(57)【要約】抗微生物ペプチドをコードする候補核酸配列の同定方法を提供する。前記方法は、目的の最初のペプチドを同定するステップと、前記最初のペプチドをコードするゲノムＤＮＡを同定するステップと、前記最初のペプチドの各端上の隣接配列を同定するステップと、前記隣接配列に相補的なプライマーを得るステップと、ステップｅ）由来のプライマーを使用して増幅することができる候補配列を同定するために、広範な核酸配列をスクリーニングするステップとを含む。いくつかの例では、抗微生物ペプチドはヘプシジンまたはプリューロシジンである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）目的の最初のペプチドを同定するステップと、
ｂ）前記最初のペプチドをコードするゲノムＤＮＡを同定するステップと、
ｃ）前記最初のペプチドの各端上の隣接配列を同定するステップと、
ｄ）前記隣接配列に相補的なプライマーを得るステップと、
ｅ）広範な核酸配列をスクリーニングして、ステップｄ）由来のプライマーを使用して増幅することができる候補配列を同定するステップと
を含む、抗微生物ペプチドをコードする候補核酸配列を同定する方法。
【請求項２】
前記目的の最初のペプチドの正味の正電荷が少なくとも２であり、両親媒性構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記目的最初のペプチドが、ヘプシジン、プリューロシジン（ｐｌｅｕｒｏｃｉｄｉｎ）、パルダキシン、ミスグリン（ｍｉｓｇｕｒｉｎ）、ＨＦＡ−１、ピスシジン、モロネシジン（ｍｏｒｏｎｅｃｉｄｉｎ）、パラシン（ｐａｒａｓｉｎ）、またはナマズ由来のヒストン２Ａの切断産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記目的の最初のペプチドが、ヘプシジンまたはプリューロシジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｇ）候補配列によってコードされるアミノ酸配列を予想し、両親媒性構造および正味の電荷を有するペプチドをコードすることが予想される核酸配列を選択するステップをさらに含む、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項６】
候補核酸配列に対応するペプチドを得て、前記ペプチド配列を抗微生物活性についてアッセイする追加のステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記目的の最初のペプチドが抗微生物活性を有することを確認するさらなるステップ（ａ’）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項の方法を使用して同定可能な単離核酸配列。
【請求項９】
請求項８の核酸配列によってコードされることができる単離ポリペプチド。
【請求項１０】
隣接配列を含む単離核酸配列。
【請求項１１】
ａ．抗微生物ペプチドをコードする標的配列の５’末端または５’末端付近に存在する第１の隣接配列と少なくとも９５％同一の第１の核酸配列と、
ｂ．抗微生物ペプチドをコードする標的配列の３’末端または３’末端付近に存在する第２の隣接配列と少なくとも９５％同一の第２の核酸配列と、
ｃ．請求項１に記載の方法を実施するための説明書と
を含む、キット。
【請求項１２】
抗微生物ペプチドの同定または増幅における少なくとも１つのシグナル配列Ｉ、酸性配列Ｉ、シグナルペプチドＩＩ、シグナルペプチドＩＩＩ、シグナルペプチドＩＶ、シグナルペプチドＶ、プロ配列Ｉ、プロ配列ＩＩ、これらをコードする核酸配列、およびこのようなコードする核酸に実質的に相補的な核酸配列の使用。
【請求項１３】
下記のペプチドａ、ｂ、ｃ、またはｄのうちの１つと少なくとも８０％相同な単離された抗微生物ペプチド。
ペプチドａ  ＧＷ（Ｇ／Ｋ）ＸＸＦＸＫ
ペプチドｂ  ＧＸＸＸＸＸＸＸＨＸＧＸＸＩＨ
ペプチドｃ  ＦＫＣＫＦＣＣＧＣＣＸＸＧＶＣＧＸＣＣ
ペプチドｄ  ＣＸＸＣＣＮＣＣ（Ｋ／Ｈ）ＸＫＧＣＧＦＣＣＫＦ
ペプチドｅ  ＦＫＣＫＦＣＣＧＣＲＣＧＸＸＣＧＬＣＣＫＦ
ペプチドｆ  ＸＸＸＣＸＸＣＣＮＸＸＧＣＧＸＣＣＫＸ
【請求項１４】
ペプチドａ、ｂ、ｃ、またはｄのうちの１つと少なくとも９０％相同な請求項１３に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１５】
ペプチドａ、ｂ、ｃ、またはｄのうちの１つである、請求項１３に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１６】
付録Ｉまたは付録ＩＩに記載の単離核酸配列。
【請求項１７】
表４または１３に記載の単離核酸配列。
【請求項１８】
ａ）目的の最初のペプチドをコードする核酸配列を同定するステップと、
ｂ）前記最初のペプチドをコードするゲノムＤＮＡを同定するステップと、
ｃ）前記最初のペプチドの各端上の隣接配列を同定するステップと、
ｄ）前記隣接配列に相補的なプライマーを得るステップと、
ｅ）広範な核酸配列をスクリーニングして、ステップｄ）由来のプライマーを使用して増幅することができる候補配列を同定するステップと、
を含む、抗微生物ペプチドをコードする候補核酸配列を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
抗微生物ペプチドは、広範な植物および動物から単離されており、微生物の侵入からの防御において重要な役割を果たす。これらは二次構造およびアミノ酸配列の類似性に基づいて以下の３つの主なクラスに分類される。αヘリックス構造、高ジスルフィド結合（システインリッチ）βシート、およびプロリンまたはアルギニンなどの単一アミノ酸の比率が高いもの。ほとんどの分子は両親媒性であり、陽イオン性および疎水性表面の両方を含み、生体膜内に挿入することができる。抗微生物ペプチドの作用様式の１つは病原体の溶解と説明されているが、これらはまた細胞内標的への結合によってその効果を示し得る。これらは、炎症の媒介および免疫応答の調整などの多数の効果を発揮することも報告されている。
【０００２】
少数の天然の抗微生物ペプチドが硬骨魚から単離されている（カレイの皮膚由来のプリューロシジン（Ｃｏｌｅ，Ｗｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）、レッドシームースソール（紅海テンジクガレイ、Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｍｏｓｅｓ  ｓｏｌｅ）由来のパルダキシン（Ｏｒｅｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｉ  １９９６）、ドジョウ由来のミスグルニン（ｍｉｓｇｕｒｎｉｎ）（Ｐａｒｋ，Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）、ヌタウナギ由来のＨＦＡ−１（Ｈｗａｎｇ，Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）、シマスズキ雑種の好酸性顆粒細胞由来のピスシジン（Ｓｉｌｐｈａｄｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｎｏｇａ  ２００１），シマスズキ雑種由来のモロネシジン（ｍｏｒｏｎｅｃｉｄｉｎｓ）（Ｌａｕｔｈ，Ｓｈｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２）、ナマズ由来のヒストン２Ａの切断産物（パラシン（ｐａｒａｓｉｎ））（Ｐａｒｋ，Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）、ならびにコイ（ＬｅＭａｉｔｒｅ，Ｏｒａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）およびマス（Ｓｍｉｔｈ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００）由来のいくつかの特徴付けられていない粘性分泌物が含まれる）。さらに、陽イオン性ステロイド系抗生物質（スクアラミン）が、サメ（Ｓｑｕａｌｕｓ  ａｃａｎｔｈｉａｓ）から単離されている（Ｍｏｏｒｅ，Ｗｅｈｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。
【０００３】
デフェンシンファミリーのシステインリッチな抗微生物ペプチドが、昆虫の脂肪体内ならびに軟体動物および甲殻類の血リンパで検出されている。これらはまた、哺乳動物の種々の上皮ならびに好中球およびマクロファージなどの循環細胞から単離されている。最近、種々の真菌、グラム陽性およびグラム陰性細菌に対して抗微生物活性を示す小システインリッチペプチドが、血液限外濾過液（Ｋｒａｕｓｅ，Ｎｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、ヒト尿路（Ｐａｒｋ，Ｖａｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、および細菌攻撃誘発シマスズキ雑種の鰓（Ｓｈｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２）から単離されている。ヘプシジンまたはＬＥＡＰ−１（肝臓発現抗微生物ペプチド）と呼ばれるこれらのペプチドは、感染に応答して脂肪体中に含まれる昆虫ペプチドの脊椎動物対応物であると提案されている（Ｐａｒｋ，Ｖａｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【０００４】
抗微生物ペプチドは、種々の潜在的な用途を有する（例えば、Ｈａｎｃｏｃｋに付与された米国特許第６，２８８，２１２号を参照のこと）。
【０００５】
抗微生物ペプチドの従来の同定アプローチは、組織または分泌物からの生化学的精製を含む。画分を抗微生物活性について試験し、活性を示す精製ペプチドを配列決定する。このアプローチは費用が高く、長時間を要し、希少または精製が困難な抗微生物ペプチドの同定にはあまり適切ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、潜在的な抗微生物ペプチドの同定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のある態様では、
ａ）目的の最初のペプチドを同定するステップと、
ｂ）前記最初のペプチドをコードするゲノムＤＮＡを同定するステップと、
ｃ）前記最初のペプチドの各端上の隣接配列を同定するステップと、
ｄ）前記隣接配列に相補的なプライマーを得るステップと、
ｅ）ステップｄ）由来のプライマーを使用して増幅することができる候補配列を同定するために、広範な核酸配列をスクリーニングするステップと
を含む、抗微生物ペプチドをコードする候補核酸配列を同定する方法を提供する。
【０００８】
本発明の１つの態様によれば、ヘプシジン様ペプチドのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を提供する。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、プリューロシジン様ペプチドのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、新規の抗微生物ペプチドをコードする核酸配列の同定、単離、および／または増幅での使用に適切なプライマーを提供する。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、抗微生物ペプチドをコードする核酸配列ファミリーの同定方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の方法は、抗微生物ペプチド（プリューロシジンおよびヘプシジンが含まれるが、これらに限定されない）周辺の隣接配列が保存されているという驚くべき発見に基づく。本発明の方法は、プリューロシジンおよびヘプシジンをコードするヌクレオチド配列の同定手段ならびにコードされたポリペプチド配列の同定手段を提供する。
【００１３】
１つの実施形態では、本方法は、一般に、１つのファミリーメンバーの同定による抗微生物ペプチドファミリーメンバーの同定方法を提供する。最初のファミリーメンバーは、目的の最初のペプチドであり得る。最初の目的のペプチドを、公知もしくは報告された抗微生物活性または他の公知の抗微生物ペプチドとの配列類似性のいずれかに基づいて同定することができる。一旦最初のペプチドが同定されると、これをコードするゲノムＤＮＡが同定され、その隣接配列が決定される。
【００１４】
本明細書中で使用される用語「隣接配列」は、抗微生物ペプチドをコードする標的核酸配列の一方または両方の末端またはその付近に存在する核酸配列をいう。
【００１５】
本明細書中で使用される「核酸配列」は、（コード領域内であろうと、コード領域の外側であろうと）、配列の一部が遺伝子末端の５０核酸以内である場合に、「標的配列の末端またはその付近」に存在する。
【００１６】
目的の最初のペプチドが公知の抗微生物活性を有する別のペプチドとの配列類似性に基づいて同定される場合、好ましくは、最初のペプチドは両親媒性構造および正味の電荷を有する。ある場合には、好ましくは、電荷は少なくとも２の正味の正電荷である。ある場合には、ペプチドは、公知の抗微生物活性を有するペプチドと少なくとも７５％、８５％、または９５％の配列が同一である。ある場合には、同定された配列類似性は、公知のペプチドをコードする核酸配列と目的のペプチドをコードする核酸配列との間の類似性に関連してもよい。このような場合には、目的のペプチドについての推定ペプチドを、推定電荷および両親媒性構造に関して考慮する。
【００１７】
例えば、プリューロシジンおよびヘプシジンのプレプロ配列が保存される傾向がある。従って、このような配列に特異的な核酸プライマーの使用により、潜在的なプリューロシジンおよびヘプシジンのコード配列を同定することができる。あるいはまたはさらに、保存されたプレプロ配列をコードするようである領域を同定するために抗微生物ペプチドの他のクラスの公知の遺伝子配列を試験することができ、このペプチドファミリーの他のメンバーを同定するために類似のストラテジーを使用することができる。このような配列によってコードされる対応する抗微生物ペプチドを、ほとんどのプリューロシジンおよびヘプシジンで見出される一般的な特徴（例えば、少なくとも２の正味の正電荷および両親媒性構造など）を使用して予想することができる。
【００１８】
抗微生物ペプチドのプレ、プロ、およびプレプロ配列に関して本明細書中で使用される、「プレ」および「プロ」は、以下の意味を有する。「プレ」は、ペプチドのシグナルペプチド部分（またはその機能的部分）をいう。「プロ」は、プロピース（ｐｒｏｐｉｅｃｅ）をいう。プリューロシジンでは、プロピースはカルボキシ末端の陰イオン性領域である。ヘプシジンでは、プロピースは、成熟ペプチドの上流領域である。本明細書中に開示の非限定的な例では、プリューロシジンプライマーをプレおよびプロ領域に基づいてデザインし、ヘプシジンプライマーをプレ領域および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に基づいてデザインした。
【００１９】
ＰＣＲを使用して、潜在的なプリューロシジンまたはヘプシジンをコードする核酸配列を増幅することができる。ＰＣＲプライマー対（一方は目的のペプチド型中に保存されたアミノ末端プレプロ配列をコードするポリヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を認識し、他方は、目的のペプチド型をコードするヌクレオチド中の３’保存領域に相補的な核酸配列を認識する）の使用によって、ＰＣＲを都合よく行うことができる。他のプレプロ配列が存在することができ、且つ特に意図されるときに有用である。例えば、遺伝コードの縮重により複数の核酸配列が特定のアミノ酸配列をコードされるときである。５’プレプロ配列に関して考察するように、他の３’保存配列が存在することができ、且つ特に意図される。プライマーをデザインする場合、配列増幅が探求される種の公知のコドン利用頻度情報に関する基準を有することが有用である。
【００２０】
本発明の１つの実施形態では、潜在的なプリューロシジンの同定または増幅におけるシグナル配列Ｉまたはこれをコードする核酸配列の使用を提供する。
【００２１】
シグナル配列Ｉ
ＭＫＦＴＡＴＦＬ（Ｘ）n（Ｌ）o（Ｆ）pＩ（Ｆ）q（Ｘ）yＶＬＭ（Ｘ）z（Ｖ）r（Ｅ）s（Ｄ）t（Ｐ）u（Ｌ）vＧＥ（Ｃ）w（Ｇ）x
式中：
ｎは１〜３である        ｕは０または１である
ｏは０〜２である        ｖは０または１である
ｐは０または１である    ｗは０または１である
ｒは０または１である
ｓは０または１である    ｘは０または１である
ｔは０または１である    ｙは０または１である
ｚは０または１である
以下の制限を含む。
ｘ＋ｏ＋ｐ＝３、        ｓ＋ｔ＝１、
ｕ＋ｖ＝１、            ｗ＋ｘ＝１、および
ｑ＋＝１。
【００２２】
本発明の１つの実施形態では、潜在的なプリューロシジンの同定または増幅における配列ＰＬ１またはＰＬ２の１つまたは両方またはこれらをコードする核酸配列の使用を提供する。
【００２３】
ＰＬ１    ＧＣＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＴＴＣＧＣＡＡＧ
ＰＬ２    ＣＴＧＡＡＧＧＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＧＣＧ
【００２４】
本発明の１つの実施形態では、潜在的なプリューロシジンの同定または増幅における酸性配列Ｉまたはこれをコードする核酸配列の使用を提供する。
【００２５】
酸性配列Ｉ
（Ｙ）a（Ｘ）b（Ｘ）c（Ｅ）d（Ｘ）e（Ｑ）f（Ｅ）gＬ（Ｎ／Ｄ）ＫＲ（Ａ／Ｓ）ＶＤ（Ｄ／Ｅ）
式中：
ａは０または１である      ｅは１〜３である
ｂは０または１である      ｆは０または１である
ｃは１または２である      ｇは０または１である
ｄは０または１である
以下の制限を含む。
ａ＋ｂ＝１、
ｃ＋ｄ＝２、および
ｅ＋ｆ＋ｇ＝３。
【００２６】
本明細書中の配列中で使用される、「Ｘ」は、任意のアミノ酸をいう。このような核酸配列に相補的な核酸配列であるので、シグナル配列Ｉおよび酸性配列Ｉをコードする核酸配列が特に意図される。
【００２７】
本発明の１つの実施形態では、ヘプシジンの同定または増幅におけるシグナルペプチドＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、またはこれらをコードする核酸の使用を提供する。
【００２８】
シグナルペプチドＩＩ
ＭＫＸＸＸＸＡＸＸＶＸＸＶＬ
【００２９】
シグナルペプチドＩＩＩ
ＭＫＴＦＳＶＡＶ
【００３０】
シグナルペプチドＩＶ
ＭＫＴＦＳＶＡＶＴＶＡＶＶＬＸＦＩＣＩＱＱＳＳＡ
【００３１】
シグナルペプチドＶ
ＭＫＴＦＳＶＡＶＡＶ（Ｔ／Ｖ）（Ｌ／Ｖ）ＶＬＡ（Ｆ）n（Ｖ／Ｃ）（Ｃ／Ｍ）（Ｉ／Ｆ）（Ｑ／Ｉ）Ｘ（Ｘ）mＳ（Ｓ／Ｔ）ＡＶＰＦＸＸＶ
（式中、ｎは０または１であり、ｍは０または１である）。
【００３２】
本発明の１つの実施形態では、ヘプシジンの同定または増幅におけるプロ配列Ｉ、プロ配列ＩＩ、またはこれらをコードするヌクレオチド配列またはこれらをコードするヌクレオチド配列に相補的な配列の使用を提供する。
【００３３】
プロ配列Ｉ
ＰＥＶＱＸＬＥＥＡＸＳＸＤＮＡＡＡＥＨＱＥ
【００３４】
プロ配列ＩＩ
ＰＦＸＸＶＸ（Ｘ）n（Ｌ／Ｔ）ＥＥＶ（Ｅ／Ｇ）（Ｇ／Ｓ）ＸＤ（Ｔ／Ｓ）ＰＶ（Ａ／Ｇ）ＸＨＱ
（式中、ｎは０または１である）
【００３５】
本発明の１つの実施形態では、ヘプシジンの同定または増幅におけるＨｃＰＡ３ｂ３’および／またはＨｃＳａｌ３’またはこれらをコードするヌクレオチド配列またはこれらをコードするヌクレオチド配列に相補的な配列の使用を提供する。
【００３６】
ＨｃＰａ３ｂ３'      ３'ＡＣＡＡＣＣＴＣＧＴＣＣＴＴＡＧＧ５'
ＨｃＳａｌ３'        ３'ＡＣＧＣＣＣＧＴＣＣＡＧＧＡＡＴ５'
【００３７】
＜非限定的な使用例＞
抗微生物ペプチドは、種々の被験体（魚類、爬虫類、鳥類、哺乳動物、両生類、および昆虫類が含まれる）の感染の治療および／または予防で有用である。
【００３８】
抗微生物ペプチドはまた、細菌の増殖および／または表面上の蓄積の減少に有用である。これは食品産業で特に有利であり、抗微生物ペプチドを食品の処理、調製、および／または輸送容器で使用する表面コーティングに使用することができる。
【００３９】
本明細書中に開示の抗微生物ペプチドを種々の方法で投与することができる。ある場合には、経口投与が望ましい。特定の消化段階で優先的に放出されるようなペプチドのカプセル化によって、いくつかの経口投与型が改良されている。ある場合には、（例えば、安定性を改良するか活性を調整するために）投与ペプチド中にプレ配列および／またはプロ配列を含めることが望ましい。プレ配列および／またはプロ配列を、適切な段階での内因性プロテアーゼによって切断して除去することができる。被験体が呼吸する吸入または鰓を取った被験体への水の添加によってペプチドを投与することができる。場合によっては注射による投与が望ましい。任意の数の部位にペプチドを注射することができる。ある場合には、静脈内注射が望ましい。またある場合には、感染部位または潜在的感染部位に直接または隣接部位に注射するのが望ましい。ある場合には、局所投与が望ましい。離れた部位および特異的部位での抗微生物ペプチドの存在が望ましい場合または長期間の抗微生物ペプチドの存在が望ましい場合、遺伝子治療を使用して、目的の組織中に１つまたは複数の抗微生物ペプチドを発現させることができる。
【００４０】
被験体が培養または飼育された生物（魚類、鳥類、または非ヒト哺乳動物など）である場合、１つまたは複数の抗微生物ペプチドを発現するトランスジェニック変種の産生が望ましい。トランスジェニック動物の産生方法は周知である（例えば、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：３３８，２００２を参照のこと）。
【００４１】
種々の抗微生物ペプチドが意図され、本発明の範囲内に含まれる。非限定的な例として、以下のアミノ酸配列またはこれらの配列と少なくとも８０％または９０％相同な配列を含むペプチドおよびこれらをコードする核酸配列が特に意図される。
ｉ）ＧＷ（Ｇ／Ｋ）ＸＸＦＸＫ
ｉｉ）ＧＸＸＸＸＸＸＸＨＸＧＸＸＩＨ
ｉｉｉ）ＦＫＣＫＦＣＣＧＣＣＸＸＧＶＣＧＸＣＣ
ｉｖ）ＣＸＸＣＣＮＣＣ（Ｋ／Ｈ）ＸＫＧＣＧＦＣＣＫＦ
ｖ）ＦＫＣＫＦＣＣＧＣＲＣＧＸＸＣＧＬＣＣＫＦ
ｖｉ）ＸＸＸＣＸＸＣＣＮＸＸＧＣＧＸＣＣＫＸ
【００４２】
目的の抗微生物配列の他の特定の非限定的な例を、表４および表１１で見出すことができる。
【００４３】
本発明の抗微生物ペプチドを修飾することができる。このような修飾により、いくつかの場合、ペプチドの安定性または活性を改良することができる。特に意図される修飾の例には、以下が含まれる。
−保存的アミノ酸置換（酸性から酸性、塩基性から塩基性、中性から中性、極性から極性、疎水性から疎水性への置換など）、
−片方の末端または両末端での正電荷のアミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）の付加、
−Ｄ型アミノ酸およびペプチド模倣物を含む構造を変化させる可能性が低いアミノ酸の他のアミノ酸との置換、
−１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失、
−Ｃ末端またはＮ末端の修飾（メチルエステルおよびアミデートが含まれる）、
−ペプチドの環状化バージョン（悪影響を与える活性を得ることなく安定性を増大させることができる）。
【実施例】
【００４４】
＜実施例−方法＞
魚類の飼育
カレイの仔魚を記載のように飼育した（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｇａｗｌｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）（参照することにより、その開示が本明細書中で組み込まれる）。セントジョン川に放流したタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ  Ｌ．）を、Ｄａｌｈｏｕｓｉｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｑｕａｔｒｏｎ  ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｈａｌｉｆａｘ，Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａにてシングルパス（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ）の加熱および脱塩素した１２℃の淡水で維持した。全ての魚を過剰量のメタンスルホン酸トリカイン（ＭＳ  ２２２，０．１ｇ  Ｌ-1，Ａｒｇｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ，ＵＳＡ）で安楽死させた後にサンプリングした。全ての動物の手順は、Ｄａｌｈｏｕｓｉｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ−Ｈａｌｉｆａｘ  Ｌｏｃａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅで承認されていた。
【００４５】
微生物での攻撃誘発
エロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）の亜種サルモニシダＡ４４９株（Ｔｒｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８３）を、１７℃のトリプシンソイブロス（ＴＳＢ）中で対数増殖中期まで培養した。細菌懸濁液の６００ｎｍでの吸光度を決定し、細菌を滅菌ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中に約５×１０7ｃｆｕｍＬ-1に再懸濁した。３匹のサケ（各２００ｇ）を、５０ｍｇＬ-1ＴＭＳで麻酔し、２．５×１０6ｃｆｕの細菌を含む５０μＬのＨＢＳＳを腹腔内注射し、淡水に戻した。同一のコホート由来の注射していない魚を、コントロールとして個別のタンクで維持した。注射から３日後、コントロールおよび感染サケを上記のように安楽死させ、組織サンプルを取り出した。尾静脈からヘパリン処理コンテナに採血した。魚がＡ．サルモニシダについて陽性であることを確認するために、感染およびコントロール魚の腎臓後部をふき取り、トリプシンソイ寒天（ＴＳＡ）の接種に使用し、室温で一晩インキュベートした。Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ，Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ，Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａで実施した細菌攻撃誘発研究からタイセイヨウオヒョウ組織サンプルを得た。
【００４６】
サンプリング
組織（食道、胃、幽門垂、肝臓、脾臓、腸、腎臓前部、腎臓後部、鰓、皮膚、卵巣、直腸、心臓、筋肉および脳）をＲＮＡＬａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）に取り出し、使用するまで−８０℃に維持した。異なる段階のカレイの仔魚および幼魚のサンプルをＲＮＡＬａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）でリンスし、０．５〜１．２５ｍｌ  ＲＮＡＬａｔｅｒを含む１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、使用するまで−８０℃で維持した。
【００４７】
プリューロシジン
従った一般的なアプローチを図２４に示す。
【００４８】
プリューロシジンｃＤＮＡの単離
カレイの皮膚から構築したｃＤＮＡライブラリー（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ  １９９６）を、縮重オリゴヌクレオチド（ＰｌｅｕｒｏＡ、ＰｌｅｕｒｏＢ；表１）を使用してスクリーニングした。ライブラリーを８０，０００ファージ／プレートでプレートし、８つの各プレートから２枚のＨｙＢｏｎｄフィルターに転写する。標準的な手順を使用して放射性末端標識ＰｌｅｕｒｏＡおよびＰｌｅｕｒｏＢプローブの混合物を５０℃でフィルターとハイブリッド形成させ、フィルターを５０℃の１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で４５分間洗浄した。両方の複製フィルター上に適合したハイブリッド形成シグナルを示すプラークを選択し、組換えプラークの純度が１００％になるまでライブラリーを再スクリーニングした。ＡＢＩ３７３ストレッチ自動シーケンサーおよびＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して２つの組換え体を完全に配列決定した。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）およびＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒを使用して、配列データを分析した。ＳｉｇｎａｌＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）を使用して、アミノ末端シグナル配列を予想した。ＧＣＧパッケージのヘリックスホイールルーチン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍ）を使用して、予想した抗微生物ペプチド配列のヘリックス構造をモデリングした。
【００４９】
ゲノムＰＣＲ
カレイプリューロシジンｃＤＮＡに特異的な２組のプライマー（ＰＬ１／ＰＬ２およびＰＬ５’／ＰＬ３’；表１；図１）を使用して、ゲノム配列を増幅した。増幅条件は、９４℃で１分間；９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間を３５サイクル、ならびに７２℃で２分間であり、産物を１％アガロースゲルで分離した。ゲルからバンドを切り出し、Ｇｅｎｅ−Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ１０１，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して抽出し、製造者が推奨するようにＴｏｐｏＴＡ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）にクローニングした。上記のように、各形質転換由来のいくつかの単離物を配列決定して分析した。ｃＤＮＡ配列との比較によってイントロンの位置を同定した。
【００５０】
ＲＴ−ＰＣＲによるさらなるカレイプリューロシジン様配列の同定
実質的にＤｏｕｇｌａｓ，Ｇａｗｌｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）に記載のように、カレイの皮膚および腸から総ＲＮＡを単離した。製造者の説明書に従ってＲＥＴＲＯＳｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を使用して２μｇの総ＲＮＡの逆転写を行った。ＰＬ３'および前駆体ポリペプチドのアミノ末端に対応するプライマー（ＰＬ５'；表１）を使用してＰＣＲを行った。増幅条件は、９４℃で１分間；９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間を３２サイクル、ならびに７２℃で２分間であり、産物を２％ＮｕＳｅｉｖｅゲルで分離した。上記のようにバンドを切り出し、クローニングし、配列決定した。
【００５１】
異なる組織由来のさらなるプリューロシジン様配列の同定
プリューロシジンの組織特異的発現を、成魚の皮膚、肝臓、卵巣、筋肉、脾臓、幽門垂、胃、および腸由来のポリアデニル化ＲＮＡ（５００ｎｇ）を使用したノーザン分析によって調査した。ＷＦ２に対応するｃＤＮＡクローン由来の全インサートを放射性標識し、ブロットと共に６０℃のＵｌｔｒａＨｙｂハイブリッド形成溶液（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）中で一晩インキュベートした。ブロットを、５０℃の１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳのストリンジェンシーで１時間洗浄後、Ｘ線フィルムに曝露した。種々の組織中の異なるプリューロシジン様変異型の発現をアッセイするために、ＷＦ１、ＷＦ１ａ、ＷＦ２、ＷＦ３、ＷＦ４、ＷＦＹＴ、およびＷＦＸ（表２）に特異的なプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲも行った。使用条件は、アニーリング温度が５２℃であること以外は前のパラグラフに記載のとおりであった。
【００５２】
異なる成長段階由来のさらなるプリューロシジン様配列の同定
２つの仔魚期間を使用して、プリューロシジン様遺伝子の成長発現を評価した。第１に、２０匹の全仔魚（孵化５日後および１３日後）、１０匹の変態中の仔魚（孵化２０日後）、および新規に変態した仔魚（孵化２７日後）のプールしたサンプル、２匹の幼魚（孵化４１日後）の腸組織、成魚の上側および下側の皮膚、ならびに成魚の上方および下方の腸由来の組織からＲＮＡを単離した。記載のようにＲＮＡを単離し（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｇａｗｌｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）（参照することにより、その開示が本明細書中に組み込まれる）、プライマーＰＬ５’およびＰＬ２および上記のＲＴ−ＰＣＲ条件を使用してアッセイを行った。ハウスキーピング遺伝子の安定な発現レベルを確認してプリューロシジン発現の腸コントロールを得るために、以前に記載のように（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｂｕｌｌｅｒｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）（参照することによりその開示が本明細書中に組み込まれる）アクチンｍＲＮＡの増幅を行った。第２の仔魚期間では、２０匹の全仔魚（孵化５日後および９日後）、および１０匹の全仔魚（孵化１５、２０、２５、３０、および３６日後）のプールしたサンプルならびに２匹の幼魚（孵化４１日後）の腸組織からＲＮＡを単離した。異なる成長段階での異なるプリューロシジン様変異型の発現を決定するために、ＷＦ１、ＷＦ１ａ、ＷＦ２、ＷＦ３、ＷＦ４、ＷＦＹＴ、およびＷＦＸに特異的なプライマーを使用してアッセイを行った（表２）。使用条件は、前のパラグラフに記載のものである。
【００５３】
サザン分析
プローブとしてＷＦ１、ＷＦ２、ＷＦ３、およびＷＦ４に対応するゲノムクローン由来の全インサートを使用して、カレイ、３つの他のフラットフィッシュ（ｆｌａｔｆｉｓｈ）（グリーンランドアカガレイ（Ｈｉｐｐｏｇｌｏｓｓｕｓ  ｐｌａｔｅｓｓｏｉｄｅｓ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）、タイセイヨウオヒョウ（Ｈｉｐｐｏｇｌｏｓｓｕｓ  ｈｙｐｐｏｇｌｏｓｓｕｓ  Ｌ．）、およびイエローテールフラウンダー（Ｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓ  ｆｅｒｒｕｇｉｅａ  Ｓｔｏｒｅｒ）、コダラ（Ｍｅｌａｎｏｇｒａｍｍｕｓ  ａｅｇｌｅｆｉｎｕｓ  Ｌ．）、ポラック（Ｐｏｌｌａｃｈｉｕｓ  ｖｉｒｅｎｓ  Ｌ．）、およびワカサギ（Ｏｓｍｅｒｕｓ  ｍｏｒｄａｘ  Ｍｉｔｃｈｉｌｌ）由来のＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩ消化ゲノムＤＮＡのサザン分析を連続して行った。以前に記載されたように６５℃で一晩ハイブリッド形成を行い（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｇａｌｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）（参照することによりその開示が本明細書中に組み込まれる）、ブロットを、６５℃の０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１時間洗浄し、Ｘ線フィルムに曝露した。ボイルした０．５％ＳＤＳ中での２回のインキュベーションによってブロットをすすぎ、Ｘ線フィルムへの一晩の曝露によって残存シグナルをチェックした。
【００５４】
他の魚類由来のさらなるプリューロシジン様配列の同定
イエローテールフラウンダー、ウィッチフラウンダー、およびタイセイヨウオヒョウの皮膚および腸から総ＲＮＡを単離し、上記のように逆転写した（ＲＴ−ＰＣＲ分析）。イエローテールフラウンダー、ウィッチフラウンダー、グリーンランドアカガレイ、およびタイセイヨウオヒョウの精巣ならびにペトレールソール、シーオーソール、イギリスガレイ、ヌマガレイ、プレイス、カラスガレイ、およびオヒョウの組織サンプルから総ゲノムＤＮＡを単離した。カレイプリューロシジンｃＤＮＡに特異的な２組のプライマー（ＰＬ１／ＰＬ２およびＰＬ５’／ＰＬ３’；表１；図１）を使用し、増幅条件は、９４℃で１分間；９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間を３２サイクル、ならびに７２℃で２分間であった。上記のように産物を２％ＮｕＳｅｉｖｅゲルで分離し、バンドを切り出し、クローニングし、配列決定した。
【００５５】
図１は、カレイ由来のＷＦ２プリューロシジンのテキストおよび図である。Ａ．皮膚ライブラリーから単離したカレイ由来のプリューロシジンのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。ＰＣＲのために使用したプライマーの位置に下線を引き、推定アミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に大文字で示す。矢印は、プリューロシジンペプチドの成熟５’末端および３’末端を示し、ダイヤモンドはイントロンの位置を示す。１つのＳｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＡＧＣＴＣ）および推定ポリアデニル化部位（ａａｔａａａ）を太字で示す。Ｂ．ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ（Ｍａｒｃｋ  １９９２）のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅオプションを使用して構築した推定プリューロシジンポリペプチドＷＦ２の疎水性プロット。成熟プリューロシジンの境界を垂直方向の矢印で示す。Ｃ．ＧＣＧのヘリックスホイールルーチンを使用して構築した推定プリューロシジンポリペプチドＷＦ２のヘリックス構造の概略図。疎水性残基およびグリシンをボックスで囲み、極性残基を囲まない。成熟ポリペプチドの第１のアミノ酸（Ｇ）が、ホイールの上部に見出される。
【００５６】
カレイゲノム中のプリューロシジン様配列の同定
プリューロシジンのための放射性標識プローブ（ＷＦ２；Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）を使用して、カレイゲノムλ−ＧＥＭライブラリーをスクリーニングした。４つのクローンを選択し、純度が１００％になるまで再プレートした。ＢａｍＨＩ、ＳｓｔＩ、ＸｈｏＩ、およびＥｃｏＲＩを使用してクローンをマッピングし、配列決定のために制限パターンが異なる２つのクローン（λ１．１およびλ５．１）を選択した。両クローンをＡＢＩ３７３ストレッチ自動シーケンサーおよびＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して完全に配列決定した。ＴｒａｎｓＦａｃおよびＴＦＤデータベースを使用したＷＷＷ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｓｉｇｎａｌ／）を使用して転写因子結合部位を同定し、ベイラー医科大学で利用可能な神経回路網ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｅｑ−ｓｅａｒｃｈ／ｇｅｎｅ−ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）による真核生物プロモーター予測を使用してプロモーターを検出した。
【００５７】
ヘプシジン
従った一般的アプローチを図２４に示す。
【００５８】
ヘプシジンｃＤＮＡ分子の特徴づけ
ヒトヘプシジンと高い類似性を示す８つのＥＳＴを、カレイＥＳＴデータベース（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｇａｌｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）から同定し、４つのＥＳＴをタイセイヨウサケデータベース（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｔｓｏｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２）から同定した。ｄｂＥＳＴをスクリーニングするためにこれらの配列を使用して、ＢＬＡＳＴＸ分析により、ヒラメ由来の２つの関連配列（Ｃ２３２９８．１およびＣ２３４３２．１）、ニジマス由来の１つの配列（ＡＦ２８１３５４＿１）、およびメダカ由来の５つの同一配列（ＡＵ１７８９６６、ＡＵ１７９２２２、ＡＵ１７９３１４、ＡＵ１７９７６８、およびＡＵ１８００４４）が明らかとなった。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）およびＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ（Ｍａｒｃｋ  １９９２）を使用して、配列データを分析した。ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）を使用してアラインメントおよび類似性行列を計算し、ＳｅｑＶｕ（Ｇａｒｖａｎ  １９９６）を使用してグラフ化した。オンラインサーバＰＳＯＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ＰＳＯＲＴ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ）、Ｃｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｈｃｕｇｅ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｉ#ｔｏｏｌ）、およびＮｅｔｗｏｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＠ｎａｌｙｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｅｃｐｒｅｄ#ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ｐｌ）を使用して、Ｎ末端シグナル配列、ｐＩおよび二次構造のそれぞれを予想した。二次構造推定プログラムには、７つの異なるアルゴリズム（詳細については、ウェブサイトを参照のこと）を使用し、これらの結果に基づいてコンセンサスによる予想を行った。
【００５９】
サザンハイブリッド形成
以前に記載のように（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｂｕｌｌｅｒｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）（その開示が本明細書中で組み込まれる）、カレイ（Ｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓ  ａｎｅｒｉｃａｎｕｓ）、イエローテールフラウンダー（Ｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓ  ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ）、ウィッチフラウンダー（Ｇｌｙｐｔｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｃｙｎｏｇｌｏｓｓｕｓ）、ヒラメ（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、グリーンランドアカガレイ（Ｈｉｐｐｏｇｌｏｓｓｏｉｄｅｓ  ｐｌａｔｅｓｓｏｉｄｅｓ）、タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）、ハドック（Ｍｅｌａｎｏｇｒａｍｍｕｓ  ａｅｇｌｅｆｉｎｕｓ）、ワカサギ（Ｏｓｍｅｒｕｓ  ｍｏｒｄａｘ）、ヌタウナギ（Ｅｐｔａｔｒｅｔｕｓ  ｂｕｒｇｅｒｉ）、トラザメ（Ｓｃｙｌｉｏｒｈｉｎｕｓ  ｔｏｒａｚａｍｅ）、およびシロチョウザメ（Ａｃｉｐｅｎｓｅｒ  ｔｒａｎｓｍｏｎｔａｎｕｓ）から総ゲノムＤＮＡを調製した。製造者の説明書に従ってＤＮＡ（７．５μｇ）をＳｓｔＩで消化し、フラグメントを１％アガロースゲルで分離した。Ｉ型カレイヘプシジンのアミノ酸残基ＷＭＥＮＰＴ．．．．ＧＣＧＦＣＣに対応する１０４ｂｐのプローブを、ＤＩＧ標識キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｖａｌ，ＰＱ，Ｃａｎａｄａ）を使用して標識し、Ｅａｓｙ  Ｈｙｂキット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｖａｌ，ＰＱ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、４２℃で２時間メンブレンにハイブリッド形成させた。メンブレンを、６５℃の０．２×ＳＳＣで洗浄し、ＤＩＧ発光検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｖａｌ，ＰＱ，Ｃａｎａｄａ）を使用してシグナルを検出した。
【００６０】
ＲＴ−ＰＣＴによるさらなるヘプシジン様配列の同定
本研究で決定したｃＤＮＡ配列に基づいてプライマーをデザインした（表３）。ハウスキーピング遺伝子の定常状態の発現レベルを確認し、ヘプシジン遺伝子発現分析用の内部コントロールを得るためにアクチンｍＲＮＡの増幅を行った。１つのプライマー人工産物を消失させるために１つのプライマーを使用し、且つ夾雑ゲノムＤＮＡから惹起される増幅産物を消失させるために逆転写を使用せずに、調節を行った。
【００６１】
製造者の説明書に従ってＲＮＡＷｉｚキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を使用して非感染成魚カレイならびに非感染および感染成魚サケおよびオヒョウの組織から総ＲＮＡを単離した。７ｍｍ発電機を使用したＰｏｌｙｔｒｏｎ標準ローター固定子ホモジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ）にて組織をホモジナイズした。さらに、２０匹の全仔魚（孵化５日後および９日後）、１０匹の全仔魚（孵化１５ｍ２０、２５、３０、および３６日後）のプールしたサンプル、２匹の幼魚（孵化４１日後）の腸組織、および成魚カレイの肝臓からＲＮＡを単離した。ＤＮＡの夾雑を排除するために、指示どおりＡｍｂｉｏｎ  無ＤＮＡ  ＴＭプロトコールを使用した。簡単に述べれば、４単位のＤＮアーゼ１を再懸濁ＲＮＡに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、酵素を除去するためにＤＮアーゼ不活化試薬を添加し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ−６４分光光度計を使用してＲＮＡ濃度を決定した。
【００６２】
ＲｅｔｒｏＳｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を使用して、１μｇの総ＲＮＡから第１のｃＤＮＡ鎖を合成し、反応産物のアリコートを、ｒＴａｑポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）またはＡｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＰＣＲに供した。プライマーおよびアニーリング温度を表３に列挙する。増幅条件は、９５℃で１分間；９５℃で１５秒間、アニーリング温度で３０秒、６８℃で３０秒を３２サイクル；４℃で保持であった。増幅産物をマーカーとして１００ｂｐラダーを使用した２％Ｎｕｓｉｅｖｅアガロースゲル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）で分離し、Ｍｕｌｔｉａｎａｌｙｓｔソフトウェアを使用したＧｅｌＤｏｃ  １０００  ｖｉｄｅｏ  ｇｅｌ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔ．，Ｃａｎａｄａ）を使用して各産物の量を定量した。
【００６３】
他の魚類由来のさらなるヘプシジン様配列の同定
上記のように細菌攻撃誘発タイセイヨウオヒョウおよびタイセイヨウサケの肝臓および脾臓から総ＲＮＡを単離し、逆転写した（ＲＴ−ＰＣＲ分析）。２組のプライマー（説明を参照のこと、図２）を使用し、増幅条件は、９４℃で２分間；９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３２サイクル；７２℃で２分間であった。上記のように産物を２％ＮｕＳｅｉｖｅゲルで分離し、バンドを切り出し、クローニングし、配列決定した。
【００６４】
活性陽イオン性ペプチド配列の予想
図３由来の成熟ペプチド配列（魚組織の遺伝子およびそれらから増幅したＰＣＲ産物のヌクレオチド配列から推定したプリューロシジン様ペプチド配列）は、配列選択の基本を構成していた。一般に、広範な配列分析により、正味の正電荷を有し且つモデル中で十分に離れて疎水性および親水性残基を有するペプチドが産生された。また、一般に、発現する可能性のある（プロモーターを有する）ペプチド遺伝子を使用するが、偽遺伝子もまたパネル中に含まれていた。以下に記載のいくつかの因子に基づいて正確な開始／終結残基を決定した。ほとんどの場合、保存シグナルペプチド領域の直後に続き、且つ他の成熟ペプチドと十分に整列するので、成熟ペプチドのＮ末端が十分に定義される。Ｎ末端アミノ酸について直接決定することが不可能である場合、これは陽イオン性ペプチドで頻繁に出くわすので、Ｎ末端にＧＷまたはＧＦを保存するように試みた。さらに、ＷＦ１ａの２つのバージョン（ＮＲＣ−２およびＮＲＣ−３）を産生した。一方はＮ末端ＧＲＲＫＲＫを含み、他方は含んでいなかった。いくつかの場合、保存酸性プロピースが直後に続くので、成熟ペプチドのＣ末端もまた十分に定義した。しかし、多数のペプチド間でＣ末端アミノ酸に関して有意なアンビギュイティーが存在した。一般に、Ｃ末端アミノ酸の決定では以下の２つの規則に従う。（１）Ｃ末端またはＣ末端付近にグリシンが出現する場合、カルボキシ末端アミド化の前駆体と考える、（２）Ｃ末端付近の多数の負電荷のアミノ酸は、一般に、成熟活性ペプチドではなくプロピースの一部と考え、配列に含めない。
【００６５】
ブリティッシュ・コロンビア大学のＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＮＡＰＳ）ｕｎｉｔにおけるＮ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学によって本研究で使用した全抗微生物ペプチドを合成した。ペプチド配列を表４に示す。いずれの場合も、ペプチドの純度をＨＰＬＣおよび質量分析によって確認した。ＮＲＣ−７の場合、サンプルが均一になるまでＲＰ−ＨＰＬＣによるさらなる精製を行った。
【００６６】
細菌株およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ
本研究で使用した全株を、表５に列挙する。ほとんどの非魚類細菌株およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓをＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨＢ；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ）中３７℃で成長させ、魚類細菌をトリプシンソイブロス（ＴＳＢ；Ｄｉｆｃｏ，５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）中１６℃で維持した。使用のために解凍するまで全株を−７０℃で保存し、毎日継代培養を行った。以下の株、緑膿菌Ｋ７９９（Ｚ６１の親）、緑膿菌Ｚ６１（抗生物質超感受性（ｓｕｐｅｒｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ））、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ１４０２８ｓ（ＭＳ７９５３の親）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＭＳ７９５３（デフェンシン超感受性）、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ヒト臨床分離株）、ならびにメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ；ブリティッシュ・コロンビア大学のＡ．Ｃｈｏｗ博士によって単離）は、ブリティッシュ・コロンビア大学のＲ．Ｅ．Ｗ．Ｈａｎｃｏｃｋ教授から進呈された。
【００６７】
チミジン、ウリジン、およびＬ−ヒスチジン栄養要求性の大腸菌ＣＧＳＣ４９０８株（ｈｉｓ−６７、ｔｈｙＡ４３、ｐｙｒ−３７）（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６３）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から無料で進呈された。．特記しない限り、５ｍｇ／Ｌチミジン、１０ｍｇ／Ｌウリジン、および２０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補足したＭＨＢを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＧＳＣ  ４９０８株を成長させた。
【００６８】
サケ科病原体エロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）の２領域単離物（ｔｗｏ  ｆｉｅｌｄ  ｉｓｏｌａｔｅ）は、ＩＭＢ  ｓｔｒａｉｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ由来である。
【００６９】
最小阻害濃度
Ｗｕ  ａｎｄ  Ｈａｎｃｏｃｋ（１９９９）によって修正されたＡｍｓｔｅｒｄａｍのマイクロタイターブロス希釈法（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９６）を使用して、最小阻害濃度（ＭＩＣ）として抗微生物ペプチドの活性を決定した。９６ウェルポリプロピレン（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）マイクロタイタープレート中にて水でのペプチドの連続希釈を行った。上記のように細菌またはＣ．アルビカンスを対数増殖中期まで成長させ、１０6ｃｆｕ／ｍｌの最終接種サイズまで希釈した。細菌または酵母の懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、適切な温度で一晩インキュベートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＧＳＣ４９０８の場合、補足ＭＨＢを使用した。ペプチドを添加しないコントロールウェルで認められる成長の半分以下の成長を阻害と定義した。各ＭＩＣの決定を３回繰り返した。
【００７０】
死滅アッセイ
最小阻害濃度（ＭＩＣ）およびＭＩＣの１０倍で適用した選択ペプチドへの曝露の際の細菌およびＣ．アルビカンスの生存を、標準的な方法を使用して測定した。試験生物をＭＨＢ中で成長させ、ペプチドに曝露した。特定の時間間隔で、等しいアリコートを培地から取り出し、ＭＨＢプレートにプレートし、得られたコロニーを計数した。対数スケールで時間に対する生存率をプロットした。各実験を２回繰り返した。
【００７１】
＜合成抗微生物ペプチドの調製＞
活性陽イオン性ペプチド配列の予想。
図３由来の成熟ペプチド配列（魚組織の遺伝子およびそれらから増幅したＰＣＲ産物のヌクレオチド配列から予想したプリューロシジン様ペプチド配列）を、配列選択の基本とした。
【００７２】
正味の正電荷を有し且つ特異的に産生したモデル中で空間的に十分に離れて疎水性および親水性残基を有するペプチドについて、配列を選択した。
ａ）正味の電荷を評価するために、ＫおよびＲが＋１、Ｈが＋１／２、ＤおよびＥが−１の値を有すると仮定し、Ｃ末端アミド化をさらなる＋１として計数した。
ｂ）ＮＲＣミラーサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｐｂｉ．ｎｒｃ．ｃａ：８０９０／ＥＭＢＯＳＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から利用可能なＥＭＢＯＳＳ  ＰｅｐｗｈｅｅｌおよびＰｅｐｎｅｔインターネットツールを使用して、ヘリックスホイールおよびヘリックス正味モデル（ｈｅｌｉｃａｌ  ｎｅｔ  ｍｏｄｅｌ）中の親水性および疎水性残基の分離を分析した。
【００７３】
また、一般に、発現する可能性が高いペプチド遺伝子（プロモーターを保有する、転写されるなど）を産生するが、偽遺伝子もパネル中に含まれた。
【００７４】
以下のいくつかの因子に基づいて正確な開始／終結残基を決定した。
ａ）ほとんどの場合、保存シグナルペプチド領域が直後に続き、且つ他の成熟ペプチドと十分に整列するので、成熟ペプチドのＮ末端は十分に定義された。
ｂ）Ｎ末端アミノ酸について直接決定することが不可能である場合、これは陽イオン性ペプチドで頻繁に出くわすので、Ｎ末端にＧＷまたはＧＦを保存するように試みた。
ｃ）さらに、ＷＦ１ａの２つのバージョン（ＮＲＣ−２およびＮＲＣ−３）を産生した。一方はＮ末端ＧＲＲＫＲＫを含み、他方は含んでいなかった；高正電荷のＧＲＲＫＲＫの存在により活性が改良されると仮定されるので、これを行った。
ｄ）いくつかの場合、成熟ペプチドのＣ末端も十分に定義されているにもかかわらず、保存酸性プロピースが直後に続くので、多数のペプチド間でＣ末端アミノ酸に関する有意なアンビギュイティーが存在した。一般に、Ｃ末端アミノ酸の決定では以下の２つの規則に従う。
１．Ｃ末端またはＣ末端付近にグリシンが出現する場合、カルボキシ末端アミド化の前駆体と考える；
２．Ｃ末端付近の多数の負電荷のアミノ酸は、一般に、成熟活性ペプチドではなくプロピースの一部と考え、配列に含めない。
【００７５】
上記ステップにしたがって産生したペプチドを、標準的手段によってインビトロで抗微生物活性についてスクリーニングする。インビトロで抗微生物活性を示すペプチドは、インビボ用および表面治療用などの抗微生物ペプチドとして有用である。
【００７６】
＜実施例−結果＞
プリューロシジン
ｃＤＮＡ配列
皮膚ｃＤＮＡライブラリーから単離した２つのクローンは互いに順序どおり同一であり、イントロンの後のゲノムＰＣＲ産物ＷＦ２を除去した（以下を参照のこと）。これらは３５６ｂｐであり、６８アミノ酸の読み取り枠をコードする（図１Ａ）。ポリＡテールを除く２６ｂｐの５’非翻訳領域および８４ｂｐの３’非翻訳領域が存在する。ポリＡテールの２２ｂｐ上流に標準的なポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡが見出される。読み取り枠の最初の２２アミノ酸が、成熟プリューロシジンのアミノ末端と正確に適合する切断部位を含むシグナルペプチドであると推定される高疎水性ドメイン（図１Ｂ）を形成する。残基２３〜４７の推定アミノ酸配列は、公開された成熟プリューロシジンのアミノ酸配列と正確に適合する（矢印、図１Ａ）。成熟ペプチドにより、一方の表面に正電荷のアミノ酸が主に含まれ、他方の表面に疎水性アミノ酸を含む両親媒性ヘリックスを推定することができる（図１Ｃ）。カルボキシ末端の２１アミノ酸は、成熟プリューロシジン中に存在しない負電荷のドメインを形成し、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）の最近の報告で確認されている。
【００７７】
ゲノムＰＣＲ
プライマーＰＬ５’およびＰＬ３’を使用して４つの異なるバンド（ＷＦ１−４）を増幅した（図４）。各産物の配列分析により、バンドサイズが一致し、各増幅産物が異なることが確認された（表６）。さらなる上流および下流配列を含むＷＦ２およびＷＦ４に対応するプライマーＰＬ１およびＰＬ２を使用して２つの異なるバンドを増幅した（データ示さず）。イントロン配列を除去した場合、ＷＦ２配列は、皮膚ライブラリーから単離したプリューロシジンｃＤＮＡクローンの配列と正確に一致した（図１Ａ）。
【００７８】
図４は、カレイゲノムＤＮＡ由来のプリューロシジン様配列のＰＣＲ増幅結果の図である。増幅産物（Ｐ）を、分子量マーカー（Ｍ）として１００ｂｐのラダーを使用した１％アガロースゲルで分離した。異なるバンドとして視覚可能な産物は、標識ＷＦ１（００ｂｐ）、ＷＦ２（８１０ｂｐ）、ＷＦ３（６５０ｂｐ）、およびＷＦ４（５１０ｂｐ）である。
【００７９】
４つ全てのプリューロシジン様遺伝子はコード配列内に２つのイントロンを含み、３つの遺伝子は同一のイントロン位置を示した（ＷＦ１、ＷＦ２、およびＷＦ４）。しかし、ＷＦ３中の第２のイントロンの位置は、他の遺伝子のイントロンの上流に出現し、より短い第２のエクソンおよびより長い第３のエクソンが得られる。イントロンのサイズおよび配列は、４つのプリューロシジン遺伝子で異なった（表６）。プライマーＰＬ１およびＰＬ２を使用して得たＷＦ２およびＷＦ４の２つ以上の伸長ゲノム配列由来の証拠は、開始コドンのすぐ上流の第３のイントロンもまたこの遺伝子ファミリーの特徴であることを示す（図５）。これはまた、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｏｌｅ，Ｄａｒｏｕｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００）によって報告されたゲノム配列で知られていた。
【００８０】
推定アミノ酸配列のアラインメントを図６に示す。イントロンの位置（縦の矢印で示す）を、対応するＲＴ−ＰＣＲおよびｃＤＮＡ由来の配列との比較によって決定した。プリューロシジンの公開されたアミノ酸配列との比較によって成熟ペプチドの位置を決定した（Ｃｏｌｅ，Ｗｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。全推定成熟ポリペプチドにより、図１Ｃに記載のものと類似の両親媒性αヘリックス構造を推定することができるが、ＷＦ２およびＷＦ４の正電荷の位置は、ＷＦ１およびＷＦ３ほど顕著ではなかった（データ示さず）。
【００８１】
図５は、プライマーＰＬ１／ＰＬ２を使用したＰＣＲによって得たＷＦ４の伸長ゲノム配列を記載する。イントロンを小文字で示し、コード配列を大文字で示す。ＰＣＲのために使用したプライマーＰＬ１およびＰＬ２の位置に下線を引く。
【００８２】
図６は、５つのカレイプリューロシジンファミリーメンバーの推定ポリペプチド配列のアラインメントを示す。大きな縦の矢印は、イントロンがゲノム配列中に見出される位置を示す。小さな縦の矢印で示したＷＦ３の第２のイントロンは、他の遺伝子よりも上流で見出される。デルマセプチンＢ１（Ａｍｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）およびセラトトキシンＢ（Ｍａｒｃｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）の推定ポリペプチド配列を、プリューロシジンファミリーメンバーの下に示す。ボックスで囲ったアミノ酸は、配列の半分を占める。
【００８３】
異なる組織由来のさらなるプリューロシジン様配列の同定
ノーザン分析のみにより皮膚中のプリューロシジン転写物を検出することができた（データ示さず）。しかし、より感度の高いＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、プリューロシジンは他の組織（特に、鰓および腸）中でも発現することが示された。プライマーＰＬ５’およびＰＬ３’を使用して、カレイ皮膚から２つのバンド（２６５および１７５ｂｐ）が得られ、腸から２つのバンド（２１５および１７５ｂｐ）が得られた。各サイズのいくつかのクローンの配列分析は、イントロン配列が除去された場合、２６５ｂｐのカレイ皮膚クローンはＷＦ１のゲノム配列に対応することを示した（表７）。皮膚由来の５つの１７５ｂｐクローンおよび腸由来の２つの１７５ｂｐクローンは、ＷＦ２のゲノム配列に対応する。これは、皮膚由来の２００ヌクレオチドｍＲＮＡのみとのハイブリッド形成を示すＷＦ２プローブに対応するｃＤＮＡクローンを使用したノーザン分析の結果と一致する（データ示さず）。他方では、腸由来の９つの１７５ｂｐクローンおよび皮膚由来の４つの１７５ｂｐクローンは、ＷＦ３のゲノム配列に対応する。ＷＦ４に対応するＲＴ−ＰＣＲ産物は得られなかった。７つの全２１５ｂｐ腸クローンは、本研究で決定されたいかなるカレイゲノム配列によっても示されない新規のファミリーメンバー（ＷＦ１ａ）に対応した。
【００８４】
上で報告した各プリューロシジン様変異型およびλクローンに対して同定された更なるプリューロシジン様変異型に特異的なプライマーを使用して、本発明者らは、異なる組織で異なる変異型が発現されることを証明することができた（図７）。ＷＦ２、ＷＦ３、およびＷＦＹＴは、組織の最も広範な分布での発現を示したが、ＷＦ１およびＷＦ４は主に鰓および皮膚で発現し、ＷＦＸは皮膚のみで発現した。ＷＦ１ａの転写物はいかなる組織でも検出することができなかった。
【００８５】
図７は、カレイの異なる組織中での特異的プリューロシジン様遺伝子の発現を記載する。組織は、食道（Ｅ）、幽門胃（ＰＳ）、噴門胃（ＣＳ）、幽門垂（ＰＣ）、肝臓（Ｌ）、脾臓（ＳＰ）、腸（Ｉ）、直腸（Ｒ）、鰓（Ｇ）、脳（Ｂ）、および皮膚（ＳＫ）であった。マーカー（Ｍ）は、１００ｂｐラダーであった。プライマーは、各プリューロシジン変異型に特異的であった（表２）。
【００８６】
異なる成長段階由来のさらなるプリューロシジン様配列の同定
プリューロシジン様ペプチドの高保存領域由来のプライマーＰＬ５’およびＰＬ２（表１）を使用して、５ｄｐｈでの転写物は明らかに低レベルであり、成長中に増加した（図８）。成魚の皮膚から強力なシグナルが得られ、腸組織から弱いシグナルが得られた。ハウスキーピング遺伝子（アクチン）の発現は、成長を通して比較的一定であった。
【００８７】
上で報告した各プリューロシジン様変異型およびλクローンに対して同定されたさらなるプリューロシジン様変異型に特異的なプライマーを使用して、成長中の異なる時期に異なる変異型が発現されることが証明された（図９）。ＷＦＸ転写物は、２０ｄｐｈのみで検出可能であり、ＷＦ２、ＷＦ３、およびＷＦＹＴは変態前の仔魚および変態幼魚で検出可能であった。ＷＦ１およびＷＦ４の発現はいかなる成長段階においても検出できなかった。
【００８８】
図８は、プリューロシジン発現の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを記載する。サンプルは、仔魚（孵化５日後および１３日後）、変態中の仔魚（孵化２０日後）、新規に変態した仔魚（孵化２７日後）、幼魚（孵化４１日後）、魚の下側（ＬＳ）および上側（ＵＳ）由来の皮膚、ならびに下方（ＬＩ）および上方（ＵＩ）の腸由来の組織に由来する。プリューロシジン（パネルＡ）およびアクチン（パネルＢ）に特異的なプライマーを使用した。
【００８９】
図９は、カレイ仔魚成長中の特異的プリューロシジン様遺伝子の発現を記載する。サンプルは、仔魚（孵化５、９、および１５日後）、変態中の仔魚（孵化２０日後）、新規に変態した仔魚（孵化２５、３０、および３６日後）、および幼魚（孵化４１日後）に由来する。５’または３’プライマーのみを使用し、且つテンプレートを使用しないコントロール（ＮＴ）も示す。プライマーは、各プリューロシジン変異型に特異的であった（表２）。
【００９０】
サザン分析
正のシグナルは、ＷＦ１、ＷＦ２、ＷＦ３、およびＷＦ４ゲノムプローブを使用して、フラットフィッシュのＤＮＡに特異的であった（図１０）。コダラ、ポロック、またはワカサギＤＮＡを使用して、シグナルは検出されなかった（データ示さず）。４つ全てのプローブは、４つ全てのフラットフィッシュのＤＮＡ由来の共通のＳｓｔＩおよびＢａｍＨＩバンドとのハイブリッド形成を示し、これは、これらのゲノム上で遺伝子がクラスターを形成していることを示した。カレイ消化物由来のハイブリッド形成フラグメントのサイズを、表８に示す。
【００９１】
図１０は、カレイ（ＷＦ）、イエローテールフラウンダー（ＹＦ）、グリーンランドアカガレイ（ＡＰ）、タイセイヨウオヒョウ（ＡＨ）のプリューロシジン遺伝子のサザン分析を記載する。総ゲノムＤＮＡ（７．５μｇ）を、ＢａｍＨＩ（Ｂ）またはＳｓｔＩ（Ｓ）で消化し、フラグメントを１．０％アガロースゲルで分離した。ブロットを、ＷＦ１、ＷＦ２、ＷＦ３、およびＷＦ４に対応するプローブで首尾よくハイブリッド形成した。マーカー（Ｍ）は、ＳｔｙＩで消化したλＤＮＡ（２４．０、７．７、６．２、３．４、２．７、１．９、１．４、０．９Ｋｂ）である。
【００９２】
他の魚類由来のさらなるプリューロシジン様配列の同定
グリーンランドアカガレイ、イエローテールフラウンダー、ウィッチフラウンダー、およびタイセイヨウオヒョウ由来のプリューロシジン様ペプチドの推定アミノ酸配列のアラインメントを図３に示す。ペトレールソール、シーオーソール、イギリスガレイ、ヌマガレイ、プレイス、カラスガレイ、およびオヒョウのゲノムＤＮＡから配列を得た。シグナルペプチドおよび酸性プロピース領域が高度に保存されているが、成熟ペプチドに対応する部分はなおさらなる変動性を示す。
【００９３】
図３は、以下の種：カレイ（ＷＦ）、イエローテールフラウンダー（ＹＦ）、ウィッチフラウンダー（ＧＣ）、グリーンランドアカガレイ（ＡＰ）、およびタイセイヨウオヒョウ（ＡＨ）の皮膚および／または腸からの遺伝子およびそれらから増幅したＰＣＲ産物のヌクレオチド配列から推測したプリューロシジン様ペプチド配列のアラインメントを記載する。同定されたプリューロシジン様配列の特定の非限定的な例を表４に示す。ｃＤＮＡおよび／またはゲノム配列の非限定的な例を付録Ｉに示す。
【００９４】
カレイゲノム中のプリューロシジン様配列の同定
１２．５ｋｂおよび１５．５ｋｂのフラグメントをそれぞれ含む２つのクローンを、カレイ由来のゲノムライブラリーから単離した。１２．５ｋｂフラグメントは、ＷＦ２に対応する遺伝子および２つの偽遺伝子をコードした。１５．６ｋｂフラグメントは、ＷＦ１に対応する遺伝子、１つの偽遺伝子、および前に記載していない２つのプリューロシジン様配列（ＷＦＸおよびＷＦＹＴという）をコードした。遺伝子配置の略図を図１１に示す。コード配列の上流配列のスキャニングにより、標準的な真核生物プロモーター（ＴＡＴＡボックスおよびＣＡＡＴボックス）ならびにいくつかの転写因子の高度に保存された部位（ＮＦ−ＩＬ６、ＡＰ１、およびαインターフェロンが含まれる）が明らかとなった（図１２）。偽遺伝子上流にプロモーター配列は同定されなかった。
【００９５】
図１２は、プリューロシジン遺伝子および偽遺伝子の転写因子結合部位上流の部位を記載する。プロモーターを斜線のボックスで示し、イントロンを黒塗りのボックスで示し、エクソンを点を打ったボックスで示す。
【００９６】
抗微生物活性ペプチド配列の予想および評価
広範な細菌病原体およびＣ．アルビカンスに対して化学的に産生されたペプチドの最小阻害濃度を決定し、表９に示す。一般的に言えば、多数のペプチドが、広範な細菌病原体およびＣ．アルビカンスの成長を阻害する能力を示した。広範な抗微生物活性を有するペプチドの特に良好な例は、グリーンランドアカガレイ由来の３つのペプチド（ＮＲＣ−１１、ＮＲＣ−１２、およびＮＲＣ−１３）およびウィッチフラウンダー由来の３つのペプチド（ＮＲＣ−１５、ＮＲＣ−１６、およびＮＲＣ−１７）である。これらのうち、ＮＲＣ−１５、ＮＲＣ−１３、およびＮＲＣ−１２は、メチシリン耐性Ｓ．アウレウス（図１３）、緑膿菌（図１４）、およびＣ．アルビカンス（図１５）をそれぞれ死滅させる能力を示した。
【００９７】
図１３は、最小阻害濃度（ＭＩＣ）およびＭＩＣの１０倍でのＮＲＣ−１５への曝露に対するグラム陽性細菌（メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス−ＭＲＳＡ）の生存を記載する。Ｓ．アウレウスを、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス中で成長させ、ＭＩＣおよびＭＩＣの１０倍のＮＲＣ−１５に曝露した。特定の間隔で、等アリコートを培養物から取り出し、ＭＨＢプレートにプレートし、得られたコロニーを計数した。
【００９８】
図１４は、最小阻害濃度（ＭＩＣ）およびＭＩＣの１０倍でのＮＲＣ−１３への曝露に対するグラム陰性細菌（緑膿菌）の生存を記載する。緑膿菌を、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス中で成長させ、ＭＩＣおよびＭＩＣの１０倍のＮＲＣ−１３に曝露した。特定の間隔で、等アリコートを培養物から取り出し、ＭＨＢプレートにプレートし、得られたコロニーを計数した。
【００９９】
図１５は、最小阻害濃度（ＭＩＣ）およびＭＩＣの１０倍でのＮＲＣ−１２への曝露に対する酵母（カンジダ・アルビカンス）の生存を記載する。Ｃ．アルビカンスを、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス中で成長させ、ＭＩＣおよびＭＩＣの１０倍のＮＲＣ−１２に曝露した。特定の間隔で、等アリコートを培養物から取り出し、ＭＨＢプレートにプレートし、得られたコロニーを計数した。
【０１００】
プリューロシジン様ペプチドが広範な細菌およびＣ．アルビカンスに対して活性であることの証明に加えて、結果は、どの因子がゲノム配列からの抗微生物活性ペプチドの選択で好ましく考慮されるべきかを示す。
【０１０１】
第１に、活性が低いか認められない顕著なペプチド群は、偽遺伝子由来のペプチドであった（ＮＲＣ−８、ＮＲＣ−９、ＮＲＣ−１０）。これらの結果は、宿主生物中で発現することができるペプチドは抗微生物物質のより良好な候補であり得ることを示す。
【０１０２】
第２に、前述のＷＦ１ａ中のＮ末端ＧＲＲＫＲＫ（図２）は、ＮＲＣ−２（ＮＲＣ−３と同一であるが、上記フラグメントを欠く）が唯一僅かに活性であるという事実によって示されるようにＮＲＣ−３における抗微生物活性の決定因子であることが証明された（表９）。この結果は、これらが元のプレプロ配列中で明らかでない場合でも、成熟ペプチド中の開始／終結残基の慎重な選択の重要性を強調するものである。
【０１０３】
したがって、本発明の１つの実施形態では、アミノ酸配列ＧＲＲＫＲＫを有するプリューロシジン関連抗微生物ペプチド群を提供する。この配列を欠くプリューロシジン様抗微生物ペプチドも存在し、本明細書中で特に意図されることが認識される。
【０１０４】
ヘリックスホイールモデル中の親水性および疎水性残基が良好に離れている正電荷のペプチドの選択、Ｎ末端でのＧＷまたはＧＦの保存、グリシンが存在するＣ末端のアミド化、および酸性Ｃ末端アミノ酸クラスターの刈り取りを含む前記原理により、抗微生物活性ペプチドが首尾よく選択された。
【０１０５】
本発明のペプチドを、一定範囲のｐＨ、塩濃度、および温度で使用することができる。これらのペプチドは、バイオフィルムまたは病原体の任意の他の成長もしくは培養条件下で成長させた病原体に対して有用である。例えば、ＮＲＣ−１３が５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で緑膿菌Ｋ７９９を死滅させる能力を示す図２５を参照のこと。ＮＲＣ−１３を、最終濃度４μｇ／ｍｌ（黒四角）または４０μｇ／ｍｌ（△）（それぞれ、ＭＩＣおよび１０×ＭＩＣを示す）まで１５０ｍＭ  ＮａＣｌを補足した緑膿菌培養物に添加した。ペプチドを添加しないコントロールも示す（◆）。
【０１０６】
ペプチドを、単独または１つまたは両方のそのプレおよびプロ配列と組み合わせて使用することができる。
【０１０７】
本発明のペプチドは、多数の用途がある（抗微生物薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗癌薬、および抗寄生虫薬（他の抗生物質、抗感染薬、および化学療法薬との組み合わせならびに相互の組み合わせが含まれる）が含まれる）。
【０１０８】
ペプチドを、創傷治癒、組織再生、消毒薬、免疫プロモーターなどのための免疫調節薬として使用することができる（他の薬剤との組み合わせなどを含む）。
【０１０９】
ペプチドを、局所的（例えば、特にＣＦ患者の気道感染用のエアゾール、軟膏、ローション、リンス、洗眼剤などが含まれる）、全身（例えば、ＩＶ、ＩＰ、ＩＭ、皮下、腔内、または経皮が含まれる）、および経口（例えば、丸薬、液剤、カプセルなど）で送達させることができる。
【０１１０】
カプセル化を介した送達（リポソーム、プロテイノイドが含まれる）が意図される（農業用動物および／または植物を含むトランスジェニック系での送達など）。
【０１１１】
ペプチドを、医療機器（カテーテなどが含まれる）、食品調製機器、および輸送容器への保護塗料として使用することができる。
【０１１２】
本明細書中に開示のペプチドと共に水産養殖業務で使用することができる抗生物質の例には、以下が含まれる。テラマイシン・アクア（オキシテトラサイクリン）、ロメット（スルファジメトキシンおよびオルメトロプリン）、およびトリブリッセン（トリメトプリムおよびスルファジアジン）。孵化場では、本明細書中に開示のペプチドと共にホルムアルデヒドを滴下することができる。ペプチドを、本明細書中に記載の任意の用途のために相互および／または従来の抗生物質と組み合わせて使用することができる。
【０１１３】
ヘプシジン
同定されたヘプシジン配列の特定の非限定的な例を表１１に示す。ｃＤＮＡまたはゲノム配列の例を、付録ＩＩに示す。
【０１１４】
細菌攻撃誘発
注射３日後、感染タイセイヨウサケは、不活発で食欲不振であった。サンプリングの際、感染魚の腎臓後部はＡ．サルモニシダ陽性であり、コントロール魚では陰性であった。
【０１１５】
ヘプシジンｃＤＮＡの分子特徴づけ
カレイＥＳＴデータベースは、肝臓、卵巣、胃、腸、脾臓、および幽門垂ｃＤＮＡライブラリー由来の配列を含み、タイセイヨウサケＥＳＴデータベースは肝臓、前腎、および脾臓由来の配列を含み、ヘプシジン様配列は両魚の脾臓および肝臓ｃＤＮＡライブラリー中のみで検出された。カレイ肝臓ライブラリー中の１３５ＥＳＴのうちの４つ（３．０％）およびカレイ脾臓ライブラリー中の２８１ＥＳＴのうちの２つ（０．７％）がヘプシジンをコードしていた。タイセイヨウサケ肝臓ライブラリー中の９８２ＥＳＴのうちの３つ（０．３％）がヘプシジンをコードしていた。エロモナス・サルモニシダでの感染時にアップレギュレーションされた転写物中に豊富なタイセイヨウサケｃＤＮＡライブラリーにおいてサブトラクションした脾臓で５つ（１．８％）およびサブトラクションした肝臓で３つ（０．６％）のヘプシジン配列も見出された。不運なことに、これらはサブトラクションされたライブラリーであるので、インサートは完全な転写物の一部のみである。
【０１１６】
タイセイヨウサケヘプシジンｃＤＮＡのヌクレオチド配列の分析により、一方のサケＥＳＴ（ＳＬ１−０４１２）は他方のものよりも約３００ヌクレオチド長いことが明らかとなった。さらに、ヘプシジンコード配列は不完全であった。このクローンの完全な配列決定により、標準的なＧＴ／ＡＧスプライス部位を含む２つのイントロンの存在が明らかとなった（図１６Ａ）。除去された場合、完全なヘプシジン様ペプチドをコードする読み取り枠が得られた。同様に、依然として第２のイントロンが保持された不完全にスプライシングされたオヒョウ転写物を増幅した（図１６Ｂ）。哺乳動物と比較すると、サケおよびおそらくオヒョウのイントロンは類似の位置に存在するが、より短い（図１６Ｃ）。これらの不完全にスプライシングされたｃＤＮＡに加えて、本発明者らは、サケおよびヒトのヘプシジンの第２のエクソンと密接に対応する他の配列と比較して欠失が大きいカレイＥＳＴ（ＷＦ４）を同定した。イントロンの位置が脊椎動物で保存されていると仮定すると、この欠失はエクソン２の除去に相当し、ＷＦ３ａおよびＷＦ３ｂで残存するペプチドの５つのアミノ酸位置のみが異なるペプチドが得られた。
【０１１７】
図１６は、Ｉ型サケ科ヘプシジンをコードする非スプライシング肝臓ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を記載する。エクソン配列を大文字で示し、推定アミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に示す。ｇｔ／ａｇイントロン／エクソン境界を太字で強調し、ポリアデニル化シグナル（ａａｔａａａ）に下線を引く。Ｂ．Ｉ型サケ科ヘプシジンをコードするオヒョウ肝臓由来の部分的スプライシングｃＤＮＡのヌクレオチド配列。Ｃ．ヒト、マウス、およびサケのイントロン／エクソン構造の比較。エクソンを斜線のボックスで示し、イントロンを一本線で示す（サイズ（ｂｐ）を真下に示す）。
【０１１８】
５つの異なるカレイヘプシジンｃＤＮＡおよび２つの異なるタイセイヨウサケヘプシジンの推定アミノ酸配列を、ヒラメ（２）、メダカ（１）、およびニジマス（１）ならびに最近報告されたシマスズキ雑種由来のヘプシジン（Ｓｈｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２）およびタイセイヨウオヒョウ由来の２つ（Ｈｂ１７およびＨｂ３５７）に対応するｄｂＥＳＴから抽出した配列と比較する目的で整列させた。ＰＣＲによってタイセイヨウサケの脾臓および肝臓（Ｓａｌ２．１およびＳａｌ８．６）およびタイセイヨウオヒョウ（Ｈｂ１．１、Ｈｂ５．３、およびＨｂ７．５）から得た配列も含む（図１７）。哺乳動物の代表としてヒトヘプシジンを含めた。シグナルペプチドによる切断位置をＰＳＯＲＴによって予想し、プロペプチドコンベルターゼに典型的なＲＸ（Ｋ／）Ｒモチーフ（Ｎａｋａｙａｍａ  １９９７）を同定した（縦の矢印；図１７）。シグナルペプチド配列は、２２〜２４アミノ酸であり、全ての魚類配列間で高度に保存されている。陰イオン性プロピースは、特定のヘプシジン変異型に依存して３８〜４０アミノ酸である。プロセシングされたヘプシジンは、１９〜２７アミノ酸を含み、ＷＦ２を除く全てが中性ｐＨで正電荷を有する（表１０）。フラットフィッシュ由来のＩ型およびＩＩＩ型ヘプシジンおよびサケ型ヘプシジンは、成熟ペプチド中に４つのジスルフィド結合を形成することが提案されている８つのシステイン残基を含む。ＩＩ型カレイヘプシジンは、２つのシステイン残基を欠き、これは、最大で３つのジスルフィド結合を形成することができることを示す。Ｈｂ３５７は、５つのシステイン残基のみを含み、残存するヘプシジン様配列と非常に異なる。二次構造推定法の結果により、魚類ヘプシジンのコンセンサス構造はほとんどがランダムコイルであることが示されたが、伸長鎖の短い鎖をいくつかの方法によって予想した。
【０１１９】
図１７は、カレイ（ＷＦ１、ＷＦ２、ＷＦ３ａ、ＷＦ３ｂ、ＷＦ４）、タイセイヨウオヒョウ（Ｈｂ１．１、Ｈｂ５．３、Ｈｂ７．５、Ｈｂ１７、Ｈｂ３５７）、およびタイセイヨウサケ（Ｓａｌ１、Ｓａｌ２、Ｓａｌ２．１、Ｓａｌ８．６）のヘプシジンとヒラメ（ＪＦＬ４、ＪＦＬ６）、メダカ、シマスズキ雑種、およびヒトのヘプシジンとのアラインメントを記載する。ニジマス由来の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２８１３５４#１）も示す。シグナルペプチドおよびプレタンパク質切断の推定部分を矢印で示す。
【０１２０】
図１７から、全てのフラットフィッシュ型ヘプシジンが、サケ科型およびヒトヘプシジンでいくらか異なる非常に類似したシグナルペプチドを有することが明らかである。同定された他の新規の特徴は、（１）システイン数、（２）フラットフィッシュＩＩＩ型における固有の挿入ＦＫＣ、（３）固有の挿入を含み得る２つの他の位置、（４）短縮バージョン（フラットフィッシュＩＶ型）、（５）より長いアミノ末端バージョンに基づいた異なるヘプシジン群を含んでいた。
【０１２１】
アラインメントに基づいて、共有する挿入および欠失によって区別可能な少なくとも３つの異なるフラットフィッシュヘプシジン群が存在することが明らかである。ＷＦ２およびＪＦＬ６（フラットフィッシュＩＩ型）は、プロセシングされた１９アミノ酸のペプチドが得られるＫＲ切断部位付近の７アミノ酸の欠失を共有し、ＷＦ３ａ、ＷＦ３ｂ、ＷＦ４、Ｈｂ１．１、Ｈｂ１７、Ｈｂ５．３およびＳａｌ８．６（フラットフィッシュＩＩＩ型）は、プロセシングされた２２アミノ酸のペプチドが得られる４アミノ酸のみの欠失を示す（ＷＦ４の喪失エクソンに対応する部分を除く）。ＷＦ１およびＪＦＬ４（フラットフィッシュＩ型）はこの欠失を含まないが、シグナルペプチダーゼ切断部位に隣接する位置に全ての他の報告したヘプシジンと比較して挿入を含む。さらに、ＷＦ１、スズキ、およびメダカは、２６〜２７アミノ酸のペプチドが得られる全ての他の報告したヘプシジンと比較して成熟ペプチド内の１つのアミノ酸の挿入を共有する。ＷＦ３ａおよびＷＦ３ｂは、互いに１アミノ酸のみが異なるが、これらは５’および３’非翻訳領域中にいくつかのサイレントな置換および相違を含む。Ｈｂ３５７は、フラットフィッシュヘプシジンの可能な第４のクラスを示す。ＷＦ２およびＷＦ１の３’非翻訳領域は、他のヘプシジン転写物のそれと非常に異なり、ＷＦ２は他と比較して長いさらなる部分を含み、ＷＦ１はより短く且つあまり保存されていない（図１８Ａ）。
【０１２２】
サケ科ヘプシジン様ペプチドは１つの群に分類され、４つの報告された配列は全て２つの欠失を共有し、互いに成熟ペプチド中の４つのアミノ酸および上流プレタンパク質部分中の４つのアミノ酸が異なる。サケヘプシジンの３’非翻訳領域は中程度にしか保存されていない（図１８Ｂ）。
【０１２３】
図１８は、（Ａ）カレイ（ＷＦ１、ＷＦ２、ＷＦ３ａ、ＷＦ３ｂ、ＷＦ４）および（Ｂ）タイセイヨウサケ（Ｓａｌ１、Ｓａｌ２）のヘプシジンｃＤＮＡｓの３’非翻訳領域のアラインメントを記載する。保存ヌクレオチドをボックスで囲む。オヒョウおよびサケ由来のヘプシジンホモログの増幅に使用したプライマーの位置を、矢印で示す。
【０１２４】
カレイヘプシジン遺伝子のゲノム組織化
Ｉ型ヘプシジンに対応するプローブを使用した広範な種々の魚類由来のゲノムＤＮＡのサザンハイブリッド形成分析により、試験した全フラットフィッシュでバンドが同定されたが、他の魚類では同定されなかった（図１９）。カレイでは、４．３ｋｂおよび４．５ｋｂの２つのフラグメントがプローブとハイブリッド形成した。同サイズのイエローテールフラウンダーの２つのフラグメント（４．３ｋｂ）がハイブリッド形成し、ウィッチフラウンダーゲノムＤＮＡの２つのフラグメント（４．３ｋｂおよび２０ｋｂ）もハイブリッド形成する一方で、グリーンランドアカガレイの１つのフラグメント（４．３ｋｂ）およびヒラメゲノムＤＮＡの１つのフラグメント（５．５ｋｂ）のみがハイブリッド形成した。
【０１２５】
図１９は、異なる魚類のヘプシジンのサザンハイブリッド形成分析を記載する。ヌタウナギ（Ｈｇ）、サメ（Ｓｈ）、シロチョウザメ（Ｓｔ）、カレイ（ＷＦ）、イエローテールフラウンダー（ＹＦ）、グリーンランドアカガレイ（ＡＰ）、ウィッチフラウンダー（Ｗｉ）、ヒラメ（ＪＦ）、タイセイヨウサケ（ＡＳ）、ワカサギ（Ｓｍ）、およびコダラ（Ｈｄ）由来のゲノムＤＮＡ（７．５μｇ）のＳｓｔＩ消化物を、カレイ由来のＩ型ヘプシジンとハイブリッド形成させた。サイズマーカー（Ｍ）は、ＳｔｙＩで消化したλＤＮＡである。
【０１２６】
ＲＴ−ＰＣＲによるヘプシジン様配列の同定
図２は、オヒョウおよびサケの肝臓および脾臓由来のヘプシジンｃＤＮＡの増幅を記載する。抗微生物ペプチド遺伝子の発現を誘導するために細菌病原体を感染させた魚の組織からＲＮＡを調製し、逆転写し、以下に列挙したプライマーを使用したＰＣＲに供した。ハウスキーピング遺伝子の発現を示すためのコントロールとして、アクチンを使用した。図の印を以下に示す。ＨＬ−オヒョウ肝臓；ＳＬ−サケ肝臓；ＨＳ−オヒョウ脾臓；ＳＳ−サケ脾臓；Ｍ−マーカー。プライマーのために、５’Ｕは全反応で使用した普遍的５’プライマーであり、ＳａｌはＨｃ  Ｓａｌ（以下）であり、ＷＦはＨｃＰＡ３ｂ（以下）である。
【０１２７】
ＨｅｐＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ５’：ＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＴＴＣＡＧＴＧＴＴＧＣＡ
ＨｃＰＡ３  ３’Ｂ２：ＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＡＴＣＣ
Ｈｃ  Ｓａｌ：ＴＧＣＴＧＧＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣ
【０１２８】
３つのカレイヘプシジンの組織特異的発現のＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を図２０に示す。Ｉ型ヘプシジンは、肝臓で豊富に発現し、より狭い範囲で幽門胃で発現した。ＩＩ型ヘプシジンを任意の組織で検出することができる一方で、ＩＩＩ型ヘプシジンは、食道、幽門胃、および肝臓で中程度に発現した。
【０１２９】
非感染タイセイヨウサケでは、Ｉ型ヘプシジンは、肝臓、血液、および筋肉において非常に高レベルで発現し、鰓および皮膚において低レベルで発現し、腎臓の前部および後部で辛うじて検出可能なレベルで発現した（図２１Ａ、表１０）。ＩＩ型ヘプシジンは、鰓および皮膚のみで辛うじて検出可能なレベルで発現した（図２１Ｂ）。しかし、エロモナス・サルモニシダを感染させた魚は、試験したほとんどの組織で両ヘプシジン型を発現した（以下を参照のこと）。
【０１３０】
異なる年齢のカレイ仔魚におけるヘプシジン遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を図２２に示す。ＩＩ型ヘプシジンの転写物は、任意の成長段階で検出することができないが、Ｉ型およびＩＩＩ型ヘプシジンは、前変態仔魚で検出可能であった。Ｉ型ヘプシジンは、ＩＩ型ヘプシジンよりも豊富に発現し、より早い段階でも発現した（孵化５日後ｖｓ孵化９日後）。
【０１３１】
図２０は、カレイの異なる組織におけるヘプシジンおよびアクチンの遺伝子発現の逆転写ＰＣＲアッセイを記載する。フラットフィッシュＩ型（パネルＡ）、ＩＩ型（パネルＢ）、およびＩＩＩ型（パネルＣ）のヘプシジンならびにアクチン（３１０ｂｐ）の遺伝子特異的プライマーを使用して、成魚カレイ由来の増幅産物を増幅し、２％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。マーカー（Ｍ）は、１００ｂｐラダー（ＢＲＬ）である。
【０１３２】
図２１は、コントロールタイセイヨウサケ（Ｃ）の異なる組織およびエロモナス・サルモニシダを感染させたもの（Ｉ）のヘプシジンおよびアクチン遺伝子発現の逆転写ＰＣＲアッセイを記載する。サケ科Ｉ型（パネルＡ）およびＩＩ型（パネルＢ）のヘプシジン（１６３ｂｐ）ならびにアクチン（４００ｂｐ）の遺伝子特異的プライマーを使用した反応由来の増幅産物を、２％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。マーカー（Ｍ）は、１００ｂｐラダー（ＢＲＬ）である。
【０１３３】
図２２は、成長中のカレイ仔魚におけるヘプシジンおよびアクチン発現の逆転写ＰＣＲアッセイを記載する。サンプルは、孵化５日後（レーン１）、孵化１２日後（レーン２）、孵化１９日後（レーン３）、孵化２７日後（レーン４）、孵化４１日後（レーン５）の仔魚、および成魚（レーン６）であった。フラットフィッシュＩ型（パネルＡ）、ＩＩ型（パネルＢ）、およびＩＩＩ型（パネルＣ）のヘプシジンならびにアクチン（４００ｂｐ）の遺伝子特異的プライマーを使用した反応由来の増幅産物を、マーカー（レーンＭ）として１００ｂｐラダー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用した２％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。
【０１３４】
他の魚類由来のさらなるヘプシジン様配列の同定
サケ（ＨｃＳａｌ３’）およびフラットフィッシュ（ＨｃＰＡ３ｂ３’）の３’ＵＴＲ中の高度に保存された配列に基づくプライマーと組み合わせた全ての報告されたヘプシジンのシグナルペプチド（Ｈｅｐ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ５’）中の高度に保存された配列に基づくプライマーを使用して、オヒョウおよびサケの肝臓および脾臓からヘプシジン様配列を増幅することが可能であった（図２）。カレイ、タイセイヨウオヒョウ、およびタイセイヨウサケ由来のヘプシジン様ペプチドの推定アミノ酸配列のアラインメントを、図１７に示す。興味深いことに、フラットフィッシュ型ヘプシジンをサケから増幅することができ（Ｓ８．６）、サケ型ヘプシジンもフラットフィッシュから増幅することができる（Ｈｂ７．５）。ペトレールソール、シーオーソール、イギリスガレイ、ヌマガレイ、プレイス、カラスガレイ、およびオヒョウのゲノムＤＮＡからさらなる配列を得た。
【０１３５】
図１７は、一定のカレイ（ＷＦ１、ＷＦ２、ＷＦ３ａ、ＷＦ３ｂ、ＷＦ４）、タイセイヨウオヒョウ（Ｈｂ１．１、Ｈｂ５．３、Ｈｂ７．５、Ｈｂ１７、Ｈｂ３５７）、およびタイセイヨウサケ（Ｓａｌ１、Ｓａｌ２、Ｓａｌ２．１、Ｓａｌ８．６）のヘプシジンとヒラメ（ＪＦＬ４、ＪＦＬ６）、メダカ、シマスズキ雑種、およびヒトのヘプシジンとのアラインメントを記載する。ニジマス由来の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２８１３５４#１）も示す。シグナルペプチドおよびプレタンパク質切断の推定部分を矢印で示す。
【０１３６】
考察
プリューロシジン
ほとんどの抗微生物ペプチド（セクロピンおよびデルマセプチンが含まれる）は、連続的遺伝子重複によって適切に惹起された多遺伝子ファミリーによってコードされる。本発明者らは、カレイおよび適切には他のフラットフィッシュがプリューロシジンに類似の抗微生物化合物をコードする遺伝子ファミリーを有することを証明した。ＰＬ１／２を使用して得たゲノム増幅産物とｃＤＮＡとの比較（図１Ａ）により、ＷＦ２およびＷＦ４が３つのイントロンを含み、その第１のイントロンがイニシエーターメチオニンから１ｂｐ上流でのみ出現することが示された。第２および第３のイントロンは共に成熟ペプチド内に出現する。ＧＬａ、キセノプシン、レビチド、およびカエルロイン（全てアフリカツメガエル由来の皮膚ペプチド）の遺伝子はまた、イニシエーターメチオニンから１ｂｐ上流にイントロンを含む（Ｋｕｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９８９）。イントロンの位置は、ＷＦ３以外の全てで保存されているが（図６）、これらはサイズが劇的に異なり（表５）、重複しているので相当な進化時間を経ているか、イントロン配列が比較的自由に移動することを示す。
【０１３７】
サザン分析は、ＷＦ１−４プローブが他のフラットフィッシュＤＮＡ（イエローテールフラウンダー、タイセイヨウオヒョウ、およびグリーンランドアカガレイが含まれる）とハイブリッド形成するが、コダラ、ワカサギ、ポロックのＤＮＡにはハイブリッド形成しないことを示す。このハイブリッド形成は、高度に保存されたシグナル配列およびこれらのフラットフィッシュから単離された配列中に保存されていることが示された陰イオン性部分に起因し得る。フラットフィッシュは、水産養殖産業のための潜在的な治療物質の豊富なリザーバを提供することができる。異なるプリューロシジンファミリーメンバーのプローブは、しばしば、カレイＤＮＡ中の同一の制限フラグメントを認識し、これは、ゲノム上で１つの遺伝子座にクラスターを形成しているかもしれないことを示す。プリューロシジンにハイブリッド形成する２つのλクローンの完全な配列決定により、このようなクラスター形成が実際に起こることが確認される（図１１）。抗微生物ペプチド遺伝子のクラスター形成は、例えば、昆虫セクロピン（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）およびアピダエシン（Ｃａｓｔｅｅｌｓ−Ｊｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）でも知られている。
【０１３８】
図１１は、カレイ由来のプリューロシジン様遺伝子および偽遺伝子（Ψ）のゲノム組織化の略図の１つの実施形態を記載する。イントロンを黒塗りのボックスで示し、エクソンをストライプのボックスで示す。
【０１３９】
プリューロシジンファミリーの全メンバーは、アミノ末端シグナル配列およびその後の活性ペプチドならびに酸性部分を有するエンディングからなるプレプロポリペプチドとしてコードされる。シグナル配列および酸性配列の推定アミノ酸配列は非常に高度に保存されている一方で、推定成熟抗微生物ペプチドのそれはより変動性がある（図６）。しかし、全て両親媒性のαヘリックスルに折りたたまれるようである。この配列保存により、カレイだけでなく種々の他のフラットフィッシュ由来のプリューロシジン遺伝子ファミリーの多数の異なるメンバーを同定するためのゲノムアプローチが使用可能である（図３、表４、付録Ｉ）。
【０１４０】
プリューロシジンプレプロポリペプチドの構造は、類似の長さ（２２アミノ酸）のシグナル配列および１６〜２５アミノ酸の酸性部分も含むカエルデルマセプチン前駆体との一定の類似物を有する。全長ｃＤＮＡクローン（図１Ａ）から、プリューロシジンの酸性部分は２１残基を含むことが示された。プリューロシジンとデルマセプチンプレポリペプチドとの間の主な相違は、酸性部分の位置である−プリューロシジン中の成熟ペプチドの下流およびデルマセプチン中の成熟ペプチドの上流。デフェンシンの酸性プロパート（ｐｒｏｐａｒｔ）は、正電荷の中和によって抗微生物ペプチドと膜との相互作用を防止することが提案されており（Ｖａｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）、これもまたプリューロシジンにおけるその機能であり得る。この特徴は、特異的に切断されるまで不活性なペプチドの送達で実質的に重要であり得る。
【０１４１】
プリューロシジンファミリーメンバーのシグナル配列および酸性カルボキシ末端配列は非常に高度に保存されている。前者およびおそらく後者は、分泌のために前駆体分子を細胞膜にターゲティングすると予想される。デルマセプチンファミリー（Ｖａｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）ならびにＧｌａ、キセノプシン、レビチド、およびカエルロイン（全てアフリカツメガエル由来の皮膚ペプチド（Ｋｕｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８９））由来の高度に保存されたシグナルペプチド（しばしば第１のエクソンによってコードされる）および異なる生物活性を有するその後の末端産物を含む抗微生物ペプチドの遺伝子ファミリーが記載されている。これらの筆者は、このモジュラー遺伝子構造によって共通の経路を使用して非常に異なるペプチドを分泌のためにターゲティングすることが可能であることを提案していた。プリューロシジン遺伝子ファミリーでは、モジュラー構造はまた、シグナル配列および抗微生物ペプチドの最初の半分をコードするエクソン２、抗微生物ペプチドの次の１０アミノ酸をコードするエクソン３、ならびに抗微生物ペプチドの最後の３アミノ酸および酸性カルボキシ末端をコードするエクソン４と共に存在する。
【０１４２】
ＷＦ２およびＷＦ４によってコードされる成熟ペプチドは、互いに６０％同一であり（図６）、デルマセプチンＢ１およびセラトトキシンＢといくらか類似性が低い（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。ＷＦ１は、ＷＦ１ａと６４％同一であるが、シグナル配列と成熟ペプチドの間にＷＦ１ａには存在しない１８アミノ酸の顕著に陽イオン性の鎖を含む。プリューロシジンＷＦ１プロセシングが起こる場合に、この潜在的に抗微生物性の１８量体ペプチドが惹起されるかどうかは依然として決定中である。ＷＦ１およびＷＦ１ａの両方は、成熟ペプチドと酸性カルボキシ末端との間にＷＦ２、ＷＦ３、およびＷＦ４と比較してさらなる１０〜１１アミノ酸を含む。ＷＦ３は、ＷＦ２／４およびＷＦ１／１ａの両方と類似する。ＷＦ２の中心部分と同一の合成プリューロシジンは、プリューロシジン、デルマセプチン、およびセラトトキシンを基本としたハイブリッドペプチドを有するので、ビブリオ・アンギラルムによる感染からギンサケを保護することが示されている（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。
【０１４３】
ノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲを使用して、プリューロシジン遺伝子の組織特異的発現を評価した。ノーザン分析により、カレイｍＲＮＡ中に存在する低レベルの転写物の検出に十分な感度ではないことが証明された。転写物は、皮膚中にのみ本方法による検出に十分な量で存在するので、より感度の高いＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用した。本方法を使用して、プリューロシジン転写物は皮膚および腸の両方で見出され、最近報告されたこれらの組織中のプリューロシジンの超構造局在化（ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ）と一致し（Ｃｏｌｅ，Ｄａｒｏｕｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、粘膜免疫におけるプリューロシジンの役割を支持する。転写物サイズ（約２００ｂｐ）は、ＲＴ−ＰＣＲで得られた産物のサイズと一致し（表７）、プリューロシジン遺伝子が個別に転写されることを示す。
【０１４４】
ＲＴ−ＰＣＲ分析は、異なるプリューロシジン様ペプチドの遺伝子が組織特異的様式で発現し、ＷＦ２が皮膚および鰓で支配的に発現され、筋肉、腸、胃、および肝臓でより狭い範囲で発現される一方で、ＷＦ１およびＷＦ４は鰓および皮膚で支配的に検出されることを示した（図７）。ＷＦ３およびＷＦＹＴはサンプリングしたほとんどの組織で発現され、ＷＦＸは皮膚のみで検出され、ＷＦ１ａはサンプリングしたいかなる組織でも発現しなかった。おそらく、異なる抗微生物ペプチドは２つの組織中の異なる細菌集団の成長を調節するのに必要である。ＷＦ４のＲＴ−ＰＣＲ産物が検出されなかったので、この遺伝子は低レベルで成魚皮膚または腸のみで発現するか、異なる成長段階または異なる組織で発現することが可能である。
【０１４５】
種々のプリューロシジン様遺伝子の転写物間で区別されないプライマーを使用して、孵化５日後で最初に発現が検出され、成長と共に増大した。しかし、ＷＦ１、ＷＦ１ａ、ＷＦ２、ＷＦ３、ＷＦ４、ＷＦＸ、およびＷＦＹＴに特異的なプライマーを使用した最近の実験では、異なる成長段階で転写物が検出された（図９）。孵化２０日後ではＷＦＸのみが検出可能である一方で、ＷＦＹＴ、ＷＦ３、およびＷＦ２は孵化５日後で検出可能であり、孵化２５〜３６日後ではより高いレベルであった。興味深いことに、ドロソフィラで示されるように（Ｒｉｖａｓ  ａｎｄ  Ｇａｎｚ  １９９９）、ＷＦ１はいかなる仔魚段階でも検出不可能であり、特定の環境条件下で特定の細菌病原体に応答した場合のみ発現することができる。これは、魚類における抗微生物ペプチドの成長発現の第１の証明であり、先天性免疫の少なくともこの成分がカレイの初期仔魚段階で存在することを示す。変態前の仔魚の死亡率は大きな懸念であるが、このような死亡率の理由は依然として知られておらず、腸への大量の細菌負荷が提案されている（Ｐａｄｒｏｓ，Ｍｉｎｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。フラットフィッシュの適応免疫系は、他の硬骨魚のそれより遅れて発達することが示されている（Ｐａｄｒｏｓ，Ｓａｌａ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）。したがって、この期間中に仔魚が抗微生物ペプチドを産生する能力は生存に重要であり、このような化合物の産生を増大させる因子の同定は水産養殖に非常に有用である。
【０１４６】
種々の細菌病原体および真菌病原体（カンジダ・アルビカンス）に対する合成ペプチドの試験結果は、広範な抗微生物活性を有する有望な候補を示す。ペプチドＮＲＣ−１３およびＮＲＣ−１５の４μｇ／ｍｌほどの濃度でのメチシリン耐性Ｓ．アウレウスの成長を阻害する能力が特に興味深い。ＮＲＣ−１３はまた、４μｇ／ｍｌでＣ．アルビカンスの成長を阻害することができ、１μｇ／ｍｌで緑膿菌の成長を阻害することができ（およびこの濃度での緑膿菌の死滅）、２μｇ／ｍｌでＡ．サルモニシダの成長を阻害することができる。これは、ＮＲＣ−１３が魚類病原体、グラム陰性ヒト細菌、薬物耐性グラム陽性ヒト細菌、および酵母に対する活性が高いことを意味する。ＮＲＣ−１３の例により、陽イオン性抗微生物ペプチドの潜在的な標的および適用の範囲が証明される。
【０１４７】
これらの結果はまた、大量の配列データからの抗微生物活性ペプチドの選択のために本発明者らが使用したプロセスを実証する。ペプチドが活性である可能性が高いことを正確に予想する能力は、ゲノミクスと治療との間の関連付けに重要である。この領域では行うべき研究が多数残されているが、本発明者らは、前述の原理の賢明な適用が活性ペプチドの選択の一助となることを明確に証明した。
【０１４８】
したがって、種々のフラットフィッシュ類由来のプリューロシジンと同一または類似の抗微生物ペプチドの前駆体をコードする種々のｃＤＮＡおよびゲノム配列を単離した。ＲＴ−ＰＣＲ産物のノーザンハイブリッド形成および配列分析により、発現が組織特異的であることが示された。最も重要には、成長中の仔魚カレイにおける異なるプリューロシジン変異型の発現のタイミングを決定し、この魚における先天性免疫系の発生を評価する。これらのプリューロシジン発現アッセイは、特定の組織および／または発達段階で発現した新規のペプチド配列の単離のためのスクリーニングストラテジーの指示で有用である。プリューロシジン産生に影響を与える環境パラメーターもアッセイすることができる。
【０１４９】
本研究は、養殖魚のための治療物質としてのプリューロシジンの過剰発現およびトランスジェニックテクノロジーによる耐病性魚の生産（抗微生物ペプチドを発現するトランスジェニックタバコで証明されており（Ｊａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）、魚類に提案されている（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．２０００）ので）を目的としたさらなる研究方法を切り開く。さらに、生理食塩水環境下で多数の魚類が生存するので、その抗微生物ペプチドの性質は、陸生動物によって産生された抗微生物ペプチドと異なることができ、固有の状況で適用される。例えば、嚢胞性線維症患者の肺粘膜は、ＮａＣｌ濃度が高く、肺によって分泌される天然の陽イオン性ペプチドを阻害する（Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。海生魚類由来の塩適合陽イオン性ペプチドは、これらの患者の肺感染治療で適用することができる。
【０１５０】
ヘプシジン
１つのサケＥＳＴ（ＳＬ−０４１２）および１つのオヒョウクローン（Ｈｂ７．５）の配列分析により、非スプライシング転写物の存在が明らかとなり、いくつかのイントロンの位置が決定された（図１６）。マウス、ヒト、およびシマスズキ雑種と類似して、サケヘプシジンは、３つのエクソンおよび２つのイントロンから構成される（Ｐａｒｋ，Ｖａｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｓｈｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｐｉｇｅｏｎ，Ｉｌｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。サケおよびスズキの第１のイントロンの位置は同一であり、２つのアミノ酸はマウスおよびヒトのアミノ酸の５’に相当する。しかし、第２のサケイントロンおよびＨｂ７．５の第２のオヒョウイントロンは、２つのアミノ酸はマウスおよびヒトのアミノ酸の３’に相当し、いくつかのアミノ酸はスズキのアミノ酸の５’に相当する。これは、おそらく、進化によってイントロンの位置が数ヌクレオチドシフトした「イントロンスライディング」に起因する。興味深いことに、ＷＦ４の欠失は第１のサケイントロンおよび第２のマウス／ヒトイントロンの位置に正確に対応し、中間体イントロン／エクソン構造を示す。
【０１５１】
マウスは、ゲノム上にクラスター形成した２つのヘプシジン遺伝子を含むが（Ｐｉｇｅｏｎ，Ｉｌｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、ヒト（Ｐａｒｋ，Ｖａｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１）およびシマスズキ（Ｓｈｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２）では、たった１つのヘプシジン遺伝子しか同定されていない。カレイおよびタイセイヨウサケ中のヘプシジン遺伝子数は決定中であるが、カレイには少なくとも５つ、タイセイヨウオヒョウには５つ、タイセイヨウサケには４つ存在する。サザンハイブリッド形成分析で使用したヘプシジンプローブ内にＳｓｔＩ部位が存在しないので、本明細書中で報告した５つのカレイヘプシジン遺伝子が２つのゲノムフラグメント上でクラスター形成している可能性が高い。複数のプリューロシジン遺伝子も存在し（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｇａｌｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、ゲノム上にクラスター形成している（図１１）。興味深いことに、大西洋由来の試験した全ての小フラウンダーは、４．３ｋｂの類似のハイブリッド形成バンドを示し、これらがゲノムレベルで類似していることを示す。太平洋で見出されたヒラメは、５．５ｋｂの１つのハイブリッド形成バンドを示した。
【０１５２】
魚プレプロ−ヘプシジンの推定アミノ酸配列を、全長で哺乳動物由来のそれと整列させることができるが、プロセシングペプチドに対応する部分のみが高類似性を示す（図１７）。しかし、魚内で、シグナルペプチドおよびプロピースも非常に高度に保存されている。これらのセグメントの保存もまた、プリューロシジンファミリーに記載されている（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｇａｌｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。プロセシングされたペプチドのアミノ末端を、ヒトヘプシジンのアミノ酸配列（Ｋｒａｕｓｅ，Ｎｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｐａｒｋ，Ｖａｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１）およびプロセシング部位に特徴的なＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒモチーフとの近さ（Ｎａｋａｙａｍａ  １９９７）に基づいて割り当てた。カレイおよびタイセイヨウサケ由来のプロセシングヘプシジンの分子量は、１９９２Ｄａ（ＷＦ２）〜３０６６（ＷＦ１）の範囲であり、マウス、ヒト、およびスズキから単離したヘプシジンに匹敵する。酸性ｐＩ（５．５４）のＷＦ２を除いて、ヘプシジンのｐＩは７．７３と８．７６との間である。
【０１５３】
プリューロシジンと同様に、ヘプシジン変異型のアミノ酸配列は、種内で類似性が高く、比較的最近の先祖遺伝子の重複が示唆される。魚類が生息する水環境は陸生動物よりも多様な抗微生物ペプチドの存在が必要である可能性がある。さらに、先天性免疫系のこの成分は、哺乳動物よりも魚類で主要な役割を果たし、より高度に進化した適応免疫系を有する。
【０１５４】
ヒトヘプシジン分子は、一連のβターン、ループ、および歪んだβシートを含む二次構造を形成することが提案されている（Ｐａｒｋ，Ｖａｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。魚ヘプシジンのコンセンサス二次構造推定は、これらがほとんどいくつかの伸長鎖構造を含むランダムコイル構造を含むことを示す。ＷＦ２、ＪＦＬ６、およびＨｂ３５７を除き、全ての報告したヘプシジンは、今までのところ以下の結合パターン：１−４、２−８、３−７、５−６（Ｐａｒｋ，Ｖａｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１）中に４つのジスルフィド結合を形成することが提案されている８つのシステイン残基を含む（Ｋｒａｕｓｅ，Ｎｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｐａｒｋ，Ｖａｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。ＷＦ２からのシステイン残基１および３の喪失により、少なくとも１つのジスルフィド結合を形成することができないことが示唆される。
【０１５５】
遺伝子特異的プライマーを使用して、本発明者らは、異なるヘプシジン遺伝子がカレイ（図２０）およびタイセイヨウサケ（図２１）の両方の異なる組織で発現することを証明することができた。タイセイヨウサケでは、ヘプシジンは正常な非感染魚で肝臓、血液、および筋肉で主に検出可能であり（表Ｉ）、より狭い範囲で鰓および皮膚で検出可能であった（両型）。これは、非感染肝臓から構築したｃＤＮＡライブラリー中のＩ型ヘプシジンの３つのＥＳＴの存在ならびに非感染肝臓、脾臓、および前腎から構築したｃＤＮＡライブラリー中のＩＩ型ヘプシジンのＥＳＴの非存在と一致する。ＩＩ型ヘプシジン発現は、水性環境と対照的に外部上皮表面に制限されるようであり、Ｉ型ヘプシジン発現はより広範に発現し、肝臓、血液、および筋肉ならびに外部上皮表面で発現する。非感染カレイでは、ＩＩ型ヘプシジンの転写物をいかなる組織でも検出することができなかったが、Ｉ型およびＩＩＩ型ヘプシジンの転写物は肝臓および幽門胃に存在した。ＩＩＩ型ヘプシジン転写物も食道中に存在した。
【０１５６】
プローブとしてマウスヘプシジン配列の１つを使用したノーザン分析によって、マウスヘプシジンはまた、肝臓で主に発現し、胃、腸、結腸、肺、心臓、および胸腺で弱く発現すると報告されていた（Ｐｉｇｅｏｎ，Ｉｌｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。しかし、この研究は、２つのヘプシジン遺伝子を区別しておらず、２つのマウス遺伝子がマウス組織で異なって発現するかどうかが知られていない。同様に、プローブとしてヒトヘプシジンｃＤＮＡを使用したヒト組織および細胞株のドットプロット分析により、成体および胎児肝臓での強力な発現ならびに成体の心臓、胎児の心臓、および成体の脊髄で弱い発現が明らかとなった（Ｐｉｇｅｏｎ，Ｉｌｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。実時間定量ＲＴ−ＰＣＲを使用した以前の研究（Ｋａｒａｕｓｅ，Ｎｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２０００）により、ヒトの肝臓、心臓、および脳でのヘプシジンの強力な発現ならびに種々の他の組織での弱い発現が明らかとなった。興味深いことに、本発明者らは、正常なタイセイヨウサケもしくはカレイの脳または正常なタイセイヨウサケの心臓でＩ型またはＩＩ型ヘプシジン発現はいずれも検出することができなかった。しかし、感染動物では、ＩＩ型ヘプシジンは両組織で発現し、この形態はストレス条件下で産生される支配的なものであることを示す。
【０１５７】
本発明者がタイセイヨウサケの血球中で構成性に発現するＩ型ヘプシジンの転写物を検出したことが興味深い。構成性に発現する非酵素抗微生物分子は魚類の血液のみで報告されており、小疎水性陽イオン性ペプチドはニジマスの粘液で見出され（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、モロネシジン（スズキ由来の抗微生物ペプチド）は、非感染動物の血液中で発現した（Ｌａｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。興味深いことに、非感染コントロール動物と比較して、感染サケの血液中でヘプシジンは増加しなかった。おそらく、ヘプシジンはコントロール動物の鉄ホメオスタシスにおける役割および抗微生物の役割を満たす。非感染動物の循環血球中でのその存在は、差し迫った感染に対する予防手段であり得る。
【０１５８】
タイセイヨウサケ由来のＩ型およびＩＩ型ヘプシジンは、エロモナス・サルモニシダの感染時にアップレギュレーションされるが、様々な組織によって程度が異なる。Ｉ型ヘプシジンが食道、胃、幽門垂、肝臓、脾臓、腸、後腎、直腸、および筋肉で顕著にアップレギュレーションされ、前腎および皮膚でより低い程度にアップレギュレーションされ、ＩＩ型ヘプシジンは、胃、幽門垂、肝臓、脾臓、腸、脳、心臓、および筋肉でより劇的な増加を示した。食道、前腎、後腎、皮膚、および直腸でより弱いアップレギュレーションを示した。これらの結果は、アップレギュレーションが肝臓で最も劇的であるが、皮膚、鰓、腸、脾臓、前腎、および血液でも証明されている細菌攻撃誘発シマスズキ雑種について報告された結果と一致する（Ｓｈｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。シマスズキ雑種に複数のヘプシジンが存在するかどうか、そうであれば、これらはタイセイヨウサケとカレイで発現が異なるかどうかは知られていない。
【０１５９】
マウスを使用した研究により、ＬＰＳを注射したマウスの肝臓でヘプシジン発現が４．３倍増加し、ＬＰＳに曝露した原発性肝細胞で７倍増加することが示された（Ｐｉｇｅｏｎ，Ｉｌｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。これらの研究は、プローブとして１つのマウスヘプシジン配列のみを使用したノーザン分析に基づいていたので、２つのマウス変異型の可能な異なる発現を区別することができなかった。類似の増加が、鉄を過剰摂取したマウスの肝臓で認められたが、クエン酸鉄に曝露した原発性肝細胞では認められず、これはおそらく肝細胞の培養状態の相違に起因する。鉄過剰摂取およびＬＰＳ曝露の両方によってヘプシジン発現が増加するという事実は、病原体に対する宿主の応答においてこれら２つの因子が重要であること示す。
【０１６０】
感染時、種々の機構によって系から鉄が除去され、それにより病原体の侵入によって鉄が利用できなくなる。最近発見されたトランスフェリン受容体２が肝細胞による鉄取り込みを媒介し、そのヘプシジン発現を増大させることが提案されている（Ｆｌｅｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｌｙ  ２００１；Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｂｅｎｎｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。同様に、ヘプシジンにより、β２ミクログロブリン、ＨＦＥ、およびトランスフェリン受容体１を介してマクロファージでの鉄蓄積を増大させ、十二指腸陰窩細胞中の食物由来の鉄の吸収を増大させる。これらの陰窩細胞は、鉄輸送タンパク質量の減少した腸細胞に分化し、それにより食物由来の鉄の取り込みが減少する。したがって、ヘプシジンは、炎症時の鉄ホメオスタシスでおよび抗微生物ペプチドとしての作用において重要な役割を果たすようである。ヘプシジンが肝臓由来の急性期タンパク質の発現を調節し、且つ免疫系の他の成分との相乗効果を示し得る可能性もある。
【０１６１】
抗微生物ペプチドは、マウスマクロファージでの遺伝子発現を調整することが示されており（Ｓｃｏｔｔ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、これらが魚マクロファージおよび肝細胞で類似の効果を発揮し得る可能性がある。マウスおよびヒトのプロヘプシジン内の機能的核局在化シグナルの存在（列中の４つのＫ／Ｒ残基）の存在は、ヘプシジンがこれらの生物中で鉄ホメオスタシスの維持に関与するシグナル伝達分子として作用することができることを示す（Ｐｉｇｅｏｎ，Ｉｌｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。興味深いことに、核局在化シグナルはまた、プロヘプシジンのプロセシングの認識シグナルを含み、プロピースの除去前のみで核局在化が起こるか、プロピース自体が核に局在化することを示す。硬骨魚ヘプシジンは、４つのＫ／Ｒ残基中の３つしか含まず、核局在化には不十分であり得る；細胞内シグナル伝達におけるヘプシジンの役割は合成またはインビトロ発現ペプチドを使用した試験が待たれている。
【０１６２】
結論として、異なる魚類由来の新規のヘプシジン様ペプチドの配列およびサザンハイブリッド形成によるいくつかのフラットフィッシュ種における関連配列の存在を決定した。さらに、種々の魚類ヘプシジン型は細菌感染の結果として仔魚成長中に正常な魚で組織特異的に異なって発現するので、新規のペプチドのさらなる配列の同定ストラテジーが得られることを示した。明らかに、魚類では、異なる組織により競合様式または誘導様式でヘプシジンが産生され、ヘプシジン変異型が異なる環境下で異なる機能を有し得ることを示す。哺乳動物の鉄ホメオスタシスにおけるその役割を考えると、魚ヘプシジン変異型はこの役割および特定の病原体の死滅の役割を満たし得る可能性がある。ヘプシジン変異型のインビトロ発現により、決定すべき抗微生物活性の範囲および先天性免疫応答に対するその効果が得られる。
【０１６３】
したがって、潜在的な抗微生物ペプチドの同定方法が得られた。
【０１６４】
表
表１．プリューロシジン様配列の単離に使用したオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。
表２．カレイの異なる組織および異なる成長段階でのプリューロシジン様遺伝子発現のアッセイに使用したオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。
表３．ヘプシジン遺伝子発現を分析するためのＲＴ−ＰＣＲアッセイで使用したプライマーのヌクレオチド配列。５’プライマーを基本とするアミノ酸配列を示す。３’プライマーは、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内に存在していた。ＰＣＲ反応で使用したアニーリング温度および増幅産物のサイズを列挙する。
表４．ゲノムおよび発現データに基づくプリューロシジンの一文字表記のアミノ酸配列。
表４ａ．本研究で使用した細菌およびカンジダ株。
表５．プライマーＰＬ５’およびＰＬ３’を使用して増幅したゲノム配列中のイントロン（ｂｐ）のサイズ。
表６．異なるプリューロシジン遺伝子に対応する皮膚および腸の由来のＲＴ−ＰＣＲ産物。
表７．カレイＤＮＡのＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩ消化物中のプリューロシジンプローブとハイブリッド形成したバンドのサイズ（ｋｂ）。
表８．広範な細菌病原体およびカンジダ・アルビカンスに対するプリューロシジン様陽イオン性抗微生物ペプチドの最小阻害濃度。
表９．カレイおよびタイセイヨウサケヘプシジン様ペプチドの特徴。
表１０．ヘプシジン発現のＰＣＲ分析結果。
表１１．ゲノムおよび発現データ（ＮＲＣ基準数が含まれる）に基づく一定のヘプシジンの一文字表記のアミノ酸配列。
表１２．表１１および１３に列挙したアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列。
表１３．ゲノムおよび発現データ（クローン名が含まれる）に基づく一定のヘプシジンの一文字表記のアミノ酸配列。
【０１６５】
付録
付録Ｉ．表４に記載のプリューロシジン様遺伝子およびｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
付録ＩＩ．表１１に記載のヘプシジン様遺伝子およびｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
【０１６６】
文献
文献の記載は、本明細書中に開示されたものの特許性に関連することを自認するものでも、示唆するものでもない。
【０１６７】
【表０Ａ】
2005536209.tif 000002
【表０Ｂ】
2005536209.tif 000003
【表０Ｃ】
2005536209.tif 000004
【表０Ｄ】
2005536209.tif 000005
【表０Ｅ】
2005536209.tif 000006
【０１６８】
【表１】
2005536209.tif 000007
【０１６９】
【表２】
2005536209.tif 000008
【０１７０】
【表３】
2005536209.tif 000009
【０１７１】
【表４】
2005536209.tif 000010
【０１７２】
【表４ａ】
2005536209.tif 000011
【０１７３】
【表５】
2005536209.tif 000012
【０１７４】
【表６】
2005536209.tif 000013
【０１７５】
【表７】
2005536209.tif 000014
【０１７６】
【表８】
2005536209.tif 000015
【０１７７】
【表９】
2005536209.tif 000016
【０１７８】
【表１０】
2005536209.tif 000017
【０１７９】
【表１１Ａ】
2005536209.tif 000018
【表１１Ｂ】
2005536209.tif 000019
【０１８０】
【表１２Ａ】
2005536209.tif 000020
【表１２Ｂ】
2005536209.tif 000021
【表１２Ｃ】
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【表１２Ｄ】
2005536209.tif 000023
【表１２Ｅ】
2005536209.tif 000024
【表１２Ｆ】
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【表１２Ｇ】
2005536209.tif 000026
【表１２Ｈ】
2005536209.tif 000027
【表１２Ｉ】
2005536209.tif 000028
【０１８１】
【表１３】
2005536209.tif 000029
【０１８２】
【表１４Ａ】
2005536209.tif 000030
【表１４Ｂ】
2005536209.tif 000031
【表１４Ｃ】
2005536209.tif 000032
【表１４Ｄ】
2005536209.tif 000033
【表１４Ｅ】
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【表１４Ｆ】
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【表１４Ｇ】
2005536209.tif 000036
【表１４Ｈ】
2005536209.tif 000037
【０１８３】
【表１５Ａ】
2005536209.tif 000038
【表１５Ｂ】
2005536209.tif 000039
【表１５Ｃ】
2005536209.tif 000040
【表１５Ｄ】
2005536209.tif 000041
【表１５Ｅ】
2005536209.tif 000042
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】カレイ由来のプリューロシジンＷＦ２のｃＤＮＡのテキストおよび図（Ａ）、ペプチドＷＦ２の推定疎水性プロットのグラフ（Ｂ）、およびＷＦ２の推定ヘリックス構造の概略図（Ｃ）を示す。
【図２】一定のヘプシジン様ｃＤＮＡの増幅の結果を示す写真である。
【図３】一定のプリューロシジン様ペプチド配列のアラインメントを示す図である。
【図４】一定のプリューロシジン様ゲノム配列のＰＣＲ増幅結果を示す写真である。
【図５】ＷＦ４の伸長ゲノム配列を示す図である。
【図６】一定のプリューロシジン様ポリペプチド配列のアラインメントを示す図である。
【図７】異なるカレイ組織中の一定のプリューロシジン様遺伝子発現の結果を示す写真である。
【図８】カレイ成長時の一定のプリューロシジン発現のＲＴＰＣＲの結果を示す写真である。
【図９】カレイ成長時の一定のプリューロシジン様遺伝子発現の研究結果を示す写真である。
【図１０】カレイの一定のプリューロシジン遺伝子のサザン分析の結果を示す写真である。
【図１１】カレイ由来の一定のプリューロシジン遺伝子のゲノム組織化を示す略図である。
【図１２】カレイ由来のプリューロシジン遺伝子の上流に存在する一定の転写因子結合部位の略図である。
【図１３】細菌生存に対するペプチドＮＲＣ−１５の影響を示す結果のグラフである。
【図１４】細菌生存に対するペプチドＮＲＣ−１３の影響を示す結果のグラフである。
【図１５】酵母生存に対するペプチドＮＲＣ−１２の影響を示す結果のグラフである。
【図１６】Ｉ型ヘプシジンをコードする非スプライシング（Ａ）および部分的スプライシング（Ｂ）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の図ならびにヒト、マウス、およびサケにおけるヘプシジン遺伝子のイントロン／エクソン構造の略図（Ｃ）である。
【図１７】アラインメント中に示す異なる種由来の一定のヘプシジン配列の図である。
【図１８】カレイ（Ａ）およびセイヨウサケ（Ｂ）由来のヘプシジン遺伝子の一定の３’非翻訳領域を示す図である。
【図１９】異なる魚類由来の一定のヘプシジンのサザンハイブリッド形成分析の結果を示す写真である。
【図２０】カレイの種々の組織中の一定のヘプシジンおよびアクチン遺伝子の発現アッセイの結果を示す写真である。
【図２１】コントロールおよび感染サケの種々の組織中の一定のＩ型（Ａ）および２型（Ｂ）ヘプシジンおよびアクチン遺伝子の発現アッセイの結果を示す写真である。
【図２２】成長中のカレイ仔魚中の一定のＩ型（Ａ）、ＩＩ型（Ｂ）、およびＩＩＩ型（Ｃ）ヘプシジンおよびアクチン遺伝子の発現アッセイの結果を示す写真である。
【図２３】プリューロシジンの同定方法の１つの実施形態で使用したステップの略図である。
【図２４】ヘプシジンの同定方法の１つの実施形態で使用したステップの略図である。
【図２５】１５０ｍＭ  ＮａＣｅの存在下で抗微生物ペプチドＮＲＣ−１３を使用した実験結果を示すグラフである。
【図１−１】
2005536209.tif 000043
【図１−２】
2005536209.tif 000044
【図２】
2005536209.tif 000045
【図３−１】
2005536209.tif 000046
【図３−２】
2005536209.tif 000047
【図３−３】
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【図４】
2005536209.tif 000049
【図５】
2005536209.tif 000050
【図６】
2005536209.tif 000051
【図７】
2005536209.tif 000052
【図８】
2005536209.tif 000053
【図９】
2005536209.tif 000054
【図１０】
2005536209.tif 000055
【図１１】
2005536209.tif 000056
【図１２−１】
2005536209.tif 000057
【図１２−２】
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【図１３】
2005536209.tif 000059
【図１４】
2005536209.tif 000060
【図１５】
2005536209.tif 000061
【図１６−１】
2005536209.tif 000062
【図１６−２】
2005536209.tif 000063
【図１６−３】
2005536209.tif 000064
【図１６−４】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
2005536209.tif 000067
【図１８−１】
2005536209.tif 000068
【図１８−２】
2005536209.tif 000069
【図１８−３】
2005536209.tif 000070
【図１９】
2005536209.tif 000071
【図２０】
2005536209.tif 000072
【図２１−１】
2005536209.tif 000073
【図２１−２】
2005536209.tif 000074
【図２２】
2005536209.tif 000075
【図２３】
2005536209.tif 000076
【図２４】
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【図２５】
2005536209.tif 000078
【国際調査報告】
2005536209.tif 000079
2005536209.tif 000080
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