(57)【要約】【課題】本発明はヒアルロン酸生産菌株ストレプトコッカス属ＫＬ０１８８及びヒアルロン酸の精製方法に関し、より詳しくはヒアルロニダーゼを発現せず、非溶血性菌株であるストレプトコッカス属ＫＬ０１８８及び芳香族吸着樹脂と活性炭を利用したヒアルロン酸の精製方法に関する。【解決手段】ストレプトコッカス属ＫＬ０１８８（ＫＣＴＣ１０２４８ＢＰ）を用い、このストレプトコッカス属ＫＬ０１８８の培養液を芳香族系吸着樹脂及び活性炭で処理し、有機溶媒で沈殿させてヒアルロン酸及びその塩を精製する工程を含んだ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロニダーゼ酵素を発現せず、非溶血性を示すヒアルロン酸産生微生物菌株ストレプトコッカス属ＫＬ０１８８（ＫＣＴＣ）。
【請求項２】
請求項１に記載のストレプトコッカス属ＫＬ０１８８（ＫＣＴＣ１０２４８ＢＰ）の培養液を芳香族系吸着樹脂及び活性炭で処理し、有機溶媒で沈殿させてヒアルロン酸及びその塩を精製する工程を含むヒアルロン酸の精製方法。
【請求項３】
前記芳香族系吸着樹脂は、ＨＰ１０、ＨＰ２０、ＨＰ２１、ＨＰ３０、ＳＰ８００、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ８７５、ＳＰ２０５、ＳＰ２０６及びＳＰ２０７からなる群より選択される一種である、請求項２に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項４】
前記精製方法は、
（ａ）前記ヒアルロン酸産生微生物菌株培養液から培養濾液を製造する工程と、
（ｂ）前記培養濾液に芳香族系吸着樹脂を加えて攪拌及び限外濾過して発熱性物質が除去されたヒアルロン酸水溶液を製造する工程と、
（ｃ）前記ヒアルロン酸水溶液に有機溶媒を加えてヒアルロン酸及びその塩を沈殿させ、これを乾燥する工程と、を有し、
前記（ａ）工程または（ｃ）工程後に、前記培養濾液または前記ヒアルロン酸水溶液に活性炭を加えて攪拌した後、活性炭を除去する工程と、を含む、請求項２に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法で精製されたヒアルロン酸及びその塩。
【請求項６】
ヒアルロン酸産生微生物菌株培養液を芳香族系吸着樹脂及び活性炭で処理し、有機溶媒で沈殿させてヒアルロン酸及びその塩を精製する工程を含む、ヒアルロン酸の精製方法。
【請求項７】
前記芳香族系吸着樹脂はスチレンとジビニルベンゼンの共重合体または臭素化ポリスチレンである、請求項６に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項８】
前記芳香族系吸着樹脂はＨＰ１０、ＨＰ２０、ＨＰ２１、ＨＰ３０、ＳＰ８００、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ８７５、ＳＰ２０５、ＳＰ２０６及びＳＰ２０７からなる群より選択される一種である請求項６に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項９】
前記精製方法は、
（ａ）前記ヒアルロン酸産生微生物菌株培養液から培養濾液を製造する工程と、
（ｂ）前記培養濾液に芳香族系吸着樹脂を加えて攪拌及び限外濾過して発熱性物質が除去されたヒアルロン酸水溶液を製造する工程と、
（ｃ）前記ヒアルロン酸水溶液に有機溶媒を加えてヒアルロン酸及びその塩を沈殿させ、これを乾燥する工程と、を有し、
前記（ａ）工程または（ｃ）工程後に、前記培養濾液または前記ヒアルロン酸水溶液に活性炭を加えて攪拌した後、活性炭を除去する工程と、を含む、請求項６に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１０】
前記ヒアルロン酸産生微生物菌株は、ストレプトコッカス属菌株である、請求項６に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸産生微生物菌株及びヒアルロン酸の精製方法に関し、より詳しくはストレプトコッカス属ＫＬ０１８８及び芳香族系吸着樹脂と活性炭を利用したヒアルロン酸の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、分子量が５０，０００乃至は１３，０００，０００Ｄａである無色の高粘度多糖類であって、反復単位であるグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンが（１−３）位と（１−４）位に交互に結合している。ヒアルロン酸は保湿効果を有し、物理的摩擦に対する潤滑効果及び細菌などの侵入に対する保護効果が優れている。ヒアルロン酸は化粧品添加剤、関節炎治療剤、眼科手術用手術補助剤及び外科手術後の癒着阻止剤などとして広範囲に使用される。このようなヒアルロン酸は牛の眼球、鶏冠、動物の緩衝組織、胎盤、癌細胞及び皮膚などに多量含まれている。
【０００３】
ヒアルロン酸の収得方法は、前記の生体組織から抽出したり（米国特許第４，１４１，９７３及び米国特許第４，３０３，６７６）、微生物を培養して発酵産物として回収する方法がある。しかし、抽出方法により得られたヒアルロン酸には、コンドロイチンサルフェート、グリコサミノグリカンサルフェートなどの不純物が含有され、これらを除去するには複雑な精製過程を要するため、生産費が高価である。これに対し、微生物を利用したヒアルロン酸の生産は相対的に生産費が安く、高分子量のヒアルロン酸を比較的に簡単な方法で収得することができる（特開昭５８−０５６６９２号公報及び米国特許第８６−０００６６号）。
【０００４】
ヒアルロン酸生産に使用される微生物としては、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ディスガラクチアエ、ストレプトコッカス・ズエピデミカス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・エクイシミリスなどがある。これらはバージー（Ｂｅｒｇｙ’ｓ）便覧によれば、ランスフィールド血清群ＡまたはＣタイプに属する。このような微生物は溶血性を有する連鎖球菌で、β−溶血作用を有することが報告されている。
【０００５】
ストレプトコッカス属微生物を利用して生産されたヒアルロン酸（日本特開昭５８−５６６９２２、米国特許公開６０−５００９９７、大韓民国特許登録１０−２５０５７３、大韓民国特許公開１０−２５０５７３）は平均分子量が３００，０００乃至３，５００，０００Ｄａで比較的小さいため、医薬用治療剤及び補助剤として使用することが難しく、化粧品用途として使用するのには保湿力が低いという短所がある。また、米国特許第６，０９０，５９６号では分子量が６，３００，０００乃至９，５００，０００Ｄａの高分子量ヒアルロン酸を生産する方法を開示したが、ヒアルロン酸の生産性が培養液１Ｌ当り０．３５ｇで非常に低い水準である。
【０００６】
微生物を利用したヒアルロン酸生産方法で、ヒアルロン酸の分離及び精製方法に関する公知技術は下記の通りである。
【０００７】
米国特許第４，１５７，２９６号はストレプトコッカスピオネス培養液をトリクロロ酢酸で処理して菌株を除去した後、有機溶媒を利用した沈殿方法によってヒアルロン酸を精製する方法を開示している。しかし、有機溶媒を利用した沈殿方法は数回の反復的な操作が要求されるため、相対的に多くの費用と時間を要する短所がある。
【０００８】
米国特許第４，７８２，０４６号では、ストレプトコッカスエクイ培養液に０．０１％陰イオン界面活性剤である硫酸ラウリルを入れて細胞壁に付着しているヒアルロン酸を分離し、非イオン界面活性剤であるヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを入れてヒアルロン酸沈殿物を作った後、アルコールを添加して沈殿させることにより精製する方法を開示している。
【０００９】
米国特許第４，７８４，９９０号では、ストレプトコッカスズエピデミカス培養液にエタノールを添加して、微生物からヒアルロン酸を分離した後、塩化セチルピリジニウムを添加して沈殿させることにより精製する方法を開示している。
【００１０】
特開昭６３−０１２２９３号では、ヒアルロン酸を含有する溶液をマクロレチキュラー（ｍａｃｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ）陰イオン交換樹脂（Ｄｉａｎｉｏｎ  ＨＰＡ−２５、ＨＰＡ−７５、ＩＲＡ−９００、ＩＲＡ−９０４）で処理して分子量１，５００，０００Ｄａ以下の低分子量ヒアルロン酸と発熱性物質を除去する方法を開示している。
【００１１】
日本特開平１３−１３１５０３号では、ヒアルロン酸含有液をアルミナまたはシリカゲルなどで処理して発熱性物質、蛋白質、核酸、金属不純物などを除去し、有機溶媒を添加して沈殿させることにより精製する方法を開示している。
【００１２】
日本特開平０６−１９９６５６号では、ヒアルロン酸を含有する溶液をｐＨ６乃至ｐＨ１０の溶液上で帯電させた膜濾過器を通過させて発熱性物質を除去し、アルコールを添加して沈殿させることにより精製する方法を開示している。
【００１３】
大韓民国特許公開１９９４−２４７８号ではヒアルロン酸産生微生物菌株培養液に亜鉛アルミネート粉末を加えてヒアルロン酸を精製する方法を記載している。
【００１４】
また、大韓民国特許公開１９９７−４２６０３号ではヒアルロン酸を含有する溶液を疎水性ポリマー（ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリスチレン）で処理した後、活性アルミナを添加してアルコールを添加して沈殿させることにより精製する方法を開示している。
【００１５】
しかしこれらの方法は、処理工程が複雑であるため生産原価を上昇させる要因として作用するだけでなく、発熱性物質、蛋白質及び核酸などの不純物を完全に除去することが困難である。
【特許文献１】米国特許第４，１４１，９７３号
【特許文献２】米国特許第４，３０３，６７６号
【特許文献３】特開昭５８−０５６６９２号公報
【特許文献４】米国特許第８６−０００６６号
【特許文献５】特開昭５８−５６６９２２号公報
【特許文献６】米国特許出願公開第６０−５００９９７号公報
【特許文献７】大韓民国特許登録１０−２５０５７３号
【特許文献８】大韓民国特許公開１０−２５０５７３号
【特許文献９】特開昭５８−５６６９２２号公報
【特許文献１０】米国特許第６，０９０，５９６号
【特許文献１１】米国特許第４，１５７，２９６号
【特許文献１２】米国特許第４，７８２，０４６号
【特許文献１３】米国特許第４，７８４，９９０号
【特許文献１４】特開昭６３−０１２２９３号公報
【特許文献１５】特開平１３−１３１５０３号公報
【特許文献１６】特開平０６−１９９６５６号公報
【特許文献１７】大韓民国特許公開１９９４−２４７８号
【特許文献１８】大韓民国特許公開１９９７−４２６０３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、高分子量のヒアルロン酸を高収率で生産することができる菌株を提供することを目的とする。
【００１７】
また本発明は、ヒアルロニダーゼ酵素を発現せず、非溶血性を有するヒアルロン酸産生微生物菌株を提供することを目的とする。
【００１８】
また本発明は、非溶血性菌株から生産及び純粋精製された高分子量のヒアルロン酸を提供することを目的とする。
【００１９】
また、本発明は微生物から生産されるヒアルロン酸を精製する方法において、発熱性物質を容易に除去し、ヒアルロン酸を高純度で分離することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記目的を達成するために本発明は、ヒアルロニダーゼ酵素を発現せず、非溶血性を示すヒアルロン酸産生微生物菌株ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＫＬ０１８８（ＫＣＴＣ１０２４８ＢＰ）を提供する。
【００２１】
また、本発明はヒアルロン酸産生微生物菌株培養液を芳香族系吸着樹脂で処理し、活性炭処理し及び有機溶媒で沈殿させてヒアルロン酸及びその塩を精製することを含むヒアルロン酸の精製方法を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係るヒアルロン酸の精製方法によれば、従来の技術に比べて発熱性物質、蛋白質、核酸及び金属性不純物を効率よく除去することができ、有機溶媒を添加することによる沈殿工程の回数を極力減らすことができ、簡単で経済的な精製工程で高純度のヒアルロン酸を製造することができる。したがって、本発明の精製方法で精製されたヒアルロン酸は９９％の高純度を有するため、化粧品または医薬的な用途として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明はヒアルロン酸産生微生物菌株及びヒアルロン酸の精製方法に関する。
【００２４】
本発明は、ストレプトコッカスズエピデミカスを突然変異させて製造したストレプトコッカス属ＫＬ０１８８を提供する。ストレプトコッカス属ＫＬ０１８８は、２００２年５月１０日付で大韓民国遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）に寄託番号ＫＣＴＣ１０２４８ＢＰで寄託した。ストレプトコッカス属ＫＬ０１８８は非溶血性菌株であり、ヒアルロニダーゼ酵素を有さないためヒアルロン酸を高収率で生産することができる。
【００２５】
ストレプトコッカス属ＫＬ０１８８は炭素源、窒素源、無機塩類及びビタミンなどの微量の元素が含まれた培地で培養することができる。炭素源としては、グルコース、スクロース、ガラクトースまたはフルクトースを使用することができるが、グルコースが好ましい。窒素源としては、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、トリプトン、ペプトン、イーストエキスまたはカサミノ酸を使用することができ、無機塩類としては塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム、硫酸第一鉄または硫酸マグネシウムを使用することができる。
【００２６】
本発明で使用したストレプトコッカス属ＫＬ０１８８培養培地の組成は、例えば次の通りである。２０乃至８０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌのイーストエキス、１７ｇ／Ｌのカゼインペプトン、７ｇ／Ｌのグルタミン、０．７ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、２．５ｇ／Ｌのリン酸第二カリウム及び５．０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム。
【００２７】
ストレプトコッカス属ＫＬ０１８８は、３０℃乃至３７℃の好気性条件で培養することが可能である。培養液のｐＨは、６．５乃至７．５に維持するのが好ましい、またｐＨは培養中に変動するため、人為的に調節することが好ましい。ｐＨの調整は５ＮのＮａＯＨ溶液または１ＮのＨＣｌ溶液を用いることによって調整することができる。このｐＨ範囲から外れる場合は、生成するヒアルロン酸の生産量と分子量が変わることがある。
【００２８】
ストレプトコッカス属ＫＬ０１８８から生成したヒアルロン酸は、通常の方法（Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｊａｐａｎ．２２，３５−４２（１９８８））または本発明に係るヒアルロン酸の精製方法で分離及び精製することができる。ストレプトコッカス属ＫＬ０１８８は、約６．０乃至７．５ｇ／Ｌのヒアルロン酸を生産し、前記ヒアルロン酸の平均分子量は、４，０００，０００Ｄａ以上の高分子量である。
【００２９】
従って、本発明に係るストレプトコッカス属ＫＬ０１８８は、低コストで高収率のヒアルロン酸が生産できるだけでなく、比較的に簡単な方法でヒアルロン酸を精製することができる。また、これから生産されたヒアルロン酸は化粧品、医薬用治療剤及び補助剤として使用することができる。
【００３０】
本発明に係るヒアルロン酸の精製方法は、既存の界面活性剤を使用したヒアルロン酸沈殿方法ではなく、ヒアルロン酸産生微生物菌株の培養液に活性炭処理、芳香族系吸着樹脂処理、限外濾過及びエタノール添加による沈殿工程を有する。
【００３１】
芳香族系吸着樹脂はスチレンジビニルベンゾタイプの樹脂を使用することができる。具体的には三菱（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）社のＨＰ１０、ＨＰ２０（ｓｔｙｒｅｎｅ  ａｎｄ  ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、ＨＰ２１、ＨＰ３０、ＳＰ８００、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ８７５、ＳＰ２０５、ＳＰ２０６及びＳＰ２０７（ｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）からなる群より選択することが好ましく、ＨＰ２０及びＳＰ２０７を用いることがより好ましい。
【００３２】
ヒアルロン酸産生微生物菌株は通常の代謝産物でヒアルロン酸を生産する菌株を全て使用することができる。代表的なものとして、ストレプトコッカス属微生物がある。ストレプトコッカス属微生物としては、ストレプトコッカスピオゲネス、ストレプトコッカスフェカリス、ストレプトコッカスディスガラクチアエ、ストレプトコッカスズエピデミカス、ストレプトコッカスエクイ、ストレプトコッカスエクイシミリス及びストレプトコッカス属ＫＬ０１８８（ＫＣＴＣ１０２４８ＢＰ）が挙げられる。前記ヒアルロン酸産生微生物菌株は、通常の培養方法で培養してヒアルロン酸を含む培養液を製造することができる。
【００３３】
より具体的なヒアルロン酸の精製方法は（ａ）ヒアルロン酸産生微生物菌株の培養液から培養濾液を製造する工程と、（ｂ）前記培養濾液に芳香族系吸着樹脂を加えて攪拌し、限外濾過してヒアルロン酸水溶液を製造する工程と、（ｃ）前記ヒアルロン酸水溶液に有機溶媒を加えてヒアルロン酸またはその塩を沈殿させ、これを乾燥する工程を有する。さらに、前記（ａ）工程または（ｂ）工程後に、培養濾液またはヒアルロン酸水溶液に活性炭を加えて攪拌した後、活性炭を除去する工程を有する。
【００３４】
（ａ）工程では、培養液に硫酸ラウリル及びホルマリンを加えて攪拌することによって菌体表面からヒアルロン酸を分離させると同時に菌体を不活性化させる。その後、培養液を遠心分離により上澄み液を分離し、培養液をろ過して濾液を収得して培養濾液を調製する。
【００３５】
（ｂ）工程では、培養濾液のｐＨを７．５乃至８．５に適定した後実施し、芳香族系吸着樹脂は０．１乃至１０重量％添加する。また、芳香族系吸着樹脂を加えた後、４乃至１０℃で攪拌して発熱性物質（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）を吸着させた後、ろ過して吸着樹脂を除去したろ液を得る。ろ液を限外濾過して各種培地成分及び無機塩類を除去する。限外濾過は、分子量が１０，０００乃至１００，０００Ｄａのろ過膜を利用して行なうことができる。
【００３６】
（ｃ）工程では、通常の有機溶媒沈殿法でヒアルロン酸またはその塩を沈殿させる。前記有機溶媒は水溶性有機溶媒のアセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルを使用することができるが、エタノールを用いることが好ましい。ヒアルロン酸水溶液に最終０．５乃至３Ｍの濃度で塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を添加した後、ろ過してろ液に１乃至５倍容の有機溶媒を添加してヒアルロン酸及びその塩を沈殿させる。沈殿物は７０％エタノールで洗浄することができ、乾燥して収得する。
【００３７】
前記活性炭処理は（ａ）工程または（ｂ）工程後に実施することができる。つまり、（ａ）工程の培養濾液または（ｂ）工程のヒアルロン酸水溶液にＮａＣｌを０．１乃至３（ｗ／ｖ）％加え、その後、活性炭を０．１乃至１０（ｗ／ｖ）％添加する。活性炭は蛋白質または核酸を吸着させ、除去するために使用する。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明の実施例を記載する。なお、下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明が下記の実施例に限られるわけではない。
【００３９】
＜実施例１：突然変異菌株のスクリーニング＞
ストレプトコッカスズエピデミカスに突然変異を誘発して非溶血性を有し、ヒアルロニダーゼ活性のない突然変異株を選別した。
【００４０】
ストレプトコッカスズエピデミカス（ＫＣＴＣ  ３３１８）を５０ｍｌのトッドヒューイット培地（ＤＩＦＣＯ社のＢａｃｔｏ  Ｔｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ  Ｂｒｏｔｈ）に接種して３７℃で代数的成長期まで培養した。培養液１ｍｌを低温で遠心分離して、沈殿した細胞を回収し、ここに５０ｍＭのトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を添加して２回洗浄した。
【００４１】
細胞は、トリス−マレイン酸緩衝液に１×１０３細胞／ｍｌの濃度で分散させ、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン）を２００μｇ／ｍｌ濃度で混合した。混合物を３７℃で３０分間攪拌した後、細胞を５０ｍＭのトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で２回洗浄した。細胞は、トッド−ヒューイット培地に接種して３７℃で１８時間培養した。培養液を収得した後、滅菌食塩水で１×１０３細胞／ｍｌ濃度に希釈し、０．１ｍｌを血液寒天培地上に培養して溶血現象を示さないコロニーを選別した。
【００４２】
選別された非溶血性突然変異菌株は、再び前記方法と同様に突然変異を誘発してヒアルロニダーゼ活性のない菌株を選別した。非溶血性突然変異菌株を４００μｇのヒアルロン酸と１％のアルブミン分画Ｖを含有するトッドヒューイット寒天培地に、単一コロニーが形成されるように塗抹した。これを３７℃の室温で２乃至５日間静置培養した後、これに２Ｎのアセテート溶液１０ｍｌを加えて１０分間放置した。この時、成長が速くて多量の粘液性物質を形成するコロニーを選別した。
【００４３】
選別したコロニーはそれぞれ、ヒアルロン酸生産用培地１．５Ｌに接種して３５℃、ｐＨ６．９５乃至７．０５で２０時間好気培養した。培養液を回収して２５℃でデジタル粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＤＶＩＩ＋、４ｓｐｉｎ、３０ｒｐｍ）を使用して絶対粘度を測定し、一部は有機溶媒で沈殿させた後、再び蒸溜水に溶かしてカルバゾール方法（Ｚ．Ｄｉｓｃｈｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６７、１８９（１９４７））によってヒアルロン酸の生産量を定量した。前記分析によって培養液の絶対粘度が高く、ヒアルロン酸生産量の高い菌株を選別した。
【００４４】
選別した菌株は、１６ＳｒＤＮＡの塩基序列を分析して同定した（Ｊｕｋｅｓ，Ｔ．Ｈ．＆Ｃ．Ｒ．，（１９６９）．Ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｐｐ．２１−１３２；Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈ．Ｎ．Ｍｕｎｒｏ．，Ｓａｉｔｏ，Ｎ．＆Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ｖｏｌ４，４０６−４２５）。その結果、選別した菌株はストレプトコッカス属であることが確認され、ストレプトコッカス属ＫＬ０１８８と命名した。このストレプトコッカス属ＫＬ０１８８は、２００２年５月１０日付で大韓民国遺伝子銀行に寄託番号ＫＣＴＣ１０２４８ＢＰで寄託した。
【００４５】
＜実施例２：ヒアルロン酸生産性検証＞
ストレプトコッカス属ＫＬ０１８８を培養してヒアルロン酸生産効率及び生産されたヒアルロン酸分子量を測定した。
【００４６】
分離した微生物は、１００ｍｌのトッド−ヒューイット培地に接種し、３５℃で代数的成長期まで培養してこれを１次種培養液として使用した。１次種培養液は、１Ｌのトリプシン大豆培地（米国Ｄｉｆｃｏ社製）に接種し、３５℃で代数的成長期まで培養して２次種培養液とした。
【００４７】
３０Ｌの発酵槽に６０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌのイーストエキス、１７ｇ／Ｌのカゼインペプトン、７ｇ／Ｌのグルタミン酸、０．７ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、２．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム及び５．０ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含むヒアルロン酸生産用培地２０Ｌを入れて滅菌し、２次種培養液１０００ｍｌを接種した。培養液のｐＨは６．９５乃至７．０５であり、温度は３５℃、通気量は１．０ＶＶＭに維持しながら好気培養した。
【００４８】
培養期間中、一定量の試料をとって培養液の粘度を測定し、培養液粘度が増加しなくなるまで培養した。２０時間培養した時、培養液粘度がそれ以上増加しないことが測定されて培養を終了した。このときの最大粘度は約２０，０００ｃｐｓであった。
【００４９】
培養液中に存在するヒアルロン酸は公知の多糖類分離精製方法（Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｊａｐａｎ．２２，３５−４２（１９８８））によって実施して回収した。ヒアルロン酸はカルバゾール方法（Ｚ．Ｄｉｓｃｈｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６７，１８９（１９４７））によって定量し、毛細管粘度計による方法（Ｎａｒｌｉｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １４７，３４７−３９５（１９８５））で生産されたヒアルロン酸の平均分子量を測定した。その結果ヒアルロン酸生産量は７．０ｇ／Ｌで、平均分子量は５，５００，０００Ｄａであった。
【００５０】
＜比較例１：ストレプトコッカスズエピデミカスのヒアルロン酸生産性検定＞
ストレプトコッカスズエピデミカス（ＫＣＴＣ３３１８）を実施例２と同様の方法で培養し、収得したヒアルロン酸の生産性及び分子量を測定した。
【００５１】
培養２４時間後、培養液の粘度がそれ以上増加しないため培養を終了した。この時、測定された粘度は約４，０００ｃｐｓであり、ヒアルロン酸生産量は３．０ｇ／Ｌ、平均分子量は２，５００，０００Ｄａであった。
【００５２】
本発明のストレプトコッカス属ＫＬ０１８８は、ストレプトコッカスズエピデミカスに比べてヒアルロン酸生産量が非常に優れており、ヒアルロン酸の平均分子量も高いことが確認できた。
【００５３】
本発明のストレプトコッカス属ＫＬ０１８８は非溶血性菌株であり、高分子量のヒアルロン酸を高収率で生産する。したがって、ストレプトコッカス属ＫＬ０１８８から生産されたヒアルロン酸は化粧品及び薬剤として使用することができる。
【００５４】
＜実施例３：芳香族系吸着樹脂ＳＰ２０７を利用したヒアルロン酸の精製＞
〔３−１  ヒアルロン酸産生微生物菌株の培養液調製〕
ストレプトコッカス属ＫＬ０１８８（寄託番号ＫＣＴＣ１０２４８ＢＰ）を１００ｍｌのトッド−ヒューイット培地に接種し、３５℃で代数的成長期まで培養させ、これを１次種培養液として使用した。この１次種培養液を１Ｌのトリプシン大豆培地（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）に接種し、３５℃で代数的成長期まで培養させ２次種培養液とした。
【００５５】
３０Ｌの発酵槽に６０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌのイーストエキス、１７ｇ／Ｌのカゼインペプトン、７ｇ／Ｌのグルタミン酸、０．７ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、２．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム及び５．０ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含むヒアルロン酸生産用培地２０Ｌを入れて滅菌し、２次種培養液１０００ｍｌを接種した。培養液のｐＨは６．９５乃至７．０５であり、３５℃で２０時間培養した。
【００５６】
〔３−２  培養濾液調製〕
ヒアルロン酸培養液をヒアルロン酸の濃度が０．１乃至０．２％になるように希釈した。これに０．０２％の硫酸ラウリル及び０．０５％のホルマリン溶液を加えて３時間攪拌した。その後、遠心分離またはろ過して菌体を除去し、培養濾液を調製した。
【００５７】
〔３−３  ＳＰ２０７樹脂処理段階〕
培養濾液のｐＨを７．５乃至８．５になるように滴定し、芳香族系吸着樹脂ＳＰ２０７を３（ｗ／ｖ）％加えた後、４乃至１０℃で３時間攪拌しながら発熱性物質を吸着させた。その後、吸着樹脂処理液をろ過して吸着樹脂が除去された濾液を収得し、限外濾過を行なった。
【００５８】
〔３−４  活性炭処理〕
濾液に塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を０．９（ｗ／ｖ）％加え、活性炭を３（ｗ／ｖ）％添加した後、２時間攪拌して蛋白質及び核酸などを活性炭に吸着させた。その後、ろ過して活性炭を除去し、ヒアルロン酸水溶液を得た。
【００５９】
〔３−５  エタノール沈殿〕
ヒアルロン酸水溶液に１Ｍの濃度になるようにＮａＣｌを添加し、０．２μｍのフィルターでろ過した。その後、１．５乃至３倍容のエタノールを加えてヒアルロン酸及びその塩を沈殿させた後、７０％エタノールで数回洗浄した。沈殿物は滅菌された条件下で乾燥してヒアルロン酸及びその塩を得た。
【００６０】
＜実施例４：芳香族系吸着樹脂ＨＰ２０を利用したヒアルロン酸の精製＞
吸着樹脂としてＨＰ２０を使用した以外は、実施例３と同様の方法でヒアルロン酸及びその塩を精製した。
【００６１】
＜実施例５：活性炭処理後の芳香族系吸着樹脂ＳＰ２０７を利用したヒアルロン酸の精製＞
活性炭処理後、ＳＰ２０７に吸着させた以外は、実施例３と同様の方法でヒアルロン酸及びその塩を精製した。
【００６２】
＜実施例６：活性炭処理後の芳香族系吸着樹脂ＨＰ２０を利用したヒアルロン酸の精製＞
活性炭処理後、ＨＰ２０に吸着させた以外は、実施例４と同様の方法でヒアルロン酸及びその塩を精製した。
【００６３】
＜実施例７：ＳＰ２０７を利用したヒアルロン酸の精製＞
ヒアルロン酸産生微生物菌株としてストレプトコッカスズエピデミカス（ＫＣＴＣ３３１８）を使用した以外は、実施例３と同様の方法でヒアルロン酸及びその塩を精製した。
【００６４】
＜比較例２＞
芳香族樹脂を利用した吸着工程を省略した以外は、実施例３と同様の方法でヒアルロン酸及びその塩を精製した。
【００６５】
＜実験例：ヒアルロン酸の精製収率測定
実施例３乃至７、及び比較例の方法で精製したヒアルロン酸及びその塩の純度を測定した。
Ａ．ヒアルロン酸収率：ヒアルロン酸収率は、カルバゾール法を変形した方法で定量して初期の体積と最終体積を比較した。
Ｂ．発熱性物質測定：ヒアルロン酸及びその塩を１．５ｇ／Ｌになるように発熱性物質含量が０．００１ＥＵ／ｍｌ以下である水に溶解した後、チャールズリバーエンドセーフ社（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ）のＬＡＬ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ）試薬を使用して添付されたマニュアルによって分析した。分析値はヒアルロン酸塩１ｍｇ当り存在するエンドトキシン単位（ＥＵ）で示した。
Ｃ．純度試験：純度試験は、カルバゾール法を変形した方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４，３３０（１９６２））で実施した。
Ｄ．蛋白質含量：ロウリ（Ｌｏｗｒｙ）法で実施した。
Ｅ．核酸含量：ヒアルロン酸及びその塩を生理食塩水に１％で溶解した後、２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
上記の測定結果を表１に示す。
【表１】
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【００６６】
表１において、実施例１乃至実施例７で精製されたヒアルロン酸及びその塩は純度が９９％であり、非常に高い値を示した。これに反し、比較例の場合、純度が９５％水準に留まった。その他、発熱性物質、蛋白質及び核酸の含量は、実施例３乃至実施例７が比較例に比べて非常に低い値を示した。
【国際調査報告】
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