(57)【要約】  本発明は、一つもしくはそれ以上の未反応の二重結合を含む多孔性ポリマー性多糖支持体の後修飾のための方法であって、その方法がポリマー性支持体を少なくとも一つのグラフト化化合物を含む液相と接触させることおよび得られた混合物においてフリーラジカル反応を開始することを含み、そこではグラフト化化合物が、任意に一つもしくはそれ以上のヘテロ原子を含むところの、直線状もしくは環状の炭素鎖に結合される反応性基としての二重結合より成る、方法に関する。有利なグラフト化化合物はビニルエーテルもしくはヒドロキシビニルエーテルである。本発明はまた本発明にしたがう方法により後修飾されているポリマー性支持体ならびに、例えばクロマトグラフィーにおける、そのような支持体の使用を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つもしくはそれ以上の未反応の二重結合を含む多孔性ポリマー性多糖支持体の後修飾のための方法であって、その方法は、
(ａ)ポリマー性支持体を、少なくとも一つのグラフト化化合物を含む液相と接触させること；
(ｂ)工程(ａ)から得られた混合物において当該ポリマー性支持体上の一つもしくはそれ以上の二重結合およびグラフト化化合物上の一つもしくはそれ以上の反応性基の間で、フリーラジカル反応を開始すること、ならびに任意に
(ｃ)ポリマー性支持体を洗浄して、過剰のグラフト化化合物を除去すること；
の工程を含み、
そこでは少なくとも一つのグラフト化化合物が、下の一般式(Ｉ)：
【化１】
2005510593.tif 000004
[式中、
Ｒ＝一つもしくはそれ以上のヒドロキシル、アミン、カルボニル、エーテル、もしくは酸素で任意に置換されている、Ｃ１−Ｃ３０のアルキル鎖；
Ｒ'＝ＨもしくはＣＨ３；
Ｒ"＝Ｃ０−Ｃ３０のアルキル基もしくは酸素；そして
Ｘ＝Ｏｎ、｛式中、もしＲ"が酸素であるならば、そのときはｎは０であって、そしてもしＲ"がアルキル鎖であるならば、そのときはｎは１であるという条件で、ｎは０〜１の整数である｝]
によって表される、方法。
【請求項２】
多孔性ポリマー性多糖支持体が化学的に交差結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多糖上に存在する反応性二重結合が官能性エポキシドによるその処理によって提供される、請求項１もしくは２に記載の方法。
【請求項４】
支持体が一つもしくはそれ以上の粒子より成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程(ｂ)が加えたグラフト化化合物をポリマー性支持体に重合させるに十分な量にてフリーラジカル開始剤を添加することにより実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
式(Ｉ)において、ＲがＣ１−Ｃ１０のアルキル鎖であり、Ｒ'はＨであり、Ｒ"はＯでありそしてｎは整数０である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
式(Ｉ)において、ＲがＣ１７アルキル鎖である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
式(Ｉ)において、ＲがＣ１−Ｃ１０アルキル鎖であり、Ｒ'はＨであり、Ｒ"はＣＨ２でありそしてｎは整数１である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも一つのグラフト化化合物が一つもしくはそれ以上の親水基を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、その方法が当該親水基(複数を含む)の誘導体化のためのさらなる工程を含む方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、少なくとも一つのグラフト化化合物が反応性二重結合に加えて一つもしくはそれ以上の官能基を含み、その官能基がそのように修飾された支持体の表面上のリガンドとして利用可能である、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項において定義される後修飾の方法を含み、異なる疎水性の少なくとも二つのグラフト化化合物が用いられる、分離媒体に予め決められた疎水性を与えるための方法。
【請求項１２】
第一のグラフト化化合物がヒドロキシアルキルビニルエーテルでありそして第二のグラフト化化合物がビニルアルキルエーテルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第一のグラフト化化合物が式(Ｉ)によって表わされそして第二のグラフト化化合物が第一のグラフト化化合物よりも低いもしくは高い疎水性の官能性モノマーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に従って作成される後修飾されたポリマー性支持体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の後修飾された多孔性ポリマー性多糖支持体のクロマトグラフィーにおける使用。
【請求項１６】
請求項１４に記載の後修飾された多孔性ポリマー性多糖支持体を含むクロマトグラフィーカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、特にクロマトグラフィーで使用するための、多孔性ポリマー性支持体の分野に関する。さらに特異的には、本発明は、クロマトグラフィーのような、分離の応用において用いられるとき、大いに改良された性質を持つ支持体をもたらす、そのような支持体の後修飾の新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
種々の分離の応用において有用な多孔性ポリマー性支持体を作成するための多くの方法が、合成的もしくは天然モノマーの懸濁重合のように、今日公知である。そのように作成された支持体の性質を改善するために、種々の戦略がまた、それらの表面の修飾のために提案されてきた。そのような表面修飾は、例えば、支持体の利用可能な表面積を増大させるために実施されて、クロマトグラフィーのためのリガンドによるその後の誘導体化を容易にし、その疎水性／親水性表面等を修飾し得る。
【０００３】
親水性ポリ(ビニルエーテル)が陽イオン重合により重合されて、続いてアガロースのような多孔性ポリマー性支持体の表面に結合される、一つのそのような表面修飾が、ＷＯ  ９５／１３８６１(Ericsson et al)で提案されている。開示された方法は必然的に、重合以前にビニルエーテルモノマーのヒドロキシル基を保護する工程および得られたポリマー中のその脱保護のための対応する工程を含む。かくして、記述された方法の欠点は、表面−修飾された生成物を得るために必要とされる多数の方法工程である。
【０００４】
クロマトグラフィーで普遍的に使用可能である、分離物質を開発するために、クロマトグラフィー支持体をグラフトすることは、ＥＰ  ０  ３３７  １４４(Merck Patent Gesellschaft mit beschraenkter Haftung)から、公知である。グラフト化は、通例のレドックス重合の過程で実施される。支持体粒子の細孔表面上にラジカル部位を形成するためには、セリウム(ＩＶ)イオンが重合触媒として利用される。かくして、ＥＰ  ０  ３３７  １４４の一つの目的は、公知物質と比較して溶解能力を改善することであって、それは、その支持体が共役結合的に結合されたポリマーでコーティングされているところの、ヒドロキシ基を含有する支持体に基づく親水性分離の使用により得られる。さらに特異的には、ポリマーは、ヒドロキシ基のα‐Ｃ原子において発生されたラジカルを介して支持体に結合されて、それ故にこの種類のグラフト化は、“からのグラフト化”原理を代表する、例えば、P F Rempp, P J Lutz: Comprehensive Polymer Science vol. 6, pp 403-421, Eds. G. Allen et al, Oxford 1989、を参照されたい。この技法は、支持体表面上における限定された数のラジカルによる重合の開始に基づいて、したがって例えば酸素による停止に対し感受性である。好ましいモノマーは、高い増殖速度を持つモノマーであって、それは典型的には、また本出願中で述べられるものであるところの、アクリルアミド、アクリル酸エステルもしくはメタクリル酸エステルのモノマーを意味する。
【０００５】
ＵＳ  ５,９２９,２１４(Peters et al)は、細孔がグラフト化される温度‐応答性ポリマーおよびコポリマーを含有する、多孔性合成ポリマーモノリスを開示する。これらのモノリスは、熱性ゲートもしくは熱性バルブとしての用途に特に適する。このようなモノリス中の細孔は、直径が約６００ｎｍより大であって、それ故にポリマーは、そのようなマクロ細孔を閉塞するに十分なサイズのものである必要がある。細孔の支持体上にグラフトされる熱的応答性ポリマーを形成するための適当なモノマーは、公知であって、窒素原子上で弱い疎水基で置換されたアクリルアミドおよびメタクリルアミド、ビニルカプロラクタム、メチルビニルエーテル、３‐ヒドロキシプロピルアクリル酸エステル、酢酸ビニル、２‐(Ｃ置換２〜Ｃ置換６)‐アルキル‐１‐ビニルオキサゾリン、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ならびに、ここで生じたポリマーの熱的応答性を妨害しないところの共重合可能なコモノマーとのそれらのコポリマー、が含まれる。適当なコモノマー、例えば、Ｎ‐アルキルアクリルアミドとのメチレンビスアクリルアミド、を用いて、交差結合および制御可能な膨潤性もしくは他の望ましい性質を付与し得る。５,９２９,２１４にしたがって生産されるポリマーは、それらの低臨界溶液温度(ＬＣＳＴ)以下における第一の構造から、それらのＬＣＳＴ以上における第二の構造へと、迅速かつ可逆的な相転移を受けて、それ故に“熱‐収縮”ポリマーと呼ばれる。
【０００６】
Dhal等(Dhal, Pradeep K.; Vidyasankar, S.; Arnold, Frances H. Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, Pasadena, CA, USA. Chem. Mater. (1995), 7(1), 154-62)は、マクロ孔質ポリ(トリメチロールプロパントリメタクリル酸エステル)への機能性ポリマーの表面グラフト化を開示している。機能性モノマーのタイプは、元来のマトリックスの物理的性質を保持するために、選択される。
【０００７】
ＵＳ  ５,８６５,９９４(Dionex Corporation)は、陽イオンとの複合体の形成を許容するところのクラウンエーテル官能基および陽イオンとの電荷相互作用の能力のあるところの非‐クラウンエーテル陽イオン‐交換官能基より成る、二官能性陽イオン‐交換組成物を開示する。好ましい非‐クラウンエーテル官能性基は、スルホン酸エステル、カルボン酸エステルおよびホスホン酸エステル基である。ＵＳ  ５,８６５,９９４では、無水マレイン酸およびエチルビニルエーテルがマクロ孔質ポリマー性樹脂上にグラフトされている、標準的陽イオン−交換樹脂の比較例が、提供されている。クロマトグラフィーの分野においては、用語“マクロ孔質”は、湿潤状態においてのみ多孔性であるところのゲル多孔性粒子と較べて、乾燥もしくは湿潤状態の両方において多孔性であるところの粒子に対して用いられる。第一のグループの例は、例えば、ジビニルベンゼンおよびスチレンのような合成的ポリマーであり、一方では後者は、アガロースのような、種々の多糖類によって例示され得る。この文脈では、ビニルエーテルは一般には、単独モノマーとして極めて重合し難いことが、周知である。表３‐１においてビニルエーテルのファミリーは、ラジカル重合に対して−(マイナス)と評価されている、例えば“重合の原理”第三版、page 200, Author: George Ordian, and publisher: John Wiley & Sons, Inc.、を参照されたい。しかしながら、上で議論されかつＵＳ  ５,８６５,９９４中で提供されている比較例では、エチルビニルエーテルが電子供与体として働くであろう一方で、無水マレイン酸が電子受容体として働くであろうので、重合が可能である。
【０００８】
最後に、不飽和基および親水性ドメインを含む疎水性ドメインを含むところの、親水性‐コーティング化支持体を形成することが、ＵＳ  ５,５０３,９３３から公知である。親水性コーティング剤は、ジビニルベンゼンで交差結合されたポリスチレンのような、疎水性ポリマーに、例えば、共役結合的に付加され得る。記述されたコーティングの目的は、疎水性支持体をマスクし、そして高低の極端なｐＨにおいて化学的に安定であるところのポリマーを提供することである。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明の一つの目的は、以前に用いられた方法と比較して、時間的必要性および複雑性に関して単純化されるところの、ポリマー性多孔性多糖支持体の後修飾の方法を提供することである。これは、請求項１および従属の請求項において説明されるように、支持体上に存在する未反応の二重結合を介して比較的短いポリマー鎖をグラフト化することにより達成される。かくして、グラフト化化合物は、例えば、支持体の表面上でラジカル重合によりインシツで重合される、ビニルエーテルであり得る。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、その頑健性が先行技術の方法と比較して改良されているところの、ポリマー性多孔性多糖支持体の後修飾のための方法を提供することである。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、クロマトグラフィーで用いられるとき、改善された機械的安定性およびその結果改善された流動的性質を示す支持体をもたらすところの、上述のような交差結合した多糖支持体の後修飾の方法を提供することである。
【００１２】
本発明のなおもう一つの目的は、その方法が特異的な性質を持つ種々の異なる支持体のデザインに関して、改善された多用性を提供するところの、上述の交差結合した多糖支持体の後修飾の方法を提供することである。本発明の特異的な目的は、その方法が先行技術の方法より少ない方法工程においてそのような種々の支持体を提供し得るところの、上で説明したような交差結合した多糖支持体の後修飾の方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、立体障害効果が減少される、クロマトグラフィーのマトリックスとして有用なポリマー性多孔性支持体を提供することである。これは、用いられるグラフト化化合物が、より大きな細孔を拡散移動に対して開放されたままに放置しながら、ミクロ細孔を本質的に遮断するのに適当な長さの鎖を提供する、上のようなポリマー性多孔性支持体の後修飾により達成される。
【００１４】
本発明のなおもう一つの目的は、先行技術の支持体と比較して、改良された分解能を示すところの、クロマトグラフィーのマトリックスとして有用なポリマー性多孔性多糖支持体を提供することである。そのような支持体は、その方法がカラム効率および選択性の両方を改良し得るところの、上で説明された後修飾の使用により提供される。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、その方法が当該支持体において得られる疎水性および親水性の程度に関して強化された柔軟性を許容するところの、多孔性ポリマー性多糖支持体の後修飾の方法を提供することである。例えば、グラフト化化合物として、親水性ビニルエーテルのような、親水性モノマーを用いることにより、支持体は親水性にさせられる。そのような親水性支持体は、ひいては望ましくない非特異的疎水相互作用が本質的に無くなるであろうところの、イオン交換体、親和性クロマトグラフィー樹脂等の製造において使用され得る。
【００１６】
これに代えて、もし、例えば、疎水性のビニルエーテル、またはスチレンもしくはスチレン誘導体が、一つのグラフト化化合物として用いられるならば、自然に本質的に疎水性であるところの支持体が得られるであろう。かくして、後修飾の新規な方法において用いられるグラフト化化合物を適当に選択することにより、そのように修飾された支持体の疎水性の程度が、容易に制御される。その結果、疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)において有利に用いられる支持体の作成が、本発明により可能となる。
本発明の他の目的および利点は、後続するところの詳細な開示ならびに付随する請求項から現れるであろう。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１は、アリル基を持つ多孔性アガロース支持体(Sepharose[登録商標]６Fast Flow)(下)および本発明にしたがってポリ‐ヒドロキシブチルビニルエーテルで後修飾された同じ種類の支持体(トップ)の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
図２は、Sepharose[登録商標]６Fast Flowおよび対応するアリル化されたSepharose[登録商標]６Fast Flowと比較して、本発明にしたがってポリ‐ヒドロキシブチルビニルエーテルで後修飾されたSepharose[登録商標]６Fast Flowの強化された機械的性質を示す、圧力／流動(それぞれ、Ｙ−およびＸ−軸)曲線である。
【００１８】
図３は、疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)による四つのタンパク質の分離を示すクロマトグラムである。本発明にしたがってポリ‐ヒドロキシブチルビニルエーテルで後修飾されたSepharose[登録商標]６High Pressureおよび６Fast Flowの改善された分解能が、トップに示される。
図４は、種々のマトリックス上の疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)による三つのタンパク質の分離を示すころの、クロマトグラムである。下部のクロマトグラムは、従来のポリマー性支持体で得られて、一方では上部のものは、本発明にしたがって後修飾された多糖支持体を用いて得られている。
【００１９】
定義
本発明では、特異的に説明されない用語は、当業者が本文脈の読み取りから理解するであろうところの従来の意味で用いられる。
【００２０】
用語“マクロ孔質”粒子は、湿潤状態においてのみ多孔性であるところの“ゲル多孔性”粒子と比較して、乾燥もしくは湿潤状態の両方で 多孔性であるところの粒子を意味する。
【００２１】
用語“グラフト化”は、第一の重合の後に未反応で残されているところの二重結合のような基が今回反応させられる、第二の重合について本明細書中で用いられる。(グラフト化の異なる原理の総説としては、例えば、P F Rempp, P J Lutz: Comprehensive Polymer Science vol. 6, pp 403-421, Eds. G Allen et al, Oxford 1989、を参照。)
【００２２】
本発明の詳細な説明
さらに特異的には、本発明は、一つもしくはそれ以上の未反応の二重結合を含む多孔性ポリマー性支持体の後修飾のための方法であって、その方法は、
(ａ)ポリマー性多糖支持体を、少なくとも一つのグラフト化化合物を含む液相と接触させること；
(ｂ)工程(ａ)から得られた混合物において、当該ポリマー性支持体上の一つもしくはそれ以上の二重結合およびグラフト化化合物上の一つもしくはそれ以上の反応性基の間で、フリーラジカル反応を開始すること、ならびに任意に
(ｃ)ポリマー性支持体を洗浄して、過剰のグラフト化化合物を除去すること；
の工程を含み、
そこではグラフト化化合物が、任意に一つもしくはそれ以上のヘテロ原子を含むところの、直線状もしくは環状の炭素鎖に結合される反応性基としての二重結合より成る、方法である。未反応の二重結合は、支持体の製造から残存し得るしそして／もしくは意図的に導入されてい得る。未反応の二重結合、即ちアリル基、は、本明細書中で説明されるように、反応に利用され得るとまた理解される。
【００２３】
上述のように、後修飾の本方法は、イオン交換法において将来の使用ための一つもしくはそれ以上の官能基を導入するために改善された可能性を含む、柔軟な方法である。本発明にしたがうグラフト化の方法は、細孔内ならびに支持体の外部表面上において有益な重合をもたらし、そしてクロマトグラフィーでの改善された結果は、恐らくは改善された物質移動に因って、示されている。
【００２４】
本文脈においては、用語“多糖”支持体は、合成的交差結合剤と交差結合されているところの、例えばアガロースもしくはデキストラン支持体のような、任意の多糖−ベース支持体を含むと解釈されることが理解される。かくして、多糖支持体は、以下に例示されるであろうような多糖より成るが、しかし加えて、多糖類でないところの少量の添加剤を含み得る。本発明にしたがって表面−修飾されている多糖支持体は、逆懸濁ゲル化(S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964))のような、標準的な方法にしたがって容易に作成され得る。これに代えて、ベースマトリックスは、Sepharose[登録商標]FF(Amersham Biosciences AB, Uppsala、スウェーデン)のような市販の製品である。
【００２５】
本方法の一つの実施態様において、工程(ｂ)は、加えたグラフト化化合物をポリマー性支持体に重合させるに十分な量にてフリーラジカル開始剤を添加することにより実施される。フリーラジカルは、例えば、過酸化ジアセチル、過酸化ジベンゾイル、過酸化ジラウロイル、過酸化ピバロン酸ｔ‐ブチル、過オクタン酸ｔ‐ブチル、過酸化ピバロン酸ｔ‐アミル、過酸化‐２‐エチルへキサン酸ｔ‐ブチル、過酸化ジ炭酸ジ‐(４‐ｔ‐ブチルシクロヘキシル)、２,２'‐アゾビス(イソブチロニトリル)、２,２'‐アゾ‐ビス(２,４‐ジメチルバレロニトリル)、もしくは１,１'‐アゾ‐ビス(シアノシクロヘキサン)、およびそれらの混合物に基づいた、任意の適当な市販の開始剤であり得る。特異的な例は、製品Ｖ６５(＝２,２'‐アゾ‐ビス(２,４‐ジメチルバレロニトリル、和光純薬工業)もしくはＡＩＢＮ(＝２,２'‐アゾ‐ビス(イソブチロニトリル)、また和光純薬工業から)である。フリーラジカル開始剤の選択は、以下により詳細に議論されるであろうところの、用いられるグラフト化化合物を考慮して、当業者により容易になされる。その量は決定的ではなく、そして、例えば、１〜１０ｍｏｌ％(モノマー当たり)の範囲内で、当業者により容易に選択される。フリーラジカル開始剤の適当な量を決めるときの基本的な考慮は、単純には、その実質的過剰が重合に負の影響を有するかもしれない一方で、過少量は望ましい結果のためには不十分であり得ることであろう。
【００２６】
グラフト化化合物上の反応性基、支持体上に存在する二重結合および上で議論されたフリーラジカル開始剤の間のラジカル反応は、加熱、ＵＶ光照射、化学物質の添加等のような、任意の従来の方法によって開始されることができる。これに代えて、重合は、その場合には開始剤が存在する必要のない、γ線もしくは電子線照射によって開始されることできる。もし加熱が用いられるならば、加熱浴、オーブン等を使用し得る。正確な温度は、例えばグラフト化化合物およびフリーラジカル開始剤の性質に依存するであろうが、しかし、例えば、約７０℃のように約５０℃以上であり得て、２〜２０時間の間のような適当な時間の期間の間継続し得る。
【００２７】
上述のように、本発明の利点の一つは、方法の単純性である。かくして、上で説明された重合反応は、従来の化学に基づき、そして工程はいかなる特異的な装置等も必要としないで、当業者により適するように容易に適合される。当然、任意の従来のフリーラジカル重合方法に対すると同一な考慮が、ここでも適用され得て、そこでは、例えば、酸素等と接触することなく作業することの利点が利用され得る。しかしながら、そのような詳細は、当業者には周知であって、請求項によって定義されるように本発明の概念を変えるものではない。
【００２８】
大抵の場合には、本発明にしたがう後修飾はまた、工程(ｃ)で説明されたように、グラフト化されたゲルポリマー性支持体を洗浄するための工程を含む。そのような洗浄は、用いられたグラフト化化合物およびポリマー性支持体に依存して、水、メタノール、エタノール、アセトンまたは任意の他の適当な緩衝液もしくは溶液を用いて、例えば、実施され得る。ゲルに共役結合的に結合されない過剰なモノマー、オリゴマーおよびポリマーのそのような除去は、当分野における従来の措置であって、当業者はその条件を容易に決めることができる。
【００２９】
本発明にしたがう後修飾の後にどの程度二重結合がポリマー性支持体上に残存するかを決めるためには、最も便利な方式は、単純に重量法を使用することである。異なるように置いて、支持体が後修飾の前後で秤量され、そして重量増加がグラフト化された化合物を表わすであろう。さらに特異的には、グラフト化されたポリマーの量は、元来存在するアリル基の量に逆比例するであろう。これに代えて、結果は、この分野で従来用いられるように、ＩＲを用いて評価され得る。かくして、当業者は、本発明にしたがう後修飾の定量的もしくは定性的な結果を決めるために、対照実験を容易に実施し得る。
【００３０】
本発明にしたがって特に有利に用いられる物質は、不飽和基の支持体密度が比較的高いものであって、その理由はそのような物質は、その後のクロマトグラフィー的適用で有用な誘導体化のために利用できる大多数の部位を提供するだろうからである。
【００３１】
本発明の有利な実施態様において、多孔性ポリマー性支持体は、重合に利用可能な反応性二重結合を提供するところの交差結合した多糖である。この文脈において、用語“反応性”は、当該基が本発明にしたがう後修飾のために利用可能であり、そしてそのような二重結合が、ラジカルで開始される重合に関与できるところのほとんど任意の基による多糖の修飾により提供され得るということを意味する。かくして、この実施態様において、支持体は、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラゲーニン、ゲラン、アルギン酸エステル等のような、交差結合した炭水化物物質を含み得る。アガロースおよびデキストラン支持体は、例えばSepharose[登録商標](Amersham Biosciences AB, Uppsala, スウェーデン)のように、市販されている。これに代えて、そのような支持体は、周知の方法を用いて当業者により容易に作成される。周知のように、たとえアガロースのような多糖類は自然にゲル化するであろうとしても、エピクロルヒドリンのような、化学的交差結合剤が好ましくは、クロマトグラフィー支持体として用いるために十分に堅固な生成物を与えるために添加される。多糖支持体の二重結合による修飾、即ち、そのような支持体に上で議論されたような未反応の二重結合を供給すること、はまた、周知の方法したがって、容易に実施される。かくして、例示的な実施態様では、本多糖は、適当な温度および反応時間で、アリル−官能性エポキシドでの処理によりアリル化されている。そのような一般的に用いられるアリル−官能性エポキシドの一つの例は、アリルグリシジルエーテル(ＡＧＥ)であるが、しかし当業者が理解するであろうように、実質的に任意の試剤を用い得る。同様に、アリル化はこれに代えて、アリル−官能性エポキシド類似体のような他のアリル−官能性試剤もしくは臭化アリル、塩化アリル等のようなハロゲン化アリルを用いることにより実施され得る。しかしながら、ビニルエポキシドのような任意の官能性エポキシドをこの目的に用いることができる。かくして、二重結合は、後修飾もしくはクロマトグラフィーにおける支持体の将来的な使用にいかなる負の効果も有しないところの任意の適当な化合物を介して、多糖支持体に付加され得る。例えば、鎖長、置換基等での対応する変動を持つ、本明細書中で説明されるグラフト化化合物に類似であるところの化合物を、使用し得る。本明細書中で与えられた式に鑑みて、容易に理解されるように、二重結合が後修飾において自由に反応する一方で、支持体表面は、次いで、分子末端の一つを置換するであろう。
【００３２】
本発明にしたがう表面修飾は、Sepharose[登録商標] XL media[登録商標] (Amersham Biosciences AB, Uppsala、スウェーデン)のような市販のデキストランでコーティングされたクロマトグラフィービーズの作成とは、そのようなデキストランコーティング剤は、その利用可能な表面積を増大させるために、そのアリル化以前にアガロースのヒドロキシ基に結合されているので、異なる。逆に、本発明は、当該ヒドロキシ基を最初にアリル化し、その後に、得られたアリル基への適当なグラフト化化合物のインシツのラジカル重合を実施する。
【００３３】
以下の実験の部で示されるであろうように、交差結合した多糖支持体が表面−修飾される、本発明の実施態様は、多大に改善された機械的性質を持つ支持体をもたらす。これは、しばしば９４〜９６％の範囲にあるところの従来のアガロース粒子の高い多孔度は、より低く有利であるところの機械的性質を伴うことが当分野内でよく認識された問題であるので、本発明の重要な利点である。さらに特異的には、従来の製品の機械的性質は、より高い流速が用いられる方法では、粒子の崩壊の危険性を必然的に伴うであろう。当然、流速が高ければ高いほど、方法は通常さらに経済的であり、それ故に、クロマトグラフィーの手順における増大した流速に耐え得るところの高度に多孔性のアガロース粒子は、長らく本発明が満足させる必要性であった。本発明をいかなる特異的な理論に限定することなしに、表面−修飾された支持体で得られる改善された機械的強度が、支持体表面上に存在するけれどもグラフト化化合物の実際の重合には関与しないところの幾つかのアリル基の、ラジカル機構による、さらなる交差−結合に因るものであることが推測される。
【００３４】
有利な実施態様において、グラフト化化合物は、ヒドロキシル基のような、容易に誘導体化される官能性であるところの基を含む。ヒドロキシルは、例えばグリシドールで誘導体化され得る。グリシドールの複数分子が、三フッ化ホウ素エーテラートの付加によりヒドロキシルにポリマー的に付加されて、複数のヒドロキシルを含むポリマー鎖を含む共役結合性コーティングを生成し得る。これに代えて、ヒドロキシルは酸化されて、複数のカルボン酸基を生成し得る。もう一つの実施態様では、ヒドロキシルは、エピブロモヒドリンのような、エピハロヒドリンのような化合物と反応させると、共役結合性のコーティング上で末端ハロゲン化物を製造し、それはアミンと反応して第四級アミンを製造し得る。
【００３５】
通常、グラフト化化合物はモノマー化合物を指して、それ故に以下ではモノマーが議論されるであろう。グラフト化反応の間に、添加されたモノマーは、支持体上に存在する未反応の二重結合と直接反応するであろう。しかしながら、同時に幾つかのモノマーが最初互いに反応して、より短いポリマー鎖を形成し、それがひいては当該未反応の二重結合を介して支持体にグラフトされるということが可能である。
【００３６】
本方法の一つの有利な態様は、上で説明されたような多孔性ポリマー性多糖支持体の後修飾の方法であって、そこでは少なくとも一つのグラフト化合物が、一般式(Ｉ)：
【化１】
2005510593.tif 000002
[式中、
Ｒ＝一つもしくはそれ以上のヒドロキシル、アミン、カルボニル、エーテル、酸素または最終の支持体の性質に全く無いかもしくは最少の負の影響を持つところの任意の他の適当な基で任意に置換されている、Ｃ１−Ｃ３０のアルキル鎖；
Ｒ'＝ＨもしくはＣＨ３；
Ｒ"＝Ｃ０−Ｃ３０のアルキル鎖もしくは酸素；そして
Ｘ＝Ｏｎ、｛式中、もしＲ"が酸素であるならば、そのときはｎは０であって、もしＲ"がアルキル鎖であるならば、そのときはｎは１であるという条件で、ｎは０〜１である｝]
によって表される。
【００３７】
かくして、グラフト化化合物は有利には、一つもしくはそれ以上の炭素原子によりお互いから任意に分離されている、一つの二重結合および一つのエーテル官能性を含むことが、見出されている。好ましくは、グラフト化化合物は、炭素鎖が少なくとも２個の炭素より成る、ビニルエーテル、即ち、エチルビニルエーテルである。
【００３８】
さらに特異的には、一つの実施態様においては、グラフト化化合物は、式(Ｉ)[式中、ＲはＣ１７のアルキル鎖であり、Ｒ'はＨであり、Ｒ"はＯであり、ＸはＣＨ２である]により説明される。かくして、グラフト化化合物はビニルエーテルであり得る。現在、市販されている約１５０の異なるビニルエーテルがある。ビニルエーテルは、陽イオン条件下で容易に重合すると公知であるが、しかし本発明は、ポリマー性支持体をグラフト化するという目的に対してそのフリーラジカル重合を、初めて開示する。一般的に、それらが簡便に取り扱われるので、約１００℃以上の沸点を有する液体形状のビニルエーテルが好ましい。かくして、エチルビニルエーテル、ｎ‐ブチルビニルエーテル、イソ‐ブチルビニルエーテル、ｔｅｒｔ‐ブチルビニルエーテル、シクロヘキシルビニルエーテル、オクタデシルビニルエーテル、ヒドロキシブチルビニルエーテル、エチレングリコールモノビニルエーテル、シクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテル、等のような任意のビニルエーテルが、簡便に用いられる。ビニルエーテルがグラフト化化合物として用いられるときに特に観察される技術的な効果は、それらが細孔中およびビーズ支持体上におけるその後の誘導体化のために利用可能な大多数の部位を提供するに十分に効果的であるところの重合を提供するように思われ、一方では、同時に、得られた重合は細孔を閉塞するには十分に効率的ではない、ということである。この結果は予期されないものであって、本発明によって得られる利点に寄与する。
【００３９】
交差結合した多糖支持体の場合には、修飾された支持体の表面上に結合基を提供し得るところの官能性リガンドをまた含む、グラフト化化合物を用いることが特に有利である。かくして、この文脈において、用語“官能性リガンド”は、表面−修飾された支持体の表面の性質を変え得るか、もしくはその上の結合基として機能し得るかのどちらかであるところの任意の基を含むと理解される。特異的な実施態様において、当該リガンドは、イオン性基、親和性基、疎水基、親水基等から成るところの群から選択される。最も有利な実施態様において、ポリマー性支持体は、交差結合したアガロースより成る。これは、支持体がクロマトグラフィーで用いられるとき、アガロース自体が標的物質に何らの、もしくは少なくとも殆どない、相互作用を提供しないので、有利である。かくして、本方法のこの実施態様は、高選択的なクロマトグラフィー支持体として有用であるところの、表面−修飾された支持体をもたらすであろう。さらに、イオン性基のような官能基を含むことにより、本発明のこの実施態様にしたがって表面−修飾されているところの支持体は、誘導体化された支持体として直接的に有用である。この故に、望ましいリガンドおよび／または性質を保持するところの支持体を作成する方法において必要とされる多数の工程は、別の工程がそのようなリガンドおよび／または性質を付加するために必要とされるときと比較すると、減少される。その結果、その費用がまた実質的に減少される。この状況において、そのような官能基は、式(Ｉ)によって表されるグラフト化化合物上に、もしくは、二種類以上のグラフト化化合物が用いられる場合には異なるモノマー上にの、どちらかに存在し得ることが理解される。修飾された支持体上で利用可能であるところの官能基の量は、異なるグラフト化化合物間の比率に依存するであろう。
【００４０】
本発明の有利な態様は、少なくとも二つの異なった疎水性のグラフト化化合物を用いる、上で定義されたような後修飾の方法を含む、分離媒体に予め決められた疎水性を提供する方法である。かくして、本方法を用いて、疎水的相互作用クロマトグラフィーのような、望ましい状況においての使用のための支持体をデザインすることができる。周知のように、用語の疎水性は、その逆が親水性、即ち、水に対する親和性、として公知である一方で、水を吸収する傾向を殆どかもしくは全く持たない物質を指す。したがって、本方法は、異なる疎水性の複数のグラフト化化合物が用いられる、方法として、等しく良く定義される。この文脈において、用語“予め決められた”は、後修飾において用いられる二つもしくはそれ以上のグラフト化化合物の割合が、最終生成物において少なくとも大まかに同一の割合をもたらすと仮定されることを意味する。したがって、さらに疎水的な支持体に対しては、さらに大きい割合のさらに疎水的なグラフト化化合物が、後修飾において用いられる。グラフト化化合物の混合物の有利な組成を日常的に確認するためには、第一および第二のグラフト化化合物の９５：５；９０：１０；８０：２０；７０：３０；６０：４０；５０：５０；４０：６０；３０：７０；２０：８０；１０：９０；および５：９５のような、もしくは三つ以上のグラフト化化合物が用いられるならばそのように任意の他の適当な割合のような、一連の異なった割合を試験することができる。したがって、組成は、異なった疎水性のグラフト化化合物の望ましい割合を選択するために、当業者により容易に最適化される。
【００４１】
当業者が容易に理解するように、それらの性質が望ましい性質の生成物を提供するに十分な程度で異なる限り、基本的には任意の組み合せのグラフト化化合物を用いることができる。
【００４２】
一つの実施態様において、第一のグラフト化化合物はヒドロキシアルキルビニルエーテルであり、第二のグラフト化化合物はビニルアルキルエーテルである。しかしながら、分岐アルキル鎖および／もしくは環構造を含むもののような、他の種類のビニルエーテルが等しく有用であることが理解される。
【００４３】
特異的な実施態様において、第一のグラフト化化合物は、式(Ｉ)によって表され、第二のグラフト化化合物は、より低いもしくはより高い疎水性の官能性モノマーである。通常は、式(Ｉ)によって表されるグラフト化化合物は、反応性溶媒として、かつこれ故に過剰に用いられる。
【００４４】
多孔性ポリマー性支持体の後修飾の本方法のもう一つの態様においては、グラフト化化合物は、一般式(ＩＩ)
【化２】
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[式中、環は、最終生成物の望ましい性質に全く無いかもしくは最小の負の影響を持つところの任意の適当な置換基を保持し得る]により説明される。したがって、この実施態様はまた、式(ＩＩ)の誘導体、即ち、スチレン誘導体、を包含する。
【００４５】
一つの有利な実施態様において、本方法は、クロマトグラフィーにおいて、好ましくは逆相クロマトグラフィー(ＲＰＣ)において、そのように作成された後修飾されたクロマトグラフィー支持体を用いる、さらなる工程(ｄ)を含む。
ＲＰＣは、例えばペプチドおよびより小さなタンパク質の分離と精製のためにしばしば用いられる方法である。本発明者は驚くべきことに、本発明にしたがう方法によって後修飾されたポリマー性支持体が、もしＲＰＣで用いられるならば、効率および選択性に関して大いに改良された結果を提供し得るということを見出している。インスリンとのような、或る場合には、シリカマトリックスを用いる従来のＲＰＣは、ジビニル‐ベースのマトリックスよりも優れた結果を与えると見出されている。しかしながら、この状況でのシリカの使用は、そのアルカリに対する感受性に因る欠点を含む。シリカベースの物質はその結果、その場でのクリーニング(ＣＩＰ)が実施される、方法での使用に対しては、そのようなクリーニングが通常水酸化ナトリウムを用いるので、不適当である。したがって、シリカベースマトリックスの寿命は、余り短かすぎて経済的ではない。しかしながら、ジビニルベースマトリックスの後修飾は、以下の実験の部で示されるように、例えば分解能に関してより優れた結果を与えるところの物質をもたらすと本発明者らによって示されている。したがって、特に有利な実施態様においては、本方法を用いて、上で説明されたように後修飾されているところのマトリックスを用いるＲＰＣにより、インスリンを精製する。本発明にしたがうそのような精製は、例えば、インスリンが組換え的に製造される方法での最終工程であり得て、そして粗い捕捉工程が最初に、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより、行われ、上で議論されたようなＲＰＣがそれに引き続かれる。これに代えて、本支持体は、インスリンの精製におけて捕捉‐工程で用いられる。当然、本発明は、他のおよび類似のたんぱく質についても、例えば、ＲＰＣを用いる高純度にまでの最終精製のためにはまた有利である。特に、その後の薬学的用途を有するところのタンパク質は、それがその産業内で要求されるほどの高レベルの純度に達することを可能にするので、この方式によって特に有利に精製される。本発明にしたがって後修飾された多孔性ポリマー性支持体を用いるＲＰＣが利用され得る、もう一つの有利な例は、分析目的のため、即ち、上で議論された分取クロマトグラフィーより小スケールにおいて、である。
【００４６】
本発明はまた、上で説明された方法を用いて後修飾されているところのポリマー性支持体も包含する。そのような支持体は、例えば、粒子、モノリスもしくは膜であり得て、クロマトグラフィーもしくはバッチ式の分離において有用である。一つの特に有利なそのような支持体は、イオン交換クロマトグラフィー(ＩＥＸ)のためのもしくは疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)のためのマトリックスである。後者の場合には、マトリックスは好ましくは、望ましい疎水性のデザインのために上で説明された方法にしたがって作成されている。本発明はまた、クロマトグラフィーにおいて上で定義されたような後修飾された多孔性ポリマー性支持体の使用を包含する。
【００４７】
最後に、本発明はまた、上で定義されたような後修飾された多孔性ポリマー性支持体を含むクロマトグラフィーカラムを包含する。そのようなカラムは、充填カラムであり得て、そして、小スケールでもしくは工業的使用のための大‐スケールでのどちらかであり得る。
【００４８】
図面の詳細な説明
図１は、アリル基を持つSepharose[登録商標]６Fast Flow(下)およびポリ‐ヒドロキシブチルビニルエーテルで後修飾されたSepharose[登録商標]６Fast Flow(トップ)の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。結果は、実施例１で説明される。
【００４９】
図２は、Sepharose[登録商標]６Fast Flowおよび対応するアリル化されたSepharose[登録商標]６Fast Flowと比較して、本発明にしたがってポリ‐ヒドロキシブチルビニルエーテルで後修飾されたSepharose[登録商標]６Fast Flowの強化された機械的性質を示す、圧力／流動曲線である。従来の支持体が用いられるときには如何に圧力が劇的に増加し、一方では、本発明にしたがって後修飾されている支持体の使用からは、はるかにより魅力的な圧力曲線がもたらされることが、明白に見える。
【００５０】
図３は、疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)による四つのタンパク質(ミオグロビン、リボヌクレアーゼＡ、キモトリプシノーゲンＡおよびアルファ‐ラクトアルブミン)の分離を示すクロマトグラムである。ポリ‐ヒドロキシブチルビニルエーテルでグラフトされたSepharose[登録商標]６High Presureおよび６Fast Flowの改善された分解能が、トップに示される。
【００５１】
図４は、種々のマトリックス上の疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)による三つのタンパク質の分離を示すころのクロマトグラムである。下部のクロマトグラムは従来のポリマー性支持体で得られていて、一方では、上部のものは本発明にしたがって後修飾された多糖支持体を用いて得られている。さらに特異的には、最下部の曲線について用いられた分離媒体は、Phenyl Sepharose[登録商標](Amersham Biosciences AB, Uppsala、スウェーデン)であり、一方では、下部のものは、トップから下部に：１００％ヒドロキシブチルビニルエーテル(ＨＢＶＥ)；８０％ＨＢＶＥおよび２０％ブチルビニルエーテル(ＢＶＥ)；６０％ＨＢＶＥおよび４０％ＢＶＥ；４０％ＨＢＶＥおよび６０％ＢＶＥ；ならびに最後にトップでは、２０％ＨＢＶＥおよび８０％ＢＶＥでもって、本発明にしたがって後修飾された支持体を示す。かくして、さらに疎水性のモノマーの比率は、図の下部からトップへ向かって増加する。用いたタンパク質は、ミオグロビン、リボヌクレアーゼ、α‐キモトリプシンおよびα‐ラクトアルブミンである。この出願で開示された原理を用いて、そのような後修飾された支持体を作成し、そしてクロマトグラムは、周知のクロマトグラフィー原理にしたがって得られた。
【実施例】
【００５２】
実験の部
本実施例は、単に例示目的のみのために本明細書中に含まれていて、付随の請求項により定義されるように本発明を限定するものと解釈されるべきではない。以下 および本明細書中の他の所において含まれる全ての参考文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
【００５３】
実施例１：ヒドロキシブチルビニルエーテルにより後修飾された支持体
２,２'−アゾ−ビス(２,４−ジメチルバレロニトリル(Ｖ−６５)  １.０ｇを、ヒドロキシブチルビニルエーテル４０.０ｍＬ中に溶解した。ラジカル重合のために利用可能なアリル基を持つ Sepharose[登録商標]6 Fast Flow  ６.００ｇを、モノマー／開始剤溶液中に浸した。反応混合物を７０℃で１５時間、機械的撹拌器で穏やかに撹拌した。完全な反応の後、樹脂に共役結合的に結合されなかった過剰のモノマー、オリゴマーおよびポリマーを、溶媒としてメタノールおよび水を用いる洗浄手順により除去した。ＮＭＲスペクトル(図１)に示されるように、５〜６ｐｐｍの間で元来観測された残存するアリル基の殆ど全てが消費されて、それぞれ、１.５および３.４ｐｐｍにおける共鳴によって示されるように、顕著な量のポリヒドロキシブチルビニルエーテルがSepharose[登録商標] Fast Flow 樹脂に挿入されている。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、アリル基を持つ多孔性アガロース支持体(Sepharose[登録商標]６Fast Flow)(下)および本発明にしたがってポリ‐ヒドロキシブチルビニルエーテルで後修飾された同じ種類の支持体(トップ)の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２】図２は、Sepharose[登録商標]６Fast Flowおよび対応するアリル化されたSepharose[登録商標]６Fast Flowと比較して、本発明にしたがってポリ‐ヒドロキシブチルビニルエーテルで後修飾されたSepharose[登録商標]６Fast Flowの強化された機械的性質を示す、圧力／流動(それぞれ、Ｙ−およびＸ−軸)曲線である。
【図３】図３は、疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)による四つのタンパク質の分離を示すクロマトグラムである。本発明にしたがってポリ‐ヒドロキシブチルビニルエーテルで後修飾されたSepharose[登録商標]６High Pressureおよび６Fast Flowの改善された分解能が、トップに示される。
【図４】図４は、種々のマトリックス上の疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)による三つのタンパク質の分離を示すころの、クロマトグラムである。下部のクロマトグラムは、従来のポリマー性支持体で得られて、一方では上部のものは、本発明にしたがって後修飾された多糖支持体を用いて得られている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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