(57)【要約】発明は、糖−修飾ヌクレオシド及び２’−デオキシヌクレオシドの交代セグメントを有するオリゴヌクレオシド及びそれらの用途に関する。発明は、さらに、糖−修飾ヌクレオチド及び２’−デオキシヌクレオチドの交代セグメントを有するオリゴヌクレオチド及びそれらの用途に関する。そのような用途は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製、及び興味のある標的核酸、例えばＲＮＡの機能の妨害又は消耗のための系における用途を含む。従って、発明のオリゴヌクレオチドは、治療用、分析用及び診断用の方法及び用途、並びにそのような方法及び用途に対応する組成物及び市販のパッケージの成分に有用である。
2005522997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
交代第１セグメント及び第２セグメントを含み、但し、第１セグメントが少なくとも１つの糖−修飾ヌクレオシドを含み、そして第２セグメントが少なくとも１つの２’−デオキシヌクレオシドを含み、第１セグメント及び第２セグメントの各々を少なくとも２つ含み、それにより少なくとも４つの交代セグメントを含む、オリゴヌクレオシド。
【請求項２】
（ａ）オリゴヌクレオシドがリン酸を含むヌクレオシド間結合をさらに含むことによりオリゴヌクレオチドとなるか、（ｂ）糖−修飾ヌクレオシドが結合したリン酸を含むことにより糖−修飾ヌクレオチドとなるか、（ｃ）２’−デオキシヌクレオシドが結合したリン酸を含むことにより２’−デオキシヌクレオチドとなるか、又は（ｄ）（ａ）から（ｃ）のあらゆる組み合わせである、請求項１記載のオリゴヌクレオシド。
【請求項３】
糖修飾オリゴヌクレオチドが，ＤＮＡ−様コンフォメーションを採る、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
糖−修飾オリゴヌクレオチドが、アラビノヌクレオチド、アルファ−Ｌ−ロックされた核酸、シクロヘキサン核酸、及び電気陰性２’−酸素原子を欠くリボ核酸からなる群から選択される、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
電気陰性２’−酸素原子を欠くリボ核酸が、２’−アルキル−Ｄ−リボース及び２’−ＳＣＨ３−Ｄ−リボースからなる群から選択される、請求項３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
セグメントが、各々別個に約１から約６のアラビノヌクレオチド又は２’−デオキシヌクレオチドを含む、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
セグメントが、各々別個に約２から約５のアラビノヌクレオチド又は２’−デオキシヌクレオチドを含む、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
セグメントが、各々別個に約３から約４のアラビノヌクレオチド又は２’−デオキシヌクレオチドを含む、請求項７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
セグメントが、各々別個に約３のアラビノヌクレオチド又は２’−デオキシヌクレオチドを含む、請求項８記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドが、
【化１】
2005522997.tif 000023
からなる群から選択され、式中、ｍ，ｘ及びｙの各々はそれぞれ別個に１より大きい整数か又は１に等しく、ｎは２より大きい整数か又は２に等しく、Ａは糖−修飾ヌクレオチドであり、そしてＤは２’−デオキシリボヌクレオチドである、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
糖−修飾オリゴヌクレオチドが、フッ素、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アジド、−ＣＨ＝ＣＨ２，−Ｃ≡ＣＨ，アルキル、官能基化されたアルキル、アルコキシ及び官能基化されたアルコキシ基からなる群から選択された２’置換基を含む、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
アルキル基が低級アルキル基である、請求項１１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
低級アルキル基が、メチル、エチル及びプロピル基からなる群から選択される、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
官能基化されたアルキル基が、メチルアミノ、エチルアミノ及びプロピルアミノ基からなる群から選択される、請求項１１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
アルコキシ基が、メトキシ、エトキシ及びプロポキシ基からなる群から選択される、請求項１１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
官能基化されたアルコキシ基が、−Ｏ（ＣＨ２）ｑ−Ｒであって、式中、ｑ＝２，３又は４であり、そして−Ｒは、−ＮＨ２，−ＯＣＨ３，及び−ＯＣＨ２ＣＨ３基からなる群から選択される、請求項１１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
糖−修飾ヌクレオチドがはアラビノヌクレオチドである、請求項３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
アラビノヌクレオチドが２’−フルオロアラビノヌクレオチド（２’ＦＡＮＡ）である、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドが、
ａ）ホスホジエステル；
ｂ）ホスホトリエステル；
ｃ）ホスホロチオエート；
ｄ）ホスホロジチオエート；
ｅ）Ｒｐ−ホスホロチオエート；
ｆ）Ｓｐ−ホスホロチオエート；
ｇ）ボラノホスフェート；
ｈ）３’−チオフォルムアセタル
ｉ）メチレン（メチルイミノ）；
ｊ）アミド；
ｋ）メチルホスフォネート；
ｌ）ホスフォルアミデート（５’Ｐ−Ｎ３’）；及び
ｍ）（ａ）から（ｌ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される一つ又は複数のヌクレオチド間結合を含む、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドが、約３０又はそれより少ないヌクレオチドからなる、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、約８から約２５のヌクレオチドからなる、請求項２０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドが、約１８のヌクレオチドからなる、請求項２１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドが構造Ｉを有し、式中、ｘ＝１，ｙ＝１そしてｎ＝９であり、それにより構造：
【化２】
2005522997.tif 000024
を有する、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドが構造ＩＩを有し、式中、ｘ＝１，ｙ＝１そしてｎ＝９であり、それにより構造：
【化３】
2005522997.tif 000025
を有する、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドが構造ＩＩＩを有し、式中、ｘ＝２，ｙ＝２そしてｍ＝３であり、それにより構造：
【化４】
2005522997.tif 000026
を有する、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドが構造ＩＶを有し、式中、ｘ＝２，ｙ＝２そしてｍ＝３であり、それにより構造：
【化５】
2005522997.tif 000027
を有する、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチドが構造Ｉを有し、式中、ｘ＝３，ｙ＝３そしてｎ＝３であり、それにより構造：
【化６】
2005522997.tif 000028
を有する、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチドが構造ＩＩを有し、式中、ｘ＝３，ｙ＝３そしてｎ＝３であり、それにより構造：
【化７】
2005522997.tif 000029
を有する、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
オリゴヌクレオチドが構造ＩＩＩを有し、式中、ｘ＝４，ｙ＝３そしてｍ＝１であり、それにより構造：
【化８】
2005522997.tif 000030
を有する、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチドが構造ＩＶを有し、式中、ｘ＝４，ｙ＝３そしてｍ＝１であり、それにより構造：
【化９】
2005522997.tif 000031
を有する、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
修飾されたヌクレオシドを含む第３のセグメントをさらに含み、但し、当該第３セグメントは、（ａ）上記の交代第１セグメント及び第２セグメントの５’末端に隣接しているか、（ｂ）上記の交代第１セグメント及び第２セグメントの３’末端に隣接しているか、又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方に隣接している、請求項１記載のオリゴヌクレオシド。
【請求項３２】
修飾されたヌクレオチドを含む第３のセグメントをさらに含み、但し、当該第３セグメントは、（ａ）上記の交代第１セグメント及び第２セグメントの５’末端に隣接しているか、（ｂ）上記の交代第１セグメント及び第２セグメントの３’末端に隣接しているか、又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方に隣接している、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
修飾されたヌクレオチドが修飾されたリボヌクレオチドである、請求項３２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
修飾されたリボヌクレオチドがその２’位に修飾を含む、請求項３３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
２’修飾が、メトキシ、メトキシエチル、フルオロ及びプロピルアミノ基からなる群から選択される、請求項３３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡに対してアンチセンスである、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
系において標的ＲＮＡの翻訳、逆転写及び／又は複製を妨害するか又は低下させる方法であって、但し、当該方法は、請求項３６記載のオリゴヌクレオチドに標的ＲＮＡを接触させることを含む。
【請求項３８】
系が、細胞、組織又は被験者からなる群から選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
細胞、組織又は被験者が、哺乳類の細胞、組織又は被験者である、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
細胞、組織又は被験者が、ヒトの細胞、組織又は被験者である、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性ＲＮＡ分割を誘導する方法であって、当該方法は、標的ＲＮＡと請求項３６記載のオリゴヌクレオチドを接触させることを含む。
【請求項４２】
ＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性ＲＮＡ分割を、ウイルスの逆転写酵素に付随したＲＮａｓｅ  Ｈ活性により作用させる、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ウイルスがヒト病原性ウイルスである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
ヒト病原ウイルスがＨＩＶ及びヘパドナウイルスからなる群から選択される、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
ＨＩＶがＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２からなる群から選択される、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
ヘパドナウイルスがＢ型肝炎ウイルスである、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
ＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を、原核又は真核オリジンのＲＮａｓｅ  Ｈ酵素に付随したＲＮａｓｅ  Ｈ活性により作用させる、請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
真核ＲＮａｓｅ  Ｈが哺乳類のＲＮａｓｅ  Ｈである、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
真核ＲＮａｓｅ  ＨがヒトＲＮａｓｅ  Ｈである、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
ヒトＲＮａｓｅ  Ｈが、ＲＮａｓｅ  Ｈ１及びＲＮａｓｅ  Ｈ２からなる群から選択される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
系において標的ＲＮａｓｅの翻訳、逆転写及び／又は複製を妨害するか又は低下させる方法及び／又は系において標的ＲＮＡの存在を検出する方法及び／又は系において遺伝子標的を確認する（validating）方法であって、当該方法は、
ａ）標的ＲＮＡを請求項３６記載のオリゴヌクレオチドと接触させ；そして
ｂ）標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分割を許容させる
ことを含む。
【請求項５２】
（ａ）系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を誘導すること；
（ｂ）系において標的ＲＮＡの翻訳を妨害するか又は低下させること；
（ｃ）系において標的ＲＮＡの逆転写を妨害するか又は低下させること；
（ｄ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害するか又は低下させること；
（ｅ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；
（ｆ）系において標的ＲＮＡに相当する遺伝子標的を確認すること；
（ｇ）系において標的ＲＮＡに関連する疾患を予防するか又は治療すること；及び
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせ；
からなる群から選択されるプロセスを作用させる方法であって、標的ＲＮＡを請求項３６記載のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。
【請求項５３】
（ａ）系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を誘導すること；
（ｂ）系において標的ＲＮＡの翻訳を妨害するか又は低下させること；
（ｃ）系において標的ＲＮＡの逆転写を妨害するか又は低下させること；
（ｄ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害するか又は低下させること；
（ｅ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；
（ｆ）系において標的ＲＮＡに相当する遺伝子標的を確認すること；
（ｇ）系において標的ＲＮＡに関連する疾患を予防するか又は治療すること；及び
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせ；
からなる群から選択されるプロセスを作用させる方法であって、上記の系に請求項３６記載のオリゴヌクレオチドを導入することを含む方法。
【請求項５４】
医学用途又は研究用途のための請求項３６記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項５５】
当該医学用途又は研究用途が、
（ａ）系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を誘導すること；
（ｂ）系において標的ＲＮＡの翻訳を妨害するか又は低下させること；
（ｃ）系において標的ＲＮＡの逆転写を妨害するか又は低下させること；
（ｄ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害するか又は低下させること；
（ｅ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；
（ｆ）系において標的ＲＮＡに相当する遺伝子標的を確認すること；
（ｇ）系において標的ＲＮＡに関連する疾患を予防するか又は治療すること；及び
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される、請求項５４記載の使用。
【請求項５６】
医薬の製造のための請求項３６記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項５７】
医薬が、
（ａ）系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を誘導すること；
（ｂ）系において標的ＲＮＡの翻訳を妨害するか又は低下させること；
（ｃ）系において標的ＲＮＡの逆転写を妨害するか又は低下させること；
（ｄ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害するか又は低下させること；
（ｅ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；
（ｆ）系において標的ＲＮＡに相当する遺伝子標的を確認すること；
（ｇ）系において標的ＲＮＡに関連する疾患を予防するか又は治療すること；及び
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される用途のためである、請求項５６記載の使用。
【請求項５８】
請求項３６記載のゴヌクレオチドを薬学上受容可能な担体と混合して含む組成物。
【請求項５９】
組成物が、
（ａ）系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を誘導すること；
（ｂ）系において標的ＲＮＡの翻訳を妨害するか又は低下させること；
（ｃ）系において標的ＲＮＡの逆転写を妨害するか又は低下させること；
（ｄ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害するか又は低下させること；
（ｅ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；
（ｆ）系において標的ＲＮＡに相当する遺伝子標的を確認すること；
（ｇ）系において標的ＲＮＡに関連する疾患を予防するか又は治療すること；及び
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される用途のためである、請求項５８記載の組成物。
【請求項６０】
請求項３６記載のオリゴヌクレオチドをその使用のための指示書と共に含む市販のパッケージ。
【請求項６１】
指示書が、
（ａ）系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を誘導すること；
（ｂ）系において標的ＲＮＡの翻訳を妨害するか又は低下させること；
（ｃ）系において標的ＲＮＡの逆転写を妨害するか又は低下させること；
（ｄ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害するか又は低下させること；
（ｅ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；
（ｆ）系において標的ＲＮＡに相当する遺伝子標的を確認すること；
（ｇ）系において標的ＲＮＡに関連する疾患を予防するか又は治療すること；及び
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される用途のためのものである、請求項６０記載の市販のパッケージ。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、オリゴヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド及びそれらの用途、特定すれば、修飾されたオリゴヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド及びそれらの用途に関する。
発明の背景
オリゴヌクレオチドはそれらの配列組成によって特異性を付与するそれらの能力に基づいて、様々な生物工学の適用のために利用される。例えば、蛋白質をコードする分子、例えばＲＮＡを標的とするようにデザインされるそれらの能力を仮定すれば、オリゴヌクレオチドの特定の用途はアンチセンス技術におけるものである。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮｓ）
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮｓ）は、バイオテクノロジーのセクターにおいて多大な興味を引き付け、そしてある範囲のヒト疾患に対する治療戦略における使用のために例外的な潜在能力を有する。ＡＯＮとその標的上のその相補配列の間の二重鎖の形成（通常はメッセンジャーＲＮＡ［ｍＲＮＡ］）は、一部「翻訳停止」によるが（ＡＯＮと標的ＲＮＡの間の二重鎖形成を通して、即ち翻訳機構を物理的又は立体的にブロックすることにより翻訳全体を阻害／妨害する）、しかし重要なことは、ＡＯＮ／ＲＮＡ二重鎖内のＲＮＡ鎖を特異的に分解する偏在性の内在性の細胞酵素であるリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）の作用を通して標的とされたＲＮＡの分解を導き出すことにより、そのようなＲＮＡの翻訳を停止させる。
【０００２】
ＲＮａｓｅ  Ｈの天然基質はＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖であるから、ＤＮＡがアンチセンス技術のために利用されてきた。しかしながら、血清及び細胞内ヌクレアーゼはホスホジエステル（ＰＤＥ）結合を有するＡＯＮｓを迅速に分解するから、ＰＤＥ−ＤＮＡからなるＡＯＮはそのような系において限定された利用性しか有さなかった。ホスホロチオエート結合（ＰＳ−ＤＮＡ）のＤＮＡは標的化ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を誘導することができ、そして血清及び細胞内ヌクレアーゼによる分解に対して耐性であるが、しかしながら、ＰＤＥ−ＤＮＡに比べて標的ＲＮＡと弱い結合を形成する。
ＲＮａｓｅ  Ｈ
ＲＮａｓｅ  ＨはＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖のＲＮＡ鎖を選択的に分解する（Ｈａｕｓｅｎ，Ｐ．；Ｓｔｅｉｎ，Ｈ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７０，１４，２７９）。ＲＮａｓｅ  Ｈを含む真核細胞抽出物による研究は、原核及び原核の酵素が共に類似のＲＮＡ分割特性を呈することを示す（Ｍｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３，２６８，１４５１４；Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９５，３１２，５９９；Ｌｉｍａ，Ｗ．Ｆ．；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７，３６，３９０）。エシェリヒアコリのＲＮａｓｅ  Ｈ１は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重らせんのマイナーな溝に結合し、そしてエンドヌクレアーゼ及びプロセッシブな３’から５’のエキソヌクレアーゼの活性の両方によりＲＮＡを分割すると考えられる（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９１，８８，１１５３５；Ｆｅｄｏｒｏｆｆ，Ｏ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３，２３３，５０９）。ＲＮａｓｅ  Ｈ分解の効率は最少配列依存性を示し、そして上記のとおり、アンチセンスオリゴヌクレオチド内の化学変化に対して極めて感受性である。
【０００３】
従って、上記の一つ又は複数の制限に取り組むための、改善されたオリゴヌクレオチドに関する要求が存在する。
発明の概要
最初の側面に従うと、発明は、糖を修飾されたヌクレオシド及び２’−デオキシヌクレオシドの交代セグメント（alternating segments）を含むオリゴヌクレオシドを提供するが、但し、セグメント又はユニットは各々が別個に少なくとも１つの糖−修飾されたヌクレオシド又は２’−デオキシヌクレオシドをそれぞれ含む。例えば、上記オリゴヌクレオシドは、交代第１セグメント及び第２セグメントを含み、但し、第１セグメントが少なくとも１つの糖−修飾ヌクレオシドを含み、そして第２セグメントが少なくとも１つの２’−デオキシヌクレオシドを含む。複数の態様において、上記オリゴヌクレオシドは、第１セグメント及び第２セグメントの各々を少なくとも２つ含み、それにより少なくとも４つの交代セグメントを含む。
【０００４】
一つの態様において、上記オリゴヌクレオシドはリン酸を含むヌクレオシド間結合を含み、それによりオリゴヌクレオチドになる。複数の態様において、糖−修飾ヌクレオシド及び／又は２’−デオキシヌクレオシドはリン酸を含み、それにより糖−修飾ヌクレオチド及び／又は２’−デオキシヌクレオチドとなる。
【０００５】
一つの態様において、発明は、アラビノヌクレオチド及び２’−デオキシヌクレオチドの交代セグメント又はユニットを含むオリゴヌクレオチドを提供するが、但し、セグメント又はユニットは各々が別個に少なくとも一つのアラビノヌクレオチド又は２’−デオキシヌクレオチドをそれぞれ含む。一つの態様において、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのアラビノヌクレオチドセグメント及び少なくとも２つの２’−デオキシヌクレオシドを含み、それにより少なくとも４つの交代ユニットを含む。
【０００６】
一つの態様において、上記糖−修飾オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ様コンフォメーションを採ることができる。一つの態様において、上記糖−修飾オリゴヌクレオチドは、アラビノヌクレオチド、アルファ−Ｌ−ロックされた核酸、シクロヘキサン核酸、及び電気陰性２’−酸素原子を欠くリボ核酸からなる群から選択される。一つの態様において、上記の電気陰性２’−酸素原子を欠くリボ核酸は、２’−アルキル−Ｄ−リボース及び２’−ＳＣＨ３−Ｄ−リボースからなる群から選択される。
【０００７】
一つの態様において、上記セグメントは、各々別個に約１から約６のアラビノヌクレオチド又は２’−デオキシヌクレオチドを含む。さらなる態様において、上記セグメントは、各々別個に約２から約５又は約３から約４のアラビノヌクレオチド又は２’−デオキシヌクレオチドを含む。さらなる態様において、上記セグメントは、各々別個に約３のアラビノヌクレオチド又は２’−デオキシヌクレオチドを含む。
【０００８】
一つの態様において、上記のオリゴヌクレオチドは、
【０００９】
【化１】
2005522997.tif 000003
からなる群から選択され、式中、ｍ，ｘ及びｙの各々はそれぞれ別個に１より大きい整数か又は１に等しく、ｎは２より大きい整数か又は２に等しく、Ａは糖−修飾ヌクレオチドであり、そしてＤは２’−デオキシリボヌクレオチドである。
【００１０】
一つの態様において、上記の糖−修飾オリゴヌクレオチドは、フッ素、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アジド、−ＣＨ＝ＣＨ２，−Ｃ≡ＣＨ，アルキル、官能基化されたアルキル、アルコキシ及び官能基化されたアルコキシ基からなる群から選択された２’置換基を含む。一つの態様において、アルキル基は低級アルキル基である。一つの態様において、低級アルキル基は、メチル、エチル及びプロピル基からなる群から選択される。一つの態様において、官能基化されたアルキル基は、メチルアミノ、エチルアミノ及びプロピルアミノ基からなる群から選択される。一つの態様において、アルコキシ基は、メトキシ、エトキシ及びプロポキシ基からなる群から選択される。一つの態様において、官能基化されたアルコキシ基は、−Ｏ（ＣＨ２）ｑ−Ｒであって、式中、ｑ＝２，３又は４であり、そして−Ｒは、−ＮＨ２，−ＯＣＨ３，及び−ＯＣＨ２ＣＨ３基からなる群から選択される。
【００１１】
一つの態様において、糖−修飾ヌクレオチドはアラビノヌクレオチドである。別の態様において、２’置換基はフッ素であり、そしてアラビノヌクレオチドは２’−フルオロアラビノヌクレオチド（２’Ｆ−ＡＮＡ；「ＦＡＮＡ」とも呼ばれる）である。
【００１２】
一つの態様において、上記のオリゴヌクレオチドは、
ａ）ホスホジエステル；
ｂ）ホスホトリエステル；
ｃ）ホスホロチオエート；
ｄ）ホスホロジチオエート；
ｅ）Ｒｐ−ホスホロチオエート；
ｆ）Ｓｐ−ホスホロチオエート；
ｇ）ボラノホスフェート；
ｈ）メチレン（メチルイミノ）（３’ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ５’）；
ｉ）３’−チオフォルムアセタル（３’Ｓ−ＣＨ２−Ｏ５’）
ｊ）アミド（３’ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−５’）；
ｋ）メチルホスフォネート；
ｌ）ホスフォルアミデート（３’−ＯＰ（Ｏ２）−Ｎ５’）；及び
ｍ）（ａ）から（ｌ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される一つ又は複数のヌクレオチド間結合を含む。
【００１３】
一つの態様において、上記のオリゴヌクレオチドは、約３０又はそれより少ないヌクレオチドからなり、別の態様において、約８から約２５のヌクレオチドからなり、そしてまたさらに別の態様において、約１８のヌクレオチドからなる。
【００１４】
一つの態様において、上記のオリゴヌクレオチドは構造Ｉを有し、式中、ｘ＝１，ｙ＝１そしてｎ＝９であり、それにより構造：
【００１５】
【化２】
2005522997.tif 000004
を有する。
【００１６】
一つの態様において、上記のオリゴヌクレオチドは構造ＩＩを有し、式中、ｘ＝１，ｙ＝１そしてｎ＝９であり、それにより構造：
【００１７】
【化３】
2005522997.tif 000005
を有する。
【００１８】
一つの態様において、上記のオリゴヌクレオチドは構造ＩＩＩを有し、式中、ｘ＝２，ｙ＝２そしてｍ＝３であり、それにより構造：
【００１９】
【化４】
2005522997.tif 000006
を有する。
【００２０】
一つの態様において、上記のオリゴヌクレオチドは構造ＩＶを有し、式中、ｘ＝２，ｙ＝２そしてｍ＝３であり、それにより構造：
【００２１】
【化５】
2005522997.tif 000007
を有する。
【００２２】
一つの態様において、上記のオリゴヌクレオチドは構造Ｉを有し、式中、ｘ＝３，ｙ＝３そしてｎ＝３であり、それにより構造：
【００２３】
【化６】
2005522997.tif 000008
を有する。
【００２４】
一つの態様において、上記のオリゴヌクレオチドは構造ＩＩを有し、式中、ｘ＝３，ｙ＝３そしてｎ＝３であり、それにより構造：
【００２５】
【化７】
2005522997.tif 000009
を有する。
【００２６】
一つの態様において、上記のオリゴヌクレオチドは構造ＩＩＩを有し、式中、ｘ＝４，ｙ＝３そしてｍ＝１であり、それにより構造：
【００２７】
【化８】
2005522997.tif 000010
を有する。
【００２８】
一つの態様において、上記のオリゴヌクレオチドは構造ＩＶを有し、式中、ｘ＝４，ｙ＝３そしてｍ＝１であり、それにより構造：
【００２９】
【化９】
2005522997.tif 000011
を有する。
【００３０】
一つの態様において、上記オリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオシドを含む第３のセグメントをさらに含み、但し、当該第３セグメントは、（ａ）上記の交代第１セグメント及び第２セグメントの５’末端に隣接しているか、（ｂ）上記の交代第１セグメント及び第２セグメントの３’末端に隣接しているか、又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方に隣接している。一つの態様において、上記修飾オリゴヌクレオチドは、その２’位に修飾を含む。一つの態様において、当該２’修飾は、メトキシ、メトキシエチル、フルオロ及びプロピルアミノ基からなる群から選択される。
【００３１】
一つの態様において、上記のオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡに対してアンチセンスである。
発明は、さらに、系において標的ＲＮＡの翻訳、逆転写及び／又は複製を妨害するか又は低下させる方法を提供し、但し、当該方法は、上記オリゴヌクレオチドに標的ＲＮＡを接触させることを含む。一つの態様において、上記の系は、細胞、組織又は被験対象からなる群から選択される。一つの態様において、細胞、組織又は被験対象は、哺乳類の細胞、組織又は被験対象であり、さらなる態様においては、ヒトの細胞、組織又は被験対象である。
【００３２】
発明は、さらに、系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性ＲＮＡ分割を誘導する方法を提供し、当該方法は、標的ＲＮＡと上記オリゴヌクレオチドを接触させることを含む。一つの態様において、ＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性ＲＮＡ分割は、ウイルスの逆転写酵素に付随したＲＮａｓｅ  Ｈ活性により作用させる。一つの態様において、ウイルスはヒト病原性ウイルスであり、さらなる態様において、ウイルスはＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）及びヘパドナウイルス（例えばＢ型肝炎ウイルス）からなる群から選択される。一つの態様において、ＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割は、原核又は真核オリジンのＲＮａｓｅ  Ｈ酵素に付随したＲＮａｓｅ  Ｈ活性により作用させる。一つの態様において、真核ＲＮａｓｅ  Ｈは哺乳類のＲＮａｓｅ  Ｈであり、さらなる態様において、ヒトＲＮａｓｅ  Ｈ（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ１及びＲＮａｓｅ  Ｈ２）である。
【００３３】
発明は、さらに、系において標的ＲＮＡの翻訳、逆転写及び／又は複製を妨害するか又は低下させる方法及び／又は系において標的ＲＮＡの存在を検出する方法及び／又は系において遺伝子標的を確認する（validating）方法を提供し、当該方法は、
ａ）標的ＲＮＡを上記オリゴヌクレオチドと接触させ；そして
ｂ）標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分割を許容させる
ことを含む。
【００３４】
発明は、さらに、
（ａ）系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を誘導すること；
（ｂ）系において標的ＲＮＡの翻訳を妨害するか又は低下させること；
（ｃ）系において標的ＲＮＡの逆転写を妨害するか又は低下させること；
（ｄ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害するか又は低下させること；
（ｅ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；
（ｆ）系において標的ＲＮＡに相当する遺伝子標的を確認すること；
（ｇ）系において標的ＲＮＡに関連する疾患を予防するか又は治療すること；及び
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択されるプロセスを作用させる方法を提供する。
【００３５】
発明は、さらに、
（ａ）系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を誘導すること；
（ｂ）系において標的ＲＮＡの翻訳を妨害するか又は低下させること；
（ｃ）系において標的ＲＮＡの逆転写を妨害するか又は低下させること；
（ｄ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害するか又は低下させること；
（ｅ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；
（ｆ）系において標的ＲＮＡに相当する遺伝子標的を確認すること；
（ｇ）系において標的ＲＮＡに関連する疾患を予防するか又は治療すること；及び
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択されるプロセスを作用させる方法を提供し、
当該方法は、上記の系に上記オリゴヌクレオチドを導入することを含む。
【００３６】
発明は、さらに、医学用途又は研究用途のための上記オリゴヌクレオチドの用途を提供する。一つの態様において、当該医学用途又は研究用途は、
（ａ）系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を誘導すること；
（ｂ）系において標的ＲＮＡの翻訳を妨害するか又は低下させること；
（ｃ）系において標的ＲＮＡの逆転写を妨害するか又は低下させること；
（ｄ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害するか又は低下させること；
（ｅ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；
（ｆ）系において標的ＲＮＡに相当する遺伝子標的を確認すること；
（ｇ）系において標的ＲＮＡに関連する疾患を予防するか又は治療すること；及び
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される。
【００３７】
発明は、さらに、医薬の製造のための上記オリゴヌクレオチドの用途を提供する。一つの態様において、当該医薬は、
（ａ）系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を誘導すること；
（ｂ）系において標的ＲＮＡの翻訳を妨害するか又は低下させること；
（ｃ）系において標的ＲＮＡの逆転写を妨害するか又は低下させること；
（ｄ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害するか又は低下させること；
（ｅ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；
（ｆ）系において標的ＲＮＡに相当する遺伝子標的を確認すること；
（ｇ）系において標的ＲＮＡに関連する疾患を予防するか又は治療すること；及び
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される用途に関する。
【００３８】
発明は、さらに、上記オリゴヌクレオチドを薬学上受容可能な担体と混合して含む組成物を提供する。一つの態様において、当該組成物は、
（ａ）系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を誘導すること；
（ｂ）系において標的ＲＮＡの翻訳を妨害するか又は低下させること；
（ｃ）系において標的ＲＮＡの逆転写を妨害するか又は低下させること；
（ｄ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害するか又は低下させること；
（ｅ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；
（ｆ）系において標的ＲＮＡに相当する遺伝子標的を確認すること；
（ｇ）系において標的ＲＮＡに関連する疾患を予防するか又は治療すること；及び
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される用途に関する。
【００３９】
発明は、さらに、上記オリゴヌクレオチドをその使用のための指示書と共に含む市販のパッケージを提供する。一つの態様において、当該指示書は、
（ａ）系において標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を誘導すること；
（ｂ）系において標的ＲＮＡの翻訳を妨害するか又は低下させること；
（ｃ）系において標的ＲＮＡの逆転写を妨害するか又は低下させること；
（ｄ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害するか又は低下させること；
（ｅ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；
（ｆ）系において標的ＲＮＡに相当する遺伝子標的を確認すること；
（ｇ）系において標的ＲＮＡに関連する疾患を予防するか又は治療すること；及び
（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される用途に関する。
発明の詳細な説明
発明は、糖−修飾されたヌクレオシド及び２’−デオキシヌクレオシドの交代セグメント（「アルチマー」）を含むオリゴヌクレオシドに関する。一つの態様において、当該オリゴヌクレオシド又はヌクレオシドはリン酸を含み、それにより、それぞれオリゴヌクレオチド又はヌクレオチドになる。
【００４０】
一つの態様において、そのような「アルチマー」は、アラビノヌクレオチド（ＡＮＡ）、例えば２’Ｆ−ＡＮＡ（又はＦＡＮＡ）の変更セグメント及びＤＮＡを含む。本明細書にて使用される「アラビノヌクレオチド」は、アラビノフラノース糖を含むヌクレオチドを意味する。
【００４１】
本明細書にて提示された結果は、（１）標的ＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドの結合親和性及び（２）標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分割を導き出すオリゴヌクレオチドの能力の研究を含む。ホスホジエステル結合された「アルチマー」及びホスホロチオエート結合された「アルチマー」の両方について、本明細書に記載された結果において評価を行った。
【００４２】
従って、発明は、複数の態様において配列特異的様式にて遺伝子発現を選択的に阻害する修飾オリゴヌクレオチドに関する。一つの態様において、発明は、糖−修飾核酸（例えば、アラビノ核酸［例えば、ＦＡＮＡ］）及びＤＮＡの交代セグメント又はユニットを含む短い鎖を使用したアンチセンス戦略によるタンパク質生合成の選択的阻害に関する。各セグメント又はユニットは、一つ又は複数のヌクレオチドを含んでよい。複数の態様において、発明は、糖−修飾核酸及びＤＮＡの交代ユニットを含む修飾オリゴヌクレオチドの、相補な（一つの態様において、完全相補な）ＲＮＡ、例えば細胞メッセンジャーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ等へのハイブリダイズのための使用に関する。別の態様において、発明は、標的ＲＮＡ配列と二重鎖を形成することができる、特定の態様においては修飾された、糖−修飾ヌクレオチド及び２’−デオキシリボヌクレオチドから構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）キメラに関する。一つの態様において、結果のＡＯＮ／ＲＮＡ二重鎖はＲＮａｓｅ  Ｈの基質であり、当該酵素はそのような二重鎖を認識してＲＮＡ標的部分を分解する。ＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性のＲＮＡ標的の分割はアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の主要な機構であると考えられる。
【００４３】
本発明は、糖−修飾ヌクレオチド、例えば修飾ＡＮＡ（例えば２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド［ＦＡＮＡ］）及び２’−デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）の交代ユニット又はセグメントから構築されており、各ユニットが一つ又は複数のそのような残基を含むアンチセンスキメラが、（ａ）天然ＤＮＡ構造及び（ｂ）均一に修飾されたＦＡＮＡオリゴマーに比較して、インビトロにおいてＲＮａｓｅ  Ｈ（例えば、真核ＲＮａｓｅ  Ｈ）の活性を導き出すことに優れているとの予測を越えた驚くべき発見に関する。同様に、本発明は、そのような糖−修飾ヌクレオチド（例えば、アラビノヌクレオチド［例えば、ＦＡＮＡ］）残基をオリゴヌクレオチド鎖へ挿入することにより、オリゴデオキシヌクレオチド（例えばＤＮＡ）のＲＮａｓｅ  Ｈ競合性が改善できることを示す。従って、（修飾された）糖−修飾ヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの交代センス又はユニットを含む発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、様々な医学及び研究の用途のための、治療剤及び／又は細胞及び生物においのて特定の遺伝子発現の研究及び調節のための手段として有用である。発明のオリゴヌクレオチドは、それらの核酸を標的とする能力に基づいて、特定の核あの存在を同定するための診断法及び検出法にも有用である。
【００４４】
本明細書にて使用される「糖−修飾オリゴヌクレオシド」又は「糖−修飾オリゴヌクレオチド」は、それぞれ天然のデオキシリボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオチド、又はそれぞれリボヌクレオシド又はリボヌクレオチドの糖部分に比較して、異なるか又は修飾された構造を有する、それぞれヌクレオシド又はヌクレオチドを意味する。そのような修飾は、限定ではないが、糖の環のコンフォメーションの変化、異なる環構造の置換又は付加、及びあらゆる糖環置換基の修飾（置換、欠失又は付加）を含む。さらなる態様において、そのような糖−修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドはＤＮＡ−様コンフォメーションを採ることができる。本明細書にて使用される「ＤＮＡ−様コンフォメーション」は、上記ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖構造を意味し、そして天然の２’−デオキシリボヌクレオシド又は２’−デオキシリボヌクレオチドの残基のコンフォメーションに似させたコンフォメーションを意味し、即ち、その糖残基がＣ２’−ｅｎｄｏ（南のひだ（pucker））及び／又はＯ４’−ｅｎｄｏ（東のひだ）コンフォメーションを採ることができるものを意味する。アラビノヌクレオチドがそのようなＣ２’−ｅｎｄｏ（南のひだ）及び／又はＯ４’−ｅｎｄｏ（東のひだ）コンフォメーションを採るかもしれないように、アラビノ核酸及びＤＮＡは類似のコンフォメーションの選択物を呈し（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｆｌｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，５６０９；Ｔｒｅｍｐｅ，Ｊ−Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，４８９６；Ｄｅｎｉｓｏｖ，Ａ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１，２９，４２８４）、即ち、複数の態様において、ＡＮＡ及びその誘導体（例えば、ＦＡＮＡ）は本明細書にて定義されたＤＮＡ−様ヌクレオチドの１種である。他のＤＮＡ−様ヌクレオチドは、限定ではないが、アルファ−Ｌ−ＬＮＡ（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１；１２３；７４３１）及びシクロヘキサン核酸（Ｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５）を含む。
【００４５】
複数の態様において、発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合は、限定ではないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート（５’Ｏ−Ｐ（Ｓ）Ｏ−３’Ｏ−，５’Ｓ−Ｐ（Ｏ）Ｏ−３’Ｏ−，及び５’Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｏ−３’Ｓ−）、ホスホロジチオエート、Ｒｐ−ホスホロチオエート、Ｓｐ−ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、メチレン（メチルイミノ）、アミド（３’ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−５’及び３’−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−５’）、メチルホスフォネート、３’−チオフォルムアセタル、（３’Ｓ−ＣＨ２−Ｏ５’）、アミド（３’−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−５’及び３’−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−５’）、メチルホスフォネート、ホスホロアミデート（例えば、５’Ｎ−３’Ｐ）基又はそれのあらゆる組み合わせを含む。ＡＮＡ残基の中の、例えばアラビノース糖の２’−置換基は、限定ではないが、フッ素、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アジド、アジド、−ＣＨ＝ＣＨ２，−Ｃ≡ＣＨ，アルキル（例えば、低級アルキル［例えば、Ｃ１−Ｃ９アルキル］例えばメチル、エチル、プロピル等）、アルコキシ（［例えば、低級アルコキシ、例えばＣ１−Ｃ９アルコキシ］例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ等）及び官能基化されたアルキル（例えば、官能基化された低級アルキル［例えば、２’−ＣＦ３］）及びアルコキシ基（例えば、エチルアミノ、プロピルアミノ及びブチルアミノ基）、及びアルコキシアルキル（例えば、メトキシエチル、エトキシエチル等）基を含む。一つの態様において、アラビノース糖の２’置換基はフッ素であり、そしてアラビノヌクレオチド誘導体は２’Ｆ−ＡＮＡ（又はＦＡＮＡ）である。上記に加えて、アラビノース糖は、カーボサイクリック（４’−ＣＨ２）誘導体（例えば、カーボサイクリックＦＡＮＡ）も含む。複数の態様において、上記糖修飾ヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性（例えば、アルファ−Ｌ−ブロックされた核酸、シクロヘキサン核酸）を導き出す他のバックボーンを含むか、又は電気陰性の２’−酸素原子を各リボースによる（例えば、２’−アルキル−Ｄ−リボース、２’−ＳＣＨ３−Ｄ−リボース）。
【００４６】
出願人は、本明細書において、糖−修飾ヌクレオチド（例えば、ＡＮＡ［例えば、ＦＡＮＡ］）及びＤＮＡ（「アルチマー」）の交代セグメントを含む混合されたバックボーンのＡＯＮが、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ（例えば、ヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩ）分解を導き出すことが可能なことを証明する。特定の「アルチマー」ＡＯＮは即ち交代トリヌクレオチドセグメントを有し、この点に関して特に良好である。
【００４７】
よって、発明のオリゴヌクレオチドは、糖−修飾ヌクレオチド（例えば、アラビノヌクレオチド類似体［例えば、ＦＡＮＡ］）を及び２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）の交代セグメント又はユニットを含む。一つの態様において、上記オリゴヌクレオチドは、糖−修飾ヌクレオチド及び２’−デオキシヌクレオチドのセグメントの各々を少なくとも２つ含み、それにより少なくとも４つの交代セグメントを全部で含む。各交代セグメント又はユニットは１又は多数のヌクレオチドを含んでよい。複数の態様において、ヌクレオチドの数（plurality）は２、３、４、５又は６ヌクレオチドからなってよい。上記オリゴヌクレオチドは複数の態様において奇数又は偶数の数の交代セグメント又はユニットを含んでよい。上記オリゴヌクレオチドは、糖−修飾ヌクレオチド残基又はＤＮＡ残基を含むセグメントにより始まるか及び／又は終結してよい。従って、複数の態様において、発明のオリゴヌクレオチドは以下により表される：
【００４８】
【化１０】
2005522997.tif 000012
式中、Ａ１，Ａ２等の各々は一つ又は複数の糖−修飾ヌクレオチド残基のユニットを表し、そしてＤ１，Ｄ２等の各々は一つ又は複数のＤＮＡ残基を表す。各ユニット中の残基の数は同じであるか又は１ユニットからその他に変更可能である。上記オリゴヌクレオチドは奇数又は偶数のユニットを有してよい。上記オリゴヌクレオチドは、ＡＮＡ−含有ユニット又はＤＮＡ−含有ユニットのいずれかで始まってよい（即ち、その５’末端にある）。上記オリゴヌクレオチドは、ＡＮＡ−含有ユニット又はＤＮＡ−含有ユニットのいずれかで終結してよい（即ち、その３’末端にある）。ユニットの全数は４ほどであってよい（即ち、少なくとも各種類が２ユニット）。
【００４９】
複数の態様において、発明のオリゴヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの「アルチマー」部分は、その５’及び／又は３’末端において（即ち、隣接して）一つ又は複数の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドをさらに含んでよく、限定ではないが、修飾されたリボヌクレオシド又はリボヌクレオチド、例えば２’−修飾されたリボヌクレオシド又はリボヌクレオチド、例えば２’−メトキシＲＮＡ（２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ）又は２’−メトキシエチルＲＮＡ（２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ）を含む。そのような２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ−アルチマー−２’−Ｏｍｅ−ＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドは、本明細書の実施例において記載されるとおり、適当なＲＮＡ標的のＲＮａｓｅ  Ｈ活性を導き出すことができる。
【００５０】
複数の態様において、発明のオリゴヌクレオチドの全長は、約３０又はそれ未満のヌクレオチド残基であり、さらなる態様においては、約８から約２５ヌクレオチド残基である。さらなる態様においては、長さが約９から約２４、約１０から約２３、約１１から約２２、約１２から約２１、約１３から約２０、約１４から約１９、約１５から約１８、又は約１６から約１７のヌクレオチド残基である。一つの態様において、発明のオリゴヌクレオチドの長さは１８ヌクレオチド残基である。
【００５１】
複数の態様において、ＤＮＡ残基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）又はヌクレオチドの塩基又はバックボーンの構造の修飾を含むバージョンの間から選択される塩基の何れかを含んでよい。複数の態様において、ＡＮＡ残基は、アデニン（Ａ）、イノシン（Ｉ）、２，６−ジアミノプリン（２，６−ＤＡＰ）、シトシン（Ｃ）、５−メチルシトシン（５ｍｅＣ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の間から選択される塩基の何れかを含んでよい。
【００５２】
この発明のＡＯＮｓは「標的ＲＮＡ」に相補（特定の態様においては一部相補、そして別の態様においては完全相補）な配列を含む。本明細書にて使用される「ハイブリダイゼーション」は、相補ヌクレオチド間の水素結合を意味する。ＡＯＮとその標的配列の間の相補の程度は可変性であってよく、そして複数の態様において、ＡＯＮは上記のとおりその標的配列に対して完全相補である。十分な特異性を達成するため、即ち、使用される特定の結合条件下で（即ち、インビボ生理条件又はインビトロアッセイ条件）、上記オリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を最少にするためには、ＡＯＮがその標的配列に対して完全に相補であることは必須でないことが認識される。「標的ＲＮＡ」は、ＲＮＡの例えば翻訳、逆転写及び複製を妨害するか又は低下させるための、本発明のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション／結合に関しての標的である、興味のあるＲＮＡ分子を意味する。複数の態様において、そのような妨害及び阻害は標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割の誘導によるから、よって、一つの態様において、発明は標的ＲＮＡを分割する方法を提供し、但し、上記方法は、発明のオリゴヌクレオチドに上記ＲＮＡを接触させることを含む。複数の態様において、そのような分割は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性の助けとなる条件、例えばバッファー手段（例えば、ｐＨ及びイオン強度を調節すること）、温度調節手段、及びＲＮａｓｅ  Ｈ活性の誘導に寄与するかもしれないあらゆる他の成分を付加的に提供することによりさらに促進してよい。特定の複数の態様において、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素か又は複数機能の酵素（例えば、ＨＩＶの逆転写酵素）のものである。特定の態様において、そのようなＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、限定ではないが、ヒト病原ウイルス、例えばＨＩＶ（例えば、レトロウイルスＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）及びヘパドナウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルスに付随したＲＮａｓｅ  Ｈ活性を含む。複数の態様において、そのようなＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、限定ではないが、原核又は真核オリジン、一つの態様においては哺乳類オリジンの、一つの態様においてはヒトオリジンのＲＮａｓｅ  Ｈ酵素に付随したＲＮａｓｅ  Ｈ活性を含む。さらなる態様において、そのようなＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、限定ではないが、原核又は真核オリジンのＲＮａｓｅ  Ｈ１及びＲＮａｓｅ  Ｈ２（時にはＲＮａｓｅ  ＨＩＩと呼ばれる）に付随したＲＮａｓｅ  Ｈ活性を含む。
【００５３】
複数の態様において、上記のＲＮＡは、上記オリゴヌクレオチドが、それぞれｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の生合成を特異的に阻害できるか、又はウイルスの複製を阻害できるように、メッセンジャーＲＮＡ、又はウイルスゲノミックＲＮＡを含む。それらのアンチセンス特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性）を増強するための５’及び／又は３’末端、又はリン酸バックボーン又は糖残基へ向けられたオリゴヌクレオチドの部分的な修飾は、発明の範囲内である。この発明において証明されるとおり（下記参照）、これらのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス治療のための要件の一つを満たし、即ち、それらは標的ＲＮＡに結合してＡＯＮ／ＲＮＡ二重鎖を形成することができ、一つの態様においては、ＲＮａｓｅ  Ｈにより認識されて分解される。さらに、以下の実施例において示すとおり、発明の「アルチマー」オリゴヌクレオチドがＲＮＡ分割を促進する効率は、ＦＡＮＡのみを含むＡＯＮにより観察される効率よりも優れており、そしていくつかの場合にはＤＮＡ残基のみを含むＡＯＮにより観察される効率よりも優れている。これは、「アルチマー」のヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合であるか又はホスホロチオエート結合であるかの真実を支える。
【００５４】
よって、本明細書にて提示される結果は、発明の「アルチマー」−含有オリゴヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドが複数の態様においてアンチセンス剤として使用可能であり、そして治療剤として及び／又は細胞及び生物において遺伝子発現を研究及び調節するための貴重な手段として作用するべきであることを確証する。
【００５５】
そうして、別の態様においては、発明は、標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の分解を誘導するか、及び又は翻訳を阻害する（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を誘導することにより、及び／又は「翻訳停止」を起こさせるか又はブロックすることにより）ために結合するアンチセンス分子を提供する。引用により本明細書に編入される、治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドの応用の例は、１９９２年８月４日に発行された米国特許第５，１３５，９１７号；１９９２年３月２４日に発行された米国特許第５，０９８，８９０号；１９９２年２月１１日に発行された米国特許第５，０８７，６１７号；１９９２年１１月２４日に発行された米国特許第５，１６６，１９５号；１９９１年４月２日に発行された米国特許第５，００４，８１０号；１９９３年３月１６日に発行された米国特許第５，１９４，４２８号；１９８９年２月２１日に発行された米国特許第４，８０６，４６３号；１９９４年２月１５日に発行された米国特許第５，２８６，７１７号；米国特許第５，２７６，０１９号；米国特許第５，２６４，４２３号；ＢｉｏＷｏｒｌｄ  Ｔｏｄａｙ，Ａｐｒ．２９，１９９４，ｐ．３を含む。
【００５６】
好ましくは、アンチセンス分子には、特定の結合が望まれるような条件、例えばインビボアッセイ又は治療処置の場合又はインビトロアッセイの場合の生理条件、又はアッセイが実施される条件下で、非標的配列へのアンチセンス分子の非特異的結合を回避するように、標的ＲＮＡに対して十分な程度の相補性が存在する。アンチセンス標的のたの標的ＲＮＡは、蛋白質をコードする情報のみならず、例えば、５’非翻訳領域、３’−非翻訳領域、５’キャップ領域及びイントロン／エクソン接合リボヌクレオチドを形成する関連のリボヌクレオチドを含んでよい。発明のＰＬＡ２阻害剤のような分子を提供するために使用されるかもしれないアンチセンス及びリボザイム核酸をスクリーニングする方法は、米国特許第５，９３２，４３５号に開示されている。
【００５７】
発明のアンチセンス分子（オリゴヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド）は、糖間のバックボーン結合、例えば、ホスホトリエステル、メチルホスフォネート、３’−チオフォルムアセタル、アミド、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子又はヘテロサイクリック糖間結合、ホスホロチオエート及びＣＨ２−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２，ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩバックボーンとしても知られる）、ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２，ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２及びＯ−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２バックボーン（ホスホジエステルはＯ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−−ＣＨ２）を含むものを含んでよい。別の態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ，時には「蛋白質」又は「ペプチド」核酸と呼ばれる）を有してよく、オリゴヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンがポリアミドバックボーンに置き換わってよく、ヌクレオシド性塩基は直接又は間接にポリアミドバックボーン中のアザ窒素原子又はメチレン基に結合する（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５４，１４９７及び米国特許第５，５３９，０８２号）。ホスホジエステル結合はキラルであって鏡像特異的な構造に置き換わってよい。
【００５８】
上記のとおり、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド塩基を含む種を含んでもよい。即ち、自然界に通常見いだされるもの以外のプリン及びピリミジンを使用してよい。上記のとおり、糖−修飾ヌクレオチドセグメント（例えば、ＡＮＡセグメント）のヌクレオチドはそのペントフラノシル部分の上に修飾を含んでよい。そのような修飾の例は、２’−Ｏ−アルキル−及び２’−ハロゲン−置換されたヌクレオチドである。本発明において有用な糖部分の２’位の修飾のいくつかの特定の例は、ＯＨ，ＳＨ，ＳＣＨ３，Ｆ，ＯＣＮ，Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２又はＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３であり、式中、ｎは１から１０；Ｃ１からＣ１０の低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル又はアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；Ｏ−Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−Ｓ−，又はＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；ＲＮＡ分割基；リポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬動力学特性を改善する基；又はオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基及び類似の特性を有する他の置換基である。糖−修飾ヌクレオチドセグメントのヌクレオチドの一つ又は複数のペントフラノシル基は、別の糖によるか、糖模倣物、例えばシクロブチルによるか又は糖の位置に配置される別の部分により置き換わってよい。
【００５９】
「ヌクレオシド」は、糖（例えば、［デオキシ］リボース、アラビノース及び誘導体）と化合された塩基（例えば、プリン［Ａ及びＧ］又はピリミジン［例えば、Ｃ，５−メチル−Ｃ，Ｔ及びＵ］を意味する。「ヌクレオチド」は、その糖部分に結合したリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。複数の態様において、これらの構造は、例えば、塩基、糖及び／又はリン酸部分の何れかの中に様々な修飾を含んでよい。本明細書において使用される「修飾されたヌクレオチド／ヌクレオシド」は、定義された天然形態とは異なり、即ち定義された天然形態を除外するヌクレオチド／ヌクレオシドを意味する。本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」は、共に連結された多数のヌクレオチドを含む配列を意味する。オリゴヌクレオチドは、そのバックボーン構造の中及び／又はその成分のヌクレオチドのような一つ又は複数の中に、修飾された構造を含んでよい。複数の態様において、発明のオリゴヌクレオチドは、約１から約２００塩基の長さ、さらなる態様においては約５から約５０塩基、約８から約４０塩基、そしてまたさらなる態様においては約１２から約２５塩基の長さである。
【００６０】
「アルキル」は、直鎖及び分枝鎖の飽和炭化水素基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル等）を意味する。「アルケニル」及び「アルキニル」は、少なくとも一つのそれぞれＣ−Ｃ二重結合及び一つのＣ−Ｃ三重結合を有する炭化水素を意味する。「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル構造を意味する。「アリル」は、置換されたか又は未置換の芳香族環状構造（例えば、フェニル、ナフチル、アンスラシル、フェナンスリル、ピレニル、及びキシリル基）を意味する。「ヘテロ」はＣ以外の原子を意味し；限定ではないが、Ｎ，Ｏ，又はＳを含む。複数の態様において、上記の基は置換されていてよい。
【００６１】
従って、様々な態様において、発明の修飾されたオリゴヌクレオチドは、治療用に製剤中で使用されるか又は医薬中で使用されることにより、特定の標的ＲＮＡの発現により特徴付けされる疾患を予防するか又は治療してよい。特定の態様において、そのような標的核酸は感染病原体の中に含まれるか又は感染病原体に由来し、及び／又は感染病原体の機能及び／又は生存性及び／又は複製／増殖に必要である。特定の態様において、そのような感染病原体はウイルスであり、特定の態様においてはレトロウイルス、さらなる態様においてはＨＩＶである。さらなる態様において、そのような標的核酸の発現は、限定ではないが炎症性疾患、糖尿病、心臓血管系疾患（例えば、再狭窄（restinosis））及び癌を含む疾患に付随する。発明は、医学治療の対応する方法を提供し、治療用量の発明の修飾オリゴヌクレオチドを薬理学上受容可能な製剤にて投与する。従って、発明は、発明の修飾オリゴヌクレオチド及び薬理学上受容可能な賦形剤又は担体を含む治療用組成物も提供する。当該治療用組成物は生理学上受容可能なｐＨにおいて水性溶液に溶解性であってよい。
【００６２】
一つの態様において、そのような組成物は、特定の標的核酸の発現により特徴付けされる疾患を治療又は予防するために十分な治療上又は予防上有効な量の発明のオリゴヌクレオチド、及び薬学上受容可能な担体を含む。
【００６３】
「治療上有効な量」は、特定の標的核酸の発現の低下又は妨害のような、所望の治療上の結果を達成するための、必要な用量及び期間において、有効な量を意味する。発明の修飾核酸の治療上有効な量は、個体の疾患の状態、年齢、性別及び体重のような因子、及び個体において所望の応答を導き出す修飾核酸の能力に従い、変更してよい。用量の管理は最適な治療反応を提供するように適合させてよい。治療上有効な量は化合物のあらゆる毒性又は有害な作用よりも治療上有益な作用がまさる量でもある。「予防上有効な量」は、特定の標的核酸の発現の妨害のような、所望の予防上の結果を達成するための、必要な用量及び期間においての、有効な量を意味する。発明の修飾核酸の予防上有効な量は、治療上有効な量に関して上記のとおりに決定することができる。任意の特定の個体に関しては、特定の用量管理を、個体の要求及び組成物の投与を執行するか又は指揮する人の専門的判断に従い、時間をかけて適合させてよい。
【００６４】
本明細書において使用される「薬学上受容可能な担体」又は「賦形剤」は、あらゆる全ての溶剤、分散媒体、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張性吸収遅延剤、及び生理学上適合可能なようなものを含む。一つの態様において、担体は、非経口投与に適している。あるいは、担体は、静脈内、腹膜内、筋肉内、舌下又は経口投与に適当であり得る。薬学上受容可能な担体は、無菌の注射可能溶液及び分散液の即席の調製のための、滅菌水性溶液又は分散液及び滅菌粉末を含む。薬学上活性な物質のためのそのような媒体及び薬品の使用は、当業界においてよく知られている。何れかの慣用の媒体又は薬品が上記活性化合物と不適合である限り以外、発明の薬学組成物中でのその使用が意図される。付加的な活性化合物も上記組成物に入れることができる。
【００６５】
治療用組成物は典型的には無菌であり、そして製造及び保存の条件下で安定でなければならない。上記組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬剤濃度に適した他の規則正しい構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール。ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及び適当なそれらの混合物を含む溶剤又は分散媒体であり得る。例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により、適当な流動性が保持され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを上記組成物中に含むことが好ましくなる。注射可能な組成物の延期された吸収は、当該組成物中に吸収を遅らせる薬品、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを含ませることにより遂行することができる。さらに、発明のオリゴヌクレオチドは、時間放出製剤、例えばスローリリースポリマーを含む組成物中にて投与することができる。修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドを素早い放出に対して防御する担体を用いて調製することができ、例えば制御された放出製剤であり、移植物及びマイクロ封入デリバリー系を含む。生物分解性及び生物適合性のポリマーを使用することができ、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸及びポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）である。そのような製剤の製造の方法の多くは特許されており、当業者には一般的である。
【００６６】
無菌の注射可能な溶液は、活性化合物、例えば発明のオリゴヌクレオチドを必要な量にて、適当な溶剤中で、単独又は必要なら上記の列挙された成分との混合物を取り込み、続く濾過滅菌により製造することができる。一般に、分散液は、上記活性化合物を、塩基性分散媒体（medium）及び上で列挙された必要とされる他の成分を含む無菌媒体（vehicle）に混ぜることにより、調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製のための好ましい方法は、真空乾燥、及び活性成分の粉末プラス予め滅菌されて濾過されたその溶液からの任意の追加の所望の成分を生じる凍結乾燥である。発明の別の側面によれば、発明のオリゴヌクレオチドを、その溶解性を増強する一つ又は複数の追加の化合物と共に製剤化してよい。
【００６７】
発明のオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性分割を誘導することができるため、即ち、標的ＲＮＡによりコードされる蛋白質の生産を低下させるため、発明の修飾されたオリゴヌクレオチドは、特定の標的ＲＮＡの選択的不活性化又は阻害が望まれるあらゆる系において使用してよい。上記のとおり、そのような使用の例はアンチセンス治療剤を含み、標的ＲＮＡの発現が病気又は疾患と関連する場合である。
【００６８】
そのような使用の別の例は、系における特定の標的遺伝子産物の選択的消耗（depletion）により、系におけるそのような消耗の表現型上の効果を研究することである。そのような所望の研究によりなされた観察は、即ち、標的遺伝子産物の機能の決定を可能にさせるかもしれない。特定の態様において、そのような使用は「標的確認（validation）」を含み、上記の戦略により、特定の標的核酸が特定の表現型又は活性と関連するか否かの確認を可能にさせ、即ち、標的の「確認」を可能にする。上記の系は、細胞又は細胞フリー；インビトロ又はインビボ；原核又は真核であってよい。
【００６９】
発明は、さらに、発明のオリゴヌクレオチドを含む市販のパッケージを提供する。一つの態様において、市販パッケージは、さらにオリゴヌクレオチドの用途の指示書を含む。特定の態様において、用途に関するそのような指示書は以下の少なくとも一つを含む：（ａ）標的ＲＮＡ配列の発現を低下させること；（ｂ）標的ＲＮＡ配列のＲＮａｓｅ  Ｈの分割を誘導すること；（ｃ）特定のＲＮＡ標的の発現により特徴付けされる疾患を予防又は治療すること；（ｄ）；系において標的ＲＮＡの逆転写を低下させること；（ｅ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害又は低下させること；（ｆ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；（ｇ）系において遺伝子標的を確認すること；及び（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせのためのオリゴヌクレオチドの用途。
【００７０】
発明は、さらに、（ａ）標的ＲＮＡ配列の発現を低下させること；（ｂ）標的ＲＮＡ配列のＲＮａｓｅ  Ｈの分割を誘導すること；（ｃ）特定のＲＮＡ標的の発現により特徴付けされる疾患を予防又は治療すること；（ｄ）；系において標的ＲＮＡの逆転写を低下させること；（ｅ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害又は低下させること；（ｆ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；（ｇ）系において遺伝子標的を確認すること；及び（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせのような、発明のオリゴヌクレオチドの用途を提供する。
【００７１】
発明は、さらに、（ａ）標的ＲＮＡ配列の発現を低下させること；（ｂ）標的ＲＮＡ配列のＲＮａｓｅ  Ｈの分割を誘導すること；（ｃ）特定のＲＮＡ標的の発現により特徴付けされる疾患を予防又は治療すること；（ｄ）；系において標的ＲＮＡの逆転写を低下させること；（ｅ）系において標的ＲＮＡの複製を妨害又は低下させること；（ｆ）系において標的ＲＮＡの存在を検出すること；（ｇ）系において遺伝子標的を確認すること；及び（ｈ）（ａ）から（ｇ）のあらゆる組み合わせのような、医薬の製造のための発明のオリゴヌクレオチドの用途を提供する。
【００７２】
発明の様々な態様が本明細書において開示されるが、多くの適合及び修飾が発明の範囲内で当業者の共通の一般的知識に従いなされてよい。そのような修飾は、実質的に同じ様式にて同じ結果を達成するための発明のあらゆる側面の公知の均等物の置換物を含む。数値の範囲は範囲を限定する数を含む。請求の範囲において、用語「含む（comprising）」は、オープンエンドの用語として使用され、句「限定ではないが含む（including，but not limited to）」と実質上均等である。以下の実施例は発明の様々な側面の例示であり、本明細書に開示された発明の広い側面を限定するこのではない。
実施例
実施例１：材料と方法
ＡＯＮｓの合成。５’−モノメトキシトリチル化２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオシド３’−Ｏ−シアノエチルホスホルアミダイトモノマーを、以前に記載されたとおりに合成した［Ｗｉｌｄｓ，Ｃ．Ｊ．＆  Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０００，２８，３６２５；Ｅｌｚａｇｈｅｉｄ，Ｍ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｔ  １．７，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｄ．Ｅ．，Ｇｌｉ，Ｇ．Ｄ．，Ｅｄｓ．，２００２］。表１及び２に示すオリゴヌクレオチドの合成は、１−マイクロモルスケールにて、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  ＤＮＡ−合成機を用いて合成した。長鎖のアルキルアミン制御された孔性ガラス（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）を固相支持体として使用した。合成サイクルは以下の工程からなった：（ａ）ＣＰＧ（３％トリクロロ酢酸／ジクロロメタン）に結合したヌクレオシド／ヌクレオチドの脱トリチル化：１５０秒；（ｂ）２’−Ｆ−アラビノヌクレオシドのカップリング（１５分）又は２’−デオキシリボヌクレオシド３’−ホスホルアミダイト（２分）モノマーのカップリング。使用されたモノマーの濃度は、ａｒａＦ−Ｔ，ａｒａＦ−Ｃ及びＤＮＡモノマーに関して５０ｍｇ／ｍＬ、そしてａｒａＡ及びａｒａＦ−Ｇに関して６０ｍｇ／ｍＬであった（溶剤としてアセトニトリル）；標準キャッピング工程を用いたアセチル化：２０秒。キャッピング溶液は「キャップＡ」及び「キャップＢ」試薬の１：１（ｖ／ｖ）からなった（キャップＡ：無水酢酸／コリジン／ＴＨＦ，１：１：８；キャップＢ：Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ．４：２１）；（ｄ）アセトニトリルを用いた大規模な洗浄（５０パルス）；（ｅ）２０秒のヨウ素／水酸化（ホスホジエステル結合オリゴマーの場合）又はピリジン／アセトニトリル（１／１，ｖ／ｖ）中の０．１Ｍの３−アミノ−１，２，４−ジチアゾリン−５−チオン（ＡＤＴＴ）による１０分の硫化（ＰＳ−オリゴマーの場合）；（ｆ）アセトニトリルによる洗浄：２０パルス；（ｇ）キャッピング試薬の添加による固相支持体の乾燥（上記工程ｃを参照）：５秒；（ｈ）アセトニトリルによる洗浄（２０パルス）。
【００７３】
鎖のアッセンブリーに続き、オリゴヌクレオチドを固相指示体から分割し、そして以前に記載されたとおりに脱保護した［Ｗｉｌｄｓ，Ｃ．Ｊ．＆  Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０００，２８，３６２５；Ｖｉａｚｏｖｋｉｎａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｔ  ４．１５，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｄ．Ｅ．，Ｇｌｉ，Ｇ．Ｄ．，Ｅｄｓ．，２００２］。粗オリゴマーをアニオン−交換ＨＰＬＣにより精製し、続いて脱塩した（ＳｅｐＰａｋカートリッジ）。収量：５０−１００Ａ２６０ユニット。ＨＰＬＣ精製の条件は、カラム：プロテインＰａｋ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ（７．５ｍｍ  ｘ  ７．５ｃｍ，Ｗａｔｅｒｓ）、溶剤：バッファーＡ：Ｈ２Ｏ；バッファーＢ：１Ｍ  ＬｉＣｌＯ４（又はＮａＣｌＯ４）、勾配：１００％バッファーＡイソクラチック１２分間、１００％Ａ−１５％Ｂ、直線（５分以上）、１５％Ｂ−５５％Ｂ，直線（６０分以上）；流速は１ｍｌ／分に設定し、温度は５０℃に調節した。検出器は分析用には２６０ｎｍに設定し、そして準備用クロマトグラフィーには２９０ｎｍに設定した。これらの条件下において、所望の完全長のオリゴマーを最後に溶離した。オリゴヌクレオチドはゲル電気泳動及び質量分析により特性決定した。使用されたオリゴヌクレオチドの配列は表１及び２に提供される。
【００７４】
Ｔｍ温度。ＡＯＮ及び相補標的ＲＮＡオリゴヌクレオチドを等モル比にて１４０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，及び５ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４バッファー、ｐＨ７．２中で混合することにより、計算値５μＭの全二重鎖濃度を提供した。サンプルを９０℃にて１５分間加熱し、次に、ゆっくりと室温まで冷却した。ＡＯＮ／ＲＮＡ二重鎖溶液を次に温度を増加させて暴露し（０．５℃／測定）、そして２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収を温度平衡化の後に測定した。表１及び２に提供されたＴｍ値は、基底ライン法を用いて計算し、そして±０．５℃の不確実性を有する。
【００７５】
ＲＮａｓｅ  Ｈの精製。エシェリヒアコリのＲＮａｓｅ  ＨＩを以前に記載されたとおりに（７）精製した。以下に公表された手法（Ｗｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４，２８２７０）を用いて、ヒトのＲＮａｓｅ  ＨＩＩを過剰発現させて、精製した。
【００７６】
ＲＮａｓｅ  Ｈアッセイ。ＲＮａｓｅ  Ｈアッセイは、室温において（≒２０℃）（表１に示すホモポリマーオリゴヌクレオチド）、又は３７℃において（表２に示すミックスされた塩基のオリゴヌクレオチド）実施した。ホモポリマー核酸二重鎖基質は、ホスホジエステル結合したＡＯＮ（２ｐｍｏｌ）を、６０ｍＭ  ＫＣｌ及び２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む１０μｌの６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）中の５’−３２Ｐ標識された相補標的オリゴ−ｒＡ１８のＲＮＡ（０．５ｐｍｏｌ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）と混合して、次に９０℃において２分間加熱し、そしてゆっくりと室温まで冷やすことにより、調製した。二重鎖基質溶液は、使用の前に室温において少なくとも１時間放置させた。反応は、ＲＮａｓｅ  Ｈ（２μＬのバッファー中７ｎｇの酵素）の添加により開始して、アリコートを様々な時間において取り出し、そして、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍｇ／ｍＬブロムフェノールブルー及び１ｍｇ／ｍＬキシレンシアノールを含む９８％脱イオン化されたホルムアルデヒドを等量添加することにより停止させた。１００℃において５分間加熱後に、反応生成物を、７Ｍ尿素を含む１６％のポリアクリルアミドゲル配列決定ゲル上での電気泳動により解析して、オートラジオグラフにより可視化し、そして生成物の形成をデンシトメトリーにより定量した。
【００７７】
混合された塩基組成のＡＯＮ／ＲＮＡハイブリッドは、ホスホロチオエートＡＯＮ鎖（表２に掲載されたオリゴマーを参照）と、対応する５’−放射性標識された標的ＲＮＡ（ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＵＡＣ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＧＡＵ  ＡＵＡ  Ａ）［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２］を混合することにより、調製した。このＲＮＡを３２Ｐにより［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを用いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’−末端標識した。２０ピコモル（２０ｐｍｏｌ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び１０ｐｍｏｌの５’−３２Ｐ−標識ＲＮＡを、６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．８），６０ｍＭ  ＫＣｌ，２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むバッファー（最終１００μｌ）中で混合し、そして９０℃において５分間加熱し、そして室温に冷却した。反応を開始するため、ヒトＲＮａｓｅ  Ｈ（２μｌのバッファー中に５ｎｇ）を、上記基質溶液８μｌに加えた。３７℃においてインキュベート後に、等量の変性負荷バッファー（９８％脱イオン化されたホルムアルデヒド、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍｇ／ｍＬブロムフェノールブルー及び１ｍｇ／ｍＬキシレンシアノール）を加えることにより、反応を停止した。生成物を、Ｔｒｉｓ−硼酸／ＥＤＴＡバッファー中で、変性１６％ゲル（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上で、２０００Ｖにて約２時間で分離した。電気泳動後に、ゲルをＸ線フィルムに暴露して、結果のオートラジオグラムをスキャンして定量した。
ルシフェラーゼアッセイ。ＨｅＬａ  Ｘ１／５細胞（ルシフェラーゼ遺伝子により安定にトランスフェクトされて機能するルシフェラーゼ酵素を発現する）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を付加したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞を９６−ウエルプレート中で２ｘ１０４細胞／ウエルにて植えた。アンチセンス実験は、植えてから２４時間後に実施し、そのとき細胞は８０％コンフルエントであった。アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に送達させるために、リポフェクチンを使用した。簡単に言えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリポフェクチンを血清を含まないＤＭＥＭにより希釈することにより、１０ｘの最終濃度のアンチセンス及び５０μｇ／ｍＬのリポフェクチンを提供した。等容量のオリゴヌクレオチド及びリポフェクチン溶液をプラスチックチューブの中で混合して、１５分間室温においてインキュベートすることにより、複合体形成を許容した。この複合体形成を、１０％ＦＢＳを含むにより５倍に希釈し、次に、細胞培養培地をこの混合物により置き換え、細胞を室温において４時間３７℃においてインキュベートした。アンチセンス／リポフェクチン混合物を細胞から取り出して、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにより置き換えて、次に細胞をさらに１６時間、３７℃においてインキュベートした。この追加の１６時間インキュベーションの後に、細胞のルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示プロトコルに従い評価した。簡単に言えば、培養培地を除去し、細胞をリン酸緩衝塩溶液により洗浄し、そして次に細胞を溶解した。細胞溶解物のアリコートをアッセイマイクロプレートに移し、ルシフェラーゼ基質溶液を加え、そして結果の発光をすぐにＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＧＥＭＩＮＩ  ＸＳマイクロプレート分光蛍光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を発光読取りモードに設定して、測定した。
実施例２：アルチマー：ＲＮＡ二重鎖の安定性
出願人は、本明細書において、ＡＮＡ／ＤＮＡ（例えば、ＦＡＮＡ／ＤＮＡ）「アルチマー」オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡと二重鎖を形成することを証明し（表１及び２）そしてこれらのＡＯＮキメラの融解温度がＦＡＮＡ含有量と直接相関することを証明する。以前の研究は、２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ  ＡＯＮも、標的ＲＮＡに、対応するＤＮＡ  ＡＯＮよりも高い親和性をもって結合することが示された。しかしながら、混合されたバックボーンの２’−Ｏｍｅ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ＡＯＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ：８−１０）は、全細胞ＤＮＡ  ＡＯＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に比較して、標的ＲＮＡに関して同じか又は低い熱結合親和性しか示さなかった。
【００７８】
【表１】
2005522997.tif 000013
実施例３：発明のＡＯＮが標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を導き出す能力
混合されたバックボーンのＡＯＮによる研究は、インビトロにおいてこれらのＡＯＮが標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を導き出す能力は、細胞内の遺伝子発現を阻害するこれらＡＯＮの能力の予言であることを示唆する（Ｍｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３，２６８，１４５１４；Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７，３６，７４３；Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｗ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １９９９，９６，３５１３）。出願人は、よって、エシェリヒアコリのＲＮａｓｅ  ＨＩ及びヒトのＲＮａｓｅ  ＨＩＩの基質として相補ＲＮＡに結合した表１に掲載された様々なＡＯＮの二重鎖を評価した。図２は、全てのＡＯＮ／ＤＮＡキメラがヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩによる標的ＲＮＡ分割を誘導したことを示す。ＲＮａｓｅ  Ｈ分割は、ＦＡＮＡバックグラウンド内の交代ＤＮＡセグメントのサイズが増加するにつれて、有効に増加した。最適な活性はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の場合に示され、ＦＡＮＡ及びＤＮＡの交代トリヌクレオチドセグメントを含む。この「アルチマー」ＡＯＮが標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  ＨＩＩ分解を導き出す能力は、均等な全−ＤＮＡのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のそれよりも顕著に優れていた。さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のこの特性は、ＦＡＮＡ／ＤＮＡ／ＦＡＮＡ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に関して改善された（図３）。
【００７９】
ＦＡＮＡ及びＤＮＡからなった「アルチマー」ＡＯＮとは違い、２’−Ｏ−メチルＲＮＡとＤＮＡからなった類似のＡＯＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：８及び９）は、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を導き出す能力に関して貧困でしかなかった（図３）。
実施例４：アンチセンスオリゴヌクレオチドのルシフェラーゼ発現に対する効果
上記のとおりに、様々なオリゴヌクレオチドを調製して、ルシフェラーゼ−コードする標的ＲＮＡに対する結合に関して特性決定し、そしてルシフェラーゼ発現に対するそれらの効果に関してアッセイした。結果を表２に提示する。以下に示す「スクランブルされた」及び「ミスマッチ」対照を除いて、ＦＡＮＡ／ＤＮＡ交代セグメントを含む全てのオリゴヌクレオチドはルシフェラーゼ活性の顕著な阻害を呈した。そのような阻害は３−ヌクレオチド交代セグメントのオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）により最大とはならなかったが、周囲の２’−メトキシＲＮＡヌクレオチドをＦＡＮＡ／ＤＮＡ交代オリゴヌクレオチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１５及び１６）に添加した場合にもそれは観察された。ＦＡＮＡ／ＤＮＡ交代セグメントを含むオリゴヌクレオチドは、非オリゴヌクレオチドの対照に比較すると極めて下限に近いレベルを呈したに過ぎなかった純粋なＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）又は２’−メトキシＲＮＡ−ＤＮＡ−２’−メトキシＲＮＡ「ギャップマー」オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）に比較すると、この点では優秀であった。
【００８０】
【表２】
2005522997.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮｓ）中で利用される特定のヌクレオチド成分の例の構造。
【図２】発明の特定の態様に従う様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドと二重鎖形成されたＲＮＡのヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩ媒介性分割。（Ａ）．３２Ｐ−標識された標的ＲＮＡの分割産物の電気泳動分析。ＡＯＮ／５’−［３２Ｐ］−ＲＮＡ二重鎖を室温においてヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩとインキュベートし、そしてアリコートを０、５、１０、及び２０分目に採り、電気泳動し、そして反応産物をオートラジオグラフにより可視化した。（Ｂ）．反応時間の函数としての残余の完全長の５’−［３２Ｐ］−標的。Ａに示すオートラジオグラムの濃度計分析によりデータを得た。
【図３】発明の特定の態様に従った、表１に掲載した様々なＡＯＮが標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を誘導する能力。ＡＯＮ／５’−［３２Ｐ］−ＲＮＡ二重鎖をヒトＲＮａｓｅ  Ｈｉｉ（黒い棒）又はエシェリヒアコリのＲＮａｓｅ  ＨＩ（影の棒）と、１０分間室温においてインキュベートし、そして反応混合物を電気泳動により解析して、オートラジオグラフにより可視化し、そして完全ＲＮＡの損失を濃度計により定量した。全ての２’Ｆ−ＡＮＡ  ＡＯＮ  ２に関して観察されたものを１００％として値を平均化した。
【配列表】
2005522997.tif 000015
2005522997.tif 000016
2005522997.tif 000017
2005522997.tif 000018
2005522997.tif 000019
2005522997.tif 000020
2005522997.tif 000021
2005522997.tif 000022
【図１】
2005522997.tif 000032
【図２】
2005522997.tif 000033
【図３】
2005522997.tif 000034
【国際調査報告】
2005522997.tif 000035
2005522997.tif 000036
2005522997.tif 000037