(57)【要約】アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、ヒトＣｋｓ１およびヒトＳｋｐ２のインヒビター、方法、ならびにヒトＣｋｓ１およびヒトＳｋｐ２に特異的な組成物が、提供される。Ｃｋｓ１発現およびＳｋｐ２発現を調節するために、そして細胞増殖（特に、腫瘍細胞増殖）を調節するためにこの組成物を使用する方法もまた、提供される。本発明は、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物およびリボザイム化合物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ｃｋｓ１アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて癌を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（技術分野）
本発明は、Ｃｋｓ１およびＳｋｐ２の発現を調節するための方法および組成物、ならびにＣｋｓ１またはＳｋｐ２と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物およびリボザイム化合物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
Ｃｋｓタンパク質は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）／サイクリン複合体に直接結合する、低分子量（９〜１８ｋＤａ）の遍在的に発現されるタンパク質である。これらは最初、酵母においてＣＤＫの欠損対立遺伝子を遺伝的に抑制することが可能な変異体として同定された。ヒトＣｋｓ１およびＣｋｓ２は１９９０年にクローニングされ、そしてこれらのデータのほとんどは、遍在化されたサイクリンＢのプロテアソーム分解のような、有糸分裂の間の機能を示した。最近、Ｃｋｓ１は、マウスに必須ではないことが示され、Ｃｋｓ１−／−細胞は、よりゆっくりと増殖するが、有糸分裂において停止しないことが示された。同時に、Ｃｋｓ１は、ｐ４５Ｓｋｐ２と会合することが示された。このｐ４５Ｓｋｐ２は、ＳＣＦユビキチンリガーゼのサブユニットであり、これは、Ｇ１／Ｓ期における幾つかの細胞周期調節因子の分解を媒介する。Ｃｋｓ１−／−細胞の分析は、Ｃｋｓ１の喪失が、サイクリンＥレベルおよびｐ２７Ｋｉｐｌタンパク質レベルの増加を誘導することを明らかにした。このことは、Ｃｋｓ１が、実際に、Ｇ１／Ｓ期の間の分解において役割を果たし、ＣＤＫとは独立した機能を果たすことを示す。
【０００３】
Ｓｋｐ２は、哺乳動物Ｇ１進行の調節因子（サイクリン依存性キナーゼｐ２７を含む）のユビキチン媒介性分解に関連している。ｐ２７は、用量依存性様式で作用する腫瘍抑制因子タンパク質である（Ｆｅｒｏ，Ｍ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９６：１７７−１８０）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
癌における役割に関連する、細胞周期におけるその役割に起因して、Ｃｋｓ１および会合タンパク質であるＳｋｐ２の発現および／または機能を調節する組成物および方法についての必要性が、当該分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、１つの実施形態において、Ｃｋｓ１およびＳｋｐ２のインヒビターを提供する。本発明のインヒビターとしては、アンチセンス分子、リボザイム、抗体または抗体フラグメント、タンパク質またはポリペプチドならびに低分子が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なアンチセンス分子は、配列番号１の核酸の少なくとも１０、１５または２０個連続したヌクレオチドを含むか、またはストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸にハイブリダイズする。配列番号１の配列の少なくとも２５個連続したヌクレオチドを含むか、またはストリンジェントな条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズするアンチセンス分子がより好ましい。代表的なアンチセンス分子は、配列番号２６〜３０として本明細書に提供される。
【０００６】
さらなる実施形態において、薬学的に受容可能なキャリア中に１つ以上のＣｋｓ１またはＳｋｐ２のインヒビターを含む組成物が提供される。
【０００７】
さらなる実施形態は、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２の遺伝子発現または生物学的活性を減少させる方法を提供する。
【０００８】
本発明は、少なくとも１つの改変されたヌクレオシド間連結を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００９】
本発明はさらに、ホスホロチオエート連結を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】
本発明はなおさらに、少なくとも１つの改変された糖部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１１】
本発明はまた、２’−Ｏ−メチル糖部分である少なくとも１つの改変された糖部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１２】
本発明はさらに、少なくとも１つの改変された核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１３】
本発明はなおさらに、改変された核酸塩基が、５−メチルシトシンである改変された核酸塩基を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１４】
本発明はまた、アンチセンス化合物が、キメラオリゴヌクレオチドであるアンチセンス化合物を提供する。
【００１５】
本発明は、ヒトの細胞または組織におけるヒトのＣｋｓ１またはＳｋｐ２の発現を阻害する方法を提供し、この方法は、ヒトのＣｋｓ１またはＳｋｐ２をコードする核酸分子に標的化された８〜３５ヌクレオチド長のアンチセンス化合物もしくはリボザイムと、細胞もしくは組織とをインビボで接触させ、それにより、ヒトのＣｋｓ１またはＳｋｐ２の発現が阻害される工程を包含する。
【００１６】
本発明はさらに、癌細胞の増殖を調節する方法を提供し、この方法は、ヒトのＣｋｓ１またはＳｋｐ２をコードする核酸分子に標的化された８〜３５ヌクレオチド長のアンチセンス化合物もしくはリボザイムと、癌細胞とをインビボで接触させ、それにより、ヒトのＣｋｓ１またはＳｋｐ２の発現が阻害される工程を包含する。
【００１７】
本発明はなおさらに、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のポリヌクレオチドの標的領域を同定するための方法を提供する。本発明はまた、インサイチュハイブリダイゼーションにより、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のポリヌクレオチドを同定するための標識化プローブを提供する。
【００１８】
本発明は、細胞増殖を調節するための医薬を調製するための本発明によるＣｋｓ１またはＳｋｐ２のインヒビターの使用を提供する。
【００１９】
本発明はまた、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２の発現を阻害するための薬学的組成物を提供し、これは、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤との混合物中に、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００２０】
本発明はさらに、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のＲＮＡを特異的に切断し得るリボザイム、およびこのリボザイムを含む薬学的組成物を提供する。
【００２１】
本発明はまた、Ｃｋｓ１の低分子インヒビターを提供し、ここで、このインヒビターは、Ｃｋｓ１もしくはＳｋｐ２の活性を減少し得るか、またはＣｋｓ１もしくはＳｋｐ２のｍＲＮＡの発現を減少または防止し得る。
【００２２】
従って、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、タンパク質、ポリペプチド、抗体、および低分子からなる群より選択される単離されたＣｋｓ１を提供する。
【００２３】
特定の実施形態において、単離されたＣｋｓ１インヒビターは、アンチセンス分子である。
【００２４】
より特定の実施形態において、単離されたＣｋｓ１インヒビターアンチセンス分子またはその相補体は、配列番号１の配列の少なくとも１０個連続した核酸を含む。
【００２５】
別の特定の実施形態において、単離されたＣｋｓ１インヒビターアンチセンス分子またはその相補体は、配列番号１の配列に高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする。
【００２６】
特定の実施形態において、単離されたＣｋｓ１インヒビターアンチセンス分子は、配列番号２６〜３０からなる群より選択される核酸配列を含む。
【００２７】
別の実施形態において、単離されたＣｋｓ１インヒビターは、リボザイムであり、なお別の実施形態において、単離されたＣｋｓ１インヒビターは、抗体および抗体フラグメントからなる群より選択される。
【００２８】
本発明はさらに、薬学的に受容可能なキャリア中の治療有効量のＣｋｓ１インヒビターを含む組成物を提供する。
【００２９】
特定の実施形態において、この組成物は、組成物中に２つ以上のＣｋｓ１インヒビターを含み、このＣｋｓ１インヒビターは、アンチセンス分子である。
【００３０】
組成物の特定の実施形態において、アンチセンス分子またはその相補体は、配列番号１の配列の少なくとも１０個の連続した核酸を含み、この組成物のより特定の実施形態において、アンチセンス分子は、配列番号２６〜３０からなる群より選択される核酸配列を含む。
【００３１】
本発明はなおさらに、哺乳動物細胞においてＣｋｓ１の発現を阻害する方法を提供し、この方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、タンパク質、ポリペプチド、抗体、および低分子からなる群より選択されるＣｋｓ１インヒビターを、この細胞に投与する工程を包含する。
【００３２】
本発明の方法の特定の実施形態において、Ｃｋｓ１インヒビターは、アンチセンス分子である。
【００３３】
本発明はなおさらに、被験体におけるＣｋｓ１遺伝子発現の発現を阻害する方法を提供し、この方法は、このＣｋｓ１遺伝子由来の選択された標的核酸配列の全部または一部に特異的にハイブリダイズするのに有効な量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、薬学的に有効なビヒクルでこの被験体に投与する工程を包含する。
【００３４】
本発明の方法の特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２６〜３０からなる群より選択される。
【００３５】
本発明はまた、腫瘍性疾患を処置する方法を提供し、この方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、タンパク質、ポリペプチド、抗体、および低分子からなる群より選択されるＣｋｓ１インヒビターを、哺乳動物細胞に投与して、それにより、腫瘍性疾患の重症度が低減される工程を包含する。
【００３６】
他の実施形態は、ヒトＣｋｓ１をコードする核酸分子に標的化された８〜３５ヌクレオチド長のアンチセンス化合物を提供し、ここで、このアンチセンス化合物は、ヒトＣｋｓ１の発現を阻害し、そして単離されたポリヌクレオチドは、転写開始領域を含む配列および少なくとも８個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列、ならびに配列番号２６〜３０からなる群より選択される３５ヌクレオチド長以下のヌクレオチドを有する。
【００３７】
転写開始領域を含む配列および少なくとも８個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列、ならびに配列番号２６〜３０からなる群より選択される３５ヌクレオチド長以下のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む組換えベクターもまた、提供される。
【００３８】
従って、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、タンパク質、ポリペプチド、抗体、および低分子からなる群より選択される単離されたＳｋｐ２インヒビターを提供する。
【００３９】
特定の実施形態において、単離されたＳｋｐ２インヒビターは、アンチセンス分子である。
【００４０】
より特定の実施形態において、単離されたＳｋｐ２インヒビターアンチセンス分子またはその相補体は、配列番号３の配列の少なくとも１０個の連続した核酸を含む。
【００４１】
別の特定の実施形態において、単離されたＳｋｐ２インヒビターアンチセンス分子またはその相補体は、配列番号３の配列に高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする。
【００４２】
特定の実施形態において、単離されたＳｋｐ２インヒビターアンチセンス分子は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群より選択される核酸配列を含む。
【００４３】
別の実施形態において、単離されたＳｋｐ２インヒビターは、リボザイムであり、なお別の実施形態において、単離されたＳｋｐ２インヒビターは、抗体および抗体フラグメントからなる群より選択される。
【００４４】
本発明はさらに、薬学的に受容可能なキャリア中に、治療有効量のＳｋｐ２インヒビターを含む組成物を提供する。
【００４５】
特定の実施形態において、この組成物は、組成物中に２つ以上のＳｋｐ２インヒビターを含み、このＳｋｐ２インヒビターは、アンチセンス分子である。
【００４６】
この組成物の特定の実施形態において、アンチセンス分子またはその相補体は、配列番号２５の配列の少なくとも１０個連続した核酸を含み、この組成物のより特定の実施形態において、このアンチセンス分子は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群より選択される核酸配列を含む。
【００４７】
本発明はなおさらに、哺乳動物細胞においてＳｋｐ２の発現を阻害する方法を提供し、この方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、タンパク質、ポリペプチド、抗体、および低分子からなる群より選択されるＳｋｐ２インヒビターを、この細胞に投与する工程を包含する。
【００４８】
本発明の方法の特定の実施形態において、Ｓｋｐ２インヒビターは、アンチセンス分子である。
【００４９】
本発明はなおさらに、被験体におけるＳｋｐ２遺伝子発現の発現を阻害する方法を提供し、この方法は、このＳｋｐ２遺伝子由来の選択された標的核酸配列の全部または一部に特異的にハイブリダイズするのに有効な量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、薬学的に有効なビヒクルで被験体に投与する工程を包含する。
【００５０】
本発明の方法の特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群より選択される。
【００５１】
本発明はまた、腫瘍性疾患を処置する方法を提供し、この方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、タンパク質、ポリペプチド、抗体、および低分子からなる群より選択されるＳｋｐ２インヒビターを、哺乳動物細胞に投与して、それにより、腫瘍性疾患の重症度が低減される工程を包含する。
【００５２】
他の実施形態は、ヒトＳｋｐ２をコードする核酸分子に標的化された８〜３５ヌクレオチド長のアンチセンス化合物を提供し、ここで、このアンチセンス化合物は、ヒトＳｋｐ２の発現を阻害し、そして単離されたポリヌクレオチドは、転写開始領域を含む配列および少なくとも８個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列、ならびに配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群より選択される３５ヌクレオチド長以下のヌクレオチドを有する。
【００５３】
転写開始領域を含む配列および少なくとも８個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列、ならびに配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群より選択される３５ヌクレオチド長以下のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む組換えベクターもまた、提供される。
【００５４】
（発明の詳細な説明）
（導入）
本発明は、Ｃｋｓ１ヌクレオチド配列またはＳｋｐ２ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現を標的化および調節するための、阻害剤（好ましくはオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンス分子またはリボザイム））の利用に関する。
【００５５】
本明細書中に開示される発明は、Ｃｋｓ１が、腫瘍形成において中心的な役割を果たすことを実証する。腫瘍細胞における、Ｃｋｓ１  ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＣｋｓ１の枯渇は、２日後に細胞死を誘導し、細胞増殖を低下させ、そして軟寒天中のコロニー形成を阻害し、従って、Ｃｋｓ１が、細胞の生存、細胞増殖、および腫瘍細胞の足場非依存性増殖に必要であることを示した。Ｃｋｓ１阻害は、ウエスタンブロット分析によって実証されるように、ＣＤＫ阻害剤ｐ２７Ｋｉｐ１の蓄積を誘導するが、ＳＷ６２０細胞の細胞周期プロフィールに影響を及ぼさない。
【００５６】
Ｃｋｓ１は、タンパク質ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）ＳＣＦ（Ｓｋｐ２）によるＣＤＫ結合基質ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン媒介性のタンパク質分解を指向する。（Ｓｐｒｕｃｋ，Ｃら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００１  ７：６３９−６５０）。Ｃｋｓ１は、Ｆボックスタンパク質Ｓｋｐ２に関連し、インビボおよびインビトロのユビキチン結合のためのｐ２７Ｋｉｐ１基質の認識に必須である。ｐ２７Ｋｉｐ１ユビキチン結合活性は、Ｃｋｓ１に依存する。ＣＫＳ１−／−マウスは異常に小さく、これらのマウス由来の細胞は、おそらく高められたｐ２７Ｋｉｐ１のレベルに起因して、不十分に増殖する（特に、マイトジェンが制限される条件下において）。本明細書中の発明は、Ｓｋｐ２ポリヌクレオチドに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、腫瘍細胞増殖を阻害し、同時に腫瘍細胞死を誘導することを実証する。
【００５７】
腫瘍組織データベースの解析により、Ｃｋｓ１（ＣＨＩＲ３９）ｍＲＮＡレベルが、結腸癌および乳癌患者の腫瘍において、正常組織と比較して２０〜４０％増大することを明らかにした。さらなる発現データにより、乳癌および結腸癌細胞株ならびに乳癌および結腸癌組織におけるＣｋｓ１の過剰発現を確認した。
【００５８】
本明細書中に開示されるデータはまた、Ｃｋｓ１および、より少ない程度にＣｋｓ２が、腫瘍細胞における細胞増殖に必要であることを示した。Ｃｋｓ１またはＣｋｓ２に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＳＷ６２０細胞の処理によって、Ｃｋｓ１アンチセンス処理細胞の増殖は阻害されるが、Ｃｋｓ２アンチセンス処理細胞の増殖は阻害されない（図４）。Ｃｋｓ１アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＳＷ６２０細胞の処理はまた、ｐ２７Ｋｉｐ１の蓄積を引き起こすが（図６）、Ｃｋｓ２アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理は、この効果を生じなかった。これらの結果により、マウス由来のＣｋｓ１−／−細胞におけるｐ２７Ｋｉｐ１レベルの以前の研究を確認する。
【００５９】
Ｓｋｐ２（配列番号１５）に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた正常ヒト線維芽細胞およびＳＷ６２０細胞の処理は、Ｓｋｐ２  ｍＲＮＡレベルを低下させ、一方、対応する逆方向コントロールオリゴヌクレオチド（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（配列番号１６）を用いた処理は、Ｓｋｐ２  ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさなかった（それぞれ、図１１および図１０Ａ）。図１２に示すように、配列番号１５を用いた処理によるＳｋｐ２枯渇は、ＳＷ６２０細胞の足場非依存性増殖をある程度阻害した。
【００６０】
腫瘍抑制因子ｐ２７を介してＳｋｐ２が果たす役割のために、サイクリンＥ分解およびｐ２７Ｋｉｐ１レベルに対するＳｋｐ２アンチセンス処理の影響を測定した。図１０Ｂに示すように、２８時間および４８時間の両方で、アンチセンスで処理したＳＷ６２０細胞が、逆方向コントロールで処理した細胞が示したレベルよりも、高いレベルのｐ２７Ｋｉｐ１を示した。サイクリンＥタンパク質レベルは、Ｓｋｐ２アンチセンス処理によって有意には変更されなかった。ｐ３４ｃｄｃ２は、分解によって影響されないタンパク質であり、ゲル負荷コントロール（ｇｅｌ−ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）としての役割を果たした（図１０Ｂ）。図１３に示すように、ｐ２７枯渇はまた、ＳＷ６２０細胞における足場非依存性増殖に対するＣｋｓ１枯渇の影響を逆転させた。
【００６１】
本明細書中の結果は、Ｓｋｐ２が発癌性でありヒト癌において発現されるという最近の報告と一致する。Ｇｓｔａｉｇｅｒ，Ｍ．ら（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９８：５０４３−５０４８，２００１）は、増大したレベルのＳｋｐ２タンパク質が、正常上皮コントロールと比較して口腔上皮性形成異常および癌腫において低いレベルの腫瘍抑制因子ｐ２７と関連することを見出した。本結果は、Ｓｋｐ２に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＳｋｐ２の阻害が、インビトロで腫瘍細胞増殖を阻害し得ることを初めて実証することによって、この情報に追加する。Ｓｋｐ２の阻害はｐ２７Ｋｉｐｌの増大したレベルに関連するので、この阻害は、ｐ２７レベルに関連してＳｋｐ２の公知の役割に起因するようである（図１０Ｂを参照のこと）。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｐ２７タンパク質レベルの低減が、ＳＷ６２０細胞の足場非依存性増殖に対するＣｋｓ１−特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害効果を逆転させることが示されたことが興味深く（図１３を参照のこと）、このことは、Ｃｋｓ１による増殖の阻害が、実際にｐ２７Ｋｉｐｌを介することを示す。
【００６２】
（Ｃｋｓ１ポリヌクレオチドおよびＳｋｐ２ポリヌクレオチド標的化のためのオリゴヌクレオチド）
本発明に従って、Ｃｋｓ１ポリヌクレオチドまたはＳｋｐ２ポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド分子は、結腸癌細胞株ＳＷ６２０の増殖を阻害した。この細胞株は、インビボにおける癌細胞の増殖および成長についての標準モデルであり、これらの結果は、Ｃｋｓ１アンチセンス分子およびＳｋｐ２アンチセンス分子のインビボにおける使用を支持し、これらのアンチセンス分子は、ヒトおよび他の哺乳類における癌を回復する。
【００６３】
ＳＷ６２０は、当業者によって認識されるように、結腸癌のための確立されたモデル系である。これらの細胞は、一人の結腸癌患者から切除された転移二次性腫瘍に由来する（Ｈｅｗｉｔｔら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０００）１９２：４４６−５４）。これらは外観上は線維芽様であり、極めて腫瘍形成性である；ＳＷ６２０異種移植片は、腫瘍細胞の固体シートを形成する。ＳＷ６２０細胞は、結腸癌の進展期の研究に使用されている（Ｈｅｗｉｔｔら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０００）１９２：４５５−５９；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ（２０００）４１：１７５３−５９；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２０００）１８５：３３１−３８）。
【００６４】
本発明は、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２ポリヌクレオチドに指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。ＳＷ６２０細胞の他の遺伝子に対して指向されるアンチセンスストラテジーが、以前に開示された。アンチセンスＦａｓＬ  ｃＤＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトしたＳＷ６２０細胞は、ＦａｓＬ翻訳を障害することにより腫瘍進行を阻害し得ることを示唆する。ＦａｓＬ翻訳は、腫瘍の進行を阻害し得る（Ｎｙｈｕｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２００１）８：２０９−１４）。ｐ５３アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＷ６２０の増殖を阻害し（Ｈｉｒｏｔａら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９６）８７：６３５−４２）、そしてアンチセンスを介してＳＷ６２０細胞のマトリリシン（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）レベルを低減させることが、結腸直腸腫瘍の腫瘍形成および進行を低減させる方法として提案されている（Ｗｉｔｔｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９４）５４：４８０５−１２）。本発明は、Ｃｋｓ１に指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、結腸癌を処置するための適切な薬剤であることを初めて開示することによって、この結腸癌細胞の処置についての知識に追加する。
【００６５】
Ｃｋｓ１  ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド（標的ポリヌクレオチドと呼ばれる）が、本発明の範囲内に含まれる。オリゴヌクレオチドは、特異的ハイブリダイゼーションが達成される限りは、標的ポリヌクレオチドに１００％相補的である必要はない。達成されるべきハイブリダイゼーションの程度は、標的ポリヌクレオチドの正常な機能（転写、翻訳、相補的配列との対合、またはタンパク質のような別の生物学的成分との結合）を妨害する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの複製および転写を妨害し得、そしてＲＮＡの転座、翻訳、スプライシング、および触媒活性を妨害し得る。
【００６６】
本発明は、本明細書中に記載されるような変異体を含む、約８〜約３５ヌクレオチド長の任意のオリゴヌクレオチドをその範囲内に含み、ここで、このオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを含むＣｋｓ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、その結果、ポリヌクレオチドの正常な機能に対する影響が達成される。このオリゴヌクレオチドは、８、１０、１５、１７、１８、２０、２２、２５、２８、３０、３２、または３５ヌクレオチド長であり得る。Ｃｋｓ１のヌクレオチド配列を、図１に示す（配列番号１）。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、以下が挙げられる：
【００６７】
【化１】
2005523280.tif 000002
コントロールオリゴヌクレオチドは、以下である：
【００６８】
【化２】
2005523280.tif 000003
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドの抗腫瘍用途は、Ｃｋｓ１アンチセンスオリゴヌクレオチドが腫瘍細胞中のＣｋｓ１  ｍＲＮＡレベルを低減し得、そして２つの別個の腫瘍細胞株の細胞の増殖を阻害し得るという発見に基づく。ｍＲＮＡに対する影響を測定するために、ＭＲＣ９細胞およびＳＷ６２０細胞を、オリゴヌクレオチドとキャリアー（特に、リピトイド（ｌｉｐｉｔｏｉｄ）またはコレステロイド（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｉｄ）であるが、他のキャリアーが当該分野で公知のように使用され得る）のトランスフェクション混合物と共にインキュベートした。インキュベーションの２〜２４時間後、トランスフェクション混合物を除去し、そして実施例に記載されるように正常増殖培地と交換した。
【００６９】
全ＲＮＡを、これらの細胞から抽出し、逆転写し、そして実施例に記載されるように増幅した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号２６〜３０）とのインキュベーションは、ＭＲＣ９細胞およびＳＷ６２０細胞におけるアクチンに対するＣｋｓ１  ｍＲＮＡレベルを低減した。
【００７０】
軟寒天アッセイを行い、足場依存性増殖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響を決定した。両方の細胞株において、各々のアンチセンスオリゴヌクレオチドによってコロニー形成が阻害された。この結果より、Ｃｋｓ１発現の阻害もまた、腫瘍細胞の足場非依存性様式で増殖する能力を阻害することを実証する。
【００７１】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の例は、配列番号２６〜３０に基づき、これは、改変された骨格または非天然のヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドを含む。改変された骨格を有するオリゴヌクレオチドとしては、この骨格内にリン原子を維持しているオリゴヌクレオチド、およびこの骨格内にリン原子を有さないオリゴヌクレオチドが挙げられる。改変された好ましいオリゴヌクレオチド骨格としては、以下が挙げられる：ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含む）、チオホスホロアミデート、チオアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル（ｔｈｉｏｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）、ならびにボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（通常の３’−５’連結、これらの２’−５’連結アナログ、およびヌクレオシド単位の隣接した対が３’−５’〜５’−３’または２’−５’〜５’−２’で連結する、逆位の極性を有する）。種々の塩、混合塩および遊離酸形態もまた、包含される。
【００７２】
Ｃｋｓ１ポリヌクレオチドに結合する能力を有する２０マーのオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号１を参照して、ポリヌクレオチド位置で示される、以下のオリゴヌクレオチドが挙げられる：
【００７３】
【化３−１】
2005523280.tif 000004
【００７４】
【化３−２】
2005523280.tif 000005
【００７５】
【化３−３】
2005523280.tif 000006
。
【００７６】
Ｃｋｓ１ポリヌクレオチドに結合する能力を有する２５マーのオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号１を参照して、ポリヌクレオチド位置で示される、以下のオリゴヌクレオチドが挙げられる：
【００７７】
【化４−１】
2005523280.tif 000007
【００７８】
【化４−２】
2005523280.tif 000008
【００７９】
【化４−３】
2005523280.tif 000009
。
【００８０】
Ｓｋｐ２ポリヌクレオチドに結合する能力を有する２０マーのオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号２５を参照して、ポリヌクレオチド位置で示される、以下のオリゴヌクレオチドが挙げられる：
【００８１】
【化５−１】
2005523280.tif 000010
【００８２】
【化５−２】
2005523280.tif 000011
【００８３】
【化５−３】
2005523280.tif 000012
【００８４】
【化５−４】
2005523280.tif 000013
【００８５】
【化５−５】
2005523280.tif 000014
【００８６】
【化５−６】
2005523280.tif 000015
【００８７】
【化５−７】
2005523280.tif 000016
。
【００８８】
Ｓｋｐ２ポリヌクレオチドに結合する能力を有する２５マーのオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号２５を参照して、ポリヌクレオチド位置で示される、以下のオリゴヌクレオチドが挙げられる：
【００８９】
【化６−１】
2005523280.tif 000017
【００９０】
【化６−２】
2005523280.tif 000018
【００９１】
【化６−３】
2005523280.tif 000019
【００９２】
【化６−４】
2005523280.tif 000020
【００９３】
【化６−５】
2005523280.tif 000021
【００９４】
【化６−６】
2005523280.tif 000022
【００９５】
【化６−７】
2005523280.tif 000023
。
【００９６】
好ましいＳｋｐ２アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、以下が挙げられる：
【００９７】
【化７−１】
2005523280.tif 000024
【００９８】
【化７−２】
2005523280.tif 000025
。
【００９９】
本発明は、Ｃｋｓ１ポリヌクレオチドまたはＳｋｐ２ポリヌクレオチドの正常な機能と干渉するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。アンチセンス技術に対して広範に適用可能であることが当該分野で公知である、アンチセンス分子のいかなる改変もバリエーションも、本発明の範囲内に包含される。このような改変としては、米国特許第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号および同第５，９５８，７７３号において開示されるような、リン含有連結の調製が挙げられる。
【０１００】
本発明のアンチセンス化合物としては、５，９５８，７７３およびそれに開示されている特許に開示されるような、改変された塩基が挙げられ得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチドを１種以上の部分または結合体に化学的に連結して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強させることによって、改変され得る。このような部分または結合体としては、脂質（例えば、コレステロール）、コール酸、チオエーテル、脂肪族酸、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミトイル部分、ならびに例えば、米国特許第５，５１４，７５８号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９７，６９６号および同第５，９５８，７７３号において開示されるような他のものが挙げられる。
【０１０１】
キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、本発明の範囲内であり、例えば、米国特許第５，０１３，８３０号、同第５，１４９，７９７号、同第５，４０３，７１１号、同第５，４９１，１３３号、同第５，５６５，３５０号、同第５，６５２，３５５号、同第５，７００，９２２号および同第５，９５８，７７３号において記載される方法を使用して、本発明のオリゴヌクレオチドから調製され得る。
【０１０２】
配列番号２６〜３０のものに加えて、好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、実施例において記載されるアッセイを使用して、慣習的な実験によって選択され得る。本発明者らは、特定の作用機構によって束縛しないが、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を使用して、細胞内の標的オリゴヌクレオチドの相補性領域への結合によって、阻害効果を達成すると考えられる。この標的ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、実験の証拠は、ハイブリッドのＲＮＡ成分がＲＮａｓｅ  Ｈによって切断されることを示している（Ｇｉｌｅｓ，Ｒ．Ｖ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９５）２３：９５４−９６１；米国特許第６，００１，６５３号）。一般に、１０塩基対を含むハイブリッドは、ＲＮａｓｅ  Ｈに対する基質として働くのに十分な長さのものである。しかし、結合特異性を達成するために、この長さの配列がヒト遺伝子の間で特有である可能性がある場合、少なくとも１７ヌクレオチドのアンチセンス分子を使用することが、好ましい。
【０１０３】
米国特許第５，９９８，３８３号（本明細書中で参考として援用される）において開示されるように、オリゴヌクレオチドは、その配列が、それらの相補的テンプレートとのオリゴヌクレオチド二重鎖形成に重要な、適切なエネルギー関連特徴を示し、かつ自己二量体形成または自己相補性について低い潜在性を示すように選択される（Ａｎａｚｏｄｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９６）２２９：３０５−３０９）。コンピュータープログラムＯＬＩＧＯ（プライマー分析ソフトウェア、バージョン３．４）を使用して、アンチセンス配列融解温度、自由エネルギー特性を決定し、そして潜在的な自己二量体形成特性および自己相補性特性を推定する。このプログラムは、これら２つのパラメーター（潜在的な自己二量体形成および自己相補性）の定性的な推定の決定を可能にし、かつ「潜在的でない」か「ある程度潜在的である」か「本質的に完全に潜在的である」かという指標を提供する。これらのパラメーターにおいて潜在的でないと推定されたＣｋｓ１ポリヌクレオチドのセグメントが、一般に、選択される。しかし、カテゴリーの１つにおいて、「ある程度潜在的である」セグメントが、使用され得る。これらのパラメーターの平衡が、その選択において使用される。
【０１０４】
アンチセンスの分野において、特定の標的に対する最適なアンチセンス分子を選択するために、ある程度の慣習的実験が必要とされる。効果的であるように、このアンチセンス分子は、好ましくは、標的ＲＮＡ分子のアクセス可能な部分、すなわち曝露された部分に標的化される。いくつかの場合において、標的ｍＲＮＡ分子の構造についての情報が利用可能であるが、アンチセンスを使用した、阻害に対する現在のアプローチは、実験による。本発明によれば、この実験は、実施例１において記載される方法を使用して、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトすることによって、慣習的に行われ得る。この細胞におけるｍＲＮＡレベルは、このｍＲＮＡの逆転写、およびそのｃＤＮＡレベルをアッセイすることによって、処理細胞およびコントロール細胞において慣習的に測定され得る。その生物学的効果は、当該分野で公知であるように、細胞増殖または細胞生存度を測定することによって、慣習的に決定され得る。
【０１０５】
ｃＤＮＡレベルをアッセイおよび分析することによってアンチセンス活性の特異性を測定することは、当該分野で認知されている、アンチセンス結果を確証する方法である。処理細胞およびコントロール細胞由来のＲＮＡを逆転写すべきであり、得られたｃＤＮＡ集団を分析すべきであることが、示唆されている（Ｂｒａｎｃｈ，Ａ．Ｄ．，Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．（１９９８）２３：４５−５０）。本発明に従って、ＳＷ６２０細胞の培養物を、Ｃｋｓ１を標的化するように設計された５つの種々のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトした。これらのオリゴヌクレオチドは、配列番号２６〜３０において示される。Ｃｋｓ１に対応するｍＲＮＡのレベルを、処理細胞およびコントロール細胞において測定した。配列番号２６〜３０は、アクチンｍＲＮＡレベルに標準化された場合、Ｃｋｓ１  ｍＲＮＡの劇的な減少を引き起こした。
【０１０６】
さらなるインヒビターとしては、リボザイム、タンパク質またはポリペプチド、抗体またはそのフラグメント、および低分子が挙げられる。これらのＣｋｓ１インヒビターおよびＳｋｐ２インヒビターの各々は、それらがそれぞれＣｋｓ１およびＳｋｐ２の発現および／または生物学的活性を低下させるという点で、共通の特徴を共有する。本明細書中に開示される例示的なＣｋｓ１インヒビターおよびＳｋｐ２インヒビターに加えて、代替のインヒビターは、本明細書中で詳細に開示されたかまたはさもなければ容易に利用可能であるかのいずれかの方法論を使用し、当業者の技術範囲内で、慣習的な実験によって得られ得る。
【０１０７】
（リボザイム）
Ｃｋｓ１インヒビターおよびＳｋｐ２インヒビターは、リボザイムであり得る。リボザイムは、特異的な阻害を生じるかまたは細胞遺伝子発現と干渉するＲＮＡ基質（例えば、ｍＲＮＡ）を特異的に切断するＲＮＡ分子である。本明細書中で使用される場合、用語「リボザイム」は、特異的認識に対するアンチセンス配列、およびＲＮＡ切断酵素活性を含むＲＮＡ分子を包含する。触媒鎖は、化学量論的濃度よりも高い濃度にて、標的ＲＮＡの特定の部位を切断する。
【０１０８】
広範な種々のリボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ（１９８７）４８：２１１−２２０；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３２８：５９６−６００；ＷａｌｂｏｔおよびＢｒｕｅｎｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３４：１９６；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３４：５８５によって記載される）；ヘアピンリボザイム（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５，２５４，６７８号（１９９３年１０月１９日発行）およびＨｅｍｐｅｌら、欧州特許公開番号０  ３６０  ２５７（１９９０年３月２６日公開））；ならびにテトラヒメナリボソームＲＮＡベースのリボザイム（Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号を参照のこと）が挙げられる）が、本発明の文脈内で利用され得る。本発明のリボザイムは、代表的に、ＲＮＡからなるが、ＤＮＡ、核酸アナログ（例えば、ホスホロチオエート）、またはそれらのキメラ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＲＮＡ）からもまた構成され得る。
【０１０９】
リボザイムは、任意のＲＮＡ転写物に標的化され得、かつそのような転写物を酵素学的に切断し得る（例えば、米国特許第５，２７２，２６２号；米国特許第５，１４４，０１９号；ならびにＣｅｃｈらに対する、米国特許第５，１６８，０５３号、同第５，１８０，８１８号、同第５、１１６、７４２号および同第５，０９３，２４６号を参照のこと）。本発明の特定の実施形態に従って、任意のこのようなＣｋｓ１  ｍＲＮＡ特異的リボザイム、またはこのようなリボザイムをコードする核酸を、宿主細胞に送達し、Ｃｋｓ１遺伝子発現の阻害をもたらし得る。従って、リボザイムなどは、真核生物プロモーター（例えば、真核生物ウイルスプロモーター）に連結されたリボザイムをコードするＤＮＡによって、宿主細胞に送達され得、その結果、核への導入の際に、このリボザイムは、直接転写される。
【０１１０】
（タンパク質およびポリペプチド）
本明細書中に開示されるアンチセンス分子およびリボザイムに加えて、本発明のＣｋｓ１インヒビターはまた、Ｃｋｓ１遺伝子発現を低下させるかまたは１以上のＣｋｓ１の生物学的活性を減少させる際に有効な、タンパク質またはポリペプチドを含む。慣習的な実験を介して、当業者がこのようなＣｋｓ１インヒビターを迅速に同定する種々の方法が、当該分野で容易に利用可能である。本発明は、以下の例示的な方法論によって制限されない。
【０１１１】
Ｃｋｓ１の生物学的活性およびＳｋｐ２の生物学的活性のインヒビターは、Ｃｋｓ１活性またはＳｋｐ２活性と干渉するタンパク質および／またはポリペプチドを含む。このような干渉は、Ｃｋｓ１活性ドメインもしくはＳｋｐ２活性ドメインとの直接的な相互作用を介してか、または例えば、アロステリック部位への結合によって、非競合的阻害もしくは不競合的阻害を間接的に介して、生じ得る。従って、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２に結合するタンパク質および／またはポリペプチドを同定するために利用可能な方法を用いて、本明細書中に開示される方法論を介して、それらのＣｋｓ１インヒビター活性またはＳｋｐ２インヒビター活性について特徴付けられ得るリード化合物を同定し得る。
【０１１２】
タンパク質−タンパク質相互作用を検出および分析するための方法を記載している文献が、当業者に利用可能である。Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，Ｅ．Ｍら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９５）５９：９４−１２３（本明細書中で参考として援用される）において総説される。このような方法としては、物理的方法（例えば、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティーブロッティング、アフィニティー免疫沈降および架橋）、およびライブラリーベースの方法（例えば、タンパク質プロービング、ファージディスプレイおよびツーハイブリッドスクリーニング）が挙げられるが、これらに制限されない。タンパク質−タンパク質相互作用を同定するために用いられ得る他の方法としては、遺伝的方法（例えば、先天性形成欠損（ｅｘｔｒａｇｅｎｉｃ）サプレッサ、合成致死効果および未結合の非相補性の使用）が挙げられる。例示的な方法が、以下でさらに詳細に記載される。
【０１１３】
本発明のＣｋｓ１インヒビターまたはＳｋｐ２インヒビターは、Ｃｋｓ１タンパク質またはＳｋｐ２タンパク質と、潜在的なインヒビタータンパク質のパネルまたはライブラリーとの間の直接的な相互作用に依存する、生物学的スクリーニングアッセイを介して同定され得る。生物学的スクリーニング方法論（種々の「ｎ−ハイブリッド技術」を含む）は、例えば、以下に記載されている：Ｖｉｄａｌ，Ｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９９）２７（４）：９１９−９２９；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）９（１）：９０−６；Ｂｒａｃｈｍａｎｎ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９７）８（５）：５６１−５６８；およびＷｈｉｔｅ，Ｍ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９６）９３：１０００１−１０００３（これらの各々が、本明細書中で参考として援用される）。
【０１１４】
ツーハイブリッドスクリーニング方法論を用いて、阻害性特性を有するＣｋｓ１結合タンパク質またはＳｋｐ２結合タンパク質についての新規または既存の標的ｃＤＮＡライブラリーを検索し得る。このツーハイブリッド系は、レポーター遺伝子の転写を増加させることによって、タンパク質−タンパク質相互作用を検出する遺伝的方法である。この系は、部位特異的転写アクチベーターがＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性ドメインを有するという事実に起因する。このＤＮＡ結合ドメインは、活性ドメインを、発現される特定の遺伝子に標的化する。転写アクチベーターのモジュラー性質に起因して、そのＤＮＡ結合ドメインは、いずれのドメインの活性も損失することなく、転写活性ドメインから共有結合的に切断され得る。さらに、これら２つのドメインは、転写機構に関連しない２つのタンパク質間のタンパク質−タンパク質接触によって近位にされ得る。従って、２つのハイブリッドは、機能的系を作製するように構築される。第一のハイブリッド（すなわち、ベイト（ｂａｉｔ））は、目的のタンパク質に融合された転写アクチベーターＤＮＡ結合ドメインからなる。第二のハイブリッド（標的）は、転写活性ドメインとタンパク質またはポリペプチドのライブラリーとの融合によって作製される。ベイトタンパク質と標的ライブラリーのメンバーとの間の相互作用は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性ドメインの近位、ならびにレポーター遺伝子発現の結果的なアップレギュレーションを生じる。
【０１１５】
種々のツーハイブリッドベースの系は、当業者に入手可能であり、これらは、酵母Ｇａｌ４またはＥ．ｃｏｌｉ  ＬｅｘＡのいずれかのＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）および酵母Ｇａｌ４または単純ヘルペスウイルスＶＰ１６転写活性化ドメインを最も一般的に使用する。Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．−Ｔ．ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９１）８８：９５７８−９５８２；Ｄａｌｔｏｎ，Ｓ．ら，Ｃｅｌｌ（１９９２）６８：５９７−６１２；Ｄｕｒｆｅｅ，Ｔ．Ｋ．ら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．（１９９３）７：５５５−５６９；Ｖｏｊｔｅｋ，Ａ．Ｂ．ら，Ｃｅｌｌ（１９９３）７４：２０５−２１４；およびＺｅｒｖｏｓ，Ａ．Ｓ．ら，Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：２２３−２３２。一般的に使用されるレポーター遺伝子としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子、ならびに選択可能な酵母遺伝子（例えば、ＨＩＳ３およびＬＥＵ２）が挙げられる。Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）（１９８９）３４０：２４５−２４６；Ｄｕｒｆｅｅ，Ｔ．Ｋ．，前出；ならびにＺｅｒｖｏｓ，Ａ．Ｓ．，前出。広範な種々の活性化ドメインライブラリーは、当該分野で容易に入手可能であり、その結果、相互作用性タンパク質についてのスクリーニングは、慣用的な実験を介して実施され得る。
【０１１６】
Ｃｋｓ１相互作用性タンパク質およびＳｋｐ２相互作用性タンパク質の同定のための適切なバイトタンパク質は、本明細書でそれぞれ配列番号１および３として表されるＣｋｓ１  ｃＤＮＡ配列またはＳｋｐ２  ｃＤＮＡ配列に基づいて設計され得る。このようなバイトタンパク質としては、全長Ｃｋｓ１タンパク質またはそのフラグメントのいずれかが挙げられる。
【０１１７】
Ｃｋｓ１およびＳｋｐ２のバイト構築物および標的ライブラリーを調製するためのプラスミドベクター（例えば、ｐＢＴＭ１１６およびｐＡＳ２−１）は、当業者に容易に入手可能であり、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のような市販の供給源から得られ得る。これらのプラスミドベクターにより、それぞれＬｅｘＡまたはＧａｌ４ＢＤのようなＤＮＡ結合ドメインとｃＤＮＡとのインフレーム融合が可能になる。
【０１１８】
本発明のＣｋｓ１インヒビターまたはＳｋｐ２インヒビターは、あるいは、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために当該分野で利用可能な物理的方法または生化学的方法のうちの１つにより同定され得る。
【０１１９】
タンパク質アフィニティクロマトグラフィー方法論によって、潜在的なＣｋｓ１またはＳｋｐ２のインヒビターとして試験されるリード化合物は、固体マトリックス（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ）に共有結合または非共有結合された場合、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２に対するそれらの特異的な保持によって同定され得る。タンパク質親和性カラムの調製は、例えば、Ｂｅｅｃｋｍａｎｓ，Ｓ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８１）１１７：５２７−５３５およびＦｏｒｍｏｓａ，Ｔ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９１）２０８：２４−４５に記載されている。細胞性タンパク質の全補体を含む細胞溶解物は、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２の親和性カラムを通じ得る。Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２に対して高い親和性を有するタンパク質は、低塩条件下で特に保持され、一方、細胞性タンパク質の大部分は、カラムを通過する。このような高親和性タンパク質は、カオトロピック溶媒またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて、高塩濃度下で固定化されたＣｋｓ１またはＳｋｐ２から溶出され得る。幾つかの実施形態において、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２の特異的結合タンパク質を同定するのに役立つので、溶解物を調製する前に細胞を放射標識することは好ましい。哺乳動物細胞を放射標識するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｓｏｐｔａ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）２６０：１０３５３−１０３６０に提供される。
【０１２０】
アフィニティクロマトグラフィーについての適切なＣｋｓ１またはＳｋｐ２のタンパク質は、タンパク質またはポリペプチドに融合され得、適切な親和性樹脂上での迅速な精製が可能になる。例えば、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のｃＤＮＡは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼについてのコード領域に融合され得、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、グルタチオン−アガロースカラムへの融合タンパク質の吸着を促進する。Ｓｍｉｔｈら，Ｇｅｎｅ（１９８８）６７：３１−４０。あるいは、融合タンパク質としては、以下が挙げられ得る：プロテインＡ（免疫グロブリンＧを保有するカラム上で精製され得る）；オリゴヒスチジン含有ペプチド（これは、Ｎｉ２＋を保有するカラム上で精製され得る）マルトース結合タンパク質（これは、アミロース含有樹脂上で精製され得る）；ならびにジヒドロ葉酸レダクターゼ（これは、メトトレキサートカラム上で精製され得る）。本明細書で示されるＣｋｓ１またはＳｋｐ２の融合タンパク質を調製するのに適した１つの例示的なタグは、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）に対するエピトープであり、これに対して、モノクローナル抗体は、容易に入手可能であり、この抗体から親和性カラムが、調製され得る。
【０１２１】
Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２の親和性カラム上で特異的に保持されるタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した後に、同定され得る。従って、細胞が、細胞溶解物の調製前に放射標識され、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２の親和性カラムを通過する場合、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２に対して高い親和性を有するタンパク質は、オートラジオグラフィーによって検出され得る。Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２の特異的結合タンパク質の同定は、タンパク質配列決定技術によって決定され得、この技術は、当業者に対して容易に入手可能である（例えば、Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｃ．Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．ｐｐ．１６６−１７０（１９９０））。
【０１２２】
（抗体フラグメント）
本発明のＣｋｓ１またはＳｋｐ２のインヒビターとしては、Ｃｋｓ１もしくはＳｋｐ２の遺伝子発現および／または生物学的活性を低下させる際に有効な抗体および／または抗体フラグメントが挙げられる。適切な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であり得る。抗体は、従来のハイブリドーマベースの方法論によって誘導され得、これらは、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２を接種された動物から単離された抗血清由来であるか、または組換えＤＮＡ技術を介するものである。あるいは、本発明の抗体または抗体フラグメントは、１つ以上の容易に入手可能なファージ提示ライブラリーの使用によってインビトロで同定され得る。例示的な方法は、本明細書に開示される。
【０１２３】
本発明の１つの実施形態において、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のインヒビターは、以下のように産生され得るモノクローナル抗体である。Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のタンパク質は、例えば、バキュロウイルスベースの系におけるＣｋｓ１またはＳｋｐ２のｃＤＮＡの発現によって産生され得る。この方法によって、Ｃｋｓ１もしくはＳｋｐ２のｃＤＮＡまたはこれらのフラグメントは、適切なプラスミドベクターに連結され、このベクターを引き続いて使用して、Ｓｆ９細胞を形質転換し、タンパク質産生を促進する。さらに、エピトープタグまたは他の部分を組み込んで、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のタンパク質の親和性精製を促進することは有利であり得る。Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２を発現するＳｆ９細胞のクローンは、例えば、酵素連結化イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって同定され、溶解物が調製され、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のタンパク質はアフィニティクロマトグラフィーによって精製され、そして精製されたタンパク質は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹膜内に注射され、抗体産生を誘導する。アジュバント（例えば、フロイントアジュバント）を加えて、得られる免疫応答を増大させることは有利であり得る。
【０１２４】
特異的抗体の産生について、血清を試験し、ポジティブな特異的抗体力価を有する動物由来の脾臓細胞は、骨髄腫との細胞融合について使用され、ハイブリドーマクローンを生成する。ハイブリドーマクローン由来の上清を、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２に対して特異性を有するモノクローナル抗体の存在について試験する。モノクローナル抗体方法論の一般的な記述について、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと。
【０１２５】
バキュロウイルス発現系に加えて、他の適切な細菌発現系または酵母発現系が、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のタンパク質またはそのポリペプチドの発現のために使用され得る。バキュロウイルス系を用いる際に、１つの市販のアフィニティタグを利用して、動物の接種の前に生成を促進することは有利であり得る。従って、Ｃｋｓ１もしくはＳｋｐ２のｃＤＮＡまたはそのフラグメントは、例えば、アガロースゲル精製によって単離され得、そして適切なタグタンパク質（例えば、６−Ｈｉｓ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））または他のこのような容易に入手可能なアフィニティタグによりインフレームで連結され得る。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．１６０−１６１（Ｇｌｉｃｋ編，Ｂ．Ｒ．およびＰａｓｔｅｒｎａｋ，Ｊ．Ｊ．編１９９８）を参照のこと。
【０１２６】
本発明の他の実施形態において、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のインヒビターは、ヒト化抗Ｃｋｓ１モノクローナル抗体または抗Ｓｋｐ２モノクローナル抗体である。句「ヒト化抗体」とは、非ヒト抗体、代表的にはマウスモノクローナル抗体由来の抗体をいう。あるいは、ヒト化抗体は、親の非ヒト抗体の抗原結合特性を保持するか、実質的に保持するが、ヒトに投与された場合に親抗体と比較して減少した免疫原性を呈するキメラ抗体由来であり得る。句「キメラ抗体」とは、本明細書で使用される場合、２つの異なる抗体由来の配列を含む抗体をいい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）、これは、代表的に、異なる種を起源とする。最も代表的には、キメラ抗体は、ヒトおよびマウスの抗体フラグメント、一般的には、ヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【０１２７】
ヒト化抗体は、親マウスモノクローナル抗体よりもヒトにおいて免疫原性が低いので、それらは、アナフィラキシーの危険性のより少ないヒトの処置のために使用され得る。従って、これらの抗体は、ヒトへのインビボでの投与を含む治療適用（例えば、腫瘍性疾患の処置のための放射感作物質としての使用または例えば、癌治療の副作用を低減させるための方法における使用）において好ましくあり得る。
【０１２８】
ヒト化抗体は、例えば、以下の種々の方法によって達成され得る：（１）ヒトフレームワーク領域および定常領域への非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のグラフト（当該分野で「ヒト化」と称されるプロセス）、あるいは、（２）全体非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によってヒト様表面によりそれらを「被覆」すること（当該分野で「ベニアリング」と称されるプロセス）。本発明において、ヒト化抗体は、「ヒト化」抗体および「ベニア」抗体の両方を含む。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：５２２−５２５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９８４）８１：６８５１−６８５５；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）４４：６２６−３０２；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４−１５３６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）２８：４８９−４９８；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）３１（３）：１６９−２１７；ならびにＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（１９９１）４：７７３−８３（これらの各々は、本明細書で参考として援用される）に開示される。
【０１２９】
句「相補性決定領域」とは、ネイティブの免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に規定するアミノ酸配列をいう。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）１９６：９０１−９１７；Ｋａｂａｔら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）を参照のこと。句「定常領域」とは、エフェクター機能を与える抗体分子の部分をいう。本発明において、マウス定常領域は、ヒト定常領域によって置換される。目的のヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリン由来である。その重鎖定常領域は、５つのアイソタイプのいずれかから選択され得る：α、δ、ε、γまたはμ。
【０１３０】
抗体をヒト化する１つの方法は、ヒト重鎖配列およびヒト軽鎖配列に対して非ヒト重鎖配列および非ヒト軽鎖配列を整列する工程、このような整列に基づいてヒトフレームワークにより非ヒトフレームワークを選択および置換する工程、分子モデリングして、ヒト化配列のコンフォメーションを予測する工程、ならびに親抗体のコンフォメーションを比較する工程を包含する。このプロセスに続いて、ヒト化配列モデルの予測されたコンフォメーションが、親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲのコンフォメーションに近似するまで、ＣＤＲの構造を妨害するＣＤＲ領域における残基の逆突然変異が反復される。このようなヒト化抗体は、さらに誘導体化され得、例えば、Ａｓｈｗｅｌｌレセプターを介する取り込みおよびクリアランスを促進する。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号（これらの特許は、本明細書で参考として援用される）を参照のこと。
【０１３１】
Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２に対するヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニック動物を使用して産生され得る。例えば、ＷＯ  ９８／２４８９３は、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示し、ここで、この動物は、内因性の重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の不活性化に起因して、機能的内因性免疫グロブリンを産生しない。ＷＯ  ９１／１０７４１はまた、免疫原に対する免疫応答を増大させ得るトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示し、ここで、この抗体は、霊長類定常領域および／または加変領域を有し、ここで、内因性免疫グロブリンコード遺伝子座は、置換または不活性化される。ＷＯ  ９６／３０４９８は、哺乳動物における免疫グロブリン遺伝子座を改変するためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示し、それにより、定常領域または可変領域の全部または一部を置換して、改変された抗体分子を形成する。ＷＯ  ９４／０２６０２は、不活性化された内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示する。米国特許第５，９３９，５９８号は、内因性重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｌａｉｍ）を欠き、そして１つ以上の異種間の定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを作製する方法を開示する。
【０１３２】
上述のトランスジェニック動物を使用して、免疫応答は、選択された抗原性分子に対して生成され得、そして抗体産生細胞は、動物から取り除かれ、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成するために使用される。免疫プロトコル、アジュバントなどは、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ  ９６／３３７３５に記載されるようにトランスジェニックマウスの免疫に使用される。この公開公報は、種々の抗原性分子（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ヒトＣＤ４、Ｌ−セレクチン、ｇｐ３９、および破傷風毒素）に対するモノクローナル抗体を開示する。これらのモノクローナル抗体は、それらの対応するタンパク質の生物学的活性または生理学的作用を阻害または中和する能力について試験され得る。ＷＯ  ９６／３３７３５は、ＩＬ−８に対するモノクローナル抗体（ＩＬ−８により免疫されたトランスジェニックマウスの免疫細胞由来）が、好中球のＩＬ−８誘導性機能をブロックすることを開示する。トランスジェニック動物を免疫するために使用される抗原に対して特異性を有するヒトモノクローナル抗体はまた、ＷＯ  ９６／３４０９６に開示される。
【０１３３】
本発明において、本発明のＣｋｓ１またはＳｋｐ２のポリペプチドおよびそれらの改変体を使用して、上述のトランスジェニック動物を免疫する。モノクローナル抗体は、当該分野で公知の方法を使用して作製され、抗体の特異性は、単離されたＣｋｓ１またはＳｋｐ２のポリペプチドを使用して試験される。臨床的用途のための抗体の適合性は、例えば、ＳＷ６２０細胞を抗体に曝露すること、および細胞増殖を測定することによって試験される。本発明に従って、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のポリヌクレオチドに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いるＣｋｓ１またはＳｋｐ２の発現の阻害は、結腸癌細胞株であるＳＷ６２０の足場非依存性増殖の阻害を引き起こす。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、卵巣癌細胞株であるＳＫＯＶ３の増殖を阻害する。Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２に特異的なヒトモノクローナル抗体またはその変異体もしくはフラグメントは、それらの増殖を阻害する能力、コロニー増殖、または腫瘍増殖、移動、もしくは転移（特に上皮起源の腫瘍細胞）の制御を示す任意の他の生物学的パラメータについて試験され得る。このような抗体は、癌細胞の増殖を予防または制御するための薬剤として、前臨床試験および臨床試験に適切である。
【０１３４】
代替のＣｋｓ１またはＳｋｐ２のインヒビター抗体が、当該分野で一般的に公知の他の方法によって容易に得られ得ることが理解される。Ｃｋｓ１に対して高い特異性を有する抗体を同定するための１つの例示的な方法論は、ファージ提示技術である。
【０１３５】
高親和性抗体の産生のためのファージ提示ライブラリーは、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）４（１）：１−２０；Ｈｏｏｇｅｎｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９７）１５：６２−７０およびＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ，Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６）１４：１１４９−１１５４（これらの各々は、本明細書で参考として援用される）に記載されている。ファージ提示技術の利点としては、従来のハイブリドーマ技術によって別の方法では容易に単離され得ないヒト起源の抗体を単離する能力である。さらに、ファージ提示抗体は、動物の免疫系に依存することなくインビトロで単離され得る。
【０１３６】
抗体ファージ提示ライブラリーは、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４（これは、本明細書で参考として援用される）の方法によって達成され得る。手短に言うと、抗体可変領域のコード配列は、ファージマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）のアミノ末端に融合される。抗体可変領域−ｐＩＩＩ融合構築物の発現により、ファージ粒子内に包含される対応する遺伝物質を有するファージ表面に対する抗体の「提示」が生じる。
【０１３７】
ファージライブラリーをスクリーニングするのに適切なＣｋｓ１またはＳｋｐ２タンパク質は、例えば、記載されるようなバキュロウイルスＳｆ９細胞（前出）における発現によって得られ得る。あるいは、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のコード領域は、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のタンパク質の所望の領域に特異的なプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。上で議論されたように、Ｃｋｓ１タンパク質は、市販のアフィニティタグのうちの１つとの融合物として、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母において発現され得る。
【０１３８】
得られる融合タンパク質は、次いで、固体マトリックス（例えば、組織培養プレートまたはビーズ）に吸着され得る。所望の抗Ｃｋｓ１結合特性または抗Ｓｋｐ２結合特性を有するファージ発現抗体は、続いて、固体マトリックスの場合には連続的なパニングによって、またはＣｋｓ１またはＳｋｐ２の抗原カラムへの親和性吸着によって単離され得る。所望のＣｋｓ１阻害活性を有するファージは、感染によって細菌へと再導入され得、そして当業者に公知の標準的な方法によって伝播され得る。ポジティブ抗体−ｐＩＩＩファージについてのスクリーニングのための方法の概説である、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，前出を参照のこと。
【０１３９】
（低分子）
本発明はまた、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）方法論の慣用的な適用によって容易に同定され得る低分子Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２インヒビターを提供する。Ｐｅｒｓｉｄｉｓ，Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ（１９９８）１６：４８８−４８９によって概説されている。ＨＴＳ方法とは、一般的に、リード化合物（例えば、低分子）の治療的潜在能力についての迅速なアッセイを可能にする技術をいう。ＨＴＳ方法論は、試験物質の機械操作、ポジティブシグナルの検出およびデータの解釈を使用する。このような方法論としては、例えば、可溶性分子を使用する機械スクリーニング技術ならびに細胞ベースの系（例えば、上で詳述されたツーハイブリッド系）が挙げられる。
【０１４０】
操作の容易さおよび、溶液とは対照的に細胞の状況内で生じる相互作用の臨床的関連性から恩恵を受ける種々の細胞ベースのＨＴＳ法が、利用可能である。リード化合物は、放射能の組み込み、または読み出しとして吸光度、蛍光または発光に頼る光学アッセイによって、同定され得る。例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）９（６）：６２４−６３１（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０１４１】
ＨＴＳ法は、例えば、Ｃｋｓ１またはｓｋｐ２の生物学的活性の１つをブロックするリード化合物についてスクリーニングするために用いられ得る。この方法によって、Ｃｋｓ１タンパク質またはＳｋｐ２タンパク質が、このタンパク質を発現する細胞から免疫沈降され得、そしてロボット式スクリーニングに適切なアッセイプレート上のウェルに適用される。次いで、個々の試験化合物は、この免疫沈降されたタンパク質と接触され、そしてＣｋｓ１またはＳｋｐ２のキナーゼ活性に対する各試験化合物の効果が、例えば、適切な緩衝液系中のγ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下でインキュベートし、そして３２Ｐの組み込みを測定することによって、評価され得る。
【０１４２】
（Ｃｋｓ１およびＳｋｐ２のインヒビターの効果を評価する方法）
リード分子または化合物は、アンチセンス分子であろうとリボザイムであろうと、タンパク質および／またはペプチド、抗体および／または抗体フラグメントもしくは低分子（これらは本明細書中に記載の方法の１つによって、またはその他の当該分野で利用可能な技術によってのいずれかで同定される）は、種々のインビトロ、エキソビボおよびインビボの動物モデルアッセイ系において、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２の遺伝子発現または生物学的活性を阻害するその能力についてさらに特徴付けされ得る。以下の実施例でさらに詳細に考察されるように、本発明のＣｋｓ１インヒビターまたはＳｋｐ２インヒビターは、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２の発現レベルを減少させる際に有効である。従って、本発明はさらに、当業者が候補インヒビターの効果を評価することを可能にする方法を開示する。
【０１４３】
候補Ｃｋｓ１インヒビターまたはＳｋｐ２インヒビターは、内因性のＣｋｓ１またはＳｋｐ２を発現するか、または哺乳動物細胞の組換えＣｋｓ１またはＳｋｐ２プラスミド構築物でのトランスフェクションによってＣｋｓ１またはＳｋｐ２を発現するように作製されるかのいずれかである細胞に投与することによって、試験され得る。
【０１４４】
有効なＣｋｓ１阻害分子またはＳｋｐ２阻害分子は、例えば、ノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲ分析によって決定したところ、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のｍＲＮＡのレベルを減少させる際に有効である。これらの手順の一般的な記載については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．およびＰａｓｔｅｒｎａｋ，Ｊ．Ｊ．編，１９９８）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。所定の候補アンチセンス分子の効力は、哺乳動物細胞に投与された場合にＣｋｓ１またはＳｋｐ２の発現に対して実質的な影響を有さないことが知られているコントロール「アンチセンス」分子と比較することによって、評価され得る。例示的なコントロール分子としては、配列番号３１〜３５（Ｃｋｓ１）および配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４（Ｓｋｐ２）として開示される、Ｃｋｓ１オリゴヌクレオチドまたはＳｋｐ２オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１４５】
本発明の代替の実施形態において、放射線または化学療法剤でのチャレンジ後のＤＮＡ合成の速度に対するＣｋｓ１インヒビターまたはＳｋｐ２インヒビターの効果は、例えば、ＹｏｕｎｇおよびＰａｉｎｔｅｒ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９）８２：１１３−１１７の方法によって評価され得る。簡単に述べると、培養細胞を、１４Ｃ−チミジンの存在下でインキュベートし、その後、例えば、Ｘ線に曝露し得る。照射の直後に、細胞を、短時間インキュベートし、その後、３Ｈ−チミジンを添加し得る。細胞を洗浄し、過塩素酸で処理し、そして濾過（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃ）する。このフィルターを、過塩素酸、７０％アルコール次いで１００％エタノールでリンスし；放射能を測定し、そして得られた３Ｈ／１４Ｃ比を使用して、ＤＮＡ合成の速度を決定する。
【０１４６】
上記の方法の１つ以上によってＣｋｓ１またはＳｋｐ２の遺伝子発現を減少させる際に有効なＣｋｓ１インヒビターまたはＳｋｐ２インヒビターは、容易に利用可能な動物モデル系の１つにおいて、効力についてインビボでさらに特徴付けされ得る。癌および遺伝子の不安定性に関連する遺伝子の研究のための種々の動物モデル系が、例えば、Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ，Ｌ．Ａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖｅｙｓ（１９９７）２９：３２９−３５２（本明細書中で参考として援用される）に開示される。
【０１４７】
（薬学的組成物）
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、リボ核酸またはデオキシリボ核酸のヌクレオチドについて当該分野で公知の任意の方法によって合成され得る。例えば、これらのオリゴヌクレオチドは、固相合成（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８０Ｂ  ＤＮＡ合成機）を使用して調製され得る。これらのオリゴヌクレオチドの最終純度は、当該分野で公知のよう決定される。
【０１４８】
本発明の方法を使用して同定されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞増殖を調節する。従って、細胞増殖、好ましくは腫瘍細胞増殖を妨害するための薬学的組成物および方法が、提供され、この方法は、組織または細胞と、本発明の方法を使用して同定された１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を包含する。好ましくは、配列番号２６〜３０または配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３の１つを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが投与される。
【０１４９】
この方法および組成物はまた、他の形態の癌を含む増殖性障害（例えば、白血病、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、肉腫、黒色腫、アデノーマ、固形組織の癌腫、低酸素性腫瘍、口、咽喉、咽頭および肺の扁平上皮細胞癌腫、泌尿生殖器癌（例えば、頸部癌および膀胱癌）、造血性癌、結腸癌、膵臓癌、頭部癌および首部癌、および神経系の癌、良性病変（例えば、パピローマ、関節硬化症、乾癬、原発性多血症および続発性多血症）、肥満細胞腫、自己免疫疾患、脈管形成、細菌感染、およびウイルス感染（例えば、ＨＩＶ感染、肝炎感染およびヘルペス感染））を処置するために使用され得る。
【０１５０】
本発明は、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のｍＲＮＡ遺伝子配列に相補的な、治療用途のための活性成分としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの薬学的組成物を提供する。これらの組成物はまた、本発明の方法において使用され得る。必要な場合、この化合物は、ヌクレアーゼ耐性である。一般的に、哺乳動物における細胞増殖を調節するため、または細胞傷害性のための薬学的組成物は、本発明の実施に必要な上記の有効量の少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、または同じ効果を有することが示されているそのフラグメント、ならびに薬学的、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む。
【０１５１】
本発明の一実施形態において、被験体における転移を減少させるための方法が提供され、この方法は、転移を減少させるために有効な量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する。最も好ましくは、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２６〜３０の１つである。
【０１５２】
哺乳動物における新生物形成性細胞の腫瘍形成性を阻害するための薬学的組成物は、有効量の少なくとも１つの活性成分および薬学的、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤から構成され、この活性成分は、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択され、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のｍＲＮＡは、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２のｍＲＮＡの全体を含むか、配列番号２６〜３０（Ｃｋｓ１）または配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３（Ｓｋｐ２）に記載されるような短い配列を有する。活性成分の組合せが使用され得る。
【０１５３】
この組成物は、悪性細胞が処置されるのに必要な場合、経口投与、皮下投与または非経口投与（静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与および鼻腔内投与、ならびにくも膜下投与および注射技術を含む）され得る。ＣＮＳ内の送達について、くも膜下送達が、例えば、Ｏｍｍａｙａリザバまたは当該分野で公知の他の方法と共に使用され得る。薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、アジュバントおよびビヒクル、ならびに移植キャリアは、一般的に、本発明の活性成分と反応しない、不活性か、非毒性固体かまたは液体のフィラー、希釈剤もしくはカプセル化材料をいう。カチオン性脂質もまた、オリゴヌクレオチド取込みを促進するために、この組成物中に含有され得る。この化合物の移植もまた有用である。一般に、薬学的組成物は、無菌である。
【０１５４】
本発明の方法において、新生物形成性細胞を含む増殖中の細胞は、Ｃｋｓ１もしくはＳｋｐ２のｍＲＮＡまたは実質的に同じ効果を有することが示されているそれらのフラグメントに対する増殖阻害量の生体活性アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触される。一実施形態において、処置される哺乳動物は、ヒトであるが、他の哺乳動物種が、獣医学用途において処置され得る。
【０１５５】
生体活性（発現可能）とは、オリゴヌクレオチドが、細胞に直接送達される場合および／または適切なプロモーターにより発現される場合、細胞において生物学的に活性であり、かつ以下に記載されるようなベクターの形態で細胞に送達される場合、活性であることを意味する。ヌクレアーゼ耐性は、本明細書中で記載される生物学的活性を実質的に妨害しない当該分野で公知の任意の方法によって提供される。
【０１５６】
「細胞を接触させる」とは、直接的であってもウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターを介しても、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への曝露または送達の方法をいい、ここでこのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、送達の際に生体活性である。送達方法は、処置される特定の癌について選択される。送達に影響を与えるパラメーターは、医療分野において公知であるように、罹患した細胞型および腫瘍位置を含み得る。
【０１５７】
処置は、一般に、疾患プロセスおよび薬物効果の長さ、ならびに処置される患者種に比例する長さを有する。ヒトは、一般に、本明細書中で例示される実施例よりも長く処置されることが記載され、この処置は、疾患プロセスおよび薬物効果の長さに比例した長さを有する。用量は、医師によって決定されるような単回用量であっても複数回用量であってもよく、そして処置過程は、疾患の軽減が達成されるまで、必要に応じて繰り返される。最適な投薬スケジュールは、身体における薬物蓄積の測定値を使用して計算され得る。当該分野の医師は、最適な投薬量、投薬法および反復速度を容易に決定し得る。最適な投薬量は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの相対効力に基づいて変化し得、そして一般に、インビトロおよびインビボの動物研究および臨床研究における値に基づいて決定され得る。使用される実施形態におけるバリエーションもまた使用され得る。その量は、改善（腫瘍増殖の減少もしくは腫瘍サイズの減少、または生存率および生存長さの改善、または薬物耐性の減少、または当業者によって適切な測定値として選択されるような他の指標が挙げられるが、これらに限定されない）を達成するのに有効でなければならない。
【０１５８】
いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞増殖をインビトロで完全には回避し得ないかもしれないが、これらのアンチセンス化合物は、これらが化学療法のような相補処置を有効にするのに十分腫瘍増殖を阻害する場合、臨床的に有用であり得る。従って、本発明の薬学的組成物は、単独でか、または他の薬物（例えば、細胞傷害性薬剤、免疫毒素、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗体および他の抗癌薬）、ならびに当該分野で公知の処置様式と組み合わせて投与される。この組成物は、個々の患者の臨床状態、投与の部位および方法、投与スケジュール、ならびに医師に公知の他の要因を考慮して、良好な医療行為に従って投与および投薬される。従って、増殖阻害のための「有効量」は、当該分野で公知のようなこのような考察によって決定される。薬学的組成物は、本発明の１つ以上の実施形態を含み得る。
【０１５９】
本発明のヌクレオチド配列は、直接的か、またはウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターを用いてかのいずれかで送達され得る。直接送達される場合、この配列は、一般に、減少したヌクレアーゼ耐性を有する。あるいは、この配列は、発現カセットまたは発現構築物に組み込まれ得、その結果、この配列は、細胞において発現される。一般に、この構築物は、この配列を標的細胞において発現させ得る適切な調節配列またはプロモーターを含む。
【０１６０】
一旦、オリゴヌクレオチド配列が送達の準備ができると、これらは当該分野で公知のように、細胞に導入される。トランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、リポソーム、コロイド状ポリマー粒子およびウイルスベクター、ならびに当該分野で公知の他の手段が、オリゴヌクレオチド配列を細胞に送達するために使用され得る。選択された方法は、少なくとも、処置される細胞および細胞の位置に依存し、そして当業者に公知である。局在化は、リポソームを指向するための表面上の特異的マーカーを有するリポソームによって、標的細胞を含む組織への直接注射を有することによって、標的細胞と空間的に近位で会合した蓄積物を有することによって、特異的なレセプター媒介性取込みによって、ウイルスベクターなどによって、達成され得る。
【０１６１】
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含むベクターを提供する。本発明は、適切な真核生物細胞および原核生物細胞から選択される宿主細胞をさらに提供し、これらの細胞は、必要に応じてこれらのベクターで形質転換されている。このような形質転換細胞は、悪性腫瘍の機能および調節の研究、ならびに本発明の処置治療を可能にする。
【０１６２】
ベクターは、当業者に公知であるか、または当業者によって構築され得、そして配列の所望の転写を達成するのに必要な全ての発現エレメントを含まなければならない。他の有利な特性（例えば、異なる形態のオリゴヌクレオチドの回復についての機構）もまた、ベクターに含まれ得る。ファージミドは、このような有利なベクターの具体例である。なぜなら、これらは、プラスミドとしてまたはバクテリオファージベクターとしてのいずれかで使用され得るからである。他のベクターの例としては、ウイルス（例えば、バクテリオファージ、バキュロウイスルおよびレトロウイルス）、ＤＮＡウイルス、リポソーム、および他の組換えベクターが挙げられる。これらのベクターはまた、原核生物宿主系または真核生物宿主系のいずれかにおいて使用するためのエレメントを含み得る。当業者は、どの宿主系が特定のベクターに適合性であるかを理解している。
【０１６３】
ベクターは、当該分野で公知の種々の方法のいずれか１つによって、細胞または組織に導入され得る。このような方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９），Ｃｈａｎｇ  ら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｇａら、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）、およびＧｉｌｂｏａら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８６）４：５０４−５１２において見出され得、そしてこれには、例えば、安定なまたは一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組換えウイルスベクターでの感染が挙げられる。
【０１６４】
当該分野で公知の組換え方法はまた、標的核酸のアンチセンス阻害を達成するために使用され得る。例えば、アンチセンス核酸を含むベクターが、標的核酸の発現の減少、従ってその活性を減少させるアンチセンスメッセージを発現するために使用され得る。
【０１６５】
本発明はまた、化合物が、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２の遺伝子の転写または翻訳を阻害し、それにより細胞増殖を調節（すなわち、減少）するか否かを評価する方法を提供し、この方法は、細胞を、Ｃｋｓ１またはＳｋｐ２をコードする核酸配列を含む発現ベクター（核酸の転写または翻訳に必要なエレメント）でトランスフェクトする工程；試験化合物を投与する工程、およびＣｋｓ１またはＳｋｐ２の発現レベルを、試験化合物の非存在下で、コントロールを用いて得られるレベルと比較する工程、を包含する。
【０１６６】
本発明は、細胞内のＣｋｓ１またはＳｋｐ２のポリヌクレオチドを画像化するための検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、遺伝子増幅が生じたか否かを決定するために、そして例えば、当該分野で公知のインサイチュハイブリダイゼーションを使用して、細胞または組織における発現レベルをアッセイするために、有用である。
【０１６７】
本発明は、特定の好ましい実施形態に従って具体的に記載されてきたが、以下の実施例は、本発明を例示するためのみに役立ち、本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１６８】
（実施例１）
（標的ＲＮＡのアンチセンス阻害）
（Ａ．トランスフェクションのためのオリゴヌクレオチドの調製）
トランスフェクションのためのキャリア分子（リピトイド（ｌｉｐｉｔｏｉｄ）またはコレステロイド（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｉｄ）を含む）を、水中０．５ｍＭに希釈し、続いて超音波処理して均一な溶液を生成し、０．４５μｍのＰＶＤＦ膜を通して濾過することによって調製した。リピトイドまたはコレステロイドを、次いで、適切な容量のＯｐｔｉＭＥＭＴＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）に希釈し、その結果、最終濃度は、約１．５〜２ｎｍｏｌリピトイド／μｇオリゴヌクレオチドであった。
【０１６９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコントロールオリゴヌクレオチドを、まず、滅菌Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水中１００μＭの作業濃度に希釈し、次いで、ＯｐｔｉＭＥＭＴＭ中２μＭ（約２０ｍｇ／ｍＬ）に希釈することによって調製した。次いで、この希釈オリゴヌクレオチドを、直ちに、希釈リピトイドに添加し、そしてピペットを上下させることによって混合した。
【０１７０】
（Ｂ．トランスフェクション）
ＳＷ６２０または正常ヒト線維芽細胞を、６ウェル培養皿中の血清を含む増殖培地に、２×１０５細胞／ウェルでプレーティングし、一晩インキュベートした。次いで、混合後直ちに、オリゴヌクレオチド／リピトイド混合物を２００ｎＭのオリゴヌクレオチドの最終濃度まで添加することによって、これらの細胞をトランスフェクトした。次いで、これらの細胞を、トランスフェクション混合物と共に、３７℃、５％  ＣＯ２で、一晩インキュベートした。インキュベーション後、このトランスフェクション混合物を除去し、そして血清を含む通常の増殖培地で置換した。
【０１７１】
（Ｃ．総ＲＮＡ抽出および逆転写）
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙＴＭキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して、製造者によって提供されたプロトコルに従って、トランスフェクトされた細胞から抽出した。抽出に次いで、ＲＮＡをＰＣＲテンプレートとして使用するために逆転写した。一般的に、総量０．２〜１μｇの抽出されたＲＮＡを、滅菌マクロファージ管に配置し、そして総容量１２．５μＬまで水を添加した。７．５μＬの緩衝液／酵素混合物を、各管に添加した。緩衝液／酵素混合物を、混合することによって、列挙されるオーダーで調製した：２．５μＬ  Ｈ２Ｏ、２．０μＬ  １０×反応緩衝液、１０μＬ（２０ｐｍｏｌ）オリゴｄＴ、１．０μＬ  ｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、０．５μＬ（２０ｕ）ＲＮＡｓｉｎ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）および０．５μＬ（５０ｕ）ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）。マクロファージ管の含量を、ピペッティングによって混合し、そして反応物を１時間、４２℃にてインキュベートした。
【０１７２】
（Ｄ．標的化配列のＰＣＲ増幅および定量）
逆転写に次いで、標的遺伝子を、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  ＣｙｃｌｅｒＴＭリアルタイムＰＣＲ機を使用して、増幅した。２０μＬアリコートのＰＣＲ増幅混合物を、以下に列挙でされるオーダーで以下の成分を混合することによって、調製した：２μＬ  １０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）および５０ｍＭ  ＫＣｌを含む、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１４０μＭの各ｄＮＴＰ、０．１７５ｐｍｏｌの各Ｃｋｓ１オリゴ、１：  ５０，０００希釈のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、０．２５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１単位のＴａｑポリメラーゼ、および２０μＬまでのＨ２Ｏ。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）は、二本鎖ＤＮＡに結合する場合に蛍光を発する染料であり、各反応において生成されるＰＣＲ産物の量を直接測定することを可能にする。２μＬの完全な逆転写反応物を、各２０μＬアリコートのＰＣＲ増幅混合物に添加し、そして増幅を、標準のプロトコルに従って行った。
【０１７３】
各ＰＣＲ反応物から得られた増幅した標的配列の量を、内部コントロール（例えば、β−アクチン）と比較して正規化した。以下の表１は、Ｃｋｓ１  ｍＲＮＡレベルが、Ｃｋｓ１アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号２６〜３０）を用いるトランスフェクション後に、コントロールｍＲＮＡと比較して、ＳＷ６２０細胞において減少したことを示す。
【０１７４】
（表１：ＳＷ６２０細胞におけるアンチセンスＣｋｓ１オリゴヌクレオチドノックアウトＣｋｓ１  ｍＲＮＡ）
【０１７５】
【表１】
2005523280.tif 000026
（実施例２：軟寒天アッセイ）
下層は、細胞の層状化の数時間内で新しくプレーティングした倍地中、２ｍｌの０．６％の寒天からなった。細胞層について、実施例１に記載されるようにトランスフェクトされた細胞を、０．０５％のトリプシン中のプレートから取り出し、そして培地中で２回洗浄した。細胞を、クールター計数器中で計数し、そして培地１ｍｌあたり１０６に再懸濁した。１０ｍｌアリコートを、９６ウェルプレート中の培地に配置するか（ＷＳＴ１で計数をチェックする）、または軟寒天アッセイのためにさらに希釈した。２０００細胞を、０．６％寒天の下層の上の複製ウェル中の８００ｍｌの０．４％寒天にプレーティングした。
【０１７６】
培地層：細胞層寒天を凝固した後、２ｍｌの培地を、上部から取り出し、そしてアンチセンスまたは逆コントロールオリゴを、送達ビヒクルを用いることなく添加した。新しい培地およびオリゴを３〜４日毎に添加した。
【０１７７】
コロニーを、１０日〜３週間で形成した。コロニーの領域を、目で数えた。ＷＳＴ−１の代謝値を使用して、開始細胞数のわずかな差異を補正した。より大きな領域を、差異の可視記録についてスキャンし得る。アンチセンスでトランスフェクトしたＳＷ６２０細胞は、コントロールオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした細胞と比較してわずかなコロニーを生じた。
【０１７８】
細胞コロニーを、各軟寒天ウェルを横切る６つのランダムに選択された格子中で計数した。コロニーの数を、開始ＷＳＴ１値と比較することによって正規化した（例えば、Ｐａｎｖｅｒａから利用可能なＷＳＴ−１細胞増殖アッセイ）。
【０１７９】
以下の表２は、Ｃｋｓ１アンチセンスオリゴヌクレオチドでのＳＷ６２０細胞の処理は、それぞれの逆相補体（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）オリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトしたコントロール細胞と比較して、足場依存性増殖を減少したことを示す。
【０１８０】
（表２：Ｃｋｓ１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、足場依存性増殖を阻害する）
【０１８１】
【表２】
2005523280.tif 000027
類似の実験を、Ｓｋｐ２アンチセンス処理ＳＷ６２０細胞を使用して行い、そして結果を図１２に示す。
【０１８２】
改変したプロトコルを使用して、図１２に示されるデータを作成した。このプロトコルにおいて、コロニーの数を、Ａｌａｍａｒブルー読み取り機（Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ  ｒｅａｄｉｎｇ）で測定し、このアッセイを９６ウェル様式で行った。このプロトコルを使用して、図１２および１３に示したデータを作成した。このプロトコルは以下のとおりである。
【０１８３】
ポリ（ＨＥＭＡ）でコーティングされたプレート中での９６ウェル軟寒天アッセイ。軟寒天アッセイは、細胞が、足場依存性様式で増殖する能力（形質転換した表現型についての性質）をモニターする。アッセイの一般的な設計は、プラスチックへの結合の可能性のないプレート中で、三次元ゲル構造に細胞を強制的に置き、そしてこれらの条件下で増殖についてのリードアウトとしてコロニー形成をモニターすることである。ポリ（ＨＥＭＡ）の下層は、プラスチックへの結合から細胞を妨げ、そして定義された数の細胞は、低い割合の寒天の上部の薄層に包埋される。このアッセイは、設定が簡単であり、そして完了まで６〜７日間かかる。各セットのアッセイに、軟寒天において増殖に影響することが公知であるポジティブコントロールを含むことが好ましい。ネガティブなトランスフェクション効果  対  問題の軟寒天設定との間を識別するためにアッセイに野生型のトランスフェクトしていない細胞株を含むこともまた好ましい。
【０１８４】
（寒天の調製）
新規の寒天を、１×ＰＢＳ−ＣＭＦ（約１００ｍｌ／ボトル）中、４％で作製し、そしてオートクレーブする（液体サイクル、１２１℃、１５分間）。その後室温で維持し、そして固体にする。
【０１８５】
（ポリ（ＨＥＭＡ）プレートの調製）
非組織培養処理された９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ参照番号３３７０）を、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ＨＥＭＡ）（Ｓｉｇｍａ参照番号Ｐ３９３２）で被膜する。ポリ（ＨＥＭＡ）は、プレートの下部への結合から細胞を妨げる公知の抗接着剤である。
【０１８６】
ポリ（ＨＥＭＡ）のマスター溶液を、以下のように作製する：３ｇの粉末を、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ管中で、最終２５ｍｌの９５％エタノールに溶解する（好ましくは、９５％産業エタノールを用意するのではなく、１００％エタノールを希釈する）。管を、パラフィンでカバーし、エバポレートを避ける。管を、室温にて完全に溶けるまで１〜２日間激しく振盪する。
【０１８７】
１／１０希釈したポリ（ＨＥＭＡ）のマスター溶液を、（１００％エタノールを使用して）９５％エタノールに調製する。９６ウェルプレートの各ウェルを、５０μｌの希釈ポリ（ＨＥＭＡ）で被膜する。プレートを、このプレートが乾燥するまで（約２４時間）、可変速度（５〜６の速度設定で）で設定されたＬａｂｓｙｓｔｅｍ  Ｗｅｌｌｍｉｘ振盪機に配置する。好ましくは、被膜は、全て半透明である。いくつかのウェルに、小さな穴がなお存在する場合、これらを、さらに２４時間、２０μｌの希釈ポリ（ＨＥＭＡ）で再被膜し得る。
【０１８８】
次いで、プレートを、組織培養フード中、ＵＶ下で一晩配置し、滅菌する。最終工程は、複数チャネルのピペットを使用して、２００μｌのＰＢＳ  １×で各ウェルを２回穏やかに洗浄することである。ＰＢＳを除去し、次いで、プレートを、Ｓａｒａｎプラスチックで包み、使用するまで室温で保存する。
【０１８９】
このアッセイにおいて、全ての工程を、同じ日に行う。アッセイを行う細胞を、トリプシン処理し、そして血球計を使用して計数する。（細胞型に依存して）１ウェルあたり３５０〜７００細胞を５０μｌ培地に播種するように希釈を計算する。なおプレーティングをコントロールするために、１００μｌ／ウェルの細胞を、ポリ（ＨＥＭＡ）プレートと同じ配置で通常の平面下部プレート（ポリ（ＨＥＭＡ）で処理されていない）に播種する。次いで、５０μｌを各ウェルから複数チャネルのピペットを使用して取り出し、ポリ（ＨＥＭＡ）プレートに移す；このプレートを、約２時間でトランスフェクトする。細胞をインキュベーターに戻し、再生する。
【０１９０】
有効なプレート（ポリ（ＨＥＭＡ）処理していない）について、培地中に１／１０希釈した５０μｌのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  （Ｔｒｅｋ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，参照番号００１００−１００）を、各ウェルに添加する。このプレートを３７℃にて、２４〜３６時間インキュベートする。蛍光を励起５３０ｎｍおよび発光５９０ｎｍでモニターする。播種が一様である場合、蛍光値は、一様であるはずである。播種が一様でない場合、これらの読み取りに関する最終データの正規化が、起こる。
【０１９１】
細胞トランスフェクション。アッセイの設定は、４プレートの代わりに１プレートのみであることを除いて、増殖アッセイに類似する。プレートの外縁は使用されないが、縁効果（ｅｄｇｅ  ｅｆｆｅｃｔ）を避けるために培地を含む。オリゴを、１行の列Ｂ〜列Ｇ中の１つの遺伝子セットについてＡＳおよびＲＣを用いて、３連で試験する。ブランクは、１行のＢ〜Ｇを使用する。これは、細胞がこれらのウェル中に存在しないことを除いて、野生型細胞と同様に処理される。増殖アッセイにおけるように１１行が使用される。野生型（トランスフェクトされていない細胞）ならびにポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを使用する。７遺伝子／プレートをＡＳおよびＲＣを用いて３連で試験する。
【０１９２】
使用される液体の型は、細胞型に依存する。ＳＷ６２０細胞について、４００細胞／ウェルを、１：２．５の比のリピトイド２（Ｌ２）を使用して、３００ｎＭオリゴを用いてトランスフェクトする。各オリゴについて、３ウェルのみをトランスフェクトする。トランスフェクションおよび寒天添加後の各ウェル中の最終容量は、１５０μｌである（５０μｌの細胞＋５０μｌのトランスフェクションミックス＋５０μｌの寒天）。トランスフェクションミックスを、オリゴの最終濃度が３００ｎＭになるように３回計算した５０μｌで行う。一旦、寒天がゲル状になると、１００μｌの培地を上部に添加する。
【０１９３】
各々の３つ組みについて、以下の溶液を２つのエッペンドルフ管において調製する：（ａ）１５０μｌ  ＯｐｔｉＭＥＭ＋３μｌのオリゴ；および（ｂ）１５０μｌ  ＯｐｔｉＭＥＭ＋７．５μｌのＬ２；直ちにＡをＢへと混合し、そして４〜５回ピペットを上げ下げし、次いで、５０μｌの混合物を３つの適切なウェルに添加する。この操作を、次のオリゴについて繰り返す。一旦、カラムを３０μｌの複数チャネルセットで充填すると、６ウェルを、カラム中に８〜１０回にわけて徐々に混合し、確実に全ての細胞を均質なトランスフェクション溶液にする。
【０１９４】
野生型（トランスフェクトされていない細胞）およびブランクについて、以下の溶液を２つのエッペンドルフ管において調製する：（ａ）１５０μｌ  ＯｐｔｉＭＥＭ；および（ｂ）１５０ｕｌ  ＯｐｔｉＭＥＭ。直ちに、ＡをＢへと混合し；そして４〜５回ピペットを上げ下げし、次いで、５０μｌを適切なウェルに分配する。
【０１９５】
寒天を、２時間内に添加するべきである。新規の寒天（ＤＩＦＣＯ）４％を、電子レンジで溶かし、そして完全に溶けた場合、寒天を、少なくとも１０分間（しかし、３０分より短い）水浴中に５６℃にて配置する。９６ウェル設定において、０．３５％の寒天の最終濃度を使用する。１２×５ｍｌのポリスチレンの丸底  Ｆａｌｃｏｎ管を、８４０μｌの培地で調製し、そして３７℃にて熱遮断で維持する（３７℃〜４０℃は、受容可能である）。３〜４ｍｌの溶かした４％寒天を含む２×１５ｍｌのポリプロピレンコニカルＦａｌｃｏｎ管を調製し、次いで、６０℃にて熱遮断中に配置する（６０〜６３℃は、受容可能である）。これらの管は、後日の希釈のための濃寒天のストックとして作用する；容量が大きくなると、溶解温度での維持に、より不活発になる。
【０１９６】
８〜１０回のカラムのトランスフェクト細胞を、徐々に混合し、均質な細胞懸濁液を作製する。３００μｌの４％寒天を、８４０μｌ温かい培地（これは、１．０５％の寒天溶液を作る）に添加し、そして均質になるように混合する。２５０μｌのリペティター（ｒｅｐｅｔｉｔｏｒ）セットを用いて、５０μｌ（４回）に分け、５０μｌの同一のＡＳを３つのウェルに添加し、次いで、残りを廃棄する；この手順を、ＲＣについて同じ操作で繰り返す。このプレートを、室温にて１０〜１５分間でセットし、堅固にゲルにし、次いで、１００μｌの培地を、複数チャネルのピペットを使用して全てのウェル上に徐々に添加する。このプレートを、３７℃にて６〜７日間セットする。４〜５日後、コロニーが可視化されるはずである。
【０１９７】
Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ染色。６〜７日後、どのくらい早くコロニーが現われるかに依存して、２０μｌの希釈していないＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ染料を、ブランクを含む各ウェルに添加する。次いで、プレートを、寒天メッシュでの浸透をなお保証するために、１０〜１５分間徐々に振盪する。次いで、プレートをインキュベーターに戻し、そして蛍光（励起５３０ｎｍ、発光５９０ｎｍ）を数時間後にモニターする（一般的に、約３時間、５時間および２４時間での複数の読み取りが好ましい）。細胞の数およびトランスフェクション効果に依存して、統計学的な有意性は、約５時間後に到達し、そしてより長いインキュベーション時間で改善する。
【０１９８】
Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅは、代謝活性の検出に依存して、増殖指標として使用され得る蛍光色素である。蛍光は、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅが細胞増殖に応答して化学的に還元される場合に現われる。細胞の数が多くなると、還元された染料が、より多く生産され、５３０ｎｍの励起、５９０ｎｍで検出される。染料の酸化された形態は、その範囲で有意に蛍光発光しない。色素のほとんどが還元される場合、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅは、青色からピンクに変わる。しかし、任意の明確な色変化を伴わずに、還元された染料が形成され得る。
【０１９９】
別の実験において、ＳＷ６２０細胞を、上記のように、Ｓｋｐ２アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１５）または逆コントロールオリゴヌクレオチド（配列番号１６）でトランスフェクトした。図１０Ａに示されるように、逆コントロール処理ではなく、アンチセンス処理は、２４および４８時間の両方でＳｋｐ２  ｍＲＮＡレベルでの還元を生じる。図１０Ｂは、ｐ２７Ｋｉｐ１のレベルが、逆コントロール処理細胞においてよりもアンチセンス処理細胞において高かったことを示す。Ｃｙｃｌｉｎ  Ｅレベルは、ゲル充填コントロールとして働くｐ３４ｃｄｃ２タンパク質レベルと比較することによって決定されるレベルを維持した。細胞周期の間、ｐ３４ｃｄｃ２タンパク質レベルは、変化しない。
【０２００】
（実施例３：アンチセンス処理細胞による乳酸デヒドロゲナーゼの増加した放出）
ＳＷ６２０細胞およびＭＲＣ９細胞を、配列番号３０のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび逆相補体（配列番号３５）を使用して、実施例１に記載される通りに形質転換した。ＬＤＨアッセイを、Ｒｏｃｈｅ  ＬＤＨキットを使用して行った。図６に示されるように、配列番号３０は、対応する逆コントロールオリゴヌクレオチドよりもより大きな細胞毒性を誘導した。Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−２ＲＣは、例示的な条件を確認するためのポジティブコントロールである。４０−１（配列番号３６）およびＲＣ４０−１（配列番号４１）は、Ｃｋｓ２に特異的まアンチセンスおよび逆コントロールオリゴヌクレオチドである。
【０２０１】
（実施例４：アンチセンス処理細胞の細胞周期プロフィール）
このアッセイを、以下の物質を使用して行った：ＰＩ／ＲＮａｓｅＡ溶液：１ｍｌ  ＰＢＳ＋１％血清−２０μｌ  ＰＩストックおよび１０μｌ  ＲＮａｓｅストックに添加される。５０×ＰＩストック：３８ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．０）中０．５ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム。光から保護された冷蔵庫中で貯蔵される。１００×ＲＮａｓｅＡストック：Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）中２５ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ。粉末から作製される場合、これを１５分間ボイルし、ＲＴまで冷却し、等分し、そして−２０℃で保存する。
【０２０２】
哺乳動物の６ウェル皿の１ウェルを、サンプルとして使用した。細胞を、トリプシンの代わりに、少数の死亡細胞およびより少ない塊を生じるＰＢＳ／ＥＤＴＡを使用して、日常的に回収した。細胞を、１０００ｇで５分間スピンし、そして上清を廃棄した。ペレットを、１％の血清で補充したＰＢＳで一回洗浄し、次いで、細胞を、０．５ｍｌ  ＰＢＳ中に再懸濁した。レベル３〜５でボルテックスする間に、１０ｍｌのＥｔＯＨ（８０％）を、非常にゆっくりと添加して塊にならないようにした。
【０２０３】
細胞を、少なくとも１５分間４℃で固定液中に置いた。そして固定した細胞を、冷蔵庫中で数週間この様式で維持し得る。細胞を、１０００ｇで５分間遠心分離し、次いで１％の血清を補充したＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞を、１ｍｌのヨウ化プロピジウム／ＲＮａｓｅＡ溶液に再懸濁し、その都度新しく作製し、そして３０分間３７℃でインキュベートした。
【０２０４】
必要に応じて、細胞を、ＦＡＣＳ管に細胞濾過器に通してピペッティングする。細胞を、２４時間内分析し、そして細胞を氷上に維持し、そしてＦＡＣＳ分析まで光から保護した。１０，０００細胞を、フィルターとしてＦＬ２−Ａを使用して計数した。図９に示されるように、アンチセンス処理によるＣｋｓ欠乏は、非同期的に増殖するＳＷ６２０細胞およびＭＲＣ９細胞の細胞周期プロフィールを有意に変更しなかった。
【０２０５】
本発明の特定の実施形態が、例示の目的のために本明細書中に記載されるが、種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、前記から理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】図１は、Ｃｋｓ１ポリヌクレオチド（配列番号１）である。
【図２】図２は、Ｓｋｐ２ポリヌクレオチド（配列番号３）およびポリペプチド（配列番号４）である。
【図３】図３は、腫瘍細胞株におけるＣｋｓ１メッセンジャーＲＮＡの発現を、アクチンに対して正規化して示す棒グラフである。
【図４Ａ】図４は、Ｃｋｓ１およびＣｋｓ２が、腫瘍細胞における細胞増殖に必要であることを示す棒グラフである。図４Ａは、Ｃｋｓ１（配列番号３０）に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでＳＷ６２０細胞を処理することによって示す。
【図４Ｂ】図４は、Ｃｋｓ１およびＣｋｓ２が、腫瘍細胞における細胞増殖に必要であることを示す棒グラフである。図４Ｂは、Ｃｋｓ２（配列番号３９）に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでＳＷ６２０細胞を処理することによって示す。
【図４Ｃ】図４は、Ｃｋｓ１およびＣｋｓ２が、腫瘍細胞における細胞増殖に必要であることを示す棒グラフである。図４Ｃは、配列番号１５（Ｓｋｐ２に特異的）で処理した細胞の増殖を示す。
【図５】図５は、配列番号２７および配列番号３０を用いて、Ｃｋｓ１枯渇が、ＳＷ６２０細胞の足場非依存性増殖を阻害することを示す棒グラフである。
【図６】図６は、アンチセンス処理によるＣｋｓ１枯渇が、ＭＲＣ９（図６Ａ）細胞およびＳＷ６２０（図６Ｂ）細胞において細胞毒性を引き起こすことを示す棒グラフである。
【図７】図７Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＣｋｓ１発現の阻害により、ｐ２７Ｋｉｐ１が蓄積することを示す棒グラフである。図７Ｂは、ｐ２７Ｋｉｐ１の蓄積を確認する写真である。ｐ３４ｃｄｃ２は、細胞周期依存性キナーゼ（Ｃｋｄ１としても公知）である。ｐ４５ｋｐ２は、タンパク質Ｓｋｐ２である。
【図８】図８は、Ｃｋｓ２ではなくＣｋｓ１の枯渇が、腫瘍細胞におけるｐ２７Ｋｉｐ１タンパク質レベルに影響を及ぼすことを示す。
【図９】図９は、アンチセンス処理によるＣｋｓ１枯渇が、非同期的に増殖するＳＷ６２０細胞およびＭＲＣ９細胞の細胞周期プロフィールを有意には変更しないことを示す。
【図１０】図１０は、Ｓｋｐ２枯渇が、サイクリンＥ分解に直接には影響を及ぼさないことを示す。Ｓｋｐ２ＡＳは配列番号１５であり、そしてＳｋｐ２ＲＣは配列番号１６である。図１０Ａにおいて、Ｓｋｐ２ＲＣではなくＳｋｐ２ＡＳが、処理したＳＷ６２０結腸癌細胞におけるＳｋｐ２  ｍＲＮＡレベルを低下した。図１０Ｂにおいて、サイクリンＥレベルは、Ｓｋｐ２ＡＳによって有意には影響されない。
【図１１】図１１は、Ｓｋｐ２ＲＣ（配列番号１６）ではなくＳｋｐ２ＡＳ（配列番号１５）が、正常ヒト線維芽細胞におけるＳｋｐ２  ｍＲＮＡレベルを低下させることを示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、足場非依存性増殖に対するＣｋｓ１およびＳｋｐ２枯渇の影響を示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、ｐ２７枯渇が、足場非依存性増殖に対するＣｋｓ１アンチセンスの影響を逆転することを示す棒グラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005523280.tif 000050
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月19日(2005.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005523280000001.app
【国際調査報告】
2005523280.tif 000057