(57)【要約】本発明は、極めて高い殺虫特性を有するキメラｄ内毒素タンパク質Ｃｒｙ１Ｅ（配列番号１）ならびに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのｄ内毒素ｃｒｙ１Ｅａおよびｄ内毒素ｃｒｙ１Ｃａに由来するキメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子（配列番号２）に関する。また、本発明は、このキメラ遺伝子の植物中で高い発現を示す設計に基づき、このキメラタンパク質を使用して、昆虫に寄生された植物を処理する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のキメラδ内毒素タンパク質Ｃｒｙ１Ｅおよび７５％以上の配列相同性を有する他のタンパク質。
【請求項２】
前記配列番号１のタンパク質が、６４１アミノ酸残基の長さである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記配列番号１のキメラタンパク質が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのδ内毒素Ｃｒｙ１ＥａおよびＣｒｙ１Ｃａから設計される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記６４１残基の長さのキメラタンパク質が、同じ位置の内毒素Ｃｒｙ１Ｅａに由来する残基１〜５２９、位置５３３〜６０２のＣｒｙ１Ｃａに由来する残基５３０〜５９９、位置５８８〜６０４のＣｒｙ１Ｅａに由来する残基６００〜６１６および合成ポリペプチド残基６１７〜６４１からなる、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項５】
Ｃｒｙ１Ｅａの５３０〜５８７由来のペプチドドメインが、他の任意のδ内毒素のペプチドドメインで置換され得る、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
最後の２５アミノ酸残基が、植物のプロテアーゼに対する安定性を改良する、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記キメラタンパク質が、４〜３５℃の範囲の温度で、安定である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
配列番号２のキメラ遺伝子。
【請求項９】
前記キメラが、配列番号１のキメラタンパク質をコードする、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１０】
前記キメラが、１９９０塩基対（ｂｐ）の長さである、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１１】
前記キメラが、１．９９ｋｂの二本鎖ＤＮＡである、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１２】
前記キメラが、効率的な翻訳を促進するように均等に分布された植物に好ましいコドンを含む、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１３】
前記キメラが、５’末端に、植物に好ましい翻訳開始コドンであるＡＴＧＧＣＴを含む、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１４】
前記キメラが、植物に好ましい翻訳終結コドンであるＴＡＡＴＧＡを含む、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１５】
前記キメラが、遺伝子の全長にわたり、約４０〜８０ｂｐの距離で一様に分布する３３個の制限部位を含む、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１６】
制限部位が、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＢａｍＨＩからなる群から選択される酵素である、請求項１５に記載のキメラ。
【請求項１７】
前記キメラが、それぞれが６〜２６塩基対（ｂｐ）の距離に位置する、長さが４０〜６５ｂｐの５８個の重複するオリゴヌクレオチドに分割される、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１８】
前記キメラが、相補鎖上の隣接するするオリゴヌクレオチドと１３〜１８ヌクレオチド重複する重複ヌクレオチドを含む、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１９】
前記キメラが、４４と５５℃との間の範囲のＴｍ値を有する、請求項８に記載のキメラ。
【請求項２０】
微生物において殺虫性キメラタンパク質Ｃｒｙ１Ｅを過剰発現させる方法であって、該方法が、以下：
（ａ）ベクターにおいて、該キメラタンパク質をコードする配列番号２の遺伝子Ｃｒｙ１Ｅをクローニングする工程、
（ｂ）該クローン化したベクターを使用して、微生物を形質転換する工程、および
（ｃ）該微生物中で、該キメラタンパク質を過剰発現させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記キメラが、細菌、藻および真菌からなる群から選択される微生物中に、発現される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記クローニングする工程のための制限酵素が、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｎｃｏｌ、ＭｆｅＩ、およびＢａｍＨＩからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質の過剰発現が、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いることによって誘導される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質の誤った折りたたみを避けるために、該タンパク質の過剰発現が１５℃においてである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ベクターが、プラスミド、ウイルスＤＮＡ、およびコスミドを含む群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
微生物におけるキメラの発現が、ＲＴ−ＴＣＲ、ウエスタン分析、およびＥＬＩＳＡによって確認される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
微生物におけるキメラの存在が、ＰＣＲおよびサザン分析によって確認される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の殺虫性キメラタンパク質を使用して、昆虫に感染された植物を処理する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）キメラタンパク質Ｃｒｙ１Ｅをコードする遺伝子を、昆虫に感染された植物内に組み込ませる工程、
（ｂ）トランスジェニック植物を昆虫に曝露する工程、および
（ｃ）該トランスジェニック植物の殺虫活性を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
昆虫ペストが、Ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐ．、およびＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｓｐ．を含む群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
植物が、タバコ、ワタ、ヒヨコマメ、ピジョンマメ、ラッカセイ、カリフラワー、キャベツ、トウガラシおよびトウガラシの実を含む群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記クローニングのための制限酵素が、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、およびＢａｍＨＩを含む群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
キメラタンパク質が、植物の可溶性タンパク質の総量の約０．５％を有する、植物中での高度な発現を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記キメラタンパク質が、前記トランスジェニック植物中で安定である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記キメラタンパク質に曝露された昆虫が、死ぬ前に体重減少を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記キメラタンパク質が、全ての発達段階の昆虫に対して殺虫特性を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記キメラタンパク質が、親タンパク質と比較して、何倍も強力な殺虫剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記キメラタンパク質の殺虫活性が、約４時間以内の曝露で、８０〜１００％の間の範囲の昆虫ペストの死亡率を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
約１時間の間、前記キメラタンパク質に曝露された昆虫が、発達遅延、不妊および変態の混乱を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｓｐ．のＥＣ５０が、昆虫の人工食餌の１ｍｌあたり２５０〜３５０ｎｇの範囲である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐ．のＥＣ５０が、人工食餌の１ｍｌあたり２５〜５０ｎｇの範囲である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記トランスジェニック植物の正常な成長に有害な影響を示さない、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、極めて高い殺虫特性を有するキメラδ内毒素タンパク質Ｃｒｙ１Ｅ（配列番号１）および上記キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子（配列番号２）に関し、また、上記のキメラタンパク質を使用して、昆虫に寄生された植物を処置する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
昆虫に起因する傷害により、作物の損失という形で、および、これらの害虫を制御するための費用として、年に数十億ドルが失われる。農業生産環境における害虫による損失としては、作物収量、作物の低い品質、増大した収穫コスト、ならびに健康および環境上の損失が挙げられる。
【０００３】
参考が、Ｈｏｆｔｅ  Ｈ．およびＷｈｉｔｅｌｅｙ  Ｈ．Ｒ．、１９８９、「Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５３：２４２〜２５５から得られ得る。ここで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂ．ｔ．）は、至る所にいるグラム陽性の胞子を形成する土壌細菌であり、胞子形成の間にパラスポーラルな（ｐａｒａｓｐｏｒａｌ）結晶性封入体を生産するその能力について既知である。これらの封入体は、結晶タンパク質またはＣｒｙタンパク質またはδ内毒素として公知のタンパク質からなり、このタンパク質は、特に鱗翅目、双翅目および鞘翅目の昆虫種の幼生に対する殺虫活性を示す。膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目の昆虫；線虫；ダニおよび原生動物に対する毒性を有するタンパク質もまた、文献（Ｌ．ｋｉｍ編のＡｄｖａｎｃｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ．中のＦｅｉｔｅｌｓｏｎ  Ｊ．Ｓ．、１９９３、「Ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｆａｍｉｌｙ  ｔｒｅｅ」、６３〜７１  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ．Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．、Ｎ．Ｙ．およびＦｅｉｔｅｌｓｏｎら、１９９２、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：ｉｎｓｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．１０：２７１〜２７５；本発明のために引用され得る）中で述べられている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂ．ｔ．）の数株は、異なる宿主スペクトルによって同定され、鞭毛抗原に基づいて異なる亜種または血清型に分類されている。Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｆｒａｎｃｅは、５５の異なる鞭毛血清型および８の非鞭毛性の生物型をカタログにしている。参考が、Ｓｃｈｎｅｐｆら、１９９８、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｉｖ．６２：７７５〜８０６から得られ得る。この文献では、いくつかのＢ．ｔ．毒素をコードする遺伝子が、クローン化され、配列決定され、特徴付けられ、そして組換えＤＮＡベースの生産物が、生産され、市販が承認された。遺伝子工学技術の使用により、これらのＢ．ｔ．毒素を農業環境に送達するために、新しいアプローチが開発されており、このようなアプローチとしては、遺伝学的に操作された作物およびδ−内毒素送達ビヒクルとしての安定化した完全な微生物細胞（Ｇａｅｒｔｎｅｒ，Ｆ．Ｈ．、Ｋｉｍ  Ｌ．、１９８８、ＴＩＢＴＥＣＨ  ６：５４〜５７）の使用が挙げられる。従って、経済的損失を引き起こす宿主（特に、害虫および昆虫）を殺すために標的化されるタンパク質をコードするδ−内毒素遺伝子が、商業的に価値あるものとなってきている。
【０００４】
所定のδ−内毒素は、狭い範囲の標的害虫に対して毒性を示すために、所定の作物環境中でのＢ．ｔ．殺虫剤の商業的使用は、制限される。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｋｕｒｓｔａｋｉ亜種の胞子および結晶の調製物は、多年の間、鱗翅目の害虫に対する市販の殺虫剤として使用されている。例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種のｋｕｒｓｔａｋｉ  ＨＤ−１は、数種のδ−内毒素を生産し、そのため、比較的広い範囲の鱗翅目の昆虫に対して、毒性である。しかし、公知のδ−内毒素（Ｂ．ｔ．ｋ．ＨＤ−１が挙げられる）に基づく処方物は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐ．（これもまた鱗翅目に属する）のような作物の重要な害虫のいくらかに対して有効ではない。他種のＢ．ｔ．、すなわちｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓおよびｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓは、特定の昆虫（それぞれ、双翅目と鞘翅目）を制御するために商業的に使用されている（Ｇａｅｒｔｎｅｒ、Ｆ．Ｈ．、１９８９、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｔｓ、Ｒ．Ｍ．Ｗｉｌｋｉｎｓ編、Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ，１９９０，ｐｐ．２４５〜２５５中の「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｌｉｖｉｎｇ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−Ｌｉｖｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」；Ｃｏｕｃｈ  Ｔ．Ｌ．、１９８０、「Ｍｏｓｑｕｉｔｏ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｖａｒ．ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２２：６１〜７６およびＢｅｅｇｌｅ  Ｃ．Ｃ．、１９７８、「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅｎｔｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ａｇｒｏｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ」、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：９７〜１０４；本発明のために引用され得る）。Ｚ．ａｎｇ．Ｅｎｔ．９６：５００〜５０８中で、Ｋｒｅｉｇら（１９８３）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種のｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓを記載している。この種は、鞘翅目の２種の甲虫（すなわちＣｏｌｏｒａｄｏ  ｐｏｔａｔｏ  ｂｅｅｔｌｅであるＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａおよびＡｇｅｌａｓｔｉｃａ  ａｌｎｉ）に対して、活性があるといわれている。
【０００５】
参考は、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅら、１９９８、「Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：８０７〜８１３から得られ得る。この文献中では、結晶タンパク質遺伝子が、主にアミノ酸配列の相同性に基づいて、２２種類に分類される。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉにおけるＢ．ｔ．結晶タンパク質遺伝子のクローニングおよび発現は、出版された文献（Ｓｃｈｎｅｐｆら、１９８１、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ」、本発明のために引用され得る。）中で、いくらかの例において記載されている。米国特許第４，４４８，８８５号および同第４，４６７，０３６号は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＢ．ｔ．結晶タンパク質の発現を開示する。米国特許第４，７９７，２７６号および同第４，８５３，３３１号は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株のｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓを開示し、これは、種々の環境において、鞘翅目の害虫を制御するために使用され得る。米国特許第４，９１８，００６は、双翅目に対して活性を有するＢ．ｔ．毒素を開示する。米国特許第４，８４９，２１７号は、アルファルファゾウムシに対して活性を有するＢ．ｔ．分離菌を開示する。米国特許第５，２０８，０１７は、コエロプテラン（ｃｏｅｌｏｐｔｅｒａｎ）活性のあるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ分離菌を開示する。米国特許第５，１５１，３６３および同第４，９４８，７３４号は、線虫に対して活性を有する特定のＢ．ｔ．分離菌を開示する。さらなる研究および資料が、新しいＢ．ｔ．分離菌およびその使用法を発見するために、使用されている。現在、新しいＢ．ｔ．分離菌および公知のＢ．ｔ．分離菌の新たな使用法の発見は、経験的な予測できない技術のままである。世界中のいくつかの研究所は、異なる宿主範囲および作用機構のために、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓからの新しいδ−内毒素遺伝子の単離を試みている。
【０００６】
Ｂｕｌｌａら、１９８０、「Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ」  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１４７〜２０４およびＧｒｏｃｈｕｌｓｋｉら、１９９５、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＣｒｙＩＡ（ａ）  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｔｏｘｉｎ：ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２５４：４４７〜４６４；は、大部分のＢ．ｔ．殺虫性結晶タンパク質が、プロトキシン（分子量１３０〜１４０ｋＤａ）という天然の形態で合成されることを報告している。プロトキシンは、疎水性相互作用、水素結合およびジスルフィド架橋により、パラスポーラル（ｐａｒａｓｐｏｒａｌ）な封入体を形成する。プロトキシンは、昆虫の幼生には毒性がなく、２つのセグメント、Ｎ末端半部およびＣ末端半部から構成される。プロトキシンは、昆虫の中腸において、アルカリ性ｐＨでのプロテアーゼによる部位特異的な切断の後で、機能的に活性のある毒素（６０〜７０ｋＤａ）に変換される。このタンパク質分解によって処理を受けた切断されたδ−内毒素は、昆虫の中腸で特異的な受容体と結合し、上皮膜に穴を作製することで、死を引き起こす（参考文献は、Ｂｉｅｔｌｏｔら、１９８９、「Ｆａｃｉｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｖａｒ．ｋｕｒｓｔａｋｉ」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｊ．、２６０：８７〜９１；Ｃｈｏｍａら、１９９０、「Ｕｎｕｓｕａｌ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：５２３〜２７；およびＨｏｆｔｅら、１９８６、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｃｌｏｎｅｄ  ｄａｌｔａ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｂｅｒｌｉｎｅｒ１７１５」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６１：２７３〜２８０；本発明のために引用され得る）。プロテアーゼ耐性の活性毒素は、プロトキシン分子のＮ末端半部に対応する。Ｃ末端半部に対応する他のセグメントは、高度に安定な結晶の形成のために必要であると考えられる。タンパク質分解による処理の間に、約２５〜３０アミノ酸残基で構成される小さなポリペプチドが、プロトキシンのＮ末端から、取り除かれる。
【０００７】
Ｃｒｙ１Ａａδ−内毒素およびＣｒｙ３Ａａδ−内毒素のコア毒素セグメントの結晶構造が、公知であり（Ｇｒｏｃｈｕｌｓｋｙら、１９９５、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＣｒｙＩＡ（ａ）  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｔｏｘｉｎ：ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：４４７〜４６４およびＬｉら、１９９１、「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  δ−ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ａｔ  ２．５Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」，Ｎａｔｕｒｅ．３５３：８１５〜８２１）、そしてその３次元構造は、重ね合わせ可能（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓａｂｌｅ）である。適切に保存されたポリペプチドドメインは、関連する毒素は、類似の位相的構造を有することを示唆する。これらは、小さなポリペプチドのリンカーにより接続される３つの異なる構造ドメインから構成される球状分子である。ドメイン間でポリペプチド鎖は交差しない。ドメインＩは、７個のαへリックス構造からなる。ドメインＩＩは、３個の逆並行βシートおよび２つの短いαへリックスからなる。ドメインＩＩＩは、２個の逆並行する高度にねじれたβシートのβサンドイッチである。ドメインＩＩおよびＩＩＩは隣に位置し、そこで、それらは、ドメインＩのヘリックスα７と面する。これらのドメインは、ドメイン間の多くのファンデルワールス力、水素結合および静電気的相互作用（塩橋）によって、密接にパッキングされている。
【０００８】
δ−内毒素の狭い宿主範囲の主要な原因の１つが、これらのタンパク質が、穴を作製して、毒性を引き起こすために、昆虫の腸に特異的な受容体を必要とすることである。所定のδ−内毒素は、非常に狭い範囲の昆虫に対して毒性を示すので、これらのタンパク質を宿主範囲を広げるため、および毒性を改良するために、幼生の中腸での受容体の認識を改変するように操作することが望ましい。２つのアプローチが、この目的のために行われる。１つ目は、タンパク質の機能ドメインを交換することによるキメラ（またはハイブリッド）遺伝子の開発である。２つ目は、部位指向性変異誘発による改良したδ−内毒素タンパク質の開発である。参考が、米国特許第５，１２８，１３０号および同第５，０５５，２９４号から得られ得る。これらの文献中では、ハイブリッドＢ．ｔ．結晶タンパク質が構築され、それは、毒性の増大を示し、および標的害虫に対する拡張された宿主範囲を表す。
【０００９】
参考は、Ｈｏｎｅｅら、１９９０、「Ａ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ａｎ  ｅｎｌａｒｇｅｄ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：８２３〜８２５から得られ得る。この文献では、２つのｃｒｙ遺伝子（ｃｒｙ１Ａｂおよびｃｒｙ１Ｃａ）の翻訳的融合がなされた。その結果として生じたハイブリッドタンパク質は、寄与する２つの親結晶タンパク質のスペクトルを重複させた、より広い毒性スペクトルを有していた。しかし、このキメラ毒素の活性は、標的昆虫ペストに対して、親毒素の任意の１つを超えるほど増加しないことが、欠点であった。弱い毒性にも関わらず、部分的な改変の後で、融合遺伝子は、タバコにおいて発現した。その改変は、トランスジェニック植物に、より広い範囲の昆虫（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓおよびＭａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａが挙げられる）に対するごく部分的な防護を与えた（参考文献、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓａｌｍら、１９９４、「Ｉｎｓｅｃｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｃｒｙＩＡｂ  ａｎｄ  ｃｒｙＩＣ  ｇｅｎｅ：ａ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｙ」、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：５１〜５９、本発明のために引用され得る）。
【００１０】
参考は、Ｈｏｎｅｅら、１９９１、「Ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ」、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：２７９９〜２８０６から得られ得る。この文献中では、親遺伝子としてｃｒｙ１Ａｂおよびｃｒｙ１Ｃａを使用して、機能ドメインを交換することにより、１１個のキメラ遺伝子が構築された。穴形成ドメインが交換された２つのキメラタンパク質しか殺虫活性を示さないことが、欠点であった。しかし、この毒素キメラタンパク質の効果は、親タンパク質よりも低かった。他のハイブリッドタンパク質は、無毒性であった。
【００１１】
Ｍａｓｓｏｎら、１９９２、「Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｋｅｎｙａｅ」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：２、６４２〜６４６は、Ｃｒｙ１  δ−内毒素の１つ、すなわちＣｒｙ１Ｅａが、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａの幼生に対する毒性を示さないことを報告した。さらに、参考が、Ｂｏｓｃｈら、１９９４、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ：ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ  １２：９１５〜９１８から得られ得る。この文献では、ｃｒｙ１Ｃａ遺伝子およびｃｒｙ１Ｅａ遺伝子のインビボでの遺伝子組換えに従って、多くのキメラ遺伝子が開発された。Ｃｒｙ１Ｅａタンパク質のドメインＩおよびドメインＩＩならびにＣｒｙ１Ｃａタンパク質のドメインＩＩＩならなるキメラ遺伝子の１つから発現したδ−内毒素は、幼虫撲滅活性を示した。Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質のドメインＩＩＩのＣｒｙ１Ｅａタンパク質への移動は、殺虫タンパク質を供給した。しかし、そのキメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｃａ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐ．に対する毒素としてよく報告される）よりも改良された毒素ではなかった。別のキメラ毒素は、非常に弱い毒性を示した。残りのキメラ毒素は、不安定であるか、無毒性であるかのいずれかであった。
【００１２】
参考が、Ｒａｎｇら、１９９９、「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６５、７：２９１８〜２５から得られ得る。この文献では、Ｃｒｙ１Ａｂδ−内毒素、Ｃｒｙ１Ａｃδ−内毒素、Ｃｒｙ１Ｃａδ−内毒素およびＣｒｙ１Ｅａδ−内毒素の間でドメインＩまたはドメインＩＩＩのいずれかをコードする領域を交換することで、多くのキメラ遺伝子が、開発され、Ｅ．ｃｏｌｉ内での安定性およびＳｆ９細胞の形質膜浸透性が検査された。キメラ毒素（Ｃｒｙ１ＣａのドメインＩおよびドメインＩＩならびにＣｒｙ１ＡｂのドメインＩＩＩからなる）は、親毒素よりもより毒性であった。Ｃｒｙ１ＡｂのドメインＩＩＩをＣｒｙ１ＣａのドメインＩＩＩで交換することにより、キメラタンパク質が、Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質よりもより活性となった。他のドメインの交換したタンパク質は、親タンパク質よりも、不安定であるか、毒性が低かった。しかし、昆虫の幼生に対するキメラタンパク質の昆虫の幼生に対する毒性は、試験されなかった。昆虫細胞系における穴形成が比較されたが、それをδ−内毒素の殺虫活性と相関付けることができない。
【００１３】
参考が、Ｃｈａｎｄｒａら、１９９９、「Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｘ  ７  ｏｆ  Ｃｒｙ１Ａｃ  δ−ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｔｏ  Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ  Ｈｕｂｎｅｒ」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５８：１７５〜１７９から得られ得る。この文献では、ジフテリア毒素のフラグメントＢのＣ末端中の疎水性モチーフが、δ−内毒素のへリックスα７と相同であることが見出された。このポリペプチドにより、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質のヘリックスα７の置換の際に、このキメラタンパク質は、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａに対する毒性において、７〜８倍の増強を示した。増大した毒性は、より高い穴形成能力に起因した。
【００１４】
これらの例は、商業的に有用なδ−内毒素を開発するために、ネイティブな毒素の改良のためのタンパク質操作の可能性を、確立する。
【００１５】
鱗翅目害虫の大部分は、自然界では広食性である。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａは、一般的な鱗翅目昆虫であり、その５種（ｌｉｔｕｒａ、ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、ｅｘｉｇｕａ、ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびｅｘｅｍｐｔａ）は、世界中で見出される。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ（エジプトワタ葉虫（Ｅｇｙｐｔｉａｎ  ｃｏｔｔｏｎ  ｌｅａｆ  ｗｏｒｍ、ＣＬＷ））は、ワタおよびヨーロッパにおける他の農業上重要な作物の主要な害虫である（参考文献（Ｍａｚｉｅｒら、１９９７、「Ｔｈｅ  ｃｒｙＩＣ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ」、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１２７：１７９〜１９０）は、本明細書中に引用され得る）。それは、特に、温暖で湿潤な地域（例えば、インド南部）において、ワタ、ラッカセイ、トウガラシ、マメ類およびいくつかの野菜作物の有名な害虫である。高い生殖力、短い生活環、破壊的な摂食習性およびしばしば報告される化学的殺虫剤に対する耐性の発生により、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａの制御が、大きくなりつつある農業上の問題となっている。参考は、Ｂａｉら、１９９３、「Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｂｕｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｅｍｐｔａ（Ｗａｌｋｅｒ）」Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅｂ．Ｐａｔｈｏｌ．６２：２１１〜２１５から得られ得る。この文献では、若い幼生は、特定のδ−内毒素に対して感受的であるが、２期齢を越える幼生は、著しい耐性を示すことが議論されている。これは、腸液中のアルカリプロテアーゼが高い含量であるためである（参考文献（Ｋｅｌｌｅｒら、１９９６、「Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  δ−ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｂｙ  ｇｕｔ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｍａｙ  ｅｘｐｌａｉｎ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｉｎｓｔａｒ  ｌａｒｖａｅ  ｏｆ  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ  ｔｏ  ＣｒｙＩＣ」、Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：３６５〜３７３）は、本明細書中に引用され得る）。
【００１６】
４つの異なるδ−内毒素が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐ．に対し、低レベルの死を引き起こすことが報告されている。そのうち、Ｃｒｙ１Ｃａは、最も有効な毒素である。Ｃｒｙ１Ｃａを高レベルで発現する植物は、初期齢の幼生に死を引き起こし、従って、初期齢の幼生に対する防護を与えた（参考文献（Ｍａｚｉｅｒら、１９９７、「Ｔｈｅ  ｃｒｙＩＣ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ」  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１２７：１７９〜１９０およびＳｔｒｉｚｈｏｖら、１９９６、「Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｒｙ１Ｃ  ｇｅｎｅ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  δ−ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ，ｃｏｎｆｅｒｓ  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ａｌｆａｌｆａ  ａｎｄ  ｔｏｂａｃｃｏ」  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：１５０１２〜１５０１７）は、本明細書中に引用され得る）。しかし、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａに対する完全な防護は、いかなる例でも報告されていない。進んだ発達段階にある幼生は、中程度のレベルの公知のδ−内毒素では、殺傷されない。従って、ＣｒｙａＣａを発現するトランスジェニック植物は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａに対する防護において、所望するほど有効ではない。他の遺伝子（例えば、ｃｒｙ１Ｃｂ、ｃｒｙ１Ｅａおよびｃｒｙ１Ｆ）は、その比較的低い毒性のために、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａに対するトランスジェニック植物の開発のために使用されていない。Ｃｒｙ１Ｃｂ  δ−内毒素は、Ｃｒｙ１Ｃａの５分の１の毒性である。Ｃｒｙ１Ｅａ  δ−内毒素の毒性は、非常に低く、特定の報告では、反論されている（Ｍａｓｓｏｎら、１９９２およびＢｏｓｃｈら、１９９４は、本明細書中に引用され得る）。Ｃｒｙ１Ｆは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ幼生に対する穏かな毒性を示す（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、１９９１は、本明細書中に引用され得る）。
【００１７】
参考が、Ｋａｌｍａｎら、１９９３、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｒｙＩＣ−ｔｙｐｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｂａｓｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｇａｌｌｅｒｉａｅ」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：４：１１３１〜１１３７から得られ得る。この文献では、Ｃｒｙ１Ｃｂδ−内毒素は、Ｃｒｙ１Ｃａの５分の１の毒性であることが、報告されている。これらのタンパク質の最初の２つのドメインは、高度に相同である（９２％同一）。主要な差違は、４８％の相同性のみを示すドメインＩＩＩにおいて観察される。Ｃｒｙ１Ｃｂ  δ内毒素に対するＣｒｙ１Ｃａ  δ内毒素のより高い毒性（５倍）は、本発明者らに、Ｃｒｙ１ＣａのドメインＩＩＩが、その効力において重要な役割を果たし得ることを示唆した。Ｃｒｙ１Ｅａ  δ−内毒素の毒性は、それが、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａの中腸で受容体と非常に弱く結合する場合は、非常に乏しいが、Ｃｒｙ１ＣａのドメインＩＩＩをＣｒｙ１Ｅａで交換することにより、後者の毒性が生じる。このことは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａの中腸での受容体との結合における、ＣｒｙＩＣタンパク質のドメインＩＩＩの役割を示唆する（参考文献（Ｂｏｓｃｈら、１９９４、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ：ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍａｎｅｇｅｍｅｎｔ」．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ  １２：９１５〜９１８）は、本明細書中に引用され得る）。この出版物において、Ｂｏｓｃｈら（１９９４）は、Ｃｒｙ１Ｃａが結合しない受容体に結合するので、ハイブリッド毒素の利点を確立した。しかし、ネイティブなＣｒｙ１ＣａおよびハイブリッドＣｒｙ１Ｅａの両方の毒性は、匹敵した。彼らは、特許（ＵＳ  ５７３６１３１）を出願し、その中では、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａに対する毒性についての１．９倍の改良が、主張されていた。毒性に増強はないことを報告する公報での結果と１．９倍の改良された毒性を主張する特許での結果の違いにより、その全体像が不明瞭になっている。
【００１８】
植物遺伝子工学技術は、過去１０年の間に有意な進歩をした。外来性遺伝子を植物に安定的に導入することが、可能となった。これにより、近代農業にとって興奮する機会が提供された。植物の病原体であるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ−プラスミド誘導体は、外来性遺伝子の植物組織への導入に、有効でかつ高度に多機能なビヒクルであることが証明されている。さらに、ＤＮＡを送達するための種々の方法（例えば、エレクトロポレーション技術、マイクロインジェクション技術、花粉媒介性の遺伝子移転技術およびパーティクルガン技術）が、同じ目的で開発されている。
【００１９】
遺伝子工学による植物の形質転換の主要な目的は、作物の改良である。実質的な努力が、有用な形質（例えば、昆虫耐性）の植物を操作するためになされている。この点において、トランスジェニック植物の昆虫耐性の操作における進歩は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株由来のδ−内毒素をコードする遺伝子の使用を通じて、達成された。δ−内毒素は、特異的な殺虫スペクトルを有しており、他の非宿主動物およびヒトに対して毒性を示さないので、これらは、商業的に有用な植物の開発に、高度に適している。δ−内毒素と同じ位の高い毒性（ｐｐｍレベル）を示し、また非標的生物に対してδ−内毒素と同じ位になお安全である他のタンパク質は、知られていない。
【００２０】
δ−内毒素を発現する昆虫耐性トランスジェニック作物の生成およびその農業上の商業的成功の実行可能性が、実証されている（参考は、本明細書中になされ得る。Ｖａｅｃｋら、１９８７、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｓｅｃｔ  ａｔｔａｃｋ」、Ｎａｔｕｒｅ．３２８：３３〜３７；Ｆｉｓｃｈｏｆｆら、１９８７、「Ｉｎｓｅｃｔ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｍａｔｏ  ｐｌａｎｔｓ」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．５：８０７〜８１３；Ｂａｒｔｏｎら、１９８７、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  δ−ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｃｕｍ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ  ｉｎｓｅｃｔｓ」、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５：１１０３〜１１０９から得られ得る）。トランスジジェニック植物は、農業における昆虫の制御に対する魅力的な代替物を提案する。それは、同時に、安全であり、環境に優しく、そして費用効率がよい。首尾良い昆虫の制御は、野外の条件下で観察されている（参考が、Ｄｅｌａｎｎａｙら、１９８９；ＭｅｅｕｓｅｎおよびＷａｒｒｅｎ、１９８９から得られ得る）。
【００２１】
参考が、Ｖｏｎ  Ｔｅｒｓｃｈら、１９９１、「Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｔｏｘｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ  ｋａｎｙａｅ：Ｇｅｎｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ  ｋｕｒｓｔａｋｉ  Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）  ｔｏｘｉｎ」、Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、５７：２：３４９〜５８に引用され得る。この文献中では、ｃｒｙ１Ａｃの２つの改変体が、２つの異なる株から単離された。それらのアミノ酸組成は、７つの位置で異なっていた。このδ−内毒素は両方とも、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させられ、そして毒性試験が行われた。この２つの毒素は、標的害虫に対する効果において、いかなる違いも示さなかった。
【００２２】
別の研究（Ｓｃｈｎｅｐｆら、１９９８、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、６２：３、７７５〜８０６）において、Ｃｒｙ１Ａｃ  δ−内毒素の３１２位〜３１４位のアミノ酸残基ＧＹＹが、これをＡＳＹ、ＧＳＹ、およびＧＦＳで置換するように改変された。これらの３つのタンパク質の毒性の違いは、分からなかった。
【００２３】
Ｃｒｙ１Ｃ  δ−内毒素の２つの天然改変体、すなわちＣｒｙ１ＣａおよびＣｒｙ１Ｃｂが存在する。これらのタンパク質は、８１％のアミノ酸配列同一性を示す（Ｓｃｈｎｅｐｆら、１９９８、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、６２：３、７７５〜８０６）。この違いがあるにもかかわらず、両毒素は、毒性のレベルにいくらかの違いはあるが、その標的害虫に対して毒性がある。宿主範囲もまた、同じである（Ｋａｌｍａｎら、１９９３、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖａｌ  ｃｒｙ１Ｃ  ｔｙｐｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ  ｇａｌｌｅｒｉａｅ」  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ５９：４：１１３１〜３７）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
（本発明の目的）
本発明の主な目的は、キメラδ内毒素タンパク質を開発することである。
【００２５】
本発明の別の主な目的は、キメラδ内毒素タンパク質をコードするキメラ遺伝子を開発することである。
【００２６】
本発明のなお別の目的は、上記キメラタンパク質を開発する方法を開発することである。
【００２７】
本発明のなお別の目的は、上記キメラタンパク質を、適切な微生物中で過剰発現させる方法の開発することである。
【００２８】
本発明のなお別の目的は、上記キメラタンパク質を使用して、昆虫に寄生された植物を処置する方法を開発することである。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、多数の薬物に耐性のある昆虫用の殺虫剤を開発することである。
【００３０】
本発明の別の目的は、有効な殺虫剤を開発することである。
【００３１】
本発明のなお別の目的は、植物に対する悪影響を有さない殺虫剤を開発することである。
【００３２】
本発明のなお別の目的は、約１００％の殺虫活性を有する殺虫剤を開発することである。
【００３３】
（本発明の要旨）
本発明は、極めて高い殺虫特性を有するキメラδ内毒素タンパク質Ｃｒｙ１Ｅ（配列番号１）および上記キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子（配列番号２）に関し、また、上記のキメラタンパク質を使用して、昆虫に寄生された植物を処置する方法にも関する。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
（本発明の詳細な説明）
従って、本発明は、極めて高い殺虫特性を有するキメラδ内毒素タンパク質Ｃｒｙ１Ｅ（配列番号１）および上記キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子（配列番号２）に関し、また、上記のキメラタンパク質を使用して、昆虫に寄生された植物を処置する方法にも関する。
【００３５】
本発明の１つの実施形態において、キメラδ内毒素タンパク質Ｃｒｙ１Ｅ（配列番号１）および７５％以上の配列相同性を有する他のタンパク質。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、キメラδ内毒素タンパク質Ｃｒｙ１Ｅ（配列番号１）。
【００３７】
本発明のなお別の実施形態において、上記タンパク質は、長さが６４１アミノ酸残基である。
【００３８】
本発明のなお別の実施形態において、上記キメラタンパク質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのδ内毒素Ｃｒｙ１Ｅａおよびδ内毒素Ｃｒｙ１Ｃａから設計される。
【００３９】
本発明のなお別の実施形態において、上記６４１残基の長さのキメラタンパク質は、同じ位置の内毒素Ｃｒｙ１Ｅａに由来する残基１〜５２９、５３３位〜６０２位のＣｒｙ１Ｃａに由来する残基５３０〜５９９、５８８位〜６０４位のＣｒｙ１Ｅａに由来する残基６００〜６１６および人工ポリペプチドの残基６１７〜６４１からなる。
【００４０】
本発明のなお別の実施形態において、Ｃｒｙ１Ｅａの５３０〜５８７のペプチドドメインは、任意の他のδ内毒素のペプチドドメインで置換され得る。
【００４１】
本発明のなお別の実施形態において、最後の２５アミノ酸残基が、植物のプロテアーゼに対する安定性を改良する。
【００４２】
本発明のなお別の実施形態において、上記キメラタンパク質は、４〜３５℃の範囲の温度で安定である。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２のキメラ遺伝子が提供される。
【００４４】
本発明の別の実施形態において、上記キメラは、配列番号１のキメラタンパク質をコードする。
【００４５】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラは、１９９０塩基対（ｂｐ）の長さである。
【００４６】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラは、１．９９ｋｂの二本鎖ＤＮＡである。
【００４７】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラは、効率的な翻訳を促進するために、均等に分布する植物に好ましいコドンを含む。
【００４８】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラは、５’末端に、植物に好ましい翻訳開始コドンであるＡＴＧＧＣＴを含む。
【００４９】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラは、植物に好ましい翻訳終結コドンであるＴＡＡＴＧＡを含む。
【００５０】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラは、遺伝子の全長にわたり、約４０〜８０ｂｐの間隔で均一に分布する３３個の制限酵素部位を含む。
【００５１】
本発明のまた別の実施形態において、制限酵素部位は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＢａｍＨＩからなる群から選択される酵素である。
【００５２】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラは、それぞれが６〜２６塩基対（ｂｐ）の間隔で位置する、長さが４０〜６５ｂｐの５８個の重複するオリゴヌクレオチドに分割される。
【００５３】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラは、相補鎖上の直ぐ近接するオリゴヌクレオチドとの１３〜１８ヌクレオチドの重複を有する上記重複するヌクレオチドを含む。
【００５４】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラは、４４℃と５５℃との間の範囲のＴｍ値を有する。
【００５５】
本発明のさらなる実施形態において、微生物中で殺虫性キメラタンパク質Ｃｒｙ１Ｅを過剰発現させる方法が提供される。
【００５６】
本発明の別の実施形態において、上記キメラタンパク質をコードする配列番号２のＣｒｙ１Ｅ遺伝子を、ベクターにクローニングする。
【００５７】
本発明のまた別の実施形態において、上記クローン化したベクターを使用して、微生物を形質転換する。
【００５８】
本発明のまた別の実施形態において、上記微生物中で、上記キメラタンパク質を過剰発現させる。
【００５９】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラは、細菌類、藻類および菌類からなる群から選択される微生物中で、発現させられる。
【００６０】
本発明のまた別の実施形態において、上記クローニングのための制限酵素は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｎｃｏｌ、ＭｆｅＩ、およびＢａｍＨＩからなる群から選択される。
【００６１】
本発明のまた別の実施形態において、上記タンパク質の過剰発現は、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導される。
【００６２】
本発明のまた別の実施形態において、上記タンパク質の誤った折りたたみを避けるために、上記タンパク質を１５℃で過剰発現させる。
【００６３】
本発明のまた別の実施形態において、上記ベクターは、プラスミド、ウイルスＤＮＡ、およびコスミドからなる群から選択される。
【００６４】
本発明のまた別の実施形態において、微生物中のキメラの発現は、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタン分析、およびＥＬＩＳＡによって確認される。
【００６５】
本発明のまた別の実施形態において、微生物でのキメラの存在は、ＰＣＲおよびサザン分析によって確認される。
【００６６】
本発明のさらなる実施形態において、上記殺虫性キメラタンパク質を使用して、昆虫に感染した植物を処置する方法が提供される。
【００６７】
本発明の別の実施形態において、キメラタンパク質Ｃｒｙ１Ｅをコードする遺伝子を、昆虫に感染した植物中に取り込ませる。
【００６８】
本発明のまた別の実施形態において、トランスジェニック植物を昆虫に曝露する。
【００６９】
本発明のまた別の実施形態において、上記トランスジェニック植物の殺虫活性を決定する。
【００７０】
本発明のまた別の実施形態において、昆虫ペストは、ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐ．、およびＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｓｐ．からなる群から選択される。
【００７１】
本発明のまた別の実施形態において、植物は、タバコ、ワタ、ヒヨコマメ、ピジョンマメ（ｐｅｇｅｏｎｐｅａ）、ラッカセイ、カリフラワー、キャベツ、チリトウガラシおよびトウガラシからなる群から選択される。
【００７２】
本発明のまた別の実施形態において、上記クローニングのための制限酵素は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｎｃｏｌ、およびＢａｍＨＩからなる群から選択される。
【００７３】
本発明のまた別の実施形態において、キメラタンパク質は、植物の可溶性タンパク質の総量の約０．５％を有することにより、植物中での高度な発現を示す。
【００７４】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラタンパク質は、上記トランスジェニック植物中で安定である。
【００７５】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラタンパク質に曝露された昆虫は、死ぬ前に体重減少を示す。
【００７６】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラタンパク質は、全ての発達段階の昆虫に対して殺虫特性を示す。
【００７７】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラタンパク質は、親タンパク質と比較して、何倍も強力な殺虫剤である。
【００７８】
本発明のまた別の実施形態において、上記キメラタンパク質の殺虫活性は、約４時間以内の曝露で、８０〜１００％の間の範囲の昆虫ペストの死亡率を示す。
【００７９】
本発明のまた別の実施形態において、約１時間の間、上記キメラタンパク質に曝露された昆虫は、発達の遅れ、不妊および変態の乱れを示す。
【００８０】
本発明のまた別の実施形態において、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｓｐ．のＥＣ５０は、昆虫の人工食餌の１ｍｌあたり２５０〜３５０ｎｇの範囲である。
【００８１】
本発明のまた別の実施形態において、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐ．のＥＣ５０は、人工食餌の１ｍｌあたり２５〜５０ｎｇの範囲である。
【００８２】
本発明のまた別の実施形態において、上記方法はトランスジェニック植物の正常な成長に悪い効果を示さない。
【００８３】
本発明のさらなる実施形態において、新規のキメラＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓδ−内毒素が、δ−内毒素のポリペプチドドメイン（ここでは、上記Ｃｒｙ１Ｅａ）を他のδ−内毒素の対応するドメインで置換し、Ｃ末端を新規のポリペプチドで置換することによって、戦略的に開発される。新規のキメラ毒素をコードし、それを植物組織中で高レベルで発現するように、遺伝子が、理論的に設計され、化学的に合成される。この遺伝子は、微生物（Ｅ．ｃｏｌｉ）および２つの双子葉植物（タバコおよびワタ）において発現された。戦略的に設計されたδ内毒素の効果は、両方の系で確立された。鱗翅目の昆虫の幼生（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａおよびＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ）に対するキメラタンパク質の毒性は、親タンパク質と比較して改良された。この合成キメラ遺伝子は、昆虫ペストに対する抵抗性のために、作物栽培学的に改良された作物用植物を開発するために使用され得るので、商業的に価値がある。
【００８４】
従って、本発明の別の実施形態において、本発明は、「殺虫活性のために改良された新規のδ−内毒素およびその植物中での高レベルな発現のための遺伝子」を提供し、Ｃｒｙ１Ｅａタンパク質のポリペプチドドメイン（５３０〜５８７の位置）をＣｒｙ１Ｃａのポリペプチドドメイン（５３３〜６０２の位置）で置換することによって、新規のキメラδ−内毒素（ここでは、上記キメラＣｒｙ１Ｅ（６１６アミノ酸残基））を戦略的に設計する工程、Ｃ末端に２５アミノ酸残基の新規のペプチドを組み込む工程、植物中で高レベルである６４１アミノ酸残基の長さのキメラδ−内毒素をコードするように遺伝子を理論的に設計する工程、理論的に設計された遺伝子を代表するオリゴヌクレオチドを設計し、化学的に合成する工程、オリゴヌクレオチドを二本鎖ＤＮＡに構築する工程、クローン化した人工ＤＮＡをクローニングし、配列分析する工程、Ｅ．ｃｏｌｉおよび植物においてキメラ遺伝子を発現させるためのベクターを構築する工程、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて合成キメラ遺伝子を発現させる工程、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａおよびＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａに対するキメラタンパク質の毒性とその親タンパク質の毒性とを比較する工程、キメラ遺伝子を用いてタバコを形質転換する工程、トランスジェニック植物において操作されたタンパク質を高レベルで発現させる工程、トランスジェニック植物からδ−内毒素タンパク質を精製する工程ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａの幼生およびＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａの幼生に対するその効果を確認する工程、標的昆虫ペストに対する防護について、トランスジェニック植物において発現したキメラ毒素の可能性を評価する工程を含む。
【００８５】
本発明の１つの実施形態において、天然のδ−内毒素、すなわちＣｒｙ１Ｅａは、それを昆虫ペスト(例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐ．)の幼生に対して生物学的に活性にするために、戦略的に設計され、それに従って改変される。
【００８６】
本発明の別の実施形態において、長さが６１６アミノ酸残基であるキメラδ−内毒素（ここではキメラＣｒｙ１Ｅという）は、Ｃｒｙ１Ｅａのペプチドドメイン（５３０〜５８７の位置）をＣｒｙ１Ｃａのペプチドドメイン（５３３〜６０２の位置）で置換することで理論的に設計された。さらに、２５アミノ酸残基の新規のポリペプチドが、δ−内毒素のＣ末端に導入された。
【００８７】
本発明のまた別の実施形態において、Ｃｒｙ１Ｅａの５３０〜５４５の位置および５７８〜５８７の位置に由来する２つのペプチドドメインは、Ｃｒｙ１Ｃａの５３３〜５５５の位置および５８８〜６０２の位置のペプチドドメインにで置換され得る。このようなキメラ毒素はまた、類似の（または同じ）生物学的活動を行い得る。
【００８８】
本発明のまた別の実施形態において、Ｃｒｙ１Ｅａの５３０〜５８７のペプチドドメインは、他のδ−内毒素のペプチドドメインによって置換され得る。
【００８９】
本発明のまた別の実施形態において、２５アミノ酸残基のポリペプチドが、δ−内毒素のＣ末端に導入される。このポリペプチドによって、植物のプロテアーゼに対するδ−内毒素の安定性が改良した。これは、昆虫の中腸におけるδ−内毒素の安定性を改良し得た。
【００９０】
本発明のまた別の実施形態において、２５アミノ酸残基の長さのポリペプチドは、他のδ−内毒素のＣ末端に含まれ得、このような毒素は、異なる種類のプロテアーゼに対して安定になり得る。
【００９１】
本発明のまた別の実施形態において、２５アミノ酸残基の長さのポリペプチドは、プロテアーゼに対する安定性のために、任意の組換えタンパク質のＣ末端に取りこまれ得る。
【００９２】
本発明のまた別の実施形態において、１．９９ｋｂの二本鎖ＤＮＡが、キメラタンパク質をコードするように理論的に設計された。植物中での高レベルの遺伝子発現を促進するために、植物に好ましいコドンを使用して、キメラ毒素タンパク質のアミノ酸がコードされた。
【００９３】
ＥＭＢＬデータベース中で与えられる、Ｃｒｙ１Ａａδ−内毒素の６つの改変体、すなわちＣｒｙ１Ａａ１〜Ｃｒｙ１Ａａ６が存在する。これらのδ−内毒素タンパク質のアミノ酸配列に対するクラスター（ｃｌｕｓｔａｌ）分析が、以下に示される。３つの位置（７７、１４８および３０２）において、アミノ酸残基が異なる。改変位置は、以下ではボールド体で示される。しかし、６つの遺伝子の全てが、異なる研究所による毒性試験において、使用されている。昆虫に対する毒性における６つの改変体の全ての効果は、同程度であった。
【００９４】
【化１−１】
2005536188.tif 000002
【００９５】
【化１−２】
2005536188.tif 000003
【００９６】
【化１−３】
2005536188.tif 000004
【００９７】
【化１−４】
2005536188.tif 000005
【００９８】
【化１−５】
2005536188.tif 000006
【００９９】
参考が、Ｖｏｎ  Ｔｅｒｓｃｈら、１９９１、「Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｔｏｘｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ  ｋａｎｙａｅ：Ｇｅｎｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ  ｋｕｒｓｔａｋｉ  Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）  ｔｏｘｉｎ」、Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、５７：２：３４９〜５８から引用され得る。この文献中では、ｃｒｙ１Ａｃの２つの改変体が、２つの異なる菌株から単離された。これらのアミノ酸組成は、７つの位置で異なっていた。両方のδ−内毒素が、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させられ、毒性実験が行われた。この２つの毒素は、標的害虫に対する効果において、全く違いを示さなかった。
【０１００】
さらに、タンパク質において、特に好ましくは内毒素の分野において、配列の高い相同性によって、活性に有意な違いをまったく生じないことが見出されることが、このことから明確に主張される。内毒素Ｃｒｙ１Ａａ１〜ＣｒｙＡａ６の上述の例は、この研究の本質を明確に反映している。本出願において、出願人は、異常に高い殺虫活性を観測する。さらに、本出願のキメラタンパク質Ｃｒｙ１Ｅの配列における７０％以上の相同性もまた、活性に有意な変化を示さないことが見出される。このことは、キメラタンパク質Ｃｒｙ１Ｅに対して７０％以上の配列相同性を有するタンパク質は、殺虫剤として使用されることを意味する。
【０１０１】
別の研究（Ｓｃｈｎｅｐｆら、１９９８、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、６２：３、７７５〜８０６）において、Ｃｒｙ１Ａｃδ−内毒素のアミノ酸残基ＧＹＹ（３１２〜３１４の位置）が、変更され、これらの残基が、ＡＳＹ、ＧＳＹおよびＧＦＳによって置換された。３つのタンパク質の毒性に違いは、見られなかった。
【０１０２】
さらに、Ｃｒｙ１Ｃδ−内毒素の２つの天然改変体、すなわちＣｒｙ１ＣａおよびＣｒｙ１Ｃｂが存在する。これらのタンパク質は、８１％のアミノ酸配列同一性を示す（Ｓｃｈｎｅｐｆら、１９９８、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、６２：３、７７５〜８０６）。この違いにもかかわらず、両毒素は、毒性のレベルにいくらかの違いはあるが、その標的害虫に対して毒性がある。これらの宿主範囲もまた、同じである（Ｋａｌｍａｎら、１９９３、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖａｌ  ｃｒｙ１Ｃ  ｔｙｐｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ  ｇａｌｌｅｒｉａｅ」  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ５９：４：１１３１〜３７）。
【発明の効果】
【０１０３】
本発明のなお別の実施形態において、５８オリゴヌクレオチドは、１．９９ｋｂのキメラｃｒｙ１Ｅ  ＤＮＡを代表するように設計された。全オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され、酵素的に融合させられて、所望の二本鎖ＤＮＡが得られた（図１を参照のこと）。
【０１０４】
本発明のなお別の実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉの発現および植物での発現のための２つの独立した構築物が作成される。親遺伝子（ｃｒｙ１Ｅａおよびｃｒｙ１Ｃａ）もまた、Ｅ，ｃｏｌｉでの発現用の他の発現ベクターに導入された。
【０１０５】
本発明のなお別の実施形態において、３つの遺伝子の全てが、Ｅ．ｃｏｌｉで発現した。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａに対するキメラＣｒｙ１Ｅの効果が、親毒素（Ｃｒｙ１ＥａおよびＣｒｙ１Ｃａ）と比較された。毒性実験により、操作された毒素は、親タンパク質と比較して数倍もの毒性があることが、立証された。
【０１０６】
本発明のなお別の実施形態において、植物中で発現したキメラタンパク質もまた、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ、別の深刻な昆虫ペストに対して毒性があることが示された。これにより、本研究で設計された新規キメラ毒素の宿主範囲の改善が確立された。
【０１０７】
本発明のなお別の実施形態において、合成遺伝子は、キメラ毒素の発現のためにタバコに導入された。トランスジェニック植物は、キメラ毒素を発現し、そして総可溶性タンパク質の０．５％まで蓄積した。トランスジェニック植物は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａの幼生に対して優れた防護を示し、全ての発達段階において１００％の死亡率を引き起こした。
【０１０８】
本発明のなお別の実施形態において、新規のキメラ毒素は、トランスジェニックタバコ植物の葉からの全可溶性タンパク質から精製され、半人工餌に混ぜられた。再度の毒性実験により、ハイブリッド毒素の効果が立証された。
【０１０９】
本発明は、高度に活性のキメラδ−内毒素の発見に関する。長さが６４１アミノ酸残基である新規のδ−内毒素（本明細書中では、キメラＣｒｙ１Ｅという）は、Ｃｒｙ１Ｅａタンパク質のポリペプチドドメイン（５３０〜５８７の位置）をＣｒｙ１Ｃａのポリペプチドドメイン（５３３〜６０２の位置）で置換することで、戦略的に設計された。同様に、キメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｅａの１〜５２９のアミノ酸残基、Ｃｒｙ１Ｃａの５３０〜５９９のアミノ酸残基およびＣｒｙ１Ｅａの６００〜６１６のアミノ酸残基を含む。２５アミノ酸残基の新規のポリペプチドは、δ−内毒素のＣ末端として含まれた。換言すると、このポリペプチドは、キメラ毒素の６１７〜６４１のアミノ酸残基を構成する。いくつかのキメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｅａ毒素の異なる部分を、戦略的に設計されたアミノ酸配列または他の毒素の部分で置換することによって、作製され得る。１．９９ｋｂのヌクレオチド配列が、上記のキメラδ−内毒素をコードするように理論的に設計された。毒素タンパク質をコードする遺伝子（本明細書中では、キメラｃｒｙ１Ｅという）は、植物に好ましいコドンを導入することによって、植物中で高レベルで発現させるために設計された。各アミノ酸についての植物に好ましいコドンは、効果的な翻訳を促進するために、均等に分布させられた。植物中での遺伝子発現に適した翻訳開始コンテキスト（ＴＡＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴ）は、５’末端に含まれ、そして２つの翻訳停止コドン（シグナル）が、キメラ毒素のリーディグフレームの末端に導入された。３３の特有の制限酵素部位の全てが、遺伝子の全長にわたり、４０〜８０ｂｐの距離で一様に導入された。クローニングを容易にするために、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限部位は、遺伝子の上流に、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位は、遺伝子の下流に作製された（図２を参照のこと）。
【０１１０】
翻訳開始コンテキストは、遺伝子のすぐ始めの場所に、ＮｃｏＩ部位を自動的に作製した。遺伝子は、その間に６〜２６塩基長のギャップを有する、５８個の重複するオリゴヌクレオチド（４０〜６５ヌクレオチドの長さ）に分割された（図１を参照のこと）。各オリゴヌクレオチドは、相補鎖上のすぐ近接するオリゴヌクレオチドとの１３〜１８ヌクレオチド長の重複を有した。相補的重複は、Ｔｍ値を４８〜５０℃の間に保つように設計された。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機（Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｓｐｅｃｉａｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上で、２００ｎｍｏｌのスケールで合成され、変性尿素−ＰＡＧＥ上で精製した。図１に示すように、５８個のオリゴヌクレオチドの全てが、ライゲーションフリー遺伝子合成法（Ｓｉｎｇｈら（１９９６））に従って、１．９９ｋｂの二本鎖ＤＮＡ（本明細書中では、キメラｃｒｙ１Ｅ遺伝子という）に組立てられた。このＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化され、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にクローン化された。このプラスミドは、ｐＰＫ２００と名付けた。この合成ＤＮＡのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ  ３７３Ａ）上でクローン化した合成ＤＮＡを配列決定することにより、確認した。
【０１１１】
カセットもまた、Ｔ７  ｌａｃプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ中でキメラ毒素を発現させるために構築された。このプラスミドｐＰＫ２００は、制限酵素ＮｃｏＩおよび制限酵素ＢａｍＨＩによって消化され、発現ベクターｐＥＴ−１９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）にクローン化された。このプラスミドは、ｐＰＫ２０６と名付けられた。Ｃｒｙ１Ｃａ毒素およびＣｒｙ１Ｅａ毒素をコードするＤＮＡが、適切なプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された。このプライマーは、アンプリコンの上流と下流に、ＮｃｏＩの制限酵素部位およびＢａｍＨＩの制限酵素部位を作製した。増幅生成物は、ｐＥＴ−１９ｂベクターにクローン化された。Ｃｒｙ１Ｃａ毒素をコードするＤＮＡおよびＣｒｙ１Ｅａ毒素をコードするＤＮＡを有する構築物は、それぞれｐＰＫ１３５およびｐＰＫ１４１と名付けられた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ＤＥ３株は、構築物ｐＰＫ２０６、ｐＰＫ１３５およびｐＰＫ１４１で形質転換された（図３を参照のこと）。毒素タンパク質は、適切な濃度のＩＰＴＧでの誘導により、発現された。この発現は、可能性のある誤った折りたたみを避けるために、１５℃で行われた。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、リゾチームによって溶解させられ、そして超音波処理をされてδ−内毒素を放出した。この毒素タンパク質は、封入体中に見出された。これらは、２８℃で、５０ｍＭの重炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中に可溶化された。この毒素タンパク質は、濃度測定により定量された。この毒素の連続希釈物は、半人工餌に混ぜられ、そして、この混合物はペトリ皿に注がれた。Ｅ．ｃｏｌｉの総タンパク質が、コントロール餌として使用された。１５匹のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａの新生幼生が、１００ｍｌビーカー中の餌の混合物のケーキ上に放出され、そしてこのビーカーの口は、ガス交換を可能にするためにモスリン布で覆われた。各実験は、６回繰り返し行われた。餌は、１日おきごとに交換された。バイオアッセイは、２５±０．２℃、１６時間／８時間の光周期で行われた。毒性データは、給餌の７日後に記録された。ＥＣ５０は、標準的ログ−プロビット分析により決定された。３つのタンパク質の全てが、同様に試験された。それを表す結果が、ここで以下の表１に示される。
【０１１２】
【表１】
2005536188.tif 000007
【０１１３】
この結果は、キメラ毒素を発現するＥ．ｃｏｌｉ株が、Ｃｒｙ１Ｅａタンパク質よりも数倍、Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質よりも４倍を超えて毒性であることを示した。Ｃｒｙ１Ｅａ毒素タンパク質は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａの幼生に全く影響を与えなかった。この結果により、生物学的に活性であり、改善された毒素である新規のキメラタンパク質Ｃｒｙ１Ｅを開発するためのＣｒｙ１Ｅａ毒素の首尾よい操作が、確立された。操作されたタンパク質は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐ．に対する周知のδ−内毒素であるＣｒｙ１Ｃａタンパク質よりも４倍毒性であった。
【０１１４】
３つのδ−内毒素の全てはまた、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｓｐ．の７２時間幼生に対して試験された。各幼生は、別々の箱の中の餌に放出された。毒素の各濃度で、４０匹の幼生をチャレンジした。毒性の結果は、キメラ毒素はまた、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａに対しても毒性であることを示す。代表的な結果が、以下の表２に示される。
【０１１５】
【表２】
2005536188.tif 000008
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「毒素」という言及は、殺虫活性の原因であるＮ末端セグメントを意味する。当業者は、相同性のδ−内毒素または異種のδ−内毒素のＣ末端フラグメントの一部または全部を含ませることにより、この毒素をプロトキシンに変換し得る。このようなプロトキシンは、微生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなど）の体内で非常に安定な分子であり得、微生物的処方物を開発する際に使用され得る。このような処方物は、殺虫剤として使用され得る。本発明者らによって開発された新規の毒素を使用することによる、このようなプロトキシンおよび処方物の開発も、本発明者らが特許請求する発明の範囲内である。
【０１１７】
本発明に従う有用な遺伝子および毒素には、６４１アミノ酸長の毒素のみならず、その新規の配列、本明細書中で詳細に例示される毒素の特徴的な殺虫活性を保持する改変体および変異体のフラグメントも含まれる。本明細書で使用される場合、遺伝子の「改変体」または「バリエーション」という用語は、同じ毒素またはそれ以下の殺虫活性を有する毒素をコードするヌクレオチド配列をいう。本明細書で使用される場合、用語「同等の殺虫活性」は、標的害虫に対して、特許請求する毒素と類似の生物学的活性または本質的に同じ生物学的活性を有する毒素をいう。
【０１１８】
同じ毒素または本質的に同じ毒素をコードする代替的なＤＮＡ配列を作成することは、十分に当業者の技術範囲であり得る。これらの改変ＤＮＡ配列は本発明の範囲内である。本明細書中で使用される場合、「本質的に同じ」配列という言及は、殺虫活性に実質的に影響を与えないアミノ酸の置換、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加またはアミノ酸の挿入を有する配列をいう。殺虫活性を保持するフラグメントもまた、この定義に含められる。
【０１１９】
本発明の新規のキメラ毒素は、本明細書中で詳細に例示されている。本発明は、例示した毒素と同じ殺虫活性または類似の殺虫活性を有する改変体または同等の毒素（および、同等の毒素をコードするヌクレオチド配列）を含むことが、容易に明らかであるべきである。同等の毒素は、例示した毒素とアミノ酸相同性を有する。このアミノ酸相同性は、代表的には７５％よりも大きく、好ましくは９０％よりも大きく、そして最も好ましくは９５％よりも大きい。アミノ酸相同性は、生物学的活性の原因であるか、または３次元構造の決定に関わり、究極的には生物学的活性の原因となる毒素の重要な領域において、最も高い。この点において、これらの置換が、生物学的活性において重要ではない領域内にある場合、または分子の３次元構造に影響しない保存的なアミノ酸の置換である場合には、特定のアミノ酸の置換が受容可能であり、そして予測され得る。例えば、アミノ酸は、以下のクラス内で置換され得る：非極性、非荷電極性、塩基性および酸性。保存的なアミノ酸の置換とは、それによって１つのクラスのアミノ酸が、同じクラスの別のアミノ酸で置換されるという置換である。この置換は、δ−内毒素の生物学的活性を重大に変更しない限り、本発明の範囲内である。以下に示す表３は、各クラスに属するアミノ酸の例のリストである。
【０１２０】
【表３】
2005536188.tif 000009
【０１２１】
いくつかの例において、非保存的置換もまた、作製され得る。これらの置換が、有意にその毒素の生物学的活性を下げてはならないということが、重要な因子である。キメラ毒素中の任意のアミノ酸をアラニンで置換することは、十分にタンパク質工学の当業者の技術範囲内であり得る。アラニンは代表的なアミノ酸であるので、この任意のアミノ酸の置換は最も安全である。このような置換もまた、本発明の範囲内である。
【０１２２】
本発明のキメラ毒素をコードする遺伝子は、幅広い種々の微生物宿主または植物宿主中に導入され得る。この毒素遺伝子の発現により、直接的にまたは間接的に、殺虫性キメラ毒素の細胞内生産および維持が起きる。適切な微生物宿主（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）について、その微生物は、害虫が増殖する場所に適用され得る。これにより、害虫の制御がもたらされる。あるいは、その毒素遺伝子の宿主微生物は、毒物の活性を延長し、細胞を安定化させる条件下で、処置され得る。毒物活性を保持する処置された細胞は、次いで、標的害虫の環境に適用され得る。キメラ毒素をコードする遺伝子が、適切なベクターを介して、微生物宿主に導入され、そして該宿主が、生きた状態で環境に適用される場合、特定の宿主微生物が使用されることが必要である。１つ以上の目的の作物の植物圏（ｐｈｙｔｏｓｐｈｅｒｅ）（葉面、葉圏、根圏、および／または根面）に寄生する微生物宿主が選択される。特定の環境中（作物環境および他の昆虫環境）で、野生型の微生物と首尾よく競合し得るように、ポリペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定的な維持および発現を与えるように、および、望ましくは、環境中の分解および不活性化からの改良された防護を殺虫剤に与えるように、これらの微生物が選択される。
【０１２３】
非常に多くの微生物が、非常に多様な重要な作物の葉面（植物の葉の表面）および／または根圏（土壌に囲まれた植物の根）に寄生することが公知である。これらの微生物としては、細菌類、藻類、および真菌類が挙げられる。微生物のうち特に興味深いのは、細菌類、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｉｕｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、およびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属；真菌類（特に酵母）、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属およびＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属である。特に興味深いのは、植物圏の細菌種、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｏｔｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｎｔｒｏｐｈｕｓおよびＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｌａｎｄｉｉ、ならびに植物圏の酵母種、例えば、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ、Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒ．ｍａｒｉｎａ、Ｒ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ｃ．ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ、Ｃ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｉ、Ｓ．ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｕｓ、Ｓ．ｏｄｏｒｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｏｎａｅおよびＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｏｌｌｕｌａｎｓ。特に興味深いのは、着色した微生物である。幅広い種々の方法が、遺伝子の安定的な維持および発現を可能にする条件下で、キメラ毒素をコードする遺伝子を微生物宿主に導入するために、利用可能である。これらの方法は、当業者にとって周知であり、例えば、米国特許第５，１３５，８６７号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０１２４】
植物の形質転換ベクターが、トランスジェニック植物の開発のために構築された。プラスミドｐＰＫ５８（重複するエンハンサーを伴うＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを有する）は、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで、ｐＰＫ２００は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、それぞれ、重複するエンハンサーを伴うＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびキメラｃｒｙ１Ｅ遺伝子を切り出した。この２つのフラグメントをｐＬＩＴＭＵＳ３８クローニングベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングするために、３度のライゲーションを行った。このプラスミド、すなわちｐＰＫ５９は、キメラ遺伝子の上流に、重複するエンハンサーを伴うＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを有する。ｐＰＫ５９の制限酵素分析が、図２に示される。ｎｏｓ転写ターミネーターを、キメラ遺伝子の下流にクローン化した。ｎｏｓポリアデニル化エレメントのＤＮＡを、ｐＢＩ１０１．１をテンプレートとして使用して、適切なプライマーで増幅した。このプライマーにより、ＭｆｅＩ制限酵素部位およびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を、それぞれ上流と下流に作製した。このプラスミドｐＰＫ５９をＥｃｏＲＩで消化して、そのＰＣＲ産物を、ＭｆｅＩ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した後で、クローン化した。人工遺伝子のＥｃｏＲＩ制限酵素部位が、ｎｏｓターミネーターのＭｆｅＩ部位とライゲートされた（これらの部位は適合する末端を有する）クローンを、選択し、ｐＰＫ２０１と名付けた。ｎｏｓターミネーターが正しく配向していることを、制限酵素分析、および配列決定によっても確認した。発現用カセット（Ｅ−３５Ｓプロモーターおよびｎｏｓターミネーターを有する人工ｃｒｙ遺伝子）を、Ｔｉバイナリベクターにクローン化した。プラスミドｐＰＫ２０１のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、プラスミドのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ｕｉｄＡ遺伝子およびｎｏｓターミネーター）と置換することで、ｐＢＩ１０１．１にクローン化した。このバイナリベクターを、ｐＰＫ２０２と名付けた。Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターおよび植物発現ベクターのマップを、図３に示す。
【０１２５】
キメラＣｒｙ１Ｅ毒素の植物内での効果を研究するために、タバコを発現用に選択した。ヘルパープラスミドｐＡＬ４４０４を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４株を、「ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ」（Ｃａｎｇｅｌｏｓｉら（１９９１））の改変プロトコルに従って、バイナリベクターｐＰＫ２０２で形質転換した。そして、形質転換したコロニーを抗生物質ストレプトマイシン、リファンピシンおよびカナマイシンによって、選択した。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｐａｔｉｔ  ＨａｖａｎａのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換を、Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５）の方法に従って、実行した。そして、トランスジェニック植物を抗生物質カナマイシンによって、選択した。キメラ毒素をコードする遺伝子の存在を、ＰＣＲおよびサザン分析によって確認し、導入遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタン分析およびＥＬＩＳＡで、立証した。ＥＬＩＳＡの結果では、選択したトランスジェニック系統の総可溶性葉タンパク質の０．５％という毒素タンパク質の発現量を示した。この高レベルの発現は、植物に好ましいコドンを専ら使用するという、遺伝子設計の結果であった。本研究で使用された植物に好ましい翻訳開始コンテキストもまた、発現の促進を達成する上で重要な役割を果たした。
【０１２６】
昆虫バイオアッセイを、２ヶ月齢のトランスジェニック植物ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａの第１齢および第５齢の幼生を使用して、行った（図４〜図６を参照のこと）。トランスジェニック植物およびコントロール植物の１５ｃｍ２の葉切片を、底に湿らせた吸収紙を収容する円筒形の箱に入れた。そして、１０匹の第１齢の幼生をその中に放出した。箱の口は、湿ったモスリン布で覆い、十分な湿気と空気の交換が維持されるようにした。毒性試験は、２５±０．２℃で３連で行い、１６時間／８時間の光周期を維持した。第５齢の幼生を使用したバイオアッセイにおいて、トランスジェニック植物とコントロール植物の完全な葉を使用した。葉柄を、綿で栓をした、１／２のＭＳ塩溶液を含む２５０ｍｌフラスコ中に入れて、葉が萎れるのを克服した。５匹の昆虫幼生に、各葉を食べさせた。コントロール植物の葉は、８時間ごとに交換し、それらは、昆虫幼生に完全に消費された。
【０１２７】
結果（図４および図６）により、第１齢および第５齢の幼生は、４８〜７２時間以内に死ぬことが立証された。第１齢の幼生によって食べられた葉の量は、貪欲に食べられたコントロール植物の葉切片と比較して、微々たる量であった。約１ｃｍ２のトランスジェニック体の葉の摂食は、第５齢の幼生を殺すのに十分であった。これらの幼生は、トランスジェニック体の葉の摂食の８〜１６時間後には、瀕死であり、最終的には２〜３日以内に死んだようである。高い水分含量の緑色の排出物が、葉の表面上に観察された。いくつかの幼生は、死ぬ前に重度の体重減少を示した。別の実験において、異なる齢の幼生に、１時間、２時間、４時間、８時間および１６時間の間、トランスジェニック植物の葉を給餌し、次いで、コントロール植物の葉に切り替えた。８時間のトランスジェニック植物の葉の給餌は、たとえ非トランスジェニック植物の給餌の後であったとしても、全ての発達段階の幼生に１００％の死亡率をもたらすのに十分であることが観察された。若い幼生による非常に少量の毒素の摂食により、蛹化が、１５日という正常な幼生サイクルから１０〜１５日遅れる。死から逃れた数匹の幼生は、ハエに成長した。これらのハエを使用した対交配の４０％が、産卵した。しかし、この卵は、不稔性であり、孵化しなかった。トランスジェニックタバコ植物の総可溶タンパク質を抽出し、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＱイオン交換カラムに供した。タンパク質を塩化ナトリウムの増加勾配により抽出し、δ−内毒素を含むピークを集め、Ｇ１０カラムで脱塩した。溶出したタンパク質を、半人工餌に混ぜた。非トランスジェニックタバコ植物の葉からの同様なタンパク質の抽出および精製も行い、そしてこれらの植物タンパク質をコントロールとして使用した。毒性試験は、上述のように行った。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａおよびＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａのＥＣ５０は、人工餌１ｍｌあたり３７ｎｇおよび２８５ｎｇであった。この結果によっても、標的昆虫ペストに対するキメラδ−内毒素の効果を確認した。
【０１２８】
昆虫ペストを制御するための新規のδ−内毒素および、それを植物体中で高レベルで発現させるための遺伝子、ここで、新規のδ−内毒素（本明細書中でキメラＣｒｙ１Ｅと称される）の理論的設計を以下のことによって、戦略的に行った：Ｃｒｙ１Ｅａタンパク質のポリペプチドドメイン（５３０位〜５８７位）をＣｒｙ１Ｃａのポリペプチドドメイン（５３３位〜６０２位）、安定性のためにそのタンパク質のＣ末端の新規の２５アミノ酸残基長のポリペプチドで置換すること、植物において高レベルでキメラδ−内毒素を発現するように遺伝子を理論的に設計すること、理論的に設計された遺伝子を代表するオリゴヌクレオチドを設計し、化学的に合成すること、オリゴヌクレオチドを二本鎖ＤＮＡに組立てること、クローン化した人工ＤＮＡをクローニングし、配列分析すること、Ｅ．ｃｏｌｉおよび植物においてキメラ遺伝子を発現させるためのベクターを構築すること、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて人工遺伝子を発現させること、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａに対するキメラタンパク質の毒性とその親タンパク質の毒性とを比較すること、植物を形質転換すること（例えば、タバコをキメラ遺伝子で形質転換すること）、トランスジェニック植物において操作されたタンパク質を高レベルで発現させること、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａに対する防護について、トランスジェニック植物におけるキメラ毒素の可能性を評価すること。本発明のまた別の実施形態において、Ｃｒｙ１Ｅａのアミノ酸番号１〜５２９のアミノ酸、Ｃｒｙ１Ｃａのアミノ酸番号５３０〜５９９のアミノ酸、Ｃｒｙ１Ｅａのアミノ酸番号６００〜６１６のアミノ酸、そして新規のポリペプチドのアミノ酸番号６１７〜６４１のアミノ酸、ならびにその構造的および／または機能的に同等な改変体またはそのフラグメント。
【０１２９】
本発明のまた別の実施形態において、上記毒素は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、親毒素であるＣｒｙ１ＥａおよびＣｒｙ１Ｃａと比較して、標的鱗翅類昆虫に対して数倍高い毒性を示す。
【０１３０】
本発明のまた別の実施形態において、鱗翅類昆虫に対して活性を有するキメラ毒素をコードするキメラｃｒｙ１Ｅ遺伝子は、配列番号２に示すヌクレオチド配列またはそのフラグメントを有する。
【０１３１】
本発明のまた別の実施形態において、鱗翅類害虫を制御するプロセスは、化学的処方物または微生物処方物ならびにそれらの成分として使用される有効量の毒素を有する、そのタンパク質を使用する。
【０１３２】
本発明のまた別の実施形態において、組換えＤＮＡ転移ベクターは、鱗翅類昆虫に対して活性を有する毒素をコードするポリヌクレオチド配列を含み、このポリヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを有する。
【０１３３】
本発明のまた別の実施形態において、組換え宿主は、この遺伝子で形質転換される。
【０１３４】
本発明のまた別の実施形態において、上記宿主は、微生物である（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、酵母、シアノバクテリアなど）。
【０１３５】
本発明のまた別の実施形態において、上記形質転換される宿主は、植物である（例えば、タバコ、ワタ、ヒヨコマメ、ピジョンマメ（ｐｅｇｅｏｎｐｅａ）、ラッカセイ、カリフラワー、キャベツ、チリトウガラシ、トウガラシなどである）。それは、毒素を発現する。この毒素は、配列番号１のアミノ酸配列および鱗翅類昆虫に対して同等の活性を有するその改変体である。
【０１３６】
本発明のさらなる実施形態において、本出願は、タンパク質、より特定すると内毒素の分野において、配列の高い相同性によって、活性に有意な相違は生じないことが見出されることを、明確に主張する。内毒素Ｃｒｙ１Ａａ１〜Ｃｒｙ１Ａａ６の上述の研究は、この研究の本質を明確に反映している。本出願において、出願人は、極めて高い殺虫活性を観察した。さらに、本出願のキメラタンパク質Ｃｒｙ１Ｅの配列との７０％以上の相同性もまた、活性に有意な変化は示さないことが見出される。これは、キメラタンパク質Ｃｒｙ１Ｅに対して７０％以上の配列相同性を有するタンパク質は、殺虫剤として使用されることを意味する。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例は、例示の方法で与えられ、そのため、本発明の範囲を制限するように解釈すべきではない。
【０１３８】
（実施例１）
（Ｅ．ｃｏｌｉで発現させた新規キメラＣｒｙ１Ｅの鱗翅類昆虫ペストの幼生に対する比較毒性）
６１６アミノ酸残基長のキメラδ−内毒素（本明細書中では、キメラＣｒｙ１Ｅという）を、Ｃｒｙ１Ｅａタンパク質のポリペプチドドメイン（５３０〜５８７位）をＣｒｙ１Ｃａのポリペプチドドメイン（５３３〜６０２位）で置換することにより、戦略的に設計した。さらに、２５アミノ酸残基のポリペプチドを、上述のようにＣ末端に含ませた。１．９９ｋｂのヌクレオチド配列を、上述のキメラδ−内毒素をコードするように理論的に設計した。各アミノ酸のコドンは、翻訳の間のｔＲＮＡの一時的な欠失を避けるために均等に分布させた。いくつかの６塩基切断の制限酵素部位を、設計した遺伝子に作製した。ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩの制限酵素部位を設計した遺伝子の５’末端に、ＥｃｏＲＩの制限酵素部位を設計した遺伝子の３’末端に作製した。この遺伝子を５８個の重複するオリゴヌクレオチド（４０〜６５ヌクレオチド長）に分割した。各オリゴヌクレオチドは、相補鎖上の直ぐ近接するオリゴヌクレオチドとの１３〜１８ヌクレオチド長の重複を含む（Ｔｍは、４８〜５０℃）。オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡシンセサイザー（Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｓｐｅｃｉａｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上で、２００ｎｍｏｌのスケールで合成し、変性尿素−ＰＡＧＥで精製した。図１に示すように、５８個のオリゴヌクレオチドの全てを、ライゲーションフリー遺伝子合成法（Ｓｉｎｇｈら、（１９９６））に従って、二本鎖ＤＮＡ（本明細書中では、ｃｒｙ１Ｅという）に組立てた。このＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローン化した。このプラスミドを、ｐＰＫ２００と名付けた。この人工ＤＮＡのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ  ３７３）上でクローン化した人工ＤＮＡの配列を決定することにより、確認した。
【０１３９】
カセットが、Ｔ７プロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ中でキメラ毒素を発現させるために構築された。このために、プラスミドｐＰＫ２００を、制限酵素ＮｃｏＩおよび制限酵素ＢａｍＨＩによって消化し、発現ベクターｐＥＴ−１９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化した。このプラスミドは、ｐＰＫ２０６と名付けられた。Ｃｒｙ１ＥａおよびＣｒｙ１Ｃａの毒素部分をコードするＤＮＡを、適切なプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。このプライマーは、両方のＤＮＡにおいて、アンプリコンの上流と下流に、それぞれ、ＮｃｏＩの制限酵素部位およびＢａｍＨＩの制限酵素部位を作製した。増幅生成物を、同じベクター（ｐＥＴ−１９ｂ）のＮｃｏＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にクローン化した。上述のように、Ｃｒｙ１Ｅａ毒素ＤＮＡを含む構築物はｐＰＫ１４１と、Ｃｒｙ１Ｃａ毒素ＤＮＡ含む構築物はｐＰＫ１３５と名付けられた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ＤＥ３株を、構築物ｐＰＫ１４１、ＰＫ１３５およびｐＰＫ２０６で形質転換した。毒素タンパク質を、適切な濃度のＩＰＴＧでの誘導により、発現した。この発現は、任意の可能性のある毒素の誤った折りたたみを避けるために、１５℃で行われた。この毒素タンパク質は、変性ポリアクリルアミドゲル上で濃度計より定量された。この毒素の連続希釈物を、半人工餌に混ぜた。Ｅ．ｃｏｌｉの総タンパク質を、コントロール餌として使用した。１５匹のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａの新生幼生が、１００ｍｌビーカー中の餌混合物のケーキ上に放出され、そしてビーカーの口を、ガス交換を可能にするようにモスリン布で覆った。各実験を、６連で行った。餌を、１日おきごとに交換した。バイオアッセイは、２５±０．２℃、１６時間／８時間の光周期で行った。毒性データは、給餌の７日後に記録した。ＥＣ５０は、標準的ログ−プロビット法により決定された。３つのタンパク質の全てが、同様に試験された。それを表す結果が、以下の表４に示される。
【０１４０】
【表４】
2005536188.tif 000010
【０１４１】
この結果は、キメラ毒素が、Ｃｒｙ１Ｅａタンパク質よりも数倍、Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質よりも４倍以上毒性であることを示した。Ｃｒｙ１Ｅａ毒素タンパク質は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａの幼生に死も成長の遅延ももたらさなかった。この結果により、Ｃｒｙ１Ｅａを生物学的に活性な改良された毒素に変換するためのＣｒｙ１Ｅａ毒素の首尾よい操作が、確立された。操作されたタンパク質は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐに対する周知のδ−内毒素であるＣｒｙ１Ｃａタンパク質よりも毒性であった。
【０１４２】
同様の毒性試験が、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａの幼生に対して行われた。この場合において、７２時間齢の幼生が、３つのタンパク質のうちの１つを含む半人工餌上に放出された。各箱には、幼生が１匹だけ放出された。給餌の７日後に体重減少が記録された。それを表す結果が、以下の表５で提供される。
【０１４３】
【表５】
2005536188.tif 000011
【０１４４】
この結果は、本発明者らによって設計された新規のδ−内毒素が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａに対してより毒性であるのみならず、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａに対しても効果的であることを示す。この設計により、毒素の宿主範囲が広がり、親タンパク質よりも実質的に毒性が改良された。
【０１４５】
（実施例２）
（新規のキメラＣｒｙ１Ｅタンパク質を発現するトランスジェニック植物の高い幼生毒性）
植物中での新規のキメラ毒素の効果を立証するために、トランスジェニック植物の開発のための植物形質転換ベクターを構築した。プラスミドｐＰＫ５８（重複するエンハンサーを伴うＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを有する）は、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで、ｐＰＫ２００は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、それぞれ、重複するエンハンサーを伴うＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびキメラｃｒｙ１Ｅ遺伝子を切り出した。この２つのフラグメントをｐＬＩＴＭＵＳ３８クローニングベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングするために、３度のライゲーションを行った。このプラスミドは、ｐＰＫ５９と名付けられ、キメラ遺伝子の上流に、重複するエンハンサーを伴うＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを有した。ｎｏｓ転写ターミネーターを、キメラ遺伝子の下流にクローン化した。ｎｏｓポリアデニル化エレメントを、ｐＢＩ１０１．１をテンプレートとして使用して、適切なプライマーで増幅した。このプライマーにより、ＭｆｅＩ制限酵素部位およびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を、それぞれ上流と下流に作製した。このプラスミドｐＰＫ５９をＥｃｏＲＩで消化して、そのＰＣＲ産物を、ＭｆｅＩ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した後で、クローン化した。人工遺伝子のＥｃｏＲＩ制限酵素部位が、ｎｏｓターミネーターのＭｆｅＩ部位とライゲートされた（これらの部位は適合する末端を有する）クローンを、選択し、ｐＰＫ２０１と名付けた。ｎｏｓターミネーターが正しく配向していることを、制限酵素分析、およびＤＮＡ配列決定によっても確認した。発現用カセット（Ｅ−３５Ｓプロモーターおよびｎｏｓターミネーターを有する人工ｃｒｙ遺伝子）を、Ｔｉバイナリベクターにクローン化した。プラスミドｐＰＫ２０１のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、プラスミドのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ｕｉｄＡ遺伝子およびｎｏｓターミネーター）と置換することで、ｐＢＩ１０１．１にクローン化した。このバイナリベクターを、ｐＰＫ２０２と名付けた。Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターおよび植物発現ベクターの構築を、図３に概略的に示す。この構築物は、ポリヌクレオチド配列ＴＡＡＡＣＣＡＴＧ ＧＣＴを植物に好ましい翻訳開始コンテキストとして有し、ＴＡＡ ＴＧＡが、翻訳の終結のために、人工遺伝子に導入された。ヘルパープラスミドｐＡＬ４４０４を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４株を、「ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ」（Ｃａｎｇｅｌｏｓｉら(１９９１)）の改変プロトコルに従って、バイナリベクターｐＰＫ２０２で形質転換し、形質転換したコロニーを、抗生物質ストレプトマイシン、リファンピシンおよびカナマイシンで選択した。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｐａｔｉｔ  ＨａｖａｎａのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換を、Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５）の方法に従って、実行した。そして、トランスジェニック植物を抗生物質カナマイシンによって、選択した。キメラ毒素をコードする遺伝子の存在を、ＰＣＲおよびサザン分析によって確認し、導入遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタン分��およびＥＬＩＳＡで、立証した。ＥＬＩＳＡの結果では、これらの実験のために選択したトランスジェニック系統の総可溶性葉タンパク質の０．５％という毒素タンパク質の発現量を示した。この高レベルの発現は、植物に好ましいコドンを専ら使用するという、遺伝子設計の結果であった。植物に好ましい翻訳開始コンテキストもまた、発現のために重要な役割を果たした。昆虫バイオアッセイは、２ヶ月齢のトランスジェニック植物およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａの新生の幼生を使用して、行った。トランスジェニック植物およびコントロール植物の１５ｃｍ２の葉切片を、底に湿らせた吸収紙を収容する円筒形の箱に入れた。そして、１０匹の第１齢の幼生をその中に放出した。箱の口は、湿ったモスリン布で覆い、十分な湿気と空気の交換が維持されるようにした。毒性試験は、２５±０．２℃で６連で行い、１６時間／８時間の光周期を維持した。その結果は、新規のキメラタンパク質を発現するトランスジェニック植物は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａの新生の幼生に対して、高い毒性を有し、給餌の４８時間以内に１００％の死亡をもたらすことを示した（図４）。昆虫の幼生による葉切片の損傷は、ほぼ完全に食べ尽くされたコントロール植物の葉切片と比較して、微々たる量であった。トランスジェニック植物を摂食した場合の高レベルのトランスジェニック植物の防護および高レベルのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ幼生の死亡率により、キメラ毒素およびトランスジェニック植物の効果が、繰り返して立証された。
【０１４６】
（実施例３）
（キメラＣｒｙ１Ｅタンパク質の、全ての発達段階におけるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐ．の幼生に対する高い毒性）
トランスジェニック植物で発現させた操作されたタンパク質の効果を立証するために、第１齢（３日齢）、第３齢（７日齢）および第５齢（１２日齢）の幼生に対して、バイオアッセイを行った。第１齢の幼生に対するバイオアッセイは、実施例２で議論した。トランスジェニック植物およびコントロール植物の全葉が、進んだ段階の幼生に給餌するために使用された。葉が萎れるのを克服するために、葉柄を、１／２のＭＳ塩溶液を含む綿で栓をした２５０ｍｌフラスコに入れた。５匹の昆虫幼生が、各葉を摂食できるようにした。第３齢の幼生（図５）および第５齢の幼生（図６）によって摂食されたコントロール植物の葉は、それぞれ１６時間と８時間後に交換した。これは、それらが、昆虫幼生によって完全に消費されたからである。この結果により、トランスジェニック体の葉を摂食することにより、４８時間以内に、全ての発達段階にある幼生に死が引き起こされることが立証された。約１ｃｍ２のトランスジェニック体の葉の摂食は、第５齢の幼生を殺すのに十分であった。これらの幼生は、トランスジェニック体の葉の給餌の８〜１６時間後には、瀕死であり、最終的には２日以内に死んだようであった。高い水分含量の緑色の排出物が、葉の表面上に観察された。いくつかの幼生は、死ぬ前に重度の体重減少を示した。
【０１４７】
別の実験において、異なる齢の幼生に、１時間、２時間、４時間、８時間および１６時間の間、トランスジェニック植物の葉を給餌し、次いで、コントロール植物の葉に切り替えた。４時間のトランスジェニック植物の葉の給餌は、たとえそれらが後で非トランスジェニック植物を食べたとしても、全ての発達段階の幼生に１００％の死亡率をもたらすのに十分であることが観察された。若い幼生による非常に少量の毒素の摂食により、蛹化が、１５日という正常な幼生サイクルから１０〜１５日遅れた。死から逃れた数匹の幼生は、ハエに成長した。これらのハエを使用した対交配の４０％が、産卵した。しかし、この卵は、不稔性であり、孵化しなかった。進んだ段階の昆虫幼生に対するδ−内毒素の毒性は、これまでのところ、文献中で報告されていない。高レベルの毒性は、昆虫幼生の中腸におけるキメラ毒素の高い安定性または、δ−内毒素の改良された受容体結合能力および穴形成能力に起因し得る。実施例は、繰り返して、キメラ毒素のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐ．に対する可能性を立証した。Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａは、タバコの葉を好んで食べないので、トランスジェニックタバコ植物を用いた毒性試験をＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａに行うことはできなかった。
【０１４８】
（実施例４）
（δ−内毒素を発現するトランスジェニックタバコ植物の葉から調製された新規のキメラＣｒｙ１Ｅの高い毒性）
総可溶タンパク質をトランスジェニックタバコ植物の葉から調製した。新鮮な葉組織を、液体窒素で粉末にし、次いで５体積のタンパク質抽出緩衝液（ＴｒｉｓＣｌ、２０ｍＭ、ｐＨ９．５；ＥＤＴＡ２ｍＭ、ｐＨ８．０；ＮａＣｌ、５０ｍＭ；ＤＴＴ、１ｍＭ；ＰＶＰ２%およびＰＭＳＦ、１００ｍＭ）に懸濁した。この懸濁液を、よく混合し、２回遠心分離した（２０，０００×ｇ、２０分、４℃）。上清を、セファロースＱカラム（１０ｃｍ×２．５ｃｍ）に供した。タンパク質を、溶出緩衝液中でＮａＣｌ勾配を増加させることによって、抽出し、５ｍｌのフラクションを１００個、収集した。δ−内毒素を、ＥＬＩＳＡで検出した。δ−内毒素を含むフラクションを集めた。植物から精製されたδ−内毒素の既知の量を、半人工餌に混ぜた。毒性試験は、上述の実施例で述べたように、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａおよびＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａの生後３日目の幼生に対して、行った。この結果により、ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａおよびＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａのＥＣ５０（５０％殺すのに必要な濃度）は、４２．３９±１．７２ｎｇ／ｍｌ（半人工餌）および２８３．１１±８．２９ｎｇ／ｍｌ（半人工餌）であることが示された。この結果は、ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａおよびＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａの幼生に対する高い毒性を、さらに立証した。植物組織内で製造された殺虫結晶タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉで製造された同じタンパク質と比較して、はるかに毒性である点に、注目すべきである。おそらく、δ−内毒素は、植物の細胞質において非常によく折りたたみする（ｆｏｌｄ）。このような構造形成において未同定のシャペロンの機能は、無視できない。
【０１４９】
（実施例５）
（植物組織中でのキメラδ−内毒素の安定性）
トランスジェニック植物の総可溶葉タンパク質を、上述のように抽出し、４℃および２８℃でインキュベートした。それらを、毒性試験に使用した。サンプルを、前者の場合には２日ごとに、後者の場合には１日ごとに取り出した。総租タンパク質を、半人工餌に混ぜ、生まれたばかりのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａの幼生に対して、毒性試験を行った。昆虫の死亡率のデータを、給餌の７日後に記録し、ＬＣ５０を計算した。この結果を、以下の表６および表７に示す。
【０１５０】
【表６】
2005536188.tif 000012
【０１５１】
【表７】
2005536188.tif 000013
【０１５２】
この結果により、本発明者らによって設計されたキメラδ−内毒素の植物プロテアーゼに対する安定性が立証された。キメラ毒素は、４℃で１６日以上、２８℃で３日以上安定であり、これが８０％以上の死亡率を引き起こした。時間と共にＬＣ５０が増加するのは、おそらく、毒素のいくらかの分解に起因する。
【０１５３】
本発明の主要な利点は、以下の通りである。
１．Ｃｒｙ１Ｅａδ−内毒素が、操作され、新規のキメラ毒素（本明細書中ではキメラＣｒｙ１Ｅという）を得られた。このキメラタンパク質の毒性は、親毒素または、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａに対して機能することが報告されている他のδ−内毒素と比較して、数倍高いものであった。その幼生毒性（ｌａｒｖｉｃｉｄａｌ）活性は、植物中で作成された場合、非常に高いものであった。
２．キメラ毒素をコードする遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび植物の両方で、発現するように設計された。従って、それは、キメラ毒素を発現させるために、微生物を操作する場合に使用され得る。このような微生物は、微生物遺伝子処方物の調製において使用され得る。同じ遺伝子はまた、昆虫耐性を得るために、植物を操作する場合にも使用され得る。本発明者らは、本発明者らによって設計された配列が、トランスジェニックタバコの葉およびワタの葉において、キメラ毒素の高レベルの発現（総可溶タンパク質の０．５％）を示すことを示した（結果は含めず）。
３．キメラ毒素を発現するトランスジェニック植物は、全ての発達段階のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａの幼生に対して高程度の防護を示した。それらは、トランスジェニック植物の摂食から２〜３日以内に死んだ。任意の鱗翅類昆虫に対するこのようなトランスジェニック植物の高レベルの毒性は、これまでに報告されていない。このタンパク質はまた、多くの他の昆虫幼生に対しても効果的である。本発明者らの結果により、この毒素は、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａにも効果的であることが示された。
４．トランスジェニック植物中のキメラ毒素の可能性は、トランスジェニック植物の短期間の給餌によっても、立証された。４時間の給餌は、すべての発達段階のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ幼生の１００％の死亡率をもたらした。極めて短期間（１時間まで）の給餌は、幼生の発達を遅らせ、変態に干渉した。このようなタンパク質は、作物栽培学上重要な作物および森林を防護する上で、極めて価値あるものであり得る。キメラ毒素をコードする遺伝子は、トランスジェニック植物の開発および／または微生物におけるこの毒素の生産のために、使用され得る。この微生物は、微生物処方物中に使用され得る。
５．新規のキメラ毒素を発現するトランスジェニック植物は、非常に短期間の給餌でＳｐｏｄｏｐｔｅｒａの幼生に１００％の死亡率を引き起こすので、このδ−内毒素に対する昆虫の耐性の発達は、極めて遅いものであり得る。
【０１５４】
【化２−１】
2005536188.tif 000014
【０１５５】
【化２−２】
2005536188.tif 000015
【０１５６】
【化２−３】
2005536188.tif 000016
【０１５７】
【化２−４】
2005536188.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、５８個の重複するオリゴヌクレオチドの１．９９ｋｂの新規のキメラｃｒｙ１Ｅ  ＤＮＡへのＰＣＲベースでの組立てを表す。レーン２〜４は、異なるＰＣＲ条件での遺伝子の組立てを表し、所望のＤＮＡフラグメントは、矢印で示される。レーン１は、λＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ分子量マーカーを示す。
【図２】図２は、新規のキメラ遺伝子の上流にＥ−３５−Ｓプロモーターを有するプラスミドｐＰＫ５９の制限分析を表す。プラスミドは、ＳａｌＩ制限酵素で消化された（遺伝子の４０ｂｐ下流で）。直鎖上のプラスミドが、さらにＮｃｏＩ（レーン２）、ＮｈｅＩ（レーン３）、ＢｓｔＸＩ（レーン４）、ＮｒｕＩ（レーン５）およびＳａｃＩ（レーン６）で消化された。レーン１およびレーン７は、λＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ分子量マーカーおよびλＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ分子量マーカーをそれぞれ表す。
【図３】図３は、プラスミドｐＰＫ２０２、プラスミドｐＰＫ１４１、プラスミドｐＰＫ１３５およびプラスミドｐＰｋ２０６のマップを表す。
【図４】図４は、トランスジェニックタバコ植物による昆虫バイオアッセイを表す。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａの第１齢の幼生は、新規のキメラｃｒｙ１Ｅ遺伝子を発現するトランスジェニック体の葉の給餌の２日後に、１００％の死亡率を示した（左）。コントロールの葉は、幼生に大量に食べられた（右）。
【図５】図５は、給餌の２日後に１００％の死亡率を示すＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａの第３齢の幼生を表す（左）。トランスジェニック植物の葉は、コントロール植物の葉とは対照的に、幼生に対し高いレベルの防護を示した（右）。
【図６】図６は、トランスジェニックタバコ葉の給餌の４８時間後でのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａの第５齢の幼生の１００％の死亡率を表す（左）。同じ期間の間、コントロール植物の葉を給餌した幼生は、６枚の葉を摂取した（右）。
【図１】
2005536188.tif 000018
【図２】
2005536188.tif 000019
【図３】
2005536188.tif 000020
【図４】
2005536188.tif 000021
【図５】
2005536188.tif 000022
【図６】
2005536188.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月21日(2004.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のキメラδ内毒素タンパク質Ｃｒｙ１Ｅ。
【請求項２】
前記配列番号１のタンパク質が、６４１アミノ酸残基の長さである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記配列番号１のキメラタンパク質が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのδ内毒素Ｃｒｙ１ＥａおよびＣｒｙ１Ｃａから設計される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記６４１残基の長さのキメラタンパク質が、同じ位置の内毒素Ｃｒｙ１Ｅａに由来する残基１〜５２９、位置５３３〜６０２のＣｒｙ１Ｃａに由来する残基５３０〜５９９、位置５８８〜６０４のＣｒｙ１Ｅａに由来する残基６００〜６１６および合成ポリペプチド残基６１７〜６４１からなる、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項５】
Ｃｒｙ１Ｅａの５３０〜５８７由来のペプチドドメインが、δ内毒素のペプチドドメインで置換され得る、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
最後の２５アミノ酸残基が、植物のプロテアーゼに対する安定性を改良する、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記キメラタンパク質が、４〜３５℃の範囲の温度で、安定である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
配列番号２のキメラ遺伝子。
【請求項９】
前記キメラが、配列番号１のキメラタンパク質をコードする、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１０】
前記キメラが、１９９０塩基対（ｂｐ）の長さである、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１１】
前記キメラが、１．９９ｋｂの二本鎖ＤＮＡである、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１２】
前記キメラが、効率的な翻訳を促進するように均等に分布された植物に好ましいコドンを含む、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１３】
前記キメラが、５’末端に、植物に好ましい翻訳開始コドンであるＡＴＧＧＣＴを含む、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１４】
前記キメラが、植物に好ましい翻訳終結コドンであるＴＡＡＴＧＡを含む、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１５】
前記キメラが、遺伝子の全長にわたり、約４０〜８０ｂｐの距離で一様に分布する３３個の制限部位を含む、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１６】
制限部位が、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＢａｍＨＩからなる群から選択される酵素である、請求項１５に記載のキメラ。
【請求項１７】
前記キメラが、それぞれが６〜２６塩基対（ｂｐ）の距離に位置する、長さが４０〜６５ｂｐの５８個の重複するオリゴヌクレオチドに分割される、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１８】
前記キメラが、相補鎖上の隣接するするオリゴヌクレオチドと１３〜１８ヌクレオチド重複する重複ヌクレオチドを含む、請求項８に記載のキメラ。
【請求項１９】
前記キメラが、４４と５５℃との間の範囲のＴｍ値を有する、請求項８に記載のキメラ。
【請求項２０】
微生物において殺虫性キメラタンパク質Ｃｒｙ１Ｅを過剰発現させる方法であって、該方法が、以下：
（ａ）ベクターにおいて、該キメラタンパク質をコードする配列番号２の遺伝子Ｃｒｙ１Ｅをクローニングする工程、
（ｂ）該クローン化したベクターを使用して、微生物を形質転換する工程、および
（ｃ）該微生物中で、該キメラタンパク質を過剰発現させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記キメラが、細菌、藻および真菌からなる群から選択される微生物中に、発現される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記クローニングする工程のための制限酵素が、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｎｃｏｌ、ＭｆｅＩ、およびＢａｍＨＩからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質の過剰発現が、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いることによって誘導される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質の誤った折りたたみを避けるために、該タンパク質の過剰発現が１５℃においてである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ベクターが、プラスミド、ウイルスＤＮＡ、およびコスミドを含む群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
微生物におけるキメラの発現が、ＲＴ−ＴＣＲ、ウエスタン分析、およびＥＬＩＳＡによって確認される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
微生物におけるキメラの存在が、ＰＣＲおよびサザン分析によって確認される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の殺虫性キメラタンパク質を使用して、昆虫に感染された植物を処理する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）キメラタンパク質Ｃｒｙ１Ｅをコードする遺伝子を、昆虫に感染された植物内に組み込ませる工程、
（ｂ）トランスジェニック植物を昆虫に曝露する工程、および
（ｃ）該トランスジェニック植物の殺虫活性を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
昆虫ペストが、Ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐ．、およびＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｓｐ．を含む群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
植物が、タバコ、ワタ、ヒヨコマメ、ピジョンマメ、ラッカセイ、カリフラワー、キャベツ、トウガラシおよびトウガラシの実を含む群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記クローニングのための制限酵素が、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、およびＢａｍＨＩを含む群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
キメラタンパク質が、植物の可溶性タンパク質の総量の約０．５％を有する、植物中での高度な発現を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記キメラタンパク質が、前記トランスジェニック植物中で安定である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記キメラタンパク質に曝露された昆虫が、死ぬ前に体重減少を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記キメラタンパク質が、全ての発達段階の昆虫に対して殺虫特性を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記キメラタンパク質が、親タンパク質と比較して、何倍も強力な殺虫剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記キメラタンパク質の殺虫活性が、約４時間以内の曝露で、８０〜１００％の間の範囲の昆虫ペストの死亡率を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
約１時間の間、前記キメラタンパク質に曝露された昆虫が、発達遅延、不妊および変態の混乱を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｓｐ．のＥＣ５０が、昆虫の人工食餌の１ｍｌあたり２５０〜３５０ｎｇの範囲である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐ．のＥＣ５０が、人工食餌の１ｍｌあたり２５〜５０ｎｇの範囲である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記トランスジェニック植物の正常な成長に有害な影響を示さない、請求項２８に記載の方法。
【国際調査報告】
2005536188.tif 000024
2005536188.tif 000025
2005536188.tif 000026