(57)【要約】本発明は、Ｐ蛋白質機能を修飾又は模倣する作用物質の特定のための方法を提供する。Ｐ蛋白質を発現する細胞は、一般に、毒素に対する感受性が高く、Ｐ蛋白質発現細胞を作用物質及び毒素に露出した後の細胞生存能力及び／又は細胞死の変化は、こうした作用物質がＰ蛋白質発現の修飾剤であることを示すものとなる。本発明は、更に、黒色腫及びその他の癌を治療するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ蛋白質の機能を修飾する作用物質を特定する方法であって、
（ａ）Ｐ蛋白質を発現する対照細胞を毒素に接触させ、前記毒素に接触させた前記対照細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、
（ｂ）前記Ｐ蛋白質を発現する試験細胞を作用物質に接触させるステップと、
（ｃ）前記作用物質接触済み試験細胞を毒素に接触させ、前記毒素に接触させた前記作用物質接触済み試験細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、
（ｄ）前記対照細胞測定値を前記試験細胞測定値と比較するステップと、
（ｅ）前記対照細胞測定値と前記試験細胞測定値との間に差異が存在する時に、前記作用物質をＰ蛋白質機能の修飾剤として特定するステップと、を備える前記方法。
【請求項２】
前記毒素は、
（ａ）メタロイドと、
（ｂ）金属と、
（ｃ）グルタチオン枯渇剤と、
（ｄ）化学療法剤と、
（ｅ）イオノフォアと、
（ｆ）液胞型ＡＴＰアーゼ阻害剤と、
（ｇ）微小管阻害剤と、
（ｈ）ＤＮＡ相互作用剤と、により構成されたグループから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記毒素は、ヒ酸塩と、三酸化ヒ素と、アンチモンとにより構成されたグループから選択されたメタロイドである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記毒素は、金属の硫酸鉄である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記毒素は、エタクリン酸とブチオニンスルホキシイミンとにより構成されたグループから選択されたグルタチオン枯渇剤である、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記毒素は、ドキソルビシンとビンブラスチンとにより構成されたグループから選択された化学療法剤である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記毒素は、イオノフォアのモネンシンである、請求項２記載の方法。
【請求項８】
前記毒素は、液胞型ＡＴＰアーゼ阻害剤のバフィロマイシンＡである、請求項２記載の方法。
【請求項９】
前記毒素は、ドキソルビシンとシスプラチンとにより構成されたグループから選択されたＤＮＡ相互作用剤である、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
前記試験細胞は、哺乳類細胞と、植物細胞と、菌類細胞と、バクテリア細胞とで構成されたグループから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記試験細胞は、哺乳類細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類細胞は、メラニン細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記試験細胞は、植物細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記試験細胞は、菌類細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
前記試験細胞は、バクテリア細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
対照細胞及び試験細胞の生存能力を測定する、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
対照細胞及び試験細胞の死亡を測定する、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記作用物質は、Ｐ蛋白質機能のアゴニストである、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記作用物質は、Ｐ蛋白質機能のアンタゴニストである、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｐ蛋白質は、組み換えＰ蛋白質である、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｐ蛋白質は、哺乳類Ｐ蛋白質である、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｐ蛋白質は、ヒトＰ蛋白質である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｐ蛋白質は、マウスＰ蛋白質である、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
Ｐ蛋白質機能を修飾する作用物質を特定する方法であって、
（ａ）Ｐ蛋白質を発現する対照細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、
（ｂ）前記Ｐ蛋白質を発現する試験細胞を作用物質に接触させるステップと、
（ｃ）前記作用物質に接触させた試験細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、
（ｄ）前記対照細胞測定値を前記試験細胞測定値と比較するステップと、
（ｅ）前記対照細胞測定値と前記試験細胞測定値との間に差異が存在する時に、前記作用物質をＰ蛋白質機能の修飾剤として特定するステップと、を備える前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚科学、細胞生物学、及び癌の分野に関する。特に、本発明は、薬物発見、特に皮膚色素沈着の生物学、及び癌の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラニン細胞は、色素沈着低下、色素沈着過度、及び黒色腫の治療の主な標的である色素生成細胞である。メラニン細胞で生成されるｐｉｎｋ−ｅｙｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ蛋白質（Ｐ）は、皮膚及び眼のユーメラニンの生成に必要だが、Ｐ蛋白質の正確な機能は知られていない。ｐｉｎｋ−ｅｙｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ遺伝子の突然変異は、世界中で最も一般的な白化症の形態を発生させる（「遺伝病の代謝及び分子基盤」、Scriverら編、Mcgraw-Hill Professional Publishing, New York, 8th Ed. (2000); pp. 4353-4392, ISBN: 0079130356）。影響された固体は、色素沈着低下を生じた皮膚、髪、及び眼を有し（Manga et al., J. Dermatol. 26:738-747 (1999)）、したがって、ＵＶ誘発癌を発症するリスクが増加する（Krombergら、Clin. Genet. 36:43-52 (1989)）。
【０００３】
何人かの著者は、チロシンをメラノソームへ送り込むチロシン輸送体としてＰ蛋白質が機能し、メラノソームでチロシナーゼ活性によりチロシンがメラニンに転換されることを指摘している（例えば、Rinchikら、Nature 361:72-76 (1993)参照）。この指摘と矛盾することに、メラノソームによるチロシンの摂取は、Ｐヌル及び野生型メラニン細胞において事実上同じとなる（Gahlら、Pigment. Cell. Res. 8:229-233 (1995)）。
【０００４】
この観察から、他の著者は、Ｐ蛋白質がメラニン形成に必要な他の何らかの小分子のメラノソームへの輸送に必要である（Nordlundら編「色素系：生理学及び病理生理学」、Oxford University, New York (1998) pp.217-229）、或いはメラノソーム蛋白質の往来を制御する（Mangaら、Pigment Cell Res. 14:362-367 (2001)）という仮説を立てることになった。
【０００５】
興味深いことに、多数の黒色腫細胞株は、ｐｉｎｋ−ｅｙｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ蛋白質（Ｐ）を発現できない（同上）。ヒト黒色腫は、メラニン細胞の悪性転換の結果である。この形態の腫瘍形成の発生率は、過去６０年間に約１５倍に増加していることが報告されている（Gilchrestら、New England J. Med. 340:1341-1348 (1999)）。
【０００６】
進行した悪性黒色腫は、特に、現在利用可能な多数の化学療法剤に対する耐性の増大を示すため、予後不良となる。プログラム細胞死又はアポトーシスの誘導を逃れるために黒色腫によって使用されるメカニズムは、様々であるように思われる。こうしたメカニズムは、標的部位から除去するための化学療法剤の輸送と、細胞無毒化に影響する酵素活性化の変更と、アポトーシス経路自体の調節とを含む（Helmbachら、Int. J. Cancer 93:617-622 (2001)）。
【０００７】
黒色腫の様々な治療が提案されてきたが、この疾病は、進行した段階では、以前として治療が非常に困難である。例えば、米国特許第５，０６６，４８９号では、黒色腫の治療のための組み合わせ治療を説明しており、米国特許第５，７３１，３２５号では、サリドマイドのみ、或いは他の抗黒色腫剤との組み合わせによる黒色腫の治療を説明しており、米国特許第６，２９１，１９６号では、黒色腫及び前立腺癌特異性抗体を、こうした疾病の免疫検出及び免疫治療のために開示している。
【０００８】
したがって、癌、特に黒色腫の治療のための改良された方法についての必要性は引き続き存在している。
【０００９】
多くの個人は、身体の色素沈着のレベルを、全身で又は部分的に、増加又は減少させることを望んでいる。更に、色素沈着過度又は低下に基づく病状も、皮膚の色素の量を増加又は減少させる上で効果的な治療を必要とする。例えば、ハイドロキノンは、皮膚の色素脱失に使用される周知の活性物質である（例えば、米国特許第６，１３９，８５４号参照）。ラクトフェリン加水分解物は、チロシナーゼ阻害剤として使用され（例えば、米国特許第５，２１４，０２８号及び第５，３８９，６１１号参照）、特定のレゾルシノール誘導体は、スキン・ライトナーとして使用されてきた（米国特許第６，１３２，７４０号）。
【００１０】
Ｐ蛋白質は、色素沈着低下又は過度の治療のために考えられる標的の一つである。例えば、ＰＣＴ特許公報Ｗ０  ０１／０１１３１  Ａ１では、Ｐ蛋白質機能のアゴニスト及びアンタゴニストの特定に関する方法を説明している。こうした方法は、細胞の生存能力又は細胞のグルタチオン含有量に基づくものではなく、むしろＰ蛋白質に依存する形のチロシナーゼ活性に影響する化合物を特定すること、或いはメラニンの生成を測定することに基づいている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
メラニン生成を阻害する更に効果的かつ効率的な方法について、この技術では依然として必要性が存在する。スキン・ライトナーの世界全体の市場が年間十億ドルを大幅に上回るという化粧品業界の推定を考慮すれば、皮膚を明るくする新しい改良された方法の必要性は明白である。加えて、「安全な日焼け」を提供する目的から、或いは、色素沈着低下の治療又は様々な形態の白化症の治療のために、色素沈着を高める作用物質の必要性も存在する。したがって、皮膚の色素沈着を制限又は阻害する改良された作用物質の開発に関する継続的な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、色素沈着過度及び低下の治療のための方法を提供する。本発明は、更に、Ｐ蛋白質機能のアゴニスト、アンタゴニスト、及び模倣物の特定と、色素沈着過度及び低下の治療に有用な、こうしたアゴニスト、アンタゴニスト、及び模倣物を含む薬学的組成物とを提供する。追加として、本発明は、癌、特にＰ蛋白質を発現しない黒色腫の治療方法及び治療剤を提供する。
【００１３】
Ｐ蛋白質を発現する細胞は、Ｐ蛋白質を発現しない細胞より毒素に対する感受性が強いことが判定されている。更に、Ｐ蛋白質を発現する細胞は、Ｐ蛋白質を発現しない細胞より少ないグルタチオンを含有することが判定されている。したがって、本発明では、本明細書で開示する方法及び組成物において、こうした結果を活用する。
【００１４】
一態様において、本発明は、Ｐ蛋白質の機能を修飾する作用物質を特定する方法を提供する。方法は、（ａ）Ｐ蛋白質を発現する対照細胞を毒素に接触させ、毒素に接触させた対照細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得することと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現する試験細胞を作用物質に接触させることと、（ｃ）作用物質接触済み試験細胞を毒素に接触させ、毒素に接触させた作用物質接触済み試験細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得することと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較することと、（ｅ）対照細胞の測定値と試験細胞の測定値との間に差異が存在する時に、作用物質をＰ蛋白質機能の修飾剤として特定することとを含む。
【００１５】
Ｐ蛋白質を修飾する作用物質の特定のための本発明の方法は、Ｐ蛋白質に依存する形でチロシナーゼ活性に影響する化合物、或いはメラニンの生成を測定するものを特定する方法とは異なる。
【００１６】
本明細書での使用において、「作用物質」という用語は、望ましい効果を達成するために細胞に供給できる任意の物質を指す。作用物質は、無機又は有機化学物質にしてよい。作用物質は、元素又は化合物又は重合体にしてよい。例えば、作用物質は、約１，５００ｇ／モル未満、約１，２００ｇ／モル未満、又は１，０００ｇ／モル未満の分子量を特徴とする小分子にしてよい。有用な小分子薬物、特に経口で有効なものは、約７００ｇ／モル未満である。
【００１７】
「修飾する」という用語は、本明細書での使用において、生得的特徴における改変又は変化を指す。Ｐ蛋白質の機能を修飾するものは、蛋白質が細胞内で従事する作用又は使用される作用を変更又は改変する。「修飾された」は、この意味において、Ｐ蛋白質の機能における増加又は減少を指す。
【００１８】
本明細書での使用において、「毒素」という用語は、細胞をその物質に接触させた時、細胞死をもたらすことが可能な物質を指す。
【００１９】
特定の実施形態において、毒素は、メタロイドと、金属と、グルタチオン枯渇剤と、化学療法剤と、イオノフォアと、液胞型ＡＴＰアーゼ阻害剤と、微小管阻害剤と、ＤＮＡ相互作用剤とにより構成されたグループから選択される。
【００２０】
本明細書での使用において、「メタロイド」という用語は、金属と結合して合金を形成できる非金属、或いは、特性において通常の金属と非金属との中間にある元素を指す。メタロイドの非制限的な例は、ホウ素と、アルミニウムと、ケイ素と、ゲルマニウムと、ヒ素と、アンチモンと、テルルと、ポロニウムと、アスタチンと、セレンとを含む。加えて、この用語は、亜セレン酸塩と、亜ヒ酸塩と、ヒ酸塩と、三酸化ヒ素とのような、こうした元素の誘導体を含む。
【００２１】
「金属」という用語は、本明細書での使用において、電気及び熱の良導体であり、電子を失うことでカチオンを形成し、塩基性酸化物及び水酸化物を発生させる、不透明で、可融性で、延性で、通常は光沢のある様々な物質のいずれかを指し、特に、合金から区別されるものとして化学元素であるものを指す。特定の金属は、「重金属」と呼ばれる。重金属という用語は、相対的に高い密度を有し、毒性、高毒性、或いは低濃度で有毒である、任意の金属化学元素を指す。重金属の非限定的な例は、水銀と、カドミウムと、ヒ素と、クロムと、タリウムと、鉛とを含む。金属という用語は、本明細書での使用において、例えば、硫酸鉄のような金属塩を包含する。
【００２２】
「グルタチオン枯渇剤」という用語は、その物質に接触させた細胞からグルタチオンを低減又は排除する物質を指す。グルタチオン枯渇剤の非制限的な例は、エタクリン酸及びブチオニンスルホキシイミンと、１−ブロモプロパンと、マレイン酸ジエチルと、ジアミドと、ブロモベンゼンと、テアニンとを含む。
【００２３】
本明細書での使用において「イオノフォア」という用語は、イオンと結合することで、或いは、イオンに対する関門の透過性を高めることで、（細胞膜内にあるような）脂質関門を越えるイオン（例えば、カルシウム）の透過を促進する化合物を指す。イオノフォアの非制限的な例は、モネンシンと、ナイジェリシンと、バリノマイシンとを含む。
【００２４】
「液胞型ＡＴＰアーゼ阻害剤」という用語は、本明細書での使用において、液胞型ＡＴＰアーゼの活性を制限又は阻害する任意の物質を指す。液胞型ＡＴＰアーゼの非制限的な例は、バフィロマイシンＡ１とコンカナマイシンとを含む
本明細書での使用において「微小管阻害剤」という用語は、細胞の細胞骨格、紡錘体、繊毛、又は鞭毛の微小管構成要素を形成するための蛋白質チューブリンの集合を妨げる任意の物質を指す。微小管阻害剤の非限定的な例は、タキソールと、タキサンと、ビンブラスチンと、コルヒチンと、ポドフィロトキシンとを含む。
【００２５】
本明細書での使用において「ＤＮＡ相互作用剤」という用語は、親水性及び／又は疎水性相互作用を経由してＤＮＡを結合する物質を指す。ＤＮＡ相互作用剤の非限定的な例は、ドキソルビシンと、シスプラチン及びその他の白金含有化合物（イプロプラチン及び白金テルピリジン錯体等）と、シクロホスファミドと、ダウノマイシンと、エトポシドと、イリノテカンと、シスプラチノールと、メルファランと、ダカルバジンと、フォテムスチンと、トレオサルファンと、ニムスチンと、２−クロトニルオキシメチル−シクロヘキサノン（ＣＯＭＣ）と、アミフォスチンと、ピラルビシンとを含む。
【００２６】
別の実施形態において、毒素は、ヒ酸塩と、ヒ素と、三酸化物と、アンチモンとで構成されたグループから選択されたメタロイドである。代替として、毒素は、重金属の硫酸鉄である。代替として、毒素は、エタクリン酸及びブチオニンスルホキシイミンで構成されたグループから選択されたグルタチオン枯渇剤である。別の実施形態において、毒素は、ドキソルビシン及びビンブラスチンで構成されたグループから選択された化学療法剤である。別の実施形態において、毒素は、イオノフォアのモネンシン又は液胞型ＡＴＰアーゼ阻害剤のバフィロマイシンＡ１であり、或いは、毒素は、ドキソルビシン及びシスプラチンで構成されたグループから選択されたＤＮＡ相互作用剤である。更に別の実施形態において、毒素は、例えば、イプロプラチン及び白金テルピリジン錯体のような、グルタチオン依存メカニズムにより無毒化された、シスプラチン及びその他の白金含有化合物で構成されたグループから選択されたＤＮＡ相互作用剤である。
【００２７】
作用物質及び毒素に接触させる本発明のこの態様の試験細胞は、哺乳類細胞と、鳥類細胞と、魚類細胞と、線虫類細胞と、昆虫細胞と、植物細胞と、菌類細胞と、バクテリア細胞とで構成されたグループから選択される。限定的な実施形態において、試験細胞は、哺乳類細胞と、植物細胞と、菌類細胞と、バクテリア細胞とで構成されたグループから選択される。特定の実施形態において、試験細胞は、ヒト、ラット、マウス、ハムスタ、又はモルモットのメラニン細胞等の哺乳類細胞、鳥類のメラニン保有細胞、魚類のメラニン保有細胞、線虫類細胞、昆虫細胞、植物細胞、菌類細胞、又はバクテリア細胞である。
【００２８】
本発明の方法の一部の実施形態では、対照細胞及び試験細胞の生存能力が測定される。他の実施形態では、対照細胞及び試験細胞の死亡が測定される。
【００２９】
特定の実施形態において、細胞に接触させる作用物質は、Ｐ蛋白質機能のアゴニスト、アンタゴニスト、又は模倣物である。更に別の実施形態において、Ｐ蛋白質は、組み換え型Ｐ蛋白質であり、或いは哺乳類Ｐ蛋白質、例えば、ヒト又はマウスＰ蛋白質である。
【００３０】
本明細書での使用において、「アゴニスト」という用語は、標的の活性を増加させる作用物質を指す。非限定的な例として、Ｐ蛋白質機能のアゴニストは、Ｐ蛋白質の活性を増加させる作用物質である。「アンタゴニスト」という用語は、標的の活性を減少させる作用物質を指す。
【００３１】
一態様において、本発明は、Ｐ蛋白質の機能の模倣物である作用物質を特定する方法を提供する。方法は、（ａ）Ｐ蛋白質を発現しない対照細胞を毒素に接触させ、毒素に接触させた対照細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現しない試験細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｃ）作用物質接触済み試験細胞を毒素に接触させ、毒素に接触させた作用物質接触済み試験細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｅ）対照細胞と対比した試験細胞の細胞生存能力の減少又は細胞死の増加が存在する時に、作用物質をＰ蛋白質機能の模倣物として特定するステップとを含む。
【００３２】
本発明の目的から、Ｐ蛋白質機能の模倣物である作用物質は、Ｐ蛋白質ではないものの、Ｐ蛋白質を含有しない細胞に投与した時、或いはこうした細胞と共に培養した時、Ｐ蛋白質の機能を、少なくとも部分的に、回復する役割を果たす化合物である。Ｐ蛋白質を含有しないメラニン形成細胞は、Ｐ蛋白質転写を発現しない細胞（本明細書で説明する、メラン−Ｐ細胞等）又は機能的Ｐ蛋白質遺伝子産物を発現しない細胞にしてよい。
【００３３】
この方法の特定の実施形態において、試験細胞は、哺乳類細胞と、鳥類細胞と、魚類細胞と、線虫類細胞と、昆虫細胞と、植物細胞と、菌類細胞と、バクテリア細胞とで構成されたグループから選択される。この方法の特定の実施形態において、試験細胞は、ヒト、ラット、マウス、ハムスタ、又はモルモットのメラニン細胞等の哺乳類細胞、鳥類のメラニン保有細胞、魚類のメラニン保有細胞、線虫類細胞、昆虫細胞、植物細胞、菌類細胞、又はバクテリア細胞である。他の特定の実施形態では、細胞生存能力又は細胞死が、作用物質との接触後に測定される。
【００３４】
更に別の態様において、本発明は、Ｐ蛋白質機能を修飾する作用物質を特定する方法を提供する。方法は、（ａ）Ｐ蛋白質を発現する対照細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現する試験細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｃ）作用物質に接触させた試験細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｅ）対照細胞の測定値と試験細胞の測定値との間に差異が存在する時に、作用物質をＰ蛋白質機能の修飾剤として特定するステップとを含む。
【００３５】
この方法の特定の実施形態において、試験細胞は、哺乳類細胞と、植物細胞と、菌類細胞と、バクテリア細胞とで構成されたグループから選択される。特定の実施形態において、試験細胞は、哺乳類細胞と、鳥類細胞と、魚類細胞と、線虫類細胞と、昆虫細胞と、植物細胞と、菌類細胞と、バクテリア細胞とである。特定の実施形態において、試験細胞は、ヒト、ラット、マウス、ハムスタ、又はモルモットのメラニン細胞等の哺乳類細胞、鳥類のメラニン保有細胞、魚類のメラニン保有細胞、線虫類細胞、昆虫細胞、植物細胞、菌類細胞、又はバクテリア細胞である。
【００３６】
方法の一部の実施形態では、対照細胞及び試験細胞の生存能力が測定される。他の実施形態では、対照細胞及び試験細胞の死亡が測定される。
【００３７】
この態様の特定の実施形態において、作用物質は、Ｐ蛋白質機能のアゴニストである。別の実施形態において、作用物質は、Ｐ蛋白質機能のアンタゴニストである。特定の実施形態において、Ｐ蛋白質は、組み換え型Ｐ蛋白質、哺乳類Ｐ蛋白質、ヒトＰ蛋白質、又はマウスＰ蛋白質である。
【００３８】
別の態様において、本発明は、Ｐ蛋白質機能の模倣物である作用物質を特定する方法を提供する。方法は、（ａ）Ｐ蛋白質を発現しない対照細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現しない試験細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｃ）作用物質接触済み試験細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｅ）試験細胞の測定値が対照細胞の測定値よりも低い時に、作用物質をＰ蛋白質機能の模倣物として特定するステップとを含む。
【００３９】
この方法の特定の実施形態において、試験細胞は、哺乳類細胞と、植物細胞と、菌類細胞と、バクテリア細胞とで構成されたグループから選択される。特定の実施形態において、試験細胞は、哺乳類細胞と、鳥類細胞と、魚類細胞と、線虫類細胞と、昆虫細胞と、植物細胞と、菌類細胞と、バクテリア細胞とである。特定の実施形態において、試験細胞は、ヒト、ラット、マウス、ハムスタ、又はモルモットのメラニン細胞等の哺乳類細胞、鳥類のメラニン保有細胞、魚類のメラニン保有細胞、線虫類細胞、昆虫細胞、植物細胞、菌類細胞、又はバクテリア細胞である。
【００４０】
本発明は、更に、別の態様において、Ｐ蛋白質の機能を修飾する作用物質を特定する方法を提供する。方法は、（ａ）Ｐ蛋白質を発現する対照菌類細胞を亜セレン酸塩に接触させ、対照菌類細胞における赤色色素形成量の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現する試験菌類細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｃ）作用物質接触済み試験菌類細胞を亜セレン酸塩に接触させ、毒素及び作用物質接触済み試験菌類細胞における赤色色素形成量の測定値を取得するステップと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｅ）対照細胞の測定値と試験細胞の測定値との間に差異が存在する時に、作用物質をＰ蛋白質機能の修飾剤として特定するステップとを含む。
【００４１】
本発明のこの態様の特定の実施形態において、菌類細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅである。
【００４２】
別の態様において、本発明は、例えば、色素沈着低下又は二型白化症の治療に有用な、メラニン形成を刺激する方法を提供する。方法は、メラニン細胞をＰ蛋白質機能のアゴニストに接触させるステップを含む。この態様において、Ｐ蛋白質機能のアゴニストは、（ａ）Ｐ蛋白質を発現する対照細胞を毒素に接触させ、毒素接触済み対照細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現する試験細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｃ）作用物質接触済み試験細胞を毒素に接触させ、毒素及び作用物質接触済み試験細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｅ）対応する対照細胞の測定値より、試験細胞の生存能力が低い時、或いは試験細胞の死亡が高い時に、作用物質をＰ蛋白質機能のアゴニストとして特定するステップとを含む方法によって特定される。
【００４３】
本明細書での使用において、「メラニン形成」という用語は、色素メラニンの形成プロセスを指し、「メラニン形成を刺激すること」という用語は、細胞内で、このプロセスを引き起こすこと、或いは増加させることを意味する。メラニン形成を刺激することの効果は、メラニンの生成を増加させ、これにより、皮膚を暗化又は「日焼け」させることである。
【００４４】
別の態様において、本発明は、本発明の方法の一つによって特定されたＰ蛋白質機能の模倣物を投与することを経て、メラニン形成を刺激する方法を提供する。
【００４５】
更に別の態様において、本発明は、例えば、母斑等、過度の色素沈着の疾患の治療に有用な、メラニン形成を阻害する方法を提供する。方法は、メラニン細胞をＰ蛋白質機能のアンタゴニストに接触させるステップを含む。この態様において、Ｐ蛋白質機能のアンタゴニストは、（ａ）Ｐ蛋白質を発現する対照細胞を毒素に接触させ、接触させた対照細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現する試験細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｃ）作用物質接触済み試験細胞を毒素に接触させ、毒素及び作用物質接触済み試験細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｅ）対応する対照細胞の測定値より、試験細胞の生存能力の測定値が高い時、或いは試験細胞の死亡の測定値が低い時に、作用物質をＰ蛋白質機能のアンタゴニストとして特定するステップとを含む方法によって特定される。
【００４６】
更に別の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体とＰ蛋白質機能のアゴニストとを含む薬学的組成物を提供する。この態様において、Ｐ蛋白質機能のアゴニストは、（ａ）Ｐ蛋白質を発現する対照細胞を毒素に接触させ、毒素接触済み対照細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現する試験細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｃ）作用物質接触済み試験細胞を毒素に接触させ、毒素及び作用物質接触済み試験細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｅ）対応する対照細胞の測定値より、試験細胞の生存能力の測定値が低い時、或いは試験細胞の死亡の測定値が高い時に、作用物質をＰ蛋白質機能のアゴニストとして特定するステップとを含む方法によって特定される。
【００４７】
別の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体とＰ蛋白質機能のアンタゴニストとを含む薬学的組成物を提供する。この態様において、Ｐ蛋白質機能のアンタゴニストは、（ａ）Ｐ蛋白質を発現する対照細胞を毒素に接触させ、毒素接触済み対照細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現する試験細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｃ）作用物質接触済み試験細胞を毒素に接触させ、毒素及び作用物質接触済み試験細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｅ）対応する対照細胞の測定値より、試験細胞の生存能力の測定値が高い時、或いは試験細胞の死亡の測定値が低い時に、作用物質をＰ蛋白質機能のアンタゴニストとして特定するステップとを含む方法によって特定される。
【００４８】
更に別の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体とＰ蛋白質機能の模倣物とを含む薬学的組成物を提供する。この態様において、Ｐ蛋白質機能の模倣物は、（ａ）Ｐ蛋白質を発現しない対照細胞を毒素に接触させ、毒素に接触させた対照細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現しない試験細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｃ）作用物質接触済み試験細胞を毒素に接触させ、毒素に接触させた作用物質接触済み試験細胞の生存能力又は死亡の測定値を取得するステップと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｅ）対照細胞と対比した試験細胞の細胞生存能力の減少又は細胞死の増加が存在する時に、作用物質をＰ蛋白質機能の模倣物として特定するステップとを含む方法によって特定される。
【００４９】
更に別の態様において、本発明は、例えば、色素沈着低下又は二型白化症の治療に有用な、メラニン形成を刺激する方法を提供する。方法は、メラニン細胞をＰ蛋白質機能のアゴニストに接触させるステップを含む。この態様において、Ｐ蛋白質機能のアゴニストは、（ａ）Ｐ蛋白質を発現する対照細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現する試験細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｃ）作用物質接触済み試験細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｅ）試験細胞の測定値が対照細胞の測定値よりも低い場合に、作用物質をＰ蛋白質機能のアゴニストとして特定するステップとを含む方法によって特定される。
【００５０】
別の態様において、本発明は、例えば、母斑等、過度の色素沈着の疾患の治療に有用な、メラニン形成を阻害する方法を提供する。方法は、メラニン細胞をＰ蛋白質機能のアンタゴニストに接触させるステップを含む。この態様において、Ｐ蛋白質機能のアンタゴニストは、（ａ）Ｐ蛋白質を発現する対照細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現する試験細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｃ）作用物質接触済み試験細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｅ）試験細胞の測定値が対照細胞の測定値よりも高い場合に、作用物質をＰ蛋白質機能のアンタゴニストとして特定するステップとを含む方法によって特定される。
【００５１】
更に別の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体とＰ蛋白質機能のアゴニストとを含む薬学的組成物を提供する。この態様において、Ｐ蛋白質機能のアゴニストは、（ａ）Ｐ蛋白質を発現する対照細胞から取得されたグルタチオン含有量の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現する試験細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｂ）作用物質に接触させた試験細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、（ｃ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｄ）試験細胞の測定値が対照細胞の測定値よりも低い場合に、作用物質をＰ蛋白質機能のアゴニストとして特定するステップとを含む方法によって特定される。
【００５２】
別の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体とＰ蛋白質機能のアンタゴニストとを含む薬学的組成物を提供する。この態様において、Ｐ蛋白質機能のアンタゴニストは、（ａ）Ｐ蛋白質を発現する対照細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現する試験細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｃ）作用物質接触済み試験細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｅ）試験細胞の測定値が対照細胞の測定値よりも高い場合に、作用物質をＰ蛋白質機能のアンタゴニストとして特定するステップとを含む方法によって特定される。
【００５３】
更に別の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体とＰ蛋白質機能の模倣物とを含む薬学的組成物を提供する。この態様において、Ｐ蛋白質機能の模倣物は、（ａ）Ｐ蛋白質を発現しない対照細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、（ｂ）Ｐ蛋白質を発現しない試験細胞を作用物質に接触させるステップと、（ｃ）作用物質接触済み試験細胞におけるグルタチオンの量の測定値を取得するステップと、（ｄ）対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較するステップと、（ｅ）試験細胞のグルタチオン測定値が対照細胞のグルタチオン値よりも低い時に、作用物質をＰ蛋白質機能の模倣物として特定するステップとを含む方法によって特定される。
【００５４】
更に別の態様において、本発明は、癌を有する患者を治療する方法を提供する。この方法において、癌細胞は、Ｐ蛋白質機能のアゴニスト又は模倣物に接触させ、Ｐ蛋白質機能のアゴニスト又は模倣物は、本発明の方法のいずれか一つによって特定される。癌細胞は、その後、化学療法剤に接触させる。その様々な実施形態において、治療される癌は、肝臓癌と、脾臓癌と、肺癌と、結腸癌と、腸癌と、胃癌と、脳腫瘍と、白血球の癌と、骨癌と、卵巣癌と、睾丸癌と、黒色腫癌とで構成されたグループから選択される。
【００５５】
別の態様において、本発明は、Ｐ蛋白質を発現しない細胞の毒素に対する感受性を増加させる方法を提供する。方法は、（ａ）細胞内でのＰ蛋白質の発現を可能にする、Ｐ蛋白質を符号化する核酸分子を、細胞に導入するステップと、（ｂ）毒素に対する細胞の感受性を増加させるのに十分なレベルで、Ｐ蛋白質を細胞内で発現させるステップとを含む。
【００５６】
別の態様において、本発明は、Ｐ蛋白質を発現しない細胞の毒素に対する感受性を増加させる方法を提供する。方法を提供する。この方法は、細胞をＰ蛋白質模倣物に接触させるステップを含む。
【００５７】
別の態様において、本発明の組成物及び薬学的組成物は、キットの形態で提供してよい。本発明のキットは、Ｐ蛋白質機能を修飾する、或いは黒色腫の治療上の処置として有用な、本発明の一つ以上の特定の組成物及び／又は薬学的組成物を容器内に備える。
【００５８】
本発明の上記及びその他の目的とその様々な特徴と本発明自体は、次の添付図面を参照して以下の説明を読むことにより更に完全に理解され得よう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
本明細書で引用した特許及び刊行物は、当該技術における知識水準を反映しており、出典を明記することによりその開示内容全体を本明細書の一部とする。こうした参考文献の教示内容と本明細書との間に生じる齟齬は、後者を優先させて解決するものとする。
【００６０】
本発明は、生物学と、遺伝学と、微生物学とに共通する手法及び方法を利用する。こうした種類の方法論に関する有用な実験室基準は、当業者に容易に利用可能である。例えば、「分子クローニング、実験室マニュアル」第三版、Sambrookら編、(2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press (ISBN: 0-879-69576-5)、「分子生物学における現在のプロトコル」Ausubelら編、(1993), John Wiley and Sons, Inc (ISBN: 0-471-30661-4)、「ＰＣＲ応用」Innisら編、(1999), Cold Spring Harbor Laboratory Press (ISBN: 0-123-72186-5)。
【００６１】
本明細書で開示する本発明は、科学界、薬学界、或いは医学界において、これまで未知であった知識を提供する。その発現がメラニン細胞でのメラニンの生成にとって重要であるＰ蛋白質を発現する細胞は、Ｐ蛋白質を発現しない細胞より毒素に対する感受性が強いことが判定されている。本発明は、更に、Ｐ蛋白質を発現する細胞がＰ蛋白質を発現しない細胞より少ない量のグルタチオンを有することを立証する。こうした観察は、本発明で開示する方法及び組成物の基盤を提供する。
【００６２】
メラニン生成におけるＰ蛋白質の重要性を考えると、Ｐ蛋白質のアンタゴニスト又はアゴニストである作用物質の特定は、色素沈着低下及び過度の治療に有用である。Ｐ蛋白質を発現する細胞の毒素感受性の測定は、治療上の処置の設計及び応用においても有用である。
【００６３】
本発明は、Ｐ蛋白質の機能を修飾又は変更する作用物質を特定する方法を提供する。本発明の一部の方法は、細胞生存能力及び／又は細胞死を測定するアッセイに基づいている。例えば、Ｐ蛋白質を発現する対照細胞を一つ以上の毒素に接触させ、次に、細胞死及び／又は細胞生存能力の測定値を取得する。同じくＰ蛋白質を発現する試験細胞を、最初に作用物質に露出し、その後、毒素又は毒素群に露出する。毒素への露出後、こうした試験細胞について、細胞死及び／又は細胞生存能力の測定値を取得する。対照細胞と試験細胞との間での細胞死及び／又は細胞生存能力の測定値の比較を取得し、作用物質がＰ蛋白質機能の修飾剤であるかを判定する。作用物質に露出していない対照細胞に比べ、試験細胞が毒素（群）に対する高い又は低い感受性を有する場合、作用物質は、Ｐ蛋白質機能の修飾剤として特定される。
【００６４】
当業者が理解するように、本発明の方法のために選択される細胞は、任意のタイプにすることができる。通常、試験細胞及び対照細胞は、起源及び／又は遺伝子型が同一である。非限定的な例として、本発明の方法で使用される細胞は、真核細胞又は原核細胞にすることができる。更に具体的には、本発明で利用される細胞は、哺乳類、植物、菌類、又はバクテリア細胞にすることができる。
【００６５】
一例において、利用される細胞は、メラニン細胞である。別の例において、本発明の方法において利用される細胞は、メラニン細胞ではない。更に具体的には、本発明の方法で利用される細胞は、Ｐ蛋白質を発現するメラニン細胞にする必要はなく、Ｐ蛋白質を発現する他の細胞型の真核細胞又は原核細胞にしてよい。通常、非メラニン細胞でのＰ蛋白質の発現は、こうした細胞内での組み換え手段による発現の結果である。
【００６６】
非制限的な例として、染色体外的な又はゲノムへの統合を介した、適切なＰ蛋白質符号化遺伝子配列の細胞への導入後、Ｐ蛋白質を十分に発現する任意の細胞型を、本発明の方法において使用することができる。Ｐ蛋白質を符号化する遺伝子配列は、化学合成手段により作成された、適切な鋳型に基づいた合成配列にすることができる。代替として、こうした遺伝子配列は、クローン化ｃＤＮＡ又はゲノム配列を運ぶ宿主細胞からのように、生物学源から取得することが可能であり、或いは、Ｐ蛋白質符号化遺伝子配列は、例えば、逆転写又はポリメラーゼ連鎖反応によって、酵素的に生成できる。Ｐ蛋白質符号化遺伝子は、この技術で公知であり、例えば、Rinchikら、Nature 361:72-76 (1993)、及び、ヒト遺伝子について、ＮＥＤＬＩＮＥデータベースの受入番号ＮＭ＿０００２７５及びＵ１９１５２等を参照されたい。
【００６７】
本発明の方法において使用される細胞が発現するＰ蛋白質符号化遺伝子配列は、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列にすることができる。選択された細胞へのＲＮＡ又はＤＮＡ配列の導入は、当業者に知られた任意の手段によって実行できる。非制限的な例として、Ｐ蛋白質符号化ＤＮＡ配列は、形質転換、カルシウム仲介形質導入、又はトランスフェクションを介して細胞に導入できる。ＤＮＡ配列は、細胞における転写及び翻訳のための適切な調節配列をそれ自体が備えた適切なベクタ配列に、随意的に関連させることができる。本発明による、Ｐ蛋白質を符号化するＲＮＡ配列は、例えば、Ｔ３又はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列等、細胞における転写及び翻訳のための適切な調節配列を備えたリポソーム又は任意のＤＮＡ又はＲＮＡベクタ等、任意の適切なベクタを経由して導入できる。
【００６８】
選択した細胞において異種遺伝子を発現させるために、通常は発現カセットが使用される。各発現カセットは、例えば、Ｐ蛋白質符号化遺伝子を発現するように設計された調節配列を含む。原核細胞での発現では、好ましくは、発現カセットに存在する各コード配列は、少なくとも一つの調節配列、即ち、プロモータ配列と適切に作用可能に結び付く。「適切に作用可能に結び付く」とは、調節配列が、コード配列を調節する機能を果たすことである（例えば、コード配列の発現のタイミング又は量を制御する、転写又は翻訳の開始又は終了を決定する、或いは、メッセージ安定性に影響を与える）。真核細胞での発現では、好ましくは、発現カセットに存在する各コード配列は、少なくとも二つの調節配列、即ち、プロモータ及びポリＡアデニル化配列と適切に作用可能に結び付く。各発現カセットは、ベクタのポリヌクレオチド配列と適切に作用可能に結び付く。各ベクタは、好ましくは、トランスフェクション細胞内の自発的染色体外要素として、或いは一つ以上の染色体の統合構成要素として、トランスフェクション細胞内での自らの選択、複製、及び維持を可能にするポリヌクレオチド配列を含む。殆どあらゆるコード配列を発現することに適応可能な発現カセットを含むベクタは、この技術で周知であり、市販されている。こうしたベクタの非制限的な例は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能なｐｃＤＮＡベクタである。
【００６９】
十分に高い割合の発現を促進する任意のプロモータを、発現カセットにおいて使用できる。プロモータは、構成要素にすること、或いは誘導することが可能である。例えば、誘導プロモータの説明は、例えば、Resendezら、Mol. Cell Biol. 8:4579-4584 (1988)及びChangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:680-684 (1987)を参照されたい。プロモータの選択は、どの細胞型がスクリーニングにおいて使用されるかと、Ｐ蛋白質を符号化する異種遺伝子の発現の望ましいレベルとに応じて決まる。有用なプロモータ配列の説明は、例えば、Gossenら、Science 268:1766-1769 (1995)と、Gossen及びBujard、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)と、米国特許第５，８５１，９８４号、第５，８４９，９９７号、第５，８２７，６８７号、第５，８１１，２６０号、第５，７８９，２１５号、第５，６６５，５７８号、第５，５１２，４８３号、第５，３０２，５１７号、第４，９５９，３１３号、及び第４，９３５，３５２号とを参照されたい。
【００７０】
プロモータ配列及び要素の更なる非限定的な例は、ＳＶ４０初期プロモータ領域（Bernoist及びChambon、Nature 290:304-310 (1981)）と、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端重複（Yamamotoら、Cell 22:787-797 (1980)）と、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Wagnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:1441-1445 (1981)）と、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら、Nature 296:39-42 (1982)）と、β−ラクタマーゼプロモータ等の原核細胞発現ベクタ（Villa-Kamaroffら、Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 75:3727-3731 (1978)）と、ｔａｃプロモータ（DeBoerら、Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 80:21-25 (1983)）とを含み、更に［著者不明］、Scientific American, 242:74-94 (1980)を参照されたく、更に、ノパリンシンセターゼプロモータ領域（Herrera-Estrellaら、Nature 303:209-213）又はカリフラワモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモータ（Gardnerら、Nucl. Acids Res. 9:2871 (1981)）を含む植物発現ベクタと、光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモータ（Herrera-Estrellaら、Nature 310:115-120 (1984)）と、Ｇａｌ  ４  プロモータ、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）プロモータ、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモータ、アルカリホスファターゼプロモータのような酵母又はその他の菌類からのプロモータ要素と、組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されてきた以下の動物転写制御領域：脾臓線房細胞において活性があるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swiftら、Cell 38:639-646 (1984)）、Ornitzら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986)、Macdonald、Hepatol. 7:425-515 (1987)）と、脾臓ベータ細胞において活性があるインスリン遺伝子制御領域（Hanahan、Nature 315:115-122 (1985)）と、リンパ球様細胞において活性がある免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら、Cell 38:647-558 (1984)、Adamesら、Nature 318:533-538 (1985)、Alexanderら、Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444 (1987)）と、睾丸、胸部、リンパ、及び肥満細胞において活性があるマウス乳癌ウイルス制御領域（Lederら、Cell 45:485-495 (1986)）と、肝臓において活性があるアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertら、Genes and Devel. 1:268-276 (1987)）と、肝臓において活性があるアルファフェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufら、Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985)、Hammerら、Science 235:53-58 (1987)）と、肝臓において活性があるアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Kelseyら、Genes and Devel. 1:161-171 (1987)）、骨髄精細胞において活性があるベータグロビン遺伝子制御領域（Mogramら、Nature 315:338-340 (1985)、Kolliasら、Cell 46:89-94 (1986)）と、脳の乏突起膠細胞において活性があるミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域（Readheadら、Cell 48:703-712 (1987)）と、骨格筋において活性があるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Sani、Nature 314:283-286 (1985)）と、視床下部において活性がある性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonら、Science 234:1372-1378 (1986)）とを含む。
【００７１】
真核細胞発現のための発現カセットにおいて使用可能な別の調節要素は、ポリＡ配列が適切に作用可能に結び付くコード配列に特異的な転写のポリアデニル化を効率的に誘導できるポリＡ配列（又はポリＡ信号）である。ポリＡ配列の説明については、米国特許第５，８６１，２９０号、第５，８５１，９８４号、第５，８４０，５２５号、及び第５，６２７，０３３号を参照されたい。
【００７２】
別の非制限的な実施形態において、本発明に従って使用される発現カセットは、エンハンサ要素、５’又は３’非翻訳配列（又は領域）、一つ以上のイントロン、ＲＮＡの安定性を調節する配列、或いはこうした要素の二つ以上の組み合わせを更に備えてもよい。こうしたカテゴリのいずれかに入る任意の配列は、本発明のベクタにおいて使用できる。こうした調節要素の説明については、米国特許第５，８６１，２９０号と、第５，８５１，９８４号と、第５，８４０，５２５号と、第５，６８１，７４４号と、第５，６２７，０３３号とを参照されたい。「５’非翻訳配列」という用語は、転写開始部位と翻訳開始部位との間のｍＲＮＡ分子の配列を指す。「３’非翻訳配列」という用語は、翻訳終了部位とポリＡ尾部との間のｍＲＮＡ分子の配列を指す。
【００７３】
こうしたアッセイにおいて使用される異種Ｐ蛋白質符号化遺伝子は、通常、トランスフェクション、形質導入、形質転換、又はこの技術で知られる他の適切な手法によって、選択された細胞に導入される。例えば、エレクトロポレーションと、リン酸カルシウムとの共沈と、マイクロインジェクションと、リポフェクションと、その他とを使用できる。トランスフェクション方法の説明については、米国特許第５，８１４，６１８号と、第５，７８９，２１５号とを参照されたい。ゲノムへの統合を介して、或いは染色体外要素の一部としての維持により、異種遺伝子又は遺伝子群を取り込む細胞は、その後、好ましくは、標準的な手法で選択される。そのため、標識を有していない細胞から、標識を有する細胞、つまりはベクタ及び異種遺伝子又は遺伝子群を含む細胞を分離可能にする、選択可能な標識を、ベクタに含めることができる。こうしたアッセイにおいて使用される細胞を準備するために選択可能な標識が必要かどうかは、ベクタを細胞に導入する特定の方法に応じて決まる。例えば、マイクロインジェクションでは形質転換頻度が高くなる傾向があるため、マイクロインジェクションを介してベクタが細胞に導入される場合、選択可能な標識は、エレクトロポレーションが使用される場合に比べて、あまり有用ではない。例えば、標識は、選択的な条件下、即ち、標識を有していない場合に細胞が培養できない条件下での細胞の培養を可能にできる（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子及びヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子）。標識は、更に、異種ポリヌクレオチド分子又はベクタを取り込んだ細胞を特定するための別の手段を提供できる（例えば、選択的染色）。選択可能な標識の説明については、米国特許第５，８５１，９８４号と、第５，７８９，２１５号とを参照されたい。
【００７４】
以前に開示したように、本発明では、Ｐ蛋白質を発現する細胞は、毒素に対する感受性がより高いと定めている。本発明の方法で利用される毒素は、様々なメカニズムで集合的に作用し、細胞を傷つける、或いは細胞死をもたらす広範な化学物質又は化合物から選択できる。非制限的な例として、こうした毒素は、メタロイド、重金属、グルタチオン枯渇剤、化学療法剤、イオノフォア、液胞型ＡＴＰアーゼ阻害剤、微小管阻害剤、又はＤＮＡ相互作用剤にしてよい。
【００７５】
本発明の特定の方法は、細胞生存能力及び／又は細胞死を測定するように設計されたアッセイを利用する。当業者に知られるように、細胞生存能力及び／又は細胞死の測定には、多数のアッセイが利用できる。例えば、細胞をトリパンブルー等の生体染色色素で染色し、低倍率の顕微鏡で検査し、細胞生存能力を判定できる。市販のアッセイキットを使用して、細胞生存能力及び／又は細胞死を測定することもできる。例えば、こうしたキットは、Ｃｙｔｏｌｕｘキット（マサチューセッツ州ボストンのＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM発光細胞生存能力アッセイ（ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を含む。
【００７６】
本発明の特定の方法は、Ｐ蛋白質の模倣物を特定する。例えば、Ｐ蛋白質を発現しない対照細胞を毒素に露出し、細胞生存能力及び／又は細胞死の測定値を取得する。更にＰ蛋白質を発現しない試験細胞を、Ｐ蛋白質模倣物特性の試験対象である作用物質に接触させた後で毒素に露出する。こうした条件下での試験細胞の細胞生存能力／細胞死の測定値を、その後、毒素に露出したＰ蛋白質を発現しない対照細胞で取得された測定値と比較する。試験細胞での細胞生存能力における増加又は細胞死における減少は、試験した作用物質がＰ蛋白質機能の模倣物であることを示す。
【００７７】
上で説明したＰ蛋白質機能を修飾する化合物のためのスクリーニング方法は、個別の化合物を試験するために、或いは多数の化合物を同時に試験するために使用できる。この技術において公知である高スループットのスクリーニング方法が有用である。
【００７８】
本発明の目的から、「高スループットのスクリーニング方法」は、多数の化合物を同時にテスト可能なスクリーニング方法として定義される。Ｐ蛋白質機能を修飾する化合物のスクリーニングにおける各ステップ又は全ステップは、候補化合物の高スループットのスクリーニング方法に従う。好ましくは、高スループットのスクリーニング方法は、部分的又は完全に自動化され、各化合物を試験するために必要な注意力の量を低減する。例えば、毒素に対する感受性の増加又は減少、或いはグルタチオンの合計レベルは、高スループットのスクリーニング方法で通常使用される形式（例えば、９６ウェルプレート等）において、容易に検出できる。
【００７９】
高スループットのスクリーニング方法は、この技術において周知であり、多数の形式のいずれかで実行できる。ロボット工学技術を含むラボラトリオートメーションは、多数の化合物をスクリーニングするために必要な時間を大幅に短縮可能であり、例えば、僅かな例を挙げれば、Ｔｅｃａｎ（ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク）と、Ｓｃｉｔｅｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＳＡ（スイス、ローザンヌ）と、Ｒｏｓｙｓ（デラウェア州ニューキャッスル）と、Ｒｉｘａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．（オハイオ州デイトン）と、ＣＲＳ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓ（カナダ、オンタリオ州バーリントン）と、Ｆａｎｕｋ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓと、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｓａｇｉａｎ（インディアナ州インディアナポリス）とから市販されている。
【００８０】
グルタチオン（γ−グルタミル−システイニルグリシン）は、殆ど全ての真核細胞に存在する最も豊富な非蛋白性チオール化合物である。細胞内グルタチオンの濃度の生理的値は、一般に、１ｍＭ乃至１０ｍＭの範囲である。グルタチオンは、酸化的ストレスからの保護、薬物無毒化、レドックス状態の維持、蛋白質の折り畳みの支援、及び硫黄の貯蔵を含め、細胞内で無数の役割を果たす。γ−グルタミル結合と、中心システイン残基における強い求核中心とによるトリペプチドの相対的な安定性は、こうした重要な機能の主な原因となり得る（Pnninckx、Enzyme Microb. Technol. 26:737-742 (2000) で検討されている）。
【００８１】
本発明では、Ｐ蛋白質を発現する細胞は、Ｐ蛋白質を発現しない細胞より少ないグルタチオンを含有すると定めている。したがって、本発明は、Ｐ蛋白質を発現し、作用物質に露出された細胞内のグルタチオン含有量をモニタすることで、Ｐ蛋白質機能を修飾する作用物質の特定のための方法を提供する。
【００８２】
例えば、Ｐ蛋白質を発現する対照細胞のグルタチオンの量の測定値を取得する。同じく同じくＰ蛋白質を発現する試験細胞を、最初に作用物質に露出する。例えば、３０分乃至７２時間といった十分な期間の後、作用物質に露出した試験細胞に存在するグルタチオンの量の測定値を取得する。対照細胞と試験細胞とにおけるグルタチオンの測定値を、その後、比較する。対照細胞からの測定値と比較した試験細胞から取得した測定値における任意の変化は、試験中の作用物質がＰ蛋白質機能の修飾剤であることを示す。例えば、作用物質に露出したＰ蛋白質発現細胞におけるグルタチオンの量の増加は、こうした細胞がＰ蛋白質を発現する細胞で予想されるより多くのグルタチオンを有することから、作用物質がＰ蛋白質機能のアンタゴニストであることを示し、作用物質に露出したＰ蛋白質発現細胞におけるグルタチオンの量の減少は、こうした細胞がＰ蛋白質を発現する細胞で予想されるより少ないグルタチオンを有することから、作用物質がＰ蛋白質機能のアゴニストであることを示す。
【００８３】
本発明のその他の方法は、Ｐ蛋白質機能の模倣物を特定する。例えば、Ｐ蛋白質を発現しない対照細胞グルタチオン含有量を取得する。同じくＰ蛋白質を発現しない試験細胞を、Ｐ蛋白質模倣物特性についての試験対象である作用物質に露出する。こうした条件下での試験細胞のグルタチオン含有量の測定値を、その後、Ｐ蛋白質を発現しない対照細胞で得られた測定値と比較する。試験細胞におけるグルタチオンのレベルの減少は、試験された作用物質がＰ蛋白質機能の模倣物であることを示す。
【００８４】
当業者が理解するように、グルタチオンを生成する様々な細胞を、本発明の方法に使用できる。例えば、こうした細胞は、原核細胞又は真核細胞にすることができる。更に具体的には、本発明で利用される細胞は、ヒト、マウス、ラット、又はハムスタ等の哺乳類、鳥類、魚類、線虫類、昆虫、菌類、又はバクテリアの細胞である。
【００８５】
一実施形態において、方法において利用される細胞は、メラニン細胞である。代替として、本発明の方法において利用される細胞は、メラニン細胞ではない。更に具体的には、本発明の方法において利用される細胞は、Ｐ蛋白質を発現するメラニン細胞にする必要はなく、Ｐ蛋白質を発現する他の細胞型の真核細胞又は原核細胞にしてよい。通常、非メラニン細胞でのＰ蛋白質の発現は、上で説明したように、こうした細胞内での組み換え技術による発現の結果である。
【００８６】
本発明は、更に、菌類細胞アッセイにおいてＰ蛋白質機能のアゴニスト、アンタゴニスト、及び模倣物を特定する方法を提供する。本明細書で以前に説明したように、Ｐ蛋白質符号化核酸は、Ｐ蛋白質を通常は発現しない菌類細胞等の細胞に導入できる。こうした細胞は、その後、Ｐ蛋白質機能のアゴニスト、アンタゴニスト、及び模倣物の特定のためのアッセイに使用できる。
【００８７】
この方法により、Ｐ蛋白質を発現する対照菌類細胞を亜セレン酸塩に接触させ、対照菌類細胞における赤色色素形成量の測定値を取得する。亜セレン酸塩に露出した菌類細胞における赤色色素形性は、４２０ｎｍでの分光光度法により都合よく測定できる（Chaudhuriら、Genetics 145:75-83 (1997)）。次に、Ｐ蛋白質を発現する試験菌類細胞を作用物質に接触させる。作用物質接触済み試験菌類細胞を、その後、亜セレン酸塩に接触させ、毒素及び作用物質接触済み試験菌類細胞における赤色色素形成量の測定値を取得する。対照細胞の測定値を試験細胞の測定値と比較することで、対照細胞の測定値と試験細胞の測定値との間に差異が存在する時、作用物質は、Ｐ蛋白質機能の修飾剤として特定できる。
【００８８】
本発明のこの態様の特定の実施形態において、菌類細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅである。
【００８９】
Ｐ蛋白質の機能を阻害するために使用できる一クラスの化合物はＰ蛋白質符号化遺伝子アンチセンス核酸である。「Ｐ蛋白質符号化遺伝子アンチセンス核酸」は、本明細書での使用において、ある程度の配列相補性に基づいて、Ｐ蛋白質符号化ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の一部とのハイブリッド形成が可能な核酸配列を有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド分子を指す。アンチセンス核酸は、Ｐ蛋白質ｍＲＮＡコード及び／又は非コード領域のどちらかと相補的であるため、Ｐ蛋白質合成の量を低減することでＰ蛋白質機能を阻害する。
【００９０】
本発明のアンチセンス核酸は、細胞又は動物の皮膚に直接的に投与可能な、或いは、異種の導入配列の転写によって細胞内で生成可能な、二本鎖又は一本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡであるオリゴヌクレオチド、或いはその修飾物又は類似物にすることができる。
【００９１】
本発明のＰ蛋白質符号化遺伝子アンチセンス核酸は、少なくとも約６ヌクレオチドの長さであり、更に好ましくは、約６乃至約５０オリゴヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、或いは少なくとも約２００ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、或いはそのキメラ混合物又は誘導体、及びその修飾されたものにすることが可能であり、いずれも一本鎖又は二本鎖にできる。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、又はリン酸バックボーンのレベルで修飾できる。オリゴヌクレオチドは、ペプチド等、その他の付随する基、或いは細胞膜を越えた輸送を促進する作用物質（例えば、Letsingerら、1989, Proc.Natl. Acad. Sci. (USA) 86:6553-6556、Lemaitreら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:648-652、１９８８年１２月１５日公開のＰＣＴ公報第ＷＯ８８／０９８１０号参照）、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤（例えば、Krolら、1988, BioTechniques 6:958-976参照）、又は挿入剤（例えば、Zon、1988, Pharm. Res. 5:539-549参照）を含んでもよい。本発明の好適な態様において、Ｐ蛋白質符号化遺伝子アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ分子である。
【００９２】
オリゴヌクレオチドは、この技術で一般に知られた置換基により、構造の任意の位置で修飾してよい。Ｐ蛋白質符号化遺伝子アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの修飾塩基部分を含んでもよく、修飾塩基部分は、５−フルオロウラシルと、５−ブロモウラシルと、５−クロロウラシルと、５−ヨードウラシルと、ヒポキサンチンと、キサンチンと、４−アセチルシトシンと、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシルと、５−カルボキシメチルアミノメチル１−２−チオウリジンと、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシルと、ジヒドロウラシルと、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシンと、イノシンと、Ｎ６−イソペンテニルアデニンと、１−メチルグアニンと、１−メチルイノシンと、２，２−ジメチルグアニンと、２−メチルアデニンと、２−メチルグアニンと、３−メチルシトシンと、５−メチルシトシンと、Ｎ６−アデニンと、７−メチルグアニンと、５−メチルアミノメチルウラシルと、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシルと、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシンと、５−メトキシカルボキシメチルウラシルと、５−メトキシウラシルと、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニンと、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）と、ワイブトキソシンと、プソイドウラシルと、ケオシンと、２−チオシトシンと、５−メチル−２−チオウラシルと、２−チオウラシルと、４−チオウラシルと、５−メチルウラシルと、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステルと、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）と、５−メチル−２−チオウラシルと、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシルと、（ａｃｐ３）ｗと、２，６−ジアミノプリンとを一部として含むグループから選択される。
【００９３】
別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノースと、２−フルオロアラビノースと、キシルロースと、ヘキソースとを一部として含むグループから選択される少なくとも一つの修飾糖部分を含んでよい。更に別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートと、ホスホロジチオアートと、ホスホラミドチアアートと、ホスホラミダートと、ホスホルジアミダートと、メチルホスホナートと、アルキルホスホトリエステルと、ホルムアセタール又はその類似物とで構成されたグループから選択される少なくとも一つの修飾リン酸バックボーン構成要素を含む。更に別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、アルファアノメリックオリゴヌクレオチドである。アルファアノメリックオリゴヌクレオチドは、相補ＲＮＡと特異性二本鎖ハイブリッドを形成し、これにおいて、通常のベータユニットとは違い、ストランドは、互いに平行に延びる（Gautierら、1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641）。
【００９４】
オリゴヌクレオチドは、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤、その他といった別の分子と共役してよい。
【００９５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、その他で市販されるような）自動ＤＮＡシンセサイザの使用によるもの等、この技術において公知である標準的な方法により合成してよい。一例として、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、Steinら、1988, Nucl. Acids Res. 16:3209の方法で合成してよく、メチルホスホナートオリゴヌクレオチドは、Starinら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:7488-7451、その他の方法を使用して、制御細孔ガラス高分子支持台により作成できる。
特定の実施形態において、Ｐ蛋白質アンチセンスオリゴヌクレオチドは、触媒ＲＮＡ又はリボザイムを含む（例えば、１９９０年１０月４日公開のＰＣＴ国際公法ＷＯ９０／１１３６４、Sarverら、1990, Science 247:1222-1225を参照）。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Inoueら、1987, Nucl. Acids Res. 15:6231-6148）、又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似物（Inoueら、1987, FEBS Lett. 215:327-330）である。
【００９６】
代替実施形態において、本発明のＰ蛋白質符号化遺伝子アンチセンス核酸は、異種配列からの転写により、細胞内で生成される。例えば、ベクタを、細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで導入し、その細胞内で、ベクタ又はその一部が転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）が生成される。こうしたベクタは、Ｐ蛋白質符号化遺伝子アンチセンス核酸を符号化する配列を含む。こうしたベクタは、望ましいアンチセンスＲＮＡを生成するために転写可能である限り、エピソームの状態を維持するか、或いは、染色体上で統合される。こうしたベクタは、この技術において公知である標準の組み換えＤＮＡ技術の方法により構築できる。S Sambrookら「分子クローニング：実験室マニュアル」第三版、Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (ISBN: 0879695765)。ベクタは、プラスミド、ウイルスベクタ、或いは、この技術において、哺乳類細胞での複製及び発現に有用なものとして公知である他のものにできる。Ｐ蛋白質符号化遺伝子アンチセンスＲＮＡを符号化する配列の発現は、こうした細胞で機能する、この技術において公知である任意のプロモータによって調節できる。こうしたプロモータは、誘導すること、或いは構成要素にすることが可能であり、上に列挙したものを一部として含むことができる。
【００９７】
本発明のアンチセンス核酸は、Ｐ蛋白質符号化遺伝子、好ましくはヒトＰ蛋白質符号化遺伝子のＲＮＡの転写の少なくとも一部と相補的な配列を備える。しかしながら、ＲＮＡとハイブリッド形成し、安定した二重螺旋を形成できる十分な相補性をアンチセンス核酸が有する限り、完全な相補性は、好適であるが必要ではない。二本鎖Ｐ蛋白質符号化遺伝子アンチセンス核酸の場合、したがって、二本鎖ＤＮＡの単一の鎖を試験してよく、或いは、三重螺旋の形成をアッセイしてよい。ハイブリッド形成の能力は、相補性の度合いと、アンチセンス核酸の長さとの両方に依存することになる。一般に、ハイブリッド形成する核酸が長いほど、含まれ得るＰ蛋白質符号化遺伝子ＲＮＡとの塩基の不一致は増えるが、安定した二重螺旋（又は、場合によっては、三重螺旋）が形成され得る。当業者は、例えば、ハイブリッド複合体の融点を判定する等、標準的な手順を使用して、不一致の許容範囲を判定できる。
【００９８】
本発明の方法により、Ｐ蛋白質機能のモジュレータ、アンタゴニスト、アゴニスト、又は模倣物として特定された化合物は、より効果的な化学的類似物の設計のための分子モデリング手法の基盤としての役割を果たせる。分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭ（マサチューセッツ州ウォルサムのＰｏｌｙｇｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＱＵＡＮＴＡ（カリフォルニア州サンディエゴのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）プログラムである。ＣＨＡＲＭは、エネルギ最小化と分子力学機能とを実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング、及び分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡでは、互いの分子との双方向的な構築、修正、視覚化、及び分析が可能となる。
【００９９】
例えば、Ｐ蛋白質機能を修飾する化合物が特定された後、化合物は、仮説の作成に使用できる。こうした仮説は、例えば、プログラムＣａｔａｌｙｓｔ（カリフォルニア州サンディエゴのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、本発明の好適な化合物の任意の一つから生成できる。更に、Ｃａｔａｌｙｓｔは、仮説を使用して、例えば、ケンブリッジ小分子データベース（英国、ケンブリッジ）のような専用データベース、及び上で引用したもの等、他のデータベース又は化合物ライブラリを検索し、本発明の化合物の追加的な例を特定できる。
【０１００】
本発明の方法により、Ｐ蛋白質機能のモジュレータ、アンタゴニスト、アゴニスト、又は模倣物として特定された化合物は、Ｌｕｄｉ、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ、Ｃ2−Ｍｉｎｉｍｉｚｅｒ、及びＡｆｆｉｎｉｔｙ（カリフォルニア州サンディエゴのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）のようなモデリングパッケージを使用して、更に効果的な類似物を設計するために使用できる。特に好適なモデリングパッケージは、ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ（ニューヨーク州ニューヨークのコロンビア大学）である。
【０１０１】
本発明の方法により、Ｐ蛋白質機能のモジュレータ、アンタゴニスト、アゴニスト、又は模倣物として特定された化合物は、更に効果的な化合物を特定するためにスクリーニングできる合理的組み合わせライブラリを作成する基盤として、更に使用できる。組み合わせライブラリの性質は、ライブラリの基盤を形成するために本発明の好適な化合物から選択した特定の化合物、更には樹脂を使用してライブラリを合成する要望といった様々な要素に依存するが、本発明の化合物は、Ｃ2−ＱＳＡＲ（カリフォルニア州サンディエゴのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）のような組み合わせ設計プログラムに適した必須データを提供する。
【０１０２】
本発明は、更に、メラニン形成を刺激する方法を提供する。メラニン細胞は、こうした細胞におけるメラニン形成を刺激するために、細胞生存能力／細胞死及び／又は細胞内のグルタチオン含有量の測定に基づいて、本発明の方法を介して特定されたＰ蛋白質機能のアゴニストに接触させることができる。
【０１０３】
メラニン形成の刺激は、メラニン形成にとって重要であることが公知である変数の測定値を取得することで判定できる。例えば、メラニンの生成にとって重要な酵素であるチロシナーゼのレベル及び／又は活性を、この技術で公知の方法を使用して測定できる。メラニン形成の刺激をモニタする別の手段は、メラニンの増加が存在するのを判定することであり、単純な目視検査によって、或いは、この技術で公知の手法を使用した細胞内のメラニンの量の測定によって実行できる。
【０１０４】
メラニン細胞に接触させ、こうした細胞でのメラニン形成を阻害するために、細胞生存能力／細胞死及び／又は細胞内のグルタチオン含有量の測定に基づいて本発明の方法を介して特定されたＰ蛋白質機能のアンタゴニストを使用可能なメラニン形成を阻害する方法が更に提供される。メラニン形成の阻害は、メラニン形成の刺激を判定するのに使用したものと同じアッセイを使用することで判定できる。
【０１０５】
メラニン形成を刺激する方法と、メラニン形成を阻害する方法とのために、メラニン細胞は、本明細書で説明したような、或いはこの技術で公知である適切な製薬担体を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで接触させることができる。
【０１０６】
本発明は、更に、細胞生存能力／細胞死及び／又は細胞内のグルタチオン含有量の測定に基づいて本発明の方法を介して特定されたＰ蛋白質機能のアゴニスト、アンタゴニスト、及び／又は模倣物を含む薬学的組成物を提供する。
【０１０７】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体と、Ｐ蛋白質機能のアンタゴニスト、アゴニスト、及び／又は模倣物である有効量の化合物とを含む。この組成物は、メラニンの生成不足又は生成過剰を発生するタイプの疾病、障害、又は状態を有する患者、人、又は動物に投与される。
【０１０８】
特定の疾病、障害、又は状態の治療において有効となる化合物の量は、疾病、障害、又は状態の性質に応じて決まり、標準的な臨床手法により決定できる。可能な場合には、治療する組織型に対する化合物の細胞毒性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定し、その後、人間で試験及び使用する前に、有用な動物モデル系において判定することが望ましい。
【０１０９】
製薬での使用に加え、本発明の方法は、化粧品の目的において有用である。本発明の方法の化粧品での応用は、皮膚又は毛髪の外観を増進するため、或いは、その他の形で改変するために、一つ以上の化合物を含む組成物を対象に局所適用することを含む。メラニンの生成、生成過剰又は生成不足の結果としての皮膚又は毛髪での顕著だが望ましくない色素沈着の発生は、本発明の薬学的組成物及び治療方法を使用して治療できる。
【０１１０】
化合物は、哺乳類の体内での有効な作用物質のメラニン細胞等の作用部位との接触を発生させる任意の手段により、メラニン合成の低減又は増加のために投与できる。化合物は、個別の治療剤として、或いは治療剤の組み合わせにおいて、製薬と併せた使用のために利用可能な任意の従来の手段により投与できる。それぞれを単独で投与することが可能だが、好ましくは、選択した投与経路と標準的な薬務とに基づいて選択された製薬担体と共に投与される。本発明の薬学的組成物は、経口、非経口、及び好ましくは、局所投与が可能であり、製薬技術に関わる当業者に周知の形で、単位投薬の形態にできる。非経口投与は、その一部に、皮下注射、静脈注射、腹腔内注射、又は筋肉注射を含む。しかしながら、局所適用が好適である。
【０１１１】
有効な投与量及び治療プロトコルは、従来の手段で決定可能であり、実験動物で低用量から開始し、効果をモニタしながら投与量を増やし、同時に投与計画を体系的に変化させる。動物での研究、好ましくは、哺乳類での研究は、キログラム重当たりの生物活性物質の最大許容容量又はＭＴＤの決定に一般的に使用される。当業者は、人間を含む他の種二対する有効性と毒性の回避とのために投与量を推定できる。
【０１１２】
人間での有効性の研究を始める前に、正常な被験者での第一相臨床研究は安全な用量を確立するのに役立つ場合がある。一定の被験者に最適な投与量を決定する時、臨床医は、無数の要素を考慮に入れることができる。これらの中で第一のものは、Ｐ蛋白質機能を修飾する選択化合物の毒性及び半減期である。追加的な要素は、患者のサイズと、患者の年齢と、患者の一般的な状態と、治療する特定の疾病、状態、又は障害と、治療する特定の疾病、状態、又は障害の重症度と、患者における他の薬物の存在と、望まれる効果と、その他とである。試験投与量は、動物研究の結果と臨床文献とを考慮した後に選択されることになる。
【０１１３】
特定のケースにおいて選択されたエンドポイントは、治療する疾病、状態、又は障害と、患者、被験者、又は治療医師が望む結果と、その他の要素とにより変化することを、当業者は理解するであろう。例えば、炎症又は肝斑のような疾病等により発生した色素沈着過度を逆転する目的等で、皮膚色を明るく又は暗くさせるために、或いは、毛髪色を明るく又は暗くさせるために組成物が使用される場合には、多数のエンドポイントの任意の一つを選択できる。例として、エンドポイントは、例えば、被験者が単純に「治療の結果に満足した時」のように、主観的に定義できる。薬理学的な組成物について、エンドポイントは、治療の結果による患者又は治療医師の満足によって定義できる。代替として、エンドポイントは、客観的に定義できる。例えば、患者又は被験者の治療範囲の皮膚又は毛髪を、カラーチャートと比較できる。治療は、治療範囲の皮膚又は毛髪の色がチャート上の色と外見で同様になった時に終了される。代替として、治療した皮膚又は毛髪の反射率を測定可能であり、治療は、治療した皮膚又は毛髪が指定の反射率に到達した時に終了できる。代替として、治療した毛髪又は皮膚のメラニン含有量を測定できる。治療は、治療した毛髪又は皮膚のメラニン含有量が、指定の値に達した時に終了できる。メラニン含有量は、メラニンの染色の有無を問わず、組織学的方法によるものを含め、この技術で公知の何らかの形で決定できる。
【０１１４】
Ｐ蛋白質機能を修飾する作用物質又は化合物（即ち有効成分）は、局所的に投与される時、例えば、下で説明するパッチ、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、溶液、又は経皮投与として投与できる。化合物は、更に、硬カプセル又はソフトゼラチンカプセル剤、錠剤、又は粉剤といった固体又は半固体の投薬形態、或いはエリキシル剤、シロップ剤、又は懸濁剤といった液体の投薬形態で、経口的に投与できる。加えて、化合物は、無菌液の投薬形態又は座剤の形態で、非経口的にも投与できる。
【０１１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用が考えられるため、組成物は、好ましくは、高純度であり、例えば、少なくともＮａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄ（ＮＦ）のグレードで、一般的には、少なくとも分析的なグレードで、好ましくは、少なくとも製薬のグレードで、潜在的に有害な汚染物を実質的に含まない。一定の化合物を使用前に合成する必要がある限りは、こうした合成又はその後の精製では、好ましくは、合成又は精製手順中に使用され得る、汚染の可能性がある任意の毒性作用物質を実質的に含まない製品が生じるべきである。
【０１１６】
Ｐ蛋白質機能を修飾する化合物の投与のための製薬の投薬形態については、下で説明する。
【０１１７】
薬学的組成物は、皮膚に直接的に供給できる。代替として、この技術で公知の経皮パッチのような、様々な経皮的薬物送達システムによって送達できる。例えば、局所投与のために、有効成分は、製薬又は化粧品として許容される形態の溶液、ゲル、ローション、軟膏、クリーム、懸濁、ペースト、塗布剤、粉剤、チンキ剤、エアロゾル、パッチ、又はその他において、この技術で周知の方法によって調製できる。組成物は、下で説明するように、溶液、ローション、スプレ、クリーム、軟膏、膏薬、ゲル、その他を含め、動物又は人間への局所適用のための、製薬又は化粧品の技術に共通する様々な形態のいずれかにすることができる。好適な物質は、治療領域にとどまる十分な粘性のあるもの、直ちに蒸散しないもの、及び／又は、随意的に石鹸、洗剤、及び／又はシャンプを利用して、水で濯ぐことにより容易に除去されるものである。
【０１１８】
局所的に供給される本発明の組成物は、本明細書で説明したようなＰ蛋白質機能を修飾する薬学的に有効な作用物質を含み、エマルジョン、クリーム、眼科用軟膏、水溶液、ローション、又はエアロゾルといった、担体として使用するのに必要な材料を含む。こうした担体の非限定的な例は、下で更に詳細に説明されており、２０００年１０月２６日公開の国際特許公報ＷＯ００／６２７４２と、１９９７年１１月２５日発行のＭａｓｏｎらの米国特許第５，６９１，３８０号と、１９９９年１１月１９日発行のＤｅｃｋｎｅｒらの米国特許第５，９６８，５２８号と、１９７９年２月１３日発行のＣｈｉｄｓｅｙ  ＩＩＩの米国特許第４，１３９，６１９号と、１９８７年８月４日発行のＯｒｅｎｔｒｅｉｃｈらの米国特許第４，６８４，６３５号とにも記載されている可能性があり、これらは参照により本明細書に組み込むものとする。適切な製薬担体は、この分野での標準的な参考文献である「レミントンの薬学」第１７版、Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)において、更に説明されている。
【０１１９】
局所用剤形を作成する実際の方法は、当業者に公知又は明白であり、「レミントンの薬学」、１９９０（前掲）と、「製薬の投薬形態及び薬物送達システム」第六版、Williams & Wilkins （１９９５）とにおいて詳細に説明されている。他の情報源は、一部として、「ＣＴＦＡ化粧品材料ハンドブック」第二版（１９９２）、Sagarinの「化粧品、科学及び技術」第二版、Vol.1, pp.3243（１９７２）、及び／又はAllured Publishing Corporation発行の「マカッチャンの洗剤及び乳化剤」北米版（１９８６）を含む。
【０１２０】
別の態様において、本発明は、癌を有する患者を治療する方法を提供する。方法は、癌細胞をＰ蛋白質機能のアゴニスト又は模倣物に接触させることを含み、Ｐ蛋白質機能のアゴニスト又は模倣物は、細胞生存能力／細胞死及び／又は細胞内のグルタチオン含有量の測定に基づいて、本発明の方法を介して特定される。先行する処理によって細胞に感受性を与えた後、癌細胞を、化学療法剤に接触させる。一実施形態において、治療される癌は、肝臓癌と、脾臓癌と、肺癌と、結腸癌と、腸癌と、胃癌と、脳腫瘍と、白血球の癌と、骨癌と、卵巣癌と、睾丸癌と、黒色腫癌とで構成されたグループから選択される。
【０１２１】
本発明の薬学的組成物は、イミプラミン、及びアミトリプチン、トリミプラミン、又はドキセピンのようなその他の三環系アミン、或いは、非定型抗鬱剤（例えば、トラゾドン及びフルオキセチン）のように、イミプラミンとの構造的類似性は欠如しているが、有用な抗鬱剤としての機能的特性をイミプラミンと共有する化合物を含まない。加えて、バフィロマイシンＡ１及びコンカナマイシンＡについては、こうした化合物はＰ蛋白質機能を修飾することが公知であるため、本発明の薬学的組成物から除外される（例えば、米国公報第０９／８２７，４２８号参照）。
【０１２２】
黒色腫は、メラニン細胞から成る、主に皮膚における悪性新生物の任意のグループである。殆どの黒色腫は、母斑と呼ばれる色素性である良性の先天的な皮膚の染みから、数ヶ月又は数年の期間を経て発生し、淡色の眼を有する肌の白い人において最も頻繁に発生する。メラノーマは、不規則な境界、境界の幅を越えて広がるように見える色素、及び／又は厳密な検査で観察可能な赤、黒、又は青の着色を有する黒又は茶色の点として発生する。結節性の表面が黒色腫を示す場合もある。黒色腫の様々な種類には、一部として、メラニン欠乏性と、良性若年性と、悪性黒子性と、皮膚原発性と、表在拡大性とが含まれる。
【０１２３】
Ｐ蛋白質アゴニスト及び／又はＰ蛋白質模倣物と化学療法剤との投与は、非経口投与を含む任意の適切な手法で実行できる。非経口投与の例は、静脈内、筋肉内、及び皮下投与と共に、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内のものを含む。更に、Ｐ蛋白質アゴニスト又は化学療法剤の供給では、任意の順序で別個に投与可能であり、或いは一緒に投与できる。
【０１２４】
用量及び投与計画は、主に、悪性度と、化学療法剤と、利用されるＰ蛋白質機能のアゴニスト及び／又は模倣物と、患者と、患者の病歴と、治療に対する患者の反応とに応じて決まる。量は、臨床的改善を発生させる上で有効である必要がある。いずれの化合物の用量も、単回投与又は複数回投与にしてよい。複数回投与を利用する場合、投与の頻度（スケジュール）は、例えば、患者と、腫瘍反応のタイプと、化学療法剤及びＰ蛋白質のアゴニストの投与量とに応じて変化することになる。週一回の投与で有効としてよいが、別のものについては、毎日の投与、或いは一日おき又は二日おきの投与で有効としてもよい。医師は、特定のケースにおいて、どの投与経路及び投与頻度が最も効果的かを、日常的な実験により確定することができるであろう。
【０１２５】
本明細書において最も効果的であると思われる化学療法剤とＰ蛋白質機能のアゴニスト及び／又は模倣物との投与量は、下の実施例１におけるプロトコルで定めるように、腫瘍負荷の緩和、無発生、又は低減を発生させ、患者に対する毒性がない、或いは毒性が許容できるものである。発熱、寒気、及び全身倦怠のような状態は、許容可能とみなされる。この最適な用量レベルは、多数の要素、例えば、患者のタイプと、患者の反応と、腫瘍のタイプと、投与の経路及びスケジュールと、既存の腫瘍負荷と、毒性の定義とに応じて決まることになる。例えば、人間の患者に対する毒性は、本明細書の目的では許容可能であるとみなされる発熱、寒気、及び全身倦怠と共に、副作用の程度及びタイプにより定義してよい。
【０１２６】
当業者に明らかなように、Ｐ蛋白質発現細胞が毒素に対して感受性が高いことを規定した本発明は、更に、別の態様において、Ｐ蛋白質を発現しない細胞の毒素に対する毒性を増加させる方法を提供する。方法は、（ａ）細胞内でのＰ蛋白質の発現を可能にする、Ｐ蛋白質を符号化する核酸分子を、細胞内に導入することと、（ｂ）毒素に対する細胞の感受性を増加させるのに十分なレベルで、Ｐ蛋白質を細胞内で発現させることとを含む。
【０１２７】
別の態様において、本発明は、Ｐ蛋白質を発現しない細胞の毒素に対する感受性を増加させる方法を提供する。この方法は、細胞をＰ蛋白質模倣物に接触させることを含む。
【０１２８】
本発明のこの態様において有用な細胞は、ヒト、ラット、マウス、ハムスタ、又はモルモット等の野乳類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、線虫類細胞、昆虫細胞、植物細胞、菌類細胞、又はバクテリア細胞を含む。
【０１２９】
当業者に理解されるように、本発明の組成物及び薬学的組成物は、キットの形態で提供してよい。本発明のキットは、Ｐ蛋白質機能を修飾する、本発明の一つ以上の特定の組成物及び／又は薬学的組成物を容器内に備える。随意的に、キットは、ラベル、又はパッケージ内の文書として、皮膚の色素沈着を調節するために、即ち、含まれる特定の組成物に応じて、皮膚を明るく又は暗くさせるために、こうした試薬の使用法を指示する、印刷済みの説明書を更に備える。こうした化合物は、汚染の防止、組成物の蒸散又は乾燥の最小化、その他のために設計された容器に入れて提供される。化合物は、事前に設定された用量又は使用量の単位で提供されてもいいし、されなくてもよい。同様の形で、本発明は、更に、黒色腫について本明細書で説明したような治療上の処置を含むキットを提供する。
【０１３０】
以下の例は、本発明を作成及び実施する好適な形態を例示しているが、同様の結果を得るために代替方法を利用してもよいため、本発明の範囲の限定することは意図されていない。
【０１３１】
実施例
実施例１：メラニン細胞における毒性のスクリーニング
Ｐ蛋白質を発現するメラニン細胞及び発現しないメラニン細胞に対する様々な毒素の差別的な影響を、様々な毒素に露出した後の野生型メラン−ａメラニン細胞（Ａ）とＰヌルメラニン細胞（Ｐ）との生存能力を調査することで決定した。
【０１３２】
アッセイは、最初に、細胞培養物をトリプシン処理し、ＲＰＭＩ１６４０培地（メリーランド州ロックビルのＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ）において１．５×１０5細胞／ミリリットルの最終濃度で細胞を再懸濁することで開始した。一ウェル当たり１００μｌの細胞懸濁物を追加することで、９６ウェルディッシュへの配置を行った。細胞は、３７℃で一晩に渡って付着させた。細胞の配置は、一晩の培養後、培養物の約８０％が融合するように、必要に応じて調節した。
【０１３３】
２４時間後、培地を除去し、１００μｌの完全培地内の適切な濃度の化合物に置き換えた。７２時間の培養後、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｉＴｉｔｅｒ  ９６増殖アッセイ（ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、細胞生存能力アッセイを実行した。このキットでは、テトラゾリウム化合物の生体還元性を使用した生存細胞の比色定量化が可能である。成長率又は死亡率は、処理ウェルにおける細胞のＯＤ490／未処理ウェルにおける細胞のＯＤ490として表現した。
【０１３４】
野生型細胞（即ち、Ｐ蛋白質発現細胞）は、Ｐヌル細胞に比べ、多くの毒素に対して感
受性が高くなることが分かった。結果は、表１にまとめている。
【表１】
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【０１３５】
実施例２：野生型及びＰヌルメラニン細胞におけるグルタチオン含有量
グルタチオン（ＧＳＨ）の細胞内レベルに対するＰ蛋白質発現の影響を判定するために、実験を行った。ＧＳＨ含有量は、ＧＴ−２０比色アッセイキット（ミシガン州オックスフォードのＯｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）を使用して測定した。このアッセイは、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）［ＤＴＮＢ］によるＧＳＨの酸化に基づいて、生物試料の合計グルタチオン（ｔＧＳＨ）含有量を測定する、動的酵素循環アッセイである。グルタチオン基準又は処理済み試料をマイクロタイタプレートのウェルに追加し、その後、ＤＴＮＢ及びグルタチオン還元酵素を追加する。ＮＡＤＰＨ２のウェルへの追加により、ＧＳＨによるＤＴＮＢの漸進的な還元が開始され、これにより色度が増加し、色度は分光光度法により４０５ｎｍでモニタされる。通常は四分間に渡って追跡される色度の変化率は、ｔＧＳＨの濃度に比例する。
【０１３６】
その結果として、未知の試料におけるｔＧＳＨの濃度は、キットに提供された指示に従って生成した基準曲線を参照することで、判定し得る。ＧＳＨは、ＤＴＮＢと反応し、４０５ｎｍの光を吸収する有色イオンと、混合ジスルフィドとを生成する。このジスルフィドは、依然として存在するＧＳＨの量と反応し、別のイオンとＧＳＳＧとを遊離させる。ＧＳＳＧは、酵素的に還元されてＧＳＨとなり、その後、再びサイクルに加わる。ＧＳＳＧは酸性溶液を含まないグルタチオンの合計において僅かなパーセンテージしか示さないため、結果的に生じるｔＧＳＨ（ＧＳＨ及びＧＳＳＧの両方を包含する）の値は、ＧＳＨに相当するものの単位で表現される。
【０１３７】
グルタチオン含有量は、野生型メラン−ａ（Ａ）とＰヌルメラン−ｐｌ（Ｐ）細胞において判定した。成長して融合した細胞をトリプシン処理により回収し、リン酸緩衝生理食塩水により二度洗浄し、５％メタリン酸（ＭＰＡ）２ｍｌに再懸濁させた。１００μｌを取り出し、蛋白質濃度を判定した（カリフォルニア州リッチモンドのＢｉｏｒａｄ）。各懸濁が等しい濃度の蛋白質を含有するように、体積を調節した。上澄みをアッセイし、存在するグルタチオンの量を判定した。
【０１３８】
Ｐ蛋白質を発現するメラニン細胞（Ａ）は、Ｐヌル細胞（Ｐ）に比べて、三倍少ないグルタチオンを有する（図２）。Ｐ蛋白質発現メラニン細胞においてグルタミンの量が少ないことは、細胞からの毒素の除去におけるグルタミンの役割を仮定すると、こうした細胞の毒素に対する感受性の増加と一致する。
【０１３９】
実施例３：酵母における毒性のスクリーニング
Ｐ蛋白質機能を修飾する化合物のスクリーニングのためのモデル系として、酵母細胞を調査した。第一のステップとして、Ｐ蛋白質を発現する酵母細胞の毒素に対する感受性を調査した。
【０１４０】
酵母細胞にＰ蛋白質発現を導入するために、マウスＰ遺伝子符号化ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームを、５’（５’−ＡＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＣＡＡＡＧ−３’、Ｂａｍ  ＨＩに下線）及び３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（５’−ＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＧＡＴＧＡＴＴＣＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、Ｅｃｏ  ＲＶ部位に下線、ＨＩＳ６タグをイタリックで表示）に対応させたオリゴヌクレオチドを使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。ＰＣＲ産物をＢａｍ  ＨＩ及びＥｃｏ  ＲＶにより切断し、ｐ４１３ＧＰＤ−Ｐを生成するｈｉｓ３標識を有する動原体発現ベクタｐ４１３ＧＰＤ（バージニア州マナッサスのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＴＣ））にサブクローニングした。プラスミドｐ４１３ＧＰＤｐｄｅｌを、実験の対照として使用した。プラスミドｐ４１３ＧＰＤｐｄｅｌは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩによるプラスミドｐ４１３ＧＰＤｐの制限消化処理後に取得され、結果として、マウスＰ蛋白質発現ｃＤＮＡの６２５及び１７１７ヌクレオチド間の領域の除去が生じた。
【０１４１】
菌株ＳＨ３８６６（ｌｅｕ２  ｕｒａ３  ｈｉｓ４  ａｄｅ６  ｐｅｐ４ｇａ１２（日本、大阪大学、応用生物工学専攻、ヒロシマサトシ博士より入手））を、動原体プラスミドｐ４１６ＧＰＤｐ及び制御プラスミドｐ４１３ＧＰＤにより形質転換した。Egnerら（Mol. Bio. Cell. 9:523-543 (1998)）のものと同様の方法を使用して、定量的薬物アッセイを実行した。
【０１４２】
Ｐ蛋白質発現酵母細胞のヒ酸塩と、三酸化ヒ素と、アンチモンとに対する感受性について、こうした化合物を様々な濃度で含む培地でのコロニ成長の程度を決定することで調査した。活発に成長している酵母培養物を、１ウェル当たり１×１０-3の濃度でプレートに配置し、プレートは３０℃で三日間に渡って培養した。図３Ａに提示した結果は、ヒ酸塩と、三酸化ヒ素と、アンチモンとに露出したＰ蛋白質を発現する酵母細胞コロニが同じ化合物に露出したＰ蛋白質を発現しない酵母細胞コロニと同じサイズに達しないことを実証している。図３Ａに結果を図示した実験では、選択寒天培地を使用して２４ウェルプレートを準備した。指示された濃度の薬物は、注入する前に追加した。活発に成長している培養物は、一ウェル当たり１×１０-3の濃度でプレートに配置した。その後、希釈培養物１０マイクロリットルを、各ウェルに点状に配置し、プレートを３０℃で三日間に渡って培養した。
【０１４３】
別の実験では、Ｐ蛋白質発現酵母細胞及び対照細胞を様々な濃度の亜セレン酸塩に露出した。酵母における亜セレン酸塩の毒性の影響は、ＤＮＡの損傷によるものと考えられる。亜セレン酸塩の無毒化の主要な形態は、細胞液胞において赤色沈着物として蓄積される元素セレンへのグルタチオンによる還元であると思われる（Pinsonら、Molecular Microbiology 36:679-687 (2000)）。
【０１４４】
１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、及び５０ｍＭ亜セレン酸溶液を５５℃の選択寒天培地に準備し、２４ウェルプレートで二重にして配置した。活発に成長している酵母培養物を、Ａ６００の値が０．００１となるように希釈し、１０μｌアリコートを亜セレン酸塩含有寒天培地上で、二重にして点状配置した。プレートは、３０℃で三日間に渡って培養した。
【０１４５】
図３Ｂを参照すると、ウェルＡ１及びＡ２は、亜セレン酸塩で処理していない対照細胞を表し、ウェルＡ３及びＡ４は、１０ｍＭ亜セレン酸塩で処理した対照細胞を表し、ウェルＡ５及びＡ６は、２０ｍＭ亜セレン酸塩で処理した対照細胞を表し、ウェルＢ１及びＢ２は、３０ｍＭ亜セレン酸塩で処理した対照細胞を表し、ウェルＢ３及びＢ４は、４０ｍＭ亜セレン酸塩で処理した対照細胞を表し、ウェルＢ５及びＢ６は、５０ｍＭ亜セレン酸塩で処理した対照細胞を表している。ウェルＣ１及びＣ２は、亜セレン酸塩で処理していないＰ発現細胞を表し、ウェルＣ３及びＣ４は、１０ｍＭ亜セレン酸塩で処理した対照細胞を表し、ウェルＣ５及びＣ６は、２０ｍＭ亜セレン酸塩で処理した対照細胞を表し、ウェルＤ１及びＤ２は、３０ｍＭ亜セレン酸塩で処理した対照細胞を表し、ウェルＤ３及びＤ４は、４０ｍＭ亜セレン酸塩で処理した対照細胞を表し、ウェルＤ５及びＤ６は、５０ｍＭ亜セレン酸塩で処理した対照細胞を表している。
【０１４６】
これらの実験は、Ｐ発現細胞が対照細胞より多くの赤色沈着物を蓄積することを明らかにしており、こうした細胞がより多くの亜セレン酸塩をセレンに変換したことを示している。Ｐ蛋白質アンタゴニストは、亜セレン酸塩で処理したＰ蛋白質発現酵母における赤色色素の蓄積を妨害するべきである。
【０１４７】
更に、図３Ｂに提示した結果は、Ｐ蛋白質を発現する細胞と対照細胞（即ち、Ｐ蛋白質を発現しないもの）との対比において、亜セレン酸塩感受性において差異が存在しないことを実証している。
【０１４８】
同様の実験を、細胞生存能力に対するナイジェリシンの影響を調べるために実施した。こうした実験の結果は、Ｐ蛋白質を発現する酵母細胞がナイジェリシンで３μＭのＩＣ50値を有し、一方、Ｐ蛋白質を発現しない酵母細胞がナイジェリシンで２５μＭのＩＣ50値を有することを示した（データ図示なし）。
【０１４９】
実施例４：Ｐ蛋白質発現酵母におけるグルタチオン含有量
Ｐ蛋白質発現細胞及び対照について、細胞のグルタチオン含有量を、実施例２において説明したようなグルタチオン比色アッセイによって測定した。アッセイは、日本の大阪大学、応用生物工学専攻、ハラシマサトシより調達した酵母菌株ＳＨ３８６６  ｌｅｕ２  ｕｒａ３  ｈｉｓ４  ａｄｅ６  ｐｅｐ４ｇａ１２において実行し、グルタチオンは、５，５’ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）−グルタチオン還元酵素共役反応によって推定した。細胞を回収し、水で二度洗浄し、５％スルホサリチル酸０．４ｍｌに再懸濁させ、等しい体積のガラスビーズと混合し、４℃での合計六分間の活発なビーズ衝撃により破砕する。抽出物を微量遠心管において遠心沈殿させ、ガラスビーズを取り除き、更に細胞残屑及び蛋白質沈殿物を取り除く。上澄みをアッセイし、グルタチオンの量を判定した。
【０１５０】
表２に提示するように、実験の結果は、Ｐ蛋白質の発現が酵母細胞におけるグルタチオンの十分の一への減少につながることを示しており、細胞からの毒素の除去におけるグルタチオンの役割を仮定すると、こうした細胞での感受性の増加の何らかの説明を提供する
。
【表２】
2005536192.tif 000003
【０１５１】
等価物
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書で説明した本発明の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識又は確認し得よう。こうした等価物は、前記特許請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１Ａ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するヒ酸塩の影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｂ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対する三酸化ヒ素の影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｃ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するアンチモンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｄ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対する硫酸鉄（ＦｅＳＯ4）の影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｅ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するビンブラスチンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｆ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するカルボニルシアニドｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｇ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するプリマキンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｈ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するシクロヘキシミド酸の影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｉ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するバフィロマイシンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｊ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対する亜ヒ酸塩の影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｋ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するエタクリン酸の影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｌ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するカドミウムの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｍ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するブチオニンスルホキシイミン（ＢＳＯ）の影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｎ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するセレン酸塩の影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｏ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するドキソルビシンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｐ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するアリルグリシンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｑ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するシスプラチンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｒ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するオリゴマイシンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｓ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するベラパミルの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｔ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するクロロキンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｕ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するビンブラスチンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｖ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するプリマキンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｗ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するアンホテリシンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｘ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するバリノマイシンの影響を実証するグラフ表現の図
【図１Ｙ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞の細胞生存能力に対するリチウムの影響を実証するグラフ表現の図
【図２】蛋白質を発現する細胞内のグルタチオンのレベルと、Ｐ蛋白質を発現しない細胞におけるレベルとを示すグラフ表現の図
【図３Ａ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞について、ヒ酸塩、三酸化ヒ素、及びアンチモンに露出した後の酵母コロニサイズの写真の複写を示す図
【図３Ｂ】Ｐ蛋白質を発現する細胞及び発現しない細胞について、亜セレン酸塩に露出した細胞における酵母コロニサイズと赤色沈着物形成とを実証する写真の複写を示す図
【図１Ａ】
2005536192.tif 000004
【図１Ｂ】
2005536192.tif 000005
【図１Ｃ】
2005536192.tif 000006
【図１Ｄ】
2005536192.tif 000007
【図１Ｅ】
2005536192.tif 000008
【図１Ｆ】
2005536192.tif 000009
【図１Ｇ】
2005536192.tif 000010
【図１Ｈ】
2005536192.tif 000011
【図１Ｉ】
2005536192.tif 000012
【図１Ｊ】
2005536192.tif 000013
【図１Ｋ】
2005536192.tif 000014
【図１Ｌ】
2005536192.tif 000015
【図１Ｍ】
2005536192.tif 000016
【図１Ｎ】
2005536192.tif 000017
【図１Ｏ】
2005536192.tif 000018
【図１Ｐ】
2005536192.tif 000019
【図１Ｑ】
2005536192.tif 000020
【図１Ｒ】
2005536192.tif 000021
【図１Ｓ】
2005536192.tif 000022
【図１Ｔ】
2005536192.tif 000023
【図１Ｕ】
2005536192.tif 000024
【図１Ｖ】
2005536192.tif 000025
【図１Ｗ】
2005536192.tif 000026
【図１Ｘ】
2005536192.tif 000027
【図１Ｙ】
2005536192.tif 000028
【図２】
2005536192.tif 000029
【図３Ａ】
2005536192.tif 000030
【図３Ｂ】
2005536192.tif 000031
【国際調査報告】
2005536192.tif 000032