(57)【要約】本発明は、ヘリコキニン受容体の生物活性を発揮するポリペプチド、及び上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び特に植物の保護のための有効成分を検出するためのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコキニン受容体の生物活性を有し、配列番号２の配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
該アミノ酸配列が配列番号２の配列に対応することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項４】
一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであることを特徴とする、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのフラグメントであることを特徴とする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
該ヌクレオチド配列が配列番号１の配列に対応することを特徴とする、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
ストリンジェント条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項３から７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド及び異種プロモーターを含むＤＮＡ構築物。
【請求項９】
請求項３から７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項８に記載のＤＮＡ構築物を含むベクター。
【請求項１０】
該ポリヌクレオチドが、原核細胞又は真核細胞における該ポリヌクレオチドの発現を保証する調節配列に機能的に連結されていることを特徴とする、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項３から７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項８に記載のＤＮＡ構築物あるいは請求項９又は１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
原核細胞、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることを特徴とする、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
真核細胞、特に哺乳類細胞又は昆虫細胞であることを特徴とする、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１５】
請求項３から７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック無脊椎動物。
【請求項１６】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）又はＣ．エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）であることを特徴とする、請求項１５に記載のトランスジェニック無脊椎動物。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の無脊椎動物のトランスジェニック子孫（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｙ）。
【請求項１８】
（ａ）請求項１１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を、請求項３から７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの発現を保証する条件下で培養すること、又は
（ｂ）インビトロ系において請求項３から７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを発現すること、
（ｃ）該細胞、培地又はインビトロ系から該ポリペプチドを得ること
を含む、請求項１に記載のポリペプチドを作製する方法。
【請求項１９】
次の段階：
（ａ）それ自体既知である方法での完全化学合成、又は
（ｂ）オリゴヌクレオチドの化学合成、該オリゴヌクレオチドの標識、それぞれ昆虫ゲノムＤＮＡ又は昆虫ｍＲＮＡから作製されるゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡに該オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすること、陽性クローンを選択すること及び陽性クローンからのハイブリダイズＤＮＡを単離すること、又は
（ｃ）オリゴヌクレオチドの化学合成及びＰＣＲによる標的ＤＮＡの増幅
を含む、請求項３から７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを作製する方法。
【請求項２０】
請求項３から７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドあるいは請求項９又は１０に記載のベクターを導入することを含む、請求項１５又は１６に記載のトランスジェニック無脊椎動物を作製する方法。
【請求項２１】
次の段階：
（ａ）請求項１１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を提供すること、
（ｂ）一化合物又は多数の化合物を含む試料の存在下で該宿主細胞を培養すること、
（ｃ）変化した性質を検出すること
を含む、作物保護のための新規活性化合物、特に請求項１に記載のポリペプチドの性質を変化させる化合物を見出す方法。
【請求項２２】
次の段階：
（ａ）請求項１に記載のポリペプチド又は請求項１１から１３のいずれ一項に記載の宿主細胞を、化合物と該ポリペプチドの相互作用を可能にする条件下で一化合物又は化合物の混合物と接触させること、及び
（ｂ）該ポリペプチドに特異的に結合する該化合物を判定すること
を含む、請求項１に記載のポリペプチドに結合する化合物を見出す方法。
【請求項２３】
次の段階：
（ａ）請求項１１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞あるいは請求項１５又は１６に記載のトランスジェニック無脊椎動物を、一化合物又は化合物の混合物と接触させること、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの濃度を測定すること、及び
（ｃ）該ポリペプチドの発現に特異的に影響を及ぼす化合物を判定すること
を含む、請求項１に記載のポリペプチドの発現を変化させる化合物を見出す方法。
【請求項２４】
作物保護のための新規活性化合物を見出すため又は昆虫において機能的に類似するヘリコキニン受容体の合成に関与するポリペプチドをコードする遺伝子を見出すための、請求項１に記載のポリペプチド、請求項３から７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項９又は１０に記載のベクター、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項１４に記載の抗体、あるいは請求項１５又は１６に記載のトランスジェニック無脊椎動物の使用。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドの調節因子の殺虫剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコキニン受容体の生物活性を有するポリペプチド、及びこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び特に作物保護のための活性化合物を見出すためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的に、農薬の開発は、特に農薬として活性のある既知の化合物の化学的及び物理的性質に集中されてきた。その結果として、新しい作用機構を有する全く新規の農薬の発見と開発ではなく、特に既存の化合物の修飾にさらなる努力が注がれた。従って、新規農薬を開発するためには、例えば潜在的農薬が結合してそれらの作用を発現することができる、害虫からの新規生物学的標的（標的タンパク質）を見出すことが特に重要である。次にこれらの新規標的タンパク質を様々な方法で発現させ、その生物学的機能を様々な生化学的アッセイにおいて検討することができる。さらに、ハイスループットアッセイ、ハイスループットスクリーニングを用いて、多数の異なる化学物質を新規標的タンパク質におけるそれらの作用に関して比較的低コストで且つ迅速に検査することができる。そのような手順を開始するとき、所与の化学物質がどの標的タンパク質に結合するかは既に明らかであるので、特に新しい農薬の開発のためのそのような標的指向アプローチにおいて、作用機構における選択性、それ故安全性に注意を払うことが可能である。例えば害虫からの標的タンパク質に変調作用を及ぼす、ハイスループットスクリーニングによって又は異なる方法で見出されたそのような化合物は、広域作用を有する毒性化合物を排除するために、１又はそれ以上の哺乳類種からクローン化した均質な標的タンパク質を使用して、選択性に関して直接検査することができる。特に適切な標的タンパク質は、例えば哺乳類などの高等生物では生じない、害虫からのタンパク質である。
【０００３】
特に適切な標的タンパク質、従って新規殺虫剤の開発のための標的は、昆虫において生物学的に活性なペプチドの受容体である。ペプチドは、例えば胚及び後胚発生、イオンホメオスタシス、浸透調節又は筋作用などの、昆虫において重要な鍵となる機能の大部分を調節する（Ｇａｄｅら、１９９７ａ；Ｏｓｂｏｒｎｅ，１９９６参照）。これらのペプチドの生物学的作用は、昆虫細胞における特異的受容体タンパク質に結合することによって仲介される。これらの内分泌又は神経ペプチドの多くは、対応するペプチドリガンドの結合後、三量体型Ｇタンパク質を活性化する（Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋら、１９９７）、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ：ＫｉｎｇとＷｉｌｓｏｎ，１９９９）と相互作用する。ペプチド受容体に結合することができ、天然ペプチドから誘導されうる又は全く新規の化学構造を有するアンタゴニストは、例えば、正常な昆虫の発育、成長、行動又はホメオスタシスに干渉すると考えられ、それ故新規の昆虫特異的及び受容体特異的殺虫剤を創製しうる。
【０００４】
昆虫筋肉からの試料から神経ペプチド、プロクトリン（Ｐｒｏｃｔｏｌｉｎ）が単離されて以来（ＢｒｏｗｎとＳｔａｒｒａｔｔ，１９７５）、様々な昆虫種から数多くのペプチドが単離され、特徴付けられてきた（総説についてはＶａｎｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋら、１９９７；Ｏｓｂｏｒｎｅ，１９９６参照）。特にそのようなペプチドのアミノ酸配列の例証及び対応する昆虫宿主細胞における生物学的機能の例証においては実質的な進歩がなされた。そこで、例えば、幼弱ホルモンの生合成を調節するペプチド（アラトトロピン（Ａｌｌａｔｏｔｒｏｐｉｎ）及びアラトスタチン（Ａｌｌａｔｏｓｔａｔｉｎ）、Ｔｏｂｅら、１９９４）、インスリン様ペプチド（Ｌａｇｕｅｕｘら、１９９０）、水分ホメオスタシスを調節するペプチド（Ｃｏａｓｔ，１９９８）、又は筋作用を制御することができるペプチド（Ｈｏｌｍａｎ，１９８６；総説についてはＧａｄｅら、１９９７ｂ参照）が様々な種から単離された。
【０００５】
キニンのグループからのペプチドは、異なるファミリーのいくつもの昆虫種から、中でも特に網翅目（ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ）、直翅目（ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）及び鱗翅目（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）から単離されている（Ｃｏａｓｔ，１９９８；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら、１９９５）。それらは共通して、配列、フェニルアラニン−Ｘａａ−Ｘｂｂ−トリプトファン−グリシン−アミド［式中、Ｘａａはチロシン、ヒスチジン、セリン又はアスパラギンでありえ、Ｘｂｂはアラニンでありうるが、主としてセリン又はプロリンである］のカルボキシ末端のペンタペプチドを含む高度に保存された構造を有する（Ｃｏａｓｔ，１９９８）。関連ペプチドも、軟体動物又はカニなどの他の無脊椎動物から単離されている（Ｃｏｘら、１９９７；Ｔｏｒｆｓら、１９９９）。このペプチドファミリーの最初の成員は、それらがゴキブリにおいて単離された腸の収縮の引き金となりうることから単離された（Ｈｏｌｍａｎ，１９９１）。キニンは昆虫において特に強力なペプチドであり、利尿作用を有し、マルピーギ小体において原尿の分泌を刺激する（Ｃｏａｓｔ，１９９８）。
【０００６】
該ペプチドの生物学的機能は、例えば筋作用（Ｈｏｌｍａｎ，１９９１）又は水分及び電解質の分泌（Ｒａｍｓｅｙ，１９５４）を測定する様々な試験において検討することができる。これらの生物学的に活性なペプチドの一部は、インビボで実験的誘導によってそれらの作用を増強した場合、害虫において死亡を引き起こすことが記述されている（Ｓｅｉｎｓｃｈｅら、２０００）。
【０００７】
数多くのペプチドが単離され、それらの構造が明らかにされて、アミノ酸配列が記述されているが、昆虫では、内分泌又は神経ペプチドに結合しうることが知られている受容体はごくわずかしかない。記述されているのは、中でも特に、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）（Ｒｅａｇａｎ，１９９４）又はカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）（Ｈａら、２０００）からの利尿ホルモンについての受容体、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）からのタキキニンについての受容体（Ｌｉら、１９９１；Ｍｏｎｎｉｅｒら、１９９２）、又はショウジョウバエからのガラニンについての受容体（Ｂｉｒｇｕｌら、１９９９）である。
【０００８】
キニンペプチドの受容体は、軟体類のタニシ、ヨーロッパモノアラガイ（Ｌｙｍｎｅａ  ｓｔａｇｎａｌｉｓ）（Ｃｏｘら、１９９７）及びダニ種の中のＡｃａｒｉ（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ，Ｈｏｌｍｅｓら、２０００）において記述されている。昆虫では、受容体は、ショウジョウバエキニンに関してショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）においてのみ記述されている（Ｔｅｒｈｚａｚら、１９９９）。昆虫におけるキニン刺激への細胞応答は、最終的にマルピーギ小体の内腔への塩化物イオンの流入をもたらす、細胞間カルシウム濃度の上昇である（Ｃｏａｓｔ，１９９８）。害虫であるオオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の幼虫において、キニンの作用は、第一に、単離マルピーギ小体における体液分泌の上昇、及び第二に、幼虫の血液リンパへの注入後、体重増加の低減と部分的死亡を生じさせる（Ｓｅｉｎｓｃｈｅら、２０００）。それ故、経済的な重要性を有する害虫のキニンについての受容体を提供することは特に有益である。
【０００９】
ショウジョウバエのゲノムはデータベースにおいて検索可能な配列として部分的又は完全に入手可能となっているので、この種の様々な受容体が記述されるか又は予測されてきた（Ｈａｕｓｅｒら、１９９８；Ｌｅｎｚら、２０００ａ；Ｌｅｎｚら、２０００ｂ；Ｅｒｉｋｓｅｎら、２０００；Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ，２００１；ＨｅｗｅｓとＴａｈｅｒｔ，２００１；国際公開広報第００／７０９８０号；国際公開広報第００／３１００５号）。双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）のファミリーからのショウジョウバエは昆虫遺伝学についての重要なモデル生物であるが、農業における害虫としてはあまり重要ではない。例えばショウジョウバエと、他のファミリー又は他の無脊椎動物からの他の昆虫からの相同な遺伝子の間でのアミノ酸配列における相違は有意でありえ、５０％を超えることが多い（ＨｅｗｅｓとＴａｇｈｅｒｔ，２００１）。ヌクレオチドのレベルでの相違はさらに一層大きい。それ故、分子生物学の常用方法を用いて（例えば、例えばショウジョウバエ遺伝子から誘導されるＤＮＡプライマー又はＤＮＡプローブを使用したＰＣＲによって）、無脊椎生物、例えば鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）種において対象とする相同な受容体遺伝子を見出し、単離することは不可能であることが多い（Ｐｉｅｔｒａｎｔｏｎｉｏら、２０００）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、それ故、昆虫から、特に経済的重要性を有する害虫からの内分泌又は神経ペプチドが結合することができ、この結合によって、これらのペプチドの生物学的機能を仲介することができ、且つ高流量の被験化合物に関するそれに基づいたアッセイ系（ハイスループットスクリーニングアッセイ；ＨＴＳ−アッセイ）を提供することができる、さらなる受容体を提供するという目的に基づく。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的は、ヘリコキニン受容体の少なくとも１つの生物活性を有し、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５、特に好ましくは少なくとも３０個の連続するアミノ酸の長さにわたって、及び極めて特に好ましくはそれらの完全長にわたって、配列番号２の配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、特に好ましくは少なくとも９０％の同一性、極めて特に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供することによって達成される。
【００１２】
アミノ酸配列の同一性の程度は、好ましくはプログラムパッケージＧＣＧ、バージョン９．１からのＧＡＰプログラムを標準設定で使用して決定される（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書において使用する「ポリペプチド」の語は、通常、ペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーと称される短いアミノ酸鎖だけでなく、通常はタンパク質と称されるより長いアミノ酸鎖にも関する。この語は、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによって、又は先行技術の化学的方法によって修飾されうるアミノ酸鎖を包含する。そのような修飾は、例えばペプチド骨格上、アミノ酸側鎖上、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端上などの、ポリペプチド内の様々な部位で反復して起こりうる。例えば、それらは、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビン、ヘム部分、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体、脂質又は脂質誘導体あるいはホスファチジルイノシトールへの共有結合、環化、ジスルフィド架橋形成、脱メチル化、シスチン形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、セレノイル化及びｔＲＮＡを介したアミノ酸付加を包含する。
【００１４】
本発明に従ったポリペプチドは、「成熟」タンパク質又はより大きなタンパク質の部分の形態で、例えば融合タンパク質として存在しうる。それらはさらに、分泌又はリーダー配列、プロ配列、多数のヒスチジン残基などの簡単な精製を可能にする配列、又は付加的な安定化アミノ酸を示しうる。
【００１５】
本発明に従ったポリペプチドは、それらがまだ完全なヘリコキニン受容体の少なくとも１つの生物活性を有している限り、完全な受容体を構成する必要はなく、そのフラグメントでもよい。配列番号２のアミノ酸配列を有する本発明に従ったポリペプチドから成るヘリコキニン受容体と比較して、５０％高い又は低い活性を有するポリペプチドは、まだ本発明に従っているとみなされる。
【００１６】
天然に生じる受容体の対応する領域と比較して、本発明に従ったポリペプチドは、それらがまだ完全なヘリコキニン受容体の少なくとも１つの生物活性を及ぼす限り、欠失又はアミノ酸置換を有しうる。保存的置換が好ましい。そのような保存的置換は、１個のアミノ酸が次の群：
１．非極性又はほとんど極性がない低分子量脂肪族残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ；
２．極性の負電荷型残基及びそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ；
３．極性の正電荷型残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ；
４．大型脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ；及び
５．芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ
からのもう１つ別のアミノ酸で置換されている変異を含む。
【００１７】
好ましい保存的置換を下記のリストに示す：
【００１８】
【表１】
2005523003.tif 000002
2005523003.tif 000003
【００１９】
本明細書において使用する「ヘリコキニン受容体の生物活性」の語は、ペプチド受容体へのペプチドの結合を意味する。
【００２０】
本発明に従ったポリペプチドの好ましい実施態様は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、特にＨｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓのヘリコキニン受容体である。
【００２１】
本発明に従ったポリペプチドの特に好ましい実施態様は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓのヘリコキニン受容体である。
【００２２】
本発明はまた、本発明に従ったポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
本発明に従ったポリヌクレオチドは、特に、一本鎖又は二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）である。好ましい実施態様は、イントロンを含みうるゲノムＤＮＡのフラグメント及びｃＤＮＡである。
【００２４】
本発明に従ったポリヌクレオチドの好ましい実施態様は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡである。
【００２５】
ストリンジェント条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、同様に本発明に包含される。
【００２６】
本明細書において使用する「ハイブリダイズすること」の語は、一本鎖核酸分子が相補鎖と塩基対合を受ける過程を表わす。ここで開示する配列情報から出発することにより、これは、例えば、ヘリコキニン受容体の生物活性を有するポリペプチドをコードするＨｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ以外の昆虫からＤＮＡフラグメントを単離することを可能にする。
【００２７】
好ましいハイブリダイゼーション条件を下記に示す：
ハイブリダイゼーション溶液：６ＸＳＳＣ／０％ホルムアミド、好ましいハイブリダイゼーション溶液：６ＸＳＳＣ／２５％ホルムアミド。
【００２８】
ハイブリダイゼーション温度：３４℃、好ましいハイブリダイゼーション温度：４２℃。
【００２９】
洗浄段階１：４０℃で２ＸＳＳＣ、
洗浄段階２：４５℃で２ＸＳＳＣ；好ましい洗浄段階２：５５℃で０．６ＸＳＳＣ；特に好ましい洗浄段階２：６５℃で０．３ＸＳＳＣ。
【００３０】
本発明はさらに、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５、特に好ましくは少なくとも３０個の連続するヌクレオチドの長さにわたって、及び極めて特に好ましくはそれらの完全長にわたって、配列番号１の配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、特に好ましくは少なくとも９０％の同一性、極めて特に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドを包含する。
【００３１】
ポリヌクレオチド配列の同一性の程度は、好ましくは、標準設定を用いてプログラムパッケージＧＣＧ、バージョン９．１からのＧＡＰプログラムを使用して決定される。
【００３２】
本発明はさらに、本発明に従ったポリヌクレオチド及び異種プロモーターを含むＤＮＡ構築物を提供する。
【００３３】
本明細書において使用する「異種プロモーター」の語は、もとの生物において問題の遺伝子の発現を制御するプロモーターの性質とは異なる性質を有するプロモーターを指す。本明細書において使用する「プロモーター」の語は、一般に発現制御配列を指す。
【００３４】
異種プロモーターの選択は、原核又は真核細胞あるいは無細胞系を発現のために使用するかどうかに依存する。異種プロモーターの例は、ＳＶ４０、アデノウイルス又はサイトメガロウイルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、λファージの主オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、酸性ホスファターゼプロモーター及び酵母α接合因子プロモーターである。
【００３５】
本発明はさらに、本発明に従ったポリヌクレオチド又は本発明に従ったＤＮＡ構築物を含むベクターを提供する。分子生物学研究室で使用されるすべてのプラスミド、ファスミド、コスミド、ＹＡＣ又は合成染色体がベクターとして使用できる。
【００３６】
本発明はまた、本発明に従ったポリヌクレオチド、本発明に従ったＤＮＡ構築物又は本発明に従ったベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３７】
本明細書において使用する「宿主細胞」の語は、天然では本発明に従ったポリヌクレオチドを含まない細胞を指す。
【００３８】
適切な宿主細胞は、バチルス属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、スタフイロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属からの細菌、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞、及び酵母、哺乳類細胞、両生類細胞、昆虫細胞又は植物細胞などの真核細胞の両方である。好ましい真核宿主細胞は、ＨＥＫ−２９３、Ｓｃｈｅｎｉｄｅｒ  Ｓ２、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９、Ｋｃ、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３又はＢＨＫ細胞及び、特にツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞である。
【００３９】
本発明はさらに、上述したポリペプチド又は受容体に特異的に結合する抗体を提供する。そのような抗体は常套的に作製される。例えば、そのような抗体は、実質的に免疫応答性の宿主に、抗体産生のために有効な量の本発明に従ったポリペプチド又はそのフラグメントを注射すること、及びその後この抗体を入手することによって作製しうる。さらに、モノクローナル抗体を産生する不朽化細胞系統は、それ自体既知の方法で入手しうる。適宜に、該抗体を検出試薬で標識してもよい。そのような検出試薬の好ましい例は、酵素、放射能標識元素、蛍光化学物質又はビオチンである。完全抗体の代わりに、所望の特異的結合特性を有するフラグメントを使用することも可能である。本明細書において使用する「抗体」の語はまた、それ故、まだ本発明に従ったポリペプチドのエピトープに結合することができる、Ｆａ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖフラグメントなどの、完全抗体の部分にも及ぶ。
【００４０】
本発明に従ったポリヌクレオチドは、特に、トランスジェニック無脊椎動物を作製するために使用できる。これらは、本発明に従ったポリペプチドの、野生型から逸脱する発現に基づくアッセイ系において使用しうる。ここで開示する情報に基づき、さらに、他の遺伝子又はプロモーターの修飾のゆえに本発明に従ったポリペプチドの発現が変化しているトランスジェニック無脊椎動物を作製することが可能である。
【００４１】
トランスジェニック無脊椎動物は、例えばショウジョウバエの場合は、Ｐエレメントを介した遺伝子導入によって（Ｈａｙら、１９９７）又はＣ．エレガンスにおいては、トランスポゾンを介した遺伝子導入によって（例えばＴｃ１によって；Ｐｌａｓｔｅｒｋ，１９９６）、作製される。
【００４２】
本発明は、それ故、本発明に従ったポリヌクレオチドの少なくとも１個を含むトランスジェニック無脊椎動物、好ましくはショウジョウバエ又はＣ．エレガンス種のトランスジェニック無脊椎動物、及びそれらのトランスジェニック子孫を提供する。トランスジェニック無脊椎動物は、好ましくは野生型から逸脱した形態の本発明に従ったポリペプチドを含む。
【００４３】
本発明はさらに、本発明に従ったポリペプチドを作製する方法を提供する。本発明に従ったポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを作製するために、本発明に従ったポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、発現すべきポリヌクレオチドが宿主細胞のコドン使用頻度に適合しうる適切な条件下で培養することができる。その後、所望ポリペプチドを細胞又は培地から常用方法で単離することができる。該ポリペプチドはまた、インビトロ系においても生産しうる。
【００４４】
本発明に従ったポリヌクレオチドを使用して宿主細胞によって合成される本発明に従ったポリペプチドを単離する迅速な方法は、融合パートナーは簡単にアフィニティー精製することが可能であるので、融合タンパク質の発現から出発する。例えば、融合パートナーはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼでありうる。該融合タンパク質を、次に、グルタチオンアフィニティーカラムで精製することができる。その後融合パートナーを、例えば融合パートナーと精製すべき本発明に従ったポリペプチドの間のリンカーにおける、部分的タンパク質分解によって除去することができる。該リンカーは、トリプシン開裂のための部位を規定する、アルギニン及びリシン残基などの標的アミノ酸配列を含むように設計することができる。そのようなリンカーを生成するには、オリゴヌクレオチドを用いた標準クローニング法が使用できる。
【００４５】
可能な他の精製方法は、分取電気泳動、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ（例えばゲルろ過、逆相又は中等度疎水性カラムを使用する）、ゲルろ過、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーに基づく。
【００４６】
本発明に従ったヘリコキニン受容体は膜タンパク質を構成するので、その精製方法は、好ましくは、例えば非イオン性界面活性剤などの、該ポリペプチドの二次及び三次構造に全く又はほとんど影響を及ぼさない界面活性剤を使用する、界面活性剤抽出を含む。
【００４７】
本発明に従ったポリペプチドの精製は、本発明に従ったポリヌクレオチドを発現する宿主細胞から出発する、膜の単離を包含しうる。そのような細胞は、好ましくは本発明に従ったポリペプチドを、膜分画中の該ポリペプチドの量が天然に該受容体を発現する細胞の同等膜におけるよりも少なくとも１０倍高くなるように、特に好ましくはその量が少なくとも１００倍、極めて特に好ましくは少なくとも１，０００倍になるように、十分に高いコピー数で発現する。
【００４８】
本明細書において使用する「単離又は精製」の語は、本発明に従ったポリペプチドが細胞又は組織の他のタンパク質又は他の高分子から分離されることを意味する。本発明に従ったポリペプチドを含む組成物のタンパク質含量は、好ましくは粗宿主細胞抽出物におけるよりも少なくとも１０倍、特に好ましくは少なくとも１００倍高い。製剤の純度又はタンパク質含量は、それ自体既知の方法で、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定することができる。
【００４９】
本発明に従ったポリペプチドはまた、該ポリペプチドに結合する抗体を用いて融合パートナーなしでアフィニティー精製しうる。
【００５０】
本発明はさらに、本発明に従ったポリヌクレオチドを作製するための方法を提供する。本発明に従ったポリヌクレオチドは常用方法で作製することができる。例えば、ポリヌクレオチドの全部を化学合成するか、又は本発明に従ったポリヌクレオチドの短い断片だけを化学合成することができ、そのようなオリゴヌクレオチドを放射能標識する又は蛍光染料で標識することができる。標識オリゴヌクレオチドは、昆虫ｍＲＮＡから出発して作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため又は昆虫ゲノムＤＮＡから出発して作製したゲノムライブラリーをスクリーニングするために使用できる。対象とするＤＮＡを単離するために標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするクローンを選択する。単離したＤＮＡの特性指摘後、本発明に従ったポリヌクレオチドが簡単に得られる。
【００５１】
あるいは、本発明に従ったポリヌクレオチドはまた、化学合成オリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲ法によっても作製することができる。
【００５２】
本明細書において使用する「オリゴヌクレオチド」の語は、１０から５０個のヌクレオチド、好ましくは１５から３０個のヌクレオチドから成るＤＮＡ分子を表わす。それらは化学合成され、プローブとして使用することができる。
【００５３】
本発明に従ったポリヌクレオチド又はポリペプチドは、本発明に従ったヘリコキニン受容体の性質を変化させる調節因子、特にアゴニスト又はアンタゴニストである化合物のような、作物保護のための新規活性化合物及び／又はヒト及び動物の治療のための製薬上活性な化合物を特定することを可能にする。このために、本発明に従った少なくとも１個のポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子を適切な宿主細胞に導入する。その宿主細胞を一化合物又は様々な化合物を含むプローブの存在下に、本発明に従った受容体の発現を可能にする条件下で増殖させる。受容体の性質の変化は、例えば下記の実施例２で述べるように検出することができる。これは、例えば殺虫性物質を見出すことを可能にする。
【００５４】
受容体は、好ましくは事前に活性化された後、Ｇタンパク質との相互作用を通して細胞内ｃＡＭＰ又は細胞内カルシウムの濃度を変化させる。それ故、例えばＨＴＳ方式のＥＬＩＳＡアッセイ系（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＲＩＡアッセイ系（ＮＥＮ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって直接細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定することにより、異種発現後に化合物による受容体特性の変化を測定することができる。ｃＡＭＰ濃度の間接測定は、その発現がｃＡＭＰ濃度に依存するレポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ）を用いて実施できる（Ｓｔｒａｔｏｗａら、１９９５）。異種系における特定Ｇタンパク質、例えばＧα１５、Ｇα１６又はキメラＧタンパク質と受容体の共発現及び、例えば蛍光染料又はエクオリンを使用して、カルシウムの上昇を測定することは、スクリーニングを実施する可能な代替法である（Ｓｔａｂｌｅｓら、１９９７、Ｃｏｎｋｌｉｎら、１９９３）。
【００５５】
さらに、活性化Ｇタンパク質へのＧＴＰの結合は、物質を検定するための読み取り（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）系として使用することができる。
【００５６】
本発明に従ったポリヌクレオチド又はポリペプチドはまた、本発明に従った受容体に結合する化合物を、該受容体の活性の変化を測定する必要なしに検出することを可能にする。例えば、本発明に従ったポリヌクレオチドを含み、対応する受容体又はポリペプチド又はそれら自体の遺伝子産物を発現する宿主細胞を、該宿主細胞、受容体又は個々のポリペプチドと少なくとも１つの化合物の相互作用を可能にする条件下で一化合物又は化合物の混合物と接触させる。そのような結合実験では、本発明に従ったポリペプチドを標識形態で使用することができる。
【００５７】
本明細書において使用する「アゴニスト」の語は、本発明に従った受容体を活性化する分子を指す。
【００５８】
本明細書において使用する「アンタゴニスト」の語は、アゴニストをその結合部位から置換する分子を指す。
【００５９】
本明細書において使用する「調節因子」の語は、アゴニスト及びアンタゴニストについての遺伝学的用語を構成する。調節因子は、本発明に従ったポリペプチドに結合する低分子量有機化学分子、ペプチド又は抗体でありうる。他の調節因子は、順次、本発明に従ったポリペプチドに結合する分子に結合し、それによってそれらの生物活性に影響を及ぼす低分子量有機化学分子、ペプチド又は抗体でありうる。調節因子は天然基質及びリガンドのミメティック（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を構成しうる。
【００６０】
該調節因子は、好ましくは低分子量有機化合物である。
【００６１】
本発明に従ったポリペプチドへの該調節因子の結合は、それによって処理される昆虫の死滅、麻痺又は生殖不能へと導くように細胞プロセスを変化させることができる。見出された調節因子の殺虫特性を確認するための昆虫、幼虫又は昆虫卵に関するインビボ試験は一般に既知である。
【００６２】
本発明はまた、それ故、本発明に従ったポリペプチドの調節因子の、本文中下記では「活性化合物」と称する、殺虫剤又は薬剤としての使用に及ぶ。
【００６３】
該活性化合物は、溶液、乳剤、水和剤、懸濁液、粉末、撒布剤、糊状剤、可溶性粉末、顆粒剤、サスポエマルジョン濃縮製剤、活性化合物を含浸させた天然及び合成材料、及びポリマー物質中の微細カプセルなどの、常用製剤に変換することができる。
【００６４】
これらの製剤は既知の方法で、例えば、適宜に界面活性剤、すなわち乳化剤及び／又は分散剤及び／又は発泡剤を使用して、該活性化合物を増量剤、すなわち液体溶剤及び／又は固形担体と混合することによって製造される。
【００６５】
使用する増量剤が水である場合は、例えば補助溶剤として、有機溶剤を使用することも可能である。基本的に、下記のものは適切な液体溶剤である：キシレン、トルエン又はアルキルナフタレンなどの芳香族化合物、クロロベンゼン、クロロエチレン又は塩化メチレンなどの塩素化芳香族化合物及び塩素化脂肪族炭化水素、シクロヘキサン又はパラフィンなどの脂肪族炭化水素、例えば鉱物油分画、鉱物油及び植物油、ブタノール又はグリコールなどのアルコール及びそれらのエーテル及びエステル、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン又はシクロヘキサノンなどのケトン、ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシドなどの強極性溶媒、及び水。
【００６６】
適切な固形担体は：例えばアンモニウム塩、及びカオリン、粘土、滑石、白亜、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト又は珪藻土などの粉砕天然鉱物、及び微細シリカ（ｆｉｎｅｌｙ  ｄｉｖｉｄｅｄ  ｓｉｌｉｃａ）、アルミナ及びシリケートなどの粉砕合成鉱物である；顆粒剤についての適切な固形担体は：例えば破砕及び分画した方解石、大理石、軽石、海泡石及び苦灰石などの天然岩石、ならびに無機及び有機荒粉の合成顆粒、及びオガクズ、ヤシ殻、トウモロコシ穂軸及びタバコ茎などの有機物質の顆粒である；適切な乳化剤及び／又は発泡剤は：例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、例えばアルキルアリールポリグリコールエーテル、アルキルスルホネート、アルキルスルフェート、アリールスルホネート及びタンパク質加水分解産物などの非イオン性及び陰イオン性乳化剤である；適切な分散剤は：例えばリグノスルファイト廃液及びメチルセルロースである。
【００６７】
カルボキシメチルセルロース、及びアラビアゴム、ポリビニルアルコール及びポリビニルアセテートなどの粉末、顆粒又はラテックスの形態の天然及び合成ポリマー、ならびにセファリン及びレシチンなどの天然リン脂質、及び合成リン脂質のような粘着付与剤が製剤において使用できる。他の添加物は鉱物油及び植物油でありうる。
【００６８】
無機顔料、例えば酸化鉄、酸化チタン及びプルシアンブルー、及びアリザリン染料、アゾ染料及び金属フタロシアニン染料などの有機染料、及び鉄、マンガン、ホウ素、銅、コバルト、モリブデン及び亜鉛の塩などの微量栄養素のような着色剤を使用することが可能である。
【００６９】
一般に該製剤は、０．１から９５重量％、好ましくは０．５から９０重量％の活性化合物を含有する。
【００７０】
該活性化合物は、好ましくは作物保護剤として、特にＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目からの昆虫、例えばＰｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｂｕｐａｌｕｓ  ｐｉｎｉａｒｉｕｓ、Ｃｈｅｉｍａｔｏｂｉａ  ｂｒｕｍａｔａ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｌｅｔｉｓ  ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ、Ｈｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ  ｐａｄｅｌｌａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ  ｎｅｕｓｔｒｉａ、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ  ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ、マイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｓｐｐ．）、Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ  ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ、Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｐｐ．、Ｅｕｘｏａ  ｓｐｐ．、Ｆｅｌｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｓｐｐ．、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐａｎｏｌｉｓ  ｆｌａｍｍｅａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ、Ｐｉｅｒｉｓ  ｓｐｐ．、Ｐｙｒａｕｓｔａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｅｐｈｅｓｔｉａ  ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ、Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｔｉｎｅｏｌａ  ｂｉｓｓｅｌｉｅｌｌａ、Ｔｉｎｅａ  ｐｅｌｌｉｏｎｅｌｌａ、Ｈｏｆｍａｎｎｏｐｈｉｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｒｅｔｅｌｌａ、Ｃａｃｏｅｃｉａ  ｐｏｄａｎａ、Ｃａｐｕａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｎａ、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ、Ｃｌｙｓｉａ  ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ、Ｈｏｍｏｎａ  ｍａｇｎａｎｉｍａ、Ｔｏｒｔｒｉｘ  ｖｉｒｉｄａｎａ、Ｃｎａｐｈａｌｏｃｅｒｕｓ  ｓｐｐ．、Ｏｕｌｅｍａ  ｏｒｙｚａｅを防除するために使用される。
【００７１】
該活性化合物による植物又は植物の部分の処理は、常用処理方法に従って、例えば浸漬、液剤散布、蒸着、噴霧、広幅散布（ｂｒｏａｄｃａｓｔｉｎｇ）、塗布（ｂｒｕｓｈｉｎｇ  ｏｎ）及び、増殖物質の場合、特に種子の場合は、さらに単層又は多層被覆によって、直接に又はそれらの環境、生息場所又は保存区域への作用によって実施される。
【００７２】
該活性化合物はまた、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ロバ、ラクダ、水牛、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ミツバチなどの農業家畜、例えばイヌ、ネコ、飼い鳥、水槽の魚などの他の家畜、及び例えばハムスター、モルモット、ラット及びマウスなどのいわゆる実験動物を攻撃する昆虫を防除するのに適する。これらの昆虫を防除することにより、死亡率及び実績低下（食肉、乳、羊毛、皮、卵、蜂蜜等）を軽減することを意図しており、その結果該活性化合物を使用することによってより経済的で簡単な動物飼育が可能となる。
【００７３】
獣医学の分野では、該活性化合物は、例えば錠剤、カプセル、飲料、水薬、顆粒剤、ペースト、ボーラス、フィードスルー法、坐薬の形態での腸内投与によって、例えば注射（筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内等）、移植片などによる非経口投与によって、鼻内投与によって、例えば浸漬又は沐浴、噴霧、注ぎかけ（ｐｏｕｒｉｎｇ−ｏｎ）及びスポッティング、洗浄、散粉の形態での皮膚投与によって、及び首輪、耳タグ、尾マーク、リムバンド、端綱、マーキング装置等のような活性化合物を含む成形品を用いて、既知の方法で使用される。
【００７４】
家畜、家禽、ペット動物等に投与するとき、該活性化合物は、１から８０重量％の量の該活性化合物を含有する製剤（例えば粉末、乳剤、フロアブル製剤）として、直接又は１００から１０，０００倍に希釈した後使用することができ、あるいは化学浴の形態で使用しうる。
【００７５】
本発明に従ったポリヌクレオチドを含む宿主細胞又はトランスジェニック無脊椎動物の使用を通して、受容体の発現を変化させる物質を検出することも可能である。
【００７６】
本発明に従った上記ポリヌクレオチド、ベクター及び調節領域はさらに、昆虫において、機能的に類似する受容体の合成に関与するポリペプチドをコードする遺伝子を見出すために使用できる。機能的に類似する受容体は、本発明に従って、ここで述べるポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるが、基本的に同じ機能を有するポリペプチドを含む受容体を意味すると理解されるべきである。
【００７７】
配列表及び図１に関する情報：
配列番号１は、単離したヘリコキニン受容体ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を示す。配列番号２は、配列番号１のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００７８】
（実施例）
【実施例１】
【００７９】
上述したポリヌクレオチド配列の単離
組換えＤＮＡテクノロジーの標準方法によってポリヌクレオチドを操作した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。プログラムパッケージＧＣＧバージョン９．１（ＧＣＧ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を用いてヌクレオチド及びアミノ酸配列を生命情報科学的に処理した。
【実施例２】
【００８０】
発現構築物の作製
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、配列番号１の配列領域を増幅し、ベクターｐＣＭＶ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＥＸ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）にクローン化した。
【００８１】
異種発現
Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓからのヘリコキニン受容体をツメガエル卵母細胞において機能的に発現させた。このために、一部のＧタンパク質活性化カリウムチャンネル（ＧＩＲＫ１及びＧＩＲＫ４）を共発現させて該受容体の活性化を測定する（Ｗｈｉｔｅら、１９９８）。
【００８２】
卵母細胞測定
１．調製
成体雌性ツメガエルから卵母細胞を入手した（Ｈｏｒｓｔ  Ｋａｈｌｅｒ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。水温１８〜２０℃の循環水が入った大きなタンク中にカエルを保持する。完全な麻酔下に、腹部の小さな切開（約１ｃｍ）を通してカエルの卵巣を切除する。次に、絶えず振とうしながら卵巣をコラゲナーゼ２５ｍｌ（Ｉ型、Ｃ−０１３０、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ＣＨＥＭＩＥ  ＧｍｂＨ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；３５５Ｕ／ｍｌ、カルシウムを含まないＢａｒｔｈ溶液（ｍＭ単位）：ＮａＣｌ  ８８、ＫＣｌ  １、ＭｇＳＯ４  ０．８２、ＮａＨＣＯ３  ２．４、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ５、ｐＨ７．４で調製する）で約１４０分間処理する。その後、カルシウムを含まないＢａｒｔｈ溶液で卵母細胞を洗浄する。成熟段階Ｖ（Ｄｕｍｏｎｔ，１９７２）の卵母細胞だけをさらなる処理のために選択し、Ｂａｒｔｈ溶液（ｍＭ単位：ＮａＣｌ  ８８、ＫＣｌ  １、ＭｇＳＯ４  ０．８２、Ｃａ（ＮＯ３）２  ０．３３、ＣａＣｌ２  ０．４１、ＮａＨＣＯ３  ２．４、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ５、ｐＨ７．４）及びゲンタマイシン（硫酸ゲンタマイシン、Ｇ−３６３２、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ＣＨＥＭＩＥ  ＧｍｂＨ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；１００Ｕ／ｍｌ）を満たしたマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ（商標）Ｐｌａｔｅｓ，カタログ番号２４５１２８＋２６３３３９（Ｌｉｄ），Ｎｕｎｃ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移す。その後卵母細胞を冷却インキュベーター（ＫＢ５３型、ＷＴＢ  Ｂｉｎｄｅｒ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍｎａｙ）において１９．２℃に保持する。
【００８３】
２．卵母細胞の注入
ピペット吸引装置（Ｐｉｐｅｔｔｅ−ｄｒａｗｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）（Ｌ／Ｍ−３Ｐ−Ａ型、Ｌｉｓｔ−ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ−Ｅｂｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して直径１０〜１５μｍの注入電極を準備する。注入の前に、受容体ＤＮＡ又はＧＩＲＫ１／４−ＤＮＡを含むアリコートを解凍し、水で１０ｎｇ／μｌの最終濃度に希釈する。ＤＮＡ試料を３，２００ｇで１２０秒間遠心分離する（Ｂｉｏｆｕｇｅ  １３型、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ，Ｈａｎａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。長いＰＥチューブを、その後、後部端からピペットを満たすための転移チューブとして使用する。注入電極をＸ、Ｙ、Ｚポジショニングシステム（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｒｅ  ＥＰ１０９０、ｉｓｅｌ−ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｅｉｔｅｒｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続する。マッキントッシュコンピュータを使用して、マイクリタイタープレートウエル中の卵母細胞にアプローチし、短期間圧を適用することによって（０．５〜３バール、３〜６秒間）ＤＮＡ溶液約５０ｎｌを卵母細胞に注入する。
【００８４】
３．電気生理学的測定
ＴＵＲＢＯ  ＴＥＣ−１０ＣＤ（ｎｐｉ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ，Ｔａｍｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）増幅器を備えた２電極ボルテージクランプを使用して電気生理学的測定を実施する。このために必要なマイクロピペットをケイ酸アルミニウムガラスから２回の運動で吸引する（キャピラリー管、製品番号１４  ６３０  ２９、１＝１００ｍｍ、外径（φｅｘｔ．）＝１．６０ｍｍ、内径（φｉｎｔ．）＝１．２２ｍｍ、Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ  ＧｍｂＨ、Ｍａｌｓｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（Ｈａｍｉｌｌら、１９８１）。直径１〜３μｍの電流及び電圧電極を１．５Ｍ  ＫＣｌ及び１．５Ｍ酢酸カリウムで満たす。該ピペットは０．２〜０．５ＭＷのキャパシタンスを有する。電気生理学的測定のために、卵母細胞を小さなチャンバーに移し、通常Ｒｉｍｌａｎｄ溶液（ｍＭ単位：ＫＣｌ  ９０、ＭｇＣｌ２  ３、ＨＰＥＰＳ  ５、ｐＨ７．２）を持続的に流す。物質を適用するため、灌流液を、所望濃度の物質をさらに含む同じ組成の物質溶液に交換する。１週間後、受容体ＤＮＡの発現の成功を−６０ｍＶのクランプ電位で調べる。非応答卵母細胞を廃棄する。その他はすべて物質試験のために使用する。データをＹＴプロッター（ＹＴ  ｐｌｏｔｔｅｒ，ＢＤ１１１型、Ｋｉｐｐ  ＆  Ｚｏｎｅｎ  Ｄｅｌｆｔ  ＢＶ，ＡＭ  Ｄｅｌｆｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて記録する。個々のデータをＯｒｉｇｉｎ（評価ソフトウエアＭｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ  ０１０６０−４４１０  ＵＳＡ）（Ａｄｄｔｉｖｅ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓｄｏｒｆ／Ｔｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に入力する。Ｏｒｉｇｉｎを使用して平均値、標準偏差、ＩＣ５０値及びＩＣ５０曲線を算定する。これらの測定を少なくとも２回実施する。
【００８５】
【表２】
2005523003.tif 000004
2005523003.tif 000005
2005523003.tif 000006
2005523003.tif 000007
2005523003.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、事前にヘリコキニン受容体ＤＮＡを注入しなかった対照卵母細胞へのペプチドの適用と比較した、ヘリコキニン受容体ＤＮＡをツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞に注入し、ヘリコキニンペプチド（ヘリコキニンＩＩＩ、１００ｎＭ、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら、１９９５）を添加した後の電気生理学的測定の結果を示す。
【配列表】
2005523003.tif 000009
2005523003.tif 000010
2005523003.tif 000011
2005523003.tif 000012
2005523003.tif 000013
【図１】
2005523003.tif 000014
【国際調査報告】
2005523003.tif 000015
2005523003.tif 000016
2005523003.tif 000017
2005523003.tif 000018
2005523003.tif 000019
2005523003.tif 000020
2005523003.tif 000021
2005523003.tif 000022
2005523003.tif 000023
2005523003.tif 000024
2005523003.tif 000025
2005523003.tif 000026