(57)【要約】  対象における筋萎縮性側索硬化症（以下「ＡＬＳ」と略記する）を、患者の症状の進行度判定と進行のモニターを含めて、診断するための方法、ＡＬＳの治療等における薬物等の有効性を評価するための方法を提供する。対象におけるＡＬＳを、患者の症状の進行度判定と進行のモニターを含めて、診断するための方法であって、（ａ）対象から試料を得る工程と、（ｂ）質量分析等により試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物を分析する工程とクレアチニンの分析の工程を含む。幾つかの実施態様において、ＡＬＳ患者およびＡＬＳの疑いのある被験者の尿、血液などの試料に含まれるこれらの物質を分析することで、患者の症状の進行度判定も含めて診断し、進行をモニターする。さらに薬物等や治療等の効果を評価する。尿成分は、尿に含まれるタンパク質、代謝物、ホルモン等の測定可能な物質である。
2011108534.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のバイオマーカーとしてプロスタグランディンＤ２およびその代謝物を用いる方法。
【請求項２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の診断法としてプロスタグランディンＤ２およびその代謝物の解析とクレアチニンの解析を組み合わせて用いる方法。
【請求項３】
対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を診断するための方法であって、
（ａ）対象から試料を得る工程、
（ｂ）試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物を測定する工程、
（ｃ）試料中のクレアチニンを測定する工程および
（ｄ）試料の陽性または陰性標品のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度およびクレアチニン濃度を比較する工程であって、ここで対象がＡＬＳとして診断される工程を含む方法。
【請求項４】
標品が陽性標品である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
標品が、筋萎縮性側索硬化症の患者又は筋萎縮性側索硬化症の疑いのある被験者から得られた試料を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
筋萎縮性側索硬化症の治療における薬物の有効性を評価するための方法であって、
（ａ）筋萎縮性側索硬化症の、および筋萎縮性側索硬化症の疑いのある被験者から第１の試料を得る工程、
（ｂ）質量分析などにより第１の試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物を分析する工程、
（ｃ）クレアチニンを分析する工程、
（ｄ）対象に薬物等を投与する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の完了後、対象から第２の試料を得る工程、
（ｆ）質量分析法などにより第２の試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物を分析する工程、
（ｇ）クレアチニンの分析の工程、および
（ｈ）第１の試料のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度およびクレアチニン濃度を、第２の試料のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度およびクレアチニン濃度と比較する工程であって、ここで薬物等の有効性が評価される工程を含む方法。
【請求項７】
薬物等の有効性が、第１の試料のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度およびクレアチニン濃度と比べた第２の試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度およびクレアチニン濃度の変化として測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
対象がヒトである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
筋萎縮性側索硬化症の患者および筋萎縮性側索硬化症の疑いのある被験者がマウス、ラット、イヌからなる群から選択されるＡＬＳモデル動物およびヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
筋萎縮性側索硬化症の発症、進行、及び治療効果の評価を患者の尿成分の解析に基づいて行い、
前記尿成分は、尿に含まれるタンパク質、ホルモン、糖、核酸、脂質、及びそれらの代謝物を含む群から選択される測定可能な物質であり、
ひとつ以上の測定された尿成分の相対関係に基づき診断を行う、請求項３から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
尿中のｔＰＧＤＭ濃度の経時変化における概日リズム（サーカディアン・リズム）のデータを利用して、任意の採尿時刻の任意のｔＰＧＤＭ濃度の患者の最高濃度と最低濃度を推測するシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロスタグランディンＤ２とその代謝物およびクレアチニンの分析による筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の、進行度判定と進行のモニターを含めた、診断方法、治療における薬物の有効性を評価する方法および尿中のｔＰＧＤＭ濃度を推測するシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ルー・ゲーリック病または運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）としても知られている筋萎縮性側索硬化症（以下「ＡＬＳ」と略記する）は、中枢神経系の数種の神経変性疾患の一種である。ＡＬＳは、６０，０００人に１人が冒されており、発症平均年齢が５０歳から５５歳であり、最も一般的な成人発症運動ニューロン疾患であるが、筋委縮を伴い、筋ジストロフィー症に似た筋肉疾患の側面も持つ。筋ジストロフィーは骨格筋の変性・壊死を主病変とし、臨床的には進行性の筋力低下をみる遺伝性の疾患と定義される（M.A.Alderfer他 J Pediatr Psychol. 33:1046-1061 (2008）、Z.Wang,他ILAR J.50:187-198 (2009)）。しかしＡＬＳは脳、脳幹、および脊髄における運動ニューロンの急速な進行性変性により特徴付けられる（Cleveland et al., Nat. Rev. Neurosci.,2, 806-19 (2001)）。このようにＡＬＳの病態は神経と筋肉の両側面を有する点、さらに構音発声障害を伴う球麻痺の場合など患者の症状の多様性を特徴とするとも言える。進行度判定と進行モニターを含めて診断方法の確立は不十分で治療方法が未確立なこの難病は、診断時からの患者の生存期間中央値は５年である。【０００３】
ＡＬＳは遺伝的背景が不明な散発性、および解明されている家族性型の両方が存在する。家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）は全ＡＬＳ症例のわずか５〜１０％である。過去１０年間に、多くの基礎および治験研究で、この疾患の家族性型の解明に重点がおかれ、ＦＡＬＳに関連する８個の遺伝子変異体の同定につながった。Ｃｕ/Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ−１（ＳＯＤ１）遺伝子の点突然変異体を発現させたトランスジェニックマウスは毒性機能獲得によりヒトＡＬＳと同様な日齢依存的進行性運動麻痺を発現する（Rosen et al., Nature, 362：59-62 (1993)、Rosen et al. Hum Mol Genet, 3：981-987 (1994)およびBorchelt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91： 8292-8296 (1994)）。【０００４】
しかしながら、これらの遺伝子変異では散発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）については説明できない。ＳＡＬＳの病因は多因子性である。一方、上述したＳＯＤ１トランスジェニックマウスおよびラットによる、インビトロ運動ニューロン初代培養または脊髄スライス培養、インビボ画像研究および組織試料の死後検査を含む多くのモデル系がＡＬＳの病因を解明するために利用されている（Subramaniam et al., Nat. Neurosci., 5: 301-307 (2002)、Nagai et al., J. Neurosci., 21: 9246-9254 (2001)、Menzies et al. Brain, 125: 1522-1533 (2002)、Kim et al. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 62: 88-103 (2003)、およびRanganathan et al., Am. J. Pathol., 162: 823-835 (2003)）。これらの研究が治療標的およびいくつもの臨床試験をもたらしてきたとはいえ、発症を遅らせる、または生存を延長させる有効な薬物はない。グルタミン酸アンタゴニストであるリルゾール（リルテック（Rilutek）（登録商標）、Aventis社）は現在のところ、ＡＬＳを治療するために入手可能である唯一のＦＤＡ（US Food and Drug Administration）認可、および日本で保険適用の薬物である。リルゾールはしかしながら、平均余命をほんの２〜３ヶ月しか伸ばせない（Miller et al., Amyotrophic Lateral Sclerosis & Other Motor Neuron Disorders, 4: 191-206 (2003)）。クレアチンおよびα−トコフェノールはＳＯＤ１トランスジェニックマウスにおいてＡＬＳの症状を緩和するのに一定の効果を示すが、ヒトＡＬＳ患者においてはわずかな効果を示すにすぎない（Groeneveld et al., Annals of Neurology, 53: 437-45 (2003)、およびDesnuelle et al., Amyotrophic Lateral Sclerosis & Other Motor Neuron Disorders, 2: 9-18 (2001)）。【０００５】
さらに、ＡＬＳのバイオマーカーとして生理活性物質を特定したものはない。【０００６】
したがって、ＡＬＳの進行度判定を含めて特定的な診断法は存在せず、最終的にはＭＲＩ、ＭＲＡ、ＣＴ、脳血管像映、髄液分析等からの除外診断である。診断には針筋電図検査も行われるが、この検査は職人技的でもある。筋肉障害の指標として血液検査でのクレアチンホスホキナーゼ値も着目されるが発症や進行とは必ずしも相関しない。腎臓障害により上昇し、その指標として広く普及している尿のクレアチニン値は、この物質が筋肉で合成されることを反映してＡＬＳではその値の低下が報告されている（Narayanan et al., Clin. Chem., 26: 1119-1126 (1980)、およびCorbett et al., Neurology, 32: 550-552 (1982)）。【０００７】
しかし、その詳細な解析と診断方法としての確立はなされていない。近年、プロテオミクスの手法により質量分析法（ＭＳ）を用い患者各部位の標本のタンパク質分析プロファイル比較により陽性・陰性を判断する方法が開発された。しかし、高価な機器が必要であり、かつ解析は特定のタンパク質を標的とするのではなく全体のＭＳスペクトルの複雑なピークの差異を判定するものである（Pasinetti et.al. Neurology 66: 1218-22 (2006)）。このような正の診断方法の無いことは確定診断を遅らせ、発症年齢の高さと相まって、発症とその原因への疑問と生活に由来する行動により非常に危険な転倒事故などを多発する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Cleveland et al., Nat. Rev. Neurosci., 2: 806-819 (2001)
【非特許文献２】Rosen et al., Nature, 362: 59-62 (1993)
【非特許文献３】Rosen et al. Hum Mol Genet, 3: 981-987 (1994)
【非特許文献４】Borchelt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8292-8296 (1994)
【非特許文献５】Subramaniam et al., Nat. Neurosci., 5: 301-307 (2002)
【非特許文献６】Nagai et al., J. Neurosci., 21: 9246-9254 (2001)
【非特許文献７】Menzies et al. Brain, 125: 1522-1533 (2002)
【非特許文献８】Kim et al. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 62: 88-103 (2003)
【非特許文献９】Ranganathan et al., Am. J. Pathol., 162: 823-835 (2003)
【非特許文献１０】Miller et al., Amyotrophic Lateral Sclerosis & Other Motor Neuron Disorders, 4: 191-206 (2003)
【非特許文献１１】Groeneveld et al., Annals of Neurology, 53: 437-445 (2003)
【非特許文献１２】Desnuelle et al., Amyotrophic Lateral Sclerosis & Other Motor Neuron Disorders, 2: 9-18 (2001)
【非特許文献１３】Pasinetti et.al. Neurology 66: 1218-1222 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＡＬＳの治療標的を同定するための改良された方法および該疾患を進行度判定と進行モニターを含めて診断するための改良された方法が緊急に必要である。【００１０】
本発明の目的はプロスタグランディンＤ２とその代謝物およびクレアチニンの分析によるＡＬＳの進行度判定とそのモニターを含めた診断方法および治療等の薬物等の効果を評価する方法を提供することである。【００１１】
プロスタグランディンＤ２は慢性的な神経疾患において、脳における免疫担当細胞であるミクログリアやアストロサイトの活性化を促して、炎症反応を増悪させる。また、クラッベ病のモデルマウスでプロスタグランディンＤ２産生抑制剤を使用すると、症状は軽減する（Mohri et al. Glia, 42: 263-274（2003）、Mohri et al. J Neurosci 26:4383-93（2006）およびMohri et al. J Neuropathol Exp Neurol.66:469-80 (2007)）。【００１２】
近年、プロスタグランディンＤ２はＤｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーでも産生が増えていることが推測されている。増加したプロスタグランディンＤ２は筋ジストロフィーモデルマウスの筋壊死を増悪させる。また、このマウスにプロスタグランディンＤ２産生抑制剤を与えると、筋肉の壊死は軽減する（谷池  他。厚生省精神・神経疾患研究8〜10年度研究報告書  筋ジストロフィーおよび関連疾患の臨床病態と治療法に関する研究  Page30-32. （1999）、Okinaga et al. Acta Neuropathol 104: 377-384. （2002）およびMohri I et.al.Am J.Path. 174:1735-44 (2009)）。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、以下に示す本発明に至った。【００１４】
本発明は対象におけるＡＬＳを進行度判定および進行モニターを含めて、診断するための方法を提供する。該方法は（ａ）対象から試料を得る工程、（ｂ）質量分析等により試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度を解析する工程、（ｃ）クレアチニン濃度を解析する工程および（ｄ）試料中のクレアチニンとプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度を、進行度および過去のデータを含めて、陽性または陰性標品と比較する工程を含む。【００１５】
本発明はまた、ＡＬＳの治療における薬物の有効性を評価するための方法を提供する。該方法は（ａ）ＡＬＳ患者および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の疑いのある被験者から第１の試料を得る工程、（ｂ）質量分析等により第１の試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度を解析する工程、（ｃ）クレアチニン濃度を解析する工程、（ｄ）対象に薬物等を投与する工程、（ｅ）工程（ｄ）の完了後、対象から第２の試料を得る工程、（ｆ）質量分析等により第２の試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度を解析する工程、（ｇ）クレアチニンの分析の工程、および（ｈ）第１の試料中のクレアチニン濃度とプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度を第２の試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度と比較する工程を含む。【００１６】
本発明はまた、筋萎縮性側索硬化症の発症、進行、及び治療効果の評価を患者の尿成分の解析に基づいて行う筋萎縮性側索硬化症の診断方法である。ここで、尿成分とは、尿に含まれるあらゆる測定可能な物質（タンパク質、ホルモン、糖、核酸、脂質、及びそれらの代謝物）を指す。さらに、本発明は、ひとつ以上の測定された尿に含まれる物質の相対関係をその診断方法の基本概念とする。
【発明の効果】
【００１７】
本願発明によれば、ＡＬＳのバイオマーカーとして、被験者の尿中のプロスタグランディンＤ２の代謝物の量または濃度の分析と、クレアチニンの量または濃度の分析を組み合わせることにより、被験者がＡＬＳを発症しているか否かが高精度で、また進行度および進行性を含めて判定可能である。また、尿中のプロスタグランディンＤ２およびプロスタグランディンＤ２の代謝物をＡＬＳのバイオマーカーとして用い、例えば、ＡＬＳ患者の治療方法の開発、ＡＬＳ患者への有効な薬剤の開発に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】プロスタグランディンＤ２の代謝物である１１，１５−ｄｉｏｘｏ−９−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，３，４，５−ｔｅｔｒａｎｏｒｐｒｏｓｔａｎ−１，２０−ｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ（ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ、以下「ｔＰＧＤＭ」と略記する）を液体クロマトグラフ質量分析により示す図である。
【図１Ｂ】ＡＬＳ患者Ｓの尿中プロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭの液体クロマトグラフ質量分析による測定結果を示す図である。
【図１Ｃ】健常者の尿中プロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭの液体クロマトグラフ質量分析による測定結果を示す図である。
【図２】図１Ｂに示したＡＬＳ患者Ｓの６ヵ月後の、昼夜における尿中ｔＰＧＤＭ濃度の推移を示す図である。
【図３Ａ】昼夜における患者Ｓを含むＡＬＳ患者（図中「ＡＬＳと表記」）の尿中ｔＰＧＤＭ濃度の推移を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ａの昼夜におけるＡＬＳ患者の尿中ｔＰＧＤＭ濃度の低濃度部位の拡大図である。
【図３Ｃ】昼夜における健常者の尿中ｔＰＧＤＭ濃度の推移を示す図である。
【図３Ｄ】図３Ｃの昼夜における健常者の尿中ｔＰＧＤＭ濃度の低濃度部位の拡大図である。
【図４Ａ】図２、図３Ａ、図３Ｃに示した昼夜２４時間におけるＡＬＳ患者および健常者の尿中ｔＰＧＤＭ平均濃度を比較した図である。
【図４Ｂ】図２、図３Ａ、図３Ｃに示した昼間（午前６時から午後６時まで）におけるＡＬＳ患者および健常者の尿中ｔＰＧＤＭ平均濃度を比較した図である。
【図４Ｃ】図２、図３Ａ、図３Ｃに示した夜間（午後６時から午前６時まで）におけるＡＬＳ患者および健常者の尿中ｔＰＧＤＭ平均濃度を比較した図である。
【図４Ｄ】図２、図３Ａ、図３Ｃに示した昼夜における尿中ｔＰＧＤＭ濃度を、それぞれのＡＬＳ患者の最低値とそれぞれの健常者の最高値とを比較した図である。
【図５Ａ】ＡＬＳ患者と健常者の約２４時間（朝から翌朝まで）採尿した総尿中のｔＰＧＤＭ濃度を示した図である。
【図５Ｂ】ＡＬＳ患者と健常者の約２４時間（朝から翌朝まで）採尿した総尿中のｔＰＧＤＭ総量を示した図である。
【図６】患者の症状の歩行機能に着目し、進行度１を歩行出来る、２を車椅子生活、３を寝たきり生活、４を人工呼吸器装着に区分し横軸に、縦軸にそれぞれの患者の尿中プロスタグランディンＤ２代謝物であるｔＰＧＤＭの昼夜平均濃度を示した図であり、健常者の昼夜平均濃度の平均は水平の破線で示した図である。
【図７Ａ】図１Ｂに示したＡＬＳ患者Ｓに対して、「ラジカット」（田辺三菱製薬（株）製、一般名「エダラボン」）を２日目１５時から１７時に点滴により３０ｍｇ投与した場合の、前後を含めたそれぞれの時間の尿全量（排尿は全て採取）中のｔＰＧＤＭ濃度の推移を示した図である。
【図７Ｂ】図７Ａに示した採尿総量中のｔＰＧＤＭ量を示した図である。
【図８Ａ】昼夜にわたるクレアチニン濃度の推移を示した図であって、尿試料はｔＰＧＤＭ解析を行った同じ試料を用い、５名のＡＬＳ患者のデータに、患者Ｓの２日間にわたるデータを加えた図である。
【図８Ｂ】昼夜にわたる健常者５名の尿中クレアチニン濃度の推移を示した図である。
【図９Ａ】図８Ａ、図８Ｂの昼夜のＡＬＳ患者および健常者の尿中クレアチニン平均濃度を比較した図である。
【図９Ｂ】図８Ａ、図８Ｂの昼間のＡＬＳ患者および健常者の尿中クレアチニン平均濃度を比較した図である。
【図９Ｃ】図８Ａ、図８Ｂの夜間のＡＬＳ患者および健常者の尿中クレアチニン平均濃度を比較した図である。
【図９Ｄ】図８Ａ、図８Ｂの昼夜のＡＬＳ患者尿中クレアチニン濃度最高値と健常者最低値の比較図である。
【図１０Ａ】ＡＬＳ患者と健常者の約２４時間（朝から翌朝まで）採尿した総尿中のクレアチニン濃度を示す図である。
【図１０Ｂ】ＡＬＳ患者と健常者の約２４時間（朝から翌朝まで）採尿した総尿中のクレアチニン総量を示す図である。
【図１１】尿中クレアチニン昼夜平均濃度と患者の症状の進行度との関係を調べた図であって、破線は健常者の尿中クレアチニン昼夜平均濃度の平均を示す図である。
【図１２Ａ】尿中のｔＰＧＤＭ濃度とクレアチニン濃度の相関をＡＬＳ患者と健常者について、昼夜の平均濃度で調べた図である。
【図１２Ｂ】尿中のｔＰＧＤＭ濃度とクレアチニン濃度の相関をＡＬＳ患者と健常者について、２４時間採取した総尿中の濃度で調べた図である。
【図１２Ｃ】尿中のｔＰＧＤＭ量とクレアチニン量の相関をＡＬＳ患者と健常者について、２４時間採取した総尿中の総量で調べた図である。
【図１３】尿中のｔＰＧＤＭ濃度から最高濃度と最低濃度を推測するシステムにより得られた濃度推移モデルの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
筋萎縮性側索硬化症（以下「ＡＬＳ」と略記する）は、全身の筋肉の萎縮と筋力低下が徐々に進行し死に至る疾患である。この疾患は、その発症原因は十分には解明されておらず治療方法も確立していない、いわゆる難病の一種である。
【００２０】
本実施の形態は対象におけるＡＬＳを進行度判定と進行速度を含めて、診断するための方法を提供する。該方法は（ａ）対象から試料を得る工程、（ｂ）質量分析等により試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度を解析する工程、（ｃ）クレアチニン濃度を解析する工程、および（ｄ）試料中のクレアチニン濃度とプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度を、進行度と本人の過去のデータを含めた、陽性または陰性標品と比較する工程を含む。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、用語「試料」は対象から単離された生体材料を示す。対象は、任意の適切な動物であり得るが、好ましくは、マウス、ラット、イヌ、サルまたはヒトなどの哺乳類である。前述の発明の方法は、対象が非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、サル、イヌなど）の場合に疾患の動物モデルにおけるＡＬＳを診断するのに用いることができることが意図される。
【００２２】
試料は例えば、生検、採血、採尿、腰椎穿刺（すなわち、脊椎穿刺）、脳室穿刺、および大槽穿刺によるなどの、当技術分野で公知の任意の適切な方法で得ることができる。本発明の好ましい実施態様において、試料は尿である。
【００２３】
アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、およびＡＬＳのような多くの神経変性疾患は、疾患の表現型に寄与するタンパク質異常の蓄積または存在により特徴付けられ、ゆえに当技術分野で「タンパク質病（Ｐｒｏｔｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）」とも呼ばれる（Jellinger, Movement Disorders, 18, Suppl 6, S2-12 (2003)、およびPaulson, American Journal of Human Genetics, 64, 339-45 (1999)）。生体試料中に存在する全てのタンパク質およびペプチドを一括して解析することは、当技術分野で「プロテオーム」と呼ばれることが多い。
【００２４】
一方、現時点で、ＡＬＳのバイオマーカーとして特定の物質および遺伝子産物は同定されていない。本発明は患者の負担が殆ど無い採尿により試料を得、プロスタグランディンＤ２およびその代謝物をクレアチニンと共に測定することにより、進行度と進行速度を含めて、早期の診断を可能とする。
【００２５】
試料調製後の、本発明の方法には、質量分析等による試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度の分析と、クレアチニン濃度の解析が含まれる。プロスタグランディンＤ２およびその代謝物の適切な質量分析法の例には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、（Ｐｒｏｔｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ））質量分析があるが、測定する物質が特定されているため、高速液体クロマトグラフィーやＥＬＩＳＡ等抗体を用いた検出、測定方法の利用も可能である。例えば、高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」と略記する）に質量分析計を直結した液体クロマトグラフ質量分析（以下「ＬＣ／ＭＳ」）を用いてもよい。
【００２６】
本実施の形態において、試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物は「ＬＣ／ＭＳ」質量分析により分析されることが好ましい。
【００２７】
本実施の形態はさらに、対象においてＡＬＳの治療における薬物等の有効性を評価するための方法を提供する。該方法は（ａ）ＡＬＳ患者およびＡＬＳの疑いのある被験者から第１の試料を得る工程、（ｂ）質量分析等により第１の試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物を解析する工程、（ｃ）第１の試料中のクレアチニンを解析する工程、（ｄ）対象に薬物等を投与する工程、（ｅ）薬物等を投与した後、対象から第２の試料を得る工程、（ｆ）質量分析等により第２の試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物を解析する工程、（ｇ）クレアチニンを解析する工程、（ｈ）第２の試料中のプロスタグランディンＤ２およびその代謝物を解析する工程、（ｉ）第２の試料中のクレアチニンを解析する工程、および（ｊ）第１の試料中と第２の試料中のクレアチニン濃度とプロスタグランディンＤ２およびその代謝物濃度を比較する工程であって、ここで薬物等の有効性が評価される工程を含む。
【００２８】
本実施の形態では、ＡＬＳの治療における薬物等の有効性を評価するための方法としてプロスタグランディンＤ２という特定されたバイオマーカーを指標とするため、プロスタグランディンＤ２およびその代謝物のいかなる測定法も利用可能である。
【００２９】
本実施の形態における方法はＡＬＳの治療に適切な任意の薬物等の有効性を評価するのに用いることができる。適切な薬物等にはリルゾール（Ｒｉｌｕｔｅｋ（登録商標）、Ａｖｅｎｔｉｓ社）のような現在市販されているもの、および今後に開発されるものが挙げられる。
【００３０】
さらに本実施の形態では、１１，１５−ｄｉｏｘｏ−９−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，３，４，５−ｔｅｔｒａｎｏｒｐｒｏｓｔａｎ−１，２０−ｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ（ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ、以下「ｔＰＧＤＭ」と略記する）が主たるプロスタグランディンＤ２の代謝物である（Song, W., Wang, M., Ricciotti, E., et al. J.Biol.Chem 283,1179-1188 (2008)）ことより、上記工程（ｂ）および工程（ｆ）において、好ましくはプロスタグランディンＤ２代謝物であるｔＰＧＤＭが質量分析法により検出されている。但し、検出物質および検出方法はこれに限るものではない。
【００３１】
本実施の形態における筋萎縮性側索硬化症の診断方法は、筋萎縮性側索硬化症の発症、進行、及び治療効果の評価を患者の尿成分の解析に基づいて行う。ここで、尿成分とは、尿に含まれるあらゆる測定可能な物質（例えばタンパク質、ホルモン、糖、核酸、脂質，及びそれらの代謝物）を指す。さらに、この診断方法では、ひとつ以上の測定された尿に含まれる物質の相対関係に基づいて、診断することを基本概念とする。
【００３２】
以下の実施例は本発明をさらに詳しく説明するものであるが、当然のことながら、その範囲の如何なる様式にも限定をするものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３３】
＜第一部＞
プロスタグランディンＤ２とその代謝物の分析によるＡＬＳの、進行度判定とそのモニターを含めた診断方法および治療等の薬物等の効果を評価する方法：
本実施例での尿中のプロスタグランディンＤ２代謝物の抽出に関しては以下の手順でプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを抽出した。
（Ｉ）尿は基本的に凍結保存する（−２０℃以下）。
（ＩＩ）凍結尿の解凍は流水で行う。前日から低温室に放置してもよい。
（ＩＩＩ）解凍後、軽く遠心を行った後、上清を使用する。なお、濁りがとれなくても良い。
（ＩＶ）上清１ｍＬに対して、以下に示すメソッド１またはメソッド２の抽出精製操作を行う。
（Ｖ）尿の一部（約１．９ｍＬ）を２ｍＬチューブ１本に小分けして凍結保存（−２０℃以下）する。その残りの尿は分析結果が出るまでの１〜２週間程度保存する。
（ＶＩ）尿の一部でクレアチニンを測定する。【００３４】
メソッド１［酢酸エチル抽出］：
（ｉ）尿検体または標準試料１ｍＬ（５０〜１０００μＬ）を分取する。
（ｉｉ）１０％酢酸２０μＬで酸性にする（最終２％）。
（ｉｉｉ）内部標準品（ＩＳ）を添加する（ｄ６−ＰＧＤＭ）。重水素ラベル化ｔＰＧＤＭ使用。
（ｉｖ）酢酸エチル２ｍＬを加え攪拌する（５秒以上）。
（ｖ）遠心３分以上（４℃で）行う。
（ｖｉ）酢酸エチル相を回収する（水相を取り込まないように注意）。
（ｖｉｉ）上記操作（iv）〜（vi）を２回〜３回繰り返す。
（ｖｉｉｉ）回収した酢酸エチル相を濃縮して（ＳｐｅｅｄＶａｃ等により）乾固させる。【００３５】
メソッド２［固相抽出／Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８  Ｐｌｕｓ］：
（ｉ）尿検体または標準試料１ｍＬ（５０〜１０００μＬ）を分取する。
（ｉｉ）１０％酢酸２０μＬ（２％分の酢酸）で酸性にする。
（ｉｉｉ）ＩＳ（内部標準品）を添加する（ｄ６−ＰＧＤＭ）。重水素ラベル化ｔＰＧＤＭ使用。
（ｉｖ）「Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８  Ｐｌｕｓ」（３６０ｍｇ）のコンディショニング：メタノール２ｍＬで湿潤、０．５％酢酸２ｍＬで平衡化する。
（ｖ）試料をＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８  Ｐｌｕｓに注入する（注意：１ｍＬ／分以下の流速で）。
（ｖｉ）０．５％酢酸０．５ｍＬを流す。
（ｖｉｉ）ヘキサン５〜６ｍＬで洗浄（多すぎても問題はない。「Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８  Ｐｌｕｓ」内の水分を十分に除去）。
（ｖｉｉｉ）酢酸エチル２ｍＬでｔＰＧＤＭを回収する。
（ｉｘ）回収した酢酸エチル溶液を濃縮して（ＳｐｅｅｄＶａｃ等により）乾固させる。
（ｘ）乾固後水分が残る場合、酢酸エチルを加えて酢酸エチル抽出操作を行う。
（ｘｉ）使用後の「Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８  Ｐｌｕｓ」はイソプロパノール（ＩＰＡ）１ｍＬと、続けてメタノール２ｍＬ程度で洗浄する（「Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８  Ｐｌｕｓ」は数回の繰り返し使用可能）。【００３６】
［実施例１］
ＡＬＳ患者ＳにおけるｔＰＧＤＭの検出：
図１ＡにはプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭの標準試料の液体クロマトグラフ質量分析（以下「ＬＣ／ＭＳ」）による測定結果が示されている。ここで、ＬＣ／ＭＳによる測定は基本的には前記のＳｏｎｇ，Ｗ．他（２００８）に準じている。検出はプレカーサーイオン；３２７ａｍｕ、プロダクトイオン；１５５ａｍｕの条件にて行った。具体的には以下である。【００３７】
【表１】
2011108534.tif 000003
【００３８】
図１ＢにはＡＬＳ患者Ｓ（６６歳、男性、体重５８ｋｇ、発症約２年、発声構音と歩行障害、平地での自力での再起立不可。ＳＯＤ１遺伝子および単球・マクロファージＣＤ１６（ＦＣγ受容体ＩＩＩ）の発現は正常。）の尿中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭのＬＣ／ＭＳによる測定結果が示されている。ＬＣ／ＭＳによる測定条件は図１Ａの場合と同様である。【００３９】
図１Ｃには健常者の尿中のプロスタグランディンＤ２代謝物であるｔＰＧＤＭのＬＣ／ＭＳによる測定結果が示されている。ＬＣ／ＭＳによる測定条件は図１Ａの場合と同様である。【００４０】
プロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭは分子量３２８の水溶性の高い化合物で、短時間で尿から排泄される。酢酸エチル抽出法と固相抽出法を用いて尿から抽出し、これを上記ＬＣ／ＭＳにて分析した。この分析ではネガティブのイオン化を行い、３２７ａｍｕの質量数のプレカーサーイオンをターゲットとし、さらにフラグメント化を行い、１５５ａｍｕのプロダクトイオンを検出することで、プロスタグランディンＤ２の代謝物を高い選択性をもって検出することができる。図１ＡにはｔＰＧＤＭの標準試料のクロマトグラムが示され、ｔＰＧＤＭは１８．２分に溶出している。【００４１】
図１Ｂに示すように、ＡＬＳ患者Ｓの尿を分析したところ、ｔＰＧＤＭが検出され、ｔＰＧＤＭの標準試料で作成した検量線から定量を行った結果、２．６ｐｇ／μｌ（ｎｇ／ｍｌ）の濃度で尿中に存在することが判明した。【００４２】
図１Ｃに示すように、健常者の尿を分析したところ、ｔＰＧＤＭは検出されなかった。【００４３】
患者Ｓの尿には、プロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭが特異的に検出されていることが分かる。従ってプロスタグランディンＤ２の代謝物である「ｔＰＧＤＭ」は「ＡＬＳのバイオマーカー」になることが分かる。【００４４】
［実施例２］
実施例１に示したＡＬＳ患者Ｓの６ヵ月後の昼夜における尿中のｔＰＧＤＭ濃度の推移を検証した。図２に示されるように、患者Ｓ尿中のｔＰＧＤＭは時間によって濃度が変動するものの全ての時間に於いて検出された。【００４５】
［実施例３］
患者Ｓに加えて、新たに５名のＡＬＳ患者（男性、５３〜７２歳）と６名の健常者に於いて、昼夜における尿中のｔＰＧＤＭ濃度の推移を検証した。【００４６】
図３Ａには、昼夜におけるＡＬＳ患者の尿中ｔＰＧＤＭ濃度の推移が示されている。図３Ｂは図３Ａの低濃度領域を拡大した図である。図３Ｃには、昼夜における健常者の尿中ｔＰＧＤＭ濃度の推移が示されている。図３Ｄは図３Ｃの低濃度領域を拡大した図である。【００４７】
実施例２の図２に示した１名と実施例３の図３Ａに示した５名の計６名のＡＬＳ患者および図３Ｃに示した６名の健常者の尿中ｔＰＧＤＭ平均濃度の比較を図４に示している。図４Ａは昼夜２４時間の、図４Ｂは昼間（午前６時から午後６時以前）の、図４Ｃは夜間（午後６時から午前６時以前）の平均濃度の比較を示した。さらに図４Ｄには、昼夜におけるそれぞれの患者最低濃度と健常者最高濃度の比較を示した。【００４８】
患者の尿にはより高濃度のｔＰＧＤＭが検出されており、片側ｔ検定により患者と健常者の値を解析した。その結果、昼夜２４時間、昼間および夜間の平均濃度の有意差はそれぞれ６２．０９ｎｇ／ｍＬ（
【数１】
2011108534.tif 000004
）、８３．８２ｎｇ／ｍＬ（
【数２】
2011108534.tif 000005
）及び５６．２４ｎｇ／ｍＬ（
【数３】
2011108534.tif 000006
）であった。【００４９】
さらに、昼夜における患者最低濃度と健常者最高濃度との有意差は３０．７１ｎｇ／ｍＬ（
【数４】
2011108534.tif 000007
）であった。【００５０】
ｔの計算式は、以下の通りである。
【数５】
2011108534.tif 000008
【００５１】
実施例２と３の結果から、患者の尿には健常者に対して有意に、如何なる時間帯でも高濃度にｔＰＧＤＭが検出されることが分かった。【００５２】
それでは最適な採尿時間帯は何時だろうか。図３のデータから患者の尿中のｔＰＧＤＭ濃度は夕刻に最低値を示し、その後上昇し午前３時〜５時の時間帯に最高値を示すことが分かる。従って、採尿はこの時間帯が最適と言える。【００５３】
［実施例４］
ＡＬＳ患者５名と健常者６名の２４時間採尿の総尿中ｔＰＧＤＭ濃度と総量を検証した。【００５４】
図５ＡにはｔＰＧＤＭ濃度を、図５ＢにはｔＰＧＤＭ量を示した。患者の尿には、健常者に対して有意に、高濃度に（有意差６６．４５ｎｇ／ｍＬ（
【数６】
2011108534.tif 000009
）、かつより多量に（有意差６７．７９μｇ（
【数７】
2011108534.tif 000010
））ｔＰＧＤＭが検出されることが明らかになった。この結果は実施例３の結果を追認している。【００５５】
以上の結果から、ｔＰＧＤＭをＡＬＳのバイオマーカーとして用いることに意義があり有効であることが判明した。【００５６】
［実施例５］
患者のＡＬＳ症状の進行状態とｔＰＧＤＭ濃度の関係を検証した。【００５７】
図６は患者の症状の歩行機能に着目し、進行度１を歩行出来る、２を車椅子生活、３を寝たきり生活、４を人工呼吸器装着に区分し横軸に、縦軸にそれぞれの患者の尿中プロスタグランディンＤ２代謝物であるｔＰＧＤＭの図４Ａの昼夜平均濃度を示した図である。健常者の昼夜平均濃度の平均は水平の破線で示してある。進行度が１から３に進むに伴い、患者の尿中プロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭの平均濃度が上昇しているのが分かる。この上昇の進行度に対する相関係数は０．８４である。また、進行度１で値が飛びぬけたデータを除外した相関係数は０．９８である。【００５８】
相関係数の計算式は、以下の通りである。
【数８】
2011108534.tif 000011
【００５９】
従って、ｔＰＧＤＭはＡＬＳのバイオマーカーとしてのみならず、進行度の判定診断にも有効であるといえる。【００６０】
［実施例６］
ＡＬＳ治療薬投与におけるｔＰＧＤＭの変化（薬剤効果のモニタリング）：
実施例１の図１Ｂに示したＡＬＳ患者Ｓに対して、１６ヵ月後に「ラジカット」（田辺三菱製薬（株）製、一般名「エダラボン」）を投与（２日目の１５時〜１７時に点滴により３０ｍｇを５００ｍＬのリンゲル液ボタコールＲ（大塚製薬）に混合投与）した。前後を含めた１日目から５日目までの、それぞれの時間の尿全量（排尿は全て採取）中のｔＰＧＤＭの濃度および量の推移を調べた。【００６１】
図７Ａには「ラジカット」投与前後のｔＰＧＤＭの濃度を、図７Ｂには総量を示した。【００６２】
点滴後は尿量が不安定であるためｔＰＧＤＭの解析には総量を用いることでより精度の高い解析結果を得ることができる。点滴投与以後から翌日（図７Ａ、７Ｂ中、３日目）は尿中のｔＰＧＤＭ量が少し低下し、一方、点滴投与後２〜３日目（図７Ａ、７Ｂ中、４，５日目）の起床直後の尿に顕著に多量にｔＰＧＤＭが検出された。【００６３】
［実施例のまとめ］
実施例１においてＡＬＳ患者Ｓの尿中に健常者には見られないｔＰＧＤＭの排出が見られた。これはＡＬＳのバイオマーカーとなりうることを示唆している。【００６４】
実施例２の図２の結果は実施例１の図１Ｂの患者の６ヵ月後のものである。尿中のｔＰＧＤＭ濃度は６カ月間で２．６ｎｇ／ｍＬから、最低５．０ｎｇ／ｍＬ、最高２４．３ｎｇ／ｍＬ、平均１７．１ｎｇ／ｍＬに上昇している。この間、患者の症状は、歩行時の頭あげ不可、自力での車の昇降不可、発声の後退等の進行が認められた。さらに実施例６の図７Ａの結果はその後１０ヶ月のものである。ラジカット点滴前のコントロールとしてのその濃度は、最低１６．２ｎｇ／ｍＬ、最高２８．７ｎｇ／ｍＬ、平均２２．７ｎｇ／ｍＬに上昇している。この間の症状の進行は自力歩行困難化等である。このように、尿中のｔＰＧＤＭはＡＬＳのバイオマーカーであり、その濃度は症状の進行速度のモニター等にも利用できることが判明した。【００６５】
実施例３において患者Ｓに加えて５名のＡＬＳ患者と６名の健常者について、尿中のｔＰＧＤＭ濃度を解析した。実施例２の患者Ｓを含め患者６名対健常者６名の解析より、患者の尿には有意に高濃度のｔＰＧＤＭが排出されていることが明らかになった。また午前３〜５時ごろに採取した患者尿中に最も高濃度のｔＰＧＤＭが排出されていることが明らかになった。【００６６】
実施例４では２４時間採尿し全てをプールした総尿量中のｔＰＧＤＭ濃度と総量を調べた。その結果、患者の尿では有意に高いｔＰＧＤＭ濃度と総量値を示した。【００６７】
以上の結果からｔＰＧＤＭはＡＬＳの診断に適したバイオマーカーである。【００６８】
実施例５および実施例１，２の患者Ｓのデータより尿中ｔＰＧＤＭ濃度とＡＬＳの進行状態に相関があることが明らかになった。このことは本法がＡＬＳ進行および治療による回復のモニタリングとしても有効であることを示唆する。【００６９】
実施例６においてラジカット投与直後尿中ｔＰＧＤＭの濃度が低下した。これはラジカットの体内動態の早さ（渡辺俊明他YAKUGAKU ZASSHI 124, 99-111 (2004)および田辺三菱製薬株式会社医薬品インタビューフォーム日本標準商品分類番号：８７１１９）と符合した一時的な阻害効果と考えられる。また、その後（投与後２〜３日後）において顕著で多量な排出を確認した。これはいわゆるリバウンドのようでもあり、投与の何らかの効果を反映していると考えられる。【００７０】
この結果のみから、「ラジカット」の点滴が治療に有効か判定することは難しいが、ｔＰＧＤＭをＡＬＳのバイオマーカーとして用い、薬効を解析することは可能であり、また「ラジカット」の点滴と他の方法を組み合わせる等の治療方法の有効性を判定することができるであろう。このように、本発明の分析により薬剤等の効果の判定が可能となる。【００７１】
＜第二部＞
クレアチニン解析によるＡＬＳの診断方法：
クレアチニンはクレアチンの代謝最終産物で、クレアチンから非酵素的にＨ２Ｏが取れた無水物である。クレアチンはグリシン、アルギニン、メチオニンの３つのアミノ酸から肝臓や腎臓で合成され、その大半はクレアチンまたはクレアチンリン酸として骨格筋に保有されている。筋肉細胞内ではクレアチンリン酸からクレアチンキナーゼ反応によってＡＴＰが生成し筋収縮活動に利用され、その代謝産物として生成したクレアチンからクレアチニンが産生される。血中非タンパク質性窒素化合物の一つであるクレアチニンは腎糸球体から濾過され、ほとんど再吸収されることなく尿中に排泄される。【００７２】
従って、腎不全等の腎疾患では血清クレアチニン濃度は上昇し、尿中クレアチニン濃度は低下することから、腎機能の検定方法として広く普及している。【００７３】
一方で、この物質は筋肉で合成されることから、筋ジストロフィーや多発性筋炎のような筋肉疾患において血清中・尿中両方でクレアチニン濃度の低下が報告されている（吉村学他:日本臨床  ５３−増−464-468 (1995)、大澤進:Medical Technology 26,389-395（1998））。【００７４】
クレアチンは細胞のエネルギー産生機構に影響を及ぼすことにより奏功する。遺伝子工学的にＡＬＳを発症するような変異を加えられたマウスに、食餌によりクレアチンを与えたところ、クレアチンの投与を受けなかったマウスよりも平均２６日間寿命が延びたというものである。クレアチンの経口投与の効果は投与量に依存性で、飲料水への１％および２％の添加で延命の程度は大幅に改善したという報告がある（Peter Kliveny 他Nature Medicine 5, 347-350 (1999)）。このクレアチンの効果はAdhihettyとBealによっても示された（Neuromolecular Med 10, 275-90 (2008)）。【００７５】
尿中のクレアチニン濃度は腎臓疾患と筋肉疾患の両方で低下し、これらの疾患の診断に有効である（吉村学他:日本臨床  53−増−464-468 (1995)および大澤進:Medical Technology 26, 389-395 (1998)）。【００７６】
本実施例での尿中のクレアチニンの解析には第一部ｔＰＧＤＭ解析で調製された尿を使用し、解析法は腎臓疾患検査で用いる既存の方法による。具体的には、和光純薬社のクレアチニン測定キットを使用する。【００７７】
実施例２，３でｔＰＧＤＭを解析した６名のＡＬＳ患者と２名の健常者、さらに３名の健常者における尿中のクレアチニンを解析した。【００７８】
［実施例７］
ＡＬＳ患者と健常者の昼夜２４時間の尿中クレアチニン濃度の推移：
実施例２，３で用いたものと同じ尿試料、更に健常者３名の尿試料を用い、昼夜におけるＡＬＳ患者の尿中クレアチニン濃度２４時間の推移を検証した。図８ＡにはＡＬＳ患者の、図８Ｂには健常者の尿中のクレアチニン濃度が示されている。【００７９】
［実施例８］
ＡＬＳ患者と健常者のクレアチニン平均濃度の比較：
図９Ａは昼夜におけるＡＬＳ患者および健常者の尿中クレアチニンの平均濃度を比較した図である。有意差は高濃度の患者一名を除くと−１１３５．５２μｇ／ｍＬ（
【数９】
2011108534.tif 000012
）である。また、全員の測定回数を取り入れた場合の有意差は、下記の計算から−１０４０．５３μｇ／ｍＬ（
【数１０】
2011108534.tif 000013
）である。【００８０】
図９Ｂは昼間におけるＡＬＳ患者および健常者の尿中クレアチニンの平均濃度を比較した図である。有意差は高濃度の患者一名を除くと−１１４９．１２μｇ／ｍＬ（
【数１１】
2011108534.tif 000014
）である。また、全員の測定回数を取り入れた場合の有意差は、下記の計算から−１０１３．４１μｇ／ｍＬ（
【数１２】
2011108534.tif 000015
）である。【００８１】
図９Ｃは夜間におけるＡＬＳ患者および健常者の尿中クレアチニンの平均濃度を比較した図である。有意差は高濃度の患者一名を除くと−１１２８．７７μｇ／ｍＬ（
【数１３】
2011108534.tif 000016
）である。また、全員の測定回数を取り入れた場合の有意差は、下記の計算から−１０６９．１１μｇ／ｍＬ（
【数１４】
2011108534.tif 000017
）である。【００８２】
図９Ｄは昼夜におけるＡＬＳ患者および健常者の尿中クレアチニンのそれぞれの患者最高濃度と健常者最低濃度を比較した図である。患者が低濃度の有意差はない。【００８３】
［実施例９］
ＡＬＳ患者５名と健常者５名の２４時間採尿の総尿中クレアチニン濃度と総量を検証した。【００８４】
図１０Ａにはクレアチニン濃度を図１０Ｂにはクレアチニン量を示した。濃度ではｔ検定での有意差は−１３１８．６μｇ／ｍＬ（
【数１５】
2011108534.tif 000018
）であり、総量では−１６９５．５２ｍｇ（
【数１６】
2011108534.tif 000019
）である。【００８５】
また高濃度の患者一名を除くと有意差は、濃度では−１４９１μｇ／ｍＬ（
【数１７】
2011108534.tif 000020
）、総量では−１７５７．５１ｍｇ（
【数１８】
2011108534.tif 000021
）である。したがって、患者の尿には、健常者に対して有意に、低濃度、少量のクレアチニンが検出されることが明らかになった。この結果は上記の実施例８の結果を追認している。【００８６】
尿中のクレアチニン量は腎臓疾患に大きく影響を受けることが知られている。本実施例ではＡＬＳ患者の尿中クレアチニン濃度は有意に健常者より低いことが明らかにされた。【００８７】
第一部の実施例１から６ではｔＰＧＤＭの解析を行った。クレアチニンの解析は第一部でｔＰＧＤＭの解析に用いたものと同じ試料を用いている。【００８８】
ｔＰＧＤＭの解析では健常者との区別が不能であったＡＬＳ患者において本実施例のクレアチニン解析では明らかに健常者と区別が可能となった。【００８９】
ｔＰＧＤＭ解析とクレアチニン解析を組み合わせることにより精度の高い診断法が可能となる。【００９０】
［実施例１０］
ＡＬＳの進行度とクレアチニン濃度の関係：
実施例６でｔＰＧＤＭ濃度を解析したＡＬＳ患者と同じ試料を使用しクレアチニン濃度の解析を行った。【００９１】
患者のＡＬＳ進行度の基準は実施例５に記載したように歩行機能に着目し、進行度１を歩行出来る、２を車椅子生活、３を寝たきり生活、４を人工呼吸器装着に区分した。【００９２】
図１１には患者の症状進行度と図９Ａ昼夜のクレアチニン平均濃度の関係を示している。図中の破線は健常者のクレアチニン昼夜平均濃度の平均を示している。【００９３】
進行度１のＡＬＳ患者１例を除き全ての患者のクレアチニン濃度は破線で示された健常者のクレアチニン平均濃度を有意に下回っていたが進行度との相関は見られなかった。【００９４】
［実施例のまとめ］
尿中のクレアチニン濃度と総量は、ＡＬＳ患者では健常者に比べて有意に低い。その濃度は症状の進行度に相関しないが、その分析はＡＬＳの診断に応用できる。採尿の最適時間帯は午後７時付近である。更に、ｔＰＧＤＭ濃度や総量の低い患者に於いてもクレアチニン濃度と総量は低い。したがって、ｔＰＧＤＭ分析では見落とされる患者も検出でき、ｔＰＧＤＭ分析を補完し両者を組み合わせることで、より精度の高いＡＬＳ診断が可能になる。【００９５】
＜第三部＞
ｔＰＧＤＭ解析とクレアチニン解析の組み合わせによるＡＬＳの診断方法：
筋肉にはクレアチンリン酸と呼ばれるエネルギーを貯めた窒素化合物が含まれている。これが酵素の働きによってクレアチンに分解されるときエネルギーを放出し、そのエネルギーを使って筋肉は動く。クレアチンは役割を終えると、クレアチニンに変えられる。【００９６】
体内の窒素は腎臓からしか排泄されないので、クレアチニンも血液を介してすべて腎臓より尿中に排泄される。このため腎疾患の進行とともに、腎機能が正常の半分以下に低下すると血清クレアチニン濃度は上昇し始める。また腎疾患により尿中のその濃度は低下する。【００９７】
一方、本法で開発されたＡＬＳバイオマーカーｔＰＧＤＭはＡＬＳ疾患において尿中で上昇する。【００９８】
ｔＰＧＤＭ解析とクレアチニン解析を組み合わせることで、より高精度のＡＬＳの診断が可能になる。【００９９】
［実施例１１］
ｔＰＧＤＭ濃度とクレアチニン濃度の相関：
以下の図のデータは第一部と第二部それぞれから使用している。図１２Ａに昼夜の両平均濃度の相関を示した。横軸にはクレアチニン平均濃度を、縦軸にはｔＰＧＤＭ平均濃度を示した。【０１００】
図１２Ｂは昼夜２４時間の採尿で得た総尿中の、ｔＰＧＤＭとクレアチニンそれぞれの濃度を、図１２Ｃは総尿量中のｔＰＧＤＭとクレアチニンそれぞれの総量を示している。【０１０１】
ｔＰＧＤＭ濃度とクレアチニン濃度、または総量の二つのパラメーターを用いることで、６名のＡＬＳ患者と２名の健常者が完全に分離できることが明らかになった。【０１０２】
［概日リズムのデータを利用して、任意の採尿時刻の任意の濃度の患者の最高濃度と最低濃度を推測するシステム（プログラム）の作成］
尿中のｔＰＧＤＭ濃度の経時変化（図３）に概日リズム（サーカディアン・リズム）が確認された。ｔＰＧＤＭは睡眠物質として知られているプロスタグランディンＤ２の代謝物である。（要すれば、Urade Y, Hayaishi O.，“Prostaglandin D2 and sleep regulation. ”Biochim Biophys Acta. 1999 Jan 4;1436(3):606-15. 及びHayaishi O, Urade Y., “Prostaglandin D2 in sleep-wake regulation: recent progress and perspectives.”Neuroscientist. 2002 Feb;8(1):12-5.）【０１０３】
尿中のｔＰＧＤＭ濃度の概日リズムの根拠は上記に由来すると考えられる。しかし、多数の新規患者を時間指定や複数回採尿は難しい。そこで、この概日リズムのデータを利用修正して、任意の採尿時刻の任意の濃度の患者の最高濃度と最低濃度を推測するシステム（プログラム）を作成することが出来た。図１３は、その試作モデルである。患者の採尿時刻とｔＰＧＤＭ濃度を記入し計算をクリックすると、尿中のｔＰＧＤＭ濃度の経時変化（図１３に示す）のデータから予め作成された基準曲線から、その患者の最高濃度と最低濃度が推算されて表示される。更に２４時間の濃度変化の推算グラフが表示される。【０１０４】
このシステムにより多数の患者のそれぞれの濃度の経時変化や最高濃度と最低濃度を推測することで患者の状態の把握や患者同士の相互比較ができて、より精度の高い診断が可能である。【０１０５】
このシステムでは、図１３に示すように、画面の採尿時刻とｔＰＧＤＭ濃度を記入し計算をクリックすると画面に最高濃度と最低濃度が表示され合わせて各時間の濃度を示すグラフが表示される。クレアチニンに関しても図８Ａから図１１に於いて概日リズムが確認され同様なシステムの作成が可能である。【０１０６】
［好ましい態様］
本発明は、さらに、睡眠物質、ヒト成長ホルモン、性周期に連動したホルモン、食事後の血糖値では経時変化が予測できるので前記のような既知データを元にした推算システムが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明の活用例として、ＡＬＳ患者の治療方法の開発および確立、ＡＬＳ患者への有効な薬剤の開発などへの適用がある。
【図１Ａ】
2011108534.tif 000022
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2011108534.tif 000024
【図２】
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【図３Ａ】
2011108534.tif 000026
【図３Ｂ】
2011108534.tif 000027
【図３Ｃ】
2011108534.tif 000028
【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
2011108534.tif 000030
【図４Ｂ】
2011108534.tif 000031
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2011108534.tif 000033
【図５Ａ】
2011108534.tif 000034
【図５Ｂ】
2011108534.tif 000035
【図６】
2011108534.tif 000036
【図７Ａ】
2011108534.tif 000037
【図７Ｂ】
2011108534.tif 000038
【図８Ａ】
2011108534.tif 000039
【図８Ｂ】
2011108534.tif 000040
【図９Ａ】
2011108534.tif 000041
【図９Ｂ】
2011108534.tif 000042
【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
2011108534.tif 000044
【図１０Ａ】
2011108534.tif 000045
【図１０Ｂ】
2011108534.tif 000046
【図１１】
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【図１２Ａ】
2011108534.tif 000048
【図１２Ｂ】
2011108534.tif 000049
【図１２Ｃ】
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【図１３】
2011108534.tif 000051
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月15日(2011.11.15)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明は対象におけるＡＬＳを進行度判定および進行モニターを含めて、ＡＬＳを判定するための方法を提供する。該方法は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のバイオマーカーとしてプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを用い、（ｂ）尿試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを測定する工程、（ｃ）試料中のクレアチニン濃度を測定する工程、（ｄ）試料中の陽性または陰性標品のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭ濃度およびクレアチニン濃度を比較する工程を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明はまた、ＡＬＳの治療における薬物の有効性を評価するための方法を提供する。該方法は（ｂ）筋萎縮性側索硬化症の、および筋萎縮性側索硬化症の疑いのある被験者からの尿を第１の試料とし、質量分析法より第１の試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを分析する工程、（ｃ）クレアチニン濃度を分析する工程、（ｄ）対象に薬物を投与する工程、（ｅ）工程（ｄ）の完了後、対象から第２の試料を得る工程、（ｆ）質量分析により第２の試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを分析する工程、（ｇ）クレアチニンの分析の工程、および（ｈ）第１の試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭ濃度およびクレアチニン濃度を、第２の試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭ濃度およびクレアチニン濃度と比較する工程であって、ここで薬物等の有効性が評価される工程を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のバイオマーカーとしてプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを用いる方法。
【請求項２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の判定に際し、プロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭの解析とクレアチニンの解析を組み合わせて用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、さらに、
対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を判定するために、
（ｂ）尿試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを測定する工程、
（ｃ）試料中のクレアチニンを測定する工程、
（ｄ）試料の陽性または陰性標品のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭ濃度およびクレアチニン濃度を比較する工程を含む方法。
【請求項４】
標品が陽性標品である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
標品が、筋萎縮性側索硬化症の患者又は筋萎縮性側索硬化症の疑いのある被験者から得られた試料を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、さらに、
筋萎縮性側索硬化症の治療における薬物の有効性を評価するために、
（ｂ）筋萎縮性側索硬化症の、および筋萎縮性側索硬化症の疑いのある被験者からの尿を第１の試料とし、質量分析により第１の試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを分析する工程、
（ｃ）クレアチニンを分析する工程、
（ｄ）対象に薬物を投与する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の完了後、対象から第２の試料を得る工程、
（ｆ）質量分析により第２の試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを分析する工程、
（ｇ）クレアチニンの分析の工程、および
（ｈ）第１の試料のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭ濃度およびクレアチニン濃度を、第２の試料のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭ濃度およびクレアチニン濃度と比較する工程であって、ここで薬物等の有効性が評価される工程を含む方法。
【請求項７】
薬物等の有効性が、第１の試料のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭ濃度およびクレアチニン濃度と比べた第２の試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭ濃度およびクレアチニン濃度の変化として測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
対象がヒトである、請求項３記載の方法。
【請求項９】
筋萎縮性側索硬化症の患者および筋萎縮性側索硬化症の疑いのある被験者がマウス、ラット、イヌからなる群から選択されるＡＬＳモデル動物およびヒトである、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
筋萎縮性側索硬化症の発症、進行、及び治療効果の評価を患者の尿成分の解析に基づいて行い、
前記尿成分は、前記プロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭ、クレアチニンに加え、尿に含まれるタンパク質、ホルモン、糖、核酸、脂質、及びそれらの代謝物を含む群から選択される測定可能な物質のひとつ以上の測定された尿成分の相対関係に基づき、筋萎縮性側索硬化症の発症、進行、及び治療効果の評価を行う、請求項３から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
尿中のｔＰＧＤＭ濃度の経時変化における概日リズム（サーカディアン・リズム）のデータを利用して、任意の採尿時刻の任意のｔＰＧＤＭ濃度の患者の最高濃度と最低濃度を推測して、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の状態を判定する、請求項１記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月27日(2012.4.27)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のバイオマーカーとしてプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを用い、尿中のｔＰＧＤＭ濃度の経時変化における概日リズム（サーカディアン・リズム）のデータを利用して、任意の採尿時刻の任意のｔＰＧＤＭ濃度の患者の最高濃度と最低濃度を推測して、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の患者の進行度を判定し進行のモニターを行う方法である。なお、本発明の参考形態は、対象におけるＡＬＳを進行度判定および進行モニターを含めて、ＡＬＳを判定するための方法を提供する。該方法は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のバイオマーカーとしてプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを用い、（ｂ）尿試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを測定する工程、（ｃ）試料中のクレアチニン濃度を測定する工程、（ｄ）試料中の陽性または陰性標品のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭ濃度およびクレアチニン濃度を比較する工程を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の参考形態は、また、ＡＬＳの治療における薬物の有効性を評価するための方法を提供する。該方法は（ｂ）筋萎縮性側索硬化症の、および筋萎縮性側索硬化症の疑いのある被験者からの尿を第１の試料とし、質量分析法より第１の試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを分析する工程、（ｃ）クレアチニン濃度を分析する工程、（ｄ）対象に薬物を投与する工程、（ｅ）工程（ｄ）の完了後、対象から第２の試料を得る工程、（ｆ）質量分析により第２の試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを分析する工程、（ｇ）クレアチニンの分析の工程、および（ｈ）第１の試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭ濃度およびクレアチニン濃度を、第２の試料中のプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭ濃度およびクレアチニン濃度と比較する工程であって、ここで薬物等の有効性が評価される工程を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明の参考形態は、また、筋萎縮性側索硬化症の発症、進行、及び治療効果の評価を患者の尿成分の解析に基づいて行う筋萎縮性側索硬化症の診断方法である。ここで、尿成分とは、尿に含まれるあらゆる測定可能な物質（タンパク質、ホルモン、糖、核酸、脂質、及びそれらの代謝物）を指す。さらに、本発明は、ひとつ以上の測定された尿に含まれる物質の相対関係をその診断方法の基本概念とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のバイオマーカーとしてプロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭを用い、尿中のｔＰＧＤＭ濃度の経時変化における概日リズム（サーカディアン・リズム）のデータを利用して、任意の採尿時刻の任意のｔＰＧＤＭ濃度の患者の最高濃度と最低濃度を推測して、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の患者の進行度を判定し進行のモニターを行う方法。
【請求項２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の患者の進行度を判定し進行のモニターを行うのに際し、プロスタグランディンＤ２の代謝物であるｔＰＧＤＭの解析とクレアチニンの解析を組み合わせて用いる、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
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2011108534.tif 000054
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