(57)【要約】  抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖のうち、２９７番目のＡｓｎに結合する糖鎖は抗体の活性や血中安定性に関与しているが、２９７番目以外の余分な糖鎖は抗体定常領域を介した活性へ影響を及ぼす可能性や抗体医薬品としての均一性に問題を生じる可能性がある。従って、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖のうち、ＥＵインデックス２９７番目以外のＡｓｎ残基に結合する余分な糖鎖を制御する方法が求められている。  ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列を構成するアミノ酸残基において、Ａｓｎから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変、ＸからＰｒｏへのアミノ酸改変およびＳｅｒ／Ｔｈｒから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変から選ばれるいずれか、少なくとも１つのアミノ酸改変が行われた改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列を構成するアミノ酸残基において、Ａｓｎから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変、ＸからＰｒｏへのアミノ酸改変およびＳｅｒ／Ｔｈｒから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸改変が行われた改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
【請求項２】
ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列中のＡｓｎにＮ−グリコシド結合型糖鎖が付加されている請求項１に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
【請求項３】
ＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列が、ＥＵインデックス３９２〜３９４番目である、請求項１または２に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
【請求項４】
ＥＵインデックスの３９２〜３９４番目のうちアミノ酸残基の少なくとも１つのアミノ酸残基が以下のアミノ酸残基に改変された、請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
ＥＵインデックス３９２番目：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ
ＥＵインデックス３９３番目：Ｐｒｏ
ＥＵインデックス３９４番目：Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ
【請求項５】
ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域が配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
【請求項６】
ＣＨ１ドメインおよびヒンジドメインを含み、該ＣＨ１ドメインおよびヒンジドメインがヒトＩｇＧ１抗体由来のアミノ酸配列を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
【請求項７】
ＥＵインデックス３３９番目のＴｈｒが、ＡｓｎまたはＴｙｒのアミノ酸残基に改変されたＦｃ領域を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
【請求項８】
ＥＵインデックス３９７番目のＭｅｔが、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＡｓｐおよびＰｈｅから選ばれるいずれか１つのアミノ酸残基に改変された抗体Ｆｃ領域を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換体を培地内で培養し、培養液中に請求項１〜８のいずれか１項に記載の改変抗体組成物または該改変抗体組成物断片を生成蓄積させ、培養液から改変抗体組成物または該改変抗体組成物断片を精製する請求項１〜８のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片を製造する方法。
【請求項１３】
ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列を構成するアミノ酸残基において、Ａｓｎから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変、ＸからＰｒｏへのアミノ酸改変およびＳｅｒ／Ｔｈｒから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸改変を行う、前記Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列のＡｓｎ残基に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖を減少させる方法。
【請求項１４】
ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列のＡｓｎ残基にＮ−グリコシド結合糖鎖が付加されている請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列が、ＥＵインデックス３９２〜３９４番目である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＥＵインデックスの３９２〜３９４番目のうちアミノ酸残基の少なくとも１つのアミノ酸残基が以下のアミノ酸残基に改変された、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
ＥＵインデックス３９２番目：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ
ＥＵインデックス３９３番目：Ｐｒｏ
ＥＵインデックス３９４番目：Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ
【請求項１７】
ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域が配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトＩｇＧ抗体がＣＨ１ドメインおよびヒンジドメインを含み、該ＣＨ１ドメインおよびヒンジドメインがヒトＩｇＧ１抗体由来のアミノ酸配列を含む請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖のうち、ＥＵインデックス２９７番目以外のＡｓｎ残基に結合する糖鎖が減少または欠損した改変抗体組成物、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖のうち、ＥＵインデックス２９７番目以外のＡｓｎ残基に結合する余分な糖鎖が減少または欠損しかつ抗体のエフェクター活性が維持された改変抗体組成物、該改変抗体分子をコードするＤＮＡ、該改変抗体組成物を生産する細胞、該改変抗体組成物を製造する方法および抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖のうち、ＥＵインデックス２９７番目以外のＡｓｎ残基に結合する余分な糖鎖を減少させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、高い結合活性、結合特異性および血中での高い安定性を有することから、ヒトの各種疾患の診断、予防および治療薬としての応用が試みられてきた（非特許文献１）。また、遺伝子組換え技術を利用して、非ヒト動物抗体からヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体が作製された（非特許文献２〜５）。【０００３】
ヒト型キメラ抗体は、抗体可変領域がヒト以外の動物の抗体、定常領域がヒト抗体から構成される。ヒト化抗体とは、ヒト以外の動物の抗体の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ以下、ＣＤＲと表記する）がヒト抗体のＣＤＲに置換された抗体である。【０００４】
ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体は、非ヒト動物抗体の高い免疫原性、低いエフェクター機能、短い血中半減期などのマウス抗体などが有する問題を解決し、モノクローナル抗体の医薬品としての応用を可能にした（非特許文献６〜９）。既に米国においては、例えば、癌治療用抗体として複数のヒト化抗体が認可され、販売されている（非特許文献１０）。【０００５】
これらのヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体は、実際に臨床においてある程度の効果を示しているが、より効果の高い抗体医薬が求められていることも事実である。【０００６】
例えば、ＣＤ２０に対するヒト型キメラ抗体であるＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（非特許文献１１）（ＩＤＥＣ社／Ｒｏｃｈｅ社／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）の単独投与では、再発性低悪性度の非ホジキンリンパ腫患者に対する第ＩＩＩ相臨床試験における奏効率は４８％（完全寛解６％、部分寛解４２％）に過ぎず、また、平均の効果持続期間は１２ヶ月と報告されている（非特許文献１２）。【０００７】
また、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）と化学療法（ＣＨＯＰ：Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）との併用では、再発性低悪性度および濾胞性の非ホジキンリンパ腫患者に対する第ＩＩ相臨床試験において、奏効率は９５％（完全寛解５５％、部分寛解４５％）と報告されているが、ＣＨＯＰに起因する副作用が認められている（非特許文献１３）。【０００８】
ＨＥＲ２に対するヒト化抗体であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）は、単独投与では、転移性乳癌患者に対する第ＩＩＩ相臨床試験における奏効率は僅か１５％であり、平均の効果持続期間は９．１ヶ月と報告されている（非特許文献１４）。【０００９】
ヒト抗体分子はイムノグロブリン（以下Ｉｇ）とも称し、その分子構造からＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの各クラスに分類される。【００１０】
抗体医薬として主に用いられるヒトＩｇＧ（以下ＩｇＧと称する）型の抗体分子は２本ずつの重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ、以下Ｈ鎖と称する）と軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ、以下Ｌ鎖と称する）と呼ばれるポリペプチドによって形成される。【００１１】
Ｈ鎖はＮ末端側からＨ鎖可変領域（以下ＶＨと表記する）、ＣＨ１、ヒンジ（Ｈｉｎｇｅ）、ＣＨ２およびＣＨ３と呼ばれる各ドメイン構造によって形成される。ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３はあわせて重鎖定常領域（以下、ＣＨと表記する）とも呼ばれ、ＣＨ２およびＣＨ３はあわせてＦｃ領域と呼ばれる。【００１２】
Ｌ鎖はＮ末端側からＬ鎖可変領域（以下ＶＬと表記する）、Ｌ鎖定常領域（以下ＣＬと表記する）と呼ばれる各ドメイン構造によって形成される。【００１３】
ＩｇＧ型抗体のＨ鎖にはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の４つのサブクラスが存在する。各ＩｇＧサブクラスのＨ鎖はお互いに、可変性に富むヒンジを除く定常領域について９５％程度のアミノ酸配列の相同性を有する。【００１４】
各ＩｇＧサブクラスはアミノ酸配列の相同性が高いにも関わらず、それらが有する生物活性の強弱は異なる（非特許文献１５）。生物活性としては、補体依存性細胞傷害活性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＣＤＣ、以下、ＣＤＣ活性と略記する）、抗体依存性細胞傷害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ以下、ＡＤＣＣ活性と略記する）、貪食活性などのエフェクター機能が挙げられ、これらは生体内で異物や病原体排除に重要な役割を果たす。【００１５】
ナチュラルキラー細胞（以下ＮＫ細胞と表記する）、単球、マクロファージ、顆粒球などの種々の白血球の表面には、Ｆｃγ受容体（以下ＦｃγＲと表記する）のファミリーが発現する。【００１６】
ＦｃγＲにはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの活性型ＦｃγＲと、ＦｃγＲＩＩｂの抑制型ＦｃγＲに分類される。ＩｇＧ抗体、特にヒトにおいてはＩｇＧ１とＩｇＧ３はこれらの受容体に強く結合し、その結果白血球によるＡＤＣＣ活性や貪食活性を誘導する。【００１７】
ＡＤＣＣ活性とは、抗原に結合した抗体が、Ｆｃ部分を介して主にＮＫ細胞表面のＦｃγＲＩＩＩａに結合し、その結果、ＮＫ細胞から放出されるパーフォリンやグランザイムなどの細胞傷害性分子によって生じる細胞融解反応である（非特許文献１６、１７）。ＡＤＣＣ活性は、一般的にはＩｇＧ１＞ＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２の序列を示す（非特許文献１８、１９）。Ｆｃ上のＦｃγＲＩＩＩａの結合部位はＣＨ２ドメインに存在し、二つのＣＨ２ドメインの間にＦｃγＲＩＩＩａが一分子結合することが結晶構造解析で示されている（非特許文献２０）。【００１８】
ＣＤＣ活性とは、抗原に結合した抗体が、血清中の補体系と呼ばれる一群の血清蛋白質の反応カスケードを活性化し、最終的に標的細胞を融解する反応である。ＣＤＣ活性は、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３において高く、一般的にＩｇＧ３≧ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２≒ＩｇＧ４の序列を示す。補体系はＣ１〜Ｃ９の各成分に分類され、その多くが部分分解を受け酵素活性を発現する酵素前駆体である。【００１９】
ＣＤＣ活性は最初にＣ１の１成分であるＣ１ｑの標的細胞上の抗体のＦｃ領域への結合に始まり、各成分が前段階の成分によって部分分解を受けることにより活性化のカスケードが進行し、最終的にはＣ５〜Ｃ９が膜侵襲複合体と呼ばれる孔形成重合体が標的細胞の細胞膜上で形成され、細胞の溶解反応を引き起こす（非特許文献１６、１７）。Ｆｃ領域上のＣ１ｑの結合部位はＣＨ２ドメインに存在することがＦｃ領域のアミノ酸置換研究により示唆されている（非特許文献２１）。【００２０】
臨床に用いられる抗体医薬の薬効メカニズムにおいても、上述のエフェクター機能の重要性が認識されている。上記のＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）は、ＩｇＧ１サブクラスのヒト型キメラ抗体であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を示す（非特許文献２２）。【００２１】
さらに、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）は、臨床効果においても、ＡＤＣＣ活性の強いＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子型を示す患者において治療効果が高いこと（非特許文献２３）、投与後に速やかに血中より補体成分が消費されること（非特許文献２４）、投与後に再発した患者の癌細胞ではＣＤＣ活性を抑制する因子であるＣＤ５９の発現が上昇していること（非特許文献２５）などから、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）が実際に患者体内でエフェクター機能を発揮していることが示唆されている。【００２２】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）もＩｇＧ１サブクラスのヒト化抗体であり、ＡＤＣＣ活性の強いＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子型を示す患者において治療効果が高いことが報告されている（非特許文献２６）。【００２３】
また、ヒトＩｇＧは血管内皮細胞等に発現する胎児性Ｆｃ受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＩｇＧ；ＦｃＲｎ、以下ＦｃＲｎと記す）とエンドソーム内の低ｐＨ条件で結合することによりリソソームによる分解を免れ、その結果７日（ＩｇＧ３）〜２１日（ＩｇＧ１、２、４）と長い血中半減期を有する。抗体のＦｃとＦｃＲｎとの結合部位はＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの界面に存在することが、Ｆｃのアミノ酸残基改変の研究より示唆されている（非特許文献２７）。【００２４】
以上のことから、ヒトＩｇＧ１抗体は他のサブクラスと比較して、強いＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を有し、さらにヒト血中での半減期が長いことなどから、抗体医薬として最適である。【００２５】
Ｃ１ｑは抗体分子のＦｃ領域に結合することが知られる。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の単量体に対するＣ１ｑの結合定数（Ｋａ）は、それぞれ１．２×１０４、０．６４×１０４、２．９×１０４、０．４４×１０４Ｍ−１である（非特許文献２８）。上述のように、Ｆｃ領域の中でも特にＣＨ２ドメインが重要である（非特許文献２９）。【００２６】
更に詳細には、ヒトＩｇＧ１ではＥＵインデックス（非特許文献３０）において、ＣＨ２中のＬｅｕ２３５（非特許文献３１）、Ａｓｐ２７０、Ｌｙｓ３２２、Ｐｒｏ３２９、Ｐｒｏ３３１（非特許文献３２）、ヒトＩｇＧ３ではＧｌｕ２３３、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６（非特許文献３３）、Ｌｙｓ３２２（非特許文献３４）などが重要なことが知られている。【００２７】
ヒトＩｇＧ重鎖定常領域中にアミノ酸改変を導入することによりＩｇＧの改変体を作製し、Ｃ１ｑとの結合活性を上昇させ、ＣＤＣ活性を増強させる試みがなされてきた。【００２８】
Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、ヒトＩｇＧ１型の定常領域およびマウス由来の可変領域を有する抗ＣＤ２０キメラ抗体Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）の重鎖定常領域中のＣＨ２ドメイン中のＥＵインデックス３２６番目のＬｙｓ、または３３３番目のＧｌｕを他のアミノ酸に置換すると、最大で２倍程度ＣＤＣ活性が増強することを報告した（非特許文献３５、特許文献２）。【００２９】
Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、さらに、ＩｇＧ１の数百分の一程度のＣＤＣ活性であったＩｇＧ２のＣＤＣ活性が、ヒトＩｇＧ２型の抗体のＥＵインデックス３２６番目のＬｙｓ、または３３３番目のＧｌｕを他のアミノ酸に置換することにより、ＩｇＧ１のＣＤＣ活性の１／２５程度まで上昇することを示した（特許文献３〜５）。【００３０】
またＤａｌｌ’Ａｃｑｕａらは、ヒトＩｇＧ１型の抗ＥｐｈＡ２抗体のヒンジ領域に様々なアミノ酸改変を施した結果、複数の改変体において、改変前の抗体よりもＣ１ｑ結合活性およびＣＤＣ活性が上昇することを報告した（非特許文献３５）。【００３１】
アミノ酸改変を導入する手法とは異なり、天然に存在する配列の組み合わせによってＣＤＣ活性を増強させる例も知られる。Ｓｈｉｔａｒａらは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン全体、およびＣＨ３ドメインの全体またはＮ末端側の一部をヒトＩｇＧ３の配列に置換すると、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３のいずれよりもＣ１ｑ結合活性およびＣＤＣ活性が大きく上昇することを見出した（特許文献６、非特許文献３６）。【００３２】
タンパク質に付加する糖鎖にはＮ−グリコシド結合型糖鎖とＯ−グリコシド結合型糖鎖の２つのタイプが存在する。Ａｓｎ側鎖のアミドのＮ原子に結合する糖鎖はＮ−グリコシド結合型糖鎖、ＳｅｒとＴｈｒ側鎖のヒドロキシ基のＯ原子に結合する糖鎖はＯ−グリコシド結合型糖鎖である。【００３３】
Ｎ−グリコシド結合型糖鎖には、高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖（コンプレックス型糖鎖）および混成型糖鎖（ハイブリッド型糖鎖）の３種のタイプがある。【００３４】
Ｎ−グリコシド結合型糖鎖の生合成の過程は、粗面小胞体においてマンノース（Ｍａｎ）９分子を含むドリコール−ピロリン酸−オリゴ糖［（Ｇｌｃ）３（Ｍａｎ）９（ＧｌｃＮＡｃ）２］が、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖のコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘはプロリン以外の全てのアミノ酸）のＡｓｎ残基に付加することから始まる。その後、種々の酵素によってＭａｎ８型、Ｍａｎ７型、Ｍａｎ６型およびＭａｎ５型の高マンノース型に変換され、さらにはマンノースの代わりにＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、シアル酸およびフコースなどが付加した複合型糖鎖が合成される（非特許文献３７）。【００３５】
ただしＮ−グリコシド結合型糖鎖はタンパク質中の全てのＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列に付加するわけではなく、さらに周辺のアミノ酸配列や立体構造によっては付加しないことが知られる。特に、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／ＴｈｒのＣ末端側に続くアミノ酸がＰｒｏである場合、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／ＴｈｒのＡｓｎ残基にはほとんど糖鎖付加が起こらないことが知られる（非特許文献３８、３９）。【００３６】
ヒトＩｇＧの定常領域には、唯一ＣＨ２ドメインの２９７番目のＡｓｎにＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が結合することが知られ（非特許文献４０）、その他の部位へのＮ−グリコシド結合型糖鎖の存在は知られていない。唯一マウスＩｇＧ３の定常領域４７１番目のＡｓｎに余分なＮ−グリコシド結合型糖鎖が結合していることが知られている（非特許文献４１）。【００３７】
一方、ヒトＩｇＧ３型の定常領域中のＣＨ３ドメインの３９２〜３９４番目にはＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒの配列が存在するが、３９５番目のアミノ酸はＰｒｏであり（非特許文献４２）、実際にＩｇＧ３の３９２位のＡｓｎへの糖鎖付加は知られていない。【００３８】
ヒトＩｇＧのＡＤＣＣ活性は、２９７番目のＡｓｎに付加するＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の構造（図１に典型的な複合型糖鎖模式図を示す）によって変化することが知られている（特許文献７）。【００３９】
抗体に結合する糖鎖のガラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミンの含量に依存して、抗体のＡＤＣＣ活性が変化する報告があるが（非特許文献４３〜４６）、最もＡＤＣＣ活性に影響を及ぼすのは、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα１，６結合するフコース（以下、コアフコースと記載する場合もある）である。【００４０】
コアフコースの無いＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体は、コアフコースが結合したＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体よりも顕著に高いＡＤＣＣ活性を示す（非特許文献４７、４８、特許文献７）。【００４１】
コアフコースの無いＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する抗体組成物を生産する細胞としては、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子がノックアウトされた細胞が知られている（特許文献８、９）。【００４２】
抗体医薬の治療効果にはＡＤＣＣ活性および貪食活性などのＦｃγＲ依存的な活性、ＣＤＣ活性並びにＦｃＲｎ結合活性のいずれもが重要である。【００４３】
しかしながら、ＣＤＣ活性を惹起する初期段階であるＣ１ｑ結合、およびＡＤＣＣ活性を惹起する初期段階であるＦｃγＲへの結合、長い血中半減期に寄与するＦｃＲｎへの結合はいずれも抗体のＦｃ領域を介しているため、Ｆｃにアミノ酸改変を導入した場合、これらの活性を損ねてしまう可能性もある。【００４４】
Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、ＣＤＣ活性を増強させたＩｇＧ１のＣＨ２ドメインへのアミノ酸の点変異導入体は、ＡＤＣＣ活性が大きく低下してしまうことを報告している（非特許文献４９）。【００４５】
またＤａｌｌ’Ａｃｑｕａらは、ＦｃＲｎへの結合活性を上昇させるＩｇＧ１のＣＨ２ドメインへのアミノ酸変異導入は、同時にＡＤＣＣ活性を低下させる現象を報告している（非特許文献５０）。【００４６】
興味深いことにこれらの報告は、Ｆｃ中のＦｃγＲＩＩＩａ、Ｃ１ｑ、ＦｃＲｎへの結合部位はそれぞれ微妙に異なる部位に位置するにも関わらず、それぞれの結合性を変化させるアミノ酸改変は、他の結合部位への予期せぬ影響を及ぼすことを示している。【００４７】
ＩｇＧ重鎖定常領域の３９２番目のアミノ酸は、抗体分子中の二つのＣＨ３ドメインの界面に位置している（非特許文献５１）。該界面に位置するアミノ酸は二つの重鎖分子の会合に大きな役割を果たしており（非特許文献５２）、例えば３９２番目のアミノ酸を改変した場合、抗体分子の立体構造および様々な生物活性に予期せぬ影響を与える可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４８】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０３２７３７８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０１５８３８９号明細書
【特許文献３】国際公開第００／４２０７２号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／０１３２１０１号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５／００５４８３２号明細書
【特許文献６】国際公開第２００７／０１１０４１号
【特許文献７】国際公開第００／６１７３９号
【特許文献８】国際公開第０２／３１１４０号
【特許文献９】国際公開第０３／８５１０７号
【非特許文献】
【００４９】
【非特許文献１】モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）
【非特許文献２】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１２，６４３（１９８４）
【非特許文献３】プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８１，６８５１（１９８４）
【非特許文献４】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２１，５２２（１９８６）
【非特許文献５】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，３２３（１９８８）
【非特許文献６】イムノロジー・トゥデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ），２１，３６４（２０００）
【非特許文献７】イムノロジー・トゥデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ），２１，４０３（２０００）
【非特許文献８】アナルズ・オブ・アレルギー・アズマ・アンド・イムノロジー（Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．），８１，１０５（１９９８）
【非特許文献９】ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），１６，１０１５（１９９８）
【非特許文献１０】ネイチャー・レビューズ・キャンサー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ），１，１１９（２００１）
【非特許文献１１】カレント・オピニオン・イン・オンコロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１０，５４８（１９９８）
【非特許文献１２】ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１６，２８２５（１９９８）
【非特許文献１３】ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１７，２６８（１９９９）
【非特許文献１４】ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１７，２６３９（１９９９）
【非特許文献１５】モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）
【非特許文献１６】ケミカル・イムノロジー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），６５，８８（１９９７）
【非特許文献１７】イムノロジー・トゥデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ），２０，５７６（１９９９）
【非特許文献１８】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，３２３（１９８８）
【非特許文献１９】ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１６６，１３５１（１９８７）
【非特許文献２０】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），４０６，２６７（２０００）
【非特許文献２１】ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６６，２５７１（２００１）
【非特許文献２２】オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ），２２，７３５９（２００３）
【非特許文献２３】ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），９９，７５４（２００２）
【非特許文献２４】ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１７２，３２８０（２００４）
【非特許文献２５】ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），２１，１４６６（２００３）
【非特許文献２６】ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），２６，１７８９（２００８）
【非特許文献２７】ネイチャー・レビューズ・イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），７，７１５（２００７）
【非特許文献２８】バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１５，５１７５（１９７６）
【非特許文献２９】ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１７３，１０２５（１９９１）
【非特許文献３０】プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），６３，７８（１９６９）
【非特許文献３１】イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），８６，３１９（１９９５）
【非特許文献３２】ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６４，４１７８（２０００）
【非特許文献３３】モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３４，１０１９（１９９７）
【非特許文献３４】モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３７，９９５（２０００）
【非特許文献３５】ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），１７７，１１２９（２００６）
【非特許文献３６】キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），６８，３８６３（２００８）
【非特許文献３７】モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）第三版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｏｘｆｏｒｄ（１９９５）
【非特許文献３８】プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｒｉｎｇ），３，４３３（１９９０）
【非特許文献３９】バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），３７，６８３３（１９９８）
【非特許文献４０】イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第５版，Ｍｏｓｂｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ（１９９８）
【非特許文献４１】モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３４，５９３（１９９７）
【非特許文献４２】シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）第５版，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）
【非特許文献４３】ヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂ  Ｈｙｂｒｉｄ），５，１４３（１９９４）
【非特許文献４４】ヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂ  Ｈｙｂｒｉｄ），６，８２（１９９５）
【非特許文献４５】ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１７，１７６（１９９９）
【非特許文献４６】バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．）７４，２８８（２００１）
【非特許文献４７】ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７７，２６７３３（２００２）
【非特許文献４８】ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７８，３４６６（２００３）
【非特許文献４９】ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），１６６，２５７１（２００１）。
【非特許文献５０】ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２８１，２３５１４
【非特許文献５１】プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｒｉｎｇ），９，６１７（１９９６）
【非特許文献５２】イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），１０５，９（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００５０】
抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖のうち、２９７番目のＡｓｎに結合する糖鎖は抗体の活性や血中安定性に関与しているが、２９７番目以外のアミノ酸残基に結合した余分な糖鎖は抗体定常領域を介した活性へ影響を及ぼす可能性や、抗体医薬品としての均一性の問題を引き起こす可能性がある。そのため、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖のうち、ＥＵインデックス２９７番目以外のＡｓｎ残基に結合する余分な糖鎖を制御する方法が求められている。【００５１】
したがって、本発明は、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖のうち、ＥＵインデックス２９７番目以外のＡｓｎ残基に結合する糖鎖が減少または欠損した改変抗体組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００５２】
上記課題を鑑み、検討した結果、本発明者らは、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列を構成するアミノ酸残基において、Ａｓｎから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変、ＸからＰｒｏへのアミノ酸改変およびＳｅｒ／Ｔｈｒから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸改変が行うことにより、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖のうち、ＥＵインデックス２９７番目以外のＡｓｎ残基に結合する糖鎖が減少または欠損することを見出し、本発明を完成させた。【００５３】
すなわち、本発明の要旨は以下である。
１．ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列を構成するアミノ酸残基において、Ａｓｎから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変、ＸからＰｒｏへのアミノ酸改変およびＳｅｒ／Ｔｈｒから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸改変が行われた改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
２．ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列中のＡｓｎにＮ−グリコシド結合型糖鎖が付加されている前項１に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
３．ＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列が、ＥＵインデックス３９２〜３９４番目である、前項１または２に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
４．ＥＵインデックスの３９２〜３９４番目のうちアミノ酸残基の少なくとも１つのアミノ酸残基が以下のアミノ酸残基に改変された、前項１〜３のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
ＥＵインデックス３９２番目：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ
ＥＵインデックス３９３番目：Ｐｒｏ
ＥＵインデックス３９４番目：Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ
５．ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域が配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む前項１〜４のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
６．ＣＨ１ドメインおよびヒンジドメインを含み、該ＣＨ１ドメインおよびヒンジドメインがヒトＩｇＧ１抗体由来のアミノ酸配列を含む前項１〜５のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
７．ＥＵインデックス３３９番目のＴｈｒが、ＡｓｎまたはＴｙｒのアミノ酸残基に改変されたＦｃ領域を含む前項１〜６のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
８．ＥＵインデックス３９７番目のＭｅｔが、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＡｓｐおよびＰｈｅから選ばれるいずれか１つのアミノ酸残基に改変された抗体Ｆｃ領域を含む前項１〜７のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片。
９．前項１〜８のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
１０．前項９に記載のＤＮＡを含有するベクター。
１１．前項１０に記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
１２．前項１１に記載の形質転換体を培地内で培養し、培養液中に前項１〜８のいずれか１項に記載の改変抗体組成物または該改変抗体組成物断片を生成蓄積させ、培養液から改変抗体組成物または該改変抗体組成物断片を精製する前項１〜８のいずれか１項に記載の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片を製造する方法。
１３．ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列を構成するアミノ酸残基において、Ａｓｎから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変、ＸからＰｒｏへのアミノ酸改変およびＳｅｒ／Ｔｈｒから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸改変を行う、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ残基に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖を減少させる方法。
１４．ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列のＡｓｎ残基にＮ−グリコシド結合糖鎖が付加されている前項１３に記載の方法。
１５．ＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列が、ＥＵインデックス３９２〜３９４番目である、前項１３または１４に記載の方法。
１６．ＥＵインデックスの３９２〜３９４番目のうちアミノ酸残基の少なくとも１つのアミノ酸残基が以下のアミノ酸残基に改変された、前項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
ＥＵインデックス３９２番目：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ
ＥＵインデックス３９３番目：Ｐｒｏ
ＥＵインデックス３９４番目：Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ
１７．ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域が配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む前項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
１８．ヒトＩｇＧ抗体がＣＨ１ドメインおよびヒンジドメインを含み、該ＣＨ１ドメインおよびヒンジドメインがヒトＩｇＧ１抗体由来のアミノ酸配列を含む前項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００５４】
本発明の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片は、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖のうち、ＥＵインデックス２９７番目以外のＡｓｎ残基に結合する糖鎖が減少または欠損した改変抗体組成物、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖のうち、ＥＵインデックス２９７番目以外のＡｓｎ残基に結合する余分な糖鎖が減少または欠損し、かつ抗体のエフェクター活性が維持された改変抗体組成物および改変抗体組成物断片である。【００５５】
本発明の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片は抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖のうち、ＥＵインデックス２９７番目以外のＡｓｎ残基に結合する糖鎖が減少または欠損しているため、２９７番目以外のアミノ酸残基に結合した余分な糖鎖による抗体定常領域を介した活性への影響、および抗体医薬品としての均一性の問題などを引き起こすことがなく、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１（ａ）および（ｂ）は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖（コンプレックス型糖鎖）の典型的な構造を示す。
【図２】図２（ａ）〜（ｃ）は、高ＣＤＣ活性型のＩｇＧ１／ＩｇＧ３ドメイン交換抗体である１１３Ｆ型抗体の構成を示している。
【図３】図３は、ＧＭ２−１１３ＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す図である。レーン１は分子量マーカー、レーン２はＧＭ２−１１３Ｆを分析した。分子量マーカーの分子量は図３の左端に示した。
【図４】図４は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ３抗体および１１３Ｆ型抗体のＨ鎖定常領域のアミノ酸配列の比較である。太字で示されたアミノ酸残基は、ＩｇＧ１抗体とＩｇＧ３抗体で異なるアミノ酸を配する部位である。星印は本研究中でアミノ酸置換を行った残基を表す。
【図５】図５は、発現ベクターの作製手順である。図５中でベクターの一部分が点線で描かれているのは、ＰＣＲ後にＨ鎖定常領域以外の塩基配列が未確認であることを表す。
【図６】図６（ａ）および（ｂ）は、ＣＤ２０トランスフェクタントＫＣ１１５６に対する１１３Ｆ抗体、Ｎ３９２Ｋ、Ｔ３９４Ｙ、Ｔ３９４Ｆおよびｒｉｔｕｘｉｍａｂの各種濃度におけるＣＤＣ活性測定の結果である。グラフの縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は抗体濃度を表す。実験はＮ＝３で行った。
【図７】図７（ａ）〜（ｅ）は、ＣＤ２０陽性腫瘍細胞株であるＲａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、ＳＴ４８６、ＥＨＥＢおよびＭＥＣ−１に対する１１３Ｆ抗体、Ｎ３９２Ｋ、Ｔ３９４Ｙ、Ｔ３９４Ｆ、Ｎ３９２Ｋ／Ｔ３３９Ｙおよびｒｉｔｕｘｉｍａｂの各種濃度におけるＣＤＣ活性測定の結果である。グラフの縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は抗体濃度を表す。実験はＮ＝３で行った。
【図８】図８は、フローサイトメーターを用いた１１３Ｆ抗体、Ｎ３９２Ｋ、Ｔ３９４ＹおよびＴ３９４ＦのＣ１ｑ結合活性測定の結果である。実験にはＣＤ２０陽性腫瘍細胞であるＤａｕｄｉを用い、抗体とヒト血清を反応させた後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣ１ｑ抗体によりＣ１ｑの結合を検出した。グラフの縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、横軸は抗体濃度を表す。実験はＮ＝３で行った。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明の改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片は、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＫａｂａｔらによるＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列を構成するアミノ酸残基において、Ａｓｎから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変、ＸからＰｒｏへのアミノ酸改変およびＳｅｒ／Ｔｈｒから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変のうち、少なくともいずれか１つのアミノ酸改変が行われた改変抗体組成物および該改変抗体組成物断片である。
【００５８】
本発明において、ＥＵインデックスとは、シーケンス・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト第５版（１９９１）を示す。以下に示すアミノ酸残基の位置は、特に記載の無い場合は全てＥＵインデックスに基づいて示す。
【００５９】
Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列は、Ａｓｎ残基のＮＨ２基に糖鎖が結合しやすい共通配列（以下、Ｎ‐グリコシド結合型糖鎖コンセンサス配列、または単にコンセンサス配列と記載する）をいう。
【００６０】
本発明において、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列としては、３９２〜３９４番目のＡｓｎが挙げられる。
【００６１】
また本発明の改変抗体組成物として、具体的には、抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス３９２〜３９４番目のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列において、Ａｓｎから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変およびＸからＰｒｏへのアミノ酸改変およびＳｅｒ／Ｔｈｒから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸改変が行われた改変抗体組成物が挙げられる。
【００６２】
本発明の改変抗体組成物として、より具体的には、抗体のＦｃ領域のＥＵインデックスの３９２〜３９４番目のアミノ酸残基において、少なくとも１つのアミノ酸残基が以下のアミノ酸残基に改変された改変抗体組成物などが挙げられる。
ＥＵインデックス３９２番目：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ
ＥＵインデックス３９３番目：Ｐｒｏ
ＥＵインデックス３９４番目：Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ
【００６３】
本発明のヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域としては、少なくともＦｃ領域のＥＵインデックスの３９２番目〜３９４番目のアミノ酸配列がＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒを有するＦｃ領域、具体的には、ＥＵインデックス２３１〜４３４番目までがヒトＩｇＧ１かつ４３５〜４４７番目までがヒトＩｇＧ３のアミノ酸配列であるＦｃ領域、更に具体的には配列番号１のアミノ酸配列を有するＦｃ領域が挙げられる。
【００６４】
本発明の改変抗体組成物として具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域において、ＥＵインデックス３９２番目のＡｓｎがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐから選ばれるいずれか１つのアミノ酸残基に改変された改変抗体組成物、ＥＵインデックス３９３番目のＴｈｒがＰｒｏに改変された改変抗体組成物、およびＥＵインデックス３９４番目のＴｈｒが、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒから選ばれるいずれか１つのアミノ酸残基に改変された改変抗体組成物などが挙げられる。
【００６５】
本発明の改変抗体組成物としてより具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域において、ＥＵインデックス３９２番目のＡｓｎがＬｙｓに改変された改変抗体組成物、配列番号３のアミノ酸配列を有する改変抗体組成物などが挙げられる。
【００６６】
更に本発明の改変抗体組成物としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域において、上述のアミノ酸改変に加えてＥＵインデックス３３９番目のＴｈｒがＴｙｒに改変された改変抗体組成物、ＥＵインデックス３９７番目のＭｅｔがＧｌｎ、Ａｓｎ、ＡｓｐおよびＰｈｅから選ばれるいずれか１つのアミノ酸残基に改変された改変抗体組成物も挙げられる。
【００６７】
更に本発明の改変抗体としては、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、かつＥＵインデックス３３９番目のＴｈｒがＴｙｒに改変された改変抗体組成物、並びにＥＵインデックス３９７番目のＭｅｔがＧｌｎ、Ａｓｎ、ＡｓｐおよびＰｈｅから選ばれるいずれか１つのアミノ酸残基に改変された改変抗体組成物も挙げられる。
【００６８】
本発明において、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列を構成するアミノ酸残基において、Ａｓｎ、ＸおよびＳｅｒ／Ｔｈｒのいずれのアミノ酸残基をどのアミノ酸残基に改変するかについては、アミノ酸改変の結果、新たなＮ−グリコシド結合型糖鎖コンセンサス配列が生じないように、アミノ酸残基改変を行う位置、改変後のアミノ酸残基を考慮することにより行うことができる。
【００６９】
本発明の改変抗体組成物は、上述のアミノ酸残基を改変することによって、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列のＡｓｎ残基に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖が減少または欠損し、かつアミノ酸残基改変を行う前の抗体と比べて、同等以上のエフェクター活性を有する。
【００７０】
本発明の改変抗体組成物としては、具体的には、ＥＵインデックス３９２番目のＡｓｎに糖鎖が結合せず、かつアミノ酸残基の改変を行う前の抗体と比べて、同等以上のエフェクター活性を有する改変抗体組成物が挙げられる。
【００７１】
本発明においてＡｓｎに結合する糖鎖が減少または欠損するとは、アミノ酸残基改変を行う前の改変抗体組成物と比べて、アミノ酸残基改変を行った後の改変抗体組成物では、実質的に糖鎖が結合していないことを示す。
【００７２】
実質的に糖鎖が結合していないとは、下記に述べる糖鎖分析方法などを用いて糖鎖を分析した場合に、該アミノ酸残基改変部位に結合する糖鎖が検出されない、または検出限界以下であることを示す。
【００７３】
本発明の改変抗体としては、変異Ｆｃを有し、かつ標的分子への結合活性を有するタンパク質であればいずれのものも包含される。具体的には、変異Ｆｃを有するモノクローナル抗体、変異Ｆｃと抗体断片が結合した融合タンパク質、変異Ｆｃと天然に存在するリガンドまたは受容体が結合したＦｃ融合タンパク質（イムノアドヘシンともいう）、複数のＦｃ領域を融合させたＦｃ融合タンパク質等も本発明に包含される。
【００７４】
標的分子との結合活性を有する抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
【００７５】
本発明の改変抗体とは、変異Ｆｃを有するタンパク質をいう。
【００７６】
本発明において変異Ｆｃとは、抗体Ｆｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖のうち、ＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外のＮ−グリコシド結合型糖鎖コンセンサス配列に結合する糖鎖を減少または欠損させるようにアミノ酸改変されたＦｃ領域をいう。
【００７７】
即ち、本発明の変異Ｆｃは、Ｆｃ領域のＥＵインデックス２９７番目のＡｓｎにＮ−グリコシド結合型糖鎖が結合し、かつそれ以外の余分なＮ−グリコシド結合糖鎖が結合しないように、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖コンセンサス配列を減少または欠損させたＦｃ領域をいう。
【００７８】
また、本発明において抗体Ｆｃ領域または単にＦｃとは、Ｋａｂａｔら［シーケンス・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト第５版（１９９１）］に報告されている、天然に存在するイムノグロブリンまたは該アロタイプのＦｃアミノ酸配列、またはエフェクター活性の制御、抗体の安定性や血中半減期の延長等を目的としてアミノ酸改変されたＦｃアミノ酸配列（国際公開第００／４２０７２号、国際公開第２００６／０３３３８６号、国際公開第２００６／１０５３３８、国際公開第２００５／０７０９６３号、国際公開第２００７／０１１０４１号、国際公開第２００８／１４５１４２号）いずれのアミノ酸配列でもよく、Ｆｃ領域とＦｃ受容体との結合活性を有しているＦｃ領域、および／またはＦｃ領域とＦｃ受容体を介したエフェクター活性を有しているＦｃ領域であれば、いずれのＦｃ領域でもよい。
【００７９】
即ち、本発明の改変抗体組成物は、抗体Ｆｃに結合するＥＵインデックス２９７番目以外の余分なＮ−グリコシド結合型糖鎖の結合を減少または欠損させた変異Ｆｃを有し、かつＦｃ受容体との結合活性および／またはエフェクター活性が制御された改変抗体組成物である。
【００８０】
本発明においてモノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一である。本発明の改変抗体組成物は、実質的にモノクローナル抗体の性質を有している改変抗体であり、モノクローナル抗体に包含される。
【００８１】
エピトープとは、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列および糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。立体構造は、天然に存在するタンパク質が有する３次元立体構造であり、細胞内または細胞膜上に発現しているタンパク質が構成する立体構造をいう。
【００８２】
抗体分子はイムノグロブリン（以下、Ｉｇと表記する）とも称され、ヒト抗体は、分子構造の違いに応じて、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭのアイソタイプに分類される。アミノ酸配列の相同性が比較的高いＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を総称してＩｇＧともいう。
【００８３】
抗体分子は重鎖（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ、以下Ｈ鎖と記す）および軽鎖（Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ、以下Ｌ鎖と記す）と呼ばれるポリペプチドより構成される。
【００８４】
また、Ｈ鎖はＮ末端側よりＨ鎖可変領域（ＶＨとも表記される）、Ｈ鎖定常領域（ＣＨとも表記される）、Ｌ鎖はＮ末端側よりＬ鎖可変領域（ＶＬとも表記される）、Ｌ鎖定常領域（ＣＬとも表記される）の各領域により、それぞれ構成される。
【００８５】
ＣＨは各サブクラスごとに、α、δ、ε、γおよびμ鎖がそれぞれ知られている。ＣＨはさらに、Ｎ末端側よりＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの各ドメインにより構成される。
【００８６】
ドメインとは、抗体分子の各ポリペプチドを構成する機能的な構造単位をいう。また、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを併せてＦｃ領域または単にＦｃという。ＣＬは、Ｃλ鎖およびＣκ鎖が知られている。
【００８７】
本発明におけるＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＦｃ領域は、ＥＵインデックスにより、Ｎ末端からのアミノ酸残基の番号で特定することができる。
【００８８】
具体的には、ＣＨ１はＥＵインデックス１１８〜２１５番のアミノ酸配列、ヒンジはＥＵインデックス２１６〜２３０番のアミノ酸配列、ＣＨ２はＥＵインデックス２３１〜３４０番のアミノ酸配列、ＣＨ３はＥＵインデックス３４１〜４４７番のアミノ酸配列とそれぞれ特定される。
【００８９】
本発明の改変抗体組成物としては、特にヒト型キメラ抗体（以下、単にキメラ抗体とも略記する）、ヒト化抗体［相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）移植抗体ともいう］およびヒト抗体なども含まれる。
【００９０】
キメラ抗体とは、ヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体のＶＨおよびＶＬと、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなる抗体を意味する。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００９１】
ハイブリドーマとは、非ヒト動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウスなどに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞をいう。したがって、ハイブリドーマが産生する抗体を構成する可変領域は、非ヒト動物抗体のアミノ酸配列からなる。
【００９２】
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産する非ヒト動物細胞由来のハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００９３】
ヒト化抗体とは、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの対応するＣＤＲに移植した抗体をいう。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ以外の領域はフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）と称される。
【００９４】
ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、非ヒト動物抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００９５】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
【００９６】
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血から単離したリンパ球を、ＥＢウイルス等を感染させることによって不死化した後、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
【００９７】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片を表面に発現させたファージのライブラリーである。
【００９８】
ヒト抗体ファージライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００９９】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。
【０１００】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
【０１０１】
本発明の改変抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、または非ヒト動物抗体のＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワークに移植したヒト化抗体のアミノ酸配列のいずれでもよい。
【０１０２】
具体的には、例えば、ハイブリドーマが産生する非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列並びにヒト抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列などが挙げられる。
【０１０３】
本発明の改変抗体におけるＣＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のアミノ酸配列または非ヒト動物抗体のアミノ酸配列のいずれでもよいが、ヒト抗体のアミノ酸配列のＣκまたはＣλが好ましい。
【０１０４】
本発明の改変抗体のＣＨとしては、イムノグロブリンに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはＩｇＧクラスに属するサブクラスである、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）およびγ４（ＩｇＧ４）のいずれも用いることができる。
【０１０５】
また、本発明の改変抗体のＣＨのアミノ酸配列としては、天然に存在するイムノグロブリンＣＨ配列（各サブクラスのアロタイプを含む）だけでなく、天然に存在する２種類以上のイムノグロブリンＣＨ配列を組み合わせたキメラ型のＣＨ配列や、抗体のエフェクター活性を制御するためにアミノ酸残基改変が行われたその他のＣＨのアミノ酸配列も含まれる。
【０１０６】
本発明の改変抗体のＣＨとしては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むＦｃ領域において、ＥＵインデックス３９２番目のＡｓｎ、３９３番目のＴｈｒおよび３９４番目のＴｈｒにおいて、ＡｓｎからＳｅｒ／Ｔｈｒ以外の他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変、ＴｈｒからＰｒｏへのアミノ酸改変およびＴｈｒから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変のうち、少なくともいずれか１つのアミノ酸改変が行われた変異Ｆｃを有するＣＨが挙げられる。
【０１０７】
本発明の改変抗体のＣＨとして具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むＦｃ領域において、ＥＵインデックス３９２番目のＡｓｎがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐから選ばれるいずれか１つのアミノ酸残基に改変された変異Ｆｃを有するＣＨ、ＥＵインデックス３９３番目のＴｈｒがＰｒｏに改変された抗体Ｆｃ領域を有するＣＨ、およびＥＵインデックス３９４番目のＴｈｒが、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒから選ばれるいずれか１つのアミノ酸残基に改変された変異Ｆｃを有するＣＨなどが挙げられる。
【０１０８】
本発明の改変抗体のＣＨとしてより具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むＦｃ領域において、ＥＵインデックス３９２番目のＡｓｎがＬｙｓに改変された変異Ｆｃを有するＣＨが挙げられる。
【０１０９】
本発明の改変抗体のＣＨとしては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むＦｃ領域において、上述のアミノ酸改変に加えてＥＵインデックス３３９番目のＴｈｒがＴｙｒに改変されたＣＨ、ＥＵインデックス３９７番目のＭｅｔがＧｌｎ、Ａｓｎ、ＡｓｐおよびＰｈｅから選ばれるいずれかのアミノ酸残基に改変された変異Ｆｃを有するＣＨ等も含まれる。
【０１１０】
また本発明の改変抗体のＣＨとしては、Ｆｃ領域以外のＣＨドメインとしてＣＨ１およびヒンジドメインがヒトＩｇＧ１であるＣＨが包含される。
【０１１１】
また本発明の改変抗体のＣＨとして具体的には、ＣＨ１およびヒンジドメインがＩｇＧ１抗体由来のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むＦｃ領域において、ＥＵインデックス３９２番目Ａｓｎ、３９３番目Ｔｈｒおよび３９４番目Ｔｈｒにおいて、ＡｓｎからＳｅｒ／Ｔｈｒ以外の他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変、ＴｈｒからＰｒｏへのアミノ酸改変およびＴｈｒから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変のうち、少なくともいずれか１つのアミノ酸改変が行われたＣＨ、配列番号２のＣＨにおいて、ＥＵインデックス３９２番目のＡｓｎ、３９３番目のＴｈｒおよび３９４番目のＴｈｒにおいて、ＡｓｎからＳｅｒ／Ｔｈｒ以外の他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変、ＴｈｒからＰｒｏへのアミノ酸改変およびＴｈｒから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変のうち、少なくともいずれか１つのアミノ酸改変が行われたＣＨなどが挙げられる。
【０１１２】
エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、抗体依存性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＤＣＣ活性）、補体依存性傷害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＣＤＣ活性）や、マクロファージや樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＤＰ活性）などが知られている。
【０１１３】
本発明においてＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性は、公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］を用いて測定することができる。
【０１１４】
ＡＤＣＣ活性とは、標的細胞上の抗原に結合した抗体が、抗体のＦｃ領域を介して免疫細胞のＦｃ受容体と結合することで免疫細胞（ナチュラルキラー細胞など）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。
【０１１５】
Ｆｃ受容体（以下、ＦｃＲと記すこともある）とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体であり、抗体の結合によりさまざまなエフェクター活性を誘導する。
【０１１６】
ＦｃＲは抗体のサブクラスに対応しており、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭはそれぞれＦｃγＲ、ＦｃεＲ、ＦｃαＲ、ＦｃμＲに特異的に結合する。
【０１１７】
更にＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のサブタイプが存在し、ぞれぞれＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、ＦｃγＲＩＣ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢのアイソフォームが存在する。これらの異なるＦｃγＲは異なる細胞上に存在している（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）。
【０１１８】
ヒトにおいては、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球に特異的に発現しており、ＦｃγＲＩＩＩＡは、単球、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ細胞（ＮＫ細胞）および一部のＴ細胞に発現している。ＦｃγＲＩＩＩＡを介した抗体の結合は、ＮＫ細胞依存的なＡＤＣＣ活性を誘導する。
【０１１９】
ＣＤＣ活性とは標的細胞上の抗原に結合した抗体が血液中の補体関連タンパク質群からなる一連のカスケード（補体活性化経路）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。また、補体の活性化により生じるタンパク質断片により免疫細胞の遊走および活性化を誘導することができる。
【０１２０】
ＣＤＣ活性のカスケードは、抗体のＦｃ領域との結合ドメインを有するＣ１ｑが、Ｆｃ領域に結合し、２つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓと結合することでＣ１複合体を形成することで開始する。
【０１２１】
本発明のＦｃ領域に結合する２９７番目以外のＡｓｎ残基に結合する糖鎖を減少または欠損させた改変抗体は、２９７番目以外のＡｓｎ残基に糖鎖が結合している抗体と同等以上のエフェクター活性、Ｃ１ｑ結合活性、ＦｃＲ結合活性、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を有する。
【０１２２】
また、本発明の改変抗体組成物は、アミノ酸改変前の抗体（親抗体ともいう）と比べて、実質的に同等、または実質的に同等以上のＣ１ｑ結合活性、ＦｃＲ結合活性、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を有する。
【０１２３】
親抗体と比べて、実質的に同等以上のＣ１ｑ結合活性、ＦｃＲ結合活性、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を有するとは、本発明の改変抗体と親抗体を同時に同じ実験系で解析した時に、ＦｃＲ結合活性、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性から選ばれるいずれか１つ以上の活性が、親抗体の活性と比べて同等かそれ以上であることを示す。
【０１２４】
アミノ酸改変を行う前の親抗体の活性と比べて同等とは、親抗体の活性を１００％とした時に、改変抗体の活性が好ましくは７５％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％、よりさらに好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに好ましくは９６％、よりさらに好ましくは９７％、よりさらに好ましくは９８％、特に好ましくは９９％、最も好ましくは１００％以上であることを示す。また、アミノ酸改変を行う前の親抗体の活性と比べて同等以上とは、好ましくは１００％、より好ましくは１１０％、さらに好ましくは１２０％、よりさらに好ましくは１３０％特に、好ましくは１４０％、最も好ましくは１５０％以上の活性であることを示す。
【０１２５】
従って、本発明の改変抗体は、ＥＵインデックス２９７番目以外のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）コンセンサス配列において、Ａｓｎから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変、ＸからＰｒｏへのアミノ酸改変およびＳｅｒ／Ｔｈｒから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変のうち、少なくともいずれか１つのアミノ酸改変を行うことにより、改変抗体のＣ１ｑ結合活性、ＦｃＲ結合活性、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を制御することが可能であり、かつ２９７番目以外のＡｓｎ残基に結合する糖鎖を減少または欠損させることができる。
【０１２６】
更に本発明の改変抗体組成物は、組成物中に含まれる重合体（会合体）量および／または抗体分解物量が減少している。重合体とは、１分子の抗体分子（１量体）が、疎水結合や水素結合などの結合を介して二つ以上重合したものをいい、ダイマー、トリマーまた数分子が重合したオリゴマー、および数分子以上が重合したポリマーなどが挙げられる。
【０１２７】
また重合体を凝集体と表現する場合もある。また、抗体分解物とは、酵素的、非酵素的に生じうる抗体分子の分解物であればいずれのものでもよく、断片化された抗体、酸化体、デアミデーション体およびイソメリゼーション体などが挙げられる。
【０１２８】
従って、本発明のＥＵインデックス２９７番目以外のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）コンセンサス配列において、Ａｓｎから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変、ＸからＰｒｏへのアミノ酸改変およびＳｅｒ／Ｔｈｒから他のアミノ酸残基へのアミノ酸改変のうち、少なくともいずれか１つのアミノ酸残基改変を含む改変抗体組成物は、抗体を作製・製造する際に重合体量および／または抗体分解物量が減少していることから、抗体医薬品として有用である。当該改変抗体組成物としては、より具体的には、ＥＵインデックスの３９２番目をＬｙｓへアミノ酸残基改変した改変抗体組成物が挙げられる。
【０１２９】
本発明において抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
【０１３０】
Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１３１】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１３２】
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１３３】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを１２残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬまたはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１３４】
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対する２特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１３５】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のＳ−Ｓ結合を介して結合させたものをいう。
【０１３６】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＤＲ同士を直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【０１３７】
本発明の改変抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
【０１３８】
本発明の改変抗体組成物は、いかなる特異性を有する抗体をも包含するが、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーまたは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスまたは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、腫瘍関連抗原を認識する抗体であることがより好ましい。
【０１３９】
腫瘍関連抗原としては、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５８、ＣＤ１６０、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ２００、ＣＤ２２７、ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＡＲＰ４）、ａｕｒｏｒａ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−ＤＣ、ｉｎｔｅｇｌｉｎ、ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２（ＢＳＴ２）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ  ９（ＣＡ９），ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｃｃ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＣＲ）４、ＣＣＲ７、ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１（ＣＦＲ−１）、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＣＴＡ、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）、ＣＴＬＡ−４、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−１８、ＤＦ３、Ｅ−ｃａｔｈｅｒｉｎ、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ３）、ＥＧＦＲ４（ＨＥＲ４）、ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＢ−ＥＧＦ）、ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＰＣＲ）、ｅｐｈｒｉｎ、ｅｐｈｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｅｐｈ）、ＥｐｈＡ２、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｓｅ−２（ＥＴ２）、ＦＡＭ３Ｄ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＰ）、Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １（ＦｃＲＨ１）、ｆｅｒｒｉｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−８（ＦＧＦ−８）、ＦＧＦ８  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  １０（ＦＺＤ１０）、ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４（ＦＺＤ−４）、Ｇ２５０、Ｇ−ＣＳＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２およびＧＭ３等）、ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ｇｐ７５、ｇｐ８８、ＧＰＲ−９−６、ｈｅｐａｒａｎａｓｅ  Ｉ、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＨＬＡ  ａｎｔｉｇｅｎ（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ等）、ＨＭ１．２���、ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ  ｆａｔ  ｇｌｏｂｕｌｅ（ＨＭＦＧ）、ｈＲＳ７、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０（ｈｓｐ９０）、ｉｄｉｏｔｙｐｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ＩＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＧＦＲ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５等）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１０ＲおよびＩＬ−１５Ｒ等）、ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ−４（ＩＲＴＡ−４）、ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  １、ＫＤＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＳ１／４、ｌａｍｐ−１、ｌａｍｐ−２、ｌａｍｉｎｉｎ−５、Ｌｅｗｉｓ  ｙ、ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  ｘ、ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＴＢＲ）、ＬＵＮＸ、ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ（ＭＣＳＰ）、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＩＣＡ、Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＭＩＳＩＩＲ）、ｍｕｃｉｎ、ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＮＣＡＭ）、Ｎｅｃｌ−５、Ｎｏｔｃｈ１、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆａｃｔｏｒ−４（ＰＦ−４）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）、Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＴＨｒＰ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ（ＲＨＡＭＭ）、ＲＯＢＯ１、ＳＡＲＴ３、ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ４Ｂ（ＳＥＭＡ４Ｂ）、ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＬＰＩ）、ＳＭ５−１、ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−７２（ＴＡＧ−７２）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴｆＲ）、ＴＧＦ−ｂｅｔａ、Ｔｈｙ−１、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｍｕｃｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  １（ＴＩＭ−１）、ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ（ｈＴＦ）、Ｔｎ  ａｎｔｉｇｅｎ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＴＦ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄ��ｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＲＡＩＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＤＲ４およびＤＲ５等）、ｓｙｓｔｅｍ  ＡＳＣ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ２（ＡＳＣＴ２）、ｔｒｋＣ、ＴＲＯＰ−２、ＴＷＥＡＫ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｎ１４、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｕＰＡＲ）、ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３等）、ｖｉｍｅｎｔｉｎおよびＶＬＡ−４等が挙げられる。
【０１４０】
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ＧＤ２抗体［アンチ・キャンサー・リサーチ（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），１３，３３１（１９９３）］、抗ＧＤ３抗体［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，２６０（１９９３）］、抗ＧＭ２抗体［キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），５４，１５１１（１９９４）］、抗ＨＥＲ２抗体［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８９，４２８５（１９９２）、欧州特許第８８２７９４号明細書］、抗ＣＤ５２抗体［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８９，４２８５（１９９２）］、抗ＣＤ４抗体、抗ＭＡＧＥ抗体［ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ），８３，４９３（２０００）］、抗ＣＣＲ４抗体（米国特許第６，９８９，１４５号明細書、国際公開第２００９／０８６５１４号）、抗ＨＭ１．２４抗体［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３６，３８７（１９９９）、国際公開第２００２／０５７３１６号］、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体［キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ），８８，２９０９（２０００）］、抗ｂＦＧＦ抗体、抗ＦＧＦ−８抗体［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８６，９９１１（１９８９）］、抗ｂＦＧＦＲ抗体、抗ＦＧＦ−８Ｒ抗体［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６５，１６４５５（１９９０）］、抗ＩＧＦ抗体［ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．），４０，６４７（１９９５）］、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体［ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．），４０，６４７（１９９５）］、抗ＰＳＭＡ抗体［ジャーナル・オブ・ウロロジー（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ），１６０，２３９６（１９９８）］、抗ＶＥＧＦ抗体［キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），５７，４５９３（１９９７）］、抗ＶＥＧＦＲ抗体［オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ），１９，２１３８（２０００）、国際公開第９６／３００４６号］、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（米国特許第７，４９８，４２０号明細書）、抗ＣＤ２０抗体［Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、カレント・オピニオン・イン・オンコロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１０，５４８（１９９８）、米国特許第５，７３６，１３７号明細書］、抗ＨＥＲ２抗体［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、米国特許第５，７２５，８５６号明細書］、抗ＨＥＲ３抗体（国際公開第２００８／１００６２４号、国際公開第２００７／０７７０２８号）、抗Ｂｉｐ抗体（国際公開第２００８／１０５５６０号）、抗ＣＤ１０抗体、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体（国際公開第２００７／１４２２７７号）、抗ＥＧＦＲ抗体（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、国際公開第１９９６／４０２０１０号）、抗Ａｐｏ−２Ｒ抗体（国際公開第９８／５１７９３号）、抗ＡＳＣＴ２抗体（国際公開第２０１０／００８０７５号）、抗５Ｔ４抗体（米国特許出願公開第２００６／００８８５２２号明細書）、抗ＣＡ９抗体（米国特許第７，３７８，０９１号明細書）、抗ＣＥＡ抗体［キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），５５（２３  ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ−５９４５ｓ，（１９９５）］、抗ＬｅｗｉｓＹ抗体、抗葉酸受容体抗体（国際公開第２００５／０８０４３１号）、抗ＴＲＯＰ−２抗体（米国特許第６，７９４，４９４号明細書）、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３３抗体［Ｍｙｌｏｔａｇ（登録商標）］、抗ＣＤ２２抗体（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ａ３３抗体、抗ＩＬ−３Ｒα抗体（国際公開第２０１０／１２６０６６号）、抗ｕＰＡＲ抗体（米国特許第２００８／０１５２５８７号明細書）、ＴＲＡＩＬ２抗体（国際公開第２００２／９４８８０号）などが挙げられる。
【０１４１】
アレルギーまたは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗インターロイキン６抗体［イムノロジカル・レビューズ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．），１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン６受容体抗体［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３１，３７１（１９９４）］、抗インターロイキン５抗体［イムノロジカル・レビューズ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．），１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体［サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ），３，５６２（１９９１）］、抗インターロイキン４受容体抗体［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），２１７，４１（１９９８）］、抗インターロイキン１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）抗体（国際公開第２００９／１５４９９５号）、抗腫瘍壊死因子抗体［ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ），１３，１８３（１９９４）］、抗腫瘍壊死因子受容体抗体［モレキュラー・ファーマコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．），５８，２３７（２０００）］、抗ＣＣＲ４抗体［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），４００，７７６，（１９９９）］、抗ＣＣＲ５抗体、抗ＣＣＲ６抗体、抗ケモカイン抗体（Ｐｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９−２５７，１９９４）または抗ケモカイン受容体抗体［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），１８６，１３７３（１９９７）］であり、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体が抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１５２，２９６８（１９９４）］、抗血小板由来増殖因子抗体［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２５３，１１２９（１９９１）］、抗血小板由来増殖因子受容体抗体［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７２，１７４００（１９９７）］、抗血液凝固因子抗体［サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ），１０１，１１５８（２０００）］、抗ＩｇＥ抗体［Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）］、抗ＣＤ２２抗体（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、抗ＢＡＦＦ抗体（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）抗αＶβ３抗体およびα４β７抗体などが挙げられる。
【０１４２】
ウイルスまたは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ｇｐ１２０抗体［ストラクチャー（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ），８，３８５（２０００）］、抗インフルエンザＡ型ウィルスのマトリックスタンパク質２（Ｍ２，国際公開第２００３／０７８６００号）、抗ＣＤ４抗体［ジャーナル・オブ・リューマトロジー（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ），２５，２０６５（１９９８）］、抗ＣＣＲ５抗体および抗ベロ毒素抗体［ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．），３７，３９６（１９９９）］などが挙げられる。
【０１４３】
さらに、本発明の改変抗体は、プロテインＡ結合活性を有する。
【０１４４】
プロテインＡ結合活性を有するとは、改変抗体組成物がプロテインＡを用いて精製可能であることをいう。
【０１４５】
プロテインＡ結合活性は、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴法などを用いて測定することができる。具体的には、プレートに固相化されたプロテインＡに、抗体組成物を反応させた後、各種標識を行ったその抗体を認識する抗体をさらに反応させて、プロテインＡに結合された抗体組成物を定量することにより測定することができる。
【０１４６】
ＩｇＧ１抗体と同等のプロテインＡ結合活性とは、上述の測定系を用いて、本発明の改変抗体組成物およびＩｇＧ１抗体のプロテインＡに対する結合活性を測定した場合、ＩｇＧ１抗体と実質的に同等な結合活性またはアフィニティーを有する活性をいう。
【０１４７】
またはセファロース等の担体に結合させたプロテインＡに、ｐＨ５〜８前後の高ｐＨ条件で抗体組成物を反応させ、洗浄後、さらにｐＨ２〜５前後の低ｐＨ条件で溶出する抗体組成物を定量することにより測定することができる。
【０１４８】
抗体分子のＦｃ領域には、２９７番目のＡｓｎ残基にＮ−グリコシド結合型糖鎖が結合するが、それ以外のＦｃ領域のＡｓｎ残基には糖鎖は結合することは殆ど知られていない。従って、通常、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。
【０１４９】
Ｆｃ領域の２９７番目のＡｓｎ残基に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖としては、コア構造（トリマンノシルコア構造）の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の側鎖を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどを有するコンプレックス型（複合型）糖鎖を挙げることができる。
【０１５０】
本発明において、コアフコース（ｃｏｒｅ−ｆｕｃｏｓｅ）またはα１，６−フコースとは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃと記す場合もある）の６位とフコース（以下、Ｆｕｃと記す場合もある）の１位がα結合した糖鎖構造をいう。また、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないことを、単にフコースが無いまたはコアフコースが無い糖鎖という。
【０１５１】
また、本発明において、コア構造またはトリマンノシルコア構造（ｔｒｉ−ｍａｎｎｏｓｙｌ  ｃｏｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）とは、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造をいう。
【０１５２】
本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖は、下記化学式で示される。
【０１５３】
【化１】
2011108502.tif 000002
【０１５４】
本発明の改変抗体組成物は、２９７番目のＡｓｎにＮ−グリコシド結合型糖鎖が結合したＦｃ領域を有する抗体分子であって、上記の糖鎖構造を有していれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。
【０１５５】
すなわち、本発明の改変抗体組成物とは、単一または複数の異なる糖鎖構造を有する改変抗体分子からなる組成物を意味する（典型的なコンプレックス型糖鎖構造を図１に示す）。
【０１５６】
さらに、本発明の改変抗体組成物のうち、２９７番目のＡｓｎにＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が結合したＦｃ領域を有する抗体分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれるＦｃに結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、コアフコースが無い糖鎖を有する抗体組成物は、ＣＤＣ活性の他に高いＡＤＣＣ活性を有する。
【０１５７】
コアフコースが無い糖鎖の割合としては、ＡＤＣＣ活性が増加すれば、いずれの割合の抗体も含まれるが、好ましくは２０％以上、より好ましくは５１％〜１００％、更に好ましくは８０％〜１００％、特に好ましくは９０％〜９９％、最も好ましくは１００％の割合が挙げられる。
【０１５８】
本発明において、フコースが無い糖鎖としては、上記で示された化学式中、還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していなければ、非還元末端の糖鎖の構造はいかなるものであってもよい。
【０１５９】
本発明において、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない（コアフコースが無い）とは、実質的にフコースが結合していないことをいう。実質的にフコースが結合していない抗体組成物とは、具体的には、後述の４に記載の糖鎖分析において、フコースが実質的に検出できない程度の抗体組成物である場合をいう。実質的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることをいう。全ての糖鎖にコアフコースが無い抗体組成物は、最も高いＡＤＣＣ活性を有する。
【０１６０】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が結合したＦｃ領域を有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、フコースが無い糖鎖を有する抗体分子の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３―糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。
【０１６１】
また、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が結合したＦｃ領域を有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、フコースが無い糖鎖を有する抗体分子の割合は、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって分析することで決定することができる。
【０１６２】
本発明の改変抗体組成物を生産する形質転換株は、抗体分子の可変領域および定常領域をコードするＤＮＡを挿入した改変抗体組成物発現ベクターを動物細胞へ導入することにより、取得することができる。
【０１６３】
改変抗体発現ベクターは、以下のように構築する。
【０１６４】
前述のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれ改変抗体発現用ベクターに挿入することにより、改変抗体組成物発現ベクターを作製する。
【０１６５】
改変抗体発現用ベクターとしては、例えば、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３−２２９７９号公報；Ｍｉｙａｊｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔ．ａｎｄ  Ｉｔｏｈ  Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７−１３１０（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｂｒａｄｙ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２７，２２３−２３２（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｏ’Ｈａｒｅ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７８，１５２７−１５３１（１９８１）］およびｐＳＧ１βｄ２−４［Ｍｉｙａｊｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３−１８０（１９９０）］等が挙げられる。
【０１６６】
改変抗体発現用ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔ．ａｎｄ  Ｉｔｏｈ  Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７−１３１０（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー［Ｋｕｗａｎａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０−９６８（１９８７）］、および免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｍａｓｏｎ  Ｊ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１，４７９−４８７（１９８５）］とエンハンサー［Ｇｉｌｌｉｅｓ  Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３，７１７−７２８（１９８３）］等が挙げられる。
【０１６７】
改変抗体組成物発現用ベクターは、Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプまたは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、改変抗体組成物発現ベクターの構築のしやすさ、動物細胞への導入のし易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスがとれる等の点でタンデム型の改変抗体組成物発現用ベクターの方が好ましい［Ｓｈｉｔａｒａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１−２７８（１９９４）］。
【０１６８】
タンデム型の改変抗体組成物発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Ｂｅｎｔｌｅｙ  Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９−５６７（１９９８）］等が挙げられる。
【０１６９】
構築された改変抗体組成物発現用ベクターのＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡの上流に、各種抗原に対する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることにより、改変抗体組成物発現ベクターを構築することができる。
【０１７０】
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法［日本国特開平２−２５７８９１号公報；Ｍｉｙａｊｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０（１９９０）］等が挙げられる。
【０１７１】
本発明の改変抗体組成物を生産する宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞および微生物など、組換え蛋白質生産に一般に用いられる宿主細胞であればいかなるものも包含される。
【０１７２】
本発明の改変抗体組成物を生産する宿主細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、ヒトバーキットリンパ腫由来ナマルバ細胞、ヒト網膜芽腫由来ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ヒト胚性腎臓組織由来ＨＥＫ２９３細胞、ヒト骨髄性白血病由来ＮＭ−Ｆ９細胞、胚性幹細胞、および受精卵細胞などが挙げられる。
【０１７３】
好ましくは、遺伝子組換え糖蛋白質医薬品を製造するための宿主細胞、遺伝子組換え糖蛋白質医薬品を生産するヒト以外のトランスジェニック動物を製造するために用いる胚性幹細胞または受精卵細胞、ならびに遺伝子組換え糖蛋白質医薬品を生産するトランスジェニック植物を製造するために用いる植物細胞などが挙げられる。
【０１７４】
親株細胞としては、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成に関与する酵素、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のコアフコース糖鎖修飾に関与する酵素またはＧＤＰ−Ｌ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質のゲノム遺伝子を改変させた細胞および遺伝子改変を行う前の細胞いずれも包含する。例えば、以下の細胞が好適に挙げられる。
【０１７５】
ＮＳ０細胞の親株細胞としては、例えば、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．），７３，２６１，（２００１）等の文献に記載されているＮＳ０細胞が挙げられる。また、例えば、理化学研究所細胞開発銀行に登録されているＮＳ０細胞株（ＲＣＢ０２１３）、またはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株なども挙げられる。
【０１７６】
ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞の親株細胞としては、例えば、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１２６，３１７，（１９８１）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２７６，２６９，（１９７８）およびヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），３，１２９，（１９９２）等の文献に記載されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞が挙げられる。また、例えば、ＡＴＣＣに登録されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）またはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１．１）なども挙げられる。
【０１７７】
チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞の親株細胞としては、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ，ＩＩ（ｐ８８３−９００）等の文献に記載されているＣＨＯ細胞が挙げられる。
【０１７８】
また、例えば、ＡＴＣＣに登録されているＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７８１）および市販のＣＨＯ−Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  Ｃａｔ＃１１６１９）並びにこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株なども挙げられる。
【０１７９】
ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞の親株細胞としては、例えば、Ｙ３／Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３１）から樹立された株化細胞が包含される。その具体的な例としては、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９３，５７６（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ，１（１９８１）等の文献に記載されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞が挙げられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２）またはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株なども挙げられる。
【０１８０】
本発明においてＣＤＣ活性だけでなく、ＡＤＣＣ活性の高い改変抗体組成物を発現させる宿主細胞としては、コアフコースを認識するレクチンに耐性を有する宿主細胞、例えば、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が結合したＦｃを有する抗体分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれるＦｃに結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、フコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物を生産する能力を有する宿主細胞、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）に挙げる少なくとも１つの蛋白質の活性が低下または失活した細胞などが挙げられる。
【０１８１】
（ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成に関与する酵素；ＧＤＰ−マンノース  ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、Ｆｘ、ＧＤＰ−ベータ−Ｌ−フコース−ピロホスフォリラーゼ（ＧＦＰＰ）、フコキナーゼ。
（ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素；α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）。
（ｃ）ＧＤＰ−Ｌ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質；ＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーター。
【０１８２】
また、これら酵素およびトランスポータータンパク質のアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕およびＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて比較、計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する酵素またはトランスポータータンパク質であって、該酵素またはトランスポータータンパク質の活性を有するものも挙げられる。
【０１８３】
本発明の改変抗体を生産する細胞としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）をコードする遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞、ＧＤＰ−マンノース  ４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）をコードする遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞、またはＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターをコードする遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞等（国際公開第０２／３１１４０号、国際公開第０３／８５１０７号）が挙げられる。
【０１８４】
このような細胞を取得する方法としては、目的とするゲノムの改変を行うことができれば、いずれの手法でも用いることができる。上述の酵素活性を欠失させる手法として、以下の（ａ）〜（ｅ）などが挙げられる。
（ａ）酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法
（ｂ）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法
（ｃ）酵素についての突然変異を導入する手法
（ｄ）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法
（ｅ）Ｎ−グリコシド結合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法
【０１８５】
Ｎ−グリコシド結合型糖鎖還元末端のコアフコースを認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンでも用いることができる。レクチンの具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）およびアスペルギルス・オリゼレクチンＡＯＬ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のＬｅｃｔｉｎ）等を挙げることができる。
【０１８６】
レクチンに耐性な細胞とは、レクチンを有効濃度与えたときにも、生育が阻害されない細胞をいう。有効濃度とは、ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞（以下、「親株細胞」とも称す）が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは、ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞が生育できない濃度と同濃度、より好ましくは２〜５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは２０倍以上である。
【０１８７】
本発明において、生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよいが、通常１０μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ〜２．０ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。
【０１８８】
本発明に用いるトランスジェニック動物としては、例えば、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成に関与する酵素、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のコアフコース糖鎖修飾に関与する酵素またはＧＤＰ−Ｌ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性を欠失させるようにゲノム遺伝子を改変させたトランスジェニック動物などが挙げられる。
【０１８９】
具体的には、例えば、α１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたトランスジェニック動物、ＧＤＰ−マンノース  ４，６−デヒドラターゼをコードする遺伝子がノックアウトされたトランスジェニック動物、またはＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターをコードする遺伝子がノックアウトされたトランスジェニック動物などが挙げられる。
【０１９０】
本発明の改変抗体には、改変抗体または該抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質、または抗体医薬などを化学的または遺伝子工学的に結合させた融合抗体を包含する。
【０１９１】
また、本発明の改変抗体と下記に記載する低分子薬剤、高分子薬剤、免疫賦活剤およびサイトカイン等の治療薬とを同時にまたは逐次的に投与する医薬であってもよいし、それぞれの薬剤成分を混合させた合剤であってもよい。それぞれの薬剤成分を混合させた合剤には、本発明の改変抗体および該抗体断片に少なくとも１種類の薬剤を結合させた融合抗体なども包含する。
【０１９２】
更に、それぞれの薬剤を含有する医薬キットを調製し、これらの薬剤を同時にまたは逐次的に患者に投与してもよいし、混合させた後に患者に投与してもよい。
【０１９３】
本発明における、融合抗体は、本発明の改変抗体または該抗体断片のＨ鎖若しくはＬ鎖のＮ末端側若しくはＣ末端側、抗体または該抗体断片中の適当な置換基若しくは側鎖、さらには抗体または該抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子薬剤、高分子薬剤、免疫賦活剤、蛋白質または抗体医薬などを化学的手法［抗体工学入門，地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
【０１９４】
また、本発明の改変抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質または抗体医薬をコードするＤＮＡとを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
【０１９５】
放射性同位元素としては、例えば、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。
【０１９６】
キレート剤としては、例えば、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
【０１９７】
低分子薬剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤およびキナーゼ阻害剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学，癌と化学療法社（１９９６）］、またはハイドロコーチゾンおよびプレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリンおよびインドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレートおよびペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制剤、並びにマレイン酸クロルフェニラミンおよびクレマシチン等の抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法，医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。
【０１９８】
抗癌剤としては、例えば、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３（Ｆｌｔ３）阻害剤、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｏｔｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、イレッサおよびタルセバなどのｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール−トランスレチノイン酸、サリドマイド、レナリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ−ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、イファスファミド���ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセート、マイタンシノイド、マイタンシノイドＤＭ１並びにマイタンシノイドＤＭ４またはその誘導体などが挙げられる。
【０１９９】
低分子薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法および水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基とを結合させる方法などが挙げられる。
【０２００】
高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマーおよびヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。
【０２０１】
これらの高分子化合物を抗体または抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的または生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失または抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品，廣川書店（１９９３）］。
【０２０２】
ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、例えば、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品，廣川書店（１９９３）］。
【０２０３】
ＰＥＧ化修飾試薬としては、例えば、リジンのε−アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１−１７８９２６号公報）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６−２３５８７号公報）、並びにアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２−１１７９２０号公報）などが挙げられる。
【０２０４】
免疫賦活剤としては、例えば、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（レンチナン、シゾフィラン）およびαガラクトシルセラミドなどが挙げられる。
【０２０５】
タンパク質としては、例えば、ＮＫ細胞、マクロファージまたは好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカインまたは増殖因子、および毒素蛋白質などが挙げられる。
【０２０６】
サイトカインまたは増殖因子としては、例えば、インターフェロン（以下、ＩＮＦと記す）−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）およびＴＲＡＩＬリガンド（Ａｐｏ２Ｌ）などが挙げられる。
【０２０７】
毒素蛋白質としては、例えば、リシン、ジフテリアトキシン、弱毒化ジフテリアトキシンＣＲＭ１９７およびＯＮＴＡＫなどが挙げられ、毒性を調節するためにタンパク質に変異を導入したタンパク毒素も含まれる。
【０２０８】
抗体医薬としては、例えば、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原、腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗原および病変部位の血管新生に関与する抗原に対する抗体が挙げられる。
【０２０９】
抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原としては、例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記載する）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、Ｆａｓ受容体、ＴＲＡＩＬ受容体、ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）−Ｃｌａｓｓ  ＩＩおよびＥｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）などが挙げられる。
【０２１０】
腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗体の抗原としては、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４等）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ等）、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（例えば、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２等）、ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４等）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ  Ｂ  ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ２５、葉酸受容体４、サイトカイン［例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）βおよびＴＮＦαなど］、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン（例えば、ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ−３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣおよびＣＴＡＣＫなど）、またはこれらのケモカインの受容体が挙げられる。
【０２１１】
病変部位の血管新生を阻害する抗体の抗原としては、例えば、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、ＥＧＦ、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、ＩＬ−８、ＥｐｈｉｌｉｎおよびＳＤＦ−１並びにこれらの受容体などが挙げられる。
【０２１２】
蛋白質または抗体医薬との融合抗体は、モノクローナル抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
【０２１３】
上記融合抗体を検出方法、定量方法、検出用試薬、定量用試薬または診断薬として使用する場合に、本発明の改変抗体またはその抗体断片に結合する薬剤としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体が挙げられる。
【０２１４】
標識体としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステルおよびロフィンなどの発光物質、並びにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
【０２１５】
本発明の改変抗体は、抗体が特異的に結合する抗原が発現している疾患であれば、いずれの疾患の治療薬でもよいが、上述した癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、循環器疾患、ウイルスまたは細菌の感染症に関連する抗原を発現している疾患の治療薬が好ましい。
【０２１６】
本発明の改変抗体は、Ｆｃ領域への不要な糖鎖の結合が無く、かつ高いエフェクター活性を有することから、癌、自己免疫疾患などの原因細胞の治療に有効である。
【０２１７】
癌としては、例えば、血液癌、頭頸部癌、グリオーマ、舌癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌（例えば、膵頭癌、膵体癌、膵尾癌および膵管癌）、小腸癌、大腸癌、肺癌（例えば、小細胞性肺癌、大細胞性肺癌、腺癌および偏平上皮癌）、中皮種、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、腎癌、子宮癌（例えば、子宮頸癌および子宮体癌）、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、骨肉種、皮膚癌、菌状息肉症、ウイング腫瘍、悪性骨腫瘍およびメラノーマなどが挙げられる。
【０２１８】
血液癌としては、例えば、白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、Ｔ細胞由来の癌などが挙げられる。具体的には、例えば、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞性リンパ腫（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，ＰＴＣＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，ＡＬＣＬ）、急性リンパ性白血病（Ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、または非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、びまん性体細胞性Ｂ細胞性リンパ腫、未分化体細胞リンパ腫、ＭＡＮＴＬリンパ腫および濾胞性リンパ腫）などが挙げられる。
【０２１９】
自己免疫疾患としては、例えば、橋本病、バセドゥ病、突発性血小板減少性紫斑病、突発性好中球減少症、巨赤芽球性貧血、溶血性貧血、重症筋無力症、乾癬、天疱瘡、類天疱瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、肝炎、心筋炎、シェーグレン症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性皮膚硬化症および移植後拒絶反応などが挙げられる。
【０２２０】
アレルギー性疾患としては、例えば、急性または慢性気道過敏症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎およびアレルギー性鼻炎などが挙げられる。
【０２２１】
以下に、本発明の改変抗体組成物の製造方法を具体的に説明する。
【０２２２】
１．改変抗体組成物の製造方法
本発明の改変抗体組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）およびＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
【０２２３】
（１）本発明の改変抗体組成物発現ベクターの構築
本発明の改変抗体組成物発現ベクターとは、本発明の改変抗体組成物に含まれる抗体分子のＨ鎖定常領域及びＬ鎖定常領域をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターである。
【０２２４】
改変抗体組成物発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターに改変抗体組成物に含まれる抗体分子のＨ鎖定常領域及びＬ鎖定常領域をコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【０２２５】
本発明の改変抗体組成物に含まれる抗体分子のＨ鎖定常領域をコードする遺伝子は、ＩｇＧ１抗体のＨ鎖定常領域をコードする遺伝子をクローニングした後、所望のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片を連結させることにより、作製することができる。
【０２２６】
また、合成ＤＮＡを用いて全ＤＮＡを合成することもでき、ＰＣＲ法による合成も可能である（モレキュラー・クローニング第２版）。さらに、これらの手法を複数組み合わせることにより、改変抗体のＨ鎖定常領域を作製することもできる。
【０２２７】
本発明において、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス２９７〜２９９番目以外に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列を構成するアミノ酸残基において、Ａｓｎ、ＸおよびＳｅｒ／Ｔｈｒのいずれのアミノ酸残基をどのアミノ酸残基に改変するかは、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖コンセンサス配列のＮ末端側またはＣ末端側のアミノ酸配列を考慮することにより、決定することができる。
【０２２８】
即ち、アミノ酸改変の結果、新たなＮ−グリコシド結合型糖鎖コンセンサス配列が生じないようにアミノ酸残基を行う位置、改変後のアミノ酸残基を考慮して行うことで適切なアミノ酸改変を行うことができる。本発明において具体的には下記のようにデザインを決定することができる。
【０２２９】
ヒト抗体のＦｃ領域（配列番号１）においてＥＵインデックス２９７〜２９９番以外の結合型糖鎖コンセンサス配列は、３９２〜３９４番目にＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒが存在し、その前後のアミノ酸配列としてはＡｓｎ３８９−Ａｓｎ３９０−Ｔｙｒ３９１−Ａｓｎ３９２‐Ｔｈｒ３９３‐Ｔｈｒ３９４−Ｐｒｏ３９５−Ｐｒｏ３９６である（図４参照）。
【０２３０】
Ａｓｎ３９２をＳｅｒ／Ｔｈｒにアミノ酸改変した場合は、３９０番目にはＡｓｎが存在するため、新たに３９０Ａｓｎ−３９１Ｔｙｒ−３９２Ｓｅｒ／Ｔｈｒのコンセンサス配列が生じてしまう。従って、Ａｓｎ３９２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐから選ばれるアミノ酸残基に改変することが好ましい。また、Ｔｈｒ３９３はＰｒｏに改変することが好ましく、３９４ＴｈｒはＳｅｒ／Ｔｈｒ以外のアミノ酸残基に改変することが好ましい。
【０２３１】
この様に、Ｎ‐グリコシド結合型糖鎖コンセンサス配列の近傍に存在するアミノ酸残基（１〜３残基）と、アミノ酸改変後のアミノ酸配列をデザインすることで、適切なアミノ酸改変位置および適切なアミノ酸改変残基を選択することができる。
【０２３２】
動物細胞用発現ベクターとしては、上述の抗体分子の定常領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＫＡＮＴＥＸ９３［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３７，１０３５（２０００）］、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等が挙げられる。
【０２３３】
動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等が挙げられる。
【０２３４】
本発明の改変抗体組成物発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプまたは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、本発明の改変抗体組成物発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、並びに動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型の抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。
【０２３５】
構築した本発明の改変抗体組成物発現ベクターは、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体の動物細胞での発現に使用することができる。
【０２３６】
（２）非ヒト動物抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの取得
非ヒト動物抗体、例えば、マウス抗体のＨ鎖可変領域（以下、ＶＨと表記する）およびＬ鎖可変領域（以下、ＶＬと表記する）をコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
【０２３７】
任意の抗体を産生するハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として用い、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージまたはプラスミド等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【０２３８】
前記ライブラリーより、既存のマウス抗体の定常領域または可変領域をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミド及びＬ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。
【０２３９】
組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
【０２４０】
任意の非ヒト動物抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、抗体が結合する抗原を非ヒト動物に免疫し、周知の方法［モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）］に従って、免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とでハイブリドーマを作製する。次いでシングルセルクローニングしたハイブリドーマを選択し、これを培養し、培養上清から精製し、取得することができる。
【０２４１】
非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【０２４２】
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、例えば、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）が挙げられる。
【０２４３】
全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、例えば、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９］等が挙げられる。
【０２４４】
また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、例えば、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＱｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。
【０２４５】
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、例えば、常法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］および市販のキットを用いる方法が挙げられる。
【０２４６】
市販のキットとしては、例えば、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）およびＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などが挙げられる。
【０２４７】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。
【０２４８】
例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等を用いることができる。
【０２４９】
ファージまたはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。
【０２５０】
例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
【０２５１】
ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンを選択する方法としては、アイソトープまたは蛍光などで標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］により選択することができる。
【０２５２】
また、プライマーを調製し、ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
【０２５３】
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【０２５４】
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬを完全に含んでいるアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
【０２５５】
さらに、抗体可変領域のアミノ酸配列または該可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列がすでに公知である場合には、以下の方法を用いて製造することができる。
【０２５６】
アミノ酸配列が公知である場合には、コドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮して該可変領域をコードするＤＮＡ配列を設計し、設計したＤＮＡ配列に基づき、１００〜１５０塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成する。その後、合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法を行うか、完全長のＤＮＡを合成することで、ＤＮＡを得ることができる。塩基配列が公知である場合には、その情報を基に上述と同様にしてＤＮＡを得ることができる。
【０２５７】
（３）非ヒト動物抗体の可変領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更には抗体が属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、同様の方法で見出すことができる。
【０２５８】
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項１の（１）に記載の本発明の改変抗体組成物発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖定常領域及びＬ鎖定常領域をコードする遺伝子の上流に、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれ挿入し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２５９】
例えば、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、非ヒト動物抗体ＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とからなり、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結する。それぞれを本項１の（１）に記載の本発明の改変抗体組成物発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖定常領域及びＬ鎖定常領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するように挿入し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２６０】
（５）ヒト化抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的の非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。
【０２６１】
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］等が挙げられる。
【０２６２】
その中でも、十分な活性を有するヒト化抗体を作製するためには、目的の非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが好ましい。
【０２６３】
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的の非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列を完全合成する。
【０２６４】
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項１の（１）で構築した本発明の改変抗体組成物発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項１の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
【０２６５】
（６）ヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト動物抗体に比べて低下してしまうことが知られている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。
【０２６６】
この原因としては、元の非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的または間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。
【０２６７】
この問題を解決するため、ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元の非ヒト動物抗体に由来するアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。
【０２６８】
ヒト化抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１１２，５３５（１９７７）］またはコンピューターモデリング［プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），７，１５０１（１９９４）］等による抗体の立体構造の構築及び解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト化抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来た。
【０２６９】
しかしながら、あらゆる抗体に適応可能なヒト化抗体の作製法は未だ確立されていない。現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
【０２７０】
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項１の（５）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項１の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
【０２７１】
（７）ヒト化抗体発現ベクターの構築
本項１の（１）に記載の本発明の改変抗体組成物発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、本項１の（５）および（６）で構築したヒト化抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを挿入し、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２７２】
例えば、本項１の（５）および（６）でヒト化抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項１の（１）に記載の本発明の改変抗体組成物発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するように挿入し、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２７３】
（８）ヒト化抗体の安定的生産
本項１の（４）及び（７）に記載のヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
【０２７４】
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［日本国特開平２−２５７８９１号公報；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等が挙げられる。
【０２７５】
ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
【０２７６】
具体的には、例えば、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などが挙げられる。これらの中でも、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、およびラットミエローマＹＢ２／０細胞等が好ましい。
【０２７７】
ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、日本国特開平２−２５７８９１号公報に開示されている方法に従い、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。
【０２７８】
動物細胞培養用培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］およびＷｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］並びにこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＣＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。
【０２７９】
得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の生産量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，１９９８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等により測定できる。
【０２８０】
また、形質転換株は、日本国特開平２−２５７８９１号公報に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
【０２８１】
ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］。
【０２８２】
また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。
【０２８３】
精製したヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖若しくは抗体分子全体の分子量は、例えば、ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］およびウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等で測定することができる。
【０２８４】
以上、動物細胞を宿主とした抗体組成物の製造方法を示したが、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体または植物個体においても動物細胞と同様の方法により抗体組成物を製造することができる。
【０２８５】
したがって、宿主細胞が抗体分子を発現する能力を有する場合には、以下に示す抗体分子を発現させる宿主細胞に抗体遺伝子を導入した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体組成物を精製することにより、本発明の改変抗体組成物を製造することができる。
【０２８６】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）およびＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等が挙げられる。
【０２８７】
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよい。例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１  プロモーターおよびＣＵＰ  １プロモーター等が挙げられる。
【０２８８】
宿主細胞としては、例えば、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物等が挙げられる。具体的には、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ等が挙げられる。
【０２８９】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）およびプロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）］に記載の方法等をあげることができる。
【０２９０】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３−２２９７９号公報；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［日本国特開平２−２２７０７５号公報］、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］およびｐＡＧＥ２１０等が挙げられる。
【０２９１】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができる。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターおよびＳＲαプロモーター等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【０２９２】
宿主細胞としては、例えば、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３−２９９号公報）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞および受精卵細胞等が挙げられる。
【０２９３】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）およびバイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
【０２９４】
即ち、発現ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
【０２９５】
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）等が挙げられる。
【０２９６】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。
【０２９７】
昆虫細胞としては、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）］およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ  ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることができる。
【０２９８】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記発現導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（日本国特開平２−２２７０７５号公報）およびリポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等が挙げられる。
【０２９９】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等が挙げられる。
【０３００】
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等が挙げられる。
【０３０１】
宿主細胞としては、例えば、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギおよびオオムギ等の植物細胞等が挙げられる。
【０３０２】
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）［日本国特開昭５９−１４０８８５号公報、日本国特開昭６０−７００８０号公報、国際公開第９４／００９７７号］、エレクトロポレーション法［日本国特開昭６０−２５１８８７号公報］およびパーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本国特許第２６０６８５６号明細書、日本国特許第２５１７８１３号明細書］等が挙げられる。
【０３０３】
組換えベクターの導入方法としては、例えば、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［日本国特開平２−２２７０７５号公報］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本国特許第２６０６８５６号明細書、日本国特許第２５１７８１３号明細書］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４―遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］等を挙げることができる。
【０３０４】
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、例えば、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、またはＦｃと他の蛋白質との融合蛋白質発現等を行うことができる。
【０３０５】
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０３０６】
酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地および合成培地のいずれを用いてもよい。
【０３０７】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンおよびデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸およびプロピオン酸等の有機酸、エタノールおよびプロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
【０３０８】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、並びに各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
【０３０９】
無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウム等を用いることができる。
【０３１０】
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は１５〜４０℃が好ましく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【０３１１】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンおよびテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０３１２】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０３１３】
培養は、通常ｐＨ６．０〜８．０、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行うことが好ましい。
【０３１４】
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０３１５】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
【０３１６】
培養は、通常ｐＨ６．０〜７．０、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行うことが好ましい。
【０３１７】
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０３１８】
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地およびホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地並びにこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
【０３１９】
培養は、通常ｐＨ５．０〜９．０、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行うことが好ましい。
【０３２０】
また、培養中必要に応じて、カナマイシンおよびハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０３２１】
上記のとおり、抗体分子をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを保有する動物細胞、または植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
【０３２２】
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、例えば、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、または融合蛋白質発現等を行うことができる。
【０３２３】
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
【０３２４】
抗体組成物が宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、例えば、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、日本国特開平０５−３３６９６３号公報および国際公開第９４／２３０２１号公報等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０３２５】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするＤＮＡ、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後に抗体分子を発現させることにより、目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０３２６】
また、日本国特開平２−２２７０７５号公報に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
【０３２７】
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
【０３２８】
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
【０３２９】
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば、公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産させる方法が挙げられる。
【０３３０】
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（日本国特開昭６３−３０９１９２号公報）または卵等をあげることができる。
【０３３１】
この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができる。例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーターおよびホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
【０３３２】
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法が挙げられる。
【０３３３】
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば、抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【０３３４】
前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５［三菱化学（株）製］等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法および等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独または組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０３３５】
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０３３６】
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物またはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０３３７】
本発明の精製された改変抗体組成物は、Ｆｃ領域においてＥＵインデックス２９７番目のＡｓｎ以外に糖鎖が結合していない抗体分子を単一に含んでいる組成物である。即ち、本発明の精製された改変抗体組成物は、Ｆｃ領域においてＥＵインデックス２９７番目のＡｓｎにのみ糖鎖が結合している改変抗体分子を単一に含んでいる組成物である。
【０３３８】
また、本発明の精製された改変抗体組成物は、Ｆｃ領域においてＥＵインデックス２９７番目のＡｓｎ以外の余分な糖鎖が結合していない抗体分子を均一に含む抗体組成物であるため、余分な糖鎖が結合した抗体分子を含む抗体組成物と比べて、より医薬品として有用である。
【０３３９】
２．本発明の改変抗体組成物を生産する細胞の作製
本発明の改変抗体組成物において、Ｆｃ領域の２９７番目のＡｓｎに結合する糖鎖のコアフコースを制御することで、２９７番目以外のＡｓｎに結合する糖鎖が減少または欠損し、かつ高いＡＤＣＣ活性を有する改変抗体組成物を作製することができる。コアフコースを制御した細胞は、以下に述べる手法により作製することができる。
【０３４０】
具体的には、抗体Ｆｃ領域の２９７番目のＡｓｎに結合する糖鎖のコアフコース糖鎖修飾に関連する酵素であるＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成もしくはゴルジ体への輸送に関与する酵素、またはコアフコースの結合に関与する酵素が失活した細胞を選択するか、または後述に示された種々の人為的手法により得られた細胞を宿主細胞として用いることもできる。以下、詳細に説明する。
【０３４１】
具体的には、コアフコース糖鎖修飾に関連する酵素活性を減少または欠損させる方法、またはコアフコース切断酵素活性を増加させることにより、コアフコースを制御した細胞を作製することができる。
【０３４２】
コアフコース糖鎖修飾に関連する酵素としては、例えば、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成または輸送に関与する酵素、およびＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のコアフコースの結合に関与する酵素が挙げられる。
【０３４３】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成またはゴルジ体への輸送に関与する酵素としては、具体的には、例えば、ＧＤＰ−マンノース  ４，６−デヒドラターゼ（以下、ＧＭＤと表記する）、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（以下、Ｆｘと表記する）、ＧＤＰ−ベータ−Ｌ−フコース−ピロホスフォリラーゼ（ＧＦＰＰ）、フコキナーゼおよびＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターなどが挙げられる。
【０３４４】
コアフコースの結合に関与する酵素としては、例えば、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＦＵＴ８と表記する）、α−Ｌ−フコシダーゼなどが挙げられる。
【０３４５】
本発明の改変抗体組成物を生産する細胞としては、上述の１つの酵素活性を低下または欠損させてもよいし、複数の酵素活性を組み合わせて低下または欠損させてもいずれでもよい。また、元々コアフコースの糖鎖修飾に関連する酵素活性が低い細胞のコアフコースの糖鎖修飾に関連する酵素活性を更に低下、欠損させることもできる。
【０３４６】
（１）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
高いＡＤＣＣ活性を有する抗体（以下、高ＡＤＣＣ活性抗体という）産生細胞の作製のために用いる宿主細胞は、コアフコース糖鎖修飾に関連する酵素の遺伝子破壊を行うことで作製することができる。
【０３４７】
ここでいう遺伝子とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【０３４８】
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、アンチセンス法、リボザイム法、相同組換え法、ＲＮＡ−ＤＮＡ  オリゴヌクレオチド法（以下、「ＲＤＯ法」と表記する）、ＲＮＡインターフェアレンス法（以下、「ＲＮＡｉ法」と表記する）、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等が挙げられる。以下これらを具体的に説明する。
【０３４９】
本発明の改変抗体組成物を作製するために用いられる宿主細胞としては、例えば、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞など、標的とするフコース修飾に関連する酵素の遺伝子を有している、または元々該フコース修飾に関連する酵素の遺伝子を有さないものであればいずれも用いることができる。具体的には、上述１．に記載の宿主細胞のいずれも用いることができる。
【０３５０】
植物細胞を用いる場合には、α１，３−フコースの結合に関与する酵素およびβ１，２−キシロースの結合に関与する酵素の遺伝子を減少または欠損させることで用いることで、ヒト型糖鎖を有するタンパク質を生産することができる。
【０３５１】
（ａ）アンチセンス法又はリボザイム法による本発明の改変抗体組成物を作製するための宿主細胞の作製
本発明の改変抗体組成物作製のために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する酵素遺伝子を標的とし、細胞工学，１２，２３９（１９９３）、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１７，１０９７（１９９９）、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），５，１０８３（１９９５）、細胞工学，１３，２５５（１９９４）およびプロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），９６，１８８６（１９９９）等に記載されたアンチセンス法またはリボザイム法を用いて、例えば、以下のように作製することができる。
【０３５２】
フコース修飾に関連する酵素をコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを調製する。調製したｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。決定したＤＮＡの配列に基づき、フコース修飾に関連する酵素をコードするＤＮＡ部分、非翻訳領域の部分またはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザイムのコンストラクトを設計する。
【０３５３】
前記アンチセンス遺伝子、またはリボザイムを細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
【０３５４】
フコース修飾に関連する酵素の活性を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることができる。また、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造または産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることもできる。
【０３５５】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能であるか、または染色体中への組み込みが可能で、設計したアンチセンス遺伝子若しくはリボザイムを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、例えば、後述３に記載の発現ベクターが挙げられる。
【０３５６】
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、例えば、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
【０３５７】
フコース修飾に関連する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
【０３５８】
（形質転換体を選択する方法）
フコース修飾に関連する酵素の活性が欠失した細胞を選択する方法としては、例えば、文献［新生化学実験講座３―糖質Ｉ，糖タンパク質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社製）谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法および遺伝子工学的な方法などを用いて、フコース修飾に関連する酵素の活性を測定する方法が挙げられる。
【０３５９】
生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法が挙げられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、酵素遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等が挙げられる。
【０３６０】
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述５に記載の方法が挙げられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述５に記載の方法が挙げられる。
【０３６１】
フコース修飾に関連する酵素をコードするｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、下記に記載の方法が挙げられる。
【０３６２】
（ｃＤＮＡの調製方法）
各種宿主細胞の組織又は細胞から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。調製した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。フコース修飾に関連する酵素のアミノ酸配列に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法でフコース修飾に関連する酵素をコードする遺伝子断片を取得する。
【０３６３】
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、フコース修飾に関連する酵素をコードするＤＮＡを取得することができる。ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞のｍＲＮＡは市販のもの（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてもよいし、以下のようにしてヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から調製してもよい。
【０３６４】
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、例えば、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５４，３（１９８７）］および酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などが挙げられる。
【０３６５】
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋  ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、例えば、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等が挙げられる。
【０３６６】
さらに、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）などの市販のキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
【０３６７】
次に、調製したヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、例えば、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ ｎｄ  Ｅｄ．（１９８９）等に記載された方法および市販のキットを用いる方法などが挙げられる。
【０３６８】
市販のキットとしては、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）およびＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いる方法などが挙げられる。
【０３６９】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクターおよびプラスミドベクター等のいずれでも使用できる。
【０３７０】
具体的には、例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰ  ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐｃＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が挙げられる。
【０３７１】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  Ｃ６００［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＹ１０８８［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＹ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
【０３７２】
このｃＤＮＡライブラリーは、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン（Ｇｅｎｅ），１３８，１７１（１９９４）；ジーン（Ｇｅｎｅ），２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製して以下の解析に用いてもよい。
【０３７３】
フコース修飾に関連する酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’末端および３’末端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、フコース修飾に関連する酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。
【０３７４】
取得した遺伝子断片がフコース修飾に関連する酵素をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
【０３７５】
該遺伝子断片をプローブとして、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーションおよびプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）等を用いて、フコース修飾に関連する酵素のＤＮＡを取得することができる。
【０３７６】
また、フコース修飾に関連する酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いて増幅することにより、フコース修飾に関連する酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
【０３７７】
取得したフコース修飾に関連する酵素をコードするＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【０３７８】
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、取得したＤＮＡがデータベース中の遺伝子の中でフコース修飾に関連する酵素をコードしている遺伝子であることを確認することもできる。
【０３７９】
上記の方法で得られるＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、国際公開第２００５／０３５７４１号に記載のＧＭＤ、及び、Ｆｘの塩基配列が挙げられる。
【０３８０】
上記の方法で得られるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のコアフコースの糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、米国特許第７３９３６８３号明細書に記載のＦＵＴ８の塩基配列が挙げられる。
【０３８１】
上記の方法で得られるＧＤＰ−Ｌ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質としては、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号明細書に記載のＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターの塩基配列が挙げられる。
【０３８２】
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３９２（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、フコース修飾に関連する酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
【０３８３】
フコース修飾に関連する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法が挙げられる。
【０３８４】
（ゲノムＤＮＡの調製方法）
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、モレキュラー・クローニング第２版およびカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法が挙げられる。
【０３８５】
また、例えば、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（登録商標） Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）などを用いることにより、フコース修飾に関連する酵素のゲノムＤＮＡを取得することもできる。
【０３８６】
取得したフコース修飾に関連する酵素をコードするＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【０３８７】
決定したゲノムＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、取得したＤＮＡがデータベース中の遺伝子の中でフコース修飾に関連する酵素をコードしている遺伝子であることを確認することもできる。
【０３８８】
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３９２（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、フコース修飾に関連する酵素のゲノムＤＮＡを取得することもできる。
【０３８９】
また、発現ベクターを用いず、フコース修飾に関連する酵素の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることもできる。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、常法またはＤＮＡ合成機により調製することができる。
【０３９０】
具体的には、フコース修飾に関連する酵素をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの塩基配列のうち、連続した好ましくは５〜１５０塩基、より好ましくは５〜６０塩基、さらに好ましくは１０〜４０塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）または該オリゴヌクレオチドの配列を含むリボザイムを合成して調製することができる。
【０３９１】
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等が挙げられる。
【０３９２】
オリゴヌクレオチド誘導体としては、例えば、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等が挙げられる［細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
【０３９３】
（ｂ）相同組換え法による本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する酵素の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用いて改変することによって作製することができる。
【０３９４】
染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８  ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の方法を用い、例えば以下のように行うことができる。
【０３９５】
フコース修飾に関連する酵素のゲノムＤＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、フコース修飾に関連する酵素の構造遺伝子、およびプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
【０３９６】
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、染色体上の標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
【０３９７】
宿主細胞としては、例えば、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞等の標的とするフコース修飾に関連する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞が挙げられる。
【０３９８】
フコース修飾に関連する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、本項１（ａ）に記載のゲノムＤＮＡの調製方法などが挙げられる。
【０３９９】
染色体上の標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）およびバイオマニュアルシリーズ８  ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。
【０４００】
ターゲットベクターは、リプレースメント型およびインサーション型のいずれでも用いることができる。
【０４０１】
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述の３に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
【０４０２】
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）およびバイオマニュアルシリーズ８  ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択およびポリＡ選択などの方法を用いることができる。
【０４０３】
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、例えば、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）およびＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等が挙げられる。
【０４０４】
（ｃ）ＲＤＯ方法による本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する酵素の遺伝子を標的とし、ＲＤＯ法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
【０４０５】
フコース修飾に関連する酵素のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを本項１（ａ）に記載の方法を用い、調製する。調製したｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。決定したＤＮＡの配列に基づき、フコース修飾に関連する酵素をコードする部分、非翻訳領域の部分またはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンストラクトを設計し合成する。
【０４０６】
合成したＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、すなわちフコース修飾に関連する酵素に変異が生じた形質転換体を選択することにより、本発明の組成物作製のための宿主細胞を作製することができる。
【０４０７】
宿主細胞としては、例えば、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞等の標的とするフコース修飾に関連する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述３に記載の宿主細胞が挙げられる。
【０４０８】
各種宿主細胞へのＲＤＯの導入には、後述３に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
【０４０９】
フコース修飾に関連する酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、本項１（ａ）に記載のｃＤＮＡの調製方法などが挙げられる。
【０４１０】
フコース修飾に関連する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、本項１（ａ）に記載のゲノムＤＮＡの調製方法などが挙げられる。
【０４１１】
ＤＮＡの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにサブクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
【０４１２】
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
【０４１３】
ＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、フコース修飾に関連する酵素の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法が挙げられる。
【０４１４】
また、前記に記載の、導入したフコース修飾に関連する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法、後述の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法、または、後述の産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法も用いることができる。
【０４１５】
ＲＤＯのコンストラクトは、例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７３，１３８６（１９９６）；ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），４，２８５（１９９８）；へパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），２５，１４６２（１９９７）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０（１９９９）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０（１９９９）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．），７５，８２９（１９９７）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７７４（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７６８（１９９９）；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．），２７，１３２３（１９９９）；インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．），１１１，１１７２（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１６，１３４３（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，４３（２０００）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，５５５（２０００）等の記載に従って設計することができる。
【０４１６】
（ｄ）ＲＮＡｉ法による本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する酵素の遺伝子を標的とし、ＲＮＡｉ法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
【０４１７】
フコース修飾に関連する酵素の上記１に記載の方法を用い、ｃＤＮＡを調製する。調製したｃＤＮＡの塩基配列を決定する。決定したｃＤＮＡの配列に基づき、フコース修飾に関連する酵素をコードする部分または非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトを設計する。
【０４１８】
前記ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したｃＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
【０４１９】
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
【０４２０】
導入したフコース修飾に関連する酵素の活性、または産生糖蛋白質分子若しくは細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることができる。
【０４２１】
宿主細胞としては、例えば、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞等の標的とするフコース修飾に関連する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、例えば、後述３に記載の宿主細胞が挙げられる。
【０４２２】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述３に記載の発現ベクターが挙げられる。
【０４２３】
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述３に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
【０４２４】
フコース修飾に関連する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、本項１に記載の方法が挙げられる。
【０４２５】
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、本項１（ａ）に記載の方法が挙げられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述５の方法が挙げられる。
【０４２６】
フコース修飾に関連する酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、本項１（ａ）に記載されたｃＤＮＡの調製方法などが挙げられる。
【０４２７】
また、発現ベクターを用いず、フコース修飾に関連する酵素の塩基配列に基づいて設計したＲＮＡｉ遺伝子を、直接宿主細胞に導入することで、本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることもできる。
【０４２８】
ＲＮＡｉ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。ＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトは、例えば、［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１５５０２（１９９８）；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９５，８５４（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，５０４９（１９９９）；セル（Ｃｅｌｌ），９５，１０１７（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，１４５１（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１３９５９（１９９８）；ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．），２，７０（２０００）］等の記載に従って設計することができる。
【０４２９】
（ｅ）トランスポゾンを用いた方法による、本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５，３５（２０００）等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、フコース修飾に関連する酵素の活性、または産生糖蛋白質分子若しくは細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
【０４３０】
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムである。通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子に突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
【０４３１】
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
【０４３２】
外来遺伝子としては、宿主細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
【０４３３】
宿主細胞としては、例えば、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞等の標的とするフコース修飾に関連する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、例えば、後述２に記載の宿主細胞が挙げられる。各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
【０４３４】
フコース修飾に関連する酵素の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、本項１（ａ）に記載の方法が挙げられる。
【０４３５】
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、本項１（ａ）に記載の方法が挙げられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、後述５に記載の方法が挙げられる。
【０４３６】
（２）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法
本発明の改変抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する酵素の遺伝子を標的とし、該酵素のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。
【０４３７】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、例えば、ＧＭＤおよびＦｘなどが挙げられる。
【０４３８】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のコアフコース糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、例えば、α１，６−フコシルトランスフェラーゼなどが挙げられる。
【０４３９】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質としては、具体的には、例えば、ＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターなどが挙げられる。
【０４４０】
これらの酵素または蛋白質は、基質特異性を有したある特定の反応を触媒する酵素や蛋白質であり、このような基質特異性を有した触媒作用を有する酵素や蛋白質の活性中心を破壊することで、これらの酵素のドミナントネガティブ体を作製することができる。
【０４４１】
標的とする酵素のうち、ＧＭＤを例として、そのドミナントネガティブ体に作製について具体的に以下に述べる。
【０４４２】
大腸菌由来のＧＭＤの立体構造を解析した結果、４つのアミノ酸（１３３番目のＴｈｒ、１３５番目のＧｌｕ、１５７番目のＴｙｒ、１６１番目のＬｙｓ）が酵素活性に重要な機能を担っていることが明らかにされている（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，２，２０００）。
【０４４３】
そこで、立体構造の情報にもとづきこれら４つのアミノ酸を異なる他のアミノ酸に置換した変異体を作製した結果、いずれの変異体においても有意に酵素活性が低下していたことが示されている。
【０４４４】
一方、ＧＭＤの補酵素ＮＡＤＰや基質であるＧＤＰ−マンノースとの結合能に関しては、いずれの変異体においてもほとんど変化が観察されていない。従って、ＧＭＤの酵素活性を担うこれら４つのアミノ酸を置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。
【０４４５】
大腸菌由来のＧＭＤのドミナントネガティブ体の作製の結果に基づき、アミノ酸配列情報をもとにした相同性比較や立体構造予測を行うことにより、例えば、ＣＨＯ細胞由来のＧＭＤでは、１５５番目のＴｈｒ、１５７番目のＧｌｕ、１７９番目のＴｙｒおよび１８３番目のＬｙｓを他のアミノ酸に置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。
【０４４６】
このようなアミノ酸置換を導入した遺伝子の作製は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
【０４４７】
高ＡＤＣＣ活性抗体生産細胞を作製するために用いる宿主細胞は、上述のように作製した標的酵素のドミナントネガティブ体をコードする遺伝子（以下、ドミナントネガティブ体遺伝子と略記する）を用い、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、例えば、以下のように作製することができる。
【０４４８】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のコアフコース糖鎖修飾に関与する酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
【０４４９】
該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
【０４５０】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のコアフコース糖鎖修飾に関与する酵素の活性、または産生抗体分子若しくは細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、高ＡＤＣＣ活性抗体生産細胞を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
【０４５１】
宿主細胞としては、例えば、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞等の標的とするＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のコアフコース糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、例えば、前述１に記載の宿主細胞が挙げられる。
【０４５２】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、目的とするドミナントネガティブ体をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、例えば、前述１に記載の発現ベクターが挙げられる。
【０４５３】
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、前述１に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
【０４５４】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のコアフコース糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述２（１）の（ａ）に記載の方法が挙げられる。
【０４５５】
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述２の（５）に記載の方法が挙げられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法が挙げられる。
【０４５６】
（３）酵素に突然変異を導入する手法
高ＡＤＣＣ活性抗体生産細胞を作製するために用いる宿主細胞は、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のコアフコース糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子に突然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製できる。
【０４５７】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、例えば、ＧＭＤおよびＦｘなどが挙げられる。
【０４５８】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のコアフコース糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、例えば、α１，６−フコシルトランスフェラーゼおよびα−Ｌ−フコシダーゼなどが挙げられる。
【０４５９】
酵素に突然変異を導入する方法としては、例えば、１）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体または自然発生的に生じた突然変異体から、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のコアフコース糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として所望の細胞株を選択する方法、２）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体または自然発生的に生じた突然変異体から、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法および３）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体または自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などが挙げられる。
【０４６０】
突然変異誘発処理としては、親株の細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失またはフレームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。具体的には、例えば、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理および放射線の照射などが挙げられる。また、例えば、種々のアルキル化剤および発癌物質なども突然変異誘発物質として用いることができる。
【０４６１】
突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術  第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編（１９９６）およびネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．），２４，３１４，（２０００）等に記載の方法を挙げることができる。
【０４６２】
自然発生的に生じた突然変異体としては、例えば、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体を挙げることができる。
【０４６３】
（４）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法
高ＡＤＣＣ活性抗体生産細胞を作製するために用いる宿主細胞は、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のコアフコース糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］、トリプル・ヘリックス技術［Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）］等を用い、標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
【０４６４】
（５）Ｎ−グリコシド結合型糖鎖還元末端のコアフコースを認識するレクチンに耐性である株を選択する手法
高ＡＤＣＣ活性抗体生産細胞を作製するために用いる宿主細胞は、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖還元末端のコアフコースを認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
【０４６５】
Ｎ−グリコシド結合型糖鎖還元末端のコアフコースを認識するレクチンに耐性である株を選択する手法としては、例えば、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法が挙げられる。
【０４６６】
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができる。
【０４６７】
その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（ＬｅｎｓＣｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）およびヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等を挙げることができる。
【０４６８】
具体的には、１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度の上述のレクチンを含む培地で好ましくは１日〜２週間、より好ましくは１日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養またはコロニーをピックアップし別の培養容器に移す。さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることによって、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択することができる。
【０４６９】
３．抗体組成物の活性評価
精製した改変抗体組成物の蛋白量、ＦｃＲ結合活性、Ｃ１ｑ結合活性、抗原結合活性、並びにＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性等の細胞傷害活性を測定する方法としては、例えば、モノクローナルアンチボディズおよびアンチボディエンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
【０４７０】
具体的な例としては、抗体組成物がヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性は、ＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。
【０４７１】
また、抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、ＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）、米国特許出願公開第２００４／０２５９１５０号明細書］。
【０４７２】
本発明の改変抗体組成物がＦｃＲへの結合活性を有することは、遺伝子組み換えＦｃγＲＩＩＩＡタンパク質や遺伝子組換え胎児ＦｃＲ（ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦｃＲｎ）タンパク質を作製して、結合活性を測定することで確認することができる（米国特許出願公開第２００４／０２５９１５０号明細書）。
【０４７３】
ＡＤＣＣ活性を測定する方法としては、例えば、放射性同位体、蛍光物質または色素等で標識された標的細胞、抗体およびエフェクター細胞を接触させた後、傷害された標的細胞から遊離される標識物質の活性または遊離する酵素の生理活性等を測定する方法など挙げられる。
【０４７４】
ＣＤＣ活性を測定する方法としては、例えば、放射性同位体、蛍光物質または色素等で標識された標的細胞、抗体および補体成分を含む血清等の生体試料を接触させた後、傷害された標的細胞から遊離される標識物質の活性または遊離する酵素の生理活性を測定する方法など挙げられる。
【０４７５】
本発明の２９７番目のＡｓｎ以外に不要な糖鎖が結合しないようにアミノ酸改変された改変抗体組成物は、アミノ酸改変を行う前の抗体と比べて、同等以上のＦｃγＲ結合活性、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を有する。
【０４７６】
即ち、本発明の改変抗体組成物は、Ｆｃ領域においてＡｓｎ２９７番目以外のＮ−グリコシド結合型糖鎖が結合するアミノ酸配列のアミノ酸改変を行ったにも関らず、元のＦｃ領域を有する抗体と同等以上のＦｃＲ結合活性、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を有する。
【０４７７】
また本発明の改変抗体組成物は、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ３よりも高いＣＤＣ活性を有し、かつアミノ酸改変を行う前の抗体と比べて、実質的に同等以上のＦｃγＲ結合活性、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を有する。
【０４７８】
更に、本発明の配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む定常領域を有する改変抗体組成物は、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ３よりも高いＣＤＣ活性を有し、かつ配列番号１のＦｃ領域を有する抗体組成物と比べて、実質的に同等以上のＦｃγＲ結合活性、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を有する。
【０４７９】
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
【０４８０】
４．抗体組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、ＩｇＧ分子に結合している糖鎖は、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）およびフコース（Ｆｕｃ）などの中性糖、並びにＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）などのアミノ糖、シアル酸（Ｓｉａｌ）などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
【０４８１】
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
抗体組成物の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
【０４８２】
具体的な方法として、例えば、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置を用いる方法が挙げられる。ＢｉｏＬＣは、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
【０４８３】
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、例えば、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
【０４８４】
（２）糖鎖構造解析
抗体組成物の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。
【０４８５】
２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
【０４８６】
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。
【０４８７】
次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
【０４８８】
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
【０４８９】
抗体Ｆｃ領域のいずれの部分に糖鎖が結合しているのかは、還元アルキル化処理した抗体をトリプシン、ペプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎなどのエンドプロテアーゼで処理したものを、逆相クロマトグラフィー（ＬＣ）で分離した後に、質量分析計（ＭＳ）などで分析することにより確認できる。
【０４９０】
即ち、目的とするＦｃ領域のアミノ酸配列に基づき、プロテアーゼ処理により生成しうるペプチドの分子量および糖鎖が結合したペプチドの分子量と、ＭＳの分析値が一致するか否かにより、実際に糖鎖が結合しているか否かを確かめることができる。
【０４９１】
５．抗体分子の糖鎖構造の識別方法
本発明の抗体組成物は、抗体Ｆｃの２９７番目のＡｓｎに結合する糖鎖構造が異なった抗体分子から構成されている。本発明の改変抗体組成物のＦｃに結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、コアフコースの無い糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物は、高いＡＤＣＣ活性を示す。このような抗体組成物は、上記４．に記載の抗体分子の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別できる。また、レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いることによっても識別できる。
【０４９２】
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いた抗体分子の糖鎖構造の識別は、文献［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）；酵素免疫測定法，第３版，医学書院（１９８７）；改訂版，酵素抗体法，学際企画（１９８５）］等に記載のウエスタン染色、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＶＩＡ（Ｖｉｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）およびＭＩＡ（Ｍｅｔａｌｌｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などの免疫学的定量方法に準じて、例えば、以下のように行うことができる。
【０４９３】
抗体組成物含まれる抗体分子の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、標識したレクチンと試料である抗体組成物を反応させる。次に、標識したレクチンと抗体分子の複合体の量を測定する。
【０４９４】
抗体分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、例えば、ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ）、ＲＩＣ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  ｌｅｃｔｉｎ）、ＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＡＣＬ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｃａｕｄａｔｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＢＰＬ（Ｂａｕｈｉｎｉａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＳＬ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＢＡ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｂｉｆｌｏｒｕｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＥＢＬ（Ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ  Ｂａｌｋ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＣＬ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ  ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＥＬ（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＮＬ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＳＬ（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＨＰＡ（Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＨＨＬ（Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｌｅｃｔｉｎ）、Ｊａｃａｌｉｎ、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＬＥＬ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＡＬ（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＰＬ（Ｍａｃｌｕｒａ  ｐｏｍｉｆｅｒａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＮＰＬ（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＰＮＡ（Ｐｅａｎｕｔ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、Ｅ−ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｅｒｙｔｈｒｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＴＬ（Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＲＣＡ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＴＬ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＳＪＡ（Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＢＡ（Ｓｏｙｂｅａｎ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＵＥＡ（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＶＶＬ（Ｖｉｃｉａ  ｖｉｌｌｏｓａ  Ｌｅｃｔｉｎ）およびＷＦＡ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）が挙げられる。
【０４９５】
コアフコースを特異的に認識するレクチンを用いることが好ましい。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）およびヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）を挙げることができる。
【０４９６】
６．本発明の遺伝子組換え抗体組成物の使用
本発明の改変抗体組成物は、Ｆｃ領域の２９７番目以外のＡｓｎの糖鎖が減少または欠損した改変抗体分子を単一に含む組成物であり、単一な抗体分子を製造しなければならないタンパク質医薬品製造において非常に有用である。
【０４９７】
また、本発明の抗体組成物のうち、コアフコースが無い糖鎖の割合が組成物全体の糖鎖の２０％以上である抗体組成物は、Ｆｃ領域の２９７番目以外のＡｓｎの糖鎖が減少または欠損した改変抗体分子を単一に含む組成物であり、かつ高いＡＤＣＣ活性を有しているため、従来の抗体組成物よりも治療効果に優れた性質を有している。
【０４９８】
また、本発明の改変抗体組成物のうち、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＦｃ領域において、３９２番目のＡｓｎがＬｙｓに改変された変異Ｆｃを有する抗体であって、コアフコースが無い糖鎖の割合が組成物全体の糖鎖の２０％以上である抗体組成物は、Ｆｃ領域の２９７番目以外のＡｓｎの糖鎖が減少または欠損した改変抗体分子を単一に含む組成物であり、ヒトＩｇＧ１およびにヒトＩｇＧ３よりも高いＣＤＣ活性を有し、かつ高いＡＤＣＣ活性を有する。
【０４９９】
更に、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＦｃ領域において、３９２番目のＡｓｎがＬｙｓに改変された変異Ｆｃを有する抗体であって、コアフコースが無い糖鎖の割合が１００％である抗体組成物は、Ｆｃ領域の２９７番目以外のＡｓｎの糖鎖が減少または欠損した改変抗体分子を単一に含む組成物であり、ヒトＩｇＧ１およびにヒトＩｇＧ３よりも高いＣＤＣ活性を有し、かつ最も高いＡＤＣＣ活性であることから、高い臨床効果が期待できる。
【０５００】
本発明の改変抗体組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つまたはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【０５０１】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与が挙げられる。抗体製剤の場合、静脈内投与が好ましい。
【０５０２】
投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏およびテープ剤等が挙げられる。
【０５０３】
経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤および顆粒剤等が挙げられる。
【０５０４】
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、例えば、水、ショ糖、ソルビトールおよび果糖等の糖類、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油および大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバーおよびペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
【０５０５】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖およびマンニトール等の賦形剤、デンプンおよびアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムおよびタルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースおよびゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、並びにグリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０５０６】
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤および噴霧剤等が挙げられる。
【０５０７】
注射剤は、例えば、塩溶液およびブドウ糖溶液並びに両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
【０５０８】
また、噴霧剤は該抗体組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
【０５０９】
担体として、具体的には、例えば、乳糖、グリセリン等が例示される。抗体組成物および用いる担体の性質により、エアロゾルおよびドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０５１０】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢および体重等により異なるが、有効成分の量として、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
【０５１１】
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、例えば、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等が挙げられる。また、インビボ実験としては、例えば、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等が挙げられる。
【０５１２】
ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性および抗腫瘍実験は、文献［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），３６，３７３（１９９３）；キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ），５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。
【実施例】
【０５１３】
以下に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【０５１４】
また、以下の実施例においてアミノ酸残基を３文字または１文字表記し、Ｎ３９２Ｋは、ＥＵインデックス３９２番目のＡｓｎ（Ｎ）をＬｙｓ（Ｋ）にアミノ酸改変した改変抗体を示す。【０５１５】
［実施例１］高ＣＤＣ活性型抗体の糖鎖分析
ヒト抗体のＦｃ領域において、ＥＵインデックス２９７〜２９９番目のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基）配列のＡｓｎに糖鎖が結合することが知られているが、２９７〜２９９番目以外のＮ−グリコシド結合型糖鎖コンセンサス配列に糖鎖が結合することは知られていない。【０５１６】
国際公開第２００７／０１１０４１号に記載の高ＣＤＣ活性型ＣＨ配列を有する抗体１１３３、１１３Ｄ、１１３Ｅ、１１３Ｆ、１１３Ｇおよび１１３Ｈは、いずれもヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とヒトＩｇＧ３のＦｃ領域の全部または一部のドメインが交換された抗体であり、ＣＨ３ドメインのＥＵインデックス３９２番目がＡｓｎであるため、Ｎ‐グリコシド結合糖鎖コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒが存在している。【０５１７】
また、天然のヒトＩｇＧ３抗体も同じＮ‐グリコシド結合糖鎖コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ有している。そこでヒトＩｇＧ３型抗体、および国際公開第２００７／０１１０４１号に記載のＩｇＧ１／ＩｇＧ３ドメイン交換抗体のＡｓｎ３９２に糖鎖が付加しているか否かを検討するため、これら抗体の糖鎖分析を行った。【０５１８】
ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ドメイン交換抗体としては、国際公開第２００７／０１１０４１号に記載の１１３Ｆ型抗ＧＭ２抗体ＧＭ２−１１３Ｆを用いた。１１３Ｆ抗体の構造は、図２（ａ）〜（ｃ）に模式的に示すように、ＣＨの１１８〜２３０番目がヒトＩｇＧ１抗体由来のアミノ酸配列、２３１〜４２２番目がヒトＩｇＧ３抗体由来のアミノ酸配列および４２３〜４４７番目がヒトＩｇＧ１抗体由来のアミノ酸配列を含む抗体である（配列番号２）。【０５１９】
ヒトＩｇＧ３型の抗体としては、ＩｇＧ１／κ型の抗ＣＤ２０キメラ抗体ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（米国特許第５，７３６，１３７号明細書）のＣＨをヒトＩｇＧ３型に置換したＫＭ３５２３（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００５，３０６：１５１−６０）およびＩＶＩＧ（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ）製剤より精製した天然に存在するヒトＩｇＧ３抗体を用いた。【０５２０】
まず初めに、ＧＭ２−１１３ＦおよびＫＭ３５２３を還元条件下で８％ゲル（Ｎｏｖｅｘ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果を図３に示す。【０５２１】
図３に示すように、ＧＭ２−１１３ＦのＨ鎖のバンド（バンドＢ）の直上にマイナーバンド（バンドＡ）を検出した。また、ＧＭ２−１１３Ｆの分子量を、液体クロマトグラス質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）を用いて測定した結果、ＧＭ２−１１３Ｆに相当する分子量（約１４８  ｋＤａ）の他に約１３８０Ｄａ大きい分子量を有する成分を検出した。【０５２２】
一方、ＫＭ３５２３および天然に存在するヒトＩｇＧ３抗体のＨ鎖のバンドは単一の分子量を示した。【０５２３】
前述の通りＡｓｎ３９２およびＴｈｒ３９４は、Ｎ‐グリコシド結合糖鎖コンセンサス配列であることから、１１３Ｆ型抗体のＡｓｎ３９２に高マンノースタイプのＮ型糖鎖（Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、分子量１３７８．４８、以下Ｍａｎ６型糖鎖と表記する）が付加している可能性が示唆されたため、以下により詳細な解析を実施した。【０５２４】
ＧＭ２−１１３ＦおよびＫＭ３５２３を６ｍｏｌ／Ｌグアニジン塩酸を含む０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に溶解し、ジチオトレイトール（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社製）を終濃度１．８  ｍｇ／ｍＬとなるように加え、５６℃で１時間還元反応を行った。反応後の溶液にヨードアセトアミド（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社製）を終濃度１１ｍｇ／ｍＬで添加し、遮光下において３７℃で１時間反応しアルキル化した。【０５２５】
次に、限外ろ過膜を用いて反応液を酵素消化用緩衝液（１ｍｏｌ／Ｌ  Ｕｒｅａ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮＨ４ＨＣＯ３）に置換し、更にＡｓｐ−Ｎ溶液（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ製）を加えて（Ｅ／Ｓ＝１／５０）、３７℃で１６時間消化し、反応は１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを適量加えて停止した。【０５２６】
Ａｓｐ−Ｎ消化によって得られるペプチド断片はＬＣ−ＭＳで解析した。即ち、ペプチド断片混合物を逆相ＨＰＬＣ（使用カラム：ＹＭＣ  Ｐｒｏ  Ｃ１８、１ｍｍＩ．Ｄ．×２５０  ｍｍ、ＹＭＣ製、流速：６０μＬ／ｍｉｎ）を使用して、移動相Ａ（０．１％  ＴＦＡ）から移動相Ｂ（０．１％  ＴＦＡ、９０％  ＣＨ３ＣＮ）の直線濃度勾配により分離した。【０５２７】
溶出液はエレクトロスプレー化によって質量分析計（ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ、ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に導入し、ペプチド断片の分子量を測定した。【０５２８】
得られたデータは質量分析計に付属のソフトフェア（Ｘｃａｌｉｂｕｒ  Ｑｕａｌ  Ｂｒｏｗｓｅｒ）を用いて解析し、Ａｓｎ３９２を含むペプチド断片（配列ＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬ）の分子イオン（ｍ／ｚ＝１２９６．５８、ｚ＝２）と、そのペプチド断片にＭａｎ６型糖鎖に相当する分子量（ｍ／ｚ＝６８９．２４、ｚ＝２）が付加した分子イオン（ｍ／ｚ＝１９８５．８１、ｚ＝２）のピークを抽出し、シグナル強度を数値化した。その結果を表１に示す。【０５２９】
表１はＧＭ２−１１３ＦおよびＫＭ３５２３のペプチドマッピングにおいて得られた、Ａｓｎ３９２を含むペプチド断片に関するＬＣ−ＭＳ解析結果を示す表である。表１中の数値は、質量分析計におけるシグナル強度を示している。Ｎ．Ｄ．はシグナルが検出されなかったことを示す。【０５３０】
【表１】
2011108502.tif 000003
【０５３１】
表１に示すように、ＧＭ２−１１３Ｆには、Ｍａｎ６型糖鎖が付加した分子イオンが検出された。一方、ＫＭ３５２３では糖鎖付加シグナルは検出されなかった。このことから、Ａｓｎ３９２への糖鎖付加はＧＭ２−１１３Ｆに固有の事象であると考えられた。【０５３２】
ＧＭ２−１１３ＦのＬＣ−ＭＳ測定結果から抗体１分子にＭａｎ６型糖鎖が１分子結合していると仮定した場合、表１に示した結果から、Ｍａｎ６型糖鎖が結合した抗体は抗体組成物全体の１０％程度と考えられた。【０５３３】
以上より、同じＮ−グリコシド結合型糖鎖コンセンサス配列を有するにも関わらず、ヒトＩｇＧ３抗体のＨ鎖定常領域のＡｓｎ３９２には全くＮ型糖鎖が結合していない一方で、１１３Ｆ型抗体のＡｓｎ３９２位には、一定の割合でＭａｎ６型糖鎖が付加することが明らかとなった。【０５３４】
［実施例２］改変抗体のデザインと作製
１．改変配列のデザイン
実施例１で明らかとなった、１１３Ｆ型のＨ鎖定常領域のＡｓｎ３９２の糖鎖付加を回避するため、Ａｓｎ３９２、Ｔｈｒ３９３、Ｔｈｒ３９４を別のアミノ酸に置換することによりＮ−グリコシド結合型糖鎖コンセンサス配列を破壊した４６種類のアミノ酸改変体の作製を試みた（下記、表２および表３）。【０５３５】
また、一部の改変抗体では、１１３Ｆ型のＦｃ領域の２７６、３３９および３９７番目のヒトＩｇＧ３抗体に特有のアミノ酸残基を改変することにより、改変抗体の生物活性に与える影響を確認した。【０５３６】
図４はヒトＩｇＧ１抗体、ヒトＩｇＧ３抗体および１１３Ｆ型抗体のＨ鎖定常領域のアミノ酸配列のアラインメントであり、本研究で改変を行った１１３Ｆ型抗体Ｆｃ領域の６アミノ酸残基を示す。【０５３７】
このうち、Ｌｙｓ２７６、Ｔｈｒ３３９、Ａｓｎ３９２、Ｍｅｔ３９７の４残基はヒトＩｇＧ１抗体とヒトＩｇＧ３抗体で異なるアミノ酸を残基である。尚、ＣＬのＤＮＡ配列はヒトΚ型配列を用い、Ｖ領域のＤＮＡ配列は抗ヒトＣＤ２０抗体ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（米国特許第５，７３６，１３７号明細書）と同じ配列を用いた。【０５３８】
２．改変抗体の作製
（１）発現ベクターの構築
発現ベクター構築の概要は図５に示す。【０５３９】
以下に記載する改変抗体のＣＨをコードするＤＮＡへの部位特異的変異導入にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（宝酒造社）を用いた。プライマーは、ＣＨ領域に各種アミノ酸残基改変（表１）を導入するような配列を製品手順書に従って設計し、合成した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）。【０５４０】
鋳型には、国際公開第２００７／０１１０４１号に記載のｐＫＴＸ９３／１１３Ｆベクターを用いた。これらのプライマーと鋳型を用いてＰＣＲ反応を行い、Ｈ鎖定常領域遺伝子配列中に目的の変異を有するベクター取得した。【０５４１】
Ｎ３９２Ｋアミノ酸改変と、２７６、３３９、３９３および３９７から選ばれるいずれか１つのアミノ酸残基改変を組み合わせた、２アミノ酸改変を有する抗体のアミノ酸配列は、上記の手順で作製したＮ３９２Ｋ変異を有する改変抗体発現ベクター（ｐＫＴＸ９３／１１３Ｆ−Ｎ３９２Ｋ）を鋳型にして同様の操作を行うことで取得した。【０５４２】
目的の変異を有するＨ鎖定常領域遺伝子配列をＡｐａＩとＮｒｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）によりｐＫＴＸ９３／１１３Ｆに移し変えた。【０５４３】
（２）抗体産生細胞の作製
細胞の培養は３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで行った。高ＡＤＣＣ型の脱フコシル化抗体を取得するため、宿主細胞にはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子をノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞（以下、ＦＵＴ８ＫＯ細胞と略記する）（米国特許第６，９４６，２９２号明細書）を用いた。【０５４４】
エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により、４μｇの発現ベクターを１．６×１０６個のＦＵＴ８ＫＯ細胞に導入した後、ＩＭＤＭ−（１０）［透析牛血清（ｄＦＢＳ）を１０％含むＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）］で培養した。２日間培養後、Ｇ４１８硫酸塩（ナカライテスク社）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−（１０）［以下ＩＭＤＭ−（１０Ｇ）と表記］に培地を交換し培養を続けた細胞をＧ４１８耐性株とした。【０５４５】
（３）抗体の発現と精製
表２およびに示す改変抗体と１１３Ｆについて、以下の方法で精製抗体を取得した。
前項で取得したＧ４１８耐性株を３×１０５個／ｍＬになるようにＩＭＤＭ−（１０Ｇ）に懸濁して３日間培養した後、Ｅｘ−ｃｅｌｌ  ３０２（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に培地を交換して７〜１１日間培養後、培養上清を回収した。【０５４６】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）担体０．５ｍＬを充填したカラムに、前項で取得した培養上清を流速０．５〜１．０ｍＬ／分で通過させた。３ｍＬのホウ酸緩衝液（０．２Ｍ  ホウ酸ナトリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）と０．２５ｍＬの０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ３．６）を順に添加して洗浄した後、１．５ｍＬの０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ３．６）で溶出した画分を粗溶出画分として回収した。【０５４７】
１０ｍＬのＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）を充填したカラムに粗溶出画分１．５ｍＬを通過させた。１．５ｍＬのクエン酸緩衝液（１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウムでｐＨ６．０に調整）で洗浄後、３．０ｍＬの同クエン酸緩衝液で溶出した画分を抗体溶液として回収した。【０５４８】
（４）改変抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
表２および表３に示す改変抗体のうち、Ｎ３９２Ｋ／Ｋ２７６Ｓ以外の精製抗体について以下の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を実施した。０ｍＭ（非還元条件）または１０  ｍＭ（還元条件）のジチオトレイトールを含有するサンプル緩衝液［０．３Ｍ  トリス塩酸（ｐＨ６．８）、１０％  ドデシル硫酸ナトリウム、５０％  グリセロール］で０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、１００℃で５分間処理した抗体溶液を、ポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ社）に１レーンあたり１０μＬ充填し、ゲル１枚あたり２０ｍＡでおよそ２時間電気泳動した。ゲルを回収後、ＣＢＢ  ｓｔａｉｎ  ｏｎｅ（ナカライテスク社）を用いて製品手順書に従い染色した。【０５４９】
非還元条件下のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、全ての改変抗体で改変前の１１３Ｆ型抗体と類似したバンドパターンを確認でき、精製品の純度に問題はないことが示された。還元処理を行ったサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、１１３ＦにおいてＨ鎖の高分子量側にマイナーバンドが観察されたが、改変抗体では同バンドの消失を認め、作製した改変抗体において３９２Ａｓｎ残基に付加した糖鎖が除去されたことが明らかになった。【０５５０】
［実施例３］改変抗体の活性評価
１．ＣＤＣ活性の測定
マウス胸腺腫細胞株ＥＬ４にヒトＣＤ２０遺伝子を導入した形質転換細胞ＫＣ１１５６［Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１１，２３２７（２００５）］とＣＤ２０陽性腫瘍細胞株Ｄａｕｄｉ（ＪＣＲＢ）、Ｒａｊｉ（ＪＣＲＢ）、ＳＴ４８６（ＡＴＣＣ）、ＥＨＥＢ（ＤＳＭＺ）、ＭＥＣ−１（ＤＳＭＺ）を標的細胞として改変抗体のＣＤＣ活性を測定した。【０５５１】
ＩｇＧ１型のＨ鎖定常領域を有する抗体のコントロールとして抗ＣＤ２０抗体ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（米国特許第５，７３６，１３７号明細書）を用いた。９６ウェル平底プレート（住友ベークライト社）の各ウェルに、１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（和光純薬工業社）を用いて１．０×１０６個／ｍＬに希釈した標的細胞５０μＬと終濃度の３倍に調整した抗体溶液５０μＬと２倍もしくはＥＬ４／ＣＤ２０−Ａでは８倍に希釈したヒト補体（ＳＩＧＭＡ社）５０μＬを分注した。【０５５２】
また、抗体を含まないウェルを０％  反応ウェル、標的細胞を含まないウェルを１００％  反応ウェルとして用意した。３７℃（５％  ＣＯ２）で２時間培養後、各反応ウェルにＷＳＴ−１（ＲＯＣＨＥ社）を１５μＬずつ添加し３７℃（５％  ＣＯ２）で３時間培養した。反応終了後、各ウェルのＯＤ４５０を測定し、下式を用いて細胞傷害活性（％）を算出した。【０５５３】
細胞傷害活性（％）＝１００×｛１−（反応ウェル吸光度−１００％反応ウェル吸光度）／（０％反応ウェル吸光度−１００％反応ウェル吸光度）｝【０５５４】
全改変抗体のＣＤＣ活性を同一条件で比較するため、抗体濃度１μｇ／ｍＬにおけるＫＣ１１５６に対するＣＤＣ活性測定を全サンプル同一プレート上で行い、結果を表２および表３に示す。【０５５５】
【表２】
2011108502.tif 000004
【０５５６】
【表３】
2011108502.tif 000005
【０５５７】
表２および表３に示すように、Ｔ３９３Ｐ、Ｔ３９４Ｙ、Ｔ３９４Ｆ、Ｎ３９２Ｋ／Ｔ３３９Ｙは改変前の１１３ＦよりＣＤＣ活性が上昇していた。また、３９２位と３９７位は網羅的に改変を行ったが、Ａｓｎ３９２の改変抗体は１１３Ｆと比較して同等以上のＣＤＣ活性を示し、Ｍｅｔ３９７の一部の改変抗体は活性が低下する傾向が明らかになった。【０５５８】
Ｎ３９２Ｋ、Ｔ３９４ＹおよびＴ３９４Ｆについて、ＣＤ２０トランスフェクタントＫＣ１１５６に対するＣＤＣ活性測定をより詳細に行った。その結果を図６（ａ）および（ｂ）に示す。【０５５９】
図６に示すように、Ｎ３９２Ｋは改変前の１１３Ｆ型抗体と同等のＣＤＣ活性であった。また、Ｔ３９４ＹとＴ３９４Ｆは、１１３Ｆ型抗体と比べて、顕著なＣＤＣ活性の増加が認められた。【０５６０】
Ｎ３９２Ｋ、Ｔ３９４Ｙ、Ｔ３９４ＦおよびＮ３９２Ｋ／Ｔ３３９ＹのＣＤ２０陽性腫瘍細胞に対するＣＤＣ活性を測定した結果を図７（ａ）〜（ｅ）に示す。【０５６１】
図７（ａ）〜（ｅ）に示すように、ＣＤ２０陽性腫瘍細胞に対するＣＤＣ活性も同様に、Ｎ３９２Ｋは１１３Ｆ型抗体と同等のＣＤＣ活性であり、Ｔ３９４Ｙ、Ｔ３９４ＦおよびＮ３９２Ｋ／Ｔ３３９Ｙは改変前の１１３Ｆ型抗体と比べて、ＣＤＣ活性の増加が認められた。【０５６２】
２．補体結合活性
補体第一成分であるＣ１ｑと改変抗体の結合活性を、フローサイトメーターを用いて測定した。比較対照として１１３Ｆ型抗体およびＩｇＧ１型抗体のｒｉｔｕｘｉｍａｂを用いた。９６ウェルＵ底プレート（ファルコン社）の各ウェルに、ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社）で１．５×１０７個／ｍＬに希釈したＤａｕｄｉ細胞５０μＬと終濃度の３倍に調整した抗体溶液５０μＬを分注して３７℃（５％  ＣＯ２）で１０分間静置した後、６％に希釈したヒト血清（ＳＩＧＭＡ社）を１ウェルあたり５０μＬずつ添加して３７℃（５％  ＣＯ２）で１５分間静置した。【０５６３】
ＰＢＳで２回洗浄後、ＦＡＣＳ用緩衝液［１％  ＢＳＡ、０．０２％  エチレンジアミン四酢酸、０．０５％  アジ化ナトリウム、ＰＢＳに溶解］で１００倍に希釈したＦＩＴＣ標識抗ヒトＣ１ｑ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）を１ウェルあたり５０μＬずつ添加し、遮光下４℃で３０分反応させた。【０５６４】
細胞をＦＡＣＳ用緩衝液２００μＬで２回洗浄後、２００μＬのＦＡＣＳ用緩衝液に懸濁して、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ  ５００  ＭＰＬ（ベックマン・コールター社）で蛍光強度を測定した。【０５６５】
尚、反応の５０％効果濃度（ＥＣ５０）は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ヒューリンクス社）の投与反応ロジスティック（ｄｏｓｅｒｓｐｌｇｓｔ）より最小値を０に固定して算出した。その結果を図８に示す。【０５６６】
また、グラフから算出したＥＣ５０の値を表４に示す。表４中のＹｍａｘは近時曲線の最大値を表す。【０５６７】
【表４】
2011108502.tif 000006
【０５６８】
図８および表４に示すように、Ｎ３９２ＫのＣ１ｑ結合活性は１１３Ｆと同等であった。本解析でＴ３９４ＦとＴ３９４ＹのＣ１ｑ結合活性は改変前の１１３Ｆ型抗体よりも更に上昇していた。【０５６９】
３．ＡＤＣＣ活性
上記実施例２で作製した改変抗体のＡＤＣＣ活性は、国際公開第２００７／０１１０４１号に記載の方法により測定した。作製した改変抗体は全て、コアフコースの無い高ＡＤＣＣ型抗体であるため、陰性対照としてｒｉｔｕｘｉｍａｂを用いた。【０５７０】
標的細胞としてＣＤ２０陽性腫瘍細胞Ｄａｕｄｉ、ＲａｊｉおよびＳＴ４８６を用い、エフェクター細胞には健常人ドナーより調製したＰＢＭＣを用いた。【０５７１】
ターゲット細胞に対するエフェクター細胞の比は、１：２０、１：２５、１：３０で実験を行い、細胞傷害活性（％）は以下の式より算出した。【０５７２】
細胞傷害活性（％）＝１００×（Ｓ−Ａｂ）／（Ｍａｘ−Ｔ）
Ｓ＝サンプル反応ウェル吸光度−培地ウェル吸光度
Ａｂ＝抗体無添加ウェル吸光度−培地ウェル吸光度
Ｔ＝標的ウェル吸光度−培地ウェル吸光度
Ｍａｘ＝１００％反応ウェル吸光度−１００％反応対照ウェル吸光度【０５７３】
その結果、Ｎ３９２Ｋ、Ｔ３９４ＦおよびＴ３９４ＹのＡＤＣＣ活性は１１３Ｆ型抗体と同等であり、ｒｉｔｕｘｉｍａｂよりも大顕著に増加した。【０５７４】
４．ＦｃＲｎおよびβ２ミクログロブリン（β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）タンパク質の作製
可溶性ヒト胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）のＣ末端にヒスチジンタグ（６個のＨｉｓが連続したアミノ酸配列）を有するタンパク質を作製するために、ヒト胎盤由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社製）を鋳型として、プライマーＦｃＲｎ  ｆｗ（配列番号４）およびプライマーＦｃＲｎ  ｒｖ（配列番号５）を用いてＰＣＲ行い、ＦｃＲｎα鎖の細胞膜ドメインのＣ末端にヒスチジンタグを有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅した。【０５７５】
ＰＣＲ反応はＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡社製）に添付の説明書に基き行い、ＦｃＲｎα鎖のＣ末端にヒスチジンタグを含むタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＣＲＦｃＲｎαを取得した。【０５７６】
一方、以下の手順でヒトβ２ミクログロブリンをコードするｃＤＮＡの構築を行った。ヒトβ２ミクログロブリンのＤＮＡ配列をカバーする４本の合成ＤＮＡを作製し、上記と同様にしてＰＣＲを行い、ヒトβ２ミクログロブリンのｃＤＮＡをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣＲＢ２Ｍ取得した。【０５７７】
次に、国際公開第９７／１０３５４号記載の動物細胞用ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３を制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ヒト抗体の重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡ領域が除去された約１１ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。【０５７８】
一方、ｐＣＲＢ２Ｍを制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより、ヒトβ２ミクログロブリンをコードする約４００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。これら約１１ＫｂｐのＤＮＡ断片と約４００ｂｐのＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換してプラスミドｐＫＡＮＴＥＸＢ２Ｍを構築した。【０５７９】
次にｐＫＡＮＴＥＸＢ２Ｍを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＤｒａＩＩＩで消化することによりヒト抗体軽鎖定常領域をコードするｃＤＮＡが除去された約１１Ｋｂｐのプラスミド断片を回収した。一方、プラスミドｐＣＲＦｃＲｎαをＥｃｏＲＩおよびＤｒａＩＩＩで消化して得られる約０．９ＫｂｐのＦｃＲｎα鎖をコードするｃＤＮＡを回収した。【０５８０】
上記、約１１ＫｂｐのＤＮＡ断片と約０．９ＫｂｐのＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈを用いて連結後、大腸菌ＤＨ５αを形質転換することにより、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸＦｃＲｎＨｉｓを得た。【０５８１】
得られたプラスミドは制限酵素ＡａｔＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ社製）で切断し、直鎖化した後、細胞への導入に用いた。切断後は反応液をアガロース電気泳動に供し、該プラスミドが正確に直鎖化されていることを確認した。【０５８２】
ＦｃＲｎとβ２ミクログロブリンを共発現させた細胞は、上述と同様にして作製し、培養を行った。培養後、培養上清を回収し、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、可溶型ＦｃＲｎの精製を行い、可溶性ＦｃＲｎタンパク質とβ２ミクログロブリンの複合体タンパク質を取得した。【０５８３】
取得した可溶性ＦｃＲｎタンパク質とβ２ミクログロブリンの複合体タンパク質を、可溶性ＦｃＲｎとして用いた。【０５８４】
５．ＦｃＲｎ結合活性
抗体の血中半減期はエンドソームに存在するｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲｎ）に対するｐＨ６．０とｐＨ７．４における結合活性と関係していることが知られている［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７６，３４６（２００６）］。【０５８５】
改変による血中半減期への影響を検討するため、改変抗体のｐＨ６．０またはｐＨ７．４におけるＦｃＲｎ結合活性をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にて評価した。【０５８６】
コントロールには、ｒｉｔｕｘｉｍａｂおよび公知の文献に記載のあるＦｃＲｎに対する結合活性が上昇したＩｇＧ１改変配列（Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７６，３４６（２００６）］を有するｒｉｔｕｘｉｍａｂを用いた。【０５８７】
Ａｃｅｔａｔｅ  ５．５で１０μｇ／ｍＬに希釈した抗β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｌｉｎ抗体（ａｂｃａｍ社）を流速１０μＬ／分で４２０秒間反応させ、アミンカップリング法にてＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に固定化した（目標量：１０，０００  ＲＵ）。【０５８８】
また、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４に調整したＨＢＳ−ＥＰ＋  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で１μｇ／ｍＬ可溶性ＦｃＲｎを流速５μＬ／分で２４秒間反応させセンサーチップ表面に捕捉した（目標量：１００ＲＵ）。【０５８９】
抗体はｐＨ６．０またはｐＨ７．４のＨＢＳ−ＥＰ＋  Ｂｕｆｆｅｒで希釈し流速３０μＬ／分で１２０秒間反応させ、結合・解離反応を測定した。センサーチップの再生はＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｐＨ２．０を流速６０μＬ／分で６０秒間反応させることで行った。【０５９０】
ＫＤ値はＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にてＢｉｖａｌｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌを用いた解析により算出した。【０５９１】
表５に改変抗体のｐＨ６．０における各種反応定数を示す。【０５９２】
【表５】
2011108502.tif 000007
【０５９３】
表５に示すように、Ｎ３９２Ｋ、Ｔ３９４ＹおよびＴ３９４ＦのｐＨ６．０における反応速度定数ＫＤは１１３Ｆ型抗体やｒｉｔｕｘｉｍａｂと同等であった。また、ｐＨ７．４においてはいずれの抗体も結合活性が認められなかった。【０５９４】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１０年３月２日付けで出願された米国仮出願（６１／３０９６３１号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【配列表フリーテキスト】
【０５９５】
配列番号１：１１３Ｆ  Ｆｃ領域のアミノ酸配列
配列番号２：１１３Ｆ  定常領域のアミノ酸配列
配列番号３：Ｎ３９２Ｋ  定常領域のアミノ酸配列
配列番号４：ＦｃＲｎ  ｆｗプライマーの塩基配列
配列番号５：ＦｃＲｎ  ｒｖプライマーの塩基配列
【図１】
2011108502.tif 000008
【図２】
2011108502.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2011108502000001.app
【国際調査報告】
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2011108502.tif 000017
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