(57)【要約】神経細胞への治療薬の送達のための結合体は、治療薬、神経細胞に結合する結合ドメイン、および神経細胞に治療薬をトランスロケートするトランスロケーションドメインを含み、結合ドメインはボツリヌス菌Ｃ１毒素のＨＣであるかまたはそれに基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞に治療薬を送達するための組成物であって、
ＧＴＰアーゼのＲｈｏ群の少なくとも１つのメンバーを阻害する治療薬、および
神経細胞ターゲティング成分であって、ボツリヌス菌Ｃ１毒素のＨＣドメインまたは天然のＨＣドメインの機能を保持するそのフラグメントを含む成分を含み、
そして該ＨＣドメインが、組換えにより作製されている、
組成物。
【請求項２】
前記治療薬の細胞へのトランスロケーションのためのドメインをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記トランスロケーションドメインがクロストリジウム菌ソース由来である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記トランスロケーションドメインが非クロストリジウム菌ソース由来である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記トランスロケーションドメインが、C.botulinum、C.butylicum、C.argentinense、またはC.tetani由来である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記トランスロケーションドメインが、ジフテリア菌毒素、シュードモナスエキソトキシンＡ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素融合性ペプチド、または両親媒性ペプチド由来である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記トランスロケーションドメインが、ボツリヌス菌Ｃ１毒素ならびにそのフラグメント、改変体および誘導体、またはジフテリア菌毒素ならびにそのフラグメント、改変体および誘導体由来である、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記トランスロケーションドメインが膜破壊ペプチドである、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記治療薬が、薬物、増殖因子、酵素、ＤＮＡ、改変されたウイルス、薬物放出システム、またはこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記治療薬がＣ３酵素である、請求項１から９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記Ｃ３酵素が、C.botulinum、C.limosum、B.cereus、S.aureus、C.acetobutylicum、S.pyogenes、またはL.monocytogenes由来である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記Ｃ３酵素が、Ｃ３Ｓｔａｕ２、Ｃ３Ｓｔａｕ１、およびＣ３ｂｏｔからなる群より選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記Ｃ３酵素が、配列番号１から１０より選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記治療薬および前記Ｈｃドメインが、直接またはリンカー分子を介して互いに連結されている、請求項１から１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記治療薬、前記Ｈｃドメイン、および前記トランスロケーションドメインが、直接またはリンカー分子を介して互いに連結されている、請求項２から１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記リンカー分子が、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、セルラーゼのドメイン間リンカー、ＰＰＰＩＥＧＲ、コラーゲン様スペーサー、トリプシン感受性ジフテリア菌毒素ペプチド、および配列番号１６から２４からなる群より選択される、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、一本鎖ポリペプチドである、請求項１から１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、二本鎖ポリペプチドである、請求項１から１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、懸濁液、乳化液、溶液、または凍結乾燥粉末である、請求項１から１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物中の構築物が、薬学的に受容可能な液体に再懸濁または希釈されている、請求項１から１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
前記治療薬と前記神経細胞ターゲティングドメインとをコードするＤＮＡを発現させる工程を含む、請求項１から２０のいずれかに記載の組成物の製造方法。
【請求項２２】
神経再生を促進するための医薬品の製造のための、請求項１から２０のいずれかの組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞への薬剤の送達、特に神経再生を促進する薬剤、該薬剤を送達するための構築物、該薬剤と構築物とを関連させた使用、およびその製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、中枢神経系の主な障害についての効果的な治療法はほとんどない。このような障害としては、神経変性疾患、発作、てんかん、脳腫瘍、感染症、およびＨＩＶ脳症が挙げられ、そしてこれらの疾患の罹患者は、癌および心臓疾患の罹患率よりはるかに多数である。脳薬理学の知識が増加し、そして基礎となる疾患の病理学が解明されるにつれて、可能性のある治療方法が明らかになる。しかし、これらの治療はすべて、関連する種々の神経細胞集団への治療剤の効率的な送達という恐るべき問題に直面している。したがって、薬物、酵素、増殖因子、治療ペプチドおよび遺伝子を含む広範囲の治療物質について、神経細胞に効率的に送達し得るベクターが必要とされる。
【０００３】
このような治療薬の使用における主な問題は、外傷部位への有用な濃度の活性薬剤の送達である。したがって、特異的な神経ベクターは、神経細胞にこのような化合物をターゲティングすることに重要な役割を果たし得る。
【０００４】
したがって、適切な神経細胞特異的ターゲティングリガンドは、神経疾患に効果的な治療が開発されることを可能にするために、広範囲な遺伝子ベクターを必要とする。
【０００５】
クロストリジウム菌神経毒素は、クロストリジウム属の様々な種、最も重要にはC.tetaniおよびC.botulinumのいくつかの菌株によって産生されるタンパク毒素である。現在、８つの異なるクラスの神経毒素が知られている：破傷風菌毒素ならびに血清型Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧのボツリヌス菌神経毒素。そしてこれらはすべて類似の構造および作用様式を有する。クロストリジウム菌神経毒素は、翻訳後改変されてジスルフィド結合によって互いに結合した２本のポリペプチド鎖を形成する一本鎖ポリペプチドとして、細菌によって合成される。２つの鎖は重鎖（Ｈ）および軽鎖（ＬＣ）と呼ばれる。クロストリジウム菌神経毒素は、神経細胞に対して非常に選択性であり、そして高い親和性で結合する。
【０００６】
ボツリヌス菌神経毒素は、クロストリジウム菌神経毒素のサブファミリーであり、その一次作用部位は神経筋接合部であり、その部位で伝達物質であるアセチルコリンの放出をブロックする。破傷風菌毒素は、ボツリヌス菌神経毒素と構造的に非常に類似しているが、その一次作用部位は中枢神経系であり、その部位で中枢シナプス（レンショー細胞）からの抑制性神経伝達物質の放出をブロックする。
【０００７】
破傷風菌神経毒素およびボツリヌス菌神経毒素の神経細胞ターゲティングは、非常に特異的であり、そしてレセプター介在事象であると考えられ、その事象に続いて、毒素がインターナライズされ、次いでエンドペプチダーゼ活性が発揮される適切な細胞内コンパートメントに輸送される。
【０００８】
クロストリジウム菌神経毒素分子内の重鎖ドメインの機能的定義を、以下のように提供することができる：
【０００９】
クロストリジウム菌神経毒素重鎖ＨＣドメイン：
細胞内への毒素のインターナリゼーションの前のクロストリジウム菌毒素の中毒作用に関連する細胞表面レセプターへの天然のホロ毒素の結合の原因である重鎖の一部。
【００１０】
クロストリジウム菌神経毒素重鎖ＨＮドメイン：
軽鎖活性の機能的発現が標的細胞内で起きるような、神経毒素分子の一部のトランスロケーションを可能にする重鎖の一部。
【００１１】
結合ドメインを介して神経毒素がその特異的細胞表面レセプターに結合した後、標的細胞内へのエンドペプチダーゼ活性のトランスロケーションの原因となるドメイン。
【００１２】
低ｐＨ条件下で脂質膜においてイオン透過孔の形成の原因となるドメイン。
【００１３】
７つの血清型の大部分に由来する破傷風菌神経毒素およびボツリヌス菌神経毒素は、それらが由来する重鎖とともに、ｎＭの範囲の高い親和性で、多様な神経細胞型、例えば、ボツリヌス菌Ｂ型神経毒素と結合することを示す（Evansら、(1986)Eur.J.Biochem. 154、409-416）。
【００１４】
神経細胞への治療薬の特異的ターゲティングを提供するために、ボツリヌス菌毒素ＡおよびＢ由来のＨＣドメインを用いることは公知である。
【００１５】
しかし、これらのターゲティングされた構築物とともに同定された問題は、ＨＣドメインが組換えにより作製される場合、神経細胞に対する親和性および特異性が著しく減少することであり、そしてこれは、神経細胞が効果的にターゲティングしないことに匹敵し得る。現在まで、この困難を克服するためにＡ毒素およびＢ毒素由来のＨＣ領域を改変する試みがなされてきたが、成功していない。
【００１６】
これとは別に、Ｃ３細胞外酵素をコードする遺伝子を神経細胞に送達するためのアデノウイルスベクターを用いて、中枢神経系の軸索再生を促進することは公知である。しかし、このアプローチは、治療を受けている患者にウイルス増殖のリスクという不利点がある。その結果、ヒトへの使用についての認可をこれまで受けられなかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の目的は、神経細胞にターゲティングされそしてそこに治療薬を送達するために用いられ得る薬剤を提供することにある。本発明の特定の実施態様の目的は、神経再生を促進し得る薬剤の神経細胞にターゲティングされた送達を提供することにある。さらなる目的は、従来技術で認められる問題および不利点を克服すること、または少なくとも改善することにある。
【００１８】
本発明は、種々の局面において、神経再生を促進するために、治療薬、例えば、Ｒｈｏ機能のインヒビター、神経細胞へのターゲティングされた送達；およびボツリヌス菌Ｃ１毒素由来のＨＣドメイン、特に組換えにより作製されたものを用いる神経細胞への治療薬のターゲティングされた送達のための構築物を提供する。
【００１９】
したがって、本発明の第１の局面は、神経細胞への治療薬の送達のための組成物を提供し、これは、治療薬および神経細胞ターゲティング成分を含み、この成分は、ボツリヌス菌Ｃ１毒素のＨＣドメイン、あるいは天然のＨＣドメインの機能を保持するそのフラグメント、改変体、または誘導体を含む。
【００２０】
したがって、本発明によれば、ボツリヌス菌毒素Ｃ１由来のＨＣ部分は組換えにより作製され、そして治療薬の神経細胞へのターゲティングを提供するために用いられる。Ａ毒素およびＢ毒素由来の対応する鎖とは対照的に、ＨＣ部分は、神経細胞に対するその結合親和性を保持する。
【００２１】
本発明の組成物は、適切には、標的細胞への治療薬のトランスロケーションのために、さらにトランスロケーションドメインを含む。神経細胞ターゲティング薬剤は、１つ以上スペーサー領域を含み得る結合、例えば、共有結合を用いて、治療薬をサイトゾルへ輸送するためのトランスロケーションドメインに結合され得る。クロストリジウム菌神経毒素由来のトランスロケーションドメインの例は以下のとおりである：
ボツリヌス菌Ａ型神経毒素  −アミノ酸残基（449〜871）
ボツリヌス菌Ｂ型神経毒素  −アミノ酸残基（441〜858）
ボツリヌス菌Ｃ型神経毒素  −アミノ酸残基（442〜866）
ボツリヌス菌Ｄ型神経毒素  −アミノ酸残基（446〜862）
ボツリヌス菌Ｅ型神経毒素  −アミノ酸残基（423〜845）
ボツリヌス菌Ｆ型神経毒素  −アミノ酸残基（440〜864）
ボツリヌス菌Ｇ型神経毒素  −アミノ酸残基（442〜863）
破傷風菌神経毒素          −アミノ酸残基（458〜879）
【００２２】
トランスロケーションドメインの他のクロストリジウム菌ソースとしては、C.butylicumおよびC.argentinenseが挙げられる。Clostridium botulinumおよびC.tetaniにおける毒素産生の遺伝学的根拠については、Hendersonら(1997)、 The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic pressを参照のこと。
【００２３】
クロストリジウム菌ソース由来の上記トランスロケーションドメインに加えて、他の非クロストリジウム菌ソースが、本発明の構築物に使用され得る。これらとしては、例えば、ジフテリア菌毒素[London, E.(1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, 25-51頁]、シュードモナスエキソトキシンＡ[Priorら、(1992) Biochem., 31, 3555-3559頁]、インフルエンザウイルス赤血球凝集素融合性ペプチド[Wagnerら、(1992) PNAS, 89, 7934-7938頁]、および両親媒性ペプチド[Murataら、(1992) Biochem., 31, 1986-1992頁]が挙げられる。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様では、トランスロケーションドメインは、ボツリヌス菌毒素Ｃ１トランスロケーションドメインおよびその機能的フラグメントおよび誘導体、ならびにジフテリア菌毒素トランスロケーションドメインおよびその機能的フラグメントおよび誘導体から選択される。
【００２５】
使用に際し、本発明の構築物のドメインは、互いに結合される。１つの実施態様では、２以上のドメインが、直接（例えば、共有結合によって）またはリンカー分子を介してのいずれかで互いに結合され得る。本発明における使用に適切な結合技法は、十分に文献に記載されている：
Chemistry of protein conjugation and cross-linking. Wong, S.S.編、1993, CRC Press Inc., Florida；および
Bioconjugate techniques, Hermanson, G.T.編、1996, Academic Press, London, UK。
【００２６】
２以上のドメインの直接結合は、現在、クロストリジウム菌神経毒素またはそのフラグメントを用いる実施態様、ならびに以下のクロストリジウム菌神経毒素ドメインの命名、すなわち、ドメインＢ（ニューロン細胞ターゲティングドメインを含む）、ドメインＴ（トランスロケーションドメインを含む）、およびドメインＥ（治療薬を含む）について記載されているが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明の１つの実施態様では、ドメインＥおよびドメインＴは、還元条件下で等モル量で一緒に混合され、そして還元剤の不在下で生理食塩溶液中に繰り返して透析（例えば、４℃で撹拌しながら）することによって共有結合され得る。この段階で、ＷＯ９４／２１３００の実施例６とは対照的に、Ｅ−Ｔ複合体は、ヨードアセタミドによってブロックされず、したがって、残存しているあらゆる遊離ＳＨ基が保持される。ドメインＢは、次いで、例えば、その後の還元でカップリング剤ＳＰＤＰでの誘導体化によって改変される。この反応では、ＳＰＤＰは、ドメインＢにスペーサー分子として結合したままではなく、単にこの還元反応の効率を上昇させる。還元されたドメインＢおよびＥ−Ｔ複合体は、次いで、非還元条件下で（例えば、４℃で）混合されて、ジスルフィド結合したＥ−Ｔ−Ｂ構築物を形成し得る。
【００２８】
他の実施態様では、カップリングされたＥ−Ｔ複合体は、ＷＯ９４／２１３００の実施例６に従って調製され得、遊離スルフヒドリル基をブロックするためのヨードアセタミドの添加を含む。しかし、Ｅ−Ｔ複合体はさらに誘導体化されず、そして残留する化学物質は、アミノ酸側鎖（例えば、リジンおよびアルギニンアミノ酸）上の遊離アミノ基（−ＮＨ２）を使用する。
【００２９】
ドメインＢは、カルボジイミド化学を用いて（例えば、ＥＤＡＣを用いて）誘導体化され得、アミノ酸側鎖上のカルボキシル基（例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸アミノ酸）を活性化し、そしてＥ−Ｔ複合体は、誘導体化されたドメインＢと混合されて、共有結合した（アミド結合した）Ｅ−Ｔ−Ｂ構築物を生じる。
【００３０】
このような構築物の生成に適切な方法論は、例えば、以下のとおりである：
ドメインＢをＭＥＳ緩衝液（０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０）に対して透析し、０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。ＥＤＡＣ（１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩）を添加して０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度にし、そして室温で３０分間反応させた。過剰なＥＤＡＣを、ＭＥＳ緩衝液で平衡化したＰＤ−１０カラム（Pharmacia）で脱塩することによって除去した。誘導体化したドメインＢを、Millipore Biomax 10濃縮器を用いて濃縮した（＞２ｍｇ／ｍｌまで）。Ｅ−Ｔ複合体（１ｍｇ／ｍｌ）を、４℃で１６時間混合し、そしてＥ−Ｔ−Ｂ複合体を、Superose 12HR10/30カラム（Pharmacia）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製して、未反応のドメインＢを除去した（カラム緩衝液：５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５＋２０ｍＭ  ＮａＣｌ）。
【００３１】
本発明の構築物／組成物の種々のドメインの直接共有結合の代わりとして、適切なリンカー分子が使用され得る。リンカー分子という用語は、スペーサー分子と同じ意味で用いられる。スペーサー技術は、本出願前に容易に利用可能であった。
【００３２】
例えば、１つの特定のカップリング剤（ＳＰＤＰ）がＷＯ９４／２１３００の実施例６に記載されている（１６頁３〜５行目を参照のこと）。実施例６では、ＳＰＤＰはＥ−Ｔ複合体に連結され、それによってリンカー分子を含むＥ−Ｔ複合体を提供している。この複合体を、次いでドメインＢと反応させ、そしてドメインＢはリンカー分子を介してＥ−Ｔ複合体に結合される。この方法では、ＳＰＤＰは、本発明の構築物の異なるドメイン間に約６．８オングストロームのスペーシング領域を生じる。
【００３３】
ＬＣ−ＳＰＤＰとして知られるＳＰＤＰの改変体は、増大した鎖長を除いて、ＳＰＤＰに関してすべて同一である。ＬＣ−ＳＰＤＰは、これらのドメイン間に１５．６オングストロームのスペーシングを生じる本発明の構築物の２つのドメインを共有結合するために使用され得る。
【００３４】
スペーサー分子の例を挙げるが、これらに限定されない：
（ＧＧＧＧＳ）２、Ｆａｂのエルボー領域−[Anandら(1991) J. Biol. Chem. 266, 21874-9を参照のこと]；
（ＧＧＧＧＳ）３−[Brinkmannら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 8616-20を参照のこと]；
セルラーゼのドメイン間リンカー−[Takkinenら(1991) Protein Eng, 4, 837-841を参照のこと]；
ＰＰＰＩＥＧＲ−[Kim(1993) Protein Science, 2, 348-256を参照のこと]；
コラーゲン様スペーサー−[Rock(1992) Protein Engineering, 5巻, 6号, 583-591頁を参照のこと]；および
トリプシン感受性ジフテリア菌毒素ペプチド−[O’Hare(1990) FEBS, 273巻, 1,2号, 200-204頁を参照のこと]。
【００３５】
本発明のさらなる実施態様では、構造Ｅ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｂを有する構築物（ここで「Ｘ」は各ドメイン間のスペーサー分子である）は、例えば、以下のように調製され得る：
ドメインＥは、ＳＰＤＰで誘導体化されるが、その後還元されない。これによりＳＰＤＰ誘導体化ドメインＥを生じる。ドメインＴは、同様に調製されるが、その後１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）で還元される。ＱＡＥカラムから溶出（ＷＯ９４／２１３００の実施例６を参照のこと）後、ドメインＴ調製物に存在する１０ｍＭ  ＤＴＴは、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムにドメインＴを通すことにより除去される。還元剤を含まないドメインＴは、次いでＳＰＤＰ誘導体化ドメインＥと４℃で撹拌しながら１６時間混合される。Ｅ−Ｔ複合体はサイズ排除クロマトグラフィー（Sephadex G-150）によって、遊離のドメインＥおよび遊離のドメインＴから単離される。その後、ＳＰＤＰでのＥ−Ｔ複合体の再誘導体化についてはＷＯ９４／２１３００の実施例６の記載と同様の手順が行なわれ得、そして続いて、ドメインＢ上の遊離のスルフヒドリルにカップリングして形成される。
【００３６】
本発明の構築物では、トランスロケーションドメイン（ドメインＴ）は限定されず、そしていずれのトランスロケーションドメインでもあり得る。トランスロケーションドメインは、低いｐＨで脂質膜中に測定可能な孔を形成し得る特性によりしばしば同定され得る（Shoneら、Eur J. Biochem. 167, 175-180）。
【００３７】
治療薬は、同様に任意の適切な薬剤であり得、そして「治療物質」または「治療薬」とは、本発明の組成物によってまたは本発明の組成物において送達される場合に、疾患の治療に有益であるあらゆる物質、薬剤、またはそれらの混合物を意味する。これらの例としては、薬物、増殖因子、酵素、および種々の形態にパッケージされたＤＮＡ（例えば、改変されたウイルス、カチオン性リポソーム、および凝縮されたＤＮＡ）が挙げられる。
【００３８】
神経再生を促進するためには、任意のＲｈｏインヒビター、特にＣ３細胞外酵素が用いられ得る。細胞外酵素のＣ３ファミリーは、通常９より大きい塩基性の等電点を有する２０〜３０ｋＤａのタンパク質のファミリーとして定義される。この酵素は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼであり、ＡＤＰ−リボースの添加によって、通常はＲｈｏファミリーの低分子量ＧＴＰアーゼを改変する。これにより、通常、ＧＴＰアーゼは不活性化する。
【００３９】
現在までに記述されるＣ３細胞外酵素ファミリーのメンバーとしては、Clostridium botulinum由来の少なくとも２つのイソ型、C.limosum由来の１つのイソ型、Bacillus cereus由来の１つのイソ型、およびStaphylococcus aureus由来の３つのイソ型が挙げられる。C.acetobutylicum、Streptococcus pyogenes、およびListeria monocytogenes由来のＣ３イソ型は、最初に本明細書中に開示されており、そして本発明のさらなる実施態様を表す。
【００４０】
Ｃ３活性を有する酵素は、例えば、実施例１に記載のアッセイを用いて同定され得る。
【００４１】
Ｃ３様毒素は、さらに、活性部位の２つのエレメントをカバーするモチーフの存在によって定義され得、そのためすべての例がコンセンサスS S/T S/T Hyd X35-40 Q/E X E Hyd Hyd Hyd（Hydは、任意の疎水性残基（通常、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＧまたはＡ）を示し、そしてＸは任意のアミノ酸を示す）を有する。モチーフは、通常、上記の２つの位置の１つに芳香族残基を有する。S S/T S/Tモチーフは、基質特異性の重要な決定基である。したがって、本発明に用いられるＣ３酵素は、好ましくは、これらのモチーフを含むものである。
【００４２】
本発明のさらなる局面は、神経細胞治療における使用のための、ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーのメンバーのインヒビターを含むポリペプチド構築物；および、神経細胞治療のための医薬品の製造での使用のための、ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーのメンバーのインヒビターの使用を提供し、両方の場合において、インヒビターは適切には、Ｃ３酵素であるかまたはＣ３酵素を含む。
【００４３】
使用に際し、本発明の構築物の利点としては、以下の１つ以上が挙げられる：
ニューロンにターゲティングされ、したがって、非神経細胞に細胞傷害性の影響がないこと、
１つのＣ３分子が多くの標的（Ｒｈｏ）分子を不活性化し得るＣ３の酵素作用は、１対１の比で標的に結合することによって作用する従来の（薬物様の）インヒビターよりも効果的である効率的阻害を提供すること、
ウイルスベクターと比較してはるかに小さい分子サイズであり、したがって、インビボで組織の浸透がより良好であること、
ウイルス送達ベクターと比較してより安全なプロファイルであり、インビボで制御されない複製の危険性がないこと、
細胞への機能的タンパク質の送達であり、ＤＮＡのタンパク質への翻訳が効果の前に生じなければならないＤＮＡ送達と対比すると、作用の遅延がないこと、
本発明の構築物は、ウイルスまたはＤＮＡ構築物よりも免疫原性が少ないこと、
Staphylococcus種由来のＣ３を用いて調製された構築物は、天然に存在する細胞内タンパク質ＲａｌＡによって阻害されないという利点を有すること、
ボツリヌス菌毒素のターゲティングされたＣ３は、効率的な作用および減少した免疫応答を生じる高親和性レセプター相互作用のため、ニューロンに迅速に結合すること、および
細胞質のＲｈｏＡとは別のＲｈｏイソ型を特異的にターゲティングすることが可能であること；例えば、エンドソームのＲｈｏＢのターゲティングは顕著な治療の可能性を有すること。
【００４４】
本発明の組成物のための改変されたクロストリジウム菌重鎖は、クロストリジウム菌神経毒素の結合ドメイン（ＨＣドメイン）と非クロストリジウム菌トランスロケーションドメインとを結合させることによって適切に産生される。したがって、例えば、改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントは、ボツリヌス菌毒素のＨＣドメイン（例えば、Ｆ型ＨＣフラグメント、残基８６５〜１２７８；Ａ型ＨＣフラグメント、残基８７２〜１２９６）に融合したジフテリア菌毒素のトランスロケーションドメイン（残基１９４〜３８６）から構築され得る。
【００４５】
本発明の他の実施態様では、改変されたクロストリジウム菌重鎖は、クロストリジウム菌神経毒素のＨＣドメインを、トランスロケーションドメインとして機能する膜破壊ペプチド、適切には、ウイルスペプチドと結合させることによって産生される。したがって、例えば、改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントは、ボツリヌス菌毒素のＨＣドメインをインフルエンザウイルス赤血球凝集素ＨＡ２（残基１〜２３）に基づくペプチドと結合させることによって構築され得る。
【００４６】
本発明の他の実施態様では、改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントは、トランスロケーションドメインのＮ末端を介してリンカーペプチドと融合され、そこにリンカーペプチドであるポリペプチドペイロードが結合し得る。このようなリンカーペプチドの例は、配列ＣＧＬＶＰＡＧＳＧＰ（配列番号２３）であり、これは、トロンビンプロテアーゼ開裂部位およびジスルフィド架橋形成のためのシステイン残基を含む。このようなペプチドリンカーは、改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントのＮ末端にリンカーペプチドによって融合されたポリペプチド治療剤分子を含む組換え融合タンパク質を産生させる。次いで、後者の一本鎖融合タンパク質は、トロンビン処理されて、二本鎖タンパク質を与え得、そこでは、ポリペプチド治療剤が、トランスロケーションドメインの遊離システインとリンカーペプチドのシステイン残基との間のジスルフィド結合によって、改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントのトランスロケーションドメインに連結される。トランスロケーションドメインがＣ末端の近くに遊離システイン残基を含まないリンカーペプチドの他の例では、例えば、トランスロケーションドメインが融合性ペプチドである場合、リンカーペプチドは、ジスルフィド架橋に必要とされる両方のシステイン残基を含む。後者のリンカーペプチドの例は、アミノ酸配列：ＣＧＬＶＰＡＧＳＧＰＳＡＧＳＳＡＣ（配列番号２４）である。
【００４７】
本発明の他の実施態様では、改変されたクロストリジウム菌重鎖は、神経細胞に送達される場合に治療上の利益を有する酵素、増殖因子、タンパク質、またはペプチドであり得るポリペプチドに連結される。ポリペプチドは、化学的手段によって改変されたクロストリジウム菌重鎖に連結され得る。あるいは、ポリペプチドは、上記のようなリンカーペプチドを用いる組換え技術によって、改変されたクロストリジウム結合フラグメントに連結された融合タンパク質として産生され得る。このような例では、構築物は以下の成分を含む：
ポリペプチド治療物質；
リンカーペプチド；および
改変されたクロストリジウム菌重鎖。
【００４８】
本発明のさらに他の実施態様では、改変されたクロストリジウム菌重鎖は、ＤＮＡに直接的または間接的に連結され、そのため、構築物は、神経細胞にＤＮＡを送達し得る。このような構築物は、遺伝子治療の適用を有し、そして細胞で選択された遺伝子のスイッチを入れるまたは切ることに用いられる。ＤＮＡは、リポソームの内部に含まれ得るかまたはペプチドもしくはタンパク質を介して凝縮され得る。改変されたクロストリジウム菌重鎖は、化学的カップリング剤によってＤＮＡ凝縮を生じるタンパク質に化学的に連結され得る。あるいは、改変されたクロストリジウム菌重鎖は、組換え技術によって、ＤＮＡの凝縮を生じ得るペプチドとの融合タンパク質として産生され得る。
【００４９】
本発明のさらに他の実施態様では、改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントは、組換えウイルスに連結され得、そのため、この改変されたウイルスは、改変された向性を有しそして細胞に形質導入することができる。このような構築物は、選択された遺伝子のスイッチを入れるまたは切ることによって神経細胞内で遺伝子欠失を修正するために有用である。改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントは、化学架橋剤を用いてウイルスの表面に直接的に連結され得る。あるいは、改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントは、ウイルスに特異的に結合する抗体を介して組換えウイルスに連結され得る。この場合、改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントは、ウイルスの表面上のマーカーを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体に化学的にカップリングされる。類似の改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメント−抗体融合タンパク質は、組換え技術によって産生され得、そこでは抗体成分は、組換え一本鎖抗体である。
【００５０】
本発明のさらに他の実施態様では、改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントは適切なポリマーから構築されるマイクロパーティクルとして薬剤放出システムに連結される。これらのポリマーとしては、例えば、ラクチド−グリコリド共重合体、ポリヒドロキシルアルコネート、コラーゲン、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、またはこのようなマイクロパーティクルに有用な他のポリマーが挙げられる。改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントは、共有化学結合、または静電もしくは疎水力によって薬剤放出システムに連結され得る。改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントはまた、改変されたクロストリジウム菌結合ドメインの一部が表面に露出される供給されるならば、治療ペイロードと一緒に放出ベヒクル内にカプセルで包まれ得る。あるいは、改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントは、ＮまたはＣ末端のいずれかで、ペプチドまたはタンパク質に連結されて、薬剤放出システムへのフラグメントのカップリングを容易にし得る。
【００５１】
他の方法は、公知であり、それにより改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントは、種々の確立された化学的架橋技法を用いて、ある範囲の治療物質に結合され得、そして改変されたクロストリジウム菌結合フラグメントおよび他のポリペプチドを含む種々の融合タンパク質が産生され得る。これらの技法を用いて、種々の物質が改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントを用いて神経細胞にターゲティングされ得る。神経送達ベクターとしての改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメントの使用の可能性がある例は、以下により詳細に示す。
【００５２】
本発明の構築物は、当該技術分野で公知の方法を用いて神経組織または非神経組織のいずれかに導入され得る。神経細胞組織へのその後の特異的結合によって、ターゲティングされた構築物は、その治療効果を発揮する。理想的には、構築物は、治療介入を必要とする部位の近くに注入される。
【００５３】
本発明の構築物は、治療物質の適応および特性に依存して、懸濁液、乳化液、溶液、または凍結乾燥粉末として生成され得る。本発明の構築物は、適応に応じて種々の薬学的に受容可能な液体に再懸濁または希釈され得る。
【００５４】
「クロストリジウム菌神経毒素」とは、破傷風菌神経毒素または７つのボツリヌス菌神経毒素のうちの１つのいずれかを意味し、後者は、血清型Ａ型、Ｂ型、Ｃ１型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、またはＧ型と命名されている。
【００５５】
「改変されたクロストリジウム菌重鎖フラグメント」とは、ボツリヌス菌または破傷風菌毒素由来の対応する重鎖と同様に神経細胞レセプターに結合するが、ボツリヌス菌毒素または破傷風菌毒素由来の対応するフラグメントと比較してそのアミノ酸配列および特性が異なる、ポリペプチドフラグメントを意味する。
【００５６】
ボツリヌス菌および破傷風菌の重鎖フラグメントに関して「結合する」とは、クロストリジウム菌フラグメントと細胞表面上の結合フラグメントの局在化を生じる１以上の細胞表面レセプターまたはマーカーとの間の特異的相互作用を意味する。クロストリジウム菌神経毒素の場合、所定の血清型のフラグメントと同様に「結合」し得るフラグメントの特性は、リガンドと天然の毒素との間のその神経細胞レセプターに対する競合によって証明され得る。
【００５７】
「クロストリジウム菌神経毒素に対応する神経細胞に特異的な高親和性結合」とは、所定の神経毒素の特異的結合に関連する神経細胞の細胞表面レセプターに、リガンドが強く結合する能力を言う。所定のリガンドがこれらの細胞表面レセプターに強く結合する能力は、従来の競合結合アッセイを用いて評価され得る。このようなアッセイでは、放射標識されたクロストリジウム菌神経毒素を、種々の濃度の非放射標識リガンドの存在下で、神経細胞と接触させる。リガンド混合物を、低温（０〜３℃）で、細胞とインキュベートして、リガンドのインターナリゼーションを抑制し、その間に放射標識されたクロストリジウム菌神経毒素と非標識リガンドとの間で競合が生じ得る。このようなアッセイでは、用いる非標識リガンドが、標識された神経毒素と同様である場合、非標識神経毒素の濃度が上昇するにつれて、放射標識されたクロストリジウム菌神経毒素は、神経細胞レセプターから置き換えられる。したがって、この場合に得られる競合曲線は、リガンドの行動を代表し、本明細書で用いられように、「クロストリジウム菌神経毒素に対応する神経細胞への高親和性結合特異性」を示す。
【００５８】
「トランスロケーションドメイン」とは、膜または脂質二重層を横切って、それ自体および／または他のタンパク質および物質を輸送するタンパク質のドメインまたはフラグメントを意味する。後者の膜は、レセプター媒介されるエンドサイトーシスのプロセス中にトランスロケーションが起こるエンドソームの膜であり得る。トランスロケーションドメインは、低いｐＨで脂質膜中に測定可能な孔を形成することができる特性によってしばしば同定され得る（Shoneら、Eur J. Biochem. 167, 175-180頁）。トランスロケーションドメインの例を、以下の図１により詳細に示す。本出願では、トランスロケーションドメインは、しばしば「ＨＮドメイン」という。
【００５９】
トランスロケーションドメインに関して「トランスロケーション」とは、細胞表面に結合した後に起こるインターナリゼーション事象を意味する。これらの事象は、神経細胞のサイトゾルに物質を輸送させる。
【００６０】
「治療物質」または「薬剤」とは、改変されたクロストリジウム菌結合フラグメントによって送達される場合、神経疾患の治療に有益である任意の物質、薬剤、またはそれらの混合物を意味する。これらの例としては、薬物、増殖因子、酵素、および種々の形態にパッケージされたＤＮＡ（例えば、改変されたウイルス、カチオン性リポソーム、および凝縮されたＤＮＡ）が挙げられる。
【００６１】
「Ｃ３様活性」とは、酵素が、Ｒｈｏファミリーの低分子量の細胞ＧＴＰアーゼに特異的であるＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を発現することを意味する。この活性においては、Ｃ３様酵素は、ＮＡＤからＲｈｏＧＴＰアーゼへのＡＤＰ−リボース部分の転移を触媒し、通常ＧＴＰアーゼの機能を喪失させる。
【００６２】
本発明では、宿主細胞中でポリペプチドをコードする核酸を発現させることによって本発明のポリペプチドを製造する方法、および神経細胞に関連する疾患状態の治療における本発明のポリペプチドまたは組成物の使用も提供される。
【００６３】
本発明は、以下の特定の実施態様で説明され、そして図を添付する。
【実施例】
【００６４】
１．酵素内の細胞外酵素Ｃ３活性の測定
細胞外酵素Ｃ３についてのアッセイを行うために、以下の成分を含むアッセイミックスを調製した：
・１０μｌのアッセイ緩衝液（最終濃度２ｍＭのＭｇＣｌ２を含む０．０５Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２）
・アッセイ緩衝液中の２０μｌの組換えＲｈｏＡ溶液（１００μｌのアッセイあたり０．５μｇを供する）
・アッセイ緩衝液中の２０μｌの[３２Ｐ]ＮＡＤ＋溶液（１００μｌのアッセイあたり１μＣｉを供する）。ＮＡＤはαリン酸位置で標識されている。
【００６５】
この混合物を、３７℃で５分間インキュベートし、次いで５０μｌのＣ３酵素溶液（予め３７℃に温めた）を加えて、酵素反応を開始した。
【００６６】
３７℃で種々の時間（代表的には１５〜１２０分の間）のインキュベーション後、１００μｌのＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれのアッセイミックスに加え、次いで０．５ｍｌの２４％トリクロロ酢酸溶液（ＴＣＡ）を加えて、反応を停止した。生じた沈殿物を、マイクロ遠心分離機で２分間高速で遠心分離し、上清液をデカントし、次いで沈殿物をさらに１ｍｌの１２％ＴＣＡ溶液で洗浄した。沈殿物を、ピペットの先端を数回通すことによって１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、次いで５ｍｌのシンチレーション液を加え、混合し、そしてシンチレーションカウンターでカウントした。
【００６７】
細胞外酵素Ｃ３または細胞外酵素Ｃ３様活性を有する酵素の存在を、Ｃ３酵素を含まないコントロールインキュベーションと比較して、ペレット中の著しく高い放射活性の存在によって確認した。
【００６８】
２．Ｃ３遺伝子のクローニングおよび発現
標準的な分子生物学プロトコルを、すべての遺伝子操作に用いた（Sambrookら、1989, Molecular cloning; A laboratory manual. 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.）。Ｃ３遺伝子をＰＣＲによって増幅して、クローニングに適切な制限部位を生成した。いくつかの場合には、E.coliでの発現に最適化したコドン使用の合成遺伝子を調製した。制限部位BamHI(5’)およびBalII(3’)をほとんどのクローニング操作について用いて、リーディングフレームを制限部位の最初の塩基で開始するように設計した。構築物を配列決定し、正しい配列の存在を確認した。ApaI-HindIII消化されたクローニングベクターｐＢＣ（Strategene）中にApaI-HindIIIフラグメントとしてサブクローニングされたｐＭＡＬ−Ｃ２ｘ（ＮＥＢ）由来のｍａｌＥ遺伝子を含む発現ベクターを調製した。Ｃ３遺伝子を、BamHI-BalIIフラグメントとしてBamHI部位にクローニングした。あるいは、Ｃ３遺伝子を、Ｔ７ポリメラーゼプロモータ部位を有する発現ベクター（例えば、ｐＥＴ２８、ｐＥＴ３０、または誘導体(Novagen Inc, Madison, WI)）中に、または適切なフラグメントとしてマルトース結合タンパク質（例えば、ｐＭＡＬｃ２ｘ（ＮＥＢ））との融合物としてのいずれかにクローニングした。配列が確認されたクローンを用いて発現宿主に形質転換した。ほとんどの発現にＴＢ１株を用い、必要に応じて代わりの宿主を用いた（Ｔ７ポリメラーゼベクターについては、E.coli BL21(DE3)（StudierおよびMoffatt, 1986 Journal of Molecular Biology 189: 113-130）JM109(DE3)またはＤＥ３溶原性を有する等価の株。ｐＭａｌｃ２ｘについては、JM109、BL21、TG1、TB1、または他の適切な発現株）。
【００６９】
標準的融合タンパク質としてのＣ３タンパク質の発現に加えて、さらなるアプローチを用いて、ターゲティングベクターへの直接アセンブリのための融合物を生成した。Ｃ３フラグメントを、ハイブリッドのジフテリア菌トランスロケーションドメイン−クロストリジウム菌神経毒素結合ドメイン融合タンパク質のような神経細胞ターゲティング部分の５’末端に導入されたBamHI部位にクローニングした。
【００７０】
ＴＢ１  ｐＢＣｍａｌＥ  Ｃ３の発現培養物を、35μg/mlのクロラムフェニコールおよび0.5％(w/v)グルコースを含むTerrific  Broth中で３０℃で２．０のＯＤ６００になるまで増殖し、そして培養物を５００μＭ ＩＰＴＧで誘導し、そして２５℃で２時間増殖した。他の発現系は、抗生物質をカナマイシンまたはアンピシリンのいずれかに変えたこと以外は類似の条件を用いた。細胞を、カラム緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．８）中での超音波処理または適切なデタージェント処理（例えば、Bugbuster試薬；Novagen）のいずれかによって溶解し、そして細胞破砕片を遠心分離によってペレットにした。上清タンパク質を、カラム緩衝液で平衡化したＳＰ−セファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムにかけて、そしてタンパク質を０〜１ＭのＮａＣｌグラジエントで溶出した。ＭＢＰ−Ｃ３融合物を、２００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。融合タンパク質を、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．８（溶出された場合）中で第Ｘａ因子で切断して、そのＭＢＰ融合パートナーからＣ３ドメインを分離した。タンパク質を希釈して、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．８の最終緩衝液濃度にし、そして初めに用いたのと同一条件下でＳＰ−セファロースカラムにかけた。本質的に夾雑タンパク質を含まないＣ３タンパク質を、約４００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。タンパク質を、必要になるまで−７０℃で保存した。
【００７１】
Ｃ３ｓｔａｕ２イソ型は、同様の方法を用いて精製され得る。細胞を、２０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ５．８で溶解し、そして可溶性物質をＳＰ−セファロースカラムにかける。タンパク質を、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出する。タンパク質を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．３に対して透析し、そして第Ｘａ因子で切断する。タンパク質を、第２のＳＰ−セファロースカラムに通し、そして約２５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出する。タンパク質は−７０℃で安定である。
【００７２】
Ｈｉｓ−タグ融合物を、Ｃｕ２＋で荷電した金属キレートカラム（Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）にかけた。タンパク質をカラムにかけて洗浄した後、タンパク質をイミダゾールを用いて溶出した。すべての緩衝液を製造業者によって指定されたように用いた。適切には、精製タグの除去を製造業者の指示書に従って行った。
【００７３】
ＭＢＰ融合物もまた、上記のように１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むTerrific  Brothで増殖した後、溶解し、製造業者（ＮＥＢ）の記載に基づいてアミロース樹脂カラムで精製し得た。
【００７４】
３．重鎖フラグメントの発現
標準的分子生物学プロトコルを、すべての遺伝子操作に用いた（Sambrookら、1989, Molecular cloning; A laboratory manual. 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.）。天然の遺伝子またはE.coliでの発現に最適化したコドン使用の合成遺伝子のいずれかに由来するクロストリジウム菌神経毒素結合ドメイン（ＢｏＮＴ／ＨｃまたはＴｅＮＴ／Ｈｃ）をＰＣＲによって増幅した。導入されたBamHI(5’)制限部位およびHindIII、SalIまたはEcoRI(3’)部位を、ほとんどのクローニング操作について用いて、リーディングフレームを制限部位の最初の塩基で開始するように設計した。構築物を配列決定して、正しい配列の存在を確認した。ジフテリア菌毒素のトランスロケーションドメイン（ＤｉｐＴ）を天然の遺伝子から増幅して、５’および３’末端にそれぞれBamHIおよびBglIIを導入した。このBamHIおよびBglIIフラグメントを、Ｈｃフラグメントの５’末端のBamHI部位にサブクローニングして、インフレーム融合物を生成した。完全な重鎖フラグメント（ＤｉｐＴ−Ｈｃ）を、BamHI-HindIIIまたはBamHI-SalIまたはBamHI-EcoRIフラグメントとして切り出し、そして適切な発現ベクターにサブクローニングした。
【００７５】
発現のため構築物を、Ｔ７ポリメラーゼプロモータ部位を有する発現ベクター（例えば、ｐＥＴ２８、ｐＥＴ３０、または誘導体(Novagen Inc, Madison, WI)に、または適切なフラグメントとしてマルトース結合タンパク質（例えばｐＭＡＬｃ２ｘ（ＮＥＢ））を有する融合物を生成するようにいずれかでサブクローニングした。配列が確認されたクローンを用いて発現宿主を形質転換した：Ｔ７ポリメラーゼベクターについては、E.coliＢＬ２１（ＤＥ３）（StudierおよびMoffatt, 1986 Journal of Molecular Biology 189: 113-130）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）。ＤＥ３溶原性を有する同等の株については、ｐＭａｌｃ２ｘ、JM109、BL21、TG1、TB1、または他の適切な発現株。
【００７６】
ｐＥＴベクターから発現した組換えタンパク質は、アミノ末端ヒスチジン（６−Ｈｉｓ）およびＴ７ペプチドタグを含み、タンパク質が、Ｃｕ２＋で荷電した金属キレートカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製されるのを可能にする。発現培養物を、30μg/mlのカナマイシンおよび0.5%(w/v)グルコースを含むTerrific  Broth中で２．０のＯＤ６００になるまで増殖し、タンパク質発現を５００μＭ ＩＰＴＧで２時間誘導した。細胞を、超音波処理または適切なデタージェント処理（例えば、Bugbuster試薬；Novagen）のいずれかによって溶解し、細胞破砕片を遠心分離によってペレットにし、そして上清をＣｕ２＋で荷電した金属キレートカラムにかけた（Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）。タンパク質をカラムにかけて洗浄した後、タンパク質をイミダゾールを用いて溶出した。すべての緩衝液を製造業者によって指定されたように用いた。適切には、精製タグの除去を製造業者の指示書に従って行った。
【００７７】
ＭＢＰ融合物もまた、上記のように１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むTerrific  Brothで増殖した後、溶解し、製造業者（ＮＥＢ）の記載に基づいてアミロース樹脂カラムで精製した。
【００７８】
４．ボツリヌス菌Ｃ１型神経毒素の重鎖の精製
工程１．ボツリヌス菌Ｃ１型神経毒素（合計５ｍｇ）を、ホウ酸／リン酸緩衝液ｐＨ８．５（２９ｍＭ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７；４２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＯＨでｐＨ８．５に滴定した）に対して透析し、次いでホウ酸／リン酸ｐＨ８．５緩衝液で平衡化したＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ(Pharmacia)のカラム（１ｃｍ×５ｃｍ）にかける（０．５ｍｌ／分）。次いで、カラムをさらに１０ｍｌの緩衝液で、次いで１０ｍＭのジチオトレイトール含む１０ｍｌのホウ酸／リン酸緩衝液で洗浄する。後者の緩衝液をカラムにほぼ完全に流した後、１００ｍＭのジチオトレイトールおよび２Ｍの尿素を含む３ｍｌのホウ酸／リン酸ｐＨ８．５緩衝液を注意深くカラムにかけ、そして２．５ｍｌのこの緩衝液をゲル上に流す。次いで、カラムを密封し、４℃で一晩中インキュベートする。
【００７９】
工程２．神経毒素の軽鎖サブユニットを、２Ｍの尿素および１０ｍＭのジチオトレイトールを含む２０ｍｌのホウ酸／リン酸ｐＨ８．５緩衝液で溶出して、１．５ｍｌずつの画分を採取する。
【００８０】
工程３．Ｃ１型神経毒素の重鎖サブユニットを、２Ｍの尿素、１０ｍＭのジチオトレイトール、および０．２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍｌのホウ酸／リン酸ｐＨ８．５緩衝液で溶出する。溶出された画分（１ｍｌ）中の重鎖の存在を、ｕｖ測定によって検出し得る。最も高い濃度のタンパク質を含む画分をプールし、次いで０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０５Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４緩衝液に対して透析する。精製されたＣ１型神経毒素を、必要になるまで、−８０℃で凍結保存し得る。
【００８１】
５．化学的Ｃ３−重鎖結合体の調製
精製したＣ３を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中で透析した。Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰを添加して、最終的にモル過剰のＳＰＤＰ：Ｃ３＝３：１にし、そして室温で２時間反応させた。遊離のＳＰＤＰを透析によって除去した。誘導体化したＣ３を、遊離システイン残基を含む天然または組換え重鎖フラグメントのいずれかを用いて４℃で２０時間インキュベートした。遊離Ｃ３を、必要に応じて、実施例１に記載のＳＰ−セファロースカラムと同じ条件下で行ったＭｏｎｏＳカラムのカチオン交換クロマトグラフィーによって除去し得た。必要に応じて、Ｃｉｂａｃｒｏｎ−Ｂｌｕｅアフィニティー樹脂でのさらなる精製も可能である。
【００８２】
６．神経芽腫細胞におけるＣ３結合体の活性の評価
ＮＧ１０８神経芽腫細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）および２ｍＭのグルタミンを含むＤＭＥＭ中、３７℃にて５％ＣＯ２飽和で培養した。細胞を、２×１０４個の密度でポリ−Ｄ−リジンでコーティングした９６ウェル培養プレートにプレーティングした。２４時間後、細胞を、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ／グルタミン培地中に変え、そして上記のようにさらに１６時間培養した。結合体または遊離のＣ３を添加し、そして細胞を３時間または一晩のいずれかにわたってインキュベートした。細胞をＤＭＥＭ／グルタミン中の１μＭのリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）で処理した。細胞を顕微鏡下で形態学的変化について観察した。図１に示すように、３０μｇ／ｍｌの最終濃度のＣ３は、ＬＰＡが媒介した神経突起退縮から細胞を防護した。ＬＰＡ処理に対する応答における細胞事象についてアッセイするために、ＭＴＴアッセイを既述のように用いた（Alley MC, Scudiero DA, Monks A, Hursey ML, Czerwinski MJら、(1988) Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res 48、589-601）。図２に示すアッセイの結果は、ＬＰＡ処理された細胞で、ＭＴＴの減少によって測定されるように、ミトコンドリア活性の著しい減少を示す。ＬＰＡの添加前にＣ３（３０μｇ／ｍｌの最終濃度）で予め処理された細胞は、未処理のコントロール細胞と類似のレベルのミトコンドリア活性を示し、これは、Ｃ３がＬＰＡで誘導された細胞の傷害を防ぐことを示す。これは、傷害を受けたニューロンにおける防護効果または神経刺激効果を示す。
【００８３】
発現した配列の同定
本明細書に添付する配列表において、配列は以下の由来を有する：
【００８４】
配列１  Ｎ末端シグナル配列を含まず、成熟配列の最初のアラニンアミノ酸に隣接する第Ｘａ因子開裂部位を含む、Clostridium  botulinum由来のＣ３タンパク質。
【００８５】
配列２  Ｎ末端シグナル配列を含まず、成熟配列の最初のアラニンアミノ酸に隣接する第Ｘａ因子開裂部位を含む、Staphylococcus aureus由来のＣ３タンパク質。このタンパク質は、Ｃ３Ｓｔａｕ２イソ型をいい、時々ＥＤＩＮ  Ｂという。
【００８６】
配列３  Ｎ末端シグナル配列を含まず、成熟配列の最初のアラニンアミノ酸に隣接する第Ｘａ因子開裂部位を含む、Staphylococcus aureus由来のＣ３タンパク質をコードする遺伝子。この合成遺伝子は、E.coliでの発現に最適化されたコドン使用を有し、時々ＥＤＩＮ  ＢといわれるＣ３Ｓｔａｕ２イソ型をコードする。
【００８７】
配列４  Staphylococcus aureus由来の成熟Ｃ３タンパク質；Ｃ３Ｓｔａｕ１（ＥＤＩＮ  Ａ）と称す。
【００８８】
配列５  Staphylococcus aureus由来の完全長Ｃ３タンパク質；Ｃ３Ｓｔａｕ１（ＥＤＩＮ  Ａ）と称し、Ｎ末端にシグナル配列を含む。
【００８９】
配列６  Clostridium limosum由来の成熟Ｃ３タンパク質。
【００９０】
配列７  Listeria monocytogenes由来のＣ３様タンパク質。
【００９１】
配列８  Clostridium acetobutylicum由来のＣ３様タンパク質。
【００９２】
配列９  Streptococcus pyogenes由来のＣ３様タンパク質（天然のタンパク質配列）。
【００９３】
配列１０  Streptococcus pyogenes由来の第２のＣ３様タンパク質（天然のタンパク質配列）。
【００９４】
配列１１  二本鎖リンカー領域を有するＢｏＮＴ／Ｃ１の天然の重鎖（ＨＣ）を示す。リンカー領域内の天然の第Ｘａ因子開裂部位も存在する。必要に応じて、フラグメントはまた、Ｎ末端にアミノ酸ＧＳを含み得、これはクローニング目的で用いられるインフレームのBamHI部位によってコードされる。
【００９５】
配列１２  ＢｏＮＴ／Ｃ１由来の単離されたレセプター結合ドメインＨＣを示す。これは、ＨＣのＣ末端ドメインに対応し、そしてニューロンレセプターに結合する能力を付与することが示されている。必要に応じて、ドメイン配列の前にフラグメントのクローニングに用いられるインフレームBamHI部位でコードされるアミノ酸ＧＳがＮ末端にある。
【００９６】
配列１３  発現構築物において、示された最初のアラニン残基の前に第Ｘａ因子開裂部位があり、そのためタンパク質分解のプロセシングによってすべての融合パートナーが除去される。鎖内リンカーは、同じプロセシング工程中に同時に開裂される。
【００９７】
配列１４  二本鎖リンカー領域を有する融合タンパク質Ｃ３Ｓｔａｕ２ＢｏＮＴ／Ｃ１−ＨＣを示す。発現構築物において、示された最初のアラニン残基の前に第Ｘａ因子開裂部位があり、そのためタンパク質分解のプロセシングによってすべての融合パートナーが除去される。鎖内リンカーは同じプロセシング工程中に同時に開裂される。
【００９８】
配列１５  天然のＢｏＮＴ／Ｃ１由来のリンカー領域を有する融合タンパク質Ｃ３ｂｏｔＢｏＮＴ／Ｃ１−ＨＣを示す。発現構築物において、示された最初のアラニン残基の前に第Ｘａ因子開裂部位があり、そのためタンパク質分解のプロセシングによってすべての融合パートナーが除去される。鎖内リンカーは同じプロセシング工程の中に同時に開裂される。この構築物は、配列１３とは異なり、ＨＮドメインを含まず、そしてトランスロケーション機能がない。これは、細胞においてＣ３フラグメントの細胞内輸送を変える。必要に応じて、リンカーは除去され得、Ｃ３フラグメントは、ＢｏＮＴ／Ｃ１−ＨＣフラグメントに直接連結される。リンカー配列に続くＧＳアミノ酸残基は、フラグメントの構築に用いられるBamHI部位に由来する。
【００９９】
配列１６〜２４  ＢｏＮＴ／Ｃ１−ＨＣまたはＨＣフラグメントにＣ３全体を連結するために適切な種々の代わりのリンカーを示す。種々の実施態様では、これらのリンカーは、必要に応じて、配列２２として同定された天然のリンカー配列に置き換えられる。いくつかの場合、これらのリンカーは、異なる特異的プロテアーゼによって開裂され得、第Ｘａ因子との融合部位および鎖内部位の連続プロセシングを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】Ｃ３酵素による、ＬＰＡ処理した神経芽腫細胞における神経突起反応に対する防護を示す。
【図２】ＬＰＡ処理したニューロンにおけるＣ３の防護または神経刺激効果を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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