(57)【要約】本発明は、ペプチドが抗原とともに提供されるアジュバントもしくは抗原を伴わない免疫調節剤として使用されうるＣＤ４関連Ｔヘルパー細胞応答を指図するペプチド、ならびにペプチドＧとして知られる位置１３５−１４９のＭＨＣ  ＩＩβ鎖からの１５ｍｅｒペプチド配列もしくはｄｅｒＧの誘導体、または誘導体が抗原の免疫応答を高める他の誘導体の修飾を含んでなる組成物、ならびに癌、自己免疫疾患、移植状態、外来の真核生物体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギー、ならびにポリペプチドを含むウイルス、ファージおよびプリオンのような原核生物体もしくは非生存病原体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギーの治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療の必要な動物に配列番号１〜２８に示されるところのポリペプチドを投与することを含んでなる、癌、自己免疫もしくは移植状態の治療方法。
【請求項２】
ポリペプチドが腫瘍に対するアジュバントもしくは免疫調節剤として使用される請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリペプチドが自己抗原に対するアジュバントもしくは免疫調節剤として使用される請求項１記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチドが同時に投与される抗原との混合物としてもしくはそれと別個に投与される請求項１記載の方法。
【請求項５】
マイクロアレイ技術を使用して配列番号１〜２８を評価する段階を含んでなる、癌、自己免疫および移植片拒絶状態に用途を持つ予防薬もしくは治療薬であると免疫調節剤を判定する方法。
【請求項６】
治療の必要な動物に配列番号１〜２８に示されるところのポリペプチドを投与することを含んでなる、外来（すなわち非自己）真核生物体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギーの治療方法。
【請求項７】
ポリペプチドが、外来真核生物体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギーに対するアジュバントもしくは免疫調節剤として使用される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチドが、抗原を伴わない外来真核生物体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギーに対するアジュバントもしくは免疫調節剤として使用される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドが同時に投与される抗原との混合物としてもしくはそれと別個に投与される請求項６記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが軍事的用途に適する組成物中に調合される請求項６記載の方法。
【請求項１１】
マイクロアレイ技術を使用して配列番号１〜２８を評価する段階を含んでなる、外来（すなわち非自己）真核生物体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギーを治療するための予防薬もしくは治療薬であると免疫調節剤を判定する方法。
【請求項１２】
治療の必要な動物に配列番号１〜２８に示されるところのポリペプチドを投与することを含んでなる、寄生生物体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギーの治療方法。
【請求項１３】
治療の必要な動物に配列番号１〜２８に示されるところのポリペプチドを投与することを含んでなる、ウイルス、ファージおよびプリオンのような原核生物体もしくは非生存病原体により引き起こされる感染状態の治療方法。
【請求項１４】
ポリペプチドが、ウイルス、ファージおよびプリオンのような原核生物体もしくは非生存病原体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギーのためのアジュバントもしくは免疫調節剤として使用される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドが、抗原を伴わないウイルス、ファージおよびプリオンのような原核生物体もしくは非生存病原体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギーのためのアジュバントもしくは免疫調節剤として使用される、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
ポリペプチドが、同時に投与される抗原との混合物としてもしくはそれと別個に投与される請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドが軍事的用途に適する組成物中に調合される請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
マイクロアレイ技術を使用して配列番号１〜２８を評価する段階を含んでなる、ウイルス、ファージおよびプリオンのような原核生物体もしくは非生存病原体により引き起こされる疾患もしくは感染状態の治療に用途を持つ予防薬もしくは治療薬であると免疫調節剤を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドが抗原とともに提供されるアジュバントもしくは抗原を伴わない免疫調節剤として使用されうる、ＣＤ４関連Ｔヘルパー細胞応答を指図するペプチドに関する。本発明はさらに、ペプチドＧとして知られる位置１３５−１４９のＭＨＣ  ＩＩβ鎖からの１５−ｍｅｒペプチド配列、もしくはｄｅｒＧの誘導体、または誘導体が抗原の免疫応答を高める他の誘導体の修飾を含んでなる組成物に関する。本発明はさらに、配列番号１〜２８に示されるところのポリペプチドを用いる、癌、自己免疫疾患、移植状態、外来真核生物体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギー、ならびにウイルス、ファージおよびプリオンのような原核生物体もしくは非生存病原体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギーの治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１種もしくはそれ以上のＴ細胞結合リガンドを抗原性ペプチドと結合することにより得られる、既知の１分類の免疫学的に活性かつ診断的ペプチド構築物は、特許文献１および特許文献２（それらはそっくりそのまま本明細書に組み込まれる）に記述されるＬ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ（リガンドエピトープ抗原提示系（Ｌｉｇａｎｄ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ））構築物である。Ｌ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ構築物はＴ細胞結合リガンド（ＴＣＢＬ）と称される別のペプチドに結合された抗原性ペプチド（Ａｇ）を有する二すなわち異種（ｈｅｔｅｒｏ−）機能性ペプチドである。本複合体は共刺激シグナルの送達と同時に抗原の提示を起こさせる。
【０００３】
引用される文献に記述されるとおり、ペプチドエピトープへのＴ細胞結合リガンドの結合は免疫応答の性質を変える（すなわち細胞媒介性（ＴＨ１）もしくは抗体（ＴＨ２）応答）。Ｌ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ技術に基づき、特定の分類のペプチド構築物が、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１および特許文献１２（それらの開示は本明細書に組み込まれる）に示されるとおりＨＩＶのような免疫学的障害のために開発された。
【０００４】
いくつかの場合には、複合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ペプチド（「ペプチド構築物」ともまた称される）由来の抗体が、慣習的なペプチド−ＫＬＨ複合物を使用して調製した抗体よりも良好に天然分子を認識することが可能である。さらに、複合化ペプチドにより誘導された抗体は、遊離の直鎖状ペプチドの形態中のみならず天然の分子中のペプチドエピトープもまた認識するより広範な特異性を有する。対照的に、ＫＬＨに複合化したペプチドは天然分子中のエピトープを認識することにしばしば失敗する。上述されたペプチド構築物のＴ細胞結合リガンド部分の一例示は、残基１３５−１４９からのＭＨＣクラスＩＩ  βの一部分（「ペプチドＧ」）の修飾である。
【０００５】
ペプチド構築物は、０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で生理的食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）もしくは注射用水（ＷＦＩ）に調製直後に溶解したペプチドＧを使用して形成した。数時間ないし数日間にわたって２〜８℃の温度すなわち冷蔵；もしくは１８〜２５℃すなわち室温；もしくは４０℃すなわち高温でかつ７．４から４．５までのｐＨ値で維持したペプチド構築物溶液に適用したＨＰＬＣ法は、とりわけより高いｐＨで脱アミノ化しがちなペプチド構築物をもたらした。脱アミノ化はアミノ末端で観察され、そしてイソアスパラギン酸もしくはアスパラギン酸いずれかの残基を生じた。
【０００６】
従って、例えば多様なプロテアーゼに対する感受性を低下させることにより安定性すなわち生物学的半減期を増大させるため、その好ましい天然のリガンドへの結合を変えるもしくは高めるため、特異的結合部位を提供するため、または標識例えば放射活性もしくは蛍光標識を導入する目的上、特定のアミノ酸置換を提供することが高度に望ましいとみられる。同一の天然のリガンドを有するペプチド模倣物が有用でありうることもまた当業者により十分に認識される。これらの模倣物およびそれらの変異に基づく製薬学的組成物もまた望ましい。
【０００７】
本発明は、ペプチドが抗原とともに提供されるアジュバントもしくは抗原を伴わない免疫調節剤として使用されうる、ＣＤ４関連Ｔヘルパー細胞応答を指図するのに有用なペプチドを企図しているため、癌（例えば前立腺癌、黒色腫、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、腎癌、骨癌、白血病、副腎癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌など）、アルツハイマー痴呆、ＡＬＳ、移植障害のような腫瘍抗原および／もしくは自己抗原に関与する疾患、ならびに糖尿病、慢性関節リウマチ、狼瘡、ＭＳ、心筋炎のような自己免疫状態、ならびに、ウイルスおよびそれらの産物（ＨＳＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶのような）、プリオン（ＣＪＤ、ｖＣＪＤ、ＢＳＥ、スクレイピー）、およびミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロスチジウム  ボツリスム（Ｃｌｏｓｔｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｓｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、炭疽（Ａｎｔｈｒａｘ）などのような感染性細菌（原核生物体）により引き起こされる感染性疾患、ならびにまたリーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）回虫、吸虫類、蠕虫、マラリアのプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）および赤痢のアメーバ属（Ａｍｏｅｂａ）のような非自己の真核生物体もしくはそれらの産物により引き起こされる疾患もしくは感染症を予防かつ／もしくは治療するための潜在的に強力なアジュバントもしくは免疫調節剤を提供することもまた望ましいとみられる。
【０００８】
とりわけ、本発明は、自己免疫成分を有することが疑われる特定のＭＨＣアレルに関連するアレルギー疾患のような望ましくないＴ細胞活性化を伴う病理学的応答の処置で有用であるかもしれない。他の有害なＴ細胞媒介性応答は、同種異系宿主からの移植片（ｇｒａｆｔ）もしくは移植片（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）として身体中に意図的に導入された外来細胞の破壊を包含する。例えば、同種移植片拒絶は外来ＭＨＣ分子との宿主Ｔ細胞の相互作用を伴う。極めてしばしば、広範なＭＨＣアレルが同種移植片に対する宿主の応答に関与している。
【０００９】
別の分類の有害な免疫媒介性応答は自己免疫疾患である。自己免疫疾患は、それが外来標的であるように免疫系が「自己」組織を攻撃する自己寛容の喪失をもたらす。重症筋無力症（ＭＧ）、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチおよびインスリン依存性糖尿病を包含する３０以上の自己免疫疾患が現在知られている。
【００１０】
本発明は、従って、感染した生物体を中和しかつ／もしくは殺すための強力な刺激物質（ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）を提供するペプチド、ならびに多様な疾患の危険にさらされているもしくは曝露されている患者に対するアジュバントもしくは免疫調節剤としての本発明の組成物の使用方法を提供する。
【００１１】
さらなる改良、ならびに抗原とともにもしくは伴わずに使用される場合にアジュバント、免疫賦活剤もしくは免疫調節剤としてのペプチドＧおよびｄｅｒＧの使用、ならびに本発明の他の態様を本明細書に記述する。
【特許文献１】米国特許第ＵＳ  ５，６５２，３４２号明細書
【特許文献２】米国特許第ＵＳ  ６，０９６，３１５号明細書
【特許文献３】米国特許第ＵＳ  ６，０９３，４００号明細書
【特許文献４】米国特許第ＵＳ  ６，２６８，４７２号明細書
【特許文献５】米国特許第ＵＳ  ６，１０３，２３９号明細書
【特許文献６】米国特許第ＵＳ  ６，２８７，５６５号明細書
【特許文献７】米国特許第ＵＳ  ６，１１１，０６８号明細書
【特許文献８】米国特許第ＵＳ  ６，２５８，９４５号明細書
【特許文献９】第ＰＣＴ／ＵＳ９８／２０６８１号明細書
【特許文献１０】第ＰＣＴ／ＵＳ  ００／４１６４７号明細書
【特許文献１１】第ＰＣＴ／ＵＳ  ００／４１６４６号明細書
【特許文献１２】第ＰＣＴ／ＵＳ  ０１／１６７９３号明細書
【発明の開示】
【００１２】
［発明の要約］
本発明は、ＡｓｎをＡｓｐで置き換えてｄｅｒＧ（Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ−配列番号７）を形成することにより得られる修飾型異形（ｖｅｒｓｉｏｎ）のペプチドＧ（Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ−配列番号５）が親分子より有意により強力な生物学的活性を有するという発見に部分的に基づく。該ペプチドは、前述されたところの複合化ペプチド（Ｌ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ構築物）として供給されることと独立に免疫応答、とりわけＣＤ４関連（細胞媒介性）応答を高める。イソアスパラギン酸はタンパク質中で天然に見出されないかもしくは遺伝暗号によりコードされないためそれは使用されない。従って、本発明は、免疫系を活性化するための医薬、アジュバント、免疫賦活剤もしくは免疫調節剤として有用な組成物の開発を可能にし、ここで組成物はペプチド、非ペプチド模倣物、もしくは脂肪族類、炭水化物、複素環類、芳香族類、置換された形態およびそれらの混合物から選択される有機分子であってよい。
【００１３】
本発明の第一の態様により、抗原性物質を排除するように応答する人の能力を高めうる、高められたＴｈ１応答を搭載するよう宿主を指図することにより免疫調節剤もしくはアジュバントとして有用な配列番号１〜２５のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含んでなるペプチドが提供される。
【００１４】
本発明の別の態様により、抗原の付随する投与を伴わない免疫調節剤もしくは免疫増強剤として供給される、上で挙げられたペプチド（配列番号１〜２８）の薬理学的に有効な組成物が提供される。
【００１５】
本発明のなお別の態様によれば、該ペプチド（配列番号５〜２８のいずれか１つ）は、他の抗原、アジュバント、安定剤もしくは賦形剤の１種もしくはそれ以上とともに、非経口製剤（注入による）、経皮製剤（皮膚を通り）、経口製剤、経鼻製剤（エアゾル霧状物により投与される）、直腸製剤（坐剤）としてもしくは他の身体開口部（眼、尿生殖器、耳）により供給される。
【００１６】
本発明のさらになお別の態様は抗体の産生のための免疫原としての上で示されたところのペプチドである。一態様においてこうした応用で産生される抗体が提供される。別の態様において抗体は標識されている。なお別の態様において抗体は固体支持体に結合されている。なおさらなる一態様において抗体は単一クローン性である。本発明のさらになお別の態様において、主題はＤＮＡの増幅に有用なプライマーすなわち配列番号５〜２８のいずれか１つのＤＮＡ配列に基づき設計されたオリゴヌクレオチドプライマーである。該態様はまた、配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含んでもよいか、またはその全部もしくは一部分に最低７０％類似である。従って、本発明の本態様は、実質的に類似の単離されたもしくは組換えのポリペプチドもしくは誘導体、相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）またはそれらの類似物に向けられる可能性がある。
【００１７】
本発明の別の態様は、治療上有効な量の配列番号１〜２８に示されるところのアミノ酸配列および製薬学的に許容できる担体を含んでなる、ＣＤ４関連Ｔヘルパー細胞応答の媒介を必要とする疾患を治療するための製薬学的組成物に向けられる。
【００１８】
付加的な態様は：
治療の必要な動物に配列番号１〜２８に示されるところのポリペプチドを投与することを含んでなる癌、自己免疫もしくは移植状態の治療方法；
マイクロアレイ技術を使用して配列番号１〜２８を評価する段階を含んでなる癌、自己免疫および移植片拒絶状態に用途を持つ予防薬もしくは治療薬としての免疫調節剤の決定方法；治療の必要な動物に配列番号１〜２８に示されるところのポリペプチドを投与することを含んでなる外来（すなわち非自己）真核生物体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギーの治療方法；
マイクロアレイ技術を使用して配列番号１〜２８を評価する段階を含んでなる外来（すなわち非自己）真核生物体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギーを治療するための予防薬もしくは治療薬としての免疫調節剤の決定方法；
治療の必要な動物に配列番号１〜２８に示されるところのポリペプチドを投与することを含んでなる寄生生物体により引き起こされる感染状態もしくはアレルギーの治療方法；
それの必要な動物に配列番号１〜２８に示されるところのポリペプチドを投与することを含んでなる細菌のウイルス、ファージおよびプリオンのような原核生物体もしくは非生存病原体により引き起こされる感染状態の治療方法；ならびに
マイクロアレイ技術を使用して配列番号１〜２８を評価する段階を含んでなる細菌のウイルス、ファージおよびプリオンのような原核生物体もしくは非生存病原体により引き起こされる疾患もしくは感染状態の治療に用途を持つ予防薬もしくは治療薬としての免疫調節剤の決定方法
を包含する。
【００１９】
当業者は、本発明の他の局面が添付される図面および以下の詳細な記述への言及に際して明らかになることができることを認識するであろう。
［発明の詳細な説明］
背景
Ｌ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ構築物はＴ細胞結合リガンド（ＴＣＢＬ）と称される別のペプチドに結合された抗原性ペプチド（Ａｇ）を包含する。本複合体は共刺激シグナルを送達すると同時に抗原の提示を起こさせる。ミョウバン、ＭＰＬ  Ｓ／ＥＴＭ（「リピドＡ」）、ムラミルジペプチド（「ＭＤＰ」）もしくは他のサポニン誘導体のようなアジュバント、ならびにＰＬＧおよびＱＳ２１のような小分子量の実体が、免疫応答を向上させるために抗原とともに使用されている。
【００２０】
ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＣＤ４０ＬもしくはＯｘ４０のようなサイトカインおよび免疫調節剤ならびにサイトカイン遺伝子もまた、前処置として使用されているか、または抗原、融合タンパク質もしくは別個の遺伝子の混合物とともに同時に投与されている。注目すべきことに、１０，０００ｋＤａより大きいもしくはそれに等しいサイトカインはリピドＡおよびＭＤＰより大きさがはるかに大きい一方、ＱＳ２１および他のサポニン誘導体は脂溶性でありかつ大きさが中間である。
【００２１】
いくつかの型のＴＣＢＬが評価されている。ペプチドＪおよびＧ、ならびに改良型異形ｄｅｒＧがとりわけ興味深く；ペプチドＪはβ２−ミクログロブリンからの短いフラグメント（アミノ酸３８−５０）であり、また、ｄｅｒＧはＭＨＣ  ＩＩ  β鎖からの修飾されたフラグメント（アミノ酸１３５−１４９）である。これらの複合物はＴ細胞の異なるサブセットを活性化するようである。ＭＨＣ  ＩＩ  β鎖の部位特異的突然変異誘発研究および／もしくはペプチド競合研究に基づけば、ペプチドＧはおそらくＣＤ４（Ｔ細胞共刺激物質分子）に結合する。ペプチドＪのリガンドはより少なく十分に定義されているが、しかし、モノクローナル抗体結合実験に基づけば、ペプチドＪ領域の一部分はＡＰＣ上でＭＨＣ  Ｉ抗原複合体に複合体形成される場合に露出される。これらのペプチドの複合物はＴ細胞の異なるサブセットを活性化するようである。
【００２２】
【表１】
2005523891.tif 000002
【００２３】
マウスの系において、抗原特異的Ｔｈ１免疫応答の免疫賦活およびこうした活性化のその後の阻害は細胞死をもたらし、ここでＣＤ４結合部位はＩ−Ａ  βｋからの相同配列（ペプチドＧ）を有するペプチドと相互作用する。しかしながら、他の研究者は、抗原特異的Ｔｈ１免疫応答の免疫賦活がＩＦＮ−γの抗原特異的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を高めたことを報告している（Ｓｈｅｎら“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ＣＤ４”、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  １０：２４７−５７およびＳｈｅｎら“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＣＤ４−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６  １５７：８７−１００）。Ｃｌａｙｂｅｒｇｅｒらはさらに、この同一領域からのペプチドが新鮮ＰＢＬのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＴＬ増殖および同種異系応答を阻害することを開示している（“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＣＤ８  ａｎｄ  ＣＤ４  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｌｏｃｋ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｉｍｕｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ”、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４  １５３：９４６−５１）。注目すべきことに、Ｇｉｌｆｉｌｌａｎら（“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＣＤ４”、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  １６１：６６２９−３７）は、プロピオニル化ペプチドを使用する場合にアミノ末端の中和が起こることを開示している（Ｓｈｅｎら“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＣＤ４−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６  １５７：８７−１００もまた参照されたい）。
【００２４】
該ペプチドのヒト対照物がＬ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ構築物のＴＣＢＬ部分として該構築物中で使用されている。とりわけ、該ペプチドは、マウス実験より低濃度でかつより少なく頻繁な投与を伴うといえども抗原提示を助長する。注目すべきことに、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  β１３５−１４９に基づくＴＣＢＬはマウスＣＤ４ならびにヒトＣＤ４に結合する（Ｃａｍｍａｒｏｔａら、“ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＣＤ４  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ  ２  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−ＤＲ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”、Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５６；ｐｐ．７９９−８０１）。加えてＭＨＣ上の第二の部位は別のＣＤ４エピトープに結合する。双方の部位が完全な応答の発生および成熟において重要である一方、双方のＭＨＣＩＩ  ＣＤ４相互作用が同時に発生し得ないために結合事象は連続して起こる（Ｙｅｌｏｎら、“Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＣＤ４−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｉ−Ｅｋ  ｄｏ  ｎｏｔ  ｉｍｐｅｄｅ  ＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ；１９９９；１６２；ｐｐ．１３４８−１３５８；Ｙｅｌｏｎら、“Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＣＤ４  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ａｃｃｏｍｐａｎｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６  ８：１０７７−９０；Ｍｏｓｔａｇｈｅｌら、“Ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＤ４  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ”、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８  １６１：６５５９−６６；およびＲｉｂｅｒｄｙら、“Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ４  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｌｏｃｋｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＤ４（＋）Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９８  ９５：４４９３−８）。
腫瘍系でのｄｅｒＧの保護効果
ｄｅｒＧが腫瘍系に対するそれ自身の免疫賦活もしくはアジュバント特性を有するかもしれないことの確認を実施例の実施例１に示す。多くの癌が類似の夥しい抗原および突然変異を発現し、ワクチンは共有される抗原に基づく。従って、同一の癌からの同種異系腫瘍でワクチン接種することにより、Ｔ細胞応答はワクチンと患者自身の腫瘍との間で共有される抗原により刺激されうる。
【００２５】
有利には、同種異系性（ａｌｌｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）はワクチン開発のための同一遺伝子腫瘍のひどく時間がかかる増殖の必要性を回避する。なおさらに、ワクチンにより遭遇される宿主対移植片誘発性の反応が、実際に抗原プロセシングを促進しかつそれによりワクチンの有効性を改善するかもしれない。マウスＢ１６黒色腫モデルの順応に基づく原理研究の証明がこの理論を立証する。
【００２６】
具体的には、Ｃ５７／ｂ１６（Ｈ２ｂ）マウスを１週間隔で最低２回、同種異系黒色腫Ｋ１７３５（Ｈ２ｋ）でワクチン接種し、そしてその後同一遺伝子Ｂ１６（Ｈ２ｂ）腫瘍で攻撃する。該モデルにおける治療的および予防的双方の形態が有意の保護を示す。同種異系ワクチン接種（ａｌｌｏ−ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）により導き出される免疫応答の研究もまた、同種異系腫瘍でのワクチン接種後に同一遺伝子腫瘍に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が発生することを示している。これは交差プライミングおよび共有される抗原の存在の明白な証拠である。
【００２７】
ペプチドｄｅｒＧもしくはＪを伴うＴＲＰ２１８０−１８８ペプチドのＬ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ構築物の免疫感作およびｄｅｒＧもしくはＪの混合物（ＴＣＢＬプール）の使用はｄｅｒＧの免疫賦活もしくはアジュバント活性を確立した。反復実験は一貫した結果を生じた。しかしながら同種異系ワクチンは小さな有効性のみを示した。さらに、Ｊ−ＴＲＰ２１８０−１８８（ＬＥＡＰＳ  １）もしくはＴＣＢＬプール（ｄｅｒＧ＋Ｊ）を単独で使用した場合に保護はみられなかった。注目すべきことに、Ｋ１７３５と組合せのＪ−ＴＲＰ２１８０−１８８（ＬＥＡＰＳ  １）は保護を示さなかった。該結果は、重要な種が複合物もしくは別個の実体としてのｄｅｒＧペプチドであることを示唆する。
【００２８】
ＴＣＢＬプールはｄｅｒＧ（ＴＣＢＬ２）およびＪ（ＴＣＢＬ）双方の混合物であったとは言え、同種異系細胞の非存在下で有効性は検出されなかった。他方、細胞の組合せは双方の実験について４０％および２０％の保護をもたらした。ＴＣＢＬプールは混合物であったため、どちらのＴＣＢＬが活性であるかを評価することは困難である。ｄｅｒＧを細胞とともに投与した場合、保護はＴＣＢＬのものに類似のレベル（３０％および４０％）でみられた。注目すべきことに、ｄｅｒＧ−ＴＲＰ２１８０−１８８は独力で２０％の有効性を示した。
【００２９】
これらのデータはｄｅｒＧが試験した化合物中の有効成分であるかもしれないことを示唆する。このペプチドはｄｅｒＧ−ＴＲＰ２１８０−１８８（ＬＥＡＰＳ  ２）およびＴＣＢＬの混合物（Ｊ＋ｄｅｒＧ）双方に存在し、双方の場合で類似のレベルの保護を生じる。保護は同種異系腫瘍細胞が存在する場合にのみ明示され、ｄｅｒＧが特異的Ｔ細胞免疫を高めることを示唆する。
【００３０】
ＣＴＬがこれらの系の主要な保護的要素であるようであることを考えれば、Ｃｒ５１を使用する殺傷活性の測定はｄｅｒＧ活性の有用な生物マーカーとなる。明らかに、同種異系ワクチン接種は同一遺伝子腫瘍を殺すことが可能なＣＴＬの生成を生じさせる。さらに、ｄｅｒＧの効果は単独でもしくは抗原（同種異系腫瘍細胞ワクチン接種）とともに偶然に起きていた可能性はない。これは、より少なく活性であった親ペプチドＧからの差異を考慮する場合にとりわけ重要である。
【００３１】
ｄｅｒＧの生物学的活性および機構を決定することが可能な別の方法はＷａｔａｎａｂｅら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：６５７７（２００１）に開示されるところの高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイの利用である。マウス脳組織に対するイチョウ（Ｇｉｎｋｏ  ｂｉｌｏｂａ）の効果の評価と同様に、遺伝子の発現および転写は、サイトカインの新規プロフィル、細胞の分化、または試験動物のリンパ系もしくは浸潤する組織もしくは細胞から抽出したＲＮＡからの活性化抗原を示す。特定の遺伝子（１種もしくは複数）およびそのコードされるタンパク質（１種もしくは複数）が一旦同定されれば、商業的に入手可能なアッセイを使用して、ｄｅｒＧもしくは関連作用物質での処置後に誘導されるタンパク質の量のモニタリングが可能である。
マラリアＬ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ構築物およびｄｅｒＧ  ＴＣＢＬ
添加物としてもしくは免疫賦活剤として使用される場合のＴＣＢＬの生物学的活性の評価は、実施例の実施例２および３に示されるところのマラリア保護アッセイで所望の結果を示した。単一種に複合化した抗原およびペプチドＧ  ＭＨＣ−ＩＩ  β１３４−１３８は保護的有効性の実質的改善を示した。
【００３２】
感染からの保護の実質的改善はまた、複合化されたにしろ単独にしろ改良ＴＣＢＬ  ｄｅｒＧを受領する群でもみられた。ＷおよびＧペプチドでのより早期の結果に基づき血清プール中のＩＦＮ−γレベルを評価した。しかしながらＢａｌｂ／Ｃ系統で保護はみられなかった。灌流により肝（感染の主要部位）および脾細胞集団から単離したＩＦＮ−γ＋／ＣＤ４＋細胞の存在を測定するＦＡＣＳ分析は、とりわけ肝細胞について増大したレベルのＩＦＮ−γをさらに示した。
【００３３】
効力を評価するために減少する用量のｄｅｒＧとともに単一系統のマウス（Ａ／Ｊ）を使用したことのみを除き第一のものに類似の別の実験を実施した。再度、結果は一貫していた。なお別の実験は３種の他のマウス系統すなわちＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｈ２Ｋ）およびハイブリッドＣＡＦ１（Ａ／Ｊ×ＢＡＬＢ／ｃ）でのｄｅｒＧの保護的有効性を評価し、ここで、該結果は、ｄｅｒＧがＣ３Ｈ／ＨｅＪを保護するがしかしＢＡＬＢ／ｃおよびハイブリッドＣＡＦ１（Ａ／Ｊ×ＢＡＬＢ／ｃ）をしないことを示す。
感染のＨＳＶ−１および乱切帯状疱疹様拡大（Ｚｏｓｔｅｒｉｆｏｒｍ  Ｓｐｒｅａｄ）モデル
ＨＳＶ感染の帯状疱疹様拡大モデルが抗ウイルス薬およびワクチンの有効性を評価し、ここで、改良動物モデルは神経侵襲性と非神経侵襲性ウイルスの間を区別する。感染の乱切（表皮剥脱）帯状疱疹様拡大モデルはＣＥＬ−１０００（ｄｅｒＧ）がＡ／Ｊマウスを致死的ＨＳＶ−１攻撃から保護することを明瞭に示した。
【００３４】
疾患の進行を監視し、そして病変の進行および重症度を０から７（死亡）までで評価した。いくつかの実験において、タイミング、投与経路およびマウス系統の改変をＣＥＬ−１０００の有効性について評価した。該モデルは２５μｇの単回投与を使用してＣＥＬ−１０００の投与のタイミングもまた評価した。とりわけ、低下した罹患率、帯状疱疹様拡大および死亡率のような症状の発症の遅延が観察された。生存は、ＨＳＶ−１での攻撃前第２８、１４、７日にセピック（Ｓｅｐｐｉｃ）ＩＳＡ−５１中で乳化したＣＥＬ−１０００（２５μｇ）の単回投与で処置したＡ／Ｊマウスについて観察された。
【００３５】
驚くべきことに筋肉内投与がより有効である。完全な（１００％）保護はＣＥＬ−１０００を攻撃２週間前に筋肉内投与した場合に達成された。加えて、該投与は他の処置と同一濃度で水性溶液中でアジュバントを伴わずに送達し、それによりアジュバントが必要でないことを示唆する。
【００３６】
ＣＥＬ−１０００の類似の保護効果が他の系統（異なるＭＨＣ背景をもつ別の近交系Ｃ５７ＢＬ６および非同系（ｏｕｔｂｒｅｄ）系統ＣＤ１双方）でみられた。明らかに、ＣＥＬ−１０００（ｄｅｒＧ）はＨＳＶ−１攻撃に対し生存を延長した。
ペプチド構築物
本出願で開示されるペプチドについて、そのアミノ酸配列を以下のような一文字および三文字識別記号により示す：
【００３７】
【表２】
2005523891.tif 000003
【００３８】
配列番号１〜２８は、多様なプロテアーゼに対する感受性を低下させることにより安定性すなわち生物学的半減期を増大させるため、その好ましい天然のリガンドへの結合を変えるもしくは高めるため、特異的結合部位を提供するため、または放射活性もしくは蛍光標識のような標識を導入する目的上改変し得る。同一の天然のリガンドを有するペプチド模倣物が有用でありうることもまた当業者により十分に認識される。
【００３９】
より高い親和性により配列番号１〜４のポリペプチドを置き換える配列番号１〜４と同一部位に結合する小分子もまた当業者により設計され得る。該分子は、限定されるものでないが脂肪族類、炭水化物、複素環類、芳香族類もしくはそれらの混合物を挙げることができる分子の以下の分類から選ぶことができる。好ましい模倣物は、米国特許第ＵＳ  ５，８３５，３８２号明細書（それはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるＥＭＰ１のようなＥＰＯ模倣物のエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体に接触する原子のものに類似の位置の原子を包含することができる。なおより好ましい模倣物は配列番号１〜２８のポリペプチドに構造的に類似であることができる。
【００４０】
小分子およびポリペプチド模倣物の設計において当業者により知られる方法は所望の構造を有する化合物のコンピュータに基づく同定方法を使用する。より具体的には、本発明は、ペプチドをＴ細胞結合受容体の一部分と共結晶化する場合に該ペプチド中の原子の一サブセットの三次元座標を使用してコンピュータの方法によってペプチドおよび非ペプチド模倣物の候補を決定する。
【００４１】
これらのコンピュータに基づく方法は２つの広範な分類すなわちデータベース法およびｄｅ  ｎｏｖｏ設計法に分かれる。データベース法において、目的の化合物を化学構造のデータベース中に存在する全化合物と比較し、そしてその構造が目的の化合物に何らかの様式で類似である化合物を同定する。データベース中の構造は、ＮＭＲもしくはｘ線結晶学により生成される実験データまたは二次元（すなわち配列）データに基づくモデル化した三次元構造のいずれかに基づく。ｄｅ  ｎｏｖｏ設計法においては、その構造が目的の化合物に何らかの様式で類似である化合物のモデルを、既知の構造由来の情報、例えばｘ線結晶学および／もしくは理論的規則により生成されるデータを使用してコンピュータプログラムにより生成する。こうした設計方法は、原子ごとの様式で、もしくは記憶された小分子フラグメントを集成することによるかのいずれかで、所望の構造を有する化合物を構築し得る。目的の化合物に類似の活性をもつ化合物の同定におけるデータベースおよびｄｅ  ｎｏｖｏ法の成功は、目的の化合物の機能的に関連する部分の同定に依存する。
【００４２】
薬物については、機能的に関連する部分はファーマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）と称される。ファーマコフォアは構造的特徴および生物学的活性に重要な官能基の配置である。所望のファーマコフォアを有する全部の同定された化合物がＴＣＢＬ模倣物として作用することができるわけではない。実際の活性は、最終的には適切な生物学的アッセイで該化合物の活性を測定することにより決定する。しかしながら、本発明の方法は、実際の模倣物を同定するために試験しなければならない化合物の数を大きく低下させるのにそれらを使用し得るために極めて価値がある。
【００４３】
本発明により企図されるペプチドフラグメントは：
【００４４】
【表３】
2005523891.tif 000004
【００４５】
である。
【００４６】
下は、上の配列の生物学的特性を改良するために意図される修飾の多様な範疇である。
群１
ペプチド（１種もしくは複数）のカルボキシルペプチダーゼに対する感受性を低下させるためのカルボキシル末端のアミド化もしくはエステル化の使用。
【００４７】
【表４】
2005523891.tif 000005
【００４８】
群２
ある種の複合物において複合および間隔を空けることを助長するためにカルボキシル端に数個のアミノ酸例えばＧＧＧ（しかしそれに制限されない）を付加する。
【００４９】
【表５】
2005523891.tif 000006
【００５０】
群３
アミノ末端のアミノ酸をより安定なもの（ＮからＤ）に変更する、もしくはグリシンに隣接の場合にアミノ末端を不安定なアスパラギンからアスパラギン酸に変更する。
【００５１】
【表６】
2005523891.tif 000007
【００５２】
群４
以下のペプチドで示されるとおり、アミノ末端のアミノ酸のアセチル化、プロピオニル化、ブロモもしくはクロロを使用してｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質分解を低下させ、そして従って半減期を増大させる：
【００５３】
【表７】
2005523891.tif 000008
【００５４】
ここで、米国特許第ＵＳ  ５，０６６，７１６号明細書に示されかつ引用することにより本明細書に組み込まれるとおり、ＣｌＡｃはクロロ酢酸を、もしくはＢｒＡｃはブロモ酢酸を表し、そしてａｃｅｔｙｌはアミノ末端に付加されるアセチル化基を表す。
群５
Ｂにより表されるアミノ酸類似物（米国特許第ＵＳ  ５，７３６，４１２号明細書を参照されたい）シクロヘキシルアラニンを使用して迅速なタンパク質分解の可能性を低下させる。
【００５５】
【表８】
2005523891.tif 000009
【００５６】
もしくは、Ｚにより表されるＤ−アミノ酸とりわけＤ−アラニン（米国特許第ＵＳ  ５，７３６，４１２号明細書）を使用して迅速なタンパク質分解の可能性を低下させる
【００５７】
【表９】
2005523891.tif 000010
【００５８】
群６
添付される配列表に同定されるＣＤ４分子への結合を増大させるＣＤ４と相互作用する部位での置換を使用する。類似の型のアミノ酸での保存的置換をグループ分けから以下のとおり列挙する。同一の範疇内だがしかし異なるレベルの場合、それらは保存的置換とみなされない。
【００５９】
【表１０】
2005523891.tif 000011
【００６０】
Ｅ１３７Ｄおよび／もしくはＡ１４０Ｇ（Ｖ、Ｌ、Ｉ）ならびにまたはＶ１４２Ｉ、Ｌ（もしくはＧ、Ａ）（ここでカッコ内の置換はより少なく類似である）など。付加的な置換を下に示す。
【００６１】
【表１１】
2005523891.tif 000012
【００６２】
群７
とりわけプロテアーゼ感受性の場合（とりわけアルギニン、リシンもしくはシステイン）にＣＤ４と相互作用しない部位での置換を使用し、また、置換ε−アミノ（メチル、アルキル）リシンもしくはヒドロキシルロイシンもしくはロイシンのような類似物の使用によりリシンについて他の保存的置換を利用する。
【００６３】
【表１２】
2005523891.tif 000013
【００６４】
群８
上の配列番号１〜１０の短縮形を使用する。
【００６５】
【表１３】
2005523891.tif 000014
【００６６】
さらに、ＣＬＩＰ、すなわち抗原性ペプチド結合部位の各コイルが３．０アミノ酸のターンあたりのアミノ酸反復頻度をもつポリプロリルＩＩ型（ＰＰＩＩ）ヘリックス（一方でそれはαヘリックスについて３．２である）のような抗原性ペプチド。ｄｅｒＧの配列の検査は１アミノ酸のみが部位特異的突然変異誘発研究により同定された２アミノ酸間で決定的に重要として見出されることを示す（同定された最初のＶを決定的に重要な「Ｖ」として使用する場合、下を参照されたい：
【００６７】
【表１４】
2005523891.tif 000015
【００６８】
１個の「Ｇ」の同一面の挿入上での「Ａ」および「Ｖ」の提示を見込む１アミノ酸だけの増加は同一面の残基をより良好に提示する。
【００６９】
【表１５】
2005523891.tif 000016
【００７０】
Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら（２０００  Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：２６９３−７）はそれらのペプチド中の４アミノ酸（ＬＭＲＫ）を置き換える５−アミノペンタン酸を開示しかつ４個のメチレン架橋（−ＨＮ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２）を付加するとは言え、アミノ官能基の遠位のＣが必要とされる。アミノ酸中の最初のすなわちα  Ｃでない。スペーサーの代わりの２アミノ酸の有用な置換は、３もしくは２アミノ酸を置き換えるγアミノ酪酸（ｇａｂａ）すなわち（ＨＮ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２）および３アミノプロパン酸（ａｐａ）すなわち（ＨＮ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２）を包含する。
【００７１】
従って、ＧＧはｇａｂａもしくはａｐａにより置換されるべきであるとは言え、以下のような他の類似の置換が本発明の範囲内にあることができる：
【００７２】
【表１６】
2005523891.tif 000017
【００７３】
この置換が具体的に説明される他の部位の例は以下のとおりである：
【００７４】
【表１７】
2005523891.tif 000018
【００７５】
ＣＤ４との接触のための別の決定的に重要な点は以下のとおり分子のより多くを包含するように伸長された配列である：
【００７６】
【表１８】
2005523891.tif 000019
【００７７】
小文字で示される残基は高度に変動性の部位を表す。例えば、４３の残基のようなＣＤ４のフェニルアラニンと接触する１４３のイソロイシンおよび１５９のロイシン。その場合、該ペプチドは以下のようなアスパラギン酸の形態：
【００７８】
【表１９】
2005523891.tif 000020
【００７９】
もしくはアミノ封鎖されたＡｃ、Ｐｒ、ＣｌＡｃもしくはＢｒＡｃの形態：
【００８０】
【表２０】
2005523891.tif 000021
【００８１】
として使用し得る。
【００８２】
伸長された形態は脱アミド化する（ｄｅａｍｉｄａｔｅ）傾向を有するＮＧ配列を有するため、より安定な形態は：
【００８３】
【表２１】
2005523891.tif 000022
【００８４】
のＤＧへの置換を有するかもしれない。
【００８５】
より少なく親水性のα−アミノブタン酸（Ａｂａ）すなわちＳもまた企図される：
【００８６】
【表２２】
2005523891.tif 000023
【００８７】
費用およびアミノ末端の大きさを、最初の決定的に重要なＥ１３７まで低下させるように短縮するため、以下の構築物を提供してよい：
【００８８】
【表２３】
2005523891.tif 000024
【００８９】
フラグメントａｖａ、ｇａｂａ（もしくはａｐａ）を、前の領域中の非接触残基、ならびに伸長された形態のＶＳＴＧＬおよびＱＮＧＤＷＴＦＱＴセグメントの代わりに用いることができる。アミノ末端の位置Ｂ（もしくはＤ、ＣｌＡｃ、ＢＲＡｃ）はＫプロテアーゼ感受性部位のεアミノ（メチル  アルキル）リシン（Ｋｅａ）、ヒドロキシルロイシン（Ｌｏｈ）もしくはイソロイシン（Ｉ）の代わりに用いることができる。フェニルアラニン（Ｆ）をより不安定なトリプトファンＷの代わりに用いることができ、また、Ｅ１３７、Ａ１４０、Ｖ１４２Ｉ、Ｌ（もしくはＧ、Ａ）の接触残基の代わりにもまた用いることができる。
【００９０】
Ｄ異性体の形態：
【００９１】
【表２４】
2005523891.tif 000025
【００９２】
を包含しかつ
【００９３】
【表２５】
2005523891.tif 000026
【００９４】
までアミノ酸を連続して（ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｌｙ）かつ連続して（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ）除去した、本発明によりまた企図され得るｄｅｒＧのアミノ酸の逆の順序は以下のとおりであることができる：
【００９５】
【表２６】
2005523891.tif 000027
【００９６】
２つの逆の形態は「ｇａｂａ」もしくは「ａｐａ」の以前の置換もまた組み込み得る。
【００９７】
本発明はまた、上の改良すなわち群１のカルボキシル末端アミド、群２のＧＧＧのカルボキシル末端伸長、群３のアミノ末端修飾（ＢもしくはＺもしくはＢｒＡｃもしくはＣｌＡｃもしくはＡｃ）、群４の結合部位の内的保存的置換および群５のプロテアーゼ感受性のＫ置換の２種もしくはそれ以上の組合せも包含する。
【００９８】
ｄｅｒＧペプチドのＥ１３７、Ｖ１４０およびＶ（Ｓ）１４２／３と類似の様式で同一のＣＤ４部位に結合しかつ従って生物学的効果のためｄｅｒＧの上述された誘導体と競合する、ｘ線結晶学的もしくは他の研究に基づくペプチド模倣物の使用。
【００９９】
アミノ酸の変動に加え、Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸が遊離酸（アミノもしくはカルボキシル基）、または免疫調節剤もしくはアジュバントのペプチドｄｅｒＧの安定性および生物学的半減期を増大しうるそれらの塩、エステル、エーテルもしくはアミドとして存在してよいこともまた認識される。とりわけ、Ｃ末端のアミド末端基およびＮもしくはＣ末端のアセチル化、例えばミリスチルなどは、該ペプチドの免疫学的特性を遂げることなくしばしば有用である。
【０１００】
該ペプチドおよびそれらの構成要素成分は、タンパク質を合成するための慣習的方法、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．、１９６３（Ｊ．ｏｆ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９−２１５４）により記述された固相ペプチド合成により製造し得る。本発明の新規ペプチド構築物もしくはそれらのペプチド成分を遺伝子工学技術により製造することもまた本発明の範囲内かつ当該技術分野の熟練内にある。
【０１０１】
本発明のペプチドの投与は単独でもしくは他の治療とともに実施してよい。本発明のペプチド構築物とともに使用してよい他の治療の例は、ＨＩＶによる感染のための処置（予防的もしくは治療的）の場合は例えばプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤などを包含する。
【０１０２】
本発明のペプチド構築物は、予防的にもしくは治療的にのいずれかで１種もしくはそれ以上の製薬学的に許容できる担体もしくは補助物質と一緒に免疫調節組成物の一成分として使用してよい。治療的に使用するため提供される場合、該免疫調節組成物は感染もしくは疾患のいかなる証拠よりも前に提供される。
【０１０３】
免疫原性ペプチド構築物が純粋なもしくは実質的に純粋な形態で投与されることが可能である一方、それを製薬学的組成物、製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）もしくは製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）として提示することが好ましい。
【０１０４】
臨床およびヒト双方の使用のための本発明の製剤は、１種もしくはそれ以上の製薬学的に許容できる担体および場合によっては他の治療的成分、とりわけ治療的免疫学的アジュバントと一緒に、上述されたところの複合化ペプチドを含んでなる。担体（１種もしくは複数）は、該製剤の他成分と適合性かつその受領体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）に対し有害でないという意味において「許容でき」なければならない。
【０１０５】
一般に、製剤は有効成分を液体担体もしくは微細に分割した固体担体または双方と均一かつ緊密に連合させること、およびその後必要な場合は生成物を所望の製剤に至らせることにより製造する。本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、いかなる担体、希釈剤、賦形剤、懸濁化剤、滑沢剤、補助物質、ベヒクル、送達系、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料もしくは甘味料も指す。製剤は、便宜的に単位投与剤形で提示してよく、かつ、製薬学的技術分野で公知のいかなる方法により製造してもよい。
【０１０６】
静脈内、筋肉内、皮下もしくは腹腔内、経鼻投与に適する可能な製剤は有効成分（１種もしくは複数）の滅菌の水性溶液を含んでなり、溶液は好ましくは受領体の血液と等張である。本発明の化合物はまた、慣習的な非毒性の製薬学的に許容できる担体、補助物質およびベヒクルを含有する投薬製剤で、経口で、非経口で、吸入スプレーにより、局所で、直腸で、頬側で、膣でもしくは埋込式リザーバを介して投与してもよい。本明細書で使用されるところの非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内で、クモ膜下で、脳室内で、胸骨内および頭蓋内注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）もしくは注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）技術を包含する。
【０１０７】
こうした製剤は、塩化ナトリウム（例えば０．１〜２．０Ｍ）、グリシンなどのような生理学的に適合性の物質を含有しかつ生理学的条件と適合性の緩衝されたｐＨを有する水中に固体の有効成分を溶解して水性溶液を生じさせること、および該溶液を滅菌にすることにより便宜的に製造してよい。これらは単位または複数用量容器例えば封止アンプルもしくはバイアル中に存在してよい。
【０１０８】
経口投与のためには、本発明の化合物を当該技術分野で既知のいずれかの適する投薬形態で提供してよい。例えば、該組成物は、当該技術分野で既知の慣習的機器および技術を使用して錠剤、散剤、顆粒剤、ビーズ、咀嚼可能なトローチ剤、カプセル剤、液体、水性懸濁剤もしくは溶液または類似の投薬形態に組み込んでよい。錠剤の投薬形態が好ましい錠剤は乳糖およびトウモロコシデンプンのような担体ならびに／もしくはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤を含有してよい。カプセル剤は乳糖および乾燥トウモロコシデンプンを包含する希釈剤を含有してよい。水性懸濁剤は有効成分と組み合わせた乳化剤および懸濁化剤を含有してよい。経口製剤は、とりわけタルク、ステアリン酸マグネシウム、晶質セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウムもしくはアラビアゴムのような典型的な担体とさらに組み合わせてよい。
【０１０９】
本発明の組成物を組み込む投薬形態を製造する場合は、化合物を、ゼラチン、糊化済デンプンなどを包含する結合剤；硬化植物油、ステアリン酸などのような滑沢剤；乳糖、マンノースおよびショ糖のような希釈剤；カルボキシメチルセルロースおよびデンプングリコール酸ナトリウムのような崩壊剤；ポビドン、ポリビニルアルコールなどのような懸濁化剤；二酸化ケイ素のような吸収剤；メチルパラベン、プロピルパラベンおよび安息香酸ナトリウムのような保存剤；ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０などのような界面活性剤；Ｆ．Ｄ．＆Ｃ．色素およびレーキのような着色剤；香料；ならびに甘味料のような慣習的賦形剤と混和してもまたよい。
【０１１０】
本発明の製剤は安定剤をさらに組み込んでよい。具体的に説明する安定剤はポリエチレングリコール、タンパク質、糖、アミノ酸、無機酸および有機酸を包含し、それらは単独でもしくは混合状態としてのいずれかで使用してよい。これらの安定剤は、使用される場合に、好ましくは免疫原の重量部分あたり約０．１ないし約１０，０００重量部分の量で組み込まれる。２種もしくはそれ以上の安定剤を使用するべきである場合には、それらの総量は好ましくは上で明記された範囲内にある。これらの安定剤は適切な濃度およびｐＨの水性溶液中で使用する。こうした水性溶液の比浸透圧は一般に約０．１ないし約３．０オスモルの範囲、好ましくは約０．８ないし約１．２の範囲にある。該水性溶液のｐＨは約５．０ないし約９．０の範囲内、好ましくは６〜８の範囲内であるように調節する。本発明の免疫調節もしくはアジュバントペプチドの処方において抗吸着剤を使用してもよい。
【０１１１】
本発明の化合物は滅菌の注入可能な製剤の形態で、例えば注入可能な水性もしくは油性懸濁剤として投与してもまたよい。これらの懸濁剤は適する分散助剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤を使用して当該技術分野で既知の技術に従って処方してよい。滅菌の注入可能な製剤は、非毒性の非経口で許容できる希釈剤もしくは溶媒中の滅菌の注入可能な溶液もしくは懸濁剤であってもまたよい。使用してよい許容できるベヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液および等張の塩化ナトリウム溶液などである。加えて、滅菌の不揮発性油を溶媒もしくは懸濁媒体として便宜的に使用する。この目的上、合成モノもしくはジグリセリドを包含するいかなる刺激のない非毒性の不揮発性油も使用してよい。とりわけそれらのポリオキシエチル化型異形のオリーブ油およびヒマシ油を包含するオレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸が注入可能製剤の製造で有用である。これらの油溶液もしくは懸濁剤は長鎖アルコール希釈剤もしくは分散体（ｄｉｓｐａｒｓａｎｔ）もまた含有してよい。
【０１１２】
本発明の化合物はまた坐剤の形態で直腸に投与してもよい。これらの組成物は、室温で固体であるがしかし直腸温度で液体でありそして従って直腸中で融解して薬物を放出することができる適する非刺激性の賦形剤と薬物を混合することにより製造可能である。こうした物質はカカオバター、ミツロウおよびポリエチレングリコールを包含する。
【０１１３】
本発明の化合物は、とりわけ、処置のために取り扱われる状態が眼、皮膚もしくは口、鼻、膣、粘膜、直腸もしくは下部腸管の神経学的障害を包含する局所適用により容易に接近可能な領域もしくは器官を伴う場合に、局所で投与してもまたよい。適する局所製剤はこれらの領域のそれぞれについて容易に製造される。
【０１１４】
眼への局所適用すなわち眼科使用のため、該化合物は等張のｐＨを調節した滅菌の生理的食塩水中の微粉状懸濁剤として、または、好ましくは、塩化ベンザルコニウムのような保存剤を含むもしくは含まないのいずれかの等張のｐＨを調節した滅菌の生理的食塩水中の溶液として処方し得る。あるいは、眼科使用のために、該化合物をワセリンのような軟膏中で処方してよい。
【０１１５】
皮膚への局所適用のためには、該化合物を、例えば以下すなわち鉱物油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋および水の１種もしくはそれ以上との混合物中に懸濁もしくは溶解した化合物を含有する適する軟膏剤に処方し得る。あるいは、該化合物は、例えば以下すなわち鉱物油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステル蝋、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水の１種もしくはそれ以上の混合物中に懸濁もしくは溶解した有効成分を含有する適するローション剤もしくはクリーム剤に処方し得る。
【０１１６】
本発明のペプチド構築物の好ましい濃度は、抗原との組合せ剤もしくは混合物中にすなわち曝露前に０．０１から１０μｇ／ｋｇまでの範囲にあってよい。しかしながら、単一の投薬形態を生じさせるために担体物質と組み合わせうる有効成分の量は、処置を受ける宿主および特定の投与様式に依存して変動することができる。いくつかの因子は、使用する特定の化合物の活性、齢、体重、全身の健康状態、性別、食餌、投与部位、投与時間、排泄速度、薬物の組合せ剤ならびに処置を受けている特定の疾患の重症度および投与の形態を包含する。
【０１１７】
製薬学的方法を使用して作用の持続時間を制御してもまたよい。制御放出製剤は該ペプチドを複合体形成もしくは吸収するポリマーの使用により達成されるかもしれない。制御送達は、適切な巨大分子（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースもしくはプロタミン硫酸）および巨大分子の濃度、ならびに放出を制御するための組み込み方法を選択することにより行ってよい。
【０１１８】
例えば、発明の化合物を数日の期間にわたる制御放出のため疎水性ポリマーマトリックス中に組み込んでよい。こうした制御放出薄膜は当該技術分野で公知である。経皮送達系がとりわけ好ましい。本発明で使用してよい、本目的上普遍的に使用されるポリマーの他の例は、外的にもしくは内的に使用してよい、非分解性のエチレン−ビニルアセテートコポリマーおよび分解性の乳酸−グリコール酸コポリマーを包含する。ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）もしくはポリ（ビニルアルコール）のようなある種のヒドロゲルが、しかし、より短い放出周期について、その場合は上に挙げられたもののような他のポリマー放出系もまた有用であるかもしれない。
【０１１９】
あるいは、これらの作用物質をポリマー粒子中に組み込む代わりに、これらの物質を例えばコアセルベーション技術もしくは界面重合により製造したマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、またはコロイド状薬物送達系、例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル中もしくはマクロエマルション中に捕捉することが可能である。
【０１２０】
中枢神経系の標的に対し治療上有効であるために、本発明の化合物は末梢で投与される場合に血液脳関門を容易に浸透すべきである。血液脳関門を浸透し得ない化合物は、脳室内経路もしくは脳への投与に適する他の適切な送達系により効果的に投与し得る。
【０１２１】
本発明のペプチド構築物はキットの形態単独で、もしくは上述されたところの製薬学的組成物の形態で供給してよい。免疫調節もしくはアジュバントペプチドおよびそれを含有する免疫調節組成物の投与は慣習的方法により実施可能である。例えば、免疫原性ペプチド構築物は、生理的食塩水もしくは水、または完全もしくは不完全アジュバントのような適する希釈剤中で使用可能である。免疫原は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経鼻、経口、直腸、膣などのような免疫系の賦活に適切ないかなる経路によっても投与可能である。免疫原は、１回、あるいは例えばＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋  Ｔ細胞および／または適切な抗原に対し向けられた抗体の有意の力価が得られるまで定期的間隔で投与してよい。とりわけ、本発明の抗原性ペプチド構築物はＴＨ１関連抗体およびＴＨ１免疫応答の他の局面を導き出す。細胞の存在は、免疫原を間歇投与した（ｐｕｌｓｅｄ）抗原提示細胞に応答してのＴＨ−１（例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２）もしくはＴＨ−２（例えばＩＬ−４、ＩＬ−１０）に特異的なサイトカイン分泌を測定することにより評価しうる。抗体は慣習的イムノアッセイを使用して血清中で検出しうる。
【０１２２】
上に示されたとおり、本発明のペプチドおよびそれを含有する免疫調節組成物の投与は予防的もしくは治療的いずれかの目的上であってよい。予防的に提供される場合、免疫原はとりわけ発生の有意の危険にさらされている患者において、いかなる証拠よりも前に、もしくは疾患を引き起こす生物体、腫瘍などによるいかなる症状よりも前に提供される。治療的に提供される場合、免疫原は疾患の発症時（もしくは後）もしくは疾患のいずれかの症状の発症時に提供される。免疫原の治療的投与は疾患を減弱させるようはたらく。
【０１２３】
同様に、他の疾患、状態もしくは障害の処置のために、例えば米国特許第ＵＳ  ５，６５２，３４２号、同第６，０９６，３１５号、同第６，０９３，４００号、同第６，２６８，４７２号、同第６，１０３，２３９号、同第６，２８７，５６５号、同第６，１１１，０６８号および同第６，２５８，９４５号明細書、上述された他の同時係属出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／２０６８１号、同第００／４１６４７号、同第００／４１６４６号および同第０１／１６７９３号明細書、もしくは本出願と同時に出願されている同時係属中出願に以前に記述されたような特定の疾患、障害もしくは状態に関連するもしくはそれらを引き起こす抗原性ペプチド、または疾患と関連するもしくは疾患を引き起こす無数の既知の抗原性ペプチドのいずれか他者から抗原性ペプチドＰ*を選ぶことができる。
【０１２４】
本発明により、本アジュバントもしくは免疫調節ペプチドにより誘導される免疫応答は、少なくとも主として、ＴＨ１に特徴的な抗体ＩｇＧ２ａ（マウス）およびおそらくそれによりＩｇＧ３（ヒト）により明示されるところの少なくとも所望のＴＨ１応答に向けられる。これらのペプチドはしかしながら、ＴＨ１に導き出される免疫応答に加えてＴＨ２免疫応答およびとりわけ混合型ＴＨ１／ＴＨ２免疫応答を導き出すかもしれない。
【０１２５】
本発明はワクチンもまた企図する。本発明のワクチンは非経口もしくは皮下注入により、筋肉内で、皮内でもしくは経口で最も便宜的に宿主に導入可能である。宿主に許容できかつ宿主に対するいかなる有害な副作用もしくはワクチンに対するいかなる有害な影響も有しない、普遍的液体もしくは固体ベヒクルのいずれを使用してもよい。生理学的ｐＨ、例えばｐＨ６．８ないし７．２、好ましくはｐＨ７のリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を単独でもしくは適するアジュバントとともに担体として使用してよい。ペプチド構築物の濃度は、動物での前臨床試験で約０．２ｍｌのような一般に約０．１から１ｍｌまで、およびヒトで約１ｍｌのような約０．５ｍｌから約２ｍｌまでの臨床溶媒の容量中に、注入あたり約２５μｇ／ｋｇのような約０．５から２００μｇ／ｋｇまで変動してよい。初回注入後に複数の注入が必要とされるかもしれず、そして、複数の注入を投与する場合、動物で約２から４週間まで、例えば約２週間、およびヒトで約４ないし８週間の間隔で投与してよい。
【実施例】
【０１２６】
実施例１
本実施例は図１に示されるところの本発明のペプチド構築物を利用する癌ワクチンの改良された有効性を示す。
【０１２７】
ペプチド構築物はＴ細胞結合リガンドとしてｄｅｒＧ（配列番号７）、ペプチドＧ（配列番号５）いずれかを使用して製造した。ペプチドは最初の８残基についてＦＭＯＣ手順および二重カップリングプロトコルを使用して合成する。通常、ペプチドはアミド形態としてのカルボキシル末端を伴い製造される。ペプチドの全部を、調製的ＨＰＬＣを使用して精製し、そして分析的ＨＰＬＣ、アミノ酸分析および質量分析計により分析する。ペプチドはＨＰＬＣ基準により９５％以上、通常は９８％以上純粋である。乾燥ペプチドは乾燥剤を含むバイアル中で−８℃で保存する。
１）７匹のマウスの８群に図１に示されるところのワクチン２００μｌを注入した。
２）これを７日後に反復した。
３）さらに７日後に、マウスをワクチン接種に対して反対側で５×１０４の生存Ｂ１６を含有する２００μｌの生理的食塩水で攻撃した。
４）腫瘍の大きさがいずれかの軸で１５ｍｍを越えた場合にマウスを殺した。
【０１２８】
臨床的同種異系ワクチンの使用をより正確にモデル化するために、凍結ワクチンをマウスモデルで使用し、ここでＫ−１７３５細胞を使用直前に融解した。保護モデルにおける有効性は４０から１０％の範囲にわたった。加えて、Ｂ１６黒色腫中で見出される抗原ＴＲＰ２（アミノ酸１８０−１８８）をＬ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ構築物中に工作し、そして同種異系マウス黒色腫モデルにおいて多様な順列で試験した。至適化が必要であるかもしれない。
【０１２９】
図１に示されるところの初期実験を反復し、ここで、ペプチドｄｅｒＧもしくはＪを伴うＴＲＰ２１８０−１８８ペプチドのＬ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ構築物の免疫感作および攻撃ならびにｄｅｒＧもしくはＪの混合物（ＴＣＢＬプール）の使用がｄｅｒＧの免疫賦活もしくはアジュバント活性を確立した。反復実験は一貫した結果（示されない）を生じた。しかしながら同種異系ワクチンは小さな有効性のみを示した。さらに、Ｊ−ＴＲＰ２１８０−１８８（ＬＥＡＰＳ  １）もしくはＴＣＢＬプール（ｄｅｒＧ＋Ｊ）を単独で使用した場合に保護はみられなかった。注目すべきことに、Ｋ１７３５と組合せのＪ−ＴＲＰ２１８０−１８８は保護を示さなかった。該結果は、ｄｅｒＧが複合物および別個の双方の実体に対し重要な種であることを示唆する。
【０１３０】
反復実験においてＴＣＢＬプールはｄｅｒＧ（ＴＣＢＬ２）およびＪ（ＴＣＢＬ１）双方の混合物であった。しかしながら有効性は同種異系細胞の非存在下で検出されなかった。他方、細胞の組合せは双方の実験について４０％および２０％の保護をもたらした。ＴＣＢＬプールは混合物であったため、どちらのＴＣＢＬが活性であるかを評価することは困難である。ｄｅｒＧを細胞と組合せで投与した場合、ＴＣＢＬのものに類似のレベルの保護（３０％および４０％）がみられた。注目すべきことに、ｄｅｒＧ−ＴＲＰ２１８０−１８８は独力で２０％の有効性を示した。
【０１３１】
これらのデータはｄｅｒＧが試験した化合物中の有効成分であるかもしれないことを示唆する。本ペプチドはｄｅｒＧ−ＴＲＰ２  Ｊ−ＴＲＰ２１８０−１８８（ＬＥＡＰＳ  ２）およびＴＣＢＬの混合物（Ｊ＋ｄｅｒＧ）双方に存在し、双方の場合で類似のレベルの保護を生じる。興味深いことに、この保護は同種異系腫瘍細胞が存在する場合にのみ明示され、ｄｅｒＧが特異的Ｔ細胞免疫を高めることを示唆する。
【０１３２】
ＣＴＬがこれらの系において主要な保護的要素であるようであることを考えれば、Ｃｒ５１を使用する殺傷活性の測定はｄｅｒＧ活性の有用な生物マーカーであるかもしれない。明らかに、同種異系ワクチン接種は同一遺伝子腫瘍を殺すことが可能なＣＴＬの生成を生じさせる。さらに、ｄｅｒＧの効果は単独でもしくは抗原（同種異系腫瘍細胞ワクチン接種）とともに偶然に起きていた可能性はない。これは、はるかにより少なく活性であった親ペプチドＧからの差異を考慮する場合にとりわけ重要である。
実施例２
本実施例は類似のペプチド構築物および慣習的ペプチド免疫原性担体構築物と比較した本発明のペプチド構築物の改良された生物学的活性を示す。
【０１３３】
ペプチド構築物はＴ細胞結合リガンドとしてｄｅｒＧ（配列番号７）、ペプチドＧ（配列番号５）いずれかを使用して製造した。
【０１３４】
ペプチドは最初の８残基についてＦＭＯＣ手順および二重カップリングプロトコルを使用して合成する。通常、ペプチドはアミドの形態としてのカルボキシル末端を伴い製造される。ペプチドの全部を、調製的ＨＰＬＣを使用して精製し、そして分析的ＨＰＬＣ、アミノ酸分析および質量分析計により分析する。該ペプチドはＨＰＬＣ基準により９５％以上、通常は９８％以上純粋である。乾燥ペプチドは乾燥剤を含むバイアル中で−８℃で保存する。
【０１３５】
添加物もしくは免疫賦活剤として使用した場合のＴＣＢＬの生物学的活性の評価はマラリア保護アッセイにおいて所望の結果を示した。表４に示されるとおり。具体的には、  Ｌ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ構築物（ＷＧ）を作成するのに使用したサブユニット（ＷもしくはＧ）２５μｇで３週間間隔で２回マウスを免疫し、そして第二の免疫感作２週間後に２００  マウスマラリア（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）スポロゾイトで攻撃した。保護的有効性は、攻撃４日後に開始して１日おきに希薄血液塗抹標本（ｔｈｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｓｍｅａｒ）により評価した。マウスは、血液段階の寄生虫が攻撃後１４日までに検出可能でなかった場合に保護されたとみなした。
【０１３６】
【表２７】
2005523891.tif 000028
【０１３７】
未複合化ＴＣＢＬ（Ｇ）およびＢ細胞ペプチド（ＮＰＮＥＰＳ）３（Ｗ）もしくは双方の混合物は、アジュバントとしてのタイターマックス［ＴｉｔｅｒＭａｘ］ＴＭとともに投与した場合に、免疫した非同系ＣＤ−１マウスにおいてＬ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ構築物に比較してより小さい保護を生じた。検査は各群の血清プール中でペプチドＷに対する検出可能な抗体を示さなかった（示されない）。
【０１３８】
付加的な保護が上のアジュバント対照で観察されたため、図２に示されるところの反復実験を行って、同様に免疫したマウスから得た脾細胞培養物中でのＩＦＮ−γ産生を測定した。
【０１３９】
次に、ＢおよびＴ細胞活性をもつ別の抗原を使用して、２種の近交系マウス（Ａ／ＪおよびＢａｌｂ／ｃ）をＬ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ構築物（Ｊ−ＧＦ／ＳＦもしくはｄｅｒ−ＳＦ／ＧＦ）またはヘテロ複合化ペプチドを作成するのに使用したサブユニット（ＳＦ／ＧＦ、ＪおよびｄｅｒＧ）で３週間間隔で２回免疫し、そして第二の免疫感作２週間後に１００  マウスマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）スポロゾイトで攻撃しかつ保護的有効性を前のとおり評価した。攻撃４日前に個々の動物から血清を収集し、プールしかつＳＦ／ＧＦペプチドに対する抗体について直ちに分析し、攻撃１５日後に免疫しかつ保護されたマウスから収集した血清をプールしそしてＥＬＩＳＡ手順によるＩＦＮ−γの測定に使用した。
【０１４０】
【表２８】
2005523891.tif 000029
【０１４１】
表５中で、Ｊ−ＳＦ／ＧＦ＝ＤＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥＧＧＧＳＦＰＭＮＥＥＳＰＬＧＦＳＰＥＥＭＥＡＶＡＳＫＦＲ、ｄｅｒＧ−ＳＦ／ＧＦ＝ＤＧＱＥＥＫＡＧＶＶＳＴＧＬＩＧＧＧＳＦＰＭＮＥＥＳＰＬＧＦＳＰＥＥＭＥＡＶＡＳＫＦＲ、ｄｅｒＧ＝ＤＧＱＥＥＫＡＧＶＶＳＴＧＬＩＧＧＧ、およびＳＦ／ＧＦ＝ＳＦＰＭＮＥＥＳＰＬＧＦＳＰＥＥＭＥＡＶＡＳＫＦＲ。
【０１４２】
感染からの保護の実質的改良は、複合化にしろ単独にしろ改良型ＴＣＢＬ  ｄｅｒＧを受領する群でみられた（表５、第五の行）。表４および図２に記述されたＷおよびＧペプチドでのより早期の結果に基づき血清プール中のＩＦＮ−γレベルを評価した。しかしながらＢａｌｂ／Ｃ系統で保護はみられなかった（表５、列１３〜１６）。灌流により肝（感染の主要部位）および脾細胞集団から単離したＩＦＮ−γ＋／ＣＤ４＋細胞の存在を測定するＦＡＣＳ分析は、とりわけ肝細胞について増大したレベルのＩＦＮ−γを示した。
【０１４３】
表６に示されるとおり、効力を評価するために減少する用量のｄｅｒＧとともに単一系統のマウス（Ａ／Ｊ）を使用したことのみを除き第一のものに類似の別の実験を実施した。
【０１４４】
【表２９】
2005523891.tif 000030
【０１４５】
実施例３
ｄｅｒＧは単独でマラリア抗原の非存在下でのマウスマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）スポロゾイト攻撃に対しＡ／Ｊマウスを保護することが可能であったため、類似の実験を３種の他のマウス系統すなわちＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｈ２Ｋ）およびハイブリッドＣＡＦ１（Ａ／Ｊ×ＢＡＬＢ／ｃ）で実施してｄｅｒＧの保護的有効性を評価した。
【０１４６】
１０匹のマウスの群を、タイターマックス［ＴｉｔｅｒＭａｘ］ＴＭアジュバント中の２５μｇのｄｅｒＧで３週間間隔で２回前処理し、そして１００  マウスマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）スポロゾイトで攻撃した。保護的有効性を上述されたとおり評価した。
【０１４７】
該結果はｄｅｒＧがＣ３Ｈ／ＨｅＪもまた保護するがしかしＢＡＬＢ／ｃおよびハイブリッドＣＡＦ１（Ａ／Ｊ×ＢＡＬＢ／ｃ）をしないことを示す。
【０１４８】
【表３０】
2005523891.tif 000031
【０１４９】
実施例４
ＨＳＶ感染の帯状疱疹様拡大モデルは抗ウイルス薬およびワクチンの有効性を評価し、ここで、改良動物モデルは神経侵襲性と非神経侵襲性のウイルスの間を区別する。感染の乱切（表皮剥脱）帯状疱疹様拡大モデルはＣＥＬ−１０００（ｄｅｒＧ）がＡ／Ｊマウスを致死的ＨＳＶ−１攻撃から保護することを明瞭に示す。
【０１５０】
４ないし６週齢の雌性Ａ／Ｊマウスの群に、別の方法で明記されない限り攻撃前に１：１の比のＩＳＡ５１アジュバント中に乳化した２５μｇのｄｅｒＧペプチドを１回皮下に接種した。未処理マウスおよびアジュバントで処理したマウスが付加的な対照としてはたらいた。マウスに、当業者に公知の方法で明記されかつＧｏｅｌら（“Ｔｈｅ  Ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ＨＳＶ  Ｓｔｒａｉｎ  ｔｏ  Ｉｎｉｔｉａｔｅ  Ｚｏｓｔｅｒｉｆｏｒｍ  Ｓｐｒｅａｄ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  Ｎｅｕｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ”、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １４７：７６３−７７３（２００２））およびＧｏｅｌら、（“Ａ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  Ｏｆ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｔｏ  Ａｃｈｉｅｖｅ  Ａ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  Ａｎｄ  Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ”、Ｊ  Ｖｉｏｌ  Ｍｅｔｈ  １０６；１５３−８（２００２））により例示されるとおり攻撃した。
【０１５１】
具体的には、毛を剃ることにより除去し、そしてその後ネアー［Ｎａｉｒ］（Ｒ）を適用する。２４時間後に、脱毛したマウス背部を引っ掻くかもしくは表皮剥脱して感受性の表皮層を露出させ、そしてウイルスを擦り込む。より詳細を提供するために、６×１０４プラーク形成単位を含有するウイルス懸濁液１０μｌをマウス背部表面上の０．５ｃｍ角の皮膚（消しゴムに接着剤でつけた紙ヤスリを使用して以前に表皮剥脱した）上にピペットで移した。未処置の動物では３日以内に接種部位で一次病変が発生し、そして関連神経根に拡大し、次いで５日以内に前向性に輸送されかつ神経の皮膚節に沿った部位で二次病変が形成された。重症例においては動物はウイルス攻撃後８日以内に死亡した。疾患の進行および生存を最低１０日間モニターした。ウイルスは局所部位病変を表し、後根神経節に移動し、そしてその後ニューロンに戻って皮膚節に沿って病変を引き起こした。病変の進行および重症度を０から７（死亡）までで評価した。このモデルは、免疫系がウイルスの進行を阻害している疾患の進行（局所部位、神経での拡大、皮膚節での病変の程度、死亡）の識別を可能にする。いくつかの実験において、タイミング、投与経路およびマウス系統の改変をＣＥＬ−１０００の有効性について評価した。
【０１５２】
このモデルは２５μｇの単回投与を使用するＣＥＬ−１０００投与のタイミングを評価した。帯状疱疹様拡大を伴う罹患率および死亡率を低下された症状の発症の遅延を図３に示す。逆に、図４は、Ａ／Ｊマウスが、ＨＳＶ−１での攻撃前第２８、１４、７日にセピック（Ｓｅｐｐｉｃ）ＩＳＡ−５１中に乳化したＣＥＬ−１０００（２５μｇ）の単回投与で治療したことを示す。
【０１５３】
図５は、同一量のＣＥＬ−１０００をアジュバントで乳化したかもしくは生理的食塩水中のｄｅｒＧの単回筋肉内投与により乳化した標準的皮下経路により投与したことを示す。
【０１５４】
驚くべきことに筋肉内投与がより有効である。完全な（１００％）保護はＣＥＬ−１０００を攻撃２週間前に筋肉内投与した場合に達成された。加えて、該投与は他の処置と同一濃度で水性溶液中でアジュバントを伴わずに送達し、それによりアジュバントが必要でないことを示唆する。
【０１５５】
ＣＥＬ−１０００の類似の保護効果が他の系統（異なるＭＨＣ背景をもつ別の近交系Ｃ５７ＢＬ６および非同系ＣＤ１双方）でみられた。明らかに、ＣＥＬ−１０００（ｄｅｒＧ）はＨＳＶ−１攻撃に対し生存を延長した。
予防実施例１
本実施例はボツリスム（Ｂｏｔｕｌｉｓｍ）神経毒（ＢｏＮＴ）組換えＨ鎖カルボキシルフラグメント（Ｈｃ）抗原（ＡもしくはＥいずれかの型を表す）よりなるタンパク質ワクチンに対する免疫応答の発生を加速しかつ高めるｄｅｒＧの能力を示すことができる。
【０１５６】
新たに発見された免疫増強ペプチドｄｅｒＧを用いるもしくは用いない抗体発生のキネティクスを比較し、ここで力価を抗原特異的抗体のクラスおよびサブクラス双方について、個々のマウスからの陽性血清について測定することができる。抗Ａ型および抗Ｅ型ワクチンの有効性を比較することができる。
【０１５７】
新たなワクチンは免疫原およびアジュバントの混合物よりなることができる。免疫原（ＢｏＮＴペプチド）はＬ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭヘテロ複合物中に組み込んでよい（Ｊ−ＢｏＮＴ、Ｇ−ＢｏＮＴ）か、もしくはｄｅｒＧと混合してよい（ｄｅｒＧ＋ＢｏＮＴ）。
【０１５８】
以下の抗原および抗原性ペプチドを商業的に得ることができる。トキソイドはリスト  バイオロジカル  ラボラトリーズ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国カリフォルニア州キャンベルから得ることができる。リスト  バイオロジカル  ラボラトリーズ  インク（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）は現在ＧＳＡ契約を有するため、政府財源で物品を購入する顧客には特別の価格設定が利用可能である。この契約は退役軍人省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ）により発せられた。契約期間は１９９２年４月１日から２００１年１２月３１日までであり（契約番号第Ｖ７９７Ｐ−５２３９ｎ号）、そしてリスト（Ｌｉｓｔ）の職員によると、最もありそうには更新されることができる。加えて、全部の主要血清型（Ａ〜Ｇ）がダインポート（Ｄｙｎｐｏｒｔ）（以前はミシガン州公衆衛生局（Ｍｉｃｈｉｇｉａｎ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ））から入手可能であるかもしれない。組換えタンパク質ＢｏＮＴ  Ｈｃは主要血清型Ａ〜Ｇの大部分についてＵＳＡＭＲＩＩＤにより製造されており、そしてボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｓｍ）の１００ｋＤａのＨ鎖の非毒性の５０ｋＤａ鎖のカルボキシル領域の大きな部分を含有する。意図は、免疫原性の向上が必要とされる試験物質としてＢｏＮＴ／Ｅ  Ｈｃを、および参照物質としてＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃを使用することである。
【０１５９】
われわれはセピック（Ｓｅｐｐｉｃ）ＩＳＡ  ５１がＬＥＡＰＳペプチド抗原を含むＭＰＬより優れていたことを以前に決定していたため、該製剤はセピック（Ｓｅｐｐｉｃ）ＩＳＡ  ５１アジュバントを包含することができる。
【０１６０】
【表３１】
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【０１６１】
Ａ／Ｊマウス（ジャクソン  ラブス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ））を使用して初期免疫原性評価を実施することができる。Ａ／ＪおよびＣ５７ＢＬ６マウスで実施したｄｅｒＧを用いる以前の研究は有望であることが示された。予備データは、Ｂａｌｂ／ｃ系統がｄｅｒＧの免疫増強もしくはアジュバント効果に応答性でないことを示唆し、また、発表された報告はＣ５７ＢＬ６がＩｇＧ２ａのそれらの遺伝子内に遺伝子変化を有することを示唆している。
【０１６２】
１０匹のマウスの群を、第０、１４および４９日に頸のうなじに皮下で表８に示されたとおり免疫することができる。各群は５匹のマウス（Ａ／Ｊ）で構成される。第０、７、１３、２８、４２および６３日に眼窩球後洞もしくは伏在静脈から試験出血を採取することができる。
【０１６３】
初期スクリーニングのため、各ワクチンはｄｅｒＧを伴うもしくは伴わない１ペプチド用量で評価することができる。血清を免疫感作期間中および後に得る。潜在的な個々のマウスの変動により、各マウスからの血清を免疫原に対する抗体反応性についてＥＬＩＳＡにより評価することができる。陽性血清はその後ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ（Ｔｈ２およびＴｈ１応答の指標）に対する特別の注意を伴い力価および抗体アイソタイプについて評価することができる。
【０１６４】
ＥＬＩＳＡのため、組換えＢｏＮＴ／Ａ  ＨｃおよびＢｏＮＴ／Ｅ  Ｈｃ抗原ならびに特異的ペプチドＢｏＮＴ／Ａ１２３０−１２５３  ＢｏＮＴ／Ｅ１２３０−１２５３に対する反応を、１μｇ／ｍＬの無関係の対照ペプチド（１種もしくは複数）（ゼラチン加水分解物、平均３５００ｋＤａ）もしくはタンパク質（ＢＳＡ）で被覆した対照ウェルと比較することができる。対照ウェルは未被覆のウェルもしくは無関係のペプチド抗原への結合によるいかなる非特異的シグナルについての補正も可能にすることができる。この影響は、大量の異常な抗体が生成されるより早期の免疫応答で大きい可能性がある。
【０１６５】
多様なペプチド免疫原に応答して産生される抗体陽性血清を力価について分析し、至適の抗原のみを使用して免疫感作の実際の有効性ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２に対する特異的アイソタイプ応答を決定することができる。非特異的結合の対照；ならびにＢｏＮＴ／Ａタンパク質でのＢｏＮＴ／Ｅ免疫したサンプルの分析による抗血清の交差反応性、およびその逆もまた分析することができる。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２アイソタイプ応答は免疫応答のＴｈ１／Ｔｈ２バイアスの指標として使用することができる。
【０１６６】
その後の実験は、より低用量のワクチン免疫原（０．５、０．１、０．０２ｍｇ）に対する応答へのｄｅｒＧの影響を比較することができる。
【０１６７】
本発明はかように記述され、それが多くの様式で変動してよいことが明らかであろう。こうした変動は本発明の技術思想の範囲からの離脱とみなされるべきでなく、そして全部のこうした改変は以下の請求の範囲の範囲内に包含されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
以下の記述は、本発明の態様のより十分な理解を提供するために付随する図面中の本文に言及し、これにより：
【図１】ＴＣＢＬとしてペプチドｄｅｒＧ（ＬＥＡＰＳ  ２）もしくはペプチドＪ（ＬＥＡＰＳ  １）もしくはｄｅｒＧおよびペプチドＪを伴うＴＲＰ２１８０−１８８ペプチドのＬ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．ＴＭ構築物の免疫感作および攻撃を示すグラフである。
【図２】非同系ＣＤ−１マウスから得た脾細胞培養物中でのＩＦＮ−γ産生を測定するグラフである。
【図３】ＨＳＶ帯状疱疹様マウスモデルにおける病変の帯状疱疹様拡大およびＣＥＬ−１０００投与のタイミングのグラフである。
【図４】帯状疱疹様マウスモデルにおける生存およびＣＥＬ−１０００投与のタイミングのグラフである。
【図５】攻撃２週間前のＣＥＬ−１０００投与の経路の比較のグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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