(57)【要約】流体試料中の関心対象の分析物の量を定量的に測定する方法、およびこの方法に有用なキットを開示する。この方法は、投入点、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを有する膜を含む固相装置を提供する段階（試料捕捉領域は接触領域と対照捕捉ゾーンの間に位置する）；ならびに分析物結合粒子の集団または分析物被覆粒子の集団を含む試料採取装置を提供する段階を含む。このアッセイ法では、流体試料を試料採取装置に導入し、結果として得られた混合物を膜の投入点に投入する。この流体は、毛管作用によってアッセイ法の成分を、試料捕捉ゾーンの方向へ輸送し、また同ゾーンを通過させ、続いて対照捕捉ゾーンの方向へ輸送し、また同ゾーンを通過させる。流体試料に含まれる分析物の量は、例えば、試料捕捉ゾーンに含まれる粒子の量と対照捕捉ゾーンに含まれる粒子の量の比として決定することが可能な、補正後の粒子の量に比例する（例えば正比例または反比例する）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、流体試料中の関心対象の分析物の量を定量的に測定する方法であって、流体試料中の関心対象の分析物の量が、補正後の分析物結合粒子の量に正比例する方法：
a）投入点、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを含む固相装置を提供する段階であって、試料捕捉ゾーンが接触領域と対照捕捉ゾーンの間に位置する段階；
b）分析物結合粒子の集団を含む試料採取装置を提供する段階であって、分析物結合粒子が分析物結合剤で被覆される段階；
c）i）流体試料を試料採取装置に導入し、混合流体試料を作製し、続いて緩衝液を混合流体試料に導入する段階；ii）緩衝液を試料採取装置に導入し、続いて流体試料を導入する段階；またはiii）固体を緩衝液中に導入し続いて流体試料を試料採取装置に導入することによって流体試料を形成する段階のいずれかであって、これにより、接触状態の分析物結合粒子を含む、緩衝された混合流体試料を作製する段階；
d）緩衝された混合流体試料を、膜ストリップの投入点に投入する段階；
e）流体が毛管作用によって、接触状態の分析物結合粒子をストリップを介して試料捕捉ゾーンに向けておよび通過して輸送でき（ここで試料捕捉用試薬は試料捕捉ゾーンに固定されている）、かつ、接触状態の分析物結合粒子が試料捕捉用試薬と結合できる条件下で、膜ストリップを維持する段階；
f）試料中の流体が毛管作用によって、接触状態の分析物結合粒子をストリップを介して対照捕捉ゾーンに向けておよび通過して輸送でき（ここで対照捕捉用試薬は対照捕捉ゾーンに固定されている）、かつ、接触状態の分析物結合粒子が対照捕捉用試薬と結合できる条件下で、膜ストリップをさらに維持する段階；
g）試料中の流体が毛管作用によって、試料捕捉用試薬にも対照捕捉用試薬にも結合していない任意の接触状態の分析物結合粒子を対照捕捉ゾーンを超えて輸送できる条件下で、膜ストリップをさらに維持する段階；
h）試料捕捉ゾーンにおける接触状態の分析物結合粒子の量、および対照捕捉ゾーンにおける接触状態の分析物結合粒子の量を決定する段階；ならびに
i）試料捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量、および対照捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量から、補正後の分析物結合粒子の量を決定する段階。
【請求項２】
補正後の分析物結合粒子の量を、対照捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量に対する、試料捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量の比として決定する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
補正後の分析物結合粒子の量を、対照捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量と試料捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量の合計に対する、試料捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子の量の比として決定する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
分析物および分析物結合剤が結合対の成分である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
分析物結合剤が、抗体、抗体断片、ハプテン、薬剤接合体、および受容体からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
分析物結合剤が抗体である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
試料捕捉用試薬が、分析物結合粒子上の抗体と同じエピトープに対する抗体、および分析物結合粒子上の抗体と異なるエピトープに対する抗体からなる群より選択される抗体である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
段階（g）で、試料中の流体が毛管作用によって、試料捕捉用試薬にも対照捕捉用試薬にも結合していない任意の接触状態の分析物結合粒子を対照捕捉ゾーンを超えてウィッキングパッド中に輸送する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
分析物結合粒子の集団を蒸発乾燥させる、真空乾燥させる、または凍結乾燥させる、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
以下の段階を含む、流体試料中の関心対象の分析物の量を定量的に測定する方法であって、流体試料中の関心対象の分析物の量が、補正後の分析物被覆粒子の量に反比例する方法：
a）投入点、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを含む固相装置を提供する段階であって、試料捕捉ゾーンが接触領域と対照捕捉ゾーンの間に位置する段階；
b）分析物被覆粒子の集団を含む試料採取装置を提供する段階であって、分析物被覆粒子が分析物または分析物の類似体で被覆される段階；
c）i）流体試料を試料採取装置に導入し、混合流体試料を作製し、続いて緩衝液を混合流体試料に導入する段階；ii）緩衝液を試料採取装置に導入し、続いて流体試料を導入する段階；またはiii）固体を緩衝液中に導入し続いて流体試料を試料採取装置に導入することによって流体試料を形成する段階のいずれかであって、これにより、分析物被覆粒子を含む、緩衝された混合流体試料を作製する段階；
d）緩衝された混合流体試料を、膜ストリップの投入点に投入する段階；
e）流体が毛管作用によって、分析物被覆粒子をストリップを介して試料捕捉ゾーンに向けておよび通過して輸送でき（ここで試料捕捉用試薬は試料捕捉ゾーンに固定されている）、かつ、分析物被覆粒子が試料捕捉用試薬と結合できる条件下で、膜ストリップを維持する段階；
f）試料中の流体が毛管作用によって、分析物被覆粒子をストリップを介して対照捕捉ゾーンに向けておよび通過して輸送でき（ここで対照捕捉用試薬は対照捕捉ゾーンに固定されている）、かつ、分析物被覆粒子が対照捕捉用試薬と結合できる条件下で、膜ストリップをさらに維持する段階；
g）試料中の流体が毛管作用によって、試料捕捉用試薬にも対照捕捉用試薬にも結合していない任意の分析物被覆粒子を対照捕捉ゾーンを超えて輸送できる条件下で、膜ストリップをさらに維持する段階；
h）試料捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量、および対照捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量を決定する段階；ならびに
i）試料捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量、および対照捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量から、補正後の分析物被覆粒子の量を決定する段階。
【請求項１１】
補正後の分析物被覆粒子の量を、対照捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量に対する、試料捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量の比として決定する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
補正後の分析物被覆粒子の量を、対照捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量と試料捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量の合計に対する、試料捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量の比として決定する、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
分析物および試料捕捉用試薬が結合対の成分である、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
試料捕捉用試薬が、抗体、抗体断片、ハプテン、薬剤接合体、および受容体からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
試料捕捉用試薬が抗体である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
段階（g）で、試料中の流体が毛管作用によって、試料捕捉用試薬にも対照捕捉用試薬にも結合していない任意の分析物被覆粒子を対照捕捉ゾーンを超えてウィッキングパッド中に輸送する、請求項10記載の方法。
【請求項１７】
分析物被覆粒子の集団を蒸発乾燥させる、真空乾燥させる、または凍結乾燥させる、請求項10記載の方法。
【請求項１８】
膜ストリップが、硝酸セルロースまたはガラスファイバーから作られる、請求項1または10記載の方法。
【請求項１９】
粒子がラテックスビーズである、請求項1または10記載の方法。
【請求項２０】
粒子が標識されている、請求項1または10記載の方法。
【請求項２１】
標識が、比色分子、蛍光分子、リン光分子、発光分子、化学発光分子、および酵素結合分子からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
結合対の成分の1つが、胞子、タンパク質、ホルモン、酵素、糖タンパク質、ペプチド、低分子、多糖、レクチン、抗体、抗体断片、核酸、薬剤、薬剤接合体、毒素、ウイルス、ウイルス粒子、細菌、細胞壁の一部、ハプテン、および受容体からなる群より選択される、請求項4または13記載の方法。
【請求項２３】
対照捕捉用試薬が抗免疫グロブリン抗体である、請求項6または15記載の方法。
【請求項２４】
流体試料が、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、精液、硝子体、および滑液からなる群より選択される、請求項1または10記載の方法。
【請求項２５】
流体試料が懸濁状態の固体を含む、請求項1または10記載の方法。
【請求項２６】
固体が、粒子試料、粉末試料、土壌試料、および胞子からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
胞子が、炭疽菌またはバチルス・グロビギーの胞子を含む、請求項16記載の方法。
【請求項２８】
流体試料が、水、地下水、汚水、および廃水からなる群より選択される、請求項1または10記載の方法。
【請求項２９】
関心対象の分析物が、ミオグロビン、リシン、C反応性タンパク質、b-ナトリウム利尿ペプチド、CK-MB、トロポニンI、およびPSAからなる群より選択される、請求項1または10記載の方法。
【請求項３０】
関心対象の分析物が、野兎病菌、クラウストリジア、またはその産生毒素、および、痘瘡ウイルスまたは他のポックスウイルスからなる群より選択される、請求項1または10記載の方法。
【請求項３１】
段階（d）で、混合流体試料を、投入パッドを介して投入点に投入する、請求項1または10記載の方法。
【請求項３２】
試料採取装置が、ピペットおよびピペットチップからなる群より選択される、請求項1または10記載の方法。
【請求項３３】
以下を含むキット：
投入点、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む膜ストリップを含む、固相装置であって、試料捕捉ゾーンが接触領域と対照捕捉ゾーンの間に位置する固相装置；ならびに
分析物結合粒子の集団を含む、試料採取装置。
【請求項３４】
試料採取装置が、ピペットおよびピペットチップからなる群より選択される、請求項33記載のキット。
【請求項３５】
分析物結合粒子の集団を蒸発乾燥させる、凍結乾燥させる、または真空乾燥させる、請求項33記載のキット。
【請求項３６】
ピペットチップ中の分析物結合粒子に関する検量線、ロット情報、および/または有効期限についての情報を追加的に含む、請求項35記載のキット。
【請求項３７】
緩衝液、および1個または複数の緩衝液容器を追加的に含む、請求項33記載のキット。
【請求項３８】
試料採取ツールを追加的に含む、請求項33記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2002年4月10日に出願された米国特許出願第10/120,774号の一部継続出願である2002年6月3日に出願された米国特許出願第10/162,138号の優先権を主張する、一部継続出願であり、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
流体試料（特に体液試料）に含まれる細胞および分析物の定量分析を行うことで、医師および患者にとって、診断および治療に関する極めて重要な情報が得られることは少なくない。定量的免疫アッセイ法では、抗原（Ag）抗体（Ab）反応の特異性を利用して、試料中のAgまたはAbの検出および定量を行う。固相免疫アッセイ法では、1種の試薬（例えばAgまたはAb）を固体表面に結合させることで、結合状態の試薬または分析物と、遊離状態の試薬または分析物の分離が容易になる。次に固相に、対象となるAgまたはAbに結合する分析物を含む試料を接触させる。結合の程度を定量することで、試料中の分析物濃度の尺度が得られる。しかし、測定可能なシグナルへと結合事象を変換することは、固相上での粒子の動きの制約条件などの複数の制限の影響を受け、これは、定量的免疫アッセイ法の特異性および応用可能性に影響する。
【発明の開示】
【０００３】
発明の概要
本発明は、関心対象の分析物および捕捉用試薬を特異的結合対の一部として用いる固相アッセイ法（例えばサンドイッチ免疫アッセイ法または阻害免疫アッセイ法）で、流体試料中の関心対象の分析物の量を測定する方法；ならびにこの方法で用いるキットに関する。
【０００４】
本発明の方法では、投入点、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを有する膜ストリップ（membrane strip）を含む固相装置を提供する（試料捕捉ゾーンは接触領域と対照捕捉ゾーンの間に位置する）。試料捕捉用試薬（例えば関心対象の分析物に対する抗体などの、関心対象の分析物に結合する薬剤）を試料捕捉ゾーンに固定する。対照捕捉用試薬（例えば抗免疫グロブリン抗体などの、分析物結合粒子に結合する薬剤）を対照捕捉ゾーンに固定する。安定な状態で保存されているリポソーム、金コロイド、または有機ポリマーラテックス粒子などの、粒子の集団を含む試料採取装置も提供する。
【０００５】
本発明の「サンドイッチ」免疫アッセイ法では、粒子は、関心対象の分析物に対する結合剤（例えば抗体）で被覆された「分析物結合」粒子である。「競合」または「阻害」アッセイ法では、粒子は、関心対象の分析物で被覆された「分析物被覆」粒子である。いずれのタイプのアッセイ法でも、粒子を、検出を容易にするために比色、蛍光、発光、化学発光、または他の適切な標識を用いて標識することができる。
【０００６】
この方法の一つの態様では、関心対象の分析物の評価対象となる流体試料を試料採取装置に導入し、次に緩衝液を混合流体試料中に導入する。この方法の別の態様では、緩衝液を試料採取装置に導入し、次に関心対象の分析物の評価対象となる流体試料を導入する。この方法の第3の態様では、固体を緩衝液中に導入することで流体試料を形成させ、次に流体試料を試料採取装置に導入する。これらのどの態様でも、粒子を含む、緩衝された混合流体試料が作られる。
【０００７】
サンドイッチアッセイ法では、試料中に存在する関心対象の分析物が分析物結合粒子と相互作用し、結果として、混合流体試料中に、接触状態の分析物結合粒子が生じる。緩衝された混合流体試料を、固相装置の膜ストリップの投入点に投入する。次に固相装置を、流体の毛管作用が、粒子を試料捕捉ゾーンの方向へ輸送し、また同ゾーンを通過させることを十分可能とする条件で維持する。
【０００８】
試料捕捉用試薬は、接触した分析物結合粒子と相互作用し、これにより、粒子は試料捕捉ゾーンで停止する。流体の毛管作用は、接触した分析物結合粒子を試料捕捉ゾーンの方向へさらに動かしてこれを通過させるだけでなく、（分析物結合粒子が対照捕捉用試薬に結合している）対照捕捉ゾーンの方向へ動かしてこれを通過させる。流体の毛管作用は、対照捕捉ゾーンを越えて、例えば吸い取りパッド（wicking pad）中に残存する、非結合状態の粒子を動かし続ける。次に試料捕捉ゾーンで停止状態にある、また対照捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子の量を決定する。
【０００９】
次に、流体試料中の関心対象の分析物の量を決定する。流体試料中の関心対象の分析物の量は例えば、（1）試料捕捉ゾーンで停止した状態の分析物結合粒子の量と、（2）対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子量の比として決定可能である。あるいは、流体試料中の関心対象の分析物の量は、（1）試料捕捉ゾーンで停止した状態の分析物結合粒子の量と、（2）対照捕捉ゾーン内の分析物結合粒子の量と、試料捕捉ゾーンで停止した状態の分析物結合粒子の量の合計の比として決定可能である。
【００１０】
競合型または阻害型のアッセイ法では、緩衝された混合流体試料を、固相装置の膜ストリップの投入点に投入する。次に固相装置を、流体の毛管作用が、粒子を試料捕捉ゾーンの方向へ輸送し、また同ゾーンを通過させることを十分可能とする条件で維持する。
【００１１】
試料捕捉用試薬は分析物被覆粒子と相互作用し、試料捕捉用試薬と分析物被覆粒子の相互作用は結果的に、分析物被覆粒子を試料捕捉ゾーンに停止させる。試料に含まれる分析物被覆粒子と分析物（存在する場合）の、試料捕捉ゾーンに含まれる試料捕捉用試薬上の結合部位をめぐる競合のために、試料捕捉ゾーンで停止した分析物被覆粒子の量は、試料に含まれる分析物の量に反比例する。流体の毛管作用はさらに、分析物被覆粒子を、試料捕捉ゾーンに向けてだけでなく、対照捕捉ゾーンに向けても動かし、そこで分析物被覆粒子は対照捕捉用試薬と結合する。試料捕捉ゾーンに、また対照捕捉ゾーンに停止した分析物被覆粒子の量を次に決定する。
【００１２】
流体試料中の関心対象の分析物の量を次に決定する。例えば、流体試料中の関心対象の分析物の量は、1）試料捕捉ゾーンに停止した分析物被覆粒子の量と、2）対照捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子の量の比に反比例する。あるいは、流体試料中の関心対象の分析物の量は、1）試料捕捉ゾーンに停止した分析物被覆粒子の量と2）対照捕捉ゾーンに含まれる分析物被覆粒子の量、および試料捕捉ゾーンに停止した分析物被覆粒子の量の合計の比に反比例する。
【００１３】
このような定量的アッセイ法における、固相を通過する流体の流れは、アッセイ法の動的特徴に寄与する。つまり、分析物と粒子の結合の量は、固相上の位置に関連する粒子の位置と同様に変動する。このため、固相反応体の構造、ならびに流体試料の粘性および他の因子は、アッセイ法の特異性の限界に寄与しうる。本発明の方法は、アッセイ法の動的特徴に関する一部の制限を減少させることで、溶液に含まれる関心対象の分析物の量のより正確な決定を可能とする。例えばサンドイッチアッセイ法では、関心対象の分析物の検討対象となる流体試料を、膜への投入前に分析物結合粒子と混合するので、関心対象の分析物が、膜内で生じる捕捉反応前に分析物結合粒子と結合するまでに長い時間を要する。また、関心対象の分析物と分析物結合粒子間の相互作用は流体相中で起こるので、粒子の移動度が大きいために、固相装置の膜のマトリックスにおける関心対象の分析物と分析物結合粒子間の同じ相互作用と比較して、早くてより効率的な結合が達成される。サンドイッチアッセイ法と阻害（競合）アッセイ法の両方において、使用される粒子の容積を増すことで、膜を過負荷状態にすることなくアッセイ法の感度を高めることが可能である。また、このような粒子は、流体の毛管作用によって、流体先端の頂点に関するクイックウエーブ（quick wave）と比較して連続的に捕捉ゾーンを通過し、粒子のより効率的な捕捉を可能とすることで、アッセイ法の感度を高めることができる。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、アッセイ法、特に定量的免疫クロマトグラフィーアッセイ法で、分析物の量を定量的に測定する方法、およびこのキットに関する。
【００１５】
本明細書で用いる「アッセイ法」とは、試料を分析して1種もしくは複数の分析物の有無を判定したり定量したりする、インビトロにおける手法を意味する。本発明のアッセイ法では、分析物および分析物結合剤を使用する。分析物および分析物結合剤は、特異的な「結合対」の要素であり、結合対の第1の要素（例えば分析物）は、第2の要素（例えば結合剤）と特異的に反応する。結合対の一方または両方の要素は抗体であってもよい。例えば、結合対の第1の要素（例えば関心対象の分析物）は抗体であってもよく、結合対の第2の要素（例えば結合剤）は抗免疫グロブリン抗体であってもよい。あるいは、結合対の第1の要素（例えば分析物）は抗原で、結合対の第2の要素（例えば結合剤）は抗体であってもよい。
【００１６】
ある態様では、アッセイ法とは、手法の成分として抗体を用いる「免疫アッセイ法」である。好ましい態様では、免疫アッセイ法は「サンドイッチ」アッセイ法であり、これは、分析物に対する抗体などの分析物結合剤で被覆された粒子に、分析物の有無または質について評価されるべき流体試料を接触させ、得られた混合物を膜に適用しその後膜を介した毛管作用により移動させるような、分析物についての試験である。正の結果は、膜の捕捉ゾーンにおける分析物と分析物結合剤被覆粒子間の相互作用の検出により示され、捕捉ゾーンの分析物結合剤被覆粒子の量は、流体試料中の分析物の量に比例する。別の好ましい態様では、免疫アッセイ法は「阻害」アッセイ法または「競合」アッセイ法であり、これは、分析物で被覆された粒子に、分析物の有無または質について評価されるべき流体被験試料を接触させ、得られた混合物を膜に適用しその後膜を介した毛管作用により移動させるような、分析物についての試験である。正の結果は、膜の捕捉ゾーンにおける分析物結合剤と分析物被覆粒子間の相互作用の検出により示され、捕捉ゾーンの分析物被覆粒子の量は、流体試料中の分析物の量に反比例する。
【００１７】
本発明のアッセイ法の別の態様では、分析物も結合剤のいずれも抗体ではなく、例えば結合対の第1の要素はリガンドであり、結合対の第2の要素は受容体でありうり、または、結合対の第1の要素はレクチンであり、結合対の第2の要素は糖でありうる。さらに別の態様では、結合対の第1の要素は核酸（例えばDNA、RNA）であり、結合対の第2の要素は、結合対の第1の要素と特異的にハイブリッドを形成する核酸の場合がある。本明細書で用いる「特異的なハイブリッドの形成」という用語は、第1の核酸が第2の核酸と（第1の核酸が第2の核酸を除く任意の核酸とハイブリッドを形成しないように）ハイブリッドを形成可能なこと（例えば、第1の核酸が、試料中の、ハイブリッドを形成する他の任意の核酸と比較して第2の核酸と高い類似性をもつ）を意味する。ハイブリッド形成の「ストリンジェンシー条件」とは、インキュベーション条件および洗浄条件（例えば、特定の核酸と第2の核酸とのハイブリッド形成を可能にする温度および緩衝液濃度の条件）を意味する当技術分野で用いられる表現であり、第1の核酸は、第2の核酸に対して完全に（すなわち100%）相補的であるか、第1の核酸と第2の核酸は、完全未満（例えば70%、75%、80%、85%、90%、95%）の、ある程度の相補性を有しうる。例えば、ある高いストリンジェンシー条件は、完全に相補的な核酸を、相補性の低い核酸と区別する際に使用されうる。核酸のハイブリッド形成における「高ストリンジェンシー条件」、「中ストリンジェンシー条件」、および「低ストリンジェンシー条件」は、「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubel, F.M.ら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons（1998）、これらは、その内容全体が参照として本明細書に組み入れられる）の2.10.1〜2.10.16、および6.3.1〜6.3.6で説明されている。ハイブリッド形成のストリンジェンシーを決定する正確な条件は、イオン強度（例えば0.2×SSC、0.1×SSC）、温度（例えば室温、42℃、68℃）、およびホルムアミドなどの不安定化剤、またはSDSなどの変性剤の濃度に依存するだけでなく、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリッドを形成する配列間のミスマッチ出現率、および他の非同一配列内に含まれる配列のサブセットの出現頻度などの諸因子にも依存する。したがって、同等の条件を、2種の核酸分子間における同程度の同一性または類似性を維持しながら、1種または複数の上記パラメータを変化させることで決定することができる。
【００１８】
分析物および結合剤の組成にかかわらず、これら2種類の成分は、第1の要素が第2の要素と特異的に反応する特異的な結合対を形成する。結合対の要素間の特異的な相互作用は、結合対の第1の要素が、結合対の第2の要素と、好ましくは、アッセイ法に含まれる別の化合物との任意の結合を除外するようにして選択的に結合すること、または相互作用することを意味する。
【００１９】
本明細書で用いる「分析物」または「関心対象の分析物」という用語は、上述の結合対の第1の要素を意味する。分析物とは、その量が測定される分子または化合物である。分析物は、乾燥物（例えば、粉末、粒子、胞子、またはその他粒子）などの個体の形状であってよく、または、液体の形状であってよい（例えば、液体中に溶解されたか懸濁された上述の固体、またはその他の液体試料）。分析物の例には、胞子、ホルモンまたは酵素などのタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、小分子、多糖、抗体、核酸、薬剤、毒素（例えば環境毒素）、ウイルスまたはウイルス粒子、微生物、その他感染物質または感染物質の産物、細胞壁の一部、および他の化合物などが含まれる。好ましい態様では、分析物は「免疫原性」を有する。この用語は、分析物に対して、または担体（例えば、ハプテンに対する抗体が生じる可能性がある、ハプテン-担体接合体）に結合した状態の分析物に対して抗体（上述）が生じる可能性があることを意味する。いくつかの代表的な態様では、関心対象の分析物は、ミオグロビン、CK-MB、トロポニンI、PSA、ジゴキシン、テオフィリン、リシン、C反応性タンパク質、またはb-ナトリウム利尿ペプチドでありうる。その他の代表的態様において、関心対象の分析物はホルモン（例えばT-3もしくはT-4）、または乱用性薬剤（LSD、THC、バルビツール酸塩など）でありうる。さらに他の代表的な態様では、関心対象の分析物は、野兎病菌（Francisella tularensis）などの感染因子または感染因子の産物；クラウストリジア（Claustridia）、または同菌が産生する毒素（ボツリヌス毒素）；痘瘡ウイルスもしくは他のポックスウイルス（例えば牛痘やサル痘）；または炭疽菌（Bacillus anthracis）やバチルス・グロビギー（Bacillus globigii）などの枯草菌の胞子であり得る。関心対象の分析物は液体試料中に存在しうるほか；関心対象の分析物は乾燥（非流体）試料（例えば、粒子試料、粉末試料、または土壌試料などの固体）中に存在してもよい。
【００２０】
本発明の方法では、流体試料を、関心対象の分析物の有無または量に関して評価する。流体は、抗体/抗原反応などの、関心対象の分析物と分析物結合剤の反応を支持する（すなわち抗体/抗原相互作用に干渉しない）流体；または毛管作用による流体の移動を可能とするように十分低い粘性をもつ、膜材料を湿らせた流体でありうる。好ましい態様では、流体は（体液などの）水溶液である。流体試料は、比較的少ない成分を含む流体（例えば関心対象の分析物を含む水溶液）であり得る。あるいは流体試料は、複合環境試料（例えば汚水、廃水、地下水、もしくは他の水試料）、または複合生物学的流体（例えば全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、精液、硝子体、滑液、または他の生物学的流体）などの多くの成分を有する流体であり得る。流体が生物学的流体である好ましい態様では、流体は全血、血漿、または血清である。望ましいならば、流体試料を希釈することができる。例えば、複合生物学的流体を流体試料として用いる場合、これを溶液（例えば水溶液）で希釈することができる。
【００２１】
関心対象の分析物が溶液中に存在しない場合（例えば関心対象の分析物が上述のように、乾燥試料もしくは固体試料中にある場合）、まず流体試料中に抽出し、懸濁し、または溶解することができる。例えば関心対象の分析物が核酸であれば、これを対象細胞から、溶液（例えば、後述する緩衝液などの水溶液）中に抽出することができる。別の例では、関心対象の分析物が粉末材料または粒状材料（例えば粉末、粒子、土壌試料、または胞子）の場合、乾燥材料の試料を（例えばスワブまたは他の器具を用いて）得ることによって、また乾燥材料を溶液中に配することによって、溶液（例えば、後述する緩衝液などの水溶液）中に懸濁するか溶解することができる。したがって「流体試料」とは、関心対象の分析物に関する評価対象となる液体試料を意味するだけでなく、固体材料（関心対象の分析物に関する評価対象となる）が抽出され、懸濁され、または溶解された流体試料を意味する場合もある。
【００２２】
本明細書で用いる「分析物結合剤」は、上述の結合対の第2の成分を意味する。分析物結合剤は、抗体、ハプテン、または薬剤接合体、受容体、または別の結合パートナーなどの、分析物（結合対の第1の成分）に特異的に結合する化合物である。好ましい態様では、分析物結合剤は、関心対象の分析物に対する抗体である。
【００２３】
サンドイッチアッセイ法
本発明の「サンドイッチ」アッセイ法では、固相装置を使用する。固相装置は、投入点、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを有する膜ストリップを含む。固相装置は任意選択で、対照捕捉ゾーンの後に吸い取りパッドを、また投入点に隣接してもしくは投入点を覆って試料パッドを含んでもよい。膜ストリップは、以下の特徴を有する物質から作製することができる：膜の表面に沿った、また膜の内部を通過する、流体の毛管作用を可能にする十分な空隙率；被覆粒子（例えば上述の分析物結合粒子）または粒子と関心対象の分析物の複合体（例えば上述のように分析物結合粒子に接触）の毛管作用による輸送可能性（すなわち粒子または、粒子と関心対象の分析物の複合体を妨害してはならない）；および（3）分析物を含む流体によって湿った状態になること（例えば、水性流体の場合は親水性、有機溶媒の場合は疎水性）。膜の疎水性は、水性流体を使用するために疎水性表面から親水性表面への変換について記載されている米国特許第4,340,482号、または米国特許第4,618,533号などに記載されている過程によって膜を親水性とするように変化させることができる。膜の物質の例には、セルロース、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ナイロン、高分子電解質イオン交換膜、アクリル共重合体/ナイロン、およびポリエーテルスルホンなどが含まれる。好ましい態様では、膜ストリップは硝酸セルロース（例えばマイラー基材（Mylar backing）を有する硝酸セルロース膜）から作製される。
【００２４】
「投入点」とは、流体を投入可能な膜上の位置である。「投入パッド」を任意選択で使用することもできる。投入パッドは膜上に、投入点のすぐ近傍に隣接するか、またはこれを覆うように存在する。投入パッドは、流体試料をパッドに、膜上の投入点に投入したときに、流体試料を輸送可能な吸収性物質から作製することができる。代表的な物質には、セルロース、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ナイロン、高分子電解質イオン交換膜、アクリル共重合体/ナイロン、ポリエーテルスルホン、またはガラスファイバーなどがある。一つの態様では、パッドはHemasep（登録商標）-Vパッド：（Pall Corporation）である。別の態様では、パッドはガラスファイバーパッドである。ウィッキングパッドが存在する場合は、これを上記のような吸収性物質から同様に作製することができる。
【００２５】
「試料捕捉ゾーン」とは、「試料捕捉用試薬」が固定される（例えば膜表面に被覆される、および/または膜を介して浸透する）、膜ストリップ上の部分を指す。試料捕捉用試薬は、上述したような分析物結合剤である。試料捕捉用試薬は、上記と同じ分析物結合剤である必要はない。しかし、試料捕捉用試薬も、関心対象の分析物と特異的および選択的に結合するという点で、関心対象の分析物と結合対を形成する。好ましい態様では、試料捕捉用試薬は、分析物に対する抗体であり、これは、分析物の同じエピトープに対する場合、または粒子表面に被覆された分析物結合剤として使用される抗体に結合するエピトープに由来する、分析物の異なるエピトープに対して誘導されうる。
【００２６】
本装置はさらに、「対照捕捉ゾーン」内に固定された「対照捕捉用試薬」を付加的に含む。対照捕捉用試薬は、分析物結合粒子と反応するが、測定対象の分析物とは相互作用しない試薬である。例えば、対照捕捉用試薬は、分析物結合剤被覆粒子表面の分析物結合剤と反応してもよく、粒子表面の別の材料と反応してもよく、または粒子そのものと反応してもよい。例えば分析物結合剤が抗体の場合、対照捕捉用試薬は抗免疫グロブリン抗体でありうる。好ましい態様では、分析物結合剤は抗体であり、対照捕捉用試薬は抗免疫グロブリン抗体である。対照捕捉用試薬は、対照捕捉ゾーンの膜上に固定される（膜表面に被覆される、および/または膜内に浸透する）。
【００２７】
対照捕捉ゾーンは、試料捕捉ゾーンが投入点と対照捕捉ゾーン間に位置するように配置される。好ましい態様では、対照捕捉ゾーンは、試料捕捉ゾーンのすぐ隣に配置する。こうすることで、アッセイ成分の毛管作用の動態が、対照捕捉ゾーンと試料捕捉ゾーンの両方において同等（例えば本質的に同等）となる。対照捕捉ゾーンと試料捕捉ゾーンは密接に隣接するが、各ゾーンで停止状態にある粒子を（例えばクロストークなしに）個別に定量可能にするための十分な空間も確保する。また好ましい態様では、試料捕捉ゾーンは、試料捕捉ゾーンと対照捕捉ゾーン間の短い距離に対して長い距離を設けることで、投入点から分離される。毛管先端（capillary front）（膜内を毛管作用で移動する流体の境界）の進む速度は、流体の投入点から毛管先端までの距離に反比例する。粒子捕捉は本発明のアッセイ法の律速段階なので、接触領域（毛管先端が分析物結合粒子を動かす場所）と、捕捉ゾーン（粒子が捕捉される場所）との距離は、毛管先端の速度を、毛管先端が試料捕捉ゾーンに到達したときに粒子の捕捉を可能にするように十分緩やかにするものでなければならない。また、この距離は、総移動時間（毛管先端が膜全体を移動する時間）が、流体試料中の遊離の分析物を分析物結合粒子と結合させるために十分長くなるように十分広くなければならない。膜ストリップ上における成分間の最適距離は、常用の実験法で決定および調節することができる。
【００２８】
定量的アッセイ法では、試料採取装置を追加的に使用する。本明細書で用いる「試料採取装置」とは、流体試料の採取に使用可能な装置を意味するほか、内部に、採取された流体試料を沈着または保存することが可能な装置を意味する。試料採取装置は、後述する、分析物結合粒子を含む場合のある、また測定済みの流体試料の容積を添加できる任意の装置であり得る。代表的な試料採取装置には、試料チューブ、試験管、バイアル、ピペットまたはピペットチップ、シリンジなどがある。好ましい態様では、試料採取装置はピペットまたはピペットチップである。
【００２９】
試料収集装置は、分析物結合剤で被覆された「分析物結合粒子」の集団を含む。粒子集団の数は、粒子の大きさおよび組成、固相装置の膜の組成、ならびにアッセイ法の感度レベルに応じて変化する。粒子集団の数は通常、約1×103〜1×109個であるが、望ましいならば、より少ない、またはより多いものを使用することができる。好ましい態様では、粒子集団は約2×10８個の粒子である。
【００３０】
分析物結合粒子は、分析物結合剤（結合対の第2の要素）で被覆可能な粒子である。好ましい態様では、分析物結合粒子は、リポソーム、金コロイド、有機高分子ラテックス粒子、無機蛍光粒子、またはリン光粒子である。特に好ましい態様では、粒子はポリスチレンラテックスビーズであり、具体的には、界面活性剤を含まないSuperactive Uniform Aldehyde/Sulfate Latexes （Interfacial Dynamics Corp.、Portland、OR）などの、界面活性剤の非存在下で調製されたポリスチレンラテックスビーズである。
【００３１】
粒子の大きさは（流体試料中の分析物について）膜の空隙率に比例し、かつ（例えば微粒子分析物について）関心対象の分析物の大きさに比例するので、粒子は、流体の毛管作用によって膜に沿って輸送されるためには十分小さくなければならず、かつ同様に、（固体、例えば微粒子状分析物について）毛管作用によって膜に沿って輸送されるためには（上述の、接触した分析物結合粒子複合体について）十分小さくなければならない。粒子を標識することで、検出が容易になる可能性がある。粒子は、粒子の物理的特性に大きく影響しない手段で標識されうる。例えば粒子の内部を標識することができる（すなわち標識を、リポソームの内部、またはポリスチレンラテックスビーズの内部などの粒子内に含める）。代表的な標識には、発光標識、化学発光標識、リン光標識、酵素結合標識、電気活性剤（例えばフェロシアン化物）などの化学標識、および比色性標識（色素もしくは蛍光標識など）がある。1つの態様では蛍光標識が使用される。別の態様では、リン光粒子、特に米国特許第5,043,265号に記載されているような「上位変換性（up-converting）」のリン光粒子が使用される。
【００３２】
粒子を、結合対の第2の要素である分析物結合剤で被覆することができる。上述したように、分析物結合剤（結合対の第2の要素）は、関心対象の分析物（結合対の第1の要素）に特異的および選択的に結合する。代表的な分析物結合剤には、抗体（または抗体断片）、ハプテン、薬剤接合体、受容体、または他の結合パートナーなどが含まれる。1つの好ましい態様では、分析物結合剤は、関心対象の分析物に対する抗体である。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でありうる。本明細書で用いる「抗体」という用語は、関心対象の分析物に十分結合する抗体断片を意味する場合もある。あるいは別の態様では、分析物結合部位を有する工学的に作製されたタンパク質などの、関心対象の分析物に特異的に結合する分子を使用することもできる（Holliger, P.およびH.R. Hoogenbloom、Trends in Biotechnology 13：7-9 （1995）；Chamow, S.M.およびA. Ashkenazi、Trends in Biotechnology 14：52-60：1996））。さらに別の態様では、関心対象の分析物が薬剤の場合、ハプテンまたは他の薬剤接合体を分析物結合剤として使用することができる。あるいは他の態様では、分析物に結合する受容体を使用することができる（例えば関心対象の分析物がリガンドの場合）。分析物が既知の特異性をもつ抗体の場合、粒子は、分析物抗体が誘導される抗原で被覆することができるほか、分析物抗体に対する抗体で被覆することができる。また分析物および分析物結合剤は結合対を形成するので、代表的な分析物として記載されている化合物または分子は、分析物結合剤として作用する場合もあり、また代表的な分析物結合剤として記載されているものは、上述したように同様に分析物となりうる。
【００３３】
試料採取装置に含まれる分析物結合粒子は、試料採取装置に安定な状態で保存される。本明細書で用いられる「安定な状態」という表現は、粒子が、保管中に化学的組成や物理的状態を大きく変化しない状態を意味する。安定な状態は、液体状態、ゲル状態、または固体状態であり得る。好ましい態様では、試料採取装置に含まれる分析物結合粒子は、蒸発乾燥された状態、凍結乾燥された状態、および/または真空乾燥された状態である。
【００３４】
特に好ましい態様では、試料採取装置は、真空乾燥された分析物結合粒子が内部に充填されるピペットチップである。
【００３５】
アッセイ法を行うためには、上述のような、関心対象の分析物の有無に関する評価対象となる流体試料を用いる。一つの態様では、流体試料を試料採取装置に導入する（流し込む、注ぐ、または挿入する）。例えば一つの態様では、ピペットチップを含む試料採取装置に流体試料を流し込む。試料採取装置に流体試料を導入することで、流体試料と分析物結合粒子が混合され、「混合流体試料」が形成される。分析物結合粒子を蒸発乾燥、凍結乾燥、または真空乾燥する場合、試料採取装置に流体試料を導入することで、流体試料中における分析物結合粒子の再水和および懸濁が可能となる。緩衝液（例えば希釈用）も混合流体試料に導入すると、「緩衝された混合流体試料」が形成される。緩衝された混合流体試料は、混合流体試料を、緩衝液を含む「緩衝液容器」（例えば試験管）内に分注することにより、または緩衝液を、流体試料を導入する前に試料採取装置に導入することによって形成することができる。あるいは、関心対象の分析物が固体（例えば、上記の粉末、粒子、胞子、または他の粒子）の場合、上記の流体試料を、緩衝液容器内に固体を導入することで調製することができる。この態様では、緩衝された混合流体試料は、流体試料（緩衝液を含む）を試料採取装置に導入することで形成される。別の態様では、緩衝液を試料採取装置に導入した後に、流体試料を試料採取装置に導入する。
【００３６】
緩衝液は、関心対象の分析物と分析物結合剤との間の反応を支持する（例えば抗体/抗原相互作用に干渉しない）水性流体の場合があり、また毛管作用による流体の移動を可能とするのに十分低い粘性を有する水性流体であり得る。一つの態様では、緩衝液は1つまたは複数の以下の成分を含む：緩衝剤（例えばリン酸塩）；塩類（例えばNaCl）；タンパク質安定剤（例えばBSA、カゼイン、血清）；および/または非イオン性の界面活性剤もしくは表面活性物質（surfactant）などの界面活性剤（例えば、表面活性物質ツールキットで通常利用されている1種類もしくは複数の以下の薬剤：NINATE 411、Zonyl FSN 100、Aerosol OT 100%、GEROPON T-77、BIO-TERGE AS-40、STANDAPOL ES-1、Tetronic 1307、Surfynol 465、Surfynol 485、Surfynol 104PG-50、IGEPAL CA210、TRITON X-45、TRITON X-100、TRITON X305、SILWET L7600、RHODASURF ON-870、Cremophor EL、TWEEN 20、TWEEN 80、BRIJ 35、CHEMAL LA-9、Pluronic L64、SURFACTANT 10G、SPAN 60、CREL）。任意選択で、望ましいならば、緩衝液は濃化剤を含んでよい。緩衝液のこのような成分は市販されている。代表的な緩衝剤には例えば、生理食塩水、または50 mM Tris-HCl、pH 7.2などがある。あるいは、緩衝液の代わりに水を用いることができる。本明細書で用いる「緩衝液」という用語は、緩衝作用をもつ溶液または水のいずれかを意味する。
【００３７】
分析物結合粒子を、流体試料中にさらに分散させるためには、望ましいならば、内部に流体試料および緩衝液が導入されている試料採取装置を、または内部に混合流体試料が導入されている緩衝液容器を（例えばボルテックスミキサーで、単に振盪することで、ピペット操作などで）攪拌するとよい。
【００３８】
好ましい態様では、試料採取装置は、チップ中に真空乾燥された分析物結合粒子を有するピペットチップを含む。流体試料をピペット内に流し込むことで、乾燥状態の分析物結合粒子が再水和され、混合流体試料が形成される。特に好ましい態様では、混合流体試料を緩衝液容器に導入し、結果として、緩衝された混合流体試料を得る。緩衝液容器内の、緩衝された混合流体試料を、試料採取装置でピペット操作することで、分析物結合粒子をさらに分散させる。関心対象の分析物が、緩衝された混合流体試料中に存在する場合、結合が、分析物と分析物結合粒子間で起こる。分析物と分析物結合粒子が「結合」するということは、粒子表面を被覆した分析物結合剤が、関心対象の分析物と相互作用（例えば結合）することを意味する。流体中の分析物（存在する場合）と、接触領域中に固定された分析物結合粒子との結合を可能とする条件で維持されている（インキュベートされている）分析物結合粒子を、本明細書では「接触状態の分析物結合粒子」と呼ぶ。接触状態の分析物結合粒子は、分析物が流体試料中に存在するか否か、また分析物が分析物結合粒子表面の分析物結合剤に結合した状態にあるか否かに応じて、分析物結合剤に結合した状態の分析物を有する場合もあれば有しない場合もある。分析物結合粒子の表面には、分析物に対する複数の結合部位があるので、分析物結合粒子に結合した状態の分析物の有無および濃度は変動し、分析物結合粒子に結合した状態の分析物の濃度は、流体試料に含まれる分析物の量に比例して増し、また分析物結合粒子が試料捕捉ゾーン（後述）で停止する確率は同様に、分析物結合粒子に結合した状態の分析物の量の増加に伴い上昇する。したがって、接触状態の分析物結合粒子の集団は、分析物結合剤に結合した状態の、さまざまな量の分析物を有する粒子、ならびに分析物結合剤に結合した状態の分析物を有しない粒子を含むことができる（最初に分析物結合剤に結合した状態の分析物を含まない分析物結合粒子と同様）。また結合の程度は、条件の時間因子の延長に伴い強くなる。つまり、結合の大半は、1分以内（例えば60秒、好ましくは60秒未満（例えば45秒、30秒、またはそれ未満）に起こり、追加インキュベーション（例えば1分以上（2分、5分、10分、15分）によって追加的な結合が生じる。
【００３９】
緩衝された混合流体試料を、固相装置の膜ストリップの投入点、または投入パッド（存在する場合）に投入する。膜ストリップを、緩衝された混合流体試料に接触させた後に、膜ストリップを、流体が膜の方向へ移動し、また膜を通過するように毛管作用によって動かすことを可能とする条件で維持する。接触状態の分析物結合粒子は、緩衝された混合流体試料から、流体の毛管作用の結果として、膜を通して移動する。また接触状態の分析物結合粒子は、膜の「試料捕捉ゾーン」の方向へ移動し、また同ゾーンを通過し、続いて「対照捕捉ゾーン」の方向へ移動し、また同ゾーンを通過する。膜ストリップを、接触状態の分析物結合粒子が毛管作用によって膜に沿って、試料捕捉ゾーンの方向へ移動し、また同ゾーンを通過し、続いて対照捕捉ゾーンの方向へ移動し、続いて捕捉ゾーンを超えて（例えばウィッキングパッド中に）移動することを可能とする条件（例えば十分な時間および流体容積）で維持することにより、任意の非結合粒子を捕捉ゾーンから除去する。
【００４０】
一部の接触状態の分析物結合粒子の移動は、接触状態の分析物結合粒子と試料捕捉ゾーンの試料捕捉用試薬の結合によって、またこれに続く、接触状態の分析物結合粒子の一部と対照捕捉ゾーンの対照捕捉用試薬の結合によって停止する。1つの好ましい態様では、分析物結合剤は、対象抗原に対する抗体であり、また対照捕捉用試薬は、分析物結合剤が由来する種の免疫グロブリンに対する抗体であり得る。この態様では、免疫グロブリンに対する抗体は、試料の他の成分と交叉反応しないようにすべきである。例えばヒト試料を検討する場合、ヒト免疫グロブリンと反応しない抗体を、対照捕捉用試薬として使用することができる。
【００４１】
試料捕捉用試薬は、接触状態の分析物結合粒子表面の分析物結合剤と結合した状態の分析物との結合によって、接触状態の分析物結合粒子と結合する。本明細書で用いる「試料-試薬-粒子複合体」という表現は、試料捕捉用試薬と、接触状態の分析物結合粒子の複合体を意味する。接触状態の分析物結合粒子は、試料捕捉ゾーンにおける分析物と試料捕捉用試薬の相互作用による、接触状態の分析物結合粒子の捕捉のために試料捕捉ゾーンで停止し、試料-試薬-粒子複合体を形成する。
【００４２】
対照捕捉用試薬は、接触状態の分析物結合粒子表面の分析物結合剤との結合によって、接触状態の分析物結合粒子と結合する。本明細書で用いる「対照-試薬-粒子複合体」という表現は、対照捕捉用試薬と、接触状態の分析物結合粒子の複合体を意味する。接触状態の分析物結合粒子は、対照捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子と対照捕捉用試薬の相互作用による、接触状態の分析物結合粒子の捕捉のために対照捕捉ゾーンで停止し、対照-試薬-粒子複合体を形成する。上述したように、対照捕捉用試薬は分析物結合粒子と相互作用する（例えば、分析物結合剤被覆粒子表面の分析物結合剤と、もしくは粒子表面の別の材料と、または粒子そのものと相互作用する）が、分析物そのものとは相互作用しない。
【００４３】
次に毛管作用が、試料捕捉ゾーンまたは対照捕捉ゾーンのいずれかで停止していない、任意の接触状態の分析物結合粒子を、これらのゾーンを超えるように前方へ動かすことによって、停止していない状態の任意の粒子を除去する。好ましい態様では、流体は、停止していない状態の、任意の接触状態の分析物結合粒子を、対照捕捉ゾーンに続くウィッキングパッド中に動かす。
【００４４】
望ましいならば、第2の洗浄段階を用いることができる。緩衝液（例えば上述の緩衝液）を、緩衝された混合流体試料が膜に染み込んで、または投入パッド（存在する場合）中に染み込んだ後に、投入点に投入することができる。緩衝された混合流体試料を希釈しない場合は、第2の洗浄段階を任意の時間に用いることができる。第2の洗浄段階は、後述するように分析物結合粒子が検出される場合に、バックグラウンドシグナルの減少に寄与しうる。
【００４５】
次に、試料捕捉ゾーンに停止した分析物結合粒子（試料-試薬-粒子複合体）の量を、分析物結合粒子表面に用いられる標識の種類に適切な手段で検出する。好ましい態様では、この量を、分析物結合粒子の標識の蛍光量を測定する方法のような光学的な方法で検出する。あるいは、電気伝導度または誘電率（電気容量）を元に、試料-試薬-粒子複合体の量を検出することができる。あるいはHayesら（Analytical Chem. 66：1860-1865（1994））に記載されているインジウム、ビスマス、ガリウム、またはテルルのイオンなどの電気活性剤（electroactive agent）、またはRobertsおよびDurst（Analytical Chem. 67：482-491（1995））で示唆されているフェロシアン化物の放出を電気化学的に検出することができる。例えばリポソームを使用する場合、リポソームで包んだフェロシアン化物が、1滴の界面活性剤を捕捉ゾーンに添加することで放出される場合があり、放出されたフェロシアン化物を電気化学的に検出することができる（RobertsおよびDurst、上記）。キレート剤-タンパク質接合体を金属イオンのキレートに用いる場合は、1滴の酸を捕捉ゾーンに添加することでイオンが放出されるので、アノーディック・ストリッピング・ボルタンメトリー（anodic stripping voltametry）（Hayesら、上記）による定量が可能となる。同様に、対照捕捉ゾーンに停止した分析物結合粒子の量を、試料捕捉ゾーンの分析物結合粒子の量と同じ手順で検出する。
【００４６】
ある態様では、分析物結合粒子の検出量は、固相（例えば膜ストリップ）に沿った位置に存在する標識の量に正比例する曲線で表される。例えば、膜ストリップ上の各位置（例えば試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーン、および/または試料捕捉ゾーンと対照捕捉ゾーンの間、または両ゾーンに隣接する領域、および/または膜ストリップの他の領域）における粒子の検出量を決定して、膜ストリップに沿った位置の距離の関数としてプロットすることができる。次に粒子量を、存在する標識の量に比例する曲線下面積の関数として計算することができる。
【００４７】
その後、補正後の分析物結合粒子量を決定し、次に分析物の量を、補正後の分析物結合粒子量から、適切な計算法で決定することができる。補正後の分析物結合粒子量は、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンで停止状態にある分析物結合粒子の量に基づく。例えば1つの態様では、補正後の分析物結合粒子量は、試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子量と、対照捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子量の比（R）として決定される。次に、存在する分析物の量は、補正後の分析物結合粒子量（比）から、標準曲線を参照して決定することができる。標準曲線は、検出対象となる分析物を含む流体に既知濃度の関心対象の分析物を含む一連の対照試料（例えば、分析物を含まない血清など）を調製することで作成する。次に、アッセイ法を、一連の対照試料を対象に行い、R値を各対照試料について測定し、同値を、対照試料中の分析物の濃度の関数としてプロットする。未知量の分析物を含む試料（「被験試料」）を、被験試料のR値を測定することでアッセイし、被験試料中の分析物の濃度を、標準曲線を参照して決定する。上述したように、1つの標準曲線を、1つのロットの全被験試料に対して（例えば、被験試薬用の特殊な調製物を用いる全被験試料に対して）作成して使用することができる。標準曲線を、各被験試料用に再び作成する必要はない。別の態様では、補正後の分析物結合粒子量を、対照捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子量と試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子量の合計の比（R）に対する、試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量の比として決定する。次に、存在する分析物の量は、補正後の分析物結合粒子量（比）から、標準曲線を参照して決定することができる。あるいは、他の比、および/または標準曲線を参照して、試料中に含まれる分析物の量を決定することもできる。また望ましいならば、バックグラウンドの標識量を、試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量と対照捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量から、比（R）の計算を行う前に差し引くこともできる。
【００４８】
「競合」または「阻害」アッセイ法
本発明の「競合」または「阻害」アッセイ法は、「サンドイッチ」アッセイ法と同様に、投入点、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む、上述の膜ストリップを含む固相装置を用いる。膜ストリップは任意選択で、対照捕捉ゾーンの次にウィッキングパッドを、また投入点の前に試料パッドを含みうる。既に述べたように、「投入点」は、流体試料が投入される膜上の位置である。この態様は上述の試料採取装置も用いる。競合（阻害）アッセイ法用の試料採取装置は、（「サンドイッチ」アッセイ法に関して述べたように、分析物結合剤で被覆される代わりに）関心対象の分析物で、または関心対象の分析物の類似体で被覆される「分析物被覆粒子」の集団を含む。本明細書で用いる分析物の「類似体」は、上述した、分析物-結合剤と結合対を形成するという点で、分析物と類似の結合特性を有する化合物である。分析物、または分析物の類似体は、粒子表面を直接被覆することができるほか、粒子に間接的に結合させることができる。後述するように、「分析物被覆粒子」という表現は、関心対象の分析物、または関心対象の分析物の類似体のいずれかで被覆された粒子を意味しうる。サンドイッチアッセイ法に関して既に記載したように、粒子の集団は、粒子の大きさおよび組成、固相装置の膜の組成、ならびにアッセイ法の感度のレベルに応じて変動する。
【００４９】
上述したように、試料捕捉ゾーンとは、試料捕捉用試薬が固定される膜ストリップ上の点を意味する。試料捕捉用試薬は、上述したような分析物結合剤である。試料捕捉用試薬は、上記と同じ分析物結合剤である必要はない。しかし試料捕捉用試薬は、関心対象の分析物と特異的また選択的に結合する点に関して、関心対象の分析物と結合対も形成する。上述したように、好ましい態様では試料捕捉用試薬は、分析物に対する抗体であるが、これは、粒子表面を被覆する分析物結合剤として使用される抗体と結合するエピトープと同じまたは異なる、分析物のエピトープに対する抗体であることができる。
【００５０】
上述のように、装置は対照捕捉用試薬を追加的に含み、これは、分析物被覆粒子と反応するが、測定対象となる分析物とは相互作用しない。例えば対照捕捉用試薬は、粒子表面の別の材料（例えば、粒子と結合状態にある分析物の担体；または抗体）と、または粒子そのものと反応しうる。好ましい態様では、試料捕捉用試薬および対照捕捉剤はいずれも抗体である。対照捕捉用試薬は、対照捕捉ゾーンの膜上に固定される（膜表面に被覆される、および/または膜内に浸透する）。
【００５１】
競合アッセイ成分は、「サンドイッチ」アッセイ法に関して既に述べた位置と同様に位置する。例えば好ましい態様では、対照捕捉ゾーンは試料捕捉ゾーンに隣接するので、このアッセイ成分の毛管作用の動態は、対照捕捉ゾーンと試料捕捉ゾーンの両方において同等（例えば本質的に同等）であり、またさらに対照捕捉ゾーンと試料捕捉ゾーンは、各ゾーンに停止した状態にある粒子が個別に定量可能な十分な空間も有する。さらに好ましい態様では、試料捕捉ゾーンは、キャピラリ先端の進む速度が、粒子の捕捉を可能にするように十分緩やかになって、また総移動時間が、分析物と試料捕捉用試薬の結合を可能にするように十分長くなることを確実なものとするために、試料捕捉ゾーンと対照捕捉ゾーンの間の短い距離に対して距離の長い空間によって投入点から隔てられる。
【００５２】
競合アッセイ法を行うためには、関心対象の分析物の有無の評価対象となる流体試料を上述のように用いる。一つの態様では、流体試料を試料採取装置に導入する（流し込む、注ぐ、またはそれ以外の方法で配置する）。例えば一つの態様では、ピペットチップを含む試料採取装置に流体試料を流し込む。試料採取装置に流体試料を導入することで、流体試料と分析物被覆粒子が混合され、「混合流体試料」が形成される。分析物被覆粒子を蒸発乾燥、凍結乾燥、または真空乾燥する場合、試料採取装置に流体試料を導入することで、流体試料中における分析物結合粒子の再水和および懸濁が可能となる。緩衝液（例えば上述の緩衝液）も混合流体試料中に導入すると、「緩衝された混合流体試料」が形成される。緩衝剤が添加された混合流体試料は、混合流体試料を、緩衝液を含む「緩衝液容器」（例えば試験管）に分注することにより、または緩衝液を、流体試料を導入する前に試料採取装置に導入することによって形成することができる。別の態様では、緩衝液を試料採取装置に導入してから、流体試料を試料採取装置に導入する。あるいは、関心対象の分析物が固体（例えば、上記の粉末、粒子、胞子、または他の粒子）の場合、上述の流体試料を、緩衝液容器に固体を導入することで調製することができる。この態様では、緩衝された混合流体試料は、流体試料（緩衝液を含む）を試料採取装置に導入することで形成される。
【００５３】
分析物被覆粒子を、流体試料中にさらに分散させるためには、望ましいならば、内部に流体試料および緩衝液が導入されている試料採取装置を、または内部に混合流体試料が導入されている緩衝液容器を（例えばボルテックスミキサーで、単に振盪することで、ピペット操作などで）攪拌するとよい。
【００５４】
好ましい態様では、試料採取装置は、真空乾燥された分析物被覆粒子をチップ中に有するピペットチップを含み、流体試料をピペットに吸い込むことによって、乾燥状態の分析物被覆粒子を再水和し、混合流体試料が形成する。特に好ましい態様では、混合流体試料を緩衝液容器に導入し、緩衝された混合流体試料を得て、緩衝液容器中の緩衝された混合流体試料を、試料採取装置を用いてピペット操作することにより、分析物被覆粒子をさらに分散させる。
【００５５】
緩衝された混合流体試料を、固相装置の膜ストリップの投入点、または投入パッド（存在する場合）に投入する。膜ストリップを、緩衝された混合流体試料に接触させた後に、膜ストリップを、流体が毛管作用によって膜の方向へ、また膜を通過して動くことを可能とする条件で維持する。分析物被覆粒子（また、試料中に存在する場合は分析物）は、膜内を、流体の毛管作用の結果として、緩衝された混合流体試料から、膜上の「試料捕捉ゾーン」の方向へ動き、また同ゾーンを通過し、続いて「対照捕捉ゾーン」の方向へ動き、または同ゾーンを通過する。膜ストリップを、分析物被覆粒子が毛管作用によって膜に沿って、試料捕捉ゾーンの方向へ、または同ゾーンを通過し、続いて対照捕捉ゾーンの方向へ、また続いて捕捉ゾーンを超えて（例えばウィッキングパッド中へ）動くことにより、任意の非結合粒子を捕捉ゾーンから除くことを可能とする条件（例えば十分な時間および流体容積）で維持する。
【００５６】
一部の分析物被覆粒子の動きは、試料捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子と試料捕捉用試薬との結合と、これに続く、対照捕捉ゾーンにおける一部の分析物被覆粒子と対照捕捉用試薬との結合によって停止する。分析物被覆粒子は、試料捕捉用試薬との結合をめぐって、試料中の分析物（存在する場合）と競合する。試料捕捉用試薬は、分析物被覆粒子表面の分析物との結合を可能にすることにより、分析物被覆粒子と結合する。本明細書で用いる「試料-試薬-分析物被覆粒子の複合体」という用語は、試料捕捉用試薬と分析物被覆粒子の複合体を意味する。分析物被覆粒子は、試料捕捉ゾーンに停止状態にあり、分析物被覆粒子が、粒子表面の分析物と、試料捕捉ゾーンの試料捕捉用試薬との相互作用によって捕捉されるために、試料-試薬-分析物被覆粒子の複合体を形成する。
【００５７】
対照捕捉用試薬は、分析物そのものを除く、分析物被覆粒子の任意の成分に結合することで、分析物被覆粒子に結合する。上記のように使用される「対照-試薬-分析物被覆粒子の複合体」という用語は、対照捕捉用試薬と分析物被覆粒子の複合体を意味する。上述したように、分析物被覆粒子は対照捕捉ゾーンで停止状態となって、分析物結合粒子と、対照捕捉ゾーンの対照捕捉用試薬の相互作用によって分析物被覆粒子が捕捉されるために、対照-試薬-分析物被覆粒子の複合体を形成する。
【００５８】
次に毛管作用は、試料捕捉ゾーンまたは対照捕捉ゾーンのいずれにおいても停止状態にない任意の分析物被覆粒子を、対照捕捉ゾーンを越える方向に向かって動かす。好ましい態様では、流体は、いずれの捕捉ゾーンにおいても停止状態にない、任意の接触状態の分析物被覆粒子を、対照捕捉ゾーンに続く吸い取りパッド中に動かす。
【００５９】
次に、試料捕捉ゾーンで停止状態にある分析物被覆粒子の量を決定する。分析物被覆粒子は、分析物被覆粒子に使用する標識の型に適した手法で検出する。好ましい態様では、分析物被覆粒子量は、分析物結合粒子の標識の蛍光量を測定する方法などの光学的な方法で決定する。対照捕捉ゾーンで停止状態にある分析物被覆粒子の量は、試料捕捉ゾーン内の分析物被覆粒子の量と同様に決定する。1つの態様では、上述したように、分析物被覆粒子の量は、固相（例えば膜ストリップ）に沿った位置に存在する標識の量に正比例する曲線で表される。例えば、膜ストリップの各位置（例えば、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーン、および/または試料捕捉ゾーンと対照捕捉ゾーンの間の領域、または試料捕捉ゾーンと対照捕捉ゾーンに隣接する領域、および/または膜ストリップの他の領域）における粒子の量を決定して、膜ストリップに沿った位置の距離の関数としてプロットすることができる。次に粒子量を、存在する標識の量に比例する曲線下面積の関数として計算することができる。
【００６０】
補正後の分析物被覆粒子量を決定し、次に分析物の量を、補正後の分析物被覆粒子量から適切な計算法で決定することができる。補正後の分析物被覆粒子量は、試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンに停止状態にある分析物被覆粒子の量に基づく。例えば1つの態様では、補正後の分析物被覆粒子量は、試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子量と、対照捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子量の比（R）に反比例する。次に、存在する分析物の量を、補正後の分析物被覆粒子量（比）から、標準曲線を参照して決定することができる。標準曲線は、検出対象となる分析物を含む流体に既知濃度の関心対象の分析物を含む一連の対照試料（分析物を含まない血清など）を調製することで作成する。次に、一連の対照試料を対象にアッセイ法を行い、R値を各対照試料について測定し、同値を、対照試料中の分析物の濃度の関数としてプロットする。未知量の分析物を含む試料（「被験試料」）のアッセイ法を、被験試料のR値を測定することで行い、被験試料中の分析物の濃度を、標準曲線を参照して決定する。上述したように、1つの標準曲線を作成して、1つのロットの全被験試料（試験用試薬の特定の調製物を用いる全被験試料）に対して使用することが可能であり、標準曲線を各被験試料について再び作成する必要はない。別の態様では、補正後の分析物被覆粒子量は、対照捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量と、試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子量の合計に対する、試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子量の比（R）に反比例する。次に、存在する分析物の量を、補正後の分析物被覆粒子量（比）を元に、標準曲線を参照して決定することができる。あるいは、他の比、および/または標準曲線を参照して、試料中の分析物の量を決定することもできる。また望ましいならば、バックグラウンドの標識量を、試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量、および対照捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量から差し引いてから比（R）の計算を行うことができる。
【００６１】
本発明の恩典
本発明の方法は、分析物結合粒子が固相装置の膜内に埋込まれたアッセイ法と比較して、感度が増強されたアッセイ法を提供する。例えばサンドイッチアッセイ法では、関心対象の分析物のアッセイ法の対象となる流体試料を、膜への投入前に分析物結合粒子と混合するので、関心対象の分析物が、膜内で生じる捕捉反応の前に分析物結合粒子と結合するまでに長い時間を要する。また、関心対象の分析物と分析物結合粒子の相互作用は流体相中で起こるので、粒子の移動度が大きいために、固相装置の膜のマトリックスにおける関心対象の分析物と分析物結合粒子間の同じ相互作用と比較して、効率的な結合が生じる可能性がある。またサンドイッチアッセイ法と競合アッセイ法の両方に関して、粒子が、固相装置に埋込まれるよりも流体採取装置に多く含まれうる。つまり数が多くなると、反応の感度がさらに高まる。また、分析物結合粒子（または分析物被覆粒子）は、緩衝された混合流体試料の固相膜への投入前に、緩衝された混合流体試料中に分散しているので、粒子は捕捉ゾーンを、流体先端の頂点でクイックウエーブというより、連続的に流体の毛管作用で通過する。結果として、低濃度の粒子は捕捉ゾーンを長い時間をかけて流れる。したがって、粒子が「捕捉」されうる時間は事実上長くなる一方で、捕捉ゾーンを通過する粒子の量は事実上減少するので、粒子が流体先端の頂点を通過する場合に生じる他のものによる一部の粒子の捕捉のブロッキングが避けられる。
【００６２】
本発明のアッセイ法は、特にイムノアッセイ法に関して説明されているが、本発明のアッセイ法は、上記の他の結合対（例えば核酸、受容体-リガンド、レクチン-糖）を対象に、上記と同じ方法で、分析物および分析物結合剤として所望の成分を対象に同様に使用することができる。本発明はまた、本明細書に記載されている方法に使用されるキットも含む。キットの成分には、特異的な結合対の第1および/または第2の要素、緩衝液、流体採取法、および標準曲線の作成に使用する対照試料、分析物結合粒子、および/または対照粒子、捕捉用試薬、および/または抗体が含まれる。
【００６３】
本発明のキット
本発明は、本明細書に記載された方法に使用されるキットも含む。キットの成分は以下を含む：特異的結合対の第1および/または第2の成分、緩衝液および/または緩衝液容器、流体採取手段、1台もしくは複数の固相装置（任意選択で投入パッドおよび/またはウィッキングパッドを含む）、少なくとも1台の試料採取装置、1種類もしくは複数の緩衝液容器、標準曲線作製用の対照試料および/または他の標準曲線情報、分析物結合粒子、分析物被覆粒子、および/または対照粒子、捕捉用試薬、抗体、関心対象の分析物の評価対象となる試料の採取を補助するツール（例えばスワブ）、処理装置（例えばバイオハザード用の廃棄用バッグ）、および/または試料採取装置に関する他の情報または指示書（例えばロット情報や有効期限など）。例えば一つの態様では、キットは、分析物結合粒子を内部に有する少なくとも1台の試料採取装置を含む。好ましい態様では、キットは、蒸発乾燥された、真空乾燥された、または凍結乾燥された分析物結合粒子を内部に有する少なくとも1個のピペットチップを含む。別の態様では、キットは、本明細書に記載された、少なくとも1台の固相装置、および少なくとも1台の試料採取装置を含む。別の好ましい態様では、キットは少なくとも1本のピペット；蒸発乾燥された、真空乾燥された、または凍結乾燥された分析物結合粒子を内部に有する少なくとも1個もしくは複数のピペットチップ；ならびに少なくとも1台の固相装置を含む。この態様は任意選択で、ピペットチップ中の分析物結合粒子に関する標準曲線、ロット情報、および/または有効期限に関する情報を含んでもよい。さらに別の好ましい態様では、キットは少なくとも1台の試料採取装置；乾燥状態の分析物結合粒子を内部に有する少なくとも1個のピペットチップ；少なくとも1台の固相装置、ならびに少なくとも1個の緩衝液容器を含む。この好ましい態様は任意選択で、緩衝液容器内に緩衝液；および固体試料の採取用のツール（例えばスワブ）を含む場合もある。
【００６４】
本発明を、以下の実施例でさらに説明するが、これらは何ら制限を意図するものではない。
【００６５】
実施例1  ラテックスの緩衝液による滴定（対照ストリップと比較時）
材料および方法
実験を以下のように設定した。固相装置（「試験カートリッジ」）を準備するために、事前にマイラー基材（Mylar backing）に事前に貼付したニトロセルロース膜を用いた。特異的抗体（試料捕捉用試薬）を膜の試料捕捉ゾーンに投入し、内部対照抗体（対照捕捉用試薬）を膜の対照捕捉ゾーンに投入した。抗体を投入した後に、膜上のタンパク質結合部位を、ポリビニルアルコール（PVA）で処理してブロックし、次に膜を洗浄して乾燥させた。次にこの膜を、投入抗体のラインに対して垂直となるように5 mm幅のストリップに切断した。次にストリップを、試験カートリッジ（固相装置）内に、以下の2枚のパッドとともに組み立てた：a）血液細胞（全血を使用する場合）を分けるフィルターとして機能する近位端における投入パッド、またはガラスファイバーのパッド（炭疽菌試験用の試料ホールド用パッドとして作用する）；およびb）膜内を、試料を添加する近位端から遠位端へ移動する流体を吸い上げる吸収パッドとして作用する、ガラスファイバーの遠位端における（抗体のラインを超える）ウィッキングパッド。
【００６６】
試験カートリッジをカートリッジの開口部と、試料パッド上の「ウェル」を圧入し、液体試料がパッドおよび膜内に吸収可能になるまで保持されるように押し込んだ。カートリッジの底には、光学的な読み値が試験実施後に得られるように、膜の低表面（マイラー基材）が曝露された「ウィンドウ」がある。カートリッジには、他の開口部はなかったが密閉されているわけではなかった。カートリッジを乾燥後に、フォイルポーチ（foil pouch）中に小さな乾燥剤とともに密閉した。
【００６７】
ピペットチップ（試料採取装置）を以下のように組み立てた。さまざまな種類の自動ピペットに使用される市販のピペットチップを、これらを垂直に12×8マトリックス（中心は9 mm）に固定するラック中に設置した。自動化システムが、5マイクロリットルの抗体被覆色素ラテックス懸濁液を各チップ中に送り込んだ。懸濁液を小さな（2 mmの）ドットとして、チップの小さな端から約1 cm離れて送り込んだ。懸濁液は、懸濁液に粘性をもたせて、チップに輸送したときにその場に留まるように；乾燥時のタンパク質の安定化に寄与するように；ならびに乾燥後のスポットがその場に留まるように「接着剤」として作用するように、トレハロース（糖）の溶液とした。次にチップを真空条件で乾燥させ、乾燥したら、カートリッジ（各1本）と同じポーチに配置してからシールした。
【００６８】
緩衝液バイアルを以下のように組み立てた。緩衝液バイアルにタイトフィットキャップ（tight fitting cap）を付け、測定済みの量の希釈液を含めた。希釈液バイアルを満たしたら、キャップをして、試験キット中に入れた。緩衝液の量および組成は、個々の異なる種類のアッセイ法によって変動した。量は、試料が各試験に適切なレベルに希釈されるように調整した。例えばミオグロビン試験では1:10の血液希釈液を使用し、トロポニンI試験では1:3の血液希釈液を使用する。炭疽菌試験では、試料およびラテックスを懸濁するために十分な緩衝液を、試験における喪失後に使用する。緩衝液は水ベースであってもよく、また複数の異なる塩、緩衝剤、ならびに界面活性剤を含んでもよい。例えば、代表的な解析物用の代表的な緩衝液は以下を含む：ミオグロビンの場合は、122 mM PB、100 mM NaCl、3.3% BSA、1.1 % Cremophor EL、0.05% ProClin 300、pH 7.2を含む緩衝液を使用することが可能であり；CKMBの場合は、115 mM PB、115 mM NaCl、2.3% BSA、0.25% Surfynol 104PG-50、0.3%カゼイン、40 mM Phe、0.5%ヒツジ血清、0.05% ProClin 300、pH 7.2を含む緩衝液を使用することが可能であり；TnIの場合は、124 mM PB、124 mM NaCl、3.24% BSA、0.76% Surfactant 10G、0.54%カゼイン、405 mM GHCl、40 mM Phe、10%ヤギ血清、pH 7.2を含む緩衝液を使用することが可能であり；炭疽菌の場合は、138 mM PB、138 mM NaCl、3.6% BSA、0.84% Surfactant 10G、0.6%カゼイン、0.05%高粘度メチルセルロース、0.05% ProClin 300、pH 7.2を含む緩衝液を使用することが可能である（略称：PB=リン酸緩衝液、NaCl=塩化ナトリウム、BSA=ウシ血清アルブミン、Phe=フェニルアラニン）。
【００６９】
血液試料を対象にアッセイ法を行うために、以下の手順を行った。
【００７０】
血液の試料を、任意の型のピペットで、またはラテックスドットを有するピペットチップ（試料採取装置）のいずれかで緩衝液バイアルに移した。これは単純な液体輸送操作であった。次にラテックスドットを有するピペットチップを用いて、液体を少なくとも10回上下させるピペット操作を繰返して試料と緩衝液を混合した。この混合操作中、液体が、ラテックスドットと接触するようになり、これを再水和させ、希釈物-試料マトリックス中で懸濁状態とした。懸濁後に、ラテックス上の抗体が、試料中の抗原（存在する場合）に結合し始めた。
【００７１】
次に、ピペット（上記と同じチップを使用）を用いて、緩衝された混合物の一部を、カートリッジの試料ウェルに移した。次にカートリッジをリーダー内に入れたリーダー内では以下が起こった：a）希釈物が、血液細胞が保持されている試料パッド中に染み込み始めた。この液体はパッド中を流れ、ニトロセルロース膜と接触した。液体（懸濁状のラテックスを含む）が、毛管作用によって、膜の長軸に沿って、湿った吸収パッドに向かって流れた。ラテックスが試験ライン（試料捕捉ゾーン）に到達したら、仮に試料中に任意の抗原が存在する場合には、一部は、固定された抗体（試料捕捉用試薬）によって捕捉される可能性がある。仮に抗原が、ラテックス表面で抗体と結合した状態であったら、ラテックスも、2つの抗体間に挟まれた抗原の存在により捕捉されると考えられる。試験ラインで捕捉されなかったラテックスは流れ続け、次に内部対照抗体系列（対照捕捉ゾーン）と遭遇した。この抗体は、ラテックスそのものの表面上の材料（抗体または他の材料）に対するものであった。ラテックスの一部は、この捕捉反応のために、内部対照ラインで捕捉された。残存液体および非結合ラテックスは、ストリップの遠位端へ移動を続け、ウィッキングパッド中に保持された。液体の流れは、パッドが飽和すると、または試料が試料パッド中に完全に吸収されて、毛細管圧が平衡になったときに停止した。次にリーダーで、試験ラインにおける、また内部対照ライン中のラテックスの量を決定し、比法（ratio method）で、試験カートリッジのロットに関して決定された標準曲線と比較することで、試料中の抗原の量を決定した。
【００７２】
粒子抗原（炭疽菌の胞子）を有する試料を対象にアッセイ法を行うためには、試料を以下のように採取する。仮に材料が、表面（例えば卓上）に由来する試料である場合、以下の手順を行った：スワブを緩衝液バイアル中に導入し、スワブの先端を湿らせ、次にスワブを用いて検討対象の表面を緩やかにぬぐい、次にスワブを緩衝液バイアル中に戻し、回転して粒状材料を希釈液中へ放出させ、スワブを除去して廃棄した。次に上記の試験手順を行った。検討対象の材料が液状（例えば粒子の液体懸濁液）であれば、以下の手順を行った：試験液体の試料（10〜30マイクロリットル）を乾燥状態のスワブに投入するか、または乾燥状態のスワブを試験液体に浸し、次にスワブを希釈液中に浸し、緩やかに回転して粒子を放出させ、スワブを除去して廃棄した。この試験手順を上記のように続けた。検討対照の材料が粉末状または顆粒状であれば以下の手順を行った：少量の粉末試料を、少量の材料をバイアル中に掻き取ることで、または湿った状態または乾燥した状態のスワブの先端を粉末に接触させた後に、これを希釈液の入ったバイアル中に配置することで希釈物に添加した。この試験手順を上記のように続けた。
【００７３】
結果
上記の方法でアッセイ法を行い、ピペットチップ中の乾燥ラテックスを用いてラテックス粒子を緩衝液（希釈物）中に滴定することで得られた結果を、ラテックス粒子で膜ストリップを（ラテックス投入部位「LAS」で）被覆することで得られた結果と比較し、試料の流体が毛管作用によってLASを介して移動してから、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンを介して移動可能とすることで得た。試料は、ベースライン（0）および0.5 ng/mlのTnIにおけるウマ血清標準および血液M5とした。緩衝液（希釈物）は、0、0.5×、1×、2×、4×、または8×のラテックス粒子を含むTnI希釈物（200 mM GHCl＋10%ヤギ血清）であった。結果を表1に示す。
【００７４】
（表１）緩衝液によるピペット内ラテックスの滴定の効果（膜ストリップ表面のLASにおけるラテックス粒子と比較時）
2005522698.tif 000002
【００７５】
0.5×、1×、2×、および4×のラテックス希釈液を用いることで、シグナル：バックグラウンド（S:B）が、対照LASストリップと比較して有意に上昇することが観察された。S:Bの上昇は、陽性試料とゼロ試料の類似のバックグラウンドの特異的結合の増加によるものであった。この結果、系の感度が上昇した。ラテックス量の増加に伴い、生のTLシグナルおよびISLシグナルが強まった。1×ラテックス希釈物は、対照LASストリップに対して、同等のTLおよびISLシグナルを生じた。したがってラテックス希釈物は、RAMPアッセイ法において対照LASストリップと比較して、高感度をもたらすと結論された。
【００７６】
実施例2
標準曲線における1×ラテックス希釈物とLASストリップの比較
実施例1に記載された方法でアッセイ法を行い、ピペットチップ中の乾燥ラテックスを用いて緩衝液（希釈物）中へのラテックス粒子の滴定で得られた結果を、上述のようにラテックス粒子で膜ストリップ（ラテックス投入部位「LAS」）を被覆することで得られた結果と比較した。試料は、ウマ血清標準および0、0.1、0.2、0.5、1、および3 ng/mlを添加した血液M35とした。緩衝液（希釈物）は、180 mM GHCl＋10%ヤギ血清を有し、1×ラテックス粒子を含むまたは含まないTnI希釈物とした。結果を表2に示す。
【００７７】
（表２）1×ラテックス粒子希釈物および完全長の膜ストリップを用いたウマ血清および血液の完全標準曲線
2005522698.tif 000003
【００７８】
1×ラテックス希釈物では、希釈物および血液試料の両方で、対照LASストリップと比較して標準曲線の範囲全体に関してS:Bに一貫した増加がみられることが観察された。感度の上昇は、高いS:Bでだけでなく、ラテックス希釈物を用いた血液中のゼロ点と0.1 ng/ml点の差においても認められたが、一方で、LASストリップに関しては、ゼロから0.5 ng/mlまで明瞭な差は認められなかった。これらの結果から、ラテックス希釈物を用いると、LASストリップと比較してRAMP系の感度が有意に高まることが確認された。
【００７９】
実施例3
ラテックス希釈物の滴定と対照LASストリップ
実施例1に記載された方法でアッセイ法を行い、ピペットチップ中の乾燥ラテックスを用いてラテックス粒子の緩衝液（希釈物）中への滴定によって得られた結果を、ラテックス粒子で膜ストリップを（ラテックス投入部位「LAS」で）上述のように被覆して得られた結果と比較した。試料は0および2000 ng/mlの炭疽菌（Bacillus anthracis）の胞子とした。緩衝液（希釈物）は、1×、3×、または6×のラテックス粒子を含むまたは含まないTnI希釈物とした。結果を表3に示す。
【００８０】
（表３）ラテックス粒子希釈物および完全長膜ストリップを用いた炭疽菌のアッセイ法
2005522698.tif 000004
【００８１】
1×、3×、および6×のラテックス希釈物を用いることで、S:Bが、炭疽菌アッセイ法の対照LASストリップと比較して有意に上昇することが観察された。3×および6×ラテックス希釈物のS:Bの方が、1×ラテックス希釈物より高かった。これらの結果から、ラテックス希釈物を用いるとことでRAMP系の感度が、炭疽菌アッセイ法に応用されたLASストリップと比較して改善されることが確認された。
【００８２】
本発明は、本発明の好ましい態様に関して特に説明および記述したが、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく形式および内容にさまざまな変更が加えられることは、当業者により理解される。
【国際調査報告】
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