(57)【要約】２以上のプロテインキナーゼ基質ポリペプチドを有する部品からなるキットであり、前記基質ポリペプチドは特異性決定部位（各基質ポリペプチドにより異なる）と、リン酸化可能な部位を有し、各ポリペプチドの前記リン酸化可能な部位はリン酸化の状態に依存して、例えば抗体のような相同する特異性の結合相手と結合でき、前記特異的な結合相手はホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンに特異的な抗体ではないキット。前記リン酸化可能部位は、好ましくはアミノ酸配列ＬＳＦＡＥＰＧを含む。
2005522518.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上のプロテインキナーゼ基質ポリペプチドを有する部品からなるキットであって、
前記基質ポリペプチドはそれぞれ特異性決定部位（各キナーゼ基質ポリペプチドにより異なる）と、リン酸化可能な部位を有し、各ポリペプチドの前記リン酸化可能部位はリン酸化の状態に依存して例えば抗体のような相同する特異性の結合相手と結合でき、前記特異的な結合相手はホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンに特異的な抗体ではない、キット。
【請求項２】
請求項１に記載のキットにおいて、前記ポリペプチドのリン酸化可能部位は同一のアミノ酸配列を有するキット。
【請求項３】
２以上のポリペプチドを有する部品からなるキットであって、前記ポリペプチドは請求項１または２に定義される２以上のプロテインキナーゼ基質ポリペプチドであり、前記ポリペプチドのリン酸化可能部位の少なくとも１はリン酸化されているキット。
【請求項４】
請求項１から３の何れかに記載のキットであって、前記各ポリペプチドはその長さがそれぞれ４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５または１４個未満のアミノ酸であるキット。
【請求項５】
請求項４に記載のキットであって、前記各ポリペプチドはその長さがそれぞれ１３、１２、１１、１０または９個のアミノ酸であるキット。
【請求項６】
請求項１から５の何れかに記載のキットであって、前記プロテインキナーゼ基質ポリペプチドはセリン／トレオニンプロテインキナーゼに対する基質であるキット。
【請求項７】
請求項１から６の何れかに記載のキットであって、前記リン酸化可能部位はアミノ酸配列ＬＳＦＡＥＰＧを有するキット。
【請求項８】
請求項１から７の何れかに記載のキットであって、さらに特異的な結合相手を有するキット。
【請求項９】
請求項１から８の何れかに記載のキットであって、前記特異的な結合相手は抗体であるキット。
【請求項１０】
アミノ酸配列ＬＳＦＡＥＰＧにより構成されるエピトープに特異的な抗体。
【請求項１１】
アミノ酸配列ＬｐＳＦＡＥＰＧにより構成されるエピトープに特異的な抗体。
【請求項１２】
長さが４０、３０、２０、１９、１８、１７、１５または１４個未満のアミノ酸のポリペプチドであって、
前記ポリペプチドはグリコーゲン合成酵素３の断片ではなく、前記ポリペプチドは前記アミノ酸配列ＬＳＦＡＥＰＧ（０、１、２、３、４または５残基（セリン残基を除く）が保存的に置換されている配列を含む）を有し、さらにプロテインキナーゼに対するコンセンサス配列と一致するアミノ酸配列（前記配列ＬＳＦＡＥＰＧと重複してもよい）を有する特異性決定部位を有し、前記コンセンサス配列と一致する配列は、前記プロテインキナーゼが前記ポリペプチドにおける前記配列ＬＳＦＡＥＰＧのセリン残基をリン酸化できるように前記配列ＬＳＦＡＥＰＧに関連して配置している、ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは長さが１３、１２、１１、１０または９個のアミノ酸であるポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のポリペプチドであって、前記コンセンサス配列に相当するアミノ酸配列は配列ＬＳＦＡＥＰＧのＮ末端まで続いているポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１２から１４の何れかに記載のポリペプチドであって、前記コンセンサス配列が、Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ、Ｈｙｄ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−ｓｅｒ、またはＸａａ−ｐＳｅｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒであるポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１２から１５の何れかに記載のポリペプチドであって、前記配列ＬＳＦＡＥＰＧのセリンはホスホセリンに置換されているポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１２から１６の何れかに記載のポリペプチドまたはリン酸化ポリペプチドを、プロテインキナーゼ活性のアッセイに用いる前記ポリペプチドの利用方法。
【請求項１８】
請求項１０または１１に記載の抗体を、プロテインキナーゼ活性のアッセイに用いる前記抗体の利用方法。
【請求項１９】
プロテインキナーゼを含むかもしれない試料に対してプロテインキナーゼをスクリーニングする方法であって、
請求項１から１８の何れかに記載のポリペプチドを試料に反応させる工程と、前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうか、さらに任意でどの程度リン酸化されたかを測定する工程を有する方法。
【請求項２０】
プロテインキナーゼの活性を評価する方法であって、
請求項１２から１５の何れかに記載のポリペプチドを前記プロテインキナーゼに反応させる工程と、前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうか、さらに任意でどの程度リン酸化されたかを測定する工程を有する方法。
【請求項２１】
第１のプロテインキナーゼと第２のプロテインキナーゼの活性を評価する方法であって、
請求項１に記載のキットの第１のポリペプチドを前記第１のプロテインキナーゼに反応させる工程と、請求項１に記載のキットの第２のポリペプチドを前記第２のプロテインキナーゼに反応させる工程と、前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうか、さらに任意でどの程度リン酸化されたかを測定する工程を有する方法。
【請求項２２】
プロテインキナーゼの活性を評価する方法であって、
請求項２に記載のキットの第１の（リン酸化されていない）ポリペプチドを前記プロテインキナーゼに反応させる工程と、前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうか、さらに任意でどの程度リン酸化されたかを測定する工程を有する方法。
【請求項２３】
プロテインキナーゼの基質特異性をキャラクタライズする方法であって、
請求項１に記載のキットの第１のポリペプチドを前記プロテインキナーゼに反応させる工程と、請求項１に記載のキットの第２のポリペプチドを前記プロテインキナーゼに反応させる工程と、前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうか、さらに任意でどの程度リン酸化されたかを測定する工程を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロテインキナーゼ、特にセリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性の測定、及びプロテインキナーゼ活性の制御物質のスクリーニングに有用な方法及び試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼにより触媒されるタンパク質に対するリン酸の付加と脱離は、細胞活動のほとんどすべてを調節している。近年、関節炎、癌、糖尿病、心疾患、高血圧症および卒中等の多くの疾患や病理が、タンパク質の異常なリン酸化を原因として、またはその結果として起こることが明らかとなりつつある。こうした理由から、製薬産業において種々のプロテインキナーゼ及びホスファターゼの活性を調節する薬の開発が主要な優先事項となっている。こうした関心はサイクロスポリン、すなわち臓器移植を可能とし、プロテインホスファターゼを阻害する免疫抑制薬（プロテインホスファターゼ２Ｂ／カルシニューリン）（非特許文献１）、とその後継でありプロテインキナーゼを阻害するラパマイシン（「哺乳類を対象とするラパマイシン」、ｍＴＯＲ）（非特許文献２）の発見により高まった。また、ａｂ１チロシンキナーゼの阻害薬であるグリーベック（ＳＴＩ５７１）は２００１年５月にアメリカ食品医薬品局によって臨床用途での使用が認可された。この化合物は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療にめざましい効果があり、ａｂ１は染色体の再配列により活性のある形態に変化する（（非特許文献３）の概要）。グリーベックは特定のプロテインキナーゼの阻害を目的として開発された初めての薬である。
【特許文献１】ＵＳ特許４，４４０，８５９（Ｒｕｔｔｅｒら、１９８４年４月３日発行）
【特許文献２】ＵＳ４，５３０，９０１（Ｗｅｉｓｓｍａｎ、１９８５年７月２３日）
【特許文献３】ＵＳ４，５８２，８００（Ｃｒｏｗｌ、１９８６年４月１５日）
【特許文献４】ＵＳ４，６７７，０６３（Ｍａｒｋ、１９８７年６月３０日）
【特許文献５】ＵＳ４，６７８，７５１（Ｇｏｅｄｄｅｌ、１９８７年７月７日）
【特許文献６】ＵＳ４，７０４，３６２（Ｉｔａｋｕｒａら、１９８７年１１月３日）
【特許文献７】ＵＳ４，７１０，４６３（Ｍｕｒｒａｙ１９８７年１２月１日）
【特許文献８】ＵＳ４，７５７，００６（Ｔｏｏｌｅ  Ｊｒ．ら、１９８８年７月１２日）
【特許文献９】ＵＳ４，７６６，０７５（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９８８年８月２３日）
【特許文献１０】ＵＳ４，８１０，６４８（Ｓｔａｌｋｅｒ、１９８９年３月７日）
【特許文献１１】ＧＢ００１８９０８．４
【特許文献１２】ＧＢ００２１６８５．３（ｓｕｐｒａ）
【非特許文献１】Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｆａｒｍｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｌａｎｅ，Ｗ．Ｓ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ  Ｓ．Ｌ．（１９９１）  Ｃａｌｅｉｎｅｕｒｉｎ  ｉｓ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ−ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ＦＫＢＰ−ＦＫ５０６  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．  Ｃｅｌｌ  ６６，８０７−８１５
【非特許文献２】Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｊ．，Ａｌｂｅｒｓ，Ｍ．Ｗ．，Ｓｈｉｎ，Ｔ．Ｂ．，Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｋ．，Ｋｅｉｔｈ，Ｃ．Ｔ．，Ｌａｎｅ，Ｗ．Ｓ．及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．（１９９４）  Ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｂｙ  Ｇｌ−ａｒｒｅｓｔｉｎｇ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３６９，７５６−７５８．
【非特許文献３】Ｍｏｒｉｎ，Ｍ．（２０００）  Ｆｒｏｍ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｔｏ  ｄｒｕｇ：  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９，６５７４−６５８３．
【非特許文献４】Ｄａｖｉｅｓ，Ｓ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｈ．，Ｃａｉｖａｎｏ，Ｍ．及びＣｏｈｅｎ，Ｐ．（２０００）  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３５１，９５−１０５
【非特許文献５】Ｐｉｎｎａ，  Ｌ．Ａ．及びＲｕｚｚｅｎｅ，Ｍ．（１９９６）  Ｈｏｗ  ｄｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｔｈｅｉｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ？  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３１４，１９１−２２５
【非特許文献６】Ｌｅｉｇｈｔｏｎ，Ｉ．Ａ．，Ｄａｌｂｙ，Ｋ．Ｎ．，Ｃａｕｄｗｅｌｌ，Ｆ．Ｂ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．Ｔ．Ｗ．及びＣｏｈｅｎ，Ｐ．（１９９５）  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐ７０  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ＭＡＰＫＡＰ−ｋｉｎａｓｅ−１  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｐ７０  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ：  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３７５，２８９−２９３．
【非特許文献７】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．及びＣｏｈｅｎ，Ｐ．（１９９９）  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｔｈａｔ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ３−ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−１  （ＰＤＫ１）  ａｎｄ  ＰＤＫ２．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３３９，３１９−３２８
【非特許文献８】Ｓｔｏｋｏｅ，  Ｄ．，Ｃａｕｄｗｅｌｌ，Ｂ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．Ｔ．Ｗ．及びＣｏｈｅｎ，Ｐ．（１９９３）  Ｔｈｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＭＡＰ）  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−２．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９６，８４３−８４９．
【非特許文献９】Ｃｒｏｓｓ，Ｄ．Ａ．Ｅ．，Ａｌｅｓｓｉ，Ｄ．Ｒ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．，  Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃｈ，Ｍ．及びＨｅｍｍｉｎｇｓ，Ｂ．Ａ．（１９９５）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｂｙ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ．  Ｎａｔｕｒｅ３７８，７８５−７８９．
【非特許文献１０】Ｆｌｏｔｏｗ，Ｈ．，Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ａ．Ｑ．，Ｆｉｏｌ  Ｃ．Ｊ．，Ｒｏｅｓｋｅ，Ｒ．Ｗ．及びＲｏａｃｈ，Ｐ．Ｊ．（１９９０）．  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｒｉａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｒｉａｓｅ  Ｉ  ａｃｔｉｏｎ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１４２６４−１４２６９．
【非特許文献１１】Ｈ．Ｚｏｌａ「モノクローナル抗体：技術マニュアル」（ＣＲＣプレス、１９８８年）
【非特許文献１２】ＪＧＲ  Ｈｕｒｒｅｌｌ「モノクローナルハイブリドーマ抗体：技術と応用」（ＣＲＣプレス、１９８２年）
【非特許文献１３】Ｃｏｒｖａｌｅｎら（１９８７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２４，１２７〜１３２／１３３〜１３７／１３８〜１４３
【非特許文献１４】Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８５１−６８５５
【非特許文献１５】Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０、１０４１
【非特許文献１６】Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１０３８
【非特許文献１７】Ｂｉｒｄら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，５８７９
【非特許文献１８】Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４
【非特許文献１９】Ｗｉｎｔｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３−２９９
【非特許文献２０】Ｈａｒｗｏｏｄら（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１，１５１５−１５２２
【非特許文献２１】Ｌｕら（１９８１）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６
【非特許文献２２】Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，４８７−４９１
【非特許文献２３】Ｍｅｚｉａｒｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２３０−３２３７
【非特許文献２４】Ａｓｋｉｎら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７、１１６７０−１１６７８
【非特許文献２５】Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８）「抗体：実験マニュアル」コールドスプリングハーバー実験室、ＩＳＢＮ０−８７９６９−３１４−２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
（プロテインキナーゼに関して例示するならば）薬を発見する課程の第一段階の一つとして、あるプロテインキナーゼの「最重要な」阻害物質を特定するために化合物ライブラリをスクリーニングすることが挙げられる。従来、そのようなプロテインキナーゼ阻害物質に対する「処理能力の高いスクリーニング」では、放射標識したリン酸（３２Ｐ及び３３Ｐ）のペプチド及びタンパク基質への取り込みに基づいて化合物の効果を測定する方法がとられる。しかしながら、そのような放射活性によるアッセイ法の欠点は、コンビナトリアルケミストリー及び合併・買収による化合物ライブラリの統合の結果、化合物ライブラリが極端に大きくなる（１００万成分以上）ことである。結果として、これらのアッセイ系を稼働するには高レベルの放射活性が必要となるため、産業的にはそれに代わる非放射性のアッセイ系の開発が注目されるようになっている。そこで注目される非放射性のアッセイ法の一つが、キナーゼ反応による産物を認識するリン酸特異的な抗体の使用である。最も簡単な方法はホスホセリンまたはホスホチロシン残基のどちらかを含むペプチドを認識するリン酸特異的な抗体を使用するものである。確かにそのような抗体はタンパク質チロシンキナーゼのアッセイに極めて有効である。しかしながら、セリン／トレオニン特異的なプロテインキナーゼまたはホスファターゼについては、ホスホセリンまたはホスホトレオニンを含むペプチドを認識する十分に良好な抗体が得られていないため、同程度なアッセイ法を開発するに至っていない。したがって、それぞれのリン酸化物質に対するリン酸特異的な抗体の開発が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
我々は多種の様々なプロテインキナーゼに対して、最も優れた基質であると考えられる合成ペプチド基質を作製した。これらのペプチドはリン酸化部位を含む共通のエピトープ（例えば７残基のエピトープ）を持ち、これが有力なリン酸特異的な抗体の標的となる。このような基質を用いることで、多種のプロテインキナーゼを共通のフォーマットでスクリーニングすることができる。例えば、この基質はプロテインキナーゼの制御物質の同定、もしくはプロテインキナーゼの同定またはキャラクタリゼーションに用いることができる。
【０００５】
多くのプロテインキナーゼのリン酸化残基、例えばセリン残基は、特定のアミノ酸モチーフ内にある。例えば、ＰＫＡ及びＰＫＧはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−配列にあるセリンをリン酸化し（非特許文献５）、またＰＫＢ、ＳＧＫ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１及びＳ６Ｋ１はＡｒｇ−（またはＬｙｓ）−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−モチーフにあるセリンをリン酸化する（非特許文献６及び７）。一方、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＡＰＫＡＰ−ＫＩＩＩおよびＣａＭＫＩＩは、Ｈｙｄ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−モチーフを認識する。ここでＨｙｄはバルキーな疎水性残基である（非特許文献８）。また、これらのプロテインキナーゼのほぼすべては、リン酸化サイトのＣ末端バルキーな疎水性残基が隣接することを好む。
【０００６】
意外にも我々は、共通のＣ末端を有するペプチドが数種の異なるキナーゼサブファミリーに属する多種のプロテインキナーゼによって十分にリン酸化されることを見いだした。実際、多くの場合においてそのようなペプチドは十分に、時にはあるプロテインキナーゼのアッセイに常法として用いられる基質よりも十分にリン酸化される。これは予期しないことであった。なぜなら、そのようなペプチドが適した構造を持っているとは予期できなかったからであり、また、先行技術は特定のキナーゼに対する特定のペプチドについて言及しているからである（例えば（非特許文献４）参照）。また、Ｃ末端エピトープは多くのプロテインキナーゼのアッセイに用いることができる一リン酸−５特異的な抗体の産出に用いることができる。Ｃ末端エピトープの配列はＮ末端エピトープよりも好ましく、Ｎ末端エピトープは最適ではないこといことがわかった。
【０００７】
特に、我々はＰＫＢによりリン酸化されるグリコーゲン合成酵素キナーゼ３のセリンを取り囲む配列について共通する７残基エピトープを含む一般的なペプチド（実施例１の表１参照）（非特許文献９）を見いだし、設計した。そのようなのエピトープは、リン酸化残基のＣ末端に強い配列特異性を持たないプロテインキナーゼ、例えばＰＫＡファミリー（例えばＰＫＧ、ＲＯＣＫＩＩ、及びＰＫＣのアイソフォームなど）、ＰＫＢファミリー（例えばＳＧＫ、ＭＳＫ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１及びＳ６Ｋ並びにＰＫＢのアイソフォーム）またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２ファミリー（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３、ＰＲＡＫ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＡＭＰＫ及びＣａＭＫＩＩ）もしくはＣＫ１のアイソフォーム並びにサブファミリー、のアッセイに特に適している。
【０００８】
実施例１及び表１で挙げられる３種のペプチドは実施例１で検討されたプロテインキナーゼと密接に関係するすべてのアイソフォーム及び同一のキナーゼサブファミリーのすべてではないとしてもほとんどの基質として用いることができると考えられる。
【０００９】
また、同様なＣ末端エピトープを持つペプチドも、リン酸化サイトのＮ末端側の特定モチーフを認識するプロテインキナーゼのアッセイに用いることができると考えられる。例えば、ＣＫ１（カゼインキナーゼ１とも呼ばれる）は、あるホスホセリン残基から３残基Ｃ末端側のセリン残基をリン酸化する（非特許文献１０）。従って、Ｘａａ−ｐＳｅｒ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ型のペプチドをリン酸化する（すなわち、実施例１において検討したのと同じＣ末端エピトープを持つ）。従って、このエピトープを持つペプチドを用いれば、少なくとも５０、おそらくは１００以上のプロテインキナーゼをアッセイすることができると考えられる。
【００１０】
ＰＫＣは前記のエピトープを有するペプチドを用いることで完全にアッセイすることができるが（表１）、この基質はこのプロテインキナーゼをアッセイするのに今まで用いられてきた他の基質に劣るものである。なぜなら、ＰＫＣはリン酸化部位よりＮ末端の基礎的な残基に加えて、リン酸化部位よりもＣ末端側の基礎的な残基を好み（非特許文献５）、それはエピトープには含まれないためであると考えられる。ＡＧＣファミリーなど、ＰＫＣのアイソフォームと関連するプロテインキナーゼに対する好ましいエピトープは、ペプチド基質ＲＲＲＬＳＦＡＥＰＧのセリンで始まる７のアミノ酸を有する、または、のみからなる。
【００１１】
また、ここに挙げる結果によれば、リン酸化部位のＣ末端側にある特定のモチーフや残基に対して厳格な要求のあるプロテインキナーゼを、共通するエピトープがペプチドの特異性に係わる部分のＮ末端側にあるペプチド基質を用いてアッセイできるかもしれない。例えば、ＭＡＰキナーゼ及びエクリン依存性プロテインキナーゼは、リン酸化部位Ｃ末端側にプロリン残基が隣接することを絶対的に要求するが（非特許文献５）、これは実施例１で試験したプロテインキナーゼにとっては否定的な決定基である。同様に、ＣＫ２はリン酸化部位のＣ末端側に連続する数個の酸性残基を要求し、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼはＣ末端のグルタミン酸を要求する（非特許文献５）。しかしながら、ここに挙げる結果によれば、共通のＮ末端エピトープを持つ第２のペプチド基質は、リン酸化において特定のＣ末端を要求する多くのプロテインキナーゼをアッセイするのに有用であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の第１の側面は、２以上のプロテインキナーゼ基質ポリペプチドを有するキットであり、前記基質ポリペプチドはそれぞれ特異性決定部位（各キナーゼ基質ポリペプチドにより異なる）と、リン酸化可能部位を有し、各ポリペプチドの前記リン酸化可能な部位はリン酸化の状態に依存して、例えば抗体のような同じ特異性の結合相手と結合でき、前記特異的な結合相手はホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンに特異的な抗体ではない。ポリペプチドのリン酸化可能部位は同一のアミノ酸配列を持つことが特に好ましい。しかし、リン酸化可能部位がリン酸化される残基を含みリン酸化の状態に依存する共通の結合部位（例えばエピトープ）を共有している限りにおいては、該アミノ酸配列は必要不可欠ではない。従って、例えば抗体である結合相手は、ホスホセリン、ホスホトレオニンまたはホスホチロシンに対して産生／選択された抗体ではない（対照的にホスホセリン、ホスホトレオニンまたはホスホチロシン残基を有するより長いアミノ酸配列に対して産生／選択されたものである）。
【００１３】
また、本発明の側面は、２以上のポリペプチドを有するキットであり、前記ポリペプチドは第１の側面のキットにおいて定義される２以上のプロテインキナーゼ基質ポリペプチドであり、そのうちの少なくとも１のポリペプチドのリン酸化可能部位はリン酸化されている。そのようなリン酸化されたポリペプチドは、プロテインホスファターゼの基質として有用である。
【００１４】
前記基質ポリペプチドはその長さがそれぞれ４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５または１４個未満のアミノ酸であることが好ましい。前記基質ポリペプチドはその長さが１３、１２、１１、１０あるいは９個のアミノ酸であることが特に好ましい。小さいペプチドは費用と簡便性の面から好ましい。
【００１５】
プロテインキナーゼ基質ポリペプチドはプロテインキナーゼの基質である。即ちプロテインキナーゼ、好ましくはセリン／トレオニンプロテインキナーゼによるリン酸化が可能である。基質ポリペプチドのリン酸化可能部位は、プロテインキナーゼによりリン酸化が可能なチロシン、より好ましくはセリンまたはトレオニンを有する。特異性決定部位（リン酸化可能部位と重複してもよい。例えばリン酸化可能なチロシン、セリンまたはトレオニン残基のＣ末端および／またはＮ末端に隣接する残基を含むことができる）は、プロテインキナーゼによるリン酸化を受けるコンセンサス配列と一致するアミノ酸配列を有する。チロシン、セリンまたはトレオニン残基は、（例えばリン酸化されたときに）エピトープの一部を構成する。例えば抗体である結合相手は、このエピトープに対して産生／選択されている。
【００１６】
特異性決定部位及び共通のリン酸化可能部位を有する基質ポリペプチドの原理は、セリン／トレオニンプロテインキナーゼだけでなくチロシンプロテインキナーゼに対しても適用されると考えられる。しかしながら、抗ホスホセリンまたは抗ホスホトレオニン抗体が高い親和性／特異性を欠いているのとは対照的に、抗ホスホチロシン抗体は高い親和性／特異性を持つことから、セリン／トレオニンプロテインキナーゼに関してより有益なものになると考えられる。
【００１７】
前述したコンセンサス配列はＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ（またはＬｙｓ）−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ、Ｈｙｄ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ、またはＸａａ−ｐＳｅｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒであることが好ましい。それぞれの場合において、コンセンサス配列はそのＣ末端のセリン（コンセンサス配列を認識するプロテインキナーゼによりリン酸化されるセリン）がリン酸化可能部位のセリンとなるように位置している。リン酸化可能部位がアミノ酸配列ＬＳＦＡＥＰＧ（０、１、２、３、４、または５の残基（セリンを除く）が保存的に置換されている配列を含む）を持つことがより好ましい。従って、リン酸化可能なセリン残基のＮ末端側に隣接するロイシン残基は、上記のコンセンサス配列においてセリン残基のＮ末端側に隣接する「Ｘａａ」残基に相当する。特に好ましい実施例では、プロテインキナーゼ基質ポリペプチドは以下に論ずるような本発明におけるポリペプチドである。
【００１８】
「保存的な置換」とは、Ｇｌｙ／Ａｌａ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｌｙｓ／ＡｒｇまたはＰｈｅ／Ｔｙｒといった組み合わせを指す。保存的に置換された残基が存在しないことが好ましく、保存的に置換された残基の数が１、２、３、４または５の少ない順で好ましい。
【００１９】
共通するリン酸化可能部位は抗原性であり、リン酸化できる残基を含んでいなければならない。基質ペプチドに対するプロテインキナーゼのＫｍは１ｍＭ未満であることが好ましく、８００、６００、５００、４００、３００、２００もしくは１００μＭ（昇順に好ましい）がより好ましい。基質ペプチドに対するプロテインキナーゼのＫｍは、該プロテインキナーゼのアッセイに通常用いられる基質に対するＫｍの２．５、１０、２０もしくは３０倍以下（降順に好ましい）が好ましい（例えば実施例１）。基質ペプチドに対するプロテインキナーゼのＶｍａｘは、該プロテインキナーゼのアッセイに通常用いられる基質に対するＶの少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％が好ましい（例えば実施例１）。当然のことながら、重要なのはＫｍとＶｍａｘの組み合わせである。基質ペプチドは妥当な時間内にリン酸化されるべきであり、例えばアッセイの完了に何時間もかかるものは特に有益であるとはいえない。アッセイに要する時間は３０分未満が好ましいが、１５、１０または５分（もしくはそれ以下）がより好ましい。アッセイは、確実で、コストとの関係から酵素基質を大量に必要としないこともまた重要である。
【００２０】
前記キットは、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体といった特異的な結合相手をさらに有していてもよい。好適な抗体の調整方法は当業者により知られているであろう。好適な方法は実施例１及び２に記載されている。
【００２１】
例えば抗体である特異的な結合相手は、２μｇ／ｍｌ（イムノブロット）または１０〜２０μｇ／ｍｌ（改良ＥＬＩＳＡ）で使用した場合、＜１０ｎｇのリン酸化した（もしくはリン酸化していない）基質ペプチド（例えば実施例１に示すようにキャリアポリペプチドと複合させた場合）を認識できることが好ましい。特異的な結合相手の結合係数（Ｋｄ）は、リン酸化した（またはリン酸化していない）基質ポリペプチド（または共有のリン酸化可能部位またはそのエピトープ）に対して、１０−４から１０−１６Ｍであることが好ましく、１０−６から１０−１０が好ましい。「リン酸化の状況に応じた結合」とは、基質ポリペプチド（または上記の共有するエピトープ）がリン酸化可能部位でリン酸化された場合は特異的な結合相手が結合可能であるが、基質ポリペプチド（または上述の共有するエピトープ）がリン酸化可能部位でリン酸化されていない場合は特異的な結合相手が結合できないことを意味する。従ってリン酸化された基質ポリペプチドとリン酸化されていない基質ポリペプチドの間で、特異的な結合相手に対する親和性が少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００または５０００倍の差があることが好ましい。実際、実施例１及び２に記載の方法（例えばリン酸化ペプチドアフィニティーカラムと非リン酸化ペプチドアフィニティーカラムを使ったアフィニティー精製）で精製／選択した特異的な結合相手は、結合において必要な親和性及び特異性を持つと予想される。
【００２２】
特異的な結合相手は、抗体全体（通常、特異性及び簡便性からモノクローナル抗体だが、ポリクローナル抗体であってもよい）またはその一部（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片）、もしくは合成抗体またはその一部であるかそれらを有する。抗体の一部分のみを有する特異的な結合相手（例えば以下に示す）は、より速い反応速度／平衡または良好な溶解性から有利である。また、補体結合などの抗体全体の効果または影響は除去される。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片はすべて大腸菌により発現及び分泌させることができるので、容易に大量生産することができる。
【００２３】
特定の抗原に対する好適なモノクローナル抗体は、例えば非特許文献１１及び１２などに記載の公知の方法により調製することができる。二重特異的な抗体は細胞融合、一価の断片の再集合または抗体の化学的な結合により調製することができる。二重特異的な抗体の調製方法は、非特許文献１３に開示されている。
【００２４】
抗体の可変Ｈ（ＶＨ）及び可変Ｌ（ＶＬ）ドメインは、抗原認識に関係しており、この事実はプロテアーゼによる消化実験により最初に認められた。そして、げっ歯目抗体の「ヒト化」によりさらに確認された。げっ歯目由来の可変領域をヒト由来の不変領域と融合させて作られた抗体は、母体となったげっ歯目抗体の抗原特異性を保持している（非特許文献１４）。
【００２５】
この抗原特異性は可変領域により付与されるものであり、不変領域からは独立していることが、１以上のすべての可変領域を含む抗体をバクテリアで発現させた実験によって知られている。これらの分子はＦａｂ様の分子（非特許文献１５）、Ｆｖ分子（非特許文献１６）、ＶＨとＶＬの組となるドメインが柔軟なオリゴペプチドを介して結合している一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（非特許文献１７）及び孤立したＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（非特許文献１８）を含んでいる。抗体断片の合成に関する技術の一般的概要については、非特許文献１９に記載されている。
【００２６】
「ＳｃＦＶ分子」とは、ＶＨとＶＬの組となるドメインが柔軟なオリゴペプチドを介して結合した分子を意味する。
【００２７】
完全体の抗体、及びＦ（ａｂ’）２断片は「２価」である。「２価」とは、抗体及びＦ（ａｂ’）２断片が２の抗原結合部位を持つことを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ及びｄＡｂ断片は１価であり、１の抗原結合部位を持つ。完全なイムノグロブリンを断片化するとＦ（ａｂ’）２断片が生成することが、非特許文献２０に開示されている。
【００２８】
抗体としては、ＩｇＧクラスの抗体が好ましい。
【００２９】
本発明の他の側面は、アミノ酸配列ＬＳＦＡＥＰＧ（すなわちリン酸化されていないセリンを含む）によって作られたエピトープに対して特異的な抗体である。本発明の他の側面は、アミノ酸配列ＬｐＳＦＡＥＰＧ（すなわちリン酸化セリンを含む）によって作られたエピトープに対して特異的な抗体である。
【００３０】
「特異的」とは、抗体はＬＳＦＡＥＰＧから作られるエピトープには結合するがＬｐＳＦＡＥＰＧから作られるエピトープには結合しない、またはその逆であることを意味する。
【００３１】
「抗体」という用語には、抗原結合部位を有する合成抗体及び完全な抗体の断片及び変異体（例えば前述）が含まれる。
【００３２】
本発明の他の側面は長さ４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５または１４個未満のアミノ酸のポリペプチドであり、前記ポリペプチドはグリコーゲン合成酵素キナーゼ３の断片ではなく、前記ポリペプチドはアミノ酸配列ＬＳＦＡＥＰＧ（セリンを除き０、１、２、３、４または５残基が保存的に置換された配列を含む）を有し、さらにプロテインキナーゼのコンセンサス配列に相当するアミノ酸配列（前記配列ＬＳＦＡＥＰＧと重複してもよい）を有する特異性決定部位を有し、前記コンセンサス配列に相当する配列は前記プロテインキナーゼが前記ポリペプチドを配列ＬＳＦＡＥＰＧのセリン残基をリン酸化することができるように前記配列ＬＳＦＡＥＰＧに関連して配置している。基質ポリペプチドの長さは１３、１２、１１、１０または９のアミノ酸であることが特に好ましい。コンセンサス配列に相当するアミノ酸配列は配列ＬＳＦＡＥＰＧのＮ末端まで続いていることが好ましい。
【００３３】
コンセンサス配列が、Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｘａａ−ｓｅｒ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ、Ｈｙｄ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−ｓｅｒ、またはＸａａ−ｐＳｅｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−ｓｅｒである実施例が特に好ましい。それぞれの場合において、コンセンサス配列のＣ末端セリン（コンセンサス配列を認識するプロテインキナーゼによりリン酸化されるセリン）は、ＬＳＦＡＥＰＧ配列のセリンである。
【００３４】
Ｈｙｄ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ中のＡｒｇ以外のアルギニンは、リジンであってもよい。
【００３５】
従ってポリペプチドは、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｈｙｄ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−ＧｌｙまたはＸａａ−ｐＳｅｒ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを有することが好ましい。
【００３６】
ポリペプチドがアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−ＧｌｙまたはＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙである実施例が特に好ましい。
【００３７】
本発明の他の側面は、上述の側面によるポリペプチドであるが配列ＬＳＦＡＥＰＧのセリンはホスホセリンに置換されている。
【００３８】
本願では、ＩＵＰＡＣ−ＩＴＪＢ生化学命名法に基づく３文字及び１文字のアミノ酸コードを用いている。ポリペプチドの配列は慣習にならいＮ末端からＣ末端の順で示している。ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す。アミノ酸はＬ−アミノ酸であることが好ましく、特に例えばＰＰ（Ｔ／Ｎ）ＫモチーフであるＳＩＭはＬ−アミノ酸のみからなることが特に好ましい。ＳＩＭに隣接、例えばＰＰ（Ｔ／Ｎ）Ｋモチーフに隣接しているアミノ酸残基（１０〜２０残基など）はＬ−アミノ酸であることが好ましいが、Ｄ−アミノ酸残基であってもかまわない。
【００３９】
ポリペプチドは下記の実施例１に示すような例えば分子生物学的手法または自動ペプチド化学合成法などの公知の方法により作成してもよい。
【００４０】
ペプチドは、非特許文献２１及びそこでの参照において開示されている固相ペプチド合成のＦｍｏｃポリアミドモードにより合成してもよい。Ｎ−アミノ酸基は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基により一時的に保護される。この塩不安定な保護基は２０％ピペリジンのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液の作用により反復的に開裂する。側鎖の官能性は、そのブチルエーテル（セリン、トレオニン及びチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸及びアスパラギン酸の場合）、ブチロキシカルボニル誘導体（リシン及びヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、及び４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル誘導体（アルギニンの場合）として保護してもよい。ここで、グルタミンまたはアスパラギンがＣ末端基である場合、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル基が側鎖アミノ官能性を保護するのに用いられる。固相支持体は、ジメチルアクリルアミド（主鎖モノマー）、ビスアクロイルエチレンジアミン（架橋剤）及びアクリロイルサルコジンメチルエステル（機能化剤）の３種のモノマーから構成されるポリジメチル−アクリルアミドポリマーを素材とする。ペプチド−樹脂間の開裂可能な結合剤としては、酸に不安定な４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体が用いられる。すべてのアミノ酸誘導体は、あらかじめ作られた対称形の無水物誘導体として添加される。但し、アスパラギン及びグルタミンは逆Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを介したカップリング法を用いて添加される。すべてのカップリング及び保護解除反応はニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸もしくはｉｓｏｔｉｎテスト法により制御される。合成が完了すると、５０％スカベンジャー混合物を含む９５％トリフルオロ酢酸で処理してペプチドを樹脂支持体より開裂させ、同時に側鎖保護基を取り除く。スカベンジャーとしては一般にはエタンジオール、フェノール、アニソール及び水が使われるが、合成されたペプチドを構成するアミノ酸に従って正確に選択される。減圧蒸発によりトリフルオロ酢酸を除去したのち、ジエチルエーテルと共に粉砕して粗ペプチドを得る。使用したあらゆるスカベンジャーは水相の凍結乾燥による簡便な抽出処理により取り除かれ、粗ペプチドはスカベンジャーフリーとなる。ペプチド合成のための試薬は、カルビオケム−ノバビオケム社（イギリス）、ノッティンガム  ＮＧ７  ２ＱＪ、イギリスにより市販されている。精製は限外クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び（主に）逆相高性能液体クロマトグラフィーなどの１もしくは組み合わせにより行われる。ペプチドの分析は薄層クロマトグラフィー、逆相高性能液体クロマトグラフィー、酸加水分解によるアミノ酸分析、及び高速原子衝突質量分析法により行ってよい。
【００４１】
一方、ポリペプチドは公知のリコンビナント核酸の発現により合成してもよい。配列コードを含む発現ベクターの作製には、例えば適当な転写または翻訳制御といった公知の方法を用いることができる。
【００４２】
本発明のポリペプチドをエンコードするＤＮＡを修飾するには非特許文献２２により開示されるポリメラーゼ連鎖反応を用いる方法が最も望ましい。この方法によれば、酵素により増幅されるＤＮＡは、増幅したＤＮＡに取り込まれる２の特異的なオリゴ核酸プライマーと隣接する。前記の特異的なプライマーは、公知の方法による発現ベクターへのクローニングに用いることのできる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいる。
【００４３】
所望のポリペプチドをエンコードする核酸は、好適なホストにおいて発現され、ポリペプチドが生産される。従ってポリペプチドをエンコードするＤＮＡは、公知の方法に従って使用されてよいが、ポリペプチドの発現と産生のための適当なホスト細胞を確立することを目的として本発明に開示される内容に基づき適宜変更してもよい。そのような方法としては、特許文献１〜１０に開示されるものを含み、これらはすべて本願に組み入れられる。
【００４４】
本発明のリコンビナントＤＮＡにより形質転換されたホスト細胞は、本願に開示される方法に基づいて公知の方法により適当な条件下で十分な時間をかけて培養され、ポリペプチドが発現して回収できるようになる。
【００４５】
ポリペプチドは、リコンビナント培養細胞より回収され、硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、水酸化アパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーによって精製される。より好ましくは、精製には高性能液体クロマトグラフィー（“ＨＰＬＣ”）が用いられる。
【００４６】
発現系としては多くが知られている。例えば、リコンビナントバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換されたバクテリア（例えば大腸菌及び枯草菌）、例えば酵母発現ベクターにより形質転換された酵母（例えば出芽酵母）、例えばウイルス発現ベクター（例えばｖａｃｕｌｏウイルスにより形質転換された昆虫の細胞系、例えばウイルスまたはバクテリア発現ベクターをトランスフェクションされた植物細胞系、及び例えばアデノウイルス発現ベクターをトランスフェクションされた動物細胞系が挙げられる。
【００４７】
当然ながら、ペプチド様の化合物も有用である。つまり、「ポリペプチド」または「ペプチド」には、ペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）で結合されたアミノ酸残基の分子だけでなくペプチド結合が逆転している分子も含まれる。そのようなレトロインバーソペプチド様化合物は、例えば本願に組み入れられる非特許文献２３に開示される公知の方法により作成することができる。この方法では、側鎖の配向ではなく主鎖を含んだ変更を含む疑似ペプチドを作製する。非特許文献２３においてＭｅｚｉｅｒｅら（１９９７）は、これらの疑似ペプチドは少なくともＭＨＣクラスＩＩ及びＴヘルパー細胞応答に対して有用であるとしている。レトロインバーソペプチドはＣＯ−ＮＨ結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含んでおり、タンパク分解に耐性がある。
【００４８】
同様に、アミノ酸残基のＣα原子間の空間を保持する適当な結合物質を用いている場合は、ペプチド結合は全く不要である。結合物質の部分の荷電分布と平面性がペプチド結合と実質的に同じであれば、特に好ましい。
【００４９】
当然ながら、ペプチドのＮ及びＣ末端は適切に保護され、細胞外タンパク分解性の消化に対する感受性を抑制している。
【００５０】
従って、当然ながら例えばアミノ酸配列ＬＳＦＡＥＰＧを有するような基質ポリペプチドは、好ましいとは言えなくとも、上述したようにペプチド様化合物である。
【００５１】
本発明の他の側面では、本発明のポリペプチドまたは本発明のリン酸化ポリペプチドが、プロテインキナーゼまたはホスファターゼのアッセイに用いられる。本発明の他の側面では、本発明の抗体が、プロテインキナーゼまたはホスファターゼのアッセイに用いられる。
【００５２】
本発明の他の側面は、試料中のプロテインキナーゼのスクリーニング方法であり、本発明のポリペプチドまたはリン酸化ポリペプチドもしくは本発明のキットのポリペプチドを試料に反応させ、前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうか、及び任意でどの程度リン酸化されたかを測定することを有する方法である。
【００５３】
試料は細胞抽出液または分画した細胞抽出液であってよい。例えば、ポリペプチドは精製プロトコルにおいてキナーゼまたはホスファターゼ活性を測定するために用いることができる。本発明の他の側面は、プロテインキナーゼの活性をアッセイする方法であって、本発明のポリペプチドをプロテインキナーゼに反応させる工程と前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうか、及び任意でどの程度リン酸化されたかを測定する工程を有する方法である。
【００５４】
本発明の他の側面は、第１のプロテインキナーゼと第２のプロテインキナーゼの活性をアッセイする方法であって、第１のプロテインキナーゼを本発明の第１の側面であるキットの第１のポリペプチドに反応させる工程と、第２のプロテインキナーゼを本発明の第２の側面である第２のポリペプチドに反応させる工程、及び前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうか、及び任意でどの程度リン酸化されたかを測定する工程を有する方法である。キットのポリペプチドが上記の本発明のポリペプチド、即ちアミノ酸配列ＬＳＦＡＥＰＧを有するポリペプチドである実施例が特に好ましい。
【００５５】
この方法は、プロテインキナーゼの基質特異性の測定またはキャラクタリゼーションに用いることができる。基質特異性のキャラクタリゼーションでは、プロテインキナーゼを１以上の本発明のポリペプチド、または本発明のキットの１以上のポリペプチド（すなわち同じリン酸化可能な（またはリン酸化された）部位を持つ１以上の基質ポリペプチド）と反応させる。
【００５６】
従って本発明の他の側面は、プロテインキナーゼの基質特異性のキャラクタリゼーション方法であって、プロテインキナーゼを本発明の第１の側面であるキットの第１のポリペプチドに反応させる工程と、本発明の第１の側面であるキットの第２のポリペプチドに反応させる工程と、前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうか、及び任意でどの程度リン酸化されたかを測定する工程を有する方法である。キットの特異的なポリペプチドが上記の本発明のリン酸化されていないポリペプチド、即ちアミノ酸配列ＬＳＦＡＥＰＧを有するポリペプチドである実施例が特に好ましい。
【００５７】
これはプロテインキナーゼの活性を測定するための基質ポリペプチドを選択するのに有用である。さらに基質ポリペプチドは、プロテインキナーゼに対するコンセンサス配列に基づいて特定のプロテインキナーゼに対して選択されてもよい。これは、プロテインキナーゼの、選択した基質との反応性、及び他の１以上の基質との反応性を比較することにより確認してもよい。
【００５８】
本発明の方法は、例えば試験化合物の存在下におけるプロテインキナーゼの反応性を測定するために用いることができる。従って、前記方法はさらにプロテインキナーゼを試験化合物に反応させる工程、及び試験化合物の存在及び非存在下でのプロテインキナーゼの活性を測定する工程を有していてもよい。プロテインキナーゼの活性に影響する化合物（基質特異性に影響する物質を含んでもよい）を選択してもよい。
【００５９】
本発明の上記の側面により同定されるまたは得られる試薬（及び以下に記すスクリーニング法の側面）は薬らしい化合物または薬らしい化合物の先導化合物であってよい。従って前記方法は、医薬様の化合物または薬らしい化合物の先導化合物を同定するための方法であってよい。
【００６０】
「薬らしい化合物」という語句は公知であり、医療使用に好適な特性を持ちうる化合物という意味を持ち、例えば薬物の有効成分である。従って、例えば、薬らしい化合物は有機化学的な方法により合成される分子であってよく、それは分子生物学または生化学的な方法により合成されるものよりもよりも好ましい。また、小さい分子であることが好ましく、５０００ダルトン未満で水溶性であってよい。薬らしい化合物は、付加的な特徴として特定のタンパク質またはタンパク質群と選択的な相互作用を示すものであってよく、生物学的利用能および／または標的の細胞膜を透過できるものであってよいが、当然ながらこれらの特徴は不可欠ではない。
【００６１】
「先導化合物」という語句も同様に公知であり、それ自体は薬として使用するには好適ではないが（例えば目的とする標的に対する効果が弱い、作用が非選択的である、不安定である、溶解性が低い、合成が困難である、毒性が強すぎるまたは生物学的利用能が低いといった理由による）、より望ましい特性を持った他の化合物を設計する出発点となるような化合物を意味する。
【００６２】
本発明の方法において同定される化合物はそれ自体薬として有用であるか、またはより効果的な化合物の設計や合成のための先導化合物であってよい。
【００６３】
当然ながらプロテインキナーゼまたはホスファターゼの生体内での活性を調節できる化合物を同定することが好ましい。従って、当然ながらこの方法に使用される試薬や条件は、前記プロテインキナーゼまたはホスファターゼと、その基質間の相互作用が生体内と実質上同じとなるように選ばれる。
【００６４】
本発明の方法によるアッセイ（特にエピトープＬＳＦＡＥＰＧを有するポリペプチドを使用する場合）にとって好ましいプロテインキナーゼとしては、リン酸化される残基のＣ末端側の配列に強く影響されないものが挙げられ、例えばＰＫＡファミリー（例えばＰＫＧ、ＲＯＣＫＩＩおよびＰＫＣのアイソフォームなど）、ＰＫＢファミリー（例えばＰＫＢ、ＳＧＫ、ＭＳＫ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１及びＳ６Ｋのアイソフォームなど）またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２ファミリー（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３、ＰＲＡＫ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＡＭＰＫ及びＣａＭＫＩＩ）もしくはＣＫ１のアイソフォームとサブファミリーが挙げられる。実施例の一つでは、化合物によりプロテインキナーゼの活性が低下している。その化合物は、例えば実質上可逆的もしくは不可逆的にプロテインキナーゼの活性部位に結合しているのかもしれない。もしくはその化合物は、プロテインキナーゼの活性部位ではないがプロテインキナーゼがその基質と結合するのを妨げるような部位に結合しているのかもしれない。またその化合物は、アロステリック効果によりプロテインキナーゼの活性を低下させるように結合しているのかもしれない。アロステリック効果はプロテインキナーゼ活性に本来的に備わっている調節方法であり、例えば「上流活性化因子」によるプロテインキナーゼの活性化などである。
【００６５】
また、他の実施例では化合物によりプロテインキナーゼの活性が上昇している。その化合物は、例えばプロテインキナーゼの活性部位ではないがプロテインキナーゼがその基質と結合するのを補助するような部位に結合しているのかもしれない。またその化合物は、アロステリック効果によりプロテインキナーゼの活性を上昇させるように結合しているのかもしれない。アロステリック効果はプロテインキナーゼ活性に本来的に備わっている調節方法であり、例えば「上流活性化因子」によるプロテインキナーゼの活性化などである。
【００６６】
共通の基質は、例えば基質とプロテインキナーゼの結合に対する化合物の効果の測定といった結合アッセイにも有用である。
【００６７】
ポリペプチド基質のリン酸化は公知の放射活性を用いた方法により、または上述したような実施例１に用いられる方法により評価してよい。しかしながら、非放射性の方法を用いるのが好ましい。特に、非放射性の方法において、基質ポリペプチドと特異的な結合相手間のリン酸化の状態に特異的な相互作用は、基質ポリペプチドのリン酸化の検出及び量的な評価に利用することができる。チロシンリン酸化基質については好適なテクニックが公知であり（抗リン酸化チロシン抗体を用いる）、これを本発明に応用してもよい。蛍光を用いる方法（またはそれほど好ましくはないが放射性の方法）を用いることが好ましい。
【００６８】
例えば、相互作用は以下に論ずるようなあらゆるタンパク質／タンパク質相互作用の測定／検出方法によって測定してよい。好適な方法としては、公知のＥＬＩＳＡ法、及び蛍光標識された２の物質の結合をその蛍光標識が近接したときの相互作用を測定することにより検出するという公知の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法が挙げられる。表面プラズモン共鳴法もまた用いることができる。特許文献１１及び１２に開示される技術は、本発明に基づいて応用すれば用いることができる。蛍光偏光法（ＦＰ）及び蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を用いてもよい。
【００６９】
基質ペプチドおよび／または結合相手（例えば抗体）の複合体も有用である。例えば、蛍光、ヨウ素またはビオチン標識複合体などである。
【００７０】
当然ながら、高い処理能力を発揮できるスクリーニング法が特に好ましい。非放射性の方法が好ましいが、公知のＳＰＡ系（シンチレーション近接アッセイ、アマシャムインターナショナル）を用いてもよい。例えば、基質ポリペプチドはＳＰＡビーズに固定してもよい。
【００７１】
当然ながら、本発明のスクリーニング法は、（例えば）糖尿病、グリコーゲン代謝の欠陥、癌（黒色腫を含む）、炎症性の症状、例えば卒中、血栓症あるいは血栓傾向などの虚血状態（例えば、抗血栓剤として有用）などの治療に有用である。
【００７２】
本発明のスクリーニング法により同定された「薬らしい化合物」及び「先導化合物」は、さらにスクリーニングすることにより糖尿病、グリコーゲン代謝の欠陥、癌（黒色腫を含む）、炎症性の症状、例えば卒中、血栓症あるいは血栓傾向などの虚血状態の治療に有用であるかどうかが決定される。追加して行われるスクリーニングとしては、必要に応じて血糖レベル、腫瘍の成長または血液凝固の程度／時間に対する化合物の効果などが挙げられる。これは典型的にはげっ歯目を用いて行われる。
【００７３】
本発明の他の側面は、本発明の方法により同定された化合物のプロテインキナーゼまたはホスファターゼの活性の調節への利用である。そうした化合物は、プロテインキナーゼ活性の制御物質として新規であることが好ましい。
【００７４】
以下、本発明を限定的ではない図及び実施例を参照しながら詳細に説明する。
【００７５】
ここに参照されるあらゆる文献は本願に組み入れられる。
【００７６】
実施例１：多数のセリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼの非放射性のアッセイ方法
【００７７】
試料と方法
試薬とペプチド
Ｒｏ３１８２２０、Ｋ２５２ｃ及びＲｏｔｔｌｅｒｉｎはカルビオケム−ノバビオケム社（ラホーヤ、ＣＡ、アメリカ）より購入した。Ｙ２は化学合成により得た。また、ＵＣＮ０１はダンディー大学生命科学校のＣａｒｌ  Ｓｍｙｔｈｅ博士のご厚意により頂いた。ヒストンＨ１はライフテクノロジーズ（パースリー、スコットランド、イギリス）より購入した。ペプチドはすべてＧｒａｈａｍ  Ｂｌｏｏｍｂｅｒｇ博士（ブリストル大学生化学学科、イギリス）及び本学のＦ．Ｂ．Ｃａｕｄｗｅｌｌ氏の合成による。
【００７８】
ペプチドはＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ９０５０またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｉｏｎｎｅｒにより合成することができる（例えば非特許文献２４参照）。
【００７９】
操作手順と品質管理：  ペプチドは合成後、メタノール及びジクロロメタンで洗浄し、最低３時間減圧下で乾燥させる。ペプチドは適当なスカベンジャーを含むＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）により樹脂から開裂させる。スカベンジャーは配列に従って選択され、水、フェノール、エタンジオール、チオアニソール及びトリイソブチルシランを含んでいてよい。また通常９０：１０の比（ここで９０はＴＦＡの％）で用いられる。その後、ＴＦＡ部分をエバポレートし、ペプチドをジエチルエーテルで沈殿させ、洗浄、ペレット化、乾燥した後、凍結乾燥する。必要に応じて逆相ＨＰＬＣにより精製を行う。Ｃ１８カラムから、０．１％ＴＦＡを含む水／アセトニトリル勾配によって溶出させる。精製ペプチドの質量は、ＭｉｃｒｏｍａｓｓＱｕａｔｔｒｏを用いて熱スプレー質量分析法により測定する。
【００８０】
プロテインキナーゼの原料と精製（詳細は（非特許文献４）参照）
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ、Ｓ．Ｈａｗｌｅｙ博士及びＤ．Ｇ．Ｈａｒｄｉｅ博士提供）、ｃＧＭＰ依存型プロテインキナーゼ（ＰＫＧ、ヴュルツブルグ大学（ドイツ）のＳｕｓａｎＬｏｈｍａｎｎ博士及びＵｌｒｉｃｈＷａｌｔｅｒ博士のご厚意による提供）、及び環状ＡＭＰ依存型プロテインキナーゼの触媒サブユニット（ＰＫＡ、Ｃ．Ｓｍｙｔｈｅ博士提供）は、それぞれラット肝臓、ウシ肺及びウシ心臓より単離したものである。これらを除きその他のプロテインキナーゼは、すべてＧＳＴ融合またはＨｉｓタグタンパクのどちらかとして発現させた（本学科のＭｓＣ．Ｃｌａｒｋ氏、ＭｓＦ．Ｄｏｕｇｌａｓ氏、Ａ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ博士、またはＭｓＧ．Ｗｉｇｇｉｒｉ氏による）。発現させたタンパク質は、ラットＲｈｏ依存型プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ−ＩＩ）及びキナーゼ１ａ（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ、ＲＳＫともいう）を活性化するラット有糸分裂因子活性型プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を除き、すべてヒト配列と同等である。ＧＳＴ融合タンパクはＧＳＨ−アガロース（アマシャムファルマシアバイオテック、アマシャム、イギリス）で、またＨｉｓタグタンパクはＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ほぼ取扱説明書に従って精製した。本研究で用いられたすべてのプロテインキナーゼは、カルモジュリン依存プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）のα−アイソフォーム、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３及びＰＫＧを除き、アップステートバイオテクノロジー社（レイクパラシッド、ＮＹ、アメリカ）より購入可能である。
【００８１】
大腸菌により発現させたプロテインキナーゼ
以下の酵素はＧＳＴ融合タンパクとして大腸菌により発現させた。細胞外シグナル調節型プロテインキナーゼ−２（ＥＲＫ２）およびストレス活性化プロテインキナーゼ−２ａ（ＳＡＰＫ２ａ、ｐ３８とも呼ばれる）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３、ＣａＭＫＩＩ（カルビオケム−ノバビオケム社）およびチェックポイントキナーゼ２（ＣＨＫ２）。ＣＨＫ２は全長生成物の精製を補助するために、Ｃ末端側の端部に補足的にＨｉｓタグを含む。ＥＲＫ２はＲａｆ活性化ＭＡＰＫキナーゼ１（ＭＫＫ１）により活性化した、またＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８は、ＭＫＫ６の構成性の活性突然変異体を用いて活性化した。ＭＫＫ１とＭＫＫ６もＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌により発現させた。
【００８２】
Ｓｆ２１細胞により発現させたプロテインキナーゼ
以下の酵素はＳｆ２１細胞により発現させた。チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＫ１）およびｐ３８調節／活性化キナーゼ（ＰＲＡＫ）プロテインキナーゼＢα（ＰＫＢα）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ、及び血清およびグリココルチコイド誘導キナーゼ１（ＳＧＫ１［Ｓ４２２Ｄ］）、Ｎ末端５９残基を欠く）、有系分裂促進物質、およびストレス活性化プロテインキナーゼ（ＭＳＫ１）、ｐ７０のリボソームのＳ６キナーゼ１（Ｓ６Ｋ１［Ｔ４１２Ｅ］）、Ｃ末端１０４残基を欠く）、ｃ−Ｒａｆ、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ（ＰＫＣα、カルビオケム−ノバケム社）、ラットＲＯＣＫＩＩ［１−５４３］）。
【００８３】
プロテインキナーゼの活性化
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３はＭｇＡＴＰ及び細胞外シグナル調節型プロテインキナーゼ−２（ＥＲＫ２）により、ＥＲＫ２はＭＡＰＫキナーゼ−１（ＭＫＫ１）により、ＭＫＫ１はＲａｆにより、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８はＭＫＫ６により、ＰＲＡＫはＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８により、ＰＫＢα、ＳＧＫ１及びＳ６Ｋ１はＰＤＫ１により活性化した。
【００８４】
抗体
以下の結果に記載する、３種の一般的なペプチド基質に含まれる共通した７残基であるリン酸化したモチーフ（ＬｐＳＦＡＥＰＧ）を認識する抗体を、ペプチドＬｐＳＦＡＥＧＣ（ここでｐＳはリン酸セリンを表す）に対して産生させた。Ｃ末端のシステイン残基は、キーホールリンペットヘモシアニンと結合できるように追加したものである。ペプチド−タンパク複合をディアグノスティックスコットランド（カールーク、イギリス）社のヒツジに注射し、抗血清をプロテインＧ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテック）により精製した（本学のＪ．Ｌｅｉｔｃｈ博士による）。抗体は、イムノブロットに対しては２μｇ／ｍｌの濃度で、また改良ＥＬＩＳＡ法におけるリン酸化ペプチドの検出には１０−２０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ウサギ抗ヤギ抗体のペルオキシダーゼ複合体は、ピアス（タッテンホール、チェシア、イギリス）より購入し、１／１０，０００に希釈して使用した。
【００８５】
キナーゼのアッセイ
すべてのプロテインキナーゼアッセイは、時間に対してリニアであった。標準的なペプチド基質を用いたアッセイについては前述している（非特許文献４）。本実施例で紹介される一般的な３のペプチドを使ったアッセイは、すべて以下の同じ緩衝液を用いて行われた。非標識のまたはビオチン標識した基質ペプチドを、０．１ｍＭ（γ３２Ｐ）ＡＴＰの存在下で、５０μｌの反応液中で３０度１０分間アッセイした。放射性のアッセイは、反応液の４０μｌをリン酸セルロース紙にスポットし、続いて７５ｍＭリン酸溶液に浸漬することで停止させた。リン酸セルロース紙はすべてリン酸で３回、アセトンで１回洗浄し、乾燥させて放射活性を測定した。非放射性のアッセイは、終濃度が２０ｍＭとなるようにＥＤＴＡを加えて停止させ、Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含む等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した後、反応により捕獲されたペプチドを洗浄済みのストレプトアビチンでコートした９６穴プレート（ＥｑｕｉｌｏｎＡ／Ｓ、Ｖｅｄｂａｅｋ、デンマーク）で６０分間ビオチン化した。そのプレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ、ＰＢＳで６回洗浄（各５分）し、その後一般的なリン酸特異的抗体（上記参照）に対して産生された抗体（１０〜２０μｇ／ｍｌ）を６０分間反応させた（上記参照）。プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ、ＰＢＳで６回洗浄（各５分）し、ペルオキシダーゼ複合抗ヤギ抗体（ピアス）をプレートに反応させてリン酸特異的な抗体の結合を検出した。プレートはさらに上記と同様に６回洗浄し、結合を増感化学ルミネッセンス（アマシャムファルマシアバイオテック）を用いて富士フイルムＬＡＳ−１０００  ＣＣＤカメラで可視化した。シグナルはＬＡＳ−１０００ＩＲソフトウェア（富士フイルム）により量的評価した。
【００８６】
結果と考察
一般的なペプチド基質の作製
上述のように、多くのプロテインキナーゼは特定のアミノ酸モチーフ状のセリン残基をリン酸化する。我々は、多くのプロテインキナーゼをアッセイでき、単リン酸特異的な抗体を産生するのに使用できそうな、共通のＣ末端エピトープを持つ多数のペプチドを試験した。その結果、表１に示すような、ＰＫＢによりリン酸化されるグリコーゲン合成酵素キナーゼ３を取り囲む配列に関連する共通した７残基を含む３の包括的ポリペプチドの作製に至った。標準的な放射性のフィルター結合アッセイによると、これらの３のポリペプチドの１以上が数種の異なるキナーゼサブファミリーに分類される１６のプロテインキナーゼにより十分にリン酸化された。実際、多くの場合、これらの３のペプチドが十分にリン酸化されていることが明らかとなったほか、通常のアッセイに常用される基質よりも十分にリン酸化される場合もあった。
【００８７】
表１：種々のポリペプチドによるペプチドのリン酸化における速度論のパラメータ
【００８８】
ＰＫＢα、ＳＧＫ１、ＭＳＫ１、Ｓ６Ｋ１、ＰＫＡ、ＰＫＧ、ＲＯＣＫＩＩ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３、ＰＲＡＫ、ＣＨＫ１およびＣＨＫ２は、５０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．５、０．１のｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール、０．０１％（ｗ／ｖ）のＢｒｉｊ−３５中で、ＡＭＰＫは５０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１ｍＭのジチオスレイトール、０．０２％のＢｒｉｊ−３５および０．２ｍＭのＡＭＰ中で、ＰＫＣαは２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、０．０３％のトリトンＸ−１００、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌのフォスファチジルセリンおよび１０μｇ／ｍｌのジオレオイル−ｓｎ−グリセロール中で、及びＣａＭＫＩＩは５０のｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ  ７．４、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０３ｍｇ／ｍｌのカルモジュリン中でアッセイした。この実施例中で作製した３の包括的ペプチドに対するＶｍａｘ値は各プロテインキナーゼの標準的なペプチド基質に対するものである。標準的なペプチド基質（一字のアミノ酸コード）は、−ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＢＧ（ＰＫＢα、ＳＧＫ１）、ＬＲＲＡＳＬＧ（ＭＳＫ１、Ｓ６Ｋ１、ＰＫＡ）、ＫＥＡＫＥＫＲＱＥＱＩＡＫＲＲＲＬＳＳＬＲＡＳＴＳＫＳＧＧＳＱＫ（ＲＯＣＫ−ＩＩおよびＰＫＧ）、ＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡ（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３）、ＫＫＬＲＲＴＬＳＶＡ（ＰＲＡＫ）、ＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲ（ＣＨＫ１とＣＨＫ２）、ＨＭＲＳＡＭＳＧＬＨＬＶＫＲＲ（ＡＭＰＫ）、ＭＨＲＱＥＴＶＤＣＬＫ（ＣａＭ−ＫＩＩ）、ヒストンＨ１（ＰＫＣ）である。
【表１−１】
2005522518.tif 000003
【表１−２】
2005522518.tif 000004
【００８９】
ＰＫＣはペプチドＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ  Ｇｌｙ（表１）を用いて完全にアッセイすることができたが、この基質はこのプロテインキナーゼのアッセイに用いられてきた他の基質よりも劣っていた。これは、ＰＫＣがリン酸化部位のＮ末端に加えてＣ末端にも塩基性の残基を好み、それはこのエピトープには存在しないためである（非特許文献５）。
【００９０】
共通のＣ末端エピトープに対するリン酸特異的な抗体の作製
本研究の主な目的は、簡潔に言えば、非放射性であり多数のプロテインキナーゼに応用できるアッセイ法による、プロテインキナーゼの「高い処理能力のスクリーニング」である。このために、我々は３の包括的基質に共通なリン酸化エピトープ（ＬｐＳＦＡＥＰＧ）を認識できるリン酸特異的な抗体を作製した（方法を参照）。この抗体は＜１０ｎｇの複合リン酸ペプチド抗原を認識する（図１）。リン酸化した状態の３の包括的基質ペプチドを認識する抗体の能力は、競合実験により確証した。この実験では、リン酸化ペプチド抗体は７残基のリン酸−ペプチド抗原による前反応だけでなく、各リン酸化された一般的なペプチド基質による前反応によっても無力化された。対照的に、リン酸化されていない状態の同様なペプチドは、抗体を無力化することができなかった（図１）。
【００９１】
多種のプロテインキナーゼに対する非放射性アッセイ法の開発
続いて、３の包括的ペプチドを上記のリン酸特異的な抗体と共に用いて、表１に示す一連のプロテインキナーゼに対するＥＬＩＳＡ法を基礎とした非放射性の簡便なアッセイ法を構築した（方法参照）。アッセイは標準的な放射性のフィルター結合アッセイと平行して行い、またペプチドの１０％未満がリン酸化されるような直線的な反応速度となる状態で行った（図２）。その結果、非放射性のアッセイは標準的な放射性のアッセイと同様な精度を持ち、用いたプロテインキナーゼに対する公知な阻害物質の存在下では両者で同等な程度に阻害が認められた（非特許文献５）。
【００９２】
結論
この実施例では、多種のプロテインキナーゼに対する高い処理能力のスクリーニングに好適な非放射性の簡便なアッセイ法について述べた。３種のペプチドは今回実験したプロテインキナーゼに深く関連するあらゆるアイソフォームの基質として、またおそらくすべてではなくもほぼすべての同じキナーゼサブファミリーに属するプロテインキナーゼの基質として用いることができると考えられる。また、同じＣ末端エピトープを持つペプチドもまた、リン酸化部位のＮ末端側にある特定のモチーフを認識する他のプロテインキナーゼのアッセイに用いることができると考えられる。例えば、ＣＫ１（カゼインキナーゼ１と呼ばれる）は、あるリン酸セリン残基から３残基Ｃ末端側のセリン残基をリン酸化する（非特許文献１０）。即ち、Ｘａａ−ｐＳｅｒ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ型のペプチドをリン酸化することができる。従って我々の方策は、少なくとも５０、おそらく１００以上のプロテインキナーゼに応用することができると考えられる。今回開発したアッセイ法は、リン酸化部位のＣ末端側のモチーフもしくは残基に厳格な要求があるプロテインキナーゼには利用することができない。例えば、ＭＡＰキナーゼ及びサイクリン依存型プロテインキナーゼはリン酸化部位に隣接するＣ末端側にプロリン残基が必ず必要であり（非特許文献５）、これは本実施例のプロテインキナーゼにとっては否定的な決定基となる。同様に、ＣＫ２はリン酸化部位のＣ末端側に数個の連続した酸性基が必要であり、またＤＮＡ依存プロテインキナーゼはＣ末端グルタミン酸が必要である（非特許文献５）。しかしながら、ここに示す結果によれば、共通のＮ末端エピトープを持つ２番目のペプチド基質はリン酸化において特定のＣ末端モチーフを要求する多数のプロテインキナーゼのアッセイに有用である。
【００９３】
実施例２
モノクローナル抗体の作製ペプチドを、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）であるキャリアタンパクと結合させることができる。キャリアタンパク（たとえばＫＬＨ）は、約１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解させる。ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のジメチルホルムアミド溶液を調製する。０．１体積のＭＢＳを、部分的に高濃度とならないよう撹拌しながらキャリアタンパク溶液に滴下する。１ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌペプチド溶液を添加する。活性化したキャリアと結合しなかったペプチドをＰＢＳを用いてＰ１０カラムで分離する。
【００９４】
モノクローナル抗体を非特許文献２５に記載される方法を用いて作製する。ハイブリドーマの作製に続いて、培養液上清から産生したＩｇＧをプロテインＡ結合マトリックスのクロマトグラフィーにより精製する。続いて、リン酸特異的な抗体を以下のプロトコルを用いて免疫アフィニティー精製により精製する。
【００９５】
常法によりリン酸化ペプチドのアフィニティーカラムを作製する。また、常法により脱リン酸化されたペプチドのアフィニティーカラムを作製する。作製した“リン酸”カラムを１ｘＴＳＢ／Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％で１回洗浄する。抗体血清（例えば４０ｍｌ）を１ｘＴＳＢ／Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％３倍に希釈して、０．２μｍのフィルターでろ過する。希釈した血清をカラムに２度流す。カラムを２０ｍＭトリスｐＨ７．５＋０．４ＭＮａＣｌでＯＤ５９５ｎｍが０．００３未満となるまで洗浄する（結合していない抗体／タンパクを除去するため）。２００μｌの１．５ＭトリスｐＨ８、０を入れた１．５ｍｌエッペンドルフへ５０ｍＭグリシンｐＨ２．５で溶出させて、１ｍｌの画分とする。画分のタンパク濃度をブラッドフォード法により確認する。タンパク濃度が高い画分（＞０．２ｍｇ／ｍｌ）を回収する。４度で一晩静置する。タンパク濃度を再度測定する。
【００９６】
“脱リン酸”カラムをカラム体積の２倍の１ｘＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％で洗浄する。カラムに上記の画分を流す。溶出液を回収する。これがリン酸化した形態のペプチドに特異的な抗体となる。タンパク濃度を測定し、−２００度で保存する。“リン酸”及び“脱リン酸”カラムをカラムの２倍の体積の１％ＳＤＳで洗浄する。カラムを２０％エタノール中で保存する。再利用に際しては、１ｘＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％で洗浄する前に、１０ｘＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０  １％で洗浄する。
【００９７】
実施例３
化合物のスクリーニング法
相同ＦＲＥＴ分析法を用いて、対象とする化合物をビオチン化ペプチド基質、酵素及びユーロピウム標識抗体にストレプトアビジンＡＰＣを含む緩衝液中で反応させた。ペプチドのリン酸化によりユーロピウム標識抗体が基質に結合し、ユーロピウムがＡＰＣと近接する。その結果、ユーロピウムからＡＰＣへの電子転移が可能となり、励起波長６１０ｎｍ、放射波長６６０ｎｍにて測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】エピトープＬｐＳＦＡＥＰＧを認識するリン酸特異的な抗体の産生。ウシ血清アルブミンと複合化したペプチドＬｐＳＦＡＥＰＧＣの一部（１０ｎｇまたは１００ｎｇ）をニトロセルロース膜にスポットし、右側に示すペプチドの存在または非存在下において、リン酸ペプチド抗原に対して産生されたリン酸特異的抗体によりイムノブロットを行った。“Ｓ”の直前の“ｐ”はペプチドのセリンがリン酸化された状態であることを示す。
【図２】新規なＥＬＩＳＡ法を基礎とするプロテインキナーゼ系のアッセイと標準的な放射性フィルター結合アッセイの比較。図示するプロテインキナーゼを、ペプチド基質ＰＡＲＴＬＳＦＡＥＰＧ（Ａ）、ＫＫＬＮＲＴＬＳＦＡＥＰＧ（Ｂ）及びＲＲＲＬＳＦＡＥＰＧ（Ｃ）を用いて図示するキナーゼ阻害物質の存在または非存在下においてＥＬＩＳＡ法（白ヌキのグラフ）または標準的な放射性のアッセイ（黒グラフ）によりアッセイした。結果を４の測定結果（２の独立した実験）について、標準誤差として阻害物質が存在しない状態のコントロールと共に示す。他の実験についても同様の結果が得られた。
【図１】
2005522518.tif 000005
【図２】
2005522518.tif 000006
【配列表】
2005522518000001.app
【国際調査報告】
2005522518.tif 000007
2005522518.tif 000008
2005522518.tif 000009