(57)【要約】本発明は、結合ポリペプチド上の特定の部位に核酸を非酵素的に共有結合する方法を提供する。これらの方法は、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを多量に産生できる。部位特異的核酸連結結合ポリペプチドは、標的検体を検出し且つ定量化するための正確で且つ感度のよい方法に使用される。したがって、本発明は、標的検体の検出に使用される部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを製造する経済的で且つ容易な方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的核酸連結結合ポリペプチドの形成方法であって、以下の工程：
（ｉ）組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＤＮＡ分子を細胞内に導入する工程、ここで当該組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子が、結合ポリペプチド成分上の所定の部位に遺伝子操作されたインテイン成分を含む；
（ｉｉ）上記細胞から上記組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子を単離する工程；
（ｉｉｉ）上記インテイン成分が求核分子で置換されることを許容する条件下で、上記組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子を当該求核分子と接触させて、結合ポリペプチド成分と第一結合を通して共有結合される求核分子成分とを含む結合ポリペプチド中間体を作製する工程；
（ｉｖ）上記求核分子成分が置換核酸で置換されることを許容する条件下で、上記第一結合を上記置換核酸と接触させて、結合ポリペプチド成分と第二結合を通して共有結合される置換核酸成分とを含む部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを形成する工程、ここで当該置換核酸が、第一求核分子基を含む；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記求核分子がチオール及びアルコールからなる群から選択され；
前記第一求核分子基がスルフヒドリル及びヒドロキシルからなる群から選択され；そして
前記第一結合及び前記第二結合が、チオエステル及びエステルからなる群から独立して選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記置換核酸が、組み換え核酸成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記置換核酸が第二求核分子基をさらに含み、上記記第二求核分子基が前記第一求核分子基を置換して、前記結合ポリペプチド成分と前記置換核酸成分との間に第三結合を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第二求核分子基が、ヒドロキシル及びアミノからなる群から選択され、
前記第三結合が、エステル及びアミドからなる群から選択される、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記求核分子が、ＨＳ−Ｒ（式中、Ｒが、置換又は未置換アルキル、置換又は未置換ヘテロアルキル、置換又は未置換シクロアルキル、置換又は未置換ヘテロシクロアルキル、置換又は未置換アリール及び置換又は未置換ヘテロアリールからなる群から選択される）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記求核分子が、チオフェノール及び２−メルカプトエタンスルホン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｖ）の前に、置換核酸を形成する工程であって、置換ヌクレオチドをポリメラーゼ及び二本鎖核酸と接触させて二本鎖置換核酸を形成することを含む工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記二本鎖核酸が第一末端及び第二末端を含み、ここで、
（ａ）上記第一末端及び上記第二末端を、酵素及び置換ヌクレオチドと接触させて第一末端求核分子基と第二末端求核分子基とを含む（ビス）置換核酸を形成し；そして
（ｂ）上記（ビス）置換核酸をヌクレアーゼと接触させて少なくとも２つの二本鎖置換核酸を形成する
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素が、ポリメラーゼ及びリガーゼから選択される群のメンバーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉｖ）の前に、前記置換核酸を形成する工程を含み、ここで上記工程が、置換ホスホルアミダイトを核酸と接触させて、置換核酸を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合ポリペプチドが、抗体、ホルモン、及び細胞表面受容体からなる群から選択さる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
試料中の標的検体の存在を検出する方法であって、以下の工程：
（ｉ）標的検体を部位特異的核酸連結結合ポリペプチドと接触させて、標的検体複合体を形成する工程、ここで当該部位特異的核酸連結結合ポリペプチドが、核酸成分及び上記標的検体が特異的に結合する結合ポリペプチド成分を含み、ここで当該部位特異的核酸連結結合ポリペプチドが非酵素的に形成される；
（ｉｉ）上記標的検体複合体の核酸成分を核酸ポリメラーゼと接触させて複数の核酸ディテクターを形成する工程；
（ｉｉｉ）上記核酸ディテクターを検出し、それにより上記試料中の上記標的検体の存在を検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項１４】
前記検出が、定量化によるものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸ポリメラーゼが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸ポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が、少なくとも２種の異なる標的検体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｉ）の前に、前記標的検体を固体支持体上に固定することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的検体が、液相中に存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的検体が、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、ビタミン、ウイルス、細菌、及び無機分子からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
試料中の標的検体を検出する方法であって、以下の工程：
（ｉ）標的検体を部位特異的核酸連結結合ポリペプチドと接触させて標的検体複合体を形成する工程、ここで当該部位特異的核酸連結結合ポリペプチドが、リボ核酸成分に共有結合する結合ポリペプチド成分を含み、ここで当該リボ核酸成分が一本鎖デオキシリボ核酸検出分子に非共有結合する；
（ｉｉ）上記デオキシリボ核酸検出分子から上記リボ核酸成分を分離する工程；
（ｉｉｉ）リボヌクレアーゼで上記リボ核酸成分を分解する工程、
（ｉｖ）上記一本鎖デオキシリボ核酸検出分子をＤＮＡポリメラーゼと接触させて二本鎖デオキシリボ核酸検出分子を形成する工程；
（ｖ）上記二本鎖デオキシリボ核酸検出分子をＲＮＡポリメラーゼと接触させて複数のリボ核酸検出分子を形成する工程；
（ｖｉ）上記リボ核酸検出分子を検出し、それにより上記試料中の上記標的検体を検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項２２】
前記検出が、定量化によるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的検体が、タンパク質、炭水化物、核酸、ウイルス、細菌、及び無機分子の群から選択されるメンバーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料が、少なくとも２種の異なる標的検体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｉ）の前に、前記標的検体を固体支持体上に固定することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的検体が、液相中に存在する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記一本鎖デオキシリボ核酸検出分子が、前記リボ核酸成分を逆転写酵素と接触させることにより形成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであり；そして
前記二本鎖デオキシリボ核酸検出分子が、Ｔ７プロモーター配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0002]  化学分子及び生体分子の検出及び定量化は、学問的領域と工業的領域との両方において非常に重要である。ＥＬＩＳＡ系免疫吸着剤アッセイ、タンパク質生体素子等をはじめとする種々の検出法が現在利用できる。しかしながら、最近では、核酸標識ポリペプチド分子の使用に基くより感度の高い検出法が開発された。
【０００２】
[0003]  核酸標識ポリペプチド分子を用いて検体を検出することにより、迅速な応答時間で感度よく検出がなされる。典型的には、核酸標識ポリペプチドは、検体に結合するポリペプチド成分、並びに検出可能なシグナルを提供する核酸標識を含む。この核酸標識は、通常ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅することにより検出される。得られた核酸増幅産物を、次にゲル電気泳動や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の確立された方法により検出する。この核酸増幅産物が検出されることは、核酸標識ポリペプチドのポリペプチド成分により、検体が結合して存在することに相当する。
【０００３】
[0004]  現在利用できる核酸標識ポリペプチド分子には、いくつかの欠点がある。例えば、核酸は、核酸標識ポリペプチドのポリペプチド成分に非共有結合することができる（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン結合系）。しかしながら、この非共有相互作用は、種々の溶液条件下で容易に分裂される。したがって、非共有的に核酸が標識されたポリペプチドは、実用性には限界がある。他の方法では、核酸は、グルタルアルデヒド等の公知の架橋剤を用いてポリペプチド成分に非特異的に共有結合されている。しかしながら、これらの方法では、ポリペプチド上の未知の位置に不明確な数の核酸標識を有する核酸標識ポリペプチドが生成する。したがって、架橋核酸標識ポリペプチドを用いた検出及び定量の結果は、あいまいであるか、不正確である。ポリペプチドに対して核酸を結合させる別の方法では、例えば、リボソーム酵素を使用してピューロマイシン置換核酸をポリペプチドに共有結合させる。しかしながら、これらの酵素法は、収率が低く、時間がかかり且つ高価である。
【０００４】
[0005]  したがって、当該技術分野においては、化学分子及び生体分子を検出及び定量化する感度がよく且つ効率的な方法が必要とされている。さらに、当該技術分野においては、核酸をポリペプチドに部位特異的に結合する、安価で且つ効率的な方法が必要とされている。本発明は、これら及び他の問題を解決できる。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
[0006]  本発明によれば、高価な酵素を使用することなく、結合ポリペプチド上の特定の部位に核酸を共有結合する方法が提供される。これらの方法では、多量の部位特異的核酸連結結合ポリペプチドが生成される。部位特異的核酸連結結合ポリペプチドは、標識検体を検出及び定量化するための正確且つ感度のよい方法に使用される。したがって、本発明によれば、標識検体の検出に使用される部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを製造する、経済的且つ容易な方法が提供される。
【０００６】
[0007]  すなわち、本発明の第一の態様によれば、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドの形成方法が提供される。この方法では、組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＤＮＡ分子を細胞に導入することを含む。前記組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子は、結合ポリペプチド成分上の所定の部位に遺伝子操作されたインテイン成分を含む。前記組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子は、細胞から単離される。求核分子をインテイン成分で置換することを可能とする条件下で、単離されたポリペプチド−インテイン分子を求核分子と接触させて結合ポリペプチド中間体を形成する。置換核酸と結合ポリペプチドとの間で部位特異的結合を形成できる条件下で、得られた結合ポリペプチド中間体を置換核酸と接触させて、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを形成する。
【０００７】
[0008]  本発明の第二の態様によれば、試料中の標識検体の存在を検出する方法が提供される。これらの方法では、標的検体を部位特異的核酸連結結合ポリペプチドと接触させて標的検体複合体を形成することを含む。この部位特異的核酸連結結合ポリペプチドは、核酸成分と、前記標的検体が特異的に結合する結合ポリペプチド成分とを含む。前記標的検体複合体の核酸成分と核酸ポリメラーゼとを接触させて複数の核酸ディテクターを形成する。前記核酸ディテクターを検出することにより、前記試料中の前記標的検体の存在を検出する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
発明の詳細な記述
定義
[0015]  特記のない限りは、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、一般的に本発明が属する当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用される命名法並びに細胞培養、分子遺伝学、遺伝子工学、組み換えＤＮＡ技術、有機化学、核酸化学及びハイブリダイゼーションにおける実験法は、当該技術分野において周知であり且つ一般的に用いられているものである。核酸合成及びペプチド合成には、標準的手法を用いる。これらの手法及び手順は、一般的に本明細書全体を通じて記載する当該技術分野及び種々の一般的な文献における通常の方法で実施される（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照、該文献は本明細書中に援用される。）。本明細書で使用される命名法及び以下で記載する分析化学及び有機合成化学における実験法は、当該技術分野において周知及び一般的に用いられているものである。標準的な手法又はその改良法を、化学合成及び化学分析に使用する。
【０００９】
[0016]  本明細書で使用される用語「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖又はそれ以上の高度に凝集したハイブリダイゼーションモチーフ及びいずれかのその化学的修飾を意味する。修飾には、概して追加の電荷、分極率、水素結合、静電相互作用、並びに核酸リガンド塩基に対する官能性又は核酸リガンドに対する官能性を組み込む化学的基を付与するものなどがあるが、これらには限定されない。このような修飾には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホジエステル基修飾（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート）、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルの置換、主鎖修飾、メチル化、異常塩基対の組み合わせ、例えば、イソ塩基、イソシチジン及びイソグアニジン等があるが、これらには限定されない。また、核酸は、非天然塩基、例えば、ニトロインドールを含むことができる。また、修飾は、３’及び５’修飾、例えば、フルオロフォア又は他の成分でのキャッピングを含むことができる。
【００１０】
[0017]  本明細書で使用される「組み換え」分子は、遺伝子又は遺伝子の一部が遺伝子工学的手法により組み合わせられた、遺伝子又は遺伝子の一部から得たか、それらを含有する分子を意味する。したがって、「組み換えＤＮＡ分子」は、遺伝子工学的手法により組み合わせられた遺伝子又は遺伝子の一部を含むＤＮＡ分子であり、「組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子」は、遺伝子工学的手法を用いて組み合わせた結合ポリペプチドとインテインを含む分子である。
【００１１】
[0018]  本明細書で使用される「所定の部位」とは、第二分子を結合しようとする第一分子上の特定の部位を意味する。
【００１２】
[0019]  「成分」は、化学分子の一つの成分、一部、又は部分を意味する。例えば、「核酸成分」は、核酸を含有する分子の成分を意味し、「結合ポリペプチド成分」とは、結合ポリペプチドを含有する分子の成分を意味する。
【００１３】
[0020]  「部位特異的核酸連結結合ポリペプチド」は、結合ポリペプチド上又は内の特定の位置で結合ポリペプチドに共有結合した核酸成分を意味する。典型的には、この共有結合は、アミド結合、エステル結合又はチオエステル結合である。
【００１４】
[0021]  「ペプチド」とは、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合により一緒に接合しているポリマーを意味する（ポリペプチドとも称される）。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニンも含まれる。遺伝子によりコードされていないアミノ酸も、本発明で使用することができる。さらに、反応性基、グリコシル化部位、ポリマー、治療用成分、生体分子等を含むように修飾したアミノ酸も、本発明に使用することができる。本発明に使用されるアミノ酸の全ては、Ｄ体又はＬ体であることができる。Ｌ体が、一般的に好ましい。さらに、他のペプチドミメティクスも、本発明に有用である。本明細書で使用される「ペプチド」とは、グリコシル化ペプチド及び非グリコシル化ペプチドの両方を意味する。また、ペプチドを発現する系により不完全にグリコシル化されたペプチドも含まれる。一般的な参考文献として、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ（アミノ酸、ペプチド及びタンパク質の化学及び生化学）、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）を参照のこと。
【００１５】
[0022]  用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸ばかりでなく、天然アミノ酸と同様な方法で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸ミメティクスを意味する。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされているものだけでなく、後で修飾したアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンがあげられる。アミノ酸アナログは、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合するα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン・スルホキシド及びメチオニン・メチル・スルホニウムを意味する。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド主鎖を有しているが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸ミメティクスは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なるが、天然アミノ酸と類似のように機能する構造を有する化学化合物を意味する。
【００１６】
[0023]  「結合ポリペプチド」は、標的検体に特異的に結合することができるペプチドを意味する。「特異的に結合」又は「特異的に結合する」とは、２つの分子の間の結合の相互作用の強さを意味する。典型的には、特異的に結合する２つの分子は、少なくともマイクロモル範囲の解離定数（ＫD）を有する。結合ペプチドは、水素結合、ファンデルワールス力及び疎水的相互作用等の種々の公知の分子間相互作用により結合することができる。本明細書で使用される「連結」とは、共有結合による結合を意味する。
【００１７】
[0024]  本明細書で使用される「インテイン(ｉｎｔｅｉｎ)」とは、インテインが結合ポリペプチドに共有結合するときに、求核分子により置き換えられる（切除又は切断とも称される）ことができるペプチド又はペプチド成分を意味する。インテインは、組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子の結合ポリペプチド成分とインテイン成分との間にチオエステル結合（システインの場合）又はエステル結合（セリン又はスレオニンの場合）を形成できる少なくとも一つのシステイン、セリン又はスレオニンアミノ酸残基を有する。システインのスルフヒドリル又はセリン若しくはスレオニンのヒドロキシルは、求核分子として作用して、インテイン成分を結合ポリペプチド成分に結合するアミド結合のアミノ官能性を置き換える。
【００１８】
[0025]  本明細書で使用される「求核分子」とは、電子対受容体と共有結合を形成できる非結合電子対を有する求核原子を有する分子を意味する。求核原子としては、例えば、ヒドロキシル成分の酸素、アミノ成分の窒素、又はスルフヒドリル成分のイオウなどがある。カルボキシル成分の炭素原子等の種々の電子対受容体（当該技術分野では、ルイス酸とも称される）は、本発明において有用である。求核分子が別の分子に共有結合している場合、「求核成分」と称される。例えば、チオフェノールは、求核イオウ原子を含む求核分子である。チオフェノールが共有チオエステル結合を通して結合ポリペプチドに結合しているとき、このチオフェノール求核分子は、「求核分子成分」である。
【００１９】
[0026]  「チオエステル」は、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−成分を有するヘテロアルキレン（以下で定義する）を意味する。したがって、「チオエステル結合」は、チオエステル・ヘテロアルキレンを有する共有結合を意味する。
【００２０】
[0027]  「結合ポリペプチド中間体」は、求核分子成分に共有結合した結合ポリペプチドを意味する。「結合ポリペプチド−チオエステル中間体」は、チオエステル結合をとおして結合ポリペプチドが求核分子成分に共有結合している結合ポリペプチド中間体を意味する。「結合ポリペプチド−エステル中間体」は、エステル結合を通して結合ポリペプチドが求核分子成分に共有結合している結合ポリペプチド中間体を意味する。
【００２１】
[0028]本明細書で使用される「置換核酸」は、少なくとも一つの求核基で置換された核酸を意味する。本明細書で使用される「求核基」とは、電子対受容体と共有結合を形成できるスルフヒドリル、アミノ又はヒドロキシル等の成分を意味する。「スルフヒドリル置換核酸」とは、少なくとも一つのスルフヒドリル求核基で置換された置換核酸を意味する。「（ビス）置換核酸」とは、各末端で少なくとも一つの求核基で置換された二本鎖核酸を意味する。「スルフヒドリル」は−ＳＨを意味し、「ヒドロキシル」は−ＯＨを意味し、「アミノ」は−ＮＨ2を意味する。
【００２２】
[0029]  「標的検体」とは、検出が望まれる分子を意味する。
【００２３】
[0030]  「非酵素的に」とは、所定のプロセス又は方法おいて酵素（単一又は複数）が存在しないことを意味する。「酵素」とは、特異的反応を触媒するタンパク質であって、該反応で中では酵素が反応で消費されないタンパク質を意味する。したがって、「酵素」は、規定された回転率で複数の反応を触媒することができる。
【００２４】
[0031]  用語「単離された」とは、物質を産生するのに使用される成分を実質的に本質的に含有しない物質を意味する。例えば、本発明の組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子は、組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子が、この組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子を調製するのに使用される混合物における物質を通常付随する成分を実質的に含有しないとき、「単離」されているという。「単離された」と「純粋な」とは、同義的に使用される。典型的には、本発明の分子は、好ましくは範囲で表される純度レベルを有する。分子について、純度範囲の下端は、約６０％、約７０％又は約８０％であり、純度範囲の上端は約７０％、約８０％、約９０％又は約９０％超である。
【００２５】
[0032]  用語「アルキレン」は、それ自体又は別の置換基の一部分として、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−により例示されるがこれには限定されないアルカン由来の二価の基を意味し、さらに、「ヘテロアルキレン」として以下に記載する基を含む。典型的には、アルキル（又はアルキレン）基は、炭素数１〜２４個を有し、本発明では炭素数１０個以下の基が好ましい。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、一般的に炭素数８個以下の短鎖アルキル又はアルキレン基である。
【００２６】
[0033]  用語「アルキル」は、それ自体又は別の置換基の一部分として、特記のない限りは、完全飽和でもよいし、一又は多未飽和でもよい直鎖若しくは分岐鎖又は環状炭化水素基又はそれらの組み合わせを意味し、所定の炭素数を有する二価及び多価のラジカルを含む（すなわち、Ｃ1−Ｃ10は、１〜１０個の炭素を意味する）。飽和炭化水素ラジカルとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル等の基、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等のホモログ及び異性体があげられるが、これらには限定されない。未飽和アルキル基は、一以上の二重結合又は三重結合を有するアルキル基である。未飽和アルキル基としては、例えば、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−プロピニル、３−プロピニル、３−ブチニル、並びにそれより高級なホモログ及び異性体があげられるが、これらには限定されない。用語「アルキル」とは、特記のない限りは、「ヘテロアルキル」等の以下で詳細に定義されるアルキルの誘導体を含むことも意味する。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と称される。
【００２７】
[0034]  用語「ヘテロアルキル」は、それ自体又は別の用語との組み合わせにおいて、特記のない限りは、定めた数の炭素原子とＯ、Ｎ、Ｓｉ及びＳからなる群から選択された少なくとも１個のヘテロ原子からなり、窒素原子及びイオウ原子が任意に酸化されていてよく、且つ窒素ヘテロ原子は任意に四級化されていてよい、安定な直鎖若しくは分岐鎖又は環状炭化水素ラジカル又はそれらの組み合わせを意味する。ヘテロ原子（単一又は複数）Ｏ、Ｎ、Ｓ及びＳｉは、ヘテロアルキル基のいずれかの内部の位置、又はアルキル基が分子の残りに結合している位置に位置していてもよい。この例としては、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ3、−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ3、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ3、−Ｓｉ（ＣＨ3）3、−ＣＨ2−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ3、及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ3などがあるが、これらには限定されない。２個以下のヘテロ原子は、例えば、−ＣＨ2−ＮＨ−ＯＣＨ3及び−ＣＨ2−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ3）3などのように連続していてもよい。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体又は別の置換基の一部分として、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−及び−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2−により例示されるがこれらには限定されないヘテロアルキル由来の二価のラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基については、ヘテロ原子は、鎖末端の一方又は両方を占めてもよい（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ等）。さらに、アルキレン及びヘテロアルキレン結合基については、結合基の向きは、結合基の式が書かれている方向によっては示されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）2Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）2Ｒ’−及び−Ｒ’Ｃ（Ｏ）2−の両方を示す。
【００２８】
[0035]  用語「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」は、それら自体又は他の用語との組み合わせにおいて、特記のない限りは、それぞれ「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環状物を表す。さらに、ヘテロシクロアルキルについては、ヘテロ原子は、複素環が分子の残りに結合している位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロペンチル等を含むが、これらには限定されない。ヘテロシクロアルキルとしては、例えば、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル等を含むが、これらには限定されない。ヘテロアルキレン基については、ヘテロ原子は、鎖末端の一方又は両方を占めうる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ等）。さらに、アルキレン及びヘテロアルキレン結合基については、結合基の向きは、結合基の式が書かれている方向によっては示されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）2Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）2Ｒ’−及び−Ｒ’Ｃ（Ｏ）2−の両方を示す。さらに、用語「シクロアルキレン」は、それ自体又は別の置換基の一部分として、シクロアルキル由来の二価のラジカルを意味し、ヘテロシクロアルキル由来の二価のラジカルを意味する「ヘテロシクロアルキレン」として記載される基を含む。
【００２９】
[0036]  用語「ハロ」又は「ハロゲン」は、それ自体又は別の置換基の一部分として、特記のない限りは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」等の用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを含むことを意図する。例えば、用語「ハロ（Ｃ1−Ｃ4）アルキル」は、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピル等を含むことを意図するが、これらには限定されない。
【００３０】
[0037]  用語「アリール」は、特記のない限りは、一緒に融合しているか又は共有結合している単環又は多環（好ましくは１〜３環）でありうる多未飽和、芳香族、炭化水素置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択された１〜４個のヘテロ原子を含むアリール基（又は環）を意味する。この場合、窒素原子及びイオウ原子は必要に応じて酸化されていてもよく、且つ窒素原子（単一又は複数）は、必要に応じて四級化されていてもよい。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りに結合することができる。アリール基及びヘテロアリール基の例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル及び６−キノリルなどが含むが、これらには限定されない。上記したアリール及びヘテロアリール環系の各々についての置換基は、以下に記載の許容できる置換基の群から選択される。さらに、用語「アリーレン」は、それ自体又は別の置換基の一部分として、アリール由来の二価のラジカルを意味し、ヘテロアリール由来の二価のラジカルを意味する「ヘテロアリール」として記載されるラジカルを含む。
【００３１】
[0038]  簡略化のために、用語「アリール」は、他の用語と組み合わせて使用するとき（例えば、アリールオキシ、アリールチオオキシ、アリールアルキル）は、上記で定義したように、アリール環及びヘテロアリール環の両方を含む。したがって、用語「アリールアルキル」は、アリール基がアルキル基に結合した基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチル等）を含むことが意図される。これには、炭素原子（例えば、メチレン基）が、例えば、酸素原子により置き換えられたアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピル等）なども含まれる。
【００３２】
[0039]  アルキル・ラジカル及びヘテロアルキル・ラジカル（しばしばアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルと称されるラジカルを含む）についての置換基は、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ''、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ''Ｒ'''、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ2Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ''、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ''、 −ＮＲ''Ｃ（Ｏ）Ｒ’、 −ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ''Ｒ'''、−ＮＲ''Ｃ（Ｏ）2Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ''Ｒ'''）＝ＮＲ''''、 −ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ''）＝ＮＲ'''、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’Ｒ''、−ＮＲＳＯ2Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ2（０〜（２ｍ’＋１）の範囲の数（ここで、ｍ’は、このような基における炭素原子の総数である））（これらには限定されない）から選択された種々の基の一つ以上であることができる。Ｒ’、 Ｒ''、 Ｒ'''及びＲ''''は、各々好ましくは独立して、水素、置換又は未置換ヘテロアルキル、置換又は未置換アリール、例えば、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換又は未置換アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基又はアリールアルキル基を意味する。本発明の化合物には、複数のＲ基を含むときには、例えば、Ｒ基の各々は、独立して各々Ｒ’、Ｒ''、Ｒ'''及びＲ''''基（これらの基の複数が存在するとき）として選択される。Ｒ’及びＲ'’が同じ窒素原子に結合しているとき、これらは、窒素原子と結合して５員環、６員環又は７員環を形成してよい。例えば、−ＮＲ’Ｒ'’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むことを意図するが、これらには限定されない。置換基についての上記の説明から、当業者は、用語「アルキル」が、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基、例えば、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ3及び−ＣＨ2ＣＦ3）及びアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ3、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ3、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＯＣＨ3等）を含むことを意図することが理解できるであろう。
【００３３】
[0040]  アルキル・ラジカルについて説明した置換基と同様に、アリール基及びヘテロアリール基についての置換基は、種々のものでよく、例えば、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ'’Ｒ'''、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ2Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ'’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ'’、−ＮＲ'’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ'’Ｒ'''、−ＮＲ'’Ｃ（Ｏ）2Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ'’Ｒ'''）＝ＮＲ''''、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ'’）＝ＮＲ'''、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’Ｒ'’、−ＮＲＳＯ2Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ2、−Ｒ’、−Ｎ3、−ＣＨ（Ｐｈ）2、フルオロ（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、及びフルオロ（Ｃ1−Ｃ4）アルキル（０〜芳香族環系上の総開価数の範囲の数）から選択されたものであり、ここで、Ｒ’、 Ｒ'’、 Ｒ'''及びＲ''''は、好ましくは独立して、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール及びヘテロアリールから選択される。本発明の化合物には、複数のＲ基を含むときには、例えば、Ｒ基の各々は、独立して各々Ｒ’基、Ｒ'’ 基、Ｒ'''基及びＲ''''基（これらの基の複数が存在するとき）として選択される。
【００３４】
[0041]  アリール環又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、必要に応じて式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）q−Ｕ−（式中、Ｔ及びＵは、独立して−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−又は単結合であり、qは、０〜３の整数である）で表される置換基で置き換えてもよい。代わりに、アリール環又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、必要に応じて式−Ａ−（ＣＨ2）r−Ｂ−（式中、Ａ及びＢは、独立して−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’−又は単結合であり、ｒは１〜４の整数である）で表される置換基で置き換えてもよい。このようにして形成された新しい環の単結合の１つは、必要に応じて二重結合と置き換えてもよい。また、アリール環又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、必要に応じて式−（ＣＲＲ’）s−Ｘ−（ＣＲ'’Ｒ'''）d−(式中、ｓ及びｄは、独立して０〜３の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−又は−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’−である)で表される置換基で置き換えてもよい。置換基Ｒ、Ｒ’、 Ｒ'’及びＲ'''は、好ましくは独立して水素又は置換若しくは未置換の（Ｃ1−Ｃ6）アルキルから選択されたものである。
【００３５】
[0042]  本明細書で使用される用語「ヘテロ原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、イオウ（Ｓ）及びケイ素（Ｓｉ）を含むことを意図する。
【００３６】
導入
[0043]本発明は、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドの調製方法を提供する。本明細書中に開示される方法は、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドの製造の分野における大きな進歩をもたらす。周知の方法とは対照的に、本発明は、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを安価に且つ大量に産生することを可能にする。また、本発明は、核酸連結結合ポリペプチドを用いた標的検体を検出する方法を提供する。
【００３７】
Ｉ．部位特異的核酸連結結合ポリペプチドの形成
[0044]  第一の態様によれば、本発明は、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドの形成方法を提供する。核酸連結結合ポリペプチドは、結合ポリペプチド上の特異的部位に核酸を共有結合させることにより形成される。
【００３８】
[0045]  一実施態様によれば、共有結合を、非酵素的（上で定義した）に形成する。非酵素的方法は、組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＤＮＡ分子を細胞に導入することを含む。ここで、前記組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子は、結合ポリペプチド成分上の所定の部位に遺伝子操作されたインテイン成分を含む分子である。前記細胞から、結合ポリペプチド−インテイン分子を単離する。単離されたポリペプチド−インテイン分子を求核分子と、求核分子によりインテイン成分が置換される条件下で接触させて、結合ポリペプチド中間体を得る。該結合ポリペプチド中間体は、結合ポリペプチド成分と第一結合を介し共有結合される求核分子成分を含む。前記結合ポリペプチド中間体は、求核分子を置換核酸で置換する条件下で、求核分子置換核酸と接触させて、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを形成する。部位特異的核酸連結結合ポリペプチドは、結合ポリペプチド成分と第二結合を介し共有結合される置換核酸成分を含む。
【００３９】
[0046]  一実施態様によれば、第一結合と第二結合はチオエステル結合であり、置換核酸は、スルフヒドリル置換核酸である。別の実施態様によれば、置換核酸は、第二求核分子基をさらに含む。第二求核分子基は、第一求核分子基にとって代わって、結合ポリペプチド成分と置換核酸成分との間に、第三結合を形成する。典型的な実施態様によれば、第三結合はアミドであり、第二求核分子基はアミノである。
【００４０】
[0047]  核酸と結合ポリペプチドとの間に共有結合を非酵素的に形成するための種々の方法を、以下で説明する(以下のセクションＡ〜Ｃを参照)。これらの方法は、組み換え結合ポリペプチド-インテイン分子を形成することを含む。核酸と結合ポリペプチドとの間に共有結合を形成する非酵素的方法は、Ｓｚｏｓｔａｋ等、ＷＯ９８／３１７００；Ｒｏｂｅｒｔｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２２９７−１２３０２（１９９７）；Ｓｚｏｓｔａｋ等、米国特許第６，２５８，５５８Ｂ１号及び米国特許第６，２６１，８０４Ｂ１号（全ての目的のために、本明細書中に援用される）に記載されている方法等の公知の酵素的方法に対して、いくつかの点で有利である。例えば、本明細書に記載の組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子を用いた非酵素的方法は、公知の酵素的方法よりも、収率が高く、効率がよく、且つ顕著に安価である。
【００４１】
[0048]  典型的な実施態様によれば、インテインを、結合ポリペプチド上の非天然で且つ所定の部位に、遺伝子操作された組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子を得る。このインテイン成分は、反応性アミノ酸、典型的には反応性システイン、スレオニン又はセリンを含む。説明を明確にするために、本発明の典型的な実施態様を、反応性システインにより説明する。インテイン成分の反応性システインは、インテインと結合ポリペプチドとの間のアミド結合を攻撃し、その結果、ＮからＳへのアシルシフトが生じる。組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子と求核分子とを、インテイン成分が求核分子により置換される条件下で接触させて結合ポリペプチド中間体を得る。説明を明確にするために、本発明の典型的な実施態様を、チオエステル第一結合を有する結合ポリペプチドチオエステル中間体を生じるチオフェノール求核分子により説明する。次に、中間体結合ポリペプチドチオエステル中間体は、チオフェノール求核分子成分を置換核酸で置換することを可能にする条件下で、置換核酸と接触されて、第二結合を有する部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを形成する。説明を明確にするために、本発明の典型的な実施態様を、チオエステル第二結合を有する部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを生じるスルフヒドリル置換核酸成分により説明する。
【００４２】
他の典型的な実施態様によれば、スルフヒドリル置換核酸成分上の第二求核分子基は、チオエステル第二結合を攻撃して第三結合を生じる。典型的な実施態様によれば、第二求核分子基は、アミド第三結合を形成するアミノ求核分子基である。
【００４３】
別の典型的な実施態様によれば、抗体-インテイン分子を単離し、それをチオフェノール求核分子と、インテイン成分がチオフェノールにより置換される条件下で反応させて、抗体-チオエステル中間体を得る。得られた抗体−チオエステル中間体は、第一チオエステル結合によりチオフェノールに共有結合した抗体成分を含む。次に、抗体−チオエステル中間体の第一チオエステル結合とスルフヒドリル置換核酸とを、求核分子成分がスルフヒドリル置換核酸により置換される条件下で接触させて、結合ポリペプチド成分と第二チオエステル結合を介して共有結合するスルフヒドリル置換核酸成分とを含む部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを形成する。
【００４４】
[0051]  天然インテイン介在タンパク質スプライシングの機構は、十分に特徴付けられている。Ｎｏｒｅｎ等，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．３９：４５０−４６６（２０００）を参照のこと。本発明に有用なインテインは、インテイン成分のＮ末端ペプチド成分（以下、「Ｎ末端ペプチド成分」と称する）からインテイン成分までのの切除又は開裂が、求核分子の付加によって制御できるもののみが含まれる。本発明のインテインは、組み換え結合ペプチド−インテイン分子のＮ末端ペプチド成分とインテイン成分との間にチオエステル結合（システインの場合）又はエステル結合（セリン又はスレオニンの場合）を形成できる少なくとも一つのシステイン、セリン又はスレオニンアミノ酸残基を含む。システインスルフヒドリル又はセリン又はスレオニンヒドロキシルが、インテイン成分をＮ末端ペプチド成分に結合しているアミド結合のアミノ官能基にとって代わる。得られたエステル結合又はチオエステル結合は、種々の求核分子から求核置換を受けて、Ｎ末端ペプチドからのインテイン成分の置換が生じる。
【００４５】
[0052]  別の実施態様によれば、核酸と結合ポリペプチドとの間の共有結合を、酵素的に形成する。典型的な実施態様によれば、リボソームは、結合ポリペプチドと核酸分子との間の共有結合の形成を触媒する。リボソームを使用して部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを形成する方法が、Ｓｚｏｓｔａｋ等、ＷＯ９８／３１７００；Ｒｏｂｅｒｔｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２２９７−１２３０２（１９９７）；Ｓｚｏｓｔａｋ等、米国特許第６，２５８，５５８Ｂ１号及び米国特許第６，２６１，８０４Ｂ１号（全ての目的のために、本明細書中に援用される）に詳細に説明されている。
【００４６】
Ａ．結合ポリペプチド−インテイン分子をコードする組み換えＤＮＡの細胞への導入
[0053]  本発明の別の実施態様によれば、核酸と、結合ポリペプチド上の特定の部位との間に共有結合を非酵素的に形成することにより部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを産生する方法が提供される。第一ステップは、典型的には組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＤＮＡ分子を細胞に導入することを含む。ここで、前記組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子は、結合ポリペプチド成分上の所定の部位に遺伝子操作されたインテイン成分を含む。この組み換えＤＮＡ分子は、典型的には遺伝子的にインテインを、結合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列内か、それに隣接するか、その近くの所定の部位に導入して、組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子を得ることにより製造できる。
【００４７】
[0054]  部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを形成する際に、組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子を使用することには、いくつかの利点がある。第一に、結合ポリペプチド−インテイン分子を組み換えにより得ることにより、ペプチド合成法を用いた場合よりも高収量で得られる。結合ポリペプチド−インテイン分子が高収量で得られると、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドの生産性を高めることができる。さらに、現行のペプチド合成法ではサイズが限定されたポリペプチドが得られるのに対して、組み換え法では、比較的大きなサイズのポリペプチドが得られた。さらに、生体外でポリペプチドをフォールディングして機能性タンパク質を形成する現行の方法は、信頼性が非常に悪く、コストが高く、且つ効率が悪い。これら及び他の理由から、組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子を使用することは、核酸をポリペプチドに連結する技術を大きく前進させる。
【００４８】
[0055]  種々の遺伝子工学的及び組み換えＤＮＡ手法が、本発明に有用である。これらの手法と手順は、当該技術分野及び種々の一般的な文献における通常の方法で一般的に実施される（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照（全ての目的のために、本明細書中に援用される））。インテインをポリペプチドの特定の部位に導入するより具体的な方法が、例えば、Ｃｏｍｂ等、米国特許第５，８３４，２４７号（全ての目的のために、本明細書中に援用される）に詳細に説明されている。さらに、種々のインテイン系クローニングベクターが、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社から市販されている。
【００４９】
[0056]  典型的な実施態様によれば、インテインをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター（すなわち、挿入された結合ポリペプチド−インテイン配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクター）に挿入する。種々の宿主−ベクター系を用いて、タンパク質コード配列を発現できる。これらには、ウィルス（例えば、ワクシニア・ウイルス、アデノウィルス等）で感染した哺乳動物細胞系；ウィルス（例えば、バキュロウィルス）で感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母等の微生物；バクテリオファージＤＮＡで形質転換した細菌；プラスミドＤＮＡ；及びコスミドＤＮＡなどがある。利用する宿主−ベクター系に応じて、多数の好適な転写及び翻訳要素のいずれか一つを使用することができる。例えば、修飾真核タンパク質を発現するときには、適当な真核ベクター及び宿主細胞を使用することが有利である。融合ＤＮＡの発現は、本発明の修飾タンパク質の産生をもたらす。
【００５０】
[0057]  別の典型的な実施態様によれば、インテインをコードするＤＮＡを、結合ポリペプチドをコードするＤＮＡの３’末端に平滑末端を形成し且つ翻訳領域内に存在する発現ベクターの制限酵素部位に挿入する。別の典型的な実施態様によれば、インテインＤＮＡ断片は、その５’末端で、スレオニン・コドン、セリン・コドン又はシステイン・コドンで合成される。次に、この断片を、翻訳領域内で、直鎖状プラスミドにライゲーションし、制限エンドヌクレアーゼにより切断して平滑末端とする。
【００５１】
[0058]  別の典型的な実施態様によれば、直鎖状のプラスミドを、ＰＣＲを用いて生成した後、この線状プラスミドを、インテインＤＮＡ断片にライゲーションする。典型的には、結合ポリペプチド配列を保有するプラスミドベクターは、比較的小さく、例えば、約５Ｋｂ未満である。この方法を用いて、インテイン遺伝子を、ポリペプチド遺伝子におけるいずれかの位置に挿入できる。
【００５２】
[0059]  本発明の結合ポリペプチドは、標的分子を結合できるいずれかの適当なポリペプチドを含む。標的分子は、例えば、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、ビタミン類、ウィルス、細菌、金属などを含む。結合ポリペプチドは、種々の結合ポリペプチドの種類、例えば、抗体、ホルモン、レセプター、タンパク質結合ドメイン、及びそれらの一部分に属しうる。典型的な結合タンパク質には、マルトース又はアラビノース結合タンパク質、細胞表面受容体（例えば、血小板由来成長因子受容体及び表皮細胞成長因子受容体）、ストレプトアビジン、キチン結合タンパク質、抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、例えば、一本鎖断片可変領域及び抗体誘導体）、炭水化物結合レクチン（植物及び動物からのもの）、抗体断片、一本鎖可変断片及びタンパク質モチーフ結合ポリペプチド（例えば、ＳＨ2ドメイン）などがある。
【００５３】
[0060]  一度得られると、組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子を、適当な公知の手法又はそれらの組み合わせにより、分離及び精製できる。これらの方法には、例えば、塩析及び溶媒析出等の溶解性を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィー等の電荷の差を利用した方法、アフィニティークロマトグラフィー 等の特異的親和性を利用した方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用した方法、及び等電点電気泳動法等の等電点の差を利用した方法などがある。
【００５４】
[0061]  典型的な実施態様によれば、インテイン成分は、インテイン分子上の特定の部位に遺伝子的に導入されるポリペプチド精製タグを含有する。この特定の部位は、典型的には、切除したときに、ポリペプチド精製タグがインテイン分子に結合したままであるように選択される。本発明に有用なポリペプチド精製タグは、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合ドメイン、キチナーゼ（例えば、キチン結合ドメイン）、セルラーゼ（セルロース結合ドメイン）、チオレドキシン、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ、ヒスチジン−６、プロテインキナーゼインヒビター、ｃ−Ｍｙｃなどを含む。
【００５５】
Ｂ．組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子と求核分子との接触
[0062]  本発明の別の実施態様によれば、組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子と求核分子とを接触させて結合ポリペプチド中間体を形成することを含む、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを非酵素的に産生する方法が提供される。
【００５６】
[0063]  本発明に有用な求核分子は、組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子のインテイン成分にとって代わって結合ポリペプチド中間体を形成できる。結合ポリペプチド中間体は、結合ポリペプチド成分と求核分子成分との間に第一結合を含む。典型的には、第一結合は、結合ポリペプチド成分と求核分子成分との間のエステル又はチオエステル結合である。したがって、求核分子は、典型的にはアルコール又はチオールである。典型的な実施態様によれば、結合ポリペプチドエステル中間体を、アルコール求核分子を用いて形成する。
【００５７】
[0064]  別の典型的な実施態様によれば、結合ポリペプチド−チオエステル中間体を、チオール求核分子を用いて形成する。別の典型的な実施態様によれば、チオール求核分子は、式ＨＳ−Ｒ（式中、Ｒが、置換若しくは未置換アルキル、置換若しくは未置換ヘテロアルキル、置換若しくは未置換シクロアルキル、置換若しくは未置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは未置換アリール、又は置換若しくは未置換ヘテロアリールである）で表される。別の典型的な実施態様によれば、Ｒは、置換若しくは未置換のヘテロアルキル又は置換若しくは未置換のアリールである。別の典型的な実施態様によれば、Ｒは、チオフェノール又は２−メルカプトエタンスルホン酸である。
【００５８】
【化１】
2005523699.tif 000002
[0065]  典型的なスキームを、上に典型的スキーム１として示す。組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子１をチオフェノール求核分子２と接触させて、チオエステル第一結合を含む結合ポリペプチド−チオエステル中間体３を形成する。２のスルフヒドリル基が、１のインテイン成分に取って代わって、置換されたインテイン４を形成する。
【００５９】
[0066]  Ｒ1は、Ｘに直接又は間接的に共有結合している結合ポリペプチド成分又はその一部分を含む。同様に、Ｒ2は、Ｘに直接又は間接的に共有結合しているインテイン成分又はその一部分を含む。Ｒ2又はＲ3が、Ｘに間接的に共有結合している場合には、ペプチジルリンカー成分は、Ｒ2又はＲ3をＸに接続する。ペプチジルリンカー成分は、典型的には長さがアミノ酸約１００個未満である。
【００６０】
[0067]  典型的には、組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子を求核分子と、インテイン成分を求核分子で置換することを可能とする条件下で、接触させて結合ポリペプチド−チオエステル中間体を生じさせる。インテイン成分の置換を可能とする適当な反応条件を決定するには、種々のパラメータが考えられる。重要なパラメータは、例えば、温度、溶液のイオン強度、ｐＨ等を含む。典型的な実施態様によれば、インテイン成分の置換についての反応条件は、上記で開示したもの等のパラメータを調節することにより最適化される。
【００６１】
[0068]  典型的な実施態様によれば、天然アミノ酸インテイン配列は、Ｎ末端セリン又はシステイン及びＣ末端セリン、スレオニン又はシステイン残基を含む。インテイン切除の制御を最適化するために、Ｃ末端セリン、スレオニン又はシステインを、アラニンで置換する。この変異は、Ｃ末端セリン、スレオニン又はシステイン残基が未成熟時期におけるインテイン成分の切除を防止する間、Ｎ末端セリン又はシステインがインテイン成分と結合ポリペプチド成分との間に所望のチオエステル結合を形成することを可能とする。
【００６２】
[0069]  本発明においては、天然インテイン配列、変異天然インテイン配列又は完全非天然インテイン配列等の種々のインテインが有用である。インテインは、適当な長さであることができる。典型的な実施態様によれば、インテインの長さは、約５００未満のアミノ酸であり、少なくとも約１のアミノ酸である。別の典型的な実施態様によれば、インテインの長さは、少なくとも約１００のアミノ酸と約３００未満のアミノ酸との間である。インテインアミノ酸の配列は、典型的には、インテインのアミノ酸側鎖が求核分子によるインテイン成分の置換を妨害しないように選択する。典型的な実施態様によれば、インテインのインテインアミノ酸配列は、その天然配列からは変更されていない。別の典型的な実施態様によれば、天然アミノ酸インテイン配列を変異させて本発明についての特性を最適化する。数多くの天然インテインは、結合ポリペプチドからインテインを外すことができるＣ末端アミノ酸を含有する。Ｎｏｒｅｎ等，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．３９：４５０−４６６（２０００）参照。例えば、インテインの求核分子Ｃ末端セリン、スレオニン又はシステインは、結合ポリペプチド成分をインテイン成分に結合しているエステル又はチオエステル結合を崩壊させうる。次に、Ｃ末端アスパラギンは、結合ポリペプチドからインテインを完全に切除できる。その結果、結合ポリペプチド中間体が形成されない。このようになるのを防ぐために、天然インテイン配列を突然変異させてインテインを結合ポリペプチドから外すことができるＣ末端アミノ酸の欠失又は置き換えをおこなう。
【００６３】
[0070]したがって、別の実施態様によれば、インテインは、結合ポリペプチドからインテインを外すことができるＣ末端アミノ酸を欠失又は置き換えた、天然インテインの突然変異形態である。典型的な実施態様によれば、アミノ酸をアラニンで置き換える。別の典型的な実施態様によれば、アミノ酸を欠失させる。
【００６４】
Ｃ．結合ポリペプチド中間体と置換核酸との接触
[0071]  別の実施態様によれば、本発明は、結合ポリペプチド中間体を置換核酸と接触させることを含む、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを非酵素的に産生させる方法が提供される。置換核酸は、少なくとも一つの第一求核分子基を含む。得られた部位特異的核酸連結結合ポリペプチドは、結合ポリペプチド成分と第二結合を介して共有結合される置換核酸成分を含む。
【００６５】
[0072]  本発明の置換核酸は、結合ポリペプチド中間体の求核分子成分を外して部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを形成できる少なくとも一つの求核分子基（すなわち、第一求核分子基）を含む。有用な第一求核分子基は、例えば、スルフヒドリル基及びヒドロキシル基を含む。したがって、典型的な実施態様によれば、置換核酸は、スルフヒドリル置換核酸であり、第二結合はチオエステルである。別の典型的な実施態様によれば、置換核酸はヒドロキシル置換核酸を含み、そして第二結合はエステルである。
【００６６】
【化２】
2005523699.tif 000003
[0073]  典型的スキームを、上の典型的スキーム２に示す。３のチオフェノール求核分子成分は、スルフヒドリル置換核酸４のスルフヒドリルにより置き換えられる。求核分子の置き換えは、部位特異的核酸連結結合ポリペプチド５と置換チオフェノール求核分子２の形成をもたらす。
【００６７】
[0074]Ｒ3は、スルフヒドリル求核分子基に直接又は間接的に共有結合した核酸成分を含む。Ｒ3がスルフヒドリル成分に間接的に共有結合している場合には、リンカー成分は、核酸成分と求核分子基を接続する。置換若しくは未置換のアルキレン又は置換若しくは未置換のヘテロアルキレンを含むいずれかの適当なリンカー成分が使用されうる。
【００６８】
[0075]  部位特異的核酸標識結合ポリペプチドの核酸成分は、いずれかの適当な配列又は長さを有することができる。典型的な実施態様によれば、核酸成分は、長さが約１０を超え且つ約５００より少ないヌクレオチドである。別の典型的な実施態様によれば、核酸成分は、長さが約５０を超え且つ約１５０より少ないヌクレオチドである。
【００６９】
[0076]  別の実施態様によれば、置換核酸は、第一求核分子基に置き換わることができる第二求核分子基をさらに含む。第二求核分子基は、第一求核分子基と結合ポリペプチドとの間の第二結合（典型的にはエステル又はチオエステル）を攻撃してアシルシフト並びに第三結合の形成をもたらすことができる。典型的な実施態様によれば、第二求核分子基は、ＯからＮ又はＳからＮへのアシルシフトを生じることができるアミノ基である。したがって、得られる第三結合は、アミド結合である。別の典型的な実施態様によれば、第二求核分子基は、ＯからＯ又はＳからＯへのアシルシフトを生じることができるヒドロキシル基である。したがって、得られる第三結合は、エステル結合である。置換核酸が第一求核分子基及び第二求核分子基を含有する場合、以下「二置換核酸」と称される。
【００７０】
【化３】
2005523699.tif 000004
[0077]  典型的スキームを、上の典型的スキーム３で示す。チオフェノール求核分子成分３は、二置換核酸６のスルフヒドリルにより置き換えられる。求核置換により、チオエステル結合を含む部位特異的核酸連結結合ポリペプチド７が形成される。続いてのＳからＮへのアシルシフトは、第三結合としてアミド結合を含む部位特異的核酸連結結合ポリペプチド８を産生する。
【００７１】
[0078]  本発明の置換核酸を形成するには、種々の方法が有用である。典型的な実施態様によれば、求核分子基を含有するホスホラミダイトを固相又は液相核酸にカップリングすることにより、置換核酸が形成される。Ｂｅａｕｃａｇｅ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９（１９８１）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（オリゴヌクレオチド及び類似体：実用的手法），（１９９１）、及びＳｔｅｔｓｅｎｋｏ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：４９００−４９０８（２０００）を参照のこと。
【００７２】
【化４】
2005523699.tif 000005
[0079]  典型的な固相合成法を、上の典型的スキーム４に示す。求核分子保護ホスホラミダイト９を、まず標準ホスホラミダイト・カップリング法を用いて固体支持体結合オリゴヌクレオチドにカップリングする。Ｂｅａｕｃａｇｅ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９（１９８１）及びＳｔｅｔｓｅｎｋｏ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：４９００−４９０８（２０００）を参照のこと。次に、支持体結合オリゴヌクレオチドを、酸化し、固体支持体から開裂する。記号Ｒ5、Ｒ7、及びＲ8は、水素又は保護基を表す。記号Ｒ9は、核酸成分を表す。
【００７３】
[0080]  求核分子基Ｘ1及びＸ2は、固体支持体からの開裂前、中又は後に脱保護して二置換核酸１０を生じうる。典型的な実施態様によれば、第二求核分子基は、インテイン成分が置き換えられた後までは脱保護されない。
【００７４】
[0081]  アルキレン基Ｒ6は、置換若しくは未置換のアルキレン、置換若しくは未置換のヘテロアルキレン、置換若しくは未置換のシクロアルキレン、置換若しくは未置換のヘテロシクロアルキレン、置換若しくは未置換のアリーレン又は置換若しくは未置換のヘテロアリーレンである。典型的な実施態様によれば、Ｒ6は、置換若しくは未置換のシクロアルキレンである。別の典型的な実施態様によれば、Ｒ6は、シクロへキシレンである。
【００７５】
[0082]  アミノ置換基Ｒ4は、置換若しくは未置換のアルキル、置換若しくは未置換のヘテロアルキル、置換若しくは未置換のシクロアルキル、置換若しくは未置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは未置換のアリール又は置換若しくは未置換のヘテロアリールを表す。典型的な実施態様によれば、Ｒ4は、置換若しくは未置換のアルキルである。別の典型的な実施態様によれば、Ｒ4は、未置換の１〜１０員のアルキルである。別の典型的な実施態様によれば、Ｒ4は、イソプロピル又はイソブチルである。単一の窒素に結合した２つのＲ4基は、場合に応じて異なる基である。
【００７６】
[0083]  種々の保護基を、典型的スキーム４に使用できる。ヒドロキシル、スルフヒドリル及びアミノ成分についての基の保護法の詳細な記載が、例えば、Ｇｒｅｅｎ等，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（有機合成についての保護基）（１９９１）；Ｓｔｅｗａｒｔ等，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（固相ペプチド合成）（１９８４）；及びＥｃｋｓｔｅｉｎ等，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（オリゴヌクレオチド及び類似体：実用的手法）（１９９１）になされている。したがって、例えば、塩基不安定保護基、酸不安定保護基、及び酸化又は還元条件下で不安定である保護基等のいずれかの適当な保護基を使用できる。典型的な実施態様によれば、Ｘ1はスルフヒドリル求核分子基であり、Ｒ7はＳ−ｔｅｒｔ−ブチルスルホニルである。別の典型的な実施態様によれば、Ｘ2はアミノ保護基であり、Ｒ8は９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）である。別の典型的な実施態様によれば、Ｒ8は２−シアノエチルである。
【００７７】
[0084]  別の典型的な実施態様によれば、求核分子基を含むヌクレオチド・トリホスフェートを核酸に連結することにより、置換核酸が形成される。典型的には、酵素は、トリホスフェートを核酸分子にカップリングするために使用される。求核分子基を含む種々のヌクレオチド・トリホスフェートが、本発明に有用である。典型的な実施態様によれば、求核分子基を含むヌクレオチド・トリホスフェートは、核酸リガーゼ又はポリメラーゼ酵素用の基質である。
【００７８】
【化５】
2005523699.tif 000006
[0085]  求核分子基を含む典型的なヌクレオチド・トリホスフェートが、上記表１に記載されている。Ｘ1及びＸ2は、それぞれ第一求核分子基及び第二求核分子基を表す。Ｘ3は、水素又はヒドロキシルを表す。Ｒ7及びＲ8は、各々水素又は保護基を表す。Ｒ6は、上記のような適当なアルキレン基を表す。Ｂは、核酸塩基を表す。
【００７９】
[0086]  表１に記載のヌクレオチド・トリホスフェートは、適当な方法を用いて生成できる。典型的な実施態様によれば、置換ジオキシウリジン・トリホスフェート（ｄＵＴＰ）は、典型的スキーム５に従って生成する。
【化６】
2005523699.tif 000007
【００８０】
[0087]  典型的スキーム５によれば、アミノアリルｄＵＴＰ１１を、保護固相システイン１２及びジメチルアセトアミドと接触させて固相置換ヌクレオチド１３を生成する。トリフルオロ酢酸で処理することにより、対応の液相置換ヌクレオチド１４が得られる。
【００８１】
[0088]  別の典型的な実施態様によれば、反応基を含むヌクレオチド・トリホスフェートを核酸にカップリングすることにより、置換核酸を形成する。次に、この反応基を、少なくとも一つの求核分子基を含む分子に共有結合する。例えば、前に組み込んだ１１を含む二本鎖ＤＮＡを１２と反応させて、液相置換核酸を直接生じうる。典型的な実施態様によれば、組み込みを、リガーゼ又はポリメラーゼで酵素的に行う。別の典型的な実施態様によれば、組み込みを、トリホスフェート成分１１の代わりにホスホラミダイト成分を用いて化学的に実施する。
【００８２】
[0089]  本発明の反応性求核分子基を、核酸に酵素的にカップリングしたときに保護又は脱保護しうる。典型的な実施態様によれば、求核分子基を、ヌクレオチド・トリホスフェートを核酸分子に酵素的に連結して組み込む前に脱保護する。別の典型的な実施態様によれば、ヌクレオチド・トリホスフェートを、求核分子基が保護された状態で核酸分子に酵素的に連結させる。別の典型的な実施態様によれは、ヌクレオチド・トリホスフェートを、少なくとも一つの求核分子基が保護された状態で且つ少なくとも一つの求核分子基が脱保護された状態で核酸分子に酵素的にカップリングさせる。
【００８３】
[0090]  別の実施態様によれば、求核分子基を含むヌクレオチド・トリホスフェートを、二本鎖核酸配列の内部の位置に酵素的にカップリングさせる。典型的な実施態様によれば、二本鎖核酸のうちの一つの鎖を、エンドヌクレアーゼ酵素でニックをいれる。次に、求核分子基を含むヌクレオチド・トリホスフェートを、ポリメラーゼ又はリガーゼとニックが入った二本鎖核酸と接触させて、核酸が内部置換された二本鎖置換核酸を形成する。
【００８４】
[0091]  別の典型的な実施態様によれば、置換ホスホラミダイトを、固相核酸に連結させて、上記した置換核酸を形成する（典型的スキーム５参照）。次に、置換核酸をＰＣＲで使用して、複数の修飾二本鎖核酸を生成する。したがって、一本鎖置換核酸を延長し、同時に二本鎖核酸に変換する。
【００８５】
[0092]  別の実施態様によれば、求核分子基を含有するヌクレオチド・トリホスフェートを、第一末端と第二末端とを含む二本鎖核酸に酵素的に連結する。第一末端及び第二末端を、ポリメラーゼ酵素及び反応性求核分子基を含有するヌクレオチド・トリホスフェートと接触させて（ビス）置換核酸を形成する。得られた（ビス）置換核酸は、第一末端求核分子基及び第二末端求核分子基を含有する。
【００８６】
[0093]  別の典型的な実施態様によれば、二本鎖核酸の第一及び第二末端は、５’オーバーハングを含む。したがって、反応性求核分子基を含むヌクレオチド・トリホスフェートを、二本鎖核酸の窪んだ３’端に付加させる。別の典型的な実施態様によれば、ポリメラーゼ酵素は、クレノー・ポリメラーゼである。
【００８７】
[0094]  別の実施態様によれば、（ビス）置換核酸を、エンドヌクレアーゼで開裂して二置換二本鎖核酸を形成する。典型的な実施態様によれば、二本鎖核酸は、パリンドローム配列の中央にエンドヌクレアーゼ開裂部位を含むパレンドローム配列である。したがって、置換二本鎖核酸産物は、等しい長さの二本鎖核酸を含む。
【００８８】
[0095]  本発明の置換核酸を形成するには、種々の核酸が有用である。典型的な実施態様によれば、核酸を、オリゴヌクレオチド合成機上の標準固相合成法を用いて形成する。Ｂｅａｕｃａｇｅ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９（１９８１）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（オリゴヌクレオチド及び類似体：実用的手法），（１９９１）を参照のこと。別の典型的な実施態様によれば、核酸を細胞から得る。例えば、細胞性ＤＮＡ又はＲＮＡを、公知の手法を用いて細胞から単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅して複数のコピーを得ることができる。得られた核酸を、次に、例えば、上記の典型的スキームに記載されている方法を使用することにより、求核分子基により置換されうる。
【００８９】
ＩＩ．試料中の標的検体の存在の検出方法
[0096]  別の態様によれば、本発明は、試料中の標識検体の存在を検出する方法を提供する。これらの方法では、標的検体と部位特異的核酸連結結合ポリペプチドとを接触させて標的検体複合体を形成することを含む。この部位特異的核酸連結結合ポリペプチドは、核酸成分と、前記標的検体が特異的に結合する結合ポリペプチド成分とを含む。前記標的検体複合体の核酸成分と核酸ポリメラーゼとを接触させて複数の核酸ディテクターを形成する。前記核酸ディテクターを検出し、それにより、前記試料中の前記標的検体の存在を検出する。典型的には、結合ポリペプチドは、標的検体に特異的に結合し、それにより標的検体を同定する。
【００９０】
[0097]  実施態様によれば、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを、上記で開示した方法により非酵素的に形成する。非酵素的に形成された部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを使用することには、いくつかの利点がある。例えば、核酸成分を、安定な共有結合を介し結合ポリペプチドに連結する。したがって、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを、多種多様な条件下で使用して標的検体を検出しうる。さらに、核酸を、規定の化学量論量で結合ポリペプチド上の特定の部位に連結する。規定の化学両論量と位置により、とりわけ検出を定量によりおこなう場合には、検出結果を解釈するのを正確且つ明確におこなうことができる。別の利点として、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを非酵素的に製造する方法は、公知の酵素的方法よりも、より効率的であり、収率がより高く、且つ安価であることがあげられる。
【００９１】
[0098]  別の実施態様によれば、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドは、リボ核酸成分に共有結合した結合ポリペプチド成分を含有する。リボ核酸成分は、一本鎖デオキシリボ核酸検出分子に非共有的に結合している。典型的な実施態様によれば、リボ核酸成分を、デオキシリボ核酸検出分子から分離し、リボヌクレアーゼで分解する。一本鎖デオキシリボ核酸検出分子を、ＤＮＡポリメラーゼと接触させて二本鎖デオキシリボ核酸検出分子を形成する。二本鎖デオキシリボ核酸検出分子を、ＲＮＡポリメラーゼと接触させて複数のリボ核酸検出分子を形成する。リボ核酸検出分子を検出することにより、試料中の前記標的検体を検出する。別の典型的な実施態様によれば、前記リボ核酸成分を逆転写酵素と接触させることにより、一本鎖デオキシリボ核酸検出分子を形成する。別の典型的な実施態様によれば、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり、二本鎖デオキシリボ核酸検出分子は、Ｔ７プロモーター配列を含む。
【００９２】
[0099]  典型的な実施態様によれば、標的検体の検出は、定量化によりなされる。定量化による検出は、典型的には核酸ディテクターを定量することによりおこなう。核酸ディテクターの定量は、いずれかの適当な方法によりおこなうことができる。核酸ディテクターを定量するのに有用な方法には、例えば、ゲル電気泳動（例えば、アガロース又はポリアクリルアミドゲル）、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）及び質量分析に基づくものなどがある。本発明に有用な定量方法は、種々の性質、例えば、蛍光（Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（蛍光プローブ及び研究用化学薬品のハンドブック），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ（１９９２）参照）、放射能、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、電気化学発光、化学発光、蛍光分極又は蛍光アニソトロピー、吸光度等に基づくものであることができる。別の典型的な実施態様によれば、検出可能な標識を、核酸検出分子に結合させる。検出可能な標識を、典型的にはポリメラーゼ基質である標識ヌクレオチドを含有させることによりディテクター核酸に付加させる。
【００９３】
[0100]  別の典型的な実施態様によれば、蛍光標識したヌクレオチドを、核酸成分のＰＣＲ増幅中に添加して複数の蛍光標識したディテクター核酸を生成する。蛍光標識したディテクター核酸を、他のＰＣＲ反応成分から分離し、蛍光標識の蛍光発光に基づいて定量する。
【００９４】
[0101]  別の典型的な実施態様によれば、核酸ポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。本発明に使用される熱安定性ポリメラーゼは、高温で機能することができる。典型的には、熱安定性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）に使用されているもの等の反復ヒートサイクル後に機能することができる。別の典型的な実施態様によれば、核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼである。
【００９５】
[0102]  別の典型的な実施態様によれば、試料は、少なくとも２つの異なる標的検体を含む。少なくとも２つの異なる標的検体を、典型的には同時に検出する。典型的な実施態様によれば、試料は、２つの異なる標的検体を含む。試料を、２つの異なる部位特異的核酸連結結合ポリペプチドと接触させる。第一の部位特異的核酸連結結合ポリペプチドは、第二部位特異的核酸連結結合ポリペプチドのものとは検出的に異なる核酸成分を有する。
【００９６】
[0103]  種々の性質により、核酸成分、例えば、核酸塩基組成物と核酸長さ等の核酸成分の間の検出可能な差を得ることができる。典型的な実施態様によれば、検出可能な差は、それぞれの核酸成分の長さにおける差である。第一及び第二部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを、核酸ポリメラーゼと接触させて、それぞれ複数の第一核酸ディテクター及び第二核酸ディテクターを形成する。第一核酸ディテクター及び第二核酸ディテクターを、第一核酸ディテクターと第二核酸ディテクターとの間の長さの差に基づいて分離する。分離を、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動等のいずれかの適当な方法を用いておこなわれうる。次に、分離した第一核酸ディテクター及び第二核酸ディテクターを検出する。これにより、２つの異なる標的検体が存在することが示される。検出は、いずれかの適当な手法、例えば、吸光度、放射活性、染色、蛍光標識、質量（例えば、質量分析）等に基づいておこなうことができる。
【００９７】
[0104]  別の典型的な実施態様によれば、検出可能な差は、核酸成分の配列である。第一及び第二部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを、核酸ポリメラーゼと接触させて、それぞれ複数の第一核酸ディテクター及び第二核酸ディテクターを形成する。第一核酸ディテクター及び第二核酸ディテクターを、第一核酸ディテクターと第二核酸ディテクターとの間の配列の差に基づいて分離する。キャピラリー電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、又はアフィニティー試薬を含むマイクロアレイ若しくはチップ（例えば、チップ又はマイクロアレイ表面に結合した相補的一本鎖核酸）等の種々の公知の分離法を用いることができる。さらに、第一核酸ディテクター及び第二核酸ディテクターを、分離前又は後のいずれかで、質量分析を用いて検出して核酸ディテクターの配列決定又は部分的な配列決定をすることができる。
【００９８】
[0105]  別の典型的な実施態様によれば、標的検体は、液相である。典型的には、溶液は水溶液であり、標的検体は水溶液に可溶である。別の典型的な実施態様によれば、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを、液相標的検体と接触させることにより、標的検体複合体を形成する。次に、標的検体複合体を、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー等の公知の分離法を用いて溶液混合物から単離する。単離した標的複合体を、核酸ポリメラーゼと接触させて核酸検出分子を形成する。
【００９９】
[0106]  別の典型的な実施態様によれば、固体支持体上に標的検体を固定化する方法も含まれる。標的検体は、典型的には標的検体を部位特異的核酸連結結合ポリペプチドと接触させる前に固定化する。本発明には、例えば、ビーズ（磁気ビーズ等）、レジン、バイオチップ等の種々の固体支持体が有用である。固体支持体は、種々の材料を含有できる。支持体材料は、典型的にはこの方法の反応を破壊しないように選択する。有用な固体支持体材料には、例えば、アガロース、ポリアクリルアミド、制御された多孔ガラス、ＰＭＭＡ、セルロース、ラテックス、場合に応じて官能化したポリスチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリスチレン（ＰＳ）の場合に応じて置換された共重合体（Ｃａｓｔｅｌｈａｎｏ等，米国特許第６，３７６，６６７号参照；該特許出願は全ての目的のために、本明細書中に援用される）、Ｔｅｎｔａｇｅｌ（商標）ビーズ（Ｏｈｌｍｅｙｅｒ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９０：１０９２２−１０９２６（１９９３））、ガラス、Ｗａｎｇ・レジン、Ｒａｐｐレジン、シリカゲル、疎水性ポリマーで被膜されたガラス粒子等、すなわち、硬質又は半硬質表面を有する材料、可溶性支持体、例えば、低分子量非架橋ポリスチレン、プラズマ変性プラスチック（例えば、プラズマ変性ポリプロピレン、及びＰＣＲに使用される他のプラズマ変性プラスチック）などがある。例えば、Ｊｕｎｅ等，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（組み合わせペプチド及び非ペプチドライブラリー、Ａ  ハンドブック）（１９９６）又はＢｕｎｉｎ等，Ｔｈｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｉｎｄｅｘ（組み合わせインデックス）（１９９８）（本明細書中に援用される）等に記載されたもの等の、当該技術分野において公知であり、且つ本発明の範囲から逸脱することなく使用できる他の支持体材料も、含まれる。
【０１００】
[0107]  別の典型的な実施態様によれば、少なくとも２つの異なる標的検体を、固体支持体に結合する。別の典型的な実施態様によれば、固体支持体は、少なくとも２つの異なる標的検体に共有結合した磁気固体支持体である。典型的には、磁気固体支持体は、形状がビーズ状であるか、球状である。
【０１０１】
[0108]  別の典型的な実施態様によれば、少なくとも２種の異なる部位特異的核酸標識結合ポリペプチドを、標的検体を含有する試料に添加する。これらの少なくとも２つの異なる部位特異的核酸標識結合ポリペプチドの各々が標的検体に結合されうる。同じ標的検体に結合する少なくとも２種の異なる部位特異的核酸標識結合ポリペプチドを使用することにより、同定及び定量精度が増加する。
【０１０２】
[0109]  本発明の方法を用いて、適当な標的検体を検出しうる。典型的な実施態様によれば、標的検体は、化学的又は生化学的検体である。別の典型的な実施態様によれば、標的検体は、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、ビタミン、ウイルス、細菌又は無機分子である。
【０１０３】
[0110]  本明細書で使用される用語及び表現は、説明の用語として使用したものであり、限定の用語として使用したものではなく、このような用語及び表現を、示され且つ記載されている特徴又はその一部分の等価物を排除するのに使用する意図はなく、種々の修正が特許請求の範囲に記載の範囲で可能である。さらに、本発明の実施態様のいずれか一つ以上の特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明のいずれかの他の実施態様の一つ以上の他の特徴と組み合わせることができる。例えば、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを形成する方法のいずれかの特徴を、本発明の範囲から逸脱することなく、標的検体を検出する方法のいずれかに組み込むことができる。
【０１０４】
[0111]  さらに、本明細書で引用した特許及び科学文献は、それらの全体を、本明細書中に援用される。
【実施例】
【０１０５】
例１
[0112]  例１は、組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＤＮＡ分子を細胞に導入する典型的な方法を示す。ここでの組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子は、結合ポリペプチド成分上の所定の部位に遺伝子的に導入したインテイン成分を含む。
【０１０６】
[0113]  結合ポリペプチドをコードする遺伝子を、翻訳領域内になるようにサッカロマイシス・セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)ＶＭＡインテイン・コード配列のアミノ末端にクローニングした。結合ポリペプチド−インテイン核酸配列を、誘導プロモーターの制御下にある細菌発現ベクターｐＴＹＢ１に挿入した。次に、ベクターを、イー・コリ(E． coli)ＥＲ２２５６に形質転換した。細菌細胞を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）０．８まで増殖させ、１ｍＭイソプロピル・チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて４時間誘導させた。細菌細胞を、遠心分離により集め、溶菌し、１２％アクリルアミドゲル電気泳動に附した後、クーマシーブルー染色した。５つのレーンを有するゲルの写真を、図１に示す。
【０１０７】
[0114]  レーン１（最左）は、タンパク質サイズの標準である。レーン２及びレーン３は、結合ポリペプチド−インテイン分子を表す。ここで、結合ポリペプチドは、ヒトサイクリン依存性キナーゼ２（ｈＣＤＫ２）に結合するポリペプチドアプタマーである。レーン３は、ポリペプチドアプタマー−インテインコード配列の誘導後の細胞溶解液を示し、レーン２は、未誘導ポリペプチドアプタマー−インテイン配列を示す。レーン３に示されるように、ポリペプチドアプタマー−インテイン配列の誘導は、矢印１で示した予想サイズのポリペプチドアプタマー−インテイン融合タンパク質を産生する。
【０１０８】
[0115]  レーン４及びレーン５は、それぞれ未誘導ストレプトアビジン−インテイン配列の産物及び誘導ストレプトアビジン−インテイン配列の産物を示す。ここでも、ストレプトアビジン−インテイン分子産物を、矢印１によりレーン５における予想サイズで示す。
【０１０９】
例２
[0116]  例２は、置換二本鎖核酸の典型的な形成方法を示す。
【０１１０】
[0117]  Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチルスルホニルで保護されたスルフヒドリル第一求核分子基とＦｍｏｃで保護されたアミノ第二求核分子基を含む置換ホスホラミダイトを、標準ホスホラミダイトカップリング条件を用いて、固相核酸分子にカップリングした。水酸化アンモニウムでの処理は、Ｆｍｏｃ脱保護及び固体支持体からの開裂をもたらし、そうして二置換核酸分子を産出した。二置換核酸分子をＰＣＲプライマーとして使用して、対応する二置換二本鎖核酸を得た。二置換二本鎖核酸を、図２に示すゲル電気泳動により単離した。矢印２は、レーン２〜４における単離された二置換二本鎖核酸を示す。レーン１（最左）及びレーン５（最右）は、制御マーカー核酸を含有している。
【０１１１】
例３
[0118]  例３は、組み換えポリペプチド−インテイン分子を用いて部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを形成する典型的な方法を示す。
【０１１２】
[0119]  例１のストレプトアビジン−インテイン分子を、チオフェノールと接触させて、ストレプトアビジン−チオフェノール中間体を得た。例２の単離された二置換二本鎖核酸を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の存在下で、ストレプトアビジン−チオフェノール中間体と接触させて、部位特異的二置換核酸連結ストレプトアビジンを生じた。部位特異的二置換核酸連結ストレプトアビジンを、イオン交換ＨＰＬＣにより精製後、逆相ＨＰＬＣにより精製した。
【０１１３】
[0120]  図３Ａ〜図３Ｃは、部位特異的二置換核酸連結ストレプトアビジン産物の精製及び検出を示す。図３Ａは、イオン交換ＨＰＬＣのクロマトグラムである。矢印３は、部位特異的二置換核酸連結ストレプトアビジン及び未反応二置換二本鎖核酸を含む主要なピークを示す。図３Ｂは、逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムである。矢印４は、精製された部位特異的二置換核酸連結ストレプトアビジンを含む主要なピークを示す。
【０１１４】
[0121]  図３Ｃは、ゲル電気泳動及び臭化エチジウムでの処理後の逆相ＨＰＬＣ画分の写真である。矢印５及び６は、それぞれ未反応二置換二本鎖核酸及び部位特異的二置換核酸連結ストレプトアビジンを示す。レーン１（最左）は、未精製反応混合物である。レーン２は、矢印３により示されるイオン交換ピークである。レーン４及びレーン９は、二置換二本鎖核酸標準である。レーン１０（最右)は、制御マーカー核酸を含む。レーン６〜８は、矢印４により示される逆相ＨＰＬＣピークから得た画分を含む。
【０１１５】
例４
[0122]  例４は、標的検体を部位特異的置換核酸連結ポリペプチドと接触させて標的検体複合体を形成する典型的な方法を示す。
【０１１６】
[0123]  例３の精製された部位特異的二置換核酸連結ストレプトアビジンを、ビオチン標識牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する溶液に添加して、ストレプトアビジン成分とビオチン成分との間の複合体を得た。この複合体を、図４に示すように、ゲル電気泳動により検出した。
【０１１７】
[0124]  図４は、ゲル電気泳動及び臭化エチジウムでの処理後の複合体形成のデジタル表現した図である。複合体は、矢印７により示され、未結合部位特異的二置換核酸連結ストレプトアビジンは、矢印８により示されている。レーン１（最左）は、精製された部位特異的二置換核酸連結ストレプトアビジンである。レーン２は、部位特異的二置換核酸連結ストレプトアビジンを添加しないビオチンＢＳＡである。レーン３（最右）は、部位特異的二置換核酸連結ストレプトアビジンとビオチンＢＳＡの反応混合物である。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は、組み換え結合ポリペプチド−インテイン分子を産生する典型的な方法を示すゲルの写真である。
【図２】図２は、置換二本鎖核酸を形成する典型的な方法を示すゲルの写真である。
【図３Ａ】図３Ａは、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを部分精製する典型的な方法を示すクロマトグラムである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、部位特異的核酸連結結合ポリペプチドを精製する典型的な方法を示すクロマトグラムである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、置換二本鎖核酸を精製する典型的な方法を示すゲルの写真である。
【図４】図４は、標的検体を部位特異的置換核酸連結ポリペプチドと接触させて標的検体複合体を形成する典型的な方法を示すゲルをデジタル表現した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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