(57)【要約】本発明は骨の医学的治療の多くの側面で有用なケラチン由来の生体適合性材料を提供する。ケラチン材料は好ましくはＳ−スルホン化されており、高分子量の中間フィラメントタンパク質で豊富化されている。ケラチン材料は骨の置換及び増強製品として使用するために多孔質であることができる。骨折の治療及び骨の再生のための内部固定器具として使用するための緻密なケラチン材料の使用、並びに骨の形態及び機能の保護、回復及び発達において使用するためのケラチン材料の調製方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨の形態及び機能の保護、回復及び発達において使用するためのケラチン含有材料。
【請求項２】
骨の置換及び増強において使用するための多孔質ケラチン材料。
【請求項３】
骨の固定及び不動化において使用するための緻密なケラチン材料。
【請求項４】
ケラチンがＳ−スルホン化されている請求項１〜３のいずれか一項記載の材料。
【請求項５】
ケラチンが中間フィラメントタンパク質で豊富化されている請求項１〜４のいずれか一項記載の材料。
【請求項６】
固形ケラチン粉末の圧縮によって調製される請求項５記載のケラチン材料。
【請求項７】
ケラチンフィルムの圧縮によって調製される請求項３記載の緻密な材料。
【請求項８】
６０％までのカルシウム塩を含む請求項１〜７のいずれか一項記載の材料。
【請求項９】
圧縮の後に固形ケラチンの凍結乾燥が行われる請求項６又は７記載の材料。
【請求項１０】
骨の形態及び機能の保護、回復及び発達における医療用支持体又は足場の製造における緻密なケラチン材料の使用。
【請求項１１】
ケラチン材料がＳ−スルホン化されている請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
ケラチンが中間フィラメントタンパク質で豊富化されている請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１３】
以下の工程を含む、Ｓ−スルホン化ケラチンの緻密な材料を整形外科製品へ成形する方法:
ａ）熱及び水の存在下でケラチンを圧縮する；
ｂ）材料を強化する；
ｃ）材料を洗浄して残留化学物質を除去する；そして
ｄ）材料を乾燥させる。
【請求項１４】
以下の工程を含む、Ｓ−スルホン化ケラチンの緻密な材料を整形外科製品へ成形する方法:
ａ）ケラチン含有出発材料を強化する；
ｂ）材料を洗浄して残留化学物質を除去する；
ｃ）材料を乾燥させる；そして
ｄ）熱及び水の存在下でケラチンを圧縮する。
【請求項１５】
以下の工程を含む、多孔質Ｓ−スルホン化豊富化ケラチン材料を成形する方法:
ａ）可溶性ポロゲンの存在下でケラチンを圧縮する；
ｂ）ポロゲンを除去し、材料を強化する；
ｃ）タンパク質材料を洗浄する；そして
ｄ）材料を凍結乾燥する。
【請求項１６】
ポロゲンが塩化ナトリウムもしくは他の生体適合性の塩、又はグリセロールもしくは他の生体適合性の溶媒から選択される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ポロゲンの量及び性質が、孔寸法を選択して、ケラチン材料が移植されたときにケラチン材料のコロニー形成を容易にするために骨前駆細胞の浸潤を可能にするように制御される請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１８】
ケラチン出発材料へのヒドロキシアパタイトの添加をさらに含む請求項１３〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
ケラチンが中間フィラメントタンパク質で豊富化されている請求項１３〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
請求項１３〜１９のいずれか一項記載の方法によって調製されるケラチン材料。
【請求項２１】
骨の置換／増強治療において使用するための、中間フィラメントタンパク質で豊富化されている多孔質ケラチンの形態の生体適合性材料。
【請求項２２】
ケラチンがＳ−スルホン化されている請求項２１記載の生体適合性材料。
【請求項２３】
６０％までのカルシウム塩を含む請求項２１又は２２記載の生体適合性材料。
【請求項２４】
材料が固形ケラチン粉末の圧縮によって調製される請求項２１〜２３のいずれか一項記載の生体適合性材料。
【請求項２５】
圧縮の後に凍結乾燥が行われる請求項２４記載の生体適合性材料。
【請求項２６】
材料がケラチンの溶液から調製される請求項２１〜２５のいずれか一項記載の生体適合性材料。
【請求項２７】
ケラチンの溶液が凍結乾燥される請求項２６記載の生体適合性材料。
【請求項２８】
骨セグメントの固定及び不動化並びに内部固定による骨折の治療のための、生体適合性ケラチン材料から製造される整形外科医療用材料。
【請求項２９】
Ｓ−スルホン化ケラチン材料から製造される請求項２８記載の整形外科医療用材料。
【請求項３０】
ケラチン材料が中間フィラメントタンパク質で豊富化されている請求項２８又は２９記載の整形外科医療用材料。
【請求項３１】
固形ケラチン粉末の圧縮によって調製される請求項２８〜３０のいずれか一項記載の整形外科医療用材料。
【請求項３２】
ケラチンフィルムの圧縮によって調製される請求項２８〜３０のいずれか一項記載の整形外科医療用材料。
【請求項３３】
ケラチンの溶液から調製される請求項２８〜３０のいずれか一項記載の整形外科医療用材料。
【請求項３４】
６０％までのカルシウム塩を含む請求項２８〜３０のいずれか一項記載の整形外科医療用材料。
【請求項３５】
圧縮の後にケラチンが凍結乾燥される請求項３１〜３３のいずれか一項記載の整形外科医療用材料。
【請求項３６】
請求項１３〜１９のいずれか一項記載の方法によって作られる請求項２８〜３５のいずれか一項記載の整形外科医療用材料。
【請求項３７】
中間フィラメントタンパク質で豊富化されたＳ−スルホン化ケラチンを、骨折の治療における内部固定器具として使用するための堅固で緻密な生体適合性材料へ再成形する方法。
【請求項３８】
ケラチンが中間フィラメントタンパク質で豊富化されている請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
湿分及び化学物質の存在下で生体適合性タンパク質を圧縮することを含む請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
所望の形状を形成するために熱も使用される請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
Ｓ−スルホン化ケラチンからスルホン酸基を除去して天然のケラチン中に本来存在するジスルフィドを再形成させるための還元剤の制御された使用も含む請求項３７〜４０のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
請求項３７〜４１のいずれか一項記載の方法により製造される生体適合性ケラチン豊富化材料。
【請求項４３】
材料がプレート、ピン又はネジである請求項２８記載の整形外科材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は羊毛、毛髪、角、ひづめ及びうろこの如き動物源由来のケラチンからの医療用材料の調製に関する。ここに記述されるケラチン材料は生体適合性であり、生体統合性であり、かつ生物分解性であり、材料の主な適用は骨の置換及び増強のための並びに骨折及び骨セグメントの固定及び不動化のための整形外科手術にある。
【背景技術】
【０００２】
ケラチンは生物学的構造において、特に高等脊椎動物の上皮組織において幅広く代表される構造タンパク質の一つのクラスである。ケラチンは二つの主なクラス、即ち軟質ケラチン（皮膚及びいくつかの他の組織に生ずる）及び硬質ケラチン）（爪、かぎ爪、毛髪、角、羽及びうろこの材料を形成する）に分けられることができる。
【０００３】
硬質ケラチンの堅固さ及び不溶性は硬質ケラチンが多くの生物学的系において基礎的な構造的役割を果たすことを可能とするものであるが、合成ポリマー由来の工業材料及び消費材料の多くにおいて見出される望ましい特性である。優れた物理的特性を有することに加えて、ケラチンはタンパク質なので高度の化学的官能性を有するポリマーであり、従って合成ポリマーが達成することができない多くの特性を示す。それ故、ケラチンは高い価値を有する適所市場用途を持つ医療用製品の開発によく適している。機能を果たした後に体組織によって吸収（再吸収）される医療用材料は、高い価値を有する製品の領域の一例であり、そこではケラチンの特殊な特性が天然及び合成の競合材料の両方をしのぐことを可能にする。
【０００４】
Ｙａｍａｕｃｈｉ（Ｋ．Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｍ．Ｍａｎｉｗａ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍｏｒｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｅｄｉｔｉｏｎ，３，２５９，１９９８）は、ケラチンがマトリックスに加工されることができ、これらのマトリックスはそれらのインビトロ及びインビボ特性のために生体適合性であるとみなされることを示している。これらの材料を作るために使用された方法は、チオールの如き還元剤の大きな濃度、及び材料の商業的な製造には好適でない加工条件を必要とする。
【０００５】
Ｋｅｌｌｙ（ＷＯ  ０３／１９６７３）は、ケラチンが商業的に実行可能な化学及び加工条件を用いて複雑な形状に加工されることができることを示している。
【０００６】
Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（ＵＳ  ５３５８９３５及びＵＳ  ２００３／００３５８２０Ａ１）は、ケラチンが高濃度の還元剤又は苛酷な酸化剤を使用してヒトの毛髪から抽出されることができ、いくつかの軟組織用途において有用な材料を製造するために加工されることができることを示している。しかし、抽出及び再構成方法は苛酷であり、ケラチンの特徴的なアミノ酸であるシスチンのシステイン酸への不可逆的な酸化を通して又はペプチドの加水分解をもたらす高ｐＨ条件へのタンパク質の暴露を通してケラチンの分解を生ずる。これはタンパク質の多くの有用な特性、特に硬組織用途のために必要な堅固さが失われる結果を生ずる。
【０００７】
整形外科用途のために好適なケラチン生物材料を製造するためには、ケラチンの特性を維持しかつ材料に良好な堅固さを与える加工方法が必要である。本発明はかかる材料及びそれらの製造方法を記述する。
【０００８】
ＵＳ  ６４３２４３５は親水性基を有するケラチンを含む組織工学的足場を特許請求の範囲に記載している。このケラチンはケラチン−ケラチンジスルフィド結合で結合されている。しかし、この特許はスルホン化されたケラチンがどのようにして骨の如き硬組織中に組込まれることができるかについて何ら開示していない。与えられている例は全て軟組織又は多孔質構造における使用に関する。
【０００９】
本発明者らは、ケラチンが骨の如き硬組織中に組込まれることができ、それ故、骨損傷の治療において使用されることができることを見出した。
【００１０】
骨を含む体の組織の多くは連続的に再生されている。新しい骨のマトリックス（これが鉱化される）は主に骨芽細胞と称される特定の細胞によって形成され、骨の異なる成分は破骨細胞によって除去される。生物学的な過程によって除去されて骨組織によって置換される移植された材料は、体内の他のメカニズムによって、例えば化学的分解によって壊される材料よりもずっと有利である。新しい骨が移植された材料の表面に隣接して形成され、それによってこの材料が完全に再吸収されて置換されるまでこの材料を組織中に一体化させることが望ましい。
【００１１】
骨は四つの微小構造成分：細胞、有機マトリックス、無機マトリックス及び可溶性シグナル因子に分類されることができる。骨芽細胞は代謝的に活発な分泌細胞であり、可溶性シグナル因子及び類骨（その細胞外修飾がＩ型コラーゲンから主になる有機不溶性基層を生ずる生成物）を発現する。骨芽細胞によるこれらの生成物の発現は骨の維持（例えば再建）及び修復中に起こる。骨髄中に見出される単核マクロファージ前駆体は循環中に入り、非同期的融合を通して、破骨細胞として知られる、直径１００がミクロンまでであり平均１０〜１２個の核を持つ多核細胞を生ずる。破骨細胞は波打ち境界を有しており、これは破骨細胞の再吸収領域を構成し、ここで骨表面の酵素的破壊が生ずる。用語「再建（ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）」は成熟した固体における恒常性及び骨修復に関連した動的な事象を記述するために用いられる。恒常的な再建に関連するプロセスの合計は活性化−再吸収−形成として知られている。骨芽細胞はシグナル因子によって活性化され、骨の領域を立ち退く；破骨細胞が刺激され、骨芽細胞が立ち退いた領域に進み、付着し、再吸収し、まだ同定されていないシグナルに応答して再吸収を停止し、それらの付着を放棄する。破骨細胞が再吸収した穴は類骨を発現する骨芽細胞の派遣によって再び占められ、これにより骨を石灰化して回復させる。ヒトでは活性化−再吸収−形成プロセスは３〜６ヶ月かかる。
【００１２】
骨が傷害（例えば骨折又は腫瘍の外科手術による除去）を受けた後、かなりの出血が起こり、２〜５日で出血は大きな凝結塊を形成する。血管新生はこの凝血塊の周囲で生じ始める。周辺の軟組織では標準的な炎症応答が起こり、多形核白血球、マクロファージ及び単核細胞が凝血塊の周囲に蓄積される。第一週の終わりまでにはほとんどの凝血塊は血管の侵入及び初期繊維形成によって組織化される。最も初期の骨（組み立てられた骨（ｗｏｖｅｎ  ｂｏｎｅ））は７日後に形成される。骨形成は良好な血液供給を必要とするので、組み立てられた骨の針状体は血管形成が最大である凝血塊の周囲に形成され始める。周辺の軟組織からの及び骨髄内からの多能性間葉細胞は骨芽細胞を生じ、これは組み立てられた骨を合成する。しばしば軟骨も形成され、結局は軟骨内の骨化作用により置換される。骨−軟骨を含む顆粒状組織は仮骨（炎症期）と称される。
【００１３】
第一週の後、次の段階が始まり、運動及び固定の度合いに応じて数ヶ月続く。この段階までには急性炎症細胞は消散し、多能性細胞の繊維芽細胞及び骨芽細胞への分化を含む修正プロセスが開始する。修復は周囲から中央に向かって進行し、二つの目的を達成する：一つ目に修復は凝血塊を組織化し、再吸収する；二つ目に、そしてより重要なことに、修復は仮骨の構築のための血管新生を与え、これは結局、骨が欠失している部位の橋渡しをする。修復をもたらす事象は次の通りである。周辺の骨からの多数の破骨細胞が治癒部位に移動する。新しい血管はこれらの細胞を伴い、栄養を供給し、細胞再生のための多能性の細胞を提供する。部位は破骨細胞によって再建される（修復期）。
【００１４】
数週間で仮骨は骨の端を封止し、再建が開始され、そこで骨は再編成されて元の皮質が回復される（再建期）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、ケラチンを含有する材料であって骨形成の補助に有用な及び／又は公衆に有用な選択肢を与える材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は骨格系の骨の形態及び機能の保護、回復及び発達において使用するためのケラチン含有材料を提供する。
【００１７】
本発明は骨の置換及び増強において使用するための多孔質ケラチン材料も提供する。
【００１８】
本発明は骨の固定及び不動化において使用するための緻密なケラチン材料も提供する。
【００１９】
ケラチンはＳ−スルホン化されていることが好ましく、中間フィラメントタンパク質で豊富化されていることがより好ましい。
【００２０】
緻密なケラチン材料は固形ケラチン粉末の圧縮によって又はケラチンフィルムの圧縮によって調製されることができる。
【００２１】
材料は６０％までのカルシウム塩を含むことができる。
【００２２】
材料は圧縮及び固形ケラチンの凍結乾燥によって調製されることができる。
【００２３】
代わりに、ケラチン溶液が凍結乾燥されることができる。
【００２４】
本発明は骨の形態及び機能の保護、回復及び発達におけるケラチン材料の使用も提供する。
【００２５】
本発明は、以下の工程を含む、多孔質Ｓ−スルホン化豊富化ケラチン材料を成形する方法も提供する:
ａ）可溶性ポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）の存在下でケラチンを圧縮する；
ｂ）ポロゲンを除去し、材料を強化する；
ｃ）タンパク質材料を洗浄する；そして
ｄ）材料を凍結乾燥する。
【００２６】
本発明はケラチン材料の整形外科製品への成形方法も提供する。
【００２７】
本発明は骨の置換／増強治療において使用するための、中間フィラメントタンパク質で豊富化されている多孔質ケラチンの形態の生体適合性材料も提供する。
【００２８】
材料はポロゲンの存在下での固形ケラチン粉末の圧縮によって調製されることができ、圧縮の後に凍結乾燥が行われることができる。ポロゲンは塩化ナトリウムもしくは他の生体適合性の塩、又はグリセロールもしくは他の生体適合性の溶媒から選択されることができる。ポロゲンの量及び性質は、孔寸法を選択して、ケラチン材料が移植されたときにケラチン材料のコロニー形成を容易にするために骨前駆細胞の浸潤を可能にするように制御されることができる。ヒドロキシアパタイトがケラチンに添加されることもできる。
【００２９】
本発明は、以下の工程を含む、Ｓ−スルホン化ケラチンの緻密な材料を整形外科製品へ成形する方法も提供する:
ａ）熱及び水の存在下でケラチンを圧縮する；
ｂ）材料を強化する；
ｃ）材料を洗浄して残余化学物質を除去する；そして
ｄ）材料を乾燥させる。
【００３０】
本発明は、以下の工程を含む、Ｓ−スルホン化ケラチンの緻密な材料を整形外科製品へ成形する方法も提供する:
ａ）ケラチン含有出発材料を強化する；
ｂ）材料を洗浄して残余化学物質を除去する；
ｃ）材料を乾燥させる；そして
ｄ）熱及び水の存在下でケラチンを圧縮する。
【００３１】
本発明は骨セグメントの固定及び不動化並びに内部固定による骨折の治療のための、生体適合性ケラチン材料から製造されるプレート、ピン及びネジの如き整形外科医療用材料も提供する。
【００３２】
本発明は中間フィラメントタンパク質で豊富化されたＳ−スルホン化ケラチンを、骨折の治療における内部固定器具として使用するための堅固で緻密な生体適合性材料へ再成形する方法も提供する。
【００３３】
湿分及び化学物質が添加されることができる。Ｓ−スルホン化ケラチンからスルホン酸基を除去して天然のケラチン中に本来存在するジスルフィドを再形成させるための還元剤の制御された使用も可能である。
【００３４】
骨の形成に使用されるケラチンはＷＯ  ０３／０１１８９４に従う方法によって作られることができる。この方法は、高分子量のケラチン誘導体の調製のためのプロセスを提供し、このプロセスは酸化的スルフィトリシス（ｓｕｌｆｉｔｏｌｙｓｉｓ）によってケラチン源をスルホン化する第一段階の分解工程及び可溶性及び不溶性ケラチンの分離、不溶性ケラチンの続く再抽出、及びこれによる高度にＳ−スルホン化されたケラチン誘導体の製造を含む第二段階の繰返しの水性抽出を含む。
【００３５】
ＷＯ  ０３／０１８６７３はＳ−スルホン化ケラチンタンパク質由来のフォーム繊維接着剤材料又はフィルムを提供する。この方法はＳ−スルホン化ケラチンタンパク質の溶液の溶液流延を含む。
【００３６】
高度にＳ−スルホン化されたケラチン中間フィラメントタンパク質由来のフィルム、繊維、フォーム又は接着剤材料の製造方法も提供される。
【００３７】
本発明はＷＯ  ０３／０１８６３及びＷＯ  ０３／０１１８９４の方法に基づく骨の構造中で使用するのに好適なケラチン材料の製造方法及び骨の構造中で使用するためのケラチン材料を提供する。
【００３８】
分解性ケラチンの器具は機能的負荷を治癒中の骨に徐々に移すことによって（現在使用されている堅い永久的な材料とは異なり）新しい骨の成長を刺激するのに十分な柔軟性を提供するであろう。さらに、ケラチン由来の固定器具又は装置を除去するための続く手術は不要である。
【００３９】
中間フィラメントタンパク質で豊富化されたＳ−スルホン化ケラチンを、骨折の治療における内部固定器具として使用するための堅固で緻密な材料へ再成形する方法は、湿分及び化学物質の存在下で生体適合性タンパク質を圧縮し、いくつかの場合には加熱して所望の形状を形成させることを含む。生物学的条件下での強度及び堅固さを確実にするための材料内での架橋の形成は圧縮中に又は続く化学処理を通して生ずる。
【００４０】
この方法は、Ｓ−スルホン化ケラチンからスルホン酸基を除去して天然のケラチン中に本来存在するジスルフィドを再形成させるための還元剤の制御された使用も含むことができる。これは二重の目的を有しており、第一の目的はジスルフィド架橋の伸張された網状構造を通してケラチンタンパク質を効果的に重合体化することによって生物学的条件下での強度及び堅固さを提供することであり；第二の目的は材料の酵素的分解を阻害することによって生物分解の速度及び程度を制御することである。生物分解の速度を制御することによって、本発明はケラチン製品を広範囲の治癒時間が望ましい用途で使用することを可能にする。
【００４１】
本願明細書に記載される再構成ケラチンは完全に生体適合性であり、いかなる有意な外来体型免疫反応も引き出さない。ケラチンは上述した骨中で生ずる正常な過程によって分解され、正常な骨と置換される。従って骨の置換及び増強において、このケラチンは自己の骨と同様の特性を有する。骨折の治療の場合、このケラチンで作られた器具は骨セグメントの固定及び不動化を実行するために必要な物理的特性を有し、一旦この機能が完了するとケラチンは徐々に再吸収され、ついには組織から消失する。再吸収の初期にケラチン器具が徐々に弱化することは増大する機能的負荷を骨に与えることによって新しい骨の形成を刺激するであろう。これは金属の器具の場合に見出される応力遮蔽効果を防止するであろう。さらに、ケラチンの分解及び再吸収は永久的に体内に保持されるか又は除去のための第二の手術を必要とする金属製の器具と比べて大きな利点である。
【００４２】
本発明はいかなる骨の形成機能にも適用されることができる。骨の形態及び機能は以下の要因によって損なわれることがありうる：
−  骨が未発達又は異常に発達する発達異常、
−  骨の損失を伴うか又は伴わない骨折や骨折脱臼を生ずる外傷、
−  悪性又は良性腫瘍／腫瘍様症状の切除の如き外科手術的介入又は骨の変性症状、
−  感染の如き症状によって生ずる骨の壊死及び破壊。
これらの症状のための治療モダリティーは骨格系の冒された骨の正常な形態及び機能を保護、回復又は発達させることを試みる。
【００４３】
用語「中間フィラメントタンパク質」は中間フィラメントタンパク質クラスからのケラチンタンパク質を記述する。ケラチン中間フィラメントは硬質アルファケラチンに由来し、Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｈａｒｄ  Ｋｅｒａｔｉｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｖｉｅｗ，Ｖｏｌ  ４，ｐｐ４７〜８３，１９９１で論じられている通り、当該技術分野ではらせんセグメント及び非らせんセグメントの両方を含む低硫黄ポリペプチドの二つのファミリーからなるものとして一般的に認識されている。
【００４４】
「中間フィラメントタンパク質で豊富化されている」は天然のケラチン源の対応する量より多くの中間フィラメントタンパク質が製品中に存在するということを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明は以下の好ましい実施態様を参照して例としてのみ記述される。
【００４６】
本発明の特徴は羊毛からの硬質α−ケラチンに基づくいくつかの方法及び用途を特に引用する。しかし、本発明の原理は他のα−ケラチン又は中間フィラメント（ＩＦ）型のタンパク質を生ずることができるいかなる源のケラチンにも等しく良好に適用することができる。
【００４７】
以下に記述されるいくつかの用途に等しく良く適合された材料を製造するために、同様の調製方法が羽の如き他のケラチン源にも出願人によって適用されている。本発明の特徴はα型タンパク質（ＩＦタンパク質）の存在に依存しない用途におけるかかるケラチンの利用の制限された領域をカバーするためにも拡張される。これはβ−ケラチン又は羽のケラチンに基づく調製がＩＦタンパク質と組合せられることができる用途を含む。
【００４８】
羊毛は硬質α−ケラチンの便利な源を代表する（しかし、いかなる他の動物繊維又は角又はひづめも所望のタンパク質の源として等しく良く役立つであろう）。羊毛は約９５％ケラチンからなり、これは三つのタンパク質のクラスに大きく分けられることができる。中間フィラメントタンパク質は高分子量（４５〜６０ｋＤ）の典型であり、部分的な繊維状三次構造及び６％程度のシステイン含量を有する。それらは羊毛繊維の約５８重量％を占めるが、この重量のほんの一部のみが構造中で実際にらせんを形成する。羊毛繊維の約２６％を占めている高硫黄タンパク質及び超高硫黄タンパク質は構造中では球状であり、１０〜４０ｋＤの分子量範囲を有し、３０モル％までのシステインを含むことができる。高グリシン−チロシンタンパク質は羊毛繊維の６％を占める微小なクラスであり、１０ｋＤ程度の分子量を有し、それらの高いグリシン及びチロシンアミノ酸残基含量によって特徴付けられる。
【００４９】
異なるクラスの羊毛ケラチンからのタンパク質は特定の用途での特有の利点をそれらに与える特徴を有する。
【００５０】
本発明は中間フィラメントタンパク質の使用及び整形外科手術で用いるための材料を製造するためのそれらの使用に主に関する。
【００５１】
それにもかかわらず、他の非繊維タンパク質はより制限された分野で独自の用途を持つ。
【００５２】
上述したような動物源由来の高度にＳ−スルホン化されたケラチンは、中間フィラメントタンパク質成分を単離するために精製された場合、整形外科用の広範囲の製品で使用するための理想的な生体適合性／生物分解性材料である。ケラチンはＷＯ  ０３／０１１８９４に記述されたような方法によって調製されることができる。Ｓ−スルホン化ケラチンタンパク質自体はＷＯ  ０３／０１８６７３の方法に従って作られることができる。これらの方法は本来のケラチン源中に存在するシスチンを変性してＳ−スルホシステインにさせる。この基は極めて極性が高く、誘導体化されたケラチンがｐＨ＞４の水性条件下で可溶になるようにすることができる。加えて、Ｓ−スルホン化された材料は湿分に対して反応性であり、整形外科治療で有用なマトリックスへと加工するのに好適である。いくつかの場合においてはＳ−スルホン酸基を保持することが有用であるが、一方他のマトリックスのためには再構成過程の一部としてタンパク質を化学的に処理してＳ−スルホン酸基を除去してケラチン中に本来存在するジスルフィド結合を回復させることが有用である。極性が極めて高く従って湿分反応性であるのと同様、Ｓ−スルホ誘導体化の存在は再構成ケラチン材料をインビボに存在するタンパク質分解酵素による酵素的分解に対して感受性にさせる。Ｓ−スルホ基（Ｓ−スルホン酸基）のシスチンへの変換はケラチン材料を不溶性にし、タンパク質分解酵素に対するある程度の抵抗性を付与する。それ故、シスチン含有材料は体内で遅い速度で分解され、これはいくつかの整形外科用途では重要な性能である。
【００５３】
Ｓ−スルホシステインのシスチンへの変換は還元剤（通常はチオグリコール酸アンモニウムの如きチオール含有溶液）の適用を通して、又はＷＯ  ０３／０１８６７３に記載されたような方法を通して生じうる。
【００５４】
タンパク質材料として、ケラチンは十分に証明されている骨生成剤ヒドロキシアパタイトの如き骨生成剤を組入れる整形外科治療材料の製造のために使用される材料として良く適合している。再構成ケラチン材料は容易に調製されることができ、再構成方法に応じて０〜６０％の濃度のヒドロキシアパタイトを含むことができる。生体材料へのヒドロキシアパタイトの含有による有利な治癒効果は十分に証明されており、本発明の一部としても示される。
【００５５】
本発明の一実施態様では、Ｓ−スルホン化ケラチンは骨置換又は増強製品として使用するための多孔質材料へと再構成される。これは塩化ナトリウムの如き可溶性ポロゲン及び水の存在下でケラチンタンパク質を圧縮することによって達成される。一般に、Ｓ−スルホン化ケラチン中間体は粉末圧縮を助けるような粒子寸法に、好ましくは１２５〜２００ミクロンに粉砕され、１：０．１〜１：１０、好ましくは１：１の比で水と、及び１：０．０１〜１：１０の比で塩化ナトリウムと混合される。ヒドロキシアパタイトもこの混合物に０〜６０重量％、好ましくは０〜１０重量％の濃度で組入れられる。この混合物は雌型に充填され、１００００〜５００００ｋＰａの範囲の圧力で１〜３０分の範囲の時間の間、圧縮される。雌型からの除去後、柱体がペレットから切り出され、柱体は化学的処理溶液中に浸漬され、ポロゲンが洗い落とされて多孔質材料が残され、一方ケラチンからスルホン酸基が除去されてタンパク質にジスルフィド架橋を回復させる。この化学的処理は以下の二つの形態のうち一つを用いて行うことができる。一つの形態では、リン酸ナトリウム（好ましくは濃度０．１Ｍ）を含む、ｐＨ７．０に緩衝されたチオグリコール酸アンモニウムの溶液（好ましくは濃度０．２５Ｍ）が２〜４８時間、好ましくは１８時間、柱体を処理するために用いられる。残存化学物質は続く水でのペレットの洗浄によって除去される。洗浄後、柱体は凍結乾燥される。代わりに柱体はチオグリコール酸を含む溶液（好ましくは０．１Ｍ）での化学的処理に２〜４８時間、好ましくは１８時間、供される。水で簡単に洗浄した後、残存化学物質は柱体を緩衝液中で４８〜９６時間洗浄することによって除去される。緩衝液は２４時間ごとに取り換えられる。水でさらに洗浄した後、柱体は凍結乾燥される。
【００５６】
材料中の孔寸法は調製に使用される塩化ナトリウムの量を変化させることによって制御されることができる。例えばタンパク質１ｇあたり０．０６ｇの塩化ナトリウムを使用した調製についての典型的な孔寸法は５０〜１５０ミクロンであり、タンパク質１ｇあたり０．１４ｇの塩化ナトリウムは３２０ミクロンまでの孔を生ずる。
【００５７】
チオグリコール酸方法を用いて調製された多孔質ケラチン材料の生物学的特性はインビトロ及びインビボの両方で証明されている。インビトロでは材料は細胞毒性を有さず、ヒト及びヒツジの繊維芽細胞の増殖を支持した。ヒツジの繊維芽細胞を用いたＩＳＯ  １０９９３−５に記載されているような細胞と多孔質材料の直接接触は以下の効果をもたらした。多孔質材料を含む又はコントロールとしての材料を含まないポリスチレン細胞培養プレートのウエルは〜１００００個の細胞で最初に播種された（０時間）。播種後の最初の２４時間、培養は細胞数の減少によって示されるように遅延時間を経験した。この現象は行われたすべてのアッセイで認識され、降下はテスト材料を含むウエルに加えてコントロールのウエルでも観察される。実験によれば、遅延時間は１２時間未満続き、増殖の指数関数期がこの時点で始まることが示された。細胞数の倍化はほぼ２４〜４８時間ごとに起こり、亜集密状態（約８０％の集密状態）は対数増殖の終わりで記録された。これは実験時間（５日又は１２０時間）の終わりに対応する。時間を延長された実験ではこの直後の細胞増殖の平坦化が培養物の完全な集密状態と共に示された。接触阻害及び栄養物の欠如がこの時点での増殖速度を制限する主な役割を果たしており、単層培養物は細胞死の徴候（即ち、膜の一体性の損失、細胞数の減少、個々の細胞の空洞化）を示す。このアッセイの間、細胞はディスクの上部表面に取り付くことが目撃された。光学顕微鏡により、これらの細胞の形態学的な外観は材料を含まないコントロールと比較してすべての基質で同様であると認められた。ヒトの繊維芽細胞を用いた同様のアッセイは極めてよく似た結果を生じ、典型的な繊維芽細胞の増殖曲線が多孔質材料の存在下で生じ、培養の１２０時間後に約８０％の集密状態に達した。コントロールのウエルはこの時点で１００％の集密状態に達した。
【００５８】
インビボ研究は、上述の方法によって処理されたケラチン材料、及び６％のヒドロキシアパタイトを含むこの材料の組成物に関連しており、直径３ｍｍ、長さ３ｍｍの棒として製造され、ガンマ線照射（２．８Ｍｒａｄｓ）によって滅菌され、成体の羊の後肢の長骨の中軸（皮質骨）及び近位並びに遠位端（皮質−海綿状骨）に移植された。移植された材料に対する組織応答は１０日目、３，６，８，１２及び２４週目での生検サンプルの組織学的調査によって研究された。チオグリコール酸を用いて調製された材料に対する骨組織応答は移植体の存在に対する最小の外来体型免疫反応を示し、移植体と周囲の骨との間には顆粒化組織（繊維症をもたらす）の薄い層のみが形成された。３〜６週間で移植体材料は類骨組織によってコロニー形成され、ケラチン移植体材料の再吸収によって作り出された空間への組み立てられた骨の沈着をもたらし、新しい骨は約６〜８週間で周囲の骨に接合された。６週目以降、組み立てられた骨の皮質海綿状骨への再建が生じた。この過程の継続は成熟した骨によって置換された移植体材料の完全な統合をもたらし、骨の欠失は完全に治癒された。
【００５９】
さらに、この多孔質材料の物理的特性がプレートの形状の材料を製造することによって調査された。これらのプレートは長さ１２ｍｍ、幅４ｍｍ、厚さ３ｍｍであり、羊に皮下移植された。これらのプレートをＩｎｓｔｒｏｎ機械で試験することによって得られたデータは引張り特性が３〜６週間にわたって約１０％弱化したことを示した。これはこの時期の約１０％の乾物重量の損失と一致する。これらの発見はこの材料が新しい骨の形成を刺激して応力遮蔽を防止し、徐々に再吸収される能力を有することを支持する。
【００６０】
多孔質ケラチン材料はＷＯ  ０３／０１８６７３に記載されたような方法を用いてＳ−スルホン化ケラチンの水溶液の凍結乾燥によっても調製され、これらの材料は骨移植用途で用いるのに好適である。高い割合のヒドロキシアパタイトを含む多孔質ケラチン材料はＳ−スルホン化ケラチンの水溶液（好ましくは５％水溶液）中に不溶性のヒドロキシアパタイトを１：０．１〜１：２の、好ましくは１：１のケラチン対ヒドロキシアパタイトの重量の比で懸濁することによって調製される。凍結及び続く凍結乾燥により、ケラチンとヒドロキシアパタイトの親密な混合物が多孔質スポンジ状材料の形で作り出され、これは骨移植製品で用いるのに好適である。
【００６１】
本発明の別の実施態様ではＳ−スルホン化ケラチンは骨固定製品として使用するための堅固で緻密な材料に再構成される。これはケラチンタンパク質を圧縮することによって達成される。一般的に、Ｓ−スルホン化ケラチンは粉末圧縮を助けるような粒子寸法に、好ましくは１２５〜２００ミクロンに粉砕され、１：０．１〜１：１０、好ましくは１：１の比で水と混合される。ヒドロキシアパタイトもこの混合物に０〜６０重量％、好ましくは０〜１０重量％の濃度で組入れられる。この混合物は雌型に充填され、１００００〜５００００ｋＰａの範囲の圧力で１〜３０分の範囲の時間の間、圧縮される。雌型からの除去後、柱体がペレットから切り出され、柱体は化学的処理溶液中に浸漬され、ポロゲンが洗い落とされて多孔質材料が残され、一方ケラチンからスルホン酸基が除去されてタンパク質にジスルフィド架橋を回復させる。この化学的処理は以下の二つの形態のうち一つを用いて行うことができる。一つの形態では、リン酸ナトリウム（好ましくは濃度０．１Ｍ）を含む、ｐＨ７．０に緩衝されたチオグリコール酸アンモニウムの溶液（好ましくは濃度０．２５Ｍ）が２〜４８時間、好ましくは１８時間、柱体を処理するために用いられる。残存化学物質は続く水でのペレットの洗浄によって除去される。洗浄後、柱体は凍結乾燥される。代わりに柱体はチオグリコール酸を含む溶液（好ましくは０．１Ｍ）の化学的処理に２〜４８時間、好ましくは１８時間、供される。水で簡単に洗浄した後、残存化学物質は柱体を緩衝液中で４８〜９６時間洗浄することによって除去される。緩衝液は２４時間ごとに取り換えられる。水でさらに洗浄した後、柱体は凍結乾燥される。
【００６２】
緻密なケラチン材料の生物学的特性はインビトロで証明され、生物物理学的特性はインビボで調査された。インビトロでは材料は細胞毒性を有さず、ヒト及びヒツジの繊維芽細胞の増殖を支持した。多孔質マトリックスについて上述された方法と同様の方法で、ヒツジの繊維芽細胞を用いたＩＳＯ  １０９９３−５に記載されているような細胞と多孔質材料の直接接触は以下の効果をもたらした。非多孔質材料を含む又はコントロールとしての材料を含まないポリスチレン細胞培養プレートのウエルは〜１００００個の細胞で最初に播種された（０時間）。播種後の最初の２４時間、培養は細胞数の減少によって示されるように遅延時間を経験した。この現象は行われたすべてのアッセイで認識され、降下はテスト材料を含むウエルに加えてコントロールのウエルでも観察される。実験によれば、遅延時間は１２時間未満続き、増殖の指数関数期がこの時点で始まることが示された。細胞数の倍化はほぼ２４〜４８時間ごとに起こり、亜集密状態（約８０％の集密状態）は対数増殖の終わりで記録された。これは実験時間（５日又は１２０時間）の終わりに対応する。時間を延長された実験ではこの直後の細胞増殖の平坦化が培養物の完全な集密状態と共に示された。接触阻害及び栄養物の欠如がこの時点での増殖速度を制限する主な役割を果たしており、単層培養物は細胞死の徴候（即ち、膜の一体性の損失、細胞数の減少、個々の細胞の空洞化）を示す。このアッセイの間、細胞はディスクの上部表面に取り付くことが目撃された。光学顕微鏡により、これらの細胞の形態学的な外観は材料を含まないコントロールと比較してすべての基質で同様であると認められた。ヒトの繊維芽細胞を用いた同様のアッセイは極めてよく似た結果を生じ、典型的な繊維芽細胞の増殖曲線が多孔質材料の存在下で生じ、培養の１２０時間後に約８０％の集密状態に達した。コントロールのウエルはこの時点で１００％の集密状態に達した。
【００６３】
生物物理学的特性（弾性率、破裂率、引張り強度）はチオグリコール酸で処理されかつ長さ１２ｍｍ、幅４ｍｍ、厚さ３ｍｍのプレートとして製造された材料を成体ラットに皮下移植することによって試験された。プレートは１，３，６及び１２週目にラットから除去され、物理学的強度が評価された。弾性率は３〜６週間にわたって４０〜７０％の減少を示した。これらの２つの時間における乾燥重量の損失は５〜１０％であり、これは多孔質材料のプレートを用いた羊での我々の研究と一致する。
【００６４】
本発明の別の側面は、多数の層のケラチンフィルムの加熱圧縮から構成された、骨の固定に使用するための堅固で緻密なケラチン材料である。ケラチンフィルムはＷＯ  ０３／０１８６７３に記述されたような方法を用いてＳ−スルホン化ケラチンから容易に調製される。ケラチンフィルムはヒドロキシアパタイトの懸濁液を含むＳ−スルホン化ケラチンの溶液を用いて構築されることもできる。この方法を用いてヒドロキシアパタイトはケラチンの重量に基づいて０〜５０％の濃度でケラチンフィルムに組入れられる。形成されたフィルムは層に積み重ねられ、１〜６０分の範囲の時間の間、５０〜２００℃の範囲の温度で１００００〜１０００００ｋＰａの範囲の圧力に圧縮される。圧縮後、圧縮された混合物に水が添加され、さらなる圧縮が理想的な条件下で行われる。生ずる材料は緻密で堅固なブロックの形状のケラチンとヒドロキシアパタイトの親密な混合物を含む。化学的処理が次に用いられてＳ−スルホン酸基をシスチンに変換する。チオグリコール酸又はチオグリコール酸アンモニウムが上述した条件と同一の処理及び洗浄条件下で用いられる。一旦乾燥されると、生ずる材料はねじ又はピンの如き整形外科手術の装置として有用な形状に機械加工されることができる。
【００６５】
代わりのアプローチでは、０〜６０％の濃度のヒドロキシアパタイトを含むケラチンフィルムが層に積み重ねられる前に、化学的処理がこれらのフィルムに適用される。化学的処理は２０〜６０分の間、上述したのと類似の組成のチオグリコール酸アンモニウムの溶液にフィルムを浸漬させることによって達成される。水中でのフィルムの多数回の洗浄は残余化学物質を除去し、乾燥により生ずる材料はＳ−スルホン酸基がシスチンに変換されたケラチンを含有する。フィルムは次に積層され、上述したのと同一の方法で圧縮され、生ずる材料は緻密で堅固なブロックの形状のケラチンとヒドロキシアパタイトの親密な混合物を含む。さらなる化学的処理は不要であり、材料はねじ又はピンの如き整形外科手術の装置として有用な形状に機械加工されることができる。
【００６６】
本発明の一つの側面は、タンパク質からスルホン酸基を除去して天然のケラチン中に本来存在するジスルフィド結合を回復させるための、上述のチオグリコール酸アンモニウム又はチオグリコール酸の如き還元剤の使用である。スルホン酸型ではケラチンはｐＨ４以上の溶液に可溶であり、インビボで迅速に再吸収される。材料を体内で長時間保持して材料の分解及び再吸収速度を制御するため、スルホン酸基を除去してタンパク質を架橋する還元剤が用いられることができる。還元剤が使用される程度、露出時間及び試薬の濃度はスルホン酸基が材料中に存在するジスルフィド結合に変換される速度に影響を与える。これは次にインビボでの強度及び分解速度に影響を与える。他の生物学的生体材料の特性を変性するために用いられる他の架橋剤、例えばグルタルアルデヒド及びエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）はコラーゲン生体材料の特性を変性するために用いられるものであるが、ケラチン生体材料の特性を変性するためにも用いられることができる。
【実施例】
【００６７】
実施例１ａ：多孔質ケラチン材料
１２５〜３００ミクロンの粒子寸法に粉砕された０．４ｇのＳ−スルホン化ケラチン中間フィラメントタンパク質粉末は０．５ｍｌの水及び０．０２４ｇの塩化ナトリウムと混合され、５分間放置された。この混合物は直径１２ｍｍの雌型に充填され、１５０００ｋＰａの圧力で２分間、圧縮された。雌型からの除去後、直径３ｍｍの柱体がペレットから切り出され、柱体は化学的処理溶液中に浸漬され、ポロゲンが洗い落とされて多孔質材料が残され、一方ケラチンからスルホン酸基が除去されてタンパク質にジスルフィド架橋を回復させた。この化学的処理は以下の二つの形態のうち一つを用いて行うことができる。一つの形態では、０．１Ｍのリン酸ナトリウムを含む、ｐＨ７．０に緩衝された０．２５Ｍのチオグリコール酸アンモニウムの溶液が１８時間、柱体を処理するために用いられる。残存化学物質は続く水での１０，４０及び１０分のペレットの洗浄によって除去される。洗浄後、柱体は凍結乾燥される。代わりに柱体は０．１Ｍのチオグリコール酸を含む溶液での化学的処理に１８時間、供される。水で簡単に洗浄した後、残存化学物質は柱体を０．１ＭのＴＲＩＳ１１．２５ｍＭ塩化カルシウム溶液中で７２時間洗浄することによって除去される。溶液は２４時間ごとに取り換えられる。水でさらに洗浄した後、柱体は凍結乾燥される。
【００６８】
実施例１ｂ：ヒドロキシアパタイトを含む多孔質ケラチン材料
この材料の製造は、６重量％のヒドロキシアパタイト濃度の最終製品を与えるために塩化ナトリウムの混入と同じ時点で０．０３４ｇのヒドロキシアパタイトが添加されたことを除いては、実施例１ａに記載される方法と同一である。
【００６９】
実施例１ｃ：ヒドロキシアパタイトを含む多孔質ケラチン材料
多孔質ケラチン材料を調製するため、５％のケラチン溶液は０．５ｇのＳ−スルホン化羊毛ケラチンタンパク質を水に懸濁させ、続いて０．５ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを力強く攪拌されている溶液に約２時間にわたって徐々に添加することによって調製された。溶液のｐＨは注意深く監視され、塩基の添加直後にｐＨ１０近くにまで上昇し、塩基がタンパク質の溶解によって吸収されるにつれて徐々に降下することが観察された。９．５の最終ｐＨが得られた。タンパク質溶液は３４０００ｇで遠心分離されて不溶性材料が除去され、０．５ｇのヒドロキシアパタイトが溶液に完全に混合された。混合物は凍結され、凍結乾燥されて多孔質材料を生じた。材料は実施例１ａで用いられたのと同一のチオグリコール酸アンモニウムの溶液中に３０分間含浸され、続いて３つのバッチの水で２０分間洗浄され、凍結乾燥された。
【００７０】
実施例２ａ：緻密なケラチン材料
１２５〜２００ミクロンの粒子寸法に粉砕された０．５ｇのＳ−スルホン化ケラチンタンパク質粉末は０．５ｍｌの水と混合され、５分間放置された。この混合物は直径１２ｍｍの雌型に充填され、１５０００ｋＰａの圧力で２分間、圧縮された。雌型からの除去後、１２ｍｍ×４ｍｍのブロックの如き所望の形状がペレットから切り出され、ブロックは化学的処理溶液中に浸漬され、ケラチンからスルホン酸基が除去されてタンパク質にジスルフィド架橋を回復させた。この化学的処理は以下の二つの形態のうち一つを用いて行うことができる。一つの形態では、０．１Ｍのリン酸ナトリウムを含む、ｐＨ７．０に緩衝された０．２５Ｍのチオグリコール酸アンモニウムの溶液が１８時間、ブロックを処理するために用いられる。残存化学物質は続く水での１０，４０及び１０分のブロックの洗浄によって除去される。洗浄後、ブロックは室温で乾燥される。代わりにブロックは０．１Ｍのチオグリコール酸を含む溶液での化学的処理に１８時間、供される。水で簡単に洗浄した後、残存化学物質はブロックを０．１ＭのＴＲＩＳ１１．２５ｍＭ塩化カルシウム溶液中で４８時間洗浄することによって除去される。溶液は２４時間ごとに取り換えられる。水でさらに洗浄した後、ブロックは周囲温度で乾燥される。
【００７１】
実施例２ｂ：ヒドロキシアパタイトを含む緻密なケラチン材料
この材料の製造は、６重量％のヒドロキシアパタイト濃度の最終製品を与えるためにプロセスの開始時に０．０３２ｇのヒドロキシアパタイトがケラチン粉末に添加されたことを除いては、実施例２ａに記載される方法と同一である。
【００７２】
実施例２ｃ：ケラチンフィルムから構成された緻密なケラチン材料
ＷＯ  ０３／０１８６７３に記載されたような方法によって調製された厚さ０．３ｍｍのＳ−スルホン化ケラチンのフィルムは４×５０ｍｍに切断された。総重量１ｇの多数のフィルム（５０枚のフィルムに相当）は５×５０ｍｍの内部寸法の加熱された鋼製ブロック中で層に積み重ねられ、５００００ｋＰａの圧力で５分間圧縮され、８０〜１００℃の温度で鋼製ブロックの加熱中維持された。成形されたケラチンブロックは実施例１ａに記載のチオグリコール酸アンモニウム溶液に１８時間浸漬され、続いて水で１０，４０，１０分間洗浄されて風乾された。
【００７３】
変形例においては、用いられたフィルムは５０％のヒドロキシアパタイトを含み、以下のようにして調製された：１．０ｇのＳ−スルホン化羊毛ケラチンタンパク質は水に懸濁され、０．２ｇのグリセロール及び１．０ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウムが力強く攪拌されている溶液に約２時間にわたって徐々に添加された。溶液のｐＨは注意深く監視され、塩基の添加直後にｐＨ１０近くにまで上昇し、塩基がタンパク質の溶解によって吸収されるにつれて徐々に降下することが観察された。９．５の最終ｐＨが得られた。タンパク質溶液は２７０００ｇで遠心分離されて不溶性材料が除去された。１．０ｇのヒドロキシアパタイトは少量の９９％エタノール（〜１ｍｌ）を用いてペーストにされ、次に５％溶液で完全に混合された。混合物は１００平方ｍｍのペトリ皿に流延され、周囲条件下で乾燥された。
【００７４】
実施例２ｄ：前処理されたケラチンフィルムから構成された緻密なケラチン材料
ＷＯ  ０３／０１８６７３に記載されたような方法によって調製された厚さ０．３ｍｍのＳ−スルホン化ケラチンのフィルムは実施例１ａに記載のチオグリコール酸アンモニウムの溶液で３０分間処理された。処理後、フィルムは水で洗浄され乾燥されてＳ−スルホン酸基よりむしろジスルフィドを含むフィルムを残した。これらのフィルムは４×５０ｍｍに切断された。総重量１ｇの多数のフィルム（７０枚のフィルムに相当）は５×５０ｍｍの内部寸法の加熱された鋼製ブロック中で層に積み重ねられ、５００００ｋＰａの圧力で５分間圧縮され、８０〜１００℃の温度で鋼製ブロックの加熱中維持された。ケラチンブロックを除去し、水に手短に浸漬させ、加熱ブロックへと圧縮し、２００００ｋＰａで５分間圧縮した。ブロックを加圧下で８０〜１００℃に加熱した。３００００ｋＰａで、３０分間圧縮した。
【００７５】
変形例においては、用いられたフィルムは５０％のヒドロキシアパタイトを含み、実施例２ｂに記載されたようにして調製された。ヒドロキシアパタイトを含む緻密なケラチン材料は実施例２ｃと同様にして調製された。
【００７６】
これまでの記述においては、公知の均等物を有する本発明の特定の成分又は要素が言及されたが、かかる均等物はここに個別に記載されているかのように組入れられる。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は医療の分野、特に骨の損傷の分野で有用であろう。本発明によるケラチン材料は生体適合性であり、骨の置換及び増強製品として用いられることができる。
【００７８】
本発明の製品は例えば外傷又は腫瘍の如き臨床症状のために失われた骨を置換するために用いられることができ、新しい骨の沈着のための足場として作用することによって治癒を促進するであろう。多孔質ケラチン足場は再吸収され、新しく組み立てられた骨によって置換され、これは続いて海綿状及び皮質骨に再建されるであろう。
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月29日(2004.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨の置換及び増強において使用するための多孔質ケラチン材料。
【請求項２】
骨の固定及び不動化において使用するための緻密なケラチン材料。
【請求項３】
ケラチンがＳ−スルホン化されている請求項１又は２記載の材料。
【請求項４】
ケラチンが中間フィラメントタンパク質で豊富化されている請求項１〜３のいずれか一項記載の材料。
【請求項５】
固形ケラチン粉末の圧縮によって調製される請求項４記載のケラチン材料。
【請求項６】
ケラチンフィルムの圧縮によって調製される請求項３記載の緻密な材料。
【請求項７】
６０％までのカルシウム塩を含む請求項１〜６のいずれか一項記載の材料。
【請求項８】
圧縮の後に固形ケラチンの凍結乾燥が行われる請求項５〜７のいずれか一項記載の材料。
【請求項９】
骨の形態及び機能の保護、回復及び発達における医療用支持体又は足場の製造における緻密なケラチン材料の使用。
【請求項１０】
ケラチン材料がＳ−スルホン化されている請求項９記載の使用。
【請求項１１】
ケラチンが中間フィラメントタンパク質で豊富化されている請求項９又は１０記載の使用。
【請求項１２】
以下の工程を含む、Ｓ−スルホン化ケラチンの緻密な材料を整形外科製品へ成形する方法:
ａ）熱及び水の存在下でケラチンを圧縮する；
ｂ）材料を強化する；
ｃ）材料を洗浄して残留化学物質を除去する；そして
ｄ）材料を乾燥させる。
【請求項１３】
以下の工程を含む、Ｓ−スルホン化ケラチンの緻密な材料を整形外科製品へ成形する方法:
ａ）ケラチン含有出発材料を強化する；
ｂ）材料を洗浄して残留化学物質を除去する；
ｃ）材料を乾燥させる；そして
ｄ）熱及び水の存在下でケラチンを圧縮する。
【請求項１４】
以下の工程を含む、多孔質Ｓ−スルホン化豊富化ケラチン材料を成形する方法:
ａ）可溶性化合物の存在下でケラチンを圧縮する；
ｂ）可溶性化合物を除去し、材料を強化する；
ｃ）タンパク質材料を洗浄する；そして
ｄ）材料を凍結乾燥する。
【請求項１５】
可溶性化合物が塩化ナトリウムもしくは他の生体適合性の塩、又はグリセロールもしくは他の生体適合性の溶媒から選択される請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
可溶性化合物の量及び性質が、孔寸法を選択して、ケラチン材料が移植されたときにケラチン材料のコロニー形成を容易にするために骨前駆細胞の浸潤を可能にするように制御される請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
ケラチン出発材料へのヒドロキシアパタイトの添加をさらに含む請求項１２〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
ケラチンが中間フィラメントタンパク質で豊富化されている請求項１２〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれか一項記載の方法によって調製されるケラチン材料。
【請求項２０】
骨の置換／増強治療において使用するための、中間フィラメントタンパク質で豊富化されている多孔質ケラチンの形態の生体適合性材料。
【請求項２１】
ケラチンがＳ−スルホン化されている請求項２０記載の生体適合性材料。
【請求項２２】
６０％までのカルシウム塩を含む請求項２０又は２１記載の生体適合性材料。
【請求項２３】
材料が固形ケラチン粉末の圧縮によって調製される請求項２０〜２２のいずれか一項記載の生体適合性材料。
【請求項２４】
圧縮の後に凍結乾燥が行われる請求項２３記載の生体適合性材料。
【請求項２５】
材料がケラチンの溶液から調製される請求項２０〜２４のいずれか一項記載の生体適合性材料。
【請求項２６】
ケラチンの溶液が凍結乾燥される請求項２５記載の生体適合性材料。
【請求項２７】
骨セグメントの固定及び不動化並びに内部固定による骨折の治療のための、生体適合性ケラチン材料から製造される整形外科医療用材料。
【請求項２８】
Ｓ−スルホン化ケラチン材料から製造される請求項２７記載の整形外科医療用材料。
【請求項２９】
ケラチン材料が中間フィラメントタンパク質で豊富化されている請求項２７又は２８記載の整形外科医療用材料。
【請求項３０】
固形ケラチン粉末の圧縮によって調製される請求項２７〜２９のいずれか一項記載の整形外科医療用材料。
【請求項３１】
ケラチンフィルムの圧縮によって調製される請求項２７〜２９のいずれか一項記載の整形外科医療用材料。
【請求項３２】
ケラチンの溶液から調製される請求項２７〜２９のいずれか一項記載の整形外科医療用材料。
【請求項３３】
６０％までのカルシウム塩を含む請求項２７〜２９のいずれか一項記載の整形外科医療用材料。
【請求項３４】
圧縮の後にケラチンが凍結乾燥される請求項３０〜３３のいずれか一項記載の整形外科医療用材料。
【請求項３５】
請求項１２〜１８のいずれか一項記載の方法によって作られる請求項２７〜３４のいずれか一項記載の整形外科医療用材料。
【請求項３６】
中間フィラメントタンパク質で豊富化されたＳ−スルホン化ケラチンを、骨折の治療における内部固定器具として使用するための堅固で緻密な生体適合性材料へ再成形する方法。
【請求項３７】
ケラチンが中間フィラメントタンパク質で豊富化されている請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
湿分及び化学物質の存在下で生体適合性タンパク質を圧縮することを含む請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
所望の形状を形成するために熱も使用される請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
Ｓ−スルホン化ケラチンからスルホン酸基を除去して天然のケラチン中に本来存在するジスルフィドを再形成させるための還元剤の制御された使用も含む請求項３６〜３９のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
請求項３６〜４０のいずれか一項記載の方法により製造される生体適合性ケラチン豊富化材料。
【請求項４２】
材料がプレート、ピン又はネジである請求項２７記載の整形外科材料。
【国際調査報告】
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