(57)【要約】本発明は、ヒト細胞を使用する血管新生のモジュレーターの同定方法に関する。本発明の方法は、in vitroアッセイ系においてヒト多分化能性幹細胞を使用して、ヒト血管新生を化合物および小分子がモジュレーションする能力に関して、該化合物および小分子をアッセイするために使用することができる。本発明は更に、非胚性多分化能性幹細胞を使用するin vitroアッセイ系において自然血管発生を試験化合物がモジュレーションする能力を測定することによる、ヒト血管新生のモジュレーターの同定方法に関する。本発明は、ヒト血管新生またはヒト血管発生をモジュレーションする化合物の同定のための、非胚性多分化能性幹細胞を使用するin vitroアッセイ系に関する。本発明はまた、ヒト血管新生または血管発生のモジュレーションを要する治療方法であって、ヒト血管新生または血管発生のインヒビターであると同定された化合物または小分子を、そのような治療を要する患者に投与することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）試験化合物の存在下、内皮細胞の増殖に適した時間にわたり及び条件下で複数の幹細胞を培養し、
（b）該試験化合物の存在下の該幹細胞からの微小血管成長の量を血管成長の対照量と比較することを含んでなり、
ここで、該微小血管成長が微小血管成長の対照レベルより高い又は低い場合には、該試験化合物が血管新生のモジュレーターとして同定される、血管新生のモジュレーターの同定方法。
【請求項２】
幹細胞を血管断片と共に培養する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
幹細胞を複数の腫瘍細胞と共に培養する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
腫瘍細胞が腫瘍細胞系の細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
幹細胞を更に、ヒドロコルチゾン、上皮増殖因子またはウシ脳抽出物の存在下で培養する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
血管新生のモジュレーターが抗血管新生剤として同定される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
血管新生のモジュレーターが血管新生剤として同定される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
試験化合物の存在下の複数の幹細胞の培養を少なくとも7日間行う、請求項1記載の方法。
【請求項９】
試験化合物の存在下の複数の幹細胞の培養を少なくとも14日間行う、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
フィブリンを含むマトリックス上で幹細胞を培養する、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
フィブリンを含む生理的ゲル内で幹細胞を培養する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
非変性コラーゲンを含む生理的ゲル内で幹細胞を培養する、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
（a）複数の腫瘍細胞および試験化合物の存在下、内皮細胞および該腫瘍細胞の増殖に適した時間にわたり及び条件下で血管断片を培養し、
（b）該試験化合物の存在下の該血管断片からの微小血管成長の量を血管成長の対照量と比較することを含んでなり、
ここで、該微小血管成長が微小血管成長の対照レベルより高い又は低い場合には、該試験化合物が血管新生のモジュレーターとして同定される、血管新生のモジュレーターの同定方法。
【請求項１４】
異常な血管成長に関連した疾患または状態を有する個体を治療するための方法であって、TNF-αインヒビターの治療的有効量を該個体に投与することを含んでなる方法。
【請求項１５】
TNF-αインヒビターがIMiDTMである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
IMiDTMがActimidTMまたはRevimidTMである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
該疾患または状態が癌である、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
癌が転移癌である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
癌が乳癌である、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
該疾患または状態が、炎症、子宮内膜症、関節炎、アテローム硬化性プラーク、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、トラコーマ、角膜移植片血管新生、乾癬、強皮症、血管腫および肥厚性瘢痕、血管癒着および血管線維腫よりなる群から選ばれる、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
血管を形成しうる複数の細胞をTNF-αのインヒビターと接触させることを含んでなる、血管新生の抑制方法。
【請求項２２】
TNF-αのインヒビターがActimidTMまたはRevimidTMである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記の複数の細胞が個体内の複数の細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
前記の複数の細胞が細胞培養内の複数の細胞である、請求項21記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2002年4月12日付け出願の米国仮特許出願第60/372,127号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
【０００２】
１．緒言
本発明は、血管細胞または非胚性幹細胞を使用する血管新生のモジュレーターの同定方法に関する。本発明の方法は、in vitroアッセイ系においてヒト多分化能性幹細胞を使用して、ヒト血管新生を化合物および小分子がモジュレーションする能力に関して、該化合物および小分子をアッセイするために使用することができる。本発明は更に、非胚性多分化能性幹細胞を使用するin vitroアッセイ系において自然血管発生を試験化合物がモジュレーションする能力を測定することによる、ヒト血管新生のモジュレーターの同定方法に関する。本発明は、ヒト血管新生またはヒト血管発生をモジュレーションする化合物の同定のための、非胚性多分化能性幹細胞を使用するin vitroアッセイ系に関する。本発明はまた、ヒト血管新生または血管発生のモジュレーションを要する治療方法であって、ヒト血管新生または血管発生のインヒビターであると同定された化合物または小分子を、そのような治療を要する患者に投与することを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
2．発明の背景
ヒト血管新生をモジュレーションする化合物の同定および創製に大きな関心が持たれている。ヒト血管新生および血管発生をモジュレーションする化合物の同定の大きな障害は、これらの過程がin vivoで生じるため、ヒト血管新生および血管発生を真に模擬するin vitroアッセイ系が存在しないことである。
【０００４】
いくつかの疾患過程は、その病理発生の一部として内皮細胞の浸潤または遊走（腫瘍浸潤、腫瘍遊走、病的血管新生、炎症および子宮内膜症を含む）を要することが示されている（Aznavoorianら, 1993, Cancer 71 (4):1368-1383; Femandezら, 1995, Fertil.およびSteril. 63 (1):45-51; Foxら, 1996, J. Pathol. 179:232-237; Lennarzら, 1991, Biochim. Biophys. Acta 1071:149-158; Liottaら, 1991,. Cell 64:327-336; Mareelら, 1990, Cancer and Metastasis Rev. 9:45-62; ならびにOsborn 1990, Cell 62:3-6）。血管新生は、血管新生依存性である多数の他の疾患および状態、例えば関節炎およびアテローム硬化性プラーク、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、トラコーマおよび角膜移植片血管新生、乾癬、強皮症、血管腫および肥厚性瘢痕、血管癒着および血管線維腫に関与する。
【０００５】
血管新生は、既存の血管から新たな血管が形成される過程である。血管発生は、内皮細胞の単層からの管形成の過程である。正常な生理的条件下では、ヒトまたは動物は、創傷治癒、胎児および胚の発生ならびに黄体、子宮内膜および胎盤の形成のような非常に特異的な状況において血管新生および血管発生を受ける。
【０００６】
内皮細胞は、すべての血管を裏打ちし血流と周辺組織との間の交換を調節する細胞の単層を形成する。培養内に単離されている場合であっても中空毛細血管を形成する能力を有するこれらの内皮細胞の成長により、既存の小血管の壁から新たな血管が発生する。血管系が完全に発生したら、血管内皮細胞は通常は静止状態で維持され、新たな血管形成は生じない。疾患または損傷が生じると、通常は、自然創傷治癒の場合と同様の新たな血管の形成が進行する。新たな血管の不十分な形成は慢性皮膚潰瘍を引き起こしうる。あるいは、成長の脱調節は、腫瘍形成、糖尿病性網膜症、乾癬および炎症の場合と同様の血管密度の異常な増加を招きうる。したがって、不適当な血管新生の抑制または非治癒創傷における血管新生の増強は薬物発見計画における極めて重要な目標である。しかし、この分野における研究は、in vivoの血管天然環境を正確に模擬する血管新生のin vitroモデルが存在しないために妨げられている。
【０００７】
血管新生は、多種多様な増殖因子、細胞外マトリックス分子、酵素および種々の細胞型が関わる極めて複雑な過程である。関係のそのような複雑性は、in vivo過程全体をモデル化するin vitroアッセイを開発する際の大きな問題を引き起こしている。血管新生は増殖、遊走および分化の3つの段階に細分されうる。これらの段階のそれぞれを別々にモデル化するアッセイは存在する。特に、簡単なin vitroアッセイは、ある範囲の細胞型の増殖における変化を測定し、基底膜タンパク質上の遊走を評価する。現在のin vitroアッセイ系は、タンパク質マトリックスの供給に基づくものであり、一般には、内皮細胞の血管形成能を測定する。分化を測定するアッセイ系は内皮細胞による帯様構造体の形成を含む。そのようなすべての系は、外的基礎タンパク質を細胞に供給することに基づくものであり、この場合、該細胞は該タンパク質上を遊走して管を形成する。しかし、これらのアッセイの問題点は、それらがいずれも、血管新生に要求される段階のすべてを兼ね備えていないことである。
【０００８】
1つのin vitroモデル系はラット大動脈輪モデルである。このラット大動脈輪モデルにおいては、ラット大動脈輪外植片培養を短期および長期維持条件下で使用する。このアッセイ系においては、内皮細胞および筋細胞の純粋な集団を得るために、ラット大動脈輪断片を短期維持条件下で3〜4日間培養する。一方、長期ラット大動脈輪外植片培養は内皮細胞および平滑筋細胞の両方の協同的成長および増殖を可能にする（Diglioら, 1989, Laboratory Investigation 60 (4):523-531）。
【０００９】
最近、別のグループが、血管新生を研究するためのヒトin vivoアッセイの構築を試みており、それを行う際に、コラーゲンゲル内に包埋された11〜12日齢の胚からの胚性大動脈輪外植片を使用している（Allesandriら, 2001, Laboratory Investigation 81 (6):875-885）。
【００１０】
血管新生の複合段階をモデル化する他のin vitroアッセイは、生後6時間以内に得たヒト胎盤組織からの血管断片の使用（Parishら, 米国特許第5,976,782号）、商業的に入手可能なブタ頚動脈の使用（Stiffey-Wilusz, 米国特許出願第2001/0046666号）、ならびに内皮細胞および繊維芽細胞の二重培養の使用（Grantら, WO 99/17116; Grantら, 米国特許出願第2001/0005581号）を含む。該二重培養に約2:1〜8:1（ヒト成人皮膚繊維芽細胞:ヒト臍静脈内皮細胞）の細胞比で播くことにより、該多細胞モデルはin vivo血管新生に最も良く似たものとなる（Grantら, WO 99/17116; Grantら, 米国特許出願第2001/0005581号）。
【００１１】
しかし、現在のところ、幹細胞、または血管組織と組合された幹細胞、または幹細胞もしくは血管組織断片と組合された腫瘍細胞を使用した血管新生モデルは存在しない。これらの細胞を使用する血管新生アッセイは、従前記載されているアッセイより正確に血管新生過程を反映すると考えられる。
【発明の開示】
【００１２】
3．発明の概要
本発明は、ヒト血管新生またはヒト血管発生をモジュレーションする化合物の同定のための、ヒト多分化能性幹細胞を使用するin vitroアッセイ系に関する。好ましい実施形態においては、ヒト多分化能性幹細胞は胎盤由来である。本発明のスクリーニングアッセイは、血管新生および／または血管発生を抑制または刺激する化合物を同定するために用いることができる。
【００１３】
本発明は、血管新生を可能にする条件下、ヒト多分化能性幹細胞を血管の一部（すなわち、血管輪）と共に培養し、血管新生過程に試験化合物が及ぼす効果を判定することを含んでなる、血管新生のモジュレーターに関してスクリーニングするためのアッセイに関する。本発明の好ましい実施形態においては、多分化能性幹細胞は非胚由来である。本発明の好ましい実施形態においては、非胚性幹細胞は胎盤由来幹細胞である。本発明のもう1つの好ましい実施形態においては、血管の一部はヒト由来であり、好ましくはヒト臍帯である。
【００１４】
本発明はまた、好ましくは、血管新生を可能にする条件下、腫瘍細胞の存在下で血管輪または幹細胞を培養し、血管新生過程に試験化合物が及ぼす効果を判定することを含んでなる、血管新生のモジュレーターに関してスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【００１５】
好ましくは、本発明のスクリーニングアッセイは、（a）適当な増殖容器内に、内皮細胞の少なくとも増殖を支持するのに適した培地を供給し、（b）結合組織を含有しないヒト血管のサンプルを該増殖容器内で少なくとも24時間培養し、（c）一定間隔で培地を交換し、（d）微小血管成長の生成をモニターする工程を含む。
【００１６】
したがって、1つの実施形態においては、本発明は、（a）試験化合物の存在下、内皮細胞の増殖に適した時間にわたり及び条件下で複数の幹細胞を培養し、（b）該試験化合物の存在下の該幹細胞からの微小血管成長の量を血管成長の対照量と比較することを含んでなり、ここで、該微小血管成長が微小血管成長の対照レベルより高い又は低い場合には、該試験化合物が血管新生のモジュレーターとして同定される、血管新生のモジュレーターの同定方法を提供する。特定の実施形態においては、幹細胞を血管断片と共に培養する。もう1つの特定の実施形態においては、幹細胞を複数の腫瘍細胞と共に培養する。より具体的な実施形態においては、腫瘍細胞は腫瘍細胞系の細胞である。もう1つの特定の実施形態においては、幹細胞を更に、ヒドロコルチゾン、上皮増殖因子またはウシ脳抽出物の存在下で培養する。さらにもう1つの特定の実施形態においては、血管新生のモジュレーターが抗血管新生剤として同定される。もう1つの特定の実施形態においては、血管新生のモジュレーターが血管新生剤として同定される。もう1つの特定の実施形態においては、試験化合物の存在下の複数の幹細胞の培養を少なくとも7日間行う。もう1つの特定の実施形態においては、試験化合物の存在下の複数の幹細胞の培養を少なくとも14日間行う。さらにもう1つの特定の実施形態においては、フィブリンを含むマトリックス上で幹細胞を培養する。もう1つの特定の実施形態においては、フィブリンを含む生理的ゲル内で幹細胞を培養する。もう1つの特定の実施形態においては、非変性コラーゲンを含む生理的ゲル内で幹細胞を培養する。
【００１７】
もう1つの実施形態においては、本発明は、（a）複数の腫瘍細胞および試験化合物の存在下、内皮細胞および該腫瘍細胞の増殖に適した時間にわたり及び条件下で血管断片を培養し、（b）該試験化合物の存在下の該血管断片からの微小血管成長の量を血管成長の対照量と比較することを含んでなり、ここで、該微小血管成長が微小血管成長の対照レベルより高い又は低い場合には、該試験化合物が血管新生のモジュレーターとして同定される、血管新生のモジュレーターの同定方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、前記アッセイにおいて同定された化合物で個体を治療するための方法を提供する。この態様においては、本発明は、ヒトの血管新生または血管発生のモジュレーションを要する治療方法であって、ヒトの血管新生または血管発生のインヒビターであると同定された化合物または小分子を、そのような治療を要する患者に投与することを含んでなる方法に関する。本発明はまた、ヒトの血管新生または血管発生のモジュレーションを要する治療方法であって、ヒトの血管新生または血管発生の刺激物質であると同定された化合物または小分子を、そのような治療を要する患者に投与することを含んでなる方法に関する。
【００１９】
したがって、1つの実施形態においては、本発明は、異常な血管成長に関連した疾患または状態を有する個体を治療するための方法であって、TNF-αインヒビターの治療的有効量を該個体に投与することを含んでなる方法を提供する。特定の実施形態においては、TNF-αインヒビターはIMiDTMである。もう1つの特定の実施形態においては、IMiDTMはActimidTMまたはRevimidTMである。もう1つの特定の実施形態においては、該疾患または状態は癌である。より具体的な実施形態においては、癌は転移癌である。もう1つのより具体的な実施形態においては、癌は乳癌である。もう1つの特定の実施形態においては、該疾患または状態は、炎症、子宮内膜症、関節炎およびアテローム硬化性プラーク、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、トラコーマ、角膜移植片血管新生、乾癬、強皮症、血管腫および肥厚性瘢痕、血管癒着および血管線維腫よりなる群から選ばれる。
【００２０】
本発明はまた、いずれかの場合の血管新生の抑制方法を提供する。したがって、本発明は、血管を形成しうる複数の細胞をTNF-αのインヒビターと接触させることを含んでなる、血管新生の抑制方法を提供する。特定の実施形態においては、TNF-αのインヒビターはActimidTMまたはRevimidTMである。もう1つの実施形態においては、前記の複数の細胞は個体内の複数の細胞である。もう1つの特定の実施形態においては、前記の複数の細胞は細胞培養内の複数の細胞である。
【００２１】
本発明はまた、胎盤由来幹細胞のサンプルとヒト臍帯のサンプルとを含んでなる血管新生アッセイキットに関する。本発明のもう1つの実施形態においては、該アッセイキットは更に、ヒト臍帯血漿のサンプルを含む。
【００２２】
本発明のスクリーニングアッセイに関連して使用しうる試験化合物の具体例には、小分子、有機化合物、無機化合物、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、核酸または他の高分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明に関連して使用しうる小分子化合物の他の具体例には、TNF-α活性を抑制する化合物が含まれるが、これに限定されるものではない。好ましくは、該化合物の分子量は1000グラム/モル未満である。そのような化合物には、置換スチレンのシアノおよびカルボキシ誘導体、環状イミド、シクロアルキルアミドおよびシクロアルキルニトリット、アリールアミド、1-オキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3イル)イソインドリンおよび1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3-イル)イソインドリン、テトラ置換2-(2,6-ジオキソピペルジン-3-イル)-1-オキソイソインドリン、イミド／アミドエーテルおよびアルコール、スクシンイミドおよびマレイミド、1-オキソおよび1,3ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドリン、非ポリペプチド環状アミド、イミドおよびアミド置換アルカノヒドロキサム酸、置換フェネチルスルホン、サリドマイド、アミノサリドマイド、3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオンならびにサリドマイド、アミノサリドマイドおよび3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオンの類似体、加水分解産物、代謝産物、誘導体および前駆体、アリールアミド、置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)フタルイミドおよび置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1-オキソイソインドールならびにイソインドール-イミド化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。1つの実施形態においては、好ましい化合物はサリドマイドならびにサリドマイドの類似体、加水分解産物、代謝産物、誘導体および前駆体である。
【００２３】
もう1つの実施形態においては、該化合物は、IMiDSTM、例えばActimidTMおよびRevimidTM（Celgene Corp., Warren, NJ）またはSeICIDｓTM（これらに限定されるものではない）である。
【００２４】
本発明のもう1つの実施形態においては、幹細胞または前駆細胞は、分娩後灌流胎盤に由来するものではなく、臍帯血、骨髄、末梢血または成体の血液のような他の起源から単離されたものである。
【００２５】
3.1  定義
本明細書中で用いる「血管新生」および「血管発生」なる語は、新たな血管の形成を意味する。
【００２６】
本明細書中で用いる「バイオリアクター」なる語は、細胞の増殖、生物材料の産生または発現、ならびに細胞、組織、類器官、ウイルス、タンパク質、ポリヌクレオチドおよび微生物の成長または培養のためのex vivo系を意味する。
【００２７】
本明細書中で用いる「胚性幹細胞」なる語は、胚盤胞（例えば、4〜5日齢のヒト胚）の内部細胞塊から誘導された多分化能性である細胞を意味する。
【００２８】
本明細書中で用いる「胚様幹細胞」なる語は、胚盤胞の内部細胞塊から誘導されたものでない細胞を意味する。本明細書中で用いる「胚様幹細胞」は「胎盤幹細胞」とも称されうる。胚様幹細胞は、好ましくは多分化能性である。しかし、胎盤から入手されうる該幹細胞には、胚様幹細胞、多能性細胞および方向づけられた前駆細胞が含まれる。本発明の方法においては、胎盤由来の胚様幹細胞は、単離された胎盤を放血し残存細胞の除去に十分な時間にわたり灌流した後、該単離胎盤から採集することが可能である。
【００２９】
本明細書中で用いる「内皮」なる語は、通常は漿液（serous）腔、リンパ管および血管を裏打ちする扁平上皮細胞の薄い層を意味する。
【００３０】
本明細書中で用いる「放血する」または「放血」なる語は、胎盤に関して用いる場合には、胎盤からの実質的にすべての臍帯血の除去および／または排液を意味する。本発明においては、胎盤の放血は、例えば、排液、重力により誘発される流出、揉み出し、搾り出し、ポンピングなど（これらは例示に過ぎない）により達成されうる。好ましい実施形態においては、胎盤の放血は更に、胎盤の放血を助ける抗凝血剤のような物質を含有していても含有していなくてもよい流体で胎盤に灌流、リンスまたはフラッシュする（流す）ことにより達成されうる。
【００３１】
本発明で用いる「灌流する」または「灌流」なる語は、器官または組織上またはそれらの内部に流体を注ぐ又は通過させること、好ましくは、器官または組織から残存細胞（例えば、非付着細胞）を除去するのに十分な力または圧力で器官または組織内に流体を通過させることを意味する。本明細書中で用いる「灌流液」なる語は、器官または組織に通過させた後に集められた流体を意味する。好ましい実施形態においては、灌流液は1以上の抗凝血剤を含有する。
【００３２】
本明細書中で用いる「内因性細胞」なる語は、「非外来性」細胞、すなわち、胎盤に由来する「自己」またはオートロガス細胞を意味する。
【００３３】
本明細書中で用いる「外因性細胞」なる語は、「外来性」細胞、すなわち、異種細胞（すなわち、胎盤ドナー以外の起源に由来する「非自己」細胞）または胎盤以外の器官または組織に由来するオートロガス細胞（すなわち、胎盤ドナーに由来する「自己」細胞）を意味する。
【００３４】
本明細書中で用いる「類器官」なる語は、見かけ上または実際の構造において哺乳動物の体（好ましくは人体）のいずれかの器官または腺として集合した1以上の細胞型の集合体を意味する。
【００３５】
本明細書中で用いる「多能性（multipotent）細胞」なる語は、哺乳動物の体の約260の細胞型のサブセットのいずれにも成長する能力を有する細胞を意味する。多分化能性細胞とは異なり、多能性細胞は該細胞型のすべてを形成する能力を有するわけではない。
【００３６】
本明細書中で用いる「多分化能性（pluripotent）細胞」なる語は、完全な分化多様性、すなわち、哺乳動物の体の約260の細胞型のいずれにも成長する能力を有する細胞を意味する。多分化能性細胞は自己再生性であることが可能であり、組織内で休眠または静止状態で維持されうる。全能性細胞（例えば、受精二倍体卵細胞）とは異なり、胚性幹細胞は通常は新たな胚盤胞を形成し得ない。
【００３７】
本明細書中で用いる「前駆細胞」なる語は、特定の細胞型に分化するよう又は特定の組織型を形成するよう方向づけられた細胞を意味する。
【００３８】
本明細書中で用いる「幹細胞」なる語は、組織および器官の特殊化細胞を形成するよう無限に再生しうるマスター細胞を意味する。幹細胞は発生的に多分化能性または多能性の細胞である。幹細胞は2つの娘幹細胞を、または1つの娘幹細胞と1つの前駆（「トランジット（transit）」）細胞（これは後に、該組織の成熟した完全に形成された細胞へと増殖する）とを産生するよう分裂しうる。
【００３９】
本明細書中で用いる「全能性細胞」なる語は、完全な胚（例えば、胚盤胞）を形成しうる細胞を意味する。
【００４０】
本明細書中で用いる「管発生」なる語は管または微小管の生成または形成を意味する。
【００４１】
本明細書中で用いる「管輪」なる語は管の断片を意味する。一般には、管断片は、輪状に見える横断片であるが、培養可能な管の任意の断片でありうる。管は任意（すなわち、動脈、静脈、リンパなど）の管でありうる。
【００４２】
4．図面の簡潔な説明
図1（A〜D）。第6.2節に記載の臍帯血管輪アッセイにおける培養細胞の光学顕微鏡写真。A．陽性対照。培地 + EGCF 200μg/mlにおいて外植片を培養した。外植片から遊走した多数の細胞が該外植片を包囲し、個々の細胞は著しい成長を示した。B．陰性対照。胎盤馴らし培地 + 補足物質において外植片を培養した。EGCFの非存在下では、外植片から遊走した細胞は陽性対照の場合（A）より少数であった。C．処理群3。胎盤馴らし培地 + EGCF 200μg/ml + ThalomidTM100μg/mlにおいて外植片を培養した。100μg/mlのThalomidTMの存在下では、細胞が外植片から遊走した距離は陽性対照の場合（A）より短かった。D．処理群2。胎盤馴らし培地 + EGCF 200μg/ml + ThalomidTM10μg/mlにおいて外植片を培養した。10μg/mlのThalomidTMの存在下では、細胞が外植片から遊走した距離は陽性対照の場合（A）より短かく、該細胞は陽性対照の場合（A）より低密度の成長を示した。
【００４３】
図2（A〜C）。第6.2節に記載の臍帯血管輪アッセイにおける培養細胞の光学顕微鏡写真。A．対照。培地 + ECGF 200μg/ml + DMSO 1μg/mlにおいて細胞を培養した。B．胎盤馴らし培地 + ECGF 200μg/ml + DMSO 1μg/ml + ThalomidTM1μg/mlにおいて細胞を培養した。対照（A）の場合より少数の細胞が見られる。B．胎盤馴らし培地 + ECGF 200μg/ml + DMSO 1μg/ml + ThalomidTM1μg/mlにおいて細胞を培養した。対照（A）または（B）の場合より少数の細胞が見られる。
【００４４】
図3（A〜B）。第6節に記載の臍帯血管輪アッセイにおける培養細胞の光学顕微鏡写真。A．対照。胎盤馴らし培地 + DMSOにおいて細胞を培養した。細胞は主として非分枝（例えば、内皮）表現型を示す。B．胎盤馴らし培地 + DMSO + ThalomidTM1μg/mlにおいて細胞を培養した。対照の場合（A）より多数の細胞が分枝（例えば、ニューロン）表現型を示す。
【００４５】
図4．ヒト血管新生に対する種々の濃度のThal1、ActimidTM（CG-4047）およびフマギリンの効果のグラフ表示。
【００４６】
図5．種々の濃度のThal1、ActimidTM（CG-4047）およびフマギリンの存在下で第6.3節に記載の臍帯血管輪アッセイにおいて培養された胎盤胚様幹細胞の光学顕微鏡写真。
【００４７】
図6。臍帯血管輪アッセイの図示。
【００４８】
5．発明の詳細な説明
本発明は、ヒト血管新生またはヒト血管発生をモジュレーションする化合物の同定のための、ヒト多分化能性幹細胞を使用するin vitroアッセイ系に関する。本発明のスクリーニングアッセイは、血管新生および／または血管発生を抑制または刺激する化合物を同定するために用いることができる。
【００４９】
本発明は、血管新生を可能にする条件下、ヒト多分化能性幹細胞または血管の一部を培養し、血管新生過程に試験化合物が及ぼす効果を判定することを含んでなる、血管新生のモジュレーターに関してスクリーニングするためのアッセイに関する。本発明の好ましい実施形態においては、多分化能性幹細胞は非胚由来である。本発明の特に好ましい実施形態においては、非胚性幹細胞は胎盤由来幹細胞である。本発明のもう1つの好ましい実施形態においては、血管の一部はヒト由来であり、好ましくはヒト臍帯由来である。本発明のもう1つの実施形態においては、幹細胞または前駆細胞は、分娩後灌流胎盤に由来するものではなく、臍帯血、骨髄、末梢血または成体の血液のような他の起源から単離されたものである。
【００５０】
本発明は、血管新生のモジュレーターを同定するためのin vitroスクリーニングアッセイを含む。該アッセイは、ヒト臍帯に由来する血管とヒト多分化能性幹細胞との共培養に基づくものである。好ましい実施形態においては、ヒト多分化能性幹細胞は胎盤由来である。
【００５１】
本発明はまた、胎盤由来幹細胞のサンプルとヒト臍帯のサンプルとを含んでなる血管新生アッセイキットに関する。本発明のもう1つの実施形態においては、該アッセイキットは更に、ヒト臍帯血漿のサンプルを含む。
【００５２】
本発明は、ヒトの血管新生または血管発生のモジュレーションを要する治療方法であって、ヒトの血管新生または血管発生のインヒビターであると同定された化合物または小分子を、そのような治療を要する患者に投与することを含んでなる方法に関する。本発明はまた、ヒトの血管新生または血管発生のモジュレーションを要する治療方法であって、ヒトの血管新生または血管発生の刺激物質であると同定された化合物または小分子を、そのような治療を要する患者に投与することを含んでなる方法に関する。
【００５３】
本発明のスクリーニングアッセイに関連して使用しうる試験化合物の具体例には、小分子、有機化合物、無機化合物、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、核酸または他の高分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
本明細書に記載の治療方法で用いられうる小分子化合物の具体例には、TNF-α活性を阻害する化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
そのような化合物には、置換スチレンのシアノおよびカルボキシ誘導体、環状イミド、シクロアルキルアミドおよびシクロアルキルニトリット、アリールアミド、1-オキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3イル)イソインドリンおよび1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3-イル)イソインドリン、テトラ置換2-(2,6-ジオキソピペルジン-3-イル)-1-オキソイソインドリン、イミド／アミドエーテルおよびアルコール、スクシンイミドおよびマレイミド、1-オキソおよび1,3ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドリン、非ポリペプチド環状アミド、イミドおよびアミド置換アルカノヒドロキサム酸、置換フェネチルスルホン、サリドマイド、アミノサリドマイド、3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオンならびにサリドマイド、アミノサリドマイドおよび3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオンの類似体、加水分解産物、代謝産物、誘導体および前駆体、アリールアミド、置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)フタルイミドおよび置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1-オキソイソインドールならびにイソインドール-イミド化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。1つの実施形態においては、好ましい化合物はサリドマイドならびにサリドマイドの類似体、加水分解産物、代謝産物、誘導体および前駆体である。
【００５６】
本発明の方法においては、臍帯血（「CB」細胞）、胎盤および他の起源から単離された幹細胞を含む（これらに限定されるものではない）任意のヒト幹細胞を使用することができる。該幹細胞には、多分化能性細胞、すなわち、自己再生性であり組織内で休眠または静止状態で維持されうる、完全な分化多様性を有する細胞が含まれうる。該幹細胞には、多能性細胞または方向づけられた（committed）前駆細胞も含まれうる。1つの好ましい実施形態においては、本発明は、臨月（full-term）の胎盤内に存在する生存可能な静止多分化能性幹細胞である幹細胞を使用し、成功した分娩および胎盤排出、放血および灌流の後、多能性および多分化能性幹細胞を回収することが可能である。
【００５７】
5.1  血管新生のモジュレーターを同定するためのスクリーニングアッセイ
本発明は、血管発生または管形成を試験化合物がモジュレーションする能力に関してスクリーニングすることを含んでなる、血管新生のモジュレーターを同定するためのスクリーニングアッセイを含む。本発明のこの態様においては、ヒト多分化能性幹細胞または血管輪を培養内で増殖させ、試験化合物と接触させ、血管新生に対する効果を判定する。
【００５８】
5.1.1  アッセイ方法
本発明は、プレーティングされた幹細胞から血管が生じる血管発生または血管新生のモジュレーターの同定方法を提供する。幹細胞をプレーティングし、好ましくは24時間の培養の後、付着細胞を非付着集団から分離する。適当な培地内で付着細胞を培養する。任意の適当な培地が該方法に含まれる。好ましい培地は、5〜20％ 臍帯血清（CBS）と抗生物質とで補足されたDMEMである。好ましくは、該培地は更に、ヒドロコルチゾン、上皮増殖因子および／またはウシ脳抽出物で補足される。該幹細胞の培養は自然血管発生をもたらす。自然血管発生は微小管構造体の集合により特徴づけられうる。この方法においては、これらの微小管構造体の集合を試験化合物がモジュレーションする能力に関して、試験化合物をアッセイする。血管新生のインヒビターは、対照（例えば、試験化合物の非存在下のアッセイ条件）と比較して微小管形成の過程をそれが予防または軽減する能力に基づいて同定されうる。逆に、血管新生の刺激は、対照（例えば、試験化合物の非存在下のアッセイ条件）と比較して微小管形成の過程をそれが増強または増加させる能力に基づいて同定されうる。
【００５９】
1つの実施形態においては、本発明は、生理的ゲル、適当な栄養素、および血管新生モジュレーション活性を有すると疑われる少なくとも1つの物質と共に、生物学的サンプルからの非胚性多分化能性幹細胞を、新たな血管組織の成長を可能にするのに十分な時間にわたり及び条件下で培養し、新たな血管組織の成長に関して該断片を検査し、該成長を対照の場合と比較することを含んでなる、血管新生モジュレーション活性に関して物質をスクリーニングするための方法を提供する。「血管新生（の）モジュレーション」なる語は、血管断片の正常な血管新生活性を物質がモジュレーションまたは改変する能力を意味し、血管新生活性の抑制、促進および増強を包含する。該方法は、血管新生のインヒビター、プロモーター（促進物質）またはエンハンサー（増強物質）でありうる化合物または物質を試験するために使用することができる。「生物学的サンプル」なる語は、特定の組織および／または動物種に対する血管新生モジュレーション活性を物質が有するかどうかを試験したいその動物組織に最終的に由来する任意のサンプルを意味する。好ましくは、生物学的サンプルはヒト組織に由来する。
【００６０】
本発明において使用しうる幹細胞には、臍帯血（CB）幹細胞、胎盤幹細胞、胚性幹（ES）細胞、胚様幹細胞、全能性幹細胞、前駆細胞ならびに多能性、多分化能性および全能性細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態においては、潜在的血管新生モジュレーション活性を有する試験化合物でスクリーニングされる培養および対照の両方に、非胚性多分化能性幹細胞を使用する。
【００６１】
本発明はまた、培養血管輪（すなわち、in vitroで成長した血管の横断片）から血管が生じる、血管発生または血管新生のモジュレーターの同定を含む。本発明のこの態様においては、血管輪の横断片（好ましくは、臍帯から得たもの）を、血管の成長を可能にする条件下で培養する。1つの実施形態においては、約1〜2mmの直径および1〜2cmの長さの血管をヒト臍帯から切り出す。好ましくは、この切り出しは分娩から12〜24時間以内に行う。動脈組織および静脈組織の両方を集め、別々に維持する。該血管を培地（例えば、2.5μg/mlのフンジゾンを含有するDMEM）内に配置し、1〜2mmの長さの断片に切断する。好ましくは、使用前に血管断片から残存血餅を除去し、該血管断片を培地に浸ける。血管の解剖および切断は、手術用顕微鏡を使用すれば最も都合良く行われる。細静脈または動脈由来の血管を使用することも可能である。好ましくは、各実験について、ただ1つの血管からの血管断片を使用する。
【００６２】
血管成長アッセイはペトリ皿またはマルチウェル培養プレート（Costar, Cambridge, Mass.）内で行う。該培養皿は、好ましくは、0.1％ ゼラチン（Sigma, St. Louis, MO）またはマトリゲル（Matrigel）で予めコーティングすることにより調製する。コーティング後、該培養皿を培地でコーティングする。本発明の典型的な実施例として、プレートのコーティング後、5mLのDMEM中の50μlのヒト臍帯血漿を各皿／ウェルに加えて該マトリックス上に表面膜を形成させる。該膜を37℃で90分間硬化させ、ついでそれを除去すると各皿／ウェル内に薄膜が残る。培養皿の調製が完了したら、血管輪断片を該培養皿内に配置する。
【００６３】
血管輪断片は一般には12時間以内にマトリックス材に付着して、浮力による血管断片の脱離を伴うことなく培地の添加を可能にする。付着後、血管を湿潤環境中、37℃で7〜21日間培養する。好ましくは、培地を一定の間隔（例えば、72時間間隔）で交換する。典型的な培養条件は、20％ ヒト臍帯血漿、L-グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびヘパリンで補足されたDMEM内での培養の維持を含む。好ましくは、培地を更に、ヒドロコルチゾン、上皮増殖因子および／またはウシ脳抽出物で補足する。好ましい実施形態においては、物質の投与の前（例えば、投与の14日前）に、良好な血管新生応答を確立するのに十分な時間にわたり血管断片を培養する。好ましくは、ついでこの応答の度合を定量し記録する。
【００６４】
血管新生のモジュレーションを判定するために、培養中に試験化合物を投与する。試験化合物は、培地の交換時に投与することが可能であり、あるいは培養中の任意の時点で別個に加えることが可能である。好ましくは、試験化合物は、幹細胞または血管輪が付着したら加え、培養を十分に7〜21日間継続する。しかし、試験化合物は他の時点で加えることも可能である。例えば、血管を培地内で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10日以上成長させ、ついで試験化合物の1回の投与を行う。用量反応分析の実施を可能にするために、各試験化合物を種々の濃度で評価する。陽性対照は、例えば内皮細胞増殖補足物質（ECGS; 200μg/ml; Collaborative Research, Bedford, MA）に対する応答（例えば、微小血管の成長）と定義されうる。陰性対照は、例えば培地のみに対する応答と定義されうる。血管の成長は、後記の表において示されるとおり陽性対照および陰性対照に対する定量的比較として、また、血管輪からのミクロン単位の血管出芽成長の最大距離および内皮細胞被覆の総面積（ECA）／血管輪の面積（VRA）の両方として形態計測学的に評価されうる。
【００６５】
本発明のスクリーニングアッセイの更にもう1つの実施形態においては、臍帯動脈から得たヒト臍帯血管輪の小断片をマトリゲル（MATRIGEL（登録商標））+ ヒトコラーゲンのような溶液中に包埋し、最適化培地（好ましくは、増殖因子を含有する血清非含有培地）内で培養する。臍帯血管輪は、1〜4週間、最適には3週間、あるいは該輪から微小管が発生する時間まで培養することが可能である。血管新生を試験化合物が抑制または増強する能力の指標として、微小管の成長を試験化合物が抑制または増強する能力に関して試験化合物をアッセイすることができる。
【００６６】
前記の2つの方法を組合せた場合には、血管輪を入手し、前記のとおりにプレーティングし、同様に前記のとおりに入手した幹細胞の存在下で培養する。血管輪および幹細胞を7〜21日間共培養し、その時点で血管の成長の度合を判定する。この場合、内皮細胞および他の細胞の増殖を可能にする任意の培地を使用することができる。幹細胞の添加は、血管の発生を促進する細胞型へのこれらの細胞の分化をもたらして、血管の天然環境を、他のアッセイ法より厳密に再現すると予想される。前記のとおり、試験化合物および／または対照化合物は、培養の開始時または培養中の任意の時点に培地に加えることができる。
【００６７】
したがって、1つの実施形態においては、本発明は、物質が新たな血管組織の成長をモジュレーション（すなわち、抑制または刺激）する及び／又は新たな血管組織の退縮を誘発する能力を判定するための方法であって、血管断片、生理的ゲルおよび適当な栄養素と共に、非胚性多分化能性幹細胞を、新たな血管組織の成長を可能にするのに十分な時間にわたり培養し、該物質を該断片に加え、適当な栄養素と共に該断片を或る時間にわたり培養し、ついで該断片を検査して、新たな血管組織の成長の抑制および／または新たな血管組織の退縮が生じたかどうかを判定することを含んでなる方法を提供する。
【００６８】
もう1つの実施形態においては、該幹細胞または血管輪を腫瘍細胞、特に、転移癌に由来する細胞と共に共培養することができる。多数の転移性または侵襲性癌は血管新生成分を有する（すなわち、該腫瘍は、血管新生を促進する因子を分泌する）ため、そのような共培養は腫瘍の天然環境を再現するであろう。そのような共培養において使用する腫瘍細胞は、個体から直接得た腫瘍細胞、個体から得、保存した細胞、または当業者に公知の多数の不死化腫瘍細胞系のいずれかでありうる。そのような腫瘍細胞系には、例えば、HTB-104またはCRL-1973細胞（American Type Culture Collectionから入手可能な精巣腫瘍細胞）、あるいはBT483、Hs578T、HTB2、BT20またはT47D細胞（乳癌細胞系）が含まれる。当業者に公知の他の癌細胞系も使用することが可能である。
【００６９】
血管輪および／または幹細胞もしくは腫瘍細胞を培養する際のそれらの下層のマトリックスの性質は、血管新生がうまく達成されるために重要である。したがって、本発明の好ましい実施形態は、成長マトリックスを得るために生理的ゲルで調製されたプレートまたは皿上でこれらの組織および細胞を培養することである。好ましくは、この成長マトリックスは非変性ヒトコラーゲンを含む。もう1つの実施形態においては、該生理的ゲルはフィブリン、コラーゲンまたはマトリゲル（登録商標）である。より好ましくは、該ゲルはフィブリンである。
【００７０】
血管新生モジュレーション活性を有すると疑われる任意の物質または物質の組合せをこの方法によりスクリーニングすることが可能である。これは植物または動物の組織抽出物のような種々の抽出物および化合物の精製調製物を含み、あるいは微生物由来でありうる。したがって、そのような物質は非胚性多分化能性幹細胞への添加のための適当な形態にされる必要があるかもしれない。そのような物質を、添加のための適当な形態にするための種々の方法が当業者によく知られている。
【００７１】
もう1つの好ましい実施形態においては、血管新生の増強に関して化合物を試験するために該方法を使用する場合には、該培地は血清を実質的に含有せず、したがって全血清を含まず、該培地は血清構成成分を含有せず、また、血清または血管新生に必要な他の起源からの最低限の構成成分も含有しない。
【００７２】
もう1つの好ましい実施形態においては、該物質を添加した後、新たな血管の成長の明らかな抑制および／または退縮を可能にするのに十分な時間（例えば、該物質の添加後7〜14日間）にわたり非胚性多分化能性幹細胞を培養する。ついで新たな血管の成長の状態を、記録されている応答、好ましくは対照と比較する。
【００７３】
5.1.2  血管新生の特徴づけ
本発明においては、当技術分野における標準的な技術（例えば、免疫細胞化学）を用いて、細胞表面マーカーの同定により血管新生を測定することが可能である。本発明のこの態様においては、検出可能な血管新生応答（すなわち、新たな血管の成長）を示すサンプルを、免疫細胞化学的技術を用いてアッセイすることが可能である。使用しうる抗体の具体例には、モノクローナルマウス抗ヒト因子VIII関連抗原（Dako, Denmark）、抗ヒト内皮細胞mAb（Gibco, Grand Island, N. Y.）およびCD31特異的mAb（クローン20G5）（John Curtin School of Medical Researchにおいて製造されたもの）が含まれる。因子VIII関連抗原を検出するためには、血管新生サンプルの免疫組織化学的染色を行うことが可能であり、これは、該成長物が血管であることを明らかに示す反応である。また、血管は、ヒト内皮細胞に特異的なmAb（Gibco）と、および内皮細胞、血小板および幾つかの白血球上のみで発現される抗原であるCD31に対するmAbと反応した。また、典型的な内皮形態学的特徴を有する細胞を示すために、電子顕微鏡下での血管新生サンプルの検査を行うことが可能である。
【００７４】
7〜21日間の培養の後、血管新生を定量し、対照培養と比較する。推定抗血管新生物質の場合には、対照培養と比較して血管の成長の軽減を判定することになる。本発明はまた、確立された血管新生応答（すなわち、7〜21日の培養の後）に試験物質を加え、次の7〜14日間にわたり血管の「枯死（die-back）」を顕微鏡でモニターすることにより、最近形成された血管の退縮を試験物質が誘発する能力に関して試験物質をアッセイすることを含む。
【００７５】
ある実施形態においては、差次的に発現された遺伝子を特徴づける（例えば、関心のある未分化前駆細胞からの遺伝子のプールを、該前駆細胞から誘導された分化細胞からの遺伝子のプールと比較して特徴づける）ことにより血管新生を同定することができる。例えば、核酸増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または転写に基づく増幅方法（例えば、in vitro転写（IVT））を用いて、例えばポリヌクレオチドマイクロアレイを使用して異なる細胞集団における遺伝子発現を特徴づけることが可能である。差次的遺伝子発現を特徴づけるためのそのような方法は当技術分野でよく知られている（例えば、Wielandら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2720-2724; Lisitsynら, 1993, Science 259:946-951; Lisitsynら, 1995, Meth. Enzymology 254:291-304; 米国特許第5,436,142号; 米国特許第5,501,964号; Lisitsynら, 1994, Nature Genetics 6:57-63; HubankおよびSchatz, 1994, Nucleic Acids Research 22:5640-5648; Zengら, 1994, Nucleic Acids Research 22:4381-4385; 米国特許第5,525,471号; Linsleyら, 米国特許第6,271,002号, 発明の名称“RNA amplification method”, 2001年8月7日付け発行; Van Gelderら, 米国特許第5,716,785号, 発明の名称“Processes for genetic manipulations using promoters”, 1998年2月10日付け発行; Stofletら, 1988, Science 239:491-494,1988; SarkarおよびSommer, 1989, Science 244:331-334; Mullisら, 米国特許第4,683,195号; Malekら, 米国特許第5,130,238号; KacianおよびFultz, 米国特許第5,399,491号; Burgら, 米国特許第5,437,990号; Van Gelderら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1663; Lockhartら, 1996, Nature Biotechnol. 14, 1675; Shannon, 米国特許第6,132,997号; Lindemannら, 米国特許第6,235,503号, 発明の名称“Procedure for subtractive hybridization and difference analysis”, 2001年5月22日付け発行を参照されたい）。
【００７６】
商業的に入手可能なキット、例えば、displayPROFILETMシリーズのキット（Qbiogene, Carlsbad, CA；これは、遺伝子発現の特徴づけのために、ゲルに基づくアプローチを用いる）が遺伝子の特徴づけに利用可能である。該キットは、真核細胞における遺伝子発現パターンを比較するために、制限断片ディファレンシャルディスプレイ（Restriction Fragment Differential Display）-PCR（RFDD-PCR）を用いる。PCR-Select Subtraction Kit（Clontech）およびPCR-Select Differential Screening Kit（Clontech）も使用可能であり、これは、サブトラクテッドライブラリーにおいて、差次的に発現されるクローンの同定を可能にする。PCR-Select Subtractionキットで差次的発現遺伝子のプールを作製した後、PCR-Select Differential Screeningキットを使用する。該サブトラクテッドライブラリーを、テスター（tester）およびドライバー（driver）集団から直接合成されたプローブ、すなわち、サブトラクテッドcDNAから作製されたプローブおよび逆サブトラクテッドcDNAから作製されたプローブ（第2サブトラクションは逆方向に行う）でハイブリダイズさせる。テスタープローブにはハイブリダイズするがドライバープローブにはハイブリダイズしないクローンが差次的に発現される。しかし、非サブトラクテッドプローブは、稀少メッセージを検出するのに十分なほどには高感度ではない。サブトラクテッドプローブは差次的発現cDNAに関して著しく濃縮されるが、偽陽性結果を与えうる。サブトラクテッドプローブおよび非サブトラクテッドプローブの両方を製造業者（Clontech）の説明に従い使用することにより、差次的発現遺伝子が同定される。
【００７７】
5.2  本発明の化合物
血管新生のモジュレーションに関してスクリーニングされうる試験化合物の具体例には、小分子、有機化合物、無機化合物、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、核酸または他の高分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
本明細書中で用いる「化合物」なる語は、任意の分子、例えば、タンパク質または非タンパク質の有機薬物を意味する。一般には、濃度によって異なる応答を得るために、種々の化合物濃度の複数のアッセイ混合物を平行して使用する。典型的には、陰性対照として、これらの濃度の1つ（すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満）を用いる。
【００７９】
候補化合物は多数の化合物クラスを含むが、典型的には、それらは有機分子、好ましくは、50ダルトンを超え約2,500ダルトン未満の分子量を有する小さな有機化合物である。候補化合物は、タンパク質との構造上の相互作用（特に水素結合）に必要な官能基を含み、典型的には、少なくとも1つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは、該官能化学基の少なくとも2つを含む。候補化合物は、しばしば、前記官能基の1以上で置換された複素環構造および／または芳香族もしくはポリ芳香族構造上に環状炭素を含む。候補化合物は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せを含む（これらに限定されるものではない）生体分子のなかにも見出される。
【００８０】
候補調節性化合物は、合成または天然化合物のライブラリーを含む多種多様な起源から得られる。例えば、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムな及び一定の合成のための多数の手段が利用可能であり、それらには、ランダムなオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現が含まれる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが入手可能であるか、または容易に製造される。また、天然の又は合成的に製造されたライブラリーおよび化合物が通常の化学的、物理的および生化学的手段により容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを得るために使用されうる。公知の薬理学的物質を一定の又はランダムな化学修飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などに付して構造類似体を得ることが可能である。論理的ドラッグデザインまたはコンピューターモデリングのような方法を用いて、新規の潜在的治療剤を創製することが可能である。スクリーニングは、公知の薬理学的に活性な化合物およびその化学的類似体、または論理的ドラッグデザインにより創製されたような未知特性を有する新規化合物に対して行うことができる。
【００８１】
5.2.1  TNF-αインヒビター
本明細書に開示されているアッセイ方法を用いて、1つの化合物クラスのメンバーが、血管新生および／または血管発生をモジュレーションするものとして同定された。より詳しくは、これらの化合物は抗血管新生化合物であり、より詳しくは、これらの化合物にはIMiDsTM（Celgene Corporation）が含まれる。特に示さない限り、本明細書で用いる「抗血管新生化合物」または本明細書中で用いる「IMiDsTM」なる語は、TNF-αを顕著に抑制し抗血管新生活性を有する小さな有機分子（すなわち、それらは、新たな血管の形成を抑制するように作用する）を包含する。特に、本発明の抗血管新生化合物はTNF-α mRNAの分解を増強する。このクラスには、これらの抗血管新生化合物のラセミ性の、立体的に富化された又は立体的に純粋な及び医薬上許容される塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、包接化合物およびプロドラッグが含まれる。本発明において使用する好ましい化合物は、約1000g/mol未満の分子量を有する小さな有機分子であり、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖または他の高分子ではない。本発明の具体的な化合物については後記で説明する。これらの化合物はCelgene（Warren, NJ）から商業的に入手可能であるか、あるいは本明細書中に挙げられている特許または刊行物に記載の方法に従い製造することができる。
【００８２】
本発明の抗血管新生化合物の具体例には、例えば米国特許第5,929,117号に開示されているような置換スチレンのシアノおよびカルボキシ誘導体；例えば米国特許第5,874,448号に記載されているような1-オキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3イル)イソインドリンおよび1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3-イル)イソインドリン；米国特許第5,798,368号に記載のテトラ置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1-オキソイソインドリン；1-オキソおよび1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドリン（例えば、サリドマイドおよびEM-12の4-メチル誘導体）、例えば米国特許第5,635,517号に開示されているもの（これらに限定されるものではない）；ならびに米国特許第5,698,579号および第5,877,200号に開示されている非ポリペプチド環状アミドのクラスが含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書中に示す各特許の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。しかし、本発明の抗血管新生化合物にはサリドマイドは含まれない。
【００８３】
本発明の他の具体的な抗血管新生化合物には、本明細書に組み入れる米国特許第5,635,517号に記載されているとおりベンゾ環においてアミノまたは置換アミノで置換された1-オキソ-および1,3 ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドリンが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの化合物は構造I：
【化１】
2005536189.tif 000002
【００８４】
（式中、XおよびYのうちの一方はC=Oであり、XおよびYのもう一方はC=OまたはCH2であり、R2は水素または低級アルキル、特にメチルである）を有する。具体的な抗血管新生化合物には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-4-アミノイソインドリン；
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-5-アミノイソインドリン；
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-6-アミノイソインドリン；
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-7-アミノイソインドリン；
1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-4-アミノイソインドリン；
および1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-5-アミノイソインドリン。
【００８５】
本発明の他の具体的な抗血管新生化合物は、例えば米国特許第6,281,230号、第6,316,471号、6,335,349号および第6,476,052号ならびに国際特許出願番号PCT/US97/13375（国際公開番号WO 98/03502）（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているような置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)フタルイミドおよび置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1-オキソイソインドールのクラスに属する。このクラスの代表的化合物は式：
【化２】
2005536189.tif 000003
【００８６】
（式中、R1は水素またはメチルである）の化合物である。別の実施形態においては、本発明は、これらの化合物のエナンチオ的に純粋な形態（例えば、光学的に純粋な（R）または（S）エナンチオマー）の使用を包含する。
【００８７】
本発明の更に他の具体的な抗血管新生化合物は、米国特許出願第10/032,286号および第09/972,487号ならびに国際出願番号PCT/US01/50401（国際公開番号WO 02/059106）（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているイソインドール-イミドクラスに属する。代表的化合物は式II：
【化３】
2005536189.tif 000004
【００８８】
の化合物ならびにその医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、包接化合物、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体および立体異性体の混合物であり、ここで、
XおよびYのうちの一方はC=Oであり、もう一方はCH2またはC=Oである；
R1はH、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(CO-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(CO-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、C(O)R3、C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3'、C(S)NR3R3'または(C1-C8)アルキル-O(CO)R5である；
R2はH、F、ベンジル、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニルまたは(C2-C8)アルキニルである；
R3およびR3'は、独立して、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(CO-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(CO-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、(C0-C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、(C1-C8)アルキル-O(CO)R5またはC(O)OR5である；
R4は(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、(C1-C4)アルキル-OR5、ベンジル、アリール、(CO-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキルまたは(CO-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリールである；
R5は(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリールまたは(C2-C5)ヘテロアリールである；
R6のそれぞれは、独立して、H、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C2-C5)ヘテロアリールまたは(C0-C8)アルキル-C(O)O-R5であるか、または複数のR6基が一緒になってヘテロシクロアルキル基を形成しうる；
nは0または1である；および
*はキラル炭素中心を表す。
【００８９】
nが0式IIの特定の化合物においては、nが0である場合、R1は(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(CO-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(CO-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、C(O)R3、C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、C(S)NHR3または(C1-C8)アルキル-O(CO)R5である；
R2はHまたは(C1-C8)アルキルである；および
R3は(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(CO-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(CO-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、(C5-C8)アルキル-N(R6)2、(C0-C8)アルキル-NH-C(O)OR5、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、(C1-C8)アルキル-O(CO)R5またはC(O)OR5である；その他の基は前記と同意義を有する。
【００９０】
式IIの他の特定の化合物においては、R2はHまたは(C1-C4)アルキルである。
【００９１】
式IIの他の特定の化合物においては、R1は(C1-C8)アルキルまたはベンジルである。
【００９２】
式IIの他の特定の化合物においては、R1はH、(C1-C8)アルキル、ベンジル、CH2OCH3、CH2CH2OCH3または
【化４】
2005536189.tif 000005
【００９３】
である。
【００９４】
式IIの化合物のもう1つの実施形態においては、R1は
【化５】
2005536189.tif 000006
【００９５】
［式中、QはOまたはSであり、R7のそれぞれは、独立して、H、(C1-C8)アルキル、ベンジル、CH2OCH3、CH2CH2OCH3である］である。
【００９６】
式IIの他の特定の化合物においては、R1はC(O)R3である。  
式IIの他の特定の化合物においては、R3は(CO-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、(C1-C8)アルキル、アリールまたは(C0-C4)アルキル-OR5である。  
式IIの他の特定の化合物においては、ヘテロアリールはピリジル、フリルまたはチエニルである。  
式IIの他の特定の化合物においては、R1はC(O)OR4である。  
式IIの他の特定の化合物においては、C(O)NHC(O)のHは(C1-C4)アルキル、アリールまたはベンジルで置換されうる。
【００９７】
本発明の更に他の特定の抗血管新生化合物は、米国特許出願第09/781,179号、国際公開番号WO 98/54170および米国特許第6,395,754号（それらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているイソインドール-イミドのクラスに属する。代表的な化合物は式III：
【化６】
2005536189.tif 000007
【００９８】
の化合物ならびにその医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、包接化合物、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体および立体異性体の混合物であり、ここで、
XおよびYのうちの一方はC=Oであり、もう一方はCH2またはC=Oである；
RはHまたはCH2OCOR'である；
（i）R1、R2、R3またはR4のそれぞれは、互いに独立して、ハロ、炭素数1〜4のアルキル、または炭素数1〜4のアルコキシ、あるいは（ii）R1、R2、R3またはR4のうちの1つはニトロまたは-NHR5であり、R1、R2、R3またはR4のうちの残りのものは水素である；
R5は水素または炭素数1〜8のアルキルである；
R6は水素、炭素数1〜8のアルキル、ベンゾ、クロロまたはフルオロである；
R'はR7-CHR10-N(R8R9)である；
R7はm-フェニレンまたはp-フェニレンまたは-(CnH2n)-（ここで、nは0〜4の値を有する）である；
R8およびR9のそれぞれは、他方から独立して、水素、または炭素数1〜8のアルキルであるか、あるいはR8とR9とが一緒になってテトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレンまたは-CH2CH2[X]X1CH2CH2-（ここで、[X]X1は-O-、S-または-NH-である）である；
R10は水素、炭素数8のアルキルまたはフェニルである；および
*はキラル炭素中心を表す。
【００９９】
本発明のもっとも好ましい抗血管新生化合物は4-(アミノ)-2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-イソインドリン-1,3-ジオンおよび3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオンである。該化合物は標準的な合成方法により得ることができる（例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,635,517号を参照されたい）。サリドマイドのようなこれらの或る化合物は商業的に入手可能であろう（例えば、ThalomidTM、ActimidTMおよびRevimidTM(Celgene, Inc., Warren, New Jersey)）。4-(アミノ)-2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-イソインドリン-1,3-ジオン（ACTIMIDTM）は以下の化学構造を有する。
【化７】
2005536189.tif 000008
【０１００】
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオン（REVIMIDTM）は以下の化学構造を有する。
【化８】
2005536189.tif 000009
【０１０１】
他の前記化合物は、前記の特許（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているものを含む当技術分野で公知の方法により製造することができる。
【０１０２】
明らかに、本発明の最も好ましい化合物はサリドマイド、アミノサリドマイドおよび3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオンである。
【０１０３】
本発明の化合物は、TNF-αの産生をそれがモジュレーションする能力に関して、当技術分野でよく知られた方法（例えば、2003年3月6日付け公開のRobargeら, 米国特許出願公開第2003045552号, 発明の名称“Isoindole-Imide Compounds, Compositions, And Uses Thereof”（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているアッセイ）を用いてアッセイされうる。
【０１０４】
特に示さない限り、本明細書中で用いる「立体的に純粋」なる語は、化合物の立体異性体の1つを含みその化合物の他の立体異性体を実質的に含有しない組成物を意味する。例えば、1個のキラル中心を有する化合物の立体的に純粋な組成物は該化合物の反対のエナンチオマーを実質的に含有しない。2個のキラル中心を有する化合物の立体的に純粋な組成物は該化合物の他のジアステレオマーを実質的に含有しない。特に示さない限り、本明細書中で用いる「エナンチオ的に純粋」なる語は、1個のキラル中心を有する化合物の立体的に純粋な組成物を意味する。特に示さない限り、本明細書中で用いる「立体的に富化された」なる語は、化合物の立体異性体の1つを約60重量％以上、好ましくは約70重量％以上、より好ましくは、化合物の立体異性体の1つを約80重量％以上含む組成物を意味する。本明細書中で用いる「エナンチオ的に純粋」なる語は、1個のキラル中心を有する化合物の立体的に純粋な組成物を意味する。同様に、「エナンチオ的に富化された」なる語は、1個のキラル中心を有する化合物の立体的に富化された組成物を意味する。
【０１０５】
5.2.2  PDE IVインヒビター
抗血管新生活性を有すると予想される化合物のもう1つのクラスはPDE IVインヒビターと称される。PDE IVインヒビターは、IMiDsと同様に、TNF-α抑制活性を有する。本発明において使用する好ましい化合物は、Celgene Corporationの公知選択的サイトカイン抑制薬（Selective Cytokine Inhibitory Drugs）（SelCIDsTM）である。この化合物クラスのメンバーは血管新生調節活性に関しても試験されうる。
【０１０６】
本明細書においては、特に示さない限り、本発明で使用する「SelCIDsTM」なる語は、例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、オリゴ糖または他の高分子ではない小さな有機分子のような小分子薬物を包含する。好ましい化合物はTNF-αの産生を抑制する。さらに、該化合物は、LPSにより誘導されるIL1βおよびIL12に対して適度な抑制効果を与えうる。
【０１０７】
より好ましくは、本発明の化合物は強力なPDE IVインヒビターである。PDE IVは、ヒト骨髄様およびリンパ様系列細胞において見出される主要なホスホジエステラーゼ イソ酵素の1つである。該酵素は、遍在性セカンドメッセンジャーcAMPの分解および低細胞内レベルでのその維持による細胞活性の調節において非常に重要な役割を果たしている。
【０１０８】
選択的サイトカイン抑制性薬の具体例には、米国特許第5,605,914号に開示されている環状イミド、それぞれ米国特許第5,728,844号および第5,728,845号のシクロアルキルアミドおよびシクロアルキルニトリル、米国特許第5,801,195号および第5,736,570号のアリールアミド（例えば、N-ベンゾイル-3-アミノ-3-(3',4'-ジメトキシフェニル)-プロパンアミドの実施形態）、米国特許第5,703,098号に開示されているイミド／アミドエーテルおよびアルコール（例えば、3-フタルイミド-3-(3',4'-ジメトキシフェニル)プロパン-1-オール）、米国特許第5,658,940号に開示されているスクシンイミドおよびマレイミド（例えば、メチル 3-(3',4',5'6'-ペトラヒドロフタルイミド)-3-(3",4"-ジメトキシフェニル)プロピオナート）、WO 99/06041に開示されているイミドおよびアミド置換アルカノヒドロキサム酸ならびに米国特許第6,020,358号に開示されている置換フェネチルスルホン、ならびに米国特許第6,046,221号に記載のN-ベンゾイル-3-アミノ-3-(3',4'-ジメトキシフェニル)プロパンアミドのようなアリールアミドが含まれるが、これらに限定されるものではない。ここに示した特許および特許出願のそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【０１０９】
さらなる選択的サイトカイン抑制薬は、3-(1,3-ジオキソベンゾ-[f]イソインドール-2-イル)-3-(3-シクロペンチルオキシ-4-メトキシフェニル)プロピオンアミドおよび3-(1,3-ジオキソ-4-アザイソインドール-2-イル)-3-(3,4-ジメトキシフェニル)-プロピオンアミドを典型的な実施形態として含む合成化合物のファミリーに属する。
【０１１０】
他の具体的な選択的サイトカイン抑制薬は、米国特許第5,698,579号および第5,877,200号（それらを共に本明細書に組み入れることとする）に開示されている非ポリペプチド環状アミドのクラスに属する。代表的な環状アミドには式：
【化９】
2005536189.tif 000010
【０１１１】
の化合物が含まれ、ここで、nは1、2または3の値を有する；
R5は、非置換のo-フェニレンであるか、またはそれぞれ独立して、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボエトキシ、カルボメトキシ、カルボプロポキシ、アセチル、カルバモイル、アセトキシ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、炭素数1〜10のアルキル、炭素数1〜10のアルキルおよびハロよりなる群から選ばれる1〜4個の置換基で置換されたo-フェニレンである；
R7は（i）フェニル、またはそれぞれ互いに独立して、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボエトキシ、カルボメトキシ、カルボプロポキシ、アセチル、カルバモイル、アセトキシ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、炭素数1〜10のアルキル、炭素数1〜10のアルコキシおよびハロよりなる群から選ばれる1以上の置換基で置換されたフェニル、（ii）非置換の、またはニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボエトキシ、カルボメトキシ、カルボプロポキシ、アセチル、カルバモイル、アセトキシ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、炭素数1〜10のアルキル、炭素数1〜10のアルコキシおよびハロよりなる群から選ばれる1〜3個の置換基で置換されたベンジル、（iii）ナフチル、ならびに（iv）ベンジルオキシである；
R12は-OH、炭素数1〜12のアルコキシ、または
【化１０】
2005536189.tif 000011
【０１１２】
である；
R8は水素、または炭素数1〜10のアルキルである；
R9は水素、炭素数1〜10のアルキル、-COR10または-SO2R10（ここで、R10は水素、炭素数1〜10のアルキル、またはフェニルである）である。
【０１１３】
このクラスの具体的な化合物には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：
3-フェニル-2-(1-オキソイソインドリン-2-イル)プロピオン酸、
3-フェニル-2-(1-オキソイソインドリン-2-イル)プロピオンアミド、
3-フェニル-3-(1-オキソイソインドリン-2-イル)プロピオン酸、
3-フェニル-3-(1-オキソイソインドリン-2-イル)プロピオンアミド、
3-(4-メトキシフェニル)-3-(1-オキシイソインドリン-イル)プロピオン酸、
3-(4-メトキシフェニル)-3-(l-オキシイソインドリン-イル)プロピオンアミド、
3-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-(1-オキシイソインドリン-2-イル)プロピオン酸、
3-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-(l-オキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル)-プロピオンアミド、
3-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-(1-オキシイソインドリン-2-イル)プロピオンアミド、
3-(3,4-ジエトキシフェニル)-3-(1-オキソイソインドリニル)プロピオン酸、
メチル 3-(1-オキソイソインドリン-2-イル)-3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)プロピオナート、
3-(1-オキソイソインドリン-2-イル)-3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)プロピオン酸、
3-(1-オキソイソインドリン-2-イル)-3-(3-プロポキシ-4-メトキシフェニル)プロピオン酸、
3-(1-オキソイソインドリン-2-イル)-3-(3-ブトキシ-4-メトキシフェニル)プロピオン酸、
3-(1-オキソイソインドリン-2-イル)-3-(3-プロポキシ-4-メトキシフェニル)プロピオンアミド、
3-(1-オキソイソインドリン-2-イル)-3-(3-ブトキシ-4-メトキシフェニル)プロピオンアミド、
メチル 3-(1-オキソイソインドリン-2-イル)-3-(3-ブトキシ-4-メトキシフェニル)プロピオナート、および
メチル 3-(1-オキソイソインドリン-2-イル)-3-(3-プロポキシ-4-メトキシフェニル)プロピオナート。
【０１１４】
他の具体的な選択的サイトカイン抑制薬には、参照により本明細書に組み入れるWO 99/06041に開示されているイミドおよびアミド置換アルカノヒドロキサム酸が含まれる。そのような化合物の具体例には、
【化１１】
2005536189.tif 000012
【０１１５】
および、プロトン化されうる窒素原子を含有する該化合物の酸付加塩が含まれ（ただし、これらに限定されるものではない）、ここで、R1およびR2のそれぞれは、互いに独立して、水素、低級アルキルであるか、またはR1およびR2は、それらの各々が結合している図示されている炭素原子と一緒になって、o-フェニレン、o-ナフチレンまたはシクロヘキセン-1,2-ジイル（これは、非置換であるか、またはそれぞれ独立して、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボエトキシ、カルボメトキシ、カルボプロポキシ、アセチル、カルバモイル、アセトキシ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、炭素数1〜10のアルキル、炭素数1〜10のアルコキシおよびハロよりなる群から選ばれる1〜4個の置換基で置換されている）を形成している；
R3は、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボエトキシ、カルボメトキシ、カルボプロポキシ、アセチル、カルバモイル、アセトキシ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、炭素数1〜10のアルキル、炭素数1〜10のアルコキシ、炭素数1〜10のアルキルチオ、ベンジルオキシ、炭素数3〜6のシクロアルコキシ、C4-C6-シクロアルキリデンメチル、C3-C10-アルキリデンメチル、インダニルオキシおよびハロよりなる群から選ばれる1〜4個の置換基で置換されたフェニルである；
R4は水素、炭素数1〜6のアルキル、フェニルまたはベンジルである；
R4'は水素、または炭素数1〜6のアルキルである；
R5は-CH2-、-CH2-CO-、-SO2-、S-、または-NHCO-である；
nは0、1または2の値を有する。
【０１１６】
本発明で使用する更なる具体的な選択的サイトカイン抑制薬には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：
3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-N-ヒドロキシ-3-(1-オキソイソインドリニル)プロピオンアミド、
3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-N-メトキシ-3-(1-オキソイソインドリニル)プロピオンアミド、
N-ベンジルオキシ-3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-3-フタルイミドプロピオンアミド、
N-ベンジルオキシ-3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-3-(3-ニトロフタルイミド)プロピオンアミド、
N-ベンジルオキシ-3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-3-(1-オキソイソインドリニル)プロピオンアミド、
3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-N-ヒドロキシ-3-フタルイミドプロピオンアミド、
N-ヒドロキシ-3-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-フタルイミドプロピオンアミド、
3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-N-ヒドロキシ-3-(3-ニトロフタルイミド)プロピオンアミド、
N-ヒドロキシ-3-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-(1-オキソイソインドリニル)プロピオンアミド、
3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-N-ヒドロキシ-3-(4-メチル-フタルイミド)プロピオンアミド、
3-(3-シクロペンチルオキシ-4-メトキシフェニル)-N-ヒドロキシ-3-フタルイミドプロピオンアミド、
3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-N-ヒドロキシ-3-(1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[f]イソインドール-2-イル)プロピオンアミド、
N-ヒドロキシ-3-{3-(2-プロポキシ)-4-メトキシフェニル}-3-フタルイミドプロピオンアミド、
3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-3-(3,6-ジフルオロフタルイミド)-N-ヒドロキシプロピオンアミド、
3-(4-アミノフタルイミド)-3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-N-ヒドロキシプロピオンアミド、
3-(3-アミノフタルイミド)-3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-N-ヒドロキシプロピオンアミド、
N-ヒドロキシ-3-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-(1-オキソイソインドリニル)プロピオンアミド、
3-(3-シクロペンチルオキシ-4-メトキシフェニル)-N-ヒドロキシ-3-(1-オキソイソインドリニル)プロピオンアミド、および
N-ベンジルオキシ-3-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-3-(3-ニトロフタルイミド)プロピオンアミド。
【０１１７】
本発明で使用する更なる選択的サイトカイン抑制薬には、フェニル環上でオキソイソインジン基で置換された置換フェネチルスルホンが含まれる。そのような化合物の具体例には、本明細書に組み入れる米国特許第6,020,358号に開示されている化合物が含まれ（それらに限定されるものではない）、以下の化合物：
【化１２】
2005536189.tif 000013
【０１１８】
が含まれ、ここで、*で示される炭素原子はキラル中心を構成する；
YはC=O、CH2、SO2またはCH2C=Oである；R1、R2、R3およびR4のそれぞれは、互いに独立して、水素、ハロ、炭素数1〜4のアルキル、炭素数1〜4のアルコキシ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシまたは-NR8R9である；あるいは隣接炭素原子上のR1、R2、R3およびR4のうちの任意の2つが、図示されているフェニレン環と一緒になって、ナフチリデンを形成している；
R5およびR6のそれぞれは、互いに独立して、水素、炭素数1〜4のアルキル、炭素数1〜4のアルコキシ、シアノ、または炭素数18までのシクロアルコキシである；
R7はヒドロキシ、炭素数1〜8のアルキル、フェニル、ベンジルまたはNR8'R9'である；
R8およびR9のそれぞれは、互いに独立して、水素、炭素数1〜8のアルキル、フェニルまたはベンジルであるか、あるいはR8およびR9のうちの一方は水素であり、もう一方は-COR10または-SO2R10であるか、あるいはR8およびR9は一緒になって、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレンまたは-CH2CH2X1CH2CH2-（ここで、X1は-O-、-S-または-NH-である）を形成している；
R8'およびR9'のそれぞれは、互いに独立して、水素、炭素数1〜8のアルキル、フェニルまたはベンジルであるか、あるいはR8'およびR9'のうちの一方は水素であり、もう一方は-COR10'または-SO2R10'であるか、あるいはR8'およびR9'は一緒になって、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレンまたは-CH2CH2X2CH2CH2-（ここで、X2は-O-、-S-または-NH-である）を形成している。  
簡単のために前記化合物はフェネチルスルホンとして示されているが、R7がNR8'R9'である場合にはそれらはスルホンアミドを含むと理解されるであろう。
【０１１９】
そのような化合物の特定のグループとして、YがC=OまたはCH2であるものが挙げられる。  
そのような化合物のもう1つの特定のグループとして、R1、R2、R3およびR4のそれぞれが、互いに独立して、水素、ハロ、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシまたは-NR8R9（ここで、R8およびR9のそれぞれは、互いに独立して、水素またはメチルであるか、あるいはR8およびR9のうちの一方は水素であり、もう一方は-COCH3ある）であるものが挙げられる。
【０１２０】
特定の化合物としては、R1、R2、R3およびR4のうちの1つが-NH2であり、R1、R2、R3およびR4のうちの残りのものが水素である化合物が挙げられる。  
特定の化合物としては、R1、R2、R3およびR4のうちの1つが-NHCOCH3であり、R1、R2、R3およびR4のうちの残りのものが水素である化合物が挙げられる。  
特定の化合物としては、R1、R2、R3およびR4のうちの1つが-N(CH3)2であり、R1、R2、R3およびR4のうちの残りのものが水素である化合物が挙げられる。
【０１２１】
そのような化合物のもう1つの好ましいグループとしては、R1、R2、R3およびR4のうちの1つがメチルであり、R1、R2、R3およびR4のうちの残りのものが水素である化合物が挙げられる。  
特定の化合物としては、R1、R2、R3およびR4のうちの1つがフルオロであり、R1、R2、R3およびR4のうちの残りのものが水素である化合物が挙げられる。
【０１２２】
特定の化合物としては、R5およびR6のそれぞれが、互いに独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、シクロペントキシまたはシクロヘキソキシである化合物が挙げられる。  
特定の化合物としては、R5がメトキシであり、R6がモノシクロアルコキシ、ポリシクロアルコキシおよびベンゾシクロアルコキシである化合物が挙げられる。  
特定の化合物としては、R5がメトキシであり、R6がエトキシである化合物が挙げられる。
【０１２３】
特定の化合物としては、R7がヒドロキシ、メチル、エチル、フェニル、ベンジルまたはNR8'R9'（ここで、R8'およびR9'のそれぞれは、互いに独立して、水素またはメチルである）である化合物が挙げられる。  
特定の化合物としては、R7がメチル、エチル、フェニル、ベンジルまたはNR8'R9'（ここで、R8'およびR9'のそれぞれは、互いに独立して、水素またはメチルである）である化合物が挙げられる。  
特定の化合物としては、R7がメチルである化合物が挙げられる。  
特定の化合物としては、R7がNR8'R9'（ここで、R8'およびR9'のそれぞれは、互いに独立して、水素またはメチルである）である化合物が挙げられる。
【０１２４】
他の具体的な選択的サイトカイン抑制薬には、2002年12月30日付け出願のG. Mullerらの米国仮特許出願第60/436,975号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に見出されるフルオロアルコキシ-置換1,3-ジヒドロ-イソインドリル化合物が含まれる。代表的なフルオロアルコキシ-置換1,3-ジヒドロ-イソインドリル化合物には、式：
【化１３】
2005536189.tif 000014
【０１２５】
の化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、包接化合物もしくはプロドラッグが含まれ、ここで、
Yは-C(O)-、-CH2、-CH2C(O)-、-C(O)CH2-またはSO2である；
Zは-H、-C(O)R3、-(C0-1-アルキル)-SO2-(C1-4-アルキル)、-C1-8-アルキル、-CH20H、CH2(O)(C1-8-アルキル)または-CNである；
R1およびR2は、それぞれ独立して、-CHF2、-C1-8-アルキル、-C3-18-シクロアルキルまたは-(C1-10-アルキル)(C3-18-シクロアルキル)であり、R1およびR2のうちの少なくとも1つは-CHF2である；
R3は-NR4R5、-アルキル、OH、-O-アルキル、フェニル、ベンジル、置換フェニルまたは置換ベンジルである；
R4およびR5は、それぞれ独立して、-H、-C1-8-アルキル、-OH、-OC(O)R6である；
R6は-C1-8-アルキル、-アミノ(C1-8-アルキル)、-フェニル、-ベンジルまたは-アリールである；
X1、X2、X3およびX4は、それぞれ独立して、-H、ハロゲン、-ニトロ、-NH2、-CF3、-C1-6-アルキル、-(C0-4-アルキル)-(C3-6-シクロアルキル)、(C0-4-アルキル)-NR7R8、(C0-4-アルキル)-N(H)C(O)-(R8)、(C0-4-アルキル)-N(H)C(O)N(R7R8)、(C0-4-アルキル)-N(H)C(O)O(R7R8)、(C0-4-アルキル)-OR8、(C0-4-アルキル)-イミダゾリル、(C0-4-アルキル)-ピロリル、(C0-4-アルキル)-オキサジアゾリルまたは(C0-4-アルキル)-トリアゾリルであるか、あるいはX1、X2、X3およびX4のうちの2つが互いに結合してシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環を形成しうる（例えば、X1およびX2、X2およびX3、X3およびX4、X1およびX3、X2およびX4、またはX1およびX4が、芳香族環でありうる3、4、5、6または7員環を形成して、イソインドリル環を有する二環系を形成しうる）；
R7およびR8は、それぞれ独立して、H、C1-9-アルキル、C3-6-シクロアルキル、(C1-6-アルキル)-(C3-6-シクロアルキル)、(C1-6-アルキル)-N(R7R8)、(C1-6-アルキル)-OR8、フェニル、ベンジルまたはアリールである。
【０１２６】
好ましい化合物には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：
3-(4-アセチルアミノ-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(3-シクロプロピルメトキシ-4-ジフルオロメトキシフェニル)-プロピオン酸、
3-(4-アセチルアミノ-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(3-シクロプロピルメトキシ-4-ジフルオロメトキシフェニル)-N,N-ジメチル-プロピオンアミド、
3-(4-アセチルアミノ-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(3 シクロプロピルメトキシ-4-ジフルオロメトキシフェニル)-プロピオンアミド、
3-(3-シクロプロピルメトキシ-4-ジフルオロメトキシフェニル)-3-(1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-プロピオン酸、
3-(3-シクロプロピルメトキシ-4-ジフルオロメトキシフェニル)-3-(1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-N-ヒドロキシ-プロピオンアミド、
3-(3-シクロプロピルメトキシ-4-ジフルオロメトキシフェニル)-3-(7-ニトロ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-プロピオン酸 メチルエステル、
3-(3-シクロプロピルメトキシ-4-ジフルオロメトキシフェニル)-3-(7-ニトロ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-プロピオン酸、
3-(3-シクロプロピルメトキシ-4-ジフルオロメトキシフェニル-3-(7-ニトロ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-)-N,N-ジメチル-プロピオンアミド、
3-(7-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(3-シクロプロピルメトキシ-4-ジフルオロメトキシフェニル)-N,N-ジメチル-プロピオンアミド、
3-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-3-(7-ニトロ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-プロピオン酸 メチルエステル、
3-(7-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-プロピオン酸 メチルエステル、
3-[7-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル]-3-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-プロピオン酸 メチルエステル、
3-(7-アセチルアミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-プロピオン酸 メチルエステル、
3-(7-アセチルアミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-プロピオン酸、
3-[7-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル]-3-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-プロピオン酸、
シクロプロパンカルボン酸 {2-[2-カルバモイル-l-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-エチル]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イル}-アミド、
シクロプロパンカルボン酸 {2-[1-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-2-ジメチルカルバモイル-エチル]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イル}-、
シクロプロパンカルボン酸 {2-[1-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-2-ヒドロキシカルバモイル-エチル]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イル}-アミド、
3-(7-アセチルアミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-プロピオンアミド、
3-(7-アセチルアミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-N,N-ジメチル-プロピオンアミド、
3-(7-アセチルアミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-N-ヒドロキシ-プロピオンアミド、
3-(4-アセチルアミノ-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-プロピオン酸、
3-(4-アセチルアミノ-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-プロピオンアミド、
3-(4-アセチルアミノ-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-N,N-ジメチル-プロピオンアミド、
3-(4-アセチルアミノ-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-3-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-N-ヒドロキシ-プロピオンアミド、
シクロプロパンカルボン酸 {2-[1-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-2-メタンスルホニル-エチル]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イル}-アミド、
N-{2-[1-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-2-メタンスルホニル-エチル]-1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イル}-アセトアミド、および
シクロプロパンカルボン酸 {2-[2-カルバモイル-1-(4-ジフルオロメトキシ-3-エトキシ-フェニル)-エチル]-7-クロロ-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イル}-アミド。
【０１２７】
他の選択的サイトカイン抑制薬には、2003年3月12日付け出願のG. Mullerらの米国仮特許出願第60/454,155号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に見出される7-アミド-置換イソインドリル化合物が含まれる。代表的な7-アミド-置換イソインドリル化合物には、式：
【化１４】
2005536189.tif 000015
【０１２８】
［式中、
Yは-C(O)-、-CH2、-CH2C(O)-またはSO2である；
XはHである；
Zは(C0-4-アルキル)-C(O)R3、C1-4-アルキル、(C0-4アルキル)-OH、(C1-4-アルキル)-O(C1-4-アルキル)、(C1-4-アルキル)-SO2(C1-4-アルキル)、(C0-4-アルキル)-SO(C1-4-アルキル)、(C0-4-アルキル)-NH2、(C0-4-アルキル)-N(C1-8-アルキル)2、(C0-4-アルキル)-N(H)(OH)、CH2NSO2(C1-4-アルキル)である；
R1およびR2は、独立して、C1-8-アルキル、シクロアルキルまたは(C1-4-アルキル)シクロアルキルである；
R3はNR4R5、OHまたはO-(C1-8-アルキル)である；
R4はHである；
R5は-OHまたは-OC(O)R6である；
R6はC1-8-アルキル、アミノ-(C1-8-アルキル)、(C1-8-アルキル)-(C3-6-シクロアルキル)、C3-6-シクロアルキル、フェニル、ベンジルまたはアリールである］
の化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、包接化合物もしくはプロドラッグ、あるいは式：
【化１５】
2005536189.tif 000016
【０１２９】
［式中、
Yは-C(O)-、-CH2、-CH2C(O)-またはSO2である；
Xはハロゲン、-CN、-NR7R8、-NO2または-CF3である；
Wは
【化１６】
2005536189.tif 000017
【０１３０】
である；
Zは(C0-4アルキル)-SO2(C1-4-アルキル)、-(C0-4アルキル)-CN、-(C0-4アルキル)-C(O)R3、C1-4-アルキル、(C0-4-アルキル)OH、(C0-4-アルキル)O(C1-4-アルキル)、(C0-4-アルキル)SO(C1-4-アルキル)、(C0-4-アルキル)NH2、(C0-4-アルキル)N(C1-8-アルキル)2、(C0-4-アルキル)N(H)(OH)または(C0-4-アルキル)NSO2(C1-4-アルキル)である；
Wは-C3-6-シクロアルキル、-(C1-8-アルキル)-(C3-6-シクロアルキル)、-(C0-8-アルキル)-(C3-6シクロアルキル)-NR7R8、(C0-8-アルキル)-NR7R8、(C0-4-アルキル)-CHR9-(C0-4-アルキル)-NR7R8である；
R1およびR2は、独立して、C1-8-アルキル、シクロアルキルまたは(C1-4-アルキル)シクロアルキルである；
R3はC1-8-アルキル、NR4R5、OHまたはO-(C1-8-アルキル)である；
R4およびR5は、独立して、H、C1-8-アルキル、(C0-8-アルキル)-(C3-6-シクロアルキル)、OHまたは-OC(O)R6である；
R6はC1-8-アルキル、(C0-8-アルキル)-(C3-6-シクロアルキル)、アミノ-(C1-8-アルキル)、フェニル、ベンジルまたはアリールである；
R7およびR8は、それぞれ独立して、H、C1-8-アルキル、(C0-8-アルキル)-(C3-6-シクロアルキル)、フェニル、ベンジル、アリールであるか、あるいはそれらを連結している原子と一緒になって3〜7員へテロシクロアルキルまたはヘテロアリール環を形成しうる；
R9はC1-4-アルキル、(C0-4-アルキル)アリール、(C0-4-アルキル)-(C3-6-シクロアルキル)、(C0-4-アルキル)-複素環である］
の化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、包接化合物もしくはプロドラッグが含まれる。
【０１３１】
さらに他の選択的サイトカイン抑制薬には、2003年3月12日付け出願のG. Mullerらの米国仮特許出願第60/454,149号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に見出されるN-アルキル-ヒドロキサム酸-イソインドリル化合物が含まれる。代表的なN-アルキル-ヒドロキサム酸-イソインドリル化合物には、式：
【化１７】
2005536189.tif 000018
【０１３２】
の化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、包接化合物もしくはプロドラッグが含まれ、ここで、
Yは-C(O)-、-CH2、-CH2C(O)-またはSO2である；
R1およびR2は、独立して、C1-8-アルキル、CF2H、CF3、CH2CHF2、シクロアルキルまたは(C1-4-アルキル)シクロアルキルである；
ZはH、C1-6-アルキル、-NH2、-NR3R4またはOR5である；
Z2はHまたはC(O)R5である；
X1、X2、X3およびX4は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、NO2、OR3、CF3、C1-6-アルキル、(C0-4-アルキル)-(C3-6-シクロアルキル)、(C0-4-アルキル)-N-(R8R9)、(C0-4-アルキル)-NHC(O)-(R8)、(C0-4-アルキル)-NHC(O)CH(R8)(R9)、(C0-4-アルキル)-NHC(O)N(R8R9)、(C0-4-アルキル)-NHC(O)(R8)、(C0-4-アルキル)-O-R8、(C0-4-アルキル)-イミダゾリル、(C0-4-アルキル)-ピロリル、(C0-4-アルキル)-オキサジアゾリル、(C0-4-アルキル)-トリアゾリルまたは(C0-4-アルキル)-複素環である；
R3、R4およびR5は、それぞれ独立して、H、C1-6-アルキル、O-C1-6-アルキル、フェニル、ベンジルまたはアリールである；
R6およびR7は、独立して、HまたはC1-6-アルキルである；
R8およびR9は、それぞれ独立して、H、C1-9-アルキル、C3-6-シクロアルキル、(C1-6-アルキル)-(C3-6-シクロアルキル)、(C0-6-アルキル)-N(R4R5)、(C1-6-アルキル)-OR5、フェニル、ベンジル、アリール、ピペリジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリノまたはC3-7-ヘテロシクロアルキルである。
【０１３３】
具体的な選択的サイトカイン抑制薬には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：
2-[1(-3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチル-スルホニルエチル]イソインドリン-1-オン、
2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-(N,N-ジメチル-アミノスルホニル)エチル]イソインドリン-1-オン、
2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチル-スルホニルエチル]イソインドリン-1,3-ジオン、
2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチル-スルホニルエチル]-5-ニトロ-イソインドリン-1,3-ジオン、
2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチル-スルホニルエチル]-4-ニトロイソインドリン-1,3-ジオン、
2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-4-アミノイソインドリン-1,3-ジオン、
2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-5-メチルイソインドリン-1,3-ジオン、
2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-5-アセトアミドイソインドリン-1,3-ジオン、
2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-4-ジメチルアミノイソンドリン-1,3-ジオン、
2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-5-ジメチルアミノイソインドリン-1,3-ジオン、
2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]ベンゾ[e]イソインドリン-1,3-ジオン、
2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-4-メトキシイソインドリン-1,3-ジオン、
1-(3-シクロペンチルオキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル-アミン、
2-[1-(3-シクロペンチルオキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]イソインドリン-1,3-ジオン、および
2-[1-(3-シクロペンチルオキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-4-ジメチルアミノイソインドリン-1,3-ジオン。
【０１３４】
更なる選択的サイトカイン抑制薬には、共に2002年3月20日付け出願のG. Mullerらの米国仮特許出願第60/366,515号および第60/366,516号ならびに共に2003年1月7日付け出願のG. Mullerらの米国仮特許出願第60/438,450号および第60/438,448号（それらのすべてを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているエナンチオ的に純粋な化合物、N-アルキル-ヒドロキサム酸-イソインドリル化合物が含まれる。好ましい化合物には、2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メチルスルホニルエチル]-4-アセチルアミノイソインドリン-1,3-ジオンのエナンチオマーおよび3-(3,4-ジメトキシ-フェニル)-3-(1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-プロピオンアミドのエナンチオマーが含まれる。
【０１３５】
本発明で使用する好ましい選択的サイトカイン抑制薬は、3-(3,4-ジメトキシ-フェニル)-3-(1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-プロピオンアミドおよびシクロプロパンカルボン酸 {2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシ-フェニル)-2-メタンスルホニル-エチル]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イル}-アミドであり、これはCelgene Corp., Warren, NJから入手可能である。3-(3,4-ジメトキシ-フェニル)-3-(1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-プロピオンアミドは以下の化学構造を有する。
【化１８】
2005536189.tif 000019
【０１３６】
シクロプロパンカルボン酸 {2-[1-(3-エトキシ-4-メトキシフェニル)-2-メタンスルホニル-エチル]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イル}-アミドは以下の化学構造を有する。
【化１９】
2005536189.tif 000020
【０１３７】
また、本発明の化合物には、シロマスト（cilomast）、テオフィリン、ザルダベリン（zardaverine）、ロリプラム（rolipram）、ペントキシフィリン（pentoxyfylline）、エノキシモン（enoximone）、イソインドール-イミド、フェネチルスルホン、アルカノヒドロキサム酸、非ポリペプチド環状アミド、オキソイソインドール、イソインドリン、インダゾール、ヘテロ置換ピリジン、ジフェニルピリジン、アリールチオフェン、アリールフラン、インデン、トリ置換フェニル、フタラジノン、ベンゼンスルホンアミド、四環性化合物、およびそれらの塩、溶媒和物、異性体、包接化合物、プロドラッグ、水和物または誘導体のようなPDE IV活性を抑制する化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。1つの実施形態においては、該化合物は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチドまたは核酸ではない。
【０１３８】
もう1つの実施形態においては、本発明の化合物は構造（I）：
【化２０】
2005536189.tif 000021
【０１３９】
を有し、その異性体、プロドラッグおよび医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、包接化合物を含み、ここで、
YはNまたはN-オキシドを表す；
R1およびR2は、独立して、H、C1-6アルキルおよびハロC1-6アルキルから選ばれ、
R3およびR4は、独立して、HおよびC1-6アルキルおよびハロC1-6アルキルから選ばれるか、または同一炭素原子に結合しているR3とR4とが一緒になってカルボニル酸素原子を表すか、または異なる炭素原子に結合しているR3とR4とが、それらが結合している炭素原子および介在原子と共に、飽和5、6または7員炭素環を表す；
R5およびR6は、独立して、H、ハロC1-6アルキルおよびCNよりなる群から選ばれるメンバーを表す；
nは0〜6の整数を表す；
Ar1は、チエニル、チアゾリル、ピリジル、フェニルおよびナフチルよりなる群から選ばれ、該Ar1は、ハロ、C1-6アルコキシ、C1-7アルキルチオ、CN、
C1-6アルキル、ヒドロキシC1-6アルキル、-C(O)C1-6アルキル、-CO2H、-CO2C1-6アルキル、NH(SO2Me)、N(SO2Me)2、SO2Me、SO2NH2、SO2NHC1-6アルキル、SO2N(C1-6アルキル)2NO2、C2-6アルケニル、
C1-6アルキルおよびNH2よりなる群から選ばれる1〜3個のメンバーで所望により置換されていてもよい；
Ar1が、2個または3個の置換基を有するフェニルまたはナフチル基を表す場合には、そのような2個の置換基が一緒になって5または6員縮合ラクトン環を表しうる。
【０１４０】
この実施形態は更に、米国特許第6,316,472号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）において見出されるような化合物を含む。
【０１４１】
もう1つの実施形態においては、本発明の化合物は構造（II）：
【化２１】
2005536189.tif 000022
【０１４２】
を有し、その異性体、プロドラッグおよび医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、包接化合物を含み、ここで、
R1およびR2はC1-C4アルキルまたはC3-C10シクロアルキルから選ばれ、
R3およびR4は、独立して、C1-4アルキル、シクロアルキル、1個の二重結合を有するC2-C4アルキレン、1個の三重結合を有するC2-C4アルキリン、(CH2)nCO(CH2)mCH3、(CH2)pCN、(CH2)pCO2Meを表すか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒になって3〜10員環を形成している；
nおよびmは0〜3である；
pは1〜3である。
【０１４３】
この実施形態は更に、米国特許第6,162,830号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）において見出されるような化合物を含む。
【０１４４】
もう1つの実施形態においては、本発明の化合物は構造（III）：
【化２２】
2005536189.tif 000023
【０１４５】
を有し、その異性体、プロドラッグおよび医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、包接化合物を含み、ここで、
R1は、各場合に、独立して、水素、ハロゲン、低級アルコキシ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルキルメルカプト、低級アルキルスルホニル、低級アルキルアミノ、ジ-低級アルキルアミノ、アミノ、ニトロ、ニトリル、 低級アルキルカルボキシラート、-CO2Hおよびスルホンアミドよりなる群から選ばれる；
R2は、水素および低級アルキルよりなる群から選ばれる；
R3は、水素、低級アルキル、ヒドロキシおよびアミノよりなる群から選ばれる；
R4は、-COMおよびCH20Hよりなる群から選ばれ、ここで、Mは、ヒドロキシ、置換低級アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、N-モルホリノ、ヒドロキシアルキルアミノ、ポリヒドロキシアミノ、ジアルキルアミノアルキルアミノ、アミノアルキルアミノおよび基OMe（ここで、Meはカチオンである）よりなる群から選ばれる；
R5はアルキルスルホニルである；
nは0〜4の整数である。
【０１４６】
この実施形態は更に、米国特許第6,177,471号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている化合物を含む。
【０１４７】
もう1つの実施形態においては、本発明の化合物は構造（IV）：
【化２３】
2005536189.tif 000024
【０１４８】
を有し、その異性体、プロドラッグおよび医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、包接化合物を含み、ここで、
R0は水素、ハロゲンまたはC1-6アルキルを表す；
R1は、水素、C1-6アルキル［これは、フェニル、ハロゲン、-CO2Ra、-NRaRb、C3-6-シクロアルキル、フェニルおよび5または6員複素環（これは、ピリジル、モルホリニル、ピペラジニル、ピロリジニルおよびピペリジニルよりなる群から選ばれ、1以上のC1-6アルキルで所望により置換されていてもよく、R1が結合している窒素原子にC1-6アルキルを介して所望により連結されていてもよい）から選ばれる1以上の置換基で所望により置換されていてもよい］よりなる群から選ばれる；
R2は、-ORa、-NRa、Rb、ハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノおよびニトロから選ばれる1以上の置換基で所望により置換されていてもよいフェニルよりなる群から選ばれる；
RaおよびRbは、独立して、水素またはC1-6アルキルを表す（その異性体、プロドラッグおよび医薬上許容される塩を含む）。
【０１４９】
この実施形態は更に、米国特許第6,218,400号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）において見出されるような化合物を含む。
【０１５０】
もう1つの実施形態においては、本発明の化合物は構造（V）：
【化２４】
2005536189.tif 000025
【０１５１】
を有し、その異性体、プロドラッグおよび医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、包接化合物を含み、ここで、
XはSまたはOである；
Ar1は、フェニル、ピリジルまたはフリルから選ばれる芳香環であり、これは2個以下の置換基で所望により置換されていてもよく、各置換基は、独立して、C1-6アルキル（これは、-OH、-CO2H、CO2C1-3アルキルまたはCNで所望により置換されていてもよい）；C1-6アルコキシ；C1-3アルキルチオ、C1-3アルキルスルホニル、C1-3フルオロアルキル（これは、-OHで所望により置換されていてもよい）；ハロ、-OH、-CO2Hまたは-CO2C1-3アルキルである；
R2は水素またはC1-3アルキルである；
R3は、2個以下の置換基で所望により置換されていてもよいフェニル、ピリジル、キノリニルまたはフリルであり、各置換基は、独立して、C1-3アルキル、C1-3フルオロアルキル、C1-6アルコキシ、C1-3フルオロアルコキシ、C1-3アルキルチオ、ハロまたは-OHである。
【０１５２】
この実施形態は更に、米国特許第6,034,089号および米国特許第6,020,339号（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）において見出されるような化合物を含む。
【０１５３】
もう1つの実施形態においては、本発明の化合物は構造（VI）：
【化２５】
2005536189.tif 000026
【０１５４】
を有し、その異性体、プロドラッグおよび医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、包接化合物を含み、ここで、
Yはハロゲンまたはアルキルもしくは-XRa基である；
Zは-O-、-S(O)p-または-N(Rb)-であり、ここで、pはゼロまたは1もしくは2の整数である；
Lは-XR、-C(R11)C(R1)(R2)または-(CHR11)nCH(R1)(R2)であり、ここで、nはゼロまたは整数の1である；
RaおよびRbのそれぞれは、独立して、水素または所望により置換されていてもよいアルキル基である；
Rは、所望により置換されていてもよいアルキル、アルケニル、シクロアルキルまたはシクロアルケニル基である；
R1およびR2のそれぞれは、同一であっても異なっていてもよく、水素、フッ素、-CN、-NO2または所望により置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、-CO2R8、-CONR9R10または-CSNR9R10基であるか、あるいはR1およびR2が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、所望により置換されていてもよいシクロアルキルまたはシクロアルケニル基を形成している；
R3は水素、フッ素、ヒドロキシまたは所望により置換されていてもよい直鎖状もしくは分枝アルキル基である；
R4は水素、-(CH2)tArまたは-(CH2)t-Ar-(L1)n-Ar1であり、ここで、tはゼロまたは1、2もしくは3の整数である；
R5は-(CH2)tArまたは-(CH2)t-Ar-(L1)n-Ar'である；
R6は水素、フッ素または所望により置換されていてもよいアルキル基である；
R7は水素、フッ素、所望により置換されていてもよい直鎖状もしくは分枝アルキル基、-ORc（ここで、Rcは水素または所望により置換されていてもよいアルキルもしくはアルケニル基である）、またはホルミル、アルコキシアルキル、アルカノイル、カルボキサミドもしくはチオカルボキサミド基である；
R8、R9およびR10のそれぞれは、独立して、水素または所望により置換されていてもよいアルキル、アルアルキルもしくはアリール基である；
R11は水素、フッ素またはメチル基である。
【０１５５】
この実施形態は更に、米国特許第5,798,373号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）において見出されるような化合物を含む。
【０１５６】
好ましい実施形態においては、該化合物は構造（VII）：
【化２６】
2005536189.tif 000027
【０１５７】
の化合物またはその医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、包接化合物、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体もしくは立体異性体の混合物である。
【０１５８】
もう1つの好ましい実施形態においては、該化合物は構造（VIII）：
【化２７】
2005536189.tif 000028
【０１５９】
の化合物であり、その異性体、塩、包接化合物、溶媒和物、水和物、プロドラッグおよび医薬上許容される塩を含む。
【０１６０】
これらの化合物の幾つかはCelgene, Inc., Warren, New Jerseyから商業的に入手可能であろう。他の前記化合物は、前記の特許（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているものを含む当技術分野で公知の方法により製造されうる。
【０１６１】
本発明の方法において有用であるPDE IVインヒビターの更なる具体例には、GB 2 063 249 A、EP 0 607 439 A1、米国特許第6,333,354号、米国特許第6,300,335号、米国特許第6,166,041号、米国特許第6,069,156、米国特許第6,011,060号、米国特許第5,891,896号、米国特許第5,849,770号、米国特許第5,710,170号、米国特許第4,101,548号、米国特許第4,001,238号、米国特許第4,001,237号、米国特許第3,920,636号、米国特許第4,060,615号、WO 97/03985、EP 0 607 439 A1、米国特許第4,101,548号、米国特許第4,001,238号、米国特許第4,001,237号、米国特許第3,920,636、米国特許第4,060,615号、WO 97/03985、EP 0 395 328、米国特許第4,209,623号、EP 0 395 328、米国特許第4,209,623、米国特許第5,354,571号、EP 0 428 268 A2、米国特許第5,354,571号、EP 0 428 268 A2、807,826、米国特許第3,031,450号、米国特許第3,322,755号、米国特許第5,401,774号、807,826、米国特許第3,031,450号、米国特許第3,322,755号、米国特許第5,401,774号、米国特許第5,147,875号、PCT WO 93/12095、米国特許第5,147,875号、PCT WO 93/12095、米国特許第4,885,301号、WO 93/07149、EP 0 349 239 A2、EP 0 352 960 A2、EP 0 526 004 A1、EP 0 463 756 A1、米国特許第4,885,301号、WO 93/07149、EP 0 349 239 A2、EP 0352 960 A2、EP 0 526 004 A1、EP 0 463 756 A1、EP 0 607 439 A1、EP 0 607 439 A1、WO 94/05661、EP 0 351 058、米国特許第4,162,316号、EP 0 347 146、米国特許第4,047,404号、米国特許第5,614,530号、米国特許第5,488,055号、WO 97/03985、WO 97/03675、WO 95/19978、米国特許第4,880,810号、WO 98/08848、米国特許第5,439,895号、米国特許第5,614,627号、PCT US94/01728、WO 98/16521、EP 0 722 943 A1、EP 0 722 937 A1、EP 0 722 944 Al、WO 98/17668、WO 97/24334、WO 97/24334、WO 97/24334、WO 97/24334、WO 97/24334、WO 98/06722、PCT/JP97/03592、WO 98/23597、WO 94/29277、WO 98/14448、WO 97/03070、WO 98/38168、WO 96/32379およびPCT/GB98/03712（それらのすべてを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているものが含まれる。
【０１６２】
本発明の一部であると意図される化合物の多くにおいては、当技術分野で公知の標準的な分割または不斉合成を用いて、前記で特定されている化合物の光学活性なエナンチオマーを富化することが可能である。例えば、Shealyら, Chem. Indus. 1030 (1965)、およびCasiniら, Farmaco Ed. Sci. 19:563 (1964)を参照されたい。
【０１６３】
本発明はまた、それらの化合物の生理的に許容される無毒性の酸付加塩に関する。そのような塩には、当技術分野で公知の有機および無機の酸または塩基から誘導されたものが含まれる。そのような酸には、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、ソルビン酸、アコニット酸、サリチル酸、フタル酸、エンボル酸（embolic acid）、エナント酸などが含まれる。
【０１６４】
実質的に酸性である本発明の化合物は、種々の医薬上許容される塩基と塩を形成しうる。本発明のそのような酸性化合物の医薬上許容される塩基付加塩を製造するために使用しうる塩基は、無毒性塩基付加塩、すなわち、薬理学的に許容されるカチオンを含有する塩（例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、特にカルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない）を形成するものである。適当な有機塩基には、N,N-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミン）、リシンおよびプロカインが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１６５】
本発明の化合物は、当技術分野でよく知られた方法、例えば米国特許第6,316,472、米国特許第6,204,275号、Featherstone R.L.ら (2000) “Comparison of phosphodiesterase inhibitors of differing isoenzyme selectivity added to St. Thomas'hospital cardioplegic solution used for hypothermic preservation of rat lungs”, Am. J. Respir Crit. Care Med. 162:850-6、およびBrackeen M.F.ら (1995) “Design and synthesis of conformationally constrained analogues of 4-(3-butoxy-4-methoxybenzyl)imidazolidin-2-one (Ro 20-1724) as potent inhibitors of cAMP-specific phosphodiesterase”, J. Med. Chem. 38:4848-54（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているアッセイを用いて、PDE IVをそれが抑制する能力に関してアッセイされうる。
【０１６６】
本発明の化合物はCelgene Corp.（Warren, NJ）から商業的に購入されうるか、または本明細書に開示されている特許または特許刊行物に記載の方法に従い製造されうる。さらに、光学的に純粋な組成物は、公知の分割剤またはキラルカラムおよび他の標準的な合成有機化学技術を用いて、不斉合成または分割されうる。
【０１６７】
5.3  幹細胞集団
本発明は、ヒトの血管新生をモジュレーションする化合物の同定方法を提供する。本発明の方法においては、任意のヒト幹細胞を使用することが可能であり、それらには、臍帯血（CB細胞）、末梢血、成体の血液、骨髄、胎盤、間葉系幹細胞および他の起源から単離された幹細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくない実施形態においては、幹細胞は、胎盤以外の起源から単離された胚性幹細胞である。
【０１６８】
間葉系幹細胞の起源には、骨髄、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児および青年期の皮膚ならびに血液が含まれる。骨髄細胞は腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨または他の髄腔から得られうる。
【０１６９】
本発明の方法において使用する幹細胞には、多分化能性細胞、すなわち、自己再生性であり組織内で休眠または静止状態で維持されうる、完全な分化多様性を有する細胞が含まれうる。該幹細胞には、多能性細胞、方向づけられた（committed）前駆細胞、および繊維芽様（fibroblastoid）細胞も含まれうる。1つの好ましい実施形態においては、本発明は、臨月（full-term）の放血灌流胎盤から単離された生存可能な静止多分化能性幹細胞である幹細胞を使用する。
【０１７０】
幹細胞集団は、商業的供給業者、例えばLifeBank USA（Cedar Knolls, NJ）、ViaCord（Boston MA）、Cord Blood Registry（San Bruno, CA）およびCryocell（Clearwater, FL）を介して得られた胎盤幹細胞よりなりうる。
【０１７１】
幹細胞集団はまた、2002年9月5日付け公開の米国特許出願公開番号US 2002/0123141（発明の名称“Method of Collecting Placental Stem Cells”）および2003年2月13日付け公開の米国特許出願公開番号US 2003/0032179（発明の名称“Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom”）（それらの両方の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている方法に従い集められた胎盤幹細胞よりなりうる。
【０１７２】
本発明に従い使用する好ましい細胞は、放血灌流胎盤に由来する胚様幹細胞、または胚様胎盤幹細胞に由来する細胞である。本発明の胚様幹細胞は、フローサイトメトリーおよび免疫細胞化学のような技術を用いた形態学的変化および細胞表面マーカーの測定、ならびにPCRのような技術を用いた遺伝子発現の変化の測定により特徴づけられうる。本発明の1つの実施形態においては、そのような胚様幹細胞は細胞表面マーカーCD10、CD29、CD44、CD54、CD90、SH2、SH3、SH4、OCT-4およびABC-Pの存在により、または細胞表面マーカーCD34、CD38、CD45、SSEA3およびSSEA4の非存在により特徴づけられうる。好ましい実施形態においては、そのような胚様幹細胞は細胞表面マーカーOCT-4+およびAPC-p+の存在により特徴づけられうる。そのような細胞表面マーカーは、当技術分野においてよく知られた方法、例えばフローサイトメトリーならびにそれに続く洗浄および抗細胞表面マーカー抗体での染色により常套的に測定される。例えば、CD-34またはCD-38の存在を測定するためには、細胞をPBS中で洗浄し、ついで抗CD34フィコエリトリンおよび抗CD38フルオレセインイソチオシアナート（Becton Dickinson, Mountain View, CA）で二重染色することが可能である。
【０１７３】
胎盤に由来する胚様幹細胞は胚性幹細胞の特徴を有するが、胚に由来しない。言い換えれば、本発明は、分娩後灌流胎盤から単離された未分化幹細胞であるOCT-4+およびABC-p+細胞の使用を含む。そのような細胞はヒト胚性幹細胞と同様に汎用的（例えば、多分化能性）である。前記のとおり、多種多様な多分化能性または多能性幹細胞が灌流胎盤から種々の時点で単離されうる（例えば、CD34+/CD38+、CD34+/CD38-、およびCD34-/CD38-造血細胞）。本発明の方法においては、胚様幹細胞の起源として、分娩後のヒト胎盤を使用する。
【０１７４】
例えば、子宮からの排出の後、アポトーシスを妨げる又は最小限にするために可能な限り迅速に胎盤を放血させる。ついで、放血の後、出来るだけ早く、胎盤を灌流して、血液、残存細胞、タンパク質、因子、および該器官内に存在する任意の他の物質を除去する。胎盤から物質残渣も除去されうる。灌流は、通常、適当な灌流液で少なくとも2時間〜24時間以上継続する。いくつかの更なる実施形態においては、少なくとも4、6、8、10、12、14、16、18、20および22時間にわたり胎盤を灌流する。すなわち、本発明は、少なくとも部分的には、分娩後の胎盤の細胞が放血および十分な時間の灌流により活性化されうるという知見に基づく。したがって、胎盤は、豊富な胚様幹細胞源として容易に使用され、該細胞は、薬物発見、病気の治療および予防、特に移植手術または療法、ならびに方向づけられた細胞、組織および類器官の作製を含む研究に使用されうる。2002年9月5日付け公開の米国特許出願公開番号US 20020123141（発明の名称“Method of Collecting Placental Stem Cells”）および2003年2月13日付け公開の米国特許出願公開番号US 2003/0032179（発明の名称“Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom”）（それらの両方の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
【０１７５】
胚様幹細胞は、臍動脈および臍静脈の一方または両方を使用する灌流技術により、排液された胎盤から抽出されうる。胎盤は、好ましくは、放血および残存血液（例えば、残存臍帯血）の回収により排液される。ついで、柔組織および血管外腔内の内在胚様幹細胞がリクルートされるex vivoの天然バイオリアクター環境が確立されるよう、排液された胎盤を加工する。胚様幹細胞は、排液された空の微小循環内へと遊走し、ここにおいて、本発明の方法では、好ましくは灌流による採集容器内への洗浄により該細胞を集める。
【０１７６】
5.4  幹細胞培養の方法
本発明の或る実施形態においては、胚性幹細胞、胚様幹細胞、前駆細胞、多分化能性細胞、全能性細胞、多能性細胞、分娩後灌流胎盤に内在性の細胞、臍帯血細胞、末梢血もしくは成体の血液に由来する幹細胞もしくは前駆細胞、または骨髄細胞を含む（これらに限定されるものではない）幹細胞または前駆細胞を本発明のin vitroスクリーニングアッセイにおいて使用する。
【０１７７】
本発明のもう1つの実施形態においては、幹細胞または前駆細胞は分娩後灌流胎盤には由来せず、その代わりに、臍帯血、骨髄、末梢血または成体の血液のような他の起源から単離され、本発明の化合物にさらされ、血管新生に関してアッセイされる。
【０１７８】
もう1つの実施形態においては、培養幹細胞、例えば、in vitroで又は分娩後灌流胎盤において培養された幹細胞を、例えばエリスロポエチン、サイトカイン、リンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子（CSF）、インターフェロン、ケモカイン、インターロイキン、組換えヒト造血成長因子、例えばリガンド、幹細胞因子、トロンボポエチン（Tpo）、インターロイキンおよび顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）または他の増殖因子の投与により、培養内で増殖するよう刺激する。
【０１７９】
5.4.1  in vitroでの幹細胞培養
in vitroでの幹細胞または前駆細胞の培養方法は当技術分野でよく知られている。例えば、Thomsonら, 1998, Science 282:1145-47（胚性幹細胞）；Hirashimaら, 1999, Blood 93(4):1253-63およびHatzopoulosら, 1998, Development 125:1457-1468（内皮細胞前駆体）；Slagerら, 1993, Dev. Genet. 14(3):212-24（ニューロンまたは筋前駆体）；Genbachevら, 1995, Reprod. Toxicol. 9(3):245-55（細胞栄養芽層、すなわち、胎盤上皮細胞前駆体）；Nadkarniら 1984, Tumori 70:503-505、Melchnerら, 1985, Blood 66(6):1469-1472、2000年5月18日付け公開の国際PCT公開WO 00/27999、Himoriら, 1984, Intl. J. Cell Cloning 2:254-262、およびDouayら, 1995, Bone Marrow Transplantation 15:769-775（造血前駆細胞）；Shamblottら, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726-31（始原生殖細胞）；Yanら, 2001, Devel. Biol. 235:422-432（栄養芽層幹細胞）を参照されたい。
【０１８０】
5.4.2  分娩後灌流胎盤における幹細胞培養
本発明の方法は、胎盤に由来する多分化能性幹細胞の使用を含む。後記のとおりのそのような細胞の入手および培養方法は、2002年9月5日付け公開の米国特許出願公開番号US 20020123141（発明の名称“Method of Collecting Placental Stem Cells”）および2003年2月13日付け公開の米国特許出願公開番号US 20030032179（発明の名称“Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom”）（それらの両方の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に詳細に記載されている。
【０１８１】
5.4.2.1  胎盤の前処理
本発明の方法においては、ヒト胎盤は、分娩後のその排出直後に回収し、ある実施形態においては、胎盤内の臍帯血を回収する。ある実施形態においては、胎盤を通常の臍帯血回収方法に付す。典型的には、針またはカニューレを使用し、重力により、胎盤から臍帯血を排出（すなわち、放血）させる（1993年3月9日付け発行のBoyseら, 米国特許第5,192,553号、1991年4月2日付け発行のBoyseら, 米国特許第5,004,681号、1994年12月13日付け発行のAnderson, 米国特許第5,372,581号、1995年5月16日付け発行のHesselら, 米国特許第 5,415,665号（発明の名称：Umbilical cord clamping, cutting, and blood collecting device and method）, entitled, issued May 16,1995）。そのような臍帯血回収は例えばLifeBank USA（Cedar Knolls, NJ）、ViaCord（Boston MA）、Cord Blood Registry（San Bruno, CA）およびCryocell（Clearwater, FL）から商業的に入手可能である。臍帯血は胎盤の排出直後に排出させることが可能である。
【０１８２】
臍帯血は分娩後胎盤から排出させる。保存胎盤は、無菌条件下および室温または5〜25℃（セ氏）の温度におかれうる。残存臍帯血の除去のための胎盤の灌流の前に胎盤を48時間より長時間にわたり保存することが可能であり、好ましくは、4〜24時間保存される。
【０１８３】
胎盤は、好ましくは、無菌条件下での排出後に回収し、抗凝血溶液中、5〜25℃（セ氏）の温度で保存する。適当な抗凝血溶液は当技術分野でよく知られている。例えば、ヘパリンまたはワーファリンナトリウムの溶液、例えば、ヘパリンの溶液（1:1000溶液中、1％ w/w）を使用することができる。排液された胎盤は、好ましくは、胚様幹細胞を集める前のせいぜい36時間にわたり保存する。残存細胞を除去するための胎盤の灌流に使用する溶液は、幹細胞の回収のための胎盤の灌流および培養に使用するのと同じ溶液であってもよい。これらの灌流液はいずれも、胚様幹細胞源として集め使用することが可能である。
【０１８４】
また、インフォームドコンセントを得た患者からも胎盤を回収することが可能であり、妊娠の前、途中および後に該患者の完全な医学的履歴をとり、胎盤と関連づける。これらの医学的記録を使用して、胎盤またはそれから回収された幹細胞の後続の使用を調整することが可能である。例えば、ついで、問題の乳児、親、同胞または他の血族のための個別化医療のためにヒト胎盤幹細胞を容易に使用することができる。実際のところ、ヒト胎盤幹細胞は臍帯血より汎用的である。しかし、本発明は、放血され灌流された及び／又は培養された胎盤により産生されたヒト胎盤幹細胞を臍帯、同じ又は異なる胎盤および臍帯からの血液に添加することを含むことに注目すべきである。得られた臍帯血は、増加したヒト幹細胞の濃度／集団を有するため、移植（例えば、骨髄移植）に、より有用である。
【０１８５】
5.4.2.2  胎盤の放血および残存細胞の除去
本発明の或る実施形態においては、胚様幹細胞を含む（これに限定されるものではない）幹細胞または前駆細胞を、放血された（すなわち、分娩後および／または通常の臍帯血回収操作後に残った臍帯血が完全に排出された）胎盤から回収することが可能である。
【０１８６】
5.4.2.3  胎盤および胎盤内の幹細胞の培養
放血および十分な時間の胎盤の灌流の後、胎盤の放血灌流微小循環内に胚様幹細胞が遊走するのが観察され、ここで、本発明の方法においては、好ましくは灌流により採集容器内に洗浄することにより、それらを集める。単離された胎盤の灌流は、残存臍帯血を除去するように働くだけでなく、酸素などの適当な栄養分を胎盤に与える。好ましくは抗凝血剤の添加無しで、残存臍帯血を除去するのに使用したのと同様の溶液で、胎盤を培養し灌流することが可能である。
【０１８７】
本発明の或る実施形態においては、排液され放血された胎盤をバイオリアクター（すなわち、細胞の増殖または生物学的物質の産生のためのex vivo系）として培養する。胎盤バイオリアクターにおいて増殖した細胞の数または産生された生物学的物質のレベルを、胎盤バイオリアクター内に導入された培地または灌流液の一部を定期的または連続的に除去することにより、平衡成長の連続状態において維持し、それより、増殖した細胞または産生された生物学的物質を回収することが可能である。新鮮な培地または灌流液は同じ率または同じ量で導入する。
【０１８８】
増殖した細胞の数および型は、フローサイトメトリー、セルソーティング、免疫細胞化学（例えば、組織特異的または細胞マーカー特異的抗体での染色）、蛍光活性化セルソーティング（FACS）、磁気活性化セルソーティング（MACS）のような標準的な細胞検出技術を用いて形態学的変化および細胞表面マーカーを測定することにより、あるいは光学または共焦点顕微鏡を使用して細胞の形態学的特徴を検査することにより、あるいはPCRおよび遺伝子発現プロファイリングのような当技術分野でよく知られた技術を用いて遺伝子発現の変化を測定することにより、容易にモニターすることができる。
【０１８９】
灌流溶液内に導入された増殖因子は未分化胚様幹細胞、方向づけられた前駆細胞または分化細胞（例えば、分化造血細胞）の増殖を刺激しうる。既に記載されているとおり、該増殖因子は生物学的物質および生物活性分子、例えば免疫グロブリン、ホルモン、酵素または増殖因子（これらに限定されるものではない）の産生を刺激しうる。消費培地を除去し、遊離細胞の数を減少させ、新鮮な培地を加えるために、培養胎盤を定期的に「供給」すべきである。培養胎盤は、汚染の可能性を減少させるために無菌条件下で保存し、また、胎盤の細胞への栄養素の適当な供給を維持する条件をもたらすために間欠および定期的加圧下に維持すべきである。胎盤の灌流および培養は、効率および能力の向上のために自動化およびコンピューター化の両方に付されうると認識されるべきである。
【０１９０】
もう1つの実施形態においては、胚様幹細胞のような全ての内因性増殖細胞を除去するために、および外来（すなわち、外因性）細胞が灌流胎盤の環境内に導入され増殖するのを可能にするために、胎盤を加工する。本発明は、胚様幹細胞、間葉系幹細胞、基質細胞、内皮細胞、肝細胞、角化細胞、および特定の細胞型、組織または器官［ニューロン、ミエリン、筋肉、血液、骨髄、皮膚、心臓、結合組織、肺、腎臓、肝臓および膵臓（例えば、膵島細胞）を含むが、これらに限定されるものではない］のための幹または前駆細胞を含む（これらに限定されるものではない）、胎盤バイオリアクター内で培養されうる多種多様な幹細胞または前駆細胞を意図する。
【０１９１】
5.5  アッセイにより同定された化合物を使用する治療方法
実施例に示されているとおり（後記第6節を参照されたい）、該アッセイは、抗血管新生活性を示す化合物のクラスを同定した。これらの化合物は、前記第5.2節に記載の化合物のクラスの代表的メンバーである。特に、該代表的化合物として、ActimidTM、RevimidTMおよびサリドマイドが挙げられる。他の化合物は、実施例の記載または本明細書中のそれ以外の記載と同様にしてアッセイにより同定することができる。そのような化合物は、血管新生または血管発生に対して所望のモジュレーション効果を及ぼす任意の化合物であることが可能であり、タンパク質、ペプチド、ペプチド類似体、核酸または核酸類似体、炭水化物、脂質、小さな無機分子などでありうる。
【０１９２】
抗血管新生物質として同定された化合物は、血管新生成分を有する任意の疾患または状態を治療するために使用することができる。例えば、癌（例えば、乳癌）の侵襲性の指標の1つは癌腫瘍による血管新生物質の産生であり、腫瘍内または腫瘍周囲の血管化の増加は腫瘍増殖速度および転移の可能性の増加につながる。この血管新生能の抑制は腫瘍の増殖および転移の抑制に役立つであろう。したがって、本発明の抗血管新生化合物は、転移癌を含む癌を治療するために使用することができる。そのような治療は、好ましくは、他の癌治療と組合される。本発明のスクリーニング方法により同定された化合物で治療されうる他の障害には、炎症、子宮内膜症、関節炎、アテローム硬化性プラーク、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、トラコーマ、角膜移植片血管新生、乾癬、強皮症、血管腫および肥厚性瘢痕、血管癒着および血管線維腫が含まれる。
【０１９３】
したがって、1つの実施形態においては、本発明は、血管新生または血管発生に関連した状態または疾患を有する個体を治療するための方法であって、抗血管新生または抗血管発生活性を有すると本明細書に記載のアッセイにおいて同定された物質の、該血管新生または血管発生を検出可能に軽減するのに十分な量を、該個体に投与することを含んでなる方法を提供する。具体的な実施形態においては、該物質は、TNF-αの活性を抑制する化合物である。より具体的な実施形態においては、該物質は、サリドマイド、ActimidTMまたはRevimidTMよりなる群から選ばれる。もう1つの実施形態においては、本発明は、血管新生または血管発生に関連した状態または疾患を有する個体を治療するための方法であって、TNF-αの活性を抑制する化合物の、該血管新生または血管発生を検出可能に軽減するのに十分な量を該個体に投与することを含んでなる方法を提供する。より具体的な実施形態においては、該化合物は、サリドマイド、ActimidTMまたはRevimidTMよりなる群から選ばれる。
【０１９４】
血管発生または血管新生を増強する化合物（すなわち、血管新生性化合物）を同定するためには、同じ同定方法を用いることが可能である。そのような物質は、不十分な血管化に関連した疾患もしくは状態または血管への損傷を治療するために使用することができる。例えば、そのような化合物は、手術、特に血管または心臓手術を受けた個体に、血管修復速度を向上させるために投与することができる。もう1つの例においては、不十分な末梢血流を有する個体、例えば非治癒性創傷またはレイノー病を有する個体を治療するために、そのような化合物を使用することが可能である。したがって、もう1つの実施形態においては、本発明は、不十分な血管新生または血管発生に関連した状態または疾患を有する個体を治療するための方法であって、血管新生または血管発生を検出可能に増強する物質の、該血管新生または血管発生を増強するのに十分な量を該個体に投与することを含んでなる方法を提供する。  
血管新生および／または血管発生のモジュレーターは、後記第5.6節に概説されている方法により投与することが可能である。
【０１９５】
5.6  医薬組成物
本発明は、本発明の方法により血管新生のモジュレーターであると同定された化合物を含んでなる医薬組成物を含む。本発明の医薬組成物は、そのような治療を要する対象に、血管新生をモジュレーションするために投与することが可能である。
【０１９６】
本発明の化合物の投与は全身投与または局所投与でありうる。ほとんどの場合には、哺乳動物への投与は本発明の化合物の全身的（すなわち、血流内への）放出をもたらすであろう。投与方法には、経腸経路、例えば経口、頬側、舌下および直腸内；局所投与、例えば経皮および皮内；ならびに非経口投与が含まれる。適当な非経口投与には、皮下針またはカテーテルを介した注射、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、動脈内、脳室内、髄腔内および眼内注射ならびに非注射経路、例えば膣内、直腸内または鼻腔内投与が含まれる。好ましくは、本発明の化合物および組成物は経口投与される。特定の実施形態においては、本発明の1以上の化合物組成物を、治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましいかもしれない。これは、例えば、手術中の局所的注入、局所的適用（例えば、手術後の傷の手当てと共に行うもの）、注射、カテーテル、坐剤またはインプラント（該インプラントは、多孔性、無孔性、ゼラチン状物質、例えば膜、例えばシアラスチック（sialastic）膜または繊維である）により達成されうる。
【０１９７】
本発明の化合物は、典型的な運搬系および非標準的な運搬系、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへの封入により投与することが可能である。例えば、本発明の化合物および組成物は、小胞、特にリポソームに含有させて運搬することが可能である（Langer, 1990, Science 249:1527-1533、Treatら, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-BeresteinおよびFidler (編), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)、Lopez-Berestein, 同誌, pp.317-327を参照されたい；全般的には、同誌を参照されたい）。もう1つの実施形態においては、本発明の化合物および組成物をコントロールリリース系において運搬することが可能である。1つの実施形態においては、ポンプを使用することができる（Langer, 前掲; Sefton, 1987, CRC Crit Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwaldら, 1980, Surgery 88:507; Saudekら, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574）。もう1つの具体例においては、高分子物質を使用することができる。Medical Applications of Controlled Release, LangerおよびWise (編), CRC Press., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenおよびBall (編), Wiley, New York (1984); RangerおよびPeppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい。また、Levyら, 1985, Science 228:190; Duringら, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howardら, 1989, J. Neurosurg. 71:105も参照されたい。さらにもう1つの具体例においては、治療すべき標的領域（例えば、肝臓）の近傍にコントロールリリース系を配置して、全身用量のごく一部の量で十分となるようにすることができる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 前掲, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい）。Langer, 1990, Science 249:1527-1533において考察されている他のコントロールリリース系も使用することが可能である。本発明の化合物は、組成物として投与される場合には、哺乳動物への適切な投与のための形態が得られるよう、適当な量の製薬上許容されるビヒクルまたは担体と共に製剤化される。「製薬上許容される」なる語は、哺乳動物、特にヒトでの使用に関して国または州政府の規制機関により承認されている又は米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に掲載されていることを意味する。「ビヒクル」なる語は、哺乳動物への投与のために本発明の化合物と共に製剤化される希釈剤、補助剤、賦形剤または担体を意味する。そのような医薬ビヒクルは液体、例えば水、および油、例えば石油、動物、植物または合成由来の油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などでありうる。該医薬ビヒクルは食塩水、ガムアカシア、ゼラチン、デンプンパスタ、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素などでありうる。また、補助剤、安定剤、増粘剤、滑沢剤および着色剤を使用することが可能である。好ましくは、哺乳動物への投与の場合には、本発明の化合物および組成物ならびに製薬上許容されるビヒクル、賦形剤または希釈剤は無菌性である。本発明の化合物を静脈内に投与する場合には、水性媒体、例えば水、食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液が、好ましいビヒクルである。
【０１９８】
本化合物および組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、植込錠、ロゼンジ、散剤、顆粒剤、シロップ剤、エリキシル剤、水剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、またはそれらの徐放製剤の形態、あるいは哺乳動物への投与に適した他の任意の形態をとりうる。好ましい実施形態においては、本発明の化合物および組成物は、ヒトへの経口または静脈内投与に適した医薬組成物としての通常の方法による投与のために製剤化される。1つの実施形態においては、製薬上許容されるビヒクルは硬ゼラチンカプセルである。適当な医薬ビヒクルおよびその製剤化方法の具体例は、参照により本明細書に組み入れるRemington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro編, Mack Publishing Co. Easton, PA, 19th ed. , 1995, Chapters 86, 87, 88, 91および92に記載されている。
【０１９９】
経口運搬用に製剤化される本発明の化合物および組成物は、好ましくは、カプセル、錠剤、丸剤の形態または任意の圧縮医薬形態である。錠剤または丸剤形態の場合には、胃腸管内での崩壊および吸収を遅らせて長期間にわたり持続作用を得るために、該化合物および組成物をコーティングすることが可能である。浸透的に活性な駆動性（driving）化合物を包囲する選択的透過性膜も、本発明の経口投与化合物および組成物に適している。これらの後者の形態においては、該駆動性化合物が、カプセルを包囲する環境から流体を吸収し、膨張して、開口を介して該物質または組成物を放出する。これらの運搬形態は実質的に0次の運搬プロフィールを与えることが可能であり、これは、即時放出製剤の急上昇プロフィールとは対照的である。グリセロールモノステアラートまたはグリセロールステアラートのような時間遅延物質を使用することも可能である。経口組成物は、標準的なビヒクル、賦形剤および希釈剤、例えばステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ガムアカシア、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップおよびメチルセルロースを含みうる。該製剤は更に、滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、保存剤、例えばメチルおよびプロピルヒドロキシベンゾアートを含みうる。そのようなビヒクルは、好ましくは、医薬等級のものである。本発明の経口投与化合物および組成物は、所望により、1以上の甘味剤、例えばフルクトース、アスパルテームまたはサッカリン；1以上の香味剤、例えばハッカ、冬緑油、またはチェリー；あるいは医薬に適した製剤を与える1以上の着色剤を含みうる。
【０２００】
個々の障害または状態の治療のための治療的に有効な投与計画はその性質および重症度に左右され、医学的実施者の判断に従い標準的な臨床技術により決定されうる。また、最適な投与量の決定を助けるために、in vitroまたはin vivoアッセイを用いることが可能である。もちろん、治療的有効量を構成する本発明の化合物の量は投与経路にも左右される。一般に、経口投与のための適当な投与量範囲は、体重1キログラム当たり、1日当たり本発明化合物約0.001ミリグラム〜約20ミリグラム、好ましくは約0.7ミリグラム〜約6ミリグラム、より好ましくは約1.5ミリグラム〜約4.5ミリグラムである。好ましい実施形態においては、本発明化合物約0.01mg〜約1000mg/日、より好ましくは約0.1mg〜約300mg/日、あるいは約1mg〜約250mgを1回量または分割量として哺乳動物、好ましくはヒトに経口投与する。本明細書に記載の投与量は、投与される合計量を意味する。すなわち、2以上の本発明化合物を投与する場合には、好ましい投与量は、投与される本発明化合物の合計量に相当する。経口組成物は、好ましくは、10〜95重量％の本発明化合物を含有する。好ましい単位経口投与形は、丸剤、錠剤およびカプセル剤を包含し、好ましくはカプセル剤である。典型的には、そのような単位投与形は単位投与当たり約0.01mg、0.1mg、1mg、5mg、10mg、15mg、20mg、50mg、100mg、250mgまたは500mgの本発明化合物、好ましくは、約5mg〜約200mgの化合物を含有するであろう。
【０２０１】
もう1つの実施形態においては、本発明の化合物および組成物は非経口的に（例えば、筋肉内、髄腔内、静脈内および動脈内経路で、好ましくは静脈内に）投与することが可能である。典型的には、静脈内投与用の本発明の化合物および組成物は無菌等張性水性ビヒクル、例えば水、食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液中の溶液である。必要に応じて、該組成物は可溶化剤をも含みうる。静脈内投与用の組成物は、所望により、注射部位における痛みを和らげるためのリグノカインのような局所麻酔剤を含みうる。静脈内投与の場合には、本発明の化合物および組成物は、活性物質の量を表示した密閉容器、例えばアンプルまたは薬袋（sachette）中の無菌の凍結乾燥粉末または水非含有濃縮物として供給されうる。ついで、静脈内投与の前に、そのような粉末または濃縮物を適当な水性媒体で希釈する。投与前の希釈のための粉末または濃縮物と共に、無菌の水、食塩水または他の適当な水性媒体のアンプルが提供されうる。あるいは、該組成物は、そのまま投与される予混形態として供給されうる。本発明の化合物または組成物を静脈内注入により投与する場合には、それは、例えば、無菌の医薬等級の水、食塩水または他の適当な媒体を含有する注入ボトルに分注されうる。
【０２０２】
直腸内投与は、カカオ脂、加工植物油および他の脂肪基剤のような通常の担体で製剤化された坐剤の使用により行うことができる。坐剤は、よく知られた処方を用いるよく知られた方法により製剤化することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れるRemington : The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, PA, 19th ed., 1995, pp.1591-1597を参照されたい。
【０２０３】
局所用剤形を製剤化し投与するためには、よく知られた経皮および皮内運搬媒体、例えばローション剤、クリーム剤および軟膏剤、ならびに経皮運搬装置、例えばパッチを使用することが可能である（本明細書に組み入れるGhosh, T. K.; Pfister, W. R.; Yum, S. I. Transdermal and Topical Drug Delivery Systems, Interpharm Press, Inc. p. 249-297）。例えば、リザーバ（貯蔵）タイプのパッチ形態は、接着剤でコーティングされた支持（backing）フィルムと、半透過性膜により皮膚から隔てられた、本発明の化合物または組成物を含むリザーバ区画とを含みうる（例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許第4,615,699号）。接着剤でコーティングされた支持層はリザーバの境界の周囲に伸張して、皮膚に対する同心性密閉をもたらし、該リザーバを皮膚に隣接して保持する。
【０２０４】
本発明はまた、1以上の本発明化合物が充填された1以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットを提供する。所望により、そのような容器には、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた形式の通知書が添付されうる。該通知書は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該機関による承認を示す。1つの実施形態においては、該キットは本発明の2以上の化合物を含有する。もう1つの実施形態においては、該キットは本発明の化合物と、別の生物学的に活性な物質とを含む。
【０２０５】
好ましくは、ヒトでの使用の前に、所望の治療または予防活性に関して本発明化合物をin vitroおよびin vivoでアッセイする。例えば、特定の本発明化合物または本発明化合物の組合せの投与が好ましいかどうかを判定するために、in vitroアッセイを用いることができる。また、動物モデル系を用いることによっても、本発明の化合物および組成物が有効である及び安全であると示されうる。他の方法は当業者に公知であり、本発明の範囲内である。
【０２０６】
6．実施例
【実施例】
【０２０７】
6.1  実施例1：ヒト血管新生アッセイの開発
多分化能性胎盤幹細胞からの自然血管発生（管形成）
ヒト多分化能性幹細胞を、単離直後にプレーティングし、24時間後、付着細胞を非付着集団から選択した。これらの付着細胞を、10％ 臍帯血清（CBS）と抗生物質とで補足されたDMEM内で培養した。微小管構造体の集合により特徴づけられる自然血管発生の時間経過プロフィールを測定し、種々の時点で細胞標本を集めて内皮特異的マーカーおよび合成産物に関してアッセイする。このようにして得られた時間経過に基づき、候補血管新生モジュレーション化学物質をスクリーニングするための時間計画および治療量を決めた。
【０２０８】
臍帯血管輪の調製
約1〜2mmの直径および1〜2cmの長さの血管を分娩から12時間以内にヒト臍帯から切り出した。動脈組織および静脈組織の両方を集め、別々に維持した。該血管を、2.5μg/mlのフンジゾンを含有するDMEM内に配置し、解剖用鉗子および虹彩切除用鋏を使用して1〜2mmの長さの断片に切断した。血管断片から残存血餅を除去し、該血管断片を使用前にDMEMに浸ける。血管の解剖および切断は、手術用顕微鏡を使用して行った。細静脈または動脈由来の血管からも同様の血管新生応答を得たが、各アッセイには、ただ1つの血管からの血管断片を使用した。アッセイの準備の図示として、図6を参照されたい。
【０２０９】
アッセイの準備
アッセイはペトリ皿（10〜25cm2）または6ウェル培養プレート（Costar, Cambridge, Mass.）内で行った。該ペトリ皿および該プレートは、0.1％ ゼラチン（Sigma, St. Louis, MO）またはマトリゲル（登録商標）（BD Biosciences）で予めコーティングしてマトリックスを形成させることにより調製した。該プレートのコーティングの後、5mLのDMEM中の50μlのヒト臍帯血漿を各皿／ウェルに加えて該マトリックス上に表面膜を形成させた。該膜を37℃で90分間硬化させ、ついでそれを除去すると各皿／ウェル内に薄膜が残った。ついで血管輪断片を該プレートまたは皿内の中央に配置した。ペトリ皿を四等分し、血管輪断片を該四分円のそれぞれの中央に配置した。6ウェル培養プレートの場合には、血管輪断片を該ウェルのそれぞれに配置した。血管輪断片は一般には12時間以内に該コート化マトリックスに付着して、浮力による脱離の可能性を伴うことなく培地の添加を可能にする。付着後、20％ ヒト臍帯血漿、L-グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびヘパリンで補足されたDMEM内で湿潤環境中、37℃で14〜21日間、血管を培養した。培地は約72時間間隔で交換した。
【０２１０】
繊維芽細胞が培養に時々混入したが、通常は培養ウェルの底に単層として現れたに過ぎなかった。なぜなら、内皮細胞とは異なり、繊維芽細胞はマトリゲルには侵入し得ないからである。血管断片を培養ウェルのプラスチック基体に接触させるのではなくフィブリンゲルに懸濁させた場合には、繊維芽細胞の成長は無視されうる。血餅退縮およびそれによる繊維芽細胞混入を抑制するために、繊溶インヒビターであるε-アミノカプロン酸を培地内に含有させた。
【０２１１】
試験化合物の添加および結果の評価
付着幹細胞が選択されたら、あるいは血管輪がマトリックスに付着したことが確認されたら、培養開始時に試験化合物を加えた。用量反応分析が可能となるよう、各試験化合物は種々の濃度で評価する。
【０２１２】
血管新生のモジュレーションは、陽性対照および陰性対照と比較した場合の各アッセイにおける変化と定義した。陽性対照は、内皮細胞増殖補足物質（ECGS; 200μg/ml; Collaborative Research, Bedford, MA）に対する応答と定義した。陰性対照は、DMSOに対する応答と定義した。
【０２１３】
血管の成長は、以下の符号表記を用いて、陽性対照および陰性対照に対する定量的比較として評価した：- 陰性；+/- 陰性対照を僅かに上回る；+ 低レベルの成長；++ 中等レベルの成長；+++ 高レベルの成長；+++ 陽性対照レベルの成長。また、血管の成長は、血管輪からのミクロン単位の血管出芽成長の最大距離および内皮細胞被覆の総面積（ECA）／血管輪の面積（VRA）の両方として形態計測学的に評価した。
【０２１４】
遊走アッセイ
血管出芽は出芽起点における細胞外マトリックスの存在および性質に感受性であると思われたため、生理的血管外環境を模擬するために、修飾した方法を用いた。非変性ヒトコラーゲンマトリックス（Anthromatrix）を使用して、固定ヒト臍動脈断片を、血管輪断片に関して前記されているのと同じ条件下で培養した。修飾として、これらの血管断片を該マトリックス上の一定位置にマウントした。この配置により、内皮出芽がマトリックス上に成長し、血管断片「カセット」全体を、分析のために細胞培養皿から回収した。血管新生の度合を、前記のとおりに評価した。
【０２１５】
免疫組織化学
免疫組織化学的検査の準備として、検出可能な血管新生応答（すなわち、新たな血管成長）を示すプレートをPBS中の4％ パラホルムアルデヒド中、4℃で一晩固定した。該固定マトリックスをパラフィン包埋した。これらの包埋マトリックスから、3μmの組織学的切片を切り出し、ポリ-L-リシンでコーティングされた顕微鏡スライド上にマウントした。該切片を3分間超音波処理し、0.1％ CaCl2中の0.1％ トリプシンで部分消化して抗原を露出させた。ついで切片を抗体と反応させ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヒツジF(ab')2抗マウスIg（Amersham, Amersham, Herts., U.K.）を検出系として使用した。該切片をジアミノベンジジンと反応させ、それと共に銀増強（silver enhancement）を行い、ヘマトキシリンで対比染色した。使用した抗体には、モノクローナルマウス抗ヒト因子VIII関連抗原（Dako, Denmark）、抗ヒト内皮細胞mAb（Gibco, Grand Island, N. Y.）、およびJohn Curtin School of Medical Researchにおいて産生されたCD31特異的mAb（クローン20G5）が含まれる。
【０２１６】
因子VIII関連抗原を検出するために、血管新生性サンプルの免疫組織化学的染色を行った。これは、該成長物が血管であるかどうかを明らかに示す反応である。また、血管を、ヒト内皮細胞（Gibco）に特異的なmAbと、および内皮細胞、血小板および幾つかの白血球上のみで発現される抗原であるCD31に対するmAbと反応させた。いくつかの場合には、典型的な内皮形態学的特徴を有する細胞を検出するために、電子顕微鏡下での血管新生サンプルの検査も行った。
【０２１７】
方法およびアッセイの正当性評価
前記のとおり、14〜21日間培養した後、血管新生を定量し、対照培養と比較した。
【０２１８】
ベースライン値を確立するために、以下の物質を試験した：
・ヘパリン（100μg/ml）、
・低分子量ヘパリン（100μg/ml）
・スラミン（血管内皮増殖因子の強力なインヒビター）（100μg/mlおよび10μg/ml）
・3-ヒドロコルチゾン（10-5 M）、
・3-ヒドロコルチゾン（10-5 M）およびヘパリン（100μg/ml）、
・酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）に対するポリクローナル中和抗体、
・塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）に対するポリクローナル中和抗体、
・aFGFに対するポリクローナル中和抗体とbFGFに対するポリクローナル中和抗体との混合物、
・血管内皮増殖因子（VEGF）に対するポリクローナル中和抗体。
【０２１９】
正当性評価基準の決定
これらの研究は、公知血管新生モジュレーターのアッセイにおいて該系が有効であることを実証するために行った。
【０２２０】
ヘパリンおよび低分子量ヘパリン（100μg/ml）は単独では通常は血管新生を抑制しない（Folkman & Brem (1992) “Angiogenesis and Inflammation,”In: INFLAMMATION, BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL CORRELATES Gallinら編, Raven Press, New York）。しかし、示されているアッセイにおいて、これらの2つの分子は、わずかではあるが有意な血管新生抑制を示した。しかし、この抑制作用は他のアッセイでは再現されないかもしれない。これとは対照的に、スラミンは100μg/mlでは血管新生を実質的に完全に抑制するが、10μg/mlではこの化合物の抑制活性は失われる。ヘパリンと同様に、ヒドロコルチゾンは単独では通常は抗血管新生活性をほとんど又は全く有さない（Folkman & Brem (1992)）。ヒドロコルチゾンは10-5 Mの比較的高い濃度では、DMSO（0.5％）希釈対照と比較して血管新生を部分的に抑制したことが公知である（引用）。しかし、この場合、ヘパリンとヒドロコルチゾンとの組合せは血管新生応答をほとんど完全に抑制した。そのような結果はin vivoで示されており、この場合、ヘパリンがステロイドと相乗作用して毛細管の成長の退縮を引き起こす（Folkman & Brem (1992)）。
【０２２１】
陽性対照
増殖因子である酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）および塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）は、公知の最も強力な血管新生因子に含まれる。より最近になって、血管内皮増殖因子（VEGF）が、特に胚発生および固形腫瘍における重要な血管新生因子として同定された。潜在的陽性対照の一覧を表1に示す。
（表１）
表1．天然に存在する血管新生刺激物質
タンパク質
・酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）
・アンギオゲニン
・塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）
・上皮増殖因子
・顆粒球コロニー刺激因子
・肝細胞増殖因子
・インターロイキン8
・胎盤増殖因子
・血小板由来内皮増殖因子
・細胞分散因子
・トランスフォーミング増殖因子
・腫瘍壊死因子α
・血管内皮増殖因子（VEGF）
小分子
・アデノシン
・1-ブチリルグリセロール
・ニコチンアミド
・プロスタグランジンE1およびE2
【０２２２】
対照抗体と比較して、bFGFに対するポリクローナル中和抗体およびaFGFに対するポリクローナル中和抗体は血管新生を部分的に抑制し、それらの2つのうちでは該抗bFGF抗体がより抑制性であることが判明した。これとは対照的に、VEGFに対する中和抗体は血管新生応答に対して全く影響を及ぼさなかった。bFGFおよびaFGFは、記載されているin vitro血管新生アッセイにおいて重要な役割を果たしているが、VEGFはそうではないことを、これらのデータは示している。
【０２２３】
陽性および／または最大応答を定量するために、自然血管新生を軽減するために培養を血清飢餓に付した。この工程は、20％ ヒト血清を含有する培地内に培養を最初の24時間にわたり維持し、ついで無血清培地内で該サンプルをその後の13〜20日間にわたり培養すること（3〜4日ごとに培地を交換した）を含むものであった。血管新生増強活性を有する疑いのある物質の別々のアリコートを、前記の個々のウェルに加える。
【０２２４】
公知血管新生促進因子に関する用量反応データの作成
種々の濃度の血管新生増殖因子bFGF、aFGFおよびVEGFを、それらが血清飢餓培養内で血管新生を増強する能力に関して評価した。標準的な用量反応分析を行った。該アッセイは、「血清飢餓（serum starved）」培養条件を用いて行うことが可能であるが、血管新生を増強する物質に関して試験する場合には、内皮細胞の生存のための無機血清構成成分を含有する培地を使用した。
【０２２５】
陰性対照
記載されている抗血管新生作用を有することが知られている因子についても、同様の用量反応分析を行った。
【０２２６】
6.2  実施例2：胎盤由来の胚様幹細胞の増殖および分化に対するThalomidTM、ActimidTMおよびRevimidTMの効果
以下の実験においては、胎盤由来の胚様幹細胞の形態学的分化に対するThalomidTM、ActimidTMおよびRevimidTMの効果を評価した。培養胚様幹細胞の形態学的分化は、DMSO（対照）、EGCF、ThalomidTM、ActimidTMまたはRevimidTMを含有する胎盤馴らし培地の存在下の14日間の培養の後に評価した。細胞を検査し、種々の細胞マーカーの存在に関して評価し、また、形態学的外観、例えば、培養皿に占める総面積、ならびに示される分枝および／または二分枝の量に関して評価した。
【０２２７】
6.2.1  材料および方法
前記第5.4節に記載のとおりに胚様幹細胞を胎盤から単離した。前記の培養条件を使用して、胚様幹細胞を培養した。  
CD34（初期造血前駆細胞のマーカー；内皮細胞マーカーでもある）、CD45（赤血球を除く全ての造血細胞のマーカー）、平滑筋細胞（SMC）特異的ミオシン重鎖、ネスチン（nestin）（血管新生のマーカー）およびグリア繊維性酸性タンパク質（GFAP）の発現に関して細胞を評価した。また、CD34細胞／TNC（細胞総数）、CD45／TNCおよびCD105細胞／TNCの比率を求めた。光学顕微鏡を使用して、占有総血管面積または領域に関して、および細胞が分枝または二分枝を示しているかどうかに関して、細胞を評価した。
【０２２８】
6.2.2  結果および考察
以下の表2〜4および図1A〜1Cに結果を要約する。表2における評価基準は以下のとおりであった：
-：染色無し；+/-：<20％ 染色；+ 20〜50％ 染色；++：50〜75％ 染色；+++：> 75％ 染色。
【０２２９】
表2の結果は、ThalomidTM、ActimidTMまたはRevimidTMの存在下で培養した場合には、CD34、CD35および平滑筋細胞（SMC）特異的ミオシン重鎖を発現する細胞の数が減少し、ネスチンおよびグリア繊維性酸性タンパク質（GFAP）を発現する細胞の数が増加したことを示している。
【表２】
2005536189.tif 000029
【０２３０】
もう1つの実験（その結果を表3に要約する）においては、DMSO（陰性対照）、ThalomidTM、ActimidTMまたはRevimidTMを含有する胎盤馴らし培地の存在下、前記の臍帯血管輪アッセイにおいて記載した条件を用いて、胎盤由来の胚様幹細胞を培養した。ついで、培養内で14日後、CD34+、CD45+およびCD105+の発現に関して該細胞を免疫染色した。
【０２３１】
結果は、ThalomidTM、ActimidTMまたはRevimidTMの存在下の培養が、CD34、CD45およびCD105を発現する細胞の数の減少を引き起こすことを示している。図2A〜2Cを参照されたい。
【表３】
2005536189.tif 000030
【０２３２】
もう1つの実験（その結果を表4に要約する）においては、EGCF、DMSO、ThalomidTM、ActimidTMまたはRevimidTMの存在下、前記の培養条件を用いて、胎盤由来の胚様幹細胞を培養した。
【０２３３】
「+」は、分枝または二分枝が観察されたことを意味し、「-」は、分枝も二分枝も観察されなかったことを意味する。表4に示す結果は、ThalomidTM、ActimidTMまたはRevimidTMの存在下の胎盤胚様幹細胞の培養が、該細胞により覆われた総血管面積／領域の減少を引き起こし、また、該細胞により示される分枝および／または二分枝を減少させることを表している。図3A、3Bを参照されたい。
【表４】
2005536189.tif 000031
【０２３４】
6.3  実施例3：in vitro血管新生アッセイにおけるサリドマイドの効果
以下の実施例は、ヒト血管新生のモジュレーターを同定するための本発明のin vitroアッセイの有効性を示す。先行技術のin vitroアッセイ、例えばラット大動脈血管新生アッセイと比較した場合、本発明のin vitroアッセイは、先行技術のアッセイによっては検出されなかった血管新生のモジュレーターの検出を可能にする、より高レベルの特異性および感度を示している。
【０２３５】
6.3.1  ラット大動脈血管新生アッセイ
12ウェルの組織培養等級のプレートを250μlのマトリゲル（Matrigel）で覆い、37℃、5％ CO2において30〜45分間ゲル化させた。8〜10週齢の雄Sprague Dawleyラットから胸大動脈を切り出し、線維脂肪性組織を除去した。該大動脈を長さ1mmの断片に切断し、EGM-2（Clonetics Corp）で8回リンスし、該マトリゲルコート化ウェル上に配置し、追加的な250μlのマトリゲルで覆い、37℃で30〜45分間ゲル化させた。該輪を2mlのEGM-2中で24時間培養した。24時間後、組換えマウスエンドスタチンをEBM中で還元（reconstitute）し、第1日に単一の処理として添加した。表5に示すとおり、ウサギミクロソームの存在下または非存在下、サリドマイドを種々の濃度（1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/mlおよび100μg/ml）で加えた。
【０２３６】
血管形成の効率的抑制を示すためには、サリドマイドはウサギミクロソームの添加を要することを、表5の結果は示した。しかし、ActimidTMは、血管形成の抑制のためにはミクロソームを要しなかった。
【表５】
2005536189.tif 000032
【０２３７】
6.3.2  ヒトの血管新生
ドナーに対する十分なインフォームドコンセントのもと、新鮮なヒト臍帯が、地元の病院から、熟練した医療従事者により集められた。該臍帯を輸送し、3時間以内に処理した。臍帯および血管内腔を冷却基礎栄養培地でリンスした。無菌区域において、機械的手段、鉗子および小さな手術用鋏を用いて、該臍帯から動脈を摘出した。該血管から結合組織を除去し、血管輪を長さ1mmに横断的に切断した。該輪を50mlの円錐底チューブ中のEGM-2培地（Clonetics Corp.）内に配置し、4℃で保存した。6ウェル組織培養プレートを250mlのマトリゲルで覆い、5％ CO2中、37℃で30〜45分間ゲル化させた。該血管輪をEGM-2培地内でリンスし、該マトリゲルコート化ウェル上に配置し、追加的な250μlのマトリゲルで覆い、37℃で30〜45分間ゲル化させた（図6を参照されたい）。該血管を4mlのEGM-2中で24時間培養して、該組織をその新たな環境に順応させた。24時間のインキュベーションの後、対照としての0.1％ DMSOまたは種々の濃度の化合物（サリドマイドまたはCC-4047）のいずれかで該輪を処理した。培地は、週2回、合計3週間にわたり交換した。
【０２３８】
培養血管輪に対する化合物の効果を血管輪に対するDMSOの効果と比較した。結果を、Image-Pro（登録商標）Plusソフトウェア（MediaCybernetics, Inc. Carlsbad, California）を使用して解析した。
【０２３９】
表6ならびに図4および5に示すとおり、サリドマイドおよびActimidTMは共に、それらをDMSO処理サンプルと比較した場合に微小血管成長の生成を用量依存的に抑制した。これらの実験は二重に行った。結果は、同じ実験における2つの輪の平均である。この実験における陽性対照としては、異なる濃度のフマギリンを使用する。
【表６】
2005536189.tif 000033
【０２４０】
このアッセイにおいては、サリドマイドが作用するのにヒトミクロソームもウサギミクロソームも要求されないことが重要である。
【０２４１】
6.4  実施例4：血管輪および幹細胞を使用する血管新生モジュレーターに関するアッセイ
血管の天然環境を効果的に再現するために、別々に培養された少なくとも10個の血管輪を幹細胞と共に共培養する。前記実施例1に示したとおりに、血管断片を得、プレーティングする。胎盤から得た胚様幹細胞を該血管断片と共にプレーティングし、血管断片および幹細胞の両方を付着させる。12時間の培養の後、非付着性幹細胞を洗浄により穏やかに除去する。該共培養を少なくとも2つの群に分ける。ついで共培養の一方の組を対照としてのDMSOで処理する。共培養のもう一方の組を試験化合物で処理する。他の共培養は陽性対照または他の対照として処理されうる。幹細胞と血管断片との共培養物を更に21日間培養する。21日間の終了時に、対照および試験共培養を検査し、血管新生の度合をイメージスキャニングにより測定する。試験共培養は、微小血管成長の平均面積が対照共培養の血管成長の平均面積より大きい場合には該試験化合物が血管新生性であることを示し、該面積が対照のものより小さい場合には該試験化合物が抗血管新生性であることを示す。
【０２４２】
6.5  実施例5：血管輪および腫瘍細胞を使用する血管新生モジュレーターに関するアッセイ
腫瘍内部または腫瘍周囲の血管の天然環境を効果的に再現するために、別々に培養された少なくとも10個の血管輪を腫瘍細胞と共に共培養する。前記実施例1に示したとおりに、血管断片を得、プレーティングする。腫瘍細胞は腫瘍サンプルまたは腫瘍細胞系から得た。腫瘍細胞を該血管断片と共にプレーティングして共培養を形成させ、血管断片および幹細胞の両方を付着させる。該共培養を少なくとも2つの群に分ける。共培養の一方の組を対照としてのDMSOで処理する。共培養のもう一方の組を試験化合物で処理する。他の共培養は陽性対照または他の対照として処理されうる。幹細胞と血管断片との共培養物を更に21日間培養する。21日間の終了時に、対照および試験共培養を検査し、血管新生の度合をイメージスキャニングにより測定する。試験共培養は、微小血管成長の平均面積が対照共培養の血管成長の平均面積より大きい場合には該試験化合物が血管新生性であることを示し、該面積が対照のものより小さい場合には該試験化合物が抗血管新生性であることを示す。
【０２４３】
本発明の範囲は、本明細書に記載されている特定の実施形態により限定されるものではない。それどころか、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の種々の修飾が前記の記載から当業者に明らかとなろう。そのような修飾も添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０２４４】
7．参考文献
本明細書中に引用されている全ての参考文献は、各個の刊行物、特許または特許出願の全体が全ての目的において参照により本明細書に組み入れられると明示的かつ個々に示されているのと同等に、それらの全体が全ての目的において参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４５】
いずれの刊行物の引用も、出願日前のその開示のためのものであり、本発明が先行発明に基づきそのような刊行物に先行する資格がないと認めるものと解釈されるべきではない。
【０２４６】
1. Folkman, J.およびBrem, H. (1992) Angiogenesis and inflammation. In :“Inflammation, Basic Principles and Clinical Correlates”. Gallin, J. I., Goldstein, I. M.およびSnyderman, R. S.編, Raven Press, New York.
2. Folkman, J. (1985) Tumour angiogenesis. Adv. Cancer Res. 43,175.
3. Folkman, J.およびKlagsbrun, M. (1987). Angiogenic factors. Science 235,442.
4. Folkman, J. (1985). Towards an understanding of angiogenesis: Search and discovery. Perspect. Biol. Med. 29,10.
5. Langer, R.およびFolkman, J. (1976). Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature 263.797.
6. Montesano, R., Orci, L.およびVassalli, P. (1983). In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell. Biol. 97,1648.
7. Madri, J. A.およびWilliams, S. K. (1983). Capillary endothelial cell cultures: phenotypic modulation by matrix components. J. Cell Biol. 97,153.
8. Kubota, Y., Kleinnmann, H. K., Martin, G. R.およびLawley, T. (1988). Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107,1589.
9. Leibovish, S. J., Polverini, S. J., Shepard, H. M., Wiseman, D. M., Shively, V.およびNuseir, N. (1987). Macrophage-induced angiogenesis is mediated by tumor necrosis factor-alpha. Science 329,640.
10. Montesano, R., Vassalli, J. D., Baird, A., Guillemin, R.およびOrci, L. (1986). Basic fibroblast growth factor induces angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 7297.
11. Montesano, R., Pepper, M. S., Vassalli, J. D.およびOrci, L. (1987). Phorbol ester induces cultured endothelial cells to invade a fibrin matrix in presence of fibrinolytic inhibitors. J. Cell. Physiol. 132,509.
12. Nicosia, R. F.およびOttinetti, A. (1990). Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63, 115.
13. Knox, P., Crooks S. Scaife. M. C.およびPatel, S. (1987). Role of plasminogen, plasmin and plasminogen activators in the migration of fibroblasts into plasma clots. J. Cell Physiol. 132,501.
14. LaRocca, R. V., Stein, C. A., Danesi, R., Jamis-Dow, C. A., Weiss, G. H.およびMyer, C. E. (1990). Suramin in adrenal cancer: modulation of steroid hormone production, cytotoxicity in vitro, and clinical antitumour effect. J. Clin. Endocrinol. Metab. 71, 497.
【図面の簡単な説明】
【０２４７】
【図１】図1（A-D）。第6.2節に記載の臍帯血管輪アッセイにおける培養細胞の光学顕微鏡写真。A．陽性対照。培地 + EGCF 200μg/mlにおいて外植片を培養した。外植片から遊走した多数の細胞が該外植片を包囲し、個々の細胞は著しい成長を示した。B．陰性対照。胎盤馴らし培地 + 補足物質において外植片を培養した。EGCFの非存在下では、外植片から遊走した細胞は陽性対照の場合（A）より少数であった。C．処理群3。胎盤馴らし培地 + EGCF 200μg/ml + ThalomidTM100μg/mlにおいて外植片を培養した。100μg/mlのThalomidTMの存在下では、細胞が外植片から遊走した距離は陽性対照の場合（A）より短かった。D．処理群2。胎盤馴らし培地 + EGCF 200μg/ml + ThalomidTM10μg/mlにおいて外植片を培養した。10μg/mlのThalomidTMの存在下では、細胞が外植片から遊走した距離は陽性対照の場合（A）より短かく、該細胞は陽性対照の場合（A）より低密度の成長を示した。
【図２】図2（A〜C）。第6.2節に記載の臍帯血管輪アッセイにおける培養細胞の光学顕微鏡写真。A．対照。培地 + ECGF 200μg/ml + DMSO 1μg/mlにおいて細胞を培養した。B．胎盤馴らし培地 + ECGF 200μg/ml + DMSO 1μg/ml + ThalomidTM1μg/mlにおいて細胞を培養した。対照（A）の場合より少数の細胞が見られる。B．胎盤馴らし培地 + ECGF 200μg/ml + DMSO 1μg/ml + ThalomidTM1μg/mlにおいて細胞を培養した。対照（A）または（B）の場合より少数の細胞が見られる。
【図３】図3（A〜B）。第6節に記載の臍帯血管輪アッセイにおける培養細胞の光学顕微鏡写真。A．対照。胎盤馴らし培地 + DMSOにおいて細胞を培養した。細胞は主として非分枝（例えば、内皮）表現型を示す。B．胎盤馴らし培地 + DMSO + ThalomidTM1μg/mlにおいて細胞を培養した。対照の場合（A）より多数の細胞が分枝（例えば、ニューロン）表現型を示す。
【図４】図4．ヒト血管新生に対する種々の濃度のThal1、ActimidTM（CG-4047）およびフマギリンの効果のグラフ表示。
【図５】図5．種々の濃度のThal1、ActimidTM（CG-4047）およびフマギリンの存在下で第6.3節に記載の臍帯血管輪アッセイにおいて培養された胎盤胚様幹細胞の光学顕微鏡写真。
【図６】図6。臍帯血管輪アッセイの図示。
【図１】
2005536189.tif 000034
【図２】
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【図３】
2005536189.tif 000036
【図４】
2005536189.tif 000037
【図５】
2005536189.tif 000038
【図６】
2005536189.tif 000039
【国際調査報告】
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