(57)【要約】目的形質を発現し前記形質の後代への分布が制御されているトランスジェニック多細胞植物又は動物の産生方法であって、前記方法が前記目的形質をコードするヌクレオチド配列の第１断片を含む第１異種ＤＮＡ配列を有する第１多細胞生物又はその細胞と、前記目的形質をコードするヌクレオチド配列の第２断片を含む第２異種ＤＮＡ配列を有する第２多細胞生物又はその細胞とを交雑することを含み、前記第１及び第２異種配列が前記交雑後にＲＮＡトランススプライシングにより前記目的形質が生じるように設計されている産生方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的形質を発現し、前記形質の後代への制御された分布を有するトランスジェニック多細胞植物又は動物の産生方法であって、前記方法が
前記目的形質をコードするヌクレオチド配列の第１断片を含む第１異種ＤＮＡ配列を有する第１多細胞生物又はその細胞、及び
前記目的形質をコードするヌクレオチド配列の第２断片を含む第２異種ＤＮＡ配列を有する第２多細胞生物又はその細胞、
を交雑することを含み、
前記第１及び第２異種配列が前記交雑後にＲＮＡトランススプライシングにより前記目的形質が生じるように設計されている、
産生方法。
【請求項２】
目的形質を発現し、前記形質の後代への制御された分布及び前記形質の制御された発現を有するトランスジェニック多細胞植物又は動物の産生方法であって、前記方法は、
前記目的形質をコードする配列の第１断片を含む第１異種ＤＮＡ配列を有する多細胞生物又はその細胞の用意、及び
前記目的形質をコードする配列の第２断片を含む第２異種ＤＮＡ（又はＲＮＡ）配列の前記多細胞生物の細胞への導入、
を含み、
前記第１及び第２異種配列が前記導入によって細胞をスイッチした後にＲＮＡトランススプライシングにより前記目的形質の発現が生じるように設計されている、
産生方法。
【請求項３】
前記第１異種ＤＮＡ配列を有する前記多細胞生物又はその細胞が多細胞生物又はその細胞に前記第１異種ＤＮＡ配列を導入することによって産生される請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第１異種ＤＮＡ配列及び前記第２ＤＮＡ（又はＲＮＡ）配列が一段階又は二段階手順で前記多細胞生物に導入される請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記の制御された分布が、前記トランスジェニック多細胞生物と、前記第１及び第２異種配列を欠く生物とを交雑するとき、子孫生物での前記形質の出現頻度が１％未満、好ましくは０．１％未満、さらに好ましくは０．０１％未満、最も好ましくは０．００１％未満であることを意味する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１及び前記第２異種ＤＮＡ配列の少なくとも一方がトランススプライシング用のリボザイムを含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
トランススプライシングするリボザイムが以下の群：グループＩイントロン由来リボザイム、グループＩＩイントロン由来リボザイム、及び特異的ＲＮＡトランススプライシングが可能な他の天然又は人工設計リボザイムから選択される請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記トランススプライシングがスプライソソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）介在性である請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記トランスジェニック多細胞植物又は動物が前記第１又は前記第２異種配列の一方の非存在下では前記目的形質を発現できない請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記トランススプライシングがタンパク質を翻訳し生産できるメッセンジャーＲＮＡを生じて目的の形質を有する前記トランスジェニック多細胞植物又は動物を与える、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記トランススプライシングが複数の発現可能なメッセンジャーＲＮＡを生じることによって、多種のタンパク質又はそれぞれ異なるキメラタンパク質を生成する請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記トランススプライシングが二本鎖ＲＮＡを生じる請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記二本鎖ＲＮＡが前記トランスジェニック多細胞植物又は動物に前記標的遺伝子が発現するのを阻害できるほど十分長い標的遺伝子と同一の配列部分を有する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記多細胞生物が前記第１又は前記第２異種配列を形成するためのウイルストランスフェクション、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在性送達、非生物的送達、又は核ＤＮＡに予め組込まれているか、又は核に自律性に維持されているポリヌクレオチド分子の変換により前記第１又は前記第２異種配列を備えている請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１及び／又は前記第２異種配列を前記多細胞生物の染色体に安定形質転換及び安定組込みすることを含む請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記第１又は前記第２異種配列を前記多細胞生物に一過性トランスフェクションすることを含む請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記多細胞生物が前記トランススプライシング及び／又は前記目的形質の前記発現に必要な機能を備えるようにさらに遺伝的に又は一過性に改変されている請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１及び／又は前記第２断片が一つ以上のトランススプライシングリボザイム又は二つ以上のそれぞれ異なるトランススプライシングリボザイムと作動可能に連結されている請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１及び／又は前記第２異種断片がイントロン又はその一部を含むことによって、前記トランススプライシング反応のＲＮＡ産物がシススプライシング可能なイントロンを含む請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記目的形質が雄性不稔に関与する請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記形質が以下の群：除草剤耐性、殺虫剤耐性、選択マーカー、対抗選択マーカーから選択される請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記目的形質の発現が前記第１及び／又は前記第２異種配列の正確なプロセシングに依存する請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記トランスジェニック多細胞植物又は動物における前記第１及び前記第２異種配列が未連鎖遺伝子座として分離している請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記未連鎖遺伝子座がそれぞれ異なる染色体上に存在する請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記未連鎖遺伝子座が対立染色体上に存在する請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記未連鎖遺伝子座が前記遺伝子座間の組換え及び連鎖の創出を最小化するように位置している請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記トランススプライシング反応及び前記トランススプライシング反応産物の翻訳が前記トランススプライシング反応によってそれに連鎖するポリペプチドを有するタンパク質を生成し、前記ポリペプチドが以下の群：シグナリング、ターゲティング、及び膜伝達ポリペプチド、並びに認識及び精製タグから選択される請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記トランスジェニック多細胞生物が後代を生産可能な請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
目的形質を発現するトランスジェニック多細胞植物又は動物であって、前記生物が前記形質の後代への制御された分布を有し、前記形質の発現がＲＮＡ断片のトランススプライシングによるＲＮＡ分子の生産を含み、前記ＲＮＡ断片がそれぞれ異なる異種ヌクレオチド分子上にコードされるか位置する、トランスジェニック多細胞植物又は動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的形質を発現し、後代又は他の生物への前記形質の分布が制御されているトランスジェニック多細胞植物又は動物の産生方法に関する。本発明はさらに、前記形質を発現する多細胞植物又は動物に関し、このとき、後代への前記形質の分布は制御されている、すなわち特に他家受粉による後代への前記形質の転移の確率が非常に低い。本発明は、好ましくは多細胞植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子操作された作物種の商業的利用は、遺伝組換え植物（ＧＭ植物）由来の導入遺伝子及び導入遺伝子によってコードされる形質が在来種、野生近縁種又は他の非ＧＭ植物品種又は関連する作物種に転移する可能性があるという懸念をもたらした（Ｅｌｌｓｔｒａｎｄ、Ｎ．Ｃ．、２００１、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２５、１５４３〜１５４５；ＱｕｉｓｔとＣｈａｐｅｌａ、２００１、Ｎａｔｕｒｅ、４１４、５４１〜５４３）。その転移は影響を受けた生態系の生態バランスを変化させたり、他の、第１には社会経済的な問題を生みかねない。さらに、導入遺伝子、特に形質転換マーカーとして使用される抗生物質耐性遺伝子がいわゆる水平転移を介して周囲の微生物に逸出する可能性があり（Ｃｈｉｔｅｒら、２０００、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４８１、１６４〜１６８）、したがって望ましくない方法で微生物相を修飾しかねないという一定の危険性がある。
【０００３】
これらの心配事の多くが十分に科学的に正当化されているわけではないが（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ、Ｐ．、２００２、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．、１１、ｉｉｉ〜ｖ）、安全で制御されている導入遺伝子の管理システムを創出することが大いに望ましい。それは、そのシステムで将来起こりうる問題を阻止できるかもしれず、最も効果的な方法で実在する植物種の生殖質を保護するための助けとなるからである。さらに、有機栽培作物又は非ＧＭ作物にトランスジェニック栽培品種が混入することによって引き起こされる問題がある。これはトランスジェニック作物と同様に非トランスジェニック作物の出荷にも重大な影響を及ぼし、生産者に無視できない問題である。
【０００４】
最新の技術で創出され環境中に放出されるいかなるトランスジェニック材料も非常に長期間環境に残留する可能性を有する。植物遺伝子工学の実践は目的遺伝子の連続コード配列を含む発現カセット及びベクターを使用することに通常基づいている。そのような発現カセットは宿主染色体に組込まれ、合法であれ非合法であれＧＭ植物と別の生物の間で交雑又は別の遺伝情報の交換が起こると、その発現カセットは機能的転写ユニットとして高い確率で後代又は別のレシピエントに伝達される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって本発明の目的は、目的形質を発現し、前記形質の後代への分布が制御され低い確率で起こるようなトランスジェニック生物、特に植物の産生方法を提供することである。
【０００６】
本発明のさらなる目的は、多細胞生物又はその細胞に目的形質を発現させるための制御された生物学的に安全な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的は、目的形質を発現し前記形質の後代への分布を制御されているトランスジェニック多細胞植物又は動物の産生方法（ｉ）によって達成される。このとき前記方法は、前記目的形質をコードする配列の第１断片を含む第１異種ＤＮＡ配列を有する第１多細胞生物又はその細胞と、前記目的形質をコードする配列の第２断片を含む第２異種ＤＮＡ配列を有する第２多細胞生物又はその細胞とを交雑することを含み、前記第１及び第２異種配列は前記交雑後にＲＮＡトランススプライシングにより前記目的形質が生じるように設計されている。トランスジェニック多細胞植物の産生が好ましい。
【０００８】
上記の目的は、目的形質を発現し前記形質の後代への分布及び発現を制御されているトランスジェニック多細胞植物又は動物の産生方法（ｉｉ）によってさらに達成される。このとき前記方法は、前記目的形質をコードする配列の第１断片を含む第１異種ＤＮＡ配列を有する多細胞生物又はその細胞を用意し、前記目的形質をコードする配列の第２断片を含む第２異種ＤＮＡ（又はＲＮＡ）配列を前記多細胞生物の細胞に導入することを含み、前記第１及び前記第２異種配列は前記導入によって細胞がスイッチされた後にＲＮＡトランススプライシングにより前記目的形質の発現が生じるように設計されている。トランスジェニック多細胞植物の産生が好ましい。
【０００９】
さらに、本発明は上記方法の一つによって得られるか得ることができるトランスジェニック生物を提供する。
【００１０】
本発明の発明者らは、トランスジェニック生物を環境に安全にする方法を初めて開発した。その方法では前記生物が発現する導入遺伝子又は目的形質が前記生物の後代へ分布することが制御されている。本発明はバイオテクノロジー、特に植物バイオテクノロジーの主要な問題を解決する。それは、ＧＭ生物から他の生物への導入遺伝子の転移が効果的に制御できるようになり制限できるからである。他の生物への導入遺伝子の転移には他家受粉による有性後代への転移や側方遺伝子転移がある。上記の方法によって目的形質の混入を制御された遺伝子修飾多細胞生物が入手可能となる。
【００１１】
本発明の両方法では、前記形質をコードするか前記形質に関わるヌクレオチド配列を二つ以上の断片に分割する。好ましくは、前記ヌクレオチド配列を二つの断片に分割する。前記ヌクレオチド配列は、典型的には前記形質に関わるＲＮＡ、又は好ましくはタンパク質のコード配列（又はオープンリーティングフレーム）である。前記断片を得るためには、前記ヌクレオチド配列は分割してそれぞれ得られる断片が発現しても前記形質を生成不可能であることが好ましい。前記形質の発現には同生物、特にその同細胞に前記両断片が存在し、前記断片をトランススプライシングによって連鎖させる必要がある。ここで、発現は転写を含み、好ましくは発現は転写と翻訳を含む。各断片は好ましくは前記形質に関わるＲＮＡ又はタンパク質の機能に必要な配列部分を含む。例えば、前記形質に関わる前記タンパク質が酵素であるならば、各断片は好ましくはその酵素の触媒又は基質の結合に必要なアミノ酸を含む。
【００１２】
次の記載は、前記ヌクレオチド配列を二つの断片に分割する好ましい実施例に焦点を合わせる。第１断片は第１異種配列に取込まれ、第２断片は第２異種配列に取込まれる。このとき、少なくとも前記第１異種配列はＤＮＡ配列である。前記方法（ｉ）において両異種配列はＤＮＡ配列である。前記方法（ｉｉ）において前記第１異種配列はＤＮＡであるが、前記第２異種配列はＲＮＡ配列であってもよいし、ＤＮＡ配列であってもよい。各異種配列は前記断片とは別に、例えばプロモーター及び転写終結シグナルのような転写に必要な配列、又は翻訳に必要な配列を好ましくは含む。
【００１３】
前記第１及び／又は前記第２異種配列は、トランススプライシングによって前記第１及び前記第２断片を連鎖させるために、それぞれ前記第２及び／又は前記第１異種配列にＲＮＡトランススプライシングできる配列をさらに含むかコードしている。ＲＮＡトランススプライシング可能な前記配列はトランススプライシング可能なリボザイム（Ｒｚ）とすることができる。トランススプライシングするリボザイムは、以下の群：グループＩイントロン由来リボザイム、グループＩＩイントロン由来リボザイム、及び特異的ＲＮＡをトランススプライシング可能な他の天然又は人工設計リボザイムから選択してもよい。さらに、前記トランススプライシングはスプライソソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）介在性でもよい。
【００１４】
本発明の方法はトランススプライシングによって二つ以上の形質をアセンブリさせるためにも使用してもよい。これは実施例１及び図５で例示するように二つの断片を各異種配列上の一つの形質に（又は二つの形質に）関わらせることによって達成できるであろう。
【００１５】
第１及び第２異種配列の効果的なトランススプライシングには前記異種配列に一定の必要条件を課す。とりわけ、リボザイムのＰ１ループと５’スプライシング断片の３’末端との相同性は５’スプライシング断片の塩基配列を限定する場合がある。そのような限定を避けるために、トランススプライシング反応のＲＮＡ産物がシススプライシング可能なイントロンを含むように前記第１及び／又は前記第２異種配列にイントロン又はその一部を含ませてもよい。特に、第１及び第２異種ＤＮＡ配列上に存在しトランススプライシングに必要な配列をそのような自己スプライシング性イントロンに取込む。次に、前記自己スプライシング性イントロンをトランススプライシング反応でアセンブリさせてもよい。トランススプライシング後に、いかなる望ましくない配列又はトランススプライシングに必要な配列もシススプライシングによってトランススプライシング反応産物から切出すことができる（図４参照）。シススプライシング性イントロンの設計は当業界で既知である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の方法（ｉ）では、当業界で一般的に既知の方法で前記第１及び前記第２異種ＤＮＡ配列を多細胞生物又はその細胞にそれぞれ取込む。好ましくは前記異種配列の少なくとも一方、さらに好ましくは両方をその生物の核ゲノムの染色体に安定的に取込む。これによって得られる前記第１及び前記第２多細胞生物を当業界で既知の方法にしたがって各異種ＤＮＡ配列に関して好ましくはホモ接合性とする。前記第１及び前記第２多細胞生物は好ましくは同科の、さらに好ましくは同属の、そして最も好ましくは同種の生物に属する。
【００１７】
前記第１多細胞生物における前記第１異種ＤＮＡ配列及び前記第２多細胞生物における前記第２異種ＤＮＡ配列を、同一（相同の）の又はそれぞれ異なる（非相同の）染色体に取込んでもよい。それらの配列を同一の染色体に取込むことが好ましい。それらの配列を同一の染色体の同一の遺伝子座に取り込むことが最も好ましい。前記第１及び前記第２異種配列のそのような相対位置を得るための方法は当業界で既知である。一つの可能性は前記異種配列のそれぞれを用いて多数の形質転換体を産生することである。次に、前記異種配列を取込んだ染色体と同様にその染色体における形質転換された配列の位置を、遺伝的又は分子生物学的方法で測定する。次に、適当な位置に前記異種配列を有する形質転換された多細胞生物を選択してもよい。これは前記第１及び前記第２多細胞生物を用いて実施でき、第１及び第２生物の適当なペアを選択できるであろう。さらなる可能性は、相同組換えを利用して特定の染色体の目的とする遺伝子座への標的組込みを利用することである。部位特異的組換えを併用し標的部位を染色体に予め組込んである多細胞植物を用いて標的組込みを実施することも好ましいであろう。同一の染色体の同一の遺伝子座に前記第１及び前記第２異種配列を導入するために後者の方法は特に有用である。それは、標的部位を予め組込んである同一の初発生物系を前記異種配列を用いた形質転換に使用してよいからである。標的組込みは、例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０２／０３２６６に記載されている。
【００１８】
次に、本発明の方法（ｉ）では、本発明のトランスジェニック多細胞植物又は動物を得るために前記第１及び前記第２多細胞生物又はその細胞を交雑する。交雑は生物の有性交配又は前記生物の細胞融合でもよい。細胞融合は生殖細胞又は体細胞の融合でもよい。前記生物が植物ならば、交雑は植物の受粉又はプロトプラストの体細胞融合を必要とするであろう。植物の有性交配が最も好ましい。前記の交雑は前記形質をコードするか前記形質に関わる前記断片を一つの生物に集め、ＲＮＡトランススプライシングにより前記目的形質が生じるようにする。ＲＮＡトランススプライシングにより生じるということは、トランススプライシングが前記目的形質の発現のために必要な状態であることを意味する。本発明のトランスジェニック生物の産生は前記交雑に加えてさらなる工程を含むことができる。植物の場合はそのようなさらなる工程の例として、種子、実生の生育及び収穫、並びに本発明の植物の生育がある。プロトプラスト融合の場合はそのようなさらなる工程には融合したプロトプラストを増殖させてコロニーを得ること、植物の再生がある。
【００１９】
様々な相対位置の前記第１及び前記第２異種配列及び個々の断片が本発明のトランスジェニック多細胞植物又は動物に存在する。前記トランスジェニック多細胞植物又は動物における前記第１及び前記第２異種配列は未連鎖遺伝子座として分離するように位置すべきである。前記未連鎖遺伝子座は前記遺伝子座間の組換えと連鎖の創出を最小化するように位置することが好ましい。例として二倍体生物を用いたときの前記相対位置を図２Ｂに一般的に示す。
【００２０】
図２ＢのケースＩでは、前記断片は同一の染色体に位置する、すなわちそれらの断片は同一のＤＮＡ分子と物理的に連鎖するがその生物本来の染色体配列によって互いに分離されている。その断片はそれぞれ異なる転写ユニットに属する。減数分裂中の交差がその断片（又はその断片を含む異種配列）の分離を生じる場合があるため、連続するコード配列によってその形質がコードされる場合は、両断片がコードする形質が後代に転移する確率は従来の場合に比べ顕著に減少する。
【００２１】
ケースＩＩ（図２Ｂ参照）では、前記第１及び前記第２断片はそれぞれ異なる染色体（対立染色体とは逆の非相同染色体）に位置する。自己交配でそれぞれ異なる染色体上に存在する二つの断片によりコードされる前記形質が遺伝する頻度は約５０％であり、これらの断片のどちらも保持しない生物との交配では２５％である。ケースＩＩはケースＩよりも好ましい。
【００２２】
さらに好ましいケース（図２ＢのケースＩＩＩ）では、その二つの断片は対立（相同）染色体に存在する。それらの断片の位置が近接すればするほど、後代にその形質が転移する頻度は低くなる。最も好ましいケース（図２ＢのケースＩＶ）では、それらの断片は同一遺伝子座に位置する。したがって、本発明の多細胞植物又は動物の交配による後代ではその形質は速やかに分離する。
【００２３】
後代への前記形質の分布が制御されていることは、前記形質が後代へ転移する確率が従来のトランスジェニック生物に比べて顕著に減少していることを意味する。そのトランスジェニック動物は染色体の一遺伝子座に、特に単一転写ユニットとしてコードされる前記形質に関わる導入遺伝子を有する。本発明の前記トランスジェニック多細胞生物と前記第１及び前記第２異種配列を欠く生物とを交配すると、後代における前記形質の出現頻度は１０％未満、好ましくは１％未満、さらに好ましくは０．１％未満、いっそうさらに好ましくは０．０１％未満、最も好ましくは０．００１％未満である。比較として、後代に導入遺伝子が出現する頻度は、単一転写ユニットに前記導入遺伝子を有し、その導入遺伝子に関してヘテロ接合性である従来のトランスジェニック（二倍体）生物と、同一種で前記導入遺伝子を有さない別の生物とを交配するとき約５０％である。
【００２４】
本発明の方法（ｉｉ）では、目的形質に関わるＲＮＡのアセンブリは生物又は細胞の交雑を必要としない。しかし、応用できる場合、そして別に明細を記さない限りは、本発明の方法（ｉ）のために上記に示した明細は方法（ｉｉ）にも当てはまる。この２番目の方法では、前記第１異種配列は前記多細胞生物の核ゲノムに組込まれている典型的にはＤＮＡである。前記第２異種配列はＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡであってもよい。もしもそれがＤＮＡならば、前記生物において転写させる配列（例えばその生物で機能的なプロモーター）はトランススプライシング可能なＲＮＡを生産するために前記第２異種配列を備えなければならない。例えばＲＮＡウイルスに基づくウイルス感染が使用されるとき、前記第２異種配列はＲＮＡでもよい。しかし、ＲＮＡウイルス性の第２異種ＲＮＡは転写してＲＮＡになるようなＤＮＡを導入することによって間接的に導入することができる。
【００２５】
前記第２異種ＤＮＡ又はＲＮＡ配列は、多細胞生物の核ゲノムに組込まれていてもよいし、組込まれていなくてもよい。その配列は核ゲノムに組込まれないことが好ましい。これによって、後代への前記第１及び第２断片にコードされる形質の分布を極めて高度に制御できる。
【００２６】
第１異種ＤＮＡ配列を有する多細胞生物又はその細胞は方法（ｉ）で記載されるように用意できる。方法（ｉ）と対照的に、その多細胞生物は第１異種配列に関して好ましくはヘテロ接合性である。
【００２７】
前記第１及び前記第２異種配列は一段階又は二段階手順で導入することができる。一段階手順では、前記第１及び前記第２異種配列を共に、又は同時に、好ましくは同一の形質転換法で多細胞生物に導入する。前記第１及び前記第２異種配列は、例えば混合物（例えばアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株の混合物であって、それぞれがＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡに前記異種配列の一方を含む）として導入できる。二段階手順では、第１異種ＤＮＡ配列を有する多細胞生物又はその細胞を最初に生産し、前記第２異種配列を独立した工程で導入する。これらの２回の導入はそれぞれ異なる形質転換又はトランスフェクション法で実施できる。前記導入はウイルス感染、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在性感染又は非生物的形質転換法によって実施できる。
【００２８】
本発明の方法ではトランスジェニック多細胞植物又は動物が産生される。多細胞植物が好ましい。動物の中では、ほ乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、並びにブタ及びウシのようなヒトの栄養摂取に使用される動物）が好ましい。ヒトは除外される。植物の中では大麦、エン麦、ライ麦、小麦、トウモロコシ、米、雑穀、ジャガイモ、菜種、カノーラ、トマト、綿、モロコシ、及びタバコをはじめとする作物が好ましい。本発明の方法は二倍体植物及び倍数体植物に適用できる。
【００２９】
特に植物に発現可能な本発明の形質の例は、雄性不稔、除草剤耐性、殺虫剤耐性、対抗選択マーカー、生物の形態、種子含量、種子安定性、気候順応性、ビタミン含量、炭水化物含量及び組成、脂肪含量及び組成などである。さらに、前記形質は目的タンパク質、特に医薬用タンパク質の発現であってもよい。そのようなタンパク質の例を下記に示す。好ましいケース（実施例１参照）では、二つの形質、例えば選択マーカー遺伝子及び昆虫耐性のような有用な形質を付与する目的遺伝子を本発明の植物に発現させる。
【００３０】
本発明の前記多細胞生物及び前記トランスジェニック多細胞生物は、例えば前記トランススプライシング及び／又は目的形質の前記発現に必要な機能を与えるためにさらに遺伝的に又は一過性に改変することができる。さらに、前記目的形質又は別の形質の発現に関わる第２導入遺伝子を発現させることができる。
【００３１】
本発明の方法は多様な用途に使用できる。この方法は、例えば前記トランスジェニック生物に目的形質を発現させるために使用できる。前記形質は、単一遺伝子又は複数の遺伝子がコードするものであろうとなかろうと、前記生物のいかなる性質であってもよい。前記形質は少なくとも一つのＲＮＡの発現又は好ましくは少なくとも一つのタンパク質の発現によって引き起こされるものとし得る。二つ以上のＲＮＡ及び／又はタンパク質が前記形質に必要な場合もある。この場合、本明細書に記載するように一つだけのＲＮＡ又はタンパク質の発現を制御することで十分であろう。しかし、本発明の方法によって形質を生産する全てのＲＮＡ又はタンパク質を制御する方が環境には安全である（実施例１、図５参照）。
【００３２】
本発明は、例えばシグナルペプチド、結合ドメイン、残留シグナル、コンパートメント化シグナル、活性化ドメイン、酵素活性を有するドメイン、アフィニティタグ、及び調節配列のモジュールを用いてタンパク質をコードする配列をアセンブリさせることも可能にする。そのようなモジュールアプローチは特異的な目的のための、又は特異的遺伝子を過剰発現させて細胞若しくはその特異的コンパートメントに蓄積させるために最適な分泌又は移行ペプチドを見つけるための最適な発現カセットを見つけることを簡単にする。この方法は機能的ゲノミクス及びプロテオミクス研究の価値ある手段となり得る。植物ライブラリが例えば創出されるかもしれず、そのライブラリの各メンバーは、例えば前記第１断片として上記モジュールのクラスの一つである特定のモジュール（例えば特異的シグナルペプチド）を含む。次に第２断片は目的タンパク質をコードするであろう。前記交雑（方法（ｉ））又は前記導入（方法（ｉｉ））の後に、前記タンパク質のＲＮＡコード配列をトランススプライシングによって前記モジュールと連鎖する。本発明の方法（ｉｉ）で、前記第２異種配列を染色体に安定組込みせずにこのモジュールアプローチを実施することが好ましい。
【００３３】
本発明では形質は前記生物の生得の遺伝子をダウンレギュレーションすることによってトランスジェニック多細胞生物に発現されることができる。遺伝子を既知のいかなる方法、例えばアンチセンス法又は低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によってダウンレギュレーションしてもよい。本発明のそのような実施例においてアンチセンスＲＮＡ又はｓｉＲＮＡはトランススプライシング反応によって、所望によりさらにシススプライシングのようなプロセシングを行った後に用意される。トランススプライシングの産物が二本鎖ＲＮＡ構造を形成するための自己相補性を有する配列部分を含むように前記第１及び第２異種配列を設計することによって、そのトランスジェニック生物中でｓｉＲＮＡを産生させてもよい。前記二本鎖ＲＮＡ構造は宿主細胞の遺伝子と配列一致性を示す部分を有することができ、前記細胞に前記遺伝子が発現するのを阻害できる十分な長さであり得る。本方法は、特に本発明の２番目の方法と組合わせるとき機能的ゲノミクス研究に特に有用である。二本鎖ＲＮＡによる遺伝阻害の方法はＷＯ９９／３２６１９に一般的に記載されている。低分子干渉性ＲＮＡを用いていかなる目的とする標的遺伝子もダウンレギュレーションする効果的な方法はＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６、５５０〜５５３）に記載されている。これらの方法は本発明の方法と容易に組合わせることができる。
【００３４】
方法（ｉ）の最も重要な応用は農業目的の植物を産出するための、又は前記植物でタンパク質を生産するための交雑種子の生産である。このとき、前記植物は後代への形質の分布が制御されている。前記交雑種子によって親系列のどちらにも発現せず後代で速やかに分離する目的形質を発現する植物を産出することができる。
【００３５】
方法（ｉｉ）の最も重要な応用は目的形質の発現制御である。前記形質の発現は前記第２異種ＤＮＡ配列の導入によって誘発され得る。前記第２異種ＤＮＡ配列を核染色体に取込むならば、前記形質の分布の制御を方法（ｉ）と同レベルで達成できる。前記第２異種ＤＮＡ配列を核染色体に取込まないならば、後代への前記形質の転移が極めて起こりそうにないことから、前記形質の分布はいっそうさらに制御される。
【００３６】
本発明は目的形質を発現するトランスジェニック多細胞植物又は動物をさらに提供し、前記生物は後代への前記形質の分布が制御され、前記形質の発現はＲＮＡ断片のトランススプライシングによってＲＮＡ分子を生産することを必要とし、前記ＲＮＡ断片はそれぞれ異なる異種ヌクレオチド分子上にコードされるか位置する。植物が好ましい。前記のそれぞれ異なる異種ヌクレオチド分子はそれぞれ異なる染色体に存在し得る。好ましくは、前記ＲＮＡ断片は対立染色体上にコードされる。最も好ましくは、前記ＲＮＡ断片はトランススプライシング後に異種タンパク質をコードする。
【００３７】
本発明は本発明のトランスジェニック生物の部分又は産物、及び前記交雑によって得られる植物種子をさらに含む。
【００３８】
本発明において、我々はある形質の発現に関わる導入遺伝子のコード配列を、ＲＮＡレベルでトランススプライシング可能な二つ以上の断片に分割し、これらの断片をトランスジェニック多細胞生物の宿主ゲノムのそれぞれ異なる染色体に、好ましくは対立染色体に導入することを提案する。これらの断片は一旦転写されるとＲＮＡトランススプライシングによってアセンブリでき、機能的ＲＮＡ、特にｍＲＮＡを形成し、そのＲＮＡは目的形質を与えることができる。この育種法は通常は親の非常に特異的な交配を必要とするため、そのような二対立遺伝子系が深刻な付加的な問題を提起しないようにしている。本発明のトランスジェニック生物（特に植物）の間のいかなる望まれない自然発生した交配でも、求められていない生物でも前記形質が効果的に分解するため、発現が廃止され、不正な後代に機能的遺伝子が転移する機会は大きく減る。
【００３９】
本発明の方法によって本質的な導入遺伝子の発現を制御するか、又はトランスジェニック品種を制御するために利用できるメカニズムを構築できる。それはいかなる不正な交配による後代も生育不能となるためである。我々の発明はこれらの可能性の両方をとりわけ考えている。
【００４０】
本発明のシステムによって当業者は選択マーカーに基づいた一次形質転換体を選択するための計画を立てることも可能になる。そのマーカーはＴ０後代で有効で作動可能であるが、その後の交配で異なるトランスジェニック後代では対立遺伝子が分離することで機能的選択遺伝子としては消失する。
【００４１】
さらに、本発明によって目的の転写ユニットのそれぞれ異なる断片を含んでいる親を交配することによって種々の遺伝子を迅速にｉｎ  ｖｉｖｏアセンブリさせることができる。このアセンブリによって翻訳エンハンサ、移行又はシグナル又はターゲティングペプチド、精製タグ、タンパク質の種々の機能的ドメインなどのような種々の機能的ドメインを、そのような遺伝子／転写ユニットの目的とする断片を保有する植物を単に交配することで交換することができる。
【００４２】
操作したリボザイムを用いてＲＮＡトランススプライシングを達成することができる。ＳｕｌｌｅｎｇｅｒとＣｅｃｈ（Ｎａｔｕｒｅ、１９９４、３７１、６１９〜６２２）はトランススプライシング現象の初期の応用例の一つを提案した。彼らは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に翻訳可能なｌａｃＺ転写体を生成させるために再操作したテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）グループＩイントロンを使ってＲＮＡの限定的な部分を機能的構造と置換するためにリボザイム介在性トランススプライシングを用いた実験について記載した。彼らは、多くの遺伝性疾患を治療する目的で特異的な宿主転写体の配列を変更する一般的な手段としてトランススプライシングを提案した。
【００４３】
Ａｙｒｅと共同研究者ら（１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、３５０７〜３５１２）はトランススプライシングの別の利用を提案した。彼らは高度に特異的な方法で細胞に標的サイトトキシンをターゲティングするためにリボザイム介在性トランススプライシングを利用する技術を開発した。彼らはジフテリアトキシンＡのｍＲＮＡをウイルスｍＲＮＡとスプライシングするためにグループＩイントロンを使用し、ウイルスｍＲＮＡを発現する細胞を不活性化させ、感染した酵母細胞を選択的に不活性化した。グループ１イントロン由来リボザイム介在性トランススプライシングの一般原理を図１に示す。
【００４４】
ＭｉｋｈｅｅｖａとＪａｒｒｅｌ（１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７４８６〜７４９０）はさらに別の重要な応用を開発した。彼らはキメラ遺伝子のアセンブリを触媒するために操作したグループＩＩイントロンを使用した。この研究でリボザイムは組織プラスミノーゲンアクチベータのｍＲＮＡをシャッフルするように改変され、得られたキメラＲＮＡはＤＮＡに逆転写された。この方法によって新規な機能を有するキメラタンパク質をコードする遺伝子のライブラリを非方向性に創作できる。
【００４５】
我々が最もよく知るところでは、生物学的に安全で制御可能な方法で植物細胞に有用な形質をアセンブリさせるためにリボザイム介在性トランススプライシングを使用することについて記載した先行技術はない。図２ＡにＦ１後代におけるトランススプライシング介在性の形質のアセンブリの概略図を示す。二つの親系統（Ｐ１及びＰ２）のいずれも前記形質をコードする完全に機能的な直鎖遺伝子を有さない。対照的に、各系統は好ましくは対立染色体上に位置する前記遺伝子の断片（Ａ又はＢ）を含む。Ｐ１とＰ２の間の受粉の結果として、断片Ａ及びＢのトランススプライシング介在性アセンブリによって機能的形質を有する後代が生成する。雑種第１代の自家受粉から得られるＳ１後代のわずか４分の１が目的形質を保持し、半分は前記形質を与えるために必要な二つの断片のうち一方しか遺伝せず、４分の１はＡとＢのどちらも有さないであろうことが前記図から明らかである。ＡとＢ断片のどちらも有さない他のいかなる植物との他家受粉（不正交配）はその形質の伝達を生じないことも明らかである。それは機能的遺伝子に必要な二断片のうちのわずか一方が各後代植物に伝達するからである。
【００４６】
選択されたＲＮＡをターゲティングできるリボザイムの操作は平凡な課題ではない。それは、リボザイムの構造に対する特異的な要求を満たさなければならないからである。この要求はトランススプライシングされた産物の配列を妥協させスプライス部位の選択に影響するであろう。このアプローチをさらに柔軟にするために、トランススプライス部位のホストとなるイントロンを操作することができる。この実施例においてトランススプライシングは機能的イントロンの形成をもたらすであろう。前記イントロンをさらにシススプライシングして前記目的形質を担う目的遺伝子（ＧＯＩ）の機能的ＲＮＡを得ることも可能である。このアプローチの概略図を図３に示す。このような各特異的リボザイムを試験の対象とするアプローチは定向進化／ドメインスワップ実験に非常に有用である。それはこのアプローチで普遍的なトランススプライス部位を操作できるからである。
【００４７】
本発明のトランススプライシングはグループＩイントロン及びそれらの誘導体の使用に限定されない。内部構築及びスプライシングメカニズムにしたがって分類される種々のグループ／クラスのイントロンがある。核のイントロンは５’及び３’末端にＧＴ−ＡＧジヌクレオチドを有しスプライシングにスプライソソームの形成を通常必要とするという共通点がある。グループＩ及びグループＩＩイントロンは種々の菌類ミトコンドリア遺伝子に見られるイントロンにちなんで命名された。それらは内部の構築にしたがって分類されているが自己のスプライシングを自己触媒する能力が共通である。
【００４８】
核のイントロンはｓｎＲＮＰ介在性（スプライソソーム介在性）メカニズムによってスプライスされる。種々の真核生物における核遺伝子の代替スプライシングを含むシススプライシングのメカニズム及び設計を記載した豊富な文献がある（総説はＡｄａｍｓら、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、８、３３１〜３３９；ＨａｓｔｉｎｇとＫｒａｉｎｅｒ、２００１、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３、３０２〜３０９を参照）。ｓｎＲＮＰ介在性メカニズムが関与した自然発生のトランススプライシングについてはトリパノソーマ（Ａｇａｂｉａｎ、Ｎ．、１９９０、Ｃｅｌｌ、６１、１１５７〜１１６０；Ｌｕｏら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４、３１９４７〜３１９５４）及びＣ．エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）（ＨｉｒｓｈとＨｕａｎｇ、１９９０、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、１４、１１５）においてｍＲＮＡの５’末端にＳＬ（スプライスリーダー）ＲＮＡが接することが記載されている。これらの低分子「スプライスリーダー」ＲＮＡはほ乳動物ｓｎＲＮＰスプライシング抽出液においてＵ１  ｓｎＲＮＡと機能的に置換できる配列と５’エクソンが連結したものから成る。ＳＬ  ＲＮＡの同様のトランススプライシングは脊索動物でも示された。ホヤ網原索動物であるユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）では少なくとも７個の遺伝子のｍＲＮＡがＳＬＲＮＡとトランススプライシングを受ける（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅら、２００１、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１５、２９４〜３０３）。ｍＲＮＡのトランススプライシングはほ乳動物細胞（Ｅｕｌら、１９９５、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１４、３２２６〜３２３５；Ｌｉら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４、１１０６０〜１１０７１；Ｃａｕｄｅｖｉｌｌａら、２００１、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、５０７、２６９〜２７９）及びショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（Ｄｏｒｎら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８、９７２４〜９７２９）でも実証された。トランススプライシングは植物の核ＲＮＡの成熟でも機能し得るという初期の指摘はコメ由来のカルシウム依存性種子特異的プロテインキナーゼ（ＳＰＫ）をコードするｍＲＮＡの分析から来た（Ｋａｗａｓａｋｉら、１９９９、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１８、６２５〜６３２）。ＳＰＫのｃＤＮＡクローンのマップ作製は、ｃＤＮＡ全体がそれぞれ異なるコメ染色体上に位置する二つの異なる領域ＳＰＫ−Ａ及びＳＰＫ−Ｂに分かれていることを示した。別のグループによる報告があり、その報告はスプライソソーム介在性メカニズムを使ってトランススプライシングを操作できることを明らかに実証している（Ｐｕｔｔａｒａｊｕら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７、２４６〜２５２；Ｌｉｕら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、４７〜５２）。
【００４９】
グループＩ及びグループＩＩイントロンはプレｍＲＮＡから自己をスプライスする能力を有する。この反応はＲＮＡ単独でｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施できる。そのような触媒活性を有するＲＮＡは一般にリボザイムと呼ばれる。本発明では、リボザイムという用語を別個のＲＮＡ分子間のトランススプライシング反応を実施可能な触媒ＲＮＡを名付けるために使用する。グループＩ及びグループＩＩイントロンの両方が人工的な系でトランススプライシング可能である（Ｂｅｅｎら、１９８６、Ｃｅｌｌ、４７、２０７〜２１６；Ｊａｃｑｕｉｅｒら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３４、１０９９〜１１９４；Ｊａｒｒｅｌｌら、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、８、２３６１〜２３６６）。クロロプラストにおける分割した遺伝子のグループＩＩイントロン（Ｋｏｈｃｈｉら、１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１６、１００２５〜１００３６）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｇａｌｌｏｗａｙ−Ｓａｌｖｏら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１１、５３７〜５４９）における人工的に分割した遺伝子のグループＩイントロンでもトランススプライシングがみられた。グループＩイントロンはテトラヒメナテルモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）のｒＲＮＡで最初に発見された（Ｃｅｃｈ、Ｔ．Ｒ．、１９９０、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９、５４３〜５６８）。それらのイントロンは５’切断部位に隣接した標的部位にＵを必要とし、切断部位の５’側の４〜６個のヌクレオチドと結合する。現在までにこのグループには７５を超えるメンバーが知られている。それらのイントロンは菌類及び植物のミトコンドリア（ＲｉｃｈａｒｄとＤｕｊｏｎ、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、３２、１７５〜１８１；Ｃｈｏら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、１４２４４〜１４２４９）、クロロプラスト（Ｔｕｒｍｅｌら、１９９３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３２、４４６〜４６）、Ｔ４ファージ（Ｇａｌｌｏｗａｙら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１１、５３７〜５４９）、ラン藻、及び他の生物にもみられる。
【００５０】
本発明を実施するために使用できるような様々な開発されたアプローチと操作されたリボザイムがある（参考文献は上記）。それらは真核細胞でのトランススプライシングを操作するために既知の種類のイントロンを全て使用することにまで実際に及んでいる。本発明に使用される以外に、グループＩテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）イントロン（ＵＳ６，０１５，７９４；Ａｙｒｅら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、３５０７〜３５１２）、スプライソソーム介在性（Ｐｕｔｔａｒａｊｕら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７、２４６〜２５２；Ｌｉｕら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、４７〜５２；ＵＳ６，０８３，７０２）、又はグループＩＩイントロン介在性トランススプライシング（ＭｉｋｈｅｅｖａとＪａｒｒｅｌｌ、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７４８６〜７４９０；ＵＳ５，４９８，５３１）に基づいて操作されたリボザイムも応用できる。
【００５１】
本発明の方法は、種々のトランスジェニック植物のモジュール又は構築ブロックとして用いて、種々の部分からの目的とする配列及び／又は発現ユニットをトランス形にアセンブリさせる便利な方法として使用することができる（図４）。それらの雑種後代は操作リボザイム介在性トランススプライシングを介してそれぞれ異なる親から遺伝したモジュールを編成するであろう。必要なモジュールを含む適当なトランスジェニック親の対を選択することによって目的形質を形成できる可能性がある。これは従来の育種で高い価値のある雑種種子を生産するために適当な親植物の対を選択することと非常によく似ている。そのようなモジュールの例には種々のシグナルペプチド、結合ドメイン、残留シグナル、コンパートメント化シグナル、活性化ドメイン、酵素活性を有するドメイン、親和性タグ、調節配列、種々の目的遺伝子及びその部分がある。
【００５２】
我々の発明に考えているトランススプライシングの一応用例は非機能的前駆体からトランススプライシングによって除草剤耐性及び昆虫耐性を形成させることである。実施例１及び実施例２で我々は植物にＢＡＲ及びＣｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡをリボザイム介在性形成させるための系を設計した。実施例１では各目的遺伝子についてのトランススプライシング系で本発明の前記第１及び前記第２断片をトランス形に含む二つの構築物の設計について記載する。ＰＰＴ（枯草剤ホスフィノトリシン）及び昆虫耐性を付与する形質の形成は図５に示す二つのＴ−ＤＮＡを保有する植物細胞で専ら生じる。
【００５３】
ＰＰＴ含有培地を使って二つのＴ−ＤＮＡの同時形質転換体を容易に選択できる。それぞれ異なる対立染色体上に存在する、例えば相反して連鎖したそれぞれ異なるＴ−ＤＮＡを含む最も適した形質転換体を選択することができるＴ−ＤＮＡ連鎖分析について、実施例２で記載する。
【００５４】
細胞、特に植物細胞に目的の異種ＤＮＡ配列を導入するために種々の戦略を採用することができる。一つのアプローチは二つの独立した形質転換体を生成させることに基づく。このとき、それぞれの形質転換体はトランススプライシングに関わる二つの異種ＤＮＡ配列の一方を含んでいる。これらの配列は有性交配又はプロトプラスト融合を介した体細胞交雑（Ｍｅｌｃｈｅｒｓ、Ｇ．、１９７６、Ｂａｓｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、８、４５５〜４６７；Ｒａｔｕｓｈｎｙａｋら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２３６、４２７〜４３２）により一か所に集めることができ、後代に目的形質をもたらす。代わりに二つの異種ＤＮＡ配列を１回又は２回の独立した形質転換で同一の植物細胞に安定組込みすることもできる。両方の場合で前記ＤＮＡ断片の間の連鎖を決定し前記断片の最も好ましい互いの相対位置を選択するために、そのような植物の後代の遺伝分析が好ましくは行われる。前記断片を含む前記異種ＤＮＡ配列がそれぞれ異なる植物に導入されるならば、雑種植物でそれらの配列は物理的に連鎖せず、それぞれ異なる染色体又は対立（相反して連鎖する）染色体上に位置する。さらに、同一の植物に前記断片を安定組込みする場合は、前記断片が物理的に連鎖する（同じ染色体上に位置する）機会が比較的大きくなる。
【００５５】
一つの場合では、前記二断片は物理的に連鎖し、例えば同一の染色体上に位置する（図２Ｂ、ケースＩ）。この場合、減数分裂交差によりそれらの断片は後代では分離し、よって先行技術よりも形質の発現及び移行をよく制御できる。このとき一つの連続した配列が前記形質をコードしている。
【００５６】
選好実施例では前記断片は物理的に連鎖せず、例えばそれぞれ異なる（非相同の）染色体上に位置する（図２Ｂ、ケースＩＩ）。この場合、自己後代のわずか半数及び両断片に関してヘテロ接合性の植物の交差後代の４分の１にその形質が遺伝する。
【００５７】
さらに好ましくは、前記断片はそれぞれ異なる対立染色体上（図２Ｂ、ケースＩＩＩ）に存在する。ここで自己後代の全てにその形質が遺伝するが、もしも減数分裂交差を無視するか減数分裂交差がないならば前記断片のどちらも保有しない植物との交配の結果として後代に形質は遺伝しない。しかし、二つの対立染色体の間の減数分裂組換えは前記断片Ａ及びＢを物理的に連鎖する恐れがある。そのような組換えの頻度は二つの対立染色体上の前記断片間の相対距離に直接依存する。
【００５８】
減数分裂組換えによる前記断片の物理的連鎖を抑制するために、好ましくは短い相対距離で、最も好ましくはそれぞれ異なる対立染色体上の同一遺伝子座に前記断片を配置する（図２Ｂ、ケースＩＶ）。これによってそのような断片間での減数分裂組換えの頻度を最小化して実質的にゼロにする。前記断片の最も好ましい対立遺伝子の位置を達成するために種々の技術的解決法がある。前記断片Ａ及びＢを一つの構築物ＡＢとして染色体ＤＮＡに組み込むことができる（図２Ｃ）。制御可能なＤＮＡ再配列（切出し、逆位又は転位）のメカニズムを使って異種ＤＮＡ断片（Ａ又はＢ）の一方を選択的に除去できるように、その構築物を設計する。これによって同一遺伝子座に断片Ａ若しくは断片Ｂのどちらかを含むか、又は断片Ａ若しくは断片Ｂを除去せずにどちらかを選択的に転写した後代を生成させる。前記断片の一方のみ又は両断片を保有するが、必要な転写体の一方しか保有しない植物を交配することによって、両断片又はその転写体を一か所に集めると、目的形質の発現が生じる。制御されたＤＮＡ組換えの例は種々の部位特異的リコンビナーゼによって認識される配列を有する隣接断片Ａ及びＢであろう。そのような認識で断片Ａと断片Ｂのどちらかが選択的に除去される。代わりに、前記配列を認識するリコンビナーゼ源の曝露が両断片でＤＮＡ断片の逆位を生じるような向きで、部位特異的組換えのための配列を両断片に隣接させることもできる。前記ＤＮＡ断片のすぐ外側に転写開始領域（プロモーター）を配置すると断片の方向に依存して断片Ａ又はＢの転写を生じ得る。別のアプローチは、転位の利用を含んでいる。そのアプローチでは例えば断片Ｂは非自律的転位性遺伝因子内に位置し転写されるが、その構築物から切出しされると断片Ａの転写を誘発する。トランスポゾンの切出しはどこか別の部位への再挿入を必ずしも招かず、断片Ａのみを含む後代を選択することができる。
【００５９】
実施例において我々は植物細胞へのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在性Ｔ−ＤＮＡ送達を利用した。そこでは前記Ｔ−ＤＮＡはベクターとして前記第１及び／又は前記第２異種配列を含む。植物細胞へのベクターの送達には、プロトプラストの微小発射ボンバードメント、エレクトロポレーション又はＰＥＧ介在性形質転換により細胞に前記ベクターを直接導入するような種々の方法を用いることができよう。特に方法（ｉ）には、そして方法（ｉｉ）の前記第１異種配列にはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在性植物形質転換が好ましい。したがって、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＵＳ５，５９１，６１６；ＵＳ４，９４０，８３８；ＵＳ５，４６４，７６３）、パーティクルボンバードメント又は微小発射ボンバードメント（ＵＳ０５１００７９２；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１）によって運搬されるＴｉプラスミドベクターによるような様々な適当な技術で植物細胞にＤＮＡを導入し質転換することができる。原則として、他の植物形質転換法、例えばマイクロインジェクション（ＷＯ０９２０９６９６；ＷＯ０９４００５８３Ａ１；ＥＰ１７５９６６Ｂ１）、エレクトロポレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１；ＷＯ０８７０６６１４Ａ１）なども利用できる。形質転換法の選択は形質転換を受ける植物種に依存する。例えば、単子葉植物の形質転換には微小発射ボンバードメントが好ましいであろうが、双子葉植物にはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在性形質転換の方が一般によい結果を与える。
【００６０】
我々の発明で記載するトランススプライシング系はトランス形で用意される二つ以上の断片から成る。これは我々の系がより良く制御されより安全であること、例えば未誘導状態で発現レベルがゼロとなり得ることを意味している。
【００６１】
本発明を利用してセンス又はアンチセンス方向で発現できる目的遺伝子又はその断片には以下のものがある：でんぷん修飾酵素（でんぷんシンターゼ、でんぷんリン酸化酵素、枝切り酵素、でんぷん分枝酵素、でんぷん分枝酵素ＩＩ、顆粒結合でんぷんシンターゼ）、スクロースリン酸シンターゼ、スクロースホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシルトランスフェラーゼ、グリコーゲンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｉｇＡ蛋白質、ＭＡＰＫ４及びオーソログ、窒素同化／代謝酵素、グルタミンシンターゼ、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼｐｈｉＣ３１、又はその活性断片若しくは変異体）、イソペンテニルトランスフェラーゼ、ＳｃａＭ５（大豆カルモジュリン）、甲虫型トキシン若しくは殺虫活性断片、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合蛋白質、並びに脂質、アミノ酸、糖、核酸及び多糖を代謝する酵素、スーパーオキシドジスムターゼ、プロテアーゼの不活性型プロ酵素、植物タンパク質性トキシン、繊維産生植物での繊維を変化させる形質、バチルススリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来甲虫活性トキシン（Ｂｔ２トキシン、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙｌＣトキシン、デルタエンドトキシン、ポリオペプチドトキシン、プロトキシンなど）、昆虫特異的トキシンＡａｌＴ、セルロース分解酵素、アチドテルムスセルロチクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓ）由来Ｅ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シンナモイルアルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース−６−リン酸シンターゼ、サイトキニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニアヘリビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）リコピンシンターゼ、ＡＣＣオキシダーゼ、ｐＴＯＭ３６コードタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタノエート）シンターゼ、アシルキャリアタンパク質、ナピン、ＥＡ９、非高等植物フォトエンシンターゼ、ｐＴＯＭ５コードタンパク質、ＥＴＲ（エチレンレセプター）、色素体ピルビン酸リン酸ジキナーゼ、原虫誘導性膜貫通孔タンパク質、植物細胞の光合成若しくは色素体機能を促進する形質、スチルベンシンターゼ、フェノールを加水分解できる酵素、カテコールジオキシゲナーゼ、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ、クロロムコネートシクロイソメラーゼ、アントラニル酸シンターゼ、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース１，６−ビホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）、ＡＭＶ  ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポティウイルスコートタンパク質、ＣＭＶコートタンパク質、ＴＭＶコートタンパク質、ルテオウイルスレプリカーゼ、ＭＤＭ���メッセンジャーＲＮＡ、変異ジェミニウイルスレプリカーゼ、ウンベルラリアカリホルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）Ｃ１２：０好性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、植物Ｃ１０若しくはＣ１２：０好性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０好性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物シンターゼ因子Ａ、植物シンターゼ因子Ｂ、６−デサチュラーゼ、植物細胞の脂肪酸をペルオキシソーム酸化する酵素活性を有するタンパク質、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、リパーゼ、とうもろこしアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣデアミナーゼ、リボザイム、翻訳後切断部位を有するタンパク質、Ｇａｌ４転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとから成る融合タンパク質、脂質相に融合タンパク質をターゲティングできるオレオシンタンパク質と目的タンパク質との翻訳融合体、スルホンアミド耐性を付与するＤＨＰＳ遺伝子、細菌ニトリラーゼ、２，４−Ｄモノオキシゲナーゼ、アセト乳酸シンターゼ若しくはアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、細菌ニトリラーゼ、プラスミドの内側エンベロープ膜に存在する成熟リン酸トランスロケータタンパク質のアミノ末端疎水性領域と前記膜にターゲティングするための目的タンパク質との融合体など。
【００６２】
トランススプライシング系を用いてヒト又は動物のいかなるタンパク質も発現させることができる。そのような目的タンパク質の例にはとりわけ、免疫応答タンパク質（モノクローナル抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞レセプターなど）、抗体、コロニー刺激因子、リラキシン、ポリペプチド性ホルモン、サイトカイン及びそれらのレセプター、インターフェロン、増殖因子及び凝固因子、酵素的に活性なリソソーム酵素、フィブリン溶解性ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシノーゲン、１−抗トリプシン（ＡＴＴ）、並びに上記タンパク質の融合体、変異体及び合成誘導体のような機能保存性タンパク質がある。
【００６３】
本発明の方法は転写後遺伝子沈静化（ＰＴＧＳ）サプレッサータンパク質をコードする遺伝子又はその機能保存性変異体若しくは断片を、前記トランスジェニックコード配列のＰＴＧＳを抑制するための植物で発現させることをさらに含み得る。前記ＰＴＧＳサプレッサータンパク質の遺伝子又はその機能保存性変異体若しくは断片は、前記トランスジェニックコード配列を保有する同一ベクター上又は余分のベクター上に存在する形で植物に与えることができる。前記ＰＴＧＳサプレッサータンパク質は好ましくはウイルス又は植物起源である。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質例として、じゃがいもウイルスＸｐ２５タンパク質、アフリカキャッサバモザイクウイルスＡＣ２タンパク質、コメ黄色斑紋ウイルスＰ１タンパク質、トマトブッシースタントウイルス１９Ｋタンパク質、ｒｇｓＣＡＭ又はこれらのタンパク質の一つの機能保存性変異体又は断片がある。前記機能保存性変異体又は断片は上記タンパク質の一つと７５％の配列同一性を有する。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質及びその使用の詳細はＷＯ０１３８５１２に見ることができる。
【００６４】
我々の発明は選択／評点マーカー遺伝子及び種々の目的遺伝子とのそれらの融合体にも応用できる。これによって、組換えタンパク質の最もよい産生体を直接選択できる。そのような選択／評点マーカーの例として、とりわけ次の遺伝子又は断片がある：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド６’−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ）、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＦＲ１）、６’ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ（６’ＧＡＴ）、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）、グリホサートオキシドレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、２−デオキシグルコース−６−リン酸ホスファターゼ（２−ＤＯＧ−６−Ｐ）、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質、並びに選択及び選別マーカー遺伝子の融合体。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
トランススプライシング介在性のＢＡＲ及びＣｒｙＩＩＩＡ転写体をアセンブリさせるための構築物の設計
一方がＢＡＲ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１７２２０）の３’末端に連鎖するリボザイム及びＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号Ｘ７０９７９）の５’末端を有し、もう一方がＢＡＲ遺伝子の５’末端及びＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子の３’末端に連鎖するリボザイムを有する二つのＴ−ＤＮＡ構築物（図５参照）を標準的な分子生物学的手法で設計した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈとＭａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、第２版）。第１構築物（図５上）は、センス方向にＨＰＴ遺伝子の２００塩基対断片と連鎖したＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子を含む３５Ｓプロモーター駆動性転写ユニットの５’末端と、アンチセンス方向に３００塩基対のＨＰＴ遺伝子断片を含むｎｏｓプロモーター駆動性転写ユニットとを保有し、ＢＡＲ遺伝子の３’末端に連鎖するリボザイムがそれに続く。第２構築物（図５、上から２番目）はアンチセンス方向に３５Ｓプロモーター駆動性２００塩基対のＨＰＴ遺伝子断片を有し、ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子の３’末端に連鎖するリボザイムがそれに続き、センス方向に３００塩基対のＨＰＴ断片と連鎖するＢＡＲ遺伝子のｎｏｓプロモーター駆動性５’末端を有する。これらの構築物及びトランススプライシング産物の概略図を図５に示す。図６に機能的ＢＡＲ遺伝子をもたらすトランススプライシング法の詳細図を示す。
【００６６】
トランススプライシング系の５’末端のクローニング：ＢＡＲ遺伝子
ＨＰＴ遺伝子（３００ヌクレオチド、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号Ｖ０１４９９９、配列は下記）の一部を標的配列として選択した。ＨＰＴは細菌遺伝子であり、植物遺伝子のいずれとも関連性がない。Ｇ／Ｃ含有率は約６０％で、ウイルスベクターの５’及び３’部分の間の塩基対形成は極めて効率的なはずである。
【化１】
2005522181.tif 000002
【００６７】
次のプライマーを３００塩基対のＨＰＴ標的配列の増幅に使用した（制限部位を太字と下線で示す）：
【化２】
2005522181.tif 000003
【００６８】
【化３】
2005522181.tif 000004
【００６９】
【化４】
2005522181.tif 000005
【００７０】
【化５】
2005522181.tif 000006
【００７１】
ＢＡＲ遺伝子のコード配列をアセチルトランスフェラーゼドメイン（アミノ酸残基６０〜１４２）の中央で二つに分割し、分離した部分のどちらにもホスフィノトリシン耐性が備わっていないことを確認した。目的断片のＰＣＲに使用したプライマーを次に示す：
【化６】
2005522181.tif 000007
【００７２】
【化７】
2005522181.tif 000008
【００７３】
ｐＩＣＢＶ１９プラスミドＤＮＡ（図７）を鋳型とし、プライマーｐｎｏｓ１及びｂａｒ１ｒを用いて、ＢＡＲ遺伝子の５’末端をｎｏｓプロモーターと共にＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ断片をＸｈｏ１及びＥｃｏＲＩで分解し、ｔａｒｇｈｐｔ１−ｔａｒｇｈｐｔ５で増幅しＫｐｎ１及びＸｈｏ１制限酵素で分解したＨＰＴ断片と共に、Ｋｐｎ１−ＥｃｏＲＩで分解したバイナリーｐＩＣＢＶ１９の長断片にクローニングした。これによってＮＯＳプロモーター制御下で３００塩基対のＨＰＴコード配列と連鎖したＢＡＲ遺伝子の５’末端を含むｐＩＣＢＶ１９を得た（中間体構築物１）。ＨＰＴ遺伝子を含む構築物ｐＩＣ１６００をＨＰＴ断片のＰＣＲ増幅のための鋳型として取得した。
【００７４】
トランススプライシング系の３’末端のクローニング：ＢＡＲ遺伝子
リボザイムと連鎖したＢＡＲ遺伝子の３’末端をクローニングするために、ｐＩＣＢＶ１９（ｐＮＯＳ−ＢＡＲ）のＫｐｎ１−ＥｃｏＲ１断片を、Ｓａｌ１及びＮｃｏ１制限部位で３’ＯＣＳ転写終止シグナルから分離されているｐＮＯＳプロモーターと置換した。
【００７５】
次のプライマーをＢＡＲ遺伝子の３’末端の増幅に使用した：
【化８】
2005522181.tif 000009
【００７６】
【化９】
2005522181.tif 000010
【００７７】
グループＩイントロンに基づく合成リボザイムの配列をテトラヒメナテルモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）の前駆２６Ｓ  ｒＲＮＡから取得した（Ｋｏｅｈｌｅｒら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２８５、１９３５〜１９５０；Ａｙｒｅら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、３５０７〜３５１２）。
【化１０】
2005522181.tif 000011
【００７８】
このリボザイムの配列はＡＴＧ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ（Ｐ０２０２００１）で配列決定され、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａｌ制限部位（プラスミドｐＩＣＨ０８０）の間に挿入され、さらなるクローニング工程に使用された。次に、ｐＩＣ０８０（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ）から得たリボザイムをアンチセンス版のＨＰＴターゲット（（プライマーＴａｒｇｈｐｔ３及びＴａｒｇｈｐｔ４で増幅された）３００塩基対のＸｂａｌ／Ｓａｌ１のＰＣＲ断片）に連結してｐＢＳ（ＫＳ＋）に基づく中間体プラスミドを得た。このプラスミドをアンチセンス方向で３００塩基対のＨＰＴ断片と連鎖したリボザイムのＨｉｎｄＩＩＩ／Ｓａｌ１断片を分離するために使用した。
【００７９】
この発現カセットのクローニングの最終段階では、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩリボザイム−ＨＰＴ断片を、ＢＡＲ遺伝子の３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩ処理ＰＣＲ断片（プライマーはｂａｒ２ｆ及びｂａｒ３ｒ）及びＮｃｏＩ／Ｓａｌ１で分解した修飾バイナリーベクターｐＩＣＢＶ１９（図７）と共に三元連結する。最終クローニングでＮＯＳプロモーター制御下でＢＡＲ遺伝子の３’末端に連鎖したリボザイムを含むｐＩＣＢＶ１９を得る（中間体構築物２）。
【００８０】
ＢＡＲ遺伝子を２本の断片にクローニングしトランススプライシングを介してそれらの断片をアセンブリさせる方法は分割領域で三つの非保存性アミノ酸残基の中立置換をもたらした（Ｇｌｕ−Ａｓｐ；Ａｌａ−Ｌｙｓ；Ｇｌｎ−Ｌｅｕ）。
【００８１】
トランススプライシング系の５’末端のクローニング−ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子
ＨＰＴ遺伝子（１８０ヌクレオチド、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号Ｖ０１４９９９、配列は下記）の一部をこの場合の標的配列として選択した。
【化１１】
2005522181.tif 000012
【００８２】
この配列は、ＢＡＲ遺伝子用のリボザイム介在性トランススプライシング系の設計に使用した３００塩基対のＨＰＴ断片と重複しない。
【００８３】
ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子の５’末端をクローニングするために、１８０塩基対のＨＰＴ断片を
2005522181.tif 000013
で増幅し、Ｘｈｏ１及びＢａｍＨ１で分解し、ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子（ＡＴＧ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）のＣｌａ１／Ｘｈｏ１合成断片と共に、中間体構築物２のゲル精製したＣｌａ１／ＢａｍＨ１長断片に連結した。プライマー配列におけるＸｈｏ１及びＢａｍＨ１の制限部位を太字で示す。最終構築物を図５（上）に示す。
【００８４】
Ｃｌａ１（５’末端）及びＸｈｏ１（３’末端）制限部位が隣接するコメアクチン１イントロン（斜体字で示す、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６３８３０）の５’末端を有する合成ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子の５’断片を次に示す：
【化１２】
2005522181.tif 000014
【００８５】
【化１３】
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【００８６】
【化１４】
2005522181.tif 000016
【００８７】
コメアクチン１イントロン（斜体で示す）の３’末端が先行し、ＨｉｎｄＩＩＩ（５’末端）及びＢａｍＨ１（３’末端）制限部位が隣接する合成ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子の３’断片を次に示す：
【化１５】
2005522181.tif 000017
【００８８】
ＣｒｙＩＩＩＡを二つの部分に分割するためにドメインＩＩ内の二つの保存されたブロック（ブロック２及びブロック３）の間の領域を選択した（Ｓｃｈｎｅｐｆら、１９９８、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ＆  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、６２、７７５〜８０６）。
【００８９】
トランススプライシング系の３’末端のクローニング−ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子
リボザイムのＨｉｎｄ１１１／Ｘｂａ１断片を１８０塩基対のＳａｃ１／Ｘｂａ１  ＨＰＴ断片と共にｐＢＳ（ＫＳ＋）のＳａｃ１／Ｈｉｎｄ１１１部位にクローニングし、アンチセンス方向でＨＰＴ遺伝子断片と連鎖するリボザイム断片を創出した。鋳型としてプラスミドｐＩＣＨ１６００を用いて
2005522181.tif 000018
と共にＨＰＴ断片をＰＣＲ増幅した。コメアクチン１遺伝子イントロン（上記参照）の３’末端が先行するｃｒｙＩＩＩＡ断片の３’末端を含む、合成Ｈｉｎｄ１１１／ＢａｍＨ１断片を、リボザイム‐ＨＰＴのＨｉｎｄ１１１／Ｓａｃ１断片と共に、中間体構築物１のＳａｃ１／ＢａｍＨ１部位にクローニングした。これによってＧＵＳ遺伝子と、リボザイムと連鎖したＣｒｙＩＩＩＡの３’部分を置換し、最終構築物（図５、上から２番目参照）を作製した。
【００９０】
（実施例２）
形質転換植物細胞におけるトランススプライシングの検出
Ｂｅｎｔら（１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５、１８５６〜１８６０）が記載したように図５に示す構築物のＴ−ＤＮＡをシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｃｏｌ−０）に同時導入した。減圧浸潤の３週間後に種子を収穫し、発芽させ、５０ｍｇ／Ｌホスフィノトリシン（ＰＴＴ）溶液を数回噴霧することで形質転換体を選別した。
【００９１】
同構築物を１０ｍｇ／ＬのＰＰＴを用いたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在性リーフディスク同時形質転換（Ｈｏｒｓｈら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９〜１２３１）にも使用した。
【００９２】
ＰＰＴに対する耐性を示すトランスジェニック植物には、ＢＡＲ遺伝子のそれぞれ異なる部分を保持する二つの異なるＴ−ＤＮＡを保有させる。二つの構築物の一方だけを使ってもＰＰＴ耐性植物は回収されなかった。このことはＣｒｙＩＩＩＡの部分がＢＡＲ遺伝子断片と連鎖していることから、ＣｒｙＩＩＩＡも細胞内に存在することを示唆している。
【００９３】
各Ｔ−ＤＮＡの単一コピーを有するトランスジェニック体を選択するためにサザン分析を実施した。
【００９４】
一次形質転換体（Ｔ０）のＴ１（Ｔ０の自家受粉）及びＦ１（Ｔ０×野生型）後代の遺伝分析によって、同一の、異なる又は対立する染色体上に二つの機能的に相補するＴ−ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を選択できる。例えば、Ｔ１はＰＰＴｒ：ＰＰＴｓ＝３：１の分離でＦ１はＰＰＴｒ：ＰＰＴｓ＝１：１の分離を示すことはＴ−ＤＮＡが連鎖し減数交差の結果としてのみ分離できることを意味している。Ｔ１がＰＰＴｒ：ＰＰＴｓ＝９：７の分離でＦ１がＰＰＴｒ：ＰＰＴｓ＝１：３の分離を示す場合は、Ｔ−ＤＮＡがそれぞれ異なる非対立染色体上に存在することを意味する。Ｔ１がＰＰＴｒ：ＰＰＴｓ＝１：１の分離でＦ１がＰＰＴｒ：ＰＰＴｓ＝０：１の分離を示すことはＴ−ＤＮＡが対立染色体上に位置することを意味する。他家受粉を介した除草剤耐性及び昆虫耐性形質の転移が非常に限られるであろうことから、後者の場合と取組むことが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】機能的ｍＲＮＡの生成をもたらすリボザイム介在性トランススプライシングの概略図である。
【図２Ａ】トランススプライシング介在性の機能的転写体の生成が雑種後代細胞で起こるという本発明の一般原理を示す図である。
【図２Ｂ】本発明のトランスジェニック多細胞生物の宿主染色体上での第１及び第２異種ＤＮＡ配列の可能性のある相対位置４種を示す図である。染色体２本と二つの断片（Ａ及びＢ）によってコードされる目的形質を有する二倍体生物を例として用いる。
【図２Ｃ】トランススプライシングのために用意される前記第１及び前記第２異種ＤＮＡ配列が対立遺伝子の位置に達するまでの基本原理を示す図である。
【図３】植物細胞においてトランススプライシング後のシススプライシングで機能的な目的遺伝子（ＧＯＩ）のアセンブリに至る方法を示す図である。
【図４】トランススプライシングにより選択したシグナルペプチドを選択した種々の遺伝子と連合させ、雑種後代に種々の遺伝子産物をコンパートメント化するというモジュール原理の概略図である。
【図５】トランススプライシングが昆虫及び除草剤耐性の形質を規定する転写体の生成をもたらす方法を示す図であり、Ｒｚはリボザイムを表す。
【図６】ＢＡＲ遺伝子断片のリボザイム介在性トランススプライシングするための相補性ＲＮＡの相互作用の詳細図である。
【図７】はバイナリーベクターｐＩＣＢＶ１９を示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
2005522181.tif 000020
【図２Ｂ】
2005522181.tif 000021
2005522181.tif 000022
2005522181.tif 000023
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【図２Ｃ】
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【図３】
2005522181.tif 000026
【図４】
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【図５】
2005522181.tif 000028
【図６】
2005522181.tif 000029
【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年7月23日(2004.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的形質を発現し、前記形質の後代への制御された分布を有するトランスジェニック多細胞植物又は動物の産生方法であって、前記方法が
前記目的形質をコードするヌクレオチド配列の第１断片を含む第１異種ＤＮＡ配列を有する第１多細胞生物又はその細胞、及び前記目的形質をコードするヌクレオチド配列の第２断片を含む第２異種ＤＮＡ配列を有する第２多細胞生物又はその細胞、
を交雑することを含み、
前記第１及び第２異種配列が前記交雑後にＲＮＡトランススプライシングにより前記目的形質が生じるように設計され、及び
前記目的物質をコードするヌクレオチド配列の前記第１及び第２断片が対立染色体に存在する、
産生方法。
【請求項２】
前記の制御された分布が、前記トランスジェニック多細胞生物と、前記第１及び第２異種配列を欠く生物とを交雑するとき、子孫生物での前記形質の出現頻度が１％未満、好ましくは０．１％未満、さらに好ましくは０．０１％未満、最も好ましくは０．００１％未満であることを意味する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１及び前記第２異種ＤＮＡ配列の少なくとも一方がトランススプライシング用のリボザイムを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
トランススプライシングするリボザイムが以下の群：グループＩイントロン由来リボザイム、グループＩＩイントロン由来リボザイム、及び特異的ＲＮＡトランススプライシングが可能な他の天然又は人工設計リボザイムから選択される請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記トランススプライシングがスプライソソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）介在性である請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記トランスジェニック多細胞植物又は動物が前記第１又は前記第２異種配列の一方の非存在下では前記目的形質を発現できない請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記トランススプライシングがタンパク質を翻訳し生産できるメッセンジャーＲＮＡを生じて目的の形質を有する前記トランスジェニック多細胞植物又は動物を与える、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記トランススプライシングが複数の発現可能なメッセンジャーＲＮＡを生じることによって、多種のタンパク質又はそれぞれ異なるキメラタンパク質を生成する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記トランススプライシングが二本鎖ＲＮＡを生じる請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記二本鎖ＲＮＡが前記トランスジェニック多細胞植物又は動物に前記標的遺伝子が発現するのを阻害できるほど十分長い標的遺伝子と同一の配列部分を有する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記多細胞生物が前記第１又は前記第２異種配列を形成するためのウイルストランスフェクション、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在性送達、非生物的送達、又は核ＤＮＡに予め組込まれているか、又は核に自律性に維持されているポリヌクレオチド分子の変換により前記第１又は前記第２異種配列を備えている請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１及び／又は前記第２異種配列を前記多細胞生物の染色体に安定形質転換及び安定組込みすることを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記多細胞生物が前記トランススプライシング及び／又は前記目的形質の前記発現に必要な機能を備えるようにさらに遺伝的に又は一過性に改変されている請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１及び／又は前記第２断片が一つ以上のトランススプライシングリボザイム又は二つ以上のそれぞれ異なるトランススプライシングリボザイムと作動可能に連結されている請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１及び／又は前記第２異種断片がイントロン又はその一部を含むことによって、前記トランススプライシング反応のＲＮＡ産物がシススプライシング可能なイントロンを含む請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記目的形質が雄性不稔に関与する請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記形質が以下の群：除草剤耐性、殺虫剤耐性、選択マーカー、対抗選択マーカーから選択される請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記目的形質の発現が前記第１及び／又は前記第２異種配列の正確なプロセシングに依存する請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記トランスジェニック多細胞植物又は動物における前記第１及び前記第２異種配列が未連鎖遺伝子座として分離している請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記未連鎖遺伝子座が前記遺伝子座間の組換え及び連鎖の創出を最小化するように位置している請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記トランスジェニック多細胞植物又は動物における前記第１及び前記第２異種配列が、前記対立染色体上の同じ遺伝子座に位置する請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記トランススプライシング反応及び前記トランススプライシング反応産物の翻訳が前記トランススプライシング反応によってそれに連鎖するポリペプチドを有するタンパク質を生成し、前記ポリペプチドが以下の群：シグナリング、ターゲティング、及び膜伝達ポリペプチド、並びに認識及び精製タグから選択される請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記トランスジェニック多細胞生物が後代を生産可能な請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１多細胞生物が前記第１異種ＤＮＡ配列に関してホモ接合であり、前記第２多細胞生物が前記第２異種ＤＮＡ配列に関してホモ接合である請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が前記トランスジェニック多細胞植物の交雑種子を産生するために使用される請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
目的形質を発現するトランスジェニック多細胞植物又は動物であって、前記生物が前記形質の後代への制御された分布を有し、前記形質の発現がＲＮＡ断片のトランススプライシングによるＲＮＡ分子の生産を含み、前記ＲＮＡ断片が対立染色体上に位置する、トランスジェニック多細胞植物又は動物。
【請求項２７】
目的形質を発現し、前記形質の後代への制御された分布及び前記形質の制御された発現を有するトランスジェニック多細胞植物又は動物の産生方法であって、前記方法は、
前記目的形質をコードする配列の第１断片を含む第１異種ＤＮＡ配列を有する多細胞生物又はその細胞の用意、及び
前記目的形質をコードする配列の第２断片を含む第２異種ＤＮＡ（又はＲＮＡ）配列の前記多細胞生物の細胞への導入、
を含み、
前記第１及び第２異種配列が前記導入によって細胞をスイッチした後にＲＮＡトランススプライシングにより前記目的形質の発現が生じるように設計されている、
産生方法。
【請求項２８】
前記第１異種ＤＮＡ配列を有する前記多細胞生物又はその細胞が多細胞生物又はその細胞に前記第１異種ＤＮＡ配列を導入することによって産生される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記第１異種ＤＮＡ配列及び前記第２ＤＮＡ（又はＲＮＡ）配列が一段階又は二段階手順で前記多細胞生物に導入される請求項２８記載の方法。
【国際調査報告】
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