(57)【要約】ＰＫＣ  Ｖ５アイソザイム特異的ペプチドが記載される。配列およびこの配列を含む組成物は、それぞれ由来する、ＰＫＣアイソザイムに関連した疾患状態を処置するために有用である。処置方法、薬学的処方物およびこのペプチドの活性を模倣する化合物を同定する方法もまた記載される。好ましい実施形態では、このペプチドは、ポリ−Ａｒｇ、Ｔａｔ、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインから選択されるキャリアペプチドにＣｙｓ−Ｃｙｓ結合している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＫＣアイソザイムによって調節される疾患状態についての処置方法であって、治療有効量の対応するＰＫＣ  Ｖ５アイソザイム特異的ペプチドを、該処置を必要とする哺乳動物へと投与する工程を包含し、ただし、該ペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１のいずれでもない、方法。
【請求項２】
前記ペプチドが、Ｖ５ドメイン、または所望の活性を保持する、その改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせもしくはハイブリッドの、Ｎ末端１５アミノ酸の６〜１２から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、前記Ｖ５ドメインのＮ末端の２アミノ酸を含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、６〜８アミノ酸を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、ただし、前記ペプチドが、配列番号５、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５７、配列番号６３または配列番号６４のいずれでもない、方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、キャリアペプチドに結合体化される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、ポリ−Ａｒｇ、Ｔａｔ、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインから選択されるキャリアペプチドにＣｙｓ−Ｃｙｓ結合している、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２、または所望の活性を保持する、それらの改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせもしくはハイブリッドの群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、配列番号２、配列番号７、配列番号８、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４５、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５９および配列番号６０、または所望の活性を保持する、それらの改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせもしくはハイブリッドの群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが、配列番号２、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５４および配列番号５９、または所望の活性を保持する、それらの改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせもしくはハイブリッドの群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが、配列番号２、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５４および配列番号５９、または所望の活性を保持する、それらの改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせもしくはハイブリッドの群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、配列番号２、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５４および配列番号５９の群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＫＣ  Ｖ５アイソザイム特異的ペプチド、または所望の活性を保有する、それらの改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせもしくはハイブリッドであり、ただし、該ペプチドは、配列番号５、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５７、配列番号６３または配列番号６４のいずれでもない、ペプチド、または所望の活性を保有する、それらの改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせもしくはハイブリッド。
【請求項１４】
前記ペプチドが、前記Ｖ５ドメイン、または所望の活性を保持する、その改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせもしくはハイブリッドの、Ｎ末端１５アミノ酸の６〜１２から選択される、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが、前記Ｖ５ドメインのＮ末端の２アミノ酸を含まない、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドが、６〜８アミノ酸を有する、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
前記ペプチドが、キャリアペプチドに結合体化される、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１８】
前記ペプチドが、ポリ−Ａｒｇ、Ｔａｔ、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインから選択されるキャリアペプチドにＣｙｓ−Ｃｙｓ結合している、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２、または所望の活性を保持する、それらの改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせもしくはハイブリッドの群から選択される、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項２０】
配列番号２、配列番号７、配列番号８、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４５、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５９および配列番号６０、または所望の活性を保持する、それらの改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせもしくはハイブリッドの群から選択される、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
配列番号２、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５４および配列番号５９、または所望の活性を保持する、それらの改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせもしくはハイブリッドの群から選択される、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２２】
配列番号２、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５４および配列番号５９、または所望の活性を保持する、それらの改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせもしくはハイブリッドの群から選択される、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
配列番号２、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５４および配列番号５９の群から選択される、請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２４】
薬学的処方物であって、薬学的に受容可能な賦形剤および請求項１３に記載のペプチドを含む、処方物。
【請求項２５】
薬学的処方物であって、薬学的に受容可能な賦形剤および請求項１４に記載のペプチドを含む、処方物。
【請求項２６】
薬学的処方物であって、薬学的に受容可能な賦形剤および請求項１５に記載のペプチドを含む、処方物。
【請求項２７】
薬学的処方物であって、薬学的に受容可能な賦形剤および請求項１６に記載のペプチドを含む、処方物。
【請求項２８】
薬学的処方物であって、薬学的に受容可能な賦形剤および請求項１７に記載のペプチド／キャリア結合体を含む、処方物。
【請求項２９】
薬学的処方物であって、薬学的に受容可能な賦形剤および請求項１８に記載のペプチド／キャリア結合体を含む、処方物。
【請求項３０】
薬学的処方物であって、薬学的に受容可能な賦形剤および請求項１９に記載のペプチドを含む、処方物。
【請求項３１】
薬学的処方物であって、薬学的に受容可能な賦形剤および請求項２０に記載のペプチドを含む、処方物。
【請求項３２】
薬学的処方物であって、薬学的に受容可能な賦形剤および請求項２１に記載のペプチドを含む、処方物。
【請求項３３】
薬学的処方物であって、薬学的に受容可能な賦形剤および請求項２２に記載のペプチドを含む、処方物。
【請求項３４】
薬学的処方物であって、薬学的に受容可能な賦形剤および請求項２３に記載のペプチドを含む、処方物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、同時係属中の仮出願第６０／３７４，５３０号（２００２年４月２２日出願）の利益を主張する。仮出願第６０／３７４，５３０号は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府の利益に関する言及）
本研究は、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｒａｎｔｓ  ＮＳ１３１０８およびＤＡ０８２５６によって部分的に支持された。従って、米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、プロテインキナーゼＣのアイソザイム特異的調節に有用なペプチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
プロテインキナーゼＣ（「ＰＫＣ」）は、種々の細胞機能（細胞の増殖、遺伝子発現の調節、イオンチャネル活性を含む）に関与するシグナル伝達における重要な酵素である。アイソザイムのＰＫＣファミリーとしては、それらの相同性およびアクチベーターに対する感度に基づいて少なくとも３つのサブファミリーに分けられ得る、少なくとも１１個の異なるプロテインキナーゼが挙げられる。各アイソザイムは、アイソザイムに特有の（「可変」または「Ｖ」）ドメインが分散した、多数の相同な（「保存された」すなわち「Ｃ」）ドメインを含む。「古典的」すなわち「ｃＰＫＣ」サブファミリーのメンバー（αＰＫＣ、βＩＰＫＣ、βＩＩＰＫＣおよびγＰＫＣ）は、４つの相同ドメイン（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４）を含み、そしてカルシウム、ホスファチジルセリン、およびジアシルグリセロールエステルまたはホルボールエステルを活性化のために必要とする。「新たな」すなわち「ｎＰＫＣ」サブファミリー（δＰＫＣ、εＰＫＣ、ηＰＫＣおよびθＰＫＣ）のメンバーは、Ｃ２相同ドメインを欠き、そしてカルシウムを活性化のために必要としない。最後に、「異常な」すなわち「αＰＫＣ」サブファミリーのメンバー（ζＰＫＣおよびλ／ｌＰＫＣ）は、Ｃ２相同ドメインおよびＣ１相同ドメインの半分の両方を欠き、そしてジアシルグリセロール、ホルボールエステルおよびカルシウムに非感受性である。
【０００５】
ＰＫＣアイソザイムの細胞下分布に対する研究は、ＰＫＣの活性化が、その細胞内でのその再分布（トランスロケーションとも呼ばれる）をもたらし、その結果、活性化ＰＫＣアイソザイムが、原形質膜、細胞骨格要素、核、および他の細胞下区画と会合することを実証する（Ｓａｉｔｏ，Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３４０９−３４１３（１９８９）；Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖ．およびＨａｌｌ，Ｐ．Ｆ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０８：５５３−５６７（１９８９）；Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ（以前はＣｅｌｌ  Ｒｅｇ．）１：６９３−７０６，（１９９０））。異なるＰＫＣアイソザイムの独特の細胞機能は、それらの細胞下位置によって決定される。例えば、活性化βＩＰＫＣは、核の内側に見出され、一方、活性化βＩＩＰＫＣは、心筋細胞の核周辺および細胞周辺に見出される（Ｄｉｓａｔｎｉｋ，Ｍ．Ｈ．ら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１０：２８７−２９７（１９９４））。カルシウムからは独立しているが、リン脂質を活性化のために必要とする新たなＰＫＣファミリーのメンバーであるεＰＫＣは、後根神経節ならびに背側脊髄の浅層の両方の一次求心性ニューロンに見出されている。
【０００６】
細胞の異なる領域への異なるＰＫＣアイソザイムの局在は、次いで、活性化Ｃ−キナーゼについてのレセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃ−Ｋｉｎａｓｅ；「ＲＡＣＫ」）と称される特異的係留分子への活性化アイソザイムの結合に起因するようである。ＲＡＣＫは、活性化ＰＫＣアイソザイムをそれらのそれぞれの細胞下部位へと選択的に係留することによって機能すると考えられている。ＲＡＣＫは、完全に活性化されたＰＫＣのみを結合し、そして必ずしも、この酵素の基質ではない。Ｎｏｒは、このキナーゼの触媒ドメインによって媒介されるＲＡＣＫへの結合である（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３９９７−４０００（１９９１））。ＰＫＣのトランスロケーションは、細胞粒状画分へと固定されたＲＡＣＫへの活性化酵素の結合を反映し、そしてＲＡＣＫへの結合は、ＰＫＣがその細胞応答を生じるのに必要とされる（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：２４７−２５１（１９９５））。インビボでのＲＡＣＫへのＰＫＣ結合の阻害は、ＰＫＣトランスロケーションおよびＰＫＣ媒介機能を阻害する（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２４９６２−２４９６６（１９９６ａ）；Ｒｏｎ，Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４９２−４９６（１９９５）；Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ｌ．およびＭｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８８：１２３５−１２４０（１９９２））。
【０００７】
一般に、ＰＫＣのトランスロケーションは、ＰＫＣアイソザイムの適切な機能に必要とされる。ＲＡＣＫ上のＰＫＣ結合部位（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２６：１４６６−１４６８（１９９１ａ）；Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，１９９５）またはＰＫＣ上のＲＡＣＫ結合部位（Ｒｏｎら，１９９５；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，１９９６ａ）のいずれかを模倣するペプチドは、インビボでこの酵素の機能を選択的に阻害するＰＫＣのアイソザイム特異的トランスロケーションインヒビターである。
【０００８】
ＰＫＣの個々のアイソザイムは、以下を含む種々の疾患状態の機構に関与している：癌（αＰＫＣおよびδＰＫＣ）；心肥大および心不全（βＩ  ＰＫＣおよびβＩＩ  ＰＫＣ）侵害受容（γＰＫＣおよびεＰＫＣ）；心筋梗塞を含む虚血（δＰＫＣ）；免疫応答（特に、Ｔ細胞媒介性）（θＰＫＣ）；および線維芽細胞（ｆｉｂｒａｂｌａｓｔ）増殖および記憶（ζＰＫＣ）。種々のＰＫＣアイソザイム特異的ペプチドおよび改変領域特異的ペプチドは、以前に記載されている（例えば、米国特許第５，７８３，４０５号を参照のこと）。疼痛知覚におけるεＰＫＣの役割は、εＶ１−２ペプチド（上記の’４０５特許に最初に記載されたεＰＫＣの選択的インヒビター）の治療用途を含め、近年報告されている（ＷＯ  ００／０１４１５；米国特許第６，３７６，４６７号）。ＲＡＣＫ１（βＩＩＰＫＣについての選択的係留タンパク質）の結合特異性は、特定のＮ−末端ペプチド、中間ペプチド、およびＣ末端ペプチドの単独、組み合わせおよびβＣ２ドメイン由来の３つのペプチドの混合物と一緒での試験を含めて、βＩＩＰＫＣのＶ５領域に存在すると近年報告されている（Ｓｔｅｂｂｉｎｓ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９６４４−２９６５０（２００１））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような報告の進展にもかかわらず、疾患の処置のための新たな選択的薬剤および方法（既知のＰＫＣアイソザイム特異的ペプチドおよび可変領域特異的ペプチドに対する代替物を含む）が所望されており、現在も所望され続けている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、ＰＫＣアイソザイムによって媒介される疾患を処置するための、ＰＫＣ  Ｖ５アイソザイム特異的ペプチド、薬学的組成物および方法を提供する。これらのペプチドは、対応するＰＫＣアイソザイムの選択的モジュレータである。
【００１１】
１つの局面では、本発明は、ＰＫＣ  Ｖ５アイソザイム特異的ペプチドに関する。
【００１２】
本発明の別の局面では、このペプチドは、Ｖ５ドメインのＮ末端１５アミノ酸の６〜１２から選択される。
【００１３】
なお別の局面では、このペプチドは、Ｖ５ドメインのＮ末端２アミノ酸を含まない。
【００１４】
なお別の局面では、このペプチドは、６〜８アミノ酸を有する。
【００１５】
本発明のなお別の局面は、キャリアペプチドに結合体化された（好ましくは、ポリ−Ａｒｇ、Ｔａｔ、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインから選択されるキャリアペプチドにＣｙｓ−Ｃｙｓ結合された）上記のペプチドに関する。
【００１６】
本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤および上記のペプチドまたはペプチド／キャリア結合体を含む薬学的処方物をさらに提供する。
【００１７】
上記のペプチド、ペプチド結合体および薬学的処方物は、所望の活性を保持する、それらの全ての改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせ、またはハイブリッドを含む。本発明のペプチドから排除されるのは、以下である：配列番号５、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５７、配列番号６３および配列番号６４。
【００１８】
本発明においてまた提供されるのは、ＰＫＣアイソザイムによって調節される疾患状態についての処置方法であり、この方法は、治療有効量の上記ＰＫＣ  Ｖ５アイソザイム特異的ペプチド、ペプチド／キャリア結合体（または所望の活性を保持する、それらの改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせもしくはハイブリッド）、またはそれらの薬学的処方物を、この処置を必要とする哺乳動物へと投与する工程を包含する。１つの実施形態では、本発明の処置方法から排除されるのは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１のペプチドを用いる方法である。別のこのような実施形態では、本発明の処置方法から排除されるのは、配列番号５、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５７、配列番号６３または配列番号６４のペプチドを用いる方法である。
【００１９】
別の局面では、本発明は、疾患を処置する化合物を同定するための、本明細書中に記載されるペプチドの使用を包含する。
【００２０】
さらなる局面は、疾患の処置において使用するための医薬の調製における、ペプチドまたはペプチド／キャリア結合体の使用を含む。
【００２１】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、本発明の以下の詳細な説明が添付の図面と関連して読まれる場合、より充分に認識される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、ヒトαＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインを表す。
【００２３】
配列番号２は、配列番号１由来のフラグメントである。
【００２４】
配列番号３は、配列番号１由来の改変フラグメントである。
【００２５】
配列番号４は、配列番号１由来の改変フラグメントである。
【００２６】
配列番号５は、配列番号１由来のフラグメントである。
【００２７】
配列番号６は、ヒトβＩＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインを表す。
【００２８】
配列番号７は、配列番号６由来のフラグメントである。
【００２９】
配列番号８は、配列番号６由来のフラグメントである。
【００３０】
配列番号９は、配列番号６由来の改変フラグメントである。
【００３１】
配列番号１０は、配列番号６由来の改変フラグメントである。
【００３２】
配列番号１１は、配列番号６由来のフラグメントである。
【００３３】
配列番号１２は、配列番号６由来のフラグメントである。
【００３４】
配列番号１３は、配列番号６由来のフラグメントである。
【００３５】
配列番号１４は、ヒトβＩＩＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインを表す。
【００３６】
配列番号１５は、配列番号１４由来のフラグメントである。
【００３７】
配列番号１６は、配列番号１４由来のフラグメントである。
【００３８】
配列番号１７は、配列番号１４由来のフラグメントである。
【００３９】
配列番号１８は、配列番号１４由来の改変フラグメントである。
【００４０】
配列番号１９は、配列番号１４由来のフラグメントである。
【００４１】
配列番号２０は、配列番号１４由来のフラグメントである。
【００４２】
配列番号２１は、配列番号１４由来のフラグメントである。
【００４３】
配列番号２２は、ヒトγＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインを表す。
【００４４】
配列番号２３は、配列番号２２由来のフラグメントである。
【００４５】
配列番号２４は、配列番号２２由来のフラグメントである。
【００４６】
配列番号２５は、配列番号２２由来の改変フラグメントである。
【００４７】
配列番号２６は、ヒトδＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインを表す。
【００４８】
配列番号２７は、配列番号２６由来のフラグメントである。
【００４９】
配列番号２８は、配列番号２６由来のフラグメントである。
【００５０】
配列番号２９は、配列番号２６由来の改変フラグメントである。
【００５１】
配列番号３０は、配列番号２６由来の改変フラグメントである。
【００５２】
配列番号３１は、配列番号２６由来のフラグメントである。
【００５３】
配列番号３２は、ヒトεＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインを表す。
【００５４】
配列番号３３は、配列番号３２由来のフラグメントである。
【００５５】
配列番号３４は、配列番号３２由来のフラグメントである。
【００５６】
配列番号３５は、配列番号３２由来の改変フラグメントである。
【００５７】
配列番号３６は、配列番号３２由来の改変フラグメントである。
【００５８】
配列番号３７は、配列番号３２由来のフラグメントである。
【００５９】
配列番号３８は、ヒトηＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインを表す。
【００６０】
配列番号３９は、配列番号３８由来のフラグメントである。
【００６１】
配列番号４０は、配列番号３８由来のフラグメントである。
【００６２】
配列番号４１は、配列番号３８由来の改変フラグメントである。
【００６３】
配列番号４２は、配列番号３８由来の改変フラグメントである。
【００６４】
配列番号４３は、配列番号３８由来のフラグメントである。
【００６５】
配列番号４４は、ヒトηＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインを表す。
【００６６】
配列番号４５は、配列番号４４由来のフラグメントである。
【００６７】
配列番号４６は、配列番号４４由来のフラグメントである。
【００６８】
配列番号４７は、配列番号４４由来の改変フラグメントである。
【００６９】
配列番号４８は、配列番号４４由来のフラグメントである。
【００７０】
配列番号４９は、ヒトμＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインを表す。
【００７１】
配列番号５０は、配列番号４９由来のフラグメントである。
【００７２】
配列番号５１は、配列番号４９由来のフラグメントである。
【００７３】
配列番号５２は、配列番号４９由来の改変フラグメントである。
【００７４】
配列番号５３は、ヒトθＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインを表す。
【００７５】
配列番号５４は、配列番号５３由来のフラグメントである。
【００７６】
配列番号５５は、配列番号５３由来のフラグメントである。
【００７７】
配列番号５６は、配列番号５３由来の改変フラグメントである。
【００７８】
配列番号５７は、配列番号５３由来のフラグメントである。
【００７９】
配列番号５８は、ヒトξＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインを表す。
【００８０】
配列番号５９は、配列番号５８由来のフラグメントである。
【００８１】
配列番号６０は、配列番号５８由来のフラグメントである。
【００８２】
配列番号６１は、配列番号５８由来の改変フラグメントである。
【００８３】
配列番号６２は、配列番号５８由来の改変フラグメントである。
【００８４】
配列番号６３は、配列番号５８由来のフラグメントである。
【００８５】
配列番号６４は、ヒトμＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメイン由来のフラグメントを表す。
【００８６】
配列番号６５は、Ｔａｔ由来キャリアペプチド（Ｔａｔ  ４７−５７）：Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇである。
【００８７】
配列番号６６は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン由来キャリアペプチド：Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓである。
【００８８】
（発明の詳細な説明）
（定義）
他に示さない限り、本明細書中に記載される全ての用語は、本発明の分野の当業者にとっての用語と同じ意味を有する。実施者は、特に、当該分野の定義および用語に関してＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ  Ｐａ．）が示される。
【００８９】
アミノ酸残基に関する略語は、２０種の一般的Ｌ−アミノ酸のうちの１つを言及するために当該分野において用いられる標準的な３文字コードおよび／または１文字コードである。
【００９０】
「保存されたセット」のアミノ酸とは、一群のタンパク質のメンバー間で同一であるかまたは非常に相同である、（例えば、保存的アミノ酸置換のみを有する）アミノ酸連続配列をいう。保存されたセットは、２〜５０を超えるアミノ酸残基長のどれかであり得る。代表的に、保存されたセットは、２と１０との間の個数連続する残基長である。例えば、２つのペプチドＣＧＲＮＡＥ（配列番号１５）およびＡＣＧＲＮＡＥ（配列番号１９）に関して、これらの２つの配列に関して保存されたセットのアミノ酸を形成する、６つの同一位置（ＣＧＲＮＡＥ）が存在する。
【００９１】
「保存的アミノ酸置換」は、選択されたポリペプチドまたはタンパク質の活性にも三次構造にも顕著な変化をもたらさない置換である。このような置換は代表的に、選択されたアミノ酸残基を、類似の物理化学的特性を有する異なる残基で置換することを含む。
例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの置換は、保存的置換と考えられる。なぜなら、両方とも、同様のサイズの負に荷電したアミノ酸であるからである。物理化学的性質によるアミノ酸のグループ分けは、当業者に公知である。
【００９２】
「ドメイン」および「領域」は、本明細書中で交換可能に用いられ、そして（代表的には保存されているかまたは可変性であるかのいずれかによって特徴付けられる）ＰＫＣアイソザイム内のアミノ酸の連続配列をいう。
【００９３】
「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に用いられ、そしてペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基鎖から構成される化合物をいう。他に示されない限り、ペプチドについての配列は、「Ｎ」（すなわちアミノ）末端から「Ｃ」（すなわちカルボキシル）末端への順番で与えられる。
【００９４】
２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列は、これらが、プログラムＡＬＩＧＮを変異ギャップマトリクスおよび６以上のギャップペナルティ（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ＡＴＬＡＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ（１９７２）第５巻，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，１０１−１１０頁、およびこの巻に対する補遺２，１−１０頁）で用いて５より高いアライメントスコア（標準偏差単位において）を有するならば、（この用語は、好ましくは本明細書中で用いられる場合）「相同」と考えられる。これらの２つの配列（またはそれらの部分）は、それらのアミノ酸が、上記のＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適にアライメントした場合に５０％以上（より好ましくは７０％以上、なおより好ましくは８０％以上）同一であるならば、より好ましくは相同である。
【００９５】
ペプチドまたはペプチドフラグメントは、親ペプチドまたは親ポリペプチドのアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸配列を有するか、または親ペプチドまたは親ポリペプチドからの保存されたフラグメントであるならば、親ペプチドまたは親ポリペプチド「由来」である。
【００９６】
「調節する」とは、ＰＫＣ活性化の低下、増大、またはＰＫＣ活性化における何らかの他の測定可能な変化を意図する。
【００９７】
「管理」とは、例えば、疼痛を処置する状況では、疼痛の低下および／または痛覚脱失の誘導の両方を意図する。
【００９８】
用語「処置」または「処置する」は、以下を包含する、哺乳動物における疾患の任意の処置を意味する：（ａ）この疾患を予防するかもしくはこの疾患に対して保護する、すなわち、臨床的徴候を発症させないこと；（ｂ）この疾患を阻害する、すなわち、臨床的徴候の発症を阻止もしくは抑制する；および／または（ｃ）この疾患を軽減する、すなわち、臨床的徴候の後退を引き起こす。ヒトの医薬において、「予防すること」と「抑制すること」との間を区別することが常に可能なわけではないことが当業者によって理解される。なぜなら、最終的な誘導性事象が未知であり得るか、潜伏性であり得るか、またはその患者はその事象の発生のずっと後まで確認しないからである。それゆえ、本明細書中で用いられる場合、用語「予防」は、本明細書中で定義される、「予防する」および「抑制する」の両方を包含する、「処置」の１要素であると意図される。用語「保護」は、本明細書中で用いられる場合、「予防」を包含することを意図する。
【００９９】
用語「有効量」は、処置されるべき障害または疾患状態についての処置を提供するに充分な投薬量を意味する。これは、患者、疾患およびもたらされる処置に依存して変動する。
【０１００】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「薬学的に受容可能な賦形剤」は、任意のそして全ての溶媒和物、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性成分もまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０１０１】
（本発明のＰＫＣペプチド）
先行技術の報告は、Ｖ１ドメイン、Ｖ３ドメインおよびＶ５ドメイン由来のＰＫＣアイソザイム特異的ペプチドおよび可変領域特異的ペプチドに焦点を合わせているが、Ｖ５ドメイン由来のペプチドの治療可能性および関連の可能性が大部分同定されていないままである。さらに、Ｖ５ドメイン由来のペプチドが記載される程度まで、このようなペプチドは、Ｖ５ドメインのＮ末端由来の約２５アミノ酸から始まって、Ｖ５ドメインのほぼ中心から優先的に選択されている。
【０１０２】
一般に、本発明は、疾患を処置および／または管理する際に使用するための、任意のプロテインキナーゼＣアイソザイムのＶ５領域由来のペプチドの使用を意図する。本発明は、このようなＰＫＣアイソザイム特異的Ｖ５ペプチド（使用方法および処置方法、組成物、およびその薬学的処方物を含む）に関する。特に、好ましいのは、Ｖ５ドメインのＮ末端１５アミノ酸、またはそれらの保存的改変物および並列物の約６〜１２から選択されるペプチドである。さらに好ましいのは、Ｖ５ドメインのＮ末端２アミノ酸を含まないペプチド（特に、６〜８アミノ酸を有するペプチド）である。これらのペプチドは、ネイティブな形態で用いられ得るか、または（例えば、キャリア上のＣｙｓとこのペプチド（例えば、以下に記載されるもの）内のＣｙｓもしくはこのペプチドに付加されたＣｙｓとの間でのジスルフィド結合を介して）キャリアに結合体化されることにより改変され得る。
【０１０３】
ネイティブ配列に相同なペプチドおよび保存的アミノ酸置換および／または並列を有するペプチド、ならびに活性を保持するフラグメントが、意図されるペプチドの範囲内にあることが認識される。例えば、ＲとＫとの間；Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＲおよびＤの間；ならびに／またはＧ、Ａ、ＰおよびＮの間で１以上のアミノ酸（好ましくは、２以下）を交換し得る。従って、用語「ＰＫＣ  Ｖ５ペプチド」は、ネイティブ配列、ならびに所望の活性を保持する、それらの全ての改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせ、およびハイブリッドを意図する。
【０１０４】
以下の配列は、種々のＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインおよびそれら由来の例示的なフラグメントに対応する。例示的な改変ペプチドもまた以下に記載され、ここで、置換が小文字で示される。全ての場合において、本明細書中に明示される配列に由来する配列および明示される配列と相同な配列（例えば、他種由来の極めて相同な配列）が意図されることが認識される。本明細書中に記載される全てのペプチドは、当該分野で公知の、自動または手動のいずれかの固相合成技術を用いる化学合成によって調製され得る。これらのペプチドはまた、当該分野で公知の技術を用いて組換え調製され得る。
【０１０５】
αＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインは、αＰＫＣの配列のアミノ酸残基６１６から得られたアミノ酸配列：「ＰＫＶＣＧ  ＫＧＡＥＮＦＤＫＦＦ  ＴＲＧＱＰＶＬＴＰＰ  ＤＱＬＶＩＡＮＩＤＱ  ＳＤＦＥＧＦＳＹＶＮＰＱＦＶＨＰＩＬＱＳ  ＡＶ」（配列番号１）を有する。例示的なペプチドとしては、アミノ酸残基６２０〜６２５に対応するＧＫＧＡＥＮ（配列番号２）、ならびに改変ペプチド「ａｒＧＡＥＮ」（配列番号３）およびｃＧＫＧＡＥＮ（配列番号４）が挙げられる。除かれるのは、ペプチドＱＬＶＩＡＮ（配列番号５）である。
【０１０６】
βＩＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインは、アミノ酸配列：「ＰＫ  ＡＲＤＫＲＤＴＳＮＦ  ＤＫＥＦＴＲＱＰＶＥ  ＬＴＰＴＤＫＬＦＩＭ  ＮＬＤＱＮＥＦＡＧＦ  ＳＹＴＮＰＥＦＶＩＮ  Ｖ」（配列番号６）を有する。例示的なペプチドとしては、ＲＤＫＲＤＴＳ（配列番号７）およびＡＲＤＫＲＤＴＳＮＦ  ＤＫ（配列番号８）、ならびに改変ペプチドｃＡＲＤＫＲＤＴＳ（配列番号９）およびｇＲＤＫＲＤＴＳ（配列番号１０）が挙げられる。除かれるのは、ペプチドＡＲＤＫＲＤＴＳ（配列番号１１）、ＫＬＦＩＭＮ（配列番号１２）およびＡＧＦＳＹＴＮＰＥＦ  ＶＩＮＶ（配列番号１３）である。
【０１０７】
βＩＩ−ＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインは、アミノ酸配列：「ＰＫ  ＡＣＧＲＮＡＥＮＦＤＲＦＦＴＲＨＰＰＶＬ  ＴＰＰＤＱＥＶＩＲＮ  ＩＤＱＳＥＦＥＧＦＳ  ＦＶＮＳＥＦＬＫＰＥ  ＶＫＳ」（配列番号１４）を有する。例示的なペプチドとしては、ＣＧＲＮＡＥ（配列番号１５）、ＫＡＣＧＲＮＡＥ（配列番号１６）およびＣＧＲＮＡＥＮ（配列番号１７）ならびに改変ペプチドＡＣＧｋＮＡＥ（配列番号１８）が挙げられる。除かれるのは、ペプチドＡＣＧＲＮＡＥ（配列番号１９）、ＱＥＶＩＲＮ（配列番号２０）およびＳＦＶＮＳＥＦＬＫＰ  ＥＶＫＳ（配列番号２１）である。
【０１０８】
γＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインは、γＰＫＣの配列のアミノ酸残基６３３から選んだアミノ酸配列：「ＰＲＰＣＧＲＳＧＥＮＦＤＫＦＦＴＲＡ  ＡＰＡＬＴＰＰＤＲＬ  ＶＬＡＳＩＤＱＡＤＦ  ＱＧＦＴＹＶＮＰＤＦ  ＶＨＰＤＡＲＳＰＴＳ  ＰＶＰＶＰＶＭ」（配列番号２２）を有する。例示は、ペプチドＧＲＳＧＥＮ（配列番号２３）およびＰＣＧＲＳＧＥＮ（配列番号２４）、ならびに改変ペプチドＧｋＳＧＥＮ（配列番号２５）である。
【０１０９】
δＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインは、アミノ酸配列：「ＰＫＶＫＳＰＲＤＹ  ＳＮＦＤＱＥＦＬＮＥ  ＫＡＲＬＳＹＳＤＫＮＬＩＤＳＭＤＱＳＡＦ  ＡＧＦＳＦＶＮＰＫＦ  ＥＨＬＬＥＤ」（配列番号２６）を有する。例示的なペプチドとしては、アミノ酸残基６２４〜６３１から得られたＶＫＳＰＲＤＹＳ（配列番号２７）、ＰＫＶＫＳＰＲＤＹ  ＳＮ（配列番号２８）、ならびに改変ペプチドＶＫＳＰｃＲＤＹＳ（配列番号２９）およびｉＫＳＰＲｌＹＳ（配列番号３０）が挙げられる。除かれるのは、ペプチドＫＮＬＩＤＳ（配列番号３１）である。
【０１１０】
εＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインは、アミノ酸配列：「ＰＲＩＫＴＫＲＤＶＮＮＦＤＱＤＦＴＲＥＥＰＶＬＴＬＶＤＥＡＩＶＫＱＩ  ＮＱＥＥＦＫＧＦＳＹＦＧＥＤＬＭＰ」（配列番号３２）を有する。例示的なペプチドとしては、アミノ酸残基６８９〜６９５から得られたＩＫＴＫＲＤＶ（配列番号３３）およびＴＫＲＤＶＮＮＦＤＱ（配列番号３４）、ならびに改変ペプチドｃＥＡＩＶＫＱ（配列番号３５）およびＩＫＴＫＲｌｉ（配列番号３６）。除かれるのは、ペプチドＥＡＩＶＫＱ（配列番号３７）である。
【０１１１】
ηＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインは、アミノ酸配列：「ＰＲＩＫＳＲＥＤＶ  ＳＮＦＤＰＤＦＩＫＥ  ＥＰＶＬＴＰＩＤＥＧＨＬＰＭＩＮＱＤＥＦ  ＲＮＦＳＹＶＳＰＥＬ  ＱＰ」（配列番号３８）を有する。例示的なペプチドとしては、アミノ酸残基６３４〜６４１から得られたＩＫＳＲＥＤＶＳ（配列番号３９）、およびＰＲＩＫＳＲＥＤＶ（配列番号４０）、ならびに改変ペプチドｖｒＳＲＥＤＶＳ（配列番号４１）およびＥＧＨｄＰＭ（配列番号４２）が挙げられる。除かれるのは、ペプチドＥＧＨＬＰＭ（配列番号４３）である。
【０１１２】
ιＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインは、アミノ酸配列：「ＰＮＩＳＧＥＦＧＬ  ＤＮＦＤＳＱＦＴＮＥＰＶＱＬＴＰＤＤＤＤ  ＩＶＲＫＩＤＱＳＥＦ  ＥＧＦＥＹＩＮＰＬＬ  ＭＳＡＥＥＣＶ」（配列番号４４）を有する。例示的なペプチドとしては、アミノ酸残基５３４〜５４１から得たＩＳＧＥＦＧＬＤ（配列番号４５）およびＤＤＤＩＶＲＫ（配列番号４６）、ならびに改変ペプチドｃＳＧＥＦＧＬＤ（配列番号４７）が挙げられる。除かれるのは、ペプチドＤＤＩＶＲＫ（配列番号４８）である。
【０１１３】
μＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインは、以下のアミノ酸配列を有する：
【０１１４】
【化１】
2005523326.tif 000002
例示的なペプチドとしては、アミノ酸残基７２３〜７３０から得たＶＫＬＣＤＦＧＦ（配列番号５０）、およびＱＶＫＬＣＤＦＧＦＡ（配列番号５１）、ならびに改変ペプチドｉｒＬＣＤＦａＦ（配列番号５２）が挙げられる。
【０１１５】
θＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインは、アミノ酸配列：「ＰＫＶＫＳＰＦＤ  ＣＳＮＦＤＫＥＦＬＮ  ＥＫＰＲＬＳＦＡＤＲＡＬＩＮＳＭＤＱＮＭ  ＦＲＮＦＳＦＭＮＰＧ  ＭＥＲＬＩＳ」（配列番号５３）を有する。例示的なペプチドとしては、アミノ酸残基６５５〜６６２から得たＶＫＳＰＦＤＣＳ（配列番号５４）、およびＤＲＡＬＩＮＳ（配列番号５５）、ならびに改変ペプチドＶｒＳＰＦＤＣＳ（配列番号５６）が挙げられる。除かれるのは、ペプチドＲＡＬＩＮＳ（配列番号５７）である。
【０１１６】
ξＰＫＣアイソザイムのＶ５ドメインは、アミノ酸配列：「ＰＱＩＴ  ＤＤＹＧＬＤＮＦＤＴ  ＱＦＴＳＥＰＶＱＬＴＰＤＤＥＤＡＩＫＲＩ  ＤＱＳＥＦＥＧＦＥＹ  ＩＮＰＬＬＬＳＴＥＥ  ＳＶ」（配列番号５８）を有する。例示的なペプチドとしては、アミノ酸残基５３９〜５４６から得たＩＴＤＤＹＧＬＤ（配列番号５９）、およびＤＤＹＧＬＤＮ（配列番号６０）、ならびに改変ペプチドＩＴＤＤＹＧｄｌ（配列番号６１）およびＥＤＡＩＲ（配列番号６２）が挙げられる。除かれるのは、ペプチドＥＤＡＩＫＲ（配列番号６３）である。
【０１１７】
また除かれるのは、米国特許第５，７８３，４０５号においてμＰＫＣ  Ｖ５ペプチド「μＶ５−１」と同定されるペプチドＳＤＳＰＥＡ（配列番号６４）である。
【０１１８】
上記に記載した例示的なフラグメントの全てにおいて、認められるほどには活性を改変しない、保存的改変体および他の改変体が作製され得、そして意図されるペプチド内に入る。
【０１１９】
好ましいのは、以下の群のペプチドである：配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２（必要に応じて、所望の活性を保持する、それらの全ての改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせおよびハイブリッドを包含する）。
【０１２０】
より好ましいのは、以下の群のペプチドである：配列番号２、配列番号７、配列番号８、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４５、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５９および配列番号６０（必要に応じて、所望の活性を保持する、それらの全ての改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせおよびハイブリッドを包含する。
【０１２１】
なおより好ましいのは、以下の群のペプチドである：配列番号２、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５４および配列番号５９（必要に応じて、所望の活性を保持する、それらの全ての改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせおよびハイブリッドを包含する）。
【０１２２】
同様に好ましいのは、以下の群のペプチドである：配列番号２、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５４および配列番号５９（必要に応じて、所望の活性を保持する、それらの全ての改変体、誘導体、フラグメント、組み合わせおよびハイブリッドを包含する）。
【０１２３】
（有用性）
（治療適応症）
本発明のＰＫＣアイソザイム特異的Ｖ５ペプチドは、それらが由来するアイソザイムに対して選択的であるＰＫＣのモジュレータとして有用である。その点について、これらのペプチドは、以下を含む、特定のＰＫＣアイソザイムに関連した、哺乳動物（特に、ヒト）の疾患状態の処置において用いられ得る：αＰＫＣ（過剰増殖性細胞疾患（例えば、癌）；βＩＰＫＣおよびβＩＩＰＫＣ（心肥大および心不全）；γＰＫＣ（疼痛管理）；δＰＫＣ（組織を虚血事象または低酸素性事象（例えば、心筋梗塞および発作）に起因した損傷、またはＵＶ照射によって誘導されるアポトーシスから保護し、そして瘢痕のない創傷治癒を促進するために線維芽細胞増殖を阻害する）；εＰＫＣ（疼痛管理、心筋機能不全）；θＰＫＣ（免疫系の調節（特に、Ｔ細胞媒介応答を含む））；およびζＰＫＣ（記憶および刺激線維芽細胞増殖）。
【０１２４】
例として、疼痛は、医師によって認められる基本的臨床症状であり、しばしば、軽度、中程度または重度に分類される。本明細書中に記載されるγＰＫＣペプチドおよびεＰＫＣペプチドは、これらの任意のカテゴリーにおいて、疼痛の処置に適切である。例えば、癌および手術後外科的疼痛は、中程度から重度の分類であるとしばしば記載される。骨、神経、軟組織、または内臓の腫瘍浸潤は、癌疼痛の一般的原因である。種々の因子（例えば、腫瘍の型、状態、および部位、ならびに患者の変動要因）は、患者における癌疼痛の有病率に影響を与える。手術後疼痛に関して、疼痛の重篤度はしばしば、介入の位置および程度に依存する。
【０１２５】
より詳細には、γＰＫＣペプチドおよびεＰＫＣペプチドは、例えば、神経障害状態または炎症状態によって引き起こされる、急性または慢性の疼痛の処置に適している。処置が意図される例示的な炎症状態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：日焼け、変形性関節症、大腸炎、心臓炎、皮膚炎、筋炎（ｍｙｏｓｔｉｓ）、神経炎、および慢性関節リウマチ、狼瘡および他のコラーゲン血管疾患、ならびに手術後外科的疼痛。神経障害疼痛に関連した状態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：外傷、外科手術、切断、膿瘍、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール症、発作、視床疼痛症候群、糖尿病、ヘルペス感染など。
【０１２６】
炎症および神経損傷は、痛覚過敏を誘導し得、ここで、有害刺激が、疼痛の閾値の低下に起因して、激しく有痛であると知覚される。従って、疼痛の処置に取り組む実施形態では、本発明は、患者における痛覚過敏を処置するための組成物および方法を意図する。さらに、本発明は、被験体における異痛症を処置する（すなわち、通常無害の刺激に関連した疼痛を処置する）ための組成物および方法を意図する。
【０１２７】
（同定方法における使用）
本発明の有用性の別の局面は、（例えば、本明細書中に記載されるペプチドを、これらのペプチドの活性を模倣する化合物の同定のための調査ツールとして用いることにより）疼痛を調節する化合物を同定する方法である。本発明はまた、これらのペプチドの作用部位を検出するためのアッセイにおける、またはこれらのペプチドの作用機構についての研究における、ペプチドの使用を意図する。これらのペプチドの活性を模倣する化合物を同定する際に、これらのペプチドが結合する細胞レセプターに結合し得るかさもなければこれらのペプチドと同様の生理学的様式で作用し得る化合物は、いくつかの技術によって同定され得る。例えば、１つの方法は、本発明のＰＫＣペプチドの活性を決定する生物学的アッセイに試験化合物を添加し、そして試験化合物の活性を検出することを包含する。あるいは、ＰＫＣアイソザイムの活性を調節する試験化合物は、アッセイを用いて決定され得、次いで対応する治療活性について試験され得る。
【０１２８】
例えば、競合的結合スクリーニングアッセイは、試験化合物および検出可能に標識された本発明のペプチドを、このペプチドの結合を可能にする条件下で、哺乳動物の細胞、組織または適切なＲＡＣＫへと添加し、そして結果を細胞、組織またはＲＡＣＫに対する（試験化合物なしの）標識ペプチドの結合に対して比較することにより、ＰＫＣアイソザイムの活性を模倣する化合物を同定するために用いられ得る。ペプチドの活性を模倣する化合物は、細胞、組織またはＲＡＣＫへの結合について、このペプチドと競合し得る。その結果、レセプターに結合することによって試験化合物がこのペプチドの活性を模倣する場合、（試験化合物がペプチドの活性を模倣せず、レセプターに結合せず、しかも親和性がより低い場合の遊離およびＲＡＣＫ結合標識ペプチドの量と比較して）より少量のＲＡＣＫに結合した標識ペプチド（またはより多量のＲＡＣＫ未結合標識ペプチド）が測定される。
【０１２９】
一般に、ＰＫＣアイソザイムの活性を模倣する化合物の同定は、試験化合物が、対応するＰＫＣアイソザイムの活性を阻害、増強または調節する能力を測定することにより、同定される。選択されたアッセイにおけるＰＫＣアイソザイムの活性は、試験化合物の存在下および不存在下において測定される。このアッセイは、競合的結合アッセイ（例えば、上記の通り）または第２メッセンジャーの産生調節、細胞代謝の変化、もしくは酵素活性に対する影響をモニタリングする細胞アッセイであり得る。次いで、ＰＫＣアイソザイムの活性を模倣または調節すると同定される化合物は、対応するインビボ疾患モデルを用いて、治療活性について試験される。
【０１３０】
（試験）
本発明のペプチドの活性は、上記の適応症の処置における効力の、確立されたインビトロアッセイおよびインビボアッセイのいずれかを用いて決定され得る。もちろん、最終的には、安全性および効力が、制御されたヒト臨床研究において決定される。
【０１３１】
代表的試験プロトコルは、疼痛の処置についての活性および虚血の処置についての活性を決定する状況について以下にまとめられる。他のＰＫＣ  Ｖ５ペプチド適応症についての試験プロトコルは、当業者に周知である。
【０１３２】
（疼痛管理についてＰＫＣペプチドによって例示されるＶ５ドメイン活性）
ＰＫＣペプチドが侵害受容を調節する効果は、カプサイシンまたはホルマリンによって誘導される急性炎症性疼痛のモデルを用いて調査される。これらのモデルおよび有害刺激に対する感受性の長期上昇を有する他のモデルは、特定のヒト病理学的疼痛をモデル化する際に有用であり得る。炎症のカプサイシンモデルは、低速熱試験とともに、慢性疼痛から生じる主な感作および痛覚過敏を模倣する。皮膚へのカプサイシンの塗布は、低加熱速度熱試験の間の足引っ込め潜在時間の顕著な低下によって示される、頑強な、何時間にもわたる、Ｃ線維選択的痛覚過敏を生じる。カプサイシンは、香辛料の利いた「辛い」食品における活性成分である。カプサイシンについてのレセプター（Ｃ線維上に見出されるＶＲ−１バニロイド（ｖａｎｉｌｌｏｉｄ）レセプター）は、近年クローニングされた。これは、リガンドゲートの非選択的カチオンチャネルである。カプサイシンに応答することに加えて、ＶＲ−１はまた、熱刺激（約４３℃）（Ｋｉｄｄ  Ｂ．Ｌ．ら，Ｂｒ．Ｊ．Ａｎａｅｓｔｈ．，８７（１）：３−１１（２００１））およびプロトンにも応答する。このことは、その活性が炎症の間に増強されることを示唆する。カプサイシンは、Ｃ線維に対して選択的に活性化および感作し、Ａδに対してはそうでないことが示されている。それゆえ、Ａδ潜伏時間の測定値は、研究の間の動物の幸福についてのコントロールとして用いられる。
【０１３３】
齧歯動物におけるホルマリンモデルは、ヒトにおける損傷誘導性疼痛を処置する際の予測試験として確認されている（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｓ．Ｇ．およびＭｅｌｚａｃｋ，Ｒ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，第３巻，７４７，Ｊ．Ｊ．Ｂｏｎｉｃａら編，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９；Ｔｊｏｌｓｅｎ，Ａ．ら，Ｐａｉｎ，５１：５−１７（１９９２））。このモデルは、二期応答を生じ、ここで、第１期は、化学的侵害受容器がメディエータであること以外は、急性期試験について記載されている特徴と特徴が類似して、一次求心性バレッジによって誘発される。第２期は、初期組織損傷から生じる痛覚過敏自然活性であると考えられ、侵害受容閾値の低下および対応する脊髄回路の起動または「興奮」を反映する。従って、末梢ニューロン回路および中枢ニューロン回路ならびにメディエータの両方とも、この有痛性組織損傷状態を誘導して維持するために必要とされる。
【０１３４】
上記の通りに試験された場合、γＰＫＣ  Ｖ５ペプチドおよびεＰＫＣ  Ｖ５ペプチドは、疼痛における実質的低減を付与する。
【０１３５】
（虚血についてＰＫＣペプチドによって例示されるＶ５ドメイン活性）
単離されたラット心筋細胞への投与は、虚血からの保護におけるδＰＫＣペプチドの活性を決定するために用いられ得る。ペプチドまたはキャリア−ペプチド結合体は、単離された成体ラット心筋細胞へと、長期虚血の１０分前に導入される。細胞損傷は、トリパンブルーの取り込みを測定することによる、浸透圧脆弱性試験を用いて評価される。
【０１３６】
エクスビボでの心臓全体への投与は、器官全体へと細胞外導入された場合、ペプチドが活性を有するか否かを決定するために用いられ得る。キャリアペプチドであるＴａｔ由来ペプチドへと必要に応じて結合体化されたペプチドは、虚血期間の誘導の前に、ランゲルドルフ灌流ラット心臓へと送達される。これらのペプチドを用いた灌流の後、全体的虚血が３０分間もたらされる。３０分間の虚血後、放出されたクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の量が、３０分間の再灌流期間の間、モニタリングされる。
【０１３７】
別の研究は、これらのペプチドがインタクトな器官へと送達されて、虚血傷害後に防御を提供し得るか否かを決定する。この研究において、上記のラット心臓モデルが用いられ、そして血流力学パラメーターが、２０分間の全体的虚血および２０分間の再灌流の間に測定される。試験ペプチドは、再灌流期間の間のみ、５００ｎＭの濃度にて送達される。
【０１３８】
組織を、虚血性事象または低酸素自称に起因する損傷から保護することは、ペプチドを成体雌性ブタに（好ましくは、３０分間の虚血性損傷の最後の１０分間の間に）インビボで投与することにより、評価され得る。５日後、心臓が組織損傷に関して分析される。
【０１３９】
別の研究では、左心室図（ｖｅｎｔｒｉｃｕｒｏｇｒａｍ）を、ブタ（ｎ＝５）において、３つの時点で行う：（１）バルーンカテーテルによる左前室間動脈の閉塞前（虚血前）；（２）２．５μＭ／１０ｍＬのδＶ１−１を用いた再灌流直後（虚血後）；および（３）６Ｆｒ．のピッグテイルカテーテルを用いた５日後の屠殺前（虚血後５日後）。ＬＶＧは、２視野（右前斜めおよび左前斜め）によって記録される。左心室に存在する総最大量値に対する最大収縮の間の駆出率（ＥＦ）（１拍動において駆出された血液のパーセント）は、ソフトウェアＰｌｕｓ  Ｐｌｕｓ（Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析され、そして２視野の平均が評価される。駆出率は、左心室の寸法に基づいて計算される。駆出率は、心臓がどれくらい良好に機能しているかの尺度であり、より高い駆出率は、より良好に機能する心臓の指標である。短期間における５０％未満の駆出率は、心不全の状態への進行を示唆し得る。
【０１４０】
発作の結果としての脳に対する損傷の阻害は、ラットの大脳虚血モデルにおいて調べられ得る。虚血は、管内縫合を用いて中脳動脈の口を閉塞させることで誘導される。Ｔａｔペプチドへ必要に応じて結合体化された試験ペプチドまたはＴａｔペプチド単独は、２時間の閉塞期間の前および後に頸動脈へと注射される。各動物からの脳は、２４時間後に収集され、染色され、そして調べられる。
【０１４１】
上記の通りに試験された場合、δＰＫＣ  Ｖ５ペプチドは、虚血の前、間または後に送達された場合、虚血によって誘導される心臓および脳に対する損傷の実質的低減を付与する。
【０１４２】
（投与）
これらのペプチドは、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と合わせることにより、投与のために調製される。従って、本発明のさらなる局面は、本発明のペプチドを含む薬学的組成物を、被験体への投与のための投薬形態で提供する。このような投薬形態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：経口投与のための、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤（ここで、適切な薬学的キャリアとしては、デンプン、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、水溶液、油−水乳濁剤などが挙げられる）。他の投薬形態としては、髄腔内、静脈内、筋肉内、皮下が挙げられ、ここで、適切な薬学的キャリアとしては、緩衝化水性媒体または非水性媒体が挙げられる。これらのペプチドは、（例えば、炎症部位付近または末梢神経損傷部位付近に）（例えば、局所適用、皮内注射または薬物送達カテーテルによって）局所投与され得る。
【０１４３】
組成物中のこれらのペプチドの量は、適切な用量が得られて治療効果が達成されるように変化され得る。投薬量は、多数の因子（例えば、投与経路、処置の持続時間、患者のサイズおよび身体状態、このペプチドの効力および患者の応答）に依存する。このペプチドの有効量は、このペプチドを、本明細書中に記載されるモデルを含め、当該分野で公知の１以上のモデルにおいて試験することにより、決定され得る。
【０１４４】
これらのペプチドは、毎時間、１日あたり数回、毎日、または疼痛を経験している人またはその人の医師が適切とみなす頻度で、必要に応じて投与され得る。これらのペプチドは、慢性適応症の継続中の管理に基づいて投与され得るか、または急性適応症の後の前に短時間に基づいて投与され得る。
【０１４５】
本発明のペプチドは、単独で、またはキャリアペプチド（例えば、Ｔａｔキャリアペプチド（このうち、配列番号６５と同定される配列を有するこのペプチドが例示的である））に連結されて、投与され得る。他の適切なキャリアペプチド（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン（配列番号６６；Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：７１５８（１９９５）；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９：１０８６（１９９６ｂ））は、公知であり、そして意図され、ここで、ＰＫＣペプチドは、Ｎ末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を介してＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａキャリアへと架橋される。ポリアルギニンは、別の例示的なキャリアペプチドである（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．，５６：３１８−３２５（２０００）；Ｒｏｌｈｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，６：１２５３−１２５７（２０００））。
【実施例】
【０１４６】
以下の実施例は、本明細書中に記載される発明をさらに例示し、そして本発明の範囲を限定することを決して意図しない。
【０１４７】
（実施例１：カプサイシン誘発性侵害受容に対するＰＫＣペプチドの影響）
成体雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００ｇ〜２５０ｇの間の体重）に、ウレタン（８００ｍｇ．ｋｇ、ｉ．ｐ．）を用いて軽く麻酔する。各動物の背表面に、墨を塗布して、背表面に熱が均質的に適用されることを確実にする。全ての動物（ｎ＝１０／試験群）のベースライン測定値を、Ｃ線維（０．９℃／秒加熱速度）およびＡδ線維（６．５℃／秒加熱速度）の両方に関して４５分間採取する。投与されたこれらのペプチドは、このアッセイにおいて以前に活性であると同定された、アミノ酸配列ＥＡＩＶＫＱ（配列番号３７）を有するポジティブコントロールのεＰＫＣアンタゴニスト、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５として同定されるγＰＫＣペプチド、ならびに配列番号３３、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６として同定されるεＰＫＣペプチドである。全てのペプチドは、Ｔａｔキャリアペプチドへと連結され、このうち、配列番号６５と同定される配列は、例示的である。第２のシリーズのこれらのペプチドは、キャリアなしで試験される。コントロールペプチドおよび試験ペプチドは、左後肢でのカプサイシン（１００μＬの３％カプサイシン）の局所投与の１５分前に、直接腰椎穿刺（２０μＬ中の１０μＭペプチド）を介して髄腔内送達される。ネガティブコントロールとして、生理食塩水およびＴａｔ−キャリアペプチドもまた、２つの別の群の試験動物へと投与する。潜伏時間測定は、直接的なペプチド効果についてのコントロールのために、ペプチド後だがカプサイシン適用前に行われる。カプサイシンの適用の２０分後、このインクが再度適用され、そして後足の背側表面は、低速加熱に最大２０秒間供される。足引っ込め潜伏時間を、１５分間の間隔で測定する。εＰＫＣ試験ペプチドおよびγＰＫＣ試験ペプチドは、ネガティブコントロールパップ（ｐｕｐ）と比較して、疼痛スコアの低下をもたらす。
【０１４８】
（実施例２：既存のカプサイシン誘発性侵害受容に対するＰＫＣペプチドの影響）
既存の慢性疼痛の処置のためのγＰＫＣペプチドおよびεＰＫＣペプチドの試験を以下の通りに行う。このペプチドが、確立されたカプサイシン誘発性熱痛覚過敏を逆転させる能力を、試験ペプチドを、試験ペプチドの種々の濃度（１μＭ、５０μＭ、および１００μＭ）で、２５分間のカプサイシン後処置に開始する１０分間の期間にわたって投与する（すなわち、カプサイシンは、ベースライン測定の後に投与される）こと以外は、実施例１に記載の手順を用いて決定する。次いで、熱試験を、実施例１に記載の通りに行う。カプサイシン適用の３０分後、足引っ込め潜伏時間を、定期的間隔で７５分間測定した。εＰＫＣ試験ペプチドおよびγＰＫＣ試験ペプチドは、ネガティブコントロールパップ（ｐｕｐ）と比較して、疼痛スコアの低下をもたらす。
【０１４９】
（実施例３：δＰＫＣトランスロケーションの阻害）
（Ａ．ペプチド調製）
δＶ５  ＰＫＣペプチド（配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０）を合成し、そして精製する。これらのペプチドを、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン（Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｌ．ら；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，１９９６ｂ）またはＴａｔ由来ペプチドへのＮ末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を介した架橋により、キャリアペプチドを用いて改変する。
【０１５０】
（Ｂ．細胞へのペプチド送達）
初代心筋細胞培養物（９０％〜９５％純粋）を、新生仔ラットから調製する（Ｇｒａｙ，Ｍ．Ｏ．ら；Ｄｉｓａｔｎｉｋ  Ｍ．−Ｈ．ら）。これらのペプチドを、１０〜２０分間にわたる、それぞれ、３ｎｍおよび１０ｎｍの濃度のホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）の存在下および不存在下にて５００ｎＭの適用濃度で、細胞へと導入する。第３セットの細胞では、これらのペプチドを、５００ｎＭ  ψδＲＡＣＫの存在下および不存在下にて、５００ｎＭの濃度で適用する。
【０１５１】
δＰＫＣアイソザイムのトランスロケーションを、ウェスタンブロット分析（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）においてδＰＫＣアイソザイム特異的抗体を用いることにより評価する。処理した細胞の細胞質ゾル画分および粒状画分のウェスタンブロット分析を、Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９５によって記載される通りに実施する。δＰＫＣアイソザイムの細胞下局在を、抗δＰＫＣ抗体、抗αＰＫＣ抗体および抗εＰＫＣ抗体を用いてプローブしたブロットの化学発光によって評価する。各画分におけるＰＫＣアイソザイムの量を、スキャナを用いて定量し、そしてトランスロケーションを、非処理細胞におけるアイソザイムの量に対する粒状画分におけるアイソザイムの量として表す。δＰＫＣアイソザイムのトランスロケーションにおける変化をまた、処理して固定した細胞の細胞免疫蛍光研究（Ｇｒａｙら，１９９７）によって決定する。トランスロケーションを、盲検様式で、１００細胞／処置について計数することによって決定する。
【０１５２】
上記の通りに試験した場合、δＶ５  ＰＫＣペプチドは、δＰＫＣトランスロケーションの活性なインヒビターである。
【０１５３】
（実施例４：単離された心筋細胞に対するペプチド投与）
これらのペプチドを、実施例３に記載の通りに調製する。
【０１５４】
成体雄性Ｗｉｓｔａｒラットの心筋細胞を、コラゲナーゼ処理（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｓ．ら）により、ランゲルドルフ装置（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅ，Ｒ．Ｓ．ら）上に調製する。これらの細胞を、１μＭのψδＲＡＣＫの存在下または不存在下において１０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、および１μＭの濃度でペプチドを用いて処理する。βＰＫＣ選択的アクチベータをまた、コントロールとして用いた。
【０１５５】
刺激された虚血に関して、キャリアに対して結合体化されたδＶ１−１ペプチドおよび／またはψδＲＡＣＫペプチドを用いて微量遠心管中で処理した成体筋細胞を、脱気した無グルコースインキュベーション緩衝液で２回洗浄し、そしてペレット化させる。最少量の緩衝液の頂部に、マイクロバルーン（Ｓｉｇ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｍｏｎｔｅｚｕｍａ，ＩＡ）または脱気して窒素で飽和した緩衝液のいずれかを用いて、細胞ペレットを重層し、そして気密トップを用いてシールする。次いで、チューブを、３７℃にて１８０分間または９０分間のいずれかでインキュベートする。
【０１５６】
細胞損傷を、低張性（８５ｍｏｓＭ）溶液中に添加したトリパンブルーの取り込みを測定することにより、浸透圧脆弱性試験によって評価する。同様の結果をまた、生死キット（ｌｉｖｅ−ｄｅａｄ  ｋｉｔ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いることにより、または以前（Ｃｈｅｎら，１９９９；Ｇｒａｙら，１９９７；Ｍａｃｋａｙら，１９９９）に記載された通りにキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて培地中へのラクトースデヒドロゲナーゼの放出を測定することにより、得る。
【０１５７】
δＶ５  ＰＫＣペプチドは、上記の通りに試験した場合、虚血損傷を阻害する。
【０１５８】
（実施例５：心臓全体へのエキソビボペプチド投与および細胞損傷に対する影響）
成体雄性ラットにｉ．ｐ．アベルチン（ａｖｅｒｔｉｎ）で麻酔をかけ、そしてそれらの心臓を迅速に取り出し、そしてランゲルドルフセットアップを用いて、当該分野（Ｃｏｌｂｅｒｔ，Ｍ．Ｃ．ら）で記載される通りの灌流のために大動脈を介してカニューレ挿入する。心臓を、取り出して９０秒以内に灌流するように注意する。これらの心臓に、ＮａＣｌ  １２０；ＫＣｌ  ５．８；ＮａＨＣＯ３  ２５；ＮａＨ２Ｏ４  １．２；ＭｇＳＯ４  １．２；ＣａＣｌ２  １．０；およびデキストロース１０（３７℃にてｐＨ７．４）（ｎｍｏｌ／Ｌ）を含む酸素化Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液を灌流する。
【０１５９】
１０〜２０分間の平衡化期間の後、心臓を、Ｔａｔ誘導体化ペプチドに結合体化されたこと以外は実施例１に記載された通りに調製したδＶ５  ＰＫＣペプチドで２０分間灌流する。灌流を、０．５μＭの適切なペプチドを含むＫｒｅｂｓ−Ｈａｎｓｅｌｅｉｔ溶液を用いて１０ｍＬ／分の一定の流れで維持する。用いたランゲルドルフ法は、心室から大動脈へと入り、そして肺動脈を迂回して、冠状動脈へと入る逆向性の流れを用いる。
【０１６０】
全体的虚血を誘導するために、流れを３０分間中断させる。虚血事象の後、これらの心臓を３０〜６０分間再灌流する。再灌流の間、虚血誘発性細胞損傷を、Ｓｉｇｍａキットを用いて灌流液においてクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）（５２０ｎｍでの吸光度）の活性を測定することにより決定する。コントロールとして、いくつかのエキソビボ心臓を未処置のままにするか、または酸素正常状態条件下で維持するか、またはＴａｔ−キャリアペプチド単独を用いて処置するか、または以前に同定された不活性ペプチドへと結合体化されたＴａｔ−キャリアペプチドを用いて処置する。
【０１６１】
これらのδＶ５  ＰＫＣペプチドは、上記の通りに試験した場合、虚血損傷を阻害する。
【０１６２】
（実施例６：虚血後のδＶ１−１のインビボ投与）
成体雌性ブタ（体重３５〜４０ｋｇ）に麻酔をかけ、そしてカテーテルを、頸動脈を通して心臓へと導入する。従来の介入心臓学技術を用いて、ワイアをカテーテルを介して、そして左前室間動脈内に配置する。バルーンをこのワイヤ上を閉塞部位へと走らせ、次いで、閉塞部位において膨張させて、血流を３０分間ブロックする。この３０分間の閉塞のうちの最後の１０分間の間に、キャリアペプチド単独を含むコントロールまたは試験ペプチド（必要に応じて、上記のキャリアＴａｔペプチドへと結合体化される）のいずれかを、ゆっくりとして拡散（１ｍＬ／分）によって、閉塞の下流に直接的に送達する。約２０μｇの試験ペプチド（体重１ｋｇあたり約４００ｎｇ）を投与する。
【０１６３】
３０分間の閉塞後、このバルーンを除去し、そしてブタを、手術から回復させる。５日後、ブタを安楽死させ、そして心臓を収集する。心臓除去後、ＬＡＤを閉塞させる。適所での閉塞を用いて、Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ色素（これは、梗塞の危険性がない全ての領域を青色に染色し、一方、血流と接近しない全ての領域を赤色のままにする）を灌流する。次いで、心臓をスライスに切断し、そしてテトラゾリウム赤色色素（これは、全ての生存領域を赤色に染色し、梗塞を起こした死んだ組織を白色に染色する）で染色する。各心臓は、複数の組織スライスを有し、独特の領域が、虚血についての危険性のある領域および梗塞を起こした領域と一致する。このことから、各スライスおよび心臓全体についての危険性のある領域あたりの梗塞のパーセントを決定する。
【０１６４】
δＶ５  ＰＫＣペプチドは、上記の通りに試験した場合、虚血損傷を阻害する。
【０１６５】
（実施例７：発作損傷保護についての、ラットへのインビボ投与）
（Ａ．大脳虚血モデル）
成体雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２８０〜３２０ｇの間の体重）を用いる。動物を、全ての手術手順の間、イソフルラン麻酔下で維持する。生理学的パラメータをモニタリングし、そして正常範囲内に維持する。直腸温度もまた測定する。この実験の完了時、これらの動物を過用量のバルビツレートで安楽死させ、そして組織学的分析のために調製する。
【０１６６】
（Ｂ．病巣モデル）
虚血を、管内閉塞縫合を用いて誘導する。炎によって先端を丸めた、３−０ナイロンモノフィラメント縫合のコーティングしていない３０ｍｍの長さのセグメントを、総頸動脈の断端へと挿入し、そして中大脳動脈の口を閉塞させるために、分岐から約１９〜２０ｍｍの内部頸動脈へと前進させる。偽コントロール動物は、類似の麻酔および外科的操作を経るが、虚血を経験しない。２時間の虚血期間の最後に、この縫合を除去し、そして動物を回復させる。脳を再灌流の２４時間後に収集する。
【０１６７】
（Ｃ．ペプチド送達）
Ｔａｔペプチドへと必要に応じて結合体化された試験ペプチド、またはＴａｔキャリアコントロールペプチド（５０μＬ生理食塩水中１０μＭ溶液）を、２時間の閉塞の直前に、または２時間の閉塞の前および後のいずれかにおいて、頸動脈中に注射する。試験ペプチドの最終血液濃度は、１μＭである。
【０１６８】
（Ｄ．組織学）
動物を、ヘパリン処理生理食塩水で灌流し、そして脳を取り出し、そして２ｍｍの厚さのスライスに切片化する。虚血傷害を評価するために、脳切片を、クレシルバイオレットまたはトリフェニルテトラゾリウムクロリド（梗塞の領域を示すための生組織染料）で染色する。次いで、梗塞（白色）の領域を、以前（Ｙｅｎａｒｉ，Ｍ．Ａ．ら，１９９８；Ｍａｉｅｒ，Ｃ．ら，１９９８）に記載された画像解析システムを用いて測定する。
【０１６９】
δＶ５  ＰＫＣペプチドは、上記の通りに試験した場合、虚血損傷を阻害する。
【０１７０】
本発明を、本発明の特定の実施形態を参照して記載してきたが、種々の変更が行われ得、そして等価物が、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく置換され得ることが当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスの工程を、本発明の目的、趣旨および範囲に適応させるために、多くの改変がなされ得る。このような全ての改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。上記に引用した全ての特許および刊行物は、本明細書中に参考として援用される。
【国際調査報告】
2005523326.tif 000003