(57)【要約】本発明は、メラノサイトを含む組成物および方法に関する。特に、本発明は、色素沈着の調節において使用するため、ならびに色素沈着における障害関連状態を診断および／または処置するための手段を決定する際に使用するために適切な、ＲＡＢ３８および変異体ＲＡＢ３８を含む組成物および方法を提供する。配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択される配列を含む、単離された核酸。前記核酸が、デオキシリボ核酸である。
2005522995.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択される配列を含む、単離された核酸。
【請求項２】
前記核酸が、デオキシリボ核酸である、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸の相補体である、単離された核酸。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
配列番号９によって示される核酸配列によってコードされる、単離されたタンパク質。
【請求項７】
Ｒａｂ３８中の変異を検出するための方法であって、以下の工程：
ａ）ゲノムＤＮＡから、Ｒａｂ３８の少なくとも一部を増幅して、Ｒａｂ３８増幅産物を得る工程；
ｂ）該Ｒａｂ３８増幅産物を精製する工程；および
ｃ）該Ｒａｂ３８増幅産物を配列決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
前記増幅する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して達成される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｒａｂ３８の少なくとも一部が、少なくとも１つのＲａｂ３８エキソン、少なくとも１つのＲａｂ３８イントロン、Ｒａｂ３８  ５’非翻訳配列およびＲａｂ３８  ３’非翻訳配列からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのＲａｂ３８エキソンが、Ｒａｂ３８エキソン１、Ｒａｂ３８エキソン２およびＲａｂ３８エキソン３からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲノムＤＮＡが、哺乳動物ゲノムＤＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記精製する工程が、サイズ選択を使用して達成される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒａｂ３８中の変異を検出するための方法であって、以下の工程：
ａ）ゲノムＤＮＡから、Ｒａｂ３８の少なくとも一部を増幅して、Ｒａｂ３８増幅産物を得る工程；
ｂ）該Ｒａｂ３８増幅産物を消化して、消化Ｒａｂ３８増幅産物を得る工程；および
ｃ）該消化Ｒａｂ３８増幅産物を電気泳動する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記増幅する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して達成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｒａｂ３８の少なくとも一部が、少なくとも１つのＲａｂ３８エキソン、少なくとも１つのＲａｂ３８イントロン、Ｒａｂ３８  ５’非翻訳配列およびＲａｂ３８  ３’非翻訳配列からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのＲａｂ３８エキソンが、Ｒａｂ３８エキソン１、Ｒａｂ３８エキソン２およびＲａｂ３８エキソン３からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ゲノムＤＮＡが、哺乳動物ゲノムＤＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＡＢ３８活性を調節する生物学的に活性な因子についてスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
ａ）以下：
（ｉ）ＲＡＢ３８活性を有するメラノサイト、および
（ｉｉ）候補因子、
を提供する工程；ならびに
ｂ）該メラノサイトを該候補因子に曝露して、処理されたメラノサイトを得る工程；ならびに
ｃ）該候補因子によって処理されたメラノサイトのＲＡＢ３８活性の調節を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記ＲＡＢ３８活性が、ＧＴＰａｓｅ活性を含む、請求項１８に記載の方法、
【請求項２０】
前記ＲＡＢ３８活性が、ＧＴＰ結合活性を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＡＢ３８活性が、ＧＤＰ放出を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＡＢ３８活性が、メラノソームへのＴＹＲＰ１輸送を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＡＢ３８活性が、メラノソームへのＲＡＢ３８輸送を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ＲＡＢ３８活性を調節する生物学的に活性な因子についてスクリーニングするためのキットであって、以下：
ａ）ＲＡＢ３８活性を有する複数のメラノサイトであって、ここで、該メラノサイトは、容器内に提供される、複数のメラノサイト、および
ｂ）該メラノサイト中のＲＡＢ３８活性の決定のための指示書、
を備える、キット。
【請求項２５】
ＲＡＢ３８活性を分析するための手段をさらに備える、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記ＲＡＢ３８活性を分析するための手段が、ＧＴＰａｓｅ活性を評価するためのアッセイを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記ＲＡＢ３８活性を分析するための手段が、ＧＴＰ結合活性を評価するためのアッセイを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記ＲＡＢ３８活性を分析するための手段が、ＧＤＰ放出を評価するためのアッセイを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】
前記ＲＡＢ３８活性を分析するための手段が、メラノソームへのＴＹＲＰ１輸送を評価するためのアッセイを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項３０】
前記ＲＡＢ３８活性を分析するための手段が、メラノソームへのＲＡＢ３８輸送を評価するためのアッセイを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項３１】
ＲＡＢ３８中の変異を検出するためのキットであって、
ＲＡＢ３８の少なくとも一部の増幅のために適切な少なくとも２つのプライマー配列、および
該キットを利用するための指示書、
を備える、キット。
【請求項３２】
前記プライマー配列が、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２からなる群より選択される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記キットが、ポリメラーゼ連鎖反応における使用に適切である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
核酸を消化するための試薬をさらに備える、請求項３１に記載のキット。
【請求項３５】
メラノソーム機能における欠損を診断するためのキットであって、
ＲＡＢ３８を含むメラノサイト、および
メラノソーム機能における欠損を評価するための指示書、
を備える、キット。
【請求項３６】
ＲＡＢ３８活性を分析するための手段をさらに備える、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記ＲＡＢ３８活性を分析するための手段が、ＧＴＰａｓｅ活性を評価するためのアッセイを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記ＲＡＢ３８活性を分析するための手段が、ＧＴＰ結合活性を評価するためのアッセイを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３９】
前記ＲＡＢ３８活性を分析するための手段が、ＧＤＰ放出を評価するためのアッセイを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４０】
前記ＲＡＢ３８活性を分析するための手段が、メラノソームへのＴＹＲＰ１輸送を評価するためのアッセイを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４１】
前記ＲＡＢ３８活性を分析するための手段が、メラノソームへのＲＡＢ３８輸送を評価するためのアッセイを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４２】
メラノサイトの色素沈着を調節するための組成物であって、ＲＡＢ３８活性のモジュレータを含む、組成物。
【請求項４３】
前記ＲＡＢ３８活性のモジュレータが、ＲＡＢ３８活性のエンハンサーである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＲＡＢ３８活性のモジュレータが、ＲＡＢ３８活性のインヒビターである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＲＡＢ３８活性のインヒビターが、ｓｉＲＮＡおよびイントラボディからなる群より選択される、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
メラノソームの色素沈着および皮膚の色の変化を調節する方法であって、皮膚表面をＲＡＢ３８活性のモジュレータと接触させ、それによって、該ＲＡＢ３８活性を調節する工程、を包含する、方法。
【請求項４７】
前記モジュレータが、ＲＡＢ３８活性をダウンレギュレートし、そして皮膚の色を明るくする、ＲＡＢ３８活性のインヒビターである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記モジュレータが、ＲＡＢ３８活性をアップレギュレートし、そして皮膚の色を暗くする、ＲＡＢ３８活性のエンハンサーである、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願へのクロスリファレンス）
本出願は、２００２年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／３４９，９２９号から優先権を主張し、そしてその内容を援用する。
【０００２】
（連邦政府によって後援を受けている研究または開発下で行われた発明についての権利に関する陳述）
適用しない。
【０００３】
（「配列表」、表、またはコンパクトディスク上に提出されたコンピュータープログラムリスト添付物についての参照）
適用しない。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、メラノサイトに関する組成物および方法に関する。特に、本発明は、色素沈着の調節での使用に適した、ならびに色素沈着についての障害に関連のある状態を診断および／または処置する手段を決定する際の使用のために適切なＲＡＢ３８および変異体ＲＡＢ３８に関する組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
メラノサイトは、皮膚、眼および髪の呈色を担う特殊色素作製細胞である。メラノサイトの欠損から生じる被毛色の変化は、マウスで容易に同定可能である。これらのマウス変異体は、候補ヒト疾患遺伝子の同定についておよび細胞機能の基本となるメカニズムの解説についての価値を証明している。今日までに、変異される場合、色素沈着に影響するマウス中には、約１００座が存在する。しかし、根本的な遺伝子欠損は、これらの約６０座中で同定されなかった（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ’ｓ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｗｅｂ  ｓｉｔｅを参照のこと）。
【０００６】
減少した色素沈着を有する障害は、それらがメラノサイト分化に影響するかどうか、またはそれらがメラノサイト、メラノソーム中で色素作製小器官の機能に影響するかどうかに従って２つの群に分けられ得る。第一群の例としては、「白色斑」パターンを生じるメラノサイトの限局性非存在によって特徴付けられる、ＰｉｅｂａｌｄｉｓｍおよびＷａａｒｄｅｎｂｕｒｇ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅが挙げられる。これらの障害中で影響される遺伝子、ＫＩＴ、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ３、ＳＯＸ１０、ＥＤＮＲＢ、ＥＤＮ３は、メラノサイト直系の特異化、移動および生存度に関する（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ６：１６１３  １６２４［１９９７］）。これらの障害のマウスモデルは、特徴あるスポット被毛パターンを有する（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ６：１６１３  １６２４［１９９７］）。眼皮膚白皮症（ＯＣＡ）Ｉ−ＩＶ、チュディアック−東症候群（ＣＨＳ）、ヘルマンスキー−パドラック症候群（ＨＰＳ）Ｉ−ＩＩＩおよびＧｒｉｓｃｅｌｌｉ症候群（ＧＳ）は、第二群に相当する。ＯＣＡ中で減少した色素沈着に寄与する分子欠損は、主にメラノソーム形成ならびに形成されるメラニン色素の量および型に影響する遺伝子（ＴＹＲ、ＴＹＲＰＩ、ＰおよびＡＩＭ１）を生じる（Ｋｉｎｇら、Ｓｃｒｉｖｅｒら、（編）Ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ、第７版（ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ｇｙｐ．４３５３〜４３９２［１９９５］）；およびＮｅｗｔｏｎら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６９：９８１〜９８８［２００１］）。ＨＰＳ、ＣＨＳおよびＧＳを担う遺伝子は、細胞内のメラノソームを含む小胞輸送の調節に関し、そしてＨＰＳｌ、ＡＰ３、ＨＰＳ３、ＣＨＳＩ；ＭＹＯ５ＡおよびＲＡＢ２７Ａを含む（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ６：１６１３〜１６２４［１９９７］；およびＭａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｓｅａｂｒａ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：７３８〜７４８［２００１］）。
【０００７】
多くの遺伝子が、色素沈着障害に関連したが、マウスおよびヒトの両方に関するこれらの障害の遺伝子異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）の観点において、これらおよび他の種類においてさらなる候補疾患遺伝子を同定することは、当該分野で必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、メラノサイトに関する組成物および方法に関する。特に、本発明は、色素沈着の調節での使用のため、ならびに色素沈着についての障害に関連のある状態を診断および／または処置する手段を決定する際の使用のために適切なＲＡＢ３８および変異体ＲＡＢ３８に関する組成物および方法を提供する。
【０００９】
本発明は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択される配列を含む単離された核酸を提供する。いくらかの実施形態において、核酸は、デオキシリボ核酸である。他の実施形態において、核酸は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２の相補体である。関連する実施形態において、核酸を含むベクターが、提供される。またベクターを含む宿主細胞も提供される。さらに、本発明は、配列番号９に示される核酸配列によってコードされたタンパク質を提供する。
【００１０】
いくらかの実施形態において、本発明は、Ｒａｂ３８増幅産物を生じるためにゲノムＤＮＡから少なくともＲａｂ３８の部分を増幅する工程；Ｒａｂ３８増幅産物を精製する工程；およびＲａｂ３８増幅産物を配列決定する工程を包含する、Ｒａｂ３８中の変異体を検出するための方法を提供する。好ましい実施形態において、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して達成される。関連する実施形態において、Ｒａｂ３８ゲノムＤＮＡの少なくとも一部分は、少なくとも一つのＲａｂ３８エキソン、少なくとも一つのＲａｂ３８イントロン、Ｒａｂ３８  ５’非翻訳配列、およびＲａｂ３８  ３’非翻訳配列からなる群から選択される。いくらかの特定の好ましい実施形態において、少なくとも一つのＲａｂ３８エキソンは、Ｒａｂ３８エキソン１、Ｒａｂ３８エキソン２、およびＲａｂ３８エキソン３からなる群から選択される。いくらかの実施形態において、ゲノムＤＮＡは、哺乳動物ゲノムＤＮＡである。また、精製がサイズ選択を介して達成される実施形態が提供される。
【００１１】
本発明は、Ｒａｂ３８増幅産物を生じるためにゲノムＤＮＡから少なくともＲａｂ３８の部分を増幅する工程；Ｒａｂ３８増幅産物を消化して、消化されたＲａｂ３８増幅殖産物を生成する工程；および消化されたＲａｂ３８増幅産物を電気泳動する工程を包含する、Ｒａｂ３８中で変異を検出するための方法をさらに提供する。好ましい実施形態において、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して達成される。いくらかの実施形態において、Ｒａｂ３８ゲノムＤＮＡの少なくとも一部分は、少なくとも一つのＲａｂ３８エキソン、少なくとも一つのＲａｂ３８イントロン、Ｒａｂ３８  ５’非翻訳配列、およびＲａｂ３８  ３’非翻訳配列からなる群から選択される。好ましい実施形態において、少なくとも一つのＲａｂ３８エキソンは、Ｒａｂ３８エキソン１、Ｒａｂ３８エキソン２、およびＲａｂ３８エキソン３からなる群から選択される。特定の好ましい実施形態において、ゲノムＤＮＡは、哺乳動物ゲノムＤＮＡである。
【００１２】
本発明はまた、ＲＡＢ３８活性を調節するための生物学的活性因子をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、ＲＡＢ３８活性を含むメラノサイト、および候補因子を提供する工程；および候補因子にメラノサイトを露呈して、処置されたメラノサイトを生じる工程；および候補因子によって処置されたメラノサイトのＲＡＢ３８活性の調節を測定する工程を包含する。任意の実施形態において、ＲＡＢ３８活性は、ＧＴＰアーゼ活性を含む。いくらかの関連した実施形態において、ＲＡＢ３８活性は、ＧＴＰ結合活性またはＧＤＰ放出を含む。いくらかの好ましい実施形態において、ＲＡＢ３８活性は、メラノソームへのＴＹＲＰ１輸送またはメラノソームへのＲＡＢ３８輸送を含む。
【００１３】
いくらかの実施形態において、本発明は、ＲＡＢ３８活性を調節する生物学的活性因子をスクリーニングするためのキットを提供し、このキットは、ＲＡＢ３８活性を含む複数のメラノサイト（ここで、このメラノサイトは、容器の中で提供される）およびメラノサイト中でＲＡＢ３８活性の決定のための説明書を備える。いくらかの好ましい実施形態において、キットは、ＲＡＢ３８活性を分析するための手段をさらに包含する。いくらかの関連する実施形態において、ＲＡＢ３８活性を分析するための手段は、ＧＴＰアーゼ活性を評価するためのアッセイ、ＧＴＰ結合活性を評価するためのアッセイ、ＧＤＰ放出を評価するためのアッセイ、メラノサイトへのＴＹＲＰ１輸送を評価するためのアッセイ、またはメラノサイトへのＲＡＢ３８輸送を評価するためのアッセイを包含する。
【００１４】
本発明はまた、ＲＡＢ３８の少なくとも一部分の増幅について適切な少なくとも２つのプライマー配列を含むＲＡＢ３８中の変異の検出のためのキット、およびこのキットを利用するための説明書を提供する。いくらかの好ましい実施形態において、プライマー配列は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される。任意の関連する実施形態において、キットは、ポリメラーゼ連鎖反応中で使用するために適切である。本発明はまた、核酸を消化するための試薬をさらに含む実施形態を提供する。
【００１５】
いくらかの実施形態において、本発明はまた、ＲＡＢ３８を含むメラノサイトを含む、メラノソーム機能中で欠損を診断するためのキットおよびメラソーム機能中で欠損を評価するための説明書を提供する。いくらかの好ましい実施形態において、キットは、ＲＡＢ３８活性を分析するための手段をさらに含む。任意の関連する実施形態において、ＲＡＢ３８活性を分析するための手段は、ＧＴＰアーゼ活性を評価するためのアッセイ、ＧＴＰ結合活性を評価するためのアッセイ、ＧＤＰ放出を評価するためのアッセイ、メラノソームへのＴＹＲＰ１輸送を評価するためのアッセイまたはメラノソームへのＲＡＢ３８輸送を評価するためのアッセイを包含する。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、メラノサイトに関与する組成物および方法に関する。特に、本発明は、色素沈着の調整における使用に適切な、ＲＡＢ３８および変異ＲＡＢ３８に関与する組成物および方法を提供する。さらに、この方法を用いて、色素沈着における障害に関する状態を、診断および／または処置し得る。
【００１７】
さらなる色素沈着疾患遺伝子を同定するという技術における必要性をみたすため、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いる発現プロファイル分析が、本発明を開発するために行われた。発現プロファイル分析は、何千もの遺伝子発現測定から見出される一般的なパターンを組織化し、そして複数の実験サンプル中の類似の特徴的な発現パターンを有する遺伝子を同定するために強力な道具である（Ｅｉｓｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１４８６３〜１４８６８［１９９８］）ので、この分析が本発明の開発のために利用された。クラスター中に含まれる遺伝子の分析は、これらの遺伝子がしばしば細胞中で機能的に関連していることを解明してきた（ＥｉｓｅｎおよびＢｒｏｗｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３０３：１７９〜２０５［１９９９］；ならびにＭｏｄｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：８８６２〜８８６７［２００１］）。以下に詳しく述べられるように、このアプローチを用いることによって、Ｒａｂ３８が、色素沈着遺伝子の候補として同定された。さらなる分析は、ＲＡＢ３８が、メラノソームタンパク質であり、マウス色素沈着変異体Ｃｈｏｃｏｌａｔｅ（ｃｈｔ）中で変異され、メラノサイトにおけるメラノソームタンパク質ＴＹＲＰ  １の選別のために重要であることを確かにした。本発明の開発の間に行われた実験は、哺乳動物色素沈着疾患遺伝子を同定するためのマイクロアレイ発現プロファイリングの最初の成功した使用を提供する。
【００１８】
（発現プロファイル分析は、ＲＡＢ３８をＣｈｏｃｏｌａｔｅ候補遺伝子として同定する）
メラノサイトの機能および疾患に関与する新しい特徴付けされていない遺伝子を同定するために、発現プロファイルおよび機能分析のために用いられるべきｃＤＮＡクローンのコレクションが、生成された（Ｌｏｆｔｕｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：９２７７〜９２８０［１９９９］）。ＩＭＡＧＥコンソーシアムライブラリ２ＮｂＨＭからのｃＤＮＡクローン（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ’ｓ  ｗｅｂ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｎｏ．１９８を参照のこと）は、メラノサイトの発達および機能を理解することを目的とした遺伝子発現研究について適切であると以前に示された（Ｌｏｆｔｕｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：９２７７〜９２８０［１９９９］；ならびにＬｏｆｔｕｓおよびＰａｖａｎ、Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １３：１４１−１４６［２０００］）。この分析のために、ライブラリ２ＮｂＨＭからの４３５６ｃＤＮＡクローンが、ガラスのスライドに印刷された。神経提由来組織および非神経提由来組織を表す合計１７の細胞株が、この分析で用いられた。１１のメラノーマ細胞株（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：５３６〜５４０［２０００］）、３つの横紋筋肉腫細胞株、１つの神経膠芽腫細胞株、ＨｅＬａ細胞、および２９３Ｔ細胞が、含まれた。これらの細胞株の各々についてのアレイハイブリダイゼーションが、参照として細胞株ＭｎＳＯＤ６  ｃｌ１からのＲＮＡを用いる、２つ１組の様式で実施された。ＭｎＳＯＤ６  ｃｌ１は、ヒト第６染色体の１領域の導入によって非腫瘍形成性にされる、非メラニン性（ａｍｅｌａｎｏｔｉｃ）黒色腫細胞株である（Ｔｒｅｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：５６８〜５７１［１９９０］）。ＭｎＳＯＤ６  ｃｌ１は、異なる一連のｃＤＮＡクローンを用いて黒色腫株の発現プロファイル分析のために以前に使用されてきた（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：５３６〜５４０［２０００］）。
【００１９】
階層性クラスター分析は、メラノサイトの機能に関与することが以前に知られた、９つの遺伝子（ＤＣＴ、ＴＹＲＰｌ、ＰＭＥＬ１７、ＡＩＭ−ｌ、ＭＥＬＡＮＡ／ＭＡＲＴＩ、ＭＬＳＮ、ＡＴＲＮ、ＰＡＸ３およびＣＨＳｌ）が一緒にクラスター化することを見出した（図１を参照のこと）。階層性クラスター化データの精密な分析において、さらなる遺伝子、Ｒａｂ３８が、これらのメラノサイト遺伝子に対して類似の発現バリエーションを有することが見出された（図１を参照のこと）。検証した９つのメラノサイト遺伝子の内、４つ（ＴＹＲＰ１、ＤＣＴ、ＭＬＳＮおよびＡＩＭ１）は、Ｅ１１．５において、レチナール色素上皮（ＲＰＥ）のメラノサイトにおいて発現された（図２を参照のこと）。この遺伝子クラスター中のＲａｂ３８の配置に一致して、ホールマウントインサイチュ分析は、Ｒａｂ３８がまた、この齢でＲＰＥのメラノサイトにおいて発現されることを実証した（図２を参照のこと）。ノーザンブロット分析は、Ｒａｂ３８発現が、メラノサイト由来の細胞株に制限されることを解明した（Ｊａｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：３５８４〜３５９１［２０００］）。
【００２０】
最近入手可能なヒトゲノム配列を利用して、Ｒａｂ３８は、ＴＹＲが近位に隣接し、ＥＥＤおよびＭＹ０７Ａが遠位に隣接して、ヒト第１１染色体上に位置することが決定された（図３、パネルＡを参照のこと）。マウス第７染色体上の保護された結合基が、ヒトゲノムマップをマウスゲノムマッピングデータと比較することによって同定された（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのウェブサイトをＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｑｕｅｒｙについて参照のこと）。マウスの保存された結合基中の遺伝子座のより精密な分析は、クローン化されていないマウス色素沈着変異体、ｃｈｔが、この問題の間に含まれることを示した（図３、パネルＡ；ならびにＰｏｔｔｅｒおよびＲｉｎｃｈｉｋ、Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４：４６〜４８［１９９３］を参照のこと）。ｃｈｔ変異は、近交系Ｃ５７Ｂ１／６Ｊバックグラウンドでの自発的な同質遺伝子的変異として生じ、１９８４年からこのバックグラウンドにおいて維持されている（ＭａｃｐｉｋｅおよびＭｏｂｒａａｔｅｎ、Ｍｏｕｓｅ  Ｎｅｗｓ  Ｌｅｔｔ  ７００：８６［１９８４］）。ｃｈｔ／ｃｈｔマウスは、より明るい皮膚および眼により生まれたときに、そしてＣ５７Ｂ１／６Ｊ親株と比較した場合深い毛色により離乳時に、同定可能である（図３、パネルＢおよびＣを参照のこと）。従って、Ｒａｂ３８は、ゲノムマップ位置ｃｈｔ／ｃｈｔマウス、ＲＰＥおよびメラノサイト誘導体において影響を及ぼされたおよび細胞型中のＲａｂ３８の発現に基づいてｃｈｔ遺伝子座についての候補遺伝子として関係づけられた。
【００２１】
（Ｒａｂ３８の変異は、ｃｈｔ／ｃｈｔマウスにおけるメラノサイト欠損の原因となる）
３つのマウスＲａｂ３８エキソンについてのエキソン／イントロン境界に隣接するゲノム配列は、マウストレースアーカイブゲノム配列から得られた（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトをＴｒａｃｅ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｑｕｅｒｙｉｎｇについて参照のこと）。Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  ｃｈｔｌ＋動物からのＤＮＡが、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｍｏｕｓｅ  ＤＮＡ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅから得られ、ゲノムＲａｂ３８プライマーを用いて増幅され、直接配列決定された。エキソン１において、Ｇ１４６Ｔヌクレオチド変異は、ｃｈｔ対立遺伝子において同定された（図４、パネルＡを参照のこと）。この配列変化は、生じるヌクレオチド置換が、ＢｓａＪＩ部位（ＣＣＮＮＧＧ）をＳｅｘＡ１制限部位（ＡＣＣＷＧＧＴ）へと変化させるので、配列変化が、複数のｃｈｔ／ｃｈｔ  ＤＮＡサンプルにおいて制限消化により確かめられた（図４、パネルＢを参照のこと）。この配列変化は、８つのさらなる近交系マウス系統（ＣＡＳＴ／Ｅｉ、ＳＰＲＥＴ／Ｅｉ、１２９／ＳＶＪ、ＦＶＢ／ＮＪ、ＡＫＲ／Ｊ、Ａ／Ｊ、ＤＢＡ／１Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＪ）の分析において検出されなかった。ＲＡＢ３８タンパク質は、門の間で高度に保存されたアミノ酸同一性を示す：ヒト／ラット（９６．２％）、ヒト／マウス（９３．８％）、ラット／マウス（９５．２％）（図４、パネルＢを参照のこと）。Ｇ１９Ｖ  ｃｈｔ変異は、高度に保存されたホスフェート／Ｍｇ２＋（ＰＭ）ドメイン内に位置し、そしてヌクレオチド結合ポケット内でＧＴＰと直接接触すると予測される（図５、パネルＡおよびＢを参照のこと）。
【００２２】
（Ｒａｂ３８ｃｈｔが、Ｔｙｒｐ１を最終段階メラノソームへと標的化する効率の減少を生ずる）
新生仔マウスから培養されたメラノサイトの分析は、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔメラノサイトが、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｔｙｒｐｌｂ／ｌＴｙｒｐｌｂメラノサイト（図６、パネルＣ；およびＨｅａｒｉｎｇら、Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ  Ｒｅｓ  ４３：８８〜１０６［１９７３］を参照のこと）において観察される色調と類似するが、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  ＋／＋メラノサイト培養物において見られる強烈に黒い、卵形のメラノソーム（図６、パネルＡおよびＢを参照のこと）とは異なる、茶色の色調の、小さな円形のメラノソームを含むことを明らかにした。Ｔｙｒｐｌ変異が茶色のマウスにおいて黒色色素から茶色色素への転換の原因となり、かつＲａｂ  ＧＴＰａｓｅが、タンパク質輸送における中心的な役割を果たすこと（Ｓｃｈｉｍｍｏｌｌｅｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２２１６１〜２２１６４  ［１９９８］；ならびにＣｈａｖｒｉｅｒおよびＧｏｕｄ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：４６６〜４７５［１９９９］）を考慮すると、ＴＹＲＰＩのメラノソームへの標的化は、Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔメラノサイトにおいて欠陥があると企図された。これと一致して、Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔメラノサイトにおける最終段階メラノソームは、ＴＹＲＰ１について、コントロールのメラノサイトにおける最終段階メラノソームが染まるよりもはるかに弱く、染まる（図７、パネルＡ  Ｄを参照のこと）。さらに、ＧＦＰタグ化ＲＡＢ３８は、野生型細胞における最終段階メラノソームと共に局在する（図７、パネルＥおよびＦを参照のこと）。従って、ＲＡＢ３８は、Ｔｙｒｐ１をトランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）から最終段階メラノソームへと移動させる小胞性中間体の輸送を調節するよう企図される。
【００２３】
（Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔは、血小板貯蔵不足を生じない）
小胞輸送に関与する遺伝子における変異体を持つマウスコーティング色変異体のサブセット（例えば、ｐａｌｅ  ｅａｒおよびｂｅｉｇｅ）はまた、ＨＰＳおよびＣＨＳを各々モデリングする血小板集合不足の原因となる。Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔマウスの病理をさらに分析するために、出血時間を血小板機能のアッセイとして測定した。野生型マウスとＲａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔマウスとの間に違いは観察されなかった（２．５３分対２．４１分；ｐ＝０．７）。この観察は、ＯＣＡＩＩＩ（Ｔｙｒｐｌｂ）マウスモデルについてのゲノムコピーであるが、ＨＰＳまたはＣＨＳのいずれでもないＲａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔと一致する。一緒にまとめると、本明細書中に示されるデータは、ＲＡＢ３８が、ＴＹＲＰ１を色素沈着メラノームへと効率的に標的化するために必要であることを示し、そしてＲａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔが、Ｔｙｒｐｌｂ／Ｔｙｒｐｌｂ  ＯＣＡＩＩＩマウスモデルのゲノムコピーであることを示唆する。
【００２４】
（Ｒａｂ３８は、哺乳動物におけるメラノサイト色素沈着遺伝子である）
従って、ｃＤＮＡマイクロアレイ発現プロファイリングを使用することによって、Ｒａｂ３８は、メラノサイト色素沈着に関与する重要な遺伝子として同定された。発現パターンの階層的クラスター化は、メラノサイト特異的様式で機能することが公知の９つの以前に同定されたメラノサイト遺伝子でＲａｂ３８を分類した。これらの遺伝子は、メラノソーム機能に必須のＤＣＴ、ＴＲＹＰ１、およびＰＭＥＬｌ７；重要なメラノーマ抗原であるＭＥＬＡＮ−Ａ／ＭＡＲＴ１およびＭＬＳＮ（Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：５９１５−５９１９［１９９６］；およびＤｕｎｃａｎら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９：５６８−５７６［２００１］）；メダカにおけるＢの原因である遺伝子として最近同定されたＡＩＭ−１（Ｆｕｋａｍａｃｈｉら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２８：３８１−３８５［２００１］）、マウスにおけるｕｎｄｅｒｗｈｉｔｅ（Ｎｅｗｔｏｎら，Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｔ  ６９：９８１−９８８［２００１］）、およびヒトにおけるＯＣＡ４（Ｎｅｗｔｏｎら，Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｔ  ６９：９８１−９８８［２００１］）；メラノソーム／リソソームベシクル輸送において機能するＣＨＳ１（Ｉｎｔｒｏｎｅら，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  ６８：２８３−３０３［１９９９］）；ならびにＴＹＲＰ１の発現を含む（Ｇａｌｉｂｅｒｔら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：２６８９４−２６９００［１９９９］）、メラノサイト遺伝子発現を調節するペアードボックス転写因子であるＰＡＸ３（Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １８：２８３−２８６［１９９８］；Ｐｏｔｔｅｒｆら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ  １０７：１−６［２０００］；およびＨｏｒｎｙａｋら，Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １０１：４７−５９［２００１］）を含む。これらの遺伝子の７つにおける変異は、色素沈着におけるバリエーションと関連する、ヒトおよび／またはマウス（ｍａｒｉｎｅ）障害において同定された（図１を参照のこと）。
【００２５】
Ｒａｂ３８は、３つの理由で、ｃｈｔ遺伝子座の候補遺伝子として評価された。第１に、比較ゲノム分析により、ヒトＲａｂ３８遺伝子の、マウスゲノムにおけるｃｈｔ遺伝子座の領域に対する同時局在化が推定された。第２に、Ｒａｂ３８の発現は、ｃｈｔ／ｃｈｔマウスにおいて罹患したそれらの細胞型に限定されることが見いだされた（図２およびＪａｇｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：３５８４−３５９１［２０００］を参照のこと）。最後に、Ｒａｂ３８は、ベシクル輸送において重要な役割を果たすことが公知のタンパク質のファミリーのメンバーである（Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １：３７６−３８２［１９９９］；ならびにＳｃｏｔｔおよびＺｈａｏ，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １１６：２９６−３０４［２００１］）。
【００２６】
ｃｈｔマウス由来のＲａｂ３８コード領域の配列分析により、エキソン１におけるＧ１４６Ｔトランスバージョンが明らかになった。この配列変化は、原因となる変異である可能性が高い。なぜなら、この対立遺伝子は、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊバックグラウンドに対する自発的変異として現れたからである。さらに、Ｇ１４６Ｔ変化は、ＲＡＢ３８のＧＴＰ結合ポケット内でのＧｌｙからＶａｌへの置換を生じた。ＲＡＢ３Ａの結晶構造分析（これは、他のＲａｂタンパク質のモデルとして使用される）により、このアミノ酸残基が、そのヌクレオチド結合ポケット内のＧＴＰと直接接触すると推定される（Ｄｕｍａｓら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  ７：４１３−４２３［１９９９］）。さらに、ＲＡＢ５（エンドソームのホモタイプ融合を調節するＲａｂ）における類似のアミノ酸残基の変異は、インビトロでＧＤＰ解離の速度の増大を生じ、インビボでエンドソーム融合の刺激を生じた（ＬｉおよびＬｉａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３５５：６８１−６８９［２００１］）。この変異の機能的関連性のさらなる支持は、Ｒａｓタンパク質の研究に由来する。Ｒａｓにおける類似のＧ１３残基における置換（Ｒａｂ３８ｃｈｔと同じＧからＶへの変異を含む）は、急性骨髄性白血病において同定された（Ｂｏｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：７２６−７３０［１９８５］；およびＳｔｉｒｅｗａｌｔら，Ｂｌｏｏｄ  ９７：３５８９−３５９５［２００１］）。本明細書中に開示される分析およびこれらの観察に基づいて、ＲＡＢ３８におけるＧｌｙからＶａｌへの変異は、インビボでＲＡＢ３８機能を破壊するために意図される。
【００２７】
Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔマウスの毛色は、ｂｒｏｗｎ（Ｔｙｒｐｌｂ／Ｔｙｒｐｌｂ）、ＯＣＡＩＩＩマウスモデルの毛色とよく似ている。このｂｒｏｗｎマウスモデルは、メラニン生合成遺伝子Ｔｙｒｐｌに欠損を含み、このことによって、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの黒色から褐色への毛色の変化をを生じる。ＴＹＲＰは、メラノソーム膜糖タンパク質である。これらは、ＤＨＩＣＡオキシダーゼ酵素として、およびメラニン生成酵素複合体におけるＴＹＲに対する構造的安定性を提供するための両方で機能する。ＴＲＹＰＩは、おそらく、最初に特徴付けられていない分類区画を通ることにより、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）から段階ＩＩのメラノソームへと、クラスリン（ｃｌａｔｈｅｒｉｎ）コートベシクルを介して伝達されると考えられる（ＭａｒｋｓおよびＳｅａｂｒａ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：７３８−７４８［２００１］）。類似の毛色表現型および推定されるＲａｂタンパク質機能に基づいて、ＲＡＢ３８は、ＴＹＲＰ１のようなメラノソームタンパク質のメラノソームへの輸送に特異的に関与することが意図される。このことと一致して、ＧＦＰタグ化ＲＡＢ３８は、培養物における色素沈着メラノサイト株においてメラノソームと同時局在し、ＴＹＲＰ１は、Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔメラノサイトにおける色素沈着最終段階メラノソームに非効率的に標的化される。Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔマウスにおいて観察される褐色の毛色は、メラノソームＴＹＲＰ１の減少した量の結果であると予測される。従って、ＲＡＢ３８は、タンパク質（例えば、ＴＹＲＰ１）のメラノソームへの適切な標的化に必要とされるベシクル輸送に関連する。
【００２８】
メラノソームの形成およびメラノソーム内のメラニン色素沈着は、一連の特異的ベシクル輸送工程を必要とする（Ｋｉｎｇら，Ｓｃｒｉｖｅｒら（編）Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，第７版．（ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ｐｐ．４３５３−４３９２［１９９５］；ならびにＭａｒｋｓおよびＳｅａｂｒａ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：７３８−７４８［２００１］）。Ｒａｂ３８ｃｈｔマウスの、タンパク質の輸送における欠損が同定された他のマウス変異体に対する表現型の比較により、ＲＡＢ３８の作用部位への知見を提供することが予測される。変異した場合に、ＨＰＳに関与する４つの遺伝子（ＨＰＳ１、ＡＰ３ならびにＨＰＳ３およびＨＰＳ４）は、マウスモデルｐａｌｅ  ｅａｒ（ｅｐ）、ｍｏｃｈａ、ｃｏｃｏａ、およびｌｉｇｈｔ  ｅａｒを、それぞれ生じる。これらのマウスモデルの各々に関して、メラノソームによって生成されるメラニンの色は、色はより薄いかまたは褐色の色調である。興味深いことに、Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔ由来メラノサイトにおいて見られるものと類似して、Ｈｐｓｌｅｐ／Ｈｐｓｌｅｐ変異体由来のメラノサイトはまた、プレメラノソームではなく、膜複合体へのＴＹＲＰ１の誤った局在化を示し（Ｓａｒａｎｇａｒａｊａｎら，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １１７：６４１−６４６［２００１］）、繰り返し、褐色マウスを生じる。メラノソーム色素欠損に加えて、ＨＰＳマウスはまた、メラノソームおよびリソソームの拡大ならびに減少した血小板細胞凝集を示す（Ｓｗａｎｋら，Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １３：５９−６７［２０００］；およびＩｎｔｒｏｎｅら，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  ６８：２８２−３０３［１９９９］）。このことは、リソソームおよびメラノソームに影響を及ぼす初期のベシクル分類事象におけるＨＳＰ遺伝子の関与を示唆する。しかし、Ｒａｂ３８ｃｈｔは、ＨＰＳマウスモデルの変異体のクラスと同じ変異体のクラスにはないようである。なぜなら、Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔマウスは、拡大したメラノソームまたはリソソームも、血小板機能の欠損も示さないからである。従って、ＨＰＳ１およびＲＡＢ３８の両方が、ＴＹＲＰ  １の適切な分類に関与しているようであるが、この調節は、その輸送プロセスにおける異なる段階で生じるようである。ＲＡＢ３８は、メラノソーム輸送にのみ影響を及ぼすようなので、ＲＡＢ３８は、ＨＰＳ遺伝子の下流のベシクル輸送に関与することが予測される。
【００２９】
Ｒａｂ３８ｃｈｔマウスは、後期段階メラノソームへの適切なＴＹＲＰ１輸送におけるＲＡＢ３８の必須の役割、従って、細胞表現型および臨床表現型を模倣することに起因して、ＴＹＲＰｌｂ（ＯＣＡマウスモデル）の遺伝子コピーであるようである。ＯＣＡは、ＴＹＲ（ＯＣＡＩ）、Ｐ（ＯＣＡＩＩ）ＴＹＲＰ１（ＯＣＡＩＩＩ）およびＡＩＭ１（ＯＣＡＩＶ）における変異と関連した不均質な（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）遺伝子障害である。しかし、ＯＣＡと臨床的に診断された患者の約１０％は、これらの遺伝子のいずれにも変異を有さない。ＯＣＡの不均一性およびＴＹＲＰＩ分類におけるＲＡＢ３８の推定される役割を仮定すると、Ｒａｂ３８は、ＯＣＡを有する患者、特に、ＴＹＲ、Ｐ、ＴＹＲＰ１またはＡＩＭ１において分子欠損が見いだされない場合の、候補遺伝子であると予測される。
【００３０】
（ＲＡＢ３８活性のモジュレーターについてのハイスループットスクリーニング）
結論として、有用な特性を有する新たな化学的実体が、ある望ましい特性または活性を有する化合物（「リード化合物」といわれる）を同定し、リード化合物の改変体を作製し、その改変体化合物のその特性および活性を評価することによって生成される。しかし、現在の傾向は、薬物発見の全ての局面について時間枠を短くすることである。非常に多くを迅速かつ効率的に試験する能力が原因で、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法が、従来のリード化合物同定法に取って代わっている。
【００３１】
１つの好ましい実施形態において、ハイスループットスクリーニング法は、多くの潜在的治療化合物（候補化合物）を含むライブラリーを提供することを包含する。次いで、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」が、本明細書中で記載されるように、１回以上のアッセイにおいてスクリーニングされて、所望の特徴的活性を示すライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）が同定される。このように同定されたこれらの化合物は、従来の「リード化合物」として作用し得るか、またはそれら自体が、潜在的または実際の治療剤として使用され得る。
【００３２】
（ａ．コンビナトリアル化学ライブラリー）
最近、新たな化合物リードの生成を補助するためにコンビナトリアル化学ライブラリーの使用に注意が向けられている。コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬のような多くの化学的「構成ブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）」を組み合わせることによって、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成される多様な化合物の収集物である。例えば、線形的コンビナトリアル化学ライブラリー（例えば、ポリペプチドライブラリー）は、所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）について、一セットの、アミノ酸といわれる化学的構成ブロックをあらゆる可能な様式で組み合わせることにより形成される。数百万の化合物が、化学的構成ブロックのこのようなコンビナトリアル混合を通じて合成され得る。例えば、ある注釈者は、１００個の交換可能な化学的構成ブロックの合成的なコンビナトリアル混合が、一億個のテトラマー化合物または１００億個のペンタマー化合物の理論的合成を生じることを観察した（Ｇａｌｌｏｐら（１９９４）３７（９）：１２３３−１２５０）。
【００３３】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーとしては、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，３７：４８７−４９３、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８４−８８を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド合成は、決して、本発明とともに使用するために想定および意図される唯一のアプローチではない。化学的多様性のライブラリーを生成するための他の化学もまた使用され得る。このような化学物質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペプトイド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１９７３５、１９９１年１２月２６日）、コードされたペプチド（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２０２４２、１９９３年１０月１４日）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０００９１、１９９２年１月９日）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなディバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９−６９１３）、ビニル性（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら（１９９２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８）、βＤグルコース足場を有する非ペプチドのペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら，（１９９２）Ｊ：Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８）、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成（Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１）、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３）、ならびに／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，（１９９４）Ｊ  Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８）。一般には、Ｇｏｒｄｏｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５、ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４を参照のこと）、およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７）、炭水化物ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２、および米国特許第５，５９３，８５３号を参照のこと）、ならびに低有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン，Ｂａｕｍ（１９９３）Ｃ＆ＥＮ，Ｊａｎ  １８，ｐａｇｅ  ３３、イソプレノイド米国特許第５，５６９，５８８号、チアゾリジノンおよびメタチアザノン米国特許第５，５４９，９７４号、ピロリジン米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号、モルホリノ化合物米国特許第５，５０６，３３７号、ベンゾジアゼピン米国特許第５，２８８，５１４号などを参照のこと）を参照のこと。
【００３４】
コンビナトリアルライブラリーの調製のためのデバイスは、市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ，Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，９０５０  Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡを参照のこと）。
【００３５】
多くの周知のロボットシステムがまた、溶液相化学のために開発された。これらのシステムとしては、Ｔａｋｅｄａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＬＴＤ．（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）によって開発された自動化合成装置のような自動化ワークステーション、および多くのロボットシステム利用ロボットアーム（Ｚｙｍａｔｅ  ＩＩ，Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓ．；Ｏｒｃａ，ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）（これは、化学者によって実行される手動の合成手順をまねる）が挙げられる。任意の上記デバイスは、本発明とともに使用するのに適している。本明細書中で考察されるように操作し得るように、これらのデバイスに対する改変（もしあれば）の性質および実施は、当業者に明らかである。さらに、多くのコンビナトリアルライブラリー自体が、市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕ，Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ，Ｍｏｓｃｏｗ，ＲＵ，３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ，Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤなどを参照のこと）。
【００３６】
（ｂ．化学ライブラリーのハイスループットアッセイ）
本明細書中に記載されるビルレンスを阻害する化合物についての任意のアッセイは、ハイスループットスクリーニングに受け入れ可能である。上記のように、ビルレンスと関連する核酸を同定した場合、同様な薬物候補が、遺伝子産物の発現を阻害するか、または発現されたタンパク質の活性を阻害するかのいずれかである。従って好ましいアッセイは、試験化合物による転写の阻害（すなわち、ＲＡＢ３８  ｍＲＮＡ産生の阻害）、試験化合物によるタンパク質発現の阻害、あるいは試験化合物による遺伝子（例えば、ｇＤＮＡ、もしくはｃＤＮＡ）または遺伝子産物（例えば、ＲＡＢ３８  ｍＲＮＡまたは発現されたタンパク質）への結合を検出する。あるいは、このアッセイは、遺伝子産物の特徴的な活性の阻害、あるいは、遺伝子産物と相互作用するレセプターまたは他の伝達分子の阻害または結合を検出し得る。
【００３７】
特定の核酸またはタンパク質産物の存在、非存在または定量化のためのハイスループットアッセイは、当業者に周知である。同様に、結合アッセイは、同様に周知である。従って、例えば、米国特許第５，５５９，４１０号は、タンパク質のハイスループットスクリーニング方法を開示し、米国特許第５，５８５，６３９号は、核酸結合のハイスループットスクリーニング方法（すなわち、アレイ）を開示し、一方、米国特許第５，５７６，２２０号および同第５，５４１，０６１号は、リガンド／抗体結合のスクリーニングのハイスループット方法を開示する。
【００３８】
さらに、ハイスループットスクリーニングシステムは、市販される（例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；Ａｉｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡなどを参照のこと）。これらのシステムは、代表的に、全てのサンプルおよび試薬のピペッティング、液体分散、時間を合わせたインキュベーション、およびアッセイに適切な検出器におけるマイクロプレートの最終の読み取りを含む、手順全体を自動化する。これらの構成可能なシステムは、ハイスループットで迅速な起動、ならびに高い程度の柔軟性および特注性（ｃｕｓｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ）を提供する。このようなシステムの製造業者は、種々のハイスループットの詳細なプロトコルを提供する。従って、例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．は、遺伝子転写、リガンド結合などの調節を検出するためのスクリーニングシステムを記載する技術的紀要を提供する。
【００３９】
（ＲＡＢ３８活性を阻害する方法）
本発明の方法は、ＲＡＢ３８活性を阻害する方法を含む。当該分野で公知の任意の方法が、使用され得、重要なことのすべては、ＲＡＢ３８活性が、野生型状態またはコントロールと比較して、減少するかまたは除去されることである。ＲＡＢ３８活性のインヒビターは、発現プロセスの任意の工程で作用し得る。
【００４０】
ＲＡＢ３８活性は、リボザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、またはＲＡＢ３８活性の低分子化学ブロッカーの使用を含む多くの方法によって阻害され得る。
【００４１】
（アンチセンスおよびＲＮＡｉポリヌクレオチド）
特定の実施形態において、ＲＡＢ３８タンパク質の活性は、コードｍＲＮＡ核酸配列（例えば、ＲＡＢ３８  ｍＲＮＡ）またはそのサブ配列に相補的であり、そして好ましくは、それに対して特異的にハイブリダイズし得る阻害性またはアンチセンスポリヌクレオチド（例えば、核酸）の使用によって、ダウンレギュレートされるかまたは全体的に阻害される。ｍＲＮＡに対するアンチセンスポリヌクレオチドの結合は、ｍＲＮＡの翻訳および／または安定性を減少させる。
【００４２】
本発明の文脈において、アンチセンスポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在するサブユニットもしくはそれらの近いホモログから形成される合成種を含み得る。アンチセンスポリヌクレオチドはまた、糖部分または糖間連結を変更され得る。これらの例示としては、ホスホロチオエートおよび他の硫黄含有種がある。アナログは、それらが、癌タンパク質ｍＲＮＡと効果的にハイブリダイズする限り、本発明によって包含される。例えば、Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｓｅｑｕｉｔｏｒ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡを参照のこと。
【００４３】
このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、組換え手段を使用して、容易に合成され得るか、またはインビトロで合成され得る。このような合成のための装置は、いくつかの販売業者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含む）によって販売される。他のオリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体）の調製もまた、周知である。
【００４４】
本明細書中で使用されるアンチセンス分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを含む。センスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス鎖への結合によって転写をブロックするために使用され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ（センス）配列またはＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合し得る一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含む。好ましいアンチセンス分子は、ＲＡＢ３８分子、またはそのリガンドもしくはアクチベーターに対する。本発明に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４〜３０ヌクレオチドのフラグメントを含む。所定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９−２６６８；およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ，ら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６に記載される。
【００４５】
ＲＮＡ干渉は、配列特異的様式で遺伝子発現を抑制する機構である。例えば、Ｂｒｕｍｅｌｋａｍｐら，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ（２１  Ｍａｒｃｈ  ２００２）；Ｓｈａｒｐ（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：  １３９−１４１；およびＣａｔｈｅｗ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３：２４４−２４８を参照のこと。哺乳動物細胞において、短い（例えば、２１ｎｔ）二本鎖の小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡｉ応答を誘導する際に効果的であることが示された。例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８を参照のこと。同定された遺伝子の発現レベルをダウンレギュレートするため（例えば、疾患の処置または疾患に対する関連の確認）の機構が使用され得る。
【００４６】
アンチセンスポリヌクレオチドに加えて、リボザイムは、ＲＡＢ３８ヌクレオチド配列の転写を標的化および阻害するために使用され得る。リボザイムは、他のＲＮＡ分子を触媒的に切断するＲＮＡ分子である。異なる種類のリボザイムが記載され、これには、Ｉ群リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、ＲＮａｓｅ  Ｐ、およびアックスヘッド（ａｘｈｅａｄ）リボザイム（例えば、異なるリボザイムの性質の一般的な総説について、Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏら、（１９９４）Ａｄｖ．ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２５：２８９−３１７を参照のこと）が挙げられる。
【００４７】
ヘアピンリボザイムの一般的な特徴は、例えば、Ｈａｍｐｅｌら、（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２９９−３０４；欧州特許公開番号０  ３６０  ２５７；米国特許第５，２５４，６７８号に記載される。調製方法は、例えば、ＷＯ  ９４／２６８７７；Ｏｊｗａｎｇら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６３４０−６３４４；Ｙａｍａｄａら、（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：３９−４５；Ｌｅａｖｉｔｔら、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６９９−７０３；Ｌｅａｖｉｔｔら、（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：１１５１−１２０；およびＹａｍａｄａら、（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０５：１２１−１２６に記載される。
【００４８】
ＲＡＢ３８のポリヌクレオチドモジュレーターは、ＷＯ９１／０４７５３に記載されるように、リガンド結合分子との結合体の形成によって標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入され得る。適切なリガンド結合分子としては、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、そのリガンド結合分子が、その対応する分子またはレセプターに結合するか、あるいはセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはその結合されたバージョンが細胞に侵入することをブロックする能力を実質的に妨害しない。あるいは、ＲＡＢ３８のポリヌクレオチドモジュレーターは、例えば、ＷＯ９０／１０４４８に記載されるような、ポリヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸配列を含む細胞に導入され得る。モデルにおけるアンチセンス分子またはノックアウトおよびノックの使用はまた、処置の方法に加えて、スクリーニングアッセイにおいて使用され得る。
【００４９】
イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）はまた、ＲＡＢ３８タンパク質の活性をブロックまたは調節するための有効な手段を提供する。細胞内で発現される抗体構築物（通常、単鎖Ｆｖ抗体）は、細胞の内側の標的に対して指向される。ｓｃＦｖ遺伝子は、細胞内に移入され得、ここで、ｓｃＦｖタンパク質発現は、その標的（例えば、ＲＡＢ３８）の特性を調節し得、時々、タンパク質機能を打ち消し、そして表現型ノックアウトをもたらす。
【００５０】
（ＲＡＢ３８インヒビターの局所投与）
有効であるために、局所的ＲＡＢモジュレーターまたはインヒビターは、調節効果を作り出すために、十分な濃度の活性因子を含み、ここで、好ましくは、この調節効果は、阻害効果であり、治療的用量を送達するように十分に、インタクトな皮膚のような組織を貫通するべきであり、そして迅速な作用の開始を示し、そして長期の効果を有するべきである。上記を達成するために、迅速な開始をもたらすために高濃度で存在し、さらにまたは代替的に、ＲＡＢ３８調節を延長するために、適用の部位で皮膚を通して迅速に吸収され得る量で過剰に存在するＲＡＢ３８モジュレーターを有することが、しばしば望ましい。
【００５１】
本発明の好ましい局所処方物において、活性ＲＡＢ３８モジュレーターは、一般的に、局所薬物投与に適し、そして当該分野で公知の任意のこのような物質を含むものである。局所キャリアは、所望の形態（例えば、液体、ローション、クリーム、ペースト、ゲル、粉末、または軟膏）で組成物を提供するように選択され、そして天然に存在するかまたは合成起源のいずれかの材料から構成され得る。選択されたキャリアが、局所処方物の活性因子または他の成分に有害に作用しないことが必須で明らかである。本明細書中での使用のための適切な局所キャリアの例としては、水、アルコールおよび他の非毒性有機溶媒、グリセリン、鉱油、シリコーン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、ワックスなどが挙げられる。本発明の組成物は、シャンプーの形態で投与され得、この場合、このような処方物の従来の成分は、同様に、例えば、界面活性剤、コンディショナー、粘度改変剤、湿潤剤などで含まれる。
【００５２】
本明細書中の特に好ましい処方物は、無色、無臭の軟膏、ローション、クリームおよびゲルである。
【００５３】
軟膏は、半固体調製物であり、これは、代表的に、石油または他の石油誘導体に基づく。使用される特定の軟膏ベースは、当業者によって理解されるように、最適な薬物送達を提供し、そして好ましくは、他の所望の特性（例えば、軟化性（ｅｍｏｌｌｉｅｎｃｙ）など）を同様に提供するものである。他のキャリアまたはビヒクルとともに、軟膏ベースは、不活性で、安定で、非刺激性で、非感受性であるべきである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５），１３９９−１４０４頁において説明されるように、軟膏ベースは、４つのクラス（油性ベース；乳化可能ベース；エマルジョンベース；および水溶性ベース）に分類され得る。油性軟膏ベースとしては、例えば、植物油、動物から得られた脂肪、および石油から得られた半固体炭化水素が挙げられる。乳化可能軟膏ベース（吸収軟膏ベースとしても公知）は、ほとんどまたは全く水を含まず、これには、例えば、ヒドロキシステアリンスルフェート、無水ラノリンおよび親水性ワセリンが挙げられる。エマルジョン軟膏ベースは、油中水（Ｗ／Ｏ）エマルジョン、または水中油（Ｏ／Ｗ）エマルジョンのいずれかであり、これには、例えば、セチルアルコール、グリセリルモノステアレート、ラノリンおよびステアリン酸が挙げられる。好ましいＷ／Ｏ軟膏ベースは、種々の分子量のポリエチレングリコールから調製され；また、さらなる情報のために、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙに対して参照がなされる必要があり得る。
【００５４】
ローション剤は、摩擦なしに表皮表面に適用される調製物であり、代表的には、固体粒子（活性因子を含む）が水またはアルコール基剤中に存在する、液体または半液体の調製物である。ローション剤は、通常、固体の懸濁剤であり、好ましくは、本発明の目的のために水中油型の液体油性乳剤を含む。ローション剤は、より多くの液体組成物を適用するのが簡便であるため、身体の大きな領域を処置するための本明細書中で好ましい処方物である。ローション剤中の不溶性物質が細かく分割されることが一般的に必要である。ローション剤は、代表液にはより良い分散を生じる懸濁剤、および活性因子を皮膚に接触して局在化および維持するのに有用な化合物（例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）を含む。本発明と組み合せて用いられる、特に好ましいローション処方物は、親水性ワセリンと混合したプロピレングリコール（例えば、Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）製のＡｑｕａｐｈｏｒ．ＲＴＭ．という商標で得られ得るもの）を含む。
【００５５】
当該分野で公知であるように、選択されたＲＡＢ３８モジュレーターを含有するクリーム剤は、水中油もしくは油中水のいずれかの粘性の液体または半固体の乳剤である。クリーム基剤は、水で洗浄可能であり、油相、乳化剤および水相を含む。油相はまた、時々、「内」相と呼ばれ、一般にワセリンおよび脂肪アルコール（例えば、セチルアルコールまたはステアリルアルコール）を含み；水相は通常、必ずというわけではないが、容積において油相を上回り、そして、一般に湿潤剤を含む。クリーム処方物中の乳化剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（前出）に説明されるように、一般に非イオン性界面活性剤か、アニオン性界面活性剤か、カチオン性界面活性剤かまたは両性界面活性剤である。
【００５６】
ゲル処方物がまた使用され得る。局所薬物処方物の分野の当業者によって理解されるように、ゲルは、半固体の懸濁型系である。単相ゲルは、キャリア液体全体に実質的に均一に分散する有機高分子を含有し、このキャリア液体は、代表的には水性であるが、また、好ましくはアルコールおよび必要に応じて油を含有する。
【００５７】
当業者に公知の種々の添加物が本発明の局所処方物に含有され得る。例えば、溶媒を使用して特定の薬物物質を可溶化し得る。他の任意の添加物としては、皮膚浸透増強剤、乳白剤、抗酸化剤、ゲル化剤、増粘剤、安定剤などが挙げられる。他の薬物（例えば、抗菌剤、抗真菌剤、抗生物質および抗炎症剤（例えば、ステロイド））もまた添加され得る。
【００５８】
本発明の好ましい局所処方物において、活性ＲＡＢ３８モジュレーターが、一般に総組成物の１０重量％未満、好ましくは約１重量％未満、そして最も好ましくは、約０．１重量％未満の量で存在する。
【００５９】
（定義）
本発明の理解を促進するために、多数の用語が定義され、以下に議論される。
【００６０】
用語「治療有効量」とは、局所的に適用される場合、効果を生じるのに十分なＲＡＢ３８モジュレーターの量を意味することが企図される。これらの量は当該分野で公知であるかまたは当該分野で公知の方法により決定され得、選択されるＲＡＢ３８モジュレーター、そして組織（例えば、皮膚）が作用部位であるかどうかに依存して、代表的には成人１人あたり約１〜２０，０００ｍｇ、好ましくは約１０〜１０，０００ｍｇの範囲であり、そして最も好ましくは、適用あたり約２０〜５，０００ｍｇの範囲のＲＡＢ３８モジュレーター剤である。
【００６１】
用語「メラノソーム（ｍｅｌａｎｏｓｍｅ）色素沈着のインヒビター」とは、メラノソームの形成を任意の程度まで阻止する、および／または、メラノソーム内の色素沈着を任意の程度まで阻止する任意の物質をいう。インヒビターは、メラノソーム色素沈着をもたらすプロセスの任意の工程において作用し得、これらの工程としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：メラノソーム小胞を輸送する工程、小胞もしくはタンパク質を選別する工程、またはタンパク質活性に作用する工程。
【００６２】
用語「皮膚色のライトニング（明るくすること）」は、皮膚の色、トーンまたは影を、わずかではあるが可視的に減少することをいう。これらの変化は、減少または阻害されたＲＡＢ３８機能の結果として生じるメラノソーム色素沈着の減少によりもたらされ得る。
【００６３】
ＲＡＢ３８ポリペプチドの「インヒビター」、「活性化剤」または「モジュレーター」は、ＲＡＢ３８活性に関するインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して同定される、阻害分子または活性化分子をいう。インヒビターは、その活性を減少、阻止、防止、活性化の遅延、不活性化、脱感作、またはダウンレギュレートする化合物である。活性化剤は、ＲＡＢ３８活性を増加、開放、活性化、促進、活性化の増強、感作またはアップレギュレートする化合物である。インヒビターおよび活性化剤に対するこのようなアッセイとしては、例えば、細胞中にＲＡＢ３８ポリペプチドを発現させ、次いでＧＴＰａｓｅ活性を測定することが挙げられる。あるいは、内因性ＲＡＢ３８を発現する細胞がこのようなアッセイにおいて使用され得る。阻害の程度を調べるために、ＲＡＢ３８タンパク質を含むサンプルまたはアッセイを、潜在性の活性化剤またはインヒビターで処理し、そして、このインヒビターを含まないコントロールサンプルと比較する。コントロールサンプル（インヒビターで処理されない）に、１００％の相対ＲＡＢ３８活性値を割り当てる。ＲＡＢ３８活性の阻害は、コントロールに対するＲＡＢ３８活性値が約９０％、好ましくは５０％、より好ましくは２５〜０％である場合に、達成される。ＲＡＢ３８活性の活性化は、コントロールに対するＲＡＢ３８活性値が１１０％、より好ましくは１５０％、最も好ましくは少なくとも２００〜５００％より高いまたは１０００％以上である場合に達成される。
【００６４】
用語「イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」は、細胞内の標的に対して指向される細胞内に発現される抗体構築物（通常は、単鎖Ｆｖ抗体）をいう。Ｎａｍ，ＣＨら（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９３：３０１；ｄｅｒ  Ｍａｕｒｒ，ＡＡら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｎｏｖ  ２２；２７７（４７）：４５０７５；Ｃｏｈｅｎ，ＰＡ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７８：３６７。ｓｃＦｖ遺伝子は細胞内に移行され得、ここで、ｓｃＦｖタンパク質発現は、その標的（例えば、ＲＡＢ３８）の特性を調節し、時々、タンパク質機能を消失させ、表現型ノックアウトを生じ得る。実際、ｓｃＦｖイントラボディは、細胞質内に発現され、任意の細胞区画に指向され得、ここで、このｓｃＦｖイントラボディは細胞内タンパク質を標的化し、そして特定の生物学的効果を誘発し得る。従って、イントラボディは、タンパク質の活性を阻止または調節するための効果的な手段を提供する。
【００６５】
用語「リボザイム」は、触媒的に他のＲＮＡ分子を切断するＲＮＡ分子をいう。異なる種類のリボザイムが記載され、これらとしては、Ｉ群リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、ＲＮａｓｅＰおよびアクスヘッド（ａｘｈｅａｄ）リボザイムが挙げられる（例えば、Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏら（１９９４）Ａｄｖ．ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２５：２８９〜３１７（異なるリボザイムの特性の一般的な総説）を参照のこと）。
【００６６】
ヘアピンリボザイムの一般的な特徴が、例えば、Ｈａｍｐｅｌら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２９９〜３０４；欧州特許公開番号０  ３６０  ２５７；米国特許第５，２５４，６７８号に記載される。調製方法は、例えば以下に記載される：ＷＯ  ９４／２６８７７；Ｏｊｗａｎｇら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６３４０〜６３４４；Ｙａｍａｄａら（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：３９〜４５；Ｌｅａｖｉｔｔら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６９９〜７０３；Ｌｅａｖｉｔｔら（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：１１５１〜１２０；およびＹａｍａｄａら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０５：１２１〜１２６。
【００６７】
ＲＮＡとして発現される任意の細胞内遺伝子産物（ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質および構造ＲＮＡ自身が挙げられる）は、配列および構造の適切な領域を含むように操作されたリボザイムによる特異的な切断および不活性化に標的化され得る。代替的な基質（ＤＮＡ基質を含む）を切断する新規のリボザイムは、直接的な進化または、注意深く合理的な設計により、Ｉ群イントロンから操作された。
【００６８】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉機構の一部である低分子の干渉ＲＮＡ分子をいう。ＲＮＡ干渉は、配列特異的な様式で遺伝子発現を抑制する機構である。例えば、Ｂｒｕｍｅｌｋａｍｐら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ（２００２年３月２１日）；Ｓｈａｒｐ（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１３９〜１４１；およびＣａｔｈｅｗ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３：２４４〜２４８を参照のこと。哺乳動物細胞において、短い（例えば、２１ｎｔ）の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、ＲＮＡｉ応答を誘導するのに効果的であることが示されている。例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８を参照のこと。この機構を使用して、例えば、皮膚色素沈着を減らす目的でＲＡＢ３８機能を阻害すると同定された遺伝子の発現レベルをダウンレギュレートし得る。
【００６９】
用語「アンチセンス分子」、「ＲＡＢ３８に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」、または「ＲＡＢ３８アンチセンスオリゴヌクレオチド」は以下の配列を有するオリゴヌクレオチドである：（ｉ）ＲＡＢ３８ヌクレオチド配列の一部と安定な三重鎖を形成し得る配列、または（ｉｉ）ＲＡＢ３８のｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二重鎖を形成し得る配列。
【００７０】
アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物のレベルを低下させる有効な手段として出現している。この技術は、これらの「アンチセンス」配列が遺伝子または関連する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、安定な二本鎖または三本鎖を形成する（それぞれ、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ結合またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合に基づく）という知見に基づく。次いで、特異的に結合するアンチセンス化合物は、それぞれの標的を、酵素的分解、転写の阻止もしくはプロセッシングにより感受性にするかまたは、さもなくば標的ポリヌクレオチドの機能を阻止するかもしくは阻害するかのいずれかである。標的ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、アンチセンス分子は、特定のＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、正常なＲＮＡプロセッシング、安定性および翻訳を妨害し、それによって、標的とされた遺伝子の発現を妨げる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与、または、目的のｍＲＮＡに相補的な細胞内アンチセンス配列を産生し得る発現構築物の送達は、インビトロおよびインビボにおいて特定の遺伝子の翻訳を阻止することが示されている。例えば、ｃ−ｍｙｃに焦点を当てるＨｏｌｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８８，８，９６３〜９７３は、ヒト前骨髄球性白血病ＨＬ−６０細胞において、標的ｍＲＮＡとの細胞内二本鎖の形成およびｃ−ｍｙｃタンパク質の選択的な減少を見出た。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、結合されるヌクレオチドから形成されるポリヌクレオチドをいう。さらに、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在するオリゴヌクレオチド、または、生態系においてより安定であるか、もしくは標的配列により強固に結合するように、オリゴヌクレオチドに特定の特性を与えるように設計された、天然に存在するサブユニットもしくは類似のサブユニットから形成される合成オリゴヌクレオチドを含む。これはまた、オリゴヌクレオチドの改変（例えば、他の化合物にそれらを化学的に結合すること）もまた含み、この改変は、細胞への送達もしくは核および細胞の他の区画への送達を増強する。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、改変ヌクレオチド間結合を含み得、ヌクレアーゼに対する安定性を提供する。例えば、本発明は、ホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチドを含み得る。従って、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドの未改変オリゴマー、ならびに、１つ以上のプリン部分もしくはピリミジン部分、糖部分またはヌクレオチド間結合が化学的に改変されているオリゴマーを含む。
【００７２】
上記の一般性を限定することなく、本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然または改変のモノマーもしくは結合の直鎖状オリゴマー（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのα−アノマー形態、ポリアミド核酸などが挙げられる）であって、規則的なパターンのモノマー−モノマー相互作用（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の塩基対合、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対合など）により標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得るものを含む。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより結合され、少数のモノマー単位（例えば、３〜４）から数百のモノマー単位の範囲のサイズのオリゴヌクレオチドを形成する。ホスホジエステル結合のアナログとしては以下が挙げられる：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデートなど（より完全には、以下に記載する）。本明細書中で使用される場合、「ヌクレオシド」は、２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシル形態を含む天然のヌクレオシド（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載される）を含む。ヌクレオシドに関連する「アナログ」は、改変された塩基部分および／または改変された糖部分を有する合成ヌクレオシドを含む（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）に一般的に記載される）。このようなアナログとしては、結合特性（例えば、二本鎖または三本鎖の安定性、特異性など）を増強するように設計された合成ヌクレオシドが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、安定性を増大させ、細胞内および細胞外の分解を妨げるように改変されることが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、その標的配列への親和性ならびに薬学的に活性な形態で哺乳動物に送達される場合の適切な細胞および細胞区画への輸送を増加させるように改変されることがさらに好ましい。
【００７３】
標的ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本差の、ＲＡＢ３８ＤＮＡであってもＲＡＢ３８ＲＮＡであってもよい。しかし、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ標的が好ましい。本発明のＲＡＢ３８アンチセンスオリゴヌクレオチドが指向される標的としては、ＲＡＢ３８の対立遺伝子形態が挙げられることが理解できる。標的ポリヌクレオチド配列の知識がある場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドのために特定の配列を選択するための、文献中の相当なガイダンスが存在する。例えば、ＰｅｙｍａｎおよびＵｌｍａｎｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３−５８４、１９９０；Ｃｒｏｏｋｅ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３２：３２９−３７６  （１９９２）；ならびにＺａｍｅｃｎｉｋおよびＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７５：２８０−２８４（１９７４）。好ましくは、ＲＡＢ３８アンチセンス化合物の配列は、Ｇ−Ｃ含量が少なくとも６０％であるように選択される。好ましいプロトオンコジーンｍＲＮＡ標的としては、５’キャップ部位、ｔＲＮＡプライマー結合部位、開始コドン部位、ｍＲＮＡドナースプライス部位、およびｍＲＮＡアクセプタースプライス部位、（例えば、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄら、米国特許第４，８０６，４６３号）が挙げられる。
【００７４】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、モノマー−ヌクレオチド相互作用の規則的なパターン（例えば、ワソソン−クリック型の塩基対形成、フーグスチン型または逆フーグスチン型の塩基対形成、など）を介して、標的ポリペプチドに特異的に結合し得る任意の重合体化合物を含み得る。本発明のアンチセンス化合物はまた、ペンダント（ｐｅｎｄｅｎｔ）基またはペンダント部分を、ポリマーの基本的な繰り返し単位の一部として、またはポリマーの基本的な繰り返し単位とは別個のいずれかで、特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達、または効率に関連する他の特性を増強するために含み得る（例えば、コレステロール部分、アクリジンのような二重鎖インターカレーター、ポリ−Ｌ−リジン、ホスホロチオエートのようなヌクレアーゼ耐性結合基の１つ以上を有する「末端キャッピング」、など）。
【００７５】
例えば、増強された脂質溶解度および／または増強されたヌクレアーゼ消化に対する耐性は、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合中のリン酸酸素をアルキル基またはアルコキシ基に置換し、アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドまたはアルキルホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを形成することによって、増強されることが公知である。非イオン性オリゴヌクレオチド、例えば、ヌクレアーゼ加水分解に対する増加した耐性、および／または増加した細胞の取り込によって特徴付けられるが、相補的な核酸配列と安定な複合体を形成する能力を保持する。特に、アルキルホスホネートは、ヌクレアーゼ切断に対して安定であり、そして脂質に可溶性である。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドの調製は、Ｔｓｏら（米国特許第４，４６９，８６３号）に開示される。
【００７６】
好ましくは、ヌクレアーゼ耐性は、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオチド間結合を提供することによって、本発明のアンチセンスに化合物に与えられる。そのような結合の多くが、当該分野で公知である（例えば、ホスホロチオエート：ＺｏｎおよびＧｅｉｓｅｒ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、６：５３９−５６８（１９９１）；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎ、米国特許第５，１６６，３８７号；Ｂｅｒｇｏｔ、米国特許第５，１８３，８８５号；ホスホロジチオエート：Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９：１５６４−１５７０（１９９３）；ＣａｒｕｔｈｅｒｓおよびＮｉｅｌｓｅｎ、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０２２９３；ホスホロアミデート例えば、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＮＲｌＲ２）−Ｏ−であって、ＲｌおよびＲ２が水素またはＣｌ−Ｃ３アルキルである；Ｊａｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７：７２３７−７２４６（１９８８）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０３１３８；ペプチド核酸：Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、８：５３−６３（１９９３）、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１２２０；メチルホスホネート：Ｍｉｌｌｅｒら米国特許第４，５０７，４３３号、Ｔｓ’ｏら、米国特許第４，４６９，８６３号；Ｍｉｌｌｅｒら米国特許第４，７５７，０５５号；ならびに種々のタイプのＰ−キラル結合、特にホスホロチオエート、Ｓｔｅｃら、欧州特許出願５０６，２４２（１９９２）およびＬｅｓｎｉｋｏｗｓｋｉ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１：１２７−１５５（１９９３）。さらなるヌクレアーゼ結合としては、ホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、アルキルホスホトリエステル（例えば、メチル−およびエチル−ホスホトリエステル）、カーボネート（例えば、カルボキシメチルエステル）、カルバメート、モルホリノカルバメート、３’−チオホルムアセタール、シリル（例えば、例えば、ジアルキル（Ｃ１−Ｃ６）−またはジフェニルシリル、スルファメートエステルなどが挙げられる。これらをオリゴヌクレオチド内に導入する結合および方法は、多くの参考文献に記載される（例えば、一般的に、ＰｅｙｍａｎおよびＵｌｍａｎｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３−５８４（１９９０）；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３６：１９２３−１９３７（１９９３）；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６８５５において概説される）。
【００７７】
ヌクレアーゼ消化に対する耐性はまた、ヌクレオチド間結合を、Ｄａｇｌｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８、４７５１−４７５７（１９９０）の手順に従って、５’末端および３’末端の両方をホスホロアミダイトで改変することによって達成され得る。
【００７８】
好ましくは、ホスホジエステル結合の亜リン酸アナログを、本発明の化合物中で使用する（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダイト、またはメチルホスホネート）。より好ましくは、ホスホロチオエートを、ヌクレアーゼ耐性結合として使用する。
【００７９】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、酸素−イオウ置換（ｓｕｌｆｕｒ−ｆｏｒ−ｏｘｙｇｅｎ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合中に含む。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、二重鎖形成のための効率的なハイブリダイゼーション特性と、本質的なヌクレアーゼ耐性を兼ね備えながら、荷電したリン酸アナログの水溶性を保持する。荷電は、レセプターを介する細胞の取り込み特性に寄与すると考えられている（Ｌｏｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８６、３４７４−３４７８（１９８９））。
【００８０】
好ましい結合基に加えて、本発明の化合物は、さらなる改変を含み得ることが考えられる（例えば、ホウ素化塩基、Ｓｐｉｅｌｖｏｇｅｌら、米国特許第５，１３０，３０２号；コレステロール部分、Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：３７７７−３７８３（１９９０）またはＬｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８６：６５５３−６５５６（１９８９）；およびピリミジンの５−プロピニル改変、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、３３：５３０７−５３１０（１９９２）。
【００８１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の方法によって合成され得る。本発明において、オリゴヌクレオチドが合成化学の方法（例えば、アセトニトリル中で、テトラエチルチウラムジスルフィド（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｔｈｉｕｒａｍ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）を用いる硫黄化作用による、ホスホルアミダイト化学）によって調製されることが好ましい。例えば、ＶｕおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｉｎ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９１、３２、３０００５−３０００８を参照のこと。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、インビトロおよびインビボ転写系（例えば、Ｔ７ポリメラーゼまたは発現ベクターによる転写）を使用して合成され得る。インビトロまたはインビボ転写系を用いて合成されたオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の化学的方法を用いて改変され得る。そのような改変の例としては、リポソーム中へのカプセル化、またはステロイド、抗体、および細胞レセプターリガンドへの化学結合が挙げられる。
【００８２】
三重鎖が所望される実施形態においては、標的配列の選択における制約がある。一般に、フーグスチン型の結合を介して会合する３番目の鎖が、二重鎖標的中のホモピリミジン−ホモプリン部分の中で、最も安定である。通常、塩基トリプレットは、Ｔ−Ａ＊ＴまたはＣ−Ｇ＊Ｃモチーフ（「−」は、ワトソン−クリック対形成を示し、そして「＊」は、フーグスチン型結合を示す）を形成するが、他のモチーフも可能である。例えば、フーグスチン塩基対形成は、状態および鎖の組成に依存して、第３の鎖（フーグスチン鎖）と、その第３の鎖が結合する二重鎖のプリン−リッチ鎖との間で、平行および逆平行の方向を許容する。特定の実施形態において、三重鎖の安定性を最大化するか、またはそうでなければ調整するために、適切な配列、方向、状態、ヌクレオシドのタイプ（例えば、リボースヌクレオシドまたはデオキシリボースヌクレオシドが使用される場合）、塩基修飾（例えば、メチル化シトシンなど）を選択するために、文献において、広範な指針が存在する（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８：９３９７−９４０１（１９９１）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１４６３−１４６６（１９９２）；Ｄｉｓｔｅｆａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９０：１１７９−１１８３（１９９３）；Ｍｅｒｇｎｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：９７９１−９７９８（１９９２）；Ｃｈｅｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：４４６５−４４７４（１９９２）；ＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：２７７３−２７７６（１９９２）；ＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：４９７６−４９８２；Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９：８６３１−８６３５（１９９２）；ＭｏｓｅｒおよびＤｅｒｖａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：６４５−６５０（１９８７）；ＭｃＳｈａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：５７１２−５７２１（１９９２）；Ｙｏｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９：３８４０−３８４４（１９９２）；ならびにＢｌｕｍｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：１７７７−１７８４（１９９２））。
【００８３】
オリゴヌクレオチド部分の長さは、特異的な結合は、所望の標的ポリヌクレオチドにおいてのみ生じ、そして他の偶発的な部位においては生じないことを確実にするように、多くの参考文献（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０５３０５；またはＳｚｏｓｔａｋら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、６８：４１９−４２９（１９７９））において説明されるように、十分長い必要がある。長さの上限は、いくつかの因子（長いオリゴマーの合成および精製の不都合および費用；より短いオリゴヌクレオチドよりも、より長いオリゴヌクレオチドの場合の、ミスマッチに対する、より大きな耐性；結合または特異性を増強するための改変が存在するか否か；二重鎖または三重鎖が所望されるか否か、などが挙げられる）によって決定される。
【００８４】
オリゴヌクレオチドの長さは、５〜２００ヌクレオチドであることが好ましい。オリゴヌクレオチドは、１０〜５０ヌクレオチド長であることがより好ましい。オリゴヌクレオチドが１５〜２５ヌクレオチド長であることが最も好ましい。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、翻訳開始部位に特異的にハイブリダイズする。本発明の１つの好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ−３’（配列番号１）を有する。このオリゴヌクレオチドは、翻訳開始コドンで始まり、その下流に伸びる、ＲＡＢ３８  ｍＲＮＡの部分と相補的である。
【００８５】
一般に、本発明の実施において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの選択された部分に完全に相補的な配列を有する。しかし、完全な相補性は、必要とされない（特に、より長いオリゴマーにおいて）。従って、本明細書における、標的ポリヌクレオチドに「対して相補的なヌクレオチド配列」との言及は、標的部分に対して１００％完全な相補性を有する配列を、必ずしも意味しない。一般に、標的（例えば、ＲＡＢ３８  ｍＲＮＡ）と安定な二重鎖を形成するのに十分な相補性を有するオリゴヌクレオチド、すなわち、「ハイブリダイズ可能」なオリゴヌクレオチドが、適切である。安定な二重鎖の形成は、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの配列および長さ、ならびに標的ポリヌクレオチドとの相補性の程度に依存する。一般に、ハイブリダイズするオリゴマーがより長い場合、より多くのミスマッチに対して耐性である。当業者は、任意の所定のアンチセンスオリゴマーおよび標的配列との間において耐えられ得るミスマッチの程度を、生じる二重鎖の融点（従って、熱安定性）に基づいて、容易に決定し得る。
【００８６】
好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによって形成されたハイブリッドの熱安定性は、溶解（すなわち、鎖の解離）曲線によって決定される。鎖の５０％が解離する温度が、融点（Ｔｍ）と考えられ、その結果、安定性の便利な尺度を提供する。Ｔｍ測定は、典型的には、中性ｐＨにおいて、約１．０〜２．０μＭの標的オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を用いて、生理食塩水溶液中で行なわれる。典型的な条件は、以下のとおりである：１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）中、または１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．０）中での、１５０ｍＭ  ＮａＣＩおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２。溶解曲線のデータは、アンチセンスオリゴヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体のサンプルを、室温から約８５〜９０℃まで熱することによって、蓄積される。サンプルの温度が上昇するにつれて、２６０ｎｍ光の吸収が、１℃のインターバルでモニターされる（例えば、Ｃａｒｙ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）モデル１ＥまたはＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア）モデルＨＰ  ８４５９  ＵＶ／ＶＩＳスペクトロフォトメーター、および、モデルＨＰ  ８９１００Ａ温度コントローラー、または類似の機器を使用する）。そのような技術は、異なる長さおよび組成のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合強度を測定し、そして比較する便利な手段を提供する。
【００８７】
１つの実施形態に従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＡＢ３８遺伝子由来のメッセンジャーＲＮＡとハイブリダイズ可能なように設計される。そのようなハイブリダイゼーションは、達成された場合に、メッセンジャーＲＮＡの通常の役割を妨げ、細胞内でのその機能の改変を生じる。妨げられるメッセンジャーＲＮＡの機能としては、全ての必須の機能（例えば、ＲＮＡのタンパク質翻訳部位への移動、ＲＮＡからタンパク質への実際の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡ種を生じるＲＮＡスプライシング、および、可能性としては、ＲＮＡが関与する独立した触媒活性でさえも）、が挙げられる。そのようにＲＮＡの機能が妨げられることの全体としての効果は、ＲＡＢ３８遺伝子発現の調節である。ＲＡＢ３８の発現を調節することによって、メラノサイトの色素沈着は調節されるか、または阻害される。
【００８８】
本明細書において使用する場合、用語「核酸」、「核酸配列」、および「ヌクレオチド配列」とは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそのフラグメントまたは部分、ならびに一本鎖または二本鎖であり得る、センス鎖またはアンチセンス鎖の、ゲノム起源のまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡをいう。
【００８９】
本明細書において使用する場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」とは、各々が、「制限部位」という特定のヌクレオチド配列においてか、またはその特定のヌクレオチド配列近傍において二重鎖ＤＮＡを切断する、細菌酵素をいう。
【００９０】
本明細書において使用する場合、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成の規則によって関係付けられる、逆平行ポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関して使用される。例えば、配列５’ＡＧＴＴＣ−３’は、配列３’ＴＣＡＡＧ−５’に対して相補的である。
【００９１】
「増幅」は、核酸配列のさらなるコピーの生成として規定され、一般的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の当該分野で周知の技術を使用して実施される（例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ  ＮＹ［１９９５］）。本明細書中で使用される場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」（「ＰＣＲ」）は、クローニングまたは精製せずに、ゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加するためのＭｕｌｌｉｓ法をいう（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，９６５，１８８号（参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）。標的配列を増幅するためのこのプロセスは、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に２つの大過剰のオリゴヌクレオチドプライマーを導入する工程、続いて、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で熱サイクリングの正確な配列決定の工程からなる。この２つのプライマーは、二本鎖標的配列のこれらのそれぞれの鎖に相補的である。増幅を実施するために、混合物は、変性され、次いで、プライマーが、標的分子内のこれらの相補的配列にアニールされる。アニーリングの後、プライマーは、ポリメラーゼを用いて伸長され、相補鎖の新規対を形成する。変性の工程、プライマーアニーリングの工程、およびポリメラーゼ伸長（ＤＮＡ合成）の工程は、代表的に、多数回反復され（すなわち、変性、アニーリング、および伸長は、１つの「サイクル」を構成し；通常、多数の「サイクル」である）、高い濃度の所望の標的配列の増幅されたセグメントを得る。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、互いに関するプライマーの相対的位置によって決定され、従って、この長さは、制御可能なパラメーターである。プロセスの反復局面によって、本方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（本明細書中以後「ＰＣＲ」）といわれる。標的配列の所望の増幅セグメントが、混合物中で（濃度に関して）優先的な配列になるので、これらは、ＶＣＲ増幅されたといわれる。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、用語「ＰＣＲ産物」および「増幅産物」は、変性、アニーリングおよび伸長の２回以上のサイクルのＰＣＲ工程が、完了以後に、得られた化合物の混合物をいう。
【００９３】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、全て、共有ペプチド結合によって結合されるアミノ酸の一次配列をいう。一般的に、ペプチドは、数個のアミノ酸、代表的には、２〜２５個のアミノ酸からなり、タンパク質より短い。「ポリペプチド」は、ペプチドおよびタンパク質の両方を含む。
【００９４】
本明細書中で使用される場合、遺伝子に対する参照の場合、用語「部分」は、この遺伝子のフラグメントをいう。いくつかの実施形態において、フラグメントは、大きさが、１０個の核酸から全核酸配列マイナス１個の核酸の範囲にある。
【００９５】
本明細書中で使用される場合、用語「精製」または「精製する」は、サンプルから少なくとも１つの夾雑物を除去することをいう。本明細書中で使用される場合、用語「実質的に精製された」は、これらの天然環境から除去されるか、「単離される」か、または「分離される」、核酸配列またはアミノ酸配列のいずれかである分子をいい、大部分は、他の成分を含まない。
【００９６】
用語「遺伝子」は、天然または組換え様式のいずれかにおいてほぼ組み合わせる場合、いくつかの産物または機能を提供する部分から構成される核酸（例えば、ＤＮＡ）配列をいう。核酸のコード領域に加えて、用語「遺伝子」はまた、コード領域の５’末端および３’末端に隣接した全長ｍＲＮＡの転写されたヌクレオチド配列を含む。これらの非コード領域は、５’非翻訳配列および３’非翻訳配列（５’ＵＴおよび３’ＵＴ）という。５’ＵＴおよび３’ＵＴの両方は、調節的役割（翻訳開始、転写後切断およびポリアデニル化を含む）を提供し得る。好ましい実施形態において、哺乳動物「Ｒａｂ３８遺伝子」が提供される。
【００９７】
いくつかの実施形態において、遺伝子の「ゲノム」形態は、転写されたｍＲＮＡ配列および他の非コード配列を含む。「イントロン」または「介在配列」は、一次転写物に含まれる遺伝子のセグメント（すなわち、異核ＲＮＡ、すなわちｈｎＲＮＡ）であるが、これは、スプライス切断され、プロセスされたｍＲＮＡ形態を生じる。逆に、「エキソン」は、プロセスされたｍＲＮＡ配列に対応する遺伝子のセグメントである。
【００９８】
用語「作動可能な組み合わせにおける」および「作動可能に連結された」は、本明細書中で核酸に関して使用される場合、所定の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指向し得る核酸分子が生成されるような様式における核酸配列の結合をいう。本発明の好ましい実施形態において、プロモーターおよび／またはエンハンサーと「作動可能に組み合わされた」哺乳動物Ｒａｂ３８遺伝子が、提供される。
【００９９】
本明細書中で使用される、用語「ベクター」は、１つの細胞から別の細胞へＤＮＡセグメントを移送する核酸分子に関して使用される。いくつかの実施形態において、ベクター「骨格」は、その維持を媒介し、その意図される用途を可能にするベクターの部分（例えば、複製に必要な配列、薬物耐性または抗生物質耐性を付与する遺伝子、マルチプルクローニング部位、および、クローン化された核酸の発現を可能にするおそらく作動可能に連結されたプロモーター／エンハンサー）を含む。ベクターは、しばしば、プラスミド、バクテリオファージ、または植物ウイルスもしくは動物ウイルスに由来する。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、用語「野生型」は、天然に存在する供給源から単離された場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する、遺伝子または遺伝子産物をいう。野生型遺伝子は、集団中に最も頻繁に観察され、従って、遺伝子の「正常」形態または「野生型」形態と自由裁量で指定される。
【０１０１】
対照的に、用語「変異体」および「突然変異」は、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物に比べた場合の、配列特性および／または機能特性の改変（すなわち、変更された特性）を示す、遺伝子または遺伝子産物をいう。天然に存在する変異体は、単離され得、これらは、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物に比べた場合、変更された特性を有するという事実によって同定されるということが、留意される。いくつかの実施形態において、本発明は、変異型Ｒａｂ３８遺伝子またはＲＡＢ３８タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、チョコレートＲａｂ３８／ＲＡＢ３８変異体が、提供される。
【０１０２】
用語「候補因子」は、任意の組成物の任意の分子をいい、これとしては、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物、有機分子、無機分子、および／または生理学的応答または生物学的応答を生じ得ると疑われる分子の組み合わせが挙げられる。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、用語「調節する」は、ＲＡＢ３８の活性の変化をいう。例えば、調節は、酵素活性、結合特性、または任意の他のＲＡＢ３８の生物学的特性もしくは機能的特性を引き起こし得る。
【０１０４】
用語「メラノサイト」は、本明細書中で使用される場合、メラニン色素を合成する皮膚および眼中の特殊な細胞をいう。メラノサイトのクラスターは、皮膚上に母斑としてしばしば見られる。用語「メラノソーム」は、メラノサイトのメラニン産生細胞小器官をいう。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、用語「ＧＴＰａｓｅ活性」および「グアノシントリホスファターゼ活性」は、ＧＴＰを加水分解し、ＧＤＰおよび正リン酸塩を産生する酵素活性をいう。ＧＴＰａｓｅ活性は、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（活性化）によって、そしてグアニンヌクレオチド放出タンパク質（阻害）によって調節される。本発明の文脈において、ＧＴＰａｓｅ活性は、「ＲＡＢ３８活性」またはＲＡＢ３８のＧＴＰａｓｅ活性をいう。ＲＡＢ３８は、ＧＤＰに結合される場合、不活性であり、そしてＧＴＰに結合される場合、活性である。従って、用語「ＧＴＰ結合」は、ＧＴＰａｓｅ（例えば、ＲＡＢ３８）によるＧＴＰの結合をいい、その一方で、用語「ＧＤＰ放出」は、ＧＴＰａｓｅ（例えば、ＲＡＢ３８）によるＧＤＰの放出をいう。ＲＡＢファミリーのＧＴＰａｓｅは、小胞輸送のプロセスに関与する。本発明の背景において、用語「ＲＡＢ活性」は、メラノサイトのメラノソームに対する「ＲＡＢ３８輸送」またはＲＡＢ３８の輸送、およびメラノソームへの「ＴＹＲＰ１輸送」またはＴＹＲＰ１の輸送を包含する。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、用語「皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）貫通剤」は、角質層を通して表皮または真皮に、薬理学的に活性な化合物を輸送し得る薬剤をいい、その一方で、薬物貫通の皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）領域に制限される薬理学的効果を維持し、好ましくは、ほとんど全身吸収しないか、または全く全身吸収しない。
【０１０７】
皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）貫通剤の「貫通増強量」は、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）貫通剤なしでの貫通速度に比べて、角質層を通るＲＡＢ３８インヒビター貫通またはモジュレーター貫通を増強する量である。
【０１０８】
用語「薬学的に受容可能な局所処方物は、本明細書中で使用される場合、表皮に対して処方物を適用することによってＲＡＢ３８モジュレーターまたはインヒビターの局所投与について、薬学的に受容可能である任意の処方物を意味する。本発明に従って、「局所処方物」は、少なくとも１つのＲＡＢ３８モジュレーターまたはインヒビターを含み、そして、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）貫通剤もまた含み得る。局所処方物の選択は、いくつかの因子に依存し、これとしては、処置される皮膚条件、存在するｃおよび他の賦形剤、処方物中でのこれらの安定性、入手可能な製造装置、ならびに費用制限が挙げられる。
【０１０９】
（実験）
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および局面を示し、さらに例示するために提供され、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１１０】
以下の実験の開示において、以下の略語が適用される：℃（摂氏度）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地）；ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）；  Ｈ２Ｏ（水）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（塩基対）；ｋｂ（キロ塩基対）；ＥＳＴ（発現された配列タグ）；ｋＤ（キロダルトン）；ｇｍ（グラム）；μｇ（マイクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｎｇ（ナノグラム）；μｌ（マイクロリットル）；ｍｌ（ミリリットル）；ｍｍ（ミリメーター）；ｎｍ（ナノメーター）；μｍ（マイクロメーター）；Ｍ（モーラー）；ｍＭ（ミリモーラー）；μＭ（マイクロモーラー）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈｒ（時間）；ＣＯ２（二酸化炭素）；Ｃｙ３（インドカルボシアニン）；Ｃｙ５（インドジカルボシアニン）；（ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）；ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．２］）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；ＳＳＣ（生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液）；ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＲＴ（逆転写）；ｗ／ｖ（重量  対  体積）；ｖ／ｖ（体積  対  体積）；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；Ａｘｏｎ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）；ＮＥＢ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）；Ｒｏｃｈｅ（Ｒｏｃｈｅ，ＭａｎｎＨｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；およびＳｉｇｎｅｔ（Ｓｉｇｎｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）。
【実施例】
【０１１１】
（実施例１）
（細胞培養）
マイクロアレイ分析についての全ての細胞を、５％  ＣＯ２中３７℃で９０％コンフルエンスまで増殖させた。これらの実験で使用される細胞株を、Ｊｅｆｆｒｙ  Ｔｒｅｎｔ（ＮＩＨ）から得た。黒色腫細胞株を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ならびに各１００単位／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地中で増殖させた。ＭｎＳＯＤ６  ｃｌ１に対する培地は、５００μｇ／ｍｌゲネチシンもまた含んだ。２９３Ｔ細胞、Ｕ１３８細胞およびＨｅＬａ細胞を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ならびに各１００単位／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地中で増殖させた。一次マウスメラノサイトを、以前に記載されるように培養した（Ｗｕら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４：１０９１−１１００［２００１］）。Ｍｅｌａｎ−ａ細胞を、５％ＣＯ２中で、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、各１００単位／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシン、２００ｎｍ  １２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール  １３−酢酸、０．０１ｍＭ  重炭酸ナトリウムならびに０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
【０１１２】
（実施例２：ＲＮＡ調製）
マイクロアレイ分析のための細胞を、掻き取ることによって収集した、４つの５００ｃｍ２ディッシュのプールの状態で入手し、ＰＢＳ中で洗浄し、そしてペレット化した。ペレットを１０ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で溶解した。２ｍｌのクロロホルムを添加し、サンプルを振盪し、次いで遠心分離して、相を分離した。水層を取り出し、そして等しい容積の７５％エタノールを、攪拌しながら滴下した。サンプルをＲＮｅａｓｙ  ｍａｘｉカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に適用し、そして製造業者の精製プロトコルに従った。サンプルを水中で溶出し、３Ｍ酢酸ナトリウムで沈澱させ、そして−８０℃で保存した。ＲＮＡペレットをＤＥＰＣ水中に１μｇ／ｐｌ濃度になるように再懸濁し、そしてＭｉｃｒｏｃｏｎ  １００カラムに適用した。ＲＮＡサンプルを遠心分離し、そして７  １０μｇ／μｌになるように濃縮した。
【０１１３】
（実施例３：標識およびハイブリダイゼーション）
ＲＮＡを逆転写して蛍光標識したｃＤＮＡを得て、実験／参照対で、スライド上に共ハイブリダイズさせた。発現配列タグ（ＥＳＴ）クローンの挿入物を調製し、そして（ＤｅＲｉｓｉら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １４：４５７−４６０［１９９６］）に記載される通りにスライドに適用した。逆転写した（ＲＴ）蛍光色素標識したｃＤＮＡを、当該分野で公知の通りに生成した（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｉｔｉａｔｉｖｅのＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔのウェブサイトを参照のこと）。反応のために、６０μｇの総ＲＮＡ（Ｃｙ３）または１２０μｇの総ＲＮＡ（Ｃｙ５）を用いた。ハイブリダイゼーションを、加湿チャンバ中で１６時間、４０μｌの最終容積で、６５℃にて実施した。スライドを室温にて、０．５×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で３分間洗浄し、続いて０．６×ＳＳＣ中で３分間、２回目の洗浄を行った。スライドを、遠心分離によって直ちにスピン乾燥した。
【０１１４】
（実施例４：画像の獲得および分析）
Ｃｙ３蛍光色素（５３２λ）およびＣｙ５蛍光色素（６３５λ）についての蛍光シグナルの強度を、Ｇｅｎｅｐｉｘ  ４０００ａスキャナー（Ａｘｏｎ）を１０μＭの分解能で用いて得た。８８個のハウスキーピングコントロール遺伝子のセットを用いて、標識効率を正規化した（Ｌｏｆｔｕｓら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：９２７７−９２８０［１９９９］）。発現プロファイル分析を、平均連結法およびＰｅｒｓｏｎの相関類似性測定を用いるクラスター化アルゴリズム（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｉｔｉａｔｉｖｅのＧｅｎｏｍｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇのウェブサイトを参照のこと）を用いて行った。
【０１１５】
（実施例５：マウスＲａｂ３８遺伝子の組織化）
マウスＲａｂ３８遺伝子の変異スクリーニングを促進するために、データベース検索を用いて、Ｒａｂ３８コード配列に隣接するゲノムＤＮＡを同定した。Ｒａｂ３８  ｍＲＮＡ配列（配列番号９およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ０６２２３７）を、マウスゲノム配列決定トレースアーカイブ（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを、トレースアーカイブクエリー（Ｔｒａｃｅ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｑｕｅｒｙｉｎｇ）について参照のこと）に対してＢＬＡＳＴした。有意な類似性を、２００よりも大きな、戻ってきたＢＬＡＳＴスコアによって決定した。適切なデータをダウンロードし、そしてＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒバージョン３．１．１（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ）を用いてこのｍＲＮＡ配列に対してアライメントした。ゲノムの組織化を、Ｓｐｉｄｅｙプログラム（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトをＳｐｉｄｅｙについて参照のこと）を用いることによって確認した。遺伝子の組織化をまた、ゲノムフラグメントのＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって実験的に確認した。この分析は、Ｒａｂ３８が以下の３つのエキソンから構成されることを明らかにした：エキソン１、ヌクレオチド１〜２９２；エキソン２、ヌクレオチド２９２〜５７２；およびエキソン３、ヌクレオチド５７３〜１４３９（ヌクレオチド位置は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ０６２２３７をいう）。確認されたエキソン配列および周囲のイントロン配列を、ＧｅｎＢａｎｋに、以下の通りに寄託した：エキソン１、ＡＦ４４８４４１（配列番号１０）；エキソン２、ＡＦ４４８４４２（配列番号１１）；およびエキソン３、ＡＦ４４８４４３（配列番号１２）。
【０１１６】
（実施例６：インサイチュハイブリダイゼーション）
時間を合わせた交配を用いて、種々の段階のＦＶＢＩＮＪ（Ｊａｃｋｓｏｎ）マウス胚を得て、そしてＥＯ．５を、膣栓形成日の正午と称した。胚をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定した。ジゴキシゲニン結合体化プローブを、ＲＴ結合部位リンカー（Ｒｏｃｈｅ）を用いた、直鎖化プラスミドおよび／またはＰＣＲ産物の逆転写（ＲＴ）によって合成した。以下のＤＮＡ源を、プローブ合成のために用いた：チロシナーゼ、ｃＤＮＡクローン４６３３４０２００７；Ｔｙｒｐ１、Ｂ１６細胞株総ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ（ＴＹＲＰ１５’Ｔ３Ｆ  ５’−ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＡ  ＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡ  ＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡ  ＧＣＡＣＣＣＣＴＧＴ  ＣＴＴＣＴ  ３’、配列番号１３；ＴＹＲＰ１５’Ｔ７Ｒ  ５’−ＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ  ＴＡＧＧＧＣＣＣＡＧ  ＴＴＧＣＡＡＡＡＴＴ  ＣＣＡＧＴ−３’、配列番号１４）；Ｄｃｔ、ｃＤＮＡ；ＡｉｍＬ／Ｍａｔｐ、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡクローンＧ３７００４５Ｌ２２；Ｍｌｓｎｌ、Ｂ１６細胞株総ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ（ＭＬＳＮ  Ｒ  Ｔ７  ５’ＧＣＧＧＧＴＡＡＴＡ  ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ  ＴＡＧＧＧＧＣＣＡＣ  ＡＡＡＣＡＴＧＴＣＣ  ＴＡＣＴＴＡＣ−３’、配列番号１５；ＭＬＳＮ  ＦＴ３  ５’ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＡ  ＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡ  ＡＡＧＧＧＡＡＧＣＴ  ＴＣＣＧＧＡＣＴＣＴ  ＣＴＡＣ  ３’、配列番号１６）；Ｒａｂ３８，Ｒｉｋｅｎ  ｃＤＮＡクローン２３  １００１１  Ｆ１４。インサイチュハイブリダイゼーションを、以下の改変を行った、公開されたプロトコル（ＷｉｌｋｉｎｓｏｎおよびＮｉｅｔｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２２５：３６１−３７３［１９９３］）を用いて行った。プローブのハイブリダイゼーション後、リボヌクレアーゼＡ消化を省略し、ＴＢＳをＰＢＳの代わりに用い、そして基質ＢＭ−パープル（Ｒｏｃｈｅ）を５−ブロモ−４クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムの代わりに用いた。
【０１１７】
（実施例７：変異検出）
マウスＲａｂ３８遺伝子ホモログを、エキソン含有ゲノムセグメントのＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定によって、変異についてスクリーニングした。以下のプライマー対を設計して、３つのタンパク質コードエキソンならびに少量の隣接イントロンＤＮＡを増幅した：４２８ｂｐの産物を生じる、Ｒａｂ３８  Ｅｘ１Ｆ  ５’−ＴＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＴＡＡＡＣＣＣ  Ｇ  ３’（配列番号１７）およびＲａｂ３８  Ｅｘ  １Ｒ  ５’ＧＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＣＴＣ  Ｃ  ３’（配列番号１８）；４６４ｂｐの産物を生じる、Ｒａｂ３８  Ｅｘ２Ｆ  ５’−ＧＧＡＴＡＴＧＡＡＧＣＴＣＣＡＧＴＧＴＡ  ＧＴＧＴＡＣ  ３’（配列番号１９）およびＲａｂ３８  Ｅｘ２Ｒ  ５’ＣＡＣＴＧＧＡＣＡＧ  ＡＡＡＣＡＴＴＡＴＴ  ＧＴＣＡＣ  ３’（配列番号２０）；ならびに５２６ｂｐの産物を生じる、Ｒａｂ３８  Ｅｘ３Ｆ  ５’−ＡＡＧＴＴＡＴＣＡＧ  ＣＣＡＧＴＧＡＧＡＴ  ＡＣＴＧＴＧ  ３’（配列番号２１）およびＲａｂ３８  Ｅｘ３Ｒ  ５’−ＣＡＣＡＴＧＴＧＧＴ  ＡＴＡＴＣＴＡＴＣＣ  ＴＧＡＣＧ  ３’（配列番号２２）。ＰＣＲ反応物は、１．５μＭの各プライマー、０．２μＭ  ｄＮＴＰ、１．５ｐＭ  ＭｇＣｌ２、１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１×の製造業者の１０×緩衝液、および４０ｎｇのマウスゲノムＤＮＡを含んでいた。サーマルサイクリングは、９３℃にて２分間の最初の変性、続いて９３℃にて１０秒間、５５℃にて５秒間および７２℃にて３０秒間を４０サイクルからなっていた。７２℃での最終伸長を、７分間行った。１％アガロースゲルでの分離後、ＰＣＲ産物を切り出し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＤＮＡ配列決定を、ＢｉｇＤｙｅターミネーター化学およびモデル３１００  ＤＮＡ配列決定機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。サイクル配列決定ルーチンは、８μＬのＢｉｇＤｙｅカクテル、０．５μＬの２５［ｔＭプライマー溶液、６．５μＬの水、および５μＬのＰＣＲ産物（約５０ｎｇ／μＬにて）を含む２０μＬ反応物を用いて、９２℃を２０秒間、５５℃を１０秒間、および６０℃を４分間の３０サイクルであった。データを抽出し、そしてＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓバージョン３．３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析し、そしてＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアバージョン３．１．１（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ）を用いてアライメントした。アライメントは、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスおよびヘテロ接合性ｃｈｔ／＋マウス、ならびにマウスＲａｂ３８  ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ０６２２３７）に由来する配列データを含んでいた。
【０１１８】
（実施例８：変異の確認および遺伝子型分類）
プライマー（ｃｈｔ  Ｅｘ１Ｆ  ５’−ＧＧＣＣＴＣＣＡＧＧ  ＡＴＧＣＡＧＡＣＡＣ  Ｃ  ３’、配列番号２３；ｃｈｔ  Ｅｘ１Ｒ  ５’ＣＣＡＧＣＡＡＴＧＴ  ＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧ  Ｃ  ３’、配列番号２４）を、Ｇ１４６Ｔ配列の変化の周囲の２１３ｂｐのフラグメントを増幅するように設計した。ＰＣＲ増幅を、実施例７に記載の通りに行った。ＳｅｘＡＩ制限消化およびＢｓａＪＩ制限消化を、１０μＬのＰＣＲ産物を含む２０［ｔＬの制限酵素消化物、１×の供給されたＢＳＡを伴う２．５単位の酵素（ＮＥＢ）および消化緩衝液を用いて行った。反応物を、製造業者の示唆する温度にて一晩インキュベートし、そして２％アガロースゲルにて電気泳動して、バンドパターンを可視化した。
【０１１９】
（実施例９：細胞のトランスフェクション）
ＧＦＰ−ＲＡＢ３８構築物を、ａｔｔ部位リンカープライマー（ＡｔｔＢ１−ＲＲａｂ  ５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴ  ＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡ  ＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣ  ＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡ  ＣＣＴＣＡＣＡＡＧ−’、配列番号２５およびＡｔｔＢ２−ＲＲａｂ−ＳＴＰ  ５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴ  ＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡ  ＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴ  ＣＴＡＧＧＡＴＴＴＧ  ＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧ  Ａ  ３’、配列番号２６）を用いるマウスＲａｂ３８を増幅するＰＣＲによって作製し、そして製造業者の指示に従ってｐＤｅｓｔ  ５３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと「Ｇａｔｅｗａｙ」クローニングした。ＧＦＰ−ＲＡＢ３８を、製造業者の指示に従って４ｃｍ２表面積において１．６ｇ／４μｌのＤＮＡ／ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００比で用いたＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｍｅｌａｎ−ａ細胞にトランスフェクトした。７２時間後、細胞を固定し、そして１：２００希釈のＴＹＲＰ１反応性抗体ＭＥＬ５（Ｓｉｇｎｅｔ）を以前（Ｗｕら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１０：８４７−８５９［１９９７］）に記載された通りに用いて染色した。
【０１２０】
（実施例１０：出血時間）
出血時間を、４つのＣ５７Ｂｌ／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔおよび４つのＣ５７Ｂｌ／６Ｊ動物において、当該分野で記載された（Ｓｖｉｄｅｒｓｋａｙａら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４８：３８１−３９０［１９９８］）通りにアッセイした。アッセイしたマウスは、６〜１２週齢であった。２ｍｍの部分の尾を除去し、そして切断した尾を直ちに３７℃の生理食塩水中に浸漬した。各マウスを、拘束機において水平位置に維持し、尾の先端を、身体の４〜５ｃｍ下に保持した。出血時間は、小さな血液流が急に停止するのに必要とされる時間であった。
【０１２１】
上記の明細書において言及した全ての刊行物および特許は、本明細書中に参考として援用される。本発明の記載される方法および系の種々の改変物およびバリエーションは、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して記載してきたが、本願発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されないべきであることを理解すべきである。実際、当該分野および／または関連する分野の当業者に明らかである、記載される発明の実施形態の種々の改変は、本発明の範囲内にあることが意図される。製造業者の指示による通りのｐＤｅｓｔ  ５３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＧＦＰ  ＲＡＢ３８を、製造業者の指示に従って４ｃｍ２表面積において１．６ｇ／４μｌのＤＮＡ／ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００比で用いたＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｍｅｌａｎ  ａ細胞中にトランスフェクトした。７２時間後、細胞を固定し、そしてＴＹＲＰ１反応性抗体ＭＥＬＳ（Ｓｉｇｎｅｔ）の１：２００希釈物で以前に記載（Ｗｕら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１０：８４７−８５９［１９９７］）された通りに染色した。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１は、様々な色素沈着制御遺伝子およびＲａｂ３８のマイクロアレイ発現プロフィールを示す。クラスター分析は、色素沈着に関することが公知の９つの遺伝子を同定した。示した遺伝子Ｒａｂ３８（矢印）に相当する右リストのマウスおよびヒト色素沈着障害へのカラムは、色素沈着に関することが公知の９つ制御遺伝子として同じ発現プロフィールクラスター内で見出された。ハイブリダイズされたサンプル細胞株は、発現プロフィールの頂点にわたってリストされる。相対的遺伝子発現は、較正された比率として評価される（サンプル細胞ライン／ＭｎＳＯＤ６ｃ１１参照）。比率値についての偽色（ｐｓｅｕｄｏｃｏｌｏｒ）スケールは、以下に示される。
【図２】図２は、公知のメラニン形成酵素のように、ＲＡＢ３８は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）中で発現される。全てのパネルは、胚日数Ｅ１１．５に眼を示す。この発生段階のＲＰＥ中で発現されたメラニン形成酵素は、チロシナーゼ（Ｔｙｒ；パネルＡ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（Ｔｙｒｐ１；パネルＢ）、およびドパクロムタウタメラーゼ（ＤＣＴ／ＴＴｙｒｐ２；パネルＣ）を含む。ＲＰＥ中で発現されるマイクロアレイクラスターデータからのさらなる制御遺伝子は、メラスタチン（ｍｅｌａｓｔａｔｉｎｌ）（Ｍｌｓｎ；パネルＤ）およびＡｉｍｌ／Ｍａｔｐ（パネルＥ）を含む。Ｒａｂ３８は、Ｅ１１．５（パネルＦ）およびＥ１０．５およびＥ１２．５のＲＰＥ中で発現される。スケールバールは、１００ｐｍに等しい。
【図３】図３は、Ｒａｂ３８マップ位置およびチョコレート（ｃｈｔ／ｃｈｔ）マウスの表現型を示す。パネルＡは、ヒトＲａｂ３８が、チロシナーゼに遠位の１．４ＭｂおよびＥＥＤ遺伝子に近位の２．５ｃＭをマップすることを示すヒト第１１染色体のマップを提供する。相当するマウス第７染色体において、シンテニー領域遺伝子順序は、保存される（例えば、ｃｈｔ座は、Ｒａｂ３８と同じ間隔にマップする）。パネルＢは、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ＋／＋（左側、黒）およびＣ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔ（右側、茶色）マウスのフォトグラフを提供する。パネルＤは、Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔマウスからの眼が、非常に少ない色素沈着を生じることを示す一方で、パネルＣは、通常の色素沈着を有する２日齢の野生型Ｃ５７Ｂ１６／Ｊ＋／＋マウスからの眼を示す。
【図４】図４は、Ｒａｂ３８変異体が、ｃｈｏｃｏｌａｔｅ（ｃｈｔ）マウス表現型を引き起こすことを示す。パネルＡは、野生型Ｃ５７Ｂ１６／Ｊ＋／＋ＤＮＡ（配列番号１）とｃｈｔ対立遺伝子中でＧ１４６Ｔヌクレオチド変化（矢印）を示す、変異体Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／＋ＤＮＡ（配列番号２）との間のＲａｂ３８配列の比較を提供する。このヌクレオチド変化は、分析された８個のさらなる近交系統中で決して見られなかった。パネルＢは、Ｇ１４６Ｔ変異が、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔＤＮＡ中でＳｅｘＡ１制限酵素部位を生成することおよび野生型Ｒａｂ３８配列中に存在するＢｓａＪＩ制限部位を除去することを示す。Ｇ１４６Ｔヌクレオチド変異を取り囲む領域によるＡ２１６は、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ＋／＋ＤＮＡおよびＣ５７Ｂ１６／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔＤＮＡの両方から増幅された。ＳｅｘＡ１は、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔのＰＣＲフラグメントを消化する（レーン１）が、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ＋／＋を消化しない（レーン２）；ＢｓａＪ１は、Ｃ５７Ｂ１６／Ｊ＋／＋のＰＣＲフラグメントを消化する（レーン４）が、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔを消化しない（レーン３）。
【図５】図５は、ＲＡＢ３８  Ｇ１９が、ＧＴＰ結合ポケット中に位置することを示す。パネルＡは、ＲＡＢ３ａについての結晶構造（ＭＭＤＢ  １０１２５；およびＤｕｍａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  ７：４１３〜４２３［１９９９］）に基づく分子モデリングデータベース（ＭＭＤＢ；Ｗａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：２４３〜２４５［２０００］）を用いて決定されるような、ヌクレオチド結合部位に関するＲＡＢ３８のアミノ酸Ｇ１９の３次元位置を提供する。ＲＡＢ３８配列をＲＡＢ３ａの配列と重ねることで、ＲＡＢ３ａのアミノ酸Ｓ３２がＲＡＢ３８のＧ１９に相当すると同定された。プログラムＣｎ３Ｄ  ３．０を用いて、結合したヌクレオチドとの相互作用を予測する、ＲＡＢ３８  Ｇ１９（白色）の位置を示した。タンパク質構造が、色により示される：緑色、α−へリックス；金色、βシート；青色、ランダムコイル；白色、ヌクレオチド結合部位に位置するＲＡＢ３８  Ｇ１９に相当するＲＡＢ３ａ  Ｓ３２の部位；灰色、Ｍｇ＋＋イオン；灰赤色、ＧｐｐＮＨｐヌクレオチドアナログ。パネルＢは、ヒトＲＡＢ３８（ＮＰ＿０７１７３２；および配列番号３）アミノ酸配列、ラットＲＡＢ３８（ＡＡＡ４２０００；および配列番号４）アミノ酸配列、およびマウスＲＡＢ３８（ＡＫ００９２９６．１；および配列番号５）アミノ酸配列；ならびにヒトＲＡＢ３ａ（Ｐ２０３３６；および配列番号６）アミノ酸配列、ヒトＲＡＢＳ（Ｆ３４３２３；および配列番号７）アミノ酸配列およびヒトＮ  ＲＡＳ（ＴＶＨＵＲＡ；および配列番号８）アミノ酸配列を含む高度に保存されたＮ末端領域のアラインメントを提供する。配列のアラインメントが、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ６：４５４〜４６２［１９９６］）を用いて行われた。棒は、ＲＡＢ３ａのＸ線結晶構造（ＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒおよびＢｒｕｎｇｅｒ、Ｃｅｌｌ  ９６：３６３〜３７４［１９９９］）で観察された、ヌクレオチド結合ポケットを占める高度に保存された領域を示す。黒色が配列同一性を示し、灰色が配列保護を示し、赤色がチョコレートマウスにおいて変異される保存されたアミノ酸を示す。
【図６】図６は、ｃｈｔ／ｃｈｔメラノソームが、Ｔｙｒｐｌｂメラノソームと形態において類似であることを例示する。パネルＡにおけるＣ５７Ｂ１６／Ｊ＋／＋マウスおよびパネルＢにおけるＣ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔマウスから単離される最初に培養されたメラノサイトの周辺部からのメラノソームの明視野画像を示す。野生型メラノサイトからのメラノソームは卵形で暗く色素沈着しており、一方Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔメラノサイトからのメラノソームは、Ｔｙｒｐｌｂ／Ｔｙｒｐｌｂ、ｍｅｌａｎ  ｂ細胞からのメラノソームに似ており、より小さく、より円形で、あまり色素沈着していない。目盛り棒は、２μｍに等しい。
【図７】図７は、ＲＡＢ３８が、適切なＴＹＲＰ１輸送のために必要なメラノソームタンパク質であることを示す。最初のメラノサイト培養物の周辺部におけるメラノソームの同一の露出部の明視野画像および一致した共焦点画像が、それぞれ上部および下部のパネルに提供される。パネルＡおよびパネルＢは、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  ＋／＋メラノソームの画像を提供し、パネルＣおよびパネルＤは、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔメラノソームの画像を提供し、そしてパネルＥおよびパネルＦは、ＧＦＰ  ＲＡＢ３８発現構築物でトランスフェクトされたｍｅｌａｎ−ａ細胞からのメラノソームの画像を提供する。ＴＹＲＰ１分布が、パネルＢおよびＤにおけるＭＥＬ５染色により明らかになり、一方パネルＦに示されるＧＦＰ  ＲＡＢ３８免疫蛍光は、ＧＦＰ  ＲＡＢ３８シグナルが、高度に染色された最終段階メラノソームと共通に局在することを実証する。パネルＡおよびＤについての目盛り棒は、１．６μＭに等しく、一方パネルＥおよびＦについての目盛り棒は、２．４μＭに等しい。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年7月23日(2004.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
オリゴヌクレオチドの長さは、５〜２００ヌクレオチドであることが好ましい。オリゴヌクレオチドは、１０〜５０ヌクレオチド長であることがより好ましい。オリゴヌクレオチドが１５〜２５ヌクレオチド長であることが最も好ましい。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、翻訳開始部位に特異的にハイブリダイズする。本発明の１つの好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ−３’（配列番号２７）を有する。このオリゴヌクレオチドは、翻訳開始コドンで始まり、その下流に伸びる、ＲＡＢ３８  ｍＲＮＡの部分と相補的である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
用語「遺伝子」は、天然または組換え様式のいずれかにおいてほぼ組み合わせる場合、いくつかの産物または機能を提供する部分から構成される核酸（例えば、ＤＮＡ）配列をいう。核酸のコード領域に加えて、用語「遺伝子」はまた、コード領域の５’末端および３’末端に隣接した全長ｍＲＮＡの転写されたヌクレオチド配列を含む。これらの非コード領域は、５’非翻訳配列および３’非翻訳配列（５’ＵＴおよび３’ＵＴ）という。５’ＵＴおよび３’ＵＴの両方は、調節的役割（翻訳開始、転写後切断およびポリアデニル化を含む）を提供し得る。好ましい実施形態において、哺乳動物「Ｒａｂ３８遺伝子」が提供される（例えば、配列番号９または配列番号２８）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
（実施例９：細胞のトランスフェクション）
ＧＦＰ−ＲＡＢ３８構築物を、ａｔｔ部位リンカープライマー（ＡｔｔＢ１−ＲＲａｂ  ５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴ  ＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡ  ＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣ  ＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡ  ＣＣＴＣＡＣＡＡＧ−３’、配列番号２５およびＡｔｔＢ２−ＲＲａｂ−ＳＴＰ  ５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴ  ＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡ  ＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴ  ＣＴＡＧＧＡＴＴＴＧ  ＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧ  Ａ  ３’、配列番号２６）を用いるマウスＲａｂ３８を増幅するＰＣＲによって作製し、そして製造業者の指示に従ってｐＤｅｓｔ  ５３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと「Ｇａｔｅｗａｙ」クローニングした。ＧＦＰ−ＲＡＢ３８を、製造業者の指示に従って４ｃｍ２表面積において１．６ｇ／４μｌのＤＮＡ／ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００比で用いたＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｍｅｌａｎ−ａ細胞にトランスフェクトした。７２時間後、細胞を固定し、そして１：２００希釈のＴＹＲＰ１反応性抗体ＭＥＬ５（Ｓｉｇｎｅｔ）を以前（Ｗｕら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１０：８４７−８５９［１９９７］）に記載された通りに用いて染色した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
【図１】図１は、様々な色素沈着制御遺伝子およびＲａｂ３８のマイクロアレイ発現プロフィールを示す。クラスター分析は、色素沈着に関することが公知の９つの遺伝子を同定した。示した遺伝子Ｒａｂ３８（矢印）に相当する右リストのマウスおよびヒト色素沈着障害へのカラムは、色素沈着に関することが公知の９つ制御遺伝子として同じ発現プロフィールクラスター内で見出された。ハイブリダイズされたサンプル細胞株は、発現プロフィールの頂点にわたってリストされる。相対的遺伝子発現は、較正された比率として評価される（サンプル細胞ライン／ＭｎＳＯＤ６ｃ１１参照）。比率値についての偽色（ｐｓｅｕｄｏｃｏｌｏｒ）スケールは、以下に示される。
【図２】図２は、公知のメラニン形成酵素のように、ＲＡＢ３８は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）中で発現される。全てのパネルは、胚日数Ｅ１１．５に眼を示す。この発生段階のＲＰＥ中で発現されたメラニン形成酵素は、チロシナーゼ（Ｔｙｒ；パネルＡ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（Ｔｙｒｐ１；パネルＢ）、およびドパクロムタウタメラーゼ（ＤＣＴ／ＴＴｙｒｐ２；パネルＣ）を含む。ＲＰＥ中で発現されるマイクロアレイクラスターデータからのさらなる制御遺伝子は、メラスタチン（ｍｅｌａｓｔａｔｉｎｌ）（Ｍｌｓｎ；パネルＤ）およびＡｉｍｌ／Ｍａｔｐ（パネルＥ）を含む。Ｒａｂ３８は、Ｅ１１．５（パネルＦ）およびＥ１０．５およびＥ１２．５のＲＰＥ中で発現される。スケールバールは、１００ｐｍに等しい。
【図３】図３は、Ｒａｂ３８マップ位置およびチョコレート（ｃｈｔ／ｃｈｔ）マウスの表現型を示す。パネルＡは、ヒトＲａｂ３８が、チロシナーゼに遠位の１．４ＭｂおよびＥＥＤ遺伝子に近位の２．５ｃＭをマップすることを示すヒト第１１染色体のマップを提供する。相当するマウス第７染色体において、シンテニー領域遺伝子順序は、保存される（例えば、ｃｈｔ座は、Ｒａｂ３８と同じ間隔にマップする）。パネルＢは、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ＋／＋（左側、黒）およびＣ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔ（右側、茶色）マウスのフォトグラフを提供する。パネルＤは、Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔマウスからの眼が、非常に少ない色素沈着を生じることを示す一方で、パネルＣは、通常の色素沈着を有する２日齢の野生型Ｃ５７Ｂ１６／Ｊ＋／＋マウスからの眼を示す。
【図４】図４は、Ｒａｂ３８変異体が、ｃｈｏｃｏｌａｔｅ（ｃｈｔ）マウス表現型を引き起こすことを示す。パネルＡは、野生型Ｃ５７Ｂ１６／Ｊ＋／＋ＤＮＡ（配列番号１）とｃｈｔ対立遺伝子中でＧ１４６Ｔヌクレオチド変化（矢印）を示す、変異体Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／＋ＤＮＡ（配列番号２）との間のＲａｂ３８配列の比較を提供する。このヌクレオチド変化は、分析された８個のさらなる近交系統中で決して見られなかった。パネルＢは、Ｇ１４６Ｔ変異が、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔＤＮＡ中でＳｅｘＡ１制限酵素部位を生成することおよび野生型Ｒａｂ３８配列中に存在するＢｓａＪＩ制限部位を除去することを示す。Ｇ１４６Ｔヌクレオチド変異を取り囲む領域によるＡ２１６は、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ＋／＋ＤＮＡおよびＣ５７Ｂ１６／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔＤＮＡの両方から増幅された。ＳｅｘＡ１は、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔのＰＣＲフラグメントを消化する（レーン１）が、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ＋／＋を消化しない（レーン２）；ＢｓａＪ１は、Ｃ５７Ｂ１６／Ｊ＋／＋のＰＣＲフラグメントを消化する（レーン４）が、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔを消化しない（レーン３）。
【図５】図５は、ＲＡＢ３８  Ｇ１９が、ＧＴＰ結合ポケット中に位置することを示す。パネルＡは、ＲＡＢ３ａについての結晶構造（ＭＭＤＢ  １０１２５；およびＤｕｍａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  ７：４１３〜４２３［１９９９］）に基づく分子モデリングデータベース（ＭＭＤＢ；Ｗａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：２４３〜２４５［２０００］）を用いて決定されるような、ヌクレオチド結合部位に関するＲＡＢ３８のアミノ酸Ｇ１９の３次元位置を提供する。ＲＡＢ３８配列をＲＡＢ３ａの配列と重ねることで、ＲＡＢ３ａのアミノ酸Ｓ３２がＲＡＢ３８のＧ１９に相当すると同定された。プログラムＣｎ３Ｄ  ３．０を用いて、結合したヌクレオチドとの相互作用を予測する、ＲＡＢ３８  Ｇ１９（白色）の位置を示した。タンパク質構造が、色により示される：緑色、α−へリックス；金色、βシート；青色、ランダムコイル；白色、ヌクレオチド結合部位に位置するＲＡＢ３８  Ｇ１９に相当するＲＡＢ３ａ  Ｓ３２の部位；灰色、Ｍｇ＋＋イオン；灰赤色、ＧｐｐＮＨｐヌクレオチドアナログ。パネルＢは、ヒトＲＡＢ３８（ＮＰ＿０７１７３２；および配列番号３）アミノ酸配列、ラットＲＡＢ３８（ＡＡＡ４２０００；および配列番号４）アミノ酸配列、およびマウスＲＡＢ３８（ＡＫ００９２９６．１；および配列番号５）アミノ酸配列；ならびにヒトＲＡＢ３ａ（Ｐ２０３３６；および配列番号６）アミノ酸配列、ヒトＲＡＢ５（Ｆ３４３２３；および配列番号７）アミノ酸配列およびヒトＮ−ＲＡＳ（ＴＶＨＵＲＡ；および配列番号８）アミノ酸配列を含む高度に保存されたＮ末端領域のアラインメントを提供する。配列のアラインメントが、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ６：４５４〜４６２［１９９６］）を用いて行われた。棒は、ＲＡＢ３ａのＸ線結晶構造（ＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒおよびＢｒｕｎｇｅｒ、Ｃｅｌｌ  ９６：３６３〜３７４［１９９９］）で観察された、ヌクレオチド結合ポケットを占める高度に保存された領域を示す。黒色が配列同一性を示し、灰色が配列保護を示し、赤色がチョコレートマウスにおいて変異される保存されたアミノ酸を示す。
【図６】図６は、ｃｈｔ／ｃｈｔメラノソームが、Ｔｙｒｐｌｂメラノソームと形態において類似であることを例示する。パネルＡにおけるＣ５７Ｂ１６／Ｊ＋／＋マウスおよびパネルＢにおけるＣ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔマウスから単離される最初に培養されたメラノサイトの周辺部からのメラノソームの明視野画像を示す。野生型メラノサイトからのメラノソームは卵形で暗く色素沈着しており、一方Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔメラノサイトからのメラノソームは、Ｔｙｒｐｌｂ／Ｔｙｒｐｌｂ、ｍｅｌａｎ  ｂ細胞からのメラノソームに似ており、より小さく、より円形で、あまり色素沈着していない。目盛り棒は、２μｍに等しい。
【図７】図７は、ＲＡＢ３８が、適切なＴＹＲＰ１輸送のために必要なメラノソームタンパク質であることを示す。最初のメラノサイト培養物の周辺部におけるメラノソームの同一の露出部の明視野画像および一致した共焦点画像が、それぞれ上部および下部のパネルに提供される。パネルＡおよびパネルＢは、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  ＋／＋メラノソームの画像を提供し、パネルＣおよびパネルＤは、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｒａｂ３８ｃｈｔ／Ｒａｂ３８ｃｈｔメラノソームの画像を提供し、そしてパネルＥおよびパネルＦは、ＧＦＰ  ＲＡＢ３８発現構築物でトランスフェクトされたｍｅｌａｎ−ａ細胞からのメラノソームの画像を提供する。ＴＹＲＰ１分布が、パネルＢおよびＤにおけるＭＥＬ５染色により明らかになり、一方パネルＦに示されるＧＦＰ  ＲＡＢ３８免疫蛍光は、ＧＦＰ  ＲＡＢ３８シグナルが、高度に染色された最終段階メラノソームと共通に局在することを実証する。パネルＡおよびＤについての目盛り棒は、１．６μＭに等しく、一方パネルＥおよびＦについての目盛り棒は、２．４μＭに等しい。
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月15日(2005.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005522995000001.app