ末端ポリ（４−ビニルピリジン）；ビニル末端ポリ（４−ビニルピリジン）；ランダムコポリマーポリ（スチレン−コ−４−ブロモスチレン）；ランダムコポリマーポリ（スチレン−コ−ｔ−ブチル−４−ビニルベンゾエート）；ランダムコポリマーポリ（スチレン−コ−ｔ−ブチルメタクリレート）；ランダムコポリマーポリ（スチレン−コ−ブタジエン）；ランダムコポリマーポリ（スチレン−コ−ｐ−カルボキシルクロロスチレン）；ランダムコポリマーポリ（スチレン−コ−ｐ−クロロメチルスチレン）；ランダムコポリマーポリ（スチレン−コ−メチルメタクリレート）；ランダムコポリマーポリ（スチレン−コ−４−ＯＨスチレン）；ランダムコポリマーポリ（スチレン−コ−４−ビニル安息香酸）；交互コポリマーポリ（カルボｔｅｒｔ．ブトキシα−メチルスチレン−アルト−無水マレイン酸）；交互コポリマーポリ（ａ−メチルスチレン−アルト−メチルメタクリレート）；交互コポリマーポリ（スチレン−アルト−メチルメタクリレート）；ポリ（ブタジエン−ｂ−スチレン−Ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−ブタジエン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−ブタジエン−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（スチレン−ｂ−ブタジエン−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（スチレン−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−ｔ−ブチルメタクリレート−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（スチレン−ｂ−ｔ−ブチルメタクリレート−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（スチレン−ｂ−イソプレン−ｂ−グリシジルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−ａ−メチルスチレン−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−ａ−メチルスチレン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−２−ビニルピリジン−ｂ−エチレンオキサイド）；ポリ（スチレン−ｂ−２−ビニルピリジン−ｂ−４−ビニルピリジン；ポリ（ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−スチレン−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート）；ポリ（ｔ−ブチルメタクリレート−ｂ−スチレン−ｂ−ｔ−ブ��ルメタクリレート）；ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−スチレン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−２−ビニルピリジン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−スチレン−ｂ−ブタジエン（１，４付加））；ポリ（エチレンオキサイド−ｂ−スチレン−ｂ−エチレンオキサイド）；ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−ブタジエン（１，４付加）−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−ブチレン−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−ｎ−ブチルアクリレート−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−エチルアクリレート−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−エチレン−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−イソプレン−ｂ−スチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−エチレンオキサイド−ｂ−スチレン）；ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−ブタジエン（１，２付加）−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−スチレン−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（４−ビニルピリジン−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（４−ビニルピリジン−ｂ−メチルメタクリレート−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（４−ビニルピリジン−ｂ−スチレン−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（イソプレン−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨウジド）；ポリ（ブタジエン−ｂ−Ｎ−メチル４−ビニルピリジニウムヨウジド）；ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸）；ポリ（スチレン−ｂ−アクリルアミド）；ポリ（スチレン−ｂ−セシウムアクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸ナトリウム）；ポリ（スチレン−ｂ−メタクリル酸）；ポリ（スチレン−ｂ−メタクリル酸ナトリウム）；ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド）；ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−メチル−４−ビニルピリジニウムヨージド）；ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−エチレンオキサイド）；ポリ（Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド−ｂ−エチレンオキサイド）；ポリ（Ｎ−メチル４−ビニルピリジニウムヨージド−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（ｔ−ブチルアクリレート−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（２−エチルヘキシルアクリレート−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（ｔ−ブチルメタクリレート−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（ｔ−ブチルメタクリレート−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（ブタジエン−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（イソプレン（１，４付加）−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（イソプレン（１，２付加）−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（イソプレン（１，４付加）−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（エチレン−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（エチレン−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（イソブチレン−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（スチレン−ｂ−ブタジエン（１，４付加））；ポリ（スチレン−ｂ−ｎ−ブチルアクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−ｔ−ブチルアクリレー��）；ポリ（スチレン−ｂ−ｔ−ブチルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−ｎ−ブチルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−ｔ−ブチルスチレン）；ポリ（スチレン−ｂ−ε−カプロラクトン）；ポリ（スチレン−ｂ−シクロヘキシルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）；ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−ジメチルシロキサン）；ポリ（スチレン−ｂ−グリシジルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）；コレステリルクロロホルメートを含むポリ（スチレン−ｂ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）；ポリ（スチレン−ｂ−イソプレン（１，４付加））；ポリ（スチレン−ｂ−Ｌ−ラクチド）；ポリ（スチレン−ｂ−メチルアクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−ｎ−プロピルメタクリレート）；ポリ（スチレン−ｂ−メチルメタクリレート（アイソタクチック））；ポリ（スチレン−ｂ−２−ビニルピリジン）；ポリ（スチレン−ｂ−４−ビニルピリジン）；テーパー付きブロックコポリマーポリ（スチレン−ｂ−ブタジエン）；テーパー付きブロックコポリマーポリ（スチレン−ｂ−エチレン）；ポリ（２−ビニルナフタレン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−ｅ−カプロラクトン）；ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−４−ビニルピリジン）；ポリ（４−ビニルピリジン−ｂ−メチルメタクリレート）；ポリ（２−ビニルＮ−メチルピリジニウムヨージド※）；ポリ（４−ビニル−Ｎ−メチルピリジニウムヨージド※）；ポリ（スチレンスルホン酸）；ポリ（４−アセトキシスチレン）；ポリ（４−ブロモスチレン）；ポリ（４−ｔ−ブチルスチレン）；ポリ（４−クロロスチレン）；ポリ（４−ヒドロキシルスチレン）；ポリ（ａ−メチルスチレン）；ポリ（４−メチルスチレン）；ポリ（４−メトキシスチレン）；ポリスチレン；ポリスチレン広分布；アイソタクチックポリスチレン；シン
ジオタクチックポリスチレン；ポリ（２−ビニルピリジン）；ポリ（４−ビニルピリジン）；ポリ（３−（ヘキサフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−スチレン）；ポリ（４−ビニル安息香酸）；ポリ（塩化ビニルベンジル）；ポリ（３（４）−ビニルベンジルテトラヒドロフルフリルエーテル）；ポリ（Ｎ−ビニルカルバゾール）；前記のすべてはＰｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｄｏｒｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃから入手可能）を含む。
【０１０４】
より好ましくは、非ランダムコポリマーを用いる。本発明による膜を形成するためのアイソタクチックまたはシンジオタクチックポリスチレンのような特によく配向した材料の使用は、プロトン・トンネリングフラックスのなおより高い密度を提供することができる。米国特許第４，９８０，１０１号参照。
【０１０５】
これまでに議論した生体適合性膜に関しては、非ランダムブロックコポリマーから生産されたものを含めた、本発明のＰＴＭと共に安定化ポリマーを用いるのが望ましく、同一の原理、方法および安定化剤を一般に使用することができる。本発明の特に好ましい態様においては、製造されたＰＴＭおよび／またはいずれかの生体適合性膜は合成ポリマー材料、好ましくは少なくとも１つのブロックコポリマー（最も好ましくは、少なくとも部分的には両親媒性であるもの）および膜を安定化できる合成ポリマー材料を含むことができる。
【０１０６】
用いる安定化ポリマーの量は、特性のいくらかの測定可能な改良が実現され、機能が不適切にも妨害されない限り、臨界的ではない。機能および寿命のいくらかの交換が予測される。しかしながら、一般には、仕上げられた膜で見出される合成ポリマー材料の全量（重量）の関数としての、用いる安定化ポリマーの量は、一般には、１／３以下であり、典型的には、３０重量％以下である。好ましくは、用いる量は５および約３０％の間であり、より好ましくは、仕上げられた膜における約５および約１５重量％の合成ポリマー材料を用いる。
【０１０７】
ポリマー材料を使用してＰＴＭを製造する議論に戻ると、前記ポリマー、コポリマーおよびブロックコポリマーは、生体適合性膜の製造と同様に、単独、または同一または異なるクラスの２以上の混合物で用いることができる。
【０１０８】
例えば、第一のポリマーの重量％で測定された２つのブロックコポリマーの混合物において、そのような混合物は１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％または４５〜５０％を含むことができる。３つのポリマーを用いる場合、第一のものは全ポリマー成分の１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％または４５〜５０％を含むことができ、第２のものは残りの１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％または４５〜５０％を含むことができる。
【０１０９】
もう１つの方法を述べれば、混合物中の各ポリマーの量は、用いるポリマーの性質および数ならびに得られる所望の特性に従ってかなり変化させることができる。しかしながら、一般には、本発明による混合物の各ポリマーは、膜または溶液中の全ポリマーの重量に基づいて少なくとも約１０％の量で存在させる。これらの同一の一般的範囲は、１以上のポリマー、コポリマーおよび／またはブロックコポリマーとの混合物から製造されたＰＴＭに適用されるであろう。また、単一ポリマー、コポリマーまたはブロックコポリマーを少量の区別されるポリマー、コポリマーまたはブロックコポリマー、１．０重量％と少量の、膜の特別の特性を調整するための膜で「ドープ」することができる場合もある。
【０１１０】
ＰＴＭは、限定されるものではないが、Ａ−Ｂ、Ａ−Ｂ−ＡまたはＡ−Ｂ−Ｃブロックコポリマーを含むことができる。Ａ（またはＣ）のトリブロックコポリマーについての平均分子量は、例えば、１，０００〜１５，０００ダルトンであり、Ｂの平均分子量は１，０００〜２０，０００ダルトンである。より好ましくは、ブロックＡおよび／またはＣは約２，０００〜１０，０００ダルトンの平均分子量を有し、ブロックＢは約２，０００〜１０，０００ダルトンの平均分子量を有する。
【０１１１】
ジブロックコポリマーを用いるならば、Ａについての平均分子量は約１，０００〜２０，０００ダルトンの間、より好ましくは約２，０００〜１５，０００ダルトンである。Ｂの平均分子量は約１，０００〜２０，０００ダルトンの間、より好ましくは約２，０００〜１５，０００ダルトンである。
【０１１２】
好ましくは、ブロックコポリマーは、（ｉ）予測される操作および貯蔵温度において固体を供し、および（ｉｉ）ミセルよりはむしろ膜様構造の形成を促進するように選択される疎水性／親水性バランスを有する。より好ましくは、疎水性含有量（またはブロック）は親水性含有量（またはブロック）を超えるべきである。従って、ジブロックまたはトリブロックコポリマーの少なくとも１つのブロックは好ましくは疎水性である。湿潤膜が可能であるが、好ましくは、疎水性および親水性合成ポリマー材料の含有量は膜をわずかに湿潤性とする。
【０１１３】
前記のように、本発明の１つの実施形態において、合成ポリマー材料の混合物を用いて製造したＰＴＭが提供される。そのような混合物は、その各ブロックの分子量を除いて同一である２以上のブロックコポリマーの混合物であり得る。例えば、生体適合性膜は、（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅからの）２つのブロックコポリマー３Ｇ５５およびＰ１２７の混合物を用いて製造することができ、第二のブロックコポリマーに対する第一のブロックコポリマーの比率は用いる全合成ポリマー材料の約６７％〜３３％ｗ／ｗである。
【０１１４】
もちろん、２以上の全く異なるブロックコポリマーを用いることができ、その各ブロックのサイズのみが異なる異なるブロックコポリマーおよび同一のブロックコポリマーの混合物も考えられる。しかしながら、混合物はブロックコポリマーに限定されない。
【０１１５】
ポリマーおよびコポリマーは、本発明に従い、単独で、組み合わせて、およびブロックコポリマーと組み合わせて用いて、本明細書中に記載した特性を有するＰＴＭを製造することができる。有用なポリマーおよびコポリマーは、好ましくは、室温（約２５℃）で固体である。それらは、用いるいずれかの他の合成ポリマー材料、用いるいずれかの添加剤、およびもし用いればポリペプチドに適用することができる溶媒または溶媒系に溶解させることができる。
【０１１６】
１以上のポリマー、コポリマーおよび／またはブロックコポリマー、および／または安定化されたポリマーに加えて、本発明の合成ポリマー材料は少なくとも１つの添加剤を含むことができる。添加剤は架橋剤、および脂質、脂肪酸、ステロールおよび他の天然の生物学的膜成分およびそれらの合成類似体を含むことができる。これらは、一般に、溶液中においては、合成ポリマー材料に添加される。これらの添加剤は、もし存在すれば全く、一般に、合成ポリマー材料の重量に基づいて、約０．５０％および約３０％の間、好ましくは約１．０％および約１５％の間の量で見出されるであろう。
【０１１７】
バリア、ＰＴＭまたは生体適合性膜が架橋剤部位を取り込む場合、架橋で有用な手法はラジカル−形成または増殖剤での化学的架橋、およびさらなるラジカル増殖剤を用いてまたは用いることなく光化学ラジカル発生を介する架橋を含む。パラメーターは、膜材料、生体適合性膜セグメントのサイズ、支持体の構造等のような条件に依存して調整することができる。もしあれば、用いるポリペプチドに対する損傷を最小化するように注意すべきである。１つの特に有用な方法は、中性ｐＨにおいて、過酸化物を用い、続いて、酸性化することを含む。
【０１１８】
柔軟性ブロックを持つポリスチレン−系ブロックコポリマーは、プロトン・トンネリング活性を示す、強力であるが変形可能な膜を形成されるのを可能とする。ポリスチレン、ポリフルオロスチレン、ポリクロロスチレンまたはポリブロモスチレンを含めたプロトン・トンネリング活性を呈するホモポリマーで調製物をドーピングすることを介して、いくつかのブロック−コポリマー系膜においてプロトン・トンネリング活性のレベルを増加させることが可能である。
【０１１９】
他の芳香族ポリマー側鎖、ならびにスチレン性ポリマーの別の置換基はそのようなプロトン・トンネリング効果を示すことが予測され、これは、限定されるものではないが、ポリフルオロスチレン、ポリ（ジフルオロ）スチレン、ポリ（トリフルオロ）スチレン、ポリ（ジブロモエチル）スチレン、ポリアミノスチレン、ポリフェノール、クロロおよびフルオロ等を含めた、スチレンで活性であることが見出されたことが同様なピリジン環置換基、シクロペンテンまたはシクロペンタジエンおよびそれらの誘導体、ピロリジンおよびその誘導体、または可逆的にプロトンと結合する親和性、またはそうする能力を呈するいずれかの共役環系を含む。
【０１２０】
しかしながら、適当なポリマー材料を単に選択するのでは一般に不十分である。層または膜が製造される方法は、ＰＴＭを作成することができるか否かにおいて重要な役割を演じることが見出された。すなわち、プロトン・トンネリングに対して高度に伝導性であることが見出された材料の使用は、本発明に従ってＰＴＭを製造するのに十分ではないであろう。
【０１２１】
一般に、本発明によるＰＴＭは、構造的一体性およびプロトン不透過性、好ましくは、実質的に全プロトン不透過性を依然として維持しつつ、できる限り薄くすべきである。この目標を達成する１つの方法は、非常に薄いフィルムを、支持体構造として作用する他の表面にキャストすることによる。例えば、膜または層は、多孔性材料、またはドリリングによるようにしてそれに開口または穴が形成された材料の表面にキャストすることができる。孔または開口は、層の一方側の一部に対するアクセスを可能とし、他方、他の側は完全に露出させることができる。単一の層を全表面を横切ってキャストする代わりに、より小さな膜を隣接する各開口または孔にキャストし、またはそこに置くことができる。もう１つの代替法において、膜または層は開口または孔内に形成することができる。
【０１２２】
別法として、膜は固体表面にキャストし、それから取り出し、いくつかの他の形態の個体支持体の上または中に置くことができる。ポリマー単層または二層はそのような適用で望ましい。
【０１２３】
同様に、より厚い層を製造することができる。一般に、これらの層は約５ミクロン以上の厚みを有することができ、しかしながら、好ましくは、それは出来る限り薄いであろう。十分なプロトン・トンネリング活性が観察される限り、上限は重要ではない。これらの測定は膜の最も広い点で取られる（対向表面の点の間の最大距離）。しかしながら、このタイプの膜を使用する場合、それは図８に示されたもののような構造を含むのが好ましい。図８はＰＴＭ１００の実施形態を断面にて示す。かかる膜は多数の孔１０４を含有し、これは、膜またはインターフェース１０６の比較的狭い部分を規定する。これらの界面領域１０６は、膜１００の周囲の部分１０２よりも有意に薄い。
【０１２４】
これらの界面部分１０６はプロトン・トンネリングの部位、またはプロトン・トンネリングの少なくともより大きな部分である。孔１０４によって作られた比較的薄い界面１０６は、１平方センチ当たり数千個の比較的薄い膜バリアを作ることができ、他方、比較的厚い部分１０２は支持超構造として作用して、構造的一体性を供する。このように、膜１００は孔を含有するフォームに似ている。この文脈において、膜はプロトン不透過性であって、好ましくは実質的に完全にプロトン不透過性でなければならないので、「孔」は、膜１００の厚みを走る、または横切るチャネルと等しくない。そのようなチャネルは透過性を増加させ、従って、一般に望ましくない。孔１０４の幅、深さおよび数は一致したり、または秩序立っている必要はない。しかしながら、好ましくは、膜１００は、比較的薄い部分１０６の含有量を最大化するように形成される。
【０１２５】
図８に示された比較的大きな割合の界面領域１０６を含むＰＴＭを作り出すために本発明に従って使用することができるもう１つの方法は、ミクロ粒子１０８の使用である。他のポリマー材料、トウモロコシ澱粉、ポリスチレンおよびアイソタクチックポリスチレンを含めた何かからミクロ粒子を作成することができる。事実、これらのミクロ粒子は、それ自体が、膜材料それ自身よりもプロトン・トンネリングに対してより伝導性である材料から作成することができる。好ましい粒子は、同素環、複素環、多環、芳香族または混合炭素ベースの環構造を含む材料を用いて製造される。図８に示すように、種々のミクロ粒子１０８によって示された位置は、プロトン・トンネリングに対して影響してもしなくても良い。ミクロ粒子１０８ａは、例えば、膜１００のポリマー材料内に完全に包まれる。この位置決定は、プロトンによるミクロ粒子１０８ａへのアクセスを大いに低下させる。従って、プロトン・トンネリングに対して有益ではないようである。しかしながら、ミクロ粒子１０８ｂは膜１００の１つの表面に配置される。この表面、孔１０４の反対側であるが、膜１００を通る穴を生じない。この結果、膜１００は比較的狭くなり、前記したように界面領域１０６を作り出すと考えられる。プロトン・トンネリングが現実の粒子によって、または比較的より薄い界面領域１０６に対するアクセスを可能とする膜１００の材料および粒子それ自体の間の小さなギャップまたは経路によって促進されるか否かは明らかではない。しかしながら、そのような粒状物質の使用はプロトン・トンネリングを改良することができることが示されている。
【０１２６】
一般に、これらのミクロ粒子は、層／膜１００の厚みよりも大きな少なくとも１つの寸法を有して、それが粒子１０８ａによって示されるように全く包まれないことを確実とすべきである。一般に、粒子のサイズは約１０〜５０ミクロンの範囲とすることができる。粒子の量は、膜が活性で、そのより少ない量にての膜よりもプロトン・トンネリングの点で有利を供する限り、重要ではない。しかしながら、他の膜材料の重量の３〜４倍の重量が通常は現実的な限界である。
【０１２７】
本発明に従ってＰＴＭを作るのに用いられるもう１つの技術は表面湿潤化である。表面湿潤化は、表面の荷電効果を克服することができ、これは、プロトンの移動に干渉し、あるいは、孔内の表面張力の低下を促進し、従って、より完全な湿潤化および、従って、膜の比較的より薄い界面領域に対するプロトンについてのより完全な界面を可能とする以外は何もしない。しかしながら、いずれにせよ、表面湿潤化技術の使用は、ＰＴＭを横切ってプロトンを輸送する能力を大いに増強することが判明した。
【０１２８】
そのような表面湿潤化は、湿潤化剤を取り込む膜の形成、湿潤性を確立するための膜の表面の修飾を通じて、あるいは他の手段によって達成することができる。その例として、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等のような水混和性有機溶媒での表面の単純な処理が、プロトン・トンネリング活性を可能とするのに十分である。しかしながら、ポリマー膜の表面は湿潤剤の添加に対して安定であるのが好ましい。米国特許第６，４３６，６９６号（ここに、リパーゼでの処理はポリエステルの表面湿潤性を改良する）におけるように、表面をポリビニルアルコールまたはグリセロールで、または表面特性を改変する酵素でコーティングするごとき他の処理も可能である。
【０１２９】
米国特許第６，４３３，２４３号または米国特許第６，４４０，５７１号、米国特許出願第２００２０００４１４０号、米国特許出願第２００２０１２０３３３号、米国特許出願第２００２００６１４０６号または米国特許出願第２００２００１７４８７号におけるごとき親水性または両親媒性ポリマーの表面への結合またはグラフティング、または米国特許出願第２００２００５１８４５号におけるごとき超臨界二酸化炭素を用いるそのような手法を用いることもでき、但し、これらのプロセスはプロトンが膜に入るのに必要な構造を閉鎖しないものとするが、これは特定の形態を意味することを意図しない。
【０１３０】
湿潤剤の使用に先立って、膜またはその１つの層を酸で処理し、続いて、中和するのが望ましいであろう。酸のタイプおよびその濃度は、酸洗浄で調製された膜と、酸洗浄なくして同一に調製された膜との間で改良が観察される限り、臨界的ではない。酸は、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、硝酸、アスコルビン酸、クエン酸のような有機酸および鉱酸を含む。一般に、酸は少なくとも約１規定の濃度を有するであろう。酸処理の時間の長さも、前記した目的が満足され、膜の構造的一体性が弱められない限り臨界的ではない。しかしながら、一般に、処理は数秒〜数分継続される。本発明による膜の少なくともいくつかで、このさらなる処理ステップは膜を最小にしか収縮させず、そのモジュラスおよび固さを増加させることが観察された。一般に、その後、湿潤化を前記したように用いる。
【０１３１】
プロトン・トンネリングを促進し、効果的なＰＴＭを製造するもう１つの方法は、ＰＴＭ内で、またはそれと会合させてある種のポリペプチドを用いることである。この点に関し、２つの興味ある現象が観察されている。まず、ＰＴＭを、例えば、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのようなブロックコポリマーおよびポリペプチドから構成される生体適合性膜と緊密に接触させた場合（「複合体Ｉ」）、プロトンが双方の層を横切って効果的に輸送される。事実、生体適合性膜の輸送の効率は危うくされない。第二に、本明細書中で記載されたようなＰＴＭ、複合体Ｉも含めた単層ＰＴＭとして作成される膜は、例えば、プロトンを伝達するのにやはり有用である。図８において、ポリペプチド１１２がＰＴＭ１００と関連付けられて示される。これらのポリペプチドは、孔内に配置された膜１００（１１０ａ参照）の一部、またはその単一表面に配置することができ（１１０ｂ参照）、あるいは膜を横切ることができる（１００ｃ参照）。この第二の実施形態について特に興味深いのは、層の他の表面に対する一方の表面から輸送されたプロトンの量は、プロトン・トンネリング能力を有しない同一量の複合体Ｉでの膜の生成、およびプロトン・トンネリング能力を有するが、複合体Ｉを有しない膜の生成から予測されることを超えることである。このような相乗作用は本発明によれば通常ではない。本質的には、この実施形態は、十分に浅い量子井戸を有するプロトン・トンネリング材料から生体適合性膜を作り出す。
【０１３２】
本発明により用いることができるポリペプチドは、ＰＴＭと関連付けられているか、またはポリペプチドと関連付けられた生体適合性膜層と隣接するＰＴＭ層を有する組み合わされた膜におけるかを問わず、膜の第一の側から第二の側へプロトンを輸送することに関与することができ、そのような輸送を促進する分子構造の形成に関与することを含む。また、本発明において有用なポリペプチドは、付加された場合、またはＰＴＭと関連付けられた他の方法にて、プロトン・トンネリングを促進する任意のものも含む。好ましくは、ポリペプチドは、ＰＴＭを横切ってプロトンを輸送するのに関与することができるように、ＰＴＭと会合する。
【０１３３】
［電子移動メディエーター］
「電子キャリアー」とは、酵素反応において電子を供するのに用いられる分子をいう。電子キャリアーは、限定されるものではないが、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（示されたＮＡＤＨ；酸化された形態の示されたＮＡＤまたはＮＡＤ＋）、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（示されたＮＡＤＰＨ；酸化された形態の示されたＮＡＤＰまたはＮＡＤＰ＋）、還元されたニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮＨ；酸化された形態ＮＭＮ）、還元されたフラリンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤＨ２；酸化された形態ＦＡＤ）、還元されたフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ２；酸化された形態ＦＭＮ）、還元された補酵素Ａなどを含む。電子キャリアーは、補酵素Ａ、プロトポルフィリンＩＸ、ビタミンＢ１２のような電子供与性補欠分子族が取り込まれたタンパク質を含む。さらに、電子キャリアーはグルコン酸（酸化された形態：グルコース）、酸化されたアルコール（例えば、エチルアルデヒド）などを含む。
【０１３４】
「電子移動メディエーター」とは、電子キャリアーから放出された電子の電極への移動を促進する組成物をいう。
【０１３５】
電子移動メディエーターは、当分野において他の文脈では、Ｗｉｎｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４：１３７−１４２、１９８２（メチルビオロゲン）；Ｐａｌｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．４４３：１５５−１６１、１９９８年２月１０日（１、１’−ジベンジル−４、４’−ジピリジニウムジクロライド、ベンジルビオロゲン）；Ｍａｔｓｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０３８：２９−３８、１９９０（Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、ＴＭＰＤ）に示されるように知られている。さらなる電子移動メディエーターの中には、複合体Ｉを用いて燃料電池デバイスで成功して用いられているメチルビオロゲン、ＴＭＰＤおよびフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）がある。
【０１３６】
いくつかの実施形態における電子移動メディエーターを用いて、バリアＢ１における電気化学還元から空間的に分離された電極へ電子を移動させる。いくつかの実施形態において、これらは側面Ｓ２に取り込むことができる。
【０１３７】
［例示的ポリペプチド］
本発明の分析物センサーのいくつかの態様において、一旦特異的分析物が導入されれば、生体適合性膜またはＰＴＭを横切っての種の輸送に関与することができるポリペプチドを使用する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、一般には、生体適合性膜を横切っての側面Ｓ１から側面Ｓ２への化学物質またはプロトンの輸送、または例えば、電子移動メディエーターを用いて電極まで運ぶことができる電子の引き抜きである触媒活性を有することができる。
【０１３８】
本明細書中において、「ポリペプチド」に対するいずれの言及も、単一ポリペプチドを含むことができるが、分析物センサーがそれに基づく輸送に関与することができる機能的ユニットを一緒になって供するポリペプチドの複合体に対する言及を含むことに注意すべきである。
【０１３９】
適切であれば、分析物を、ポリペプチドＰＰが作用することができる形態へ変換する酵素または試薬のような成分を含む。そのような酵素はポリペプチドＰＰに隣接して固定化することができる。
【０１４０】
本発明により生体適合性膜またはＰＴＭを形成するように合成ポリマー材料と会合することができ、かつ酸化／還元および膜貫通輸送機能（分子、原子、プロトン、電子）の一方または双方に関与することができる有用なポリペプチドの例は、限定されるものではないが、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（「複合体Ｉ」）（例えば、大腸菌からのもの、Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏｎ  ｐｕｍｐｉｎｇ  ＮＡＤＨ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ｉ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＡＤＨ  ｔｏ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４：１５５、１９９７）、ＮＡＤＰＨトランスヒドロゲナーゼ、プロトンＡＴＰａｓｅおよびシトクロムオキシダーゼおよびその種々の形態を含む。さらなるポリペプチドは、（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能な多数のタイプのこの酵素を含めた、いくつかの源から入手可能なＮＡＤＨを用いる）グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰＨ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰＨ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＨ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＨ、Ｓｉｇｍａ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＨ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ；ＮＡＤＰＨ、Ｓｉｇｍａ）、ａ−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＮＡＤＨ、Ｓｉｇｍａ）およびプロトン−移動ピロホスフェートを含む。また、コハク酸：キノンオキシドレダクターゼも含まれ、また、「Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＩＩ」、「Ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ：ｑｕｉｎｏｎｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄａｃｔａｓｅｓ」Ｈａｇｅｒｈａｌｌ、Ｃ．およびＨｅｄｅｒｓｔｅｄｔ、Ｌ．ＦＥＢＳ  レター３８９；２５−３１（１９９６）および「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ：ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」Ｔｏｒｎｒｏｔｈ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５５３；１７１−１７６（２００２）、ヘテロジスルフィドレダクターゼ、Ｆ（４２０）Ｈ（２）デヒドロゲナーゼ、（Ｂａｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｆ４２０Ｈ２  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  ｉｓ  ａ  Ｒｅｄｏｘ−ｄｒｉｖｅｎ  ｐｒｏｔｏｎ  ｐｕｍｐ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ＮＡＤＨ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ」２７５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９６８（２０００））またはギ酸ヒドロゲンリアーゼ（Ａｎｅｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  １２−ｃｉｓｔｒｏｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｐｅｒｏｎ（ｈｙｆ）ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｏｎ−ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｌｙａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ）１４３  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３６３３（１９９７））、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ：「Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｎｅｒｇｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｏｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ」Ｈａｔｅｆｉ、Ｙ．およびＹａｍａｇｕｃｈｉ、Ｍ．、Ｆａｓｅｂ  Ｊ．、１０；４４４−４５２（１９９６）、プロリンデヒドロゲナーゼ：「ｐｒｏｌｉｎｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２」Ｇｒａｈａｍ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９；２６５６−２６６１（１９８４）、およびシトクロムをいい、限定されるものではないが、（ウンデシル−ｂ−Ｄ−マルトシドまたはシクロヘキシル−ヘキシル−ｂ−Ｄ−マルトシドいずれかで結晶化された）シトクロムＣオキシダーゼ、シトクロムｂｃ１：「Ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ  ａｔ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｎ  ｉｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｒｉｐｈａｓｉｃ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂｃ１  ｃｏｍｐｌｅｘ」Ｓｎｙｔｅｒ、Ｃ．Ｈ．およびＴｒｕｍｐｏｗｅｒ、Ｂ．Ｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４；３１２０９−１６（１９９９）、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂｏ３：「ｏｙｘｇｅｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｎ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｈｅｌｉｘ  ＶＩＩＩ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂｏ３．」Ｓｖｅｎｓｓｏｎ、Ｍ．ら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４；５２５２−５８（１９９５）、「Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂｏ３．」Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｂ．Ｅ．およびＣｈａｎ、Ｓ．Ｉ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５；１１６４３−４８（１９９８）、およびシトクロムｄ：「Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ、ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｏｘｉｄａｓｅ．」Ｋｏｌａｎｄ、Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３；４４５−４５３（１９８４）、ＪｏｏｓｔおよびＴｈｏｒｅｎｓ、「Ｔｈｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ＧＬＵＴ−ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｓｕｇａｒ／ｐｏｌｙｏｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒｓ：ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ、ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒｓ（ｒｅｖｉｅｗ）」１８  Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．２４７−５６（２００１）を含み、およびＧｏｌ��ｉｎ、Ａ．Ｌ．、「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  Ｎａ（＋）ｃｈａｎｎｅｌｓ．」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２０５；５７５−８４（２００２）、Ｃｈｏｅ、Ｓ．、「Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．」Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３；１１５−２１（２００２）、Ｄｉｍｒｏｔｈ、Ｐ．、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｉｏｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ．」Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ６５；３８１−９５（１９９４）、およびＰａｒｋ、Ｊ．Ｈ．およびＳａｉｅｒ、Ｍ．Ｈ．Ｊｒ．、「Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ、ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａ−Ｋ−Ｃｌ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｆａｍｉｌｙ．」Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１４９；１６１−８（１９９６）に開示されたものを含めた選択的チャネルタンパク質を含む。前記の全てはここに参照して組み込む。
【０１４１】
加えて、修飾された酵素のような遺伝子的に修飾されたポリペプチドを用いることができると考えられる。酵素を遺伝的に修飾するための１つの通常に適用される技術は、組換えツール（例えば、エキソヌクレアーゼ）を用いて、Ｎ末端、Ｃ末端または内部配列を欠失させる。これらの欠失産物を作り出し、通常の実験を用いて系統的にテストする。しばしば当てはまるように、遺伝子産物の重要な部分は、注目する市販の機能に対してほとんど影響を見出すことができない。より焦点が当てられた欠失および置換は、本発明で用いることができる酵素を供する安定性、操作温度、触媒速度および／または溶媒適合性を増加させることができる。勿論、望ましいように、本明細書中に記載する種々のポリペプチドの混合物を用いることが可能である。
【０１４２】
［シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）］
シトクロムＰ４５０「オキシドレダクターゼ」（「ＣＹＰ」）は酸素および電子キャリアー（一般に、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ）を利用して、酸素をヒドロキシル化、エポキシド化または過酸化反応において基質に付加する。ＣＹＰの重要なサブセットは、しばしば、薬物と反応して、一次的には、これらの生体異物化学物質をより水溶性とし、よって、その排出を促進する。ＣＹＰはそのような薬物を活性化し、または不活化し、あるいはいくつかの場合には、そのような薬物の毒性誘導体を生じるように作用することもできる。また、薬物は、有害な薬物相互作用についての可能性を生じるＣＹＰの阻害剤として作用することもでき、ここに、薬物を除去し、よって、薬物についての予測される薬物動態学を確立するように作用するＣＹＰが不活化される。そのような阻害の結果、予測されるよりも長く身体に薬物が滞留し、形成された薬物および毒性の余りにも大きな可能性に導く。ＣＹＰ阻害は、潜在的に、重要な薬理学的介入を不能とすることによって潜在的に害を引き起こすもう１つの薬物の活性化を妨げることもできる。
【０１４３】
ヒトにおいては、２０を超えるＣＹＰ酵素のファミリーから、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１および３つの密接に関連する「ＣＹＰ３Ａ」酵素（ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５およびＣＹＰ３Ａ７）は、ほとんど全ての臨床的に有用な医薬の代謝を説明する。ＣＹＰ３Ａ４は、ＣＹＰのより臨床的に重要なものの１つであると信じられ、それが経口投与医薬に作用する早い機会を有するように、小腸ならびに肝臓で存在する。
【０１４４】
本発明の分析セルを用いて、化学物質が所与のＣＹＰによって作用されるか否か、または化学物質が、最初の化学物質がＣＹＰの阻害剤または活性化剤あるかを問わず、ＣＹＰによって作用される化学物質と共に分析セルに導入されるかを測定することができる。
【０１４５】
ＣＹＰ活性は、例えば、電子移動メディエーターへの電子の遺漏によって検出される。
【０１４６】
ＣＹＰ１Ａ２についての配列情報はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託Ｐ０５１７７下で見出すことができ；ＣＹＰ２Ｃ９については受託Ｐ１１７１２下で；ＣＹＰ２Ｃ１９については受託Ｐ３３２６１下で；ＣＹＰ２Ｄ６については受託Ｐ１０６３５下で；ＣＹＰ２Ｅ１については受託Ｐ０５１８１下で；ＣＹＰ３Ａ４については受託Ｐ０８６８４下で；ＣＹＰ３Ａ５については受託Ｐ２０８１５下で；ＣＹＰ３Ａ７については受託Ｐ２４４６２下で見出すことができる。組換え体の膜環境ＣＹＰへの復元は、ＣＹＰアッセイの通常の構成要素である。例えば、Ｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３９５５３−３９５６１、２００１参照。
【０１４７】
［糖トランスポーター］
以前の研究では、グルコーストランスポーターを用いて、生物学的膜を横切って、グルコースを、電極に付着させた水性ゲルの薄い層まで輸送させてきた。該生物学的膜はゲルにも結合された。ゲル、架橋ゲルまたは芳香族ポリアミン−ポリマーのいずれかをアビジンでドープし、電気重合によって金属電極に沈積させる。（１０ｎｍ厚み未満の）この層は膜下区画として働く。人赤血球から精製された促進されたグルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ−１）を、人工ビオチニル化脂質を含有する脂質膜に取り込み、グルコース感受性電極の活性化された表面と反応させた。Ｎｅｕｍａｎｎ−Ｓｐａｌｌａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６８（３）：１５３−６９、１９９７。
【０１４８】
本発明においては、糖トランスポーターは、バリアＢ１の膜Ｍ１に取り込まれ、その膜は電極上に支持されていない。トランスポーターはＣ５〜Ｃ９糖、または（アセチル化されていてもよい）アミンまたは水素による水酸化物の１〜２の置換によって、カルボン酸（またはその塩）を形成するためのさらなる酸化によって、１以上のヒドロキシルのメチル化またはエチル化によって、１以上のヒドロキシルにおけるホスホエステルの形成によって、または脱水反応によって形成されたエーテルブリッジによってそのアノマー炭素において接合された前記分子の２つによって（全体として、分子のクラスを一般に「糖」ともいう）それに関連する分子のいずれかの促進トランスポーターであり得る。好ましくは、トランスポーターはグルコースまたはフルクトース、最も好ましくはグルコースを輸送する。トランスポーターは、好ましくは、（赤血球からの）ＧＬＵＴ１、（肝臓からの）ＧＬＵＴ２、（脳からの）ＧＬＵＴ３、（筋肉からの）ＧＬＵＴ４、（小腸からの）ＧＬＵＴ５および（ミクロソームからの）ＧＬＵＴ７を含むＧＬＵＴｘファミリーのメンバーである。非常に多数のこれらのトランスポーターがクローン化されており、それらについての情報はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースで見出すことができる。
【０１４９】
トランスポーターは検出側面Ｓ２への選択的侵入方法を提供する。側面Ｓ２においては、グルコースオキシダーゼが連結されるかまたは吸収された電極を含めた通常の検出手段を使用することができる。あるいは、バリアＢ１によって供される選択性のため、側面Ｓ２で測定される適当な波長における光学回転、着色した産物を形成するジフェニルヒドラジンとの反応などにおける増加または減少を測定することを含めた選択性がより低い検出方法を用いることができる。
【０１５０】
［アミノ酸トランスポーター］
非常に多数のアミノ酸トランスポーターが特徴付けされており、それらは、分析セルで用いることができる。そのようなアミノ酸トランスポーターは、γアミノ酪酸、タウリン、および植物または動物で利用される他のアミノ酸についてのトランスポーターを含む。トランスポーターが、グリシントランスポーターＧｌｙｔ１の場合におけるナトリウムおよび塩化物のような他の分子を共輸送する場合、共輸送された部位は適切には側面Ｓ１またはＳ２に置かれる。あるいは、そのようなトランスポーターは、従って、共輸送された物質に依存する輸送を支持するのに必要な供された共輸送物質およびアミノ酸を検出することができる。また、共輸送された部位は、それが、アミノ酸が輸送された場合に、他の側に検出可能に輸送されるように、共輸送された部位は優先的に置くことができる。従って、いくつかの実施形態において、側面Ｓ１への輸送は、活性の表示、または活性の補足的表示を供することができる（共輸送された物質に対するこれらの考慮は、いずれの共輸送するトランスポーターにも適用されるが、そのようなアミノ酸トランスポーターには適用されない）。
【０１５１】
これらのアミノ酸トランスポーターが脂質二重層類似システムで復元できることは、例えば、Ｆａｆｏｕｒｎｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：４８０５−４８１１、１９８９によって記載された可溶化された「システムＡ」アミノ酸トランスポーターのリポソームへの復元によって示されている。
【０１５２】
再度、電極に付着させたアミノ酸異化酵素を利用する系のような、高度に特殊化された検出系に加えて、バリアＢ１によって供される選択性はより低い選択性の検出の使用を可能とする。そのような検出はアミンについての比色検出（例えば、ニンヒドリンとの反応）およびアミンについての蛍光測定検出（例えば、ｏ−フタルアルデヒドとの反応）などを含む。
【０１５３】
［電子および／またはプロトン輸送タンパク質］
（分析物としての、または分析物の異化の結果としての）電子キャリアーの存在は、そのような電子キャリアーからの電子を輸送するレドックス酵素で検出することができる。適当な電子移動メディエーターの使用は、別々に位置する電極へそのような電子を運ぶ。あるいは、トランスポーターがプロトンを共輸送する場合、ｐＨの変化を検出することができる。
【０１５４】
酸化／還元およびプロトンポンピング機能の一方または双方を供する特に好ましいレドックス酵素の例は、例えば、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（「複合体Ｉ」）、ＮＡＤＰＨトランスヒドロゲナーゼ、プロトンＡＴＰａｓｅ、およびシトクロムオキシダーゼおよびその種々の形態などを含む。オペロンから発現される複合体Ｉ  ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（または、ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼ）は、オペロン中のＴ７プロモーターを置き換えて、本発明で有用な量を供することによって、大腸菌で過剰発現させることができる。
【０１５５】
複合体Ｉは、ドデシルマルトシドでの可溶化を用い、前記したＳｐｅｈｒらによって記載された方法によって、過剰発現する大腸菌から単離することができる。
【０１５６】
さらなるレドックス酵素は、生体適合性膜またはＰＴＭと人工的に会合させることができる。例えば、親水性端部に連結されたタンパク質反応性部位を有する両親媒性分子を用いて、ポリペプチドを生体適合性膜またはＰＴＭに直接的にまたは間接的に会合させることができる。間接的会合は、例えば、ビオチニル化酵素に強く会合させるためのアビジンの両親媒性物質へのカップリングを含む。この使用、および他のレドックス酵素の使用については、補酵素Ｑのような脂質可溶性電子移動メディエーターは、側面Ｓ２への電子の運動を促進することができる。理解できるように、レドックス酵素のいくつかは、還元された電子キャリアーの発生がシグナルを誘発する事象ではないように、予期される分析物（または誘導体）の存在に依存して反応する。これらの場合、還元された電子キャリアーは、単一トリガリング反応を支持するのに十分な量で側面Ｓ１において供される。
【０１５７】
本発明で用いられるいずれのポリペプチドの源も、より温度安定性ポリペプチドを供する好熱性生物であり得ることが認識されるであろう。例えば、複合体Ｉは、（複合体Ｉにつき他の箇所で用いられたタイプの界面活性剤抽出を用いる予備的単離を記載する）Ｓｃｈｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５１２：８０−８４、２００２に記載されているように、９０℃にて最適に作動する形態でＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓから単離することができる。
【０１５８】
１つの実施形態において、本発明は毒性スクリーニングを提供し、それにより、生物活性物質または期待される生物活性物質（例えば、薬物）を、神経伝達物質につき多数のトランスポーターに対してテストする。
【０１５９】
［孔形成性ポリペプチド］
グラミシジン（Gramacidin）は、有機溶媒中で安定であり、従って、生体適合性膜への取り込みに導く孔形成性膜ポリペプチドである。グラミシジンは、種、例えば、イオンとの対または群にて機能し、２以上のグラミシジン分子が関連付けられて孔を形成する場合にのみ膜を通過する。種の輸送を可能とする膜の能力は、グラミシジン分子の会合した対または群の数によって測定される。本発明の分析物センサーを用いて、分析物または分析物の誘導体がグラミシジンに作用するか、またはグラミシジンと相互反応して、グラミシジン対の孔形成機能を阻害するかを測定することができる。本発明のこの実施形態において、グラミシジン孔を通っての輸送が可能であることが知られた種は、分析物センサーの第一の区画に導入することができ、第二の区画におけるこの種の存在は、グラミシジン孔が種輸送を可能とするように機能していることを示す。グラミシジンと相互作用して孔および検出された種の輸送を破壊する分析物または分析物の誘導体の存在。例えば、第二の区画におけるシグナルの低下または排除による検出は、分析物の存在を示す。グラミシジンは、約１：５０，０００と低い量のポリマーに対するポリペプチドの質量比にて膜に取り込むことができ；好ましくは、有用な量は約１：１００〜約１：５０，０００である。
【０１６０】
［生体適合性膜およびＰＴＭを含めたバリアの形成］
用いるポリペプチドの量は、用いるポリペプチドタイプ、ＰＴＭまたは生体適合性膜の性質および機能、それが用いられる環境、および用いるポリマー材料などで変化するであろう。しかしながら、一般には、幾らかのポリペプチドが存在し、かつ機能的である限り、かつ用いるポリペプチドの量が膜形成を妨げず、または膜を不安定にしない限り、かつ、もしＰＴＭで用いれば、プロトン・トンネリングが増強される限り、ポリペプチドのいずれの量も有用である。一般に、ポリペプチドの量は、生体適合性膜またはＰＴＭの最終重量に基づいて少なくとも約０．０１重量％、より好ましくは少なくとも約５重量％、なおより好ましくは、少なくとも約１０重量％、なおより好ましくは、少なくとも約２０重量％、および最も好ましくは３０重量％以上であろう。最大量は、安定かつ機能的膜を形成する能力を除き、同様に限定されない。溶媒に対するポリペプチドの量は０．００１％ｗ／ｖと低く、かつ５０．０％ｗ／ｖと高くすることができる。好ましくは、濃度は約０．５％〜約５．０％ｗ／ｖである。より好ましくは、濃度は約１．０％〜約３．０％ｗ／ｖである。これらの範囲は、ＰＴＭおよび生体適合性膜双方に適用される。
【０１６１】
共溶媒、界面活性剤などのような適当な可溶化および／または安定化剤も、特に、ポリペプチド溶液に関連して必要であり得る。可溶化界面活性剤は、典型的には、０．０１％〜１．０％濃度レベルで有用であり、より好ましくは、約０．５％までが考えられる。そのような界面活性剤はイオン性界面活性剤：ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ−ドデシルサルコシン酸ナトリウム、Ｎ−ドデシルベータ−Ｄ−グルコピラノシド、オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、ドデシル−マルトシド、デシル、ウンデシル、テトラデシル−マルトシド（一般に、イオン性界面活性剤の一般的形態としての、糖に結合した約８以上の炭素のアルキル鎖）オクチル−ベータ−Ｄ−グルコシドおよびポリオキシエチレン（９）ドデシル−エーテル、Ｃ12Ｅ9、ならびにトリトンＸ−１００またはノニデットＰ−４０のような非イオン性界面活性剤を含む。また、有用なのは、ＢＡＳＦのＰｌｕｒｏｎｉｃ  ｓｅｒｉｅｓ、またはＤｉｓｐｅｒｐｌａｓｔ（ＢＹＫ−Ｃｈｅｍｉｅ）のような、界面活性剤の特性を呈するある種のポリマー、典型的にはジブロックコポリマーである。
【０１６２】
合成ポリマー材料溶液を製造するのに用いる溶媒は、好ましくは、用いる水（ポリペプチド溶液はしばしば水を含む）および合成ポリマー材料（ポリマー、コポリマーおよび／またはブロックコポリマー）の少なくとも１つの双方と混和性であるように選択される。しかしながら、前記したように、水混和性でない溶媒または混合物を用いて膜を形成することが可能である。溶液を製造するための溶媒の使用が好ましいが、本明細書中で用いる用語「溶液」は、一般には、同様に懸濁液を含むことに注意されたし。
【０１６３】
ブロックコポリマーを用いる場合、溶媒はこれらの合成ポリマー材料を可溶化すべきである。合成ポリマー材料は溶媒に比較的わずかにしか溶けないが（５％ｗ／ｖ未満）、それは、好ましくは、５％ｗ／ｖよりも可溶性であり、一般には、溶解度は溶媒に対して少なくとも５〜１０％ｗ／ｖ、好ましくは１０％ｗ／ｖ合成ポリマー材料よりも大きい。
【０１６４】
適当な溶媒は、限定されるものではないが、メタノール、エタノール、２−プロパノール、イソプロパノール、１−プロパノールのような１および１２炭素の間の低分子量脂肪族アルコールおよびジオール、フェノール、ベンジルアルコールのようなアリールアルコール、アセトン、メチルエチルケトンのような低分子量アルデヒドおよびケトン、ベンゼン、シクロヘキサン、トルエンおよびテトラヒドロフランのような環状化合物、ジクロロメタンおよびクロロホルムのようなハロゲン化溶媒および１，４−ジオキサン、通常なアルカン（Ｃ2−Ｃ12）および水のような通常の溶媒物質を含む。混合物が適当な混和性、蒸発速度、および個々の溶媒について記載された他の基準を有する限り、溶媒混合物も可能である。ペルオキシドのようなプロトン−破壊的汚染物を形成するいずれかの傾向を有する溶媒成分は、それらが適当に精製され、取り扱うことができる限り用いることができる。溶媒は、典型的には、３０％  ｖ／ｖ以上のポリペプチド／合成ポリマー材料溶液、好ましくは２０％  ｖ／ｖ以上、有用には１０％  ｖ／ｖを含む。
【０１６５】
生体適合性膜またはＰＴＭが界面活性剤、脂質（例えば、カルジオリピン）、ステロール（例えば、コレステロール）または緩衝液および／または塩のような「他の材料」を含むべき場合、膜の形成に先立って他の材料もまた添加される。他の材料は、仕上げられた生体適合性膜の重量に基づいて、約０．０１％から約３０％、好ましくは約０．０１％から約１５％の間の量にて存在させる。他の材料は、添加物とは反対に、最もしばしばポリペプチド溶液と混合するが、合成ポリマー溶液とは混合しない。
【０１６６】
ＰＴＭにおけるプロトン・トンネリングを改良するための１つの技術は、ドーピングの使用である。ドーパントは、粒子とは反対に、使用する溶媒または溶媒の組合せにおいて一次的合成ポリマーと共に可溶性である。これは、例えば、約２０重量％までのポリスチレン、ポリフルオロスチレン、ポリクロロスチレン、またはポリブロモスチレンを含めたプロトン・トンネリング活性を呈するホモポリマーを含めることによって達成することができる。
【０１６７】
ＰＴＭ形成は、特に、いくつかの方法で達成することができる。他の技術は、まず、適当な溶媒で用いるべきポリマーの溶液を作成することを含む。ＰＴＭの作成で一般に有用な溶媒は既に議論した。しかしながら、ほとんどのスチレンポリマーでは、脂肪族または芳香族有機溶媒が必要とされる。３Ｇ５５のペレットを溶解させるためには、５０％ｖ／ｖアセトンとアルカン溶媒（ペンタン、ヘキサン、ヘプタンまたはオクタンいずれか）との混合物が有用であるが、テトラヒドロフラン中のＳＴＹＲＯＬＵＸ  ３Ｇ５５（ポリスチレン−ポリブタジエン−ポリスチレントリブロックポリマー）ペレットの溶解が好ましい。有用な溶液の濃度は１％〜５０％ｗ／ｖで変化し、より好ましくは、濃度は５％〜１０％ｗ／ｖである。
【０１６８】
ポリエチレン、アイソタクチックポリスチレン、またはコーンスターチ、ドーパントなどで生成されたもののような、ＰＴＭに非溶解性ミクロ粒子を含ませることは、もし考えられれば、この時点でポリマー溶液に添加すべきである。
【０１６９】
また、ドデシルマルトシド、トリトンＸ−１００、ノニデットＰ−４０、ドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤、またはプルロニックＬ０１０１（ＢＡＳＦ）のようなポリマー界面活性剤を膜形成性溶液に含めることもできる。そのように含めると、必ずしもさらなる界面活性化を必要としない湿潤性表面が提供される。もしＰＴＭがポリペプチドを含むべきならば、それもまたこの時点で添加すべきである。ポリペプチドは膜形成性溶液に直接添加することができるか、あるいは本明細書中に議論するように、まず、導入用の別の溶液に入れることができる。
【０１７０】
１つの実施形態において、ポリマー溶液は、ポリイミド（Ｋａｐｔｏｎ）、熱形成ポリスチレンシートまたはポリスルホンのような材料の薄いシート支持体中の開口に接触させることができる。後者の２つの材料については、支持体もまた溶媒（ＴＨＦ）に溶解性であり、従って、結合は前者の場合におけるよりも完全であり、ここに、もし膜形成性ポリマーおよび支持体の機械的特性が、ホモポリマーポリクロロスチレンとのように、よくマッチしなければ、離層が起こり得る。
【０１７１】
支持体中の開口は、１ミクロンと小さくすることができるか、あるいはポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標）、Ｄｕｐｏｎｔ社製）のような離層裏打ちの必要性なくして数ミリメートルと大きくすることができる。そのような裏打ちに関しては、直径が１ｃｍを超える開口を用いることができる。
【０１７２】
また、これらのポリマー材料で支持されていない膜をキャストすることもできる。規則的なまたは不規則な形状の膜が、平方インチよりも大きな領域にてキャストされており、より大きな膜が可能である。
【０１７３】
前記したように形成された全てのＰＴＭは、少なくとも加えて１５分間真空乾燥に先立って目に見えて乾燥するまで、換気フード中での溶媒蒸発を介して形成される。
【０１７４】
乾燥に続き、ＰＴＭの表面を処理して、（特に、界面活性剤を用いてポリマーシートを形成する場合）より大きな湿潤度を可能とすることができる。そのような処理は、一次的には、湿潤溶液の浴中への浸漬または湿潤溶液で膜の表面を最小にコーティングするまたはスプレイすることを含む。湿潤溶液は、アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール）またはアルコール・水混合液、界面活性剤溶液（前記した化合物の１％ｗ／ｖまで）を含むか、あるいは膜の表面をより親水性にする他の処理を含むことができる。ポリペプチドをＰＴＭに含ませる場合、界面活性剤を全く添加する必要はないであろう。これは、多くの有用なポリペプチドが単離され、商業的には、既に界面活性剤を含有する溶液中にて提供されるからである。しかしながら、プロトン輸送が可能な酵素の存在は表面湿潤に対する必要性を全く排除できると考えられる。界面活性剤としてポリペプチドを取り込むＰＴＭ中でさらなる表面湿潤剤を用いることが、ある場合にポリペプチドを変性しかねない場合、やはり注意すべきである。
【０１７５】
本発明によると、生体適合性膜、およびポリペプチドを含むＰＴＭは、得られる生体適合性膜およびＰＴＭが本明細書中で記載するように有用である限り、膜の製造で用いられる多数の従来技術のいずれか１つを用いて合成ポリマー材料から製造することができる。ＰＴＭの形成でやはり有用な生体適合性膜を形成する１つの方法は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、２００２年８月７日に出願された同時係属米国出願第１０／２１３，４７７号に記載されている（発明者Ｒｏｓａｌｙｎ  ＲｉｔｔｓおよびＨｏｉ−Ｃｈｅｏｎｇ  Ｓｔｅｖｅ  Ｓｕｎ；譲受人ＰｏｗｅｒＺｙｍｅ，Ｉｎｃ．）。
【０１７６】
しかしながら、一般に、本発明の分析物センサーで用いることができるポリペプチドと会合させた生体適合性膜およびＰＴＭは共に以下のステップを含む。
【０１７７】
１．溶媒または混合溶媒系中の合成ポリマー材料の溶液または懸濁液を形成する。該溶液または懸濁液は２以上のブロックコポリマーの混合物であり得るが、それは１以上のポリマーおよび／またはコポリマーを含むことができる。該溶液または懸濁液は、好ましくは、１〜９０％ｗ／ｖ合成ポリマー材料、より好ましくは２〜７０％、またはなおより好ましくは３〜２０％ｗ／ｖを含む。７％ｗ／ｖが特に好ましい。
【０１７８】
２．（典型的には、可溶化界面活性剤と共に）１以上のポリペプチドを、別々に、または存在するポリマー溶液または懸濁液に添加することによって、溶液または懸濁液に入れる。合成ポリマー材料を可溶化するのに用いる溶媒が同一である場合、またはポリペプチドを可溶化できるものに対して同様の特徴および溶解性である場合、通常、ポリペプチドをポリマー溶液または懸濁液に直接添加するのがより便利である。さもなければ、合成ポリマー材料およびポリペプチドを含有する２以上の溶液または懸濁液は、恐らくは、さらなる共溶媒または可溶化剤と混合しなければならない。最もしばしば、ポリペプチドで用いる溶媒は水性である。
【０１７９】
これらの溶液および／または懸濁液の混合はしばしば比較的簡単なことであり、手によって、または自動混合ツールによって達成することができる。また、加熱または冷却は、用いる溶媒およびポリマーに応じて膜の形成で有用であり得る。一般に、迅速に蒸発する溶媒は冷却しつつ良好に膜を形成する傾向があり、他方、極端にゆっくりと蒸発する溶媒は僅かな程度の加熱から最も利益を受けるようである。最も好都合な特徴を持つものを選択するのに用いられる溶媒の沸点を調べることができるが、但し、それは用いるポリマーに適したものとする。しかしながら、もちろん、溶媒ポリマー混合物にポリペプチドを取り込む必要性も考慮しなければならず、これは、些細でないことであり得る。例えば、１０ｍｇ／ｍｌの複合体Ｉを有する５マイクロリットルの界面活性剤安定化複合体Ｉ（０．１５％ｗ／ｖドデシルマルトシド）を、アセトンおよびヘキサンの５０／５０混合液中の３．２％ｗ／ｖポリスチレン−ポリブタジエン−ポリスチレントリブロックコポリマーの混合物（ＢＡＳＦから入手可能な商標ＳＴＹＲＯＬＵＸ  ３Ｇ５５下で販売される完全に疎水性のトリブロック）に混合し、膜形成を可能とするようにそれを沈積させることが可能である。この場合、最終混合物は、合成ポリマー材料の重量に対して、約５％ｖ／ｖの水、および０．７５％ｗ／ｗ複合体Ｉを含む。一般には、溶液は少なくとも約３０分間有用である室温で十分に安定であり、但し、溶媒はその時間の間は蒸発しないものとする。また、それらは冷蔵条件下で一晩、またはそれよりも長く貯蔵できる。
【０１８０】
３．ポリペプチドおよび合成ポリマー材料を共に含むある容量の最終溶液または懸濁液を膜に形成し、少なくとも部分的に乾燥させ、それにより溶媒の少なくとも一部を除去する。本発明により製造された膜のいくつかを完全に乾燥するか、または実質的にそれを乾燥することが可能である。実質的に乾燥とは、室温で数時間放置されればしばしば保持される約１５％までのいくらかの残存する溶媒があることを意味する。生体適合性膜は、ＰＴＭとは反対に、観察されたプロトン・トンネリング特性を有しないポリマーを選択することによって形成することができる。１つの実施形態において、生体適合性膜を形成し、第２の膜と会合させることができる。この第２の膜はＰＴＭであり、すなわち、それらは多層膜を形成する。好ましくは、２つの膜は積み重ねることなどにより、本質的に接触させて置く。さもなければ、それらは間を開けることができ、ギャップはいくらかの流体、通常は、液体電解質によって満たされる。
【０１８１】
特に好ましい実施形態において、仕上げられた膜の重量の実質的に全てはポリペプチドまたは合成ポリマー材料いずれかであろう。添加剤および安定化ポリマーを含めた合成ポリマー材料の量は、もしあれば、仕上げられた膜の約７０重量％〜約９９重量％の範囲である。しかしながら、比較的高いポリペプチド含有量を有するのが望ましいか、あるいはいくらかの溶媒を保持する必要があり、従って、合成ポリマー材料の量はそれに従って低下させることができる。しかしながら、一般に、仕上げられた生体適合性膜の少なくとも約５０重量％は合成ポリマー材料であろう。合成ポリマー材料が、安定化ポリマー以外のブロックコポリマーおよびポリマーまたはコポリマーを含む混合物である場合、ブロックコポリマーは膜の少なくとも約３５重量％の量で存在させることができる。膜の約３０重量％までは、本明細書中で定義された「添加剤」および「他の材料」（集合的に）であり得る。より好ましくは、添加剤および他の材料の量は膜の約１５重量％までである。合成ポリマー材料の約３０重量％までは安定化ポリマーであり得る。一般に、安定化ポリマーは用いる合成ポリマー材料の約５重量％および約２０重量％の間の量で存在させる。これらの数は、ＰＴＭの表面を処理するのに用いられるミクロ粒子およびいずれかの湿潤剤が専らである。
【０１８２】
いずれの溶媒が本発明で特に有用であるか、およびポリマーおよびポリペプチドならびに溶媒のいずれの組合せを用いるべきかを識別するのは、多数の因子に依存し、そのいくつかは、混和性、蒸発等の項目ですでに議論した。ポリマーおよびポリペプチド構成要素は、溶媒または溶媒混合液に完全に溶解できなければならない。蒸発速度が、一回で膜を生じるのに十分長くなければならない。しかしながら、時間の量は余りにも長くて、製造を非現実的とするものであってはならない。無極性溶媒が有用であろうが、一般的には、より無極性の溶媒はある状況では有用ではなかろう。というのは、ポリマーのイオン性またはヒドロキシル構成要素は完全に無極性の溶媒には貧弱にしか溶解できないからである。従って、ポリスチレンのような高度に剛性で疎水性の成分を溶解させることができ、アクリル酸のような高度にイオン性の成分を同時に溶解させることはできない。しかしながら、完全に疎水性の特徴のポリマーでは、無極性溶媒が好ましい。溶媒は、一般には、部分的に非水性であるべきである。というのは、ポリマーは少なくとも部分的には非水溶解性だからである。水混和性は膜タンパク質の復元で最も望まれるが、それは厳密に限定する因子ではない。従って、好ましくは、全ての溶媒は非水である。しかしながら、ポリペプチドおよび安定化ポリマーについての溶媒は圧倒的に水または少なくとも水混和性である。
【０１８３】
少なくとも１つの合成ポリマー材料および安定化ポリマーを共に含めた生体適合性膜を形成する好ましい方法は、ブロックコポリマーの適当な溶液を作成し、次いで、通常はポリマーおよびポリペプチドを別々に安定化するステップを含む。他の箇所で記載したように、ポリペプチドは１以上の界面活性剤または界面活性剤を含むことができ、典型的には、水溶溶液である。一旦適当な溶液が作成され、混合されたならば、例えば、開口誘電性基材を溶液でコーティングし、続いて、溶媒を少なくとも部分的に蒸発させることを含めた本明細書で記載した、または当分野で知られた技術のいずれかによって膜を作成することができる。そのような蒸発は真空中で促進することができる。
【０１８４】
水素結合リッチな安定化ポリマーを含めた生体適合性膜を形成する１つの方法は以下の通りである。
【０１８５】
１．供給された溶媒中のプロトライト（Protolyte）Ａ７００ブロックコポリマーの溶液または懸濁液を等容量のエタノール（５％水ｗ／ｖ）で希釈する。該溶液は約５％ｗ／ｖのブロックコポリマーを含有する。
【０１８６】
２．別途、９４３ｍｇのポイエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）を混合して、約２．３％ｗ／ｖの濃度を有する溶液を得ることによって、安定化剤の水性溶液または懸濁液を作成する。溶液中の安定化剤の濃度は飽和限界に近い。
【０１８７】
３．次に、０．１５％ｗ／ｖのドデシルマルコシドと共に１０ｍｇ／ｍｌの大腸菌由来の複合体Ｉを含む４マイクロリットルの溶液を、６マイクロリットルの該ＰＥＧ溶液に添加し、それらを混合して溶液または懸濁液を生じさせる。
【０１８８】
４．次いで、１０マイクロリットルの溶液を、ブロックコポリマーを含む１０マイクロリットルの溶液と混合する。
【０１８９】
５．小容量（例えば、４マイクロリットル）の得られた溶液を、直径が１００マイクロメートルで、深さが１ミルである開口を有する、１ミル（２５．４ミクロン）の厚みのＫＡＰＴＯＮ（ポリイミドのブランド）の穴のあいた基材の開口（支持体を通じてドリルした穴）のサブセットの開口に滴下する。
【０１９０】
６．該溶液をフード中で風乾させ、溶媒を除去する。
【０１９１】
７．必要に応じて、ステップ５およびステップ６を反復して全ての開口を被覆する。
【０１９２】
ブロックコポリマーの存在下で非水性溶媒と混合するに先立って、安定化ポリマーを含有する溶液にポリペプチドを導入する前記方法は、生体適合性膜で用いるポリペプチドの機能を安定化すると考えられる。しかしながら、該ポリマーおよびブロックポリマーを混合し、得られた溶液を一般には水性のポリペプチド溶液と混合することもできよう。所望により、各開口をチェックして膜の形成を確実とし、あるいは少なくとも統計学的に関連する数の開口を顕微鏡でチェックする。もし開口が膜を含まなければ、さらなる溶液およびミクロピペットスケールのピペッティングデバイスを用いて修復する。典型的には、非常に小容量の溶液がそのような穴を修復するのに必要であるにすぎない。真空装置またはデシケーター中で膜を完全にまたは実質的に完全に乾燥することができる。このように形成された膜を、所望であれば、真空中で乾燥するか、あるいはデシケーター中で乾燥することができる。
【０１９３】
パラメーターは膜材料の、生体適合性膜のサイズ、生体適合性膜の厚み、支持体の構造等のような条件に依存して調整することができる。
【０１９４】
一旦ポリペプチド／合成ポリマー材料溶液が製造されたならば、それは膜に形成することができる。本発明による生体適合性膜はそれ自体で独立している膜であり得る。そのような膜は、溶液をパン中へ、またはシート上に、それらが所望の厚みを達成するように注ぐことによって形成される。一旦溶液が乾燥され、溶媒が乾燥して除去されたならば、乾燥した膜をパンから取り出し、または裏打ち層から剥がすことができる。適当な粘着防止剤を用いて、この工程において援助することができる。生体適合性膜は、ガラス上に、表面修飾して疎水性を増大させる炭素、または（ポリ酢酸ビニル、ＰＤＭＳ、Ｋａｐｔｏｎ（登録商標）、過フッ素化ポリマー、ＰＶＤＦ、ＰＥＥＫ、ポリエステル、またはＵＨＭＷＰＥ、ポリプロピレンまたはポリスルホンのような）ポリマーをコーティングすることによるようにして、固体材料に対して形成することができる。ＰＤＭＳのようなポリマーは、生体適合性膜をその上に形成することができる開口を確立するのに用いることができる優れた支持体を提供する。
【０１９５】
次いで、膜を切断し、または所望の形状とし、あるいはそのまま用いる。さらに、膜の使用を容易とするために、膜を物理的に、または固定デバイスまたは接着剤を通じて、所望であれば、ホルダーに付着させることができる。これは、フレームが支持体であって、膜がキャンバスである場合に、絵を描くに先立って、キャンバスをフレーム上に延ばすことと観念できる。別法として、膜は直接的に、そのような構造との関連において形成することができる。適当な類似のものを、気泡を吹きつけ、それを石鹸および水の溶液に浸漬するために用いる子供の気泡杖（children's bubble wand）を取るであろう。石鹸および水の膜が杖の開口を横切って形成される。膜の周辺における構造材料は膜を扱い、操作することを可能とし、剛性および強度を提供する。また、それは膜の所望の形状を提供することを助ける。物理的構造および本発明の膜形成性溶液を用い、同様のプロセスを使用することができる。
【０１９６】
本発明で用いる生体適合性膜は、所望により、固体支持体に対して安定化される。そのような安定化を達成するための１つの方法は、脂質関連分子の硫黄媒介連結を用いて、金属表面またはもう１つの固体支持体の表面を生体適合性膜に接着し、連結し、または結合する。例えば、多孔性支持体を犠牲または除去可能な充填剤層でコートし、コートされた表面を、例えば、研磨によって平滑化することができる。そのような多孔性支持体は、典型的には、プロトン伝導性ポリマー膜をコーティングに続いて平滑化でき、後記する処理に対して安定である限り、議論したプロトン伝導性ポリマー膜のいずれも含むことができる。１つの有用な多孔性支持体はガラスフリットである。次いで、平滑化表面を（必要であれば先の洗浄と共に）クロムの第一の層および金のオーバーコートのような金属でコートする。次いで、犠牲材料を溶解によるようにして取り外し、孔を囲う金属化表面で、残る以外は、それで孔上の金属化を行う。犠牲層はフォトレジスト、パラフィン、（エチルセルロースのような）セルロース樹脂等を含むことができる。
【０１９７】
連結体または接着体は、生体適合性膜を連結するのに適合したアルキルチオール、アルキルジスルフィド、チオ脂質等を含む。そのような連結体は、例えば、Ｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １０：１９７−２１０，１９９４に記載されている。このタイプのさらなる連結体はＬａｎｇらの米国特許第５，７５６，３５５号およびＨｕｉらの米国特許第５，９１９，５７６号に記載されている。
【０１９８】
生体適合性膜は、例えば、Ｎｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，５４１，９０８号（シトクロムＣの電極へのアニーリング）およびＰｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．２９２：１１５，１９９０に詳細に記載された方法によってその中に取り込まれた孔、穴または開口およびポリペプチドを横切って形成することができる。そのような方法は、既に議論したポリペプチドおよび合成ポリマー材料の適当な溶液を作成するステップを含むことができ、開口された基材、好ましくは、誘電性基材を溶液に浸漬して、ポリペプチド含有生体適合性膜を形成する。音波処理または界面活性剤希釈が、生体適合性膜への酵素取り込みを容易とするのが必要であろう。例えば、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３１：５２７−５３４，１９８２；Ｍａｄｄｅｎ，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ」，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ  ４０：２０７−２２２，１９８６；Ｍｏｎｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｎａｒ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ」Ｑｕａｒｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１４：１−７９，１９８１；Ｈｅｌｅｎｉｕｓら．「Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ」，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６：２７−３１，１９８１；Ｖｏｌｕｍｅｓ  ｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（例えば、Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｃｋｅｒ（編））、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ参照。
【０１９９】
別法として、小さな開口を持つテフロン（登録商標）のような疎水性材料で（好ましくは、必ずしも必要ではないが）作成された薄い隔壁は、少量の導入された両親媒性体を有する。コートされた開口を、その上で液滴が薄くなり、開口にわたって自然に自己配向する希薄な電解液溶液に浸漬させる。かなりの面積の生体適合性膜がこの一般的技術を用いて調製されている。生体適合性膜それ自体の形成用の２つの通常の方法はラングミュア−ブロジェット技術および注入技術である。前記を参照し、また、引用することにより本明細書の一部をなすものとする同時係属米国出願第１０／２１３，５３０号に詳細に記載されている。
【０２００】
基材の厚みは、それが開口を有する穴が開けられた基材であるか多孔性材料であるかを問わず、例えば、約１５マイクロメートル〜約５ミリメートル、好ましくは約１５〜約１，０００マイクロメートル、より好ましくは約１５マイクロメートル〜約３０マイクロメートルであり得る。穴または孔の幅は、例えば、約１マイクロメートル〜約１，５００マイクロメートル、より好ましくは約２０〜約２００マイクロメートル、なおより好ましくは約６０〜約１４０マイクロメートルである。約１００マイクロメートルが特に好ましい。好ましくは、穴または孔は、面積の約５０〜約７５％のような、チャンバーの間の輸送に関連する誘電性基材のいずれかの領域の領域の約３０％過剰を含む。
【０２０１】
本発明による生体適合性膜の厚みは、特定のサイズの孔、穴、パンまたはトレイ等に導入される容量の制御のように公知の技術によって調整することができる。膜の厚みは、その組成および機能によって大いに支持される。複合体Ｉのような膜貫通プロトン輸送複合体を含むことを意図した膜は、ポリペプチド複合体に対して十分な支持体および配向を供するのに十分な厚みでなければならない。しかしながら、余りにも厚くて、膜を横切ってのプロトンの効果的な輸送を妨げるものであってはならない。約１００の開口アレイの直径１００ミクロンの開口または穴、以前に同定されたＭｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の論文の１つに記載された約７％ｗ／ｖのポリ（２−メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（ジメチルシロキサン）−ブロック−ポリ（２−メチルオキサゾリン）−トリブロックコポリマーを含有するコポリマー溶液中の約４マイクロリットルの量にて複合体Ｉを含む溶液については、適当な厚みの膜を得ることができる。膜の厚みは、その必要な寿命、その機能等に依存して広く変化することができる。プロトンを輸送するために設計された膜は、例えば、しばしば、酸化反応に関連するポリペプチドと関連付けられた膜よりも薄い。しかしながら、一般には、膜は約１０ナノメートル〜１００マイクロメートルの間、またはそれよりも厚いであろう。事実、分析物センサー中でプロトンを輸送するのに有用な生体適合性膜は１０ナノメートル〜１０マイクロメートルまでの厚みで成功している。再度、より厚い膜が可能である。
【０２０２】
［１つの実施形態の操作］
本発明の分析物センサーの好ましい実施形態において、センサーは分析物の導入に適合した第一の区画、およびポリペプチドと関連付けられた生体適合性膜を含むバリアによって第一の区画から分離された第二の区画を含む。このポリペプチドはバリアを横切っての種（この場合はプロトンの輸送）に関与することができる。電極の対を含む検出器を用いて、輸送される種を検出し、第一の電極はアノード区画に配置され、および第二の電極はカソード区画に配置される。
【０２０３】
図９は、この実施形態によるアノード側の模式的ブロックダイアグラム表示を示す。アノード区画は、分析物、メタノールを潜在的に含有する溶液が導入される第一の区画である。この場合、標的化された分析物は消費され、単一の炭素分子に変換され、その消費がプロトンを生じる有機分子である。センサーが検出するように適合する他の化合物の例は、限定されるものではないが、酸化可能な糖および糖アルコール、アルコール、ピルベート、スクシネート等、脂肪酸、乳酸、クエン酸等のような有機酸、アミノ酸および短いポリペプチド、アルデヒド、ケトン等を含む。この実施形態における分析物であるメタノールはまずポリペプチド、この場合、ＤＨで示されるアルコールデヒドロゲナーゼによって最初に作用される。後記で分かるように、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびギ酸デヒドロゲナーゼのような他のデヒドロゲナーゼを用いることもでき、あるいはそれを相互に組み合わせて用いることができる。これらのポリペプチドは、分析物に作用して電子およびプロトンを生じさせる酵素である。
【０２０４】
プロトンおよび電子は、分析物に対するポリペプチドの配位作用によって、補因子ともいわれる電子キャリアーまで移動される。１つのそのような電子キャリアーはＮＡＢ＋／ＮＡＤＨである。電子キャリアーは、存在する場合、一般には、約１マイクロモル〜約２モル、より好ましくは約１０マイクロモル〜約１モル、および最も好ましくは約１００マイクロモル〜約５００ミリモルの間の濃度で供される。
【０２０５】
ポリペプチド、プロトンおよび電子の影響下で、ＮＡＤ+はＮＡＤＨに変換される。この点から、電子および／またはプロトンは多数のさらなる補因子および／または移動メディエーターの間で扱われ、やりとりすることができる。電子移動メディエーターは電子キャリアーから放出された電子のもう１つの分子、この場合には、典型的には電極への移動を容易とする。その例は、これまでに同定されたものに加えて、フェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）、ピロロキノリンキノン（メトキサチンとも呼ばれるＰＱＱ）、ヒドロキノン、メトキシフェノール、エトキシフェノール、または他の典型的なキノン分子、メチルビヨルゲン、１，１’−ジベンジル−４，４’−ジピリジニウムジクロライド（ベンジルビヨロゲン）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン（ＴＭＰＤ）およびジシクロペンタジエニル鉄（Ｃ10Ｈ10Ｆｅ、フェロセン）を含む。電子移動メディエーターは、存在する場合、一般に、約１マイクロモル〜約２モルの間、より好ましくは約１０マクロモルおよび約２モルの間、なおより好ましくは約１００マイクロモルおよび約２モルの間の濃度で供される。
【０２０６】
しかしながら、簡単のために、図９に示すように、還元された補因子または電子キャリアーは、次に、本発明による生体適合性膜に包埋されたポリペプチド、この場合、複合体Ｉ（ＣＩ）のデヒドロゲナーゼＤＨ機能と相互作用することができる。複合体Ｉ（ＣＩ）はＮＡＤＨ分子からプロトン、ならびに電子を放出する。電子は直接アノードまで流れるであろう。しかしながら、よりしばしばは、それらは移動メディエーターによって捉えられ、これは、次いで、電子をアノードまで輸送する。ＡＴＭは活性輸送膜をいう。
【０２０７】
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ複合体Ｉは、生体適合性膜を横切ってプロトンを輸送することにやはり関与することができる点で興味あるポリペプチドである。しかしながら、特に興味あるのは、移動したプロトンが、複合体Ｉのデヒドロゲナーゼ部分の作用によって放出されたプロトンでは必ずしもないことである。従って、最も成功したのは、本発明のこの特別の態様による分析物センサーはアノード区画においてさらなるプロトン種を含むであろう。複合体Ｉのプロトン輸送機能は、レドックス機能として、図９に示す。
【０２０８】
移動メディエーターが電子をアノードに与える場合、それは酸化され、他の電子キャリアーを酸化することによって放出されたさらなる電子を得ることができるようにする。また、今や、酸化された補因子（ＮＡＤ+）は、ポリペプチドと分析物との相互作用に際してプロトンおよび電子を受け取る準備ができている。ちょうど記載した反応はアノード電極において、およびアノード区画において起こり、化学的には以下のように例示することができる。
【化１】
2005522692.tif 000003
【０２０９】
この反応は以下の反応によって供することができる。
【化２】
2005522692.tif 000004
【０２１０】
従って、反応および電子生成反応の合計は以下の通りである。
【化３】
2005522692.tif 000005
【０２１１】
メタノールのような有機分子から（先に説明したＮＡＤＨのような）還元された電子キャリアーを生じさせるのに用いることができるポリペプチドは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の形態で出発することができる。適当なＡＤＨ酵素は、例えば、Ａｍｍｅｎｄｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＮＡＤ（＋）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ：ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｏｔｈｅｒ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１２５１４−２３，１９９２；Ｃａｎｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＮＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ」，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３０１−５，１９９６；Ｓａｌｉｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｗｏ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ａｒｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ」，Ｙｅａｓｔ  ７：３９１−４００，１９９１；  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＡＤＨ３，ａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｉｓｏｚｙｍｅ  ｏｆ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：３０２４−３４，１９８５に記載されている。もし得られたホルムアルデヒドが酸化されれば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＮＤ）を用いる。適当なＡＬＤ酵素は、例えば、Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｉｃｅ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｃｏｍｐａｒｔｉｂｌｅ  ｂｌａｓｔ  ｆｕｎｇｕｓ」，ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＦ３２３５８６；Ｓａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ［ｔｈａｌｅ  ｃｒｅｓｓ］ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＮＡＤ＋）−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ」ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＦ３２７４２６に記載されている。もしさらなる得られたギ酸が酸化されれば、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）を用いる。適当なＦＤＨ酵素は、例えば、Ｃｏｌａｓ  ｄｅｓ  Ｆｒａｎｃｓ−Ｓｍａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｆｒｏｍ  ｎｏｎｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｓ  ＮＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ［ｆｒｏｍ  ��ｏｔａｔｏ］」、Ｐｌａｎｔｏ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２（４）：１１７１−１１７７，１９９３；Ｈｏｕｒｔｏｎ−Ｃａｂａｓｓａ，「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｐｉｅｓ  ｏｆ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｐｏｔａｔｏ  ｆｄｈ  ｇｅｎｅｓ，ｆｄｈ１，ｆｄｈ２  ａｎｄ  ｆｄｈ３」，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１７：７１９−７１９，１９９８に記載されている。
【０２１２】
後に議論する理由で、用いるのに適合しているか、あるいはそうでなければキノン−ベースの電子キャリアを収容することができるポリペプチドを用いるのが有用で有り得る。そのようなポリペプチドは、例えば、Ｐｏｍｍｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｐｈａｔｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」，Ｂｉｏｃｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１１０７（２）：３０５−１３，１９９２（「Ｔｈｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｉｓ  ａｐｐａｒｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ａｃｃｅｐｔｏｒｓ  ｗｈｉｃｈ  ｉｎｃｌｕｄｅ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，５−ｄｅａｚａｆｌａｖｉｎ，ｑｕｉｎｏｎｅｓ，ａｎｄ  ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ」）；Ｆｅｒｒｙ，Ｊ．Ｇ．「Ｆｏｒｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ」ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７（３−４）；３７７−８２，１９９０（キノン活性を持つホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｙｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｓｏｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ｒｅｄｏｘ−ａｃｔｉｖｅ  ｑｕｉｎｏｎｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３０１（Ｐｔ  １）：２８９−９５，１９９４（結合したキノン補因子を持つデヒドロゲナーゼについての多数の論文の代表）；Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ＰＱＱ  ａｎｄ  ＰＱＱ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ」Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４０：１−８０，１９９８（キノンを利用するアルコールデヒドロゲナーゼについて）；Ｍａｓｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｐ−ｎｉｔｒｏｓｏｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｈｏｒｓｅ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｉ−ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＤＨ）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（５０）：３１５７９−８４，１９９４（酵素によるＮＡＤＨ還元に続くＮＡＤＨから電極への電子のメディエータ−触媒移動の例）；およびＰａｎｄｅｙ，「Ｔｅｔｒａｃｙａｎｏｑｕｉｎｏｄｉｍｅｔｈａｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆｌｏｗ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ＮＡＤＨ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１（２）：３９２−６，１９９４に記載されている。
【０２１３】
カソード区画（第二の区画）におけるカソードでの対応する反応は、有用なレドックスポテンシャルにて製造された電子を消費するいずれの反応でもあり得る。酸素を用い、例えば、該反応は以下のものであり得る。
【化４】
2005522692.tif 000006
反応２を用い、陰極液（カソード区画で用いられる電解質）を緩衝化して、水素イオンを消費させることができ、水素イオン供与化合物を分析物センサーの操作の間に供給することができるか、あるいはより好ましくは、アノードおよびカソード区画の間のバリアは中和水素イオン（水素イオンまたはプロトン）を送達するのに十分効果的なものとする。
【０２１４】
１つの実施形態において、カソードにおける対応する反応は以下のものである。
【化５】
2005522692.tif 000007
このカソード反応の結果、水の正味の生成が起こり、これは、もし重要であれば、例えば、オーバーフロー液体のための空間を供することによって、または気相廃棄（vapour-phase exhaust）を供することによって取り扱うことができる。多数の電子アクセプター分子は、しばしば、操作温度において固体であるか、キャリア液体中の溶質であり、その場合、カソードチャンバーはそのような非気体材料を運ぶように適合すべきである。
【０２１５】
［分離デバイス］
本発明のさらにもう１つの実施形態において、試料を少なくとも２つの試料成分に分けるのに適合した分離モジュールを含む検出デバイスが提供される。そのような分離は、例えば、クロマトグラフィー、電気泳動、電荷流（charge-flow、ここで、電場または磁場は流体流内の種の異動に影響する）、移動に影響する音波を生じさせるイオンパルスデバイス、（例えば、光または両親媒性物質で）ｐＨ変化を誘導し、その結果、移動速度が区別されるデバイス、密度または沈降速度に基づいて分離する（例えば、そのデバイスから分離された層が遠心後に分析物センサーを通って排出される）遠心分離機、細胞ソーター、および化学または細胞種を分離するためのいずれかの他のデバイスによって達成することができる。分離の結果、次いで、少なくとも１つの成分は移動エレメント、例えば、チュービングおよびポンプによって、特定の分析物を検出するのに適合した本発明の分析物センサーの第一の区画に移動され、またはそこへ向けられる。
【０２１６】
（センサーの使用のためのこのまたは他の文脈における）細胞検出では、検出された種は細胞の酵素産物、または抗体またはもう１つのアフィニティー結合により細胞に結合した酵素によって製造された酵素産物であり得る。
【０２１７】
流動検出においては、支持試薬を同時流動させるのが時々有用であろう。１つの場合、支持試薬は必要な１以上の成分を加えるが、分離デバイスからの流れには供給しない。その中へ分離デバイスからの流れが流入する生体適合性膜の他方側で、もし必要であれば同時流動を用いて、いずれかの検出支持成分の新鮮な供給を確保することができる。例えば、図７に示すように、分離デバイスＳｅｐは流体の流れを（隣接する矢印によって示された）チュービングＴ１に供給し、貯蔵器Ｒｅｓ１はチュービングＴ２を介して（側面Ｓ１およびＳ２を有する）分析物センサーＡＳにおける検出用の試薬（もし必要であれば）を共する（隣接矢印によって示される流れ）。チュービングＴ１およびＴ２を通じての流れは、ミキサー、例えば、スタティックミキサーを含むことができる接合Ｊ１において接合し、合わされた流れは分析物センサーＡＳの側面Ｓ１まで進み、次いで、チュービングＴ４を通じて外へ出る。接合Ｊ１は、適切には分析物センサーから近くまたは遠くに置かれて、貯蔵器Ｒｅｓ１からの流体によって要求されるいずれかの化学（例えば、反応キネティックス）を支持することができる。貯蔵器Ｒｅｓ２は、必要なら、側面Ｓ２へチュービングＴ５を通じて、それからチュービングＴ６を通じて取り出し、試薬を提供する。
【０２１８】
試料を分離することなく注入する場合（例えば、アイテムＳｅｐをインジェクターで置き換える場合）、同一タイプの支持試薬の流れを用いることができるのは明らかであろう。次いで、データまたは読出を分析物センサーＳ１／Ｓ２から取る。
【０２１９】
また、分離モジュールは、成分の分析物センサーへの移動に先立って１を超える分離を行うことができるのも明らかであろう。分離モジュールは、試料を一連の分離に付すのに適合させることができ、これは、１を超えるタイプの分離デバイスを用いて達成することができる。例えば、細胞ソーターを使用し、続いて、遠心し、または複数回遠心することができる。さらにもう１つの例では、試料を遠心に付し、続いて、クロマトグラフィーカラムによって分離することができる。
【０２２０】
［実施例１〜４３６］  （生体適合性膜）
〔実施例１〕
【０２２１】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は以下の通りに製造した。２ＫＤ−５ＫＤ−２ＫＤの平均分子量を有する、７％ｗ／ｖ（７０ｍｇ）のブロックコポリマー（ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチル（オキサゾリン）））を、磁気スターラーを用いて攪拌しつつ、９５％ｖ／ｖ／５％ｖ／ｖエタノール／水溶媒混合液に溶解させた。６マイクロリットルのこの溶液を取り出し、水中の０．０１５％ｗ／ｖドデシルマルトシド、４０マイクログラムの複合体Ｉ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含有する４マイクロリットルの溶液と混合した。次いで、これを混合する。得られた溶液は４．２％ｗ／ｖのポリマー、５５％ｖ／ｖのＥｔＯＨ、４５％ｖ／ｖのＨ2Ｏ、０．０６％ｗ／ｖのドデシルマルトシドを含有し、タンパク質／ポリマーの比率は６％ｗ／ｗである。
〔実施例２〕
【０２２２】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、より少量のポリペプチド溶液を用いて、合成ポリマー材料に対して０．０１５％ｗ／ｖドデシルマルトシドおよび１．５％ｗ／ｗポリペプチドを含む最終溶液を供する変化を施して、実施例１に記載するように調製した。
〔実施例３〕
【０２２３】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、より少量のポリペプチド溶液を用いて、０．０３％ｗ／ｖのドデシルマルトシドを含む最終溶液を供し、最終溶液が合成ポリマー材料に対して３．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含有する変化を施し、実施例１に記載するように調製した。
〔実施例４〕
【０２２４】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、より少量のポリペプチド溶液を用いて、０．０４５ｗ／ｖのドデシルマルトシドを含む最終溶液を供し、最終溶液が合成ポリマー材料に対して４．５％ｗ／ｗのポリペプチドを含有するよう変形を施し、実施例１に記載するように調製した。
〔実施例５〕
【０２２５】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、より少量のポリペプチド溶液を用いて、０．００７５ｗ／ｖのドデシルマルトシドを含む最終溶液を供し、最終溶液が合成ポリマー材料に対して０．７５％ｗ／ｗのポリペプチドを含有するよう変形を施し、実施例１に記載するように調製した。
〔実施例６〕
【０２２６】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、合成ポリマー材料を元来５．０％ｗ／ｖの溶液に存在させる変形を施し、実施例５に記載するように調製した。実施例１に記載したタイプの十分なポリペプチド溶液を添加して、合成ポリマー材料に対して０．００７５％ｗ／ｖのドデシルマルトシドおよび０．７５％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液を得た。
〔実施例７〕
【０２２７】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、実施例１に記載した十分なポリペプチド溶液を含めて、０．０１５％ｗ／ｖのドデシルマルトシドを含む最終溶液を得、最終溶液が合成ポリマー材料に対して１．５％ｗ／ｗのポリペプチドを含有するよう変形を施し、実施例６に記載されたタイプで調製した。
〔実施例８〕
【０２２８】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、実施例１に記載された十分なポリペプチド溶液を含めて、０．０３％ｗ／ｖのドデシルマルトシドを含む最終溶液を得、最終溶液が合成ポリマー材料に対して３％ｗ／ｗのポリペプチドを含有するように変形を施し、実施例６に記載したタイプで調製した。
〔実施例９〕
【０２２９】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、実施例１に記載された十分なポリペプチド溶液を含ませて、０．０４５％ｗ／ｖのドデシルマルトシドを含む最終溶液を得、最終溶液が合成ポリマー材料に対して４．５％ｗ／ｗのポリペプチドを含有するよう変形を施して、実施例６に記載したタイプで調製した。
〔実施例１０〕
【０２３０】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、実施例１に記載された十分なポリペプチド溶液を含ませて、０．０６％ｗ／ｖのドデシルマルトシドを含む最終溶液を得、最終溶液が合成ポリマー材料に対して６．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含有するように変形を施し、実施例６に記載したタイプで調製した。
〔実施例１１〜１５〕
【０２３１】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各溶液で用いる合成ポリマー材料の量が元来１０％ｗ／ｖであった以外は、各々、実施例１〜５に記載されたように調製した。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載したタイプの十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．０６、０．１５、０．０３、０．０４５および０．００７５％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および６．０、１．５、３．０、４．５および０．７５％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造された。
〔実施例１６〕
【０２３２】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に実施例３に記載されるように調製したが、合成ポリマー材料を溶解させるのに用いた溶媒はエタノール、２５％ｖ／ｖのメタノールおよび、実施例３に示された量の水を含んだ。十分なポリペプチド溶液を用いて、合成ポリマー材料に対して０．０３％ｗ／ｖのドデシルマルトシドおよび３．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液を得た。
〔実施例１７〕
【０２３３】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に実施例２に記載したように調製したが、合成ポリマー材料を溶解するのに用いた溶媒は、４７．５％ｖ／ｖのエタノール、２．５％ｖ／ｖの水、２５％ｖ／ｖのテトラヒドロフラン（「ＴＨＦ」）、２５％ｖ／ｖのジクロロメタンを含有した。十分なポリペプチド溶液を用いて、合成ポリマー材料に対して０．０１５％ｗ／ｖのドデシルマルトシドおよび１．５％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液を得た。
〔実施例１８〕
【０２３４】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に実施例６に記載するように調製することができるが、合成ポリマー材料を溶解するのに用いた溶媒は９．５％ｖ／ｖのエタノール、０．５％ｖ／ｖの水、４０％ｖ／ｖのアセトン、および４０％ｖ／ｖのヘキサンを含むものであった。
〔実施例１９−２４〕
【０２３５】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、前記実施例１１〜１５に記載されたように調製したが、ドデシルマルトシドの最終濃度は０．１５％ｗ／ｖであった。本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、前記実施例４に記載するように調製することができるが、ポリペプチド溶液で用いた界面活性剤の残りはドデシルｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、界面活性剤の最終濃度は０．１５％ｗ／ｖである。
〔実施例２６〕
【０２３６】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、前記実施例９に記載したように調製したが、ポリペプチド溶液で用いた界面活性剤は、ＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎドイツ国からの商標ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ１０１、ロットＷＰＤＸ−５２２Ｂ下で販売されるポリマー界面活性剤、および同一濃度の実施例９で特定されるドデシルマルトシドの混合物を含んだ。ポリマー界面活性剤は最終溶液中でのその供給された濃度の０．１％ｗ／ｗまで希釈した。
〔実施例２７〕
【０２３７】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、前記実施例２に記載したように調製したが、ポリペプチド溶液で用いた界面活性剤は、ＢＹＫ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ  ＣＴからの商標ＤＩＳＰＥＲＰＬＡＳＴ、ロット番号３１Ｊ０２２下で販売されるポリマー界面活性剤、および同一濃度の実施例２で特定されるドデシルマルトシドの混合物を含むものであった。ポリマー界面活性剤は最終溶液中の供給された濃度の０．１３５％ｖ／ｖまで希釈した。
〔実施例２８〜３２〕
【０２３８】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例６〜１０に記載したように調製することができるが、用いた合成ポリマー材料は３ｋＤ−７ｋＤ−３ｋＤの平均分子量を有するポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（５％ｗ／ｖ）であり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載したタイプの十分なポリペプチド溶液と混合する場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．０６０％ｗ／ｖドデシルマルトシド、および０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％ｖ／ｖポリペプチドを含む最終溶液が製造される。
〔実施例３３〜３８〕
【０２３９】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、各々、一般に、実施例１〜５に記載したように調製されるが、用いた合成ポリマー材料は、その双方が、そのうち１つが２ｋＤ−５ｋＤ−２ｋＤの平均分子量を有し、他方が１ｋＤ−２ｋＤ−１ｋＤの平均分子量を有し、第二のブロックコポリマーに対する第一のブロックコポリマーの比率が用いた全ポリマーの約６７％〜３３％ｗ／ｗであるポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（合計７％ｗ／ｖ）である２つのブロックコポリマーの混合物であった。６マイクロリットルのその溶液の実施例１に記載したタイプの十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．０６、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．００７５％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造された。
〔実施例３９〜４３〕
【０２４０】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例１１〜１５に記載するように調製することができるが、用いる合成ポリマー材料は、その双方が、その一方が１ｋＤ−２ｋＤ−１ｋＤの平均分子量を有し、他方が３ｋＤ−７ｋＤ−３ｋＤを有し、第二のブロックコポリマーに対する第一のブロックコポリマーの比率は用いる全ポリマーの約３３％〜６７％ｗ／ｗであるポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（１０％ｗ／ｖ）である２つのブロックコポリマーの混合物であり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載したタイプの十分なポリペプチド溶液と混合する場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．０７５、０．１５、０．３０、０．４５および０．６０％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造される。
〔実施例４４〜４８〕
【０２４１】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例６〜１０に記載されたように調製することができるが、用いる合成ポリマー材料は、その双方が、その一方が２ｋＤ−５ｋＤ−２ｋＤの平均分子量を有し、他方が３ｋＤ−７ｋＤ−３ｋＤの平均分子量を有し、第二のブロックコポリマーに対する第一のブロックコポリマーの比率が用いる全ポリマーの約３３％〜６７％ｗ／ｗであるポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（５％ｗ／ｖ）である２つのブロックコポリマーの混合物であり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載されたタイプの十分なポリペプチド溶液と混合する場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．０６０％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造される。
〔実施例４９〜５３〕
【０２４２】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例１〜５に記載されたように調製することができるが、用いる合成ポリマー材料は、その双方が、その一方が２ｋＤ−５ｋＤ−２ｋＤの平均分子量を有し、他方が３ｋＤ−７ｋＤ−３ｋＤの平均分子量を有し、第二のブロックコポリマーに対する第一のブロックコポリマーの比率は用いる全ポリマーの約６７％〜３３％ｗ／ｗであるポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（７％ｗ／ｖ）である２つのブロックコポリマーの混合物であり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載したタイプの十分なポリペプチド溶液と混合する場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．０６、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．００７５％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および６．０、１．５、３．０、４．５および０．０２５％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造される。
〔実施例５４〜５８〕
【０２４３】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例１〜５に記載されたように製造することができるが、用いる合成ポリマーは、８５％ｖ／ｖトリブロックコポリマー溶液、１５％ｖ／ｖのポリエチレングリコール溶液の割合の、水中のほぼ３，３００ダルトンの平均分子量を持つ２３．５％ｗ／ｖのポリエチレングリコールの溶液と混合した、９５％のエタノール、５％の水の溶媒中の平均分子量２ｋＤ−５ｋＤ−２ｋＤの平均分子量を有するポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（７％ｗ／ｖ）の混合物であり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載したタイプの十分なポリペプチド溶液と混合する場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．０６、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．００７５％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および６．０、１．５、３．０、４．５および０．７５％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造される。
〔実施例５９〜６３〕
【０２４４】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、実施例１２に記載されたように調製したが、用いた合成ポリマーは、８５％ｖ／ｖのトリブロックコポリマー、１５％ｖ／ｖのポリエチレングリコール溶液の割合の、水中のほぼ８，０００ダルトンの平均分子量を持つ２３．５％ｗ／ｖのポリエチレングリコールの溶液と混合した９５％のエタノール、５％の水溶媒中の２ｋＤ−５ｋＤ−２ｋＤの平均分子量を有する１０％ｗ／ｖのポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）の混合物であった。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載されたタイプの十分なポリペプチド溶液と混合した場合、合成ポリマー材料に対して０．１５％ｗ／ｖドデシルマルトシドおよび１．５％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造された。同様な溶液は実施例１１および１３〜１５の手法を用いて作成することができる。
〔実施例６４〜６８〕
【０２４５】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例２８〜３２に記載したように調製することができるが、用いた合成ポリマーは、８５％ｖ／ｖのトリブロックコポリマー溶液、１５％ｖ／ｖのポリエチレングリコール溶液の割合の、水中のほぼ３，３００ダルトンの平均分子量を持つ２３．５％ｗ／ｖポリエチレングリコールの溶液と混合した９５％エタノール、５％水の溶媒中の３ｋＤ−７ｋＤ−３ｋＤの平均分子量を有する５％ｗ／ｖのポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）の混合物であり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載したタイプの十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．０６０％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造される。
〔実施例６９〜７３〕
【０２４６】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例１〜５に記載したように調製することができるが、用いる合成ポリマーは、８５％ｖ／ｖのトリブロックコポリマー溶液、１５％ｖ／ｖのポリエチレングリコール溶液の割合の、水中のほぼ８，０００ダルトンの平均分子量を持つ２３．５％ｗ／ｖのポリエチレングリコールの溶液と混合した９５％エタノール、５％水の溶媒中の３ｋＤ−７ｋＤ−３ｋＤの平均分子量を有する７％ｗ／ｖのポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）の混合物であり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載されたタイプの十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して、０．０６０、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．００７５％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および６．０、１．５、３．０、４．５および０．７５％ｖ／ｖのポリペプチドを含む最終溶液が製造される。
〔実施例７４〜７８〕
【０２４７】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例６〜１０に記載されたように製造することができるが、使用される合成ポリマーは、８０％ｖ／ｖのブロックコポリマー、２０％ｖ／ｖポリスチレンの割合の５０％ｖ／ｖアセトン、５０％ｖ／ｖオクタン中の分子量が約２５０，０００の５％ｗ／ｖポリスチレンの溶液と混合された５０％ｖ／ｖアセトン、５０％ｖ／ｖヘプタンの溶媒中の２ｋＤ−５ｋＤ−２ｋＤの平均分子量を有する５％ｖ／ｖのポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）の混合物であり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載されたタイプの十分なポリペプチド溶液と混合する場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．０６０％ｗ／ｖドデシルマルトシド、および０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％ｗ／ｗポリペプチドを含む最終溶液が製造される。
〔実施例７９〜８３〕
【０２４８】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例１〜５に記載したように調製することができるが、合成ポリマーは、各々、６６％ｖ／ｖ〜３３％ｖ／ｖの割合の、５０％ｖ／ｖＴＨＦ、５０％ｖ／ｖのジクロロメタンの溶媒中の４ｋＤ−８ｋＤ−４ｋＤの平均分子量を有する５％ｗ／ｖのポリメチルメタクリレート−ポリジメチルシロキサン−ポリメチルメタクリレートの溶液と混合した９５％エタノール、５％水の溶媒中の２ｋＤ−５ｋＤ−２ｋＤの平均分子量を有する７％ｗ／ｖのポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）の混合物であり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載されたタイプの十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．０６、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．００７５％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および６．０、１．５、３．０、４．５および０．０７５％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造される。
〔実施例８４〜８８〕
【０２４９】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例１１〜１５に記載されたように製造したが、用いる合成ポリマー材料は、５％ｖ／ｖの水を含有するエタノールで５０％ｖ／ｖに希釈され供給された溶媒中のＤａｉｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃ，Ｏｄｅｓｓａ，ＦＬによるＰｒｏｔｏｌｙｔｅ（登録商標）Ａ７００、ロット番号ＬＣ−２９／６０−０１１として供給された１０％ｖ／ｗのスルホン化スチレン／エチレン−ブチレン／スルホン化スチレンであった。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載されたタイプの十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．０６０％ｗ／ｖのドデシルマルトシドおよび０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％のｗ／ｗポリペプチドを含む最終溶液が製造された。
〔実施例８９〕
【０２５０】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、実施例８４に記載したように調製することができるが、合成ポリマー材料を希釈するのに用いる溶媒は５０％ｖ／ｖのテトラヒドロフラン（「ＴＨＦ」）、５０％ｖ／ｖのジクロロメタンを含むことができる。
〔実施例９０〜９４〕
【０２５１】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、前記実施例８４〜８８に記載されたように調製したが、ドデシルマルトシドの最終濃度は０．１５％ｗ／ｖであった。
〔実施例９５〕
【０２５２】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に前記実施例８５に記載したように調製することができるが、ポリペプチド溶液で用いる界面活性剤はドデシルｂ−Ｄ−グルコピラノシドおよびドデシルマルトシドの混合物を含むことができ、界面活性剤の最終濃度は０．１５％ｗ／ｖである。
〔実施例９６〕
【０２５３】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、前記実施例８７に記載するように調製したが、ポリペプチド溶液で用いた界面活性剤はＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎドイツ国からの商標ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ１０１、ロットＷＰＤＸ−５２２Ｂ下で販売されるポリマー界面活性剤および実施例８７で特定される同一濃度のドデシルマルトシドの混合物を含んだ。ポリマー界面活性剤は、最終溶液におけるその供給された濃度の０．１％ｖ／ｖまで希釈した。
〔実施例９７〕
【０２５４】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、前記実施例８８に記載されたように調製したが、ポリペプチド溶液で用いる界面活性剤はＢＹＫ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ  ＣＴからの商標名ＤＩＳＰＥＲＰＬＡＳＴ、ロット番号３１Ｊ０２２下で販売されるポリマー界面活性剤、および実施例８８で特定される同一濃度のドデシルマルトシドの混合物を含んだ。ポリマー界面活性剤の最終濃度は、最終溶液中での供給された濃度の０．１３５％ｖ／ｖまで希釈した。
〔実施例９８〜１０２〕
【０２５５】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例８４〜８８に記載されたように調製したが、用いる合成ポリマー材料は、その一方が５％ｖ／ｖ水を含有するエタノールで５０％ｖ／ｖに希釈され供給された溶媒中のＤａｉｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃ、Ｏｄｅｓｓａ、ＦＬによってＰｒｏｔｏｌｙｔｅ（登録商標）Ａ７００、ロット番号ＬＣ−２９／６０−０１１として供給された１０％ｗ／ｖのスルホン化スチレン／エチレン−ブチレン／スルホン化スチレンであり、その他方が２ｋＤ−５ｋＤ−２ｋＤの平均分子量を有する５％ｗ／ｖのポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）であり、第二のブロックコポリマーに対する第一のブロックコポリマーの比率は用いる全ポリマーの約６７％〜３３％ｗ／ｗである２つのブロックコポリマーの混合物であった。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載された十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．０６０％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造された。
〔実施例１０３〜１０７〕
【０２５６】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例８４〜８８に記載されたように調製したが、用いる合成ポリマー材料は、その一方が５％ｖ／ｖの水を含有するエタノールで５０％ｖ／ｖに希釈され供給された溶媒中のＤａｉｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃ、Ｏｄｅｓｓａ、ＦＬによってＰｒｏｔｏｌｙｔｅ（登録商標）Ａ７００、ロット番号ＬＣ−２９／６０−０１１として供給される１０％ｗ／ｖのスルホン化スチレン／エチレン−ブチレン／スルホン化スチレンであり、その他方が２ｋＤ−５ｋＤ−２ｋＤの平均分子量を有する５％ｗ／ｖのポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）であり、第二のブロックコポリマーに対する第一のブロックコポリマーの比率は用いる全ポリマーの約３３％〜６７％ｗ／ｗである２つのブロックコポリマーの混合物であった。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載された十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．０６０％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造された。
〔実施例１０８〜１１２〕
【０２５７】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例１０３〜１０７に記載されたように製造することができるが、用いる合成ポリマー材料は、その一方が５％ｖ／ｖの水を含有するエタノールで５０％ｖ／ｖに希釈され供給された溶媒中のＤａｉｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃ、Ｏｂｅｓｓａ、ＦＬによってＰｒｏｔｏｌｙｔｅ（登録商標）Ａ７００、ロット番号ＬＣ−２９／６０−０１１として供給された１０％ｗ／ｖのスルホン化スチレン／エチレン−ブチレン／スルホン化スチレンであり、その他方が５０％ｖ／ｖＴＨＦ、５０％ｖ／ｖジクロロメタンの溶媒混合物中の４ｋＤ−８ｋＤ−４ｋＤの平均分子量を有する５％ｗ／ｖのポリメチルメタクリレート−ポリジメチルシロキサン−ポリメチルメタクリレートであり、第二のブロックコポリマーに対する第一のブロックコポリマーの比率は用いる全ポリマーの約６７％〜３３％ｗ／ｗである２つのブロックコポリマーの混合物であり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載したタイプの十分なポリペプチド溶液と混合すると、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．０６０％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造される。
〔実施例１１３〜１１７〕
【０２５８】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例１０３〜１０７に記載されたように製造することができるが、用いる合成ポリマーは、その一方が５％ｖ／ｖ水を含有するエタノールで５０％ｖ／ｖに希釈され供給された溶媒中のＤａｉｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃ、Ｏｄｅｓｓａ、ＦＬによってＰｒｏｔｏｌｙｔｅ（登録商標）Ａ７００、ロット番号ＬＣ−２９／６０−０１１として供給された１０％ｗ／ｖのスルホン化スチレン／エチレン−ブチレン／スルホン化スチレンであり、その他方が５０％ｖ／ｖのＴＨＦ、５０％ｖ／ｖのジクロロメタンの溶媒混合液中の４ｋＤ−８ｋＤ−４ｋＤの平均分子量を有する５％ｗ／ｖのポリメチルメタクリレート−ポリジメチルシロキサン−ポリメチルメタクリレートであり、第二のブロックコポリマーに対する第一のブロックコポリマーの比率が用いる全ポリマーの約３３％〜６７％ｗ／ｗである２つのブロックコポリマーの混合物であり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載されたタイプの十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．０６０％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造される。
〔実施例１１８〜１２２〕
【０２５９】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例８４〜８８に記載したように調製したが、用いる合成ポリマー材料は、８５％ｖ／ｖのトリブロックコポリマー溶液、１５％ｖ／ｖのポリエチレングリコール溶液の割合の、水中のほぼ３，３００ダルトンの平均分子量を持つ２３．５％ｗ／ｖのポリエチレングリコールの溶液と混合した、５％ｖ／ｖの水を含有するエタノールで５０％ｖ／ｖに希釈され供給された溶媒中のＤａｉｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃ、Ｏｄｅｓｓａ、ＦＬによってＰｒｏｔｏｌｙｔｅ（登録商標）Ａ７００、ロット番号ＬＣ−２９／６０−０１１として供給された１０％ｗ／ｖのスルホン化スチレン／エチレン−ブチレン／スルホン化スチレンの混合物であった。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載したタイプの十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．０６０％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造された。
〔実施例１２３〜１２７〕
【０２６０】
本発明による生体適合性膜を製造するために有用な溶液は、一般に、各々、実施例８４〜８８に記載されたように調製したが、用いた合成ポリマー材料は、８５％ｖ／ｖのトリブロックコポリマー溶液、１５％ｖ／ｖのポリエチレングリコール溶液の割合の、水中のほぼ８，０００ダルトンの平均分子量を持つ２３．５％ｗ／ｖポリエチレングリコールの溶液と混合した、５％ｖ／ｖの水を含有するエタノールで５０％ｖ／ｖに希釈され供給された溶媒中のＤａｉｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃ、Ｏｄｅｓｓａ、ＦＬによってＰｒｏｔｏｌｙｔｅ（登録商標）Ａ７００、ロット番号ＬＣ−２９／６０−０１１として供給された１０％ｗ／ｖのスルホン化スチレン／エチレン−ブチレン／スルホン化スチレンの混合物であった。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載されたタイプの十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．０６０％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造された。
〔実施例１２８〜１３２〕
【０２６１】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例６〜１０に記載されたように調製することができるが、用いる合成ポリマー材料は、５０％ｖ／ｖのＴＨＦ、５０％ｖ／ｖのジクロロメタンの溶媒混合物中の４ｋＤ−８ｋＤ−４ｋＤの平均分子量を有する５％ｗ／ｖのポリメチルメタクリレート−ポリジメチルシロキサン−ポリメチルメタクリレートであり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載されたタイプの十分なポリペプチド溶液と混合する場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５、０．０３０、０．０４５および０．０６０％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５、１．５、３．０、４．５および６．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造された。
〔実施例１３３〜１３４〕
【０２６２】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例６および７に記載されたように調製したが、用いる合成ポリマー材料は、アセトンおよびヘキサンの５０％／５０％ｖ／ｖ混合液中のＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎドイツ国によってＳｔｒｙｏｌｕｘ（登録商標）３Ｇ５５、ロット７４５３０６４Ｐとして供給される３．２％ｗ／ｖのポリスチレン−ポリブタジエン−ポリスチレンであった。６マイクロリットルのその溶液の実施例１の記載されたタイプの十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５および０．０１５％ｗ／ｖのドデシルマルトシドおよび０．７５および１．５％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造された。
〔実施例１３５〜１３６〕
【０２６３】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例６および７に記載したように調製したが、用いた合成ポリマー材料は、アセトンおよびヘプタンの５０％／５０％ｖ／ｖ混合液中のＢＡＳＦ、Ｌｕｅｗｉｇｓｈａｆｅｎドイツ国によってＳｔｒｙｏｌｕｘ（登録商標）３Ｇ５５、ロット７４５３０６４Ｐとして供給される３．２％ｗ／ｖのポリスチレン−ポリブタジエン−ポリスチレンであった。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載されたタイプの十分なポリペプチド溶液と混合すると、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５および０．０１５％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５および１．５％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造された。
〔実施例１３７−１３８〕
【０２６４】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例１３５および１３６に記載したように製造したが、用いた合成ポリマー材料は、アセトンおよびヘプタンの５０％／５０％ｖ／ｖ混合液中のＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎドイツ国によってＳｔｒｙｏｌｕｘ（登録商標）３Ｇ５５、ロット７４５３０６４Ｐとして供給された５％ｗ／ｖのポリスチレン−ポリブタジエン−ポリスチレンであった。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載されたタイプの十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５および０．０１５％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５および１．５％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造された。
〔実施例１３９−１４１〕
【０２６５】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例６〜８に記載されたように調製することができるが、用いる合成ポリマー材料は、各々、約８０％ｖ／ｖ〜２０％ｖ／ｖの割合の、アセトンおよびヘキサンの５０％／５０％ｖ／ｖ混合液中のＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎドイツ国によってＳｔｒｙｏｌｕｘ（登録商標）３Ｇ５５、ロット７４５３０６４Ｐとして供給される５％ｗ／ｖのポリスチレン−ポリブタジエン−ポリスチレン、および同一溶媒中の２ｋＤ−５ｋＤ−２ｋＤの平均分子量を有する５％ｗ／ｖポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）の混合物であり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載したタイプの十分なポリペプチド溶液と混合した場合、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５、および０．０３０％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５、１．５および３．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造される。
〔実施例１４２−１４５〕
【０２６６】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例１３９〜１４１に記載されたように製造することができるが、用いる合成ポリマー材料は、各々、約８０％ｖ／ｖ〜２０％ｖ／ｖの割合の、アセトンおよびヘキサンの５０％／５０％ｖ／ｖ混合液中のＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎドイツ国によってＳｔｒｙｏｌｕｘ（登録商標）３Ｇ５５、ロット７４５３０６４Ｐとして供給される５％ｗ／ｖのポリスチレン−ポリブタジエン−ポリスチレン、および同一溶媒中の３ｋＤ−７ｋＤ−３ｋＤの平均分子量を有する５％ｗ／ｖのポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリジメチルシロキサン−ポリ（２−メチルオキサゾリン）の混合物であり得る。６マイクロリットルのその溶液を実施例１に記載したタイプの十分なポリペプチド溶液と混合すると、各々、合成ポリマー材料に対して０．００７５、０．０１５および０．０３０％ｗ／ｖのドデシルマルトシド、および０．７５、１．５および３．０％ｗ／ｗのポリペプチドを含む最終溶液が製造される。
〔実施例１４６−２９０〕
【０２６７】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例１〜１４５に記載されたように調製することができるが、合成ポリマーと混合するポリペプチド溶液は、Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮから入手可能な０．１５％のＴｈｅｓｉｔ（ポリオキシエチレン（９）ドデシルエーテル、Ｃ１２Ｅ９）も含むことができる水中の１０ｍｇ／ｍｌのスクシネート：ユビキノンオキシドレダクターゼ（複合体ＩＩ）の溶液であり得る。この界面活性剤は、一般に、同様な濃度の実施例１〜１４５におけるドデシルマルトシドを置き換える。
〔実施例２９１〜４３５〕
【０２６８】
本発明による生体適合性膜を製造するのに有用な溶液は、一般に、各々、実施例１〜１４５に記載したように調製することができるが、合成ポリマーを希釈するのに用いるポリペプチド溶液は、０．１５％のトリトンＸ−１００も含むことができる水中の１０ｍｇ／ｍｌのニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼの溶液であり得る。この界面活性剤は、一般に、同様な濃度の実施例１〜１４５におけるドデシルマルトシドを置き換える。さらに、ドデシルｂ−Ｄ−グルコピラノシドを含む実施例１〜１４５においては、この界面活性剤は同様な濃度のノニデットＰ−４０と置き換えることができる。
〔実施例４３６〕
【０２６９】
誘電性の穴を開けた支持体上に膜を形成する。該支持体はＤｕＰｏｎｔから入手可能なＫＡＰＴＯＮ（１ミル厚み）で作成され、直径が１００マイクロメーターおよび深さが１ミルの開口を持つようにレーザー・ドリル処理する。開口のアレイは１，７００開口／ｃｍ2と高い密度を有することができる。生体適合性膜は、先に詳細に記載したＰＥＧ８０００／ＰＲＯＴＯＬＹＴＥ  Ａ７００膜を用いて開口を横切って形成される。ブロックコポリマー、安定化ポリマーおよびポリペプチドを含有する得られた最終溶液を、次いで、ピペットにより、一回につき４マイクロリットルにて滴下して開口を完全に覆うように、基材上に沈積させる。溶媒をフード下で室温にて蒸発させた。膜−支持体アセンブリーを使用に先立って真空チャンバー中で貯蔵した。
〔実施例４３７−４６４〕  （プロトン・トンネリング膜）
【０２７０】
実施例４３７〜４３９については、以下のＰＴＭ溶液を用いた。
【０２７１】
テトラヒドロフラン（ロット１５８７９ＣＡ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）中の５０ｍｇ／ｍｌのポリスチレン−ポリ（１−４）ブタジエン−ポリスチレン（３Ｇ５５ロット７４５３０６４Ｐ、ＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、ドイツ国）の溶液を、連続的に攪拌しつつ、ガラス瓶中の溶媒にポリマーペレットを溶解させることによって調製した。
〔実施例４３７〕
【０２７２】
Ｋａｐｔｏｎ（ポリイミド、Ｄｕｐｏｎｔ）支持体をレーザードリリングして、各々直径がほぼ１００ミクロンの１００開口（１０×１０）の４アレイの組を作成し、アレイ当たりほぼ０．０５５ｃｍ2の開いた領域、または開口に隣接するほぼ３３％の開いた領域を持つ領域にわたる０．２２ｃｍ2の合計開いた領域を作成した。アレイをピースの中央として、Ｋａｐｔｏｎをほぼ１インチ×１．７５インチに切断し、Ｌｅｘａｎの３／８インチの厚みのピース中のより大きな開口（ほぼ１インチ）上に一時的に設置した。
【０２７３】
マイクロピペットデバイスを用い、前記した４マイクロリットルのポリスチレン−ポリ（１−４）ブタジエン−ポリスチレン溶液を、アレイ中の全ての開口を被覆するように、各アレイに適用した。溶液を化学フード中で風乾し、次いで、真空オーブンに移し、いずれかの圧力で室温にて１５分間完全に乾燥させた。
【０２７４】
次いで、膜と共に支持体をオーブンから取り出し、Ｌｅｘａｎから取り出し、５分間７０％エタノール（３０％脱イオン水）に浸漬させた。
【０２７５】
次いで、以下のテストセルを構築することによって、膜をテストした。ポリスルホンプレート（２”×３”×３／８”）を外側シェルとして機能させた。亜鉛ホイルのピース（１”×３”×０．２５ｍｍ、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ＬＳ２３７１７１、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）をアノードとして機能させ、続いて、シリコーンゴムガスケット（３／８”厚み）でアノード区画をＫａｐｔｏｎ支持体／膜に対してシールし、次いで、第二のガスケット（１／４”厚み）で支持体を黒鉛カソードに対してシールした。（Ｐｏｃｏ、Ｄｅｃａｔｕｒ、ＴＸ）。第一のプレートと同一サイズの最終ポリスルホンプレートをネジを介して第一のプレートに固定し、層を一緒に締め付けたが、ネジは電極にも、また陽極液または陰極液にも接触させなかった。
【０２７６】
次いで、陽極区画に０．８ｍｌの２．３Ｍテトラメチルアンモニウム（ＴＭＡ）−フォルメートｐＨ８．０および０．２ｍｌの２．６ＴＭＡ−ＯＨ（ｐＨ  １５）の混合物を満たし、カソード区画を０．１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4および１％Ｈ2Ｏ2で補足した１．０ｍｌの１００マイクロモルのＴＭＡ−スルフェートｐＨ７．０（最終濃度）を満たした。
【０２７７】
アノードおよびカソードを、電位計と平行に、コンピューター−制御の可変負荷回路を介して結合させた。電流および電圧を測定し、膜を通じてアノード区画からカソード区画へのプロトンの移動に合致させて、テストセルによって生じさせた。
〔実施例４３８〕
【０２７８】
（さらなる未知の可塑剤を含む）１−ｍｍ厚みのポリスチレンシートを１”×１．７５”のサイズに切断し、７／１６”直径の開口をその中央でパンチした。開口に沈積させた場合、液体が開口から離れて小さな距離（１／４インチ未満）だけ超えてポリエチレンおよびテフロン（登録商標）ピースの間をはじくことができないように、該ピースをバインダークリップでほぼ３”×３”×３／８”のポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標）−Ｄｕｐｏｎｔ）ブロックに固定した。
【０２７９】
１００マイクロリットルの容量の前記したポリスチレン−ポリブタジエン−ポリスチレンブロックコポリマー溶液を開口中に沈積させた。溶媒を化学ヒュームフード中で蒸発乾固させ、次いで、装置を真空フードまで輸送し、そこで、膜を室温にて１５分間乾燥させた。
【０２８０】
真空フードからの取り出しに続き、膜−ポリスチレン支持体をテフロン（登録商標）ブロックから機械的に脱離させ、７０％エタノール中で５分間インキュベートし、実施例４３７に記載したようにテストした。テストセルの電圧および電流出力を、アノード区画からカソード区画へのプロトン移動と合致させた。
〔実施例４３９〕
【０２８１】
２．２５”×２”×２０ミルの粉砕した空間を持つアルミニウムキャスティングブロック（３．２５”×３”×１／２”）を、前記ポリスチレン−ポリブタジエン−ポリスチレンブロックコポリマー溶液（２８０マイクロリットル）を、ＴＨＦ中の２５ｍｇ／ｍｌジオクチルスルホスクシネートのナトリウム塩（ロット１１３１２、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）の１ｍｌの懸濁液と共に、５０ｍｇ／ｍｌのポリ（４−クロロスチレン）（Ｐ１３５１、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ、Ｄｏｒｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ）の７０マイクロリットルの溶液およびＴＨＦ中の５０ｍｇ／ｍｌの超高分子量ポリスチレン（ＵＨＭＷＰＥ）ミクロ粒子（ＧＳＩ  Ｅｘｉｍ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｍａｓｏｎ、ＯＨ；グレードＸＭ２２１Ｕ、ロット１９１１０Ａ）の３５０マイクロリットルの懸濁液と混合することによって形成されたポリマー溶液の層で被覆した。実施例４３７におけるように、溶媒をヒュームフード中で蒸発させ、次いで、膜を真空オーブン中で乾燥した。脱イオン水に浸漬させることによって、膜をキャスティング金型から放出させ、次いで、エタノールに１５分間浸漬させた。
【０２８２】
実施例４３７におけるように膜をテストしたが、より小さなプレートを３．２５”×３×面積のもので置き換え、シートアルミニウム（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、ＬＳ２３８５０５  ＬＣ）のピースをアノードとして機能させた。
【０２８３】
このアセンブリーは、アノードからカソードへのプロトンの移動に合致した電圧および電流も生じた。
〔実施例４４０〕
【０２８４】
膜を前記実施例４３７におけるように形成させたが、まず膜をエタノールに浸漬させることなくテストセルを組み立てた。テストセルは合致した電圧出力を生じさせず、電流出力を生じさせなかった。これは、アノードおよびカソードの間の完全な誘電体によって生じた出力と合致し、プロトン移動が起こらないものである。
〔実施例４４１〕
【０２８５】
１．６マイクロリットルの０．１５％ドデシルマルトシド（Ｓｉｇｍａ）の水性溶液をポリマー溶液にさらに含めて、膜を前記実施例４３７におけるように形成した。真空乾燥に続き、テストセルの組立に先立って膜をエタノールに浸漬させなかった。しかしながら、膜は、アノードからカソードへの膜を通ってのプロトン移動に合致した電流および電圧を生じた。
〔実施例４４２〕
【０２８６】
膜を前記実施例４３７におけるように形成させ、次いで、組立に先立って、７０％エタノールの代わりに０．１５％ドデシルマルトシドの溶液に浸漬させた。
〔実施例４４３〕
【０２８７】
実施例４３７におけるように、ポリスチレン−ポリ（１−４ブタジエン）−ポリスチレンブロックコポリマー（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ）の５０ｍｇ／ｍｌ溶液から膜を形成させた。エタノール浸漬し、前記したようにテストセルに組み立てると、この第二の製造業者からの材料はプロトン移動をやはり示した。
〔実施例４４４〕
【０２８８】
８０％（ｖ／ｖ）の前記した５０ｍｇ／ｍｌのポリスチレン−ポリブタジエン−ポリスチレンブロックコポリマー溶液および５０ｍｇ／ｍｌのポリ（４−クロロスチレン）（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ）の２０％（ｖ／ｖ）の溶液の混合物にて、膜を前記実施例４３７におけるように形成させた。
〔実施例４４５〕
【０２８９】
ポリ（４−メチルスチレン）でポリ（４−クロロスチレン）を置き換え、膜を前記実施例４４３におけるように形成させた。
〔実施例４４６〕
【０２９０】
６０％（ｖ／ｖ）のポリスチレン−ポリブタジエン−ポリスチレンブロックコポリマー溶液および４０％（ｖ／ｖ）のポリ（４−クロロスチレン）溶液にて、膜を前記実施例４４３におけるように形成させた。
〔実施例４４７〕
【０２９１】
２５０ｍｇ／ｍｌのポリスチレン（２５０，０００ｍｗ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ）の溶液を用い、膜を前記実施例４３７におけるように同一のＫａｐｔｏｎ支持体上に形成させた。エタノール浸漬、および燃料電池組み立てに続き、この膜はやはりプロトン移動を示した。
〔実施例４４８〕
【０２９２】
ポリマーとしてポリ（１−４ブタジエン）−ポリスチレン−ポリ（１−４ブタジエン）を用い、膜を前記実施例４３７におけるように形成させた。
〔実施例４４９〕
【０２９３】
ポリスチレン−ポリ（１−２ブタジエン）−ポリスチレンブロックコポリマーを用い、膜を前記実施例４３７におけるように形成させた。テストセルは合致した電圧出力を生じず、電流出力を生じなかった。これは、アノードおよびカソードの間の完全な誘電体によって生じた出力と合致し、プロトン移動が起こらないものである。
〔実施例４５０〕
【０２９４】
膜を前記実施例４３７におけるように形成させた。テストセル組立に先立って、膜をイソプロパノールに浸漬させた。
〔実施例４５１〕
【０２９５】
ポリマーとしてポリ２−ビニルナフタレンを用い、膜を前記実施例４３８におけるように形成させた。
〔実施例４５２〕
【０２９６】
ポリマーとしてポリ（２−ビニルピリジン）−ポリ（１−２ブタジエン）−ポリ（２−ビニルピリジン）を用い、膜を前記実施例４３８におけるように形成させた。テストセルは合致した電圧出力を生じず、電流出力を生じなかった。これは、アノードおよびカソードの間の完全な誘電体によって生じた出力と合致し、プロトン移動が起こらないものである。
〔実施例４５２〕
【０２９７】
膜を実施例４５０におけるように形成し、エタノール中への浸漬に続き、１Ｎ硫酸（Ｏｐｔｉｍａグレード、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）中で一晩インキュベートし、次いで、テストセルに組み立てた。
〔実施例４５３〕
【０２９８】
前記３に記載した１００マイクロリットルのポリマー−ＵＨＭＷＰＥ−界面活性剤溶液にて、前記実施例４３８に記載したポリスチレン支持体を用い、膜を形成した。
〔実施例４５４〕
【０２９９】
ＴＨＦ単独中の１０ｍｇ／ｍｌのポリスチレン−ポリブタジエン−ポリスチレンブロックコポリマーを用い、膜を前記実施例４３９におけるように形成した。
〔実施例４５５〕
【０３００】
ジオクチルスルホスクシネートを等質量のプルロニックＬ−１０１（ＢＡＳＦ）で置き換える以外は、前記実施例４３９におけるようにに膜を形成させた。
〔実施例４５６〕
【０３０１】
ＵＨＭＷＰＥを等質量のコーンスターチ（Ａｒｇｏ）で置き換える以外は、前記した実施例４３９におけるように膜を形成させた。
〔実施例４５７〕
【０３０２】
ＵＨＭＷＰＥを等質量のアイソタクチックポリスチレン（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ）で置き換える以外は、前記実施例４３９におけるように膜を形成させた。
〔実施例４５８〕
膜を前記実施例４３７におけるように形成させ、エタノールに５分間浸漬させた。処理に続き、膜／支持体を設置し、２つの２０ミリリットル区画を分離する２つのＯ−リングの間をシールした。区画を一方側は０．１Ｎ硫酸で満たし、他方側は０．１Ｎ水酸化ナトリウムで満たした。膜のいずれか側の溶液のｐＨをモニターした。２４時間にわたり、いずれか側のｐＨは不変であった。
〔実施例４５９〕
【０３０３】
以下の修飾を施して、実施例４３７からのブロックコポリマー溶液を用いて膜を形成した。１４．４マイクロリットルの溶液に１．６マイクロリットルの以下の：１０ｍｇ／ｍｌの大腸菌複合体Ｉ、５０ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ６．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１５％ドデシルマルトシドを含有する溶液を添加した。膜を実施例４３７におけるように形成し、テストした。生じたプロトンフラックスは標準ＰＴＭのそれの３倍であった。
〔実施例４６０〕
【０３０４】
膜を前記実施例４５９におけるように製造し、膜／支持体を設置し、２つの２０ミリリットル区画を分離する２つのＯ−リングの間をシールした。該区画を一方側は０．１Ｎ硫酸で満たし、他方側は０．１Ｎ水酸化ナトリウムで満たした。膜のいずれか側で溶液のｐＨをモニターした。２４時間にわたりいずれか側のｐＨは不変であった。
〔実施例４６１〕
【０３０５】
以下を例外として、膜を実施例４５９におけるように形成した。ポリペプチド、緩衝液、塩および界面活性剤を含有する、ブロックコポリマー処方に添加した溶液を、ブロックコポリマーに混合するに先立ち、沸騰水浴中で１０分間で１００℃まで加熱した。形成された膜を実施例１におけるようにテストした。（実施例５におけるように）セルは、同様な量のドデシルマルトシド界面活性剤単独にてＰＴＭよりも小さな出力を生じた。
〔実施例４６２〕
【０３０６】
膜を前記実施例４４９におけるように形成させた。１４．４マイクロリットルのポリスチレン−ポリ（１−２ブタジエン）−ポリスチレンブロックコポリマーに、以下の：１０ｍｇ／ｍｌの大腸菌複合体Ｉ、５０ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ６．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１５％ドデシルマルトシドを含有する１．６マイクロリットルの溶液を添加した。膜を実施例４３７に記載したように形成し、テストした。テストセルは、今や、電流および電圧を生じた。
〔実施例４６３〕
【０３０７】
膜を前記実施例４５９におけるように製造した。テストセル組立およびテストに先立って、膜を７０％エタノール（３０％脱イオン水）に浸漬させた。テストセルは、未処理膜よりも少ない出力を生じた。
〔実施例４６４〕
【０３０８】
膜を実施例４３９におけるように製造した。キャストからの取出に続き、２−ｃｍ×２−ｃｍ平方を膜から切り出し、Ｄｏｃｕｓｅａｌ−４０ラミネーター（Ｑｕａｒｔｅｔ）にてラミネーティングパンチ（ＡＢＣ  Ｄｏｃｕｓｅａｌ、Ｑｕａｒｔｅｔ  Ｃｏ．Ｓｋｏｋｉｅ、ＩＬ）中の１−ｃｍ×１−ｃｍ開口を横切ってラミネートした。ラミネートした膜を実施例１におけるように活性化し、プロトン移動活性につきテストし、これは存在しないことが判明した。
【０３０９】
膜を前記実施例２９におけるように形成し、ラミネートした。ラミネートした膜を、５０％アセトン、５０％ヘキサンの混合物の薄い表面コーティングで処理した。次いで、溶媒を蒸発させた。これは、フォーム様構造の概観を膜に戻すことが判明し、ラミネーションに先立っての元の膜からの低下したレベルにかかわらず、次いで、プロトン移動活性を再度呈した。
【０３１０】
一般的な現象として、界面活性剤を添加することなく形成した実施例４３７〜４６４でテストした膜の全ては、湿潤剤での表面処理の不存在下では完全に誘電性であった。
〔実施例４６５〕  （分析物センサーの製造）
【０３１１】
分析物センサーは以下のようにに構築することができる。
【０３１２】
直径１００マイクロメーターおよび深さ１ミルの開口にてレーザードリリングしたＤｕＰｏｎｔ（１ミル厚み）から入手可能なＫＡＰＴＯＮで作成された、支持体としての、誘電性の穴を開けたバリア上に膜を形成することができる。開口は、１，７００開口／ｃｍ2と高い密度を有することができる。先に詳細に記載したＰＥＧ８０００／ＰＲＯＴＯＬＹＴＥ  Ａ７００膜を用い、生体適合性膜を開口を横切って形成させる。ブロックコポリマー、安定化ポリマーおよびポリペプチドを含む得られた最終溶液を、次いで、ピペットによって一度に４マイクロリットルを滴下して開口を完全に被覆するように、基材上に沈積させる。溶媒をフード下で室温にて蒸発させる。次いで、膜−支持体アセンブリーを使用に先立って真空チャンバーに貯蔵することができる。
【０３１３】
セルはＤＥＬＲＡＮプラスチックから構築することができる。次いで、前記したように製造した膜−支持体アセンブリーを、ゴムガスケットを備えた燃料電池内の所定の位置にシールして、２つの区画、アノード区画およびカソード区画を形成することができる。次いで、アノードおよびカソード区画を水性電解質（アノード区画では１ＭのＴＭＡ−ホルメートｐＨ１０、およびカソード区画では１％過酸化水素を含有する１００ｍＭのＴＭＡ−スルフェート、ｐＨ２．０）で満たす（各々、２０ｍｌ）。次いで、チタンホイルアノードを電子的に変化させる負荷に平行に連結することができる。アナログ／デジタルボードを備えたコンピューターを用いて、電流および電圧出力を測定する。これらのエレメントをカソード区画中の黒鉛カソード電極に配線することによって回路は完成する。
【０３１４】
チタンホイルアノードをアノード区画の電解質に浸漬させる。アノード（第一の）区画に、検出すべき分析物となるべき５％ｖ／ｖメタノールを導入し、１２．５ｍＭのＮＡＤ＋を電子キャリアーとして用い、１Ｍヒドロキノンを電子移動メディエーターとして用い、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（５，０００ユニット）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（１０ユニット）およびギ酸デヒドロゲナーゼ（１００ユニット）を可溶性酵素として用いる。
【０３１５】
本明細書中にて特定の実施形態を参照して本発明を記載してきたが、これらの実施形態は本発明の原理および適用の単なる例示であると理解されるべきである。従って、多数の修飾を例示的実施形態になすことができ、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなく、他の配置を工夫することができるのが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０３１６】
【図１Ａ】本発明の分析物センサーの１つの実施形態を示す。
【図１Ｂ】膜を含むバリアの側面図である。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｂに示された分析物センサーの膜と関連付けられた膜貫通タンパク質のクローズアップ図である。
【図１Ｄ】本発明の分析物センサーのもう１つの実施形態を示す。
【図２Ａ−２Ｃ】本発明の分析物センサーのさらなる実施形態を示す。
【図３】分析物センサーのアレイを示す。
【図４】先行技術の生物学的膜タイプのセンサーを示す。
【図５Ａ−５Ｂ】膜をバリアに固定させることを示す。
【図６Ａ−６Ｂ】織物／メッシュに支持された膜を示す。
【図７】付着された分析物センサーを備えた分離デバイスを示す。
【図８】本発明の１つの態様によるＰＴＭの断面図である。
【図９】本発明の１つの実施形態における分析物センサーのアノード区画での電子およびプロトンの移動の模式的表示である。
【図１Ａ】
2005522692.tif 000008
【図１Ｂ】
2005522692.tif 000009
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2005522692.tif 000017
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2005522692.tif 000019
【図６Ｂ】
2005522692.tif 000020
【図７】
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【図８】
2005522692.tif 000022
【図９】
2005522692.tif 000023
【国際調査報告】
2005522692.tif 000024