(57)【要約】本発明は、変異したヒト ＤＤＡＨ１タンパク質をコードする核酸配列及び上記ヒト 変異ＤＤＡＨ１タンパク質、並びに対象生物が変異ＤＤＡＨ１タンパク質をコードする変異遺伝子を保因するか否かを判定するために対象動物をスクリーニングする方法に関する。更に本発明は、対象生物における、循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度あるいは循環器疾患及び糖尿病の素因を判定又は診断するための方法、対象生物に適した治療法を選択する方法、循環器疾患薬及び糖尿病薬の治験に適した対象生物を選択する方法、並びにＩＩ型糖尿病の治療方法に関し、トランスジェニック動物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＤＡＨ １タンパク質の８７番〜９４番アミノ酸残基、１７３番〜１７７番アミノ酸残基及び２２１番〜２２８番アミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸で置換されている変異ＤＤＡＨ １タンパク質をコードする核酸。
【請求項２】
該核酸がゲノムヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
変異ＤＤＡＨ １タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含し、該変異ＤＤＡＨ １タンパク質は、ヒト ＤＤＡＨ １遺伝子の第１エクソン中のコドン８７のコードするスレオニンがメチオニンに置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
配列番号１のゲノムヌクレオチド配列を包含することを特徴とする、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
該核酸がｃＤＮＡであることを特徴とする、請求項３に記載の核酸。
【請求項６】
ＲＮＡ配列を包含することを特徴とする、請求項３に記載の核酸。
【請求項７】
ＤＤＡＨ １タンパク質の８７番〜９４番アミノ酸残基、１７３番〜１７７番アミノ酸残基、２２１番〜２２８番アミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸で置換されている変異ＤＤＡＨ １ポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列を包含することを特徴とする、請求項７に記載の変異ＤＤＡＨ １ポリペプチド。
【請求項９】
１本鎖である請求項５のｃＤＮＡを包含する捕捉用プローブ。
【請求項１０】
生物学的試料における請求項１の核酸の存在の有無を判定するための方法であって、ターゲット核酸となる該核酸を一本鎖にしてから核酸捕捉用プローブ及び核酸検出用プローブと接触させて、核酸捕捉用プローブ、ターゲット核酸及び核酸検出用プローブからなる複合体を検出する方法。
【請求項１１】
該核酸捕捉用プローブが固相と接着しているか又は接着しうるものであり、且つ請求項５のｃＤＮＡを包含し、固相から検出されるシグナルは、生物学的試料における請求項１の核酸の存在を示すことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該核酸捕捉用プローブが固相と接着しているか又は接着しうるものであり、且つ野生型ＤＤＡＨ １タンパク質をコードする遺伝子に対応するｃＤＮＡを包含し、固相から検出されるシグナルは、生物学的試料中に請求項１の核酸が存在しないことを示すことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
変異ＤＤＡＨ １タンパク質をコードする対立遺伝子のパターンを決定することで、対象生物の循環器疾患及び糖尿病の罹病性を診断するための、以下の工程を包含する方法。
ａ）対象生物から試験に付すための生物学的試料を得るための工程、及び
ｂ）生物学的試料におけるヒト ＤＤＡＨ １の変異遺伝子型の存在を検出するための工程であって、変異遺伝子型の存在は、該対象生物が循環器系疾患及び糖尿病を発症する危険度が高いことを示す。
【請求項１４】
ヒト ＤＤＡＨ １の該変異遺伝子型が、Thr87Met変異のヘテロ接合型（Thr/Met型）又はThr87Met変異のホモ接合型（Met/Met型）であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
検出するための工程がＤＮＡアッセイであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子又はＤＮＡからなるチップ、マイクロアレイ、ストリップ又はパネル、あるいはアッセイの対象となる複数の遺伝子、変異又はＲＮＡの発現を上記と同様に組み合わせたものを用いて検出するための工程を行うことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
対立遺伝子のパターンをポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
生物学的試料が血液試料又は口腔の細胞試料であり、該試料からゲノムＤＮＡを単離することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
検出するための工程を、請求項７の変異ＤＤＡＨ １ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する捕捉用プローブ又は一本鎖ｃＤＮＡを用いて行うことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
対象生物における一酸化窒素の有効性、産生又は代謝に作用する薬剤による治療が、対象生物において有効であるか否かを判定するために用いることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
対象生物におけるＡＤＭＡの有効性又は濃度を低下させる薬剤による治療が、対象生物において有効であるか否かを判定するために用いることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＤＡＨ １作動薬などのＤＤＡＨ １の存在量又は濃度を高める薬剤による治療が、対象生物において有効であるか否かを判定するために用いることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＤＡＨ １拮抗薬の投与によって対象生物が副作用を患う危険度が高いか否かを判定するために用いることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
化合物の糖尿病、高血圧及び心筋虚血を防止する作用の臨床薬物治験に適した、非変異型のＤＤＡＨタンパク質をコードするＤＤＡＨ遺伝子配列を有する対象生物を選択するための工程を更に包含することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
対象生物におけるヒト ＤＤＡＨ １の遺伝子型が変異型であるか否かを判定することで変異ＤＤＡＨ １をコードする対立遺伝子のパターンを決定し、高血圧症の対象生物において循環器疾患及び糖尿病に対して標的治療を行う方法であって、請求項１３の方法の工程（ａ）と（ｂ）を実施し、そして一酸化窒素の有効性、産生又は代謝に作用する薬剤を用いて、変異遺伝子型を有する対象生物を処置することを包含する方法。
【請求項２６】
ヒト ＤＤＡＨ １の該変異遺伝子型が、Thr87Met変異のヘテロ接合型（Thr/Met型）又はThr87Met変異のホモ接合型（Met/Met型）であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該薬剤が、対象生物のＡＤＭＡの活性又は濃度を、直接的に調節、上昇又は低減する薬剤、あるいは中枢神経系作用等を介して間接的に調節、上昇又は低減する薬剤であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
該薬剤が、対象生物のＤＤＡＨ １の活性又は濃度を、直接的に調節、上昇又は低減する薬剤、あるいは中枢神経系作用等を介して間接的に調節、上昇又は低減する薬剤であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
該薬剤が、サブタイプ選択的又は非選択的なＤＤＡＨ作動薬であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
該循環器疾患が、冠動脈心疾患、脳血管疾患又は高血圧症であることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
ＩＩ型糖尿病を患うヒト又は動物の治療方法であって、対象となるヒト又は動物における一酸化窒素の有効性、産生量又は濃度を上昇させる療法を包含する方法。
【請求項３２】
糖尿病の血管系合併症の治療方法であって、対象となるヒト又は動物における一酸化窒素の有効性、産生量及び濃度を上昇させる療法を包含する方法。
【請求項３３】
対象生物における一酸化窒素の有効性、産生量又は濃度を上昇させる化合物を対象生物に投与することを包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ＩＩ型糖尿病を患うヒト又は動物の治療方法であって、ＡＤＭＡの活性又は濃度上昇を、直接的に低減又は阻害する化合物、あるいは中枢神経系作用等を介して間接的に低減又は阻害する化合物を対象生物に投与することを包含する方法。
【請求項３５】
ＩＩ型糖尿病を患うヒト又は動物の治療方法であって、ＤＤＡＨの活性又は濃度を、直接的に亢進又は誘発する化合物、あるいは中枢神経系作用等を介して間接的に亢進又は誘発する化合物を対象生物に投与することを包含する方法。
【請求項３６】
ＩＩ型糖尿病を患うヒト又は動物の治療方法であって、ＤＤＡＨタンパク質の形成を阻害する酵素や化合物に対する阻害性物質と、ＤＤＡＨタンパク質の形成を賦活化する物質に対する活性化化合物を共に対象生物に投与することを包含する方法。
【請求項３７】
該薬剤が、サブタイプ（ＤＤＡＨ １、ＤＤＡＨ ２）選択的又は非選択的なＤＤＡＨ拮抗剤であることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
該療法が、遺伝子治療又は遺伝子導入であることを特徴とする、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３９】
該療法が、非変異ＤＤＡＨ １遺伝子、その断片又はその誘導体の導入を包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
対象生物が循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度を判定するためのキットであって、対象生物から得た生物学的試料中の変異ＤＤＡＨをコードする対立遺伝子のパターンを決定するための手段を包含し、所望により、対立遺伝子のパターンを決定するために得た結果を解析するためのソフトウェアを更に包含するキット。
【請求項４１】
生物学的試料における、請求項１の核酸の存在の有無を判定するためのキット。
【請求項４２】
核酸捕捉用プローブを包含することを特徴とする、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
請求項７の変異ＤＤＡＨ １ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含するヒトＤＮＡ配列を保因するトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異したヒト ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドラーゼ（ＤＤＡＨ １）タンパク質をコードする核酸配列及び上記ヒト 変異ＤＤＡＨ １タンパク質、並びに対象生物が変異ＤＤＡＨ １タンパク質をコードする変異遺伝子を保因するか否かを判定するために対象動物をスクリーニングする方法に関する。さらに本発明は、対象生物における、循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度あるいは循環器疾患及び糖尿病の素因を判定又は診断するための方法、対象生物に対して標的治療を行う方法、抗糖尿病薬の治験に適した対象生物を選択する方法、並びにＩＩ型糖尿病の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景技術の説明、特に当業界の慣例である技術の詳細を提供するために本願明細書で使用した出版物及びその他の資料は、後述する参考文献によって本願に組み込まれているものとする。
【０００３】
一酸化窒素は、一酸化窒素合成酵素の作用によりアミノ酸であるアルギニンから合成される気体状伝達物質である。一酸化窒素合成酵素には３種類の異性体（ＮＯＳ １〜３）が存在し、それぞれ内皮環境、神経環境及び誘導環境下で主として作用する。循環器系において内皮は、単球及び白血球の接着、血小板の凝集、血栓の発生、平滑筋細胞の増殖及び血管制御において重要な役割を担っている。
【０００４】
血管内皮が有する血管拡張刺激能の低下と定義される内皮機能障害は、アテローム性動脈硬化症の発症において重要な役割を果たしており、アテローム性動脈硬化症の素因となる様々な病理状態、例えば高コレステロール血症、高血圧症、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病、高ホモシステイン血症、慢性腎不全、（腹部）肥満症、感染症、加齢、喫煙及び激しい運動においても重要な役割を担っている。内皮機能障害の主な原因は、血管内皮において内皮ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）によってＬ−アルギニンから産生される強力な生物学的血管拡張物質である一酸化窒素（ＮＯ）の生物学的に利用可能量の低下である。
【０００５】
ＡＤＭＡは、一酸化窒素合成酵素を阻害する天然の化合物である。ＡＤＭＡはタンパク質中のアルギニン残基をメチル化することによって形成され、酵素であるジメチルアルギニンジメチルアミノヒドラーゼ（ＤＤＡＨ）によって代謝される。ＡＤＭＡ濃度は、若年の高コレステロール血症患者では上昇し（Boger et al., 1998）、健康な中年個体（Miyazaki et al., 1999）及びＩＩ型糖尿病患者（Fard et al., 2000）においては内中膜厚と相互に関連がある。ＡＤＭＡは中年男性において、急性冠動脈関連事象の予測因子となることが報告されている（Valkonen et al., 2001）。
【０００６】
高血糖症は、糖尿病の最も典型的な病状である。糖化最終産物（ＡＧＥ）の存在は高血糖症と密接な関係があり、ＡＧＥの病理生化学は、糖尿病に関連した合併症の変遷の多くを説明する。しかし、ＡＧＥとＡＧＭＡの関連性についてはこれまで研究されていない。
【０００７】
ＤＤＡＨ １遺伝子は、第１染色体上に位置している。この染色体は、家族性複合型高脂血症、若年性冠動脈疾患（ＣＡＤ）、インスリン非依存型糖尿病及び拡張期高血圧症を含むいくつかの疾患に対する罹病性に関与している。また、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）コレステロールの濃度も、第１染色体との関わりが示唆されている。低下した内皮機能と一酸化窒素の産生能の変化は、上述したすべての疾患の病理と関係がある。
【０００８】
ヒト ＤＤＡＨ １と、マウス又はラットのＤＤＡＨ １との間の配列の相同性は非常に高い。従って、ＤＤＡＨ １をコードする遺伝子にはいくつかの保存領域がある。ヒトとマウス及びラットとの間では、同一である長いアミノ酸配列が合計３つ存在する：８７〜９４番アミノ酸残基、１７３〜１７７番アミノ酸残基及び２２１〜２２８番アミノ酸残基。
【０００９】
発明の概要 
本発明の目的は、ＤＤＡＨ １遺伝子の遺伝子型に基づいて、個体が循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度を判定するために、対象生物をスクリーニングする方法、及び抗高血圧治療、抗虚血症治療及び血糖値降下治療を標的治療として行う方法を提供することである。本発明の更なる目的は、薬剤の抗高血圧作用、抗虚血作用及び抗糖尿病作用を試験するための実験動物及びヒト治験対象を選択するための方法を提供することである。本発明の第３の目的は、ヒト又は動物のＩＩ型糖尿病の治療方法を提供することである。本発明の第４の目的は、ヒトの変異ＤＤＡＨ １をコードする遺伝子を保因するトランスジェニック動物を供給することである。
【００１０】
本発明は、対象生物におけるヒト ＤＤＡＨ １の遺伝子型が変異型であるか否かを判定することで変異ＤＤＡＨ １をコードする対立遺伝子のパターンを決定し、対象生物が循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度を判定する方法であって、以下の工程を包含する方法に関する。
ａ）対象生物から試験に付すための生物学的試料を得るための工程、及び
ｂ）生物学的試料におけるヒト ＤＤＡＨ １遺伝子の変異遺伝子型の存在を検出するための工程であって、変異遺伝子型の存在は、対象生物が循環器系疾患及び糖尿病を発症する危険度が高いことを示す。
【００１１】
本発明によると、上記方法によって対象生物の遺伝子型が変異型であるか否かを確定することが可能となり、血液試料や口腔の細胞などの生物学的試料中の変異遺伝子型の存在は、対象生物が循環器疾患及び糖尿病を発症する危険性が高いこと、及び／又は対象生物がＤＤＡＨ １作動薬又はＤＤＡＨ活性を誘発する他の治療を必要としていることを意味する。
【００１２】
本発明の好ましい態様においては、本発明は、対象生物におけるヒト ＤＤＡＨ １の遺伝子型がThr/Met型かMet/Met型であるかを決定することで、変異ＤＤＡＨをコードする対立遺伝子のパターンを決定し、対象生物が循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度を判定するための方法であって、以下の工程を包含する方法に関する。
ａ）対象生物から試験に付すための生物学的試料を得るための工程、及び
ｂ）生物学的試料におけるThr/Met遺伝子型又はMet/Met遺伝子型のヒト ＤＤＡＨ １遺伝子の存在を検出するための工程であって、Thr/Met遺伝子型又はMet/Met遺伝子型の存在は、対象生物が循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度が高いことを示す。
【００１３】
本発明によると、上記方法によって対象生物の遺伝子型が、Thr/Met型又はMet/Met型であるか否かを確定することが可能となり、血液試料や口腔の細胞などの生物学的試料中のThr/Met遺伝子型又はMet/Met遺伝子型の存在は、対象生物が循環器疾患及び糖尿病を発症する危険性が高いこと、及び／又は対象生物がＤＤＡＨ作動薬又はＤＤＡＨ活性を誘発する他の治療を必要としていることを意味する。
【００１４】
上記の方法は、循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度が高い対象生物、及び／又は治療（循環器疾患及び糖尿病に対するサブタイプ選択的な又は非選択的なＤＤＡＨ作動薬或いは拮抗薬による治療など）を必要とする対象生物を同定する工程を含んでいてもよい。
【００１５】
従って、本発明は、次の工程（ｃ）を更に包含する方法にも関する。
ｃ）対象生物の遺伝子型がThr/Met型又はMet/Met型であるか否かに基づいて、次の（i）及び（ii）から選ばれる少なくとも一つを判定する工程。
（i）対象生物が循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度、及び
（ii）対象生物における、循環器疾患及び糖尿病に対するサブタイプ（１vs２）選択的な又は非選択的な作動薬による治療の必要性。
【００１６】
本発明の更なる目的は、対象生物におけるヒト ＤＤＡＨ １の遺伝子型がThr/Met型かMet/Met型であるかを判定することで変異ＤＤＡＨ１をコードする対立遺伝子のパターンを決定し、対象生物において循環器疾患及び糖尿病の治療又は標的治療を行うための方法であって、上述した工程を包含し、遺伝子型がThr/Met型又はMet/Met型である対象生物に対して、ＮＯＳ及び／又はＤＤＡＨ活性に作用する薬剤、あるいはＮＯ産生用の基質に作用する補給物で治療する工程を更に包含する方法。
【００１７】
さらに本発明は、対象生物が循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度を判定するためのキットであって、生物学的試料中の変異ＤＤＡＨをコードする対立遺伝子のパターンを決定するための手段を包含するキット、並びに循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度を判定するためのその用途に関する。
【００１８】
更に本発明は、ＤＤＡＨポリペプチドの８７番アミノ酸を他のアミノ酸で置換した変異ＤＤＡＨタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する核酸配列を提供する。８７番アミノ酸を含む上記ポリペプチドの領域は高度に保存された領域である、即ち、完全に同一のアミノ酸配列を他の多くの哺乳類が有することから、非常に重要な領域である。
【００１９】
ＤＤＡＨ １タンパク質の同じ保存領域（即ち、８７番〜９４番のアミノ酸）又は他の保存領域（例えば、１７３番〜１７７番のアミノ酸及び２２１番〜２２８番のアミノ酸）におけるいかなるアミノ酸置換も、疾患を発症する危険度及び薬剤の適正に対して８７番アミノ酸の置換と同様の役割を担い、影響を与えると考えることは妥当である。
【００２０】
さらに本発明は変異ＤＤＡＨ １ポリペプチドを提供する。
【００２１】
発明の詳細な説明 
本発明は、変異したヒト ＤＤＡＨ １をコードする核酸分子と変異ＤＤＡＨ １タンパク質、並びに哺乳類において、個体が循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度を判定する方法、循環器疾患及び糖尿病の治療法と治験に付す対象生物を選択する方法、及びヒト又は動物におけるＩＩ型糖尿病の治療方法に関し、更に変異ＤＤＡＨ遺伝子を有するトランスジェニック動物に関する。
【００２２】
本発明において、「治療」という用語には、「予防」という意味も含まれる。
【００２３】
我々はヒト ＤＤＡＨ遺伝子（配列番号３）の変異型（配列番号１）を同定した。この変異型遺伝子は、ポリペプチドの第８７番アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたタンパク質（配列番号２）をコードする。
【００２４】
後述する実験結果は、１６０８名のフィンランド人中年男性からなる標本においては、上記のＤＤＡＨ １変異の保因者、即ち、ＤＤＡＨ １遺伝子の遺伝子型がThr/Met型又はMet/Met型である保因者が循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度は有意に高いことを示した。これらの結果及び上記で参照した先行文献によると、Thr/Met型やMet/Met型の遺伝子型は、ＡＤＭＡをシトルリンに代謝してＡＤＭＡを不活性化する能力の低下と関連すると仮定することができる。ＤＤＡＨの機能変化は、循環器疾患及び糖尿病の病因との関連が考えられるので、循環器疾患及び糖尿病の他の危険因子が存在する場合には、ＤＤＡＨの機能変化は、野生型の遺伝子型を有する対象生物、並びにThr/Met型又はMet/Met型の遺伝子型を有する対象生物においても関連性があると考えられる。
【００２５】
ＤＤＡＨ類は、循環器疾患及び糖尿病などの疾患と関連するＡＤＭＡ及び一酸化窒素の代謝を調節する。変異遺伝子型を有する患者においては、ＤＤＡＨ亢進療法が特に有効であるが、ＤＤＡＨ拮抗剤を投与した場合には、副作用を患う危険性が高くなる。それゆえに、ＤＤＡＨ遺伝子のThr/Met型変異又はMet/Met型変異を有する対象生物を認識する遺伝子試験は、診断や、特定の治療手段及び臨床薬物治験に用いる患者の選択に有用である。ＤＤＡＨの遺伝子型がThr/Met型又はMet/Met型であることを認識する遺伝子試験は、Thr/Met遺伝子型又はMet/Met遺伝子型と関連がある循環器疾患及び糖尿病を個体が発症する危険度を判定するのに有用である。このような試験は、循環器疾患及び糖尿病の遺伝的病因論に基づいて、循環器疾患及び糖尿病の副診断（subdiagnosis）に用いることもできる。
【００２６】
更に、ＤＤＡＨのThr/Met遺伝子型又はMet/Met遺伝子型を認識する遺伝子試験は、循環器疾患および糖尿病を患う患者のための薬物治療を選択する際に有用である。治療に用いる薬剤は、次の３つの主要な分類のいずれかに属するものである。  １）ＮＯの産生を促進する薬物（例えば、生物起源のアミン）、現在循環器系薬剤として使用されているものの一部（例えば、ジヒドロピリジン）、スタチン、アンジオテンシン変換酵素、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬および抗糖尿病薬の一部（例えば、ビグアニド系薬剤）；  ２）内因性一酸化窒素の機能のうち、特定の機能に作用する薬剤（例えば、フォスフォジエステエラーゼ系の酵素阻害剤）又はｃＧＭＰフォスフォジエステラーゼの選択的阻害剤を用いた薬剤；並びに  ３）ＮＯを供給する薬剤、即ち、ＮＯガス又はＮＯを発生する薬剤（例えば、有機硝酸塩、Ｓ-ニトロソグルタチオン、ｅＮＯＳの基質であるＬ-アルギニン又はＬ-アルギニンの補因子であるテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ4））を用いるＮＯ交換療法用の薬剤。また、新種の一酸化窒素発生薬があり、容易に加水分解可能な硝酸エステル分子と共に製剤に含まれる、臨床で使用されている非ステロイド系抗炎症薬も第３の分類に属する。また、血管内皮において有益な変化をもたらす新たな手法、例えば、植物化学物質に富む植物性食品の天然抽出物の使用も挙げられる。
【００２７】
ＤＤＡＨ １遺伝子のThr/Met遺伝子型又はMet/Met遺伝子型を認識する遺伝子試験は、一酸化窒素拮抗薬又は一酸化窒素産生を阻害する他の化合物の投与によって副作用を患う危険度が高い患者に対して薬剤治療を選択する際にも有用である。つまり、このような患者においては、一酸化窒素拮抗剤の使用を避けるか、又は特定の一酸化窒素作動薬を患者の治療計画に取り入れることが可能となる。
【００２８】
核酸の配列は、対象生物が変異遺伝子を保有するか否かを判定するためのスクリーニングに用いることができる。このような判定は、正常遺伝子及び変異遺伝子の直接ＤＮＡシークエンシング法や、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた対立遺伝子の特異的増幅による正常又は変異遺伝子の検出を含む公知のＤＮＡ分析法あるいは正常又は変異遺伝子を間接的に検出するための、例えば、ＰＣＲ−一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）法や、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）法を含む種々の分子生物学的手法によって行うことができる。遺伝子が正常か変異型かの判定には、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法を用いることもできる。同様に、遺伝子チップ又は遺伝子アレイ技術に基づいた試験方法も、一本鎖ヌクレオチド多型を検出するために現在用いられている多くの試験から類推により容易に開発することができる。
【００２９】
上述のような判定は、ＲＮＡレベルで行うこともでき、種々の方法により組織レベルで発現するＲＮＡを分析すればよい。ハイブリダイゼーションで用いるために対立遺伝子特異的プローブを設計することができる。ハイブリダイゼーションは、例えばノーザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ又はin situ ハイブリダイゼーション法を用いて行うことができる。正常又は変異遺伝子由来のＲＮＡは、組織ＲＮＡをまずｃＤＮＡに変換し、その後、対立遺伝子特異的ＰＣＲ法でｃＤＮＡを増幅することによって分析することもできる。
【００３０】
本発明の方法を実施するためのキットは、本発明の方法を実施するための種々の成分を別々の容器及び／又はバイアルに納められたものと、本発明の方法を実施するための指示書を含むことが好ましい。従って、判定を実施するために必要ないくつかの又は全ての試薬や材料、例えば、緩衝液、プライマー、酵素、対照サンプル又は標準物質など、を別々に梱包したものを使用できるように同じ箱に入れて提供する。本発明の方法を実施するための指示書もこの箱の中に添付するが、それは独立した挿入物として収められていてもよいし、箱及び／又は個々のバイアルのラベルとして収められていてもよい。キットは、このキットを用いて得た結果を解析したり、本発明の方法で使用する遺伝子チップから得た結果を利用するためのソフトウェアを含んでいてもよい。
【００３１】
後述する観察結果に基づき、ＮＯの有効性又は濃度を高める治療は、ＮＯの代謝異常との関連が知られる疾患に罹患しているヒト又は動物を治療するために有効であると考えられる。このような疾患には、アテローム性動脈硬化症及びアテローム性動脈硬化症の素因となる種々の病理学的状態、例えば、高コレスレロール血症、高血圧症、ＩＩ型糖尿病、抗ホモシステイン血症及び慢性腎不全（Luscher TF et al., 1993; WO 00/44888）が挙げられる。既にＩＩ型（インスリン非依存型）糖尿病におけるＮＯの役割は示されており、糖尿病の治療方法としてＮＯ修飾治療が提案されているほどである。しかしながら、ＤＤＡＨ修飾治療は、糖尿病患者において内皮機能を改善するための新しい試みである。内皮依存性血管応答の異常は、インスリン耐性糖尿病患者に見出されている（Mc Veigh GE et al, 1992; Williams SB et al., 1996）。後述する本発明者らの知見に基づき、ＤＤＡＨ １遺伝子の欠陥及びこれに伴うＤＤＡＨ １タンパク質の活性低下、並びにその結果として生じるＡＤＭＡ異化作用の欠陥及びそれに伴う一酸化窒素の阻害は、ＩＩ型（インスリン非依存性）糖尿病発症率の有意な上昇と関連している。これを基に、我々はＩＩ型糖尿病及びその血管性合併症に対し、上述した治療方法を提案する。
【００３２】
変異遺伝子配列の影響はトランスジェニック動物で調査することができる。トランスジェニック動物は、例えば、標的相同組み換え技法によって作製することができる。この技法は、新規薬物分子を調査及びスクリーニングするための、変異遺伝子の及ぼす影響を修飾した理想的な前臨床モデルを提供する。
【００３３】
以下の発明を実施するための最良の形態において、本発明をさらに詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
ＤＤＡＨ遺伝子をコードするゲノム対立遺伝子の決定 
問題となるコドンの対立遺伝子パターンを決定するための本発明の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をシークエンシング又は制限断片長多型法と併用することで実施することができる。
【００３５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） 
ヒト ジメチルアルギニン ジメチルアミノヒドラーゼ １（ＤＤＡＨ 1）の第１エクソンを増幅するためのプライマー ペアのヌクレオチド配列は次のとおりである：5エ- GTC CCC CGC CTC CGC ATA CTT -3エ（配列番号５）及び 5エ- CCA CCT GCC CGA GAC CGT ACA A - 3エ（配列番号６）。増幅したＤＤＡＨ １ 第１エクソンのＰＣＲ産物の大きさは、８９２ｂｐであった。上記プライマーは、ミア ピルスカネンが設計し、Ａ．Ｉ．ヴィルタネン分子化学研究所（A. I. Virtanen Institute for Molecular Sciences）（フィンランド国、クオーピオ）内のＤＮＡ合成及びシークエンシング施設（DNA Synthesis and Sequencing Facility）が作製したものである。
【００３６】
ＰＣＲによる増幅は２０μｌの反応系で行った。反応混合物は、６０ｎｇのヒト ゲノムＤＮＡ（抹消血から抽出）、１× GeneAmp（登録商標）ゴールドバッファー（Gold Buffer）（カリフォルニア州、フォスターシティ、Applied Biosystems社製）、１．２５ｍＭのＭｇＣｌ2（カリフォルニア州、フォスターシティ、Applied Biosystems社製）、各ヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）を１００μＭ、各プライマーを０．５μＭ、１Ｕの AmpliTaq Gold（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア州、フォスターシティ、Applied Biosystems社製）及び１Ｍのベタイン（米国、ミズーリ州、セントルイス、Sigma-Aldrich, Inc.製）を含有した。
【００３７】
標的ＤＮＡ配列（ＤＤＡＨ １遺伝子の第１エクソン）を、上記のＰＣＲ反応によって増幅した。ＰＣＲは、GeneAmp（登録商標）PCR System 9700のプログラム可能なサーマルブロック（カリフォルニア州、フォスターシティ、Applied Biosystems社製）を用い、以下の条件で行った。最初に９４℃で７分間維持して反応を行い、次の２工程を４０サイクル繰り返した：９４℃で４５秒、６８℃で１分３０秒。その後、７２℃で５分間反応を行い、最後に４℃で反応系を維持した。
【００３８】
シークエンシング 
シークエンシング反応を行う前に、増幅したＤＤＡＨ １遺伝子の第１エクソンのＰＣＲ産物をＧＦＸTM９６ ＰＣＲ精製キット（PCR Purification Kit）（ニュージャージー州、ピスカタウェイ、Amersham Pharmacia Biotech Inc.製）で精製した。シークエンシング反応は、AmpliTaq（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ ＤＮＡ シークエンシング キット（カリフォルニア州、フォスターシティ、Applied Biosystems社製）を用いて BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing v2.0 Ready Reactionsで行った。ＤＤＡＨ １の第１エクソンのシークエンシング プライマーは、5エ- CCG ACG GGA AGT TGT GAA - 3エ（配列番号７）であった。シークエンシング プライマーはミア ピルスカネンが設計し、Ａ．Ｉ．ヴィルタネン分子化学研究所（フィンランド国、クオーピオ）内のＤＮＡ合成及びシークエンシング施設が作製したものである。
【００３９】
サイクルシークエンシングは、GeneAmp（登録商標） PCR System 9700 のプログラム可能なサーマルブロック（カリフォルニア州、フォスターシティ、Applied Biosystems社製）を用いて、以下のプログラムで行った。次の３つの工程：９６℃で１０秒、５０℃で５秒及び６０℃で４分を２５サイクル繰り返し、その後４℃で反応を停止した。（標準条件でサイクルシークエンシングを行う際には、カリフォルニア州、フォスターシティ、Applied Biosystems社の“ABI PRISM（登録商標）3100 Genetic Analyzer Sequencing Chemistry Guide”を参照）。
【００４０】
ダイターミネーターの除去及びシークエンシング反応のクリーンアップは、MultiScreen（登録商標）−ＨＶ濾過プレート（HV filtration plate）（マサチューセッツ州、ベッドフォード、Millipore社製）を用いて行った。精製後のサンプルはMicroAmp（登録商標）光学９６ウェル反応プレート（Optical 96-Well Reaction Plate）（カリフォルニア州、フォスターシティ、Applied Biosystems社製）に移し、１６本のキャピラリーを備えた自動蛍光キャピラリー電気泳動ＤＮＡ解析システムであるABI PRISM（登録商標）3100 Genetic Analyzerを用いてシークエンシングを行った。
【００４１】
制限断片長多型法 
ＤＤＡＨ １遺伝子の第１エクソンのＰＣＲ産物（８９２ｂｐ）を、１× NEBuffer 3（マサチューセッツ州、ビバリー、New England BioLabs Inc.製）中で制限酵素BsmA Iで６時間消化し、６×ローディングダイ溶液と混合し、１．７％アガロースゲルで電気泳動に付した。正常型及び変異型対立遺伝子の同定は電気泳動における制限酵素断片の大きさの違いに基づいて行い、それぞれの対立遺伝子に対して以下の特徴的なバンドが検出された：Thr87の正常なホモ接合型（Thr/Thr型）： ４８６ｂｐ、２８４ｂｐ、１１２ｂｐと１０ｂｐ；Thr87Met変異のヘテロ接合型（Thr/Met型）： ７７０ｂｐ、４８６ｂｐ、２８７ｂｐ、１１２ｂｐと１０ｂｐ；並びにThr87Met変異のホモ接合型（Met/Met型）： ７７０ｂｐ、１１２ｂｐと１０ｂｐ。
【００４２】
集団遺伝学的研究 
前述した集団遺伝学的研究、即ち、ＤＤＡＨ遺伝子のThr/Met変異を保因する１３人の対象者を含む１６０８人のフィンランド人中年男性を対象とした研究について、以下により詳細に述べる。
【００４３】
ＮＯと競合するＡＤＭＡの血管収縮特性及びＡＤＭＡの異化作用におけるＤＤＡＨの役割に関する知見に基づいて、ＤＤＡＨ １遺伝子に見られる対立遺伝子の多様性は、冠動脈性心疾患などの循環器疾患、脳血管疾患及び高血圧症、並びに糖尿病と関連すると仮定した。この仮定を検討するために、１６０８人のフィンランド人中年男性を対象に集団遺伝学研究を実施した。この研究は、クオピオ虚血性心疾患危険因子研究（Kuopio Ischemic Heart Disease Risk Factor Study）(KIHD）の一部として行われ、ＫＩＨＤはフィンランド東部の男性における心臓血管疾患及びそれに伴うその他の症状の危険因子を調査するために進行中の集団病理学的研究である（Salonen, 1988）。この地域は、母集団が均質であること（Sajantila et al., 1996）、心疾患罹患率及び致死率が高いこと（Keys, 1980）、そして糖尿病罹患率及び有病率が高いことで知られる（Jousilahti P. et al., 1998）。
【００４４】
１６０８人の対象者のうち、１３人（０．８％）が、ＤＤＡＨ １遺伝子のThr/Met型変異のヘテロ接合型保因者だった。そしてホモ接合型であるMet/Met型変異の保因者はいなかった。
【００４５】
１５９５人のＤＤＡＨ変異非保因者のうち、３２０人（２０．１％）に一般的な冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）が認められたが、上記１３人の変異保因者のうち、９人（６９．２％）に一般的なＣＨＤが認められた。未修正のオッズ比は９．０（９５％ＣＩ：２．７〜２９．３、ｐ＜０．００１）である。一般的なＣＨＤは、心筋梗塞又は狭心症の病歴と定義し、労作性狭心症はロンドン大学公衆衛生学大学院（London School of Hygiene）の問診表に基づく診断か、ニトログリセリン錠剤の常用を意味する。年齢、検査年数及び喫煙状況に合わせて修正した多変量ロジスティックモデルにおいては、変異遺伝子の保因者は、ＣＨＤを発症する危険度が９．４倍だった（９５％ＣＩ：２．４〜３６．８、ｐ＝０．００１）。年齢、検査年数、喫煙状況、ボディーマス指数（ｋｇ/ｍ2）、血清セレン濃度、カロリー制限をした食事によるビタミンＣ摂取量及び食事で摂取した飽和脂肪酸に対する多価不飽和脂肪酸の割合を含めたステップ・アップモデルにおいては、変異遺伝子保因者は、ＣＨＤを発症する危険度が１６．０倍だった（９５％ＣＩ：３．７〜６９．２、ｐ＜０．００１）。
【００４６】
１５９５人のＤＤＡＨ変異非保因者のうち４９２人（３０．８％）に運動負荷試験時にＣＨＤが認められ、１３人の変異保因者については、９人（６９．２％）に運動負荷によるＣＨＤが認められた。運動負荷によるＣＨＤは、運動中又は運動後の典型的な胸痛又は虚血性ＥＫＧ変化と定義した（Kaplan and Salnen, 1990; Laukkanen et al., 2001）。未修正のオッズ比は５．０だった（９５％ＣＩ：１．５〜１６．５、ｐ＝０．００５）。年齢、検査年数及び喫煙状況を考慮したロジスティックモデルにおいては、オッズ比は６．０だった（９５％ＣＩ：１．５〜２３．１、ｐ＝０．０１０）。運動負荷による虚血に対する最も大きな危険因子に対して修正したステップ・アップモデルにおいては、ＤＤＡＨ変異保因状況に対するオッズ比は６．８だった（９５％ＣＩ：１．７〜２６．９、ｐ＝０．００６）。
【００４７】
一般的なＣＨＤと運動負荷によるＣＨＤを推測するロジスティックモデルにＤＤＡＨ変異保因状況と同時に最も強力な９つの危険因子を導入した（表１）。外力項を持つこのようなモデルでは、変異保因者が一般的なＣＨＤを発症する危険度は９．６倍であり、運動誘発性ＣＨＤを発症する危険度は５．３倍であった。
【００４８】
ＤＤＡＨ変異保因状況と一般的な高血圧症との関係について、遺伝子型を決定した男性１６０８人を対象に研究した。高血圧症は、収縮期血圧（ＢＰ）が１６５ｍｍＨｇ以上又は弛緩期血圧が９５ｍｍＨｇ以上、あるいは抗高血圧症治療を受けている状態と定義した。両方の血圧は、午前８時から１０時の間に、一人の看護師によってランダムゼロ（random-zero）水銀血圧計を用いて測定した。測定プロトコルは、臥位測定を３回、起立測定１回、座位測定を２回行い、これらを５分間隔で行った。全６回の測定値の平均値を収縮期血圧及び弛緩期血圧として用いた。高血圧症に対するその他の強力な危険因子（年齢及びボディーマス指数）並びに検査年数を考慮したロジスティックモデルにおいて、ＤＤＡＨ変異保因者は、非保因者と比べて高血圧症を発症する危険度が４．３倍だった（９５％ＣＩ：１．１２〜１５．８、ｐ＝０．０３２）。
【００４９】
ＤＤＡＨ変異保因状況と糖尿病の発症率との関係については、検査開始時（baseline）には糖尿病に罹患しておらず、糖尿病の状態を再検査するための追跡調査に１１年間にわたって参加した６８８人の男性を対象に研究した。糖尿病は、空腹時の血中ブドウ糖濃度が８．０ ｍｍｏｌ／Ｌ以上、又は糖尿病と診断されたか治療を受けている状態と定義した。年齢、ボディーマス指数、喫煙状態及び検査年数を考慮したロジスティックモデルにおいては、変異保因者が糖尿病を発症する危険度は６．９倍である（９５％ＣＩ：１．０〜４８．１、ｐ＝０．０５）。糖尿病を引き起こすもう一つの変異をロジスティックモデルに追加した場合、ＤＤＡＨ １変異保因状態に対するオッズ比は、７．３だった（９５％ＣＩ：１．１〜４９．７、ｐ＝０．０４２）。
【００５０】
ＤＤＡＨ １の遺伝子型が、狭心症による胸痛に対するニトログリセリンの有効性に及ぼす効果について、１６０８人を対象に研究した。８７番アミノ酸がMetであるＤＤＡＨ １の対立遺伝子を保因する男性においては、胸痛に対するニトリグリセリンの効果は、変異非保因と比べて低かった。
【００５１】
更に、４８人の男性対象者からなる群について、糖尿病に関連した代謝物質の病理生化学におけるＡＤＭＡの重要性を研究した。タンパク質中のカルボニル基（ＡＧＥファミリーに属す）及びＡＤＭＡの測定を実験開始時及び１２ヵ月後に実施した。ＡＤＭＡとタンパク質中のカルボニル基の関連を示す相関係数は、実験開始時には０．４８（ｐ＜０．００１）であり、１２ヵ月後には０．４６（ｐ＝０．００１）であった。本研究は、内皮障害の危険因子であるＡＤＭＡと、糖尿病関連合併症との関係が示されている化合物であるＡＧＥとの相関関係を明らかにした最初の研究である。
【００５２】
ＡＤＭＡとＤＤＡＨについて既に知られている生物学的特性、フィンランド人母集団の均質性、研究計画、比較的大きい研究対象集団、並びにＣＨＤ、高血圧症及び糖尿病が１つの形質と関連付けられたことを総合的に考慮すると、ＤＤＡＨ １遺伝子のThr/Met遺伝子型又はMet/Met遺伝子型は、循環器疾患及び糖尿病の遺伝的危険因子であることを示唆した。
【００５３】
本発明の方法は、ここで開示したわずかな態様だけでなく、種々の態様が組み込まれうることを御理解いただきたい。他の態様が存在し、それらは本発明の精神から外れぬことは当業者には明らかである。従って、本願明細書に記載した態様は具体例であり、本発明を制限するものではない。
【００５４】
【表１】
2005523023.tif 000002
【００５５】
参考文献
Boger RHm Bode-Boger SM, Szuba A, et al. Asymmetric dimethylarginine (ADMA): a novel risk factor for endothelial dysfunction. Its role in hypercholesterolemia. Circulation 1998;98:1842-1847.
Fard A, Tuck CH, Donis JA, et al. Acute elevations of plasma asymmetric dimethylarginine and impaired endothelial function in response to a high-fat meal in patients with type 2 diabetes. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000;20:2039-2044.
Jousilahti P, Vartiainen E, Tuomilehto J, Pekkanen J, Puska P. Role of known risk factors in explaining the difference in the risk of coronary heart disease between eastern and southwestern Finland. Ann Med 1998;30(5):481-487.
Kaplan GA, Salonen JT. Socioeconomic conditions in childhood and ischaemic heart disease during middle age. BMJ 1990;301(6761):1121-1123.
Keys A: Seven Countries: A Multivariate Analysis of Death and Coronary Heart Disease. Cambridge, Mass, Harvard University Press, 1980.
Laukkanen JA, Kurl S, Lakka TA, et al. Exercise-induced silent myocardial ischemia and coronary morbidity and mortality in middle-aged men. J Am Coll Cardiol 2001;38(1):72-79.
Leiper J, MacAllister R, Whitley G, Santa Maria J, Chubb A, Charles I, Vallance P. Identification of two human dimethylarginine dimethylaminohydrolases with distinct tissue distributions and homology to microbial arginine deiminases. Biochem J 1999;343:209-214.
Luscher TF, Boulanger CM, Yang Z, Noll G, Dohi Y. Interactions between endothelium-derived relaxing and contracting factors in health and cardiovascular disease. Circulation 1993;87(suppl 5):36-44
McVeigh GE, Brennan GM, Johnston GD, et al. Impaired endothelium-dependent and independent vasodilation in patients with type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus. Diabetologia 1992;35:771-776.
Miyazaki H, Matsuoka H, Cooke JP, et al. Endogenous nitric oxide synthase inhibitor: a novel marker of atherosclerosis. Circulation 1999;99:1141-1146.
Sajantila A, Salem AH, Savolainen P, Bauer K, Gierig C, Paabo S: Paternal and maternal DNA lineages reveal a bottleneck in the founding of the Finnish population.  Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1996;93:12035-12039.
Salonen JT. Is there a continuing need for longitudinal epidemiologic research? The Kuopio Ischaemic Heart Disease Risk Factor Study.  Ann Clin Res 1988;20:46-50.
Tran Cam TL, Fox MF, Vallance P, Leiper J. DDAH 1 and DDAH 2 encode asymmetric methyl aminohydrolases with distinct expression patterns in adult and fetal tissues and are located on chromosomes 1p22 and 6p21.3 respectively. Genomics 2000;68:101-105.
Valkonen VP, Paiva H, Salonen JT, et al. Risk of acute coronary events and serum concentration of asymmetrical dimethylarginine. Lancet 2001 358(9299): 2127-2128.
Williams SB, Cusco JA, Roddy MA, Johnstone MT, Creager MA. Impaired nitric oxide-mediated vasodilation in patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus. J Am Coll Cardiol 1996;27:567-574.
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号１    変異したヒト ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドラーゼ 1（ＤＤＡＨ １）タンパク質のコード配列
配列番号３    ヒト ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドラーゼ １（ＤＤＡＨ １）タンパク質のコード配列
配列番号５    合成配列に関する記載：  ＰＣＲプライマーペア
配列番号６    合成配列に関する記載：  ＰＣＲプライマーペア
配列番号７    合成配列に関する記載：  シークエンシングプライマー
【配列表】
2005523023000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月30日(2004.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＤＡＨ １タンパク質の８７番〜９４番アミノ酸残基、１７３番〜１７７番アミノ酸残基及び２２１番〜２２８番アミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸で置換されている、変異したヒト ＤＤＡＨ １タンパク質をコードする核酸。
【請求項２】
該核酸がゲノムヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
変異ＤＤＡＨ １タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含し、該変異ＤＤＡＨ １タンパク質は、ヒト ＤＤＡＨ １遺伝子の第１エクソン中のコドン８７のコードするスレオニンがメチオニンに置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
配列番号１のゲノムヌクレオチド配列を包含することを特徴とする、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
該核酸がｃＤＮＡであることを特徴とする、請求項３に記載の核酸。
【請求項６】
ＲＮＡ配列を包含することを特徴とする、請求項３に記載の核酸。
【請求項７】
ＤＤＡＨ １タンパク質の８７番〜９４番アミノ酸残基、１７３番〜１７７番アミノ酸残基、２２１番〜２２８番アミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸で置換されている、変異したヒト ＤＤＡＨ １ポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列を包含することを特徴とする、請求項７に記載の変異ＤＤＡＨ １ポリペプチド。
【請求項９】
１本鎖である請求項５のｃＤＮＡを包含する捕捉用プローブ。
【請求項１０】
生物学的試料における請求項１の核酸の存在の有無を判定するための方法であって、ターゲット核酸となる該核酸を一本鎖にしてから核酸捕捉用プローブ及び核酸検出用プローブと接触させて、核酸捕捉用プローブ、ターゲット核酸及び核酸検出用プローブからなる複合体を検出する方法。
【請求項１１】
該核酸捕捉用プローブが固相と接着しているか又は接着しうるものであり、且つ請求項５のｃＤＮＡを包含し、固相から検出されるシグナルは、生物学的試料における請求項１の核酸の存在を示すことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該核酸捕捉用プローブが固相と接着しているか又は接着しうるものであり、且つ野生型ＤＤＡＨ １タンパク質をコードする遺伝子に対応するｃＤＮＡを包含し、固相から検出されるシグナルは、生物学的試料中に請求項１の核酸が存在しないことを示すことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
変異ＤＤＡＨ １タンパク質をコードする対立遺伝子のパターンを決定することで、対象生物の循環器疾患及び糖尿病の罹病性を診断するための、以下の工程を包含する方法。
ａ）対象生物から試験に付すための生物学的試料を得るための工程、及び
ｂ）生物学的試料におけるヒト ＤＤＡＨ １の変異遺伝子型の存在を検出するための工程であって、変異遺伝子型の存在は、該対象生物が循環器系疾患及び糖尿病を発症する危険度が高いことを示す。
【請求項１４】
ヒト ＤＤＡＨ １の該変異遺伝子型が、Thr87Met変異のヘテロ接合型（Thr/Met型）又はThr87Met変異のホモ接合型（Met/Met型）であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
検出するための工程がＤＮＡアッセイであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子又はＤＮＡからなるチップ、マイクロアレイ、ストリップ又はパネル、あるいはアッセイの対象となる複数の遺伝子、変異又はＲＮＡの発現を上記と同様に組み合わせたものを用いて検出するための工程を行うことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
対立遺伝子のパターンをポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
生物学的試料が血液試料又は口腔の細胞試料であり、該試料からゲノムＤＮＡを単離することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
検出するための工程を、請求項７の変異ＤＤＡＨ １ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する捕捉用プローブ又は一本鎖ｃＤＮＡを用いて行うことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
対象生物における一酸化窒素の有効性、産生又は代謝に作用する薬剤による治療が、対象生物において有効であるか否かを判定するために用いることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
対象生物におけるＡＤＭＡの有効性又は濃度を低下させる薬剤による治療が、対象生物において有効であるか否かを判定するために用いることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＤＡＨ １作動薬などのＤＤＡＨ １の存在量又は濃度を高める薬剤による治療が、対象生物において有効であるか否かを判定するために用いることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＤＡＨ １拮抗薬の投与によって対象生物が副作用を患う危険度が高いか否かを判定するために用いることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
化合物の糖尿病、高血圧及び心筋虚血を防止する作用の臨床薬物治験に適した、非変異型のＤＤＡＨタンパク質をコードするＤＤＡＨ遺伝子配列を有する対象生物を選択するための工程を更に包含することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
対象生物におけるヒト ＤＤＡＨ １の遺伝子型が変異型であるか否かを判定することで変異ＤＤＡＨ １をコードする対立遺伝子のパターンを決定し、高血圧症の対象生物において循環器疾患及び糖尿病に対して標的治療を行う方法であって、請求項１３の方法の工程（ａ）と（ｂ）を実施し、そして一酸化窒素の有効性、産生又は代謝に作用する薬剤を用いて、変異遺伝子型を有する対象生物を処置することを包含する方法。
【請求項２６】
ヒト ＤＤＡＨ １の該変異遺伝子型が、Thr87Met変異のヘテロ接合型（Thr/Met型）又はThr87Met変異のホモ接合型（Met/Met型）であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該薬剤が、対象生物のＡＤＭＡの活性又は濃度を、直接的に調節、上昇又は低減する薬剤、あるいは中枢神経系作用等を介して間接的に調節、上昇又は低減する薬剤であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
該薬剤が、対象生物のＤＤＡＨ １の活性又は濃度を、直接的に調節、上昇又は低減する薬剤、あるいは中枢神経系作用等を介して間接的に調節、上昇又は低減する薬剤であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
該薬剤が、サブタイプ選択的又は非選択的なＤＤＡＨ作動薬であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
該循環器疾患が、冠動脈心疾患、脳血管疾患又は高血圧症であることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
ＩＩ型糖尿病を患うヒト又は動物の治療方法であって、対象となるヒト又は動物における一酸化窒素の有効性、産生量又は濃度を上昇させる療法を包含する方法。
【請求項３２】
糖尿病の血管系合併症の治療方法であって、対象となるヒト又は動物における一酸化窒素の有効性、産生量及び濃度を上昇させる療法を包含する方法。
【請求項３３】
対象生物における一酸化窒素の有効性、産生量又は濃度を上昇させる化合物を対象生物に投与することを包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ＩＩ型糖尿病を患うヒト又は動物の治療方法であって、ＡＤＭＡの活性又は濃度上昇を、直接的に低減又は阻害する化合物、あるいは中枢神経系作用等を介して間接的に低減又は阻害する化合物を対象生物に投与することを包含する方法。
【請求項３５】
ＩＩ型糖尿病を患うヒト又は動物の治療方法であって、ＤＤＡＨの活性又は濃度を、直接的に亢進又は誘発する化合物、あるいは中枢神経系作用等を介して間接的に亢進又は誘発する化合物を対象生物に投与することを包含する方法。
【請求項３６】
ＩＩ型糖尿病を患うヒト又は動物の治療方法であって、ＤＤＡＨタンパク質の形成を阻害する酵素や化合物に対する阻害性物質と、ＤＤＡＨタンパク質の形成を賦活化する物質に対する活性化化合物を共に対象生物に投与することを包含する方法。
【請求項３７】
該薬剤が、サブタイプ（ＤＤＡＨ １、ＤＤＡＨ ２）選択的又は非選択的なＤＤＡＨ拮抗剤であることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
該療法が、遺伝子治療又は遺伝子導入であることを特徴とする、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３９】
該療法が、非変異ＤＤＡＨ １遺伝子、その断片又はその誘導体の導入を包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
対象生物が循環器疾患及び糖尿病を発症する危険度を判定するためのキットであって、対象生物から得た生物学的試料中の、変異したヒト ＤＤＡＨ １をコードする対立遺伝子のパターンを決定するための手段を包含し、所望により、対立遺伝子のパターンを決定するために得た結果を解析するためのソフトウェアを更に包含するキット。
【請求項４１】
生物学的試料における、請求項１の核酸の存在の有無を判定するためのキット。
【請求項４２】
核酸捕捉用プローブを包含することを特徴とする、請求項４０又は４１に記載のキット。
【請求項４３】
請求項７の変異ＤＤＡＨ １ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含するヒトＤＮＡ配列を保因するトランスジェニック動物。
【国際調査報告】
2005523023.tif 000003
2005523023.tif 000004
2005523023.tif 000005
2005523023.tif 000006
2005523023.tif 000007
2005523023.tif 000008