(57)【要約】抗原（例えば、グリコスフィンゴリピド）、抗原提示細胞、および細胞生存因子の存在下で繰返し培養することによってＴ細胞（例えば、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋ヒトＮＫＴ細胞）をインビトロで増幅する方法を提供する。ＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋）の集団は、５週間で１００万倍以上に、１０週間で１０億倍以上に増幅することができる。
2005536982.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴ細胞の増殖をインビトロで刺激する方法であって、ドナーＴ細胞を抗原提示細胞、抗原、細胞生存因子および血清の存在下でＴ細胞の増殖を刺激する条件下で少なくとも７日間繰返し培養することを含んでなる方法。
【請求項２】
増殖したＴ細胞の少なくとも一部がＶα２４Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増殖したＴ細胞の少なくとも一部がＣＤ３またはＣＤ１６１を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
増殖したＴ細胞の少なくとも一部が細胞殺傷能力を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗原提示細胞がヒトドナーＴ細胞のドナーと同一のヒトからのものであるかまたは異なるヒトからのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗原提示細胞がヒトまたは非ヒト由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗原提示細胞がヒトもしくは非ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃもしくはＣＤ１ｄまたはヒトもしくは非ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃもしくはＣＤ１ｄの糖脂質結合活性を有する分子を発現するように作出されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗原提示細胞がヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に存在するかまたはそれから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞が少なくとも５回継代される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
血清がヒト由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
血清が非ヒト由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
血清が無血清培地で代替される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞生存因子がＴ細胞表面上の分子に結合する分子を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞生存因子がＩＬ−２を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
細胞生存因子がＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−１５を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が約１０８細胞またはそれ以上に１０週間にわたって増殖する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
抗原がグリコスフィンゴリピド、細菌抗原またはウイルス抗原を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
グリコスフィンゴリピドがＫＲＮ７０００またはＫＲＮ７０００類似体を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＫＲＮ７０００類似体がβ−グルコシルセラミド（β−ＧｌｕＣｅｒ）を含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細菌抗原が破傷風トキソイド、ジフテリアトキシン、ＢＣＧ、百日咳抗原、Ｂ型インフルエンザ抗原または肺炎球菌抗原を含んでなる、請求項1７に記載の方法。
【請求項２１】
ウイルス抗原が麻疹ウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、水痘ウイルス抗原、または肝炎ウイルス抗原を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ドナーＴ細胞が抗原感作された、請求項１に記載の方法。  
【請求項２３】
増殖したＴ細胞の少なくとも一部が一つまたはそれ以上のサイトカインを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
増殖したＴ細胞の少なくとも一部が抗腫瘍細胞活性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
増殖したＴ細胞の少なくとも一部がＮＫ細胞を活性化して抗腫瘍細胞活性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
抗原提示細胞が非生存細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
抗原提示細胞が放射線処理された、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
ヒトＴ細胞の増殖をインビトロで刺激する方法であって、ドナーＴ細胞を抗原提示細胞、抗原、ＩＬ−２（ＩＬ−７またはＩＬ−１５なしで）、および血清の存在下でＴ細胞の増殖を刺激する条件下で繰返し培養することを含んでなる方法。
【請求項２９】
増殖したＴ細胞の少なくとも一部がＶα２４Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
増殖したＴ細胞の少なくとも一部がＣＤ３またはＣＤ１６１を発現する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
増殖したＴ細胞の少なくとも一部が細胞殺傷能力を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
抗原提示細胞がヒトドナーＴ細胞のドナーと同一のヒトからのものであるかまたは異なるヒトからのものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
抗原提示細胞がヒトまたは非ヒト由来である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
抗原提示細胞がヒトもしくは非ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃもしくはＣＤ１ｄまたはヒトもしくは非ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃもしくはＣＤ１ｄの糖脂質結合活性を有する分子を発現するように作出されたものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
抗原提示細胞がヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に存在するかまたはそれから得られる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
細胞が少なくとも５回継代される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
血清がヒト由来である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
血清が非ヒト由来である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
血清が無血清培地で代替される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
細胞が約１０８細胞またはそれ以上に１０週間にわたって増殖する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
抗原がグリコスフィンゴリピド、細菌抗原またはウイルス抗原を含んでなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
グリコスフィンゴリピドがＫＲＮ７０００またはＫＲＮ７０００類似体を含んでなる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＫＲＮ７０００類似体がβ−グルコシルセラミド（β−ＧｌｕＣｅｒ）を含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
細菌抗原が破傷風トキソイド、ジフテリアトキシン、ＢＣＧ、百日咳抗原、Ｂ型インフルエンザ抗原または肺炎球菌抗原を含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ウイルス抗原が麻疹ウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、水痘ウイルス抗原、または肝炎ウイルス抗原を含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
ドナーＴ細胞が抗原感作された、請求項２８に記載の方法。  
【請求項４７】
増殖したＴ細胞の少なくとも一部が一つまたはそれ以上のサイトカインを産生する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４８】
増殖したＴ細胞の少なくとも一部が抗腫瘍細胞活性を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項４９】
増殖したＴ細胞の少なくとも一部がＮＫ細胞を活性化して抗腫瘍細胞活性を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項５０】
抗原提示細胞が非生存細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項５１】
抗原提示細胞が放射線処理された、請求項２８に記載の方法。  
【請求項５２】
請求項１または２８に記載の方法によって製造される増殖したＴ細胞培養物。
【請求項５３】
対象に細胞治療を提供する方法であって、対象に治療を提供するに充分な量で請求項２８に記載のＴ細胞培養物を対象に投与することを含んでなる方法。
【請求項５４】
ドナーＴ細胞が、増殖したＴ細胞を投与する対象から得られる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
対象が望ましくない数のＴ細胞を有するかそのおそれを有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
対象がＶα４Ｔ細胞レセプターを発現するＴ細胞を望ましくない数で有するかそのおそれを有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
対象が器官または組織移植を受ける予定のまたはそれを受けた者である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
対象が免疫不全、自己免疫疾患、癌または感染症を有するまたはそのおそれを有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
免疫不全が器官または組織移植に関連している、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
自己免疫疾患が糖尿病、多発性硬化症、全身性硬化症、腸炎、肝炎、ループス、リュウマチ性関節炎またはシェーグレン症候群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
癌が固形腫瘍、転移性腫瘍、白血病、リンパ腫または骨髄腫を含んでなる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
白血病がＴ細胞、Ｂ細胞または単球白血病を含んでなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
リンパ腫がホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫を含んでなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
癌が腺腫、形質細胞腫、肉腫、癌腫または神経芽細胞腫を含んでなる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
感染症がウイルス、細菌、真菌類または寄生虫によって起きる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６６】
ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を含んでなる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
細菌が結核、ライム病またはハンセン病を起こす、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
寄生虫がマラリアまたはシャーガス病を起こす、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
増殖したヒトＴ細胞の集団を製造する方法であって、ドナーＴ細胞を抗原提示細胞、抗原、細胞生存因子および血清の存在下で少なくとも７日間繰返し培養して、それによって増殖したヒトＴ細胞の集団を製造することを含んでなる方法。
【請求項７０】
細胞生存因子がＩＬ−２を含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
細胞生存因子がＩＬ−７またはＩＬ−１５なしでＩＬ−２を含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
増殖したヒトＴ細胞の集団を製造する方法であって、ドナーＴ細胞を抗原提示細胞、抗原、ＩＬ−２（ＩＬ−７またはＩＬ−１５なしで）、および血清の存在下で繰返し培養し、これによって増殖したヒトＴ細胞の集団を製造することを含んでなる方法。
【請求項７３】
ドナーＴ細胞を少なくとも７日間培養する、請求項７２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、一般には免疫学に関し、より詳細にはインビトロでのＴ細胞数の増幅およびそのような増幅されたＴ細胞集団の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、ＣＤ１６１（ＮＫＲ−Ｐ１Ａ、主にＮＫ細胞系に関連する）のような細胞表面レセプターを発現するＣＤ３＋Ｔ細胞の一サブセットである。ヒトＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１６１＋）の小副集団は、Ｖβ１１に優先して結びつく高度に保存されたＴ細胞レセプター鎖Ｖα２４−ＪαＱを発現する（Bendelac, et al., Annu Rev Immunol 15:535 (1997); Dellabona, et al., J Exp Med 180:1171 (1994)）。このＶα２４＋Ｖβ１１＋Ｔ細胞集団は、多くの免疫学的障害に関連づけされてきた。
【０００３】
ヒトＶα２４＋ＮＫＴ細胞は、ネズミＶα１４ＮＫＴ細胞との高度の表現型および機能性保存性を示し、これは免疫系における重要な生物学的機能を示唆する（Kawano, et al., Science 278:1626 (1997); Spada and Porcelli, J Exp Med 188:1529 (1998); Nieda, et al., Hum Immunol 60:10 (1999); Brossay, et al., J Exp Med 188:15221 (1998)）。マウスにおけるように、ヒトＶα２４＋またはＫＲＮ７０００反応性Ｔ細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に一般に関連するＣＤ１６１（またはマウスにおけるＮＫ１．１）のような表面分子を発現し得る。しかしながら、この分子やその他分子は、Ｔ細胞の活性化状態によって影響され、いくつかのＶα２４＋Ｔ細胞またはＴ細胞系集団上には存在しないこともあり得る（Takahashi, et al., J Immunol 164:4458 (2000)）。したがって、ＫＲＮ７０００反応性またはＶα２４＋Ｔ細胞はＮＫ細胞様殺傷（killing）活性を有するかもしれないが、厳密にはＮＫＴ細胞とは分類されないこともあり得る。
【０００４】
ヒトＶα２４＋およびマウスＶα１４＋ＮＫＴ細胞はともに、糖脂質α−ガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００としても知られる）を提示するＣＤ１ｄ＋抗原提示細胞に依存してそれによって活性化される（Kawano, et al., Science 278:1626 (1997); Spada and Porcelli, J Exp Med 188:1529 (1998); Nieda, et al., Hum Immunol 60:10 (1999); Brossay, et al., J Exp Med 188:15221 (1998); Burdin, et al., J Immunol 161:3271 (1998)）。ＣＤ１分子は、染色体１上で密に連結した遺伝子によってコードされる関連タンパク質のファミリーであり、主要組織適合（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩタンパク質の双方との相同性を有する（Porcelli and Modlin, Annu Rev Immunol 17:297 (1999)）。四つのヒトＣＤ１遺伝子（ＣＤ１ａ、ｂ、ｃおよびｄ）はタンパク質として発現され、β２−マイクログロブリンと非共有結合していることが知られている。ＣＤ１ｄタンパク質は、Ｂ細胞、単球および樹状細胞を含む抗原提示細胞によって（Exley, et al., Immunology 100:37 (2000); Spada, et al., Eur J Immunol 30:3468 (2000)）、さらにまたいくつかの活性化されたＴ細胞、皮質胸腺細胞、および腸管上皮によって（Exley, et al., Immunology 100:37 (2000); Blumberg, et al., J Immunol 147:2518 (1991)）も発現される。
【０００５】
ＣＤ１ｄに加えて、ヒトＶα２４＋ＮＫＴ細胞の最適活性化は、ＫＲＮ７０００（Nieda, et al., Hum Immunol 60:10 (1999); Brossay, et al. J Exp Med 188:15221 (1998)）またはＣＤ１ｄに結合する関連類似体（Ishihara, et al., J Immunol 165:1659 (2000)）の提示によって得ることができる。マウスにおける対応するＴ細胞集団もまた、ＫＲＮ７０００の類似体によって（Brossay, et al., J Immunol 161:5124 (1998)）、およびおそらくはネズミＣＤ１ｄ１に結合する内因性リン脂質によって（Joyce, et al., Science 279:1541 (1998)）、活性化することができる。ＫＲＮ７０００は、マウスにおいて迅速なサイトカイン分泌および有力な抗腫瘍応答を誘導をすることができ（Toura, et al., J Immunol 163:2387 (1999); Nakagawa, et al., Oncol Res 12:51 (2000); Nakagawa, et al., Cancer Res 58:1202 (1998); Morita, et al., J Med Chem 38:2176 (1995)）、そしてヒト腫瘍細胞系の殺傷を誘導することができる（Takahashi, et al., J Immunol 164:4458 (2000); Nicol, et al., Immunology 99:229 (2000); Metelitsa, et al., J Immunol 167:3114 (2001); Kawano, et al., Cancer Res 59:102 (1999)）。さらに、ＫＲＮ７０００刺激されたＮＫＴ細胞は、ＮＫ細胞増殖を誘導し、インビトロでの腫瘍細胞系およびインビボでの腫瘍のＮＫ細胞の殺傷を促進することができるという証拠がある。このように、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋ＮＫＴ細胞は、腫瘍細胞の撲滅に直接的または間接的な役割を果たすことができる。
【０００６】
Ｖα２４＋Ｔ細胞における変化が多様な疾患の患者において認められてきた。ヒトＶα２４＋Ｔ細胞数の減少およびサイトカイン分泌における変化は、ヒト自己免疫疾患（Tahir, et al., J Immunol 167:4046 (2001); Gumperz, et al., J Exp Med 195:625 (2002); Kita, et al., Gastroenterology 123:1031 (2002); Sumida, et al., J Exp Med 182:1163 (1995); Oishi, et al, J Rheumatol 28:275 (2001)）、前立腺癌（Van Der Vliet, et al., Immunology 98:557 (1999)）、および原発性胆汁性肝硬変（Gumperz, et al., J Exp Med 195:625 (2002)）の進行およびそれに関連する組織傷害と関連づけされてきた。これに対して、Ｖα２４＋Ｔ細胞の増加は、アトピー（Van Der Vliet, et al., Clin Immunol 100:144 (2001)）、慢性ウイルス性肝炎（Magnan, et al., Allergy 55:286 (2000)）、および重症筋無力症（Nuti, et al., Eur Immunol 28:3448 (1998)）の患者に認められてきた。自己免疫疾患、感染症、および癌の治療においてＶα２４＋Ｔ細胞またはＫＲＮ７０００に応答するＴ細胞の役割は、マウスにおける疾患モデルによって支持されており（Reinhardt and Melms Neurology 52:1485 (1999); Kronenberg and Gapin, Nat. Rev. Immunol. 2:557 (2002)に論評されている）、これはこれらＴ細胞の過発現またはＫＲＮ７０００を用いるインビボ治療が腸炎（Hammond and Godfrey, Tissue Antigens 59:353 (2002)）、腫瘍転移、糖尿病を予防または治癒し、ワクチン能を増強する（Saubermann, et al., Gastroenterology 119:119 (2000)）ことを示す。
【０００７】
機能変化した、低減したまたは検出不可のＶα２４＋Ｔ細胞を示す対象において、インビボまたは続いての別個体移入を伴うインビトロにおけるこれら細胞の増幅および活性化は、治療上、とくに悪性細胞の選択的殺傷またはいくつかの自己免疫疾患の治療に有益であり得る。本発明は、この要求に取り組み、関連する恩恵を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ヒトＴ細胞の増殖をインビトロにおいて刺激する方法を提供する。一実施態様では、方法は抗原提示細胞、抗原、細胞生存因子（cell survival factor）および血清の存在下でＴ細胞の増殖を刺激する条件下で少なくとも７日間ドナーＴ細胞を繰返し培養することを含む。別の実施態様では、方法は抗原提示細胞、抗原、ＩＬ−２（ＩＬ−７またはＩＬ−１５なしで）、および血清の存在下でＴ細胞の増殖を刺激する条件下でドナーＴ細胞を繰返し培養することを含む。種々の面において、増殖したＴ細胞はＶα２４Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）、ＣＤ３またはＣＤ１６１を発現し；細胞殺傷能を有し；一つまたはそれ以上のサイトカインを産生し；抗腫瘍細胞活性を示し；ＮＫ細胞を活性化して抗腫瘍細胞活性を示す。さらなる面において、抗原提示細胞は、ヒトまたは非ヒトのものであり；ヒトドナーＴ細胞と同一のヒトからのものかまたは異なるヒトからのものであり；ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に存在するかまたはそれから得られ；生存または非生存性（例えば放射処理された）であり；樹状、Ｂ−、単球またはマクロファージ細胞であり；ヒトもしくは非ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃもしくはＣＤ１ｄ、またはヒトもしくは非ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃもしくはＣＤ１ｄの糖脂質結合活性を有する分子を発現するように作出される。別の面において、細胞は少なくとも５回継代される。
【０００９】
本発明による有用な血清には、例えば、ヒトもしくは非ヒト血清または無血清代替培地が含まれる。本発明による有用な細胞生存因子には、例えば、Ｔ細胞表面の分子に結合する分子、サイトカイン、またはインターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−１５）またはインターフェロンが含まれる。本発明による有用な抗原には、例えば、グリコスフィンゴリピド（例えば、ＫＲＮ７０００またはβ―グルコシルセラミドのようなＫＲＮ７０００類似体）、細菌抗原（例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキシン、ＢＣＧ、百日咳抗原、Ｂ型インフルエンザ菌抗原または肺炎球菌抗原）またはウイルス抗原（例えば、麻疹ウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、水痘ウイルス抗原または肝炎ウイルス抗原）が含まれる。ドナーＴ細胞は非感作または一つまたはそれ以上の抗原で感作されたものでもよい。
【００１０】
本発明の方法には、１０週間にわたって約１０８個またはそれ以上に増殖している細胞が含まれる。
【００１１】
本発明はまた、本発明の方法によって製造される増殖したＴ細胞培養物を提供する。一実施態様において、増殖したＴ細胞は少なくともその一部がＶα２４またはＶβ１１を発現する細胞集団を含んでなる。
【００１２】
さらに本発明は、増殖したＴ細胞を含むキットを提供する。一実施態様において、キットは少なくともその一部がＶα２４またはＶβ１１を発現する細胞集団を含んでなる増殖したＴ細胞を含む。別の実施態様において、増殖したＴ細胞はキット中の医薬処方物に含まれる。
【００１３】
さらに本発明は、対象に細胞治療を提供する方法を提供する。一実施態様において、方法は、本発明に従って調製されたＴ細胞培養物を対象を治療するに充分な量で対象に投与することを含む。一面において、増殖に用いるドナーＴ細胞は、増殖したＴ細胞を投与する対象から得られる。さらなる面において、対象は、望ましくない数のＴ細胞（例えば、Ｖα４Ｔ細胞レセプターを発現するもの）を有するかそのおそれを有する者；器官または組織移植を受ける候補者または受けた者；免疫不全（例えば、器官または組織移植に関連した）、自己免疫疾患（例えば、糖尿病、多発性硬化症、全身性硬化症、腸炎、肝炎、ループス、リューマチ性関節炎またはシェーグレン症候群）、癌または感染症を有するかそのおそれを有する者である。より具体的な面において、癌は、固形腫瘍、転移性腫瘍、白血病（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞または単球白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫）、骨髄腫、腺腫、形質細胞腫、肉腫、癌腫または神経芽細胞腫を含んでなる。より具体的な面において、感染症は、ウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、細菌（例えば、結核、ライム病またはハンセン病を起こすもの）、真菌類、または寄生虫（例えば、マラリアやシャーガス病を起こすもの）によって引き起こされる。
【発明の具体的説明】
【００１４】
本発明は、少なくとも一部は、抗原提示細胞、抗原、細胞生存因子および血清の存在下でドナーＴ細胞を繰返し培養することによってＴ細胞はインビトロで刺激されて増殖することができるということを見出したことに基づく。とくに、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋Ｔ細胞は、自家ドナーＰＢＭＣ、ＫＲＮ７０００、およびＩＬ−２を用いる繰返し刺激によって多数の細胞にインビトロで増幅された。繰返し培養のわずか５週間後に、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞の１００万倍以上の増幅が達成された。自家ＰＢＭＣ、ＫＲＮ７０００，およびＩＬ−２を用いる１０週間の追加繰返し培養によって、１０９個までのＶα２４＋Ｔ細胞が産生された。Ｖα２４抗体を用いて選別した後、Ｔ細胞系は少なくとも１１回継代することができ、１０週間にわたって１０９細胞以上に増幅することができた。Ｖα２４＋Ｖβ１１＋Ｔ細胞の増幅されたＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ４−８−（ＣＤ４−）サブセットは、機能性であった。例えば、増幅された細胞はサイトカインを分泌し、細胞傷害活性を示した（例えば、ＫＲＮ７０００の存在下で腫瘍細胞を殺し、インビボでＮＫ細胞を活性化して腫瘍細胞系を殺した）。
【００１５】
本発明の増幅されたＴ細胞は、種々のＴ細胞関連病状または障害の治療に用い得る。例えば、免疫不全、自己免疫、移植片対宿主病またはアレルギーなど望ましくない免疫応答によって特徴づけられる病状や障害、癌などの過増殖性障害および自己免疫疾患は、増幅されたＴ細胞によって治療し得る。
【００１６】
したがって、本発明は、Ｔ細胞を増幅する方法、増幅したＴ細胞集団を製造する方法および増幅したＴ細胞集団を用いて対象を治療する方法を提供する。一実施態様において、方法は、抗原提示細胞、抗原、細胞生存因子および血清の存在下でＴ細胞の増殖を刺激する条件下で少なくとも７日間ドナーＴ細胞を繰返し培養することを含む。一面において、増殖したＴ細胞の少なくとも一部は、Ｖα２４Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現する。他の面において、増殖したＴ細胞の少なくとも一部は、ＣＤ３またはＣＤ１６１を発現する。さらなる他の面において、増殖したＴ細胞の少なくとも一部は、細胞を殺傷するか他の細胞を活性化して細胞を殺傷することができる。
【００１７】
ここで用いる表現「繰返し培養された」または「繰返された刺激」およびその文法的変化形表現は、細胞が、その生存または増殖が可能な条件下で一般に１回またはそれ以上の継代で増殖されることを意味する。増殖した培養細胞は、適当な細胞密度（例えば、１０５〜１０９細胞／ｍｌ、一般に約２×１０６細胞／ｍｌ）に達するまで増殖する。細胞は継代され、すなわち必要であれば抗原提示細胞、細胞生存因子などを含む新鮮培地に低細胞密度に分けられ（例えば、１：１０、１：５、１：４、１；３、１：２に希釈する）、Ｔ細胞を続けて増殖させ、これによってＴ細胞集団が増幅される。このようにして、増殖しているＴ細胞を繰返し培養すなわち継代することによって大量のＴ細胞が得られる。
【００１８】
ここで用いる「抗原提示細胞」とは、抗原に対する免疫応答を刺激または阻害（例えば寛容にする）する目的で抗原を提示することができる細胞全てを意味する。抗原提示細胞は、ヒトドナーＴ細胞を得たと同一ヒトからのものであっても異なるヒトからのものであってもよい。抗原提示細胞はまた、非ヒト、例えば霊長目動物からのものでもよい。抗原提示細胞は、生存または非生存のいずれでもよい。例えば、抗原提示細胞は本発明の方法を実施する前に処理して非生存にしてもよい。一実施例において、抗原提示細胞は放射線処理される。抗原提示細胞はまた、タンパク質を発現するように作出され、あるいは遺伝子操作や他の方法で改変される。例えば、具体的一実施例において、抗原提示細胞はヒトもしくは非ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄまたはヒトもしくは非ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄの糖脂質結合活性を有する分子を発現するように作出される。
【００１９】
抗原提示細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に存在し、したがってそれから得ることができる。したがって、他の実施例において、抗原提示細胞はヒト（自家または非自家）末梢血単核細胞を含んでなる。
【００２０】
抗原提示細胞の具体的な非限定例には、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび単球が含まれる。抗原提示細胞にはさらに、そのような細胞の前駆細胞が含まれるが、それら前駆細胞には抗原提示能が欠けることもあり得る。抗原提示細胞は任意に、繰返し培養されたＴ細胞にＴ細胞の増殖を再刺激するために随時加えてもよい。
【００２１】
本発明に有用な抗原提示細胞と同等のものには、抗体、およびＣＤ３鎖（ガンマ、デルタ、イプシロンおよびゼータ）とＴ細胞レセプター鎖（アルファおよびベータ）からなるＴ細胞レセプター複合体に結合するリガンド（例えば、遺伝子操作された生理学的リガンド）のような分子が含まれる。モノクローナル抗体の例としては、例えば、抗Ｖα２４、抗Ｖβ１１（Beckman-Coulter）、抗ＣＤ３が挙げられる。リガンドの例としては、例えば、糖脂質（例えば、ＫＲＮ７０００または類似体）をロードした遺伝子操作されたＣＤ１ｄ分子（ヒトもしくはマウスモノマー、ダイマーまたはテトラマー）が挙げられる。本発明において有用なさらなる抗原提示細胞同等物には、ホルボールエステル（例えばＰＭＡ）およびカルシウムイオノフォア（例えばイオノマイシン）が含まれる。
【００２２】
ここに記載されたおよび当業者に公知の抗原提示細胞およびその同等物に加えて、ＣＤ２８、ＣＤ１３４，ＣＤ１３７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ５４およびＣＤ２のようなマーカー分子に対する抗体を含むリガンドを増殖または生存を増強するために細胞に加えてもよい。上記タンパク質マーカーに対するリガンドは、市販されている（例えば、ＯＸ４０およびＣＤ１３７リガンドを結合する可溶性ＯＸ４０リガンドはAlexis Biochemicalsから入手可能である）。上記マーカーに対する抗体もまた、市販されている。したがって、本発明の方法において、Ｔ細胞は、抗原提示細胞またはその同等物に加えてそのような分子によって刺激または誘導され得る。
【００２３】
抗原提示細胞はしたがって、上記リガンド、Ｔ細胞レセプター結合分子および抗体によって代替または補足することができる。例えば、Ｖα２４Ｖβ１１細胞のソーティングに続いて、ＣＤ３、Ｖα２４、Ｖβ１１などに対する抗体を、ロードしたＫＲＮ７０００（例えば、ＣＤ１ｄテトラマーをロードしたＫＲＮ７０００）とともに用いて、抗原提示細胞なしでＴ細胞を増幅することができる。
【００２４】
用語「リガンド」は、ＣＤマーカーなどの参照エンティティーに結合する全ての分子を意味する。そのようなリガンドには、特異的な、すなわちエンティティーに優先的に結合する分子が含まれる。しかしながら、リガンドにはまた、エンティティーに特異的に結合しない分子も含まれる。例えば、ＣＤ２８のリガンドはＣＤ２８に結合するが、ＣＤ２８に関連しないか配列または構造でＣＤ２８に関連する一つまたはそれ以上の異なる分子ともまた結合し得る。
【００２５】
ドナーＴ細胞は、ヒトなどの哺乳動物から得ることができる。ドナーＴ細胞はＰＢＭＣなどの細胞との混合物からなり得るが、混合物中のＴ細胞は混合物中全細胞数の極小パーセント（例えば、細胞の０．０１〜０．１％）または極大パーセント（例えば、細胞の２０〜２５％またはそれ以上）からなることができる。
【００２６】
ドナーＴ細胞は抗原感作されていてもよい。例えば、ドナーＴ細胞は抗原にあらかじめ暴露されていた対象から得ることができる。具体的な抗原としては、例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキシン、ＢＣＧ、百日咳抗原、Ｂ型インフルエンザ抗原および肺炎球菌抗原などの細菌抗原、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘ウイルスまたは肝炎ウイルス抗原などのウイルス抗原、酵母などの真菌類、マラリアなどの寄生虫などが含まれる。
【００２７】
増殖するドナー細胞は、子孫細胞を産生する。ドナー細胞およびその子孫細胞は、任意の期間、一般に１〜３または１〜５日またはそれ以上、例えば、５〜７、５〜１０、５〜１４日の期間で培養または繰返し培養すなわち継代培養することができる。細胞は任意に培養され、細胞培養は、例えば、７〜１０、７〜１４、１０〜１４、１０〜２１、１４〜２８、１４〜３５、１４〜４２日またはそれ以上の、より長期間に繰返し培養または継代される。
【００２８】
ドナー細胞およびその子孫細胞は、抗原提示細胞を用いて複数回刺激される（例えば、１代またはそれ以上の継代で１、２、３、４、５回またはそれ以上）。したがって、抗原提示細胞、抗原、細胞生存因子および血清を用いる最初の培養に続いて、追加の抗原提示細胞またはその同等物を、培養もしくは繰返し培養されたまたは継代されたＴ細胞に一回またはそれ以上随時加えることができる。ドナー細胞およびその子孫細胞はまた、抗原および／または細胞生存因子を用いて複数回刺激される（例えば、一回またはそれ以上の継代で１、２、３、４、５回またはそれ以上）。ここでも、追加の抗原提示細胞または細胞生存因子を最初の培養もしくは繰返し培養されたまたは継代されたＴ細胞に随時加えることができる。
【００２９】
種々の実施例において、特定のＴ細胞サブセットを培養内で増幅することができる。これは、特定Ｔ細胞サブセットの優先的増殖によって、あるいは、特定のＴ細胞サブセットを選別してそれを再培養して増殖することによって達成できる。すなわち、種々の実施例において、特定の特徴を有するＴ細胞、すなわち、特定のＴ細胞レセプター（例えば、Ｖα２４Ｖβ１１）を発現する、一つまたはそれ以上のサイトカインまたは特定型のサイトカインを産生する、または直接的もしくは間接的に細胞を殺傷する活性（例えば、ＮＫ細胞を活性化して抗腫瘍細胞活性を呈する）などの特定の活性を有するＴ細胞を、優先的に刺激して増殖させることができる。例えば、一面において、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞は、細胞ソーティングをしてまたはせずに、優先的に増幅される。他の面において、直接的または間接的な細胞殺傷活性を有するＴ細胞が優先的に増幅される。
【００３０】
ここで用いる用語「細胞生存因子」とは、細胞の生存、増殖、分化を刺激する分子、または細胞運動を調節する、または細胞死（例えば、アポトーシスすなわちプログラム細胞死）を阻害または防止する分子を意味する。そのような因子の具体的な非限定例としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５）およびインターフェロンなどのサイトカイン、キモカイン、抗アポトーシス因子、抗原、または免疫系の細胞表面に通常位置している「ＣＤ」分子と呼ばれる細胞決定因子すなわちマーカーが挙げられる。細胞生存因子として機能するＴ細胞表面分子としては、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０としても知られる）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢとしても知られる）、ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１としても知られる）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１としても知られる）、およびＣＤ２が挙げられる。抗体、リガンドまたはＴ細胞表面分子に結合する作出されたリガンドはまた、細胞生存因子としても機能する。具体例としては、ＣＤ８０およびＣＤ８６などのＣＤ２８リガンド、ＯＸ４０ＬなどのＣＤ１３４リガンド（ＯＸ４０リガンド）、４−１ＢＢＬなどのＣＤ１３７リガンド（４−１ＢＢリガンド）、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、およびＩＣＡＭ−３などのＣＤ１１ａリガンド、およびＣＤ１１ａなどのＣＤ５４リガンドが挙げられる。
【００３１】
細胞生存因子は、単一の刺激用量として加えてもよい。細胞生存因子は、Ｔ細胞生存を伸展延長するために、繰返し培養されたＴ細胞に同一または種々の濃度で複数回任意に加えてもよい。例えば、繰返し培養したＴ細胞に細胞生存因子を７〜９日毎に加えることができる。
【００３２】
抗原にはグリコスフィンゴリピドが含まれる。グリコスフィンゴリピド抗原の例としては、ＫＲＮ７０００（α−ガラクトシルセラミド、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｎ−ヘキサコサノイル−２−アミノ−１，３，４−オクタデカントリオール、麒麟麦酒株式会社、東京、日本）、およびＫＲＮ７０００類似体が挙げられる。ここで用いる用語「ＫＲＮ７０００類似体」とはＫＲＮ７０００と同様に機能する分子を意味し、例えば、ＣＤ１ｄを結合し、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞を活性化するものである。したがって、そのような分子には、ＫＲＮ７０００誘導体、および構造がＫＲＮ７０００に類似する化合物が含まれる。ＫＲＮ７０００類似体の一具体例は、β―グルコシルセラミド（β―ＧｌｕＣｅｒ）である。他のＫＲＮ７０００類似体は当業者に公知であり、本発明に適用でき、例えば、ＷＯ９３／０５０５５、ＷＯ９４／０９０２０、ＷＯ９４／２４１４２、ＷＯ９４／０２１６８、特開平５−９１９３号、およびＵＳ２００２／００３２１５８に記載されている類似体がある。
【００３３】
抗原にはまた、細菌抗原が含まれる。具体的な非限定例としては、破傷風トキソイド、ジフテリアトキシン、ＢＣＧ、百日咳、Ｂ型インフルエンザおよび肺炎球菌抗原が挙げられる。さらなる例としては、ウイルス抗原が挙げられる。具体的な非限定例には、麻疹、風疹、水痘、および肝炎ウイルス抗原が含まれる。
【００３４】
いずれの哺乳動物からの血清も本発明に適用できる。血清は、ドナーＴ細胞をそれから得たヒト対象者、それとは異なるヒト対象者、または非ヒトから得ることができる。血清同等物または無血清培地を哺乳類血清の代替としてもよい。細胞生存および増殖を可能にするアルブミンや増殖因子などの因子を含むそのような血清同等物および無血清培地は当業者に公知であり、さらに市販されている（例えば、ＡＩＭＶ、Gibco-BRL,Inc）。ヒト血清が最大のＴ細胞増殖能を提供する。
【００３５】
ここで用いる「細胞生存因子なしで」または「細胞の非存在下で」という表現は、例えば、ＩＬ−７またはＩＬ−１５などのサイトカインに関して用いられた場合は、ドナー細胞の子孫細胞の培養または繰返し培養中に外因性のＩＬ−７またはＩＬ−１５は細胞に加えられないことを意味する。しかしながら、少量の細胞生存因子（例えば、ＩＬ−７またはＩＬ−１５）がドナーＴ細胞または抗原提示細胞に存在することがある。例えば、細胞がそれらの天然インビボ環境から分離されるために、少量の細胞生存因子がドナー細胞または末梢血単核細胞中に存在することがある。したがって、該表現は少量の一つまたはそれ以上の細胞生存因子が培養されたＴ細胞に存在するような状態は除外しない。
【００３６】
ここで用いる用語「結合」およびその文法的変化形は、言及される構成物が互いに親和性を有することを意味する。「特異的に結合する」とは、結合が二つの分子間で選択的である場合である。特異的結合の一具体例は、リガンドとレセプターＴ細胞表面分子間で起きるものである。結合親和性は、二分子間の解離定数（ＫＤ）で通常、定量的に表される。一般に、解離定数（ＫＤ）が約１×１０−５Ｍ未満または約１×１０−６Ｍまたは１×１０−７Ｍまたは１×１０−８Ｍ未満である場合には特異的結合が非特異的結合から識別される。特異的結合は、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、化学的交差結合を用いるあるいは用いない共沈殿、２ハイブリッドアッセイ等によって検出することができる。
【００３７】
用語「抗体」とは、重鎖および軽鎖可変部、ＶＨおよびＶＬを介して他の分子（抗原）に結合するタンパク質をさす。抗体には、ポリクローナルまたはモノクローナルＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥが含まれる。抗体は、完全な免疫グロブリン分子、ジスルフィド結合で二つの全長軽鎖に連結された二つの全長重鎖、および定常部を含むまたは含まない抗原のエピトープに結合する免疫グロブリンのサブ配列（すなわち断片）、またはそのサブ配列（すなわち断片）であることができる。抗体サブ配列の具体例には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、または一本鎖抗体（ＳＣＡ）断片(例えば、ｓｃＦｖ）が含まれる。
【００３８】
抗体は、カッパまたはラムダ鎖配列を含む。全長抗体は、二つのカッパまたはラムダ軽鎖を含む。カッパとラムダ軽鎖間の主な違いは、定常部の配列にある。ヒトにおいては、カッパ鎖可変部配列はラムダ鎖可変部配列よりも高可変性であり、その結果としてより異なる（多様な）抗体が生じる。
【００３９】
リガンドはまた、一つまたはそれ以上のアミノ酸置換（例えば、保存性置換、すなわち非ヒトまたは非霊長目アミノ酸のヒトまたは霊長目アミノ酸への置換）、付加または欠失を、修飾が機能を破壊しないように有する配列などの修飾型を含む。例えば、修飾された抗体は少なくとも一部は抗原結合活性を維持する。したがって、用語「修飾する」およびその文法的変化形は、修飾された分子の全活性を破壊しない分子の改変を意味する。
【００４０】
修飾物にはまた誘導体配列物が含まれ、例えば、遊離アミノ基が塩酸アミン、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基を形成するアミノ酸；遊離カルボキシル基が塩、メチルおよびエチルエステルを形成するアミノ酸；遊離水酸基がＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成するアミノ酸、ならびにプロリンに代わる４−ヒドロキシプロリン、リジンに代わる５−ヒドロキシリジン、セリンに代わるホモセリン、リジンに代わるオルニチンのような天然に生じるアミノ酸の誘導体が含まれる。さらに、二つのシステイン残基間をジスルフィド架橋して環状ポリペプチドを産するような共有結合を付与する修飾も含まれる。修飾にはまた、タグ（例えば、ポリヒスチジン、Ｔ７、免疫グロブリンなど）、金粒子のような機能的エンティティーを共有結合または非共有結合で抗体に付けるような付加も含まれる。修飾にはさらに、放射性あるいは非放射性の検出可能な標識を分子に付けるあるいは組み入れるものも含まれる。修飾物は、当業者に公知の種々の方法（例えば、ＰＣＲに基づく部位特異的欠失および挿入突然変異、化学修飾および突然変異、交差連結など）を用いて生じさせることができる。
【００４１】
ここで用いる用語「サブ配列」または「断片」は、全長分子の一部を意味する。すなわち、抗体のサブ配列は全長ポリペプチドよりも一つまたはそれ以上のアミノ酸が少ない長さのものである（例えば、一つまたはそれ以上の内部またはアミノもしくはカルボキシ末端アミノ酸の欠失）。したがって、サブ配列は、全長分子よりもアミノ酸が一つ少ないものまでのいずれの長さのでもあり得る。
【００４２】
ポリクローナル抗体の調製およびその精製は、当業者に公知である（例えば、Green et al. (1992) Immunochemical Protocols, pages 1-5, Manson, ed., Humana Press; Harlow et al. (1988), 前出; Coligan et al. (1994) Current Protocols in Immunology, Wiley; およびBarnes et al. (1992) Method in Molecular Biology, Vol. 10, 79-104, Humana Pressを参照されたい）。代わりに、抗体を発現する動物由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作出することによってモノクローナル抗体を産生してもよい。次いで、選出した分泌ハイブリドーマをインビトロ（例えば、組織培養で）またはインビボ（マウス腹水として）で培養して、抗体を精製する。抗体はまた、当業者によく知られた他の技術によって分離または精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988を参照されたい）。モノクローナル抗体もまた、他の技術を用いて調製される（例えば、米国特許第4,902,614, 4,543,439および 4,411,993号; さらにMonoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennet, McKearn, and Bechtol (eds.), 1980を参照されたい）。
【００４３】
本発明の増殖したＴ細胞は対象、ドナー細胞を提供したと同一の対象または異なる対象に導入されて、それによって対象中でＴ細胞数が増加する。このように、本方法は対象に細胞療法を提供する。したがって、本発明はまた、Ｔ細胞関連障害または病状を治療する方法を提供する。
【００４４】
一実施例において、方法は、本発明によって製造されるＴ細胞培養物を対象に治療を施すに充分なように対象に投与することを含む。一面において、ドナーＴ細胞は、増殖したＴ細胞を投与する対象から得る。別の面において、対象は望ましくない数のＴ細胞を有するまたはそのおそれを有する。さらなる面において、対象はＶα２４Ｔ細胞レセプターを発現するＴ細胞を望ましくない数で有するまたはそのおそれを有する者であり、対象は器官または組織移植の候補者またはそれを受けた者であり、あるいは対象は免疫不全（例えば、器官または組織移植に関連した）、自己免疫障害、癌または感染症を有するまたはそのおそれを有する者である。
【００４５】
ここで用いる用語「Ｔ細胞関連障害」とは、望ましくない生理学的病状または病理学的障害で、Ｔ細胞数を増加することまたは細胞殺傷活性、一つまたはそれ以上のサイトカイン産生能、または他の免疫細胞における有益な活性を刺激する能力などの一つまたはそれ以上の固有の有益なＴ細胞活性を有するＴ細胞を提供することによって該病状または障害の一つまたはそれ以上の望ましくない症状が改善されるか該病状または障害の一つまたはそれ以上の原因を軽減できるようなもの全てを意味する。したがって、Ｔ細胞関連病状または障害は、Ｔ細胞数またはＴ細胞活性における異常や不足によって起きるものでなくてもよく、したがって、対象のＴ細胞と完全に無関係であってもよい。むしろ、生理学的病状または病理学的障害は、Ｔ細胞病状または障害と考慮されるためには、本発明の増殖したＴ細胞で治療可能であるかそれに応答することのみがここでは求められる。例えば、腫瘍を有する対象に抗腫瘍活性を有する増殖したＴ細胞を導入することで腫瘍サイズの縮小または腫瘍サイズのさらなる増大や転移を防止することが可能で、対象のＴ細胞は異常や不足でなくても、これによって治療的効果が対象に提供される。
【００４６】
したがって、標的対象には、ここに記述したようなまたは当業者に公知のＴ細胞関連病状または障害を有する者および本発明の増殖したＴ細胞集団を用いて改善できる対象が含まれる。
【００４７】
用語「対象」とは動物を指し、一般には非ヒト霊長目（サル、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、マカクサル）、飼い慣らされた動物（イヌおよびネコ）、家畜（ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、テンジクネズミ）およびヒトを指す。対象には、動物病気モデル（例えば免疫不全または自己免疫マウス）などの哺乳動物が含まれる。
【００４８】
本発明にしたがって治療され得る対象の具体例には、移植片対宿主病、炎症または望ましくない免疫応答、自己免疫疾患、免疫不全および細胞増殖（例えば過増殖）および／または分化障害を有するまたはそのおそれを有する対象が含まれる。ここで用いる「増殖障害」とは、異常な細胞増殖または細胞生存（例えば不十分なアポトーシスによる）によって特徴づけられる病理学的または非病理学的生理学的病状を意味する。用語「分化障害」とは、異常または不十分な細胞分化によって特徴づけられる病理学的または非病理学的生理学的病状を意味する。
【００４９】
対象にはまた、例えば、病原感染症（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルスおよびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などのウイルスによるもの、結核、ライム病またはハンセン病などの細菌性のもの、酵母などの真菌類によるもの、マラリア（プラスモジウム）またはシャーガス病（Trypanosoma cruzi）などの寄生虫性のもの、マイコプラズマによるものなど）を有するまたはそのおそれを有するもの；ワクチン（例えば、ウイルス、細菌、真菌類、寄生虫、マイコプラズマなどに対するもの）を受けているもの；過増殖病状（例えば、転移性または非転移性癌または腫瘍）を有するまたはそのおそれを有するもの；および自己免疫障害または疾患を有するまたはそのおそれを有するものが含まれる。
【００５０】
自己免疫疾患には、例えば、糖尿病、関節炎（リュウマチ性関節炎、若年性リューマチ性関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角膜結膜炎、潰瘍性腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚紅班性狼瘡、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆反応、結節性紅班性ハンセン病、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性知覚神経聴覚喪失、再生不良性貧血、純赤血球貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活性肝炎、スチブンス・ジョンソン病、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、類肉腫症、原発性胆汁性肝硬症、後方ブドウ膜炎、自己抗体の産生、および間質性肺線維症が含まれる。
【００５１】
望ましくない免疫応答には、例えば、炎症またはアトピー性アレルギーなどの抗原または抗生物質に対するアレルギー反応；アテローム性動脈硬化症病変、プラーク破壊および血栓形成などの血管系炎症性疾患；および細胞、組織または器官移植を受けたまたは受けようとしている対象（例えば、移植片対宿主病）が含まれる。移植片対宿主病が起き得る移植の具体的な非限定例としては、骨髄、血管、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓および皮膚移植が挙げられる。移植には、個人の生体からの組織や器官を同一個人のまたは異なる個人の異なる場所に移植するものが含まれる。同一種の遺伝的に不同の動物間の組織または器官の移植は、同種異系移植と称される。動物器官のヒトへの移植は、異種移植と称される。
【００５２】
治療可能な増殖または分化障害または病状には、対象における異常なまたは望ましくない細胞数、細胞増殖または細胞生存によって特徴づけられる、良性および腫瘍性の双方の疾患および生理学的病状が含まれる。用語は、組織病理学的型や侵襲の程度に関係なく、全ての型の癌性増殖または腫瘍形成過程、転移性組織または悪性に変化した細胞、組織、または器官を含むことを意図する。
【００５３】
細胞の増殖および／または分化障害の例としては、癌腫、肉腫、腺癌、神経芽細胞腫などの癌、リンパ腫、白血病、形質細胞腫および骨髄腫などの転移性障害または造血性腫瘍性障害が含まれる。
【００５４】
転移性腫瘍は多数の原発性腫瘍型から起き得るが、これには、乳房、肺、甲状腺、喉頭、頭および首、脳、リンパ系、消化器系（口、食道、胃、小腸、結腸、直腸）、生殖泌尿器官系（子宮、卵巣、子宮頸部、膀胱、睾丸、前立腺）、腎臓、膵臓、肝臓、胆嚢、骨、筋肉、皮膚などの腫瘍が含まれるが、これらには限定されない。
【００５５】
癌腫（carcinoma）とは、上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指し，これには呼吸器系癌、消化器系癌、生殖器泌尿器系癌、睾丸癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、および黒色腫が含まれる。癌腫の代表例としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭および首、結腸、肝臓および卵巣から形成されるものが挙げられる。用語はまた、例えば癌腫性および肉腫性組織からなる悪性腫瘍などを含む癌肉腫を包含する。腺癌には、腺組織の癌腫またはそこで腫瘍が腺様構造を形成するような癌腫が含まれる。
【００５６】
肉腫（sarcoma）とは、間葉系細胞起源の悪性腫瘍を指す。肉腫の例としては、例えば、リンパ肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、および線維肉腫が挙げられる。
【００５７】
増殖性障害のさらなる例としては、造血系癌性障害が挙げられる。ここで用いる用語「造血系癌性障害」には、造血器官の過形成／癌性細胞に関連する疾患、例えば、骨髄、リンパ球または赤血球系またはその前駆細胞から生じるものが含まれる。一般に、疾患は，赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病などの低分化急性白血病から起きる。さらなる骨髄性障害の例としては、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Vaickus, L., Crit Rev. in Oncol/Hemotol. 11:267 (1991)）が挙げられるが、これらには限定されない。リンパ系悪性腫瘍には、Ｂ細胞系ＡＬＬおよびＴ細胞系ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、毛様細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレーム（型）マクログロブリン血症（ＷＭ）が含まれるが、これには限定されない。悪性リンパ腫の追加型として、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫およびその変異型、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）およびリード−シュテルンベルク病が挙げられるが、これらには限定されない。
【００５８】
標的対象もまた、Ｔ細胞関連病状および障害が現われるおそれのある者を含み、例えば、腫瘍（例えば、ｂｒｃａ（乳癌責任遺伝子）の突然変異または遺伝によって乳癌のおそれのある女性などの遺伝子スクリーニング、結腸中の良性ポリープの結腸癌への進行傾向を示す結腸内視鏡検査などの生検、前立腺特異抗原の上昇前立腺癌のリスク増大を示す男性の尿などの生物体液の試験などを通して確認されるものなど）の現われるおそれのある対象が含まれる。したがって、本発明の方法は、Ｔ細胞関連病状または障害が現われるおそれがあるが、病状または障害の明白な症状をまだ呈していない対象の治療に適用できる。
【００５９】
Ｔ細胞は、Ｔ細胞関連病状または障害が起きる前に対象に予防的に投与することができる。例えば、免疫抑制剤（例えば、ステロイド）治療をまさに受けようとしている対象に、免疫抑制療法に続いて一般に起きる免疫抑制を阻害するために、Ｔ細胞を投与することができる。したがって、予防的方法もまた含まれる。
【００６０】
したがって、治療に適切なリスクを有する対象は、適切な対照対象と対比してＴ細胞関連病状または障害を発展させる遺伝的素質または家族歴を有するものとみなすことができる。そのような対象は、ルーチン遺伝子スクリーニング、病状または障害のリスクがあることを確立するための対象の家族歴の照会、組織の生検または病状または障害の高リスク対象であることを示す分子の存在または非存在に関する生物体液のスクリーニングを用いることによって、確認することができる。
【００６１】
本発明の方法は、対象のＴ細胞関連病状または障害の治療を含むが、例えば、病状または障害の一つまたはそれ以上の症状の軽減または期間短縮を含む対象の病状または障害の改善、またはＴ細胞関連病状または障害に関連した症状が現われる対象のリスクを低減するという結果をもたらすであろう。したがって、改善には、免疫不全、自己免疫、アレルギー、過増殖または腫瘍または癌などの過形成病状、病原体感染に関連する一つまたはそれ以上の症状の軽減が含まれ、これらは全て満足すべき臨床的終点である。
【００６２】
改善にはまた、病状または障害の治療に用いられている他の療法の要求を減らすことが含まれる。例えば、Ｔ細胞関連病状または障害を有するまたはそのおそれを有する対象の治療に用いられる薬剤の頻度または量（用量）の低減がある。とくに、ステロイド治療を受けている自己免疫患者では、本発明の増殖したＴ細胞との組合せ療法の場合にはステロイドの必要量を減らすことができる。したがって、改善には、本発明の増殖したＴ細胞を用いる治療前に対象に投与されていたステロイド投与の頻度または用量に比べて、Ｔ細胞治療後はその投与頻度または用量が低減されることが含まれる。
【００６３】
改善は比較的短期間で、例えば、改善は数時間、数日または数週間のこともあるが、例えば数ヶ月または数年間のより長期間にわたることもある。本発明の治療は、Ｔ細胞関連病状または障害のいくらかまたは全症状の完全除去の必要はない。例えば、重度のリューマチ性関節炎をより軽度にすることは改善である。同様に、糖尿病対象におけるインシュリン投与の頻度または用量の低減は改善である。このように、短期または長期間に、対象の病状に主観的または客観的に検出できる改善がある場合に、満足すべき臨床的終点が達成される。
【００６４】
Ｔ細胞の投与量は、一般に「有効量」で、上述したようなＴ細胞関連病状または障害またはその症状における治療的効果や改善のような望ましい効果をもたらすに充分な量である。例えば、対象のＴ細胞数を増加することが望ましい場合の有効量とは、認め得るほどにＴ細胞数を増加させる量である。対象の固形腫瘍の治療が望まれる場合の有効量とは、腫瘍の大きさの縮小が認められるか、腫瘍の少なくとも一部（例えば、細胞の１０％または２０％またはそれ以上）の腫瘍の大きさのさらなる増大を防ぐか、または腫瘍の転移を阻害するような量であり、これらの改善は全て満足すべき臨床的終点である。侵襲または非侵襲的画像法を用いて固形腫瘍を検査することによって、腫瘍サイズの縮小または腫瘍サイズの増大阻害を確認することができる。
【００６５】
もちろん、本発明による対象の治療にはさらに、Ｔ細胞関連病状または障害の治療に用いられる他の療法を補足することが含まれる。他の療法には、薬剤療法、外科的切除、移植、放射線治療などが含まれる。Ｔ細胞は、他の治療プロトコルの前に、それと平行してまたはその後に投与することができる。例えば、増殖したＴ細胞は、病原体または癌に対する免疫応答を上げるための免疫増強剤または他の治療的プロトコル（例えば、サイトカイン治療、化学療法、外科的除去など）とともに用いることができる。あるいは、増殖したＴ細胞は、自己免疫障害、炎症の治療または移植片対宿主病などの移植拒絶反応の阻害のための免疫抑制剤（例えば、ステロイド）または他の治療的プロトコルとともに用いることができる。
【００６６】
増殖したＴ細胞は、例えば、Ｔ細胞関連病状または障害の一つまたはそれ以上の症状の軽減および持続期間短縮を達成するために、例えば、単一または複数用量で週１回、約１〜１０週間または適当な期間、対象に投与することができる。用量は、治療される特定の病状または障害、病状や障害の範囲や程度、望まれる臨床終点、以前のまたは同時進行の治療、対象の健康状態、年齢、性別または人種および他の当業者に公知の因子によって変化し得る。そのような因子は、治療効果に充分な量の提供に要求される投与量および時間に影響を及ぼし得る。用量は経験的に決定されるか動物疾患モデルを用いるか随意にヒト臨床治験において決定することができる。予防的および治療的処理を含む本発明の方法において、方法、用量またはプロトコルは薬理ゲノム的データに基づいて特別に調整または修飾することができる。
【００６７】
本発明はさらに医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は、例えば、対象にインビボまたはエキソビボ投与して、本発明の方法を実施するためのＴ細胞関連病状または障害の治療に有用である。
【００６８】
医薬組成物は、「薬学的に許容できる」および「生理学的に許容できる」担体、希釈剤または賦形剤を含む。ここで用いる用語「薬学的に許容できる」および「生理学的に許容できる」には、増殖したＴ細胞の投与と適合する溶媒（水性および非水性）、溶液、乳液、分散媒が含まれる。
【００６９】
医薬組成物は特定の投与経路に適合するように調製され得る。したがって、医薬組成物は、種々の投与経路に適した担体、希釈剤または賦形剤を含む。薬物調製およびデリバリーシステムは当業者に公知である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa, (1993); およびPoznansky et al., Drug Dilivery Systems, R.L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980) pp. 253-315を参照されたい）。
【００７０】
本発明はさらに、適当な包装材中に任意に包装された増殖したＴ細胞およびその医薬処方物を含むキットを提供する。通常、キットには、構成物の記述またはその組成物のインビトロ、インビボ、またはエキソビボにおける使用説明を含むラベルまたは包装挿入物が含まれる。
【００７１】
用語「包装材」とは、キットの構成物を収納する物理的構造物を指す。包装材は、構成物を滅菌状態に保つことができ、そのような目的に通常使用される材料で作ることができる（例えば、紙、波形線維、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど）。キットの各構成物を個々の容器内に封入して、種々の容器の全てを単一の包装に収めることができる。本発明のキットは冷蔵に適するように作出できる。
【００７２】
ラベルまたは包装挿入物には、適当な記述説明を含むことができる。したがって、本発明のキットは、キット構成物を本発明の任意の方法において使用するためのラベルまたは説明書を追加して含むことができる。説明書には、ここに記述した治療方法を含む本発明の任意の方法を実施するための説明書を含むことができる。
【００７３】
説明書は、キット内またはそれに添付した紙または厚紙などの「印刷物」上、またはキットまたは包装材に添付されたまたはキットの構成物を含むバイアルもしくはチューブに貼付けられたラベル上にあることができる。説明はさらに、ディスク（フロッピーディスクまたはハードディスク）などのコンピュータ可読媒体、ＣＤ−またはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭなどの光学ＣＤ、磁気テープ、ＲＡＭおよびＲＯＭなどの電気記憶媒体ならびに磁気／光学記憶媒体などのこれらの混成物上に含まれてもよい。
【００７４】
とくに定義がなければ、ここで用いられる全ての技術および科学用語は、本発明の属する分野の通常の技術者に普通に理解されるのと同じ意味を有する。ここに記述されたものに類似するまたは同等の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、ここには適する方法および材料を記述する。
【００７５】
ここに引用された全ての出版物、特許および他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ引用およびＡＴＣＣ引用は、参考文献としてここに完全なものを付する。矛盾する場合は、定義を含んで、明細書に準拠する。
【００７６】
ここで用いる単数表現は、前後関係で明示されない限り、複数の意味を包含する。したがって、例えば、「Ｔ細胞機能または活性」という表現には、そのような機能または活性が複数であることを含み、「Ｔ細胞」は一つまたはそれ以上のＴ細胞について言及していると理解されたい。
【００７７】
次のような略語が使用される。ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞、ＫＲＮ７０００：海綿に由来するα−ガラクトシルセラミド誘導体、Ｖα２４：Ｔ細胞レセプターのアルファ鎖、Ｖβ１１：Ｔ細胞レセプターのベータ鎖、ＮＫ：ナチュラルキラー細胞、ＮＫＴ：ナチュラルキラーＴ細胞、ＴＴ：破傷風トキソイド、ｒｈＩＬ−２：組換えヒトインターロイキン−２、ｈＣＤ１ｄ−ＫＲＮ７０００テトラマー：ＫＲＮ７０００をロードしたヒトＣＤ１ｄテトラマー、およびＦＣＳ：ウシ胎児血清。
【００７８】
本発明の多数の実施例を記述した。それでも、本発明の精神および範囲に反することなく種々の修飾をなすことができることは理解されよう。したがって、次の実施例はクレームに記述の発明の範囲を説明することを意図するものであって、それを限定するものではない。
【実施例】
【００７９】
実施例１
本実施例は材料および方法に関する。
【００８０】
細胞分離
ヘパリン化静脈血は、Scripps Research Institute, La Jolla, CA（GCRC正常血液採血プログラム）において健康な成人ボランティアから得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Histopaque-1077（Sigma Diagonistics, Inc., St. Louis, MO）を用いる密度勾配遠心分離によって得た。細胞は、９０％ウシ胎児血清（カタログ番号２６３００−０６１、GibcoBRL, Grand Island NY）または９０％のプールしたヒト血清（ICN Biomedicals, Inc, Aurora, OH）および１０％ＤＭＳＯ（カタログ番号ＢＰ２３１−１、Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ）を含む培地中で１０〜２０×１０６／ｍｌの濃度で凍結し、冷凍バイアル（カタログ番号５０００−００１２、Nalge Co., Rochester, NY）に入れて液体窒素中で保存した。
【００８１】
抗原
海綿Agelas mauritaniusに由来するグリコスフィンゴリピドであるＫＲＮ７０００（α−ガラクトシルセラミド、麒麟麦酒株式会社、東京、日本）を用いて、ＰＢＭＣを刺激した。ＫＲＮ７０００類似体のβ−ガラクトシルセラミド（β−ＧａｌＣｅｒ）もまた麒麟から得た。ストック溶液は１００μｇ／ｍｌＤＭＳＯ溶液で、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で用いた。ビヒクル対照培養物は０．１％ＤＭＳＯを含んだ。破傷風トキソイド（＃８０５１）は、Dutch National Institutes of Health (Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieuhygiene, Bilthoven, The Netherlands）から得た。
【００８２】
抗体および試薬
抗ヒトＶα２４−ＦＩＴＣおよび抗ヒトＶβ１１−ＰＥは、Beckman Coulter（Miami, FL）から得た。抗ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣおよび抗ヒトＣＤ４−ＰＥは、BD/PharMingen（San Diego, CA）から得た。ＫＲＮ７０００をロードしたヒトＣＤ１ｄテトラマー（ｈＣＤ１ｄ−ＫＲＮ７０００テトラマー）をピコエリスリン−ストレプトアビジン（BD/PharMingen）またはサイクロム−ストレプトアビジン（BD/PharMingen）に付けたものは、記述（Kroft and Swain, J Immunol 154:4269 (1995)）を修飾した方法で作出したもので、M. Kronenberg（La Jolla Institute for Allergy and Immunology）またはA. Matsumoto（Gemini Science, Inc., San Diego, CA）から得た。ＰＢＭＣ培養のためのｒｈＩＬ−１５（カタログ番号２００−１５、Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ）は１００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いた。マウス抗ヒトＣＤ１ｄ抗体（４２．１）（Exley, et al., Immunology 100:37 (2000)）はMark Exley（Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA）から寄贈された。アイソトープ対照マウスＩｇＧ１は、Southern Biotech（Birmingham, AL）から購入した。ＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウスＩｇＧは、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.（West Grove, PA）から購入した。フローサイトメトリーは記述（Rogers and Croft, J Immunol 163:1205 (1999)）のように行って、データをCellquestソフトウェアを用いて分析した。
【００８３】
細胞培養
ＰＢＭＣは、Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩（カタログ番号１７−６０２Ｅ、Bio Whittaker, Walkersville, MD）、１０ｍＭヘペス（カタログ番号１５６３０−０８０、GibcoBRL）および５．５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール（カタログ番号２１９８５−０２３、GibcoBRL）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（カタログ番号１１８７５−０９３）中で培養した。培養物は、１０％のプールされた正常ヒト血清（カタログ番号８２３２０、ICN Biomedicals, Inc.）、１０％ヒトＡＢ血清（カタログ番号８２３１８、ICN)、または１０％の自家ドナー血清を含んだ。血清は使用前に５６℃で２０分間加熱して不活化した。
【００８４】
最初の刺激のために、ＰＢＭＣを、４８または２４穴プレート（Falcon＃３０７８または３０４７、Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ）で１×１０６細胞／ｍｌで６％ＣＯ２を用いて加湿したインキュベーター中で７〜１２日間培養した。培養開始時に、ＫＲＮ７０００を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２（カタログ番号２００−０２、Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJまたはカタログ番号２３−６０１９、Hoffmann-La Roche, Inc., Nutley, NJ）とともに加えた。
【００８５】
再刺激培養
再刺激培養のためのＰＢＭＣは、新鮮血から分離するか凍結ＰＢＭＣのバイアルから調製した。細胞を融かして、ＲＰＭＩ中で２回洗浄した。約１０×１０６個の細胞を、１０％ヒト血清および１００ｕｇ／ｍｌのＫＲＮ７０００を含む４ｍｌの培地に再懸濁した。細胞を、６０ｍｍペトリ皿（カタログ番号０８−７５７−１３Ａ、Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）で３７℃で４〜５時間培養した。細胞をピペットで吸ってペトリ皿を掻いて、細胞をチューブ中に集めて１３７Ｃｓ（Gammacell 40, Kanata, カナダ）を用いて３０００ラドを放射した。デブリをナイロンストレーナー（Falcon＃２３５０、Becton Dicknson）を通してピペットを用いて除去して、細胞を使用前に１回洗浄した。細胞回収率は一般に出発細胞数の５０〜８０％であった。選別しなかったＮＫＴ細胞（２×１０５／ｍｌ）を、５倍量のＫＲＮ７０００パルスされた放射処理した自家ＰＢＭＣを用いて１０％ヒトＡＢ血清（ICN Biomedicals, Inc., Aurora, OH）を含むＲＰＭ１１６４０培地中で再刺激した。ｒｈＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ、Hoffman LaRoche, Nutley, NJ）を１日後に加えた。一定量の細胞（通常０．５−２×１０６個）を７日毎に再刺激した。Ｖα２４選別したＮＫＴ細胞系は上記のようにして再刺激されたが、同種異系（自家の代わりに）のＫＲＮ７０００パルスされた放射処理したＰＢＭＣを含んだ。ＮＫＴ細胞系を刺激する同種異系ＰＢＭＣの能力における有意差は検出されなかった。選別されたＶα２４＋Ｔ細胞系を定期的に凍結し、液体窒素中で保存し、次いで融解して１年にわたって再刺激した。合計１０〜１１回の再刺激サイクルを、ドナー１８（＞９０％ＣＤ４＋）およびドナー２０（＞９５％ＣＤ４−）Ｔ細胞系を用いて行った。Ｔ細胞はトリパンブルー排除法を用いて定量した。培養期間を通して、選別されたＴ細胞系は、＞９０％Ｖα２４＋およびｈＣＤ１ｄ／ＫＲＮ７０００テトラマー＋(テトラマー＋）を維持した。Ｖα２４抗体（Beckman/Coulter）およびｈＣＤ１ｄ／ＫＲＮ７０００をロードしたテトラマーはＴ細胞の同一集団を確認し、これらの研究において交替して使用された。
【００８６】
細胞ソーティング
精製Ｖα２４＋細胞は、ビオチン化抗Ｖα２４抗体（Beckman Coulter）を用いたポジティブ磁気ビーズソーティング（MACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA）、続いてのストレプトアビジン標識ミクロビーズ（Miltenyi Biotec）によって得た。あるいは、Ｔ細胞は、FACSStarplusソーター（Becton Dickinson, Mountain View, CA）を用いてＶα２４＋ＣＤ４＋およびＶα２４＋ＣＤ４−サブセットに無菌的に選別された。
【００８７】
細胞系
細胞系Ｕ９３７（組織球リンパ腫）、ＲＡＪＩ（バーキットＢ細胞リンパ腫）およびＫ５６２（赤白血病）は、元はAmerican Type Culture Collection ＡＴＣＣ（Mannassas, VA））から得られたもので、Dr. D. Green（La Jolla Institutive for Allergy and Immunology (LIAI), San Diego, CA）から寄贈された。Ｔ細胞白血病Jurkat細胞系は、Nobuaki Takahashi(麒麟麦酒株式会社、群馬、日本）から得た。細胞は、上記のように１０％ウシ胎児血清（GibcoBRL）、ペニシリン、ストレプトマイシン、２−メルカプトエタノールおよびヘペスを含むＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。細胞傷害分析のために、分析前に細胞を１×１０５／ｍｌの濃度で５０ｎｇ／ｍｌのＫＲＮ７０００、β−ＧａｌＣｅｒまたは０．５％ＤＭＳＯ（ビヒクル）とともに１６時間培養した。
【００８８】
クロム放出およびＴ細胞増殖分析
５１Ｃｒ細胞傷害性分析を次のようにして行った。０．２ｍｌ培養培地中、Ｕ９３７、Ｋ５６２またはJurkat細胞系からの合計５×１０３個の５１Ｃｒ標識細胞（Ｎａ２５１ＣｒＯ３）（ICN Biomedicals，Inc.）を標識細胞として、さらに種々の数のエフェクターＶα２４＋Ｔ細胞を、丸底マイクロタイターウェルに入れた。培養は３７℃で６％ＣＯ２を含む雰囲気下で５時間行い、０．１ｍｌの上清を各ウェルから集めた。特異的５１Ｃｒ放出のパーセントを次のように算出した。［（ｃｐｍ実験群−ｃｐｍ自然放出）／（ｃｐｍ最大放出−ｃｐｍ自然放出）］×１００。
【００８９】
ＰＢＭＣの増殖は、２×１０５細胞／ウェル（０．２ｍｌ）を用いて９６穴平底プレートで三重測定した。細胞を５日間培養して、［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウェル、ICN Pharmaceuticals, Irvine, CA）を用いて最後の１２時間にパルスした。
【００９０】
ＮＫ細胞分離および細胞傷害分析
ＮＫ細胞をStem Cell Technologies (Vancouver, BC, カナダ）（カタログ番号１４０５５）からのキットを用いて健康ドナーＰＢＭＣからポジティブ選択した。精製後に得た細胞の９５％以上は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−であった（データ非表示）。これら精製ＮＫ細胞（新鮮ＮＫ細胞）はエフェクターとして５１Ｃｒ放出分析に用いるか、または活性化ＮＫＴ細胞系からの上清とともに３日間培養した。あるいは、ＮＫ細胞を２ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−γとともに培養した。ＮＫＴ細胞系からの上清は、抗Ｖα２４被覆したウェル上で１７時間活性化した後に得られた。Ｔ細胞を５×１０５／ｍｌで４８穴プレートに入れて、加湿インキュベータで６％ＣＯ２下で培養した。１７時間後に上清を集めて、０．２２μＭフィルターで濾過して、１：２希釈でＮＫ細胞培養物に加えた。ＮＫ細胞を１×１０６細胞／ｍｌで２４または４８穴プレートにプレートして分析前に３日間培養した。
【００９１】
サイトカイン分析
サイトカイン分泌を既記されたようにＥＬＩＳＡによって上清中で測定した（Matsuda, et al., J Exp Med 192:741 (2000)）。Ｔ細胞を、１０％ヒトＡＢ血清、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび５００ｎｇ／ｍｌイオノマイシンを含むＲＰＭＩ培地中５×１０５／ｍｌでプレートした。２４時間の活性化後に上清を集めて、−８０℃で凍結した。抗ＩＬ−４（カタログ番号１４−７０４９）、ビオチン化抗ＩＬ−４（カタログ番号１３−７０４８）、抗ＩＦＮ−γ（カタログ番号１４−７３１８）およびビオチン化抗ＩＦＮ−γ（カタログ番号１３−７３１９）、抗ＩＬ−１０（カタログ番号１４−７１０８−８１）、ビオチン化抗ＩＬ−１０（カタログ番号１３−７１０９−８１）、抗ＴＮＦα（カタログ番号１４−７３４８−８１）、ビオチン化抗ＴＮＦα（カタログ番号１３−７３４９−８１）、およびビオチン化抗ＩＬ−５（カタログ番号１３−７０５９−８１）は、eBioscience（San Diego, CA）から購入した。抗ＩＬ−２（カタログ番号５５５０５１）、ビオチン化抗ＩＬ−２（カタログ番号５５５０４０）、抗ＧＭ−ＣＳＦ（カタログ番号５５４５０２）およびビオチン化抗ＧＭ−ＣＳＦ（カタログ番号５５４５０５）は、BD PharMingen（San Diego, CA）から購入した。抗ＩＬ−５（クローンＴＲＦＫ５）はMichael Croft（La Jolla Institute for Allergy and Immunology, San Diego, CA）から得た。ｒｈＴＮＦα（カタログ番号３００−０１Ａ）、ｒｈＩＬ−５（カタログ番号２００−０５）、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（カタログ番号３００−０３）、およびｒｈＩＬ−１０（カタログ番号２００−１０）標準は、Pepro Tech Inc. から購入した。ＥＬＩＳＡの検出限界は１０〜１００ｐｇ／ｍｌであった。
【００９２】
細胞内サイトカイン染色は記述のように行った（Rogers, P.R. and M. Croft, J Immunol, 163:1205 (1999))。簡単に述べると、選別されたＶα２４＋Ｔ細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ，５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン、および５μｇ／ｍｌのブレフェルディンＡ（Sigma, St. Louis, MO)を含む培地で５×１０５／ｍｌで５時間培養した。細胞を集めて、ビオチン標識抗Ｖα２４抗体、続いてサイクロム−ストレプトアビジン（BD PharMingen）を用いて染色した。細胞を固定して、サポニン（Sigma）で透過性にして、ＰＥ標識した抗ヒトＩＬ−２（BD/PharMingen）、抗ヒトＩＦＮ−γ（Caltag Laboratories, Burlingame, CA）または抗ヒトＩＬ−４（Caltag Laboratories）抗体とともにインキュベートした。特異的染色は生存Ｖα２４＋細胞上で示される。
【００９３】
実施例２
本実施例は、Ｖα２４／Ｖβ１１Ｔ細胞レセプターを有する健康ヒトドナーＰＢＭＣ中にＮＫＴ細胞が存在し、これら細胞がヒトｈＣＤ１ｄ−ＫＲＮ７０００テトラマー試薬を結合することを示すデータについて記述する。
【００９４】
ヒトＰＢＭＣは、多くの異なる細胞型を含み、そのいくつかはＣＤ３およびＣＤ１６１に対する抗体で識別される。従来のＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１６１−）はドナーＰＢＭＣにおける細胞の主要（平均５５％）をなし、一方、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１６１＋）は約２〜１５％をなす（平均６、図１）。１０〜２０％のＣＤ３＋Ｔ細胞はＣＤ１６１表面マーカーを発現し、ＮＫＴ細胞と分類される（Bendelac, et al., Annu Rev Immunol 15:535 (1997)）。これらの細胞はＰＢＭＣ中の細胞の５〜１１％を占める。極めてわずかなパーセントのＴ細胞（０．００６〜０．１５％）はＶα２４／Ｖβ１１Ｔ細胞レセプターを発現し（図１の下段パネルおよび図２の上段パネル）、ＣＤ９４、ＣＤ１６１、ＮＫＧ２Ａ、および２Ｂ４などのＮＫ細胞マーカーの多様な発現を示す（Exley, et al., J Exp Med 186:109 (1997); Wilson, et al., Nature 391:177 (1998); Lee, et al., J Exp Med 195:637 (2002)）。
【００９５】
ドナーＰＢＭＣは、Ｖα２４／Ｖβ１１Ｔ細胞レセプターを発現する小パーセントのＴ細胞を含む（図１）。図２（上段パネル）に示されるように、ＰＢＭＣ中のほぼ同パーセントの細胞もまた、ＣＤ３に対する抗体およびＫＲＮ７０００をロードした新規ヒトＣＤ１ｄテトラマー試薬（ｈＣＤ１ｄ／ＫＲＮ７０００テトラマー）によって確認される（Kroft and Swain, J Immunol 154:4269 (1995); Benlagha, et al., J Exp Med 191:1895 (2000)）。健康ドナーＰＢＭＣ中のＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞の頻度は、ｈＣＤ１ｄ／ＫＲＮ７０００テトラマー＋／ＣＤ３＋細胞とほぼ同じである（Gumperz, et al., J Exp Med 195:625 (2002)）。これらのデータは、ｈＣＤ１ｄ−ＫＲＮ７０００テトラマーはＴ細胞のＶα２４＋Ｖβ１１＋Ｔ細胞レセプター陽性集団に結合し、それを確認するという仮説を支持する。
【００９６】
ＫＲＮ７０００およびｒｈＩＬ−２のＰＢＭＣへの添加は、Ｖα２４／Ｖβ１１Ｔ細胞レセプターを発現する特定のＴ細胞サブセットの増幅を誘導する。これらの細胞は、Ｖα２４またはＶβ１１に対する抗体またはｈＣＤ１ｄ−ＫＲＮ７０００テトラマープラス抗ＣＤ３抗体を用いて確認することができる（Gumperz, et al., J Exp Med 195:625 (2002)）。
【００９７】
データは、ＫＲＮ７０００に応答してインビトロで増幅されるＴ細胞はほぼ全てがＶα２４＋Ｖβ１１＋およびＣＤ１ｄ／ＫＲＮ７０００テトラマー＋であることを示す（図２、下段パネル）。ＫＲＮ７０００およびｒｈＩＬ−２を用いる７日間培養の後、ヒトＰＢＭＣ中の生細胞の１４％はＶα２４およびＶβ１１に対する抗体を用いて染色される（図２、下段パネル）。ｈＣＤ１ｄ／ＫＲＮ７０００テトラマーはほぼ同パーセントの細胞と結合し、ほぼ全てのｈＣＤ１ｄ／ＫＲＮ７０００テトラマー＋細胞はまたＶα２４およびＶβ１１陽性である。これらデータは、ＫＲＮ７０００に応答して増幅する細胞はＴ細胞レセプター鎖に対する抗体（Ｖα２４およびＶβ１１）またはｈＣＤ１ｄ／ＫＲＮ７０００テトラマー試薬のいずれかを用いて確認できることを示す。ほぼ全てのｈＣＤ１ｄ／ＫＲＮ７０００テトラマー結合細胞はＶα２４＋である。したがって、ＫＲＮ７０００に応答して増幅する細胞を確認するために、ｈＣＤ１ｄ−ＫＲＮ７０００テトラマー（抗ＣＤ３抗体ありまたはなしで）はＶα２４またはＶβ１１に対する抗体と交替で用いることができる。
【００９８】
実施例３
本実施例は、外因性増殖因子がＫＲＮ７０００反応性（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋）Ｔ細胞を増幅できることを示すデータに関して記述する。
【００９９】
表１に示すように、健康ドナーＰＢＭＣのＫＲＮ７０００またはＩＬ−２をそれぞれ単独を用いた刺激は、ごく僅かのｈＣＤ１ｄ−ＫＲＮ７０００テトラマー＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の増幅しか誘導しない（パーセントおよび細胞数の双方において）。しかしながら、ＩＬ−２またはＩＬ−１５のような細胞生存因子の添加は、培養中のテトラマー＋Ｔ細胞のパーセントおよび細菌数の双方を大いに増加する。ＫＲＮ７０００単独に比べて、ＩＬ−２をＫＲＮ７０００とともに加えると、培養中のテトラマー＋Ｔ細胞数は約３００倍増加した。同様のデータが異なる８以上のドナーで得られた。
【０１００】
表１  ＣＤ３＋ｈＣＤ１ｄ／ＫＲＮ７０００テトラマー＋Ｔ細胞の増幅
試料         ％CD3＋テトラマー細胞  細胞回収（×10６）テトラマー＋細胞数
KRN7000単独            0.03              1.04              312
IL-2単独               0.28              0.71            1,988
KRN7000プラスIL-2      8.9               1.05           93,450
KRN7000プラスIL-15     7.2               0.66           47,520
ＰＢＭＣ（１×１０６／ｍｌ）をＫＲＮ７０００単独（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＩＬ−２単独、または１００ｎｇ／ｍｌのＫＲＮ７０００プラス１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２もしくは１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１５を用いて７日間培養した。ＣＤ３＋テトラマー＋細胞のパーセントは、ＣＤ３およびｈＣＤ１ｄ／ＫＲＮ７０００テトラマーに対する抗体を用いるフローサイトメトリーによって決定した。細胞回収は、トリパンブルー排除法によって決定した。テトラマー＋細胞数は、ＣＤ３＋テトラマー＋細胞のパーセントに回収された細胞数を掛けることによって決定した。
【０１０１】
ＫＲＮ７０００およびｒｈＩＬ−２を用いて刺激された２０のドナーＰＢＭＣからのＶα２４＋Ｖβ１１＋Ｔ細胞増幅の要約を、表２に示す。ＫＲＮ７０００およびｒｈＩＬ−２を用いた培養の７日後に、培養中のＶα２４＋Ｖβ１１＋Ｔ細胞のパーセントは平均５４倍に増加した（７〜１８６倍の範囲）。
【０１０２】
表２  ＰＢＭＣからのＶα２４＋Ｖβ１１＋Ｔ細胞増幅
Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞の％  Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞増幅％（倍）
ドナー       ０日目       ７日目
2.11          0.20         19                 95
1             0.11          1.8               16
2             0.04          6.6              165
3             0.008         0.12              15
4             0.59         23                 39
5             0.07         13                186
8             0.03          0.20               7
9             0.05          1.5               30
10            0.08          1.1               14
11            0.04          0.33               8
12            0.10          3.6               36
13            0.008         0.40              50
14            0.04          2.3               58
15            0.02          0.72              36
16            0.006         0.37              62
17            0.10          2.7               27
18            0.09         12                 33
19            0.07          5.3               76
20            0.07          0.56               8
21            0.07          0.89              13
ＰＢＭＣ中（０日目）または１００ｎｇ／ｍｌのＫＲＮ７０００および１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を用いて７日間培養したＰＢＭＣ中のＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞のパーセントは、フローサイトメトリーによって決定した。
【０１０３】
７日後の培養中のＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞のパーセントの増幅倍数を右欄に示す。
【０１０４】
実施例４
本実施例は、外因性ＩＬ−２が破傷風トキソイドの添加によって代替できることを示すデータに関する。
【０１０５】
インビトロおよびインビボでのＴ細胞増幅のための外因性ＩＬ−２の使用は、目的の細胞の特異的な増幅だけでなく、他のＴ細胞集団の増幅をももたらす。もしＩＬ−２または他の細胞生存因子をその場で充分量生じさせることができれば、外因性ＩＬ−２の量を減らすまたは除くことができる。外因性ＩＬ−２の必要性（ＫＲＮ７０００で刺激されたＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞の増幅において）はドナーがそれに対して免疫を受けたタンパク質の添加によってなくすことができ得る。
【０１０６】
多くのヒトがジフテリア／百日咳／破傷風（ＤＰＴ）で免疫され、破傷風トキソイドで追加免疫されていることから、活性化されて破傷風トキソイドに応答してサイトカインを分泌する記憶Ｔ細胞を保持している。ＰＢＭＣは破傷風トキシンに応答する。健康ドナーＰＢＭＣへの破傷風トキソイドの添加は、トリチウム化チミジン取込みで測定されるように細胞増殖を誘導する（表３、右方欄）。これに対して、ＫＲＮ７０００単独の添加は細胞の増殖をほとんどまたは全く誘導しなかった。破傷風トキソイドをＫＲＮ７０００培養物に添加した結果、ＫＲＮ７０００または破傷風トキソイド単独添加よりも細胞増殖が増大した。ＩＬ−２をＫＲＮ７０００培養物に添加した結果、細胞増殖がはるかに増大したが、この増殖の増大の多くはＩＬ−２のみによるものだった。破傷風トキソイドの最も顕著な影響は、７日目に回収できるＶα２４／Ｖβ１１細胞数に見られる（第３欄）。ＫＲＮ７０００、ＩＬ−２、または破傷風トキソイドを単独で用いる培養では、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞の増幅はほとんど見られなかったが、ＫＲＮ７０００との破傷風トキソイドの添加によってＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞数は大きく増加した。破傷風トキソイドプラスＫＲＮ７０００を用いて生じたＴ細胞数は、ＫＲＮ７０００に加えて外因性ＩＬ−２を用いた培養のものの６５％であった（３２，０００対４９，５８０）。したがって、破傷風トキソイドは外因性ＩＬ−２の細胞増殖効果を一部代替することができ、Ｖα２４＋Ｔ細胞増幅を助ける作用剤として使用され得る。同様の結果は、他の４ドナーのうちの３ドナーにおいて見られた。
【０１０７】
表３  破傷風トキソイド（ＴＴ)は、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞増幅における外因性ＩＬ−２を一部代替することができる。
条件 細胞回収（×106） Vα24/Vβ11細胞％ Vα24/Vβ11細胞数 増殖cpm
培養前           1.0              0.07%                 700     
IL-2＋DMSO       1.01             0.20                2,020          30,233 
KRN7000単独      0.85             0.25                2,125           1,145
TT単独           1.2              0.60                7,200          11,783
TT＋KRN7000      1.28             2.5                32,000          16,431
KRN7000＋IL-2    1.34             3.7                49,580          45,704
TT+KRN7000+IL-2  1.72             3.1                53.320          51,405
右欄（増殖）は、５日間培養された細胞のトリチウム化チミジン取込みを示す。代表的５ドナーの一つを示す。ドナー９からのＰＢＭＣ（１×１０６／ｍｌ）を、１００ｎｇ／ｍｌのＫＲＮ７０００、破傷風トキソイド（ＴＴ）、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２（ＩＬ−２）、またはビヒクル（ＤＭＳＯ）を用いて７日間培養した。細胞回収はトリパンブルー排除法で決定し、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞のパーセントはフローサイトメトリーによって決定した。Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞数は、細胞回収に培養中のＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞のパーセントを掛けて決定した。
【０１０８】
実施例５
本実施例は、ドナー血清の使用によってＶα２４／Ｖβ１１Ｔ細胞の増幅を増大できることを示すデータに関して記述する。
【０１０９】
ドナー特異性すなわち自家血清の使用は、Ｔ細胞増幅に関して最良だった。表４は、市販のプールされたヒト血清またはヒトＡＢ血清を加えた培養物に対して、熱不活化自家ドナー血清の使用がインビトロでのＶα２４／Ｖβ１１細胞の増幅を増大できることを示す。３ドナーにおいて、Ｖα２４／Ｖβ１１細胞の増加はＫＲＮ７０００で増幅され、自家ドナー血清は市販のプールされたヒト血清を用いた場合よりも７倍まで増幅された。これらの結果は、自家ヒト血清はＫＲＮ７０００を用いて増幅されたＴ細胞数を増大することができ、ＰＢＭＣの初期培養に最大の増殖効果をもたらす可能性があることを示す。
【０１１０】
表４  ドナー血清は最良のＶα２４＋Ｖβ１１＋Ｔ細胞増幅をもたらす。
ドナーPBMC      ７日間でのVα24+Vβ11+Ｔ細胞数の増加（倍）
プールされたヒト血清 ヒトＡＢ血清 ドナー血清
13                  3.4                11                  25
14                 68                 243                 395
15                 11                  67                  73
７日間培養後のＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞の増加（倍）を示す。２実験のうちの一つを示すが、同様のデータが他の４ドナーを用いた場合も得られた。ドナー１３〜１５からのＰＢＭＣ（１×１０６／ｍｌ）をＫＲＮ７０００（１００ｎｇ／ｍｌ）およびｒｈＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて１０％プール血清、１０％ＡＢ血清、または１０％ドナー血清を含む培地中で７日間培養した。細胞を数えて、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞のパーセントをフローサイトメトリーによって決定した。培養前および培養後のＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞数は、回収された細胞数に培養中のＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞のパーセント（フローサイトメトリーで決定）を掛けて決定した。
【０１１１】
実施例６
本実施例は、ＣＤ３＋テトラマー＋（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋）Ｔ細胞がＫＲＮ７０００およびＩＬ−２を用いる繰返し培養（刺激）によってインビトロで増幅できること、および健康ドナーＮＫＴ細胞系はソーティングおよび再刺激後にインビトロで増幅し続けることを示すデータに関する。
【０１１２】
表１および２に示したように、ＫＲＮ７０００およびｒｈＩＬ−２を用いたＰＢＭＣの最初の刺激の結果、Ｖβ１１＋Ｖβ１１＋（またはＣＤ３＋テトラマー＋）細胞の著しい増幅が７日後にもたらされる。この増幅は、培養物がＫＲＮ７０００−パルスされて放射処理された自家ＰＢＭＣおよびｒｈＩＬ−２で再刺激される場合に継続する（表５〜７）。表５および６において、Ｔ細胞はＫＲＮ７０００およびＩＬ−２を用いて最初に７日間増幅される。次いで、細胞の一部を同一ドナーからのＰＢＭＣ（すなわち自家ＰＢＭＣ）で再刺激する。全非分離自家ＰＢＭＣの使用は簡単で、Ｔ細胞再刺激および増幅のための抗原提示細胞の精製の必要がない。
【０１１３】
９ドナー培養物の再刺激の結果（表５）は、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞のパーセントは各再刺激期間（７日目、１４日目および２１日目）後のほとんどの培養物で増幅し続けることを示す。培養２１〜２８日後（再刺激２〜３回目）、９ドナーのうちの４ドナーにおける細胞の大部分は、Ｖα２４／Ｖβ１１表現型を有した。この再刺激法を用いると、多数の比較的純粋なＴ細胞（Ｖα２４＋）を得るためのＶα２４＋Ｔ細胞のソーティングの必要がなくなる。これら培養物からのＶα２４＋Ｖβ１１＋Ｔ細胞数の定量によって、３ドナーにおいて培養３５日以内にＴ細胞の２００〜５００万倍の増幅があったことが示された（表６）。Ｖα２４＋Ｖβ１１＋Ｔ細胞の増幅は、１ドナー（＃１６）でより少なく、４週間で約１０００倍でしかなかった。Ｖβ１１＋Ｖβ１１＋細胞数の増加倍数は、最初の７日において最大で、一般に繰返し刺激後に緩やかになった（表６）。
【０１１４】
表５および６に示すように、ＫＲＮ７０００パルスした自家ＰＢＭＣによるＰＢＭＣ培養物の再刺激の結果、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞が増加し続ける。しかしながら、ドナーによっては、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞のパーセントは低く維持されるか繰返し再刺激時に低下する傾向があった（表５、ドナー１３、１６および１８）。
【０１１５】
増幅されたＮＫＴ細胞の機能およびインビトロでの長期増幅の可能性を調べるために、ＫＲＮ７０００およびＩＬ−２で刺激されたＰＢＭＣの短期（１−２週間）培養物を、Ｖα２４Ｔ細胞レセプターに対する抗体を用いてまたは抗Ｖα２４抗体プラス抗ＣＤ４を用いて選別した。データは、ヒトＶα２４＋Ｔ細胞系の培養および再刺激は３週間以上延長できることを示す。表７は、１１週まで断続的に再刺激された二つのＶα２４＋選別したヒトＴ細胞系の増幅を示す。ＩＬ−２および放射処理した同種異系のＫＲＮ７０００パルスされたＰＢＭＣを用いるＴ細胞刺激は、週平均８倍のＴ細胞の増幅を誘導した。１０週間にわたる総Ｔ細胞増幅の計算によって、ＮＫＴ細胞は少なくとも１０億（１０９）倍に増幅され得たことが示された。最初のＰＢＭＣサンプルから前選別されたＶα２４＋細胞の最初の増幅（表２）を含むと、これら細胞の総増幅能はほぼ１０１１倍である。
【０１１６】
表５  再刺激後の培養中のＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞のパーセント
培養中のＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞（％）
ドナー ０日目 ７日目 １４日目 ２１日目 ２８日目
13         .008        .47       1.1          1
14         .015       6.3       33           55
15         .025       1.9       17           44
16         .006       0.28       1.5          2.8          0.8
17         .10       20         44           75           78
18         .09       11         38           18            7.6
19         .07       11         66           83           80
20         .083       0.6        3.5         19           28
21         .053       0.5        2.3         41           62
ドナーＰＢＭＣ（１×１０６／ｍｌ）を１００ｎｇ／ｍｌのＫＲＮ７０００および１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を用いて７日間刺激した。次いで、細胞の一部（０．２〜１×１０６）を３〜５倍量のＫＲＮ７０００パルスした放射処理した自家ＰＢＭＣおよびｒｈＩＬ−２を用いて７日毎に再刺激した。各培養期間後、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞のパーセントをフローサイトメトリーで決定した。０日目は、培養しないエキソビボのＰＢＭＣの細胞を表す。
【表１】
2005536982.tif 000003
【０１１７】
健康ドナーＰＢＭＣ（１×１０６／ｍｌ）を培養して、表５に示したように週に１回３５日まで再刺激した。各回の刺激後、細胞を集めて、数えて、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞のパーセントをフローサイトメトリーによって決定した。培養物中に存在するＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞数は、回収された細胞数に培養物中のＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞のパーセントを掛けて決定した。Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞数の増加（倍）は、得られた細胞数を７日前に存在した細胞数で割って得た。総増幅（右欄）は、２８〜３５日後のＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞の実際の増幅能を表し、各週に見られる増幅を全部掛け合わせて得る。NA：分析せず。
【０１１８】
表７  選別されたＶα２４＋ヒトＴ細胞系はインビトロで１０週間で１０９細胞に増幅することができる。
培養週 １週当たりのＴ細胞数の増幅（倍）
ドナー１８ ドナー２０
1                       8.5            4.2
2                       8.3            6.8
3                       5.3           11.8
4                       6             17
5                       6.6            9.1
6                       6.6           10.5
7                       8.2            3.2
8                       8.4           14.7
9                       8.8            8.5
10                       9.9            3.7
11                       NA             5.1
平均増幅／週                  7.7            8.6
総増幅                      5.9 x 108       4.2 x 109
Ｖα２４選別したＴ細胞系（ドナー１８およびドナー２０）を、ＫＲＮ７０００パルスした放射処理した同種異系ＰＢＭＣおよび１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２（２×１０５／ｍｌのＴ細胞プラス１×１０６／ｍｌのＰＢＭＣ）を用いて毎週刺激した。トリパンブルー排除法で細胞を数えて、週あたりの増幅（倍）を決定した。細胞系は培養期間を通して９０％以上のＶα２４＋を維持した（データ非表示）。
【０１１９】
実施例７
本実施例は、ＫＲＮ７０００およびＩＬ−２を用いて増幅されたＶα２４＋Ｔ細胞系は大量のサイトカインを活性化の際に分泌し、細胞傷害性であり、ＮＫ細胞の細胞傷害性を間接的に活性化できることを示すデータに関する。
【０１２０】
増幅されたＶα２４＋Ｔ細胞の機能を調べるために、Ｖα２４＋ＣＤ４＋およびＶα２４＋ＣＤ４−Ｔ細胞を蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって精製した（図３Ａ）。次いで、これら二つの細胞集団をＫＲＮ７０００パルスしたＰＢＭＣおよびｒｈＩＬ−２を用いてインビトロで７日間、表７のように増幅した。二つの細胞集団のサイトカイン分泌能を決定するために、それらを次いでＰＭＡプラスイオノマイシンを用いて刺激した。図３Ｂの結果（細胞内サイトカイン染色）は、両Ｔ細胞集団がＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生できることを示す。ＩＬ−４はＣＤ４＋サブセットにおいてのみで低レベルで検出された（図３Ｂ、右下ヒストグラム）。
【０１２１】
八つの異なるＶα２４選別したＮＫＴ細胞系からの七つの異なる分泌サイトカインのＥＬＩＳＡ分析を表８に示す。ＰＭＡプラスイオノマイシンを用いて刺激した後、ＣＤ４＋およびＣＤ４−細胞系の双方は大量のＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、およびＩＦＮ−γを分泌した。より低い不定のレベルのIＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０もまた形成される。ＩＬ−４分泌を除いて、ＣＤ４＋とＣＤ４−系との間には明白な差はなかった。発表された報告（Wilson, et al., Nature 391:177 (1998); Lee, et al., J. Exp Med 195:637 (2002)）と一致して、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞はＣＤ４−ＮＫＴ細胞よりも多くのＩＬ−４を分泌する傾向にあった。産生されるＩＬ−２およびＢＭ−ＣＳＦのレベルはＰＭＡプラスイオノマイシン刺激によるものの１０〜５０分の１であるが、ＫＲＮ７０００パルスしたＰＢＭＣによるＶα２４＋Ｔ細胞系の活性化もまたサイトカイン分泌をもたらした。
【表２】
2005536982.tif 000004
【０１２２】
ドナー４、１５、１７、１８および２０からの精製されたＣＤ４＋およびＣＤ４−Ｖα２４＋Ｖβ１１＋ヒトＴ細胞系（５×１０５／ｍｌ）を、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンを用いて２４時間刺激した。上清を集めて、サイトカイン含量をＥＬＩＳＡによって決定した。
【０１２３】
サイトカイン分泌に加えて、増幅されたＶα２４＋Ｔ細胞のＣＤ４＋およびＣＤ４−双方の集団は、ＫＲＮ７０００を用いてパルスされた腫瘍標的細胞系を特異的に殺傷することができた（図４）。単球（Ｕ９３７）およびＴ細胞白血球標的細胞（Jurkat）の双方は、それらがＫＲＮ７０００で前パルスされた場合にのみ、溶解（lysed）された。赤白血球細胞系のＫ５６２は、ＫＲＮ７０００で前パルスされた場合でも溶解されなかった（ＲＡＪＩおよびＭｏｌｔ−４系もまた殺されなかった、データ非表示）。この殺傷のパターンはＣＤ１ｄの標的細胞上での発現と関連があり（Metelitsa, et al., J Immunol 167:3114 (2001)）、ＫＲＮ７０００の存在を要求した。加えて、ガラクトシルセラミドの「β」型またはビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）でパルスされた標的細胞は溶解されなかったことから、標的細胞溶解はガラクトシルセラミドの「α」型（ＫＲＮ７０００）に極めて特異的であった。
【０１２４】
図４のデータは、異なる２ドナーからの異なる４ＮＫＴ細胞系からの結果によって裏付けられる（表９）。エフェクター対標的の比（Ｅ：Ｔ）が１．２５：１と低い場合でも、ＫＲＮ７０００パルスしたJurkat腫瘍細胞の実質的殺傷（２５％以上）がある。加えて、ＫＲＮ７０００パルスしたＵ９３７は殺されたが、Ｍｏｌｔ−４やＲＡＪＩ細胞は殺されなかった（データ非表示）。これらの結果は、ＰＢＭＣおよびＫＲＮ７０００を用いる繰返し培養（再刺激）によってインビトロで増幅されたＮＫＴ細胞系は、機能性で、抗原依存的（ＫＲＮ７０００）およびＣＤ１ｄ依存的様式でのみ殺傷することを示す。
【０１２５】
表９  ヒトＶα２４＋Ｔ細胞系はＫＲＮ７０００パルスした腫瘍細胞を殺傷することができる。
細胞系 特異的溶解割合（％）
エフェクター：標的比
1.25:1 5:1
ドナー４、CD4+       29           45
ドナー４、CD4-       49           61
ドナー15、CD4+       25           37
ドナー15、CD4-       54           63
ドナー20、CD4+       26           41
ドナー20、CD4-       26           41
培養は図４のように三重設定して、ＫＲＮ７０００パルスした５１Ｃｒ標識したJurkat腫瘍細胞を用いて行った。異なる３ドナーからのヒトＶα２４＋Ｔ細胞を、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を１．２５：１および５：１にしてJurkat標的に加えた。特異的溶解をパーセントで示す。データは、各ＮＫＴ細胞系を用いた２または３実験の代表である。ＫＲＮ７０００が存在しない場合は、Jurkat標的は溶解されなかった（５％以下の特異的溶解）。
【０１２６】
ＫＲＮ７０００（Carnaud, et al., J Immunol 163:4647 (1999); Jacobson, Pilaro and Smith, Proc Natl Acad Sci USA 93:10405 (1996)）およびインビトロ由来ヒトＮＫＴ細胞（Metalitsa, et al., J Immunol 167:3114 (2001)を用いて処理したネズミ腫瘍モデルにおける以前の報告は、腫瘍細胞の殺傷はＮＫ細胞によって成立され得ることを示している。表１０のデータは、活性化されたＮＫＴ細胞からの上清はＮＫ細胞における活性化および殺傷活性を誘導できたことを示す。新鮮なＮＫ細胞は細胞傷害性ではなかったが、活性化されたＶα２４ＮＫＴ細胞系からの上清とともに培養したＮＫ細胞は活性化されて腫瘍細胞系のJurkat、Ｕ９３７、Ｋ５６２およびＲＡＪＩを効果的に殺傷することができた（表１０）。他の二つのＮＫＴ細胞系からの上清もまた、ＮＫ細胞を活性化して腫瘍細胞を殺傷するのに有効であった。ＮＫＴ細胞上清を用いて活性化されたＮＫ細胞は、組換えＩＬ−２プラスＩＦＮ−γ、ＮＫ細胞傷害性活性に重要であると示されたサイトカインを用いて活性化されたＮＫ細胞と活性の面でほぼ同一であった（Metelitsa, et al., J Immunol 167:3114 (2001)。しかしながら、ＮＫＴ細胞による殺傷（図４および表９）とは違って、ＮＫ細胞による殺傷は腫瘍標的細胞によるＫＲＮ７０００の提示を要求しなかった。したがって、インビボでのＮＫＴ細胞の活性化は、直接的メカニズム（ＣＤ１ｄ＋および腫瘍細胞のＮＫＴ細胞殺傷）および間接的メカニズム（ＮＫ細胞活性化ならびにＣＤ１ｄ＋およびＣＤ１ｄ＋腫瘍細胞の双方の殺傷）によって腫瘍細胞溶解をもたらし得る。
【０１２７】
表１０  Ｖα２４＋細胞はＮＫ細胞傷害性を間接的に活性化する。
エフェクター細胞 ５：１のＥ：Ｔ比における特異的細胞溶解（％）
Jurkat U937 K562 RAJI
新鮮ＮＫ細胞                   2.6    0.6   7.3    0.6
ＮＫＴ上清処理した細胞        44     35    53     38
IL-2＋IFN-γ処理した細胞      46     33    43     31
クロム放出アッセイにおけるエフェクターとしての使用に先立ち、新鮮ヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞を、活性化されたＣＤ４＋ＮＫＴ細胞系（ドナー１５、ＣＤ４＋）からの上清を用いてまたは２ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−γを用いて３日間培養した。培養したＮＫ細胞の殺傷活性を、図４に記述したように（ただし、エフェクター細胞はＴ細胞ではなくてＮＫ細胞である）クロム放出アッセイにおいて新鮮ＮＫ細胞と比較した。種々の数のエフェクターＮＫ細胞を、５１Ｃｒ標識標的細胞（５×１０３／ウェル）とともにそれぞれ三重で培養した。平均したカウントからの特異的溶解を示す。活性化されたＶα２４＋Ｔ細胞からの上清は８．７ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４および２８ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ（ＥＬＩＳＡで決定）を含み、１：２の希釈でＮＫ細胞の前培養に用いた。  
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、健康ドナーＰＢＭＣにおけるＴ細胞およびＮＫ細胞サブセットを示す。（上のパネル）左のヒストグラムは、代表的ドナーＰＢＭＣの前方散乱（ＦＳＣ−Ｈ）および側方散乱（ＳＳＣ−Ｈ）を示す（囲みは生細胞の周囲を描く）。右のヒストグラムは、生存ゲートされた（live-gated）細胞に対するＣＤ３＋およびＣＤ１６１＋細胞のパーセントを示す。下のパネルは、ドナーＰＢＭＣ中のＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１６１−）、ＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１６１＋）、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋、およびＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１６１＋）のパーセントを示す。
【図２】図２は、新鮮および培養した健康ドナーＰＢＭＣにおけるＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞とｈＣＤ１ｄ−ＫＲＮ７０００テトラマー＋ＣＤ３＋細胞との相関を示す。（上パネル）リンパ球ゲートされたＰＢＭＣに対するＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞およびｈＣＤ１ｄ−ＫＲＮ７０００テトラマー＋ＣＤ３＋細胞のパーセントは、ゲートされた生存リンパ球（Ｒ２）に対してフローサイトメトリーによって決定された。（下パネル）培養中のＶα２４＋Ｖβ１１＋およびｈＣＤ１ｄ−ＫＲＮ７０００テトラマー＋細胞の頻度は、ＫＲＮ７０００（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いる７日間の刺激後に決定された。
【図３】図３は、増幅して選別されたＶα２４＋Ｔ細胞は機能性で、サイトカインを産生することを示す。（Ａ）Ｖα２４＋ＣＤ４＋およびＶα２４＋ＣＤ４−サブセットに選別された細胞。（Ｂ）ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−４に対する抗体を用いたＶα２４＋細胞の細胞内染色。ヒストグラムは、Ｖα２４＋ＣＤ４＋およびＶα２４＋ＣＤ４−生細胞の染色を示す。太線はＰＭＡおよびイオノマイシン活性化細胞の染色を表す。細線は非刺激細胞の染色を示す。ヒストグラム中の数字は、非刺激細胞に対する陽性染色のパーセントを表す。
【図４】図４は、選別され増幅されたＶα２４＋Ｔ細胞がＫＲＮ７０００でパルス（pulse）された標的細胞を選択的に殺傷することを示す。特異的５１Ｃｒ放出のパーセントを殺傷量として算出した。上のパネルがＶα２４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、下のパネルがＶα２４＋ＣＤ４−Ｔ細胞を示す。
【図１】
2005536982.tif 000005
【図２】
2005536982.tif 000006
【図３】
2005536982.tif 000007
【図４】
2005536982.tif 000008
【国際調査報告】
2005536982.tif 000009
2005536982.tif 000010
2005536982.tif 000011
2005536982.tif 000012