(57)【要約】開示された発明はカルシトニン遺伝子の新規な5'上流のCpGアイランドのメチル化パターンの分析のための方法および配列を提供する。特定の実施態様が、癌のための新規診断、予後、および治療マーカーとしてメチル化変化したDNA配列を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体内のカルシトニン遺伝子5'上流領域のメチル化状態を検出する方法であって、前記方法が、前記被験体から得た生体サンプル中の、配列番号1〜5およびその相補物から成る群から選択した配列に相補的な、あるいは、ストリンジェントまたは中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも16個のヌクレオチドの連続塩基配列を含む核酸を、少なくとも1種類の試薬または一連の試薬と接触させることを含み、前記試薬または一連の試薬が標的核酸内のメチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを識別するものである方法。
【請求項２】
請求項１による1個またはそれ以上の配列のメチル化状態の測定による細胞増殖性疾患の分析方法であって、前記配列が、配列番号1〜5およびその相補物から成る群から選択した配列に相補的な、あるいは、ストリンジェントまたは中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも16個のヌクレオチドの連続塩基配列をいずれの場合も含む、細胞増殖性疾患の分析方法。
【請求項３】
前記方法を結腸細胞または乳房細胞に適用する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号1〜5およびその相補物から成る群から選択した配列に相補的な、あるいは、ストリンジェントまたは中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも16個のヌクレオチドの長さの連続塩基配列を含む核酸分子。
【請求項５】
オリゴマー、特にオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸(PNA)オリゴマーであって、前記オリゴマーが、いずれの場合も、配列番号1〜5およびその相補物から成る群から選択した配列に相補的な、あるいは、ストリンジェントまたは中程度にストリンジェントな条件下で前記配列にハイブリダイズする少なくとも9個のヌクレオチドの長さを有する少なくとも1つの連続塩基配列を含む、オリゴマー。
【請求項６】
前記塩基配列が少なくとも1個のCpGジヌクレオチドを含む、請求項５に記載のオリゴマー。 
【請求項７】
前記CpGジヌクレオチドのシトシンが前記オリゴマーのほぼ3等分した中央部分に位置することを特徴とする、請求項６に記載のオリゴマー。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載の少なくとも2個のオリゴマーを含む、オリゴマーセット。
【請求項９】
配列番号1およびそれに相補的な配列内の全CpGジヌクレオチドのメチル化状態を検出するためのオリゴマーを含む、請求項８に記載のオリゴマーセット。
【請求項１０】
配列番号1〜配列番号5およびそれに相補的な配列の1のDNA配列の増幅にプライマーオリゴヌクレオチドとして使用できる、請求項５〜９の一に記載の少なくとも2個のオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項１１】
少なくとも1個のオリゴヌクレオチドを固相に結合することを特徴とする、請求項８または９に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項１２】
配列番号1〜配列番号5およびそれらに相補的な配列を含む群から得た配列内のシトシンメチル化状態および／または一塩基多型(SNP)を検出するための、請求項５〜１１のいずれかに記載の少なくとも3個のオリゴマーを含むオリゴヌクレオチドセットの使用。
【請求項１３】
カルシトニン遺伝子のCpGジヌクレオチドのメチル化状態に関連する疾患を分析するための担体材料に固定された各種オリゴマー配置(アレイ)を製造する方法であって、請求項５〜１１のいずれかに記載の少なくとも1個のオリゴマーを固相に結合する、各種オリゴマー配置(アレイ)を製造する方法。
【請求項１４】
請求項１３により入手可能な各種オリゴマー配置(アレイ)。
【請求項１５】
請求項１４に記載の各種オリゴヌクレオチドおよび／またはPNA-オリゴマー配列のアレイであって、これらが長方形または六角形の格子状に平面固相上に配置されていることを特徴とする、各種オリゴヌクレオチドおよび／またはPNA-オリゴマー配列のアレイ。
【請求項１６】
前記固相の表面がシリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなることを特徴とする、請求項１４または１５のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１７】
前記請求項の一に記載の少なくとも1個の核酸を含む、カルシトニン遺伝子のメチル化状態に関連する疾患を分析するためのDNAおよび／またはPNAアレイ。
【請求項１８】
請求項１〜３の一に記載の少なくとも1個の核酸分子内のメチル化状態を測定する方法であって：
a) ゲノムDNAを含有する生体サンプルの入手；
b) ゲノムDNAの抽出；
c) 前記DNAサンプル内で5-位がメチル化されていないシトシン塩基を、化学処理により、ハイブリダイゼーション挙動がシトシンと異なるウラシルまたは別の塩基に変換；
d) 請求項１０または１１の一に記載のプライマーオリゴヌクレオチドセットおよびポリメラーゼを使った、化学的に前処理したゲノムDNAの断片の増幅；および
e) 1個またはそれ以上のシトシン位置のメチル化状態の同定
を含む、メチル化状態を測定する方法。
【請求項１９】
請求項５〜１１に記載の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって段階e)を実施することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項５〜１１に記載の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび少なくとも1個のヌクレオチド塩基による前記ハイブリダイゼーションされたオリゴヌクレオチド(群)の伸長によって段階e)を実施することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記段階e)を配列決定によって実施することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記段階d)をメチル化特異的プライマーを使って実施することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記段階e)を、請求項１９〜２２に記載の方法の少なくとも2種類の併用によって実施することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩または二亜硫酸塩の溶液によって化学処理を実施することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号1を含む核酸分子内のメチル化を分析する方法であって：
a) ゲノムDNAを含有する生体サンプルの入手；
b) ゲノムDNAの抽出；
c) 1種類以上のメチル化感受性制限酵素による、配列番号1を含むゲノムDNAの消化；および
d) 段階c)の消化物中に生成されるDNA断片の検出
を含む、核酸分子内のメチル化を分析する方法。
【請求項２６】
段階d)に先行してDNA消化物を増幅する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
100〜2000塩基対長を有する10個以上の各種断片を増幅することを特徴とする、請求項１８〜２２の一に記載の方法。
【請求項２８】
複数のDNAセグメントの増幅を1個の反応容器中で実施することを特徴とする、請求項１８〜２３の一に記載の方法。
【請求項２９】
ポリメラーゼが耐熱性DNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項１８〜２４の一に記載の方法。
【請求項３０】
増幅をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって実施することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
増幅産物のラベルが蛍光ラベルであることを特徴とする、請求項１８〜２４の一に記載の方法。
【請求項３２】
増幅産物のラベルが放射性核種であることを特徴とする、請求項１８〜２４の一に記載の方法。
【請求項３３】
増幅産物のラベルが、質量分析計で検出される典型的な質量を有する分離可能分子断片であることを特徴とする、請求項１８〜２４の一に記載の方法。
【請求項３４】
増幅産物または増幅産物断片を質量分析計で検出することを特徴とする、請求項１８〜２４の一に記載の方法。
【請求項３５】
質量分析計でさらに良好な検出能を有するために、生成された断片が単一の正または負の正味荷電を持つことを特徴とする、請求項２８および／または２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
検出を、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析法(MALDI)によって、あるいは、電子スプレー質量分析法(ESI)を使って実施および可視化することを特徴とする、請求項２８〜３０の一に記載の方法。
【請求項３７】
DNAを含有する細胞または細胞成分からゲノムDNAを入手し、DNA源が例えば株化細胞、組織検査用スライド、生検検体、パラフィン封埋組織およびすべての可能なそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１８〜３１の一に記載の方法。
【請求項３８】
重亜硫酸塩(=二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩)試薬、並びに、請求項５〜１２の一に記載のオリゴヌクレオチドおよび／またはPNA-オリゴマーを含むキット。
【請求項３９】
さらに、MS-SNuPE、MSP、MethylLightTM、HeavyMethylTM、核酸配列決定およびそれらの組み合わせから成る群からのメチル化アッセイの実施用の標準試薬を含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
細胞増殖性疾患または細胞増殖性疾患に対する素因の特徴付け、分類、鑑別、重症度判定、病期判定および／または診断のための、請求項４に記載の核酸、請求項５〜７の一に記載のオリゴヌクレオチドまたはPNAオリゴマー、請求項３８または３９の一に記載のキット、請求項１４〜１７の一に記載のアレイ、請求項８〜１２の一に記載のオリゴヌクレオチドセット、あるいは、請求項１〜３、１３および１８〜３７の一に記載の方法、の使用。
【請求項４１】
細胞増殖性疾患の治療のための、請求項４に記載の核酸、請求項５〜７の一に記載のオリゴヌクレオチドまたはPNAオリゴマー、請求項３８または３９の一に記載のキット、請求項１４〜１７の一に記載のアレイ、請求項８〜１２の一に記載のオリゴヌクレオチドセット、あるいは、請求項１〜３、１３および１８〜３７の一に記載の方法、の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌患者においてメチル化パターンの変化(高メチル化または低メチル化)を呈するヒトDNA配列に関する。これら新規なメチル化変化DNA配列は、ヒトの癌の診断マーカー、予後マーカーおよび治療マーカーとして有用である。
【０００２】
（関連出願のクロスリファレンス）
本願は、2002年8月8日提出の米国特許出願番号第10/215,890号の一部継続出願である2002年10月25日提出の米国特許出願番号第10/281,076号の優先権の利益を享受するものである。
【背景技術】
【０００３】
5-メチルシトシンは、真核細胞のDNAの中で最も多い共有結合塩基修飾体である。該塩基は、例えば、転写調節、遺伝子刷り込みおよび腫瘍発生に役割を果たす。そのため、遺伝情報の一要素としての5-メチルシトシンの同定は、かなり興味深い。しかし、5-メチルシトシンの位置は、配列決定法では同定できない。それは、5-メチルシトシンがシトシンと同一の塩基対合挙動を示すからである。さらに、5-メチルシトシンが保有する後天的情報は、PCR増幅中に完全に失われる。
【０００４】
CpGメチル化状態評価のための現行の重亜硫酸塩(bisulfite)修飾の使用  比較的新しく、現在最も多く使用されている5-メチルシトシンに関するDNAの分析方法は、重亜硫酸塩のシトシンとの特異的反応に基づく。このシトシンは、その後のアルカリ加水分解時に、塩基対合挙動に関してチミジンに相当するウラシルに変換される。しかし、5-メチルシトシンは、これらの条件下では未修飾のままである。この結果、元のDNAが変換されて、本来ハイブリダイゼーション挙動によってシトシンと区別できなかったメチルシトシンが、「通常の」分子生物学的技術の使用、例えば増幅およびハイブリダイゼーションまたは配列決定によって、唯一残ったシトシンとして検出できるようになる。これらの技術はすべて、塩基対合に基づいており、今ではこの性質は完全に利用可能である。感度に関してみると、先行技術は、分析対象のDNAをアガロースマトリックス中に密封することによってDNAの拡散と復元を防止する(重亜硫酸塩は、一本鎖DNAのみと反応する)方法であって、全沈殿精製工程を迅速透析で代用する(Olek A, et al.,A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylationanalysis (重亜硫酸塩によるシトシンメチル化の分析用の修飾および改良方法), Nucleic Acids Res. 24：5064-6,1996（非特許文献１）)方法によって限定される。この方法を使用すると、個々の細胞を分析することが可能で、これは、該方法の潜在能力を表している。しかし、目下、約3000塩基対までの長さの個別の領域しか分析されておらず、数千の考え得るメチル化事象に関する細胞の総合的分析が見込まれる。さらに、この方法は、少量のサンプルからの極小断片を確実に分析できない。前記断片は、拡散が防御されているにもかかわらず、マトリックスから失われる。技術上公認の5-メチルシトシン検出方法の概説がRein, T. et al, Nucleic Acids Res., 26：2255, 1998（非特許文献２）に提供されている。
【０００５】
現在、いくつかの例外(例、Zeschnigk M, et al., Eur J Hum Genet. 5：9498, 1997（非特許文献３）)を除いて、重亜硫酸塩技術は、研究でしか使用されていない。いずれの場合も、既知遺伝子の短い特異的断片を重亜硫酸塩処理後に増幅し、その後完全に配列決定し(Olek &Walter, Nat Genet. 1997 17：275-6, 1997（非特許文献４）)、1回以上のプライマー伸長反応に供し(Gonzalgo &Jones, Nucleic Acids Res., 25：2529-31, 1997（非特許文献５）；WO 95/00669（特許文献１）；米国特許No. 6,251,594（特許文献２）)、個々のシトシンの位置を分析するか、あるいは、酵素消化によって処理する(Xiong & Laird, Nucleic Acids Res., 25：2532-4, 1997（非特許文献６）)。さらに、ハイブリダイゼーションによる検出も記載されている(Olek et al., WO99/28498（特許文献３）)。
【０００６】
個別遺伝子のメチル化を検出するための重亜硫酸塩技術の使用を扱った別の刊行物は：Grigg &Clark, Bioassays,16：431-6, 1994（非特許文献７）；Zeschnigk M,et al., Hum Mol Genet., 6：387-95, 1997（非特許文献８）；Feil R, et al.,Nucleic Acids Res., 22(4)：695-, 1994（非特許文献９）；Martin V, et al., Gene, 157：261-4, 1995（非特許文献１０）；WO 97/46705（特許文献４）およびWO 95/15373（特許文献５）である。
【０００７】
癌と異常DNAメチル化の相関  CpG「アイランド」内の異常DNAメチル化は、広域の遺伝子の抑止または過剰発現を招くCpGジヌクレオチド配列の高または低メチル化を特徴とする。これは、ヒトの悪性腫瘍に認められる最早期の最も多い変化の一つであり、ヒトの悪性腫瘍と相関する。さらに異常メチル化は、特定の腫瘍に関する遺伝子のイントロン部分および解読(コーディング)部分のCpGリッチ調節要素で生じることが示されている。結腸癌では、異常DNAメチル化は、最も顕著な変化の一つであり、多くの腫瘍抑制遺伝子、例えばp14ARF、p16INK4a、THBS1、MINT2およびMINT31、並びに、DNAミスマッチ修復遺伝子、例えばhMLH1、を不活性化する。
【０００８】
腫瘍抑制遺伝子の特異的高メチル化とは対照的に、DNAの全体的低メチル化を腫瘍細胞で認めることができる。この全体的メチル化の減少は、明らかな腫瘍形成が発生するはるか以前に、早くも検出できる。低メチル化と遺伝子発現増加の間の相関は、多数のオンコジーンについて確認されている。
【０００９】
結腸直腸癌  DNAメチル化エラー(methlation error)は、結腸直腸癌の分子的発生に 二つの際立った役割を果たすことが示唆されている。正常な結腸粘膜細胞では、加齢に伴って、あるいは、時間依存的事象としてメチル化エラーが蓄積し、これらの細胞を腫瘍に形質転換し易くする。例えば、複数の遺伝子座の高メチル化は、腺腫、特に管状絨毛および絨毛サブタイプにおいてすでに存在することが認められている。後期には、CpGアイランドのDNAメチル化増加が、いわゆる「CpGアイランドメチレーター表現型」(CIMP)の影響を受ける腫瘍サブセットで重要な役割を果たす。大半のCIMP-陽性腫瘍は、散発性結腸直腸癌全体の約15%を構成し、hMLH1プロモーターおよび他のDNAミスマッチ修復遺伝子の高メチル化によるマイクロサテライト不安定性(MIN)を特徴とする。対照的に、CIMP-陰性結腸癌は、より典型的な遺伝的不安定性経路(CIN)に沿って発達し、p53突然変異および染色体変化が高頻度で起こる。
【００１０】
これらの結腸癌サブタイプは、様々な頻度で分子変化を示す(例、MIN vs CIN)上に、2種類の有意に異なる臨床クラスに小分類できる。ほぼすべてのMIN腫瘍は、近位結腸(上行および横行)に発生するが、CIN腫瘍の70%は、遠位結腸および直腸に位置する。この空間的な差異は、結腸の様々な区域で諸発癌物質の蔓延性が相違することに起因するとされている。近位結腸の有力な発癌物質であるメチル化発癌物質は、MIN癌の病原に関係があるとされ、一方CIN腫瘍は、結腸および直腸の遠位部分で存在率が高い付加物形成発癌物質によって引き起こされることが多いと考えられる。さらに、MIN腫瘍は、CIN表現型腫瘍よりも予後が良好で、アジュバント化学療法への応答がさらに良好である。
【００１１】
乳癌  乳癌は、乳房組織内の細胞の無制御な増殖であると定義されている。乳房は、乳管によって結合された15〜20個の乳腺葉から成る。癌は、この管内に最も多く発生するが、炎症性乳癌と呼ばれる最もまれなタイプの癌では、乳腺葉中にも認められる。
【００１２】
乳癌は、現在、女性の間で2番目に多いタイプの癌である。例えば、米国では、2001年に、190,000例以上の侵襲性乳癌の新規症例と47,000例以上の上皮内乳癌の追加症例が診断された。発現率と死亡率は年齢と共に増加する。例えば、1994〜1998年の間、20〜24才の女性の乳癌発現率は、人口100,000人当たりわずか1.5人であった。この危険性は、75〜79才年齢群内では人口100,000人当たり489.7人までに増加する。ここ10年で、死亡率は約5%減少しており、5年生存率に影響する要因には、年齢、癌病期、社会経済的要因および人種がある。
【００１３】
治療方法には、手術、放射線療法、化学療法およびホルモン療法の使用があり、これらは手術の補助的治療法としても使用される。いずれの治療も、その第一段階は、本疾患の確定分類と比較した患者の病態の評価である。典型的には、乳癌は、大きさ、位置、転移の有無に応じて病期が決定される。しかし、前記の方式の価値は、本質的に分類の質に依存し、子宮頸癌や皮膚癌などの一部の他の一般的な癌の検出とは対照的に、乳癌の分類と検出に特有の難しさがある。
【００１４】
乳癌の評価に目下使用され、あるいは、その評価を補足する別の予測因子(例、組織検査、エストロゲン受容体マーカーなど)は、腫瘍の発症および挙動の正確な予測または分類を提供できないことが多い。その結果、治療に対する患者の応答を正確に予測できないことが多く、総合的な転帰の予測に問題がある。
【００１５】
乳癌分析技術の継続的開発は、目下、分子生物学的マーカーの研究に絞られている。伝統的な組織病理分析の代替法としての分子生物学的マーカーの開発は、一塩基多型(SNPs)および単一遺伝子、例えばBRCA1およびBRCA 2の分析に焦点を合わせてきた。さらに、侵襲性乳癌の評価には、前記オンコジーンの突然変異に加えて、遺伝子増幅および異型接合性の喪失が使用されている。ごく最近では、マイクロアレイ技術および遺伝子発現プロファイリングの使用によって、複数の遺伝子の同時分析、並びに、RNAおよびタンパク分析による遺伝子発現プロファイリングが可能になっている(Friend et. al., Nature 415：530-536,2002；using gene expression profiling to predict theoutcome of treatment in breast cancer patients (乳癌患者における治療転帰を予測する遺伝子発現プロファイリングの使用)（非特許文献１１）)。
【００１６】
しかし、遺伝性乳癌は症例の5%〜10%を占めるにすぎず、後天的メカニズム並びに環境因子が乳癌の発症には影響する。
【００１７】
カルシトニン遺伝子  第11染色体の短(「P」)アームには、カルシトニン遺伝子を含めた数種の腫瘍抑制遺伝子が位置する。複数のタイプの癌の発癌性が、この領域の低メチル化と関連付けられている。
【００１８】
アルファ-カルシトニン遺伝子は、カルシトニン、カタカルシンおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)を含むペプチド小ファミリーをコード化する。カルシトニンおよびカタカルシンは、ある前駆物質から生産され、CGRPは別の前駆物質から生産される。カルシトニンおよびカタカルシンは、主として甲状腺中/甲状腺から生産されるが、CGRPは、甲状腺および中枢神経系の両方に存在する。カルシトニンは骨格完全性(skeltenal integrity)に関与し、カルシトニンの分泌は、少なくとも一部は、エストロゲン依存性である。従って、閉経後のカルシトニン分泌低下は閉経後骨粗鬆症発症の一要因である可能性があり、カルシトニンは、この病態の予防および、もしかすると治療に有用であることが立証されるかもしれない。
【００１９】
カルシトニン遺伝子の研究では、急性白血病の場合を含めて、複数の癌タイプの腫瘍細胞中に該遺伝子のプロモーター領域の高メチル化が存在することが認められている。カルシトニン遺伝子プロモーターおよび／または第一エキソンでの制限酵素に基づく方法を使って実施された研究の例は、以下のものを含む：結腸癌(Hiltunen et al., Br J Cancer, 76：1124-30,1997（非特許文献１２）；Silvermanet al., Cancer Res., 49：3468-7,1989（非特許文献１３）)；白血病(Roman et al., Br J Haematol., 113：329-3, 2001（非特許文献１４）)；および乳癌(Hakkarainenet al., Int J Cancer, 69：471-4, 1996（非特許文献１５）)；骨髄異形成症候群(Dhodapkar et al., LeukRes., 19：719-26, 1995（非特許文献１６）)。
【００２０】
ただし、これらの研究は、カルシトニンの後天的要因を複数のタイプの癌と関連付けるが、範囲が非常に限定されている。具体的には、前記研究は、主として、メチル化感受性制限酵素に基づく方法を使って実施されたので、カルシトニン遺伝子の特異的プロモーターおよび第一エキソン領域内のみに位置する限られた数の特異的CpG高メチル化事象しか同定していない。
【００２１】
ごく最近、重亜硫酸塩に基づく方法により、カルシトニン遺伝子内のメチル化パターンを若干広範囲に分析することが可能になっている(例、Silvermanet al., Cancer Res., 49：3468-73, 1989（非特許文献１３）；Hiltunen et al., Br J Cancer, 76：1124-30,1997（非特許文献１２）)。しかし、この場合も、これらの研究はカルシトニン第一エキソンおよびプロモーター領域内の特定CpGジヌクレオチドの分析に偏っている。
【００２２】
重要な点として、前記先行技術の方法および所見は、カルシトニン遺伝子内の他の場所にある、または、この遺伝子と隣接する他のCpG位のメチル化状態の決定を、診断上および／または予後に関して利用する可能性の根拠を示すものでない。前記の限定的な先行技術で分析されるCpG位がCpGアイランドの一部でない場合には特にそうである。
【００２３】
以上、癌にかかわる多数の遺伝子に関連して言及したように、相関するプロモーター領域のメチル化は、遺伝子発現の調節に関与することが立証されている。例えば、前立腺癌患者において、GSTP1 (グルタチオニルトランスフェラーゼP1)遺伝子のプロモーターは、高メチル化され、GSTP1発現のサイレンシングをきたす。しかし、現在まで、カルシトニン遺伝子のさらに上流に位置するCpGジヌクレオチドおよび／またはCpGアイランドは、癌発症と関連付けられていない。
【００２４】
とりわけ白血病、乳癌、結腸癌、骨髄異形成症候群を含む癌および増殖性疾患の早期発見、分類および治療(処置)に関する既存の方法を改良することが絶えず求められていることは、当業者の認識するところである。前記の癌および増殖性疾患に関する予測のための新規関連性、特に、カルシトニン遺伝子内およびそれに隣接する後天的事象に関する疾患予測上の関連性を発見し、利用することも、技術上急務である。
【００２５】
他の関連する先行技術の方法  オリゴマーアレイ製造における先行技術の概説を、Nature Genetics (Nature Genetics 補遺、21巻、1999年１月およびその引用文献から（非特許文献１７）)の特別編から収集できる。
【００２６】
固定DNAアレイのスキャニングには、蛍光標識プローブが使用されることが多い。蛍光標識に特に適しているのは、特定プローブの5'-OHにCy3およびCy5色素を簡単に結合させたものである。ハイブリダイズプローブの蛍光の検出は、例えば、共焦点顕微鏡によって実施してよい。Cy3およびCy5色素は、様々な別の色素とともに市販されている。
【００２７】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析(MALDI-TOF)は、生体分子の分析に非常に効率的な開発技術である(Karas & Hillenkamp, Anal Chem., 60：2299-301,1988（非特許文献１８）)。検体を光吸収マトリックスに封埋する。該マトリックスを短レーザーパルスで蒸発させると、それによって、検体分子が切断されないまま蒸気相に運搬される。該検体はマトリックス分子との衝突によってイオン化される。電圧を加えて、イオンを加速させ、無電界飛行管内へ送り込む。イオンは、質量に差があるため、異なる速度で加速される。イオンが小さいほど、大きなイオンよりも早く検出器に到達する。
【００２８】
MALDI-TOFスペクトロメトリーは、ペプチドおよびタンパクの分析に極めて適している。核酸の分析は、若干困難である(Gut & Beck, Current Innovations and FutureTrends, 1：147-57,1995（非特許文献１９）)。核酸の分析に対する感度は、ペプチドの場合の約1/100未満で、断片サイズの増加に反比例して減少する。さらに、主鎖が多数の負電荷を伴う核酸の場合、マトリックスを経由するイオン化プロセスは、かなり効率が悪い。MALDI-TOFスペクトロメトリーでは、マトリックスの選択は極めて重要な役割を果たす。ペプチドの脱着の場合、ごく微細な結晶を生じる複数の非常に効率的なマトリックスが確認されている。現在、DNA応答マトリックスはいくつかあるが、ペプチドと核酸の間の感度差は減少していない。しかし、DNAがよりペプチドと類似するようになる様式で該DNAを化学修飾することによって、この感度差は減少できる。例えば、主鎖の通常のリン酸基がチオリン酸基で置換されているホスホロチオエート核酸は、単純なアルキル化化学を使って中性荷電DNAに変換できる(Gut& Beck, Nucleic Acids Res. 23：1367-73, 1995（非特許文献２０）)。この修飾DNAに荷電タグをカップリングすると、MALDI-TOFの感度がペプチドで認められる感度と同レベルまで向上する。荷電タグのさらなる長所は、非修飾基質の検出をより一層困難にする不純物に対して分析の安定性が増加することである。
【特許文献１】WO 95/00669
【特許文献２】米国特許No. 6,251,594
【特許文献３】WO 99/28498
【特許文献４】WO 97/46705
【特許文献５】WO 95/15373
【非特許文献１】Olek A, et al., Amodified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis,Nucleic Acids Res. 24：5064-6, 1996
【非特許文献２】Rein, T. et al,Nucleic Acids Res., 26：2255, 1998
【非特許文献３】Zeschnigk M, et al., Eur J Hum Genet. 5:9498,997
【非特許文献４】Olek &Walter, Nat Genet. 1997 17：275-6, 1997
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【非特許文献２０】Gut & Beck, Nucleic Acids Res. 23：1367-73, 1995
【発明の開示】
【００２９】
（発明の要旨）
本発明は、これまでは癌発症と関連付けられていなかった新規CpGアイランドの分析を含む、細胞増殖性疾患を分析するための新規方法を提供する。さらに、本発明は、前記領域内のシトシンメチル化パターンを分析するための、ゲノムおよび化学修飾核酸配列、並びに、オリゴヌクレオチドおよび／またはPNA-オリゴマーを開示する。
本発明は、ゲノムの、カルシトニン遺伝子上流の新規CpGリッチ領域に関する遺伝的および後天的パラメーター、特にシトシンメチル化パターンが、癌および他の細胞増殖性疾患の診断、予後、管理および／または治療に特に有用であるという発見に一部基づいている。
【００３０】
（図面の簡単な説明）
図１は、下記の実施例１に従って実施した、MethylLightTMアッセイを使った重亜硫酸塩処理DNAの分析を示す。Y軸は、プローブがカバーするCpG位のメチル化%を示す。ダークグレーのバー(図の説明中の「A」)は、腫瘍サンプルに相当し、白色のバー(「B」)は、正常対照組織に相当する。腫瘍サンプルは、正常対照組織に比較して高メチル化されている。
図２は、下記の実施例２に記載の重亜硫酸塩処理DNAの増幅を示す。下位グラフ(B)は、正常な結腸組織由来DNAの増幅を示し、一方、上位グラフ(A)は、腫瘍組織由来DNAの増幅を示す。X軸は、増幅サイクル数を示し、Y軸は、検出された増幅産物の量を示す。
図３は、下記の実施例２に記載の併用(combined)HeavyMethyl MethylLightアッセイを使った重亜硫酸塩処理DNAの分析を示す。X軸は、プローブがカバーするCpG位のメチル化%を示す。ダークグレーのバーは、腫瘍サンプルを表し、白色のバーは、正常対照組織を表す。
図４は、下記の実施例２に従って評価した乳癌および健康組織のメチル化レベルを示す(HeavyMethylアッセイを使用)。Y軸は、被験カルシトニン遺伝子領域内のメチル化度を示す。腫瘍サンプルは、黒色ひし形で表し、正常乳房組織サンプルは白色四角で表す。結果から分かるように、正常組織サンプルに比較して、腫瘍サンプル中に有意に高いメチル化度(高メチル化)が認められた。
図５は、MethylLightTMアッセイ(下記実施例４に記載)とHeavyMethyl MethylLight TM併用アッセイ(下記実施例５に記載)を使った乳癌および正常対照組織由来重亜硫酸塩処理DNAのメチル化分析を示す。Y軸は、プローブがカバーするCpG位のメチル化%を示す。黒色のバーは、腫瘍サンプルに相当し、白色のバーは、正常対照組織に相当する。X軸の左手側の棒グラフは、併用(HeavyMethylTM)アッセイを使って測定したメチル化%を示し、右の棒グラフは、MethylLightTMアッセイによって実施した分析を示す。両アッセイによる分析は、正常対照組織に比較して、乳癌サンプルが有意に高メチル化されていることを示す。
【００３１】
（発明の詳細な記述）
定義： 
用語「実測/予測比」(O/E比)とは、特定のDNA配列内のCpGジヌクレオチドの頻度を指し、各断片に関する[CpG部位数/(C塩基数 x G塩基数)]xバンド長に相当する。
【００３２】
用語「CpGアイランド」とは、(1)「実測/予測比」>0.6に相当するCpGジヌクレオチド頻度を有し、かつ(2)「GC含量」>0.5を有するとした基準を満たすゲノムDNAの連続領域を指す。CpGアイランドは、必ずではないが、典型的には、長さが約0.2〜約1 kbの範囲である。
【００３３】
用語「メチル化状態」とは、DNA配列内の1個または複数のCpGジヌクレオチドでの5-メチルシトシン(「5-mCyt」)の有無を指す。DNA配列内の1個またはそれ以上の特定のパリンドロームCpGメチル化部位(それぞれ、2個のCpGCpGジヌクレオチド配列を持つ)のメチル化状態は、「非メチル化」、「完全メチル化」および「半メチル化」を含む。
【００３４】
用語「半メチル化」とは、パリンドロームCpGメチル化部位の特定メチル化状態を指し、この場合、パリンドロームCpGメチル化部位の2個のCpGジヌクレオチド配列のうちの一方の単一シトシンのみがメチル化されている(例、5'-CCMGG-3'(上側鎖)：3'-GGCC-5' (下側鎖))。
【００３５】
用語「高メチル化」とは、特定メチル化状態であって、正常対照DNAサンプル内の対応するCpGジヌクレオチドに認められる5-mCyt量と比較した場合の、被験DNAサンプルのDNA配列内の1個または複数のCpGジヌクレオチドに存在する5-mCytの増加に相当する状態を指す。
【００３６】
用語「低メチル化」とは、特定メチル化状態であって、正常対照DNAサンプル内の対応するCpGジヌクレオチドに認められる5-mCyt量と比較した場合の、被験DNAサンプルのDNA配列内の1個または複数のCpGジヌクレオチドに存在する5-mCytの減少に相当する状態を指す。
【００３７】
用語「マイクロアレイ」とは、広く、技術上公認の「DNAマイクロアレイ」と「DNAチップ」の両方を指し、技術上公認の全ての固形支持体を包含し、該支持体に核酸分子を貼付する、あるいは、当該支持体上で核酸を合成する全方法を包含する。
【００３８】
用語「ハイブリダイゼーション」とは、サンプルDNA中の、ワトソン-クリック塩基対合系に沿った完全相補配列へのオリゴヌクレオチドの結合であって、二重らせん構造を形成する結合と理解する。
【００３９】
本明細書で定義する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、5xSSC/5xデンハート溶液/1.0% SDS中68℃でのハイブリダイゼーションおよび0.2 x SSC/0.1% SDS中室温での洗浄を含む。あるいは、それと同等の技術上公認の条件(例、2.5x SSC緩衝液中60℃でハイブリダイゼーションを実施した後、37℃の低緩衝液濃度で数回洗浄する工程に付し、安定を保つ条件)を含む。ここで定義する中程度にストリンジェントな条件とは、42℃の3xSSCでの洗浄、あるいは、技術上公認のそれと同等の処理を含めた条件に関する。塩濃度および温度のパラメーターを変えて、プローブと標的核酸の間で至適レベルの同一性を達成することができる。技術上、前記条件に関する指針を、例えばSambrook et al. , 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.；およびAusubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N. Y.)単元2.10.から得ることができる。
【００４０】
「遺伝的パラメーター」とは、遺伝子およびその調節に別途必要とされる配列の突然変異および多型性である。突然変異と指定できるのは、特に挿入、欠失、点変異、逆位および多型性で、特に好ましいのはSNPs (一塩基多型)である。
【００４１】
「後天的パラメーター」とは、特にシトシンのメチル化である。別の後天的パラメーターは、例えばヒストンのアセチル化を含む。ヒストンのアセチル化は上記の方法を使って直接分析できないが、やはりDNAメチル化と相関するものである。
【００４２】
カルシトニン遺伝子の上流のCpGリッチ領域(CpGアイランド)内CpGジヌクレオチド配列は、癌および他の細胞増殖性疾患の診断、予後、管理および／または治療に有用であると確認された：
【００４３】
本発明は、カルシトニン遺伝子ファミリーの染色体領域内で、カルシトニン遺伝子(遺伝子バンク(Genbank)受け入れ番号X15943)の(5')上流に位置するCpGリッチ領域の同定に基づく。これまで、前記CpGリッチアイランドは、腫瘍形成および／または他の増殖性疾患と関連付けられていなかった；以前に発表されたカルシトニン遺伝子内のメチル化分析に関する研究は、関連プロモーターおよび第一エキソン領域の範囲に限定されていた。本明細書で開示するCpGリッチ領域は、カルシトニン遺伝子転写開始部位の約1000塩基対(1Kb)上流に存在する。これまで、癌関連メチル化パターンは、前記遺伝子の転写開始部位付近により隣接して存在する特定のCpGジヌクレオチド配列と関連付けられているだけであった。本発明の目的は、前記の新規CpGアイランドの分析によって細胞増殖性疾患の診断、予後、管理および／または治療のための改良法を提供することである。
【００４４】
本発明は、これまで癌発症と関連付けられていなかった新規CpGアイランドの分析を含む、細胞増殖性疾患を分析するための新規方法を提供する。さらに、本発明は、前記領域内のシトシンメチル化パターンを分析するための、ゲノムおよび化学修飾核酸配列、並びに、オリゴヌクレオチドおよび／またはPNA-オリゴマーを開示する。
【００４５】
本発明は、ゲノムの、カルシトニン遺伝子上流の新規CpGリッチ領域に関する遺伝的および後天的パラメーター、特にシトシンのメチル化パターンが、癌および他の細胞増殖性疾患の診断、予後、管理および／または治療に特に有用であるという発見に一部基づいている。
【００４６】
本発明の目的は、配列番号1に記載のゲノム配列とそれに相補的な配列内のCpGジヌクレオチドのメチル化状態の分析を含む。配列番号1は、カルシトニン遺伝子の上流のCpGリッチ領域の断片に相当し、この断片は、1個またはそれ以上の疾患特異的CpGメチル化パターンを呈するCpGジヌクレオチドを含有する。前記カルシトニン遺伝子断片のメチル化パターンは、これまで、癌および／または他の細胞増殖性疾患に関して分析されていない。
【００４７】
本方法の好ましい実施態様では、本発明の目的は、配列番号2〜配列番号5のいずれかに記載の、長さが少なくとも18塩基(または、長さが少なくとも16、18、20、22、23、25、30または35塩基)の連続配列、および、それと相補的な配列を含む化学修飾核酸の分析を含む。配列番号2〜配列番号5は、配列番号1に記載の核酸の化学修飾型を提供し、この場合、前記配列の化学修飾では、固有の、配列番号1とは異なる配列を有する核酸が合成される。これまで、配列番号1〜配列番号5に記載の核酸分子は、癌および／または他の細胞増殖性疾患の分析に関連する遺伝的および後天的パラメーターの確定と結び付けることができなかったが、結び付けられた。
【００４８】
別の好ましい実施態様では、前記の分析は、配列番号1〜配列番号5に記載のゲノムまたは前処理(化学修飾)DNA内のシトシンメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用を含む。前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、少なくとも9ヌクレオチド長(または、少なくとも9、12、15、16、18、20、22、23、25、30または35ヌクレオチド長)を有する少なくとも１個の連続塩基配列を含有し、ストリンジェントな、または、中程度にストリンジェントな条件下で配列番号2〜配列番号5に記載の前処理核酸配列および／またはそれに相補的な配列にハイブリダイズし、あるいは、配列番号1を含むゲノム配列および／またはそれに相補的な配列にハイブリダイズする。
【００４９】
本発明に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、本明細書で開示する新規CpGアイランドの遺伝的および後天的パラメーターを確定するのに有用な新規かつ有効なツールである。前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの塩基配列は、好ましくは少なくとも1個のCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含有する。このプローブは、特に好ましい対合性を有するPNA(ペプチド核酸)の形式で存在してもよい。本発明に記載の特に好ましいオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、CpGジヌクレオチドのシトシンがこのオリゴヌクレオチドを三等分した中央部分の範囲内であるものである；即ち、このオリゴヌクレオチドが、例えば13塩基長である場合、CG、TGまたはCAジヌクレオチドは、5'末端から5番目〜9番目のヌクレオチドの範囲内に位置する。
【００５０】
本発明の特定の実施態様に記載されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、「セット」で使用するのが典型的であり、該セットは、ゲノム配列の配列番号1およびそれに相補的な配列のCpGジヌクレオチドの各々を分析するための少なくとも1個のオリゴマー、または、配列番号2〜配列番号5に記載の前処理核酸の配列およびそれらに相補的な配列内の対応するCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドに対するものを含有する。
【００５１】
ある好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドセットは、配列番号2〜配列番号5および配列番号1それぞれに記載の前処理およびゲノムの両方の型の前記遺伝子配列中のカルシトニン遺伝子内CpGジヌクレオチド毎に少なくとも1個のオリゴマーを含有する。しかし、経済的要因または他の要因から、前記配列内の限定的に選択したCpGジヌクレオチドを分析し、適宜オリゴヌクレオチドセットの内容を変更するのが好ましいこともある、と予想される。
【００５２】
そのため、特定の実施態様では、本発明は、前処理ゲノムDNA(配列番号2〜配列番号5およびそれらに相補的な配列)およびゲノムDNA(配列番号1およびそれに相補的な配列)中のシトシンのメチル化状態を検出するのに有用な少なくとも3個(オリゴヌクレオチドおよび／またはPNA-オリゴマー)のセットを提供する。これらのプローブは、細胞増殖性疾患の遺伝的および後天的パラメーターの診断、予後、および／または治療を可能にする。このオリゴマーセットは、前処理ゲノムDNA(配列番号2〜配列番号5、およびそれらに相補的な配列)およびゲノムDNA(配列番号1、およびそれに相補的な配列)中の一塩基多型(SNPs)の検出に使用してもよい。
【００５３】
別の実施態様では、本発明は、少なくとも2個のオリゴヌクレオチドのセットを提供し、配列番号1〜配列番号5のいずれかのDNA配列およびそれに相補的な配列、またはそのセグメントを増幅するための「プライマー」オリゴヌクレオチドとしてこれを使用する。
【００５４】
例えば配列番号1を参照してポリヌクレオチドの位置によって示せば、本発明の長さX(ヌクレオチド単位)のオリゴヌクレオチドの例は、一定長の(of length)連続してオーバーラップするオリゴヌクレオチドのセット(例、センスおよびアンチセンスセット)に対応するオリゴヌクレオチドを含み、ここに(既定のX値に対応する)各連続オーバーラップセット内のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの位置：n〜(n+ (X-1))から、オリゴヌクレオチドZ個の有限なセットとして規定される；
上記式中、n = 1、2、3、...(Y- (X-1))；
上記式中、Yは配列番号1の長さ(ヌクレオチドまたは塩基対) (965)に等しく；
上記式中、Xはセット中の各オリゴヌクレオチドの共通の長さ(ヌクレオチド単位)に等しく(例、連続してオーバーラップする20量体のセットではX=20)；ならびに
この場合、長さYの既定配列番号に関する長さXの連続オーバーラップオリゴマー数(Z)はY-(X-1)に等しい。例えば、配列番号1のセンスまたはアンチセンスセットに関してZ = 965-19 = 946で、この場合X=20である。
【００５５】
特定の実施態様では、好ましいセットは、少なくとも1個のCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む上記オリゴマーに限定したセットである。
【００５６】
本発明の20量体オリゴヌクレオチドの例は、以下の946個のオリゴマーのセット(およびそれに相補的なアンチセンスセット)を含み、これは配列番号1を参照するポリヌクレオチドの位置：
1-20、2-21、3-22、4-23、5-24、...... 944-963、945-964および946-965
によって示される。
【００５７】
特定の実施態様では、好ましいセットは、少なくとも1個のCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む上記オリゴマーに限定したセットである。
【００５８】
本発明は、配列番号1〜配列番号5(センスおよびアンチセンス)それぞれに関して、長さXのオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドの多数の連続オーバーラップセットを包含し、この場合、例えば、X= 9、10、17、18、20、22、23、25、27、30または35ヌクレオチドである。
【００５９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを1個またはそれ以上の部分または共役体に化学結合させて修飾し、該オリゴヌクレオチドの活性、安定性または検出を高めることもできる。前記部分または共役体は、発色団、発蛍光団、脂質、例えば、コレステロール、コール酸、チオエーテル、脂肪鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール(PEG)、パルミチル部分、並びに、例えば米国特許No. 5,514,758、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,597,696および5,958,773に開示されている他の部分を含む。このプローブは、特に好ましい対合性を有するPNA(ペプチド核酸)の形式で存在してもよい。従って、このオリゴヌクレオチドは、ペプチドなどの他の追加基団を含んでよく、ハイブリダイゼーション誘発切断剤(Krol et al., BioTechniques 6：958-976,1988)またはインターカレーション剤(Zon, Pharm. Res. 5：539-549,1988)を含んでよい。このために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば発色団、発蛍光団、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など、と共役させてよい。
【００６０】
オリゴヌクレオチドはまた、少なくとも1個の技術上公認の修飾糖および／または塩基部分を含んでよく、あるいは修飾主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含んでよい。
【００６１】
好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドセットの少なくとも1個、より好ましくは全部の構成体を固相に結合させる。 
【００６２】
特定の実施態様では、本発明に従って作成した各種オリゴヌクレオチドおよび／またはPNA-オリゴマーの配置物(いわゆる「アレイ」)は、同様に固相に結合されている様式で存在するのが好ましい。このような各種オリゴヌクレオチドおよび／またはPNA-オリゴマー配列のアレイは、例えば、長方形または六角形の格子状に固相上に配置される点を特徴とし得る。この固相表面は、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、または金から成るのが好ましい。しかし、ニトロセルロース、並びに、ナイロンなどのプラスチックを使用してもよく、これはペレット状で、あるいは、樹脂マトリックスとしても存在し得る。
【００６３】
従って、別の実施態様では、本発明は、細胞増殖性疾患と関連する分析のために担体材料に固定したアレイを製造する方法であって、本発明に記載の少なくとも1個のオリゴマーが固相に結合されている方法を提供する。このようなアレイの製造方法は既知で、例えば、米国特許No. 5,744,305に記載されており、これは固相化学および光不安定保護基を用いる方法である。
【００６４】
本発明は、さらに、細胞増殖性疾患分析用のDNAチップを提供する。DNAチップは既知であり、例えば米国特許No. 5,837, 832に記載されている。
【００６５】
さらに、本発明の主題は、例えば、重亜硫酸塩含有試薬、少なくとも2個のオリゴヌクレオチドを含有するプライマーオリゴヌクレオチドセットであって、そのオリゴヌクレオチドの配列が、各事例で、配列番号1〜配列番号5の核酸配列およびそれらに相補的な配列の18塩基長セグメントに相当する、あるいは、このセグメントと相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドセット、オリゴヌクレオチドおよび／またはPNA-オリゴマー、並びに、既述の方法を実施および評価するための指示書から成っていてよい「キット」を含む。しかし、本発明のキットは、前述の構成品の一部のみを含むこともできる。
【００６６】
本発明は、さらに、シトシンのメチル化と一塩基多型を分析することによって、被験体内のカルシトニン遺伝子の遺伝的および／または後天的パラメーターを確定する方法を提供する。この方法は、前記被験体から得た生体サンプル中で、配列番号1〜配列番号5から成る群由来の1個またはそれ以上の配列を含む核酸を、少なくとも1種類の試薬または一連の試薬と接触させることを含み、この場合、試薬または一連の試薬が、標的核酸内のメチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドを識別する。
【００６７】
好ましくは、前記方法は、以下の段階を含む：第1段階では、分析対象組織のサンプルを入手する。サンプル源は、細胞または細胞成分、株化細胞、生検検体、血液、痰、便、尿、脳脊髄液、パラフィン封埋組織、例えば眼球、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、結腸、乳房または肝臓由来組織、組織検査対象スライド、あるいはそれらの組み合わせなどのいずれかの適切なサンプル源であってよい。
【００６８】
第2段階では、サンプルからDNAを単離する。抽出は、当業者にとって標準的な方法によって行ってよく、これらの方法は、洗浄剤溶解物、超音波処理およびガラスビーズを伴う渦巻攪拌の使用を含む。核酸を抽出した後、二本鎖ゲノムDNAを分析で使用する。
【００６９】
本方法の第3段階では、5'-位でメチル化されていないシトシン塩基をウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動がシトシンと異なる別の塩基に変換する方法でゲノムDNAサンプルを処理する。本明細書では、これを「前処理」として理解する。
【００７０】
上述のゲノムDNA処理は、好ましくは、重亜硫酸塩(亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩)およびその後のアルカリ加水分解によって実施し、これにより非メチル化シトシン核酸塩基がウラシルまたは、塩基対合挙動がシトシンと異なる別の塩基へ変換される。
【００７１】
本方法の第4段階では、本発明に記載のプライマーオリゴヌクレオチドセットおよび、好ましくは熱安定性ポリメラーゼを使って、前処理DNA断片を増幅する。統計上および実施上の配慮から、約100〜約2,000塩基対長を有する、10個以上の異なる断片を増幅するのが好ましい。複数のDNAセグメントの増幅は、1個の同じ反応容器中で同時に実施できる。典型的には、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使って実施する。プライマーオリゴヌクレオチドセットは、少なくとも2個のオリゴヌクレオチドあって、その配列がそれぞれ、配列番号1〜配列番号5の塩基配列およびそれらに相補的な配列の少なくとも18塩基対長(または、少なくとも22、23、25、30または35塩基対長)のセグメントと逆相補的または同一であるオリゴヌクレオチドを含む。
【００７２】
本方法の代替の実施態様では、配列番号2〜配列番号5を含む核酸配列内で予め選択したCpG位のメチル化状態を、メチル化特異的プライマーオリゴヌクレオチドの使用によって検出してもよい。この技術(MSP)は、Hermanの米国特許No. 6,265,171に記述されている。重亜硫酸塩処理DNAの増幅にメチル化状態特異的プライマーを使用することによって、メチル化核酸と非メチル化核酸の間の識別が可能になる。MSPプライマー対は、重亜硫酸塩処理CpGジヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも1個のプライマーを含有する。そのため、前記プライマーの配列は、少なくとも1個のCG、TGまたはCAジヌクレオチドを含む。非メチル化DNAに特異的なMSPプライマーは、CpG中C位の3'位に1個の「T」 を含有する。そのため、好ましくは、前記プライマーの塩基配列は、配列番号2〜配列番号5に記載の前処理核酸配列とそれに相補的な配列にハイブリダイズする少なくとも9(または、少なくとも16、少なくとも18または少なくとも25)ヌクレオチド長を有する配列を含むことが必要であり、その場合、前記オリゴマーの塩基配列は、少なくとも1個のCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む。
【００７３】
増幅によって得られる断片は、直接または間接に検出可能なラベルを保持できる。好ましいのは、蛍光ラベル、放射性核種または質量分析計で検出可能な典型的質量を有する分離可能な分子断片の形式のラベルである。前記ラベルが質量ラベルである場合、標識化増幅産物(amplificates)が単一の正または負の正味荷電を有し、質量分析計で良好な検出能を提供するのが好ましい。検出は、例えばマトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析(MALDI)によって、あるいは、電子スプレー質量分析(electron spray mass spectrometry) (ESI)を使って実施および可視化してよい。
【００７４】
本方法の第5段階では、処理前にCpGジヌクレオチドのメチル化状態を確かめるために、本方法の第4段階で得られた増幅産物を分析する。
【００７５】
MSP増幅によって増幅産物を入手した実施態様では、増幅産物の有無がそれ自体、プライマーがカバーするCpG位のメチル化状態を示し、これは前記プライマーの塩基配列に基づく。
【００７６】
標準およびメチル化特異的PCRの両方によって得られた増幅産物は、さらに、アレイ技術やプローブ利用技術などのハイブリダイゼーションに基づく方法によって、並びに、配列決定や鋳型特異的伸長などの技術によって分析してよいが、これらの方法に制約されるものではない。
【００７７】
本方法のある実施態様では、第4段階で合成した増幅産物を、その後、オリゴヌクレオチドおよび／またはPNAプローブのアレイまたはセットにハイブリダイズさせる。これに関連して、該ハイブリダイゼーションは、次のようにして行う：ハイブリダイゼーション中に使用するプローブセットは、好ましくは、少なくとも2個のオリゴヌクレオチドまたはPNA-オリゴマーから成る；その過程で、該増幅産物は、予め固相に結合したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとして働く；その後、非ハイブリダイズ断片を除去する；そして、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも9ヌクレオチド長を有する少なくとも1個の塩基配列を含有しており、この塩基配列は、本配列表に明記した塩基配列のセグメントと逆相補的または同一である；また、該セグメントは、少なくとも1個のCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む。
【００７８】
ある好ましい実施態様では、前記ジヌクレオチドは、該オリゴマーを三等分した中央部分に存在する。例えば、該オリゴマーが1個のCpGジヌクレオチドを含む場合、前記ジヌクレオチドは、13量体の5'-末端から5〜9番目のヌクレオチドであるのが好ましい。配列番号1に記載の配列内の各CpGジヌクレオチド、および配列番号2〜5内の等価な位置の分析用に、1個のオリゴヌクレオチドが存在する。前記オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸の形式で存在してもよい。次に、非ハイブリダイズ増幅産物を除去する。
【００７９】
本方法の最終段階では、ハイブリダイズした増幅産物を検出する。これに関連して、増幅産物に結合したラベルは、オリゴヌクレオチド配列が配置されている固相の各位置で同定可能であるのが好ましい。
【００８０】
さらに別の本方法の実施態様では、CpG位のゲノムメチル化状態は、PCR増幅プライマーと同時に重亜硫酸塩処理DNAにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブによって確定してもよい(この場合、前記プライマーは、メチル化特異的であるか、あるいは標準的であってよい)。
【００８１】
本方法の特に好ましい実施態様は、二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブ(TaqMan TMPCR、ABI Prism 7700 SequenceDetection System, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California使用)を利用した蛍光に基づくリアルタイム定量的PCR (Heid et al., Genome Res. 6：986-994,1996；米国特許No. 6,331,393も参照)の使用である。TaqManTM PCR反応は、TaqManTMプローブと称される非伸長性の尋問用(interrogating)オリゴヌクレオチドの使用を採用しており、該プローブは、フォワード増幅プライマーとリバース増幅プライマーの間に位置するGpCリッチ配列にハイブリダイズするように設計されている。TaqManTMプローブは、さらに、蛍光「レポーター部分」と「クエンチャー部分」を含み、両部分はTaqManTMオリゴヌクレオチドのヌクレオチドに結合したリンカー部分(例、ホスホルアミダイト)に共有結合している。重亜硫酸塩処理後に核酸内のメチル化を分析するためには、このプローブがメチル化特異的であることが必要であるが、これは米国特許No.6,331,393 (この文献は、引用によりその全体が本明細書に包含される)に記載される通りであり、この方法はMethylLightTMアッセイとしても知られる。前記発明での使用に別途適しているTaqManTM検出方法論のバリエーションには、二重プローブ技術(LightcyclerTM)または蛍光増幅プライマー(SunriseTM技術)の使用がある。これらの技術は共に、重亜硫酸塩処理DNAとともに使用するのに、さらには、CpGジヌクレオチド内のメチル化分析に適するように改良してもよい。
【００８２】
重亜硫酸塩処理核酸を分析することによってメチル化を評価するためのプローブオリゴヌクレオチドの使用にさらに適した方法では、ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を含む。前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用は、Yuら,BioTechniques 23：714-720,1997によって記述されている。ブロッキングプローブオリゴヌクレオチドは、PCRプライマーと同時に重亜硫酸塩処理核酸にハイブリダイズさせる。ブロッキングプローブの5'位で核酸のPCR増幅が終結することによって、このブロッキングプローブに相補的な配列が存在する場合、核酸の増幅が抑制される。このプローブは、メチル化状態特異的に重亜硫酸塩処理核酸にハイブリダイズするように設計してよい。例えば、非メチル化核酸群内のメチル化核酸を検出する場合、所定の位置でメチル化されていない核酸の増幅抑制は、「CpA」に対して、所定の位置に「CpG」を含むブロッキングプローブを使用して実施されるであろう。
【００８３】
本方法のさらに好ましい実施態様では、本方法の第5段階は、Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25：2529-2531,1997に記載のMS-SNuPEのような鋳型特異的(template-directed)オリゴヌクレオチド伸長の使用を含む。
【００８４】
本方法のさらに別の実施態様では、本方法の第5段階は、本方法の第3段階で生成した増幅産物の配列決定(シークエンシング)およびその後の配列分析を含む(Sanger F., et al., PNAS USA 74：5463-5467,1977)。
【００８５】
本発明の追加の実施態様では、前処理を必要としない、本発明に基づくゲノムDNA (配列番号1)のメチル化状態を分析する方法を提供する。
【００８６】
前記の追加実施態様の第1段階では、ゲノムDNAサンプルを組織または細胞ソースから単離する。好ましくは、前記ソースは、株化細胞、組織検査用スライド、体液またはパラフィン封埋組織を含む。抽出は、当業者にとって標準的な手段によって行ってよい。この手段は、洗浄剤溶解物、超音波処理およびガラスビーズとの渦動攪拌の使用を含むがこれらに限定されない。核酸を抽出した後、二本鎖ゲノムDNAを分析に使用する。
【００８７】
ある好ましい実施態様では、該DNAを処理前に切断してよいが、これは、従来技術において標準的な任意の手段、特にメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを用いる手段であってよい。次いで第2段階では、該DNAを1種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化する。消化を実施すると、制限部位で該DNAが加水分解されることにより特定CpGジヌクレオチドのメチル化状態を検知することができる。
【００８８】
任意であるが、好ましい実施態様である第3段階では、制限断片を増幅する。これは、ポリメラーゼ連鎖反応を使って実施するのが好ましい。
【００８９】
最終段階では、増幅産物を検出する。検出は、技術上標準的な任意の手段、例えば、ゲル電気泳動分析、ハイブリダイゼーション分析、PCR産物内への検出可能タグの組み込み、DNAアレイ分析、MALDIまたはESI分析によって行ってよいが、これらの手段に限定されない。消化後の核酸断片を検出する際の使用に適したラベルは、上記の発蛍光団ラベル、放射性核種および質量ラベルを含む。
【００９０】
本発明に記載のオリゴマーまたはそのアレイ、並びに、本発明に記載のキットは、癌および他の細胞増殖性疾患の診断および／または治療に有用である。本発明に従って、本方法は、好ましくは、カルシトニン遺伝子の(5')上流に位置する新規CpGリッチ領域内の重要な遺伝的および／または後天的パラメーターの分析による、細胞増殖性疾患の診断および／または治療に有用である。
【００９１】
本発明に記載の方法は、例えば、細胞増殖性疾患の診断および／または治療に使用する。
【００９２】
本発明に記載の核酸、配列番号1〜配列番号5およびそれらに相補的な配列は、カルシトニン遺伝子に関連する遺伝的および／または後天的パラメーターの診断および／または治療に使用できる。
【００９３】
本発明は、さらに、カルシトニン遺伝子に関連する疾患の診断および／または治療用の診断薬および／または治療薬を製造する方法であって、前記遺伝子のメチル化パターンを分析することを含み、前記診断薬および／または治療薬が、その製造に、場合により適切な添加剤および補助剤と合わせて、本発明に記載の少なくとも1個の核酸を使用することを特徴とする方法に関する。
【００９４】
本発明のさらなる主題は、カルシトニン遺伝子に関連する疾患の診断薬および／または治療薬に関するものであり、これは前記遺伝子のメチル化パターンを分析することを含み、前記診断薬および／または治療薬は、場合により適切な添加剤および補助剤と合わせて、本発明に記載の少なくとも1個の核酸を含有する。
【００９５】
本発明は、さらに、患者または個人に不利な事象の診断および／または予後に関し、この場合、カルシトニン遺伝子内の重要な遺伝的および／または後天的パラメーターをマーカーとして使用してよい。本発明によって得られる前記パラメーターは、遺伝的および／または後天的パラメーターの別のセットと比較してよく、その差は患者または個人に不利な事象の診断および／または予後の基礎として役立つものである。
【００９６】
さらに、本発明の主題は、例えば、重亜硫酸塩含有試薬、少なくとも2個のオリゴヌクレオチドを含有するプライマーオリゴヌクレオチドセットであって、そのオリゴヌクレオチドの配列が、各事例にて、別紙に明記する塩基配列(配列番号1〜配列番号5)の18塩基長セグメントに相当する、または、これと相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドセット、オリゴヌクレオチドおよび／またはPNA-オリゴマー、並びに、本記述の方法を実施および評価するための指示書、を含むキットである。別の好ましい実施態様では、前記キットは、さらに、CpG位特異的メチル化分析を実施するための標準試薬を含んでよく、この場合、前記分析は1種類以上の以下の技術を含む：MS-SNuPE、MSP、MethylLightTM、HeavyMethylTMおよび核酸配列決定。しかし、本発明の系列に沿ったキットはまた、前述の要素の一部のみを含むことができる。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例では、2種類の別々の方法を使って、配列番号lとして開示されているCpGアイランドのメチル化状態を分析した。第１の実施例では、問題のCpG位を網羅するリアルタイムPCRアッセイにおいて蛍光標識プローブを使って、重亜硫酸塩処理DNAに対してリアルタイムPCRを実施した(MethyLightTMアッセイとして周知のTaqmanアッセイの別法)。第２の実験では、同領域のメチル化状態を重亜硫酸塩処理によって分析した。この後、処理済みの核酸をCpG位をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブと併用したMethylLightTMアッセイを使って分析した(HeavyMethylTMアッセイ)。
【００９８】
（実施例１）
（結腸癌組織内のメチル化をMethyLightTMアッセイを使って分析した）
QiagenTM抽出キットを使って、結腸腺癌サンプル34個および結腸の正常隣接組織42個からDNAを抽出した。各サンプルから得たDNAを、アガロース-ビーズ法(Olek et al 1996)に従って重亜硫酸塩溶液(亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩)を使って処理した。該処理によって、サンプル内のすべての非メチル化シトシンはチミジンに変換される。対照的に、サンプル内の5-メチル化シトシンは、未修飾のままである。
【００９９】
目的のCpGアイランドおよびベータアクチン遺伝子由来の対照断片用に設計されたMethyLightTMアッセイによってメチル化状態を測定した(Eads et al., 2001)。CpGアイランドアッセイは、プライマーおよびTaqManTMスタイルプローブ両者のCpG部位をカバーする。一方、対照遺伝子ではそうならない。対照遺伝子は、トータルDNA濃度の基準として使用し、CpGアイランドアッセイ(メチル化アッセイ)は、上記部位のメチル化レベルを測定する。
【０１００】
方法  カルシトニン遺伝子CpGアイランドアッセイは、以下のプライマーおよびプローブを使って実施した：
プライマー：AGGTTATCGTCGTGCGAGTGT(配列番号6)；
プライマー：TCACTCAAACGTATCCCAAACCTA(配列番号7)；および
プローブ：CGAATCTCTCGAACGATCGCATCCA(配列番号8)。
【０１０１】
対応する対照アッセイは、以下のプライマーおよびプローブを使って実施した：
プライマー：TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT(配列番号9)；
プライマー：AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号10)；および
プローブ：ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA(配列番号11)。
【０１０２】
以下のアッセイ条件下で、各DNAサンプルに対して反応を3回実施した。
反応溶液：(900 nMプライマー；300 nMプローブ；3.5 mM塩化マグネシウム；taqポリメラーゼ1単位；200 μM dNTPs；DNA7 μl、最終反応容量20 μl中)；
反応サイクル条件：(95℃10分間；95℃ 15秒間；67℃ 1分間(3サイクル))；(95℃15秒間、64℃ 1分間(3サイクル))；(95℃ 15秒間、62℃1分間(3サイクル))；および(95℃15秒間、60℃ 1分間(40サイクル))。
【０１０３】
従来文献記載のPMR計算法を使ってデータを分析した(Eads et al 2001)。
【０１０４】
結果  正常サンプルの平均PMRは0.19、標準偏差0.79であった。正常サンプルで、正常平均値に対する標準偏差が2を上回るものはなかったが、腫瘍サンプル34個中18個はこのレベルのメチル化に達した。腫瘍サンプルと正常サンプルの間のメチル化レベルの総合差は、t-検定で有意である(p=0.002)。
【０１０５】
図１は、この実施例１に従って実施したMethylLightTMアッセイを使った重亜硫酸塩処理DNAの分析を示す。Y軸は、プローブがカバーするCpG位のメチル化%を示す。ダークグレーのバー(図の説明中の「A」)は、腫瘍サンプルに相当し、白色のバー(「B」)は、正常対照組織に相当する。
【０１０６】
有意な点として、腫瘍サンプルは、正常対照組織に比較して、実質的に高メチル化されている。
【０１０７】
（実施例２）
（結腸癌および乳癌組織内のメチル化を、HeavyMethyl MethyLightTMアッセイを使って分析した）
上記実施例１の結腸および正常組織DNAサンプル(乳癌および正常乳房組織と共に；下記の本実施例参照)を使って、HeavyMethylアッセイとも称されるHeavyMethyl MethyLightTM(またはHM MethyLightTM)アッセイを使用して、カルシトニン上流CpGアイランドのメチル化を分析した。目的のCpGアイランドおよび上述の同対照遺伝子アッセイ用に設計されたHM MethyLightTMアッセイでメチル化状態を測定した。CpGアイランドアッセイは、ブロッカーおよびTaqmanTMスタイルプローブ両者のCpG部位をカバーする。一方、対照遺伝子ではそうならない。
【０１０８】
方法  以下のプライマーおよびプローブを使ってCpGアイランドアッセイ(メチル化アッセイ)を実施した：
プライマー：GGATGTGAGAGTTGTTGAGGTTA (配列番号12)；
プライマー：ACACACCCAAACCCATTACTATCT (配列番号13)；
プローブ：ACCTCCGAATCTCTCGAACGATCGC (配列番号14)；および
ブロッカー：TGTTGAGGTTATGTGTAATTGGGTGTGA (配列番号15)。
【０１０９】
以下の条件下で、各DNAサンプルに対して反応を3回実施した：
反応溶液：(300 nMプライマー；450 nMプローブ；3.5 mM塩化マグネシウム；taqポリメラーゼ2単位；400 μM dNTPs；およびDNA 7 μl、最終反応容量20μl中)。
反応サイクル条件：(95℃ 10分間)；(95℃ 15秒間、67℃1分間(3サイクル))；(95℃ 15秒間、64℃ 1分間(3サイクル)；(95℃ 15秒間、62℃ 1分間(3サイクル))；および(95℃ 15秒間、60℃ 1分間(40サイクル))。
【０１１０】
腫瘍サンプル中にメチル化を有する結腸癌患者5名および健康な対照被験者11名の血清サンプルからDNAを抽出した。DNAサンプルは、HM MethyLightTMアッセイで分析し、PMRを計算した。
【０１１１】
結果；結腸癌組織  正常サンプルの平均PMRは0.13、標準偏差0.58であった。正常サンプルで、正常平均値に対する標準偏差が2を上回るものはなかったが、腫瘍サンプル34個中19個はこのレベルのメチル化に達した。腫瘍サンプルと正常サンプルの間のメチル化レベルの総合差は、t-検定で有意である(p=0.0004)。
【０１１２】
図２は、本実施例２に記載の重亜硫酸塩処理DNAの増幅を示す。下位グラフ(B)は、正常な結腸組織からのDNAの増幅を示し、一方、上位グラフ(A)は、腫瘍組織からのDNAの増幅を示す。X軸は、増幅サイクル数を示し、Y軸は、検出された増幅産物の量を示す。
【０１１３】
図３は、本実施例２に記載の併用(combined)HeavyMethyl MethylLightTMアッセイを使った重亜硫酸塩処理DNAの分析を示す。X軸は、プローブがカバーするCpG位のメチル化%を示す。ダークグレーのバーは、腫瘍サンプルを表し、白色のバーは、正常対照組織を表す。
【０１１４】
有意な点として、結腸癌患者の血清サンプル全5個は、健康な対照の平均値を少なくとも6標準偏差上回るメチル化レベルを有した。
【０１１５】
結果；乳癌組織の結果  さらに、上述のHeavyMethylTMアッセイを使って、健康な乳房組織サンプル8個と乳癌サンプル9個の間のメチル化の差を評価した。すべてのプライマー、プローブ、ブロッカーおよび反応条件は、上述の結腸癌分析のものと同一であった。
【０１１６】
図４は、本実施例２の方法に従って評価した乳癌および健康組織のメチル化レベルを示す(HeavyMethylTMアッセイを使用)。Y軸は、被験カルシトニン遺伝子領域内のメチル化度を示す。腫瘍サンプルを黒色のひし形で、正常乳房組織サンプルを白色の四角で示す。腫瘍サンプルで健康組織サンプルよりも有意に高いメチル化度が認められた。t-検定を使って測定した有意水準は、0.012であった。従って、本アッセイを使って健康正常サンプルと腫瘍サンプルの間に認められた差の程度は、乳房組織よりも結腸組織で幾分高かった(ただし、多数の腫瘍および対照サンプルから得た結果を示す下記の実施例４および５を参照のこと)。
【０１１７】
（実施例３）
（配列番号1のヌクレオチド576位のCpGジヌクレオチド部位のメチル化状態をメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ消化を使って測定した）
カルシトニン遺伝子の上流領域の断片(配列番号1)を、プライマーCCTTAGTCCCTACCTCTGCT(配列番号16)およびCTCATTTACACACACCCAAAC(配列番号17)を使ったPCRによって増幅した。得られた378塩基対長の増幅産物は、ヌクレオチド165位(配列番号1のヌクレオチド576位に対応)に情報性(informative)CpGを含有した。増幅DNAをメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼNar Iで消化した；認識モチーフGGCGCC。前記エンドヌクレアーゼによる加水分解は、該増幅産物の165位のCpGがメチル化されているとブロックされる。この消化物は対照として使用した。
【０１１８】
DNA WizzardTM DNA単離キット(Promega)を使って、サンプルからゲノムDNAを単離した。製造元(New England Biolabs)の推奨に従い、NarIを使って各サンプルを消化した。
【０１１９】
その後、約10 ngの各ゲノム消化物を、PCRプライマーCCTTAGTCCCTACCTCTGCT(配列番号16)およびCTCATTTACACACACCCAAAC(配列番号17)を使って増幅した。このPCR反応は、サーモサイクラー(Eppendorf GmbH)を使用し、10ngのDNA、6 pmoleの各プライマー、200 μMの各dNTP、1.5 mM MgCl2および1単位のHotstartTM Taq(Qiagen AG)を使って実施した。その他の条件は、Taqポリメラーゼ製造元が推奨する通りであった。
【０１２０】
上述のプライマーを使って、遺伝子断片をPCRによって増幅した。該PCRでは、第1段階の96℃で14分間の変性、それに続く30〜45サイクル(第2段階：96℃で60秒間、第3段階：52℃で45秒間、第4段階：72℃で75秒間)およびその後の72℃で10分間の最終延長を行った。PCR産物の有無は、アガロースゲル電気泳動で分析した。
【０１２１】
問題の組織(乳房または結腸)が高メチル化DNAを含有する場合には、単離したNar I-加水分解DNAを用いて、サイクルプログラムの第2〜第4段階を34、37、39、42および45回繰り返した時点でPCR産物を検出可能であった。対照的に、低メチル化組織(乳房または結腸)から単離したNar I-加水分解DNAでは、サイクルプログラムの第2〜第4段階を42回および45回繰り返した時点でようやくPCR産物を検出できた。
【０１２２】
（実施例４）
（MethyLightTMアッセイを使って乳癌組織でメチル化を分析した）
Qiagen抽出キットを使って、乳癌サンプル21個および正常乳房組織17個からDNAを抽出した。各サンプル由来のDNAを、アガロース-ビーズ法(Olek et al 1996)に従い、重亜硫酸塩溶液(亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩)を使って処理した。該処理によって、サンプル内の全非メチル化シトシンはチミジンに変換される。対照的に、サンプル内の5-メチル化シトシンは、未修飾のままである。
【０１２３】
目的のCpGアイランドおよびベータアクチン遺伝子由来の対照断片用に設計されたMethyLightTMアッセイでメチル化状態を測定した(Eads et al., 2001)。このCpGアイランドアッセイは、プライマーおよびTaqmanTMスタイルプローブ両者のCpG部位をカバーする。一方、対照遺伝子ではそうならない。対照遺伝子は、トータルDNA濃度の基準として使用し、CpGアイランドアッセイ(メチル化アッセイ)は、上記部位のメチル化レベルを測定する。
【０１２４】
方法  以下のプライマーおよびプローブを使って、カルシトニン遺伝子CpGアイランドアッセイを実施した：
プライマー：AGGTTATCGTCGTGCGAGTGT(配列番号6)；
プライマー：TCACTCAAACGTATCCCAAACCTA(配列番号7)；および
プローブ：CGAATCTCTCGAACGATCGCATCCA(配列番号8)。
【０１２５】
以下のプライマーおよびプローブを使って、対応する対照アッセイを実施した：
プライマー：TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT(配列番号9)；
プライマー：AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号10)；および
プローブ：ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA(配列番号11)。
【０１２６】
以下のアッセイ条件下で、各DNAサンプルに対して反応を3回実施した：
反応溶液：(900 nMプライマー；300 nMプローブ；3.5 mM塩化マグネシウム；taqポリメラーゼ1単位；200 μM dNTPs；DNA 7 ml、最終反応容量20μl中)；
反応サイクル条件：(95℃ 10分間；95℃ 15秒間；67℃ 1分間(3サイクル))；(95℃ 15秒間、64℃ 1分間(3サイクル))；(95℃ 15秒間、62℃ 1分間(3サイクル))；および(95℃ 15秒間、60℃ 1分間(40サイクル))。
【０１２７】
文献にすでに記述されているPMR計算法を使ってデータを分析した(Eads et al 2001)。
【０１２８】
結果  図５の右半分の棒グラフは、MethylLightTMアッセイによって、本実施例４に従って実施した。実施した重亜硫酸塩処理DNAのメチル化分析を示す(この図の左半分は、下記の実施例５に従ったHeavyMethylMethylLightTM併用アッセイの結果を示す)。Y軸は、プローブがカバーするCpG位のメチル化%を示す。黒色のバーは、腫瘍サンプルに相当し、白色のバーは、正常対照組織に相当する。
【０１２９】
正常サンプルの平均PMRは0.94で、標準偏差は1.28であった。腫瘍サンプルの平均PMRは8.38で、標準偏差は11.18であった。腫瘍サンプルと正常サンプルの間のメチル化レベルの総合差は、t-検定で有意である(p=0.0065)。
【０１３０】
重要な点として、両アッセイによる分析は、腫瘍サンプルが、正常対照組織に比較して有意に高メチル化されていることを示す。
【０１３１】
（実施例５）
（乳癌組織のメチル化を、HeavyMethyl MethyLightTMアッセイを使って分析した）
上記実施例４の乳癌および正常サンプルをまた、HeavyMethylTMアッセイとも称されるHeavyMethyl MethyLightTM(またはHMMethyLightTM)アッセイを用いて分析した。目的のCpGアイランドおよび対照遺伝子アッセイ用に設計されたHM MethyLightTMアッセイでメチル化状態を測定した。CpGアイランドアッセイは、ブロッカーおよびTaqmanTMスタイルプローブ両者のCpG部位をカバーする。一方、対照遺伝子ではそうならない。
【０１３２】
方法  カルシトニン遺伝子CpGアイランドアッセイ(メチル化アッセイ)を、以下のプライマーおよびプローブを使って実施した：
プライマー：GGATGTGAGAGTTGTTGAGGTTA (配列番号12)；
プライマー：ACACACCCAAACCCATTACTATCT (配列番号13)；
プローブ：ACCTCCGAATCTCTCGAACGATCGC (配列番号14)；および
ブロッカー：TGTTGAGGTTATGTGTAATTGGGTGTGA (配列番号15)。
【０１３３】
以下のアッセイ条件下で、各DNAサンプルに対して反応を3回実施した：
反応溶液：(300 nMプライマー；450 nMプローブ；3.5 mM塩化マグネシウム；taqポリメラーゼ2単位；400 μM dNTPs；およびDNA 7 ml、最終反応容量20μl中)；
反応サイクル条件：(95℃ 10分間)；(95℃ 15秒間、67℃1分間(3サイクル))；(95℃ 15秒間、64℃ 1分間(3サイクル)；(95℃ 15秒間、62℃ 1分間(3サイクル))；および(95℃ 15秒間、60℃ 1分間(40サイクル))。
【０１３４】
結果  図５の左半分の棒グラフは、併用HeavyMethyl MethylLightTMアッセイによって、本実施例５に従って実施した重亜硫酸塩処理DNAのメチル化分析を示す(この図の右半分は、上記の実施例４に従ったMethylLightTMアッセイの結果を示す)。Y軸は、プローブがカバーするCpG位のメチル化%を示す。黒色のバーは、腫瘍サンプルに相当し、白色のバーは、正常対照組織に相当する。
【０１３５】
正常サンプルの平均PMRは0.58で、標準偏差は0.94であった。腫瘍サンプルの平均PMRは3.01で、標準偏差は3.91であった。腫瘍サンプルと正常サンプルの間のメチル化レベルの総合差は、t-検定で有意である(p=0.0012)。
【０１３６】
重要な点として、両アッセイによる分析は、腫瘍サンプルが、正常対照組織に比較して有意に高メチル化されていることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】実施例１に従って実施した、MethylLightアッセイを使った重亜硫酸塩処理DNAの分析を示す。
【図２】実施例２に記載の重亜硫酸塩処理DNAの増幅を示す。
【図３】実施例２に記載の併用HeavyMethyl MethylLightアッセイを使った重亜硫酸塩処理DNAの分析を示す。
【図４】実施例２に従って評価した乳癌および健康組織のメチル化レベルを示す(HeavyMethylアッセイを使用)。
【図５】MethylLightTMアッセイ(実施例４に記載)と併用HeavyMethylMethylLight TMアッセイ(実施例５に記載)を使った乳癌および正常対照組織由来の重亜硫酸塩処理DNAのメチル化分析を示す。
【図１】
2005536229.tif 000002
【図２】
2005536229.tif 000003
【図３】
2005536229.tif 000004
【図４】
2005536229.tif 000005
【図５】
2005536229.tif 000006
【配列表】
2005536229000001.app
【国際調査報告】
2005536229.tif 000007
2005536229.tif 000008