(57)【要約】本発明は、哺乳類の中枢神経系内のニューロン成長を促進する新規方法、かかる方法に用いるための化合物および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の中枢神経系内のニューロン成長を促進する方法であって、５−ＨＴ６受容体アンタゴニストを投与する工程を含む方法。
【請求項２】
該５−ＨＴ６受容体アンタゴニストが医薬組成物の形態で投与される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該５−ＨＴ６受容体アンタゴニストが、５−クロロ−３−メチルベンゾ［ｂ］チオフェン−２−スルホン酸（４−メトキシ−３−ピペラジン−１−イルフェニル）アミドまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物である、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
医薬上許容される塩が塩酸塩である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該５−ＨＴ６受容体アンタゴニストが、Ｎ−（３，５−ジクロロ−２−メトキシ−フェニル）−４−メトキシ−３−ピペラジン−１−イル−ベンゼンスルホンアミドまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物である、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項６】
医薬上許容される塩が塩酸塩である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
哺乳類の中枢神経系内のニューロン成長を促進するための医薬の製造における５−ＨＴ６受容体アンタゴニストの使用。
【請求項８】
該５−ＨＴ６受容体アンタゴニストが医薬組成物の形態で投与される、請求項７記載の使用。
【請求項９】
該５−ＨＴ６受容体アンタゴニストが、５−クロロ−３−メチルベンゾ［ｂ］チオフェン−２−スルホン酸（４−メトキシ−３−ピペラジン−１−イルフェニル）アミドまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物である、請求項７または請求項８記載の使用。
【請求項１０】
医薬上許容される塩が塩酸塩である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
該５−ＨＴ６受容体アンタゴニストが、Ｎ−（３，５−ジクロロ−２−メトキシ−フェニル）−４−メトキシ−３−ピペラジン−１−イル−ベンゼンスルホンアミドまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物である、請求項７または請求項８記載の使用。
【請求項１２】
医薬上許容される塩が塩酸塩である、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
哺乳類の中枢神経系内のニューロン成長を促進するのに用いるための５−ＨＴ６受容体アンタゴニストを含む医薬組成物。
【請求項１４】
該５−ＨＴ６受容体アンタゴニストが、５−クロロ−３−メチルベンゾ［ｂ］チオフェン−２−スルホン酸（４−メトキシ−３−ピペラジン−１−イルフェニル）アミドまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物である、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
医薬上許容される塩が塩酸塩である、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
該５−ＨＴ６受容体アンタゴニストが、Ｎ−（３，５−ジクロロ−２−メトキシ−フェニル）−４−メトキシ−３−ピペラジン−１−イル−ベンゼンスルホンアミドまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物である、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１７】
医薬上許容される塩が塩酸塩である、請求項１６記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、哺乳類の中枢神経系内のニューロン成長を促進する新規方法、かかる方法において用いるための化合物および医薬組成物に関する。
【０００２】
アルツハイマー病またはパーキンソン病および卒中のような傷害に不随するニューロンの永久喪失が、細胞の再生を不可能にするという広く行き渡った考え方は、成熟した脳内にある神経幹細胞の多数の証拠により異議が唱えられている（Gage, F. H. (2000) Science 287, 1433-1438）。ニューロン新生およびこれらの新生細胞のシナプス可塑性は、ストレス、富化環境および運動により影響されうる（van Praag et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 13427-13431; Nilsson et al., (1999) J. Neurobiol. 39, 569-578）。また、インシトゥで生み出された新しい細胞は生化学的に操作することができ、存在する構成内に取り込まれうる。５ＨＴ１Ａ受容体を介するセロトニン、または抗鬱剤、例えばトラニルシプロミン、レボキセチンまたはフルオキセチンでの慢性的治療により、海馬ニューロン新生が刺激される（Gould, E. (1999) Neuropsychopharm. 21, 46S-51S; Malberg et al., (2000) J. Neurosci. 20, 9104-9110; BrezunおよびDaszuta (2000) 12, 391-396）。対照的に、競合ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＣＧＰ４３４８７およびアヘン剤受容体アゴニストモルヒネは、海馬ニューロン新生の速度を減少させる（Eisch et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7579-7584; Nacher et al., (2001) Eur. J. Neurosci. 13, 512-520）。
【０００３】
収集した一連のデータにより、ポリシアル酸化形態のニューロン細胞付着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）が、成熟した神経系の視床下部、嗅球および海馬のような領域の、構造再生およびシナプス可塑性の支持に関与していることが示唆されている（Seki, T.およびArai, Y. (1993) Neurosci. Res. 17, 265-290; Kiss, J.およびRougon, G. (1997) Curr. Opin. Neurobiol. 7, 640-646）。ヒトを含むいくつかの哺乳類の成熟した海馬における構造可塑性は、歯状回顆粒細胞下帯における、ニューロン前駆体の増殖を含み、これらの新たに産生された顆粒神経は一時的にＮＣＡＭＰＳＡを発現する（Seki, T.およびArai, Y. (1993) J. Neurosci. 13, 2351-2358）。また、前脳室下帯から生じると推測される、新たに産生されたポリシアル酸化ニューロンが、大脳皮質の関連領域、例えば側頭葉において見出された（Doetsch et al. (1997) J. Neurosci. 17, 5046-5061; O'Connell et al., (1997) J. Neurochem. 68, 2538-2546; NiDhuill et al. (1999) J. Neurosci. Res. 55, 99-106; Gould et al. (1999) Science 286, 548-525）。さらに、回避条件付けまたは空間学習パラダイムのいずれかの統合の間、ポリシアル酸化細胞頻度における一時的な増加は、訓練期間後１２時間後に生じ、ラット海馬および内側頭葉において観察される不随樹状レモデリングに必須である（Fox et al. (1995) J. Neurochem. 65, 2796-2799; Murphy et al. (1996) J. Neurochem. 67, 1268-1274; O'Connell et al. (1997) J. Neurochem. 68, 2538-2546; O'Malley et al. (1998) Neuroscience 87, 607-613; O'Malley et al. (2000) Neuroscience 99, 229-232; Fox et al (2000) J. Neurobiol. 45, 135-141）。
【０００４】
複数の５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）受容体が同定されており（５−ＨＴ１Ａ／１Ｂ／１Ｄ／１Ｅ／１Ｆ、５−ＨＴ２Ａ／２Ｂ／２Ｃ、５−ＨＴ３Ａ／３Ｂ、５−ＨＴ４Ａ／４Ｂ、５−ＨＴ５Ａ／５Ｂ、５−ＨＴ６および５−ＨＴ７Ａ／７Ｂ／７Ｃ／７Ｄ）、多数の証拠により、５−ＨＴ受容体が学習および記憶の役割を担っていることが示唆されている。５−ＨＴ受容体の５−ＨＴ６サブグループの多くのアンタゴニストが発見されており、国際公開番号ＷＯ９８／２７０８１、ＷＯ９８／２７０５８、ＷＯ９９／０２５０２、ＷＯ９９／３７６２３、ＷＯ９９／４２４６５、ＷＯ００／１２０７３、ＷＯ００／１２６２３、ＷＯ０１／３２６４６（すべてSmithKline Beecham plc）により公開されており、これらの化合物は、ある種のＣＮＳ疾患、例えば不安症、鬱病、癲癇、強迫性傷害、片頭痛、アルツハイマー病（認知記憶の増強）、睡眠障害（日周期リズム障害を含む）、摂食障害、例えば拒食症および過食症、パニック発作、薬物乱用、例えばコカイン、エタノール、ニコチンおよびベンゾジアゼピンによる禁断症状、統合失調症、ＡＤＨＤ、脊髄損傷および／または頭部傷害に不随する障害、例えば水頭症およびある種のＧＩ障害、例えばＩＢＳの治療に用いることができると考えられている。相対的に高レベルの５ＨＴ６受容体は、海馬歯状回の分子層において見出され（Gerald et al. (1997) Brain Res. 746, 207-219）、この拮抗作用は、直接またはＧＡＢＡ作動性介在ニューロン介在阻害作用により、興奮性を増強させうる。
【０００５】
ＷＯ９８／２７０８１の実施例８３に開示されている一のかかる化合物は、５−クロロ−３−メチルベンゾ［ｂ］チオフェン−２−スルホン酸（４−メトキシ−３−ピペラジン−１−イルフェニル）アミド塩酸塩であり、また、これはＳＢ−２７１０４６とも称されている。ＳＢ−２７１０４６は、ヒト（ｐＫｉ８．８〜８．９）およびラット（ｐＫｉ９．０）５−ＨＴ６受容体の強力なアンタゴニストとして特徴付けられている。加えて、該化合物は、５５の他の受容体、結合部位およびイオン・チャンネルと比較して、５−ＨＴ６受容体に対して２００倍以上感受性である。ＳＢ−２７１０４６は、経口で生物学的利用能があり、広範囲の投与量（０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ）でのラット最大電気ショック発作閾値試験における、発作閾値（抗痙攣特性を示す作用）を増加させる（Routledge et al, (2000) British J. Pharm. 130, 1606-1612）。１０ｍｇ／ｋｇの経口投与で、ＳＢ−２７１０４６は、ラットの空間記憶タスクの記憶力を有意に改善し、かくして、ヒトの認知プロセスを増強させる可能性が強調されている（Rogers, D. C. & Hagan, J. J. (2001) Psychopharmacology 158: 114-119）。
【０００６】
本発明者らは、５−ＨＴ６受容体アンタゴニストが、脳領域、例えばラットの内側頭葉および関連する海馬において、基礎および学習により誘発されるポリシアル酸化ニューロン細胞頻度（frequency）を増加させることができる。
【０００７】
かくして、本発明により、哺乳類の中枢神経系内のニューロン成長を促進する方法であって、５−ＨＴ６受容体アンタゴニストを投与する工程を含む方法を提供する。
【０００８】
好ましくは、ニューロン成長は、主に学習機能および記憶機能に関与する領域内、例えば哺乳類の中枢神経系の海馬または内側頭葉で促進されるだろう。
好ましくは、５−ＨＴ６受容体アンタゴニストは、医薬組成物の形態で投与されるだろう。
【０００９】
本発明の方法により治療することができる疾患は、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病および卒中を含む。
【００１０】
該５−ＨＴ６受容体アンタゴニストが医薬組成物の形態で投与される場合、これは、１つまたはそれ以上の医薬上許容される賦形剤と混合して調製されうる。
【００１１】
本発明の第２の態様において、哺乳類の中枢神経系内のニューロン成長を促進するたの医薬製造における、５−ＨＴ６受容体アンタゴニストの使用を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる態様において、哺乳類の中枢神経系内のニューロン成長を促進するのに用いるための５−ＨＴ６受容体アンタゴニストを含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
適当には外界温度および大気圧で調製することができる、本発明の医薬組成物は、通常には、経口、非経口または直腸投与に適しており、錠剤、カプセル、経口液体製剤、粉末、顆粒、ロゼンジ、復元粉末、注射または注入可能溶液または懸濁液、あるいは坐剤の形態であってもよい。経口投与可能組成物が、一般的には好ましい。
【００１４】
経口投与用の錠剤およびカプセルは、単位剤形であってもよく、慣用的な賦形剤、例えば結合剤、充填剤、打錠滑沢剤、崩壊剤および許容される湿潤剤を含んでいてもよい。錠剤は、通常の医薬手法においてよく知られている方法に従ってコートすることができる。
【００１５】
経口液体製剤は、例えば水性または油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形態であってもよく、あるいは使用前に水または他の適当なビヒクルで復元する乾燥粉末の形態であってもよい。かかる液体製剤は、慣用的な添加剤、例えば懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含んでいてもよい）、保存剤、および要すれば慣用的なフレーバーまたは着色剤を含有していてもよい。
【００１６】
非経口投与に関しては、液体単位剤形を、本発明の化合物またはその医薬上許容される塩および滅菌ビヒクルを利用して調製することができる。使用するビヒクルおよび濃度に応じて、化合物は、ビヒクル中に懸濁または溶解することができる。溶液の調製において、化合物は、注射用に溶解し、濾過滅菌し、ついで、適当なバイアルまたはアンプルに充填し、シールすることができる。有利には、アジュバント、例えば局所麻酔剤、保存剤および緩衝剤を、ビヒクル中に溶解させる。安定性を増強するために、組成物をバイアルに充填した後に冷凍し、減圧下で水を除去することができる。非経口懸濁液は、化合物をビヒクル中に溶解する代わりに懸濁させ、滅菌を濾過により行えないこと以外は、実質的に同様の方法で調製する。化合物は、滅菌ビヒクルに懸濁させる前に、エチレンオキシドに曝して滅菌することができる。有利には、界面活性剤または湿潤剤が、化合物の均一な分散を促進するために組成物中に含まれる。
【００１７】
組成物は、投与方法に応じて、０．１重量％〜９９％重量、好ましくは１０〜６０重量％の活性物質を含有することができる。
【００１８】
上記した障害の治療において用いられる化合物の投与量は、障害の重症度、患者の体重および他の同様の因子により、通常変化するだろう。しかしながら、一般的に指針としては、適当な単位投与量は、０．０５〜１０００ｍｇ、より適当には０．０５〜２００ｍｇ、例えば２０〜４０ｍｇであってもよく；かかる単位投与量は、１日１回以上の投与が必要とされてもよいが、好ましくは１日１回であり、かかる治療は、数週間または数ヶ月に及んでもよい。
【００１９】
当該分野で知られている５−ＨＴ６受容体アンタゴニストは、哺乳類の中枢神経系内のニューロン成長を促進するのに使用することができる。例えば、これらの５−ＨＴ６受容体アンタゴニストは、国際公開番号ＷＯ９８／２７０８１、ＷＯ９８／２７０５８、ＷＯ９９／０２５０２、ＷＯ９９／３７６２３、ＷＯ９９／４２４６５、ＷＯ００／１２０７３、ＷＯ００／１２６２３、ＷＯ０１／３２６４６（すべて、SmithKline Beecham plc）（出典明示により本明細書に組み入れる）に開示されている。
【００２０】
本発明の一の好ましい態様において、該５−ＨＴ６受容体アンタゴニストは、５−クロロ−３−メチルベンゾ［ｂ］チオフェン−２−スルホン酸（４−メトキシ−３−ピペラジン−１−イルフェニル）アミドまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物であり、最も好ましくは塩酸塩である。
【００２１】
本発明の第２の好ましい態様において、該５−ＨＴ６受容体アンタゴニストは、Ｎ−（３，５−ジクロロ−２−メトキシ−フェニル）−４−メトキシ−３−ピペラジン−１−イル−ベンゼンスルホンアミドまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物であり、最も好ましくは塩酸塩である。
【００２２】
本発明を、以下の実施例を参照することにより説明する：
実施例
（ａ）一般実験
実験に未使用の８０日齢（ＮＣＡＭ−ＰＳＡ評価時）の雄のウイスター・ラット（Wistar rat）を、すべての試験で用いた。すべての動物を、２２±２℃を維持し、標準的な１２時間明／暗サイクルで、食餌および水を自由に摂れる状態で、個別に飼育した。動物を、いずれの実験開始の少なくとも３日前に、実験部屋に誘導した。
実施例において、ＳＢ２７１０４６なる語は、５−クロロ−３−メチルベンゾ［ｂ］チオフェン−２−スルホン酸（４−メトキシ−３−ピペラジン−１−イルフェニル）アミド塩酸塩を意味し、ＳＢ３９９８８５語は、Ｎ−（３，５−ジクロロ−２−メトキシ−フェニル）−４−メトキシ−３−ピペラジン−１−イル−ベンゼンスルホンアミド塩酸塩を意味する。
【００２３】
（ｂ）ＮＣＡＭ ＰＳＡ発現の定量分析
（ｉ）凍結切片法
新たに解剖したラットの全脳を、注意深く、最適切削温度（ＯＣＴ）化合物でコートし、乾燥氷冷ｎ−ヘキサンを含有するＣｒｙｏｐｒｅｐ冷凍装置中に入れた。ＯＣＴ化合物ｎ−ヘキサンの機能は、組織を均等に冷凍させ、かくして、凍結による悪影響を回避する。すべての実験の水平断面図は、Ｍｉｃｒｏｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５００低温保持装置で、半自動的または自動的に切断した。新たな冷凍脳切片（１２μｍ）を、低温保護して、−１５℃で切り取った。すべての切片を実験日に準備し、前もって切り取り、冷凍保存することはなかった。ＮＣＡＭ ＰＳＡ−陽性海馬歯状回顆粒細胞層／門境界細胞の分析に関して、１０の代替切片を、ブレグマ（Bregma）（Paxinos and Watson, 1986）の下−５．６ｍｍに相当するレベルで取り、このレベルで、この細胞集団が最大限に見られた。
また、ラット内側頭葉におけるポリシアル酸化ニューロンの頻度は、５−ＨＴ６アンタゴニストに慢性被爆させて、実験した。内嗅皮質および嗅周皮質の第ＩＩ層に位置し、頻度の背腹増加を示すこれらのポリシアル酸化ニューロンは、ブレグマレベル−７．１，−７．６、−８．１および−８．６で試験された。
【００２４】
（ｉｉ）免疫組織化学的プロトコル
ブレグマ（上記を参照）を基準にして種々のレベルで、冷凍した組織から水平凍結切片を切り取り、これらを、ｄＨ２Ｏ中に希釈したポリ−ｌ−リシンでコートされたスライドガラス上に置いて解凍し、７０％のエタノールで３０分間浸漬した。ついで、各々の切片を１０分間、０．１Ｍのリン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンおよび１％（ｖ／ｖ）の正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ中に１：５００で希釈した一次抗体と、室温で、加湿したチャンバー中で、２０時間インキュベートして、非特異的染色を減少させた。加湿チャンバーにより切片を蒸発から防止した。一次抗体は、ＰＳＡに対して単クローン性であり、これは、Professor G, Rougon（CNRS UMR 6545, 13288 Marseille, France）により提供されている。一次抗体のインキュベーションが完了すると、各々の切片を、ＰＢＳで１０分間２回洗浄し、１％のＢＳＡおよび１％のＮＧＳを含有するＰＢＳ中に希釈係数１：１００で希釈した、二次抗体と加湿したチャンバー中で３時間室温でインキュベートした。二次抗体は、フルオレセインにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＭ（ＦＩＴＣ）である。二次インキュベーションに続いて、切片を再びＰＢＳで１０分間２回洗浄し、蛍光増強培地Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ（登録商標）に置き、Ｌｅｉｔｚ ＤＭ ＲＢ蛍光顕微鏡で蛍光を観察した。
【００２５】
（ｉｉｉ）ＮＣＡＭＰＳＡ発現の定量評価
定量画像分析を、高感度ＣＣＤビデオカメラを有する蛍光顕微鏡に接続された、Ｌｅｉｃａ Ｑｕａｎｔｉｍｅｔ ５００（登録商標）Ｐ．Ｃ．−に基づくソフトウェアパッケージを用いて行った。各々の顕微鏡レンズは、１ｍｍの目盛りを用いる、長さおよび面積に対する目盛りがついている。右の歯状回顆粒細胞層／門境界のＮＣＡＭ ＰＳＡ−免疫反応性ニューロンの総数は、ブレグマ（Paxinos and Watson, 1986）から−５．６ｍｍで始まる７つの代替１２μｍ切片において計数し、５〜１０μｍの周核体の二重計算を防止する。細胞の同定を、核対比染色ヨウ化プロピジウム（４０ｎｇ／ｍｌのＰＢＳ；６０秒）を用いることにより補助した。ついで、細胞の数を歯状回顆粒細胞層の総面積で除し、ｐ８０ラットに関する平均顆粒細胞層面積を掛け、これはこのレベルで０．１５±０．０１ｍｍ２である。これを各々の切片に対して行い、平均±ＳＥＭを、各々の脳に関して計算し、その結果をＰＳＡ−陽性細胞／単位面積として表した。ついで、これらの結果を用いて、各々の動物群に関する平均±ＳＥＭを得た。細胞同定を、再び、核対比染色ヨウ化プロピジウム（４０ｎｇ／ｍｌのＰＢＳ；６０秒）を、可能性ある二重計算を除外する代替切片と用いることにより行った。細胞数を、大脳皮質の長さで除し、大脳皮質の平均長さを掛けて、これは１０ｍｍであった。これを、各々の切片に対して行い、平均±ＳＥＭを、各々の脳に関して計算し、その結果を、ＰＳＡ−陽性細胞／単位面積で表した。これらの結果を用いて、各々の動物群の最終平均±ＳＥＭを得た。
【００２６】
（ｉｖ）水迷路学習
１．行動評価
このプロトコルにおいて、動物を学習の５日前に学習環境下に誘導し、標準的な条件により別個に飼育した。動物を、１および２日目は操作せずに放置してその環境に慣らし、３、４および５日目に、動物を操作し、体重を測定し、５分間の間オープンフィールド装置での自然行動を評価する。オープンフィールド研究は、すべての学習プロシージャの主要部分からなる。オープンフィールド装置は、６２０ｍｍの奥行き、６２０ｍｍの幅および１５０ｍｍの高さの、黒く塗られた木材からなる。装置の白く塗られた床は、左右に線を引き、７７ｘ７７ｍｍ四方の一連の箱にそれを分割する。自発運動を、３００秒間に横切った線の数として測定した。観測された他の行動は、立ち上がり、身繕い、立毛、排便および身構えであった。これらの行動評価は、学習計画に対して応答していない動物を検出するため、または試験結果を混同させうる不当な薬剤効果の可能性を検出するために非常に重要である。
【００２７】
２．装置
水迷路装置は、特にブラックパースペックス（black Perspex）における従来の設計で構成される、円形プール（直径１ｍ、高さ８０ｃｍ）からなる。温度は、水を循環させるポンプを有する二重底により覆われた発熱体により、２６℃に維持した。プラットホーム（直径１１ｃｍ）は、水面下１．５ｃｍに沈め、また、ブラックパースペックスからなる。学習の間、プラットホームは、側壁から３０ｃｍの迷路の四分円の１つに隠した。迷路およびプラットホームのブラックパースペックスは、脱出行為を誘導する手掛かり合図を迷路内に与えない。しかしながら、学習ルームは、脱出学習に必要な空間地図の作成を補助する、いくつかの迷路外の見える手掛かりを与える。自動化追跡システム「水迷路３．１」を用いた。このプログラムは、デジタルカメラにより獲得したビデオ画像および画像獲得ボード、測定した経路の長さ、期間、最大速度、角（泳ぎを開始した方向と終点（プラットホーム）の間の角）およびエントリー数および水迷路の各々の四分円において費やした水泳期間を分析する。
【００２８】
３．単一セッション水迷路学習
これは、前記した刊行物（Murphy et al. (1996) J. Neurochem. 67, 1268-1274）に記載のような学習および記憶強化に付随する分子事象を研究するために用いられる標準的なパラダイムである。各々の試験は、３つの所定の位置の１つで、迷路の壁に向かい合わせたラットから始める。ラットに迷路を探索させ、６０秒の標準期間内に隠されたプラットホームを見つけるのに要した時間を、脱出待ち時間として測定した。最初の試験において、６０秒以内にプラットホームを発見するのに失敗したラットを、１０秒間その位置においた。次の試験において、プラットホームの発見に失敗した動物には、二度とそれを示さなかった。試験間隔を３００秒開けた５回の試験で、脱出待ち時間を測定した。
急性的および慢性的に処理した群からの動物を上記のように試験した。すべての動物は、試験１および試験５の間、プラットホームを発見する待ち時間の減少が示されるように、課題を習得した［急性試験：薬剤処理して学習したもの−Ｆ（４，１９）＝３．５３１；ｐ＝０．０３２；未処理で学習したもの−Ｆ（４，１９）＝７．７４８；ｐ＝０．００１４］［慢性試験：薬剤処理して学習したもの−Ｆ（４，１９）＝１３．３４５；ｐ＜０．０００１；未処理で学習したもの−Ｆ（４，１９）＝１．４５５；ｐ＝０．２６４７］。続いて、試験５の終了の１２時間後、動物を、頸部脱臼により死亡させ、脳組織を取り出し、上記したＮＣＡＭポリシアル酸化の定量のために低温保存した。
【００２９】
（ｖ）データ分析
ＮＣＡＭ ＰＳＡ−陽性細胞数を、各々の細胞群から得た。結果を、群あたり少なくとも３〜６の値を有する平均±ＳＥＭとして表し、ＡＮＯＶＡまたは記載した非対応非パラメータースチューデントｔ−検定により分析した。
【００３０】
（ｃ）ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）発現の定量分析
（ｉ）組織調製
ｐＨ７．４で４％のパラホルムアルデヒド溶液を用いて経心腔的潅流に続いて、脳を除去し、同じ固定液中に一晩貯蔵した。続いて、脳を注意深く最適切断温度（ＯＣＴ）化合物でコートし、ドライアイスで冷却したｎ−ヘキサンを含むＣｒｙｏｐｒｅｐ冷凍装置中に置いた。ＯＣＴ化合物およびｎ−ヘキサンの機能は、組織の均等冷却を付与し、かくして、冷凍による悪影響を避けるものである。
【００３１】
（ｉｉ）凍結切片法
すべての試験の切片を、水平方向に、Ｍｉｃｒｏｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５００低温保持装置で、手動で切断した。新たな凍結脳切片（５０μｍ）を、低温保護しながら−２５℃で切断した。すべての切片を実験日に調製し、前もって切断して冷凍保存しない。これにより、最適な組織形態が得られる。ＢｒｄＵ−免疫陽性海馬歯状回顆粒細胞層細胞の分析に関して、８つのフローフローティング（free-floating）切片を各々の脳から得、抗凍結剤（０．３２Ｍのシュークロース）中に貯蔵した。これらはブレグマ下−４．１ｍｍと等価であるレベルで開始する５００μｍ間隔で得られる。
【００３２】
（ｉｉｉ）  免疫組織学的プロトコル
切片を抗凍結剤から取り出し、５ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍＭのＣａＣｌ２（ＤＮＡｓｅ酵素の安定化に必要）を含有する０．１ＭのＰＢＳ溶液中で、各々５分間３回洗浄した。ＤＮＡ変性のため、切片を３７℃で１時間ＤＮＡｓｅ（１０００ユニット／ｍｌ）中でインキュベートした。この切片を再び洗浄し、１０％ｗ／ｖのＮＧＳで３０分間遮断し、ついで、室温で２０時間、１０％のＮＧＳ（ｖ／ｖ）を含有するＰＢＳ中に１：１００で希釈した一次抗体（抗−ＢｒｄＵラットＩｇＧ、Harlan UK）とインキュベートして、非特異的染色を減少させた。続いて、切片を洗浄し、室温で１時間、１０％のＮＧＳを含有するＰＢＳ中に再び１：２００で希釈した、二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８−複合ヤギ抗−ラットＩｇＧ、Molecular Probes UK）とインキュベートした。二次インキュベーションに続いて、切片を再び洗浄し、Citifluor中においた。
【００３３】
（ｉｖ）ＢｒｄＵ発現の定量評価
右歯状回顆粒細胞層におけるＢｒｄＵ−免疫活性細胞の頻度を、海馬の全範囲にわたる１０個の無作為な切片において計数した。ついで、定量画像分析を、Ｌｅｉｃａ Ｑｕａｎｔｉｍｅｔ ５００ソフトウェアを用いて行い、各々の切片の顆粒細胞層の面積を、ついで、顆粒細胞層容量をカバリエリ（Cavalieri）法で測定した。ついで、顆粒細胞層あたりのＢｒｄＵ−免疫陽性細胞の総数を、得られた細胞密度および顆粒細胞層容量から確立し、これを用いて顆粒細胞層あたりのＢｒｄＵ−免疫陽性細胞平均±ＳＥＭ数を得た。統計分析にはスチューデントｔ−検定を用いた。
【００３４】
実施例１：ＳＢ２７１０４６の慢性投与の、海馬中のニューロン細胞成長への影響
４０日齢の雄の動物（上記したセクション（ａ）に詳細を記載した一般的な方法に従って保持した）に、３、１０または２０ｍｇ／ｋｇのＳＢ２７１０４６を、チューブにより４０日間投与した。薬剤投与は、動物を死亡させる２４時間前に終了した。動物の体重を得、一般的な物理的状態を毎日測定した。メチルセルロース（１％ｗ／ｖ）処理対照および抗精神病剤クロザピンを比較に用いた。ついで、ＮＣＡＭ ＰＳＡ発現を、各々の５つの群（例えば、対照、３、１０および２０ｍｇ／ｋｇのＳＢ２７１０４６およびクロザピン）の動物に関して上記したセクション（ｂ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）に記載の一般的方法に従って定量した。
【００３５】
得られたデータを、上記セクション（ｂ）（ｖ）に記載のように分析し、ＳＢ２７１０４６が、下記する表１に記載のように、投与量に依存して、ラット海馬歯状回の副脳室領域のポリシアル酸化ニューロンの頻度の有意な増加が見られた。この効果は、ビヒクル処理対照または抗精神病剤クロザピンでは、観察されなかった。これらのポリシアル酸化ニューロンは、顆粒細胞層／門境界に位置する蛍光細胞により示され、樹状突起は海馬歯状回の分子層にまで及んだ。
【００３６】
【表１】
2005522432.tif 000002
【００３７】
また、ラットの内側頭葉におけるポリシアル酸化ニューロンの頻度は、下記表２に記載のように、ＳＢ２７１０４６（２０ｍｇ／ｋｇ）に慢性的に暴露することにより増加した。これらのポリシアル酸化ニューロンは、内嗅皮質および嗅周皮質の第ＩＩ層に位置し、頻度の背腹増加が示される。ブレグマレベル７．１、−７．６および８．６で、ポリシアル酸化細胞頻度は、メチルセルロース処理対照動物と比較して有意に増加した。ブレグマレベル−８．１においては、ポリシアル酸化細胞頻度の有意な増加はなかった。
【００３８】
【表２】
2005522432.tif 000003
【００３９】
対照群は、二次ＡＮＯＶＡにより、治療群とは有意に行っている。各々のブレグマレベル間での有意な相違を、星印により示し（ｐ＜０．０５、非対応非パラメータースチューデントｔ−検定）、すべての場合においてｎ＝３。
【００４０】
実施例２：ＳＢ２７１０４６の急性的および慢性的投与の、海馬のニューロン細胞成長の学習誘発活性化に対する影響
８０日齢の雄の動物（上記したセクション（ａ）に詳細を記載した一般的な方法に従って保持した）に、上記セクション（ｂ）（ｉｖ）に記載した方法に従って水迷路学習を行う３０分前に、２０ｍｇ／ｋｇのＳＢ２７１０４６をチューブにより投与するか（急性投与）、または４０日齢の雄の動物に、２０ｍｇ／ｋｇのＳＢ２７１０４６をチューブで４０日間投与し、８０日齢で、上記セクション（ｂ）（ｉｖ）に記載した方法に従って水迷路学習を行った（慢性投与）。メチルセルロース（１％ｗ／ｖ）処理対照を、比較のために用いた。ついで、ＮＣＡＭ ＰＳＡ発現を、４つの群の動物（例えば、未学習、学習対照、２０ｍｇ／ｋｇのＳＢ２７１０４６を投与した動物）を、上記したセクション（ｂ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）に記載の一般的方法に従って定量した。
【００４１】
得られたデータを、上記セクション（ｂ）（ｖ）に記載のように分析し、ＳＢ２７１０４６の急性投与では、水迷路学習後１２時間で、薬剤を投与した未学習の動物と比較して、また、学習したが薬剤陰性である動物に関して、ラット海馬歯状回の副脳質領域のポリシアル酸化ニューロンの頻度の有意な増加が見られた（表３）。同様の結果が、ＳＢ２７１０４６に慢性的に暴露した動物で得られた（表４）。
【００４２】
【表３】
2005522432.tif 000004
【００４３】
【表４】
2005522432.tif 000005
【００４４】
【表５】
2005522432.tif 000006
【００４５】
【表６】
2005522432.tif 000007
【００４６】
実施例３：ＳＢ３９９８８５の慢性投与の、海馬内のニューロン細胞成長に対する影響
４０日齢の雄の動物（上記したセクション（ａ）に詳細を記載した一般的な方法に従って保持した）に、３、１０または２０ｍｇ／ｋｇのＳＢ３９９８８５をチューブで４０日間投与した。薬剤投与は動物を死亡させる２４時間前に終えた。動物の体重を得、一般的な物理的状態を毎日測定した。メチルセルロース（１％ｗ／ｖ）処理対照を比較に用いた。さらにＳＢ２７１０４６（２０ｍｇ／ｋｇ）処理群を、前記した実験の結果と比較できるように利用した。ついで、ＮＣＡＭＰＳＡ発現を上記したセクション（ｂ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）に記載の一般的方法に従って定量した。
【００４７】
得られたデータを、上記したセクション（ｂ）（ｖ）に記載のように分析し、ＳＢ３９９８８５では、表５に示すように、投与量に依存して、ラット海馬歯状回におけるポリシアル酸化ニューロンの頻度の有意な増加が見られた。この効果はビヒクル処理対照においては観察されなかった。これらのポリシアル酸化ニューロンは、顆粒細胞層／門境界に位置する蛍光細胞により示され、樹状突起は海馬歯状回の分子層にまで及んだ。
【００４８】
【表７】
2005522432.tif 000008
【００４９】
さらに、差異分析は、慢性ＳＢ３９９８８５処理による海馬ポリシアル酸化ニューロンの基底頻度の投与量依存増加が、実施例１の慢性ＳＢ２７１０４６で観察されたものよりも有意に大きいことを示している（Ｆ［１，２１］＝５．８８２；Ｐ＝０．０２４４）。さらに、この実験において、実施例１に観察されたものと比較して、ＳＢ２７１０４６−処理動物のラット海馬歯状回の副脳室領域における、ポリシアル酸化ニューロンの頻度の差異はない。
【００５０】
実施例４：ＳＢ３９９８８５の慢性投与の、水迷路学習後の、海馬ポリシアル酸化ニューロン細胞頻度に対する影響
４０日齢の雄の動物（上記したセクション（ａ）に詳細を記載した一般的な方法に従って保持した）に、チューブで４０日間、２０ｍｇ／ｋｇのＳＢ３９９８８５を投与し、８０日齢の上記セクション（ｂ）（ｉｖ）に記載の方法に従って水迷路学習を行った（慢性投与）。メチルセルロース（１％ｗ／ｖ）処理対照を比較に用いた。ついで、ＮＣＡＭ ＰＳＡ発現を、上記セクション（ｂ）（ｉ）−（ｉｉｉ）に記載の一般的方法により定量した。
【００５１】
得られた結果を、上記セクション（ｂ）（ｖ）に記載のように分析し、ＳＢ３９９８８５の慢性投与では、水迷路学習後１２時間で、薬剤を投与した未学習の動物と比較して、また、学習したが薬剤陰性である動物に関して、ラット海馬歯状回の副脳室領域のポリシアル酸化ニューロンの頻度の有意な増加が見られた（表６）。
【００５２】
【表８】
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【００５３】
【表９】
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【００５４】
さらに、慢性的にＳＢ３９９８８５（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与したこれらの動物において、水迷路学習の１２時間後、海馬ポリシアル酸化ニューロンの観察された頻度の有意な増加は、実施例２におけるＳＢ２７１０４６処理後に観察されたものよりも有意に大きかった（スチューデントｔ−検定；Ｐ＝０．０３３７）。
【００５５】
実施例５：ＳＢ２７１０４６またはＳＢ３９９８８５の慢性投与の海馬ニューロン新生に対する影響
４０日齢の雄の動物（上記したセクション（ａ）に詳細を記載した一般的な方法に従って保持した）に、４０日間チューブで２０ｍｇ／ｋｇのＳＢ２７１０４６またはＳＢ３９９８８５を投与した（慢性投与）。最後の８日間は、各々の処理群からの研究動物に、脳ニューロン新生を研究するのに広く使われているＤＮＡ合成のマーカーであるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、１００ｍｇ／ｋｇ、非経口）（Gage (2002) J. Neurosci. 22, 612-613）を投与した。薬剤投与を動物を死亡させる２４時間前に終えた。動物の体重を得、一般的な物理的状態を毎日観察した。メチルセルロース（１％ｗ／ｖ）処理対照を、比較に用いた。ついで、ＢｒｄＵ発現を、上記セクション（ｃ）に記載の方法に従って定量した。
【００５６】
ＳＢ２７１０４６またはＳＢ３９９８８５慢性投与のいずれかにより、表７に示すように、ビヒクル処理対照と比較して、海馬歯状回顆粒細胞層におけるＢｒｄＵ−免疫陽性細胞の発現が有意に変化し、両方の化合物が、神経速度を変えることなく、ＮＣＡＭ ＰＳＡ発現を活性化させる能力が示された。
【００５７】
【表１０】
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【００５８】
本明細書に記載された特許および特許出願は、本明細書に出典明示により組み入れる。
【国際調査報告】
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