(57)【要約】本発明は、バイオマスの収穫とタンパク質、特に医薬への応用に好適な組換えタンパク質の単離を目的として、管理された室内環境で植物を密集して育てるために、アラビドプシスを用いることによって、そのアラビドプシスが持つ様々な生育要因を利用できる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程
（ａ）組換えタンパク質を発現させることができる、少なくとも一つの発現カセットをアラビドプシスの細胞に導入する、
（ｂ）組換えタンパク質を、望ましいレベル及び／又は活性で、発現している細胞を同定する、
（ｃ）同定された細胞の子孫から種子を得る、
（ｄ）種子を迅速に生産する環境で得られた種子を栽培する、
（ｅ）組換えタンパク質を望ましいレベルで及び／又は望ましい活性で発現している植物を同定するために、種子から得られた植物をスクリーニングする、
（ｆ）タンパク質を生産する植物を、少なくとも２世代栽培し、種子を迅速に生産する条件でタンパク質生産が最も多いものを選抜する、
（ｇ）最も多い量のタンパク質を発現する植物系統を、３０ｃｍ四方の面積あたり少なくとも約５０グラムのバイオマスを生産できる条件で栽培する、
を含むアラビドプシスでの大規模量の組換えタンパク質の製造方法。
【請求項２】
３０ｃｍ四方の面積あたり、少なくとも約１００グラムのバイオマスを生産するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
３０ｃｍ四方の面積あたり、少なくとも約２００グラムのバイオマスを生産するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程
（Ａ）組換えタンパク質を発現する少なくとも一つの発現カセットを含むアラビドプシスの品種を、植物性で葉の多いバイオマスの生産を向上するような条件下に育てる、
（Ｂ）種子形成前に、組換えタンパク質を含むアラビドプシスの少なくとも一部分を収穫する、
（Ｃ）１年間に少なくとも１グラムの組換えタンパク質を回収する、
を含むアラビドプシスでの組換えタンパク質の製造方法。
【請求項５】
アラビドプシスが、タンパク質の最大の発現及び／又は活性のために、事前に選抜されたアラビドプシスである、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項６】
アラビドプシスが、タンパク質の翻訳後糖鎖形成のレベル低下を示すアラビドプシスである、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項７】
アラビドプシスが、ヒトの糖転移酵素遺伝子を含むアラビドプシスである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アラビドプシスが、ｃｇｌ変異体又はｍｕｒ変異体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、野生型のアラビドプシス株に比べて平均バイオマスの増大を実現したアラビドプシスの株を事前に選抜し、そしてその株からアラビドプシスの細胞を得る工程をさらに含む方法。
【請求項１０】
請求項１又は４に記載の方法において、少なくとも一つの発現カセットが浸潤法によりアラビドプシスに導入される方法。
【請求項１１】
浸潤法が減圧下に行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項４に記載の方法において、アラビドプシスの一部分を種子形成まで栽培し、その部分から種子を得る方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、少なくともいくつかの種子を再び植える方法。
【請求項１４】
請求項４に記載の方法において、工程（Ａ）及び（Ｂ）を、少なくとも６ヶ月の期間にわたって繰り返す方法。
【請求項１５】
発現コンストラクトが、機能するように制御配列と連結した組換えタンパク質発現遺伝子からなる発現コンストラクトである、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項１６】
制御配列が、一つもしくはそれ以上のプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、もしくは、ＩＲＥＳ因子を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組換えタンパク質が、成長因子、レセプター、リガンド、シグナル分子、キナーゼ、腫瘍抑制因子、血液凝固蛋白、細胞周期タンパク、テロメラーゼ、代謝タンパク質、酵素、病状をもつヒト患者に欠乏しているタンパク質、抗体、抗原、インシュリン、アルブミン、インターフェロン及びサイトカインからなる群から選ばれるものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
発現カセットが、複数の組換えタンパク質を発現させるものである、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項１９】
発現カセットが、ポリシストロン性のメッセンジャーＲＮＡを発現するものである、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項２０】
発現カセットが、マルチサブユニットタンパク質を発現するものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
マルチサブユニットタンパク質が、Ｔ細胞レセプター、ＭＨＣ分子、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、核酸に結合するタンパク質、マルチサブユニットの酵素、及びマルチサブユニットのアブザイムからなる群から選ばれるものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質がヒトのタンパク質である、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質が、医薬剤、検査用タンパク質、健康増進食品、美容食品、獣医薬剤である、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質が、融合タンパク質である、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項２５】
融合タンパク質が、エフェクターポリペプチドを含むものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
融合タンパク質が、その融合タンパク質の転写を増強する転写活性化ポリペプチドを含むものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
融合タンパク質が、タグポリペプチドを含むものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
融合タンパク質が、リンカーペプチドを含むものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
リンカーペプチドが、切断しうるリンカーである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３０】
制御配列が、２０〜４０日齢の植物体においてアラビドプシスの５０％以上の植物組織で活性のあるプロモーターを含むものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項３１】
制御配列が、葉、茎、根の組織のうちの少なくとも一つ以上で活性であるプロモーターからなるものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項３２】
制御配列が、アラビドプシスアクチン２プロモーター、ＯＣＳ（ＭＡＳ）プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウィルス３４Ｓプロモーター、及び葉緑体プロモーターからなる群から選ばれるものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項３３】
タンパク質が、ターゲッティング配列を含むものである、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項３４】
ターゲッティング配列が、細胞膜、細胞外空隙、プラスチド及び内膜からなる群から選ばれる植物細胞の特定の場所を、組換えタンパク質の標的とすることができるものである、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項３５】
ターゲッティング配列が、カルレティキュリン、ズブチリシンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
融合タンパク質が、部位特異的切断サイトを含む融合タンパク質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１又は４に記載の方法において、さらにタンパク質を単離することを含む方法。
【請求項３８】
少なくとも約１０グラムを含むアラビドプシスのバイオマスであって、そのアラビドプシスバイオマスの可溶タンパク質のうち少なくとも０．１％が組換えタンパク質であるバイオマス。
【請求項３９】
種子以上に含むものである、請求項３８に記載のバイオマス。
【請求項４０】
アラビドプシスの細胞、又はその画分をヒトに経口投与することからなる、ヒトへのタンパク質供給方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法において、アラビドプシスにおいては自然には発現されないタンパク質である方法。
【請求項４２】
タンパク質が、アラビドプシス細胞で発現される組換え遺伝子にコードされるものである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
細胞が、効果的な免疫応答を誘発するための抗原を含む細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
請求項４０に記載の方法において、生産されたアラビドプシスの少なくとも一部分から、種子ではないバイオマスを収穫することをさらに含む方法。
【請求項４５】
約２回の生育サイクルにわたり、少なくとも２回の収穫を行うものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
約５回の生育サイクルにわたり、少なくとも５回の収穫を行うものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
約１０回の生育サイクルにわたり、少なくとも１０回の収穫を行うものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
約２回より多い生育サイクルにわたり、少なくとも約２回の収穫を行うものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
約５回以上の生育サイクルにわたり、少なくとも約５回の収穫を行うものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
請求項４５又は４６に記載の方法において、バイオマスを収穫しない生育サイクルが少なくとも１回ある方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アラビドプシス  タリアナ（Arabidopsis thaliana）を利用した、タンパク質の大規模な製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
治療用タンパク質などの組換え遺伝子産物をヒト用に有効に利用するためには、大規模なタンパク質の製造が必要となる。微生物を用いたシステムは、多くの場合、クローニング及びトランスジェニック細胞の作成が素早くできるという点が目立って優れているが、しばしば、実験室での培養から大規模培養槽へのスケールアップが困難である。また、細菌と真核生物とでは翻訳後プロセッシングが異なるため、原核生物を用いたシステムでは簡単には製造できないタンパク質のカテゴリーが存在する。
【０００３】
哺乳動物細胞及び昆虫細胞の培養の、たぶんもっとも重要な利点は翻訳後プロセッシングであり、様々な種類のタンパク質の生産に広く利用されるようになっている。その一方、培地及び装置、そして面倒な培養条件などが生産コストを引き上げ、このシステムにおける明らかな欠点となっている。そして、このシステムのもう一つの欠点は、ウイルス粒子及びプリオンの混入により人の健康に影響を与える可能性があることである。
【０００４】
ヒトのタンパク質をミルク中に生産し、尿中に分泌し、又は鳥類の卵中に生産するトランスジェニック動物も報告されている。動物細胞の培養の場合と同じく、トランスジェニック動物は、翻訳後修飾を必須とするタンパク質を与えるであろう。しかしながら、トランスジェニック動物は生産が遅く、維持が難しく、簡単に生産規模をスケールアップすることができない。このシステムにおいては、生産コストはかなり高く、また、同様にタンパク精製が問題である。
【０００５】
細菌、酵母、昆虫及び動物又はその細胞を用いた生産システム以外の魅力的な選択肢としては、組換えタンパク質発現系、あるいは、「バイオリアクター」として植物を用いることである。植物によるタンパク質の製造には多くの利点があり、トランスジェニックタンパク質生産のために植物を用いることが広く支持されるようになってきている。
【０００６】
植物を用いた生産システムでは、動物由来の病原性汚染がなくタンパク質を精製することが容易である。多数の植物種について形質転換方法がある。多くの種子植物及び栽培作物では、大量のものを収穫し取り扱うための方法及びインフラがすでに存在している。スケールアップは比較的単純であり、種子の生産及び栽培面積に基づいている。従って、製品コストを実質的に引き下げ、動物のウイルス及びプリオンによる汚染のリスクが減り、そして、動物細胞の培養及びトランスジェニック動物によって同じものを製造するのと比べ、原材料及び生産設備のために要求される資本が比較的少ない。一般に、植物ではただ一つの重大な欠点がある。それはタンパク質の翻訳後の糖鎖修飾の範囲にある。しかしながら、多くの場合には、植物の代替炭化水素修飾は、有害な作用や、望ましくない免疫原特性を引き起こさないことが証明されている。
【０００７】
植物内でタンパク質を発現させるために多くのシステムが開発されている。これらには、油体中で発現させる方法（Rooijen et al., 109, Plant Physiology, p.1353-1361, 1995; Liu et al., 3, Molecular Breeding, p.463-470, 1997）、根から分泌させる方法（Borisjuk et al., 17, Nature Biotechnology, p.466-469, 1999）、種子で発現させる方法（Hood et al., 3, Molecular Breeding, p.291-306, 1997; Hood et al., In Chemicals via Higher Plant Bioengineering (ed. Shahidi et al.), Plenum Publishing Corp., p.127-148, 1999; Kusnadi et al., 56, Biotechnology and Bioengineering, p.473-484, 1997; Kusnadi et al., 60, Biotechnology and Bioengineering, p.44-52, 1998; Kusnadi et al., 14, Biotechnology Progress, p.149-155, 1998; Witcher et al., 4, Molecular Breeding, p.301-312, 1998）、ウイルスの表面のエピトープとして発現させる方法（Verch et al., 220, J.Immunological Methods, p.69-75, 1998; Brennan et al., 73, J.Virology, p.930-938, 1999; Brennan et al., 145, Microbiology, p.211-220, 1999）、ジャガイモの塊茎にタンパク質を安定して発現させる方法（Arakawa et al., 6, Transgenic Research, p.403-413, 1997; Arakawa et al., 16, Nature Biotechnology, p.292-297, 1998; Tacket et al., 4, Nature Medicine, p.607-609, 1998）がある。組換えタンパク質は、種子もしくは葉緑体を標的にすることも、又は、蓄積の最も高い場所を同定するため分泌させることもできる。
【０００８】
タンパク質生産の問題をバイオテクノロジーで解決するために、植物開発になされた努力のほとんどは、主要条植え作物の利用に焦点をあてたものであった。その重要視される点は、主にバイオマス生産にあった。そして、農生産は既に世界的に最大のバイオマス生産システムであるファーミング（farming）へと発展してしてきている。過去７〜８年の間に、栽培植物での外来タンパク質（例えば、ワクチン、モノクローナル抗体、アビジンその他）の例が非常に多くある。そして、農業生産植物は、外来タンパク質を非常に費用効率よく生産する手段として貢献できることが明確に立証されている。典型的な醗酵法により製造されたもののコストに比較して、このような植物により製造されたもののコストの見積りでは、たいていの場合、植物の使用によりコストが５０〜１００分の１になることが示された。
【０００９】
植物による生産システムでは、特定の生産物を生産するために適当に裁植可能な土地を全てかぞえたとき、生産能力を著しく高めることができることも事実である。しかしながら、今日現在、このシステムと手法は、顕著な欠点と不利益なしには存在しない。高度に規制された医薬用途の生物製剤の製造に関係する場合に、もっとも深刻な欠点の一つは、野外生産システムの非規制な性質である。また、野外の条件の変わりやすさの故に、有効なかつＣＧＭＰ適合のプロセスを開発することは困難であるか又は野外で遺伝子改変生物（GMOs; Genetically modified organisms）を育てることは懸念させるかのいずれかである。
【００１０】
この数十年来、植物バイオテクノロジーの研究は、小さくて成長が早い雑草であるアラビドプシス（Arabidopsis thaliana, thale cress）を使用する最初の発見によって大きく促進された。この植物は、実験室での役割のために都合の良い性質を多く持つ。それは、アラビドプシスは小さくて、ライフサイクルが短く、種子を多産する能力があり、比較的小規模で複雑でないゲノムを持ち、様々な方法で容易に形質転換することができ、そして、多くの変異株が存在することである。この十年間で、そのシロシヌナズナのゲノム配列が完全にシークエンスされた。最初の高等植物が到達すべき一里塚としてマークされた。これらの理由から、Arabidopsisは、植物バイオテクノロジーにおける共通の研究用生物となった。しかしながら同時に、この小さな雑草はモデルにすぎないということが広く認識されて来た。
【００１１】
このように、アラビドプシスは一般に研究場面でのみ活用されてきた。作物に特化した研究プログラムにおけるそれらのワーキングのためには、いくつかの世界の主要食糧作物及び園芸作物についてより完全に理解し、その理解をこれらの種の改変及び改良に役立てるため、アラビドプシスの研究から得られた知見が典型として利用された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
生物医薬材料もしくは診断用材料をつくる際に、生育条件、産物の製造のニーズ、規制のニーズ（regulatory needs）を考慮することが不可欠の要素である。本発明の方法は、組換えタンパク質製造の最初の試験段階及び試作段階から本格的規模の製造までのスケールアップを可能とし、かつ、高い信頼性と迅速性を備えるシステムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
アラビドプシスのように植物と種子の世代交代が早い植物種はほとんど存在しない。一つの測面として、本発明は、組換えタンパク質を高収量で発現する遺伝子コンストラクト及びトランスジェニック植物のスクリーニングにより、アラビドプシスから該タンパク質を大規模に製造する方法を提供する。アグロバクテリウム（Agrobacterium）のフローラルディップ形質転換法もしくは減圧浸潤形質転換法のような、いかなる適当な手法を用いてもよい。好ましくは、形質転換から形質転換種子までの期間は１０週間以下、例えば約８〜１０週間である。他の側面としては、新たな遺伝子コンストラクトの正確な機能を、それが作られてから数日のうちに試験するために、葉及び幼植物（seedling）の浸潤法又はプロトプラストのエレクトロポレーション法のような迅速なトランジェント発現解析システムが用いられる。
【００１４】
そのような組換えコンストラクトの挿入に使用されるベクターは、これらに限定されるわけではないが、選ばれた染色体座に特異的に組み込まれることを促進する部位特異的組換えサイト（site-specific recombination site）、通常用いられる選抜マーカー（例えば、ＢＡＲ、ＮＰＴII等）、及び／又は、ＧＦＰ（green fluorescent protein又はその変異・改変体）、ルシフェラーゼもしくはＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）のような他の選別可能なマーカーを含む有用な配列を含むことができる。好ましくは、組換えコンストラクトは、プロモーター、及び／又は、IRES（内部リボソーム侵入サイト internal ribosome entry sites）のような一つ以上の遺伝子調節領域が機能するように連結している目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００１５】
一つの測面は、安定性及び／又は活性の向上のような望ましい性質を持つタンパク質のコンストラクトを同定するために、ランダム変異法もしくは合理的な設計又はこれらの手法の組み合わせのいずれかによって、変異組換えタンパク質をスクリーニングする。このようなタンパク質を発現する組換えコンストラクトは、好ましくは、野生型の形態のタンパク質を発現するコンストラクトと並列で、トランジェントアッセイにより試験される。
【００１６】
この種の生物学的「アナログ」試験のための変異体をつくりだす他の方法は、最終産物に変化を及ぼすような製造システムの何かを変更してみることである。アラビドプシスでは既存のアラビドプシスの変種を用いることによって、あるいは、植物のタンパク質プロセッシング特性が変化した植物の変異種をつくりだすことによって、これを容易に達成できる。すなわち、翻訳時又は翻訳後の一定の改変を行うために、新しいタンパク質をつくるためのシステムに追加されたいかなるＤＮＡの情報も宿主植物の能力に応じて幾分変更されるかもしれない。
【００１７】
糖鎖形成は、この論考において特に関わりのある事例である。糖鎖形成でタンパク質に付加する糖は、動物と植物とで異なっていることが知られている。コアグリカンの大部分は同じであるが、主にキシロース及びα−１−３フコースの付加、及び末端のシアル酸の欠損によって異なっているコアグリカンが存在する。もし、これらの差異が、植物ベースの産物の医薬用分子としての効力及び安全性の点において、いかなる又はあるとすればどれ程の問題になるのかは未だ確かではない。活性及び安全性のいずれか又は双方にとってマイナス面であることを示唆するこのような変化が、活性及び安全性及びその他のものにとってはとるに足らないものであることを示す文献が十分にある。例えば変異したグリカン側鎖を持つタンパク質を生産できるアラビドプシス変異体のセットを持つことは、本発明により提供されるシステマチックな手法にとって、はっきりとした利点である。例えば、医薬上許容される組換えタンパク産物の生産のための、変異した又は遺伝子工学によりつくりかえられたアラビドプシスの品種を同定するために、野生型と、変異又は遺伝子工学によりつくりかえられたさまざまなアラビドプシスの品種から得れらた少量のタンパク質を、並列でインビトロの機能検定を使用して試験することができる。
【００１８】
付け加えられる有用な変異系統の例は、これらに限定はされるわけではないが、プロテアーゼが欠損した系統及び、他のアラビドプシスの系統と比べて平均バイオマス（特に葉のバイオマス）が増加したそれらの変異種が挙げられる。ここで、焦点は生産量を増加させることであり、必ずしも生産物の変化型を生産することではない。
【００１９】
このように、安定な形質転換系統がつくられる前に、どの遺伝子コンストラクトが、どの変異型が、そして、どのバックグラウンドのホスト系が、目的のタンパク質を薬理学上最も有用な形態で生産するかを決定することが、本発明の好ましい一面である。
【００２０】
本発明の特に好ましい一面を見出す一つの方法は、ありきたりのアラビドプシスを用いた研究を辞めるところから始まる。かつて、アラビドプシスは、特定のタンパク質を植物内で発現させることを確立するためのモデルとして、あるいは、特定の発現ベクターの特色を評価するデータを提供するためのモデルとして利用されてきた。このタンパク質とベクターは、工業的には、一般にアラビドプシス以外の植物で使用された。それに対し本発明は、前記したように、生産段階前での検定で同定された最適のコンストラクトとアラビドプシス株とを利用して、望ましい発現コンストラクトを事前に選抜し、そのコンストラクトをアラビドプシスにおいて大規模に発現させる方法とシステムを提供するものである。一つの好ましい測面として、本発明はこのように、最適な量及び／又は最適な形態のタンパク質を生産する植物を同定し、その植物の子孫、純系（clonally）に関連する植物もしくは遺伝学的に実質同一の植物を用いてタンパク質を大規模に製造することからなるものである。
【００２１】
最も好ましくは、選抜されたアラビドプシスの株と使用される発現系とは、植物に対するタンパク質の収量を最大化するよう設計されたものである。これには、植物体のできるだけ多くの部分にわたってタンパク質を発現するように設計された発現ベクターの使用及び、遺伝子中の配列におけるマルチプルコピーの使用を含むことができる。これらのベクターはそののちアラビドプシスに導入され、植物の生育とタンパク質の発現が最大となるように意図された条件下で植物を生育させる間に発現が引き起こされる。生産量を最大化するよう最適化されたシステムが最も好ましいが、経済的に実施可能なサブオプティマルな生産であっても、本発明のこの測面の範囲になおあるものと見なされる。
【００２２】
通常、本発明の植物は、葉及び根のバイオマスの生産に好ましい条件で育てれられるものである。種子の量を減ずる、または、種子産生及び成熟前に植物を収穫する犠牲があったとしてもよい。
【００２３】
本発明の一つの側面では、目的の組換えタンパク質を安定して発現する植物体及び／又は種子を生育および生産するため、前記した検定方法により選抜された最適化ベクターと遺伝子コンストラクトとを植物細胞に導入するのに、アグロバクテリウム（Agrobacterium）が利用されることである。好ましくは、減圧浸潤法のような浸潤法が用いられる。
【００２４】
非常に短期間にかつとても小さなスペースで、何百ものＴ１形質転換系統をつくることができ、それらは数週間内に何千ものＴ１とみなされる形質転換系統となる。これらの何千ものＴ１形質転換系統とみなされる植物のなかから、導入遺伝子を発現させるのに望ましい系統がどれかを評価する選抜が行われる。これらの系統はそののち自家受粉させられ、約８週間でＴ２世代が生まれる。遺伝子の挿入された場所が一つとしたとき、標準メンデル遺伝を指針として使用すれば、名目上このＴ２世代の２５％がホモ接合体の遺伝子導入系統となるはずである。これらの系統はそののち、「純粋繁殖用」ホモ接合体種子の大量生産へ素早くスケールアップするために用いることができる。
【００２５】
望ましくは、研究に用いられうる育成規模よりもはるかに大きな規模で、植物の育成が行われる。例えば、温室もしくは育成部屋のような特殊な育成室で、アラビドプシスはいつ何時でも育てることができる唯一の植物であろう。しかしながら、その温室でそれぞれの植物が、全く同じ単数もしくは複数のタンパク質の生産を最大化するという全く同じ目標をもって、全く同じコンストラクトを持つというわけではない。しかし、同一温室全体において同一タンパク質を生産するように設計された、同一の発現系を持つ同一の植物を育てることも、本発明を使用して、ありうる。
【００２６】
本発明の特に好ましい実施の形態において、この規模での生産を、数週間、数ヶ月、数年といった延長された期間にわたって継続することである。たとえ、誰かが一つのタンパク質を発現する一つの遺伝子コンストラクトをもつアラビドプシスを研究目的で温室いっぱいに育てることを考えたとしても、これらの植物のライフサイクルを、全く同一の条件での２回、３回、４回及び５回の植付を始めるためにのみこれらの植物のライフサイクルを全うすることはありそうもない。たとえば、何度も何度も繰り返して、温室内のすべての植物を収穫し、同じ種類の発現系で同じ種類のタンパク質を発現する同じ種類の植物を温室の全ての空間に再び植える。従って、本発明の一つの側面は、２次元で栽培する場合には面積あたりで一定の量のタンパク質を生産することであり、また、育成部屋で平面を積み重ねてする栽培のように３次元で栽培する場合には、立方メートルあたりで一定の量を生産することである。
【００２７】
本発明のこの側面に沿った特に好ましい実施の形態は、前述した生産規模で及び／又は少なくとも６ヶ月の単位で生産を継続し、工業的に意味をなす量のタンパク質を生産することである。
【００２８】
一つの側面は、一つの平面層で植物を育てた場合に、６メートル×６メートル（３６平方メートル）の育成部屋を用いて約４５〜６０日で収穫して、総量約４ｋｇのアラビドプシスのバイオマスを得ることである。もう一つの側面は、植物を多層で育てることである。例えば、少なくとも６層にまで増やせば、約４５〜６０日の期間の育成で一部屋あたり少なくとも約２４０ｋｇの植物バイオマスの生産が可能になる。育成／収穫のサイクルが年に６〜８回の間とし、総可溶性タンパクの約０．５％が発現されていると少なめに見積もると、このシステムで、毎年約７２〜９６ｍｇの目的の精製可能なタンパク質を生み出すと見積もられる。
【００２９】
従って一つの側面は、本発明は少なくとも総計１０ｋｇの植物バイオマスに達するように形質転換アラビドプシスを適当な条件で栽培生産する方法からなるものであり、そのすべての植物バイオマスから十分な量の精製可能な組換えタンパク質産物が得られることである。好ましいこことに、この方法はスケールアップ可能であり、植える面積を増やしたり、目的のタンパク質を示す総タンパク質の比率を増すことにより、もしくは一定のバイオマスと目的のタンパク質を得るために必要な時間を短縮することにより、又はこれらの組み合わせにより、容易に生産レベルを増すことが達成できる。
【００３０】
本発明の特に好ましい実施の形態は、アラビドプシスから望ましいタンパク質を製造する方法である。この製法により得られたタンパク質はまた、意図されたものである。これらの方法は、少なくとも一つの目的タンパク質を発現する一以上の発現カセットを持ったアラビドプシスの特定の変種を提供する工程を含むものである。このタンパク質は、植物にとって異種であってもよく、あるいは外来のものであってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明においては、小さな雑草アラビドプシス（Arabidopsis thaliana）をタンパク質生産のための宿主として用いる。本発明は、バイオマスの収穫とタンパク質の単離を目的として、管理された室内環境で植物を密集して育てるために、アラビドプシスを用いることによって、そのアラビドプシスが持つ様々な生育要因を利用できる方法を提供する。ここで、単位面積・単位空間あたり、又は単位時間あたりに育成できる植物材料の量が最大となるように、生育要因と投入量を定めるのが本発明の方法である。
【００３２】
定義：
本願特許請求の範囲及び明細書に使用される特定の意味をもつ用語について、以下のような定義が与えられる。
【００３３】
本願の特許請求の範囲と明細書で使用される名詞は、他に明示される事情がない限り、複数を指すことも含む。例えば、「細胞」という用語は、複数の細胞、その混合物をも含むものである。また、「タンパク質」という用語は、複数のタンパク質をも含むものである。
【００３４】
ここで使用される「アラビドプシス」とは、無傷の植物あるいはその一部を指す。この用語は、これらに限定されるわけではないが、植物全体、植物細胞、植物組織、植物の種子、プロトプラスト、カルス、培養細胞、構造的及び／又は機能的単位によりまとめられる植物細胞のグループをも包含する。上に列記、もしくはこの定義に包含される特定の種類の植物組織のいかなるものと、「アラビドプシス」という用語を組み合わせて用いても、又は組み合わせずに用いても、他の種類の植物組織を排除する意図があるわけではない。
【００３５】
ここで使用される「植物細胞」とは、植物組織の植物細胞、培養した植物組織と植物細胞とプロトプラスト、又は、単離若しくはなかば単離された細胞を含むものである。「植物組織」とは、分化及び未分化の植物組織をも包み、これらに限定されるわけではないが、根、地上部、葉、花粉、種子、腫瘍組織を含み、また、単細胞、プロトプラスト、胚若しくはカルスの細胞等の培養された細胞のいろいろな形態を含む。植物組織とは、植物体もしくは器官の組織であってもよく、組織もしくは培養細胞であってもよい。
【００３６】
ここで使用される「植物材料」とは、それを処理した派生物をも含み、これらに限定されるわけではないが、食品、食料品、食品添加物、エキス、濃縮物、錠剤、飴、チュアブル組成物、粉末、調合乳、シロップ、キャンディー、ウエハース、カプセル、又はタブレットをも含む。
【００３７】
「スクリーニング」とは一般に、植物へ形質転換された組換え遺伝子を発現している細胞を同定することを指す。たいてい、スクリーニングは、植物の更なる栽培及び（例えば、トランスジェニック植物の生産のための）植物の発生のために、うまく形質転換した種子（例えば、トランスジェニック種子）を選抜することにより実行されるものである。以下に述べるように、形質転換体を選抜する能力を高めるために、目的の組換え遺伝子に加えて、または単独で、選択可能な又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子を用いることが望まれるかもしれない。この場合、一般的にはこののちに、細胞、種子、植物若しくは幼植物を、一つ以上の選択薬剤で処理することにより、形質転換されている可能性のある細胞、種子若しくは植物が検定されることになる、或いは、望ましいマーカー遺伝子により、細胞、種子、植物若しくは植物の組織がスクリーニングされることになる。例えば、抗生物質（例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ＢＡＳＴＡ）のような選択薬剤を含む培地上で種子もしくは幼植物を生育させるというような選択条件によって、形質転換細胞、種子もしくは植物がスクリーニングすることができ、このような選択薬剤に耐性をもつ遺伝子で形質転換された植物が形質転換の成功した植物となる。
【００３８】
ここで使用される「マルチサブユニットタンパク質」とは、一つ以上の分離したポリペプチド、又は、お互いに結合して一つの球状タンパク質となるペプチド鎖を含むタンパク質であり、この場合には、少なくとも二つの分離したポリペプチドは別の遺伝子によりコードされているものとする。好ましい側面の一つとしては、マルチサブユニットタンパク質が、少なくとも抗体の免疫学的に活性な部分からなり、それによって抗原と特異的に結合できるものである。例えば、マルチサブユニットタンパク質は抗体分子の重鎖もしくは軽鎖又はそれらの部分からなることができる。複数の抗原と結合する部分は、多価の抗体をうみだすように複数の異なる構造遺伝子にコードされることができる。
【００３９】
医薬用物質の場合には、「実質的に純粋」との用語は一般に、少なくとも９７％純粋な物質を指し、より好ましくは少なくとも９９％、さらに好ましくは少なくとも９９．９９９％純粋な物質を指す。
【００４０】
「間質液」によりとは、原形質膜（例えば細胞膜）に囲まれていない植物のあらゆる場所から得られた抽出物を意味する。この用語は、あらゆる分泌液、物質を含むものであり、明らかな細胞溶解といえるものではない処理により原形質から放出される可能性のある分子を含み、細胞内（ここで、細胞内とは細胞の内側と同意義であると定義される）ではない植物の場所もしくは空間を含むものである。この用語と同意義のものは、エキソプラズム、アポプラズム、細胞間質液、細胞外液であろう。
【００４１】
「プロモーター」という用語は、構造遺伝子の５´末端にあり、転写の開始を命令するヌクレオチド配列を意味する。一般に、プロモーター配列はその下流にある遺伝子の発現を活発化するのに必要であるが、つねに十分なものではない。異種のプロモーター／構造遺伝子の組み合わせを構築する際には、遺伝子の発現がプロモーター配列に制御されるように、構造遺伝子をプロモーターの制御下に配置する。プロモーターは、好ましくは構造遺伝子の上流に配置し、かつ、自然の状態での該プロモーターと遺伝子との間の距離と近似する距離で、プロモーターと転写開始サイトを配置する。本発明の属する技術分野において周知であるように、プロモーターの機能を失わせずに、プロモーターと転写開始サイトとの距離を多少変えることができる。本願で使用される「連結して機能する」という語の意味は、コード領域の転写がプロモーターで制御又は統御されるように、プロモーターがコード領域が結合していることである。プロモーターとコーディング領域が機能するように連結させる方法は、本発明の属する技術分野において周知である。
【００４２】
「組換え遺伝子」又は「組換え核酸」とは、形質転換される植物にとって外来の、もしくは自然には見られない、遺伝子又は核酸である。このような外来配列は、ウイルス、原核生物もしくは真核生物の配列を含む。原核生物由来の配列は、これらに限定されるわけではないが、微生物の配列（例えば、ワクチンとして投与できる抗原を生産するための配列−ウイルスの配列もこの目的のために使用することができる）がある。真核生物の配列は、哺乳動物の配列だけでなく、哺乳動物ではない真核生物、他の植物の配列さえ含むものである。好ましい側面としては、組換え遺伝子／核酸がヒトのタンパク質をコードしていることである。「組換え遺伝子」又は「組換え核酸」とは、天然に存在するもの、化学的に合成されたもの、ｃＤＮＡもしくは変異したもの、又はこれらの組み合わせであってもよい。
【００４３】
「融合タンパク質」とは、本来一つのタンパク質として発現されることはない２つ以上の異なるアミノ酸配列がペプチド結合しているものからなるタンパク質である。
【００４４】
ここで使用される「エフェクター分子」とは、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのようなアミノ酸配列を指し、これらに限定されるわけではないが、制御因子、酵素、抗体、毒素、それに類するものを含むことができる。エフェクター分子により生み出される望ましい効果の限定されない例としては、細胞増殖、細胞死、免疫反応の開始、または、検査目的で検出分子として作用すること（例えば、ＧＦＰ，ＥＧＦＰ，ＢＦＰ，ＹＦＰ、ＥＢＦＰ及びそれに類するもののような蛍光ペプチドを融合タンパクがコードできる）を含む。
【００４５】
ここで使用される「糖鎖形成が弱まった」とは、アラビドプシスの野生型の株に見られるレベルより少なくとも１０％糖鎖形成が少ないことを指す。
【００４６】
ここで使用される「栽培された」又は「栽培する」とは、アラビドプシスを種子から少なくとも葉が生産されるまで生育させることを意味する。
【００４７】
ここで使用される「検査用タンパク質」又は「検査用試薬」とは、生体分子との反応により生体分子の存在を検出するタンパク質又はポリペプチドを指す。ここで使用される「生体分子との反応」とは、生体分子との結合、生体分子の触媒、切断もしくは修飾を意味する。ひとつの側面として、検査用タンパク質もしくは試薬を、生体分子との反応により計測可能な応答が生じるように、直接もしくは間接にラベルする。本発明の検査用タンパク質／試薬の例としては、抗体又はその抗原結合断片がある。抗体は、２重鎖のものであっても、１重鎖のものであってもよい。２重鎖の抗体の場合には、抗体の鎖は別々のシストロンにコードされるか、一つのポリシストロンユニットの一部としてコードされる。
【００４８】
こで使用される「エフェクター分子」とは、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのようなアミノ酸配列を指し、これらに限定されるわけではないが、制御因子、酵素、抗体、毒素、それに類するものを含むことができる。エフェクター分子により生み出される望ましい効果の限定されない例としては、細胞増殖、細胞死、免疫反応の開始、または、検査目的で検出分子として作用すること（例えば、ＧＦＰ，ＥＧＦＰ，ＢＦＰ，ＹＦＰ、ＥＢＦＰ及びそれに類するもののような蛍光ペプチドを融合タンパクがコードできる）を含む。
【００４９】
ここで使用される「バイオマス」とは、生育区域（例えば、生育室）の特定の範囲から分離したアラビドプシスの全ての生体組織を指す。好ましくは、このバイオマスは種子を含まない組織の量である。
【００５０】
アラビドプシスの株：
アラビドプシスの株は市販のものがあり、手に入れることができる。例えば、Ｌｅｈｌｅ  Ｓｅｅｄ社（sales@arabidopsis.com）並びに、アラビドプシス生物資源センター（ABRC: The Arabidopsis Biological Resource Center）（The Ohio State University, 309 Botany&Zoology Building, 1735 Neil Avenue, Columbus, OH 43210 USA）、ノッティンガムアラビドプシス保存センター（Plant Science Division, School of Biosciences, University of Nottiingham, Sutton Bonnington Campus、Loughborough、LE12、5RD、UK）等のさまざまな保存センターから入手できる。一つの側面としては、野生型のアラビドプシスの株を以下に記載する遺伝子コンストラクト（http://www.arabidopsis.com/main/cat/seeds/wildtypes/!wl.html参照）のホストバックグラウンドとして用いることができる。このような株には、形質転換系統を選抜するためにマーカーを用いることができ、また、用いなくともよい。
【００５１】
タンパク質産物のいろいろな形態をつくるためのアラビドプシスの変異株
アラビドプシスには多くの変異系統が存在するので、生産されるタンパク質の変形態を生じさせる特定の経路が欠損した系統を得て利用することができる。アラビドプシスのゲノムは完全にシークエンスされているので、望むような効果を果たす特定の遺伝子及び経路の変異を同定もしくは単離することができ、また、つくりだすことができる。既存の好ましい変異株の例としては、タンパク質翻訳後の糖鎖修飾の活性が弱まったｃｇｌ変異体およびｍｕｒ変異体がある。このような株は、植物独特のタンパク質糖鎖修飾が省かれていることにより、ある種のタンパク質（例えば、ヒトの抗体又はヒトの糖タンパク質）の生産を促進することができる。
【００５２】
植物により生産された生物製剤の効き目、安全性、使用において、糖鎖修飾がどれほど重要な役割を果たしているのかについては未だ明らかではない。トランスジェニック植物で発現された組換えタンパク質だけでなく、植物に内在する糖タンパク質の糖鎖修飾パターンにおいても、高度の不均一性がある。この不均一性は、温度及び光のような特定の生育条件だけでなく、植物の生育段階によっても影響を受け得る。従って、本発明の一つの側面として、タンパク質、特に治療剤として用いられるタンパク質を生産するトランスジェニック植物をつくるために、ｃｇｌ、ｍｕｒ１、ｍｕｒ４変異株が用いられる。他の側面として、よりヒトに近い植物のホスト系をうみだすために、ヒトの糖転移酵素をコードする遺伝子がバックグラウンドの株に導入される。例えば、国際公開第ＷＯ００／３４，４９０号公報の記載を参照。
【００５３】
他の望ましい株は、通常の変異手法により生み出すことができる。さらに、変異した種子は市販のもの、例えばLehle Seed社（http://www.arabidopsis.com/main/cat/seeds/M2/EMS/!2e.html）から入手できる。
【００５４】
発現カセット：
本発明の好ましい実施の形態は、野生型、変異もしくは組換え種のアラビドプシスにおいて、遺伝子工学の手法により目的の遺伝子を発現させることである。このようなコンストラクトは、望みのタンパク質をコードする核酸配列と、それに連結して働くプロモーター、及び／又は、遺伝子の転写と最後のタンパク質翻訳を促進するその他の制御因子を最小限含むコンストラクトである。
【００５５】
一つの側面として、遺伝子コンストラクトは、５´から３´の向きに、プロモーター、遺伝子、ターミネーターを有するように設計される。もう一つの側面として、遺伝子コンストラクトは、一つの共通プラスミドに複数のコード領域が連結したものからなるか、あるいは、共に形質転換される複数のコード領域からなる（このような「共に形質転換されるコンストラクト」は、ここでは「遺伝子コンストラクト」という語の中にまとめて含まれる）。複数の遺伝子は、別個のシストロンにコードされていてもよく、ポリシストロンユニットの一部にコードされていてもよい。さらなる側面として、遺伝子コンストラクトは一つもしくはそれ以上のＩＲＥＳ因子を持つ。
【００５６】
タンパク質：
本発明で製造されるタンパク質にはいかなる限定も予想されないが、管理されかつ再現可能な条件である物質を生産する必要がある場合に、特に関わりが深いといえるタンパク質のカテゴリーが存在する。特に、生産の過程で実験室の基準及び有効な方法が使用されなければならないものである、あらゆる部類の医薬用及び／又は検査用タンパク質がこれに含まれるであろう。
【００５７】
これらの産物はヒトが直接摂取し、ヒトに注入し、ヒトに塗布（例えば、局部投与）に使用されるものなので、タンパク質を健康増進食品及び美容食品に利用するために発現させることもできる。医薬用途と同様に規制される必要のある獣医薬用途に使用するためにも、タンパク質を発現させることができる。しかしながら一般に、規制されるものであるか否か、又はヒトもしくは動物の消費、治療もしくは検査での使用を目的とするものであるか否かには関係なく、あらゆる型のタンパク質の大量生産にとって、本発明の方法並びに以下に記載するトランスジェニック植物及びトランスジェニック植物細胞は有用なものである。
【００５８】
生産されうる典型的なタンパク質としては、これらに限定はされるわけではないが、成長因子（例えば、インシュリン様成長因子Ｉ）、リセプター、リガンド、シグナル分子、キナーゼ、腫瘍抑制因子、血液凝固蛋白、細胞周期タンパク、テロメラーゼ、代謝タンパク質、神経細胞、心臓タンパク質、特定の病状で欠乏しているタンパク質、抗体、抗原（例えば、経口投与抗原）、耐病性を持たせるタンパク質、抗微生物タンパク質、ヒト血清アルブミン、インターフェロン、そして、サイトカインが挙げられる。
【００５９】
化学合成もしくは他の工業的プロセスのため酵素反応経路をうみだすために、一つ又はそれ以上の遺伝子によって植物を形質転換することもできる。
【００６０】
もう一つの側面として、大規模なタンパク質生産源としての利用性を高めるために、アラビドプシスが一つ又はそれ以上の遺伝子によって形質転換される。このような遺伝子としては、病気及び虫に対する耐性をアラビドプシスに与える遺伝子、及び又は、抗菌、抗微生物又は抗ウイルス活性を呈するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００６１】
一つの側面として、アラビドプシスに適したコドンとなるように設計された核酸配列が、望みのタンパク質をコードする核酸配列が選択される。アラビドプシスの使用コドンの特徴は、例えば、Wadaら著作の「Codon Usage Tabulated From The GenBank Genetic Sequence Data」（Nucleic Acids Research 19(Supp.), p.1981-1986, 1991）に記載されている。
【００６２】
さらに以下に記載するように、一つの側面として、本発明は複数の組換えタンパク質を発現させる方法を提供する。このようなタンパク質は、独立したコンストラクトを共に形質転換して発現させることができ、また、以下に述べるようにポリシストロン性発現ユニットから発現させることもできる。このようなタンパク質としては、生物学的に活性になるために複数の構造遺伝子が共に発現することを自然の状態で必要としているタンパク質を含むことができる。一つの側面として、このタンパク質は、活性になるために複数のサブユニットの組み合わせを必要とする。他の一つの側面は、このタンパク質は未成熟な形態でうまれ、活性になるためにタンパク質分解による切断又はタンパク質修飾（例えば、リン酸化、糖鎖修飾、リボシル化、アセチル化、ファルネシル化等）のようなプロセッシングを他の一つ又は複数のタンパク質により受ける。
【００６３】
このようなタンパク質の例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｔ細胞レセプター、ＭＨＣ分子、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、核酸に結合するタンパク質（例えば、複製因子、転写因子等）、酵素、アブザイム、レセプター（特に可溶性レセプター）、成長因子、細胞膜タンパク質、分化因子、ヘモグロビン様タンパク質、多量体型キナーゼ、及びそれに類するものの如きヘテロダイマー又はヘテロマルチダイマーのタンパク質がある。
【００６４】
本発明の特に好ましい側面は、発現カセットがヒトのタンパク質のコードすることである。
【００６５】
本発明の特に好ましい側面は、発現カセットが、一つ又はそれ以上のモノクローナル抗体の遺伝子をコードすることである。このような遺伝子は、ネズミ、ヒト、又は他の動物資源から得ることができる。あるいは、このような遺伝子を、例えば、抗体分子の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子のキメラもしくは修飾体のように、合成することができる。コンストラクト上のコード領域の順序（例えば、重鎖→軽鎖又は軽鎖→重鎖）は重要ではない。重鎖又は軽鎖のポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、可変重鎖または可変軽鎖のポリペプチド）はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭを産生する細胞から得ることができる。免疫グロブリンの可変領域の遺伝子をクローニングできるゲノムＤＮＡの断片を準備する方法は、本発明の属する技術分野で周知である。例えば、Herrmann et al., Method in Enzymol., 152, p180-183, 1987; Frischauf, Methods in Enzymol., 152, p199-212, 1987を参照。好ましい実施の態様は、以下に記載するように、これらの遺伝子がポリシストロンユニットの一部としてコードされていることである。
【００６６】
遺伝子は融合タンパク質をコードすることもできる。例えば、構造遺伝子はエフェクターポリペプチドをコードする配列からなることができる。ここで使用される「エフェクター分子」とは、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのようなアミノ酸配列を指し、これらに限定されるわけではないが、制御因子、酵素、抗体、毒素およびこれらに類するものを含む。エフェクター分子により生み出される望ましい効果の限定されない例としては、細胞増殖、細胞死、免疫反応の開始、又は検査目的での分子を検出（例えば、ＧＦＰ，ＥＧＦＰ，ＢＦＰ，ＹＦＰ、ＥＢＦＰ等の蛍光ペプチドを融合タンパク質がコードする）が挙げられる。さらなるもう一つの側面としては、タンパク質の安定性を向上させるアミノ酸配列、又は、タンパク質の転写を増加させるアミノ酸配列を含むタンパク質とすることもできる。例えば、遺伝子が働くように連結したプロモーターからの転写を活性化することができる転写活性化因子をタンパク質に融合させることもできる（例えば、Schwechheimer, et al., Funct. Integr. Genomics 1 (1): 35-43 (2000)を参照）。
【００６７】
制御因子：
特定のコンストラクトをうみだすのに適した制御因子は発現する組換えタンパク質の種類に基づいて選択される。一般に、２０〜４０日齢のアラビドプシスの植物組織の全てあるいはほとんどの部分において、高いレベルの発現をする能力が望まれる。
【００６８】
植物プロモーター：
使用される遺伝子コンストラクトは、すべての遺伝学的材料、並びに、プロモーター及びＩＲＥＳ因子等のようなものを含むことができる。これらの発現カセットは、特定の栄養素・薬剤の添加もしくは温度変化等のような発現を誘発する外部からの刺激を必要とすることができ、あるいはそうではなく、コードされたタンパク質を即座に、及び／又は、成長のあいだ中自発的に発現させるよう設計することができる。
【００６９】
このように、望みのタンパク質をコードする遺伝子の発現は、恒常性もしくは制御性のプロモーターによりコントロールすることができる。制御性のプロモーターは、それが植物細胞で機能するのであれば、組織特異的であってよく、成長段階により制御されてもよく、または、抑制可能もしくは誘発可能であってもよい。この制御は、時間、空間もしくは発育上のきっかけに基づくものであってもよく、環境からシグナルを受けてもよく、あるいは、誘発化学もしくは抑制化学物質により制御可能であってもよく、このような薬剤は天然由来もしくは合成されたものでよく、プロモーターは天然由来もしくは遺伝子工学的につくられたものであってもよい。プロモーターはまた、例えば二つ以上の異なる天然もしくは合成されたプロモーター由来の配列因子を用いて得られたような、キメラであってもよい。
【００７０】
好ましくは、コンストラクトで用いられるプロモーターは、高い遺伝子発現レベルを生み出すものであり、総可溶性タンパクのうちの少なくとも約０．１〜１％、より好ましくは少なくとも約１〜５％、さらに好ましくは少なくとも約５％のタンパク質の集積をもたらすのであり、そして／あるいは、細胞内液（ＩＣＦ: intercellular fluid）の抽出可能な総タンパク質のうち少なくとも約０．１％、より好ましくは少なくとも約０．５％、もっとも好ましくは少なくとも約１％をもたらすものである。
【００７１】
このプロモーターは、すべての植物組織で優先的に発現させるべきだが、最も好ましいのは、全ての葉、茎および根の組織で発現させることである。それに加えて、またはそれとは別に、プロモーターは、花および／または種子の組織で発現させるものである。本発明では、アラビドプシスのアクチン２プロモーター、ＯＣＳ（ＭＡＳ）プロモーター、及びこれらの変異形態、ＣａＭＶ３５Ｓ及びゴマノハグサモザイクウイルス３４Ｓプロモーターが好ましい。しかしながら、他の恒常性プロモーターを使用されうる。例えば、トランスジェニック植物で使用するために、いくつかの種からユビキチンプロモーターがクローニングされている（例えば、ヒマワリ（Binet et al., Plant Science, 79, 87-94, (1991)）； トウモロコシ（Christensen et al., Plant Molec. Biol., 12, 619-632, (1989)））。さらには、有用なプロモーターとして、トウモロコシ由来のＵ２及びＵ５ ｓｎＲＮＡプロモーター（Brown et al., Nucleic Acids Res., 17, 8991, (1989)）とアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーター（Dennis et al., Nucleic Acids Res., 12, 3983, (1984)）がある。
【００７２】
もう一つの側面として、制御性プロモーターは機能するように遺伝子と連結される。制御的プロモーターとしては、これらに限定されるわけではないが、（例えば、化学物質、光、温度、それに類するもののような、外部要因の利用によるような）外部影響により制御されるプロモーター、植物の制御された発育変化のような内在するきっかけによって制御されるプロモーターが挙げられる。制御性プロモーターは、特に収穫時又はそれに近いときに望みのタンパク質を高レベルで発現させるのに有用である。これは、目的のタンパク質が植物の生育を制限もしくは阻止するものであるとき、あるいは目的のタンパク質がいくぶん不安定である場合に、特に有用である。
【００７３】
異なった植物組織で導入遺伝子が発現するのをコントロールする植物プロモーターが、これらの当業者に知られている（Gasser&Fraley, Science 244:1293-99 (1989) ）。カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ）とそのＣａＭＶプロモーターの強化された誘導体（Odell et al., Nature, 3(13): 810 (1985) ）、アクチンプロモーター（McElroy et al., Plant Cell 2: 163-71 (1990) )、ＡｄｈＩプロモーター（Fromm et al., Bio/Technology 8:833-39 (1990), Kyozuka et al., Mol. Gen. Genet. 228: 40-48 (1991) ）、ユビキチンプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター、マンノピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、オクトピン合成酵素プロモーター、及びこれらの誘導体が、恒常性プロモーターとされている。制御性プロモーターは、光誘発性（例えば、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターの小サブユニット）、ヒートショックプロモーター、硝酸及び他の化学物質により誘導されるプロモーター（例えば、米国特許第５，３６４，７８０号；第５，３６４，、７８０号；及び第５，７７７，２００号を参照）として記載されている。
【００７４】
組織特異的プロモーターは、植物の特定の部位でタンパク質を発現させる理由があるときに使用される。葉に特異的なプロモーターとしては、３５Ｓエンハンサーの後に位置するＣ４ＰＰＤＫプロモーター（Sheen, 15 EMBO, 12: 3497-505 (1993) )もしくは、葉での発現に特異的なあらゆるプロモーターを挙げることができる。種子でタンパク質を発現させるためには、ｎａｐｉｎ遺伝子プロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号及び第５，６０８，１５２号）、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼプロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号及び第５，６０８，１５２号）、２Ｓアルブミンプロモーター、種子貯蔵タンパク質プロモーター、ファゼオリンプロモーター（Slightom et. al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80 :1897-901 (1983) ）、オレオシンプロモーター（Plant et al., Plant Mol. Bio. 25: 193-205 (1994); Rowley et al., 1997, Biochem.Biophys.Acta., 1345 : 1-4 (1997); 米国特許第５，６５０，５５４号；国際公開第ＷＯ９３／２０２１６号公報）、ゼインプロモーター、グルテリンプロモーター、デンプン合成酵素プロモーター、デンプン枝分かれ酵素プロモーター、これら全てが役立つものである。
【００７５】
一般に、植物で発現しうる遺伝子コンストラクトはどれでも、本発明の方法での使用に適したものである。発現させる組換えタンパク質の種類を考慮して特定のプロモーターを選択することができる。
【００７６】
エンハンサー配列などの他の制御因子も提供されうる。例えば、一つには、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子由来の多重結合性転写エンハンサーが使用される。例えば、Weigel, et al. Plant Physiol 122 (4): 1003-13 (2000)を参照。
【００７７】
ＩＲＥＳ因子：
産物をコードするＤＮＡの基本的機能区分は、プロモーターとそれに続くタンパク質をコードする領域そして次なるターミネーターであることが一般に受け入れられている。この基本的な、単一のシストロン（「モノシストロン」とも呼ばれる）形式は、どの生物で遺伝子を発現させる場合にも、ながらく標準となるものであった。たいていの真核生物ｍＲＮＡにとって従来の説であるリボゾーム−スキャニングモデルによれば、４０Ｓリボソームサブユニットが５´−キャップに結合し、ＡＵＧコドンに到達するまで、転写されない５´側配列に沿って移動する（Kozak Adv.Virus Res. 31:229-292(1986); Kozak J.Mol.Biol. 108:229-241(1989) ）。真核ｍＲＮＡの大部分は、最初のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）だけが転写される活性があるのだが、複数のコード領域のそれぞれがひとつの離れたプロモーターにより制御されずに発現するような、ポリシストロン的（Kozak Adv.Virus Res. 31:229-292(1986) ）に機能するｍＲＮＡの別のメカニズムが存在する。
【００７８】
従って、本発明の一つの側面は、ＩＲＥＳ技術を用いて転写が制御された発現カセットが提供されることである。従って本発明は、それぞれのコード領域に対する複数プロモーターを使用することに頼る遺伝子コンストラクトには限定されない。
【００７９】
ＩＲＥＳ因子は、植物細胞で活性のある、以前に報告されたもの（Atebekov et al. 国際公開第ＷＯ９８／５４３４２号公報）でも、人工的なＩＲＥＳであってもよい。複数のＩＲＥＳを有するコンストラクトのために、異なるＤＮＡ配列を有するＩＲＥＳ因子を使用することが便利であろう。最近、新しいトバモウイルスｃｒＴＭＶがオレラシア（Oleracia officinalis L.）植物から単離され、そのｃｒＴＭＶゲノムが配列決定された（６３１２ヌクレオチド）（Dorokhov et al., 332 Doklady of Russian Academy of Sciences 518-22(1993); Dorokhov et al., 350 FEBS Lett. 5-8(1994) ）。
【００８０】
典型的なトバモウイルスのＲＮＡとは異なり、ｃｒＴＭＶ ＲＮＡの３´側に最も近いＣＰ遺伝子の翻訳は、インビトロでもインプランタでも、特定の配列因子ＩＲＥＳＣＰ（Ivanov et al. Virology 232, 32-43 (1997) ）によって介される内部からのリボソーム侵入機構によって起こる。この結果は、ｃｒＴＭＶのＣＰ遺伝子の上流の１４８ヌクレオチドの領域が、インビトロ及びインビボ（プロトプラストとトランスジェニック植物）で翻訳の開始を促進するＩＲＥＳＣＰを含むことを示す。
【００８１】
最近、トバモウイルスのゲノムＲＮＡが含むＭＰ遺伝子の上流の配列が、インビトロにてキャップに依存しないやり方で、その配列が機能するように連結されたキメラｍＲＮＡから、３´側に最も近い遺伝子の発現を促進できることが明らかとなった。そのｃｒＴＭＶ ＲＮＡのＭＰ遺伝子から上流の２２８ヌクレオチドの配列（ＩＲＥＳＭＰ２２８ＣＲ）は、バイシストロン性の転写物から３´側に最も近いＧＵＳ遺伝子の翻訳を仲介した。ｃｒＴＭＶ ＲＮＡのＭＰ遺伝子の上流の７５ヌクレオチドの領域は、この２２８ヌクレオチドの配列と同じくらいなお効果があるものであった。従って、この７５ヌクレオチドの配列がＩＲＥＳＭＰ因子（ＩＲＥＳＭＰ７５ＣＲ）を含む。ｃｒＴＭＶ  ＲＮＡと同様に、トバモウイルスグループの一種のメンバー（ＴＭＶ ＵＩ）のゲノムＲＮＡの上流の７５ヌクレオチドの配列もまた、ＩＲＥＳＭＰ７５ＵＩを含むことが発見された。
【００８２】
トバモウイルスは、ピコルナウイルス及び他のウイルス及び真核生物のｍＲＮＡで示されるＩＲＥＳとは顕著に性質が異なる、中途からの翻訳開始の新しい例を提供するものである。キャップに依存しない翻訳を仲介することができるＩＲＥＳＭＰ因子はｃｒＴＭＶ ＲＮＡだけでなく、トバモウイルスグループの一種のメンバーのゲノムにも含まれる。従って、トバモウイルスグループの別のメンバーはＩＲＥＳＭＰを持っている。
【００８３】
本発明は、従って、ＩＲＥＳ及び／又はプロモーターのあらゆる組み合わせを用いたポリシストロン性の遺伝子コンストラクトの発現によるタンパク質の生産をも含むものである。
【００８４】
例とするために、二つの特定のＩＲＥＳ因子が本発明の実証として用いられる。クルーサファータバコモザイクウイルス（ｃｒＴＭＶ crucifer tobacco mosaic virus）のゲノム由来の二つのＩＲＥＳのヌクレオチド配列は：
【００８５】
ＩＲＥＳｍｐ７５ｃｒ
５´ＴＴＣＧＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＴＡＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＡＡＧＡＧＡＴＴＧＴＴＴＡＧＡＧＡＴＴＴＧＴＴＣＴＴＴＧＴＴＴＧＡＴＡ ３´（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）
【００８６】
ＩＲＥＳｃｐ１４８ｃｒ
５´ＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＴＴＣＧＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴＴＡＡＡＧＣＧＧＴＴＧＡＣＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＴＧＴＡＧＴＡＡＧＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧＴＡＣＡＧＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＴＡＣＧＣＣＧＧＴＣＣＴＧＡＴＴＣＧＴＴＴＡＡＴＴＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡ ３´
【００８７】
従って本発明の一つの側面は、内部リボソーム結合配列（ＩＲＥＳ）によりそれぞれ隔てられた転写イニシエーターと複数の構造遺伝子を、５´から３´の向きに含む組換え核酸に、直接結びつくものである。
【００８８】
ＩＲＥＳ因子からなるコンストラクトは、２００２年６月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１７９２７号にさらに記載されている。その全体はここでの言及に組み込まれる。
【００８９】
ターゲッティング配列
好ましい実施の形態は、細胞膜、細胞外空隙、または、葉緑体のようなプラスチドに例示される細胞オルガネラ、これらのような植物細胞の特定の場所を発現産物の標的とすることである。特に好ましい実施の形態は、細胞外空隙を発現産物の標的とし、細胞外液の単離から生成を可能にすることである。例えば、米国特許第６，０９６，５４６号、第６，２８４，８７５号及び国際公開第ＷＯ０，００９，７２５号公報を参照。
【００９０】
タンパク質は、ターゲッティング配列の効果により、特定の細胞内組織もしくは細胞外の場所を標的とすることができる。ある場合には、そのターゲット配列のアミノ酸配列はポリペプチドの終結部分として合成され、輸送または局在の過程の間に、あるいはその後に、プロテアーゼにより分解される。たとえば、真核生物でのタンパク質分泌経路のモデルでは、リボソームがｍＲＮＡに結合し翻訳が開始されるのに続き、新生のポリペプチド鎖が現れる。もし、それが分泌される予定のタンパク質であるならば、出現したタンパク質のアミノ末端がシグナル識別粒子（ＳＲＰ：signal recognition particle）によって識別され、ｍＲＮＡとリボソームとＳＲＰの複合体が小胞体（ＥＲ）とドッキングする間、翻訳が一時的に失速する。ドッキングの後、翻訳が再び始まりるのだが、ポリペプチド鎖が翻訳されると共にＥＲの内腔へと転移される。
【００９１】
タンパク質が翻訳された後に転移されることもありうる。しかしながら、このプロセスは、インビボでははるかに有効性が少なく、一般にはＥＲへの侵入の通常の方法とは考えられてはいない。液胞への局在もしくは分泌のために膜内システムへ向かうターゲッティングプロテインのシグナル配列は、植物と動物とで似ている。シグナルペプチドは本発明での使用のために標準の技術に従って改造する（例えば、他のどの遺伝子とも読み枠をあわせてサブクローニングするために適当な末端をつくる）ことができる。
【００９２】
ひとつの側面として、望みのタンパク質をコードする発現カセットは、望みのタンパク質をコードする配列と読み枠を合わせて結合されたシグナル配列からなる。一つの好ましい側面は、シグナル配列が遺伝子発現産物の分泌経路への移行を指示できるものであることである。
【００９３】
抗体は、普通は分泌されたタンパク質である−この分泌プロセスは成熟した抗体分子の生産に重要な役割を果たす。これを植物で成し遂げるためには、本来持っている哺乳動物のシグナルペプチドをコードする領域を持ったまま、あるいは、植物のシグナルペプチドに置き換えられた融合タンパク質として、遺伝子が合成（例えばクローニング）される。シグナルペプチドとタンパク質との融合は、タンパク質のアミノ酸の末端がヒトを宿主として生み出されたものと同じになるように植物でプロセッシングされるものであるべきである。
【００９４】
好ましい実施の形態は、カルレティキュリンタンパク質由来の分泌ターゲッティングシグナルが用いられることである。この植物シグナルペプチドは、植物のアポプラスト空間を外来タンパク質の標的とする動因となることが証明されている（例えば、Borisjuk et al., 17 Nature Biotechnology 466-69 (1999)参照）。他の植物タンパク質のシグナルペプチドも、オオムギで報告されている（α−アミラーゼ、During et al. 15 Plant Molecular Biology 287-93 (1990); Schillberg et al. 8 Transgenic Research 255-63）ように使用することができる。
【００９５】
植物の膜内システムへ向かうターゲッティングプロテインは、タンパク質のアミノ末端が正しく成熟するのに役立つものであるため、成熟体になるためにアミノ末端のプロセッシングを通常必要とするタンパク質の場合には、本発明の好ましい実施の形態となる。さらに、目的のタンパク質が追加のターゲッティング情報を有しているか、あるいは、持つように遺伝子工学的に操作された場合に、膜内システムへ向かうの特定の領域へ局在させることが実施できる（例えば、Voss et al., 1 Mol. Breeding 39-50 (1995); During et al., 15 Plant Mol. Biol. 281-93 (1990); Baum et al., 9 Mol. Plant-Microbe Interact. 382-87 (1996); DeWilde et al., 114 Plant Sci. 231-41 (1996); Ma et al., 24 Eur.J.Immunology 131-38(1994); Schouten et al., 30 Plant Mol. Biol. 781-93 (1996); Firek et al., 23 Plant Mol.Biol. 861-70 (1993); Artsaenko et al., 8 Plant J. 745-50 (1995); Conrad&Fiedler 38 Plant Mol. Biol. 101-09 (1998) ）。
【００９６】
プラスチド（例えば、葉緑体及びミトコンドリア）のようなオルガネラを標的とすることは、望ましいアミノ末端の成熟をなすために有利である。なぜなら、これらの場所のいずれかを標的とすることは、アミノ末端のシグナル配列の指示をうけ、後に分裂する結果となるからである。好ましい実施の形態は、シグナルペプチドが発現産物をプラスチド（例えば葉緑体）もしくは他の細胞内オルガネラへ誘導することである。一つの例は、アルファルファのリブロースビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットの輸送ペプチドである（Khoudi et al., 197 Gene 343-5 (1997) ）。ペルオキシソームターゲッティング配列とは、Ｃ末端ターゲッティングトリペプチドＳＫＬ（Banjoko et al., 107 Plant Physiol. 1201-08 (1995) ）のような、ペルオキシソームをタンパク質の標的とすることができる、Ｎ末端、内部、Ｃ末端のいずれかの、あらゆるペプチド配列を指す。
【００９７】
一方、核局在シグナルは通常５´末位（アミノ末端）に限定されず、いかなる周知の細胞メカニズムによってもタンパク質分解で取り除かれることはない。従って、プロセッシングという観点からは、核へのターゲッティングプロテインは望ましくないかもしれない。
【００９８】
加えて、特定の細胞内の場所を標的とすることの他の選択肢として、一つに、「エピトープタグ」及び／又は部位特異的開烈サイトを加えて融合タンパク質をつくることがある。このようなタグの有用性は、便利な精製手法を提供することにある。例えば、ストレプトアビジンに結合するために決定的なビオチンのアミノ酸配列からなる小ペプチドを、目的の遺伝子の５´末に遺伝子工学的に加えることができる。この新しく合成されたタンパク質はそののち、基本的にビオチンとストレプトアビジンの結合に基づく既知の多くの方法によって捕らえられる。もし、タンパク質から「ビオチン様」ペプチドを取り除くのが望ましいのであれば、プロテアーゼ認識サイトを含ませることも可能である。プロテアーゼ認識サイトは「エピトープタグ」配列の下流で、かつ、望むタンパク質の成熟体をコードする配列の直前に挿入することもできる。エピトープタグとプロテアーゼとしてたくさんの（Ｘａ因子、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、エンテロキナーゼ等のような）選択肢があり、好ましいサイトとプロテアーゼの選択は問題の特定のタンパクアミノ酸とＤＮＡ配列に依存するであろうことは、当業者にわかるであろう。
【００９９】
上記のように、プロモーター、エンハンサー、ＩＲＥＳ因子、そしてシグナル配列のような制御因子の選択は、一般に、発現されるタンパク質の種類に依存するであろう。例えば、一つには、ＩｇＧをつくる目的での好ましいコンストラクトのいくつかは以下のものを有するコンストラクトである：  アラビドプシスアクチン２プロモーター；  （いかなる植物の）カルレティキュリンシグナルペプチド；  ＩｇＧ重鎖遺伝子の成熟した部分；  翻訳終止シグナル；  ＩＲＥＳ（ｍｐ７５ ｃｐ１４８）；  ＢＡＲ；  転写終止およびポリアデニル化配列、並びに上記において、重鎖遺伝子が軽鎖遺伝子に置き換えられ、ＢＡＲ遺伝子がＧＦＰのようなかわりの選抜／スクリーニング遺伝子に置き換えられた同じ因子を含む２次構成物。
【０１００】
ベクター
一般に、適した発現ベクターは、トランスジェニック植物で有用であることが知られたどのベクター系であってもよい。一般に、このようなベクターは、エピソームとして、あるいは、内生の植物染色体の一部として、ベクターを安定して植物細胞内で複製するための一つ又はそれ以上の配列を含むであろう。植物染色体への組み込みを促進するための配列もまた提供されうる。いくつかの側面としては、一つの型の細胞で増幅を促進させ、別の型の細胞でタンパク質の発現を促進させるために、ことなる型の細胞由来の複製起源を与えることが望まれる。例えば、一般にタンパク質の発現は植物細胞で維持されるのだが、植物細胞の形質転換に適した量の核酸を得るために、増幅は原核細胞（例えば、細菌細胞）で行うことができる。
【０１０１】
本発明の真意は、アラビドプシス属植物へ導入する遺伝子コンストラクトの厳密な性質については特に区別がないことである、すなわち、アラビドプシスで発現しうるいかなる核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡコンストラクト）は、ウイルスに基づく発現系を含む本発明においても、適するものである。しかしながら、新しい遺伝子をアラビドプシスに形質転換して世代形成が成功した種子の有意な量を生産できるスピードにメリットとなる本発明の一つの側面として、アグロバクテリウムフローラルディップや減圧浸潤法がゲノムへ安定して組み込ませるための遺伝子導入に好ましい方法であり、それゆえに、このような手法に適したコンストラクトが特に好まれる。
【０１０２】
例えば、アグロバクテリウムを介する形質転換のために、一つの好ましいベクターはＴｉプラスミド由来のベクターである。使用しうる他の適切なベクターは、本発明の属する技術分野で知られている。植物組織及びプロトプラストを形質転換するのに適したベクターは、deFramond, A. et al., Bio/Technology 1,263(1983); An, G. et al., EMBO J. 4,277(1985);  そしてRothstein, S.J. et al., Gene 53, 153(1987)に記載されている。
【０１０３】
部位特異的なゲノムへの組み込み、及び／又は、制御された切り出し、及び又は、ゲノムへの再挿入を促進する配列もまた提供されうる。例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘシステムは、アラビドプシスゲノムのｌｏｘサイトを標的としてアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡを組み込ませるために用いることができる。部位特異的な組換え、そしてランダムでない結果が、サイレントｌｏｘ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔII）ターゲット遺伝子の活性化により優先的に選抜される。Ｃｒｅリコンビナーゼは共形質転換アプローチも用いることによって一過性で提供されうる。例えば、Vergunst, et al., Plant Mol Biol 38(3): 393-406 (1998)を参照。
【０１０４】
葉緑体の形質転換に適したベクターも使用される。クロロプラストは真核細胞内部の原核成分である。葉緑体の転写および翻訳の機構は、大腸菌と似ている（Brixey et al., 1997）ので、植物の葉緑体にて、核よりも非常に高いレベルで原核遺伝子を発現することができる。そのうえ、植物細胞は、環状プラスチドゲノム（Bendich 1987）を５０，０００コピー以上含み、これは組換え遺伝子をプラスミドのように増幅して発現レベルを高めることができる。トランスジェニック植物では葉緑体での発現が核での発現よりも百倍高い場合もある（Daniell, 国際公開第ＷＯ９９／１０５１３号公報）。
【０１０５】
従って、一つの側面として、発現カセットはクロロプラストのベクターへクローニングされる。好ましくは、発現カセットは、機能するようにクロロプラストプロモーター（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ）に連結した組換え遺伝子からなるものである。一つの側面として、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、スペクチノマイシンへの耐性を付与するアミノグリコシドアデニル転位酵素（aadA））を用いることもできる。組換え遺伝子、及び／又は、選択マーカーの下流に配置するターミネーター（例えば、光化学系II反応中心構成要素をコードする遺伝子由来のターミネーターであるｐｓｂＡ ３´領域由来のターミネーター配列のようなもの）も葉緑体のゲノムから提供されうる。ベクターは、好ましくは、相同組換えのための隣接領域としてアラビドプシスの葉緑体ゲノムを含む。
【０１０６】
＜選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子＞
選択マーカー、例えば抗生物質（例えば、カナマイシン及びヒグロマイシン、ｎｐｔII、ｈｐｔ）耐性、除草剤（グルホシネート、イミダズリノン、グリホサート、ＡＨＡＳ、ＥＰＥＰＳ）耐性又は生理マーカー（可視又は生化学的）は、核酸コンストラクトで形質転換された細胞の選別に使用される。一方、非組換え細胞（例えば、非形質転換体）は、選択された条件下で、死滅させられるか、或いは優先的には生育できない。一側面においては、選択マーカー遺伝子は耐性又は生理マーカーを備えるタンパク質をコードする遺伝子である。しかし乍ら他の側面に於いては、選択マーカー遺伝子はアンチセンス核酸をコードする遺伝子である。
【０１０７】
レポーター遺伝子は、コンストラクト中に含まれていても、或いは究極的にコンストラクトを植物細胞に輸送するベクター中に含まれていてもよい。本明細書において使用される「レポーター遺伝子」は、それが観察可能又は測定可能な表現型で発現される細胞を提供できる遺伝子であればどのような遺伝子であってももよい。
【０１０８】
レポーター遺伝子の発現は、検出可能な結果、例えば、可視的な比色、蛍光、発光、又は生化学的にアッセイし得る産物；生理機能及び増殖の差に基づいて形質転換体の選択を可能とする選択マーカー；を生じ、又は、可視的な生理学的又は生化学的特性を表示する。一般的に使用されるレポーター遺伝子として、容易に可視化され或いはアッセイし得る、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質及びその変異体又は修飾体）、ルシフェラーゼ、又はＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）が挙げられる。そのような遺伝子は、組み合わせて、又は問題とするクローンを容易に見つけることができるように、選択マーカーの代わりに使用されてもよい。一側面においては、選択マーカー遺伝子はタンパク質産物をコードする遺伝子である。
【０１０９】
選択マーカーは、そのマーカーを発現する細胞の単離を容易にする分子を包含することもできる。例えば、選択マーカーは、抗体によって認識され、親和性に基づいた精製技術又はフローサイトメトリーにより形質転換細胞を単離するのに使用される抗原をコードすることができる。レポーター遺伝子は、又、植物細胞には外来であることによって（例えば、ＰＣＲによって検出可能）検出される配列を含んでもよい。この実施態様において、レポーター遺伝子はタンパク質を発現する必要はなく、又、表現型における可視的変化をきたす必要もない。
【０１１０】
＜アラビドプシスの形質転換＞
ＤＮＡ分子を植物宿主ゲノムに運搬し組み込む方法は周知である。アラビドプシス減圧浸潤法又は浸漬法のような手法は、多量の植物体の形質転換が省スペースで可能であり、形質転換体を選別するための大量の種子を産出するので好ましい。アグロバクテリウム（による方法）は、典型的には、明確な末端（Ｔ−ＤＮＡ境界）を有する直鎖状ＤＮＡ断片（Ｔ−ＤＮＡ境界）を運搬するので、同様に好ましい方法である。マイクロインジェクション、化学的処理等、又はマイクロプロジェクタイル法若しくはバイオリスティックス（好ましくはクロロプラスト介在形質転換法）のような直接ＤＮＡを導入する形質転換法もまた有用である。組換えコンストラクトのサイズに制限がなければ、配列をコードする遺伝子は、ウイルスベクターを用いて植物体に届けられる。形質転換された植物細胞は、プロトプラスト、培養細胞、カルス組織、懸濁培養、葉、花粉或いは分裂組織の形状であってもよい。第一段階としては、発現は一過的に、即ちその後の安定した形質転換株を産生するのに使用されるコンストラクトの適合性を確立するまでの期間だけ必要である。迅速形質転換系は花の浸漬（floral dip)又は減圧浸潤法（Bechtold, et al., C.R. Acad. sci. Paris, 316 Life science 1194-99(1993)）；葉及び幼植物浸潤法（Kapila, et al., 122 Plant Science 101-108(1997)), 及びプロトプラストエレクトロポレーションを包含するが、これに制限されない。
【０１１１】
好ましい一態様に於いて、適切な遺伝子型を有するアラビドプシスの植物体は開花（flowering)まで育成される。アラビドプシスの形質転換は最も便利には発育中の花の組織をアグロバクテリウムの溶液に浸すことにより行われる。この工程は（３５日齢くらいの）微小な植物体を浸漬段階で減圧に付し、又は付すことなく行うことができる。アラビドプシス植物体はフローラルディップに付されて数週間以内に収穫でき、かつ標的の遺伝子を含有するそのＴ１植物体用に選別できる種子となる。例えば、Clough and Bent, Plant J. 16:735-43 (1998）を参照のこと。
【０１１２】
好ましい態様に於いては、その種子を１平方フィート当たり、おおよそ１０粒又はそれ以上の密度で鉢植え用土ミックス（例えば、Metromix 350)に播種し次いで形質転換できなかった植物体を死滅させるのに十分な割合でグルホシネート（glufosinate）又はホスフィノスリシン（phophinothricin）をスプレー散布することでこれは達成される。選択マーカー（この例においてはＢＡＲ）を発現しているＴ１形質転換植物体は上記処理に於いて生存し、選択試薬の散布後１〜３日以内で容易に同定可能となる。使用できる他の方法および選択可能な試薬があり、それらは本発明の範囲に包含されるものではあるが、上記方法が簡便で処理能力が高いことから好ましい。
【０１１３】
＜最適なコンストラクトの同定＞
Ｔ１植物を、成熟するまで育成し自家受粉させる。好ましい態様に於いては、目論まれた特定のタンパク質生産計画に最適な遺伝子コンストラクトを同定するためにトランジエント発現アッセイが行われる。より好ましくは、タンパク質の発現、タンパク質の修飾、タンパク質の安定性及び／又は活性の適切な性質を示すコンストラクトを選抜するために、一連のコンストラクトが並列で導入されることである。少なくとも一つのコンストラクトは野生型のタンパク質を発現するが、一方、その他の一つ又はそれ以上のコンストラクトは、ランダムに突然変異及び／又は合理的に突然変異したタンパク質を発現する。
【０１１４】
この様なコンストラクトの発現は、標的タンパク質に適当な感度を示すアッセイで評価できるし、望ましい産物の発現／活性を確認するために生き残っている形質転換Ｔ１植物体からの小量の組織を試験してもよい。そのような試験は望ましいタンパク質を最大相対量発現している植物体及び／又は特に望ましい活性又は活性レベルを有するタンパク質を発現する植物体を同定するのに用いられる。好ましい態様としては、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２５０又は少なくとも約５００のコンストラクトが並列で試験されることである。
【０１１５】
別の態様としては、植物体の小量の組織又は間質液（例えば、適当なタンパク質のサンプルを得るのに十分な）を採取し、粉砕し又は減圧浸潤法で回収して、タンパク質のレベル及び／又は活性を測定するのに適当なアッセイに付す。タンパク質のレベル／活性を評価するのに適当なアッセイであればどのようなアッセイが選択されてもよい。一つの態様としては、免疫学的アッセイ（immunoassay）が挙げられる。
【０１１６】
例えば、サンプルは、遠心分離され、タンパク質を結合させるために適当な薄膜フィルタ（例えば、ＰＶＤＦ薄膜）上にブロットされる。好ましくは、薄膜は洗浄され、次いで一次及び二次抗体存在下で培養される。一次抗体は目的のタンパク質を認識して結合し、二次抗体は一次抗体に結合する。二次抗体は典型的にはアルカリホスファターゼ酵素又は西洋わさびパーオキシダーゼ酵素に結合し、簡便な比色分析又は蛍光定量法用の基質を加えることによって検出を可能にするものである。同様に、マルチウェルプレートを用いて行われるＥＬＩＳＡアッセイは一種又はそれ以上の目的タンパク質の検出に用いることができる。このような方法は当業者には周知のものであり、検出される固有のタンパク質に応じて改変して用いられてもよい。
【０１１７】
更には、又或いは、シロイヌナズナ中の発現カセット又は「導入遺伝子」の存在を確認するために、種々のアッセイが行われてもよい。それらのアッセイは、例えばサザンブロット法、ノーザンブロット法及びＰＣＲ法等の分子生物学的アッセイ；生化学的アッセイ、酵素機能アッセイ；電気泳動アッセイ；クロマトグラフィーアッセイ；マススペクトロメトリーによって；葉又は根のアッセイ等の部分植物体アッセイによって；及び、全再生植物の表現型を解析することも含む。
【０１１８】
Ｔ２及びＴ３世代の種子も同様に、最も高生産性で最も安定な遺伝子コンストラクトを有するの植物株を同定するために選抜される。一般に、挿入された遺伝子とホモ接合の植物株を取得するのが好ましいが、通常、二世代目、三世代目を得ることによって成就、確立される。これは、メンデル遺伝学の基本原理に基づくものである。複数の遺伝子が挿入される場合で、その遺伝子が物理的にお互いにリンクされていない場合、各々の遺伝子座においてホモ接合である株をスクリーニングするにはより多くの世代を経ることになるであろう。何れの場合もアラビドプシスは、子孫形成の容易さと早さにおいて通常の作物種に較べ格段の優位性を誇る。アラビドプシスにおいては僅か８〜１０週で世代の１サイクルが完結する。個々の植物体に於いて少なくとも２００粒の種子の産生が見込まれるが、たいていこれより遙かに多く（例えば、約５００粒くらいの種子が）形成される。
【０１１９】
この様に、一態様に於いて、プロセスは階層的であり、安定した「所定の発現特性」を有する植物の最適な次世代、即ち安定した形質転換株（トランスジェニック株）を産出するためには、望ましい特性を有するコンストラクトを同定するためにまずＴ１世代をスクリーニングして、次いでそのコンストラクトを発現している最適なＴ１世代の植物体を選抜する。トランジエントアッセイが階層的手法で、即ち細胞ベースのアッセイによってまずコンストラクトをスクリーニングし次いでＴ１世代に於いて最初のアッセイで同定された最適なコンストラクトをスクリーニングするといった手法で行われてもよい。特に好ましい一態様では、植物体は、産出されたバイオマスに対して最も大量にタンパク質を発現するものを同定するためにスクリーニングされる。一態様に於いて、栽培された植物体平方フィート当たり少なくとも約５０グラム、少なくとも約１００グラム、少なくとも約１５０グラム、少なくとも約２００グラムのバイオマスを産生する植物体の株が同定される。
【０１２０】
＜タンパク質の大規模生産＞
一態様に於いて、少なくとも一つの遺伝子コンストラクト含む多様なアラビドプシス種が植物性及び葉性バイオマス（vegetative and leafy biomass）の産生を促進する条件下で育成される。つまり、強健な葉系を有し、成熟した種子が形成される前に収穫される健全な植物体のことである。産生規模拡大（scale-up）の目的で、ある一定量の安定な形質転換植物体が各植物体当たり少なくとも約２００個の種子を取得できる様な好条件下で栽培される。次いで、アラビドプシス（種子又は成熟した植物体）は収穫され一つ又はそれ以上の目的のタンパク質が収穫された植物体から分離される。複数の（multiple）組換えタンパク質が産生される場合、これらは個々のタンパク質として又は複数サブユニット複合体（multi-subunit complexes)として産生される。好ましくは、この様な複数サブユニット複合体は集合されたものとして機能する。
【０１２１】
本発明の大規模生産に用いられるアラビドプシス株は、公知の量のタンパク質を公知のレベル／タイプの活性及び公知の修飾パターン（改変型）で発現する。同様に、植物自体の生物学的な特徴は公知のものである（例えば、特にタンパク質の安定性、ターゲティング、修飾等に影響する特徴）。この様に、従来の技術においてアラビドプシスを用いる方法とは対照的に、大規模タンパク質産生においては、事前に設定、選択されているアラビドプシス及び発現系には、「所定の発現特性」が備えられている。これは、前記のトランジエント発現アッセイによって発現するタンパク質の性質、発現の度合い、植物体又は植物細胞内（葉、根、植物全体、アポプラスト、ＥＲ、クロロプラスト）に於ける発現点、好ましい条件、好ましい発現ベクター、産出高（収穫高）等が予め決定されていることを意味している。
【０１２２】
例えば、大規模に栽培されるアラビドプシスの特定の株について言えば、この種のアラビドプシスは、植裁後の所定の日に収穫され、また特定の条件下で栽培されたとすれば、おおよそ予測可能な量の外来／異種タンパク質を発現することがわかっている。少なくとも一つの対象タンパク質のバイオマスを産生するアラビドプシスの大規模栽培のために、所定の発現特性を有する植物体又は種子が提供される。
【０１２３】
この特性は時、場所、収穫高及び諸条件等の要因に対するグロース（growth）の考察によって最も良く説明される。しかしながら、例えば時と場所は計測可能であるから、限定されることなしに、例証となるものを一セットで選ぶのが最もよい。よって、単層の植物体生育培地（天然の土壌、市販の及び人工の土壌、水耕培地）を有する２０フィート四方（２０ feet×２０ feet）の植物体生育室又は生育部屋を一考されたい。本発明に於いて「植物体生育室（plant growth chamber)」という用語は自然光、水等から完全に遮断されることができればどのようなタイプのスペースをも含み、又は自然の太陽光、雨等に曝される量を多様に変えることができる温室であってもよい。この用語は更に、２０フィート四方（２０'×２０'）の水耕栽培又は従来の土壌ベースでの耕作で使用されているような露天の又は覆われた栽培地をも包含する。
【０１２４】
一態様において、アラビドプシスは植物性及び葉性バイオマスの産生を促進する条件下で栽培される。好ましくは、植物体は約８〜１０時間、日光又は生育に適した光線に曝され、約１８℃〜約２４℃の間の温度で保たれる。育成培地は旺盛な発育を促進するのに十分な栄養（肥料）（例えば、Miracle Grow印の植物用肥料又はその他の類似品）を施される。土壌栽培の場合、これは湿り気を保つための給水を底からやることにより最もよく達成される。しかし生育過程を通して過剰に飽和した土壌とならないようにする。
【０１２５】
本発明の一態様によれば、植物体生育室には、上記の条件下で少なくとの一種の目的のタンパク質を発現する、少なくとも一つの発現カセットを含む単一種のアラビドプシスが植えられている。実際に、植物種とカセットの組合せは、発現したタンパク質の識別ができるように、また発現の程度も妥当な概算ができるくらいに、予め試験され特徴付けられているので、生育室当たりのアラビドプシスの所定の収穫量に基づいて（タンパク質の）産出高の見積が可能である。
【０１２６】
好適に定められた条件下で栽培される植物は、植えてから約３０〜８０日で、より好ましくは４０〜７０日で、最も好ましくは約４５〜６０日の間に収穫されるのが理想的である。最適な収穫の日数は通常、標的タンパク質のために最適なアラビドプシスの宿主種、最適な発現カセット及び最適なバイオマスからのタンパク質収率を決定する初期の段階で予め決められている。一般的には、目安の収穫日は総状花序が現れる頃又はその頃から種子形成の少し前まで及びその頃までである。これが収穫できる葉及び根のバイオマスの量を最大にすることを許容するので、この時間窓が目標とされている。
【０１２７】
更に成長させれば結果的により多くの植物体バイオマスを産出することができるが、これらの組織（茎、花、種のさや及び種子）は通常、アラビドプシスからの工業用大規模タンパク質生産の目的のため、意図された対象組織ではない。それ故、好ましくは、有用なタンパク質産物を提供するために、最大量のバイオマスが産生されればよく、通常それ以上は必要ない。
【０１２８】
その後も、同じ望ましいタンパク質又は複数のタンパク質を発現して、ほぼ同量の当該タンパク質を産出するよう意図された同じ発現系を有する同種の追加の植物体が、同じか又は似かよったスペースに栽植される。これを、月又は年単位の一定の期間内に約２、３、４、５回又はそれ以上繰り返し行うことができる。それぞれの裁植／収穫のサイクル後に、目的のタンパク質は、例えば薬剤向けの使用に適する実質的に純粋なタンパク質を得るために、得られたバイオマスから分離される。研究目的でのアラビドプシスの使用とは対照的に、相同植物（即ち、最適のコンストラクトを発現している植物体の安定な形質転換株からの種子）は、そのような植物体からバイオマスを得るため、また特徴付けされたタンパク質産物を単離するために、何度となく繰り返し栽培される。好ましくは、種子は迅速に（例えば約８〜１０週未満で）産生されるのがよい。
【０１２９】
アラビドプシスの独自の形態はバイオマス産出量を最大化すべくスペースの効率的な活用をも可能にする。アラビドプシスはロゼット葉の展開を促進する小規模でコンパクトな成長形態を有している。約５〜８週の内に、播種密度１０〜１５粒／ｆｔ２で１平方フィートの総表面が、栽培基質表面からおよそ２〜５センチに成長した葉の密集したマットで完全に覆われる。この時期に根の形状でも、ほぼ同量のバイオマスが産生されている。この段階では植物体の背丈の成長が遅いので、植物体を栽培する棚を縦に何段も（即ち、少なくとも約２段、少なくとも約３段、少なくとも約４段、少なくとも約５段、少なくとも約６段、少なくとも約７段、少なくとも約８段、少なくとも約９段、少なくとも約１０段）上に積み重ねることができる。これに対して、種子の供給を増量する必要が生じた場合、これは、より好適な光レジム（regimes）のもとで植物を生育し、そして花ボルトが生じるのに十分な空間を準備することによって容易に成就させることができる。一般に、播種から次の種子の収穫までに約８〜１０週かかり、その各植物から少なくとも数百の種子を産出する。
【０１３０】
上記の通り、通常、本発明によれば、２０フィート四方（２０'×２０'）の生育室の一室で、栽培／収穫の１サイクルで栽培されたアラビドプシスを収穫して回収した可溶性タンパク質の総重量の少なくとも０．１％、好ましくは少なくとも０．５％、より好ましくは１％又はそれ以上の望ましいタンパク質を産出する。
【０１３１】
もう一つの計測方法で言えば、２０フィート四方（２０'×２０'）の生育室一室から好ましくは、少なくとの約１ｇｍ（例えば、１００ｇ／ｆｔ２×４００ｆｔ２×６層×１０ｇタンパク質／１０００ｇバイオマス×０．１％の総タンパク質中の望ましいタンパク質＝２．４ｇｍ）の望ましいタンパク質が産生されるが、より好ましくは、少なくとも約５ｇｍ、そしてさらに好ましくは、少なくとも約１０ｇの望ましい目的のタンパク質が産生される。より好ましくは、少なくとも約５００ｍｇ、１ｇｍ、２．５ｇｍ、５ｇｍ、７ｇｍ、８ｇｍ、９ｇｍ、又は少なくとも約１０ｇの組換えタンパク質が産生される。
【０１３２】
タンパク質のこれらの生産量は絶対的なものであり、即ち時間に非依存性である。言うならば、所定の生育室は望ましいレベルの標的タンパク質が産生されるまで何度も繰り返し使用される。このような条件下では、例えば、年一回の栽培で１ｇのタンパク質が産生され、その回収された可溶性の総タンパク質の１％超の標的タンパク質を得るか、又は１サイクルが３５〜４５日間の裁植／収穫のサイクルを８〜１０回繰り返して、年間のほぼ同期間中にわたって、かなり低濃度で標的タンパク質を産出するかどうかは重要なことではない。
【０１３３】
アラビドプシスが望ましい条件以下の条件で栽培された場合、収穫窓（harvesting window）をある程度修正することになるであろう。例えば、２５℃より高い温度では、３５日目から収穫し始めてもよいかもしれない。温度が２０℃を下回れば、一般的には葉の産生には有利に働くかもしれないが、植物体全体としてはストレスとなって相対的にかなり非生産的なものとなるであろう。
【０１３４】
あらかじめ注記した通り、上記で考察した要素のいくつかは拡張可能である。総収率は多数の要因の関数であって、その要因には例えば、植物体の裁植密集度、育生継続の許容範囲、所定のスペースで所定の期間、例えば１年間の裁植と収穫のサイクル数、所定の植物体に発現したタンパク質の量等が含まれるがこれらに限定はされない。しかしまた、裁植の範囲はタンパク質の最終収率に大きな役割を果たす。前述の例では、単層の裁植可能な面として２０フィート四方（２０フィート×２０フィート）の栽培面積を持つ生育室を考えた。しかし一般的に生育室又は温室では、段状の層又は多層のカートと言った所定のスペースに２又はそれ以上の個別の層を積み重ねることが可能である。よって収率は所定のスペースに植えられた層の数に乗じたものとなる。好ましくは、生育室には植物を植える層が少なくとも約２層あって、少なくともその一部分が、種子ではないバイオマス用に栽培されるのがよい。
【０１３５】
収率は平方フィート換算の面積比で求められる。例えば、１年間で４ｇの標的タンパク質が単層の栽培培地を有する２０フィート四方（２０'×２０'）の生育室で産生されたとすると、その年の収率は４ｇ／４００平方フィート／年で求められる。植栽が数エーカーに及んだとしても、収率は平均で４００平方フィートベースで考えたとき、ほぼ同じになるはずである。総裁植面積が８００平方フィートで、可溶性の総タンパク質から現実に単離されたタンパク質の総量が同じ年に８ｇであるという仮定で、同じ生育室で２層で裁植がなされたとすれば、同様の計測方法がまた用いられる。比率はやはり年間４００平方フィート当たり４ｇとなる。最小及び最大作付け面積は、即ち室数、土地等の利用できるスペース、品種による実質的な収率、選択された発現カセット系、必要なタンパク質の総希望量、もしあれば時間的制約といった多くの要素で決定される。短期間でより多くのタンパク質が必要とされる場合、より広い作付け面積及び／又はより多くの植裁／収穫サイクルが必要である。あるいは、より効率的な発現系の開発が必要であろう。
【０１３６】
最小の作付けスペースは少なくとも年間１００ｍｇの望ましいタンパク質を提供するもので、より好ましくは年間少なくとも約３００ｍｇの望ましいタンパク質、更に好ましくは年間少なくとも約５００ｍｇの望ましいタンパク質、更に好ましくは年間少なくとも約７００ｍｇの望ましいタンパク質、もっとも好ましくは年間少なくとも約１ｇ又はそれ以上の望ましいタンパク質を提供するものである。本明細書で挙げられる例（２０'×２０'の生育室）は基準を示すものである。過程のすべての局面は、所定量の特定の産物を産出するために、スペースと時間の観点からで計測できる。スペースと時間の局面は、いずれの特定のアラビドプシスの宿主株におけるいずれの特定のタンパク質のパーセント収率に基づいて、肯定的にも又は否定的にも影響する。
【０１３７】
２０フィート四方（２０'×２０'）程度の部屋でさえも、植物体を収穫するための自動化された又はある程度自動化された方法が導入されることが好まれる。実際の栽培基質（土壌に対して水耕）によって好まれるシステムがある。収穫したばかりの大量の生の植物組織からのタンパク質の精製は、その数例が米国特許番号６，０９６，５４６号、国際公開第ＷＯ００００９２７５号公報，及び国際公開第ＷＯ０９９４６２８８号公報のタンパク質の精製に見られるような多くの方法によって成される。
【０１３８】
アラビドプシスは培養室及び温室の条件に影響されて成長する。光の強さ及び昼間の時間の長さ等の栽培条件を花の発育への転換に対して葉のバイオマスの産生に有利になるように改変することもできる。一般的に、昼間の時間が短めであれば（８〜１０時間）、より多くの葉を産する表現型に有利に働き、昼間の時間がより長くなれば（＞１２時間）花と種子の発育を促進する。栽培温度も形態形成に影響し、低温での育成は葉の成長に有利に働く。従って一般的には、昼間の長さ１２〜１４時間で栽培温度２４℃〜２５℃がより早期の成熟と種子の産生を促すのに較べて、昼間の長さが８〜１０時間で栽培温度が２０℃〜２３℃であれば、葉性の植物体の成長を促す。一方、アラビドプシスは種子の増率においてはかなり多産であるが、その種子が極めて微小であることから、タンパク質（の産生）にとっては望ましい収穫物ではない。本研究において、望ましいタンパク質が発現し、植物体の葉性部分（種子にも発現はするが）から単離される。
【０１３９】
一態様に於いては、植物体は２インチ丈の栽培層でメトロミックス（Metromix）３５０に植えられ３５日間、２５℃、昼間の長さ（日照時間）１０時間で栽培される。１平方フィート当たり植物体１０〜１５本の播種密度で、１平方フィート当たり生の植物体で総重量１００〜１５０ｇの産生が容易である。そのおよそ１グラムが可溶性タンパク質の総量である。いかなる特定の遺伝子導入産物に対する相対的な発現レベルは、総可溶性タンパク質の少なくとも約０．１〜１％レベルで達成される。望ましい組換えタンパク質は、バイオマスとして単離される総可溶性タンパク質の、好ましくは少なくとも約１〜５％、そしてより好ましくは５％より多いことである。工業用の大規模生産目的としては、１００平方フィートのアラビドプシスの幼植物からミリグラム、好ましくはグラム量の純粋なタンパク質を得ることである。一方、アラビドプシスは背丈はあまり高くないが葉のバイオマスに真価がある。本研究は、高密度栽培に利用される場合に於いて、スペース、時間、エネルギー、植物の成長に必要な投入物の総量に対して大変満足できるバイオマス総産出高を期待できることを実証するものである。
【０１４０】
本発明は、タンパク質の大規模産生のためのアラビドプシスタリアナ植物の使用を明確にするもので、特に、製薬及び診断用の試薬といった規制された分野での使用に適する条件下に産生されるタンパク質をも包含する。
【０１４１】
＜タンパク質の単離＞
栽培後、バイオマスは収穫され、組換えタンパク質を回収する。この収穫ステップは、全植物、或いは植物の葉、又は根又は細胞のみを収穫することを含む。このステップは、植物を死滅させるか、或いは、もし組換え植物の部分が収穫されるだけなら、植物の残りは生育を続けさせることができる。しかし、好ましくは、栽培ゾーン（即ち、区域（area）若しくは温室等の生育室）で栽培される、種子も含めて全植物の組織を含む全バイオマスの少なくとも一部分が収穫される。残りの部分は再裁植のための採種用に付され、採種後の植物はさらに継続して育成されてもよいし若しくは組換えタンパク質を回収するため集められるバイオマスに加えることもできる。
【０１４２】
収穫後、タンパク質の単離が、当該技術における常法を使用して実施される。例えば、少なくともバイオマスの一部分が、ホモジナイズされ、組換えタンパク質が抽出され、更に精製される。抽出は、ホモジネートを適切な溶媒に液浸又は浸漬することを含む。上記考察のように、タンパク質は、例えば、米国特許第６，２８４，８７５号に記載されているように、減圧浸潤法によって植物の組織液（interstitial fluids）から単離することもできる。
【０１４３】
精製方法は、免疫親和性精製、及びタンパク質／タンパク質複合体の特異的な大きさ、電気泳動の移動度、生物活性、及び／又は単離される組換えタンパク質の実効電荷又はタンパク質におけるタグ分子の存在に基づいた精製手順を包含するが、これらに限定されるものではない。
【０１４４】
しかしながら、一態様に於いては、組換えタンパク質が単離されるのではなく、動物（例えば、人間のような）に経口投与するために、バイオマスの画分が得られる。そのような画分は錠剤、カプセル、ペレット及び懸濁液（例えば、ドリンク、シロップ等の形態で）の形態で提供されてもよいが、これらに限定されるものではない。つまり一つの局面においては、アラビドプシスの細胞又は細胞の画分を動物に経口投与する方法を包含する。
【０１４５】
＜医薬組成物＞
シロイヌナズナから単離される組換えタンパク質は病気の予防又は治療法に、その栄養価の面で、栄養補助剤（サプリメント）として、化粧品として、抗菌剤として、望ましい免疫応答を引き出すため（例えば、ワクチンとして）等に利用される。
【０１４６】
本発明の一態様において、シロイヌナズナから得られた組換えタンパク質やその生物学的に活性な断片は医薬組成物に製剤される。医薬組成物は、好ましくは、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、乳(濁)液であって、生理的に許容できる担体（即ち、活性成分の働きを妨げない非毒性の原料）を含有するもので、より好ましくは、非発熱性で、ウイルスや細菌類のいないものである。当業者に周知の適当な担体であれば、どのようなものを使用してもよい。代表的な担体としては、生理食塩水、ゼラチン、水、アルコール、天然又は合成オイル、糖液、グリコール、オレイン酸エチルと言った注射可能な有機エステル類又はこれらの組み合わせが挙げられるが、それに制限されるわけではない。また、医薬組成物は更に、保存料及び／又は、例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤及び／又は不活性ガス類といった添加物、及び／又はその他の活性成分を含んでいてもよい。
【０１４７】
投与の経路及び頻度、また用量も患者によって、予防若しくは治療の状況、又は享受できる利益（例えば、栄養補助剤として与えれた際の）によって異なる。一般的に、医薬組成物は静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、局所投与、吸入等によって投与するが、厳密な投与方法が限定されているわけではない。組換えタンパク質又はその活性断片の効果的な用量が投与されるのである。
【０１４８】
本明細書中に用いられる「効果的な用量」とは、患者の病状に改善がみられるのに十分な量又は患者に十分な利益を与え得る量である。この様な改善又は利益は、従来技術で周知の適切な臨床的又は生化学的結果を監視することによって検出できる。一般的には、組換えタンパク質の用量はホストの１ｋｇ当たり約１μｇから約１００ｍｇの範囲である。適当な用量サイズは患者の大きさ（サイズ）によて変わるが、通常は１０から６０ｋｇの動物に対して約１０ｍＬから約５００ｍＬの範囲である。患者は、ヒト又は家畜等の哺乳動物である。
【０１４９】
本明細書に引用された特許及び非特許文献は、本発明に関係する当業者の技術水準を表すものである。これらの全ての文献及び特許出願は、あたかも、個々の文献又は特許出願が、本明細書に参照することによってとり入れられているように特異的に且つ個別に示されているのと同じ程度に、参照することによって、本明細書にとり入れられている。
【０１５０】
当業者であれば、本明細書に記載された常法の実験以上のものの使用がないこと、特定の物質及び手順の多くの均等物を認識又は確認できるであろう。そのような均等物は本発明の範囲内にあると考えられ、そして前述の特許請求の範囲内にある。
【０１５１】
本発明は本明細書において特別の態様について記載されているが、これらの態様は単に本発明の原理及び応用を説明しているものであると理解するべきである。よって、説明のための態様に於いては多くの修正がなされてもよく、またその他の処理は本発明の特許請求の範囲で定義されている本発明の精神と範囲を逸脱することなく講じられてもよいことを理解されたい。
【配列表】
2005510207000001.app