(57)【要約】式（１）：2005536504.tif 000018［式中Ｒ１は−ＣＨ３，−（ＣＨ２）３ＣＨ３，−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ，−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３，−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ，−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３，式（ＩＩ）の基である］のフェニルアラニンエナミド誘導体、及びその塩、溶媒和物及びＮ−オキシドを記述する。本発明の化合物はｏＡインテグリン類に有効で選択的な阻害物質である。この化合物は細胞接着の調節に有用であり、特に白血球の血管外遊出が関与する炎症を含む病気又は障害の予防及び治療に有用である。本発明はそのような使用及びそのような病気又は障害を治療するための医薬品を製造するためのこの化合物の使用に及ぶ。
2005536504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
2005536504.tif 000017
の化合物並びにその塩、溶媒和物及びＮ−オキシド。
【請求項２】
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソスピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸ブチル及びその塩、溶媒和物及びＮ−オキシドである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソスピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸ブチルである化合物。
【請求項４】
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソ−スピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸２−ヒドロキシエチル及びその塩、溶媒和物及びＮ−オキシドである請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソスピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸２−ヒドロキシエチルである化合物。
【請求項６】
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソスピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸メチル及びその塩、溶媒和物及びＮ−オキシドである請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソスピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸メチルである化合物。
【請求項８】
一つ又はそれ以上の医薬として受容しうる担体、賦形剤又は希釈剤と共に請求項１から７のいずれか一つに記載の化合物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多数のフェニルアラニンエナミドエステル（phenylalanine enamide esters）、それを含有する組成物、それらの製法、及び医薬品としてのそれらの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
この数年の間に、炎症性白血球の相互間及び体の他の細胞との相互作用が免疫及び炎症性応答の調節に重要な役割を演じていることが次第に明らかになってきている［Springer,T.A.,Nature,346,425,(1990);Springer,T.A.,Cell,76,301,(1994)］。細胞接着分子と総称される特定の細胞表面分子はこれ等の相互作用の多くを仲介する。
【０００３】
接着分子は、その構造に基づいて種々のグループに小分類されている。免疫及び炎症応答の調節において特に重要な役割を演じていると考えられている接着分子のファミリーは、インテグリンファミリーである。細胞表面糖タンパク質であるこのファミリーは、典型的な非共有結合性ヘテロ２量体構造を有している。少なくとも１６種の異なるインテグリンアルファ鎖及び８種の異なるインテグリンベータ鎖が確認されている［Newman,P.et al,Molecular Medicine Today,304,(1996)］。このファミリーのメンバーは、この分野では慣用名で広く知られているが、通常はそのヘテロ２量体の組成に従って命名される。したがってインテグリンα４β１はインテグリンベータ１鎖を伴うインテグリンアルファ４鎖からなるが、これはまた、広くＶｅｒｙ  Ｌａｔｅ抗原４又はＶＬＡ−４とも呼ばれている。インテグリンのアルファ鎖及びベータ鎖の可能な組み合わせの全てが実際に発見されているわけではないが、インテグリンファミリーは今までに認められている組合せに基づいて多数のサブグループに小分類されている［Sonnenberg,A.,Current Topics in Microbiology and Immunology,184,7,(1993)］。
【０００４】
正常な生理的応答においてインテグリン機能が重要であることは、インテグリン機能が失われている二種のヒト欠損症により脚光を浴びた。たとえば白血球粘着異常症（LAD）と呼ばれる病気では、白血球上に発現するインテグリンファミリーの一つが欠損している［Marlin,S.D.et al,J.Exp.Med.164,855,(1986)］。この病気に罹患した患者は、炎症部位へ白血球を動員する能力が減少し、極端な場合には致命的となることがある再発性の感染症に患わされる。Ｇｌａｎｚｍａｎ血小板減少症（ベータ３インテグリンファミリーメンバーの欠損）と呼ばれる病気に罹患した患者の場合では、血液凝固に異常がある［Hodivala-Dilke,K.M.,J.Clin.Invest.103,229,(1999)］。
【０００５】
細胞接着をうまく変化させるような方法でインテグリンの機能を調節する可能性については、これ等の分子の種々の機能を阻害する特異的抗体及びペプチドを使用して、動物モデルで詳細に検討されてきた［例えば、Issekutz,T.B.,J.Immunol.149,3394,(1992);Li,Z.et al,Am.J.Physiol.263,L723,(1992);Mitjans,F.et al,J.Cell Sci.108,2825,(1995);Brooks,P.C.et al,J. Clin.Invest.96,1815,(1995);Binns,R.M.et al,J.Immunol.157,4094(1996);Hammes,H.-P.et al,Nature Medicine 2,529,(1996);Srivata,S.et al,Cardiovascular Res.36,408(1997)］。特に抗α４β７−抗体は、炎症性腸疾患の非ヒト霊長類モデルにおいて臨床的にも組織学的にも炎症性活性及び病気の改善をもたらすことが実証されている［Hesterberg,P.E.et al,Gastroenterol,111,1373-80(1996)］。インテグリン機能を阻害する多数のモノクロナール抗体が、現在ヒトの病気における治療効果について検討されており、その一つ、ＲｅｏＰｒｏ、血小板インテグリンαＩＩｂβ３に対するキメラ抗体は、冠血管形成術後の心臓血管合併症の患者に使用する有効な抗血栓薬として使用されている。
【０００６】
インテグリンは、細胞表面及び細胞外マトリックスのいずれのリガンドも認識し、リガンド特異性は、その分子の特定のアルファ−ベータサブユニットの組合せにより決まる［Ｎｅｗｍａｎ，Ｐ．，前出］。興味あるインテグリンの一つの特別なサブグループは、二つの異なるβ鎖β１及びβ７と組合せを作るα４鎖を含んでいる［Sonnenberg,A.,前出］。α４β１の組合せは多数の循環白血球（例えば、リンパ球、単球、好酸球及び好塩基球）上で生じるが、循環好中球上には存在しないか又は低いレベルでのみ存在する。α４β１は炎症部位の内皮細胞上でしばしば上方調節されている接着分子（ＶＣＡＭ−１としても知られている血管細胞接着分子−１）に結合する［Osborne,L.,Cell,62,3,(1990)］。この分子はまた、マトリックス分子のフィブロネクチンの少なくとも３箇所に結合することが示されている［Humphries,M.J.et al,Ciba Foundation Symposium,189,177,(1995)］。動物モデルにおいてモノクロナール抗体を使用して得られたデータに基づき、α４β１と他の細胞及び細胞外マトリックス上のリガンドとの間の相互作用は、白血球の移動及び活性化において重要な役割を演じていると考えられている［Yednock,T.A.et al,Nature,356,63,(1992);Podolsky,D.K.et al,J.Clin.Invest.92,372,(1993);Abraham,W.M.et al,J.Clin.Invest.93,776,(1994)］。
【０００７】
α４及びβ７の組合せにより生じるインテグリンはＬＰＡＭ−１と命名されている［Holzmann,B.and Weissman,I.L.,EMBO J.8,1735,(1989)］。α４β７の組合せは、Ｔ及びＢリンパ球のあるサブグループ上及び好酸球上に発現する［Erle,D.J.et al,J.Immunol.153,517(1994)］。α４β１と同様に、α４β７はＶＣＡＭ−１及びフィブロネクチンに結合する。さらにα４β７は、胃腸粘膜のような粘膜組織への白血球のホーミングに関与すると考えられているＭＡｄＣＡＭ−１と呼ばれる接着分子に結合する［Berlin,C.et al,Cell,74,185,(1993)］。ＭＡｄＣＡＭ−１は胃腸管で選択的に発現する。α４β７及びＭＡｄＣＡＭ−１の間の相互作用は、粘膜組織外の炎症部位においても重要であると思われる［Yang,X.-D.et al,PNAS,91,12604,(1994)］。
【０００８】
α４Ｂ１及びα４β７がそのリガンドと結合する場合にα４β１及びα４β７によって認識されるペプチド配列の領域は同定されている。α４β１は、フィブロネクチン中のＬＤＶ，ＩＤＡ又はＲＥＤＶペプチド配列及びＶＣＡＭ−１中のＱＩＤＳＰ配列を認識すると思われ［Humphries,M.J.et al,前出］、その一方α４β７は、ＭＡｄＣＡＭ−１中のＬＤＴ配列を認識する［Birskin,M.J.et al,J.Immunol.156,719,(1996)］。これ等の短いペプチド配列の修飾により設計されたこれ等の相互作用に対する阻害物質についていくつかの報告がある［Cardarelli,P.M.et al,J.Biol.Chem.,269,18668,(1994);Shorff,H.N.et al,Biorganic Med.Chem.Lett.,6,2495,(1996);Vanderslice,P.et al,J.Immunol.,158,1710,(1997)］。フィブロネクチン中のα４β１結合部位に由来する短いペプチド配列がトリニトロクロロベンゼンで感作したマウスにおける接触過敏性反応を阻害できることも報告されている［Ferguson,T.A.,et al,PNAS,88,8072,(1991)］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
インテグリンのアルファ４サブグループは主に白血球上に発現するので、その阻害は多くの免疫性又は炎症性の病態において有益であることが期待される。しかし、インテグリンファミリーの他のメンバーはいたるところに存在し、それらによって実行される機能は広範囲に及ぶので、アルファ４サブグループの選択的阻害物質を同定できることが重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
我々は今回、α４インテグリンの有効で選択的な阻害物質である多数のエステルを見出した。この化合物は、例えば本明細で記述するような細胞アッセイにおいて、通常は他のサブグループのαインテグリンに対して阻害作用を有しないか又は極わずかしか有しない濃度でα４β１及び／又はα４β７のようなα４インテグリンを阻害することができる。
【００１１】
即ち、本発明の一態様によれば、式（１）の化合物：
2005536504.tif 000003
並びその塩、溶媒和物及びＮ−オキシドが提供される。
【００１２】
式（１）の化合物は、エナンチオマー又はジアステレオマーとして存在できることが理解される。本発明は、ラセミ化合物を含む、そのようなエナンチオマー、ジアステレオマー及びその混合物の全てに及ぶ。式（１）は、特別に記述しない限り、個別の異性体及びその混合物の全てを表すことを意図している。
【００１３】
本発明の化合物の塩は、医薬として受容しうる塩、例えば無機又は有機の酸に由来する酸付加塩を含む。
【００１４】
酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、アルキルスルホン酸塩（例えば、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、又はイソチオン酸塩）、アリールスルホン酸塩（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ベシレート又はナプシレート）、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩及び安息香酸塩がある。
【００１５】
本発明による化合物の特に有用な塩としては、医薬として受容しうる塩、特に医薬として受容しうる酸付加塩を含む。
【００１６】
本発明の化合物としては：
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソ−スピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸  ２−メトキシエチル並びにその塩、溶媒和物及びＮ−オキシド；
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソ−スピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸  ２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル並びにその塩、溶媒和物並びにＮ−オキシド；
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソ−スピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸  ２−（２−メトキシエトキシ）エチル並びにその塩、溶媒和物及びＮ−オキシド；
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソ−スピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸  ２−（モルホリン−４−イル）エチル並びにその塩、溶媒和物及びＮ−オキシド；
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソ−スピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸  ２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エチル並びにその塩、溶媒和物及びＮ−オキシドがあり、
【００１７】
特に：
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソ−スピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸  ブチル及びその塩、溶媒和物及びＮ−オキシド；
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソ−スピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸  ２−ヒドロキシエチル及びその塩、溶媒和物及びＮ−オキシド；
（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソ−スピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸  メチル及びその塩、溶媒和物及びＮ−オキシドがある。
【００１８】
本発明による化合物は、α４インテグリンの有効で選択的な阻害物質である。この様式で作用する化合物の知能は、後に示す実施例で記述されている細胞アッセイのような試験を使用することにより簡単に測定することができる。
【００１９】
この化合物は細胞接着を調節するのに有用であり、特に白血球の血管外遊出が関与する炎症を含む病気又は障害の予防及び治療に有用である。本発明はそのような使用並びに当該病気又は障害の治療のための薬剤を製造するためのその化合物の使用に及ぶ。
【００２０】
このタイプの病気又は障害としては、慢性関節リュウマチのような炎症性関節炎、血管炎又は多彩皮膚筋炎（polydermatomyositis）、多発性硬化症、同種移植片拒絶反応、糖尿病、乾癬又は皮膚炎のような炎症性皮膚病、喘息及び炎症性腸疾患がある。
【００２１】
病気の予防又は治療のために、本発明による化合物を医薬組成物として投与することができ、本発明の別の態様によれば、１又はそれ以上の医薬として受容しうる担体、賦形剤又は希釈剤と共に、式（１）の化合物を含有する医薬組成物が提供される。
【００２２】
本発明による医薬組成物は、経口、口腔、非経口、鼻腔、局所又は直腸投与に適した形態或いは吸入又は吹入（unsufflation）による投与に適した形態をとることができる。
【００２３】
経口投与用に、本発明による医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、ゼラチン化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉またはグリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬として受容しうる賦形剤を使用する通常の手段により調製される、錠剤、トローチ又はカプセルの形態を取ることができる。錠剤は当技術分野においてよく知られている方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液剤は、例えば、溶液、シロップ又は懸濁剤の形態をとることができ、或いは使用前に水やその他の適当な基剤と共に構成させるための乾燥製品として提供することもできる。そのような液体製剤は、懸濁剤、乳化剤、非水性基剤及び保存剤などの医薬として受容しうる添加物と共に通常の手段により調製することができる。製剤は適宜、緩衝性塩、矯臭剤、着色剤及び甘味剤を含ませることができる。
【００２４】
経口投与用の製剤は、活性化合物が制御放出されるように適切に製剤化することができる。
【００２５】
口腔投与用において、本発明による組成物は、通常の方法で製剤化された錠剤又はトローチの形態をとることができる。
【００２６】
式（１）の化合物は、例えば、ボーラス注射若しくは注入などの注射による非経口投与用に製剤化することができる。注射用の製剤は、例えば、硝子アンプルなどの単位投与量の形態或いは例えば、硝子バイアルなどの複数回投与容器で提供することができる。注射用の組成物は、油性若しくは水性の基剤中における懸濁剤、溶液又は乳剤のような形態をとることができ、懸濁剤、安定剤、保存剤及び／又は分散剤のような製剤用物質を含むことができる。そのほかに、活性成分を、使用前に適当な基剤、例えば、発熱物質を含まない滅菌水と共に構成させるための粉末形態にすることもできる。
【００２７】
上記の製剤に加えて、式（１）の化合物は、デポー製剤として製剤化することができる。そのような持続作用型製剤は、埋め目込み又は筋肉内注射により投与することができる。
【００２８】
鼻腔投与用又は吸入による投与用には、本発明に従って使用する化合物を、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロローフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適当なガスまたはガスの混合物などの適当な高圧ガスを使用する、加圧容器やネブライザーによるエアロゾル噴霧発生形態として供給するのが便利である。
【００２９】
望むならば、組成物は、活性成分を含有する単位投与量の１または複数を含む包装またはディスペンサーに入れて提供することができる。その包装またはディスペンサーには投与の説明書を添付することができる。
【００３０】
個々の病気の予防または治療に必要な本発明の化合物の量は、選択した化合物、及び治療すべき患者の状態により異なるであろう。しかし、一般的には、経口または口腔投与における１日投与量は、約１００ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇから４０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、非経口投与では、約１０ｎｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、鼻腔投与または吸入若しくは吹入による投与では、約０．０５ｍｇから約１０００ｍｇ、例えば、約０．５ｍｇから約１０００ｍｇの範囲である。
【００３１】
式（１）のエステルは、後記の実施例に記述されている方法に従って調製することができる。一般的にこの方法は、酸触媒、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸の存在下に式Ｒ１ＯＨのアルコールと反応させるような当業者既知の標準的方法を使用する式（２）：
2005536504.tif 000004
の中間体酸のエステル化を含んでいる。また、縮合剤、例えば１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド又はＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドのようなジイミドを使用することができ、Ｎ−ヒドロキシ化合物、例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールのようなＮ−ヒドロキシトリアゾールなどの触媒の存在下で使用することが有利である。
【００３２】
式（２）の中間体は、後記の実施例に記述する方法を使用して調製することができる。
【００３３】
式（１）のエステルはまた、好ましくは酸触媒の存在下にエステル交換を行って、式（１）の別のエステルを生じさせることができる。
【００３４】
式（１）のエステルはまた、式（３）のアミン：
2005536504.tif 000005
と式（４）の活性化した酸：
2005536504.tif 000006
のカップリングによっても調製することができる。
【００３５】
式（４）の酸は、例えば、後記の実施例に記述されているような当業者に既知の標準的方法を使用して、酸クロリドに変換することにより活性化することができる。カップリング反応は、ヒドリド（例えば、ナトリウムヒドリド）又はアミン、（例えば、トリエチルアミン又はＮ−メチルモルホリン）のような塩基の存在下に、ハロゲン化炭化水素、（例えば、ジクロロメタン又は四塩化炭素）のような溶媒中或いはアミド（例えばジメチルホルムアミド）又はエーテル（例えばテトラヒドロフランのような環状エーテル）のような双極性非プロトン性溶媒中において、例えば室温において行うことができる。そのほかには、縮合剤、例えば１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド又はＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドのようなジイミドを使用することにより、式（４）の酸を式（３）のアミンと直接カップリングさせることができ、Ｎ−ヒドロキシ化合物、例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールのようなＮ−ヒドロキシトリアゾールなどの触媒の存在下に行うことが有利である。そのほかには、所望のアシル化反応に先立って、酸をクロロ蟻酸エステル、例えばクロロ蟻酸エチルと反応させることができる。
【００３６】
式（３）のアミンは、下記スキームＡに示す一般的ルートを使用して調製することができる。
2005536504.tif 000007
【００３７】
このように、式（３）のアミンは、式（５）のニトロ化合物の還元により調製することができる。適当な条件は、エーテル（例えば、テトラヒドロフラン）又はアルコール（例えば、メタノール又はエタノール）のような溶媒中で、金属触媒（例えば炭素のような支持体上のパラジウム）の存在下に、例えば水素を使用する、触媒的水素化を含むことができる。この反応は、大気圧において又は１００ｐｓ．ｉまでの圧において行うことができる。そのほかには、塩酸のような酸の存在下に、金属、例えば、錫又は鉄を使用する、化学的還元を用いることができる。
【００３８】
式（５）のニトロ化合物は、式（７）のシクロブタジエンと式（６）のアミンとの反応により調製することができる。この反応は、不活性な溶媒又は溶媒の混合物、例えば芳香族炭化水素（例えば、ベンゼン又はトルエン）のような炭化水素及び／又は１，２−ジクロロエタン、又はジクロロメタンのようなハロゲン化炭化水素中で、０℃から還流温度（reflux temperature）の温度において行うことができる。必要がある場合、例えば式（６）のアミンの塩を使用する場合は、ジイソプロピルエチルアミンのような有機塩基を加えることができる。
【００３９】
式（６）のアミンは、市販されている４−ニトロフェニルアラニンのエステル化のような、当業者に既知の標準的な方法を使用して調製することができる。
【００４０】
式（７）の中間体は、国際特許出願ＷＯ  ０２／０６８３９３に記述されている方法を使用して調製することができる。
【００４１】
さらに、式（１）の化合物のＮ−オキシドは、例えば高い温度、例えば約７０℃から８０℃において、酢酸のような酸の存在下に、過酸化水素のような酸化剤を使用して対応する窒素塩基を酸化することによって調製することができるし、或いは室温で、溶媒、例えば、ジクロロメタン中において、過酢酸のような過酸との反応により調製することができる。
【００４２】
式（１）の塩は、通常の方法を使用して、適当な溶媒又は溶媒の混合物（例えば、ジエチルエーテルのようなエーテル、又は例えば、エタノールのようなアルコールなどの有機溶媒）中において、式（１）の化合物と適当な酸とを反応させることにより調製することができる。
【００４３】
式（１）の化合物の特定のエナンチオマーを得ることを望む場合は、エナンチオマーを分割する適当な従来方法を使用して、対応するエナンチオマーの混合物から特定のエナンチオマーを製造することができる。
【００４４】
このようにして、ジアステレオマー誘導体例えば塩は、式（１）のエナンチオマー、例えば、ラセミ化合物と、適当なキラル化合物、例えば、キラル塩基と混合物の反応により製造することができる。ジアステレオマーは次いで簡便な方法、例えば結晶化により分離され、例えば、ジアステレオマーが塩である場合には、酸で処理することにより求めるジアステレオマーを回収することができる。
【００４５】
その他の分割方法において、式（１）のラセミ化合物をキラル高速液体クロマトグラフィーを使用して分離することができる。そのほかには、必要があれば、上記のプロセスの一つにおいて適当なキラル中間体を使用することにより特定のエナンチオマーを得ることができる。そのほかには、エナンチオマー特異性の酵素による生物学的転換反応、例えば、エステラーゼを使用してエステル加水分解を行い、次いで反応しなかったエステル対掌体から、エナンチオマーとして純粋な加水分解された酸のみを精製することにより特定のエナンチオマーを得ることができる。
【００４６】
本発明の特別な立体異性体を得たい場合には、中間体又は最終産物にもクロマトグラフィー、再結晶及びその他の定法の分離方法を使用することができる。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例は、本発明の化合物の調製法を説明するものである。温度は全て℃で示した。以下の略語を使用する：
ＮＭＭ−Ｎ−メチルモルホリン；
ＥｔＯＡｃ−酢酸エチル；
ＭｅＯＨ−メタノール；
ＢＯＣ−ブトキシカルボニル；
ＤＣＭ−ジクロロメタン；
ＡｃＯＨ−酢酸；
ＤＩＰＥＡ−ジイソプロピルエチルアミン
ＥｔＯＨ−エタノール；
Ｐｙｒ−ピリジン；
Ａｒ−アリール；
ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド；
ｉＰｒ−イソプロピル；
Ｅｔ２Ｏ−ジエチルエーテル；
Ｍｅ−メチル；
ＴＨＦ−テトラヒドロフラン；
ＤＭＦ−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；
ＨＯＢＴ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール；
ＦＭＯＣ−９−フルオレニルメトキシカルボニル；
ＤＢＵ−１，８−ジアザビシクロ［５，４−０］ウンデカ−７−エン；
ＤＭＡＰ−４−（ジメチルアミノ）ピリジン。
ＮＭＲは全て３００  ＭＨｚ又は４００  ＭＨｚのいずれかにおいて測定した。中間体及び実施例は全てＢｅｉｌｓｔｅｉｎ  Ａｕｔｏｎｏｍ（MDL Information Systems GmbH,Therdor-Heuss-Allee 108D 60486,Frankfurt,Germany より入手可能）に従って命名されるか又は首尾一貫すると思われる名称が与えられている。但し、例外として、慣用名（propionate）でなくＩＵＰＡＣ命名法によりｐｒｏｐａｎｏａｔｅと命名し、そしてピリジン−４−カルボニルの代りにイソニコチノイル（慣用名）を使用した。
【００４８】
（中間体１）：３，５−ジクロロピリジン−４−カルボン酸
ＴＨＦ（２５ｍｌ）中の３，５−ジクロロピリジン（５．００ｇ，３３．８ｍｍｏｌ）溶液を、窒素下−７８°において、ＴＨＦ（２５ｍｌ）中のＬＤＡ［ｎＢｕＬｉ（２．５Ｍヘキサン溶液、１４．９ｍｌ，３７．２ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルアミン（４．１０ｇ，５．７ｍｌ，４０．６ｍｍｏｌ）から作製］の溶液に加えて、黄色／褐色のスラリーを得た。この反応液を、−７８°で３０分間撹拌し、次いでＣＯ２ガスを吹き込んで、徐々に沈殿を生じさせ透明褐色溶液を得た。これを２時間かけて室温に温め、次いで水（２０ｍｌ）で反応を止め、そしてＥｔ２Ｏ（１００ｍｌ）及び１Ｍ  ＮａＯＨ（１００ｍｌ）に分配した。水層を分離し、濃塩酸でｐＨ１まで酸性化し、次いで１０％ＭｅＯＨを加えたＤＣＭ（１００ｍｌｘ３）で抽出した。合せた有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で溶媒を除去して褐色固体を得、それをエタノールから再結晶し、減圧下に乾燥してピンクがかった結晶として表題化合物を得た（２．６３ｇ，４１％）。
2005536504.tif 000008
【００４９】
（中間体２）：（２Ｓ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸エチル
ＤＣＭ（１９５ｍｌ）中の中間体１の化合物（５１．２ｇ，０．２６７ｍｏｌ）及びチオニルクロリド（１９５ｍｌ，２．６７ｍｏｌ）のスラリーをＤＭＦ（５滴）を加え４時間還流加熱した。反応液にトルエン（２ｘ５０ｍｌ）を加えて反応液を減圧下で濃縮し共沸させて、黄色固体を得、これを更に精製せずに使用した。ＤＣＭ（８００ｍｌ）中の（Ｓ）−３−（４−アミノフェニル）−２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパン酸エチル（１３０．８ｇ，０．４２５ｍｏｌ）の溶液を０°まで冷却し、ＮＭＭ（５６．０ｍｌ，０．５１ｍｏｌ）で処理し、５分間撹拌し、次いで反応温度を５°未満に保ちながらＤＣＭ（２００ｍｌ）中の酸クロリド（９８．３ｇ，０．４６８ｍｏｌ）溶液を滴下した。反応液を１時間撹拌し、ＮａＨＣＯ３溶液（５００ｍｌ）で反応を止め、有機層を分離し、ＮａＨＣＯ３溶液（５００ｍｌ）、１０％クエン酸溶液（５００ｍｌ）及びＮａＨＣＯ３溶液（５００ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、そして減圧下で濃縮して黄色固体を得、これを再結晶（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）して表題化合物を得た（１４０ｇ，６９％）。
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【００５０】
（中間体３）：（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸エチル塩酸塩
ＥｔＯＡｃ（５００ｍｌ）及び１，４−ジオキサン（５０ｍｌ）中の中間体２の化合物（７０ｇ，０．１４６ｍｏｌ）溶液を、ＥｔＯＡｃ中のＨＣｌ溶液（５００ｍｌ，３Ｍ）を加え、そして室温で４時間撹拌した。反応液を、減圧下で濃縮して黄色固体を得、これをＥｔ２Ｏで粉砕し、次いで再結晶し（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、表題化合物を得た（５９．３ｇ，９２％）。
2005536504.tif 000010
【００５１】
（中間体４）：（２Ｓ）−２−（３−オキソスピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸エチル
１−ケト−３−ヒドロキシスピロ［３，５］−ノン−２−エン（４００ｍｇ，２．６ｍｍｏｌ）［Wasserman,H.H.et al,J.Org.Chem.,38,1451-1455(1973）の方法に従って調製］及び中間体３の遊離アミン（４００ｍｇ，１．０４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液を、室温において４８時間撹拌した。揮発物を減圧下で除去し、残留物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ２；ＥｔＯＡｃ）にかけ、白色粉末として表題化合物を得た（５１２ｍｇ，０．９９ｍｍｏｌ，９５％）。
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【００５２】
（中間体５）：（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソスピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸エチル
中間体４（５００ｍｇ，０．９７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２ｅｑ，２７０μｌ）を含有するＴＨＦ（１０ｍｌ）の溶液に、０°においてブロム（１．１ｅｑ，１７０ｍｇ）のＴＨＦ（５ｍｌ）溶液を滴下した。２０分後、反応液を室温まで上昇させ、その後ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で希釈した。粗反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２０ｍｌ）及び食塩液（２０ｍｌ）で洗い、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮した。残留泡状物を、クロマトグラフィー（ＳｉＯ２；ＥｔＯＡｃ）にかけて白色粉末として表題化合物を得た（５１１ｍｇ，０．８６ｍｍｏｌ，９５％）。
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【００５３】
（中間体６）：（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソスピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸
ＴＨＦ（５ｍｌ）中の中間体５の化合物（５１１ｍｇ，０．８６ｍｍｏｌ）に、Ｈ２Ｏ（１ｍｌ）中のＬｉＯＨ．Ｈ２Ｏ（５０ｍｇ，１．１９ｍｍｏｌ）を一度に加え、反応液を室温で２時間撹拌した。次いでＨＯＡｃ（氷酢酸、１ｍｌ）を加えて反応を停止し、揮発物を減圧下で除去した。次いで残留物に水（１０ｍｌ）を加えて沈殿を生じさせた。沈殿物を減圧濾過により集め、残留物を水（２ｘ５ｍｌ）で洗った。減圧下で乾燥して微細白色固体として表題化合物を得た（４２１ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ，８７％）
2005536504.tif 000013
【００５４】
（実施例１）：（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソスピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸２−ヒドロキシエチル
中間体６の化合物（０．５ｇ，０．８９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍｌ）溶液に、ＥＤＣ（１９０ｍｇ，０．９７ｍｍｏｌ），ＨＯＢＴ（１４０ｍｇ，１．０３ｍｍｏｌ）及びエチレングリコール（２．５ｍｌ）を加えた。混合物を室温で４８時間撹拌し、次いでＥｔＯＡｃ（１５ｍｌ）及び水（１０ｍｌ）に分配した。水層を分離し、有機層を水（３ｘ５ｍｌ）、食塩液（１０ｍｌ）で洗い、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮して粗製固体を得た。粗製物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ２；ＥｔＯＡｃ）にかけて白色粉末として表題化合物を得た（２８７ｍｇ，５３％）。
2005536504.tif 000014
【００５５】
（実施例２）：（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソスピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸メチル
実施例１のエステルの調製と同様な方法を使用して［酸（０．５０ｇ，０．９ｍｍｏｌ），ＥＤＣ（０．１９ｇ），ＨＯＢＴ（０．１４ｇ），メタノール（１．０ｍｌ），ＤＭＦ（５ｍｌ）］、表題化合物を調製した（０．４２ｇ，８０％）。
2005536504.tif 000015
【００５６】
（実施例３）：（２Ｓ）−２−（２−ブロモ−３−オキソスピロ［３，５］ノン−１−エン−１−イルアミノ）−３−｛４−［（３，５−ジクロロイソニコチノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸ブチル
実施例１のエステルの調製と同様な方法を使用して［酸（０．５０ｇ，０．９ｍｍｏｌ），ＥＤＣ（０．１９ｇ），ＨＯＢＴ（０．１４ｇ），ｎ−ブタノール（１．０ｍｌ），ＤＭＦ（５ｍｌ）］、表題化合物を調製した（０．４８ｇ，８６％）。
2005536504.tif 000016
【００５７】
以下の細胞アッセイは本発明による化合物の効能及び選択性を示すために使用することができる。これ等の検定のそれぞれにおいて、各試験化合物に対してＩＣ５０値が決定され、ＩＣ５０値は、１００％＝試験化合物が存在しないときに測定された接着で、０％＝細胞が入っていないウエルにおける吸光度とした場合の細胞接着の５０％阻害を達成するのに必要な化合物の濃度を示す。
【００５８】
α４β１インテグリン−依存性のＶＣＡＭ−ＩｇへのＪｕｒｋａｔ細胞の接着
９６ウエルＮＵＮＣプレートを、Ｆ（ａｂ）２フラグメントヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ−特異的抗体［Jackson Immuno Research 109-006-098:2μg/ml 0.1 M NaHCO3,pH8.4の100μl］で、終夜４°でコーティングした。このプレートをリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中で洗い（３ｘ）、次いで振とう機上で１時間室温でＰＢＳ／１％  ＢＳＡ中においてブロックした。洗浄（ＰＢＳ中３ｘ）後、ＰＢＳ／１％  ＢＳＡで希釈した精製２ｄ  ＶＣＡＭ−１−ｈＦｃの３５ｎｇ／ｍｌを加え、プレートを６０分間室温で振とう機上においた。プレートを洗い（ＰＢＳ中３ｘ）次いで２．５ｘ１０５Ｊｕｒｋａｔ細胞を含む合計容量２００μｌ中において濃度を変えた試験化合物の存在下又は非存在下で３７°で３０分間アッセイを実施した。
【００５９】
各プレートを培地で洗い（２ｘ）、接着細胞を１０分間１００μｌのメタノールで固定し、その後もう一度洗った。ＰＢＳ中０．２５％（ｗ／ｖ）のＲｏｓｅ  Ｂｅｎｇａｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｒ４５０７）の１００μｌを室温で５分間加え、プレートをＰＢＳ中で洗った（３ｘ）。ＰＢＳ中の５０％（ｖ／ｖ）エタノール１００μｌを加え、プレートを６０分間放置した後に吸光度（５７０ｎｍ）を測定した。
【００６０】
α４β７インテグリン−依存性のＭＡｄＣＡＭ−ＩｇへのＪＹ細胞の接着
このアッセイは、２ｄ  ＶＣＡＭ−１−ｈＦｃの代りにＭＡｄＣＡＭ−ｈＦｃ（３００ｎｇ／ｍｌ）を使用し、Ｊｕｒｋａｔ細胞の代りにβ−リンパ芽球細胞系のＪＹ亜系を使用したこと以外は、α４β１検定と同様にして行った。各試験化合物に対するＩＣ５０値は、α４β１インテグリンアッセイで記述したようにして測定した。
【００６１】
α５β１インテグリン−依存性のフィブロネクチンへのＫ５６２細胞の接着
９６ウエル組織培養プレートを、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中の５μｇ／ｍｌのヒト血漿フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ  Ｆ０８９５）で、２時間３７℃でコーティングした。プレートを洗い（ＰＢＳ中３ｘ）、次いで振とう機上で室温で１００μｌ  ＰＢＳ／１％  ＢＳＡにおいて中１時間ブロックした。ブロックしたプレートを洗い（ＰＢＳ中３ｘ）、次いで２．５ｘ１０５Ｋ５６２細胞、１０ｎｇ／ｍｌのホルボール−１２−ミリスチン酸−１３−酢酸を含有する全容量２００μｌ中において濃度を変えた試験化合物の存在下又は非存在下で３７℃においてアッセイを行った。インキュベーション時間は３０分間であった。各プレートを固定しそして上記α４β１検定において記述したように染色した。
【００６２】
αｍβ２依存性のプラスチックへのヒト多形核好中球の接着
９６ウエル組織培養プレートを、３７℃において２時間ＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＦＣＳでコーティングした。新鮮な単離ヒト静脈多形核好中球（ＰＭＮ）の２ｘ１０５個を、１０ｎｇ／ｍｌのホルボール−１２−ミリスチン酸−１３−酢酸を含有する全容量２００μｌの入ったウエル中に加え、試験化合物の存在下又は非存在下に、３７℃で２０分間次いで室温で３０分間インキュベートした。プレートを培地で洗い、０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０中の０．１％（ｗ／ｖ）ＨＭＢ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、Ｓｉｇｍａ  Ｈ５８８２）の１００μｌを、各ウエルに加えた。次いでプレートを室温で６０分間振とう機上においた。次いで内在性パーオキシダーゼ活性を、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して以下のように評価した。即ち、ＰＭＮ溶解試料を、０．２２％  Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ）及び０．１Ｍ酢酸ナトリウム／クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０中の５０μｇ／ｍｌ  ＴＭＢ（Boehringer Mannheim）と混合し、６３０ｎｍにおいて吸光度を測定した。
【００６３】
αＩＩｂ／β３依存性のヒト血小板凝集
ヒト血小板凝集は、Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｌｕｍｉａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒのインピーダンス凝集を使用して検定した。ヒト血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）は、０．３８％（ｖ／ｖ）クエン酸三ナトリウムで抗凝固化した新鮮ヒト静脈血を２２０ｘｇにおいて１０分間遠心分離することにより得、６ｘ１０８／ｍｌの細胞密度になるように自家血漿で希釈した。キュベットには等容量のＰＲＰ及び濾過したＴｙｒｏｄｅ緩衝液（ｇ／リットル：ＮａＣｌ８．０；ＭｇＣｌ２．Ｈ２０  ０．４２７；ＣａＣｌ２０．２；ＫＣｌ  ０．２；Ｄ−グルコース１．０；ＮａＨＣＯ３１．０；ＮａＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ  ０．０６５）を入れた。阻害物質の存在下又は非存在下に２．５μＭ  ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ）を加えた後に凝集を測定した。
【００６４】
上記アッセイにおいて、実施例の化合物のような本発明の化合物は、一般的に、α４β１検定において１μＭ以下のＩＣ５０値を有し、α４β７アッセイにおいて５μＭ以下のＩＣ５０値を有する。即ち例えば実施例１の化合物はα４β１アッセイにおいて４ｎＭのＩＣ５０値を有する。
【国際調査報告】
2005536504.tif 000019
2005536504.tif 000020