【誤訳訂正書】
【提出日】令和2年5月29日(2020.5.29)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト膵臓内分泌細胞を生成するための方法であって、
Ｔ３を補充するが、ＡＬＫ５阻害剤を補充しない第一増殖培地でヒト多能性幹細胞由来のヒト前腸内胚葉細胞を培養し、ヒト膵臓前腸前駆細胞を製造することと、
Ｔ３とＡＬＫ５阻害剤の両方を補充した追加的増殖培地で前記ヒト膵臓前腸前駆細胞を培養し、ヒト膵臓内胚葉細胞／ヒト膵臓内分泌前駆細胞を製造することと、
さらに、Ｔ３を含むが、ＡＬＫ５阻害剤を含まないさらなる増殖培地で前記ヒト膵臓内胚葉細胞／ヒト膵臓内分泌前駆細胞を培養し、ヒト膵臓内分泌細胞を製造することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記ヒト前腸内胚葉細胞を、前記第一増殖培地で２〜３日の期間培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト膵臓前腸前駆細胞を追加的増殖培地で約３〜６日間培養する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト膵臓内胚葉細胞／ヒト膵臓内分泌前駆細胞を、前記さらなる増殖培地で約３日の期間培養する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ヒト膵臓内分泌細胞を生成する方法であって、
ヒト多能性幹細胞由来のヒト膵臓内胚葉細胞またはヒト膵臓内分泌前駆細胞を、Ｔ３とＡＬＫ５阻害剤で処置することを含み、
Ｔ３は、膵臓内分泌細胞への分化を誘導するのに十分な量で存在する、方法。
【請求項６】
ヒト膵臓内分泌細胞を生成する方法であって、
（ａ）ヒト前腸内胚葉細胞のヒト膵臓前腸前駆細胞への分化を誘導するのに十分な量のＴ３でヒト多能性幹細胞由来のヒト前腸内胚葉細胞を処置することと、
（ｂ）前記ヒト膵臓前腸前駆細胞のヒト膵臓内胚葉細胞／ヒト膵臓内分泌前駆細胞への分化を誘導するのに十分な量のＴ３とＡＬＫ５阻害剤で前記ヒト膵臓前腸前駆細胞を処置することと、
（ｃ）前記ヒト膵臓内胚葉細胞／ヒト膵臓内分泌前駆細胞のヒト膵臓内分泌細胞への分化を誘導するのに十分な量のＴ３またはＴ３とＡＬＫ５阻害剤で前記ヒト膵臓内胚葉細胞／ヒト膵臓内分泌前駆細胞を処置することと
を含む、方法。
【請求項７】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤  ＳＢ４３１５４２、ＴＴＤ−Ｉ、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩからなる群から選択される、または前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト膵臓内分泌細胞が、インスリンを産出する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ａ．分化培地と、ここで前記分化培地はトリヨードチロニン（Ｔ３）、またはＴ３とＡＬＫ５阻害剤両方で補充された増殖培地を含む、
ｂ．ヒト多能性幹細胞由来の細胞を含む分化したヒト細胞の集団と、ここで少なくとも１０パーセントの前記細胞がＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１およびＨＢ９を共発現する、
を含む、インビトロ細胞培養物。
【請求項１０】
前記増殖培地がさらに、
ａ．ＳＡＮＴ−１およびＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストと、
ｂ．ＬＤＮ−１９３１８９、ＮｏｇｇｉｎおよびＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤と、
ｃ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡおよびＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
ｄ．レチノイン酸と、
ｅ．アスコルビン酸と、
の１つ以上で補充されている、請求項９に記載の細胞培養物。
【請求項１１】
前記増殖培地がさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸で補充されている、請求項９または１０に記載の細胞培養物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１８】
（実施例１）
ヒト多能性細胞から由来した膵臓内胚葉集団を産出している先に発行されたプロトコールは、実質的にＨＢ９タンパク質を発現しない。
本例は、本実施例にて記述したような多能性幹細胞から由来する細胞中のＨＢ９の発現パターンの同定を指向する。ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＭＴＥＳＲ（（登録商標））１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｎｄａ）中のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コートディッシュ上に、１×１０5細胞／ｃｍ2にて、単一細胞として播いた。播種４８時間後、培養液を、不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａなしのリン酸緩衝食塩水）で洗浄した。培養液を次いで、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、６１，２０１６，２０１２にて先に記述されたように、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に分化された。使用した分化プロトコールは以下のようであった。
ａ．１：３０  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コート表面上にプレートした未分化Ｈ１細胞の６０〜７０％コンフルエント接着培養液を、０．２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｕｔａｈ）、１００ｎｇ／ｍｌアクチビン−Ａ（ＡＡ；Ｐｅｐｒｏ−ｔｅｃｈ；Ｒｏｃｈｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、１日目のみ曝露した。次の２日間、細胞を、０．５％  ＦＢＳと１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＡを含むＲＰＭＩ中で培養した。
ｂ．（ａ）から得られた細胞を、２％  ＦＢＳと５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏ−ｔｅｃｈ）を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、３日間曝露した。
ｃ．（ｂ）から得られた培養液を、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２μＭレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１％（ｖ／ｖ）の、商標Ｂ２７（（登録商標））の下売られている栄養補助物（カタログ番号：１７５０４０４４，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を補充した、ＤＭＥＭ−ＨＧ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、４日間続けた。
ｄ．（ｃ）から得られた細胞を、単層フォーマットにて、１μＭ  ＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５ｉ；Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）、１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ、５０ｎＭ  ＴＰＢ（（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ  ＮＪ）及び１％  Ｂ２７で補充したＤＭＥＭ−ＨＧ培地中で３日間培養した。培養の最後の日のために、細胞を５ｍｇ／ｍＬジスパーゼで５分間処理し、続いて穏やかにピペッティングして、混合し、細胞塊（１００ミクロン未満）に破壊した。細胞クラスタを、使い捨てポリスチレン１２５ｍｌ  Ｓｐｉｎｎｅｒ  Ｆｌａｓｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、１μＭ  ＡＬＫ５阻害剤、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｎｏｇｇｉｎ及び１％  Ｂ２７を補充したＤＭＥＭ−ＨＧを含む懸濁液中、終夜８０〜１００ｒｐｍにて回転させた。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１９】
（ｄ）の最後に、ｍＲＮＡを、関連する膵臓内胚葉／内分泌遺伝子のＰＣＲ解析のために回収した。トータルＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（（登録商標））Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で抽出し、製造業者の説明書にしたがって、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて逆転写した。ｃＤＮＡを、カスタムＴａｑｍａｎ（（登録商標））Ａｒｒａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上へ前もってロードしたＴａｑｍａｎ（（登録商標））  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘとＴａｑｍａｎ（（登録商標））Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓを用いて増幅した。データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析し、ΔΔＣｔ法（すなわち、内部標準で補正したｑＰＣＲ結果（ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ試料−ΔＣｔreference））を用いて、未分化ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞に対して標準化した。全てのプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入された。ＦＡＣＳ及び免疫蛍光解析を、先に記述された（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，６１，２０１２６，２０１２）ように実施した。ＨＢ９抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ，Ｉｏｗａ）から得た。実施例で使用したように、Ｙ２７６３２（（１Ｒ，４ｒ）−４−（（Ｒ）−１−アミノエチル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）シクロヘキサンカルボキシアミド）は、細胞透過性低分子Ｒｈｏ−関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤である。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２２】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２を補充した、ｍＴｅＳＲ（（登録商標））１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コートディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて、単一細胞として播いた。播種４８時間後、培養液を、不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａなしのリン酸緩衝食塩水）で洗浄した。培養液を次いで、以下に概要を記したプロトコールによって、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化した。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２３】
ａ．ステージ１（３日間）：幹細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０３７２−０１９）中で１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｉｎｓｕｌｉｎ，−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ−Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、２日間処理した。
ｄ．ステージ４（３日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び１００ｎＭ  ＴＰＢを補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｅ．ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、および５００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＳＤ２０８を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。ＳＤ２０８は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００７，７２：１５２−１６１に開示された、式Ｉの構造を有する、（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）プテリジン−４−イル］ピリジン−４−イル−アミン）である。ＳＤ２０８は、２，４−二置換プテリジン、ＴＧＦ−βＲＩキナーゼのＡＴＰ−競合阻害剤である。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２４】
【化１】
2019088316.tif 000001
ｆ．ステージ６（３〜１５日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２６】
図４は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９に対する、ステージ４（図４Ａ）、ステージ５（図４Ｂ）及びステージ６（図４Ｃ）でのＦＡＣＳデータを描写している。実施例１からのデータと一致して、ステージ４〜６で、実質的な数のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１陽性細胞が存在したけれども、ＨＢ９の発現は非常に低かった。ステージ５にてピークとなったＨＢ９に対する発現は、ステージ６で減少した。全体として、実施例２にて概要を記したプロトコールを用いて発生した細胞に対するＨＢ９の発現は、実施例１にて概要を記したプロトコールを用いて発生した細胞と比較してより高かった。図５Ａは、ステージ２〜６での、ヒト膵島と比較して、ＨＢ９のｍＲＮＡ発現を示す。実施例１と同様に、ステージ３〜４でのＨＢ９のｍＲＮＡ発現レベルがヒト膵島と等価であったけれども、ＨＢ９タンパク質発現がステージ４にて非常に低かった（図５Ｂ）。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２７】
図６Ａ〜６Ｊは、実施例２にて概要を説明したようにステージ４で分化し、ステージ４のみ、ステージ４〜ステージ５、又はステージ４〜ステージ６で処理した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１中の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＮＫＸ６．１（図６Ａ）、ＰＤＸ１（図６Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｃ）、グルカゴン（図６Ｄ）、インスリン（図６Ｅ）、ソマトスタチン（図６Ｆ）、ＣＤＸ２（図６Ｇ）、アルブミン（図６Ｈ）、ガストリン（図６Ｉ）及びＳＯＸ２（図６Ｊ）。ステージ４〜６でのＴ３の添加は、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリンを有意にダウンレギュレートし、一方で、ステージ５にてインスリン発現が穏やかに増加した。ステージ４〜６でのＴ３の添加は、ＮＫＸ２．２の発現を有意に減少させたように見え、一方でＮＫＸ６．１とＰＤＸ１発現に明確な影響は無かった。さらに、Ｔ３添加は、ＳＯＸ２（胃マーカー）及びアルブミン（肝マーカー）発現を抑制する一方で、ＣＤＸ２（腸マーカー）発現に影響は無かった。ステージ６での対照及び処理した培養液の免疫染色は、ステージ６での対照（図７Ａ）と比較して、Ｔ３処理群（図７Ｂ）中のＨＢ９陽性細胞の数での有意な増加を明らかにした。さらに、増加量のＮＫＸ６．１陽性細胞が、Ｔ３処理培養液中のＨＢ９の発現を示した。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２８】
（実施例３）
ステージ６でのＴ３とＡＬＫ５阻害剤での組合せ処理は、ＨＢ９の発現を増強する
本実施例は、ステージ６での培地中の、ＡＬＫ５阻害剤とＴ３の組合せが、ＨＢ９の発現を有意にブーストすることが明らかであることを実証する。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２９】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２を補充した、ｍＴｅＳＲ（（登録商標））１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コートディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて、単一細胞として播いた。播種４８時間後、培養液を、不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａなしのリン酸緩衝食塩水）で洗浄した。培養液を次いで、以下に概要を記したプロトコールによって、膵臓内胚葉／内分泌系統に分化した。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、２日間処理した。
ｄ．図テージ４（３日間）：ステージ３細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１００ｎＭ  ＴＰＢ及び１μＭ  Ｔ３を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｅ．ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１μＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＳＤ２０８及び１００ｎＭのＴ３を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｆ．ステージ６（３〜１５日間）：ステージ５細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤、５０ｎＭ  ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び１０ｎＭ  Ｔ３を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３０】
図８Ａと８Ｂは、ステージ６、７日目でのＮＫＸ６．１とＨＢ９に対する免疫染色を描写している。図８Ｃは、実施例３にて概要を示した、ステージ６まで分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の、ＨＢ９の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。免疫染色イメージと一緒に、ＨＢ９のｍＲＮＡ発現は、ＡＬＫ５阻害剤とＴ３への延長した曝露が、ＮＫＸ６．１の強力な発現を維持する一方で、ＨＢ９の発現を有意に増強するように見えることを示す。図９Ａ及び９Ｂは、それぞれステージ６、５日目及び１５日目でのＦＡＣＳデータを描写している。ステージ６細胞の有意な画分は、ステージ６、１５日目の培養液中、ＨＢ９の発現を示す。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３１】
（実施例４）
用量依存様式でのＴ３は、ＨＢ９の発現を増強する
本実施例は、用量依存様式でのＴ３が、ステージ６でのＮＫＸ６．１の発現を維持する一方で、ＨＢ９の発現を増強するために使用してよいことを示す。ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２を補充した、ｍＴｅＳＲ（（登録商標））１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コートディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて、単一細胞として播いた。播種の４８時間後に、培養物は、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。培養液を次いで、以下に概要を記したプロトコールによって、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞の特徴であるマーカーを発現している細胞に分化した。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕａｔＭａｘＴＭ、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、２日間処理した。
ｄ．ステージ４（３日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び１００ｎＭ  ＴＰＢを補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｅ．ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１μＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＳＤ２０８、及び０〜１０００ｎＭ  Ｔ３を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｆ．ステージ６（６日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤、５０ｎＭ  ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び０〜１０００ｎＭ  Ｔ３を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、６日間処理した。