(57)【要約】  植物に由来するＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の複製を阻止する抗ＨＳＶ薬。さらに抗ＨＳＶ活性を有するマツカサの水酸化カリウム抽出物の製造方法、および抗ＨＳＶ薬が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マツカサから水酸化カリウム溶液で抽出された抽出物を活性成分として含有する抗ＨＳＶ薬。
【請求項２】
前記水酸化カリウムは、水酸化カリウムの１％溶液である請求項１に記載の抗ＨＳＶ薬。
【請求項３】
前記活性成分は、マツカサから水酸化カリウムで抽出された抽出物に含まれるＰＰＣである請求項１に記載の抗ＨＳＶ薬。
【請求項４】
前記抽出物は、Ｐｉｎｕｓ属のいずれかの亜種または種のマツカサから抽出される請求項１に記載の抗ＨＳＶ薬。
【請求項５】
該マツカサは、Ｐ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ、Ｐ．ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒａおよびＰ．ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉからなる群から選択される請求項４に記載の抗ＨＳＶ薬。
【請求項６】
該活性成分は、２６０〜２８０ｎｍで吸収の肩を有する褐色を有し、これは水およびアルコール、およびアセトンに溶解し、並びに多糖類およびポリフェニルプロペノイドの複合体からなり、ファスト・プロテイン・リキッド・クロマトグラフィーにより決定されるように、５つの主要な成分は約１００、２１．０、１３．５、３．６および２．１ｋＤａ以上の分子量を有し、前記ＰＰＣはｐＨ７でマツカサの水酸化カリウム抽出物からの沈殿から得られる請求項３で設定されるような抗ＨＳＶ薬。
【請求項７】
前記抽出物は、少なくともｐＨ８を有する水酸化カリウムで抽出された請求項１の抗ＨＳＶ薬。
【請求項８】
前記水酸化カリウムは、６〜８のｐＨを有する請求項７の抗ＨＳＶ薬。
【請求項９】
エタノールおよび熱水で抽出できる材料を除去した後、マツカサを１％  ＫＯＨで抽出し、２４時間空気乾燥するステップ、平均粒子サイズが０．２μｍより大きい粒子状物質を除去するステップ、および
得られた上澄のｐＨを６と８の間に調整するステップを含んでなるＰＰＣを生成する方法。
【請求項１０】
請求項５に従って得られるような有効量のＰＰＣおよびカリウムを含有する抗ＨＳＶ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の複製を阻止する植物に由来する抗ＨＳＶ薬、および抗ＨＳＶ活性を有する植物由来物質を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、およびＩＩ型単純ヘルペスウイルスはおよそ５０００万人のアメリカ人が患い、そして毎年新たに約５００，０００例が発症する。およそ３０００万人のアメリカ人が陰部ヘルペスに感染する。（米国社会保健協会）。ＨＳＶビリオンは大きな（１００〜１５０ｍ  ガンマ）、２０面体キャプシドを有するエンベロープウイルスである。これは少なくとも７０ポリペプチドをコードするゲノムを伴う２本鎖ＤＮＡを有する。この多量の制御情報により、ウイルスがそれ自体の遺伝子発現を調節し、そして感染細胞内で複数の複合事象を修飾することが可能になる。標的組織のみに広がる単純ヘルペスウイルスは直接接触により宿主に進入し、ニューロン軸索の流れを介して宿主に広がり、後根神経節を標的化し、そして宿主の急性感染からの回復の後、標的組織に潜伏する。ＨＳＶウイルスは、そのウイルスの数世代にわたって不利な環境条件に適合して生存することができるメカニズムを有しているようであるので、これを処置するのは困難である。
【０００３】
一度ウイルスが感受性のある個体に伝染すると、ＨＳＶは粘膜表面の上皮細胞において複製する。ＨＳＶ抗体に関して血清陽性である多くの個体により明らかにされているように、ＨＳＶ複製は通常、無症候性であるが、症候性感染の病歴はない。感染により重篤な潰瘍性病変に至り得る個体もある。
【０００４】
上皮での複製の後、ウイルスは感染部位を神経支配する感覚神経の末梢終末に感染し、そしてニューロン軸索を介して核に輸送される。ウイルスＤＮＡは神経細胞核に進入し、潜伏感染が確立される。潜伏感染は宿主の生存期間中、肉体のこれらの神経細胞に残るので、ＨＳＶによる感染は、再発性疾患および伝染の多くのエピソードを招く可能性を有している。
【０００５】
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイルスの医薬品および薬草処置の使用は先行技術で公知である。より具体的には、処置は、ヘルペスの１次的原因であるＨＳＶ−１、または陰部ヘルペスの主要な原因であるＨＳＶ−２に焦点が当てられている。疫学的研究により、ＨＳＶ−２による感染は、性器潰瘍を引き起こすその他の性行為感染症と一緒にＨＩＶ獲得の危険性を増加させることが示唆されている。この危険性の増加のメカニズムは解っていないが、ＳＴＤにより生じる炎症性免疫応答の間に性器粘膜に存在するＨＩＶ感受性細胞（ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびマクロファージ）の数が増加するためであろう（Ｌａｔｉｆら（１９８９年））。
【０００６】
現在利用可能な処置は宿主免疫系を補助し、ヘルペスウイルスと共にそれ自体をコピーするのを補助する。大部分の現行の処置は、宿主細胞膜レセプターに負の影響を及ぼすことにより、または融合に必要なウイルスタンパク質のグリコシル化に干渉することにより、および宿主細胞核内でのウイルス複製を低下させることにより、ビリオンエンベロープと宿主細胞の原形質膜との融合を防御することに焦点が当てられている。アクシロビル、ガンシクロビルおよびフォスカルネットなどのＨＳＶ複製の阻止に利用できる多くの抗ウイルス薬がある。陰部ヘルペスを処置するために処方される最もよく知られた医薬品のうちの３つは：アクシロビル、ファミシクロビルおよびバラシクロビルである。
【０００７】
アクシロビル（ＡＣＶ）、９−［（２−ヒドロキシエトキシ）メチル］グアニンは、種々のヘルペスウイルス感染の処置に用いられている主要な抗ウイルス薬である。これを局所用、経口用または静脈内用調製物として投与することができるが、局所用調製物はあまり効果がない。アクシロビル治療に随伴される副作用はほとんどない。バラシクロビルすなわちアクシロビルのＬ−バリンエステルはアクシロビルのプロドラッグである。抗ヘルペスウイルス薬であるペンシクロビル、９−（４−ヒドロキシ−３−ヒドロキシメチルブト−１−イル）−グアニンはアクシロビルに類似するヒトヘルペスウイルスに対する活性スペクトルを有している。ペンシクロビルの６−デオキシ誘導体であるファムシクロビルは、酸化代謝により体内でペンシクロビルに変換される。
【０００８】
ヌクレオシドアナログ、例えばグアノシンアナログ・アクシロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル、ファムシクロビルはフォスカルネットよりもさらに狭い抗ウイルススペクトルを有し、主にＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２およびＶＺＶウイルスに対する効果を示す。これらの化合物はフォスカルネットのようにウイルスＤＮＡポリメラーゼに直接作用しないが、ウイルスポリメラーゼの阻止を達成させるために、ウイルスおよび細胞酵素により３回リン酸化されなければならない。これらは本来経口組成物として投与されるが、その他の投与方法、例えば非経口投与もまた可能である。非経口投与によるヘルペスウイルス感染の処置におけるいくつかの問題は、高用量および多量を投与すべきであることおよび、循環中の抗ウイルス化合物の半減期が短いことである。さらに、これらの処置は長時間の毎日の薬物投与を必要とする。再発性皮膚ウイルス疾患に及ぼすヌクレオシドアナログ・アクシロビル、バラシクロビル、ペンシクロビルおよびファムシクロビルの臨床有効性はフォスカルネットと同様に限定的である。局所処置では、治癒時間はおよそ２〜３日減るだけである。
【０００９】
前記の全ての薬物は感受性のある細胞の感染に続くウイルスＤＮＡの複製を標的化することに注目すべきである。損傷を引き起こす程度にまで感染が進行してしまった後に局所的に適用した場合、性器上皮におけるウイルス複製の低下にはこれらは無効であることが示されている。初期感染の間の上皮複製の低下は、神経節に存在する潜在性ウイルスの量を低下させ、そして再発性疾患の頻度および重篤度を低下させることが動物モデルにおいて実証されている。しかしながら、その他の研究により、上皮複製は動物モデルにおける潜在感染の確立に関して必須条件ではないことが実証されている。さらに、潜在性ウイルスを有するが、症候性感染の病歴がない女性のパーセンテージが高いことにより、ヒトにおける高レベルの複製が潜在性の確立に必要ではないということを示唆している。
【００１０】
前記で列挙した薬物に加えて、多くの薬草処置が用いられており、その有効性は継続的に研究されている。たいていの薬草における活性成分は、かなり過剰に摂取した場合には非常に有毒な分子であるアルカロイドである。たいていのウイルスの手に負えないいくつかの薬草がある、例えばラベンダー、ミルラ樹脂およびセージである。天然のエッセンシャルオイルが接触したＨＳＶウイルスに対して強力な結果を有する実例さえもある。活性成分はテルペン、セスキテルペンからケトン、アルデヒド、エステルまで、アルコールおよびフェノールまで変化する。概してエッセンシャルオイルは植物の花、葉および根から精製された活性成分である。最も一般的に用いられるのは、ラベンダー、バジル、カレンジュラ、レモン、ティー・ツリー、シナモン、シトロネラ、クローブ、ユーカリ、ゼラニウム、ニコウリ（ｎｉｑｏｕｌｉ）、オレガノ、ペパーミント、タイム、ジンジャー、パチュリ、シダー・ウッド、メリッサ、カユブテ、ローズマリーおよび多くのその他のものである。
【００１１】
この薬草および天然生成物の使用におけるこの復活の結果は、薬草に随伴される薬理作用に関する生物学的基盤を調査するための多くの研究に拍車をかけている。可能性のある薬理作用を有しているこのような植物生成物の１つはマツカサの抽出物である。マツカサ抽出物は種々の感染性疾患およびいくつかの腫瘍に改善効果を有していることが報告されている。
【００１２】
マツカサのアルカリ性抽出物は米国特許第４，９８５，２４９号により教示されている。この特許では、アルカリ性抽出物をｐＨ５で沈殿させて公知のＰＣ６の分画を生じ、さらにアルコールによる沈殿により、ＰＣ７と称される別の分画に至る。双方の分画、ＰＣ６およびＰＣ７の活性成分は共有結合により多糖類に連結されたリグニンまたはポリフェニルプロペノイドを含有することが示されている。さらに、特許第４，９８５，２４９号はインビトロでヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）複製に対する阻止活性を有することが解明されている。
【００１３】
１次的および再活性化された感染に続いてＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の複製のレベルを低下させる有効な処置を提供するために、本発明者らはマツカサの水酸化カリウム抽出物の抗ＨＳＶ活性を検定した。
【００１４】
マツカサ抽出物にカリウムを添加することにより、抗ＨＳＶ薬の一般的な健康上の利益が改善される。カリウムは水分バランスおよび分配；酸・塩基バランス；筋肉および神経細胞機能；心臓機能、および腎臓および副腎機能の維持において機能する体内における非常に重要な電解質であることが解っている。
【特許文献１】米国特許第４，９８５，２４９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、先行技術により解決されずに残っている、ウイルス複製および再活性化の問題を解決するために用いることができる新たな、改善された抗ＨＳＶ薬に関して継続的な必要性が存在することを理解することができる。この点で、本発明はこの必要性を満足する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は植物から誘導された抗ＨＳＶ薬を用いてＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の複製を阻止する方法、すなわち抗ＨＳＶ活性を有し、カリウムを含有するマツカサ抽出物を生成するための水酸化カリウム抽出方法である。
【００１７】
多くの試験および検定の後に、発明者は水酸化カリウム水溶液を用いることによりマツカサから高収量の抽出物が得られることを見出した。さらに発明者はポリフェニルプロペノイド・多糖類複合体（ＰＰＣまたはＰＣＥ）と称される、得られた抽出物は抗ウイルス活性を有することを見出した。従って、本発明の主要な機能は、強力な抗ＨＳＶ活性を有する植物由来の物質を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、植物由来の抗ＨＳＶ薬を用いてＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の複製を阻止する方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、マツカサから抗ＨＳＶ物質を入手するための方法を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる別の目的は、カリウムを含む抗ＨＳＶ薬を提供することである。
【００２１】
本発明の目的は、マツカサ抽出物の生成のための方法を提供することである。本発明の別の目的はその方法により生成されたマツカサ抽出物を提供することである。
【００２２】
本発明の抗ＨＳＶ薬は、該薬物が種々マツカサ、例えばＰｉｎｕｓ  ｐａｒｖｉｆｌｒｏａ  Ｓｉｅｂ．Ｅｔ  Ｚｕｃｃ．の水酸化カリウム抽出物、とりわけこの抽出物の高分子量抗ＨＳＶ物質を含有することを特徴とする。前記した高分子量抗ＨＳＶ物質は、マツカサを水酸化カリウム溶液で抽出することにより入手することができる。
【００２３】
本発明の別の目的は、容易におよび効率的に製造され、そして市販される抗ＨＳＶ薬を用いてＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の複製を阻止する新たなおよび改善された方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる別の目的は、材料および労力の双方に関して低コストの製造が可能であり、従って、次に一般消費者への低価格の販売が可能であり、それにより抗ＨＳＶ活性を伴うマツカサ抽出物を生成するこのような方法を経済的見地から一般購買者に利用可能にする、抗ＨＳＶ活性を有するマツカサの水酸化カリウム抽出物を生成するための方法を提供することである。
【００２５】
これらのおよびその他の本発明の目的は、発明を特徴付ける新規性の種々の特徴と共に、この開示に添付された、およびこの開示の一部を形成する請求の範囲における特殊性で指摘される。本発明、その操作利点およびその使用により得られる具体的な目的をよりよく理解するために、本発明の好ましい実施形態が説明されている添付の図面および記述的事柄を参照すべきである。
【００２６】
以下のその詳細な記載を考慮すると、本発明はよりよく理解され、前記で示したもの以外の目的が明らかになろう。かかる記載は添付の図面を参照する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
数千年もの間、植物は医薬用化合物の主要な供給源であった。植物材料から誘導された化学成分およびアナログは今では臨床使用における医薬品の主要な部分を含んでなる。このような植物の１つは種々のマツの木のマツカサから誘導される。いずれかの市販により入手可能なマツカサ材料を抗ＨＳＶ物質の調製に用いることができる。特定の程度の活性を有する物質をＫＯＨのアルカリ性素溶液でマツカサから抽出することができる。抽出物に含まれ、活性成分として用いられる物質は高分子量物質である。最も強力な物質はＰＰＣまたはＰＣＥと命名された。
【００２８】
抽出された溶液を所望の濃度まで濃縮し、必要な場合、適当な酸で中和し、次に凍結乾燥して適当な濃度の溶液または固体を得るべきである。さらに分画化することなく、これらを活性成分として用いることができる。さらに加工しない物質は冷蔵保存する。
【００２９】
本発明に関する限り、有用なマツカサはいずれかの種および種々のＰｉｎｕｓ属、とりわけ表１のものでよいが、その表の分類学による分類の正確さに限定することを意図するものではない。好ましいマツカサはＰ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ、Ｐ．ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒａおよびＰ．ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉのものである。本発明者らは、一般的なマツカサおよびとりわけ好ましい種のマツカサがワクチン接種および／または治療方法に有用な物質および成分（活性成分）を含有することを見出した。
【００３０】
【表１】
2005510490.tif 000002
【００３１】
本発明を以下の実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００３２】
ＰＰＣまたはＰＣＥの精製手順
【００３３】
いずれかの市販により入手可能な、予め細かく切断されたマツカサ材料を選択する。一度予め細かく切断されたマツカサ材料を選択すると、脱脂され粉砕されたマツカサ材料の熱抽出が必要とされる。水酸化カリウムを含有する水性溶媒の存在下で熱抽出を実施する。一度マツカサ材料を抽出すると、平均粒子サイズが０．２μｍより大きい粒子状物質を除去する。次いで得られた抽出物のｐＨを６．０と８．０の間に調整して抽出物を得る。
【００３４】
次の抽出が促進されるので、細かく切断されたマツカサ材料が好ましい。またそれは市販による入手が可能であるために、これは容易に得られる。さらに、細かく切断されたマツカサは十分な安定性、およびいくつかのバッチ中で均質な組成を維持している。
【００３５】
精製手順で使用する前に、細かく切断されたマツカサ材料を洗浄する。その手順の間、細かく切断されたマツカサ材料を約１０リットルの脱イオン水を用いる連続洗浄で２回洗浄する。次いで洗浄した材料を抽出の前に９５％  エタノールで１回洗浄することにより脱脂する。エタノールおよび洗浄したマツカサ材料を攪拌し、次いで液を捨てる。清浄したマツカサ材料を一晩空気乾燥する。脱脂したマツカサ材料を密閉容器中室温で保存する。
【００３６】
抽出工程の前に脱脂したマツカサを好ましくは小型粒子に粉砕する。この処置により活性成分の放出が促進される。好ましくは、粒子サイズは８０〜１２０メッシュの範囲にすべきである。
【００３７】
マツカサの熱抽出のための溶媒は水酸化カリウム（ＫＯＨ）を含んでなる水溶液である。溶液は少なくとも０．２５重量／重量％  水酸化カリウムを含んでなり、好ましくは、これは０．５〜２重量／重量％  水酸化カリウムを含んでなり、さらに好ましくは、これは１重量／重量％  水酸化カリウムを含んでなる。本発明者らはこれらの水酸化カリウム濃度でとりわけ有効な抽出物を得ることができることを見出した。溶媒のｐＨは少なくとも８、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは１１〜１３の範囲である。
【００３８】
溶媒をマツカサに添加し、そして混合物を、好ましくは８０℃（１７６°Ｆ）またはそれ以上の温度で加熱することによりマツカサ材料の抽出を実施する。本発明者らは、溶媒を沸騰させた場合に都合よく速く、そして十分な抽出速度で抽出を実施できることを見出した。オートクレーブで１２１℃で処理することによりマツカサ材料を抽出するのがとりわけ好ましい。このようにとりわけ速く、穏やかで、完全な活性成分の抽出を達成することができる。
【００３９】
抽出後、混合物を好ましくは室温まで冷ますのが都合よい。必要な場合、さらに加工する前に混合物を１２時間冷蔵庫で保存することができる。
【００４０】
次いで０．２０μｍより大きい平均粒子サイズを有する粒子状物質を除去する。いずれかの粒子分離法によりこれを達成することができる。本発明者らは、とりわけ便利で有効な方法は２段階方法であり、ここで第１工程では、粗い粒子状物質を濾過により除去し、次いで残りの望ましくない粒子状物質を、好ましくは４℃±２℃で遠心により除去することを見出した。
【００４１】
次に、得られた粒子枯渇混合物を処理してｐＨを６．０と８．０の間に調整する。これは１Ｎ  ＨＣＬを用いて、混合物のｐＨが７．０になるまで滴定することにより行うのが好ましい。ＨＣＬを用いる中和方法の間に、塩化カリウムの副産物を生じ、混合物中に残る。次いでこの混合物を包装単位に分配することができる。
【００４２】
ｐＨを調整した後、混合物を滅菌することができる。１２１℃でのオートクレーブ処理により、液体サイクルを２０分間で滅菌するのが好ましい。照射、ホモジナイズなどのその他の滅菌技術を適用することもできる。
【００４３】
ｐＨ調整および場合によっては滅菌の後、混合物を保存することができる。長期保存安定性は低温、好ましくは４℃またはそれ以下で、さらにより好ましくは凍結状態で、最も好ましくは−２０℃での保存により最良であることが確認されている。しかしながら、混合物を全く保存せずに即座に使用するのが好ましい。
【００４４】
マツカサ抽出物生成方法の実例
【００４５】
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な、例えばロボリー・パイン（ｌｏｂｏｌｌｙ  ｐｉｎｅ）、スプラッシュ・パイン（ｓｐｌａｓｈ  ｐｉｎｅ）、およびロングリーブ・パイン（ｌｏｎｇｌｅａｖｅｓ  ｐｉｎｅ）を脱イオン水  約１０リットルを用いる連続的２回洗浄、次いで９５％  エタノール  １０リットルを用いる１回洗浄により、細かく切断されたマツカサ材料約５ｋｇを洗浄する。エタノールおよび洗浄したマツカサ材料を攪拌し、次いで液を捨てる。清浄したマツカサ材料を一晩空気乾燥する。清浄したマツカサ材料をブレンダーで粉砕し、８０〜１２０メッシュの範囲の粒子サイズを得る。清浄し、粉砕したマツカサ材料６００ｇを取り、フラスコ内に入れる。１％  ＫＯＨを４．５リットル加える。フラスコの開口部をチーズ・クロスで包んだ綿栓で塞ぐ。１％  ＫＯＨ中でマツカサ材料を１時間、低排出でオートクレーブ処理する（液体サイクル、１２１℃）。フラスコを冷ます。内容物を即座にさらに加工しない場合、フラスコを冷蔵庫内で４℃で保存することができる。
【００４６】
そこに真空が適用されている吸引フラスコに取り付けられたブフナー漏斗上のナイロンメッシュフィルターでオートクレーブ処理した懸濁液から大きな粒子を濾過して除く。４℃で、８００ｒｐｍで１０分間中速遠心を用いて濾液を遠心することにより微細粒子の除去を実施する。得られた上澄を捨てて、さらに加工する。粒子状物質を残しておく。
【００４７】
次いで得られた粒子枯渇混合物を処理してｐＨ６．０から８．０の間に調整する。これは、混合物のｐＨが７．０になるまで１Ｎ  ＨＣＬで滴定することにより行うのが好ましい。得られた物質はＰＰＣまたはＰＣＥであり、これを包装単位に分配することができる。
【００４８】
ｐＨを調整した後、包装単位で室温で放置した混合物を脱イオン水中で２０分間オートクレーブ処理することにより滅菌することができる（液体サイクル、１２１℃）。その他の滅菌技術、例えば照射、ホモジナイズ等を用いることができる。
【００４９】
ｐＨを調整し、そして場合によっては滅菌した後、混合物を保存することができる。長期保存安定性は低温、好ましくは４℃またはそれ以下で、さらにより好ましくは凍結状態で、最も好ましくは−２０℃での保存により最良であることが確認されている。しかしながら、混合物を全く保存せずに即座に使用するのが好ましい。
【００５０】
分析手順
【００５１】
分光光度計で２８０ｎｍでの吸光度（ブランクは蒸留水）を読むことによりリグニンの濃度が得られ、そして２００〜７００ｎｍのスキャンによりスペクトルが得られる。得られた物質を冷蔵庫で保存する。
【００５２】
ＨＳＶ感染
【００５３】
試験系はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得られたベロ細胞からなる。ＨＳＶ−１（Ｆ）はＤｒ．Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｒｏｉｚｍａｎ（シカゴ大学）から入手した。ベロ細胞でウイルスストックを調製し、ストックおよび組織抽出物をベロ細胞単層で力価決定した。
【００５４】
ＰＰＣまたはＰＣＥ（マツ抽出物）は２６０〜２８０ｎｍで吸収の肩を有する褐色の液体である。これは水、および水とエチルアルコールの混合物に、並びにアセトンに溶解する。これは多糖類およびポリフェニルプロペノイドの複合体を含有する。分子量はファスト・プロテイン・リキッド・クロマトグラフィー（ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＦＰＬＣ）により決定される。５つの主要な成分は１００、２１．０、１３．５、３．６および２．１ｋＤａ以上の分子量を有する。
【００５５】
ＰＰＣ／ＰＣＥの抗ＨＳＶ活性
【００５６】
抽出物の経口投与
【００５７】
抽出物を飲料水で投与した。感染の５日前に処置を開始し、実験の間中続け、水を交換し、そして新鮮な抽出物を毎日加えた。２５０μｇ／ｍｌまでの濃度で１０日間まで投与したマウスで抽出物の毒性または飲んだ水の容量の低下は観察されなかった。
【００５８】
動物におけるＨＳＶ感染に及ぼすＰＰＣ／ＰＣＥの影響では、５週齢ＣＢＡ／Ｊマウスは角膜をＨＳＶ−１（Ｆ）で感染した。角膜を３０ｇの針で８〜１０回傷つけ、１０４〜１０６ｐｆｕ／眼のＨＳＶ−１（Ｆ）を含有するウイルス接種材料１０μｌを各眼に点眼した。
【００５９】
図１に示すように、極度に高いウイルス接種用量である１０５および１０６では、２５０μｇ／ｍｌまでの濃度でほとんど効果がなかった。しかしながら、低いウイルス接種用量である１０４では、ウイルス力価の著明な低下が観察された。被験抽出物の最高濃度で最大効果が認められ、１０４ｐｆｕ／眼の感染の後の１つの実験で観察された；この場合、処置マウスの眼の幾何平均力価が未処置対照と比較して１００倍低下した。いくつかの反復実験では、力価の低下は３〜５倍であった。雄対雌マウスの感染から得られた結果の間に差異は観察されなかった。
【００６０】
用量決定
【００６１】
抽出物の最適用量を決定するために、マウスを１×１０４ｐｆｕ／眼で感染し、種々用量の抽出物を投与した。２０、５０、１００、２５０μｇで投与した抽出物の効果に差異は観察されなかった；全ての処置群の眼の力価は、対照と比較しておよそ８倍低下した（図２；対照と比較して２５０μｇ／ｍｌに関してｐ＜０．０５）。しかしながら、最低用量（２０μｇ／ｍｌ、図３）で処置したマウスと比較して、抽出物の最高用量（２５０μｇ／ｍｌ）で処置したマウスから得られた実質的に低い力価を有する眼から得られたウイルスの幾何平均力価では差異が観察された。この差異は、主にウイルスが回復できなかった、２５０μｇ／ｍｌ群におけるいくつかの眼の存在に起因し、これは抽出物がこれらの眼の感染を完全に防御したことを示している。
【００６２】
本データは、前記で設定した条件下で、マツカサの水酸化カリウム抽出物から調製したＰＰＣ抽出物がマウス角膜においてＨＳＶ−１（Ｆ）の複製を効率的に低下させたことを実証している。前記したように、本発明のＰＰＣは強力な抗ＨＳＶ活性を有している。従って、好ましくは作用物質はＨＳＶを患うヒトの症状を改善し、その効果はその他の化学療法剤（すなわちアクシロビル、バラシクロビル、ペンシクロビルおよびファムシクロビル）との組み合わせ療法により増進されることがほぼ確実である。
【００６３】
従って、前記は本発明の原理の説明としてのみ考えられる。網羅的であること、または本発明を開示した正確な様式に限定することを意図するものではない。前記の教示を鑑みて明白な修飾または変化が可能である。このような修飾および変化は全て、添付の請求の範囲により決定されるように、適正に、合法的に、公平に権利が与えられた広さに従って解釈された場合、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】種々の量のウイルスでの感染の２４時間後の眼の平均力価を示す。
【図２】種々の濃度のＰＣＥ抽出物の投与に続いて、感染の２４時間後の眼の平均力価を示す。
【図３】種々の量の抽出物の投与に続いて、感染の２４時間後の眼の幾何平均力価を示す。
【図１】
2005510490.tif 000003
【図２】
2005510490.tif 000004
【図３】
2005510490.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月29日(2004.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分としてマツカサからの抽出物を含んでなる抗ＨＳＶ薬であって、マツカサの水酸化カリウム溶液での抽出により抽出物が得られ、前記抽出物がカリウムを含んでなる、抗ＨＳＶ薬。
【請求項２】
前記水酸化カリウムは、水酸化カリウムの１％溶液である請求項１に記載の抗ＨＳＶ薬。
【請求項３】
前記抽出物の前記活性成分は、ポリフェニルプロペノイド・多糖類複合体（ＰＰＣ）である請求項１に記載の抗ＨＳＶ薬。
【請求項４】
前記抽出物は、Ｐｉｎｕｓ属のいずれかの亜種または種のマツカサから抽出される請求項１に記載の抗ＨＳＶ薬。
【請求項５】
該マツカサは、Ｐ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ、Ｐ．ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒａおよびＰ．ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉからなる群から選択される請求項４に記載の抗ＨＳＶ薬。
【請求項６】
ポリフェニルプロペノイド・多糖類複合体（ＰＰＣ）が２６０〜２８０ｎｍで吸収の肩を有する褐色を有し、これは水およびアルコール、およびアセトンに溶解し、並びに多糖類およびポリフェニルプロペノイドの複合体（ＰＰＣ）からなり、ファスト・プロテイン・リキッド・クロマトグラフィーにより決定されるように、５つの主要な成分は約１００、２１．０、１３．５、３．６および２．１ｋＤａ以上の分子量を有し、前記ポリフェニルプロペノイド・多糖類複合体（ＰＰＣ）はｐＨ７でマツカサの水酸化カリウム抽出物からの沈殿から得られる請求項３で設定されるような抗ＨＳＶ薬。
【請求項７】
前記抽出物は、少なくともｐＨ８を有する水酸化カリウムで抽出された請求項１の抗ＨＳＶ薬。
【請求項８】
前記水酸化カリウムは、６〜８のｐＨを有する請求項７の抗ＨＳＶ薬。
【請求項９】
細かく切断されたマツカサ材料をエタノール洗浄で脱脂するステップと、
脱脂した後、前記マツカサ材料を空気で乾燥するステップと、
エタノールおよび熱水抽出可能材料を除去し、２４時間空気乾燥した後、前記マツカサの混合物を１％  ＫＯＨ溶液で熱抽出するステップと、
平均粒子サイズが０．２μｍより大きい粒子状物質を前記混合物から除去するステップ、および
得られた粒子枯渇混合物のｐＨを６と８の間に調整し、前記ＫＯＨのカリウムは前記粒子枯渇混合物に残留するステップと、
を含んでなるポリフェニルプロペノイド・多糖類複合体（ＰＰＣ）を生成する方法。
【請求項１０】
請求項９に従って得られるような有効量のポリフェニルプロペノイド・多糖類複合体（ＰＰＣ）およびカリウムを含有する抗ＨＳＶ組成物。
【国際調査報告】
2005510490.tif 000006