(57)【要約】【課題】  本発明は，副作用の少ない，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物での他家の免疫機能の強化剤，特に動物新生子の虚弱症候群を治療するための剤を提供する。【解決手段】  上記の課題は，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物の組織由来の活性化リンパ球を有効成分として含む，動物と同種であり他家動物の免疫機能の強化剤により解決される。本発明は，動物から分離されたリンパ球を増殖及び活性化し活性化リンパ球を得る他家動物の免疫機能の強化剤の製造方法をも提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを除く哺乳動物の組織由来の活性化リンパ球を有効成分として含む，前記動物と同種であり他家動物の免疫機能の強化剤。
【請求項２】
前記動物の組織由来の活性化リンパ球が，インターロイキン−２及び抗ＣＤ３抗体のいずれか又は両方により活性化された活性化リンパ球である，請求項１に記載の剤。
【請求項３】
前記ヒトを除く哺乳動物が，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しないヒトを除く哺乳動物である，請求項1に記載の剤。
【請求項４】
前記ヒトを除く哺乳動物が，ウシ又はウマである，請求項１に記載の剤。
【請求項５】
請求項１に記載の剤であって，
前記動物の新生子の虚弱症候群を治療するための剤として用いられる剤。
【請求項６】
前記虚弱症候群が感染症を含む，請求項５に記載の剤。
【請求項７】
ヒトを除く哺乳動物からリンパ球を分離する工程と，
分離されたリンパ球を増殖及び活性化し活性化リンパ球を得る工程と，
得られた活性化リンパ球を用いて製剤する工程と
を含む，
他家動物の免疫機能の強化剤の製造方法。
【請求項８】
前記活性化リンパ球を得る工程が，
インターロイキン−２及び抗ＣＤ３抗体のいずれか又は両方の存在下に分離されたリンパ球を培養する工程を含む，
請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記動物がウシであり，活性化リンパ球を得る工程が，抗ウシＣＤ３抗体の存在下に分離されたリンパ球を培養する工程を含み，
前記抗ウシＣＤ３抗体が，ＩｇＧ１型の抗体である，
請求項７に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記他家動物の免疫機能の強化剤が，
前記動物と同種であり他家新生子の虚弱症候群を治療するための，前記動物の新生虚弱子症候群の治療剤である，
請求項７に記載の製造方法。
【請求項１１】
ヒトを除く哺乳動物から分離され，増殖及び活性化されたリンパ球を前記動物と同種であり他家の動物に投与する工程を含む，
前記動物の免疫機能強化方法。
【請求項１２】
前記リンパ球を投与する工程は，前記動物の新生子に増殖及び活性化されたリンパ球を投与する工程である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンパ球を投与する工程は，生後直後から１年以下の前記動物に増殖及び活性化されたリンパ球を投与する工程である請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，免疫機能の強化剤に関する。より詳しく説明すると，本発明は，他家由来の活性化リンパ球を含む，ヒトを除く哺乳動物の免疫機能の強化剤，ヒトを除く哺乳動物の新生虚弱子症候群の治療剤，及びこれらの剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシやウマに代表される草食動物は，胎子期に，抗体や免疫細胞などの免疫物質を,胎盤を介して母畜から受け取ることができない。このため，これらの動物の新生子は免疫機能が弱く，新生虚弱子症候群に罹患するケースがある。これらの動物の新生子は，通常，初乳を介して抗体や免疫細胞などの免疫物質を摂取し，これにより新生子自身の免疫細胞の機能を促進する。しかしながら，新生虚弱子症候群に罹患した新生子は初乳の吸収率が低いため，感染症に罹患しやすいほか，重篤な場合は死に至ることもある。さらに，家畜には初乳を介して感染し重篤な病状を招く伝染病が存在するため，感染予防を目的に生産現場では母牛から新生子に対して直接生初乳を与えず，免疫細胞が含まれず免疫性に劣る加工初乳を給与して対処することも少なくない。【０００３】
ヒトやイヌ及びネコを含む小動物の癌の免疫療法の一つとして，活性化リンパ球療法が知られている。活性化リンパ球療法は，自己の末梢血リンパ球を体外で活性化及び増幅し，再び自己の体内へ戻すものである。【０００４】
また，特開２００４−２３１２号公報（特許文献１）には，ＨＬＡ（ヒト白血球型抗原）が一致する他人由来の活性化リンパ球を含む製剤が開示されている。この製剤は，活性化リンパ球を含むため，自己免疫疾患の予防及び治療に有効であるとされている。【０００５】
しかしながら，ヒト以外の動物の免疫機能を強化するための剤や新生子虚弱症候群の治療剤は，開発されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−２３１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
たとえば，黒毛和牛のような希少価値の高いブランド牛や，血統の良いサラブレットは，新生虚弱子症候群に罹患する確率が高い。このため，ブランド牛やサラブレットは，新生期における死亡率が高い。一方，他家動物由来の成分を投与した場合，重篤な副作用が生ずることがある。【０００８】
そこで，本発明は，副作用の少ない，自己以外のヒトを除く哺乳動物の免疫機能の強化剤を提供することを目的とする。この免疫機能の強化剤は，特に動物新生子の虚弱症候群を治療するための剤として有効である。また，本発明は，このような剤を製造する方法を提供することを目的とする。さらに本発明は，動物の免疫機能の強化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は，基本的には，自己以外の活性化リンパ球を用いても，ヒトを除く哺乳動物，とりわけ抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物においては，意外にも重篤な副作用無しに他家動物の免疫機能を強化でき，特に動物新生子の虚弱症候群の治療に有効であるという実施例による知見に基づくものである。【００１０】
本発明の第１の側面は，ヒトを除く哺乳動物の組織由来の活性化リンパ球を有効成分として含む，その動物と同種であり他家動物の免疫機能の強化剤に関する。【００１１】
本発明の第１の側面の剤の好ましい態様は，ヒトを除く哺乳動物の組織由来の活性化リンパ球が，インターロイキン−２及び抗ＣＤ３抗体のいずれか一方又は両方により活性化された活性化リンパ球である。【００１２】
本発明の第１の側面の剤の好ましい態様は，哺乳動物が抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物であり，具体的にはウシ又はウマである。【００１３】
本発明の第１の側面の剤の好ましい態様は，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物の新生子の虚弱症候群を治療するための剤として用いられるものである。そして，虚弱症候群の例は感染症である。ウシ又はウマであれば，他家由来の活性化リンパ球を投与した場合でも，重篤な副作用は認められなかった。また，先に説明した通り，虚弱体質に出生した新生期のウシ又はウマは，下痢や肺炎などの感染症に罹患しやすく，治療の効果無く死に至る確立が高い。本発明の剤を用いると，特にウシ又はウマの虚弱症候群を治療できる。その結果，例えば感染症からウシ又はウマの新生子を守ることができる。【００１４】
本発明の第２の側面は，他家動物の免疫機能の強化剤の製造方法に関する。この方法は，ヒトを除く哺乳動物からリンパ球を分離する工程と，分離されたリンパ球を増殖及び活性化し活性化リンパ球を得る工程と，得られた活性化リンパ球を用いて製剤する工程とを含む。【００１５】
本発明の第２の側面の方法の好ましい態様は，活性化リンパ球を得る工程が，インターロイキン−２及び抗ＣＤ３抗体のいずれか一方又は両方の存在下にリンパ球を培養する工程を含むものである。【００１６】
本発明の第２の側面の方法の好ましい態様は，他家動物の免疫機能の強化剤が，ヒトを除く哺乳動物，とりわけ抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物と同種であり他家新生子の虚弱症候群を治療するための，動物新生虚弱子症候群の治療剤である。【００１７】
本発明の第３の側面は，ヒトを除く哺乳動物，とりわけ抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物の免疫機能強化方法に関する。この方法は，動物から分離され，増殖及び活性化されたリンパ球を，動物と同種であり他家の動物に投与する工程を含む。【００１８】
本発明の第３の側面の好ましい態様は，ヒトを除く哺乳動物，とりわけ抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物の新生子に増殖及び活性化されたリンパ球を投与するものである。すなわち，この態様は，新生子の免疫機能を強化し，虚弱症候群を治療するものである。【００１９】
本発明の第３の側面の好ましい態様は，生後直後から１年以下，さらに好ましいのは生後直後から３ヶ月以下の新生子の抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物に増殖及び活性化されたリンパ球を投与するものである。生後数カ月以内の動物は，免疫寛容状態が強いため，他家由来の活性化リンパ球を投与しても拒絶反応がそれほど起こらない。このため，本発明の剤は，月齢数カ月の動物の免疫機能を強化するために有効に用いることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば，実施例により実証された通り，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物において，副作用が少ない他家動物の免疫機能の強化剤を提供できる。この免疫機能の強化剤は，特に動物新生子の虚弱症候群を治療するための剤として有効である。また，本発明によればそのような剤を製造する方法を提供できる。【００２１】
さらに本発明によれば，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物の免疫機能を強化する方法を提供できる。これにより，ブランド牛やサラブレットといった高級な動物を効果的に育成できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は，活性リンパ球の増殖曲線を示すグラフである。
【図２】図２は，末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の変化を示すグラフである。
【図３】図３は，ＣＤ３陽性Ｔリンパ球の変化を示すグラフである。
【図４】図４は，Ｂリンパ球の変化を示すグラフである。
【図５】図５は，ＩｇＭ型Ｂリンパ球の変化を示すグラフである。
【図６】図６は，ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の変化を示すグラフである。
【図７】図７Ａは，ＣＤ４＋細胞の変化を示すグラフである。図７Ｂは，ＣＤ４＋ＣＤ４５Ｒ−細胞の変化を示すグラフである。
【図８】図８Ａは，ＣＤ８＋細胞の変化を示すグラフである。図８Ｂは，ＣＤ８＋ＣＤ４５Ｒ−細胞の変化を示すグラフである。
【図９】図９Ａ，図９Ｂ，図９Ｃ及び図９Ｄは，それぞれＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＩＬ−６遺伝子及びＩＦＮ−γ遺伝子の発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の第１の側面は，ヒトを除く哺乳動物の組織由来の活性化リンパ球を有効成分として含む，その動物と同種であり他家動物の免疫機能の強化剤に関する。他家動物とは，同種でありいわゆるアロジェニックを意味する。動物と同種とは，例えば，リンパ球を採取した対象がウマであれば，ウマを意味する。他家動物とは，非自己を意味する。他家動物の例は，母子（リンパ球を採取する対象が母畜であり，活性化リンパ球を含む剤を投与される対象が子畜）である。他家動物の別の例は，父子である。もっとも，実施例において実証された通り記動物は他家由来の成分を移入しても，重篤な副作用は認められない。このため，他家動物は，血縁関係にない同種の動物であってもよい。
【００２４】
哺乳動物には胎盤を介して十分な抗体が移行するヒトのみならず，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物がある。抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物の例は，ウシ，ウマ，ヒツジ，ヤギ，ブタ及びパンダである。本発明の剤は，このような抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物（以下，「対象動物」ともよぶ）に対して有効に用いられる。対象動物は，胎子期に母畜の胎盤を介して胎子へ抗体や免疫細胞を含む免疫物質が全く移行できない。これらの中でも，本発明の剤は，ウシ又はウマに好ましく用いることができる。
【００２５】
ウシは，新生子牛に発生する新生子虚弱症候群（ＷＣＳ）に罹患する確率が高い。ＷＣＳは，ウシの出生時から免疫機能（特に免疫細胞のうちＴリンパ球の機能）が低下していることに起因して発症する。よって，本発明の剤は，特にウシの新生子虚弱症候群の治療に有効である。ブランド牛の新生子は，感染症により死亡する確率が高い。後述する実施例に示されるように，本発明の剤によりウシ新生子の免疫機能を高めることができるので，本発明の剤は，ウシの新生子の感染症を防止するために有効に用いることができる。また，ウマもウシと同様に，母畜の胎盤を介して免疫物質を移行できない。このため，本発明の剤は，ウマの新生子虚弱症候群の治療に有効である。
【００２６】
抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物の組織由来の活性化リンパ球は，例えば，動物の末梢血からリンパ球を分離して培養したものを用いればよい。動物の組織には，例えば，骨髄幹細胞など，骨髄に存在する細胞があげられる。活性化リンパ球は，例えば，インターロイキン−２又は抗ＣＤ３抗体により活性化された活性化リンパ球が好ましい。
【００２７】
本発明は，ウシ又はウマに活性化リンパ球を投与する場合，白血球抗原が自己のものと一致しない他家由来の活性化リンパ球を投与することができる点において有効である。通常，個体間で白血球抗原が一致する確率は低い。また，白血球抗原が一致しない他家由来の活性化リンパ球を投与した場合，重篤な副作用が生じる。そのため，活性化リンパ球を用いた感染症の治療には，自己由来の活性化リンパ球が用いられることが多い。白血球抗原が自己のものと一致したものを見つけられた場合に限り，白血球抗原が自己のものと一致した他家由来の活性化リンパ球が用いられていた。
【００２８】
自己由来の活性化リンパ球を用いる場合，自己の末梢血からの採血をし，そこから分離したリンパ球を活性化し，増殖させるために２週間程度培養することが必要である。そのため，新生子虚弱症候群（ＷＣＳ）に罹患する確率が高いウシやウマの新生子に，生後直後に，自己由来の活性化リンパ球を投与し，新生子の感染症を予防することは不可能であった。
【００２９】
白血球抗原が自己のものと一致した活性化リンパ球を用いる場合，個体間で白血球抗原が一致する確率は低いため，ブランド牛やサラブレット馬を育成している畜産動物種間だけでは，白血球抗原が一致する個体を見つけることは困難であった。さらに，白血球抗原が自己のものと一致した活性化リンパ球を用いる場合，他家由来の白血球抗原が自己の白血球抗原と一致することを確認するまでの検査に，時間及び費用がかかるとうい問題もあった。
【００３０】
本発明では，ウシ又はウマに活性化リンパ球を投与する場合，白血球抗原が一致しない他家由来の活性化リンパ球を投与することができる。そのため，他家由来の活性化リンパ球の製剤を，あらかじめ製造し，保存しておくことにより，活性化リンパ球の製剤を新生子の生後直後に投与することができる。このことにより，活性化リンパ球の製剤は，新生子の感染症を予防することができ，特に問題となっていた新生子虚弱症候群の治療に有効に作用する。さらに，本発明では，ウシ又はウマに活性化リンパ球を投与する場合，白血球抗原が一致しない他家由来の活性化リンパ球を投与できるため，白血球抗原の検査の工程を省くことができる。また，白血球抗原の一致が必要ないため，ある１個体の活性化リンパ球を量産することにより，活性化リンパ球製剤の大量生産が可能となり，製造コストを抑えることができる。
【００３１】
次に，本発明の第２の側面に関する，他家動物の免疫機能の強化剤の製造方法について説明する。この方法は，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物からリンパ球を分離する工程と，分離されたリンパ球を増殖及び活性化し活性化リンパ球を得る工程と，得られた活性化リンパ球を用いて製剤する工程とを含む。この活性化リンパ球の製造方法は，例えば，特開２００４−２３１２号公報に開示された方法に適宜修正を加えた方法を採用すればよい。この方法の好ましい態様は，インターロイキン−２又はＴ細胞増殖を促進する因子（たとえば，抗ＣＤ３抗体）の存在下に分離されたリンパ球を培養する工程を含むものである。後述する実施例により実証された通り，抗ＣＤ３抗体として，ＩｇＧ１型のものを用いると，活性化リンパ球を効果的に活性化できる。
【００３２】
ウシ又はウマに投与する活性化リンパ球を得る工程では，リンパ球の培養培地に，ゼラチンを加えることもできる。ゼラチンはリンパ球の活性化を促進する。また，ゼラチンを培地に添加した場合，ゼラチンは活性化されたリンパ球を保護する働きをする。さらに，後述するように，ウシ又はウマに投与する活性化リンパ球を含む製剤は冷凍保存することができるため，ゼラチンは冷凍保存の際には緩衝材として機能することができる。
【００３３】
ゼラチンとしては，豚皮ゼラチン，牛骨ゼラチン，魚類の骨又は魚類の皮革のゼラチンを用いることができる。ゼラチンは，培養培地１００重量部に対して，０．１重量部から１０重量部，好ましくは１重量部から５重量部添加することができる。ゼラチンは通常の方法で培地に混合される。リンパ球を，ゼラチンを含有した培地で培養する場合，培養温度は，３７℃から４２℃であれば良く，好ましくは，３９℃から４２℃の比較的高温域で培養することが好ましい。３９℃から４２℃以下の温度は通常の培養温度よりも高い。しかし，３９℃以上４２℃以下の温度はゼラチンを均一に溶解できる温度であり，かつ，ウシ又はウマの平均体温に近い温度である。そのため，ウシ又はウマに投与するリンパ球を３９℃以上４２℃以下の温度で培養することにより，ウシ又はウマに対してより活性の高いリンパ球を得ることができる。
【００３４】
本発明の強化剤は，製造後冷凍保存してもよい。そして，例えば，新生子が生まれる際に解凍し，投与してもよい。また，本発明の剤は，液剤として調整し，ブランド牛や競走馬（サラブレッド）の雄の精子とともに冷凍したキットとして提供されてもよい。このように，雄の精子と活性リンパ球製剤がキットとなることで，比較的副作用の起きにくい活性化リンパ球製剤を販売できる。すなわち，このようなキットに含まれる精子を用いて受精し，生まれた新生子にとってその父親由来の活性リンパ球を含む剤が存在するので，比較的副作用が少ない状態で本発明の剤を投与することができる。ブランド牛やサラブレッドのうち種牛や種馬は限られているため，本発明のキットを有効に用いることができる。
【００３５】
活性化リンパ球を主成分とする製剤の投与量は，例えば，対象となる抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物の種類により適宜増減して使用してもよい。１回あたりの製剤の投与量の例は，体重１ｋｇあたりのリンパ球投与量が，１×１０２個以上１×１０９個以下である。１回あたりの製剤の投与量は，リンパ球投与量が，１×１０３個以上１×１０11個以下でもよく，１×１０４個以上１×１０10個以下でもよい。
【００３６】
本発明の剤は，公知の剤型を採用できる。本発明の剤の好ましい剤系は，注射剤である。この剤の例は，０．０１〜５体積％の血清又は血清アルブミンを含む生理食塩液に適量の活性リンパ球を分散した注射剤である。注射剤の投与方法の例は，静脈への注射である。投与頻度の例は１回／日以上１回／月以下である。
【００３７】
本発明の第３の側面は，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物の免疫機能強化方法に関する。この方法は，動物から分離され，増殖及び活性化されたリンパ球を，動物と同種であり他家の動物に投与する工程を含む。
【００３８】
本発明の第３の側面の好ましい態様は，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物の新生子に増殖及び活性化されたリンパ球を投与するものである。すなわち，この態様は，新生子の免疫機能を強化し，虚弱症候群を治療するものである。
【００３９】
本発明の第３の側面の好ましい態様は，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物において，生後直後から１年以下，さらに好ましいのは生後直後から３ヶ月以下の動物の新生子に増殖及び活性化されたリンパ球を投与するものである。生後数カ月以内の動物は，免疫寛容状態が強いため，他家由来の活性化リンパ球を投与しても拒絶反応がそれほど起こらない。このため，本発明の剤は，月齢数カ月の動物の免疫機能を強化するために有効に用いることができる。
【実施例１】
【００４０】
活性化リンパ球の調整
この実施例では，ウシ末梢血からリンパ球を採取し，採取したリンパ球をＩＬ−２及び抗ウシＣＤ３抗体を用いて活性化することで，活性化リンパ球を得た。以下，各工程について説明する。【００４１】
活性化リンパ球培養用フラスコの調製
抗ウシＣＤ３抗体（ＭＭ１Ａ（ＩｇＧ１），ＶＮＲＤ社製）を滅菌したリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で２．５μl／ｍｌの濃度に希釈し，表面積７５ｃｍ２のフラスコ（住友ベークライト社製）に１０ｍｌ注入した。この抗体希釈液をフラスコの底面にまんべんなく広げ，冷蔵庫（４℃）で使用時まで静置し，固相化した。使用時に冷蔵庫から取り出し，抗体希釈液を吸引除去後，滅菌ＰＢＳで３回洗浄し，最後に洗浄した残りの液を十分に吸引除去し，活性化リンパ球培養用フラスコを調製した。【００４２】
培養用培地の調製
インターロイキン（ＩＬ）−２を７００Ｕ/ｍｌ含有するＬＡＭ−１培地（株式会社ケーナインラボ製）に体積比２．５％仔牛血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製，放射線滅菌済み）を含むよう添加して，調製した。培養工程の途中で使用するＩＬ−２を１７５Ｕ/ｍｌ含むＬＡＭ−２培地（株式会社ケーナインラボ製）及びＩＬ−２を１７５Ｕ／ｍｌを含むＬＡＭ−３培地（ガス透過性バッグ入り，全量７５０ｍｌ，株式会社ケーナインラボ製）は，既成ものを使用した。【００４３】
末梢血からのリンパ球の分離
ヘパリン処理した採血管を用いて，ウシの頸静脈から末梢血全血２０ｍｌを採血した。末梢血を１,６００回転で１０分間遠心分離し，分離された血漿を新しい滅菌チューブに分取した。血球成分が含まれる遠心分離の沈さに，総量が全血量の２倍である４０ｍｌになるようにＲＰＭＩ−１６４０培地（和光純薬社製）を加えて希釈し，Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ社製）３ｍｌに対し希釈血液１０ｍｌを重層して，１，６００回転，３０分，２２℃の条件で遠心を行い，リンパ球を含む末梢血単核球（ＰＢＭＣ）層を回収し，ＲＰＭＩ−１６４０培地で１回洗浄した。この操作で，約１×１０７個の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が得られた。【００４４】
リンパ球の培養
回収したＰＢＭＣを，ＩＬ−２を７００Ｕ/ｍｌ及び体積比２．５％の仔牛血清を含むＬＡＭ−１培地２０ｍｌ中に懸濁させ，抗ウシＣＤ３抗体を固相化したフラスコ中に入れて，培養を開始した。培養３日後にＬＡＭ−２培地を２０ｍｌ添加し，さらにその２日後（培養５日後）にＬＡＭ−２培地を４０ml添加した。その２日後（培養７日後）に細胞が十分に増殖したことを確認し，ＬＡＭ−３培地に細胞浮遊液の全量を移した。以降，増殖した細胞を回収するまでの５〜１０日間，炭酸ガスインキュベーター内に静置した。培養温度は，３７℃から４２℃であれば良く，好ましくは，３９℃から４２℃の比較的高温域で培養することができる。【００４５】
培養リンパ球製剤の調製
投与予定が確定した培養リンパ球は，培養リンパ球が浮遊した培養液が入ったバッグ培養容器（ＬＡＭ−３）をよく攪拌し，サンプルポートから細胞浮遊液を遠心管に回収して，１,６００回転，７分間の条件で遠心し，培養リンパ球を回収した。その後，０．１％自己血清（全血から遠心分離した血漿を１日以上冷蔵保存した後，５６℃で３０分間インキュベーションし非働化した。さらに１日以上冷蔵保存した後，３，０００回転，２０分間の条件で遠心し，その上清を自己血清とした。）を含む生理食塩液で２回洗浄し，最後に１％自己血清を含む生理食塩液５０ｍｌに浮遊させ，注射筒に充填し，投与製剤とした。なお，培養リンパ球浮遊培養液中のエンドトキシン測定（トキシカラーテスト，生化学工業社製）とトリプトソーヤ寒天培地（ニッスイ社製）による細菌培養を実施し，投与前に安全性を確認した。【００４６】
培養リンパ球の表面型の測定
上記により得られた培養リンパ球５×１０５個を試験管に分取し，ＰＢＳを加えて1回洗浄後上清を除去して，直接染色の場合ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）またはＰＥ（フィコエリスリン）標識モノクローナル抗体１０μｌを，間接染色の場合非標識モノクローナル抗体１μｇをそれぞれ加えよく撹拌した。冷蔵庫内で３０分間静置の後，ＰＢＳで1回洗浄した。間接染色の場合，次に適当に希釈したＦＩＴＣ標識ヒツジ抗マウス抗体（セロテック社製）５０μｌを加えよく撹拌し，冷蔵庫内に３０分間静置した。その後，ＰＢＳで１回洗浄し，最後にシース液０．５ｍｌを加え，よく撹拌し，ＣｙＡｎ（Ｄａｋｏ社製）で各抗体に反応した表面抗原を測定した。測定に用いたモノクローナル抗体は，直接染色にはＦＩＴＣ標識抗ウシＣＤ８抗体（９ＡＣＴ８０Ｃ：ＶＮＲＤ社製），ＰＥ標識抗ウシＣＤ４抗体（ＣＡＣＴ１８３Ｂ：ＶＮＲＤ社製），ＰＥ標識抗イヌＣＤ２１抗体（ＭＣＡ１７８１ＰＥ，セロテック社製），間接染色には抗ウシＣＤ３抗体（ＭＭ１Ａ，ＶＮＲＤ社製），抗ウシγδＴ細胞抗体（ＷＣ−１，セロテック社製），抗Ｂ−Ｂ７（ＣＤ２１-ｌｉｋｅ）抗体（ＧＢ２５Ａ，ＶＭＲＤ），を用いた。対照として非特異的反応を測定するため，ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｄａｋｏ社製）及びＰＥ標識抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｄａｋｏ社製）を用いた。その結果を，表１に示す。【００４７】
【表１】
2012017678.tif 000003
【実施例２】
【００４８】
この実施例では，母ウシ由来の活性化リンパ球を得て，新生子牛に活性リンパ球を含む剤を投与した。以下，この実施例の各工程について説明する。【００４９】
活性化リンパ球の調製  ホルスタイン種，黒毛和種及び雑種の母牛から，分娩予定日の２〜３週間前に末梢血全血を採血した。そして，実施例１に従って活性リンパ球を分娩当日まで継続して培養した。図１は，活性リンパ球の増殖曲線を示すグラフである。【００５０】
培養リンパ球の仔牛への投与
培養リンパ球を，新生子牛の出生日（０日齢）から２日以内に回収し，新生子牛の頸静脈から移入した。活性化リンパ球の投与量は，約１×１０９個であった。これらの新生仔牛を活性化リンパ球投与群とした。一方，新生仔牛のうち活性化リンパ球を投与しなかった群を対照群とした。そして，全ての新生子牛に対し，母牛からの初乳摂取による影響を排除するため，出生後に市販の粉末初乳製剤を給与した。その後，２週齢後に１回目ワクチン接種，６週齢後に２回目ワクチン接種をそれぞれ実施し，０，３，７日齢，２週齢とその３日後，６週齢とその３日後及び６日後の計８回について末梢血の採血を行い，末梢血中白血球の分画の解析及びリンパ球表面型の測定，ＰＨＡ（フィトヘムアグルチニン）刺激によるサイトカイン遺伝子発現量の解析を行った。【００５１】
末梢血中リンパ球表面型の測定
実施例１と同様にして，末梢血中リンパ球の表面型を測定した。【００５２】
図２は，末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の変化を示すグラフである。図３は，ＣＤ３陽性Ｔリンパ球の変化を示すグラフである。図４は，Ｂリンパ球の変化を示すグラフである。図５は，ＩｇＭ型Ｂリンパ球の変化を示すグラフである。図６は，ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の変化を示すグラフである。【００５３】
図２，図３及び図６から，活性化リンパ球投与群及び対照群とも，末梢血単核球（ＰＢＭＣ）数，ＣＤ３陽性Ｔリンパ球数，ＣＤ８キラーＴ細胞数及びＮＫ細胞数は，出生後緩やかに増加することが分かる。ただし，これらの細胞増殖は２回目のワクチン接種後において活性化リンパ球投与群の方が対照群に比べ高いことが分かる。【００５４】
一方，図４及び図５から，対照群に比べて活性化リンパ球投与群は，２回目ワクチン接種３日後及び６日後においてＢリンパ球（ＭＨＣ ｃｌａｓｓ−ＩＩ＋ＣＤ１４−Ｂ細胞）とＩｇＭ型Ｂリンパ球（ＣＤ２１＋ＩｇＭ＋Ｂ細胞）が有意に増加したことが分かる。【００５５】
図７ＡはＣＤ４＋細胞の変化を示すグラフである。図７Ｂは，ＣＤ４＋ＣＤ４５Ｒ−細胞の変化を示すグラフである。図８Ａは，ＣＤ８＋細胞の変化を示すグラフである。図８Ｂは，ＣＤ８＋ＣＤ４５Ｒ−細胞の変化を示すグラフである。図７Ａ，図７Ｂ，図８Ａ，図８Ｂから，これらの細胞増殖は，活性化リンパ球投与群の方が対照群に比べて高いことが分かる。このことは，本実施例における活性化リンパ球が，新生仔牛の免疫機能を強化させたことを示す。また，これらの細胞は，１回目のワクチン接種後から緩やかに増加し，２回目のワクチン接種後により増加する。このことは，１回目のワクチン接種により，細胞の抗原応答性が高くなり，２回目のワクチン接種時にはより，抗原に対する応答性が高くなっていることを示す。【００５６】
サイトカイン遺伝子発現量の解析
ヘパリン添加血液から比重液を用いて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離し，ｍＲＮＡを抽出した。従来の方法を参考に，抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し，ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ
ＰＣＲを実施した。内部標準遺伝子としてβ−アクチン（ａｃｔｉｎ）を用いて実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, ＣＡ, ＵＳＡ）を利用して報告されている方法に準じて７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを実施した。【００５７】
ＰＣＲの条件は，Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ ＰｌｕｓＴＭＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ (Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｊａｐａｎ)の取扱説明書に従った。この装置にサンプルをセットし，５０℃３０分間，９５℃１５分間をそれぞれ１回行い，９５℃１５分間，６０℃１分間を１サイクルとした反応を４５回繰り返した。【００５８】
対象遺伝子と，ＰＣＲ用のフォワードプライマー及びリバースプライマーは，以下の表２に示す通りであった。【００５９】
【表２】
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【００６０】
サイトカイン遺伝子発現量は増幅した各遺伝子のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ値）を用いて，サイトカイン遺伝子発現量＝２(−(サイトカインのＣｔ値/ｂ−アクチンのＣｔ値))の計算式にて求めた。【００６１】
その結果を図９に示す。図９Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤは，それぞれＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＩＬ−６遺伝子及びＩＦＮ−γ遺伝子の発現量を示すグラフである。図９Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤから，いずれのサイトカイン遺伝子も２回目ワクチン接種前及び３日後は，活性化リンパ球を投与した群の方が対象群に比べてサイトカイン発現量が多いものの，６日目には活性化リンパ球を投与した群の方が対象群に比べてサイトカイン発現量が少なくなることが分かる。このことは，本実施例における活性化リンパ球が，新生仔牛の免疫機能を早期に強化したことを示す。【００６２】
上記実施例では，自己以外の他家動物として新生子とその実母の例が用いられていたが，実母以外の雌牛への受精卵移植による出生の一例が含まれており，母子関係にない場合の他家においても，本発明は有効である。
【実施例３】
【００６３】
この実施例では，母ウマ由来の活性化リンパ球を得て，新生子馬に活性リンパ球を含む剤を投与した。【００６４】
母ウマ由来の末梢血を使用してリンパ球を採取し，採取したリンパ球をＩＬ−２及び抗ウマ抗体を用いて活性化する以外は，実施例２と同様にして活性化リンパ球を調整した。これらの活性化リンパ球を含む剤を，実施例２と同様に新生子馬に投与した。これらの新生子馬を活性化リンパ球投与群とした。一方，新生子馬のうち活性化リンパ球を投与しなかった群を対照群とした。そして，全ての新生子牛に対し，母馬からの初乳摂取による影響を排除するため，出生後に市販の粉末初乳製剤を給与した。その後，２週齢後に１回目ワクチン接種，６週齢後に２回目ワクチン接種をそれぞれ実施し，０，３，７日齢，２週齢とその３日後，６週齢とその３日後及び６日後の計８回について末梢血の採血を行い，末梢血中白血球の分画の解析及びリンパ球表面型の測定，ＰＨＡ（フィトヘムアグルチニン）刺激によるサイトカイン遺伝子発現量の解析を行った。【００６５】
その結果，ワクチン接種後３日から７日後において，活性化リンパ球投与群は対照群に比べて，末梢血中のＴ細胞やＮＫ細胞数が増加したことがわかった。さらに，活性化リンパ球投与群は対照群に比べて，サイトカイン遺伝子の発現量が増加することがわかった。このことから，母ウマ由来の活性化リンパ球を新生子ウマに投与することにより，ウシの場合と同様に新生子ウマの免疫機能を早期に強化することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の剤及びその製造方法は，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物の免疫機能の強化剤や動物新生虚弱子症候群の治療剤として製薬産業において利用されうる。また，本発明の動物の免疫機能強化方法は，獣医業において利用されうる。
【配列表フリーテキスト】
【００６７】
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年4月2日(2012.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の組織由来であって，白血球抗原が自己のものと一致しない他家由来の活性化リンパ球を有効成分として含み，
前記哺乳動物は，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物である， 
前記哺乳動物と同種であり他家動物の免疫機能の強化剤。
【請求項２】
哺乳動物の組織由来であって，白血球抗原が自己のものと一致しない他家由来の活性化リンパ球を有効成分として含み， 
前記哺乳動物は，ウシ，ウマ，ヒツジ，ヤギ，ブタ又はパンダである，
前記哺乳動物と同種であり他家動物の免疫機能の強化剤。
【請求項３】
前記活性化リンパ球が，インターロイキン−２及び抗ＣＤ３抗体のいずれか又は両方により活性化された活性化リンパ球である，請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
前記哺乳動物が，ウシ又はウマである，請求項１又は２に記載の剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の剤であって，
前記哺乳動物の新生子の虚弱症候群を治療するための剤として用いられる剤。
【請求項６】
前記虚弱症候群が感染症を含む，請求項５に記載の剤。
【請求項７】
哺乳動物から白血球抗原が自己のものと一致しない他家由来のリンパ球を分離する工程と， 
分離されたリンパ球を増殖及び活性化し活性化リンパ球を得る工程と， 
得られた活性化リンパ球を用いて製剤する工程とを含み，
前記哺乳動物は，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物である， 
他家動物の免疫機能の強化剤の製造方法。
【請求項８】
哺乳動物から白血球抗原が自己のものと一致しない他家由来のリンパ球を分離する工程と， 
分離されたリンパ球を増殖及び活性化し活性化リンパ球を得る工程と，
得られた活性化リンパ球を用いて製剤する工程とを含み，
前記哺乳動物は，ウシ，ウマ，ヒツジ，ヤギ，ブタ又はパンダである， 
他家動物の免疫機能の強化剤の製造方法。
【請求項９】
前記活性化リンパ球を得る工程が，
インターロイキン−２及び抗ＣＤ３抗体のいずれか又は両方の存在下に分離されたリンパ球を培養する工程を含む， 
請求項７又は８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物がウシであり，前記活性化リンパ球を得る工程が，抗ウシＣＤ３抗体の存在下に分離されたリンパ球を培養する工程を含み，
前記抗ウシＣＤ３抗体が，ＩｇＧ１型の抗体である，
請求項７又は８に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記他家動物の免疫機能の強化剤が，
前記哺乳動物と同種であり他家新生子の虚弱症候群を治療するための，前記哺乳動物の新生虚弱子症候群の治療剤である，
請求項７又は８に記載の製造方法。
【請求項１２】
ヒト以外の哺乳動物から分離され，増殖及び活性化された白血球抗原が自己のものと一致しない他家由来のリンパ球を前記哺乳動物と同種であり他家の動物に投与する工程を含み， 
前記哺乳動物は，抗体や免疫細胞が母体から胎子へ胎盤を介して移行しない動物である， 
前記哺乳動物の免疫機能強化方法。
【請求項１３】
ヒト以外の哺乳動物から分離され，増殖及び活性化された白血球抗原が自己のものと一致しない他家由来のリンパ球を前記哺乳動物と同種であり他家の動物に投与する工程を含み， 
前記哺乳動物は，ウシ，ウマ，ヒツジ，ヤギ，ブタ又はパンダである， 
前記哺乳動物の免疫機能強化方法。
【請求項１４】
前記リンパ球を投与する工程は，前記哺乳動物の新生子に増殖及び活性化されたリンパ球を投与する工程である請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記リンパ球を投与する工程は，生後直後から１年以下の前記哺乳動物に増殖及び活性化されたリンパ球を投与する工程である請求項１２又は１３に記載の方法
【国際調査報告】
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