(57)【要約】  観測対象粒子の濃度又は数密度が低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な光分析技術が提供される。本発明の光分析技術は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、微小領域の試料溶液内に於ける位置を移動しながら（微小領域により試料溶液内を走査しながら）、観測対象粒子である発光粒子からの光を検出して時系列の光強度データを生成し、光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、特性値を用いて発光粒子の各々からの光信号を個別に検出し、発光粒子のカウンティングや発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。
2011108371.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、前記特性値を用いて前記発光粒子の各々からの光信号を個別に検出することを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１の装置であって、前記信号処理部が、前記発光粒子からの光信号を有する前記所定幅の時間区間の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数することを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１又は２の装置であって、前記光検出部がフォトンカウンティングにより前記光検出領域からの光を検出し、前記時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであることを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかの装置であって、前記単一の発光粒子からの光が存在している前記所定幅の時間区間に於ける前記光強度の特性値が前記単一の発光粒子からの光が存在していない前記所定幅の時間区間に於ける前記光強度の特性値よりも大きく、前記光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに前記所定幅の時間区間に前記発光粒子からの光信号が存在すると判定されることを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項３の装置であって、前記光強度の特性値が、前記所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であることを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかの装置であって、前記所定幅が、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定され、且つ、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から別の発光粒子の前記光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定されることを特徴とする装置。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
【請求項９】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、
前記時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出する過程と、
前記所定幅の時間区間毎の光強度の特性値に基づいて個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する過程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９の方法であって、更に、前記発光粒子からの光信号を有する前記所定幅の時間区間の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０の方法であって、前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程に於いて、前記光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、前記時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項９乃至１１のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項９乃至１２のいずれかの方法であって、前記単一の発光粒子からの光が存在している前記所定幅の時間区間に於ける前記光強度の特性値が前記単一の発光粒子からの光が存在していない前記所定幅の時間区間に於ける前記光強度の特性値よりも大きく、前記光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに前記所定幅の時間区間に前記発光粒子からの光信号が存在すると判定されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１の方法であって、前記光強度の特性値が、前記所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項９乃至１４のいずれかの方法であって、前記所定幅が、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定され、且つ、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から別の発光粒子の前記光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項９乃至１５のいずれかの方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置の移動中に前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
前記時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出する手順と、
前記所定幅の時間区間毎の光強度の特性値に基づいて個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順と
をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１８】
請求項１７のコンピュータプログラムであって、更に、前記発光粒子からの光信号を有する前記所定幅の時間区間の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１９】
請求項１７又は１８のコンピュータプログラムであって、前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順に於いて、前記光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、前記時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項２０】
請求項１７乃至１９のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項２１】
請求項１７乃至２０のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記単一の発光粒子からの光が存在している前記所定幅の時間区間に於ける前記光強度の特性値が前記単一の発光粒子からの光が存在していない前記所定幅の時間区間に於ける前記光強度の特性値よりも大きく、前記光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに前記所定幅の時間区間に前記発光粒子からの光信号が存在すると判定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項２２】
請求項１９のコンピュータプログラムであって、前記光強度の特性値が、前記所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項２３】
請求項１７乃至２２のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記所定幅が、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定され、且つ、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から別の発光粒子の前記光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定されることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１７乃至２３のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）からの光を検出して、溶液中の粒子の状態を分析又は解析するための光分析装置、光分析方法並びにそのためのコンピュータプログラムに係り、より詳細には、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、種々の粒子、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子の状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラムに係る。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、非特許文献１−３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が達成される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity  Distribution  Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon  Counting  Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献４）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。更に、特許文献５、６に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献７は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。【０００３】
特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６
【特許文献２】特開２００８−２９２３７１
【特許文献３】特許第４０２３５２３号
【特許文献４】国際公開２００８−０８０４１７
【特許文献５】特開２００７−２０５６５
【特許文献６】特開２００８−１１６４４０
【特許文献７】特開平４−３３７４４６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】金城政孝、蛋白質  核酸  酵素  Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁  １９９９年
【非特許文献２】エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁
【非特許文献３】加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術に於いて有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい（典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であることが好ましい。）。換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るときには（例えば、１ｎＭを大幅に下回るときには）、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入してこない状態が発生し、蛍光強度の計測結果に於いて、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれると共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなるので、上記の如き蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を望むことができなくなる。【０００７】
特許文献５、６に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の如き蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、数秒間に亘る計測時間に於ける有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中に於ける観測対象となる蛍光分子等の有無が特定でき、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られることが開示されている。特に、特許文献６では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法に於いても、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することに留まっており、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することができず、例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７に記載された技術は、フローサイトメータに於けるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出するものであり、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではないので、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７の技術は、フローサイトメータに於ける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含むため、検査に必要な試料量は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなるとともに、実施者に於いて複雑で高度な操作技術が要求されると考えられる。【０００８】
かくして、本発明の一つの課題は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術にて実行されている如き、統計的処理を含まず、従って、観測対象粒子の濃度又は数密度がそれらの光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な新規な光分析技術を提供することである。【０００９】
また、本発明のもう一つの課題は、上記の如き新規な光分析技術を実現する光分析装置、方法又はそのためのコンピュータプログラムであって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術と同様に測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、観測対象粒子の濃度又は数密度等の特性を定量的に特定することが可能な光分析装置、光分析方法又は光分析用コンピュータプログラムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
概して述べれば、本発明に於いては、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）からの光を検出する光分析技術であって、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域の位置を移動させながら、即ち、微小領域により試料溶液内を走査しながら、微小領域からの光を検出し、これにより、微小領域内を横切る発光粒子を個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする新規な方式の光分析技術が提案される。【００１１】
本発明によれば、一つの態様として、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、試料溶液内に於ける前記の光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光信号を個別に検出する信号処理部とを含み、信号処理部が、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、かかる特性値を用いて発光粒子の各々からの光信号を個別に検出することを特徴とする装置が提供される。かかる構成に於いて、「試料溶液中に分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の物であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。なお、本明細書に於いて、「光信号」という場合には、「光を表す信号」を意味している。【００１２】
上記から理解される如く、本発明の装置の基本的な構成に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が光検出部にて検出されるので、その光を捉えることにより、一つの発光粒子の存在が検出できることとなる。この点に関し、より詳細には、光検出部から時系列に出力される信号、即ち、光強度データに於いて、単一の発光粒子からの光が光検出部に到来している時間区間に於いて、光検出部の出力信号の値は、パルス状にて変化し、ノイズのみが生ずる発光粒子からの光が到来していない時間区間とは異なる特徴を有する。そこで、装置の信号処理部は、逐次的に光検出部により検出される信号から時系列の光強度データを生成し、かかる時系列の光強度データに於いて、所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、その特性値を用いて発光粒子の各々からの光信号を個別に検出するよう構成される。【００１３】
かかる特性値としては、単一の発光粒子からの光が存在している所定幅の時間区間に於けるその大きさが、単一の発光粒子からの光が存在していない所定幅の時間区間に於ける大きさよりも大きくなる任意の値が採用可能である。その場合、光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに所定幅の時間区間に発光粒子からの光信号が存在すると判定される。そのような特性値は、例えば、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び光強度の自己相関関数の相関時間を０としたときの値から算定される粒子数のうちのいずれかであってよい。なお、典型的には、光検出部は、フォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、従って、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。従って、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。【００１４】
また、上記の如く所定幅の時間区間毎の特性値を用いて発光粒子の信号を検出する手法の場合、所定幅が一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも短い場合には、一つの発光粒子の光が二つの以上の時間区間に亘って検出されることとなり、所定幅が複数の発光粒子の光の到来時間を包含するほど長い場合には、一つの時間区間に於いて、複数の発光粒子の情報が含まれることとなり、いずれも場合も、一つの時間区間に対して一つの発光粒子が対応する関係が成立しなくなるため、発光粒子の各々からの光信号を個別に検出するための信号処理が煩雑となる。そこで、上記の特性値を算出する時間区間の所定幅は、好適には、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定され、且つ、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定される。換言すれば、時間区間の所定幅は、その下限が、一つの発光粒子の光信号の時間幅よりも実質的に長くなるように設定され、その上限が各時間区間に包含される発光粒子数が実質的に１個以下となるように設定される。なお、上記の表現に於いて、「実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定」或いは「一つの発光粒子の光信号の時間幅よりも実質的に長くなるよう設定」とは、所定幅が、殆どの発光粒子の光信号の時間幅よりも長く設定すること、即ち、誤差の範囲で所定幅よりも長い時間幅を有する発光粒子の光信号の存在が許されることを意味している。また、「実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定」或いは「各時間区間に包含される発光粒子数が実質的に１個以下となるように設定」とは、殆どの時間区間に於いて見出される発光粒子数が１個以下となるよう設定すること、即ち、誤差の範囲で２個以上の発光粒子を包含する時間区間の存在が許されることを意味している。かかる構成によれば、発光粒子からの光が存在している一つの時間区間が決定された際、殆どの場合、その時間区間に含まれる光信号は、一つの発光粒子からの光信号であると判断でき、これにより、一つの発光粒子の存在が確認されることとなるので、発光粒子を個別に検出する処理が簡単となり、有利である。【００１５】
上記の如く、試料溶液中にてランダムに運動している発光粒子が個別に検出可能となると、発光粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。具体的には、例えば、上記の本発明の装置に於いて、信号処理部が、個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（発光粒子のカウンティング）。その場合、上記の如く、所定幅の時間区間毎の光強度の特性値を用いて発光粒子を個別に検出する場合には、発光粒子からの光信号を有する所定幅の時間区間の数が発光粒子の数に対応するので、発光粒子からの光信号を有する所定幅の時間区間の数を計数して、光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数が計数される。かかる構成によれば、発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量とを組み合わせることにより、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。【００１６】
また、上記の本発明の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。当業者に於いて理解される如く、発光粒子から検出される光の態様は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、一つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、一つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。【００１７】
更に、本発明の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、光検出領域が発光粒子の存在位置を通過したときにその発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（発光粒子の存在を表す）光信号が検出されてしまい、検出された光信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を一つの（発光粒子の存在を表す）光信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。【００１８】
光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、光検出領域を固定して、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける位置を移動するようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。【００１９】
上記の本発明の装置に於いて試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、個々の発光粒子からの光信号を個別に検出するという特徴的な光分析技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於ける前記の光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出する手順と、所定幅の時間区間毎の光強度の特性値に基づいて個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順とをコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。【００２０】
かかるコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して又は発光粒子からの光信号を有する所定幅の時間区間の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順に於いて、光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、その場合、時系列の光強度データは時系列のフォトンカウントデータとなる。また、光検出領域の位置を移動する手順に於いて、光検出領域の位置が所定の速度にて或いは発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるようになっていてよく、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。【００２１】
更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、所定幅の時間区間に於ける光強度の特性値は、単一の発光粒子からの光が存在している場合には、単一の発光粒子からの光が存在していない場合よりも大きくなる値であってよく、光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに所定幅の時間区間に発光粒子からの光信号が存在すると判定されてよい。そのような特性値は、具体的には、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び相関時間を０とした光強度の自己相関関数値から算定される粒子数のうちのいずれかが採用されてよい。特に、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであるときには、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。更に、上記の時間区間の所定幅は、好適には、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定され、且つ、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定される。【００２２】
更に、上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、上記の如く、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行って個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する新規な光分析方法が実現される。従って、本発明の共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法は、試料溶液内に於ける前記の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出する過程と、所定幅の時間区間毎の光強度の特性値に基づいて個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する過程とを含むことを特徴とする。【００２３】
かかる方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して又は発光粒子からの光信号を有する所定幅の時間区間の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程に於いて、光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、その場合、時系列の光強度データは時系列のフォトンカウントデータとなる。また、光検出領域の位置を移動する過程に於いて、光検出領域の位置が所定の速度にて或いは発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるようになっていてよく、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。【００２４】
更に、上記の方法に於いても、所定幅の時間区間に於ける光強度の特性値は、単一の発光粒子からの光が存在している場合には、単一の発光粒子からの光が存在していない場合よりも大きくなる値であってよく、光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに所定幅の時間区間に発光粒子からの光信号が存在すると判定されてよい。そのような特性値は、具体的には、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び相関時間を０とした光強度の自己相関関数値から算定される粒子数のうちのいずれかが採用されてよい。特に、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであるときには、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。更に、上記の時間区間の所定幅は、好適には、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長くなるよう設定され、且つ、実質的に、一つの発光粒子の前記光検出領域への進入時から別の発光粒子の前記光検出領域への進入時までの時間幅よりも短くなるよう設定される。
【発明の効果】
【００２５】
上記の本発明による装置、方法又はコンピュータプログラムにより実現される光分析技術は、その光検出機構自体については、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、本発明に於いては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、本発明の光分析技術は、発光粒子の数密度又は濃度がＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。【００２６】
また、本発明では、溶液中に分散又は溶解した発光粒子の各々を個別に検出するようになっているので、その情報を用いて、定量的に、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度若しくは数密度の算定又は濃度若しくは数密度に関する情報の取得が可能となる。例えば、特許文献５，６に記載の技術では、所定時間内に於ける所定の閾値以上の強度を有する蛍光信号の頻度の集計値と試料溶液中の蛍光分子等の粒子数との相関を得ることが可能であるが、計測領域を通過する粒子の動的な振る舞い（粒子が計測領域を真直ぐ通過したのか、粒子が計測領域内に滞留していたのか）を把握することはできず、従って、所定の閾値以上の強度を有する蛍光信号と計測領域を通過する粒子との対応が不明確であったため、発光粒子のカウンティングは原理的に不可能であり、試料溶液中の粒子の濃度を精度よく決定することが困難であった。しかしながら、本発明によれば、光検出領域を通過する発光粒子と、その光信号の光検出部への到来の時間とを１対１に対応させて発光粒子を一つずつ検出するので、溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子のカウンティングが可能となり、従前に比して、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。【００２７】
本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。【００２８】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１（Ａ）は、本発明による光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。
【図２】図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明による光分析技術による光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、光強度データから発光粒子からの光を個別に検出する原理を説明する図である。図２（Ｄ）は、時間区間の所定幅と二つ以上の発光粒子の光が同時に進入している確率（複数の発光粒子が一つの所定幅ωの時間区間に包含される割合）との関係を示している。
【図３】図３（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図と、その場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。
【図４】図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図と、その場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。
【図５】図５（Ａ）は、本発明の光分析技術により計測された時系列フォトンカウントデータの全体を表す図であり、図５（Ｂ）は、時系列フォトンカウントデータの一部の区間を拡大した図であり、参照している区間について算出された種々の特性値を示している。
【図６】図６は、発光粒子濃度が１０ｆＭ〜１００ｐＭのそれぞれの溶液について、本発明に従って算出された特性値を用いて、時系列フォトンカウントデータに於いて個別に検出された発光粒子数を示している。
【図７】図７は、本発明に従った光分析技術による時系列フォトンカウントデータに於ける時間区間の所定幅と発光粒子の存在が検出された区間の数との関係を表す図である。
【図８】図８は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。
【符号の説明】
【００３０】
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００３２】
光分析装置の構成
本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。
【００３３】
更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するステージ位置変更装置１７ａが採用されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。
【００３４】
観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
【００３５】
本発明の光分析技術の原理
ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、図８（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図８（Ｂ）に描かれているように、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
【００３６】
そこで、本発明に於いては、観測対象粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく光分析技術が提案される。
【００３７】
本発明の光分析技術に於いて、実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａ）を駆動して、図２にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図２（Ａ）の如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ〜ｔ２）に於いて一つの発光粒子（図中、蛍光色素）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２（Ｂ）に描かれている如く、パルス状の信号として、有意な光強度（Ｅｍ）が検出されることとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如き有意な光強度、即ち、パルス状の信号を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる本発明の光分析技術の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、発光粒子（観測対象粒子）の濃度が低い試料溶液でも、発光粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能であることは理解されるべきである。
【００３８】
なお、実際の光強度データ（フォトンカウントデータ）に於いては、図２（Ｃ）にて例示されている如く、発光粒子からの光の他に、ノイズ（光検出器の熱ノイズ、背景光）が存在するので、発光粒子からの光信号とノイズとを区別して、発光粒子からの光信号の存在を検出する必要がある。そこで、そのような発光粒子からの光信号の存在を抽出する手法の一つとして、本実施形態に於いては、時系列光強度データ上に於いて、所定幅の時間区間毎に、逐次的に、時間区間内の光強度値（光子数）を用いて単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値が算出される。かかる光強度の特性値の大きさを参照すると、所定幅の時間区間毎に、単一の発光粒子からの光信号が存在しているか否かが検出できるので、これにより、発光粒子が一つずつ検出される。単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値は、典型的には、単一の発光粒子からの光の信号が存在すると、単一の発光粒子からの光の信号が存在していない場合（ノイズのみしか存在していない場合）に比して、増大する任意の値であってよく、例えば、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差値（ＳＤ値）、光強度の分散値、光強度のエントロピー（ＥＰ値）、光強度の最大値及び相関時間を０とした光強度の自己相関関数値から算定される粒子数などであってよい。特に、本実施形態では、光強度データは、フォトンカウンティングによるフォトンカウントデータなので、特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差値、光子数の分散値、光子数のエントロピー値、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。
【００３９】
また、上記の特性値の算出のための時間区間の所定幅は、好適には、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長く、且つ、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも短く設定される。このように所定幅を設定すると、発光粒子の光信号の存在する一つの時間区間が、一つの発光粒子の存在に対応する、即ち、時間区間と発光粒子の存在が一対一の関係となるので、発光粒子のカウンティングに於ける処理が簡単となり有利である。（もし時間区間の所定幅が一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも短い場合には、一つの発光粒子の光信号が複数の時間区間に亘って存在することになり、複数の時間区間を一つの発光粒子に対応させるための処理が必要となる。また、もし時間区間の所定幅が一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも長い場合には、一つの時間区間に複数の発光粒子の光信号が存在することとなり、発光粒子を一つずつ検出することが困難となる。）
【００４０】
上記の所定幅の下限ωlowは、発光粒子が光検出領域の中心を直線的に通過すると仮定した場合（下記の（１）試料溶液の光強度の測定及び図４参照）、例えば、光検出領域の直径２Ｗｏと移動速度ｕとを用いて、
ωlow＝２Ｗｏ／ｕ      …（１）
設定されてよい。
【００４１】
所定幅の上限ωhighは、各時間区間に於いて包含される発光粒子数が実質的に１以下となる所定幅である。所定幅の上限ωhighは、下記のいずれかの手法により決定可能である。
（１）発光粒子が試料溶液内に均等に分散していると仮定した場合
所定幅ωの時間区間に於ける光検出領域の移動の間に検出される発光粒子数ｎは、
ｎ＝ｃＮＡＳｕω      …（２ａ）
により与えられる。ここで、ｃは、発光粒子のモル濃度であり、ＮＡは、アボガドロ数であり、Ｓは、光検出領域の断面積である。Ｓ〜πＷｏ２と近似して、所定幅ωの時間区間に於いて一つの発光粒子が存在する（ｎ＝１）と仮定すると、所定幅ωは、
ω＝１／（ｃＮＡπＷｏ２ｕ）      …（２ｂ）
により与えられる。従って、所定幅ωhighは、予想される発光粒子の濃度ｃを用いて、式（２ｂ）にて算出される値ωか、発光粒子の存在位置のばらつきを考慮して、それよりも小さい値に設定されてよい。
【００４２】
（２）所定幅の時間区間に発光粒子がポアソン分布にて進入すると仮定した場合
所定幅ωの時間区間に於ける光検出領域の移動の間に検出される平均の発光粒子数ｎは、上記の式（２ａ）にて与えられる。一方、所定幅ωの時間区間に出現する発光粒子数がｋである確率ｐｋは、
【数１】
2011108371.tif 000003
となるので、所定幅ωの時間区間に出現する発光粒子数が２以上である確率ｐ＞１、即ち、複数の発光粒子が一つの所定幅ωの時間区間に包含される割合は、
【数２】
2011108371.tif 000004
となる。図２（Ｄ）は、所定幅ωに対する式（２ｄ）の変化の例を表した図である（ｃ＝１０ｐＭ、ｕ＝１５ｍｍ／ｓ、Ｗｏ＝１μｍとして算出した。）。同図を参照して、図示の例では、所定幅ω＝２００μ秒とすると、５％の時間区間が複数の発光粒子を包含する可能性があることが理解される。かくして、所定幅ωhighは、予想される発光粒子の濃度ｃを用いて、上記の式（２ｄ）に於いて、許容誤差を与える所定幅ωに設定されてよい。
【００４３】
本発明の光分析装置の作動と処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明による光分析に於いては、具体的には、（１）発光粒子（観測対象粒子）を含む試料溶液の光強度の測定処理過程と、（２）測定された光強度の分析処理過程とが実行される。
【００４４】
（１）試料溶液の光強度の測定
本発明の光分析技術の観測対象物となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。
【００４５】
本発明の光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
【００４６】
光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
【００４７】
ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図３（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度が図３（Ｂ）の如くランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ａ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図４（Ｂ）に例示の如く、個々の発光粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（発光粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
【００４８】
具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ      …（４）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ      …（５）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ      …（６）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
【００４９】
（２）光強度の分析
上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラム（時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出する手順、所定幅の時間区間毎の光強度の特性値に基づいて個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順）に従った処理により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。
【００５０】
（ｉ）一つの発光粒子の検出
時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ａ）に示されている如く略直線状である場合、その発光粒子に対応する光強度の変化は、図４（Ｂ）に模式的に描かれている如く、（光学系により決定される）光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル（通常、略釣鐘状）を有し、発光粒子が通過していない期間のデータ（ノイズがランダムに発生する状態）とは顕著に異なる。そこで、既に触れた如く、本実施形態に於いては、時系列の光強度データ上に於ける所定幅の時間区間毎に光強度の特性値が算出される。光強度の特性値としては、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータである場合には、上記の如く、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差値、光子数の分散値、光子数のエントロピー値、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。
【００５１】
各特性値について、より詳細には、光子数の合計値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値である。発光粒子の光信号が存在する時間区間の合計値は、その他の時間区間の合計値よりも発光粒子からの光子数だけ増大するので、或る時間区間の合計値の大きさが所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の光信号が存在すると判定される。
【００５２】
光子数の中央値、最大値は、それぞれ、所定幅の時間区間に見出される光子数の中央値、最大値である。発光粒子の光が光検出器に到来している期間は、通常のノイズのみが発生する場合より光子数が大きくなるので、発光粒子の光信号が存在する時間区間の中央値、最大値も増大する。従って、或る時間区間の中央値又は最大値の大きさが所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の光信号が存在すると判定される。
【００５３】
光子数の平均値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の時間平均値である。上記の如く、発光粒子の光信号が存在する時間区間の合計値は、その他の時間区間の合計値よりも発光粒子からの光子数だけ増大するので、所定幅の時間区間に於ける光子数の時間平均値も増大する。従って、或る時間区間の平均値の大きさが所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の光信号が存在すると判定される。
【００５４】
光子数の標準偏差値、分散値及びエントロピー値は、それぞれ、所定幅の時間区間に於ける光子数の時間平均に於ける標準偏差値、分散値及び情報量のエントロピー値であり、所定幅の時間区間内に見出される光子数の時間変化のばらつきの程度を表す特性値である。或る時間区間に発光粒子の光信号が存在する場合、その他の時間区間に比して、光子数の時間変化が激しくなる。従って、発光粒子の光信号が存在する時間区間の光子数の標準偏差値、分散値、エントロピー値は、その他の時間区間の各値に比して増大するので、或る時間区間の各値が、所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の光信号が存在すると判定される。なお、光子数のエントロピー値は、或る時点（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）に於ける光子数がｘ個である確率がpｘであったとき、或る時間区間に於いて光子数がｘ個の時点の数ixを用いて、
−ｌｏｇ２（p0i0・p1i1・…・pxix・…・pnin）      …（７）
により与えられる値である。通常、光子数がｘ個である確率pｘは、p0＞p1＞p2＞…＞px…＞pnである。ノイズのみしか存在していない区間のエントロピー値は、−ｌｏｇ２（p0i0・p1i1・p2i2）程度であるが、発光粒子の光信号が存在する区間では、−ｌｏｇ２（p0i0・p1i1・p2i2・p3i3・p4i4）などとなり、値が増大する。
【００５５】
所定幅の時間区間に於ける相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数とは、その時間区間に於ける粒子数に相当する量である。ＦＣＳの理論によれば、光強度の自己相関関数Ｃ（τ）は、
【数３】
2011108371.tif 000005
により与えられる（ここで、τＤは、並進拡散時間であり、ＡＲは、ストラクチャ・パラメータであり、Ｎは、粒子数である。）。上記の式に於いて、相関時間τ＝０のときのＣ（０）から、粒子数Ｎは、１／（Ｃ（０）−１）により与えられる。この粒子数は、時間区間毎に見出される粒子数であると考えられるので、上記の特性値と同様に、所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の光信号が存在すると判定される。
【００５６】
（ii）発光粒子のカウンティング
上記の発光粒子の検出処理に於いて、時間区間の所定幅が、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長く、且つ、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも短く設定されている場合、一つの発光粒子は、発光粒子の光信号が存在すると判定された一つの時間区間に対応するので、かかる時間区間の数を計数することにより、発光粒子の数が決定される。
【００５７】
（iii）発光粒子の数密度又は濃度の決定
発光粒子のカウンティングが為されると、光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、発光粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは困難である。そこで、本実施形態に於いては、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された発光粒子の数と対照溶液の発光粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、発光粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。対照溶液の発光粒子としては、好ましくは、観測対象粒子と同様の波長特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ      …（９）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の数密度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ      …（１０）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（９））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
【００５８】
かくして、上記の本発明の光分析技術によれば、試料溶液内に於いて光検出領域である微小領域の位置を移動させながら、即ち、試料溶液内を走査しながら、光検出領域内を横切る発光粒子を個別に検出し、或いは、かかる発光粒子のカウンティングを行うという手法によって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等に於いて実行される蛍光強度のゆらぎの演算等の統計的処理を含まず、従って、観測対象粒子の濃度又は数密度がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能となる。
【００５９】
なお、本発明の光分析技術は、基本的には、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様の光学系を使用するので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と組み合わせて実行されてもよい。例えば、複数種の物質を含む溶液中に於いて複数種の物質の間の相互作用等検出する場合などであって、物質の濃度差が大きいとき、例えば、一方の物質の濃度がｎＭオーダーであり、他方の物質がｐＭオーダーであるときなどに於いて、濃度の高い物質については、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにより測定及び分析を行い、濃度の低い物質については、本発明の光分析技術を用いて測定及び分析を行うといった分析態様が実行されるであろう。そのような場合、図１（Ａ）に例示されている如く、複数個の光検出器を準備しておくと有利である。
【００６０】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例１】
【００６１】
発光粒子として、蛍光色素であるＡＴＴＯ６３３（シグマ−アルドリッチ社(Signma-Aldrich)  Cat.No.  １８６２０）を用い、本発明による試料溶液中の発光粒子の濃度の測定可能範囲を検証した。試料溶液としては、ＡＴＴＯ６３３を、その濃度が１０ｆＭ、１００ｆＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭとなるようにリン酸緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む）をそれぞれ調製した。【００６２】
本発明の光分析技術による計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（１）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の各試料溶液について、時系列の光強度データを取得した。対物レンズには、水浸対物レンズ（４０倍、ＮＡ＝１．１５、ＷＤ＝０．２６）を用いた。なお、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器を用い、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングとした。従って、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用い、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて６６０−７１０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ  ＴＩＭＥを１０μ秒とし、２秒間の測定を３回行った。【００６３】
図５（Ａ）は、２秒間の測定により得られた時系列フォトンカウントデータの全体の例を示しており、図５（Ｂ）は、２秒間の測定による時系列フォトンカウントデータのうちの一部を拡大して示している。上記の光強度の測定後、各試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータに於ける発光粒子の光信号の検出は、図５（Ｂ）に例示されている如く、時系列のフォトンカウントデータの全域を２００μ秒の幅を有する時間区間に区分し、各時間区間に於いて、単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値として、光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差値（ＳＤ値）、光子数の分散値、光子数のエントロピー値、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数を算定した。その結果、例えば、図５（Ｂ）にて示されている如く、目視にて発光粒子の光信号が存在すると判断できる区間（Ｗｉｎｄｏｗ＃３０、Ｗｉｎｄｏｗ＃３２）に於いて、例示の特性値は、発光粒子の光信号が存在していないと判断できる区間（Ｗｉｎｄｏｗ＃３１）の特性値よりも大きな値であった。【００６４】
かくして、時系列のフォトンカウントデータの全域に於ける時間区間毎に光強度の特性値を算出した後、上記の各特性値が、対応する所定の閾値を超えた時間区間に一つの発光粒子の光信号が存在するとの仮定の下、特性値の各々について、所定の閾値を超えた時間区間の数を計数した。図６は、上記の各溶液について、各特性値の所定の閾値を超えた時間区間の数を表している。それぞれの特性値の閾値は、以下の通りとした。
光子数合計値                      １００個
光子数中央値                      ４．５個
光子数標準偏差値                  ３．５個
光子数分散値                    １２．５個
光子数エントロピー                  １０５
光子数最大値                        １３個
粒子数（自己相関関数値から算定）  ０．４個
なお、比較のため、時系列フォトンカウントデータに於いて、光子数が２を超える連続した時間領域の数が併記されている（二値化領域数）。【００６５】
図６を参照して、例示の特性値は、いずれも、試料溶液中の発光粒子濃度の増大と共に増大した。ただし、相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数については、発光粒子濃度が１ｐＭ未満では、顕著な変化は見られなかった。一方、二値化領域数については、測定に使用した試料溶液では、顕著な濃度依存性は得られなかった。かくして、上記の結果は、本発明に従って、光の計測を行って得られた時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に単一の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、かかる特性値を参照することによって、発光粒子からの光が個別に検出され、その濃度が決定できることを示唆している。【００６６】
更に、上記の時系列フォトンカウントデータに於いて、特性値を算出する時間区間の幅による発光粒子の検出数の影響を検証した。図７は、発光粒子濃度が１０ｐＭの試料溶液の時系列フォトンカウントデータに於いて、特性値（光子数合計値）を算出する時間区間の幅を変更した場合の発光粒子の検出数（特性値が所定の閾値を超えた時間区間の数）を示している。同図を参照して、時間区間幅が１００〜２００μ秒であるときに、発光粒子の検出数は、安定した。一方、時間区間幅が１００μ秒を下回ると、粒子の検出数は、みかけ上増大した。本実験例の測定の条件では、単一の発光粒子が光検出領域を直線的に通過する際の所要時間は、約７４μ秒と算定されるので、時間区間幅を単一の発光粒子が光検出領域を直線的に通過する際の所要時間よりも長くすることにより、一つの発光粒子が二つ以上の時間区間に亘って検出される回数が低減されたと考えられる。また、上記の結果に於いて、時間区間幅が２００μ秒を上回ると、粒子の検出数は、みかけ上低減した。これは、時間区間幅を長くすると、複数の発光粒子の光信号が存在する時間区間の数が増えるためであると考えられる。実際、上記の溶液条件及び装置条件に於いて、式（２ｄ）を用いて許容誤差を約５％として算定される時間区間の所定幅の上限ωhighは、約２００μ秒であった（光検出領域の半径Ｗｏ〜１μｍに設定した。）。これらの結果は、時間区間の幅を、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から脱出時までに要する時間幅よりも長く、且つ、実質的に、一つの発光粒子の光検出領域への進入時から別の発光粒子の光検出領域への進入時までの時間幅よりも短く設定することにより、一つの時間区間に一つの発光粒子を対応させることができることを示唆している。【００６７】
かくして、本発明の光分析技術によれば、従前の蛍光強度を利用した方法に於いて計測可能であった数密度又は濃度限界よりも低い濃度範囲まで、発光粒子の数密度又は濃度を決定可能であることが示された。更に、蛍光強度のゆらぎの算出などの統計的処理を含むＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術に於いて計測可能な粒子濃度の下限が１ｎＭ程度であったのに対し、本実施例の計測可能な粒子濃度の下限は、〜１０ｆＭであり、従って、本発明によれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術の場合よりも大幅に低い濃度域の粒子について計測可能であることが示された。
【図１】
2011108371.tif 000006
【図２】
2011108371.tif 000007
【図３】
2011108371.tif 000008
【図４】
2011108371.tif 000009
【図５】
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【図６】
2011108371.tif 000011
【図７】
2011108371.tif 000012
【図８】
2011108371.tif 000013
【国際調査報告】
2011108371.tif 000014
2011108371.tif 000015
2011108371.tif 000016
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