(57)【要約】本発明は、細胞を培養するために有用である拡張可能な表面領域を有するバイオリアクター装置を開示する。細胞培養方法もまた、本発明に含まれる。該方法は、容器および容器に近接する担体を提供する工程、ここで容器は流入および流出を含み、担体は拡張可能な表面領域を含む；流入を介して担体に細胞を供給する工程、ここで細胞は担体に付着し、増殖する；および容器の流入を介して栄養分を継続的に供給する工程を含む。その上で細胞を培養するための拡張可能な表面領域を含む担体を含む細胞培養用デバイスもまた、本発明に含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）容器；
（ｂ）該容器内の担体、ここで該担体はその上で細胞が培養される拡張可能な表面領域を含む；
（ｃ）該表面領域と流動的に通じている入口；および
（ｄ）該表面領域と流動的に通じている出口
を含む細胞培養用装置。
【請求項２】
前記担体が前記容器と統合されている請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記担体が前記容器の一部である請求項２記載の装置。
【請求項４】
前記表面領域が可逆的に拡張可能である請求項１記載の装置。
【請求項５】
前記担体が生物分解性材料である請求項４記載の装置。
【請求項６】
前記生物分解性材料がコラーゲンである請求項５記載の装置。
【請求項７】
前記担体が生物分解性材料である請求項１記載の装置。
【請求項８】
前記表面領域がその上で細胞が増殖する最適な表面領域を含む、請求項1記載の装置。
【請求項９】
前記担体が、糸、薄片、球体、膜または任意のその組合せからなる群より選択される、請求項1記載の装置。
【請求項１０】
前記担体が球体である請求項９記載の装置。
【請求項１１】
前記担体が多数の球体である請求項１０記載の装置。
【請求項１２】
前記担体が取り外し可能な境界を有する組織培養プレートを含む、請求項1記載の装置。
【請求項１３】
前記境界が同軸を有する請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
前記担体が固定された境界を有する組織培養プレートを含む、請求項1記載の装置。
【請求項１５】
その上で細胞が培養される拡張可能な表面領域を有する担体を含む、細胞培養用装置。
【請求項１６】
前記表面領域が可逆的に拡張可能である請求項１５記載の装置。
【請求項１７】
前記担体が取り外し可能な境界を有する組織培養プレートを含む、請求項１５記載の装置。
【請求項１８】
前記境界が同軸を有する請求項１７記載の装置。
【請求項１９】
（ａ）容器および該容器に近接する担体を提供する工程、ここで該容器は流入および流出を含み、該担体は拡張可能な表面領域を含む；
（ｂ）流入を介して細胞を該担体に供給する工程、ここで該細胞は該担体に付着し、増殖する；
（ｃ）該容器の流入を介して栄養分を継続的に供給する工程
を含む細胞培養方法。
【請求項２０】
前記担体の表面領域が可逆的に拡張可能である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記担体が球形である請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記担体が多数の球体である請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記担体が取り外し可能な境界を有する組織培養プレートを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
前記境界が同軸を有する請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記担体が生物分解性材料である請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
前記生物分解性材料がコラーゲンである請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記担体が前記容器と統合されている請求項１９記載の方法。
【請求項２８】
前記担体が前記容器の一部である請求項１９記載の方法。
【請求項２９】
その上で細胞が培養される拡張可能な表面領域を含む担体を含む、細胞培養用デバイス。
【請求項３０】
前記担体が生物分解性材料である請求項２９記載のデバイス。
【請求項３１】
前記生物分解性材料がコラーゲンである請求項２９記載のデバイス。
【請求項３２】
前記表面領域がその上で細胞が増殖する最適な表面領域を含む、請求項２９記載のデバイス。
【請求項３３】
前記担体が、糸、薄片、球体、膜および任意のその組合せからなる群より選択される、請求項２９記載のデバイス。
【請求項３４】
前記担体が球形である請求項２９記載のデバイス。
【請求項３５】
前記担体が多数の球体である請求項２９記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は細胞培養技術の分野に関する。特に、本発明は細胞を培養するための新規な方法、装置、およびデバイスに関する。
【０００２】
発明の背景
生物学的産物、たとえばモノクローナル抗体、インターフェロン、ワクチン、治療的タンパク質、組織構造物などが、細胞および特に哺乳動物細胞の助けを借りて生産される。係る産物の生産の経済状態は、細胞増殖の効率および細胞内に生産される所望物質の可能である最高濃度に一部依存する。これを成し遂げるために、細胞の大スケール培養に使用される手順およびデバイスの特別な必要条件が要求される。気体、特に酸素と同様に栄養分の十分な供給を提供することが重要である。廃産物、たとえば細胞培養物中で必要とされず、しばしば細胞の増殖を阻害する細胞代謝産物は除去されなければならない。温度およびpH値などの他の全ての環境条件もまた制御されなければならない。
【０００３】
ウイルス性ワクチン、増殖因子、受容体または治療的タンパク質の生産に使用される多くの動物細胞は、足場依存性（つまり、それらは増殖するために適合性のある表面へ付着しなければならない）である。この要求性は、正常な二倍体細胞に関して特に厳密である；これらの細胞は、表面に付着する必要があるだけでなく、付着後に偏りがあって細長い細胞形状を生じ、結局は増殖して表面を覆い、コンフルエントな状態に達する。これらのタイプの細胞は表面上に単層を形成し、コンフルエントなとき、つまり、細胞が最大密度に達したときに細胞分裂が停止する。
【０００４】
培養細胞間の接触阻害はまた、細胞増殖を停止させる。増殖は、トリプシンなどの蛋白質分解剤への曝露により細胞が付着表面から剥離され、より大きな表面上で再培養された後でしか回復しない。
【０００５】
従来、細胞は、ローラー瓶中でまたは組織培養プレートもしくはフラスコ上で（その全てが固定化された表面領域を有する）培養されてきた。1980年代以来、大量の治療的タンパク質に対する需要の結果、大スケール操作により適した多くの代替培養法のより広範な適用が生じた。これらの代替法には、pHなどの環境条件を正確に制御するためにバイオリアクターを用いること、栄養分を提供すること、および老廃物を除去することが含まれる。付着性細胞に関して、微細担体がバイオリアクター内の付着表面として使用され得る。係る微細担体は、デキストラン(Van Wezel, A. L. 1967, Nature 216:64:65参照); ポリスチレン(Johansson, A.ら, 1980, Dev. Biol. Stand 46:125-129 およびKuo, M.ら, 1981, In Vitro 17:901-906参照); セルロース(Reuveny, S.,ら, 1982, Dev. Biol. Stand. 50:115-123参照); コラーゲン(R. C. Dean ら, 1985, Large Scale Mammalian Cell Culture Technology. B. K. Lydersen編、Hansen Publishers, New York, N.Y., pp. 145-167参照); またはゼラチンを主材料とする大孔性(macroporous)ビーズ(Cultisphere, Technical Bulletin, Percell Biolytica AB参照)から調製され得る。撹拌手段が、リアクター内部の培養培地を動かし、従って、その上に付着性細胞が付着し、増殖し得る微細担体の均質な分配を提供する。代替的なバイオリアクターとしては、中空繊維バイオリアクター(Knazek,ら, 1972, Science 178:65参照) およびセラミックバイオリアクター(Lydersen,ら, 1985, Biotechnology 3:63参照)が挙げられる。
【０００６】
伝統的な細胞培養に対するこれらの代替的な選択対象の中で、典型的には微細担体を含むバイオリアクターが、付着性細胞に対して最も広範に使用される。微細担体の寸法の幅の範囲は、哺乳動物細胞の増殖に対して通常、100〜400ミクロンが適切である(たとえば、Butler, M., 1987, Adv. Biochemical Engineering/Biotechnology 34:57-84参照)。微細担体技術は、リアクター容器内に利用可能な細胞増殖エリアをたくさん提供する。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、細胞培養用装置およびデバイスを提供する。一態様において、該装置は、容器、容器内の担体、流入、流出、およびかき混ぜ機構を含む。該担体は、その上で細胞が培養される拡張可能な表面領域を含む。
【０００８】
一態様において、担体は小球体である。別の態様において、担体は糸である。さらに別の態様において、担体は薄片である。別の態様において、担体はいくつかの糸の塊である。別の態様において、担体は小球体、糸、薄片、または糸の塊の任意の組合せである。
【０００９】
本発明の装置の別の態様において、担体の表面領域は可逆的に拡張可能である、すなわち、表面領域は拡張され、次に元の表面領域に戻らされる。
【００１０】
本発明はまた、その中で容器および担体が互いに統合されている装置を提供する。
【００１１】
一局面において、可逆的に拡張可能な担体は、任意に同軸の境界である多数の取り外し可能な境界を有する組織培養プレートであり、そのため、細胞増殖により表面領域が最適下限になると、境界を取り外すことで組織培養プレートの表面領域が増大される。境界の形状は、任意の規則的または変則的な形状、たとえば正方形、長方形、三角形、円形、線状、または非線状である。
【００１２】
本発明の別の局面において、境界は組織培養皿上に固定され、固定された境界は曲がりくねっているか、波状、またはジグザク形である。
【００１３】
本発明はまた、本発明の装置を用いた細胞培養方法を提供する。該方法は、容器および容器に近接する担体を提供する工程を含む。容器は流入および流出を有し、担体は拡張可能な表面領域を有する。本発明の方法の一態様において、担体の表面領域は可逆的に拡張可能である。
【００１４】
本発明の別の態様において、その上で細胞を培養するための拡張可能な表面領域を有する担体を有するデバイスが開示される。一態様において、担体は生物分解性である。別の態様において、担体はコラーゲンから調製される。
【００１５】
本発明のデバイスの別の態様において、担体は多数の球体である。別の態様において、担体は、取り外し可能な境界、好ましくは同軸の境界を有する組織培養プレートである。別の態様において、担体はデバイスと統合されている。別の態様において、担体は、糸、薄片、球体、糸の塊、またはその組合せである。本発明のデバイスの別の態様において、担体は細胞増殖に最適な表面領域を含む。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞培養用装置のいくつかの態様を記載する。各態様において、本発明は、収穫までの長期にわたり細胞を継続的に培養するための拡張可能な表面領域を含む。付着性細胞は、その上に付着し増殖するために最適な表面領域を有する。仮に表面領域が細胞にとって大きすぎる、または小さすぎると、そのときは細胞は生育しないであろう。従って、細胞の付着および生育に対して最適な表面領域が必要である。
【００１７】
本発明の一態様において、図面を参考に用いると、拡張可能な表面領域は、内部に液体20および液体20内に少なくとも1つの担体22を有する容器10と共に使用され得る。容器10は、液体20、流入12および流出14を含む。流入12および流出14は、たとえばチューブ18を介して担体22と液体および気体のやり取りをする。細胞21は、担体22上のバイオリアクターにおける拡張可能な表面領域23に付着し、生育し、増殖する。
【００１８】
拡張可能な表面領域23が、細胞増殖にとって最適下限になると、表面領域23は、担体22の表面領域を拡張させること、または、たとえば、バイオリアクター自身と統合している細胞培養表面領域23を拡張させることのいずれかにより拡張され、その結果、表面領域23は再び、より多数の細胞21にとって細胞生育および増殖に関して最適となる。
【００１９】
図１は、小球体としての担体22の一態様を図示する。図１が、球形の形状を有する多数の固体担体22を図示する一方、担体22は、任意の形状またはサイズであり得、任意にその中に種々のサイズおよび形状の孔を有し得る。たとえば、担体22は、糸、糸の塊(たとえば、丸い形態、またはより合わせた形態を生じる)、薄片、膜、スポンジ、または任意のその組合せであり得る。担体22の例は、2002年5月1日に出願された米国特許出願第60/376,709号(その全体において本明細書中で参考として援用される)に記載される。
【００２０】
担体22は、たとえば、担体22に付着される特定の細胞、バイオリアクター設計、および培養培地によって異なる材料から形成される。かかる材料としては、限定されるものではないが、米国特許第5,114,805号、米国特許第5,830,507号、および米国特許第6,214,618号(その全体において本明細書中で参考として援用される)に記載されるような、コラーゲンなどの天然タンパク質、デキストランなどの糖を主材料にしたポリマー、ポリスチレンおよびポリヒドロキシ酪酸などのプラスチックポリマー、ゼラチンを主材料にした材料、セルロースなどの不溶性繊維、中空繊維、およびセラミックが挙げられる。球状または繊維状の形状に形成され得る任意の材料が、担体22に関して許容され得る材料である。
【００２１】
担体22を形成するために有用な材料としてはまた、ヒアルロン酸、澱粉、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール、およびポリブチレンテレフタレートが挙げられる。リポソーム被覆材料もまた、本発明において有用である。
【００２２】
本発明の一態様において、担体22は、SEPHADEX2TM (架橋デキストランビーズ)およびCYTODEXTM(Sigma, St. Louis, MO)を含む、市販の小球体である。小球体の他の商業的供給業者としては、ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA)、Imedex(Alphretta, GA)、Matricel(Germany)、Collagen Products，Pharmacia(Piscataway, NJ)、Solo Hill Engineering(Ann Arbor, MI)、およびVerax Corporationが挙げられる。
【００２３】
担体22は、架橋または非架橋材料から調製され得る。架橋材料は、任意の架橋剤、たとえばグルタルアルデヒドを用いて、または任意の架橋方法、たとえばTardyらへの米国特許第4,931,546号に記載されるような過ヨウ素酸酸化により架橋される。
【００２４】
図１に示される一態様において、担体22はコラーゲン材料の小球体である。担体22は、再吸収性、または非再吸収性、および生体適合性である。
【００２５】
本発明の一態様において、担体22は、膜および/または接着剤の存在下または非存在下で培養され得る。膜および接着剤は、自己由来または非自己由来であり得る。膜および/または接着剤は、たとえばフィブリンまたはコラーゲンであり得る。膜および接着剤は、細胞21に対して非毒性であるが、細胞培養に対して最適なパラメーターを決定するため、使用の前に膜および接着剤の粘着性、孔隙率、および/または物理学的強度が試験されるべきである。
【００２６】
本発明において有用な膜としては、ChondroGide(登録商標)(Ed Geistlich Sohne, Wolhusen, Switzerland)、BioGide(登録商標)(Ed Geistlich Sohne, Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Switzerland)、ならびにMentor Corporation(Santa Barbara, CA)製のSuspend SlingTM、Glycar Vascular, Inc.(Dallas, TX)製のStaple StripsTM、Boston Scientific(Natick, MA)製のSurgical Fabrics、Cook Biotech, Inc.(West Lafayette, IN)製のSurgiSISTM SlingおよびSurgiSISTM Mesh、Sentron Medical, Inc.(Cincinnati, OH)製のSIS Hernia Repair Device、およびDePuy Orthopaedics製のRestore(登録商標)Soft Tissue Implantを含む小腸粘膜下層(SIS)が挙げられる。
【００２７】
本発明において有用な他のタイプの膜が、米国特許出願第10/121,249号(その全体において本明細書中で参考として援用される)中に開示される。
【００２８】
図２−Ａおよび図２−Ｂは、軟骨細胞21が担体22へ付着される、本発明の一態様を示す。担体22が形成される材料は、任意のタイプの付着性細胞21の要求を満たし、任意のタイプの付着性細胞21を適応させるために選択される。従って、本発明は、軟骨細胞に限定されず、また1つの特定のタイプの担体材料に限定されない。幹細胞、腱細胞、神経細胞、角化細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、肝細胞、腎細胞、甲状腺細胞、副腎細胞および生殖腺細胞を含む内分泌細胞、ならびにリンパ球および赤血球を含む血球を含む他の細胞21はまた、本発明の装置および方法を用いて培養され得る。
【００２９】
一態様において、本発明は、担体22およびその上に細胞が付着し、増殖する拡張可能な表面領域を有する、細胞増殖用バイオリアクターを含む。本発明によると、バイオリアクターの表面領域は、多くの方法で拡張される。本発明の一態様において、表面領域が細胞21にとって最適下限になると、その上に細胞21が付着し、生育し、増殖する、使用可能な表面として追加の担体22が、容器10へ添加される。本発明の一態様において、追加の表面領域は、容器10へ担体22を添加することで得られ、ここで該担体は、既に容器10内に存在する担体22と同じサイズおよび形状である。代替的な態様において、添加される担体22は、容器10内に既存の担体22に比べて大きい、小さい、または種々のサイズおよび形状である。
【００３０】
細胞密度は、担体22のサイズに関して変化し、また細胞生育の段階にも依存する。従って、拡張可能な生育エリアに対する細胞の最適な割合の取得は、細胞生育の段階および細胞密度に一部依存する。担体22は、約20ミクロン〜約500ミクロンのサイズ内で変化する。一態様において、薄片である担体22は、約20ミクロン〜約2ミリメートルの寸法内で変化し得る。
【００３１】
本発明の一態様において、表面領域は、水、脂肪酸、油、およびリポソームなどの水和剤を用いて担体22を水和することにより増大される。さらなる水和が表面領域の増大を生じさせるように、担体22はバイオリアクター装置に添加されるときに完全に乾燥していてもよく、また任意の水和段階であってもよい。
【００３２】
上記態様の任意の態様において、最適な表面領域は、好ましくはより多くの担体22を添加する前に決定される。この算出は、特定の担体材料および特定のタイプの細胞を用いた予備実験により決定される。予備実験が行われた後、特有の量の担体22がバイオリアクター装置へ添加され、かかる量は、例えば担体を数えること、特定の重量の担体22を添加すること、および/または特定の表面領域(たとえば、丸い小球体に関して、公式は1/3πr3であろう)を添加することにより計量される。この方法での表面領域の拡張は、多くの回数（約20反復まで）繰り返され得る。好ましくは、細胞は2〜10反復後に収穫され、より好ましくは、細胞は2〜5反復後に収穫される。
【００３３】
本発明の別の態様において、拡張可能な表面領域は、酵素または担体22を溶解もしくは分解するが細胞21には影響を及ぼさない他の溶液を用いて担体22を溶解または分解することにより増大される。一態様において、担体22が溶解された後、細胞21はペレット化され、収穫され、洗浄され、新しい担体22と再懸濁されて細胞生育および増殖を続ける。本発明の一態様において、新しい担体22は、以前にバイオリアクター中にあった担体22よりも大きい。別途の態様において、新しい担体22は、以前にバイオリアクター中にあった担体22よりも小さい。さらに別の態様において、新しい担体22は、以前にバイオリアクター中にあった担体22と比べて小さい担体から大きい担体までサイズにおいて異なる。上記３つの態様の任意の態様において、最適な表面領域は新しい担体22の添加前に決定される。この算出は、細胞21を液体20中に再懸濁する工程、液体20中に存在する細胞21の数を数える工程、およびその上でこれらの細胞が増殖する最適表面領域を決定する工程により行われる。この過程は、上記の通り数回繰り返され得る。
【００３４】
任意の上記の態様に関して、容器10は、たとえばガラス、セラミック、またはプラスチック材料であり得る。一態様において、容器10は、限定されないが、ポリスチレン、ポリエチレン、PVC、ポリスチレンおよび他の形作ることのできる人工樹脂を含むプラスチックポリマーである。
【００３５】
上記態様の任意の態様において、かき混ぜ機構16は好ましくは撹拌機構、たとえば図１に図示されるような磁気撹拌バーまたはモーター駆動撹拌ロッドである。かき混ぜはまた、振盪機構、回転機構を介して、または循環流により生じ得る。
【００３６】
本発明の別の態様において、担体22は、流入12および流出14を有する組織培養プレート25である。組織培養プレート25は、任意の表面領域サイズであり得、拡張可能および収縮可能(contractable)な表面領域を有し得る。組織培養プレート25の表面領域サイズを選ぶ場合に考慮すべき要素としては、温度、二酸化炭素含有量、ガス交換、細胞培養培地、組織培養皿が被覆されているかどうか、細胞に対する細胞培養培地の量、および細胞が前処理または前インキュベートされているかどうか、が挙げられる。
【００３７】
一態様において、組織培養プレート25は、図３−Ａおよび３−Ｂに示される通り取り外し可能な境界24を有し、該境界は細胞培養過程を通してバイオリアクターの表面領域を調整する。図３−Ａは、取り外し可能な境界24を有する、円形の組織培養プレート25を明示する。図３−Ｂは、正方形の形状の組織培養プレート25を明示する。組織培養プレート25の形状は本発明にとって本質的なものではない。従って、組織培養プレート25は、これらに限定されないが、円形、正方形、三角形、長方形、および偏菱形を含む、任意の規則的または変則的な形状であり得る。
【００３８】
本発明の一態様において、取り外し可能な境界24は同軸である、すなわち該境界は同じ中心を有する。図３−Ａおよび３−Ｂに示されるような一態様において、細胞21は組織培養プレート25の最も内側の境界の中に接種され、該境界内の表面領域が細胞増殖に対して最適下限になると、外側に隣接する境界24が取り外される。一般的に、約65パーセント〜90パーセントの細胞がコンフルエントなとき、細胞増殖に対して表面領域が最適下限になる。この時点で、細胞が収穫されるかまたは境界24が取り外されるかのいずれかである。別の態様において、細胞21は、組織培養プレート25の最も外側の境界の中に接種され、該境界内の表面領域が細胞増殖に対して最適下限になると、内側に隣接する境界24が取り外される。
【００３９】
本発明の別の態様において、図３−Ｃに図示される通り、連続した取り外し可能な垂直の境界24が使用され得る。この態様において細胞21は、任意の境界領域中に接種され、表面領域が最適下限になると表面領域を増大させるために、上記のように１以上の隣接する境界24が取り外される。
【００４０】
本発明のさらに別の態様において、組織培養プレート25は、図４−Ａおよび４−Ｂに図示されるように、固定された波形の境界27を有する。図４−Ａは、ジグザグ境界としての境界27を図示する。波形境界27の各ピーク下の角度は同じであるか、または多様にされてもよく、0と180度との間の角度である。細胞21は、固定された境界の任意の部分に接種され、組織培養プレート25の縁に沿って、たとえば区画Ａ、区画Ｂなどの上で継続的に増殖する。
【００４１】
本発明の別の態様が図４−Ｂに図示され、ここで、固定された境界27は、連続的であるか、または変動し、たとえば波形もしくは曲がりくねった曲線である。一態様において、これらの境界のピークおよび谷は丸みが付けられており、波形境界27の各ピーク下の領域は同じである。
【００４２】
本発明の一態様において、組織培養プレート25および取り外し可能な境界24または固定された境界27は同じ材料から形成される。バイオリアクターに適した材料としては、限定されないがポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ガラス、PVC、および他の非毒性で滅菌可能なプラスチック材料を含むプラスチックポリマーまたはプラスチックポリマーの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
代替的に、組織培養皿25および取り外し可能な境界24または固定された境界27は異なる材料由来である。一態様において、組織培養皿25は、ポリスチレンなどのプラスチックポリマーであり、取り外し可能な境界24または固定された境界27は、その上に細胞21が付着しない材料、たとえばガラス、テフロン、シリコナイズした表面、および負に荷電した表面から形成される。
【００４４】
本発明の別の態様において、担体22および組織培養皿25は、細胞を培養するために共に使用される。組織培養皿25は、バイオリアクター装置に関して容器として使用され得、担体22および/または培養皿25は、その上で細胞21が増殖し得る拡張可能な表面領域を提供する。
【００４５】
典型的には上記の全態様は、１以上の共通の特徴を有する。本発明の一態様において、液体20は、細胞培養培地である。細胞培養培地は、異なる細胞タイプに対して異なり、同じ細胞タイプは様々なタイプの培地を用いて培養され得る。同様に、細胞培養培地は様々な栄養分、血清を含む自己由来の物質、増殖因子、抗生物質、抗真菌薬、糖などを補充され得る。
【００４６】
細胞21が軟骨細胞である本発明の一態様において、一例として、液体20は、軟骨細胞培養培地であり、約500ミリリットルの増殖培地を生成するために2.5ミリリットルの初期濃度７０マイクロモル/リットルのゲンタマイシン硫酸塩、4.0ミリリットルの初期濃度２．２マイクロモル/リットルのアンホテリシン(商品名Fungizone(登録商標)、Squibbより入手可能な抗真菌薬)、15ミリリットルの初期濃度300マイクロモル/リットルの1-アスコルビン酸、100ミリリットルのウシ胎児血清(終濃度20％)、および残余分であるDMEM/F12培地を含む。
【００４７】
液体20はまた、最適な細胞増殖のために栄養分を含み得る。腫瘍細胞またはその細胞タイプに通常見られる遺伝子を欠失している遺伝的に変化した細胞のような培養することが困難である細胞などの特定の細胞21の大スケール生産が所望され得るようである。従って、限定されないが、最適な表現型もしくは遺伝子型ではない特異的な表現型または遺伝子型の細胞21を生産するために特殊化された培地を含む他の液体もまた、本発明に含まれる。
【００４８】
滅菌条件および最適増殖パラメーターはまた、細胞生育および増殖に関して重要である。本発明の一態様において、バイオリアクター装置は相対的に小さいサイズであり、層流フード下および遠心分離機の中の双方で作動可能である。該装置はまた、インキュベーター内で容易に操作され得る。ガス交換は入口12(図１)を介して生じ、拡散または撹拌機構16(図１)を介してもまた生じ得る。本発明の一態様において、細胞21および担体22は入口12を介してバイオリアクターチャンバーへ添加される。また、本発明の好ましい態様において、バイオリアクター装置は無菌の、好ましくはねじ込むことのできるキャップを含む。
【００４９】
上記態様の全てにおいて、細胞は、細胞の成長段階および細胞の最終的な用途に依存して、細胞培養過程の任意の工程で収穫され得る。通常、細胞は約65パーセント〜約95パーセントの融合性(confluency)が達成されたときに収穫される。いつ細胞が収穫されるべきかを決定するための基準は、融合性を測定するために細胞培養培地のアリコートあたりの細胞を数える工程を含む。
【００５０】
組織培養態様の任意の態様に関して、細胞は、培養表面領域全体の約65パーセントと95％の間のコンフルエントに近づいたとき収穫される。
【００５１】
本発明のこれらのおよび他の局面が、以下の実施例からよりよく理解され得るが、これらは本発明を例証しようとするが限定するものではない。
【実施例】
【００５２】
実施例１  コラーゲン小球体上への細胞接種
100マイクロリットルの細胞培養培地中の100,000個ヒト軟骨細胞を、対照細胞集団として使用するために6穴組織培養プレートの１ウェル中に接種した。40ミリグラムのコラーゲン小球体(Mcox-001;Imedex,France)の3バッチ分をリン酸塩緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄した。各バッチで40ミリグラムのコラーゲン小球体あたり100,000個のヒト軟骨細胞を接種した。接種後1時間で、3.5ミリリットルの細胞培養培地を添加し、該球体を振盪機上で37℃で3日間インキュベートした。
【００５３】
3日間のインキュベート後、さらなる10、20、または40ミリグラムの新しい小球体をバッチ1、2、および3へそれぞれ添加した。初期の小球体の接種後1週間、培地をこの間に一回交換し、さらなる10、20、または40ミリグラムの新しい小球体をバッチ1、2、および3へそれぞれ添加した。
【００５４】
8日後、小球体をコラゲナーゼで消化し、細胞をトリプシン処理した。細胞の数と生存度を測定した。接種前および接種後の細胞の数と生存度を表１に示す。
【００５５】
【表１】
2005536225.tif 000002
【００５６】
これらのデータから、細胞の数および生存度を、所望される最大細胞数が達成されるまで、培養過程を通じて定期的に新しい小球体を添加することで増やし得ると結論付けることができる。このことは、従来の方法、すなわち有限な表面領域を用いて細胞を培養することなく成し遂げることができる。
【００５７】
実施例２  様々な担体および材料の比較
本実施例の目的は、様々なタイプの担体材料、すなわち、それぞれ単独で使用されるグルタルアルデヒドを用いて架橋されたコラーゲン糸およびグルタルアルデヒドを用いずに架橋されたコラーゲン糸、コラーゲン小球体ならびにコラーゲン膜間の差を実証することである。
【００５８】
本実施例に関して、Chondro-Gide(登録商標)膜を陽性および陰性対照として使用した。担体材料無しの軟骨細胞もまた、さらなる対照として使用した。試験材料は以下の通りである：
・約0.5センチメートルの直径を有する球形状にプレスされ、グルタルアルデヒドを用いて架橋された糸(Pcox-R1;Imedex)；
・約0.5センチメートルの直径を有する球形状にプレスされ、グルタルアルデヒドを用いずに架橋された糸(Pcox-001;Imedex；Tardyら、米国特許第4,931,546号中の架橋方法参照)；
・グルタルアルデヒド架橋されていない小球体(Mcox-001;Imedex)；および
・グルタルアルデヒドを用いて架橋された二層CR-1膜(Imedex)。
【００５９】
5,000,000個の凍結ヒト軟骨細胞を解凍し、PBSで洗浄し、細胞の生存度を測定した。解凍および洗浄後、4.2x106個の細胞が溶液中に存在しており、その中の62％が生存していた。次に、細胞を2つのフラスコに分配し、37℃で3日間インキュベートし、従来の方法で継代培養して、それぞれ4.3x106個および5x106個の細胞を得た。各フラスコの生存度は、それぞれ89％および86％であった。次に、細胞懸濁液を混合し、合計9.3x106個細胞および平均生存度87.5％であった。
【００６０】
各コラーゲン材料をPBSで洗浄し、12穴組織培養プレートの各ウェルに添加した。次に、軟骨細胞懸濁液をトリプシン処理し、100,000個細胞を有する懸濁液を調製済みの担体材料を含む各ウェルへ適用した。担体材料を加えた細胞混合物を37℃で3日間インキュベートした。
【００６１】
第一の細胞のトリプシン処理により対照細胞を収穫し、次に洗浄し、遠心分離により細胞をペレット化した。細胞の量および生存度を測定した。コラーゲン材料上に接種した細胞をトリプシンおよびコラゲナーゼで処理し、コラーゲン材料の溶解を定期的に顕微鏡観察でモニターした。コラーゲン担体の溶解後、細胞を遠心分離し、数えた。
【００６２】
対照群(n=12)および球体群(n=12)から、3日間のインキュベーション後に約175,000個細胞を収穫した。グルタルアルデヒドを用いずに架橋された糸(n=11)は、約200,000個細胞を生じ、一方、グルタルアルデヒドを用いて架橋された糸(n=9)は、約55,000個細胞しか生じなかった。グルタルアルデヒドを用いて架橋された糸は、コラゲナーゼ中で容易に溶解せず、細胞はインタクトな糸から回収されなければならなかったことに気付いた。約175,000個細胞をChondro-Gide(登録商標)(n=12)から回収した。最後にCR-1膜(n=6)は、約40,000個細胞を生じた(図５参照)。
【００６３】
球体、グルタルアルデヒドを用いずに架橋された糸、およびChondro-Gide(登録商標)の全てから陽性結果が提供され、少なくとも対照群と同様に機能した。グルタルアルデヒドを用いて架橋された糸およびCR-1膜は、対照群よりも実質的に少なく産出した；しかしながら低めの収穫量は、細胞が担体材料を結合した強度を含む多くの他の要因に依るかもしれない。細胞が担体を強く結合すればするほど、結合した細胞が収穫量へ勘定されることはますますありそうも無い。
【００６４】
細胞の生存度もまた、各群において評価した。図６は、対照試料と比較した細胞の生存度を示す棒グラフである。双方とも約70％の生存度を生じたグルタルアルデヒドを用いて架橋された糸およびCR-1膜を除いて、全ての群が90％より大きい生存度を示した。キャリア材料を機械的により小片に粉砕した場合の生存度の増大(データは示されない)に示唆されるように、低めの生存度は、これらの担体をコラゲナーゼで長時間消化した事実によるものかもしれない。
【００６５】
本明細書中で引用した各ならびに全ての特許、特許出願および出版物の開示は、本明細書によりその全体が参考として援用される。
【００６６】
本発明は、特別な態様に関して開示されているが、本発明の他の態様および変形体が、本発明の真意および範囲を逸脱することなく当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのかかる態様および同価値の変形体を含むと解釈されることを意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、本発明の装置の一態様の側面図である。
【図２−Ａ】図２−Ａは、その表面に付着した細胞を有する小球体の側面図である。
【図２−Ｂ】図２−Ｂは、最大数の付着した細胞を有する小球体の側面図である。
【図３−Ａ】図３−Ａは、本発明の、取り外し可能な同軸の境界を有する組織培養皿の一態様の平面図である。
【図３−Ｂ】図３−Ｂは、本発明の、取り外し可能な同軸の境界を有する組織培養皿の別の態様の平面図である。
【図３−Ｃ】図３−Ｃは、本発明の、取り外し可能な垂直で直線的な境界を有する組織培養皿の別の態様の断面図である。
【図４−Ａ】図４−Ａは、本発明の、固定されたジグザク形の境界を有する組織培養皿の別の態様の断面図である。
【図４−Ｂ】図４−Ｂは、本発明の、固定され、曲がりくねった境界を有する組織培養皿の別の態様の断面図である。
【図５】図５は、様々な担体材料から回収された細胞数を詳述する棒グラフである。
【図６】図６は、様々な担体材料から回収された細胞の生存度を詳述する棒グラフである。
【図１】
2005536225.tif 000003
【図２−Ａ】
2005536225.tif 000004
【図２−Ｂ】
2005536225.tif 000005
【図３−Ａ】
2005536225.tif 000006
【図３−Ｂ】
2005536225.tif 000007
【図３−Ｃ】
2005536225.tif 000008
【図４−Ａ】
2005536225.tif 000009
【図４−Ｂ】
2005536225.tif 000010
【図５】
2005536225.tif 000011
【図６】
2005536225.tif 000012
【国際調査報告】
2005536225.tif 000013
2005536225.tif 000014
2005536225.tif 000015