(57)【要約】本発明は、当該分野における上記の長期間感じられている必要性および他の欠陥に取り組む。この取り組みは、１つ以上の血液悪性疾患（特に、Ｂ細胞白血病およびリンパ腫および多発性骨髄腫）を同定、検出、スクリーニング、診断、予後判定、予防、治療、および免疫調節するための新規で有効なストラテジーを同定することによる。本発明は、部分的には、１つ以上の型の血液悪性疾患において過剰発現される、以前に未知または未同定であった特定のヒトポリペプチド、ペプチド、およびそれらに由来する抗原性フラグメントをここに同定したという、驚くべき予測できない発見に基づく。
2005523002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における癌の存在を検出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）該患者由来の生物学的サンプルを、配列番号１１，０５７、１１，０５８または１１，２９３からなる群から選択されるポリペプチドに結合する結合因子と接触させる工程；
（ｂ）該サンプル中の、該結合因子に結合するペプチドの量を検出する工程；および
（ｃ）該患者のサンプル中に存在するポリペプチドの量と、所定のカットオフ値とを比較し、これから患者における癌の存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ポリオペプチドが、配列番号１１，０５７によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号１１，０５８によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号１１，２９３によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記結合因子が、配列番号１１，０５７、１１，０５８または１１，２９３からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸１〜４２のエピトープに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記結合因子が、配列番号１１，０５８のアミノ酸１７５〜１９２のエピトープに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記結合因子が、配列番号１１，２９３のアミノ酸１３６〜１４３のエピトープに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記結合因子が、抗体である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記癌が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
患者における癌の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該患者由来の生物学的サンプルを、配列番号１１，０３６、１１，０３８および１１，２９２からなる群から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補体に結合するオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（ｂ）該サンプル中の、該オリゴヌクレオチドに結合するポリヌクレオチドの量を検出する工程；および
（ｃ）該患者のサンプル中に存在するポリヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値と比較し、それから、患者における癌の存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１１，０３６、１１，０３８および１１，２９２のヌクレオチド１〜１２６の部分またはその相補体に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、配列番号１１，０３６、１１，０３８および１１，２９２のヌクレオチド１〜１２６の間の領域の一部を増幅し得るＰＣＲプライマーとして使用するのに適切な一対のオリゴヌクレオチドが、前記生物学的サンプルに結合する、方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、ＰＣＲ反応に使用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＣＲ反応が、ＲＴ−ＰＣＲ反応である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１１，０３８のヌクレオチド５２３５７６の間の領域またはその相補体に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１１，２９２のヌクレオチド４０６〜４３２の間の領域またはその相補体に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍タンパク質に特異的なＴ細胞を刺激および／または拡大するための方法であって、Ｔ細胞を、以下：
（ａ）請求項５に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項６に記載のポリペプチド；
（ｃ）請求項７に記載のポリペプチド；
（ｄ）請求項５、６または７に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、からなる群から選択される少なくとも１つの成分と、該Ｔ細胞の刺激および拡大を可能にする条件下で、これに十分な時間接触させる工程を包含する、
方法。
【請求項１８】
個体における免疫応答を刺激するための方法であって、生理学的に受容可能なキャリア中の、発現制御配列に作動可能に連結された、配列番号１１，０３６、１１，０３８または１１，２９２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列、および免疫刺激剤を含む発現ベクターを含む組成物を、患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法に従って調製されたＴ細胞を含む、単離されたＴ細胞集団。
【請求項２０】
患者における癌の発生を阻害する方法であって、以下の工程：
（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋細胞を、（ｉ）請求項５、６または７に記載のポリペプチド；（ｉｉ）請求項１２、１５または１６に記載のポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）請求項５、６または７に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、からなる群から選択される少なくとも１つの成分と共に、Ｔ細胞が増殖するように、インキュベートする工程；
（ｂ）有効量の該増殖されたＴ細胞を該患者に投与し、それにより、該患者における癌の発生を阻害する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
生理学的に受容可能なキャリアおよび免疫抑制剤からなる群から選択される第１の成分、ならびに、以下：
（ａ）請求項１に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項５に記載のポリペプチド；
（ｃ）請求項６に記載のポリペプチド；
（ｄ）請求項７に記載のポリペプチド；および
（ｅ）請求項１９に記載のＴ細胞、
からなる群から選択される第２の成分を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、２００２年５月２３日に出願した米国特許出願番号１０／１５４，８８４の一部継続である。この米国特許出願番号１０／１５４，８８４は、２００１年１１月６日に出願した、発明の名称「血液悪性疾患の検出、診断および治療のための組成物および方法」、代理人整理番号０１４０５８−０１３５２０ＵＳの米国特許出願番号１０／０４０，８６２号の一部継続である。上記米国特許出願の各々の明細書全体、特許請求の範囲、配列、および図面は、放棄することなくその全体が、すべての目的のために本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府に援助された研究開発の下でなされた発明に対する権利に関する陳述）
適用せず。
【０００３】
（コンパクトディスクにて提出された、「配列表」、表、またはコンピュータプログラムリスト添付物に対する言及）
適用せず。
【０００４】
（１．発明の背景）
（１．１．発明の分野）
本発明は、一般的には、癌の診断および治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、血液悪性疾患（特に、Ｂ細胞白血病、ならびにリンパ腫および多発性骨髄腫）の検出および免疫治療のための組成物および方法についての驚くべき発見に関する。本発明は、抗原性ポリペプチドおよびそれから単離された抗原性ペプチドフラグメントに対する免疫およびＴ細胞応答を惹起するための新規で有効な方法、組成物、およびキットを提供する。そして本発明は、種々の型のヒトの血液悪性疾患の診断、検出、処置、モニタリング、および／または予防のためにそのような組成物を使用するための方法を提供する。特に、本発明は、種々の型の血液悪性疾患を同定および識別する際に使用するための、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合フラグメント、ハイブリドーマ、宿主細胞、ベクター、ならびにポリヌクレオチド化合物および組成物を提供する。そして本発明は、罹患した動物においてそのような状態を検出、診断、予後判定、モニタリング、および治療するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００５】
（１．２．関連技術の説明）
（１．２．１．血液悪性疾患）
血液悪性疾患（例えば、白血病およびリンパ腫）は、造血細胞の異常な増殖および成熟により特徴付けられる状態である。白血病は、一般的には、造血幹細胞の新形成障害であり、成人および小児の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、および続発性白血病を包含する。リンパ腫には、２つの別個のグループ：非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）と、ホジキン病とが存在する。ＮＨＬは、Ｂ細胞またはＴ細胞のクローン性増殖の結果であるが、ホジキン病の分子病因（系統誘導（ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）およびクローン性を含む）は、不明のままである。他の血液悪性疾患としては、脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）および骨髄腫が挙げられる。血液悪性疾患は、一般的に深刻な障害であり、種々の症状（骨髄不全および器官不全を含む）を生じる。
【０００６】
ＮＨＬは、米国において癌関連死の６番目に一般的な原因である。前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、および膀胱癌のみが、現在、年間罹患率がリンパ腫を上回る。１９９５年に、４，５００件より多くの新規なＮＨＬが診断され、２１，０００人より多くの患者が、これらの疾患により死亡した。リンパ腫患者の平均年齢は、比較的若く（４２歳）、これらの疾患により失われた人生の年数によって、ＮＨＬは、米国における癌のうちで経済的影響が４番目である。過去１５年間において、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙは、ＮＨＬの発症率が５０％増加したことを報告した。これは、すべての癌グループについて最も大きく増加したうちの１つである。この増加のうちの多くは、ＡＩＤＳになった若い男性におけるリンパ腫の発症に帰因している。リンパ腫はまた、３番目に一般的な小児悪性疾患であり、小児の癌のうちの約１０％を占める。生存率（全年齢）は、７３％（低リスク）から２６％（高リスク）まで変動する。
【０００７】
（１．３．先行技術における欠陥）
多くの血液悪性疾患（白血病およびリンパ腫を含む）についての処置は、困難なままであり、既存の治療は、普遍的には有効ではない。特定の免疫治療を含む処置は、かなり潜在能力を有するようであるが、そのような処置は、少数の既知の悪性疾患関連抗原によって制限されている。さらに、そのような血液悪性疾患を初期段階で検出する能力は、特定の疾患に依存して極めて困難であり得る。その疾患の充分な数の特異的診断マーカーおよび予後判定マーカー、ならびに罹患し得る細胞および組織の同定が欠けていることは、腫瘍学の分野を有意に制限している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、Ｂ細胞白血病およびリンパ腫および多発性骨髄腫のような血液悪性疾患を検出、スクリーニング、診断および処置するための改良法について、当該分野で必要性が残っている。本発明は、この分野におけるこれらおよび他の固有の必要性を満たす。本発明は、そのような血液悪性疾患のうちの１つ以上において過剰発現することが示されている１つ以上のポリペプチドを発現する細胞および細胞型の検出において、有意な利点を提供する。
【０００９】
（２．発明の要旨）
本発明は、当該分野における上記の長期間感じられている必要性および他の欠陥に取り組む。この取り組みは、１つ以上の血液悪性疾患（特に、Ｂ細胞白血病およびリンパ腫および多発性骨髄腫）を同定、検出、スクリーニング、診断、予後判定、予防、治療、および免疫調節するための新規で有効なストラテジーを同定することによる。
【００１０】
本発明は、部分的には、１つ以上の型の血液悪性疾患において過剰発現される、以前に未知または未同定であった特定のヒトポリペプチド、ペプチド、およびそれらに由来する抗原性フラグメントをここに同定したという、驚くべき予測できない発見に基づく。これらのポリペプチドのうちのいくつかをコードする遺伝子が、ここに同定され、単離形態で得られ、一連の分子生物学的方法論（差引きライブラリー分析、マイクロアレイスクリーニング、ポリヌクレオチド配列決定、ペプチドおよびエピトープの同定および特徴づけ、ならびに発現プロフィール作成、およびインビトロ全遺伝子細胞プライミングを含む）を使用して特徴付けられている。これらのポリヌクレオチド、ならびにこれらがコードするポリペプチド、ペプチド、および抗原性フラグメントの組が、ここに同定され、血液悪性疾患（特に、白血病およびリンパ腫のような疾患）の発症、進行、および／または結果の複雑なプロセスに関係付けられている。
【００１１】
本発明者らは、多数のこれらのポリヌクレオチド、およびそのコードされるポリペプチド、ならびに抗体、抗原提示細胞、Ｔ細胞、およびそのような抗体由来の抗原結合フラグメントが、これらの疾患のうちの１つ以上、ならびに特に、（ａ）配列番号１１，０００〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２のうちのいずれか１つにおいて開示される核酸配列を含む少なくとも第１配列領域を含む１つ以上のポリヌクレオチドの発現の増加、変化、上昇、または維持によって特徴付けられる状態、あるいは（ｂ）上記のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列または配列番号１１，０３９〜１１，０５８および１１，２９３のうちのいずれか１つにおいて開示されるアミノ酸配列を含む少なくとも第１配列領域を含む１つ以上のポリペプチドの生物学的活性の増加、変化、上昇、または維持によって特徴付けられる状態を、検出、診断、予後判定、予防、および／または治療するための特に有利な組成物および方法の開発において有用であることを、さらに実証する。
【００１２】
本発明はまた、動物（特に、ヒトのような哺乳動物）において免疫応答を生成するかまたはＴ細胞応答を生成する際における、本発明の開示されるペプチド、ポリペプチド、抗体、抗原結合フラグメント、およびポリヌクレオチド組成物のうちの１つ以上についての方法および使用を提供する。本発明はまた、臨床サンプル、単離細胞、全組織、および罹患個体さえにおける血液悪性疾患組成物の同定、検出、および定量における、これらの組成物の１つ以上についての方法および使用を提供する。本明細書中に開示される組成物および方法はまた、このような疾患の診断および／または治療のために、１つ以上の診断試薬、アッセイ、医薬、または治療剤の調製において使用され得る。
【００１３】
第１の重要な実施形態において、上記のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列または配列番号１１，０３９〜１１，０５８および１１，２９３のうちのいずれか１つにおいて開示されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも第１の単離されたペプチドもしくはポリペプチドを含む、組成物が提供される。例示的な好ましい配列は、上記のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列または配列番号１１，０３９〜１１，０５８および１１，２９３のうちのいずれか１つにおいて開示されるアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、または約９４％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも第１のコード領域を含む、配列であり、上記のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列または配列番号１１，０３９〜１１，０５８および１１，２９３のうちのいずれか１つにおいて開示されるアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも第１のコード領域を含む配列が、本発明の実施において特に好ましい配列の例である。同様に、上記のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列または配列番号１１，０３９〜１１，０５８および１１，２９３のうちのいずれか１つにおいて開示されるアミノ酸配列を含むか、これらから実質的になるか、またはこれらからなる、ペプチドおよびポリペプチドの化合物および組成物もまた、提供される。
【００１４】
同様に、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫の検出、診断、予後判定、予防、処置、および治療のための組成物および方法を提供する、本明細書中に開示される実施形態もまた、存在する。本発明のこの局面に関連する例示的に好ましいペプチドおよびポリペプチドの化合物および組成物としては、上記のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列または配列番号１１，０３９〜１１，０５８および１１，２９３のうちのいずれか１つにおいて開示されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも第１の単離されたペプチドもしくはポリペプチドを含む、ペプチドおよびポリペプチドの化合物および組成物が挙げられ、上記のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列または配列番号１１，０３９〜１１，０５８および１１，２９３のうちのいずれか１つにおいて開示されるアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、または約９４％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも第１のコード領域を含む、ペプチドおよびポリペプチドの化合物および組成物が挙げられ、そして上記のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列または配列番号１１，０３９〜１１，０５８および１１，２９３のうちのいずれか１つにおいて開示されるアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも第１のコード領域を含む配列さえ挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
本発明の例示的なペプチドは、その特定の適用に依存して任意の適切な長さであり得、約９アミノ酸長、約１０アミノ酸長、約１５アミノ酸長、約２０アミノ酸長、約２５アミノ酸長、約３０アミノ酸長、約３５アミノ酸長、約４０アミノ酸長、約４５アミノ酸長、約５０アミノ酸長、約５５アミノ酸長、約６０アミノ酸長、約６５アミノ酸長、約７０アミノ酸長、約７５アミノ酸長、約８０アミノ酸長、約８５アミノ酸長、約９０アミノ酸長、約９５アミノ酸長、もしくは約１００アミノ酸長程度のペプチドを包含する。当然、本発明のペプチドはまた、記載された範囲内にある任意の中間的長さまたは整数を包含し得る。
【００１６】
本発明の例示的なポリペプチドおよびタンパク質は、その特定の適用に依存して任意の適切な長さであり得、約１００アミノ酸長、約１５０アミノ酸長、約２００アミノ酸長、約２５０アミノ酸長、約３００アミノ酸長、約３５０アミノ酸長、もしくは約４００アミノ酸長程度のポリペプチドおよびタンパク質を包含する。当然、本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、記載された範囲内にある任意の中間的長さまたは整数を包含し得る。
【００１７】
本発明のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、および抗原結合フラグメントは、上記のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによりコードされるかまたは配列番号１１，０３９〜１１，０５８および１１，２９３のうちのいずれか１つにおいて開示されるペプチドのうちのいずれか１つからの、少なくとも約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、もしくは１００個連続するアミノ酸の配列を好ましくは含む。
【００１８】
さらに、本発明のポリペプチド、タンパク質、抗体、および抗原結合フラグメントは、上記のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによりコードされるかまたは配列番号１１，０３９〜１１，０５８および１１，２９３のうちのいずれか１つにおいて開示されるペプチドのうちのいずれか１つからの、少なくとも約１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、もしくは２００個連続するアミノ酸の配列を含む、少なくとも第１の単離されたコード領域を、なおより好ましくは含む。
【００１９】
同様に、本発明のポリペプチド、タンパク質、抗体、および抗原結合フラグメントは、上記のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによりコードされるかまたは配列番号１１，０３９〜１１，０５８および１１，２９３のうちのいずれか１つにおいて開示されるペプチドのうちのいずれか１つからの、実質的により長い配列（例えば、少なくとも約２００個、２２０個、２４０個、２６０個、２８０個、もしくは３００個以上連続するアミノ酸のうちの１つ）を含む、少なくとも第１の単離されたコード領域を含み得る。
【００２０】
例示的実施形態（特に、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫に関連する方法および組成物に関する実施形態）において、本発明のポリペプチドは、上記のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによりコードされるかまたは配列番号１１，０３９〜１１，０５８および１１，２９３のうちのいずれか１つにおいて開示されるアミノ酸配列を、（ａ）含むか、（ｂ）それから本質的になるか、あるいは（ｃ）それからなる、アミノ酸配列を含む。
【００２１】
本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、配列番号１１，０００〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２のうちのいずれか１つのうちの少なくとも２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、もしくは３０個連続するヌクレオチド配列を含む少なくとも第１の核酸セグメントによってコードされるアミノ酸配列を、好ましくは含む。
【００２２】
本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、配列番号１１，０００〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２のうちのいずれか１つのうちの少なくとも約３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、もしくは４０個連続するヌクレオチドの配列を含む少なくとも第１の核酸セグメントによってコードされるアミノ酸配列を、好ましくは含み得る。本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、配列番号１１，０００〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２のうちのいずれか１つのうちの少なくとも約４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、もしくは５０個連続するヌクレオチドの配列を含む少なくとも第１の核酸セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、１つ以上のコード領域を、好ましくは含み得る。本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、配列番号１１，０００〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２のうちのいずれか１つのうちの少なくとも約５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、もしくは６０個連続するヌクレオチドの配列を含む少なくとも第１の核酸セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、１つ以上のコード領域を、好ましくは含み得る。本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、配列番号１１，０００〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２のうちのいずれか１つのうちの少なくとも約７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個もしくは１５０個連続するヌクレオチド配列を含む第１の核酸セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、１つ以上のコード領域を、好ましくは含み得る。本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、配列番号１１，０００〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２のうちのいずれか１つのうちの少なくとも約１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、もしくは４００個連続するヌクレオチドの配列を含む少なくとも第１の核酸セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、１つ以上のコード領域を、好ましくは含み得る。本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、配列番号１１，０００〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２のうちのいずれか１つのうちの少なくとも約５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、１１００個、１２００個、１３００個、１４００個、もしくは１５００個連続するヌクレオチドの配列を含む少なくとも第１の核酸セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、１つ以上のコード領域を、好ましくは含み得る。
【００２３】
第２の重要な実施形態において、配列番号１１，０００〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２のうちのいずれか１つの核酸配列と、少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一である核酸配列を含む少なくとも第１の単離されたポリヌクレオチドを含む、組成物が提供される。例示的な好ましい配列は、配列番号１１，０００〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２のうちのいずれか１つの核酸配列と、少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、または約９４％同一である核酸配列を含む配列であり、配列番号１１，０００〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２のうちのいずれか１つの核酸配列と、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一である少なくとも核酸配列を含む配列が、本発明の実施において特に好ましい配列の例である。
【００２４】
Ｂ細胞白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫を検出、診断、予後判定、予防、処置および治療するための組成物および方法に特に関連する実施形態において、例示的な好ましいポリヌクレオチド組成物は、配列番号１１，０００〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２のうちのいずれか１つの核酸配列と、少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一である配列を含む少なくとも第１の単離された核酸セグメントを含む組成物を包含する。そのようなポリヌクレオチドは、好ましくは、１つ以上の単離されたコード領域を含み、このコード領域の各々は、配列番号１１，０００〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２の核酸配列を（ａ）含み得るか、（ｂ）これから本質的になり得るか、あるいは（ｃ）これからなり得る。
【００２５】
本発明の例示的なポリヌクレオチドは、その特定の適用に依存して任意の適切な長さであり得、そして、（ａ）少なくとも約２７、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００個程度の核酸の長さであるポリペプチドか、または（ｂ）少なくとも２７、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００個程度の核酸の長さである少なくとも第１の単離された核酸セグメントを含むポリヌクレオチド、またはその長さ核酸、ならびに、（ａ）少なくとも１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、または３０００個程度の核酸の長さのポリヌクレオチドか、あるいは（ｂ）少なくとも約１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、または３０００個程度の核酸の長さの少なくとも第１の単離された核酸セグメントを含むポリヌクレオチド、ならびに実質的にそれより長いポリヌクレオチドを含み得る。もちろん、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸セグメントはまた、記載された範囲内の任意の中間の長さまたは整数を含み得る。
【００２６】
本発明の組成物は、単一のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含み得るか、あるいは、２つ以上のこのような血液悪性疾患化合物（例えば、２つ以上のポリペプチド、２つ以上のポリヌクレオチド、または１つ以上のペプチドもしくはポリペプチドと１つ以上のポリヌクレオチドとの組み合わせでさえ）も含み得る。２つ以上のポリペプチドが、特定の適用を企図している場合、第２および／または第３および／または第４などの単離されたペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、好ましくは、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるアミノ酸配列または配列番号１１，０３９〜１１，０５８、および配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示されるアミノ酸配列と少なくとも約９１％、９３％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上のコード領域を含み得、このコード領域は、タンパク質または第１の融合ペプチド（例えば、開示された血液悪性疾患ペプチドまたはポリペプチドのうちの１つ以上に対して正確なリーディングフレームで融合されたアジュバトコード領域）をコードする。あるいは、この融合タンパク質は、検出可能なタンパク質もしくはペプチド、または免疫刺激タンパク質もしくはペプチド、または他のこのような構築物に対する正確なリーディングフレームで融合された血液学悪性疾患ポリペプチドまたはペプチドを含み得る。これらのような融合タンパク質は、本明細書に論じられるような血液悪性疾患のうちの１つ以上の診断、検出、および治療に関連する実施形態において特に有用である。
【００２７】
本発明はまた、本明細書に開示されるペプチドまたはポリペプチドの１つ以上に対して免疫特異性を有するモノクローナル抗体、または少なくとも１つの第１のモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合フラグメント（このようなペプチドまたはポリペプチドに対して免疫特異性を有する）を産生する少なくとも第１のハイブリドーマ細胞株を含む組成物を提供する。抗原結合フラグメントは、このような抗体の軽鎖可変領域、重鎖可変領域、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、または抗原結合フラグメントを含み得る。
【００２８】
本発明はまた、本明細書に開示されるペプチドもしくはポリペプチドを発現する少なくとも第１の単離された抗原提示細胞を含むか、またはこのようなペプチドもしくはポリペプチドに特異的に反応する複数の単離されたＴ細胞を含む、組成物を提供する。このような複数の単離されたＴ細胞は、本明細書に記載される１つ以上のペプチドまたはポリペプチドをＴ細胞とを接触させることによって刺激または拡大され得る。Ｔ細胞は、拡大前にクローニングされ得、そして健常な哺乳動物または少なくとも第１の血液悪性疾患（例えば、白血病またはリンパ腫）に罹患している哺乳動物由来の骨髄、骨髄フラクション、末梢血、または末梢血フラクションから得られ得る。
【００２９】
上記のように、本発明の単離されたポリペプチドは、９〜約１０００アミノ酸長程度であり得、あるいは、５０〜約９００アミノ酸長、７５〜約８００アミノ酸長、１００〜約７００アミノ酸長、または１２５〜約６００アミノ酸長程度であり得、または任意の他のこのような適切な範囲であり得る。
【００３０】
このような単離されたポリペプチドをコードする単離された核酸セグメントは、２７〜約１０、０００ヌクレオチド長、１５０〜約８０００ヌクレオチド長、２５０〜約６０００ヌクレオチド長、３５０〜約４０００ヌクレオチド長、４５０〜約２０００ヌクレオチド長程度であり得るか、または任意の他のこのような適切な範囲であり得る。
【００３１】
核酸セグメントは、少なくとも第１の異種、組換えプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、組織特異的誘導性プロモーター、そうでなければ、調節されたプロモーター）の制御下で、作動可能に配置され得る。このようなプロモーターは、ポリヌクレオチドの発現が所望される特定の細胞型に依存して、１つ以上のさらなるエンハンサーまたは調節領域の存在によってさらに制御または調節され得る。本発明のポリヌクレオチドおよび核酸フラグメントは、ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）内に含まれ得る。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドはまた、宿主細胞（例えば、組換え宿主細胞、またはヒト宿主細胞（例えば、血液細胞もしくは骨髄細胞））内に含まれ得る。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも第２の単離された核酸セグメントにインフレームで作動可能に結合された少なくとも第１の単離された核酸セグメントを含み得、その結果、このポリヌクレオチドは、第１のペプチドまたはポリペプチドが、第２のペプチドまたはポリペプチドに連結された、融合タンパク質をコードする。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、任意の適切な長さの連続したアミノ酸を含み得、例えば、約２０００、約１９００、約１８５０、約１８００、約１７５０、約１７００、約１６５０、約１６００、約１５５０、約１５００、約１４５０、約１４００、約１３５０、約１３００、約１２５０、約１２００、約１１５０、約１１００アミノ酸、または約１０００程度のアミノ酸長のアミノ酸を含み得る。同様に、本発明のポリペプチドおよびペプチドは、約９５０、約９００、約８５０、約８００、約７５０、約７００、約６５０、約６００、約５５０、約５００、約４５０、約４００、約３５０、約３００、約２５０、約２００、約１５０、または約１００アミノ酸長程度の、わずかにより短い連続したアミノ酸コード領域を含み得る。
【００３４】
類似の様式において、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、約９５、約９０、約８５、約８０、約７５、約７０、約６５、約６０、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１５、または約９アミノ酸長程度のより短い連続したコード領域を含み得る。
【００３５】
全てのこのような実施形態において、好ましい範囲（例えば、少なくとも約９４、約９３、約９２、約９１、約８９、約８８、約８７、約８６、約８４、約８３、約８２、約８１、約７９、約７８、約７７、約７６、約７４、約７３、約７２、約７１、約６９、約６８、約６７、約６６アミノ酸長程度などの少なくとも第１のコード領域を含むペプチドおよびポリペプチド）内の全ての整数を含む中間の長さを有するペプチドおよびポリペプチドは、本発明の範囲内に入るように全て企図される。
【００３６】
特定の実施形態において、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドのうちのいずれか１つ以上にて開示された、または本明細書における配列番号１１，０３９〜１１，０５８、ならびに配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示される、少なくとも約９、または約１０、または約１１、または約１２、または約１３、または約１４、または約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１９、または約２０、または約２１、または約２２、または約２３、または約２４、または約２５、または約２６、または約２７、または約２８、または約２９、または約３０、または約３１、または約３２、または約３３、または約３４、または約３５、または約３６、または約３７、または約３８、または約３９、または約４０、または約４１、または約４２、または約４３、または約４４、または約４５、または約４６、または約４７、または約４８、または約４９、または約５０個の連続したアミノ酸の配列を含み得る。
【００３７】
他の実施形態において、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドのいずれか１つにおいて開示されるか、または本明細書における配列番号１１，０３９〜１１，０５８、ならびに配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示される、少なくとも約５１、または約５２、または約５３、または約５４、または約５５、または約５６、または約５７、または約５８、または約５９、または約６０、または約６１、または約６２、または約６３、または約６４、または約６５、または約６６、または約６７、または約６８、または約６９、または約７０、または約７１、または約７２、または約７３、または約７４、または約７５、または約７６、または約７７、または約７８、または約７９、または約８０、または約８１、または約８２、または約８３、または約８４、または約８５、または約８６、または約８７、または約８８、または約８９、または約９０、約９１、または約９２、または約９３、または約９４、または約９５、または約９６、または約９７、または約９８、または約９９、または１００個の連続したアミノ酸の配列を含み得る。
【００３８】
なお他の実施形態において、本発明の好ましいペプチドおよびポリペプチドは、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドのいずれか１つにおいて開示されるか、または本明細書における配列番号１１，０３９〜１１，０５８、ならびに配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示される、少なくとも約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、または４００個以上連続したアミノ酸の配列を含む。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、代表的に、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドに従うか、あるいは配列番号１１，０３９〜１１，０５８、ならびに配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示される、少なくとも第１の連続したアミノ酸配列を含むが、また必要に応じて、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドのいずれかに従うか、あるいは配列番号１１，０３９〜１１，０５８、ならびに配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示される、少なくとも第２の、少なくとも第３の、少なくとも第４の、またはそれ以上の連続したアミノ酸配列を含み得る。単一のポリペプチドは、単一のコード領域のみを含み得るか、または、単一のポリペプチドは、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドのいずれかに従うか、あるいは配列番号１１，０３９〜１１，０５８、ならびに配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示される、複数の同一もしくは別個の異なる連続したアミノ酸配列を含み得る。事実、上記ポリペプチドは、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドのいずれか、あるいは配列番号１１，０３９〜１１，０５８、ならびに配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示される、１つ以上の異なる連続したアミノ酸配列を含み得る。例えば、単一のポリペプチドは、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドのいずれか１つ由来、または配列番号１１，０３９〜１１，０５８、ならびに配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示される、単一の連続したアミノ酸配列を含み得るか、あるいは上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドの１つ以上に由来、または配列番号１１，０３９〜１１，０５８、ならびに配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示される、２つ以上の識別可能に異なる連続したアミノ酸配列を含み得る。事実、上記ポリペプチドは、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドの１つ以上、または配列番号１１，０３９〜１１，０５８、ならびに配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示される、２、３、４、もしくはなお５の識別可能に異なる連続したアミノ酸配列を含み得る。あるいは、単一のポリペプチドは、２、３、４、またはなお５個の別個のコード領域を含み得る。例えば、ポリペプチドは、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドのいずれか１つ、または配列番号１１，０３９〜１１，０５８、および配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示される、第１の連続したアミノ酸配列を含む少なくとも第１のコード領域と、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドの１つ以上または配列番号１１，０３９〜１１，０５８、および配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示される、第２の連続したアミノ酸配列を含む少なくとも第２のコード領域とを、含み得る。対照的に、ポリペプチドは、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドのいずれか１つまたは配列番号１１，０３９〜１１，０５８、および配列番号１１，２９３のいずれか１つに開示される、第１の連続したアミノ酸配列を含む少なくとも第１のコード領域と、第２の識別可能に異なるペプチドまたはポリペプチド（例えば、アジュバントまたは免疫刺激ペプチドもしくはポリペプチド）を含む少なくとも第２のコード領域とを、含み得る。
【００４０】
このような場合において、２つのコード領域は、同じポリペプチド上で分離しており得るか、またはこの２つのコード領域は、正確なリーディングフレームにおいて各々に作動可能に結合され得、その結果、融合ポリペプチドが産生され、この融合ポリペプチドにおいて、第１のコード領域の第１のアミノ酸配列は、第２のコード領域の第２のアミノ酸配列に連結されている。
【００４１】
本開示全体を通じて、例えば、「配列番号１１，０００〜１１，００４に開示される配列」のような語句は、これらの配列識別子のいずれか１つによって開示される任意および全ての連続した配列を包含することが意図される。すなわち、「配列番号１１，０００〜１１，００４のいずれかに開示される配列」とは、配列番号１１，０００、配列番号１１，００１、配列番号１１，００２、配列番号１１，００３または配列番号１１，００４のいずれか１つにおいて開示される任意の配列を意味する。同様に、「配列番号２５〜３７のいずれかにおいて開示される配列」とは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６または配列番号３７などのいずれか１つにおいて開示される任意の配列を意味する。
【００４２】
同様に、例えば、「配列番号５５〜６２のいずれか１つ由来の少なくとも第１の配列」のような語句は、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、または配列番号６２のいずれか１つにおいて開示される第１の配列をいうことが意図される。
【００４３】
本発明のキット、および組成物は、全体的および一般的な意味で、少なくとも１つ以上の特定のポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびペプチドを含み、これらは、配列番号１１，０００〜１１，０３８および配列番号１１，２９１〜１１，２９２において本明細書で開示される核酸配列１つ以上の由来、または上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるアミノ酸配列１つ以上の由来、または、配列番号１１，０３９〜１１，０５８、および配列番号１１，２９３のいずれか１つにおいて開示される、１つ以上の連続した配列を含むこと、そしてこのようなペプチド組成物、ポリペプチド組成物およびポリヌクレオチド組成物は、１つ以上の血液悪性疾患（特に、種々の特定の型のリンパ腫）の診断、検出、予防、および治療について本明細書に開示される１つ以上の特定の方法および用途において使用され得ることもまた、理解される。ペプチド組成物およびポリペプチド組成物を使用して、哺乳動物においてＴ細胞応答または免疫応答を生成し得ること、そして、このような組成物はまた、このようなペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合する免疫特異的抗体および抗原結合フラグメントが、単離または同定され得る動物に投与され得ることもまた、本明細書の教示の利益を有する当業者にとって理解される。このような当業者はまた、本開示によって同定されたポリヌクレオチドを使用して、組換えタンパク質産生方法論により、このようなペプチド、ポリペプチド、抗体および抗原結合フラグメントを生成し得、この方法論はまた、本明細書に提供される特定のアミノ酸配列および核酸配列の利益を有する当業者の能力範囲内であることもまた、認識する。
【００４４】
同様に、開示された組成物の１つ以上を、１つ以上の診断方法論または検出方法論において使用して、生物学的サンプル、宿主細胞、または動物の身体もしくは組織内でさえ、特定の抗体、ペプチド、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドを同定し得ることが、当業者によって理解される。開示された核酸組成物またはアミノ酸組成物の１つ以上は、動物（特に、本明細書に開示され、特許請求される悪性状態にある動物）において、１つ以上の血液悪性疾患の診断、検出、予後診断、予防、または治療における使用のための１つ以上の医薬の調製または製造において使用され得ることが、当業者によって理解される。
【００４５】
本発明の方法、キット、および使用は、好ましくは、本明細書に開示される化合物および／または組成物の１つ以上を使用し得、この化合物および／または組成物は、添付の配列表の配列番号１１，０００〜１１，０３８、および配列番号１１，２９１〜１１，２９２において表され得る１つ以上連続したヌクレオチド配列を含むこともまた、当業者にとって容易に明らかである。
【００４６】
同様に、本発明の方法、キット、および使用はまた、本明細書に開示される化合物および／または組成物の１つ以上を使用し得、この化合物および／または組成物は、上記のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるペプチドのいずれかまたは添付の配列表の配列番号１１，０３９〜１１，０５８のいずれか１つにおいて表される、１つ以上連続したアミノ酸配列を含むこともまた、当業者にとって容易に明らかである。
【００４７】
（４．  例示的な実施形態の説明）
本明細書中に記載される本発明が、より完全に理解され得るために、種々の例示的な実施形態の以下の説明が示される。
【００４８】
本発明は、一般的に、血液の悪性腫瘍（例えば、Ｂ細胞白血病およびＢ細胞リンパ腫ならびに多発性骨髄腫）の免疫治療および診断のための組成物および方法に関する。
【００４９】
（４．１  核酸送達およびＤＮＡトランスフェクションの方法）
特定の実施形態において、１つ以上のＲＮＡまたはＤＮＡならびに／または本明細書中に開示される代替のポリヌクレオチド組成物を使用して、適切な宿主細胞をトランスフェクトすることが企図される。ＲＮＡおよびＤＮＡならびにそれらを含むベクターの適切な宿主細胞への導入のための技術は、当業者に周知である。特に、１つ以上の活性ペプチド、化合物またはワクチンの治療的投与が、１つ以上の目的の治療化合物をコードする１つ以上のポリヌクレオチド構築物の発現によって達成される場合、このようなポリヌクレオチドを使用して、一般的に１つ以上の宿主細胞を形質転換し得る。
【００５０】
適切な標的細胞へポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを導入するための種々の手段は、当業者に公知である。例えば、ポリヌクレオチドが、細胞への送達について意図される場合、培養された哺乳動物細胞への発現構築物の転移のためのいくつかの非ウイルス性方法は、当業者が使用のために利用可能である。これらとしては、以下が挙げられる：例えば、リン酸カルシウム沈殿法（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅら，１９９０）；ＤＥＡＥ−デキストラン沈殿（Ｇｏｐａｌ，１９８５）；エレクトロポレーション（ＷｏｎｇおよびＮｅｕｍａｎｎ，１９８２；Ｆｒｏｍｍら、１９８５；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４；Ｓｕｚｕｋｉら、１９９８；Ｖａｎｂｅｖｅｒら、１９９８）、直接ミクロ注入（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８０；ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５）、ＤＮＡ−充填リポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９；Ｔａｋａｋｕｒａ，１９９８）およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞音波破砕（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）、高速微粒子銃を使用する遺伝子衝撃（Ｙａｎｇら、１９９０；Ｋｌｅｉｎら、１９９２）、ならびにレセプター媒介トランスフェクション（Ｃｕｒｉｅｌら、１９９１；Ｗａｇｎｅｒら、１９９２；ＷｕおよびＷｕ，１９８７；ＷｕおよびＷｕ，１９８８）。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエキソビボでの使用の首尾よく適応され得る。
【００５１】
１つ以上の開示された発現ベクターで形質転換された細菌、酵母細胞または動物細胞は、本発明の重要な局面を示す。このような形質転換された宿主細胞は、しばしば本明細書中で開示される種々のＤＮＡ遺伝子構築物の発現における使用のために所望される。本発明のいくつかの局面において、本明細書中で開示される遺伝子セグメントの発現を調製するか、調節するかまたは制御されることをしばしば所望する。このような方法は、分子遺伝学の分野の当業者に日常的である。代表的に、特定の遺伝子の増加または過剰発現が所望される場合、特に活性プロモーター、および特に組織特異的プロモーター（例えば、本明細書中に開示されるもの）を使用することによって、ならびに特定の形質転換された宿主細胞におけるメセンジャーＲＮＡの安定性を増加する配列を使用することによって、種々の操作は、メッセンジャーＲＮＡの発現を増加するために使用され得る。
【００５２】
代表的に、開始領域および翻訳終結領域は、終止コドン、ターミネーター領域および必要に応じてポリアデニル化シグナルを含む。転写の方向において、すなわちコード配列またはセンス配列の５’から３’への方向において、構築物は、転写調節領域、必要であれば、プロモーターを含み、調節領域は、プロモーター、リボソーム結合部位、開始コドン、構造遺伝子（開始コドンを有する相においてオープンリーディングフレームを有する）、終止コドン、ポリアデニル化シグナル配列、必要であれば、ターミネーション領域の５’または３’のいずれかであり得る。二重鎖としてのこの配列は、微生物宿主または真核生物宿主の形質転換のためにそれ自体によって使用され得るが、第２のＤＮＡ配列が、宿主にＤＮＡを導入する間に発現構築物に結合し得る場合、マーカーを含むＤＮＡ配列を通常含み得る。
【００５３】
機能的な複製系が存在しない場合、構築物はまた、好ましくは、宿主中の配列と少なくとも約３０、または約４０または約５０の塩基対（ｂｐ）かそこらの配列を含み、好ましくは少なくとも約６０、約７０、約８０または約９０〜約１００かそこらのｂｐ、そして通常約５００〜約１０００以下かそこらのｂｐの配列相同性を含む。この方法において、正確な組換えの確立は増加され、その結果、遺伝子は、宿主に組み込まれ、そして宿主によって安定に維持される。望ましい、発現構築物の調節領域は、相補性を提供する選択された治療遺伝子ならびに競合的な利点を提供する遺伝子に密接である（そしてまた必要に応じてこれらに関連して位置付けされる）。従って、治療遺伝子が欠損する事象において、得られた生物はまた、競合的な利点を提供する遺伝子を欠損するようであり、その結果、インタクトな構築物を保持する遺伝子を有する環境において競合し得ない。
【００５４】
選択された治療遺伝子は、開始領域の調節制御下に存在するので、転写および翻訳開始領域と転写および翻訳終結領域との間に導入され得る。この構築物は、プラスミド中に含まれ得、このプラスミドは、少なくとも１つの複製系を含むが、１つより多い複製系を含み得、１つの複製系はプラスミドの発達の間クローニングのために使用され、そして第２の複製系は、最終的な宿主（この場合、哺乳動物宿主細胞）における機能のために必要である。さらに、１つ以上のマーカーが存在し得る（これは以前に記載されてい）。組み込みが所望される場合、プラスミドは、望ましくは、宿主ゲノムと相同な配列を含む。
【００５５】
本明細書中に開示される場合、遺伝子または他の核酸セグメントは、当該分野で周知の種々の技術を使用して宿主細胞へと挿入され得る。細胞へ核セグメントを送達するための一般的な５つの方法は、以下に記載されている：（１）化学的方法（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７３）；（２）物理的方法（例えばミクロ注入）（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８０）、エレクトロポレーション（米国特許第５，４７２，８６９号；ＷｏｎｇおよびＮｅｕｍａｎｎ，１９８２；Ｆｒｏｍｍら、１９８５）、微粒子銃（ｂｏｕｎｂａｒｔｍｅｎｔ）（米国特許第５，８７４，２６５号、詳細には、この全体は本明細書中に参考として援用される）、「遺伝子銃」（Ｙａｎｇら、１９９０）；（３）ウイルス性ベクター（ＥｇｌｉｔｉｓおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９８８）；（４）レセプター媒介機構（Ｃｕｒｉｅｌら、１９９１；Ｗａｇｎｅｒら、１９９２）；および（５）細菌媒介型形質転換。
【００５６】
（４．２血液悪性腫瘍関連特異的抗体およびその抗原結合フラグメント）
本発明は、本明細書中に開示されるような少なくとも第１のペプチドまたはペプチド改変体に特異的に結合する（またはこれらに対して免疫特異的である）抗体およびその抗原結合フラグメントをさらに提供する。本明細書中で使用される場合、抗体または抗原結合フラグメントは、ペプチドと検出可能なレベル（例えば、ＥＬＩＳＡ）で反応し、そして同様の条件下で関連のないペプチドまたはタンパク質と検出可能に反応しない場合、ペプチドに「特異的に結合する」といわれる。本明細書中で使用される場合、「結合」とは、「複合体」が形成されるような２つの別々の分子間の非共有結合をいう。結合する能力は、例えば、この複合体の形成についての結合定数を決定することにより評価され得る。結合定数は、その複合体の濃度が構成成分の濃度の積で除算される場合に得られる値である。一般に、２つの化合物は、複合体形成についての結合定数が約１０３Ｌ／ｍｏｌを超える場合に、本発明の文脈において、「結合する」と言われる。結合定数は、当業者に周知の方法を使用して決定され得る。
【００５７】
上記の要求を満足する任意の因子は、結合因子であり得る。例示的な実施形態において、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。このような抗体は、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって、調製され得る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８）。一般に、抗体は、細胞培養技術（本明細書に記載されるようなモノクローナル抗体の生成を含む）によって、または組換え抗体の生成を可能にするために、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、生成され得る。１つの技術において、このポリペプチドを含む免疫原が、最初に、広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変を有さない免疫原として作用し得る。あるいは、特に、比較的短いポリペプチドについて、優れた免疫応答が、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合される場合に、惹起され得る。この免疫原は、好ましくは、１回以上のブースト免疫を組み込む所定のスケジュールに従って、動物宿主に注射され、そしてこれらの動物が、定期的に採血される。このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、次いで、例えば、適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製され得る。
【００５８】
目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体が、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）の技術およびその改善物を使用して、調製され得る。簡潔には、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を生成し得る不死細胞株の調製を含む。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫された動物から得られる脾臓細胞から生成され得る。次いで、この脾臓細胞が、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは、免疫された動物と同系であるものとの融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、数分間、非イオン性界面活性剤と組合され、次いで、ハイブリッド細胞の増殖は支持するが、骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地に低密度でプレートされ得る。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間の後、通常、約１〜２週間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーを選択し、そしてそれらの培養上清を、このポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【００５９】
モノクローナル抗体は、増殖ハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術が、収量を増加させるために使用され得、この技術は、例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔へのハイブリドーマ細胞株の注入である。次いで、モノクローナル抗体が、腹水または血液から回収され得る。混入物が、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、および抽出）によって抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティートクロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて使用され得る。
【００６０】
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が好まれ得る。このようなフラグメントには、Ｆａｂフラグメントが挙げれ、これは標準的な技術を使用して調製され得る。手短に言うと、免疫グロブリンが、プロテインＡビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより、ウサギ血清から精製され得（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８）、そしてＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを産生するためにパパインにより消化され得る。ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントが、プロテインＡビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより分離され得る。
【００６１】
モノクローナル抗体およびそのフラグメントは、１つ以上の治療剤に結合され得る。この点に関して適切な薬剤としては、例えば、自己骨髄をインビトロでパージするために使用され得る、放射性トレーサーおよび化学療法剤が挙げられる。代表的な治療剤としては、放射性核種、分化インヂューサー、薬物、毒素およびそれらの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化インデューサーとしては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。診断目的については、放射性薬剤の結合が、転移の追跡を容易にするためか、または血液悪性腫瘍関連陽性腫瘍の位置を決定するために、使用され得る。
【００６２】
治療剤は、適切なモノクローナル抗体に直接的または間接的に（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が他のものと反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の上の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、酸無水物または酸ハロゲン化物）または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応し得る。
【００６３】
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とを結合させることが所望され得る。リンカー基は、結合の可能性を妨げることを回避するために、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるように働き得、従って結合効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使用を促進し得る（さもなければ、可能ではない）。
【００６４】
種々の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基およびスルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【００６５】
本発明の免疫結合体の抗体部分がないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインターナリゼーションの間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元（米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射（米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（米国特許第４，５６９，７８９号）による切断を含む。
【００６６】
１つより多い薬剤を抗体に結合させることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、薬剤の複数の分子が１つの抗体分子に結合される。別の実施形態において、１つより多い型の薬剤が１つの抗体に結合され得る。特定の実施形態に関わらず、１つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つより多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。キャリアは、種々の方法（直接的にかまたはリンカー基を介するかのいずれかの共有結合を含む）で薬剤を保有し得る。適切なキャリアとしては、アルブミンのようなタンパク質（米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、例えばリポソーム小胞内に、非共有結合によってかまたはカプセル化によって、薬剤を保有し得る（米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３、０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むものを含む、キレート化合物から形成され得る。例えば、米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
【００６７】
抗体および免疫結合体について、種々の投与経路が使用され得る。代表的には、投与は、静脈内、筋肉内、皮下、または切除された腫瘍のベッドにおいてである。抗体／免疫結合体の正確な用量は、使用される抗体、腫瘍上の抗原密度、および抗体のクリアランスの速度に依存して変動することが明らかである。
【００６８】
また、関連する血液悪性腫瘍の免疫原性部分を模倣する抗イディオタイプ抗体が、本明細書中に提供される。このような抗体は、周知の技術を使用して、関連する血液悪性腫瘍の免疫原性部分に特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合フラグメントに対して惹起され得る。関連する血液悪性腫瘍の免疫原性部分を模倣する抗イディオタイプ抗体は、本明細書中に記載されるように、関連する血液悪性腫瘍の免疫原性部分に特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合フラグメントに結合する抗体である。
【００６９】
オリジナルの血液悪性腫瘍の供給源に関係なく関連するペプチド特異的抗体、インタクトな抗体、抗体多量体または種々の機能的な抗体の抗原結合領域のいずれか１つが、本発明に使用され得る。例示的な機能領域としては、血液悪性腫瘍関連ペプチド特異的抗体のｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２が挙げられる。このような構築物の調製のための技術は、当業者に周知であり、そしてさらに本明細書中で例示される。
【００７０】
抗体構築物の選択は、種々の因子によって影響され得る。例えば、延長された半減期は、腎臓内のインタクトな抗体の活性読出し吸着（ｒｅａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）（免疫グロブリンのＦｃ切片の性質）を生じ得る。従って、ＩｇＧベースの抗体は、それらのＦａｂ’対応物より遅い血液クリアランスを示すことが予測される。しかし、Ｆａｂ’フラグメントベースの組成物は、一般的に、より良好な組織浸透能力を示す。
【００７１】
抗体フラグメントは、非特異的チオールプロテアーゼ（パパイン）による全免疫グロブリンのタンパク質分解によって得られ得る。パパイン消化は、２つの同一の抗原結合フラグメント（「Ｆａｂフラグメント」と言われる、それぞれは、１つの抗原結合部位および残りの「Ｆｃフラグメント」を有する）を産生する。
【００７２】
パパインは、まず、システイン、２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールで活性部位中のスルフヒドリル基を還元することによって活性化されるべきである。貯蔵された酵素中の重金属は、ＥＤＴＤ（２ｍＭ）でキレート化によって除去され、最大の酵素活性を保証されるべきである。酵素および基質は、通常１：１００の重量比で混合される。インキュベートの後、反応は、ヨードアセトアミドでのチオール基の不可逆的なアルキル化によってまたは簡単に透析によって停止され得る。消化の完全性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターされ、そして種々の因子は、プロテインＡセファロースまたはイオン交換クロマトグラフィーによって分離されるべきである。
【００７３】
ウサギおよびヒト起源のＩｇＧ由来のＦ（ａｂ）’フラグメントの調製のための通常の手順は、酵素ペプシンによるタンパク質分解に限定される。条件（ｐＨ４．５、３７℃で酢酸緩衝液中１００×抗体過剰ｗｔ／ｗｔ）は、抗体が内重鎖ジスルフィド結合のＣ末端側で切断されることを示唆する。マウスＩｇＧの消化比は、サブクラスで変化し得、そしていくつかの未消化ＩｇＧまたは完全に消化されたＩｇＧを必要としない活性Ｆ（ａｂ）’フラグメントの高い収率を得ることは困難であり得る。特に、ＩｇＧ２ｂは、完全な分解を非常に起こしやすい。他のサブクラスは、最適な結果を生じる異なるインキュベーション条件を必要とし、これらの全ては、当該分野で公知である。
【００７４】
インタクトな抗体のペプシン処理により、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが生じる。このＦ（ａｂ’）２フラグメントは、２つの抗原結合部位を有し、かつ依然として抗原を架橋する能力を有する。ペプシンによるラットＩｇＧの消化は、０．１Ｍアセテート緩衝液（ｐＨ４．５）中での透析、次いで１％（重量／重量）ペプシンとの４時間のインキュベーションを含む条件を必要とする；ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの消化は、最初に４℃にて０．１Ｍホルメート緩衝液（ｐＨ２．８）に対して１６時間透析し、続いてアセテート緩衝液に対して透析した場合に改善される。ＩｇＧ２ｂは、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）中、ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼ（３％（重量／重量））における、３７℃にて４時間のインキュベーションによって、より一貫した結果を与える。
【００７５】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメイン（抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む）のカルボキシル末端におけるわずかな残基の付加だけ、Ｆａｂフラグメントとは異なる。（Ｆａｂ’）２抗体フラグメントは、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として、本来産生された。抗体フラグメントの他の化学結合もまた、公知である。
【００７６】
用語「可変部（ｖａｒｉａｂｌｅ）」は、抗体を参照して本明細書中で使用される場合、可変ドメインの特定の部分が、抗体間の配列において広範に異なっていることを意味し、その特定の抗原に対する、各特定の抗体の結合および特異性において使用される。しかし、この変動性は、抗体の可変ドメイン全体を通して均一には分布されていない。これは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの両方において、「超可変領域」と称される３つのセグメントに濃縮される。
【００７７】
可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブの重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、大部分がβシート配置を取り入れた、各々４つのＦＲ（それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、これらのＦＲは、３つの超可変領域によって接続されている。この可変ドメインは、このβシート構造に接続し、そしていくつかの場合において、このβシート構造の一部を形成する、ループを形成する。
【００７８】
各鎖における超可変領域は、ＦＲによって一緒に近位で保持され、他の鎖由来の超可変領域は、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、１９９１（詳細に本明細書中で参考として援用される））。その定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接的に関与するのではなく、種々のエフェクター機能（例えば、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与）を示す。
【００７９】
用語「超可変領域」とは、本明細書中で使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。この超可変領域は、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおいては、残基２４〜３４（Ｌ１）、残基５０〜５６（Ｌ２）および残基８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおいては、残基３１〜３５（Ｈ１）、残基５０〜５６（Ｈ２）および９〜１０２（Ｈ３）（Ｋａｂａｔら、１９９１（詳細に本明細書中で参考として援用される））、および／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおいては、残基２６〜３２（Ｌ１）、残基５０〜５２（Ｌ２）および残基９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変領域については、残基２６〜３２（Ｈ１）、残基５３〜５５（Ｈ２）および残基９６〜１０１（Ｈ３））を含む。「フレームワーク」残基または「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義される超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。
【００８０】
「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む、最小抗体フラグメントである。この領域は、密接に非共有結合（ｃｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ）した、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つの超可変領域は、このＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するように相互作用する。集合的に、６つの超可変領域が、この抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかし、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえもが、結合部位全体よりも低い親和性にもかかわらず、抗原を認識しかつ抗原に結合する能力を有する。
【００８１】
「一本鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、このＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このポリペプチドリンカーにより、ｓＦｖは、抗原結合のための所望の構造を形成することができる。
【００８２】
用語「ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」とは、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントをいい、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成され、２つの抗原結合部位が作製される。ジアボディは、例えば、欧州特許出願番号ＥＰ  ４０４，０９７号；および国際特許出願番号ＷＯ  ９３／１１１６１（各々は詳細に、本明細書中で参考として援用される）において記載されている。二特異性または一特異性であり得る「直鎖状抗体」は、Ｚａｐａｔａら（１９９５）（詳細に本明細書中で参考として援用される）において記載されるように、一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムなＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。
【００８３】
他の型の改変体は、それらが作製される親抗体に対して、改善された生物学的特性を有する抗体である。このような改変体、または第二世代化合物は、代表的には、親抗体の１以上の置換された超可変領域の残基を含む、置換改変体である。このような置換改変体を作製するための従来方法は、ファージディスプレイを使用するアフィニティー成熟である。
【００８４】
ファージディスプレイを使用するアフィニティー成熟において、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７個の部位）が変異され、各部位にて、全ての可能なアミノ置換が生じる。このように作製された抗体改変体は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として、糸状ファージ粒子から一価の様式で提示される。次いで、このファージディスプレイ改変体は、本明細書中に開示されるように、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変についての候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発が、抗原結合に有意に寄与するとして同定された超可変領域残基において行われ得る。
【００８５】
あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を示しそして分析して、抗体と標的との間の接触点を同定する。このような接触残基および隣接残基は、置換の候補である。一旦、このような改変体が作製されると、この改変体のパネルはスクリーニングに供され、そして類似しているが異なっている抗体、または１つ以上の関連したアッセイにおいてなお優れた特性を有する抗体が、さらなる開発のために選択される。
【００８６】
組織浸透に対して付随した利点を伴って、Ｆａｂ’フラグメントまたは抗体の抗原結合フラグメントを使用する際に、フラグメントを改変してその半減期を増加させることによって、さらなる利点が得られ得る。種々の技術（例えば、抗体分子それ自体の操作または改変、ならびにまた不活性キャリアへの結合体化）が用いられ得る。薬剤を標的に送達するのではなく、半減期を増加させるだけの目的の任意の結合体は、Ｆａｂ’フラグメントまたは他のフラグメントが組織を浸透するように選択される点で、慎重にアプローチされるべきである。それにもかかわらず、非タンパク質ポリマー（例えば、ＰＥＧなど）への結合体化は、企図されていない。
【００８７】
従って、結合体化以外の改変は、抗体フラグメントの構造を改変し、この構造をより安定にし、そして／または体内での異化速度を低下させることに基づく。このような改変のための１つの機構は、Ｌアミノ酸の代わりにＤアミノ酸を使用する。当業者は、このような改変の導入は、得られた分子が所望の生物学的特性を依然として維持していることを確実にするために、この分子の剛直性試験に従うことが必要であることを理解している。さらに安定化させる改変としては、安定化部分を、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか、またはそれらの両方に付加する使用が挙げられ、これは、生物学的分子の半減期を延長させるために、一般的に使用される。例のみとして、アクリル化またはアミン化によって、末端を改変することが望ましくあり得る。
【００８８】
本発明とともに使用するための、中程度の結合体化型改変としては、抗体フラグメントへの、救出（ｓａｌｖａｇｅ）レセプター結合エピトープの組み込みが挙げられる。この組み込みを達成するための技術としては、抗体フラグメントの適切な領域の変異、またはこの抗体フラグメントに結合されたペプチドタグとしてのエピトープの組み込みが挙げられる。国際特許出願番号ＷＯ  ９６／３２４７８は、このような技術をさらに例証する目的で参照することによって、本明細書中で参考として詳細に援用される。救助レセプター結合エピトープは、代表的に、抗体フラグメント上の類似の位置に移入されるＦｃドメインの１つまたは２つのｌｏｐｓ由来の３つ以上のアミノ酸の領域である。国際特許出願番号ＷＯ  ９８／４５３３１において開示される救助レセプター結合エピトープは、本発明とともに使用するために、本明細書中で参考として援用される。
【００８９】
（４．３  血液悪性腫瘍関連ペプチドに特異的なＴ細胞組成物）
免疫治療組成物はまた、またはあるいは、関連する血液悪性腫瘍に特異的なＴ細胞を含む。このような細胞は、一般に、標準的な手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離系（例えば、Ｎｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＩｓｏｌｅｘＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、哺乳動物（例えば、患者）の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分内に存在し得る（またはそれらから単離され得る）（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；国際特許出願番号ＷＯ８９／０６２８０；国際特許出願番号ＷＯ９１／１６１１６および国際特許出願番号ＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）。あるいは、Ｔ細胞は、関連しているかまたは関連していない、ヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物に由来し得る。
【００９０】
Ｔ細胞は、血液悪性腫瘍関連ポリペプチド、血液悪性腫瘍関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または血液悪性腫瘍関連ポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）で刺激され得る。このような刺激は、血液悪性腫瘍関連ポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を許容するに十分な条件下および時間で行われる。好ましくは、血液悪性腫瘍関連ポリペプチドまたは血液悪性腫瘍関連ポリヌクレオチドは、抗原特異的Ｔ細胞の生成を容易にするために、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）内に存在する。簡潔には、Ｔ細胞は、慣用的な技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配遠心分離によって）、患者または関連しているかもしくは関連していないドナーから単離され得、血液悪性腫瘍関連ポリペプチドとともにインキュベートされる。例えば、Ｔ細胞は、血液悪性腫瘍関連ポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）または匹敵する量の血液悪性腫瘍関連ポリペプチドを合成する細胞とともに、３７℃で２〜９日間（代表的には４日間）インビトロでインキュベートされ得る。コントロールとして働く血液悪性腫瘍関連ポリペプチドの非存在下で、Ｔ細胞サンプルの別々のアリコートをインキュベートすることが所望され得る。
【００９１】
Ｔ細胞は、このＴ細胞が血液悪性腫瘍関連ポリペプチドでコーティングされているか、またはこのようなポリペプチドをコードする遺伝子を発現している標的細胞を殺傷する場合に、血液悪性腫瘍関連ポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞の特異性は、任意の種々の標準的な技術を使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいては、陰性コントロールと比較して、溶解および／または増殖における刺激指数の２倍を超える上昇は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）に記載されるように行われ得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の上昇した速度を測定することによって（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡ中に取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）検出され得る。Ｔ細胞増殖を検出する他の様式は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生、Ｃａ２＋フラックス、または色素（例えば、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム）の取り込みにおける上昇を測定することを包含する。あるいは、リンホカイン（例えば、インターフェロン−γ）の合成が、測定され得るか、または血液悪性腫瘍関連ポリペプチドに応答し得るＴ細胞の相対数が、定量され得る。サイトカイン放出（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）のレベルにおける２倍の上昇がＴ細胞活性化を示す標準的なサイトカインアッセイを使用して測定した場合に、血液悪性腫瘍関連ポリペプチド（２００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との３〜７日間の接触は、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の上昇を生じるはずであり、そして／または上記のような２〜３時間の接触は、Ｔ細胞の活性化を生じるはずである（Ｃｏｌｉｇａｎら、１９９８）。血液悪性腫瘍関連特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して拡大され得る。好ましい実施形態において、このＴ細胞は、患者、または関連しているかもしくは関連していないドナーに由来し、そして刺激および拡大の後に患者に投与される。
【００９２】
血液悪性腫瘍関連ポリペプチド、血液悪性腫瘍関連ポリヌクレオチド、または血液悪性腫瘍関連発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的活性化が、種々の様式で検出され得る。特異的Ｔ細胞活性化を検出するための方法は、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン（例えば、リンホカイン）の産生、または細胞溶解活性の生成（すなわち、関連した血液悪性腫瘍に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の生成）を検出することを包含する。ＣＤ４＋Ｔ細胞については、特異的Ｔ細胞活性化を検出するために好ましい方法は、Ｔ細胞の増殖の検出である。ＣＤ８＋Ｔ細胞については、特異的Ｔ細胞活性化を検出するために好ましい方法は、細胞溶解性活性の生成の検出である。
【００９３】
治療目的のために、血液悪性腫瘍関連ポリペプチド、血液悪性腫瘍関連ポリヌクレオチド、またはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで数の上では増殖され得る。インビトロでのこのようなＴ細胞の増殖は、種々の様式で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）、および／または血液悪性腫瘍関連ポリペプチドを合成する刺激性細胞を添加してか、または添加することなく、血液悪性腫瘍関連ポリペプチドに再び曝露され得る。刺激性細胞の添加は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成する場合に好ましい。Ｔ細胞は、血液悪性腫瘍関連ポリペプチドでの断続的な再刺激に応答する特異性を保持したまま、インビトロで多数に増殖され得る。簡潔には、一次的なインビトロ刺激（ＩＶＳ）については、多数のリンパ球（例えば、４×１０７よりも多い）が、ヒト血清を含む培地を有するフラスコ中に置かれ得る。血液悪性腫瘍関連ポリペプチド（例えば、１０μｇ／ｍｌでのペプチド）が、破傷風毒素（例えば、５μｇ／ｍｌ）とともに、直接的に添加され得る。次いで、これらのフラスコが、インキュベートされ得る（例えば、３７℃で７日間）。第２のＩＶＳについては、次いで、Ｔ細胞が収集され、そして２×１０７〜３×１０７の照射された末梢血単核細胞を有する新しいフラスコ中に置かれる。血液悪性腫瘍関連ポリペプチド（例えば、１０μｇ／ｍｌ）が、直接的に添加される。これらのフラスコが、３７℃で７日間インキュベートされる。第２のＩＶＳの２日後および４日後に、２〜５単位のインターロイキン−２（ＩＬ−２）が、添加され得る。第３のＩＶＳについては、Ｔ細胞は、ウェル中に置かれ得、そしてこのペプチドでコーティングされた、個体独自のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞で刺激され得る。ＩＬ−２が、各々の周期の２日目および４日目に添加され得る。これらの細胞が特異的な細胞傷害性Ｔ細胞であることが示されるとすぐに、これらは、２日目、４日目および６日目で、より多いＩＬ−２（２０単位）を用いて、１０日の刺激周期を使用して拡大され得る。
【００９４】
あるいは、血液悪性腫瘍関連ポリペプチドの存在下で増殖する１以上のＴ細胞が、クローニングによって、数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野において周知であり、そして限界希釈を含む。応答性Ｔ細胞は、密度勾配遠心分離およびヒツジ赤血球細胞ロゼッティングにより感作された患者の末梢血から精製され得、そして照射された自己充填細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｆｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）の存在下で名目上の抗原で刺激することによって培養物中で確立され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞株を生成するために、血液悪性腫瘍関連ポリペプチドが、抗原性刺激として使用され、そしてエプスタイン−バーウイルスでの感染により不死化された自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）またはリンパ芽球腫細胞株（ＬＣＬ）は、抗原提示細胞として使用される。ＣＤ８＋Ｔ細胞株を生成するために、血液悪性腫瘍関連ポリペプチドを産生する発現ベクターでトランスフェクトされた自己抗原提示細胞が、刺激性細胞として使用され得る。確立されたＴ細胞株は、１×１０６の照射されたＰＢＬ細胞またはＬＣＬ細胞および組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）（５０Ｕ／ｍｌ）を有する９６ウェル平底プレートに、１ウェルあたり０．５の細胞の頻度で、刺激されたＴ細胞をプレートすることによって抗原刺激の２〜４日後にクローニングされ得る。確立されたクローン増殖を有するウェルは、最初のプレーティングのおよそ２〜３週間後に同定され、そして自己抗原提示細胞の存在下で適切な抗原で再刺激され、次いで、抗原刺激の２〜３日後での低用量のｒＩＬ２（１０Ｕ／ｍｌ）の添加によって実質的に拡大され得る。Ｔ細胞クローンは、およそ２週間毎の抗原およびｒＩＬ２での定期的な再刺激によって２４ウェルプレートにおいて維持され得る。クローン化された細胞および／または拡大された細胞は、例えば、Ｃｈａｎｇら（１９９６）によって記載されるように、患者に戻して投与され得る。
【００９５】
特定の実施形態では、同種異系Ｔ細胞が、インビボおよび／またはインビトロで初回免疫され得る（すなわち、関連した血液悪性腫瘍に感作される）。このような初回免疫は、血液悪性腫瘍関連ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはこのようなポリペプチドを産生する細胞と、Ｔ細胞とを、Ｔ細胞を初回免疫することを許容する条件下かつ時間で、接触させることによって達成され得る。一般に、Ｔ細胞は、例えば、本明細書中に記載される標準的な増殖、クロム放出アッセイおよび／またはサイトカイン放出アッセイにより測定されるように、血液悪性腫瘍関連ポリペプチドとの接触がＴ細胞の増殖および／または活性化を生じる場合に、初回免疫されるとみなされる。陰性コントロールと比較して、増殖または溶解における２倍よりも大きい上昇、およびサイトカインレベルにおける３倍よりも大きい上昇の刺激指数は、Ｔ細胞特異性を示す。インビトロで初回免疫された細胞は、例えば、骨髄移植において、またはドナーリンパ球注入として、用いられ得る。
【００９６】
関連した血液悪性腫瘍に特異的なＴ細胞は、血液悪性腫瘍関連タンパク質を発現する細胞を殺傷し得る。関連した血液悪性腫瘍のためのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）鎖をコードする遺伝子の導入は、関連した血液悪性腫瘍を保有する、白血病細胞および癌細胞に対する応答を量的かつ質的に改善する手段として使用される。血液悪性腫瘍関連陽性細胞と反応し得るＴ細胞の数を増加させるためのワクチンは、関連した血液悪性腫瘍を保有する細胞を標的化するための一つの方法である。関連した血液悪性腫瘍に特異的なＴ細胞を用いたＴ細胞療法は別の方法である。代替的な方法は、関連した血液悪性腫瘍に特異的なＴＣＲ鎖をＴ細胞または溶解能を有する他の細胞に導入することである。適切な実施形態において、このＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、ＷＯ９６／３０５１６（これは、本明細書中において、参考として援用される）に記載されるように、血液悪性腫瘍関連特異的Ｔ細胞株からクローン化され、そして養子Ｔ細胞治療のために使用される。
【００９７】
（４．４  薬学的組成物およびワクチン処方物）
特定の局面において、ペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、および／またはＴ細胞は、薬学的組成物または免疫原性組織（すなわち、ワクチン）に組み込まれ得る。あるいは、薬学的組成物は、抗原提示細胞が血液悪性関連ペプチドを発現するように、血液悪性関連ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含み得る。薬学的組成物は、１つ以上のこのような化合物または細胞、および生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。ワクチンは、１つ以上のことのような化合物または細胞、および免疫刺激因子（例えば、アジュバントまたはリポソーム（その中に化合物が組み込まれる））を含み得る。免疫刺激因子は、外来抗原に対する免疫応答（抗体媒介応答および／または細胞媒介応答）を増強または強化する任意の物質であり得る。免疫刺激因子の例としては、アジュバント、生物分解性ミクロスフィア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）、およびリポソーム（その中に化合物が組み込まれる）（米国特許第４，２３５，８７７号）が挙げられる。ワクチン調製物は、一般的に、例えば、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ（１９９５）に記載されている。本発明の範囲内の薬学的組成物およびワクチンはまた、他の化合物を含み得、それらは生物学的に活性であってもなくてもよい。例えば、他の腫瘍抗原の１つ以上の免疫原性部分が、融合ペプチドに組み込まれてか、または別の化合物として、その組成物またはワクチン中に存在し得る。
【００９８】
特定の実施形態において、薬学的組成物およびワクチンは、患者（例えば、ヒト）における血液悪性関連ペプチドに特異的なＴ細胞応答を誘発するよう設計される。一般的には、Ｔ細胞応答は、比較的短いペプチド（例えば、ネイティブ血液悪性関連ペプチドの２３未満の連続するアミノ酸残基、好ましくは４〜１６連続残基、より好ましくは８〜１６連続残基、およびさらにより好ましくは８〜１０連続残基を含む）の使用を通すことが好ましくあり得る。あるいは、または加えて、ワクチンは、Ｔ細胞応答を優先的に増強する免疫刺激因子を含み得る。言いかえると、免疫刺激因子は、血液悪性関連ペプチドに対するＴ細胞応答のレベルを、抗体応答が増強される量よりも比例して多い量増強し得る。例えば、標準の油ベースのアジュバント（例えば、ＣＦＡ）と比較した場合、Ｔ細胞応答を優先的に増強する免疫刺激因子は、抗体応答を検出可能に増強することなく、血液悪性関連ネガティブコントロール細胞株と比較して、増殖性Ｔ細胞応答を少なくとも２倍、溶解応答を少なくとも１０％、そして／またはＴ細胞活性化を少なくとも２倍増強し得る。血液悪性関連ペプチドに対するＴ細胞応答または抗体応答が増強される量は、一般的に、当該分野で代表的な任意の技術（例えば、本明細書中に提供される技術）を用いて決定され得る。
【００９９】
薬学的組成物またはワクチンは、上記のようなペプチドの１つ以上をコードするＤＮＡを含み得、その結果、このペプチドは、インサイチュで生成される。上記のように、このＤＮＡは、当業者に公知の任意の種々の送達系（核酸発現系、細菌およびウイルス発現系、ならびに哺乳動物発現系が挙げられる）内に存在し得る。多くの遺伝子送達技術が当該分野で周知である（Ｒｏｌｌａｎｄ，１９９８、およびその文献で引用される参考文献）。適切な核酸発現系は、患者内での発現のための必要なＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ配列（例えば、適切なプロモーターおよび終結シグナル）を含む。細菌送達系は、その細胞表面にそのペプチドの免疫原性部分を発現するかまたはそのようなエピトープを分泌する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含む。好ましい実施形態において、そのＤＮＡは、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアもしくは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を用いて導入され得、この導入は、非病原性（欠損性）、複製コンピテントウイルスの使用を含み得る（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら，１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、同第５，０１７，４８７号；国際特許出願公開ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；英国特許ＧＢ２，２００，６５１号；欧州特許ＥＰ０，３４５，２４２号；国際特許出願公開ＷＯ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ，１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，１９９１；Ｋｏｌｌｓら，１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら，１９９３；Ｇｕｚｍａｎら，１９９３ａ；およびＧｕｚｍａｎら，１９９３）このような発現系にＤＮＡを組み込む技術は当業者に周知である。ＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら（１９９３）に記載されるように、およびＣｏｈｅｎ（１９９３）により総説されるように、「裸」であり得る。裸のＤＮＡの取り込みは、細胞内に効果的に輸送される生物分解性ビーズをＤＮＡでコーティングすることにより増大され得る。ワクチンは、ポリヌクレオチド成分およびポリペプチド成分の両方を含み得ることは明らかである。このようなワクチンは、増強された免疫応答を提供し得る。
【０１００】
上記のように、薬学的組成物またはワクチンは、血液悪性関連ペプチドを発現する抗原提示細胞を含み得る。治療目的については、上記のように、抗原提示細胞は、好ましくは、自己樹状細胞である。このような細胞は、標準技術（Ｒｅｅｖｅｓら，１９９６；Ｔｕｔｉｎｇら，１９９８；およびＮａｉｒら，１９９８）を用いて調製およびトランスフェクトされ得る。抗原提示細胞の表面上での血液悪性関連ペプチドの発現は、本明細書中に記載されるように、インビトロ刺激および標準的な増殖、ならびにクロム放出アッセイによって確認され得る。
【０１０１】
ワクチンが、本明細書中に提供されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることが、本教示の利益を享受する当業者に明らかである。このような塩は、薬学的に受容可能な非毒性塩基（有機塩基（例えば、一級アミン、二級アミン、および三級アミンならびに塩基性アミノ酸）および無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、およびマグネシウムの塩）を含む）から調製され得る。句「薬学的または薬理学的に受容可能」とは、動物またはヒトに適切に投与された際に、有害な反応、アレルギー性反応、または他の厄介な反応を生じない分子実体および組成物をいう。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤がその活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が企図される。ヒトへの投与について、調製物は、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓにより必要とされる、滅菌性、発熱性、および総合安全性、ならびに純度標準を満たしているべきである。補助活性成分もまた、この組成物に組み込まれ得る。
【０１０２】
当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明の薬学的組成物において用いられ得るが、キャリアの型は、投与の様式に依存して変化する。本発明の組成物は、任意の適切な投与様式（例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与が挙げられる）のために処方され得る。非経口投与（例えば、皮下注射）については、キャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含む。経口投与については、上記キャリアまたは固形キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウム）のいずれかが使用され得る。生物分解性ミクロスフィア（例えば、ポリラクテートポリグリコレート）もまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。適切な生物分解性ミクロスフィアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号；および同第５，９４２，２５２号に開示されている。特定の局所適用については、周知の成分を用いる、クリームまたはローションとしての処方物が調製される。
【０１０３】
このような組成物はまた、緩衝液（例えば、中性緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）、糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）またはグルタチオン、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、処方物にレシピエントの血液との等張性、低張性または弱高張性を与える溶質、懸濁剤、増粘剤および／または防腐剤を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得るか、または１つ以上のリポソーム、ミクロスフェア、ナノ粒子、もしくは周知の技術を使用する微粉化送達系として処方され得る。
【０１０４】
任意の種々の免疫賦活剤（例えば、アジュバント）は、本発明のワクチン組成物の調製に用いられ得る。大部分のアジュバントは、抗原を急速な異化から保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答刺激剤（例えば、脂質Ａ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ誘導タンパク質またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ誘導タンパク質）を含む。適切なアジュバントは、例えば、ミョウバンベースのアジュバント（例えば、アルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）、レヒドロゲル（Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ）、リン酸アルミニウム、Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ、水酸化アルミニウム）；オイルベースアジュバント（フロイントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｓｐｅｃｏｌ，ＲＩＢＩ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５０またはＳｅｐｐｉｃ  ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７２０）；非イオンブロックコポリマーベースアジュバント、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＦｌａｔ３リガンド）；Ｍｅｒｃｋアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオン性またはアニオン性の誘導ポリサッカリド；ポリホスファゼン；生物分解可能なミクロスフェア；モノホスホリル脂質ＡおよびＱｕｉｌ  Ａとして市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、インターロイキン−７、またはインターロイキン−１２）もまた、アジュバントとして使用され得る。
【０１０５】
ヘモシアニンおよびヘモエリトリンもまた、本発明に使用され得る。他の軟体動物および節足動物のヘモシアニンおよびヘモエリトリンが使用される得るが、キーホールリンペット由来のヘモシアニン（ＫＬＨ）の使用が、特に好ましい。種々のポリサッカリドアジュバントもまた、使用され得る。ポリサッカリドのポリアミンの変種が特に好ましい（例えば、脱アセチル化キチンを含む、キチンおよびキトサン）。
【０１０６】
さらに好ましいアジュバントの群は、細菌性ペプチドグリカンのムラミルジペプチド（ＭＤＰ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）群である。ムラミルジペプチドの誘導体（例えば、アミノ酸誘導体スレオニルＭＤＰ、および脂肪酸誘導体ＭＴＰＰＥ）もまた企図される。
【０１０７】
米国特許第４，９５０，６４５号は、ムラミルジペプチドの脂肪親和性ジサッカリドトリペプチド誘導体を記載し、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールから形成される人工リポソームでの使用を提案している。ヒト単球の活性化および腫瘍細胞の破壊に有効であるとされているが、通常、高用量で無毒である。米国特許第４，９５０，６４５号および国際特許出願公開番号ＷＯ９１／１６３４７の化合物はまた、本発明の特定の局面を達成するのに使用される。
【０１０８】
ＢＣＧおよびＢＣＧの細胞壁骨格（ＣＷＳ）はまた、本発明においてジミコール酸トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）を含むかまたは含まないアジュバントとして使用され得る。ジミコール酸トレハロースは、それ自体で使用され得る。Ａｚｕｍａら（１９８８）は、ジミコール酸トレハロースの投与がマウスにおけるインフルエンザウイルス感染に対する増大した耐性と相関することを示す。ジミコール酸トレハロースは、米国特許第４，５７９，９４５号に記載されるように調製され得る。
【０１０９】
両親媒性および表面活性の薬剤（例えば、サポニンおよびＱＳ２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような誘導体）は、本発明の免疫原と共に使用するために好ましいアジュバントのなお別の群を形成する。非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈら、１９９４；Ｈｕｎｔｅｒら、１９９１）もまた、使用され得る。Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８８）によって記載されるオリゴヌクレオチドは、アジュバントの別の有用な群である。Ｑｕｉｌ  Ａおよびレンチネン（ｌｅｎｔｉｎｅｎ）もまた、好ましいアジュバントである。
【０１１０】
スーパー抗原もまた、本発明におけるアジュバントとしての使用のために企図される。「スーパー抗体」は、一般的に、抗体プロッセシングのための必要性なしに、ペプチド抗原より高い割合のＴリンパ球を刺激する細菌産物である（Ｍｏｏｎｅｙら、１９９４）。スーパー抗原としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのエキソタンパク質（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来のαエンテロトキシン、βエンテロトキシン、γエンテロトキシンおよびδエンテロトキシンならびにαＥ．ｃｏｌｉ外毒素、βＥ．ｃｏｌｉ外毒素、γＥ．ｃｏｌｉ外毒素およびδＥ．ｃｏｌｉ外毒素）が挙げられる。
【０１１１】
一般的なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンは、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）およびブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）〜エンテロトキシンＥ（ＳＥＥ）として知られている（（Ｒｏｔｔら、１９９２）に記載）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｂ（ＳＥＢ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓエンテロトキシン（Ｂｏｗｎｅｓｓら、１９９２）、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞膜結合タンパク質（ＣＡＰ）（Ｓａｔｏら、１９９４）およびＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のトキシックショック症候群トキシン−１（ＴＳＳＴ−１）（Ｓｃｈｗａｂら、１９９３）はさらに有用なスーパー抗原である。
【０１１２】
本発明の使用にとって特に好ましいアジュバントの１つの群は、無毒化エンドトキシン（例えば、米国特許第４，８６６，０３４号の精製された無毒化エンドトキシン）である。これらの精製された無毒化エンドトキシンは、哺乳動物においてアジュバント応答を生じるのに有効である。
【０１１３】
無毒化されたエンドトキシンは、他のアジュバントと組み合わされ得る。米国特許第４，４３５，３８６号に記載されるように、無毒化されたエンドトキシンとトレハロースジミコレートとの組み合わせが、企図される。米国特許第４，４３６，７２７号，同第４，４３６，７２８号および同第４，５０５，９００号に記載されるような、無毒化されたエンドトキシンと細胞壁骨格（ＣＷＳ）またはＣＷＳおよびトレハロースジミコレートとの組み合わせのように、無毒化されたエンドトキシンとトレハロースジミコエートおよびエンドトキシン糖脂質との組み合わせもまた、企図される（米国特許第４，５０５，８９９号）。無毒化されたエンドトキシンを含まない、ＣＷＳとトレハロースジミコレートだけの組み合わせもまた、米国特許第４，５２０，０１９号に記載されるように、有用であることが想定されている。
【０１１４】
ＭＰＬは、現在、本明細書中で使用するための１つの好ましい免疫増強剤である。ＭＰＬの使用に関する参考文献としては、以下が挙げられる：Ｔｏｍａｉら（１９８７）、Ｃｈｅｎら（１９９１）、ならびにＧａｒｇおよびＳｕｂｂａｒａｏ（１９９２）（これらは各々、加齢マウスの反応におけるＭＰＬの特定の役割に関する）；Ｅｌｌｉｏｔｔら（１９９１）（これは、Ｄ−ガラクトサミンをロードしたマウス、ならびにリポ多糖類およびＭＰＬに対するその増強された感受性に関する）；Ｃｈａｓｅら（１９８６）（これは、細菌感染に関する）；ならびにＭａｓｉｈｉら（１９８８）（これは、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉに対するマウスの耐性に対するＭＰＬおよびエンドトキシンの効果を記載する）。Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ（１９９１）はまた、梅毒性ワクチンの免疫原性をアップレギュレートするためおよびウサギにおける負荷感染に対する有意な保護を与えるためのＭＰＬの使用について報告している。
【０１１５】
従って、ＭＰＬは、上記のモデル系において示されるように、使用に安全であることが知られている。第Ｉ段階の臨床試験はまた、ＭＰＬが使用に安全であることを示している（Ｖｏｓｉｋａら、１９８４）。実際には、１００μｇ／ｍ２が、外来患者に基づいてでさえ、ヒトの使用に安全であることが知られている（Ｖｏｓｉｋａら、１９８４）。
【０１１６】
ＭＰＬは、一般に、ポリクローナルＢ細胞活性化を含み（Ｂａｋｅｒら、１９９４）、そしてまた、例えば、以下のような多くの系において抗体産生を増大させることが示されている：免疫学的に未成熟なマウスにおいて（Ｂａｋｅｒら、１９８８）；加齢マウスにおいて（ＴｏｍａｉおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８９）；ならびにヌードマウスおよびＸｉｄマウスにおいて（ＭａｄｏｎｎａおよびＶｏｇｅｌ，１９８６；Ｍｙｅｒｓら、１９９５））。抗体産生は、赤血球（Ｈｒａｂａら、１９９３）；Ｔ細胞依存性抗原およびＴ細胞非依存性抗原；Ｐｎｕ免疫ワクチン（ＧａｒｇおよびＳｕｂｂａｒａｏ，１９９２）；単離された腫瘍関連抗原（米国特許第４，８７７，６１１号）；同系腫瘍細胞（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、１９８５；Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈら、１９９４ａ；ｂ）；ならびに腫瘍関連ガングリオシド（Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈら、１９９４ａ；ｂ）に対して示されている。
【０１１７】
ＭＰＬの別の有用な性質は、Ｂａｋｅｒら（１９８８ａ）（彼らは、若齢マウスにおいて抗体応答を増大させるＭＰＬの能力を記載している）によって示されるように、ＩｇＭ応答を増大させることである。これは、特に、本発明の特定の実施形態において使用するためのアジュバントの有用な特徴である。Ｍｙｅｒｓら（１９９５）は、近年、Ｔ細胞非依存性抗体産生によってＭＰＬがＩｇＭ抗体を誘導する能力について報告している。
【０１１８】
Ｍｙｅｒｓら（１９９５）の研究において、ＭＰＬは、ハプテンであるＴＮＰに結合された。ＭＰＬは、ペプチドのような他のハプテンについてのキャリアとしての使用を提案された。
【０１１９】
ＭＰＬはまた、マクロファージを活性化し、そして補充する（Ｖｅｒｍａら、１９９２）。ＴｏｍａｉおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８９）は、ＭＰＬで刺激されたＴ細胞がマクロファージによるＩＬ−１分泌を促進することを示した。ＭＰＬはまた、マウス腹膜マクロファージにおいて、スーパーオキシド産生、リボザイム活性、貪食、およびＣａｎｄｉｄａの殺傷を活性化することが知られている（Ｃｈｅｎら、１９９１）。
【０１２０】
Ｔ細胞に対するＭＰＬの効果としては、ＭＰＬによってＢＣＧプライムしたマウスの血清における、ＴＮＦのような細胞障害性因子の内在性産生が挙げられる（Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９８８）。Ｋｏｖａｃｈら（１９９０）およびＥｌｌｉｏｔら（１９９１）はまた、ＭＰＬが、ＴＮＦ活性を誘導することを示す。ＭＰＬは、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの放出を誘導するためにＴＮＦ−αと共に作用することが知られている。ＭＰＬに応答した、Ｔ細胞によるＩＮＦ−γ産生はまた、ＴｏｍａｉおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８９）、ならびにＯｄｅａｎら（１９９０）によって実証されている。
【０１２１】
ＭＰＬはまた、強力なＴ細胞アジュバントであることが公知である。例えば、ＭＰＬは、黒色腫抗原特異的ＣＴＬの増殖を刺激する（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９８８、１９９３）。さらに、Ｂａｋｅｒら（１９８８ｂ）は、非毒性ＭＰＬがサプレッサーＴ細胞活性を不活性化することを示した。当然、生理学的環境において、Ｔサプレッサー細胞の不活性化は、例えば、抗体産生を増大させることによって認められるように、動物に対する利点を増大させることを可能にする。ＪｏｈｎｓｏｎおよびＴｏｍａｉ（１９８８）は、ＭＰＬのアジュバント作用の、潜在的な細胞性メディエータおよび分子メディエータに関して報告した。
【０１２２】
ＭＰＬはまた、セロトニン分泌の誘導（Ｇｒａｂａｒｅｋら、１９９０）の前に、血小板の凝集および血小板タンパク質のリン酸化を誘導することが知られている。この研究は、ＭＰＬが、プロテインキナーゼＣ活性化およびシグナル伝達に関与することを示す。
【０１２３】
ＭＰＬの構造および機能に関する多くの論文が挙げられる。これらは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｒｅ５９５リポ多糖類から得られたＭＰＬホモログの構造的特徴づけを記載するＪｏｈｎｓｏｎら（１９９０）の論文を含む。Ｇｒａｂａｒｅｋら（１９９０）と共通して、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９０）の研究は、ＭＰＬの脂肪酸部分が、市販の種においてでさえも変動し得ることを示す。薄層クロマトグラフィーによる８つの画分へのＭＰＬの分離において、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９０）は、ヒト血小板応答を用いて評価した場合、３つの画分が特に活性であったことを発見した。種々のＭＰＬ種の化学成分は、Ｊｏｈａｎｓｏｎら（１９９０）によって特徴付けられた。
【０１２４】
Ｂａｋｅｒら（１９９２）は、リピドＡおよびそのアナログが、サプレッサＴ細胞活性の発現を消滅させる能力に影響する構造的特徴をさらに分析した。彼らは、リピドＡ中のリン酸基の数を２から１へ減少すること（すなわち、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を作出すること）ならびに脂肪アシル含量を減少させること（主として、３位の残基を除去することによる）が、毒性の漸進的な減少を生じるが、しかし、これらの構造改変は、Ｔｓ機能の発現を消滅させるその能力に影響しないことを報告した（Ｂａｋｅｒら、１９９２）。これらのタイプのＭＰＬは、本発明における使用に理想的である。
【０１２５】
Ｂａｋｅｒら（１９９２）はまた、脂肪アシル含量を５から４に減少すること（リピドＡ前駆体ＩＶＡまたはＩａ）が、Ｔｓ機能に影響する能力を除去するが、Ｂ細胞のポリクローナル活性化を誘導する能力は除去しないことを示した。これらの研究は、Ｔｓ機能の発現を消滅させるために、リピドＡがグルコサミン二糖でなければならず、１つまたは２つのいずれかのリン酸基を有し得、そして少なくとも５つの脂肪アシル基を有しなければならないことを示す。また、ヒドロキシル化されていない脂肪酸の鎖長ならびにアシルオキシアシル基の位置（２’位  対  ３’位）は、重要な役割を果たし得る（Ｂａｋｅｒら、１９９２）。
【０１２６】
サプレッサＴ細胞（Ｔｓ）活性の発現を消滅させるリピドＡの能力に関する脂肪アシル基の鎖長と位置との間の関係を調べた際に、Ｂａｋｅｒら（１９９４）は、Ｃ１２〜Ｃ１４の脂肪アシル鎖長が、生物活性に最適なようであることを見出した。従って、それらの使用もなお可能であるが、比較的短い鎖長（Ｃ１０〜Ｃ１２（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ由来））または主として長い鎖長（Ｃ１８（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来））を有するリピドＡ調製物は、本発明における使用には、やや好ましくない。
【０１２７】
Ｂａｋｅｒら（１９９４）はまた、主として、このようなオリゴ糖（グラム陰性細菌間で構造が比較的保存されている）が、関連のない微生物抗原に対する通常の抗体応答の過程で生成されるＣＤ８＋  Ｔｓの集団に対して成長するかまたは伸長する能力に起因して、いくつかの細菌性リポ多糖のリピドＡに近位の内部コア領域オリゴ糖がＴｓ活性の発現を増大させることを示した。観察された付加された免疫抑制の発現に必要な最小限の構造は、２つのピロホスホリルエタノールアミン基を結合した、１つの２−ケト−３−デオキシオクトネート残基、２つのグルコース残基、および３つのヘプトース残基を含む六糖であることが報告された（Ｂａｋｅｒら、１９９４）。この情報は、本発明において使用されるさらなるアジュバントを用いる際、または設計する際ですら考慮され得る。
【０１２８】
一般に関連した流れの研究において、Ｔａｎａｍｏｔｏら（１９９４ａ；ｂ；１９９５）は、アセチル化またはスクシニル化後の化学合成リピドＡ前駆体における内毒素活性の解離を記載した。従って、「アセチル４０６」および「スクシニル５１６」（Ｔａｎａｍｏｔｏら、１９９４ａ；ｂ；１９９５）のような化合物もまた、本発明における使用が考慮される。
【０１２９】
合成ＭＰＬは、抗原の特に好ましい基を形成する。例えば、Ｂｒａｄｅら（１９９３）は、抗リピドＡ  ＭＡｂに結合するリピドＡのビスリン酸化（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）グルコサミン二糖骨格を含む人工糖結合体を記載した。これは、本発明の特定の局面において使用される１つの候補である。
【０１３０】
米国特許第４，９８７，２３７号に記載のＭＰＬ誘導体は、本発明の使用について特に考慮される。米国特許第４，９８７，２３７号は、モノホスホリルリピドＡ核の主要ヒドロキシル基にエステル基を通して結合した側鎖上に１つ以上の遊離基（例えば、アミン）を含むＭＰＬ誘導体を記載する。誘導体は、種々の生物学的に活性な物質にカップリング剤を通じてリピドＡをカップリングするための簡便な方法を提供する。リピドＡの免疫刺激特性が維持される。米国特許第４，９８７，２３７号に従う全てのＭＰＬ誘導体が、本発明のＭＰＬアジュバント取り込み細胞において使用することが想起される。
【０１３１】
種々のアジュバント（ヒトにおいて一般的に使用されないアジュバントでさえ）が、例えば、抗体を惹起させたり、または続いて活性化Ｔ細胞を得たりすることを望む動物において、なお使用され得る。アジュバントまたは細胞のいずれからも生じ得る毒性または他の有害な作用（例えば、非照射腫瘍細胞を用いて生じ得るような）は、このような状況において無関係である。
【０１３２】
本明細書中に提供されるワクチンにおいて、アジュバント組成物は、好ましくは、主にＴｈ１型の免疫応答を誘導するように設計される。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与される抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ（１９８９）を参照のこと。
【０１３３】
Ｔｈ１型優勢の応答を誘発するための好ましいアジュバントは、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組み合わせを含む。ＭＰＬアジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として詳細に援用される）を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）もまた、Ｔｈ１優勢の応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、そして例えば国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５５５および国際特許出願公開番号ＷＯ９９／３３４８８に記載される。免疫賦活剤ＤＮＡ配列がまた、例えば、Ｓａｔｏら（１９９６）によって記載される。別の好ましいアジュバントは、サポニン（好ましくは、ＱＳ２１）（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）であり、これは、単独または他のアジュバントと組み合わせて使用され得る。例えば、増強された系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ、例えば、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ９４／００１５３を参照のこと）、またはＱＳ２１がコレステロールでクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）される、低反応発生性（ｌｅｓｓ  ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）の組成物（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／３３７３９を参照のこと）を含む。他の好ましい処方物は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油型エマルジョン中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを使用する、別の特に好ましいアジュバント処方物もまた、記載されている（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１７２１０を参照のこと）。
【０１３４】
他の好ましいアジュバントとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、アジュバントのＳＢＡＳシリーズ（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）が挙げられる。
【０１３５】
本明細書中に提供される任意のワクチンは、１つ以上の抗原、１つ以上の免疫賦活剤もしくはアジュバント、および１つ以上の適切なキャリア、賦形剤、もしくは薬学的に受容可能な緩衝液の組み合わせを生じる周知の方法を用いて調製され得る。本明細書中に記載の組成物は、徐放性処方物（すなわち、投与後に化合物の緩慢な放出を生じるカプセル、スポンジ、またはゲル［例えば、多糖で構成される］のような処方物）の一部として投与され得る。このような処方物は、一般に、周知の技術を用いて調製され得る（Ｃｏｏｍｂｅｓら、１９９６）、そして、例えば、経口、直腸、もしくは皮下移植により、または所望の標的部位への移植により、投与され得る。徐放性処方物は、キャリアマトリックス中に分散されるか、および／または速度制御性の膜に取り囲まれたレザバー内に含まれた、ペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体を含み得る。
【０１３６】
このような処方物内での使用のためのキャリアは、好ましくは、生体適合性であり、そしてまた生分解性であり得る。好ましくは、この処方物は、比較的一定レベルの活性成分の放出を提供する。このようなキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の遅延放出キャリアとしては、非液性（ｎｏｎ−ｌｉｑｕｉｄ）親水性コア（例えば、架橋ポリサッカリドまたはオリゴサッカリド）、および必要に応じて、両親媒性化合物を含む外部層（例えば、リン脂質）（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号；国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２００７８；国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２３７０１；および国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０６６３８）を含む超分子バイオベクターが挙げられる。徐放性処方物内に含まれる活性な化合物の量は、移植の部位、放出の速度および予期される放出持続期間、ならびに処置または予防されるべき状態の性質に依存する。
【０１３７】
種々の送達ビヒクルのいずれかが、腫瘍細胞を標的化する抗原特異的免疫応答の生成を促進するために、薬学的組成物およびワクチン内に用いられ得る。送達ビヒクルとしては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、および有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）が挙げられる。このような細胞は、抗原を提示する能力を増大するように、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を改良するように、それ自体で抗腫瘍効果を有するように、そして／あるいは受け手と免疫学的に適合性（すなわち、ＨＬＡハプロタイプの適合）であるように遺伝学的に改変されてもよいが、改変される必要はない。ＡＰＣは、一般に、種々の生物学的な流体および器官（腫瘍および腫瘍周辺組織を含む）のいずれかから単離されてもよいし、そして自己細胞、同種異系細胞、同系細胞、または異種細胞であってもよい。
【０１３８】
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、１９９８）、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫を惹起するための生理学的アジュバントとして有効であることが示されてきた（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、１９９９）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは目に見える顕著な細胞質突起（樹状突起）を有する）、高い効率で抗原を取り込み、プロセシングし、そして提示するそれらの能力、および未刺激Ｔ細胞応答を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。もちろん樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このような改変樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替物として、分泌小胞抗原ローディング樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、１９９８）。
【０１３９】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または任意の他の適切な組織もしくは流体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドならびに／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを添加することによって、樹状細胞に分化され得る。
【０１４０】
樹状細胞は、「未成熟」細胞および「成熟」細胞として便宜的に分類され、このことは、２つの充分に特徴付けられた表現型の間を単純な方法で区別することを可能にする。しかしこの命名は、分化のあらゆる可能な中間段階を排除すると解釈されるべきではない。未成熟樹状細胞は、抗原の取り込みおよびプロセシングの高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化を担う細胞表面分子の高発現ではなく、これらのマーカーのより低い発現によって特徴付けられる。
【０１４１】
ＡＰＣは、一般に、血液悪性関連ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされ得、その結果、このペプチドまたはその免疫原性部分が細胞表面上に発現される。このようなトランスフェクションはエキソビボで生じ得、次いでこのようなトランスフェクトされた細胞を含む組成物またはワクチンが、本明細書中に記載されるように、治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与され得、インビボで起こるトランスフェクションを生じる。樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ９７／２４４４７に記載される方法、またはＭａｈｖｉら（１９９７）によって記載される遺伝子銃アプローチのような当該分野で公知の任意の方法を使用して一般に実施され得る。樹状細胞の抗原ローディングは、樹状細胞または前駆細胞を、血液悪性関連ペプチド、ＤＮＡ（裸のもしくはプラスミドベクター中の）またはＲＮＡ；あるいは抗原発現性組換え細菌またはウイルス（例えば、牛痘、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクター）とインキュベートすることによって達成され得る。ローディングの前に、このペプチドは、Ｔ細胞の補助を提供する免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に共有結合され得る。あるいは、樹状細胞は、別々にまたはポリペプチドの存在下で、結合していない免疫学的パートナーでパルスされ得る。
【０１４２】
組み合わせ治療もまた意図され、そして基礎となる薬学的組成物の同じタイプが、単一の医薬品および医薬品組み合わせの両方のために使用され得る。ワクチンおよび薬学的組成物は、単位投薬または多投薬の容器（例えば、密封されたアンプルもしくはバイアル）中に入れられ得る。このような容器は、好ましくは、使用するまで、処方物の滅菌性を保持するために、密封される。一般に、処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中に懸濁液、溶液、または乳濁液として貯蔵され得る。あるいは、ワクチンまたは薬学的組成物は、使用直前に滅菌液体キャリアの添加のみを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵され得る。
【０１４３】
（４．５  血液悪性疾患のための診断方法および予後判定方法）
本発明は、本明細書中に開示されたポリペプチド組成物またはポリヌクレオチド組成物の１つ以上と関連した悪性疾患を検出するための方法、およびこのような疾患のための免疫化または治療の有効性をモニタリングするための方法をさらに提供する。本明細書中に開示されたポリペプチド組成物またはポリヌクレオチド組成物の１つ以上と関連した悪性疾患の存在または不在を決定するために、患者は、このような組成物の１つ以上に特異的なＴ細胞のレベルについて試験され得る。特定の方法では、本明細書中に記載のように、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルが、本明細書中で開示されたポリペプチド組成物またはポリヌクレオチド組成物の１つ以上、および／またはこのようなペプチドまたはポリペプチドの１つ以上を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法によって）患者から単離され得る。Ｔ細胞は、２〜９日間（代表的に４日間）、３７℃にて、開示されたペプチド組成物、ポリペプチド組成物、またはポリヌクレオチド組成物の１つ以上（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともにインビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立てるために、当該組成物の非存在下でインキュベートすることが所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して、活性化は好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては、活性化は好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患のない患者におけるよりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルは、開示されたポリペプチド組成物またはポリヌクレオチド組成物の１つ以上の発現と関連した悪性疾患の存在を示す。当該分野で周知の方法を用いて、増殖レベルおよび／または細胞溶解活性レベルと、治療に対する推定応答との間でさらなる相関付けがなされる。特に、より高い抗体の増殖応答および／または溶解応答を提示する患者が、より大きな治療応答性を示すことが予期され得る。
【０１４４】
他の方法において、患者から得られた生物学的サンプルは、本明細書中で開示された血液悪性関連ペプチドまたはポリペプチドの１つ以上について特異的である抗体のレベルについて試験される。この生物学的サンプルは、血液悪性関連ペプチドもしくはポリペプチド、またはこのようなペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはこのようなペプチドもしくはポリペプチドを発現するＡＰＣと共に、免疫複合体が形成するのに十分な条件下かつ時間内で、インキュベートされる。選択されたペプチドもしくはポリペプチドと、この選択されたペプチドもしくはポリペプチドに特異的に結合する生物学的サンプル中の抗体との間で形成された免疫複合体が、次いで、検出される。このような方法において使用するための生物学的サンプルは、抗体を含むことが予想される患者から得られる任意のサンプルであり得る。適切な生物学的サンプルとしては、血液、血清、腹水、骨髄、胸水、および脳脊髄液が挙げられる。
【０１４５】
生物学的サンプルは、反応混合物中の選択されたペプチドもしくはポリペプチドと共に、選択されたペプチドもしくはポリペプチドと、このようなペプチドもしくはポリペプチドに免疫特異的である抗体との間で、免疫複合体が形成するのに十分な条件下かつ時間内で、インキュベートされる。例えば、生物学的サンプルおよび選択されたペプチドもしくはポリペプチドは、４℃で２４〜４８時間の間、インキュベートされ得る。
【０１４６】
インキュベーションの後、反応混合物は、免疫複合体の存在について試験される。選択されたペプチドもしくはポリペプチドと、生物学的サンプル中に存在する抗体との間で形成された免疫複合体の検出は、種々の公知の技術（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって達成され得る。適切なアッセイは、当該分野で周知であり、そして学術文献および特許文献において十分に記載されている  （ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）。使用され得るアッセイとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：二重モノクローナル抗体サンドイッチ免疫アッセイ技術（米国特許第４，３７６，１１０号）；モノクローナル−ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ（Ｗｉｄｅら、１９７０）；「ウエスタンブロット」法（米国特許第４，４５２，９０１号）；標識リガンドの免疫沈降（Ｂｒｏｗｎら、１９８０）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＲａｉｎｅｓおよびＲｏｓｓ、１９８２）；免疫細胞化学技術（蛍光色素の使用を含む）（Ｂｒｏｏｋｓら、１９８０）；および活性の中和  （Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅら、１９８４）。他の免疫アッセイとしては、以下に記載のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第３，８１７，８２７号；同第３，８５０，７５２号；同第  ３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；ならびに同第４，０９８，８７６号。
【０１４７】
検出目的のために、選択されたペプチドもしくはポリペプチドは、標識されても標識されなくてもよい。未標識のポリペプチドペプチドは、凝集アッセイにおいて、または免疫複合体に結合する標識検出試薬（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチン、および選択された血液悪性関連ペプチドもしくはポリペプチドに特異的に結合する抗体に結合可能である二次抗体またはその抗原結合フラグメント）と組み合わせて、使用され得る。選択されたペプチドもしくはポリペプチドが標識されている場合、レポーター基は、当該分野で公知の任意の適切なレポーター基であり得、このようなレポーター基としては、放射性同位体、蛍光基、発光基、酵素、ビオチンおよび色素粒子が挙げられる。
【０１４８】
特定のアッセイにおいて、未標識のペプチドもしくはポリペプチドが固体支持体上に固定化される。この固体支持体は、このペプチドが結合され得る、当業者にとって公知の任意の物質であり得る。例えば、この固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロセルロースもしくは他の適切なメンブレンであり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックス、または、ポリスチレンもしくはポリビニルクロライドのようなプラスチック材料）であり得る。この支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示されるもののような）であり得る。ペプチドは、特許文献および科学文献に十分に記載される、当業者に公知である種々の技術を用いて、固体支持体上に固定化され得る。本発明の文脈において、用語「固定化」とは、非共有結合的な結合（例えば、吸着）および共有結合的な結合（これは、薬剤と支持体上の官能基との間の直接的な連結であり得るか、または架橋剤による連結であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレート中のウェルまたはメンブレンへの吸着による固定化が好ましい。このような場合において、吸着は、適切な時間の間、固体支持体と、適切な緩衝液中で、選択されたペプチドまたはポリペプチドを接触させることによって達成され得る。接触時間は温度によって変動し得るが、代表的には、約１時間と約１日間との間である。一般的に、プラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロライド）のウェルを、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、および好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの量の範囲の量のペプチドと接触させることが、適切な量のペプチドを固定化するために十分である。
【０１４９】
固定化後、支持体上の残ったタンパク質結合部位は、代表的に、ブロックされる。当業者に公知である任意の適切なブロッキング剤（例えば、ウシ血清アルブミン、ＴｗｅｅｎＴＭ  ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、熱不活性化正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、またはＢＬＯＴＴＯ（防腐剤、塩類、および消泡剤もまた含有する脱脂粉乳の緩衝化溶液））が使用され得る。次いで、この支持体は、特異的抗体を含有する疑いのある生物学的サンプルと共にインキュベートされる。このサンプルは、そのまま適用され得るか、またはより頻繁には、通常、少量（０．１重量％〜５．０重量％）のタンパク質（例えば、ＢＳＡ、ＮＧＳ、またはＢＬＯＴＴＯ）もまた含有する緩衝化溶液中に希釈され得る。一般的に、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、選択されたペプチドもしくはポリペプチドについて免疫特異的である抗体もしくは抗原結合フラグメントの存在を、このような抗体もしくはそれらの結合フラグメントを含むサンプル内で検出するに十分である時間の間である。好ましくは、接触時間は、結合した抗体と結合していない抗体との間の平衡において達成される結合のレベルの少なくとも約９５％である結合のレベルを達成するに十分である時間の間である。当業者は、平衡を達成するのに必要な時間が、時間の間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって容易に決定され得ることを理解する。室温においては、約３０分間のインキュベーション時間が、一般的に十分である。
【０１５０】
次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％ＴｗｅｅｎＴＭ２０を含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去され得る。次いで、免疫複合体に結合し、そして少なくとも第１の検出可能な標識または「レポーター」分子を含む検出試薬が添加され得る。検出試薬は、免疫複合体とともに、結合した抗体またはそのフラグメントに結合している抗原を検出するために十分な量の時間インキュベートされる。適切な量の時間は、一般的に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、非結合の標識または検出試薬は除去され、そして結合した標識または検出試薬が、適切なアッセイまたは分析機器を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光部分あるいは化学発光部分および種々の色素原標識、蛍光標識などを検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性基もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼ）は、一般的に、基質の添加（一般的には、特定の時間の間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。使用される特定の方法に関わらず、バックグラウンド（すなわち、疾患のない個体から得られた生物学的サンプルに対し観察されたレベル）の少なくとも２倍である、結合した検出試薬のレベルは、選択したペプチドまたはポリペプチドの発現に関連する悪性疾患の存在を示す。
【０１５１】
一般的に、免疫または治療の有効性をモニタリングする方法としては、サンプル中、または動物（例えば、ヒトの患者）中の選択したペプチドまたはポリペプチドに特異的な抗体またはＴ細胞のレベルの変化のモニタリングが挙げられる。抗体レベルをモニタリングする方法としては、以下の工程が包含される：（ａ）治療または免疫する前の患者から得られた、第１の生物学的サンプルを、選択したペプチドまたはポリペプチドとインキュベーションする工程であって、ここで、このインキュベーションは、免疫複合体の形成を可能にするために十分な条件下および時間で行われる、工程；（ｂ）選択したペプチドまたはポリペプチドと抗体または抗原結合フラグメントとの間で形成された免疫複合体を検出する工程であって、この免疫複合体は、選択したペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合する、工程；（ｃ）後の時点（例えば、治療または免疫が与えられた後）で患者から得られた第２の生物学的サンプルを使用して工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）第１の生物学的サンプルで検出された免疫複合体の数を、第２の生物学的サンプルで検出された免疫複合体の数と比較する、工程。あるいは、選択したペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または選択したペプチドもしくはポリペプチドを発現するＡＰＣは、選択したペプチドまたはポリペプチド自体の代わりに使用され得る。このような方法で、生物学的サンプル中の、選択したペプチドまたはポリペプチド（ポリヌクレオチドによりコードされるか、またはＡＰＣにより発現される）と抗体および／または抗原結合フラグメントとの間の免疫複合体が、検出される。
【０１５２】
Ｔ細胞活性化および／または血液悪性腫瘍のポリペプチド特異的な前駆体の数をモニタリングする方法は、以下の工程を包含し得る：（ａ）治療または免疫の前の患者から得られたＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞を含む第１の生物学的サンプル（例えば、骨髄、末梢血またはそれらの画分）を、血液悪性腫瘍のペプチドまたはポリペプチドとともにインキュベーションする工程であって、ここでこのインキュベーションが、Ｔ細胞の特異的活性化、増殖および／または溶解を可能にするために十分な条件下および時間で行われる、工程；（ｂ）Ｔ細胞の活性化、増殖、および／または溶解の量を検出する、工程；（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、そして治療または免疫後の同じ患者から得られた第２の生物学的サンプルを使用して、工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）第１の生物学的サンプル中のＴ細胞の活性化、増殖、および／または溶解の量を、第２の生物学的サンプル中のＴ細胞の活性化、増殖、および／または溶解の量と比較する、工程。あるいは、血液悪性腫瘍関連のペプチド、またはこのようなペプチドを発現するＡＰＣは、血液悪性腫瘍のペプチド自体の代わりに使用され得る。
【０１５３】
このような方法で使用される生物学的サンプルは、抗体、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含むと予想される患者から得られた任意のサンプルであり得る。適切な生物学的サンプルとしては、血液、血清、腹水、骨髄、胸水および脳脊髄液が挙げられる。第１の生物学的サンプルは、治療または免疫の開始の前または治療またはワクチンレジメンの途中で得られ得る。第２の生物学的サンプルは、同様の方法であるが、さらなる治療または免疫の後の時点で得られ得る。第２の生物学的サンプルは、治療または免疫の完了または途中で得られ得、第１の生物サンプルと第２の生物サンプルの間の分離を起こす、治療または免疫の少なくとも一部分を提供する。
【０１５４】
両方のサンプルのインキュベーションおよび検出の工程は、一般的に上記のように行われる。第１のサンプルに対する第２のサンプル中の免疫複合体の数における統計学的に有意な増加は、成功した治療または免疫を反映する。
【０１５５】
（４．６  薬学的組成物および薬学的処方物の投与）
特定の実施形態において、本発明は、単独でか、あるいは抗癌治療の１つ以上の様式と組み合わせてか、または１つ以上の診断薬または治療薬と組み合わせてかのいずれかで細胞または動物に投与されるための、薬学的に受容可能な溶液中の、本明細書中で開示された１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、または抗原結合フラグメント組成物の処方に関連する。
【０１５６】
所望の場合、本明細書中に開示された核酸セグメント、ＲＮＡ、またはＤＮＡ組成物は、同様に他の薬物（例えば、タンパク質またはペプチドあるいは様々な薬学的に活性な物質）と組み合わされて投与され得る。この組成物が本明細書中に開示される少なくとも１つの遺伝子発現構築物を含む限り、標的細胞または宿主組織との接触に、顕著に有害な影響を引き起こさない、さらなる物質を含み得るかまたは生じ得る、他の組成物に実質的に限定されない。従って、ＲＮＡ由来組成物またはＤＮＡ由来組成物は、特定の例において必要とされるような様々な他の物質と共に送達され得る。このようなＲＮＡ組成物またはＤＮＡ組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、または本明細書中に記載されるように化学的に合成され得る。同様に、このような組成物は、単独でか、修飾されたペプチド誘導体または核酸置換誘導体、および／または他の抗癌治療剤と組み合わせてかのいずれかで、１つ以上の治療遺伝子構築物を含み得る。
【０１５７】
当業者に周知な薬学的に受容可能な賦形剤およびキャリア溶液の処方は、様々な処置様式において、本明細書に記載された特定の組成物の使用に適した投薬および処置様式の開発であり、例えば、経口、静脈内、鼻腔内、経皮、前立腺内、腫瘍内、および／または筋肉内投与および処方が挙げられる。
【０１５８】
（４．６．１  注入可能な送達）
例えば、本明細書中で開示された薬学的な組成物は、非経口的、静脈内、筋肉内、または米国特許第５，５４３，１５８号、同５，６４１，５１５号、同５，３９９，３６３号（各々、その全体が参考として本明細書中に特別に援用される）に記載されるように腹膜内にまでも投与され得る。遊離基または薬理学的に受容可能な塩のような活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適当に混合された水の中で、調製され得る。分散はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物ならびに油中において調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調整物は、保存剤を含有し、微生物の増殖を防ぐ。
【０１５９】
注入可能な使用に適した薬学的形態としては、滅菌水溶液または分散および滅菌した注射用溶液または分散の即席調整物のための滅菌粉末が挙げられる（米国特許第５，４６６，４６８号、その全体が参考として本明細書中に特別に援用される）。全ての場合において、形態は、滅菌であるべきであり、そして容易な注射可能性が存在する範囲の流体であるべきである。その形態は、製造および保存の条件下で、安定であるべきであり、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の混入活性に対して保存されるべきである。キャリアは、溶媒または分散媒体であり得、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロプレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散の場合、所望の粒子サイズの維持および界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の活性阻害は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）により成し遂げられ得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩酸）を含むことが好ましい。注射用組成物の長時間吸収は、吸収を遅延する薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）と組み合わせて使用することにより成し遂げられ得る。
【０１６０】
水溶液中の非経口投与に対し、例えば、溶液は必要な場合適切に緩衝化され得、そして希釈液は、まず十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされ得る。これら特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与が特に適切である。この結合において、利用され得る滅菌水性培地は、本開示の権利内で当業者に公知である。例えば、１つの投薬量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または適切な注入部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、Ｈｏｏｖｅｒ，１９７５を参照のこと）。処置される被験者の状態により、いくつかの投薬量変化が、必然的に生じる。投与の責任者が、いかなる場合でも、個々の非験体に適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与に対し、調製物は、無菌性、発熱性、および一般的な安全性およびＦＤＡ  ＯｆｆｉｃｅのＢｉｏｌｏｇｉｃｓ基準により要求されるような純度基準を満たし得る。
【０１６１】
滅菌した注射用溶液は、遺伝子治療構築物を、必要とされる量、上に列挙されたいくつかの他の成分を有する適切な溶媒中に取り込むことにより調製され得、必要とされる場合、濾過滅菌され得る。一般的に、分散は、様々な滅菌した活性成分を、基礎分散媒体および上に列挙される必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに取り込むことにより調製される。滅菌された注射用溶液の調製の滅菌された粉末の場合、調製の好ましい方法は、以前に滅菌されたその溶液から活性成分の粉末およびいくつかのさらなる所望の成分を産生する真空乾燥法および凍結乾燥法である。
【０１６２】
本明細書中で開示された組成物は、中性または塩形態で処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩が挙げられ、そして無機酸（例えば、塩酸、リン酸）、または例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などといった有機酸で形成される。遊離カルボキシル基でに形成される塩はまた、無機ベース（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第２鉄）および例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどといった有機ベースから生じ得る。処方において、溶液は、投薬処方物に適応する方法で、治療的に有効な量で投与され得る。この処方物は、様々な投薬形態（例えば、注射用溶液、薬物放出カプセルなど）で容易に投与される。
【０１６３】
本明細書中で使用される場合、「キャリア」としては、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌性剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどが挙げられる。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体または薬剤の使用は、当該分野で周知である。従来の媒体または薬剤の範囲以外は、活性成分に不適合であり、治療組成物におけるその使用が、検討される。補足的な活性成分がまた、組成物中に取り込まれ得る。
【０１６４】
（４．６．２  鼻腔内送達）
１つ以上の開示されたペプチドおよびポリペプチドを用いる、血液悪性腫瘍をの処置のための鼻内溶液または鼻内噴霧、鼻内エアロゾルまたは吸入薬でさえも使用され得る。鼻内溶液は、通常、水滴またはスプレーで鼻腔への投与のために設計された水溶液である。鼻内溶液は、鼻分泌物に多くの点で似るように、正常の繊毛作用が持続されるように調製され得る。従って、水性鼻内溶液は、通常等張性であり、そしてわずかに緩衝化され、約５．５〜約６．５のｐＨを維持する。加えて、眼科調製物中で使用されるものと同じ抗菌保存剤、および適切な薬物安定剤は、必要とされる場合、処方物中に含まれ得る。様々な市販の鼻内調製物が公知である。
【０１６５】
吸入薬および吸入剤は、薬物または化合物を、患者の呼吸樹に送達するために設計された薬学的な調製物である。蒸気またはミストは、投与され、そして作用領域に到達し、しばしば気管支うっ血および鼻詰まりの症状から救済する。しかし、この経路はまた、薬剤を体循環に送達するためにも利用され得る。吸入薬は、経鼻呼吸性経路または経口呼吸性経路により投与され得る。ミストが細気管支に到達するように液滴が十分に小さくかつ均一な場合、吸入薬溶液の投与のみが有用である。
【０１６６】
産物の別の群（吸入薬としても知られ、そしてしばしば吸入剤と呼ばれる）は、細かく粉末化された薬物または液状の薬物からなる。このような薬物は、薬物の溶液または懸濁液を、液化ガス噴霧剤中に保持する、特別な送達系（例えば、薬学的なエアロゾル）の使用により気道に運ばれる。適切な弁および口内アダプターで放出された場合、吸入薬の測定された用量は、患者の気道に推進される。
【０１６７】
粒子サイズは、調製物のこの型の投与において重要である。肺胞への侵入に最適な粒子サイズは、約０．５〜約７μｍの状態であることが報告されている。微細なミストは、加圧エアロゾルにより生成され、従って、これらは有用と見なされる状態において使用される。
【０１６８】
（４．６．３  リポソーム、ナノカプセルおよびミクロ粒子媒介送達）
特定の実施形態において、本発明者らは、本発明のポリヌクレオチド組成物の適切な宿主細胞への導入のための、リポソーム、ナノカプセル、ミクロ粒子、マイクロスフェア脂質粒子、小胞などの使用を企図する。特に、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化された、本発明のポリヌクレオチド組成物が、送達のために処方され得る。
【０１６９】
このような処方物は、本明細書中に開示された核酸の薬学的に受容可能な処方物の導入に好まれ得る。リポソームの形成および使用は、一般的に当業者に公知である（例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら，１９７７；Ｃｏｕｖｒｅｕｒ，１９８８；Ｌａｓｉｃ，１９８８（これらは、細胞内細菌感染および疾患に対する、標的の抗体治療においてリポソームおよびナノカプセルの使用を記載する）参照のこと）。近年、改良された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（ＧａｂｉｚｏｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，１９８８；ＡｌｌｅｎおよびＣｈｏｕｎ，１９８７；米国特許第５，７４１，５１６号、その全体が、参考として本明細書中に特別に援用される）。さらに、可能な薬物キャリアとしてのリポソーム様調製物の様々な方法が概説されている（Ｔａｋａｋｕｒａ，１９９８；Ｃｈａｎｄｒａｎら，１９９７；Ｍａｒｇａｌｉｔ，１９９５；米国特許第５，５６７，４３４号；同第５，５５２，１５７号；同第５，５６５，２１３号；同第５，７３８，８６８号および同第５，７９５，５８７号、その全体が、参考として本明細書中に特別に各々援用される）。
【０１７０】
リポソームは、トランスフェクションに対して通常は抵抗性である多くの細胞型と共に、Ｔ細胞上清、初期肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順により、うまく使用される（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら，１９９０；Ｍｕｌｌｅｒら，  １９９０）。さらに、リポソームは、ウイルスベース送達系に典型的なＤＮＡ長の束縛がない。リポソームは、効果的に使用され、遺伝子、薬物（ＨｅａｔｈおよびＭａｒｔｉｎ，１９８６；Ｈｅａｔｈら，１９８６；Ｂａｌａｚｓｏｖｉｔｓら，１９８９；ＦｒｅｓｔａおよびＰｕｇｌｉｓｉ，１９９６）、放射線治療剤（Ｐｉｋｕｌら，１９８７）、酵素（Ｉｍａｉｚｕｍｉら，１９９０ａ；Ｉｍａｉｚｕｍｉら，１９９０ｂ）、ウイルス（ＦａｌｌｅｒおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８４）、転写因子およびアロステリック・エフェクター（ＮｉｃｏｌａｕおよびＧｅｒｓｏｎｄｅ，１９７９）を、様々な培養細胞株および動物に導入する。さらに、リポソーム媒介薬物送達の有効性を試験する、いくつかの成功した臨床試験が完成されている（Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎら，１９８５ａ；１９８５ｂ；Ｃｏｕｎｅ，１９８８；Ｓｃｕｌｉｅｒら，１９８８）。さらに、いくつかの研究は、全身送達後、リポソームの使用が自己免疫応答、毒性または生殖腺局在に関連しないことを示唆する（ＭｏｒｉおよびＦｕｋａｔｓｕ，１９９２）。
【０１７１】
リポソームは、水性媒体中で分散するリン脂質から形成され、そして自発的に多層状同心性（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ）の二重層ビヒクル（多層状ビヒクル（ＭＬＶ）とも称される）を形成する。ＭＬＶは、一般的に２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００〜５００Åの範囲の直径を有し、その核に水溶液を含有する、小さな単層ビヒクル（ＳＵＶ）の形成を生じる。
【０１７２】
リポソームは細胞膜と類似し、そしてペプチド組成物のキャリアとして、本発明と共に使用するために企図される。それらは、水溶性物質および油溶性物質の両方が、取り込まれ得る（すなわち、それぞれ、水性空間（ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｐａｃｅ）および二重層自体中）ため、幅広く適している。薬物保有リポソームは、リポソーム処方物を選択的に改変することにより、活性因子の部位特異的送達でも利用され得る。
【０１７３】
Ｃｏｕｖｒｅｕｒら（１９７７；１９８８）の技術に加え、以下の処方物が、リポソーム処方物の生成において利用され得る。リン脂質は、水中で分散した場合、水に対する脂質のモル比に基づいて、リポソーム以外の様々な構造を形成し得る。低い割合で、リポソームは好ましい構造である。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価の陽イオンの存在に基づく。リポソームは、イオン性物質および極性物質に対して低い浸透性を示すが、高い温度で、浸透性を顕著に変化させる相転移を起こす。相転移は、密接に充填され、規則的な構造（ゲル状態として知られる）からゆるく充填され、あまり規則的ではない構造（流体状態として知られる）への変化を含む。この変化は、特有の相転移温度で生じ、イオン、糖、および薬物に対する浸透性を増加させる。
【０１７４】
あるいは、本発明は、本発明のポリヌクレオチド組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは、一般的に化合物を安定かつ再現性のある方法で取りこみ得る（Ｈｅｎｒｙ−Ｍｉｃｈｅｌｌａｎｄら，１９８７；Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら，１９９８；Ｄｏｕｇｌａｓら，１９８７）。細胞内重合過負荷による副作用を避けるため、このような超微細粒子（約０．１μｍの大きさ）は、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計され得る。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノカプセルは、本発明における使用に企図され、そしてこのような粒子は、以下に記載されるように、容易に作製され得る（Ｃｏｕｖｒｅｕｒら，１９８０；１９８８；ｚｕｒ  Ｍｕｈｌｅｎら，１９９８；Ｚａｍｂａｕｘら，１９９８；Ｐｉｎｔｏ−Ａｌｐｈａｎｄｒｙら，１９９５および米国特許第５，１４５，６８４号（その全体が参考として本明細書中に詳細に援用される））。特に、ナノカプセルまたはナノスフェア（Ｓｃｈｗａｂら，１９９４；Ｔｒｕｏｎｇ−Ｌｅら，１９９８）のいずれかを用いてポリヌクレオチドを標的細胞に送達する方法はまた、動物（特にヒト）への投与のための開示された組成物の処方において有用であることが特に企図される。
【０１７５】
（４．７  治療剤およびキット）
本発明はまた、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤、キャリア、希釈剤、アジュバント、および／または医薬の調製に使用するための他の成分、または診断試薬と共に処方された血液悪性関連組成物の１つ以上、ならびにその必要のある動物への投与、または本明細書中に記載の１つ以上の血液悪性関連化合物に特異的であるポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または抗体を同定するための１つ以上の診断アッセイにおける使用が意図される、このような組成物、医薬品、または処方物の１つ以上を含む種々のキットを提供する。開示されたエピトープ、抗体、および抗原結合フラグメントに加えて、抗体または抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド、またはさらなる抗癌剤、ポリヌクレオチド、ペプチド、抗原、または他の治療化合物が、本明細書中に開示の特定の組成物または処方物の処方において、および特に、罹患した哺乳動物への投与のために抗癌剤または抗血液悪性治療の調製において使用され得る。
【０１７６】
従って、本明細書中に開示された薬学的組成物の投与のために好ましい動物としては、哺乳動物、および特にヒトが挙げられる。他の好ましい動物としては、霊長類、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、オオカミ、イヌ、およびネコ、ならびに他の哺乳動物（一般に、ペット、家畜、または商業的に関連した動物種とみなされる）が挙げられる。この組成物および処方物は、部分的または著しく精製されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体もしくは抗原結合フラグメントの組成物を、単独で、または、１つ以上のさらなる活性成分、抗癌剤、ワクチン、アジュバント、または他の治療剤（これらは、天然の供給源または組換え供給源から得られ得るか、あるいは天然に得られ得るか、または化学合成され得るか、または別に１つ以上のこのようなさらなる活性成分、キャリア、アジュバント、補因子、または他の治療化合物をコードする１つ以上の核酸セグメントを発現する組換え宿主細胞からインビトロで生成され得る）と組み合わせてのいずれかで、含み得る。
【０１７７】
（４．８  診断試薬およびキット）
本発明は、種々の診断アッセイ（例えば、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよび「サンドイッチ」型免疫アッセイ）を含む）に使用するための、診断試薬および１つ以上のこのような試薬を含むキットを提供する。好ましくは、このようなキットは、少なくとも、本発明の第一のペプチド、または第一の抗体もしくは抗原結合フラグメント、それらの機能的フラグメント、あるいはそれらのカクテル、およびシグナル生成手段を含み得る。キットの構成要素は、固体支持体に予め付着されていても、またはキットが使用されるときに固体支持体の表面に適用されてもよい。シグナル生成手段は、使用前に、本発明の抗体と予め会合され得るか、または１つ以上の構成要素（例えば、緩衝液、抗体−酵素結合体、酵素基質など）との組み合わせを必要とし得る。キットはまた、さらなる試薬、（例えば、固相表面への非特異的結合を減少させるためのブロッキング試薬、洗浄試薬、酵素基質など）を含み得る。固相表面は、マイクロタイタープレート、ミクロスフェア、またはタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドの固定化に適した他の材料の形態であり得る。好ましくは、化学発光産物もしくは色素生成産物の形成または化学発光基質もしくは色素生成基質の減少を触媒する酵素は、シグナル生成手段の構成要素である。このような酵素は、当該分野で周知である。
【０１７８】
このようなキットは、血液悪性関連ペプチド、ポリペプチド、抗体、および／またはポリヌクレオチド、ならびに本明細書中に開示された１つ以上のこのような組成物を含むハイブリドーマ、宿主細胞、およびベクターの過剰発現または不適切な発現によって特徴付けられる状態の検出、モニタリング、および診断に有用である。
【０１７９】
本明細書中に開示された抗体、ペプチド、抗原結合フラグメント、ハイブリドーマ、ベクター、ワクチン、ポリヌクレオチド、または細胞組成物の少なくとも１つ、ならびに、診断試薬または治療剤として組成物を使用するための指示書を含む、本発明の治療キットおよび診断キットもまた、調製され得る。このようなキットにおいて使用するための容器は、代表的には、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器、または他の適切な容器であり得、この中に、診断組成物および／または治療組成物の１つ以上が配置され得、好ましくは適切に分配され得る。第二の治療剤もまた提供される場合、キットは、第二の別の容器を含み得、この容器に、この第二の診断組成物および／または治療組成物が配置され得る。あるいは、複数の化合物が、単一の薬学的組成物中に調製され得、そして単一容器手段（例えば、バイアル、フラスコ、注射器、瓶、または他の適切な単一容器）中にパッケージングされ得る。本発明のキットはまた、代表的には、市販のために、密閉してバイアルを含むための手段（例えば、射出または吹き込み成型プラスチック容器）を含み得、ここに、所望の容器が保持される。放射性標識、色素生成標識、蛍光生成標識、または他のタイプの検出可能標識または検出可能手段がキット内に含まれる場合、標識化剤は、診断組成物または治療組成物それ自体と同じ容器中に提供され得るか、または別に、第二の組成物が配置され、そして適切に分配され得る第二の別の容器手段中に配置され得る。あるいは、検出試薬および標識が単一容器手段において調製され得、そしてほとんどの場合、このキットはまた、代表的に、市販のために、および／または好都合なパッケージングおよび送達のために、密閉してバイアルを含むための手段を備える。
【０１８０】
（４．９  ポリヌクレオチド組成物）
本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」は、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まない単離されたＤＮＡ分子をいう。従って、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントとは、ＤＮＡセグメントが得られる種の全ゲノムＤＮＡから実質的に単離されたか、またはこのゲノムＤＮＡから精製された、１つ以上のコード配列を含むＤＮＡセグメントをいう。ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのより小さなフラグメント、そしてまた、組換えベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどを含む）が、用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」内に含まれる。
【０１８１】
当業者に理解されるように、本発明のＤＮＡセグメントは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現し得るように適応されたゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドにコードされる配列、ならびにより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、自然に単離され得るか、または人の手によって合成的に改変され得る。
【０１８２】
本明細書中で使用される場合、「単離された」は、ポリヌクレオチドが、実質的に他のコード配列から隔離されており、そしてＤＮＡセグメントが無関係のコードＤＮＡ（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子あるいはポリペプチドコード領域）の大部分を含まないことを意味する。当然のことながら、これは、最初に単離されたＤＮＡセグメントをいい、そして後に人の手によってセグメントに加えられた遺伝子またはコード領域を除外しない。
【０１８３】
当業者に認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子（これはイントロンを含み、そしてＤＮＡ分子に１対１の様式で対応する）、およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）を含む。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るがその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結され得るがその必要はない。
【０１８４】
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、血液悪性関連腫瘍タンパク質またはその部分をコードする内因性配列）を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体、または生物学的もしくは抗原的な機能的均等物を含み得る。ポリヌクレオチド改変体は、以下にさらに記載されるように、好ましくはネイティブの腫瘍タンパク質と比較して、コードされたポリペプチドの免疫原性が減少しないように、１つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含み得る。コードされたポリペプチドの免疫原性の効果は、一般に、本明細書中に記載されるように評価され得る。用語「改変体」はまた、異種の起源の相同な遺伝子を含む。
【０１８５】
ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載されるように最大一致について整列されるときと同じである場合、２つの配列が「同一」であるといわれる。２つの配列の間の比較は、代表的には、配列類似性の局部領域を同定および比較するために、比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）にわたって配列を比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続した位置のセグメントをいい、ここで、２つの配列が最適に整列された後に、配列が連続した位置の同じ数の参照配列と比較され得る。
【０１８６】
比較のための配列の最適な整列は、バイオインフォマティクスソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｕｉｔｅにおけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメーターを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，補遺３，３４５−３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ６２６−６４５頁  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【０１８７】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ２：４８２の局部同定アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同定整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【０１８８】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを使用して使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公に利用可能である。１つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基の対についての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出され得る。アミノ酸配列について、スコアリング行列は、累積スコアを算出するために使用され得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長さ（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０をデフォルトとして使用し、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）は、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を整列する。
【０１８９】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０位置の比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【０１９０】
従って、本発明は、本明細書中に開示される配列に実質的に同一性を有するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列（例えば、本明細書中に記載される方法（例えば、以下に記載するような標準パラメーターを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用する本発明のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と比較して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれ以上の配列同一性を含む配列）を含む。当業者は、これらの値が、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置などを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、適切に調整され得ることを認識する。
【０１９１】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書中に記載の配列の１つ以上に同一であるかまたは相補的な配列の種々の長さの連続したストレッチを含む単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。例えば、本発明に開示される配列の１つ以上の、少なくとも約１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００、またはそれ以上の連続したヌクレオチド、ならびにその間の中間の長さの連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。本発明の状況において、「中間の長さ」が、示される値の間の任意の長さ（例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００〜５００；５００〜１，０００などの間の全ての整数を含む）を意味することが容易に理解される。
【０１９２】
本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、そのコード配列の長さに関わらず、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組合わされ得、その結果、その全体の長さは、相当変化し得る。従って、ほとんど任意の長さの核酸フラグメントが使用され得ることが意図され、その全長は、好ましくは意図した組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０の塩基対長など（全ての中間の長さを含む）の全長を有する例示的なＤＮＡセグメントが、本発明の多くの実行において有用であることが意図される。
【０１９３】
他の実施形態において、本発明は、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列またはそのフラグメント、あるいはその相補配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドに関する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野において周知である。例示の目的で、本発明のポリヌクレオチドの、他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での前洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション；続いて０．１％  ＳＤＳを含む２×、０．５×、および０．２×ＳＳＣで各２０分、６５℃で２回の洗浄を含む。
【０１９４】
さらに、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの用法における差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって詳細に意図される。さらに、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化する内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有するが、その必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
【０１９５】
（４．１０  プローブおよびプライマー）
本発明の他の実施形態において、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸のハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、有利に使用され得る。そのようなものとして、本明細書中で開示される少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ヌクレオチド長の連続した配列と同じ配列か、またはこの連続した配列に相補的な配列を有する、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ヌクレオチド長の連続した配列の配列領域を含む核酸セグメントが、種々のハイブリダイゼーションの実施形態において、特定の有用性を見出すことが意図される。開示されたポリヌクレオチドと同様に、より長い連続した同一または相補的な配列（例えば、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００ですら、またはその程度のヌクレオチド（全ての中間長さを含む）および全ての全長配列）もまた、プローブ、プライマー、または増幅標的などとして、特定の実施形態において使用される。
【０１９６】
このような核酸プローブの、目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力は、所定のサンプルにおける相補配列の存在を検出における使用を可能にする。しかし、他の用途（例えば、変異体種プライマーの調製のための配列情報の使用、または他の遺伝的構築物の調製における使用のため、および全長ポリヌクレオチドおよび全長または実質的に全長のｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどを同定および特徴付けするためのプライマーの使用）もまた想定される。
【０１９７】
本明細書中に開示される１つ以上のポリヌクレオチド配列に同一または相補的な連続したヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有するポリヌクレオチド分子は、例えばサザンハイブリダイゼーション分析またはノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。これは、遺伝子産物またはそのフラグメントの、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方における分析を可能とする。フラグメントの全サイズ、ならびに相補的ストレッチのサイズは、究極的には、特定の核酸セグメントの意図される用途または適用に依存する。より小さなフラグメントは、一般にハイブリダイゼーション実施形態における用途を見出し、ここで連続した相補領域の長さが変化され得る（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０またはその程度、およびそれまでの間、およびそれを含む）、ならびにより大きな連続した相補的配列（約７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、または２００、またはその程度のヌクレオチド長のものを含む）もまた、所定の所望の目標、およびハイブリダイゼーション分析により検出を望む相補配列の長さに従って、使用され得る。
【０１９８】
約２０〜約５００の間のヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定で選択的な二重鎖分子の形成を可能にする。約２０またはその程度の塩基長より長いストレッチの連続した相補配列を有する分子が、ハイブリッドの安定性および選択性を増加するために一般に好ましく、それによって、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善する。約２５〜３００またはその程度の間の連続したヌクレオチド、または望まれる場合にはより長い遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計するのが一般には好ましい。
【０１９９】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に記載される配列のいずれかの、任意の部分から選択され得る。必要とされることの全ては、開示された配列、あるいはプローブまたはプライマーとしての利用を望む場合は、このような配列の約１５〜３０ヌクレオチド長から全長配列まで、および全長配列を含む配列の任意の連続した部分までを再検討することである。プローブおよびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配され得る。例えば、全配列の末端に向かってプライマーを使用することが望まれ得る。
【０２００】
小さなポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、通常は自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して行われるので、例えば化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲＴＭ技術）の適用によって、組換え産物のために選択配列を組換えベクターに導入することによって、および一般に分子生物学の分野の当業者に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、得られ得る。
【０２０１】
本発明のヌクレオチド配列は、目的の完全遺伝子または遺伝子フラグメントのいずれかの相補的ストレッチと、二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。想定される適用に依存して、代表的には、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度に達するために、ハイブリダイゼーションの種々の条件を使用することが望ましい。高い選択性を必要とする適用について、代表的には、ハイブリッドを形成するための比較的ストリンジェントな条件（例えば、比較的低い塩、および／または高温の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩の塩濃度によって提供されるような）を使用することが望ましい。このような選択条件は、存在する場合、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチにわずかに許容性であり、そして関連する配列の単離のために特に適切である。
【０２０２】
当然のことながら、いくつかの適用（例えば、潜在的なテンプレートにハイブリダイズする変異体プライマー鎖を使用する、変異体の調製が望ましい場合）について、低ストリンジェント（減少したストリンジェンシー）のハイブリダイゼーション条件は、ヘテロ二重鎖を形成するために代表的に必要とされる。これらの状況において、約２０℃〜約５５℃の温度範囲で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩の条件のような塩条件を使用することが望ましくあり得る。これによって、交差ハイブリダイズ種は、コントロールハイブリダイゼーションに関して、陽性ハイブリダイズシグナルとして容易に同定され得る。任意の場合において、ホルムアミド（これは、増加した温度と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化するように作用する）の増加した量の添加によって、条件がよりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、そして一般に、所望の結果に依存する最良の方法である。
【０２０３】
（４．１１  ポリヌクレオチドの同定および特徴付け）
ポリヌクレオチドは、種々の十分に確立された技術のいずれかを使用して同定、調製および／または作製され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、以下により詳細に記載されるように、腫瘍関連発現（すなわち、本明細書中で提供される代表的なアッセイを使用して決定された、正常な組織における発現よりも少なくとも２倍多い、腫瘍における発現）についてのｃＤＮＡのマイクロアレイのスクリーニングによって、同定され得る。このようなスクリーニングは、例えば、Ｓｙｎｔｅｎｉマイクロアレイ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用し、製造業者の説明書に従って、（そして、本質的に、Ｓｃｈｅｎａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０６１４−１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２１５０−２１５５，１９９７に記載されるように）実施され得る。あるいは、ポリヌクレオチドを、本明細書中に記載されるタンパク質を発現する細胞（例えば、血液悪性関連腫瘍細胞）から調製されるｃＤＮＡから増幅し得る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され得る。このアプローチのために、配列特異的プライマーは、本明細書中に提供される配列に基づいて設計され得、そして購入され得るか、または合成され得る。
【０２０４】
本発明のポリヌクレオチドの増幅された部分は、周知技術を使用して適切なライブラリー（例えば、血液悪性関連腫瘍ｃＤＮＡライブラリー）から、全長遺伝子を単離するために使用され得る。このような技術において、ライブラリー（ｃＤＮＡまたはゲノム）は、増幅に適切な１以上のポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマーを使用してスクリーニングされる。好ましくは、ライブラリーは、より大きい分子を含むようにサイズ選択される。ランダムプライムライブラリーもまた、遺伝子の５’領域および上流領域を同定するために好ましくあり得る。ゲノムライブラリーは、イントロンおよび伸長５’配列を得るために好ましい。
【０２０５】
ハイブリダイゼーション技術のために、部分配列が、周知技術を使用して標識され得る（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐでの末端標識によって）。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、一般に、変性させた細菌コロニーを含むフィルター（またはファージプラークを含む菌叢）にその標識プローブをハイブリダイズさせることによってスクリーニングされる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズしたコロニーまたはプラークが、選択および増幅され、そのＤＮＡがさらなる分析のために単離される。ｃＤＮＡクローンは、例えば、その部分配列由来のプライマーおよびベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析され、付加配列の量が決定され得る。制限地図および部分配列を作製し、１以上の重複クローンを同定し得る。次いで、完全配列が、標準的技術（これは、一連の欠失クローンの作製を含み得る）を使用して決定され得る。次いで、得られた重複配列を、単一の連続する配列にアセンブルし得る。全長ｃＤＮＡ分子を、周知技術を使用して、適切なフラグメントを連結することによって作製し得る。
【０２０６】
あるいは、部分ｃＤＮＡ配列から全長コード配列を得るための、多くの増幅技術が存在する。このような技術において、増幅は、一般に、ＰＣＲを介して行われる。任意の種々の市販のキットを使用して、この増幅工程を行い得る。プライマーは、例えば、当該分野で周知のソフトウェアまたはアルゴリズムまたは式を使用して設計され得る。
【０２０７】
１つのこのような増幅技術は、逆ＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。逆ＰＣＲは、制限酵素を使用して、遺伝子の既知の領域にフラグメントを作製する。次いで、このフラグメントを、分子内連結によって環状化し、そしてその既知領域由来の異なるプライマーを用いるＰＣＲのテンプレートとして使用する。代替的アプローチにおいて、部分配列に隣接する配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知領域に特異的なプライマーを用いる増幅によって、回収し得る。この増幅された配列を、代表的には、同じリンカープライマーおよび既知領域に特異的な第２のプライマーを用いる２回目の増幅に供する。この手順の変形型（これは、その既知配列から反対方向への伸長を開始する２つのプライマーを使用する）が、ＷＯ９６／３８５９１に記載される。別のこのような技術は、「ｃＤＮＡ末端の迅速増幅」すなわちＲＡＣＥとして公知である。この技術は、ポリＡ領域またはベクター配列とハイブリダイズする、内部プライマーおよび外部プライマーの使用を包含し、既知配列の５’側および３’側の配列を同定する。さらなる技術としては、捕捉ＰＣＲ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げられる。増幅を使用する他の方法もまた、全長ｃＤＮＡ配列を得るために使用され得る。
【０２０８】
特定の例において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋから利用可能なデータベース）に提供された配列の分析によって全長ｃＤＮＡ配列を得ることが可能である。重複ＥＳＴについての検索は、一般に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索）を使用して実施され得、そしてこのようなＥＳＴを使用して、連続した全長配列を製作し得る。全長ＤＮＡ配列はまた、ゲノムフラグメントの分析によって得られ得る。
【０２０９】
（４．１２  宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現）
本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチド、あるいはその融合タンパク質または機能的均等物をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現を指向するために、組換えＤＮＡ分子中で使用され得る。遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じかまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が生成され得、そしてこれらの配列は、所定のポリペプチドをクローニングおよび発現するために使用され得る。
【０２１０】
当業者に理解されるように、いくつかの場合において、天然に存在しないコドンを保有するポリペプチドコードヌクレオチド配列を生成することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物または真核生物の宿主に好ましいコドンは、タンパク質発現の速度を増加するために選択され得るか、または所望される特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を生成するために選択され得る。
【０２１１】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由のためにポリペプチドコード配列を変化（クローニング、プロセシング、および／または遺伝子産物の発現を改変する変化が挙げられるがこれらに限定されない）するために、当該分野で一般に公知の方法を使用して操作され得る。例えば、ランダム断片化によるＤＮＡシャッフリング、ならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再構築は、ヌクレオチド配列を操作するために使用され得る。さらに、部位特異的変異誘発は、新しい制限部位を挿入するため、グリコシル化パターンを変化するため、コドンの優先度を変化するため、スプライス改変体を生成するため、または変異を導入するためなどに使用され得る。
【０２１２】
本発明の別の実施形態において、天然、改変、または組換え核酸配列は、融合タンパク質をコードするために異種配列に連結され得る。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体によって認識され得るキメラタンパク質をコードすることが有用であり得る。融合タンパク質はまた、ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作され得、その結果、ポリペプチドは切断され得、そして異種部分から精製され得る。
【０２１３】
所望のポリペプチドをコードする配列は、全体的または部分的に、当該分野で周知の化学的方法を使用して合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５−２２３，Ｈｏｒｎ，Ｔ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５−２３２を参照のこと）。あるいは、このタンパク質自身は、ポリペプチドのアミノ酸配列、またはその部分を合成するために、化学的方法を使用して生成され得る。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を使用して行われ得（Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２−２０４）、そして自動合成は、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して達成され得る。
【０２１４】
新しく合成されるペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｅｓ，ＷＨ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）または当該分野で利用可能な他の匹敵する技術によって実質的に精製され得る。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）によって確認され得る。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその任意の部分は、直接合成の間に変化され得、そして／または、化学的方法を使用して、他のタンパク質もしくはその任意の部分と組み合わされ得、改変体ポリペプチドを生成する。
【０２１５】
所望のポリペプチドを発現するために、このポリペプチドまたはその機能的均等物をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されるコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター）に挿入され得る。当業者に周知の方法は、目的のポリペプチドをコードする配列、および適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。このような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載される。
【０２１６】
種々の発現ベクター／宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含み、そして発現するために利用され得る。これらとしては、微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌）；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス，ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは動物細胞系が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１７】
発現ベクター中に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、ベクターの非翻訳領域−−エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域−−であり、これらは宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写および翻訳を行う。このようなエレメントは、その長さおよび特異性が変化し得る。用いられるベクター系および宿主に依存して、任意数の適切な転写および翻訳エレメント（構成性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。例えば、細菌系におけるクローニングの場合、誘導性プロモーター（例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなど）が使用され得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子由来または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが一般に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株の生成が必要な場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターは、適切な選択マーカーを用いて有利に使用され得る。
【０２１８】
細菌系において、多くの発現ベクターが、発現されるポリペプチドについて意図される使用に依存して選択され得る。例えば、多くの量が必要とされる場合（例えば、抗体の誘導のために）、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが使用され得る。このようなベクターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：多機能のＥ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））ここで、目的のポリペプチドをコードする配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよび続く７残基についての配列とインフレームでベクターに連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ，ＧおよびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出によって溶解細胞から容易に精製され得る。このような系で作製されたタンパク質は、へパリン、スロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され得、その結果、目的のクローニングされたポリペプチドが、ＧＳＴ部分から自由に放出され得る。
【０２１９】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨなど）を含む多くのベクターが、使用され得る。総説については、Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）およびＧｒａｎｔら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと。
【０２２０】
植物発現ベクターが使用される場合、ポリペプチドをコードする配列の発現は、多くのプロモーターのいずれかによって駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーター）が、単独であるいはＴＭＶ由来のωリーダー配列と組合せて使用され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１）。あるいは、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小分子サブユニット）または熱ショックプロモーターが使用され得る（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら（１９８４），ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒ．ら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．ら（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構築物は、直接的なＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションによって植物細胞に導入され得る。このような技術は、多くの一般的に入手可能な総説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，Ｓ．またはＭｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｙｅａｒｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （１９９２）ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；１９１−１９６頁を参照のこと）。
【０２２１】
昆虫系もまた、目的のポリペプチドを発現するために使用され得る。例えば、１つのこのような系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このポリペプドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリへドリン遺伝子）にクローニングされ得、そしてポリへドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。ポリペプチドコード配列の首尾よい挿入は、ポリへドリン遺伝子を不活性にし、そしてコートタンパク質を欠く組み換えウイルスを産生する。次いで、これらの組換えウイルスは、例えば、目的のポリペプチドが発現され得るＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅを感染するために使用され得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
【０２２２】
哺乳動物宿主細胞において、多くのウイルスベースの発現系が、一般に利用可能である。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合において、目的のポリペプチドをコードする配列は、アデノウイルス転写／翻訳複合体に連結され得、この複合体は、後期プロモーターおよび３つの部分からなるリーダー配列からなる。ウイルスゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域における挿入は、感染された宿主細胞においてこのポリペプチドを発現し得る生存可能なウイルスを得るために使用され得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）が、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させるために使用され得る。
【０２２３】
特定の開始シグナルもまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。このようなシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。このポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列が、適切な発現ベクターに挿入される場合において、さらなる転写または翻訳制御シグナルは、必要ではない。しかし、コード配列のみ、またはその一部が挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、この開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするために、正確なリーディングフレーム内にあるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）であり得る。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適切なエンハンサーの包含によって増強され得、特定の細胞系は、例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されている。
【０２２４】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するその能力または所望の様式で発現タンパク質をプロセシングするその能力について、選択され得る。ポリペプチドのこのような改変は、以下を含むがこれらに限定されない：アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、ホスホリル化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化。翻訳後プロセシング（これは、タンパク質の「プレプロ」形態を切断する）はまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または働きを容易にするために、使用され得る。異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）（これらは、このような翻訳後活性について特異的な細胞性の機械的機構および特徴的な機構を有する）は、外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするために選択され得る。
【０２２５】
組換えタンパク質の長期にわたる高収量産生のために、安定な発現が一般に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株は、発現ベクターを使用して形質転換され得、この発現ベクターは、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントを含みおよび同じまたは異なるベクター上に選択マーカー遺伝子を含み得る。ベクターの導入に続いて、細胞は、それらが選択培地に切り換えられる前に、富化培地で１〜２日増殖され得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、そしてその存在は、導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して増殖され得る。
【０２２６】
任意の数の選択系が、形質転換された細胞株を回収するために使用され得る。これらは、以下を含むが、これらに限定されない：単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら（１９７７）Ｃｅｌｌ  １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら（１９９０）Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−２３）遺伝子（これらは、それぞれ、ｔｋ．ｓｕｐ−またはａｐｒｔ．ｓｕｐ．−細胞において使用され得る）。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性が、選択の基準として使用され得る；例えば、ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を与える）（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０）；ｎｐｔ（これは、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与える）（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ら（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４）；およびａｌｓまたはｐａｔ（これらは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える）（Ｍｕｒｒｙ，前出）。例えば、以下のようなさらなる選択遺伝子が記述されている：ｔｒｐＢ（これは、細胞が、トリプトファンの代わりにインドールを使用することを可能にする）またはｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）。最近、可視マーカーの使用は、一般的となっており、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンのようなマーカーが、形質転換体を同定するのみでなく、特定のベクター系に寄与可能な一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するためにも広く使用される（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【０２２７】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子がまた存在することを示唆するが、その存在および発現は、確認されることを必要とし得る。例えば、ポリペプチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含む組換え細胞が、マーカー遺伝子機能の非存在によって同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、単一プロモーターの制御下でポリペプチドコード配列とタンデムで配置され得る。誘導または選択への応答におけるマーカー遺伝子の発現は、同様に、通常、タンデムな遺伝子の発現を示す。
【０２２８】
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含みそして発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の手順によって同定され得る。これらの手順は、以下を含むが、これらに限定されない：ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたは免疫アッセイ技術（これらは、核酸またはタンパク質の検出および／または定量化のための膜、溶液またはチップに基づく技術を含む）。
【０２２９】
ポリヌクレオチドにコードされた産物に特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、ポリヌクレオチドにコードされた産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野において公知である。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する２つの部位の、モノクローナルベースのイムノアッセイが、いくつかの適用について好適であり得るが、競合的結合アッセイもまた、用いられ得る。これらのアッセイおよび他のアッセイは、とりわけＨａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）に記載される。
【０２３０】
広範な種々の標識および結合体化技術は、当業者に公知であり、そして種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブを生成するための手段としては、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識または標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの産生のために、配列またはその任意の部分が、ベクター内にクローニングされ得る。そのようなベクターは、当該分野において公知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを添加することにより、ＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用され得る。これらの手順は、種々の市販キットを使用して実施され得る。使用され得る適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または色素形成剤ならびに基質、補因子、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【０２３１】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、タンパク質を発現し、そして細胞培養物からタンパク質を回収するのに適した条件下で培養され得る。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、分泌されてもよく、細胞内に含まれてもよい。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物細胞膜または真核生物細胞膜を介して、コードされたポリペプチドの分泌を指向するシグナル配列を含むように設計され得る。他の組換え構築物を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させ得る。そのような精製促進ドメインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固定された金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）において利用されるドメイン。精製ドメインとコードされるポリペプチドとの間に切断可能なリンカー配列（例えば、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに対して特異的な配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））を含めることを使用して、精製を促進させ得る。そのような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドおよびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前の、核酸によってコードされる６ヒスチジン残基を含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ら（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載されるように、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上での精製を促進する一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９３；ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１２：４４１−４５３）に提供される。
【０２３２】
組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントは、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を使用する、直接的ペプチド合成によって産生され得る。タンパク質合成は、手動技術を使用してか、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別々に化学的に合成されて、そして化学的方法を使用して合わせられて、全長分子が産生され得る。
【０２３３】
（４．１３  部位特異的変異誘発）
部位特異的変異誘発は、ポリペプチドをコードする基礎を成すポリヌクレオチドの特異的変異誘発を介して、個々のペプチド、または生物学的に機能的に等価なポリペプチドを調製する際に有用な技術である。当業者に周知の技術は、例えば、１つ以上の上記の考慮すべきことがらを取り入れながら、１つ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡ内に導入することによって、配列改変体を調製し、そして試験する迅速な能力をさらに提供する。部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介した変異体の産生を可能にし、横断される欠失結合部の両側に安定な二重鎖を形成するために十分なサイズでかつ十分な配列複雑性のプライマー配列を提供する。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、減少させるか、修飾するか、さもなくば変化させるため、そして／またはコードされるポリペプチドの特性、活性、組成、安定性または一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
【０２３４】
本発明の特定の実施形態において、本発明者らは、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、ポリペプチドワクチンの抗原性）を変更するような開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発を意図する。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野で周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を作製するために広範に使用される。例えば、部位特異的変異誘発は、しばしば、ＤＮＡ分子の特定部分を変更するために使用される。そのような実施形態において、代表的に約１４ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長などを含むプライマーが使用され、配列の結合部の両側にある、約５残基〜約１０残基が変更される。
【０２３５】
当業者によって理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、しばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用してきた。部位指向性変異誘発において有用である代表的なベクターとしては、例えば、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は、一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージへと移入する工程を取り除く部位指向性変異誘発において慣用的に使用される。
【０２３６】
一般的に、本発明に従う部位指向性変異誘発は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む、一本鎖ベクターを最初に入手する工程またはその配列を含む二本鎖ベクターの２本の鎖を融解して分ける工程によって実行される。所望の変異した配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に、合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖ベクターとアニーリングされ、そして変異を保有する鎖の合成を完了するために、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ  Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）に供せられる。このようにヘテロ二重鎖が形成され、ここで１つの鎖は、変異を有さないもともとの配列をコードし、そして２つ目の鎖は所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用され、そして、変異した配列の配置（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【０２３７】
部位指向性変異誘発を使用する、選択されたペプチドコードＤＮＡセグメントの配列改変体の調製は、潜在的に有用な種を産生する手段を提供し、そしてこれは、限定を意味するものではない。なぜなら、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列が入手され得る他の方法が存在するからである。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、変異誘発剤（例えば、ヒドロキシルアミン）で処理されて、配列改変体を入手し得る。これらの方法およびプロトコルに関する具体的な詳細は、その目的に関する、Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ、１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２（各々が本明細書中に参考として援用される）の教示において見出される。
【０２３８】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド指向性変異誘発手順」とは、鋳型依存的プロセスおよびベクター媒介増殖であって、その初期の濃度と比較して、特定の核酸分子の濃度の上昇を生じるか、または検出可能なシグナルの濃度の上昇（例えば、増幅）を生じるものをいう。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド指向性変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を含むプロセスをいうことが意図される。用語鋳型依存的プロセスとは、新規に合成された核酸鎖の配列が、相補的塩基対合の周知の規則によって指示される、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成をいう（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７を参照のこと）。代表的には、ベクター媒介方法論は、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン性増幅、および増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。このような方法論の例は、具体的にその全体が参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，２３７，２２４号によって提供される。
【０２３９】
（４．１４  ポリヌクレオチド増幅技術）
多数の鋳型依存性プロセスが、サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載され、これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＰＣＲＴＭにおいては、標的配列の向かい合った相補鎖上の領域に対して相補的な２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合液に添加する。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはその標的に結合し、そしてポリメラーゼが、ヌクレオチドを付加することによって標的配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合液の温度を上昇および下降させることによって、伸長したプライマーは、標的から解離して反応生成物を形成し、過剰のプライマーは標的および反応生成物に結合し、そしてこのプロセスが反復される。好ましくは、逆転写およびＰＣＲＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
【０２４０】
増幅のための別の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲともいわれる）であり、欧州特許出願公開番号３２０，３０８（その全体が特に本明細書中に参考として援用される）において開示されている。ＬＣＲにおいては、２つの相補的プローブ対が調製され、そして標的配列の存在下では、各対がその標的の向かい合った相補鎖に結合し、その結果、それらは隣接する。リガーゼの存在下では、これらの２つのプローブ対は、連結して１つの単位を形成する。温度サイクリングによって、ＰＣＲＴＭにおけるのと同様に、結合した連結単位は標的から解離し、次いで過剰のプローブ対の連結のために「標的配列」として働く。米国特許第４，８８３，７５０号（その全体が参考として本明細書中に援用される）は、標的配列に対するプローブ対の結合のためのＬＣＲに類似する増幅の代替方法を記載する。
【０２４１】
Ｑβレプリカーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載され、その全体が参考として本明細書中に援用される）もまた、本発明におけるなお別の増幅方法として使用され得る。この方法において、標的の配列に相補的な領域を有するＲＮＡの複製配列が、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でサンプルに添加される。このポリメラーゼは、次いで検出され得る複製配列をコピーする。
【０２４２】
等温増幅方法（ここで、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用して、制限部位の一方の鎖におけるヌクレオチド５’−［α−チオ］三リン酸を含む標的分子の増幅を達成する（Ｗａｌｋｅｒら、１９９２、その全体が参考として本明細書中に援用される））もまた、本発明における核酸の増幅において有用であり得る。
【０２４３】
鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）は、複数回の鎖置換および合成（すなわち、ニックトランスレーション）を含む核酸の等温増幅を実行する別の方法である。同様の方法（修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）と呼ばれる）は、本発明において有用であり得る別の増幅方法であり、そして増幅のために標的化される領域全体にわたっていくつかのプローブをアニーリングする工程、続いて４種の塩基のうちの２種の塩基のみが存在する修復反応を包含する。他の２種の塩基は、容易な検出のためにビオチン化誘導体として添加され得る。同様のアプローチは、ＳＤＡにおいて使用される。
【０２４４】
配列はまた、周期的プローブ反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＣＰＲ）を使用して検出され得る。ＣＰＲにおいて、非標的ＤＮＡの３’配列および５’配列ならびに標的タンパク質特異的ＲＮＡの内部配列または「中間」配列を有するプローブは、サンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションに際して、反応物はＲＮａｓｅＨで処理され、そしてプローブの生成物は、消化後に遊離されるシグナルを生成することによって特有の産物として同定される。もともとの鋳型は、別のサイクリングプローブにアニーリングされ、そして反応が反復される。従って、ＣＰＲは、標的遺伝子特異的に発現された核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションによって生成されるシグナルを増幅する工程を包含する。
【０２４５】
英国特許出願番号２  ２０２  ３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５（これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるなお他の増幅方法は、本発明に従って使用され得る。前者の出願において、「改変された」プライマーが、ＰＣＲ様の鋳型および酵素依存性合成において使用される。それらのプライマーは、捕捉部分（例えば、ビオチン）および／または検出体部分（例えば、酵素）で標識することによって改変され得る。後者の出願において、過剰の標識されたプローブがサンプルに添加される。標的配列の存在下において、プローブが結合し、そして触媒的に切断される。切断後、標的配列は、過剰のプローブによって結合されるためにインタクトで遊離される。標識されたプローブの切断は、標的配列の存在をシグナルによって示す。
【０２４６】
他の核酸増幅手順には、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）（Ｋｗｏｈら、１９８９；ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８８／１０３１５（その全体が本明細書中に参考として援用される））が挙げられ、これには、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲが含まれる。ＮＡＳＢＡにおいて、核酸は、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、サンプルの熱変性、溶解緩衝液を用いる処理、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの単離のためのミニスピンカラムまたはＲＮＡの塩化グアニジウム抽出によって増幅のために調製され得る。これらの増幅技術は、標的配列に特異的な配列を有するプライマーをアニーリングさせる工程を包含する。重合後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅＨで消化され、一方、二本鎖ＤＮＡ分子は再度熱変性される。いずれの場合においても、一本鎖ＤＮＡは第２の標的特異的プライマーの添加、続いて重合によって完全に二本鎖にされる。次いで、二本鎖ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）によって何倍も転写される。等温サイクル反応において、ＲＮＡはＤＮＡに逆転写され、そして再度ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）を用いて転写される。得られる生成物は、短縮型または完全型のいずれにせよ、標的特異的配列を示す。
【０２４７】
欧州特許出願公開番号３２９，８２２（その全体が本明細書中に参考として援用される）は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（これらは、本発明に従って使用され得る）をサイクル的に合成する工程を包含する核酸増殖プロセスを開示する。ｓｓＲＮＡは、第１のプライマーオリゴヌクレオチド（これは、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される）のための最初の鋳型である。次いで、ＲＮＡは、得られるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖からリボヌクレアーゼＨ（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとの二重鎖中のＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅである、ＲＮａｓｅＨ）の作用によって除去される。得られたｓｓＤＮＡは、第２のプライマーのための第２の鋳型（これはまた、その鋳型に対するその相同性に対して５’側であるＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって例示される）の配列を含む）である。次いで、このプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな「Ｋｌｅｎｏｗ」フラグメントによって例示される）によって伸長させられ、プライマー間にもともとのＲＮＡの配列と同一の配列を有し、そして一方の端にプロモーター配列をさらに有する、二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子として得られる。このプロモーター配列は、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作製するために適切なＲＮＡポリメラーゼによって使用され得る。次いで、これらのコピーはサイクルに再び入り得、非常に迅速な増幅をもたらす。酵素の適切な選択を用いて、この増殖は、各サイクルで酵素の添加なしに等温で行われ得る。このプロセスのサイクル性の性質のために、出発配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形態であるように選択され得る。
【０２４８】
ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８９／０６７００（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）への、プロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーション、続いてこの配列の多くのＲＮＡコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキームを開示する。このスキームは、サイクル性ではない；すなわち、新しい鋳型は、得られたＲＮＡ転写物から産生されない。他の増幅方法としては、「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ」（Ｏｈａｒａ、１９８９）が挙げられ、これらは当業者に周知である。
【０２４９】
生じる「ジ−オリゴヌクレオチド」の配列を有し、それによってジ−オリゴヌクレオチドを増幅する核酸の存在下で２つ（または２より多い）のオリゴヌクレオチドの連結に基づく方法（ＷｕおよびＤｅａｎ、１９９６、その全体が参考として本明細書中に援用される）もまた、本発明のＤＮＡ配列の増幅において使用され得る。
【０２５０】
（４．１５  インビボポリヌクレオチド送達技術）
さらなる実施形態において、本発明の１以上のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物は、インビボで細胞に導入される。これは、種々のまたは周知のアプローチのいずれかを用いて達成され得、これらのいくつかは、例示の目的で以下に概説される。
【０２５１】
（４．１５．１．アデノウイルス）
１以上の核酸配列のインビボ送達のための好ましい方法の１つは、アデノウイルス発現ベクターの使用を包含する。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）この構築物のパッケージングを支持するため、および（ｂ）センス方向またはアンチセンス方向でその中にクローニングされたポリヌクレオチドを発現するため、に十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。当然のことながら、アンチセンス構築物の文脈において、発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。
【０２５２】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作された形態を含む。アデノウイルスの遺伝的構成の知見（３６ｋｂ、線状、二本鎖ＤＮＡウイルス）は、７ｋｂまでの外来性配列でアデノウイルスＤＮＡの大きな断片を置換することを可能にする（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体への組込みを生じない。なぜなら、アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性を有さないエピソーム性様式で複製し得るからである。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、そして大規模な増幅後にゲノム再構成は検出されなかった。アデノウイルスは、細胞の細胞周期段階に関わりなく、実質的にすべての上皮細胞に感染し得る。今日まで、アデノウイルス感染は、穏やかな疾患（例えば、ヒトの急性呼吸器疾患）にのみに関連しているらしい。
【０２５３】
アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノム、操作の容易さ、高い力価、広範な標的−細胞範囲、および高い感染力のため、遺伝子移入ベクターとしての使用のために特に適している。ウイルスゲノムの両端は１００〜２００塩基対の逆方向反復（ＩＴＲ）を含み、これらは、ウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、異なる転写単位を含み、これは、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分裂する。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成を生じる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与する（Ｒｅｎａｎ、１９９０）。後期遺伝子の産物（ウイルスキャプシドタンパク質の大多数を含む）は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって与えられる単一の一次転写物の有意なプロセシング後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８  ｍ．ｕ．に位置する）は、感染の後期の間に特に効率的であり、そしてこのプロモーターに由来するすべてのｍＲＮＡは、５’−３成分リーダー（ＴＰＬ）配列（この配列は、ＲＮＡを翻訳のために好ましいｍＲＮＡにする）を有する。
【０２５４】
現在の系では、組換えアデノウイルスが、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから生成する。２つのプロウイルスベクター間の可能な組換えに起因して、野生型アデノウイルスは、このプロセスから生成され得る。従って、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離すること、およびそのゲノム構造を調べることが重要である。
【０２５５】
複製欠損である現在のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、特有のペルパー細胞株（２９３と称される）に依存し、そのヘルパー細胞株は、Ａｄ５  ＤＮＡフラグメントによりヒト胚性腎臓細胞から形質転換され、そしてＥ１タンパク質を構成的に発現する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムから不必要であるので（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）、２９３細胞の補助によって、現在のアデノウイルスベクターは、Ｅ１もしくはＤ３のいずれかまたはその両方の領域に、外来ＤＮＡを保有する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）。本質的には、アデノウイルスは、ＤＮＡより約２ｋＢ多い容量を仮定すると、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージし得る（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）。Ｅ１およびＥ３領域で交換可能である約５．５ｋＢのＤＮＡと組合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は、７．５ｋＢより低いか、またはベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスのウイルス性のゲノムの８０％より多くは、ベクター骨格内にあり、そしてベクター保有（ｂｏｒｎｅ）細胞毒性の供給源である。また、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損は、不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現のリーク（ｌｅａｋａｇｅ）は、高い感染多重度（ＭＯＩ）で、現在利用可能なベクターで観察された（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３）。
【０２５６】
ヘルパー細胞株は、ヒト細胞（例えば、ヒト胚性腎臓細胞、筋細胞、造血細胞または他のヒト胚性間葉細胞または上皮細胞）に由来し得る。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに対して許容性である他の哺乳動物種の細胞に由来し得る。このような細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル胚性間葉細胞もしくは上皮細胞が挙げられる。上記のように、現在、好ましいヘルパー細胞株は、２９３である。
【０２５７】
最近、Ｒａｃｈｅｒら（１９９５）は、２９３細胞の培養およびアデノウイルスの増殖についての改良方法を開示した。１つのフォーマットにおいて、天然の細胞の凝集物は、１００〜２００ｍｌの培地を含む１リットルのシリコン処理した攪拌フラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）内に、個々の細胞を接種することによって増殖する。４０ｒｐｍでの攪拌後、細胞生存度を、トリパンブルーで評価する。別のフォーマットにおいて、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を、以下のように使用する。５ｍｌの培地に再懸濁された細胞接種材料を、２５０ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に添加し、そして時々攪拌しながら、１〜４時間、静止させておく。次いで培地を、５０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そして振盪を開始する。ウイルス産生のために、細胞を、約８０％のコンフルーエンスまで増殖させ、その後、培地を置換し（最終容量の２５％まで）、そしてアデノウイルスを０．０５のＭＯＩで添加する。培養物を、一晩静止させ、その後容量を１００％まで増やし、そしてさらに７２時間の振盪を開始する。
【０２５８】
アデノウイルスベクターは、複製欠損または少なくとも条件付で複製欠損であるという要件以外に、アデノウイルスベクターの特性は、本発明の首尾よい実施に重要でないと考えられる。アデノウイルスは、４２の異なる既知の血清型またはサブグループＡ〜Ｆの任意のアデノウイルスであり得る。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明において使用するための条件付複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい開始材料である。なぜならアデノウイルス５型は、大量の生化学的情報および遺伝学的情報が公知であるヒトアデノウイルスであり、そしてそれは、ベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築物に歴史的に使用されてきたからである。
【０２５９】
上記のように、本発明による代表的なベクターは、複製欠損であり、そしてアデノウイルスＥ１領域を有さない。従って、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、Ｅ１コード配列が除去された位置に導入することが最も簡便である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入の位置は、本発明に重要ではない。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）に記載されるように、Ｅ３置換ベクターに、欠失したＥ３領域の代わりに挿入され得るか、またはヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補足するＥ４領域に挿入され得る。
【０２６０】
アデノウイルスは、容易に増殖し、かつ容易に操作され、そしてインビトロおよびインビボでの広い宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高い力価（例えば、１０９〜１０１１プラーク形成単位／ｍｌ）で獲得され得、そしてそれらは非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達された外来遺伝子は、エピソーム性であり、従って、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。副作用は、野生型アデノウイルスでのワクチン接種の研究において報告されていない（Ｃｏｕｃｈら、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）。このことは、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのそれらの安全かつ治療的な可能性を示す。
【０２６１】
アデノウイルスベクターを、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチンの開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ，１９９２）に使用した。最近、動物研究は、組換えアデノウイルスは、遺伝子療法に使用され得ることを示唆した（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織に組換えアデノウイルスを投与する際の研究としては、気管点滴注入法（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈内注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）および脳における定位接種法（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅら、１９９３）が挙げられる。
【０２６２】
（４．１５．２．レトロウイルス）
レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染された細胞においてそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに転換する能力によって特徴付けられる一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次いで、生じるＤＮＡを、プロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込み、そしてウイルスタンパク質を合成させる。この組込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持を生じる。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。ｇａｇ遺伝子の上流に見出された配列は、ビリオンへのゲノムのパッケージングのためのシグナルを含む。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、そしてまた宿主細胞ゲノムへの組込みに必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。
【０２６３】
レトロウイルスベクターを構築するために、１つ以上の目的のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸が、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入され、複製欠損であるウイルスを作製する。ビリオンを作製するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ成分およびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲ配列およびパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含む組換えプラスミドがこの細胞株に（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）導入される場合、パッケージング配列は、ウイルス粒子にパッケージングされる組換えプラスミドのＲＮＡの転写を可能にし、次いで培養培地に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次いで、この組換えレトロウイルスを含む培地は、収集され、必要に応じて、濃縮され、そして遺伝子移入のために使用される。レトロウイルスベクターは、広範な種々の細胞型に感染し得る。しかし、組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【０２６４】
レトロウイルスベクターの特異的な標的化を可能にするように設計された新規な方法が最近、ラクトース残基のウイルスエンベロープへの化学的な付加によるレトロウイルスの化学的な改変に基づいて、開発された。この改変は、シアログリコタンパク質レセプターを介する肝細胞の特異的な感染を可能にし得る。
【０２６５】
組換えレトロウイルスの標的化のための異なる方法が、設計され、この方法においては、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特定の細胞レセプターに対するビオチン化抗体が使用された。この抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。主要組織適合性複合体の、クラスＩ型抗原およびクラスＩＩ型抗原に対する抗体を使用して、著者らは、インビトロでエコトロピックウイルスを伴なった細胞表面抗原を保持する種々のヒト細胞の感染を実証した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０２６６】
（４．１５．３．アデノ随伴ウイルス）
ＡＡＶ（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ，１９８４）は、パルボウイルス（ｐａｒｏｖｉｒｕｓ）であり、アデノウイルスのストックの夾雑物として発見された。ＡＡＶは、いかなる疾患にも関連していない偏在する（抗体は、アメリカ人の集団の８５％に存在する）ウイルスである。ＡＡＶはまた、ＡＡＶの複製がヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）の存在に依存するので、デペンドウイルスとして分類される。５つの血清型が単離されている。そのうち、ＡＡＶ−２は、最も特徴付けされている。ＡＡＶは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３にキャプシド形成され、直径２０ｎｍ〜２４ｎｍの正二十面体のビリオンを形成する、一本鎖の線状ＤＮＡを有する（ＭｕｚｙｃｚｋａおよびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，１９８８）。
【０２６７】
このＡＡＶ  ＤＮＡは、約４．７キロベース長である。このＤＮＡは、２つのオープンリーディングフレームを含み、そして２つのＩＴＲに隣接される。ＡＡＶゲノム中には、２つの主な遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ）が存在する。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスの複製を担うタンパク質をコードし、これに対し、ｃａｐは、キャプシドタンパク質ＶＰ１−３をコードする。各々のＩＴＲは、Ｔ形状のヘアピン構造を形成する。これらの末端繰り返しは、染色体組み込みのためのＡＡＶの必須のｃｉｓ成分のみである。従って、このＡＡＶは、送達のための遺伝子のカセットによって全てのウイルスコード配列が除去および置換されたベクターとして使用され得る。それらのマップ位置に従って、３つのウイルスプロモーターが同定され、そしてｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と称されている。ｐ５およびｐ１９からの転写はｒｅｐタンパク質の産生を生じ、そしてｐ４０からの転写はキャプシドタンパク質を産生する（ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９８４）。
【０２６８】
発現ベクターとしてｒＡＡＶを使用する可能性を研究するために研究者を刺激するいくつかの因子が存在する。１つは、宿主染色体に組み込むために遺伝子を送達する必要が、驚くべきことに少ないことである。１４５ｂｐのＩＴＲ（ＡＡＶゲノムのわずか６％である）を有することが必要である。これは、４．５ｋｂのＤＮＡ挿入物を作製する余地をベクター残す。この保有能力は、ＡＡＶが大きな遺伝子を送達するのを妨げ得るが、本発明のアンチセンス構築物を送達するのに十分に適している。
【０２６９】
ＡＡＶはまた、その安全性に起因して、送達ビヒクルの優れた選択である。相対的に複雑な救援機構が存在する：野生型のアデノウイルス遺伝子だけでなく、ＡＡＶ遺伝子もまた、ｒＡＡＶを動員するために必要とされる。同様に、ＡＡＶは、病原性ではなく、そしていかなる疾患にも関連しない。ウイルスコード配列の除去は、ウイルス遺伝子発現に対する免疫反応を最小化し、従って、ｒＡＡＶは、炎症応答を招かない。
【０２７０】
（４．１５．４．発現構築物としての他のウイルスベクター）
他のウイルスベクターを、宿主細胞へのオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の送達のための本発明における発現構築物として用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、レンチウイルス、ポリオウイルス、およびヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターを用いてもよい。これらは、種々の哺乳動物細胞に、いくつかの魅力のある特性を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【０２７１】
Ｂ型肝炎欠損ウイルスの最近の認識によると、新しい見識は、異なるウイルス配列の構造−機能の関連性を与えた。インビトロでの研究は、このウイルスが、そのゲノムの８０％までの欠失にもかかわらず、ヘルパー依存パッケージングおよび逆転写についての能力を保持し得ることを示した（Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。このことは、ゲノムの大部分が外来の遺伝物質と交換され得ることを示唆した。肝臓向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）および持続（組込み）は、肝臓指向性遺伝子移入についての特に魅力的な特性であった。Ｃｈａｎｇら、（１９９１）は、ポリメラーゼコード配列、表面コード配列、および前表面（ｐｒｅ−ｓｕｒｆａｃｅ）コード配列に代えて、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をアヒルＢ型肝炎ウイルスゲノムに導入した。これを、野生型ウイルスと共に、トリ肝炎細胞株へと、同時トランスフェクトした。高力価の組換えウイルスを含む培養培地を用いて、初代仔ガモ肝細胞を感染させた。安定なＣＡＴ遺伝子発現を、トランスフェクション後の少なくとも２４日間検出した（Ｃｈａｎｇら、１９９１）。
【０２７２】
（４．１５．５．非ウイルスベクター）
本発明のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の発現をもたらすために、発現構築物は、細胞に送達されなければならない。この送達は、細胞株を形質転換するための実験室手順の際のように、インビトロで達成され得るか、または特定の疾患状態の処置の際のように、インビボもしくはエキソビボで達成され得る。上記のように、送達のための１つの好ましい機構は、ウイルス感染を介する機構であり、ここで、発現構築物は、感染性ウイルス粒子の中にカプセル化される。
【０２７３】
一旦、発現構築物が、細胞の中に送達されると、所望のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸は、異なる部位に配置され、そして異なる部位で発現し得る。特定の実施形態では、この構築物をコードする核酸は、細胞のゲノムの中に安定に組込まれ得る。この組込みは、相同組換えを介する特定の位置および特定の配向であってもよい（遺伝子置換）し、またはこれは無作為な非特異的な位置に組込まれてもよい（遺伝子増強）。なおさらなる実施形態では、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして、細胞の中で安定に維持され得る。このような核酸セグメント、または「エピソーム」は、宿主細胞周期から独立して、または宿主細胞周期に同調して維持および複製させるのに十分な配列をコードする。どのように発現構築物を細胞に送達させ、そして細胞の中のどこで核酸を維持するかは、用いられる発現構築物の型に依存する。
【０２７４】
本発明の特定の実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む発現構築物は、単に、裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドから構成されてもよい。この構築物の移入は、細胞膜を物理的または化学的に透過化処理する、上記の方法のいずれかにより行われ得る。このことは、特に、インビトロでの移入に適用可能であるが、これはインビボでの使用でも同様に適用され得る。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、（１９８４）は、ポリオーマウイルスＤＮＡを、成体および新生仔マウスの肝臓および腎臓に、リン酸カルシウム沈澱物の形態で首尾良く注入した。これは、能動的ウイルス複製および急性感染を実証した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＲｅｓｈｅｆ（１９８６）はまた、沈降リン酸カルシウムプラスミドの直接的腹腔内注入が、トランスフェクトした遺伝子の発現を生じることを実証した。目的の遺伝子をコードするＤＮＡはまた、インビボで同じ様式で移入され得、遺伝子産物を発現することが想定される。
【０２７５】
細胞の中に裸のＤＮＡ発現構築物を移入するための本発明の別の実施形態では、微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を包含し得る。この方法は、ＤＮＡをコーティングした微粒子を、この粒子が細胞膜を貫き、そして細胞を殺すことなく細胞に侵入することが可能な高速まで加速させる能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。小さな粒子を加速させるためのいくつかの装置が、開発されている。このような装置の１つは、高電圧放電に依存して電流を発生させ、これは、次いで原動力を提供する（Ｙａｎｇら、１９９０）。用いられる微粒子は、タングステンビーズまたは金ビーズのような生物学的に不活性な物質からなっている。
【０２７６】
ラットおよびマウスの肝臓組織、皮膚組織、および筋肉組織を含む選択された器官は、インビボでボンバードされた（Ｙａｎｇら、１９９０；Ｚｅｌｅｎｉｎら、１９９１）。このことは、銃と標的器官との間の任意の介在組織を除去するための、組織または細胞の外科的露出を必要とし得る（すなわち、エキソビボ処置）。また、特定の遺伝子をコードするＤＮＡは、この方法を介して送達され、そしてなお本発明により取り込まれ得る。
【０２７７】
（４．１６  アンチセンスオリゴヌクレオチド）
遺伝子情報の流れの最終的結果は、タンパク質の合成である。ＤＮＡは、ポリメラーゼによってメッセンジャーＲＮＡへと転写され、そしてリボソーム上で翻訳されて、フォールディングされた機能性タンパク質を生じる。従って、この経路に沿って、タンパク質合成が阻害され得るいくつかの段階が存在する。本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするネイティブのＤＮＡセグメントは、すべての哺乳動物ＤＮＡ鎖のように、水素結合により結合された２つの鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を有する。ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡは、センスＤＮＡ鎖と同じヌクレオチド配列を有するが、ただし、そのＤＮＡのチミジンがウリジンに置き換わっている。従って、合成アンチセンスヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡに結合し、そしてそのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現を阻害する。
【０２７８】
従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドにｍＲＮＡを標的とさせることは、タンパク質合成を妨げるための１つの機構であり、結果的に、強力かつ標的化された治療アプローチを示す。例えば、ポリガラクタウロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）の合成およびムスカリン２型アセチルコリンレセプターは、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号（各々その全体が、本明細書中に詳細に参考として援用される））。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡレセプターおよびヒトＥＧＦを用いて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、１９８８；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ、１９８９；Ｐｅｒｉｓら、１９９８；米国特許第５，８０１，１５４号；同第５，７８９，５７３号；同第５，７１８，７０９号および同第５，６１０，２８８号（各々その全体が、本明細書中に詳細に参考として援用される））。種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害しそして処置するために使用され得る、アンチセンス構築物もまた、記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；同第５，５９１，３１７号および同第５，７８３，６８３号（各々その全体が、本明細書中に特に参考として援用される））。
【０２７９】
従って、例示的実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る任意の配列もしくはその相補体のすべてまたは一部を含む、オリゴヌクレオチド配列を提供する。１つの実施形態において、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはその誘導体を含む。第３の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート改変骨格を含む、改変ＤＮＡである。第４の実施形態において、そのオリゴヌクレオチド配列は、ペプチド核酸またはその誘導体を含む。各場合において、好ましい組成物は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドのうちの１つ以上の部分に相補的な、より好ましくは実質的に相補的な、そしてさらにより好ましくは完全に相補的な、配列領域を含む。
【０２８０】
所定の遺伝子配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択された標的配列（すなわち、これらの例示的例においては、ラット配列およびヒト配列）の分析に基づき、そして二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、相対的安定性の決定に基づき、そしてアンチセンス組成物は、二量体、ヘアピン、または宿主細胞において標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少または妨げる他の二次構造をそれらが形成できない相対的能力に基づいて選択された。
【０２８１】
ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域と実質的に相補的な配列である。これらの二次構造分析および標的部位選択の考慮は、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのバージョン４（Ｒｙｃｈｌｉｋ、１９９７）およびＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を使用して実施された。
【０２８２】
短いペプチドベクター（ＭＰＧ（２７残基）と称する）を使用するアンチセンス送達法の使用もまた意図される。このＭＰＧペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメインと、ＳＶ４０  Ｔ抗原の核局在化配列由来の親水性ドメインとを含む（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９７）。このＭＰＧペプチドのいくつかの分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドをコートし、そして比較的高効率（９０％）で１時間未満で培養哺乳動物細胞へと送達され得ることが示された。さらに、ＭＰＧとの相互作用は、ヌクレアーゼに対するそのオリゴヌクレオチドの安定性および形質膜を横切る能力の両方を強力に増加させる（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９７）。
【０２８３】
（４．１７  リボザイム）
タンパク質が伝統的に、核酸の触媒のために使用されているが、別のクラスの高分子が、この試みにおいて有用であることが明らかになった。リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、１９８７；Ｇｅｒｌａｃｈら、１９８７；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｓｏｎｓ、１９８７）。例えば、多数のリボザイムが、高い程度の特異性でホスホエステル転移反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中の数個のホスホエステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら、１９８１；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、１９９２）。この特異性は、この基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）との特異的塩基対形成相互作用を介して結合するという要件に帰せられている。
【０２８４】
リボザイム触媒は、主に、核酸を含む配列特異的切断／連結反応の一部として観察されている（Ｊｏｙｃｅ、１９８９；Ｃｅｃｈら、１９８１）。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号（詳細に本明細書中に参考として援用される）は、特定のリボザイムが、配列特異性が既知のリボヌクレアーゼの配列特異性よりも高くかつＤＮＡ制限酵素の配列特異性に近い、エンドヌクレアーゼとして作用し得ることを報告している。従って、遺伝子発現の配列特異的リボザイム媒介性阻害は、治療適用に特に適切であり得る（Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０）。最近、リボザイムが適用されたいくつかの細胞株においてそのリボザイムが遺伝子変化を惹起したこと；その変化した遺伝子がオンコジーンであるＨ−ｒａｓ，ｃ−ｆｏｓおよびＨＩＶの遺伝子を含んだことが、報告された。この研究のほどんどは、特定のリボザイムにより切断される特定の変異体コドンに基づく、標的ｍＲＮＡの改変を含んだ。
【０２８５】
天然に存在する酵素的ＲＮＡの６つの基本的変種が、現在公知である。各々が、生理学的条件下で、トランスで、ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得）る。一般に、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡへの結合によって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。従って、その酵素的核酸はまず、標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対形成を介してその標的ＲＮＡに結合し、そして一旦正確な部位に結合すると、その標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされるタンパク質を直接合成する標的ＲＮＡの能力を破壊する。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合しそして切断した後、その酵素的核酸は、別の標的を探索するためにそのＲＮＡから離れ、そして繰り返し、新しい標的に結合しそして切断し得る。
【０２８６】
リボザイムの酵素特性は、多くの技術（例えば、アンチセンス技術（ここで、核酸分子は、翻訳を阻害するために核酸標的に単に結合する））に対して有利である。なぜなら、治療的処置に影響を与えるのに必要であるリボザイムの濃度は、アンチセンスオリゴヌクレオチの濃度よりも低いからである。この利点は、酵素学的に作用するリボザイムの能力を反映する。従って、単一のリボザイム分子は、標的ＲＮＡの多くの分子を切断し得る。さらに、このリボザイムは、高度に選択的なインヒビターであり、この阻害の特異性は、標的ＲＮＡに結合する塩基対形成の機構に依存するだけでなく、標的ＲＮＡの切断の機構にも依存する。切断部位付近の１個のミスマッチまたは塩基置換により、リボザイムの触媒活性が完全になくなり得る。アンチセンス分子内の同様のミスマッチでは、それらの作用は妨げられない（Ｗｏｏｌｆら、１９９２）。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の特異性よりも高い。
【０２８７】
この酵素学的核酸分子は、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）モチーフ、ヘアピンモチーフ、δ型肝炎ウイルスモチーフ、Ｉ群イントロンモチーフまたはＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ誘導配列に関連する）あるいはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡモチーフに形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら（１９９２）に記載される。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ０３６０２５７）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ（１９８９）、Ｈａｍｐｅｌら（１９９０）および米国特許第５，６３１，３５９号（本明細書中で詳細に参考として援用される）に記載される。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ（１９９２）に記載される；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら（１９８３）に記載される；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９０；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９１；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，１９９３）に記載される；そしてＩ群イントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載される（本明細書中で詳細に参考として援用される）。本発明の酵素学的核酸分子において重要であることは、１以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である特定の基質結合部位を有すること、およびこの分子にＲＮＡ切断活性を付与する、基質結合部位内のヌクレオチド配列またはこの基質結合部位の周囲のヌクレオチド配列を有することだけである。従って、リボザイム構築物は、本明細書中に記載される特定のモチーフに限定する必要はない。
【０２８８】
特定の実施形態において、所望の標的のＲＮＡ（例えば、本明細書中において開示される配列の１つ）に対して高度の特異性を示す、酵素学的切断試薬を産生することが重要であり得る。好ましくは、この酵素学的核酸分子は、標的ｍＲＮＡの高度に保存された配列領域に対して標的化される。このような酵素学的核酸分子は、必要とされる場合、特定の細胞に外因的に送達され得る。あるいは、このリボザイムは、特定の細胞に送達されるＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターから発現され得る。
【０２８９】
小さな酵素学的核酸モチーフ（例えば、ハンマーヘッド構造またはヘアピン構造のモチーフ）はまた、外因的送達のために使用され得る。これらの分子の単純な構造は、酵素学的核酸がｍＲＮＡ構造の標的化領域に浸潤する能力を増大させる。あるいは、触媒ＲＮＡ分子は、真核生物のプロモータから細胞内で発現され得る（例えば、Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２；Ｄｒｏｕｐｕｌｉｃら、１９９２；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、１９９１；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２；Ｃｈｅｎら、１９９２；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０）。当業者は、任意のリボザイムが、真核生物細胞において適切なＤＮＡベクターから発現され得ることを理解する。このようなリボザイムの活性は、第二リボザイムによる第一転写物からの解放によって増強され得る（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９、および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５（これらの両方は、参考として援用される）；Ｏｈｋａｗａら、１９９２；Ｔａｉｒａら、１９９１；ならびにＶｅｎｔｕｒａら、１９９３）。
【０２９０】
リボザイムは、直接的に添加されるか、またはリポソーム内にパッケージングされたカチオン性脂質と共に複合体化され（脂質複合体）、さもなければ、標的細胞に送達され得る。ＲＮＡまたはＲＮＡ複合体は、生体高分子中に取り込んだ状態または取り込んでない状態で、注射、エアロゾル吸入、注入ポンプまたはステントを介して、関連する組織（エキソビボ、またはインビボ）に局所的に投与され得る。
【０２９１】
リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に記載されるように設計され得、そして記載されるようにインビトロおよびインビボにおいて試験するために合成され得る。このようなリボザイムはまた、送達するために最適化され得る。特定の例が提供されるが、当業者は、他の種において等価なＲＮＡ標的が、必要な場合に利用され得ることを理解する。
【０２９２】
ハンマーヘッドリボザイムまたはヘアピンリボザイムを、コンピュータフォールディング（Ｊａｅｇｅｒら、１９８９）によって個々に分析し、リボザイム配列が、適切な２次構造に折り畳まれたかどうかを評価し得る。結合アームと触媒中心との間で好ましくない分子内相互作用を有するこれらのリボザイムは、考慮から外される。種々の結合アームの長さが、活性を最適化するために選択され得る。一般に、各アームにおいて少なくとも５個以上の塩基が標的ＲＮＡに結合するか、さもなくばこの標的ＲＮＡと相互作用し得る。
【０２９３】
ハンマーヘッドモチーフまたはヘアピンモチーフのリボザイムは、ｍＲＮＡメッセージの種々の部位に対してアニールするように設計され得、そして化学的に合成され得る。使用される合成の方法は、Ｕｓｍａｎら（１９８７）およびＳｃａｒｉｎｇｅら、（１９９０）に記載されるような通常のＲＮＡ合成のための手順に従い、そして一般的な核酸保護基およびカップリング基（例えば、５’末端においてジメトキシトリチルおよび３’末端においてホスホルアミダイト）が使用される。平均的、段階的なカップリング収率は、代表的に、９８％より高い。ヘアピンリボザイムは、２個の部分で合成され得、そして活性リボザイムを再構築するためにアニールされ得る（ＣｈｏｗｒｉｒａおよびＢｕｒｋｅ、１９９２）。リボザイムは、大規模に改変され得、ヌクレアーゼ耐性基を用いて改変すること（例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−ｏ−メチル、２’−Ｈ（概説については、例えばＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２を参照のこと））によって安定性が増大され得る。リボザイムは、一般的な方法を使用するゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィーによって精製され得、そして水中に再懸濁され得る。
【０２９４】
リボザイムの活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更することにより、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐ改変（例えば、国際特許出願番号ＷＯ  ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９０；Ｐｉｅｋｅｎら、１９９１；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｅｎ、１９９２；国際特許公開番号ＷＯ  ９３／１５１８７；国際特許出願公開番号ＷＯ  ９１／０３１６２；欧州特許出願公開番号９２１１０２９８．４；米国特許第５，３３４，７１１号、および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／１３６８８（これには、酵素学的ＲＮＡ分子の糖部分に対して成され得る、種々の化学的修飾が記載される）を参照のこと）、細胞中でのリボザイムの効力を増強する改変、ならびにＲＮＡの合成時間を短縮および化学的必要性を低下させるためのステム（ｓｔｅｍ）ＩＩ塩基を除去して、リボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。
【０２９５】
Ｓｕｌｌｉｖａｎら（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５）は、酵素学的ＲＮＡ分子の送達のための一般的な方法を記載する。リボザイムは、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与され得、これらには、リポソームへのカプセル化、イオン泳動法、あるいは、例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性ミクロスフィアのような他のビヒクルへの取り込みによるもの、が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの指針のために、リボザイムは、エキソビボで細胞または組織に、上記のビヒクルを使用してか、または使用せずに直接送達され得る。あるいは、ＲＮＡ／ビヒクルの組合せは、直接的な吸入、直接的な注射、またはカテーテル、注入ポンプもしくはステントの使用により、局所的に送達され得る。他の送達経路としては、血管内注射、筋内注射、皮下注射または関節注射、エアロゾル吸入、経口送達（錠形態または丸薬形態）、局所送達、全身送達、眼送達、腹腔内送達および／またはくも膜下腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイム送達および投与のより詳細な記載は、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に提供される。
【０２９６】
高濃度のリボザイムを細胞内に蓄積する別の手段は、リボザイムコード配列をＤＮＡ発現ベクターに組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のためのプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞内で高レベルで発現される；所定の細胞型における所定のｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用され得るが、但し、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素は、適切な細胞において発現される（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ、１９９０；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ、１９９３；Ｌｉｅｂｅｒら、１９９３；Ｚｈｏｕら、１９９０）。このようなプロモーターから発現するリボザイムは、哺乳動物細胞において機能し得る（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｒら、１９９２；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２；Ｃｈｅｎら、１９９２；Ｙｕら、１９９３；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、１９９２；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら、１９９３）。このような転写ユニットは、哺乳動物細胞内への導入のための種々のベクター（プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター）が挙げられるがこれらに限定されない）に組み込まれ得る。
【０２９７】
リボザイムを診断道具として使用して、疾患細胞内の遺伝的変動および変異を試験し得る。これらをまた使用して、標的ＲＮＡ分子のレベルを評価し得る。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間の緊密な関係は、標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を変える分子の任意の領域において変異の検出を可能にする。複数のリボザイムを使用することにより、インビトロならびに細胞および組織でのＲＮＡの構造および機能に対して重要であるヌクレオチドの変化をマップし得る。リボザイムを用いる標的ＲＮＡの切断を使用して、遺伝子発現を阻害し得、そして疾患の進行における特定の遺伝子産物の役割（必須性）を規定し得る。この様式で、他の遺伝子標的が、その疾患の重要な媒介物として、規定され得る。これらの研究は、併用治療の可能性（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のリボザイム、公知の低分子インヒビターに結合したリボザイム、あるいはリボザイムおよび／または他の化学的分子もしくは生物学的分子と併用した間欠性処置）を提供することにより、疾患の進行のより良好な処置をもたらす。リボザイムのインビトロでの他の使用は、当該分野で周知であり、そしてＩＬ−５に関連する状態に関するｍＲＮＡの存在の検出を含む。このようなＲＮＡは、標準的な方法論を使用してリボザイムを用いて処置した後に、切断産物の存在を決定することによって検出される。
【０２９８】
（４．１８  ペプチド核酸）
特定の実施形態において、本発明者らは、本発明の方法の実施において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用を考慮する。ＰＮＡは、核酸塩基が、偽ペプチド骨格に結合されたＤＮＡ模倣物である（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、１９９７）。ＰＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡを伝統的に使用した複数の方法において利用され得る。時々、ＰＮＡ配列は、対応するＲＮＡまたはＤＮＡ配列よりも技術的により良く実施され、そしてＲＮＡにもＤＮＡにも固有でない有用性を有していた。作製方法、特徴、および使用方法を含むＰＮＡの総説は、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）によって提供され、そして本明細書中で参考として援用される。このように、特定の実施形態において、ＡＣＥ  ｍＲＮＡ配列の１以上の部分に相補的であるＰＮＡ配列を調製し得、そしてこのようなＰＮＡ組成物は、ＡＣＥ特異的ｍＲＮＡの翻訳を調節、変更、減少、または低下させるために使用され得、これにより、このようなＰＮＡ組成物が投与された宿主細胞におけるＡＣＥ活性のレベルを変更する。
【０２９９】
ＰＮＡは、ＤＮＡの通常のホスホジエステル骨格を置換する２−アミノエチル−グリシン連結を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１；Ｈａｎｖｅｙら、１９９２；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，１９９６；Ｎｅｉｌｓｅｎ、１９９６）。この化学は、３つの重要な結果を有する。第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと対照的に、ＰＮＡは、中性の分子であり；第２に、ＰＮＡは、アキラル（立体選択的な合成を開発する必要がない）であり；そして第３に、ＰＮＡ合成は、固相ペプチド合成のための標準的なＢｏｃプロトコル（Ｄｕｅｈｏｌｍら、１９９４）またはＦｍｏｃプロトコル（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５）を使用する。一方、改良型Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を含む他の方法が使用される（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９５）。
【０３００】
ＰＮＡモノマーまたは既製のオリゴマーは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）から市販されている。ＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡの合成は、手動プロトコルまたは自動プロトコルを使用して簡単に実施される（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５）。この手動プロトコルは、それ自体で、化学的に修飾されたＰＮＡの産生または密接に関係するＰＮＡのファミリーの同時合成を導く。
【０３０１】
ペプチドの合成に関して、特定のＰＮＡ合成の成功は、選択した配列の特性に依存する。例えば、理論上、ＰＮＡは、ヌクレオチド塩基の任意の組合せを取り込み得るが、隣接するプリンの存在は、産物における、１以上の残基の欠失を導き得る。この困難性の見込みにおいて、隣接するプリンを有するＰＮＡを産生する際に、おそらく非効率的に加えられている残基のカップリングを繰り返すべきであることを提案する。この後、ペプチド合成の間に観測されるのと類似する産物の収率および純度を提供する逆相高圧液体クロマトグラフィーによってＰＮＡを精製するべきである（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５）。
【０３０２】
所与の適用のためのＰＮＡの修飾が、固相合成の間にアミノ酸をカップリングすることによって、または露出されたＮ末端アミンにカルボン酸基を含む化合物を付加することによって達成され得る。あるいは、ＰＮＡは、導入されたリジンまたはシステインにカップリングすることによって合成した後に修飾され得る。ＰＮＡが修飾され得る簡便さにより、より良い溶解度または特定の機能的必要性の最適化を容易にする。一旦合成されると、ＰＮＡおよびそれらの誘導体の同定は、質量分析器によって確認され得る。いくつかの研究が、ＰＮＡの修飾物を作製および利用した（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５；Ｈａａｉｍａら、１９９６；Ｓｔｅｔｓｅｎｋｏら、１９９６；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９５；Ｕｌｍａｎｎら、１９９６；Ｋｏｃｈら、１９９５；Ｏｒｕｍら、１９９５；Ｆｏｏｔｅｒら、１９９６；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、１９９５；Ｋｒｅｍｓｋｙら、１９９６；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９５；Ｂｏｆｆａら、１９９５；Ｌａｎｄｓｄｏｒｐら、１９９６；Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉら、１９９６；Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９７；Ｓｅｅｇｅｒら、１９９７；Ｒｕｓｋｏｗｓｋｉら、１９９７）。米国特許第５，７００，９２２号は、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラ分子および診断におけるその分子の使用、生物中の修飾タンパク質、ならびに治療に対して影響を受け易い状態の処置について議論する。
【０３０３】
負に荷電した連結を含有するＤＮＡおよびＲＮＡと対照的に、ＰＮＡ骨格は、中性である。この劇的な変更にも係らず、ＰＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対形成によって相補的なＤＮＡおよびＲＮＡを認識し（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９１）による初期のモデル化を確認する。ＰＮＡは、３’〜５’の極性を欠き、そして平行様式または逆平行様式のいずれかで結合し得るが、逆平行様式が好ましい（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。
【０３０４】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドとＤＮＡおよびＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、相補鎖の負に荷電したリン酸骨格の間の静電気的な反発によって不安定化される。対照的に、ＰＮＡ−ＤＮＡまたはＰＮＡ−ＲＮＡの二重鎖において電荷の反発がないことにより、融解温度（Ｔｍ）が上昇し、そして一価のカチオンまたは二価のカチオンの濃度へのＴｍの依存度が減少する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）。ハイブリダイゼーションの増加した速度および親和性は重要である。なぜならば、これらは、緩和した二重鎖ＤＮＡ内の相補配列の鎖侵入を実施するようなＰＮＡの驚くべき能力の原因となるからである。さらに、逆方向反復での効果的なハイブリダイゼーションは、ＰＮＡが、二重鎖ＤＮＡ内で効果的に二次構造を認識し得ることを示唆する。増強した認識はまた、表面上に固定化されたＰＮＡで生じ、Ｗａｎｇらは、支持体に結合したＰＮＡが、ハイブリダイゼーション事象を検出するために使用され得ることを示した（Ｗａｎｇら、１９９６）。
【０３０５】
相補的な配列に対するＰＮＡの強固な結合がまた、類似の（同じではない）配列との結合を増加し、ＰＮＡ認識の配列特異性を減少させることが予期され得る。しかし、ＤＮＡハイブリダイゼーションに関して、選択的認識は、オリゴマー長およびインキュベーション温度を平均化することにより達成され得る。さらに、ＰＮＡの選択的ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションよりも低い塩基ミスマッチを許容するＰＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって促進される。例えば、１６ｂｐのＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖内での１個のミスマッチは、１５℃までＴｍを低下させ得る（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。高いレベルの識別は、点変異の分析に対して、数種のＰＮＡに基づく戦略の開発を可能にする（Ｗａｎｇら、１９９６；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、１９９６；Ｔｈｉｅｄｅら、１９９６；ＷｅｂｂおよびＨｕｒｓｋａｉｎｅｎ、１９９６；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、１９９６）。
【０３０６】
高い親和性結合は、ＰＮＡに対する分子認識および新規適用の開発のための明確な利点を提供する。例えば、１１〜１３個のヌクレオチドＰＮＡは、テロメラーゼ（本質的なＲＮＡ鋳型を使用するテロメア末端を伸長するリボヌクレオ−タンパク質）の活性を阻害するが、類似のＤＮＡオリゴマーは、阻害しない（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９６）。
【０３０７】
中性ＰＮＡは、類似のアナログＤＮＡオリゴマーよりもより疎水性であり、そしてこのことは、特に、ＰＮＡが高いプリン含有量を有する場合、または二次構造を形成するような能力を有する場合に、このＰＮＡを中性のｐＨで溶解するのをより困難にし得る。これらの溶解度は、１以上の正の電荷をＰＮＡ末端に付与することによって増加され得る（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）。
【０３０８】
Ａｌｌｆｒｅｙおよび共同実験者による発見は、鎖の侵入が染色体ＤＮＡ内の配列において自然に起こることを示唆している（Ｂｏｆｆａら、１９９５；Ｂｏｆｆａら、１９９６）。これらの研究は、ヌクレオチドＣＡＧの三塩基反復に対してＰＮＡを標的化し、そして転写性活性ＤＮＡを精製（Ｂｏｆｆａら、１９９５）し、そして転写を阻害（Ｂｏｆｆａら、１９９６）するためにこの認識を使用した。この結果は、ＰＮＡが細胞内に送達され得た場合、このＰＮＡが遺伝子発現の一般的な配列特異的調節因子となる能力を有することを示唆する。ＰＮＡのアンチセンスおよび抗遺伝子試薬としての使用に関する研究および総説には、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９３ｂ）、Ｈａｎｖｅｙら（１９９２）、およびＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９７）が挙げられる。Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓら（１９９７）は、ＨＩＶ−１の逆転写を阻害するためにＰＮＡを使用して、ＰＮＡが抗ウイルス治療に使用され得ることを示した。
【０３０９】
ＰＮＡのアンチセンス結合特性を特徴づけする方法は、Ｒｏｓｅ（１９９３）およびＪｅｎｓｅｎら（１９９７）において議論される。Ｒｏｓｅは、キャピラリーゲル電気泳動を使用して、相対的な結合速度論および化学量論を測定することで、ＰＮＡのそれらの相補的オリゴヌクレオチドとの結合を決定する。同じタイプの測定が、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ技術を使用してＪｅｎｓｅｎらによって成された。
【０３１０】
ＰＮＡの他の適用には、ＤＮＡ鎖の侵入（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）、アンチセンス阻害（Ｈａｎｖｅｙら、１９９２）、変異分析（Ｏｒｕｍら、１９９３）、転写の増強（Ｍｏｌｌｅｇａａｒｄら、１９９４）、核酸の精製（Ｏｒｕｍら、１９９５）、転写活性遺伝子の単離（Ｂｏｆｆａら、１９９５）、転写因子結合のブロッキング（Ｖｉｃｋｅｒｓら、１９９５）、ゲノムの切断（Ｖｅｓｅｌｋｏｖら、１９９６）、バイオセンサー（Ｗａｎｇら、１９９６）、インサイチュハイブリダイゼーション（Ｔｈｉｓｔｅｄら、１９９６）、およびサザンブロットの代替（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ、１９９６）における使用が挙げられる。
【０３１１】
（４．１９  ポリペプチド、ペプチドおよびペプチド改変体）
他の局面において、本発明は、ポリペプチド組成物を提供する。一般に、本発明のポリペプチドは、哺乳動物種由来の単離されたポリペプチド（もしくはエピトープ、改変体、またはその活性フラグメント）である。好ましくは、ポリペプチドは、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列または本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列に対して穏やかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によってコードされる。あるいは、ポリペプチドは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列由来の連続アミノ酸配列を含むポリペプチド、または本明細書中に開示される全体のアミノ酸配列を含むポリペプチドとして規定され得る。
【０３１２】
本発明において、ポリペプチド組成物はまた、本発明のポリペプチド（特に、開示されたポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド）、あるいはそれらの活性フラグメント、または改変体もしくは生物学的機能の等価物に対して産生される抗体と免疫学的に反応性である１以上のポリペプチドを含むことが理解される。
【０３１３】
同様に、本発明のポリペプチド組成物は、本明細書中に開示される１以上の連続する核酸配列、あるいはその活性フラグメントまたは改変体、または中程度から高いストリンジェンシーな条件下で１以上のこれらの配列の１つ以上とハイブリダイズする１以上の核酸配列によってコードされる１以上のポリペプチドと免疫学的に反応性である抗体を誘発し得る１以上のポリペプチドを含むことが理解される。
【０３１４】
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドの活性フラグメントは、ポリペプチドの全体または一部を含み、これは、従来の技術（例えば、突然変異誘発）により、または付加、失欠、もしくは置換によって改変されるが、この活性フラグメントは、本明細書中に記載されるようなポリペプチドと実質的に同一の構造、機能、脈管形成性などを示す。
【０３１５】
特定の例示的実施形態において、本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、血液悪性疾患関連腫瘍タンパク質またはその改変体の少なくとも免疫原性部分を含み得る。上記のように、「血液悪性疾患関連腫瘍タンパク質」は、血液悪性疾患関連腫瘍細胞によって発現されるタンパク質である。血液悪性疾患関連腫瘍タンパク質であるタンパク質はまた、血液悪性疾患を有する患者からの抗血清を用いる免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）において、検出可能に反応する。本明細書に記載されるようなポリペプチドは、任意の長さであり得る。ネイティブタンパク質および／または異種配列由来のさらなる配列が存在し得、そしてそのような配列は、さらに、免疫原性特性または抗原特性を有し得る（しかし、有する必要はない）。
【０３１６】
本明細書中で使用される場合、「免疫原性部分」は、Ｂ細胞表面抗原レセプターおよび／またはＴ細胞表面抗原レセプターによって認識される（すなわち、特異的に結合される）タンパク質の部分である。このような免疫原性部分は、一般に、血液悪性疾患関連腫瘍タンパク質またはその改変体の、少なくとも５アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１０アミノ酸残基、なおより好ましくは、少なくとも２０アミノ酸残基を含む。特定の好ましい免疫原性部分は、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインが欠失されたペプチドを含む。他の好ましい免疫原性部分は、成熟タンパク質と比較して、少ないＮ末端欠失および／またはＣ末端欠失（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）を含み得る。
【０３１７】
免疫原性部分は、一般的にＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版、２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびそこに引用される参考文献に要約されるような周知技術を使用して、同定され得る。このような技術は、抗原特異的な抗体、抗血清および／あるいはＴ細胞株またはＴ細胞クローンと反応する能力についてポリペプチドをスクリーニングする工程を含む。本明細書中で使用される場合、抗血清および抗体は、それらが抗原に特異的に結合する（すなわち、これらが、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてそのタンパク質と反応し、無関係なタンパク質とは検出可能に反応しない）場合、「抗原特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書中に記載されるように、そして周知技術を使用して調製され得る。ネイティブの血液悪性疾患関連腫瘍タンパク質の免疫原性部分は、（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）その全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に小さくないレベルで、このような抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。免疫原性部分は、このようなアッセイにおいて、その全長ポリペプチドの反応性と類似またはそれより大きいレベルで反応し得る。このようなスクリーニングは、一般的に、当業者に周知の方法（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載のような技術）を使用して行われ得る。例えば、ポリペプチドを固体支持体に固定し、そして患者の血清を接触させて、その血清中の抗体をその固定されたポリペプチドに結合させ得る。次いで、結合されなかった血清を除去し、結合された抗体を、例えば、１２５Ｉ標識化プロテインＡを使用して検出し得る。
【０３１８】
上記のように、組成物は、ネイティブの血液悪性疾患関連腫瘍タンパク質の改変体を含み得る。本明細書中で使用される場合、ポリペプチド「改変体」は、ネイティブの血液悪性疾患関連腫瘍タンパク質と、１以上の置換、欠失、付加および／または挿入において異なるポリペプチドであり、その結果、そのポリペプチドの免疫原性が、実質的には減少されない。言い換えると、抗原特異的な抗血清と反応する改変体の能力は、そのネイティブタンパク質と比較して、増強されても、または変化されなくてもよく、あるいは、そのネイティブタンパク質と比較して、５０％未満、そしてより好ましくは、２０％未満に減少されてもよい。このような改変体は、一般に、本明細書中に記載のように、上記ポリペプチド配列の１つを改変し、この改変ポリペプチドの抗原特異的な抗体または抗血清との反応性を評価することによって同定され得る。好ましい改変体は、１つ以上の部分（例えば、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン）が取り除かれた改変体を含む。他の好ましい改変体は、小さな部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が、成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から取り除かれた改変体を含む。
【０３１９】
本発明によって包含されるポリペプチド改変体は、好ましくは、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の、本明細書中に開示されたポリペプチドに対する同一性（上記のように決定された）を示す。
【０３２０】
好ましくは、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、あるアミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸と置換されている置換であり、その結果、ペプチド化学の当業者は、そのポリペプチドの二次構造および疎水性親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）性質が、実質的に変化されないことを予測する。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性性質の類似性に基づいて作製され得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニン；および類似の親水性値を有する非荷電の極性頭部を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他のグループとしては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変体はまた、またはあるいは、非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、５以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によって、ネイティブの配列とは異なる。改変体はまた（またはあるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性性質に最小限の影響しか有さないアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【０３２１】
上記のように、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時に、または翻訳後に、そのタンパク質の転移を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするために、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列または他の配列（例えば、ポリＨｉｓ）に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
【０３２２】
ポリペプチドは、任意の種々の周知技術を使用して調製され得る。上記のＤＮＡ配列によってコードされる組換えポリペプチドは、当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを使用して、ＤＮＡ配列から容易に調製され得る。発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母、および高等真核生物の細胞が挙げられる。好ましくは、使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母または哺乳動物細胞株（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ）である。組換えタンパク質または組換えポリペプチドを培養培地中に分泌する適切な宿主／ベクター系からの上清は、市販のフィルターを使用して、最初に濃縮され得る。濃縮後、この濃縮物を、適切な精製基質（例えば、アフィニティー基質またはイオン交換樹脂）に適用し得る。最終的に、１以上の逆相ＨＰＬＣ工程を使用して、組換えポリペプチドをさらに精製し得る。
【０３２３】
約１００アミノ酸未満、そして一般に、約５０アミノ酸未満のアミノ酸を有する部分および他の改変体もまた、当業者に周知の技術を使用して、合成手段によって生成され得る。例えば、このようなポリペプチドは、任意の市販の固相技術（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法（ここでは、アミノ酸が連続的に付加されて、アミノ酸鎖を成長させる））を使用して、合成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６，１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような供給者から市販され、そして製造業者の説明書に従って操作され得る。
【０３２４】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび関連しない配列（例えば、公知の腫瘍タンパク質）を含む融合タンパク質であり得る。例えば、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供する際に補助し得るか、またはネイティブの組換えタンパク質より高い収量でタンパク質（発現エンハンサー）を発現する際に補助し得る。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解性を増加するように、またはタンパク質が所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーには、親和性タグ（これは、タンパク質の精製を容易にする）が挙げられる。
【０３２５】
融合タンパク質は、一般に、標準的な技術（例えば、化学的結合体化）を使用して調製され得る。好ましくは、融合タンパク質は、発現系において、組換えタンパク質として発現され、非融合タンパク質と比較して、増加したレベルの産生を可能にする。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を、別々にアセンブルし得、そして適切な発現ベクターに連結し得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、これらの配列のリーディングフレームが同じ相にあるように連結される。このことが、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質への翻訳を可能にする。
【０３２６】
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド構成要素を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質中に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）フレキシブルな伸長したコンホメーションを採る能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を採ることができないこと；および（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の無いこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列を含む。リンカー配列は、一般的に１から約５０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされない。
【０３２７】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終結シグナルを終了するために必要とされる停止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【０３２８】
本発明のポリペプチドを関係のない免疫原性タンパク質とともに含む融合タンパク質もまた提供される。好ましくは、免疫原性タンパク質は、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を参照のこと）。
【０３２９】
好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性の細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂの表面タンパク質である、プロテインＤ（ＷＯ  ９１／１８９２６）に由来する。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、ほぼ３分の１の最初のタンパク質（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポタンパク質Ｄ融合パートナーの最初の１０９残基は、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するように、そしてＥ．ｃｏｌｉ中の発現レベルを増加する（従って、発現エンハンサーとして機能する）ように、Ｎ末端に含まれる。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）を含む。代表的に、Ｎ末端の８１アミノ酸が用いられるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが用いられてもよい。
【０３３０】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその部分（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ  ４３：２６５〜２９２，１９８６）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）への親和性についての原因である。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために開発された。アミノ酸末端でＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９５〜７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合タンパク質に組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
【０３３１】
一般に、本明細書に記載されるようなポリペプチド（融合タンパク質を含む）およびポリヌクレオチドが単離される。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質は、それが天然の系中で共存する物質のいくつかまたは全てから分離されている場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。ポリヌクレオチドは、例えば、それが天然の環境の一部でないベクターにクローニングされる場合、単離されていると考えられる。
【０３３２】
（４．２０  結合剤）
本発明は、さらに血液悪性疾患関連腫瘍タンパク質に特異的に結合する因子（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）をさらに提供する。本明細書において用いる場合、抗体またはその抗原結合フラグメントは、血液悪性疾患関連腫瘍タンパク質と検出可能レベルで反応し（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて）、そして類似の条件下で無関係のタンパク質とは検出可能に反応しない場合、血液悪性疾患関連腫瘍タンパク質に「特異的に結合する」といわれる。本明細書において用いる場合、「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、「複合体」が形成されるような２つの別々の分子間の非共有結合をいう。結合する能力は、例えば、複合体の形成についての結合定数を決定することにより評価され得る。結合定数は、複合体の濃度を成分濃度の積で割って得られる値である。一般に、２つの化合物は、複合体形成の結合定数が約１０３Ｌ／ｍｏｌを超える場合、本発明の文脈中で「結合している」といわれる。結合定数は、当該分野で周知の方法を用いて決定され得る。
【０３３３】
結合剤は、本明細書において提供される代表的アッセイを用いて、血液悪性疾患を有する患者と有さない患者の間でさらに区別され得る。言い換えれば、血液悪性疾患関連腫瘍タンパク質に結合する抗体または他の結合剤は、疾患を有する少なくとも約２０％の患者においては血液悪性疾患の存在を示すシグナルを生成し、そしてこの疾患を有さない少なくとも約９０％の個体においては疾患の存在しないことを示すネガティブなシグナルを生成する。結合剤がこの要件を満たすか否かを決定するために、血液悪性疾患を有する患者および血液悪性疾患を有さない（標準的臨床試験を用いて決定した場合）患者由来の生物学的サンプル（例えば、血液、血清、尿、および／または腫瘍生検）は、この結合剤に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載のようにアッセイされ得る。疾患を有するサンプルおよび疾患を有さない統計的に有意な数のサンプルをアッセイすべきであることが明白である。それぞれの結合剤は、上記の基準を満たすべきであるが；当業者は、結合剤が感受性を改善する組み合わせで用いられ得ることを認識する。
【０３３４】
上記の要件を満たす任意の薬剤が結合剤であり得る。例えば、結合剤はリボソーム（ペプチド成分を伴うかまたは伴わない）、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術により調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般に、組換え抗体の産生を可能にするために、細胞培養技術（本明細書中に記載のモノクローナル抗体の産生を含む）によってか、または適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、抗体は産生され得る。１つの技術では、ポリペプチドを含む免疫原は、任意の広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギ）にまず注射される。この工程で、本発明のポリペプチドは、改変なしの免疫原として働く。あるいは、特に、相対的に短いポリペプチドについて、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合する場合、優れた免疫応答が惹起され得る。この免疫原は、好ましくは所定のスケジュール（１回以上のブースター免疫を組み込む）に従って、動物宿主に注射され、そしてこの動物は、定期的に採血される。次いで、このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、例えば、安定な固体支持体に結合しているポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。
【０３３５】
目的の抗原性ポリペプチドについて特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６の技術、ならびにその改良型を使用して調製され得る。手短に言うと、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調製を包含する。このような細胞株は、例えば、上記のように、免疫された動物から得られた脾臓細胞から産生され得る。次いで、脾臓細胞は、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー（好ましくは、免疫された動物と同系のもの）との融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細胞は、非イオン性界面活性剤と数分間組み合わせられ得、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、ミエローマ細胞の増殖を支持しない選択培地上で低密度でプレートされる。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間（通常約１〜２週間）後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーが選択され、そしてそれらの培養上清が、ポリペプチドに対する結合活性について試験される。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０３３６】
モノクローナル抗体は、増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔内へのハイブリドーマ細胞株の注射のような種々の技法が、収量の増加のために利用され得る。次いで、モノクローナル抗体は、腹水または血液から収集され得る。夾雑物は、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈降、および抽出のような従来の技法によってこの抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティクロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて用いられ得る。
【０３３７】
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が好ましくあり得る。このようなフラグメントとしては、Ｆａｂフラグメントが挙げられ、これは、標準的な技術を使用して調製され得る。簡単には、免疫グロブリンは、プロテインＡビーズカラムのアフィニティークロマトグラフィーによってウサギ血清から生成され得（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、そしてパパインによって消化され、ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを生じる。このＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントは、プロテインＡビーズカラムのアフィニティークロマトグラフィーによって分離され得る。
【０３３８】
本発明のモノクローナル抗体およびこれらのフラグメントは、放射性核種、分化誘導物質、薬物、毒素、およびそれらの誘導体のような１種以上の治療剤と組み合わせられ得る。好ましい放射性核種として、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物として、メトトレキセート、ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化誘導物質として、フォルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素として、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、シュードモナス外毒素、赤痢菌毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウィルス性タンパク質が挙げられる。特定のインビボおよびエキソビボの治療のために、抗体またはそのフラグメントは、好ましくは、放射活性部分または化学療法剤部分のような細胞障害性因子と結合される。
【０３３９】
治療薬は、適切なモノクローナル抗体と、直接的にかまたは（例えば、リンカー基を介して）間接的にかのいずれかで結合（例えば、共有結合）され得る。各々が、他と反応し得る置換基を有する場合、物質と抗体との間の直接的な反応が可能である。例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基のような求核基は、無水物または酸ハロゲン化物のようなカルボニル含有基と、あるいは他方では良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を有するアルキル基と反応し得る。
【０３４０】
あるいは、リンカー基を介して治療薬と抗体と結合することが望ましいであろう。リンカー基は、結合能力の妨害を避けるために、物質から抗体を離すスペーサーのように機能し得る。リンカー基はまた、物質または抗体上の置換基の化学反応性を増大するために供し得、従って結合効率を増大する。化学反応性の増大はまた、（さもなければ不可能である）物質または物質上の官能基の使用を容易にし得る。
【０３４１】
ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方の種々の二官能性試薬または多官能性試薬（例えば、これらは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログに記載されている）が、リンカー基として利用され得ることが当業者に明らかである。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭化水素残基を通じてなされ得る。このような方法論（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに与えられた、米国特許第４，６７１，９５８号）を記載する多数の参考文献が存在する。
【０３４２】
本発明の免疫複合体の抗体部分がないときに治療薬がより効き目のある場合は、細胞中への内在化の間か、あるいは内在化の際に切断され得るリンカー基を用いることが望ましいだろう。多数の異なる切断可能なリンカー基が、記載されている。これらリンカー基からの物質の細胞内放出に関するメカニズムとして、ジスルフィド結合の還元（例えば、米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射（例えば、米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体を媒介した加水分解（例えば、米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、米国特許第４，５６９，７８９号）による切断が挙げられる。
【０３４３】
抗体に対する１つ以上の物質の結合が所望される得る。１つの実施態様において、物質の複数の分子が、１つの抗体分子に対して結合される。別の実施態様において、１つ以上のタイプの物質が、１つの抗体分子に対して結合され得る。特定の実施態様に関係なく、１つ以上の物質を有する免疫複合体が、多様な方法で調製され得る。例えば、１つ以上の物質が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが用いられ得る。あるいは、キャリアが用いられ得る。
【０３４４】
キャリアは、直接的にかまたはリンカー基を介してかのいずれかで共有結合を含む、多様な方法でこの物質を保持し得る。適切なキャリアとして、アルブミンようなタンパク質（例えば、米国特許第４，５０７，２３４号）、アミノデキストランのようなペプチドおよびポリサッカライド（例えば、米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、非共有結合によるか、またはカプセル化（例えば、リポソーム小胞中（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および米国特許第４，８７３，０８８号））により物質を運び得る。放射性核種物質に特異的なキャリアとして、放射ハロゲン化（ｒａｄｉｏｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ）低分子およびキレート化合物が挙げられる。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属放射性核種、または金属酸化物放射性核種を結合するための供与体原子として、窒素原子および硫黄原子を含むようなキレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらに与えられた、米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
【０３４５】
この抗体および免疫複合体に関して種々の投与経路が用いられ得る。代表的には、投与は、静脈内、筋肉内、皮下、または切除した腫瘍の床（ｂｅｄ）内である。抗体／免疫複合体の正確な用量は、用いる抗体、腫瘍に対する抗原密度、および抗体のクリアランス速度に依存して変化する。
【０３４６】
（４．２１．ワクチン）
本発明の特定の好ましい実施形態においては、ワクチンが提供される。このワクチンは、一般的に、免疫賦活剤と組み合わせて、上記で考察されるような１つ以上の薬学的組成物を含む。免疫賦活剤は、外来性の抗原に対する免疫応答（抗体媒介性および／または細胞媒介性）を向上または増強させる任意の物質であり得る。免疫賦活剤の例としては、アジュバント、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）およびリポソーム（この中に化合物が組み込まれる；例えば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国特許第４，２３５，８７７号を参照のこと）が挙げられる。ワクチン調製物は、一般的に、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＮ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ（編）、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）（ＮＹ，１９９５）に記載される。本発明の範囲内の薬学的組成物およびワクチンはまた、他の化合物に含まれ得、この化合物は、生物学的に活性であっても不活性であってもよい。例えば、他の腫瘍抗原の１つ以上の免疫原性部分が、融合ポリペプチドに組み込まれてか、または別個の化合物としてのいずれかで、この組成物またはワクチン中に存在し得る。
【０３４７】
例示的なワクチンは、上記のようなポリペプチドのうちの１つ以上をコードするＤＮＡを含み得、その結果、このポリペプチドは、インサイチュで産生される。上記のように、このＤＮＡは、当業者に公知の種々の送達系（核酸発現系、細菌およびウイルス発現系を含む）のいずれかにおいて存在し得る。多数の遺伝子送達技術が当該分野において周知であり、例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５：１４３−１９８（１９９８）およびそこに引用される参考文献に記載される技術がある。適切な核酸発現系は、患者における発現のために必要なＤＮＡ配列（例えば、適切なプロモーターおよび終止シグナル）を含む。細菌送達系は、その細胞表面上でこのポリペプチドの免疫原性部分を発現するか、またはこのようなエピトープを分泌する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含む。好ましい実施形態においては、ＤＮＡは、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を用いて導入され得、これは非病原性（欠損）の複製コンピテントなウイルスの使用を含み得る。適切な系は、例えば、以下に開示される：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３１７−３２１（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６−１０３（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７−２１（１９９０）；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ２，２００，６５１；ＥＰ０，３４５，２４２；ＷＯ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２７（１９８８）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１５−２１９（１９９４）；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１４９８−１１５０２（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８３８−２８４８（１９９３）；およびＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２−１２０７（１９９３）。ＤＮＡをこのような発現系に組み込むための技術は、当業者に周知である。ＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９（１９９３）に記載され、そしてＣｏｈｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１−１６９２（１９９３）により概説されるように、「裸（ｎａｋｅｄ）」であり得る。裸のＤＮＡの取込みは、このＤＮＡを生分解性ビーズにコーティングすることによって増加され得、これは、細胞中に効率的に輸送される。ワクチンは、ポリヌクレオチド成分およびポリペプチド成分の両方を含み得ることは明らかである。このようなワクチンは、増強された免疫応答を提供し得る。
【０３４８】
ワクチンは、本明細書中で提供されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることが明らかである。このような塩は、薬学的に受容可能な非毒性の塩基（有機塩基（例えば、一級アミン、二級アミンおよび三級アミンならびに塩基性アミノ酸の塩））および無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩）を含む）から調製され得る。
【０３４９】
当業者に公知の任意の適切なキャリアは、本発明のワクチン組成物において使用され得るが、キャリアの型は、投与の様式に依存して変化する。本発明の組成物は、任意の適切な投与の様式（例えば、局所投与、経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与または筋内投与を含む）のために処方され得る。非経口投与（例えば、皮下注射）のためには、キャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ロウまたは緩衝液を含む。経口投与のためには、上記のキャリアまたは固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石粉、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウム）が使用され得る。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコレート）はまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号；および同第５，９４２，２５２号に開示される。米国特許第５，９２８，６４７号に記載される粒子状タンパク質複合体を含むキャリアもまた使用され得、これは、宿主においてクラスＩ−制限細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
【０３５０】
このような組成物はまた、緩衝液（例えば、中性緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、この処方物を、レシピエントの血液と等張、低浸透圧または弱高浸透圧にする溶質、懸濁剤、濃化剤および／または保存剤を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥剤として処方され得る。化合物はまた、周知の技術を用いてリポソームにカプセル化され得る。
【０３５１】
任意の種々の免疫賦活剤が、本発明のワクチンに使用され得る。例えば、アジュバントが含まれ得る。ほとんどのアジュバントは、抗原を急速な異化作用から保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）、および免疫応答の刺激因子（例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ誘導タンパク質）を含む。適切なアジュバントは、例えば、以下として市販されている：フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩；カルシウム、鉄、または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化された糖類；カチオン性またはアニオン性に誘導体化された多糖類；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびクイルＡ。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、インターロイキン−７もしくはインターロイキン−１２もまた、アジュバントとして使用され得る。
【０３５２】
本明細書中で提供されるワクチンにおいて、アジュバント組成物は、好ましくは、主にＴｈ１型の免疫応答を誘導するように設計される。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を助ける傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を助ける傾向がある。本明細書中で提供されるようなワクチンの適用後に、患者は、Ｔｈ１型およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が主にＴｈ１型である好ましい実施形態においては、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルを大いに超えるまで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的なアッセイを用いて容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５−１７３（１９８９）を参照のこと。
【０３５３】
Ｔｈ１型応答を主に誘発する際の使用のための好ましいアジュバントとしては、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組合せが挙げられる。ＭＰＬアジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号；および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）より入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）はまた、主にＴｈ１応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載される。免疫刺激性ＤＮＡ配列はまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２（１９９６）により記載される。別の好ましいアジュバントは、サポニン、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）であり、これは、単独で、または他のアジュバントと共に使用され得る。例えば、向上したシステムは、モノホスホリルリピドＡおよびサポニン誘導体の組み合わせ（例えば、ＷＯ９４／００１５３に記載されるようなＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に記載されるようにＱＳ２１がコレステロールでクエンチされる低反応発生性組成物）を含む。他の好ましい処方物は、水中油エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油エマルジョン中の特に潜在能力のあるアジュバント処方物（ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む）は、ＷＯ９５／１７２１０に記載される。
【０３５４】
他の好ましいアジュバントとしては、以下が挙げられる：Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、アジュバントのＳＢＡＳシリーズ（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍより入手可能））、Ｄｅｔｏｘ（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、および係属中の米国特許出願第０８／８５３，８２６号および同第０９／０７４，７２０号（これらの開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される）に記載されるような、他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰｓ）。
【０３５５】
本明細書中で提供される任意のワクチンは、抗原、免疫応答エンハンサーおよび適切なキャリアまたは賦形剤の組合せを生じる周知の方法を使用して調製され得る。本明細書中に記載される組成物は、持続放出処方物（すなわち、投与後に化合物の緩徐な放出を行うカプセル、スポンジまたはゲル（例えば、多糖類で構成される）のような処方物）の一部として投与され得る。このような処方物は、一般的に、周知の技術（例えば、Ｃｏｏｍｂｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：１４２９−１４３８（１９９６）を参照のこと）を用いて調製され得、そして例えば、経口、直腸もしくは皮下移植により、または所望の標的部位への移植により投与され得る。持続放出処方物は、キャリアマトリックス中に分散され、そして／または速度制御膜に囲まれたレザバに含まれた、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体を含み得る。
【０３５６】
このような処方物における使用のためのキャリアは生体適合性であり、そしてまた生分解性であり得；好ましくはこの処方物は、比較的一定のレベルの活性成分の放出を提供する。このようなキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、スターチ、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の遅延放出キャリアとしては、超分子バイオベクターが挙げられ、これは、非液体親水性コア（例えば、架橋多糖またはオリゴ糖）、および必要に応じて、両親媒性化合物（例えば、リン脂質）を含む外部層を含む（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ９４／２３７０１およびＷＯ９６／０６６３８を参照のこと）。持続放出処方物に含まれる活性化合物の量は、移植の部位、放出の速度および予測される持続時間ならびに処置されるかまたは予防されるべき状態の性質に依存する。
【０３５７】
任意の種々の送達ビヒクルが、薬学的組成物およびワクチンにおいて使用され、腫瘍細胞を標的化する抗原特異的免疫応答の生成を容易にし得る。送達ビヒクルとしては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球および有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）が挙げられる。このような細胞は、必須ではないが、抗原を提示する能力を増加させるため、Ｔ細胞応答の活性化および／もしくは維持を向上させるため、それ自体で抗腫瘍効果を有するように、ならびに／またはレシーバーと免疫学的に適合性である（すなわち、一致したＨＬＡハプロタイプ）であるように、遺伝的に改変され得る。ＡＰＣは、一般的に、任意の種々の生物学的流体および器官（腫瘍および腫瘍周囲の組織を含む）から単離され得、そして自己細胞、同種異系細胞、同系細胞または外因性細胞であり得る。
【０３５８】
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として樹状細胞またはその前駆細胞を用いる。樹状細胞は、非常に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５〜２５１（１９９８））、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫を惹起するための生理学的なアジュバントとして有効性が示されている（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７〜５２９（１９９９）を参照のこと）。一般には、樹状細胞は、その典型的な形状（インサイチュで星状（インビトロで可視の顕著な細胞質性突起（樹状突起）を有する））、その取り込み能、高い効率のプロセシングおよび抗原提示、ならびにナイーブなＴ細胞応答を活性化する能力に基いて同定され得る。当然ながら、樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞に通常見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、そしてこのような改変された樹状細胞が、本発明によって意図される。樹状細胞の代替として、分泌型小胞抗原負荷樹状細胞（ｓｅｒｅｃｔｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）（エキソソーム（ｅｘｏｘｏｍｅ）と呼ばれる）をワクチン内で用い得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：５９４〜６００（１９９８））。
【０３５９】
樹状細胞および前駆体は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周囲組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または任意の他の適切な組織もしくは体液から得ることができる。例えば、樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組合せを、末梢血から収集した単球の培養物に添加することにより、エキソビボで分化し得る。あるいは、末梢血、臍帯血、または骨髄から収集したＣＤ３４陽性細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンド、および／または他の化合物（樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する）の組み合わせを、培養培地に添加することにより、樹状細胞に分化し得る。
【０３６０】
樹状細胞は、都合よく、「未成熟」および「成熟」細胞として分類分けされる。これは、２つの十分に特徴付けられた表現型の間を識別するための単純な方法を与える。しかし、この命名法は、分化の全ての可能な中間段階を排除すると解釈されるべきではない。未成熟樹状細胞は、抗原の取り込みおよびプロセシングについての高い能力（これは、Ｆｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高発現と相関する）を有するＡＰＣとして、特徴付けられる。成熟表現型は、代表的に、これらのマーカーのより低い発現（しかし、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）、ならびに同時刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のような、Ｔ細胞活性化を担う細胞表面分子の高発現）によって特徴付けられる。
【０３６１】
ＡＰＣは、一般的に、血液癌関連腫瘍タンパク質（または、その部分もしくは他の改変体）をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得、その結果、その血液癌関連腫瘍ポリペプチドまたはその免疫原性部分が、その細胞表面上で発現される。このようなトランスフェクションは、エキソビボで生じ得、次いで、このようなトランスフェクトされた細胞を含む組成物またはワクチンが、本明細書中に記載のような治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的化する遺伝子送達ビヒクルが患者に投与され得、インビボで生じるトランスフェクションを生じさせる。樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、例えば、一般的に、当該分野において公知の任意の方法（例えば、ＷＯ  ９７／２４４４７に記載される方法、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７５：４５６−４６０、１９９７に記載される遺伝子銃アプローチ）を使用して実施され得る。樹状細胞の抗原負荷は、血液癌関連腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸またはプラスミドベクター中）もしくはＲＮＡと共に；または、抗原を発現する組換え細菌もしくはウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、アデノウイルス、またはレンチウイルスのベクター）と共に、樹状細胞または前駆細胞をインキュベートすることによって、達成され得る。負荷の前に、ポリペプチドは、Ｔ細胞補助（例えば、キャリア分子）を提供する、免疫学的パートナーと共有結合で結合体化され得る。あるいは、樹状細胞に、個々にかまたはポリペプチドの存在下で、結合体化されていない免疫学的パートナーに適用（ｐｕｌｓｅ）され得る。
【０３６２】
ワクチンおよび薬学的組成物は、単位用量容器または複数回用量容器（例えば、密封されたアンプルまたはバイアル）で存在し得る。このような容器は、好ましくは、使用まで処方物の滅菌性を保つように完全に密封される。一般的に、処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中に、懸濁物、溶液またはエマルジョンとして保存され得る。あるいは、ワクチンまたは薬学的組成物は、使用直前に滅菌液体キャリアを添加しさえすれば良い凍結乾燥状態で保存され得る。
【０３６３】
（４．２２  癌治療）
本発明のさらなる局面において、本明細書中に記載される組成物は、癌（例えば、血液癌）の免疫療法のために使用され得る。このような方法では、代表的に、薬学的組成物およびワクチンが患者に投与される。本明細書中で使用される場合、「患者」は、任意の温血動物、好ましくはヒトをいう。患者は、癌に冒されていても冒されていなくともよい。従って、上記の薬学的組成物およびワクチンは、癌の発症を妨げるためか、または癌に冒された患者を処置するために使用され得る。癌は、当該分野で一般に認められている判定基準（悪性腫瘍の存在を含む）を使用して診断され得る。薬学的組成物およびワクチンは、原発性腫瘍の外科的除去ならびに／または放射線療法あるいは従来の化学療法薬物の投与のような処置の前後のいずれかに投与され得る。投与は、任意の適切な方法（静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、鼻腔内経路、皮内経路、肛門経路、膣経路、局所経路および経口経路による投与が挙げられる）によるものであり得る。
【０３６４】
特定の実施形態では、免疫療法は能動免疫療法であり得る。能動免疫療法において、処置は、免疫応答改変因子（例えば、本明細書に提供されるような、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与による、腫瘍に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
【０３６５】
他の実施形態では、免疫療法は受動免疫療法であり得る。受動免疫療法において、処置は、確立された腫瘍免疫反応性を有する因子（例えば、エフェクター細胞または抗体）の送達を包含する。この因子は、抗腫瘍効果を直接または間接的に媒介し得、そして、必ずしもインタクトな宿主免疫系に依存するとは限らない。エフェクター細胞の例としては、以下が挙げられる：上記のようなＴ細胞、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋  Ｔヘルパー腫瘍浸潤リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞、および本明細書中に提供されるポリペプチドを発現する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）。本明細書中に列挙されるポリペプチドに対して特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫療法のために、クローン化され、発現され、そして他のベクターまたはエフェクター細胞中に移入され得る。本明細書中に提供されるポリペプチドはまた、受動免疫療法のために、抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載のような）を生成するために使用され得る。
【０３６６】
エフェクター細胞は、本明細書中に記載されるように、一般的にインビトロでの増殖による養子免疫療法のために十分な量で獲得され得る。単一抗原特異的エフェクター細胞を、インビボでの抗原認識を保持しながらその数を何十億にまで増殖させるための培養条件は、当該分野で周知である。このようなインビトロ培養条件は、代表的に、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および非分裂性フィーダー細胞の存在下における、抗原での断続刺激を利用する。上記のように、本明細書中に提供される免疫反応性ポリペプチドは、免疫療法のために十分な数の細胞を生成するために、抗原特異的Ｔ細胞培養物を迅速に増殖させるように使用され得る。特に、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞および／またはＢ細胞）は、当該分野で周知の標準的技術を使用して、免疫反応性ポリペプチドを適用され得るか、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルスまたは他の発現系において発現を増加させるために適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療における使用のための培養エフェクター細胞は、インビボで広く増殖および分布し得、そして長期間生存し得なければならない。培養エフェクター細胞が、ＩＬ−２を補充された抗原での反復刺激により、インビボで増殖しそして実質的な数で長期間生存するように誘導され得ることが、研究により示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
【０３６７】
あるいは、本明細書中に詳述されるポリペプチドを発現するベクターが、患者から採取された抗原提示細胞に導入され得、そして同じ患者へ戻す移植のためにエキソビボでクローン的に増殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で公知の任意の手段を使用して、好ましくは、滅菌形態で静脈内投与、腔内投与、腹腔内投与、または腫瘍内投与により患者に再導入され得る。
【０３６８】
本明細書に記載の治療組成物の投与の経路および頻度ならびに投薬量は、個体間で変化し、そして標準的技術を使用して容易に確立され得る。一般に、薬学的組成物およびワクチンは、注射により（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻腔的に（例えば、吸入）、経口的に投与され得る。好ましくは、１〜１０の間の用量が、５２週間にわたり投与され得る。好ましくは、１ヶ月の間隔で、６用量が投与され、そしてその後、追加免疫ワクチン接種が定期的に与えられ得る。代替的プロトコルが、個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記されるように投与される場合に、抗腫瘍免疫応答を促進し得、そして基底（すなわち、未処理）レベルより少なくとも１０〜５０％上である化合物の量である。このような応答は、患者において抗腫瘍抗体を測定することによってか、またはインビトロで患者の腫瘍細胞を殺傷し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存的産生によってモニターされ得る。このようなワクチンはまた、ワクチン接種されていない患者と比較して、ワクチン接種された患者において改善された臨床結果（例えば、より頻繁な寛解、完全もしくは部分的、またはより長い、疾患のない生存）に導く免疫応答を引き起こし得るべきである。一般に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、１用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主１ｋｇあたり約２５μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量サイズは、患者のサイズとともに変化するが、代表的には、約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【０３６９】
一般的に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的および／または予防的利点を提供するに十分な量の活性化合物を提供する。このような応答は、ワクチン接種されていない患者と比較して、処置された患者において改善された臨床結果（例えば、より頻繁な寛解、完全もしくは部分的、またはより長い、疾患のない生存）を確立することによって、モニターされ得る。血液癌関連腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答の増加は、一般的に、改善された臨床結果と相関する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイまたはサイトカインアッセイを使用して評価され得る。これらのアッセイは、処置の前後の患者から得られたサンプルを用いて実施され得る。
【０３７０】
（４．２３  癌の検出および診断）
一般的に、癌は、患者から得られた生物学的サンプル（例えば、血液、血清、尿、および／または腫瘍生検）における、１つ以上の血液癌関連腫瘍タンパク質および／またはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいて、患者において検出され得る。換言すれば、このようなタンパク質は、血液癌のような癌の存在または非存在を示すためのマーカーとして使用され得る。さらに、このようなタンパク質は、他の癌の検出のために有用であり得る。本明細書中に提供される結合剤は、一般的に、生物学的サンプル中の因子に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブが、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベル（これはまた、癌の存在または非存在の指標である）を検出するために使用され得る。一般的に、血液癌関連腫瘍配列は、正常組織においてよりも腫瘍組織において少なくとも３倍高いレベルで存在すべきである。
【０３７１】
サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するために結合剤を使用することに関して、当業者に公知の種々のアッセイ様式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。一般的に、患者における癌の存在または非存在は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを結合剤と接触させること；（ｂ）この結合剤に結合するポリペプチドのレベルを、サンプル中において検出すること；および（ｃ）このポリペプチドのレベルを、予め決定されたカットオフ値（ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｖａｌｕｅ）と比較すること、によって決定され得る。
【０３７２】
好ましい実施形態では、このアッセイは、サンプルの残渣（ｒｅｍａｉｎｄｅｒ）由来のポリペプチドに結合し、そしてそれを取り出すための固体支持体に固定された結合剤の使用を含む。次いで、レポーター基（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ）を含み、そして結合剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して、結合したポリペプチドを検出し得る。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドもしくは抗体に特異的に結合する結合剤、またはこの結合剤に特異的に結合する他の因子（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡ、またはレクチン）を含み得る。あるいは、競合的アッセイが使用され得る。ここでは、ポリペプチドをレポーター基で標識し、そして結合剤とサンプルとのインキュベーションの後に、固定された結合剤に結合させる。サンプルの成分が、結合剤への標識化ポリペプチドの結合を阻害する程度は、固定された結合剤とのサンプルの反応性の指標である。このようなアッセイにおける使用のために適切なポリペプチドとしては、上記のような、全長血液癌関連腫瘍タンパク質、および結合剤が結合するその部分が挙げられる。
【０３７３】
この固体支持体は、この腫瘍タンパク質が結合され得ることが当業者に公知である、任意の材料であり得る。例えば、この固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェルであっても、ニトロセルロース膜であっても、または他の適切な膜であってもよい。あるいは、この支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス）、ガラス繊維、ラテックス、であっても、あるいはプラスチック材料（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）であってもよい。この支持体はまた、磁性粒子であっても、光ファイバー検出器（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に記載されるもの）であってもよい。この結合剤は、当業者に公知の種々の技術を使用して、この固体支持体上に固定され得、このような技術は、特許および科学文献に十分記載されている。本発明の状況において、用語「固定」とは、非共有結合（例えば、吸着）および共有結合（この薬剤とこの支持体上の官能基との間の直接の結合であっても、架橋剤による結合であってもよい）の両方をいう。マイクロタイタープレート中のウェルまたは膜への吸着による固定が、好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中にあるこの結合剤を固体支持体と適切な時間接触させる工程によって、達成され得る。この接触時間は、温度によって変化するが、代表的には、約１時間と約１日との間である。一般的には、プラスチックのマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルを、約１０ｎｇ〜約１０μｇの範囲の量の結合剤、好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合剤と接触させる工程が、十分な量の結合剤を固定するに十分である。
【０３７４】
固体支持体への結合剤の共有結合は、一般的には、まず、この支持体を二官能性試薬と反応させる工程によって達成され得、ここで、この二官能性試薬は、この支持体、およびこの結合剤上の官能基（例えば、ヒドロキシル基またはアミノ基）の両方と反応する。例えば、この結合剤は、ベンゾキノンを使用してか、またはこの支持体上のアルデヒド基をこの結合パートナー上のアミンおよび活性水素と縮合させることによって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に共有結合され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２〜Ａ１３を参照のこと）。
【０３７５】
特定の実施形態において、このアッセイは、二抗体サンドイッチアッセイである。このアッセイは、固体支持体（一般的には、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定されている抗体を、まずそのサンプルと接触させて、その結果、このサンプル内のポリペプチドがこの固定された抗体に結合するのを可能にすることによって、実施され得る。次いで、未結合サンプルが、この固定されたポリペプチド−抗体複合体から除去され、そしてレポーター基を含む検出試薬（好ましくは、このポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体）が添加される。次いで、この固体支持体に結合したままである検出試薬の量が、この特定のレポーター基に適切な方法を使用して、決定される。
【０３７６】
より詳細には、上記のように、一旦この抗体が支持体上に固定されると、この支持体上の残りのタンパク質結合部位は、代表的にはブロックされる。任意の適切なブロック試薬（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ  ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））は、当業者に公知である。次いで、この固定された抗体は、そのサンプルとともにインキュベートされ、そしてポリペプチドがこの抗体に結合するのを可能にする。このサンプルは、適切な希釈剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈された後にインキュベートされ得る。一般には、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、血液癌を有する個体から得られたサンプル中のポリペプチドの存在を検出するに十分な時間である。好ましくは、この接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡な状態で達成されるレベルの少なくとも約９５％である結合レベルを達成するに十分である。当業者は、平衡を達成するために必要な時間が、一定時間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって容易に決定され得ることを、認識する。室温では、約３０分というインキュベーション時間が、一般的に十分である。
【０３７７】
次いで、非結合サンプルは、適切な緩衝液（例えば、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０ＴＭ）含有ＰＢＳ）を用いてこの固体支持体を洗浄することによって除去され得る。次に、レポーター基を含む第２の抗体が、この固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基としては、上記の基が挙げられる。
【０３７８】
次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な時間の間、固定化抗体−ポリペプチド複合体と共にインキュベートされる。適切な時間量は、一般に、経時的に生じる結合のレベルをアッセイすることにより決定され得る。次いで、結合されない検出試薬が除去され、そして結合された検出試薬が、レポーター基を使用して検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射活性基については、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィー方法が、一般に適切である。分光学的方法が、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基（通常、放射活性基または蛍光基、あるいは酵素）にカップリングされたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般に、特定の時間の間）、続いてその反応産物の分光学的分析または他の分析により、検出され得る。
【０３７９】
癌（例えば、血液癌）の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままであるレポーター基から検出されるシグナルが、一般には、予め決定されたカットオフ値に対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施形態において、癌の検出のためのカットオフ値は、癌を有していない患者由来のサンプルとともに固定化抗体をインキュベートした場合に得られる、平均シグナルの平均値である。一般に、予め決定されたカットオフ値より標準偏差が３上であるシグナルを発生するサンプルが、癌について陽性であるとみなされる。代替の好ましい実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８５、１０６〜１０７頁の方法に従って、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｕｒｖｅを使用して決定される。手短に言うと、この実施形態において、このカットオフ値は、診断試験の結果についての各可能なカットオフ値に対応する、真の陽性割合（すなわち、感受性）および偽陽性の割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。左側上方の隅に最も近いプロットに対するカットオフ値（すなわち、最も大きい領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そしてこの方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生成するサンプルは、陽性であるとみなされ得る。あるいは、このカットオフ値は、プロットに沿って左にシフトされて、偽陽性の割合を最小化し得るし、または右にシフトされて偽陰性の割合を最小化し得る。一般に、この方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生成するサンプルは、癌について陽性であるとみなされる。
【０３８０】
関連する実施形態において、このアッセイは、貫流型（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）または小片（ｓｔｒｉｐ）試験形式で実行され、ここで、結合剤は、膜（例えば、ニトロセルロース）上に固定化される。貫流型試験において、サンプル中のポリペプチドは、そのサンプルが膜を通過するときに、固定化結合剤に結合する。次いで、第２の標識結合剤が、その第２の結合剤を含む溶液が膜を貫流するときに、結合剤−ポリペプチド複合体に結合する。次いで、結合した第２の結合剤の検出が、上記のように実施され得る。小片試験形式において、結合剤が結合される膜の一端が、そのサンプルを含む溶液中に浸される。そのサンプルは、第２の結合剤を含む領域を通って、固定化結合剤の領域まで膜に沿って移動する。固定化抗体の領域での第２の結合剤の濃縮は、癌の存在を示す。代表的に、その部位での第２の結合剤の濃縮は、視覚的に読取られ得るパターン（例えば、線）を生じる。このようなパターンがないことは、陰性の結果を示す。一般に、膜上に固定化される結合剤の量は、その生物学的サンプルが、上記で考察した形式で、二抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生成するのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合に、視覚的に識別可能なパターンを生成するよう選択される。このようなアッセイにおける使用のための好ましい結合剤は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化された抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇ、より好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である、このような試験は、代表的に、非常に少量の生物学的サンプルを用いて実施され得る。
【０３８１】
もちろん、本発明の腫瘍タンパク質または結合剤を用いての使用に適切な、多くの他のアッセイプロトコールが存在する。上記の記載は、例示であることのみが意図される。例えば、上記のプロトコルが、生物学的サンプル中でこのようなポリペプチドを結合する抗体を検出するために血液学的な悪性腫瘍関連腫瘍ポリペプチドを使用するように容易に改変され得ることが、当業者には明らかである。このような血液学的な悪性腫瘍関連腫瘍タンパク質特異的抗体の検出は、癌の存在と相関し得る。
【０３８２】
癌はまた、または代わりに、生物学的サンプル中の血液学的な悪性腫瘍関連腫瘍タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法において、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルが、血液学的な悪性腫瘍関連腫瘍ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてそのＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるが、これに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用的技術（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離）によって、患者から単離され得る。Ｔ細胞は、ポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともに、３７℃で２〜９日間（代表的には４日間）、インビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立つように、血液学的な悪性腫瘍関連腫瘍ポリペプチドの非存在下でインキュベーションすることが、所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞について、活性化は、好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋細胞について、活性化は、細胞溶解活性を評価することによって、好ましくは検出される。疾患に罹患していない患者においてよりも少なくとも２倍高いレベルの増殖、および／または少なくとも２０％高いレベルの細胞溶解活性は、その患者における癌の存在を示す。
【０３８３】
上記のように、癌はまた、または代わりに、生物学的サンプル中の血液学的な悪性腫瘍関連腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、生物学的サンプル由来の血液学的な悪性腫瘍関連腫瘍タンパク質ｃＤＮＡの一部を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて使用され得、これらのオリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、血液学的な悪性腫瘍関連腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、この増幅されたｃＤＮＡは、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を使用して、分離および検出される。同様に、血液学的な悪性腫瘍関連腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが、生物学的サンプル中のこの腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するために、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。
【０３８４】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さの血液学的な悪性腫瘍関連腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有する、オリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記のように、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に使用され得るオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示される配列を有するＤＮＡ分子のうちの、少なくとも１０個連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３、１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９を参照のこと）。
【０３８５】
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを使用し、ＲＴ−ＰＣＲにおいては、ＰＣＲが、逆転写と組み合わせて適用される。代表的には、ＲＮＡが、生検組織のような生物学的サンプルから抽出され、そしてｃＤＮＡ分子を生成するように逆転写される。少なくとも１つの特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅は、例えば、ゲル電気泳動を使用して分離および可視化され得る、ｃＤＮＡ分子を生じる。増幅は、試験患者および癌に罹患していない個体から採取された、生物学的サンプルに対して実施され得る。この増幅反応は、２桁の大きさに及ぶｃＤＮＡのいくつかの希釈物に対して実施され得る。非癌性サンプルのいくつかの希釈物と比較して、試験患者サンプルの同じ希釈物における２倍以上の発現の増加は、代表的に陽性とみなされる。
【０３８６】
別の実施形態において、本明細書中に記載の組成物は、癌の進行についてのマーカーとして使用され得る。この実施形態において、癌の診断のための上記のようなアッセイが、経時的に実施され得、そして反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化が評価され得る。例えば、このアッセイは、６ヶ月〜１年の期間に２４〜７２時間ごとに実施され得、その後も必要ならば実施され得る。一般的に、癌は、検出されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが経時的に増加する患者において進行している。対照的には、この癌は、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが一定のままであるかまたは時間とともに減少するかのいずれかである場合には、進行していない。
【０３８７】
特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍に対して直接実施され得る。１つのこのようなアッセイは、腫瘍細胞を結合剤と接触させる工程を包含する。次いで、結合された結合剤が、直接的またはレポーター基を介して間接的に検出され得る。このような結合剤はまた、組織学的適用において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブが、このような適用において使用され得る。
【０３８８】
上記のように、感度を改善するために、複数の血液学的な悪性腫瘍関連腫瘍タンパク質マーカーが、所定のサンプルにおいてアッセイされ得る。本明細書中に提供される異なるタンパク質に特異的な結合剤が、単一のアッセイ中で混合され得ることは、明らかである。さらに、複数のプライマーまたはプローブが、同時に使用され得る。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、最適な感度を生じる組み合わせを決定するための慣用的実験に基づき得る。さらに、またはあるいは、本明細書中に提供される腫瘍タンパク質についてのアッセイが、他の公知の腫瘍抗原についてのアッセイと組み合わせられ得る。
（４．２４  ＤＮＡ配列の調製）
血液学的な悪性腫瘍関連抗原の部分をコードするｃＤＮＡ分子の特定の核酸配列は、ＰＣＲＴＭに基づく減法によって単離された。この技術は、差示的に発現するｃＤＮＡの標準化、稀な転写物の回復の容易化に役立ち、そしてまた、少量のポリＡＲＮＡ材料を用いて、かつ多数回のハイブリダイゼーションなしにｃＤＮＡの濃縮を可能にするという利益を有する。非ホジキンリンパ腫で過剰発現する抗原を得るために、３種のＴ細胞非ホジキンリンパ腫ｍＲＮＡのプールから調製された試験ライブラリーで２つの減法を行った。２つのライブラリーは、個々にドライバｃＤＮＡの異なるプールで取り除かれた。ドライバ番号１は、特定の正常組織から調製されたｃＤＮＡを含み（リンパ節、骨髄、Ｔ細胞、心臓および脳）、そしてこの減法はライブラリーＴＣＳ−Ｄ１（ドライバ番号１で取り除かれたＴ細胞非ホジキンリンパ腫ライブラリー）を生成した。ドライバ番号２は、非特異的正常組織（結腸、大腸、肺、膵臓、脊髄、骨格筋、肝臓、腎臓、皮膚、および脳）を含み、そしてこの減法は、ライブラリーＴＣＳ−Ｄ２（ドライバ番号２で取り除かれたＴ細胞非ホジキンリンパ腫ライブラリー）を生成した。２つの他の減法を、３種のＢ細胞非ホジキンリンパ腫ｍＲＮＡのプールから調製した試験ライブラリーで行った。２つのライブラリーは、個々にドライｃＤＮＡの異なるプールで取り除いた。ドライバ番号１は、特定の正常組織（リンパ節、骨髄、Ｂ細胞、心臓および脳）から調製したｃＤＮＡを含み、そしてこの減法は、ライブラリーＢＣＮＨＬ／Ｄ１（ドライバ番号１で取り除いたＢ細胞非ホジキンリンパ腫ライブラリー）を生成した。ドライバ番号２は、非特異的正常組織（脳、肺、膵臓、脊髄、骨格筋、結腸、脾臓、大腸およびＰＢＭＣ）を含み、そしてこの減法は、ライブラリーＢＣＮＨＬ／Ｄ２（ドライバ番号２で取り除いたＢ細胞非ホジキンリンパ腫ライブラリー）を生成した。ＰＣＲＴＭ増幅のプールは、取り除かれたライブラリーから生成され、そしてクローンの配列決定を行った。血液学的な悪性腫瘍関連抗原の配列は、さらに任意の種々の周知の技術を使用して特徴づけした。例えば、ＰＣＲＴＭ増幅のクローンは、マイクロアレイ解析のためにガラススライドの上に並べ得た。組織分布を決定するために、並べたクローンは、異なる一本鎖ｃＤＮＡプローブでハイブリダイズするための標的として使用され得、それは、リンパ腫プローブ、白血病プローブそして異なる正常組織からのプローブを含む。白血病プローブおよびリンパ腫プローブは、結果が良くない（従来の化学療法の後に完全な寛解に達することができなかったか、または再発した患者）または結果がよい（長期の回復を達成した患者）ＮＨＬ患者、ホジキン障害患者、ＡＭＬ患者、ＣＭＬ患者、ＣＬＬ患者、ＡＬＬ患者、ＭＤＳ患者および骨髄腫患者から、診断時に得られる凍結保存したサンプルから生成され得る。造血性分化の間に発現する遺伝子を分析するために、プローブは、健康な個体由来のＣＤ３４＋、ＣＤ２＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１５＋およびＣＤ１９＋の９５％以上純粋な画分から生成され得る。
【０３８９】
ポリヌクレオチド改変体は、一般的に当該分野で公知の任意の方法によって調製され得、その方法としては、例えば、固相ホスホルアミデート化学合成による化学的合成が挙げられる。ポリヌクレオチド配列の改変はまた、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発のような標準の変異誘発技術を使用して導入され得る（例えば、Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ  ２：１８３、１９８３を参照のこと）。あるいは、ＲＮＡ分子は、ＤＮＡが、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＴ７またはＳＰ６）とともにベクター内に組み込まれるのであれば、ＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボ転写によって生成され得る。特定の部分は、本明細書中に記載のコードされたポリペプチドを調製するために使用され得る。さらに、またはあるいは、部分は、患者に投与され得、その結果、コードされるポリペプチドは、インビボで生成される（例えば、血液学的な悪性腫瘍関連抗原をコードするｃＤＮＡ構築物で、樹状細胞のような抗原提示細胞をトランスフェクトし、そのトランスフェクトされた細胞の患者への投与によって）。
【０３９０】
コード配列に相補的な配列部分（すなわち、アンチセンスポリヌクレオチド）は、また、プローブとして使用され得、または血液学的な悪性腫瘍関連抗原の発現を調節するために使用され得る。アンチセンスＲＮＡに転写され得るｃＤＮＡ構築物はまた、アンチセンスＲＮＡの生成の容易化のために、細胞または組織に導入され得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、本明細書中に記載のように、血液学的な悪性腫瘍関連抗原の発現を阻害するために使用され得る。アンチセンス技術は、３重鎖構造を通して遺伝子発現を調節するために使用され得、これは、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために、二重鎖が十分に開く能力を損なう（Ｇｅｅら、ＨｕｂｅｒおよびＣａｒｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ、Ｆｕｔｕｒａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ，ＮＹ；１９９４）を参照のこと）。あるいは、アンチセンス分子は、遺伝子の調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサーまたは転写開始部位）とハイブリダイズし、遺伝子の転写をブロックするように設計され得；または転写物のリボソームへの結合を阻害することによって翻訳を阻害するように設計され得る。
【０３９１】
コード配列部分または相補的配列の部分はまた、遺伝子の発現を検出するためのプローブまたはプライマーとして設計され得る。プローブは、放射性核種および酵素のような種々のレポーター群で標識され得、そして、好ましくは、少なくとも１０ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長であり、さらにより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド長である。上記に記載のように、プライマーは、好ましくは、２２〜３０ヌクレオチド長である。
【０３９２】
任意のポリヌクレオチドは、さらにインビボでの安定性を増加させるために改変され得る。可能な改変は、５’末端および／または３’末端に隣接する配列の付加；骨格中のホスホジエステラーゼ連結よりもむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；および／または非従来の塩基（例えば、イノシン、キューオシン、およびワイブトシンならびにアセチル改変形態、メチル改変形態、チオ改変形態、および他の改変形態のアデノシン、シチジン、グアニン、チミジンおよびウリジン）の含有が挙げられるが、それに限定されない。
【０３９３】
血液学的な悪性腫瘍関連抗原ポリヌクレオチドは、確立した組換えＤＮＡ技術を使用して種々の他のヌクレオチド配列に連結され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、任意の種々のクローニングベクター中にクローン化され得、そのベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ラムダファージ誘導体およびコスミドが挙げられる。特に関連するベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよび配列決定ベクターが挙げられる。一般的に、ベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位および１つ以上の選択マーカーを含む。他のエレメントは、所望される使用に依存し、そして当業者に明らかである。
【０３９４】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、哺乳類の細胞内に侵入しそしてそこで発現することを可能とするために処方され得る。このような処方物は、特に以下に記載するような治療目的に対して有用である。当業者は、標的細胞におけるポリヌクレオチドの発現を達成するために多くの方法が存在し、任意の適切な方法が使用され得ることを認識する。例えば、ポリヌクレオチドは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、またはワクシニアもしくは他のポックスウイルス（例えば、トリポックスウイルス）が挙げられるが、これらに限定されないウイルスベクターに組み込まれ得る。このようなベクターにＤＮＡを組み込む技術は、当業者に周知である。レトロウイルスベクターは、さらに選択マーカー（形質導入した細胞の同定または選択を補助するために）および／または、ベクター標的特異性を提供するための、特定の標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする遺伝子のような標的部分の遺伝子を移入するかまたは組み込み得る。標的化はまた、抗体を使用して当業者に公知の方法によって達成され得る。
【０３９５】
治療目的の他の処方物は、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、そして水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームのような脂質に基づく系のようなコロイド分散系が挙げられる。インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとしての使用に好ましいコロイド系は、リポソームである（すなわち、人工膜小胞）。このようなシステムの調製および使用は、当該分野において周知である。
【０３９６】
（４．２５  治療方法）
本発明のさらなる局面において、本明細書中に記載の組成物は、成人および小児ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬ、脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）、二次的白血病、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含む血液学的な悪性腫瘍の免疫療法に対して使用され得る。さらに、本明細書中に記載の組成物は、重篤な再生不良性貧血のような、造血前駆細胞に対する自己免疫応答に関連する疾患の治療のために使用され得る。
【０３９７】
免疫療法は、任意の種々の技術を使用して実行され得、本明細書中に提供した化合物または細胞は、患者から血液学的な悪性腫瘍関連抗原発現細胞を取り除くために機能する。このような除去は、血液学的な悪性腫瘍関連抗原または血液学的な悪性腫瘍関連抗原を発現する細胞に対して特異的な患者における免疫応答を促進または誘導の結果、生じ得る。あるいは、血液学的な悪性腫瘍関連抗原を発現する細胞は、エキソビボ（例えば、自己骨髄、末梢血または、骨髄または末梢血の画分の処置によって）に取り除かれ得る。骨髄または末梢血の画分は、当該分野の任意の標準的な技術を使用して獲得され得る。
【０３９８】
このような方法において、薬学的な組成物およびワクチンが代表的に患者に投与される。本明細書中で使用される場合、「患者」は任意の温血動物を示し、好ましくはヒトである。患者は、血液学的な悪性腫瘍に冒されていてもよいし、そうでなくてもよい。従って、上記の薬学的組成物およびワクチンは悪性腫瘍の発生を防ぐため、または悪性腫瘍に冒されている患者を処置するために使用され得る。血液学的な悪性腫瘍は、当該分野で一般的に認められている基準を使用して診断され得る。薬学的組成物およびワクチンは、原発性腫瘍の外科的な除去およびまたは放射線治療または従来の化学療法的な薬物の投与あるいは骨髄移植（自己、同種間、同系間）のような処置に先立つか、それに続けてかのどちらかで、投与され得る。
【０３９９】
特定の実施形態の中で、免疫療法は、能動的な免疫療法であり得、ここで処置は、免疫応答調節薬剤（例えば、本明細書中で提供したポリペプチドおよびポリヌクレオチドのような）を投与して、腫瘍に対して反応する内因性の宿主免疫システムのインビボでの刺激に依存する。
【０４００】
他の実施形態の中で、免疫療法は受動的な免疫療法であり、ここで処置は、確立された腫瘍−免疫反応性（例えば、エフェクター細胞または抗体のような）とともに薬剤の送達を必要とし、これは直接的にまたは間接的に抗腫瘍効果を誘導し、そして無処置の宿主免疫システムに依存する必要がない。上記のように、エフェクター細胞の例は、上で議論されるＴ細胞、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、本明細書中に提供されるポリペプチドを発現するＢ細胞および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）を含む。本明細書中に記載されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫療法のためにクローン化され、発現され、他のベクター中またはエフェクター細胞中に移入され得る。本明細書中に提供されるポリペプチドはまた、受動的な免疫療法のための抗体または抗イディオタイプの抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載）を生成するために使用され得る。
【０４０１】
エフェクター細胞は、一般的に本明細書中に記載のように、インビトロでの増殖によって養子免疫療法に十分な量が得られ得る。単一抗体特異的エフェクター細胞の、インビボにおける抗原認識の保持を伴う、全部で数十億までの拡張のための培養条件は、当該分野で周知である。このようなインビトロでの培養条件は、代表的に、しばしば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および非分裂性のフィーダー細胞の存在下で、抗原での断続的な刺激を使用する。上に記載したように、本明細書中で提供される免疫反応的なポリペプチドは、免疫療法に十分な数の細胞を生成するために抗原特異的Ｔ細胞培養物の迅速な拡張のために使用され得る。特に、樹状細胞、マクロファージ細胞またはＢ細胞のような抗原提示細胞は、当該分野で周知の標準的な技術を使用して、免疫反応的ポリペプチドでパルスされ得るか、または１以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルス系または他の発現系における発現を増加させるのに適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療で使用するための培養されたエフェクター細胞は、増殖し、広く分布しなければならず、そして、インビボで長期間生存しなくてはならない。研究により、培養されたエフェクター細胞は、ＩＬ−２で補充された抗原で繰り返し刺激することによって、インビボで増殖、そして十分な数で長期間の生存するために導入され得ることが示された（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １５７：１７７、１９９７）。
【０４０２】
あるいは、本明細書中に記載されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から得られた抗原提示細胞中に導入され得、そして同じ患者の中に戻して移植するために、エキソビボでクローン化により増殖され得る。トランスフェクトした細胞は、当該分野で公知の任意の方法を使用して患者の中に、好ましくは無菌的形態において、静脈内、腔内、腹腔内または腫瘍内投与よって再び導入され得る。
【０４０３】
本明細書中に提供される組成物は、単独でまたは、外科手術、放射線照射、化学療法および／または骨髄移植（自己、同系間、同種間または無関係の）などのような従来の治療的養生法と組合わせて使用され得る。以下により詳細に説明するように、本明細書中に提供される結合薬剤およびＴ細胞は、自己の幹細胞の浄化のために使用され得る。このような浄化は、例えば、骨髄移植または血液またはそれらの構成物の輸液に先立って有用である。本明細書中に提供される結合薬剤、Ｔ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および組成物は、さらに自己、同種間、同系間または無関連の、インビトロおよび／またはインビボにおける血液学的な悪性腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞の増殖および刺激（またはプライミング）のために使用され得る。このような血液学的な悪性腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞は、例えば、ドナーリンパ球注入において使用され得る。
【０４０４】
本明細書中に記載の治療的組成物の投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個人間で変化し、そして標準的な技術を使用して容易に確立し得る。一般的に、薬学的組成物およびワクチンは、注射によって投与され得るか（例えば、皮内、筋内、静脈内または皮下）、経鼻（例えば、吸入）、または経口によって投与され得る。好ましくは、１〜１０用量が５２週間にわたって投与され得る。好ましくは、６用量が１ヶ月周期で投与され、そして、追加免疫ワクチン接種が、その後周期的に所与され得る。代替的なプロトコルは、個々の患者に対して適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与される場合、抗腫瘍免疫応答を促進することが可能な化合物の量であり、そして、基底レベル（すなわち無処置レベル）を少なくとも１０％〜５０％越える。このような応答は、患者における抗腫瘍抗体を測定することによって、またはインビトロで患者の腫瘍細胞を殺傷することが可能な細胞溶解性のエフェクター細胞のワクチン依存的な生成によってモニターされ得る。このようなワクチンは、また、免疫反応を起こすことが可能であるはずであり、ワクチン非接種の患者と比べて、ワクチン接種した患者においては、改善された臨床的な結果（例えば、より頻度の高い回復、完全または一部またはより長期の疾患なしの生存）を導く。一般的に、１以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンに対して、各々のポリペプチドの量は、宿主１ｋｇあたり約１００μｇ〜約５ｍｇの範囲の用量で存在する。適切な用量大きさは、患者の大きさによって変化するが、代表的に約０．１ｍＬ〜５ｍＬの範囲である。
【０４０５】
一般的に、適切な投与量および治療レジメンは、治療的効用および／または予防的効用を提供するのに十分な量の活性化合物を提供する。そのような応答は、処置を受けていない患者と比較して、処置を受けた患者において、改良された臨床結果（例えば、より頻繁な寛解（完全または部分的）、または、より長い罹患のない生存）を確立することによって、モニターされ得る。一般的に、血液悪性関連抗原に対する既存の免疫応答の増加は、改良された臨床結果と相関する。一般的に、そのような免疫応答は、標準的な増殖アッセイ、細胞傷害アッセイ、またはサイトカインアッセイを用いて評価され得、そのアッセイは、処置前および後の患者から得たサンプルを用いて行われ得る。
【０４０６】
さらなる局面では、血液悪性関連抗原の発現と関連した悪性疾患の発症を阻害する方法は、上述のように、血液学的な悪性関連抗原ポリペプチドまたは血液悪性関連抗原発現ＡＰＣに応答して活性化された自己Ｔ細胞の投与を包含する。そのようなＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得、上述のように増殖され得る。Ｔ細胞は、悪性疾患の発症を阻害するのに効果的な量で患者に投与され得る。代表的に、約１×１０９〜１×１０１１Ｔ細胞／Ｍ２が、静脈内に、腔内に、または切除した腫瘍のベッド（ｂｅｄ）に投与される。細胞の数および投与の頻度は、患者の応答に依存することは、当業者に明らかである。
【０４０７】
特定の実施形態では、Ｔ細胞が、自己骨髄移植の前に刺激され得る。そのような刺激は、インビボまたはインビトロで行われ得る。インビトロ刺激では、患者から得た骨髄および／または末梢血（あるいは、骨髄または末梢血の画分）を、上述のように、Ｔ細胞の刺激を可能にするのに十分な条件下および時間で、血液学的な悪性関連抗原ポリペプチド、血液悪性関連抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または血液悪性関連抗原ポリペプチドを発現するＡＰＣと接触させ得る。次いで、骨髄、末梢血幹細胞および／または血液悪性関連抗原特異的Ｔ細胞が、標準的な技術を用いて患者に投与され得る。
【０４０８】
関連した実施形態では、関連したドナーまたは無関係のドナーのＴ細胞が、同系のまたは異系の（関連したまたは無関係の）骨髄移植の前に刺激され得る。そのような刺激は、インビボまたはインビトロで行われ得る。インビトロ刺激では、関連したドナーまたは無関係のドナーから得た骨髄および／または末梢血（あるいは、骨髄または末梢血の画分）を、上述のように、Ｔ細胞の刺激を可能にするのに十分な条件下および時間で、血液悪性関連抗原ペプチド、血液悪性関連抗原ポリヌクレオチドおよび／または血液悪性関連抗原ポリペプチドを発現するＡＰＣと接触させ得る。次いで、骨髄、末梢血幹細胞および／または血液悪性関連抗原特異的Ｔ細胞が、標準的な技術を用いて患者に投与され得る。
【０４０９】
他の実施形態では、本明細書で記載される血液悪性関連抗原特異的Ｔ細胞、抗体またはその抗原結合フラグメントが、生物学的サンプル（例えば、自己骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分（例えば、患者への投与前のＣＤ３４＋富化の末梢血（ＰＢ）））から、血液悪性関連抗原を発現する細胞を除去するために使用され得る。そのような方法は、血液悪性関連抗原を発現する細胞を、骨髄または末梢血中の骨髄細胞またはリンパ球細胞の総数の、１０％未満、好ましくは５％未満、そしてより好ましくは１％未満にまで減少させるのに十分な条件下および時間で、そのようなＴ細胞、抗体または抗体フラグメントと、生物学的サンプルを接触させることによって行われ得る。そのような接触は、例えば、標準的技術を用いて抗体が結合されるカラムを用いて、接触され得る。抗原発現細胞は、カラム上に保持される。そのような細胞が除去された程度は、標準的方法（例えば、定性ＰＣＲ解析および定量ＰＣＲ解析、形態学、免疫組織化学およびＦＡＣＳ解析）によって、容易に決定され得る。次いで、骨髄またはＰＢ（またはそれらの画分）が、標準的な技術を用いて、患者に投与され得る。
【０４１０】
（４．２６  診断方法）
一般的に、血液悪性は、患者から得られた生物学的サンプル（例えば、血液、血清、尿および／または腫瘍生検）中の血液悪性関連抗原および／またはポリヌクレオチドの存在に基づいて、患者において検出され得る。言い換えれば、血液悪性関連抗原は、そのような悪性の存在または非存在を示すマーカーとして使用され得る。一般的に、本明細書中で提供される結合剤は、生物学的サンプルにおける薬剤と結合する抗原のレベルの検出を可能にする。ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、血液悪性関連抗原をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得、ｍＲＮＡレベルの検出が、悪性の有無の指標となる。一般的に、血液悪性関連抗原は、罹患していない個体から得たサンプルよりも、血液悪性に罹患した患者から得たサンプルにおいて、少なくとも３倍高いレベルで存在し得る。
【０４１１】
結合剤を使用してサンプル中のポリペプチドマーカーを検出するための、当業者に公知である様々なアッセイ形式がある。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。一般的には、患者における血液悪性腫瘍の存在または不存在は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを結合剤と接触差せる工程；（ｂ）結合剤に結合するポリペプチドのレベルをサンプル中で検出する工程；および（ｃ）所定のカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）値とポリペプチドのレベルを比較する工程によって決定され得る。
【０４１２】
好ましい実施形態において、アッセイは、ポリペプチドに結合し、そして残りのサンプルからそのポリペプチドを除去するための、固体支持上に固定された結合剤の使用に関する。次いで、結合されたポリペプチドは、レポーター基を含み、そして結合剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出薬剤を使用して検出され得る。このような検出薬剤は、例えば、特にポリペプチドまたは抗体または結合剤に特異的に結合する他の因子（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡもしくはレクチン）に特異的に結合する結合剤を含む。あるいは、競争アッセイは、ポリペプチドが、レポーター基で標識化され、そしてサンプルと結合剤とのインキュベーション後、固定された結合剤に結合することを可能にするように利用され得る。サンプルの成分が、標識化されたポリペプチドの結合剤への結合を阻害する程度は、固定された結合剤とサンプルとの反応性の指標である。このようなアッセイにおける使用のために適切なポリペプチドは、上記されたような、結合剤が結合する全長血液悪性腫瘍関連抗原およびその一部分を含む。
【０４１３】
固体支持体は、血液悪性腫瘍関連抗原ポリペプチドが接触され得る、当業者に公知である任意の物質であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートの試験ウェルまたはニトロセルロース膜もしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、支持体は、ガラス、ファイバーガラス、ラテックスまたはプラスチック物質（例えば、ポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル）のようなビードまたはディスクであり得る。支持体はまた、例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示されるような、磁性粒子または光ファイバーセンサーであり得る。結合剤は、特許および科学文献に十分に記載される、当業者に公知である様々な技術を使用して、固体支持体上に固定され得る。本発明の状況において、用語「固定化」とは、非共有結合（例えば、吸着）および共有結合（薬剤と支持体上の官能基との間の直接連結、または架橋剤を介する連結であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレート中のウェルまたは膜への吸着による固定化が、好ましい。このような場合において、吸着は、適切な時間にわたって、適切な緩衝液中で、結合剤を固体支持体と接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度とともに変化するが、代表的には、約１時間と約１日との間である。一般的には、プラスチックマイクロタイタープレートのウェル（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）を、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、そして好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合剤と接触させることは、適切な量の結合剤を固定化するのに十分である。
【０４１４】
固体支持体への結合剤の共有結合が、支持体および結合剤上の官能基（例えばヒドロキシル基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と支持体とを最初に反応することによって一般に達成され得る。例えば、結合剤は、ベンゾキノンを用いる適切なポリマーコーティングを有する支持体に共有結合され得るかまたは支持体上のアルデヒド基と結合パートナー上のアミンおよび活性水素との縮合によって共有結合され得る。（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９１，Ａ１２−Ａ１３を参照のこと）
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。このアッセイは、固体支持体（一般に微小滴定プレートの壁）上で固定した抗体と、サンプル（例えば、サンプル中のポリペプチドは、固定された抗体に結合することは可能である）とを最初に接触させることによって実施し得る。次いで，結合しないサンプルを、固定ポリペプチド−抗体複合体から取り除き、そしてレポーター基を含む検出試薬（好ましくはポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体）が加える。次いで、固体支持体に結合したままである検出試薬の量を、特異的なレセプター基に対して適切な方法を用いて決定する。
【０４１５】
より詳細には、一旦、抗体が、上記のように支持体上に固定されると、支持体上の残るタンパク質結合部位は、代表的にブロックされる。当業者に公知の任意の適切なブロック試薬は、例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ  ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）である。次いで、固定された抗体を、サンプルとし、そしてポリペプチドが、抗体と結合可能である。サンプルは、インキュベーション前に適切な希釈剤（例えば、ホスフェート緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。一般に、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、血液悪性疾患を有する個体から得られるサンプル中でポリペプチドの存在を検出するのに十分な期間である。好ましくは、接触時間は、結合したポリペプチドと結合していないポリペプチドとの間の平衡で達成されるものの少なくとも９５％である結合レベルを達成するのに十分である。当業者は、平衡を達成するのに必要な時間が、経時的に生じる結合レベルをアッセイすることにより容易に決定され得ることを認識する。室温では、約３０分のインキュベーション時間は、一般に十分である。
【０４１６】
次いで、結合していないサンプルは、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０ＴＭを含有するＰＢＳ）で固体支持体を洗浄することにより取り除かれ得る。次いで、レポーター基を含む第２の抗体が、固体支持体に加えられ得る。好ましいレポーター基は、上に引用された基を含む。
【０４１７】
次いで、検出試薬を、結合しているポリペプチドを検出するのに十分な時間量で、固定された抗体−ポリペプチドとインキュベートする。適切な時間の量は、一般に経時的に生じる結合レベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、結合していない検出試薬を取り除かれ、そして結合している検出試薬は、レポーター基を用いて検出する。レポーター基を検出するために用いられる方法は、レポーター基の性質に依存する。放射活性基について、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィー方法が、一般に適切である。分光学的方法が、色素、発光基および蛍光基を検出するために用いられ得る。ビオチンが、アビジンを用いて検出され得、異なるレセプター基（一般に放射活性基もしくは蛍光基または酵素）と結合され得る。酵素レポーター基が、一般に基質の追加（一般に特定の期間の間）、その後の反応生成物の分光学的分析または他の分析により検出され得る。
【０４１８】
血液悪性疾患の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままであるレポーター基から検出されるシグナルが、一般に所定のカットオフ値に対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施形態において、血液悪性疾患の検出についてカットオフ値は、固定された抗体が悪性疾患を有さない患者からのサンプルとインキュベートされる場合に得られる平均シグナルである。一般に、所定のカットオフ値を超える３つの標準偏差であるシグナルを生じるサンプルは、悪性疾患に対してポジティブであると考えられる。代替の好ましい実施形態において、カットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８５，ｐ．１０６−７の方法に従うＲｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｕｒｖｅを用いて決定される。簡潔に、この実施形態において、カットオフ値は、診断試験結果に対する各々の可能性のあるカットオフ値に対応する真のポジティブ比（すなわち、感受性）および偽のポジティブ比（１００％特異性）の対のプロットから決定され得る。上部左手角に最も近いプロット上のカットオフ値（すなわち、最も大きな領域を含む値）は、最も正確なカットオフ値であり、この方法により決定されるカットオフ値よりも大きなシグナルが生じるサンプルは、ポジティブであると考えられ得る。あるいは、カットオフ値が、プロットに沿って左に移動して、偽のポジティブ比を最小化し得、または右に移動して、偽のネガティブ比を最小化し得る。一般に、この方法により決定されるカットオフ値よりも大きなシグナルが生じるサンプルは、悪性疾患に対してポジティブであると考えられる。
【０４１９】
関連した実施形態において、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式においてアッセイを行う。ここで、結合剤をメンブラン（例えば、ニトロセルロース）に固定化する。フロースルー試験において、サンプル中のポリペプチドは、サンプルがメンブランを通過する時、固定化した結合剤に結合する。次いで、二次結合剤を含む溶液がメンブランを通って流れる時、二次標識した結合剤が結合剤−ポリペプチド複合体に結合する。次いで、結合した二次結合剤の検出を、上記のように行い得る。ストリップ試験形式において、結合剤が結合しているメンブランの一つの末端を、サンプルを含有している溶液中に浸す。サンプルは、二次結合剤を含有する領域を通って固定化されている結合剤の領域に、メンブランに沿って移動する。固定化された抗体の領域での二次結合剤の濃度は、血液悪性疾患の存在を示す。代表的に、その部位での二次結合剤の濃度は、視覚的に読み取られ得るパターン（例えば、線）をもたらす。このようなパターンがないことは、ネガティブな結果を示す。一般的に、生物学的サンプルが、２抗体サンドイッチアッセイ（上で議論された形式）において、ポジティブなシグナルをもたらすために十分なポリペプチドのレベルを含有する場合、メンブラン上に固定化された結合剤の量が選択され、視覚的に認識可能なパターンをもたらす。このようなアッセイにおける使用に好ましい結合剤は、抗体およびそれらの抗原結合フラグメントである。好ましくは、メンブラン上に固定化された抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲にわたり、そしてより好ましくは約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、非常に少ない量の生物学的サンプルで代表的に行われ得る。
【０４２０】
もちろん、本発明の血液悪性疾患関連抗原配列または結合剤を用いた使用に適切な多くの他のアッセイプロトコルが存在する。上記は、例示的であることのみを意図する。例えば、上記のプロトコルは容易に改変され、血液悪性疾患関連抗原ペプチドを使用し、生物学的サンプル内でこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出し得ることは、当業者に明らかである。血液悪性疾患関連抗原特異的抗体の検出は、血液悪性疾患の存在と関連し得る。
【０４２１】
悪性疾患はまた、またはあるいは、生物学的サンプル中の血液悪性疾患関連抗原と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法において、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルを、血液悪性疾患関連抗原ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドを発現するＡＰＣとともにインキュベートし、そしてＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるが、これに限定されない。例えば、Ｔ細胞を、患者から、常用技術（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法）により単離し得る。Ｔ細胞を、インビトロで、２〜９日間（代表的には４日間）、３７℃で、Ｍｔｂ−８１ポリペプチドまたはＭｔｂ−６７．２ポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートし得る。コントロールとなるように、血液悪性疾患関連抗原ポリペプチドの非存在下で、Ｔ細胞サンプルの別のアリコートをインキュベートすることが所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞に対し、活性化を、Ｔ細胞の増殖を評価することによって、好ましくは検出する。ＣＤ８＋Ｔ細胞に対し、活性化を、細胞溶解活性を評価することによって、好ましくは検出する。疾患のない患者よりも、少なくとも２倍高い増殖のレベル、および／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性のレベルは、患者に血液悪性疾患が存在することを示す。
【０４２２】
上記のように、血液悪性疾患をまた、またはあるいは、生物学的サンプル中の血液悪性疾患関連抗原をコードするｍＲＮＡのレベルに基づいて検出し得る。例えば、生物学的サンプルに由来する血液悪性疾患関連抗原ｃＤＮＡの一部を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイにおいて、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用し得、ここで、このオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが、血液悪性疾患関連抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的（すなわちハイブリダイズする）。次いで、増幅したｃＤＮＡを、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動法）で分離し、そして検出する。同様に、血液悪性疾患関連抗原をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを、ハイブリダイゼーションアッセイで使用し、生物学的サンプル中に、血液悪性疾患関連抗原をコードするポリヌクレオチドの存在を検出し得る。
【０４２３】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さの、血液悪性疾患関連抗原をコードするポリヌクレオチドの一部に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記に規定されるような、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に用いられ得るオリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
【０４２４】
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを用い、ここでは、ＰＣＲは、逆転写とともに適用される。代表的に、ＲＮＡは生物学的サンプル（例えば、生検組織）から抽出され、そして逆転写されてｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生成し、このｃＤＮＡ分子は、例えば、ゲル電気泳動を用いて分離および可視化され得る。増幅は、試験患者および血液悪性疾患に罹患していない個体から採取された生物学的サンプルについて行われ得る。増幅反応は、２桁の大きさにおよぶいくつかのｃＤＮＡ希釈物について行われ得る。正常個体由来のサンプルのいくつかの希釈物と比較して２倍以上の、試験患者サンプルの同じ希釈物における発現増加は、代表的に、陽性とみなされる。
【０４２５】
好ましい実施形態において、このようなアッセイは、目的の血液悪性疾患関連抗原を発現する細胞について富化されたサンプルを使用して行われ得る。このような富化は、例えば、本明細書中に提供される結合薬剤を使用して、生物学的サンプルの残りからこれらの細胞を取り出すことによって達成され得る。次いで、これらの取り出された細胞は、その生物学的サンプルについて上記のようにアッセイされ得る。
【０４２６】
さらなる実施形態において、血液悪性疾患関連抗原は、血液悪性疾患の疾患進行またはその治療に対する応答をモニタリングするためのマーカーとして使用され得る。この実施形態において、血液悪性疾患の診断について上記に記載されたようなアッセイは、経時的に行われ得、反応性ポリペプチドのレベルの変化が評価され得る。例えば、このアッセイは、６ヶ月〜１年の期間にわたって、２４〜７２時間毎に行われ得、その後、必要に応じて行われ得る。一般に、悪性疾患は、結合剤によって検出されるポリペプチドのレベルが経時的に増大する患者において進行している。対照的に、その悪性疾患は、反応性ポリペプチドのレベルが、一定のままであるかまたは経時的に減少するかのいずれかの場合、進行していない。
【０４２７】
特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍に対して直接行われ得る。１つのこのようなアッセイは、腫瘍細胞と、結合薬剤とを接触させることを包含する。次いで、結合した結合薬剤は、直接的にか、またはレポーター基を介して間接的に検出され得る。このような結合薬剤はまた、組織学的適用において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブが、このような適用範囲内で使用され得る。
【０４２８】
上記のように、感受性を改善するために、多数のマーカーが、所定のサンプル内でアッセイされ得る。本明細書中に提供される異なるタンパク質に対して特異的な結合薬剤が、単一のアッセイ内で組み合わされ得ることは、明らかである。さらに、複数のプライマーまたはプローブが、同時に使用され得る。マーカーの選択は、最適な感度を生じる組み合わせを決定するための慣用的な実験に基づき得る。
【０４２９】
さらに、診断的適用は、髄外疾患（例えば、白血病における芽球の大脳浸潤）の検出を含む。このような方法において、結合薬剤は、追跡物質に結合され得、診断は、周知の技術を使用して、インビボで行われる。結合した結合薬剤は、上記のように投与され得、髄外疾患は、追跡物質の存在をアッセイすることに基づいて検出され得る。あるいは、追跡物質は、血液悪性疾患関連抗原に特異的なＴ細胞と関連し得る。このことは、追跡物質の位置を検出するためのアッセイに基づいて、髄外疾患の検出を可能にする。
【０４３０】
（４．２７  典型的定義）
本発明に従って、核酸配列は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡまたは外来性ＤＮＡを含むが、これらに限定されない）、遺伝子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡを含むが、これらに限定されない）、ヌクレオチド、および適切な核酸セグメント（天然供給源から得られるか、化学合成されるか、改変されるか、そうでなければ、全体的にまたは部分的に手動で調製されるかのいずれか）を含むが、これらに限定されない。
【０４３１】
別段規定されなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語または科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載の方法および組成物と類似または等価な任意の方法および組成物が、本発明の実施または試行において使用され得るが、好ましい方法および組成物を本明細書中に記載する。本発明の目的に関して、次の用語が、以下に規定される：
ａ、ａｎ：長い間続いている特許法の慣例に従って、語句「ａ」および「ａｎ」は、特許請求の範囲を含む、本出願において使用される場合、「１以上」を意味する。
【０４３２】
発現：コードされたペプチドまたはポリペプチドを合成するために構造遺伝子のようなポリヌクレオチドによって受ける、転写および翻訳を含む、細胞内プロセスの組み合わせ。
【０４３３】
プロモーター：転写を調節する核酸配列の領域を一般的に記載するために使用される用語。
【０４３４】
調節エレメント：転写を調節する核酸配列の領域を一般的に記載するために使用される用語。
【０４３５】
構造遺伝子：コードされたペプチドまたはポリペプチドを生成するために発現される、遺伝子または配列領域。
【０４３６】
形質転換：外因性ポリヌクレオチド配列（例えば、ベクター、組換えＤＮＡ分子または組換えＲＮＡ分子）を宿主細胞またはプロトプラストに導入するプロセスであって、この宿主細胞またはプロトプラスト中に、外因性核酸セグメントが、少なくとも第１の染色体に組み込まれるか、または形質転換された宿主細胞内で自律的複製し得る、プロセス。トランスフェクション、エレクトロポレーション、および裸の核酸取り込みは、全て、１以上のポリヌクレオチドでの宿主細胞を形質転換するために使用される技術の例を示す。
【０４３７】
形質転換細胞：核酸相補体が、１以上の外因性ポリヌクレオチドの細胞への導入によって改変された宿主細胞。
【０４３８】
トランスジェニック細胞：形質転換細胞に由来するかもしくは形質転換細胞から再生される、またはトランスジェニック細胞に由来するか、またはこのような形質転換宿主細胞の任意の世代の子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）または子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）に由来する、任意の細胞。
【０４３９】
トランスジェニック動物：形質転換動物細胞に由来する動物、またはその任意の世代の子孫もしくは子孫であって、この動物のＤＮＡは、同じ種のネイティブの野生型非トランスジェニック動物に元から存在しない、導入された外因性核酸分子を含む、動物。用語「トランスジェニック動物」および「形質転換動物」は、１以上の外因性核酸セグメントを含むように改変された遺伝的状況の動物を規定する類似の用語として、当該分野でときおり使用されている。
【０４４０】
ベクター：宿主細胞において複製し得、そして／または別の核酸セグメントが、結合されたセグメントの複製をもたらすように、作動可能に連結され得る核酸分子（代表的には、ＤＮＡから構成される）。プラスミド、コスミド、またはウイルスが、例示的なベクターである。
【０４４１】
用語「〜に実質的に一致する」、「実質的に相同」または「実質的に同一」は、本明細書中で使用される場合、核酸配列またはアミノ酸配列の特徴を示し、ここで選択された核酸配列またはアミノ酸配列は、選択された参照核酸配列または参照アミノ酸配列と比較して、少なくとも約７０％または約７５％の配列同一性を有する。より代表的には、選択された配列および参照配列は、少なくとも約７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、または８５％さえの配列同一性、およびより好ましくは少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％さえの配列同一性を有する。より好ましくは、なお高い相同性の配列は、しばしば、選択された配列と、比較される参照配列との間で少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％より高い配列同一性を共有する。配列同一性のパーセンテージは、比較される配列の長さ全体に対して計算され得るか、または選択された参照配列の約２５％未満になる少数の欠失または付加を排除することにより計算され得る。参照配列は、より大きな配列のサブセット（例えば、遺伝子または隣接配列の一部）または染色体の反復部分であり得る。しかし、２以上のポリヌクレオチド配列の配列相同性の場合、参照配列は、代表的には、少なくとも約１８〜２５ヌクレオチド、より代表的には、少なくとも約２６〜３５ヌクレオチド、およびなおより代表的には、少なくとも約４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチドまたは１００ヌクレオチド程度すら含む。望ましくは、どの非常に相同性のフラグメントが望ましいか、２つの配列間の％同一性の程度は、当業者に周知の１以上の配列比較アルゴリズム（例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）によって記載されるＦＡＳＴＡプログラム分析）により容易に決定されるように、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、およびより好ましくは約９０％または９５％以上である。
【０４４２】
用語「天然に存在する」とは、物体に適用される場合に本明細書中で使用される場合、物体が天然に見いだされ得るという事実を言及する。例えば、天然の供給源から単離され得、実験室において人間の手により意図的に改変されていない、生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。本明細書中で使用される場合、伝統的な遺伝学に従って選択的に交配され得る齧歯類の実験系統は、天然に存在する動物であると考えられる。
【０４４３】
本明細書中で使用される場合、「異種」は、所定の参照される遺伝子配列に関して規定される。例えば、構造遺伝子配列に関して、異種プロモーターが、参照される構造遺伝子に隣接して天然に存在しないが、実験操作によって配置されるプロモーターとして規定される。同様に、異種遺伝子または核酸セグメントは、参照されるプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに天然には隣接して存在しない遺伝子または核酸セグメントはとして規定される。
【０４４４】
「転写調節エレメント」とは、単独で、または１以上の他の核酸配列と組み合わせて、転写を活性化するポリヌクレオチド配列をいう。転写調節エレメントは、例えば、１以上のプロモーター、１以上の応答エレメント、１以上のネガティブ調節エレメント、および／または１以上のエンハンサーを含み得る。
【０４４５】
本明細書中で使用される場合、「転写因子認識部位」および「転写因子結合部位」とは、頻繁に、直接タンパク質−ＤＮＡ結合の形態をとる、１以上の転写因子の配列特異的相互作用のための部位であると同定されるポリヌクレオチド配列または配列モチーフをいう。代表的には、転写因子結合部位は、ＤＮＡフットプリンティング、ゲル移動度シフトアッセイなどによって同定され得るか、そして／あるいは公知のコンセンサス配列モチーフに基づいて、または当業者に公知の他の方法によって推定され得る。
【０４４６】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結される」とは、機能的関係において２以上のポリヌクレオチドまたは２以上の核酸配列の連結をいう。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に、「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるは、ＤＮＡ配列が、代表的には連続して連結されていることを意味し、２つのタンパク質コード領域を繋ぐことが必要である場合は、連続しかつリーディングフレーム中で連結されていることを意味する。しかし、エンハンサーは、一般には、数キロベースだけプロモーターから離れている場合に機能し、イントロン配列は、可変性の長さであり得るので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結されているが、連続していない。
【０４４７】
「転写ユニット」とは、少なくとも第１のシス作用性プロモーター配列に作動可能に連結され、構造遺伝子配列の効率的な転写に必要な１つ以上の他のシス作用性核酸配列に必要に応じて作動可能に連結されている少なくとも第１の構造遺伝子、ならびにそのプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの制御下で作動可能に配置された構造遺伝子配列の適切な組織特異的かつ発生的転写に必要であり得るような少なくとも第１の遠位調節エレメント、ならびに効率的な転写および翻訳に必要な任意のさらなるシス配列（例えば、ポリアデニル化部位、ｍＲＮＡ安定性制御配列など）を含むポリヌクレオチド配列をいう。
【０４４８】
上記のように、本出願は、一般に、組成物および例えば、癌（例えば、血液悪性疾患）の治療および診断においてこの組成物を使用するための方法に関する。本明細書中に記載される特定の例示的組成物は、以下を含む：血液悪性疾患関連腫瘍ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗体のような結合薬剤、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および／または免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）。「血液悪性疾患関連腫瘍タンパク質」とは、この用語が本明細書中で使用される場合、一般に、本明細書中で提供される代表的なアッセイを使用して決定されるように、正常組織における発現レベルより少なくとも２倍大きい、および好ましくは少なくとも５倍大きいレベルで、血液悪性疾患関連腫瘍細胞において発現されるタンパク質をいう。特定の血液悪性疾患関連腫瘍タンパク質は、血液悪性疾患に罹患した患者の抗血清と（イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット）内で）検出可能に反応する腫瘍タンパク質である。
【０４４９】
（４．２８  生物学的機能的等価物）
修飾および変化が、本発明のポリヌクレオチドおよびペプチドの構造においてなされ得、そしてなお、所望の特性を有するペプチドをコードする機能的分子を入手し得るか、または所望の発現特異性および／もしくは特性を有する遺伝的構築物をなお入手する。特定のポリヌクレオチド配列に１以上の変異を導入することがしばしば所望されるように、当業者に公知のポリヌクレオチドまたはペプチド配列に変異を導入する種々の手段は、選択された細胞または動物種に導入され得る異種配列の調製のために使用され得る。特定の状況において、得られるコードされたペプチド配列はこの変異によって変更され、または他の場合には、このポリペプチドの配列は、コードするポリヌクレオチドにおける１以上の変異によっては変化しない。他の状況において、１以上の変化が、発現エレメントの活性または特異性を変化させる、ポリヌクレオチド構築物のプロモーター領域および／またはエンハンサー領域に導入され、従って、そのエレメントの制御下に作動可能に配置された異種治療核酸セグメントの発現を変化させる。
【０４５０】
等価物または、なお改善された第２世代の分子を作製するために、発現構築物によってコードされる、１以上の異種ペプチドのアミノ酸配列を変化させることが所望される場合、このアミノ酸の変化は、表１に従ってコードＤＮＡ配列のコドンの１以上を変化させることによって達成され得る。
【０４５１】
例えば、特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造を有するタンパク質構造中の他のアミノ酸に、容易に感知できる程度の相互作用的な結合能の損失なしで、置換され得る。タンパク質の相互作用的な能力および性質がタンパク質の生物学的機能的活性を規定するので、特定のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列、および当然ながら、その根底にあるＤＮＡコード配列においてなされ得、そしてそれにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質が入手される。従って、種々の変化が、ペプチドの生物学的有用性または活性の感知できる程度の損失なしで、開示された組成物のペプチド配列またはそのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列においてなされ得ることが本発明者らによって意図される。
【０４５２】
【表１】
2005523002.tif 000003
このような変化を作製するために、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般的に当該分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、本明細書中に参考として援用される）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性的性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これは次には、そのタンパク質の他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定することが受け入れられている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０４５３】
特定のアミノ酸が同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そしてなお同様の生物学的活性を有するタンパク質を生じる（すなわち、生物学的に機能的に等価なタンパク質をなお入手する）ことが、当該分野において公知である。このような変化を作製する際に、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその疎水性親水性指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中に参考として具体的に援用される）は、タンパク質の生物学的特性と相関するその隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、そのタンパク質の最大局所的平均親水性に言及する。
【０４５４】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、同様の親水性の値を有する別のアミノ酸に置換され得、そしてなお、生物学的に等価なタンパク質（特に、免疫学的に等価なタンパク質）を得ることが理解される。このような変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。
【０４５５】
上記に概説したように、従って、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズ、など）に基づく。前述の種々の特徴を考慮する典型的な置換は当業者に周知であり、そして以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【０４５６】
（５．実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。しかし、当業者は、本開示を考慮して、多くの変化が、開示される特定の実施形態に対してなされ得、添付の特許請求の範囲に記載される発明の精神および範囲から逸脱することなく、類似または同様の結果をなお得ることができることが理解される。
【０４５７】
（５．１  実施例１−血液悪性疾患関連抗原ポリヌクレオチドの同定）
この実施例は、非ホジキンリンパ腫からの血液悪性疾患関連抗原ポリヌクレオチドの同定を実証する。
【０４５８】
血液悪性疾患関連抗原ポリヌクレオチドは、ＰＣＲベースの減算によって単離された。ポリＡ  ｍＲＮＡを、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫および正常組織から調製した。６つのｃＤＮＡライブラリーを構築し、ＰＣＲ減算し、そして分析した。２つのライブラリーを、３つのＴ細胞非ホジキンリンパ腫ｍＲＮＡのプール（ＴＣＳライブラリーとして本明細書中で呼ばれる）を使用して構築した。２つの他のものは、３つのＢ細胞非ホジキンリンパ腫ｍＲＮＡのプール（ＢＣＮＨＬライブラリーとして本明細書中で呼ばれる）を使用して、構築した。２つの他のライブラリーは、２つのホジキンリンパ腫ｍＲＮＡのプール（本明細書中において、ＨＬＳライブラリーと呼ばれる）を使用して構築した。ｃＤＮＡ合成、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈのユーザーマニュアル（ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）に従って、以下の変更を伴って実施した：１）ｃＤＮＡを、単一の酵素ＲｓａＩの代わりに、酵素の混合物（ＭｓｃＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｔｕＩおよびＤｒａＩを含む）を用いて制限した；および２）テスターｃＤＮＡをに対する送達の比を、ハイブリダイゼーション工程において（７６：１）まで増加して、よりストリンジェントな減算を生じた。
【０４５９】
２つのＴＣＳライブラリーを、異なるプールのドライバｃＤＮＡを用いて独立して減算した。ドライバ＃１は、特異的正常組織（リンパ節、骨髄、Ｔ細胞、心臓および脳）から調製されたｃＤＮＡを含み、そしてこの減算は、ライブラリーＴＳＣ−Ｄ１を生成した（ドライバ＃１を用いた、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫減算ライブラリー）を生成した。ドライバ＃２は、非特異的正常組織（結腸、大腸、肺、膵臓、脊髄、骨格筋、肝臓、腎臓、皮膚および脳）を含み、そしてこの減算は、ライブラリーＴＣＳ−Ｄ２（ドライバ＃２を用いた、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫減算ライブラリー）を生成した。
【０４６０】
同様に、２つのＢＣＮＨＬライブラリーは、ドライバｃＤＮＡの異なるプールをもちいて独立して減算された。ドライバ＃１は、特異的正常組織（リンパ節、骨髄、Ｂ細胞、心臓および脳）から調製されたｃＤＮＡを含み、そしてこの減算は、ライブラリーＢＣＮＨＬ／Ｄ１（ドライバ＃１を用いた、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫減算ライブラリー）を生成した。ドライバ＃２は、非特異的正常組織（脳、肺、膵臓、骨髄、骨格筋、結腸、脾臓、大腸およびＰＢＭＣ）を含み、そしてこの減算は、ライブラリーＢＣＮＨＬ／Ｄ２（ドライバ＃２を用いた、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫減算ライブラリー）を生成した。
【０４６１】
２つのＨＬＳライブラリーは、独立して、ドライバｃＤＮＡの異なるプールを用いて減算された。ドライバ＃１は、特異的正常組織（リンパ節、骨髄、Ｂ細胞、および肺）から調製したｃＤＮＡを含み、そしてこの減算は、ＨＬＳ−Ｄ１（ドライバ＃１を用いた、ホジキンリンパ腫減算ライブラリー）を生成した。ドライバ＃２は、非特異的正常組織（結腸、大腸、肺、膵臓、脊髄、骨格筋、肝臓、腎臓、皮膚および脳）を含み、そしてこれは、ライブラリーＨＬＳ−Ｄ２（ドライバ＃２を用いた、ホジキンリンパ腫減算ライブラリー）を生成した。
【０４６２】
減算の効率を分析するために、アクチン（ハウスキーピング遺伝子）を、減算ＰＣＲサンプルおよび非減算ＰＣＲサンプルの希釈物からＰＣＲ増幅した。さらに、各ライブラリーの複雑性および冗長性を、ＰＣＲ減算ライブラリー（ＴＣＳ−Ｄ１、ＴＣＳ−Ｄ２、ＢＣＮＨＬ／Ｄ１、ＢＣＮＨＬ／Ｄ２、ＨＬＳ−Ｄ１およびＨＬＳ−Ｄ２）の各々からの９６クローンを配列決定することによって特徴付けた。これらの分析は、ライブラリーが、白血病組織、特に、Ｔ細胞およびＢ細胞の非ホジキンリンパ腫サンプルならびにＭ．ホジキンリンパ腫サンプルにおいて過剰発現した遺伝子について富化されることを示した。
【０４６３】
ＰＣＲ増幅に続いて、ｃＤＮＡを、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【０４６４】
これらの分析から得られた配列を、ＢＬＡＳＴ  ２．０放出を使用して、公に利用可能なデータベースにおいて、公知の配列に対して検索した。使用したデフォルトＢＬＡＳＴパラメータは、以下の通りであった：ギャップパラメータ：オープンギャップ＝０、伸長ギャップ＝０；出力パラメータ：期待値＝１０．０、閾値＝０、アライメント数＝２５０；ＢＬＡＳＴＮについて、検索パラメータは、以下の通りであった：ミスマッチ−３、リワード（Ｒｅｗａｒｄ）＝１、ワードサイズ＝０。アライメントをペアで示し、ウィンドウパーセント同一性＝２２であった。全ての利用可能なタンパク質およびヌクレオチドデータベース（ＰＩＲ、ＳｗｉｓｓＰＲＯＴ、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｍｏｕｓｅ  ＥＳＴ、Ｈｕｍａｎ  ＥＳＴ、Ｏｔｈｅｒ  ＥＳＴ、Ｈｕｍａｎ反復および高スループット配列、および公開された特許および特許出願データベースを含む）を検索した。
【０４６５】
これらから、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の配列データベースにおいて先に記載されていない新規なポリヌクレオチド配列を表す多くの独特の配列が、同定された。データベースにおいて以前に同定された１つ以上の配列と有意な相同性を含むようである多くの他の配列が、同定されたが、これらは、ゲノムまたはｃＤＮＡクローンとしてのみ記載され、公知の機能を有さなかった。残りの配列は、公知の遺伝子と対応した。この分析から得られたクローンを、同時係属出願ＵＳＳＮ  ０９／７９６，６９２における表２〜６に要約した。
【０４６６】
（５．２  実施例２−−マイクロアレイ分析による減算ｃＤＮＡ配列の分析）
減算ｃＤＮＡ配列を、マイクロアレイ分析によって分析して、血液悪性疾患および正常組織におけるそれらの発現を評価した。このアプローチを使用して、ｃＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅し、そして血液悪性疾患および正常組織におけるそれらのｍＲＮＡ発現プロフィールを、本質的に記載されるように（Ｓｈｅｎａら、１９９５）、ｃＤＮＡマイクロアレイ技術を使用して試験した。
【０４６７】
簡単に述べると、減算ｃＤＮＡライブラリー分析から同定されたクローンを、マイクロアレイスライド上の複数の複製として、ガラススライド上に固定化および配列し、そしてスライドを、２つの異なるセットのプローブを用いてハイブリダイズし、マイクロアレイスライド上の各位置は、独特のｃＤＮＡクローンに対応した（５５００もの多くのクローンが、単一のスライド、またはチップ上に配列され得る）。各チップを、それぞれ、Ｃｙ３およびＣｙ５で蛍光標識された一対のｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。血液悪性疾患から誘導されたプローブのセットをｃｙ３で標識し、一方、正常組織のプールから誘導されたプローブの他のセットは、ｃｙ５を用いて標識された。代表的に、１μｇのポリＡ＋ＲＮＡを使用して、各ｃＤＮＡプローブを作製した。ハイブリダイゼーション後、チップを走査し、そして蛍光強度をＣｙ３チャネルおよびＣｙ５チャネルについて記録した。両方のプローブセットでのハイブリダイゼーション後の強度における差（すなわち、ｃｙ３／ｃｙ５の比）は、腫瘍対正常組織においてスライドに固定された各ｃＤＮＡ配列の相対発現レベルについての情報を提供した。複数の一体型品質管理工程が存在する。第１に、プローブ品質を、普遍に発現される遺伝子のパネルを使用してモニターした。第２に、コントロールプレートはまた、酵母ＤＮＡフラグメントを含み得、この相補ＲＮＡは、プローブの品質および分析の感度を測定するために、プローブ合成にスパイクされ得る。この方法論は、ｍＲＮＡの１００，０００コピーのうちの１つの感度を提供し、そしてこの技術の再現性を、複製されたコントロールｃＤＮＡエレメントを異なる位置で含めることによって、保証し得る。
【０４６８】
種々のマイクロアレイチップでのマイクロアレイ分析による血液悪性疾患減算クローンの分析は、同時係属出願のＵＳＳＮ０９／７９６，６９２の配列番号１〜配列番号６６８に記載される配列セットを同定し、血液悪性疾患対正常組織において、少なくとも２倍で過剰発現される。
【０４６９】
（５．３  実施例３−−ポリヌクレオチドおよびポリペプチド組成物：減算ハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイ分析によって同定されるｃＤＮＡクローンおよびオープンリーディングフレームの簡単な説明）
同時係属出願のＵＳＳＮ０９／７９６，６９２の表７は、本発明の分析の間に得られるポリヌクレオチドの配列を列挙する。クローン名識別子、ならびにこのクローンが最初に同定された優先権の仮特許出願のシリアル番号および出願日を伴う、６６８個のポリヌクレオチド配列が示される。
【０４７０】
同時係属出願のＵＳＳＮ０９／７９６，６９２の表８は、同時係属出願の配列番号１〜配列番号６６８において得られるｃＤＮＡ配列の分析から得た推定オープンリーディングフレームを同定する。配列識別子、クローン名および翻訳フレーム、ならびにオープンリーディングフレームのポリペプチド配列を生成するために使用される対応するＤＮＡ配列における開始ヌクレオチドおよび終止ヌクレオチドが示される。
【０４７１】
同時係属出願のＵＳＳＮ０９／７９６，６９２の表９は、上記減算的ライブラリーおよびマイクロアレイ方法を使用して得られた特定の血液悪性疾患関連ｃＤＮＡ配列のさらなるセットを同定する。これらの配列（同時係属出願において配列番号２５３３〜配列番号９５９７と指定される）を、元のクローン名、ならびにこのクローンが最初に記載された優先権の仮特許出願のシリアル番号および出願日とともに、表に示す。
【０４７２】
（５．４  実施例４−−Ｂ細胞白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫と関連する特異的遺伝子ＬＹ１４４８Ｐの同定）
同時係属出願ＵＳＳＮ１０／０４０，８６２の配列番号９５９９（「Ｌｙ１４４８Ｐ」とも呼ばれる）（この一部は、同時係属出願ＵＳＳＮ０９／７９６，６９２において配列番号６３６として先に開示される）を、同時係属出願ＵＳＳＮ０９／７９６，６９２のセクション５．１〜５．３における実施例１〜３に記載されるように、一連のＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ分析で同定した。配列番号９５９９の部分に対して特異的なオリゴヌクレオチドを、正常細胞および血液悪性疾患細胞から単離されたＲＮＡを使用して、一連のＲｅａｌＴｉｍｅ  ＰＣＲ実験において使用した。配列番号９５９９は、正常Ｂ細胞株、ＣＤ１９＋細胞株において発現され、そして非ホジキンＢ細胞リンパ腫細胞株、ホジキンリンパ細胞株、濾胞性リンパ腫細胞株、および慢性リンパ球性白血病細胞株のサブセットにおいて高度に発現されたようであった。
【０４７３】
配列番号９５９９（５２３塩基対のｃＤＮＡフラグメントである）を使用して、ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）Ｇｏｌｄデータベースをスクリーニングし、そして２つのさらなるクローン、配列番号９５９８（「ＬＳ  １３８４２５８．１」とも呼ばれ、６２２塩基対のｃＤＮＡフラグメントである）、および配列番号９６００（「ＬＳ  ３６８１０９．１」とも呼ばれ、これは、１，９０８塩基対のｃＤＮＡである）を同定した。
【０４７４】
ＢＬＡＳＴ分析は、配列番号９６００のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、ヌクレオチド７７７において開始し、ヌクレオチド１５６２において終止し、配列番号９６１１において同定される２６１アミノ酸タンパク質をコードする（Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質と呼ばれる）ことを決定した。ＴＭｐｒｅｄおよびＰＳＯＲＴＩＩの両方を使用する配列番号９６００のさらなる分析は、配列番号９１６６が、１ｂ型膜タンパク質（アミノ酸１５６で開始し、そしてアミノ酸１７７で終了する推定膜貫通ドメインを含む）であることを示した。配列番号９６１１の細胞外部分は、免疫グロブリンと相同性を有し、推定Ｉｇ様ドメインを含む。配列番号９６１１の細胞内部分は、Ｓｒｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−２（ＳＨ２）結合ドメイン、免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）およびおよび免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。このように、Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質は、造血細胞シグナル伝達において特定の役割を果たし得る。これらのｃＤＮＡフラグメントのさらなる構造および相同性の分析は、同時係属出願ＵＳＳＮ１０／０４０，８６２に記載され、そして以下に議論される。
【０４７５】
ＢＬＡＳＴ分析はまた、Ｌｙ１４４８Ｐが、２つの他のタンパク質ファミリー（ＳＰＡＰ１ファミリーおよびＩＲＴＡファミリー）と相同性を共有することが示された。Ｌｙ１４４８Ｐは、ＳＰＡＰ１ファミリーのタンパク質と相同性を共有し、これは、３つメンバー（ＳＰＡ１ａ、ＳＰＡＰ１ｂ、およびＳＰＡＰ１ｃ）からなる。以下にさらに詳細に考察されるように、全ての同定されたＳＰＡＰ１タンパク質は、独特の４２アミノ酸末端を有する。ＳＰＡＰ１ｂは、独特の１８アミノ酸カルボキシ末端を有し、そしてＳＰＡＰ１ｃは、独特の９アミノ酸カルボキシ末端を有する。Ｌｙ１４４８Ｐはまた、ＩＲＴＡファミリーのタンパク質、特に、ＩＲＴＡ４と相同性を共有する。以下にさらに詳細に考察されるように、Ｌｙ１４４８ＰおよびＩＲＴＡは、複数のエキソンを共有し、そして同定されたタンパク質は、選択的スプライシング事象から生じるようである。
【０４７６】
（５．５  実施例５−−ＬＹ１４４８免疫原性ペプチドの同定）
この実施例は、細胞傷害性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞応答を生成するために有用なペプチドの同定を説明する。
【０４７７】
細胞性免疫応答を生成するために有用なＬｙ１４４８Ｐタンパク質ペプチドを同定した。多くのＨＬＡクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子についての好ましいエピトープ結合モチーフは公知である。Ｌｙ１４４８Ｐアミノ酸配列を、表２に同定される特異的なＨＬＡ分子に結合するペプチドについて検索した。特異的ＨＬＡ分子の各々に結合することが推定される９マーペプチドを同定し、各ＨＬＡ分子に結合するペプチドに対応する配列番号を示す。
【０４７８】
（表２）
（同定されたＬｙ１４４８  ＣＴＬペプチド）
【０４７９】
【表２−１】
2005523002.tif 000004
【０４８０】
【表２−２】
2005523002.tif 000005
さらなる免疫原性ペプチドの位置を、プログラムＴＳＩＴＥＳを使用して、配列番号９６１１の完全Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質アミノ酸配列を分析することによって決定した。結果を図５に示す。ＴＳＩＴＥＳは、推定両親媒性らせん体の位置（Ａ）、Ｒｏｔｈｂａｒｄ／Ｔａｙｌｏｒモチーフにマッチングするアミノ酸残基の位置（Ｒ）、ＩＡｄモチーフにマッチングする残基の位置（Ｄ）およびＩＥｄモチーフにマッチングする残基の位置を同定した。この分析に基づいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞に結合するエピトープを含むと推定される４つのさらなるペプチドを、同定した。ペプチド１は、Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質のアミノ酸４０〜７８にわたり、そして配列番号１０４５５によって表される。ペプチド２は、Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質のアミノ酸１２７〜１５０にわたり、配列番号１０４５６によって表される。ペプチド３は、Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質のアミノ酸２１０〜２３３にわたり、配列番号１０４５７によって表される。ペプチド４は、Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質のアミノ酸１４１〜１７８にわたり、配列番号１０４５８によって表される。
【０４８１】
細胞外ドメインＬｙ１４４８Ｐタンパク質（配列番号９６１１のアミノ酸１〜１５６）の５個の非重複３１マーまたは３２マーアミノ酸フラグメント（配列番号９６１３〜９６１７）を含むＬｙ１４４８Ｐタンパク質免疫原性ペプチドを作製し、そしてＬｙ１４４８Ｐタンパク質に対して特異的な抗体を作製するために使用した。これらの抗体は、正常細胞および疾患細胞の両方において診断的使用および治療的使用についてのＬｙ１４４８Ｐタンパク質を認識する際に有用である。抗体を作製するために使用される各ペプチドフラグメントはまた、フラグメントのカルボキシ末端においてＧＣＧペプチドリンカーを含む。これらの抗体はまた、ＩＲＴＡ４タンパク質を認識し得る。配列番号９６１４〜９６１７によって規定されるペプチドに存在するエピトープに免疫反応性の抗体はまた、ＳＰＡＰ１ａに存在するエピトープを認識し得る。
【０４８２】
Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質配列由来の１７個の重複免疫原性ペプチドもまた作製した。１６〜３０マーのアミノ酸ペプチドを作製し、各々のペプチドが、連続したアミノ酸配列を含み、そして１５アミノ酸（配列番号１０４３８〜１０４５３）だけ隣接する配列を含むペプチドと重複する。Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質のカルボキシ末端をコードする１つのペプチドは、２１アミノ酸長であり、１５アミノ酸（配列番号１０４５４）だけ隣接するペプチドと重複する。これらの１７個のペプチドはまた、ペプチドに存在するエピトープに免疫反応性の抗体を作製するために使用される。配列番号１０４３８および１０４３９によって同定されるペプチドに存在するエピトープを認識する抗体は、Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質を認識するが、配列番号１０４４０〜１０４５４によって同定されるペプチドに存在するエピトープを認識する抗体は、Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質およびＳＰＡＰ１ａタンパク質の両方を認識し得る。これらのペプチドの全てに対して生成された抗体はまた、ＩＲＴＡ４を認識し得る。これらの１７個の重複するペプチドに対して作製された抗体は、診断目的および治療目的の両方に有用である。
【０４８３】
（５．６  実施例６  ＩＲＴＡタンパク質由来の免疫原性ペプチド誘導形態）
本実施例は、細胞傷害性Ｔ細胞応答またはヘルパーＴ細胞応答を生じるために有用なペプチドの同定を例示する。
【０４８４】
ＩＲＴＡタンパク質ＩＲＴＡ  １、２ａ、２ｂ、２ｃ、３、４および５の各々のアミノ酸配列は、ＴＳＩＴＥＳプログラムを使用して分析した。このプログラムは、Ｔ細胞ヘルパー細胞に結合するための適切なエピトープを同定する。各々のタンパク質にとってＴヘルパーエピトープの各々に対応するペプチドを同定した。各々のペプチドに対応する配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ（ｓ））を、表３に提供する。
【０４８５】
【表３】
2005523002.tif 000006
（５．７  実施例７  Ｂ細胞白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫に関連する２つの特異的遺伝子である、ＬＹ１４４７およびＬＹ１４８１の同定）
本実施例は、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫に関連する２つの特異的遺伝子の同定を例示する。
【０４８６】
Ｌｙ１４４７およびＬｙ１４８１（これらの一部分が、同時係属出願ＵＳＳＮ  ０９／７９６，６９２において事前に記載される）は、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫にまたは関連するｃＤＮＡである。Ｌｙ１４４７のヌクレオチド配列は、本明細書中で、配列番号９６０２として開示される。Ｌｙ１４８１のヌクレオチド配列は、配列番号９６０３として本明細書中開示される。配列番号６によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号１０４６６として開示される。
【０４８７】
配列番号９６０２および９６０３を、ＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎＳｅｑデータベースの両方のＢＬＡＳＴＸサーチにおいて使用した。相同配列は、ＧｅｎＳｅｑデータベースにおいてのみ見いだされた。この分析によって、配列番号９６０２は、第１染色体上のＩＲＴＡ２ｃ遺伝子の３’非翻訳領域に相同であった。配列番号９６０３は、第１染色体上のＩＲＴＡ３のコード領域の一部分に相同であった。
【０４８８】
遺伝子のＩＲＴＡスーパーファミリーは、ＩＲＴＡ１、２ａ、２ｂ、２ｃ、３、４、および５を含み、これらの核酸配列は、それぞれ、配列番号９６０４〜９６１０として本明細書中に開示され、そして対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０４５９〜１０４６５として開示される。これらのＩＲＴＡ遺伝子は、第１染色体（ｑ２１）に位置付けられ、そして、染色体転座に関与する。これらの転座は、第１４染色体（ｑ３２）の一部分と、第１染色体の一部分とを組み合わせる。第１４染色体の一部分は、免疫グロブリンタンパク質をコードする遺伝子の位置である。これらの染色体転座は、種々のＢ細胞白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫瘍と関連する。
【０４８９】
（５．８  実施例８  血液悪性疾患を有する患者におけるＬＹ１４４８Ｐ特異的抗体およびＴＣＬ−１特異的抗体の検出）
本実施例は、ＬＹ１４４８Ｐ特異的抗体およびＴＣＬ−１特異的抗体が、血液悪性疾患（例えば、リンパ腫を含むがこれらに限定されない）を有する患者の血清中に存在することを例示する。これらの特異的抗体の検出によって、血液性悪性疾患の早期診断のための（具体的には、健常な個体または進行性のリンパ腫を発症する危機に瀕する個体（例えば、移植患者および免疫無防備患者（すなわち、ＡＩＤＳ患者））を、血液性悪性疾患の存在についてスクリーニングのための）ツール、または最小残余疾患をモニタリングするためのマーカーが提供される。さらに、これらのデータは、Ｌｙ１４４８ＰおよびＴＣＬ−１が、患者にとって免疫原性であることを実証する。
【０４９０】
これらの患者に由来する具体的な抗体は、血液性悪性疾患を治療するために使用され得るエピトープを同定するのに使用され得る。図５は、Ｌｙ１４４８Ｐ特異的Ａｂデータ（黒白）を示す。４８のコントロール血清を、組換えＬｙ１４４８Ｐタンパク質またはＴＣＬ−１タンパク質を使用するＥＬＩＳＡアッセイによってスクリーニングした。４８全ての正常血清のこれらの平均ＯＤ読み取り値±２．５偏差を、カットオフレベルとして決定して、図において実線として示した。高いレベルを実証する全ての血清は、陽性として定義した。
【０４９１】
（５．９  実施例９−−Ｂ細胞白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫と関連したＬｙ１４４８Ｐスプライス改変体）
本実施例は、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫と関連している、Ｌｙ１４４８Ｐ遺伝子およびそのコードされたタンパク質の全てのエキソンおよび種々のスプライスされた形態の同定を例示する。
【０４９２】
同時係属出願であるＵＳＳＮ  １０／０４０，８６２は、Ｌｙ１４４８Ｐをコードする核酸配列（配列番号９６００）を使用して、公的に利用可能なヒトゲノムデータベースであるＧｅｎｂａｎｋおよび専用データベースをスクリーニングしたことを記載している。さらなるＬｙ１４４８Ｐ配列を、配列番号１１，０１６において、本明細書中に提示する。相同配列を、データベース中で、およびヒト第一染色体上で同定した。ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴ検索は、Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質が、３つの最近同定されたタンパク質、ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ（ＳＰＡＰ１ａ）、１ｂ（ＳＰＡＰ１ｂ）、および１ｃ（ＳＰＡＰ１ｃ）（Ｘｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８０：７６８−７７５（２００１））と相同性を共有することを決定した。これらの３つのタンパク質は、Ｌｙ１４４８Ｐの選択的にスプライシングされた形態であるようである。ＳＰＡＰ１ａ（Ｌｙ１４４８Ｐの選択的にスプライシングされた改変体）をコードする核酸配列は、７６５ヌクレオチド長であり（配列番号１１，０３６）、そして２５５アミノ酸長のタンパク質をコードする（配列番号９６１２および１１，０５７）。さらなるＳＰＡＰ１ａヌクレオチド配列は、配列番号９６０１および１１，０３５、およびＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ３１９４３８において見出され得る。ＳＰＡＰ１ｂは、Ｌｙ１４４８ＰおよびＳＰＡＰ１ａの両方の選択的にスプライシングされた改変体である。ＳＰＡＰ１ｂをコードする核酸配列は、５７６ｂｐであり（配列番号１１，０３８）、そして１９２アミノ酸長のタンパク質をコードする（配列番号１１，０５８）。さらなるＳＰＡＰ１ｂヌクレオチド配列は、配列番号１１，０３７およびＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ３１９４３９において見出され得る。ＳＰＡＰ１ｃは、Ｌｙ１４４８ＰおよびＳＰＡＰ１ａおよびＳＰＡＰ１ｂの選択的にスプライシングされた改変体である。ＳＰＡＰ１ｃをコードするヌクレオチド配列は、４３２ヌクレオチド長であり（配列番号１１２９２およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３１９４４０）、そして１４４アミノ酸長のタンパク質をコードする（配列番号１１２９３）。
【０４９３】
ＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＳｅｑの両データベースのＢＬＡＳＴＸ検索は、Ｌｙ１４４８Ｐ、ならびにＳＰＡＰ１ａ、ＳＰＡＰ１ｂ、およびＳＰＡＰ１ｃがまた、免疫グロブリンレセプタートランスロケーション関連タンパク質４（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）（「ＩＲＴＡ４」）とも相同性を共有することを示した。ＩＲＴＡ４はまた、Ｌｙ１４４８ＰならびにＳＰＡＰ１ａ、ＳＰＡＰ１ｂ、およびＳＰＡＰ１ｃの選択的にスプライシングされた改変体であるようである。ＩＲＴＡ４をコードするヌクレオチド配列は、１５２４ヌクレオチド長であり（配列番号１１，００１）、そして５０８アミノ酸長のタンパク質をコードする（配列番号１０，４６４および１１，０３９）。さらなるＩＲＴＡ４ヌクレオチド配列は、配列番号９６０９および１１，０００ならびにＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ４５９６３３において見出され得る。近年、ＩＲＴＡ４はまた、Ｆｃレセプターホモログのファミリーのメンバー（具体的には、ＦｃＲＨ２（Ｄａｖｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７７２−９７７７（２００１）およびＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ０４３４６５））として同定された。ファミリーメンバーは、優先的なＢ細胞発現を示す。
【０４９４】
以下のヌクレオチド配列を含むＰＣＲプライマー：ヌクレオチド配列５’ＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＣＴＧＧＴＣ３’（センス）（配列番号１１，０５９）および５’ＧＡＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＧＧＧＡＴＡＴＴＣ３’（アンチセンス）（配列番号１１，０６０）、を使用し、３つのＢ細胞非ホジキン病リンパ腫サンプルから調製したｃＤＮＡを含むＢ細胞ｃＤＮＡライブラリから、ＩＲＴＡ４およびＩＲＴＡ４様配列を増幅した。単離および特徴づけされた１つのクローンは、Ｌｙ１４４８ＰおよびＩＲＴＡ４の別の選択的にスプライシングされたバージョンであるようであった。これを、Ｐａｔｔｉ  ＰＣＲクローンまたはＦＬ  ＰＣＲ  ＯＲＦクローンと称する（配列番号１１，０３２）。配列番号１１，０３２は、２３９２ヌクレオチド長であり、そして２つのオープンリーディングフレームを含む。オープンリーディングフレーム１（「ＯＲＦ１」）（配列番号１１，０３３）は、４２０ヌクレオチド長であり、そして１４０アミノ酸タンパク質（配列番号１１，０５５）をコードする。オープンリーディングフレーム２（「ＯＲＦ２」）（配列番号１１，０３４）は、７８３ヌクレオチド長であり、そして２６１アミノ酸タンパク質（配列番号１１，０５６）をコードする。
【０４９５】
エキソンおよびイントロンを、公的に利用可能な第一染色体ゲノム配列データを、Ｌｙ１４４８Ｐフラグメント、ＩＲＴＡ４、ＬＹ１４４８Ｐ、Ｐａｔｔｉ  ＰＣＲクローン、ＳＰＡＰ１ａ、ＳＰＡＰ１ｂ，、およびＳＰＡＰ１ｃをコードするヌクレオチド（それぞれ、配列番号９５９８、１１，０００、１１，０１６、１１，０３２、１１，０３５、１１，０３７、および１１，２９２）に比較することによって同定し、そしてこれを図７に図解として示す。オープンリーディングフレームをＤＮＡＳＴＡＲＴＭ  ＭａｐＤｒａｗプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）を用いて同定した。この比較は、第一染色体のこの領域中に１８個のエキソンを同定した。この比較は、代替的に使用されるエキソン、および代替的に使用されるスプライスドナーまたはスプライスアクセプターを含むエキソンをさらに同定した。これらのエキソン、および代替的に使用されるスプライスドナーまたはアクセプターを含むエキソンの各々の配列は、表４に示すように、配列番号１０，９７９〜１０，９９９において見い出される。
【０４９６】
【表４】
2005523002.tif 000007
エキソン１０および１３は、代替的に使用されるスプライスドナーを含み、そしてエキソン１１および１２は、代替的に使用されるスプライスアクセプターを含む。全長エキソン１１は、Ｌｙ１４４８Ｐフラグメント（配列番号９５９８）において使用される。他の全ての転写物は、エキソン１１の選択的にスプライシングされたアクセプター形態を使用する。全長エキソン１２は、翻訳開始部位を含み、そして全てのＳＰＡＰ１転写物（スプライス形態ｒおよびｓならびにＳＰＡＰ１ｃ）（配列番号１１，０３５〜１１，０３８および１１，２９１〜１１，２９２）において使用される。スプライス形態ＳＰＡＰ１ｃは、いかなるエキソン１３配列も含まず、そしてＳＰＡＰ１ｃタンパク質のカルボキシ末端で見い出される９つのさらなるアミノ酸をコードする、エキソン１２の３’末端の２７のさらなるヌクレオチドを含む（配列番号１１，２９３）。全長エキソン１３は、ＳＰＡＰ１ｂ転写物（スプライス形態ｓ）（配列番号１１，０３７〜１１，０３８）において使用され、そして転写終止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む。エキソン７は、翻訳開始部位を含み、そしてＩＲＴＡ４転写物（スプライス形態ａ−ｈおよびｑ）（配列番号１１，０００〜１１，０１５および１１，０３２〜１１，０３３）において使用される。エキソン１〜６は、Ｌｙ１４４８Ｐ転写物（スプライス形態ｉ〜ｐ）（配列番号１１，０１６〜１１，３１）において使用される。エキソン９は、スプライス形態ｉ〜ｐについての翻訳開始部位を含む。選択的スプライスドナーを使用するエキソン１０は、Ｐａｔｔｉ  ＰＣＲクローン（スプライス形態ｑ１）（配列番号１１，０３２〜１１，０３４）において見い出される。エキソン１３および１３ＧＴは、膜貫通ドメインを含む。エキソン１２は、スプライス形態ｒおよびｓについて翻訳開始部位（ｓｉｇｈｔ）を含む。これらの結果はまた、図８および図９中に図解として示す。潜在的な組み合わせの各々をコードする配列は、表５中に見い出され得る。
【０４９７】
遺伝子およびそれらのコードされたタンパク質についての多数の選択的スプライシング形態は、推定の膜性分子（レセプター）および非膜性分子の両方を含む。例えば、Ｐａｔｔｉ  ＰＣＲクローンＯＲＦ１は、分泌された非膜結合分子をコードする（配列番号１１，０３２〜１１，０３３および１１，０５５）。Ｐａｔｔｉ  ＰＣＲクローンＯＲＦ１は、エキソン７〜９および１０ＧＴにおいて見い出される細胞外ドメイン、およびエキソンＡＧ１１によってコードされた新規アミノ酸を含む（図９、スプライス形態ｑ１を参照のこと）。ＳＰＡＰ１ｃはまた、分泌タンパク質をコードする（配列番号１１，２９１〜１１，２９３）。ＳＰＡＰ１ｃは、ＳＰＡＰ１ａおよびＳＰＡＰ１ｂにおいて見いだされた同じアミノ末端１３５アミノ酸を含み、そして独特の９アミノ酸カルボキシ末端を含む。図８および表５において同定され、そして図９中に図解として示された、選択的にスプライシングされた分子は全て、異なる生物学的活性を有する。例として、異なる膜性（レセプター）Ｌｙ１４４８Ｐ分子は、それらの細胞内ポリペプチド配列（その分子の「シグナル伝達」部分）およびそれらの細胞外ポリペプチド配列（その分子の「リガンド結合」部分）の組成に依存して、異なるシグナル伝達特性を有し得る。異なる細胞内配列への異なる細胞外ドメインの連結は、同じまたは異なるリガンドに応じて、異なる機能的シグナル（例えば、増殖、分化、アポトーシス）を生じるレセプターを提供する。非膜性Ｌｙ１４４８Ｐ分子は、リガンドに結合することにより、またはレセプターからのシグナルの伝達を担う細胞内タンパク質に結合することにより、競合者として作用することにより膜レセプターＬｙ１４４８Ｐ分子からシグナルを調整するように作用する。このような例は、これらのタンパク質を発現する細胞に対してポジティブな影響（例えば、増殖／分化）およびネガティブな影響（例えば、アポトーシス）を生じる。種々の形態のＬｙ１４４８Ｐに対して指向される抗体は、異なるエピトープを含むが、同様の様式でＬｙ１４４８Ｐの生物学的効果を調整する。タンパク質または核酸の選択的にスプライシングされた形態に対して指向されるプローブ（例えば、抗体またはオリゴヌクレオチド）は、どのＬｙ１４４８Ｐ改変体が発現されるかを決定するための診断剤として有用である。これらのプローブは、Ｌｙ１４４８Ｐ遺伝子またはタンパク質の特定の形態を拮抗するための治療剤として有用である。
【０４９８】
【表５】
2005523002.tif 000008
（５．１０  実施例１０−−Ｌｙ１４４８Ｐ特異的抗体）
本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＬｙ１４４８Ｐタンパク質の産生を例示する。本実施例は、さらに、その組換えタンパク質に対するポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗血清の産生を例示する。これらの抗血清は、Ｌｙ１４４８Ｐ抗原を発現する腫瘍を同定するために、診断剤として有用である。これらの抗血清は、Ｌｙ１４４８Ｐ抗原を発現する腫瘍を処置するための治療剤として有用である。
【０４９９】
Ｌｙ１４４８Ｐをコードするヌクレオチド配列（配列番号９６００のヌクレオチド７８０〜１５７３）を、このベクターの転写開始配列に隣接して開始メチオニン残基、グルタミン残基、および６アミノ酸ヒスチジンタグをコードするヌクレオチドを含むように改変したＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ  ２８にクローニングした。配列番号９６００のヌクレオチド配列７８０〜８０１（センス）および１５５９〜１５７３（アンチセンス）を含むＰＣＲプライマーを用いて、標準的な技術を用いて、配列番号９６１１のアミノ酸２〜２６１をコードするヌクレオチド配列を増幅した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出）。このアンチセンスプライマーはまた、クローニングを容易にするために、ＸｈｏＩ制限酵素部位を含んだ。得られたＰＣＲ産物をＸｈｏＩで消化し、Ｅｃｏ７２ＩおよびＸｈｏＩで消化しておいた改変ｐＥＴ２８に連結した。組換えクローンを使用して、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細菌およびＨＭＳ  １７４  ｐＬｙｓ  Ｓ細菌を形質転換した。Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質を組換え細菌培養物から精製した。Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質を、Ｎｉカラムクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）によって、続いてアニオン交換クロマトグラフィー工程および抗ｈｉｓアフィニティークロマトグラフィー工程によって、細胞溶解物から精製した。
【０５００】
得られた精製組換え体Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質ならびにＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）が結合したＬＹ１４４８アミノ酸１〜３１に対応する３１マーのペプチド（配列番号９６１３）（ＭＧＫＫＴＱＲＳＬＳＡＥＬＥＩＰＡＶＫＥＳＤＡＧＫＹＹＣＲＡＤ−ＧＣＧ−ＫＬＨ）（ペプチド１）およびＫＬＨが結合したＬＹ１４４８アミノ酸６３〜９３に対応する３１マーのペプチド（配列番号９６１５）（ＱＡＡＶＧＤＬＬＥＬＨＣＥＡＬＲＧＳＰＰＩＬＹＱＦＹＨＥＤＶＴ−ＧＣＧ−ＫＬＨ）（ペプチド３）を、以下のスキームを用いてウサギに注射した：０日目：０．１５ｍｇ／ウサギ、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）中、皮下、２１日目：０．１５ｍｇ／ウサギ、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）中、皮下、３５日目：０．１５ｍｇ／ウサギ、ＩＦＡ中、皮下、４２日目：産物を採血（約２０ｍＬ）。
【０５０１】
抗原特異的のＥＬＩＳＡ分析のために、ウサギ血清を、Ｌｙ１４４８Ｐコーティング（０．１ｍｇ／ウェル）した９６ウェルマイクロタイタープレートに対して力価滴定した。サンプルを、まず１：１００に、次いで連続的に３倍に希釈し、そして二連でプレートに添加した。プレートへのウサギＩｇＧの抗原特異的結合を、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ結合体によって曝露させ、このプレートをＴＭＢ基質で発色させ、マイクロプレートリーダー上でＯＤ４５０ｎｍで読み取った。
【０５０２】
ＦＡＣＳ分析のために、ＨＥＫ２９３およびＬｙ１４４８Ｐ／ＨＥＫ２９３細胞（下記）を採集し、氷冷染色緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋アジ化ナトリウム）で洗浄した。次に、細胞を、５０μｌ染色緩衝液中で再懸濁させ、そして氷上で３０分間、７５μｌのウサギ抗Ｌｙ１４４８Ｐ組換え体またはペプチド血清（１：５００希釈）と共に、インキュベートした。予め採血した血清を、ネガティブコントロールと同じ濃度で使用した。この細胞を染色緩衝液で３回洗浄し、次いで、ヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の１：１００希釈と共に、氷上で３０分間、インキュベートした。３回洗浄後、この細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む染色緩衝液（透過性の細胞の同定を可能にする生体染色）中に再懸濁し、そしてこれをＦＡＣＳによって分析した。
【０５０３】
ＦＡＣＳ分析の結果は、全長組換えタンパク質（抗Ｌｙ１４４８Ｐ抗血清）および、両方の合成ペプチド（抗ペプチド抗血清）に対して惹起されたポリクローナル抗血清が、ＨＥＫ２９３トランスフェクタント中に発現される全長ネイティブＬｙ１４４８Ｐを認識し、そしてそれに結合可能であったことを示す。各ウサギから得られた免疫前（出血前）抗血清は、Ｌｙ１４４８Ｐ／ＨＥＫ２９３発現細胞に結合しなかった。同様に、抗Ｌｙ１４４８Ｐおよび抗ペプチド抗血清は、コントロールのＨＥＫ２９３細胞に結合しなかった。
【０５０４】
ＥＬＩＳＡアッセイの結果は、惹起された抗Ｌｙ１４４８Ｐ抗血清が、固定化された組換えＬｙ１４４８Ｐおよびペプチド１（配列番号９６１３）に強く結合し得、そして、ペプチド３（配列番号９６１５）に弱く結合し得たことを示す。合成ペプチド１（配列番号９６１３）に対して惹起されたポリクローナル抗血清（抗ペプチド１）は、ペプチド１（配列番号９６１３）および組換えＬｙ１４４８タンパク質に強く結合し、ペプチド３（配列番号９６１５）に全く結合しなかった。合成ペプチド３（配列番号９６１５）に対して惹起されたポリクローナル抗血清（抗ペプチド３）は、ペプチド３（配列番号９６１５）および組換えＬｙ１４４８Ｐタンパク質に強く結合した。抗ペプチド３は、ペプチド１に弱く結合した。これらの結果は、抗Ｌｙ１４４８Ｐ抗血清および抗ペプチド抗血清が、ＬＹ１４４８上に存在するエピトープを認識し、そして治療目的および診断目的の両方について有用である。
【０５０５】
組換えＬｙ１４４８Ｐに特異的なマウスモノクローナル抗体がまた、生成された。モノクローナル抗体を、バクテリア性発現組換えタンパク質Ｌｙ１４４８Ｐを用いたマウスの免疫化によって惹起した。従来の抗体分泌マウスハイブリドーマを、免疫脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞との融合によって作製した。Ｌｙ１４４８Ｐ特異的ｍＡｂを、組換えＬｙ１４４８Ｐタンパク質およびＬｙ１４４８Ｐ−ＦＬＡＧ／ｐＣＥＰ４／ＨＥＫ２９３トランスフェクタントを用いたＥＬＩＳＡによって、ハイブリドーマの上清中に同定した。ハイブリドーマを、クローン化し、そして抗体分泌を、安定化した。抗体の特異性を、組換えタンパク質を用いたウエスタンブロットおよびＬｙ１４４８Ｐ／ＨＥＫトランスフェクタントを用いた免疫組織化学によって確認した。エピトープの特異性を、Ｌｙ１４４８Ｐの配列から推定される合成ペプチドを用いたＥＬＩＳＡによって決定した。これらのモノクローナル抗体を、治療的に使用されるか、または血液悪性疾患における診断試薬として使用する。
【０５０６】
雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、９日〜６０日の間隔で、アジュバンド中の１０〜２５μｇの細菌産生組み換えＬｙ１４４８Ｐタンパク質で腹腔内的に免疫した。アジュバンド中の５回免疫の後、３μｇの組換えタンパク質を、アジュバンドの非存在下で腹腔内的に投与した。免疫後２日の脾臓細胞を、回収し、そして、ハイブリドーマを、従来のＰＥＧ媒介性融合を使用して作製し、そして細胞を、数百μｌのウェルに分配し、ＨＡＴ選択下で培養した。約２週間、大多数のウエルが増殖を示し、上清を回収し、そして、組換えＬｙ１４４８Ｐタンパク質に対して反応性の抗体の存在についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。ＥＬＩＳＡ法を、以下のように実施した：
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウエルプレート（Ｓｉｇｍａ）を、１０μｇ／ｍｌの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の（１００μｌ／ウエルを使用して）ペプチドを用いて４℃で、一晩コーティングした。Ｌｙ１４４８Ｐ組換えタンパク質および関連のないペプチドを、それぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして１μ／ｍｌでコーティングした。プレートを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ）を用いて洗浄し、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ（２５０μｌ／ウエル）を用いて、１時間室温でブロックした。プレートを、ブロック後、洗浄し、ｍＡｂおよびコントロールマウスＩｇＧを、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ中で１μｇ／ｍｌまで希釈し、各々別個のペプチド／タンパク質コーティングウエルに、１００μｌ／ウエルで添加した。インキュベーション時間は、室温で１時間である。プレートを、インキュベーション期間の終わりに、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて、洗浄した。結合抗体を、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で１：５０００希釈）（１５０μｌ／ウエル）を加えることによって検出し、室温で１時間インキュベートした。ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ）を、作製し、洗浄されたプレートに加え（１５０μｌ／ウエル）、室温で２０分間インキュベートした。反応を、２Ｎ  ＨＣｌを添加（５０μｌ／ウエル）することによって停止した。４９０ｎｍでの吸光度を、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ製）によって測定した。
【０５０７】
この方法によって陽性として同定されたウエルからの細胞を、限定希釈によって２回、サブクローンした。各々のサブクローンについて、ｍＡｂ分泌クローンを、組換えＬｙ１４４８Ｐタンパク質ＥＬＩＳＡアッセイを用いて同定した。４つのクローン化されたｍＡＢを、単離し、以下のアイソタイプ決定した：７Ａ９、ＩｇＧ１；１１Ｅ１，ＩｇＧ１；１８Ｂ９，ＩｇＧ２ａ；１８Ｈ１０，ＩｇＧ１。これらのｍＡｂによって認識される特異的エピトープを、Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質の異なるセグメントをコードする合成ペプチドを用いて決定した。このＥＬＩＳＡを、異なるペプチドを、マイクロタイターウエルをコーティングするために使用したことを除いて上記の通りに実施し、各々のｍＡｂを、エピトープの位置を決定するために、別個に、各々のペプチドに対して試験した。３つのｍＡｂ（７Ａ９，１１Ｅ１および１８Ｂ９）は、配列番号１１，０５０のアミノ酸３４３−３６７によって表されるＬｙ１４４８ＰのＣ末端２５アミノ酸セグメントにわたるペプチドに結合した。１８Ｈ１０ｍＡｂは、Ｌｙ１４４８Ｐの２５アミノ酸セグメントに結合し、Ｃ末端ペプチドの開始から３１アミノ酸のＮ末端で開始し、それは、配列番号１１，０５０のアミノ酸３１３−３３６によって表される。従って、全てのｍＡｂを、Ｌｙ１４４８のＣ末端５５アミノ酸セグメント内にマッピングした。
【０５０８】
（５．１１  実施例１１−−ＬＹ１４４８タンパク質は、細胞表面タンパク質である）
この実施例は、配列番号９６００によってコードされるＬｙ１４４８Ｐタンパク質が、細胞表面タンパク質であることを示す。
【０５０９】
Ｌｙ１４４８Ｐをコードするヌクレオチド配列を、以下のように哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローンした。Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質の部分をコードする配列番号９６００の部分を、配列番号９６００のヌクレオチド７７７−８００およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含む５’末端のさらなるヌクレオチドを含むセンス増幅因子（ａｍｐｌｉｍｅｒ）ならびに、配列番号９６００のヌクレオチド１５４４−１５７０およびＮｏｔＩ制限酵素部位を含む３’末端のさらなるヌクレオチドを含むアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。正確な配列を有するｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔクローン由来のＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、Ｌｙ１４４８Ｐ  ｃＤＮＡ挿入物を遊離し、そして、ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグ（Ｓｉｇｍａ；アミノ酸配列  ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号１１，２９０）を含むようにあらかじめ改変された哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。得られた組換えベクターＬｙ１４４８Ｐ−ＦＬＡＧ／ｐＣＥＰは、Ｌｙ１４４８Ｐ−ＦＬＡＧ融合タンパク質をコードした。
【０５１０】
組換え発現ベクターＬｙ１４４８Ｐ−ＦＬＡＧ／ｐＣＥＰが、タンパク質を発現するかどうかを決定するために、組換えベクターを、製造業者の指示書（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に従ってリポフェクタミン２０００を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に一時的にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞をまた、別個に、組換えＦＬＡＧ構築物および非組換えｐＣＥＰ４ベクターを含むコントロールベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、４８時間培養し、次いで、全細胞溶解物を、調製した。溶解物を、ポリアクリルアミドゲル上でランし、ゲルを、標準的技術（Ａｕｓｕｂｅｌら）を用いて、ニトロセルロース膜に電気的ブロットした。電気的ブロットを、マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いて調査し、マウスｍＡｂの結合を、ビオチン化ウサギ抗マウスＩｇＧを用いて検出し、アビジンＨＲＰおよびＥＣＬ薬剤を用いて現像した。抗ＦＬＡＧ抗体は、予想分子量のＬｙ１４４８Ｐ−ＦＬＡＧ融合タンパク質を認識した。
【０５１１】
組換えＬｙ１４４８Ｐタンパク質が、細胞表面上に存在するかどうかを決定するために、Ｌｙ１４４８Ｐ−ＦＬＡＧ／ｐＣＥＰ４で一過性トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、ビオチン−７−ＮＨＳを用いてビオチン化し、細胞を洗浄し、全細胞溶解物をＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００溶解緩衝液中で生成した。溶解物を、抗ＦＬＡＧセファロースを用いて、免疫沈降し、得られた免疫沈降物質を、ポリアクリルアミドゲル上でランした。ゲルを、ニトロセルロース膜上に電気的ブロットし、ブロットをアビジンＨＲＰおよびＥＣＬ試薬を用いて現像した。データは、Ｌｙ１４４８Ｐ−ＦＬＡＧ融合タンパク質についての予想分子量の抗ＦＬＡＧセファロースを用いて沈降可能なタンパク質を、Ｌｙ１４４８Ｐが、細胞表面上に見出されることを示す全細胞アッセイにおいて、ビオチン化した。
【０５１２】
（５．１２  実施例１２−−ＬＹ１４４８Ｐは、Ｂ細胞白血病の細胞表面上に発現された）
この実施例は、Ｌｙ１４４８Ｐタンパク質を、実施例１０に記載のポリクローナル抗体を用いて、急性リンパ芽球性白血病細胞株ＳＵＰ−Ｂ１５（ＡＴＣＣ  カタログ番号ＣＲＬ−１９２９）の表面上で検出したことを示す。
【０５１３】
ＳＵＰ−Ｂ１５細胞を、供給業者の推奨に従って培養した。ＦＡＣＳ分析について、ＳＵＰ−Ｂ１５およびヒト線維芽細胞を、採取し、氷冷した染色緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋アジ化ナトリウム）を用いて洗浄した。次に、細胞を、５０μｌの染色緩衝液中に再懸濁し、７５μｌの、１：５００に希釈したウサギ抗Ｌｙ１４４８Ｐ組換え血漿（実施例１０を参照のこと）と共に、氷上で３０分間インキュベートした。出血前血漿を、ネガティブコントロールとして同一の濃度で使用した。細胞を、染色緩衝液で３回洗浄し、次いで１：１００希釈のヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に、３０分間氷上でインキュベートした。３回洗浄後、細胞を、プロピジウムヨージド（ＰＩ）を含む染色緩衝液中に再懸濁し、生体染色を、浸透性細胞の同定について行わせ、そしてＦＡＣＳによって分析した。
【０５１４】
ＦＡＣＳ分析の結果は、抗Ｌｙ１４４８Ｐポリクローナル抗血清が、ＳＵＰ−Ｂ１５細胞の表面上に通常発現されるネイティブＬｙ１４４８Ｐを認識し得、そしてそれに結合し得たことを示す。抗Ｌｙ１４４８Ｐ抗血清を産生するために使用される各ウサギから得られた、免疫前（出血前）抗血清は、ＳＵＰ−Ｂ１５細胞に結合しなかった。同様に、抗Ｌｙ１４４８Ｐ抗血清は、コントロールヒト線維芽細胞に結合しなかった。これらの結果は、腫瘍細胞（例えば、ＳＵＰ−Ｂ１５）上に通常発現されるＬｙ１４４８Ｐに結合するＬｙ１４４８Ｐ組換えタンパク質に対して惹起されたポリクローナル抗血清およびこれらの抗体を、Ｂ細胞悪性疾患（例えば、リンパ腫、骨髄腫およびＢ細胞白血病（例えば、ＣＬＬおよびＡＬＬ）の診断および処置のために使用した。
【０５１５】
（５．１３  実施例１３−−ＬＹ１４４８Ｐスプライス改変体に関連する新規のスプライス接合部）
この実施例は、実施例９において同定されたＬｙ１４４８Ｐの複数のスプライス改変体の間を区別するために有用な１１の新規のヌクレオチド配列および１１の新規のポリペプチド配列の同定を示す。エピトープを含む新規のポリペプチド接合部は、特有である。各エピトープに対して特異的な抗体は、スプライス形態が、目的の腫瘍サンプルまたは組織サンプル中に発現されることを決定するために有用である。開示されるヌクレオチド配列は、スプライス改変体が、目的の腫瘍サンプルまたは組織サンプル中に発現されることを決定するためのプローブとして有用である。
【０５１６】
新規の接合部＃１は、スプライス形態Ｌｙ１４４８Ｐ  ｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｉ、ｋ、ｍおよびｏにおいて同定され、図９において概略的に示される。新規の接合部＃１を、エキソン９中のスプライスドナーおよびエキソン（ａｇ）１１中のスプライスアクセプターから生成する。エキソン１０を、このＬｙ１４４８Ｐのスプライス改変体において除去する。Ｌｙ１４４８Ｐの新規の接合部＃１  ４０マーは、新規のタンパク質接合部のいずれか１面に２０アミノ酸を含むポリペプチド（配列番号１１，１８６）であり、そして、このポリペプチド接合部および、それをコードするスプライス形態に対して特異的である抗体によって認識される新規の線形エピトープを含む。Ｌｙ１４４８Ｐの新規の接合部＃１  ３０マーは、同じ新規のタンパク質接合部のいずれかの側に１５アミノ酸を含むより短いポリペプチド（配列番号１１，１８７）であり、そして、この接合部および、それをコードするスプライス形態に対して特異的である抗体によって認識される、より規定された新規の線形エピトープを含む。これらの２つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号：１１，１７８および配列番号１１，１７９中に同定した。
【０５１７】
新規の接合部＃２は、スプライス形態Ｌｙ１４４８Ｐ  ｃ、ｄ、ｇ、ｈ、ｋ、ｌ、ｏおよびｐ中に同定され、図９において概略的に示される。新規の接合部＃２を、エキソン１１の末端中のスプライスドナーおよびエキソン１３中のスプライスアクセプターから生成する。エキソン１２を、このＬｙ１４４８Ｐのスプライス改変体において除去する。Ｌｙ１４４８Ｐの新規の接合部＃２  ４０マーは、新規のタンパク質接合部のいずれかの側に２０アミノ酸を含むポリペプチド（配列番号１１，１８８）であり、そして、このポリペプチド接合部および、それをコードするスプライス形態に対して特異的である抗体によって認識される新規の線形エピトープを含む。Ｌｙ１４４８Ｐの新規の接合部＃２  ３０マーは、同じ新規のタンパク質接合部のいずれかの側に１５アミノ酸を含むより短いポリペプチド（配列番号１１，１８９）であり、そして、この接合部および、それをコードするスプライス形態に対して特異的である抗体によって認識される、より規定された新規の線形エピトープを含む。これらの２つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号：１１，１８０および配列番号１１，１８１中に同定した。
【０５１８】
新規の接合部＃３は、スプライス形態Ｌｙ１４４８Ｐ  ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐおよびｓ中に同定され、図９において概略的に示される。新規接合部＃３は、エキソン１３中に存在するスプライスドナーを利用できないことによって、膜貫通ドメインに近接するスプライスドナーの読み過しを生じるおよび残りのエキソン１３によってコードされる新規のペプチドの合成ことによって生成される。Ｌｙ１４４８ｐの新規の接合部＃３  ３８マーは、エキソン１３スプライスドナーのアミノ側に２０アミノ酸、およびエキソン１３スプライスドナーのカルボキシ側に１８アミノ酸を含むポリペプチド（配列番号１１，１９０）である。このポリペプチドは、このポリペプチド接合部および、それをコードするスプライス形態に対して特異的である抗体によって認識される新規の線形エピトープを含む。Ｌｙ１４４８Ｐ新規接合部＃３  ３０マーは、同一のエキソン１３スプライスドナーのいずれかの側に１５アミノ酸を含むより短いポリペプチド（配列番号１１，１９１）でり、この接合部および、それをコードするスプライス形態に特異的な抗体によって認識される、より規定された新規の線形エピトープを含む。これらの２つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１１，１８２および配列番号１１，１８３として同定される。
【０５１９】
新規の接合体＃４は、スプライス形態Ｌｙ１４４８Ｐ  ｑ１において同定され、図９において概略的に示される。新規の接合部＃４は、エキソン１０（ｇｔ）中の新規のスプライスドナーおよびエキソン（ａｇ）中のスプライスアクセプターから生成される。エキソン１０の部分は、除去され、エキソン（ａｇ）１１によってコードされる４つの新規なアミノ酸は、このスプライス改変体に組み込まれる。新規なアミノ酸は、このスプライス改変体中に含まれる部分エキソン（ａｇ）１１に対する、異なるリーディングフレームの使用から生じる。Ｌｙ１４４８Ｐの新規の結合部＃４  ２４マーは、新規のタンパク質接合部のアミノ酸側に２０個のアミノ酸およびこの新規のタンパク質接合部のカルボキシ側に４つのアミノ酸を含むポリペプチドである（配列番号１１，１９２）。このポリペプチドは、このポリペプチド接合部およびそれをコードするスプライス形態に対して特異的な抗体によって認識される新規の線形エピトープを含む。Ｌｙ１４４８Ｐの新規の接合部＃４  １９マーは、新規のタンパク質接合部のアミノ側に１５個のアミノ酸および新規のタンパク質接合部のカルボキシ側に４個のアミノ酸を含む、より短いポリペプチド（配列番号１１，１９３）である。このポリペプチドは、このポリペプチド接合部およびそれをコードするスプライス形態に特異的な抗体によって認識される新規の線形エピトープを含む。これらの２つのポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１１，１８４および１１，１８５に開示される。
【０５２０】
新規の接合体＃５は、スプライス形態Ｌｙ１４４８Ｐ  ｒおよびｓにおいて同定され、図９において概略的に示される。新規の接合部＃５は、エキソン１２全てを含む転写物によって生成される。エキソン１２全体の翻訳は、他のＬｙ１４４８Ｐ改変体に含まれない４２個のアミノ酸を含むペプチドを生成する。Ｌｙ１４４８Ｐスプライス改変体ｒおよびｓに対して特有であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ならびにコードされるペプチドは、それぞれ配列番号１１，２０６および１１，２０９に開示される。Ｌｙ１４４８Ｐ  ＃５＋２０マーは、特有のＬｙ１４４８Ｐ改変体ｒおよびｓのポリペプチド、ならびにエキソン１３によってコードされる新規なペプチドに近接する２０個のアミノ酸を含むポリペプチド（配列番号１１，２１１）である。このポリペプチドは、このポリペプチドに特異的な抗体によって認識される新規の線形エピトープ、ならびにＬｙ１４４８Ｐスプライス形態ｒおよびｓによってコードされる特有の接合部を含む。Ｌｙ１４４８Ｐ  ＃５＋１５マーは、特有のＬｙ１４４８Ｐ改変体ｒおよびｓポリペプチド、ならびにエキソン１３によってコードされる新規なペプチドに近接する１５個のアミノ酸を含むより短いポリペプチド（配列番号１１，２１０）である。このポリペプチドは、Ｌｙ１４４８Ｐ改変体ｒおよびｓに特異的な抗体によって認識される、より規定される新規な線形エピトープ、ならびにエキソン１３によってコードされるこの接合部を含む。これら２つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１１，２０８および配列番号１１，２０７として含まれる。Ｌｙ１４４８Ｐ  ＃５＋１５マーおよびＬｙ１４４８Ｐ  ＃５＋２０マーとして記載される、独特のＬｙ１４４８Ｐ改変体ｒおよびｓポリペプチドに対して惹起される抗体は、Ｌｙ１４４８Ｐ改変体ｒおよびｓに特異的である。ＳＰＡＰ１ｃは、Ｌｙ１４４８Ｐ改変体ｒおよびｓの改変体である。ＳＰＡＰ１ｃは、Ｌｙ１４４８Ｐ改変体ｒおよびｓ（また、ＳＰＡＰ１ａおよび１ｂとして公知）として、同一のアミノ末端の１３５個のアミノ酸を含むが、特有の９個のアミノ酸カルボキシ末端（配列番号１１，２９３）を含む。この９個のアミノ酸領域に対して惹起される抗体は、ＳＰＡＰ１ｃ改変体ｒおよびｓとＬｙ１４４８Ｐ改変体ｒおよびｓとの間で区別され得る。それらの抗体の全ては、一般的におよびＣＬＬ特異的に、血液悪性疾患の診断、モニタリングおよび治療的処置において使用される。
【０５２１】
上述のこれらのエピトープを認識する抗体は、それらのエピトープをコードし、そして、それらを含まないスプライス改変体から分化するＬｙ１４４８Ｐのスプライス改変体を特異的に認識する。さらに、異なるポリペプチド接合部および新規のポリペプチド接合部の含有物は、異なるスプライシングの結果として、それらを含む異なる二次構造の分子、三次構造の分子を生じる。異なるスプライシングの結果として生じるＬｙ１４４８Ｐ分子に指向される抗体は、それらの特有の二次構造および三次構造、ならびに異なる二次構造および三次構造に基づく、それらの新規のスプライス形態を認識する。異なるスプライシングから生じる二次構造および三次構造における差異に基づく異なるＬｙ１４４８Ｐ分子を認識する抗体は、Ｌｙ１４４８Ｐの特定の異なるスプライス改変体を同定し、そしてそれらの間を区別する。特異的なスプライス形態に指向される抗体（裸のおよび結合体化した）は、異なる血液悪性疾患（異なるクラスのＢ細胞非ホジキンリンパ腫およびＣＬＬを含むが、それらに限定される必要はない）の間で、差次的に発現され得るこれらのスプライス形態を、同定および標的化するために使用され得る。このため、１つ以上のＬｙ１４４８Ｐスプライス形態に指向される抗体は、１つの臨床的徴候  対  別の臨床的徴候において、より良い診断的抗体または治療的抗体を提供する。
【０５２２】
記載されるＬｙ１４４８Ｐ改変体ｒポリペプチドおよびＬｙ１４４８Ｐ改変体ｓポリペプチドは、一般的におよびＣＬＬ特異的に血液悪性疾患の処置にためのＴ細胞治療的ワクチンとして利用され得るＴ細胞エピトープを含む。ポリペプチド配列（９マー）は、異なるＨＬＡクラスＩサブタイプによって結合されることが、ＥｐｉＳｅｅｋ  ＨＬＡクラスＩ結合予測プログラム（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−１７５（１９９４）が、配列番号１１，２１２−１１，２８７に開示される）によって予測されるポリペプチド配列Ｌｙ１４４８Ｐ  ＃５＋２０マー内に含まれる。
【０５２３】
（５．１４  実施例１４――Ｂ細胞新形成におけるＩＲＴＡ  １、２Ａ、２Ｂ、５およびＬｙ１４４８Ｐスプライシング改変体の同定）
本実施例は、細胞表面タンパク質ＩＲＴＡ１、２ａ、２ｂ、５およびＬｙ１４４８Ｐスプライシング改変体が、Ｂ細胞新形成において発現することを例示する。これらの分子に対する診断抗体および治療抗体ならびに診断化合物および治療化合物が、これらのタンパク質を発現する新形成を処置するのに有用である。
リアルタイムＰＣＲ分析を、ＣＬＬ患者サンプル、リンパ腫患者サンプル、正常に血液の細胞および正常の組織由来のｃＤＮＡパネルについて実施した。ＩＲＴＡまたはＬｙ１４４８Ｐファミリーメンバーの各々に特異的なプライマーを、設計した。順方向のＩＲＴＡ１プライマーおよび逆方向のＩＲＴＡ１プライマーを、配列番号１１，１９４および配列番号１１，１９５にそれぞれ開示する。順方向のＩＲＴＡ２ａプライマーおよび逆方向のＩＲＴＡ２ａプライマーを、配列番号１１，１９６および配列番号１１，１９７にそれぞれ開示する。順方向のＩＲＴＡ２ｂプライマーおよび逆方向のＩＲＴＡ２ｂプライマーを、配列番号：１１，１９８および配列番号１１，１９９にそれぞれ開示する。Ｌｙ１４４８Ｐスプライシング改変体ａ−ｐおよびｑ２に含まれるエキソン１１の一部を増幅する順方向のプライマーおよび逆方向のプライマーを、配列番号１１，２００および配列番号１１，２０１にそれぞれ開示する。Ｌｙ１４４８Ｐスプライシング改変体ｒおよびｓに含まれるエキソン１２の一部を増幅する順方向のプライマーおよび逆方向のプライマーを、配列番号１１，２０２および配列番号１１，２０３にそれぞれ開示する。順方向のＩＲＴＡ５プライマーおよび逆方向のＩＲＴＡ５プライマーを、配列番号１１，２０４および配列番号１１，２０５にそれぞれ開示する。順方向のＣＤ２０プライマーおよび逆方向のＣＤ２０プライマーが、配列番号１１，２８８および配列番号１１，２８９それぞれに開示する。
【０５２４】
リアルタイムＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７７００  Ｐｒｉｓｍ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いてＧｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５−１００１（１９９６）およびＨｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４（１９９６）によって記載されるように実施した。一致するプライマーおよび蛍光プローブを、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって提供されるプライマー発現プログラムを用いることによって、目的の遺伝子について設計する。プライマーおよびプローブの最適濃度を、慣用実験によって決定し、そしてコントロール（例えば、β−アクチン）プライマーおよびプローブは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。リアルタイムＰＣＲで決定されるＣｔ値を用いる標準曲線を、作成する。ここで、この値は、アッセイ中で用いられる初期ｃＤＮＡ濃度に関する。１０〜１０６コピー数の範囲の目的の遺伝子の標準希釈物は、一般に十分である。さらに、標準曲線を、コントロール配列について作成する。このことは、比較の目的のためのコントロール量に対する組織サンプルの最初のＲＮＡ含有量の標準化を可能にする。
【０５２５】
リアルタイムの結果は、ΔＣＴ（各々のサンプルは、アクチンに対して正規化されたが、目的の遺伝子の標準曲線は、ＲＮＡ１ｐｇあたりのアクチンメッセージのコピー数を決定するためには実行されない）として表された。従って、値は、特定の実験／実行中で互いに相対的であるに過ぎない。絶対値を、最大増幅の半分にかかる平均サイクルを比較することによって実験間で概算した。全ての実験／実行について、アクチンは、増幅されるのに２０〜２３のサイクルを必要とした。比較として、高度に発現されるＢ細胞マーカーであるＣＤ２０遺伝子は、ＣＤ１９＋分別細胞（Ｂ細胞）から増幅されるのに２１サイクルを必要とし、Ｌｙ１４４８Ｐスプライシング改変体を含むエキソン１２は、同じ細胞集団から増幅されるのに２６サイクルを必要とし、そしてＬｙ１４４８Ｐスプライシング改変体を含むエキソン１１は、３３サイクルを必要とした。
この結果は、全長エキソン１２を含むＬｙ１４４８スプライシング改変体ｒ／ｓが、ＣＬＬサンプルの５９％（１０／１７）において過剰発現され、ＣＤ１９＋細胞中で見られるのと匹敵するまたはより大きなレベルでＢ細胞非ホジキンリンパ腫／ホジキンサンプルにおいて検出可能な発現を有さなかった（０／５）ことを示す。エキソン１１の一部を含むＬｙ１４４８Ｐスプライシング改変体ａ−ｐおよびｑ２は、ＣＬＬサンプルの６％（１／１７）においてのみ発現されたが、ＣＤ１９＋細胞中に見られるのと匹敵するまたはより大きなレべルでＢ細胞非ホジキンリンパ腫／ホジキンサンプルの１００％（５／５）において見られた。従って、Ｌｙ１４４８Ｐスプライシング改変体を含むエキソン１１の過剰発現は、ＣＤ１９＋細胞およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫／ホジキンリンパ腫サンプルに特異的であり、ここでＬｙ１４４８Ｐスプライシング改変体を含む全長エキソン１２の過剰発現は、ＣＤ１９＋細胞およびＣＬＬサンプルの大部分に特異的である。両方の型のスプライシング改変体は、分析される単一の濾胞性のリンパ腫サンプルにおいて発現される。しかし、Ｌｙ１４４８Ｐスプライシング改変体を含むエキソン１２の発現は、Ｌｙ１４４８Ｐスプライシング改変体を含むエキソン１１の発現より相当に高く、２９〜３１サイクルと比較して、増幅されるのにわずか２３〜２５サイクルを必要とする。
【０５２６】
同様に、ＩＲＴＡ２ａ／ｂおよびＩＲＴＡ５はまた、Ｌｙ１４４８Ｐスプライシング改変体を含むエキソン１２に見られるのと匹敵するレベルでＣＬＬサンプル中での過剰発現を示す。対照的に、ＩＲＴＡ１は、Ｌｙ１４４８Ｐスプライシング改変体を含むエキソン１１について観察されるのと類似に、より低いレベルでリンパ腫中で過剰発現される。これらのＲＮＡ発現データは、Ｌｙ１４４８Ｐスプライシング改変体であるＩＲＴＡ２ａ／ｂおよびＩＲＴＡ５を含むエキソン１２が、ＣＤ２０について見られるよりも低いレベルで、しかし有意なタンパク質産生を生じるレベルで、ＣＬＬ中に特異的に過剰発現されることを示す。Ｌｙ１４４８Ｐスプライシング改変体であるＩＲＴＡ２ａ／ｂおよびＩＲＴＡ５を含むエキソン１２は、ＣＬＬ特異的な診断標的および治療標的を構成する。Ｌｙ１４４８Ｐスプライシング改変体およびＩＲＴＡ１を含むエキソン１１は、ＣＬＬにおいて有意には発現されないが、リンパ腫において過剰発現される。Ｌｙ１４４８Ｐスプライシング改変体およびＩＲＴＡ１を含むエキソン１１は、リンパ腫特異的な診断標的および治療標的を構成する。
【０５２７】
（５．１５  実施例１５――ＳＰＡＰ１ａの発現）
本実施例は、発現ベクターｐＣＥＰ４  ｆｌａｇへのＳＰＡＰ１ａ（Ｌｙ１４４８Ｐ改変体ｒ）のクローニングを例示する。この開示はまた、ＳＰＡＰ１ａの独特なアミノ末端４２アミノ酸ドメインを含むペプチドを用いたマウス免疫が、ＳＰＡＰ１と結合するが、関連性のないペプチドとは結合しない、血清抗体の産生を生じることを実証する。これらのポリクローナル血清は、空のｐＣＥＰ４構築物と比較して、ＳＰＡＰ１ａ−ｐＣＥＰ４  ｆｌａｇ構築物でトランスフェクトされたＨＥＫと優先的に結合し、従って、ＳＡＰ−１ａ分子の表面発現を実証する。最後に、本実施例は、血清および抗ｆｌａｇ抗体の両方が、ｐＣＥＰ４（空のベクター）でトランスフェクトされたＨＥＫ細胞の溶解物中に存在しない、ＳＰＡＰ１ａ−ｐＣＥＰ４  ｆｌａｇでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞の溶解物中に過剰発現された３２ｋｄバンドを、ウェスタンブロット中で同定することを例示する。
【０５２８】
ＨＥＫ細胞中でＳＰＡＰ１ａを発現することは、この抗原が哺乳動物細胞において表面に、そして全細胞中で発現され得ることを明らかにした。ＳＰＡＰ１ａペプチドで免疫したマウスのＥＬＩＳＡによるポジティブの血清力価は、この抗原の免疫原性を実証した。
【０５２９】
ＳＰＡＰ１ａを発現する細胞は、治療モノクローナル抗体生成のための免疫原として、またはＳＰＡＰ１ａ特異的ＣＴＬの生成における使用のために用いられ得る。
全長ＳＰＡＰ１ａ  ｃＤＮＡテンプレートを、ｒｔ  ＰＣＲによって生成した。ＳＰＡＰ１ａを、ＯＲＦの５’側のＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位をコードするプライマー（ｇｔａａｇｃｔｔａｃｃａｔｇｔｇｇｇａａｔｇｇａａａａｔａｔｇｃａａｃ）（配列番号：１１，２９４）およびＯＲＦの３’側のＮｏｔ  Ｉ部位をコードするプライマー（ｇｇｔａｇｃｇｇｃｃｇｃｔｇａｔｔｔｃｔｔｃａｃａｇａａｇａｇｔａｇａｔｇａｃ）（配列番号：１１，２９５）を用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＮｏｔ  Ｉクローニング部位およびカナマイシン耐性遺伝子を含むＴＯＰＯブラントシャトルベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングをした。この材料を、カナマイシン含有アガロースプレートにプレーティングされた化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉを形質転換するのに用いた。終夜のインキュベーションの後、選択クローンを、２×  ＹＴ培地およびカナマイシン中で振盪しながら３７℃で増殖させた。プラスミドＤＮＡを単離した。５”Ｈｉｎｄ  ＩＩＩクローニング部位、上記のようなＮｏｔ  Ｉクローニング部位の３’側のｆｌａｇタグエピトープ、およびアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＮＡおよびｐＣＥＰ４ベクターの両方を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化した。ゲル精製に続いて、ＳＰＡＰ１ａ挿入物およびｐＣＥＰ４ｆｌａｇベクターを、連結した。化学的にコンピテントな細菌を、この産物で形質転換し、カルベニシリン含有アガロースプレート培地にプレーティングした。終夜のインキュベーションに続いて、選択クローンを、２×  ＹＴ培地およびカルベニシリン中で振盪しながら３７℃で増殖させた。ＤＮＡプラスミドを、配列決定し、クローンを確認のために選択した。
【０５３０】
ＥＬＩＳＡを実施して、ＳＰＡＰ１ａの独特なアミノ末端にまたがるペプチドで２回免疫された４匹のマウスの血清中で含まれる抗ＳＰＡＰ１ａ抗体の力価を決定した。ペプチド１は、配列番号１１，０５７のアミノ酸１〜２５を含み、ペプチド２は、配列番号１１，０５７のアミノ酸２０〜４２を含んだ。プレートを、ＳＰＡＰ１ａペプチドまたは関連性のないペプチドのペプチド（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングした。プレートを、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）でブロックした。６回のプレート洗浄に続いて、血清希釈液を、ブロック緩衝液においてプレーティングし、インキュベートした。プレートを洗浄し、続いて抗マウスＨＲＰ抗体（１：１０，０００）をプレーティングした。プレートをインキュベートし、次いでもう一度洗った。プレートをペルオキシダーゼ基質で発色させ、次いで１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４でクエンチし、Ａ４５０−Ａ５７０について読みとった。ＥＬＩＳＡの結果は、ＳＰＡＰ１ａペプチド１および２で免疫されたマウスからの血清が、１：１０２４００希釈において、ＳＰＡＰ１ａペプチド１および２に対して反応性を有するが、関連性のないペプチドに対しては反応性を有さないことを実証した。
【０５３１】
ＳＰＡＰ１ａ発現が、上記のＳＰＡＰ１ａ−ｐＣＥＰ４−ｆｌａｇ組み換えベクターを用いたＨＥＫ細胞の一過性トランスフェクション、続いてＳＰＡＰ１ａペプチドで免疫されたマウスの血清を用いたＦＡＣＳ染色、または同じ血清もしくは抗ｆｌａｇ抗体を用いたウェスタンブロットプロービングにより確認された。ＳＰＡＰ１ａ−ｐＣＥＰ４  ｆｌａｇは、この構築物を用いたＨＥＫのトランスフェクション、続いて表面の発現を同定するフローサイトメトリーおよび全ての発現を同定するウェスタンブロット分析により確認された。ＨＥＫのトランスフェクションを、以下の２つの構築物を用いて実施した：ＳＰＡＰ１ａ−ｐＣＥＰ４ｆｌａｇおよびｐＣＥＰ４これはＳＰＡＰ１ａもｆｌａｇエピトープも含まなかった。２．５μｇのＤＮＡおよび５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を、１２５μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ）を含む別々のチューブに入れ、室温で５分間インキュベートした。次いで内容物を合わせ、６ウェルプレート中の９０％コンフルエントなＨＥＫに加える前にさらに２０分間インキュベートした。３７℃で２日間培養した後、サンプルをフローサイトメトリー分析およびウェスタンブロッティングのために集め、調製した。フローサイトメトリーサンプル（１０００００細胞／ウェル）を洗浄し、ＰＢＳ＋０．５％  ＢＳＡ＋１０μｇ／ｍｌ  抗ヒト免疫グロブリン中で染色した。サンプルを、ＳＰＡＰ１ａペプチドで免疫されたマウス４番の血清または関係のない抗原で免疫されたマウスの血清（関連性のない血清）の希釈液で氷上で３０分間染色した。３回の洗浄の後、サンプルを、氷上で３０分間、フィコエリトリン結合体化ヤギ抗マウス二次免疫グロブリン（ヒト免疫グロブリンに吸着された）で染色した。サンプルを３回洗浄し、その後、浸透化細胞ＤＮＡの染色のためにＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｖｉａ−Ｐｒｏｂｅを加えた。フローサイトメトリーサンプルを、フィコエリトリン染色の分析のための大きな、染料不透性の（生存している）細胞のみを集めるためにゲートで制御した。ＦＡＣＳ分析は、ＳＰＡＰ１ａペプチドで免疫したマウス４番の血清が、ｐＣＥＰ４でトランスフェクト化細胞と比較して、ＳＰＡＰ１ａ−ｐＣＥＰ４ｆｌａｇでトランスフェクトされた細胞に優先的に結合し、一方、関連性のないマウス血清は結合しないことを実証する。ウェスタンブロットサンプルを、採取されたトランスフェクト細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、その後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびプロテアーゼインヒビターを含む培地中にペレットを溶解させることによって、調製した。溶解物を１４０００ｇにて遠心分離し、タンパク質を含む上清を採取した。等しい数の細胞の上清を含むサンプルが、２−メルカプトエタノールを受け入れ、そしてこれを１０分間煮沸した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングし、２００Ｖ×１時間で泳動し、そして３０分間２５Ｖにて膜に移した。このブロットを、４５分間、ＴＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０＋１０％乳でブロックした。これを半分に切り、１時間、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０＋１％乳中の第１の試薬でプローブした。一方の半分を、マウス抗ｆｌａｇ抗体（３．３３μｇ／ｍｌ）でプローブし、他方の半分を、ＳＰＡＰ１ａペプチド免疫マウス４番（１：１００希釈）の血清でプローブした。３回の洗浄後、ブロットを１時間、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０−１％乳中でロバ抗マウス免疫グロブリン（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰでプローブし、３回洗浄した。このブロットを、再びアセンブリし、そして化学発光試薬で発色させた。ＳＰＡＰ１ａは、３２ｋｄでの優勢なバンドとして表された。これは、抗ｆｌａｇまたは抗ＳＰＡＰ１ａマウス血清のいずれかによってプローブされたＳＰＡＰ１ａ−ｆｌａｇ／ＨＥＫのレーンにおいて明らかであるが、ｐＣＥＰ４／ＨＥＫレーン中では明らかでない。
（６．参考文献）
以下の引用は、これらが、本明細書中に示される手順または詳細に補足的な例示的な手順または他の詳細を提供する程度まで、本明細書中に参考として特に援用される。
米国特許第３，８１７，８２７号。
米国特許第３，８５０，７５２号。
米国特許第３，９０１，６５４号。
米国特許第３，９３５，０７４号。
米国特許第３，９８４，５３３号。
米国特許第３，９９６，３４５号。
米国特許第４，０３４，０７４号。
米国特許第４，０９８，８７６号。
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米国特許第４，４２９，００８号。
米国特許第４，４３６，７２７号。
米国特許第４，４５２，９０１号。
米国特許第４，４８９，７１０号。
米国特許第４，５０７，２３４号。
米国特許第４，５５４，１０１号。
米国特許第４，５６９，７８９号。
米国特許第４，６０３，１１２号。
米国特許第４，６２５，０１４号。
米国特許第４，６３８，０４５号。
米国特許第４，６７１，９５８号。
米国特許第４，６７３，５６２号。
米国特許第４，６８３，１９５号。
米国特許第４，６９９，７８４号。
米国特許第４，７３５，７９２号。
米国特許第４，７５１，１８０号。
米国特許第４，７６９，３３０号。
米国特許第４，７７７，１２７号。
米国特許第４，８６６，０３４号。
米国特許第４，８７３，０８８号。
米国特許第４，８７７，６１１号。
米国特許第４，８９７，２６８号。
米国特許第４，９１２，０９４号。
米国特許第４，９３５，２３３号。
米国特許第５，０１７，４８７号。
米国特許第５，０７５，１０９号。
米国特許第５，１４５，６８４号。
米国特許第５，１５１，２５４号。
米国特許第５，２１５，９２６号。
米国特許第５，２４０，８５６号。
米国特許第５，３５０，８４０号。
米国特許第５，３５９，６８１号。
米国特許第５，３９９，３４６号。
米国特許第５，３９９，３６３号。
米国特許第５，４６６，４６８号。
米国特許第５，４７２，８６９号。
米国特許第５，５４３，１５８号。
米国特許第５，５５２，１５７号。
米国特許第５，５６５，２１３号。
米国特許第５，５６７，４３４号。
米国特許第５，６３３，２３４号。
米国特許第５，６４１，５１５号。
米国特許第５，７３８，８６８号。
米国特許第５，７４１，５１６号。
米国特許第５，７９５，５８７号。
米国特許第５，８１１，１２８号。
米国特許第５，８１４，３４４号。
米国特許第５，８２０，８８３号。
米国特許第５，８５３，７６３号。
米国特許第５，８７４，２６５号。
米国特許第５，９２８，６４７号。
米国特許第５，９４２，２５２号。
米国特許第６，１１０，７０２号。
欧州特許番号ＥＰ０，３４５，２４２。
英国特許番号ＧＢ２，２００，６５１。
国際特許出願公開番号ＷＯ８９／０１９７３。
国際特許出願公開番号ＷＯ８９／０６２８０。
国際特許出願公開番号ＷＯ９１／０２８０５。
国際特許出願公開番号ＷＯ９１／１６１１６。
国際特許出願公開番号ＷＯ９２／０７２４３。
国際特許出願公開番号ＷＯ９４／００１５３。
国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２００７８。
国際特許出願公開番号ＷＯ／９４／２３７０１。
国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１７２１０。
国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５５５。
国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０６６３８。
国際特許出願公開番号ＷＯ９６／３０５１６。
国際特許出願公開番号ＷＯ９６／３３７３９。
国際特許出願公開番号ＷＯ９７／２４４４７。
国際特許出願公開番号ＷＯ９９／３３４８８。
【０５３２】
Ａａｒｏｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｔｏｄａｒｏ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７２：１４１−４８，１９６８．
Ａｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ，２：１８３，１９８３．
【０５３３】
【数１】
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【０５３４】
【数２】
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【０５３５】
【数３】
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【０５３６】
【数４】
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【０５３７】
【数５】
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【０５３８】
【数６】
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【０５３９】
【数７】
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【０５４０】
【数８】
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【０５４１】
【数９】
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【０５４２】
【数１０】
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【０５４３】
【数１１】
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【０５４４】
【数１２】
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【０５４５】
【数１３】
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【０５４６】
【数１４】
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【０５４７】
【数１５】
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本明細書中で開示され、請求される組成物および方法の全てが、本開示を考慮して過度の実験なしに行なわれ、実行され得る。本発明の組成物および方法が、好ましい実施形態に関して記載されてきた一方、バリエーションが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される組成物、方法および方法の工程または一連の工程に適用され得ることが当業者に明らかである。より詳細には、同じまたは類似の結果を達成しながらも、化学的、生理学的両方で関連する特定の薬剤が、本明細書中に記載される薬剤に置き換わり得ることが明らかである。当業者に明らかな全てのこのような類似の置換物および改変物が、添付の特許請求の範囲に規定されるような本発明の精神、範囲および概念内であると考える。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願が、全ての目的についてその全体において本明細書によって参考として援用される。従って、特許されることが求められる排他権は、添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
【図面の簡単な説明】
【０５４８】
本発明は、添付の図面と組み合わせて、以下の説明を参照することによって理解され得、ここで、同様の参照番号は、同様の要素を同定する。
【図１】図１は、節５．１．に記載される本発明のｃＤＮＡ標的を同定するために使用されるマイクロアレイチップ技術アプローチの概略図を示す。
【図２】図２は、抗原特異的株を生成し、そして目的のクローンを同定するために使用されるインビトロでの全遺伝子ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミング手順についての一般的プロトコルの概略図を示す。
【図３】図３は、抗原特異的株を生成し、そして目的のクローンを同定するために使用されるインビトロでの全遺伝子ＣＤ４＋Ｔ細胞プライミング手順についての一般的プロトコルの概略図を示す。
【図４】図４は、リンパ腫細胞において過剰発現されるｃＤＮＡを同定するために使用されるプローブのパネルを示す。
【図５】図５は、プログラムＴＳＩＴＥＳにより配列番号９６１１を分析した結果を示す。
【図６】図６は、リンパ腫患者におけるＬｙ１４４８Ｐ特異的血清抗体の存在を示す。
【図７】図７は、第１染色体上に存在する１８ＬＹ１４４８Ｐエキソンおよび幾つかのスプライス改変体におけるこれらのエキソンの位置を概略的に示す。
【図８】図８は、各々において使用されるＬｙ１４４８Ｐスプライス形態およびエキソンを示す。
【図９】図９は、Ｌｙ１４４８Ｐスプライス形態の各々の構造を概略的に示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年7月20日(2004.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９６０１で記載される核酸配列によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１に記載のモノクローナル抗体をコードする核酸。
【請求項３】
請求項１に記載のモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が、配列番号９６０１で記載される核酸配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸１〜４２に特異的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１に記載のモノクローナル抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項５】
キメラ抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
Ｆａｂフラグメントである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
Ｆｖフラグメントである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
ｓｃＦｖである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
レポーター基をさらに含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
治療部分をさらに含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
前記治療部分が、放射性核種である、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項１に記載のモノクローナル抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
哺乳動物被験体における血液悪性疾患の処置のための医薬の製造における有効量の薬学的組成物の使用であって、該薬学的組成物は、配列番号９６０１で記載される核酸配列によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、使用。
【請求項１４】
前記血液悪性疾患が、ＳＰＡＰの過剰発現に関連する、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記血液悪性疾患が、リンパ腫、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記血液悪性疾患が、慢性リンパ性白血病である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
前記哺乳動物被験体が、ヒトである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１８】
前記投与が、静脈内である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１９】
患者における血液悪性疾患の検出のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該患者由来の生物学的サンプルを、配列番号９６０１で記載される核酸配列によってコードされるポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させ、それによって該モノクローナル抗体が、配列番号９６０１によってコードされるポリペプチドとの複合体を形成する工程；
（ｂ）該複合体の量を検出し、それによって、該患者における癌を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記血液悪性疾患が、リンパ腫、Ｂ細胞白血病および多発性骨髄腫、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記血液悪性疾患が、慢性リンパ性白血病である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
血液悪性疾患細胞を検出するためのキットであって、該キットが、以下：
配列番号９６０１で記載される核酸配列によってコードされるポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体；および
使用のための指示書、
を備える、キット。