(57)【要約】本発明は、哺乳動物細胞における正常および過増殖的セリンパルミトイルトランスフェラーゼ発現のレベルを比較測定する方法そしてそれの使用に向けたものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞によるセリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現レベルを測定する方法であって、
（ａ）セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物を哺乳動物細胞に接触させることで多数の化合物−セリンパルミトイルトランスフェラーゼ複合体を生じさせ、そして
（ｂ）前記複合体の存在を検出することで、前記細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルを測定する、
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
哺乳動物細胞によるセリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現を測定する方法であって、
（ａ）セリンパルミトイルトランスフェラーゼを基礎的に発現させる１番目の哺乳動物細胞に、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物を接触させることで、多数の１番目の化合物−セリンパルミトイルトランスフェラーゼ複合体を生じさせ、
（ｂ）セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる２番目の哺乳動物細胞に、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物を接触させることで、多数の２番目の化合物−セリンパルミトイルトランスフェラーゼ複合体を生じさせ、
（ｃ）前記１番目および２番目の多数の複合体の存在を検出することで、前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルを測定し、そして
（ｄ）前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルの差を測定する、
ことを含んで成る方法。
【請求項３】
組織のインビボイメージング方法であって、
（ａ）検出可能標識を含んで成り、且つ過増殖的にセリンパルミトイルトランスフェラーゼを発現させる哺乳動物細胞と結合する、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物を哺乳動物に投与し、そして
（ｂ）前記検出可能標識のイメージングによって前記哺乳動物の組織の中の前記細胞の位置を決定する、
ことを含んで成る方法。
【請求項４】
前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルの測定差を用いて癌の検出、診断、転移の可能性の診断、予後および進行の監視または処置の治療的効果の監視を行う段階も更に含んで成る、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記癌が乳癌、結腸癌、カルシノイド、胃癌、神経膠腫、肝細胞癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、未分化癌および白血病から成る群から選択される請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルの測定差を用いて血管損傷の存在を検出または診断する段階も更に含んで成る、請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記血管損傷が再狭窄である請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルの測定差を用いて炎症の存在を検出または診断する段階も更に含んで成る請求項２記載の方法。
【請求項９】
前記炎症が潰瘍性大腸炎、炎症性腸症候群、クローン病、リュウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症、発作または喘息の結果である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼを阻害する治療的に有効な化合物を選別する方法であって、
（ａ）セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる１番目の哺乳動物細胞に、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物を接触させることで、多数の１番目の化合物−セリンパルミトイルトランスフェラーゼ複合体を生じさせ、
（ｂ）セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる２番目の哺乳動物細胞に、可能性のあるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤化合物を接触させることで、多数の２番目の化合物−セリンパルミトイルトランスフェラーゼ複合体を生じさせ、
（ｃ）前記１番目および２番目の多数の化合物−セリンパルミトイルトランスフェラーゼ複合体の存在を検出することで、前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルを測定し、そして
（ｄ）前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルの差を測定することで、前記可能性のある阻害剤化合物がセリンパルミトイルトランスフェラーゼ発現を阻害するか否かを測定する、
ことを含んで成る方法。
【請求項１１】
前記セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物が、セリンパルミトイルトランスフェラーゼと結合する化合物、セリンパルミトイルトランスフェラーゼと結合する単一特異性抗体およびセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡとハイブリダイズするであろう核酸から成る群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物が、セリンパルミトイルトランスフェラーゼと結合する化合物、セリンパルミトイルトランスフェラーゼと結合する単一特異性抗体およびセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡとハイブリダイズするであろう核酸から成る群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項１３】
前記セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物が、セリンパルミトイルトランスフェラーゼと結合する化合物、セリンパルミトイルトランスフェラーゼと結合する単一特異性抗体およびセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡとハイブリダイズするであろう核酸から成る群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項１４】
前記セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物が、セリンパルミトイルトランスフェラーゼと結合する化合物、セリンパルミトイルトランスフェラーゼと結合する単一特異性抗体およびセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡとハイブリダイズするであろう核酸から成る群から選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
前記セリンパルミトイルトランスフェラーゼを発現させる哺乳動物細胞が、副腎細胞、脳細胞、乳房細胞、結腸細胞、上皮細胞、内皮細胞、心臓細胞、免疫学的細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、肺細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、前立腺細胞、皮膚細胞、脾臓細胞、胃細胞、精巣細胞、甲状腺細胞、子宮細胞および血管細胞から成る群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記上皮細胞が、内皮細胞、非神経膠ニューロン細胞、結腸細胞、乳房細胞、腎臓の近位管、前立腺の平滑筋、子宮の平滑筋および精巣の平滑筋から成る群から選択される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫学的細胞が、多形核白血球、単球、マクロファージ、類上皮細胞、巨細胞、小膠細胞、クッパー細胞および肺胞のマクロファージから成る群から選択される請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼを基礎的に発現させる哺乳動物細胞が、副腎細胞、脳細胞、乳房細胞、結腸細胞、上皮細胞、内皮細胞、心臓細胞、免疫学的細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、肺細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、前立腺細胞、皮膚細胞、脾臓細胞、胃細胞、精巣細胞、甲状腺細胞、子宮細胞および血管細胞から成る群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項１９】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる哺乳動物細胞が、上皮細胞、内皮細胞、癌細胞、免疫学的細胞および腫瘍微細環境内の細胞から成る群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項２０】
前記癌細胞が、乳癌、結腸癌、カルシノイド、胃癌、神経膠腫、肝細胞癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、未分化癌および白血病から成る群から選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記上皮細胞が、内皮細胞、非神経膠ニューロン細胞、結腸細胞、乳房細胞、腎臓の近位管、前立腺の平滑筋、子宮の平滑筋および精巣の平滑筋から成る群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫学的細胞が、多形核白血球、単球、マクロファージ、類上皮細胞、巨細胞、小膠細胞、クッパー細胞および肺胞のマクロファージから成る群から選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍微細環境内の細胞が、線維芽細胞ストローマ、単球ストローマおよび筋線維細胞から成る群から選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼ介在障害の治療を必要としている被験体におけるそれを治療する方法であって、前記被験体にセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤化合物（場合により、このセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤化合物は細胞毒性がある）の製薬学的処方物を治療有効量で投与することを含んで成る方法。
【請求項２５】
前記セリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤化合物が、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記セリンパルミトイルトランスフェラーゼ介在障害が、癌、炎症および血管損傷から成る群から選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記癌が、乳癌、結腸癌、カルシノイド、胃癌、神経膠腫、肝細胞癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、未分化癌および白血病から成る群から選択される請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記炎症が、潰瘍性大腸炎、炎症性腸症候群、クローン病、リュウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症、発作または喘息の結果である請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記血管損傷が再狭窄の結果である請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物が、場合により細胞毒性剤による標識を付けておいてもよい単一特異性抗体、およびセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡと場合によりハイブリダイズするであろう核酸から成る群から選択する請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
前記製薬学的処方物をバルーンカテーテルまたはステントの上に被覆しそして時間依存様式で放出させる請求項２４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は２００１年３月２０日付けで提出した仮出願連続番号６０／２７７，２５２（引用することによって本明細書に組み入れられる）の利点を請求するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は哺乳動物の細胞におけるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ｓｅｒｉｎｅ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓ）の発現レベル（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ）を測定する方法およびそれの使用を提供するものである。より詳細には、本発明は、正常な哺乳動物細胞および過増殖的（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）哺乳動物細胞におけるセリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現レベルを比較測定する方法およびそれの使用を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
膜脂質の組成はいろいろな膜に非常に特徴的で、細胞の生理学的状態に依存する可能性があり、従って、そのような現象の調節を理解することは重要である（非特許文献１）。スフィンゴリピドは原核ではなく真核細胞膜に遍在する成分である。スフィンゴリピドは細胞および細胞小器官の膜に構造的一体性を与えている以外にいろいろな細胞機能の調節にも関与していることを示す証拠が示されてきている。スフィンゴリピドの代謝中間体、例えばスフィンゴシン、スフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ−１−Ｐ）およびセラミドなどが細胞の成長および分化、老化細胞サイクルおよび増殖アポトーシス（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の調節に関与している（非特許文献２）。他のシグナル伝達機能には、ＤＡＧ／ＰＫＣ経路、細胞内のＣａ２＋移動およびＫ＋流入の阻害が含まれる。そのようなスフィンゴリピドの機能および他の機能は、スフィンゴリピド代謝が生理学的に重要な現象、例えば腫瘍の抑制、組織の生育、損傷および萎縮などに潜在的に重要であることが基礎になっている（非特許文献３の中に論評されている）。
【０００４】
スフィンゴリピドの代謝を調節する酵素は細胞の恒常性の維持にとって重要であり、それらの活性が乱れると病気になる可能性がある。フモニシンミコトキシン（ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ）が動物の餌に混入してセラミドシンターゼ（ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）が阻害されると結果としてウマのロイコエンセファロマラシア（ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｍａｌａｃｉａ）およびブタの肺水腫がもたらされる。ＴＮＦ−αにより誘導された内皮細胞におけるＳ−１−Ｐ産生をＨＤＬで低下させると接着蛋白質（ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の発現が減少し、その結果として、アテローム性動脈硬化症に対する保護が向上する。従って、スフィンゴリピド代謝を調節する酵素は細胞現象のスフィンゴリピド介在調節を制御する時の鍵となる因子である。
【０００５】
いろいろなスフィンゴリピドの骨格は長鎖塩基であるスフィンガニン、スフィンゴシンそして酵母ではフィトスフィンガニンから生じる。長鎖塩基合成に関係する最初のユニークな反応は、Ｌ−セリンと脂肪酸アシル−ＣｏＡが酵素であるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ［ＳＰＴ；パルミトイル−ＣｏＡ；Ｌ−セリンＣ−パルミトイルトランスフェラーゼ（脱カルボキシル化）］によって縮合して３−ケトジヒドロスフィンゴシンが生じることを伴う（非特許文献１）。内在性ミクロソーム膜蛋白質であるＳＰＴは少なくとも２つのサブユニット、即ちＳＰＴ１とＳＰＴ２で構成されている。ＳＰＴの触媒作用サブユニットがＳＰＴ２であると考えられている一方、調節活性はＳＰＴ１サブユニットによると考えられている。酵母では、ＬＣＢの活性にＬＣＢ１とＬＣＢ２サブユニットの両方が必要でありそしてＬＣＢの機能が最適であるにはＴｓｃ３ｐが必須である。
【０００６】
ＳＰＴはデノボスフィンゴリピド生合成の鍵となる調節酵素であることから、ＳＰＴの活性が変わるとスフィンゴリピドが介在する細胞機能調節が影響を受けるであろうと予測される。酵母では、ＳＰＴが熱および高浸透圧応力反応に関係していると推測されていた。培養されたヒトケラチノサイトに紫外線照射を受けさせると、それがＳＰＴ活性を上向き調節し、相当してＳＰＴ２のｍＲＮＡおよび蛋白質のレベルが増加することが示されている。化学治療剤であるエトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）で細胞を処理すると、アポトーシス中にＳＰＴの活性が高くなりかつそれによってデノボセラミド合成が左右される（非特許文献２）。ブタ腎細胞ＬＬＣＫ−１では、ＳＰＴの活性をミリオシン（ｍｙｒｉｏｃｉｎ）で抑制するとセラミドシンターゼ阻害剤であるフモニシンのアポトーシスおよび抗増殖効果が逆転する。
【０００７】
最近、ＳＰＴの発現が病生理学的状態と密に関連していることが示された。血管形成などの如き処置の結果として血管損傷がもたらされ、そしてこのような損傷に反応して、集合的に再狭窄として知られる一連の出来事が始まる。バルーンで損傷を受けさせたラット頸動脈の中で血管平滑筋細胞および線維芽細胞が増殖する時にＳＰＴ１とＳＰＴ２の両方の発現が増加することが報告された（非特許文献４）。
【０００８】
正常な細胞が脱分化を起こす時に最初に起こる出来事はとりわけ脂質代謝経路の変化である。研究により、肝細胞癌の膜に存在するスフィンゴリピドのパーセントの方が正常な肝細胞のそれよりも高いことが示された（非特許文献５）。
【０００９】
本発明の方法を用いて、培養物の中で増殖している線維芽細胞およびある種の腫瘍では悪性疾患細胞を取り巻く宿主である「反応性（ｒｅａｃｔｉｖｅ）」ストローマ線維芽細胞（ｓｔｒｏｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）の中にＳＰＴが豊富に発現する（これは正常な細胞ではその取り巻くストローマ線維芽細胞に観察されなかった）ことを立証する。重要なストローマ反応（線維形成（ｄｅｓｍｏｐｌａｓｉａ））が数多くの癌腫に見られ、このことは、ストローマ細胞が癌病因である役割を果たしていることを示唆している（非特許文献６）。反応性線維芽細胞（また筋線維細胞としても知られる）がしばしば上皮が源のいろいろな癌に関係しておりかつ癌細胞の侵入および転移の可能性に影響を与える（非特許文献６）。本方法を用いて、更に、ＳＰＴサブユニットが確立された数種のヒト腫瘍細胞系の中で高度に発現しかつヒト悪性疾患細胞の中でインサイチュー発現することも示す。加うるに、増殖する線維芽細胞および悪性疾患細胞では細胞下のＳＰＴ場所が変化することも観察した。
【００１０】
核脂質代謝がシグナル伝達カスケードで果たす役割が最近明らかになった。燐脂質代謝に関与する酵素であるジアシルグリセロールキナーゼは核に局在することが示され、これは核シグナル伝達に関与している。また、分裂促進因子で処理することで刺激して核のＳＰＨＫ活性を高めると２４時間以内にスフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）が３Ｔ３細胞の核の中に局在するようになることも示された（非特許文献７）。核調製物の中にスフィンゴリピド代謝産物が存在していて活性を示すことが示され、このことは、スフィンゴリピドが核の中からの細胞の活性に介在することで調節的役割を果たすと言った案を支持している。我々の研究は、増殖する線維芽細胞および悪性疾患細胞ではＳＰＴが核と関連していることを立証している。このことは、スフィンゴリピド代謝に関与する２番目の酵素が刺激時に核と関係するようになることを示している。このようなデータは、スフィンゴリピドが以前に報告されたように細胞質シグナル伝達カスケード（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅｓ）で細胞間シグナル伝達分子として活性を示すことに加えて核内のシグナル伝達分子としてある役割を果たすことを示唆している。
【００１１】
ＳＰＴの活性は細胞の生理学的状態が変わると変化することから、この酵素が正常な組織の中に存在する基礎的レベル（ｂａｓａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）を測定することが絶対的に必要である。ＳＰＴ１およびＳＰＴ２サブユニットの分布は細胞活性の指標になる可能性があり、この酵素のレベルが高くなることは代謝活性（例えば好中球および／またはマクロファージの浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ニューロン伝達、エキソサイトーシス）または細胞増殖が増加したことを反映している可能性がある。次に、正常な組織および細胞型で測定したＳＰＴ１およびＳＰＴ２レベルを用いて異常な状態の細胞型を分析することができる。病生理学的状態、例えば癌、炎症（例えば潰瘍性大腸炎、炎症性腸症候群、クローン病、リュウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症、発作、喘息）および血管損傷（例えば再狭窄）などとＳＰＴ発現増加が関連しているならば、それは挑発的な治療目標になる。このように、ＳＰＴの調節が細胞反応および病因に幅広く関係している可能性がある、と言うのは、スフィンゴリピド代謝カスケードに関係している律速段階に触媒作用を及ぼす酵素としてそれが重要な位置を占めているからである。
【００１２】
個々のスフィンゴ糖脂質種［特に，Ｎ−テトラコサノイル（リグノセロイル）モノグリコシルセラミド、Ｎ−テトラコサノイル（ネルボノイル）モノグリコシルセラミド、Ｎ−ドコサニルモノグリコシルセラミドおよびＮ−リノレオイルモノグリコシルセラミドから選択されるグリコセラミド（ｇｌｙｃｏｃｅｒａｍｉｄｅ）］を識別する方法が特許文献１に記述されており、それらは特定種の癌細胞（リンパ腫、黒色腫、肉腫、白血病、網膜芽細胞腫、肝細胞癌、骨髄腫、神経膠腫、中皮腫または癌から選択）における多剤耐性の指標であり、それらが減少すると結果として抗癌剤の化学感受性が向上する。そのような識別方法には、クロマトグラフィー、癌細胞をスフィンゴ糖脂質種のエピトープと免疫学的に結合する抗体または抗体−成分混合物に接触させること、または癌細胞をグリコセラミドに免疫学的反応性を示す精製抗体と接触させることが含まれる。
【００１３】
セラミド合成の阻害剤、グリコシルコセラミド合成の阻害剤、アシルセラミド合成の阻害剤、スフィンゴミエリン合成の阻害剤、脂肪酸合成の阻害剤、コレステロール合成の阻害剤、燐脂質およびグリコスフィンゴリピド（グルコシルセラミド、アシルセラミドおよびスフィンゴミエリンを包含）分解の阻害剤、遊離脂肪酸、セラミド、アシルセラミドまたはグルコシルセラミドおよびスフィンゴミエリンの分解酵素（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）の阻害剤、または遊離脂肪酸、セラミドおよびコレステロールの代謝酵素の両方の阻害剤および／または賦活剤から選択される少なくとも１種の作用剤を上皮障壁崩壊量（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ）で用いて上皮障壁機能を崩壊することによって生理学的活性物質が皮膚または経皮搬送で示す透過性を向上させる方法および配合が特許文献２に記述されている。
【特許文献１】米国特許第６，０９０，５６５号
【特許文献２】米国特許第６，１９０，８９４号
【非特許文献１】Ｍｅｒｒｉｌｌ，Ａ．Ｈ．，Ｊｒ．、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１９８３、７５４、２８４−９１
【非特許文献２】Ｄ．Ｋ．Ｐｅｒｒｙ、Ｊ．Ｃａｒｔｏｎ、Ａ．Ｋ．Ｓｈａｈ、Ｆ．Ｍｅｒｅｄｉｔｈ、Ｄ．Ｊ．ＵｈｌｉｎｇｅｒおよびＹ．Ａ．Ｈａｎｎｕｎ、「Ｓｅｒｉｎｅ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｃｅｒｍｉｄｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００、２７５、９０７８−８４
【非特許文献３】Ｙ．Ａ．Ｈａｎｎｕｎ、「Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ  ｓｅｃｏｎｄ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｓ：Ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｌｉｐｉｄｓ：Ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌｉｐｉｄｓ」、Ｃａｎｃｅｒ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｉｎｊｕｒｙ、１９９７、２、３０５−３１２
【非特許文献４】Ｄ．Ｊ．Ｕｈｌｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｍ．Ｃａｒｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．Ａｒｇｅｎｔｉｅｒｉ、Ｂ．Ｐ．ＤａｍｉａｎｏおよびＭ．Ｒ．Ｄ’Ａｎｄｒｅａ、「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｅｒｉｎｅ  Ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＳＰＴ）ｉｎ  Ｂａｌｌｏｏｎ−ｉｎｊｕｒｅｄ  Ｒａｔ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ」、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍ．、２００１、８６、１３２０−６
【非特許文献５】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＲＤ、Ｎｉｘｏｎ  ＤＷ、Ｍｅｒｒｉｌｌ，Ａ．Ｈ．，Ｊｒ．、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐａｏｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎ  Ｍｏｒｒｉｓ  Ｈｅｐａｔｏｍａ  ７７７７  ａｎｄ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４、４４（５）、１９１８−２３
【非特許文献６】Ｍ．Ｇｒｅｇｏｉｒｅ、Ｂ．Ｌｉｅｕｂｅａｕ、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｂｅｈａｖｉｏｒ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．、１９９５、１４（４）、３３９−５０
【非特許文献７】Ｋｌｅｕｓｅｒ  Ｂ．、Ｍａｃｅｙｋａ  Ｍ．Ｍｉｌｓｔｉｅｎ  Ｓ．およびＳｐｉｅｇｅｌ  Ｓ．「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ。、２００１、５０３（１）、８５−９０
【発明の要約】
【００１４】
本発明は、１つの態様において、哺乳動物細胞によるセリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現レベルを測定する方法を提供し、この方法は、
（ａ）セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物を哺乳動物細胞に接触させることで多数の（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）化合物−セリンパルミトイルトランスフェラーゼ複合体を生じさせ、そして
（ｂ）前記複合体の存在を検出することで前記細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルを測定する、
ことを含んで成る。
【００１５】
本発明は、２番目の態様でも、哺乳動物細胞によるセリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現を測定する方法を提供し、この方法は、
（ａ）セリンパルミトイルトランスフェラーゼを基礎的に（ｂａｓａｌｌｙ）発現させる１番目の哺乳動物細胞にセリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物を接触させることで多数の１番目の化合物−セリンパルミトイルトランスフェラーゼ複合体を生じさせ、
（ｂ）セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｌｙ）発現させる２番目の哺乳動物細胞にセリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物を接触させることで多数の２番目の化合物−セリンパルミトイルトランスフェラーゼ複合体を生じさせ、
（ｃ）前記１番目および２番目の多数の複合体の存在を検出することで前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルを測定し、そして
（ｄ）前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルの差を測定する、
ことを含んで成る。
【００１６】
前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルの測定差を用いて、例えば癌の検出もしくは診断、癌の転移の可能性の診断、癌の予後および進行の監視、または癌の処置の治療的効果の監視などを行う。前記癌には、これらに限定するものでないが、乳癌、結腸癌、カルシノイド（ｃａｒｃｉｎｏｉｄ）、胃癌、神経膠腫、肝細胞癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、未分化癌（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および白血病が含まれる。
【００１７】
また、前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルの測定差を用いて血管損傷の存在を検出または診断することも可能であり、そのような血管損傷には、これらに限定するものでないが、再狭窄が含まれる。
【００１８】
更にその上、前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルの測定差を用いて炎症の存在を検出または診断し、そのような炎症には、これらに限定するものでないが、潰瘍性大腸炎、炎症性腸症候群、クローン病、リュウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症、発作または喘息の結果としてもたらされる炎症が含まれる。
【００１９】
本方法は、別の態様において、組織のインビボイメージング（ｉｍａｇｉｎｇ）方法を提供し、この方法は、
（ａ）セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物（この化合物は検出可能標識を含んで成り、かつこの化合物は、過増殖的にセリンパルミトイルトランスフェラーゼを発現させる哺乳動物細胞と結合する）を哺乳動物に投与し、そして
（ｂ）前記検出可能標識のイメージングによって前記哺乳動物の組織の中の前記細胞の位置を検出する、
ことを含んで成る。
【００２０】
本発明は、更に別の態様において、セリンパルミトイルトランスフェラーゼを阻害する治療的に有効な化合物を選別する方法を提供し、この方法は、
（ａ）セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる１番目の哺乳動物細胞にセリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物を接触させることで多数の１番目の化合物−セリンパルミトイルトランスフェラーゼ複合体を生じさせ、
（ｂ）セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる２番目の哺乳動物細胞に可能性のある（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）セリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤化合物を接触させることで多数の２番目の化合物−セリンパルミトイルトランスフェラーゼ複合体を生じさせ、
（ｃ）前記１番目および２番目の多数の化合物−セリンパルミトイルトランスフェラーゼ複合体の存在を検出することで前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルを測定し、そして
（ｄ）前記１番目および２番目の細胞が発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼのレベルの差を測定することで前記可能性のある阻害剤化合物がセリンパルミトイルトランスフェラーゼ発現を阻害するか否かを測定する、
ことを含んで成る。
【００２１】
本発明が意図するセリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物には、これらに限定するものでないが、セリンパルミトイルトランスフェラーゼと結合する化合物、セリンパルミトイルトランスフェラーゼと結合する単一特異性（抗体、またはセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡとハイブリダイズするであろう核酸が含まれる。
【００２２】
前記セリンパルミトイルトランスフェラーゼを発現させる哺乳動物細胞には、これらに限定するものでないが、副腎細胞、脳細胞、乳房細胞、結腸細胞、上皮細胞、内皮細胞、心臓細胞、免疫学的細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、肺細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、前立腺細胞、皮膚細胞、脾臓細胞、胃細胞、精巣細胞、甲状腺細胞、子宮細胞または血管細胞が含まれる。セリンパルミトイルトランスフェラーゼを発現させる好適な上皮細胞には、これらに限定するものでないが、内皮細胞、非神経膠ニューロン細胞（ｎｏｎ−ｇｌｉａｌ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌｓ）、結腸細胞、乳房細胞、腎臓の近位管（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｕｂｕｌｅｓ）、前立腺の平滑筋、子宮の平滑筋または精巣の平滑筋が含まれる。セリンパルミトイルトランスフェラーゼを発現させる好適な免疫学的細胞には、多形核白血球（ＰＭＮ）、単球、マクロファージ、類上皮細胞、巨細胞、小膠細胞、クッパー細胞または肺胞のマクロファージが含まれる。
【００２３】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼを基礎的に発現させる哺乳動物細胞には、これらに限定するものでないが、副腎細胞［皮質、髄質（クロム親和性）］、脳細胞［ニューロン、星状細胞、オリゴ樹状突起（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｉｔｅ）またはプルキンエ］、乳房細胞［上皮］、結腸細胞［上皮、粘膜のマクロファージまたは平滑筋］、上皮細胞、内皮細胞、心臓細胞［カーディオサイト（ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ）または筋内膜］、免疫学的細胞、腎臓細胞［糸球の内皮細胞または上皮（遠位もしくは近位管）］、肝臓細胞［肝細胞または内皮］、肺細胞［上皮、内皮またはマクロファージ（ダスト（ｄｕｓｔ）細胞）］、卵巣細胞［上皮、皮質ストローマまたは筋線維細胞］、膵臓細胞［ランゲルハンス島または腺胞細胞］、前立腺細胞［上皮または平滑筋］、皮膚細胞［表皮または真皮］、脾臓細胞［洞様内皮、リンパ球、マクロファージまたはＰＭＮ］、胃細胞［上皮、粘膜のマクロファージまたは平滑筋］、精巣細胞［輪精上皮、セルトリ細胞またはライディッヒ細胞］、甲状腺細胞［上皮］、子宮細胞［上皮または子宮筋層］または血管細胞［内皮または平滑筋］が含まれる。
【００２４】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる哺乳動物細胞には、これらに限定するものでないが、上皮細胞、内皮細胞、癌細胞［乳癌、結腸癌、カルシノイド、胃癌、神経膠腫、肝細胞癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、未分化癌および白血病から選択される］、免疫学的細胞または腫瘍微細環境（ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）内の細胞が含まれる。
【００２５】
本発明のさらなる態様には、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ介在障害の治療を必要としている被験体におけるそれを治療する方法が含まれ、この方法は、前記被験体にセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤化合物（場合により、このセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤化合物は細胞毒性がある）の製薬学的処方物を治療有効量で投与することを含んで成る。好適なセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤化合物には、これらに限定するものでないが、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物が含まれる。本発明のこの面の好適な態様では、本製薬学的処方物をバルーンカテーテルまたはステントの上に被覆しそして時間依存様式で放出させる。
（発明の詳細な説明）
この上に示したように、セリンパルミトイルトランスフェラーゼを基礎的に発現させる哺乳動物細胞には、これらに限定するものでないが、副腎細胞［髄質（クロム親和性）］、脳細胞［ニューロンまたはプルキンエ］、乳房細胞［上皮］、結腸細胞［上皮、粘膜のマクロファージまたは平滑筋］、上皮細胞、内皮細胞、心臓細胞［筋内膜］、免疫学的細胞、腎臓細胞［糸球の内皮細胞または上皮（遠位もしくは近位管）］、肝臓細胞［内皮］、肺細胞［上皮、内皮またはマクロファージ（ダスト細胞）］、卵巣細胞［皮質ストローマまたは筋線維細胞］、膵臓細胞［腺胞細胞］、前立腺細胞［上皮または平滑筋］、皮膚細胞［表皮］、脾臓細胞［洞様内皮、マクロファージまたはＰＭＮ］、胃細胞［上皮、粘膜のマクロファージまたは平滑筋］、精巣細胞［輪精上皮、セルトリ細胞またはライディッヒ細胞］、甲状腺細胞［上皮］、子宮細胞［上皮または子宮筋層］または血管細胞［内皮または平滑筋］が含まれる。
【００２６】
好適には、セリンパルミトイルトランスフェラーゼを基礎的に発現させる哺乳動物細胞には、副腎細胞［髄質（クロム親和性）］、脳細胞［ニューロンまたはプルキンエ］、乳房細胞［上皮］、結腸細胞［上皮、粘膜のマクロファージまたは平滑筋］、上皮細胞、内皮細胞、免疫学的細胞、腎臓細胞［糸球の内皮細胞または上皮（近位管）］、肝臓細胞［内皮］、肺細胞［上皮、内皮またはマクロファージ（ダスト細胞）］、卵巣細胞［皮質ストローマまたは筋線維細胞］、膵臓細胞［腺胞細胞］、前立腺細胞［上皮または平滑筋］、脾臓細胞［洞様内皮、マクロファージまたはＰＭＮ］、胃細胞［上皮、粘膜のマクロファージまたは平滑筋］、精巣細胞［ライディッヒ細胞］、甲状腺細胞［上皮］、子宮細胞［上皮または子宮筋層］または血管細胞［内皮または平滑筋］が含まれる。
【００２７】
より好適には、セリンパルミトイルトランスフェラーゼを基礎的に発現させる哺乳動物細胞には、副腎細胞［髄質（クロム親和性）］、脳細胞［ニューロン］、結腸細胞［粘膜のマクロファージ］、上皮細胞、内皮細胞、免疫学的細胞、腎臓細胞［上皮（近位管）］、肺細胞［マクロファージ（ダスト細胞）］、卵巣細胞［皮質ストローマ］、膵臓細胞［腺胞細胞］または胃細胞［上皮または粘膜のマクロファージ］が含まれる。
【００２８】
また、この上に示したように、セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる哺乳動物細胞には、これらに限定するものでないが、上皮細胞、内皮細胞、癌細胞［乳癌、結腸癌、カルシノイド、胃癌、平滑筋肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎細胞癌、肉腫、未分化癌または白血病から選択される］、免疫学的細胞または腫瘍微細環境内の細胞が含まれる。
【００２９】
好適には、セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる哺乳動物細胞には、上皮細胞、内皮細胞、癌細胞［乳癌、結腸癌、胃癌、平滑筋肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎細胞癌、肉腫、未分化癌または白血病から選択される］、免疫学的細胞または腫瘍微細環境内の細胞が含まれる。
【００３０】
より好適には、セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる哺乳動物細胞には、上皮細胞、内皮細胞、癌細胞［乳癌、結腸癌、平滑筋肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、肉腫または未分化癌から選択される］、免疫学的細胞または腫瘍微細環境内の細胞が含まれる。
【００３１】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる特に好適な上皮細胞には内皮細胞、非神経膠ニューロン細胞、結腸細胞、乳房細胞、腎臓の近位管、前立腺の平滑筋、子宮の平滑筋または精巣の平滑筋が含まれる。
【００３２】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる免疫学的細胞に関して、好適な細胞には、ＰＭＮ、単球、マクロファージ、類上皮細胞、巨細胞、小膠細胞、クッパー細胞または肺胞のマクロファージが含まれる。
【００３３】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる腫瘍微細環境内の好適な細胞には線維芽細胞ストローマ、単球ストローマまたは筋線維細胞が含まれる。
【００３４】
上述したように、好適なセリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物には、単一特異性抗体（場合により細胞毒性剤による標識が付けられていてもよい）または核酸（これは場合によりセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡとハイブリダイズするであろう）が含まれる。
【００３５】
本発明では、まず最初に、酵素であるセリンパルミトイルトランスフェラーゼが特定の組織病気状態の時に上向き調節されると言った証拠を示す。特に、ＳＰＴ酵素を構成している２種類の蛋白質サブユニット、即ちＳＰＴ１（アクセス番号ＮＰ００６４０６を有するポリペプチド）とＳＰＴ２（またＬＣＢ２としても知られる、アクセス番号ＮＰ００４８５４を有するポリペプチド）は、細胞の過増殖が起こる病気状態の時にか或はＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２の無調節の過剰発現を伴う（従って更に細胞が過剰増殖し得る）細胞の中で上向き調節される。
【００３６】
従って、ある細胞の中のＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２の存在を検出しかつその量を測定するか或はＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２の存在をインビボで検出することは、病気の状態を診断または監視する方法になり、そのような病気の状態には、決して限定するものでないが、癌および腫瘍の転移、炎症または血管の損傷（再狭窄の如き）が含まれる。従って、ＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２の上向き調節もしくは無秩序な過剰発現を抑制することは、ＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２の発現が介在する病気の状態を治療する方法になる。
【００３７】
当該癌関連病気状態の多くは、過剰増殖する上皮細胞、過剰増殖する間葉細胞、特定の免疫学的細胞または腫瘍微細環境の細胞の場合のようにセリンパルミトイルトランスフェラーゼが過剰発現することを特徴とする。
【００３８】
特に過剰増殖する上皮細胞（この細胞ではＳＰＴ１および／またはＳＰＴ２が正常の細胞の場合よりも多い量で発現する）には、これらに限定するものでないが、内皮の細胞、非神経膠ニューロン細胞、結腸細胞、乳房細胞、腎臓の近位管、または前立腺、子宮もしくは精巣の平滑筋が含まれる。
【００３９】
特に過剰増殖する間葉細胞（この細胞ではＳＰＴ１および／またはＳＰＴ２が正常の細胞の場合よりも多い量で発現する）には、これらに限定するものでないが、肉腫の癌細胞が含まれる。
【００４０】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼを多い量で発現させる特別な免疫学的細胞には、これらに限定するものでないが、ＰＭＮ、単球、マクロファージ、および特殊化されたマクロファージ、例えば類上皮細胞、巨細胞、小膠細胞、クッパー細胞または肺胞のマクロファージが含まれる。
【００４１】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼを過増殖的に発現させる転移性腫瘍の微細環境の近隣に存在する他の細胞には、これらに限定するものでないが、線維芽細胞ストローマ、単球ストローマまたは筋線維細胞が含まれる。
【００４２】
本明細書に記述する方法または本技術分野で良く知られている他の方法を用いて、ＳＰＴ１および／またはＳＰＴ２を過増殖的に発現させる他の過増殖性上皮、間葉または免疫学的細胞を検出することができる。
【００４３】
用語「細胞」は少なくとも１個の細胞を指し、これには、検出方法の感度に適した多数の細胞または細胞の部分が含まれる。本発明で用いるに適した細胞は、単離されて精製された細胞集団または組織化された組織生検の一部として存在していてもよい。細胞の一部を例えば生検の組織断片の状態で単離してもよい。
【００４４】
用語「上向き調節された」または「過増殖的に発現した（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）」を本明細書で用いる場合、これは、目標組織の中で検出され得るＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２遺伝子産物の量が基準サンプルのそれよりも多いことを意味する。「基準サンプル」を本明細書で用いる場合、これは、検出可能な病気を示さないサンプルを指し、これには、例えば、組織保管所が保存している組織断片などが含まれ得る。特に、基準サンプルは保管されているサンプルであってもよく、この場合には、ＳＰＴを病気状態の進行を測定する量で用いる。サンプルはセリンパルミトイルトランスフェラーゼを含有する個々の細胞または細胞断片であってもよいか、或はこのサンプルはより大きな組成物の中の一成分、例えば生検の組織断片であってもよく、この場合に興味の持たれる細胞は、ある分野のいろいろな細胞型の中の１種以上の細胞サブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅｓ）に属する細胞であり得る。
【００４５】
語句「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物」は、例えば他の蛋白質または核酸に比べて約２０倍以上の親和力でセリンパルミトイルトランスフェラーゼと結合する合成もしくは天然のアミノ酸ポリペプチド、蛋白質、小型の合成有機分子またはデオキシ−もしくはリボ核酸配列などを指す。例えば、決して限定するものでないが、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ蛋白質もしくはそれのペプチド断片に対して生じさせたポリクローナルもしくはモノクローナル［古典的またはファージディスプレー（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）を包含］抗体、またはセリンパルミトイルトランスフェラーゼのｍＲＮＡとハイブリダイズする核酸プローブが本発明で用いるに適する。
【００４６】
本発明の蛋白質測定およびインビボイメージング態様で用いるに適した化合物は、直接検出手段または間接手段による検出、例えば標識を付けておいた２番目の化合物などを用いて標識を付けておいた化合物であり得る。ＳＰＴ介在病の治療に向けた方法におけるＳＰＴ特異的化合物は阻害剤、アンチセンスヌクレオチド、または細胞毒性剤による標識を付けておいた化合物であり得る。小型分子である阻害剤は公知であり、これは一般にセリンもしくはスフィンゴシンへの構造的相同性が基になっている。
【００４７】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤化合物の例には、これらに限定するものでないが、ミリオシン（ＣＡＳ登録番号３５８９１−７０−４）、３−クロロ−Ｄ−アラニン（ＣＡＳ登録番号３９２１７−３８−４）、Ｌ−シクロセリン（ＣＡＳ登録番号３３９−７２−０）およびＤ−セリン（３１２−８４−５）が含まれる。セリンパルミトイルトランスフェラーゼ酵素活性を測定する方法を用いて新規な阻害剤を見いだした。細胞毒性剤による標識が付けられる化合物には、例えば、細胞毒性剤による標識が付けられてセリンパルミトイルトランスフェラーゼと免疫学的に反応する抗体などが含まれる。抗体に細胞毒性剤による標識を付ける方法は本技術分野で良く知られている。
【００４８】
語句「標識を付けておいた化合物」は、放射性原子、酵素、蛍光分子または代替タグ（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔａｇｓ）、例えばビオチンなどを含んで成る測定可能部分を指す。本技術分野で良く知られていて例えばＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｉｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９６などに記述されている技術を用いて、蛋白質、ペプチド、炭水化物および核酸を検出可能標識に接合させる。本発明で標識として用いるに有用な特別な放射性同位元素は３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐ、２１２Ｂｉ、９０Ｙ、８８Ｙ、９９Ｔｃ、６７Ｃｕ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１１５Ｉｎまたは１０Ｂなどであり、これらは本技術分野で公知である。本分野の技術者に公知の通常手段、例えばチロシン残基のヨウ素化、セリンもしくはトレオニン残基のホスホリル化、またはトリチウム、炭素もしくは硫黄が用いられている放射性アミノ酸前駆体の組み込みなどで放射性元素をポリペプチドに導入する。金属キレート部分をポリペプチドに連結させる二官能キレート剤を用いて他の放射性原子を導入する。本発明で用いるに適した酵素の特別な例は、西洋わさびのペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはルシフェラーゼである。検出可能標識の好適な例は、基質を開裂させて色素原もしくは冷光を発する生成物をもたらす酵素である。本発明の方法で用いるに有用な蛍光分子の特別な例には、これらに限定するものでないが、クマリン、キサンテン染料、例えばフルオレセイン、ロドールおよびローダミン、レソルフィン、シアニン染料、ビマン（ｂｉｍａｎｅｓ）、アクリジン、イソインドール、ダンシル染料、アミノフタリックヒドラジド、例えばルミノールおよびイソルミノール誘導体、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジカノヒドロキノン、そしてユーロピウムおよびテルビウム錯体および関連化合物が含まれる。放射性原子または蛍光を発する分子の存在を観察するか或は比色もしくは冷光を発する基質の酵素活性を観察することで直接測定を実施する。標識を含有させておいた追加的化合物を試験サンプルに添加してそれが試験サンプルと結合する前記化合物と相互作用し得るようにすることで間接的測定を実施する。良く知られている例は、標識を付けておいた化合物がビオチンを含んで成りそして２番目の化合物がアビジンもしくはストレプトアビジンと検出可能標識を含んで成る例である。良く知られている２番目の例は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ蛋白質と結合する１番目の抗体を用いそしてそれを検出可能標識を含んで成る２番目の抗抗体で検出する例である。
【００４９】
本発明の１つの態様は、ある細胞内に過増殖的に発現したＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２を測定する方法に関し、この方法は、前記細胞をセリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物と接触させそして化合物がＳＰＴと結合する結果として生じたセリンパルミトイルトランスフェラーゼ−化合物複合体を測定もしくは検出することを含んで成る。セリンパルミトイルトランスフェラーゼを検出する方法は、更に、前記細胞の中に存在するセリンパルミトイルトランスフェラーゼの量の変化を基準サンプルと比較することで定義可能である。本明細書に記述した方法を用い、有利には、ＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２の発現を用いて、ある組織が細胞内にＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２の過増殖的発現が起こった細胞を含有するか否かを測定することができる。１つの態様では、本発明の方法を用いて、癌または転移性腫瘍を診断するか、腫瘍転移の予後または進行を監視するか、或は癌もしくは転移性腫瘍に関する何らかの介入もしくは治療の治療効果を監視する。他の態様では、本発明の方法を用いて、血管損傷（再狭窄の場合の如き）または炎症の存在を診断するか或は再狭窄もしくは炎症に関する何らかの介入もしくは治療の治療効果を監視する。
【００５０】
本発明に記述する新規な方法では、いろいろな病生理学的状態におけるＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２蛋白質の上向き調節をどのようにすれば可視化することができるかを記述する。そのような上向き調節を可視化する方法はまたＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２の核酸にも適用可能で、本技術分野で良く知られている方法を用いて実施可能であり、そのような方法には、これらに限定するものでないが、標識を付けておいた核酸プローブを用いたハイブリダイズ技術または定量的ＲＴ−ＰＣＲによる技術が含まれる。本技術分野で良く知られた方法を用いてＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２蛋白質を可視化する他の方法を実施することも可能であり、そのような方法には、これらに限定するものでないが、親和力検出方法、ウエスタンブロッティング、蛍光フローサイトメトリー方法または免疫組織学／免疫細胞学的方法が含まれる。
【００５１】
そのような技術では、一般に、興味の持たれる蛋白質に特定のプローブによる標識を付けて、そのプローブがサンプルに取り込まれる度合を用いてそれを検出する。流動血球計算では細胞を溶液の状態で分析する一方、細胞イメージング技術では、ある場（ｆｉｅｌｄ）の細胞をプローブ結合（ｐｒｏｂｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）の量に関して比較する。一般に好適な態様では抗体をプローブとして用い、これに検出可能なプローブ、例えば放射性原子または蛍光を発する分子などによる標識を付ける。
【００５２】
本発明の別の態様は、インビボイメージングによるＳＰＴの検出に関する。従って、標識を付けておいたセリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物を哺乳動物に投与することで前記標識を付けておいた化合物をＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２と結合させそしてその標識を付けておいた化合物の場所を過剰増殖する細胞の場所の画像を形成させる方法として測定する。
【００５３】
本発明の特別な態様では、抗体に放射性原子の標識を付け、そして本技術分野で良く知られているように、それを用いてＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２蛋白質の存在をインビボで測定する。このような方法を用いると、Ｍａｒｔｉｎ他の米国特許第４，７８２，８４０号に記述されているように、オートラジオロジカル（ａｕｔｏｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ）技術でか或は光子放出を可聴レポートに変換する装置を用いた聴覚シグナル伝達で転移性腫瘍の存在および場所を画像で見ることができるようにすることができる。別の態様では、蛍光検出でＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２の画像を生じさせることができるように、プローブ（特に抗体）に約３００ｎｍから約１３００ｎｍの範囲の光を吸収する発色団による標識を付けてもよい。３００−１３００ｎｍの範囲の光を吸収する種類の発色団がＴｏｗｌｅｒ他のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０２８３３に記述されている。
【００５４】
本発明の別の面は、過剰増殖する細胞の中に存在する無秩序なＳＰＴが介在する病気の状態を治療することに関する。この病気治療方法は、ＳＰＴの酵素活性を抑制するか、細胞内に発現するＳＰＴの量を少なくするか、或は過剰増殖する細胞を細胞毒性のあるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤化合物と接触させることを含んで成る。１つの態様における阻害剤はセリンパルミトイルトランスフェラーゼの酵素活性を抑制する小型分子である阻害剤である。
【００５５】
本発明の別の態様において、転移性腫瘍の進行を制限または防止する方法は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現を減少させる化合物を投与することを含んで成る。特別な態様では、ＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２のいずれかのｍＲＮＡとハイブリダイズするであろうアンチセンス核酸を用いてセリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現を減少させる。
【００５６】
別の態様では、過剰増殖する細胞を標識を付けておいた細胞毒性のあるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物で処理する。特別な態様では、細胞毒性のあるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ特異的化合物を用いて転移性腫瘍の進行を制限もしくは防止する。
【００５７】
有利には、悪性疾患にかかった被験体にセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤を他の少なくとも１種の白金含有および白金を含有しない抗腫瘍剤と一緒に投与する。例えば、本発明を限定するものでないが、抗セリンパルミトイルトランスフェラーゼ化合物を細胞毒性化合物、例えばＤＮＡアルキル化剤などと一緒にか或は抗脈管形成性化合物と一緒に投薬管理で投与してもよい。好適な抗腫瘍剤をクラドリビン［２−クロロ−２’−デオキシ−（ベータ）−Ｄ−アデノシン］、クロラムブシル［４−［ビス（２−クロルエチル）アミノ］ベンゼン酪酸］、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ［５−（３，３，−ジメチル−１−トリアゼノ）−イミダゾール−４−カルボキサミド］、白金化学治療薬および非白金化学治療薬から成る群から選択する。白金含有抗腫瘍剤には、これらに限定するものでないが、シスプラチン［シス−ジクロロジアミン白金］が含まれる。白金を含有しない抗腫瘍剤には、これらに限定するものでないが、シクロホスファミド、フルオロウラシル、エピルビシン、メトトレキセート、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびエトポシドが含まれる。各抗腫瘍剤を治療有効量の範囲内で投与するが、この量は本技術分野で良く知られており、用いる作用剤、悪性疾患の種類および他の状態を基にして多様である。
【００５８】
別の態様では、セリンパルミトイルトランスフェラーゼの阻害剤をバルーン−カテーテルまたはステントの上に被覆しておくことで、それが部位指向様式および時間依存様式で放出されるようにする。そのようなデバイスは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼを阻害することで内皮の過剰増殖を防止することを通して再狭窄が起こらないようにするに有用である。ＳＰＴ介在病を治療する方法は、小分子である治療剤または阻害剤化合物を用いてこれをＳＰＴ発現が上向き調節される病気の状態の組織（このような組織では細胞の過剰増殖が起こっている）またはＳＰＴの無秩序な過剰発現が起こっている細胞に直接もしくは間接的に搬送または「まく（ｓｅｅｄｅｄ）」ことを包含する。
【００５９】
通常の薬剤技術に従って本薬剤組成物の調製を行う。薬学的に受け入れられる担体を本発明の組成物で用いてもよい。本組成物は投与で望まれる調剤の形態に応じて幅広く多様な形態を取り得るが、そのような投薬には、これらに限定するものでないが、静脈内（巨丸剤および注入の両方）、経口、鼻、経皮、吸蔵有り無しの局所、腹腔内、皮下、筋肉内または非経口が含まれ、このような使用形態は全部薬剤技術を有する通常の技術者に良く知られている。本組成物を経口投薬形態で調製する場合、通常の薬剤担体、例えば液状の経口調剤（例えば懸濁液、エリキシルおよび溶液）の場合の水、グリコール、油、アルコール、風味剤、防腐剤、着色剤、シロップなど、または固体状の経口調剤（例えば粉末、カプセルおよび錠剤）の場合の澱粉、糖、希釈剤、顆粒剤、滑剤、結合剤、崩壊剤などの如き担体の１種以上を用いてもよい。
【００６０】
別法として、本活性材料を不活性な液状担体に溶解させることで構成させた調剤を注射することでセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害性化合物を非経口投与することも可能である。そのような注射可能調剤は適切な液状の不活性担体と混ざり合っている本活性材料を含有する調剤であってもよい。受け入れられる液状担体には植物油、例えば落花生油、綿実油、胡麻油などばかりでなく、有機溶媒、例えばソルケタール（ｓｏｌｋｅｔａｌ）、グリセロールのホルマールなどが含まれる。代替として、また、水性の非経口調剤を用いることも可能である。例えば、受け入れられる水性溶媒には水、リンガー溶液および等張性食塩水溶液が含まれる。その上、水性調剤の場合には一般に無菌性の非揮発性油を溶媒または懸濁剤として用いてもよい。本活性材料を液状の担体に最終調剤の活性材料含有量が０．００５から１０重量％になるように溶解または懸濁させることで本調剤の調製を行う。他の添加剤を適切に用いることも可能であり、そのような添加剤には、防腐剤、等張剤、可溶化剤、安定剤および痛みを和らげる作用剤などが含まれる。
【００６１】
また、本発明の方法で用いる化合物をリポソーム搬送系、例えば小型の単層小胞、大型の単層小胞および多層小胞などの形態で投与することも可能である。本技術分野で良く知られているように、多様な燐脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどを用いてリポソーム含有搬送系を生じさせる。
【００６２】
本薬剤組成物またはこれに入れる化合物の「薬学的有効量」を本明細書で用いる場合、これは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性の機能を抑制する量を意味する。本薬剤組成物に含有させる１回投薬単位（ａ  ｐｅｒ  ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ）（例えば錠剤、カプセル、粉末、注射、茶サジ一杯など）は一般に約０．００１から約１００ｍｇ／ｋｇである。１つの態様において、本薬剤組成物に含有させる化合物の１回投薬単位は約０．０１から約５０ｍｇ／ｋｇ、好適には約０．０５から約２０ｍｇ／ｋｇである。本薬剤組成物の治療有効量を決定する方法は本技術分野で公知である。本薬剤組成物を人に投与するに有効な量は、例えば、動物試験の結果から数学的に決定可能である。その上、適切な鼻内媒体を局所的に用いることで本発明の化合物を鼻内形態で投与してもよいか或は本分野の通常の技術者に良く知られている経皮皮膚パッチの形態を用いることで経皮経路で投与してもよい。経皮搬送系の形態で投与すべき場合には、勿論、投薬は投薬管理全体に渡って断続的ではなくむしろ連続的であろう。
生物学的実施例
以下に示す実施例で本発明の説明を行うが、しかしながら、本発明をそれに限定するものでない。
【実施例１】
【００６３】
細胞識別用抗体
抗体発生
Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓのアルゴリズムで予測した抗原ペプチド配列を用いてＳＰＴサブユニットに対するラビットポリクローナル抗体を生じさせた。ヒトＳＰＴ１サブユニット（アクセス番号Ｙ０８６８５）に対する抗体の発生で用いたペプチドはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：１（ＫＬＱＥＲＳＤＬＴＶＫＥＫＥＥＣ、残基４５−５９に相当）およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：２（ＫＥＱＥＩＥＤＱＫＮＰＲＫＡＲＣ、残基２２２−２３６に相当）であった。ヒトＳＰＴ２サブユニット（アクセス番号Ｙ０８６８６）の抗原として用いたペプチドはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：３（ＣＧＫＹＳＲＨＲＬＶＰＬＬＤＲＰＦ、残基５３８−５５２に相当）およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：４（ＣＧＤＲＰＦＤＥＴＴＹＥＥＴＥＤ、残基５４９−５６１に相当）であった。
【００６４】
前記ペプチドのアミノ末端にシステインおよびグリシンを付加させることでＫＬＨ接合を可能にしかつ結合による立体障害を低くした。各ＳＰＴサブユニットそれぞれの両方のペプチドに対してラビットポリクローナル抗体を生じさせた。その結果として生じた免疫血清をプールしそして混合したポリクローナル抗血清を特定のＳＰＴサブユニットに対する抗体源として用いた。ＩｇＧ部分を２μｇ／ｍＬ用いた。
抗体の特徴付け
ラビット抗−ＳＰＴ１もしくはラビット抗−ＳＰＴ２ポリクローナル抗体の特異性をイムブロット分析で評価した。ＨＥＫ２９３細胞のミクロソーム膜を調製した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの４レーンの各々でミクロソーム膜蛋白質を５０ミクログラム分別した。その膜をニトロセルロース膜に移した後、この上に記述した如く調製したペプチド特異的ポリクローナル抗体の１：１０００希釈液を用いて精査した。アルカリ性ホスファターゼを接合させたヤギ抗−ラビットＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて結合した抗体を検出した。
【００６５】
図１は、ＨＥＫ２９３ミクロソーム膜調合物に入っているＳＰＴ１およびＳＰＴ２で予測した分子量を有する蛋白質を前記抗体が認識しそして前記調合物に入っている他の蛋白質とは反応しなかったことを示している。
【００６６】
表１に示すビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）に対する一次モノクローナルおよびポリクローナル抗体を正常なヒト組織で用いることで組織の抗原性および試薬の品質を立証した。負の対照に、前記一次抗体の代わりに同じ種のＩｇＧイソタイプの免疫化を受けさせていない血清（ｓａｍｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＩｇＧ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｓｅｒｕｍ）を用いることを含めた。
【００６７】
【表１】
2005523416.tif 000002
【００６８】
表２に示すビメンチンに対する一次モノクローナルおよびポリクローナル抗体を過剰増殖するヒト組織で用いることで組織の抗原性および試薬の品質を立証した。負の対照に、前記一次抗体の代わりに同じ種のＩｇＧイソタイプの免疫化を受けさせていない血清を用いることを含めた。加うるに、別の負の対照として、前記抗体をこれらの特異的抗原に前以て抗原の１０倍タイター過剰量で一晩吸収させておいた。
【００６９】
【表２】
2005523416.tif 000003
【実施例２】
【００７０】
正常なヒト組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）
市販のヒトの正常および腫瘍チェッカーボード組織スライド（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ；Ｂｉｏｍｅｄａ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のパラフィンを除去し、水和させた後、常規ＩＨＣで処理した。簡単に述べると、スライドにマイクロ波処理をＴａｒｇｅｔ（Ｄａｋｏ）内で受けさせ、冷却し、燐酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７．４、ＰＢＳ）に入れた後、３．０％のＨ２Ｏ２の中に入れた。アビジン−ビオチンブロッキングシステム（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  ＣＡ）の説明に従って用いてスライドを処理した後、ＰＢＳの中に入れた。あらゆる試薬のインキュベーションおよび洗浄を室温で実施した。通常のブロッキング用血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）をあらゆるスライドの上に１０分間置いた。ＰＢＳを用いた濯ぎを短時間行った後、一次抗体（表１）をスライドの上に３０分間置いた。これらのスライドを洗浄した後、ビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）一次抗体、ヤギ抗−ラビット（ポリクローナル抗体）またはウマ抗−マウス（モノクローナル抗体）を組織断片の上に３０分間置いた（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）。ＰＢＳを用いた濯ぎを行った後、アビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ−ビオチン複合体試薬（ＡＢＣ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を加えて３０分間置いた。スライドを洗浄した後、色素原である３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｂｉｏｍｅｄａ）で処理し、ｄＨ２Ｏで濯いだ後、ヘマトキシリンで後染色した。
二重免疫組織化学標識付け（ＩＨＣ：ＩＨＣ）
同時二重免疫組織化学標識付け（ＩＨＣ：ＩＨＣ）のプロトコルが以前に公開され、これは、スライドに１番目の抗原検出プロトコルの２番目の色素原段階の後に後染色の処理を受けさせない以外は単一の免疫組織化学標識付けに示されているそれに類似している。その代わりに、前記スライドをＰＢＳの中に入れた。
【００７１】
アルカリ性ホスファターゼ−Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、ＣＡ；Ｄａｋｏ、ＣＡ）系を用いて２番目の抗原を検出した。前記一次抗体を前記スライドの上に室温で３０分間置いた。洗浄を短時間行った後、二次ビオチニル化抗体を加えて室温に３０分間置いた。次に、前記スライドをＰＢＳに入れて洗浄した後、これらのスライドの上にストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、ＣＡ）試薬を置いて室温に３０分間置いた。洗浄を行った後にＦａｓｔ  Ｒｅｄ色素原（Ｄａｋｏ、ＣＡ）を前記スライドの上に５分間置くことを２回実施した。その後、前記スライドにヘマトキシリンによる後染色処理を常規通り受けさせ、洗浄そして水が基になったスライドを作る媒体（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）（Ｄａｋｏ、ＣＡ）の中でカバースリップを受けさせる（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｄ）ことで、ＢＸ−５０  Ｏｌｙｍｐｕｓ光顕微鏡で見えるようにした。
【００７２】
前記スライドに関して行った標識付けの解釈が適切であることを保証する目的で複数の対照を実施した。検出装置のための対照として前記一次抗体の代わりに適切な種のイソタイプを用いた。別の組の対照では、１番目の一次抗体を省いて２番目の一次抗体に処理を受けさせ、そしてその逆も実施した。
ＳＰＴ１およびＳＰＴ２抗体の特異性
前記２種類のヒトＳＰＴサブユニットに特異的なラビットポリクローナル抗体を生じさせた後、これらの抗体が示す特異性を図１に示す免疫ブロットで立証した。
【００７３】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの４レーンを用いてＨＥＫ２９３ミクロソーム膜蛋白質を５０ミクログラム分別した。これらの蛋白質をニトロセルロース膜に移した後、前記４レーンを切り離し、そしてＳＰＴ１予免疫血清（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｒｕｍ）（ＰｒｅＳＰＴ１）、ＳＰＴ１抗血清（ＳＰＴ１）、ＳＰＴ２予免疫血清（ＰｒｅＳＰＴ２）またはＳＰＴ２抗血清（ＳＰＴ２）のいずれかから得た蛋白質Ｇ精製抗体（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の１：１０００希釈液を用いて個別に精査した。アルカリ性ホスファターゼを接合させたヤギ抗−ラビットＩｇＧの１：２０００希釈液を用いて結合した抗体を検出した。図１に、ＳＰＴ１（５５ｋＤ）およびＳＰＴ２（６５ｋＤ）の予測分子量を有する帯を示す。
【００７４】
野生型ＨＥＫ細胞から得たミクロソーム膜部分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで溶解させた後、予免疫血清またはＳＰＴ特異的ポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロットを精査した。予測した分子量を有する単一の免疫反応性帯、特にＳＰＴ１のＭｒ〜５５ｋＤａ（レーン３）およびＳＰＴ２のＭｒ〜６５ｋＤａ（レーン５）を観察したが、予免疫血清を用いた時には非特異的結合を観察しなかった（レーン２および４）。
ＳＰＴ１およびＳＰＴ２の組織分布
ＳＰＴ１およびＳＰＴ２蛋白質の発現が正常なヒト組織の中で起こることに関する分析をＩＨＣを用いて得て、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２がヒト組織の中で示した分布を表３に示す。表３は、ＳＰＴ１の免疫標化（ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｉｎｇ）とＳＰＴ２の免疫標識化の間に差が見られないことを示している。
【００７５】
可能性のある染色人為産物、例えばスライドからスライドへの変動および実験から実験の変動などをなくす目的で、ホルマリンで固定してパラフィンに埋め込んだ組織を多組織フォーマット（ｍｕｌｔｉ−ｔｉｓｓｕｅ  ｆｏｒｍａｔ）で用いた。表１に、実験抗体に加えて正の対照および負の対照を挙げる。正の標識を褐色染色の強度で定義しそして下記の判断基準に従って評価した：１）免疫反応性なしを陰性（Ｎ）として評価し、２）明褐色の免疫反応性を弱（Ｗ）として評価し、３）褐色の免疫反応性を中（Ｍ）として評価し、そして４）暗褐色の免疫反応性を強（Ｓ）として評価した。負の対照は観察できる標識付けをもたらさなかった。正常なヒト組織の場合、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２に関して標識付けを受けさせた細胞の数は、１００Ｘで見た場の中にｎ＝２−１０であり、陰性（Ｎ）には標識が付けられた細胞が存在せず、弱（Ｗ）には標識が付けられた細胞が１−１０個存在し、中（Ｍ）には標識が付けられた細胞が１１−２０個存在し、強（Ｓ）には標識が付けられた細胞が＞２０個存在していた。
【００７６】
【表３】
2005523416.tif 000004
【００７７】
【表４】
2005523416.tif 000005
【００７８】
【表５】
2005523416.tif 000006
【００７９】
一般的には、ヒト組織全体に渡って存在する血管の内皮細胞および平滑筋細胞がＳＰＴ１およびＳＰＴ２に関して示した免疫陽性の度合は中程度であった。試験を受けさせたあらゆる組織の上皮細胞がＳＰＴ１およびＳＰＴ２に関して示した免疫陽性の度合は、卵巣の上皮を除いて、中から強であった。加うるに、結腸、肺および胃の粘膜のマクロファージがＳＰＴ１およびＳＰＴ２に関して示した免疫陽性の度合は強であった。脾臓では、マクロファージに加えて、多形核細胞（ＰＭＮ）がＳＰＴ１およびＳＰＴ２の両方に関して積極的に染色されたが、リンパ球には全く反応性が観察されなかった。結腸、肺、前立腺、胃、甲状腺、子宮および血管の組織がＳＰＴ１およびＳＰＴ２に関して示した免疫陽性の度合は中から強であった。しかしながら、皮膚および心臓の組織にはＳＰＴ１およびＳＰＴ２のいずれもほとんど存在しないか或は全く検出不能である。
【００８０】
図２−７に、免疫組織化学を用いてＳＰＴ１およびＳＰＴ２の発現に関する試験を受けさせた正常なヒト組織のいくつかを示す。
【００８１】
図２に、予免疫血清（図２Ａ）、ＳＰＴ１（図２Ｂ）およびＳＰＴ２（図２Ｃ）特異的抗体のそれぞれによる免疫標識付けを受けさせた（ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｅｄ）正常な脳を示す。大脳の皮質では錐体形ニューロンがＳＰＴ１およびＳＰＴ２に関して陽性の細胞内免疫反応性を示した。ニューロンの細胞質の中にＳＰＴ１およびＳＰＴ２の両方が存在し、両方のサブユニットの発現レベルは同様であると思われた。ヒト小脳に見られるプルキンエ細胞がＳＰＴ１およびＳＰＴ２の両方に関して示した免疫陽性の度合は中程度であった（データは示していない）。それとは対照的に、他の種類のニューロン細胞、例えば星状細胞、小膠細胞およびオリゴデンドリティック（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）細胞などには全くＳＰＴ１もＳＰＴ２も検出されなかった。
【００８２】
図３に、予免疫血清（図３Ａ）、ＳＰＴ１（図３Ｂ）およびＳＰＴ２（図３Ｃ）抗体による免疫標識付けを受けさせた正常なヒト大腸を示す。上皮細胞（小さい矢じり）およびマクロファージ（大きな矢じり）はＳＰＴ１（図３Ｂ）およびＳＰＴ２（図３Ｃ）に関して陽性の細胞内免疫反応性を示す。ニューロンの場合と同様に、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２の両方の発現は主に細胞質で起こった。上皮細胞の中で起こるＳＰＴ２の発現は中程度であるのに比較して、粘膜のマクロファージはＳＰＴ２に対してずっと強力な免疫反応性を示した。予免疫血清を用いた染色では如何なる種類の細胞にも全く免疫反応性が観察されなかった（３Ａ）。ＳＰＴの発現が結腸の中の粘膜のマクロファージ（図３Ａおよび３Ｂ）そして胃およびダスト細胞（肺胞のマクロファージ）（表３）の中で高度に起こったことは、そのようなマクロファージが、環境にさらされる傾向があることで活性化を受け易い組織に関連していることによるものであろう。
【００８３】
図４に、予免疫血清（図４Ａ）またはＳＰＴ１（図４Ｂ）およびＳＰＴ２（図４Ｃ）特異的抗体のそれぞれによる免疫標識付けを受けさせた正常なヒト副腎を示す。副腎髄質のクロム親和性細胞（大きな矢じり）、血管の平滑筋細胞（矢印）および内皮（小さい矢じり）がＳＰＴ１およびＳＰＴ２に関して強い陽性の細胞質免疫反応性を示す。副腎皮質にはＳＰＴ１の発現もＳＰＴ２の発現も検出されなかった。内皮およびクロム親和性細胞ではＳＰＴ２発現の方がＳＰＴ１発現よりも大きかった。また、細胞質以外に、クロム親和性細胞核にもＳＰＴ２の発現を明らかに観察することができる。支持している線維芽細胞ストローマには検出可能なＳＰＴ１免疫標識付けもＳＰＴ２免疫標識付けも存在しない。
【００８４】
図５に、予免疫血清（図５Ａ）、ＳＰＴ１（図５Ｂ）およびＳＰＴ２（図５Ｃ）特異的抗体による正常なヒト腎臓の免疫標識付けを示す。近位管（矢じり）がＳＰＴ１およびＳＰＴ２に関して示した免疫反応性は陽性であった。近位管の上皮細胞の中でＳＰＴ１が示した拡散細胞内標識パターン（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎｓ）は同じ種類の細胞の中でＳＰＴ２が示した斑点状標識パターンとは異なっていた。細胞質の中で起こったＳＰＴ１の発現は拡散していたが、ＳＰＴ２の免疫染色はより斑点状であり、全体に渡ってＳＰＴ１より弱かった。予免疫血清を用いた時には免疫反応性が全く観察されなかった。図５Ｃは、ＳＰＴ活性が内質小網の細胞質ゾル側に局在していることを示しており、腎臓の近位管上皮の中で起こったＳＰＴ２の発現は斑点状であり、従って、ＳＰＴ２の発現は内質小網に関して起こることを示唆している。
【００８５】
図６に、予免疫血清（図６Ａ）またはＳＰＴ１（図６Ｂ）およびＳＰＴ２（図６Ｃ）特異的抗体のそれぞれによる免疫標識付けを受けさせたいくつかの正常なヒト子宮組織サンプルを示す。子宮ストローマの平滑筋細胞（大きな矢じり）および内皮（小さい矢じり）がＳＰＴ１およびＳＰＴ２に関して示した免疫反応性は陽性であり、内皮細胞内ではＳＰＴ２発現の方が大きかった（ＳＰＴ１に比較して）。予免疫血清を用いた時には全く免疫反応性が観察されなかった。
【００８６】
本発明の方法を用いて、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２が代謝活性細胞（例えば自律神経刺激でエピネフリンおよびノルエピネフリンを分泌する副腎のクロム親和性細胞）およびニューロンおよび卵巣皮質ストローマ細胞の中に発現することを示す。増殖する種類の細胞、例えば胃、肺（データを示していない）、腎臓の近位管および結腸の管腔などの中の上皮層がＳＰＴ１およびＳＰＴ２の標識付けに陽性であることを観察したことから、ヒト大腸の二重免疫組織化学標識付けを実施した。
【００８７】
図７に、トポイソメラーゼＩＩαに対する抗体（細胞増殖およびＳＰＴ１のマーカー）（赤色）（図７Ａ）およびＳＰＴ２（図７Ｂ）に特異的な抗体（褐色）を用いたヒト大腸の二重免疫組織化学的標識付けを示す。矢じりは赤色に標識された細胞と褐色に標識された細胞が一緒に存在することを示しており、このことは、増殖する上皮細胞の中にＳＰＴ１およびＳＰＴ２が発現することを示している（大きい矢じり）。小さい矢じりはＳＰＴ１（図７Ａ）およびＳＰＴ２（図７Ｂ）がマクロファージの中に存在することを示している。
結果
本発明の方法を用いて、セリンパルミトイルトランスフェラーゼのサブユニットＳＰＴ１およびＳＰＴ２が正常なヒト組織の中で示す分布を特徴付け、それによって、ＳＰＴ１とＳＰＴ２が類似していることとそれらが示し得る機能の情報が得られる。ＳＰＴ１の発現とＳＰＴ２の発現に差があることを観察したことから、ＳＰＴの場所および発現レベルが細胞の生理学的状態に関連している可能性があることが分かった。
【００８８】
ＳＰＴの発現レベルは代謝活性細胞および増殖する細胞の方が高かった。同じ組織の中の同じ種類の細胞の中で起こるＳＰＴ１発現とＳＰＴ２発現の間に差があることは、ＳＰＴが活性を示し得る時に各サブユニットが特定の機能を果たし、恐らくは独立して機能を果たすに違いないことを示唆していた。酵母とは異なり、ヒトＨＥＫ２９３細胞では、マウスＳＰＴ２が単独で過剰発現し、その結果として、それに相当してＳＰＴ活性が高くなったが、ＳＰＴ１単独ではＳＰＴの活性を高くしない（ＷｅｉｓｓおよびＳｔｏｆｆｅｌ、１９９７）。ヒトＳＰＴは、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２に加えて、また、酵母に存在するＴｓｃ３ｐ蛋白質のような追加的成分も有する可能性がある。また、ＳＰＴ２が核の中に存在することは、ＳＰＴ２が別の核蛋白質１種または２種以上と関連しているか或は修飾を受けて核の中に輸送されることを示唆している可能性がある。このように、ＳＰＴ１の発現とＳＰＴ２の発現の動力学的差を解析することはＳＰＴの活性を明らかにするに役立つであろう。
【００８９】
ＳＰＴの発現が正常な細胞の中で起こることを確認したことを利用して増殖性障害、例えば癌などにおける異常な細胞活性を測定することができる。ＳＰＴの絶対的発現レベルおよび酵素活性の場所の両方とも細胞生理の変化の指標になり得る。病生理学的状態、例えば血管の過形成（Ｄ．Ｊ．Ｕｈｌｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｍ．Ｃａｒｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．Ａｒｇｅｎｔｉｅｒｉ、Ｂ．Ｐ．ＤａｍｉａｎｏおよびＭ．Ｒ．Ｄ’Ａｎｄｒｅａ、「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｅｒｉｎｅ  Ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＳＰＴ）ｉｎ  Ｂａｌｌｏｏｎ−ｉｎｊｕｒｅｄ  Ｒａｔ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ」、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍ．、２００１、８６、１３２０−６）、創傷治癒および腫瘍などでＳＰＴの活性が高くなることが観察されたことは、ＳＰＴが治療効力を有することを示唆している。そのような状態の時にＳＰＴの活性を抑制または低くするとそのような状態に関連した症状が影響を受ける可能性がある。ブタ上皮腎臓細胞ＬＬＣ−ＰＫ１では、この細胞をミリオシンの如きＳＰＴ１特異的阻害剤で処理すると、フモニシン誘発細胞毒性および抗増殖効果が低下した。同じ試験で、ミリオシンをＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔内投与すると腎臓に蓄積する遊離スフィンゴシンの量が６０％少なくなり、それ付随した臨床的副作用は全く見られなかった。このように、ＳＰＴ阻害剤、例えばミリオシンなどは増殖性障害、例えば癌などの治療で重要な治療効力を有する可能性があり、かつ炎症および血管損傷などの状態に関連した病生理に影響を与える可能性がある。
【００９０】
本発明の方法では、最初に正常なヒト組織におけるＳＰＴ１およびＳＰＴ２発現の直接的免疫位置決め（ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）および比較を行い、これはＳＰＴが細胞の中で示す活性の複雑さを明らかにすることに向かう重要な段階である。そのような成分がＳＰＴ活性に関して示す役割を理解することは、いろいろな病気状態、例えば癌および再狭窄などにおける数多くの重要なスフィンゴリピド介在細胞機能および反応の調節を測定するに絶対的に必要である。
【実施例３】
【００９１】
過剰増殖するヒト組織の免疫組織化学
実施例２のＩＨＣ手順を用い、ホルマリンで固定してパラフィンに埋め込んだ組織に対するＩＨＣを用いて、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２蛋白質の場所を測定した。可能性のある染色人為産物、例えばスライドからスライドへの変動および実験から実験への変動などを無くす目的で正常なヒト組織および悪性疾患のヒト組織に評価を多組織フォーマットで同時に受けさせた。
細胞培養物
ヒト新生児の皮膚線維芽細胞およびこれらの培養媒体をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ／Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。細胞懸濁液（５Ｘ１０４／ｍＬ）を免疫細胞化学用４個ウエルチャンバスライド（４−ｗｅｌｌ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅｓ）（ＮＵＮＣ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）に種付けした。分化した休止状態の線維芽細胞のインビボ活性化をインビトロで模擬する目的で、引っ掻いて傷を付ける（ｓｃｒａｐｅ−ｗｏｕｎｄｉｎｇ）モデルを用いた。簡単に述べると、細胞を２日間培養［不完全融合（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）、増殖状態）または９日間培養（過剰融合、休止状態）するか、或は９日目の休止状態の培養物にピペット末端部を用いた機械的引っ掻きを受けさせた。創傷反応における発現を評価する目的で、傷を付けた後の細胞を更に５日間培養した。
免疫細胞化学（ＩＣＣ）
４個のチャンバで培養したスライドを室温で１０％の中性緩衝ホルマリンで１０分間固定し、ＰＢＳで濯いだ後、ＩＣＣに関する評価を行った。あらゆる洗浄段階をｔｗｅｅｎ−２０を用いた自動緩衝装置（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）で実施した。
二重免疫組織化学（ＩＨＣ：ＩＨＣ）
ＳＰＴが増殖細胞と一緒に存在するか否かを測定する目的で、ＩＨＣ：ＩＨＣを用いて、増殖する細胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）（ＰＣＮＡ）である増殖マーカー（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ）の検出と同時にＳＰＴ１もしくはＳＰＴ２発現を検出した。簡単に述べると、最初に、この上に記述した如きＳＰＴ−１もしくはＳＰＴ−２検出用単一ＩＨＣ標識付けプロトコルに従ってスライドを処理した。ヘマトキシリンの目的でスライドを処理しないで、ＰＣＮＡ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｉｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）を組織の上に３０分間置いた。ＰＢＳによる洗浄を数回行った後、ビオチニル化ウマ抗−マウス二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を同様にインキュベートした。アルカリ性ホスファターゼ接合ＡＢＣ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）と一緒にインキュベートすることによるアルカリ性ホスファターゼ検出システムに続いてＦａｓｔ  Ｒｅｄ色素原（Ｓｉｇｍａ）を用いた現像でＰＣＮＡ陽性細胞の存在を可視化した。次に、スライドに後染色を常規通り受けさせた後、取り付けた。
【００９２】
表４に、いろいろなヒト悪性疾患組織におけるＳＰＴ１およびＳＰＴ２の免疫位置決めを示す。標識付け（ｌａｂｅｌｉｎｇ）が陽性であることを褐色の染色が現れることで定義し、異なる１８種類のヒト腫瘍において、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２に関して標識が付けられた細胞の数（１００Ｘで見た場の中の）に従って評価した。５種類の癌（結腸、卵巣、膵臓、甲状腺、未分化）および２種類の肉腫に両方のＳＰＴサブユニットの過剰発現が強力に起こったことが示された。負の対照は観察できる標識付けをもたらさなかった。悪性疾患のヒト組織の場合、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２に関して標識付けを受けさせた細胞の数は、１００Ｘで見た場の中にｎ＝２−１０であり、陰性（Ｎ）には標識が付けられた細胞が存在せず、弱（Ｗ）には標識が付けられた細胞が１−１０個存在し、中（Ｍ）には標識が付けられた細胞が１１−２０個存在し、強（Ｓ）には標識が付けられた細胞が＞２０個存在していた。
【００９３】
【表６】
2005523416.tif 000007
【００９４】
図８−１２に、免疫組織化学を用いてＳＰＴ１およびＳＰＴ２の発現に関する試験を受けさせた過剰増殖性ヒト組織のいくつかを示す。
【００９５】
図８に、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２の細胞発現および場所を観察する目的でＩＣＣを用いた不完全融合ヒト皮膚線維芽細胞の免疫標識付けを示す。ＳＰＴ１（図８Ｃ）およびＳＰＴ２（図８Ｄ）による標識付けを受けさせた細胞のそれぞれを負の対照による標識付けを受けさせた細胞（図８Ａ）およびＰＣＮＡによる標識付けを受けさせた細胞（図８Ｂ）と比較した結果は、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２の過剰発現が増殖性線維芽細胞の中の核と関連していることを示している。
【００９６】
図９に、分化した休止状態の線維芽細胞にインビトロで傷を付けるモデルの結果を示す。増殖する細胞の中で起こるＳＰＴの発現を更に特徴づける目的でインビボ組織活性化を模擬するそのようなモデルを用いた。休止状態の線維芽細胞培養物を、機械的引っ掻きを受けさせた後に５日間の回復を受けさせた融合培養物（創傷状態）と比較した。図９は、負の対照（図９Ａおよび図９Ｂ）およびＰＣＮＡ（図９Ｄおよび図９Ｅ）抗体を用いて免疫標識付けを受けさせた９日もしくは１４日目の休止状態の培養物ではＩＣＣによるＳＰＴ標識付けは起こらないことを示している。ＳＰＴ１（図９Ｇおよび図９Ｈ）およびＳＰＴ２（図９Ｊおよび図９Ｋ）抗体を用いると軽く拡散した標識付けが観察された。１４日目の傷を付けた線維芽細胞（図９Ｃ、９Ｆ、９Ｉおよび９Ｌ）はＰＣＮＡ（図９Ｆ）、ＳＰＴ１（図９Ｉ）およびＳＰＴ２（図９Ｌ）に関して強力な免疫標識付けを示す。ＳＰＴ１およびＳＰＴ２で免疫標識が付けられた細胞が最も顕著に観察されたことは、１４日目の傷付けられた線維芽細胞（図９Ｉおよび９Ｌ）では核に関連した標識付けが強力に生じたことを示しており、そのような標識付けは、９日目の休止状態の細胞（図９Ｇおよび９Ｊ）および１４日目の休止状態の細胞（図９Ｈおよび９Ｋ）には存在しない。
【００９７】
図１０に、ＰＣＮＡ（図１０Ｂおよび１０Ｄ）がＳＰＴ１発現の増加（図１０Ａ）およびＳＰＴ２発現の増加（図１０Ｃ）と一致することを示す目的で用いた核二重染色（ｎｕｃｌｅｉ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）（ＩＦ：ＩＦ）を示す。矢印はＰＣＮＡが検出された細胞を示す。標識が付けられた細胞は強力なＳＰＴ発現を示し、その発現したＳＰＴは核と関連していた。矢じりはＰＣＮＡ標識付けを示さなかった細胞を示しており、ＳＰＴ標識付けが拡散していることは核と特に関連していないことを示している。核二重染色およびインビトロ傷付けモデルで観察した発現パターンから、増殖する細胞ではＳＰＴの発現が増加し、そのＳＰＴ１およびＳＰＴ２の発現は核と関連していると思われる。また、脱分化を起こした線維芽細胞およびバルーンで創傷を負わせたラット頸動脈の中の増殖する血管平滑筋細胞ではＳＰＴ１およびＳＰＴ２の発現が増加することが最近報告された（Ｕｈｌｉｎｇｅｒ  ＤＪ、Ｃａｒｔｏｎ  ＪＭ、Ａｒｇｅｎｔｉｅｒｉ  ＤＣおよびＤａｍｉａｎｏ  ＢＰ、Ｒ．ＤＡＭ、「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｅｒｉｎｅ  Ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＳＰＴ）ｉｎ  Ｂａｌｌｏｏｎ−ｉｎｊｕｒｅｄ  Ｒａｔ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ」、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、２００１、８６：１２２０−６）。
【００９８】
図１１は、充分に確立された３種類の癌細胞系であるＪｕｒｋａｔ（図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃ）、ＨＴ−２９（図１１Ｄ、１１Ｅおよび１１Ｆ）およびＳＨ−ＳＹ  ５Ｙ（図１１Ｇ、１１Ｈおよび１１Ｉ）の中でＳＰＴ免疫標識付けが強力に起こることを示している。インビトロおよびインビボ両方の創傷修復モデルでＳＰＴ１およびＳＰＴ２の発現が増加することを観察したことは、創傷修復反応と腫瘍形成の間に類似性（ｐａｒａｌｌｅｓ）が存在することを示している。数種の癌細胞系にＩＣＣを用いた選別をＳＰＴ１およびＳＰＴ２の過剰発現に関して受けさせた時の表４に示した結果は、５種類の癌（結腸、卵巣、膵臓、甲状腺および未分化）および２種類の肉腫では両方のＳＰＴサブユニットとも強力に過剰発現するが、他の腫瘍に発現したＳＰＴ１のレベルもＳＰＴ２のレベルも僅かまたは検出不能なレベルであることを示していた。
【００９９】
図１２に、ＩＨＣおよび予免疫血清（図１２Ａ）、ＳＰＴ１（図１２Ｂ）およびＳＰＴ２（図１２Ｃ）に対する抗体を用いた処理を受けさせたヒト悪性結腸癌組織を示す。この悪性疾患細胞にはＳＰＴ１（小さい矢じり）およびＳＰＴ２（小矢じり）の細胞内標識付けが強力に観察された。加うるに、腫瘍に隣接して位置する線維芽細胞ストローマにも免疫染色を観察した（大きな矢じり）。ＩＨＣおよび予免疫血清（図１２Ｄ）、ＳＰＴ１（図１２Ｅ）およびＳＰＴ２（図１２Ｆ）に対する抗体を用いた処理をヒト悪性未分化癌組織に受けさせた（図１２Ｄ、１２Ｅおよび１２Ｆ）。未分化ヒト癌組織ではＳＰＴ１シグナル伝達（矢じり、図１２Ｅ）の方がＳＰＴ２シグナル伝達（この方が弱い）（図１２Ｆ）に比べて強いと思われた。シグナル伝達の強度を組織サンプルの間で比較することは関連があり得る。２種類のＳＰＴサブユニットが果たす酵素活性の役割（触媒作用であるか或は調節作用であるか）はまだ明瞭でないことから、細胞の反応にとってＳＰＴ１の発現が増加するか或はＳＰＴ２発現に対するＳＰＴ１発現の比率が高くなることが重要であるか否かは明らかでない。図１２Ｇ、１２Ｈおよび１２Ｉに、予免疫血清（図１２Ｇ）、ＳＰＴ１（図１２Ｈ）およびＳＰＴ２（図１２Ｉ）に対する抗体を用いて処理したヒト悪性甲状腺癌組織を示す。この腫瘍細胞の大部分にＳＰＴ特異的染色が見られた。ＳＰＴ１およびＳＰＴ２シグナル伝達（矢じり）の強度は細胞から細胞でいろいろであった。悪性疾患細胞のいくつかはＳＰＴサブユニットを非常に高いレベルで発現させ、このことは、腫瘍細胞が要求する前記サブユニットの発現レベルは多様であり得ることを示している。図１２Ｊ、１２Ｋおよび１２Ｌにヒト悪性肉腫組織を示す。このような悪性疾患ではＳＰＴ１およびＳＰＴ２（矢じり）が豊富に発現した。
【０１００】
このような結果は、癌細胞におけるＳＰＴの過剰発現は上皮細胞に由来するそれら、例えば癌腫などに限定されないことを示している。また、間葉細胞に由来する癌、例えば肉腫などもＳＰＴサブユニットを多く発現すると思われる。
結果
本発明で生じさせたヒトＳＰＴ１およびＳＰＴ２に対する抗体を用いると、これらの酵素サブユニットが正常なヒト組織の中で発現することそして血管の平滑筋細胞およびバルーンで損傷を負わせたラット頸動脈の中の活性化を受けた線維芽細胞および傷を付けたヒト皮膚線維芽細胞の増殖する細胞では発現レベルが高くなることを観察する方法が得られ、それによって、インビトロ傷つけモデルでＳＰＴ１およびＳＰＴ２の発現が増加することを立証することができ、このことは、両方のＳＰＴサブユニットの個々別々の細胞上向き調節（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）および強力な免疫標識付けが起こることを示している。増殖していない休止状態の線維芽細胞が示したＳＰＴ１およびＳＰＴ２染色は細胞全体に渡って僅かのみでありかつ拡散していた。また、増加したＳＰＴ１およびＳＰＴ２免疫標識付けの多くは核に関連していることも明らかになった。ＳＰＴが核に存在することはスフィンゴリピドの核シグナル伝達（ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（例えば有糸分裂誘発のための）に関係している可能性がある。線維芽細胞をＰＤＧＦで処理するとスフィンゴシンキナーゼが核に移ることを観察したことは、増殖する細胞および形質転換を受けた細胞ではスフィンゴリピドが核シグナル伝達に関与していると言った仮定を支持している。
【０１０１】
本発明の方法を用いると、正常なヒト組織で起こるＳＰＴの発現を過剰増殖するヒト組織で起こるＳＰＴの発現と比較する手段が得られ、それによって、細胞の創傷修復反応に関与する鍵となる分子のいくらかがまた腫瘍の成長および転移にも関係していると言った直面する範例の裏付けを立証した。
【０１０２】
充分に確立された数種のヒト腫瘍細胞系でＳＰＴサブユニットが豊富に発現したが、そのような腫瘍細胞系にはリンパ腫、腺癌および神経芽腫が含まれる。本方法を用いて、悪性癌細胞ばかりでなく腫瘍微細環境を形成する種類の細胞、例えば反応性線維芽細胞ストローマおよび局所的マクロファージなどでもＳＰＴ１およびＳＰＴ２の発現が増加すると言った形態学的証拠を得た。同様な正常組織の中の線維芽細胞ストローマにはＳＰＴ１もＳＰＴ２も検出されなかった。そのような種類の細胞ではＳＰＴサブユニットのレベルが高くなることはＳＰＴが細胞転移活性および増殖にある役割を果たしていることを示唆している。
【０１０３】
また、炎症反応に関係して活性化された白血球でもＳＰＴの発現が増加することが観察された（２）。ヒトマクロファージではＳＰＴが上向き調節されることでスフィンゴリピド生合成経路による流出（ｆｌｕｘ）が多くなることが立証された。ヒト悪性疾患でＳＰＴの発現が増加することは、腫瘍転換（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を起こした細胞およびそれを取り巻く微細環境の細胞にスフィンゴリピド生合成経路が生じることで流出が調節されることの指標であり得る。スフィンゴリピドは増殖および転移過程に関係していると思われていた。細胞の表面で起こるいろいろなグリコスフィンゴリピドの発現が変化することを癌表現型、腫瘍の進行および転移の取得および持続と相互に関係付けられることが行われた。
【０１０４】
本発明の方法を用いて、また、最初にヒト悪性腫瘍細胞、局所的マクロファージそして腫瘍細胞を取り巻く「反応性」線維芽細胞ストローマの中で起こるＳＰＴ１およびＳＰＴ２蛋白質の発現をインサイチューで組織学的に比較する。ＳＰＴのレベルが高くなることは、腫瘍の中ばかりでなく腫瘍微細環境（ＴＭＥ）を形成する種類の細胞の中で起こり得る異常な細胞活性のいくつかの機構を示唆している。増殖する線維芽細胞では細胞下のＳＰＴサブユニット場所が拡散および細胞質から核関連に移行することを観察したことは、この酵素が果たすある機能的役割を示唆している。加うるに、ＳＰＴのレベルとこれの細胞の中の場所が特定の種類の腫瘍と相互に関係している可能性があり、そして腫瘍細胞および線維芽細胞ストローマの中に存在するＳＰＴ１とＳＰＴ２の相対量が臨床的に関係している可能性もある。ＴＭＥ細胞の中に存在するＳＰＴ１およびＳＰＴ２は、転移活性の明瞭な指標になり得、従って、診断および予後の価値を有する可能性がある。より重要なことは、特定の新形成に対して治療的有用性を有する新規なＳＰＴ阻害剤化合物を識別する選別方法として本方法を更に用いることができることを前記データが示唆している点にある。
【実施例４】
【０１０５】
内皮組織におけるＳＰＴ１およびＳＰＴ２の検出
バルーン血管形成ラットモデル
以前に記述された方法を用いてラットの総頸動脈をバルーン−カテーテルで膨張させることで血管の損傷を誘発した。ケタミン／キシラジン（７５／５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）を用いて体重が３５０−４５０グラムのオスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに麻酔をかけた。無菌技術を用いて、２Ｆ塞栓切除用カテーテル（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を外部頸動脈経由で左側の総頸動脈の中に挿入した。バルーンの先端を大動脈の中に進め、３０ｐ．ｓ．ｉにまで膨張させた後、捩り動作を伴わせてゆっくり引き抜いた。これを全体で３回繰り返した。前記カテーテルを取り除いた後、外部頸動脈をしっかり結んだ。損傷を与えて１日、３日、７日および１４日後にケタミン／キシラジン（７５／５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）を用いてラットに麻酔をかけた。ヘパリンを１０００Ｕ入れておいた５％のＥｖａｎのブルー溶液を１ｍＬ静脈内投与した。１０分後、ラットに食塩水による潅流を大動脈に通して１００ｍｍＨｇで１０分間に続いて燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％のパラホルムアルデヒドによる潅流を受けさせた。左側および右側の総頸動脈を取り出した後、調製してパラフィンに埋め込んだ。完全な血栓性閉塞を伴う頸動脈ばかりでなく損傷を受けた部分が青色に染色されなかった頸動脈も分析から排除した。
組織調製
組織断片（５μＭ）をスライドの上に乗せた後、ヘマトキシリンとエオシンを用いて頸動脈中央部の代表的な断片に染色を受けさせた。エラスチン−ファンギエソン染色（ｅｌａｓｔｉｎ−ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ  ｓｔａｉｎ）に修飾を受けさせた方法（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて隣接もしくはほぼ隣接する断片にエラスチンおよびコラーゲンに関する染色を組織化学的に受けさせた。他の隣接もしくはほぼ隣接する断片を免疫組織化学分析で用いた。
二重免疫組織化学標識付け
損傷を受けさせた頸動脈および正常な頸動脈の断片に、ヒトＳＰＴ１に対して生じさせたポリクローナルペプチド特異的抗体を用いた免疫組織化学的標識付けを受けさせそして別の実験では実施例２に記述したようにしてヒトＳＰＴ２に対して生じさせた抗ペプチド抗体を用いて受けさせた。また、断片に因子ＶＩＩＩ関連抗原、平滑筋アクチンおよびＰＣＮＡに対する抗体を用いた標識付けも受けさせた。標識付けの適切な解釈を保証する目的で１組の対照を実施した。検出装置の制御で一次抗体の代わりに適当な種のイソ型を用いた。別の組の制御では、１番目の一次抗体を排除して２番目の一次抗体に処理を受けさせ、そしてその逆も行った。
【０１０６】
同時二重免疫組織化学標識付け（ＩＨＣ：ＩＨＣ）では、同じ断片に対して各々の免疫組織化学標識付け手順を逐次的に実施した後、後染色を実施した。アルカリ性ホスファターゼ−ＦＡＳＴ  ＲＥＤ（Ｄａｋｏ）系を用いて２番目の抗原を検出した。１番目の免疫組織化学標識付けの後、２番目の標識付けのための一次抗体をスライドの上に室温で３０分間置いた。洗浄を短時間行った後、二次ビオチニル化抗体を室温で加えて３０分間置いた。次に、これらのスライドをＰＢＳで洗浄した後、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を前記スライドの上に室温で３０分間置いた。洗浄後、スライドをＦＡＳＴ  ＲＥＤ  ＣＨＲＯＭＯＧＥＮ（Ｄａｋｏ）に接触させた。次に、前記スライドにヘマトキシリンを用いた後染色、洗浄そして水が基になった取り付け用媒体（Ｄａｋｏ）の中でカバースリップを受けさせることで、光顕微鏡で見えるようにした。
【０１０７】
正常な血管では内側の平滑筋および内皮におけるＳＰＴ標識付けが拡散していてパッチ状（ｐａｔｃｈｙ）であった。損傷を起こさせて１日後および３日後、新内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）が現れる前に、損傷もしくは壊死平滑筋細胞に隣接する細胞でＳＰＴ１およびＳＰＴ２の標識が増加した。加うるに、増殖する外膜の筋線維細胞がＳＰＴ１およびＳＰＴ２に関して強力に標識付けされた。損傷を起こさせて７日および１４日後、損傷を起こさせた血管の中膜および新内膜のＳＰＴ標識付けが増加し、この標識付けは、新内膜の管腔縁の所が最も強力であった。このような管腔縁は活動的に増殖する平滑筋細胞を含んで成ることが記述かつ示されている。二重免疫組織化学標識付けによって、ＳＰＴの最大の発現が起こる領域はＰＣＮＡ陽性細胞の密度が最大の領域であることが立証された。
【０１０８】
図１３に、バルーン血管形成を受けさせて１４日後のラットモデルで観察された典型的な病変を示す。バルーンで傷を付けた動脈（左側のパネル）では傷を付けなかった動脈（右側のパネル）に比べて中膜の厚みが顕著に厚くなるばかりでなく新内膜が顕著に存在することを観察した。傷を付けた動脈の中膜および新内膜ばかりでなく傷を付けなかった動脈の中膜の全体に渡って平滑筋アクチン標識が存在していた（図１３Ｃ）。傷を付けた血管の中膜および新内膜にＰＣＮＡ陽性細胞が観察され、管腔縁の所の標識付けが最大であった（図１３Ｅ、矢じり）。傷を付けなかった血管ではＰＣＮＡ陽性細胞が多くは発現しなかった（図１３Ｆ）。傷を付けなかった頸動脈で見られたＳＰＴ標識付けは無傷の内皮層に沿った所のみであった（矢じり、図１３Ｈおよび１３Ｊ）。動脈に傷を付けて１４日後、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２標識付けが管腔細胞から新内膜に至るまで広がった。ＳＰＴ２標識付けの方がより強力であり、特に管腔縁の所の標識付けが強力であると思われた。このようなデータは、ＳＰＴ１およびＳ２が血管の損傷に反応して特異的に上向き調節されることを示している。中膜平滑筋の損傷に関連した細胞、増殖する外膜の筋線維細胞および新内膜の平滑筋細胞、特に新内膜の増殖する管腔縁の所の平滑筋細胞にＳＰＴ１およびＳＰＴ２の上向き調節が観察される。
【０１０９】
図１４に、血管形成後１日、３日、７日および３カ月目にＰＣＮＡ、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２発現を検査することによる血管損傷反応の時間的過程を示す。３日目に損傷中膜の平滑筋細胞（矢印を見よ）にＰＣＮＡ標識付けが見られた（図１４Ｄ）。３日目にＳＰＴ１（図１４Ｅ）およびＳＰＴ２（図１４Ｆ）陽性免疫反応が中膜（大きい矢じり）ばかりでなく損傷血管の管腔縁に沿って付着した血小板（小さい矢じり）の中に観察された。７日目にＰＣＮＡ標識付けがよりずっと顕著になった。早期の新内膜の標識付けが最も強力であったが、また、損傷血管の中膜にも標識付けが存在した（図１４Ｇ）。７日目の損傷血管の新内膜に存在するＳＰＴ１（図１４Ｈ）およびＳＰＴ２（図１４Ｉ）免疫標識付けの方が内膜の軽いＳＰＴ１およびＳＰＴ２免疫標識付けよりも強力であった。このように、ＳＰＴの発現は活動的に増殖する平滑筋細胞と一致していると見られる。損傷後３カ月目では、ＰＣＮＡ、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２に関する標識付けは新内膜の管腔の所の後から２番目の層に限定されている。
【０１１０】
図１５に、外膜およびマトリックスリモデリング（ｍａｔｒｉｘ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）において筋線維細胞が血管形成に反応して示した脱分化および増殖を示す。傷を付けていない頸動脈（図１５Ａ）および傷を付けて３日目の血管（図１５Ｂ）をヘマトキシリンおよびエオシンで染色したところ、傷を付けた血管では対照の血管外膜のそれに比べて外膜がより厚くなりかつ細胞が多くなった。免疫組織化学特徴づけを用いて、傷を付けた血管の外膜が示した反応およびＳＭＡ（図１５Ｃ）、ＰＣＮＡ（図１５Ｄ）、ＳＰＴ１（図１５Ｅ）およびＳＰＴ２（図１５Ｆ）に対する抗体が示した反応を示す。ＳＭＡ陽性免疫標識付けは外膜に脱分化した反応性筋線維細胞が存在することを示しており、それは対照血管には観察されなかった。また、外膜にＰＣＮＡ陽性免疫標識付け（矢じり）が顕著に存在することも観察され（図１５Ｄ）、このことは反応性線維芽細胞が存在することを示している。ＳＰＴ１（図１５Ｅ）およびＳＰＴ２（図１５Ｆ）が顕著である。また、外膜の中の筋線維細胞にも免疫標識付けを観察した（矢じり）。このような特徴的損傷反応変化はいろいろな癌で観察した変化に類似しており、このことは、ＳＰＴが線維芽細胞の過形成と新形成の両方に共通のシグナル伝達経路に関与している可能性があることを示している。
【実施例５】
【０１１１】
インビボ再狭窄モデル
ケタミン／キシラジン（７５／５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）を用いて体重が３５０−４５０グラムのオスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに麻酔をかけた。以前に記述された方法（Ｄａｍｉａｎｏ他、１９９９）を用いて、バルーン−カテーテルをラットの総頸動脈の中で膨張させることで血管損傷を誘発する。一群のラットにセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤であるミリオシンを０日、２日、５日および１０日目にｉ．ｐ．で０．５ｍｇ／ｋｇ注射することによる処理を受けさせる。１日、３日、７日および１４日目に動物を屠殺しそして損傷群および対照群の断片に関して頸動脈再狭窄損傷の組織病理を評価しかつセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットの発現を免疫組織化学的に検査した。処理した動物では再狭窄損傷（即ち血管が狭くなっている）度合が低いことはＳＰＴ阻害剤が効力を有することの指標である。
【実施例６】
【０１１２】
Ｂ１６肺転移モデル
標準的条件を用いてＢ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞（ＩＣＬＣカタログコードＡＴＬ９９０１０）を単層組織培養物として増殖させる。４から８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾の静脈に約２ｘ１０６個の細胞をｉｖ．注射する。一群のマウスでは、０日、２日および５日目にセリンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばミリオシンなどを約０．５ｍｇ／ｋｇのレベルで同時にｉｐ投与する。対照群では溶媒を注射した。これらのマウスを腫瘍が確立されるように腫瘍注射後９日間保持した後、安楽死させた。肺を取り出し、Ｂｏｕｉｎの溶液で固定した後、解剖用顕微鏡を用いて肺転移の数を数えた。マウスで肺転移の数が減少したことはＳＰＴ阻害剤によってＢ１６−Ｆ１０腫瘍の確立が防止されたことの指標である。
【実施例７】
【０１１３】
炎症を起こした結腸におけるＳＰＴ２検出−ラット結腸炎モデル
ハロタンを用いて動物に麻酔をかけ、それらの結腸をエタノールで洗浄（３０％、１ｍｌ、約３０秒間）して粘液バリヤー（ｍｕｃｏｕｓ  ｂａｒｒｉｅｒ）を壊した後、食塩水で濯いだ（１ｍｌ）。次に、栄養用針を肛門の中に約７−８ｃｍの深さにまで挿入することでチモサン（１ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）または等しい体積の媒体（食塩水）を結腸の中に注入した。チモサンを注入した動物では、結腸内注入後２０時間目に屠殺した。これらの動物に固定液による潅流を噴門経由で受けさせた。結腸を取り出した後、同じ溶液を用いて後固定を行った（ｐｏｓｔ−ｆｉｘｅｄ）。
組織調製
結腸の遠位末端部、即ちこのモデルで結腸炎反応を起こしたことを確認した領域から結腸の約１ｃｍの断片を連続的に３個切り取って、動物１匹当たり１個のパラフィンブロックの中に埋め込むことで同時観察を実施した。各パラフィンブロックから組織断片（５μＭ）を切り取った。断片をスライドの上に乗せた後、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２に特異的な抗体を用いて処理することで、免疫組織化学的分析を行った。追加的免疫組織化学マーカーを用い、ミエロペルオキシダーゼに特異的な抗体を用いて多形核白血球（ＰＭＮ）の存在を証明しそしてマクロファージに特異的な抗体であるＭＡＣ−１を用いてマクロファージの存在を証明した。
【０１１４】
図１６に、炎症を起こした結腸の中に白血球が入り込むことを示す。上方のパネルの矢印（図１６Ａ）は、マクロファージは活性化を受けるに伴ってＳＰＴ２のレベルが高くなることを示している。下方のパネル（図１６Ｂ）は、炎症を起こした結腸の管腔側で好中球の浸潤が起こることを示している。矢印はＳＰＴ２発現の増加を示した場の中の活性化を受けた数多くの好中球の中の３個を示している。ＳＰＴ１免疫標識付けでも同様な結果を得た（データは示していない）。ＳＰＴ１およびＳＰＴ２免疫陽性ＰＭＮおよびマクロファージが顕著に存在することに加えて、移動する上皮舌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏｎｇｕｅ）にも陽性の免疫標識付けが観察され、それは正常な上皮から移動して来たと思われ（データは示していない）、このことは、ＳＰＴ１およびＳＰＴ２が炎症細胞に存在するばかりでなくまた増殖する上皮細胞にも存在（恐らくは損傷を解決する試みで）ことを示唆している。
【０１１５】
この上に示した明細は説明の目的で与えた実施例を伴って本発明の原理を教示するものであるが、本分野の技術者は本説明を考慮することで本発明のいろいろな面のさらなる修飾を思い浮かべるであろうことそして本発明の実施に添付請求の範囲そしてそれらの相当物（そのような変形の全部を包含すると解釈する）の範囲内に入る如き通常の変形、代替態様、適用および／または修飾形の全部を包含させることは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１に、ヒトＳＰＴ１およびＳＰＴ２に対して生じさせたペプチド特異的ポリクローナル抗体の特異性を評価する免疫ブロット分析の結果を示す。
【図２】図２に、正常なヒト脳組織におけるＳＰＴ発現を６００Ｘ倍率で示す。
【図３】図３に、正常なヒト結腸織におけるＳＰＴ発現を６００Ｘ倍率で示す。
【図４】図４に、正常なヒト副腎組織におけるＳＰＴ発現を６００Ｘ倍率で示す。
【図５】図５に、正常なヒト腎臓組織におけるＳＰＴ発現を６００Ｘ倍率で示す。
【図６】図６に、正常なヒト子宮組織におけるＳＰＴ発現を６００Ｘ倍率で示す。
【図７】図７に、正常なヒト結腸組織におけるトポイソメラーゼと一緒のＳＰＴ１およびＳＰＴ２それぞれの共発現を６００Ｘ倍率で示す。
【図８】図８に、不完全融合線維芽細胞におけるＳＰＴ１およびＳＰＴ２発現を３００Ｘ倍率（図８Ａおよび８Ｂ）および６００Ｘ倍率（図８Ｃおよび８Ｄ）で示す。
【図９】図９に、休止状態および創傷線維芽細胞におけるＳＰＴ１およびＳＰＴ２発現を３００Ｘ倍率（図９Ａから９Ｆ）および６００Ｘ倍率（図９Ｇから９Ｌ）で示す。
【図１０】図１０に、線維芽細胞の二重染色（ＩＦ：ＩＦ）を１５００Ｘ倍率で示す。
【図１１】図１１に、ヒト腫瘍細胞系におけるＳＰＴ発現を９００Ｘ倍率で示す。
【図１２】図１２に、ヒト悪性結腸癌組織、未分化癌組織、甲状腺癌組織および肉腫組織におけるＳＰＴ発現を６００Ｘ倍率で示す。
【図１３】図１３に、ラットバルーン血管形成モデルにおける血管損傷の特徴を１４日間に渡って示す。
【図１４】図１４に、血管形成後１日目、３日目、７日目および３カ月目の血管損傷反応の時間的過程を示す。
【図１５】図１５に、外膜およびマトリックスリモデリングにおいて筋線維細胞が血管形成に反応して示す脱分化および増殖を示す。
【図１６】図１６に、炎症を起こした結腸の中に活性化を受けたマクロファージおよび好中球が入り込むことを示す。
【図１７】図１７に、スフィンゴリピドのデノボ合成経路を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図９Ｋ】
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【図９Ｌ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１２Ｊ】
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【図１２Ｋ】
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【図１２Ｌ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１４Ｊ】
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【図１４Ｋ】
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【図１４Ｌ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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