(57)【要約】本発明はバイオマスベースの供給原料基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ生物変換の所望の最終生成物を生成するための方法を提供し、限定されないが、そのような物質としてでんぷん及びセルロースがある。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は基質のゲル化及び／または液化を必要としない。特に好ましい実施態様において、本発明はエタノールを生成する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
最終生成物としてアルコールを生成する方法であって、以下の工程を含む：
ａ）炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させて中間体を生成する工程；及び
ｂ）前記中間体と少なくとも１の中間体変換酵素を接触させる工程であって、前記中間体は前記中間体酵素により実質的に全てアルコールに変換される。
【請求項２】
前記中間体変換酵素が微生物酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中間体変換微生物酵素が前記中間体と接触して微生物により分泌される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記基質変換酵素が微生物酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記基質変換微生物酵素が前記基質と接触して微生物により分泌される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記中間体変換酵素及び前記基質変換酵素が同じ種の微生物により生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記中間体変換酵素及び前記基質変換酵素が異なる種の微生物により生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記中間体の濃度レベルが前記中間体から前記最終生成物への変換において異化代謝産物抑制を引き起こすレベル以下で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記中間体の濃度レベルが前記中間体から前記最終生成物への変換において酵素抑制を引き起こすレベル以下で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記中間体が濃度を０．２５％以下に維持するために十分な速度で前記最終生成物に変換される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質がバイオマス及びでんぷんからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオマスが固形コーン（ｃｏｒｎ  ｓｏｌｉｄｓ）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記中間体がヘキソース及びペントースからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヘキソースがグルコースである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記基質及び基質変換酵素との接触工程がさらに前記基質を生物変換して前記中間体を生成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルコール最終生成物がエタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記基質と前記少なくとも１の基質変換酵素を接触させる工程がさらに、前記基質変換酵素を前記少なくとも１の中間体変換酵素により変換される前記中間体の量以下の濃度で前記中間体を生成する濃度で、一定量供給する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１の基質変換酵素が少なくとも５０％の前記基質を前記中間体に７２時間以内に変換する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１の基質変換酵素が少なくとも９０％の前記基質を前記中間体に７２時間以内に変換する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１の基質変換酵素が少なくとも９５％の前記基質を前記中間体に７２時間以内に変換する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１の基質変換酵素及び前記少なくとも１の中間体変換酵素がリゾプス及びアスペルギルスからなる群より選択される微生物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
最終生成物を生成する方法であって、以下の工程を含む：
ａ）炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させて、中間体を生成する工程；及び
ｂ）前記中間体と少なくとも１の中間体変換酵素を接触させる工程であって、ここで前記中間体は前記中間体酵素により実質的に全てアルコール最終生成物に変換され、前記最終生成物の存在が前記アルコール最終生成物のさらなる生成を阻害しない。
【請求項２３】
前記中間体変換酵素が微生物酵素である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記中間体変換微生物酵素が前記中間体と接触して微生物により分泌される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記基質変換酵素が微生物酵素である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記基質変換微生物酵素が前記基質と接触して微生物により分泌される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記中間体変換酵素及び前記基質変換酵素が同じ種の微生物により生成される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記中間体変換酵素及び前記基質変換酵素が異なる種の微生物により生成される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記アルコール最終生成物がエタノールである、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
アルコール最終生成物を生成する方法であって、以下の工程を含む：
ａ）炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させて、中間体を生成する工程；及び
ｂ）前記中間体と少なくとも１の中間体変換酵素を接触させる工程であって、ここで前記中間体は前記中間体酵素により実質的に全てアルコール最終生成物に変換され、前記基質の存在が前記アルコール最終生成物のさらなる生成を阻害しない。
【請求項３１】
前記中間体変換酵素が微生物酵素である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記中間体変換微生物酵素が前記中間体と接触して微生物により分泌される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記基質変換酵素が微生物酵素である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記基質変換微生物酵素が前記基質と接触して微生物により分泌される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記中間体変換酵素及び前記基質変換酵素が同じ種の微生物により生成される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記中間体変換酵素及び前記基質変換酵素が異なる種の微生物により生成される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記アルコール最終生成物がエタノールである、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はバイオマスベースの供給原料基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ生物変換の所望の最終生成物を生成するための方法を提供し、限定されないが、そのような物質としてでんぷん及びセルロースがある。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は基質のゲル化及び／または液化を必要としない。特に好ましい実施態様において、本発明はエタノールを生成する方法を提供する。
【０００２】
発明の背景
工業的発酵はタンパク質、酵素及び化学物質の生成のための供給原料としてグルコースを主に利用する。これらの発酵は通常、バッチ、フェッドバッチまたは連続式であり、基質限定条件下で操作し、及び／または副生成物形成が最小となるよう設計される。当業者に公知なように、これらは発酵時間、収率及び効果を最適化するために発酵中制御しなければならない特定の重要な操作条件である。
【０００３】
グルコースは開始基質として多数の化学的及び生物学的合成用途に有用な天然で、炭素ベースの化合物である。しかしながら、純度レベル９０％以上のグルコースを含むシロップは比較的高価である。さらに、グルコースが高濃度で存在すると発酵系が微生物汚染を受けやすくなり、それにより生成効率に悪影響を与える。他の欠点としては、低レベルから中レベルのグルコースが発酵樽中に存在している場合であっても、例えば、酵素阻害及び／または異化代謝産物抑制、及び／または微生物の成長により、グルコースから所望の最終生成物への転換に悪影響を与える。結果として、工業的発酵のコストを下げるため、特にグルコースより費用の安い基質の利用において種々の試みがなされてきた。しかしながら、多数の手段が開発されたにもかかわらず、当業界において、経済的で、効果的に活用できる発酵用の基質の必要性が依然としてある。実際に、より効率的に所望の最終生成物を生成するために、グルコースよりも費用のかからない開始物質を利用する方法が当業界において大いに必要とされている。
【０００４】
発明の概要
本発明はバイオマスベースの供給原料基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ生物変換の所望の最終生成物を生成するための方法を提供し、限定されないが、そのような物質としてでんぷん及びセルロースがある。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は基質のゲル化及び／または液化を必要としない。特に好ましい実施態様において、本発明はエタノールを生成する方法を提供する。いくつかの特に好ましい実施態様において、本発明は顆粒でんぷんから直接エタノールを生成する方法を提供し、変化した異化代謝産物抑制に関する。
【０００５】
いくつかの実施態様において、本発明は異化代謝産物抑制を避けることによる該方法の効率及び／またはでんぷんからエタノールへの酵素的変換におけるグルコースの酵素的抑制効果を高めるために、変換培地のグルコース濃度が低濃度、好ましくは異化代謝産物抑制及び／または酵素抑制を引き起こす閾値以下で維持される、エタノールを生成する方法を提供するものである。
【０００６】
別の実施態様において、本発明はエタノールを生成する方法であって、少なくとも１の炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させ、少なくとも１の中間体を生成する工程、及びそれから少なくとも１の中間体と少なくとも１の中間体生成酵素を反応器中で接触させる工程を含み、ここで少なくとも１の中間体は実質的に全て最終生成物に変換される方法を提供する。いくつかの好ましい実施態様において、この生物変換を達成するために微生物を使用する。変換培地中の中間体を低濃度で維持することにより、中間体の異化代謝産物抑制及び／または酵素抑制効果が変化する（例えば、減少する）。また、本発明は様々なレベルの中間体濃度、基質、中間体及び中間体をエタノールに変換する工程を提供する。
【０００７】
本発明は以下の工程を含む、最終生成物としてアルコールを生成する方法を提供する：炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させ、中間体を生成する工程；及び該中間体と少なくとも１の中間体変換酵素を接触させる工程あって、ここで該中間体は中間体酵素により実質的に全てがアルコールに変換される。好ましい実施態様において、中間体変換酵素は微生物酵素である。別の好ましい実施態様において、中間体変換微生物酵素は中間体と接触して微生物により分泌される。さらに別の実施態様において、基質変換酵素は微生物酵素である。さらに別の好ましい実施態様において、基質変換微生物酵素は基質と接触して微生物により分泌される。さらに別の好ましい実施態様において、中間体変換酵素及び基質変換酵素は同じ種の微生物により生成される。別の実施態様において、中間体変換酵素及び基質変換酵素は異なる種の微生物により生成される。さらに別の実施態様において、中間体の濃度レベルは、中間体から最終生成物への変換において異化代謝産物抑制効果が引き起こされるレベル以下で維持する。さらに別の実施態様において、中間体の濃度レベルは中間体から最終生成物への変換において酵素抑制効果が引き起こされるレベル以下で維持する。いくつかの好ましい実施態様において、中間体は濃度を０．２５％以下に維持するように十分な速度で最終生成物に変換される。別の実施態様において、基質はバイオマス及びでんぷんからなる群より選択される。いくつかの好ましい実施態様において、バイオマスは固形コーン（ｃｏｒｎ  ｓｏｌｉｄｓ）を含む。いくつかの特に好ましい実施態様において、中間体はヘキソース及びペントースからなる群より選択される。いくつかの実施態様において、ヘキソースはグルコースである。いくつかの実施態様において、基質は本発明で使用する前に加熱し、一方、他の実施態様において、基質は本発明での使用前に加熱しない。さらに別の実施態様において、基質と基質変換酵素を接触する工程はさらに、基質を生物変換して中間体を生成する工程を含む。最も好ましい実施態様において、アルコール最終生成物はエタノールである。さらに他の実施態様において、基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させる工程は、少なくとも１の中間体変換酵素により変換される中間体の量以下の濃度で中間体を生成する濃度でさらに一定量の基質変換酵素を提供する工程を含む。いくつかの別の実施態様において、少なくとも１の基質変換酵素は少なくとも５０％の基質を７２時間以内に中間体に変換し、一方、他の実施態様において、少なくとも１の基質変換酵素は７２時間以内に少なくとも９０％の基質を中間体に変換し、好ましい実施態様において、少なくとも１の基質変換酵素は７２時間以内に少なくとも９５％の基質を中間体に変換する。さらに別の実施態様において、少なくとも１の基質変換酵素及び少なくとも１の中間体変換酵素はリゾプス及びアスペルギルスからなる群より選択される微生物から得られる。別の実施態様において、基質変換及び／または中間体変換酵素は無細胞抽出物として提供される。さらに好ましい実施態様において、接触工程は反応器内で行い、限定されないが、タンク、ボトル、フラスコ、袋、生物反応器、及び本発明���方法を行うのに適した任意のその他の容器が挙げられる。
【０００８】
本発明はさらに、最終生成物としてアルコールを生成する方法を提供し、該方法は炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触して中間体を生成する工程、及び中間体と少なくとも１の中間体変換酵素を接触させる工程を含み、ここで中間体は中間体酵素により実質的に全てアルコール最終生成物に変換され、最終生成物の存在はさらなるアルコール最終生成物の生成を阻害しない。いくつかの好ましい実施態様において、中間体変換酵素は微生物酵素である。別の好ましい実施態様において、中間体変換微生物酵素は中間体と接触して微生物により分泌される。さらに好ましい実施態様において、基質変換酵素は微生物酵素である。さらに別の実施態様において、基質変換微生物酵素は基質接触した微生物により分泌される。いくつかの実施態様において、中間体変換酵素及び基質変換酵素は同じ種の微生物により生成され、一方、他の実施態様において、中間体変換酵素及び基質変換酵素は異なる種の微生物により生成される。他の実施態様において、基質はバイオマス及びでんぷんからなる群より選択される。いくつかの好ましい実施態様において、バイオマスは固形コーンを含む。いくつかの特に好ましい実施態様において、中間体はヘキソース及びペントースからなる群より選択される。いくつかの実施態様において、ヘキソースはグルコースである。いくつかの実施態様において、基質は本発明で使用する前に加熱し、一方、他の実施態様において、基質は本発明での使用前に加熱しない。特に好ましい実施態様において、アルコール最終生成物はエタノールである。さらに他の実施態様において、基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させる工程は、少なくとも１の中間体変換酵素により変換される中間体の量以下の濃度で中間体を生成する濃度でさらに一定量の基質変換酵素を提供する工程を含む。いくつかの別の実施態様において、少なくとも１の基質変換酵素は少なくとも５０％の基質を７２時間以内に中間体に変換し、一方、他の実施態様において、少なくとも１の基質変換酵素は７２時間以内に少なくとも９０％の基質を中間体に変換し、好ましい実施態様において、少なくとも１の基質変換酵素は７２時間以内に少なくとも９５％の基質を中間体に変換する。さらに別の実施態様において、少なくとも１の基質変換酵素及び少なくとも１の中間体変換酵素はリゾプス及びアスペルギルスからなる群より選択される微生物から得られる。別の実施態様において、基質変換及び／または中間体変換酵素は無細胞抽出物として提供される。さらに好ましい実施態様において、接触工程は反応器内で行い、限定されないが、タンク、ボトル、フラスコ、袋、生物反応器、及び本発明の方法を行うのに適した任意のその他の容器が挙げられる。
【０００９】
さらに本発明はアルコール最終生成物を生成する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させ、中間体を生成する工程；及び該中間体と少なくとも１の中間体変換酵素を接触させる工程であって、ここで、該中間体は中間体酵素により実質的に全てアルコール最終生成物に変換され、かつ基質の存在はさらなるアルコール最終生成物の生成を阻害しない。いくつかの好ましい実施態様において、中間体変換酵素は微生物酵素である。別の好ましい実施態様において、中間体微生物酵素は中間体と接触した微生物により分泌される。さらに好ましい実施態様において、基質変換酵素は微生物酵素である。さらに別の実施態様において、基質変換微生物酵素は基質と接触した微生物により分泌される。いくつかの実施態様において、中間体変換酵素及び基質変換酵素は同じ種の微生物により提供され、一方、他の実施態様において、中間体変換酵素及び基質変換酵素は異なる種の微生物により生成される。別の実施態様において、基質はバイオマス及びでんぷんからなる群より選択される。いくつかの好ましい実施態様において、バイオマスは固形コーンを含む。いくつかの特に好ましい実施態様において、中間体はヘキソース及びペントースからなる群より選択される。いくつかの実施態様において、ヘキソースはグルコースである。いくつかの実施態様において、基質は本発明で使用する前に加熱し、一方、他の実施態様において、基質は本発明での使用前に加熱しない。特に好ましい実施態様において、アルコール最終生成物はエタノールである。さらに他の実施態様において、基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させる工程は、少なくとも１の中間体変換酵素により変換される中間体の量以下の濃度で中間体を生成する濃度でさらに一定量の基質変換酵素を提供する工程を含む。いくつかの別の実施態様において、少なくとも１の基質変換酵素は少なくとも５０％の基質を７２時間以内に中間体に変換し、一方、他の実施態様において、少なくとも１の基質変換酵素は７２時間以内に少なくとも９０％の基質を中間体に変換し、好ましい実施態様において、少なくとも１の基質変換酵素は７２時間以内に少なくとも９５％の基質を中間体に変換する。さらに別の実施態様において、少なくとも１の基質変換酵素及び少なくとも１の中間体変換酵素はリゾプス及びアスペルギルスからなる群より選択される微生物から得られる。別の実施態様において、基質変換及び／または中間体変換酵素は無細胞抽出物として提供される。さらに好ましい実施態様において、接触工程は反応器内で行い、限定されないが、タンク、ボトル、フラスコ、袋、生物反応器、及び本発明の方法を行うのに適した任意のその他の容器が挙げられる。
【００１０】
発明の説明
本発明はバイオマスベースの供給原料基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ生物変換の所望の最終生成物を生成するための方法を提供し、限定されないが、そのような物質としてでんぷん及びセルロースがある。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は基質のゲル化及び／または液化を必要としない。特に好ましい実施態様において、本発明はエタノールを生成する方法を提供する。いくつかの特に好ましい実施態様において、本発明は顆粒でんぷんから直接エタノールを生成する方法を提供し、変化した異化代謝産物抑制に関する。
【００１１】
特に、本発明は異化代謝産物抑制及び酵素抑制のレベルが変化し、従って、プロセス効率が増加したことを特徴とするエタノールを作成する方法を提供する。本発明の方法は炭素基質と基質変換酵素を接触させ、中間体を生成する工程、及び中間体と中間体生成酵素を反応器内で接触する工程を含み、ここで、中間体は実質的に全て最終生成物生成微生物により生物変換される。変換培地中で中間体濃度を低く維持することにより、本方法において中間体の異化代謝産物抑制または酵素抑制効果が変化する。
【００１２】
また、本発明はでんぷんまたはバイオマス及び加水分解酵素をでんぷんまたはセルロースをグルコースに変換するために用いる方法を提供する。さらに、本発明はでんぷんからグルコースへの変換と各発酵生成物形成に必要なグルコース供給速度が一致するような速度でこれらの基質が提供される方法を提供する。従って、本発明は重要なグルコース限定発酵条件及び多くの代謝調節及び抑制を回避する方法を提供する。
【００１３】
いくつかの好ましい実施態様において、本発明は所望の最終生成物を生成する手段を提供し、グルコースの連続供給が制御速度条件下でなされ、原材料コストの低下、低粘度、代謝効率の改善された酸素移動、改善された生物変換効率、高収率、異化代謝産物抑制及び酵素抑制レベルの改変、及び全体的な製造原価の低減などの利点を提供する。
【００１４】
上述の通り、グルコースよりも安価な開始物質を使用して効率的に所望の最終生成物を生成する方法への大きな必要性が当業界に存在している。ここに詳細に記載するように、本発明はでんぷん（例えば、コーンスターチ及び小麦でんぷん）及びバイオマスなどの基質を含む方法を提供する。
【００１５】
でんぷん（スターチ）は植物ベースの発酵炭素源である。コーンスターチ及び小麦でんぷんは発酵用のグルコース炭素供給原料よりもかなり安価な炭素源である。液化でんぷんからグルコースへの変換は当業界に公知であり、通常、α−アミラーゼ、プルラナーゼ及びグルコアミラーゼなどの酵素を用いて行う。多数の方法が液化でんぷんから単糖類、グルコースへの変換に関して記載されている。グルコースはそれ自体価値があり、フルクトースなどその他の糖類の前駆体としても価値がある。さらに、グルコースはエタノールまたはその他の発酵生成物に発酵されることもできる。しかしながら、第１の炭素源から中間体、特にグルコースへの酵素的変換能力は中間体の存在により損なわれる。
【００１６】
例えば、日本の酒造及びアルコール生成に用いられる一般的な方法は加熱処理なしででんぷんを用いる。しかしながら、これらの技術は、有害微生物の汚染を防止する、麦芽汁の酸性化（ｐＨ３．５）などの特別な処理を必要とする。さらに、これらの方法は本発明よりも、糖化及び発酵に長期間の時間を要する。さらに、これらの方法は発酵培養液の透析など複雑なプロセス工程を必要とし、発酵生成物の一般的な生成に利用するには面倒すぎる。
【００１７】
発酵の際の供給原料としての溶性デキストリン及びグルコースの使用は種々の欠点を有し、例えば、高い加工費及び粘度及び酸素移動に関する問題がある。さらに、本発明と比較して、これらの方法は所望の生成物の収率が低く、副生成物の形成に関する問題をより多く生じる。実際に、でんぷんまたはバイオマスをデキストリンに変換する費用は多大であり、高いエネルギー導入量、別個の反応槽、多くの時間、細かいバイオプロセス操作、不完全な糖化、逆反応、及び一般的な発酵前糖化工程に関する酵素を伴う。これらの問題により１つの反応容器またはコンテナー内で、低温で、直接でんぷんを変換する方法を提供する試みが多数なされた。混合培養物中での炭水化物源から１，３−プロパンジオールのバイオ変換は米国特許第５，５９９，６８９号（Ｈａｙｎｉｅ，ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。Ｈａｙｎｉｅ，ｅｔ  ａｌ．に記載された方法はグリセロール（すなわち、中間体）生成生物とジオール生成生物（すなわち、最終生成物）を混合し、該混合培養基と炭素基質を接触し、該混合培養基を培養して所望の最終生成物、１，３−プロパンジオールを生成することを含む。米国特許第４，５１４，４９６号において、Ｙｏｓｈｉｚｕｍａは、加熱処理なしで（すなわち、糖化前の高温液化なしで）発酵によりアルコールを生成するため、マッシュに関するスラリー中の原材料の濃度を維持することを含む方法について記載している。それでもなお、これらの方法は本発明により提供される効率及び経済的利点を欠いたものである。
【００１８】
本発明は、有機酸（例えば、グルコン酸、アスコルビン酸中間体、琥珀酸、クエン酸、酢酸、グルコン酸、及び乳酸）、アミノ酸、抗生物質、酵素及び有機溶媒（例えば、１，３−プロパンジオール、ブタノール及びアセトン）、グリセロール及びエタノールなど、最終生成物を生成する方法を提供する。好ましい実施態様において、本方法は少なくとも１の炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させて、少なくとも１の中間体を生成する工程、及び少なくとも１の中間体と中間体生成酵素を（通常、任意の適切な種類の反応容器内で）接触させる工程であって、ここで少なくとも１の中間体が実質的に完全に最終生成物に生物変換される工程を含む。好ましい実施態様において、この生物変換は微生物により達成される。変換培地内で低濃度の中間体を維持することにより、中間体の異化代謝産物抑制及び／または酵素抑制効果が変化する（例えば、減少する）。本発明は種々の中間体濃度レベル、基質、中間体及び中間体を所望の最終生成物に変換する工程も提供する。
【００１９】
定義
ここで別に定めない限り、ここで用いる全ての技術及び科学用語は本発明が属する当業者に通常理解される意味と同じ意味を有するものとする。種々の参考文献（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）；及びＨａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１））はここで用いる多くの言葉の一般的な定義を提供する。さらに、ここで引用する全ての特許及び文献、当該特許及び文献に開示される全ての配列は明示的に引用するものとする。
【００２０】
ここに記載される方法及び物質に類似または同等のものは本発明の実施に有用であるが、好ましい方法及び物質をここに記載する。数値範囲は範囲を定める数を含む。別段の定めがない限り、それぞれ、核酸は５’から３’方向で左から右に記載し、アミノ酸配列はアミノからカルボキシ方向で左から右に記載する。本発明は記載した特定の方法論、手順及び試薬に限定されず、これらは変形できることは当然に理解されることである。
【００２１】
ここに提供する表題は、明細書全体を参照することにより得られる種々の本発明の側面または実施態様を限定するものではない。さらに、この後に定義する言葉は明細書全体を参照することでより十分に定義される。
【００２２】
ここで使用する、“炭素基質”の語は、中間体に酵素的に変換でき、続いて所望の炭素最終生成物中に変換できる、少なくとも１の炭素原子を含んだ物質をいう。典型的な炭素基質は、限定されないが、バイオマス、でんぷん、デキストリン及び糖が挙げられる。
【００２３】
ここで用いる“バイオマス”とはセルロース及び／またはでんぷん含有原料をいい、限定されないが、木材チップ、コーンストーバー、米、草、飼い葉、ペリエグラス（ｐｅｒｒｉｅ−ｇｒａｓｓ）、ジャガイモ、塊茎、根、ひきトウモロコシ（ｗｈｏｌｅ  ｇｒｏｕｎｄ  ｃｏｒｎ）、トウモロコシの穂軸、穀物、小麦、大麦、ライ麦、ミロ、ブラン、シリアル、糖含有原料（例えば、糖蜜、果物原料、サトウキビまたは甜菜）、木及び枯れ植物が挙げられる。実際に、本発明はバイオマスとして用いるいかなる特定物質にも限定する趣旨ではない。本発明の好ましい実施態様において、原材料はでんぷん含有原料（例えば、トウモロコシの穂軸、ひきトウモロコシ、トウモロコシ、穀物、ミロ及び／またはシリアル及びこれらの混合物）である。特に好ましい実施態様において、該語は任意の植物源を原料に得られるでんぷん含有物質をいう。
【００２４】
ここで用いる、“でんぷん”は任意のでんぷん含有物質をいう。特に、該語は種々の植物ベースの物質をいい、限定されないが、小麦、大麦、ジャガイモ、サツマイモ、タピオカ、トウモロコシ（ｃｏｒｎ、ｍａｉｚｅ）、カサバ、ミロ、ライ麦及びブランが挙げられる。実際、本発明はでんぷんの特定の種類及び／または原料に限定するものではない。一般に、該語は植物の複合多糖炭水化物を含み、アミロース及びアミロペクチンを含む任意の物質をいい、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘであり、“ｘ”は任意の数字である。
【００２５】
ここで、“セルロース”の語はセルロース含有物質をいう。特に、該語はグルコース（または“セロビオース”）のポリマーをいい、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘを有し、“ｘ”は任意の数字である。セルロースは植物細胞壁が主成分であり、自然界で最も豊富な有機物質である。セルロース中にはβ−グルコシド結合があるが、でんぷんにはα−グルコシド結合がある。リグニンと組み合わせて、セルロースは“リグノセルロース”を形成する。
【００２６】
ここで用いる“固形コーン”の語はコーン由来の挽き材料をいい、限定されないが、トウモロコシ穀粒、ブラン、及びトウモロコシの穂軸がある。
【００２７】
ここで用いる“中間体”の語は、炭素基質が酵素的に変換された少なくとも１の炭素原子を含む化合物をいう。典型的な中間体としてが、限定されないが、ペントース（例えば、キシロース、アラビノース、リキソース、リボース、リブロース、キシルロース）；ヘキソース（例えば、グルコース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース及びタガトース）；及びそれらの有機酸が挙げられる。
【００２８】
ここで用いる、“酵素変換”の語は、基質または中間体と酵素を接触させることによる、炭素基質から中間体への変形または中間体から最終生成物への変形をいう。いくつかの実施態様において、接触は基質または中間体を適当な酵素に直接さらすことにより行う。他の実施態様において、接触は基質または中間体を酵素を発現または分泌する生物、及び／または所望の基質及び／または中間体をそれぞれ所望の中間体及び／または最終生成物に代謝する生物にさらすことを含む。
【００２９】
ここで用いる“でんぷん加水分解酵素”の語は、でんぷんを中間体糖（例えば、ヘキソースまたはペントース）に変換できる任意の酵素をいう。
【００３０】
ここで用いる、“単糖類”は実験式（ＣＨ２Ｏ）ｎを有する任意の化合物をいい、ここでｎは３〜７であり、好ましくは５〜７である。いくつかの実施態様において、該語は単一のポリヒドロキシアルデヒドまたはケトン単位からなる“単糖”をいう。該語は、限定されないが、グルコース、ガラクトース及びフルクトースを含む。
【００３１】
ここで用いる“二糖類”は２つの共有結合単糖単位を含む任意の化合物をいう。該語は、限定されないが、スクロース、ラクトース及びマルトースなどの化合物を含む。
【００３２】
ここで用いる、“オリゴ糖”はグルコシド結合で結合した２〜１０の単糖単位を有する任意の化合物をいう。いくつかの実施態様において、該語は共有結合により共に結合した単糖単位の短鎖をいう。
【００３３】
ここで用いる、“多糖類”は直鎖または分岐鎖で結合した複数の単糖単位を有する任意の化合物である。いくつかの好ましい実施態様において、該語は１００または１，０００の単糖単位を含む長鎖をいう。セルロースなどいくつかの多糖類は直鎖を有し、一方別の多糖類（例えば、グリコーゲン）は分岐鎖を有する。最も豊富な多糖類はでんぷん及びセルロースであり、繰り返しグルコース単位からなる（これらの化合物はグルコース単位の結合の仕方が異なる）。
【００３４】
ここで用いる“培養”は炭素基質から所望の最終生成物への発酵生物変換をいう（通常、反応容器内）。特に好ましい実施態様において、培養は所望の最終生成物の生成のために適当な条件下で微生物の成長を伴う。
【００３５】
ここで用いる、“糖化”の語は、生物変換または発酵生物変換のために使用に適さない多糖類を有用な糖供給原料に直接変換することをいう。
【００３６】
ここで用いる、“発酵”の語は、微生物による有機基質の酵素的及び嫌気性崩壊をいい、単純な有機生成物を生成する。好ましい実施態様において、発酵は微生物（例えば細菌）による炭水化物の利用をいい、嫌気性条件下で起こる酸化還元代謝プロセスを伴い、有機基質は最終的な（酸素というよりも）水素受容体として働く。発酵は嫌気性条件下で起こるが、該語は、発酵は酸素の存在下でも起こるので、厳密な嫌気性条件に単に限定する趣旨のものではない。
【００３７】
ここで使用する、“実質的に全て消費される”及び“実質的に全て生物変換される”とは、中間体変換酵素が中間体を最終生成物またはその他の中間体に変換する能力及び／または基質変換酵素が基質を中間体に変換する能力において、中間体（例えば、ヘキソース）の酵素抑制、酸素移動、収率、副生成物最小化及び／または異化代謝産物抑制効果に悪影響を及ぼす、変換培地中で中間体を低レベルに維持することをいう。
【００３８】
ここで使用する、“生物変換”及び“生物変換された”の語は、炭素基質または中間体がそれぞれ中間体または最終生成物に変換されるような条件下で微生物と炭素基質または中間体を接触させることをいう。いくつかの実施態様において、これらの語は生体触媒のみを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で別の仲介中間体の生成について記載するために用いる。好ましい実施態様において、該語は微生物による代謝及び／または所望の変換を達成する酵素の発現または分泌を含む。
【００３９】
ここで用いる、“変換媒体”及び“変換培地”は、酵素及び炭素基質、中間体及び最終生成物がお互い接触する媒体／培地をいう。これらの言葉は、限定されないが、酵素及び炭素基質、中間体及び最終生成物を溶解または懸濁する発酵媒体、有機及び／または嫌気性媒体を含む。いくつかの実施態様において、媒体は複合体であり、他の実施態様において媒体は合成である。
【００４０】
ここで用いる“最終生成物”は中間体から酵素的に変換された炭素源由来分子生成物をいう。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は“所望の最終生成物” （すなわち、これらの方法を使用して生成することを目的とした生成物）を生成するために用いる。
【００４１】
ここで用いる、“低濃度”とは、化合物の存在により有害な影響を生じる場合よりも少ない化合物の濃度レベルをいう。特に好ましい実施態様において、該語は異化代謝産物抑制及び／または酵素抑制の有害な影響が観察される場合より少ない特定の中間体濃度関して用いる。いくつかの実施態様において、該語は基質及び／または生成物により異化代謝産物抑制及び／または酵素抑制を引き起こす以上の特定の中間体の濃度レベルをいう。
【００４２】
ここで用いる“異化代謝産物抑制効果を引き起こす以下のレベルで維持する”とは、中間体濃度を異化代謝産物抑制を引き起こすレベル以下に維持することをいう。
【００４３】
ここで用いる、“異化代謝産物抑制の減少”とは、異化代謝産物抑制の効果が生じる状態を意味する。好ましい実施態様において、該語は中間体濃度が異化代謝産物抑制効果を引き起こす閾値よりも低い状態をいう。
【００４４】
ここで用いる、“酵素抑制の減少”とは、酵素抑制が通常、標準状態での酵素抑制と比較して減少している状態を意味する。本発明の好ましい実施態様において、該語は中間体、基質及び／または酵素反応の生成物の濃度が酵素抑制を引き起こす閾値よりも低い状態をいう。
【００４５】
ここで用いる“基質変換酵素”は基質（例えば、顆粒でんぷん）を中間体（例えば、グルコース）に変換する酵素をいう。基質変換酵素は限定されないが、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、でんぷん加水分解酵素及びこれらの種々の組み合わせを含む。
【００４６】
ここで用いる、“中間体変換酵素”の語は中間体（例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース等）を所望の最終生成物に変換する酵素をいう。好ましい実施態様において、この変換は加水分解により達成され、他の実施態様において、該変換は中間体から最終生成物への微生物による代謝に関する。しかしながら、本発明は特定の変換酵素または手段に限定されない。実際、任意の適当な酵素が本発明の種々の実施態様において活用できる。
【００４７】
ここで用いる、“収量”は本発明の方法を用いて生成した最終生成物または中間体の量をいう。好ましい実施態様において、本発明の方法を用いて得られた収量は当業界で公知の方法を用いて得られた収量よりも大きい。いくつかの実施態様において、収量は最終生成物または中間体の量をいうが、他の実施態様において、該語は組成物中の最終生成物または中間体の濃度に関して用いる。
【００４８】
ここで用いる“副生成物形成”は望ましくない生成物の生成をいう。好ましい実施態様において、本発明は当業界に公知の方法と比較して、副生成の生成を回避または減少させる方法を提供する。
【００４９】
ここで用いる、“酵素的抑制”の語は酵素上の物理的または生化学的効果による酵素活性の損失をいう。いくつかの実施態様において、抑制は酵素活性により生成される生成物の効果から生じ、一方、他の実施態様において、抑制は酵素上の基質または中間体の作用から生じる。
【００５０】
ここで用いる、“酵素活性”はその基質上での酵素の働きをいう。いくつかの実施態様において、酵素活性は基質から中間体への変換を決定するための手段を用いて定量され、一方、他の実施態様において、基質から最終生成物への変換を決定する手段を用い、さらに別の実施態様において、中間体から最終生成物への変換を決定する手段を用いる。
【００５１】
ここで用いる、“酵素単位”の語は（特に示さない限り）最適分析条件で１分当たり１ミクロモルの基質を基質生成物に変換する酵素量をいう。いくつかの実施態様において、市販の酵素は本発明の方法において使用できる（例えば、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）、ＤＩＳＴＡＬＬＡＳＥ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）、ジェネンコー・インターナショナル）。
【００５２】
ここで用いる“グルコアミラーゼ単位”（ＧＡＵ）は、４０℃、ｐＨ５．０の分析条件下で１分当たり１ミクロモルのグルコースを生成するために必要な酵素量として定義される。
【００５３】
ここで用いる“グルコースオキシダーゼ単位”（ＧＯＵ）は２５℃、ｐＨ７．０の分析条件下で１分当たり１ミクロモルのＤ−グルコースをグルコン酸に酸化するために必要な酵素量として定義される。
【００５４】
ここで用いる“カタラーゼ単位”（ＣＵ）は４０℃、ｐＨ５．０の分析条件下で１分当たり１ミクロモルの過酸化水素を分解するために必要な酵素量として定義される。
【００５５】
ここで用いる１のＡＧ単位（ＧＡＵ）は２５℃、ｐＨ４．３で１分当たり１ミクロモルのマルトースを分割する酵素量である。本発明のいくつかの実施態様において、ｍｌ当たり４００ＧＡＵ活性の市販の液状グルコアミラーゼ（ＯＰＴＩＤＥＸ（登録商標）Ｌ−４００、ジェネンコー・インターナショナル）を使用する。別の実施態様において、グルコアミラーゼの市販の液体タイプ（ＡＭＧ  ＮＯＶＯ１５０）はｍｌ当たり１５０ＡＧＵの活性を有し、使用できる。
【００５６】
ここで用いる“でんぷん加水分解単位”及び“生でんぷん加水分解単位”（ＲＨＵ）は、２５℃及びｐＨ５．０の分析条件下、でんぷんから１分当たり１ｇのグルコースを作るために必要な酵素量として定義される。
【００５７】
ここで用いる、“炭素最終生成物”とは炭素中間体から生成される任意の炭素生成物を意味し、当該基質は少なくとも１の炭素原子を含む（すなわち炭素基質）。
【００５８】
ここで用いる“炭素中間体”は炭素含有基質から炭素最終生成物への変換時に生成される炭素含有化合物をいう。
【００５９】
ここで用いる“酵素的制御”とは反応において使用される酵素の量または活性を変化させることにより炭素基質から生成される炭素中間体の量を調節することを意味する。
【００６０】
ここで用いる、“微生物”は一般的に顕微鏡でしか見えないと考えられる細胞を含む生物をいい、当該有機体として細菌、真菌（酵母及びかび）、リケッチア及び原生動物が挙げられる。本発明は特定の微生物または微生物種に限定するものではなく、種々の微生物及び細菌性酵素は本発明での使用に適している。本発明はまた、野生型微生物に限定するものでもなく、組換えＤＮＡ技術を用いて生成した微生物及び細菌性酵素も本発明で使用される。
【００６１】
ここで用いる、“微生物酵素”は微生物により生成される酵素をいう。ここで用いる“微生物中間体変換酵素”は中間体を最終生成物に変換する酵素であり、“微生物基質変換酵素”は基質を中間体に変換、または基質を最終生成物に直接変換する（すなわち中間体化合物が存在しない）酵素である。
【００６２】
ここで用いる、“エタノール生成（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ）微生物”の語は糖またはオリゴ糖をエタノールに変換する能力を有する微生物をいう。エタノール生成微生物は当業界に公知であり、エタノール生成細菌を含む。当該微生物は１以上の酵素で個々にまたは一緒に糖をエタノールに変換する酵素を発現できる能力によりエタノール生成性である。
【００６３】
ここで用いる、“エタノール生成体”及び“エタノール生成生物”とはヘキソースまたはペントースからエタノールを生成できる生物または細胞をいう。一般に、エタノール生成細胞はアルコール・デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを含む。
【００６４】
ここで用いる“抗菌剤”とは微生物を殺すまたは抑制する任意の化合物をいう。
【００６５】
ここで用いる、“連結培養（ｌｉｎｋｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）”とは、少なくとも２つの細胞培養物を使用する発酵システムをいい、培養物を連続して加える。連結システムの実施態様のほとんどにおいて、初代培養または一連の初代培養は所望の中間体の生成に最適な発酵条件下で成長する（すなわち、中間体は培養基中に解放され、“ならし培地”を生成する）。初代培養の発酵に続いて、ならし培地をそれから二次培養にさらす。二次培養はそれからならし培地中で中間体を所望の最終生成物に変換する。本発明のいくつかの実施態様において、初代培養は通常、グリセロール生成体であり、二次培養は１，３−プロパンジオール生成体である。
【００６６】
ここで用いる、“混合培養”とは、培地中に微生物種の組み合わせが存在することをいう。いくつかの好ましい実施態様において、混合培養は、混合生物の個々の代謝過程の相互作用によりいずれの生物も個々で生成できないような生成物を生じるように反応容器中で成長する。本発明は特定の数の微生物種を含む混合培養に限定するものではない。
【００６７】
ここで用いる、“ならし培地”とは、微生物増殖の有機副生成物により補完された、微生物の成長に適した発酵培地をいう。本発明の好ましい実施態様において、ならし培地は連結培養の発酵時に生成され、グリセロール生成細胞がグリセロールを発酵培地中に分泌し、続いて１，３−プロパンジオールに変換する。
【００６８】
ここで用いる、“酸素摂取速度”（“ＯＵＲ”）とは、反応容器内の酸素の個別の消費量の決定をいう。酸素消費量は当業界に公知の種々のオンライン測定を用いて決定できる。１の実施態様において、ＯＵＲ（ｍｍｏｌ／（リットル＊時間）は以下の式により決定する：（気流（固定リットル／分）／発酵重量（発酵培養液の重量、キログラム）×供給Ｏ２×培養液密度×（標準２０．０℃の代わりに２１．１℃での気流較正のための定数）−（［気流／発酵重量］×［オフガスＯ２／オフガスＮ２］×供給Ｎ２×培養液密度×定数）。
【００６９】
ここで用いる、“炭素放出率”（“ＣＥＲ”）とは、発酵時に反応容器内でどれくらい多くのＣＯ２が生成されるかの決定をいう。通常、ＣＯ２は最初またはその後に反応容器に供給されないので、ＣＯ２は反応容器内で起こる発酵過程で生成されると考えられる。“オフガスＣＯ２”とは反応容器内で測定されたＣＯ２の量をいい、通常は当業界で公知の質量分光法により測定する。
【００７０】
ここで用いる、“高められた”の語は、目的のタンパク質の生成が向上したことをいう。好ましい実施態様において、本発明は目的のタンパク質の高められた（すなわち、向上した）生成及び分泌を提供する。これらの実施態様において、“高められた”生成は宿主（例えば野生型細胞）による生成の通常レベルと比較して向上している。従って、異種タンパク質については、基本的に任意の発現は高められ、該細胞は通常は該タンパク質を生成しない。
【００７１】
ここで用いる“単離した”及び“精製した”とは、それがもともと含まれている少なくとも１の成分から取り出した核酸またはアミノ酸をいう。
【００７２】
発明の詳細な説明
本発明はバイオマスベースの供給原料基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ生物変換の所望の最終生成物を生成するための方法を提供し、限定されないが、そのような物質としてでんぷん及びセルロースがある。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は基質のゲル化及び／または液化を必要としない。特に好ましい実施態様において、本発明はエタノールを生成する方法を提供する。いくつかの特に好ましい実施態様において、本発明は顆粒でんぷんから直接エタノールを生成する方法を提供し、変化した異化代謝産物抑制に関する。
【００７３】
好ましい実施態様において、本発明は市販の炭素基質（例えば、バイオマス及び／またはでんぷん）を中間体、好ましくはエタノールのようなアルコールなどの多数の所望の最終生成物に容易に変換できる中間体に直接変換する方法を劇的に向上させる手段を提供する。特に好ましい実施態様において、本発明は顆粒でんぷんをグルコースに直接変換する方法を劇的に向上させる手段を提供し、中間体はエタノールに容易に変換できる。
【００７４】
別の実施態様において、本発明はでんぷんまたはセルロースをグルコースに変換する方法を劇的に向上させる手段を提供し、同様に所望の最終生成物に変換する。変換培地内で中間体を低濃度で維持することにより、生成の全体的な効率が向上する。いくつかの実施態様において、酵素的抑制及び／または異化代謝産物抑制、必要酸素摂取量及び／または副生成物形成が減少する。別の好ましい実施態様において、本発明は顆粒でんぷんからグルコースへの非加熱変換、続いて所望の最終生成物への変換を劇的に向上させる手段を提供する。
【００７５】
いくつかの好ましい実施態様において、最小中間体濃度の維持は中間体濃度を低濃度で維持することにより達成される。１の実施態様において、中間体の濃度は培地重量の０．２５重量％以下である（例えば、０．２５重量％〜０．００００１重量％）。その他の実施態様において、中間体の濃度は０．２０重量％、０．１０重量％、０．０５重量％または０．０１重量％以下である（例えば、それぞれ０．２０重量％〜０．００００１重量％、０．１０重量％〜０．００００１重量％、０．０５重量％〜０．００００１重量％、０．０１重量％〜０．００００１重量％）。もしくは、中間体濃度は変換培地中で２．０μモル以下の濃度に維持する。他の実施態様において、濃度は１．０μモル以下に維持する。さらに別の実施態様において、中間体の濃度は０．７５μモル以下の濃度で維持する。いずれにしても、低濃度での維持は酵素抑制（すなわち、酵素抑制効果）、異化代謝産物抑制（すなわち異化代謝産物抑制効果）を生じる閾値以下で中間体濃度を維持することを意味する。
【００７６】
別の実施態様において、最小濃度の維持は基質から中間体への変換率を中間体から最終生成物への変換率以下で維持することにより達成される。基質から中間体への変換は必ずしも中間体から最終生成物への変換の律速である必要はないことが認識されるが、炭素基質から最初の酵素変換により実質的に全ての中間体が生成される変換のために十分な中間体変換酵素を供給することにより、実質的に全ての中間体が開始基質から変換されて変換培地中の中間体の存在を最小にする速さで最終生成物に変換される。そのような過剰な中間体変換を提供する典型的な方法は過剰な中間体変換酵素を提供することを含み、中間体変換酵素の酵素活性を増加させ、及び／または基質変換酵素の活性を低下させて基質から変換されるとできるだけ早く中間体を最終生成物に変換する。変換の実際の速度は生成される特定の最終生成物により様々であると考えられ、様々な量及び量を決定する実験がいくつか考えられる。しかしながらこれらの決定を行う指針をここに提供する。
【００７７】
本発明のいくつかの実施態様において、中間体の変換または消費速度は、混合培地のその他の物理的パラメーター及びを考慮に入れて混合培地中に存在する生物の量を計算することにより決定し、一般的に公知の変換率をその量に掛けた。これにより中間体（例えば、グルコース）から最終生成物への変換率が得られる。いくつかの実施態様において、中間体から所望の最終生成物へのこの変換は天然生物による中間体から最終生成物への変換または生物変換による、またはそのような生物変換を提供するための変異によるものである。中間体から最終生成物への変換の他の実施態様は公知の酵素による酵素変換の使用を含み、公知の酵素変換方法を用いて所望の最終生成物に変換する。例えば、いくつかの実施態様において、グルコースから所望の最終生成物（例えば、プロパンジオール、琥珀酸、グルコン酸、乳酸、アミノ酸、抗菌剤、エタノール、アスコルビン酸中間体及び／またはアスコルビン酸）への変換はグルコースを所望の特定最終生成物へ変換することが知られる一定の酵素を添加することにより達成される。
【００７８】
中間体から所望の最終生成物への変換率が決定されると、炭素基質から中間体への変換の限界が同じように決定できる。中間体から最終生成物変換の上限を計算することにより、炭素基質から中間体への変換速度が決定でき、変換培地中の中間体濃度レベルが通常の中間体の異化代謝産物抑制／酵素抑制効果に逆の影響を与えるのに十分に低レベルで維持されると主として考えられる。１の実施態様において、これは中間体から最終生成物への過剰な変換率または炭素基質から中間体への変換率と等しい変換率を維持することにより達成される。従って、本発明は最終生成物への変換率を増加させる手段を提供し、及び炭素基質から中間体への変換を制限する手段を提供する。
【００７９】
中間体から最終生成物への変換率が炭素基質からの中間体生成以上であるかを決定する他の方法は反応容器内の中間体の重量％を測定することである。反応容器中に存在する中間体の量は種々の公知の方法により測定でき、限定されないが、反応容器中に存在する中間体の量を直接または間接的に測定することを含む。直接測定は反応容器内の中間体及び／または最終生成物の量を同定するための公知の分析法を用いて、該反応器の周期的分析によりできる。さらに、反応容器内の中間体量の直接測定はオンライン気体、液体及び／または当業界に公知の高性能液体クロマトグラフィー法を含む。
【００８０】
生成される中間体または最終生成物のレベルの間接測定は当業界に公知の方法を用いて酸素摂取量または二酸化炭素生成の測定により評価できる（例えば、酸素摂取量率及び／または炭素放出率を測定する）。
【００８１】
基質
本発明の基質は酵素的に中間体化合物に変換できる炭素ベース化合物である。適当な基質は、限定されないが、糖に変換できる成分を含む被加工原料である（例えば、セルロース誘導体バイオマス、グリコーゲン、でんぷん及びそれらの種々の形態、例えばコーンスターチ、小麦でんぷん、固形コーン及び固形小麦）。本発明の研究において、コーンスターチ及び小麦でんぷんを用いて優れた結果が得られたが、その他の供給源、穀物及びイモ類（ｔｕｂｅｒｓ）（例えば、サツマイモ、ジャガイモ、米及びキャッサバでんぷん）由来のでんぷんなども本発明で用いられる。種々のでんぷんが市販されている。例えば、コーンスターチはＣｅｒｅｓｔａｒ、Ｓｉｇｍａ及びＫａｔａｙａｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．（日本）から市販されており、小麦でんぷんはＳｉｇｍａから市販、サツマイモでんぷんはＷａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．（日本）から、及びジャガイモでんぷんはＮａｋａｒｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｖｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．（日本）から市販されている。特に有用な炭素基質はコーンスターチである。本発明のいくつかの実施態様において、顆粒でんぷんはでんぷん比率が約２０％〜約３５％のスラリー中で用いる。好ましくは、でんぷんは約１０％〜約３５％の濃度である。特に好ましい実施態様において、でんぷんの比率範囲は３０％〜３２％である。原料の顆粒でんぷんに加えて、その他の炭素基質原料は本発明で使用でき、限定されないが、バイオマス、多糖類、及び酵素的に中間体に変換できるその他の炭素ベース材料が挙げられる。
【００８２】
発酵性糖は幅広い種類の原料から得られ、リグノセルロース物質などがある。リグノセルロース物質はリグノセルロース廃棄物（例えば、枯れ植物及び古紙）から得られる。適当な枯れ植物の例としては、限定されないが、幹、葉、穀粒や種子の外皮、トウモロコシの皮、トウモロコシの軸穂等、及び伐採残、ｂｅｇａｓｓｅｓ、木材、木くず、木材パルプ、及びおがくずが挙げられる。古紙の例としては、限定されないが、任意の種類の廃棄紙（例えば、コピー紙、コンピューター印刷紙、ノート紙、メモ用紙、タイプライター紙等）、及び新聞、雑誌、ボール紙、及び紙ベースの包装材料が挙げられる。糖をエタノールに変換する条件は当業界に公知である。一般に、温度は約２５℃〜３５℃である（例えば、２５℃〜３５℃、及び特に３０℃）。変換培地に有用なｐＨ範囲は約４．０〜６．０。４．５〜６．０、及びｐＨ５．５〜５．８である。しかしながら、本発明はこれらの条件として特定の温度及び／またはｐＨに限定するものではなく、関連する基質、酵素、中間体、及び／または最終生成物により左右される。
【００８３】
酵素
本発明の好ましい実施態様において、基質変換酵素である酵素（すなわち最初に炭素基質を炭素中間体に変換できる酵素）及び中間体変換酵素である酵素（すなわち最終的な中間体を仲介中間体及び／または所望の最終生成物に変換することができる酵素）の両方は本発明で使用できる。炭素基質を中間体に変換するために本発明の実施態様において使用できる酵素は、限定されないが、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、でんぷん加水分解グルコアミラーゼ、及びプルラナーゼが挙げられる。中間体から最終生成物への変換に使用できる酵素は主として実際の所望の最終生成物による。例えば、糖を１，３−プロパンジオールに変換するために有用な酵素は限定されないが、大腸菌及びその他の微生物により生成された酵素が挙げられる。例えば、糖を乳酸に変換するために有用な酵素は限定されないが、乳酸菌及びザイモモナスにより生成された酵素が挙げられる。糖をエタノールに変換するために有用な酵素は限定されないが、アルコール・デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼが挙げられる。糖をアスコルビン酸中間体に変換するために有用な酵素は限定されないが、グルコース・デヒドロゲナーゼ、グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸塩レダクターゼ及び種々のその他の酵素が挙げられる。糖をグルコン酸に変換するために有用な酵素は限定されないが、グルコースオキシダーゼ及びカタラーゼが挙げられる。
【００８４】
いくつかの実施態様において、本発明の方法で用いられるα−アミラーゼは通常、でんぷんのα−（１，４）グルコシド結合をランダムに切断する酵素である。ほとんどの実施態様において、α−アミラーゼはＥ．Ｃ．番号Ｅ．Ｃ．３．２．１．１、特にＥ．Ｃ．３．２．１．１−３を有する微生物酵素の中から選択される。好ましい実施態様において、α−アミラーゼは熱安定性細菌性α−アミラーゼである。最も好ましい実施態様において、α−アミラーゼはバチルス種由来である。実際に、本発明の開発時に、バチルス・リケニホルミスから得られたＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）α−アミラーゼ（ジェネンコー）を用いて良い結果が得られた。他の実施態様において、加熱処理（ｐｒｅｃｏｏｋｉｎｇ）なしでトウモロコシ及びキャッサバなどのでんぷんからアルコール性発酵する方法において記載されている黒麹アミラーゼ（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，５０：２３７−２４２［１９８０］；及びＵｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，５８；２３７−２４２［１９８０］）は本発明で使用できる。
【００８５】
当業者に理解されるように、本発明の方法で使用されるα−アミラーゼの量はα−アミラーゼの酵素活性及び最終生成物変換体による生成グルコースの変換率に依存する。通常は０．００１〜２．０ｍｌの量のα−アミラーゼ溶液を原材料に加えるが、いくつかの実施態様において、０．００５〜１．５ｍｌの当該溶液を加える。いくつかの好ましい実施態様において、０．１〜１．０ｍｌの当該溶液を加える。さらに別の実施態様において、別の量が利用される。例えば、通常は０．０１〜１．０ｋｇの量のＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ（ジェネンコー）を１メートルトンのでんぷんに加える。いくつかの実施態様において、酵素は０．４〜０．６ｋｇの量で加え、一方、他の実施態様において、０．５〜０．６ｋｇの量のＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤを１メートルトンのでんぷん毎に加える。
【００８６】
本発明の好ましい実施態様において、グルコアミラーゼはでんぷんの非還元末端から連続グルコース単位を取り除く酵素である。該酵素はでんぷん、アミロース及びアミロペクチンの直鎖及び分岐グルコシド結合の両方を加水分解できる。ほとんどの実施態様において、本発明の方法で用いられるグルコアミラーゼは微生物酵素である。好ましい実施態様において、グルコアミラーゼは、アスペルギルス・グルコアミラーゼなどの熱安定性真菌グルコアミラーゼである。実際に、本発明の開発中、アスペルギルス・ニガー由来のＤＩＳＴＡＬＬＡＳＥ（登録商標）グルコアミラーゼ（ジェネンコー）を用いて良い結果が得られた。また、アスペルギルス・ニガー由来のグルコアミラーゼ調製物は前もって加熱処理（ｐｒｅｃｏｏｋｉｎｇ）なしで用いた（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２３：２９１［１９８１］を参照）。３つのグリコアミラーゼはでんぷんの加水分解に使用するためにアスペルギルス・アワモリ  ｖａｒ．カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．ｋａｗａｃｈｉ）から選択的に分離されている（Ｈａｙａｓｈｉｄａ，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３９：２０９３−２０９９［１９７３］）。加熱しないＥｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｏｅｕグルコアミラーゼによるサツマイモのアルコール性発酵についても記載されている（Ｓａｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２５：１１８１−１１８６［１９８３］）。本発明で使用できる他の酵素は、非還元末端から徐々にα−１，４−グルコシド鎖を加水分解する酵素である、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）である。この酵素はα−１，６−グルコシド鎖も加水分解する。グルコアミラーゼは本発明の方法で使用できるアスペルギルス、リゾプス及びムコール属の菌類からも分泌される。これらの酵素はグルコース生成及びグリコーゲン及びでんぷんの定量にも使用できる。Ｅ．フィブリゲラから得られるグルコアミラーゼ調製物（ＩＦＯ０１１１）はアルコール発酵のためにサツマイモでんぷんと接触するために使用されてきた（Ｓａｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２５：１１８１−１１８６［１９８３］を参照）。この酵素の主な用途の一つはでんぷん材料由来エチルアルコールの生成において糖化剤としてである。しかしながら、ここに記載するその他のグルコアミラーゼと同様に、この酵素も本発明の方法において使用できる。
【００８７】
本発明の方法で使用できる別のグルコアミラーゼはリゾプス及びフミコーラ属から得られるものがあり、特に高い生産性及び酵素的活性を有することを特徴とする。さらに、その他の生物から得たグルコアミラーゼと比較して、リゾプス由来グルコアミラーゼはでんぷん上で強い作用を示し、最適ｐＨなどその酵素学的及び化学的性質は特に穀類でんぷんの糖化に適している。これらの特徴のため、リゾプス由来グルコアミラーゼは非加熱または低温加熱でんぷんを用いたアルコール生成に最も適していると考えられる（米国特許第４，５１４，４９６号及び４，０９２，４３４号を参照）。リゾプスグルコアミラーゼを含む生コーンスターチはリゾプスα−アミラーゼとともに使用して培養し、グルコアミラーゼによるでんぷん分解を加速させることに留意した。本発明を特定のメカニズムまたは理論に限定することを意図するものではないが、リゾプスグルコアミラーゼはやはりα−アミラーゼを含むアスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ調製物よりも強い分解活性を有するものと考えられる（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｎｐｕｎ  Ｋａｇａｋｕ、３７：１２９−１３６［１９９０］を参照）。本発明で使用できる１の市販調製物はＳｈｉｎ  Ｎｉｐｐｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から市販のリゾプスｎｉｖｅｕｓ株の麹培養から得られるグルコアミラーゼ調製物である。他の本発明で使用できる１の市販調製物はＢｉｏｃｏｎ  Ｉｎｄｉａ（バンガロール、インド）から市販の市販でんぷん加水分解組成物Ｍ１である。
【００８８】
当業者に理解されるように、本発明の方法で使用されるグルコアミラーゼの量はグルコアミラーゼ（例えば、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）Ｌ−４００）の酵素活性に依存する。通常、０．００１〜２．０ｍｌの量のグルコアミラーゼ溶液を２０〜３５％乾燥固体に調節した４５０ｇｍのスラリーに加え、該スラリーは糖化時に液化するマッシュであり、及び／または発酵時に加水分解されたでんぷん及び糖中にある。いくつかの実施態様において、グルコアミラーゼは０．００５〜１．５ｍｌの当該溶液に加える。好ましい実施態様において、酵素は０．０１〜１．０ｍｌの当該溶液に加える。
【００８９】
上述の通り、プルラナーゼも本発明の方法で使用できる。これらの酵素はα−１，６−グルコシド結合を加水分解する。従って、液化でんぷんの糖化時に、プルラナーゼはでんぷんの非還元末端から連続グルコース単位を取り除く。この酵素はでんぷん、アミロース及びアミロペクチンの直鎖及び分岐グルコシド結合の両方を加水分解することができる。
【００９０】
本発明の方法で使用できる別の酵素はフミコーラＲＳＨグルコアミラーゼ酵素調製物などでんぷん加水分解（ＲＳＨ）酵素が挙げられる（米国特許第４，６１８，５７９号）。このフミコーラＲＳＨ酵素調製物はｐＨ５．０〜７．０の範囲内、特に５．５〜６．０の範囲内で最大活性を示す。さらに、当該酵素調製物は５０℃〜６０℃の温度範囲内で最大活性を示す。従って、当該酵素を用いる本発明の各工程において、でんぷんの酵素溶解は好ましくはこれらのｐＨ及び温度範囲内で行う。
【００９１】
いくつかの実施態様において、真菌生物株フミコーラ・グリセアｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａから得られるフミコーラＲＳＨ酵素調製物は本発明の方法で使用できる。特に好ましい実施態様において、これらのフミコーラＲＳＨ酵素はＡＴＣＣ（米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）１６４５３、ＮＲＲＬ（ＵＳＤＡ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）１５２１９、ＮＲＲＬ  １５２２０、ＮＲＲＬ  １５２２１、ＮＲＲＬ  １５２２２、ＮＲＲＬ  １５２２３  ＮＲＲＬ  １５２２４、及びＮＲＲＬ  １５２２５及びこれらの酵素由来の遺伝子組換え株からなる群より選択される。
【００９２】
本発明の方法で使用できる別のＲＳＨグルコアミラーゼはリゾプスＲＳＨグルコアミラーゼ酵素調製物を含む。いくつかの実施態様において、Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（日本）から商標名“ＣＵ  ＣＯＮＣ”で市販のリゾプスｎｉｖｅｕｓの麹株から得られる酵素が使用できる。他の有用な酵素調製物はＡｍａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌから商標名“ＧＬＵＣＺＹＭＥ”で市販のリゾプス由来の市販の消化剤である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，９８：６６３−６７１［１９８５］を参照）。別の酵素はリゾプス種の３つの形態のグルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）を含み、すなわち、“Ｇｌｕｃ１”（ＭＷ７４，０００）、“Ｇｌｕｃ２”（ＭＷ５８，６００）及び“Ｇｌｕｃ３”（ＭＷ６１，４００）である。Ｇｌｕｃ１はＧｌｕｃ２またはＧｌｕｃ３より２２〜２５倍効果的であることがわかった。従って、Ｇｌｕｃ２及びＧｌｕｃ３は本発明では有用だが、Ｇｌｕｃ１はでんぷんに固く結合し、最適ｐＨが４．５なので、Ｇｌｕｃ１が本発明での使用に特に適している。本発明に使用される別のＲＳＨグルコアミラーゼ酵素調製物はＢｉｏｃｏｎ  Ｉｎｄｉａ，Ｌｔｄ．，（バンガロール、インド）から記号表示“Ｍ１”で市販の酵素調製物を含み、Ｍ１は、図１及の高性能液体クロマトグラフィースペクトル及び図２のＳＤＳゲルにより示される、多面的（ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ）酵素組成物または混合物である。
【００９３】
上述の通り、ほとんどの実施態様において、フミコーラＲＳＨグルコアミラーゼ酵素調製物はグルコアミラーゼ活性及びでんぷんを溶解する促進因子を含む。促進因子及びその他のＲＳＨ酵素調製物におけるグルコアミラーゼ活性の相対的比率は若干変化し得る。しかしながら、本発明で使用できるＲＳＨグルコアミラーゼ酵素調製物を用いて、グルコアミラーゼフラクションと一緒に生成される促進因子は通常は十分にある。従って、ＲＳＨグルコアミラーゼ酵素調製物の活性はそれらのグルコアミラーゼ活性に関して決められる。
【００９４】
また、グルコアミラーゼ活性は、ＲＳＨ酵素調製物または従来のグルコアミラーゼに関して１０Ｄ．Ｅ．単位で本発明の目的のために測定できる。“１０Ｄ．Ｅ．単位”は分析条件下、１分当たり１マイクロモルのグルコースを生成するいずれかのタイプの酵素の量である。本発明の目的のグルコアミラーゼ活性を測定するために、０．０６単位〜１．１単位を含む、必要に応じて希釈した１０ｍｌの酵素調製物を、５０℃、５分間で前もって加熱した０．９ｍｌの基質溶液に加える。基質溶液は４０体積部０．２５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）及び５０体積部４重量％１０Ｄ．Ｅ．マルトデキストリン水溶液からなる。基質溶液は、酵素溶液を加える前に５０℃で、５分間保存する。１０分後、反応を前もって加熱した１６ｍｍ試験管に注ぎながら冷まし、１００℃の水槽中で６分間加熱する。グルコース濃度を従来方法により測定する（例えば、グルコース試薬キットＮｏ．１５−ＵＶ、シグマ・ケミカル  Ｃｏ．またはＴｅｃｈｎｉｃｏｎ  Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒなどの機器を用いて）。
【００９５】
特に有用な酵素組成物はグルコアミラーゼ（例えば、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）及びＲＳＨ（例えば、Ｍ１）の混合物を含む。この組み合わせで有用なグルコアミラーゼ量の範囲は、粒状固体１ｇ当たりグルコアミラーゼが０．２〜１．０ＧＡＵ単位である。より有用なグルコアミラーゼ量は固体１ｇ当たり約０．７５〜０．５ＧＡＵである。この混合物に存在するでんぷん加水分解酵素（Ｍ１）の範囲は固体１ｇ当たり０．２でんぷん加水分解単位（ＲＳＨＵ）〜約１．０ＲＳＨＵである。特に有用な混合物は固形コーン１ｇ当たり約０．６ＧＡＵ  ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）及び固形コーン１ｇ当たり０．２ＲＳＨＵ  Ｍ１を含む。
【００９６】
上述の酵素を含む酵素組成物の使用に加えて、本発明は微生物が基質に曝露され、所望の最終生成物を生成するために微生物が基質を使用する方法を提供する。従って、いくつかの実施態様において、基質または中間体を含む所望の最終生成物を生成する真菌、細菌またはその他の微生物を基質または中間体を所望の中間体または最終生成物に変換するために使用する。
【００９７】
本発明の好ましい実施態様において、いったん炭素基質を酵素的に中間体に変換すると、適当な方法で所望の最終生成物に変換する。変換は任意の適当な方法により達成される（例えば、酵素的または化学的）。好ましい実施態様において、変換は中間体を微生物と接触させることにより中間体の生物変換により達成する。別の好ましい実施態様において、それぞれ基質変換酵素及び中間体変換酵素は基質及び／または中間体と直接接触させる。いくつかの実施態様において、酵素は単離、精製または濃縮製剤として提供される。
【００９８】
別の実施態様において、基質及び／または中間体は、それぞれ基質または中間体を分泌または代謝する微生物（例えば、細菌または真菌）と直接接触させる。従って、本発明は基質から最終生成物へ生物変換する方法を提供する。いくつかの実施態様において、少なくとも１の中間体化合物はこの変換工程時に生成される。
【００９９】
いくつかの実施態様において、野生型生物により通常は生成されない酵素を発現するように遺伝子組換えされた微生物が利用される。いくつかの特に好ましい実施態様において、微生物は野生型生物により通常生成される酵素を過剰発現するように改変される。
【０１００】
実際、市販のα−アミラーゼ及びグルコアミラーゼは、経済的に現実的な酵素濃度で本発明の方法で使用できる。一般的な発酵条件は最適温度を利用しないが、発酵のｐＨ条件は市販の糖化酵素（すなわち、グルコアミラーゼ）に最適なｐＨに近いところで実に一致する。本発明のいくつかの実施態様において、グルコースへの完全な糖化は顆粒でんぷんを徐々に溶解することにより有利となる。おそらく、酵素は常に低濃度のデキストリンに曝露されている。さらに、発酵の間中グルコースを除去することで発酵培地中の低グルコース含量を維持する。従って、グルコアミラーゼは低濃度のグルコースに曝露される。結果として、グルコアミラーゼが非常に効率的に用いられるので、経済的に実行できる投与レベルのグルコアミラーゼは本発明の方法での使用に適したものとなる（すなわち、０．０５〜１０．０ＧＡＵ／（でんぷん）ｇのグルコアミラーゼ投与；及び好ましくは０．２〜２．０ＧＡＵ／（でんぷん）ｇ。
【０１０１】
グルコアミラーゼの上述の用量は発酵培養液中の酵素的糖化活性の効果的な濃度のおおよそを述べただけであり、糖化活性の別の割合としてα−アミラーゼが寄与する。本発明を特定のメカニズムまたは理論で限定する意図のものではないが、α−アミラーゼはでんぷん顆粒上のグルコアミラーゼによりあけられた穴をさらに広げるものと考えられる（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａを参照）。通常、市販のα−アミラーゼの使用によりかなりの量のグルコース及びマルトースなどの糖の生成を生じる。
【０１０２】
アスペルギルス・オリゼー由来α−アミラーゼ（例えば、ＦＵＮＧＡＭＹＬ）のマッシュへの添加は醸造業で提案されてきた。この特定酵素はデキストリンをマルトトリオース及びマルトースに糖化する。従って、α−アミロースの目的はでんぷんを液化することであるが、その糖化傾向はα−アミラーゼが糖化酵素含量の一部にもなる。α−アミラーゼはＭ１組成物中にも存在すると考えられる。
【０１０３】
また、アスペルギルス・オリゼー（例えば、ＣＬＡＲＡＳＥ（登録商標）Ｌ（ジェネンコー・インターナショナル））由来のα−アミラーゼのマッシュへの添加は醸造業での使用が考えられる。この特別な酵素はデキストリンをマルトトリオース及びマルトースへ糖化する。従って、α−アミラーゼの目的はでんぷんを液化することだが、その糖化傾向はα−アミラーゼを糖化酵素含量の一部にもできる。
【０１０４】
さらに、いくつかの市販グルコアミラーゼはα−アミラーゼ活性を含む。従って、グルコアミラーゼのみの存在下で（通常は実用的ではないが）粒状でんぷんを発酵することが可能である。しかしながら、当該実施態様を本発明から除外する意図のものではない。従って、市販のでんぷん加水分解酵素はでんぷん加水分解酵素、αアミラーゼ及びグルコアミラーゼを含む酵素混合物の一部として本発明で使用できると考えられる。本発明の方法のほとんどの実施態様において、α−アミラーゼを効果的な量で粒状でんぷんのスラリーに加える。グルコアミラーゼが寄与するα−アミラーゼ活性の不明確な量に加えて、α−アミラーゼの効果的活性は供給業者から与えられる単位活性値とは全く違い得ることは当業者が当然に理解することである。α−アミラーゼの活性はｐＨ依存性であり、発酵のために選択されるｐＨ範囲で異なり得る（すなわち、供給業者により用いられるそれらの報告単位活性値に関する試験条件と比較して）。従って、α−アミラーゼの最も効果的用量を確立するために、ここに明示的に記載していないが、本発明の方法に使用できる、いくつかの予備的実験が時には必要であると考えられる。
【０１０５】
いくつかの最も好ましい実施態様において、真菌α−アミラーゼのα−アミラーゼ用量範囲は０．０２ＧＡＵ／ｇ（真菌アミラーゼ単位）〜２．０ＦＡＵ／（でんぷん）ｇであるが、いくつかの特に好ましい実施態様においては、当該範囲は０．０５〜０．６ＦＡＵ／ｇである。“ＦＡＵ”は標準条件下で１時間当たり５２６０ｍｇのでんぷんを分解する酵素の量であり、約２５ＳＫＢ単位に対応する（Ｃｅｒｉａｌ  Ｃｈｅｍ．，１６：７１２−７２３［１９３９］を参照）。バチルスα−アミラーゼを利用するほとんどの実施態様において、該範囲は０．０１ＫＮＵ／ｇ〜０．６ＫＮＵ／ｇであり、好ましくは０．０５〜０．１５ＫＮＵ／ｇであり、ＮＵ（またはＮｏｖｏ単位）は標準条件下で１時間当たり５．２６ｍｇのでんぷんを分解する酵素の量である。１ＫＮＵは１０００ＮＵに相当する。
【０１０６】
発酵スラリー内のグルコアミラーゼ及びα−アミラーゼの両方の実際の活性が不明確であると、いくつかの実施態様を実施する予備的な調査が必要であると考えられる。最適化の考慮として、一定グルコアミラーゼ含量を含むα−アミラーゼ用量を増加させることにより、発酵速度を増加させるという事実がある。さらに、一定α−アミラーゼ含量を含むグルコアミラーゼ用量を増加させることにより発酵速度を増加させる。酵素用量を一定に維持すること及び／またはスラリー中のでんぷん含量を増加させることでも発酵速度が増加する。実際に、いくつかの実施態様において、最適α−アミラーゼ用量はこれまで液化でんぷんに関して推奨されてきた用量をかなり上回り、最適グルコアミラーゼは糖化シロップに関して推奨された用量をかなり上回ることが考えられる。しかしながら、酵素用量レベルは酵素使用法と混同するべきではない。でんぷんスラリー中に投与される酵素の実質的な割合は、新たに顆粒でんぷんを発酵での使用のための発酵培養液から回収するために利用可能である。
【０１０７】
発酵温度で酵素を使用することから生じる問題をさらに検討すると、酵素は低相対活性を示すが（例えば、発酵温度でのＢ．リケニフォルミス由来α−アミラーゼの活性は最高活性の多くて約２５％である）、低相対活性は発酵継続期間を４８〜１２０時間延長することにより、及び高温にさらされなかった酵素の半減期を延長することにより埋め合わせされる。実際に、酵素活性の９０％以上は発酵７２時間後に維持されていることが測定された。Ｍ１の使用は７２時間後には少なくとも５０％加水分解されるでんぷん固体、いくつかの場合には７２時間後に少なくとも９０％が加水分解される、７２時間後には少なくとも９５％が加水分解されるでんぷん固体を生じることにも留意した。
【０１０８】
Ｂ．リケニフォルミスのα−アミラーゼ（ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＡＡ及びＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ酵素；ジェネンコー）は蒸留器温度への短い曝露に耐えられる程度に十分安定している。従って、蒸留廃液（ｓｔｉｌｌａｇｅ）の再利用はα−アミラーゼを再利用する方法として使用できる。しかしながら、再利用蒸留廃液中の酵素の回収は、酵素を不活性化させるエタノール回収温度に発酵培養液がさらされることを避ける注意が必要である。例えば、アルコールは発酵培養液から真空回収でき、そのような蒸留廃液は次の反応での使用に適した酵素を回収するために再利用する。
【０１０９】
しかしながら、前述の通り、いくつかのＲＳＨグルコアミラーゼ（例えば、リゾプスから得られる酵素）は非加熱温度（例えば、２５〜３５℃）ででんぷんをグルコースに変換するのに利用でき、酵素組成物を蒸留器温度に曝露する必要性を減少させる。これは炭素基質を所望の最終生成物に変換するエネルギー費用を減少させ、それにより製造の全体的なコストを減少させる。従って、これらの酵素は本発明の方法で特に使用できる。
【０１１０】
本発明の好ましい実施態様において、いったん炭素基質を酵素的に中間体に変換すると、適当な方法で所望の最終生成物に変換する。変換は任意の適当な方法により達成される（例えば、酵素的または化学的）。好ましい実施態様において、変換は中間体を微生物と接触させることにより中間体の生物変換により達成する。別の好ましい実施態様において、それぞれ基質変換酵素及び中間体変換酵素は基質及び／または中間体と直接接触させる。いくつかの実施態様において、酵素は単離、精製または濃縮製剤として提供される。
【０１１１】
所望の最終生成物は基質から最終生成物へ酵素的に変換することにより生成される任意の生成物であってよい。いくつかの好ましい実施態様において、基質は最初は少なくとも１の中間体に変換され、それから中間体から最終生成物に変換される。例えば、ヘキソースは多数の生成物に生物変換でき、例えば、アスコルビン酸中間体、エタノール、１，３−プロパンジオール、及びグルコン酸である。アスコルビン酸中間体は、限定されないが、２，５−ジケトグルコン酸塩、２ＫＬＧ（２−ケト−Ｌ−グルコン酸塩）、及び５ＫＤＧ（５−ケト−Ｄ−グルコン酸塩）が挙げられる。グルコン酸塩はグルコースとグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を接触させることによりグルコースから変換できる。さらに、グルコン酸塩自体はグルコン酸塩とＧＤＨを接触させることにより２−ＫＤＧ（２−ケト−Ｄ−グルコン酸塩）に変換できる。さらに、２−ＫＤＧは２−ＫＤＧと２−ＫＤＧＨを接触させることにより２，５−ＤＫＧに変換できる。グルコン酸塩は、グルコン酸塩と２ＫＲを接触させることにより２−ＫＤＧにも変換できる。グルコースはグルコースと大腸菌を接触させることにより１，３−プロパンジオールにも変換できる。さらに、グルコースはグルコースと大腸菌を接触させることにより琥珀酸に変換できる。
【０１１２】
別の実施態様も、ここに記載するように、本発明により提供される。本発明の特に好ましい実施態様において、最終生成物はエタノールである。グルコースが中間体の実施態様において、グルコースとエタノール生成（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ）微生物を接触させることによりエタノールに変換される。中間体と中間体変換酵素の接触において、単離及び／精製酵素は中間体と接触すると考えられる。他の実施態様において、中間体は、中間体を取り込み、所望の最終生成物を生成する細菌、真菌またはその他の生物などの生物変換剤と接触させる。いくつかの実施態様において生物は野生型であり、一方、他の実施態様において変異体である。
【０１１３】
エタノール生成微生物の好ましい例として、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを発現するエタノール生成細菌があり、例えばザイモモナス・モビリスから得られる（例えば、米国特許第５，０２８，５３９号、第５，０００，０００号、第５，４２４，２０２号、第５，４８７，９８９号、第５，４８２，８４６号、第５，５５４，５２０号、第５，５１４，５８３号、及び同時継続中の米国出願番号第０８／３６３，８６８号（１９９４年１２月２７日出願）、米国出願番号第０８／４７５，９２５号（１９９５年６月７日）及び米国出願番号第０８／２１８，９１４号（１９９４年３月２８日）を参照）。これら全ての教示の内容はここに引用するものとする。
【０１１４】
別の実施態様において、エタノール生成微生物は、キシロースをキシルロースに変換する酵素である、キシロースレダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼを発現する。さらに別の実施態様において、キシロースイソメラーゼはキシロースをキシルロースに変換するために使用される。別の実施態様において、エタノール生成微生物は、キシルロースからキシルロース−５−リン酸への変換を触媒するキシルロキナーゼも発現する。別の酵素はトランスアルドラーゼ及びトランスケトラーゼを含む経路の完成に関与する。これらの酵素は大腸菌、クレブシエラ・オキトカ及びエルウィニア種から得られる（例えば、米国特許第５，５１４，５８３号を参照）。
【０１１５】
特に好ましい実施態様において、ペントース及びヘキソースの両方をエタノールに発酵できる微生物を利用する。例えばいくつかの実施態様において、１セットの酵素を本来有する組換え生物及び酵素の相補セットを含むように遺伝子組換えされた組換え生物を使用する（例えば、米国特許第５，０００，０００号、第５，０２８，５３９号、第５，４２４，２０２号、第５，４８２，８４６号、第５，５１４，５８３号及びＷＯ９５／１３３６２を参照）。いくつかの実施態様において、特に好ましい微生物はクレブシエラ・オキトカＰ２及び大腸菌ＫＯ１１である。
【０１１６】
いくつかの実施態様において、補助剤を栄養培地（すなわち、培養基）に加え、限定されないが、ビタミン、主要栄養素及び微量栄養素を加える。ビタミンは、限定されないが、塩化コリン、ニコチン酸、チアミンＨＣｌ、シアノコバラミン、ｐ−アミノ安息香酸、ビオチン、パントテン酸カルシウム、葉酸、ピリドキシン．ＨＣｌ及びリボフラビンが挙げられる。主要栄養素は、限定されないが、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮａＣｌ及びＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏが挙げられる。微量栄養素は、限定されないが、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、モリブデン酸（ｔｅｃｈ）、ＣｕＣｌ３・２Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及びＨ３ＢＯ３が挙げられる。
【０１１７】
培地及び炭素基質
本発明の変換培地は適当な炭素基質を含んでいなければならない。適当な炭素基質は、限定されないが、バイオマス、単糖類（例えば、グルコース及びフルクトース）、二糖類（例えば、ラクトース及びスクロース）、オリゴ糖、多糖類（例えば、でんぷん及びセルロース）、及びこれらの混合物が挙げられ、及び例えば、乳清浸透液（ｃｈｅｅｓｅ  ｗｈｅｙ  ｐｅｒｍｅａｔｅ）、コーンスティープリカー、甜菜糖液及び大麦モルトなど再生可能な供給原料由来の非精製混合物が挙げられる。別の実施態様において、炭素基質は二酸化炭素などの１炭素基質または重要な生化学中間体への代謝変換を示すためのメタノールを含む。
【０１１８】
上述の全ての炭素基質及びそれらの混合物は本発明の方法で使用できると考えられるが、好ましい炭素基質は単糖類、二糖類、オリゴ糖、多糖類及び１炭素基質である。特に好ましい実施態様において、炭素基質はグルコース、フルクトース、スクロース及び単一炭素基質、例えば、メタノール及び二酸化炭素からなる群より選択される。最も特に好ましい実施態様において、基質はグルコースである。
【０１１９】
当業界に公知であるように、適当な炭素源に加えて、発酵培地適当な窒素源、ミネラル、塩、共同因子、バッファー、及び培養物の成長及び所望の最終生成物（例えば、グリセロール）の生成に必要な酵素経路の促進に適したその他の成分を含まなければならない。いくつかの実施態様において、（ＩＩ）塩及び／またはビタミンＢ１２またはこれらの前駆体は本発明で使用できる。
【０１２０】
培養条件
通常、細胞は適当な培地中で約３０℃で成長する。本発明で利用する好ましい成長培地は一般に市販の調製培地を含み、例えば、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）培地、サブローデキストロース（ＳＤ）培地またはＹＭ（Ｙｅａｓｔ  Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）培地である。しかしながら、必要に応じてその他の規定のまたは合成成長培地も使用できる。適当な培養条件は当業界に公知である。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、異化代謝産物抑制を直接または間接的に調節することが知られる薬剤は（例えば、環状アデノシン２’：３’−モノリン酸または環状アデノシン２’：５’−モノリン酸）は反応培地中に組込まれる。同様に、グリセロール生成を高める酵素活性を調節することが知られる薬剤の使用（例えば、亜硫酸塩剤、重亜硫酸及びアルカリ）も遺伝子操作と併せてまたは代わりとして使用できる。
【０１２２】
発酵に適したｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０の範囲が反応系の初期条件に特に好ましい。さらに、反応は利用する生物に合わせて好気性、微好気性、または嫌気性条件下で行うことができる。
【０１２３】
バッチ及び連続発酵
いくつかの好ましい実施態様において、本方法はバッチ発酵方法を用いる。古典的バッチ発酵は閉鎖系であり、培地組成物は発酵の最初に用意し、発酵中は人為的な変更を加えない。従って、発酵の開始時に培地に所望の生物を植菌する。この方法では、当該系にいかなる成分も加えることなく発酵が起こる。通常、バッチ発酵は炭素源の追加に関して“バッチ”とし、ｐＨや酸素濃度などの制御因子で行われることが多い。バッチシステムの代謝産物及びバイオマス組成は発酵が止まる時間まで常に変化する。バッチ培養物内で、細胞は静電遅滞期から高成長ログ期及び最終的に成長率が減少または止まる静止期を通して穏やかである。未処理の場合、静止期の細胞は最終的に死ぬ。通常、遅滞期の細胞は最終生成物または中間体の生成の大半に関与している。
【０１２４】
標準的なバッチシステムの変化形は“フェッドバッチ発酵”システムであり、本発明で使用できる。この一般的なバッチシステムの変化形において、基質は発酵が進行する毎に追加する。フェッドバッチシステムは異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にあり、培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に有用である。フェッドバッチシステム中の実際の基質濃度の測定は困難であり、従って、ｐＨ、溶存酸素及びＣＯ２など排ガスの分圧などの測定可能因子の変化に基づき評価する。バッチ及びフェッドバッチ発酵は一般的であり、当業界に公知である。
【０１２５】
本発明の方法は連続発酵法にも適合可能であることが当然に理解される。連続発酵は、規定の発酵培地を連続的に生物反応器に加え、等量の調整培地を処理用に同時に取り除く開放系である。連続発酵は通常、細胞が主としてログ期成長となる一定の高密度で培養物を維持する。
【０１２６】
連続発酵は、細胞成長及び／または最終生成物濃度に影響を与える１の因子または多数の因子の調節を可能とする。例えば、１の実施態様において、炭素源、または窒素レベルなどの限定栄養素は定率でその他全てのパラメーターを抑えることができるように維持される。他のシステムにおいて、成長に影響を与える多数の因子は、培地濁度により測定される細胞濃度を一定に保ちながら連続的に変化させることができる。連続システムは成長条件を定常状態に維持しようとするものである。従って、取り除かれた培地による細胞消失は発酵中の細胞成長率に対して平衡が保たれなければならない。連続発酵方法の栄養素と成長因子を調節する方法及び生成物形成率を最大化させる技術は工業微生物学の当業界で公知である。
【０１２７】
いくつかの実施態様において、本発明はバッチプロセスを用いて実行され、一方、他の実施態様において、フェッドバッチまたは連続プロセス及びその他の発酵に適した方法が使用される。さらに、いくつかの実施態様において、細胞は全細胞触媒として基質上に固定化され、適当な最終生成物の生成のための発酵条件に供する。
【０１２８】
最終生成物の同定及び精製
発酵培地から最終生成物を精製する方法は当業界に公知である。例えば、プロパンジオールは反応混合物を有機溶媒、蒸留及びカラムクロマトグラフィーを用いた抽出に供することにより細胞培地から得られる（例えば、米国特許第５，３５６，８１２号を参照）。この方法の特に優れた有機溶媒はシクロヘキサンである（例えば、米国特許第５，００８，４７３号を参照）。
【０１２９】
いくつかの実施態様において、最終生成物は培地を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供することにより直接同定する。本発明の１の方法は、定組成で０．０１Ｎ  硫酸の移動相を用いた分析イオン交換カラムにおける発酵培地の分析を含む。
【０１３０】
酵素の同定及び精製
培地中の酵素レベルは酵素分析により測定できる。例えば、１，３−プロパンジオールの製造において、タンパク質Ｇ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼの発現レベルは酵素分析により測定する。Ｇ３ＰＤＨ活性分析はＤＨＡＰのＧ３Ｐへの変換における補基質、ＮＡＤＨのスペクトル特性に依存する。ＮＡＤＨは固有ＵＶ／ｖｉｓ吸収を有し、その消費量は分光光度法で３４０ｎｍで観測できる。Ｇ３Ｐホスファターゼ活性は反応において解放された無機リン酸を測定する任意の方法により測定できる。最も一般的に使用される検出方法は、青色リンモリブデン酸アンモニウム錯体の可視分光測定を用いる。
【０１３１】
従って、当業界に公知の方法及び本発明の方法間で種々の表面的な類似性があるが、本発明は本発明、特に酵素再利用、バイオマス及びでんぷん再利用などの実施を独特のものとする多くの詳細な特徴を反映するより総合的な目的を提供する。
【０１３２】
回収
概して、再利用蒸留廃液における酵素の回収は、変換培地が酵素を不活性化させる温度に曝されるのを避けるために注意が必要である。１の例において、エタノールの変換のため、アルコールは発酵培養液から真空除去され、蒸留廃液は酵素を回収するために再利用する。いくつかの実施態様において酵素は限外ろ過または電気透析の使用により回収し、再利用する。
【０１３３】
プロセス検討事項
上述の通り、顆粒でんぷんスラリーの発酵はシロップの発酵と比べて全く異なる特徴を有する。通常、溶液中約２０％の固体濃度は発酵培地中の最大糖含量と考えられ、より高い濃度では発酵の開始及び最後に問題を生じる。しかしながら、でんぷんスラリーの発酵において同様の制限は存在しない。スラリー中のでんぷん濃度は１０〜３５％で様々であり、発酵の開始で認識できる影響はない。でんぷん濃度を増加すると（例えば、一定酵素量で）生物変換率の速度が上がり、または反対に、所定の生物変換率を達成するために必要な酵素量の低下を可能にする。いずれにせよ、培養液が７〜１０％アルコールになるまで、発酵は、発酵分野で一般的であるように、依然として可能である。過剰（すなわち余剰の）顆粒でんぷんは、実質的な酵素量と一緒に回収でき、再び発酵に供することができる。従って、でんぷん濃度の制御は本発明の実施の主なプロセスパラメーターである。
【０１３４】
１の好ましい実施態様において、１０〜３５重量％でんぷんを有する顆粒でんぷんスラリーの生物変換及び発酵の手段を提供する。いくつかの好ましい実施態様において、大腸菌を含む１０〜３５％でんぷんスラリーの発酵は、発酵が目的の有機酸または１，３−プロパンジオール含量レベルに進行した場合、余剰でんぷんの生成を生じる。しかしながら、この反応は微生物及び使用するバイオプロセス条件に依存し、従って、でんぷん粒子上の酵素の再利用は余剰でんぷんが再度発酵されたときに起こる。しかしながら、たとえ２５〜３５％のでんぷんスラリーが発酵された場合でも、好ましい実施態様において、発酵は、新しい発酵のために、顆粒でんぷんが完全に消失する前に止まる。従って、でんぷんの再利用は再利用のための酵素を回収する容易な方法である。
【０１３５】
別の実施態様において、２５〜２５重量％の顆粒でんぷんスラリーを発酵する手段を提供する。一般的なパン酵母を用いた２５〜３５％のでんぷんスラリーの発酵は常に、発酵を目的のアルコール含量レベル（例えば、７〜１０％）に進めた場合、使用する微生物に応じて余剰でんぷんを生じ、余剰でんぷんが再度発酵された場合でんぷん粒子上の酵素の再利用が起こる。しかしながら、本発明はこの範囲に制限されるものではなく、その他の重量％でも使用でき、本方法で使用する基質及び／または酵素系に依存する。例えば、いくつかの実施態様において１０〜３５重量％の顆粒でんぷんスラリーは好ましい。特に有用な微生物は本方法により生成されるアルコールに耐性を有するものである。
【０１３６】
本発明の好ましい実施態様において、（顆粒）でんぷん及び微生物は一緒に取り除かれる（例えば、遠心分離またはろ過により）。この除去でんぷん及び微生物は新しい顆粒でんぷん及び必要な酵素の追加アリコートと混合し、別の発酵操作のための発酵分量を生じる。
【０１３７】
他の好ましい実施態様において、１０〜３５重量％セルロース誘導体を有するコーンストーバー（トウモロコシ伐採残）スラリーの生物変換及び発酵が提供される。１の実施態様において、大腸菌を含む１０〜３５％のセルロース誘導体スラリーの発酵は、発酵が目的の有機酸または１，３−プロパンジオール含量レベルに進行した場合、余剰セルロース誘導体を生じる。この反応は使用する微生物及びバイオプロセス条件に依存する。上述の通り、セルロース誘導体において酵素の再利用は余剰コーンストーバーが再度発酵された場合に起こる。しかしながら、２５〜３５％のセルロース誘導体スラリーが発酵された場合でも、好ましい実施態様において、発酵は、新しい発酵のために、ストーバーが完全に消失する前に止まる。従って、ストーバーの再利用は再利用のために酵素を回収する容易な方法である。
【０１３８】
他の好ましい実施態様において、顆粒でんぷんまたはコーンストーバー及び微生物は一緒に取り除かれる（例えば、遠心分離またはろ過により）。除去された顆粒でんぷんまたはコーンストーバー及び微生物のこの混合物は新しい顆粒でんぷんまたはコーンストーバー及び必要な酵素の追加アリコートと一緒に混合し、他の発酵操作のための発酵分量を生じる。
【０１３９】
当業者に理解されるように、最適方法の詳細への到達に工学技術の交互使用が考慮され、これらの交互使用は様々であり、各特定の状況に依存する。それにもかかわらず、ここで提供される方法は最適方法を得るための当該交互使用を生じるために必要な技術を提供する。例えば、妥当な最も速い発酵を達成するために、高でんぷんまたはセルロース含量及び高酵素量が示される。しかし、結果的に速い発酵は発酵培養液中の栄養素レベルの生成に徐々に収まり、それから栄養素の回収に影響し、または発酵は比較的低最終生成物（例えば、アルコール）含量で止まる。しかしながら、比較的低発酵率が許容可能であれば、それから、酵素量は比較的低く、及び栄養素損失は従来発酵分野で受け入れられていたレベルに保たれる。最終生成物（例えば、アルコール）の最高収率が主な目的である場合、α−アミラーゼ量を抑える低でんぷん含量スラリー及び高グルコアミラーゼ量は本発明で使用できる。しかしながら、本発明を特定の方法設計に限定するものではない。
【０１４０】
ここに示すように、本発明はかなりの量の熱エネルギーを節約する。しかしながら、開始基質（例えば、でんぷん）が液化のために用いられる熱条件に供されることがないので、基質は熱殺菌されない。従って、いくつかの実施態様において、開始基質（例えば、顆粒でんぷん）は汚染微生物を発酵培地に添加することが考えられる。従って、いくつかの実施態様において、発酵培地に、再利用基質（例えば、でんぷん）に関連する多数の生成物生成微生物を蒔くことが有利である。汚染物質を大きく数で上回ることにより、再利用微生物は汚染微生物を圧倒し、それにより発酵で優勢となり、所望の最終生成物の生成を生じる。従って、いくつかの実施態様において、本方法は顆粒でんぷんの再利用を伴うと考えられる多数のエタノール生成微生物を含む発酵培地を播種することを含む。それらの数が多いことにより、再利用微生物は汚染微生物を圧倒し、それにより、発酵で優勢となり、望ましい。
【０１４１】
いくつかの実施態様において、最初に発酵槽中に充填される酵母の量はエタノール発酵に実施される従来技術に従い、発酵の過程において酵母細胞は増加するのでこれらの量は広く変わり得る。酵母細胞の再利用は必須ではないが、行ってもよい。いくつかの実施態様において、酵母は余剰でんぷんを再利用する前に余剰でんぷん粒子から取除く。しかしながら、本発明の実施はでんぷんの熱処理（すなわち、でんぷんを熱殺菌する熱条件）を必ずしも必要とするものではないことに再度留意されたい。従って、細菌のように、本発明のいくつかの実施態様において、比較的大量の酵母細菌を（不注意の）汚染の可能性の克服を助けるために発酵中に充填することは望ましい。さらに、いくつかの実施態様において、抗菌剤を発酵培地に加えて汚染微生物の成長を抑圧する。さらに別の実施態様において、冷滅菌技術が本方法で用いる材料と一緒に用いられる。
【０１４２】
最も好ましい実施態様において、本発明の実施は代謝糖を制御速度で微生物（例えば、酵母）に放出し、酵素抑制または異化代謝産物抑制を引き起こさないレベルで中間体（例えば、グルコース）濃度を維持することにより発酵速度を制御する。この方法は本発明の研究前に行われてきとものとは非常に異なった方法である。実際に、先行技術は発酵前に固形でんぷんと酵素を取り扱うこと及び／またはエネルギーを保存するため及び／または発酵効率を向上させるために発酵培地に酵素を含めることについて示唆する。しかしながら、これらの教示は異化代謝産物抑制及び／または酵素抑制の悪影響を避けるための発酵の特徴を変化させるものではない。本発明はグルコース由来の望ましくない副生成物を生成する悪影響に対抗する手段も提供する。また本発明は、特に高温でんぷん液化に関する先行技術と比較して、エネルギーを保存する手段を提供する。実際、本発明は他の方法より多くの熱エネルギーを保存する手段を提供する。本発明は高発酵効率で作用し、いくぶんでんぷん後退に起因する生成物損失、不完全糖化及び発酵性物の不完全発酵が減少する方法を提供する。でんぷん濃度の制御により発酵率を調整する能力、及び酵素含量及び比率の制御は、最小の炭水化物含量を有する発酵培養液生成物を作成する能力を含む。
【０１４３】
上述の通り、いくつかの実施態様において、最初に発酵槽または生物反応器に充填される微生物及び酵素の量は種々の生成物の発酵または生物変換の先行技術に従う。これらの量は発酵の過程において微生物細胞が増殖するので様々であり、それに対し、生物変換に使用される酵素は制限された半減期を有する。いくつかの実施態様において、微生物の再利用を用いるが、多くの実施態様において、本発明の実施に必須のものではない。それに対し、特に好ましい実施態様において、酵素を再利用することは望ましい（しかし、本発明を酵素の再利用が必須の方法に限定するものではない）。
【０１４４】
従って、いくつかの実施態様において、微生物は余剰でんぷんまたはバイオマス粒子から余剰でんぷんまたはバイオマスを再利用する前に取除く。しかしながら、本発明の実施は開始物質（例えば、でんぷん）の熱処理を必ずしも必要とするものではないことに再度留意されたい。従って、いくつかの実施態様において、開始基質は熱殺菌されるが、一方、他の実施態様においてはされない。従って、いくつかの実施態様において、発酵／生物変換は比較的大量の酵母細菌の存在下で汚染の影響を克服するために行う。別の実施態様において、抗菌剤を発酵培地に加えて汚染微生物の成長を抑圧する。さらに別の実施態様において、冷滅菌技術、紫外線放射、６５℃低温殺菌が開始（例えば、基質）材料を殺菌するために用いられる。しかしながら、バイオマスは発酵槽または生物反応器の殺菌に関して何の問題も引き起こさない。
【０１４５】
開始物質としてでんぷんを使用することより、上述の現在使用されている方法の短所に対処するだけでなく、コーンスターチとＤ−グルコースの原材料費用、基質の還元及び／または生物変換に使用される酵素の生成物ベースの阻害に関する３つのさらなる著しい利点を有し、及び同時に高酵素量の必要性が著しく減少する。
【０１４６】
本記載及び実施例の種々のその他の例及び変更は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく当該開示の内容を読んだ当業者に明らかであり、そのような例または変更のすべては請求の範囲内に含まれる。ここに記載されたすべての文献及び特許はその内容の全体をここに引用するものとする。
【０１４７】
実験
以下の実施例は特定の好ましい本発明の実施態様及び側面を示し、さらに説明するために提供するものであり、その範囲を限定すると解釈されるものではない。実際、これらの技術はさらにここに記載された方法システムを最適化するために使用できる。
【０１４８】
以下の実験的記載において、以下の省略形は、ｗｔ％（重量％）、℃（摂氏温度）、ｒｐｍ（１分当たりの回転数）、Ｈ２Ｏ（水）、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）、ＨＣｌ（塩酸）、ａａ（アミノ酸）、ｂｐ（塩基対）、ｋｂ（キロ塩基対）、ｋＤ（キロダルトン）、ｇｍ（グラム）、μｇ（マイクログラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｎｇ（ナノグラム）、μｌ（マイクロリットル）、ｍｌ（ミリリットル）、ｍｍ（ミリメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、μｍ（マイクロメートル）、Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、μＭ（マイクロモル）、Ｕ（単位（ユニット））、Ｖ（ボルト）、ＭＷ（分子量）、ｐｓｉ（ポンド／平方インチ絶対圧力）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（ｓ）（分）、ｈｒ（ｓ）（時間）、Ｑ．Ｓ．及びｑ．ｓ．（十分量（ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ））、ＯＤ（光学密度）、ＯＤ２８０（２８０ｎｍの光学密度）、ＯＤ６００（６００ｎｍの光学密度）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２］、Ｃｅｒｅｓｔａｒ（Ｃｅｒｅｓｔａｒ，Ｃａｒｇｉｌｌ  Ｉｎｃ．，カンパニー、ミネアポリス、ミネソタ州）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ｗ／ｖ（重量対体積）、ｖ／ｖ（体積対体積）、ＡＴＣＣ（米国菌培養収集所、ロックビル、メリーランド州）、Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、ミシガン州）、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬまたはＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ（ライフ・テクノロジーズ，Ｉｎｃ．，ゲイサーズバーグ、メリーランド州）、ジェネンコー（ジェネンコー・インターナショナル，Ｉｎｃ．，パロアルト、カリフォルニア州）、Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ（新日本、日本）、ＢｉｏＲａｄ（ＢｉｏＲａｄラボラトリーズ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）、及びＬｅＳａｆｆｒｅ（ＬｅＳａｆｆｒｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）である。
【０１４９】
以下の実施例において、当業者に公知の追加の種々の培地及びバッファーを用い、以下を含む。
【０１５０】
実施例１
非加熱トウモロコシ・マッシュの発酵
この実施例では、でんぷん加水分解酵素活性と非加熱でんぷん上のグルコアミラーゼを比較するために行う実験について説明する。
【０１５１】
発酵実験を２５０ｍｌフラスコ中で行い、３０℃振とう水槽中で培養した。この実験で０．５％の乾燥コーンスティープを含んだ１１２ｇｍの３２．１％トウモロコシ粉スラリーを２５０ｍｌフラスコ中に加えた。スラリーのｐＨは約５．７であり、さらなる調節は必要なかった。所望の酵素（ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）またはＳｕｍｉｚｙｍｅ  ＣＵ；Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ）を加え、一緒に０．３７ｇｍのＲｅｄ  Ｓｔａｒ活性乾燥酵母（ＬｅＳａｆｆｒｅ）を加えて糖化及び発酵を開始させた。発酵中、ビールのサンプルを遠心分離し、０．５ｍｌの上澄みを５％グルタルアルデヒドを含んだ０．０５ｍｌの１．１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を含む試験管に加えて、発酵及び酵素活性の両方を停止させた。サンプルをそれから５．０ｍｌの水で希釈し、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム上でＨＰＬＣ分析を行った。結果を下の表１に示す。
【表１】
2005523689.tif 000002
【０１５２】
表１に示すように、少しでもビール中に検出可能なグルコースがあれば、でんぷんとして示され、当該でんぷんは加水分解され、酵母により素早くエタノールに変換された。図１は種々の試験のエタノール含量を示すグラフである。
【０１５３】
これらの結果はでんぷん加水分解酵素が非加熱でんぷんをＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）よりもかなり効率的に変換できたことを示す。発酵速度はＲＳＵ活性により関連しているように思われる。ＣＵの０．２ＧＡＵ／ｇｍレベルは０．５９０ＲＨＵ／ｇｍに相当し、一方、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）の１．０ＧＡＵ／ｇｍレベルは０．１０８ＲＨＵ／ｇｍだけに相当する。ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）のＲＨＵ／ＧＡＵ比は０．５４であり、一方、ＣＵのＲＨＵ／ＧＡＵ比は２．９８であり、高ＲＨＵ／ＧＡＵ比を有する酵素がより非加熱でんぷんを加水分解できることを示す。
【０１５４】
実施例２
トウモロコシ粉スラリーの発酵
これらの実施例では、３５．９％トウモロコシ粉スラリー（コーンマッシュの代わりに）を用いたこと、及び発酵を開始する前に低温殺菌工程として１時間、６５℃の水にスラリーを置いた以外は、実施例１と同じ手順をこの実験に関して用いた。スラリーのゲル化は観測されなかった。試験した酵素はＳｕｍｉｚｙｍｅ  Ｃｕ（実施例１）、１７８ＧＡＵ／ｇｍ及び２７７ＲＨＵ／ｇｍで分析したＢｉｏｃｏｎからのリゾプス・グルコアミラーゼ調製物（Ｍ１）、及び３６１ＧＡＵ／ｇｍ及び１９６ＲＨＵ／ｇｍのＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）Ｌ−４００（Ｄｉｓｔ．）である。表２はこの研究で用いた条件を示し、結果を簡単に示す。
【表２】
2005523689.tif 000003
【０１５５】
Ｍ１及びＣＵを用いた発酵から得たエタノール結果を図２Ａ及び２Ｂプロットする。Ｍ１の０．２ＧＡＵ／ｇｍレベルで、エタノールの速度及び収量は０．５及び０．７５レベル以下であり、０．２レベルが酵素限界であることを示す。Ｍ１の０．５及び０．７５レベルは酵素がもはや制限されないことを示す非常に類似の結果を与えるように思われる。ＣＵからの結果は同様に、０．２酵素レベルはいくぶん発酵を制限するが、Ｍ１結果の０．２ＧＡＵ／ｇｍより速いということを示す。これはＲＨＵ活性が非加熱でんぷんの加水分解を示す、より良いパラメーターであることを示す。ＣＵはＧＡＵ当たり、Ｍ１の約２倍のＲＨＵ活性を有し、ＣＵは類似のＧＡＵレベルで非加熱でんぷんをより速く加水分解するようである。０．５及び０．７５ＧＡＵ／ｇｍ量で過剰グルコースは特に高酵素レベルで観測される。実際に、でんぷん加水分解速度は発酵速度よりも速いようである。これらの結果は１５％程度のエタノールで、発酵が停止するようなので、エタノールが酵母に対して毒性を有するようであることも示す。
【０１５６】
図２のグラフ、パネルＣはＭ１をＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）に添加した発酵から得たエタノール結果を示す。当該結果が示すように、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）を低レベルのＭ１、０．２ＧＡＵ／ｇｍに添加することにより、エタノールの速度及び収量の両方がＭ１の性能を向上させた。これらの結果はＧＳＨ比が０．６以下しかないＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）に１．５以上のＧＳＨ比を有するグルコアミラーゼ調製物を加えることにより、非加熱でんぷんを加水分解でき、エタノールが加熱工程のない方法により作ることができるようになるということを示す。
【０１５７】
実施例３
加熱と非加熱コーンマッシュの比較
これらの実施例では、８３ｇｍの２８．９％トウモロコシ粉スラリーを磁気棒を含んだ２５０ｍｌボトル中に加えた以外は、実施例１に記載したものと類似の発酵を行った。ボトルを３０℃、水槽中の水中磁気攪拌器上に置き、発酵中穏やかにマッシュが混合されるようにした。ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）及びＭ１の組合せを表３に示すように試験した。これらの発酵を０．２７ｇｍの乾燥酵母を用いて開始させた。発酵後、ビールを６５℃強制空気オーブン中で乾燥させ、ＤＤＧＳと考えられるものが得られた（蒸留器乾燥粒子及びその溶解物）。このようにして、ＤＤＧＳの量的推計が得られ、ＤＤＧＳのでんぷん含量をでんぷん分析技術により得た。発酵のＨＰＬＣプロファイルも表３に示す。
【表３】
2005523689.tif 000004
【０１５８】
図３、パネルＡ、Ｂ及びＣに示すように、試験したＭ１の各レベルで、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）の添加によりエタノールの発酵速度及び収量が向上した。
【０１５９】
ＤＤＧＳのでんぷん分析は表４に示す。これらの分析及びＤＤＧＳの量から、その後、評価を発酵器中で変換されないまま残っているでんぷんの量から行った。これらの結果が示すように、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）のＭ１への添加は非加熱でんぷんの加水分解を改善するのを助ける。
【表４】
2005523689.tif 000005
【０１６０】
従って、これらの実施例で得られた結果は、１．５以上のＧＳＨ比を有するグルコアミラーゼ調製物を０．６以下のＧＳＨ比を有するグルコアミラーゼに加えることにより非加熱でんぷんを加水分解でき、エタノール発酵を非加熱のマッシュ上で行うことができるようになるということを示す。これらの結果は９％程度の低ＧＳＨ比に対する高ＧＳＨ比グルコアミラーゼの組成比率は非加熱でんぷんを加水分解するのに非常に効果的であるということを示した。
【０１６１】
実施例４
加熱と非加熱マッシュの発酵における残液の影響
この実施例は種々のレベルの残液を含む液化コーンマッシュの発酵を、種々のレベルの残液を含む非加熱コーンマッシュの発酵と比較して評価するために行う実験について記載する。当該発酵で使用する酵素は異なるものを用いた。ＦＥＲＭＥＮＺＹＭＥ（登録商標）は液化マッシュの発酵に用い、商業的に使用されるものと類似の調製物である。非加熱マッシュ発酵のために、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）及びＲＳＨ酵素Ｍ１の組み合わせを用いた。
【０１６２】
当該実験は、残液から得た固体が変化しても固形コーンが一定になるように準備した。これは、発酵槽中の合計固体は残液が増加するにつれて増加することを意味する。この残液はローカル乾式ミルエタノール設備から得られた。薄い残液は真空回転エバポレーターで４４％固体まで濃縮した。発酵槽中の合計固体を扱いやすくするために薄い残液を濃縮することが必要だった。各発酵槽のマッシュ組成は表５に示す。
【表５】
2005523689.tif 000006
【０１６３】
液化コーンマッシュに使用した酵素はＦＥＲＭＥＮＺＹＭＥ（登録商標）の０．４ＧＡＵ／ｇｍの液化コーンである。ＦＥＲＭＥＮＺＹＭＥ（登録商標）は、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）とコーンマッシュを発酵するための真菌プロテアーゼの特別なブレンドであり、ジェネンコー（登録商標）から市販している。非加熱発酵のために、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）とＭ１の組み合わせを液化コーンマッシュ試験操作に用いたＦＥＲＭＥＮＺＹＭＥ（登録商標）に含まれる同量のプロテアーゼと一緒に用いた。表５に示すように、発酵槽中の固体は様々である（マッシュ％ＤＳ）。発酵結果は下の表６に示す。
【表６】
2005523689.tif 000007
【０１６４】
商慣行において、特定量の残液は酵母栄養分のために再利用され、工場設備中の水分平衡を助ける。従って、残液にあまり影響されない発酵系は工業発酵設備において非常に望ましい。これらの実験の結果は、残液が非加熱マッシュにおける場合以上に液化マッシュの発酵に影響を与えるということを示す。
【０１６５】
図４は、両タイプのマッシュに加えた残液の量に対するエタノールの反応を示す。両方の場合において、残液固体が増加すると、エタノールレベルが減少する。しかし、図４が示すように、非加熱マッシュは加熱マッシュよりも残液に対してあまり敏感でない。
【０１６６】
図５は発酵７２時間後のグルコースプロファイルを示し、その結果は非常に飛躍的である。残液固体が加熱マッシュ中で増加すると、より多くのグルコースが発酵されずに残った。一方、非加熱マッシュ中では、基本的に検出可能なレベルのグルコースは全ての残液レベルで観測されなかった。この観測は、でんぷんが加水分解されると、素早く酵母によりエタノールになったので、非常に重要である。このレベルのグルコース蓄積は非常に例外的である。この観測は、たとえグルコースレベルが非常に低くても酵母が発酵中非常に活性なままであるという点において、特に酵母に関しても重要である。それに対し、加熱マッシュでは、たとえグルコースが十分に供給されていても、酵母はグルコースを発酵できなかった。
【０１６７】
図６は、加えた残液に関して発酵７２時間後の二糖類のプロットである。非加熱マッシュの二糖類レベルは加えた残液範囲の全体にわたって基本的に検出不可能であったが、加熱マッシュにおいて、残液レベルが増加すると二糖類レベルは増加した。
【０１６８】
図７に示すように、高級糖（すなわち、二糖類より大きなオリゴ糖）の図は多少類似した図であり、加熱マッシュの高級糖レベルは非加熱マッシュよりも加えた残液に関して高かった。
【０１６９】
図８は発酵７２時間後の乳酸レベルを示す。見ての通り、当該レベルは非加熱マッシュよりも加熱マッシュの方が高い。乳酸に関して一つ考えられることは、汚染の指標になるということである。本発明をいかなる特定の理論またはメカニズムに限定する趣旨のものでもないが、グルコース及び二糖類の両レベルは非加熱マッシュ中で常に非常に低いので、汚染微生物が基質をほとんど利用できないようにできる。
【０１７０】
図９は発酵７２時間後のグリセロールレベルを簡単に示す。そこに示す通り、やはり当該レベルはそれぞれの残液添加レベルにおいて、加熱マッシュよりも非加熱マッシュを用いた方が低い。酵母を用いた発酵時のグリセロール形成の要因は酵母が受けるストレスである。一般に、より多くのストレスを酵母が受けると、より多くのグリセロールが形成される。図９の結果は類似の残液レベルで、非加熱マッシュ中の酵母は受けるストレスがより少ないということを示す。しかし、加熱マッシュを用いて操作できるより高い残液レベルでも、より高いレベルのグリセロールが形成された。非加熱マッシュ中でより高いグリセロールレベルを用いても、酵母はより多くのエタノールを生成した。従って、酵母は加熱マッシュ中より非加熱マッシュ中のほうがより効果的に発酵するようである。
【０１７１】
前述の本記載及び実施例の種々のその他の例及び変更は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく当該開示の内容を読んだ当業者に明らかであり、そのような例または変更のすべては請求の範囲内に含まれる。ここに記載されたすべての文献及び特許はその内容の全体をここに引用するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】実施例１に記載した実験のエタノールの結果を示すグラフである。
【図２Ａ】パネルＡはＭ１を用いた非加熱トウモロコシ粉発酵からのエタノール結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】パネルＢはＣＵを用いた非加熱トウモロコシ粉発酵からのエタノール結果を示すグラフである。
【図２Ｃ】パネルＣはＭ１とＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）を用いた非加熱トウモロコシ粉発酵からのエタノール結果を示すグラフである。
【図３Ａ】パネルＡは実施例３に記載した実験で得られたエタノール結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】パネルＢは実施例３に記載した実験で得られたエタノール結果を示すグラフである。
【図３Ｃ】パネルＣは実施例３に記載した実験で得られたエタノール結果を示すグラフである。
【図４】２タイプのメッシュに加えた残液（ｓｔｉｌｌａｇｅ）の量に対するエタノールの反応を示す。
【図５】実施例４に記載した発酵７２時間後のグルコースの特徴を示す。
【図６】加えた残液に関する発酵７２時間後の二糖類のプロットである（実施例４を参照）。
【図７】高級糖（すなわち、二糖類より大きなオリゴ糖）のレベルを示す（実施例４を参照）。
【図８】発酵７２時間後の乳酸レベルを示す（実施例４を参照）。
【図９】発酵７２時間後のグリセロールレベルを簡単に示す（実施例４を参照）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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