(57)【要約】本発明は、２つのループ構造および１つのステム構造を備えた環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）を提供し、ここで、このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明は、上記ＣＤＯＤＮを含有する薬学的組成物を、さらに提供する。この薬学的組成物は、このような転写因子に関連する疾患または障害を、処置および／または予防するために、使用され得る。本発明はまた、このような転写因子に関連する疾患または障害を、処置および／または予防する方法を提供する。この方法は、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えたＣＤＯＤＮを被験体に投与する工程を包含し、ここで、上記ステム構造は、上記転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つのループ構造および１つのステム構造を備える環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）であって、該ステム構造が、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項２】
前記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項３】
酵素的連結によって共有結合する２つの相同なステムループ構造を有する、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項４】
いかなる化学改変されたヌクレオチドも含まない、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項５】
前記ステム構造が、２つ以上の転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項６】
前記転写因子がＡＰ−１である、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項７】
前記ＡＰ−１のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列が、５’−ＴＧＡＣＴＣＡ−３’である、請求項６に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項８】
前記相同なステムループ構造のそれぞれが、配列番号３の配列を有する、請求項６に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項９】
ステム構造が、別の転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列をさらに含む、請求項６に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項１０】
インビトロ競合結合アッセイで評価した場合に、配列番号４の配列を有するリン酸化オリゴヌクレオチドより、約５倍以上強いＡＰ−１配列特異性を有する、請求項６に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項１１】
前記転写因子がＥ２Ｆである、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項１２】
前記Ｅ２ＦのＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列が、５’−ＴＴＴＣＧＣＧＣ−３’である、請求項１１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項１３】
前記相同なステムループ構造のそれぞれが、配列番号６の配列を有する、請求項１１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項１４】
インビトロ競合結合アッセイで評価した場合に、配列番号７の配列を有するリン酸化オリゴヌクレオチドより、約５倍以上強いＥ２Ｆ配列特異性を有する、請求項１１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項１５】
前記転写因子がＮＦκＢである、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項１６】
被験体において、転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防する方法であって、該方法は、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えたＣＤＯＤＮを被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ステム構造は、該転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項１７】
前記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
薬学的受容可能キャリアが、ＨＶＪ−リポソーム組成物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記転写因子がＡＰ−１である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記転写因子に関連する疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
被験体において、前記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物が、血管損傷前に投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記転写因子がＥ２Ｆである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
被験体において、前記治療有効量のＣＤＯＤＮが、被験体において再狭窄を防ぐために有効である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＤＯＤＮが、血管損傷後に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記転写因子がＮＦκＢである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
被験体において、転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、治療有効量の２つのループ構造および１つの該転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含むステム構造を備えたＣＤＯＤＮ、ならびに薬学的受容可能キャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３０】
前記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記薬学的受容可能キャリアが、ＨＶＪ−リポソーム組成物である、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
前記転写因子がＡＰ−１である、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
前記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
被験体において、前記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
前記転写因子がＥ２Ｆである、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
前記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
被験体において、前記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
前記転写因子がＮＦκＢである、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
前記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
被験体において転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬品の製造における、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えたＣＤＯＤＮの使用であって、ここで、該ステム構造は、該転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、使用。
【請求項４１】
前記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記医薬品が、ＨＶＪ−リポソーム組成物の形態である、請求項４０に記載の使用。
【請求項４３】
前記転写因子がＡＰ−１である、請求項４０に記載の使用。
【請求項４４】
前記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
被験体において、前記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、請求項４３に記載の使用。
【請求項４６】
前記転写因子がＥ２Ｆである、請求項４０に記載の使用。
【請求項４７】
前記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
被験体において、前記治療有効量のＣＤＯＤＮが、被験体において再狭窄を防ぐために有効である、請求項４０に記載の使用。
【請求項４９】
前記転写因子がＮＦκＢである、請求項４０に記載の使用。
【請求項５０】
前記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、請求項４６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療分野の発明である。本発明は特に、新規のデコイオリゴデオキシヌクレオチドおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
転写因子の還元性トランス活性のための二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮまたは「デコイ（ｄｅｃｏｙ）」）は、遺伝子治療および遺伝子産物の機能研究のための、革新的かつ魅力的な戦略である。幾つかの異なった二本鎖ＤＮＡ構造（非改変オリゴヌクレオチド二重鎖、脱アノマーオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド二重鎖、およびダンベルオリゴヌクレオチドが挙げられる）が、転写因子のためのデコイとして、導入されている（Ｓｃｈｏｌｅｒ  ＨＲおよびＧｒｕｓｓ  Ｐ．，Ｃｅｌｌ  １９８４；３６：４０３−４１１；Ｃｅｒｅｇｈｉｎｉ  Ｓｅｔら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９８８；２：９５７−９７４；Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ  ＬＡら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８９；９：４２７２−４２８１；Ｔａｎａｋａ  Ｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９４；２２：３０６９−３０７４；Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ  Ａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０；２５０：９９７−１０００；Ｃｌｕｓｅｌ  Ｃら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９３；２１：３４０５−３４１１；Ｌｉｍ  ＣＳら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９７；２５：５７５−５８１；Ｈｏｓｏｙａ  Ｔら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９９；４６１：１３６−１４０；Ｍａｎｎ  ＭＪおよびＤｚａｕ  ＶＪ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０６：１０７１−１０７５を、参照のこと）。
【０００３】
二本鎖シスエレメントデコイＯＤＮのトランスフェクションは、同配列の内在性シスエレメントからのトランス活性因子の隔離をもたらし、その結果、遺伝子発現の阻害をもたらす（Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ  Ａら，１９９０（前出）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら１９９８（前出）；およびＳａｗａ  Ｙ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９７；９６：ＩＩ−２８０−ＩＩ−２８５を、参照のこと）．
さらに、ＮＦ−κＢ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃｄｃ２、ｃｄｋ２、Ｅ２Ｆ、およびＣＲＥに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはデコイオリゴヌクレオチドの投与は、悪液質を減少すること（Ｋａｗａｍｕｒａ  Ｉら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９９；６：９１−９７）、実験的狭窄におけるインビトロの細胞増殖および内膜肥厚（Ｓｉｍｏｎｓ  Ｍら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５９：６７−７３；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４；９３：１４５８−１４６４；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９３；９０：８４７４−８４７８；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら，１９９５（前出）；  Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７；３：８９４−８９９；Ｋａｎｅｄａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９７；４５：９９−１０５；Ｔｏｍｉｔａら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９８；２７５：Ｆ２７８−Ｆ２８４；Ｍａｅｓｈｉｍａ  Ｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８；１０１：２５８９−２５９７；Ａｋｉｍｏｔｏ  Ｍら，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１９９８；６７：３９５−４０１；Ｍａｎｎ  ＭＪら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９９；３５４：１４９３−１４９８；Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｚａｕ  ２０００（前出）；Ｋａｗａｕｃｈｉ  Ｍら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２０００；８７：１０６３−１０６８；Ｍａｎｇｉ  ＡＡ  ａｎｄ  Ｄｚａｕ  ＶＪ，Ａｎｎ  Ｍｅｄ  ２００１；３３：１５３−１５５；Ｅｈｓａｎ  Ａら，Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ２００１；１２１：７１４−７２２；Ｋａｗａｕｃｈｉ  Ｍら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２００１；３３：４５１；ＭｃＣａｒｔｈｙ  Ｍ，Ｌａｎｃｅｔ，２００１；３５８：１７０３を参照のこと）、増殖性胆管炎の抑制（Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｍら，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．２００２；１０２：９５−１０１）および癌モデルにおいて腫瘍増殖を遅くし、アポトーシスを誘導すること（Ｐａｒｋ  ＹＧら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：１５７３−８０；Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ  ＹＳら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００；２１２：２９−３４；Ａｌｐｅｒ  Ｏら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１；２１８：５５−６３）が、それぞれ示されている。
【０００４】
非改変オリゴヌクレオチドＯＤＮの主な制限は、これらが血清中および細胞中のヌクレアーゼによって容易に分解されることである。この問題を解決するため、改変結合（例えば、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート）を有するオリゴヌクレオチドが、開発されている。しかし、これらの改変ＯＤＮは、ＲＮａｓｅ  Ｈ  に対する非反応性、細胞性ＤＮＡ内への加水分解された改変ヌクレオチドの再利用の可能性、ＯＤＮベースの遺伝子治療の配列特異的結合効果の欠如、および免疫活性化などの問題点を示す（Ｍｏｏｎ  ＩＪら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：４６４７−４６５３；Ｈｏｓｏｙａ  Ｔら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９９；４６１：１３６−１４０；Ｋｈａｌｅｄ  Ｚら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９６；２４：７３７−７７５；Ｇａｏ  ＷＹら，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９２；４１：２２３−２２９；Ｂｒｏｗｎ  ＤＡら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９４；２６９：２６８０１−２６８０５；およびＢｕｒｇｅｓｓ  ＴＬら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５；９２：４０５１−４０５５を参照のこと）。
【０００５】
近年、デコイが、転写因子に関連する疾患および障害（新内膜形成を含む）の処置のために提案されている。新内膜形成は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の過剰増殖および中膜から内膜への転移から生じ、これらは、アテローム性動脈硬化症および再狭窄（経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の主要な問題である）の病因における、重要な工程である（Ｃｕｒｒｉｅｒ  ＪＷ，およびＦａｘｏｎ  ＤＰ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  １９９５；２５：５１６−５２０；Ｃｌｏｗｅｓ  ＡＷ，ら，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９８３；４９：２０８−２１５；Ｌｉｕ  ＭＷ，ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９８９；７９：１３７４−１３８７；Ｒｏｓｓ  Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９０；３６２：８０１−８０９；およびＰａｕｌｅｔｔｏ  Ｐ，ら，Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ．１９９４；８７：４６７−４７９を、参照のこと）。
【０００６】
ＰＴＣＡ後の再狭窄の発生率および割合を減少するために、多くの薬物の試験が行われているが、結果は芳しくない。この十年にわたって、ＶＳＭＣ増殖に主眼を置いた抗遺伝子治療が、ＰＴＣＡ後の再狭窄を減少するための、可能性のある魅力的な戦略として、出現している（Ｓｉｍｏｎｓ  Ｍ，ら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５９：６７−７３；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，ら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４；９３：１４５８−１４６４；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９３；９０：８４７４−８４７８；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５；９２：５８５５−５８５９；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，ら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７；３：８９４−８９９；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．２００１；９１：１０５−１１４，Ｍｏｔｏｋｕｎｉ  Ａら，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  ２００１；５９：４３−５２を参照のこと）。
【０００７】
これまでの研究では、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）およびｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）（両方とも分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーに属する）は、バルーン損傷後に、迅速かつ過渡的に活性化されることが見出されている（Ｏｈａｓｈｉ  Ｎ，ら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２０００；２０：２５２１−２５２６；Ｋｏｙａｍａ  Ｈ，ら，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９８；８２：７１３−７２１；Ｈｕ  Ｙ，ら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．１９９７；１７：２８０８−２８１６；およびＰｙｌｅｓ  ＪＭ，ら，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９７；８１：９０４−９１０を参照のこと）。
【０００８】
損傷した血管壁におけるＥＲＫ２活性およびＪＮＫ１活性は、バルーン損傷後迅速に上昇し、損傷５分後に高レベルに達する。ＥＲＫ２キナーゼ活性における持続的な上昇は、損傷後７日間にわたって動脈壁において、そして１４日にわたって新内膜において、観察された。（Ｈｕ  Ｙ，ら，１９９７（前出）；およびＩｚｕｍｉ  Ｙ，ら，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００１；８８：１１２０−１１２６）。
【０００９】
ＪＮＫおよびＥＲＫは、核内に転座し、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓ（二量体化し、転写因子複合体ＡＰ−１を形成する）を活性化することが公知である。ＡＰ−１は、多様な範囲の細胞増殖性応答（例えば、細胞外マトリックス産生）（Ｋａｒｉｎ  Ｍ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：１６４８３−１６４８６；およびＷｈｉｔｍａｒｃｈ  ＡＪ，ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ  ＲＪ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１９９６；７４：５８９−６０７を参照）、アポトーシス（Ｌｅ−Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ  Ｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９；１９：７５１−７６３；Ｔａｉｍｏｒ  Ｇ．ら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００１；１５：２５１８−２５２０）、血管再形成（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９８；２４３：３６１−３６７；Ｌａｕｔｈ  Ｍ．ら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２０００；７８：４４１−４５０；Ｗａｇｎｅｒ  ＡＨ  ら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．２０００；５８：１３３３−１３４０；Ｃａｔｔａｒｕｚｚａ  Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：３６９９９−３７００３）、ＣＯＸ−２媒介性炎症（Ａｄｄｅｒｌｅｙ，ＳＲおよびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ＤＪ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９９；２７４：５０３８−５０４６；ｖｏｎ  Ｋｎｅｔｈｅｎ  Ａら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９９９；１０：３６１−３７２；ｖｏｎ  Ｋｎｅｔｈｅｎ  Ａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９；１６３：２８５８−２８６６；Ｓｕｂｂａｒａｍａｉａｈ  Ｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：１２４４９−１２４４８）および１型プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ−１）の産生（Ａｈｎ  ＪＤ．ら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２００１；４４：７１３−７２０）ＴＧＦ−β（Ｊｉｎ  ＧおよびＨｏｗｅ  ＰＨ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２：２６６２０−２６６２６）およびＩＬ−６（Ｖｉｅｄｔ  Ｃ  ら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２０００；１４：２３７０−２３７２）に関連する多くの遺伝子の中に存在する、特定のＤＮＡ配列に結合する。
【００１０】
これらの結果は、ＡＰ−１結合が、血管損傷における血管平滑筋細胞増殖に関連し得ることを示唆する。しかし、ＡＰ−１結合の阻害が、新内膜形成を阻害するか否かは、知られていない。
【００１１】
近年の報告はまた、転写因子Ｅ２Ｆ（サイクリンＡ、ｃｄｋ２、およびｐＲＢと複合体を形成し、これらの細胞周期調節遺伝子を活性化およびリン酸化する）が、細胞成長および細胞増殖を維持するために重要であることを示している（Ｐａｇａｎｏ  Ｍら  ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９２；１１：９６１−９７１；Ｐａｒｄｅｅ  ＡＢ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９７４；７１：１２８６−１２９０；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  ＳＪ，ら  Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５８：２５９−２６１；Ｐａｇａｎｏ  ＭＧ，ら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２；２５５：１１４４−１１４７；およびＲｏｓｅｎｂｌａｔｔ  Ｊ，ら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９２；８９：２８２４−２８２８）。
【００１２】
転写因子である核因子−κＢ（ＮＦκＢ）は、サイトカインおよび接着分子遺伝子（虚血および再灌流後の心筋障害に関連し得る）の協調的トランス活性化において、中心的な役割を果たす。ＮＦκＢに特異的なデコイは、転写因子に結合し、心筋の炎症を仲介する遺伝子の活性を阻害するためにインビボで使用され、従って、心筋炎症に対する効果的な治療を提供する（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ．ら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７  Ａｕｇ；３（８）：８９４−９）。
【００１３】
転写因子に関連する幾つかの疾患および障害に対して、成功したデコイの適用はあるが、上述の非改変オリゴヌクレオチドＯＤＮの、これらが血清中および細胞中に存在するヌクレアーゼによって容易に分解されるという主な制限は、これらの疾患および障害を処置しかつ予防する際の、デコイの有効性をかなり低下させる。
【００１４】
インビトロ研究において、共有結合的に閉じたＯＤＮが、これらの制限を克服する目的で、２つの相同な分子の酵素的な結合によってエキソヌクレアーゼ活性を避けるために、開発されている。酵素的結合による３’端および５’端の連結によってオリゴヌクレオチドを環状化して作製された、天然のＤＮＡに似た非毒性非改変バックボーンを有する、環状ダンベルオリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対するより高い安定性を有し、化学改変直鎖状オリゴヌクレオチドと比較してより高い細胞内への取り込みを有していた（Ｃｈｕ  ＢＣＦおよびＯｒｇａｌ  Ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２；２０：５８５７−５８５８；およびＡｂｅ  Ｔ，ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９８；４２５：９１−９６を参照のこと）。
【００１５】
しかし、このような共有結合的に閉じたＯＤＮまたは環状ダンベルオリゴヌクレオチドが、疾患または障害の処置または予防において有効であることを示す報告は、存在していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、本発明の目的は、転写因子に関連する疾患および障害を処置または予防するための、より効率的かつより有効な手段を、提供することである。
【００１７】
さらに、本発明の目的は、ＶＳＭＣのトランスフェクションのための転写因子（例えば、ＡＰ−１）結合部位を含むデコイＯＤＮのような手段を提供することであり、この結合部位は、デコイを効果的にＡＰ−１に結合させ、細胞増殖性応答に関連する不可欠な遺伝子のトランス活性化を防ぎ、そしてそれにより新内膜形成を阻害する。
【００１８】
従って、本発明の別の目的は、環状ダンベル構造（ＣＤＯＤＮ）を有する新規のＡＰ−１デコイＯＤＮを提供し、バルーン損傷におけるＡＰ−１活性化の役割を明らかにすることである。環状ダンベル構造（ＣＤＯＤＮ）を有するＡＰ−１デコイＯＤＮは、センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームを用いてトランスフェクトされ得る。この発明において、本発明者らは、ＣＤＯＤＮの安定性および有効性を、インビトロおよびインビボで評価した。ここで、本発明者らは、ＡＰ−１活性化が、損傷への応答におけるＶＳＭＣ増殖において重要な役割を果たすこと、およびバルーン損傷工程前のラット動脈への新規ＣＤＯＤＮのトランスフェクションが、バルーン損傷したラット動脈における新内膜形成をほぼ完全に防ぐことを実証した。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、血管形成術後の再狭窄についての新規の治療戦略を開発することであり、この戦略は、血管形成術の前、その間、またはその後に、有効量のＣＤＯＤＮ  ＡＰ−１デコイまたは他のＡＰ−１阻害的化合物を、患者に投与する工程を包含する。
【００２０】
本発明のなおさらなる目的は、新規のＥ２Ｆデコイを提供することであり、この新規のＥ２Ｆデコイは、エキソヌクレアーゼ活性を避けるため、２つの相同なオリゴ分子の共有結合閉環によって作製される。本発明者らは、不可欠な細胞周期調節遺伝子のトランス活性化の際、ならびにＶＳＭＣ増殖および新内膜形成の際の、この環状ダンベルＥ２Ｆデコイ（ＣＤ−Ｅ２Ｆ）の安定性および配列特異的阻害効果を調査した。
【００２１】
本発明のなおさらなる目的は、血管形成術後の再狭窄についての新規の治療戦略を開発することであり、この戦略は、血管形成術の前、その間、またはその後に、有効量のＣＤ−Ｅ２Ｆデコイを、患者に投与する工程を包含する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
本発明は、２つのループ構造および１つのステム構造を含む環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）を提供し、このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明は、さらに、上記ＣＤＯＤＮを含有する薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、このような転写因子に関連する疾患または障害を処置および／または予防するために、使用され得る。本発明はまた、このような転写因子に関連する疾患および／または障害を処置または予防する方法を提供し、この方法は、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えたＣＤＯＤＮを被験体に投与する工程を包含し、ここで、このステム構造は、該転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
好ましくは、この転写因子は、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される。好ましくは、ＮＦ−κＢデコイは、配列５’−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号９）を含み得る（ＮＦ−κＢデコイ）；ＳＴＡＴ−１デコイは、配列５’−ＧＡＴＣＴＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号１０）を含み得る（ＳＴＡＴ−１デコイ）；ＧＡＴＡ−３デコイは、配列５’−ＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴ−３’（配列番号１１）を含み得る（ＧＡＴＡ−３デコイ）；ＳＴＡＴ−６デコイは、配列５’−ＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴ−３’（配列番号１２）を含み得る（ＳＴＡＴ−６デコイ）；ＡＰ−１デコイは、配列５’−ＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号１３）または５’−ＴＧＡＣＴＣＡ−３’を含み得る（ＡＰ−１  デコイ）；ｅｔｓデコイは、配列５’−ＡＡＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡ−３’（配列番号１４）を含み得る（Ｅｔｓデコイ）；ＣＲＥデコイは、配列５’−ＴＧＡＣＧＴＣＡ−３’を含み得る（ＣＲＥデコイ）；およびＥ２Ｆデコイは、配列５’−ＴＴＴＣＧＣＧＣ−３’を含み得る（Ｅ２Ｆ  デコイ）。
【００２４】
血管平滑筋細胞の過剰増殖および新内膜形成は、アテローム性動脈硬化症および経皮的血管形成術後の再狭窄の病因における重大な工程である。このような疾患および障害の処置または予防におけるＡＰ−１のＣＤＯＤＮの有効性を示すため、以下の研究が行われ、転写因子ＡＰ−１は、これらの過程において重要な役割を果たすという本発明者らの仮説を試験し、そして血管形成後の再狭窄についての新規の治療戦略を開発した。全体的に、本発明者らの結果は、ＡＰ−１活性化は、血管損傷における平滑筋細胞増殖の媒介において、重要であることを示した。従って、本発明は、再狭窄を導く平滑筋細胞増殖に対する新規の戦略を提供する。
【００２５】
本発明者らは、エキソヌクレアーゼによる破壊を避けるために、環状ダンベル構造（ＣＤＯＤＮ）を有する新規のＡＰ−１デコイＯＤＮを開発した。この新しい形態のＡＰ−１デコイＯＤＮは、ホスホチオエート直鎖状デコイＯＤＮ（ＰＳＯＤＮ）よりも、より安定で、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたは血清のどちらかの存在下でのインキュベーション後、その構造的完全性を大いに保った。ＡＰ−１デコイＯＤＮのトランスフェクションは、血管平滑筋細胞の増殖および転移の両方を、強く阻害した。ＡＰ−１デコイＯＤＮはまた、ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの、高濃度グルコース誘導性転写発現および血清誘導性転写発現も、阻害した。インビトロでのデータと一致して、センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム法を使用したＡＰ−１デコイＯＤＮのインビボの投与は、ラット頚動脈のバルーン損傷後の新内膜形成を、ほぼ完全に阻害した。従来のＰＳＯＤＮと比較して、ＣＤＯＤＮは、インビトロの平滑筋細胞の増殖阻害およびインビボの新内膜形成の阻害においてより効果的であった。ＰＳＯＤＮと比較しておよそ半分の用量のＣＤＯＤＮが、インビトロおよびインビボの血管平滑筋細胞の増殖阻害において同様の結果を得るために、十分であった。その上、ＡＰ−１のＣＤＯＤＮ結合の配列特異性は、予想外に、従来のＰＳＯＤＮよりも１０倍以上高かった。
【００２６】
従って、本発明は、非常に効果的なＨＶＪ−リポソーム送達法を用いた、ＡＰ−１に対しより安定なＣＤＯＤＮの使用は、ヒトにおいて、血管形成後の再狭窄の予防のための新規の治療戦略を提供することを、示す。
【００２７】
さらに、本発明は、細胞周期調節に関する幾つかの分子のトランス活性化において重要な役割を果たす、転写因子Ｅ２Ｆに関係する。先行研究は、Ｅ２Ｆ結合ドメインに対応するシスエレメント二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（デコイ）のトランスフェクションは、損傷した血管における血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）増殖および新内膜肥厚を阻害し得ることを示している。本研究において、本発明者らは、環状ダンベル構造を有する新規のＥ２Ｆデコイ（ＣＤ−Ｅ２Ｆ）を開発し、そしてこのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を、従来のホスホチオエート化Ｅ２Ｆデコイ（ＰＳ−Ｅ２Ｆ）と比較した。本発明者らは、ＣＤ−Ｅ２Ｆは、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも、より安定で、ヌクレアーゼまたは血清のどちらかの存在下でのインキュベーション後、その構造的完全性を大いに保った。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、細胞周期調節遺伝子の高濃度グルコース誘導性転写発現および血清誘導性転写発現を、ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較して、より強く阻害した。ＣＤ−Ｅ２Ｆのトランスフェクションは、ＶＳＭＣ増殖およびインビボの新内膜形成の阻害において、ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較して、より効果的であった。ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較して、４０〜５０％減少した用量のＣＤ−Ｅ２Ｆが、インビトロのＶＳＭＣ増殖阻害およびインビボの新内膜形成において同様の結果を得るために、十分であった。その上ＣＤ−Ｅ２Ｆは、予想外にも、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも１０倍高いＥ２Ｆに対する配列特異性を示した。
【００２８】
結論として、本発明者らの結果は、例えば、血管形成後の再狭窄の処置において、ＣＤ−Ｅ２Ｆが、ＶＳＭＣ増殖を阻害する遺伝子治療（のため、そして転写調節の研究のために、従来のＥ２Ｆデコイより、価値の高い薬剤であることを示す。
【００２９】
（課題を解決するための手段）
本発明は、以下を提供する：  
１．２つのループ構造および１つのステム構造を備える環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）であって、このステム構造が、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド。
【００３０】
２．上記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３１】
３．酵素的結合によって共有結合する２つの相同なステムループ構造を有する、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３２】
４．いかなる化学改変されたヌクレオチドも含まない、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３３】
５．上記ステム構造が、２つ以上の転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列をさらに含む、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３４】
６．上記転写因子がＡＰ−１である、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３５】
７．上記ＡＰ−１のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列が、５’−ＴＧＡＣＴＣＡ−３’である、項目６に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３６】
８．上記相同なステムループ構造のそれぞれが、配列番号３の配列を有する、項目６に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３７】
９．ステム構造が、別の転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列をさらに含む、項目６に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３８】
１０．インビトロ競合結合アッセイで評価した場合に、配列番号４の配列を有するリン酸化オリゴヌクレオチドより、約５倍強いＡＰ−１配列特異性を有する、項目６に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３９】
１１．上記転写因子がＥ２Ｆである、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００４０】
１２．上記Ｅ２ＦのＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列が、５’−ＴＴＴＣＧＣＧＣ−３’である、項目１１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００４１】
１３．上記相同なステムループ構造のそれぞれが、配列番号６の配列を有する、項目１１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００４２】
１４．インビトロ競合結合アッセイで評価した場合に、配列番号７の配列を有するリン酸化オリゴヌクレオチドより、約５倍強いＥ２Ｆ配列特異性を有する、項目１１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００４３】
１５．上記転写因子がＮＦκＢである、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００４４】
１６．被験体において、転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防する方法であって、この方法は、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えたＣＤＯＤＮを被験体に投与する工程を包含し、ここで、このステム構造は、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、方法。
【００４５】
１７．上記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
【００４６】
１８．薬学的受容可能キャリアが、ＨＶＪ−リポソーム組成物である、項目１６に記載の方法。
【００４７】
１９．上記転写因子がＡＰ−１である、項目１６に記載の方法。
【００４８】
２０．上記転写因子に関連する疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成を含む、項目１８に記載の方法。
【００４９】
２１．被験体において、上記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、項目１９に記載の方法。
【００５０】
２２．上記化合物が、血管損傷前に投与される、項目２０に記載の方法。
【００５１】
２３．上記転写因子がＥ２Ｆである、項目１６に記載の方法。
【００５２】
２４．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成を含む、項目２３に記載の方法。
【００５３】
２５．被験体において、上記治療有効量のＣＤＯＤＮが、被験体において再狭窄を防ぐために有効である、項目２３に記載の方法。
【００５４】
２６．上記ＣＤＯＤＮが、血管損傷後に投与される、項目２４に記載の方法。
【００５５】
２７．上記転写因子がＮＦκＢである、項目１６に記載の方法。
【００５６】
２８．上記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、項目１６に記載の方法。
【００５７】
２９．被験体において、転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防するための薬学的組成物であって、この薬学的組成物は、治療有効量の２つのループ構造および１つの該転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含むステム構造を備えたＣＤＯＤＮ、ならびに薬学的受容可能キャリアを含有する、薬学的組成物。
【００５８】
３０．上記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００５９】
３１．上記薬学的受容可能キャリアが、ＨＶＪ−リポソーム組成物である、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６０】
３２．上記転写因子がＡＰ−１である、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６１】
３３．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６２】
３４．被験体において、上記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６３】
３５．上記転写因子がＥ２Ｆである、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６４】
３６．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、項目３５に記載の薬学的組成物。
【００６５】
３７．被験体において、上記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、項目３６に記載の薬学的組成物。
【００６６】
３８．上記転写因子がＮＦκＢである、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６７】
３９．上記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６８】
４０．被験体において転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬品の製造における、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えたＣＤＯＤＮの使用であって、ここで、このステム構造は、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、使用。
【００６９】
４１．上記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、項目４０に記載の使用。
【００７０】
４２．上記医薬品が、ＨＶＪ−リポソーム組成物の形態である、項目４０に記載の使用。
【００７１】
４３．上記転写因子がＡＰ−１である、項目４０に記載の使用。
【００７２】
４４．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、項目４３に記載の使用。
【００７３】
４５．被験体において、上記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、項目４３に記載の使用。
【００７４】
４６．上記転写因子がＥ２Ｆである、項目４０に記載の使用。
【００７５】
４７．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、項目４６に記載の使用。
【００７６】
４８．被験体において、上記治療有効量のＣＤＯＤＮが、被験体において再狭窄を防ぐために有効である、項目４０に記載の使用。
【００７７】
４９．上記転写因子がＮＦκＢである、項目４０に記載の使用。
【００７８】
５０．上記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、項目４６に記載の使用。
【００７９】
本発明の別の局面において、本発明は、ＡＰ−１に関連する疾患または障害を処置する方法をさらに提供し、この方法は、治療有効量の、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼの遺伝子のＡＰ−１によるトランス活性化を阻害し得る化合物、および薬学的受容可能キャリアを被験体に投与する工程を包含する。
【００８０】
さらに、本発明は、被験体において血管損傷後の血管平滑筋細胞増殖または新内膜肥厚を予防する方法を提供し、この方法は、治療有効量の、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼの遺伝子のＡＰ−１によるトランス活性化を阻害し得る化合物、および薬学的受容可能キャリアを被験体に投与する工程を包含する。
【００８１】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、上記ＡＰ−１が上記遺伝子のプロモーターに結合する能力を、阻害し得る。
【００８２】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、抗体、または核酸もしくは核酸アナログである。
【００８３】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、ＡＰ−１のプロモーターへの結合を、競合的に阻害し得る。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態において、この化合物は、２つのループ構造および１つのステム構造を備える環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）であって、このステム構造は、ＡＰ−１のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。
【００８５】
本発明の１つの実施形態において、ＣＤＯＤＮの量は、被験体において再狭窄を防ぐために十分であり得る。
【００８６】
本発明の１つの実施形態において、薬学的受容可能キャリアは、ＨＶＪ−リポソーム組成物であり得る。
【００８７】
本発明の別の局面において、本発明は、被験体において血管損傷後の血管平滑筋細胞増殖または新内膜肥厚を予防する薬学的組成物を提供し、この薬学的組成物は、治療有効量の、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼの遺伝子のＡＰ−１によるトランス活性化を阻害し得る化合物、および薬学的受容可能キャリアを含有する。
【００８８】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、上記ＡＰ−１が上記遺伝子のプロモーターに結合する能力を、阻害し得る。
【００８９】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、抗体、または核酸もしくは核酸アナログである。
【００９０】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、ＡＰ−１のプロモーターへの結合を、競合的に阻害し得る。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態において、この化合物は、２つのループ構造および１つのステム構造を備える環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）であり得、このステム構造は、ＡＰ−１のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。
【００９２】
本発明の１つの実施形態において、ＣＤＯＤＮの量は、被験体において再狭窄を防ぐために十分であり得る。
【００９３】
本発明の１つの実施形態において、薬学的受容可能キャリアは、ＨＶＪ−リポソーム組成物であり得る。
【００９４】
本発明の別の局面において、本発明は、被験体において血管損傷後の血管平滑筋細胞増殖または新内膜肥厚を予防する薬物の製造における、治療有効量の、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼの遺伝子のＡＰ−１によるトランス活性化を阻害し得る化合物の使用を、提供する。
【００９５】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、上記ＡＰ−１が上記遺伝子のプロモーターに結合する能力を、阻害し得る。
【００９６】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、抗体、または核酸もしくは核酸アナログである。
【００９７】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、ＡＰ−１のプロモーターへの結合を、競合的に阻害し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９８】
単数形の冠詞（例えば、英語において「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など；ドイツ語において「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその活用形；フランス語において「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌａ」、「ｌｅ」など；他の言語においては、冠詞、形容詞、または任意の他の等価物など）は、他に言及されない限り、その複数形の概念を含むということが、本明細書全体にわたって理解されるべきである。また、本明細書中で使用される用語は、他に言及されない限り、当該分野で通常使用されている定義を有することも理解されるべきである。
【００９９】
他に明記しない限り、本発明の実施は、タンパク質化学、ウイルス免疫生物学、分子生物学および当該分野の技術の範囲内の組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。このような技術は、文献にて完全に例示される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）；およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１００】
特に明記しない限り、本明細書中で使用される用語は、当該分野で使用されるものと同じ意味を有する。簡便のために、本明細書中、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される用語をここに集める。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、用語「動物」とは、哺乳動物をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトなどの霊長類であり得る。同様に、本発明の方法によって処置される「患者」または「被験体」は、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを意味し得る。好ましくは、このような被験体または患者はヒトであり得る。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、用語「デコイ」または「デコイ化合物」とは、ＡＰ−１もしくはＥ２Ｆのような転写因子する染色体の部位を模倣するか、または、転写調節因子が結合する、ＡＰ−１もしくはＥ２Ｆなどのような転写因子によって制御される遺伝子の染色体部位（本明細書中で後に、「標的結合部位」と称する）を模倣して、それによって染色体結合部位の転写因子への結合に競合する、化合物をいう。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、「ダンベルデコイ」または「ＣＤＯＤＮ」とは、２本鎖ステム領域および２つのループ構造を有する環状のオリゴヌクレオチドをいう。このステム領域は、デコイとして働く配列を含む。好ましくは、ＣＤＯＤＮは、２つの同一のステム−ループ構造の連結から形成される。
【０１０４】
用語「ＥＤ５０」とは、その最大応答または効果の５０％を生じる薬物の量を意味する。用語「ＬＤ５０」は、処置される集団の５０％に対して致死的である薬物の量を意味する。
【０１０５】
本発明の方法に関して、本発明の化合物（例えば、デコイ）または組成物の「有効量」は、ＥＦ−２またはＡＰ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するために有効な量をいう。本発明の方法に関して、本発明の化合物（例えば、デコイ）または組成物の「治療有効量」または「薬理学的有効量」とは、所望の薬理学的効果（例えば、処置される疾患または障害の緩和、治癒または発症の遅延）に十分な量をいう。
【０１０６】
投与される量は、処置される被験体または処置される疾患もしくは障害を含む種々の因子に依存し、そして、好ましくは、このような量は、重大な副作用を伴わずに所望の効果が得られるように最適化されるべきである。このような量は、当業者によって決定され得る。本発明の化合物または組成物の「有効量」、「治療有効量」または「薬理学的有効量」は、ＥＤ５０および／またはＬＤ５０を用いて決定され得る。治療指数は、治療効果と毒性効果の間の用量比であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０の比として表され得る。このような薬学的組成物が有する治療指数が大きいほど、より好ましい効果が得られ得る。ＥＤ５０およびＬＤ５０の決定のために、細胞培養アッセイおよび動物実験が用いられ得、そこから得られたデータを用いて、ヒトへの用途のための用量範囲を外挿し得る。好ましくは、本発明は毒性効果がほとんどないか、または毒性効果がまったくない。このような用量は、投与の形態、被験体の感受性、投与経路などに依存して変化する。
【０１０７】
用語「器官（臓器）」とは、組織の２つ以上の近接する層をいい、この組織の層は、細胞−細胞および／または細胞−マトリクス相互作用のいくつかの形態を維持して、微小構造を形成する。用語「組織」は、同様に特定化された細胞の集団または層をいい、一緒になってある特定化された機能を行う。
【０１０８】
用語「異種」とは、核酸に関して使用される場合、核酸が自然状態においては互いに同じ関係性で見出されない、２つ以上のサブ配列を含むことを指す。例えば、この核酸は、代表的には組み替え的に作製され、新しい機能的な核酸を生じるように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を有する。例えば、１つの実施形態において、この核酸は、異なる遺伝子由来のコード配列の発現に向かうように配置された１つの遺伝子由来のプロモーターを有する。従って、このコード配列に関して、このプロモーターは異種性である。
【０１０９】
２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」とは、最大の一致で配置されたときに、同じである、２つの配列における残基をいう。配列同一性の割合がタンパク質またはペプチドに関して使用される場合、同一でない残ステム分は、保存的アミノ酸置換によってしばしば異なり、ここで、アミノ酸残基は、同様な化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、従って、分子の機能的特性は変化しない。保存的置換において配列が異なる場合、配列同一性の割合は、置換基の保存的性質について補正するように上向きに調整され得る。この調整を行う手段は当業者に周知である。代表的には、この手段は、完全なミスマッチよりはむしろ、部分的なミスマッチとして保存的置換をスコア付け、それによって、配列同一性の割合を上昇させる工程を含む。従って、例えば、同一なアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は、０〜１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア付けは、例えば、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムに従って、  例えば、  プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）において実行されるように、計算される。
【０１１０】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）によって；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）によって：ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの同様の方法についての検索（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４）によって；これらのアルゴリズムのコンピュータ制御の実行（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．、ＧＡＰ製のＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡにおけるＴＦＡＳＴＡが挙げられるがこれらに限定されない）によって実行され得る。；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８８）Ｇｅｎｅ，７３：２３７−２４４ならびにＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６，１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇら（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８，１５５−６５，ならびにＰｅａｒｓｏｎら（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４，３０７−３１によって十分に記載される。アラインメントはまた、しばしば、目視および手動の整列によって行われる。
【０１１１】
サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、かつ、異なる環境パラメータ下において異なる。核酸のハイブリダイゼーションへの広範囲にわたる手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２「ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、所定のイオン強度およびｐＨにて特定の配列に対する熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（所定のイオン強度およびｐＨ下で）標的配列の５０％が、完全に適合するプローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブに対するＴｍと同じになるように選択される。
【０１１２】
用語「核酸」とは、１本鎖または２本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいう。他に限定されないが、この用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを含むポリマー配列を包含し、これらの塩基アナログとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリン。
【０１１３】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチドまたは前駆体（例えば、ｃ−ｍｙｃ）の産生に必須のコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列をいう。このポリペプチドは、全長ポリペプチドまたは活性フラグメントの所望の活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など）が保持される限り、全長のコード配列によってか、または任意の部分のコード配列によってコードされ得る。この用語はまた、構造遺伝子のコード領域を含み、いずれかの端の約１ｋｂ以上の距離で、５’末端および３’末端の両方のコード領域に近接して配置される配列を含み、その結果、遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応する。コード領域の５’に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムの形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「干渉領域」または「干渉配列」と呼ばれる非コード領域によって中断されるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり；イントロンは、エンハンサーのような調節エレメントを含み得る。イントロンは、核または最初の転写物から除去されるかまたは「スプライスアウト」され；従って、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の間に機能して、新生（ｎａｓｃｅｎｔ）ポリペプチドのアミノ酸の配列または順序を特定する。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子発現」は、遺伝子にコードされている遺伝情報を、遺伝子のＲＮＡへの「転写」を介して（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を介して）、および、タンパク質をコードする遺伝子については、タンパク質へのｍＲＮＡの「翻訳」を介して、ｍＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡ）に変換するプロセスをいう。遺伝子発現は、プロセスにおいて多くの段階で調節され得る。「アップレギュレーション」または「活性化」は、遺伝子発現産物（すなわち、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増加する調節をいい、他方、「ダウンレギュレーション」または「抑制」は、産生を減少する調節をいう。アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに関する分子（例えば、転写因子）は、しばしば、それぞれ「アクチベーター」および「リプレッサー」と呼ばれる。
【０１１５】
用語「野生型」は、天然に存在する供給源から単離された場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する、遺伝子または遺伝子産物をいう。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察される遺伝子であり、従って、遺伝子の「正常な」または「野生型」形態を任意に設計する。それに対して、用語「改変された」または「変異体」は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較する場合に、配列および／または機能的特性における改変（すなわち、改変された特性）を示す遺伝子または遺伝子産物をいう。天然に存在する変異体が単離され得；野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較する場合に、それらが改変された特性を有するという事実によって同定されることに留意されたい。
【０１１６】
ＤＮＡ分子は、「５’末端」および「３’末端」を有するといわれる。なぜなら、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、ホスホジエステル結合を介して一方向にある、１つのその隣接する３’酸素に結合する様式で、モノヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを生じるように反応するからである。従って、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されない場合に「５’末端」、そしてその３’末端の酸素が続くモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結されない場合に「３’末端」と称される。本明細書中で使用される場合、核酸配列はまた、より長いオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの内部であったとしても、５’末端および３’末端を有すると言われ得る。鎖状または環状のいずれかのＤＮＡ分子において、異なるエレメントが「下流」または３’に対してまたは「上流」または５’にあると言われる。この用語は、転写がＤＮＡ鎖にそって５’から３’の様式で進む事実に反映される。連結された遺伝子の転写に指向するプロモーターおよびエンハンサーは、一般に、５’またはコード領域の上流に配置される。しかし、エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントおよびコード領域の３’に配置された場合でさえも、その効果を発揮し得る。転写終止シグナルおよびポリアデニル化シグナルは、コード領域の３’下流に配置される。
【０１１７】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、短い長さの１本鎖ポリヌクレオチド鎖をいう。オリゴヌクレオチドは、代表的には１００残基長以下（例えば、１５〜５０の間）であるが、本明細書中で使用される場合、この用語はまた、より長いポリヌクレオチド鎖を包含することが意図される。オリゴヌクレオチドはしばしば、その長さによって称される。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドは、「２４マー」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズによってかまたは他のポリヌクレオチドとのハイブリダイズによって、二次構造および三次構造を形成し得る。このような構造としては、二重鎖、ヘアピン、十字形、屈曲型および三重鎖が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー」は、精製された制限酵素消化（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｄｉｇｅｓｔ）において天然に生じるか、または合成的に産生されるかのいずれかのオリゴヌクレオチドをいい、これは、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドの存在下、かつＤＮＡポリメラーゼのような試薬を含み、そして適切な温度およびｐＨ）に配置される場合に、合成の開始点として作用し得る。プライマーは、好ましくは、増幅における最大効率のために１本鎖であるか、あるいは、２本鎖であり得る。２本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、まず処理されてその鎖を分離する。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成を初回刺激する（ｐｒｉｍｅ）のに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、多くの因子に依存し、これらとしては、温度、プライマーの供給源および使用方法が挙げられる。
【０１１９】
用語「単離された」は、核酸に関して「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」のように使用される場合、その天然の環境下では通常付随する、少なくとも１つの混入した核酸から同定および分離された核酸配列をいう。単離された核酸は、天然で見出される形態とは異なる形態またはセッティングで存在するような核酸である。それに対し、単離されていない核酸は、天然において存在する状態で見出されるＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸である。例えば、所定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、近傍遺伝子に近接する宿主細胞染色体上で見出される；ＲＮＡ配列（例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列）は、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞において見出される。しかし、所定のタンパク質をコードする単離された核酸は、例として、細胞において所定のタンパク質を通常発現するような核酸を含み、この核酸は、天然の細胞の位置とは異なる染色体位置にあるか、または、そうでなければ、天然で見出される核酸配列以外の異なる核酸配列によって隣接している。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖の形態で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがタンパク質を発現させるのに使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、最低限でセンス鎖または有意鎖を有する（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは１本鎖であり得る）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含み得る（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは２本鎖であり得る）。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」は、精製された制限酵素消化によって天然に生じたか、または合成的に、組換え的に、もしくはＰＣＲ増幅によって合成され、目的の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）をいう。プローブは、１本鎖または２本鎖であり得る。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離に有用である。本発明において使用される任意のプローブは、任意の「レポーター分子」で標識され、その結果、任意の検出システム（酵素（例えば、ＥＬＩＳＡならびに酵素ベースの組織化学的アッセイ）、蛍光、放射活性および発光システムが挙げられるがこれらに限定されない）で検出され得ることが企図される。本発明は、任意の特定の検出システムまたは標識に限定されることを意図しない。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、用語「転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）」または「転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ）」とは、互いにおよびＲＮＡポリメラーゼ酵素と相互作用して転写を調節するタンパク質をいう。転写因子は、特定のＤＮＡ調節配列（例えば、エンハンサー）または他の転写因子を認識することによって遺伝子を標的化する。転写因子はしばしば、「シスエレメント」（例えば、エンハンサー）と相互作用する「トランス因子」と呼ばれる。なぜならば、これらは、代表的にはその調節部位（シス）から離れて位置する遺伝子（トランス）から産生される。いくつかの転写因子は、それ自体の別のコピー（すなわち、「ホモ二量体化ドメイン」を介して連結するホモ二量体）にか、または他の転写因子（すなわち、「ヘテロ二量体化ドメイン」を介して連結するヘテロ二量体）に結合する場合にのみ生物学的に活性である。多くの転写因子について、タンパク質の特定かつ別個の領域は、ＤＮＡ結合（すなわち、「ｔＤＮＡ結合ドメイン」）および転写の活性化（すなわち、「活性化ドメイン」）を媒介する。最も重要なレベルの遺伝子発現調節は、遺伝子からメッセンジャーＲＮＡ分子へのこの情報の移動プロセスで発揮される。このプロセスは、転写と呼ばれる。これらのタンパク質または転写因子は、その作用様式に従って４群に分類される：一般的な転写因子、アクチベーター、コアクチベーターおよびリプレッサー。転写因子に関して、無虹彩症、ルービンスタイン−テービ症候群およびホジキン病のような疾患が関連しており、そしていくらかは分子が原因であり、すなわち、転写因子の分子不全の原因である変異体が明らかにされている。用語「ＡＰ−１」とは、細胞分化応答および細胞外マトリクス産生に関する多数の遺伝子に存在する特異的なＤＮＡ配列に結合する転写因子をいう。「Ｅ２Ｆ」とは、アデノウイルスＥ２プロモーターのＥ１Ａ媒介性活性化に重大な意味を持つことが示された転写因子をいう。Ｅ２Ｆは、元々はＦ９胚性癌腫細胞の分化の間にダウンレギュレートされた転写因子として説明された、分化調節転写因子であるＤＲＴＦと同一であることが現在知られている。Ｅ２Ｆは、サイクリンＡ、ｃｄｋ２およびｐＲＢと複合体を形成し、活性化し、そしてこれらの細胞周期調節遺伝子をリン酸化して、細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）のプロセスに重大な意味を持つ。
【０１２２】
本明細書中で使用される場合、用語「転写因子に関連する疾患または障害」とは、病変した細胞または組織におけるこのような転写因子が増加したかもしくは減少したレベル、または不適切な（増強された、改変された、または減じられた、など）機能を伴う疾患または障害をいう。好ましくは、このような疾患としては、炎症性疾患（慢性関節性リウマチ、変形性関節炎など）、皮膚炎（アトピー性皮膚炎、乾癬など）、動脈瘤、動脈硬化症、血管炎、ＰＴＣＡおよびＰＴＡ後の再狭窄、癌または癌腫、喘息などが挙げられる。ダンベルデコイを用いることによって、本発明はヌクレアーゼに対する抵抗性のような選考技術にわたる有意な効果を達成し、そして、細胞または組織における長期作用を有意に改善した。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、「ＡＰ−１に関連する疾患または障害」とは、病変した細胞または組織において増殖したかもしくは減少したレベルのＡＰ−１に関連する疾患もしくは障害、または、ＡＰ−１によって活性化された遺伝子の増加した発現に関連する疾患もしくは障害をいう。好ましくは、このような疾患は、炎症および細胞増殖に関連する。より好ましくは、このような疾患または障害は、血管平滑筋細胞の増殖または新内膜の過形成であり得る。用語「Ｅ２Ｆに関する疾患または障害」とは、病変した細胞または組織において増殖したレベルのＥ２Ｆに関する疾患もしくは障害、または、Ｅ２Ｆによって活性化された遺伝子の増加した発現に関する疾患もしくは障害をいう。好ましくは、このような疾患または障害は、血管平滑筋細胞増殖または新内膜過形成であり得る。
【０１２４】
用語「生物学的に活性」とは、本明細書中で使用される場合、天然に存在する分子（例えば、転写活性、または遺伝子の特定の部位に対する結合親和性を有する分子）の構造的、調節的または生化学的機能を有するタンパク質または他の分子をいう。
【０１２５】
（ｉｉ．本発明の好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、２つのループ構造および１つのステム構造を含む環状のダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）を提供し、ここで、このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明は、上記ＣＤＯＤＮを含む薬学的組成物をさらに提供する。薬学的組成物は、このような転写因子に起因する疾患または障害を処置および／または予防するために使用され得る。本発明はまた、このような点差Ｈ因子に関する疾患または障害を処置および／または予防するための方法を提供し、この方法は、２つのループ構造および１つのステム構造を含むＣＤＯＤＮの治療有効量を被験体に投与する工程を包含する。このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明は、環状のダンベルデコイまたはデコイ組成物を提供し、それによって被験体に投与した後のデコイまたはデコイ組成物の有意に改善した安定性を提供することによって、従来のデコイまたはデコイ組成物と比較して、転写因子に関する疾患または障害を処置および／または予防するための改善された効果を達成した。
【０１２６】
本発明は、新規なＡＰ−１デコイＯＤＮの移動が、インビトロでのＶＳＭＣ増殖および、インビボでのバルーン損傷後の新内膜形成（新内膜）を防いだことを示す。これらの結果は、転写因子であるＡＰ−１が、ＶＳＭＣの増殖およびバルーン損傷後の新内膜形成において重要な役割を果たすことを示す。
【０１２７】
積み重ねた証拠が、ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化が損傷に対する応答におけるＶＳＭＣの増殖および細胞増殖の重要な事象であることを示唆する（Ｏｈａｓｈｉ  Ｎら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２０００：２０：２５２１−２５２６；Ｋｏｙａｍａ  Ｈら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９８；８２：７１３−７２１；Ｈｕ  Ｙら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．１９９７：１７：２８０８−２８１６；Ｐｙｌｅｓ  ＪＭら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９７：８１：９０４−９１０；およびＩｚｕｍｉ  Ｙら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００１：８８：１１２０−１１２６を参照のこと）。これらのＪＮＫおよびＥＲＫのようなＡＰキナーゼは、ＡＰ−１転写因子の発現および活性化を制御する（Ｄａｖｉｓ  ＲＪ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９３：２６８：１４５５３−１４５５６；およびＳｅｇｅｒ  Ｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９５：９：７２６−７３）。ＡＰ−１は、ＶＳＭＣの増殖応答および細胞外マトリクスの産生に関連する多数の遺伝子において存在する特異的なＤＮＡ配列に結合する（Ｋａｒｉｎ  Ｍ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：１６４８３−１６４８６；およびＷｈｉｔｍａｒｃｈ  ＡＪ，Ｄａｖｉｓ  ＲＪ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１９９６：７４：５８９−６０７を参照のこと）。これらの知見は、ＡＰ−１の活性化が新内膜形成をもたらす重要な段階であり得ることを示唆する。しかし、新内膜形成の要因におけるＡＰ−１の役割の直接的な証明は、ＡＰ−１の特異的かつ潜在的な薬理学的インヒビターが存在しないことによって妨害されている。ＡＰ−１がＶＳＭＣの増殖および新内膜形成において重要な役割を果たすという仮説を検証するために、本発明者らは、新しいＡＰ−１  ＯＤＮトランスフェクション方法を用いた。２本鎖のシスエレメントデコイＯＤＮのトランスフェクションは、同じ配列の内因性のシスエレメント由来の全てのトランス因子の除去をもたらし、その後、遺伝子発現を阻害した。従って、本発明は、まず、ＶＳＭＣの増殖および新内膜形成におけるＡＰ−１の関与を直接的に示す。本発明において、発明者らは、ＶＳＭＣの増殖および遊走を増強するための刺激物質として高血糖および血清を用いた。これらの刺激因子は、ＭＡＰＫ経路を介して多くの初期遺伝子、増殖因子および分裂促進因子を誘導する（Ｍｉａｎｏ  ＪＭら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ．１９９３：１３：２１１−２１９：Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＭＲら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４：９３：８２０−８２８；Ｂｒｉａｔａ  Ｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９：１６５：１１２３−１１２９；Ｉｎａｂａ  Ｔら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９６：４５：５０７−５１２：Ｄｉ  Ｐａｏｌｏ  Ｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９６；１４９：２０９５−２１０６；Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＳＭら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９５：７７：４４５−４６５；Ｌｉｎｄｎｅｒ  Ｖら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９１；６８：１０６−１１３を参照のこと）。本発明はまた、高血糖および血清が、細胞周期がＧ１期からＳ期への進行に必要とされる細胞周期調節遺伝子、サイクリンＡおよび��ＣＮＡの内因性の発現を刺激することを実証する。ＡＰ−１  ＯＤＮは、高血糖および血清によって誘導される、ＶＳＭＣの増殖、遊走ならびにサイクリンＡ遺伝子およびＰＣＮＡ遺伝子の発現を効率的に消滅させる。さらに、サイクリンＡプロモーターの連続欠損または変異構築物を用いた本発明者らのデータは、ＡＰ−１タンパク質のような転写因子の結合に重大な意味を有するＡＴＦ（活性化転写因子）部位が高血糖によるサイクリンＡ遺伝子の発現のアップレギュレーションを媒介することを示した。ルシフェラーゼレポーター構築物を有するが、ＯＤＮにはミスマッチでないＡＰ−１デコイＯＤＮのトランスフェクションはまた、高血糖および血清により誘導されるサイクリンＡのルシフェラーゼ発現を完全に消滅させる。これらの観察は、ＡＰ−１デコイを用いたトランスフェクションがＶＳＭＣの増側および遊走を阻害したというインビトロでの結果と合わせて、ＶＳＭＣの増殖およびＶＳＭＣの遊走の抑制が、ＡＰ−１デコイによる新内膜形成の阻害に関与したことを実証した。
【０１２８】
ラット頸動脈中へとＡＰ−１デコイＯＤＮをトランスフェクトするために、本発明者らは、ＨＶＪ−リポソーム技術を使用した。このＨＶＪ−リポソーム技術は、内皮露出に供されていないインタクトな動脈の内側ＶＳＭＣ中への遺伝子移入において非常に有効な方法である。ＨＶＪ−リポソーム法によるＦＩＴＣ標識ＯＤＮのトランスフェクションは、強力な蛍光を生じた。この蛍光は、動脈の全ての層において容易に検出された。本発明はまた、ＡＰ−１  ＯＤＮが、バルーン損傷後の新生内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）形成を有効に防止することも示す。興味深いのは、デコイＯＤＮを用いる事前処置が、事後処置よりも有効であったという知見である。この知見は、損傷した動脈におけるＡＰ−１活性化の時間経過によって説明され得る。以前の研究によって、脈管壁におけるＥＲＫ活性およびＪＮＫ活性が、容易に増加し、損傷後５分でプラトーに達し、バルーン血管形成術後１時間維持されることが、報告された。極初期遺伝子であるｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓの発現は、バルーン損傷後３０分でピークに達する。本発明者らの結果はまた、ＡＰ−１活性が、バルーン損傷後３０分で留意され、そしてバルーン損傷後３時間で最大値に達することを示す。これらのデータは、バルーン損傷に応答したシグナル伝達が迅速であること、そしてブロックの時期が、バルーン損傷による引き起こされるシグナルの流れをブロックするためには重要であることを、示す。
【０１２９】
本発明において顕著であるのは、ＡＰ−１環状ダンベルデコイＯＤＮ（ＣＤＯＤＮ）が、化学的に改変されたＯＤＮよりも安定かつ有効であったことである。このＣＤＯＤＮは、開口端を有さない単一のデコイ分子においてＡＰ−１の２つの結合部位を含み、これにより、１つよりも多くのプロモーター部位の多重標的化が可能である。以前の研究において、改変されたＯＤＮ（例えば、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート）が、ヌクレアーゼに対する安定性を増強するために広範に使用された（Ｋｈａｌｅｄ  ＡＲら、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １９９８；８６：１７０〜１７９；Ｌａｒｒｏｕｙ  Ｂら、Ｇｅｎｅ  １９９２；１２１：１８９〜１９４を参照のこと）。アンチセンスとしてｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃｄｃ２およびｃｄｋ２に対するこれらの改変されたＯＤＮ、またはデコイとしてＮＦ−κＢおよびＥ２Ｆに対するこれらの改変されたＯＤＮは、実験的再狭窄において内膜肥厚を減少した（Ｓｉｍｏｓ  Ｍら、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４；９３：１４５８〜１４６４、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら、１９９３（上記）、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら、１９９４（上記）、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら、１９９７（上記）を参照のこと）。しかし、これらの改変されたＯＤＮは、ＲＮａｓｅＨに対する非感受性、加水分解された改変されたヌクレオチドをゲノムＤＮＡへと再利用される可能性、配列特異的結合効果の欠如、および免疫活性化などの問題を示す。最近の報告（Ｃｈｕ  ＢＣＦら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２：２０：５８７３〜５８５８；およびＡｂｅ  Ｔら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９８；４２５：９１〜９６を参照のこと）に従って、ＣＤＯＤＮは、血清の存在下のＰＳＯＤＮ、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびＳ１ヌクレアーゼよりも安定であった。ＡＰ−１についての結合部位を含むＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮの配列特異性を評価するために、本発明者らは、インビトロ競合アッセイを設定した。非標識ＣＤＯＤＮおよび非標識ＰＳＯＤＮを競合因子として使用した場合、ＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮの両方が、標識プローブへのＡＰ−１の結合を完全に阻害したが、ＣＤＯＤＮの配列特異性は、ＰＳＯＤＮの効果よりも約１０倍大きかった。さらに、本発明者らは、ＶＳＭＣにおける高濃度グルコースまたは血清によって誘導される、ＡＰ−１結合活性に対するＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮの阻害効果を評価した。ＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮの両方は、ＡＰ−１結合活性を有意に減弱したが、ＣＤＯＤＮの阻害効果は、より大きかった。これらの結果は、ＣＤＯＤＮが、ＰＳＯＤＮよりも高い親和性を、ＡＰ−１結合タンパク質に対して有することを示す。これらのインビトロデータに従って、ＣＤＯＤＮは、脈管損傷後の新生内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）形成を防止する際により有効であった。ダンベルデコイＯＤＮのさらなる可能な利点は、ＤＮＡ複製の間でのゲノムＤＮＡ中への導入または加水分解された改変されたヌクレオチドの再利用の際の修復に起因する、変異能の欠如である。
【０１３０】
結論として、本発明は、ダンベルデコイＯＤＮが、以前に試みられた改変されたＯＤＮと比較して、顕著に増強された安定性を有することを示す。さらに、デコイＯＤＮによるＡＰ−１活性の阻害は、細胞の増殖および遊走をインビボで有効に減少させ、ならびにインビボでの新生内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）形成を有効に減少させた。本発明は、ＣＤＯＤＮを最低限の副作用しか伴わずに使用し、そして非常に有効なＨＶＪ−リポソーム遺伝子送達芸術を使用することによって、再狭窄の処置のために可能な新規な治療ストラテジーを提供する。
【０１３１】
本発明の別の局面において、本発明は、新規なＥ２Ｆ−デコイを提供する。いくつかの研究によって、細胞周期調節遺伝子の阻害は、損傷した脈管におけるＶＳＭＣ増殖および新生内膜形成を首尾良くブロックしたことが、示された。しかし、単一の細胞周期調節遺伝子の阻害は、ＶＳＭＣ増殖および新生内膜形成を防止するには不十分である。従って、本発明者らは、転写因子Ｅ２Ｆに焦点を合わせた。Ｅ２Ｆは、Ｇ１／Ｓ細胞周期進行に関与する種々の遺伝子（ＰＣＮＡ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃｄｃ２、およびｃｄｋ２を含む）のアップレギュレートされた発現に関係する（Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ  Ａら、１９９０（上記）；Ｃｈｕ  ＢＣＦ，Ｏｒｇａｎ  Ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２；２０：５８５７〜５８５８；およびＡｂｅ  Ｔら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９８；４２５：９１〜９６を参照のこと）。本発明において、本発明者らは、Ｅ２Ｆデコイの転写が、損傷した脈管における平滑筋細胞の増殖および新生内膜肥厚を首尾良くブロックしたことを示す。このことは、以前のインビトロ研究およびインビボ研究と一致する。
【０１３２】
本発明において、本発明者らは、ヌクレアーゼに対する安定性を改善するための新規な環状ダンベルデコイを考案した。以前の研究において、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、または他の外来物質を用いるＯＤＮの改変が、ヌクレアーゼに対する安定性を増強するために使用された（Ｔａｎａｋａ  Ｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９４；２２：３０６９〜３０７４；Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ  Ａら、１９９０（上記）を参照のこと）。ヌクレアーゼに対するＯＤＮの安定性は、化学的改変によって増強されたが、これらの改変されたＯＤＮは、ＯＤＮを改変するための外来物質の使用が原因である他の異なる問題を誘導し得る。最近、ダンベル型ＯＤＮが、化学的に改変された線状ＯＤＮと比較して、ヌクレアーゼ耐性および細胞中への取り込みを増強すると、報告されている（Ｃｈｕ  ＢＣら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９２：２０：５８５７〜５８５８；Ａｂｅ  Ｔら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９８；４２５：９１〜９６を参照のこと）。従って、本発明者らは、Ｅ２Ｆ結合部位のための新規な環状ダンベルデコイＯＤＮを設計した。本発明者らのＣＤ−Ｅ２Ｆは、開放端を有さない単一のデコイ分子において、Ｅ２Ｆの２つの結合部位を含み、これにより、１つの標的プロモーター部位の多重標的化または１つより多くのプロモーター部位を標的化することが、可能である。予期されるように、このＣＤ−Ｅ２Ｆは、ヌクレアーゼおよび血清の存在下で、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも安定であった。さらに、ＣＤ−Ｅ２Ｆの配列特異性は、インビトロ競合結合アッセイによって評価した場合、ＰＳ−Ｅ２Ｆの配列特異性よりもほぼ１０倍大きかった。さらに、ＶＳＭＣにおけるグルコース誘導性Ｅ２Ｆ結合活性および血清誘導性Ｅ２Ｆ結合活性に対するＣＤ−Ｅ２Ｆの阻害効果もまた、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも大きかった。これらの結果は、ＣＤ−Ｅ２Ｆが、増強された安定性、およびＥ２Ｆ結合部位に対する優れた配列特異的阻害効果を有することを示す。
【０１３３】
従来のリポソーム方法によって送達されたＯＤＮの、乏しい細胞取り込みおよびエンドサイトーシス後のリポソーム分解が、ＯＤＮ治療についての主要な障壁であった（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒｅ  ＣＪ．、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｍ  １９８８；１７２：２８９〜２９５；Ｓｔｅｉｎ  ＣＡ，Ｃｏｈｅｎ  ＪＳ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８８；４８：２６５９〜２６６８を参照のこと）。この障壁を克服するために、本発明者らは、ＨＶＪ−リポソーム技術を使用して、Ｅ２Ｆデコイをラット頸動脈中にトランスフェクトした。この送達系において、外因性分子（例えば、プラスミドＤＮＡまたはＯＤＮ）は、リン脂質とコレステロールとを含むリポソーム中に、包まれる。その後、これらのリポソームは、ＵＶ照射したＨＶＪと融合されて、ＨＶＪ−リポソームを形成する。ＨＶＪからの融合タンパク質は、これらのリポソームと細胞膜との融合、およびその細胞中への分子の配置を促進する。本発明者らは、ＨＶＪ−リポソーム方法を使用してＦＩＴＣ標識デコイを培養ヒトＶＳＭＣ中へトランスフェクションすると、従来のトランスフェクション方法（Ａｈｎ  ＪＤら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２００１；４４：７１３〜７２０を参照のこと）よりも遺伝子移入において非常に有効であったことを報告した。これに従って、インビボでのＨＶＪ−リポソーム方法によるＦＩＴＣ標識デコイのトランスフェクションは、強力な蛍光を生じ、この蛍光は、その動脈のすべての層において容易に検出された。
【０１３４】
高血糖は、糖尿病患者における大血管合併症の発症に寄与することが示唆されているが、ＶＳＭＣに対するグルコース濃度上昇の直接的効果に対して焦点を合わせた研究は、ほとんどない（Ａｈｎ  ＪＤら、２００１（上記）；Ｎａｔａｒａｊａｎ  Ｒら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １９９９；３３：３７８〜３８４；Ｙａｓｕｎａｒｉ  Ｋら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １９９７；８１：９５３〜９６２）。本発明において、本発明者らは、ＶＳＭＣにおけるＥ２Ｆ  ＤＮＡ結合活性、ならびに細胞周期調節遺伝子、およびＶＳＭＣの増殖に対する、高濃度グルコース濃度の効果を試験した。本発明者らの研究は、［Ｅ２Ｆ］×４−ルシフェラーゼ構築物（これは、プロモーター領域中に４つのＥ２Ｆ結合部位を含む）のＥ２Ｆ  ＤＮＡ結合活性およびルシフェラーゼ活性は、ＶＳＭＣにおける高濃度グルコース濃度処理後に、有意に増加されたことを示す。これらの効果は、血清と相加的であった。本発明はまた、高濃度グルコースおよび血清が、細胞周期調節遺伝子（例えば、サイクリンＡおよびＰＣＮＡ）（これらは、Ｇ１期からＳ期への細胞周期進行のために重要である）の内因性発現を刺激する。Ｅ２Ｆデコイ（しかし、ミスマッチ配列オリゴヌクレオチド（Ｍ−Ｅ２Ｆ）ではない）のトランスフェクションは、ＶＳＭＣ増殖、ならびに高濃度グルコースおよび血清により誘導されるＰＣＮＡ遺伝子およびサイクリンＡ遺伝子の発現を効果的に減弱した。このことは、サイクリンＡのプロモーター研究の結果と一致した。さらに、サイクリンＡプロモーター連続欠失または変異構築物の使用から導かれる本発明者らのこの結果は、サイクリンＡ遺伝子発現のグルコース刺激性アップレギュレーションは、サイクリンＡプロモーターにおけるＥ２Ｆ部位によって媒介されることを実証する。Ｅ２Ｆデコイ（Ｍ−Ｅ２Ｆではない）とルシフェラーゼレポーター構築物との同時トランスフェクションはまた、高濃度グルコースにより誘導されるサイクリンＡプロモーター下のルシフェラーゼ発現を、完全に排除した。
【０１３５】
最後に、ＣＤ−Ｅ２Ｆのトランスフェクションは、バルーン損傷後の新生内膜形成を、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも有効に防止した。ＣＤ−Ｅ２Ｆで処理した脈管中のＰＣＮＡ染色について陽性である細胞はまた、ＰＳ−Ｅ２Ｆで処理した脈管または非トランスフェクション脈管においてよりもかなり少ないことが、見出された。これらの知見は、インビトロ研究の結果とまとめると、ＣＤ−Ｅ２Ｆが、ＶＳＭＣ増殖の抑制および脈管損傷後の新生内膜形成の防止において、より有効であることを示す。ＣＤ−Ｅ２Ｆのさらなる潜在的な治療利益は、変異の可能性がないことであり、一方、外来物質を用いて改変されたＯＤＮは、加水分解されたヌクレオチドがＤＮＡ複製の間に再利用されてゲノムＤＮＡ中に導入された場合に、変異する可能性を有し得る。
【０１３６】
結論として、本発明は、ＣＤ−Ｅ２Ｆが、従来の改変されたＯＤＮと比較して顕著に増加した安定性と、優れた配列特異的デコイ効果とを有することを、示す。さらに、ＣＤ−Ｅ２Ｆを使用してＥ２ＦのＤＮＡ結合活性を阻害すると、インビトロならびにインビボで、細胞周期調節遺伝子の発現および細胞増殖が有意に減少された。新規なＣＤ−Ｅ２Ｆと非常に有効なＨＶＪ−リポソーム送達技術とを使用する本発明は、ヒトにおける脈管形成術後の再狭窄を、副作用を最小限しか伴わずに防止するための新規な治療ストラテジーを提供する。
【０１３７】
従って、本発明の好ましい実施形態において、本発明は、種々のＡＰ−１関連疾患またはＥ２Ｆ関連疾患の治療または予防のための薬学的組成物を提供し、この治療および予防のための方法を提供する。この組成物は、ＡＰ−１を含み、あるいはまたはさらに、Ｅ２Ｆデコイを活性成分として含み、必要に応じて別の転写因子（例えば、ＮＦκＢ）デコイを含む。
【０１３８】
本発明の治療組成物／予防組成物が示される疾患は、ＡＰ−１関連疾患であり、そしてまたＥ２Ｆ関連疾患である。これらは、すなわち、転写調節因子であるＡＰ−１またはＥ２Ｆの制御下にある遺伝子の望ましくない活性化によって引き起こされる疾患である。このような疾患としては、炎症疾患（慢性関節リウマチ、変形性関節症など）、皮膚炎（アトピー性皮膚炎、乾癬など）、動脈瘤、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、血管炎、ＰＴＣＡおよびＰＴＡ後の再狭窄、癌または癌腫、喘息などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
ＡＰ−１は、種々の重要な遺伝子の重要な調節因子であり、これらの遺伝子は、（ｉ）組織破壊を引き起こす酵素の生成に関与する遺伝子、（ｉｉ）慢性炎症に関連するサイトカインの生成に関与する遺伝子、および（ｉｉｉ）細胞増殖に必要なタンパク質の生成に関与する遺伝子を包含する。従って、ＡＰ−１ダンベルデコイは、慢性炎症疾患を処置する際の潜在的に強力な因子であり得る。
【０１４０】
転写因子のＥ２Ｆファミリーは、細胞増殖の調節において重要な役割を果す。従って、本発明により提供される新規なＥ２Ｆデコイは、異常な細胞増殖に関連する疾患を処置する際の潜在的に強力な因子であり得る。
【０１４１】
本発明の別の実施形態において、本発明の治療組成物／予防組成物が示される疾患は、ＮＦ−κＢ関連疾患であり、この疾患は、すなわち、転写調節因子であるＮＦ−κＢの制御下にある遺伝子の望ましくない活性化により引き起こされる疾患である。そのような疾患には、虚血性疾患、炎症疾患、自己免疫疾患、癌転移および癌浸潤、ならびに悪液質が数えられ得る。この虚血性疾患としては、器官の虚血性疾患（例えば、虚血性心不全（例えば、心筋梗塞、急性心不全、慢性心不全など）、虚血性脳疾患（例えば、脳梗塞）、および虚血性肺疾患（例えば、肺梗塞）、器官移植または器官手術の予後の悪化（例えば、心臓移植、心臓手術、腎臓移植、腎臓手術、肝臓移植、肝臓手術、骨髄移植、皮膚移植、角膜移植、および肺移植の、予後の悪化）、再灌流障害、ならびにＰＴＣＡ後の再狭窄が挙げられる。上記の炎症疾患としては、とりわけ、種々の炎症疾患（例えば、腎炎、肝炎、関節炎など）、急性腎不全、慢性腎不全、および動脈硬化症が挙げられる。上記の自己免疫疾患としては、リウマチ、多発性硬化症、および橋本甲状腺炎が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本発明に従うＮＦ−κＢデコイを活性成分として含む薬学的組成物は、虚血性疾患における再灌流障害、器官移植もしくは器官手術の予後の悪化、ＰＴＣＡ後の再狭窄、癌の転移および浸潤、ならびに悪液質（例えば、癌の発症後の体重減少）を治療および予防するために非常に適切である。
【０１４２】
転写因子が関連する他の任意の疾患が、本発明のデコイによって処置または予防され得る。そのような疾患としては、Ｅ２Ｆに関連する疾患、障害、または状態（例えば、新生内膜肥厚、新形成、糸球体腎炎、新脈管形成、炎症）；ＡＰ−Ｉに関連する疾患、障害、または状態（例えば、新生内膜肥厚、心筋細胞の増殖／分化）；ＮＦκＢに関連する疾患、障害、または状態（例えば、炎症、免疫応答、移植片拒絶、虚血再灌流損傷、糸球体腎炎、炎症腸疾患）；ＳＳＲＥに関連する疾患、障害、または状態（例えば、新生内膜肥厚、バイパス移植片、新脈管形成、側副枝形成）；ＣＲＥＢに関連する疾患、障害、または状態（例えば、ｃＡＭＰ活性化事象）；ＭＥＦ−２に関連する疾患、障害、または状態（例えば、心筋氏亜傍の分化および増殖）；ＣＡｒＧボックスに関連する疾患、障害、または状態（例えば、心筋細胞の分化および増殖）；ｔａｘに関連する疾患、障害、または状態（例えば、ＨＴＬＶ関連）；ＶＰ１６に関連する疾患、障害、または状態（例えば、ＨＩＶ感染）；ＧＲＥ／ＨＲＥ  ＭＲＥに関連する疾患、障害、または状態（例えば、ステロイドホルモンプロセス）（乳房もしくは前立腺の細胞増殖））；熱ショックＲＥに関連する疾患、障害、または状態（例えば、細胞ストレス（例えば、虚血性低酸素症））；ＳＲＥに関連する疾患、障害、または状態（例えば、細胞の増殖／分化）；ＡＰ−２に関連する疾患、障害、または状態（例えば、細胞増殖）；ステロール応答エレメントに関連する疾患、障害、または状態（例えば、高コレステロール血症）；ＴＲＥ（ＴＧＦｂ応答エレメント）に関連する疾患、障害、または状態（例えば、細胞の増殖、分化、遊走、新脈管形成、内膜応答性肥厚、マトリックス生成、エレメントアポトーシス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
特に、本発明に従うデコイを活性成分として含む薬学的組成物は、虚血性疾患における再灌流障害、器官移植もしくは器官手術の予後の悪化、ＰＴＣＡ後の再狭窄、癌の転移および浸潤、ならびに悪液質（例えば、癌の発症後の体重減少）を処置および予防するために非常に適切である。
【０１４４】
本発明において使用され得るデコイは、転写因子の型に対応する染色体の結合部位と特異的に拮抗する任意の化合物であり得、このデコイとしては、核酸およびそれらのアナログが挙げられるが、これらに限定されない。上記デコイの好ましい例として、ＴＧＡＣＴＣＡ（ＡＰ−１）のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、およびＴＴＴＣＧＣＧＣ（Ｅ２Ｆ）のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド（それぞれ、配列表の配列番号１および２の５’末端から7番目〜１３番目のヌクレオチドの配列、ならびに５’末端から８番目〜１５番目のヌクレオチドの配列）、ＧＧＧＡＴＴＴＣ（ＮＦκＢ）のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチド、それらのムテイン、ならびに上記オリゴヌクレオチド配列のうちのいずれかを含む化合物が、言及され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、そしてまた、改変されたヌクレオチドおよび／または擬性ヌクレオチドを含み得る。さらに、それらのオリゴヌクレオチド、その改変体、またはそれらのうちのいずれかを含む化合物は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、そして直鎖状であっても環状であってもよい。改変体とは、転写因子が結合する染色体結合部位と特異的に拮抗する、上記の配列のうちの何らかの部分の変異（例えば、置換、付加、および／または欠失）を含む核酸配列である。より好ましいデコイとしては、上記のヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数を各々が含む二本鎖オリゴヌクレオチド、ならびにそれらの改変体が挙げられる。本発明において使用され得るオリゴヌクレオチドとしては、生分解に対して感受性が低くなるように改変されたオリゴヌクレオチド（例えば、ホスホジエステル部分の酸素を硫黄で置き換える（Ｓ−オリゴ）際に利用可能なチオホスホジエステル結合を含むオリゴヌクレオチド、ならびにホスホジエステル部分を、電荷を保有しないメチルホスフェート基で置換する際に利用可能なオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１４５】
本発明において使用するためのデコイを生成するための技術に関して、従来の化学合成法または生化学合成法が、使用され得る。例えば、核酸がデコイとして使用されるべき場合、遺伝子操作において一般的に使用される核酸合成のための方法が、使用され得る。例えば、目的のデコイオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機において直接合成され得る。または、各々予め合成された核酸もしくはそのフラグメントが、ＰＣＲによってか、またはクローニングベクターなどを使用して、増幅され得る。さらに、望ましい核酸は、制限酵素などを用いる切断、および／またはＤＮＡリガーゼなどによる連結のような手順によって、得られ得る。細胞中でより安定であるデコイヌクレオチドを得るために、本核酸の塩ステム分、糖部分、および／またはリン酸部分は、アルキル化、アシル化、さもなければ化学改変され得る。本発明に従って活性成分としてデコイを含む薬学的組成物は、その活性成分が罹患部位中の細胞または標的組織の細胞によって取り込まれ得る限り、形態を限定されない。従って、本デコイは、単独でかまたは一般的な薬学的キャリアと混合してかのいずれかで、経口投与、非経口投与、局所投与、または外部投与され得る。
【０１４６】
本薬学的組成物は、溶液、懸濁物、シロップ剤、リポソーム、ローションなどのような、液体投与形態でか、または錠剤、顆粒、散剤、およびカプセル剤などのような固体投与形態で、提供され得る。必要な場合は、薬学的組成物は、種々のビヒクル、賦形剤、安定化剤、滑沢剤、および／または他の従来の薬学的添加剤（例えば、ラクトース、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、石膏、スクロース、コーンスターチ、滑石、ゼラチン、寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油、カカオバター、エチレングリコールなど）を補充され得る。
【０１４７】
特に核酸またはその改変産物がデコイとして使用される場合、好ましい投与形態としては、遺伝子治療において一般的に使用される投与形態（例えば、リポソーム（センダイウイルスを使用する膜融合リポソーム、およびエンドサイトーシスを利用するリポソーム）、カチオン性脂質を含む調製物（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ  Ｏｒｉｅｎｔａｌ））、またはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどを使用するビロソームが、挙げられる。特に好ましいのは、膜融合リポソームである。
【０１４８】
このようなリポソーム調製物の構造は、大きな単層リポソーム（ＬＵＶ）、多層リポソーム（ＭＬＶ）、小さな単層リポソーム（ＳＵＶ）のいずれかであり得る。小胞のおよそのサイズは、ＬＵＶについて２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲、ＭＬＶについて４００ｎｍ〜３５００ｎｍの範囲、そしてＳＵＶについて２０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲であり得るが、センダイウイルスを使用する膜融合リポソーム調製物の場合、例えば、直径２００ｎｍ〜１０００ｎｍの小胞系を含むＭＬＶが、好ましくは使用される。
【０１４９】
本デコイが小胞中で首尾良く捕捉され得る限り、リポソーム生成のための技術に関して、制限は存在しない。従って、そのようなリポソームは、従来の技術（例えば、２〜３例挙げると、逆相エバポレーション法（Ｓｚｏｋａ，Ｆ．ら：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．６０１  ５５９（１９８０））、注入法（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．Ｗ．；Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３０８  ２５０（１９７８））、および界面活性剤法（Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．ら：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，ｖｏｌ．４５５  ３２２（１９７６）））によって製造され得る。
【０１５０】
リポソームを形成するために使用され得る脂質としては、リン脂質、コレステロール、およびその融合体、ならびに窒素含有脂質が挙げられるが、リン脂質が、一般的には好ましい。使用され得るリン脂質としては、天然に存在するリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルディオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、ダイズレシチン、リソレシチンなど）、従来の方法によって水素添加された対応するリン脂質、ならびに合成リン脂質（例えば、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、オレオステアロイルホスファチジルコリン、オレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、オレオステアロイルホスファチジルセリンなど）が、挙げられる。
【０１５１】
上記脂質（特に、リン脂質）は、個別にかまたは適切な組合せで、使用され得る。正に荷電した基（例えば、エタノールアミンまたはコリン）を含む脂質を使用することによって、電気的に負のデコイヌクレオチドの結合が、増強され得る。主要なリン脂質に加えて、種々の化合物（例えば、リポソーム添加剤として公知である、コレステロールおよびその誘導体、ステアリルアミン、トコフェロールなど）が、リポソームの製造において添加され得る。
【０１５２】
生じるリポソームに、膜融合プロモーター（例えば、センダイウイルス、不活化センダイウイルス、センダイウイルスから精製した膜融合促進タンパク質、ポリエチレングリコールなど）が、罹患部位または標的組織の細胞による細胞内取り込みを補助するために添加され得る。
【０１５３】
薬学的リポソームの生成のための代表的な手順が、ここに、詳細に記載される。上記のリポソーム形成物質、ならびにコレステロールなどが、有機溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、クロロホルム、エタノールなど）中に溶解される。適切な容器において、その溶媒は減圧下で蒸発されて、その容器の内壁にリポソーム形成物質のフィルムが残る。その後、本デコイを含む緩衝液が添加され、そしてその混合物が攪拌される。上記膜融合プロモーターの必要に応じて添加した後、そのリポソームは単離される。そのようにして本デコイが捕捉されたリポソームが、適切な媒体中に懸濁されるか、またはその凍結乾燥体が、治療において使用するために適切な媒体中に再分散される。上記膜融合プロモーターは、リポソームを単離した後と使用の前との間の期間に添加され得る。
【０１５４】
本デコイを活性成分として含む薬学的組成物のデコイ含有量に関して、そのデコイが転写因子関連疾患を制御するために有効な量で含まれる限り、制限はない。従って、このデコイ含有量は、制御されるべき疾患、標的部位、投与形態、および投与スケジュールに従って、自由に選択され得る。
【０１５５】
上記の様式で提供されるような本デコイを活性成分として含む薬学的組成物は、疾患の型および含まれるデコイの種類に従って、種々の方法によって投与され得る。虚血性疾患、炎症疾患、自己免疫疾患、癌の転移または浸潤、ならびに悪液質を例として採ると、本組成物は、脈管内に注入され得るか、罹患領域に直接適用され得るか、病巣中に注射され得るか、または罹患領域中の局所的血管中へと投与され得る。さらなる具体例として、ＰＴＣＡが器官梗塞の処置のために実施される場合、本薬学的組成物が、手術と同時にか、手術前および手術後に、局所的血管中に投与され得る。器官移植のために、移植片物質は、本発明の組成物で前もって処理され得る。さらに、変形性関節症またはリウマチの処置において、本組成物は、関節中に直接注射され得る。
【０１５６】
本デコイの投与量は、患者の年齢および他の要因、疾患の型、使用されるデコイの種類などを参照して選択されるが、脈管内投与、筋肉内投与、または関節内投与のためには、例えば、単位用量１０ｎｍｏｌ〜１０，０００ｎｍｏｌが、一般的には１日１回から２〜３回投与され得る。
【０１５７】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されるものではない。
【実施例】
【０１５８】
（実施例１：インビトロでの脈管平滑筋細胞の増殖およびインビボでの新生内膜形成に対する、新規なＡＰ−１デコイオリゴヌクレオチドの阻害効果）
（材料および方法）
（動物）
２８０ｇ〜３２０ｇの体重である９週齢〜１０週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈｙｏｃｈａｎｇ，Ｔａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ）を、使用した。すべての手順は、研究施設における動物研究に関する指針に従った。
【０１５９】
（細胞培養）
ヒトＶＳＭＣを、Ａｈｎら、２００１（上記）に記載される通りに採集し、ラット大動脈平滑筋細胞を、成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２５０ｇ）の胸大動脈から採集した。ＶＳＭＣを、２０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で培養した。ＶＳＭＣの純度を、平滑筋特異的α−アクチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いる陽性染色によって特徴付けた。
【０１６０】
（ＣＤＯＤＮの構築）
本発明において使用したダンベル型およびＡＰ−１結合部位から誘導したホスホロチオエート二本鎖ＯＤＮおよびミスマッチＯＤＮの配列は、以下の通りである：
ＣＤＯＤＮ（コンセンサス配列に下線を付している）、５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＡＴ−３’（配列番号３）；
ホスホロチオエート線状ＡＰ−１デコイＯＤＮ（ＰＳＯＤＮ）、５’−ＡＧＣＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号４）；ミスマッチＡＰ−１デコイＯＤＮ（ＭＯＤＮ）、５’−ＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＴＴ−３’（配列番号５）。
【０１６１】
ステムの５’末端は、ＢａｍＨＩの制限部位として、６塩基の一本鎖配列５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’を有する。２つのオリゴ分子を、両方の５’末端の相補的な６塩基配列によって結合した。温度を８０℃から２５℃へと下げながら、ＯＤＮを２時間アニールさせた。１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、１６℃で２４時間インキュベートして、共有結合したダンベルデコイＯＤＮ分子（ＣＤＯＤＮ）を生成した。このＣＤＯＤＮは、２つのループと１つのステムとからなり、この１つのステムは、２つのＡＰ−１コンセンサス配列を直列に含む（図１Ａ）。
【０１６２】
（ＣＤＯＤＮの安定性）
ＣＤＯＤＮの安定性を試験するために、各々１μｇの非連結ホスホジエステルＯＤＮ、ＰＳＯＤＮ、およびＣＤＯＤＮを、ヒト血清、ウシ胎仔結成、仔ウシ胎仔血清、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、またはＳ１ヌクレアーゼとともにインキュベートした。すべての血清は、ＤＮａｓｅ活性を保存するために、熱不活化をせずに使用した。各血清を、ＯＤＮに１００μｌの反応容器中５０％まで添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。１６０単位／μｇのエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）をＯＤＮに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。１０単位／μｇ  ＯＤＮのＳ１ヌクレアーゼをＯＤＮに添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。その後、ＯＤＮをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、１５％変性ポリアクリルアミドゲル上で試験した。
【０１６３】
（ＶＳＭＣの増殖に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果）
ＶＳＭＣを、９６ウェル組織培養プレート上に播種した。３０％コンフルエンスにて、ＶＳＭＣを、規定した無血清培地中で２４時間インキュベーションすることによって、休止状態にした。その後、１００ｎｍｏｌ／ＬデコイＯＤＮを含むリポフェクチンを、これらのウェルに添加した。これらの細胞を、３７℃で５時間インキュベートした。２〜３日間後、細胞増殖の指標を、ＷＳＴ細胞計数キット（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）の使用によって決定した。
【０１６４】
（細胞遊走アッセイ）
ＶＳＭＣ遊走を、改変型Ｂｏｙｄｅｎチャンバ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して評価した。コントロール培地中に懸濁したＶＳＭＣ（２×１０５細胞／ウェル）を、上部チャンバに添加し、試験サンプルを、下部チャンバ中に配置した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、細胞を固定し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。そのフィルターの下部表面上の無作為に選択した４つの高倍率（×４００）視野からの平均細胞数を、計数した。
【０１６５】
（電気泳動移動度アッセイ（ＥＭＳＡ））
核抽出物を、Ａｈｎ  ＪＤら（上記）に記載される通りに、ＶＳＭＣから調製した。簡単に述べると、ＤＮＡプローブ（例えば、ＡＰ−１およびミスマッチデコイＯＤＮ）を、プライマーとして標識した。タンパク質−ＤＮＡ結合反応を、容量２０μｌにて室温で２０分間実施した。この反応混合物は、６μｇの核抽出物、１００μｇ／ｍｌのポリｄＩ：ｄＣ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、０．５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＤＴＴ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロールおよび６０，０００ｃｐｍの３２Ｐ標識プライマーＤＮＡを含んだ。インキュベーション後、これらのサンプルを、０．５×Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中にある４％ネイティブポリアクリルアミドゲル上にローディングし、１５０Ｖにて２時間泳動した。そのゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーによって可視化した。競合研究のために、実験条件は同一であった。但し、適切な競合ＯＤＮを、核抽出物の添加前に反応混合物に５０倍モル過剰〜１００倍モル過剰で添加した。
【０１６６】
（ルシフェラーゼアッセイ）
ＡＰ−１ルシフェラーゼ構築物ｐＡＰ１（ＰＭＡ）−ＴＡ−Ｌｕｃを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。サイクリンＡプロモータールシフェラーゼ構築物を、Ｍａｓａｏ  Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により親切にも提供された（Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ  Ｍら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９７；２７２：２２２５９〜２２２６４を参照のこと）。このルシフェラーゼ発現を分析するために、その細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌの１×Ｒｅｐｏｒｔｅｒ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて溶解した。５０μｌの各溶解物を、ルシフェラーゼ活性について試験した。
【０１６７】
（ノーザンブロット分析）
ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの遺伝子発現を、ノーザンブロッティングによって測定した。ノーザンブロット分析のために、１０μｇの全ＲＮＡを、１％歩済むアルデヒド−アガロースゲルに適用し、ナイロン膜に移した。このナイロン膜を、６５℃のＥｘｐｒｅｓｓ  ＨｙｂＴＭ溶液中で、放射標識ＰＣＮＡ  ｃＤＮＡプローブまたはサイクリンＡ  ｃＤＮＡプローブ（Ｙｏｕｎｇ−Ｃｈａｅ  Ｃｈａｎｇ博士、Ｄａｎｋｏｏｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｋｏｒｅａによって寄贈された）を用いてハイブリダイズし、製造業者の指示に従って洗浄した。この膜をＸ線フィルムに露光し、そしてそのｍＲＮＡ発現を、濃度測定分析を用いて定量した。
【０１６８】
（日本赤血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの調製）
ＨＶＪ−ＡＶＥリポソームを、Ａｈｎ  ＪＤら、２００１（上記）に記載される通りに調製した。簡単に述べると、コレステロール、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、およびホスファチジルセリンを、モル比５０：１３．３：１３．３：１３．３：１０で混合した。この脂質混合物を、クロロホルム除去によって、フラスコの側面に堆積させた。乾燥した脂質を、ＯＤＮを含む２００μｌの平衡塩溶液（ＢＳＳ；１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ，５．４ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）中で水和した。リポソームを、振盪および濾過によって調製した。精製ＨＶＪ（Ｚ染色）を、使用直前に３分間のＵＶ照射によって不活化した。このリポソーム懸濁物を、総容量２ｍｌのＢＳＳ中にあるＨＶＪとともに混合した。その混合物を４℃で５分間インキュベートし、その後、穏やかに振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。遊離したＨＶＪを、ショ糖密度勾配遠心分離によって、ＨＶＪ−リポソームから除去した。そのショ糖勾配の最上層を、使用のために収集した。
【０１６９】
（バルーン損傷およびインビボ遺伝子移入）
２  Ｆｒｅｎｃｈ  Ｆｏｇａｒｔｙカテーテルを使用して、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２８０ｇ〜３２０ｇ）中に脈管損傷を誘導した。これらのラットを、ペントバルビタールで麻酔し、左総頸動脈を外科的に露出させた。外頸動脈を介して、この総頸動脈中にカテーテルを導入した。外頸動脈中に動脈切開を介してバルーンカテーテルを３回通過および膨張させることによって、この総頸動脈の脈管損傷を誘導した。損傷した部分を、一時的結紮によって一過的に分離させた。バルーン損傷後、ＣＤＯＤＮ、ＭＯＤＮ、ＦＩＴＣ標識ＰＳＯＤＮのいずれかを含むＨＶＪ−リポソームまたはＨＶＪ−リポソーム単独を２０μｌ、室温にて１０分間管腔中でインキュベートした。１０分間のインキュベーションの後、注入カニューレを取り出した。トランスフェクションの後、その総頸動脈への血流を、結紮糸の解放によって回復し、その後、その創傷を閉鎖した。有害な神経学的効果も脈管への効果も、この手順を行ったどの動物においても観察されなかった。
【０１７０】
（組織学的分析）
トランスフェクション後２週間目に、ラットを屠殺し、そして脈管を、４％パラホルムアルデヒドで灌流固定した。新生内膜のサイズを、サンプルの正体を知らない個人による形態計測によって、定量した。内膜面積および中膜面積を、デジタル処理システム（モデルＩＮＴＵＯＳ  ６×８、Ｗａｃｏｍ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＷＡ，ＵＳＡ）において測定した。ＦＩＴＣ標識ＡＰ−１デコイＯＤＮトランスフェクションの場合、脈管を、トランスフェクション後３日目に採集し、そして４％パラホルムアルデヒドで灌流固定した。切片を、蛍光顕微鏡によって試験した。免疫組織化学のために、切片を、ウサギ抗増殖細胞核抗原抗体（１：２００希釈、ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともにインキュベートし、そして標準的様式で免疫組織化学のために処理した。
【０１７１】
（統計学的分析）
結果を、平均値±標準誤差平均として表す。その後のＤｕｎｃａｎ検定を用いる分散分析を使用して、多重比較における差の有意性を決定した。Ｐ＜０．０５を、統計学的に有意であると見なした。すべての実験は、少なくとも３回実行した。
【０１７２】
（結果）
（安定性が増強したダンベル型ＡＰ−１デコイの構築）
種々のデコイＯＤＮの安定性を調査するために、本発明者らは、まず、ヌクレアーゼに対する分子の安定性を試験した。ＣＤＯＤＮは、エキソヌクレアーゼＩＩＩに対して安定であったが、ＰＳＯＤＮおよびアニールしたデコイＯＤＮの両方は、エキソヌクレアーゼＩＩＩと２時間インキュベートした後に、完全に分解された（図１Ｂ）。本発明者らはさらに、Ｓ１ヌクレアーゼを使用して、ＣＤＯＤＮの分子特徴を試験した。Ｓ１ヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子における一本鎖領域を消化する。ダンベルデコイ（７２塩基）およびＰＳＯＤＮ（３８塩基）の両方のステム領域は、Ｓ１ヌクレアーゼから保護されることが見出されたが、アニール型デコイＯＤＮのステム領域は、保護されなかった（図１Ｂ）。
【０１７３】
ＰＳＯＤＮおよびアニールしたデコイＯＤＮの両方は、非不活化ヒト血清、ウシ胎仔血清および仔ウシ胎仔血清の存在下での２４時間のインキュベーションの後、有意に加水分解された。しかし、ＣＤＯＤＮは、これらの種々の血清との２４時間のインキュベーションの後に、大部分がインタクトなままであった。このことは、ＰＳＯＤＮおよびアニール型デコイＯＤＮと比較した場合に、かなり改善された安定性を示す（図１Ｂ）。
【０１７４】
（ＡＰ−１標的部位を有するダンベルデコイＯＤＮへのＡＰ−１の特異的結合）
ＣＤＯＤＮが、配列特異的様式で、デコイとして十分に強くＡＰ−１と相互作用することを実証するために、インビトロ競合アッセイを行った。非標識化ＡＰ−１デコイＯＤＮの増加は、タンパク質によって形成された複合体に対応する遅延バンドの強度を減少させた（図２Ａ）。１０００倍モル過剰の非標識化ＰＳＯＤＮは、競合物質として、標識化プローブへのＡＰ−１結合に対してほぼ完全に競合した。ＣＤＯＤＮを、競合物質としてＰＳＯＤＮの代わりに用いた場合、１００倍モル過剰の非標識化ＣＤＯＤＮ競合物質は、標識化プローブへのＡＰ−１結合に対して完全に競合した。次いで、本発明者らは、ＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮを高濃度のグルコースおよび血清刺激条件下で細胞中にトランスフェクトして、ＣＤＯＤＮがＡＰ−１のＤＮＡ結合活性を特異的に阻害するか否かを調べた。予想通り、高濃度のグルコースでの処理により、低濃度のグルコースと比較して、ＡＰ−１結合活性が有意に増大した（図２Ｂ、ｐ＜０．００１）。同様に、血清もまた、用量依存的にＡＰ−１のＤＮＡ結合活性を増大させた（ｐ＜０．００１）。ＰＳＯＤＮおよびＣＤＯＤＮの両方のトランスフェクションは、高濃度のグルコースまたは血清によって誘導されたＡＰ−１ＤＮＡ結合活性を有意に低減した（ｐ＜０．０１）が、ＣＤＯＤＮは、ＡＰ−１結合活性のより高い阻害を示した（ｐ＜０．００１）。
【０１７５】
（平滑筋細胞における遺伝子発現に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果）
本発明者らは、プロモーター領域にＡＰ−１結合部位を含むレポーター遺伝子構築物を用いて、プロモーター活性に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を研究した。高濃度グルコースによるサイクリンＡプロモーター活性のアップレギュレーションにおけるＡＰ−１結合部位の役割を調べるために、一連の種々の長さのヒトサイクリンＡ５’フランキング配列を含むルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドを、高濃度のグルコースで処理した平滑筋細胞中にトランスフェクトした。これらのプラスミド中の２つのプラスミド（ｐＣＡ−２６６／＋２０５ｍｔおよびｐＣＡ−１３３／−２０５ｍｔ）のみが、有意に低下したルシフェラーゼ活性を示し（図３Ａ、ｐＣＡ−２６６／＋２０５またはｐＣＡ−１３３／＋２０５と比較して、ｐ＜０．００１）、そしてこれらのレポーター遺伝子構築物は、サイクリンＡプロモーター由来のＡＰ−１タンパク質を担う、ＡＴＦ部位を変異させる。これらのデータは、平滑筋細胞において、ＡＰ−１デコイＯＤＮが、高濃度のグルコースによって誘導されるサイクリンＡのプロモーター活性をダウンレギュレートし得たことを示す。
【０１７６】
次いで、本発明者らは、ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＡＰ１（ＰＭＡ）−ＴＡ−ＬｕｃおよびＡＰ−１結合部位を含むサイクリンＡプロモータールシフェラーゼ構築物（ｐＣＡ−２６６／＋２０５）の高濃度グルコースおよび血清誘導性活性に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を比較した。予想通り、ルシフェラーゼレポーターのＰＳＯＤＮおよびＣＤＯＤＮとの同時トランスフェクションは、高濃度グルコース刺激性および血清刺激性ルシフェラーゼ遺伝子発現を顕著に低減した（図３ＢおよびＣ、ｐ＜０．０１）。しかし、ＣＤＯＤＮは、ＰＳＯＤＮよりも有効であった（ＰＳＯＤＮと比較して、ｐ＜０．０１）。従って、本発明者らは、インビトロの細胞周期−調節遺伝子の内因性の発現に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を調べた。この目的のために、ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの遺伝子発現を、ノーザンブロット法によって測定した。サイクリンＡおよびＰＣＮＡの両方は、Ｇ１期からＳ期への細胞周期進行に必要である。図３Ｄに示すように、ヒトＶＳＭＣおよびラット大動脈平滑筋細胞の両方において、高濃度グルコースおよび血清の両方が、ＰＣＮＡおよびサイクリンＡ  ｍＲＮＡの発現を刺激した。ミスマッチのＯＤＮではなく、ＡＰ−１デコイＯＤＮのトランスフェクションにより、これらの遺伝子の高濃度グルコースおよび血清誘導性の発現の低減が引き起こされた。さらに、このような刺激条件において、これらの遺伝子発現に対するＣＤＯＤＮの阻害効果は、ＰＳＯＤＮよりも強かった。
【０１７７】
（インビトロにおける平滑筋細胞の増殖および遊走の阻害に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果）
高濃度グルコースおよび血清刺激性の初代培養ヒトＶＳＭＣおよびラットＶＳＭＣの増殖を、コントロールと比較した（図４Ａおよび４Ｂ）。ＡＰ−１デコイＯＤＮのトランスフェクションにより、高濃度グルコースまたは血清によって刺激される細胞と比較して、細胞増殖の有意な阻害が引き起こされた（ｐ＜０．０５）。注目すべきは、ＣＤＯＤＮが、細胞増殖をほぼ完全に阻害することである（ｐ＜０．０１）。同様に、ＶＳＭＣの遊走は、高濃度グルコースおよび高濃度血清の両方によって、コントロールと比較して増大し（図４Ｃおよび４Ｄ、ｐ＜０．０５）、そして、この高濃度グルコースおよび高濃度血清の両方によって刺激された遊走は、ＡＰ−１デコイＯＤＮでの処理によって有意に低減され（ｐ＜０．０１）、一方、ＣＤＯＤＮは、遊走に対して最も強力な阻害効果を示した（ｐ＜０．００１）。
【０１７８】
（ラットバルーン損傷頸動脈における新内膜形成に対するＣＤＯＤＮの効果）
本発明者らは、蛍光（ＦＩＴＣ）−標識化ＡＰ−１デコイＯＤＮを用いたＨＶＪ−リポソーム法のラット頸動脈中へのトランスフェクション効率を試験した。ＨＶＪ−リポソーム法によるＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮのトランスフェクションにより、強い蛍光を生じ（図５ＡおよびＢ）、動脈の全層において容易に検出された。従って、本発明者らは、ラット頸動脈中にＡＰ−１デコイＯＤＮをトランスフェクトするために、ＨＶＪ−リポソーム法を選択した。
【０１７９】
ＨＶＪ−リポソーム法を用いて、ラット頚動脈バルーン損傷モデルにおける新内膜形成に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を検査した。図５に示すように、ミスマッチのＯＤＮとトランスフェクトした脈管は、未処理の脈管と同様に、トランスフェクションの２週間後に新内膜形成を示した。対照的に、ＰＳＯＤＮおよびＣＤＯＤＮの単回投与は、新内膜形成の有意な低下を引き起こした（ｐ＜０．００１）。インビトロのデータと一致して、新内膜形成に対するＣＤＯＤＮの阻害効果は、ＰＳＯＤＮよりも強力であった（ｐ＜０．０００１）。
【０１８０】
次いで、本発明者らは、損傷頚動脈における新内膜形成の阻害に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの前処理および後処理の効果を比較した。図６に示すように、バルーン損傷前のラット頸動脈中へのＡＰ−１デコイＯＤＮでの前処理は、新内膜形成の阻害において、後処理よりも有効であった（バルーン損傷脈管と比較して、ｐ＜０．０００１、ＣＤＯＤＮの後処理と比較して、ｐ＜０．０１）
（インビボにおけるＡＰ−１  ＤＮＡ結合活性および遺伝子発現に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果）
ＡＰ−１デコイＯＤＮが、インビボにおけるＡＰ−１  ＤＮＡ結合活性を効果的にブロックしたことを確認するために、本発明者らは、損傷動脈由来の細胞を用いて、ゲル移動性シフトアッセイを行った。図７Ａに示すように、ＡＰ−１  ＤＮＡ結合活性は、損傷後３０分で増大し、損傷後３時間で最大になった。この活性化は、ＣＤＯＤＮでの処理によって阻害された。デコイＯＤＮでの前処理は、後処理よりもより効果的にＡＰ−１活性を低減させた。
【０１８１】
細胞増殖に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの阻害効果は、ＰＣＮＡ染色（正常な状態および疾患状態の両方における増殖マーカーとして広く用いられる）によって確認された。図７Ｂに示すように、非損傷動脈におけるＰＣＮＡ染色はなかった。損傷の２週間後、ＰＣＮＡ染色陽性の細胞における顕著な増大が、新内膜領域および再増殖した内皮細胞中に検出された。対照的に、ＡＰ−１デコイＯＤＮで処理された脈管において、ＰＣＮＡ染色陽性の細胞はさらに少なかった。
【０１８２】
（実施例２：新規Ｅ２Ｆデコイオリゴデオキシヌクレオチドの効果）
（材料および方法）
（動物）
体重２８０〜３２０ｇの９〜１０週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを用いた。全ての手順は、研究施設における動物研究に関する指針に従った。
【０１８３】
（細胞培養）
ヒトＶＳＭＣを、心臓移植ドナーの胸大動脈から単離した。この組織の収集は、機関の倫理委員会によって承認された。ラットＶＳＭＣを、成体雄性ＳＤラットの胸大動脈から回収した。ＶＳＭＣを、２０％  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で培養した。ＶＳＭＣの純度を、平滑筋特異的なα−アクチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ，ＵＳＡ）を用いるポジティブ染色によって特徴付けた。
【０１８４】
１００ｍｍディッシュ中で８０〜９０％のコンフルエンスに達した後、ヒトＶＳＭＣを、無血清培地中で２４時間血清飢餓させ、そしてコントロール正常グルコース培地（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコースを含むＤＭＥＭ）または馴化培地（１０％血清および２２ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコースを含むＤＭＥＭ）のいずれかに供した。次いで、細胞を、以下に記載されるような核タンパク質抽出またはＲＮＡ抽出で処理した。
【０１８５】
（ダンベル型デコイＯＤＮの構築）
本発明において使用される、Ｅ２Ｆ結合部位に対するダンベル型およびホスホロチオエート二重鎖ＯＤＮならびに変異型ＯＤＮの配列は、以下の通りである：ＣＤ−Ｅ２Ｆ（注記；コンセンサス配列に下線を付す）、５’−ＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＧＣＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＧＡＡＡＣ−３’（配列番号６）；ホスホロチオエートＥ２Ｆデコイ（ＰＳ−Ｅ２Ｆ）、５’−ＡＴｓＴＴＡＡＧＴＴＴＣＧＣＧＣＣＣＴＴＴＣＴＣＡｓＡｓ−３’（配列番号７）；変異型Ｅ２Ｆデコイ（Ｍ−Ｅ２Ｆ）、５’−ＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＣＧＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＣＧＡＡＡＣ−３’（配列番号８）。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、ステムループ構造を形成すると予測された。ステムは、各オリゴの両端の相補的な配列によって形成される。ステムの５’末端は、ＢａｍＨＩの酵素部位として６塩基の一本鎖配列５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’を有する。２つのオリゴ分子を、両方の５’末端の相補的な６塩基の配列によって連結した。温度を８０℃から２５℃に低下させながら、ＯＤＮを２時間アニーリングさせた。１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、そして１６℃で２４時間インキュベートして、共有結合したダンベル型デコイ分子を生成した。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、２つのループおよび２つのＥ２Ｆコンセンサス配列を含む１つのステムからなる（図８Ａ）。
【０１８６】
（ＣＤ−Ｅ２Ｆの安定性）
ＣＤ−Ｅ２Ｆの安定性を試験するために、各々１μｇのＰＳ−Ｅ２Ｆ、非連結ホスホジエステルオリゴおよびＣＤ−Ｅ２Ｆを、ヒト血清、ＦＢＳ、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＳ１ヌクレアーゼのいずれかと共にインキュベートした。ＤＮａｓｅ活性を維持するために、全ての血清を熱不活化せずに使用した。各血清を１００μｌの反応容積中５０％までオリゴに添加し、そして３７℃で２４時間インキュベートした。オリゴ１μｇ当たり１６０単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）をオリゴに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。オリゴ１μｇ当たり１０単位のＳ１ヌクレアーゼ（Ｔａｋａｒａ）をオリゴに添加し、そして２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、これらのオリゴをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、そして１５％変性ポリアクリルアミドゲルで試験した。
【０１８７】
（インビトロ遺伝子移入）
細胞に、新鮮な培養培地を供給し、その一日後に、デコイを添加し、そして各試験の前にＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で２回洗浄した。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ（モル比；ＤＮＡ：脂質＝１：３）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と合わせて、１００ｎＭのデコイＯＤＮでトランスフェクションした。デコイＯＤＮ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの混合物を、製造業者の指示に従って細胞に滴下した。これらの細胞を３７℃で５時間インキュベートした。次いで、新鮮な培地を１０％  ＦＢＳに交換した後、これらの細胞をＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。
【０１８８】
（ＶＳＭＣ増殖に対するデコイＯＤＮの効果）
ＶＳＭＣを、９６ウェルの組織培養プレートに播種した。３０％コンフルエンスで、ＳＭＣを、規定された無血清培地中で２４時間インキュベートすることによって静止状態にした。次いで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ：デコイＯＤＮ（１００ｎＭのＯＤＮを含む）をウェルに添加した。これらの細胞を３７℃で５時間インキュベートした。２〜３日後、細胞増殖の指標を、ＷＳＴ細胞計数キット（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して決定した。
【０１８９】
（電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ））
核抽出物を、Ａｈｎ  ＪＤら、２００１（前出）に記載されるようにＶＳＭＣから調製した。簡潔には、Ｅ２Ｆおよび変異型ＯＤＮに対するプローブのようなＤＮＡプローブを、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、プライマーとして標識した。末端標識後、３２Ｐ標識したＯＤＮをＮＡＰ−５カラムを用いて精製した。タンパク質−ＤＮＡ結合反応を、２０μｌの容量で室温にて２０分間実施した。この反応混合物は、６μｇの核抽出物、１００μｇ／ｍｌのポリｄＩ：ｄＣ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、０．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、０．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＤＴＴ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロールおよび６０，０００ｃｐｍ  ３２Ｐ標識プライマーＤＮＡを含んだ。インキュベーション後、サンプルを、０．５×Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中で４％非変性ポリアクリルアミドゲルに充填し、そして１５０Ｖで２時間泳動した。ゲルを乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーによって可視化した。競合実験について、実験条件は、適切な競合ＯＤＮを、反応混合物に対して５０倍〜１００倍モル過剰で添加し、その後各抽出物を添加したこと以外、同一であった。
【０１９０】
（ノーザンブロット分析）
ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの遺伝子発現を、ノーザンブロットによって測定した。１０μｇの総ＲＮＡを、１％ホルムアルデヒド−アガロースゲルにアプライし、そしてナイロンメンブレンに移した。このナイロンメンブレンをＥｘｐｒｅｓｓ  ＨｙｂＴＭ溶液中で６５℃で２時間、放射性標識したＰＣＮＡ  ｃＤＮＡプローブまたはサイクリンＡ  ｃＤＮＡプローブ（Ｄｒ  Ｙｏｕｎｇ−Ｃｈａｅ  Ｃｈａｎｇ，Ｄａｎｋｏｏｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｋｏｒｅａにより贈与）とハイブリダイズさせ、そして製造業者の指示に従って洗浄した。このメンブレンを、２４〜４８時間Ｘ線に曝露し、そしてｍＲＮＡ発現を、濃度測定分析によって定量した。充填の差異を、１８ｓ  ｒＲＮＡ  ｃＤＮＡプローブを用いて正規化した。
【０１９１】
（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの調製）
ＨＶＪ−リポソームを、Ａｈｎ  ＪＤら、２００１（前出）に記載されるように調製した。簡潔には、コレステロール、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンおよびホスファチジルセリンを、５０：１３．３：１３．３：１３．３：１０のモル比で混合した。この脂質混合物を、クロロホルムの除去によってフラスコ側面に堆積させた。乾燥脂質を、ＯＤＮを含む、２００μｌの平衡塩溶液（ＢＳＳ；１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）中に水和した。リポソームを、攪拌および濾過によって調整した。精製ＨＶＪ（Ｚ株）を、使用直前に３分間のＵＶ照射によって不活化した。リポソーム懸濁物を、総容量２ｍｌのＢＳＳ中でＨＶＪと混合した。この混合物を４℃で５分間インキュベートし、次いで、３７℃で３０分間穏やかに攪拌した。遊離のＨＶＪを、スクロース密度勾配遠心分離によってＨＶＪリポソームから除去した。スクロース勾配の上層を、使用するために収集した。
【０１９２】
（バルーン損傷およびインビボの遺伝子移入）
２つのＦｒｅｎｃｈ  Ｆｏｇａｒｔｙカテーテルを使用して、雄性ＳＤラットの血管損傷を誘導した。これらのラットを、ペントバルビタールで麻酔し、そして左総頚動脈を外科的に露出させた。カニューレを、外部総頚動脈を介して総頚動脈中に導入した。インビボの遺伝子移入を、挿入したバルーンカテーテルを３回膨脹させることによって、総頚動脈の血管損傷を誘導した後に、実施した。損傷したセグメントを、一時的結紮によって一過的に隔離した。バルーン損傷後、ＣＤＥ２Ｆ、Ｍ−Ｅ２Ｆ、ＦＩＴＣ−標識化ＰＳ−Ｅ２ＦまたはＨＶＪ−リポソームのみのいずれかを含む、２０μｌのＨＶＪ−リポソーム複合体を、室温にて管腔内で１０分間インキュベートした。１０分間のインキュベーション後、注入カニューレを除去した。トランスフェクション後、総頚動脈への血流を、結紮の解放によって回復させ、次いで、創傷を閉じた。有害な神経学的効果も血管の効果も、この手順を受けた全ての動物で観察されなかった。
【０１９３】
（ルシフェラーゼアッセイ）
Ｅ２Ｆルシフェラーゼ構築物は、Ｄｒ．Ｙｏｕｎｇｃｈａｅ  Ｊａｎｇ（Ｄａｎｋｏｏｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｕｎａｎ，Ｋｏｒｅａ）の厚意により提供された。ルシフェラーゼ発現を分析するために、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして２００μｌの１×Ｒｅｐｏｒｔｅｒ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）で溶解させた。５０μｌの各溶解物を、ルシフェラーゼ活性について試験した。
【０１９４】
（組織学的分析）
トランスフェクションの２週間後、ラットを屠殺し、そして血管を４％パラホルムアルデヒドで灌流固定した。新内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）サイズを、サンプルの正体について盲目の個体による形態測定によって定量した。内部領域および中間領域を、デジタル化システム（モデルＩＮＴＵＯＳ  ６ｘ８，Ｗａｃｏｍ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＷＡ，ＵＳＡ）で測定した。ＦＩＴＣ標識Ｅ２ＦデコイＯＤＮトランスフェクションの場合、血管を、トランスフェクション後の３日目に回収し、そして４％パラホルムアルデヒドで灌流固定した。切片を、蛍光顕微鏡によって試験した。免疫組織化学について、切片を、ウサギ抗増殖細胞核抗原抗体（１：２００希釈、ＳａｎｔａＣｒｕｚ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共にインキュベートし、そして標準的な様式で免疫組織化学のために処理した。
【０１９５】
（統計的分析）
結果を、平均値±ＳＥＭとして示す。引き続くＤｕｎｃａｎ試験を用いた分散の分析を使用して、複数の比較における差異の有意差を決定した。Ｐ＜０．０５を、統計的に有意とみなした。全ての実験を少なくとも３回実施した。
【０１９６】
（結果）
（ＣＤ−Ｅ２Ｆの安定性）
新たに合成したＣＤ−Ｅ２Ｆの安定性を調査するために、本発明者らは、ヌクレアーゼの存在下での分子の安定性を最初に試験した（図８Ｂ）。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、予測どおり、エキソヌクレアーゼＩＩＩに耐性であり、そしてゲル電気泳動において主要なバンドとして観察された。ＣＤ−Ｅ２Ｆと対照的に、ＰＳ−Ｅ２Ｆおよびアニールしたデコイの両方が、エキソヌクレアーゼＩＩＩとの２時間のインキュベーション後に、完全に分解された。ＣＤ−Ｅ２Ｆのステムループ構造を確認するために、本発明者らは、Ｓ１ヌクレアーゼを使用して、ＣＤ−Ｅ２Ｆの分子特徴をさらに試験した。デコイを、ＤＮＡ分子中の一本鎖領域を消化するＳ１ヌクレアーゼと共にインキュベートした。ＣＤ−Ｅ２Ｆ（７４塩基）およびＰＳ−Ｅ２Ｆ（５０塩基）の両方のステム領域は、Ｓ１ヌクレアーゼから保護されるが、アニールした型のデコイのステム領域は保護されないことが見出された（図８Ｂ）。
【０１９７】
エキソヌクレアーゼ活性は、細胞質および血清におけるヌクレアーゼ活性のほとんどを構成することが報告されている。従って、本発明者らは、熱不活化していない血清とのインキュベーションによって、デコイの安定性を試験した。デコイを、５０％の非不活化ヒト血清、ＦＢＳまたはウシ血清で２４時間処理した。ＰＳ−Ｅ２Ｆおよびアニールした型のデコイの両方が、各血清の存在下での２４時間のインキュベーション後に、有意に加水分解された。しかし、ＣＤ−Ｅ２Ｆは、これらの異なる血清との２４時間のインキュベーション後にほぼインタクトなままであり、ＰＳ−Ｅ２Ｆおよびアニールした型のデコイの両方と比較して、改善された安定性を示した（図８Ｂ）。
【０１９８】
（Ｅ２Ｆの、Ｅ２Ｆ標的部位を有するＣＤ−Ｅ２Ｆに対する特異的結合）
ＣＤ−Ｅ２Ｆの配列特異性を試験するために、インビトロ競合アッセイを実施した。非標識Ｅ２Ｆデコイの増大は、Ｅ２Ｆタンパク質によって形成される複合体に対応する、遅延したバンドの強度を減少させた（図９Ａ）。競合物としての非標識ＰＳ−Ｅ２Ｆの１０００倍モル過剰は、Ｅ２Ｆ結合において、標識プローブに対して完全に競合した。他方で、ＣＤ−Ｅ２ＦをＰＳ−Ｅ２Ｆの代わりに競合物として使用した場合、１００倍モル過剰の非標識ＣＤ−Ｅ２Ｆ競合物のみが、標識プローブに対するＥ２Ｆ結合について完全に競合するのに必要であった。次に、本発明者らは、デコイがＥ２ＦのＤＮＡ結合活性を特異的に阻害し得るか否かを調べるために、細胞にデコイをトランスフェクトした。予測されるように、高濃度のグルコースおよび血清を含む馴化培地における培養は、コントロール培地中での培養と比較して、Ｅ２Ｆ結合活性が有意に増大していた（図９Ｂ、ｐ＜０．０１）。ＰＳ−Ｅ２ＦおよびＣＤ−Ｅ２Ｆのトランスフェクションは、高濃度のグルコースおよび血清によって誘導されるＥ２Ｆ  ＤＮＡ結合活性を有意に減弱させた（ｐ＜０．０１）。しかし、高濃度のグルコースおよび血清によって誘導されるＥ２Ｆ  ＤＮＡ結合活性の増大は、ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較して、ＣＤ−Ｅ２Ｆによって強力に阻害された（ｐ＜０．０５）。
【０１９９】
（平滑筋細胞におけるサイクリンプロモーター活性に対するＥ２Ｆデコイの効果）
本発明者らは、プロモーター活性に対するＥ２Ｆデコイの効果を調査するために、レポーター遺伝子構築物を使用した。この構築物は、プロモーター領域中にＥ２Ｆ結合部位を含む。高濃度のグルコースによるサイクリンＡプロモーター活性のアップレギュレーションに対するＥ２Ｆ結合部位の役割を調査するために、本発明者らは、種々の長さのヒトサイクリンＡの５’隣接配列を含む、一連のルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドを、高濃度のグルコースで処理した平滑筋細胞中にトランスフェクトした。これらのプラスミド中で、２つのプラスミド（ｐＣＡ−１３３／＋２０５およびｐＣＡ−１３３／−２）だけが、有意に減少したルシフェラーゼ活性を示し（図１０Ａ）、そしてｐＣＡ−１３３／−２構築物（本発明者らが、サイクリンＡプロモーターから２つのＥ２Ｆ結合部位を欠失させた）の活性は、最低だった。これらのデータは、Ｅ２Ｆ部位が、ＶＳＭＣにおける高濃度のグルコースによるサイクリンＡプロモーター活性のアップレギュレーションを媒介することを示す。次に、本発明者らは、レポーター遺伝子プラスミドｐＣＡ−２６６／＋２０５および［Ｅ２Ｆ］Ｘ４−Ｌｕｃ（これは、プロモーター領域中に４つのＥ２Ｆ結合部位を含む）のプロモーター活性に対するＥ２Ｆデコイの阻害効果を調査した。予想されるように、Ｅ２Ｆデコイの共トランスフェクションは、高濃度のグルコースおよび血清によってアップレギュレートされたルシフェラーゼ遺伝子発現を顕著に減弱させた（図１０ＢおよびＣ、ｐ＜０．０１）。また、ＣＤ−Ｅ２Ｆは、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも有効であり（ｐ＜０．０５）そしてＭ−Ｅ２Ｆは、ルシフェラーゼ活性の増大を無効にした。
【０２００】
（ＶＳＭＣにおける細胞周期調節遺伝子の発現に対するＥ２Ｆデコイの効果）
本発明者らは、内因性の細胞周期調節遺伝子の発現に対するＥ２Ｆデコイの効果を評価した。図１１に示されるように、高濃度のグルコースおよび血清は、ヒトＶＳＭＣおよびラットＡＳＭＣの両方において、サイクリンＡ遺伝子およびＰＣＮＡ遺伝子の発現を刺激した（ｐ＜０．０１）。Ｍ−Ｅ２ＦではなくＥ２Ｆデコイのトランスフェクションは、ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの遺伝子発現の減弱を生じた（ｐ＜０．０１）。１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現は、Ｅ２Ｆデコイのトランスフェクションによって影響されなかった。これらの遺伝子の発現に対するＣＤ−Ｅ２Ｆの阻害効果は、これらの刺激条件下で、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも強力であった（ｐ＜０．０５）。
【０２０１】
（インビトロのＶＳＭＣ増殖の阻害に対するＥ２Ｆデコイの効果）
バルーン損傷に対する血管の共通の特徴は、ＶＳＭＣの増殖であるので、Ｅ２Ｆデコイを、平滑筋細胞の増殖を阻害するその能力について試験した。高濃度のグルコースおよび血清での処理は、ＷＳＴ細胞計数キットによって評価されるように、コントロールと比較して、培養初代ヒトＶＳＭＣおよびラットＶＳＭＣの増殖を刺激した（図１２ＡおよびＢ）。Ｅ２Ｆデコイのトランスフェクションは、高濃度のグルコースまたは血清で刺激された細胞と比較して、細胞増殖の有意な阻害を生じた（ｐ＜０．０１）。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、ほぼ完全に細胞増殖を阻害した（ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５）。
【０２０２】
（バルーン損傷したラット頚動脈に対するＣＤ−Ｅ２Ｆの効果）
本発明者らは、ＨＶＪ−リポソーム法を使用して、ラット頚動脈へのＥ２Ｆデコイのトランスフェクションの効率を試験した。ＨＶＪ−リポソーム法を使用する、ＦＩＴＣ標識Ｅ２Ｆデコイのトランスフェクションは、動脈の全ての層において容易に検出される強い蛍光を生じた（図１３Ｂ）。従って、本発明者らは、実験の残りについて、ラット頚動脈へＥ２Ｆデコイをトランスフェクションするために、ＨＶＪ−リポソーム法を使用した。
【０２０３】
本発明者らは、ラット頚動脈バルーン損傷モデルにおいてＥ２Ｆデコイを使用して、インビボ抗原ストラテジーの効果を試験した。図１３に示されるように、Ｍ−Ｅ２Ｆでトランスフェクトした血管は、トランスフェクション後２週間目で、未処理の血管と類似の新内膜形成を示した。対照的に、ＰＳ−Ｅ２ＦおよびＣＤ−Ｅ２Ｆの単一の投与は、新内膜形成の有意な減少を生じた（ｐ＜０．００１）。インビトロのデータと一致して、新内膜形成に対するＣＤ−Ｅ２Ｆの阻害効果は、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも強力であった（ｐ＜０．０５）。デコイ処理は、中間領域を変更しなかった。新内膜形成における減少は、トランスフェクトされた領域に限定された。
【０２０４】
ＰＣＮＡの遺伝子は、Ｅ２Ｆ依存性であることが示され、そして元々、その出現が細胞の増殖状態と相関する核タンパク質として定義された。従って、本発明者らは、ＰＣＮＡ発現に対するバルーン損傷の効果と、Ｅ２Ｆデコイでの処理がＰＣＮＡ発現を阻害するかどうかとを試験した。図１４に示されるように、非損傷のコントロール動脈においては、ＰＣＮＡ染色は存在しなかった。損傷の２週間後、新内膜領域のＰＣＮＡポジティブ細胞および再増殖する内皮細胞の顕著な増大が存在した。対照的に、Ｅ２Ｆデコイ処理した血管のＰＣＮＡポジティブ細胞の数は、未処理の血管よりもかなり低かった。
【０２０５】
（実施例３：新規ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドの効果）
（ダンベル型デコイＯＤＮの構築）
本発明において使用された、ＮＦκＢ結合部位に対するダンベル型およびホスホロチオエート二本鎖ＯＤＮの配列ならびに変異型ＯＤＮは、以下の通りである：ＣＤ−ＮＦ（注記：コンセンサス配列に下線を付す）、５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＧＡＡＡＣ−３’（配列番号１５）；ホスホロチオエートＮＦκＢデコイ（ＰＳ−ＮＦ）、５’−ＡＴｓＴＴＡＡＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＡｓＡｓ−３’（配列番号１６）：変異型Ｅ２Ｆデコイ（Ｍ−ＮＦ）、５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＡＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＣＧＡＡＡＣ−３’（配列番号１７）。ＣＤ−ＮＦは、ステムループ構造を形成することが予測された。ステムは、各オリゴの両端における相補的配列によって形成される。ステムの５’末端は、ＢａｍＨＩの酵素部位として６塩基の一本鎖配列５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’を有する。２つのオリゴ分子を、両方の５’末端で、相補的な６塩基の配列によって連結した。温度を８０℃から２５℃に低下させながら、ＯＤＮを２時間アニーリングさせた。１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、そして１６℃で２４時間インキュベートして、共有結合したダンベル型デコイ分子を生成した。ＣＤ−ＮＦは、２つのループおよび２つのＮＦκＢコンセンサス配列を含む１つのステムからなる。
【０２０６】
（ＮＦ−κＢデコイ（デコイオリゴヌクレオチド）の合成）
ＤＮＡ合成器で、ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドおよびスクランブルデコイオリゴヌクレオチド（ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドと同じ塩基組成であるがランダム化された配列を有するオリゴヌクレオチド）（これらのヌクレオチド配列は、以下に示される）を、それぞれ、Ｓ−オリゴヌクレオチドから合成した。これらのヌクレオチドを８０℃で３０分間加熱し、次いで２時間かけて室温まで冷却させて、二本鎖ＤＮＡを提供した。
【０２０７】
ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチド
ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ（配列番号９）
ＧＧＡＡＣＴＴＣＣＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧ（配列番号１８）
スクランブルデコイオリゴヌクレオチド
ＴＴＧＣＣＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＴＡＧＣＣ（配列番号１９）
ＡＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＴＣＧＧ（配列番号２０）。
【０２０８】
（ＣＤ−ＮＦの安定性）
ＣＤ−ＮＦの安定性を試験するために、各々１μｇのＰＳ−ＮＦ、非連結ホスホジエステルオリゴおよびＣＤ−ＮＦを、ヒト血清、ＦＢＳ、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＳ１ヌクレアーゼのいずれかと共にインキュベートした。ＤＮａｓｅ活性を維持するために、全ての血清を熱不活化せずに使用した。各血清を１００μｌの反応容積中５０％までオリゴに添加し、そして３７℃で２４時間インキュベートした。オリゴ１μｇ当たり１６０単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）をオリゴに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。オリゴ１μｇ当たり１０単位のＳ１ヌクレアーゼ（Ｔａｋａｒａ）をオリゴに添加し、そして２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、これらのオリゴをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、そして１５％変性ポリアクリルアミドゲルで試験した。
【０２０９】
（インビトロ遺伝子移入）
細胞に、新鮮な培養培地を供給し、その一日後に、デコイを添加し、そして各実験の前にＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で２回洗浄した。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ（モル比；ＤＮＡ：脂質＝１：３）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と合わせて、５μＭのデコイＯＤＮでトランスフェクションした。デコイＯＤＮ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの混合物を、製造業者の指示に従って細胞に滴下した。これらの細胞を３７℃で５時間インキュベートした。次いで、１０％  ＦＢＳを含む新鮮な培地に交換した後、これらの細胞をＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。
【０２１０】
（ＣＤ−ＮＦのセンダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの調製）
ＨＶＪ−リポソームを、Ａｈｎ  ＪＤら、２００１（前出）に記載されるように調製した。簡潔には、コレステロール、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンおよびホスファチジルセリンを、５０：１３．３：１３．３：１３．３：１０のモル比で混合した。この脂質混合物を、クロロホルムの除去によってフラスコの側面に堆積させた。乾燥脂質を、ＯＤＮを含む、２００μｌの平衡塩溶液（ＢＳＳ；１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）中に水和した。リポソームを、攪拌および濾過によって調整した。精製ＨＶＪ（Ｚ株）を、使用直前に３分間のＵＶ照射によって不活化した。リポソーム懸濁物を、総容量２ｍｌのＢＳＳ中でＨＶＪと混合した。この混合物を４℃で５分間インキュベートし、次いで、３７℃で３０分間穏やかに攪拌した。遊離のＨＶＪを、スクロース密度勾配遠心分離によってＨＶＪリポソームから除去した。スクロース勾配の上層を、使用するために収集した。
【０２１１】
（正常なＮＦ−κＢデコイのリポソーム調製物の生成）
１：４．８：２の重量比（合計１０ｍｇ）で提供されたホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを、テトラヒドロフラン中に溶解させた。ロータリーエバポレータを使用して、テトラヒドロフランを脂質溶液から除去して、この脂質をフラスコ壁に接着したフィルムの形態にした。これに、実施例１において調製したＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチド（０．７ｍｇ）を含む約２００ｍｌの生理食塩水（ＢＳＳ；１３９ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）を添加し、そしてこの混合物を通常の条件下で攪拌し、超音波処理して、ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドを含むリポソーム懸濁物を提供した。このリポソーム小胞の懸濁物（０．５ｍｌ、脂質含量１０ｍｇ）を、使用の３分前に、ＵＶ照射（１１０ｅｒｇ／ｍｍ２／秒）に曝露した精製センダイウイルス（Ｚ株１００００血球凝集単位）と混合し、そしてこの混合物を、ＢＳＳで４ｍｌにした。この混合物を４℃で５分間維持し、次いで、３７℃で３０分間の穏やかな攪拌に供した。リポソームに結合しなかったセンダイウイルスをスクロース密度勾配遠心によって除去した後、最上層を分離し、そしてその濃度をＢＳＳで調節して、捕捉された場合に８μＭのＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドを含むリポソーム調製物を提供した。リポソーム調製物を、ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドの代わりに、実施例１のスクランブルデコイオリゴヌクレオチドを使用して同様に生成した。
【０２１２】
（再灌流モデル実験）
（（１）方法）
９〜１０週齢のＳＤラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔した後、カニューレを、気道に隣接する左頚動脈中に挿入し、そして心臓の大動脈弁の近傍（冠状動脈の口の近く）に留置した。さらに、気管にカニューレ挿入し、そして動物を、気管カニューレを人工呼吸器に接続することによって、支持的呼吸におく。その後、左肋間切開を行い、ラット心臓の左下行前動脈を結紮して、虚血状態を生じた。３０分後、結紮縫合を切断して、再灌流を開始した。その直後、１．５ｍｌ／ラットの、上記のように調製した、リポソームに捕捉されたＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦ、Ｍ−ＮＦ、ＮＦ−κＢデコイヌクレオチドまたはスクランブルデコイヌクレオチドを、冠状動脈の口の近くに留置されたカニューレを介して、投与した。胸部を閉じた後、気管もまた縫合し、そして動物を生存させた。２４時間後、このラットを再麻酔し、そして心臓を摘出し、そして生理食塩水で洗浄した。ラット心臓の心室を、６枚の切片にスライスし、これを、塩化テトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色した。６枚の切片をそれぞれ撮影し、そして画像分析に供した。梗塞領域を、以下の式によって計算した。
梗塞率（％）＝６枚の切片の梗塞面積の合計／６枚の切片の合計×１００
統計的分析を、多重比較（ＡＮＯＶＡ）によって行った。
【０２１３】
（（２）結果）
未処置コントロール群、Ｍ−ＮＦおよびスクランブルデコイ処置群において、心筋梗塞は、ほぼ等しい程度で見出された。ＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦおよびＮＦ−κＢデコイヌクレオチドを与えられた群において、梗塞は、未処置コントロール群、Ｍ−ＮＦおよびスクランブルデコイ処置群から、有意な程度まで抑制される。これらのポジティブ群において、ＣＤ−ＮＦを与えられた群は、正常なデコイまたはＰＳ−ＮＦよりも、有意により高い抑制を示す。
【０２１４】
類似の阻害効果は、リポソームが梗塞の誘導直前に投与される場合に見出された。
【０２１５】
（癌転移の阻害）
（（１）方法）
７週齢のＣ５７ＢＬ／６株の雌性マウスに、１×１０４のマウス小網細胞肉腫Ｍ５０７６細胞を静脈内投与し、そして２４時間後、各々０．２ｍｌ（６ｎｍｏｌｅ）の、リポソームに捕捉された、上記と同じ様式で調製された、上記で調製したＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦ、Ｍ−ＮＦ、ＮＦ−κＢデコイヌクレオチドまたはスクランブルデコイヌクレオチドを静脈内投与した。コントロール群は、同じ様式で０．２ｍｌの生理食塩水を受けた。Ｍ５０７６の静脈内注射後１４日目に、動物を剖検し、そして肝臓表面上の腫瘍小節の数を、立体顕微鏡下で計数した。各群は、１０匹のマウスからなった。統計的分析のために、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験およびＤｕｎｎｅｔｔ多重比較を使用した。
【０２１６】
（（２）結果）
ＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦおよびＮＦ−κＢデコイ処置した群は、Ｍ−ＮＦで処置した群またはコントロール群よりも腫瘍サイズの抑制における有意な効果を示した。これらのポジティブ群の中で、ＣＤ−ＮＦを受けた群は、正常デコイまたはＰＳ−ＮＦよりも、腫瘍サイズにおける有意に大きい抑制を示す。
【０２１７】
（悪液質の阻害）
（（１）方法）
７週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して、マウス結腸癌系統Ｃｏｌｏｎ  ２６の２ｍｍ立方の腫瘍塊を、皮下移植した。移植後７日目に開始して、０．２ｍｌ（６ｎｍｏｌｅ）のリポソームに捕捉された、上記のように調製したＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦ、Ｍ−ＮＦ、ＮＦ−κＢデコイヌクレオチドまたはスクランブルデコイヌクレオチドを、この腫瘍塊に投与し、そして体重および腫瘍重量を連続的に決定した。動物を１３日目に剖検し、そして精巣上体脂肪および腓腹筋を単離し、そして計量した。さらに、残りの器官および腫瘍を全て除いた死体の湿重量を決定した。腫瘍重量を、以下の式によって、各腫瘍塊の大きい方の直径および小さい方の直径から計算した。
腫瘍重量（ｍｇ）＝大きい方の直径×小さい方の直径２／２
各群は、１０匹のマウスからなった。統計的分析を、一方向のレイアウトのＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔ多重比較によって行った。
【０２１８】
（（２）結果）
腫瘍保有群において、腫瘍の増殖は、体重、精巣上体脂肪重量、腓腹筋重量および死体湿重量の有意な増加を生じた。ＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦおよびＮＦ−κＢデコイ群において、改善が得られる。この改善は、ＰＳ−ＮＦ群またはＮＦ−κＢ群よりも、ＣＤ−ＮＦ群において有意に高い。しかし、Ｍ−ＮＦ群およびスクランブルデコイ群においては改善は見出されない。Ｍ−ＮＦ群またはスクランブルデコイ群においては、腫瘍重量に対する明確な効果は存在しない。
【０２１９】
本発明の上記の実施形態の記載は、例示および説明の目的のために提供されている。これらは、網羅的であることも、開示された明確な形態に本発明を限定することも意図せず、そして上記教示に鑑みて多くの改変およびバリエーションが明らかに可能である。これらの実施形態は、本発明の原理およびその実際の適用を最良に説明し、それによって、当業者が、意図された特定の使用に適切である種々の実施形態で、そして種々の改変を共なって、本発明を最良に利用することができるようにするために、選択し、記載した。本発明の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲によって規定されることが意図される。本明細書中に引用される全ての参考文献は、本明細書中で参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０２２０】
本発明は、２つのループ構造および１つのステム構造を備える環状ダンベルオリゴヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）を提供し、ここで、このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインと結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明はさらに、このＣＤＯＤＮを含む薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、このような転写因子に関する疾患または傷害を処置および／または予防するために使用され得る。本発明はまた、このような転写因子に関する疾患または傷害を処置および／または予防するための方法を提供し、この方法は、治療有効量の、２つのループ構造および１つのステム構造を備えるＣＤＯＤＮを被験体に投与する工程を包含し、ここで、このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインと結合し得るヌクレオチド配列を含む。
【０２２１】
さらに、本発明は、転写因子ＡＰ−１のトランス活性化能力を阻害することによる、血管形成術後の再狭窄の処置のための方法および組成物を提供する。これらの組成物および方法は、血管障害の処置において有用である。
【０２２２】
本発明はまた、転写因子ＡＰ−１およびＥ２Ｆに対する新規の環状ダンベルオリゴヌクレオチドデコイ（ＣＤＯＤＮ）を提供し、これは、ＡＰ−１およびＥ２Ｆ関連の傷害の処置およびこれらの転写因子の細胞での役割を解明する際に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】図１は、ＡＰ−１デコイＯＤＮの構造および分子安定性を示す。［Ａ］ＡＰ−１デコイＯＤＮの構造。ＣＤＯＤＮは、２つの共有結合した同一のステム−ループ分子から作製される。従って、ＣＤＯＤＮは、そのステム領域にＡＰ−１に対する２つの結合部位を有する。［Ｂ］エキソヌクレアーゼＩＩＩ（左パネル）、Ｓ１ヌクレアーゼ（左パネル）、または血清（右パネル）の存在下でのデコイＯＤＮの安定性試験。ＥｘｏＩＩＩ；エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理したデコイＯＤＮ、Ｓ１；Ｓ１ヌクレアーゼで処理したデコイＯＤＮ、ＣＳ；仔ウシ血清、Ｄ；ＣＤＯＤＮ、Ｐ；ＰＳＯＤＮ、Ｌ；連結前のＣＤＯＤＮのアニールした形態。
【図２】図２は、ＡＰ−１のＤＮＡ結合活性におけるＣＤＯＤＮの効果を示す。［Ａ］競合アッセイ。種々の濃度の未標識オリゴヌクレオチドの存在下で、標識化プローブとＡＰ−１タンパク質との間でＡＰ−１複合体を形成させた。［Ｂ］ＡＰ−１デコイＯＤＮでトランスフェクトしたＶＳＭＣからのゲルシフトアッセイの代表例。この実験を５回繰り返した。ＮＧ；標準のグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、ＨＧ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＡＰ−１デコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳＯＤＮ、Ｄ；ＣＤＯＤＮ、Ｍ；ミスマッチＡＰ−１デコイＯＤＮ。ＥＭＳＡ結果の定量化を５回の独立の実験の平均値±ＳＥＭとして表した。＊ＮＧと比較してｐ＜０．００１、†ＨＧと比較してｐ＜０．０１、§ＮＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．００１、¶ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１。
【図３】図３は平滑筋細胞における遺伝子発現に対するＣＤＯＤＮの効果を示す。［Ａ］細胞を、平滑筋にて高濃度グルコース条件下で、デコイＯＤＮとサイクリンＡプロモーターの連続欠失体または変異体とを同時トランスフェクトした。＊ｐＣＡ−２６６／＋２０５と比較してｐ＜０．００１、†ｐＣＡ−１３３／＋２０５と比較してｐ＜０．００１。［Ｂ］および［Ｃ］細胞を、デコイＯＤＮ、とプラスミドＡＰ１（ＰＭＡ）−ＴＡ−Ｌｕｃ（Ｂ）またはｐＣＡ−２６６／＋２０５（Ｃ）とを同時トランスフェクトした。デコイＯＤＮの活性は、ルシフェラーゼ活性をダウンレギュレートする能力に反映する。値は、β−ガタクトシダーゼ活性による正規化後の６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、†ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１、‡ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．００１、［Ｄ］代表的なノーザンブロット解析。サイクリンＡ（上のパネル）およびＰＣＮＡ（下のパネル）の遺伝子発現をＲＡＳＭＣ（左パネル）またはＨＶＳＭＣ（右パネル）のノーザンブロッティングによって測定した。Ｎ：正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＡＰ−１デコイＯＤＮでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳＯＤＮ、Ｄ；ＣＤＯＤＮ、Ｍ；ミスマッチＡＰ−１デコイＯＤＮ。
【図４】図４は、ＨＶＳＭＣ（Ａ）およびＲＡＳＭＣ（Ｂ）における細胞増殖の阻害に対するＣＤＯＤＮの効果を示す。増殖活性は、６回の測定値の平均値±ＳＥＭである。ＨＶＳＭＣ（Ｃ）およびＲＡＳＭＣ（Ｄ）における細胞遊走に対するＣＤＯＤＮの効果。フィルターの低い方の表面上で、４つのランダムに選択した強拡（×４００）場での平均細胞数を計数した。各実験を三連で行い、４回の別の実験を行った。遊走活性は平均値±ＳＥＭである。Ｎ；正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ：１００ｎｍｏｌ／ｌのＡＰ−１デコイＯＤＮでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳＯＤＮ、Ｄ；ＣＤＯＤＮ、Ｍ；ミスマッチＡＰ−１デコイＯＤＮ。＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、†ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０５、‡ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１。
【図５】図５は、ラット頚動脈のバルーン損傷後の新内膜形成についてのＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を示す。（Ａ）＋（Ｂ）左総頚動脈の蛍光顕微鏡法：ＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮのみで処理した（Ａ）か、またはＨＶＪ−ＡＶＥリポソームを有するＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮで処理した（Ｂ）：（Ｃ）〜（Ｇ）コントロールラットの左総頚動脈の横断面（Ｃ）、バルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面（Ｄ）、（Ｅ）〜（Ｇ）ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法を用いてＭＯＤＮ（Ｅ）、ＰＳＯＤＮで（Ｆ）、およびＣＤＯＤＮで（Ｇ）で処理したバルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面。（Ｈ）ＡＰ−１デコイＯＤＮを含むＨＶＪ−リポソームでトランスフェクトした群における左頚動脈の内膜領域／中膜領域の平均比。棒は、試験した動物の各群（ｎ＝１０）からのバルーン損傷後の総頚動脈の新内膜／中膜比を表す。値は、平均値±ＳＥＭである。＊バルーン損傷した動脈と比較してｐ＜０．０１、†ＰＳＯＤＮ処理した動脈と比較してｐ＜０．０５。
【図６】図６は、損傷した頚動脈における新内膜形成の阻害へのＣＤＯＤＮ処理時点の効果を示す。（Ａ）〜（Ｅ）コントロールラットの左総頚動脈の横断面（Ａ）、バルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面（Ｂ）、ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法を使用してＭＯＤＮの前処理をした左総頚動脈の横断面（Ｃ）、ＣＤＯＤＮの前処理をした左総頚動脈の横断面（Ｄ）、およびＣＤＯＤＮの後処理をした左総頚動脈の横断面（Ｅ）。（Ｆ）ＡＰ−１デコイＯＤＮを含むＨＶＪ−リポソームでトランスフェクトした群における左頚動脈の内膜領域／中膜領域の平均比。棒は、研究した動物の各群（ｎ＝１０）からのバルーン損傷後の総頚動脈の新内膜／中膜比を表す。値は、平均値±ＳＥＭ。＊バルーン損傷動脈と比較してｐ＜０．００５、†ＣＤＯＤＮで前処理した動脈と比較してｐ＜０．０１、‡ＣＤＯＤＮで後処理した動脈と比較してｐ＜０．０１。
【図７】図７Ａは、動脈抽出物におけるＡＰ−１結合活性の分析を示す。損傷後に示された時点での頚動脈からの細胞の核抽出物を用いてゲル移動度シフトアッセイを行った（ｎ＝１０）。バルーン損傷の前（ＣＤＯＤＮ前処理した）または後（ＣＤＯＤＮ後処理した）に、２０μｌのＣＤＯＤＮを含むＨＶＪ−リポソーム複合体を室温にて管腔内で１０分間インキュベートした。図７Ｂは、バルーン損傷後のラット頚動脈におけるＰＣＮＡ発現を示す。コントロール血管のＰＣＮＡ染色（１）、バルーン損傷した血管のＰＣＮＡ染色（２）、ＭＯＤＮで前処理した動脈のＰＣＮＡ染色（３）、ＣＤＯＤＮで前処理した動脈のＰＣＮＡ染色（４）およびＣＤＯＤＮで後処理した動脈のＰＣＮＡ染色（５）。ＰＣＮＡ陽性細胞は、茶色がかった黒に見える。全ての図は、４００×の拡大率である。
【図８】図８は、Ｅ２Ｆデコイの構造および分子安定性を示す。［Ａ］ＣＤ−Ｅ２Ｆ分子を形成するために共有結合された２つの同一のステム−ループから構成されるＥ２Ｆデコイの構造。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、そのステム領域上のＥ２Ｆに対する２つの結合部位からなる。［Ｂ］エキソヌクレアーゼＩＩＩ（左パネル）、Ｓ１ヌクレアーゼ（左パネル）または血清（右パネル）の存在下でのデコイの安定性。略語：ＥｘｏＩＩＩ；エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理したデコイ、Ｓ１：Ｓ１ヌクレアーゼで処理したデコイ、ＣＳ；仔ウシ血清、Ｄ；ＣＤ−Ｅ２Ｆ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、およびＬ；連結前のＣＤ−Ｅ２Ｆのアニールした形態。
【図９】図９は、Ｅ２ＦのＤＮＡ結合活性についてのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を示す。［Ａ］種々の濃度の未標識のＯＤＮの存在下での標識化プローブとＥ２Ｆタンパク質との間に形成されるＥ２Ｆ複合体の量。［Ｂ］ゲルシフトアッセイの代表例をＥ２ＦデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣについて示す。この実験を６回繰り返した。略語：ＮＧ；正常のグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）、ＨＧ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＥ２ＦデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、Ｄ；ＣＤ−Ｅ２Ｆ、およびＭ：Ｍ−Ｅ２Ｆ。ＥＭＳＡの結果を５回の別の実験の平均値±ＳＥＭとして表す。統計的有意差を以下のように決定した：＊ＮＧと比較してｐ＜０．００１、†ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１、‡ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５。
【図１０】図１０は、平滑筋細胞における細胞周期関連遺伝子のプロモーター活性についてのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を示す。（Ａ）ＶＳＭＣを、高濃度グルコース条件下で、デコイと、サイクリンＡプロモーターの連続欠失体または変異体構築物とを同時トランスフェクトした。統計的有意差を以下のように決定した：＊ｐＣＡ−２６６／＋２０５と比較してｐ＜０．０１、†ｐＣＡ−１３３／＋２０５と比較してｐ＜０．０１。ＶＳＭＣを、デコイと、プラスミドｐＣＡ−２６６／＋２０５（Ｂ）または［Ｅ２Ｆ］×４−Ｌｕｃ（Ｃ）とを同時トランスフェクトした。デコイの活性は、ルシフェラーゼ活性をダウンレギュレートする能力に反映される。値をβ−ガラクトシダーゼ活性の正規化後の５回の別の実験の平均値±ＳＥＭで表す。統計的有意差を以下のように決定した：＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、†ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．００１、‡ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５。略語：Ｎ：正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＥ２ＦのデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、Ｄ：ＣＤ−Ｅ２Ｆ、Ｍ；Ｍ−Ｅ２Ｆ。
【図１１】図１１は、ＶＳＭＣにおける遺伝子発現についてのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を示す。（Ａ）代表的なノーザンブロット解析。ＲＡＳＭＣ（ＢおよびＤ）またはＨＶＳＭＣ（ＣおよびＥ）におけるサイクリンＡ（ＢおよびＣ）およびＰＣＮＡ（ＤおよびＥ）の遺伝子発現を、濃度測定分析を用いて量化した。略語：Ｎ；正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＥ２ＦデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、Ｄ；ＣＤ−Ｅ２Ｆ、Ｍ；Ｍ−Ｅ２Ｆ。値は、５回の別の実験の平均値±ＳＥＭを表す。統計的有意差を以下のように決定した：＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、＃ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１、＃＃ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５。
【図１２】図１２は、ＨＶＳＭＣ（Ａ）およびＲＡＳＭＣ（Ｂ）における細胞増殖の阻害についてのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を示す。増殖活性は６つの測定値の平均値±ＳＥＭである。デコイを平滑筋細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２〜３日後、ＷＳＴ細胞計数キットを使用して細胞増殖の指数を決定した。統計的有意差を以下のように決定した：＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、＃ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１、および＃＃ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５。略語：Ｎ：正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ：高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＥ２ＦデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、Ｄ；ＣＤ−Ｅ２Ｆ、Ｍ；Ｍ−Ｅ２Ｆ。
【図１３】ラット頚動脈におけるバルーン損傷後に生じる新内膜形成についてのＥ２Ｆデコイの効果。図は、ＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮのみ（Ａ）か、またはＨＶＪ−リポソームを有するＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮ（Ｂ）で処理した左総頚動脈の蛍光顕微鏡法を図示する。コントロールラットの左総頚動脈の横断面（Ｃ）、バルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面（Ｄ）、ＨＶＪ−リポソーム法を使用してＰＳ−Ｅ２Ｆを伴う、バルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面（Ｅ）、ＨＶＪ−リポソーム法およびＣＤ−Ｅ２Ｆを伴う左総頚動脈の横断面（Ｆ）、またはＨＶＪ−リポソーム法およびＭ−Ｅ２Ｆを伴う左総頚動脈の横断面（Ｇ）を示す。Ｅ２Ｆデコイを含むＨＶＪ−リポソームでトランスフェクトした群における左頚動脈の内膜領域／中膜領域の平均比を示す（Ｈ）。棒は、試験した動物の各群（ｎ＝１０）からのバルーン損傷後の総頚動脈の、新内膜／中膜の比を表す。値は、平均値±ＳＥＭで表し、以下のように統計的有意差を決定した：＊バルーン損傷した動脈と比較してｐ＜０．０１、＃ＰＳ−Ｅ２Ｆ処理した動脈と比較してｐ＜０．０５。元の倍率の１００×（ＡおよびＢ）および２５×（Ｃ〜Ｇ）。スケールバーは、２００μｍを表す。
【図１４】図１４は、バルーン損傷後のラット頚動脈におけるＰＣＮＡ発現を示す。コントロール血管（Ａ）、バルーン損傷した血管（Ｂ）、Ｍ−Ｅ２Ｆで処理した動脈（Ｃ）、ＰＳ−Ｅ２Ｆで処理した動脈（Ｄ）およびＣＤ−Ｅ２Ｆで処理した動脈（Ｅ）のＰＣＮＡ染色。ＰＣＮＡ陽性細胞は、茶色がかった黒に見える。全ての図は、２００×の拡大率である。スケールバーは、５０μｍを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月21日(2005.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つのループ構造および１つのステム構造を備える環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）であって、該ステム構造が、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項２】
前記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項３】
酵素的連結によって共有結合する２つの相同なステムループ構造を有する、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項４】
前記ステム構造が、２つ以上の転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項５】
前記転写因子がＡＰ−１である、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項６】
前記ＡＰ−１のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列が、５’−ＴＧＡＣＴＣＡ−３’である、請求項５に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項７】
前記相同なステムループ構造のそれぞれが、配列番号３の配列を有する、請求項５に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項８】
ステム構造が、別の転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項９】
前記転写因子がＥ２Ｆである、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項１０】
前記Ｅ２ＦのＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列が、５’−ＴＴＴＣＧＣＧＣ−３’である、請求項９に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項１１】
前記相同なステムループ構造のそれぞれが、配列番号６の配列を有する、請求項９に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項１２】
前記転写因子がＮＦκＢである、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
【請求項１３】
被験体において、転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、治療有効量の２つのループ構造および１つの該転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含むステム構造を備えたＣＤＯＤＮ、ならびに薬学的受容可能キャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項１４】
前記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記薬学的受容可能キャリアが、ＨＶＪ−リポソーム組成物である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記転写因子がＡＰ−１である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記転写因子がＥ２Ｆである、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記転写因子がＮＦκＢである、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
被験体において転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬品の製造における、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えたＣＤＯＤＮの使用であって、ここで、該ステム構造は、該転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、使用。
【請求項２３】
前記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記医薬品が、ＨＶＪ−リポソーム組成物の形態である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
前記転写因子がＡＰ−１である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２６】
前記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記転写因子がＥ２Ｆである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２８】
前記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記転写因子がＮＦκＢである、請求項２２に記載の使用。
【請求項３０】
前記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、請求項２７に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療分野の発明である。本発明は特に、新規のデコイオリゴデオキシヌクレオチドおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
転写因子の還元性トランス活性のための二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮまたは「デコイ（ｄｅｃｏｙ）」）は、遺伝子治療および遺伝子産物の機能研究のための、革新的かつ魅力的な戦略である。幾つかの異なった二本鎖ＤＮＡ構造（非改変オリゴヌクレオチド二重鎖、脱アノマーオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド二重鎖、およびダンベルオリゴヌクレオチドが挙げられる）が、転写因子のためのデコイとして、導入されている（Ｓｃｈｏｌｅｒ  ＨＲおよびＧｒｕｓｓ  Ｐ．，Ｃｅｌｌ  １９８４；３６：４０３−４１１；Ｃｅｒｅｇｈｉｎｉ  Ｓｅｔら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ
１９８８；２：９５７−９７４；Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ  ＬＡら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８９；９：４２７２−４２８１；Ｔａｎａｋａ  Ｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９４；２２：３０６９−３０７４；Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ  Ａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０；２５０：９９７−１０００；Ｃｌｕｓｅｌ  Ｃら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９３；２１：３４０５−３４１１；Ｌｉｍ  ＣＳら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９７；２５：５７５−５８１；Ｈｏｓｏｙａ
Ｔら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９９；４６１：１３６−１４０；Ｍａｎｎ  ＭＪおよびＤｚａｕ  ＶＪ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０６：１０７１−１０７５を、参照のこと）。
【０００３】
二本鎖シスエレメントデコイＯＤＮのトランスフェクションは、同配列の内在性シスエレメントからのトランス活性因子の隔離をもたらし、その結果、遺伝子発現の阻害をもたらす（Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ  Ａら，１９９０（前出）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら１９９８（前出）；およびＳａｗａ  Ｙ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９７；９６：ＩＩ−２８０−ＩＩ−２８５を、参照のこと）．
さらに、ＮＦ−κＢ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃｄｃ２、ｃｄｋ２、Ｅ２Ｆ、およびＣＲＥに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはデコイオリゴヌクレオチドの投与は、悪液質を減少すること（Ｋａｗａｍｕｒａ  Ｉら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９９；６：９１−９７）、実験的狭窄におけるインビトロの細胞増殖および内膜肥厚（Ｓｉｍｏｎｓ  Ｍら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５９：６７−７３；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４；９３：１４５８−１４６４；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９３；９０：８４７４−８４７８；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら，１９９５（前出）；  Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７；３：８９４−８９９；Ｋａｎｅｄａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９７；４５：９９−１０５；Ｔｏｍｉｔａら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９８；２７５：Ｆ２７８−Ｆ２８４；Ｍａｅｓｈｉｍａ  Ｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８；１０１：２５８９−２５９７；Ａｋｉｍｏｔｏ  Ｍら，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１９９８；６７：３９５−４０１；Ｍａｎｎ  ＭＪら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９９；３５４：１４９３−１４９８；Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｚａｕ  ２０００（前出）；Ｋａｗａｕｃｈｉ  Ｍら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２０００；８７：１０６３−１０６８；Ｍａｎｇｉ  ＡＡ  ａｎｄ  Ｄｚａｕ  ＶＪ，Ａｎｎ  Ｍｅｄ  ２００１；３３：１５３−１５５；Ｅｈｓａｎ  Ａら，Ｊ
Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ２００１；１２１：７１４−７２２；Ｋａｗａｕｃｈｉ  Ｍら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２００１；３３：４５１；ＭｃＣａｒｔｈｙ  Ｍ，Ｌａｎｃｅｔ，２００１；３５８：１７０３を参照のこと）、増殖性胆管炎の抑制（Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｍら，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．２００２；１０２：９５−１０１）および癌モデルにおいて腫瘍増殖を遅くし、アポトーシスを誘導すること（Ｐａｒｋ  ＹＧら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：１５７３−８０；Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ  ＹＳら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００；２１２：２９−３４；Ａｌｐｅｒ  Ｏら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１；２１８：５５−６３）が、それぞれ示されている。
【０００４】
非改変オリゴヌクレオチドＯＤＮの主な制限は、これらが血清中および細胞中のヌクレアーゼによって容易に分解されることである。この問題を解決するため、改変結合（例えば、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート）を有するオリゴヌクレオチドが、開発されている。しかし、これらの改変ＯＤＮは、ＲＮａｓｅ  Ｈ  に対する非反応性、細胞性ＤＮＡ内への加水分解された改変ヌクレオチドの再利用の可能性、ＯＤＮベースの遺伝子治療の配列特異的結合効果の欠如、および免疫活性化などの問題点を示す（Ｍｏｏｎ
ＩＪら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：４６４７−４６５３；Ｈｏｓｏｙａ  Ｔら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９９；４６１：１３６−１４０；Ｋｈａｌｅｄ  Ｚら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９６；２４：７３７−７７５；Ｇａｏ  ＷＹら，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９２；４１：２２３−２２９；Ｂｒｏｗｎ  ＤＡら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９４；２６９：２６８０１−２６８０５；およびＢｕｒｇｅｓｓ  ＴＬら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５；９２：４０５１−４０５５を参照のこと）。
【０００５】
近年、デコイが、転写因子に関連する疾患および障害（新内膜形成を含む）の処置のために提案されている。新内膜形成は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の過剰増殖および中膜から内膜への転移から生じ、これらは、アテローム性動脈硬化症および再狭窄（経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の主要な問題である）の病因における、重要な工程である（Ｃｕｒｒｉｅｒ  ＪＷ，およびＦａｘｏｎ  ＤＰ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ
１９９５；２５：５１６−５２０；Ｃｌｏｗｅｓ  ＡＷ，ら，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９８３；４９：２０８−２１５；Ｌｉｕ  ＭＷ，ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９８９；７９：１３７４−１３８７；Ｒｏｓｓ  Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９０；３６２：８０１−８０９；およびＰａｕｌｅｔｔｏ  Ｐ，ら，Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ．１９９４；８７：４６７−４７９を、参照のこと）。
【０００６】
ＰＴＣＡ後の再狭窄の発生率および割合を減少するために、多くの薬物の試験が行われているが、結果は芳しくない。この十年にわたって、ＶＳＭＣ増殖に主眼を置いた抗遺伝子治療が、ＰＴＣＡ後の再狭窄を減少するための、可能性のある魅力的な戦略として、出現している（Ｓｉｍｏｎｓ  Ｍ，ら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５９：６７−７３；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，ら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４；９３：１４５８−１４６４；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９３；９０：８４７４−８４７８；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５；９２：５８５５−５８５９；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，ら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７；３：８９４−８９９；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．２００１；９１：１０５−１１４，Ｍｏｔｏｋｕｎｉ
Ａら，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  ２００１；５９：４３−５２を参照のこと）。
【０００７】
これまでの研究では、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）およびｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）（両方とも分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーに属する）は、バルーン損傷後に、迅速かつ過渡的に活性化されることが見出されている（Ｏｈａｓｈｉ  Ｎ，ら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２０００；２０：２５２１−２５２６；Ｋｏｙａｍａ  Ｈ，ら，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９８；８２：７１３−７２１；Ｈｕ  Ｙ，ら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．１９９７；１７：２８０８−２８１６；およびＰｙｌｅｓ  ＪＭ，ら，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９７；８１：９０４−９１０を参照のこと）。
【０００８】
損傷した血管壁におけるＥＲＫ２活性およびＪＮＫ１活性は、バルーン損傷後迅速に上昇し、損傷５分後に高レベルに達する。ＥＲＫ２キナーゼ活性における持続的な上昇は、損傷後７日間にわたって動脈壁において、そして１４日にわたって新内膜において、観察された。（Ｈｕ  Ｙ，ら，１９９７（前出）；およびＩｚｕｍｉ  Ｙ，ら，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００１；８８：１１２０−１１２６）。
【０００９】
ＪＮＫおよびＥＲＫは、核内に転座し、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓ（二量体化し、転写因子複合体ＡＰ−１を形成する）を活性化することが公知である。ＡＰ−１は、多様な範囲の細胞増殖性応答（例えば、細胞外マトリックス産生）（Ｋａｒｉｎ  Ｍ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：１６４８３−１６４８６；およびＷｈｉｔｍａｒｃｈ  ＡＪ，ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ  ＲＪ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１９９６；７４：５８９−６０７を参照）、アポトーシス（Ｌｅ−Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ  Ｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９；１９：７５１−７６３；Ｔａｉｍｏｒ  Ｇ．ら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００１；１５：２５１８−２５２０）、血管再形成（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９８；２４３：３６１−３６７；Ｌａｕｔｈ  Ｍ．ら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２０００；７８：４４１−４５０；Ｗａｇｎｅｒ  ＡＨ  ら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．２０００；５８：１３３３−１３４０；Ｃａｔｔａｒｕｚｚａ  Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：３６９９９−３７００３）、ＣＯＸ−２媒介性炎症（Ａｄｄｅｒｌｅｙ，ＳＲおよびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ＤＪ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９９；２７４：５０３８−５０４６；ｖｏｎ  Ｋｎｅｔｈｅｎ  Ａら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９９９；１０：３６１−３７２；ｖｏｎ  Ｋｎｅｔｈｅｎ  Ａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９；１６３：２８５８−２８６６；Ｓｕｂｂａｒａｍａｉａｈ  Ｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：１２４４９−１２４４８）および１型プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ−１）の産生（Ａｈｎ  ＪＤ．ら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２００１；４４：７１３−７２０）ＴＧＦ−β（Ｊｉｎ  ＧおよびＨｏｗｅ  ＰＨ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２：２６６２０−２６６２６）およびＩＬ−６（Ｖｉｅｄｔ  Ｃ  ら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２０００；１４：２３７０−２３７２）に関連する多くの遺伝子の中に存在する、特定のＤＮＡ配列に結合する。
【００１０】
これらの結果は、ＡＰ−１結合が、血管損傷における血管平滑筋細胞増殖に関連し得ることを示唆する。しかし、ＡＰ−１結合の阻害が、新内膜形成を阻害するか否かは、知られていない。
【００１１】
近年の報告はまた、転写因子Ｅ２Ｆ（サイクリンＡ、ｃｄｋ２、およびｐＲＢと複合体を形成し、これらの細胞周期調節遺伝子を活性化およびリン酸化する）が、細胞成長および細胞増殖を維持するために重要であることを示している（Ｐａｇａｎｏ  Ｍら  ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９２；１１：９６１−９７１；Ｐａｒｄｅｅ  ＡＢ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９７４；７１：１２８６−１２９０；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ
ＳＪ，ら  Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５８：２５９−２６１；Ｐａｇａｎｏ  ＭＧ，ら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２；２５５：１１４４−１１４７；およびＲｏｓｅｎｂｌａｔｔ  Ｊ，ら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９２；８９：２８２４−２８２８）。
【００１２】
転写因子である核因子−κＢ（ＮＦκＢ）は、サイトカインおよび接着分子遺伝子（虚
血および再灌流後の心筋障害に関連し得る）の協調的トランス活性化において、中心的な役割を果たす。ＮＦκＢに特異的なデコイは、転写因子に結合し、心筋の炎症を仲介する遺伝子の活性を阻害するためにインビボで使用され、従って、心筋炎症に対する効果的な治療を提供する（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ．ら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７  Ａｕｇ；３（８）：８９４−９）。
【００１３】
転写因子に関連する幾つかの疾患および障害に対して、成功したデコイの適用はあるが、上述の非改変オリゴヌクレオチドＯＤＮの、これらが血清中および細胞中に存在するヌクレアーゼによって容易に分解されるという主な制限は、これらの疾患および障害を処置しかつ予防する際の、デコイの有効性をかなり低下させる。
【００１４】
インビトロ研究において、共有結合的に閉じたＯＤＮが、これらの制限を克服する目的で、２つの相同な分子の酵素的な結合によってエキソヌクレアーゼ活性を避けるために、開発されている。酵素的結合による３’端および５’端の連結によってオリゴヌクレオチドを環状化して作製された、天然のＤＮＡに似た非毒性非改変バックボーンを有する、環状ダンベルオリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対するより高い安定性を有し、化学改変直鎖状オリゴヌクレオチドと比較してより高い細胞内への取り込みを有していた（Ｃｈｕ  ＢＣＦおよびＯｒｇａｌ  Ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２；２０：５８５７−５８５８；およびＡｂｅ  Ｔ，ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９８；４２５：９１−９６を参照のこと）。
【００１５】
しかし、このような共有結合的に閉じたＯＤＮまたは環状ダンベルオリゴヌクレオチドが、疾患または障害の処置または予防において有効であることを示す報告は、存在していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、本発明の目的は、転写因子に関連する疾患および障害を処置または予防するための、より効率的かつより有効な手段を、提供することである。
【００１７】
さらに、本発明の目的は、ＶＳＭＣのトランスフェクションのための転写因子（例えば、ＡＰ−１）結合部位を含むデコイＯＤＮのような手段を提供することであり、この結合部位は、デコイを効果的にＡＰ−１に結合させ、細胞増殖性応答に関連する不可欠な遺伝子のトランス活性化を防ぎ、そしてそれにより新内膜形成を阻害する。
【００１８】
従って、本発明の別の目的は、環状ダンベル構造（ＣＤＯＤＮ）を有する新規のＡＰ−１デコイＯＤＮを提供し、バルーン損傷におけるＡＰ−１活性化の役割を明らかにすることである。環状ダンベル構造（ＣＤＯＤＮ）を有するＡＰ−１デコイＯＤＮは、センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームを用いてトランスフェクトされ得る。この発明において、本発明者らは、ＣＤＯＤＮの安定性および有効性を、インビトロおよびインビボで評価した。ここで、本発明者らは、ＡＰ−１活性化が、損傷への応答におけるＶＳＭＣ増殖において重要な役割を果たすこと、およびバルーン損傷工程前のラット動脈への新規ＣＤＯＤＮのトランスフェクションが、バルーン損傷したラット動脈における新内膜形成をほぼ完全に防ぐことを実証した。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、血管形成術後の再狭窄についての新規の治療戦略を開発することであり、この戦略は、血管形成術の前、その間、またはその後に、有効量のＣＤＯＤＮ  ＡＰ−１デコイまたは他のＡＰ−１阻害的化合物を、患者に投与する工程を包含する。
【００２０】
本発明のなおさらなる目的は、新規のＥ２Ｆデコイを提供することであり、この新規のＥ２Ｆデコイは、エキソヌクレアーゼ活性を避けるため、２つの相同なオリゴ分子の共有結合閉環によって作製される。本発明者らは、不可欠な細胞周期調節遺伝子のトランス活性化の際、ならびにＶＳＭＣ増殖および新内膜形成の際の、この環状ダンベルＥ２Ｆデコイ（ＣＤ−Ｅ２Ｆ）の安定性および配列特異的阻害効果を調査した。
【００２１】
本発明のなおさらなる目的は、血管形成術後の再狭窄についての新規の治療戦略を開発することであり、この戦略は、血管形成術の前、その間、またはその後に、有効量のＣＤ−Ｅ２Ｆデコイを、患者に投与する工程を包含する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
本発明は、２つのループ構造および１つのステム構造を含む環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）を提供し、このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明は、さらに、上記ＣＤＯＤＮを含有する薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、このような転写因子に関連する疾患または障害を処置および／または予防するために、使用され得る。本発明はまた、このような転写因子に関連する疾患および／または障害を処置または予防する方法を提供し、この方法は、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えたＣＤＯＤＮを被験体に投与する工程を包含し、ここで、このステム構造は、該転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
好ましくは、この転写因子は、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される。好ましくは、ＮＦ−κＢデコイは、配列５’−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号９）を含み得る（ＮＦ−κＢデコイ）；ＳＴＡＴ−１デコイは、配列５’−ＧＡＴＣＴＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号１０）を含み得る（ＳＴＡＴ−１デコイ）；ＧＡＴＡ−３デコイは、配列５’−ＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴ−３’（配列番号１１）を含み得る（ＧＡＴＡ−３デコイ）；ＳＴＡＴ−６デコイは、配列５’−ＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴ−３’（配列番号１２）を含み得る（ＳＴＡＴ−６デコイ）；ＡＰ−１デコイは、配列５’−ＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号１３）または５’−ＴＧＡＣＴＣＡ−３’を含み得る（ＡＰ−１  デコイ）；ｅｔｓデコイは、配列５’−ＡＡＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡ−３’（配列番号１４）を含み得る（Ｅｔｓデコイ）；ＣＲＥデコイは、配列５’−ＴＧＡＣＧＴＣＡ−３’を含み得る（ＣＲＥデコイ）；およびＥ２Ｆデコイは、配列５’−ＴＴＴＣＧＣＧＣ−３’を含み得る（Ｅ２Ｆ  デコイ）。
【００２４】
血管平滑筋細胞の過剰増殖および新内膜形成は、アテローム性動脈硬化症および経皮的血管形成術後の再狭窄の病因における重大な工程である。このような疾患および障害の処置または予防におけるＡＰ−１のＣＤＯＤＮの有効性を示すため、以下の研究が行われ、転写因子ＡＰ−１は、これらの過程において重要な役割を果たすという本発明者らの仮説を試験し、そして血管形成後の再狭窄についての新規の治療戦略を開発した。全体的に、本発明者らの結果は、ＡＰ−１活性化は、血管損傷における平滑筋細胞増殖の媒介において、重要であることを示した。従って、本発明は、再狭窄を導く平滑筋細胞増殖に対する新規の戦略を提供する。
【００２５】
本発明者らは、エキソヌクレアーゼによる破壊を避けるために、環状ダンベル構造（ＣＤＯＤＮ）を有する新規のＡＰ−１デコイＯＤＮを開発した。この新しい形態のＡＰ−１デコイＯＤＮは、ホスホチオエート直鎖状デコイＯＤＮ（ＰＳＯＤＮ）よりも、より安定で、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたは血清のどちらかの存在下でのインキュベーション後、その構造的完全性を大いに保った。ＡＰ−１デコイＯＤＮのトランスフェクションは、血管平滑筋細胞の増殖および転移の両方を、強く阻害した。ＡＰ−１デコイＯＤＮはまた、ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの、高濃度グルコース誘導性転写発現および血清誘導性転写発現も、阻害した。インビトロでのデータと一致して、センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム法を使用したＡＰ−１デコイＯＤＮのインビボの投与は、ラット頚動脈のバルーン損傷後の新内膜形成を、ほぼ完全に阻害した。従来のＰＳＯＤＮと比較して、ＣＤＯＤＮは、インビトロの平滑筋細胞の増殖阻害およびインビボの新内膜形成の阻害においてより効果的であった。ＰＳＯＤＮと比較しておよそ半分の用量のＣＤＯＤＮが、インビトロおよびインビボの血管平滑筋細胞の増殖阻害において同様の結果を得るために、十分であった。その上、ＡＰ−１のＣＤＯＤＮ結合の配列特異性は、予想外に、従来のＰＳＯＤＮよりも１０倍以上高かった。
【００２６】
従って、本発明は、非常に効果的なＨＶＪ−リポソーム送達法を用いた、ＡＰ−１に対しより安定なＣＤＯＤＮの使用は、ヒトにおいて、血管形成後の再狭窄の予防のための新規の治療戦略を提供することを、示す。
【００２７】
さらに、本発明は、細胞周期調節に関する幾つかの分子のトランス活性化において重要な役割を果たす、転写因子Ｅ２Ｆに関係する。先行研究は、Ｅ２Ｆ結合ドメインに対応するシスエレメント二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（デコイ）のトランスフェクションは、損傷した血管における血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）増殖および新内膜肥厚を阻害し得ることを示している。本研究において、本発明者らは、環状ダンベル構造を有する新規のＥ２Ｆデコイ（ＣＤ−Ｅ２Ｆ）を開発し、そしてこのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を、従来のホスホチオエート化Ｅ２Ｆデコイ（ＰＳ−Ｅ２Ｆ）と比較した。本発明者らは、ＣＤ−Ｅ２Ｆは、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも、より安定で、ヌクレアーゼまたは血清のどちらかの存在下でのインキュベーション後、その構造的完全性を大いに保った。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、細胞周期調節遺伝子の高濃度グルコース誘導性転写発現および血清誘導性転写発現を、ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較して、より強く阻害した。ＣＤ−Ｅ２Ｆのトランスフェクションは、ＶＳＭＣ増殖およびインビボの新内膜形成の阻害において、ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較して、より効果的であった。ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較して、４０〜５０％減少した用量のＣＤ−Ｅ２Ｆが、インビトロのＶＳＭＣ増殖阻害およびインビボの新内膜形成において同様の結果を得るために、十分であった。その上ＣＤ−Ｅ２Ｆは、予想外にも、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも１０倍高いＥ２Ｆに対する配列特異性を示した。
【００２８】
結論として、本発明者らの結果は、例えば、血管形成後の再狭窄の処置において、ＣＤ−Ｅ２Ｆが、ＶＳＭＣ増殖を阻害する遺伝子治療（のため、そして転写調節の研究のために、従来のＥ２Ｆデコイより、価値の高い薬剤であることを示す。
【００２９】
（課題を解決するための手段）
本発明は、以下を提供する：
１．２つのループ構造および１つのステム構造を備える環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）であって、このステム構造が、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド。
【００３０】
２．上記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３１】
３．酵素的結合によって共有結合する２つの相同なステムループ構造を有する、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３２】
４．いかなる化学改変されたヌクレオチドも含まない、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３３】
５．上記ステム構造が、２つ以上の転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列をさらに含む、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３４】
６．上記転写因子がＡＰ−１である、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３５】
７．上記ＡＰ−１のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列が、５’−ＴＧＡＣＴＣＡ−３’である、項目６に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３６】
８．上記相同なステムループ構造のそれぞれが、配列番号３の配列を有する、項目６に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３７】
９．ステム構造が、別の転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列をさらに含む、項目６に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３８】
１０．インビトロ競合結合アッセイで評価した場合に、配列番号４の配列を有するリン酸化オリゴヌクレオチドより、約５倍強いＡＰ−１配列特異性を有する、項目６に記載のＣＤＯＤＮ。
【００３９】
１１．上記転写因子がＥ２Ｆである、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００４０】
１２．上記Ｅ２ＦのＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列が、５’−ＴＴＴＣＧＣＧＣ−３’である、項目１１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００４１】
１３．上記相同なステムループ構造のそれぞれが、配列番号６の配列を有する、項目１１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００４２】
１４．インビトロ競合結合アッセイで評価した場合に、配列番号７の配列を有するリン酸化オリゴヌクレオチドより、約５倍強いＥ２Ｆ配列特異性を有する、項目１１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００４３】
１５．上記転写因子がＮＦκＢである、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。
【００４４】
１６．被験体において、転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防する方法であって、この方法は、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えたＣＤＯＤＮを被験体に投与する工程を包含し、ここで、このステム構造は、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、方法。
【００４５】
１７．上記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
【００４６】
１８．薬学的受容可能キャリアが、ＨＶＪ−リポソーム組成物である、項目１６に記載の方法。
【００４７】
１９．上記転写因子がＡＰ−１である、項目１６に記載の方法。
【００４８】
２０．上記転写因子に関連する疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成を含む、項目１８に記載の方法。
【００４９】
２１．被験体において、上記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、項目１９に記載の方法。
【００５０】
２２．上記化合物が、血管損傷前に投与される、項目２０に記載の方法。
【００５１】
２３．上記転写因子がＥ２Ｆである、項目１６に記載の方法。
【００５２】
２４．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成を含む、項目２３に記載の方法。
【００５３】
２５．被験体において、上記治療有効量のＣＤＯＤＮが、被験体において再狭窄を防ぐために有効である、項目２３に記載の方法。
【００５４】
２６．上記ＣＤＯＤＮが、血管損傷後に投与される、項目２４に記載の方法。
【００５５】
２７．上記転写因子がＮＦκＢである、項目１６に記載の方法。
【００５６】
２８．上記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、項目１６に記載の方法。
【００５７】
２９．被験体において、転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防するための薬学的組成物であって、この薬学的組成物は、治療有効量の２つのループ構造および１つの該転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含むステム構造を備えたＣＤＯＤＮ、ならびに薬学的受容可能キャリアを含有する、薬学的組成物。
【００５８】
３０．上記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００５９】
３１．上記薬学的受容可能キャリアが、ＨＶＪ−リポソーム組成物である、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６０】
３２．上記転写因子がＡＰ−１である、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６１】
３３．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６２】
３４．被験体において、上記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６３】
３５．上記転写因子がＥ２Ｆである、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６４】
３６．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、項目３５に記載の薬学的組成物。
【００６５】
３７．被験体において、上記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、項目３６に記載の薬学的組成物。
【００６６】
３８．上記転写因子がＮＦκＢである、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６７】
３９．上記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、項目２９に記載の薬学的組成物。
【００６８】
４０．被験体において転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬品の製造における、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えたＣＤＯＤＮの使用であって、ここで、このステム構造は、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、使用。
【００６９】
４１．上記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、項目４０に記載の使用。
【００７０】
４２．上記医薬品が、ＨＶＪ−リポソーム組成物の形態である、項目４０に記載の使用。
【００７１】
４３．上記転写因子がＡＰ−１である、項目４０に記載の使用。
【００７２】
４４．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、項目４３に記載の使用。
【００７３】
４５．被験体において、上記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、項目４３に記載の使用。
【００７４】
４６．上記転写因子がＥ２Ｆである、項目４０に記載の使用。
【００７５】
４７．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の新内膜過形成である、項目４６に記載の使用。
【００７６】
４８．被験体において、上記治療有効量のＣＤＯＤＮが、被験体において再狭窄を防ぐために有効である、項目４０に記載の使用。
【００７７】
４９．上記転写因子がＮＦκＢである、項目４０に記載の使用。
【００７８】
５０．上記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、項目４６に記載の使用。
【００７９】
本発明の別の局面において、本発明は、ＡＰ−１に関連する疾患または障害を処置する方法をさらに提供し、この方法は、治療有効量の、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼの遺伝子のＡＰ−１によるトランス活性化を阻害し得る化合物、および薬学的受容可能キャリアを被験体に投与する工程を包含する。
【００８０】
さらに、本発明は、被験体において血管損傷後の血管平滑筋細胞増殖または新内膜肥厚を予防する方法を提供し、この方法は、治療有効量の、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼの遺伝子のＡＰ−１によるトランス活性化を阻害し得る化合物、および薬学的受容可能キャリアを被験体に投与する工程を包含する。
【００８１】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、上記ＡＰ−１が上記遺伝子のプロモーターに結合する能力を、阻害し得る。
【００８２】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、抗体、または核酸もしくは核酸アナログである。
【００８３】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、ＡＰ−１のプロモーターへの結合を、競合的に阻害し得る。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態において、この化合物は、２つのループ構造および１つのステム構造を備える環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）であって、このステム構造は、ＡＰ−１のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。
【００８５】
本発明の１つの実施形態において、ＣＤＯＤＮの量は、被験体において再狭窄を防ぐために十分であり得る。
【００８６】
本発明の１つの実施形態において、薬学的受容可能キャリアは、ＨＶＪ−リポソーム組成物であり得る。
【００８７】
本発明の別の局面において、本発明は、被験体において血管損傷後の血管平滑筋細胞増殖または新内膜肥厚を予防する薬学的組成物を提供し、この薬学的組成物は、治療有効量の、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼの遺伝子のＡＰ−１によるトランス活性化を阻害し得る化合物、および薬学的受容可能キャリアを含有する。
【００８８】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、上記ＡＰ−１が上記遺伝子のプロモーターに結合する能力を、阻害し得る。
【００８９】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、抗体、または核酸もしくは核酸アナログである。
【００９０】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、ＡＰ−１のプロモーターへの結合を、競合的に阻害し得る。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態において、この化合物は、２つのループ構造および１つのステム構造を備える環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）であり得、このステム構造は、ＡＰ−１のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。
【００９２】
本発明の１つの実施形態において、ＣＤＯＤＮの量は、被験体において再狭窄を防ぐために十分であり得る。
【００９３】
本発明の１つの実施形態において、薬学的受容可能キャリアは、ＨＶＪ−リポソーム組成物であり得る。
【００９４】
本発明の別の局面において、本発明は、被験体において血管損傷後の血管平滑筋細胞増殖または新内膜肥厚を予防する薬物の製造における、治療有効量の、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼの遺伝子のＡＰ−１によるトランス活性化を阻害し得る化合物の使用を、提供する。
【００９５】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、上記ＡＰ−１が上記遺伝子のプロモーターに結合する能力を、阻害し得る。
【００９６】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、抗体、または核酸もしくは核酸アナログである。
【００９７】
本発明の１つの実施形態において、この化合物は、ＡＰ−１のプロモーターへの結合を、競合的に阻害し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９８】
単数形の冠詞（例えば、英語において「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など；ドイツ語において「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその活用形；フランス語において「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌａ」、「ｌｅ」など；他の言語においては、冠詞、形容詞、または任意の他の等価物など）は、他に言及されない限り、その複数形の概念を含むということが、本明細書全体にわたって理解されるべきである。また、本明細書中で使用される用語は、他に言及されない限り、当該分野で通常使用されている定義を有することも理解されるべきである。
【００９９】
他に明記しない限り、本発明の実施は、タンパク質化学、ウイルス免疫生物学、分子生物学および当該分野の技術の範囲内の組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。このような技術は、文献にて完全に例示される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）；およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１００】
特に明記しない限り、本明細書中で使用される用語は、当該分野で使用されるものと同じ意味を有する。簡便のために、本明細書中、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される用語をここに集める。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、用語「動物」とは、哺乳動物をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトなどの霊長類であり得る。同様に、本発明の方法によって処置される「患者」または「被験体」は、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを意味し得る。好ましくは、このような被験体または患者はヒトであり得る。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、用語「デコイ」または「デコイ化合物」とは、ＡＰ−１もしくはＥ２Ｆのような転写因子する染色体の部位を模倣するか、または、転写調節因子が結合する、ＡＰ−１もしくはＥ２Ｆなどのような転写因子によって制御される遺伝子の染色体部位（本明細書中で後に、「標的結合部位」と称する）を模倣して、それによって染色体結合部位の転写因子への結合に競合する、化合物をいう。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、「ダンベルデコイ」または「ＣＤＯＤＮ」とは、２本鎖ステム領域および２つのループ構造を有する環状のオリゴヌクレオチドをいう。このステム領域は、デコイとして働く配列を含む。好ましくは、ＣＤＯＤＮは、２つの同一のステム−ループ構造の連結から形成される。
【０１０４】
用語「ＥＤ５０」とは、その最大応答または効果の５０％を生じる薬物の量を意味する。用語「ＬＤ５０」は、処置される集団の５０％に対して致死的である薬物の量を意味する。
【０１０５】
本発明の方法に関して、本発明の化合物（例えば、デコイ）または組成物の「有効量」は、Ｅ２ＦまたはＡＰ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するために有効な量をいう。本発明の方法に関して、本発明の化合物（例えば、デコイ）または組成物の「治療有効量」または「薬理学的有効量」とは、所望の薬理学的効果（例えば、処置される疾患または障害の緩和、治癒または発症の遅延）に十分な量をいう。
【０１０６】
投与される量は、処置される被験体または処置される疾患もしくは障害を含む種々の因子に依存し、そして、好ましくは、このような量は、重大な副作用を伴わずに所望の効果が得られるように最適化されるべきである。このような量は、当業者によって決定され得る。本発明の化合物または組成物の「有効量」、「治療有効量」または「薬理学的有効量」は、ＥＤ５０および／またはＬＤ５０を用いて決定され得る。治療指数は、治療効果と毒性効果の間の用量比であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０の比として表され得る。このような薬学的組成物が有する治療指数が大きいほど、より好ましい効果が得られ得る。ＥＤ５０およびＬＤ５０の決定のために、細胞培養アッセイおよび動物実験が用いられ得、そこから得られたデータを用いて、ヒトへの用途のための用量範囲を外挿し得る。好ましくは、本発明は毒性効果がほとんどないか、または毒性効果がまったくない。このような用量は、投与の形態、被験体の感受性、投与経路などに依存して変化する。
【０１０７】
用語「器官（臓器）」とは、組織の２つ以上の近接する層をいい、この組織の層は、細胞−細胞および／または細胞−マトリクス相互作用のいくつかの形態を維持して、微小構造を形成する。用語「組織」は、同様に特定化された細胞の集団または層をいい、一緒になってある特定化された機能を行う。
【０１０８】
用語「異種」とは、核酸に関して使用される場合、核酸が自然状態においては互いに同じ関係性で見出されない、２つ以上のサブ配列を含むことを指す。例えば、この核酸は、代表的には組み替え的に作製され、新しい機能的な核酸を生じるように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を有する。例えば、１つの実施形態において、この核酸は、異なる遺伝子由来のコード配列の発現に向かうように配置された１つの遺伝子由来のプロモーターを有する。従って、このコード配列に関して、このプロモーターは異種性である。
【０１０９】
２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」とは、最大の一致で配置されたときに、同じである、２つの配列における残基をいう。配列同一性の割合がタンパク質またはペプチドに関して使用される場合、同一でない残ステム分は、保存的アミノ酸置換によってしばしば異なり、ここで、アミノ酸残基は、同様な化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、従って、分子の機能的特性は変化しない。保存的置換において配列が異なる場合、配列同一性の割合は、置換基の保存的性質について補正するように上向きに調整され得る。この調整を行う手段は当業者に周知である。代表的には、この手段は、完全なミスマッチよりはむしろ、部分的なミスマッチとして保存的置換をスコア付け、それによって、配列同一性の割合を上昇させる工程を含む。従って、例えば、同一なアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は、０〜１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア付けは、例えば、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムに従って、  例えば、  プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）において実行されるように、計算される。
【０１１０】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）によって；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）によって：ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの同様の方法についての検索（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４）によって；これらのアルゴリズムのコンピュータ制御の実行（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．、ＧＡＰ製のＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡにおけるＴＦＡＳＴＡが挙げられるがこれらに限定されない）によって実行され得る。；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８８）Ｇｅｎｅ，７３：２３７−２４４ならびにＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６，１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇら（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８，１５５−６５，ならびにＰｅａｒｓｏｎら（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４，３０７−３１によって十分に記載される。アラインメントはまた、しばしば、目視および手動の整列によって行われる。
【０１１１】
サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、かつ、異なる環境パラメータ下において異なる。核酸のハイブリダイゼーションへの広範囲にわたる手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２「ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ
ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、所定のイオン強度およびｐＨにて特定の配列に対する熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（所定のイオン強度およびｐＨ下で）標的配列の５０％が、完全に適合するプローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブに対するＴｍと同じになるように選択される。
【０１１２】
用語「核酸」とは、１本鎖または２本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいう。他に限定されないが、この用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを含むポリマー配列を包含し、これらの塩基アナログとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリン。
【０１１３】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチドまたは前駆体（例えば、ｃ−ｍｙｃ）の産生に必須のコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列をいう。このポリペプチドは、全長ポリペプチドまたは活性フラグメントの所望の活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など）が保持される限り、全長のコード配列によってか、または任意の部分のコード配列によってコードされ得る。この用語はまた、構造遺伝子のコード領域を含み、いずれかの端の約１ｋｂ以上の距離で、５’末端および３’末端の両方のコード領域に近接して配置される配列を含み、その結果、遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応する。コード領域の５’に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムの形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「干渉領域」または「干渉配列」と呼ばれる非コード領域によって中断されるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサーのような調節エレメントを含み得る。イントロンは、核または最初の転写物から除去されるかまたは「スプライスアウト」される。従って、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の間に機能して、新生（ｎａｓｃｅｎｔ）ポリペプチドのアミノ酸の配列または順序を特定する。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子発現」は、遺伝子にコードされている遺伝情報を、遺伝子のＲＮＡへの「転写」を介して（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を介して）、および、タンパク質をコードする遺伝子については、タンパク質へのｍＲＮＡの「翻訳」を介して、ｍＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡ）に変換するプロセスをいう。遺伝子発現は、プロセスにおいて多くの段階で調節され得る。「アップレギュレーション」または「活性化」は、遺伝子発現産物（すなわち、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増加する調節をいい、他方、「ダウンレギュレーション」または「抑制」は、産生を減少する調節をいう。アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに関する分子（例えば、転写因子）は、しばしば、それぞれ「アクチベーター」および「リプレッサー」と呼ばれる。
【０１１５】
用語「野生型」は、天然に存在する供給源から単離された場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する、遺伝子または遺伝子産物をいう。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察される遺伝子であり、従って、遺伝子の「正常な」または「野生型」形態を任意に設計する。それに対して、用語「改変された」または「変異体」は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較する場合に、配列および／または機能的特性における改変（すなわち、改変された特性）を示す遺伝子または遺伝子産物をいう。天然に存在する変異体が単離され得；野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較する場合に、それらが改変された特性を有するという事実によって同定されることに留意されたい。
【０１１６】
ＤＮＡ分子は、「５’末端」および「３’末端」を有するといわれる。なぜなら、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、ホスホジエステル結合を介して一方向にある、１つのその隣接する３’酸素に結合する様式で、モノヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを生じるように反応するからである。従って、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されない場合に「５’末端」、そしてその３’末端の酸素が続くモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結されない場合に「３’末端」と称される。本明細書中で使用される場合、核酸配列はまた、より長いオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの内部であったとしても、５’末端および３’末端を有すると言われ得る。鎖状または環状のいずれかのＤＮＡ分子において、異なるエレメントが「下流」または３’に対してまたは「上流」または５’にあると言われる。この用語は、転写がＤＮＡ鎖にそって５’から３’の様式で進む事実に反映される。連結された遺伝子の転写に指向するプロモーターおよびエンハンサーは、一般に、５’またはコード領域の上流に配置される。しかし、エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントおよびコード領域の３’に配置された場合でさえも、その効果を発揮し得る。転写終止シグナルおよびポリアデニル化シグナルは、コード領域の３’下流に配置される。
【０１１７】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、短い長さの１本鎖ポリヌクレオチド鎖をいう。オリゴヌクレオチドは、代表的には１００残基長以下（例えば、１５〜５０の間）であるが、本明細書中で使用される場合、この用語はまた、より長いポリヌクレオチド鎖を包含することが意図される。オリゴヌクレオチドはしばしば、その長さによって称される。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドは、「２４マー」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズによってかまたは他のポリヌクレオチドとのハイブリダイズによって、二次構造および三次構造を形成し得る。このような構造としては、二重鎖、ヘアピン、十字形、屈曲型および三重鎖が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー」は、精製された制限酵素消化（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｄｉｇｅｓｔ）において天然に生じるか、または合成的に産生されるかのいずれかのオリゴヌクレオチドをいい、これは、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドの存在下、かつＤＮＡポリメラーゼのような試薬を含み、そして適切な温度およびｐＨ）に配置される場合に、合成の開始点として作用し得る。プライマーは、好ましくは、増幅における最大効率のために１本鎖であるか、あるいは、２本鎖であり得る。２本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、まず処理されてその鎖を分離する。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成を初回刺激する（ｐｒｉｍｅ）のに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、多くの因子に依存し、これらとしては、温度、プライマーの供給源および使用方法が挙げられる。
【０１１９】
用語「単離された」は、核酸に関して「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」のように使用される場合、その天然の環境下では通常付随する、少なくとも１つの混入した核酸から同定および分離された核酸配列をいう。単離された核酸は、天然で見出される形態とは異なる形態またはセッティングで存在するような核酸である。それに対し、単離されていない核酸は、天然において存在する状態で見出されるＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸である。例えば、所定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、近傍遺伝子に近接する宿主細胞染色体上で見出される。ＲＮＡ配列（例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列）は、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞において見出される。しかし、所定のタンパク質をコードする単離された核酸は、例として、細胞において所定のタンパク質を通常発現するような核酸を含み、この核酸は、天然の細胞の位置とは異なる染色体位置にあるか、または、そうでなければ、天然で見出される核酸配列以外の異なる核酸配列によって隣接している。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖の形態で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがタンパク質を発現させるのに使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、最低限でセンス鎖または有意鎖を有する（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは１本鎖であり得る）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含み得る（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは２本鎖であり得る）。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」は、精製された制限酵素消化によって天然に生じたか、または合成的に、組換え的に、もしくはＰＣＲ増幅によって合成され、目的の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）をいう。プローブは、１本鎖または２本鎖であり得る。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離に有用である。本発明において使用される任意のプローブは、任意の「レポーター分子」で標識され、その結果、任意の検出システム（酵素（例えば、ＥＬＩＳＡならびに酵素ベースの組織化学的アッセイ）、蛍光、放射活性および発光システムが挙げられるがこれらに限定されない）で検出され得ることが企図される。本発明は、任意の特定の検出システムまたは標識に限定されることを意図しない。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、用語「転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）」または「転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ）」とは、互いにおよびＲＮＡポリメラーゼ酵素と相互作用して転写を調節するタンパク質をいう。転写因子は、特定のＤＮＡ調節配列（例えば、エンハンサー）または他の転写因子を認識することによって遺伝子を標的化する。転写因子はしばしば、「シスエレメント」（例えば、エンハンサー）と相互作用する「トランス因子」と呼ばれる。なぜならば、これらは、代表的にはその調節部位（シス）から離れて位置する遺伝子（トランス）から産生される。いくつかの転写因子は、それ自体の別のコピー（すなわち、「ホモ二量体化ドメイン」を介して連結するホモ二量体）にか、または他の転写因子（すなわち、「ヘテロ二量体化ドメイン」を介して連結するヘテロ二量体）に結合する場合にのみ生物学的に活性である。多くの転写因子について、タンパク質の特定かつ別個の領域は、ＤＮＡ結合（すなわち、「ｔＤＮＡ結合ドメイン」）および転写の活性化（すなわち、「活性化ドメイン」）を媒介する。最も重要なレベルの遺伝子発現調節は、遺伝子からメッセンジャーＲＮＡ分子へのこの情報の移動プロセスで発揮される。このプロセスは、転写と呼ばれる。これらのタンパク質または転写因子は、その作用様式に従って４群に分類される：一般的な転写因子、アクチベーター、コアクチベーターおよびリプレッサー。転写因子に関して、無虹彩症、ルービンスタイン−テービ症候群およびホジキン病のような疾患が関連しており、そしていくらかは分子が原因であり、すなわち、転写因子の分子不全の原因である変異体が明らかにされている。用語「ＡＰ−１」とは、細胞分化応答および細胞外マトリクス産生に関する多数の遺伝子に存在する特異的なＤＮＡ配列に結合する転写因子をいう。「Ｅ２Ｆ」とは、アデノウイルスＥ２プロモーターのＥ１Ａ媒介性活性化に重大な意味を持つことが示された転写因子をいう。Ｅ２Ｆは、元々はＦ９胚性癌腫細胞の分化の間にダウンレギュレートされた転写因子として説明された、分化調節転写因子であるＤＲＴＦと同一であることが現在知られている。Ｅ２Ｆは、サイクリンＡ、ｃｄｋ２およびｐＲＢと複合体を形成し、活性化し、そしてこれらの細胞周期調節遺伝子をリン酸化して、細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）のプロセスに重大な意味を持つ。
【０１２２】
本明細書中で使用される場合、用語「転写因子に関連する疾患または障害」とは、病変した細胞または組織におけるこのような転写因子が増加したかもしくは減少したレベル、または不適切な（増強された、改変された、または減じられた、など）機能を伴う疾患または障害をいう。好ましくは、このような疾患としては、炎症性疾患（慢性関節性リウマチ、変形性関節炎など）、皮膚炎（アトピー性皮膚炎、乾癬など）、動脈瘤、動脈硬化症、血管炎、ＰＴＣＡおよびＰＴＡ後の再狭窄、癌または癌腫、喘息などが挙げられる。ダンベルデコイを用いることによって、本発明はヌクレアーゼに対する抵抗性のような先行技術にわたる有意な効果を達成し、そして、細胞または組織における長期作用を有意に改善した。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、「ＡＰ−１に関連する疾患または障害」とは、病変した細胞または組織において増殖したかもしくは減少したレベルのＡＰ−１に関連する疾患もしくは障害、または、ＡＰ−１によって活性化された遺伝子の増加した発現に関連する疾患もしくは障害をいう。好ましくは、このような疾患は、炎症および細胞増殖に関連する。より好ましくは、このような疾患または障害は、血管平滑筋細胞の増殖または新内膜の過形成であり得る。用語「Ｅ２Ｆに関する疾患または障害」とは、病変した細胞または組織において増殖したレベルのＥ２Ｆに関する疾患もしくは障害、または、Ｅ２Ｆによって活性化された遺伝子の増加した発現に関する疾患もしくは障害をいう。好ましくは、このような疾患または障害は、血管平滑筋細胞増殖または新内膜過形成であり得る。
【０１２４】
用語「生物学的に活性」とは、本明細書中で使用される場合、天然に存在する分子（例えば、転写活性、または遺伝子の特定の部位に対する結合親和性を有する分子）の構造的、調節的または生化学的機能を有するタンパク質または他の分子をいう。
【０１２５】
（ｉｉ．本発明の好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、２つのループ構造および１つのステム構造を含む環状のダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）を提供し、ここで、このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明は、上記ＣＤＯＤＮを含む薬学的組成物をさらに提供する。薬学的組成物は、このような転写因子に起因する疾患または障害を処置および／または予防するために使用され得る。本発明はまた、このような転写因子に起因する疾患または障害を処置および／または予防するための方法を提供し、この方法は、２つのループ構造および１つのステム構造を含むＣＤＯＤＮの治療有効量を被験体に投与する工程を包含する。このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明は、環状のダンベルデコイまたはデコイ組成物を提供し、それによって被験体に投与した後のデコイまたはデコイ組成物の有意に改善した安定性を提供することによって、従来のデコイまたはデコイ組成物と比較して、転写因子に関する疾患または障害を処置および／または予防するための改善された効果を達成した。
【０１２６】
本発明は、新規なＡＰ−１デコイＯＤＮの転移が、インビトロでのＶＳＭＣ増殖および、インビボでのバルーン損傷後の新内膜形成（新内膜）を防いだことを示す。これらの結果は、転写因子であるＡＰ−１が、ＶＳＭＣの増殖およびバルーン損傷後の新内膜形成において重要な役割を果たすことを示す。
【０１２７】
積み重ねた証拠が、ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化が損傷に対する応答におけるＶＳＭＣの増殖および細胞増殖の重要な事象であることを示唆する（Ｏｈａｓｈｉ  Ｎら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２０００：２０：２５２１−２５２６；Ｋｏｙａｍａ  Ｈら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９８；８２：７１３−７２１；Ｈｕ  Ｙら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．１９９７：１７：２８０８−２８１６；Ｐｙｌｅｓ  ＪＭら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９７：８１：９０４−９１０；およびＩｚｕｍｉ  Ｙら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００１：８８：１１２０−１１２６を参照のこと）。これらのＪＮＫおよびＥＲＫのようなＭＡＰキナーゼは、ＡＰ−１転写因子の発現および活性化を制御する（Ｄａｖｉｓ  ＲＪ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９３：２６８：１４５５３−１４５５６；およびＳｅｇｅｒ  Ｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９５：９：７２６−７３）。ＡＰ−１は、ＶＳＭＣの増殖応答および細胞外マトリクスの産生に関連する多数の遺伝子において存在する特異的なＤＮＡ配列に結合する（Ｋａｒｉｎ  Ｍ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：１６４８３−１６４８６；およびＷｈｉｔｍａｒｃｈ  ＡＪ，Ｄａｖｉｓ  ＲＪ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１９９６：７４：５８９−６０７を参照のこと）。これらの知見は、ＡＰ−１の活性化が新内膜形成をもたらす重要な段階であり得ることを示唆する。しかし、新内膜形成の要因におけるＡＰ−１の役割の直接的な証明は、ＡＰ−１の特異的かつ潜在的な薬理学的インヒビターが存在しないことによって妨害されている。ＡＰ−１がＶＳＭＣの増殖および新内膜形成において重要な役割を果たすという仮説を検証するために、本発明者らは、新しいＡＰ−１  ＯＤＮトランスフェクション方法を用いた。２本鎖のシスエレメントデコイＯＤＮのトランスフェクションは、同じ配列の内因性のシスエレメント由来の全てのトランス因子の除去をもたらし、その後、遺伝子発現を阻害した。従って、本発明は、まず、ＶＳＭＣの増殖および新内膜形成におけるＡＰ−１の関与を直接的に示す。本発明において、発明者らは、ＶＳＭＣの増殖および遊走を増強するための刺激物質として高血糖および血清を用いた。これらの刺激因子は、ＭＡＰＫ経路を介して多くの初期遺伝子、増殖因子および分裂促進因子を誘導する（Ｍｉａｎｏ  ＪＭら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ．１９９３：１３：２１１−２１９：Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＭＲら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４：９３：８２０−８２８；Ｂｒｉａｔａ  Ｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９：１６５：１１２３−１１２９；Ｉｎａｂａ  Ｔら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９６：４５：５０７−５１２：Ｄｉ  Ｐａｏｌｏ  Ｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９６；１４９：２０９５−２１０６；Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＳＭら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９５：７７：４４５−４６５；Ｌｉｎｄｎｅｒ  Ｖら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９１；６８：１０６−１１３を参照のこと）。本発明はまた、高血糖および血清が、細胞周期がＧ１期からＳ期への進行に必要とされる細胞周期調節遺伝子、サイクリンＡおよ��ＰＣＮＡの内因性の発現を刺激することを実証する。ＡＰ−１  ＯＤＮは、高血糖および血清によって誘導される、ＶＳＭＣの増殖、遊走ならびにサイクリンＡ遺伝子およびＰＣＮＡ遺伝子の発現を効率的に消滅させる。さらに、サイクリンＡプロモーターの連続欠損または変異構築物を用いた本発明者らのデータは、ＡＰ−１タンパク質のような転写因子の結合に重大な意味を有するＡＴＦ（活性化転写因子）部位が高血糖によるサイクリンＡ遺伝子の発現のアップレギュレーションを媒介することを示した。ルシフェラーゼレポーター構築物を有するが、ＯＤＮにはミスマッチでないＡＰ−１デコイＯＤＮのトランスフェクションはまた、高血糖および血清により誘導されるサイクリンＡのルシフェラーゼ発現を完全に消滅させる。これらの観察は、ＡＰ−１デコイを用いたトランスフェクションがＶＳＭＣの増殖および遊走を阻害したというインビトロでの結果と合わせて、ＶＳＭＣの増殖およびＶＳＭＣの遊走の抑制が、ＡＰ−１デコイによる新内膜形成の阻害に関与したことを実証した。
【０１２８】
ラット頸動脈中へとＡＰ−１デコイＯＤＮをトランスフェクトするために、本発明者らは、ＨＶＪ−リポソーム技術を使用した。このＨＶＪ−リポソーム技術は、内皮露出に供されていないインタクトな動脈の内側ＶＳＭＣ中への遺伝子移入において非常に有効な方法である。ＨＶＪ−リポソーム法によるＦＩＴＣ標識ＯＤＮのトランスフェクションは、強力な蛍光を生じた。この蛍光は、動脈の全ての層において容易に検出された。本発明はまた、ＡＰ−１  ＯＤＮが、バルーン損傷後の新生内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）形成を有効に防止することも示す。興味深いのは、デコイＯＤＮを用いる事前処置が、事後処置よりも有効であったという知見である。この知見は、損傷した動脈におけるＡＰ−１活性化の時間経過によって説明され得る。以前の研究によって、脈管壁におけるＥＲＫ活性およびＪＮＫ活性が、容易に増加し、損傷後５分でプラトーに達し、バルーン血管形成術後１時間維持されることが、報告された。極初期遺伝子であるｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓの発現は、バルーン損傷後３０分でピークに達する。本発明者らの結果はまた、ＡＰ−１活性が、バルーン損傷後３０分で留意され、そしてバルーン損傷後３時間で最大値に達することを示す。これらのデータは、バルーン損傷に応答したシグナル伝達が迅速であること、そしてブロックの時期が、バルーン損傷による引き起こされるシグナルの流れをブロックするためには重要であることを、示す。
【０１２９】
本発明において顕著であるのは、ＡＰ−１環状ダンベルデコイＯＤＮ（ＣＤＯＤＮ）が、化学的に改変されたＯＤＮよりも安定かつ有効であったことである。このＣＤＯＤＮは、開口端を有さない単一のデコイ分子においてＡＰ−１の２つの結合部位を含み、これにより、１つよりも多くのプロモーター部位の多重標的化が可能である。以前の研究において、改変されたＯＤＮ（例えば、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート）が、ヌクレアーゼに対する安定性を増強するために広範に使用された（Ｋｈａｌｅｄ  ＡＲら、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １９９８；８６：１７０〜１７９；Ｌａｒｒｏｕｙ  Ｂら、Ｇｅｎｅ  １９９２；１２１：１８９〜１９４を参照のこと）。アンチセンスとしてｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃｄｃ２およびｃｄｋ２に対するこれらの改変されたＯＤＮ、またはデコイとしてＮＦ−κＢおよびＥ２Ｆに対するこれらの改変されたＯＤＮは、実験的再狭窄において内膜肥厚を減少した（Ｓｉｍｏｓ  Ｍら、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４；９３：１４５８〜１４６４、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら、１９９３（上記）、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら、１９９４（上記）、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒら、１９９７（上記）を参照のこと）。しかし、これらの改変されたＯＤＮは、ＲＮａｓｅＨに対する非感受性、加水分解された改変されたヌクレオチドをゲノムＤＮＡへと再利用される可能性、配列特異的結合効果の欠如、および免疫活性化などの問題を示す。最近の報告（Ｃｈｕ  ＢＣＦら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２：２０：５８７３〜５８５８；およびＡｂｅ  Ｔら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９８；４２５：９１〜９６を参照のこと）に従って、ＣＤＯＤＮは、血清の存在下のＰＳＯＤＮ、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびＳ１ヌクレアーゼよりも安定であった。ＡＰ−１についての結合部位を含むＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮの配列特異性を評価するために、本発明者らは、インビトロ競合アッセイを設定した。非標識ＣＤＯＤＮおよび非標識ＰＳＯＤＮを競合因子として使用した場合、ＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮの両方が、標識プローブへのＡＰ−１の結合を完全に阻害したが、ＣＤＯＤＮの配列特異性は、ＰＳＯＤＮの効果よりも約１０倍大きかった。さらに、本発明者らは、ＶＳＭＣにおける高濃度グルコースまたは血清によって誘導される、ＡＰ−１結合活性に対するＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮの阻害効果を評価した。ＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮの両方は、ＡＰ−１結合活性を有意に減弱したが、ＣＤＯＤＮの阻害効果は、より大きかった。これらの結果は、ＣＤＯＤＮが、ＰＳＯＤＮよりも高い親和性を、ＡＰ−１結合タンパク質に対して有することを示す。これらのインビトロデータに従って、ＣＤＯＤＮは、脈管損傷後の新生内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）形成を防止する際により有効であった。ダンベルデコイＯＤＮのさらなる可能な利点は、ＤＮＡ複製の間でのゲノムＤＮＡ中への導入または加水分解された改変されたヌクレオチドの再利用の際の修復に起因する、変異能の欠如である。
【０１３０】
結論として、本発明は、ダンベルデコイＯＤＮが、以前に試みられた改変されたＯＤＮと比較して、顕著に増強された安定性を有することを示す。さらに、デコイＯＤＮによるＡＰ−１活性の阻害は、細胞の増殖および遊走をインビボで有効に減少させ、ならびにインビボでの新生内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）形成を有効に減少させた。本発明は、ＣＤＯＤＮを最低限の副作用しか伴わずに使用し、そして非常に有効なＨＶＪ−リポソーム遺伝子送達技術を使用することによって、再狭窄の処置のために可能な新規な治療ストラテジーを提供する。
【０１３１】
本発明の別の局面において、本発明は、新規なＥ２Ｆ−デコイを提供する。いくつかの研究によって、細胞周期調節遺伝子の阻害は、損傷した脈管におけるＶＳＭＣ増殖および新生内膜形成を首尾良くブロックしたことが、示された。しかし、単一の細胞周期調節遺伝子の阻害は、ＶＳＭＣ増殖および新生内膜形成を防止するには不十分である。従って、本発明者らは、転写因子Ｅ２Ｆに焦点を合わせた。Ｅ２Ｆは、Ｇ１／Ｓ細胞周期進行に関与する種々の遺伝子（ＰＣＮＡ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃｄｃ２、およびｃｄｋ２を含む）のアップレギュレートされた発現に関係する（Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ  Ａら、１９９０（上記）；Ｃｈｕ  ＢＣＦ，Ｏｒｇａｎ  Ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２；２０：５８５７〜５８５８；およびＡｂｅ  Ｔら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９８；４２５：９１〜９６を参照のこと）。本発明において、本発明者らは、Ｅ２Ｆデコイの転写が、損傷した脈管における平滑筋細胞の増殖および新生内膜肥厚を首尾良くブロックしたことを示す。このことは、以前のインビトロ研究およびインビボ研究と一致する。
【０１３２】
本発明において、本発明者らは、ヌクレアーゼに対する安定性を改善するための新規な環状ダンベルデコイを考案した。以前の研究において、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、または他の外来物質を用いるＯＤＮの改変が、ヌクレアーゼに対する安定性を増強するために使用された（Ｔａｎａｋａ  Ｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ
１９９４；２２：３０６９〜３０７４；Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ  Ａら、１９９０（上記）を参照のこと）。ヌクレアーゼに対するＯＤＮの安定性は、化学的改変によって増強されたが、これらの改変されたＯＤＮは、ＯＤＮを改変するための外来物質の使用が原因である他の異なる問題を誘導し得る。最近、ダンベル型ＯＤＮが、化学的に改変された線状ＯＤＮと比較して、ヌクレアーゼ耐性および細胞中への取り込みを増強すると、報告されている（Ｃｈｕ  ＢＣら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９２：２０：５８５７〜５８５８；Ａｂｅ  Ｔら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９８；４２５：９１〜９６を参照のこと）。従って、本発明者らは、Ｅ２Ｆ結合部位のための新規な環状ダンベルデコイＯＤＮを設計した。本発明者らのＣＤ−Ｅ２Ｆは、開放端を有さない単一のデコイ分子において、Ｅ２Ｆの２つの結合部位を含み、これにより、１つの標的プロモーター部位の多重標的化または１つより多くのプロモーター部位を標的化することが、可能である。予期されるように、このＣＤ−Ｅ２Ｆは、ヌクレアーゼおよび血清の存在下で、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも安定であった。さらに、ＣＤ−Ｅ２Ｆの配列特異性は、インビトロ競合結合アッセイによって評価した場合、ＰＳ−Ｅ２Ｆの配列特異性よりもほぼ１０倍大きかった。さらに、ＶＳＭＣにおけるグルコース誘導性Ｅ２Ｆ結合活性および血清誘導性Ｅ２Ｆ結合活性に対するＣＤ−Ｅ２Ｆの阻害効果もまた、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも大きかった。これらの結果は、ＣＤ−Ｅ２Ｆが、増強された安定性、およびＥ２Ｆ結合部位に対する優れた配列特異的阻害効果を有することを示す。
【０１３３】
従来のリポソーム方法によって送達されたＯＤＮの、乏しい細胞取り込みおよびエンドサイトーシス後のリポソーム分解が、ＯＤＮ治療についての主要な障壁であった（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒｅ  ＣＪ．、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｍ  １９８８；１７２：２８９〜２９５；Ｓｔｅｉｎ  ＣＡ，Ｃｏｈｅｎ  ＪＳ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８８；４８：２６５９〜２６６８を参照のこと）。この障壁を克服するために、本発明者らは、ＨＶＪ−リポソーム技術を使用して、Ｅ２Ｆデコイをラット頸動脈中にトランスフェクトした。この送達系において、外因性分子（例えば、プラスミドＤＮＡまたはＯＤＮ）は、リン脂質とコレステロールとを含むリポソーム中に、包まれる。その後、これらのリポソームは、ＵＶ照射したＨＶＪと融合されて、ＨＶＪ−リポソームを形成する。ＨＶＪからの融合タンパク質は、これらのリポソームと細胞膜との融合、およびその細胞中への分子の配置を促進する。本発明者らは、ＨＶＪ−リポソーム方法を使用してＦＩＴＣ標識デコイを培養ヒトＶＳＭＣ中へトランスフェクションすると、従来のトランスフェクション方法（Ａｈｎ  ＪＤら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２００１；４４：７１３〜７２０を参照のこと）よりも遺伝子移入において非常に有効であったことを報告した。これに従って、インビボでのＨＶＪ−リポソーム方法によるＦＩＴＣ標識デコイのトランスフェクションは、強力な蛍光を生じ、この蛍光は、その動脈のすべての層において容易に検出された。
【０１３４】
高血糖は、糖尿病患者における大血管合併症の発症に寄与することが示唆されているが、ＶＳＭＣに対するグルコース濃度上昇の直接的効果に対して焦点を合わせた研究は、ほとんどない（Ａｈｎ  ＪＤら、２００１（上記）；Ｎａｔａｒａｊａｎ  Ｒら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １９９９；３３：３７８〜３８４；Ｙａｓｕｎａｒｉ  Ｋら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １９９７；８１：９５３〜９６２）。本発明において、本発明者らは、ＶＳＭＣにおけるＥ２Ｆ  ＤＮＡ結合活性、ならびに細胞周期調節遺伝子、およびＶＳＭＣの増殖に対する、高濃度グルコース濃度の効果を試験した。本発明者らの研究は、［Ｅ２Ｆ］×４−ルシフェラーゼ構築物（これは、プロモーター領域中に４つのＥ２Ｆ結合部位を含む）のＥ２Ｆ  ＤＮＡ結合活性およびルシフェラーゼ活性は、ＶＳＭＣにおける高濃度グルコース濃度処理後に、有意に増加されたことを示す。これらの効果は、血清と相加的であった。本発明はまた、高濃度グルコースおよび血清が、細胞周期調節遺伝子（例えば、サイクリンＡおよびＰＣＮＡ）（これらは、Ｇ１期からＳ期への細胞周期進行のために重要である）の内因性発現を刺激する。Ｅ２Ｆデコイ（しかし、ミスマッチ配列オリゴヌクレオチド（Ｍ−Ｅ２Ｆ）ではない）のトランスフェクションは、ＶＳＭＣ増殖、ならびに高濃度グルコースおよび血清により誘導されるＰＣＮＡ遺伝子およびサイクリンＡ遺伝子の発現を効果的に減弱した。このことは、サイクリンＡのプロモーター研究の結果と一致した。さらに、サイクリンＡプロモーター連続欠失または変異構築物の使用から導かれる本発明者らのこの結果は、サイクリンＡ遺伝子発現のグルコース刺激性アップレギュレーションは、サイクリンＡプロモーターにおけるＥ２Ｆ部位によって媒介されることを実証する。Ｅ２Ｆデコイ（Ｍ−Ｅ２Ｆではない）とルシフェラーゼレポーター構築物との同時トランスフェクションはまた、高濃度グルコースにより誘導されるサイクリンＡプロモーター下のルシフェラーゼ発現を、完全に排除した。
【０１３５】
最後に、ＣＤ−Ｅ２Ｆのトランスフェクションは、バルーン損傷後の新生内膜形成を、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも有効に防止した。ＣＤ−Ｅ２Ｆで処理した脈管中のＰＣＮＡ染色について陽性である細胞はまた、ＰＳ−Ｅ２Ｆで処理した脈管または非トランスフェクション脈管においてよりもかなり少ないことが、見出された。これらの知見は、インビトロ研究の結果とまとめると、ＣＤ−Ｅ２Ｆが、ＶＳＭＣ増殖の抑制および脈管損傷後の新生内膜形成の防止において、より有効であることを示す。ＣＤ−Ｅ２Ｆのさらなる潜在的な治療利益は、変異の可能性がないことであり、一方、外来物質を用いて改変されたＯＤＮは、加水分解されたヌクレオチドがＤＮＡ複製の間に再利用されてゲノムＤＮＡ中に導入された場合に、変異する可能性を有し得る。
【０１３６】
結論として、本発明は、ＣＤ−Ｅ２Ｆが、従来の改変されたＯＤＮと比較して顕著に増加した安定性と、優れた配列特異的デコイ効果とを有することを、示す。さらに、ＣＤ−Ｅ２Ｆを使用してＥ２ＦのＤＮＡ結合活性を阻害すると、インビトロならびにインビボで、細胞周期調節遺伝子の発現および細胞増殖が有意に減少された。新規なＣＤ−Ｅ２Ｆと非常に有効なＨＶＪ−リポソーム送達技術とを使用する本発明は、ヒトにおける脈管形成術後の再狭窄を、副作用を最小限しか伴わずに防止するための新規な治療ストラテジーを提供する。
【０１３７】
従って、本発明の好ましい実施形態において、本発明は、種々のＡＰ−１関連疾患またはＥ２Ｆ関連疾患の治療または予防のための薬学的組成物を提供し、この治療および予防のための方法を提供する。この組成物は、ＡＰ−１を含み、あるいはまたはさらに、Ｅ２Ｆデコイを活性成分として含み、必要に応じて別の転写因子（例えば、ＮＦκＢ）デコイを含む。
【０１３８】
本発明の治療組成物／予防組成物が示される疾患は、ＡＰ−１関連疾患であり、そしてまたＥ２Ｆ関連疾患である。これらは、すなわち、転写調節因子であるＡＰ−１またはＥ２Ｆの制御下にある遺伝子の望ましくない活性化によって引き起こされる疾患である。このような疾患としては、炎症疾患（慢性関節リウマチ、変形性関節症など）、皮膚炎（アトピー性皮膚炎、乾癬など）、動脈瘤、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、血管炎、ＰＴＣＡおよびＰＴＡ後の再狭窄、癌または癌腫、喘息などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
ＡＰ−１は、種々の重要な遺伝子の重要な調節因子であり、これらの遺伝子は、（ｉ）組織破壊を引き起こす酵素の生成に関与する遺伝子、（ｉｉ）慢性炎症に関連するサイトカインの生成に関与する遺伝子、および（ｉｉｉ）細胞増殖に必要なタンパク質の生成に関与する遺伝子を包含する。従って、ＡＰ−１ダンベルデコイは、慢性炎症疾患を処置する際の潜在的に強力な因子であり得る。
【０１４０】
転写因子のＥ２Ｆファミリーは、細胞増殖の調節において重要な役割を果す。従って、本発明により提供される新規なＥ２Ｆデコイは、異常な細胞増殖に関連する疾患を処置する際の潜在的に強力な因子であり得る。
【０１４１】
本発明の別の実施形態において、本発明の治療組成物／予防組成物が示される疾患は、ＮＦ−κＢ関連疾患であり、この疾患は、すなわち、転写調節因子であるＮＦ−κＢの制御下にある遺伝子の望ましくない活性化により引き起こされる疾患である。そのような疾患には、虚血性疾患、炎症疾患、自己免疫疾患、癌転移および癌浸潤、ならびに悪液質が数えられ得る。この虚血性疾患としては、器官の虚血性疾患（例えば、虚血性心不全（例えば、心筋梗塞、急性心不全、慢性心不全など）、虚血性脳疾患（例えば、脳梗塞）、および虚血性肺疾患（例えば、肺梗塞）、器官移植または器官手術の予後の悪化（例えば、心臓移植、心臓手術、腎臓移植、腎臓手術、肝臓移植、肝臓手術、骨髄移植、皮膚移植、角膜移植、および肺移植の、予後の悪化）、再灌流障害、ならびにＰＴＣＡ後の再狭窄が挙げられる。上記の炎症疾患としては、とりわけ、種々の炎症疾患（例えば、腎炎、肝炎、関節炎など）、急性腎不全、慢性腎不全、および動脈硬化症が挙げられる。上記の自己免疫疾患としては、リウマチ、多発性硬化症、および橋本甲状腺炎が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本発明に従うＮＦ−κＢデコイを活性成分として含む薬学的組成物は、虚血性疾患における再灌流障害、器官移植もしくは器官手術の予後の悪化、ＰＴＣＡ後の再狭窄、癌の転移および浸潤、ならびに悪液質（例えば、癌の発症後の体重減少）を治療および予防するために非常に適切である。
【０１４２】
転写因子が関連する他の任意の疾患が、本発明のデコイによって処置または予防され得る。そのような疾患としては、Ｅ２Ｆに関連する疾患、障害、または状態（例えば、新生内膜肥厚、新形成、糸球体腎炎、新脈管形成、炎症）；ＡＰ−Ｉに関連する疾患、障害、または状態（例えば、新生内膜肥厚、心筋細胞の増殖／分化）；ＮＦκＢに関連する疾患、障害、または状態（例えば、炎症、免疫応答、移植片拒絶、虚血再灌流損傷、糸球体腎炎、炎症腸疾患）；ＳＳＲＥに関連する疾患、障害、または状態（例えば、新生内膜肥厚、バイパス移植片、新脈管形成、側副枝形成）；ＣＲＥＢに関連する疾患、障害、または状態（例えば、ｃＡＭＰ活性化事象）；ＭＥＦ−２に関連する疾患、障害、または状態（例えば、心筋氏亜傍の分化および増殖）；ＣＡｒＧボックスに関連する疾患、障害、または状態（例えば、心筋細胞の分化および増殖）；ｔａｘに関連する疾患、障害、または状態（例えば、ＨＴＬＶ関連）；ＶＰ１６に関連する疾患、障害、または状態（例えば、ＨＩＶ感染）；ＧＲＥ／ＨＲＥ  ＭＲＥに関連する疾患、障害、または状態（例えば、ステロイドホルモンプロセス）（乳房もしくは前立腺の細胞増殖））；熱ショックＲＥに関連する疾患、障害、または状態（例えば、細胞ストレス（例えば、虚血性低酸素症））；ＳＲＥに関連する疾患、障害、または状態（例えば、細胞の増殖／分化）；ＡＰ−２に関連する疾患、障害、または状態（例えば、細胞増殖）；ステロール応答エレメントに関連する疾患、障害、または状態（例えば、高コレステロール血症）；ＴＲＥ（ＴＧＦｂ応答エレメント）に関連する疾患、障害、または状態（例えば、細胞の増殖、分化、遊走、新脈管形成、内膜応答性肥厚、マトリックス生成、エレメントアポトーシス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
特に、本発明に従うデコイを活性成分として含む薬学的組成物は、虚血性疾患における再灌流障害、器官移植もしくは器官手術の予後の悪化、ＰＴＣＡ後の再狭窄、癌の転移および浸潤、ならびに悪液質（例えば、癌の発症後の体重減少）を処置および予防するために非常に適切である。
【０１４４】
本発明において使用され得るデコイは、転写因子の型に対応する染色体の結合部位と特異的に拮抗する任意の化合物であり得、このデコイとしては、核酸およびそれらのアナログが挙げられるが、これらに限定されない。上記デコイの好ましい例として、ＴＧＡＣＴＣＡ（ＡＰ−１）のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、およびＴＴＴＣＧＣＧＣ（Ｅ２Ｆ）のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド（それぞれ、配列表の配列番号１および２の５’末端から7番目〜１３番目のヌクレオチドの配列、ならびに５’末端
から８番目〜１５番目のヌクレオチドの配列）、ＧＧＧＡＴＴＴＣ（ＮＦκＢ）のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチド、それらのムテイン、ならびに上記オリゴヌクレオチド配列のうちのいずれかを含む化合物が、言及され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、そしてまた、改変されたヌクレオチドおよび／または擬性ヌクレオチドを含み得る。さらに、それらのオリゴヌクレオチド、その改変体、またはそれらのうちのいずれかを含む化合物は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、そして直鎖状であっても環状であってもよい。改変体とは、転写因子が結合する染色体結合部位と特異的に拮抗する、上記の配列のうちの何らかの部分の変異（例えば、置換、付加、および／または欠失）を含む核酸配列である。より好ましいデコイとしては、上記のヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数を各々が含む二本鎖オリゴヌクレオチド、ならびにそれらの改変体が挙げられる。本発明において使用され得るオリゴヌクレオチドとしては、生分解に対して感受性が低くなるように改変されたオリゴヌクレオチド（例えば、ホスホジエステル部分の酸素を硫黄で置き換える（Ｓ−オリゴ）際に利用可能なチオホスホジエステル結合を含むオリゴヌクレオチド、ならびにホスホジエステル部分を、電荷を保有しないメチルホスフェート基で置換する際に利用可能なオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１４５】
本発明において使用するためのデコイを生成するための技術に関して、従来の化学合成法または生化学合成法が、使用され得る。例えば、核酸がデコイとして使用されるべき場合、遺伝子操作において一般的に使用される核酸合成のための方法が、使用され得る。例えば、目的のデコイオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機において直接合成され得る。または、各々予め合成された核酸もしくはそのフラグメントが、ＰＣＲによってか、またはクローニングベクターなどを使用して、増幅され得る。さらに、望ましい核酸は、制限酵素などを用いる切断、および／またはＤＮＡリガーゼなどによる連結のような手順によって、得られ得る。細胞中でより安定であるデコイヌクレオチドを得るために、本核酸の塩基部分、糖部分、および／またはリン酸部分は、アルキル化、アシル化、さもなければ化学改変され得る。本発明に従って活性成分としてデコイを含む薬学的組成物は、その活性成分が罹患部位中の細胞または標的組織の細胞によって取り込まれ得る限り、形態を限定されない。従って、本デコイは、単独でかまたは一般的な薬学的キャリアと混合してかのいずれかで、経口投与、非経口投与、局所投与、または外部投与され得る。
【０１４６】
本薬学的組成物は、溶液、懸濁物、シロップ剤、リポソーム、ローションなどのような、液体投与形態でか、または錠剤、顆粒、散剤、およびカプセル剤などのような固体投与形態で、提供され得る。必要な場合は、薬学的組成物は、種々のビヒクル、賦形剤、安定化剤、滑沢剤、および／または他の従来の薬学的添加剤（例えば、ラクトース、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、石膏、スクロース、コーンスターチ、滑石、ゼラチン、寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油、カカオバター、エチレングリコールなど）を補充され得る。
【０１４７】
特に核酸またはその改変産物がデコイとして使用される場合、好ましい投与形態としては、遺伝子治療において一般的に使用される投与形態（例えば、リポソーム（センダイウイルスを使用する膜融合リポソーム、およびエンドサイトーシスを利用するリポソーム）、カチオン性脂質を含む調製物（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ  Ｏｒｉｅｎｔａｌ））、またはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどを使用するビロソームが、挙げられる。特に好ましいのは、膜融合リポソームである。
【０１４８】
このようなリポソーム調製物の構造は、大きな単層リポソーム（ＬＵＶ）、多層リポソーム（ＭＬＶ）、小さな単層リポソーム（ＳＵＶ）のいずれかであり得る。小胞のおよそのサイズは、ＬＵＶについて２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲、ＭＬＶについて４００ｎｍ〜３５００ｎｍの範囲、そしてＳＵＶについて２０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲であり得るが、センダイウイルスを使用する膜融合リポソーム調製物の場合、例えば、直径２００ｎｍ〜１０００ｎｍの小胞系を含むＭＬＶが、好ましくは使用される。
【０１４９】
本デコイが小胞中で首尾良く捕捉され得る限り、リポソーム生成のための技術に関して、制限は存在しない。従って、そのようなリポソームは、従来の技術（例えば、２〜３例挙げると、逆相エバポレーション法（Ｓｚｏｋａ，Ｆ．ら：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．６０１  ５５９（１９８０））、注入法（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．Ｗ．；Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３０８  ２５０（１９７８））、および界面活性剤法（Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．ら：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，ｖｏｌ．４５５  ３２２（１９７６）））によって製造され得る。
【０１５０】
リポソームを形成するために使用され得る脂質としては、リン脂質、コレステロール、およびその融合体、ならびに窒素含有脂質が挙げられるが、リン脂質が、一般的には好ましい。使用され得るリン脂質としては、天然に存在するリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルディオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、ダイズレシチン、リソレシチンなど）、従来の方法によって水素添加された対応するリン脂質、ならびに合成リン脂質（例えば、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、オレオステアロイルホスファチジルコリン、オレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、オレオステアロイルホスファチジルセリンなど）が、挙げられる。
【０１５１】
上記脂質（特に、リン脂質）は、個別にかまたは適切な組合せで、使用され得る。正に荷電した基（例えば、エタノールアミンまたはコリン）を含む脂質を使用することによって、電気的に負のデコイヌクレオチドの結合が、増強され得る。主要なリン脂質に加えて、種々の化合物（例えば、リポソーム添加剤として公知である、コレステロールおよびその誘導体、ステアリルアミン、トコフェロールなど）が、リポソームの製造において添加され得る。
【０１５２】
生じるリポソームに、膜融合プロモーター（例えば、センダイウイルス、不活化センダイウイルス、センダイウイルスから精製した膜融合促進タンパク質、ポリエチレングリコールなど）が、罹患部位または標的組織の細胞による細胞内取り込みを補助するために添加され得る。
【０１５３】
薬学的リポソームの生成のための代表的な手順が、ここに、詳細に記載される。上記のリポソーム形成物質、ならびにコレステロールなどが、有機溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、クロロホルム、エタノールなど）中に溶解される。適切な容器において、その溶媒は減圧下で蒸発されて、その容器の内壁にリポソーム形成物質のフィルムが残る。その後、本デコイを含む緩衝液が添加され、そしてその混合物が攪拌される。上記膜融合プロモーターの必要に応じて添加した後、そのリポソームは単離される。そのようにして本デコイが捕捉されたリポソームが、適切な媒体中に懸濁されるか、またはその凍結乾燥体が、治療において使用するために適切な媒体中に再分散される。上記膜融合プロモーターは、リポソームを単離した後と使用の前との間の期間に添加され得る。
【０１５４】
本デコイを活性成分として含む薬学的組成物のデコイ含有量に関して、そのデコイが転写因子関連疾患を制御するために有効な量で含まれる限り、制限はない。従って、このデコイ含有量は、制御されるべき疾患、標的部位、投与形態、および投与スケジュールに従って、自由に選択され得る。
【０１５５】
上記の様式で提供されるような本デコイを活性成分として含む薬学的組成物は、疾患の型および含まれるデコイの種類に従って、種々の方法によって投与され得る。虚血性疾患、炎症疾患、自己免疫疾患、癌の転移または浸潤、ならびに悪液質を例として採ると、本組成物は、脈管内に注入され得るか、罹患領域に直接適用され得るか、病巣中に注射され得るか、または罹患領域中の局所的血管中へと投与され得る。さらなる具体例として、ＰＴＣＡが器官梗塞の処置のために実施される場合、本薬学的組成物が、手術と同時にか、手術前および手術後に、局所的血管中に投与され得る。器官移植のために、移植片物質は、本発明の組成物で前もって処理され得る。さらに、変形性関節症またはリウマチの処置において、本組成物は、関節中に直接注射され得る。
【０１５６】
本デコイの投与量は、患者の年齢および他の要因、疾患の型、使用されるデコイの種類などを参照して選択されるが、脈管内投与、筋肉内投与、または関節内投与のためには、例えば、単位用量１０ｎｍｏｌ〜１０，０００ｎｍｏｌが、一般的には１日１回から２〜３回投与され得る。
【０１５７】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されるものではない。
【実施例】
【０１５８】
（実施例１：インビトロでの脈管平滑筋細胞の増殖およびインビボでの新生内膜形成に対する、新規なＡＰ−１デコイオリゴヌクレオチドの阻害効果）
（材料および方法）
（動物）
２８０ｇ〜３２０ｇの体重である９週齢〜１０週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈｙｏｃｈａｎｇ，Ｔａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ）を、使用した。すべての手順は、研究施設における動物研究に関する指針に従った。
【０１５９】
（細胞培養）
ヒトＶＳＭＣを、Ａｈｎら、２００１（上記）に記載される通りに採集し、ラット大動脈平滑筋細胞を、成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２５０ｇ）の胸大動脈から採集した。ＶＳＭＣを、２０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で培養した。ＶＳＭＣの純度を、平滑筋特異的α−アクチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いる陽性染色によって特徴付けた。
【０１６０】
（ＣＤＯＤＮの構築）
本発明において使用したダンベル型およびＡＰ−１結合部位から誘導したホスホロチオエート二本鎖ＯＤＮおよびミスマッチＯＤＮの配列は、以下の通りである：
ＣＤＯＤＮ（コンセンサス配列に下線を付している）、５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＡＴ−３’（配列番号３）；
ホスホロチオエート線状ＡＰ−１デコイＯＤＮ（ＰＳＯＤＮ）、５’−ＡＧＣＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号４）；ミスマッチＡＰ−１デコイＯＤＮ（ＭＯＤＮ）、５’−ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＴＴ−３’（配列番号５）。
【０１６１】
ステムの５’末端は、ＢａｍＨＩの制限部位として、６塩基の一本鎖配列５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’を有する。２つのオリゴ分子を、両方の５’末端の相補的な６塩基配列によって結合した。温度を８０℃から２５℃へと下げながら、ＯＤＮを２時間アニールさせた。１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、１６℃で２４時間インキュベートして、共有結合したダンベルデコイＯＤＮ分子（ＣＤＯＤＮ）を生成した。このＣＤＯＤＮは、２つのループと１つのステムとからなり、この１つのステムは、２つのＡＰ−１コンセンサス配列を直列に含む（図１Ａ）。
【０１６２】
（ＣＤＯＤＮの安定性）
ＣＤＯＤＮの安定性を試験するために、各々１μｇの非連結ホスホジエステルＯＤＮ、ＰＳＯＤＮ、およびＣＤＯＤＮを、ヒト血清、ウシ胎仔血清、仔ウシ胎仔血清、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、またはＳ１ヌクレアーゼとともにインキュベートした。すべての血清は、ＤＮａｓｅ活性を保存するために、熱不活化をせずに使用した。各血清を、ＯＤＮに１００μｌの反応容器中５０％まで添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。１６０単位／μｇのエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）をＯＤＮに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。１０単位／μｇ  ＯＤＮのＳ１ヌクレアーゼをＯＤＮに添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。その後、ＯＤＮをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、１５％変性ポリアクリルアミドゲル上で試験した。
【０１６３】
（ＶＳＭＣの増殖に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果）
ＶＳＭＣを、９６ウェル組織培養プレート上に播種した。３０％コンフルエンスにて、ＶＳＭＣを、規定した無血清培地中で２４時間インキュベーションすることによって、休止状態にした。その後、１００ｎｍｏｌ／ＬデコイＯＤＮを含むリポフェクチンを、これらのウェルに添加した。これらの細胞を、３７℃で５時間インキュベートした。２〜３日間後、細胞増殖の指標を、ＷＳＴ細胞計数キット（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）の使用によって決定した。
【０１６４】
（細胞遊走アッセイ）
ＶＳＭＣ遊走を、改変型Ｂｏｙｄｅｎチャンバ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して評価した。コントロール培地中に懸濁したＶＳＭＣ（２×１０５細胞／ウェル）を、上部チャンバに添加し、試験サンプルを、下部チャンバ中に配置した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、細胞を固定し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。そのフィルターの下部表面上の無作為に選択した４つの高倍率（×４００）視野からの平均細胞数を、計数した。
【０１６５】
（電気泳動移動度アッセイ（ＥＭＳＡ））
核抽出物を、Ａｈｎ  ＪＤら（上記）に記載される通りに、ＶＳＭＣから調製した。簡単に述べると、ＤＮＡプローブ（例えば、ＡＰ−１およびミスマッチデコイＯＤＮ）を、プライマーとして標識した。タンパク質−ＤＮＡ結合反応を、容量２０μｌにて室温で２０分間実施した。この反応混合物は、６μｇの核抽出物、１００μｇ／ｍｌのポリｄＩ：ｄＣ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、０．５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＤＴＴ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロールおよび６０，０００ｃｐｍの３２Ｐ標識プライマーＤＮＡを含んだ。インキュベーション後、これらのサンプルを、０．５×Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中にある４％ネイティブポリアクリルアミドゲル上にローディングし、１５０Ｖにて２時間泳動した。そのゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーによって可視化した。競合研究のために、実験条件は同一であった。但し、適切な競合ＯＤＮを、核抽出物の添加前に反応混合物に５０倍モル過剰〜１００倍モル過剰で添加した。
【０１６６】
（ルシフェラーゼアッセイ）
ＡＰ−１ルシフェラーゼ構築物ｐＡＰ１（ＰＭＡ）−ＴＡ−Ｌｕｃを、Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈから購入した。サイクリンＡプロモータールシフェラーゼ構築物を、Ｍａｓａｏ  Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により親切にも提供された（Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ  Ｍら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９７；２７２：２２２５９〜２２２６４を参照のこと）。このルシフェラーゼ発現を分析するために、その細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌの１×Ｒｅｐｏｒｔｅｒ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて溶解した。５０μｌの各溶解物を、ルシフェラーゼ活性について試験した。
【０１６７】
（ノーザンブロット分析）
ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの遺伝子発現を、ノーザンブロッティングによって測定した。ノーザンブロット分析のために、１０μｇの全ＲＮＡを、１％ホルムアルデヒド−アガロースゲルに適用し、ナイロン膜に移した。このナイロン膜を、６５℃のＥｘｐｒｅｓｓ  ＨｙｂＴＭ溶液中で、放射標識ＰＣＮＡ  ｃＤＮＡプローブまたはサイクリンＡ  ｃＤＮＡプローブ（Ｙｏｕｎｇ−Ｃｈａｅ  Ｃｈａｎｇ博士、Ｄａｎｋｏｏｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｋｏｒｅａによって寄贈された）を用いてハイブリダイズし、製造業者の指示に従って洗浄した。この膜をＸ線フィルムに露光し、そしてそのｍＲＮＡ発現を、濃度測定分析を用いて定量した。
【０１６８】
（日本赤血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの調製）
ＨＶＪ−ＡＶＥリポソームを、Ａｈｎ  ＪＤら、２００１（上記）に記載される通りに調製した。簡単に述べると、コレステロール、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、およびホスファチジルセリンを、モル比５０：１３．３：１３．３：１３．３：１０で混合した。この脂質混合物を、クロロホルム除去によって、フラスコの側面に堆積させた。乾燥した脂質を、ＯＤＮを含む２００μｌの平衡塩溶液（ＢＳＳ；１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ，５．４ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）中で水和した。リポソームを、振盪および濾過によって調製した。精製ＨＶＪ（Ｚ染色）を、使用直前に３分間のＵＶ照射によって不活化した。このリポソーム懸濁物を、総容量２ｍｌのＢＳＳ中にあるＨＶＪとともに混合した。その混合物を４℃で５分間インキュベートし、その後、穏やかに振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。遊離したＨＶＪを、ショ糖密度勾配遠心分離によって、ＨＶＪ−リポソームから除去した。そのショ糖勾配の最上層を、使用のために収集した。
【０１６９】
（バルーン損傷およびインビボ遺伝子移入）
２  Ｆｒｅｎｃｈ  Ｆｏｇａｒｔｙカテーテルを使用して、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２８０ｇ〜３２０ｇ）中に脈管損傷を誘導した。これらのラットを、ペントバルビタールで麻酔し、左総頸動脈を外科的に露出させた。外頸動脈を介して、この総頸動脈中にカテーテルを導入した。外頸動脈中に動脈切開を介してバルーンカテーテルを３回通過および膨張させることによって、この総頸動脈の脈管損傷を誘導した。損傷した部分を、一時的結紮によって一過的に分離させた。バルーン損傷後、ＣＤＯＤＮ、ＭＯＤＮ、ＦＩＴＣ標識ＰＳＯＤＮのいずれかを含むＨＶＪ−リポソームまたはＨＶＪ−リポソーム単独を２０μｌ、室温にて１０分間管腔中でインキュベートした。１０分間のインキュベーションの後、注入カニューレを取り出した。トランスフェクションの後、その総頸動脈への血流を、結紮糸の解放によって回復し、その後、その創傷を閉鎖した。有害な神経学的効果も脈管への効果も、この手順を行ったどの動物においても観察されなかった。
【０１７０】
（組織学的分析）
トランスフェクション後２週間目に、ラットを屠殺し、そして脈管を、４％パラホルムアルデヒドで灌流固定した。新生内膜のサイズを、サンプルの正体を知らない個人による形態計測によって、定量した。内膜面積および中膜面積を、デジタル処理システム（モデルＩＮＴＵＯＳ  ６×８、Ｗａｃｏｍ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＷＡ，ＵＳＡ）において測定した。ＦＩＴＣ標識ＡＰ−１デコイＯＤＮトランスフェクションの場合、脈管を、トランスフェクション後３日目に採集し、そして４％パラホルムアルデヒドで灌流固定した。切片を、蛍光顕微鏡によって試験した。免疫組織化学のために、切片を、ウサギ抗増殖細胞核抗原抗体（１：２００希釈、ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともにインキュベートし、そして標準的様式で免疫組織化学のために処理した。
【０１７１】
（統計学的分析）
結果を、平均値±標準誤差平均として表す。その後のＤｕｎｃａｎ検定を用いる分散分析を使用して、多重比較における差の有意性を決定した。Ｐ＜０．０５を、統計学的に有意であると見なした。すべての実験は、少なくとも３回実行した。
【０１７２】
（結果）
（安定性が増強したダンベル型ＡＰ−１デコイの構築）
種々のデコイＯＤＮの安定性を調査するために、本発明者らは、まず、ヌクレアーゼに対する分子の安定性を試験した。ＣＤＯＤＮは、エキソヌクレアーゼＩＩＩに対して安定であったが、ＰＳＯＤＮおよびアニールしたデコイＯＤＮの両方は、エキソヌクレアーゼＩＩＩと２時間インキュベートした後に、完全に分解された（図１Ｂ）。本発明者らはさらに、Ｓ１ヌクレアーゼを使用して、ＣＤＯＤＮの分子特徴を試験した。Ｓ１ヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子における一本鎖領域を消化する。ダンベルデコイ（７２塩基）およびＰＳＯＤＮ（３８塩基）の両方のステム領域は、Ｓ１ヌクレアーゼから保護されることが見出されたが、アニール型デコイＯＤＮのステム領域は、保護されなかった（図１Ｂ）。
【０１７３】
ＰＳＯＤＮおよびアニールしたデコイＯＤＮの両方は、非不活化ヒト血清、ウシ胎仔血清および仔ウシ胎仔血清の存在下での２４時間のインキュベーションの後、有意に加水分解された。しかし、ＣＤＯＤＮは、これらの種々の血清との２４時間のインキュベーションの後に、大部分がインタクトなままであった。このことは、ＰＳＯＤＮおよびアニール型デコイＯＤＮと比較した場合に、かなり改善された安定性を示す（図１Ｂ）。
【０１７４】
（ＡＰ−１標的部位を有するダンベルデコイＯＤＮへのＡＰ−１の特異的結合）
ＣＤＯＤＮが、配列特異的様式で、デコイとして十分に強くＡＰ−１と相互作用することを実証するために、インビトロ競合アッセイを行った。非標識化ＡＰ−１デコイＯＤＮの増加は、タンパク質によって形成された複合体に対応する遅延バンドの強度を減少させた（図２Ａ）。１０００倍モル過剰の非標識化ＰＳＯＤＮは、競合物質として、標識化プローブへのＡＰ−１結合に対してほぼ完全に競合した。ＣＤＯＤＮを、競合物質としてＰＳＯＤＮの代わりに用いた場合、１００倍モル過剰の非標識化ＣＤＯＤＮ競合物質は、標識化プローブへのＡＰ−１結合に対して完全に競合した。次いで、本発明者らは、ＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮを高濃度のグルコースおよび血清刺激条件下で細胞中にトランスフェクトして、ＣＤＯＤＮがＡＰ−１のＤＮＡ結合活性を特異的に阻害するか否かを調べた。予想通り、高濃度のグルコースでの処理により、低濃度のグルコースと比較して、ＡＰ−１結合活性が有意に増大した（図２Ｂ、ｐ＜０．００１）。同様に、血清もまた、用量依存的にＡＰ−１のＤＮＡ結合活性を増大させた（ｐ＜０．００１）。ＰＳＯＤＮおよびＣＤＯＤＮの両方のトランスフェクションは、高濃度のグルコースまたは血清によって誘導されたＡＰ−１ＤＮＡ結合活性を有意に低減した（ｐ＜０．０１）が、ＣＤＯＤＮは、ＡＰ−１結合活性のより高い阻害を示した（ｐ＜０．００１）。
【０１７５】
（平滑筋細胞における遺伝子発現に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果）
本発明者らは、プロモーター領域にＡＰ−１結合部位を含むレポーター遺伝子構築物を用いて、プロモーター活性に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を研究した。高濃度グルコースによるサイクリンＡプロモーター活性のアップレギュレーションにおけるＡＰ−１結合部位の役割を調べるために、一連の種々の長さのヒトサイクリンＡ５’フランキング配列を含むルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドを、高濃度のグルコースで処理した平滑筋細胞中にトランスフェクトした。これらのプラスミド中の２つのプラスミド（ｐＣＡ−２６６／＋２０５ｍｔおよびｐＣＡ−１３３／−２０５ｍｔ）のみが、有意に低下したルシフェラーゼ活性を示し（図３Ａ、ｐＣＡ−２６６／＋２０５またはｐＣＡ−１３３／＋２０５と比較して、ｐ＜０．００１）、そしてこれらのレポーター遺伝子構築物は、サイクリンＡプロモーター由来のＡＰ−１タンパク質を担う、ＡＴＦ部位を変異させる。これらのデータは、平滑筋細胞において、ＡＰ−１デコイＯＤＮが、高濃度のグルコースによって誘導されるサイクリンＡのプロモーター活性をダウンレギュレートし得たことを示す。
【０１７６】
次いで、本発明者らは、ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＡＰ１（ＰＭＡ）−ＴＡ−ＬｕｃおよびＡＰ−１結合部位を含むサイクリンＡプロモータールシフェラーゼ構築物（ｐＣＡ−２６６／＋２０５）の高濃度グルコースおよび血清誘導性活性に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を比較した。予想通り、ルシフェラーゼレポーターのＰＳＯＤＮおよびＣＤＯＤＮとの同時トランスフェクションは、高濃度グルコース刺激性および血清刺激性ルシフェラーゼ遺伝子発現を顕著に低減した（図３ＢおよびＣ、ｐ＜０．０１）。しかし、ＣＤＯＤＮは、ＰＳＯＤＮよりも有効であった（ＰＳＯＤＮと比較して、ｐ＜０．０１）。従って、本発明者らは、インビトロの細胞周期−調節遺伝子の内因性の発現に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を調べた。この目的のために、ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの遺伝子発現を、ノーザンブロット法によって測定した。サイクリンＡおよびＰＣＮＡの両方は、Ｇ１期からＳ期への細胞周期進行に必要である。図３Ｄに示すように、ヒトＶＳＭＣおよびラット大動脈平滑筋細胞の両方において、高濃度グルコースおよび血清の両方が、ＰＣＮＡおよびサイクリンＡ  ｍＲＮＡの発現を刺激した。ミスマッチのＯＤＮではなく、ＡＰ−１デコイＯＤＮのトランスフェクションにより、これらの遺伝子の高濃度グルコースおよび血清誘導性の発現の低減が引き起こされた。さらに、このような刺激条件において、これらの遺伝子発現に対するＣＤＯＤＮの阻害効果は、ＰＳＯＤＮよりも強かった。
【０１７７】
（インビトロにおける平滑筋細胞の増殖および遊走の阻害に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果）
高濃度グルコースおよび血清刺激性の初代培養ヒトＶＳＭＣおよびラットＶＳＭＣの増殖を、コントロールと比較した（図４Ａおよび４Ｂ）。ＡＰ−１デコイＯＤＮのトランスフェクションにより、高濃度グルコースまたは血清によって刺激される細胞と比較して、細胞増殖の有意な阻害が引き起こされた（ｐ＜０．０５）。注目すべきは、ＣＤＯＤＮが、細胞増殖をほぼ完全に阻害することである（ｐ＜０．０１）。同様に、ＶＳＭＣの遊走は、高濃度グルコースおよび高濃度血清の両方によって、コントロールと比較して増大し（図４Ｃおよび４Ｄ、ｐ＜０．０５）、そして、この高濃度グルコースおよび高濃度血清の両方によって刺激された遊走は、ＡＰ−１デコイＯＤＮでの処理によって有意に低減され（ｐ＜０．０１）、一方、ＣＤＯＤＮは、遊走に対して最も強力な阻害効果を示した（ｐ＜０．００１）。
【０１７８】
（ラットバルーン損傷頸動脈における新内膜形成に対するＣＤＯＤＮの効果）
本発明者らは、蛍光（ＦＩＴＣ）−標識化ＡＰ−１デコイＯＤＮを用いたＨＶＪ−リポソーム法のラット頸動脈中へのトランスフェクション効率を試験した。ＨＶＪ−リポソーム法によるＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮのトランスフェクションにより、強い蛍光を生じ（図５ＡおよびＢ）、動脈の全層において容易に検出された。従って、本発明者らは、ラット頸動脈中にＡＰ−１デコイＯＤＮをトランスフェクトするために、ＨＶＪ−リポソーム法を選択した。
【０１７９】
ＨＶＪ−リポソーム法を用いて、ラット頚動脈バルーン損傷モデルにおける新内膜形成に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を検査した。図５に示すように、ミスマッチのＯＤＮとトランスフェクトした脈管は、未処理の脈管と同様に、トランスフェクションの２週間後に新内膜形成を示した。対照的に、ＰＳＯＤＮおよびＣＤＯＤＮの単回投与は、新内膜形成の有意な低下を引き起こした（ｐ＜０．００１）。インビトロのデータと一致して、新内膜形成に対するＣＤＯＤＮの阻害効果は、ＰＳＯＤＮよりも強力であった（ｐ＜０．０００１）。
【０１８０】
次いで、本発明者らは、損傷頚動脈における新内膜形成の阻害に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの前処理および後処理の効果を比較した。図６に示すように、バルーン損傷前のラット頸動脈中へのＡＰ−１デコイＯＤＮでの前処理は、新内膜形成の阻害において、後処理よりも有効であった（バルーン損傷脈管と比較して、ｐ＜０．０００１、ＣＤＯＤＮの後処理と比較して、ｐ＜０．０１）
（インビボにおけるＡＰ−１  ＤＮＡ結合活性および遺伝子発現に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果）
ＡＰ−１デコイＯＤＮが、インビボにおけるＡＰ−１  ＤＮＡ結合活性を効果的にブロックしたことを確認するために、本発明者らは、損傷動脈由来の細胞を用いて、ゲル移動性シフトアッセイを行った。図７Ａに示すように、ＡＰ−１  ＤＮＡ結合活性は、損傷後３０分で増大し、損傷後３時間で最大になった。この活性化は、ＣＤＯＤＮでの処理によって阻害された。デコイＯＤＮでの前処理は、後処理よりもより効果的にＡＰ−１活性を低減させた。
【０１８１】
細胞増殖に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの阻害効果は、ＰＣＮＡ染色（正常な状態および疾患状態の両方における増殖マーカーとして広く用いられる）によって確認された。図７Ｂに示すように、非損傷動脈におけるＰＣＮＡ染色はなかった。損傷の２週間後、ＰＣＮＡ染色陽性の細胞における顕著な増大が、新内膜領域および再増殖した内皮細胞中に検出された。対照的に、ＡＰ−１デコイＯＤＮで処理された脈管において、ＰＣＮＡ染色陽性の細胞はさらに少なかった。
【０１８２】
（実施例２：新規Ｅ２Ｆデコイオリゴデオキシヌクレオチドの効果）
（材料および方法）
（動物）
体重２８０〜３２０ｇの９〜１０週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを用いた。全ての手順は、研究施設における動物研究に関する指針に従った。
【０１８３】
（細胞培養）
ヒトＶＳＭＣを、心臓移植ドナーの胸大動脈から単離した。この組織の収集は、機関の倫理委員会によって承認された。ラットＶＳＭＣを、成体雄性ＳＤラットの胸大動脈から回収した。ＶＳＭＣを、２０％  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で培養した。ＶＳＭＣの純度を、平滑筋特異的なα−アクチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ，ＵＳＡ）を用いるポジティブ染色によって特徴付けた。
【０１８４】
１００ｍｍディッシュ中で８０〜９０％のコンフルエンスに達した後、ヒトＶＳＭＣを、無血清培地中で２４時間血清飢餓させ、そしてコントロール正常グルコース培地（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコースを含むＤＭＥＭ）または馴化培地（１０％血清および２２ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコースを含むＤＭＥＭ）のいずれかに供した。次いで、細胞を、以下に記載されるような核タンパク質抽出またはＲＮＡ抽出で処理した。
【０１８５】
（ダンベル型デコイＯＤＮの構築）
本発明において使用される、Ｅ２Ｆ結合部位に対するダンベル型およびホスホロチオエート二重鎖ＯＤＮならびに変異型ＯＤＮの配列は、以下の通りである：ＣＤ−Ｅ２Ｆ（注記；コンセンサス配列に下線を付す）、５’−ＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＧＣＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＧＡＡＡＣ−３’（配列番号６）；ホスホロチオエートＥ２Ｆデコイ（ＰＳ−Ｅ２Ｆ）、５’−ＡＴｓＴＴＡＡＧＴＴＴＣＧＣＧＣＣＣＴＴＴＣＴＣＡｓＡｓ−３’（配列番号７）；変異型Ｅ２Ｆデコイ（Ｍ−Ｅ２Ｆ）、５’−ＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＣＧＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＣＧＡＡＡＣ−３’（配列番号８）。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、ステムループ構造を形成すると予測された。ステムは、各オリゴの両端の相補的な配列によって形成される。ステムの５’末端は、ＢａｍＨＩの酵素部位として６塩基の一本鎖配列５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’を有する。２つのオリゴ分子を、両方の５’末端の相補的な６塩基の配列によって連結した。温度を８０℃から２５℃に低下させながら、ＯＤＮを２時間アニーリングさせた。１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、そして１６℃で２４時間インキュベートして、共有結合したダンベル型デコイ分子を生成した。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、２つのループおよび２つのＥ２Ｆコンセンサス配列を含む１つのステムからなる（図８Ａ）。
【０１８６】
（ＣＤ−Ｅ２Ｆの安定性）
ＣＤ−Ｅ２Ｆの安定性を試験するために、各々１μｇのＰＳ−Ｅ２Ｆ、非連結ホスホジエステルオリゴおよびＣＤ−Ｅ２Ｆを、ヒト血清、ＦＢＳ、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＳ１ヌクレアーゼのいずれかと共にインキュベートした。ＤＮａｓｅ活性を維持するために、全ての血清を熱不活化せずに使用した。各血清を１００μｌの反応容積中５０％までオリゴに添加し、そして３７℃で２４時間インキュベートした。オリゴ１μｇ当たり１６０単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）をオリゴに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。オリゴ１μｇ当たり１０単位のＳ１ヌクレアーゼ（Ｔａｋａｒａ）をオリゴに添加し、そして２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、これらのオリゴをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、そして１５％変性ポリアクリルアミドゲルで試験した。
【０１８７】
（インビトロ遺伝子移入）
細胞に、新鮮な培養培地を供給し、その一日後に、デコイを添加し、そして各試験の前にＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で２回洗浄した。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ（モル比；ＤＮＡ：脂質＝１：３）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と合わせて、１００ｎＭのデコイＯＤＮでトランスフェクションした。デコイＯＤＮ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの混合物を、製造業者の指示に従って細胞に滴下した。これらの細胞を３７℃で５時間インキュベートした。次いで、新鮮な培地を１０％  ＦＢＳに交換した後、これらの細胞をＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。
【０１８８】
（ＶＳＭＣ増殖に対するデコイＯＤＮの効果）
ＶＳＭＣを、９６ウェルの組織培養プレートに播種した。３０％コンフルエンスで、ＶＳＭＣを、規定された無血清培地中で２４時間インキュベートすることによって静止状態にした。次いで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ：デコイＯＤＮ（１００ｎＭのＯＤＮを含む）をウェルに添加した。これらの細胞を３７℃で５時間インキュベートした。２〜３日後、細胞増殖の指標を、ＷＳＴ細胞計数キット（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して決定した。
【０１８９】
（電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ））
核抽出物を、Ａｈｎ  ＪＤら、２００１（前出）に記載されるようにＶＳＭＣから調製した。簡潔には、Ｅ２Ｆおよび変異型ＯＤＮに対するプローブのようなＤＮＡプローブを、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、プライマーとして標識した。末端標識後、３２Ｐ標識したＯＤＮをＮＡＰ−５カラムを用いて精製した。タンパク質−ＤＮＡ結合反応を、２０μｌの容量で室温にて２０分間実施した。この反応混合物は、６μｇの核抽出物、１００μｇ／ｍｌのポリｄＩ：ｄＣ、１０ｍｍｏｌ／ｌ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、０．５ｍｍｏｌ／ｌ
ＥＤＴＡ、０．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＤＴＴ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロールおよび６０，０００ｃｐｍ  ３２Ｐ標識プライマーＤＮＡを含んだ。インキュベーション後、サンプルを、０．５×Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中で４％非変性ポリアクリルアミドゲルに充填し、そして１５０Ｖで２時間泳動した。ゲルを乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーによって可視化した。競合実験について、実験条件は、適切な競合ＯＤＮを、反応混合物に対して５０倍〜１００倍モル過剰で添加し、その後各抽出物を添加したこと以外、同一であった。
【０１９０】
（ノーザンブロット分析）
ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの遺伝子発現を、ノーザンブロットによって測定した。１０μｇの総ＲＮＡを、１％ホルムアルデヒド−アガロースゲルにアプライし、そしてナイロンメンブレンに移した。このナイロンメンブレンをＥｘｐｒｅｓｓ  ＨｙｂＴＭ溶液中で６５℃で２時間、放射性標識したＰＣＮＡ  ｃＤＮＡプローブまたはサイクリンＡ  ｃＤＮＡプローブ（Ｄｒ  Ｙｏｕｎｇ−Ｃｈａｅ  Ｃｈａｎｇ，Ｄａｎｋｏｏｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｋｏｒｅａにより贈与）とハイブリダイズさせ、そして製造業者の指示に従って洗浄した。このメンブレンを、２４〜４８時間Ｘ線に曝露し、そしてｍＲＮＡ発現を、濃度測定分析によって定量した。充填の差異を、１８ｓ  ｒＲＮＡ  ｃＤＮＡプローブを用いて正規化した。
【０１９１】
（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの調製）
ＨＶＪ−リポソームを、Ａｈｎ  ＪＤら、２００１（前出）に記載されるように調製した。簡潔には、コレステロール、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンおよびホスファチジルセリンを、５０：１３．３：１３．３：１３．３：１０のモル比で混合した。この脂質混合物を、クロロホルムの除去によってフラスコ側面に堆積させた。乾燥脂質を、ＯＤＮを含む、２００μｌの平衡塩溶液（ＢＳＳ；１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）中に水和した。リポソームを、攪拌および濾過によって調整した。精製ＨＶＪ（Ｚ株）を、使用直前に３分間のＵＶ照射によって不活化した。リポソーム懸濁物を、総容量２ｍｌのＢＳＳ中でＨＶＪと混合した。この混合物を４℃で５分間インキュベートし、次いで、３７℃で３０分間穏やかに攪拌した。遊離のＨＶＪを、スクロース密度勾配遠心分離によってＨＶＪリポソームから除去した。スクロース勾配の上層を、使用するために収集した。
【０１９２】
（バルーン損傷およびインビボの遺伝子移入）
２つのＦｒｅｎｃｈ  Ｆｏｇａｒｔｙカテーテルを使用して、雄性ＳＤラットの血管損傷を誘導した。これらのラットを、ペントバルビタールで麻酔し、そして左総頚動脈を外科的に露出させた。カニューレを、外部総頚動脈を介して総頚動脈中に導入した。インビボの遺伝子移入を、挿入したバルーンカテーテルを３回膨脹させることによって、総頚動脈の血管損傷を誘導した後に、実施した。損傷したセグメントを、一時的結紮によって一過的に隔離した。バルーン損傷後、ＣＤＥ２Ｆ、Ｍ−Ｅ２Ｆ、ＦＩＴＣ−標識化ＰＳ−Ｅ２ＦまたはＨＶＪ−リポソームのみのいずれかを含む、２０μｌのＨＶＪ−リポソーム複合体を、室温にて管腔内で１０分間インキュベートした。１０分間のインキュベーション後、注入カニューレを除去した。トランスフェクション後、総頚動脈への血流を、結紮の解放によって回復させ、次いで、創傷を閉じた。有害な神経学的効果も血管の効果も、この手順を受けた全ての動物で観察されなかった。
【０１９３】
（ルシフェラーゼアッセイ）
Ｅ２Ｆルシフェラーゼ構築物は、Ｄｒ．Ｙｏｕｎｇｃｈａｅ  Ｊａｎｇ（Ｄａｎｋｏｏｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｕｎａｎ，Ｋｏｒｅａ）の厚意により提供された。ルシフェラーゼ発現を分析するために、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして２００μｌの１×Ｒｅｐｏｒｔｅｒ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）で溶解させた。５０μｌの各溶解物を、ルシフェラーゼ活性について試験した。
【０１９４】
（組織学的分析）
トランスフェクションの２週間後、ラットを屠殺し、そして血管を４％パラホルムアルデヒドで灌流固定した。新内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）サイズを、サンプルの正体について盲目の個体による形態測定によって定量した。内部領域および中間領域を、デジタル化システム（モデルＩＮＴＵＯＳ  ６ｘ８，Ｗａｃｏｍ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＷＡ，ＵＳＡ）で測定した。ＦＩＴＣ標識Ｅ２ＦデコイＯＤＮトランスフェクションの場合、血管を、トランスフェクション後の３日目に回収し、そして４％パラホルムアルデヒドで灌流固定した。切片を、蛍光顕微鏡によって試験した。免疫組織化学について、切片を、ウサギ抗増殖細胞核抗原抗体（１：２００希釈、ＳａｎｔａＣｒｕｚ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共にインキュベートし、そして標準的な様式で免疫組織化学のために処理した。
【０１９５】
（統計的分析）
結果を、平均値±ＳＥＭとして示す。引き続くＤｕｎｃａｎ試験を用いた分散の分析を使用して、複数の比較における差異の有意差を決定した。Ｐ＜０．０５を、統計的に有意とみなした。全ての実験を少なくとも３回実施した。
【０１９６】
（結果）
（ＣＤ−Ｅ２Ｆの安定性）
新たに合成したＣＤ−Ｅ２Ｆの安定性を調査するために、本発明者らは、ヌクレアーゼの存在下での分子の安定性を最初に試験した（図８Ｂ）。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、予測どおり、エキソヌクレアーゼＩＩＩに耐性であり、そしてゲル電気泳動において主要なバンドとして観察された。ＣＤ−Ｅ２Ｆと対照的に、ＰＳ−Ｅ２Ｆおよびアニールしたデコイの両方が、エキソヌクレアーゼＩＩＩとの２時間のインキュベーション後に、完全に分解された。ＣＤ−Ｅ２Ｆのステムループ構造を確認するために、本発明者らは、Ｓ１ヌクレアーゼを使用して、ＣＤ−Ｅ２Ｆの分子特徴をさらに試験した。デコイを、ＤＮＡ分子中の一本鎖領域を消化するＳ１ヌクレアーゼと共にインキュベートした。ＣＤ−Ｅ２Ｆ（７４塩基）およびＰＳ−Ｅ２Ｆ（５０塩基）の両方のステム領域は、Ｓ１ヌクレアーゼから保護されるが、アニールした型のデコイのステム領域は保護されないことが見出された（図８Ｂ）。
【０１９７】
エキソヌクレアーゼ活性は、細胞質および血清におけるヌクレアーゼ活性のほとんどを構成することが報告されている。従って、本発明者らは、熱不活化していない血清とのインキュベーションによって、デコイの安定性を試験した。デコイを、５０％の非不活化ヒト血清、ＦＢＳまたはウシ血清で２４時間処理した。ＰＳ−Ｅ２Ｆおよびアニールした型のデコイの両方が、各血清の存在下での２４時間のインキュベーション後に、有意に加水分解された。しかし、ＣＤ−Ｅ２Ｆは、これらの異なる血清との２４時間のインキュベーション後にほぼインタクトなままであり、ＰＳ−Ｅ２Ｆおよびアニールした型のデコイの両方と比較して、改善された安定性を示した（図８Ｂ）。
【０１９８】
（Ｅ２Ｆの、Ｅ２Ｆ標的部位を有するＣＤ−Ｅ２Ｆに対する特異的結合）
ＣＤ−Ｅ２Ｆの配列特異性を試験するために、インビトロ競合アッセイを実施した。非標識Ｅ２Ｆデコイの増大は、Ｅ２Ｆタンパク質によって形成される複合体に対応する、遅延したバンドの強度を減少させた（図９Ａ）。競合物としての非標識ＰＳ−Ｅ２Ｆの１０００倍モル過剰は、Ｅ２Ｆ結合において、標識プローブに対して完全に競合した。他方で、ＣＤ−Ｅ２ＦをＰＳ−Ｅ２Ｆの代わりに競合物として使用した場合、１００倍モル過剰の非標識ＣＤ−Ｅ２Ｆ競合物のみが、標識プローブに対するＥ２Ｆ結合について完全に競合するのに必要であった。次に、本発明者らは、デコイがＥ２ＦのＤＮＡ結合活性を特異的に阻害し得るか否かを調べるために、細胞にデコイをトランスフェクトした。予測されるように、高濃度のグルコースおよび血清を含む馴化培地における培養は、コントロール培地中での培養と比較して、Ｅ２Ｆ結合活性が有意に増大していた（図９Ｂ、ｐ＜０．０１）。ＰＳ−Ｅ２ＦおよびＣＤ−Ｅ２Ｆのトランスフェクションは、高濃度のグルコースおよび血清によって誘導されるＥ２Ｆ  ＤＮＡ結合活性を有意に減弱させた（ｐ＜０．０１）。しかし、高濃度のグルコースおよび血清によって誘導されるＥ２Ｆ  ＤＮＡ結合活性の増大は、ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較して、ＣＤ−Ｅ２Ｆによって強力に阻害された（ｐ＜０．０５）。
【０１９９】
（平滑筋細胞におけるサイクリンプロモーター活性に対するＥ２Ｆデコイの効果）
本発明者らは、プロモーター活性に対するＥ２Ｆデコイの効果を調査するために、レポーター遺伝子構築物を使用した。この構築物は、プロモーター領域中にＥ２Ｆ結合部位を含む。高濃度のグルコースによるサイクリンＡプロモーター活性のアップレギュレーションに対するＥ２Ｆ結合部位の役割を調査するために、本発明者らは、種々の長さのヒトサイクリンＡの５’隣接配列を含む、一連のルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドを、高濃度のグルコースで処理した平滑筋細胞中にトランスフェクトした。これらのプラスミド中で、２つのプラスミド（ｐＣＡ−１３３／＋２０５およびｐＣＡ−１３３／−２）だけが、有意に減少したルシフェラーゼ活性を示し（図１０Ａ）、そしてｐＣＡ−１３３／−２構築物（本発明者らが、サイクリンＡプロモーターから２つのＥ２Ｆ結合部位を欠失させた）の活性は、最低だった。これらのデータは、Ｅ２Ｆ部位が、ＶＳＭＣにおける高濃度のグルコースによるサイクリンＡプロモーター活性のアップレギュレーションを媒介することを示す。次に、本発明者らは、レポーター遺伝子プラスミドｐＣＡ−２６６／＋２０５および［Ｅ２Ｆ］Ｘ４−Ｌｕｃ（これは、プロモーター領域中に４つのＥ２Ｆ結合部位を含む）のプロモーター活性に対するＥ２Ｆデコイの阻害効果を調査した。予想されるように、Ｅ２Ｆデコイの共トランスフェクションは、高濃度のグルコースおよび血清によってアップレギュレートされたルシフェラーゼ遺伝子発現を顕著に減弱させた（図１０ＢおよびＣ、ｐ＜０．０１）。また、ＣＤ−Ｅ２Ｆは、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも有効であり（ｐ＜０．０５）そしてＭ−Ｅ２Ｆは、ルシフェラーゼ活性の増大を無効にした。
【０２００】
（ＶＳＭＣにおける細胞周期調節遺伝子の発現に対するＥ２Ｆデコイの効果）
本発明者らは、内因性の細胞周期調節遺伝子の発現に対するＥ２Ｆデコイの効果を評価した。図１１に示されるように、高濃度のグルコースおよび血清は、ヒトＶＳＭＣおよびラットＡＳＭＣの両方において、サイクリンＡ遺伝子およびＰＣＮＡ遺伝子の発現を刺激した（ｐ＜０．０１）。Ｍ−Ｅ２ＦではなくＥ２Ｆデコイのトランスフェクションは、ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの遺伝子発現の減弱を生じた（ｐ＜０．０１）。１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現は、Ｅ２Ｆデコイのトランスフェクションによって影響されなかった。これらの遺伝子の発現に対するＣＤ−Ｅ２Ｆの阻害効果は、これらの刺激条件下で、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも強力であった（ｐ＜０．０５）。
【０２０１】
（インビトロのＶＳＭＣ増殖の阻害に対するＥ２Ｆデコイの効果）
バルーン損傷に対する血管の共通の特徴は、ＶＳＭＣの増殖であるので、Ｅ２Ｆデコイを、平滑筋細胞の増殖を阻害するその能力について試験した。高濃度のグルコースおよび血清での処理は、ＷＳＴ細胞計数キットによって評価されるように、コントロールと比較して、培養初代ヒトＶＳＭＣおよびラットＶＳＭＣの増殖を刺激した（図１２ＡおよびＢ）。Ｅ２Ｆデコイのトランスフェクションは、高濃度のグルコースまたは血清で刺激された細胞と比較して、細胞増殖の有意な阻害を生じた（ｐ＜０．０１）。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、ほぼ完全に細胞増殖を阻害した（ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５）。
【０２０２】
（バルーン損傷したラット頚動脈に対するＣＤ−Ｅ２Ｆの効果）
本発明者らは、ＨＶＪ−リポソーム法を使用して、ラット頚動脈へのＥ２Ｆデコイのトランスフェクションの効率を試験した。ＨＶＪ−リポソーム法を使用する、ＦＩＴＣ標識Ｅ２Ｆデコイのトランスフェクションは、動脈の全ての層において容易に検出される強い蛍光を生じた（図１３Ｂ）。従って、本発明者らは、実験の残りについて、ラット頚動脈へＥ２Ｆデコイをトランスフェクションするために、ＨＶＪ−リポソーム法を使用した。
【０２０３】
本発明者らは、ラット頚動脈バルーン損傷モデルにおいてＥ２Ｆデコイを使用して、インビボ抗原ストラテジーの効果を試験した。図１３に示されるように、Ｍ−Ｅ２Ｆでトランスフェクトした血管は、トランスフェクション後２週間目で、未処理の血管と類似の新内膜形成を示した。対照的に、ＰＳ−Ｅ２ＦおよびＣＤ−Ｅ２Ｆの単一の投与は、新内膜形成の有意な減少を生じた（ｐ＜０．００１）。インビトロのデータと一致して、新内膜形成に対するＣＤ−Ｅ２Ｆの阻害効果は、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも強力であった（ｐ＜０．０５）。デコイ処理は、中間領域を変更しなかった。新内膜形成における減少は、トランスフェクトされた領域に限定された。
【０２０４】
ＰＣＮＡの遺伝子は、Ｅ２Ｆ依存性であることが示され、そして元々、その出現が細胞の増殖状態と相関する核タンパク質として定義された。従って、本発明者らは、ＰＣＮＡ発現に対するバルーン損傷の効果と、Ｅ２Ｆデコイでの処理がＰＣＮＡ発現を阻害するかどうかとを試験した。図１４に示されるように、非損傷のコントロール動脈においては、ＰＣＮＡ染色は存在しなかった。損傷の２週間後、新内膜領域のＰＣＮＡポジティブ細胞および再増殖する内皮細胞の顕著な増大が存在した。対照的に、Ｅ２Ｆデコイ処理した血管のＰＣＮＡポジティブ細胞の数は、未処理の血管よりもかなり低かった。
【０２０５】
（実施例３：新規ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドの効果）
（ダンベル型デコイＯＤＮの構築）
本発明において使用された、ＮＦκＢ結合部位に対するダンベル型およびホスホロチオエート二本鎖ＯＤＮの配列ならびに変異型ＯＤＮは、以下の通りである：ＣＤ−ＮＦ（注記：コンセンサス配列に下線を付す）、５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＧＡＡＡＣ−３’（配列番号１５）；ホスホロチオエートＮＦκＢデコイ（ＰＳ−ＮＦ）、５’−ＡＴｓＴＴＡＡＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＡｓＡｓ−３’（配列番号１６）：変異型Ｅ２Ｆデコイ（Ｍ−ＮＦ）、５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＡＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＣＧＡＡＡＣ−３’（配列番号１７）。ＣＤ−ＮＦは、ステムループ構造を形成することが予測された。ステムは、各オリゴの両端における相補的配列によって形成される。ステムの５’末端は、ＢａｍＨＩの酵素部位として６塩基の一本鎖配列５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’を有する。２つのオリゴ分子を、両方の５’末端で、相補的な６塩基の配列によって連結した。温度を８０℃から２５℃に低下させながら、ＯＤＮを２時間アニーリングさせた。１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、そして１６℃で２４時間インキュベートして、共有結合したダンベル型デコイ分子を生成した。ＣＤ−ＮＦは、２つのループおよび２つのＮＦκＢコンセンサス配列を含む１つのステムからなる。
【０２０６】
（ＮＦ−κＢデコイ（デコイオリゴヌクレオチド）の合成）
ＤＮＡ合成機で、ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドおよびスクランブルデコイオリゴヌクレオチド（ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドと同じ塩基組成であるがランダム化された配列を有するオリゴヌクレオチド）（これらのヌクレオチド配列は、以下に示される）を、それぞれ、Ｓ−オリゴヌクレオチドから合成した。これらのヌクレオチドを８０℃で３０分間加熱し、次いで２時間かけて室温まで冷却させて、二本鎖ＤＮＡを提供した。
【０２０７】
ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチド
ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ（配列番号９）
ＧＧＡＡＣＴＴＣＣＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧ（配列番号１８）
スクランブルデコイオリゴヌクレオチド
ＴＴＧＣＣＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＴＡＧＣＣ（配列番号１９）
ＡＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＴＣＧＧ（配列番号２０）。
【０２０８】
（ＣＤ−ＮＦの安定性）
ＣＤ−ＮＦの安定性を試験するために、各々１μｇのＰＳ−ＮＦ、非連結ホスホジエステルオリゴおよびＣＤ−ＮＦを、ヒト血清、ＦＢＳ、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＳ１ヌクレアーゼのいずれかと共にインキュベートした。ＤＮａｓｅ活性を維持するために、全ての血清を熱不活化せずに使用した。各血清を１００μｌの反応容積中５０％までオリゴに添加し、そして３７℃で２４時間インキュベートした。オリゴ１μｇ当たり１６０単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）をオリゴに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。オリゴ１μｇ当たり１０単位のＳ１ヌクレアーゼ（Ｔａｋａｒａ）をオリゴに添加し、そして２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、これらのオリゴをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、そして１５％変性ポリアクリルアミドゲルで試験した。
【０２０９】
（インビトロ遺伝子移入）
細胞に、新鮮な培養培地を供給し、その一日後に、デコイを添加し、そして各実験の前にＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で２回洗浄した。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ（モル比；ＤＮＡ：脂質＝１：３）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と合わせて、５μＭのデコイＯＤＮでトランスフェクションした。デコイＯＤＮ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの混合物を、製造業者の指示に従って細胞に滴下した。これらの細胞を３７℃で５時間インキュベートした。次いで、１０％  ＦＢＳを含む新鮮な培地に交換した後、これらの細胞をＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。
【０２１０】
（ＣＤ−ＮＦのセンダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの調製）
ＨＶＪ−リポソームを、Ａｈｎ  ＪＤら、２００１（前出）に記載されるように調製した。簡潔には、コレステロール、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンおよびホスファチジルセリンを、５０：１３．３：１３．３：１３．３：１０のモル比で混合した。この脂質混合物を、クロロホルムの除去によってフラスコの側面に堆積させた。乾燥脂質を、ＯＤＮを含む、２００μｌの平衡塩溶液（ＢＳＳ；１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）中に水和した。リポソームを、攪拌および濾過によって調整した。精製ＨＶＪ（Ｚ株）を、使用直前に３分間のＵＶ照射によって不活化した。リポソーム懸濁物を、総容量２ｍｌのＢＳＳ中でＨＶＪと混合した。この混合物を４℃で５分間インキュベートし、次いで、３７℃で３０分間穏やかに攪拌した。遊離のＨＶＪを、スクロース密度勾配遠心分離によってＨＶＪリポソームから除去した。スクロース勾配の上層を、使用するために収集した。
【０２１１】
（正常なＮＦ−κＢデコイのリポソーム調製物の生成）
１：４．８：２の重量比（合計１０ｍｇ）で提供されたホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを、テトラヒドロフラン中に溶解させた。ロータリーエバポレータを使用して、テトラヒドロフランを脂質溶液から除去して、この脂質をフラスコ壁に接着したフィルムの形態にした。これに、実施例１において調製したＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチド（０．７ｍｇ）を含む約２００ｍｌの生理食塩水（ＢＳＳ；１３９ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）を添加し、そしてこの混合物を通常の条件下で攪拌し、超音波処理して、ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドを含むリポソーム懸濁物を提供した。このリポソーム小胞の懸濁物（０．５ｍｌ、脂質含量１０ｍｇ）を、使用の３分前に、ＵＶ照射（１１０ｅｒｇ／ｍｍ２／秒）に曝露した精製センダイウイルス（Ｚ株１００００血球凝集単位）と混合し、そしてこの混合物を、ＢＳＳで４ｍｌにした。この混合物を４℃で５分間維持し、次いで、３７℃で３０分間の穏やかな攪拌に供した。リポソームに結合しなかったセンダイウイルスをスクロース密度勾配遠心によって除去した後、最上層を分離し、そしてその濃度をＢＳＳで調節して、捕捉された場合に８μＭのＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドを含むリポソーム調製物を提供した。リポソーム調製物を、ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドの代わりに、実施例１のスクランブルデコイオリゴヌクレオチドを使用して同様に生成した。
【０２１２】
（再灌流モデル実験）
（（１）方法）
９〜１０週齢のＳＤラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔した後、カニューレを、気道に隣接する左頚動脈中に挿入し、そして心臓の大動脈弁の近傍（冠状動脈の口の近く）に留置した。さらに、気管にカニューレ挿入し、そして動物を、気管カニューレを人工呼吸器に接続することによって、支持的呼吸においた。その後、左肋間切開を行い、ラット心臓の左下行前動脈を結紮して、虚血状態を生じた。３０分後、結紮縫合を切断して、再灌流を開始した。その直後、１．５ｍｌ／ラットの、上記のように調製した、リポソームに捕捉されたＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦ、Ｍ−ＮＦ、ＮＦ−κＢデコイヌクレオチドまたはスクランブルデコイヌクレオチドを、冠状動脈の口の近くに留置されたカニューレを介して、投与した。胸部を閉じた後、気管もまた縫合し、そして動物を生存させた。２４時間後、このラットを再麻酔し、そして心臓を摘出し、そして生理食塩水で洗浄した。ラット心臓の心室を、６枚の切片にスライスし、これを、塩化テトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色した。６枚の切片をそれぞれ撮影し、そして画像分析に供した。梗塞領域を、以下の式によって計算した。
梗塞率（％）＝６枚の切片の梗塞面積の合計／６枚の切片の合計×１００
統計的分析を、多重比較（ＡＮＯＶＡ）によって行った。
【０２１３】
（（２）結果）
未処置コントロール群、Ｍ−ＮＦおよびスクランブルデコイ処置群において、心筋梗塞は、ほぼ等しい程度で見出された。ＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦおよびＮＦ−κＢデコイヌクレオチドを与えられた群において、梗塞は、未処置コントロール群、Ｍ−ＮＦおよびスクランブルデコイ処置群から、有意な程度まで抑制される。これらのポジティブ群において、ＣＤ−ＮＦを与えられた群は、正常なデコイまたはＰＳ−ＮＦよりも、有意により高い抑制を示す。
【０２１４】
類似の阻害効果は、リポソームが梗塞の誘導直前に投与される場合に見出された。
【０２１５】
（癌転移の阻害）
（（１）方法）
７週齢のＣ５７ＢＬ／６株の雌性マウスに、１×１０４のマウス小網細胞肉腫Ｍ５０７６細胞を静脈内投与し、そして２４時間後、各々０．２ｍｌ（６ｎｍｏｌｅ）の、リポソームに捕捉された、上記と同じ様式で調製された、上記で調製したＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦ、Ｍ−ＮＦ、ＮＦ−κＢデコイヌクレオチドまたはスクランブルデコイヌクレオチドを静脈内投与した。コントロール群は、同じ様式で０．２ｍｌの生理食塩水を受けた。Ｍ５０７６の静脈内注射後１４日目に、動物を剖検し、そして肝臓表面上の腫瘍小節の数を、立体顕微鏡下で計数した。各群は、１０匹のマウスからなった。統計的分析のために、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験およびＤｕｎｎｅｔｔ多重比較を使用した。
【０２１６】
（（２）結果）
ＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦおよびＮＦ−κＢデコイ処置した群は、Ｍ−ＮＦで処置した群またはコントロール群よりも腫瘍サイズの抑制における有意な効果を示した。これらのポジティブ群の中で、ＣＤ−ＮＦを受けた群は、正常デコイまたはＰＳ−ＮＦよりも、腫瘍サイズにおける有意に大きい抑制を示す。
【０２１７】
（悪液質の阻害）
（（１）方法）
７週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して、マウス結腸癌系統Ｃｏｌｏｎ  ２６の２ｍｍ立方の腫瘍塊を、皮下移植した。移植後７日目に開始して、０．２ｍｌ（６ｎｍｏｌｅ）のリポソームに捕捉された、上記のように調製したＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦ、Ｍ−ＮＦ、ＮＦ−κＢデコイヌクレオチドまたはスクランブルデコイヌクレオチドを、この腫瘍塊に投与し、そして体重および腫瘍重量を連続的に決定した。動物を１３日目に剖検し、そして精巣上体脂肪および腓腹筋を単離し、そして計量した。さらに、残りの器官および腫瘍を全て除いた死体の湿重量を決定した。腫瘍重量を、以下の式によって、各腫瘍塊の大きい方の直径および小さい方の直径から計算した。
腫瘍重量（ｍｇ）＝大きい方の直径×小さい方の直径２／２
各群は、１０匹のマウスからなった。統計的分析を、一方向のレイアウトのＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔ多重比較によって行った。
【０２１８】
（（２）結果）
腫瘍保有群において、腫瘍の増殖は、体重、精巣上体脂肪重量、腓腹筋重量および死体湿重量の有意な増加を生じた。ＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦおよびＮＦ−κＢデコイ群において、改善が得られる。この改善は、ＰＳ−ＮＦ群またはＮＦ−κＢ群よりも、ＣＤ−ＮＦ群において有意に高い。しかし、Ｍ−ＮＦ群およびスクランブルデコイ群においては改善は見出されない。Ｍ−ＮＦ群またはスクランブルデコイ群においては、腫瘍重量に対する明確な効果は存在しない。
【０２１９】
本発明の上記の実施形態の記載は、例示および説明の目的のために提供されている。これらは、網羅的であることも、開示された明確な形態に本発明を限定することも意図せず、そして上記教示に鑑みて多くの改変およびバリエーションが明らかに可能である。これらの実施形態は、本発明の原理およびその実際の適用を最良に説明し、それによって、当業者が、意図された特定の使用に適切である種々の実施形態で、そして種々の改変を共なって、本発明を最良に利用することができるようにするために、選択し、記載した。本発明の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲によって規定されることが意図される。本明細書中に引用される全ての参考文献は、本明細書中で参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０２２０】
本発明は、２つのループ構造および１つのステム構造を備える環状ダンベルオリゴヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）を提供し、ここで、このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインと結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明はさらに、このＣＤＯＤＮを含む薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、このような転写因子に関する疾患または傷害を処置および／または予防するために使用され得る。本発明はまた、このような転写因子に関する疾患または傷害を処置および／または予防するための方法を提供し、この方法は、治療有効量の、２つのループ構造および１つのステム構造を備えるＣＤＯＤＮを被験体に投与する工程を包含し、ここで、このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインと結合し得るヌクレオチド配列を含む。
【０２２１】
さらに、本発明は、転写因子ＡＰ−１のトランス活性化能力を阻害することによる、血管形成術後の再狭窄の処置のための方法および組成物を提供する。これらの組成物および方法は、血管障害の処置において有用である。
【０２２２】
本発明はまた、転写因子ＡＰ−１およびＥ２Ｆに対する新規の環状ダンベルオリゴヌクレオチドデコイ（ＣＤＯＤＮ）を提供し、これは、ＡＰ−１およびＥ２Ｆ関連の傷害の処置およびこれらの転写因子の細胞での役割を解明する際に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】図１は、ＡＰ−１デコイＯＤＮの構造および分子安定性を示す。［Ａ］ＡＰ−１デコイＯＤＮの構造。ＣＤＯＤＮは、２つの共有結合した同一のステム−ループ分子から作製される。従って、ＣＤＯＤＮは、そのステム領域にＡＰ−１に対する２つの結合部位を有する。［Ｂ］エキソヌクレアーゼＩＩＩ（左パネル）、Ｓ１ヌクレアーゼ（左パネル）、または血清（右パネル）の存在下でのデコイＯＤＮの安定性試験。ＥｘｏＩＩＩ；エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理したデコイＯＤＮ、Ｓ１；Ｓ１ヌクレアーゼで処理したデコイＯＤＮ、ＣＳ；仔ウシ血清、Ｄ；ＣＤＯＤＮ、Ｐ；ＰＳＯＤＮ、Ｌ；連結前のＣＤＯＤＮのアニールした形態。
【図２】図２は、ＡＰ−１のＤＮＡ結合活性におけるＣＤＯＤＮの効果を示す。［Ａ］競合アッセイ。種々の濃度の未標識オリゴヌクレオチドの存在下で、標識化プローブとＡＰ−１タンパク質との間でＡＰ−１複合体を形成させた。［Ｂ］ＡＰ−１デコイＯＤＮでトランスフェクトしたＶＳＭＣからのゲルシフトアッセイの代表例。この実験を５回繰り返した。ＮＧ；標準のグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、ＨＧ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＡＰ−１デコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳＯＤＮ、Ｄ；ＣＤＯＤＮ、Ｍ；ミスマッチＡＰ−１デコイＯＤＮ。ＥＭＳＡ結果の定量化を５回の独立の実験の平均値±ＳＥＭとして表した。＊ＮＧと比較してｐ＜０．００１、†ＨＧと比較してｐ＜０．０１、§ＮＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．００１、¶ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１。
【図３】図３は平滑筋細胞における遺伝子発現に対するＣＤＯＤＮの効果を示す。［Ａ］細胞を、平滑筋にて高濃度グルコース条件下で、デコイＯＤＮとサイクリンＡプロモーターの連続欠失体または変異体とを同時トランスフェクトした。＊ｐＣＡ−２６６／＋２０５と比較してｐ＜０．００１、†ｐＣＡ−１３３／＋２０５と比較してｐ＜０．００１。［Ｂ］および［Ｃ］細胞を、デコイＯＤＮ、とプラスミドＡＰ１（ＰＭＡ）−ＴＡ−Ｌｕｃ（Ｂ）またはｐＣＡ−２６６／＋２０５（Ｃ）とを同時トランスフェクトした。デコイＯＤＮの活性は、ルシフェラーゼ活性をダウンレギュレートする能力に反映する。値は、β−ガタクトシダーゼ活性による正規化後の６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、†ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１、‡ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．００１、［Ｄ］代表的なノーザンブロット解析。サイクリンＡ（上のパネル）およびＰＣＮＡ（下のパネル）の遺伝子発現をＲＡＳＭＣ（左パネル）またはＨＶＳＭＣ（右パネル）のノーザンブロッティングによって測定した。Ｎ：正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＡＰ−１デコイＯＤＮでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳＯＤＮ、Ｄ；ＣＤＯＤＮ、Ｍ；ミスマッチＡＰ−１デコイＯＤＮ。
【図４】図４は、ＨＶＳＭＣ（Ａ）およびＲＡＳＭＣ（Ｂ）における細胞増殖の阻害に対するＣＤＯＤＮの効果を示す。増殖活性は、６回の測定値の平均値±ＳＥＭである。ＨＶＳＭＣ（Ｃ）およびＲＡＳＭＣ（Ｄ）における細胞遊走に対するＣＤＯＤＮの効果。フィルターの低い方の表面上で、４つのランダムに選択した強拡（×４００）場での平均細胞数を計数した。各実験を三連で行い、４回の独立した実験を行った。遊走活性は平均値±ＳＥＭである。Ｎ；正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ：１００ｎｍｏｌ／ｌのＡＰ−１デコイＯＤＮでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳＯＤＮ、Ｄ；ＣＤＯＤＮ、Ｍ；ミスマッチＡＰ−１デコイＯＤＮ。＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、†ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０５、‡ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１。
【図５】図５は、ラット頚動脈のバルーン損傷後の新内膜形成についてのＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を示す。（Ａ）＋（Ｂ）左総頚動脈の蛍光顕微鏡法：ＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮのみで処理した（Ａ）か、またはＨＶＪ−ＡＶＥリポソームを有するＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮで処理した（Ｂ）：（Ｃ）〜（Ｇ）コントロールラットの左総頚動脈の横断面（Ｃ）、バルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面（Ｄ）、（Ｅ）〜（Ｇ）ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法を用いてＭＯＤＮ（Ｅ）、ＰＳＯＤＮで（Ｆ）、およびＣＤＯＤＮで（Ｇ）で処理したバルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面。（Ｈ）ＡＰ−１デコイＯＤＮを含むＨＶＪ−リポソームでトランスフェクトした群における左頚動脈の内膜領域／中膜領域の平均比。棒は、試験した動物の各群（ｎ＝１０）からのバルーン損傷後の総頚動脈の新内膜／中膜比を表す。値は、平均値±ＳＥＭである。＊バルーン損傷した動脈と比較してｐ＜０．０１、†ＰＳＯＤＮ処理した動脈と比較してｐ＜０．０５。
【図６】図６は、損傷した頚動脈における新内膜形成の阻害へのＣＤＯＤＮ処理時点の効果を示す。（Ａ）〜（Ｅ）コントロールラットの左総頚動脈の横断面（Ａ）、バルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面（Ｂ）、ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法を使用してＭＯＤＮの前処理をした左総頚動脈の横断面（Ｃ）、ＣＤＯＤＮの前処理をした左総頚動脈の横断面（Ｄ）、およびＣＤＯＤＮの後処理をした左総頚動脈の横断面（Ｅ）。（Ｆ）ＡＰ−１デコイＯＤＮを含むＨＶＪ−リポソームでトランスフェクトした群における左頚動脈の内膜領域／中膜領域の平均比。棒は、研究した動物の各群（ｎ＝１０）からのバルーン損傷後の総頚動脈の新内膜／中膜比を表す。値は、平均値±ＳＥＭ。＊バルーン損傷動脈と比較してｐ＜０．００５、†ＣＤＯＤＮで前処理した動脈と比較してｐ＜０．０１、‡ＣＤＯＤＮで後処理した動脈と比較してｐ＜０．０１。
【図７】図７Ａは、動脈抽出物におけるＡＰ−１結合活性の分析を示す。損傷後に示された時点での頚動脈からの細胞の核抽出物を用いてゲル移動度シフトアッセイを行った（ｎ＝１０）。バルーン損傷の前（ＣＤＯＤＮ前処理した）または後（ＣＤＯＤＮ後処理した）に、２０μｌのＣＤＯＤＮを含むＨＶＪ−リポソーム複合体を室温にて管腔内で１０分間インキュベートした。図７Ｂは、バルーン損傷後のラット頚動脈におけるＰＣＮＡ発現を示す。コントロール血管のＰＣＮＡ染色（１）、バルーン損傷した血管のＰＣＮＡ染色（２）、ＭＯＤＮで前処理した動脈のＰＣＮＡ染色（３）、ＣＤＯＤＮで前処理した動脈のＰＣＮＡ染色（４）およびＣＤＯＤＮで後処理した動脈のＰＣＮＡ染色（５）。ＰＣＮＡ陽性細胞は、茶色がかった黒に見える。全ての図は、４００×の拡大率である。
【図８】図８は、Ｅ２Ｆデコイの構造および分子安定性を示す。［Ａ］ＣＤ−Ｅ２Ｆ分子を形成するために共有結合された２つの同一のステム−ループから構成されるＥ２Ｆデコイの構造。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、そのステム領域上のＥ２Ｆに対する２つの結合部位からなる。［Ｂ］エキソヌクレアーゼＩＩＩ（左パネル）、Ｓ１ヌクレアーゼ（左パネル）または血清（右パネル）の存在下でのデコイの安定性。略語：ＥｘｏＩＩＩ；エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理したデコイ、Ｓ１：Ｓ１ヌクレアーゼで処理したデコイ、ＣＳ；仔ウシ血清、Ｄ；ＣＤ−Ｅ２Ｆ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、およびＬ；連結前のＣＤ−Ｅ２Ｆのアニールした形態。
【図９】図９は、Ｅ２ＦのＤＮＡ結合活性についてのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を示す。［Ａ］種々の濃度の未標識のＯＤＮの存在下での標識化プローブとＥ２Ｆタンパク質との間に形成されるＥ２Ｆ複合体の量。［Ｂ］ゲルシフトアッセイの代表例をＥ２ＦデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣについて示す。この実験を６回繰り返した。略語：ＮＧ；正常のグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）、ＨＧ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＥ２ＦデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、Ｄ；ＣＤ−Ｅ２Ｆ、およびＭ：Ｍ−Ｅ２Ｆ。ＥＭＳＡの結果を５回の別の実験の平均値±ＳＥＭとして表す。統計的有意差を以下のように決定した：＊ＮＧと比較してｐ＜０．００１、†ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１、‡ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５。
【図１０】図１０は、平滑筋細胞における細胞周期関連遺伝子のプロモーター活性についてのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を示す。（Ａ）ＶＳＭＣを、高濃度グルコース条件下で、デコイと、サイクリンＡプロモーターの連続欠失体または変異体構築物とを同時トランスフェクトした。統計的有意差を以下のように決定した：＊ｐＣＡ−２６６／＋２０５と比較してｐ＜０．０１、†ｐＣＡ−１３３／＋２０５と比較してｐ＜０．０１。ＶＳＭＣを、デコイと、プラスミドｐＣＡ−２６６／＋２０５（Ｂ）または［Ｅ２Ｆ］×４−Ｌｕｃ（Ｃ）とを同時トランスフェクトした。デコイの活性は、ルシフェラーゼ活性をダウンレギュレートする能力に反映される。値をβ−ガラクトシダーゼ活性の正規化後の５回の別の実験の平均値±ＳＥＭで表す。統計的有意差を以下のように決定した：＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、†ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．００１、‡ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５。略語：Ｎ：正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＥ２ＦのデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、Ｄ：ＣＤ−Ｅ２Ｆ、Ｍ；Ｍ−Ｅ２Ｆ。
【図１１】図１１は、ＶＳＭＣにおける遺伝子発現についてのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を示す。（Ａ）代表的なノーザンブロット解析。ＲＡＳＭＣ（ＢおよびＤ）またはＨＶＳＭＣ（ＣおよびＥ）におけるサイクリンＡ（ＢおよびＣ）およびＰＣＮＡ（ＤおよびＥ）の遺伝子発現を、濃度測定分析を用いて定量化した。略語：Ｎ；正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＥ２ＦデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、Ｄ；ＣＤ−Ｅ２Ｆ、Ｍ；Ｍ−Ｅ２Ｆ。値は、５回の別の実験の平均値±ＳＥＭを表す。統計的有意差を以下のように決定した：＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、＃ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１、＃＃ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５。
【図１２】図１２は、ＨＶＳＭＣ（Ａ）およびＲＡＳＭＣ（Ｂ）における細胞増殖の阻害についてのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を示す。増殖活性は６つの測定値の平均値±ＳＥＭである。デコイを平滑筋細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２〜３日後、ＷＳＴ細胞計数キットを使用して細胞増殖の指数を決定した。統計的有意差を以下のように決定した：＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、＃ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１、および＃＃ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５。略語：Ｎ：正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ：高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＥ２ＦデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、Ｄ；ＣＤ−Ｅ２Ｆ、Ｍ；Ｍ−Ｅ２Ｆ。
【図１３】ラット頚動脈におけるバルーン損傷後に生じる新内膜形成についてのＥ２Ｆデコイの効果。図は、ＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮのみ（Ａ）か、またはＨＶＪ−リポソームを有するＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮ（Ｂ）で処理した左総頚動脈の蛍光顕微鏡法を図示する。コントロールラットの左総頚動脈の横断面（Ｃ）、バルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面（Ｄ）、ＨＶＪ−リポソーム法を使用してＰＳ−Ｅ２Ｆを伴う、バルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面（Ｅ）、ＨＶＪ−リポソーム法およびＣＤ−Ｅ２Ｆを伴う左総頚動脈の横断面（Ｆ）、またはＨＶＪ−リポソーム法およびＭ−Ｅ２Ｆを伴う左総頚動脈の横断面（Ｇ）を示す。Ｅ２Ｆデコイを含むＨＶＪ−リポソームでトランスフェクトした群における左頚動脈の内膜領域／中膜領域の平均比を示す（Ｈ）。棒は、試験した動物の各群（ｎ＝１０）からのバルーン損傷後の総頚動脈の、新内膜／中膜の比を表す。値は、平均値±ＳＥＭで表し、以下のように統計的有意差を決定した：＊バルーン損傷した動脈と比較してｐ＜０．０１、＃ＰＳ−Ｅ２Ｆ処理した動脈と比較してｐ＜０．０５。元の倍率の１００×（ＡおよびＢ）および２５×（Ｃ〜Ｇ）。スケールバーは、２００μｍを表す。
【図１４】図１４は、バルーン損傷後のラット頚動脈におけるＰＣＮＡ発現を示す。コントロール血管（Ａ）、バルーン損傷した血管（Ｂ）、Ｍ−Ｅ２Ｆで処理した動脈（Ｃ）、ＰＳ−Ｅ２Ｆで処理した動脈（Ｄ）およびＣＤ−Ｅ２Ｆで処理した動脈（Ｅ）のＰＣＮＡ染色。ＰＣＮＡ陽性細胞は、茶色がかった黒に見える。全ての図は、２００×の拡大率である。スケールバーは、５０μｍを表す。
【配列表】
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【国際調査報告】
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