(57)【要約】本発明は新規のストレプトアビジン結合ペプチドを教示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１−１２による１個のアミノ酸配列を含むまたは１個のアミノ酸配列からなるストレプトアビジン結合ペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のストレプトアビジン結合ペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
請求項２記載の核酸を含むプラスミド。
【請求項４】
請求項１記載のストレプトアビジン結合ペプチドの製造方法において、請求項２記載の１個の核酸が細胞ベースまたは細胞なしのタンパク質生物合成系の中に発現または過発現される方法。
【請求項５】
タンパク質生物合成系で製造した一定のタンパク質の精製のための請求項１記載のストレプトアビジン結合ペプチドの使用において、一定のタンパク質と、それに結合した、ストレプトアビジン結合ペプチドとをコードする核酸が別法により調節配列によってコントロールされて転写および／または翻訳にかけられ、このように得た翻訳産物を含む溶液が固定化したストレプトアビジンと接触され、ストレプトアビジンと結合しないストレプトアビジンの物質を含む溶液の分離後に前記翻訳産物がストレプトアビジンから遊離かつ溶離される使用。
【請求項６】
一定のタンパク質の標識のための請求項１記載のストレプトアビジン結合ペプチドの使用において、一定のタンパク質と、それに結合した、ストレプトアビジン結合ペプチドとをコードする核酸が転写および／または翻訳にかけられ、このように得た翻訳産物がレポーター分子を含むストレプトアビジン・コンジュゲートと接触され、かつそれに結合される使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトアビジン結合ペプチドならびに細胞ベースまたは細胞なしのタンパク質生物合成系におけるストレプトアビジン結合ペプチドの製造方法に関する。
【０００２】
さらに本発明は、タンパク質生物合成系で製造された一定のタンパク質の精製のためのストレプトアビジン結合ペプチドの使用、ならびに一定のタンパク質の標識のためのストレプトアビジン結合ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
種々の原核−および真核生物の有機体内の一定のタンパク質の効率的発現方法が知られており、さらなる説明は不要である。一定のタンパク質とは、この関連性において、発現に使用した有機体または細胞なしの発現系の中で天然のまたは形質転換もしくは一定のＲＮＡの使用によって発現し、精製ステップで濃縮されるペプチドおよび／またはタンパク質である。
【０００４】
一定のタンパク質の細胞なしの発現方法は、たとえば文献箇所ＥＰ０３１２６１７Ｂ１、ＥＰ０４０１３６９Ｂ１およびＥＰ０５９３７５７Ｂ１から知られている。それらによれば転写および／または翻訳に必要な成分が一定のタンパク質をコードする核酸線条体のほかに反応容器の中でインキュベートされ、発現後にポリペプチド／タンパク質が反応溶液から単離される。転写にも翻訳にも必要な成分は、原核−および真核生物の細胞溶解物の上清から遠心によって得ることができる。
【０００５】
原核−および真核生物の有機体内の一定のタンパク質の発現および細胞なしの発現における本質的な問題点は、発現した一定のタンパク質の精製および／または検出である。これは特に抗血清またはモノクロナール抗体が存在しない一定のタンパク質で問題となる。このような一定のタンパク質の精製および検出の簡素化のために、これらがいわゆる融合タンパク質として発現される。この場合、一定のタンパク質Ｎ−および／またはＣ−末端にアミノ酸配列が接合され、または２個のタンパク質ドメイン（内部）の間に挿入される、融合パートナーである。これは核酸レベルで行なれ、それによって一定のタンパク質も検出および／または洗浄のために接合された融合パートナーも転写−／翻訳過程中に一緒に一定のタンパク質と融合パートナーとからなるキメラ（融合）タンパク質として発現される。ここで接合した融合パートナーは個々のアミノ酸としてよく、さらにペプチドまたはタンパク質としてよい。この接合した融合パートナーに精製のために不動化した結合パートナーを供給し、それらによって融合タンパク質を単離することができる。タンパク質の洗浄の可能性のほかに、該タンパク質を融合パートナーに特異的な結合パートナーによっても検出することができる。この結合パートナーは融合パートナーに特異的な抗体またはその他のタンパク質、ペプチドまたは融合パートナーに特異的に結合する化学的結合としてよい。
【０００６】
このような融合タンパク質の例は、Ｍｙｃ−ｔａｇ（ＭｕｎｒｏおよびＰｅｌｈｅｍ  （１９８６）  Ｃｅｌｌ  ４６、２９１−３００；  Ｗａｒｄら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、５４４−５４６）、フラグペプチド（Ｈｏｐｐら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６  １２０４−１２１０）、ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎｅｔら（１９９０）  Ｃｅｌｌ  ６３、８４３−８４９；  Ｍａｒｔｉｎら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５、１９２−１９４）およびアルファ−チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６６、１４１６３−１４１６６）であり、これらは全て成功裡にタンパク質の検出と一部洗浄にも利用された。通常３〜１２個のアミノ酸の長さである。融合パートナーの一部について、該融合パートナーが一定のタンパク質の生物学的機能に影響を及ぼさないことを示すことができた。それに対して一定のタンパク質の生物学的機能は、付加的に発現したアミノ酸が、たとえば２次−、３次−および／または４次構造の形成に影響を及ぼしうるので、融合パートナーの長さの増加によって影響される。従って、長い融合パートナーはタンパク質の検出に適しているが、タンパク質の洗浄にはあまり適していない。他方、長い融合パートナーはしばしばその特異的結合パートナーとのより高い親和性を有する。
【０００７】
精製における上記融合パートナーの本質的な欠点は、結合パートナーへの結合が抗原／抗体結合に基づき、結合パートナーとして利用した抗体の製造および洗浄は費用がかりかつ高価であることによって理由づけられている。もう１つの欠点は、抗原／抗体結合が結合パートナー、たとえばマトリックスに固定化した抗体と融合パートナーとの間に非常に強い結合を引き起こすことによって理由づけられている。これは結果的に、融合パートナーを介して結合した融合タンパク質が溶離する際に、部分的に一定のタンパク質に関係する一部非常に非生理学的結合を構築しなければならないことを生ぜしめる。非生理学的結合とは、この関連性において、非常に高いまたは極めて低い塩濃度、カオトロピック塩の使用および一定のタンパク質の天然のｐＨ値からはるかに偏位するｐＨ値を有する条件である。これは場合により一定のタンパク質の構造および／または機能性に影響を及ぼしまたは不可逆的に破壊しうる。それに応じて一定のタンパク質の洗浄は、タンパク質の機能性を得るために可能な限り保護する生理学的条件下に行われるべきである。上記３つの融合パートナー（Ｈｏｐｐら（１９８８））（Ｍａｒｔｉｎら（１９９０）（Ｓｋｉｎｎｅｒら（１９９１））において拮抗的なペプチドによる保護条件下でも溶離を達成できたが、費用がかかりかつ高価に製造かつ洗浄（結合パートナーとして利用）される抗体とそのマトリックスへの結合の問題が残る。
【０００８】
８ないし９個のアミノ酸からなるその他の融合パートナーは、文献箇所ＵＳ５，５０６，１２１とシュミットおよびスケラ（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＆  Ｓｋｅｒｒａ  （Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ｖｏｌ．  ６、ｎｏ．１、１０９−１２２、１９９３）とから知られている。当該箇所に開示された融合パートナーは、ストレプトアビジンまたは「コア」ストレプトアビジンに、タンパク質分解によるストレプトアビジンの分裂生成物を結合することができる（Ｂａｙｅｒら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２５９，３６９−３７６）。
【０００９】
ストレプトアビジンに結合する全ての公知の融合パートナーは、アミノ酸シーケンスＨＰＱ、ストレプトアビジンのビオチン結合ポケットと相互作用に入る、いわゆるＨＰＱ結合モチーフを含む。すでに知られているペプチドには、１０−３７μＭの解離定数Ｋｄを有するいわゆるＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩ：ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ、１８−７２μｍの解離定数Ｋｄを有するいわゆるＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫおよび２．５ｎＭの解離定数Ｋｄを有するいわゆるＳＢＰ−ｔａｇ：ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰが含まれる。両方の短いＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩおよびＩＩと異なり、長いＳＢＰ−ｔａｇはストレプトアビジンに対して本質的に強い結合を有する。しかし、上述のように、一定のタンパク質の機能は、特に融合パートナーの長さの増加によって影響される。また特に長い融合パートナーは一定のタンパク質の結晶化において妨げとなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ストレプトアビジンに対して強い結合を有する可能な限り短いストレプトアビジン結合ペプチドを提供する技術的問題を基礎においている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この技術的課題の解決のために本発明は配列番号１−１２による１個のアミノ酸配列を含むまたは１個のアミノ酸配列からなるストレプトアビジン結合ペプチドを教示する。
【００１２】
配列番号１−１２による１個のアミノ酸配列を含む本発明によるストレプトアビジン結合ペプチドによって、先行技術に比べ、ストレプトアビジン結合ペプチドとストレプトアビジンとの間に本質的により強い結合が達成され、もしくは同じ結合強度においてストレプトアビジン結合ペプチドを本質的に短縮することができる。
【００１３】
さらに本発明は配列番号１−１２によああるストレプトアビジン結合ペプチドをコードする核酸、ならびに本発明による核酸を含むプラスミドを教示する。本発明によるストレプトアビジン結合ペプチドをコードする核酸および／またはプラスミドは各発現系／タンパク質生物合成系に適合できることは自明である。プラスミドは、一定のタンパク質をコードする核酸配列を挿入でき、それによって一定のタンパク質が配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドと共に発現される制限酵素のための少なくとも１つのインタフェースを有する領域を含む、特に細菌のための発現ベクターとしてデザインしてよい。一定のタンパク質および配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドをコードする領域は、好適なプロモーターおよび／またはオペレータおよびターミネータのコントロール下に存在することは自明である。少なくとも１個の制限酵素に対して少なくとも１つのインタフェースを有する領域は、配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドをコードする核酸領域から５’および３’方向においてよい。配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドをコードする核酸領域は直接一定のタンパク質をコードする核酸領域に接続できず、むしろ両方の領域の間に１ないし２０個のアミノ酸、特に５ないし１０個のアミノ酸をコードする核酸をおいてよい。
【００１４】
本発明は、配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドの製造方法において、１個の核酸が細胞ベースまたは細胞なしのタンパク質生物合成系の中に発現または過発現される方法に関する。このように製造されたペプチドは容易にストレプトアビジンへの結合を介して単離することができる。得た翻訳産物、たとえば配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドは、固定化したストレプトアビジンと接触され、かつそれに結合される。ストレプトアビジンに結合しない物質を含む溶液の分離後、この翻訳産物が溶離される。溶離剤としてビオチンまたは同類の物質および／またはイミノビオチン、デスチオビオチンおよび／またはジアミンビオチンのような誘導体を含有する緩衝液を使用してよい。得た配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドは、一定のタンパク質と融合する場合に前記タンパク質を担う。これは一定のタンパク質に関係なく抗体製造のために利用してもよい。得た抗体は、たとえば配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドの検出または精製のために、もしくは配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドが融合パートナーとして使用される場合は、前記融合パートナーに結合した一定のタンパク質の検出または精製に利用してよい。
【００１５】
配列番号１−１２によるアミノ酸配列を含む前記のようなストレプトアビジン結合ペプチドの製造は、たとえばＡｂｉｍｅｄ社（ランゲンフェルト、ドイツ連邦共和国）の自動合成装置を用いる、たとえば化学的固相合成によっても可能であることは自明である。この方法はＦｍｏｃ化学の標準プロトコルに基づく（Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル）。
【００１６】
本発明は、タンパク質生物合成系で製造した一定のタンパク質の精製のための配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドの使用において、一定のタンパク質と、それに結合した、ストレプトアビジン結合ペプチドとをコードする核酸が転写および／または翻訳にかけられ、このように得た翻訳産物を含む溶液が固定化したストレプトアビジンと接触され、かつそれと結合され、ストレプトアビジンに結合しない物質を含む溶液の分離後に前記翻訳産物が溶離される使用に関する。溶離は一定のタンパク質に対する保護条件下に行うことができる。溶離剤としてビオチンまたは同類の物質および／または、イミノビオチン、デスチオビオチンおよび／またはジアミノビオチンのような誘導体を含む緩衝液を使用してよい。製造した一定のタンパク質は、融合パートナーとして用いる配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドをＮ−および／またはＣ−末端に含有してよい。
【００１７】
ストレプトアビジン−セファロース−カラムを使用する際に、一定の被検タンパク質を融合パートナーとして用いる配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドによってマトリックスに固定化し、分子たとえば細胞溶解物の混合物から単離することができる。
【００１８】
本発明は、一定のタンパク質の標識のための配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドの使用において、一定のタンパク質と、それに結合した、ストレプトアビジン結合ペプチドとをコードする核酸が転写および／または翻訳にかけられ、このように得た翻訳産物がレポーター分子を含むストレプトアビジン・コンジュゲートと接触され、かつそれに結合される使用にも関する。標識した一定のタンパク質は、標識に用いる配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドをＮ−および／またはＣ−末端に含有してよい。レポーター分子は、たとえば放射性および／または放射性標識物質としてよい。ストレプトアビジンは自体として放射性標識および／または放射性活性としてよいことは当然である；この場合は、レポーター分子を省いてよい。レポーター分子は、たとえばアルカリ性ホスファターゼまたはペルオキシダーゼのような蛍光性物質または酵素としてもよい。このようなレポーター分子に結合したストレプトアビジン化合物によって、たとえば配列番号１−１２によるストレプトアビジン結合ペプチドを融合パートナーとして有するタンパク質をウェスターン・ブロット法または酵素免疫測定法ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｔ  ａｓｓａｙ）で検出かつ／または定量することができる。一定のタンパク質が結合タンパク質である場合は、この方法により前記タンパク質に結合する別のタンパク質で検出することができる。結合タンパク質とは、この関連性において、自体別のタンパク質と結合し、および／または自体、たとえば抗原／抗体結合またはレセプターへのタンパク質の結合のような別のタンパク質に結合するタンパク質である。
【００１９】
３０個以下のアミノ酸、好ましくは２０個以下のアミノ酸、最も好ましくは１０個以下のアミノ酸を含むストレプトアビジン結合ペプチドが有利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明は単に実施形態を示した図ならびに例を利用してより詳しく説明する。
【実施例１】
【００２１】
本発明による結合ペプチドおよび解離定数を有する比較ペプチド
専門的常法により脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢ（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をウシ心臓からイン・ビトロで結合した転写翻訳系によって細胞なしのタンパク質生物合成系で発現した。この発現したＦＡＢタンパク質はＮ−末端にそれぞれ１５個のアミノ酸からなる様々なアミノ酸配列を融合パートナーとしてもつ付加的なストレプトアビジン結合ペプチドを占めた。
【００２２】
２個の結合ペプチドはそのアミノ酸配列の中に先行技術に記載されたＨＰＱモチーフ（モチーフ１および２）を含み、２個が本発明による配列番号１−６（モチーフ３および４）によるストレプトアビジン結合ペプチドを含んだ。ペプチドの配列は表１に示している。さらに発現したタンパク質は、６個のヒスチジンからなるＣ−末端に存在する“Ｈｉｓ−ｔａｇ”を有していた。このタンパク質はアフィニティクロマトグラフィによってＮｉ２＋−ＩＤＡ−アガロースを介して専門的常法で精製した。同じ長さの場合、本発明による配列を有する結合ペプチドはＨＰＱモチーフを有する結合ペプチドより本質的に小さい解離定数を有することが分かる。本発明による結合ペプチドのＫｄ値は、ＳＢＰ−Ｔａｇの約２．５倍の長さにもかかわらずＳＢＰ−Ｔａｇのオーダーにある。
【００２３】
表１
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【実施例２】
【００２４】
表１からの解離定数の測定方法
解離定数の測定はＢｉａｃｏｒｅ社のＢｉａｃｏｒｅＸシステムおよびセンサチップＮＴＡを用いて実施した。実施例１に記載した発現から生じたタンパク質、すなわちＮ末端に１５個のアミノ酸からなるそれぞれ１個のペプチドを融合パートナーとして、およびＣ末端に固定化のためにセンサチップ上に必要であった６個のヒスチジンを占めるＦＡＢタンパク質を測定した。例１に記載した発現から生じた、ストレプトアビジンへのタンパク質の結合親和性は製造者の指示によりバイアコア機器で測定した。この場合、被測定タンパク質はセンサチップ上にあり、一定の濃度を有するストレプトアビジン溶液が噴霧される。両分子間の相互作用（結合）はこの機器で測定し、いわゆる共鳴単位（ＲＵ）として表示した。測定のために製造者が指示した緩衝液を使用した。
【００２５】
測定の結果は表２に示している。得た測定値は付属のソフトウエアで評価し、表１に示した解離定数をもたらした。
【００２６】
表２
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【実施例３】
【００２７】
融合タンパク質の精製
専門的常法により、Ｎ末端に１５個のアミノ酸からなる、アミノ酸配列ＤＶＥＡＷＬＤＥＲＶＰＬＶＥＴ（モチーフ３）を有する付加的ペプチドを融合パートナーとして占めるＦＡＢタンパク質をイン・ビトロで細胞なしのタンパク質生物合成において結合した転写翻訳系によって発現した。過発現した一定のタンパク質の精製のために、ストレプトアビジンは固相に結合した。固相としてセファロースを用いた。発現したＦＡＢタンパク質をそれに続き専門的常法によりアフィニティクロマトグラフィでストレプトアビジン−セファロースまたはストレプタクチン−セファロースを含むカラムを介して精製した。精製のために以下の緩衝液を使用した：洗浄緩衝液（１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）。
【００２８】
ストレプトアビジンの溶離のために洗浄緩衝液は２ｍＭビオチンを含み、ストレプタクチンの溶離のために洗浄緩衝液は２．５ｍＭデスチオビオチンを含んだ。
【００２９】
アフィニティクロマトグラフィの種々の画分への使用した一定のタンパク質の百分率配分は表３から読み取れる。表３において、Ｄは試料／通過液の塗布を表し、Ｗは洗浄画分を表し、Ｆは溶離画分を表す。
【００３０】
表３
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【００３１】
ストレプトアビジン−セファロースを使用する場合、塗布したタンパク質の９０％をカラムから回収でき、７８％が溶離物に消失した。精製品質は図１に示している。
【００３２】
ストレプタクチン−セファロースを使用する場合、塗布したタンパク質の８４％をカラムから回収でき、７１％が溶離物に消失した。精製品質は図２に示している。
【実施例４】
【００３３】
個々の結合ペプチドの最適化
配列ＤＶＥＡＷＬＤＥＲＶＰＬＶＥＴを有する結合ペプチド（ＦＡｘ３）を置換分析にかけ、それにより場合によって生じる最少モチーフ（＝短縮ペプチド）を同定し、結合特異性に及ぼす個々のアミノ酸交換作用が検査されるべきであった。置換分析ではペプチドをスポット法（Ｆｒａｎｋ、Ｒ．１９９２）によって固相として用いるセルロース膜上で合成した。この場合、１５個のアミノ酸を含むペプチドの各位置を体系的にその他の１９個のＬ−アミノ酸に置換した。
【００３４】
置換分析はペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを用いてインキュベートし、発光基質によって展開した。それによって、ペプチドをどれだけ短縮できるか、およびどのアミノ酸が「保存」され、それによって交換できないかまたは非常に粗悪に交換できるかを検出することができた。以下の像を得た：
充分なストレプトアビジン結合を有するペプチドは、６−ｍｅｒペプチドＤＶＥＡＷＬである。明らかに良いストレプトアビジン結合は、９−ｍｅｒペプチドＤＶＥＡＷＬＤＥＲを有する。置換分析は、当初別のアミノ酸に対する交換がどこにストレプトアビジン結合の改良を必然的にもたらし得るかの位置を指示する。
【００３５】
置換分析からの情報は、種々のペプチドの結合定数が「表面プラズモン共鳴」分光法によってＢＩＡｃｏｒｅ機器の使用下に同定することによって検査した。この測定はＢＩＡｃｏｒｅ社のＮＴＡセンサチップと、ウシ心臓由来の脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）を用いて行った。ＦＡＢＰはペプチドの固定化および表出に利用した。さらに、このようにアフィニティクロマトグラフィで現れる条件は、ペプチドが将来的にタンパク質の精製のためのアフィニティペプチドとして使用する必要があるので模擬されるべきであった。被測定ペプチドがどこでＦＡＢＰの４個のＮ末端アミノ酸を代替するかの第１の測定と異なり、ペプチドの配列は今回もＮ末端であったが、該配列はＦＡＢＰの一部ではなかった。固定化に必要なＨｉｓ−ｔａｇも変化した。該Ｈｉｓ−ｔａｇは第１の測定のようにＦＡＢＰのＣ末端にあったが、６個から８個のヒスチジンに拡大され、特に２個のグリシンからなるリンカーによってＦＡＢＰから離れた。それによってリガンドの固定化が明らかに改善され、それによってリガンドの低成長から生じるベースラインのドリフトを低減することができた。各測定のために約１１００共鳴単位（ＲＵ）のベースラインの上昇に相当する各ＦＡＢＰの同一量を固定化した。参照としてＨｉｓ−ｔａｇを有するＦＡＢＰを用いたが、Ｎ末端結合ペプチドはなかった。
【００３６】
好適化した測定方法から生じる結合定数は以下のとおりであった：
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【００３７】
短縮した９−ｍｅｒペプチドに及ぼす別のアミノ酸の影響：
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【００３８】
ポジティブな影響は特に位置７のグリシンおよび位置８のアラニンに現れる。この両方のアミノ酸の組合せ：
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【００３９】
起始１５−ｍｅｒペプチドはそれ以上改良できない。逆に短縮した９−ｍｅｒペプチドはアスパラギン酸に代わるグリシンによって位置７で明らかに改良することができる。位置８のグルタミン酸に代わるアラニンもストレプトアビジンに対して多少良好な結合親和性を有する。この両方のアミノ酸の組合せによって結合親和性をそれ以上改良できないが、該組合せは劣化もしない。
【００４０】
本発明はそれによってその位置をもたないもしくは僅かに保存された位置を有する９−ｍｅｒペプチドも含む：
ＤＶＸＡＷＬＸＸＲ（Ｘ＝任意のアミノ酸）
【００４１】
特に天然の位置７にグリシンを有する短縮ペプチド：
ＤＶＥＡＷＬＧＥＲ
および位置７にグリシンを有する短縮ペプチドと位置８のアラニン：
ＤＶＥＡＷＬＧＡＲ
【実施例５】
【００４２】
本発明による配列の変異体
以下、本発明による特に好適な配列を示す。
2005536184.tif 000008
【００４３】
位置３のＸは任意であるが、特にＥ、ＤまたはＧとしてよい。Ｘは位置７で任意であるが、特にＧまたはＤとしてよい。Ｘは位置８で任意であるが、特にＡまたはＥとしてよい。配列１３は別法により配列１１のカルボキシ末端伸長体であり、配列１３から、アミノ末端でアミノ酸１ないし６から開始し、配列１１に接続することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ストレプトアビジン・アフィニティカラムを介した細胞なしのタンパク質生物合成系による融合パートナーとしてのモチーフ３によるストレプトアビジン結合ペプチドを含むＦＡＢＰの洗浄。各画分からＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって比較可能量を分析した。（Ａ）クーマシー染色および（Ｂ）オートラジオグラム。番号を付けた微量成分中の試料は（１）分子量マーカー；（２）反応混合物；（３）試料塗布の通過液；（４−６）洗浄画分；（７−９）溶離画分；（１０）放射性分子量マーカーである。
【図２】ストレプタクチン・アフィニティカラムを介した細胞なしのタンパク質生物合成系による融合パートナーとしてのモチーフ３によるストレプトアビジン結合ペプチドを含むＦＡＢＰの洗浄。各画分からＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって比較可能量を分析した。（Ａ）クーマシー染色および（Ｂ）オートラジオグラム。番号を付けた微量成分中の試料は（１）分子量マーカー；（２）試料塗布の通過液；（３−５）洗浄画分；（６−１０）溶離画分；（１１）放射性分子量マーカーである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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