(57)【要約】  本発明は、１個または複数の遊離ヒドロキシル官能および／または１個または複数の置換または無置換第一級または第二級アミン官能を有する化合物をスルホン化する方法であって、該化合物を、酸捕捉剤の存在下にＳＯ３−ＤＭＦ複合体で処理することを特徴とする該方法を対象とする。酸捕捉剤は、沸点が１００℃未満のアルケン類またかアルキン類もしくはこれらの混合物のうちから選択するのが有利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個または複数の遊離ヒドロキシル基および／または１個または複数の第一級または第二級アミン官能を有する飽和または不飽和の化合物をスルホン化する方法であって、該化合物を、酸捕捉剤の存在下に、ＳＯ３−ＤＭＦ複合体により処理することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記酸捕捉剤が、沸点が１００℃未満のアルケン類またはアルキン類またはそれらの混合物からなる群から選ばれたものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
前記酸捕捉剤が、２−メチル−２−ブテン（２Ｍ２Ｂ）、２−メチルプロペン、２−メチルペンテンまたはそれらの異性体類、あるいはそれらの混合物からなる群から選ばれたものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
【請求項４】
下記の工程を包含することを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の方法：
ａ）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミドとジメチルホルムアミドとからなる共溶媒などの無水の溶媒または共溶媒中のスルホン化すべき化合物の均質な溶液の可溶化または調製。
ｂ）２−メチル−２−ブテンなどの共溶媒混和性酸捕捉剤の過剰モル量の外界温度（２０−２２℃）での添加。
ｃ）攪拌下でのＳＯ３−ＤＭＦ複合体の速やかな添加、
ｄ）前工程で得られた混合物の、３０℃未満の制御された温度での１〜２時間の攪拌、
ｅ）アルカリ性溶液、たとえば重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）または他のアルカリの２％溶液への、決して４未満にならないようなｐＨ制御下での、前記混合物の添加による反応の停止による被スルホン化化合物の塩の取得。
【請求項５】
前記工程（ｅ）で得られたスルホン化された化合物の精製を包含することを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）に先立ち、当該化合物をプロトン化して、工程（ａ）に際してのそれの可溶化を助長することを特徴とする特許請求の範囲第４項または第５項に記載の方法。
【請求項７】
スルホン化すべき化合物が、単量体類、オリゴマー類および重合体類からなる群から選ばれたものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
スルホン化すべき化合物が、式
ＡａＸｘＹｙ    （Ｉ）
（ここに、Ａは単量体であり；Ｘは基ＲＣＯＯＲ′を表わし；Ｙは、Ａに固定された、式ＲＯＳＯ３Ｒ′、ＲＮＳＯ３Ｒ′のいずれかに相当するＯまたはＮ−スルホナト基を表わし；基Ｒは、場合により枝分れしていてもよく、および／または不飽和であってもよく、１個または複数の芳香族環を含んでいてもよい脂肪族炭化水素鎖であり（ただし、ベンジルアミンおよびスルホン酸ベンジルアミンを除く）；Ｒ′は水素原子または陽イオン／カチオンを表わし；ａは単量体の数を表わし；ｘは単量体Ａの基Ｘによる置換の割合または置換度を表わし；ｙは単量体Ａの基Ｙによる置換の割合または置換度を表わす）の重合体であることを特徴とする特許請求の範囲第７項に記載の方法。
【請求項９】
前記重合体がデキストラン誘導体またはリンゴ酸の共重合体であることを特徴とする特許請求の範囲第７項または第８項に記載の方法。
【請求項１０】
前記重合体が、酸性媒質中で不安定な官能基、とりわけエステル、アミド、エーテル、アセタール官能基によって実現された単量体間または単量体とそれの置換基との間の結合を含んでいることを特徴とする特許請求の範囲第７項〜第９項のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正確な分子の定義が記述されていなければならない用途において、たとえば医薬として、使用することが可能な硫酸化化合物を、非分解惹起性で再現性のある条件下で調製する方法に関するものである。
【０００２】
本発明の方法は、遊離ヒドロキシル基（ＯＨ）もしくは置換または無置換第一級または第二級アミノ基を含有するあらゆる単量体、オリゴマーまたは重合体化合物に適用される。とりわけ、本発明は、官能化された重合体のＯ−スルホン化およびＮ−スルホン化の方法に関するものである。
【０００３】
先行技術において報告されている硫酸化化合物調製方法は、一般に、Ｏ−またはＮ−スルホン化に際して、重合体鎖の切断を誘発し、それゆえ、毒性をもつ可能性のある反応残渣の生成を惹起する。本発明の方法は、オリゴ糖類などの初期重合体の元のままの構造を変化させないように設定した条件のもとで、スルホン酸基の制御された付加を可能ならしめることによって、まさに上記の不都合を回避することを目的とする。
【０００４】
先行技術において、抗凝固作用をもつ官能化された重合体、とりわけ、デキストラン（Ｄ）鎖に、カルボキシメチル基（ＣＭ）、メチルベンジルアミド（Ｂ）およびメチルベンジルアミドスルホナート（Ｓ）を置換して得られる誘導体（略してＣＭＤＢＳという）の一族が知られている。これらの重合体の製造方法は、とりわけ仏国特許第２４６１７２４号明細書ならびに米国特許第４７４０５９４号明細書に記載されている。これらの特許のいずれもが、得られた重合体構造の精密な分析結果を示しておらず、記載されている方法も、得られた製品が均質であることを証明できるものではない。これらの特許に記載されているスルホン化反応の実験条件は、グリコシド残基の遊離ＯＨ基へのスルホンの固定を優先するものであり、提示されている分析結果は、ベンジルアミンスルホナートの存在を明瞭に証明することができないものである。
【０００５】
「ヘパリン結合性増殖因子」、略してＨＢＧＦと呼ばれるＣＭＤＢＳ族の他のメンバーが、米国特許第５６９３６２５号明細書に瘢痕形成剤として記載されている。ＨＢＦＧＰＰ類も、筋肉組織（仏国特許第２７１８０２４号明細書）、神経組織（仏国特許第２７１８０２６号明細書）、消化管組織（仏国特許第２７１８０２３号明細書）中に誘発された損傷の修復および再生を促進するというそれらの性質ならびにそれらの抗炎症性（仏国特許第２７１８０２５号明細書）について記載されている。これらの特許は、すべての生体適合性重合体のうちから、下記の４つの機能的性質を示すものを選別することを可能ならしめる機能上の一連の基準を確立している：
−  ＦＧＦ１および２などの線維芽細胞増殖因子のごときヘパリンに親和性をもつ増殖因子（ＨＢＧＦ）やＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング因子を蛋白質分解から保護し、また、それらの生物活性を細胞培養についての一連の試験において増強する。
−  １ｍｇ当り１０国際単位以下の抗凝固作用を示す。
−  生理的条件下で、白血球エラスターゼの活性を阻害する。
−  生理的条件下で、プラスミンの活性を阻害する。
【０００６】
仏国特許出願第９８０９３０９号明細書は、ＨＢＧＦＰＰの諸性質を示し、「再生剤（ＲｅＧｅｎｅｒａＴｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ）」を略してＲＧＴＡと呼ばれる重合体の一族の構造を報告しており、それらの製造方法および性質を記載している。ＲＧＴＡは、とりわけ皮膚瘢痕の質を改善できる抗線維化作用、とりわけフリーラジカル（電離性放射線を受けたのちまたは虚血により誘発された酸化的ストレスがあったとき）の有害な作用に対処するための抗酸化作用およびとりわけ骨性塊の組織の恒常性を調節する性質を示す。これらの性質は、ＨＢＧＦＰＰについて記載されているそれらを補って完全なものとする。
【０００７】
仏国特許第９８０９３０９号に記載されている重合体は、次式に対応する：
ＡａＸｘＹｙ    （Ｉ）
式中：Ａは単量体であり；Ｘは基ＲＣＯＯＲ′を表わし；Ｙは、Ａに固定された、式ＲＯＳＯ３Ｒ′、ＲＮＳＯ３Ｒ′のいずれかに相当するＯまたはＮ−スルホナト基を表わし；基Ｒは、場合により枝分れしていてもよく、および／または不飽和であってもよく、１個または複数の芳香族環を含んでいてもよい脂肪族炭化水素鎖であり（ただし、ベンジルアミンおよびスルホン酸ベンジルアミンを除く）；Ｒ′は水素原子または陽イオン／カチオンを表わし；ａは単量体の数を表わし；ｘは単量体Ａの基Ｘによる置換の割合または置換度を表わし；ｙは単量体Ａの基Ｙによる置換の割合または置換度を表わす。
【０００８】
仏国特許第９８０９３０９号に記載されている重合体のうち、デキストランの誘導体をＣＭＤＳとして挙げることができる。ＣＭＤＳタイプの重合体は、抗凝固剤として記載されてもいる（マイガ（Ｍａｉｇａ）ら、カーボハイドレート・ポリマーズ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、１９９７年、第３２巻、第８９−９３頁）。
【０００９】
これらの先行技術例において、記載されている合成法は、分子の無損傷状態の維持および汚染物質の不存在を保証する十分な再現性という基準に従って製品を取得することができない。すなわち、カルボキシル基を置換する方法が先行技術において広く記載されており、十分な再現性を保証する制御された巧みな置換を可能にするとはいえ、それらのスルホン化法は、使いこなすのがかなり困難である。
【００１０】
それらのスルホン化法は、きわめて酸性のｐＨで実施されるが、このため、重合体鎖の無損傷状態を保存することが、とりわけそれが天然の糖類から構成されている場合、できなくなる。さらに、これらのスルホン化条件は、制御の困難な脱炭酸を惹起する。
【００１１】
そのようなわけで、先行技術の多くの研究業績が、Ａａタイプの多糖類の硫酸化を可能にする方法を記述している。たとえば、デキストラン硫酸（またはＯ−スルホナート）（ＤＳ）、カルボキシルデキストラン硫酸（ＣＭ−Ｄ−Ｓ）（またはＯ−スルホナート）、またはキシランやデンプンなどの他のオリゴ糖の硫酸化物（またはＯ−スルホナート）が、米国特許第４８１４４３７号明細書に記載されているタイプの諸方法によって硫酸化（またはＯ−スルホン化）されている。これらの方法のうち、スルホン化剤のような強酸を用いて多糖類をスルホン化することを提案している方法は、多くの研究者によって報告されている。たとえば、米国特許第４７４０５９４号明細書、同第４７５５３７９号明細書および仏国特許第２７７２３８２号明細書は、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を溶媒として用い、クロロスルホン酸で処理して、ＣＭ−Ｄ−ＳおよびＣＭ−Ｄ−Ｂ−Ｓタイプの分子を製造することを記載している。この方法は、塩基性溶媒としてピリジンを用いたＤＳの合成に同じ酸がすでに使用されており（リケッツ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓ）、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．）第５１巻第２１０−１３３頁、１９５２年）、以前の業績中にすでに広く記載されているものである。ホルムアミド存在下での硫酸およびスルホン酸も、米国特許第３４９８９７２号明細書および同第３１４１０１４号明細書中に記載されているように、低温でのＤＳの調製にすでに使用されている。これらの強度に酸性の反応条件は、塩基性の溶媒が存在していても、または低温においてであっても、製品の部分的分解を惹起する。それらは、重合体製品の場合には、高分子鎖の著しい断片化を惹起し、被スルホン化分子中に含まれているある種の官能基の加水分解を惹起する。強酸性のこれらの条件に対するいくつかの改良が、よりよく緩衝されたまたはより酸性度の小さい媒質の使用によってもたらされている。たとえば、それほど過酷でないスルホン化剤としての三酸化硫黄（ＳＯ３）複合体の使用がすでに導入されている（アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）第９５巻第３６−４１頁、１９６１年；テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）第２９巻第７号第８０３−８０６頁、１９８８年；ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイアティ・パーキン・トランスアクションズ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．）第１巻第１５７頁、１９９５年）。いくつかのＳＯ３−アミンタイプ複合体が市販されており、たとえばＳＯ３−Ｍｅ３Ｎ（トリメチルアミン）、ＳＯ３−Ｅｔ３Ｎ（トリエチルアミン）、ＳＯ３−ピリジンおよびＳＯ３−ピペリジンがある。これらの試薬は、ＤＭＦ、ホルムアミド、ＤＭＳＯなどの溶媒中の無水の媒質中で使用されている。しかし、これらの方法は、とりわけ、エステル、エーテルまたはアミド基によって官能化されているデキストランから誘導されたものなどの硫酸化多糖類の製造に利用されるのではあるが、下記の結果をもたらすゆえに、重大な不都合を示す：
−  割合はスルホン酸類を用いたときほど大きくはないが、重合体の高分子鎖の予測できない断片化、
−  上記の重合体上にすでに存在する官能基の部分的加水分解および
−  調製物を汚染し、生体内接種後に毒性を示した（ブレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．）第１６巻第２０８−２号第４７３−４７８頁、１９８１年）アミン類の形成による副生物の生成。
【００１２】
これらの技術は、ピリジンの場合には米国特許第４８１４４３７号明細書記載の方法が推奨されるなど、毒性のある残留物を最大限除去するようにさらに改良された。というのも、この先行技術の方法で使用されるＳＯ３−アミンは、大部分の多糖類の、とりわけデキストランの、還元性末端に存在するアルデヒド基と反応性であって、かくして形成される結合は共有結合であり、それゆえ永続性のものである。
【００１３】
ＳＯ３−アミンタイプの複合体を使用した場合の難点は、ＳＯ３−ＤＭＦ、ＳＯ３−ＦＡなどのＳＯ３−アミドタイプの複合体を用いることによっても克服された。たとえば、ＤＳの塩類、とりわけナトリウム塩が、今日、米国特許第４８５５４１６号明細書に記載されているように、ホルムアミドを溶媒として用い、ホルムアミドに会合したＳＯ３の複合体（ＳＯ３−ＦＡ）によるＯ−スルホン化によって調製されている。この方法は、ＳＯ３−ＦＡ複合体のその場での生成とそれに続くデキストランとの反応を包含している。ＳＯ３−ＦＡ複合体の強い反応性は、不活性雰囲気（Ｎ２）および無水溶媒の使用にもかかわらず、強い酸性を生じさせる。このことも、高分子鎖の崩壊を惹起する。
【００１４】
他のきわめて有用な非アミン複合体は、ＳＯ３−ＤＭＦである。それは、また、仏国特許第２７７２３８２号明細書において、ＣＭ−Ｄ−ＳおよびＣＭ−Ｄ−Ｂ−Ｓタイプの硫酸化多糖類の合成のために提案されている。しかし、ＳＯ３−ＤＭＦ複合体は、ＳＯ３−ＦＡ複合体と同様に、反応媒質の強い酸性の原因となり、このことも、高分子鎖の断片化および不安定な基の加水分解をもたらし、最終製品合成の制御をうしなわせる。それゆえ、この方法も、それらが偶発的にかつ制御されずに切断されることを望まない高分子量のポリアニオン重合体を調製する場合には、他の諸方法と同様に不完全である。
【００１５】
ＣＭＤＢＳおよびＣＭＤＳの取得を可能ならしめるプロトコールが仏国特許第９７１５７０２号明細書に記載されているのは、まさにそれらの合成法を改良せんとしてのことである。仏国特許第９７１５７０２号明細書によれば、この改良は、一方で、分子量のより高い均質性を示すデキストラン誘導体の取得を可能ならしめ、他方では、構造のより高い均質性、従ってより優れた定義を確実なものにする置換率の制御を可能ならしめる。しかし、仏国特許第９７１５７０２号明細書に記載されている方法は、先行技術におけると同様に、ＳＯ３−アミン（ＤＭＦ、ピリジンまたはトリエチルアミン）を使用しての多糖類のスルホン化に依存しており、与えられている実施例は、もっぱらＳＯ３−ピリジンを用いて得られている。さらに、この方法は、残留痕跡量のピリジンの生成に至らしめるが、ヒトに対するこのものの毒性は周知であり、また、多糖類鎖断片の形成が生じないようにできるとは思われない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、まさに、ヒドロキシル官能もしくは第一級または第二級アミン官能を含む化合物にスルホナト基を置換する条件をきわめて厳密かつ正確に制御することを可能にする新規な一般的スルホン化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記目的は、１個または複数の遊離ヒドロキシル基および／または１個または複数の第一級または第二級アミン官能を有する飽和または不飽和の化合物をスルホン化する方法であって、該化合物を、酸捕捉剤の存在下に、ＳＯ３−ＤＭＦ複合体により処理することを特徴とするスルホン化方法によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
酸捕捉剤とは、溶液中のプロトンと選択的に反応できる物質または物質混合物をいう。反応混合物にこの酸捕捉剤を添加すると、プロトンは該酸捕捉剤によって捕捉され、それらはもはや反応性ではないために、もはやｐＨの低下に関与しない。
【００１９】
前記酸捕捉剤は、たとえば、沸点が１００℃未満のアルケン類またはアルキン類もしくはそれらの混合物からなる群のなかから選ばれる。
【００２０】
前記酸捕捉剤は、２−メチル−２−ブテン（２Ｍ２Ｂ）、２−メチルプロペン、２−メチルペンテン、またはそれらの異性体、あるいはそれらの混合物であることが有利である。
【００２１】
本発明の方法は、過度に酸性のｐＨの使用を回避でき、かくして被処理化合物の切断という危険を取り除くことができる点で、優れたものである。さらに、それは、完全に除去することが困難または不可能な毒性物質を持ち込まないという利点を示す。
【００２２】
とりわけ、本発明の方法は、つぎの工程を包含する：
ａ）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミドとジメチルホルムアミドとからなる共溶媒などの無水の溶媒または共溶媒中のスルホン化すべき化合物の均質な溶液の可溶化または調製。
ｂ）２−メチル−２−ブテンなどの共溶媒混和性酸捕捉剤の過剰モル量の外界温度（２０−２２℃）での添加。
ｃ）攪拌下でのＳＯ３−ＤＭＦ複合体の速やかな添加、
ｄ）前工程で得られた混合物の、３０℃未満の制御された温度での１〜２時間の攪拌、
ｅ）アルカリ性溶液、たとえば重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）または他のアルカリの２％溶液への、決して４未満にならないようなｐＨ制御下での、前記混合物の添加による反応の停止による被スルホン化化合物の塩の取得。
【００２３】
本発明の方法は、有利には、たとえば、分画分子量が１０００ドルトンの限外濾過膜を通しての水（ヒトに注射可能なものと同質のもの）に対する接線限外濾過による、工程（ｅ）で得られたスルホン化化合物の精製を包含する。
【００２４】
工程（ａ）で使用する溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではないことが好ましい。本発明の範囲内で実施された研究によって、この溶媒は、スルホン化多糖類調製物から除去するのがきわめて困難であり、それゆえ、医薬品形態の調製にそれら調製物を使用するのに障害となることが明らかにされたからである。
【００２５】
スルホン化すべき化合物が無水の溶媒または共溶媒に溶けにくい場合、本方法を実施する特別な一形態は、該化合物をプロトン化して、それの可溶化を助長することにある。とりわけ、１個以上のカルボキラート基により置換されたデキストランなどの糖の重合体である被スルホン化化合物がそうであり、それらのプロトン化は、たとえば陽イオン交換樹脂カラムを通過させることにより、−ＣＯＯＨ基の形成に導く。
【００２６】
従って、スルホン化の条件は、最初からカルボキシル基によって置換されている重合体の脱炭酸を回避するのに十分なように設定、制御する。その結果、スルホン化の条件はつぎのようであるのが有利である：
スルホン化すべき重合体を無水の溶媒に溶解させる（実施例２の１参照）。過剰モル量の酸捕捉剤（アルケン２Ｍ２Ｂなど）を加える。ＳＯ３−ＤＭＦ複合体などのスルホン化試薬（ＳＯ３）を加え、前記酸捕捉剤の蒸発温度よりも低い温度で反応を進行させる。ＮａＨＣＯ３などのアルカリ性溶液の添加により反応を停止させる。
【００２７】
本発明の方法は、単量体、オリゴマーまたは重合体に適用される。それは、とくに、先に定義したＨＢＧＦＰＰやＲＧＴＡなどの重合体に、従ってとりわけデキストランから誘導された化合物やリンゴ酸共重合体に、適合している。かくして、本発明は、とくに式：
ＡａＸｘＹｙ    （Ｉ）
の重合体を対象とする。
【００２８】
上記式中、Ａは単量体であり；Ｘは基ＲＣＯＯＲ′を表わし；Ｙは、Ａに固定された、式ＲＯＳＯ３Ｒ′、ＲＮＳＯ３Ｒ′のいずれかに相当するＯまたはＮ−スルホナト基を表わし；基Ｒは、場合により枝分れしていてもよく、および／または不飽和であってもよく、１個または複数の芳香族環を含んでいてもよい脂肪族炭化水素鎖であり（ただし、ベンジルアミンおよびスルホン酸ベンジルアミンを除く）；Ｒ′は水素原子または陽イオン／カチオンを表わし；ａは単量体の数を表わし；ｘは単量体Ａの基Ｘによる置換の割合または置換度を表わし；ｙは単量体Ａの基Ｙによる置換の割合または置換度を表わす。
【００２９】
本発明の方法は、重合体、とりわけ式（Ｉ）の重合体であって、式（Ｉ）の重合体のＡ−ＡまたはＡ−Ｘ結合などの単量体間または単量体とそれらの置換基との間の結合が酸性媒質中で不安定な官能基、とりわけエステル、アミド、エーテル、アセタール（グリコシド性）官能または他の基によって行われている重合体に対して実施することができる。
【００３０】
それゆえ、本発明の方法は、単量体またはヘパリンのある種の断片などのオリゴマーである硫酸化糖類、さらにはＲＧＴＡ族重合体、とりわけＡが、デキストランまたは他のあらゆる多糖類化合物を基礎とした重合体の場合のように、配糖体単量体であるものといった硫酸化糖類を調製するのにとくに適している。
【００３１】
本発明の他の利点および特徴は、本発明方法の実施に関するものであり、添付の図面を参照して説明する以下の実施例から明らかになるであろう。
【００３２】
図面中、図１は、末端アルデヒドが認められるＣＭＤＳの１個の分子を図示したものである。ｘおよびｙの値が０ではないＣＭＤＳ分子の場合、ａ）アルデヒドまたはヘミアセタール、ｂ）カルボキシメチルグルコシドおよびｃ）スルホナトグルコシドの３つのタイプの単位Ｚが存在する。
【００３３】
図２は、置換デキストランの末端単位のアルデヒド官能とヘミアセタールとの間の平衡を示す。アノマー位において置換されている単位は、もはや平衡に関与しない。
【００３４】
図３は、表３に示した構造特性をもつＣＭＤＳタイプの分子のクロマトグラフィープロフィールを示す。
【００３５】
図４は、異なるゲル濾過カラムでの同一製品ＰＡ０７について得られたクロマトグラフィープロフィールを示す。
【００３６】
図５は、ＣＭＤＳの構造を示す。
【００３７】
これらの実施例は、とりわけＣＭＤＳ、ＣＭＤＢＳなどのデキストランから誘導された重合体のスルホン化についての、本発明の方法と先行技術の方法との比較をも包含している。この比較は、仏国特許第９７１５７０２号明細書および仏国特許第９９０７６３６号明細書の中で提案されているプロトコールでは、デキストラン重合体の分子の完全性（無損傷性）の良好な保持ができないことを示している。それらが、簡単な方法で検出、定量できる断片化ならびに高分子鎖上にグラフトされた基の加水分解を生じるからである。
【実施例１】
【００３８】
Ｉ−スルホン化の評価
【００３９】
Ｉ．１−カルボキシル基およびスルホナト基の測定方法
【００４０】
異なるスルホン化方法を比較できるよう、我々は、グルコース１単位当りのカルボキシル基（ｘ）およびスルホナト基（ｙ）による置換の程度（ｄｓ）を測定した。デキストランはグルコースの重合体であるので、各グルコース単位は３個の反応性ＯＨ基をもっている。従って、理論極大ｄｓは３である。定量は、先行技術において記載されている慣用のプロトコールに従った滴定法および元素分析によって行う。
【００４１】
滴定定量を元素分析と組合せるとき、カルボキシメチルエーテル基（ｘ）およびスルホナト基（ｙ）による総置換率（ｘ＋ｙ）を求めることができる。
【００４２】
Ｉ．２−置換基の位置の決定
【００４３】
グルコシド単位上のグラフトされた基の位置を明らかにするために、我々は、当業者に既知の（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２７５巻第３８号第２９３８３−２９３９０頁、２０００年）慣用的条件に従ったＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴）による分析法を用いた。我々は、ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）２００ＭＨｚ分析計を用いた。
【００４４】
Ｉ．３−ポリグルコシド鎖の断片化を測定できる方法
【００４５】
スルホナト基付加前後の重合体鎖の完全性を測定するために、溶液中の製品中に存在するアルデヒドを定量した。
【００４６】
アルデヒドの定量により、製品の還元性末端単位の数を求めることができる。図１に示したように、重合体の還元性末端のみがアルデヒド基を有するからである。このように、スルホン化すべき製品について、アルデヒド基の数を求めるが、この場合、それは、製品１ｇ当りアルデヒド１マイクロモルに等しい。この値は、反応の過程で切断が生じなければ、いずれの場合にも、出発製品の値以下であるはずである。
【００４７】
実際に、スルホン化反応後に測定された遊離アルデヒドの値は、スルホナト基導入前に測定した値（０．５ミリモル／ｇのＣＭＤＳの場合、１．０マイクロモル／ｇ）よりも小さい。ｘ＝０．５、ｙ＝１．２５のＣＭＤＳタイプの製品の場合に通常見出される遊離アルデヒドの値は、製品１グラム当りアルデヒド０．４マイクロモル近傍である。これに対し、この数が出発値（１．０）を超えれば、切断が強度に生じている。
【００４８】
それゆえ、この方法は、断片の生成を測定することができる。鎖の切断ごとに、反応性で検出可能な新しいアルデヒド基が生じるからである。
【００４９】
Ｉ．４−分子量の測定と調製物の見かけの均質性の検討を可能ならしめる方法
【００５０】
分子量測定は、直列接続したゲル濾過カラムＫＢ−８０４およびＫＢ−８０５（ショーデックス、日本）を用いた０．７ｍｌ／分の０．１Ｍ  ＮａＮＯ３による高速立体排除クロマトグラフィーによって行う。生成物を、ミニドーン（ｍｉｎｉ  Ｄａｗｎ）光散乱検出器およびＲＩＤ１０型屈折計によって検出する（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２７５巻第３８号第２９３８３−２９３９０頁、２０００年）。調製物の均質性は、分子量分布曲線とピーク幅の大きさ（半分の高さのところでの）ならびにその曲線の対称性の程度によって反映される。
【００５１】
ＨＰＬＣ−ゲル濾過という第二の手法は、分子量分布に関して分子の均質性を証明することを可能ならしめる。ガウス分布の一例を図３に示す。
【００５２】
クロマトグラフィー条件は、次の通りである：カラム：ＴＳＫゲルＧ４０００ＰＷＸ（東ソー・ハース）、３０℃、７．８ｍｍＩＤｘ３０ｃｍ；移動相：０．３Ｍ  ＮａＣｌ；流量：０．７ｍｌ／分；検出：ＩＲ０．０６。
【００５３】
ＳＯ３−アミン複合体を用いる手法に従って合成された製品の場合、調製物の均質性は、用いるクロマトグラフィー系によって異なることが認められた。
【００５４】
製品をショーデックスカラムによって分離するとき、ピークは非対称であるが、第二のクロマトグラフィー分離系を用いるときには、同じ製品に対応するピークは、図４に示すように、対称的になる。このことは、これらの調製品ならびに先行技術のそれらにおける分子量ばらつきの均質性が使用する分離系と関係があることを示している。
【実施例２】
【００５５】
ＩＩ−本発明を利用してのカルボキシメチルデキストランのＯ−スルホン化の例および先行技術との比較
【００５６】
クロロスルホン酸あるいはＳＯ３−アミン複合体、ＳＯ３−ＤＭＦ複合体および本発明の対象である酸捕捉剤２−メチル−２−ブテン存在下のＳＯ３−ＤＭＦ（ＳＯ３−ＤＭＦ／２Ｍ２Ｂ）による種々のＯ−スルホン化反応を、以下の実施例において記載する。
【００５７】
これらの比較を確立するために、カルボキシメチルデキストランを出発重合体として選択した。
【００５８】
ＩＩ．１−ＳＯ３−ＤＭＦ複合体／２−メチル−２−ブテンによる酸捕捉剤存在下での反応
【００５９】
５００ｍＬフラスコ中で、酸型カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤＨ＋）５ｇ（２４．２７ミリモル）をホルムアミド４０ｍＬに溶解させ、つぎに２−メチル−２−ブテン４０ｍＬ（２５当量）を攪拌下に加える。ＳＯ３−ＤＭＦ７．９０ｇ（グルコース単位当り５当量）を加える。攪拌下、３０℃で２時間反応させる。
【００６０】
反応媒質を２００ｍｌの２％ＮａＨＣＯ３中へきわめてゆっくり注ぐことによって、反応を停止させる。ｐＨは７の近傍になければならない。そうでない場合には、水酸化ナトリウムまたはＨＣｌを添加して溶液を中和する。いずれの場合にも、溶液のｐＨは、製品の分解を回避するために、決して５より低くなってはならない。
【００６１】
減圧下での回転蒸発によって過剰の水、ＤＭＦおよび２Ｍ２Ｂを除去したのち、製品を接線限外濾過とそれに続く凍結乾燥によって精製する。スルホン化された製品６ｇが、白色粉末の形で得られる。
【００６２】
以下の表１は、グルコース１単位当り５当量のＳＯ３−ＤＭＦおよび２５当量の２Ｍ２ＢによるＣＭＤＨ＋（ｘ＝０．５２）のＯ−スルホン化の再現性を示している。ＥＭ（平均誤差）百分率は、同一のＣＭＤから調製した複数製品に関して求めるべきものである。
【００６３】
【表１】
2005510587.tif 000002
【００６４】
表中、ＥＭ＝平均偏差（％）
【００６５】
以下の表２は、試薬ＳＯ３−ＤＭＦ／２Ｍ２Ｂ（１：５）の量の関数としてのＣＭＤＨ＋のＯ−スルホン化を示している。
【００６６】
【表２】
2005510587.tif 000003
【００６７】
以下のプロトコールに従って、１０回の独立した操作を行った：５回は、表１のエントリー１−４に従い、５当量のＳＯ３−ＤＭＦおよび２５当量の２Ｍ２Ｂを用いる同一のプロトコールに厳密に従って実施した。他の５回は、試薬ＳＯ３−ＤＭＦ／２Ｍ２Ｂの量をグルコース１単位当り試薬２から５当量まで変化させて実施した。ＳＯ３−ＤＭＦ対２Ｍ２Ｂの比は、常に一定で、１：５である（表２、エントリー１−５）。
【００６８】
それらの結果は、エーテル基およびグルコシド結合を有する製品を取得する場合に前記方法が再現性のあるものであることを示している。
【００６９】
これらのいずれの場合にも、ＥＭ（平均誤差）百分率は、１０％に設定した最大限度未満である。
【００７０】
（ｘ）が有意には変化せず（ＥＭ＜２％）（脱炭酸がない）、（ｙ）が＜３％であることに注目する必要がある。
【００７１】
分子量測定により、不均質性がなく（表１、エントリー４に記載の製品に対応する図３）、ＰＭ（分子量）＝６７５００＋／−７５００であることが確認される。
【００７２】
得られた結果は、２Ｍ２Ｂの存在下では、得られるスルホン化率が、反応の化学量論比の関数であることを示している。さらに、前記の反応条件は、ＣＭＤ上に事前に付加されていたカルボキシメチルエーテル基の割合に影響しない。
【００７３】
ＩＩ．２−プロトンＮＭＲ分析による分子の説明
【００７４】
滴定定量、元素分析、還元糖類の定量、ＭＡＬＬＳ検出と組合せたＨＰＬＣ／ゲル濾過とこれを補完する１Ｈ−ＮＭＲ分光分析などの分析手法を用いて、合成された製品の分析を行った。
【００７５】
１Ｈ−ＮＭＲ分光分析によって、出発デキストランのグルコシド単位のＣ２およびＣ３，４における３個の反応性ヒドロキシルへの異なる基の置換位置および置換割合を明確にすることができる。以下の表３は、ＣＭ−Ｄ−Ｓタイプのデキストランの例においてのＮＭＲ分析によるＡへのＸおよびＹの置換の位置を示している。
【００７６】
【表３】
2005510587.tif 000004
【００７７】
ｄ．ｓ．：グルコース単位（Ａ）当りの各基の置換度。Ｘ＝ＣＭ：ＣＨ２ＣＯＯＮａ；Ｙ＝ＳＯ３Ｎａ
ＯＨ：単量体Ａ当りの未反応ＯＨ基の数を表す
ｄ．ｓ．は、置換されなかった残存ヒドロキシル基（出発時の遊離ＯＨの数は、Ａのグルコース単量体当り３である）に基づいて計算する（ｎ＝３）
Ｃ３＋Ｃ４：Ｘ、Ｙおよび遊離ＯＨについて、総ｄ．ｓ．と位置Ｃ−２について求めたｄ．ｓ．との差として計算したＣ−３＋Ｃ−４位における総置換度。
【００７８】
ＩＩＩ−先行技術との比較
【００７９】
ＩＩＩ．１−クロロスルホン酸のよるＯ−スルホン化。ＣｌＳＯ３Ｈとの反応
【００８０】
カルボキシメチルデキストラン５ｇ（２４．２７ミリモル、グルコース単位当り１当量）を、ジクロロメタン１６２ｍＬ中へ加える。不均質な混合物が得られる。この混合物を強く攪拌して、ジクロロメタン中の該製品の均質な懸濁液を得る。
【００８１】
クロロスルホン酸１．６ｍＬ（２４．２７ミリモル、グルコース単位当り１当量）を、上記混合物にゆっくり加える。反応媒質を攪拌下に２時間保持する。反応の間に、褐色の生成物の凝集体が生じる。この混合物を濾過し（Ｎｏ．４フリットガラスフィルター上）、回収した製品を、ジクロロメタン１００ｍＬで２回、ジクロロメタン／ジオキサン（１：１）混合物１００ｍＬで３回、最後にジオキサン１００ｍＬで１回洗う。得られた製品を蒸留水２００ｍＬに溶解させ、溶液を、２Ｍ水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ９．５とし、つぎに０．０５モル／ＬのＨＣｌでｐＨ７とする。
【００８２】
この溶液を濾過し、濃縮し、メタノール５００ｍＬで沈殿させる。かくして得られた沈殿をつぎに、精製に先立ち、乾燥装置中で乾燥する。
【００８３】
このプロトコールに従って、３回の独立した操作を行った：
１回は、１当量のクロロスルホン酸を用い、外界温度で、
１回は、２当量のクロロスルホン酸を用い、外界温度で、
１回は、２当量のクロロスルホン酸を用い、４℃で。
【００８４】
ＩＩＩ．２−ＳＯ３−アミンまたはアミド複合体との反応
【００８５】
ＳＯ３を基礎とする複合体：ＳＯ３−ピリジン、ＳＯ３−トリメチルアミン、ＳＯ３−トリエチルアミンおよびＳＯ３−ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）を用いて、以下に詳述するプロトコールを実施した。
【００８６】
後記の表４は、種々のＳＯ３複合体によるＣＭＤ（ｄ．ｓ．Ｃ＝０．５６）のＯ−スルホン化によって得られた製品の構造上および生物学的特性を示している。
【００８７】
５００ｍＬフラスコに、カルボキシメチルデキストラン５ｇ（２４．２７ミリモル、グルコース単位当り１当量）をホルムアミド５０ｍＬに溶解させる。カルボキシメチルデキストランの溶解を助長するために、反応媒質の温度を５０℃にする。製品がいったん溶解すると、溶液を外界温度にもどす。実施する各反応につき、下記の表４に示した複合体のそれぞれを含有する溶液を、ホルムアミド５０ｍＬ中で個々に調製し、先のカルボキシメチルデキストラン溶液に攪拌下に加える。反応を、外界温度で２時間進行させる。
【００８８】
４℃の蒸留水２ｌを加えて反応を停止させる。混合し、２Ｍ  ＮａＯＨ溶液を用いて反応媒質のｐＨを７．５−８にもどす。
【００８９】
減圧下での回転蒸発により過剰の水を除去したのち、製品を接線限外濾過およびそれに続く凍結乾燥によって精製する。硫酸化製品６ｇが、白色粉末の形で得られる。
【００９０】
このプロトコールに従って、４回の独立した操作を行った：
１回は、ＳＯ３−ピリジン複合体を用いて、外界温度で、
１回は、ＳＯ３−トリメチルアミンを用いて、外界温度で、
１回は、ＳＯ３−トリエチルアミンを用いて、外界温度で、
１回は、ＳＯ３−ＤＭＦを用いて、外界温度で。
【００９１】
一方、仏国特許第９７１５７０２号明細書実施例５に記載されているプロトコールに厳密に従って、反応を実施した（表４の８行目）。そこでは、ＣＭＤの可溶化を、トリエチルアンモニウム塩の形成によって達成する。遊離ＯＨ当りの複合体のモル比が０．４（これはグルコース単位当り複合体２当量に相当する）のＳＯ３−ピリジンをＤＭＳＯに溶解させ、重合体溶液に加える。反応は、ジメチルホルムアミド中外界温度で行う。
【００９２】
表４は、種々の方法に従って合成したＣＭＤＳタイプのいくつかの重合体の構造特性および各方法の制約を示している。本発明の方法は、表４のエントリー１０および１１に相当し、反応条件は実施例１に記載したものである。
【００９３】
【表４】
2005510587.tif 000005
【００９４】
表中、Ｎｄ＝測定せず
＊この実験における出発製品は、グルコース単位当り１残基がＣＭにより置換されていた。
【００９５】
カルボキシラート置換度ｘ＝０．５６の単一ロットのカルボキシル化デキストラン（表４、エントリー１）から、ＤＣＳタイプの種々の製品を合成した。精製後、製品を種々の構造分析手法によって特性決定した。
【００９６】
滴定分析の結果は、クロロスルホン酸およびＳＯ３−アミドまたはアミンによるＯ−スルホン化反応がグラフトされたカルボキシラート基（ｄｓＣまたはｘ）のエーテル結合の切断および高分子鎖の分解（分子量および還元糖の定量）を惹起することを示している。この切断は、加えられる試薬の当量数が大きいほど、より顕著である。反応媒質の温度を低下させると、この分解を抑制することができる。
【００９７】
ＳＯ３−Ｅｔ３Ｎ複合体（表４、エントリー６）により調製した製品は、もっともスルホン化された製品であるが、もっとも大規模な脱炭酸を受けたものでもあることを指摘しておかなければならない。
【００９８】
表の最後の２つのエントリー（エントリー１０および１１）は、グラフトされたカルボキシラート基および高分子鎖のエーテル結合の分解ならびに鎖の分解を抑制するための酸捕捉剤として働く２Ｍ２Ｂを作用させている。
【００９９】
製品２Ｍ２Ｂの存在下では、スルホン化後に得られる製品のｄｓＣが前駆体のｄｓＣと同じであること認められる。このことは、加える試薬の量にかかわらず確認される。実際に、ＳＯ３−ＤＭＦ複合体を２．５倍用いるとき（エントリー１１）、高いｄｓＳが得られるが、とりわけｄｓＣは変化しない。かくして、２Ｍ２Ｂ存在下でのプロトコールの有効性が証明される。
【０１００】
既知のＯ−スルホン化手法では、脱炭酸および高分子鎖の分解があるが、２Ｍ２Ｂ存在下でＯ−スルホン化する手法は、デキストランにグラフトされたカルボキシラート基が失われるという問題を解決することを可能ならしめる。
【０１０１】
生体内活性の測定および生体内毒性の測定は、Ｊ．ゴートロン（Ｇａｕｔｒｏｎ）、Ｃ．ケジア（Ｋｅｄｚｉａ）、Ｉ．フスマン（Ｈｕｓｍａｎｎ）およびＤ．バリトー（Ｂａｒｒｉｔａｕｌｔ）：「デキストラン誘導体による成熟ラット骨格筋再生の促進」、コントランデュ・ドゥ・ラカデミ・デ・シィアンス・ドゥ・パリ（パリ科学アカデミー紀要；Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ）、シィアンス・ドゥ・ラ・ヴィ(生命科学；Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｄｅ  ｌａ  Ｖｉｅ)（１９９５年）第３１８巻第６７１−６７６頁に記載されている実験条件に従い、押しつぶし後の成熟ラット後肢長指伸筋の筋再生のモデルにおいて行う。組織切片上での再生を、再生された筋線維の数を測定することによって定量化する。毒性は、線維形成の減少（生理食塩水を注入した対照と比較しての）により、また、再生の様相の分析および再生異常帯域または筋組織変性を示す炎症性帯域の生成を明らかにすることによって、測定する。
【０１０２】
ＩＶ−他のタイプの重合体に対する方法の一般化
【０１０３】
表５は、本発明の方法による式ＡａＸｘＹｙ（Ａは糖であり、ａは１より大である）の種々の重合体の合成およびそれらの分析上の特性を示す。
【０１０４】
【表５】
2005510587.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】末端アルデヒドが認められるＣＭＤＳの１個の分子を示した説明図である。
【図２】置換デキストランの末端単位のアルデヒド官能とヘミアセタールとの間の平衡を示した説明図である。
【図３】表３に示した構造特性をもつＣＭＤＳタイプの分子のクロマトグラフィープロフィールを示した説明図である。
【図４】異なるゲル濾過カラムでの同一製品ＰＡ０７について得られたクロマトグラフィープロフィールを示した説明図である。
【図５】ＣＭＤＳの構造を示した説明図である。
【図１】
2005510587.tif 000007
【図２】
2005510587.tif 000008
【図３】
2005510587.tif 000009
【図４】
2005510587.tif 000010
【図５】
2005510587.tif 000011
【国際調査報告】
2005510587.tif 000012
2005510587.tif 000013
2005510587.tif 000014
2005510587.tif 000015