(57)【要約】検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質、例えば、発酵または蛍光タンパク質をコードするDNA配列を含む微生物または細胞を含有する診断および医薬組成物が開示され、特定の態様では、さらに腫瘍治療および／または転移性腫瘍に適切なタンパク質、例えば、細胞傷害性たまたは細胞分裂停止タンパク質をコードするDNA配列が開示される。
2005523875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質をコードするDNA配列を含む微生物または細胞を含有してなる診断および／または医薬組成物。
【請求項２】
前記微生物または細胞が腫瘍治療および／または転移性腫瘍の排除に適切なタンパク質をコードするDNA配列をさらに含んでなる請求項１記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項３】
前記検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質が発光および／または蛍光タンパク質である請求項１または２記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項４】
前記タンパク質がリガンドに結合可能な細胞レセプターである請求項１〜３いずれか記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項５】
放射性核種標識リガンドであるリガンドをさらに含有してなる請求項４記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項６】
常磁性-または超常磁性-金属-標識リガンドであるリガンドをさらに含有してなる請求項４記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項７】
毒素に結合されたリガンドをさらに含有してなる請求項４記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項８】
治療用タンパク質に結合されたリガンドをさらに含有してなる請求項４記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項９】
前記リガンドが抗体である請求項４〜８いずれか記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項１０】
前記検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質が磁気共鳴画像法（MRI）により検出可能なシグナルを誘導するか、または組織の可視化のために必要とされる造影剤、発色団またはリガンドに結合可能なタンパク質である請求項１記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項１１】
前記微生物が細菌またはウイルスである請求項１〜１０いずれか記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項１２】
前記細菌が磁性細菌である請求項１１記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項１３】
前記ウイルスがワクシニアウイルスである請求項１１記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項１４】
前記細菌が弱毒化Vibrio choleraeである請求項１１記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項１５】
前記細胞が哺乳動物細胞である請求項１〜１０いずれか記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項１６】
前記発光または蛍光タンパク質がルシフェラーゼ、RFPまたはGFPである請求項３記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項１７】
前記微生物または細胞がルシフェラーゼの基質をコードする遺伝子をさらに含んでなる請求項１６記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項１８】
腫瘍画像化または治療的腫瘍処置をモニタリングするための診断組成物の調製のための請求項１〜１７いずれかに規定される微生物または細胞の使用。
【請求項１９】
腫瘍画像化またはモニタリングがMRIにより行われる請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
（ａ）腫瘍治療および／または転移性腫瘍の排除に適したタンパク質に融合された抗菌化合物、および／または（ｂ）検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質に融合された抗菌化合物をさらに含有してなる請求項１〜１７いずれか記載の診断および／または医薬組成物。
【請求項２１】
前記腫瘍治療および／または転移性腫瘍の排除に適したタンパク質が、エンドスタチンまたは組換えキメラ毒素PE37／トランスフォーミング成長因子α（TGF-α）である請求項１、２、３および１０〜１７いずれか記載の診断および医薬組成物。
【請求項２２】
前記腫瘍治療および／または転移性腫瘍の排除に適したタンパク質が、非毒性プロドラッグを腫瘍に対して細胞傷害性である毒性薬物に変換可能なタンパク質である請求項１、２および１０〜１７いずれか記載の診断および医薬組成物。
【請求項２３】
前記DNA配列がBAC、MAC、サイバー細胞またはサイバーウイルス上にある請求項１〜１７いずれか記載の診断および医薬組成物。
【請求項２４】
腫瘍治療および／または転移性腫瘍の排除のための医薬組成物の調製のための請求項１〜２３いずれかに規定される微生物または細胞の使用。
【請求項２５】
前記腫瘍が膀胱の腫瘍、胸部の腫瘍、前立腺の腫瘍、神経膠腫、肝臓の腫瘍、皮膚の腫瘍、大腸の腫瘍、肺の腫瘍、卵巣の癌腫、または脾臓の癌腫である請求項２４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質、例えば、発光または蛍光タンパク質をコードするDNA配列に関し、特定の態様では、さらに、腫瘍治療および／または転移性腫瘍の排除に適したタンパク質、例えば、細胞傷害または細胞分裂停止タンパク質をコードするDNA配列を含む診断および医薬組成物に関する。
【０００２】
腫瘍における細菌の存在は、約５０年前に報告された。いくつかの刊行物は、予期せぬ多数の細菌がヒト患者から切り出された腫瘍に発見されたという早期の臨床的発見を実証した。研究者らは、慢性的感染が細胞を悪性増殖し易くしうることを主張する。クラミジアの種々の株の慢性感染は、肺癌および子宮頸癌ならびに悪性リンパ腫に関連する。特定の細菌種の存在と癌発生との間の別のよく記載されている関連は、胃潰瘍の患者におけるHelicobacter pyloriである。H.pylori関連抗体のレベルの上昇は、十二指腸潰瘍および胃の腺癌を有する患者において見出される。これらの観察は、腫瘍部位での細菌の随伴性の存在を示す；しかし、微生物が腫瘍形成の原因であるかどうか、または腫瘍性組織が細菌コロニー形成し易いかどうかが明らかではなかった。マウスに静脈内注射された厳密な嫌気性細菌、Clostridiumpasteurianumは、腫瘍において選択的に複製し、壊死中心における低酸素の微小環境を示唆した。弱毒化Salmonella typhimurium変異体の静脈内注射は、組織学的および細菌学的解析においてマウスの他の器官と比べて腫瘍組織において細菌タイターの上昇を生じた。
【０００３】
同様に、ウイルス粒子の存在は、早くも1965年に切り出されたヒト胸部腫瘍において報告された。さらに最近、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のデータに基づいて、ヒトパピローマウイルスは肛門性器の腫瘍および食道の癌、乳癌、および最も一般的な子宮頸癌に関連すると主張されている。また、ヒト肝細胞の癌におけるC型肝炎ウイルスの存在、Kirnura病の扁平上皮細胞癌腫におけるエプスタイン-バーウイルスの存在、ヒト乳癌におけるマウス乳房腫瘍ウイルス様粒子（MMTV）の存在、マカク星状細胞腫におけるSV40ウイルスの存在、およびカメ線維乳頭腫におけるヘルペスウイルスの存在が報告された。驚くことに、腫瘍におけるウイルス粒子の濃度は患者間で変動を示す。食道の扁平上皮細胞癌腫におけるヒトパピローマウイルスの存在は０〜72％（10〜15）の範囲である。腫瘍組織とは対照的に、同じ患者の食道上皮の腫瘍がない領域にはウイルス粒子は見出されず、これはウイルス粒子が腫瘍組織にのみに位置することを示唆する。
【０００４】
しかし、これまで、上記の微生物が腫瘍のような障害の発生を担うかどうか（パピロローマウイルス以外）、または、例えば腫瘍もしくは細菌がウイルスを誘引および／または保護しうるかどうかは明確に示されていなかった。従って、腫瘍の診断または治療のためのかかる微生物の使用に関する基礎がなかった。MRI（磁気共鳴映像法）等の従来の腫瘍診断方法は、感度および特異性を欠失しており、治療方法、例えば、外科術は、侵襲性であり、あまり感度は高くなかった。
【０００５】
それゆえ、本発明の目的は、現在使用されている診断および治療アプローチの不利な点を解消する効率的かつ信頼のできる腫瘍の診断および治療のための手段を提供することである。
【０００６】
本発明によれば、これは、特許請求の範囲に規定される主題により達成される。発光融合遺伝子構築物rVV-ruc-gfpを保有するワクシニアウイルス（LIVP株）がヌードマウスに静脈内注射された場合、発光の消失により決定されるように全ての器官から４日以内に浄化されることが見出された。対照的に、注射されたワクシニアウイルスの運命が、皮下移植されたC6ラット神経膠腫細胞から増殖した腫瘍を有するヌードマウスにおいて同様に従った場合、ウイルス粒子は、腫瘍組織において長期間保持されることが見出され、長期の発光を生じた。同じ腫瘍におけるウイルスコード融合タンパク質の存在および増幅は、立体顕微鏡下でGFP蛍光を観察することにより、および弱光（low light）ビデオ画像化カメラ下でルシフェラーゼ触媒発光を収集することにより生存動物においてモニターされた。腫瘍特異的発光は、ウイルス注射後４日目に25〜2500mm3のサイズの皮下C6神経膠腫移植物を保有するヌードマウスで検出された。シグナルは、注射４日後に強くなり、30〜45日間持続し、ウイルス複製の継続を示した。rVV-ruc-gfpウイルス粒子の腫瘍蓄積はまた、移植されたPC-3ヒト前立腺細胞から発生した皮下腫瘍を保有するヌードマウス、および同所移植されたMCF-7ヒト胸部腫瘍を有するマウスにおいて見られた。さらに、免疫適格性ラットにおける頭蓋内C6ラット神経膠腫細胞移植物およびC57マウスにおけるMB-49マウス膀胱腫瘍細胞移植物はまた、ワクシニアウイルスにより標的化された。C6神経膠腫の断面は、発光が、迅速に分裂する細胞が存在する腫瘍の末梢に「パッチ」でクラスター形成していたことを示した。対照的に、胸部腫瘍の断面は、腫瘍全体に分布する蛍光の「島」を示した。原発性胸部腫瘍に加えて、小転移性腫瘍はまた、対側性胸部領域の外側、および曝露肺表面上の小結節で検出され、これは対側性胸部および肺への転移を示唆する。要約すると、発光細胞または微生物、例えば、ワクシニアウイルスは、原発性および転移性腫瘍を検出および処置するために使用されうる。
【０００７】
同様の結果が、マウスに静脈内注射され、弱光イメージャー下で直ちに全ての動物で可視化され得た発光細菌（Salmonella、Vibrio、Listeria、E.coli）で得られた。発光は、免疫系によるクリアリングの結果として細菌注射の36時間後には両方の胸腺欠損（nu/nu）マウスおよび免疫適格性C57マウスにおいて検出されなかった。静脈内注射された動物の皮膚創傷において、細菌の発光は増大し、注射の６日後まで検出可能なままである。移植されたC6神経膠腫細胞から発生した腫瘍を有するヌードマウスにおいて、発光は、腫瘍を有さないマウスと同様に、細菌の送達後36時間で完全に動物から消失した。しかし、注射の48時間後、予期せぬことに、腫瘍領域のみから起こる強く、迅速に増大した発光が観察された。この観察は、腫瘍組織における継続的な細菌複製を示す。発光の程度は、使用される細菌株に依存する。持続する発光を伴う誘導プロセス（homing-inprocess）はまた、前立腺、膀胱、および胸部腫瘍を保有するヌードマウスにおいて示された。原発性腫瘍に加えて、転移性腫瘍もまた、胸部腫瘍モデルにおいて例証されるように可視化され得た。腫瘍特異的発光はまた、膀胱腫瘍を有する免疫適格性C57マウスおよび脳神経膠腫移植物を有するLewisラットにおいて観察された。腫瘍において一旦、発光細菌は観察されずに循環に放出され、同一の動物において移植された腫瘍に続いて再コロニー形成することが観察された。さらに、Ruc-gfp融合タンパク質を発現する哺乳動物細胞は、血流への注射の際に神経膠腫に誘導され、増殖することもまた見出された。
【０００８】
これらの知見は、（ａ）発光のようなシグナルに基づく腫瘍の検出、および／または例えば、消光により合図される腫瘍発生および／または血管形成の抑制のために有用な多機能性ウイルスベクター設計ならびに（ｂ）癌の治療のための治療用遺伝子構築物と組み合わせた細菌および哺乳動物細胞ベース腫瘍標的システムの開発のための道を開く。これらのシステムは以下の利点：（ａ）これらは正常組織に影響することなく腫瘍を特異的に標的化する；（ｂ）治療用遺伝子構築物の発現および分泌は、好ましくは、誘導性プロモーターの制御下にあり、分泌をスイッチオンまたはオフすることができる；および（ｃ）腫瘍内部の送達システムの位置は、遺伝子発現およびタンパク質送達を活性化する前に直接的な可視化により確認されうる、を有する。
【０００９】
従って、本発明は、検出可能なタンパク質、または検出可能なシグナルを誘導可能であるタンパク質をコードするDNA配列を含む微生物または細胞を含有する診断組成物および／または医薬組成物に関する。
【００１０】
好ましい態様では、前記診断および／または医薬組成物の微生物または細胞はさらに、細胞傷害タンパク質、細胞分裂停止タンパク質、血管形成を阻害するタンパク質またはアポトーシスを刺激するタンパク質等の腫瘍治療および／または転移性腫瘍の排除に適切なタンパク質をコードするDNA配列を含む。かかるタンパク質は、当業者に周知であり、適切なタンパク質のさらなる例は以下に示される。
【００１１】
任意の微生物または細胞は、それらが生物中で複製し、生物に対して病原性ではなく（例えば、弱毒化）、生物の免疫系により認識される等の場合、本発明の組成物に有用である。本発明に有用な微生物の例は、細菌およびウイルスである。本明細書において使用される用語「細菌」は、それ自体は腫瘍標的化されない（すなわち、それらが癌性細胞または組織と非癌性の対応する細胞または組織とを区別し得ない）細菌をいう。なぜなら、本発明に至る実験の結果が、細菌などがこの環境において宿主細胞の免疫系による攻撃に曝されないという事実のためにそれらが腫瘍において蓄積することを示しているからである。本発明の目的に有用であり、腫瘍標的化されない候補細菌のリストが下記表１に示される。当業者は、一般に利用可能な方法、例えば、WO96/40238のセクション6.1に記載される方法により腫瘍標的化されないかかる細菌を容易に同定しうる。好ましくは、前記細菌は、細胞間細菌、例えば、E.coli、E.faecalis,Vibrio cholerae, Vibrio fischeri, Vibrio Harveyi, Lactobacillus spp.,Pseudomonas spp.である。本発明の方法において、腫瘍標的化されないウイルスおよび細胞、特に哺乳動物細胞が好ましい。特に好ましいのは細胞質ウイルスである。
【００１２】
特に好ましい態様では、診断組成物および／または医薬組成物は、発光タンパク質および／または蛍光タンパク質をコードするDNA配列を含む微生物または細胞を含有する。
【００１３】
本明細書中で使用される用語「発光タンパク質および／または蛍光タンパク質をコードするDNA配列」はまた、融合タンパク質として発光タンパク質および蛍光タンパク質をコードするDNA配列を含む。
【００１４】
診断組成物および／または医薬組成物の代替的な好ましい態様では、DNA配列によりコードされるタンパク質は、診断用リガンドまたは治療用リガンドでありうるリガンドに結合可能な細胞レセプターである。リガンドは、タンパク質（大ペプチドまたは小ペプチド、抗体等を含む）、合成化合物（合成ステロイドアナログ等）等でありうる。それゆえ、生存動物およびヒト患者における標識リガンドのインビボ位置は、例えばSPECTまたはPETによりリアルタイムで可視化されうる。腫瘍標識のためのほとんどの任意の公知のタンパク質リガンド-レセプター対は本発明の方法に有用である。好ましくは、特異性を増大するために、変異タンパク質リガンド（またはそれが化合物である場合にはアナログ）または変異リガンドレセプターは、遺伝的または化学的に操作され得、その結果、それらは、いかなる内因性分子にも結合しない。特異性の増大に加えて、これらの変異体／アナログはまた、正常な宿主生理学に有害な影響を制限する。
【００１５】
本発明の診断組成物および／または医薬組成物のより好ましい態様では、リガンドは放射性核種標識リガンドである。前記リガンドは、例えば、レセプタータンパク質遺伝子構築物を保有する、例えば、操作された細菌、ウイルス、または哺乳動物細胞の静脈内送達に続く、腫瘍細胞の表面上に特異的に発現される放射性核種標識リガンドのレセプターへの放射性核種標識リガンドの結合から生じる、シングルフォトンエミッションコンピュータ断層撮影法（SPECT）またはポジトロン-コンピュータ断層撮影法（PET）による腫瘍可視化に有用である。放射性核種は、従来の腫瘍シンチグラフィー、PETおよびおそらく腫瘍の内部放射線治療に有用でありうる。本発明に有用な放射性核種の例は、（ａ）11C、13N、15Oまたは64Cu等のβ+-エミッタまたは（ｂ）123I等のγ-エミッタである。例えば、PETのためのトレーサーとして使用されうる他の放射性核種は、55Co、67Ga、68Ga、60Cu(II)、67Cu(II)、57Ni、55Co、52Fe、18F等が含まれる。
【００１６】
SPECTおよびPETは、本発明による腫瘍画像化のために有用でありうる高感度の技術である。SPECTおよびPETの両方は、放射性核種からの微量のβ+およびγ発光を検出しうる。PETは、SPECTよりもさらに高感度である。実験小動物を用いる実験において、腫瘍画像化は、ミクロPET装置を用いて行われ、これは、例えばConcordeMicrosystems (Knoxville, TN)により市販されている。
【００１７】
有用な放射性核種-標識薬剤の例は、64Cu-標識操作抗体断片（Wuら、PNASUSA 97 (2002), 8495-8500）、64Cu-標識ソマトスタチン（Lewisら、J.Med.Chem. 42(1999), 1341-1347, 64Cu-ピルブアルデヒド-ビス(N4-メチルチオセミカルバゾン）（64Cu-PTSM）（Adonaiら、PNASUSA 99 (2002), 3030-3035, 52Fe-クエン酸（Leendersら、J.Neural Transm.suppl.43 (1994), 123-132, 52Fe/52mMn-クエン酸）（Calonderら、J.Neurochem.73 (1999), 2047-2055）および52Fe-標識水酸化鉄（III）-ショ糖複合体（Besharaら、Br.J.Haematol.104 (1999), 288-295, 296-302）である。
【００１８】
腫瘍検出に放射性核種-標識リガンドを適用するために、リガンドが結合しうるレセプタータンパク質をコードする遺伝子は、本発明の静脈内注射された細菌、ウイルス、または哺乳動物細胞により送達される。所定の静脈内注射された細菌、ウイルスおよび哺乳動物細胞が腫瘍において特異的に複製することは下記の実施例に示されるので、腫瘍におけるレセプタータンパク質の発現は、放射性核種標識リガンドにより標的化のために腫瘍を標識する。
【００１９】
例えば、ワクシニアウイルスの場合には、効率的な腫瘍検出を可能にするために、ウイルスは、リガンドに特異的に結合しうるレセプタータンパク質をコードする遺伝子構築物を輸送するために使用されうる。組換えワクシニアウイルスの静脈内注射は、レセプター遺伝子の送達および腫瘍組織におけるレセプタータンパク質の表面発現を可能にする。次いで、放射性核種標識リガンドは、宿主に静脈内注射される。放射性核種-標識リガンドと腫瘍細胞表面上に発現されたそのレセプターとの間の特異的結合は、腫瘍からにのみ由来するβ+-またはγ-発光に基づく腫瘍の検出を可能にする。放射性核種での腫瘍の標識は、腫瘍と正常組織との間の容易な区別を可能にする。それゆえ、外科的ブレードホルダー（bladeholder）に取り付けられる手がかりβ+-またはγ-検出器が設計されうる。β+-またはγ-発光のシグナルに基づいて、標識された腫瘍は、正常組織の除去を最小に保ちながら、きれいに切り出されうる。
【００２０】
本発明の目的にはガリウム-67が特に好ましい。ガリウム-67（67GA）は、PET、SPECT、またはシンチグラフィーを用いて診断用画像化のために使用されうる。これは、炎症性傷害および腫瘍、特にリンパ腫、また膵臓の腫瘍、肺の腫瘍等の多くの他の型の腫瘍において蓄積するその能力について知られている。67Ga取り込みの機序は、トランスフェリン-依存性経路およびトランスフェリン-非依存性経路の両方を介すると提唱されている。トランスフェリン-依存性経路では、トランスフェリンレセプターの過剰発現が腫瘍細胞による67Ga取り込みを有意に増大させることが示されている。さらに、抗-トランスフェリンレセプター抗体は、腫瘍細胞により67Gaを有意にブロックする。小さな腫瘍の画像化のために、非常に高い濃度の67Gaがバックグラウンドシグナルを克服するために必要とされる。従って、この場合、ウイルスの静脈内注射に続いて、生存動物またはヒト患者の腫瘍細胞の表面にトランスフェリンレセプターを特異的に過剰発現させるためにトランスフェリンレセプター遺伝子構築物を保有する組換えワクシニアウイルスの使用が好ましい。67Gaはまた、静脈内に送達される。過剰発現されたトランスフェリンレセプターからの補助を伴う腫瘍細胞における67Gaの高レベルの蓄積は、生存動物およびヒト患者における腫瘍検出能力を有意に改善するために役立つ。
【００２１】
別の好ましい態様では、本発明の診断組成物および／または医薬組成物は、磁気共鳴画像法（MRI）により検出可能であるシグナルを誘導可能なタンパク質、例えば、金属結合タンパク質をコードするDNA配列を含む微生物または細胞を含有する。さらに、前記タンパク質は、組織の可視化のために必要とされる造影剤、発色団、リガンドまたは化合物に結合しうる。好ましくは、前記タンパク質は、常磁性-または超常磁性-金属-標識リガンドに結合可能な細胞レセプターである。例えば、レセプタータンパク質遺伝子構築物を保有する本発明の操作された細菌、ウイルス、または哺乳動物細胞の静脈内送達に続く常磁性-または超常磁性-金属-標識リガンドの、腫瘍細胞の表面上に特異的に発現されるそれらのレセプターへの結合から生じるMRIによる腫瘍可視化はいくつかの利点を有する。腫瘍におけるこれらの金属の高レベルの蓄積は、腫瘍検出を促進する。実質的に、任意の常磁性金属または超常磁性金属はこの目的のために使用されうる。好ましくは、裸の重金属の全身性の毒性のために、常磁性または超常磁性は、有害な影響を最小に維持するように注意深く選ばれる。大抵の現在入手可能な造影剤では、金属粒子が、キレートに連結しているか、ポリマーでコートされているかのどちらかであり、裸の粒子よりも大いに安全に使用される。それゆえ、キレートされたかまたはポリマーコートされた金属でタグ化されたリガンドの使用が好ましい。
【００２２】
タンパク質に連結された造影剤を作製する方法は当業者に周知であり、例えば、タンパク質リガンド（または他の化合物リガンド）はキレート（例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA））に最初に化学的に付着される。次いで、キレート-タンパク質複合体は金属で標識される。類似した標識方法はガリウム標識ソマトスタチンアナログを作製することにおいて使用され、DTPA-ビス（ステアリルアミド）を用いるインジウム-111-標識低密度リポタンパク質の製造に使用される。造影剤に使用されるキレートでのタンパク質修飾の詳細は以前に記載されている。例えば、二機能性キレート2-(4-イソチオシアノトベンジル-6-メチル)ジエチレントリアミン-ペンタ酢酸（MX-DTPA）でのタンパク質の修飾（Mirzadehら、Bioconjug.Chem.1 (1990), 59-65）およびジエチレントリアミン-ペンタ酢酸の環状無水物（cDTPAA）でのタンパク質の修飾（DuncanおよびWelch,J.Nucl.Med. 34 (1993), 1728-1738）が記載されている。
【００２３】
あるいは、MRIは以下のアプローチにより行われうる。
【００２４】
（ａ）酵素／タンパク質送達による修飾されたガドリニウム活性化
このアプローチは、遺伝子定方向酵素プロドラッグ治療（Gene-Directed Enzyme Prodrug Therapy）(GDEPT)の原理に基づき、この場合、酵素／タンパク質は、全身に送達された非毒性プロドラッグを活性な毒性薬物に活性化する。腫瘍における酵素／タンパク質による強い緩和状態への弱い緩和状態のMRI造影剤の特異的活性化は腫瘍検出を可能にする。腫瘍への酵素／タンパク質送達は、静脈内注射された操作された細菌、ウイルス、および哺乳動物細胞により達成され、これは、β-ガラクトシダーゼ（または任意の他の関連する酵素）をコードする遺伝子を保有する。β-ガラクトシダーゼは、細胞外に分泌される形態または細菌または哺乳動物細胞表面に発現されるかのいずれかでありうる。β-ガラクトシダーゼにより切断され得、腫瘍検出のためのMRI画像化において使用され得るMRI薬剤の例は、(4,7,10-トリ(酢酸)-1-(2-β-ガラクトピラノシルエトキシ)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン)ガドリニウム(Egad)(Moatsら、1997,)である。この化合物において、ガラクトピラノース残基は、Gd3+イオンの第９配位部位に位置される。この障害物のために、水プロトンは、Gd3+イオンとの相互作用から排除され、それゆえ、T1緩和時間における効果が減少した。β-ガラクトシダーゼの存在下で、酵素は、キレートからガラクトピラノースを切断し、配位部位を遊離させ、弱い緩和状態から強い緩和状態への造影剤の不可逆的な遷移を可能にする。細菌-、ウイルス-、または哺乳動物細胞-ベース酵素発現は腫瘍でのみ起こるので、酵素-媒介緩和状態遷移はまた、腫瘍においてのみ起こる。それゆえ、MRI造影剤のこの酵素媒介活性化は腫瘍検出のために使用されうる。
【００２５】
上記MRI造影剤に加えて、他の型の残基がキレートに付着されうる類似の新規造影剤が開発されうる。これらの残基は、その対応する酵素により除去され得（ガラクトシダーゼによるガラクトピラノースの除去に類似する）（例えば、α-マンノシダーゼ、α-およびβ-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ）、Gd3+イオンの第９配位部位を遊離し、腫瘍検出のためのT1緩和時間を変更する。これらの酵素をコードする遺伝子は、本発明の操作された細菌、ウイルス、または哺乳動物細胞によって全て送達されうる。さらに、ガドリニウム以外の金属を使用する新規造影剤が、酵素活性化MRI腫瘍画像化のために開発されうる。
【００２６】
このアプローチは、以下のセクションに示されるように治療と組み合わされうる。
【００２７】
（ｂ）第一に造影剤（例えば、修飾ガドリニウム）の活性化のための送達ベクター系の操作、次いで同一の構成的に発現される酵素（例えば、β-ガラクトシダーゼ）による注射されたプロドラッグの活性化−１遺伝子産物ベース検出および治療システム（OGPBDTS）
例えば、ガドリニウム-ベース造影剤は、上記のように酵素（例えば、β-ガラクトシダーゼ）により活性化され得、これは腫瘍検出のために使用されうる。次いで、静脈内に送達されたプロドラッグ（CBI、TMI、PCI等）（米国特許第5,646,298号に記載されている）は、腫瘍内で同一のβ-ガラクトシダーゼにより切断され、癌処置のための腫瘍細胞に対する活性な細胞傷害性薬物を生じうる。
【００２８】
（ｃ）２遺伝子産物ベース検出および治療システム（TGPBDTS）での送達ベクター系の操作
遺伝子１は、構成プロモーターに連結され、造影剤（例えば、金属結合タンパク質、修飾ガドリニウム、または他の薬剤）を感知するための酵素／タンパク質を生成し、遺伝子２は、外因的に活性可能なプロモーターに連結され、これは活性化薬物なしでは沈黙し、検出ベクター系がMRIにより陽性であるとわかった後にのみ、スイッチが入る。ベクターベースプロモーター遺伝子構築物の活性化は、注射により、またはアクチベーター薬物の経口投与により達成される。造影剤の注射の繰り返しにより、処置手順の間に腫瘍サイズおよび転移の位置のリアルタイムモニタリングが可能となる。
【００２９】
好ましくは、細胞をトランスフェクトするために、上記の（診断用または治療用）タンパク質、例えば、発光タンパク質および／または蛍光タンパク質をコードするDNA配列はベクターまたは発現ベクターに存在する。当業者はその実例に精通している。DNA配列はまた、適切な発現カセットを含む組換えウイルスに含まれうる。本発明の診断組成物または医薬組成物に使用されうる適切なウイルスとしては、バキュロウイルス、ワクシニア、シンドビスウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、AAVウイルスまたはMVMまたはH-1等のパルボウイルスが挙げられる。ベクターはまた、MoMULV、MoMuLV、HaMuSV、MuMTV、RSVまたはGaLV等のレトロウイルスでありうる。哺乳動物における発現のために、適切なプロモーターは、例えば、ヒトサイトメガロウイルス「最初期プロモーター」（pCMV）である。さらに、組織および／または器官特異的プロモーターは有用である。好ましくは、例えば、発光タンパク質および／または蛍光タンパク質をコードするDNA配列は高発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結される。かかるプロモーター、例えば、誘導性プロモーターは当業者に周知である。好ましくは、上記構築物は適切な組み込みにより細菌ゲノムに挿入される。かかる構築物が、哺乳動物ベクターを用いて哺乳動物細胞内で生成される場合、腫瘍細胞における長期発現のために、単一コピー挿入で安定に形質転換された細胞株が生成される。
【００３０】
上記のDNA配列の生成のため、およびそのDNA配列を含む発現ベクターまたはウイルスを構築するために、当業者に公知の一般的な方法を使用することができる。これらの方法としては、例えば、Sambrookら、MolecularCloning, A Laboratory Manual, 第２版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NYに記載されるような、例えば、インビトロ組換え技術、合成法およびインビボ組換え法が挙げられる。上記のベクターを用いることによる細胞のトランスフェクション法、トランスフェクタントを表現型により選択する方法およびDNA配列を発現させる方法は当業者に公知である。
【００３１】
当業者は、タンパク質、例えば、本発明の診断組成物および／または医薬組成物に使用されうる発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードするDNA配列を知っている。過去10年間、発光に基づいて細菌、ウイルスまたは哺乳動物細胞の追跡を可能にするVibrio harveyi由来（Belasら、Science218 (1982), 791-793）およびVibrio fischerii由来（ForanおよびBrown, Nucleic acids Res. 16(1988), 177）の細菌ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ（de Wetら、Mol.Cell.Biol. 7 (1987), 725-737）、Aequoreavictoria由来のエクオリン（Prasherら、Biochem. 26 (1987), 1326-1332）、Renilla reniformis由来のRenillaルシフェラーゼ（Lorenzら、PNASUSA 88 (1991), 4438-4442）およびAequorea victoria由来のグリーン蛍光タンパク質（Prasherら、Gene 111(1987), 229-233）の由来の発光タンパク質をコードする構造遺伝子の同定および単離が記載された。細菌におけるこれらの遺伝子の形質転換および発現は、弱光画像化カメラの補助による細菌コロニーの検出または蛍光顕微鏡下での個々の細菌の検出を可能にする（Engebrechtら、Science227 (1985), 1345-1347; Legockiら、PNAS 83 (1986), 9080-9084; Chalfieら、Science 263(1994), 802-805）。
【００３２】
ルシフェラーゼ遺伝子は種々の生物で発現される。ニトロゲナーゼプロモーターに融合されたlux ABを用いる、発光に基づくプロモーター活性化は、弱光画像化により感染した根粒の細胞の細胞質内に存在するRhizobiaで示された（Legockiら、PNAS83 (1986), 9080-9084; O'Kaneら、J.Plant Mol.Biol. 10 (1988), 387-399）。luxAおよびluxB遺伝子の融合は完全に機能性であるルシフェラーゼタンパク質を生じた（Escherら、PNAS86 (1989), 6528-6532）。この融合遺伝子（Fab2）を、Bacillus subtilisおよびBacillus megatheriumにキシロースプロモーター下に導入し、次いで昆虫の幼虫に与え、虫の血液リンパに注入した。発光の画像化を弱光ビデオカメラを用いて行った。形質転換シロイヌナズナ植物（病原活性化PALプロモーター-細菌ルシフェラーゼ融合遺伝子構築物を保有する）における病原性細菌の移動および局在化を、PseudomonasまたはErviniaspp.感染を局在化させることにより、弱光イメージャー下で示し、ならびにトマト植物および多くのジャガイモで示した（GiacominおよびSzalay,Plant Sci. 116 (1996), 59-72）。
【００３３】
細菌において発現されるルシフェラーゼの全ては、発光のためにデカナル（decanal）またはセレンテラジン等の基質の外因的な添加を必要とする。対照的に、GFP蛍光の可視化は基質を必要としないが、励起光源が必要とされる。より最近では、細菌ルシフェラーゼおよび細胞内にデカナルを提供するためのタンパク質をコードする遺伝子クラスター（luxCDABEを含む）がXenorhabdusluminescens（MeighenおよびSzittner, J. Bacteriol. 174 (1992), 5371-5381）およびPhotobacteriumleiognathi（Leeら、Eur.J.Biochem. 201 (1991), 161-167）から単離され、細菌に伝達され、外因的に添加された基質から独立して、継続的な発光を生じる（Fernandez-PinasおよびWolk,Gene 150 (1994), 169-174）。完全なluxオペロン配列を含む細菌は、腹腔内、筋肉内、または静脈内に注射された場合、生存マウスにおいて細菌の可視化および局在化を可能にし、ルシフェラーゼ発光は組織を貫通し得、外部から検出されうることを示す（Contagら、Mol.Microbiol.18 (1995), 593-603）。
【００３４】
好ましくは、本発明の微生物は、腫瘍標的化されない細菌、例えば、弱毒化細菌である。本発明（すなわち、BMPT（細菌媒介タンパク質治療）および腫瘍画像化）に有用であり得、腫瘍標的化され得ない候補細菌株のリストが表１に列挙される。当業者は、一般に利用可能である方法、例えば、WO96/40238のセクション6.1に記載される方法により腫瘍標的化されないかかる細菌を容易に同定しうる。
【００３５】
ヒトへの安全かつ直接的な適用性のために、ほとんどの個体に自然に消費され、固形腫瘍に直接注射された場合に内因性抗腫瘍活性を有する、ミルクおよびチーズに関連する微生物等の細菌細胞株が好ましい。かかる細菌はまた、種々の型の腫瘍と、または特定の型の腫瘍と共存（共生）を発達したヒト腫瘍から天然に単離された細菌を含む。細菌による治療タンパク質の細胞外分泌は、シグナルペプチドまたは内因性タンパク質分泌経路により媒介される。BMPTにさらに安全性を提供するために、細菌誘導性プロモーター、例えば、IPTG-誘導性lacプロモーターは、細菌による治療用タンパク質産生を外因的に調節するために使用されうる。細菌における哺乳動物タンパク質のIPTG調節発現は十分に考証されている。IPTGはまた、動物におけるプロモーター活性化に機能性であることが示されている。lacプロモーターに加えて、細菌における遺伝子発現の調節を可能にするプロモーターの他の例としては、araプロモーター（アラビノースにより活性化）およびPLtetO-1プロモーター（アンヒドロテトラサイクリン（aTc）により活性化）（LutzおよびBujard,Nucleic Acids Res. 25 (1997), 1203-1210）が挙げられる。
【００３６】
【表１−１】
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【００３７】
【表１−２】
2005523875.tif 000004
【００３８】
【表１−３】
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【００３９】
【表１−４】
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【００４０】
【表１−５】
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【００４１】
【表１−６】
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【００４２】
【表１−７】
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【００４３】
【表１−８】
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【００４４】
【表１−９】
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【００４５】
弱毒化されたVibrio choleraeが特に好ましい。
【００４６】
腫瘍画像化または治療的腫瘍処置をモニタリングするための診断用組成物の調製に有用な細菌のさらなる例は、磁性細菌である（金属結合細菌媒介腫瘍検出（MBBMTD））。かかる細菌は、鉄ベースの造影剤の蓄積による腫瘍検出を可能にする。磁性細菌は新鮮な海洋の堆積物から単離され得る。これらは磁性粒子（Fe3O4）を生成し得る（Blakemore,Anuu.Rev.Microbiol. 36(1982), 217-238）。そうするため、これらは効率のよい鉄取り込み系を有し、この系が不溶性および可溶性形態の鉄の両方を利用可能にする。Magnetospirillummagneticum AMB-1はかかる磁性細菌の例であり、単離され、磁性粒子生成のために培養される（Yangら, EnzymeMicrob.Technol. 29(2001), 13-19）。これらの磁性細菌（天然に存在するかまたは遺伝的に改変される）は、静脈内に注射される場合、Vibriocholeraと同様の腫瘍蓄積能力を有する、例えば、これらの細菌は腫瘍に鉄ベースの造影剤を蓄積するために使用され得、次いでMRIによる腫瘍検出を可能にする。同様に、他の天然に単離された細菌の金属蓄積株は腫瘍標的化、造影剤由来の金属の吸収、および最終的には（eventually）腫瘍画像化のために使用され得る。
【００４７】
あるいは、ワクシニアウイルス、AAV、レトロウイルスなどのウイルスもまた、本発明の診断用および治療用組成物に有用である；本発明に有用なウイルスの例を列挙した表２参照。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
好ましくは、ウイルスはワクシニアウイルスである。
【００５０】
好ましくは、本発明の診断用または治療用組成物の細胞は、生物に対して自系または異種であり得る幹細胞などの哺乳動物細胞である。好適な細胞型の例は表３に示される。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
本発明の診断用および／または治療用組成物のさらに好ましい態様において、ルミネセンスまたは蛍光タンパク質は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）または赤色蛍光タンパク質（RFP）である。
【００５３】
特に好ましい態様において、本発明の診断用および／または医薬組成物の微生物または細胞は、ルシフェラーゼに対する基質をコードする遺伝子をさらに含む。いっそうより好ましい態様において、本発明の診断用および／または医薬組成物の微生物または細胞は、ワクシニアの強力な合成初期／後期（RE/L）プロモーターの制御下でRenillaルシフェラーゼ（ruc）およびAequorea gfp cDNA配列を含むruc-gfp発現カセットまたはluxCDABEカセットを含む。
【００５４】
上記微生物および細胞の好ましい使用は、腫瘍画像化用の診断用組成物の調製である。本発明の診断用組成物は、例えば、手術中に使用され、腫瘍および転移を同定し得る。さらに、本発明の診断用組成物は、治療的腫瘍処置をモニタリングするのに有用である。例えば、生物、器官または組織におけるルミネセンスおよび／または蛍光タンパク質の限局化あるいは分布を解析するための好適なデバイスは、当業者に周知であり、さらに、上記引用文献および以下の実施例に記載される。さらに、微生物および細胞は金属を結合するように改変され得、MRI技術に有用であり、腫瘍限局化をより明確にする。
【００５５】
本発明はまた、腫瘍画像化または治療的腫瘍処置をモニタリングするための抗菌剤（例えば抗菌（antibacterial）または抗ウイルス化合物）、例えば、検出可能なタンパク質に融合されたペプチドまたはタンパク質に関する。この診断用組成物は、腫瘍に限局化している細菌と抗菌化合物（例えば、発光または放射性標識抗菌ペプチド／タンパク質）との結合を介する腫瘍検出（ペプチド結合腫瘍標的化ベクター検出（PLTTVD））に有用である。
【００５６】
本発明はまた、腫瘍治療用医薬組成物の調製のための抗菌剤（例えば、抗菌または抗ウイルス化合物）、例えば、治療的タンパク質に融合されたペプチドまたはタンパク質の使用に関する。
【００５７】
天然に存在する抗菌タンパク質の例としては、ユビキシジン（ubiquicidin）（UBI、6.7kDa）およびラクトフェリン（hLF、77kDa）が挙げられる。UBIは当初マウスマクロファージから、後ほどヒト気道上皮細胞から単離された。hLFは粘膜および好中球で見出され、グラム陰性およびグラム陽性細菌の両方の表面構造に結合することが公知である。UBIまたはhLFの細菌結合ドメインを含む小さな合成ペプチドが、無菌炎症とは区別され得る細菌感染の画像化のために設計されている（Nibberingら,Nucl.Med.Commun. 19(1998), 1117-1121；Wellingら,, Nucl.Med.Biol. 29(2000),413-422；Wellingら, Eur.J.Nucl.Med. 27(2002), 2929-301）。これらのペプチドは99mTcで放射性標識され、二次元シンチグラフィーを用いて生きた動物におけるリアルタイムの視覚化を可能にする。例えば、低エネルギー汎用パラレルホールコリメーターを備える二次元ガンマカメラ（例えば、ToshibaGCA 7100/UI, Tokyo, Japan）を使用して、生きた動物またはヒトにおける99mTc標識抗菌ペプチドを視覚化し得る。腫瘍検出のためにこれらの合成ペプチドを利用するため、まず、腫瘍を有する（tumorous）個体は細胞外細菌の特定の株で感染させられる。腫瘍の細菌コロニー形成後、放射性標識化合物、例えばペプチドが静脈内的に送達される。腫瘍における細菌への標識ペプチドの特異的結合は、シンチグラフィーによりリアルタイムで視覚化され得、従って、ヒトおよび動物における腫瘍の位置確認を可能にする。99mTcでの標識に加えて、化合物、例えば合成ペプチドはまた、MRIを用いる視覚化のために常磁性または超常磁性金属粒子で標識され得るか、または化合物はSPECTまたはPETによる非侵襲性視覚化のために放射性核種（例えば、55CO、68Ga、60CU(II)、123Iなど）で標識され得る。さらに、化合物、例えば合成ペプチドはまた、個体におけるリアルタイム視覚化のために蛍光プローブ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）またはDsRed）、またはルミネセンスタンパク質（例えば、Renillaルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ）でタグ化され得る。
【００５８】
UBIおよびhLFに加えて、本発明の目的に有用である細菌、植物、無脊椎動物、およびヒトを含む脊椎動物により生成される抗菌ペプチド／タンパク質の多くの他の例がある（Schroder,Cell.Mol.Life Sci. 56(1999), 32-46；ColeおよびGanz, Biotechniques 29(2000),822-826, 828, 830-831）、例えば、乳酸細菌由来のペジオシン（pediocin）PA-1、Bacillus Brevis由来のグラミシジンS、ブタ白血球由来のプロテグリン（protegrin）-1、ヒツジ骨髄性細胞由来のSMAP-29、アジアヒキガエル由来のブホリン（buforin）IおよびブホリンII、βディフェンシン、LL-37、ヒトカテリシジン（cathelicidin）hCAP-18由来のフラグメント、ナマズ由来のアラシン（arasin）I、グラニュリシン（granulysin）、Propionibaeteriumjensenii由来のPAMPなど。これらの天然に存在する抗菌タンパク質に基づいて、小さなペプチドを設計、合成して、もともとのタンパク質による細菌殺傷効果を排除すると同時に細菌結合能力を保持し得る。次いで、これらの合成ペプチドは細菌媒介腫瘍検出に使用され得る。
【００５９】
抗菌化合物（例えば、ペプチド／タンパク質）による細菌の検出と同様に、抗ウイルス化合物（例えば、ペプチド／タンパク質）は、腫瘍においてウイルス粒子を検出するために使用され得る。ラクトフェリシン（lactoferricin）は、ウイルス粒子を検出するためのペプチドを設計するために使用され得る抗ウイルスペプチド／タンパク質の一つの例である。考察した抗菌ペプチド／タンパク質に加えて、放射性標識または発光タンパク質／プローブ標識抗体フラグメントはまた、腫瘍検出用に腫瘍に局在する細菌またはウイルスを標的化するために使用され得る。
【００６０】
さらに、抗菌化合物は、腫瘍における本発明の細菌、ウイルスなどを検出するための金属結合タンパク質（融合ペプチド結合腫瘍標的化ベクター検出（PLTTVD））に融合され得る。融合構築物と腫瘍における遺伝子工学で作製された（engineered）細菌などとの結合を可能にした後、金属剤（MRI、PETまたはSPECTによる検出に使用され得る）が静脈内注射される。細菌などによる金属剤の結合および吸収により、間接的な腫瘍検出を可能にする。
【００６１】
本発明はまた、リガンドの結合を可能にする細胞レセプターをコードするDNA配列を含む微生物または細胞およびさらに毒素（＝キメラ毒素）に結合するリガンドを含有する医薬組成物に関する。リガンドに結合され得る好適な毒素は当業者にとって周知である。いくつかのキメラ毒素は以前に記載されている。まず、Tfn-CRM107キメラ毒素が、トランスフェリンを変異ジフテリア毒素CRM 107に結合体化することにより調製され（Johnsonら, J.Neurisurg.70(1989), 240-248）、これはトランスフェリンレセプターを標的化する。二番目に、425.3-PE抗毒素が、抗EGFレセプター抗体を全Pseudomonas体外毒素Aに結合体化することにより調製された（Myklebustら,Cancer Res. 53(1993), 3784-3788）。三番目に、Tfn-PEが、トランスフェリンをPseudomonas体外毒素に結合体化することにより調製された（Hallら,J.Neurosurg. 76(1992), 838-844；Hallら, Neurosurgery 34(1994), 649-656）。これらのキメラ毒素が髄芽腫、小細胞肺癌、神経膠腫異種移植片および頭蓋内腫瘍に対して抗腫瘍活性を有することが動物モデルおよびヒト患者において示された。従って、例えば、組み換えワクシニアウイルスは、抗腫瘍処置へのこれらのレセプター標的化キメラ毒素の使用を可能にするように、腫瘍細胞の表面にトランスフェリンレセプターを特異的に発現するために設計され得る。
【００６２】
本発明はまた、(a)リガンドの結合を可能にする細胞レセプターをコードするDNA配列を含む微生物または細胞および(b)治療用タンパク質に結合される該リガンドを含有する医薬組成物に関する。好適な治療用タンパク質および治療用タンパク質をリガンドタンパク質に結合することにより治療用リガンド融合タンパク質を生成する方法は当業者にとって周知である。好適な治療用タンパク質の例は表４および５に示される。
【００６３】
【表４−１】
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【００６４】
【表４−２】
2005523875.tif 000015
【００６５】
【表４−３】
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【００６６】
【表４−４】
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【００６７】
【表４−５】
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【００６８】
【表５−１】
2005523875.tif 000019
【００６９】
【表５−２】
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【００７０】
【表５−３】
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【００７１】
【表５−４】
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【００７２】
静脈内注射した遺伝子工学で作製された細菌、ウイルスまたは細胞を用いて腫瘍組織がリガンドレセプターで標識され得るので、治療用リガンド融合タンパク質のリガンドレセプターへの結合は、腫瘍組織に対する治療用タンパク質の標的化を可能にする。細胞内細菌およびウイルスは、腫瘍細胞表面を設計されたレセプタータンパク質で標識するのに特に有用である。しかしながら、隣接細胞に対する治療用タンパク質の「巻き添え効果」により、細胞外細菌および哺乳動物細胞もまた、治療用タンパク質を送達するために使用され得る。
【００７３】
遺伝子指向酵素プロドラッグ治療（GDEPT）（以下参照）の場合、例えば、細胞外細菌は、酵素リガンド融合タンパク質を分泌するために使用され得る。腫瘍細胞表面は、ウイルスによってレセプタータンパク質で標識され得る。プロドラッグの静脈内送達の後、レセプターを発現する細胞は活性薬物と共に浴され殺傷されるだけではなく、周囲の腫瘍細胞（レセプターで標識されていなくてもよい）もまた殺傷される。
【００７４】
ウイルス（例えばワクシニアウイルス）はまた、レセプタータンパク質で腫瘍細胞表面を標識するために使用され得る。例えば、腫瘍組織は、静脈内注射された遺伝子工学で作製されたワクシニアウイルス（例えば、トランスフェリンレセプター遺伝子を保有する）（細胞表面発現のための単一ペプチドもコードする）により特異的に感染される。腫瘍細胞表面上のトランスフェリンレセプターの発現は、治療用リガンド融合タンパク質によって標的化するためにこれらの細胞にマークをつける。この場合、リガンドはトランスフェリンタンパク質であり、治療用タンパク質はPseudomonas体外毒素（または任意の他の細胞障害性治療用タンパク質）であり得る。トランスフェリン／トランスフェリンレセプター対の腫瘍細胞内在化により、治療用タンパク質の内在化を可能にし、次いで腫瘍細胞に特異的に細胞障害性を与える。トランスフェリン／トランスフェリンレセプター対は、使用され得るリガンドレセプター対の多くの例のうちのたった一つである。さらに、互いに非常に特異的な親和性を有する変異体リガンドおよび変異体レセプターは、内因性タンパク質への結合を避けるために使用され得る。
【００７５】
好適なタンパク質のさらなる例はヒトエンドスタチンおよびキメラPE37/TGF-α融合タンパク質である。エンドスタチンはコラーゲンXVIIIのカルボキシ末端ペプチドであり、これは特徴付けられている（Dingら,PNAS USA 95(1998), 10443）。エンドスタチンが内皮細胞増殖および移動を阻害し、インビトロで内皮細胞のG1停止およびアポトーシスを誘導し、種々の腫瘍モデルにおいて抗腫瘍効果を有することが示されている。ウイルス性DNAおよびエンドスタチンをコードするカチオン性リポソーム複合プラスミドDNAの静脈内または筋肉内注射は、腫瘍においてエンドスタチンの発現レベルの制限を生じた。しかしながら、精製エンドスタチンの腫瘍内注射は、腫瘍増殖の顕著な阻害を示す。Pseudomonas体外毒素は、Pseudomonasaeruginosaにより分泌される細菌性毒素である。PEは、延長因子２（EF-2）を不活化することによりその細胞障害性効果を顕在化し、これにより、哺乳動物細胞におけるタンパク質合成のブロックを生じる。単鎖PEは機能的に３つのドメインに分けられる：ドメインIaは細胞表面レセプターへの結合に必要であり、ドメインIIは標的細胞サイトゾルへ毒素を転移するのに必要であり、ドメインIIIはEF-2を不活化することによる細胞障害性を司る。PE40は、結合ドメインIaを欠く野生型Pseudomonas体外毒素由来である。抗体フラグメントまたはタンパク質リガンドなどの他のタンパク質は、結合ドメインの代わりに挿入され得る。これにより、PE40リガンド融合タンパク質をそのレセプターに特異的にする。非常に特異的な遺伝子工学で作製されたキメラ毒素のうちの一つは、TGFα/PE40融合タンパク質であり、TGFαポリペプチドのＣ末端がPE40タンパク質のＮ末端とインフレームで融合されている。TGFαは上皮成長因子レセプター（EGFR）のリガンドの一つであり、種々の腫瘍細胞の表面に選択的に発現されることが示されている。TGFα-PE40融合タンパク質は、細胞表面に上昇したEGFRを有する腫瘍細胞に対して非常に毒性であり、一方、表面EGFRをほとんど提示していない近くの細胞に対してほとんど毒性ではないことが示されている。TGFα-PE40キメラタンパク質の毒性は、キメラタンパク質をその活性形態に変換するためのタンパク質分解処理工程に依存し、この工程は標的により実施される。タンパク質分解の必要性を克服するため、新規なキメラ毒性タンパク質が、Theuerおよび同僚らにより構築されている（J.biol.Chem.267(1992), 16872）。新規な融合タンパク質はPE37/TGFαと呼ばれ、これは腫瘍細胞に対してTGFα-PE40融合タンパク質よりも高い毒性を示す。
【００７６】
本発明の診断用および／または医薬組成物の特に好ましい態様において、リガンドは、天然に存在するリガンドではなく、レセプターに特異的に結合し得る任意の化合物（例えば、抗体）である。用語「抗体」は、好ましくは、種々のエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体から本質的になる抗体、ならびに別個のモノクローナル抗体調製物に関する。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により、特定のレセプターのフラグメントを含む抗原から作製される（例えば、Koehlerら, Nature 256(1975), 495参照）。本明細書で使用される場合、用語「抗体」（Ab）または「モノクローナル抗体」（Mab）は、レセプターに特異的に結合し得るインタクトな分子および抗体フラグメント（例えば、FabおよびF(ab')2フラグメント）を含むことが意味される。FabおよびF(ab')2フラグメントは、インタクトな抗体のFcフラグメントを欠き、循環からより速やかになくなり、インタクトな抗体よりも小さな非特異的組織結合性を有する（Wahlら,J.Nucl.Med. 24:316-325(1983)）。従って、これらのフラグメント、およびFABの産物または他の免疫グロブリン発現ライブラリーが好ましい。さらに、本発明の抗体は、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体を含む。
【００７７】
抗体リガンドは、例えば、抗体と治療用タンパク質との間の融合タンパク質（例えば、免疫療法用タンパク質）を用いる抗腫瘍治療に有用である：まず、細胞表面レセプターをコードする遺伝子は、静脈内注射された遺伝子工学で作製された細菌およびウイルスによって生きた生物の腫瘍細胞に送達される。かかるレセプターは、例えば、トランスフェリンレセプター、EGFレセプター、ソマトスタチンレセプターなどであり得る。細菌またはウイルス感染後の細胞表面におけるレセプターの過剰発現は、腫瘍細胞をマークするために使用され得る。次に、抗体、好ましくは抗体フラグメント（過剰発現された表面レセプターに特異的）と治療用タンパク質（例えば、任意の型の毒素、表５参照）との間の融合タンパク質（免疫療法用タンパク質）が調製される。静脈内注射された融合タンパク質は、マークされた腫瘍細胞に結合し、腫瘍組織中のこれらの細胞に細胞障害性を示す。
【００７８】
本発明はまた、上記のような微生物または細胞ならびにさらに(a)腫瘍治療および／または転移腫瘍の排除に好適なタンパク質に融合された抗菌化合物および／または(b)検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導し得るタンパク質に融合された抗菌化合物を含有する診断用および／または医薬組成物に関する。抗菌化合物（例えば、ペプチド／タンパク質）と治療用タンパク質との間のかかる融合タンパク質を用いる抗腫瘍治療は、抗菌ペプチド／タンパク質と治療用タンパク質（上記表５参照）との間のハイブリッドタンパク質をコードする融合遺伝子構築物をまず調製することにより実施され得る。タンパク質発現後、ハイブリッドタンパク質は精製され、静脈内注射できる状態になる。次に、例えば、発光細菌（抗菌ペプチド／タンパク質により認識され結合され得る）が、腫瘍特異的蓄積のために被験体に静脈内注射される。腫瘍における抗菌ペプチド／タンパク質の細菌への特異的結合は、腫瘍において特異的に治療用タンパク質を濃縮する助けとなり、従って、腫瘍特異的細胞障害性を顕在化し得る。
【００７９】
さらに、腫瘍治療および／または転移腫瘍の排除に好適なタンパク質は、生物に投与される不活性物質（プロドラッグ）を腫瘍または転移を殺傷する活性物質（すなわち、毒素）に変換する酵素である（遺伝子指向酵素プロドラッグ治療（GDEPT））。GDEPTの原理は、酵素／タンパク質が全身に送達された非毒性プロドラッグを腫瘍に対して細胞障害性である活性毒性薬物に活性化することである。詳細には、GDEPTは二工程処置である。第一工程では、外来酵素をコードする遺伝子が投与され、腫瘍に指向され、特定の転写エレメントを用いて発現され得る。第二工程では、プロドラッグが投与され、腫瘍で発現された外来酵素により活性化される。酵素／タンパク質が腫瘍のみに存在する場合、活性薬物はまた腫瘍のみで生成され、従って腫瘍細胞に対してのみ細胞障害性を示し、同時に全身性の毒性が最小である。酵素／タンパク質をコードする遺伝子は、静脈内注射された本発明の遺伝子工学で作製された細菌、ウイルス、または（哺乳動物）細胞を用いて腫瘍に特異的に送達される。これらの遺伝子は、構成的プロモーターまたはさらに毒素へのプロドラッグの変換が標的組織、すなわち腫瘍のみで生じることを保証する外因的に調節される誘導性プロモーターのいずれかの制御下であり得る。かかるプロモーターは、例えば、IPTG-、抗生物質-、熱-、pH-、光-、金属-、好気性-、宿主細胞-、薬物-、細胞周期-または組織特異的-誘導性プロモーターである。
【００８０】
例えば、酵素は、ほとんど毒性のない形態の化学療法剤、グルクロニルドキソルビシンをより毒性のある形態に変換するグルクロニダーゼであり得る。好ましくは、かかる酵素をコードする遺伝子は、構成的または誘導性プロモーターであるプロモーターにより指向される。本発明の医薬組成物に有用な酵素／プロドラッグ対のさらなる例は、上記表４に挙げられる。
【００８１】
さらに、本願の送達系は、全身適用される場合のその高い毒性により、これまで腫瘍治療に使用され得なかった化合物の適用さえ可能である。かかる化合物としては、延長因子を阻害するタンパク質、リボソームサブユニットに結合するタンパク質、ヌクレオチドを修飾するタンパク質、ヌクレアーゼ、プロテーゼまたはサイトカイン（例えば、IL-2、IL-12など）（実験データが、サイトカインの局所放出が腫瘍の免疫抑制状態に陽性効果を有することを示唆するので）が挙げられる。
【００８２】
さらに、微生物または細胞は、特定の経路（例えば、抗血管新生、アポトーシス、創傷治癒または抗腫瘍増殖）のいくつかまたは全てのタンパク質をコードするBAC（細菌人工染色体）またはMAC（哺乳動物人工染色体）を含み得る。さらに、細胞は、複数の組み合わせでこれらのタンパク質をコードするコンピュータ設計されたサイバー細胞またはサイバーウイルスであり得る。
【００８３】
投与のために、本発明の微生物または細胞は、好ましくは適切な医薬担体とあわされる。適切な医薬担体の例は、当該分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水乳濁液などの乳濁液、種々の型の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。かかる担体は、通常の方法により調剤され得、適切な用量で被験体に投与されうる。微生物または細胞の投与は、種々の方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所または皮内投与により実施されうる。好ましい投与経路は、静脈内注射である。投与経路は、もちろん、腫瘍の性質、および医薬組成物に含まれる微生物または細胞の種類に依存する。投薬養生法は、かかりつけの医師により様々な臨床因子に基づいて決定される。医学分野で周知のように、任意の１人の患者に対する投薬は、患者の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与の時間および経路、腫瘍の種類、大きさおよび局在化、一般的健康および同時に投与される他の薬物を含む多くの因子に依存する。
【００８４】
本発明の微生物または細胞で処置されうるのに好適な腫瘍は、膀胱腫瘍、胸部腫瘍、前立腺腫瘍、脳腫瘍、大腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣癌、および膵臓癌；肝臓癌、皮膚腫瘍である。
【００８５】
本発明を実施例により説明する。
【００８６】
実施例１：材料および方法
(A)細菌株。使用した細菌株は、弱毒化したSalmonellatyphimurium(SL7207 hisG46, DEL407[aroA544::Ynl0])、弱毒化したVibrio cholerae(Bengal 2Serotyp 0139, M010 DattRS1)および弱毒化したListeria monocytogenes(D2 mpl, actA, plcB)であった。細菌株は、Prof.W. Goebel(University of Wuerzburg, Germany)の好意により提供された 。
【００８７】
(B)プラスミド構築物。luxCDABEカセットを含有するプラスミドpLITE201を、Dr. Marines, Biotech 24, 1998, 56-58)から得た。キシロースプロモーターの制御下でgfp-cDNAのオペロン配列、luxAB、luxCDおよびluxEを有するプラスミドpXylA-dualは、Dr. Phil Hill(University of Nottingham,UK)の好意により提供された。
【００８８】
(C)細菌の形質転換。細菌をエレクトロポレーションにより形質転換した。
【００８９】
(D)腫瘍細胞株。10％(v/v)FBSおよび1×ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したRPMI-1640培地(Cellgro,Mediatech, Inc., Herndon, VA)において、ラットC6ニトロソ尿素誘導神経膠腫細胞株(ATCC, Rockille, MID)を培養した。L-グルタミンおよび10％(v/v)FBSを補充したDMEM培地(Cellgro,Mediatech, Inc., Herndon, VA)において、ヒトPC3前立腺癌細胞株(ATCC, Rockville, MD)およびMB-49マウス膀胱腫瘍細胞およびラット9L神経膠腫細胞を維持した。HT1080線維肉腫細胞(ATCC,Manassas, VA)を、10％FBSおよび1×ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したF12最少必須培地(Cellgro, Mediatech,Inc., Herndon, VA)において培養した。5％FBSおよび560μg/mlのG418(Life Technologies, GrandIsland, NY)を補充したDMEM/F12培地において、pro-IGF-II cDNAを保有するプラスミド(Dr. Daisy De Leon,Loma Linda University, Loma Linda, CAから入手)で恒久的に形質転換されたMCF-7ヒト乳癌細胞株(ATCC,Rockville, MD)を培養した。
【００９０】
(E)発光安定形質転換細胞株を作製するためのレトロウイルスの作製および増殖。PT67パック細胞(Clontech, Palo Alto,CA)を10％(v/v)FBSで補充したDMEM培地において培養した。70％コンフルエンスで、12時間リン酸カルシウム沈殿法(ProfectionMammalian Transfection Systems, Promega, Madison, WI)を用いてPT67細胞をpLEIN(Clontech,Palo Alto, CA)で形質転換した。この時に新しい培地を補給した。形質転換の48時間後にPT67細胞から回収されたレトロウイルスの上清を、0.45μmのフィルターを介して濾過し、標的HT1080細胞にポリブレンと一緒に最終濃度4μg/mlまで添加した。24時間後、培地を置き換え、細胞を400μg/mlでのG418選択で処理し、1200μg/mlまで徐々に増加した。
【００９１】
(F)組換えワクシニアウイルスの増殖。ワクシニアウイルスLister株(LIVP)を野生型ウイルスとして使用した。組換えワクシニアウイルスrVV-ruc-gfpを、ワクシニアウイルスゲノムへruc-gfp-カセット(Wangら、Proc.Biolumin. Chemilumin. 9, 1996, 419-422)を相同組換えを介して挿入することにより構築した。CV-1細胞単層への0.1pfu/細胞の感染多重度(MOI)でのウイルス粒子の添加、続く10分毎に簡単に撹拌する37℃で１時間のインキュベーションにより、CV-1細胞においてウイルスを増幅した。この時に、ウイルス粒子を有する上清液体を除去し、細胞単層を血清無含有培地で一度洗浄した。次いで、完全に増殖した培地を添加し、細胞を37℃でインキュベートした。CV-1細胞において増殖したrVV-ruc-gfpビリオンをスクロース勾配を介して精製した。プラーク検定を感染の72時間後に使用し、50％結晶バイオレット溶液を含有するエタノールで細胞を染色することにより、組換えウイルスの力価を決定した。
【００９２】
(G)腫瘍移植片を保有するマウスの作製。5〜6週齢の雄BALB/c無胸腺nu/nuマウス(体重25〜30g)およびLewisラット(体重250〜300g)をHarlan(Frederick,MD)から購入した。C57BL/6J Min/+マウスをJackson Laboratories(Bar Harbor, ME)から入手し、Min(多発性腸管腫瘍形成)は、ネズミApc遺伝子のコドン850におけるナンセンス変異を含む常染色体優勢特性であり、この動物が突発性腸管腺腫形成を受けやすくする。
【００９３】
ヌードマウスにおいて腫瘍を得るために、C6神経膠腫細胞を増殖し、採取し、細胞数をトリパンブルー排除法により決定した。消毒薬を皮膚表面に塗布し、次いで約5×105細胞を100μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁し、各マウスの右側面大腿部に皮下注射した。腫瘍の大きさをデジタルカリパスを用いて記録することにより腫瘍増殖をモニターした。腫瘍容積(mm3)を式(L×H×W)/2(式中、Lは腫瘍の長さであり、Wは腫瘍の幅であり、Hは腫瘍の高さ(mm)である)により見積もった。
【００９４】
ラットの頭部にC6神経膠腫細胞を注射することにより大脳内神経膠腫を作製した。注射の前に、ペントバルビタールナトリウム(Nembutal（登録商標）ナトリウム溶液、AbbotLaboratories, North Chicago, IL; 60mg/kg体重)を用いてラットに麻酔をかけた。正中頭皮切開(0.5〜1cm)を作製し、皮膚を収縮させ、ブレグマ(brigma)の左に2mm、かつ後方2.5mmの位置で頭蓋に1mmのバーホールを作製した。29ゲージ針を備え、かつ定位固定ホルダーに固定されたインスリン注射器に、腫瘍細胞をピペットで取った。バーホールを介して3mmの深さまで垂直に針を挿入した。10μl容積で5×105のC6細胞の脳への注射後、針を15秒定位置に保ち、次いで引き抜いた。皮膚切開を外科用クリップで閉じた。3×106のPC3ヒト前立腺細胞の皮下移植の後、1ヶ月の期間をかけて、皮下前立腺腫瘍を保有するマウスを作製した。
【００９５】
MB-49マウス膀胱腫瘍細胞をC57マウス膀胱に移植して、膀胱腫瘍を有する動物を作製した。乳癌を有する動物(TianおよびDeLeon、刊行物として提出)を作製するために、雌ヌードマウスの皮膚に0.72mg/90日放出17β-エストラジオールペレット(InnovativeResearch, Rockville, MD)を最初に移植し、胸部腫瘍発達および転移を促進させた。エストロゲンペレット移植の1日後、pro-IGF-II(Dullら、Nature310 (1984), 777-781)で形質転換した1×106のMCF-7ヒト乳癌細胞を、乳房脂肪パッドに移植した。正常位移植片のために、移植細胞から発達した腫瘍を一部切除し、乳房脂肪パッドへの組織移植のために1mm3立方体に切り分けた。
【００９６】
(H)生存動物におけるレニラルシフェラーゼのアッセイ。それぞれレニラルシフェラーゼアッセイ前にNembutal(60mg/kg体重)を用いてマウスに麻酔をかけた。5μlのセレンテラジン(0.5μg/μl希釈エタノール溶液)および95μlのルシフェラーゼアッセイバッファー(0.5MNaCl; 1mM EDTA;および0.1Mリン酸カリウム、pH7.4)の混合物の静脈内注射後、レニラルシフェラーゼ活性を測定した。次いで、生存動物全体を暗ボックス中でHamamatsuARGUS100弱光ビデオカメラを用いて画像化し、画像をImage Pro Plus3.1ソフトウエア(Media Cybernetics, SilverSpring, MD)を用いて記録した。発光の部位を正確に位置付けるために、動物のグレースケール画像上に偽着色光子発生画像を重ねた。
【００９７】
(I)発光および蛍光の検出。画像化直前に、Nembutal（登録商標）(60mg/kg体重)を用いてマウスおよびラットに麻酔をかけた。光子計数および重ねた画像の記録(ARGUS100 Hamamatsu, Hamamatsu, Japan)のために、動物を暗ボックス内に置いた。光子回収は動物の腹面および背面視野から１分間であった。次いで光画像を記録し、次いで弱光画像を光画像に重ね、発光活性の位置を記録した。
【００９８】
生存動物の腫瘍におけるGFP発現の画像化を、水銀ランプパワーサプライおよびGFPフィルター(470nmで励起)を備え付けたLeica MZ8立体蛍光顕微鏡を用いて行った。SONYDKC-5000 3CCDデジタルフォトカメラを使用して画像を記録した。
【００９９】
(J)腫瘍組織の組織学。麻酔下において、動物を過剰用量のNembutal（登録商標）を用いて安楽死させた。目的の組織を取り出し、Tissue-TekOCT化合物(Miles Scientific, Naperville, IL)に埋め込み、固定せずに液体窒素中で直ちに凍結させた。Reichert-JungCryocut 1800クリオスタットを用いて-20℃で凍結切片を切断した。Leica蛍光顕微鏡下で組織のGFP蛍光をモニターし、画像をPhotoshopソフトウエアを用いて記録した。
【０１００】
実施例２：組換えワクシニアウイルスrVV-ruc-gfpのマウスへの静脈内注射により得られた結果
(A)免疫不全マウスにおけるウイルス媒介マーカー遺伝子発現のモニタリング
レニラルシフェラーゼ-GFP融合発現カセット(rVV-ruc-gfp)を保有するワクシニアウイルス(1×108pfu)を、腫瘍を有さないヌードマウスに静脈内に導入した。弱光イメージャー下で動物を3日ごとに1回2週間の期間にわたり観察し、セレンテラジンの静脈内注射直後のルシフェラーゼ触媒発光をモニターし、蛍光顕微鏡下においてGFP発現を明視化した。外部から画像化した場合、明白な発光もグリーン蛍光も、小さな皮膚病変を有する一定の位置を除いて動物において検出されなかった。かかる発光および蛍光シグナルは、いったん病変が治癒すると数日後に消失した。ウイルス感染の1週間後および2週間後に動物を屠殺し、その器官を取り出し、発光およびGFP蛍光シグナルの存在について試験した。ウイルス注射の１週間後、脳、肝臓、肺、脾臓、腎臓または精巣において発光もグリーン蛍光も検出し得なかった。これらの結果は、rVV-ruc-gfpウイルスは注射後に器官特異性を示さず、ウイルスは血流を介する全身送達の後すぐに免疫系により動物から除去されるようであることを示した。
【０１０１】
(B)生存ヌードマウスの神経膠腫におけるワクシニアウイルス媒介マーカー遺伝子発現の明視化
皮下移植したC6神経膠腫を保有するヌードマウスにおける注射したワクシニアウイルスの分布を調査した。約500mm3の大きさの腫瘍を有するヌードマウスに、1×108pfuのrVV-ruc-gfpウイルスを用いて静脈内注射した。ウイルス注射の7日後、蛍光顕微鏡下でGFP発現について動物をモニターし、約2500mm3の大きさまで増殖した腫瘍においてウイルス感染の存在および多重度を決定した。驚くべきことに、生存動物の腫瘍領域においてのみグリーン蛍光を検出した。ウイルス注射の7日後、GFP蛍光は、腫瘍領域に限定されたパッチ様パターンに非常に強度に局在化された(図1A〜A'')。血管分枝の末端にしばしば見られるこれらのパッチは、毛細管の漏出性末端を取り巻く腫瘍細胞の局部ウイルス感染を示しうる。同じ腫瘍のリアルタイム観察の間に、これらのパッチの中心からのGFPシグナルが消失を開始し、新しいグリーン蛍光中心が、消滅パッチの周囲でリングの形態で現れる。強いGFP蛍光の新しい部位は、腫瘍の増殖および拡大期間に腫瘍内部の近くの細胞へのウイルス感染の進行から生じうる。マウスの注意深い検査の後、腫瘍領域を除いて、体表面上または解剖した器官内以外の場所で、検出可能なグリーン蛍光は見られなかった。この実験は、成熟した充実性腫瘍が、発光に基づいて標識ワクシニアウイルスにより容易に局在化されうることをはっきり示し、ウイルス粒子の腫瘍組織に対する親和性もまた示した。
【０１０２】
腫瘍の大きさおよび血管新生が腫瘍におけるウイルス保持に対する決定的な因子であるかどうかを決定するために、ヌードマウスに、皮下C6細胞移植の1日後、1×108のrVV-ruc-gfpワクシニアウイルス粒子を用いて静脈内注射した。驚くべきことに、ウイルス注射の1日後、約25mm3の容積を有する5日齢C6腫瘍においてGFP発現が見られた(図1B〜B'')。5日より若い移植腫瘍におけるGFP発現の明視化による標識ワクシニアウイルス腫瘍標的化の試験は、生存マウスにおいて実施できなかった。なぜなら、蛍光顕微鏡下での検出が可能となるのに十分なレベルのマーカー遺伝子発現には約4日間必要であったからである。
【０１０３】
宿主の血流へのrVV-ruc-gfpワクシニアウイルスの注射が非侵襲性腫瘍検出に適切な腫瘍におけるGFP発現および蓄積を生じるという知見は、本発明者らがリアルタイムで同じ動物におけるこのウイルスの侵入および複製プロセスを追跡するのを可能にした(図1C〜C''、D〜D''、E〜E'')。GFP蛍光の連続的な増加レベルを、動物を屠殺する前に予定された時間であるウイルス注射後20日間通じて同じ動物において観察した。検出可能な蛍光におけるかかる増加は、腫瘍組織における非常に強いウイルス複製を示し、後者はウイルス複製についての保護免疫学的寛容環境として機能することを示した。腫瘍におけるウイルス複製は、細胞培養物における単離されたウイルス粒子のウイルス力価および発光を決定することにより実証された。興味深いことに、拡大している腫瘍の周辺内での血管の局在化および新血管新生は、容易に可視であり、明るいグリーン蛍光バックグラウンドについて外部に明視化することにより確認した(図1A〜A''、D〜D''、E〜E''および図2)。
【０１０４】
腫瘍内部のウイルス感染の位置を決定するために、動物を屠殺し、腫瘍の上の皮膚を注意深く折り返して腫瘍を曝露した。曝露した腫瘍において、GFP蛍光がもっぱら腫瘍組織において集中しているのが見られた(図3B〜B''およびD〜D'')。非腫瘍状大腿部筋肉は、図3D〜D''の矢印に示されるようにウイルス感染のいずれの蛍光も示さなかった。腫瘍をおおった皮膚もまた非蛍光であった(図3B〜B''およびD〜D''において星印により示される)。しかしながら、腫瘍の断面図は、活発に分裂している腫瘍細胞がおそらく位置している腫瘍の周辺において、強いグリーン蛍光領域がパッチとしてほとんど見出されることを明らかにした(図3C〜C''における二重矢印)。
【０１０５】
GFP発現に基づくC6神経膠腫におけるウイルス感染のパターンをさらに調査するために、蛍光顕微鏡下における顕微鏡解析用に腫瘍組織を切断した。種々の組織切片の比較解析は、GFP蛍光が腫瘍内部の細胞の大クラスター中に存在することを明らかにしたが(図4)、心臓、肺、肝臓、脾臓、および腎臓などの正常な組織中で蛍光は可視でなかった。
【０１０６】
GFPに加えて、組換えrVV-ruc-gfpウイルスは、GFPとの融合タンパク質の形態でレニラルシフェラーゼをコードする第２マーカー遺伝子を保有した。それゆえに、本発明者らは、腫瘍においてレニラルシフェラーゼに由来する発光とGFP蛍光の部位とを直接重ね合わせ得た。セレンテラジン(レニラルシフェラーゼに対する基質)を静脈内注射により送達した直後、非常に強いルシフェラーゼ活性を弱光ビデオカメラの下で腫瘍領域においてのみ記録した(図５)。光検出の飽和を避けるために弱光ビデオカメラの感度を下げることにより、本発明者らは、腫瘍の周辺における局在化したパッチ中のレニラルシフェラーゼ遺伝子発現を同定し得た。これらのパッチ様パターンは、GFPシグナルに正確に相関した。
【０１０７】
(C)動物に移植した種々の腫瘍に対する、血流に送達されたワクシニアウイルスの活性
ワクシニアウイルスの誘引が神経膠腫に限定されるかどうかまたはこの誘引が他の腫瘍において観察されうるかどうかを決定するために、組換えワクシニアウイルスを、種々の型の移植腫瘍を有するマウスに組換え的に導入した。これらの腫瘍モデルの１つは、移植された皮下PC-3ヒト前立腺癌を有するヌードマウスであった。腫瘍発達が由来するPC3移植片は移植した皮下神経膠腫に比べて非常にゆっくりした速度で増殖したが、これらの腫瘍は同一の力価(1×108)を静脈内注射した場合ワクシニアウイルス感染に関して同一の動力学を示した(図6A〜A'')。神経膠腫に関する本発明者らの知見に類似して、ウイルス注射の4日後にGFP発現を最初に検出し、蛍光は3週間の観察期間を通して続いた。
【０１０８】
確立された胸部腫瘍を有する雌ヌードマウスをまた、標識ワクシニア注射のために使用した。これらの胸部腫瘍を、pro-IGF-11 cDNAで形質転換したMCF-7ヒト乳癌細胞の移植片を動物が受けた後6ヶ月間増殖させた。ワクシニアウイルス注射の時に、腫瘍は最大増殖に達し、腫瘍容積(約400〜500mm3)は、実験期間中有意に変化しなかった。先の実験と同様に、1×108のrVV-ruc-gfpウイルス粒子の静脈内送達の6日後、強いGFP発現を胸部腫瘍領域において観察し(図6B〜B''、図7A〜A''およびB〜B'')、体の他の場所では観察されなかった。
【０１０９】
ウイルス感染胸部腫瘍の断面図の調査は、感染の中心または周辺の好みを示すことなく腫瘍のいたるところに発光「島」を明らかにした(図7C〜C'')。これらの胸部腫瘍モデルに使用したMCF-7腫瘍細胞は転移することが知られており、原発充実性腫瘍に加えて体の左側に見出されるより小さい転移腫瘍はGFP蛍光を示した(図7D〜D''、E〜E''およびF〜F'')。摘出した肺組織をまた、転移の検出のために調査した。肺の表面上の直径0.5mm程の転移腫瘍は、GFP蛍光について陽性であった(図7G〜G'')。強いレニラルシフェラーゼ媒介発光の存在は、基質セレンテラジンを生存動物に静脈内注射した場合これらの胸部腫瘍においてルシフェラーゼ-GFP融合タンパク質の発現を確認したが、体の他の場所では確認されなかった。これらの実験は、静脈内送達されたワクシニアウイルス粒子は、おそらく腫瘍微環境の免疫無防備状態の結果としてヌードマウスの原発および転移胸部腫瘍において選択的に蓄積および複製されることを示した。
【０１１０】
ウイルス粒子が腫瘍の外に移動し、循環に再び入りうるかどうかを決定するために、本発明者らは、C6神経膠腫細胞をマウスの大腿部に注射し、標識ワクシニアウイルスで感染された胸部腫瘍をすでに保有している動物に第２の腫瘍を形成した。ウイルス粒子が腫瘍から放出され、有意な数で循環に再び入る場合、それらは新しく移植した神経膠腫にコロニーを作製しうる。これらの第２の腫瘍のモニタリングは、神経膠腫細胞の移植の7日および14日後、新しい神経膠腫においてGFPシグナルが可視でないことを示した。新しく移植した神経膠腫が標識ワクシニアウイルスにより標的化されうることを説明するために、rVV-ruc-gfpウイルスの第２用量(1×108pfu)を静脈内注射した。5日後、もとの胸部腫瘍に見られるGFP発現に加えて新しく形成した神経膠腫において腫瘍特異的GFP発現を検出した。これらの知見は、感染された腫瘍におけるウイルス粒子は、循環に再放出されることが全くないか、または第２の腫瘍において感染および複製するのに十分な数で放出されないことを示唆した。
【０１１１】
頭蓋内C6ラット神経膠腫を有するLewisラットおよび膀胱においてMB-49マウス膀胱腫瘍を有するC57マウスを含む２つのさらなる腫瘍モデルを、ワクシニア感染に使用した。ウイルス粒子の腫瘍親和性がT-リンパ球機能の減少したヌードマウスにおける腫瘍に限定された現象であるかどうか、またはそれは免疫適格動物においてもまた示されうる腫瘍の一般的な保護特性であるかどうかを決定するために、頭蓋内C6ラット神経膠腫を有するLewisラットおよび膀胱においてMB-49マウス膀胱腫瘍を有するC57マウスを使用した。100μl容積中全5×105のC6神経膠腫細胞を、4匹の免疫適格Lewisラットのうちの2匹の脳に定位に移植し、腫瘍を5日間増殖させた。対照として提供するために、他の2匹のラットにリン酸緩衝生理食塩水を用いて頭蓋内注射した。6日目に、全4匹のラットに大腿部血管を介してrVV-ruc-gfpウイルス粒子を用いて静脈内注射した。ウイルス注射の5日後、全4匹のマウスを屠殺し、蛍光顕微鏡による解析のためにそれらの脳を注意深く摘出した。移植頭蓋内腫瘍を有する脳でGFP発現を検出し(図6C〜C'')、一方対照の脳ではGFP発現は見られなかった。平行実験において、膀胱腫瘍を有するかまたは有さないC57マウスを２群に分けた。１つの群にrVV-ruc-gfpワクシニアウイルス(1×108pfu)を用いて静脈内注射し、他方に対照として生理食塩水を用いて静脈内注射した。ウイルス注射の5日後、動物を屠殺し、蛍光顕微鏡下で調査した。C57マウスの膀胱腫瘍領域でGFP発現を観察したが、対照マウスでは観察しなかった(図6D〜D'')。
【０１１２】
まとめると、これらの実験は、ワクシニアウイルス粒子が、種々の腫瘍内に選択的に蓄積および保持され、おそらく腫瘍微環境により保護され、それらは免疫無防備ならびに免疫適格動物の非腫瘍性組織において生存し得なかったことを示す。発光２重マーカー遺伝子を保有するワクシニアウイルスを静脈内注射することによる腫瘍標的化プロセスは、ワクシニアウイルス系の生存動物における原発および転移腫瘍を検出する能力を説明した。
【０１１３】
実施例３：細菌および哺乳動物発光細胞のマウスへの静脈内注射の結果
（Ａ）静脈内注射後の動物全体に存在する発光細菌の明視化
動物における静脈内注射した発光細菌の最終結果を決定するために、50μl中pLITE201プラスミドを保有する107の細菌を、マウスの左大腿部血管に麻酔下に注射した。縫合での切開の閉鎖の後、マウスを弱光イメージャー(ARGUS100 Camera System, Hamamatsu, Hamamatsu, Japan)下でリアルタイムでモニターし、光子を1分間回収した。画像化を2日の時間間隔で繰り返し、所定の動物から発光の存在を決定した。マウスへの細菌の静脈内注射の後の発光の分布パターンは、使用した細菌株に特有であることを見出した。血流への弱毒化したV.choleraの注射は、肝臓において局在化した発光を直ちに生じた。しかしながら、S.typhimuriumの注射は、動物の体のいたるところに広まり、宿主細胞系との相互作用における差異を示唆した(図8A〜8D)。感染の24時間後および48時間後の同じ動物の画像化は、より早い時間から検出可能な発光の全てが迅速に減少し、注射した動物から完全に除去されることを示した。これらの知見は、大腿部血管を介して血流に注射された発光細菌が取り除かれることを示唆する。このプロセスは、摘出された器官の光子発生解析により確認され、発光を欠如することが見出された。同様のデータが、免疫適格マウスおよびラットにおいて得られ、血液からの細菌の除去が両方の系において有効であることが示唆された。
【０１１４】
（Ｂ）細菌はヌードマウスの神経膠腫内にホーミング(home)する
細菌が腫瘍性組織において優先的にコロニー形成するか否かを調べるため、右後肢に10日目の腫瘍（約500mm3）を有するヌードマウスに、107 S. typhimuriumまたは107V. choleraを含む50μl容量の細菌懸濁液を、大腿静脈を介して静脈内注射した。注射後、切開した創傷を縫合し、動物を弱光画像形成装置(low light imager)下で６日間モニターした。各観察時点で、正確に1分間光子を集めた。S. typhimuriumを注射したマウスでは、蛍光細菌が動物の全身に散在しており、無腫瘍マウスにおける所見と類似した（図９Ａ）。V.choleraを注射したヌードマウスは、観察初期の間、肝臓領域にのみ蛍光活性を示した（図９Ｅ）。注射した細菌の種とは無関係に、注射２日後、腫瘍領域にのみ蛍光活性が観察された（図９Ｂおよび９Ｆ）。注射後４日目および６日目における暗部画像形成装置下でのマウスのモニタリングにより、S.typhimuriumを注射した動物において、検出可能な蛍光の量の減少が示された（図９Ｃおよび９Ｄ）。この所見は、V. choleraを注射したマウスの腫瘍における所見と顕著に対照的であり、これは、腫瘍塊における細菌の生存だけでなく、細菌の増殖を示し、発光の劇的な増加を示した（図９Ｇおよび９Ｈ）。
【０１１５】
右後肢皮下にＰＣ３ヒト前立腺腫瘍を有するヌードマウスに、gfp cDNAを有するpsod-gfpプラスミドDNAで形質転換した107 の弱毒化L. monocytogenesを静脈内注射した。GFP蛍光を蛍光立体顕微鏡下で観察した。細菌注射の27時間後、GFPシグナルは腫瘍領域のみにおいて検出された（図10）。動物の他の部分ではGFPシグナルは観察されなかった。
【０１１６】
（Ｃ）細菌感染に必要な神経膠腫の最小サイズおよび時間(age)の測定
この実験の目的は、腫瘍のサイズが、その細菌によってコロニー形成される能力に対してなんらかの影響を有するか否かを調べることである。腫瘍は、記載のようにして神経膠腫細胞の皮下注射によりヌードマウスの右後肢に誘導した。腫瘍誘導の０、２、４、６、８および10日目、pLITE201プラスミドを有する弱毒化S. typhimuriumおよびV. choleraを、大腿静脈を介して静脈内注射した。注射後２日目および４日目に、弱光画像形成装置下で正確に1分間光子を集めることにより腫瘍における蛍光細菌の存在を調べた。また、デジタルカリパスを用いて大きさを測ることにより腫瘍体積を測定した。腫瘍において蛍光活性が認められた最も早い時点は腫瘍誘導から８日目であった。相当する腫瘍体積は約２００mm3であった。
【０１１７】
（Ｄ）細菌はヌードマウスの乳房腫瘍内にホーミングする
腫瘍の細菌コロニー形成が神経膠腫細胞に限定されるか否かを調べるため、またはこのことがすべての腫瘍について観察される一般現象であるか否かを調べるため、右乳房パッドに腫瘍を有する雌ヌードマウスに、107 V. choleraを含む50μl容量の細菌懸濁液を静脈内注射した。播種後最初の10分間以内で、弱光画像形成装置下で1分間、動物をモニターすると、肝臓領域において典型的な蛍光パターンが示された（図１１Ａ）。２日後、肝臓は明白な蛍光細菌が消失したが、乳房腫瘍は標識V.choleraによりコロニー形成された。メインの腫瘍に加えて、左乳房に転移性腫瘍が蛍光活性を示した（図１１Ｂ）。５日目、動物は、切開創傷にコロニー形成した細菌の消失を示したが、腫瘍は蛍光を発したままであった（図１１Ｃ）。図１１Ｄは、メインの腫瘍において継続したコロニー形成および増殖を示したが、転移性の小さい腫瘍では消失した。蛍光活性は、右乳房腫瘍において45日間にわたって継続した。同様の実験を、大腸菌を用いて行なうと、細菌による腫瘍内へのホーミングは種依存性でないことが示された（図１１Ｅおよび１１Ｆ）。
【０１１８】
腫瘍からの細菌が、有意な量で血流に入り、他の部位でコロニー形成するか否かを調べるため、第２の腫瘍（Ｃ６神経膠腫）をこれらの動物の右後肢において誘導した。腫瘍を10日間、成長させた。神経膠腫において蛍光活性は観察されず、これは、この腫瘍でのコロニー形成を引き起こし得る有意な細菌の非存在を示す。しかしながら、動物に107の弱毒化V.choleraを静脈内に再チャレンジすると、脚部腫瘍は強い蛍光活性を示した。
【０１１９】
これらの実験の所見は、より大きな腫瘍は、経時的に、より効果的に細菌を保持することを示す。さらに、腫瘍内の細菌は、他の腫瘍などの感受性部位に感染するのに充分な量では血液中に漏出しない。
【０１２０】
（Ｅ）細菌は免疫応答性マウスの膀胱腫瘍内にホーミングする
Ｃ５７マウスに、luxオペロンをコードするpLITE201で形質転換した107の弱毒化V.choleraを静脈内注射した。細菌送達後９日目、弱光画像形成装置下で1分間の光子収集により蛍光活性を記録した。動物の全身のうち膀胱領域において発光が認められた（図１２Ａ）。動物を屠殺し、腹部切開を行なって膀胱を露出させた。蛍光活性が膀胱に限定されることが明確に確認された（図１２Ｂ）。マウスから膀胱を取り出すと、動物においてどこにも蛍光活性が見えなくなったが、切除した膀胱は発光を示し続けた（図１２Ｃ）。この実験の結果に基づくと、免疫応答性マウスおよびヌードマウスにおいて、細菌は腫瘍を標的化し得る。さらに、細菌はより小さい腫瘍も標的化し得る。
【０１２１】
（Ｆ）細菌はラットの脳の神経膠腫内にホーミングする
免疫応答性動物において、細菌が血液脳関門を通過して腫瘍を標的化し得るか否かを調べるため、脳に神経膠腫を有するルイスラットに、pLITE201プラスミドを有する108の弱毒化V. choleraを、左大腿静脈を介して静脈内注射した。翌日、すべての動物を弱光画像形成装置下で１分間モニターし、頭蓋を通して低レベルの蛍光活性が観察された。ラットを屠殺し、蛍光細菌の正確な位置をさらに評価するために脳組織をひとかけら取出した。画像形成装置下での切除脳の可視化により、脳の特定の領域において強い蛍光活性が示された（図１３Ａ）。標識細菌を静脈内注射した、腫瘍を有さない対照ラットの同様の画像形成では、蛍光活性が全く存在しないことが示された（図１３Ｂ）。
【０１２２】
（Ｇ）形質転換ヒト線維肉腫細胞はヌードマウスの皮下神経膠腫内にホーミングする
ヒト乳房腫瘍を有するヌードマウスに、pLEIN由来レトロウイルスで終生(permanent)形質転換された、５×105のヒト線維肉腫細胞を静脈内注射した。注射の7日後、動物をNembutalで麻酔し、蛍光立体顕微鏡下でモニターした。蛍光細胞が、皮膚を通して、マウスの全身のうち腫瘍領域のみに認められた（図１４Ａ１〜３）。重層皮膚の反転により腫瘍組織を露出させると（図１４Ｂ１〜３）、腫瘍の断面において（図１４Ｃ１〜３）、蛍光パッチが異なる領域に可視化された。マウスの器官を詳細に検査すると、動物の脚において蛍光細胞の小集団の存在が示され、これは、腫瘍性組織に加え、肺に対する線維肉腫細胞の親和性を示す。
【０１２３】
実施例４：  発光性タンパク質コード発現カセットおよびシス配置の治療用遺伝子発現構築物を有する細菌プラスミドベクターの構築
【０１２４】
（Ａ）原理
上述の発光性発現系を用いて、動物において45日までの間、発光に基づいて腫瘍の画像形成を行うことができた。これらの所見は、選別の非存在下での細菌における顕著なＤＮＡ安定性を示唆する。したがって、発光性タンパク質発現カセットとシス配置で治療用遺伝子カセットを同じレプリコン上に配置することにより、発光を治療用構築物の存在および安定性の指標として使用し得る。発光性タンパク質とは対照的に、治療用タンパク質、エンドスタチンおよびシュードモナス体外毒素／TGFα融合タンパク質は、腫瘍成長の阻害のため、細菌から培地内または腫瘍細胞のサイトゾル内に分泌されることが必要である。細胞外複製大腸菌から腫瘍内へのタンパク質の分泌を達成するため、異なるシグナル配列を有する２つの構築物を設計し得る。エンドスタチンの分泌のため、ｏｍｐＦシグナル配列をエンドスタチンのコード領域の上流に配置し得、これは、原形質周囲空間への分泌を容易にする。エンドスタチンを培地内に放出させるため、さらなるタンパク質、ＰＡＳタンパク質をエンドスタチンと同時発現させる必要がある。ＰＡＳは、膜漏出および分泌タンパク質の培地内への放出を引き起こすことが示されている（Tokugawaら,J. Biotechnol. 37 (1994), 33; Tokugawaら, J. Biotechnol. 35 (1994), 69）。大腸菌からのシュードモナス体外毒素／TGFα融合タンパク質の分泌のための第２の構築物は、融合遺伝子の上流にＯｍｐＡシグナル配列を有し、原形質周囲空間から培地内への放出は、体外毒素の第IIドメインに存在する配列により促進される（Chaudharyら,PNAS 85 (1988), 2939: Kondoら, J. Biol. Chem. 263 (1988), 9470; KiharaおよびPastan,Bioconj. Chem. 5 (1994), 532）。L. monocytogenesからのエンドスタチンおよびシュードモナス体外毒素／TGFα融合タンパク質の分泌を促進するた、リステリオリジン(listeriolysin)（ＬＬＯ）（Mengaudら,Infect. Immun. 56 (1988), 766）を各コード配列の上流に配置し得る。
【０１２５】
細菌におけるエンドスタチンおよびシュードモナス体外毒素／TGFα融合タンパク質発現レベルの調節のため、治療用タンパク質をコードする遺伝子がT7プロモーターまたはPspac合成プロモーターの制御下にあるベクターを作製し得る（FreitagおよびJacobs,Infect. Immun. 67 (1999), 1844）。外因性誘導なしでは、治療用タンパク質のレベルは大腸菌およびL. monocytogenesにおいて低い。細菌における治療用タンパク質の最小レベルは、操作した細菌の静脈内注射後でのより高い安全性を提供する。以下に、大腸菌およびL.monocytogenesにおける、エンドスタチンおよびシュードモナス体外毒素／TGFα融合タンパク質の構成的および調節された発現のための６つのプラスミドＤＮＡの構築を記載する。大腸菌内に伝達されるすべてのプラスミドは構成的に発現される細菌Luxオペロンを有し、L.monocytogenes内に伝達されるすべてのプラスミドは構成的に発現されるsod-gfpカセットを有する。プラスミドBSPT#1-ESiおよびBSPT#2-Ptiは大腸菌のみにおいて複製可能であり、プラスミドBSPT#3、#4、#5および#6は大腸菌およびL.monocytogenesにおいて複製する。
【０１２６】
（Ｂ）タンパク質発現および大腸菌からの分泌のためのプラスミドベクターの構築
大腸菌内で用いられるエンドスタチン分泌ベクターの構築は以下の通りである。ヒトエンドスタチンコード配列（591bp）を、両端に必要な制限部位を導入したプラスミドpES3からＰＣＲにより増幅し、次いでpBluescript (Clontech,Corp., USA)クローニングベクターにライゲートしてpBlue-ESを作製する。ｏｍｐＦシグナル配列（Nagahariら, EMBO J. 4(1985), 3589）をTaqポリメラーゼで増幅し、エンドスタチン配列の上流にインフレームに挿入してpBlue-ompF/ESを作製する。T7プロモーターにより駆動される発現カセットを切り出し、上記実施例１（Ｂ）に記載の、luxCDABEカセットを保有するpLITE201ベクター内に挿入し、プラスミドpLITE-ompF/ESを作製する。ＰＡＳ因子（76アミノ酸のポリペプチド）をコードする配列を、プライマー5'-GGGAAAGACATGAAACGCTTA3'-および 5'-AAACAACGAGTGAATTAGCGCT-3'を用い、Taqポリメラーゼにより、Vibrioalginolyticus（以前はAchromobacter iophagusと称した）（NCIB 11038）の染色体ＤＮＡから増幅し、pCR-Blunt(Clontech, Corp., USA)のマルチクローニングサイトに挿入し、lacプロモーターの制御下の発現カセットを作製する。得られるプラスミドをpCR-PASと命名する。pas遺伝子と連結されたlacプロモーターをpCR-PASから切り出し、pLITEompF/ESに挿入して最終プラスミドBSPT#1-ESIを得る。
【０１２７】
プラスミドpVC85（Kondoら,1998, J. Biol. Chem. 263: 9470-9475）は、T7プロモーター、続いてompAシグナル配列、ならびにシュードモナス体外毒素の第２および第３ドメインをコードする配列（PE40）を含有する。PE40をコードするＤＮＡ配列を制限酵素で切り出し、プラスミドCT4（KiharaおよびPastan,1994, Bioconjug. Chem. 5; 532-538）から得たPE37/TGFα（シュードモナス体外毒素Ａ280-613/TGFα）の断片と置き換え、プラスミドpVC85-PE37/TGFαを作製する。T7プロモーターと連結されたompAPE37/TGFαの発現カセットを切り出し、pLITE201に挿入して最終プラスミドBSPT#2-PTIを得る。
【０１２８】
（Ｃ）タンパク質発現およびL.monocytogenesから分泌のためのプラスミドベクターの構築
エンドスタチンまたはPE37/TGFαをコードする遺伝子を、プラスミドpCHHI内のリステリオリジン（ＬＬＯ）シグナル配列の下流に挿入し、pCHHI-ESおよびpCHHI-PE37/TGFαを作製する。上述の分泌カセットを、pCHHIベクターから得たリステリオリジンプロモーターに連結させることにより、治療用タンパク質の構成的発現を得る。プラスミドpsod-gfp（印刷中のGoetaらPNAS）から切り出したsod-gfp発現カセットを、pCHHI-ESに挿入してBSPT#3-EScを作製し、pCHHI-PE37/TGFαに挿入してBSPT#4-PTcを作製する。IPTG誘導性プロモーターの制御下での治療用タンパク質の発現のため、BSPT#3-EScおよびBSPT#4-PTc内のリステリオリジンプロモーターを、プラスミドpSPAC（YansuraおよびHenner,PNAS USA 81 (1984), 439）由来のPspacプロモーターと置き換え、BSPT#5-ESiおよびBSPT#6-PTiを作製する。Pspacは、バクテリオファージSPO-1プロモーターおよびlacオペレータからなるハイブリッドプロモーターである。PspacプロモーターからのIPTG-誘導性GFP発現は、哺乳動物細胞のサイトゾルでのL.monocytogenesにおいて実証されている。
【０１２９】
実施例５：  細菌におけるルシフェラーゼおよびGFPの発現の実証、ならびにエンドスタチンと組換え毒素／TGFα融合タンパク質の分泌および培養アッセイにおけるそこれらの機能の確認
生きている動物の腫瘍組織における大腸菌およびL. monocytogenesの存在の検出を可能にするためには、細菌において構成的に発現されるルシフェラーゼおよびGFPのレベルが充分である必要がある。したがって、レシピエント大腸菌またはL.monocytogenesの実施例４に記載の構築物での形質転換後、最も高いルシフェラーゼ発光またはGFP蛍光を有するクローンを選択する。静脈注射前における選択された各コロニーからの発光の特徴付けに加え、選択された形質転換体がエンドスタチンおよびシュードモナス体外毒素／TGFα融合タンパク質を培地内に分泌する能力を確認する必要がある。大腸菌およびL.monocytogenes内で合成されたエンドスタチンおよびシュードモナス体外毒素／TGFα融合タンパク質の存在を、これらのタンパク質を細胞ペレットから抽出することにより調べる。培地内に分泌されたタンパク質を濃縮し、ゲル分離により解析し、ウエスタンブロットにより量を測定する。培地内に存在する大腸菌またはL.monocytogenesのいずれかにおいて、各プラスミド構築物から発現された、新たに合成されたタンパク質の割合を調べることは重要である。また、エンドスタチンおよびシュードモナス体外毒素／TGFα融合タンパク質の構成発現に加え、細菌培養培地にIPTGを添加すると発現が大腸菌およびL.monocytogenesにおいて誘導され得ることを確認することも必須である。将来的な腫瘍治療プロトコルの設計のためには、最初に細菌培養物中において、構成発現系により分泌されるタンパク質の相対量を規定の期間に誘導された発現レベルと比較する必要がある。提案した構築物から生成した場合、大腸菌およびL.monocytogenesにおいて合成された場合に両タンパク質が生物学的に活性であることを調べることも同様に必須である。両タンパク質は予め大腸菌において合成され、活性であることが示された。
【０１３０】
以下に記載する実験の結果は、PASポア形成タンパク質発現との組み合わせでOmpFシグナルペプチドを用い、エンドスタチンが大腸菌から良好に分泌されることを確認するはずである。これらの実験はまた、PEの第IIドメインとの組み合わせでOmpAシグナルペプチドを用い、PE40/TGFαおよびPE37/TGFα融合タンパク質が細菌から分泌されるか否かを示す。さらに、リステリオリジンシグナルペプチドもまた、エンドスタチンおよびキメラ毒素／TGFα融合タンパク質の培地内および感染腫瘍細胞のサイトゾル内への分泌を促進し得る。内皮細胞移動阻害アッセイおよびタンパク質合成阻害アッセイを用い、培地内に分泌された両タンパク質が生物学的に活性であることを調べることが期待できる。これらのタンパク質の存在および量が、構成プロモーターをIPTGにより誘導され得るプロモーターに置換することにより調節され得る。
【０１３１】
以下に記載する分泌系に加えて、大腸菌HlyBD-依存性分泌経路(Schlorら, Mol. Gen. Genet. 256 (1997), 306)などの代替分泌系も使用し得る。Bacillus.sp.エンドキシラナーゼシグナルペプチド(Choiら, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53 (2000), 640; JeongおよびLee,Biotechnol. Bioeng. 67 (2000), 398)などの他のグラム陽性菌からの代替分泌シグナルが導入され得る。
【０１３２】
（Ａ）エンドスタチンおよびシュードモナス体外毒素／TGFα融合タンパク質の細菌から増殖培地への分泌の確認
大腸菌株（DH5αおよびBL21(λDE3)）をBSPT#1-ESiおよびBSPT#2-PTiプラスミドDNAで形質転換する。L.monocytogenes菌株EGDA2をプラスミドBSPT#3-ESc、BSPT#4-PTc、BSPT#5-ESiおよびBSPT#6-PTiで個々に形質転換する。適切な抗生物質含有プレート上にプレーティングした後、各形質転換混合物から個々のコロニーを選択する。弱光画像形成装置および蛍光顕微鏡下で、それぞれルシフェラーゼおよびGFP発現について、これらのコロニーをスクリーニングする。各形質転換バッチから最も発光強度の強い３つのコロニーを、さらなる研究のために選択する。選択した形質転換体の各々からのエンドスタチンおよびシュードモナス体外毒素／TGFα融合タンパク質の分泌を確認するため、細胞を最少必須培地内で対数期まで成長させる。遠心して細菌を沈降させた後、上清みを0.45μm孔径フィルターに通し、分泌されたタンパク質の沈殿のために細菌非含有培地を用いる。沈殿物を遠心分離により回収する。ペレットを洗浄し、乾燥し、タンパク質のゲル分離のために試料バッファー中に再懸濁させる。10％SDS-ポリアクリルアミドゲルでの分離後、10μlの細菌培養物に相当するアリコート由来のタンパク質を200μlの培養上清み由来のタンパク質と比較する。エンドスタチンに対するポリクローナル抗体（Timpl,Methods Enzymol. 82 (1982), 472により記載された抗体産生プロトコルに従う）およびTGFαに対するモノクローナル抗体（OncogeneResearch Products, Cambridge, MA, USA）を用いてウエスタンブロット解析を行なう。成長の間、異なる時間に増殖培地をサンプリングすることにより分泌の至適性抗条件を確立する。同様の方法が、以前、Salmonellatyphimurium培養上清み中の分泌タンパク質を解析するために使用されている(Kanigaら, J. Bacteriol. 177 (1995),3965)。これらの方法を用いることにより、誘導なしで構築物のそれぞれにより作製された細菌培養培地中の分泌タンパク質の量が確立される。培地中における分泌タンパク質の量の増加を推定するため、対数期の細菌培養物にIPTGを３〜６時間添加することにより、IPTG-依存性プロモーター活性化実験を行ない、分泌されたタンパク質を上記のようにしてアッセイする。
【０１３３】
（Ｂ）移動阻害アッセイを用いた、大腸菌およびL. monocytogenesにより分泌されたエンドスタチンの生物学的活性の確認
エンドスタチンは、血管内皮成長因子(VEGF)-誘導ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)-移動を阻害することが示されている。したがって、細菌により分泌されたエンドスタチンの生物学的活性を、CascadeBiologics, Portland, ORにより提供されるHUVEC移動アッセイを用いて試験し得る。細胞移動の阻害は、48ウェル化学走性チャンバ(NeuroProbe, Galthersburgs, MD)(Polverineら, Methods Enzymol. 198 (1991), 440)において評価する。各分泌構築物由来の細菌非含有上清みを、30分間のプレインキュベーションのためにHUVECに添加する。インキュベーション後、HUVECを上側チャンバに入れる。VEGF165(R&DSystems, Minneapolis, NIN)により誘導されるHUVECの下側チャンバへの移動を、顕微鏡解析により定量する。培地中の機能性エンドスタチン濃度は、HUVEC移動の阻害の程度に正比例する。
【０１３４】
（ｃ）腫瘍細胞培養物における分泌組換えPE毒素の細胞毒性の試験
哺乳動物細胞におけるキメラ毒素の阻害活性を、EF-2の不活性化による新規タンパク質合成の阻害に基づいて測定する(CarrollおよびCollier, J. Biol. Chem.262 (1987), 8707)。大腸菌およびL. monocytogenesにおける種々の組換えPE分泌構築物の発現から得られた細菌非含有上清みのアリコートをC6神経膠腫細胞またはHCTI16結腸癌腫細胞に添加する。培地での処理後、哺乳動物細胞を[3H]-ロイシンでパルスし、タンパク質画分において取り込みを測定する。L.monocytogenes-感染哺乳動物細胞における分泌キメラ毒素タンパク質の存在を調べるため、ゲンタマイシン処理により培地から細菌を除去する。サイトゾル内にL.monocytogenesを含有する哺乳動物細胞を溶解させ、放出された細菌を濾過により溶解物から除去する。分泌キメラ毒素を含有する哺乳動物細胞溶解物を、タンパク質合成阻害実験においてアッセイする。腫瘍細胞培養物における[3H]-ロイシン取り込みの阻害は、培地および細胞溶解物における生物学的活性キメラ毒素タンパク質の量に正比例する。
【０１３５】
実施例６：  生きた動物の腫瘍における静注した細菌の侵入、局在および分布
（Ａ）原理
少数の静注した細菌のみが、腫瘍に進入することにより免疫系から脱出するため、生きた動物におけるその直接的な局在は発光の制限から不可能である。これらの局在は、発光の初期中心を確認するために腫瘍を区切ることによってのみ確認され得る。後期の時点における切片を見ると、細菌は急速な複製により腫瘍全体にわたって見られ得る。１つまたは多数の細菌が同じ部位に進入したか否かを調べるため、赤色蛍光タンパク質を用いて細胞外複製大腸菌を標識し得、細胞内複製L. monocytogenesには緑色蛍光タンパク質を用い得る。組織切片における赤および緑蛍光の分布を可視化することにより、大腸菌およびL.monocytogenesの進入部位ならびに複製および局在を、腫瘍の中心および周辺領域において個々に、および同時に測定し得る。移植した腫瘍において得られた進入および分布のパターンは、自然発生腫瘍のものと類似することが期待され得、したがって、細菌に基づく診断およびタンパク質治療法が有効なアプローチとなる。
【０１３６】
セクション（Ｂ）に記載した実験により、以下に、自然発生腫瘍における発光細菌の進入、複製および分布を、移植した腫瘍における分布パターンと比較し得る。さらに、二重標識実験により、作業者が、同じ腫瘍切片における細胞外複製大腸菌および細胞内複製L. monocytogenesの正確な位置を確認することが可能になる。最後に、（５日間細菌コロニー形成後）細菌が腫瘍内に均一に分布しているか、または腫瘍の周辺もしくは壊死中心に優先的局在が起こっているか否かを確認し得る。これらの動物の免疫能による自然発生腫瘍内での細菌進入の低下の可能性は、静注した細菌の数を増加することにより解決され得る。
【０１３７】
（Ｂ）移植した腫瘍および自然発生腫瘍を有するヌードマウスおよび齧歯類への赤色蛍光タンパク質発現大腸菌および緑色蛍光タンパク質発現L. monocytogenesの静注
構成プロモータの制御下のDsRed(Matzら, Nat. Biotech. 17 (1999), 969)発現カセットを有する大腸菌(DH5α)を、この実験に使用する。毒性遺伝子の各々にインフレーム欠失を有するL.monocytogenes EGD菌株誘導体を、構成SODプロモーターにより駆動される緑色蛍光タンパク質カセットで個々に標識した。
【０１３８】
最初に、細菌の局在および腫瘍内分布を、移植されたC6神経膠腫またはHCT116結腸癌腫瘍を有するヌードマウスにおいて研究する。C6神経膠腫またはHCT116結腸癌腫瘍細胞(100μl中5x 105)を動物の右後肢に皮下注射する。腫瘍細胞注射の12日後、動物に麻酔し、左大腿静脈を外科的に露出させる。発光細菌(50μlの生理食塩水中に懸濁した1x 106)を静脈注射し、切開傷を縫合により閉じる。腫瘍を週に３回カリパーを用いて測定する。腫瘍体積を以下のようにして計算する：小径×大径×高さ／２。
【０１３９】
GFPまたはRFPに基づいて、腫瘍内の細菌の局在もまた、冷凍切片腫瘍組織を用いて解析する。信頼性のある形態学的および組織学的保存、および再現可能なGFPまたはRFP検出は、低速組織凍結プロトコル(Shariatmadariら,Biotechniques 30 (2001), 1282)を用いて得られ得る。簡単には、腫瘍組織を屠殺動物から、PBS含有ペトリ皿に取り出し、所望の大きさに切断する。試料を４％パラホルムアルデヒド(PFA)含有PBS中で室温にて２時間混合する。これらをPBSで１回洗浄し、室温でTissue-Tekに包埋し、次いで、暗所に４℃で24時間維持し、-70℃にてゆっくりと凍結させる。細分化の前に、組織を-20℃で30分間維持する。次いで、10〜50μm厚の切片をReichert-JungCryocut 1800クリオスタットで切り取り、ポリ-L-リジン(1%)処理顕微鏡スライド上に集める。細分化の際、材料を室温で維持して、数回の凍結・解凍サイクルを回避する。最後に、切片をPBS中でリンスし、PBS中にいれて暗所に４℃にて維持する。
【０１４０】
血流から腫瘍内への発光大腸菌およびL. monocytogenesの進入をモニターするため、27匹のヌードマウスにC6腫瘍細胞を注射し、27匹のヌードマウスにHCT116結腸癌腫瘍細胞を注射する。腫瘍発生から12日後、C6群の９匹の動物およびHCT116群の９匹の動物に、RFP構築物を有する大腸菌の静脈注射を行なう。各群の別の９匹にはGFPcDNA 構築物で形質転換したL. monocytogenesを静脈注射する。第３の群の各腫瘍モデル由来の９匹の動物には、大腸菌およびL.monocytogenesの両方(それぞれ1 x 106細胞)を与える。注射後５時間、25時間および５日後、各処理群の３匹の動物を屠殺し、その腫瘍を切除し、上述の凍結細分化プロトコルにおいて記載したようにして個々に処理する。凍結後、各腫瘍を半分に切断する。片方の腫瘍を厚切片(60〜75μm)の調製に使用し、これを、実験の各時点で得られた腫瘍の切片における細菌の分布を観察するため、蛍光立体顕微鏡下で解析する。目的の領域を同定し、薄片化し、調製し、レーザー走査サイトメトリーにて共焦点顕微鏡下で解析した後、画像を再構築する。
【０１４１】
平行実験において、表６に列挙した自然発生腫瘍を有する動物を入手し、細菌luxオペロンを有する大腸菌を用いる静脈注射実験に使用する。各腫瘍モデルの２匹の動物を使用し、ルシフェラーゼ発光を毎日、弱光画像形成装置下でモニターする。自然発生腫瘍は、細菌ルシフェラーゼ発現に基づき、移植された腫瘍と同様に画像形成し得ることが期待される。２種類の自然発生腫瘍モデル、大腸の腺癌腫を有するマウスおよび乳房組織の腺癌腫を有するマウスを、上述のようなRFP発現大腸菌およびGFP発現L.monocytogenesの静脈注射後の細菌局在下実験に使用する。これらの実験は、細菌に基づく診断およびタンパク質治療法システムの重要性を強調することが期待される。
【０１４２】
【表６】
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【０１４３】
実施例７：  移植された腫瘍または自然発生腫瘍を有する齧歯類における細菌媒介性腫瘍標的化および細菌分泌タンパク質治療法
（Ａ）原理
先の実施例において示したように、発光細菌の静脈注射は、動物の腫瘍領域のみにおける侵入、複製および蓄積をもたらす。このプロセスは、腫瘍における発光の画像形成によりモニターし得る。エンドスタチンおよびキメラ毒素発現遺伝子カセットを発光遺伝子カセットに対してシス位に配置すると、細菌を介したこれらの一次的かつ特別な送達のための間接インビボ検出系が提供される。
【０１４４】
エンドスタチンおよびキメラ毒素発現遺伝子カセットを、配列をコードするシグナルペプチドに連結させると、腫瘍の細胞外空間内または感染腫瘍細胞のサイトゾル内へのこれらのタンパク質の分泌が促進される。細菌から腫瘍の細胞外空間内に分泌された両タンパク質は、直接注射された精製タンパク質と同様に機能することが期待される。L. monocytogenesから感染腫瘍細胞のサイトゾル内に分泌された両タンパク質は、エンドスタチンについて以前に報告されたウイルス送達系と類似する。細菌系は、腫瘍において、構成的分泌系として、または外来的に添加されるIPTG-活性化可能な分泌系として使用し得る。腫瘍にコロニー形成する細菌における治療用タンパク質の発現レベルを調節することにより、腫瘍成長を阻害するタンパク質の分泌量を決定し得る。IPTGの添加なしでは、静注した細菌からの阻害性タンパク質分泌は、血液循環中では最小に維持される。これは、細菌送達の間、腫瘍を有するレシピエント動物に対してさらなる安全性を提供する。BSPT系を用い、IPTGの添加により、治療の開始および継続期間をコントロールし得る。処置の完了時、細菌感染の処置と同様に、抗生物質の投与により細菌送達系を除去し得る。
【０１４５】
（Ｂ）移植された腫瘍を有する動物の腫瘍成長に対する、大腸菌およびL. monocytogenesにより分泌されたエンドスタチンおよびシュードモナス体外毒素／TGFα融合タンパク質の効果の測定
腫瘍における、大腸菌およびL.monocytogenesにより分泌されるエンドスタチンの阻害性効果およびキメラ毒素の細胞障害性を以下のようにして調べる。10日目のC6腫瘍を有する35匹のヌードマウスに、以下：(a)５匹のマウスに、エンドスタチンを分泌するように操作した大腸菌；(b)５匹のマウスに、キメラ毒素を分泌するように操作した大腸菌；(c)５匹のマウスに、エンドスタチンを分泌するように操作したL.monocytogenes；(d)５匹のマウスに、キメラ毒素を分泌するように操作したL. monocytogenes；(e)５匹のマウスに、エンドスタチンおよびキメラ毒素を分泌する大腸菌；(f)対照群：５匹のマウスに、細菌ルシフェラーゼのみを発現する大腸菌、および５匹のマウスに、GFPを発現するL.monocytogenes、のように細菌構築物を注射する。細菌の注射時、各腫瘍体積を測定する。注射３日後、腫瘍における細菌複製を弱光画像形成装置下または蛍光立体顕微鏡下でモニターする。発光および腫瘍体積を毎日、細菌注射後20日まで測定する。注射の10日後、各群の動物1匹を屠殺し、腫瘍組織内に存在する分泌タンパク質のレベルを、ウエスタンブロット解析により解析する。これらの実験は、エンドスタチン処理動物おける腫瘍成長の阻害またはキメラ毒素タンパク質で処理した動物におけるより劇的な腫瘍退縮をもたらす。対照動物においては、腫瘍成長は細菌のみによって影響されることは期待されない。
【０１４６】
追跡実験では、乳房組織の自然発生腺癌種(FVB-neuN(N#202)株、表６)を用い、腫瘍成長に対する分泌タンパク質の効果を研究する。C6腫瘍解析で記載したものと同一の実験スキームを使用する。腫瘍治療の終了時、腫瘍組織におけるエンドスタチンおよびキメラ毒素の存在を、ウエスタンブロット解析により調べる。同一の実験計画を用い、C6腫瘍内ならびに自然発生乳房腫瘍マウスモデル内の細菌におけるエンドスタチンおよびキメラ毒素産生のIPTG-誘導効果をアッセイする。細菌におけるタンパク質発現の多IPTG誘導は、良好な腫瘍治療に必要とされ得ることが期待される。
【０１４７】
腫瘍処置のいかなる段階においても、発光治療用遺伝子含有細菌を動物から除去することが必要とされ得る。この実験を行なうため、12日目のC6腫瘍を有するマウスに、細菌ルシフェラーゼ発現大腸菌を静脈注射する。注射３日後、1日２回のゲンタマイシン(５mg/kg体重)、または新しく発見されたclinafloxacin(CL960)(Nichterleinら, Zentralbl. Bakteriol. 286 (1997), 401)の腹腔内投与により抗生物質治療を開始する。この処置を５日間行い、細菌に対する抗生物質の効果を、毎日の動物からの発光の画像形成によりモニターする。
【０１４８】
上記の実験を完了させることにより、腫瘍内に分泌されたエンドスタチンおよびキメラ毒素タンパク質は、腫瘍成長の阻害および測定可能な腫瘍退縮を引き起こすことが期待される。移植された腫瘍を有する齧歯類および自然発生腫瘍を有する齧歯類の両群において腫瘍退縮が達成されることが予期される。腫瘍処置における分泌エンドスタチンおよびキメラ毒素タンパク質の同時適用は、最も将来有望な結果を与え得る。抗生物質の投与による腫瘍からの操作された細菌の除去は、本発明の細菌分泌タンパク質治療(BSPT)の安全性を追加する手段である。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、ヌードマウスの皮下C6神経膠腫におけるGFP発現の外部画像化を示す。C6神経膠腫細胞(5×105)を右側面大腿部に皮下移植した。腫瘍細胞移植後の指定された日に、1×108pfuのrVV-ruc-gfpウイルス粒子を用いて動物を静脈内感染した。GFP発現を蛍光立体顕微鏡下でモニターした。皮下神経膠腫の明視野（上端）、蛍光(中央)、および明視野、蛍光オーバーレイ（底部）画像を示す。わずか22mm3の大きさの腫瘍(B〜B'')または18日齢程度の腫瘍(大きさ約2500mm3)(A〜A'')においてGFPシグナルが観察されうる。より古い腫瘍において、GFP発現は、「パッチ」様パターンで見られた（A'において矢印により示した）。同じ動物の腫瘍におけるマーカー遺伝子発現は、静脈内ウイルス感染の4日後(C〜C'')、7日後(D〜D'')、および14日後(E〜E'')に連続的にモニターされうる。(バー＝5mm)。
【図２】図２は、腫瘍血管形成の明視化である。C6神経膠腫細胞(5×105)をヌードマウスの右側面大腿部に皮下移植した。腫瘍細胞移植の10日後、1×109pfuのrVV-ruc-gfpを用いて動物を静脈内感染させた。ウイルス注射の7日後、GFP発現をモニターした。皮下C6神経膠腫の表面での血管新生が、ワクシニア媒介遺伝子発現に従う腫瘍における明るいグリーン蛍光バックグラウンドに対して示される。皮下神経膠腫の明視野(A)、蛍光(B)、および明視野、蛍光オーバーレイ(C)画像が明示される。(バー＝5mm)。
【図３】図３は、同じ動物の皮下神経膠腫におけるGFPの発現を示す。5×105のC6神経膠腫細胞の右側面大腿部への皮下移植の5日後、108のrVV-ruc-gfpウイルス粒子を静脈内注射した。ウイルス注射の5日後、蛍光顕微鏡下におけるGFP発現の解析のために動物に麻酔をかけ、屠殺した。おおっている皮膚を折り返して(B〜B'')、断面図において(C〜C'')、および切断した脚において(D〜D'')、腫瘍を外部に明視化した(A〜K)。皮下神経膠腫の明視野(A)、蛍光(B)、および明視野、蛍光オーバーレイ(C)画像が明示される。最も強いGFP発現が、右の腫瘍の外側表面に沿って位置するパッチとして見られる(C〜C''における2重矢印)。腫瘍組織および正常な筋肉組織におけるGFP発現の鮮明な差異(D〜D''における矢印)は、はっきり認識できる。折り返した皮膚に星印をつける(B〜B''およびD〜D'')。(バー＝5mm)。
【図４】図４は、GFPを発現する腫瘍細胞の明視野(A)および蛍光(B)画像を示す。1×108のrVV-ruc-gfpウイルス粒子を用いて静脈内注射したヌードマウスから、神経膠腫組織の凍結切片(30μ厚)を調製した。(バー＝50μm)。
【図５】図５は、麻酔をかけたヌードマウスの弱光(low light)画像であり、静脈内注射した基質セレンテラジン(coelenterazine)(5μgエタノール溶液)の存在下でのレニラルシフェラーゼ誘発発光の位置を示す。
【図６】図６は、ヌードマウスにおける皮下PC-3ヒト前立腺腫瘍(A〜A'')およびMCF-7ヒト胸部腫瘍(B〜B'')、Lewisラットにおける頭蓋内C6ラット神経膠腫(C〜C''、矢印は腫瘍の位置を示す)、およびC-57マウスにおけるMB-49マウス膀胱腫瘍(D〜D'')を含む種々の腫瘍モデルにおけるGFP遺伝子発現に基づく腫瘍特異的ウイルス感染のモニタリングを示す。1×108のrVV-ruc-gfpウイルス粒子の静脈内注射の7日後に、動物をモニターした。腫瘍の明視野(上端)、蛍光(中央)、および明視野、蛍光オーバーレイ（底部）画像を示す。(バー＝5mm)。
【図７】図７は、胸部腫瘍モデルにおけるワクシニア媒介GFP発現のモニタリングを示す。胸部腫瘍を保有するヌードマウスに、1×108のrVV-ruc-gfpウイルス粒子を用いて静脈内注射した。原発腫瘍(A〜A''、B〜B''およびC〜C'')および転移腫瘍(D〜D''、E〜E''およびF〜F'')の両方を、外部に(A〜A''およびD〜D'')、おおっている皮膚を除去して(B〜B''およびE〜E'')、それらを裂いて開けた場合に(C〜C''およびF〜F'')、明視野、蛍光（'）および明視野、蛍光オーバーレイ（''）画像のセットで明視化した。同じ動物での肺転移におけるGFP発現もまた、明視化した(G〜G'')。(バー＝5mm(A〜A''からF〜F'')、およびバー＝1mm(G〜G'')。
【図８】図８は、弱光イメージャー下における発光の検出に基づく、ヌードマウスからの発光細菌のクリアランスの明視化を示す。弱毒化したS.typhimurium(A,B)およびV.cholera(C,D)の107細胞を用いてヌードマウスに静脈内注射した。両方の株を、luxオペロンを保有するpLITE201で形質転換した。細菌注射の20分後(A,C)および2日後(B,D)に、光子回収を行った。
【図９】図９は、弱毒化した細菌による神経膠腫のホーミングを示す。右後脚にC6神経膠腫を有するヌードマウスに、luxオペロンをコードするpLITE201プラスミドDNAで共に形質転換された107の弱毒化したS.typhimurium(A〜D)およびV.cholera(E〜H)を用いて静脈内注射した。光子回収を弱光イメージャー下において１分間行った。S.typhimuriumを用いて注射したマウスは、動物全体を通して、直ちに発光を示した(A)。対照的に、V.choleraを用いて注射したマウスにおける発光は、肝臓領域において可視であった(E)。細菌注射の2日後、マウスの両群は、腫瘍領域においてのみ発光を示した(B,F)。S.typhimuriumに感染した腫瘍における発光は、細菌注射の4日後(C)および6日後(D)にゆっくり減少した。V.choleraに感染した腫瘍は、注射の4日後(G)および6日後(H)に非常に増加した発光を示し、腫瘍組織における細菌の持続複製を示唆する。
【図１０】図１０は、胸部腫瘍への細菌のホーミングを示す。右胸部パッドにおいて胸部腫瘍を有するヌードマウスに、luxオペロンをコードするpLITE201プラスミドDNAで形質転換された107の弱毒化したV.cholera(A〜D)または107の大腸菌(E〜H)を用いて静脈内注射した。光子回収を弱光イメージャー下において１分間行った。細菌送達の20分後、発光V.choleraが肝臓(A)において観察された。注射の48時間後、右胸部領域における原発胸部腫瘍および左胸部領域における転移腫瘍（矢印）において、ならびに切断創傷(B)において、発光を示した。5日目に、発光は腫瘍領域においてのみ可視であり、創傷(C)では可視でなかった。細菌注射の8日後、発光活性はより小さい腫瘍領域からは廃止されたが、原発胸部腫瘍(D)では強く残っていた。静脈内細菌注射の2日後、ヌードマウスにおける胸部腫瘍へのE.coliのホーミングがまた観察された(E:側面図、F:腹面図)。
【図１１】図１１は、C57マウスにおける膀胱腫瘍への細菌のホーミングを示す。C57マウスに、luxオペロンをコードするpLITE201で形質転換された107の弱毒化したV.choleraを用いて静脈内注射した。細菌送達の9日後、動物全体の膀胱領域において発光を示した(A)。動物を屠殺し、腹部切開を作製し、膀胱を曝露した。発光は、膀胱領域に限定された(B)。摘出された膀胱の写真画像をおおった弱光光子発生画像のオーバーレイにより説明されるように、マウスからの膀胱の除去(C)と共に、発光の全供給源が除去された(D)。
【図１２】図１２は、Lewisラットにおける脳神経膠腫への細菌のホーミングを示す。Lewisラットに、luxオペロンをコードするpLITE201で形質転換された108細胞の弱毒化したV.choleraを用いて静脈内注射した。細菌注射の24時間後、弱光イメージャー下における明視化の間に動物全体のうち頭部領域において弱い発光を示した。動物を屠殺し、その脳を除去した。脳腫瘍を有するラット(A)および脳腫瘍を有さないラット(B)から、１分間光子回収を行った。脳腫瘍を有するラットの脳の領域において強い発光を確認した(Aにおいて矢印をつけた)。対照脳組織(B)において、発光は全くなかった。
【図１３】図１３は、形質転換されたヒト線維肉腫細胞がヌードマウスの皮下神経膠腫上にホーミングすることを示す。皮下神経膠腫を有するヌードマウスに、pLEINに由来するレトロウイルスで恒久的に形質転換された5×105のヒト線維肉腫細胞を用いて静脈内注射した。注射の7日後、動物に麻酔をかけ、蛍光立体顕微鏡下でモニターした。皮膚を介するマウス全体のうち腫瘍領域においてのみ、蛍光細胞を示した(A1〜3)。おおった皮膚の折り返しによる腫瘍組織の曝露の際(B1〜3)、腫瘍の断面図において(C1〜3)、別個の領域において蛍光パッチが認識できた。マウスの器官の精密な実験は、動物の肺における蛍光細胞の小さなクラスターの存在を示し、腫瘍組織に加えて肺に対する線維肉腫細胞の親和性を示した(D1〜3)。(バー＝5mm(A1〜C3)、＝1mm(D1〜D3))。
【図１４】図１４は、弱毒化されたListeria monocytogenesの皮下前立腺腫瘍へのホーミングを示す。右後脚に皮下ヒトPC3前立腺腫瘍を有するヌードマウスに、gfpcDNAを保有するpsod-gfpプラスミドDNAで形質転換された107の弱毒化したL.monocytogenesを用いて静脈内注射し、蛍光立体顕微鏡下でGFP蛍光を観察した。細菌注射の27時間後、GFPシグナルを腫瘍領域においてのみ検出した。腫瘍が、可視光(a)、蛍光(b)、および可視光および蛍光オーバーレイ(C)画像のセットで示される。(バー＝5mm)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月30日(2004.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）腫瘍治療および／または転移性腫瘍の排除用の医薬組成物の調製のための；または
ｂ）治療的腫瘍処置を腫瘍画像化またはモニタリングするための診断組成物の調製のための、
検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質をコードするDNA 配列を含む微生物または細胞の使用であって、該微生物または細胞は腫瘍に蓄積することができ、患者の免疫系により認識される、使用。
【請求項２】
前記微生物または細胞が腫瘍治療および／または転移性腫瘍の排除に適切なタンパク質をコードするDNA配列をさらに含んでなる請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質が発光および／または蛍光タンパク質である請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
前記タンパク質がリガンドに結合可能な細胞レセプターである請求項１〜３いずれか記載の使用。
【請求項５】
前記組成物が放射性核種標識リガンドであるリガンドをさらに含有してなる請求項４記載の使用。
【請求項６】
前記組成物が常磁性-または超常磁性-金属-標識リガンドであるリガンドをさらに含有してなる請求項４記載の使用。
【請求項７】
前記組成物が毒素に結合されたリガンドをさらに含有してなる請求項４記載の使用。
【請求項８】
前記組成物が治療用タンパク質に結合されたリガンドをさらに含有してなる請求項４記載の使用。
【請求項９】
前記リガンドが抗体である請求項４〜８いずれか記載の使用。
【請求項１０】
前記検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質が磁気共鳴画像法（MRI）により検出可能なシグナルを誘導するか、または組織の可視化のために必要とされる造影剤、発色団またはリガンドに結合可能なタンパク質である請求項１記載の使用。
【請求項１１】
前記微生物が細菌またはウイルスである請求項１〜１０いずれか記載の使用。
【請求項１２】
前記細菌が磁性細菌である請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
前記ウイルスがワクシニアウイルスである請求項１１記載の使用。
【請求項１４】
前記細菌が弱毒化Vibrio choleraeである請求項１１記載の使用。
【請求項１５】
前記細胞が哺乳動物細胞である請求項１〜１０いずれか記載の使用。
【請求項１６】
前記発光または蛍光タンパク質がルシフェラーゼ、RFPまたはGFPである請求項３記載の使用。
【請求項１７】
前記微生物または細胞がルシフェラーゼの基質をコードする遺伝子をさらに含んでなる請求項１６記載の使用。 
【請求項１８】
腫瘍画像化またはモニタリングがMRIにより行われる請求項１〜１７いずれか記載の使用。
【請求項１９】
前記診断組成物および／または医薬組成物が、
（ａ）腫瘍治療および／または転移性腫瘍の排除に適したタンパク質に融合された抗菌化合物、および／または（ｂ）検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質に融合された抗菌化合物をさらに含有してなる請求項１〜１８いずれか記載の使用。
【請求項２０】
前記腫瘍治療および／または転移性腫瘍の排除に適したタンパク質が、エンドスタチンまたは組換えキメラ毒素PE37／トランスフォーミング成長因子α（TGF-α）である請求項２〜６および１０〜１８いずれか記載の使用。
【請求項２１】
前記腫瘍治療および／または転移性腫瘍の排除に適したタンパク質が、非毒性プロドラッグを腫瘍に対して細胞傷害性である毒性薬物に変換可能なタンパク質である請求項２〜６および１０〜１８いずれか記載の使用。
【請求項２２】
前記DNA配列がBAC、MAC、サイバー細胞またはサイバーウイルス上にある請求項１〜２１いずれか記載の使用。 
【請求項２３】
前記腫瘍が膀胱の腫瘍、胸部の腫瘍、前立腺の腫瘍、神経膠腫、肝臓の腫瘍、皮膚の腫瘍、大腸の腫瘍、肺の腫瘍、卵巣の癌腫、または脾臓の癌腫である請求項１〜２２いずれか記載の使用。
【国際調査報告】
2005523875.tif 000038
2005523875.tif 000039
2005523875.tif 000040
2005523875.tif 000041
2005523875.tif 000042
2005523875.tif 000043
2005523875.tif 000044
2005523875.tif 000045
2005523875.tif 000046
2005523875.tif 000047
2005523875.tif 000048
2005523875.tif 000049
2005523875.tif 000050
2005523875.tif 000051