(57)【要約】組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを用いて異種の遺伝子を哺乳動物被験体に搬送するための方法が述べられている。代謝蛋白質をコードしている異種の遺伝子を含む組み換えAAVビリオンは、代謝疾患を有している哺乳動物被験体へ運ばれる。rAAVビリオンに運ばれた異種の遺伝子は治療的なレベルで発現し、それによって代謝疾患の兆候や症状を改善する。代謝疾患を例示する例には、芳香族アミノ酸代謝における欠陥によりもたらされるものがある。異種の遺伝子を例示する例には、芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ、およびテトラヒドロバイオプテリン合成に関与する酵素が含まれる。フェニルケトン尿症を治療するための方法も述べられている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物被験体に蛋白質を搬送するための組み換えビリオン組成物であって、該組成物は組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを備え、前記rAAVビリオンはアミノ酸代謝に関与している代謝蛋白質をコードしている異種の遺伝子を備える、上記組成物。
【請求項２】
前記代謝蛋白質は芳香族アミノ酸代謝において有用である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記代謝蛋白質はフェニルアラニンヒドロキシラーゼである、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記代謝蛋白質はチロシンヒドロキシラーゼである、請求項２記載の組成物。
【請求項５】
前記代謝蛋白質はグアノシントリフォスフェートシクロヒドロラーゼIである、請求項２記載の組成物。
【請求項６】
前記代謝蛋白質はジヒドロ葉酸レダクターゼである、請求項２記載の組成物。
【請求項７】
前記代謝蛋白質は6-ピルボイル-テトラヒドロプテリン合成酵素である、請求項２記載の組成物。
【請求項８】
前記哺乳動物被験体はヒト被験体であり、前記rAAVはヒト被験体に対して治療上有効な量で含まれている、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
組み換えビリオン組成物であって、該組成物は組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを備え、前記rAAVビリオンはアミノ酸代謝に関与している代謝蛋白質をコードしている異種の遺伝子を備え、且つ、そのrAAVは哺乳動物被験体に投与されたときに異種の該遺伝子を発現させるのに十分な量で存在し、発現により治療効果を発揮する、上記組成物。
【請求項１０】
前記治療効果は好ましくはフェニルアラニンの血中濃度の低下である、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
フェニルアラニンの血中濃度がおよそ1000マイクロモル以下へ低下する、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
組み換えビリオン組成物であって、該組成物は組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを備え、前記rAAVビリオンはアミノ酸代謝に関与している代謝蛋白質をコードしている異種の遺伝子を備え、且つ、異種の該遺伝子は、哺乳動物被験体の標的細胞内における該遺伝子の発現に影響することが可能な異種のプロモーターと動作が可能なように結合している、上記組成物。
【請求項１３】
組み換えビリオン組成物であって、該組成物は組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを備え、前記rAAVビリオンはアミノ酸代謝に関与している代謝蛋白質をコードしている異種の遺伝子を備え、rAAVは哺乳動物被験体あたり少なくとも5×1012ウイルスゲノムの量で存在している、上記組成物。
【請求項１４】
哺乳動物被験体においてアミノ酸病を治療するために有用な組成物を作製するための方法であって、：
組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを提供する工程であって、該rAAVビリオンはアミノ酸代謝に関与している代謝蛋白質をコードする核酸分子を有するrAAVベクターを備え、該核酸分子は、宿主細胞内に存在するときに該核酸分子の転写に影響する制御配列と動作が可能なように結合している上記工程、および
該組み換えrAAVビリオンを薬学的に需要可能なベヒクルと組み合わせる工程、
の上記工程からなる上記方法。
【請求項１５】
前記代謝蛋白質は芳香族アミノ酸代謝において有用である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記代謝蛋白質はフェニルアラニンヒドロキシラーゼである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記代謝蛋白質はチロシンヒドロキシラーゼである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記代謝蛋白質はグアノシントリフォスフェートシクロヒドロラーゼIである、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記代謝蛋白質はジヒドロ葉酸レダクターゼである、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記代謝蛋白質は6-ピルボイル-テトラヒドロプテリン合成酵素である、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物被験体はヒト被験体であり、前記rAAVはヒト被験体に対して治療上有効な量で含まれている、請求項１４記載の方法。
【請求項２２】
アミノ酸病を有する哺乳動物被験体へ組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを搬送するための薬剤の製造におけるrAAVビリオンの使用方法であって、該rAAVビリオンは核酸分子を備え、該核酸分子は、アミノ酸代謝に関与している代謝蛋白質をコードしている遺伝子を備え、インビボで該遺伝子の転写に影響することができる制御配列と動作が可能なように結合している、上記使用方法。
【請求項２３】
前記rAAVは前記代謝蛋白質を哺乳動物被験体へ搬送することが可能である、請求項２２記載の使用方法。
【請求項２４】
前記代謝蛋白質は芳香族アミノ酸代謝において有用である、請求項２２記載の使用方法。
【請求項２５】
前記代謝蛋白質はフェニルアラニンヒドロキシラーゼである、請求項２４記載の使用方法。
【請求項２６】
前記代謝蛋白質はチロシンヒドロキシラーゼである、請求項２４記載の使用方法。
【請求項２７】
前記代謝蛋白質はグアノシントリフォスフェートシクロヒドロラーゼIである、請求項２４記載の使用方法。
【請求項２８】
前記代謝蛋白質はジヒドロ葉酸レダクターゼである、請求項２４記載の使用方法。
【請求項２９】
前記代謝蛋白質は6-ピルボイル-テトラヒドロプテリン合成酵素である、請求項２４記載の使用方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物被験体はヒト被験体であり、前記rAAVはヒト被験体に対して治療上有効な量で含まれている、請求項２２記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝疾患を有する患者に遺伝子を達る方法に関する。より特異的には本発明は、アミノ酸代謝疾患の治療のための、組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを使用した遺伝子の搬送に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は化学的および物理学的な平衡状態にあるのではない。むしろそれらは、環境が疾患へと志向することに対抗して秩序を維持するために、自由エネルギーの継続的な流入を必要とする。代謝の全過程を通して、生物はこの秩序を保つのに（即ち、生命を持続するのに必要な機能を実施するために）要する自由エネルギーを獲得して利用する。生物はこれを、栄養酸化のエネルギー放出性の反応を、生きている状態を維持するのに必要なエネルギー吸収性の過程（例えば、機械的な作業の遂行、濃度勾配に逆らった分子の活性輸送、および複雑な巨大分子の生合成）と共役させることにより達成する。
【０００３】
動物はこの自由エネルギーを他の生物から得た有機化合物（炭水化物、脂質および蛋白質）を酸化することにより獲得する。酸化反応から放出された自由エネルギーは、アデノシントリフォスフェートおよび他の高エネルギー燐酸化合物の中間体合成を通じて、エネルギー吸収性の反応と最もしばしば共役する。完全に酸化される事に加えて、栄養は、他の生物学的な分子の生合成の前駆体として利用される共通中間体へ分解される。
【０００４】
代謝経路中の成分が欠損しているときには、それは所謂「代謝の先天的な過誤」（1908年にSir Archibald Garrodよって最初に使用されたフレーズ）をもたらす事が多い。代謝それ自身の複雑さを反映して代謝病には、多くの生化学的、生理学的および医学的な効果を有する広く且つ複雑な部類の疾患が含まれる。本質的に良性のものから致死的なものまで、例えば微細な神経学的な変化から全身的な解剖学的な異常まで、それらの疾患はそれら自身を明らかにする。３００以上もの既知の先天的な代謝異常があり、それらの多くの発生頻度は非常に低く（いくつかは世界的に１０症例のみである）、そして糖尿病などの他のものは一般的な集団中に広く蔓延している。
【０００５】
対謝病は一般的に、一つまたはそれ以上の機能しない蛋白質を生じる遺伝子の変異から起こる。これらの変異は優性遺伝するが（Garrodが代謝病を先天的であると言った理由である）、それらは体細胞性でも起こり；いくつかの場合には変異はいくつかの遺伝子が影響される多遺伝子的なものであり（例えば、先天的な心臓病、糖尿病において）、他の場合にはその変異は、一つの遺伝子のみが影響される単遺伝子的なもの（例えば、フェニルケトン尿症、ムコ多糖症、糖原病において）である。全体として、単遺伝子性疾患は比較的に一般的であり、１００人が生まれるにつきおよそ１人に発生する。遺伝的な欠陥に蛋白質をコードしない遺伝子が関与することもあり得るが（例えば、転移RNAの遺伝子における欠陥）、それらは比較的に稀である。
【０００６】
殆ど全ての代謝疾患は臨床的に２つの広い領域に区分され、一つの機能的なシステムのみ又は一つの器官または解剖学的なシステムのみのいずれかに関与する疾患、及び、生化学的な欠損が多数の細胞あるいは器官に共通する一つの代謝経路に影響するもの又はそれが一つの器官に限定されているが体液性のあるいは全身性の影響を生じるもののいずれかの疾患である。前者の領域には、内分泌および免疫システムなどの生理学的なシステムに関与する疾患があり、腸、尿細管または結合組織など一つの組織あるいは解剖学的なシステムに限定されている疾患である。起こる症状は均一であり、基になる生化学的な障害が全身的な影響を生じるときでさえも、正しい診断の確立は比較的に容易である。
【０００７】
後者の領域の疾患は更に３つの群に分けることができる。一つのグループは複雑な分子の合成または代謝が妨げられる疾患である。症状は永続的であり、進行し、食物の摂取には関連していない（リソソーム貯蔵病およびα１-アンチトリプシンの欠損は典型的な例である）。蛋白質輸送に影響する疾患もこの領域に入る。
【０００８】
他の群は中間代謝の先天的な異常からなり、少なくとも一部分はエネルギー産生と利用の欠損に依る症状を有し、肝臓、心筋、筋肉または脳の異常を生じる。この群に含まれているものには、糖原病、糖新生異常、先天的乳酸血症（ピルビン酸カルボキシラーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼの異常）、脂肪酸酸化異常、およびミトコンドリア呼吸鎖疾患がある。この群に共通する症状には、低血糖症、高乳酸血症、重篤な全身性低血圧症、ミオパシー、心筋症、心不全、乳幼児突然死症候群（SIDS）が含まれる。
【０００９】
最後の群は中間代謝の先天性の異常であり、それは、代謝阻害に近接した有毒化合物の蓄積による急性または進行性の中毒へと至る。これには、有機性酸性尿症（メチルマロニル酸、プロピオン酸、イソ吉草酸など）の大部分、先天性の尿素回路異常、糖不耐性（ガラクトース血症、遺伝性フルクトース不耐性など）、およびアミノ酸病（フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、高チロシン血症など）がある。
【００１０】
アミノ酸病はアミノ酸代謝の異常である。アミノ酸は蛋白質を形成する必須の単量体サブユニットであるが、それらは他の分子にも代謝されて多彩な機能を果たす。例えば、多段階の工程において、フェニルアラニンはフマル酸塩へと代謝され、それはクエン酸サイクルの一要素であってグルコース生合成経路の構成成分であり；同じ代謝経路において、フェニルアラニンはアセトアセテートへ変換され、それは脂肪酸生合成経路の構成成分である。代わりに、多段階反応の他のセットにおいて、フェニルアラニンはチロシンを経由してドパミン、ノルエピネフリン、およびエピネフリンへ代謝され、それらは多くの中枢性および末梢性の機能を有する生体アミンである。そのためにフェニルアラニン代謝の誤りは種々の疾患に至る可能性がある。同様に他のアミノ酸の代謝の誤りは多彩な疾患へ至る可能性がある。
【００１１】
代謝病の遺伝的な病因論により、現在の治療は標準的な対症療法（例えば、薬剤による治療、外科的治療）に限られていることが多く；基礎にある遺伝的な欠陥は直されていない。標準的な治療が比較的良く働いているいくつかの事例はあり、それには例えば糖尿病のインシュリン療法があるが、その疾患の病因となる根本的な遺伝的な障害は直されてないので、糖尿病はアメリカにおける死因の第三番目のままである。フェニルケトン尿症（フェニルアラニン代謝異常から起こる疾患）を持って産まれてきた子供達には非常に制限の強い食餌療法が処方され；その効果は高いが、患者のコンプライアンスの困難さによって危うくなることが多い。他の代謝病については利用可能な治療はなく、疾患に依ってそれは重篤な病的状態と死亡率に至る可能性がある。
【００１２】
現在の治療が不足していることにより、その疾患の原因である欠損しているか又は異常に機能している代謝蛋白質を発現することが可能な代替え遺伝子を搬送するための遺伝子治療方法の開発への努力が刺激された。代謝疾患の治療において遺伝子治療のアプローチには、標準的な治療のアプローチには欠如しているいくつかの利点があり：治療遺伝子を送り（それによって病気の根本的な原因を治療できる可能性がある）、そして病気の中心にある器官または組織を特異的に標的とするというものであるが、注目に値する例は殆どない。
【００１３】
種々の方法で遺伝子を患者に搬送することができる。トランスフェクション法には、燐酸カルシウム沈殿法およびリポゾームにより仲介されたトランスフェクションなどの化学的な方法、および電気穿孔法のような物理的な方法が含めた方法がある。現在のウイルスにより仲介された遺伝子搬送ベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）に基づいたものが含まれる。
【００１４】
アデノ随伴ウイルスに仲介された遺伝子治療
アデノ随伴ウイルスはデペンドウイルス（Dependovirus）属に属し、６つの既知の抗原型（AAV-1からAAV-6まで名付けられている）を有するパルボウイルスであり、他のウイルスには見られない魅力的な特徴を有している。例えばAAVは、非分裂細胞を含む広範囲の宿主細胞に感染できる。更にAAVは異なった種に由来する細胞に感染することができる。重要な事にAAVは如何なるヒト又は動物の疾患に関連しておらず、組み込みにより宿主細胞の生理学的な性質を変化させないようである。最後にAAVは、それ自身を産生、貯蔵、および輸送する要件へ導くことになる、広範囲の物理的及び化学的な条件において安定である。
【００１５】
AAVゲノムは、およそ4700ヌクレオチドを含んでいる（AAV-2ゲノムは4681ヌクレオチドからなる）直鎖状の一本鎖DNA分子であり、逆方向末端反復（ITRs）と各末端で隣接している内部非反復部分を一般的には含む。逆方向末端反復の長さはおよそ145ヌクレオチドであり（AAV-1は143ヌクレオチドの逆方向末端反復を有する）、複製の起点として、またウイルスゲノムのパッケージングシグナルとして作用することを含む、多数の機能を有する。
【００１６】
ゲノムの内部非反復部分には、AAV複製（rep）領域およびカプシド（cap）領域として知られている2つの大きな読み枠（ORFs）が含まれる。これらの読み枠は複製およびカプシド遺伝子産物をそれぞれコードし：複製およびカプシド遺伝子産物（すなわち蛋白質）により完全なAAVビリオンの複製、構築、およびパッケージングが可能となる。より特異的には、少なくとも4つのウイルス蛋白質のファミリーがAAVのrep領域：Rep78, Rep68, Rep52およびRep40から発現し、それら全てはそれらの見かけ分子量より名付けられている。AAVのcap領域は少なくとも３つの蛋白質：VP1, VP2およびVP3をコードする。
【００１７】
AAVはヘルパー依存性のウイルスであり、機能が完全なAAVビリオンを形成するために、ヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクチニアウイルス）との共感染を必要とする。ヘルパーウイルスとの共感染がないとAAVは潜伏状態となり、潜伏状態においてウイルスゲノムは宿主細胞染色体へ挿入しているか、またはエピソームの形で存在しているが、感染性のビリオンは生成しない。ヘルパーウイルスによって引き続いて感染させると挿入されたゲノムは「救出」され、それは複製してウイルスカブシドヘパッケージすることが可能となり、それによって感染性のビリオンを再構成する。AAVは異なった種に由来する細胞に感染できるが、ヘルパーウイルスは宿主細胞と同じ種でなければならない。そこで例えば、イヌのアデノウイルスと共感染したイヌ細胞中で、ヒトAAVは複製するであろう。
【００１８】
興味の被験体である遺伝子を含んでいる組み換えAAV（rAAV）ビリオンを生成するために、適切な宿主細胞株は、その遺伝子を含んでいるがrepとcapを欠いているAAVベクターによりトランスフェクトされる。その後宿主細胞を野生型（wt）AAVおよび適切なヘルパーウイルスにより感染して組み換えAAVビリオンを形成する。代わりに野生型AAV遺伝子（ヘルパー機能遺伝子として知られ、repとcapを含む）およびヘルパーウイルス機能遺伝子（アクセサリー機能遺伝子として知られている）を一つ又はそれ以上のプラスミド中に提供し、それによって組み換えAAVビリオンの産生における野生型AAVとヘルパーウイルスの必要性を除外する。ヘルパーおよびアクセサリー機能遺伝子産物は宿主細胞中で発現し、そこでそれらは治療遺伝子を含んでいる組み換えAAVベクターにおいてトランスで機能する。その後に興味の被験体である遺伝子を複製し、それはあたかも野生型AAVゲノムであるかのように複製およびパッケージされ、組み換えAAVビリオンを産生する。得られる組み換えAAVビリオンが患者の細胞に形質導入されると、遺伝子は入って患者の細胞中で発現する。患者の細胞はアクセサリー機能遺伝子のみならず、repとcap遺伝子を欠いているので、組み換えAAVビリオンは、そのゲノムは更に複製およびパッケージすることはできない。更にrepとcap遺伝子の起源を欠いているので、野生型AAVビリオンは患者の細胞内で生成しない。
【００１９】
単なる対症療法ではなく、基となる欠陥を治す代謝疾患を治療するための戦略を開発することは、本技術分野において有利であろう。そのような方法をこの中において述べる。
【発明の開示】
【００２０】
（発明の概要）
本発明によると、代謝疾患を有している哺乳動物の被験体へ、遺伝子の使用および搬送のための方法とベクターが提供された。一つの態様においてその代謝疾患は、哺乳動物の被験体の血流中でのアミノ酸レベルが過剰となるアミノ酸代謝疾患である。他の態様においてそのアミノ酸代謝疾患により、哺乳動物被験体の尿中でアミノ酸またはアミノ酸代謝産物は過剰となる。好適な態様においてアミノ酸代謝疾患は芳香族アミノ酸代謝の異常から生じ、血中での芳香族アミノ酸レベルが過剰となる。他の態様において、過剰レベルの芳香族アミノ酸および/またはそれらの代謝物が哺乳動物被験体の尿中に存在する。特に好適な態様によると、芳香族アミノ酸代謝疾患は高フェニルアラニン血症、最も好適にはフェニルケトン尿症である。
【００２１】
他の態様においてアミノ酸代謝疾患では生体アミンのレベルが異常となる。一つの態様においてその生体アミンはドパミンであり、他の態様においてその生体アミンはセロトニンであり、そしてなお他の態様においてその生体アミンはヒスタミンである。他の態様においてその生体アミンはノルエピネフリンであり、そしてなお他の態様においてその生体アミンはエピネフリンである。
【００２２】
組み換えAAVに運ばれた遺伝子は代謝疾患を有する哺乳動物被験体中で発現し、一度発現すると、その蛋白質は治療効果を提供する。好適な態様においてその哺乳動物はヒトである。
【００２３】
高フェニルアラニン血症を有している哺乳動物において、肝臓細胞中で発現した時にフェニルアラニンの血中レベルを低下させる遺伝子を含んでいる組み換えAAVビリオンを搬送することは、本発明の目的の一つである。好適にはその哺乳動物はヒトである。一つの態様においてその遺伝子はフェニルアラニンヒロドキシラーゼを、好適にはヒトのフェニルアラニンヒロドキシラーゼコードする。他の態様において、その遺伝子はグアノシントリフォスフェートシクロヒドロラーゼIを、好適にはヒトのグアノシントリフォスフェートシクロヒドロラーゼIをコードする。なおも他の態様において、その遺伝子は6-ピルボイル-テトラヒドロプテリン合成酵素を、好適には6-ピルボイル-テトラヒドロプテリン合成酵素をコードする。なおも他の態様において、その遺伝子はジヒドロプテリジン還元酵素を、好適にはヒトのジヒドロプテリジン還元酵素をコードする。
【００２４】
他の態様において、組み換えAAVビリオンは逆行性管投与（retroductal administration）により、好適には内視鏡的逆行性胆道膵管造影法の手段により哺乳動物被験体の肝臓に送られる。
【００２５】
他の態様において、組み換えAAVビリオンは哺乳動物被験体の血流へ送られる。一つの観点において、組み換えAAVビリオンは末梢血管に向けられている（即ち、静脈注射）。他の観点において、組み換えAAVビリオンは門脈への注入の手段により肝臓に送られる。なおも他の観点において、組み換えAAVビリオンは肝臓動脈へ注入する手段により肝臓へ送られる。好適な態様において、組み換えAAVビリオンは末梢動脈中への、好適には大腿動脈へのカテーテル挿入の手段により肝臓動脈へ導入される。
【００２６】
代謝蛋白質遺伝子は組織特異的なプロモーターの手段により肝臓内で発現させることができる。一つの観点において、その組織特異的なプロモーターは肝臓特異的なプロモーターであり、好適にはヒトアルファ1-アンチトリプシン（hAAT）プロモーターである。特に好適に態様において、HAATプロモーターはアポリポ蛋白質E肝臓制御領域と動作が可能なように結合している。
【００２７】
フェニルケトン尿症（PKU）を有している哺乳動物において、フェニルケトン尿症の治療方法を提供することは本発明の他の目的であり、その方法は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子、好適にはヒトのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子を含んでいるAAVビリオンを提供し、フェニルケトン尿症を有している哺乳動物の肝臓と接触させ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子を発現させる過程からなり、それによって治療効果が達成される。好適な態様において、フェニルアラニンヒドロキシラーゼの発現はフェニルアラニンの血中レベルを低下させる結果となり、好適には1000μM以下の濃度となる。
【００２８】
蛋白質を哺乳動物被験体へ搬送するための組み換えビリオン組成物を提供することは本発明の更なる目的であって、その組成物は組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを備え、その前記rAAVビリオンはアミノ酸代謝に関与している代謝蛋白質をコードしている異種の遺伝子を備える。その組成物において、その代謝蛋白質は芳香族アミノ酸の代謝に有用である。
【００２９】
代謝蛋白質は好適には、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、グアノシントリフォスフェートシクロヒドロラーゼI、ジヒドロ葉酸還元酵素、または6-ピルボイル-テトラヒドロプテリン合成酵素からなる。
【００３０】
哺乳動物被験体は好適にはヒト被験体であり、rAAVはヒト被験体にとって治療に有効な量で含まれる。
【００３１】
本発明の更なる目的は組み換えビリオン組成物を提供することであり、その組成物は組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを備え、前記rAAVビリオンはアミノ酸代謝に関与している代謝蛋白質をコードしている異種の遺伝子を備え、且つ、そのrAAVは哺乳動物被験体に投与されたときに異種の遺伝子を発現させるのに十分な量で存在し、発現により治療効果を発揮する。
【００３２】
治療効果は好ましくはフェニルアラニンの血中濃度の低下である。更にフェニルアラニンの血中濃度は好適にはおよそ1000マイクロモル以下へ低下する。
【００３３】
本発明の更なる目的は、組み換えビリオン組成物を提供することであり、その組成物は組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを備え、前記rAAVビリオンはアミノ酸代謝に関与している代謝蛋白質をコードしている異種の遺伝子を備え、且つその異種の遺伝子は、哺乳動物被験体の標的細胞においてその遺伝子の発現に影響することが可能な異種のプロモーターと動作が可能なように結合している。
【００３４】
本発明の更なる目的は組み換えビリオン組成物を提供することであり、その組成物は組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを備え、前記rAAVビリオンはアミノ酸代謝に関与している代謝蛋白質をコードしている異種の遺伝子を備え、rAAVは哺乳動物被験体あたり少なくとも5×1012ウイルスゲノムの量で存在している。
【００３５】
本発明の更なる目的は、アミノ酸病を有する哺乳動物被験体へ組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを搬送するための薬剤の製造におけるrAAVビリオンの使用方法を提供することであり、そのrAAVビリオンは核酸分子を備え、その核酸分子は、アミノ酸代謝に関与している代謝蛋白質をコードする遺伝子を備え、インビボでその遺伝子の転写に影響することができる制御配列と動作が可能なように結合している。
【００３６】
その組成はHBS（Hepes緩衝生理食塩水；50mM Hepes + 150mM NaCl, pH7.4）中におけるAAVベクター懸濁液である。貯蔵溶液のベクター濃度は、例えば1×1013から1×1014ベクターゲノム/mlである。
【００３７】
ベクター用量の範囲は、3×1012から1×1014ベクターゲノム/マウスである。他の哺乳動物被験体へ適用するときには、ベクター用量の適切な範囲はマウスにおけるその範囲に基づいて定められる。治療効果はその範囲内において用量依存的な様式で観察される。
【００３８】
AAVベクターの急性毒性は典型的には：
i) アデノ随伴ウイルスベクターにより仲介された血液凝固因子IXの遺伝子輸送によるイヌ血友病Bの長期の修正。Herzog, R et al., Nature Medicine 5: 56-63, 1993．
ii) 非ヒト霊長類の筋肉への組み換えアデノ随伴ウイルス注入の急性および長期安全性。Favre, D et al. Molecular Therapy 4: 559-66, 2001．
iii) 技術評価：AAV因子IX遺伝子治療、Avigen Inc. Fabb, SA and Dickson, JG. Curr Opin Mol Ther 2: 601-6, 2000．
において議論されている。
【００３９】
（本発明の特定の態様の説明）
本発明は、代謝経路に関与している蛋白質をコードしている遺伝子を代謝疾患を有する哺乳動物被験体へ搬送するために、組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを使用する方法を与える。その遺伝子は一度送られると転写および翻訳され、その翻訳産物（即ち、蛋白質）は代謝疾患を有する哺乳動物被験体に治療効果を提供する。本発明との関連では、「蛋白質」という用語はポリペプチド、ペプチド、蛋白質およびペプチド輸送体、酵素、蛋白質複合体のポリペプチドサブユニット、蛋白質の機能的ドメインなどの全ての分類を含む。
【００４０】
本発明との関連では、「代謝経路」という用語は、栄養酸化のエネルギー放出性の反応を生きている状態を維持するために必要なエネルギー吸収性の過程と共役させる、多数の生化学反応の中の任意の概念を伝えるものである。その用語は「同化」反応（即ち、分子の生合成に関与している化学反応）と「異化」反応（即ち、分子の分解に関与している化学反応）の両者を含む。
【００４１】
「代謝疾患」とは、基になる又は関連している原因が代謝における欠陥と関与している任意の疾患を意味するものである。そのような疾患は比較的良性であることもあり、重篤な衰弱をもたらしたり、致死であることすらある。「治療効果」とは、任意の代謝疾患の臨床的な兆候または代謝疾患の症状の改善を意味するものである。
【００４２】
本発明との関連では、「組み換えAAVビリオン」または「rAAVビリオン」とは、「組み換えAAV（rAAV）ベクター」を包んでいるAAV蛋白質の殻（shell）（即ち、カプシド）から成る感染性ウイルスであり、この中でrAAVベクターは異種の遺伝子および一つまたはそれ以上のAAV逆方向末端反復（ITRs）を備えると規定されている。「異種」とは、天然の核酸分子との関連においては見出されない核酸配列が隣接している核酸分子を意味する。あるいは「異種」とは、それ自身は天然において見出されない核酸分子（例えば、天然遺伝子とは異なったコドンを有する合成配列）の概念を含む。対立遺伝子の変化または天然に起こる変異事象は、本願明細書中における異種の核酸分子を生じない。核酸分子は、本願明細書中における「異種」の定義を守る限り、遺伝子、プロモーター、エンハンサー、または任意の他の核酸含有分子の形態であることができる。
【００４３】
組み換えAAVベクターは、本技術分野で知られている組み換え技術を用いて構築することができ、機能を有するITRsに隣接する一つまたはそれ以上の異種の遺伝子を含むこともある。組み換えAAVベクターのITRsは野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、例えばヌクレオチドの挿入、欠損、または置換により、その配列適切な機能、即ちAAVゲノムの救出（レスキュー）、複製、およびパッケージングを提供する限りにおいて改変できる。
【００４４】
組み換えAAVビリオンは本分野で知られている種々の技術を使用して作製できる。例えば当業者は、野生型AAVとヘルパーウイルスを用いて、vAAVビリオンを産生するための複製機能に必要な機能を提供することができる（例えば米国特許番号5,139,941を見よ、本願に引用して援用する）。代わりに、ヘルパー機能遺伝子を含んでいるプラスミドを、良く知られているヘルパーウイルスの一つによる感染と組合わせて、複製機能の起源として使用できる（米国特許番号5,622,856を見よ、本願に引用して援用する；米国特許番号5,139,941, 上を見よ）。同様に当業者は、アクセサリー機能遺伝子を含んでいるプラスミドを、必要な複製機能を提供するために野生型AAVと組合わせて利用することができる。当業者が良く精通しているようにこれら３つのアプローチは、vAAVベクターと組合わせて使用すると、それぞれvAAVビリオンを産生するのに十分である。当業者は本技術分野でよく知られている他のアプローチを用いて、vAAVビリオンを産生することも可能である。
【００４５】
本発明の好適な態様においてvAAVビリオンを産生するために、トリプルトランスフェクション法（米国特許番号5,001,650において詳細に述べられており、その全体を本願に引用して援用する）を使用することができる。なぜならばこの方法は、感染性のヘルパーウイルスを使用する事が必要ではなく、いかなる検出可能なヘルパーウイルスが存在せずに、vAAVビリオンの産生を可能とするからである。これはvAAVビリオン産生のための3つのベクター：AAVヘルパー機能機能ベクター、アクセサリー機能ベクター、およびvAAVベクター、を使用する事により達成することができる。しかしこれらのベクターによりコードされる核酸配列は、2つまたはそれ以上のベクターを種々に組み合わせて提供できる事を当業者は理解するであろう。この中で使用される「ベクター」という用語は、例えばプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝的要素を含むものであり、適切な制御因子と連結したときに複製することができ、細胞間に遺伝子配列を移送できる。そこでその用語はウイルスベクターのみならず、クローニングおよび発現ベヒクルを含む。
【００４６】
AAVヘルパー機能ベクターは「AAVヘルパー機能」配列（即ち、repとcap）をコードし、それは産生的なAAV複製およびカプシド化のためにトランスで（in trans）で機能する。好適には、AAVヘルパー機能ベクターは、いかなる検出可能な野生型AAVビリオン（即ち、機能を有するrepとcap遺伝子を含むAAVビリオン）を産生することなく、効率的なAAVベクター産生を支持する。そのようなベクターの例は、米国特許番号6,001,650（上を見よ）および実施例１（下を見よ）において述べられたpHLP19である。AAVヘルパー機能ベクターのrepとcap遺伝子は、既知のAAV抗原型のいずれかより得ることができる。例えば、AAVヘルパー機能ベクターはAAV-2由来のrep遺伝子とAAV-6由来のcap遺伝子を持つことがあり、定義づけられる特徴のrAAVビリオン産生を支持する能力を有する他のrepとcap遺伝子の組み合わせも可能である事を当業者は認識するであろう。
【００４７】
アクセサリー機能ベクターは、複製においてAAVが依存している（すなわち「アクセサリー機能」）、非AAV由来のウイルスおよび/または細胞機能のためのヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能はAAV複製のために必要とされる機能を含み、それらに限定されるものではなく、AAV遺伝子転写の活性化、段階特異的なAAV mRNAのスプライシング、AAV DNAの複製、cap発現産物の合成、およびAAVカプシドのアッセンブリーに関与する分子を含む。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（I型単純ヘルペスウイルス以外）、およびワクチニアウイルスのいずれかより得られる。好適な態様において、アクセサリー機能プラスミドpLadeno5が使用される（pLadeno5に関する詳細は米国特許番号6,004,797に述べられており、その全体を本願に引用して援用する）。このプラスミドは、AAVベクター産生のためのアデノウイルスアクセサリー機能の完全なセットを提供するが、複製能力を有するアデノウイルスの生成に必要な成分を欠いている。
【００４８】
rAAVベクターは、AAV-1、AAV-2、AAV-3A、AAV-3B、AAV-4、AAV-5、AAV-6などを含む任意のAAV抗原型から得られ、それには限定されるものではない。AAVベクターは、全体または一部（即ち、repおよび/またはcap遺伝子）が欠損した野生型AAV遺伝子を一つまたはそれ以上有することができるが、AAVビリオンの救出（レスキュー）、複製、およびパッケージングのために必要とされる、少なくとも一つの機能を有するフランキングITR配列を保持する。そこで本願明細書中で、AAVベクターは、ウイルスの複製およびパッケージングのために必要とされる配列（例えば、機能を有するITRs）を少なくとも一つ、シスで（in cis）含むと定義される。ITRsは野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、その配列が救出（レスキュー）、複製、およびパッケージングの機能を提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠損、または置換により改変することができる。AAVベクターを本技術分野で知られている組み換え技術により構築し、機能を有するAAV ITRsに隣接した異種の遺伝子を一つまたはそれ以上含ませることができる。
【００４９】
異種の遺伝子は異種のプロモーター（構成的、細胞特異的、または誘導可能な）と動作が可能なように結合し、それによって遺伝子は適切な又は望ましい条件下で患者の標的細胞中で発現する事が可能となる。「動作が可能なように結合」とは、要素の配置を意味するものであって、記載されている成分がそれらの通常の機能を行うように構成されている。そこで、コード配列と動作が可能なように結合した制御配列は、そのコード配列の転写に影響することができる。その制御配列は、その転写に向けて機能する限りコード配列と隣接している必要はない。そこで例えば、既に転写された未翻訳の逆転した配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在することも可能であり、そのプロモーター配列は尚もコード配列と「動作が可能なように結合」していると見做すことができる。
【００５０】
構成的であり、細胞特異的であり、また誘導可能なプロモーターの例が本技術分野において多く知られており、例えば肝臓細胞特異的な発現のための肝臓特異的なヒトアルファ-1アンチトリプシンプロモーターの選択、高レベルの継続的な又はほぼ継続的な発現のための構成的なCMVプロモーターの選択、あるいは誘導された発現のための誘導可能なエクジソン（ecdysone）プロモーターの選択など、特定の意図する用途のために当業者はあるプロモーターを容易に選択できる。誘導された発現により当業者は合成される蛋白質の量を制御できる。この方法において治療産物の濃度を変化させることができる。良く知られた他の誘導プロモーターには、ステロイドプロモーター（例えば、エストロゲンおよびアンドロゲンプロモーター）およびメタロチオネインプロモーターが含まれる。
【００５１】
「エンハンサーエレメント」の手段により遺伝子発現を促進することができる。「エンハンサーエレメント」とは転写因子と結合したときに、プロモーター単独からの発現と比較して発現を増加させるDNA配列（すなわち、シス作動性エレメント）を意味するものである。本技術分野では多くのエンハンサー配列が知られており、特定の目的のために当業者は容易にエンハンサーエレメントを選択することができる。肝臓における遺伝子発現の増加に有用なエンハンサーエレメントの例は、アポリポ蛋白質E肝制御領域である（Schachter et al. (1993) J Lipid Res 34:1669-1707において述べられている）。
【００５２】
本発明は代謝過程に関与している異種の遺伝子を備えるrAAVビリオンの、代謝疾患を有する哺乳動物被験体への搬送を含む。そこで、本発明は一つまたはそれ以上の代謝疾患の治療に有用なペプチド、ポリペプチド、蛋白質、または酵素をコードするDNA配列を備える遺伝子の搬送を含み、その様な遺伝子および関連している代謝疾患状態は、それらに限定されるものではないが、以下の：グリコーゲン貯蔵欠損症I型に関連しているグルコース-6-リン酸をコードするDNA；ペプック欠損症（Pepck deficiency）に関連しているフォスフォエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするDNA；ガラクトース血症に関連しているガラクトース-1-フォスフェートウリジルトランスフェラーゼをコードするDNA；2-ケトアジピン酸血症に関連している2-ケトアジピン酸デヒドロゲナーゼをコードするDNA；I型グルタル酸血症に関連しているグルタリル-CoAデヒドロゲナーゼをコードするDNA；重篤な代謝性アシドーシスと中枢神経系機能欠損症に関連しているグルタチオン合成酵素をコードするDNA；乳酸酸血症に関連しているピルビン酸カルボキシラーゼをコードするDNA；乳酸酸血症に関連しているピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニットをコードするDNA；メチルマロン酸酸血症に関連しているメチルマロニル-CoAムターゼをコードするDNA；中等度鎖（medium chain）アセチルCoA欠損症と乳幼児突然死症候群に関連している中等度鎖アセチルCoAデヒドロゲナーゼをコードするDNA；家族性高コレステロール血症に関連している低密度リポ蛋白質受容体蛋白質をコードするDNA；クリーグラー・ナジャー病に関連しているUDP-グルコウロノシルトランスフェラーゼをコードするDNA；複合性免疫不全症候群に関連しているアデノシンデアミナーゼをコードするDNA；グートおよびレッシュ・ナイハン症候群に関連しているヒポキサンチングアニン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼをコードするDNA；ビオチニダーゼ欠損症に関連しているビオチニダーゼをコードするDNA；ゴーシェ病に関連しているベータ-グルコセレブロシダーゼをコードするDNA；スライ症候群に関連しているベータ-グルクロニダーゼをコードするDNA；ツェルウェガー症候群に関連しているペルオキシゾーム膜蛋白質70kDaをコードするDNA；急性間欠性ポルフィリン症に関連しているポルフォビリノーゲンアミナーゼをコードするDNAを含む。
【００５３】
好適な態様においてrAAVビリオンはアミノ酸代謝に関連している蛋白質をコードする遺伝子を搬送するのに使用される。「アミノ酸代謝」とは、引き続いての生化学的な使用（異化産物のグルコース、脂肪酸などへの導入、あるいは異化産物の生体アミンまたはプリンおよびピリミジン窒素塩基への変換）のためのアミノ酸から非アミノ酸代謝物へ酵素的な転位又は分解のみならず、蛋白質、ポリペプチド、酵素などに直接に導入することをも意味するものである。その用語は、天然由来のアミノ酸（その中の20は蛋白合成において使用され；シトルリンとオルニチンの様な他のものは蛋白合成には使用されないが、他の生化学的な機能を有する）とそれらの代謝産物のみならず、合成および半合成アミノ酸分子およびそれらの代謝産物を含む。
【００５４】
本発明は一つまたはそれ以上のアミノ酸代謝疾患（「アミノ酸病」として知られている）の治療のために有用なペプチド、ポリペプチド、蛋白質、または酵素をコードするDNA配列を備える遺伝子の搬送を含み、その様な遺伝子および関連しているアミノ酸病は、それらに限定されるものではないが、以下の：ヒスチジン血症に関連しているヒスチジンアンモニア-リアーゼをコードするDNA；メープルシロップ尿症に関連している分鎖ケト酸デカルボキシラーゼをコードするDNA；バリン血症に関連しているバリンアミノトランスフェラーゼをコードするDNA；ホモシスチン尿症に関連しているシスタチオニンβ-合成酵素をコードするDNA；シスタチオニン血症に関連しているシスタチオナーゼをコードするDNA；非ケト性高グリシン血症に関連しているグリシンデカルボキシラーゼP蛋白質をコードするDNA；非ケト性高グリシン血症に関連しているH蛋白質をコードするDNA；β-アラニン血症に関連しているβ-アラニン-α-ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼをコードするDNA；I型プロリン血症に関連しているプロリンオキシダーゼをコードするDNA；II型プロリン血症に関連しているピロリン-5-カルボキシラーゼデヒドロゲナーゼをコードするDNA；高プロリン血症に関連しているヒドロキシプロリンオキシダ−ゼをコードするDNA；高リジン血症および高リジン尿症に関連しているリジンケトグルタル酸レダクターゼをコードするDNA；サッカロピン尿症と高リジン血症に関連しているα-アミノアジピック・セミアルデヒドグルタミン酸レダクターゼをコードするDNA；高ピペコリン酸血症に関連しているピペコレートオキシダーゼをコードするDNA；N-アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症に関連しているN-アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするDNA；カルバモイルリン酸合成酵素欠損症および高アンモニア血症に関連しているカルバモイルリン酸合成酵素をコードするDNA；オルニチントランスカルバモイラーゼ欠損症および高アンモニア血症に関連しているオルニチントランスカルバモイラーゼをコードするDNA；シトルリン血症に関連しているアルギノコハク酸合成酵素をコードするDNA；アルギノコハク酸高アンモニア血症に関連しているアルギノサクシナーゼをコードするDNA；アルギニン血症および症候性高アンモニア血症に関連しているアルギナーゼをコードするDNA；大量のイミドジペプチド尿症に関連しているプロリダーゼをコードするDNA；高オルニチン血症に関連しているオルニチン-δ-アミノトランスフェラーゼをコードするDNA；高オルニチン血症に関連しているオルニチンデカルボキシラーゼをコードするDNA；高オルニチン血症に関連しているオルニチンケト酸トランスアミナーゼをコードするDNA；サルコシン血症に関連しているサルコシンデヒドロゲナーゼをコードするDNA；ピログルタミン酸血症に関連している5-オキソプロリングルタチオン合成酵素をコードするDNA；イソバレリル酸血症に関連しているイソバレリル-CoAデヒドロゲナーゼをコードするDNA；β-ヒドロキシイソバレリル酸尿症に関連しているβ-メチルクロトニルCoAカルボキシラーゼをコードするDNA；HMG-CoAリアーゼ欠損症および3-ヒドロキシ-3-メチルグルタル酸尿症に関連している3-ヒドロキシ-3-メチル-グルタリル-CoAリアーゼをコードするDNA；α-メチルアセト酢酸尿症に��連しているアセチル-CoAチオラーゼをコードするDNA；プロピオン酸血症に関連しているプロピオニル-CoAカルボキシラーゼをコードするDNA；メチルマロニル酸血症に関連しているマチルマロニル-CoAムターゼをコードするDNA；高メチオニン血症に関連しているメチオニンアデノシルトランスフェラーゼをコードするDNA；ホモシスチン尿症に関連しているホモシステイン：メチルメチルテトラヒドロフォレートメチルトランスフェラーゼをコードするDNAを含む。
【００５５】
特に好適な態様においては、本発明は芳香族アミノ酸代謝に関与する酵素をコードする遺伝子を備えるrAAVビリオンを含む。蛋白質合成に使用される20の天然由来のアミノ酸の中で芳香族性であるのは、フェニルアラニン、チロシンとトリプトファンの3つのみである。
【００５６】
芳香族アミノ酸の分解の最初の（及び律速の）段階において、フェニルアラニン、チロシンとトリプトファンは水酸化されて、チロシン、ジヒドロキシフェニルアラニン（L-ドーパ）、および5-ヒドロキシトリプロファンをそれぞれ生成する。特定の芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼは水酸化反応を仲介し、例えばフェニルアラニンヒドロキシラーゼはフェニルアラニンを水酸化し、チロシンヒドロキシラーゼはチロシンを水酸化し、そしてトリプトファンヒドロキシラーゼはトリプトファンを水酸化ずる。チロシンは天然由来のアミン酸である事と、フェニルアラニンの異化における最初の代謝産物であるという両者において独特である。引き続いての代謝過程は、エネルギー産生（クエン酸サイクルと酸化的リン酸化を介して）および脂肪酸と炭水化物の生合成において使用される中間産物の生成につながる。
【００５７】
器官の特定の必要性に応じて、芳香族アミノ酸は異なった一連の経路を介して代謝されることが可能であり、独特な部類の化合物である生体アミンを形成する。L-ドーパと5-ヒドロキシトリプトファンの両者について特異性を有する芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼは、これら2つの化合物の脱カルボキシル化を仲介し、それぞれドパミンとセロとニンを生成する。セロトニンは種々の末梢性および中枢性の効果を有しており、それには平滑筋収縮のアゴニストとしての効果と中枢神経系における神経伝達物質としての効果が含まれる。セロトニンレベルの不均衡は、抑鬱や不安を含むいくつかの精神医学的な疾患に関与している。カテコールアミン神経伝達物質であるドパミンは、身体の運動の適切な制御に必須である。黒質のドパミン作動性ニューロンの分解により、それが脳内に不在となるとパーキンソン病へつながる。
【００５８】
ドパミンは、ドパミンβ-ヒドロキシラーゼを介した水酸化反応を介して更に代謝され、ノルエピネフリンを生成する。ノルエピネフリンは、交感神経の神経系統における基本的な神経伝達物質として作用するカテコールアミンである。フェニルエタノールアミンN-メチルトランスフェラーゼにより仲介される一段階メチル化反応において、ノルエピネフリンはエピネフリンに代謝される。エピネフリンは副腎髄質により産生され、血中低グルコース、運動、およびストレスに反応して血流中へ分泌され、肝臓におけるグリコーゲンの分解、脂肪組織からの脂肪酸遊離、および心拍数の増加へつながる。
【００５９】
血液中のチロシン、トリプトファン、またはフェニルアラニンのレベル過剰（チロシン血症I型およびII型、高トリプトファン血症、および高フェニルアラニン血症と呼ばれる）は、少なくとも一部分は、芳香族アミノ酸の異化に関与する多くの異なった酵素の欠損の結果でありうる。その後のこれらの芳香族アミノ酸の血中レベルによりその効果は、精神的および身体的な遅延および死を含めて非常に重篤でありうる。フェニルアラニンヒトロキシラーゼ（GenBank Accession No. U49897）、チロシンヒドロキシラーゼ（GenBank Accession No. NM_000360）、およびトリプトファンヒドロキシラーゼ（GenBank Accession No. NM_004179）にみならず、他の芳香族アミノ酸代謝蛋白質（下記で議論する）をコードする遺伝子の遺伝的な変異は、血中の芳香族アミノ酸レベルの上昇につながる。
【００６０】
芳香族アミン酸ヒドロキシラーゼに加えて、3つの芳香族アミン酸ヒドロキシラーゼの全てにおいて必要な補因子である、テトラヒドロプテリン（BH4）の合成に関与する酵素も、効率的な芳香族アミノ酸異化のために必要とされる。中でもより重要なBH4合成酵素は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（GenBank Accession No. XM_017857）、ジヒドロプテリジンレダクターゼ（GenBank Accession No. AB053170）、6-ピルボイル-テトラヒドロプテリン合成酵素（GenBank Accession No. NM_000317）、およびグアノシントリフォスフェートシクロヒドロラーゼI（GenBank Accession No. NM_000161）である。もし、これらの酵素のいずれかをコードする遺伝子における変異によりもたらされるBH4合成の異常が生じたら、チロシン、トリプトファン、またはフェニルアラニンの代謝分解は悪影響を受け、これらのアミノ酸の血中レベルの上昇へとつながる。
【００６１】
チロシンの血中レベルが上昇すると高チロシン血症となる。チロシンヒドロキシラーゼとBH4合成酵素をコードする遺伝子の変異は高チロシン血症を引き起こすが、他のチロシン代謝酵素の変異に関連している特異な型の疾患が2つあり：I型チロシン血症とII型チロシン血症である。I型とII型のチロシン血症の両者は他の型の高チロシン血症よりも臨床的にはより消耗性である。I型チロシン血症は、フマリルアセトアセテート・ヒドロキシラーゼ（GenBank Accession No. NM_000317）活性の欠損と関連する遺伝性のチロシン代謝疾患であり、結果として肝癌を含む重篤な肝臓疾患を引き起こす。患者は幼児期に深刻な肝臓と腎臓の疾患を示し、子供時代の後期において肝癌と肝細胞の腫瘍を発症する。チロシンとフェニルアラニンが低い食餌療法が歴史的にこの疾患の唯一の治療であった。しかしそのような治療は肝臓の合併症の進展を長期に防ぐようには見られず、肝臓移植治療の近年の成功に注目が集まっていた。しかしその食餌療法は、移植のための適合する肝臓が設置されるまでは行われなければならず、利用可能な肝臓が不足しているという移植療法の大きな問題がある。
【００６２】
II型チロシン血症は、血漿と尿におけるチロシンレベルの増加と尿中におけるチロシン代謝物レベルの増加を含む、独特の代謝異常を有する常染色体の劣性の疾患である。眼皮膚チロシン血症における欠陥はチロシンアミノトランスフェラーゼ（GenBank Accession No. XM_041180）にあり、その酵素は正常ならばチロシンからp-ヒドロキシフェニルピルビン酸への変換を触媒する。この疾患は特徴的な臨床上の症候群として、眼と皮膚の病変、永続的な神経学的な障害、精神的な遅延、および失明を伴っていることが多い。効果的な対症療法のためには早期の診断が最も重要である。
【００６３】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼとBH4合成酵素の遺伝的変異は高フェニルアラニン血症を引き起こす。その状態の最も重篤な型であるフェニルケトン尿症（PKU）は比較的に一般的な（白人とアジアの集団において1:10,000の出生率）、常染色体の劣性の形質として遺伝する先天性の疾患である。異常に高レベルのフェニルアラニンは、フェニルピルビン酸およびその代謝誘導体であるフェニル酢酸、フェニル乳酸、およびオルトヒドロキシフェニル酢酸の生成に回される。これらの酸が尿中に過剰に排泄される。加えてチロシンとトリプトファンとの正常な代謝との干渉もあり、これら2つのアミノ酸の異常な中間産物も尿中に出現する。
【００６４】
精神遅延は通常は重篤な程度のものであり、治療せずに放置した時に起こるこの疾患の臨床的な兆候の一つである。小発作と痙攣大発作がしばしば発生し、痙攣がなくても共通した異常な脳波図は高頻度で発生する。治療していない患者における神経学的な兆候には、筋肉の緊張亢進、過度の腱反射、振動、および多動が含まれる。未治療の症例のおよそ15-20％において、乳児湿疹と類似した皮膚炎が報告された。多くの症例は、メラニンの産生が不十分であることによる色素代謝の異常を現した。
【００６５】
受胎の時および妊娠の間にPKUのための特定の栄養上の支援を受けていなかったPKUの母親の子に起きる、精神的および身体的な遅延の臨床的な症例が多く報告されている。彼女らの子はそれ自体はPKUを有しないが；代わりに子宮中でそれらの子供達は母親の高フェニルアラニンレベルで障害を受ける。PKUの母親の血漿フェニルアラニンレベルは妊娠の間に制御されなければならない。妊娠の間にフェニルアラニンを制限した食餌療法により治療すると、特にもし受胎の前に開始されるならば、胎児を出生異常からいくらか保護するようである。
【００６６】
現在のPKUの治療は、フェニルアラニンを除くように注意深く制御された強度に制限された食餌療法からなる。精神遅延を防ぐために、産まれた最初の日から治療を開始しなければならない。早期の良好に維持された治療は正常な発育を促して中枢神経系の関与を防ぐ。2から3歳の後に開始された治療は、非常に過度の活発性と難治性の発作を制御する事にのみ有効かもしれない。治療期間の長さは未だに完全には解明されていない。脳のミエリン化が殆ど完成した時には治療を終了しても安全であると以前には考えられていたが、知能指数および学習発達の低下と問題行動が報告され、この提言は再考査されている。現在のデータは食餌療法は生涯であるべきであると示唆している。その様に制限された食餌療法は、特にもし生涯であるならば、患者のコンプライアンスを含めていくつかの問題を提起する。加えて、体内における蛋白質の正常な異化回転は、食餌療法によっては制御できない内在性フェニルアラニンの供給源となる。
【００６７】
芳香族アミノ酸代謝の異常を治療するために本発明は、芳香族アミノ酸代謝酵素をコードする遺伝子を芳香族アミノ酸代謝疾患を有する哺乳動物被検体へ搬送するためのrAAVビリオンの使用方法を検討する。最も好適には、本発明はフェニルアラニン代謝に関与する酵素をコードする遺伝子を備えるrAAVビリオンを含み、それは本発明の方法を用いて高フェニルアラニン血症を有する哺乳動物の細胞へ送られる。その様な遺伝子には、限定されるものではないが、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ジヒドロプテリジンレダクターゼ、6-ピルボイル-テトラヒドロプテリン合成酵素、およびグアノシントリフォスフェートシクロヒドロラーゼIが含まれる。
【００６８】
フェニルアラニン代謝酵素をコードする遺伝子を搬送することにより、高フェニルアラニン血症に冒された哺乳動物において治療効果を達成できる。好適には本発明はPKUの治療のためのフェニルアランン代謝酵素の搬送を含み、最も好適には送られる遺伝子はフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする。PKUの状況で治療効果は、血漿フェニルアラニンを1000μM（デシリットルあたり20ミリグラム（mg/dL）と同等である）以下の濃度に、そして臨床的により良性の型の高フェニルアラニン血症（即ち、PKU以外のいずれかの高フェニルアラニン血症）においては、好ましくは120μM以下の濃度に低下させる事により達成される。
【００６９】
高フェニルアラニン血症とPKUの副作用の一つに色素沈着過剰症がある。過剰な血中レベルのフェニルアラニンは、チロシンをメラニンに変換するメラニン特異的な酵素であるチロシナーゼを阻害する。本発明の方法を使用することにより、フェニルアラニンレベルを1000μM以下、好適には120μM以下に低下させると、高フェニルアラニン血症を有している患者において色素沈着過剰症を軽減するようである。この様にして医者は、高フェニルアラニン血症と関連した色素沈着過剰症を治療する事ができる。
【００７０】
PAH欠損症による血漿フェニルアラニンレベルの過剰により、チロシン生成が低下する。上記で議論したように、チロシンはフェニルアラニンの水酸化により生成するが、その最初の段階はフェニルアラニンの異化である。チロシンはドパミンのみならず（上記で議論したように）、チロイドホルモンのトリヨードチロニン（T3）とテトラヨードチロニン（T4）を含む種々のホルモンの生成に必須なアミノ酸である。本発明の方法を用いてフェニルアラニン代謝酵素を含むrAAVビリオンを送り、それによってチロシンの生成を多くする事により、医者はT3とT4の不足より生じる代謝疾患を治療できる。その様なチロイド関連代謝疾患には、それに限定されるものではないが、甲状腺機能亢進症とクレチン症が含まれる。
【００７１】
フェニルアラニンの血漿レベルは、限定されるものではないが、ガスクロマトグラフィー質量分析法、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、または酵素的微蛍光測定を含む広く知られている技術を用いて測定できる。
【００７２】
体内の原発的な代謝疾患が生じている特定の器官または組織へrAAVビリオンを搬送することは望ましい。そこで例えばエピネフリン欠損症の場合において、それが要求される訳ではないが、フェニルエタノールアミンN-メチルトランスフェラーゼ遺伝子を備えるrAAVビリオンを、天然において体内でエピネフリンを合成する場所である副腎髄質の細胞へ搬送する事は好適であろう。当業者は静脈を介した投与、動脈を介した投与、および直接注入を含むよく知られた投与経路を使用し、rAAVビリオンによる標的細胞（例えば、副腎髄質の細胞）の形質導入を保障する事ができる。しかし、代謝疾患のとの関連においてrAAVビリオン遺伝子搬送のための魅力的な標的を提供するであろう器官や細胞は多数あり、形質導入するべき器官または細胞を選択する事は当業者が良く為す範囲内であり、その選択は、それらに限定されるものではないが、治療するべき疾患と治療の体内において天然にその代謝蛋白質が発現している場所を含む、いくつかの因子に依存している。
【００７３】
フェニルアラニンの代謝酵素（そして他のアミノ酸の代謝酵素）を搬送するのにあたり、それが要求される訳ではないが、これらの酵素を備えるrAAVビリオンを高フェニルアラニン血症を有する哺乳動物被験体の肝臓に搬送する事は好適である。それ程好適ではないが、フェニルアラニンの代謝酵素（そして他のアミノ酸の代謝酵素）を直接注入により哺乳動物被験体の筋肉組織へ搬送する事は本発明の範囲内である。
【００７４】
肝臓へのrAAVビリオンの搬送は、門脈注入、肝血管注入、および肝臓組織への直接注入を含む、種々の既知の方法によって達成できる。好適には、肝臓への搬送は侵襲が最小の手段を用いて実施されるであろう。例えば本技術分野で良く知られているように、末梢血管を介して肝臓へrAAVビリオンを注入するのに、カテーテル技術を使用できるであろう。この手段においては大腿を切れ目を入れ、大腿動脈を入手し、カテーテルを大腿動脈へ挿入してrAAVビリオンが注入される肝動脈へ通し、それによってビリオンは肝臓の形質導入を行う事を可能とする。代わりにrAAVビリオンを、静脈を介して哺乳動物被験体へ注入する事もでき、その様な注入は肝臓が形質導入されるという結果となる。
【００７５】
他の態様において、本発明を使用するために逆行性管投与（retrograde ductal administration）が検討される。逆行性管投与は侵襲が最小の手法であり、そのためにrAAVビリオンを肝臓へ搬送するのに特に魅力的な方法となる。「逆行性管投与」とは、管の中の物質の正常な流れに対して反対の方向でrAAVビリオンを投与する事を意味する。rAAVビリオンの導入は、管の中の物質の正常な流れの反対方向へrAAVビリオンが移動できる様な手段でrAAVビリオンが投与される限り、総胆管、総肝管、胆嚢管または肝管などの肝臓と関連した管の外部開口部へ投与する方法により、あるいは管壁を通じた方法により可能である。逆行性管投与は、単一の、不連続な投与（例えば、単一投与）、または連続的な投与（例えば、潅流）であることができる。
【００７６】
好適には、rAAVビリオンを肝臓へ搬送するのに、逆行性管投与の一形態である内視鏡的逆行性胆道膵管造影法（ERCP）を使用する。この方法は食道へ挿入される内視鏡を使用するが、それは消化管を通って総胆管へ向かい、そして総胆管を通って肝管へ通じる。そして肝管にカニューレが挿入され、逆行性管投与の手段により物質を肝臓内へ導入できる。もし望むならば、脾臓または胆嚢へ物質が導入をする事を防ぐために、例えばバルーン閉塞により膵管と胆嚢管を閉塞することもできる。
【００７７】
特的の治療効果を達成するために標的細胞（好適には一つまたはそれ以上の肝臓細胞）へ搬送する必要があるrAAVビリオンの用量、例えば哺乳動物あたりのウイルスゲノム中の用量単位（vg）、または体重あたりのウイルスゲノム中の用量単位（vg/kg）は、以下の因子：治療効果を達成するために必要とされる遺伝子発現のレベル、治療するべき特定の疾患、rAAVビリオンに対する潜在的な宿主免疫反応、遺伝子産物に対する宿主免疫反応、および遺伝子産物の安定性、を含むいくつかの因子に基づいて変化するであろう。ウイルスゲノムはrAAVベクター（送られて哺乳動物内で発現する遺伝子を含む）を備え、rAAVベクターはrAAVベクタービリオン中でカプシド化されているので、用量との関連で「ウイルスゲノム」という用語は、「ビリオン」と同義である。当業者が良く気付いているように、用量に言及するときには、ウイルスゲノムの検出には終点があるので、用量の定量的な測定のためにウイルスゲノムは好適な用語である。そのような定量的な測定のいくつかは本技術分野で良く知られており、それらに限定されるものではないが、ドットプロットハイブリダイーション法（米国特許番号6,335,011の中で述べられ、本願に引用して援用する）、および定量的ポリメラーゼ鎖反応（QPCR）法（Real Time Quantitative PCR ”リアルタイムの定量的PCR”, Heid C.A., Stevens J., Livak K.J. and Williams P.M. 1996, Genome Research 6:986-994. Cold Spring Harbor Pressの中で述べられている）を含む。当業者は上記の因子のみならず本技術分野で良く知られている他の因子に基づいて、特定の代謝疾患を有する患者を治療するためのrAAVビリオンの用量範囲を容易に決定することができる。
【００７８】
本発明の方法を用いることにより、rAAVビリオンが搬送したフェニルアラニンヒドロキシラーゼは、フェニルアラニンの血漿レベルをPKUのマウスモデルにおいて95％も低下させ、治療されたマウスの大部分は、rAAV注入の6週間後には血漿フェニルアラニンは治療されたレベルとなっていた（表１を見よ）。
【００７９】
【表１】
2005522517.tif 000002
1 = 組み換えAAV2-CAG-mPAH-SV40polyAビリオン
2 = 組み換えAAV2-GSTE-CAG-mPAH-SV40polyAビリオン
3 = 組み換えAAV5-CAG-mPAH-SV40polyA
4 = 組み換えAAV5-GSTE-CAG-mPAH-SV40polyA
【実施例】
【００８０】
下記の実施例は本発明の好適な態様をより十分に述べるために提示されるものである。しかし、それらはいかなる意味においても本発明の広さを限定するものと解釈されるべきではなく、本発明の広さは添付した特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００８１】
実施例１：組み換えAAVフェニルアラニンヒドロキシラーゼビリオンの調製
マウスのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子を含む組み換えAAVビリオンは、米国特許番号6,01,650（上記参照）において述べられたトリプルトランスフェクションの手法を用いて調製された。
【００８２】
ベクター構築
AAV pHLP19ヘルパー機能ベクター構築
AAV pHLP19ヘルパー機能ベクター通常の分子生物学的技術を用いて構築され；その構築は米国特許番号6,001,650（上記参照）において詳細に述べられている。
【００８３】
要約すると、AAV pHLP19ヘルパー機能ベクターは、AAV-2プロウイルス, pSM620, GenBnak Accession Number K01624とK01625から得られたAAV-2配列を用いた多段階工程において構築された。最初にrepとcap配列からITRsを除去した。プラスミドpSM620をSmaIとPvuIIにより消化し、4543塩基対のrepとcapをコードしているSmaI断片をpUC19のSmaI部位へクローン化し、7705塩基対のプラスミド、pUCrecapを作製した。そしてrepとcap遺伝子に隣接している残りのITR配列を、オリゴヌクレオチド145A（5'-GCTCGGTACCCGGGCGGAGGGGTGGAGTCG-3'）（配列番号１）と145B（5'-TAATCATTAACTACAGCCCGGGGATCCTCT-3'）（配列番号２）を用いて、オリゴヌクレオチド指向性突然変異生成により除去した。得られたプラスミド、pUCRepCapMutated（pUCRCM）（7559塩基対）は全AAV-2ゲノム（AAV-2ゲノム、GenBnak Accession Number NC_001401）を含み、ITR配列（4389塩基対）は有していなかった。突然変異原性のオリゴヌクレオチドが一部分導入されたSrfI部位は、このコンストラクトにおいてrepとcap遺伝子と隣接する。そのAAV 配列はAAV-2の146-4,534の位置に対応していた。
【００８４】
第２にEco47III制限酵素部位は、p5の3’ボーダーに導入された。このEco47III部位は、p5プロモーター配列の切除を促進するためにp5プロモーターの3’末端に導入された。これを行うために、プライマーP547（5'-GGTTTGAACGAGCGCTCGCCATGC-3'）（配列番号３）によりpUCRCMの突然変異を生成した。得られた7559塩基対のプラスミドをpUCRCM47IIIと称した。
【００８５】
第３に、pBluntscriptと呼ばれるアッセンブリープラスミドが構築された。pBSII SK+のポリリンカーは、オリジナルをBssHIIIで切除することにより改変され、オリゴヌクレオチドブラント（blunt）１と２によって置換された。得られたプラスミドであるpBluntscriptは、長さが2830塩基対であり、新たなポリリンカーは制限部位EcoRV, HpaI, SrfI, PmeIおよびEco47IIIをコードする。ブラント１配列は5'-CGCGCCGATATCGTTAACGCCCGGGCGTTTAAACAGCGCTGG-3'（配列番号４）であり、ブラント２配列は5'-CGCGCCAGCGCTGTTTAAACGCCCGGGCGTTAACGATATCGG-3'（配列番号５）である。
【００８６】
第４に、pUCRCM由来の4397塩基対のrepとcapがコードするSmaI断片を、pBluntscriptのSrfI部位へ、HpaI部位がrep遺伝子に近接するように結合させる事により、プラスミドpH1を構築した。プラスミドpH1の長さは7228塩基対であった。
【００８７】
第５に、プラスミドpH2を構築した。pH1のp5プロモーターがpGN1909（ATCC Accession Number 69871）の非翻訳領域により置換された事を除き、プラスミドpH2はpH1と同一であった。プラスミドpGN1909の構築は米国特許番号5,622,856の中に述べられており、その全体を本願に引用して援用する。これを成し遂げるために、pW1909lacZ329（米国特許番号5,622,856の中で詳細に述べられている、上記参照）由来の5’非翻訳領域をコードする329塩基対のAscI(blunt)-SfiI断片を、pH1の6831塩基対のSmaI(partial)-SfiI断片へ結合し、pH2を作製した。プラスミドpH2の長さは7155塩基対であった。
【００８８】
第６に、プラスミドpH8を構築した。pUCRCM47III由来のp5プロモーターをコードするSmaI-Eco47III断片の172塩基対をpH2のEco47部位へ挿入する事により、pH2の3’末端にp5プロモーターを付加した。3つのAAVプロモーター全ての転写方向が同じとなるようにこの断片を配向させた。このコンストラクトの長さは7327塩基対であった。
【００８９】
第７に、AAVヘルパー機能ベクターpHLP19を構築した。3’ p5のTATAボックス（AAV-2位置255-261、配列TATTTAA（配列番号６））を、突然変異生成性オリゴヌクレオチド5DIVE2（5'-TGTGGTCACGCTGGGGGG GGGGGCCCGAGTGAGCACG-3'）（配列番号８）を用いて、その配列をGGGGGGG（配列番号７）へ変えることにより除去した。得られたコンストラクト、pHLP19の長さは7327塩基対であった。
【００９０】
AAV pRepCap5ヘルパー機能ベクター構築
AAV pRepCap5ヘルパー機能ベクターは、AAV-5 repとcap遺伝子（GenBnak Accession Number Y18065）を、pUCプラスミド（Chiorini et al. (1999) J.Viol 73:1309-1319を見よ）のXbaI部位へ挿入することにより構築された。
【００９１】
pLadeno5アクセサリー機能ベクター
下記のようにしてpLadeno5アクセサリー機能ベクターを構築した。精製したアデノウイルス抗原型-2 DNA（Gibco/BRLから入手）から単離されたE2a, E4およびVA RNA領域をコードするDNA断片を、pAmpscriptと呼ばれるプラスミドへ結合した。pAmpscriptプラスミドを以下のようにして組み立てた。オリゴヌクレオチド指向性の突然変異生成を用いて、ポリリンカーとpBSII s/k+（Strarageneから入手した）由来のアルファ相補性発現カセットを含む623塩基対領域を除去し、EcoRV部位と置換した。オリゴヌクレオチド指向性の突然変異生成性に使用された突然変異生成性オリゴの配列は、5’-CCGCTACAGGGCGCGATATCAGCTCACTCAA-3’ （配列番号９）であった。ポリリンカー（下記の制限部位を含む：BamHI; KpnI; SrfI; XbaI; ClaI; Bst1107I; SalI; PmeI;およびNdeI）を合成し、そのリンカーのBamHI部位が改変されたプラスミドのf1起点に近接するように上記で生成されたEcoRV部位へ挿入し、pAmpscriptプラスミドを提供した。ポリリンカーの配列は5’-GGATCCGGTACCGCCCGGGCTCTAGAATCGATGTATACGTCGACGTTTAAACCATATG-3’ （配列番号１０）であった。
【００９２】
アデノウイルス抗原型-2 E2aとVA RNA配列を備えるDNA断片をpAmpscriptへ直接クローン化した。特に、E2a領域を含んでいる5962塩基対のSrfI-KpnI（部分）断片をpAmpscriptのSrfIとKpnI部位の間にクローン化した。その5962塩基対はアデノウイルス抗原型-2ゲノムの21,606-27,568塩基対を備えていた。アデノウイルス抗原型-2の完全な配列はGenBnak No. 9626158としてアクセスできる。
【００９３】
アデノウイルス抗原型-2のE4配列を備えるDNAは、pAmpscriptポリリンカー中へ挿入される前に改変されなければならなかった。特に、E4に隣接するアデノウイルス末端反復をSrfI部位と置換するために、PCR突然変異生成を使用した。このSrfI部位の位置はアデノウイルス抗原型-2ゲノムの塩基対35,836-35,844と同等である。突然変異生成に使用したオリゴヌクレオチドの配列は5’-AGAGGCCCGGGCGTTTTAGGGCGGAGTAACTTGC-3’ （配列番号１１）と5’-ACATACCCGCAGGCGTAGAGAC-3’ （配列番号１２）であった。上記の改変されたE4遺伝子をSrfIとSpeIで開裂することにより生成した3,192塩基対E4断片を、pAmpscriptのSrfIとXbaI部位の間に結合し、それは既にE2aとVA RNA配列を含んでおり、pLadeno5プラスミドを与える結果になった。その3,192塩基対断片はアデノウイルス抗原型-2ゲノムの塩基対32,644-35,836と同等である。
【００９４】
組み換えAAV-mPAH-SV40polyAベクター
ヒトのサイトメガウイルス即時早期（immediate early）プロモーター/エンハンサー（CAG）、マウスのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子（mPAH）、およびシミアンウイルス40ポリアデニレーション（SV40polyA）配列（”rAAV2-CAG-mPHA-SV40polyA”）を備える組み換えアデノ随伴ウイルス抗原型2、またはCAGプロモーターの5’に設置されたラット胎盤のグルタチオンS-トランスフェラーゼエンハンサー（GSTE）を有する同じベクター（”rAAV2-CAG-mPHA-SV40polyA”）を、以下のように構築した：マウスフェニルアラニンラニンヒドロキシラーゼ配列をマウス肝臓mRNAからRT-PCRクローン化した。ベクタープラスミドの一つのシリーズにおいて、ヒトのサイトメガウイルスエンハンサー-アクチンプロモーター-グロビンイントロン（CAG）プロモーター（Niwa H. et al. (1991) Gene 108:193-199）がフェニルアラニンラニンPAH発現を駆動する。SV40後期（late）アデニレーションがマウスPAH遺伝子の3’末端に隣接する。他のシリーズのベクターは、ラット胎盤のグルタチオンS-トランスフェラーゼエンハンサー（GSTE）がCAGプロモーター配列の5’に設置されている以外には同一であった。CAG-mPHA-SV40polyAまたはGSTE-CAG-mPHA-SV40polyAカセットのいずれかを、AAV2またはAAV5の5’と3’ITR配列の間に挿入した。AAV-2の左ITRの配列はGenBnak No. K01624として公開され、AAV-2の右ITRの配列はGenBnak No. K01625として公開されている。AAV-5のITRを含んでいる組み換えAAVベクターも同じようにして構築した。2つのITRを含んでいるAAV-5の完全なゲノムは公開されている（Chiorini et al., 上記を見よ）。
【００９５】
トリプルトランスフェクション法
AAVヘルパー機能ウイルスpHLP19ベクター（AAV-2 ITRsを含むrAAVベクターと共に使用した）またはAAV pRepCap5ヘルパー機能ベクター（AAV-5 ITRsを含むrAAVベクターと共に使用した）、アクセサリー機能ベクターpLadeno5、およびrAAV2-CAG-mPHA-SV40polyA、rAAV2-GSTE-CAG-mPHA-SV40polyA、rAAV5-CAG-mPHA-SV40polyAまたはrAAV5-GSTE-CAG-mPHA-SV40polyAベクターのいずれかを用いて、組み換えAAV-mPAH-sv40polyAビリオンを産生した。2つの完全なセットの組み換えベクターが作製され：1つのセットはAAV-2 ITRsを有し、1つのセットはAAV-5 ITRsを有していた。
【００９６】
ヒト胚腎臓細胞293型（293細胞-アメリカンタイプ・カルチャーコレクションから入手可能、カタログ番号CRL-1573）をセルファクトリー（Nunc）に、1000mLの培養培地中にフラスコあたり3.5×108細胞の密度で蒔き、その培養培地は10％のウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグルス培地から成り、加湿した環境下で5％CO2中37℃でインキュベートした。一晩インキュベートした後、293細胞はおよそ80％コンフルエントであった。その後リン酸カルシウム沈殿法により293細胞をDNAでトランスフェクトした。簡単には、650μgの各ベクター（pHLP19またはpRepCap5, pLadeno5,およびrAAV-mPAH-SV40polyAベクター）を250mLの滅菌したポリスチレンの簡易（snap）キャップチューブへ、滅菌ピペットチップを用いて添加した。300mM CaCl2(JRHグレード)を100mL各チューブへ添加し、ピペット操作で上下させる事により混和した。100mLのピペットで等量の2X HBS（274mM NaCl, 10mM KCl, 42mM HEPES, 1.4mM Na2PO4, 12mM デキストロース、pH7.05、JRHグレード）を添加し、その溶液を３回ピペット操作で上下させた。DNA混合液を293細胞へ即座にフラスコ中に均一に添加した。その後細胞を、加湿した環境下で5％CO2中37℃で6時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞培養物中で顆粒状の沈殿物が見られた。6時間後に細胞からDNA混合液を除去し、その後その細胞に新鮮な細胞培養培地を与え、更に72時間インキュベートした。
【００９７】
72時間後に細胞を溶解してヌクレアーゼで処理し、残った細胞内およびプラスミドDNAを減少させた。沈殿の後、rAAVビリオンを2サイクルの等密度遠心分離により精製し；rAAVビリオンを含む画分をプールし、透析し、そして濃縮した。濃縮されたビリオンを処方し、濾過滅菌し（0.22μM）、そしてガラスバイアル中へ無菌的に充填した。ウイルスゲノムをドットブロット解析により定量した。
【００９８】
実施例２：フェニルケトン尿症マウスモデル
Shedrovskyにおいて述べられた方法（Shedrovsky et al. (1993) Genetics 134: 1205-1210）に従って生殖細胞系列のエチルニトロソウレア（ENU）突然変異生成を行い、BTBR系列のマウスでPAHenu2と名付けたフェニルケトン尿症マウスモデルを確立した。PAHenu2マウスにおいて、PAH遺伝子のエキソン7におけるTからCへの転位はF263S変異を引き起こす結果となり、肝臓におけるPAH活性が低下した。影響を受けた同型のマウスは、血中フェニルアラニンの顕著な増加（フェニルアラニンは1000μM以上、または20 mg/dl以上）、過剰な色素沈着、および神経発達の欠損など、古典的なヒトPKUの表現型を示した。
【００９９】
実施例３：組み換えAAVビリオンの搬送および血漿フェニルアラニンレベルの定量
組み換えAAVビリオンをリン酸緩衝生理食塩水中で再懸濁した。本技術分野でよく知られている方法に従ったイソフルラン麻酔下で、上腸間膜静脈を介してオスのPAHenu2マウスに種々の用量のビリオン（表１に見られる通り）を300μLの溶液で与えた。血中フェニルアランンレベルを、Enzaplate PKU-R（バイエル薬品、東京、日本）を用いた酵素的な微蛍光測定法により測定した。テイルクリッピングによりマウスを出血させ、マススクリーンググレードの紙フィルター（＃545、アドバンテック東京、東京、日本、より提供された）上に血液をスポットした。直径3mmのディスクを血液スポットから打ち抜き、96穴プレート上に設置した。フェニルアラニンをディスクから溶出し、NAD依存性酵素であるフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよびレサズリン（resazurin）と共にインキュベートした。酵素反応によりNADPHを産生し、その代わりにジアフォラーゼの助けでレサズリンはレソルフィンへ変換する。得られたレソルフィンを、フルオロスキャン・アセント（ラボシステム、ヘルシンキ、フィンランド）および544nm/590nmの励起/放射フィルターセットにより測定した。
【０１００】
実施例４：マウス肝臓への逆行性管投与
フェニルケトン尿症のマウス（PAHenu2マウス）へ、250μLのrAAV2-CAG-hPAH-SV40polyA, rAAV2-GSTE-CAG-hPAH-SV40polyA, rAAV5-CAG-hPAH-SV40polyAまたはrAAV5-GSTE-CAG-hPAH-SV40polyAビリオンを、肝管への逆行性管投与を介して注入した。マウスを麻酔し、胆嚢管へ接近するために手術用顕微鏡の下で正中腹部切開を行った。前部肝鎌状間膜（falciform ligamentum anterior）を分離し、中肝葉（median lober lobe）を移動させて、胆嚢、胆嚢管、肝管および総胆管を露出させた。脾管との接合部の上で総胆管をクランプし、ベクターの十二指腸への順行性の流れと脾臓への逆行性の流れを防止した。しかし、総胆管のクランプするのに先立って総胆管に生理食塩水を流した。絹の縫合糸を胆嚢に隣接した部位の周囲へ緩く置き、胆嚢管にカニューレを挿入した。組み換えAAVビリオンをカニューレへゆっくりと注入した。各用量群あたり6匹のマウスで3つの用量群を確立し、低用量群には1×1012のrAAV-CAG-hPAH-SV40polyAまたはrAAV2-GSTE-CAG-hPAH-SV40polyAウイルスゲノムを投与し、中間用量群には5×1012ウイルスゲノムを投与し、高用量群には1×1013ウイルスゲノムを投与した。注入の後、ポリエチレンチューブの遠位端を固め、全ての鉤とキシフォイド（xyphoid）クランプを取り除き、腸管をその元の位置に戻した。rAAVビリオンを注入して1時間後、総胆管からクランプを除去することにより、胆管から十二指腸への順行性の流れを回復した。その後、腹部を2層で閉じた。血漿フェニルアラニンレベルを実施例３と同様に測定した。
【０１０１】
実施例５：組み換えAAV-mPAHの単独またはヒトのグアノシントリフォスフェートシクロヒドロラーゼI遺伝子（rAAV-hGCH）と組合わせてのマウス筋肉組織への搬送
組み換えAAVビリオンをリン酸緩衝生理食塩水溶液中に再懸濁した。本技術分野で良く知られている手法に従い、オスPAHenu2マウスにrAAVビリオンを前脛骨筋への注入を介して投与した。前脛骨筋上で皮膚を切除して筋膜を同定した。露出させた脛骨筋の中へ組み換えAAVビリオンを直接注入した。一回のrAAVビリオンの注入はrAAV-mAPHからなる。各用量群あたり6匹のマウスで3つの用量群を確立し、低用量群には1×1012のrAAV-CAG-hPAH-SV40polyAまたはrAAV2-GSTE-CAG-hPAH-SV40polyAウイルスゲノムを投与し、中間用量群には5×1012ウイルスゲノムを投与し、高用量群には1×1013ウイルスゲノムを投与した。血液フェニルアラニンレベルを実施例３で述べた手法と同様に測定した。
【０１０２】
加えて別個の実験において、ヒトのグアノシントリフォスフェートシクロヒドロラーゼI（hGCH）遺伝子（rAAV-hGCH）を含んでいるrAAVとrAAV-mPAHを共にマウスに注入した。hGCH遺伝子はGenBnak Accession No. NM_000161として入手可能である。各用量群あたり6匹のマウスで3つの用量群を確立し、低用量群には1×1012のrAAV-CAG-hPAH-SV40polyAまたはrAAV2-GSTE-CAG-hPAH-SV40polyAウイルスゲノムおよび1×1012のrAAV-GCHを投与し、中間用量群には5×1012ウイルスゲノムを投与し、高用量群には1×1013ウイルスゲノムを投与した。血液フェニルアラニンレベルを実施例３で述べた手法と同様に測定した。
【配列表】
2005522517.tif 000003
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【国際調査報告】
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