(57)【要約】本発明は、アンギオテンシンＩ変換酵素の活性Ｃ末端部位を選択的に阻害することのできる医薬品の製造のためのホスフィン酸シュードペプチド誘導体の使用に関する。これらの誘導体は、下式(II)：【化１】2005522420.tif 000065[式中、R1は、ペプチド化学において通常使用されるアミノ官能基のための保護基、または上記のタイプの保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドであってよく、R2及びR3は天然または非天然のアミノ酸側鎖に相当し、R4及びR5は水素原子またはカウンターイオンを表す]に相当する。応用は、ヒトにおける心臓血管疾患の予防及び治療である。
2005522420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのホスフィン酸シュードペプチド誘導体：
【化１】
2005522420.tif 000039
[式中、
・R2及びR3は、同一または相違し、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、下式の配列：
【化２】
2005522420.tif 000040
はまたPro(プロリン)残基を形成していてもよく、更に
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す]
の、アンギオテンシンＩ変換酵素のＣ末端部位を選択的に阻害することのできる医薬生成物の製造のための使用。
【請求項２】
下式(II)：
【化３】
2005522420.tif 000041
[式中、
R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2及びR3は、同一または相違し、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、下式の配列：
【化４】
2005522420.tif 000042
はまたPro残基を形成していてもよく、
・R4は、水素原子または薬理学的に許容されるカウンターイオンを表し、更に
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す]
に相当するホスフィン酸シュードペプチド誘導体の、アンギオテンシンＩ変換酵素のＣ末端部位を選択的に阻害することのできる医薬生成物の製造のための使用。
【請求項３】
R1が、アセチル及びベンジルオキシカルボニル基から選択されるアミン官能基のための保護基を表す、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
R2が、ベンジル、メチル、またはフェニルエチル基を表す、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
R3が、アラニン、アルギニン、またはトリプトファンの側鎖を表す、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
配列-NH-CH(R3)-CO-が、下式：
【化５】
2005522420.tif 000043
のPro残基を成す、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
R4及び／またはR5が、水素原子を表す、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
ホスフィン酸シュードペプチド誘導体が、下式：
【化６】
2005522420.tif 000044
に相当する、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
下式（Ｉ）：
【化７】
2005522420.tif 000045
[式中、
・R2は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、
・下式の配列：
【化８】
2005522420.tif 000046
はPro残基：
【化９】
2005522420.tif 000047
を形成し、
・R4は、水素原子または薬理学的に許容されるカウンターイオンを表し、更に
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す]
のアミノ酸配列を含むホスフィン酸シュードペプチド誘導体。
【請求項１０】
下式（II）：
【化１０】
2005522420.tif 000048
[式中、
・R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、
・下式の配列：
【化１１】
2005522420.tif 000049
はPro残基：
【化１２】
2005522420.tif 000050
を形成し、
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す]
に相当するホスフィン酸シュードペプチド誘導体。
【請求項１１】
下式：
【化１３】
2005522420.tif 000051
のホスフィン酸シュードペプチド誘導体。
【請求項１２】
請求項９乃至１１のいずれか一項に記載の、少なくとも１つのホスフィン酸シュードペプチド誘導体を含む製薬品組成物。
【請求項１３】
前記ホスフィン酸シュードペプチド誘導体が、下式：
【化１４】
2005522420.tif 000052
に相当する、製薬品組成物。
【請求項１４】
下式(II)：
【化１５】
2005522420.tif 000053
[式中、
R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2及びR3は、同一または相違し、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、下式の配列：
【化１６】
2005522420.tif 000054
はまたPro残基を形成していてもよく、更に
・R4及びR5は、水素原子を表す]
のシュードペプチドの調製方法であって、以下の工程：
１）式（III）：
【化１７】
2005522420.tif 000055
[式中、R1及びR2は上記定義通りである]
の化合物を、下式（IV）：
【化１８】
2005522420.tif 000056
[式中、Acはアセチル基を表し、Etはエチル基を表す]
の化合物と反応させて下式（V）：
【化１９】
2005522420.tif 000057
の化合物を得る工程；
２）化合物（V）を水素化ホウ素ナトリウムと反応させることによって、化合物（V）を化合物（VI）：
【化２０】
2005522420.tif 000058
に変換する工程；
３）化合物（VI）のヒドロキシル基を保護基R5、例えばアダマンチル基Adで保護して、下式（VII）：
【化２１】
2005522420.tif 000059
の化合物を得る工程；
４）化合物（VII）を鹸化して、下式（VIII）：
【化２２】
2005522420.tif 000060
の化合物を得る工程；
５）下式(VIII）の化合物を下式（IX）または（X）：
【化２３】
2005522420.tif 000061
[式中、
R3は上記の定義通りである]
のアミノ酸とカップリングさせる工程；更に
６）保護基Adを除去する工程；
を含む方法。
【請求項１５】
ペプチドカップリング工程５）が、式（IX）または（X）のアミノ酸で置換された樹脂を固相として使用する固相ペプチド合成を経て行われる、請求項１４に記載される方法。
【請求項１６】
下式(II)：
【化２４】
2005522420.tif 000062
[式中、
R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2及びR3は、同一または相違し、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、下式の配列：
【化２５】
2005522420.tif 000063
はまたPro残基を形成していてもよく、
・R4は、水素原子を表し、更に
・R5は、生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す]
のシュードペプチドの調製方法であって、
請求項１４または１５の方法を経て得られるシュードペプチドのホスフィン酸官能基が、式R5OHのアルコールとのカップリングによって、または式R5X（式中、Xはハロゲン原子を表す）のハロゲン化物との反応によってエステル化される、調製方法。
【請求項１７】
式（VIII）：
【化２６】
2005522420.tif 000064
[式中、
・R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表す]
の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトのアンギオテンシンＩ変換酵素（ACE）のＣ末端活性部位を選択的に阻害する、すなわちACEのＮ末端活性部位に影響を与えないための、医薬生成物の調製のためのホスフィン酸シュードペプチド誘導体の使用に関する。                   
【０００２】
こうした医薬生成物は、ヒトの様々な心臓血管病理の予防及び治療において使用して良い。
【０００３】
本発明はまた、新規なホスフィン酸シュードペプチド誘導体、これらを含有する製薬組成物、及び前記ホスフィン酸シュードペプチド誘導体の調製方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
アンギオテンシンＩ変換酵素（ACE）は、動脈圧の制御において、及び心臓血管組織の様々な生理学的機能のホメオスタシスにおいて、中心的な成分である。これらの作用は、部分的には、
・不活性ペプチドであるアンギオテンシンＩの、ACEを用いるＣ末端の開裂を経る、強力な血管収縮薬であるアンギオテンシンIIの成熟、及び
・ACEを経る、強力な血管拡張薬であるブラジキニンの分解、
に依存しているようである。
【０００５】
これらの作用を以下に図示する。
【化１】
2005522420.tif 000003
【０００６】
動脈高血圧及び心臓組織疾患もまた、様々な血管収縮性ホルモンの調節悪化から生じる。血管収縮薬と血管拡張薬との間の平衡を、後者のために再構築することは、動脈高血圧及び心臓組織疾患を改善させるためのヒトの臨床治療において使用される医薬生成物の主たる治療目的の一つである。従って、アンギオテンシンIIの生成を防止し、且つブラジキニンを増強することによって、ACEの阻害がこれらの目的に向けて如何に関与しうるかが理解される。参考文献[１]及び[２]に記載の通り、ACE阻害剤は、ヒトの臨床治療において、動脈高血圧を軽減するためのみならず、心臓組織の機能を維持するためにも使用される。
【０００７】
ACEのクローニングに続いてその基本構造を決定することにより、驚くべきことに、参考文献[３]に記載のように、この酵素中に二つの活性部位の存在が示された。部位指向性変異誘発を経て、二つの活性部位が完全に機能性であること、すなわちACEの生理学的基質、例えばアンギオテンシンＩ及びブラジキニンを開裂可能であることを証明することができた（参考文献[４]及び[５]）。
【０００８】
ACEについて２０年以上も行われた全ての研究にも関わらず、祖先遺伝子の複製から生じる哺乳類のACE中の二つの活性部位の存在が、特定の機能的役割に相当するか否かは依然知られていない。しかしながら、ヒトでは、生体内において、ペプチドAc-SDKP（N-アセチル Ser-Asp-Lys-Pro）は本質的にACEのＮ末端活性部位を経て開裂されるとの最近の発見は、ACEの活性部位それぞれに別個の機能的役割があるという説を支持する（参考文献[６]）
【非特許文献１】Dzan V.J., 2001, Hypertension 37, 1047-1052
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これらに鑑みて、研究者等は、ACEの各部位の生体内での機能的役割を確立することのできる道具を供給するために、ACEの二つの活性部位を高度に選択的に識別することのできる阻害剤の開発を試みている。これに関して、臨床研究において今日まで使用されている全ての阻害剤は、混合ACE阻害剤、即ちACEの二つの仮性部位を同時にブロックする阻害剤であることを強調することが重要である。
【００１０】
ACEのＮ末端部位を選択的にブロックする第一の阻害剤であるRX407は、ホスフィン酸シュードペプチドであるが、これは最近開発された（参考文献[７]及び[８]）。この阻害剤は、ラット及びマウス内では代謝されないものであるが、更にまた、マウス内では生体内でペプチドN-アセチル Ser-Asp-Lys-Pro（Ac-SDKP）の分解を阻害することができる（参考文献[９]）。従って、RX407を注入すれば、ACEのＮ末端部位のブロックにより、Ac-SDKPの生体内分解が防止されるであろう。
【００１１】
この阻害剤は、前記動物において前臨床研究の対象を形成するが、これは、化学療法治療の際に造血組織を保護するためにその有用性を示す傾向がある。
【００１２】
しかしながら、ACEのＣ末端部位と本質的に相互作用することによってACEの二つの活性部位を識別することのできる阻害剤は、今日までに開示されていない。しかしながら、こうした阻害剤が入手可能となることが望ましい。その理由は、実験的及び臨床的研究におけるこれらの価値の他にも、これらは、標準的な混合ACE阻害剤に対して、ACEのＮ末端部位の活性、例えばペプチドAc-SDKPの代謝と関連する生理学的機能を妨げないという主要な利点を有するであろう。
【００１３】
ホスフィン酸ペプチドが、ACEが属するペプチダーゼ群である亜鉛金属ペプチダーゼを非常に強力に阻害することのできる化合物の一般的な群を表すことは、参考文献[９]乃至[１６]に見られるように証明されている。これらの化合物においては、PO2-基の役割はこれらの酵素の活性部位に位置する亜鉛原子と相互作用することである。
【００１４】
【化２】
2005522420.tif 000004
【００１５】
PO2-基の存在の他にも、残基P2、P1、P1'、およびP2'の化学的性質が、特定のホスフィン酸ペプチドと所定の亜鉛金属ペプチダーゼとの間の相互作用の選択性を保証するための決定的役割を果たす（参考文献[８]、[１２]、及び[１３]を参照のこと）。従って、P2、P1、P1'、およびP2'位にある非常に特定的な残基の存在によって、選択的な阻害剤を得ることが可能になり、これは所定の亜鉛金属ペプチダーゼのみを阻害する。こうした選択性は、これらの阻害剤の生体内での使用の状況において、必須の因子となりうる。特に、所定の阻害剤の生体内毒性は、主に、所定のターゲットに対する選択性が欠けていることによるのであろうことが推定される。
【００１６】
これらの原理により、ACEのＣ末端部位を選択的にブロックすることのできる阻害剤の探索は、ホスフィン酸化合物の群中から、ACEのＣ末端部位と選択的に相互作用する性能を阻害剤に付与する、P1、P1'、およびP2'位に位置する特定残基を同定することからなる。
【００１７】
この研究により、ホスフィン酸シュードペプチド中のシュードプロリン残基の存在が、ACEのＣ末端部位の選択的阻害剤を得るための必須の要因を構成するとの発見に至った。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
従って、本発明の一つの主題は、下式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのホスフィン酸シュードペプチド誘導体：
【化３】
2005522420.tif 000005
[式中、
・R2及びR3は、同一または相違し、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、下式の配列：
【化４】
2005522420.tif 000006
はまたPro(プロリン)残基を形成していてもよく、更に
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す]
の、アンギオテンシンＩ変換酵素のＣ末端部位を選択的に阻害することのできる医薬生成物の製造のための使用である。
【００１９】
この配列中、PO2基は、水素原子または薬理学的に許容されるカウンターイオン、例えばK+、Na+、NH4+、または他のあらゆる薬理学的に許容される金属もしくは非金属のイオンと会合してPO2-形態であって良い。水中では荷電した基は解離するため、カウンターイオンの性質は無関係である。
【００２０】
PO2基はまた、生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルの形態であっても良い。この場合は、シュードペプチドはプロドラッグタイプのものであり、且つエステルの生体内加水分解の後には、これはシュードペプチドの活性形態を生成する。
【００２１】
R5に使用して良いこのタイプの基は、特に参考文献[２０]に記載されている。
【００２２】
挙げることのできるこうした基の例は、下式に相当する基である。
【００２３】
【化５】
2005522420.tif 000007
【００２４】
これらの式中、t-Buは、tert-ブチル基を表す。
【００２５】
本発明の特定の実施態様の一つによれば、ホスフィン酸シュードペプチド誘導体は、下式（II）：
【化６】
2005522420.tif 000008
[式中、
R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2及びR3は、同一または相違し、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、下式の配列：
【化７】
2005522420.tif 000009
はまたPro残基を形成していてもよく、
・R4は、水素原子または薬理学的に許容されるカウンターイオンを表し、更に
・R5は、以上に定義される通りである]
に相当する。
【００２６】
上記式において、R2及びR3は天然もしくは非天然のアミノ酸、例えばシュードアミノ酸の側鎖を表す。
【００２７】
天然のアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ニトロフェニルアラニン、ホモアルギニン、チアゾリジン、及びデヒドロプロリンから選択して良い。
【００２８】
シュードアミノ酸は、アミノ官能基もしくはカルボニル官能基が別の化学基で置換されたアミノ酸と定義して良い。
【００２９】
上記式（II）において、R1基はペプチド化学におけるアミン官能基にとっての一般的な保護基であってよい。こうした保護基は、当業者には良く知られ、また示されており、例えば「有機合成における保護基」第２版、T.W.Green及びP.G. M. Wuts, John Wiley & Sons, Inc., 309-315頁[１７]と題される本にある通りである。本発明において使用して良いこうした基の例としては、アセチル基及びベンジルカルボニル基を挙げて良い。
【００３０】
R1はまた、上述のもの等の一般的な保護基でその末端アミノ官能基が保護された、天然もしくは非天然のアミノ酸またはペプチドを表しても良い。
【００３１】
本発明によれば、以下に見られるように、ACEのＣ末端活性部位に対する選択性を得るためには、シュードプロリン残基の存在が必須である。しかし、R2及びR3中に存在する側鎖の性質もまた、本発明によって使用される誘導体の、ACEのＮ末端及びＣ末端部位との相互作用の選択性において重要な役割を果たす。
【００３２】
ACEのＣ末端部位の阻害に関する優れた結果が、R2基がベンジル、メチル、またはフェニルエチル基を表す、すなわちフェニルアラニン、アラニン、及びホモフェニルアラニンの側鎖である、シュードペプチドを用いて得られている。
【００３３】
R3については、優れた結果は、R3がアラニン、アルギニン、またはトリプトファンの側鎖を表す場合に、または配列-NH-CH(R3)-CO-がPro残基を表す場合に得られている。
一般的に、R4及びR5は水素原子を表す。
【００３４】
本発明の好ましい実施態様の一つによれば、ホスフィン酸シュードペプチド誘導体は、下式に相当する。
【００３５】
【化８】
2005522420.tif 000010
【００３６】
本発明によって使用して良いホスフィン酸シュードペプチド誘導体は、アンギオテンシンＩ変換酵素のＣ末端活性部位を選択的に阻害することができ、したがって、ヒトの動脈圧及び心臓血管機能のホメオスタシスの制御における中心的な役割を担う、アンギオテンシンIIの生体内での生理学的濃度を制御できるが、ブラジキニンの代謝またはペプチドAc-SDKPの代謝を妨げることのないことが判明している。
【００３７】
従って、医薬生成物中における有効成分としてのこれらの使用は、ヒトの心臓血管病理、とりわけブラジキニンがあまり作用しないと考えられる、例えばアテローム性動脈硬化症などの病理の予防及び治療に多数の応用を見出すはずである。
【００３８】
その使用が本発明によって企図されるホスフィン酸シュードペプチド誘導体の中には、文献に記載されたことのないものもある。
【００３９】
したがって、本発明の主題はまた、式（Ｉ）のアミノ酸配列を含むホスフィン酸シュードペプチド誘導体であり、式中、
式中、
・R2は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、
・下式の配列：
【化９】
2005522420.tif 000011
はPro残基：
【化１０】
2005522420.tif 000012
を形成し、
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す。
【００４０】
これらの誘導体の中で、とりわけ好ましいのは、上記式（II）に相当するものであり、式中、
・R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、
・下式の配列：
【化１１】
2005522420.tif 000013
はPro残基：
【化１２】
2005522420.tif 000014
を形成し、
・R4は、水素原子または薬理学的に許容されるカウンターイオンを表し、更に
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す。
【００４１】
特に、好ましいホスフィン酸シュードペプチド誘導体は、下式：
【化１３】
2005522420.tif 000015
のものである。
【００４２】
本発明の主題はまた、上記の式（II）に相当する少なくとも１つのホスフィン酸シュードペプチド誘導体を含む薬理組成物であり、式中、
・R2は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、
・下式の配列：
【化１４】
2005522420.tif 000016
はPro残基：
【化１５】
2005522420.tif 000017
を形成し、
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す。
【００４３】
この組成物中では、ホスフィン酸シュードペプチド誘導体は好ましくは下式：
【化１６】
2005522420.tif 000018
に相当する。
上記の記載に関して、こうした薬理組成物は、とりわけヒトの様々な心臓血管病理の予防及び治療に多数の応用を見出すはずである。
【００４４】
上記式（II）に相当するホスフィン酸シュードペプチド誘導体であって、R4及びR5が水素原子を表すものは、以下の工程を含む方法を経て調製して良い。
１）式（III）：
【化１７】
2005522420.tif 000019
[式中、R1及びR2は上記定義通りである]
の化合物を、下式（IV）：
【化１８】
2005522420.tif 000020
[式中、Acはアセチル基を表し、Etはエチル基を表す]
の化合物と反応させて下式（V）：
【化１９】
2005522420.tif 000021
の化合物を得る工程；
２）化合物（V）を水素化ホウ素ナトリウムと反応させることによって、化合物（V）を化合物（VI）：
【化２０】
2005522420.tif 000022
に変換する工程；
３）化合物（VI）のヒドロキシル基を保護基R5、例えばアダマンチル基Adで保護して、下式（VII）：
【化２１】
2005522420.tif 000023
の化合物を得る工程；
４）化合物（VII）を鹸化して、下式（VIII）：
【化２２】
2005522420.tif 000024
の化合物を得る工程；
５）下式(VIII）の化合物を下式（IX）または（X）：
【化２３】
2005522420.tif 000025
[式中、
R3は上記の定義通りである]
のアミノ酸とカップリングさせる工程；更に
６）保護基Adを除去する工程。
【００４５】
この方法によれば、シュードプロリンを含む式（VIII）のホスフィン酸ブロックがまず合成され、その後このホスフィン酸ブロックの所望のアミノ酸とのペプチドカップリングが行われる。
【００４６】
有利には、ペプチドカップリング工程５）は、そのＮ末端がFmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）基で予め保護された、式（IX）または（X）のアミノ酸で置換された樹脂を固相として使用する固相ペプチド合成によって行われる。
【００４７】
必要であれば、式（II）においてR5が水素原子を表すシュードペプチドのホスフィン酸官能基は、その後適当な試薬と反応させることによってエステル化または塩化されていて良い。
【００４８】
エステル化は、式R5OH（式中、R5が生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す）のアルコールとのカップリングによって、例えば参考文献[２０]に記載の方法（方法Ａ）を用いて得てよい。
【００４９】
エステル化はまた、R5X（式中、R5が生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す）のハロゲン化物との反応によって行って良い。この反応は、参考文献[２０]に記載の方法（方法Ｂ）を用い、アルカリ条件下で行って良い。
【００５０】
このエステル化を実行する前に、シュードペプチドのカルボン酸官能基を、適当な保護基で保護するが、これは標準的な技術を用いて後に除去する。
【００５１】
式（II）（式中、R5が水素原子である）のシュードペプチドのホスフィン酸官能基を塩化して、この水素原子を薬理学的に許容されるカウンターイオンで置き換えることが望ましい場合には、シュードペプチドをこのカウンターイオンを含む適当な塩基、例えばNaOH、KOH、またはNH4OHと反応させる。
【００５２】
シュードペプチドの末端カルボキシル基を塩化するためには、水素原子を薬理学的に許容冴えるカウンターイオンで置き換えるために、同様の技術を使用して良い。
【００５３】
本発明の別の特徴は、本発明によるシュードペプチド誘導体を調製するための、及びこれらの特性を示すための実施例に関する以下の記載を、添付の図面を参照して読むに従って一層明らかになるであろう。
【００５４】
言うまでもないが、以下の記載は、例示目的で与えられるものであり、本発明の主題に如何なる限定を加えるものでもない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
ホスフィン酸シュードペプチドの合成を、図１に記載された合成スキームに従って行った。
【００５６】
この図は、下式（VIII）：
【化２４】
2005522420.tif 000026
[式中、
・R1はベンジルオキシカルボニル（Cbz）基を表し、
・R2は、フェニル基（化合物1a、3a、4a、5a、及び6a）、フェニルエチル基（化合物1b、3b、4b、5b、及び6b）、またはメチル基（化合物1c、3c、4c、5c、及び6c）である]
の合成素子を生じる方法の工程を示す。
【実施例】
【００５７】
（実施例１：化合物6aの調製）
１）化合物1aの調製
このアミノホスフィン酸酸誘導体を、Baylis[１８]に記載の操作に従って調製すると、Baylis[１８]に報告されるプロトコルによる再結晶を経て、Ｒ配置のエナンチオマーが得られる。
【００５８】
２）化合物2aの調製
この化合物は、Villierasら[１９]によって発表された操作に従って得られる。得られる生成物をNMRによって特徴付けた。
（NMR1）
2005522420.tif 000027
【００５９】
３）化合物3aの調製
化合物1a（3.2g、10mmol）とヘキサメチルジシラザン（10.5mL、50mmol）とのアルゴン気流下の混合物を、１１０℃にて３時間に亘って加熱する。化合物２（5.5g、12mmol）をこの温度で加え、この溶液を４時間に亘り９０℃にて撹拌する。この溶液を７０℃に冷却し、ここに10mLの無水エタノールEtOHを滴下し、この号物を７０℃で３０分間に亘り撹拌する。溶媒を蒸発除去した後、残渣を５％のNaHCO3（10mL）及び5mLのヘキサン中に溶解させる。酢酸エチルEtOAcで３回抽出（３×５mL）した後、溶媒を蒸発除去して、粗製生成物を得る。クロロホルム／メタノール／酢酸の混合物（７／０．３／０．３）を移動相として使用してシリカカラムで精製すると、4gの純粋化合物3aが、白色固体の形態で得られる（収率89%）。
【００６０】
この生成物のNMR特徴付けは、COSY、TOCSY、及びHMQC試験に基づく。
（NMR2）
2005522420.tif 000028
【００６１】
I及びIIの表示は、別々のジアステレオ異性体に相当する。
【００６２】
（元素分析）
理論値：
C：61.80%、H：6.27%、N：3.00%。
実測値：
C：61.89%、H：6.23%、N：2.98%。
【００６３】
４）化合物4aの調製
化合物3a（1.4g、3.06mmol）及びNiCl2/6H2O（1.09g、9.2mmol）を、ＴＨＦ（12.4mL）／メタノール（73.7mL）の混合物中に溶解させる。NaBH4(0.58g、15.4mmol)をこの溶液に少量ずつ、−３０℃にて３０分間に亘って添加する。この混合物を更に１０分間−３０℃にて撹拌する。溶媒を蒸発除去し、生成物をEtOAc（25mL）及び１ＮのHCl（20mL、pH1）の混合物で抽出する。
【００６４】
有機相を回収し、水（10mL）で洗った後にNa2SO4で乾燥させる。溶媒を蒸発除去した後、生成物を、クロロホルム／メタノール／酢酸の混合物（７／０．３／０．３）を移動相として使用してシリカカラムで精製する。1.28gの化合物4aが得られる（収率91%）。
【００６５】
ネガティブモード質量スペクトルによる分析（実測質量MH-＝458.48、理論質量＝459.47）は、化合物4aの化学構造にしたがうものである。
【００６６】
（元素分析）
理論値：
C：61.78%、H：6.63%、N：3.00%。
実測値：
C：61.98%、H：6.31%、N：3.08%。
【００６７】
５）化合物5aの調製
化合物4aのアダマンチル化を、Yiotakisら[１４]によって記載されるプロトコルに従って行う。
【００６８】
1-アダマンチルブロミド（538mg、2.5mmol）およびAg2O（577mg）を、５等分に分け、１時間かけて化合物4a（1.03g、2.24mmol）のクロロホルム中の溶液に加える。２時間後、0.5当量のAdBrと0.5当量のAg2Oとを加え、混合物を１０時間還流させる。溶媒を蒸発除去した後、粗製生成物を、クロロホルム／イソプロパノールの混合物（９．８／０．２）を移動相として使用してシリカカラムで精製する。化合物5aが、純粋形態で、９６％の収率で得られる（1.27g）。
質量スペクトルによる分析（ポジティブモード）：実測質量MH+＝594.21、理論質量＝593.1。
【００６９】
（元素分析）
理論値：
C：67.76%、H：7.53%、N：2.32%。
実測値：
C：67.49%、H：7.58%、N：2.24%。
【００７０】
６）化合物6aの調製
メタノール（20mL）中の化合物5a（1.1g、1.85mmol）を希釈した後、４ＮのNaOHを2mL加える。６時間撹拌した後、反応をTLCでモニターすることにより出発物質の鹸化の完了を確認する。溶媒を蒸発除去した後、生成物を水の混合物（10mL）にとり、次いでEtOAc（15mL）を添加し、更に1NのHClを用いてpH1に酸化する。残渣を有機相にとり、抽出操作を二度繰り返す。混合有機相をNa2SO4で乾燥させ、溶媒を蒸発除去する。純粋化合物6aが、収率９４％で得られる（0.98g）。
質量スペクトル（ポジティブモード）による分析（実測質量MH+＝566.15、理論質量＝565.26）。
【００７１】
（元素分析）
理論値：
C：67.95%、H：7.13%、N：2.48%。
実測値：
C：67.64%、H：7.30%、N：3.08%。
【００７２】
（実施例２：化合物6bの調製
[１８]に記載の操作に従って調製される化合物1bから出発し、実施例１と同様の操作に従って、化合物6bを調製する。
化合物6bの質量スペクトルによる分析により、以下の結果を得た：理論質量＝579.27、実測質量MH+＝580.29。
【００７３】
（実施例３：化合物6cの調製）
[１８]に記載の操作に従って調製される化合物1cから出発し、実施例１と同様の操作に従って、化合物6cを調製する。
化合物6cの質量スペクトルによる分析により、以下の結果を得た：理論質量＝489.23、実測質量MH+＝490.11。
【００７４】
（実施例４：下式のシュードペプチドＧの調製）
【化２５】
2005522420.tif 000029
【００７５】
このシュードペプチドを、固相ペプチド合成の標準的プロトコルを使用して固相上で合成した。Fmoc-Trp（732mg、0.58mmol）で置換したWang樹脂を、N-メチルピロリドンNMP（5mL）中に懸濁させ、５分間撹拌する。濾過によりNMPを除去した後、NMP中20%の濃度で10mLのピペリジンを添加し、混合物を１５分間撹拌する。濾過の後、該樹脂を以下の溶媒で洗う：NMP（７×10mL）、CH2Cl2（３×10mL）、及びEt2O（２×10mL）。その後、2mlのNMP、ジイソプロピルエチルアミンDIEA（749mg、5.76mmol）およびNMP（2mL）中に希釈した化合物6a（360mg、0.64mmol）及び2-(1H)ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートHBTU（730mg、1.92mmol、3mLのNMP中に希釈）を、反応容器に加える。混合物を２４時間撹拌する。濾過の後、樹脂をNMP（４×７mL）及びCH2Cl2（５×７mL）で洗う。トリフルオロ酢酸TFA／CH2Cl2／H2O／トリイソプロピルシラン（９０／７．５／１．２５／１．２５）溶液を反応容器に加え、混合物を３時間に亘って撹拌する（脱保護相）。濾過の後、シュードペプチドＧを含有する濾液を回収し、溶媒を蒸発除去して生成物をH2O中に溶解させる。凍結乾燥させた後、シュードペプチドＧを逆相HPLCによって精製する（Vydacカラム、C18、半調製）。
【００７６】
図２は、得られたクロマトグラムを示す。この図中には、シュードペプチドＧ中に存在する４つのジアステレオ異性体に相当する４つのピークが観察される（これら４つのピークは同一の質量スペクトルを有する。実測質量MH+＝618.23、理論質量＝617.23）。ピーク１のみがACEに対して阻害力を示す。
【００７７】
シュードペプチドＧのNMR特徴付け、ピーク１HPLCは、COSY、TOCSY、及びHMQC試験に基づく。
（NMR3）
2005522420.tif 000030
【００７８】
（実施例５乃至７：下式のシュードペプチドＢ、Ｃ、及びＤの調製）
【化２６】
2005522420.tif 000031
【００７９】
【化２７】
2005522420.tif 000032
【００８０】
シュードペプチドＢ、Ｃ、及びＤを、アラニン（Ｂ）、プロリン（Ｃ）、およびアルギニン（Ｄ）で置換したWang樹脂を用い、シュードペプチドＧの調製のために記載したプロトコルを使用して固相上で合成した。これらのシュードペプチドのＨＰＬＣ精製により、ACEを阻害することのできるこれらシュードペプチドのジアステレオ異性体を単離することができた。
【００８１】
質量スペクトルによるシュードペプチドの分析により、これらのシュードペプチドの構造が確認される。
シュードペプチドＢ：理論質量502.19；実測質量503.21。
シュードペプチドＣ：理論質量528.53；実測質量529.11。
シュードペプチドＤ：理論質量587.25；実測質量587.24。
【００８２】
（実施例８及び９：下式のシュードペプチドＥ及びＦの調製）
【化２８】
2005522420.tif 000033
【００８３】
シュードペプチドＥ及びＦは、化合物6b及び6cから出発して、シュードペプチドＧの調製について記載されたプロトコルに従う、固相合成を経て得られる。逆相C18HPLCによる精製の後、これらシュードペプチドのそれぞれについて回収された第一フラクションはACEを阻害可能であることが判明した。
【００８４】
質量スペクトルによるシュードペプチドの分析により、以下の結果が得られた。
シュードペプチドＥ：理論質量541.20；実測質量542.26。
シュードペプチドＦ：理論質量631.24；実測質量632.26。
【００８５】
（実施例１０：ACEのＮ末端及びＣ末端部位に対する、シュードペプチドＡ乃至Ｇの阻害定数の測定）
ヒトの組換えACEを、この測定に使用する。シュードペプチドＡ乃至Ｇを用いる、ACEの阻害の曲線は、クエンチした蛍光基質Mca-Ala：Mca-Ala-Ser-Asp-Lys-DpaOH（Mca：7-メトキシ-クマリン-2-酢酸；DpaOH：N-3-（2,4-ジニトロフェニル）-L-2,3-ジアミノプロピオニル）を使用して得られる。
【００８６】
シュードペプチドＡ乃至ＧそれぞれのＨＰＬＣによる精製の際に回収された第一フラクション（シュードペプチドＧについて、図２のピーク１）を、これらの試験のために使用する。
【００８７】
各シュードペプチドＡ乃至Ｇについて、この基質を用いて得られる阻害プロフィールから、Diveら[８]によって記載の操作に従って定数Ki Ｎ及びKi Ｃを決定することが可能である。
【００８８】
阻害実験を、25℃、pH6.8、50mM HEPES、10mM、CaCl2、200mM NaClにて行った。
【００８９】
比較の目的のために、シュードプロリン残基を含まないシュードペプチドＡを用いて同一の試験を行った。得られた結果を表１にも記載する。このシュードペプチドは、Yiotakisら[１４]により記載のようにホスフィン酸ブロックZPhe[PO(OAd)-CH2]AlaOHから調製し、次いで残基Fmoc-Alaで置換したWang樹脂にこのブロックをカップリングさせた。
【００９０】
ACEに対するシュードペプチドＡ乃至Ｇの阻害効果の研究及び、ACEのＮ末端部位（Ki N）及びＣ末端部位（Ki C）に対するこれらの親和性の比較（表１）により、下記の結論を導き出すことができる。
【００９１】
１°）シュードペプチドＡ及びＢ
ACEの二つの活性部位に対する親和性に関しては、シュードプロリン残基の存在はシュードアラニン残基の存在よりも格段に好ましくないようである。その一方で、これらのホスフィン酸シュードペプチドのP1'位にシュードプロリン残基が存在することにより、ACEのＣ末端部位の選択的阻害が容易になる。
この結果は、ACEのＣ末端部位に対する阻害剤の選択性を制御する、シュードプロリン残基の本質的な役割を示す。
【００９２】
２°）シュードペプチドＢ、Ｃ、Ｄ、及びＧ
アラニン、プロリン、アルギニン、及びトリプロファン残基を用いたP2'位の修飾は、この位置での側鎖の性質もまた選択性にとっての本質的要因であることを示す。プロリン残基が存在すれば（シュードペプチドＣ）、強力だが選択性が僅かなACEのＮ及びＣ部位の阻害剤を発生する。その一方で、トリプトファン残基の存在により、ACEのＣ末端部位の非常に選択的な阻害剤（シュードペプチドＧ）を得ることが可能になる。
【００９３】
３°）シュードペプチドＥ及びＦ
シュードアラニンまたはシュード-ホモ-フェニルアラニン残基による、シュードペプチドのP1でのシュードフェニルアラニン残基の置換によれば、シュードペプチドＧよりも力が弱く選択性も低いシュードペプチドが得られる。この最後の結果は、選択性に関する阻害剤のP1位の重要性がより低いことを示す。
【００９４】
シュードペプチドＡ乃至Ｇの研究により、本発明のシュードペプチドにおいては、P1、P1'、及びP2'の各位置が相互作用の選択性に関与していると結論することができる。シュードフェニルアラニン、シュードプロリン、及びトリプトファン残基がシュードペプチドＧ中に存在することにより、とりわけ著しい選択性が得られる。
【００９５】
（実施例１１：シュードペプチドＧの生体内特性の証明）
アンギオテンシンＩのアンギオテンシンIIへの変換を阻害する、シュードペプチドＧの性能を検査し、また一方ではブラジキニンの、他方ではペプチドAc-SDKPの開裂に対するその作用を検定するために、生体内研究を行う。
【００９６】
１）研究プロトコル
この研究を、それぞれ体重が２０乃至２３gのオスのC57BL6/Jマウス（Iffa Credo）のバッチ（各バッチは６匹のマウスを含む）に行う。
【００９７】
このために、マウスに、体重１kgあたり80mgの投薬量でのナトリウムペントバルビタール（Sanofi）の腹腔内投与によって麻酔をかける。右の頸動脈を単離し、カテーテル（PE10、0.28×0.61、A-M Systems, Inc.）をこの動脈に挿入して血液サンプルの採取を行い、その一方では別のカテーテル（FEP、0.12×0.67、Carnegie Medecin）を同側の頸静脈に挿入して前記物質の投与できるようにする。実験の間中、マウスの体温は３８°に維持する。
【００９８】
第一工程において、同一バッチのマウスに、灌流によって３０分間に亘り、以下のいずれかの投与を行う：
・体重1kgあたり０．９、３、１０、または３０mgの投与量に相当するシュードペプチドＧの量を含有し、pH7に調整された、５０μLの等張性溶液、または
・５０μLの生理食塩水、あるいはまた
・体重1kgあたり１０mgの投与量に相当するペリンドプリル（この物質はACEの強力な混合阻害剤である（Servier））の一定量を含有する、５０μLの溶液。
【００９９】
次いで、ボーラスとして以下のいずれかを投与する：
・５０μLの等張性溶液中に、２μgの非標識アンギオテンシンＩ及び２１μCiの3H-アンギオテンシンＩを含む混合物、または
・５０μLの等張性溶液中に、２μgの非標識Ac-SDKP及び１７μCiの3H-Ac-SDKPを含む混合物、または
・５０μLの等張性溶液中に、２μgの非標識ブラジキニン及び１１μCiの3H-ブラジキニンを含む混合物。
【０１００】
約５０μlの動脈血のサンプルを、マウスにアンギオテンシンＩ混合物またはブラジキニン混合物を注射した３０、６０、及び９０秒後に、これら混合物を受容したマウスから採取し、また、マウスにAc-SDKP混合物の注射の開始から１、５、１０、及び１５分後にこの混合物を受容したマウスから採取する。いずれの場合においても、血液は、予め計量し、４０μLの水、１０μLの８０％TFA、及び１μLのヘパリンを入れたポリプロピレン試験管に回収する。採取した血液の正確な量を、前記試験管を再計量することによって決定する。１９５μLの蒸留水を加えた後、これらの試験管をアイスバス中に１０分間置き、その後サンプルを４℃にて遠心分離にかけて血漿抽出物を得る。
【０１０１】
これら抽出物の分析を、放射性元素検出器（Z 500-4 cell, Berthold）に接続したHPLC系（Perkin Elmer 200）を使用する液体クロマトグラフィーによって行う。クロマトグラフィーによる分離は、５０μLのサンプルの注射により、また下記の移動相及び勾配溶離を使用して、Kromasil C18カラム（AIT）上で行う。
【０１０２】
・アンギオテンシンＩ分析：
移動相：
溶媒Ａ：CH3CN/H2O/TFA（１０／９０／０．１）
溶媒Ｂ：CH3CN/H2O/TFA（９０／１０／０．１）
勾配溶離：
0-30分：0-30%  Ｂ
30-35分：30-100%  B
【０１０３】
・ブラジキニン分析：
移動相：
溶媒Ａ：CH3CN/H2O/TFA（１０／９０／０．１）
溶媒Ｂ：CH3CN/H2O/TFA（９０／１０／０．１）
勾配溶離：
0-30分：0-25%  Ｂ
30-35分：25-100%  B
【０１０４】
・Ac-SDKP分析：
移動相：
溶媒Ａ：H2O/TFA（１０／９０／０．１）
溶媒Ｂ：CH3CN/H2O/TFA（９０／１０／０．１）
勾配溶離：
0-30分：0-30%  Ｂ
30-35分：30-100%  B
【０１０５】
溶離されたピークを、その滞留時間を非標識の基質（アンギオテンシンＩ、ブラジキニン、及びAc-SDKP）によって、また予期される開裂生成物（アンギオテンシンII、BK（1-7）、及びBK（1-5））によって示される滞留時間との比較によって同定する。
【０１０６】
アッセイは、クロマトグラムの対応するピークの下の領域の積分によって行う。こうして得られる値を、各マウスから採取した血液の重量の関数として正規化する。
【０１０７】
結果の統計的比較を、非パラメータMann-Whitney U試験によって行う（Statview5 ソフトウェア）。
【０１０８】
２）結果
図３は、棒グラフの形態で、体重1kgあたりシュードペプチドＧを０．９、３、１０、及び３０mg受容したマウス（それぞれ棒グラフ０．９、３、１０、及び３０）の場合に得られる、アンギオテンシンII／アンギオテンシンＩ比の平均±SD値、更にまた、コントロールマウス（棒グラフＴ）、すなわち、５０μlの生理食塩水を受容したマウスにおいてこの同一の比について得られる平均±SD値を示す。この図においては、コントロールマウスとの比較により、＊はｐ＜０．０５に相当し、＊＊はｐ＜０．０１に相当する。
【０１０９】
図３は、シュードペプチドＧはアンギオテンシンIIへのアンギオテンシンＩの開裂を生体内で阻害することができ、またこの阻害が投薬量依存性であるという事実を示す。然るに、コントロールマウスにおいて測定されるアンギオテンシンII／アンギオテンシンＩ比は、体重１kgあたり0.9mgのシュードペプチドＧで処理したマウスの場合には５０％、体重１kgあたり30mgのシュードペプチドＧで処理したマウスの場合には９０％、低減される。
【０１１０】
図４は、棒グラフの形態で、体重１kgあたり0.9mgのシュードペプチドＧを10mg受容したマウスの場合（棒グラフＧ）、及びコントロールマウスの場合（棒グラフＴ）（すなわち体重１kgあたり１０mgのペリンドプリルを受容したマウスの場合である）に得られる、ブラジキニンの保護の平均±SDパーセンテージを示す。この図中では、コントロールマウスとの比較により、＊＊はｐ＜０．０１に相当する。
【０１１１】
図４に見られるように、任意に１００％に固定したペリンドプリルによるブラジキニンの保護の平均的程度については、この保護の程度は体重1kgあたり１０mgのシュードペプチドＧを受容したマウスの場合には９．２％のみである。然るにこのシュードペプチドは、生体内でのブラジキニンの開裂を非常に穏やかに防止できるのみのようである。  
【０１１２】
図５もまた棒グラフの形態で、体重1kgあたりシュードペプチドＧを１０mg受容したマウスの場合（棒グラフＧ）、及びコントロールマウスの場合（棒グラフＴ）、すなわち、５０μlの生理食塩水を受容したマウスの場合に得られる標識した外因性Ac-SDKPペプチドの平均±SD血液濃度（血液のpmol/gで表示）を示す。この図中では、コントロールマウスとの比較により、＊＊はｐ＜０．０１に相当する。
【０１１３】
図５はまた、比較の目的のために、体重1kgあたり10mgのシュードペプチドRX407（参考文献[７]および[８]にACEのＮ末端部位の選択的阻害剤として記載）で処理し、同一の操作プロトコルに従うマウスの場合（棒グラフＲ）の、標識した外因性Ac-SDKPペプチドの平均±SD血液濃度を示す。
【０１１４】
図５に示されるように、シュードペプチドＧは、体重1kgあたり１０mgの投薬量では、ペプチドAc-SDKPの開裂に何ら著しい効果を持たないように見えるが、その一方でRX407は、このペプチドの血漿含量を、コントロールマウスの場合に観察されるものの１６倍増大させる。
【０１１５】
このように、生体内において、シュードペプチドＧは、ブラジキニンの分解を全く妨げることなく、またペプチドAc-SDKPの分解についてはさらになく、アンギオテンシンＩのアンギオテンシンIIへの変換を非常に有効に阻害する。
【表１Ａ】
2005522420.tif 000034
【表１Ｂ】
2005522420.tif 000035
（参考文献）
2005522420.tif 000036
2005522420.tif 000037
2005522420.tif 000038
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、本発明によるホスフィン酸シュードペプチドの調製のために有用な合成素子の合成を示す図である。
【図２】図２は、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によるシュードペプチドＧの精製の際に得られるクロマトグラムを示す図である。
【図３】図３は、アンギオテンシンＩのアンギオテンシンIIへの開裂に対するシュードペプチドＧの生体内効果を示す図である。
【図４】図４は、ブラジキニンの開裂に対するシュードペプチドＧの生体内効果を示す図である。
【図５】図５は、ペプチドAc-SDKPの開裂に対する、シュードペプチドＧとPRX407との生体内効果（ACEのＮ末端部位の選択的阻害）を示す図である。
【図１】
2005522420.tif 000066
【図２】
2005522420.tif 000067
【図３】
2005522420.tif 000068
【図４】
2005522420.tif 000069
【図５】
2005522420.tif 000070
【国際調査報告】
2005522420.tif 000071
2005522420.tif 000072
2005522420.tif 000073
2005522420.tif 000074
2005522420.tif 000075
2005522420.tif 000076