(57)【要約】前駆細胞表面抗原を認識し、結合し、かつ／または前駆細胞表面抗原（１．０２）と相互作用して細胞（１．０１）をデバイス表面に固定化する抗体（１．０３）、抗体断片、または小分子を組込んだ生体適合性マトリクス（１．０６）でコーティングされた、ステント（１．０７）、ステント移植片、合成血管移植片、心臓弁のような医療用デバイスを生産するための組成物および方法を提供する。デバイスのコーティングはまた、内膜過形成を防ぐために、デバイス表面で、前駆内皮細胞（１．０１）が、結合した細胞の接着、増殖、および分化を加速して成熟した機能的内皮細胞にするように促進する化合物または増殖因子を含有し得る。そのような医療用デバイスの調製法、組成物、および再狭窄、粥状動脈硬化のような血管疾患または他の型の血管閉塞を有する哺乳類の治療法が開示される。
2005523050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）コーティング、（ｂ）治療上有効量の少なくとも１つの型の抗体、抗体断片、またはそれらの組合せ、および（ｃ）少なくとも１種の化合物を含み、該コーティングは、少なくとも１層の生体適合性マトリクスを含み、前記少なくとも１つの型の抗体または抗体断片は、前駆内皮細胞表面上の抗原に対するものであり、そして前記少なくとも１種の化合物は医療用デバイスの表面に内皮を形成するように前記前駆内皮細胞を刺激する、医療用デバイス。
【請求項２】
前記医療用デバイスがステント、ステント移植片、合成血管移植片、心臓弁、カテーテル、血管プロテーゼフィルター、ペースメーカー、ペースメーカーリード線、除細動器（defibrilator）、卵円孔開存中隔閉鎖（septal closure）デバイス、血管クリップ、血管動脈瘤オクルーダー（occluder）、血液透析移植片、血液透析カテーテル、房室シャント（atrioventricular shunt）、大動脈瘤移植片デバイス、静脈弁、縫合糸、血管吻合クリップ、静脈留置カテーテル、動脈留置カテーテル、血管外筒（vascular sheath）および薬物送達ポートからなる群より選択される、請求項１に記載の医療用デバイス。
【請求項３】
前記医療用デバイスがステントである、請求項２に記載の医療用デバイス。
【請求項４】
前記ステントは、ステンレス鋼、ＮｉＴｉ、ＭＰ３５Ｎ、およびクロム合金からなる群より選択される材料を含む、請求項３に記載の医療用デバイス。
【請求項５】
前記ステントが架橋ＰＶＡヒドロゲル、ｅＰＴＦＥ、ＰＴＦＥ、多孔質ＨＤＰＥ、ポリウレタン、およびポリエチレンテレフタレートからなる群より選択される、ジャケット、カバーリング、または被包形成をさらに含む、請求項２または３に記載の医療用デバイス。
【請求項６】
前記合成血管移植片は、架橋ポリビニルアルコール、ｅＰＴＦＥ、ＰＴＦＥ、多孔質ＨＤＰＥ、ポリウレタン、およびポリエチレンテレフタレートからなる群より選択される材料を含む、請求項２に記載の医療用デバイス。
【請求項７】
前記生体適合性マトリクスは、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン尿素／ヘパリン、ポリＬ乳酸、セルロースエステル、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニル、デキストラン、およびゼラチンからなる群より選択される合成材料を含む、請求項１に記載の医療用デバイス。
【請求項８】
前記生体適合性マトリクスは、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン、フィブリン、セルロース、および非晶質炭素からなる群より選択される天然に生じる材料を含む、請求項１に記載の医療用デバイス。
【請求項９】
前記生体適合性マトリクスは、炭素原子数が約Ｃ２０〜約Ｃ１５０の範囲であるフラーレンを含む、請求項１に記載の医療用デバイス。
【請求項１０】
前記フラーレンの炭素原子数はＣ６０またはＣ７０である、請求項９に記載の医療用デバイス。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの型の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の医療用デバイス。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの型の抗体または抗体断片は、該医療用デバイスをコーティングする前記生体適合性マトリクスの最外層に、共有結合または非共有結合されるか、あるいはリンカー分子により共有結合でつなぎ止められる、請求項１に記載の医療用デバイス。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの型の抗体または抗体断片は、ヒト前駆内皮細胞に特異的である、請求項１に記載の医療用デバイス。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの型の抗体または抗体断片は、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤｗ９０、ＣＤ１１７、ＨＬＡＤＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｍｕｃ１８（ＣＤ１４６）、ＣＤ１３０、幹細胞抗原（Ｓｃａ１）、幹細胞因子１（ＳＣＦ／ｃＫｉｔリガンド）、Ｔｉｅ２、およびＨＡＤＤＲからなる群より選択される前駆内皮細胞表面抗原に対するものである、請求項１に記載の医療用デバイス。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの型の抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２断片を含むモノクローナル抗体である、請求項１または１１に記載の医療用デバイス。
【請求項１６】
前記抗体断片は、合成または天然由来の小分子を含む、請求項１に記載の医療用デバイス。
【請求項１７】
前記少なくとも１種の化合物は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、塩基性繊維芽細胞増殖因子、血小板誘導（platelet-induced）増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β１、酸性繊維芽細胞増殖因子、オステオネクチン、アンジオポエチン（angiopoietin）１、アンジオポエチン２、インシュリン様増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子ＡＢ、内皮ＰＡＳタンパク質１、トロンボスポンジン、プロリフェリン（proliferin）、エフリンＡ１、Ｅセレクチン、レプチン、ヘパリン、インターロイキン８、チロキシン、およびスフィンゴシン１ホスフェートからなる群より選択される増殖因子である、請求項１に記載の医療用デバイス。
【請求項１８】
前記増殖因子は、ＶＥＧＦファミリーまたはアンジオポエチンファミリーの一員である、請求項１７に記載の医療用デバイス。
【請求項１９】
前記生体適合性マトリクスはデキストランを含み、前記少なくとも１つの型の抗体はＣＤ３４細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体であり、そして前記少なくとも１種の化合物はＶＥＧＦまたはＡｎｇ２である、請求項１、２、または３に記載の医療用デバイス。
【請求項２０】
前記生体適合性マトリクスはデキストランを含み、前記少なくとも１つの型の抗体はＣＤ１３３細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体であり、そして前記少なくとも１種の化合物はＶＥＧＦまたはＡｎｇ２である、請求項１、２、または３に記載の医療用デバイス。
【請求項２１】
前記生体適合性マトリクスはゼラチンを含み、前記少なくとも１つの型の抗体はＣＤ３４またはＣＤ１３３細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体であり、そして前記少なくとも１種の増殖因子はＶＥＧＦまたはＡｎｇ２である、請求項１、２、または３に記載の医療用デバイス。
【請求項２２】
前記生体適合性マトリクスはゼラチンまたはデキストランを含み、前記少なくとも１つの型の抗体はＴｉｅ２細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体であり、そして前記少なくとも１種の増殖因子はＶＥＧＦまたはＡｎｇ−２である、請求項１、２、または３に記載の医療用デバイス。
【請求項２３】
前記生体適合性マトリクスはフラーレンを含み、前記少なくとも１つの型の抗体はＴｉｅ−２細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体であり、そして前記少なくとも１種の増殖因子はＶＥＧＦまたはＡｎｇ２である、請求項１に記載の医療用デバイス。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの型の抗体は、該医療用デバイスをコーティングする前記生体適合性マトリクスの最外層の表面に、リンカー分子により共有結合でつなぎ止められる、請求項１５に記載の医療用デバイス。
【請求項２５】
前記前駆内皮細胞はヒト細胞である、請求項１に記載の医療用デバイス。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの型の抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２断片を含むモノクローナル抗体である、請求項１４または１８に記載の医療用デバイス。
【請求項２７】
（ａ）生体適合性マトリクス、（ｂ）治療上有効量の少なくとも１つの型の抗体、抗体断片、またはそれらの組合せ、および（ｃ）医療用デバイスの表面に内皮を形成するように前駆内皮細胞を刺激するための治療上有効量の少なくとも１種の化合物を含む、該医療用デバイスのコーティング用組成物。
【請求項２８】
前記医療用デバイスは、ステント、ステント移植片、合成血管移植片、心臓弁、カテーテル、血管プロテーゼフィルター、ペースメーカー、ペースメーカーリード線、除細動器、ＰＦＯ中隔閉鎖デバイス、血管クリップ、血管動脈瘤オクルーダー、血液透析移植片、血液透析カテーテル、房室シャント、大動脈瘤移植片デバイス、静脈弁、縫合糸、血管吻合クリップ、静脈留置カテーテル、動脈留置カテーテル、血管外筒および薬物送達ポートからなる群より選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記生体適合性マトリクスは、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン尿素／ヘパリン、ポリＬ乳酸、セルロースエステル、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニル、デキストラン、およびゼラチンからなる群より選択される合成材料を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記生体適合性マトリクスは、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン、フィブリン、セルロース、および非晶質炭素からなる群より選択される天然に生じる材料を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記生体適合性マトリクスは、炭素原子数が約Ｃ２０〜約Ｃ１５０の範囲であるフラーレンを含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの型の抗体または抗体断片は、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤｗ９０、ＣＤ１１７、ＨＬＡＤＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｍｕｃ１８（ＣＤ１４６）、ＣＤ１３０、幹細胞抗原（Ｓｃａ１）、幹細胞因子１（ＳＣＦ／ｃＫｉｔリガンド）、Ｔｉｅ２、およびＨＡＤＤＲからなる群より選択される前駆内皮細胞表面抗原を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの型の抗体は、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびモノクローナル抗体からなる群より選択され、該モノクローナル抗体はＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２断片を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３４】
前記少なくとも１種の化合物は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、塩基性繊維芽細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β１、酸性繊維芽細胞増殖因子、オステオネクチン、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、インシュリン様増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子ＡＢ、内皮ＰＡＳタンパク質１、トロンボスポンジン、プロリフェリン、エフリンＡ１、Ｅセレクチン、レプチン、ヘパリン、インターロイキン８、チロキシン、およびスフィンゴシン１ホスフェートからなる群より選択される増殖因子である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３５】
ａ．医療用デバイスの表面に少なくとも１層の生体適合性マトリクスを塗布する工程であって、該生体適合性マトリクスは、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン−尿素／ヘパリン、ポリ−Ｌ−乳酸、セルロースエステル、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニル、デキストラン、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン、フィブリン、セルロース、および炭素、およびフラーレンからなる群より選択される少なくとも１種の構成成分を含む、少なくとも１層の生体適合性マトリクスを塗布する工程、および
ｂ．治療上有効量の少なくとも１つの型の抗体、抗体断片、またはそれらの組合せ、ならびに内皮細胞の増殖および分化を刺激する少なくとも１種の化合物を、同時にまたは順次、該生体適合性マトリクスに塗布する工程、を含む、医療用デバイスのコーティング法。
【請求項３６】
前記医療用デバイスは、ステント、ステント移植片、合成血管移植片、心臓弁、カテーテル、血管プロテーゼフィルター、ペースメーカー、ペースメーカーリード線、除細動器、卵円孔開存中隔閉鎖デバイス、血管クリップ、血管動脈瘤オクルーダー、血液透析移植片、血液透析カテーテル、房室シャント、大動脈瘤移植片デバイス、静脈弁、縫合糸、血管吻合クリップ、静脈留置カテーテル、動脈留置カテーテル、血管外筒および薬物送達ポートからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの型の抗体は、前記医療用デバイスをコーティングする前記生体適合性マトリクスに、共有結合または非共有結合される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記フラーレンの炭素原子数はＣ６０またはＣ７０である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの型の抗体または抗体断片は、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤｗ９０、ＣＤ１１７、ＨＬＡＤＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｍｕｃ１８（ＣＤ１４６）、ＣＤ１３０、幹細胞抗原（Ｓｃａ１）、幹細胞因子１（ＳＣＦ／ｃＫｉｔリガンド）、Ｔｉｅ２、およびＨＡＤＤＲからなる群より選択される前駆内皮細胞表面抗原に対するものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの型の抗体はモノクローナル抗体であり、そして該抗体の巨大分子または小分子を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１種の化合物は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、塩基性繊維芽細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β１、酸性繊維芽細胞増殖因子、オステオネクチン、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、インシュリン様増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子ＡＢ、内皮ＰＡＳタンパク質１、トロンボスポンジン、プロリフェリン、エフリンＡ１、Ｅセレクチン、レプチン、ヘパリン、インターロイキン８、チロキシン、およびスフィンゴシン１ホスフェートからなる群より選択される増殖因子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
医療用デバイスを哺乳類の血管または管状器官中に移植することを含む、哺乳類での血管疾患の治療法であって、前記医療用デバイスは（ａ）生体適合性マトリクス、（ｂ）治療上有効量の少なくとも１つの型の抗体、抗体断片、またはそれらの組合せ、および（ｃ）少なくとも１種の化合物、でコーティングされ、そして該抗体または抗体断片は、前記マトリクスの表面で前駆内皮細胞が固定化されるように該前駆内皮細胞表面の抗原を認識して結合し、そして前記化合物は、前記医療用デバイスの表面に内皮を形成するように前記固定化された前駆内皮細胞を刺激するものである、哺乳類での血管疾患の治療法。
【請求項４３】
前記医療用デバイスは、ステント、ステント移植片、合成血管移植片、心臓弁、カテーテル、血管プロテーゼフィルター、ペースメーカー、ペースメーカーリード線、除細動器、卵円孔開存中隔閉鎖デバイス、血管クリップ、血管動脈瘤オクルーダー、血液透析移植片、血液透析カテーテル、房室シャント、大動脈瘤移植片デバイス、静脈弁、縫合糸、血管吻合クリップ、静脈留置カテーテル、動脈留置カテーテル、血管外筒および薬物送達ポートからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記生体適合性マトリクスは、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン−尿素／ヘパリン、ポリ−Ｌ−乳酸、セルロースエステル、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニル、デキストラン、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン、フィブリン、セルロース、非晶質炭素、およびフラーレンからなる群より選択される少なくとも１種の構成成分を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記フラーレンの炭素原子数はＣ６０またはＣ７０である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの型の抗体または抗体断片は、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤｗ９０、ＣＤ１１７、ＨＬＡＤＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｍｕｃ１８（ＣＤ１４６）、ＣＤ１３０、幹細胞抗原（Ｓｃａ１）、幹細胞因子１（ＳＣＦ／ｃＫｉｔリガンド）、Ｔｉｅ２、およびＨＡＤＤＲからなる群より選択される前駆内皮細胞表面抗原に対するものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの型の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体からなる群より選択され、そして該モノクローナル抗体は該抗体の巨大分子または小分子を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも１種の化合物は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、塩基性繊維芽細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β１、酸性繊維芽細胞増殖因子、オステオネクチン、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、インシュリン様増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子ＡＢ、内皮ＰＡＳタンパク質１、トロンボスポンジン、プロリフェリン、エフリンＡ１、Ｅセレクチン、レプチン、ヘパリン、インターロイキン８、チロキシン、およびスフィンゴシン１ホスフェートからなる群より選択される増殖因子である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記血管疾患は、粥状動脈硬化、再狭窄、血栓症、血管および管状器官の閉塞からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記生体適合性マトリクスは炭素原子数がＣ６０またはＣ７０のフラーレンを含み、前記少なくとも１つの型の抗体または断片は前記前駆細胞表面抗原ＣＤ３４またはＣＤ１３３を認識して結合し、そして前記化合物はＶＥＧＦまたはＡｎｇ−２である、請求項１、２、または３に記載の医療用デバイス。
【請求項５１】
前記フラーレンはナノチューブとして配列される、請求項９または５８に記載の医療用デバイス。
【請求項５２】
医療用デバイスを哺乳類の血管または管状器官中に移植することを含む、哺乳類での内膜過形成（intimal hyperplasia）の阻害法であって、前記医療用デバイスは、（ａ）少なくとも１層の生体適合性マトリクス、（ｂ）治療上有効量の少なくとも１つの型の抗体、抗体断片、またはそれらの組合せ、および（ｃ）少なくとも１種の化合物、でコーティングされ、そして前記抗体または抗体断片は、前記マトリクスの表面で前駆内皮細胞が固定化されるように前記前駆内皮細胞表面上の抗原を認識して結合し、そして前記少なくとも１種の化合物は、前記医療用デバイスの表面に内皮を形成するように前記固定化された前駆内皮細胞を刺激するものである、哺乳類での内膜過形成の阻害法。
【請求項５３】
前記医療用デバイスは、ステント、ステント移植片、合成血管移植片、心臓弁、カテーテル、血管プロテーゼフィルター、ペースメーカー、ペースメーカーリード線、除細動器、卵円孔開存中隔閉鎖（デバイス、血管クリップ、血管動脈瘤オクルーダー、血液透析移植片、血液透析カテーテル、房室シャント、大動脈瘤移植片デバイス、静脈弁、縫合糸、血管吻合クリップ、静脈留置カテーテル、動脈留置カテーテル、血管外筒および薬物送達ポートからなる群より選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記生体適合性マトリクスは、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン尿素／ヘパリン、ポリＬ乳酸、セルロースエステル、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニル、デキストラン、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン、フィブリン、セルロース、非晶質炭素およびフラーレンからなる群より選択される少なくとも１種の構成成分を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記フラーレンの炭素原子数はＣ６０またはＣ７０である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記少なくとも１つの型の抗体または抗体断片は、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤｗ９０、ＣＤ１１７、ＨＬＡＤＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｍｕｃ１８（ＣＤ１４６）、ＣＤ１３０、幹細胞抗原（Ｓｃａ１）、幹細胞因子１（ＳＣＦ／ｃＫｉｔリガンド）、Ｔｉｅ２、およびＨＡＤＤＲからなる群より選択される前駆内皮細胞表面抗原を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記少なくとも１つの抗体断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体からなる群より選択され、そして該抗体の巨大分子または小分子を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも１種の化合物は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、塩基性繊維芽細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β１、酸性繊維芽細胞増殖因子、オステオネクチン、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、インシュリン様増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子ＡＢ、内皮ＰＡＳタンパク質１、トロンボスポンジン、プロリフェリン、エフリンＡ１、Ｅセレクチン、レプチン、ヘパリン、インターロイキン８、チロキシン、およびスフィンゴシン１ホスフェートからなる群より選択される増殖因子である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
コーティングおよび治療上有効量の少なくとも１つの型の小分子を含む医療用デバイスであって、前記コーティングは少なくとも１層の生体適合性マトリクスを含み、そして前記小分子は前駆内皮細胞表面の抗原と相互作用して該デバイスの表面の前記前駆内皮細胞を固定化する、医療用デバイス。
【請求項６０】
前記医療用デバイスがステント、ステント移植片、合成血管移植片、心臓弁、カテーテル、血管プロテーゼフィルター、ペースメーカー、ペースメーカーリード線、除細動器、卵円孔開存中隔閉鎖デバイス、血管クリップ、血管動脈瘤オクルーダー、血液透析移植片、血液透析カテーテル、房室シャント、大動脈瘤移植片デバイス、静脈弁、縫合糸、血管吻合クリップ、静脈留置カテーテル、動脈留置カテーテル、血管外筒および薬物送達ポートからなる群より選択される、請求項５９に記載の医療用デバイス。
【請求項６１】
前記生体適合性マトリクスは、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン尿素／ヘパリン、ポリＬ乳酸、セルロースエステル、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニル、デキストラン、およびゼラチンからなる群より選択される合成材料を含む、請求項５９に記載の医療用デバイス。
【請求項６２】
前記生体適合性マトリクスは、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン、フィブリン、セルロース、および非晶質炭素からなる群より選択される天然に生じる材料を含む、請求項５９に記載の医療用デバイス。
【請求項６３】
前記生体適合性マトリクスは、炭素原子数が約Ｃ２０〜約Ｃ１５０の範囲であるフラーレンを含む、請求項５９に記載の医療用デバイス。
【請求項６４】
前記フラーレンは炭素原子数がＣ６０またはＣ７０である、請求項６３に記載の医療用デバイス。
【請求項６５】
前記小分子は、天然に生じるペプチド、合成ペプチド、糖ペプチド、リポペプチド、脂質、糖類、有機分子、無機分子、および核酸からなる群より選択される、請求項５９に記載の医療用デバイス。
【請求項６６】
前記小分子は、前記マトリクスの表面に共有結合または非共有結合されるか、あるいは該医療用デバイスをコーティングする前記マトリクスの最外層に、リンカー分子により共有結合でつなぎ止められる、請求項５９に記載の医療用デバイス。
【請求項６７】
前記小分子はヒト前駆内皮細胞に特異的である、請求項７０に記載の医療用デバイス。
【請求項６８】
前記小分子は、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤｗ９０、ＣＤ１１７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、Ｍｕｃ−１８（ＣＤ１４６）、ＣＤ１３０、幹細胞抗原（Ｓｃａ−１）、幹細胞因子１（ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔリガンド）、Ｔｉｅ−２、およびＨＡＤ−ＤＲからなる群より選択される前駆内皮細胞表面抗原に対するリガンドである、請求項５９に記載の医療用デバイス。
【請求項６９】
前記医療用デバイスが血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、塩基性繊維芽細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β１、酸性繊維芽細胞増殖因子、オステオネクチン、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、インシュリン様増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子ＡＢ、内皮ＰＡＳタンパク質１、トロンボスポンジン、プロリフェリン、エフリンＡ１、Ｅセレクチン、レプチン、ヘパリン、インターロイキン８、チロキシン、およびスフィンゴシン１ホスフェートからなる群より選択される増殖因子をさらに含む、請求項５９に記載の医療用デバイス。
【請求項７０】
請求項５９または６９に記載の医療用デバイスを、そのような治療を必要としている哺乳類の血管または管状器官中に移植することを含む、哺乳類での内膜過形成の治療法。
【請求項７１】
請求項５９または６９に記載の医療用デバイスを、そのような治療を必要としている該哺乳類の血管または管状器官中に移植することを含む、哺乳類での内膜過形成の阻害法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、体内の血管または中空組織に移植される医療用デバイスの分野に関する。詳細には、本発明は、コーティングされたステント、ステント移植片、合成血管移植片、心臓弁、カテーテル、および血管プロテーゼフィルターのような医療用デバイスの、人工的な管腔内血液接触表面に関する。移植された医療用デバイスのコーティングは、移植されたデバイスの表面上で前駆内皮細胞が接着し、増殖し、そして分化して機能的内皮を形成するのを促進し、それにより移植部位での血管または組織の内膜過形成を阻害する。
【０００２】
本出願は、２００２年２月６日に提出した米国仮出願第６０／３５４，６８０号の優先権を主張する。
【０００３】
［発明の背景］
粥状動脈硬化は、世界中での死亡および障害の主な原因の１つである。粥状動脈硬化は、動脈の管腔表面上の脂肪プラークの沈着を伴う。この脂肪プラークの沈着は、動脈の断面積の狭窄（narrowing）を引き起こす。最終的には、この沈着は、その病変から遠位への血流を遮断し、その動脈により供給されている組織の虚血性損傷を引き起こす。
【０００４】
冠動脈は、心臓に血液を供給する。冠動脈粥状動脈硬化疾患（ＣＡＤ）は、米国において最も一般的で深刻な慢性の生命に関わる病気であり、１１００万人を超える人々が冒されている。冠動脈粥状動脈硬化の社会的および経済的負担は、たいていの他の疾患の負担をはるかにしのぐ。冠動脈管腔の狭窄は、心筋の破壊を引き起こし、まずアンギナを生じ、その後心筋梗塞、最終的には死をもたらす結果となる。米国では、毎年１５０万人以上の心筋梗塞が見られる。そのような患者のうち６０万人（すなわち４０％）が、急性心筋梗塞を患い、そのような患者のうち３０万人を超える人々が、病院にたどり着く前に死亡している（「ハリソン内科学（Harrison's Principles of Internal Medicine）」、14th Edition, 1998）。
【０００５】
ＣＡＤは、経皮経管冠動脈バルーン血管形成術（ＰＴＣＡ）を用いて治療することができる。米国では、毎年４００，０００件を超えるＰＴＣＡ処置が実施される。ＰＴＣＡでは、バルーンカテーテルを、末梢動脈に挿入し、動脈系を通して、遮断された冠動脈へと通す。次いで、バルーンを膨張させ、動脈を引き伸ばし、閉塞している脂肪プラークを平らにし、それにより罹患した動脈を通る血液の断面流量を増加させる。しかしながら、この療法は通常、罹患した冠動脈を永久的に開口させる結果とならない。ＰＴＣＡにより治療される患者の５０％もが、冠動脈の再度の狭窄を治すために、６ヶ月以内に反復処置が必要となる。医学上、ＰＴＣＡによる治療後の動脈のこの再度の狭窄は、再狭窄と呼ばれる。再狭窄は、急激な血管のリコイル（recoil）および収縮を伴う。続いて、血管のリコイルおよび収縮の後、ＰＴＣＡによる動脈の損傷に応じて、中間平滑筋細胞が増殖する。一部、平滑筋細胞の増殖は、トロンボキサンＡ２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、損傷した領域由来の様々な炎症性因子の放出によって媒介される。様々な薬物またはステントでの動脈開口の機械的保持を用いた患者の治療を含む、いくつかの異なる技法を用いて、再狭窄という問題を克服している。（「ハリソン内科学」、14th Edition, 1998）。
【０００６】
再狭窄を克服するのに用いられる様々な手法のうち、ステントは、最も効果的であることが証明されている。ステントは、正常な血管腔を作成するための、罹病血管区に位置付けられる金属スカフォールド（scaffolds）である。罹患動脈区におけるステントの配置は、動脈のリコイルとそれに続く閉鎖とを防止する。ステントはまた、動脈の中間層に沿った動脈の局所解離を防止することもできる。ＰＴＣＡ単独を用いて作成された管腔よりも大きな管腔を保持することにより、ステントは、３０％も再狭窄を減少させる。それらの成功にも関わらず、ステントによって、完全に再狭窄がなくなってはいない。（Suryapranata et al. 1998. 「急性心筋梗塞を有する選択患者におけるバルーン血管形成術を用いた冠動脈ステント使用の無作為比較（Randomized comparison of coronary stenting with balloon angioplasty in selected patients with acute myocardial infarction）」. Circulation 97: 2502-2502)。
【０００７】
動脈の狭窄は、大動脈腸骨動脈、鼠蹊下部（infrainguinal）動脈、遠位大腿深動脈、遠位膝窩動脈、脛骨動脈、鎖骨下動脈、および腸間膜動脈を含む冠動脈以外の血管で起き得る。末梢動脈粥状動脈硬化疾患（ＰＡＤ）の有病率は、罹患した特定解剖学的部位、ならびに閉塞診断用に用いられる基準に依存する。伝統的に、医師は、ＰＡＤが存在するかどうかを決定するために、間欠性跛行試験を使用している。しかしながら、この測定は、集団における疾患の実際の発生を非常に過少評価する可能性がある。ＰＡＤの割合は、年齢とともに変化するようであり、高齢者になるほどＰＡＤの発生が増加する。ナショナルホスピタルディスチャージサーベイ（National Hospital Discharge Survey）のデータより、毎年、５５，０００人の男性および４４，０００人の女性が、慢性ＰＡＤであると新規に診断され、６０，０００人の男性および５０，０００人の女性が、急性ＰＡＤであると新規に診断されていると概算される。急性ＰＡＤの場合の９１％が、下肢に関わっていた。ＰＡＤを有する患者における共存ＣＡＤの有病率は、５０％を上回り得る。さらに、ＰＡＤを有する患者の間に、脳血管疾患の有病率の増加が見られる。
【０００８】
ＰＡＤは、経皮経管バルーン血管形成術（ＰＴＡ）を用いて治療することができる。ＰＴＡと併用したステントの使用は、再狭窄の発生を減少させる。しかしながら、ステントのような医療用デバイスを用いて得られる術後の結果は、標準的な手術的血管再生処置、すなわち静脈またはプロテーゼバイパス材料を用いたものを用いて得られる結果に匹敵しない。（「外科学原理（Principles of Surgery）」 Schwartz et al. eds. Chapter 20, Arterial Disease, 7th Edition, Mcgraw-Hill Health Professions Division, New York 1999）。
【０００９】
好ましくは、ＰＡＤは、動脈の遮断面が移植片を用いてバイパスされるバイパス法を用いて治療される。（「外科学原理」 Schwartz et al. eds. Chapter 20, Arterial Disease, 7th Edition, Mcgraw-Hill Health Professions Division, New York 1999）。移植片は、伏在静脈のような自己静脈区、あるいはポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）または発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、または他の重合体材料から作製されるもののような合成移植片から構成され得る。術後の開通率は、バイパス移植片の管腔寸法、移植片に用いる合成材料の型および流出部位を含む多数の異なる要素に依存する。しかしながら、過剰な脈管内膜過形成および血栓症は、バイパス移植片を使用してさえも依然として重要な問題である。例えば、ｅＰＴＦＥバイパス移植片を用いた３年目での鼠蹊下部バイバス法の開通性は、大腿−膝窩バイバスに関しては５４％であり、大腿−脛骨バイパスに関してはわずか１２％である。
【００１０】
したがって、ＣＡＤおよびＰＡＤの罹患率ならびに死亡率をさらに減少させるために、ステント、合成バイパス移植片、ならびに他の慢性的に血液と接触する表面および／またはデバイスの性能を改良する必要性が多いにある。
【００１１】
ステントを用いる場合、そのアプローチは、血栓症および再狭窄を減少させるために、様々な抗血栓剤または抗再狭窄剤でステントをコーティングすることであった。例えば、放射性物質をステントに含浸させることは、筋繊維芽細胞の移動および増殖を抑制することにより再狭窄を抑制するようである。（米国特許第５，０５９，１６６号、第５，１９９，９３９号、および第５，３０２，１６８号）。処理した血管の照射は、患者に関して重篤な縁再狭窄問題を引き起こし得る。さらに、照射は、罹患した血管の均一な治療を可能にしない。
【００１２】
あるいは、ステントはまた、ヘパリン、ホスホリルコリン、ラパマイシン、およびタキソールのような化学薬剤でコーティングされ、それらの全てが、血栓症および／または再狭窄を減少させるようである。ヘパリンおよびホスホリルコリンは、動物モデルにおいて、短期的には再狭窄を著しく減少させるようであるが、これらの薬剤での治療は、再狭窄の防止に対して長期の効果をもたらさないようである。さらに、ヘパリンは、血小板減少症を誘発し、発作のような重篤な血栓塞栓性合併症を引き起こし得る。したがって、この様式での再狭窄の治療を実用的にするのに十分な治療上有効量のヘパリンまたはホスホリルコリンいずれかをステントにロードすることは、実現不可能である。
【００１３】
合成移植片は、術後の再狭窄および血栓症を減少させるために様々な方法で処理されてきた。（Bos et al. 1998. 「小径の血管移植片プロテーゼ：現状（Small-Diameter Vascular Graft Prostheses: Current Status）」Archives Physio. Biochem. 106: 100-115）。例えば、メッシュのポリカーボネートウレタンのようなポリウレタンの複合材料は、ｅＰＴＦＥ移植片と比べて再狭窄を減少させることが報告されている。移植片の表面はまた、高周波グロー放電を用いて修飾され、ポリテレフタレート移植片がフッ素化される。コラーゲンのような生体分子を合成移植片に含浸させることもまた行われてきた。しかしながら、これらのアプローチはいずれも、長期間にわたって血栓症または再狭窄の発生を有意に減少させなかった。
【００１４】
内皮細胞（ＥＣ）層は、正常な血管壁の重要な構成成分であり、血流と血管壁の周囲組織との間の界面を提供する。内皮細胞はまた、血管新生、炎症、および血栓予防を含む生理学的事象にも関与している（Rodgers GM. FASEB J 1988 ; 2: 116-123. ）。脈管構造を構成する内皮細胞に加え、最近の研究ではＥＣおよび内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が出生後に
末梢血中を循環することが明らかになっている（Asahara T, et al. Science 1997 ; 275: 964-7; Yin AH, et al. Blood 1997 ; 90: 5002-5012; Shi Q, et al. Blood 1998 ; 92: 362-367; Gehling UM, et al. Blood 2000 ; 95: 3106-3112; Lin Y, et al. J Clin Invest 2000 ; 105: 71-77）。ＥＰＣは、外傷性および虚血性損傷の部位を含む、損傷した内皮内張（endothelial lining）のある循環系の領域に移動すると思われる（Takahashi T, et al. Nat Med 1999 ; 5: 434-438）。通常の成人において、末梢血中のＥＰＣ濃度は、３〜１０細胞／ｍｍ３である（Takahashi T, et al. Nat Med 1999 ; 5: 434-438; Kalka C, et al. Ann Thorac Surg. 2000 ; 70: 829-834）。損傷に対する血管応答の各期が内皮により影響される（制御されないとしても）ことが、現在明らかである。損傷したステント使用血管区上での機能的内皮層の迅速な再確立（re-establishment）は、循環サイトカインに対する障壁を提供すること、血栓の悪影響を防ぐこと、および下に横たわる平滑筋細胞層を不動態化する物質を産生する内皮細胞の能力により、これらの潜在的に深刻な事態を防ぐ助けとなり得ると思われる。（Van Belle et al. 1997. 「ステントの内皮化（Stent Endothelialization）」. Circulation 95: 438-448; Bos et al. 1998. 「小径の血管移植片プロテーゼ：現状」Archives Physio. Biochem. 106: 100-115)。
【００１５】
内皮細胞は、ステント移植後の、内皮細胞分裂促進因子である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の局所送達により、ステント表面での増殖が助長されている（Van Belle et al. 1997. 「ステントの内皮化」. Circulation 95: 438-448. ）。損傷部位での、生理食塩溶液での組換えタンパク質増殖因子、ＶＥＧＦの塗布は望ましい効果を誘導するものの、ＶＥＧＦは、チャンネルバルーンカテーテルを用いたステント移植後に損傷部位へ送達される。この技法は、１回の用量送達効率が低く、かつ一貫しない結果をもたらすことが実証されているため、望ましくない。それゆえ、この手順は毎回正確に再現することができない。
【００１６】
合成移植片はまた、内皮細胞を播種されてきたが、内皮播種を用いた臨床的結果は、一般に乏しく、すなわち、最も可能性が高い理由として、細胞が移植片に適切に接着しなかったため、および／または細胞がｅｘ−ｖｉｖｏ操作によりそのＥＣ機能を失ったために、術後の開通率が低かった（Lio et al. 1998. 「微小血管移植における新規概念および材料：プロテーゼ移植片内皮細胞接種および遺伝子治療（New concepts and Materials in Microvascular Grafting: Prosthetic Graft Endothelial Cell Seeding and Gene Therapy）」 Microsurgery 18: 263-256)。
【００１７】
それゆえ、ｉｎ  ｓｉｔｕの内皮細胞増殖因子および環境条件は、血管損傷部位での内皮細胞の接着、増殖、および分化を調節するのに重要である。したがって、集密（confluent）ＥＣ単層が標的血管区または移植管腔に形成されることで新たな内膜過形成を阻害するように、移植されたデバイスの表面上での機能的内皮の形成を促進かつ加速する、ステントおよび合成移植片を含む医療用デバイスをコーティングするための新規方法および組成物を開発する必要性がある。この型のコーティングは、再狭窄を阻害するだけでなく、デバイス移植に起因する血栓塞栓性合併症も阻害するだろう。そのような改善を提供する方法および組成物は、従来技術の短所を排除し、かつＣＡＤおよびＰＡＤに関連する罹患率ならびに死亡率に対して顕著な上向きの影響を与える。
【００１８】
［発明の概要］
コーティングされた、ステント、ステント移植片、心臓弁、カテーテル、血管プロテーゼフィルター、人工心臓、外部および内部左心室補助デバイス（ＬＶＡＤ）、ならびに再狭窄、粥状動脈硬化、血栓症、血管閉塞などを含む血管疾患の処置用合成血管移植片のような、医療用デバイスを提供することが、本発明の目的である。１つの実施形態において、本医療用デバイスのコーティングは、生体適合性マトリクス、少なくとも１つの型の抗体または抗体断片あるいは抗体および断片の組合せ、ならびに少なくとも１種の、機能的内皮の形成を誘導して再狭窄を防ぐ上で内膜過形成を阻害し、それにより血管疾患で治療された患者の予後を改善するために、医療用デバイスの表面上に捕獲された前駆内皮細胞の接着、増殖、および分化を調節するための増殖因子のような化合物を含む。
【００１９】
１つの実施形態において、生体適合性マトリクスは、治療上有効量の、少なくとも１つの型の抗体、抗体断片、または抗体および抗体断片の組合せを付着させるための外面を備える。本抗体または抗体断片は、細胞がマトリクス表面に固定化されるように、細胞膜または前駆内皮細胞表面上の抗原を認識して結合する。さらに、コーティングは、医療用デバイス表面上の成熟した機能的内皮の形成を加速するように固定化された前駆内皮細胞を刺激するための治療上有効量の少なくとも１種の化合物を含む。
【００２０】
本発明の医療用デバイスは、器官または管腔を含む身体部分中に移植するために用いられる任意のデバイスであってもよく、そしてステント、ステント移植片、合成血管移植片、心臓弁、カテーテル、血管プロテーゼフィルター、ペースメーカー、ペースメーカーリード線、除細動器、卵円孔開存（ＰＦＯ）中隔閉鎖デバイス、血管クリップ、血管動脈瘤オクルーダー、血液透析移植片、血液透析カテーテル、房室シャント、大動脈瘤移植片デバイスまたは構成要素、静脈弁、縫合糸、血管吻合クリップ、静脈もしくは動脈留置カテーテル、血管外筒および薬物送達ポートであり得るが、それらに限定されない。医療用デバイスは、デバイスに応じて多数の材料で作られ得る。例えば、本発明のステントは、ステンレス鋼、ニチノール（ＮｉＴｉ）、またはクロム合金で作られ得る。合成血管移植片は、架橋ＰＶＡヒドロゲル、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、多孔性高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリウレタン、およびポリエチレンテレフタレートで作られ得る。
【００２１】
本デバイスのコーティングを形成する生体適合性マトリクスは、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン−尿素／ヘパリン、ポリ−Ｌ−乳酸、セルロースエステル、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニル、デキストラン、およびゼラチンのような合成材料、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなどの基底膜成分、ヘパリン、フィブリン、セルロース、および非晶質炭素のような天然に生じる材料、またはフラーレンを含む。
【００２２】
本発明の実施形態において、医療用デバイスは、フラーレンを含む生体適合性マトリクスを備える。この実施形態において、フラーレンは炭素原子数が約Ｃ２０〜約Ｃ１５０の範囲であってもよく、そしてより詳細にはフラーレンはＣ６０またはＣ７０である。本発明のフラーレンはまた、医療用デバイスの表面上にナノチューブとして配列され得る。
【００２３】
医療用デバイスのコーティングに提供するための抗体は、少なくとも１つの型の抗体または抗体の断片を含む。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であり得る。抗体または抗体の断片は、前駆内皮（成熟した、機能的内皮細胞になる能力を有する内皮細胞、前駆細胞、または幹細胞）細胞表面抗原を認識して結合し、そして医療用デバイス表面上への細胞の接着を調節する。本発明の抗体または抗体断片は、マトリクス表面に共有結合または非共有結合し得るか、または医療用デバイスをコーティングするマトリクスの最外層にリンカー分子により共有結合でつなぎ止められ得る。本発明のこの態様において、例えば、モノクローナル抗体はさらにＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２断片を含み得る。本発明の抗体断片は、抗体として標的抗原を認識して結合する特徴を保持する巨大分子および小分子のような任意の断片の大きさを含む。
【００２４】
本発明の抗体または抗体断片は、処置される哺乳類に対する特異性を有する抗原を認識して結合し、そしてそれらの特異性は細胞系譜に依存しない。１つの実施形態において、抗体または断片は、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤｗ９０、ＣＤ１１７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、Ｍｕｃ−１８（ＣＤ１４６）、ＣＤ１３０、幹細胞抗原（Ｓｃａ−１）、幹細胞因子１（ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔリガンド）、Ｔｉｅ−２、およびＨＡＤ−ＤＲのようなヒト前駆内皮細胞表面抗原に特異的である。
【００２５】
別の実施形態において、医療用デバイスのコーティングは、上記に記載されるような生体適合性マトリクスの層を少なくとも１層備え、マトリクスは、治療上有効量の少なくとも１つの型の天然または合成由来の小分子を結合するための外面を備える。小分子は、前駆内皮細胞表面の抗原を認識し相互作用して、デバイスの表面に前駆内皮細胞を固定化して内皮を形成させる。小分子は、脂肪酸、タンパク質、核酸、糖類などのような細胞構成成分のような、さまざまな源に由来していてもよく、そして抗体と同じ結果または効果を伴って、前駆内皮細胞の表面の抗原と相互作用し得る。本発明のこの態様において、医療用デバイスのコーティングは、抗体または抗体断片を含むコーティングに関連して本明細書で記載されるような増殖因子などの化合物をさらに含み得る。
【００２６】
本発明のコーティングの化合物は、前駆細胞から成熟した機能的内皮細胞への成長および分化を刺激するかまたは加速させる任意の化合物を含む。例えば、本発明で使用する化合物として、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β１、酸性繊維芽細胞増殖因子、オステオネクチン、アンジオポエチン１（Ａｎｇ−１）、アンジオポエチン２（Ａｎｇ−２）、インシュリン様増殖因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子ＡＢ、および内皮ＰＡＳタンパク質１のような増殖因子がある。
【００２７】
本発明はまた、本発明のコーティングされた医療用デバイスを用いた、粥状動脈硬化、再狭窄、血栓症、動脈瘤、および血管閉塞のような血管疾患の治療法も提供する。本発明のこの実施形態において、本方法は、血管ホメオスタシスを確立し、それにより過剰な内膜過形成を防ぐための、ステントまたは合成血管移植片、心臓弁、腹部大動脈瘤デバイス、およびそれらの構成要素のような、血管壁への医療用デバイスインサートの保持または密閉に関する限り、従来技術の方法を超える改良点を提供する。粥状動脈硬化を治療する本方法において、動脈は、冠動脈または大腿動脈のような末梢動脈のいずれでもよい。静脈もまた、本発明の技法および医療用デバイスを用いて処置され得る。
【００２８】
本発明はまた、治癒反応を誘導する操作された方法を提供する。１つの実施形態において、移植された血管の標的領域で移植されたデバイスの管腔表面に内皮の集密層形成を迅速に誘導する方法が提供され、ここで内皮細胞は、一酸化窒素合成酵素ならびに他の抗炎症因子および炎症調節因子を発現する。本発明はまた、従来技術のデバイスを超える生体適合性の増加した、そして医療用デバイスの移植部位での内側管腔表面に沿った平滑筋細胞移動、平滑筋細胞分化、およびコラーゲン沈着を減少または阻害することによる、組織に基づく過剰な内膜過形成および再狭窄を減少または阻害する、医療用デバイスを提供する。
【００２９】
本発明の実施形態において、医療用デバイスのコーティング法は、医療用デバイスの表面に少なくとも１層の生体適合性マトリクスを塗布する工程であって、生体適合性マトリクスは、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン−尿素／ヘパリン、ポリ−Ｌ−乳酸、セルロースエステル、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニル、デキストラン、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン、フィブリン、セルロース、ならびに炭素およびフラーレンからなる群より選択される構成成分を少なくとも１種含む、少なくとも１層の生体適合性マトリクスの層を塗布する工程、および
【００３０】
治療上有効量の少なくとも１つの型の抗体、抗体断片、またはそれらの組合せ、ならびに内皮細胞の増殖および分化を刺激する少なくとも１種の化合物を、同時にまたは順次、生体適合性マトリクスに塗布する工程、を含む。
【００３１】
本発明はさらに、哺乳類で血管疾患を治療する方法を提供し、これは哺乳類の血管または管状器官中に医療用デバイスを移植することを含み、ここで医療用デバイスは（ａ）生体適合性マトリクス、（ｂ）治療上有効量の少なくとも１つの型の抗体、抗体断片、またはそれらの組合せ、および（ｃ）少なくとも１種の化合物でコーティングされており、ここで抗体または抗体断片は、前駆内皮細胞がマトリクス表面に固定化されるように、前駆内皮細胞表面上の抗原を認識して結合し、そして化合物は医療用デバイスの表面に内皮を形成するように固定化された前駆内皮細胞を刺激するためのものである。
【００３２】
本発明はまた、哺乳類での内膜過形成の阻害法を提供し、これは哺乳類の血管または管状器官中に医療用デバイスを移植することを含み、ここで医療用デバイスは（ａ）少なくとも１層の生体適合性マトリクス、（ｂ）治療上有効量の少なくとも１つの型の抗体、抗体断片、またはそれらの組合せ、および（ｃ）少なくとも１種の化合物でコーティングされており、ここで抗体または抗体断片は、前駆内皮細胞がマトリクス表面に固定化されるように、前駆内皮細胞表面上の抗原を認識して結合し、そして少なくとも１種の化合物は医療用デバイスの表面に内皮を形成するように固定化された前駆内皮細胞を刺激するためのものである。
【００３３】
［詳細な説明］
本発明は、コーティングされた、ステントのような移植可能な医療用デバイス、医療用デバイスをコーティングする方法および組成物、ならびにコーティングされた医療用デバイスで血管疾患を処置する方法を提供する。図１Ａ〜図１Ｃは、本発明の医療用デバイスの表面コートの概略図を示す。医療用デバイスのコートは、デバイス表面での内皮細胞集密層の形成を促進して過剰な内膜過形成を阻害し、それにより再狭窄および血栓症を防ぐための生体適合性マトリクスを含む。１つの実施形態において、マトリクスは、合成または天然に生じる材料を含み、これは内皮細胞、前駆細胞、または幹細胞の医療用デバイスへの接着を促進する、治療上有効量の少なくとも１つの型の抗体、内皮細胞の増殖および分化を刺激する、増殖因子のような少なくとも１種の化合物。デバイス移植の際、デバイス表面に接着する細胞は、医療用デバイスの管腔表面で内皮の成熟した集密機能層になる。医療用デバイス上の内皮細胞集密層の存在は、移植部位での再狭窄および血栓症の発生を減少させる。
【００３４】
本明細書中用いられる場合、「医療用デバイス」は、医学的症状の予防または治療のために、哺乳類に一時的または永久的に導入されるデバイスを示す。これらのデバイスには、皮下、経皮、または外科的に導入されて、臓器、組織、または動脈、静脈、心室もしくは心房のような臓器管腔内に残されるいずれのものも含まれる。医療用デバイスとしては、ステント、ステント移植片、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）または発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）で被覆したもののような被覆ステント、または合成血管移植片、人工心臓弁、人工心臓および血管循環へプロテーゼ器官を接続するための取付具（fixtures）、静脈弁、腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）移植片、下大静脈フィルタ、永久薬剤注入カテーテル、塞栓コイル、血管塞栓形成に用いられる塞栓材料（例えば、架橋ＰＶＡヒドロゲル）、血管縫合糸、血管吻合取付具、心筋内血管再生（transmyocardial revascularization）ステント、および／または他の導管を挙げることができる。
【００３５】
本発明の組成物および方法を用いた医療用デバイスのコーティングは、医療用デバイスの表面上の集密内皮細胞層の発達を刺激して、それにより再狭窄を予防し、かつ医療用デバイスの移植に起因する局所的慢性炎症応答および他の血栓塞栓性合併症を調節する。
【００３６】
医療用デバイスをコーティングするマトリクスは、ポリマー性ゲル発泡体のような合成材料、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−乳酸、セルロースエステル、またはポリエチレングリコールでできたヒドロゲルで構成されてもよい。１つの実施形態において、デキストラン化合物のような非常に親水性の化合物が、マトリクスを作るための合成材料を構成し得る。別の実施形態において、マトリクスは、コラーゲン、フィブリン、エラスチン、または非晶質炭素のような天然に生じる材料で構成される。マトリクスは、合成材料または天然に生じる材料から構成される第１の層および抗体から構成される第２の層を有する複数の層を含んでもよい。層は、第１の層がステントまたは合成移植片表面に直接接触し、第２の層の一方の表面が第１の層に接触し、反対の表面が血管腔と接触して、順次整列されてもよい。
【００３７】
マトリクスはさらに、内皮細胞の増殖および分化を促進する、少なくとも１種の増殖因子、サイトカインなどを含む。例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）およびアイソフォーム、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板誘導増殖因子（ＰＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ．ｂ１）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、オステオネクチン、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、インシュリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）、血小板由来増殖因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ−ＡＢ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）など、またはそれらの機能性断片が、本発明で使用され得る。
【００３８】
別の実施形態において、マトリクスは、フラーレンを含んでもよく、ここでフラーレンは、炭素数が約Ｃ２０〜約Ｃ１５０の範囲である。フラーレンはまた、分子またはタンパク質を組込んだナノチューブとして配列されてもよい。フラーレンマトリクスはまた、ステンレス鋼、ＰＴＦＥ、またはｅＰＴＦＥ医療用デバイスの表面に塗布されてもよく、次いでこの層が機能化されて、その表面を抗体および増殖因子でコーティングされる。あるいは、ＰＴＦＥまたはｅＰＴＦＥが、例えばステンレス鋼医療用デバイス上に第１の層を成し、続いてフラーレンが第２の層を成し、次いで抗体および増殖因子が添加され得る。
【００３９】
マトリクスは、医療用デバイスに非共有結合されても共有結合されてもよい。抗体および増殖因子は、異種または同種二官能性架橋試薬を用いてマトリクスに共有結合され得る。増殖因子は、抗体を用いた標準技法を用いて、または抗体結合後に、マトリクスに添加され得る。
【００４０】
本明細書中使用される場合、「抗体」という用語は、１つの型のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、あるいはその組合せを示し、ここでモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体は、１つの抗原またはその抗原の機能的等価物に結合する。抗体断片という用語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２のような、抗体の任意の断片を包含し、任意の大きさ、すなわち抗体と同じ結果または効果を有する巨大分子または小分子のものであり得る。（抗体は、抗体１モル当たり６．０２２×１０２３個の分子に等しい複数の別個の抗体を含む。）
【００４１】
本発明の態様において、本発明のステントまたは合成移植片は、循環前駆内皮細胞の医療用デバイスへの接着を調節する抗体を含む生体適合性マトリクスでコーティングされる。本発明の抗体は、循環する血液中の前駆内皮細胞表面抗原を認識して結合するので、細胞がデバイス表面に固定化される。１つの実施形態において、抗体は、血管内皮増殖因子受容体−１、−２および−３（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、およびＶＥＧＦＲ−３、ならびにＶＥＧＦＲ受容体ファミリーアイソフォーム）、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ２、ＣＤ３４、Ｔｈｙ−１、Ｔｈｙ−２、Ｍｕｃ−１８（ＣＤ１４６）、ＣＤ３０、幹細胞抗原−１（Ｓｃａ−１）、幹細胞因子（ＳＣＦまたはｃ−Ｋｉｔリガンド）、ＣＤ１３３抗原、ＶＥ−カドヘリン、Ｐ１Ｈ１２、ＴＥＫ、ＣＤ３１、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、あるいは前駆内皮細胞表面で発現する抗原のような、前駆内皮細胞表面抗原、または前駆もしくは幹細胞表面抗原と反応性の（認識して結合する）モノクローナル抗体を含む。１つの実施形態において、１つの抗原と反応する１つの型の抗体が使用され得る。あるいは、異なる前駆内皮細胞表面抗原に対する複数の異なる抗体が一緒に混合されてマトリクスに添加され得る。別の実施形態において、モノクローナル抗体のカクテルが用いられて標的とする特異的細胞表面抗原による上皮形成の速度が増加する。本発明のこの態様において、例えば、抗ＣＤ３４および抗ＣＤ１３３が併用されて、ステント上のマトリクス表面に結合される。
【００４２】
本明細書中使用される場合、「治療上有効量の抗体」は、内皮細胞、前駆細胞、または幹細胞の医療用デバイスへの接着を促進する抗体の量を意味する。本発明を実施するのに必要な抗体の量は、使用する抗体の性質により様々である。例えば、使用する抗体の量は、抗体とそれが反応する抗原との間の結合定数に依存する。特定の抗原を用いるための治療上有効量の抗体の決定方法は、当業者に既知である。
【００４３】
本明細書中使用される場合、「化合物」という用語は、前駆内皮細胞から、一酸化窒素合成酵素のような分子を発現する成熟した機能的内皮細胞への増殖および分化を刺激する、アンジオポエチンファミリーおよびＶＥＧＦファミリーに属するもののような増殖因子、ならびにＡおよびＣのようなビタミンなどの任意の物質を示す。
【００４４】
本明細書中使用される場合、「増殖因子」という用語は、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、またはそれらの断片もしくは修飾物、あるいは成熟した機能的内皮細胞へ増殖して分化するように内皮細胞、幹細胞、または前駆細胞を刺激する合成分子を示す。成熟した内皮細胞は、一酸化窒素合成酵素を発現し、それにより一酸化窒素を組織中に放出する。以下の表１は、医療用デバイスをコーティングするのに用いられ得る増殖因子のいくつかを示す。
【００４５】
【表１】
2005523050.tif 000003
【００４６】
本明細書中使用される場合、「ＶＥＧＦ」という用語は、アイソフォームがその数字またはアルファベットでの略称で具体的に特定されないかぎり、上記の表１に示される血管内皮増殖因子の任意のアイソフォームを意味する。
【００４７】
本明細書中使用される場合、「治療上有効量の増殖因子」という用語は、内皮細胞、前駆細胞、または幹細胞が増殖および分化するのを刺激または誘導し、それにより医療用デバイスの管腔表面に成熟した機能的内皮細胞の集密層を形成する、増殖因子の量を意味する。本発明を実施するのに必要な増殖因子の量は、使用する増殖因子の性質、および増殖因子とその受容体との間の結合速度論により様々である。例えば、１００μｇのＶＥＧＦは、医療用デバイス上の内皮細胞接着を刺激して上皮集密層を形成することが示されている。内皮細胞の細胞増殖および分化を刺激するのに用いるための治療上有効な量の増殖因子の決定方法は、当業者に既知である。
【００４８】
本明細書中用いられる場合、「内膜過形成」は、血管壁での平滑筋細胞増殖およびマトリクス沈着の望ましくない増加である。本明細書中用いられる場合、「再狭窄」は、血管腔狭窄の再発を示す。血管は、再狭窄が理由で閉塞されるようになり得る。ＰＴＣＡまたはＰＴＡ後、通常は内膜に存在しない培養液および外膜由来の平滑筋は、増殖して、内膜へ移動し、タンパク質を分泌し、内膜内に平滑筋およびマトリックスタンパク質の蓄積を形成する。この蓄積が、動脈管腔の狭窄を引き起こし、狭窄部から遠位への血流を減少させる。本明細書中使用される場合、「再狭窄の阻害」は、再狭窄およびそれから生じる合併症を防止するように、タンパク質分泌の防止により達成される、平滑筋の移動および増殖の抑制を指す。
【００４９】
本発明の医療用デバイス、方法、および組成物を用いて治療され得る被検体は、哺乳動物、より具体的には、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、げっ歯類またはサルであり得る。
【００５０】
本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施されてもよい。
【００５１】
「前駆内皮細胞」という用語は、骨髄、血液または局所組織由来の、前駆細胞または幹細胞から成熟した機能的上皮細胞への任意の発達段階における内皮細胞を示し、そしてこれらは非悪性である。
【００５２】
コーティングされた医療用デバイスのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究または使用のため、完全に分化した内皮細胞は動脈またはヒト臍静脈のような静脈から単離され得るが、一方前駆内皮細胞は末梢血または骨髄から単離される。内皮細胞は、内皮細胞を、抗体、増殖因子、または内皮細胞に接着する他の薬剤を組込んだマトリクスでコーティングされた医療用デバイスとともにインキュベーションすることにより、医療用デバイスに結合される。別の実施形態において、内皮細胞は、形質転換した内皮細胞であり得る。形質移入した内皮細胞は、血栓形成、再狭窄、または任意の他の治療終了を阻害する増殖因子またはタンパク質を発現するベクターを含む。
【００５３】
本発明の血管疾患の治療法は、任意の動脈または静脈において実施され得る。冠動脈、鼠蹊下部動脈、大動脈腸骨動脈、鎖骨下動脈、腸間膜動脈および腎動脈を含む任意の動脈の粥状動脈硬化が、本発明の範囲内に包含される。解離性（dissecting）動脈瘤に起因するもののような他の型の血管閉塞もまた、本発明に包含される。
【００５４】
血管疾患を有する哺乳類の治療法は、例えば、血管形成手術の間のコーティングされたステントの場合、患者の器官または血管中にコーティングされた医療用デバイスを移植することを含む。一旦ｉｎ  ｓｉｔｕで、前駆内皮細胞は、コーティングに存在する抗体により、前駆細胞表面の抗原が認識されて結合することにより、コーティングされたステント表面に捕獲される。一旦前駆細胞がマトリクスに接着すると、コーティング上の増殖因子は、新たに結合した前駆内皮細胞が増殖し分化してステントの管腔表面に集密的で成熟した機能的内皮を形成することを促進する。あるいは、医療用デバイスは、医療用デバイスの移植前に、患者の血液、骨髄、または血管から単離された前駆細胞、幹細胞、または成熟内皮細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮細胞でコーティングされる。いずれの場合にしろ、医療用デバイスの管腔表面上の内皮細胞の存在が、過剰な内膜過形成および血栓症を阻害または防止する。
【００５５】
内皮細胞
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Jaffe, et AL., J. Clin. Invest., 52: 2745-2757,1973（本明細書中参照により援用される）の方法に従って、臍帯から得られるものであり、本実験ではこれが用いられた。簡単には、コラーゲン分解酵素での処理により血管壁から細胞を剥がし、そしてゼラチンコート組織培養フラスコにて、１０％の低エンドトキシンウシ胎児血清、９０μｇ／ｍｌの防腐剤非含有ブタヘパリン、２０μｇ／ｍｌの内皮細胞増殖添加物（ＥＣＧＳ）、およびグルタミンを含有するＭ１９９培地中で培養する。
【００５６】
前駆内皮細胞（ＥＰＣ）は、Asahara et al.の方法に従ってヒト末梢血から単離される（「血管新生のための推定前駆内皮細胞の単離（Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis）」. Science 275: 964-967,1997, 本明細書中参照により援用される）。ＣＤ３４に対する抗体でコーティングした磁気ビーズを、分画したヒト末梢血とともにインキュベートする。インキュベーション後、結合した細胞を溶出させ、これはＥＢＭ２培養液中培養することができる。(Clonetics, San Diego, CA)。あるいは、これらの細胞を単離するために濃縮培地単離物を用いることができる。簡単には、健康な男性志願者から末梢静脈血を採取し、そして密度勾配遠心分離により単核球フラクションを単離して、５％ウシ胎児血清、ヒトＶＥＧＦＡ、ヒト繊維芽細胞増殖因子２、ヒト上皮増殖因子、インシュリン様増殖因子１、およびアスコルビン酸を補充したＥＣ基礎培地２（ＥＢＭ２）（Clonetics）中、フィブロネクチンコーティングした培養スライド（Becton Dickinson）に細胞を蒔く。４８時間毎に培養液を交換しながら、７日間ＥＰＣを増殖させる。細胞を、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＶＥＧＦＲ２、Ｔｉｅ２、およびＥセレクチンに対する蛍光抗体で特性決定する。
【００５７】
従来の方法を用いて、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、または酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）のようなタンパク質をコードする任意のクローン化遺伝子を含有する任意の発現ベクターで、哺乳動物細胞を形質移入する。（例えば、Stratagene, San Diego, CAから市販されている哺乳類発現ベクターおよび形質移入キットを参照）。例えば、精製ブタ前駆内皮細胞は、Rosengart et al.の方法に従って、ＶＥＧＦ  ｃＤＮＡを発現するアデノウイルス発現ベクターを用いて、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）で形質導入される。（「ＶＥＧＦ１２１  ｃＤＮＡを発現するアデノウイルスベクターの直接心筋内投与を用いた冠動脈疾患を治療するための血管新生遺伝子治療の第Ｉ相治験の６ヶ月目の評価（Six-month assessment of a phase I trial of angiogenic gene therapy for the treatment of coronary artery disease using direct intramyocardial administration of an adenovirus vector expressing the VEGF121 cDNA）」. Ann. Surg. 230 (4): 466-470 (1999), 本明細書中参照により援用される）。
【００５８】
抗体
発明の方法に有用なモノクローナル抗体は、Kohler and Milsteinの標準的技法（「所定の特異性の抗体を分泌する融合細胞の連続培養（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）」. Nature 265 : 495-497,1975, 本明細書中参照により援用される）に従って産生され得るか、または市販源から入手できる。内皮細胞は、内皮細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を産生するための免疫原として使用され得る。
【００５９】
内皮細胞に対するモノクローナル抗体は、ＨＵＶＥＣまたは精製前駆内皮細胞をマウスまたはラットに注射することにより調製される。十分な時間の後、マウスを屠殺して、脾臓細胞を得る。一般的に、例えばポリエチレングリコールのような非イオン性洗浄剤の存在下、脾臓細胞を、骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞と融合させることにより、脾臓細胞を不死化する。融合ハイブリドーマを含む得られた細胞を、ＨＡＴ培地のような選択培地で増殖させ、そして生存細胞を、限界希釈条件を用いてそのような培地で増殖させる。細胞を、適した容器（例えばマイクロタイターウェル）中で増殖させ、そして上清を、所望の特異性、すなわち内皮細胞抗原との反応性を有するモノクローナル抗体についてスクリーニングする。
【００６０】
モノクローナル抗体の収率を向上させるための、細胞を受け入れる哺乳動物宿主の腹膜腔へのハイブリドーマ細胞の注射およびそれに続く腹水液の回収のような様々な技法が存在する。腹水液に集まるモノクローナル抗体の量が不十分な場合、抗体は、宿主の血液から回収される。モノクローナル抗体が他のタンパク質および他の混入物を含まないようにするための、モノクローナル抗体を単離および精製する様々な従来法が存在する。
【００６１】
同じく本発明の範囲内に含まれるものとして、これらのモノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２のような、抗内皮細胞モノクローナル抗体の有用な結合断片がある。抗体断片は従来技法により得られる。例えば、有用な結合断片は、パパインまたはペプシンを用いた抗体のペプチダーゼ消化により調製されてもよい。
【００６２】
本発明の抗体は、マウス源由来のＩｇＧクラスの抗体に関するが、これは、限定を意味しない。上記抗体および上記抗体と機能的等価性を有する抗体（マウス源からか、ヒトを含む哺乳動物源からか、他の供給源からか、またそれらの組合せからかを問わない）ならびにＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等のような他のクラス（そのようなクラスのアイソタイプを含む）は、本発明の範囲内に包含される。抗体の場合、「機能的等価性」という用語は、２つの異なる抗体各々が抗原上の同じ抗原部位に結合すること、換言すると、抗体が同じ抗原に結合するのを競うことを意味する。抗原は、同じまたは異なる分子上にあってもよい。
【００６３】
１つの実施形態において、内皮細胞表面抗原ＣＤ３４と反応するモノクローナル抗体が用いられる。固体支持体に結合された抗ＣＤ３４モノクローナル抗体は、ヒト末梢血由来の前駆内皮細胞を捕獲することが示されている。捕獲後、これらの前駆細胞は、内皮細胞に分化することが可能である。（Asahara et al. 1997.「血管新生のための推定前駆内皮細胞の単離」 Science 275: 964-967.）ＣＤ３４に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、American Type Tissue Collection (Rockville, MD)から入手可能である。別の実施形態において、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２、ＣＤ１３３、またはＴｉｅ２のような内皮細胞表面抗原と反応性を有するモノクローナル抗体が使用される。
【００６４】
医療用デバイスインプラントを受け入れる種と同じ種から単離した内皮細胞に対して反応性を有するポリクローナル抗体もまた使用され得る。
【００６５】
ステント
本明細書中、「ステント」という用語は、血管の管腔に挿入または移植されると、血管の断面管腔を拡張する任意の医療用デバイスを意味する。「ステント」という用語には、本発明の方法によりコーティングされている市販のステンレス鋼ステント、ＰＴＦＥまたはｅＰＴＦＥで被覆したもののような被覆ステントが含まれる。１つの実施形態において、これは、冠状動脈閉塞を治療するのに、または脾血管、頚動脈血管、腸骨血管および膝窩血管の切開もしくは動脈瘤を封鎖するために、経皮的に送達されるステントを包含する。別の実施形態では、ステントは静脈に送達される。ステントは、ポリマーまたは金属構造要素で構成することができ、その上に抗体および増殖因子のような化合物を含むマトリクスが塗布されるか、またはステントはポリマーと混合されたマトリクスの複合材料であり得る。例えば、米国特許第４，８８６，０６２号（Wiktor, 本明細書中参照により援用される）に開示されるもののような、変形可能な金属ワイヤステントが使用され得る。国際特許出願公開番号第ＷＯ９１／１２７７９号「管腔内薬物溶出プロテーゼ（Intraluminal Drug Eluting Prosthesis）」（本明細書中参照により援用される）に開示されるもののような、弾性ポリマー性材料の自己拡張ステントもまた使用され得る。ステントはまた、ステンレス鋼、ポリマー、ニッケルチタン、タンタル、金、白金イリジウムまたはエルジロイ（Elgiloy）、およびＭＰ３５Ｎ、ならびに他の鉄材料を用いて製造されてもよい。ステントは、カテーテルにより体管腔を通して治療部位に送達され、そこでステントがカテーテルから放出され、ステントが拡張して血管の管腔壁と直接接触するようになる。別の実施形態において、ステントは、生分解性ステントを含む（H. Tamai, pp 297 in Handbook of Coronary Stents 3RD Edition, Eds. PW Serruys and MJB Kutryk, Martin Dunitz (2000)）。他の自己拡張ステント設計（例えば、弾性金属ステント設計）が、本発明の抗体、増殖因子、およびマトリクスとともに使用され得ることは、当業者に明らかであろう。
【００６６】
合成移植片
「合成移植片」という用語は、生体適合特性を有する任意の人工プロテーゼを意味する。１つの実施形態において、合成移植片は、ポリエチレンテレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）、ＰＥＴ）またはポリテトラフルオロエチレン（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、ｅＰＴＦＥ）で作られ得る。別の実施形態において、合成移植片は、ポリウレタン、架橋ＰＶＡヒドロゲル、および／またはヒドロゲルの生体適合性発泡体で構成される。さらに第３の実施形態において、合成移植片は、メッシュのポリカーボネートウレタンの内層およびメッシュのポリエチレンテレフタレートの外層で構成される。任意の生体適合性合成移植片が、本発明の抗体、増殖因子、およびマトリクスとともにとともに使用され得ることは、当業者に明らかであろう。（Bos et al. 1998. 「小径の血管プロテーゼ：現状（Small-Diameter Vascular Prostheses: Current Status）」Archives Physio. Biochem. 106: 100-115、本明細書中参照により援用される）。合成移植片は、血管の端端、端側、側端、側側、または管腔内および吻合に、あるいは罹病血管区のバイパスに、例えば、腹部大動脈瘤デバイスとして使用され得る。
【００６７】
マトリクス
（Ａ）合成材料ステントまたは合成移植片をコーティングするのに使用されるマトリクスは、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン尿素／ヘパリン、ポリＬ乳酸、セルロースエステル、ポリエチレングリコール、架橋ＰＶＡヒドロゲル、ヒドロゲルの生体適合性発泡体、またはカルボキシメチルデキストランのような親水性デキストランなどの合成材料から選択されてもよい。
【００６８】
（Ｂ）天然に生じる材料マトリクスは、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、ラミニン、ヘパリン、フィブリン、セルロース、または炭素のような天然に生じる物質から選択されてもよい。マトリクスの第１の要件は、ステントまたは合成移植片の露出表面上で破壊されない状態を保つのに、十分弾性および柔軟性を有するということである。
【００６９】
（Ｃ）フラーレンマトリクスはまた、フラーレンを含んでもよい（「フラーレン」という用語は、複数のフラーレン分子を包含する）。フラーレンは、炭素カゴ分子である。フラーレン種における炭素（Ｃ）分子数は、約Ｃ２０〜約Ｃ１５０まで様々である。フラーレンは、当業者に既知のプロセスにより、例えば、炭素のレーザー蒸発、電気アークでの炭素加熱、またはすす処理用火炎（sooting flames）での炭化水素の燃焼により、炭素元素、または炭素含有種の高温反応によって生成される（米国特許第５，２９２，８１３号（Patel et al．）、本明細書中参照により援用される、および米国特許第５，５５８，９０３号（Bhushan et al）、本明細書中参照により援用される）。いずれの場合も、炭素質の沈積物またはすすが生成される。このすすから、トルエンのような適切な溶媒を用いた抽出により、様々なフラーレンが得られる。フラーレンは、既知の方法により、特に高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分離される。フラーレンは、合成されてもよく、あるいはDynamic Enterprises, Ltd.（Berkshire,England）、またはSouthern Chemical Group, LLC（Tucker,Georgia）、またはBucky USA（ Houston Texas）から購入してもよい。
【００７０】
フラーレンは、米国特許第５，５５８，９０３号に開示されるように、昇華、レーザー蒸発、スパッタリング、イオンビーム、スプレーコーティング、ディップコーティング、ロールオンもしくはブラシコーティングを含む様々な異なる方法で、またはステント表面の誘導体化により、表面に蒸着され得る。
【００７１】
フラーレンの重要な特徴は、それらの「活性炭」を形成する能力である。フラーレンの電子構造は、多数の結合電子が分子表面の周囲に協同的に存在するように、π軌道を重ね合わせた系である。(Chemical and Engineering News, Apr. 8, 1991, page 59、本明細書中参照により援用される）。活性炭の形態として、フラーレンは、弱い相互作用のための相当のファンデルワールス力を示す。フラーレン表面の吸着性は、特異的細胞膜相互作用を導く目的のためにそれ自身にさらなる修飾を加えてもよい。例えば、特定の細胞型の細胞膜に、または細胞膜の特定の構成成分（例えば、レクチンまたは抗体）に選択的に結合する化学的性質を有する特異的な分子は、フラーレン表面に吸着され得る。異なる分子のフラーレン表面への結合は、様々な細胞型（例えば、前駆内皮細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、一次外植片またはＴ細胞部分集団）に選択的に結合する表面を作成するように操作されてもよい。米国特許第５，３１０，６６９号（Richmond et al）、本明細書中参照により援用される; Stephen R. Wilson,「フラーレンの生物学的側面（Biological Aspects of Fullerenes）」、Fullerenes : Chemistry, Phvsics and Technology, Kadish et al. eds., John Wiley & Sons, NY 2000、本明細書中参照により援用される。
【００７２】
フラーレンはまた、他の原子または分子を組込んだナノチューブを形成してもよい。(Liu et al. Science 280: 1253-1256 (1998)、本明細書中参照により援用される）。カーボンナノチューブの合成および調製は、当該技術分野で既知である。（米国特許第５，７５３，０８８号（Olk et al.）、および米国特許第５，６４１，４６６号（ Ebbsen et al.)、両方とも本明細書中参照により援用される）。タンパク質のような分子もまた、カーボンナノチューブ内部に組込まれ得る。例えば、ナノチューブは、ナノチューブの端を切断した後に、酸素、例えば、Ｚｎ２Ｃｄ２−メタロチオネイン、チトクロームＣおよびＣ３、ならびにβ−ラクタマーゼを充填されてもよい。(Davis et al. Inorganica Chim. Acta 272: 261 (1998); Cook et al. Full Sci. Tech. 5 (4): 695 (1997), 両方とも本明細書中参照により援用される）。
【００７３】
三次元フラーレン構造もまた、使用され得る。米国特許第５，３３８，５７１号（Mirkin et al、本明細書中参照により援用される）は、三次元多層フラーレン構造を開示しており、これは（ｉ）フラーレンを化学的に修飾して結合形成種を提供すること、（ｉｉ）基質表面を化学的に処理して、溶液中のフラーレンの結合生成種と共有結合するのに有効な結合形成種を提供すること、および（ｉｉｉ）修飾フラーレンの溶液を処理した基質表面と接触させて、処理した基質表面に共有結合したフラーレン層を形成すること、により基質表面に形成される。
【００７４】
（Ｄ）医療用デバイスへのマトリクス塗布
マトリクスは、ステントまたは合成移植片の表面にしっかりと接着すべきである。好ましくは、これは、連続薄層中にマトリクスを塗布することにより達成される。あるいは、抗体および増殖因子が、血管腔と直接接触する外層の表面にのみ塗布される。異なる型のマトリクスが、連続層に連続して塗布されてもよい。抗体は、ステントにマトリクスが塗布された後に、マトリクスに共有結合でまたは非共有結合でコーティングされてもよい。
【００７５】
ステントのような医療用デバイスをコーティングするために、ステントは、中程度の粘性を有するマトリクスの溶液を用いて、ディッピングされるかまたは噴霧される。各層の塗布毎に、次の層の塗布前に、ステントは乾燥される。１つの実施形態において、薄い塗料状マトリクスコーティングは、全厚１００ミクロンを超えない。
【００７６】
１つの実施形態において、ステント表面は最初に機能化され、続いてマトリクス層が塗布される。その後、抗体および増殖因子がマトリクス表面に結合される。本発明のこの態様において、ステント表面の技法が、官能性である化学基を生成する。アミンのような化学基は、次いで、抗体および増殖因子の支持体として機能するマトリクス中間層を固定するために用いられる。
【００７７】
別の実施形態において、適したマトリクスコーティング溶液は、無菌条件下、ポリＤ，Ｌ乳酸（lactid）（Boehringer INC., Ingelheim, GermanyのＲ２０３として入手可能）のような薬物キャリア４８０ミリグラム（ｍｇ）を３ミリリットル（ｍｌ）のクロロホルムに溶解することにより調製される。しかしながら、原則として、塗布後に、医療用デバイス上で比較的速く乾燥して自己接着性ラッカーまたは塗料状コーティングになるのであれば、血液および組織適合性（生体適合性）であり、かつ溶解、分散、または乳化することが可能な任意の生分解性（または非生分解性）マトリクスが、マトリクスとして使用可能である。
【００７８】
例えば、フィブリンでステントをコーティングすることは当業者に既知である。Muller et alに発行された米国特許第４，５４８，７３６号（本明細書中参照により援用される）において、フィブリンは、トロンビンとフィブリノーゲンを接触させることにより凝固される。好ましくは、移植されたデバイスの機械的特性および生体安定性を改善するために、Gerendasに発行された米国特許第３，５２３，８０７号（本明細書中参照により援用される）に記載されるように、または欧州特許出願公開第０３６６５６４号（本明細書中参照により援用される）に記載されるように、本発明のフィブリン含有ステント中のフィブリンは、凝固中に存在する第ＸＩＩＩ因子およびカルシウムを有する。好ましくは、本発明においてフィブリンを作製するのに使用されるフィブリノーゲンおよびトロンビンは、任意の種間免疫応答（例えば、ヒト抗ウシ）を回避するために、ステントが移植される種と同じ動物またはヒト種由来のものである。フィブリン生成物は、フィブリノーゲンおよびトロンビンを組合せたものをフィルムにキャストした後に、浸透圧的に半透膜を通して、フィルムから水分を除去することにより生産される微細フィブリンフィルムの形態であり得る。欧州特許出願第０３６６５６４号では、基質（好ましくは、高い多孔性またはトロンビンもしくはフィブリノーゲンのいずれかに対する高い親和性を有する）を、フィブリノーゲン溶液およびトロンビン溶液と接触させる。その結果として、医療用デバイスの表面上でのフィブリノーゲンの重合によりフィブリン層が形成される。この方法により塗布されるフィブリンの複数層は、任意の所望の厚さのフィブリン層を提供することを可能とする。あるいは、フィブリンが最初に凝固され、次いで粉砕されて粉末になり、これが水と混合され、そして熱金型で所望の形状に型押しされ得る（米国特許第３，５２３，８０７号）。グルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドのような固定剤とフィブリンを接触させることにより、成形されたフィブリンで安定性の増加も達成され得る。フィブリンを製造および形成するための当業者に既知のこれらおよび他の方法が、本発明に使用され得る。
【００７９】
合成移植片がコラーゲンでコーティングされる場合、コラーゲンを調製し、それを合成移植片デバイス上で形成する方法は、米国特許第５，８５１，２３０号（Weadock et al.、本明細書中参照により援用される）に記載されるように既知である。この特許は、合成移植片をコラーゲンでコーティングする方法を記載する。多孔質移植片基質にコラーゲンを接着する方法は、通常は、基質にコラーゲン分散液を塗布し、それを乾燥させて、このプロセスを繰り返すことを含む。コラーゲン分散液は、通常は、酸性ｐＨ（２〜４の範囲のｐＨ）で、分散液中に不溶性コラーゲン（約１〜２重量％）を混合することにより作製される。分散液は、通常は、移植片の管腔に、シリンジを介して注入され、コラーゲンスラリーで内部表面全体を覆うように手でマッサージされる。過剰なコラーゲンスラリーは、移植片の開口端の一方を通じて除去される。コーティング工程および乾燥工程は、十分な処理を提供するために数回繰り返される。
【００８０】
さらに別の実施形態において、ステントまたは合成移植片は、非晶質炭素でコーティングされる。米国特許第５，１９８，２６３号（本明細書中参照により援用される）において、フッ素化ガスまたは他のハロゲン化ガスの存在下、非晶質炭素フィルムの高速低温蒸着を生成する方法が記載されている。この発明の方法による蒸着は、高周波のプラズマ補助化学蒸着プロセスを用いて、室温を含む１００℃未満で実施され得る。この発明の方法を用いて生成される非晶質炭素フィルムは、例えば、ガラス、金属、半導体およびプラスチックを含む、多くの型の基質に十分に接着する。
【００８１】
フラーレン−移植片、アミン含有ポリマーを形成するためのアミン含有ポリマーの反応性アミノ基部位へのフラーレン部分の結合は、米国特許第５，２９２，８１３号に記載されるように実施されてもよい。この様式での化学修飾は、ステントへのフラーレンの直接的組み込みを可能にする。別の実施形態において、フラーレンは、上記に記載されるように、ステントまたは合成移植片の表面上に蒸着されてもよい。（ＷＯ９９／３２１８４号（Leone et al.）を参照、本明細書中参照により援用される）。フラーレン（例えば、Ｃ６０）はまた、ステンレス鋼表面へのエポキシド結合により結合されてもよい（Yamago et al., 「酸化、還元ならびにＣ−ＯおよびＣ−Ｃ結合形成反応による有機フラーレンの化学的誘導体化（Chemical Derivatization of organofullerenes through Oxidation, Reduction and C-O and C-C Bond Forming Reactions）」. J. ORG. Chem., 58 4796-4798 (1998)、本明細書中参照により援用される）。結合は酸素への共有結合を介したものである。カップリング用のこの化合物およびプロトコルは、Bucky USA(BuckyUSA, Houston, Texas)から市販されている。
【００８２】
（Ｅ）マトリクスへの抗体および増殖因子の添加前駆内皮細胞の接着を促進する抗体、および細胞の増殖および分化を促進するための増殖因子は、共有結合または非共有結合のいずれかで、マトリクス内に組込まれる。抗体および増殖因子は、抗体および増殖因子をマトリクスコーティング溶液と混合し、次いでデバイス表面に塗布することによりマトリクス層に組込まれてもよい。通常、抗体および増殖因子は、デバイスの管腔表面に塗布されたマトリクスの最外層の表面に結合されているので、抗体および増殖因子は循環する血液と接触している表面に置かれている。抗体および増殖因子は、標準技法を用いて、表面マトリクスに塗布される。
【００８３】
１つの実施形態において、抗体は、マトリクスを含有する溶液に添加される。例えば、抗Ｄ３４モノクローナル抗体上のＦａｂ断片は、５００〜８００ｍｇ／ｄｌの間の濃度でヒトフィブリノーゲンを含有する溶液とともにインキュベートされる。抗ＣＤ３４Ｆａｂ断片の濃度は様々であり、当業者は過度の実験をすることなく最適濃度を決定することができることが理解されるだろう。ステントがＦａｂ／フィブリン混合物に加えられ、そしてフィブリンは濃縮トロンビン（少なくとも１０００Ｕ／ｍｌの濃度で）の添加により活性化される。マトリックス中に直接組込まれたＦａｂ断片を含有する、得られた重合フィブリン混合物を、ステントまたは合成移植片の表面上に薄膜状（１００μｍ未満）にプレスする。事実上いかなる型の抗体または抗体断片も、この様式で、ステントまたは合成移植片のコーティング前に、マトリクス溶液中に組込まれ得る。
【００８４】
例えば、別の実施形態において、抗体断片および増殖因子を有する、または有さない抗体全体がマトリクスに共有結合でカップリングされる。１つの実施形態において、抗体および増殖因子（単数または複数）は、異種または同種二官能性リンカー分子を用いて、マトリクスに共有結合でつなぎ止められる。本明細書中使用される場合、「つなぎ止める」という用語は、リンカー分子により、抗体がマトリクスに共有結合されることを指す。本発明に関連したリンカー分子の使用は、通常は、マトリクスがステントに接着された後に、マトリクスにリンカー分子を共有結合させることを含む。マトリクスに共有結合した後、リンカー分子は、１つまたは複数の型の抗体を共有結合するのに使用され得るいくつかの活性な官能基をマトリクスに提供する。図１Ａは、架橋分子を介した結合の図を提供する。内皮細胞１．０１は、細胞表面抗原１．０２により、抗体１．０３に結合する。抗体は、架橋分子１．０４によりマトリクス１．０５〜１．０６につなぎ止められる。マトリクス１．０５〜１．０６は、ステント１．０７に接着する。リンカー分子は、直接（すなわち、カルボキシル基を通じて）、または既知のカップリング化学（例えば、エステル化、アミド化、およびアシル化）により、マトリクスに結合されてもよい。リンカー分子は、アミド結合の直接形成によりマトリクスに結合され、抗体との反応に利用可能なアミン官能基を提供するジアミンまたはトリアミン官能性化合物であってもよい。例えば、リンカー分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアリルアミン（ＰＡＬＬＡ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリアミン官能性ポリマーであり得る。様々なＰＥＧ誘導体、例えば、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート（succinimidyl propionate）、またはｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドは、共有結合のためのプロトコルとともに、Shearwater Corporation（Birmingham, Alabama）から市販されている。(Weiner et al., 「固定化抗体による抗原捕獲に対するポリエチレングリコールスペーサーの影響（Influence of a poly-ethyleneglycol spacer on antigen capture by immobilized antibodies）」. J. Biochem. Biophys. Methods 45: 211- 219 (2000)もまた参照、本明細書中参照により援用される）。特定のカップリング剤の選択は、使用する抗体の型に依存し、そのような選択は、過度の実験をすることなくなされ得ることが理解されるだろう。これらのポリマーの混合物もまた使用され得る。これらの分子は、１つまたは複数の抗体を表面固定化するのに使用され得る複数のペンダントアミン官能基を含有する。
【００８５】
抗体は、ステントの表面上に直接蒸着されたＣ６０フラーレン層に結合させてもよい。架橋剤は、フラーレンに共有結合させてもよい。次いで、抗体を架橋剤に結合させ、続いてそれをステントに結合させる。図１Ｂは、Ｃ６０による結合の図を提供する。内皮細胞２．０１は、細胞表面抗原２．０２を介して、抗体２．０３に結合され、これは続いてマトリクス２．０４に、共有結合または非共有結合される。マトリクス２．０４は、Ｃ６０（２．０５）を介して、ステント２．０６に共有結合される。
【００８６】
本発明の小分子は、抗体、増殖因子、またはそれらの断片の代わりに使用され得る、合成または天然に生じる分子もしくはペプチドを含む。例えば、レクチンは、天然に生じる、非免疫起原の糖結合ペプチドである。内皮細胞特異的レクチン抗原（Ｕｌｅｘ  Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ｕｅａ  １）(Schatz et al.2000 「ヒト子宮内膜内皮細胞：組織因子および１型プラスミノーゲン活性化因子インヒビターの単離、特性決定、および炎症媒介発現（Human Endometrial Endotherial Cells : Isolation, Characterization, and Inflammatory-Mediated Expression of Tissue Factor and Type 1 Plasminogen Activator Inhibitor）」Biol Reprod 62: 691-697)は、前駆内皮細胞の細胞表面に選択的に結合し得る。
【００８７】
様々な細胞表面受容体を標的とするために、合成「小分子」が生成されてきた。これらの分子は、特異的受容体（単数または複数）に選択的に結合し、そして前駆内皮細胞のような特定の細胞型を標的とし得る。小分子は、ＶＥＧＦのような内皮細胞表面マーカーを認識するように合成され得る。ＳＵ１１２４８（Sugen Inc.）(Mendel et al. 2003 「血管内皮増殖因子および血小板由来増殖因子受容体を標的とする新規チロシンリン酸化酵素インヒビター、ＳＵ１１２４８のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性：薬物動態学的／薬力学的関連性の決定（In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor reseptors: determination of a pharmacokinetic/pharmacodynamic relationship）」Clin Cancer Res. Jan; 9 (1) : 327-37)、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４(Drevs J. et al. 2003「受容体チロシンリン酸化酵素：新規抗癌治療の主要な標的（Receptor tyrosine kinases: the main targets for new anticancer therapy）」Curr Drug Targets. Feb; 4 (2): 113-21)、およびＳＵ６６６８(Laird, AD et al. 2002 「ＳＵ６６６８はｉｎ  ｖｉｖｏでＦｌｋ１／ＫＤＲおよびＰＤＧＦＲβを阻害し、マウスで腫瘍脈管構造の急速なアポトーシスおよび腫瘍退行をもたらす（SU6668 inhibits Flk1/KDR and PDGFRbeta in vivo, resulting in rapid apoptosis of tumor vasculature and tumor regression in mice）」FASEB J. May; 16 (7): 681-90)は、ＶＥＧＦＲ２に結合する小分子である。
【００８８】
内皮細胞表面を標的とする、合成小分子の別のサブセットは、α（ｖ）β（３）インテグリンインヒビターである。ＳＭ２５６およびＳＤ９８３(Kerr JS. et al. 1999「新規小分子αｖインテグリンアンタゴニスト：既知の血管新生インヒビターと比較した抗癌効果（Novel small molecule alpha v integrin antagonists: comparative anti-cancer efficacy with known angiogenesis inhibitors）」Anticancer Res Mar-Apr; 19 (2A): 959-68) は、両方とも、内皮細胞表面に存在するα（ｖ）β（３）を標的として結合する合成分子である。
【００８９】
本発明は、以下の実験の詳細の節で説明される。これらの節は、本発明の理解のために以下に記載するが、以下に続く特許請求の範囲に記載されるとおりの本発明をいかなる場合においても限定するためのものでなく、また限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００９０】
内皮前駆細胞表現型化（Phenotyping）
内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を、ＣＤ３４＋磁気ビーズ単離（Dynal Biotech）または最近記載された（Asahara T, Murohara T, Sullivan A, et al.「血管新生のための推定前駆内皮細胞の単離」 Science 1997 ; 275: 964-7）ように濃縮培地単離のいずれかで単離した。簡単には、健康な男性志願者から末梢静脈血を採取し、そして密度勾配遠心分離により単核球フラクションを単離して、５％ウシ胎児血清、ヒトＶＥＧＦ−Ａ、ヒト繊維芽細胞増殖因子−２、ヒト上皮増殖因子、インシュリン様増殖因子−１、およびアスコルビン酸を補充したＥＣ基礎培地−２（ＥＢＭ−２）（Clonetics）中、ヒトフィブロネクチンコーティングした培養スライド（Becton Dickinson）に細胞を蒔いた。４８時間毎に培養液を交換しながら、７日間ＥＰＣを増殖させた。これらの実験の結果を図２Ａおよび図２Ｂに示す。図２Ａおよび図２Ｂは、抗ＣＤ３４単離細胞がより紡錘様であるらしいことを示し、このことは細胞が内皮細胞へ分化していることを示唆する。
【００９１】
免疫組織化学によりＥＣ表現型を決定した。簡単には、ＥＰＣを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Sigma）中２％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Sigma）で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして様々なＥＣ特異的マーカー、ウサギ抗ヒトＶＥＧＦＲ−２（Alpha Diagnostics Intl. Inc.）、マウス抗ヒトＴｉｅ−２（Ｃｌｏｎｅ  Ａｂ３３、Upstate Biotechnology）、マウス抗ヒトＣＤ３４（Becton Dickinson）、ＥＣ−レクチン（Ｕｌｅｘ  Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ｕｅａ  １）（Sigma）、およびマウス抗ヒト  因子８（Sigma）で染色した。フルオレセインイソチオシアネート共役（ＦＩＴＣ）二次抗体に細胞を曝露することにより、抗体の存在を確認した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を核マーカーとして用いた。これらの実験結果を図２Ｃ〜図２Ｇに示す。図２Ｃは、ＶＥＧＦＲ−２が培養の２４時間後に発現することを示し、細胞が内皮細胞であることを確かにする。図２Ｄおよび図２Ｆは、インキュベーション７日後の結合細胞の核染色を示し、そして図２Ｅおよび図２Ｇは、同じ領域の、抗Ｔｉｅ−２抗体で染色した細胞である。
【００９２】
ＥＣ機能の顕著な特徴である、内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）をＥＰＣが発現する能力を、ｅＮＯＳ  ｍＲＮＡの逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ−ＰＣＲ）により決定した。ＥＰＣを、ＥＢＭ−２培地中７日間まで増殖させ、その後ＧｅｎＥｌｕｔｅ哺乳類全ＲＮＡキット（Sigma）を用いて全ＲＮＡを単離して２６０ｎｍでの吸光度により定量した。Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（Qiagen）を用いて、１μｇのランダムプライマーで、全ＲＮＡを２０μＬ体積中逆転写した。各ＲＴ産生物について、最終反応体積の分取分（２〜１０μＬ）を、ｅＮＯＳ（２９９ｂｐ産生物、センス５'−ＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧ−３'、アンチセンス５'−ＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＣＡＴＣＧＣＣＧＣＡＧ−３'）、またはＧＡＰＤＨ（３４３ｂｐ産生物、センス５'−ＣＴＣＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＴ−３'、アンチセンス５'−ＧＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３'）特異的プライマーおよびＴａｑポリメラーゼ（Pharmacia Biotech Amersham）を用いて、２つの平行ＰＣＲ反応で増幅させた。ＰＣＲサイクルは以下のとおりであった：９４℃で５分間、６５℃で４５秒間、７２℃で３０秒間（ｅＮＯＳについて３５サイクル、およびＧＡＰＤＨについて２５サイクル）。ｒｔ−ＰＣＲ産生物を、２％アガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウムを用いて可視化してデンシトメトリーで定量した。この実験の結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。図３Ａおよび図３Ｂに示されるとおり、一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）は、細胞が、酸素の存在下または非存在下、培養の３日間培地でインキュベートされた後に発現する．ｅＮＯＳ  ｍＲＮＡ発現は、培養の７日後存在し続けている。ｅＮＯＳ  ｍＲＮＡの存在は、細胞が３日目までに成熟内皮細胞に分化し、そして完全に分化した内皮細胞のように機能しはじめたことを示す。
【実施例２】
【００９３】
抗ＣＤ３４コーティングされたステンレス鋼ディスクによる内皮細胞捕獲
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）(American Type Culture Collection）は、実験期間中内皮細胞増殖培地で増殖させる。細胞を、ＣＭＤＸおよびその表面上に抗原を有するかまたは有さないゼラチンでコーティングした試料あるいはむき出しのステンレス鋼（ＳＳＴ）試料とともにインキュベートする。インキュベーション後、増殖培地を除去して、試料をＰＢＳで２回洗浄する。細胞を、２％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、各洗浄に１０分かけて全ての固定剤の除去を確実にする。各試料を、室温で３０分間、ブロッキング溶液とともにインキュベートして全ての非特異的結合をブロックする。試料をＰＢＳで１回洗浄し、そしてＶＥＧＦＲ−２抗体の１：１００希釈物に曝露させて一晩インキュベートする。続いて、試料をＰＢＳで３回洗浄し、全ての一次抗体の除去を確実にする。ブロッキング溶液中のＦＩＴＣ-共役二次抗体を、１：１００の希釈で各それぞれの試料に加え、そしてベリーダンサー（Belly Dancer）装置上室温で４５分間インキュベートする。インキュベーション後、試料をＰＢＳで３回、０．１％のＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで１回、次いでＰＢＳで再度洗浄する。試料をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）でマウントし、そして共焦点顕微鏡下、可視化する。
【００９４】
図４Ａ〜図４Ｅは、ＣＭＤＸおよび抗ＣＤ３４抗体でコーティングされたＳＳＴ試料（図４Ａ）、ゼラチンおよび抗ＣＤ３４抗体でコーティングされたＳＳＴ試料（図４Ｂ）、むき出しのＳＳＴ（図４Ｃ）、ＣＭＤＸコーティングされて抗体を有さないＳＳＴ試料（図４Ｄ）ならびにゼラチンコーティングされて抗体を有さないＳＳＴ試料（図４Ｅ）の顕微鏡写真である。図は、抗体でコーティングされた試料のみが、ＰＩ染色で示されるように、試料表面上に結合した多数の細胞を含むことを示す。むき出しのＳＳＴ対照ディスクは、その表面に結合した少数の細胞を示す。
【００９５】
図５Ａ〜図５Ｃは、その表面に結合した抗体を有さないＣＭＤＸコーティングした対照試料の顕微鏡写真である。図５Ａは、ＰＩ染色により見られるように、極少数の細胞が試料表面に接着したことを示す。図５Ｂは、接着細胞がＶＥＧＦＲ−２陽性であることを示し、それらが内皮細胞であることを示しており、そして図５Ｃは、染色された核とＶＥＧＦＲ−２陽性の緑色蛍光との組合せを示す。図５Ｄ〜図５Ｆは、その表面に結合した抗体を有さないゼラチンコーティングした対照試料の顕微鏡写真である。図５Ｄは、試料にＰＩ染色が存在しないことおよび試料から放射される緑色蛍光が存在しないことから、細胞がないことを示す（図５Ｅおよび図５Ｆを参照）。
【００９６】
図６Ａ〜図６Ｃは、その表面に結合した抗ＣＤ３４抗体を有するＣＭＤＸコーティングしたＳＳＴ試料の顕微鏡写真である。図は、緑色蛍光により示されるように、集密した単層に近いものを確立している（図６Ａ）、およびＶＥＧＦＲ−２陽性である（図６Ｂおよび図６Ｃ）多数の接着細胞を試料が含有することを示す。同様に、図６Ｄ〜図６Ｆは、その表面に結合した抗ＣＤ３４抗体を有するゼラチンコーティングした試料の顕微鏡写真である。これらの図もまた、多数の赤色染色した核およびＶＥＧＦＲ−２／ＦＩＴＣ抗体からの緑色蛍光により示されるように（図６Ｅおよび図６Ｆ）、試料表面にＨＵＶＥＣが結合したことを示す。
【実施例３】
【００９７】
前駆内皮細胞のＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２染色
前駆細胞を、実施例１で記載されるように、ヒト血液から単離し、そして増殖培地中ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、２４時間、７日間、および３週間インキュベートする。インキュベーション後、増殖培地を除去して、試料をＰＢＳで２回洗浄する。細胞を、２％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、各洗浄に１０分かけて全ての固定剤の除去を確実にする。各試料を、室温で３０分間、４４０μｌのヤギ（ＶＥＧＦＲ−２に対して）またはウマ（Ｔｉｅ−２に対して）ブロッキング溶液とともにインキュベートして全ての非特異的結合をブロックする。試料をＰＢＳで１回洗浄し、そしてＶＥＧＦＲ−２またはＴｉｅ−２抗体を１：１００の希釈で加え、そして試料を一晩インキュベートする。次いで、試料をＰＢＳで３回洗浄し、全ての一次抗体が洗い流されたことを確実にする。ウマまたはヤギブロッキング溶液中のＦＩＴＣ−共役二次抗体（２００μＩ）を、１：１００の希釈でそれぞれの試料に加え、そしてベリーダンサー装置上室温で４５分間インキュベートする。インキュベーション後、試料をＰＢＳで３回、０．１％のＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで１回、次いでＰＢＳで再度洗浄する。試料をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）でマウントし、そして共焦点顕微鏡下、可視化する。
【００９８】
図７は、２４時間細胞とともにインキュベートされたＣＤ３４抗体をその表面に含有するＣＭＤＸコーティングされた試料の顕微鏡写真であり、前駆細胞が試料表面に捕獲され、赤色染色した核により実証されるとおり、試料表面に存在することを示す。図はまた、約７５％の細胞が円形の形態を有しＶＥＧＦＲ−２陽性であることを示す。
【００９９】
図８Ａおよび図８Ｂは、細胞とともに７日間インキュベートされた試料からのものである。図８Ａに見られるように、赤色染色した核により示されるように試料に細胞が存在しており、これはＶＥＧＦＲ−２陽性であり（図８Ｂ、１００％）、そして細胞の紡錘形により示されるようにより内皮的である。図９Ａおよび図９Ｂは、その表面にＣＤ３４抗体を含有するＣＭＤＸコーティングされた試料の顕微鏡写真であり、これは細胞とともに７日間インキュベートされ、そしてインキュベート後、試料はＴｉｅ−２抗体に曝露された。図９Ａに見られるように、赤色染色した核により示されるように多数の細胞が試料表面に結合している。試料に接着した細胞はまた、細胞から放出される緑色蛍光により示されるようにＴｉｅ−２陽性（１００％）である（図９Ｂ）。まとめると、試料表面に結合した多数の細胞ならびに接着細胞表面上のＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２受容体の存在からわかるように、細胞を試料とともに７日間インキュベーションした後、ＣＤ３４抗体コーティングされた試料は、その表面に内皮細胞を捕獲し得る。さらに、７日目において試料表面に１００％内皮細胞が存在することは、非内皮細胞が剥離した可能性があること、または全ての接着細胞が７日目までに内皮細胞マーカーを発現し始めたことを示唆する。
【０１００】
図１０Ａ〜図１０Ｃは、内皮細胞増殖培地で３週間増殖した前駆内皮細胞の位相差顕微鏡写真である。図１０Ａは、矢印で血管の管腔を連想させる二次元管様構造（矢印）により示されるように、細胞が成熟した内皮細胞に分化したことを示す。図１０Ｂは、複数層になった、すなわち順に重なった細胞の三次元での集積が存在することをし、これは長期間増殖させた内皮細胞が順に重なって層を形成し始めたという報告を確実にする。図１０Ｃは、蒔いてから３週間後の培養液中で増殖する前駆細胞が内皮細胞の外観を有することを示し、この図は、細胞表面に存在するＣＤ３４／ＦＩＴＣ抗体の緑色蛍光により実証されるように、細胞が内皮細胞であることを確実にする。
【０１０１】
上記のデータは、ヒト血液から単離された白血球がＣＤ３４陽性前駆細胞を有すること、およびそれらの細胞が発達して成熟した内皮細胞になり容易に内皮細胞表面抗原を発現し得ることを示す。（ＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２）データはまた、本発明のコーティングされた医療用デバイスの表面上の前駆または幹細胞を捕獲するために、前駆または幹細胞表面抗原に対する抗体が用いられ得ることを示す。
【実施例４】
【０１０２】
フラーレンコーティングされた、ならびに抗ＣＤ３４抗体および／または内皮細胞増殖因子（Ａｎｇ−２、ＶＥＧＦ）とともにフラーレンコーティングされたステンレス鋼
以下の手順を用いて、ステンレス鋼ステントおよびディスクを、抗体および／または増殖因子（すなわち、ＶＥＧＦまたはＡｎｇ−２）を結合させるための官能性フラーレン層で誘導体化する：
【０１０３】
最初の工程において、ＳＳＴステントまたはディスクの表面を０．５ＭＨＣｌで活性化し、これにより表面から任意の不動態化混入物も取り除かれる。金属試料を活性化浴から取り出し、蒸留水ですすぎ、メタノールで乾燥させ、そして７５℃でオーブン乾燥させる。次いで、ステントを、酸化フラーレン（Ｃ６０−Ｏ）を含むトルエン誘導体溶液に、上限２４時間の期間で浸漬する。酸化フラーレンは、ステント上に見いだされるＦｅ−Ｏ、Ｃｒ−Ｏ、およびＮｉ−Ｏを介してステントに結合する。ステントを誘導体化浴から取り出し、トルエンですすぎ、そして新たなトルエンとともにソックスレー抽出器に１６時間置いて、物理吸着した（physisorbed）いかなるＣ６Ｏも除去する。ステントを取り出して、１０５℃で一晩オーブン乾燥させる。この反応により、フラーレンの単層で完全に誘導体化されたステントまたはディスクを得る。
【０１０４】
第２工程において、セバシン酸を塩化チオニルまたはオキシ塩化硫黄（ＳＯＣＩ２）と反応させて塩化セバコイルを形成させることにより、溶液中にジアルデヒド分子を形成させる。以下に示されるように、得られる塩化セバコイルはＬｉＡＩ［ｔ−Ｏブチル］３Ｈおよびジグリムと反応して、１，１０−デカンジオールが得られる。
【０１０５】
【化１】
2005523050.tif 000004
【０１０６】
第３工程において、ステントまたはディスク（第１工程由来）の表面にＮ−メチルピロリジン誘導体が形成される。還流トルエン中窒素下で４８時間、等モル量のフラーレンおよびＮ−メチルグリシンを第２工程の反応の１，１０−デカンジオール生成物と反応させることにより、フラーレン分子はさらに誘導化されて、以下に示されるように、Ｎ−メチルピロリジン誘導体化フラーレン−ステンレス鋼ステントまたはディスクが得られる。
【０１０７】
【化２】
2005523050.tif 000005
【０１０８】
誘導体化ステンレス鋼ステントまたはディスクを洗浄して、いかなる化学残渣も除去し、そして標準技法を用いて抗体および／または（ＶＥＧＦまたはＡＮＧ−２）を結合させるのに用いる。前駆細胞を、実施例１に記載されるようにヒト血液から単離し、そして抗ＣＤ３４抗体コーティングされたフラーレンディスクに曝露させる。インキュベーション後、増殖培地を除去し、そして試料をＰＢＳで２回洗浄する。細胞を２％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、各洗浄に１０分かけて全ての固定剤の除去を確実にする。各試料を、室温で３０分間、ブロッキング溶液とともにインキュベートして全ての非特異的結合をブロックする。試料をＰＢＳで１回洗浄し、そしてＶＥＧＦＲ−２抗体の１：１００の希釈物に曝露させて一晩インキュベートする。続いて、試料をＰＢＳで３回洗浄し、全ての一次抗体が除去されたことを確実にする。ブロッキング溶液中のＦＩＴＣ−共役二次抗体を、１：１００の希釈でそれぞれの試料に加え、そしてベリーダンサー装置上室温で４５分間インキュベートする。インキュベーション後、試料をＰＢＳで３回、０．１％のＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで１回、次いでＰＢＳで再度洗浄する。試料をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）でマウントし、そして共焦点顕微鏡下、可視化する。図１１は、前駆細胞に結合する本発明の官能性フラーレンコーティングされたステント表面の概略図を示す。図１２Ａ〜図１２Ｂは、それぞれ、ＰＩで染色された、（１２Ａ）、および抗ＶＥＧＦＲ−２／ＦＩＴＣ−共役抗体染色された、抗体を有さないフラーレンコーティングされた対照試料の顕微鏡写真である。図１２Ｃおよび図１２Ｄは、フラーレン／抗ＣＤ３４抗体コーティングでコーティングされた試料の顕微鏡写真である。図に示されるように、抗ＣＤ３４抗体コーティングされた試料は、表面に結合したより多くの細胞（これはＶＥＧＦＲ−２陽性である）を含む。
【０１０９】
抗体とともに、または抗体なしでフラーレンコーティングされた試料を、実施例５に記載されるようにヨークシャーブタに移植する。組織学のためステントを外植し、そしてステント使用区を１０％緩衝ホルマリンで３０秒間フラッシュし、続いて処理されるまで１０％緩衝ホルマリンで固定する。各ステントから５つの切片を切り取る；ステントの近位１ｍｍ、ステントの近位末端から１ｍｍ、ステント中央、ステントの遠位端から１ｍｍ、およびステントの遠位１ｍｍ。切片を、ヘマトキシリン＆エオシン（ＨＥ）およびエラスチントリクロム（Elastin Trichrome）で染色する。図１３Ａ〜図１３Ｄは、４週間移植されていたステントの冠動脈外植片を通る断面の顕微鏡写真である。データは、フラーレンコーティングされた（図１３Ｂおよび図１３Ｄ）ステントが、対照（むき出しのステント、図１３Ａおよび図１３Ｃ）に勝って過剰な内膜過形成を阻害することを示す。
【実施例５】
【０１１０】
ブタバルーン損傷の研究
２５〜３０ｋｇの間の体重の若年のヨークシャーブタで、抗体コーティングしたステントの移植を実施する。動物管理は、「実験室動物の管理および使用に関するガイド（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）」（NIH publication No.80-23,revised 1985）にまとめられている。一晩の断食後、塩酸ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）で動物を鎮静させる。チオペンタール（１２ｍｇ／ｋｇ）での麻酔誘導後、動物に挿管し、酸素および亜酸化窒素の混合物（１：２［ｖｏｌ／ｖｏｌ］）を投与する通気口を接続する。０．５〜２．５体積％のイソフルランで麻酔を持続させる。プロカインペニシリンＧおよびベンザチンペニシリンＧ（ストレプトマイシン）の混合物１，０００ｍｇの筋内注射により、抗生予防を提供する。
【０１１１】
無菌条件下、左冠動脈の動脈切開を実施して８Ｆ−導入針シースを左冠動脈に設置する。全ての動物に、体重１キログラムあたり１００ＩＵのヘパリンを与える。３００秒を上回る活性凝固時間を維持するために、手順全体にわたって、さらに２，５００ＩＵボーラスのヘパリンを定期的に投与する。６Ｆ誘導カテーテルを、頚動脈鞘を通して導入して冠動脈の小孔まで通す。冠内ニトログリセリン２００ｕｇの投与後、血管造影を行い、定量的冠動脈造影システムを用いて、画像を解析する。３Ｆ−塞栓摘出カテーテルを、冠動脈の近位部分に挿入してステント移植に選択された区の遠位に通し、そして内皮を裸出させる。抗ＣＤ３４抗体を組込むコーティングされたＲステントを、誘導カテーテルを通して導入して冠動脈の裸出区に配置する。むき出しのステンレス鋼ステントまたはマトリクスでコーティングされた（ただし抗体なしの）ステントを対照として用いる。１．１のステント対動脈割り当て（ration）で、ステントを、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）または右冠動脈（ＲＣＡ）または冠動脈回旋枝（Ｃｘ）のいずれかに移植する。ステントの大きさおよび配置を血管造影により評価して、導入針シースを取り出し、そして皮膚を２層中に閉じた。実験期間中、動物を３００ｍｇのＡＳＡで飼育する。
【０１１２】
ステント移植後、１、３、７、１４、および２８日目で、動物を屠殺する。上記のように、動物をまず鎮静させ、そして麻酔をかける。ステントを入れた冠動脈を、ステントの近位および遠位の、ステントの入っていない血管１ｃｍとともに外植する。ステントを入れた動脈を３つの方法、組織学、免疫組織化学、または走査電子顕微鏡により、処理する。
【０１１３】
免疫組織化学用に、解剖したステントを１０％ホルマリンで３０秒間穏やかにフラッシュして、処理するまで１０％ホルマリン／ＰＢＳ溶液中に置く。免疫組織化学の予定になっているステントをＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で３０秒間フラッシュし、次いで２％ＰＦＡ溶液中に１５分間置き、洗浄し、そしてウサギ抗ヒトＶＥＧＦＲ−２またはマウス抗ヒトＴｉｅ−２抗体を用いた免疫組織化学が行われるまでＰＢＳ中に貯蔵する。
【０１１４】
１０％緩衝ホルマリンで３０秒間フラッシュし、続いて０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中２．５％グルタルアルデヒドとともに２％ＰＦＡで一晩固定することで、ＳＥＭ用にステントを調製する。次いで、試料をカコジル酸緩衝液で３回洗浄し、そして一晩洗ったままにする。０．１Ｍのカコジル酸緩衝液中１％四酸化オスミウム（Sigma）で後固定を完了させ、これに続いて、エタノール（３０％エタノール、５０％、７０％、８５％、９５％、１００％、１００％）で脱水し、引き続きＣＯ２で臨界点乾燥を行った。乾燥後、試料に金蒸着させてＳＥＭ下で可視化する。（「正常なブタ冠動脈におけるヘパリンコーティングしたパルマ−シャッツステントを用いた血栓現象の減少（Reduction in thrombotic events with heparin-coated Palmaz-Schatz stents in normal porcine coronary arteries）」, Circulation 93: 423-430、本明細書中参照により援用される）。
【０１１５】
組織学用に、ステント使用区を１０％緩衝ホルマリンで３０秒間フラッシュし、続いて処理するまで１０％緩衝ホルマリンで固定する。各ステントから５つの切片を切り取る；ステントの近位１ｍｍ、ステントの近位末端から１ｍｍ、ステント中央、ステントの遠位端から１ｍｍ、およびステントの遠位１ｍｍ。切片を、ヘマトキシリン＆エオシン（ＨＥ）およびエラスチントリクロムで染色する。
【０１１６】
図１４Ａ〜図１４Ｇは、移植１時間後（図１４Ａおよび図１４Ｂ）および４８時間後（図１４Ｃ〜図１４Ｇ）に採取して走査電子顕微鏡下で観察した外植片を示す。顕微鏡写真は、デキストランコーティングした対照（図１４Ａ、図１４Ｃ、および図１４Ｄ）と比較して、４８時間後に、高倍率（４００倍）で細胞の紡錘型の外観により示されるように、デキストラン／抗ＣＤ３４抗体コーティングしたステント（図１４Ｂ、図１４Ｅ〜図１４Ｇ）が前駆内皮細胞を捕獲していたことをはっきりと示す。
【０１１７】
ブタ冠動脈からの外植片の断面図もまた、対照（むき出しのステンレス鋼である図１４Ｈおよび図１４１；デキストランコーティングした図１４Ｊおよび図１４Ｋ）と比較して、デキストラン−抗ＣＤ３４抗体コーティングしたもの（図１４Ｌ、図１４Ｍ）が内膜過形成（動脈平滑筋層の厚さ）の明白な阻害を引き起こしたことを示す。図１３Ｂ〜図１３Ｄに示されるように、フラーレンコーティングしたステント移植片もまた、むき出しの対照ステンレス鋼ステントよりも良好に内膜過形成を阻害する。
【０１１８】
図１５Ａおよび図１５Ｂは、それぞれ、長さ１８ｍｍの、その表面に抗体なしでデキストラン−血漿コーティングしたステント、およびデキストラン-血漿コーティングした抗ＣＤ３４抗体ステントの、４８時間外植片の共焦点顕微鏡写真を示す。ステントは、若年の雄ヨークシャーブタの冠動脈に移植されていた。外植片を免疫組織化学的に処理し、そしてＶＥＧＦＲ−２について染色し、続いてＦＩＴＣ−共役二次抗体処理して、共焦点顕微鏡下で調査した。図１５Ｂおよび図１５Ｃは、抗体を有さないステント上に内皮が全くない（図１５Ａ）ことと比較して、断面の緑色蛍光により示されるように、抗体含有ステントが内皮細胞で覆われていることを示す。
【実施例６】
【０１１９】
ステントに塗布された固定化抗体マトリクス中への内皮増殖因子の組込み
以下は、内皮前駆細胞の細胞表面抗原に対する抗体を血管内ステントに塗布された生体適合性マトリクスに固定化し、次いで血管内ステントに、血液と接触した時の循環内皮前駆細胞の結合の向上およびそれらの機能的内皮への成熟のために内皮増殖因子を吸着させる工程を記載する。
【０１２０】
マトリクス沈着：当業者に既知の方法を用いて、ステンレス鋼ステントを血漿沈着で処理してステント表面にアミン官能性を導入する。カルボキシ官能性デキストラン（ＣＭＤＸ）の層は、血漿沈着層のアミン基にとって血漿層と官能性ＣＤＭＸとの間にアミド結合を形成する水性条件下、水溶性カルボジイミドカップリング化学反応として既知の標準技法を用いて、ＣＭＤＸカルボキシル基の活性化を通じて、ステントに沈着したアミン官能性層に結合するだろう。
【０１２１】
抗体固定化：内皮前駆細胞の細胞表面抗原に対する抗体（例えば、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ３４）は、緩衝化酸性溶液中水性水溶性カルボジイミド化学反応でのインキュベーションにより、ＣＤＭＸコーティングしたステントと共有結合でカップリングするだろう。
【０１２２】
増殖因子の吸着：ステントに塗布されたＣＭＤＸマトリクスへのモノクローナル抗ヒトＣＤ３４の固定化の後、増殖因子がＣＭＤＸマトリクス中に吸着されるような適切な濃度で、内皮増殖因子（例えば、アンジオポエチン−２）の水溶液中でデバイスをインキュベートする。処理したデバイスを緩衝生理食塩水溶液（physiologic buffered saline solution）ですすぎ、そしてアジ化ナトリウム保存溶液に貯蔵する。
【０１２３】
標準血管造影技法を用いると、上記に記載されるデバイスは、ブタ冠動脈に移植されてヒト血液に曝された場合、循環内皮前駆細胞の処理ステント表面への取り込みおよび結合の向上をもたらし、かつそれらの機能的内皮への成熟を加速する。機能的内皮の迅速な確立は、デバイスの血栓形成性を減少させ、そして内膜過形成の度合いを調節することが予期される。
【実施例７】
【０１２４】
内皮増殖因子および抗体のステントへの固定化
以下は、血液と接触した場合の循環内皮前駆細胞の結合およびそれらの機能的内皮への成熟を向上させるための、血管内ステントに塗布された生体適合性マトリクスへの、内皮前駆細胞の細胞表面抗原に対する抗体および内皮増殖因子の固定化の工程を記載する。
【０１２５】
マトリクス沈着：マトリクス沈着：当業者に既知の方法を用いて、ステンレス鋼ステントを血漿沈着で処理してステント表面にアミン官能性を導入する。カルボキシ官能性デキストラン（ＣＭＤＸ）の層は、血漿沈着層のアミン基にとって血漿層と官能性ＣＤＭＸとの間にアミド結合を形成する水性条件下、水溶性カルボジイミドカップリング化学反応として既知の標準技法を用いて、ＣＭＤＸカルボキシル基の活性化を通じて、ステントに沈着したアミン官能性層に結合するだろう。
【０１２６】
抗体および増殖因子固定化：内皮前駆細胞の細胞表面抗原に対する抗体（例えば、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ３４）および内皮増殖因子（例えば、アンジオポエチン−２）は、酸性条件下、水溶性カルボジイミド溶液中、等モル濃度でのインキュベーションにより、ＣＤＭＸコーティングしたステントと共有結合でカップリングするだろう。処理したデバイスを緩衝生理食塩水溶液ですすぎ、そしてアジ化ナトリウム保存溶液に貯蔵する。
【０１２７】
標準血管造影技法を用いると、上記に記載されるデバイスは、ブタ冠動脈に移植されてヒト血液に曝された場合、循環内皮前駆細胞の処理ステント表面への取り込みおよび結合の向上をもたらし、かつそれらの機能的内皮への成熟を加速する。機能的内皮の迅速な確立は、デバイスの血栓形成性を減少させ、そして内膜過形成の度合いを調節することが予期される。
【実施例８】
【０１２８】
ステントの小分子機能化：前駆内皮細胞を、実施例１に記載されるように単離した。細胞をフィブロネクチンコーティングしたスライドに蒔き、ＥＢＭ−２培養液中７日間増殖させた。細胞を固定して、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびＦＩＴＣ−共役内皮細胞特異的レクチン（Ulex Europaeus Uea 1）で染色した。これらの実験の結果を図１６Ａおよび図１６Ｂに示す。図は、前駆内皮細胞がフィブロネクチンコーティングしたスライドに結合すること、および細胞がその表面にレクチンに対するリガンドを発現することを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１Ａ】架橋分子によりマトリクスへ共有結合でつなぎ止められた抗体の概略図である。
【図１Ｂ】マトリクスに固着するＣ６０Ｏ分子の図を示す。
【図１Ｃ】本発明のマトリクスでコーティングされたステントの概略図を示す。
【図２Ａ】濃縮培地から単離した細胞を含有するフィブロネクチンコーティングしたスライドに接着した前駆内皮細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図２Ｂ】抗ＣＤ３４抗体コーティングした磁気ビーズで単離された細胞を含有するフィブロネクチンコーティングしたスライドに接着した前駆内皮細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図２Ｃ】細胞は、ＶＥＧＦＲ−２抗体についての抗体蛍光により示されるように、成熟した内皮細胞マーカーを発現する。
【図２Ｄ】７日間インキュベートしてＰｉ核染色で染色した前駆内皮細胞の顕微鏡写真である。
【図２Ｅ】細胞は、Ｔｉｅ−２抗体についての抗体蛍光により示されるように、成熟した内皮細胞マーカーを発現する。
【図２Ｆ】７日間インキュベートしてＰｉ核染色で染色した前駆内皮細胞の顕微鏡写真である。
【図２Ｇ】細胞は、Ｔｉｅ−２抗体についての抗体蛍光により示されるように、成熟した内皮細胞マーカーを発現する。
【図３Ａ】内皮一酸化窒素合成酵素、ｅＮＯＳおよびグリセルアルデヒドホスフェート脱水素酵素、ＧＡＰＤＨについて、半定量ＲＴ−ＰＣＲの臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲルの写真である。培養の７日後のフィブロネクチンコーティングしたスライド上で、前駆内皮細胞はｅＮＯＳ  ｍＲＮＡを発現しはじめた。
【図３Ｂ】内皮一酸化窒素合成酵素、ｅＮＯＳおよびグリセルアルデヒドホスフェート脱水素酵素、ＧＡＰＤＨについて、半定量ＲＴ−ＰＣＲの臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲルの写真である。培養の３日後のフィブロネクチンコーティングしたスライド上で、前駆内皮細胞はｅＮＯＳ  ｍＲＮＡを発現しはじめた。
【図４Ａ】ＣＭＤＸおよび抗ＣＤ３４抗体コーティングしたステンレス鋼ディスクに結合したＨＵＶＥＣの顕微鏡写真である。これはＨＵＶＥＣ細胞とともにインキュベートしてヨウ化プロピジウムで染色した。
【図４Ｂ】ゼラチンおよび抗ＣＤ３４抗体コーティングしたステンレス鋼ディスクに結合したＨＵＶＥＣの顕微鏡写真である。これはＨＵＶＥＣ細胞とともにインキュベートしてヨウ化プロピジウムで染色した。
【図４Ｃ】むき出しのステンレス鋼ディスクに結合したＨＵＶＥＣの顕微鏡写真である。これはＨＵＶＥＣ細胞とともにインキュベートしてヨウ化プロピジウムで染色した。
【図４Ｄ】ＣＭＤＸコーティングしたステンレス鋼ディスクに結合したＨＵＶＥＣの顕微鏡写真である。これはＨＵＶＥＣ細胞とともにインキュベートしてヨウ化プロピジウムで染色した。
【図４Ｅ】ゼラチンコーティングしたステンレス鋼ディスクに結合したＨＵＶＥＣの顕微鏡写真である。これはＨＵＶＥＣ細胞とともにインキュベートしてヨウ化プロピジウムで染色した。
【図５Ａ】抗体なしでＣＭＤＸでコーティングした対照の顕微鏡写真である。
【図５Ｂ】抗体なしでＣＭＤＸでコーティングした対照の顕微鏡写真である。
【図５Ｃ】抗体なしでＣＭＤＸでコーティングした対照の顕微鏡写真である。
【図５Ｄ】その表面に結合した抗体のない、ゼラチンでコーティングした対照ステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。
【図５Ｅ】その表面に結合した抗体のない、ゼラチンでコーティングした対照ステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。
【図５Ｆ】その表面に結合した抗体のない、ゼラチンでコーティングした対照ステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。
【図６Ａ】その表面に結合した抗ＣＤ３４抗体とともにＣＭＤＸマトリクスでコーティングされたステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。
【図６Ｂ】その表面に結合した抗ＣＤ３４抗体とともにＣＭＤＸマトリクスでコーティングされたステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。
【図６Ｃ】その表面に結合した抗ＣＤ３４抗体とともにＣＭＤＸマトリクスでコーティングされたステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。
【図６Ｄ】その表面に結合した抗体とともにゼラチンマトリクスでコーティングされたステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。
【図６Ｅ】その表面に結合した抗体とともにゼラチンマトリクスでコーティングされたステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。
【図６Ｆ】その表面に結合した抗体とともにゼラチンマトリクスでコーティングされたステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真である。
【図７】その表面に結合した抗体とともにＣＭＤＸマトリクスでコーティングされたステンレス鋼ディスクの顕微鏡写真であり、これは前駆細胞とともに２４時間インキュベートされた。
【図８Ａ】その表面に結合した抗ＣＤ３４抗体を含有するＣＭＤＸマトリクスでコーティングされたステンレス鋼ディスクを前駆細胞とともに７日間インキュベートして抗ＫＤＲ抗体とともに発達させたものの顕微鏡写真である。
【図８Ｂ】その表面に結合した抗ＣＤ３４抗体を含有するＣＭＤＸマトリクスでコーティングされたステンレス鋼ディスクを前駆細胞とともに７日間インキュベートして抗ＫＤＲ抗体とともに発達させたものの顕微鏡写真である。
【図９Ａ】その表面に結合した抗ＣＤ３４抗体を含有するＣＭＤＸマトリクスでコーティングされたステンレス鋼ディスクを前駆細胞とともに７日間インキュベートして抗Ｔｉｅ−２抗体とともに発達させたものの顕微鏡写真である。
【図９Ｂ】その表面に結合した抗ＣＤ３４抗体を含有するＣＭＤＸマトリクスでコーティングされたステンレス鋼ディスクを前駆細胞とともに７日間インキュベートして抗Ｔｉｅ−２抗体とともに発達させたものの顕微鏡写真である。
【図１０Ａ】ＣＭＤＸコーティングされたステンレス鋼ディスクを内皮増殖培地中前駆細胞とともに３週間インキュベートしたものの位相差顕微鏡写真であり、これは成熟した内皮細胞を示す。
【図１０Ｂ】ＣＭＤＸコーティングされたステンレス鋼ディスクを内皮増殖培地中前駆細胞とともに３週間インキュベートしたものの位相差顕微鏡写真であり、これは成熟した内皮細胞を示す。
【図１０Ｃ】ＣＭＤＸコーティングされたステンレス鋼ディスクを内皮増殖培地中前駆細胞とともに３週間インキュベートしたものの位相差顕微鏡写真であり、これは成熟した内皮細胞を示す。
【図１１】前駆細胞に結合する、本発明の官能性フラーレンコーティングしたステント表面の概略図である。
【図１２Ａ】抗ＣＤ３４抗体なしでフラーレンコーティングした試料を臭化プロピジウムおよび抗ＶＥＧＦＲ−２抗体で染色した顕微鏡写真である。
【図１２Ｂ】抗ＣＤ３４抗体なしでフラーレンコーティングした試料を臭化プロピジウムおよび抗ＶＥＧＦＲ−２抗体で染色した顕微鏡写真である。
【図１２Ｃ】抗ＣＤ３４抗体とともにフラーレンコーティングした試料を臭化プロピジウムおよび抗ＶＥＧＦＲ−２抗体で染色した顕微鏡写真である。
【図１２Ｄ】抗ＣＤ３４抗体とともにフラーレンコーティングした試料を臭化プロピジウムおよび抗ＶＥＧＦＲ−２抗体で染色した顕微鏡写真である。
【図１３Ａ】むき出しのステンレス鋼ステントを４週間移植した冠動脈外植片の、低倍率で取られた顕微鏡写真である。
【図１３Ｂ】フラーレンコーティングした試料を４週間移植した冠動脈外植片の、低倍率で取られた顕微鏡写真である。
【図１３Ｃ】むき出しのステンレス鋼ステントを４週間移植した冠動脈外植片の、高倍率で取られた顕微鏡写真である。
【図１３Ｄ】フラーレンコーティングした試料を４週間移植した冠動脈外植片の、高倍率で取られた顕微鏡写真である。
【図１４Ａ】１時間後の走査電子顕微鏡写真であり、移植１時間後の、デキストランコーティングしたステント（図１４Ａ）の外植片である。
【図１４Ｂ】１時間後の走査電子顕微鏡写真であり、移植１時間後の、デキストラン／抗ＣＤ３４抗体コーティングしたステントの外植片である。
【図１４Ｃ】４８時間後の対照試料の外植片を示す。
【図１４Ｄ】４８時間後の対照試料の外植片を示す。
【図１４Ｅ】移植４８時間後のデキストラン／抗ＣＤ３４抗体コーティングしたステントである。
【図１４Ｆ】移植４８時間後のデキストラン／抗ＣＤ３４抗体コーティングしたステントである。
【図１４Ｇ】移植４８時間後のデキストラン／抗ＣＤ３４抗体コーティングしたステントである。
【図１４Ｈ】４週間移植されていた雄ヨークシャ−ブタからの、コーティングしていない（むき出しのステンレス鋼）外植片の冠動脈を通る断面の組織学的顕微鏡写真である。
【図１４Ｉ】４週間移植されていた雄ヨークシャ−ブタからの、コーティングしていない（むき出しのステンレス鋼）外植片の冠動脈を通る断面の組織学的顕微鏡写真である。
【図１４Ｊ】４週間移植されていた雄ヨークシャ−ブタからの外植片の冠動脈を通る断面の組織学的顕微鏡写真であり、デキストランコーティングした対照である。
【図１４Ｋ】４週間移植されていた雄ヨークシャ−ブタからの外植片の冠動脈を通る断面の組織学的顕微鏡写真であり、デキストランコーティングした対照である。
【図１４Ｌ】４週間移植されていた雄ヨークシャ−ブタからの外植片の冠動脈を通る断面の組織学的顕微鏡写真であり、デキストラン／抗ＣＤ３４抗体コーティングしたものである。
【図１４Ｍ】４週間移植されていた雄ヨークシャ−ブタからの外植片の冠動脈を通る断面の組織学的顕微鏡写真であり、デキストラン／抗ＣＤ３４抗体コーティングしたものである。
【図１５Ａ】長さ１８ｍｍの、その表面に抗体を有さないデキストラン−血漿コーティングしたステントの、４８時間外植切片の共焦点顕微鏡写真である。
【図１５Ｂ】長さ１８ｍｍの、デキストラン−ＰＬＡＳＭＡコーティングした／抗ＣＤ３４抗体コーティングしたステントの、４８時間外植切片の共焦点顕微鏡写真である。
【図１５Ｃ】長さ１８ｍｍの、デキストラン−ＰＬＡＳＭＡコーティングした／抗ＣＤ３４抗体コーティングしたステントの、４８時間外植切片の共焦点顕微鏡写真である。
【図１６Ａ】ヨウ化プロピジウム試料の顕微鏡写真である。
【図１６Ｂ】抗レクチン／ＦＩＴＣ−共役試料の顕微鏡写真である。
【図１Ａ】
2005523050.tif 000006
【図１Ｂ】
2005523050.tif 000007
【図１Ｃ】
2005523050.tif 000008
【図２Ａ】
2005523050.tif 000009
【図２Ｂ】
2005523050.tif 000010
【図２Ｃ】
2005523050.tif 000011
【図２Ｄ】
2005523050.tif 000012
【図２Ｅ】
2005523050.tif 000013
【図２Ｆ】
2005523050.tif 000014
【図２Ｇ】
2005523050.tif 000015
【図３Ａ】
2005523050.tif 000016
【図３Ｂ】
2005523050.tif 000017
【図４Ａ】
2005523050.tif 000018
【図４Ｂ】
2005523050.tif 000019
【図４Ｃ】
2005523050.tif 000020
【図４Ｄ】
2005523050.tif 000021
【図４Ｅ】
2005523050.tif 000022
【図５Ａ】
2005523050.tif 000023
【図５Ｂ】
2005523050.tif 000024
【図５Ｃ】
2005523050.tif 000025
【図５Ｄ】
2005523050.tif 000026
【図５Ｅ】
2005523050.tif 000027
【図５Ｆ】
2005523050.tif 000028
【図６Ａ】
2005523050.tif 000029
【図６Ｂ】
2005523050.tif 000030
【図６Ｃ】
2005523050.tif 000031
【図６Ｄ】
2005523050.tif 000032
【図６Ｅ】
2005523050.tif 000033
【図６Ｆ】
2005523050.tif 000034
【図７】
2005523050.tif 000035
【図８Ａ】
2005523050.tif 000036
【図８Ｂ】
2005523050.tif 000037
【図９Ａ】
2005523050.tif 000038
【図９Ｂ】
2005523050.tif 000039
【図１０Ａ】
2005523050.tif 000040
【図１０Ｂ】
2005523050.tif 000041
【図１０Ｃ】
2005523050.tif 000042
【図１１】
2005523050.tif 000043
【図１２Ａ】
2005523050.tif 000044
【図１２Ｂ】
2005523050.tif 000045
【図１２Ｃ】
2005523050.tif 000046
【図１２Ｄ】
2005523050.tif 000047
【図１３Ａ】
2005523050.tif 000048
【図１３Ｂ】
2005523050.tif 000049
【図１３Ｃ】
2005523050.tif 000050
【図１３Ｄ】
2005523050.tif 000051
【図１４Ａ】
2005523050.tif 000052
【図１４Ｂ】
2005523050.tif 000053
【図１４Ｃ】
2005523050.tif 000054
【図１４Ｄ】
2005523050.tif 000055
【図１４Ｅ】
2005523050.tif 000056
【図１４Ｆ】
2005523050.tif 000057
【図１４Ｇ】
2005523050.tif 000058
【図１４Ｈ】
2005523050.tif 000059
【図１４Ｉ】
2005523050.tif 000060
【図１４Ｊ】
2005523050.tif 000061
【図１４Ｋ】
2005523050.tif 000062
【図１４Ｌ】
2005523050.tif 000063
【図１４Ｍ】
2005523050.tif 000064
【図１５Ａ】
2005523050.tif 000065
【図１５Ｂ】
2005523050.tif 000066
【図１５Ｃ】
2005523050.tif 000067
【図１６Ａ】
2005523050.tif 000068
【図１６Ｂ】
2005523050.tif 000069
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月4日(2005.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
ＥＣ機能の顕著な特徴である、内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）をＥＰＣが発現する能力を、ｅＮＯＳ  ｍＲＮＡの逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ−ＰＣＲ）により決定した。ＥＰＣを、ＥＢＭ−２培地中７日間まで増殖させ、その後ＧｅｎＥｌｕｔｅ哺乳類全ＲＮＡキット（Sigma）を用いて全ＲＮＡを単離して２６０ｎｍでの吸光度により定量した。Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（Qiagen）を用いて、１μｇのランダムプライマーで、全ＲＮＡを２０μＬ体積中逆転写した。各ＲＴ産生物について、最終反応体積の分取分（２〜１０μＬ）を、ｅＮＯＳ（２９９ｂｐ産生物、センス５'−ＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧ−３'ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、アンチセンス５'−ＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＣＡＴＣＧＣＣＧＣＡＧ−３'ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、またはＧＡＰＤＨ（３４３ｂｐ産生物、センス５'−ＣＴＣＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＴ−３'ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、アンチセンス５'−ＧＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３'ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）特異的プライマーおよびＴａｑポリメラーゼ（Pharmacia Biotech Amersham）を用いて、２つの平行ＰＣＲ反応で増幅させた。ＰＣＲサイクルは以下のとおりであった：９４℃で５分間、６５℃で４５秒間、７２℃で３０秒間（ｅＮＯＳについて３５サイクル、およびＧＡＰＤＨについて２５サイクル）。ｒｔ−ＰＣＲ産生物を、２％アガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウムを用いて可視化してデンシトメトリーで定量した。この実験の結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。図３Ａおよび図３Ｂに示されるとおり、一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）は、細胞が、酸素の存在下または非存在下、培養の３日間培地でインキュベートされた後に発現する．ｅＮＯＳ  ｍＲＮＡ発現は、培養の７日後存在し続けている。ｅＮＯＳ  ｍＲＮＡの存在は、細胞が３日目までに成熟内皮細胞に分化し、そして完全に分化した内皮細胞のように機能しはじめたことを示す。
【国際調査報告】
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